(57)【要約】本発明は、定方向性核酸ライブラリを構築するためのキットを含む方法および組成物を提供する。本発明は、さらに定方向性ｃＤＮＡライブラリを増幅および配列決定するための方法および組成物を提供する。本明細書では、ＲＮＡおよびｄｓＤＮＡからの定方向性配列決定ライブラリ生成のための方法、組成物およびキットを提供する。これらの方法、組成物およびキットは、全トランスクリプトーム、全ゲノム、標的化されたかまたは選択された転写物の定方向性ライブラリの生成に使用され得、また無方向性全ゲノム配列決定ライブラリの生成にも適用され得る。
2016511007.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
定方向性ｃＤＮＡライブラリを生成するための方法であって、
ａ）１つまたはそれより多くのプライマーを鋳型ＲＮＡにアニーリングさせる工程と、
ｂ）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＵＴＰを含む反応混合物の存在下で前記１つまたはそれより多くのプライマーを伸長させる工程であって、ここで、前記反応混合物は、ある一定のｄＵＴＰ対ｄＴＴＰ比を含み、前記比は所望の密度でのｄＵＴＰの組込みを可能にし、それによって所望の密度で組み込まれたｄＵＴＰを含む１つまたはそれより多くの第１鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が生成される、工程と、
ｃ）ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）および前記ＵＮＧにより作製される脱塩基部位にあるホスホジエステルバックボーンを開裂することができる作用因子で、所望の密度で組み込まれたｄＵＴＰを含む前記１つまたはそれより多くの第１鎖ｃＤＮＡを選択的に開裂する工程であって、ここで、前記開裂により、ブロックされた３’末端を含む所望のサイズの複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成される、工程と、
ｄ）部分的デュプレックスおよび３’オーバーハングを含む第１アダプターを、ブロックされた３’末端を含む前記複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントのうちの１つまたはそれより多くの３’末端にアニーリングさせる工程であって、ここで、前記第１アダプターは配列Ａを含み、前記アニーリングは、前記３’オーバーハングにあるランダム配列を、ブロックされた３’末端を含む前記複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントのうちの前記１つまたはそれより多くの３’末端に存在する相補配列にハイブリダイズさせることを含む、工程と、
ｅ）前記相補配列にハイブリダイズされた前記３’オーバーハングをＤＮＡポリメラーゼで伸長させる工程であって、ここで、一方の端に前記配列Ａを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成される、工程と、
ｆ）配列Ｂを含む第２アダプターを、一方の端に前記配列Ａを含む前記１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントにライゲーションさせる工程であって、ここで、前記ライゲーションにより、一方の端に前記配列Ａおよび反対端に前記配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、それによって前記定方向性ポリヌクレオチドライブラリが生成される、工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
全トランスクリプトーム定方向性配列決定のための方法であって、
ａ）１つまたはそれより多くのプライマーを鋳型ＲＮＡにアニーリングさせる工程と、
ｂ）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＵＴＰを含む反応混合物の存在下で前記プライマーを伸長させる工程であって、ここで、前記反応混合物は、ある一定のｄＵＴＰ対ｄＴＴＰ比を含み、前記比は所望の密度でのｄＵＴＰの組込みを可能にし、それによって所望の密度で組み込まれたｄＵＴＰを含む１つまたはそれより多くの第１鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が生成される、工程と、
ｃ）ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）および前記ＵＮＧにより作製される脱塩基部位にあるホスホジエステルバックボーンを開裂することができる作用因子で、所望の密度で組み込まれたｄＵＴＰを含む前記１つまたはそれより多くの第１鎖ｃＤＮＡを選択的に開裂する工程であって、ここで、前記開裂により、ブロックされた３’末端を含む所望のサイズの複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成される、工程と、
ｄ）部分的デュプレックスおよび３’オーバーハングを含む第１アダプターを、ブロックされた３’末端を含む前記複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントのうちの１つまたはそれより多くの３’末端にアニーリングさせる工程であって、ここで、前記第１アダプターは配列Ａを含み、前記アニーリングは、前記３’オーバーハングにあるランダム配列を、ブロックされた３’末端を含む前記複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントのうちの前記１つまたはそれより多くの３’末端に存在する相補配列にハイブリダイズさせることを含む、工程と、
ｅ）前記相補配列にハイブリダイズされた前記３’オーバーハングをＤＮＡポリメラーゼで伸長させる工程であって、ここで、一方の端に前記配列Ａを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成される、工程と、
ｆ）配列Ｂを含む第２アダプターを、一方の端に前記配列Ａを含む前記１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントにライゲーションさせる工程であって、ここで、前記ライゲーションにより、一方の端に前記配列Ａおよび反対端に前記配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、それによって定方向性ｃＤＮＡライブラリが生成される、工程と、
ｇ）前記定方向性ｃＤＮＡライブラリを増幅および／または配列決定する工程と、
を含む方法。
【請求項３】
定方向性ｃＤＮＡライブラリを生成するための方法であって、
ａ）鋳型ｄｓＤＮＡをニッキング酵素で処理する工程であって、ここで、前記処理により、前記鋳型ｄｓＤＮＡの１鎖のホスホジエステルバックボーンに１つまたはそれより多くの破断が生じ、前記破断により、前記１鎖において１つまたはそれより多くの３’ヒドロキシルが生成される、工程と、
ｂ）前記１つまたはそれより多くの３’ヒドロキシルを伸長させる工程であって、ここで、前記伸長はｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＵＴＰを含む反応混合物の存在下で行われ、前記反応混合物は、ある一定のｄＵＴＰ対ｄＴＴＰ比を含み、前記比は所望の密度でのｄＵＴＰの組込みを可能にし、それによって所望の密度で組み込まれたｄＵＴＰを含む１つまたはそれより多くの第１鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が生成される、工程と、
ｃ）ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）および前記ＵＮＧにより作製される脱塩基部位にあるホスホジエステルバックボーンを開裂することができる作用因子で、所望の密度で組み込まれたｄＵＴＰを含む前記１つまたはそれより多くの第１鎖ｃＤＮＡを選択的に開裂する工程であって、ここで、前記開裂により、ブロックされた３’末端を含む所望のサイズの複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成される、工程と、
ｄ）部分的デュプレックスおよび３’オーバーハングを含む第１アダプターを、ブロックされた３’末端を含む前記複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントのうちの１つまたはそれより多くの３’末端にアニーリングさせる工程であって、ここで、前記第１アダプターは配列Ａを含み、前記アニーリングは、前記３’オーバーハングにあるランダム配列を、ブロックされた３’末端を含む前記複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントのうちの前記１つまたはそれより多くの３’末端に存在する相補配列にハイブリダイズさせることを含む、工程と、
ｅ）前記相補配列にハイブリダイズされた前記３’オーバーハングをＤＮＡポリメラーゼで伸長させる工程であって、ここで、一方の端に前記配列Ａを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成される、工程と、
ｆ）配列Ｂを含む第２アダプターを、一方の端に前記配列Ａを含む前記１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントにライゲーションさせる工程であって、ここで、前記ライゲーションにより、一方の端に前記配列Ａおよび反対端に前記配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、それによって定方向性ｃＤＮＡライブラリが生成される、工程と、
を含む、方法。
【請求項４】
全ゲノム配列決定のための方法であって、
ａ）ゲノムＤＮＡをニッキング酵素で処理する工程であって、前記処理により、前記ゲノムＤＮＡの１鎖のホスホジエステルバックボーンに１つまたはそれより多くの破断が生じ、前記破断により、前記１鎖において１つまたはそれより多くの３’ヒドロキシルが生成される、工程と、
ｂ）前記１つまたはそれより多くの３’ヒドロキシルを伸長させる工程であって、前記伸長はｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＵＴＰを含む反応混合物の存在下で行われ、前記反応混合物は、ある一定のｄＵＴＰ対ｄＴＴＰ比を含み、前記比は所望の密度でのｄＵＴＰの組込みを可能にし、それによって所望の頻度で組み込まれたｄＵＴＰを含む１つまたはそれより多くの第１鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が生成される、工程と、
ｃ）ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）および前記ＵＮＧにより作製される脱塩基部位にあるホスホジエステルバックボーンを開裂することができる作用因子で、所望の密度で組み込まれたｄＵＴＰを含む前記１つまたはそれより多くの第１鎖ｃＤＮＡを選択的に開裂する工程であって、ここで、前記開裂により、ブロックされた３’末端を含む所望のサイズの複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成される、工程と、
ｄ）部分的デュプレックスおよび３’オーバーハングを含む第１アダプターを、ブロックされた３’末端を含む前記複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントのうちの１つまたはそれより多くの３’末端にアニーリングさせる工程であって、ここで、前記第１アダプターは配列Ａを含み、前記アニーリングは、前記３’オーバーハングにあるランダム配列を、ブロックされた３’末端を含む前記複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントのうちの前記１つまたはそれより多くの３’末端に存在する相補配列にハイブリダイズさせることを含む、工程と、
ｅ）前記相補配列にハイブリダイズされた前記３’オーバーハングをＤＮＡポリメラーゼで伸長させる工程であって、ここで、一方の端に前記配列Ａを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成される、工程と、
ｆ）配列Ｂを含む第２アダプターを、一方の端に前記配列Ａを含む前記１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントにライゲーションさせる工程であって、ここで、前記ライゲーションにより、一方の端に前記配列Ａおよび反対端に前記配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、それによって定方向性ｃＤＮＡライブラリが生成される、工程と、
ｇ）前記定方向性ｃＤＮＡライブラリを増幅および／または配列決定する工程と、
を含む方法。
【請求項５】
前記１つまたはそれより多くのプライマーが、ランダムプライマーを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記１つまたはそれより多くのプライマーが、標的鋳型ＲＮＡまたはＲＮＡの群に特異的な配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡの群が実質的に全ての転写物を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＮＡの群が、構造的ＲＮＡを含まず、前記構造的ＲＮＡがリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ホスホジエステルバックボーンを開裂することができる前記作用因子が、酵素、化学的作用因子、および／または熱を含む、請求項１、２、３または４に記載の方法。
【請求項１０】
前記化学的作用因子がポリアミンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリアミンがＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（ＤＭＥＤ）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素がエンドヌクレアーゼである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記エンドヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼＶＩＩＩである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記部分的デュプレックスが長鎖および短鎖を含み、前記長鎖が、前記短鎖とデュプレックスを形成する前記配列Ａおよび３’オーバーハングを含む、請求項１、２、３または４に記載の方法。
【請求項１５】
前記短鎖がさらに３’および／または５’末端にブロックを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１アダプターが複数の第１アダプターを含み、前記複数の第１アダプターのそれぞれにおける前記ランダム配列が、前記複数の第１アダプターの別のものにおけるランダム配列とは異なり、各々の前記複数の第１アダプターは、前記配列Ａを含む、請求項１、２、３または４に記載の方法。
【請求項１７】
工程ｄ）の結果、３’末端にアニーリングされた前記複数の第１アダプターの１つをさらに含む工程ｃ）で生成されたブロックされた３’末端を含む所望のサイズの前記複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントの実質的に全てが得られる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１アダプターがさらにステムループを含み、前記ステムループが前記部分的デュプレックスの長鎖の５’末端を前記部分的デュプレックスの短鎖の３’末端と連結し、前記長鎖が前記配列Ａおよび前記３’オーバーハングを含む、請求項１、２、３または４に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１アダプターがさらに前記長鎖の５’末端にブロックを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１アダプターがさらに前記短鎖の５’末端にブロックを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記３’オーバーハングが、少なくとも６、７、８または９個のヌクレオチドを含む、請求項１、２、３または４に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２アダプターが部分的デュプレックスを含み、前記部分的デュプレックスは短鎖にハイブリダイズされた長鎖を含み、前記長鎖は前記配列Ｂおよびオーバーハングを含む、請求項１、２、３または４に記載の方法。
【請求項２３】
前記長鎖が前記配列Ｂおよび３’オーバーハングを含み、前記短鎖が３’末端にブロックを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ライゲーションにより、一方の端に前記配列Ａおよび反対端に前記配列Ｂを含む前記１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、前記配列Ａが一方の端の５’末端にあり、前記配列Ｂが反対端の３’末端にある、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記長鎖が前記配列Ｂおよび５’オーバーハングを含み、前記短鎖が５’末端にブロックを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記ライゲーションにより、一方の端に前記配列Ａおよび反対端に前記配列Ｂを含む前記１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、前記配列Ａが一方の端の５’末端にあり、前記配列Ｂが反対端の５’末端にある、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記反対端の３’末端が鋳型として前記配列Ｂを用いて伸長され、それにより一方の端の５’末端に前記配列Ａおよび反対端の３’末端に前記配列Ｂと相補的な配列Ｂ’を含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
さらに前記定方向性ｃＤＮＡライブラリを増幅する工程を含み、それにより増幅生成物が生成される、請求項１または３に記載の方法。
【請求項２９】
さらに前記増幅生成物を配列決定する追加的工程を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記増幅がＳＰＩＡを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記増幅がプライマーの使用を含み、前記プライマーの１つまたはそれより多くが１つまたはそれより多くのバーコード配列を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記配列決定が、次世代配列決定を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記増幅がＳＰＩＡを含む、請求項２または４に記載の方法。
【請求項３４】
前記増幅がプライマーの使用を含み、前記プライマーの１つまたはそれより多くがバーコード配列を含む、請求項２または４に記載の方法。
【請求項３５】
前記配列決定が、次世代配列決定を含む、請求項２または４に記載の方法。
【請求項３６】
工程ｂ）の後さらに前記鋳型ＲＮＡを分解する工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３７】
前記開裂が、前記鋳型ＲＮＡ試料をリボヌクレアーゼに曝露することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３８】
前記ニッキング酵素が鎖特異的ニッキング酵素を含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項３９】
工程ｂ）での前記１つまたはそれより多くの３’ヒドロキシルの前記伸長が、鎖置換活性を含むＤＮＡポリメラーゼにより行われる、請求項３または４に記載の方法。
【請求項４０】
前記ライゲーションが、平滑末端ライゲーションを含み、工程ｅ）で生成された一方の端に前記配列Ａを含む前記１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが工程ｆ）の前に末端修復される、請求項１、２、３または４に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１アダプターおよび／または前記第２アダプターがさらに１つまたはそれより多くのバーコードを含む、請求項１、２、３または４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
この出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／８０１，５１０号の利益を主張し、また２０１３年９月１８日に出願された米国出願第１４／０３０，７６１号（これらの出願は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益も主張する。
【背景技術】
【０００２】
背景
近年の大規模並列処理配列決定技術における急速な発達により、機能ゲノム学への新たなアプローチを開発する、全ゲノムおよび全トランスクリプトームの配列決定および解析が可能となった。これらの次世代配列決定方法の１つは、メッセンジャーおよび構造的ＲＮＡから生成された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の直接配列決定（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）を伴うものである。ＲＮＡ−Ｓｅｑは、伝統的な配列決定方法を凌ぐ幾つかの重要な利益をもたらし得る。ＲＮＡ−Ｓｅｑにより、全ての発現されたコーディングおよび非コーディング転写物について、各転写物の５’および３’末端およびスプライス接合点に注釈をつける、それらの高解像度研究が可能となり得、各細胞における転写物の相対数の定量化によって、各スプライス変異体のレベルを測定することによりＲＮＡスプライシングを測定し、特性確認する方法が提供され得る。同様に、大規模並列処理配列決定技術は、高解像度での全ゲノム配列決定または興味の対象であるマルチプレックス標的化ゲノム配列の配列決定を可能にし得る。
【０００３】
標準的ＲＮＡ−Ｓｅｑの実施に伴う１つの潜在的欠点は、転写方向に関する情報の欠如である。ＲＮＡ−Ｓｅｑのために構築された標準的ｃＤＮＡライブラリは、ランダムプライミングされた２本鎖ｃＤＮＡから成る。配列決定前の普遍的プライミング部位を含むアダプターの無方向性ライゲーションは、どの鎖が元のＲＮＡ鋳型に存在したかについての情報の喪失を招き得る。鎖情報は、場合によっては、例えば、タンパク質をコードする転写物における読み枠（ＯＲＦ）情報を使用することにより、または真核生物ゲノムにおけるスプライス部位情報を評価することにより、後続の解析により推測され得るが、起点となる鎖に関する直接情報が望ましいものであり得る。例えば、どの鎖が元のＲＮＡ試料に存在したかについての直接情報は、センス鎖を非コーディングＲＮＡに割り当てるため、および重複転写物の分割時に使用され得る。
【０００４】
鎖特異的ＲＮＡ−Ｓｅｑについての幾つかの方法が近年開発されている。これらの方法は２つの主なクラスに分けられ得る。第１のクラスは、ＲＮＡ転写物の５’および３’末端に対し既知配向で異なるアダプターを使用し得る。最終成果は、元のＲＮＡの５’および３’末端に２つの異なるアダプターが隣接しているｃＤＮＡライブラリであり得る。この方法の不利な点は、クローン分子の両端のみが方向情報を保存しているということであり得る。この状況は、長いクローンの鎖特異的操作についての問題をはらみ得、フラグメント化がある場合に方向情報の喪失を招き得る。
【０００５】
鎖特異的ＲＮＡ−Ｓｅｑ方法の第２のクラスは、元のＲＮＡ（例えば、重亜硫酸塩処理による）または転写されたｃＤＮＡ（例えば、修飾ヌクレオチドの組込みによる）のどちらかの１鎖をマーキングすることができ、次いでマーキングされていない鎖の分解が行われ得る。ＲＮＡの重亜硫酸塩処理による鎖のマーキングは、労働集約的であり得、２鎖のうちの１つで全シトシン塩基がチミンに変換されている参照ゲノムに対するシーケンシングリードのアラインメントを必要とし得る。さらに、この解析は、重亜硫酸塩処理中の塩基変換効率が不完全、すなわち１００％未満であり得るという事実故に複雑なものになり得る。
【０００６】
ｃＤＮＡの第２鎖の修飾による鎖マーキングは、定方向性ｃＤＮＡクローニングおよび配列決定にとって好ましいアプローチになっている（例、Ｌｅｖｉｎら、２０１０を参照）。しかしながら、ｃＤＮＡ第２鎖マーキングアプローチは、慣用的平滑末端ライゲーションおよびデュプレックスアダプターでのｃＤＮＡライブラリ構築戦略（２つの普遍的配列決定部位を２つの別々のアダプターにより導入する）を用いるに際し、方向性情報を保存するには不十分なものであり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現行の定方向性トランスクリプトームまたはゲノム配列決定の主たる欠点は、ランダムな第２鎖合成により所望のライブラリに未知の歪みが導入され、配列決定ライブラリ生成にコンプレキシティーが加わり得る限り、フラグメント化および定方向性または無方向性アダプターの結合の前にｄｓＤＮＡを生成するために、所望のインプット鎖の第１および第２鎖コピー、またはＲＮＡ転写物の生成を必要とすることであり得る。
【０００８】
トランスクリプトームまたはゲノム配列決定のための定方向性ｃＤＮＡライブラリの改善された簡便な方法が要望されている。本明細書記載の方法、組成物およびキットはこの要望を満たすことができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書では、ＲＮＡおよびｄｓＤＮＡからの定方向性配列決定ライブラリ生成のための方法、組成物およびキットを提供する。これらの方法、組成物およびキットは、全トランスクリプトーム、全ゲノム、標的化されたかまたは選択された転写物の定方向性ライブラリの生成に使用され得、また無方向性全ゲノム配列決定ライブラリの生成にも適用され得る。
【００１０】
一実施態様において、本明細書で提供される方法は、規定密度で非カノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ヌクレオチドを含む相補的ＤＮＡ鎖を合成することにより、酵素を用いてｃＤＮＡを所望のサイズ範囲にフラグメント化させ得るものであり、この酵素が非カノニカルヌクレオチドの塩基部分を開裂して、脱塩基部位を生成させ、さらにこの脱塩基部位にあるバックボーンが酵素的または化学的または熱（ｔｈｅｒｍａｌ）（例、熱（ｈｅａｔ））手段により開裂され得る。製造されたＤＮＡフラグメントはブロックされた３’末端を含み得る。脱塩基部位での酵素開裂は５’リン酸末端を生じさせ得、これがアダプターライゲーションのためのさらなる操作で使用され得る。
【００１１】
別の実施態様において、本明細書では、上記で生成された第１鎖相補的ＤＮＡの全フラグメントの３’−末端にアニーリングするように設計されたプライマーを用いて第２鎖合成をプライミングする方法が提供される。
【００１２】
全ＲＮＡなどのＲＮＡ鋳型からの第１鎖相補的ＤＮＡ合成は、様々なプライミングスキームを用いて実施され得る。本明細書で提供されている方法の実行に有用な第１鎖プライマーは、標的ＲＮＡ上の多部位でプライミングすることが可能であり得る、ランダムヘキサマーなどのランダムプライマーであり得る。別の実施形態では、第１鎖プライマーは、標的化転写物またはその一部へのハイブリダイゼーションに特異的な配列を含み得る。さらに別の実施形態において、この第１鎖プライマーは、所望されていない転写物群以外の全転写物でプライミングするように設計された配列を含み得る。例えば、第１鎖ｃＤＮＡプライマーは、全ｒＲＮＡなどの構造的ＲＮＡでプライミングするのではなく、全転写物で優先的にプライミングするように設計された配列を含み得る。
【００１３】
第１鎖ｃＤＮＡプライマーの設計とは関係なく、第１鎖合成は、対応するヌクレオチドの混合物において１つまたはそれより多くの非カノニカルヌクレオチドを含む反応混合物中の逆転写酵素により実施され得、このカノニカルヌクレオチド対非カノニカルヌクレオチドの比は、所望のフラグメントサイズ範囲内のフラグメントを生成させるフラグメント化を可能にする密度で非カノニカルヌクレオチドが組み込まれるように選択され得る。フラグメント化生成物の所望のサイズ範囲は、様々な選択された配列決定プラットフォーム、または任意の他のダウンストリーム操作での使用に適応させるため、配列決定ライブラリにおいて挿入物の所望のサイズ範囲に適合するように選択され得る。
【００１４】
所望のサイズ範囲の１本鎖ｃＤＮＡフラグメントの生成は、配列決定ライブラリおよび他のライブラリの生成のための完全自動化プロセスにとって有益であり得る。場合によっては、第１鎖ｃＤＮＡフラグメントの生成が、生成物の喪失をもたらし得る音波処理などのフラグメント化の物理的方法を要求しないこともあり、単一細胞分析または非常に小さな試料からの鋳型の分析など、微量の鋳型投入量からのライブラリの生成に有用であり得る。
【００１５】
非カノニカルヌクレオチドｄＵＴＰを、ＵＮＧ処理と組み合わせて使用することにより、脱塩基部位を生成することができる。脱塩基部位にあるバックボーンのフラグメント化は、ＤＭＥＤなどのポリアミン、またはＵＳＥＲ（ＵＮＧとＮＥＢからのエンドヌクレアーゼＶＩＩＩとの組み合わせ）におけるなど、酵素の組み合わせにより同じ反応混合物中で実施され得る。別法として、脱塩基部位での開裂は、反応混合物の加熱により、または様々な化学的方法により実施され得る。
【００１６】
本明細書で提供される方法は、様々なライブラリ調製方法で汎用されている、ランダム部位での第２鎖合成を要求しない。したがって、本明細書で提供される方法は、第２鎖ｃＤＮＡを生成するための選択的プライミングの偏向の低減を提供する。
【００１７】
ｃＤＮＡ生成物の２末端における規定された異なる配列の付加は、鎖ライブラリまたは鎖特異性を保持するライブラリの生成に使用され得る。本明細書で提供される手順により生成される全フラグメントの３’−末端に規定された配列を付加するプロセスは、３’−末端に１本鎖ＤＮＡを含む、部分的デュプレックスをもつ全フラグメントのプライミングにより実施され得、この１本鎖ＤＮＡ部分はランダム配列を含むものとする。１本鎖オーバーハングの長さは少なくとも６から少なくとも７、８または９個のヌクレオチドに変化し得る。１本鎖オーバーハングは、生成された全フラグメントの３’−末端にハイブリダイズさせることができ、ＤＮＡポリメラーゼによりこのフラグメントに沿って伸長され得る。部分的デュプレックスプライマーの様々な構造が予測される。幾つかの例を図２に示す。ｄｓＤＮＡ部分を形成する２本の鎖は、さらにループにより連結され得る２本のオリゴヌクレオチドであり得る。ループまたはリンカーは、オリゴヌクレオチドを含み得るか、または非ヌクレオチドリンカーまたはその組み合わせを含み得る。それはまた、ヌクレオチド類似体を含み得る。
【００１８】
ＤＮＡポリメラーゼによるフラグメントに沿った前記部分的デュプレックスのハイブリダイズされた１本鎖ＤＮＡ部分の伸長後、新たに合成されたｄｓＤＮＡの末端が修復されて平滑末端が生成され得る。合成された第２鎖ｃＤＮＡの他端にある第２の規定された配列は、ライゲーションにより付加され得る。様々なライゲーションモードが予測される。第２アダプターのライゲーションの２つの例を図１Ａおよび図１Ｂに示す。Ａ／Ｔ依存的ライゲーションも可能である。これまで記載されたプロセスの生成物は、２末端に規定された末端をもつ第２鎖ｃＤＮＡであり得、増幅、所望のプラットフォームでの解析に適した所望の配列の付加、クローニングなどのさらなる操作に好適であり得る。付加される配列は、１つまたはそれより多くのバーコード、および／またはＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定フローセルなどの固体表面への結合に有用な配列を含み得る。付加される配列はまた、絶対的定量化を可能にし得るユニーク配列で全フラグメントをマーキングするのに有用なランダム配列を含み得る。
【００１９】
本明細書記載の方法および組成物を用いてＲＮＡから定方向性配列決定ライブラリを生成するプロセスの作業の流れを図３に示す。
【００２０】
また、本明細書では、ゲノムＤＮＡ鋳型などのｄｓＤＮＡ鋳型からのライブラリの生成のための方法および組成物が提供される。このライブラリは、全ゲノム増幅および配列決定に有用であり得、鋳型ｄｓＤＮＡの物理的フラグメント化を必要とすることなく、非常に小さな試料からのライブラリ生成にも有用であり得る。図４に示すように、相補鎖合成の開始は、変性ｄｓＤＮＡ鋳型へのプライマーアニーリングを伴わずに実施され得る。鋳型ＤＮＡ鎖に沿ったＤＮＡ合成は、ニック部位から開始され得る。様々なニッキング酵素の使用については当業界では周知である。鎖特異的であるかまたは鎖特異的ではないニッキング酵素は、本明細書記載の方法に有用であり得る。ニック部位からの伸長により生成された相補的ＤＮＡのランダムフラグメント化は、ランダムニッキングではなく、非カノニカルヌクレオチドのランダム挿入により達成され得る。したがって、選択されたニッキング酵素の配列依存性とは関係なく、いかなる所望のニッキング酵素も使用することが可能である。ｄｓＤＮＡ鋳型をニッキングして、ニッキング部位間に大きな距離を生じさせる酵素は、本明細書記載の方法による最大適用範囲およびランダムフラグメント化にとって望ましいものであり得る。
【００２１】
ｄｓＤＮＡ鋳型からライブラリを生成するためのプロセスは、図４で概略を示すように、鎖ｃＤＮＡ配列決定ライブラリの生成について記載されたものと類似したさらなる工程を含み得る。
【００２２】
図５は、キメラＤＮＡ／ＲＮＡプライマーを用いる単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）によりフラグメント化および付加された生成物を増幅するためのプロセスを記載している。このプロセスにより生成された増幅生成物は、３’および５’部分に規定された配列を含み得るため、投入された鋳型に関して鎖の保持力を提供する。
【００２３】
一実施態様において、本明細書では、定方向性ｃＤＮＡライブラリを生成する方法であって、ａ）１つまたはそれより多くのプライマーを鋳型ＲＮＡにアニーリングすることと、ｂ）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＵＴＰを含む反応混合物の存在下で前記の１つまたはそれより多くのプライマーを伸長させ、ここで、この反応混合物は、ある一定のｄＵＴＰ対ｄＴＴＰ比を含むものとし、この比は所望の密度でのｄＵＴＰの組込みを可能にし、それによって所望の密度で組み込まれたｄＵＴＰを含む１つまたはそれより多くの第１鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が生成されることと、ｃ）ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）およびＵＮＧにより作製される脱塩基部位にあるホスホジエステルバックボーンを開裂することができる作用因子で、所望の密度で組み込まれたｄＵＴＰを含む１つまたはそれより多くの第１鎖ｃＤＮＡを選択的に開裂し、ここで、この開裂により、ブロックされた３’末端を含む所望のサイズの複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成されることと、ｄ）部分的デュプレックスおよび３’オーバーハングを含む第１アダプターを、ブロックされた３’末端を含む複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントのうちの１つまたはそれより多くの３’末端にアニーリングし、ここで、この第１アダプターは、配列Ａを含み、このアニーリングは、３’オーバーハングにあるランダム配列を、ブロックされた３’末端を含む複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントのうちの１つまたはそれより多くの３’末端に存在する相補配列にハイブリダイズさせることを含むことと、ｅ）相補配列にハイブリダイズされた３’オーバーハングをＤＮＡポリメラーゼで伸長させ、ここで、一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成されることと、ｆ）配列Ｂを含む第２アダプターを、一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの前記２本鎖ｃＤＮＡフラグメントにライゲーションし、ここで、このライゲーションにより、一方の端に配列Ａおよび反対端に配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、それによって定方向性ポリヌクレオチドライブラリが生成されることを含む方法が記載される。一部の実施形態において、前述の１つまたはそれより多くのプライマーはランダムプライマーを含む。一部の実施形態において、前述の１つまたはそれより多くのプライマーは、標的鋳型ＲＮＡまたはＲＮＡの群に特異的な配列を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡの群は、実質的に全ての転写物を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡの群は、構造的ＲＮＡを含まず、この構造的ＲＮＡはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を含むものとする。一部の実施形態において、本方法は、さらに定方向性ｃＤＮＡライブラリを増幅することを含み、それにより増幅生成物が生成される。一部の実施形態において、本方法は、さらに増幅生成物を配列決定する追加的工程を含む。一部の実施形態において、この増幅は、ＳＰＩＡを含む。一部の実施形態において、この増幅はプライマーの使用を含み、このプライマーの１つまたはそれより多くは１つまたはそれより多くのバーコード配列を含むものとする。一部の実施形態において、この配列決定は、次世代配列決定を含む。一部の実施形態において、本方法は、工程ｂ）の後にさらに鋳型ＲＮＡを分解することを含む。一部の実施形態において、開裂は、鋳型ＲＮＡ試料をリボヌクレアーゼに曝露することを含む。一部の実施形態において、ホスホジエステルバックボーンを開裂することができる作用因子は、酵素、化学的作用因子および／または熱を含む。一部の実施形態において、化学的作用因子はポリアミンである。一部の実施形態において、ポリアミンはＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（ＤＭＥＤ）である。一部の実施形態において、酵素はエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩである。一部の実施形態において、部分的デュプレックスは、長鎖および短鎖を含み、この長鎖は、短鎖とデュプレックスを形成する配列Ａおよび３’オーバーハングを含むものとする。一部の実施形態において、短鎖はさらに３’および／または５’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、第１アダプターはさらに長鎖の５’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、第１アダプターは複数の第１アダプターを含み、前述の複数の第１アダプターのそれぞれにおけるランダム配列は、前述の複数の第１アダプターの別のものにおけるランダム配列とは異なるものとし、その複数の第１アダプターのそれぞれが配列Ａを含むものとする。一部の実施形態において、工程ｄ）の結果、３’末端でアニーリングされた複数の第１アダプターの１つをさらに含む工程ｃ）で生成されたブロックされた３’末端を含む所望のサイズの前述の複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントの実質的に全てが得られる。一部の実施形態において、第１アダプターはさらに短鎖の５’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、第１アダプターはさらにステムループを含み、このステムループは、部分的デュプレックスの長鎖の５’末端を部分的デュプレックスの短鎖の３’末端と連結し、この長鎖は配列Ａおよび３’オーバーハングを含むものとする。一部の実施形態において、３’オーバーハングは少なくとも６、７、８または９個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、第２アダプターは部分的デュプレックスを含み、この部分的デュプレックスは、短鎖とハイブリダイズされた長鎖を含み、この長鎖は配列Ｂおよびオーバーハングを含むものとする。一部の実施形態において、長鎖は配列Ｂおよび３’オーバーハングを含み、この短鎖は３’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、ライゲーションにより、一方の端に配列Ａを、反対端に配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、この配列Ａは一方の端の５’末端にあり、配列Ｂは反対端の３’末端にある。一部の実施形態において、長鎖は配列Ｂおよび５’オーバーハングを含み、短鎖は５’末端にブロックを含むものとする。一部の実施形態において、ライゲーションにより、一方の端に配列Ａを、反対端に配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、この配列Ａは一方の端の５’末端にあり、配列Ｂは反対端の５’末端にある。一部の実施形態において、反対端の３’末端は、鋳型として配列Ｂを用いて伸長されており、それによって、一方の端の５’末端に配列Ａを、そして反対端の３’末端に配列Ｂと相補的な配列Ｂ’を含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成される。一部の実施形態において、ライゲーションは平滑末端ライゲーションを含み、工程ｅ）で生成された一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントは、工程ｆ）の前に末端修復されるものとする。一部の実施形態において、第１および／または第２アダプターは、さらに１つまたはそれより多くのバーコードを含む。
【００２４】
一実施態様において、本明細書では、全トランスクリプトーム定方向性配列決定方法であって、ａ）１つまたはそれより多くのプライマーを鋳型ＲＮＡにアニーリングすることと、ｂ）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＵＴＰを含む反応混合物の存在下で前記プライマーを伸長させ、ここで、この反応混合物は、ある一定のｄＵＴＰ対ｄＴＴＰ比を含むものとし、この比は所望の密度でのｄＵＴＰの組込みを可能にし、それによって所望の密度で組み込まれたｄＵＴＰを含む１つまたはそれより多くの第１鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が生成されることと、ｃ）ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）およびＵＮＧにより作製される脱塩基部位にあるホスホジエステルバックボーンを開裂することができる作用因子で、所望の密度で組み込まれたｄＵＴＰを含む１つまたはそれより多くの第１鎖ｃＤＮＡを選択的に開裂し、ここで、この開裂により、ブロックされた３’末端を含む所望のサイズの複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成されることと、ｄ）部分的デュプレックスおよび３’オーバーハングを含む第１アダプターを、ブロックされた３’末端を含む複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントのうちの１つまたはそれより多くの３’末端にアニーリングし、ここで、この第１アダプターは配列Ａを含み、このアニーリングは、３’オーバーハングにあるランダム配列を、ブロックされた３’末端を含む複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントのうちの１つまたはそれより多くの３’末端に存在する相補配列にハイブリダイズさせることを含むことと、ｅ）相補配列にハイブリダイズされた３’オーバーハングをＤＮＡポリメラーゼで伸長させ、ここで、一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成されることと、ｆ）配列Ｂを含む第２アダプターを、一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの前記２本鎖ｃＤＮＡフラグメントにライゲーションし、ここで、このライゲーションにより、一方の端に配列Ａおよび反対端に配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、それによって定方向性ｃＤＮＡライブラリが生成されることと、ｇ）その定方向性ｃＤＮＡライブラリを増幅および／または配列決定することを含む方法が記載されている。５一部の実施形態において（５Ｉｎ  ｓｏｍｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ）、前述の１つまたはそれより多くのプライマーはランダムプライマーを含む。一部の実施形態において、前述の１つまたはそれより多くのプライマーは、標的鋳型ＲＮＡまたはＲＮＡの群に特異的な配列を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡの群は、実質的に全ての転写物を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡの群は、構造的ＲＮＡを含まず、前記構造的ＲＮＡはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を含むものとする。一部の実施形態において、増幅はＳＰＩＡを含む。一部の実施形態において、この増幅はプライマーの使用を含み、このプライマーの１つまたはそれより多くはバーコード配列を含むものとする。一部の実施形態において、この配列決定は、次世代配列決定を含む。一部の実施形態において、本方法は、工程ｂ）の後に鋳型ＲＮＡを分解することを含む。一部の実施形態において、開裂は��鋳型ＲＮＡ試料をリボヌクレアーゼに曝露することを含む。一部の実施形態において、ホスホジエステルバックボーンを開裂することができる作用因子は、酵素、化学的作用因子および／または熱を含む。一部の実施形態において、化学的作用因子はポリアミンである。一部の実施形態において、ポリアミンはＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（ＤＭＥＤ）である。一部の実施形態において、酵素はエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩである。一部の実施形態において、部分的デュプレックスは、長鎖および短鎖を含み、この長鎖は、短鎖とデュプレックスを形成する配列Ａおよび３’オーバーハングを含むものとする。一部の実施形態において、短鎖はさらに３’および／または５’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、第１アダプターはさらに長鎖の５’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、第１アダプターは複数の第１アダプターを含み、前述の複数の第１アダプターのそれぞれにおけるランダム配列は、前述の複数の第１アダプターの別のものにおけるランダム配列とは異なるものとし、その複数の第１アダプターのそれぞれが配列Ａを含むものとする。一部の実施形態において、工程ｄ）の結果、３’末端でアニーリングされた複数の第１アダプターの１つをさらに含む工程ｃ）で生成されたブロックされた３’末端を含む所望のサイズの前述の複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントの実質的に全てが得られる。一部の実施形態において、第１アダプターはさらに短鎖の５’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、第１アダプターはさらにステムループを含み、このステムループは、部分的デュプレックスの長鎖の５’末端を部分的デュプレックスの短鎖の３’末端と連結し、この長鎖は配列Ａおよび３’オーバーハングを含むものとする。一部の実施形態において、３’オーバーハングは少なくとも６、７、８または９個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、第２アダプターは部分的デュプレックスを含み、この部分的デュプレックスは、短鎖とハイブリダイズされた長鎖を含み、この長鎖は配列Ｂおよびオーバーハングを含むものとする。一部の実施形態において、長鎖は配列Ｂおよび３’オーバーハングを含み、この短鎖は３’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、ライゲーションにより、一方の端に配列Ａを、反対端に配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、この配列Ａは一方の端の５’末端にあり、配列Ｂは反対端の３’末端にあるものとする。一部の実施形態において、長鎖は配列Ｂおよび５’オーバーハングを含み、短鎖は５’末端にブロックを含むものとする。一部の実施形態において、ライゲーションにより、一方の端に配列Ａを、反対端に配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、この配列Ａは一方の端の５’末端にあり、配列Ｂは反対端の５’末端にある。一部の実施形態において、反対端の３’末端は、鋳型として配列Ｂを用いて伸長され、それによって、一方の端の５’末端に配列Ａを、そして反対端の３’末端に配列Ｂと相補的な配列Ｂ’を含む１つまたはそれより多くの��本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成される。一部の実施形態において、ライゲーションは平滑末端ライゲーションを含み、工程ｅ）で生成された一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントは、工程ｆ）の前に末端修復されるものとする。一部の実施形態において、第１および／または第２アダプターは、さらに１つまたはそれより多くのバーコードを含む。
【００２５】
一実施態様において、本明細書では、定方向性ｃＤＮＡライブラリを生成する方法であって、ａ）鋳型ｄｓＤＮＡをニッキング酵素で処理し、ここで、この処理により、鋳型ｄｓＤＮＡの１鎖のホスホジエステルバックボーンに１つまたはそれより多くの破断が生じ、この破断により、その１鎖において１つまたはそれより多くの３’ヒドロキシルが生成されることと、ｂ）前述の１つまたはそれより多くの３’ヒドロキシルを伸長させ、ここで、この伸長はｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＵＴＰを含む反応混合物の存在下で行われ、この反応混合物は、ある一定のｄＵＴＰ対ｄＴＴＰ比を含み、この比は所望の密度でのｄＵＴＰの組込みを可能にし、それによって所望の密度で組み込まれたｄＵＴＰを含む１つまたはそれより多くの第１鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が生成されることと、ｃ）ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）およびＵＮＧにより作製される脱塩基部位にあるホスホジエステルバックボーンを開裂することができる作用因子で、所望の密度で組み込まれたｄＵＴＰを含む１つまたはそれより多くの第１鎖ｃＤＮＡを選択的に開裂し、ここで、この開裂により、ブロックされた３’末端を含む所望のサイズの複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成されることと、ｄ）部分的デュプレックスおよび３’オーバーハングを含む第１アダプターを、ブロックされた３’末端を含む複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントのうちの１つまたはそれより多くの３’末端にアニーリングし、ここで、この第１アダプターは配列Ａを含み、このアニーリングは、３’オーバーハングにあるランダム配列を、ブロックされた３’末端を含む複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントのうちの１つまたはそれより多くの３’末端に存在する相補配列にハイブリダイズさせることを含むことと、ｅ）相補配列にハイブリダイズされた３’オーバーハングをＤＮＡポリメラーゼで伸長させ、ここで、一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成されることと、ｆ）配列Ｂを含む第２アダプターを、一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの前記２本鎖ｃＤＮＡフラグメントにライゲーションし、ここで、このライゲーションにより、一方の端に配列Ａおよび反対端に配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、それによって定方向性ｃＤＮＡライブラリが生成されることを含む方法が記載される。一部の実施形態において、本方法は、さらに定方向性ｃＤＮＡライブラリを増幅することを含み、それにより増幅生成物が生成される。一部の実施形態において、本方法は、さらに増幅生成物を配列決定する追加的工程を含む。一部の実施形態において、この増幅は、ＳＰＩＡを含む。一部の実施形態において、この増幅はプライマーの使用を含み、このプライマーの１つまたはそれより多くは１つまたはそれより多くのバーコード配列を含むものとする。一部の実施形態において、この配列決定は、次世代配列決定を含む。一部の実施形態において、ニッキング酵素は、鎖特異的ニッキング酵素を含む。一部の実施形態において、工程ｂ）における１つまたはそれより多くの３’ヒドロキシルの伸長は、鎖置換活性を含むＤＮＡポリメラーゼにより行われる。一部の実施形態において、ホスホジエステルバックボーンを開裂することができる作用因子は、酵素、化学的作用因子および／または熱を含む。一部の実施形態において、化学的作用因子はポリアミンである。一部の実施形態において、ポリアミンはＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（ＤＭＥＤ）である。一部の実施形態において、酵素はエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩである。一部の実施形態において、部分的デュプレックスは、長鎖および短鎖を含み、この長鎖は、短鎖とデュプレックスを形成する配列Ａおよび３’オーバーハングを含むものとする。一部の実施形態において、短鎖はさらに３’および／または５’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、第１アダプターはさらに長鎖の５’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、第１アダプターは複数の第１アダプターを含み、前述の複数の第１アダプターのそれぞれにおけるランダム配列は、前述の複数の第１アダプターの別のものにおけるランダム配列とは異なるものとし、その複数の第１アダプターのそれぞれが配列Ａを含むものとする。一部の実施形態において、工程ｄ）の結果、３’末端でアニーリングされた複数の第１アダプターの１つをさらに含む工程ｃ）で生成されたブロックされた３’末端を含む所望のサイズの前述の複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントの実質的に全てが得られる。一部の実施形態において、第１アダプターはさらに短鎖の５’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、第１アダプターはさらにステムループを含み、このステムループは、部分的デュプレックスの長鎖の５’末端を部分的デュプレックスの短鎖の３’末端と連結し、この長鎖は配列Ａおよび３’オーバーハングを含むものとする。一部の実施形態において、３’オーバーハングは少なくとも６、７、８または９個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、第２アダプターは部分的デュプレックスを含み、この部分的デュプレックスは、短鎖とハイブリダイズされた長鎖を含み、この長鎖は配列Ｂおよびオーバーハングを含むものとする。一部の実施形態において、長鎖は配列Ｂおよび３’オーバーハングを含み、この短鎖は３’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、ライゲーションにより、一方の端に配列Ａを、反対端に配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、この配列Ａは一方の端の５’末端にあり、配列Ｂは反対端の３’末端にある。一部の実施形態において、長鎖は配列Ｂおよび５’オーバーハングを含み、短鎖は５’末端にブロックを含むものとする。一部の実施形態において、ライゲーションにより、一方の端に配列Ａを、反対端に配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、この配列Ａは一方の端の５’末端にあり、配列Ｂは反対端の５’末端にある。一部の実施形態において、反対端の３’末端は、鋳型として配列Ｂを用いて伸長されており、それによって、一方の端の５’末端に配列Ａを、そして反対端の３’末端に配列Ｂと相補的な配列Ｂ’を含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成される。一部の実施形態において、ライゲーションは平滑末端ライゲーションを含み、工程ｅ）で生成された一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントは、工程ｆ）の前に末端修復されるものとする。一部の実施形態において、第１および／または第２アダプターは、さらに１つまたはそれより多くのバーコードを含む。
【００２６】
一実施態様において、本明細書では、全ゲノム配列決定方法であって、ａ）ゲノムＤＮＡをニッキング酵素で処理し、この処理により、ゲノムＤＮＡの１鎖のホスホジエステルバックボーンに１つまたはそれより多くの破断が生じ、この破断により、その１鎖において１つまたはそれより多くの３’ヒドロキシルが生成されることと、ｂ）前述の１つまたはそれより多くの３’ヒドロキシルを伸長させ、ここで、この伸長はｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＵＴＰを含む反応混合物の存在下で行われ、この反応混合物は、ある一定のｄＵＴＰ対ｄＴＴＰ比を含み、この比は所望の密度でのｄＵＴＰの組込みを可能にし、それによって所望の頻度で組み込まれたｄＵＴＰを含む１つまたはそれより多くの第１鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が生成されることと、ｃ）ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）およびＵＮＧにより作製される脱塩基部位にあるホスホジエステルバックボーンを開裂することができる作用因子で、所望の密度で組み込まれたｄＵＴＰを含む１つまたはそれより多くの第１鎖ｃＤＮＡを選択的に開裂し、ここで、この開裂により、ブロックされた３’末端を含む所望のサイズの複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成されることと、ｄ）部分的デュプレックスおよび３’オーバーハングを含む第１アダプターを、ブロックされた３’末端を含む複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントのうちの１つまたはそれより多くの３’末端にアニーリングし、ここで、この第１アダプターは配列Ａを含み、このアニーリングは、３’オーバーハングにあるランダム配列を、ブロックされた３’末端を含む複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントのうちの１つまたはそれより多くの３’末端に存在する相補配列にハイブリダイズさせることを含むことと、ｅ）相補配列にハイブリダイズされた３’オーバーハングをＤＮＡポリメラーゼで伸長させ、ここで、一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成されることと、ｆ）配列Ｂを含む第２アダプターを、一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの前記２本鎖ｃＤＮＡフラグメントにライゲーションし、ここで、このライゲーションにより、一方の端に配列Ａおよび反対端に配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、それによって定方向性ｃＤＮＡライブラリが生成されることと、ｇ）定方向性ｃＤＮＡライブラリを増幅および／または配列決定することを含む方法が記載される。一部の実施形態において、この増幅は、ＳＰＩＡを含む。一部の実施形態において、この増幅はプライマーの使用を含み、このプライマーの１つまたはそれより多くはバーコード配列を含むものとする。一部の実施形態において、この配列決定は、次世代配列決定を含む。一部の実施形態において、ニッキング酵素は、鎖特異的ニッキング酵素を含む。一部の実施形態において、工程ｂ）における１つまたはそれより多くの３’ヒドロキシルの伸長は、鎖置換活性を含むＤＮＡポリメラーゼにより行われる。一部の実施形態において、ホスホジエステルバックボーンを開裂することができる作用因子は、酵素、化学的作用因子および／または熱を含む。一部の実施形態において、化学的作用因子はポリアミンである。一部の実施形態において、ポリアミンはＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（ＤＭＥＤ）である。一部の実施形態において、酵素はエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩである。一部の実施形態において、部分的デュプレックスは、長鎖および短鎖を含み、この長鎖は、短鎖とデュプレックスを形成する配列Ａおよび３’オーバーハングを含むものとする。一部の実施形態において、短鎖はさらに３’および／または５’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、第１アダプターはさらに長鎖の５’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、第１アダプターは複数の第１アダプターを含み、前述の複数の第１アダプターのそれぞれにおけるランダム配列は、前述の複数の第１アダプターの別のものにおけるランダム配列とは異なるものとし、その複数の第１アダプターのそれぞれが配列Ａを含むものとする。一部の実施形態において、工程ｄ）の結果、３’末端でアニーリングされた複数の第１アダプターの１つをさらに含む工程ｃ）で生成されたブロックされた３’末端を含む所望のサイズの前述の複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントの実質的に全てが得られる。一部の実施形態において、第１アダプターはさらに短鎖の５’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、第１アダプターはさらにステムループを含み、このステムループは、部分的デュプレックスの長鎖の５’末端を部分的デュプレックスの短鎖の３’末端と連結し、この長鎖は配列Ａおよび３’オーバーハングを含むものとする。一部の実施形態において、３’オーバーハングは少なくとも６、７、８または９個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、第２アダプターは部分的デュプレックスを含み、この部分的デュプレックスは、短鎖とハイブリダイズされた長鎖を含み、この長鎖は配列Ｂおよびオーバーハングを含むものとする。一部の実施形態において、長鎖は配列Ｂおよび３’オーバーハングを含み、この短鎖は３’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、ライゲーションにより、一方の端に配列Ａを、反対端に配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、この配列Ａは一方の端の５’末端にあり、配列Ｂは反対端の３’末端にあるものとする。一部の実施形態において、長鎖は配列Ｂおよび５’オーバーハングを含み、短鎖は５’末端にブロックを含むものとする。一部の実施形態において、ライゲーションにより、一方の端に配列Ａを、反対端に配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、この配列Ａは一方の端の５’末端にあり、配列Ｂは反対端の５’末端にある。一部の実施形態において、反対端の３’末端は、鋳型として配列Ｂを用いて伸長されており、それによって、一方の端の５’末端に配列Ａを、そして反対端の３’末端に配列Ｂと相補的な配列Ｂ’を含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成される。一部の実施形態において、ライゲーションは平滑末端ライゲーションを含み、工程ｅ）で生成された一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントは、工程ｆ）の前に末端修復されるものとする。一部の実施形態において、第１および／または第２アダプターは、さらに１つまたはそれより多くのバーコードを含む。
【００２７】
一実施態様において、本明細書では、定方向性ポリヌクレオチドライブラリを生成する方法であって、ａ）１つまたはそれより多くのプライマー、逆転写酵素、および非カノニカルヌクレオチドを含む反応混合物の存在下で鋳型ＲＮＡを逆転写し、ここでこの反応混合物は所望の密度で非カノニカルヌクレオチドを組み込ませるのに適した比率の非カノニカルヌクレオチドを含み、それによって所望の密度で組み込まれた非カノニカルヌクレオチドを含む１つまたはそれより多くの第１鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が生成されることと、ｂ）所望の密度で組み込まれた非カノニカルヌクレオチドを含む１つまたはそれより多くの第１鎖ｃＤＮＡを開裂作用因子で選択的に開裂し、ここでこの開裂作用因子による開裂により、ブロックされた３’末端を含む所望のサイズの複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成されることと、ｃ）部分的デュプレックスおよび３’オーバーハングを含む第１アダプターを、ブロックされた３’末端を含む複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントのうちの１つまたはそれより多くの３’末端にアニーリングし、ここで、この第１アダプターは配列Ａを含み、このアニーリングは、３’オーバーハングにあるランダム配列を、ブロックされた３’末端を含む複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントのうちの１つまたはそれより多くの３’末端に存在する相補配列にハイブリダイズさせることを含むことと、ｄ）相補配列にハイブリダイズされた３’オーバーハングをＤＮＡポリメラーゼで伸長させ、ここで、一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成されることと、ｅ）配列Ｂを含む第２アダプターを、一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの前記２本鎖ｃＤＮＡフラグメントにライゲーションし、ここで、このライゲーションにより、一方の端に配列Ａおよび反対端に配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、それによって定方向性ポリヌクレオチドライブラリが生成されることを含む方法が記載される。一部の実施形態において、鋳型ＲＮＡはｍＲＮＡを含む。一部の実施形態において、前述の１つまたはそれより多くのプライマーはランダムプライマーを含む。一部の実施形態において、前述の１つまたはそれより多くのプライマーは、標的ＲＮＡまたはＲＮＡの群に特異的な配列を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡの群は、実質的に全ての転写物を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡの群は、構造的ＲＮＡを含まず、前記構造的ＲＮＡはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を含むものとする。一部の実施形態において、本方法は、工程ａ）の後にさらに鋳型ＲＮＡを分解することを含む。一部の実施形態において、非カノニカルｄＮＴＰはｄＵＴＰを含む。一部の実施形態において、開裂作用因子は、グリコシラーゼおよびポリアミン、熱または酵素を含む。一部の実施形態において、グリコシラーゼはウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）である。一部の実施形態において、ポリアミンはＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（ＤＭＥＤ）である。一部の実施形態において、酵素はエンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩである。一部の実施形態において、第１アダプターは複数の第１アダプターを含み、前述の複数の第１アダプターのそれぞれにおけるランダム配列は、前述の複数の第１アダプターの別のものにおけるランダム配列とは異なるものとし、その複数の第１アダプターのそれぞれが配列Ａを含むものとする。一部の実施形態において、アニーリングの結果、３’末端でアニーリングされた複数の第１アダプターの１つをさらに含むブロックされた３’末端を含む所望のサイズの前述の複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントの実質的に全てが得られる。一部の実施形態において、部分的デュプレックスは、長鎖および短鎖を含み、この長鎖は、短鎖とデュプレックスを形成する配列Ａおよび３’オーバーハングを含むものとする。一部の実施形態において、短鎖はさらに３’および／または５’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、第１アダプターはさらにステムループを含み、このステムループは、部分的デュプレックスの長鎖の５’末端を部分的デュプレックスの短鎖の３’末端と連結し、この長鎖は配列Ａおよび３’オーバーハングを含むものとする。一部の実施形態において、第１アダプターはさらに長鎖の５’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、第１アダプターはさらに短鎖の５’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、３’オーバーハングは少なくとも６、７、８または９個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、第２アダプターは、デュプレックス、部分的デュプレックス、またはステムループにより連結されたデュプレックス部分を含む１本鎖を含む。一部の実施形態において、第１および／または第２アダプターは、さらに１つまたはそれより多くのバーコードを含む。一部の実施形態において、第２アダプターは部分的デュプレックスを含み、この部分的デュプレックスは、短鎖とハイブリダイズされた長鎖を含み、この長鎖は配列Ｂおよびオーバーハングを含むものとする。一部の実施形態において、長鎖は配列Ｂおよび３’オーバーハングを含み、この短鎖は３’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、ライゲーションにより、一方の端に配列Ａを、反対端に配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、この配列Ａは一方の端の５’末端にあり、配列Ｂは反対端の３’末端にあるものとする。一部の実施形態において、長鎖は配列Ｂおよび５’オーバーハングを含み、短鎖は５’末端にブロックを含むものとする。一部の実施形態において、ライゲーションにより、一方の端に配列Ａを、反対端に配列Ｂを含む前述の１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、この配列Ａは一方の端の５’末端にあり、配列Ｂは反対端の５’末端にある。一部の実施形態において、反対端の３’末端は、鋳型として配列Ｂを用いて伸長され、それによって、一方の端の５’末端に配列Ａを、そして反対端の３’末端に配列Ｂと相補的な配列Ｂ’を含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成される。一部の実施形態において、本方法は、さらに定方向性ｃＤＮＡライブラリを増幅することを含み、それにより増幅生成物が生成され、さらに増幅生成物を配列決定する追加的工程を含む。一部の実施形態において、この増幅は、ＳＰＩＡを含む。一部の実施形態において、この増幅はプライマーの使用を含み、このプライマーの１つまたはそれより多くはバーコード配列を含むものとする。一部の実施形態において、この配列決定は、次世代配列決定を含む。一部の実施形態において、ライゲーションは平滑末端ライゲーションを含み、工程ｅ）で生成された一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントは、工程ｆ）の前に末端修復されるものとする。
【００２８】
一実施態様において、本明細書では、定方向性ポリヌクレオチドライブラリを生成する方法であって、ａ）鋳型ＤＮＡをニッキング酵素で処理し、この処理により、鋳型ＤＮＡの１鎖のホスホジエステルバックボーンに１つまたはそれより多くの破断が生じ、この１つまたはそれより多くの破断により、その１鎖において１つまたはそれより多くの３’ヒドロキシルが生成されることと、ｂ）前述の１つまたはそれより多くの３’ヒドロキシルを伸長させ、ここで、この伸長は非カノニカルヌクレオチドを含む反応混合物の存在下で行われ、この反応混合物は、所望の密度で非カノニカルヌクレオチドを組み込ませるのに適した比率の非カノニカルヌクレオチドを含み、それによって所望の密度で組み込まれた非カノニカルヌクレオチドを含む１つまたはそれより多くの第１鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が生成されることと、ｃ）所望の密度で組み込まれた非カノニカルヌクレオチドを含む１つまたはそれより多くの第１鎖ｃＤＮＡを開裂作用因子で選択的に開裂し、ここでこの開裂作用因子による開裂により、ブロックされた３’末端を含む所望のサイズの複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成されることと、ｄ）部分的デュプレックスおよび３’オーバーハングを含む第１アダプターを、ブロックされた３’末端を含む複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントのうちの１つまたはそれより多くの３’末端にアニーリングし、ここで、この第１アダプターは配列Ａを含み、このアニーリングは、３’オーバーハングにあるランダム配列を、ブロックされた３’末端を含む複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントのうちの１つまたはそれより多くの３’末端に存在する相補配列にハイブリダイズさせることを含むことと、ｅ）相補配列にハイブリダイズされた３’オーバーハングをＤＮＡポリメラーゼで伸長させ、ここで、一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成されることと、ｆ）配列Ｂを含む第２アダプターを、一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの前記２本鎖ｃＤＮＡフラグメントにライゲーションし、ここで、このライゲーションにより、一方の端に配列Ａおよび反対端に配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、それによって定方向性ポリヌクレオチドライブラリが生成されることを含む方法が記載される。一部の実施形態において、鋳型ＤＮＡは２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含む。一部の実施形態において、鋳型ＤＮＡはゲノムＤＮＡを含む。一部の実施形態において、ニッキング酵素は、鎖特異的ニッキング酵素を含む。一部の実施形態において、工程ｂ）における３’ヒドロキシルの伸長は、鎖置換活性を含むＤＮＡポリメラーゼにより行われる。一部の実施形態において、非カノニカルｄＮＴＰはｄＵＴＰを含む。一部の実施形態において、開裂作用因子は、グリコシラーゼおよびポリアミン、熱または酵素を含む。一部の実施形態において、グリコシラーゼはウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）である。一部の実施形態において、ポリアミンはＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（ＤＭＥＤ）である。一部の実施形態において、酵素はエンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩである。一部の実施形態において、第１アダプターは複数の第１アダプターを含み、前述の複数の第１アダプターのそれぞれにおけるランダム配列は、前述の複数の第１アダプターの別のものにおけるランダム配列とは異なるものとし、その複数の第１アダプターのそれぞれが配列Ａを含むものとする。一部の実施形態において、アニーリングの結果、３’末端でアニーリングされた複数の第１アダプターの１つをさらに含むブロックされた３’末端を含む所望のサイズの前述の複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントの実質的に全てが得られる。一部の実施形態において、部分的デュプレックスは、長鎖および短鎖を含み、この長鎖は、短鎖とデュプレックスを形成する配列Ａおよび３’オーバーハングを含むものとする。一部の実施形態において、短鎖はさらに３’および／または５’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、第１アダプターはさらにステムループを含み、このステムループは、部分的デュプレックスの長鎖の５’末端を部分的デュプレックスの短鎖の３’末端と連結し、この長鎖は配列Ａおよび３’オーバーハングを含むものとする。一部の実施形態において、第１アダプターはさらに長鎖の５’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、第１アダプターはさらに短鎖の５’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、３’オーバーハングは少なくとも６、７、８または９個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、第２アダプターは、デュプレックス、部分的デュプレックス、またはステムループにより連結されたデュプレックス部分を含む１本鎖を含む。一部の実施形態において、第１および／または第２アダプターは、さらに１つまたはそれより多くのバーコードを含む。一部の実施形態において、第２アダプターは部分的デュプレックスを含み、この部分的デュプレックスは、短鎖とハイブリダイズされた長鎖を含み、この長鎖は配列Ｂおよびオーバーハングを含むものとする。一部の実施形態において、長鎖は配列Ｂおよび３’オーバーハングを含み、この短鎖は３’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、ライゲーションにより、一方の端に配列Ａを、反対端に配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、この配列Ａは一方の端の５’末端にあり、配列Ｂは反対端の３’末端にあるものとする。一部の実施形態において、長鎖は配列Ｂおよび５’オーバーハングを含み、短鎖は５’末端にブロックを含むものとする。一部の実施形態において、ライゲーションにより、一方の端に配列Ａを、反対端に配列Ｂを含む前述の１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、この配列Ａは一方の端の５’末端にあり、配列Ｂは反対端の５’末端にある。一部の実施形態において、反対端の３’末端は、鋳型として配列Ｂを用いて伸長され、それによって、一方の端の５’末端に配列Ａを、そして反対端の３’末端に配列Ｂと相補的な配列Ｂ’を含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成される。一部の実施形態において、本方法は、さらに定方向性ｃＤＮＡライブラリを増幅することを含み、それにより増幅生成物が生成される。一部の実施形態において、本方法は、さらに増幅生成物を配列決定する追加的工程を含む。一部の実施形態において、この増幅は、ＳＰＩＡを含む。一部の実施形態において、この増幅はプライマーの使用を含み、このプライマーの１つまたはそれより多くはバーコード配列を含むものとする。一部の実施形態において、この配列決定は、次世代配列決定を含む。一部の実施形態において、ライゲーションは平滑末端ライゲーションを含み、工程ｅ）で生成された一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントは、工程ｆ）の前に末端修復されるものとする。
【００２９】
一実施態様において、本明細書では、定方向性ポリヌクレオチドライブラリを生成する方法であって、ａ）１つまたはそれより多くの脱塩基部位に１つまたはそれより多くの脱塩基部位（ｓｉｔｓｅ）を含む１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドのホスホジエステルバックボーンを化学的に開裂し、これによって所望のサイズ範囲内にある、ブロックされた３’末端を含む１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドが生成されることと、ｂ）ブロックされた３’末端を含む１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドの３’末端に第１アダプターを付加し、この第１アダプターは配列Ａを含み、この配列Ａは、前述のブロックされた３’末端を含む１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションできないことと、ｃ）鋳型として前述のブロックされた３’末端を含む１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドを用いて、前述のブロックされた３’末端を含む１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドの３’末端に付加された第１アダプターの３’末端を伸長させ、ここで一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ポリヌクレオチドが生成されることと、ｄ）一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ポリヌクレオチドに配列Ｂを含む第２アダプターを付加し、ここで配列Ｂは配列Ａとは異なり、この付加により、一方の端に配列Ａを、反対端に配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ポリヌクレオチドが生成され、それにより定方向性ポリヌクレオチドライブラリが生成されることを含む方法が記載される。一部の実施形態において、ホスホジエステルバックボーンをポリアミンで開裂することにより、所望のサイズ範囲内の、ブロックされた３’末端を含む１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドが生成される。一部の実施形態において、ポリアミンはＮ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン（ＤＭＥＤ）である。一部の実施形態において、１つまたはそれより多くの脱塩基部位を含む１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドは、非カノニカルヌクレオチドの塩基部分を開裂することができる酵素で、１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドにおける非カノニカルヌクレオチドの塩基部分を開裂することにより生成され、そこで脱塩基部位が生成される。一部の実施形態において、非カノニカルヌクレオチドは、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ、および５−ＯＨ−Ｍｅ−ｄＣＴＰから成る群から選択される。一部の実施形態において、非カノニカルヌクレオチドの塩基部分を開裂することができる酵素は、Ｎ−グリコシラーゼである。一部の実施形態において、Ｎ−グリコシラーゼは、ウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）、ヒポキサンチン−Ｎ−グリコシラーゼ、およびヒドロキシ−メチルシトシン−Ｎ−グリコシラーゼから成る群から選択される。一部の実施形態において、非カノニカルヌクレオチドはｄＵＴＰであり、非カノニカルヌクレオチドの塩基部分を開裂することができる酵素はＵＮＧである。一部の実施形態において、非カノニカルヌクレオチドはｄＵＴＰであり、非カノニカルヌクレオチドの塩基部分を開裂することができる酵素はＵＮＧであり、ホスホジエステルバックボーンはＤＭＥＤで開裂される。一部の実施形態において、１つまたはそれより多くの非カノニカルヌクレオチドを含む１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドは、２つまたはそれより多くの異なる非カノニカルヌクレオチドの存在下で合成され、それによって２つまたはそれより多くの異なる非カノニカルヌクレオチドを含む１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドが合成される。一部の実施形態において、１つまたはそれより多くの脱塩基部位を含む１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む鋳型核酸から合成される。一部の実施形態において、鋳型核酸は、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡから成る群から選択される。一部の実施形態において、１つまたはそれより多くの脱塩基部位を含む１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖である。一部の実施形態において、１つまたはそれより多くの脱塩基部位を含む１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換型増幅（ＳＤＡ）、多置換型増幅（ＭＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）およびＲｉｂｏ−ＳＰＩＡから成る群から選択される増幅方法により合成される。一部の実施形態において、１つまたはそれより多くの脱塩基部位を含む１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドは、逆転写、プライマー伸長、限定プライマー伸長、複製、およびニック翻訳から成る群から選択された方法により合成される。一部の実施形態において、第１アダプターはさらに部分的デュプレックスおよび３’オーバーハングを含む。一部の実施形態において、第１アダプターは複数の第１アダプターを含み、前述の複数の第１アダプターのそれぞれにおけるランダム配列は、前述の複数の第１アダプターの別のものにおけるランダム配列とは異なるものとし、その複数の第１アダプターのそれぞれが配列Ａを含むものとする。一部の実施形態において、アニーリングの結果、３’末端でアニーリングされた複数の第１アダプターの１つをさらに含むブロックされた３’末端を含む所望のサイズの前述の複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントの実質的に全てが得られる。一部の実施形態において、この付加には、第１アダプターの３’オーバーハングを、ブロックされた３’末端を含むポリヌクレオチドの３’末端にアニーリングすることが含まれ、このアニーリングは、３’オーバーハングにあるランダム配列を、ブロックされた３’末端を含むポリヌクレオチドの３’末端に存在する相補配列にハイブリダイズさせることを含む。一部の実施形態において、部分的デュプレックスは、長鎖および短鎖を含み、この長鎖は、短鎖とデュプレックスを形成する配列Ａおよび３’オーバーハングを含むものとする。一部の実施形態において、短鎖はさらに短鎖の３’および／または５’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、第１アダプターはさらにステムループを含み、このステムループは、部分的デュプレックスの長鎖の５’末端を部分的デュプレックスの短鎖の３’末端と連結し、この長鎖は配列Ａおよび３’オーバーハングを含むものとする。一部の実施形態において、第１アダプターはさらに長鎖の５’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、第１アダプターはさらに短鎖の５’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、３’オーバーハングは少なくとも６、７、８または９個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、工程ｄ）は第２アダプターをライゲーションすることを含む。一部の実施形態において、このライゲーションは、平滑末端ライゲーションを含む。一部の実施形態において、工程ｃ）で生成された一方の端に配列Ａを含むポリヌクレオチドは、工程ｄ）の前に末端修復される。一部の実施形態において、第２アダプターは、デュプレックス、部分的デュプレックス、またはステムループにより連結されたデュプレックス部分を含む１本鎖を含む。一部の実施形態において、第１および／または第２アダプターは、さらに１つまたはそれより多くのバーコードを含む。一部の実施形態において、第２アダプターは部分的デュプレックスを含み、この部分的デュプレックスは、短鎖とハイブリダイズされた長鎖を含み、この長鎖は配列Ｂおよびオーバーハングを含むものとする。一部の実施形態において、長鎖は配列Ｂおよび３’オーバーハングを含み、この短鎖は３’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、第２アダプターの付加により、一方の端に配列Ａを、反対端に配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ポリヌクレオチドが生成され、この配列Ａは一方の端の５’末端にあり、配列Ｂは反対端の３’末端にあるものとする。一部の実施形態において、長鎖は配列Ｂおよび５’オーバーハングを含み、短鎖は５’末端にブロックを含むものとする。一部の実施形態において、第２アダプターの付加により、一方の端に配列Ａを、反対端に配列Ｂを含む前述の１つまたはそれより多くの２本鎖ポリヌクレオチドが生成され、この配列Ａは一方の端の５’末端にあり、配列Ｂは反対端の５’末端にある。一部の実施形態において、反対端の３’末端は、鋳型として配列Ｂを用いて伸長され、それによって、一方の端の５’末端に配列Ａを、そして反対端の３’末端に配列Ｂと相補的な配列Ｂ’を含む１つまたはそれより多くの２本鎖ポリヌクレオチドが生成される。一部の実施形態において、本方法は、さらに定方向性ｃＤＮＡライブラリを増幅することを含み、それにより増幅生成物が生成される。一部の実施形態において、本方法は、さらに増幅生成物を配列決定する追加的工程を含む。一部の実施形態において、この増幅は、ＳＰＩＡを含む。一部の実施形態において、この増幅はプライマーの使用を含み、このプライマーの１つまたはそれより多くはバーコード配列を含むものとする。一部の実施形態において、この配列決定は、次世代配列決定を含む。
【００３０】
一実施態様において、本明細書では、定方向性ポリヌクレオチドライブラリを生成する方法であって、ａ）非カノニカルヌクレオチドの存在下で鋳型核酸から１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドを合成し、これにより非カノニカルヌクレオチドを含む１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドが生成されることと、ｂ）非カノニカルヌクレオチドの塩基部分を開裂することができる酵素で、１つまたはそれより多くの合成されたポリヌクレオチドからの非カノニカルヌクレオチドの塩基部分を開裂し、これにより脱塩基部位が生成されることと、ｃ）この脱塩基部位で脱塩基部位を含む１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドのホスホジエステルバックボーンを開裂し、これによりブロックされた３’末端を含む所望のサイズ範囲内の１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドが生成されることと、ｄ）ブロックされた３’末端を含む１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドの３’末端に第１アダプターを付加し、この第１アダプターは配列Ａを含み、この配列Ａは、前述のブロックされた３’末端を含む１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションできないことと、ｅ）鋳型として前述のブロックされた３’末端を含む１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドを用いて、前述のブロックされた３’末端を含む１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドの３’末端に付加された第１アダプターの３’末端を伸長させ、ここで一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ポリヌクレオチドが生成されることと、ｆ）一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ポリヌクレオチドに配列Ｂを含む第２アダプターを付加し、ここで配列Ｂは配列Ａとは異なり、この付加により、一方の端に配列Ａを、反対端に配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ポリヌクレオチドが生成され、それにより定方向性ポリヌクレオチドライブラリが生成されることを含む方法が記載される。一部の実施形態において、工程（ｂ）および（ｃ）は同じ反応混合物中で同時に実施される。一部の実施形態において、本方法は、全４カノニカルヌクレオチドおよび１非カノニカルヌクレオチドの存在下で鋳型核酸から１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドを合成することを含むもので、非カノニカルヌクレオチドは、所望のサイズ範囲内にあるフラグメントを生成するのに適した比率で提供されるものとする。一部の実施形態において、前述の非カノニカルヌクレオチドを含む１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換型増幅（ＳＤＡ）、多置換型増幅（ＭＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）およびＲｉｂｏ−ＳＰＩＡから成る群から選択される増幅方法により合成される。一部の実施形態において、前述の非カノニカルヌクレオチドを含む１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドは、逆転写、プライマー伸長、限定プライマー伸長、複製、およびニック翻訳から成る群から選択された方法により合成される。一部の実施形態において、第１アダプターはさらに部分的デュプレックスおよび３’オーバーハングを含む。一部の実施形態において、第１アダプターは複数の第１アダプターを含み、前述の複数の第１アダプターのそれぞれにおけるランダム配列は、前述の複数の第１アダプターの別のものにおけるランダム配列とは異なるものとし、その複数の第１アダプターのそれぞれが配列Ａを含むものとする。一部の実施形態において、アニーリングの結果、３’末端でアニーリングされた複数の第１アダプターの１つをさらに含むブロックされた３’末端を含む所望のサイズの前述の複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントの実質的に全てが得られる。一部の実施形態において、この付加には、第１アダプターの３’オーバーハングを、ブロックされた３’末端を含む１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドの３’末端にアニーリングすることが含まれ、このアニーリングは、３’オーバーハングにあるランダム配列を、ブロックされた３’末端を含む１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドの３’末端に存在する相補配列にハイブリダイズさせることを含む。一部の実施形態において、部分的デュプレックスは、長鎖および短鎖を含み、この長鎖は、短鎖とデュプレックスを形成する配列Ａおよび３’オーバーハングを含むものとする。一部の実施形態において、短鎖はさらに３’および／または５’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、長鎖はさらに５’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、第１アダプターはさらにステムループを含み、このステムループは、部分的デュプレックスの長鎖の５’末端を部分的デュプレックスの短鎖の３’末端と連結し、この長鎖は配列Ａおよび３’オーバーハングを含むものとする。一部の実施形態において、第１アダプターはさらに短鎖の５’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、３’オーバーハングは少なくとも６、７、８または９個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、工程ｆ）は第２アダプターをライゲーションすることを含む。一部の実施形態において、このライゲーションは、平滑末端ライゲーションを含む。一部の実施形態において、工程ｅ）で生成された一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドは、工程ｆ）の前に末端修復される。一部の実施形態において、第２アダプターは、デュプレックス、部分的デュプレックス、またはステムループにより連結されたデュプレックス部分を含む１本鎖を含む。一部の実施形態において、第１および／または第２アダプターは、さらに１つまたはそれより多くのバーコードを含む。一部の実施形態において、第２アダプターは部分的デュプレックスを含み、この部分的デュプレックスは、短鎖とハイブリダイズされた長鎖を含み、この長鎖は配列Ｂおよびオーバーハングを含むものとする。一部の実施形態において、長鎖は配列Ｂおよび３’オーバーハングを含み、この短鎖は３’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、第２アダプターの付加により、一方の端に配列Ａを、反対端に配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ポリヌクレオチドが生成され、この配列Ａは一方の端の５’末端にあり、配列Ｂは反対端の３’末端にあるものとする。一部の実施形態において、長鎖は配列Ｂおよび５’オーバーハングを含み、短鎖は５’末端にブロックを含むものとする。一部の実施形態において、第２アダプターの付加により、一方の端に配列Ａを、反対端に配列Ｂを含む前述の１つまたはそれより多くの２本鎖ポリヌクレオチドが生成され、この配列Ａは一方の端の５’末端にあり、配列Ｂは反対端の５’末端にあるものとする。一部の実施形態において、反対端の３’末端は、鋳型として配列Ｂを用いて伸長され、それによって、一方の端の５’末端に配列Ａを、そして反対端の３’末端に配列Ｂと相補的な配列Ｂ’を含む１つまたはそれより多くの２本鎖ポリヌクレオチドが生成される。一部の実施形態において、本方法は、さらに定方向性ポリヌクレオチドライブラリを増幅することを含み、それにより増幅生成物が生成される。一部の実施形態において、本方法は、さらに増幅生成物を配列決定する追加的工程を含む。一部の実施形態において、この増幅は、ＳＰＩＡを含む。一部の実施形態において、この増幅はプライマーの使用を含み、このプライマーの１つまたはそれより多くはバーコード配列を含むものとする。一部の実施形態において、この配列決定は、次世代配列決定を含む。
【００３１】
本明細書ではまた、定方向性ｃＤＮＡライブラリを生成する方法であって、（ａ）鋳型ＲＮＡに１つまたはそれより多くのプライマーをアニーリングすることと、（ｂ）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＵＴＰを含む反応混合物の存在下で前述の１つまたはそれより多くのプライマーを伸長させ、ここで反応混合物は、ある一定のｄＵＴＰ対ｄＴＴＰ比を含み、この比は所望の密度でのｄＵＴＰの組込みを可能にし、それにより所望の密度で組み込まれたｄＵＴＰを含む１つまたはそれより多くの第１鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が生成されることと、（ｃ）ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）およびＵＮＧにより作製される脱塩基部位にあるホスホジエステルバックボーンを開裂することができる作用因子で、所望の密度で組み込まれたｄＵＴＰを含む１つまたはそれより多くの第１鎖ｃＤＮＡを選択的に開裂し、ここで、この開裂により、ブロックされた３’末端を含む所望のサイズの複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成されることと、（ｄ）部分的デュプレックスおよび３’オーバーハングを含む第１アダプターを、ブロックされた３’末端を含む複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントのうちの１つまたはそれより多くの３’末端にアニーリングし、ここで、この第１アダプターは配列Ａを含み、このアニーリングは、３’オーバーハングにあるランダム配列を、ブロックされた３’末端を含む複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントのうちの１つまたはそれより多くの３’末端に存在する相補配列にハイブリダイズさせることを含むことと、（ｅ）相補配列にハイブリダイズされた３’オーバーハングをＤＮＡポリメラーゼで伸長させ、ここで、一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成されることと、（ｆ）配列Ｂを含む第２アダプターを、一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの前記２本鎖ｃＤＮＡフラグメントにライゲーションし、ここで、このライゲーションにより、一方の端に配列Ａおよび反対端に配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、それによって定方向性ポリヌクレオチドライブラリが生成されることと、（ｇ）任意選択でこの定方向性ｃＤＮＡライブラリを増幅および／または配列決定することを含む方法が提供される。
【００３２】
本明細書ではまた、定方向性ｃＤＮＡライブラリを生成する方法であって、（ａ）鋳型ｄｓＤＮＡをニッキング酵素で処理し、ここで、この処理により、鋳型ｄｓＤＮＡの１鎖のホスホジエステルバックボーンに１つまたはそれより多くの破断が生じ、この破断により、その１鎖において１つまたはそれより多くの３’ヒドロキシルが生成されることと、（ｂ）前述の１つまたはそれより多くの３’ヒドロキシルを伸長させ、ここで、この伸長はｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＵＴＰを含む反応混合物の存在下で行われ、この反応混合物は、ある一定のｄＵＴＰ対ｄＴＴＰ比を含み、この比は所望の密度でのｄＵＴＰの組込みを可能にし、それによって所望の密度で組み込まれたｄＵＴＰを含む１つまたはそれより多くの第１鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が生成されることと、（ｃ）ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）およびＵＮＧにより作製される脱塩基部位にあるホスホジエステルバックボーンを開裂することができる作用因子で、所望の密度で組み込まれたｄＵＴＰを含む１つまたはそれより多くの第１鎖ｃＤＮＡを選択的に開裂し、ここで、この開裂により、ブロックされた３’末端を含む所望のサイズの複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成されることと、（ｄ）部分的デュプレックスおよび３’オーバーハングを含む第１アダプターを、ブロックされた３’末端を含む複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントのうちの１つまたはそれより多くの３’末端にアニーリングし、ここで、この第１アダプターは配列Ａを含み、このアニーリングは、３’オーバーハングにあるランダム配列を、ブロックされた３’末端を含む複数の第１鎖ｃＤＮＡフラグメントのうちの１つまたはそれより多くの３’末端に存在する相補配列にハイブリダイズさせることを含むことと、（ｅ）相補配列にハイブリダイズされた３’オーバーハングをＤＮＡポリメラーゼで伸長させ、ここで、一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成されることと、（ｆ）配列Ｂを含む第２アダプターを、一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの前記２本鎖ｃＤＮＡフラグメントにライゲーションし、ここで、このライゲーションにより、一方の端に配列Ａおよび反対端に配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、それによって定方向性ｃＤＮＡライブラリが生成されることと、（ｇ）任意選択でこの定方向性ｃＤＮＡライブラリを増幅および／または配列決定することを含む方法が提供される。
【００３３】
本明細書ではまた、全ゲノムライブラリを生成する方法であって、（ａ）ニッキングされた、および／またはフラグメント化されたｄｓＤＮＡ鋳型核酸を変性させることと、（ｂ）部分的デュプレックスおよび３’オーバーハングを含む第１アダプターを、複数の１本鎖ＤＮＡフラグメントの１つまたはそれより多くの３’末端にアニーリングし、ここで、この第１アダプターは配列Ａを含み、このアニーリングは、３’オーバーハングにあるランダム配列を、前述の複数の１本鎖ＤＮＡフラグメントの１つまたはそれより多くの３’末端に存在する相補配列にハイブリダイズさせることを含むことと、（ｃ）相補配列にハイブリダイズされた３’オーバーハングをＤＮＡポリメラーゼで伸長させ、ここで、一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成されることと、（ｅ）配列Ｂを含む第２アダプターを、一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの前記２本鎖ｃＤＮＡフラグメントにライゲーションし、ここで、このライゲーションにより、一方の端に配列Ａおよび反対端に配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、それによって定方向性ｃＤＮＡライブラリが生成されることと、（ｆ）任意選択でこの定方向性ｃＤＮＡライブラリを増幅および／または配列決定することを含む方法が提供される。
【００３４】
前述の方法のいずれかの一部の実施形態において、１つまたはそれより多くのプライマーは、ランダムプライマーを含む。一部の実施形態において、１つまたはそれより多くのプライマーは、実質的に全ての転写物を含むＲＮＡの群に特異的な配列を含む。一部の実施形態において、１つまたはそれより多くのプライマーは、構造的ＲＮＡを含まないＲＮＡの群に特異的な配列を含み、この構造的ＲＮＡはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を含むものとする。一部の実施形態において、ホスホジエステルバックボーンを開裂することができる作用因子は、酵素、化学的作用因子および／または熱を含む。一部の実施形態において、化学的作用因子はポリアミンである。一部の実施形態において、ポリアミンはＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（ＤＭＥＤ）である。一部の実施形態において、第１アダプターは、長鎖および短鎖を含み、この長鎖は、短鎖とデュプレックスを形成する配列Ａおよび３’オーバーハングを含むものとする。一部の実施形態において、第１アダプターは複数の第１アダプターを含み、前述の複数の第１アダプターのそれぞれにおけるランダム配列は、前述の複数の第１アダプターの別のものにおけるランダム配列とは異なるものとし、その複数の第１アダプターのそれぞれが配列Ａを含むものとする。一部の実施形態において、第１アダプターはさらにステムループを含み、このステムループは、部分的デュプレックスの長鎖の５’末端を部分的デュプレックスの短鎖の３’末端と連結し、この長鎖は配列Ａおよび３’オーバーハングを含むものとする。一部の実施形態において、３’オーバーハングは少なくとも６、７、８または９個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、第２アダプターは部分的デュプレックスを含み、この部分的デュプレックスは、短鎖とハイブリダイズされた長鎖を含み、この長鎖は配列Ｂおよびオーバーハングを含むものとする。一部の実施形態において、長鎖は配列Ｂおよび３’オーバーハングを含み、この短鎖は３’末端にブロックを含む。一部の実施形態において、このライゲーションにより、一方の端に配列Ａを、反対端に配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、この配列Ａは一方の端の５’末端にあり、配列Ｂは反対端の３’末端にあるものとする。一部の実施形態において、長鎖は配列Ｂおよび５’オーバーハングを含み、短鎖は５’末端にブロックを含むものとする。一部の実施形態において、このライゲーションにより、一方の端に配列Ａを、反対端に配列Ｂを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成され、この配列Ａは一方の端の５’末端にあり、配列Ｂは反対端の５’末端にあるものとする。一部の実施形態において、反対端の３’末端は、鋳型として配列Ｂを用いて伸長され、それによって、一方の端の５’末端に配列Ａを、そして反対端の３’末端に配列Ｂと相補的な配列Ｂ’を含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントが生成される。一部の実施形態において、ニッキング酵素は鎖特異的ニッキング酵素を含む。一部の実施形態において、工程ｂ）における１つまたはそれより多くの３’ヒドロキシルの伸長は、鎖置換活性を含むＤＮＡポリメラーゼにより行われる。一部の実施形態において、ライゲーションは平滑末端ライゲーションを含み、工程ｅ）で生成された一方の端に配列Ａを含む１つまたはそれより多くの２本鎖ｃＤＮＡフラグメントは、工程ｆ）の前に末端修復される。一部の実施形態において、第１および／または第２アダプターは、さらに１つまたはそれより多くのバーコードを含む。
【００３５】
参照による援用
本明細書で挙げた全ての出版物、特許および特許出願は、個々の出版物、特許、または特許出願がそれぞれ具体的かつ個別に参照によって援用されることが示されているかのごとく、同じ程度まで出典明示により本明細書に援用されている。
【００３６】
新規な特徴を、添付の請求の範囲に詳細に示す。本明細書で提供される方法、組成物およびキットの原理が利用されている実例となる実施形態を示す以下に詳述する記載および以下に説明する添付図面を参照することにより、特徴および利点に関して理解が深まるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、ＲＮＡ鋳型からの定方向性ｃＤＮＡライブラリの生成方法を示す。図１Ａは、生成物の５’末端および３’末端に規定された配列ＡおよびＢをそれぞれ伴う鎖特異的生成物を含むＲＮＡ鋳型からの定方向性ｃＤＮＡライブラリの生成を示す。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、ＲＮＡ鋳型からの定方向性ｃＤＮＡライブラリの生成方法を示す。図１Ｂは、生成物の５’末端および３’末端に規定された配列ＡおよびＢ’をそれぞれ伴う鎖特異的生成物を含むＲＮＡ鋳型からの定方向性ｃＤＮＡライブラリの生成を示す。
【図２】図２は、図１Ａおよび１Ｂで示した方法で使用するためのランダム配列を含む３’オーバーハングを含む第１アダプターを示す。Ｉは、両端にブロッキング基（ｘ）を伴う長鎖および長い方の鎖の５’部分に相補的な短い単鎖を含む３’オーバーハングを含む第１アダプターを示す。ブロックはまた、長鎖の５’末端にも存在し得る。ブロッキング基は全て任意選択的であり得る。オリゴヌクレオチドの末端は、さらにホスホチオエート結合により保護され得る。ＩＩは、３’オーバーハングおよびステムループオリゴヌクレオチドを含む第１アダプターを示す。ステムループのループ部分は、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはその組み合わせ、非ヌクレオチドリンカー、ヌクレオチド類似体またはそれらの混合物を含み得る。５’末端はまた、ブロッキング基を含み得る。これらの末端は、さらにホスホチオエート結合により保護され得る。
【図３】図３は、ＲＮＡ鋳型からの鎖ｃＤＮＡライブラリの生成についての作業の流れを示す。
【図４】図４は、図１Ａおよび１Ｂで示した方法との組み合わせでニッキング酵素（複数も可）およびＤＮＡポリメラーゼを使用する２本鎖ＤＮＡ（例、ゲノムＤＮＡ）鋳型からのライブラリの生成を示す。
【図５】図５は、図１Ａおよび１Ｂで示した方法により生成されたｃＤＮＡ生成物の単一プライマー等温増幅を示す。
【図６】図６は、実施例１に記載された、１００ｎｇのＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＵＨＲ）全ＲＮＡから製造された定方向性配列決定ライブラリのサイズ分布のＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）トレースを示す。
【図７】図７は、実施例１記載の要領で生成されたＵＨＲ全ＲＮＡ（１００ｎｇ）からの定方向性配列決定ライブラリ（ｓ４＿Ｌ２ＤＲ１４；ｓ４＿Ｌ２ＤＲ１５）のトランスクリプトーム配列決定データを示す。
【図８】図８は、実施例１記載の要領で生成されたＵＨＲ全ＲＮＡ（１００ｎｇ）からの２つの定方向性配列決定ライブラリ（ｓ４＿Ｌ２ＤＲ１４；ｓ４＿Ｌ２ＤＲ１５）のトランスクリプトーム配列決定データの１００万当たりの１キロベース転写物当たりのリード（ＲＰＫＭ）値の相関関係を示す。
【図９】図９は、実施例１および２に記載されたＵＨＲ全ＲＮＡから生成された３つの定方向性配列決定ライブラリから得られた配列決定データの要約を示す。
【図１０】図１０は、実施例２に記載の要領で生成されたＵＨＲ全ＲＮＡ（１ｎｇ）からの定方向性配列決定ライブラリからのトランスクリプトーム配列決定データを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
Ｉ．概要
本明細書では、核酸（例、ＲＮＡおよびＤＮＡ）鋳型からの定方向性核酸配列決定ライブラリ構築のための方法、組成物およびキットが提供される。一実施態様において、本明細書では、ハイスループット配列決定方法と適合し得、同時に元の核酸試料の方向性（鎖性）情報を維持するＲＮＡおよびＤＮＡ鋳型から核酸ライブラリを生成するための方法、組成物およびキットが提供される。これらの方法を用いることにより、鋳型ゲノムｄｓＤＮＡの物理的フラグメント化を必要とせずに、全トランスクリプトームおよび全ゲノムを表すライブラリを生成することができる。また、これらの方法を用いることにより、単細胞を含む非常に小さな試料からライブラリを生成することができる。
【００３９】
ＩＩ．鎖特異的選択
本明細書で提供される組成物、方法およびキットは、鋳型核酸についての方向性情報を保持するのに使用され得る。鋳型核酸はＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。鋳型核酸は、１本鎖または２本鎖であり得る。「鎖特異的」、「（定）方向性」または「鎖性」の語は、互いに相補的である２つの鎖間において２本鎖ポリヌクレオチドでの区別を生じさせる能力を指し得る。「鎖ライブラリ」、「鎖ｃＤＮＡライブラリ」、「定方向性ライブラリ」または「定方向性ｃＤＮＡライブラリ」の語は互換的に使用され得る。「鎖マーキング」の語は、２本鎖ポリヌクレオチドの２つの鎖間で区別するための任意の方法を指し得る。「選択」の語は、２本鎖ポリヌクレオチドの２つの鎖間で選択を行う任意の方法を指し得る。
【００４０】
本明細書記載の方法に基づくと、核酸鋳型の方向性および鎖情報の保持は、５０％を超える効率で決定され得る。本明細書記載の方法を用いることによる方向性および鎖配向の保持の効率は、＞５０％。＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、または＞９５％であり得る。方向性および鎖配向の保持の効率は、＞７０％、＞８０％、＞９０％または＞９９％であり得る。本明細書記載の方法を用いることにより、ポリヌクレオチドライブラリにおいて５０％を超えるポリヌクレオチドが特異的鎖配向を含む定方向性ポリヌクレオチドライブラリを生成することができる。本明細書記載の方法を用いた特異的鎖配向の保持は、＞５０％。＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、または＞９５％であり得る。定方向性ポリヌクレオチドライブラリにおけるポリヌクレオチドの特異的鎖配向の保持は＞９９％であり得る。
【００４１】
ＩＩＩ．ポリヌクレオチド、試料およびヌクレオチド
定方向性核酸ライブラリは、核酸の任意の供給源から得られた核酸鋳型から生成され得る。核酸はＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。核酸は１本鎖または２本鎖であり得る。場合によっては、核酸はＤＮＡである。ＤＮＡは、当業界における標準技術を用いて入手および精製され得、精製または非精製形態のＤＮＡを含み得る。ＤＮＡは、ミトコンドリアＤＮＡ、無細胞ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはゲノムＤＮＡであり得る。場合によっては、核酸はゲノムＤＮＡである。ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）であり得る。ＤＮＡは、１つまたはそれより多くの染色体に由来し得る。例えば、ＤＮＡがヒト由来の場合、ＤＮＡは、染色体１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、Ｘ、またはＹのうちの１つまたはそれより多くに由来し得る。場合によっては、ＤＮＡは２本鎖ＤＮＡである。場合によっては、２本鎖ＤＮＡはゲノムＤＮＡである。場合によっては、ＤＮＡはｃＤＮＡである。場合によっては、ｃＤＮＡは２本鎖ｃＤＮＡである。場合によっては、ｃＤＮＡはＲＮＡに由来し、このＲＮＡに対し第１鎖合成、次いで第２鎖合成が行われる。ＲＮＡは、当業界における標準技術を用いて入手および精製され得、精製または非精製形態のＲＮＡを含み得、限定される訳ではないが、例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、レトロウイルス、小非コーディングＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、ポリソームＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、イントロンＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、無細胞ＲＮＡおよびそれらのフラグメントが挙げられる。非コーディングＲＮＡまたはｎｃＲＮＡには、ｓｎｏＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡおよび長ｎｃＲＮＡが含まれ得る。
【００４２】
本明細書記載の方法に用いる核酸の供給源は、核酸を含む試料であり得る。核酸は、試料から単離され、試料からの核酸の精製について当業界で既知の方法のいずれかにより精製され得る。試料は、ポリヌクレオチドを含む非細胞体（例、ウイルス）または細胞に基づく生物（例、古細菌、細菌または真核生物ドメインの構成員）に由来し得る。場合によっては、試料は、扉または卓上などの表面のスワッブから得られる。
【００４３】
試料は、対象、例えば植物、真菌、真正細菌、古細菌、原生生物（ｐｒｏｔｅｓｔ）または動物に由来し得る。対象は、生物、すなわち単細胞または多細胞生物であり得る。対象は培養細胞であり得、とりわけ一次細胞または確立された細胞系からの細胞であり得る。試料は、まず任意の好適な形態の多細胞生物から単離され得る。動物は、魚類、例えばゼブラフィッシュであり得る。動物は哺乳類であり得る。哺乳類は、例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、マウス、ラットまたはブタであり得る。哺乳類は、霊長類、例えばヒト、チンパンジー、オランウータン、またはゴリラであり得る。ヒトは男性または女性であり得る。試料は、ヒト胚またはヒト胎児由来であり得る。ヒトは、幼児、小児、ティーンエージャー、成人または高齢者であり得る。女性は、妊娠しているか、妊娠している疑いがあるか、または妊娠する計画がある女性であり得る。場合によっては、試料は対象からの単一または個別の細胞であり、ポリヌクレオチドは単一または個別の細胞に由来することもある。場合によっては、試料は、個々の微生物、または微生物の集団、または微生物と宿主細胞核酸または無細胞核酸との混合物であることもある。
【００４４】
試料は、健康な対象（例、ヒト対象）由来であり得る。場合によっては、試料は、少なくとも妊娠４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６週目の対象（例、妊婦）から採取されることもある。場合によっては、対象は、遺伝的疾患に罹患しているか、遺伝的疾患についてのキャリアであるか、または遺伝的疾患を発症するか伝える危険があることもあり、この場合、遺伝的疾患は、突然変異、挿入、付加、欠失、転座、点突然変異、トリヌクレオチド反復障害および／または１塩基多型（ＳＮＰ）などの遺伝的変異に結びつき得る何らかの疾患である。
【００４５】
試料は、特異的な疾患、障害または状態を有するか、または特異的な疾患、障害または状態を有する疑いがある（または有する危険がある）対象に由来し得る。例えば、試料は、癌患者、癌を有する疑いがある患者、または癌を有する危険がある患者に由来し得る。癌は、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌腫、カポジ肉腫、肛門癌、基底細胞癌腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、脳幹グリオーマ、脳癌、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽細胞腫、髄上皮腫、松果体実質腫瘍、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、カルチノイド腫瘍、子宮頸癌、脊索腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非浸潤性乳管癌、子宮体癌、食道癌、ユーイング肉腫、眼部癌、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、線維性組織球腫、胆嚢癌、胃癌、グリオーマ、有毛細胞性白血病、頭部および頸部癌、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、腎臓癌、喉頭癌、口唇癌、口腔癌、肺癌、非小細胞癌腫、小細胞癌腫、メラノーマ、口癌、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、髄芽腫、鼻腔癌、副鼻腔癌、神経芽細胞腫、上咽頭癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、乳頭腫症、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、セザリー症候群、皮膚癌、非黒色腫、小腸癌、軟組織肉腫、扁平上皮癌腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ヴァルデンシュトレームマクログロブリン血症、またはウィルムス腫瘍であり得る。試料は、癌患者からの癌組織および／または正常組織由来であり得る。
【００４６】
試料は、房水、ガラス体液、胆汁、全血、血清、血漿、母乳、脳脊髄液、耳垢、内リンパ液、外リンパ液、胃液、粘液、腹腔液、唾液、皮脂、精液、汗、涙、膣分泌物、吐物、糞または尿であり得る。試料は、病院、研究室、臨床または医学研究室から入手され得る。試料は、対象から採取され得る。
【００４７】
試料は、水、土壌、空気などの媒体を含む環境的試料であり得る。試料は、法医学的試料（例、毛髪、血液、精液、唾液など）であり得る。試料は、生物テロ攻撃で使用される作用因子（例、インフルエンザ、炭疽病、天然痘）を含み得る。
【００４８】
試料は、核酸を含み得る。核酸は、例えば、ミトコンドリアＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｃＲＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはｃＤＮＡであり得る。試料は、無細胞核酸を含み得る。試料は、細胞系、ゲノムＤＮＡ、無細胞血漿、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料、または瞬間冷凍試料であり得る。ホルマリン固定パラフィン包埋試料は、核酸を抽出する前に脱パラフィン処理され得る。試料は、臓器、例えば心臓、皮膚、肝臓、肺、胸部、胃、膵臓、膀胱、結腸、胆嚢、脳などに由来し得る。核酸は、当業者に利用可能な手段により試料から抽出され得る。
【００４９】
試料は、フラグメント化、ライゲーション、変性、および／または増幅または本明細書で提供される方法のいずれにも適格なものとなるように処理され得る。例としての試料処理としては、試料の細胞溶解による核酸の放出、試料の精製（例、酵素反応を阻害し得る他の試料成分から核酸を単離するため）、試料の希釈／濃縮、および／またはさらなる核酸処理用の試薬との併用を挙げることができる。一部の実施例では、試料を、制限酵素、逆転写酵素または核酸処理の任意の他の酵素と組み合わすことができる。
【００５０】
本明細書記載の方法は、１つまたはそれより多くの標的核酸を分析または検出するのに使用され得る。ポリヌクレオチドの語またはその文法的均等内容語は、共有結合により一緒になった少なくとも２つのヌクレオチドを指し得る。本明細書記載のポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合を含み得るが、場合によっては、下記で概説するように（例えばプライマーおよび標識プローブなどのプローブの構築において）、例えば、ホスホルアミド（Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９（１０）：１９２５（１９９３）およびそこに出てくる参考文献、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００（１９７０）、Ｓｐｒｉｎｚｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９（１９７７）、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３４８７（１９８６）、Ｓａｗａｉら、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５（１９８４）、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）およびＰａｕｗｅｌｓら、Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ  ２６：１４１  ９１９８６））、ホスホロチオエート（Ｍａｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：１４３７（１９９１）および米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１（１９８９））、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照）、およびペプチド核酸（本明細書では「ＰＮＡ」とも称す）バックボーンおよび結合（Ｅｇｈｏｌｍ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５（１９９２）、Ｍｅｉｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８（１９９２）、Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６（１９９３）、Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：２０７（１９９６）を参照、これら全てについては、出典明示で援用する）を含む代替的バックボーンを有し得る核酸類似体も包含される。他の類似体核酸には、ロックト核酸（本明細書では「ＬＮＡ」とも称す）を含む二環式構造を有するもの（Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０．１３２５２  ３（１９９８））、正のバックボーンを有するもの（Ｄｅｎｐｃｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６０９７（１９９５））、非イオン性バックボーンを有するもの（米国特許第５，３８６，０２３，５，６３７，６８４，５，６０２，２４０，５，２１６，１４１および４，４６９，８６３号、Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ  ３０：４２３（１９９１）、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  １３：１５９７（１９９４）、第２および３章、ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”、Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ編、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５（１９９４）、Ｊｅｆｆｓら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ  ３４：１７（１９９４）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９６））ならびに、米国特許第５，２３５，０３３および５，０３４，５０６号、ならびに第６および７章、ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ編、に記載されたものを含む、非リボースバックボーンを有するものがある。また、１つまたはそれより多くの炭素環状糖を含む核酸も、核酸の定義内に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．（１９９５）ｐｐ１６９  １７６を参照）。幾つかの核酸類似体は、Ｒａｗｌｓ、Ｃ  ＆  Ｅ  Ｎｅｗｓ  １９９７年６月２日号３５頁に記載されている。「ロックト核酸」もまた、核酸類似体の定義の範囲内に含まれる。ＬＮＡは、リボース環が２’−Ｏ原子を４’−Ｃ原子と連結するメチレン架橋により「ロックされた」核酸類似体の１つのクラスである。これらの参考文献は全て、出典明示により本明細書に援用する。リボース−リン酸バックボーンのこれらの修飾を行うことにより、生理学的環境における上記分子の安定性および半減期を増加させることができる。例えば、ＰＮＡ：ＤＮＡおよびＬＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは、さらに高い安定性を呈し得るため、場合によっては使用されることもあり得る。核酸は、明記したように１本鎖状または２本鎖状であり得、または２本鎖配列や１本鎖配列の両方の部分を含み得る。適用法によって、核酸は、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡを含む）またはハイブリッドであり得、この場合、核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの任意の組み合わせ、およびウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン（ｘａｔｈａｎｉｎｅ）、ヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｔｈａｎｉｎｅ）、イソシトシン、イソグアニンなどを含む、塩基の任意の組み合わせを含む。
【００５１】
「非修飾ヌクレオチド」または「非修飾ｄＮＴＰ」または「古典的ｄＮＴＰ」の語は、ＤＮＡ合成においてビルディングブロックとして通常使用され得る４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸、ｄＡＴＰ（デオキシアデノシン三リン酸）、ｄＣＴＰ（デオキシシチジン三リン酸）、ｄＧＴＰ（デオキシグアノシン三リン酸）およびｄＴＴＰ（デオキシチミジン三リン酸）を指し得る。
【００５２】
「カノニカルｄＮＴＰ」または「カノニカルヌクレオチド」の語は、ＤＮＡに通常見い出される４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを指すのに使用され得る。
【００５３】
「修飾ヌクレオチド」、「修飾ｄＮＴＰ」または「ヌクレオチド類似体」の語は、１つの対応する非修飾ヌクレオチドまたは古典的ｄＮＴＰを置換するのに好適な任意の分子を指し得る。かかる修飾ヌクレオチドに対しては、それが置き換わる古典的または非修飾ｄＮＴＰと同一の、または類似した塩基対マッチングが行われることが可能でなければならない。修飾ヌクレオチドまたはｄＮＴＰは、それが好適な分解剤または開裂作用因子により選択的に分解されるかまたは開裂される特異的な分解または開裂に好適なものでなくてはならない。修飾ヌクレオチドは、選択的除去または開裂に適格な修飾ヌクレオチドを含むＤＮＡ鎖をマーキングしなければならず、またはポリヌクレオチド鎖の分離を促進しなければならない。かかる除去または開裂または分離は、修飾ヌクレオチドと選択的に相互作用する、したがって唯一のポリヌクレオチド鎖を選択的に除去するか、または除去のためにマーキングするかまたは開裂する分子、粒子または酵素により達成され得る。
【００５４】
「非カノニカル」の語は、ＤＮＡにおける４つのカノニカル塩基以外のＤＮＡにおける核酸塩基、またはそれらのデオキシリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド類似体を指し得る。ウラシルはＲＮＡにおける共通の核酸塩基であるが、ウラシルはＤＮＡにおける非カノニカル塩基である。場合によっては、非カノニカルｄＮＴＰはｄＵＴＰである。
【００５５】
「バーコード」の語は、そのバーコードを随伴する核酸の何らかの特徴を識別させ得る既知核酸配列を指し得る。場合によっては、同定されるべき核酸の特徴は核酸が由来する試料である。場合によっては、バーコードは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれより長いヌクレオチド長である。場合によっては、バーコードは、１０、９、８、７、６、５、または４ヌクレオチド長より短いこともある。オリゴヌクレオチド（例、プライマーまたはアダプター）は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の異なるバーコード、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０より多いかまたは少ない異なるバーコード、または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の異なるバーコードを含み得る。バーコードは、鋳型核酸を含む試料由来の鋳型核酸に（例、アニーリングまたはライゲーションによって）随伴され得る。場合によっては、ある１つの試料に由来する鋳型核酸に随伴したバーコードが、別の試料に由来する鋳型核酸に随伴したバーコードと異なることもある。第１の試料に由来する鋳型核酸に随伴したバーコードは、第２の試料に由来する鋳型核酸に随伴したバーコードとは異なる長さを有し得る。バーコードは、十分な長さを有し得、試料に伴うバーコードに基づいて試料を識別させ得るのに十分な程度異なり得る配列を含み得る。場合によっては、バーコード、およびそれが関与する試料供給源は、バーコード配列における１つまたはそれより多くのヌクレオチドの突然変異、挿入、または欠失の後、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くのヌクレオチドの突然変異、挿入、または欠失の後に、正確に識別され得る。場合によっては、複数のバーコードにおける各バーコードは、少なくとも３つのヌクレオチド位置、例えば少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くの位置でその複数のバーコードにおける他の全てのバーコードとは異なることもある。場合によっては、アダプターが、複数のバーコード配列のうちの少なくとも１つを含むこともある。場合によっては、第２アダプターオリゴヌクレオチドのためのバーコードは、第１アダプター／プライマーオリゴヌクレオチドのためのバーコードから独立して選択されることもある。場合によっては、バーコードを有する第１アダプター／プライマーオリゴヌクレオチドおよび第２アダプターオリゴヌクレオチドが、この対のアダプターが同一または異なる１つまたはそれより多くのバーコードを含むように対合されることもある。場合によっては、本明細書記載の方法は、標的核酸が連結しているバーコード配列に基づいて鋳型核酸が由来する試料を識別することをさらに含むこともある。バーコードは、鋳型核酸に連結されると、鋳型核酸が由来した試料の識別子としての役割を果たすポリヌクレオチド配列を含み得る。
【００５６】
場合によっては、バーコードは、複数の核酸フラグメントを含む試料内の個々のフラグメントにそれぞれユニークなマーキングをするのに有用なランダム配列を含むことがある。ユニークに付加されたバーコードは、大規模並列処理次世代配列決定などのダウンストリーム定量化手順中におけるユニークフラグメントの定量化手段を提供する。バーコードは、本明細書記載の方法において有用な任意のアダプターおよび／またはプライマーの一部であり得るため、本明細書で提供される方法により個別フラグメントまたは複数のフラグメントに付加され得る。これらの場合、バーコードは、ランダムに付加され、試料ではなくそれらが付加されるフラグメントについてユニークである。これらのバーコードは、試料または核酸の供給源に特異的なバーコードと組み合わされ得る。
【００５７】
例えばポリヌクレオチド合成、非カノニカルヌクレオチドの塩基部分の開裂、脱塩基部位でのホスホジエステルバックボーンの開裂など、ある事象を「起こらせ得る」または「可能にする」条件または事象が起こるのに「好適」である条件とは、かかる事象が起こるのを妨げない条件である。したがって、これらの条件は、この事象を可能にする、促進する、容易にする、および／または事象に対し誘導的である。当業界で既知であり、本明細書に記載のかかる条件は、例えばポリヌクレオチド配列の性質、温度、および緩衝条件によって異なる。これらの条件はまた、ポリヌクレオチド合成、非カノニカルヌクレオチドの塩基部分の開裂、脱塩基部位でのホスホジエステルバックボーンの開裂など、どのような事象が所望されるかによって異なる。
【００５８】
ＩＶ．非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成
非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、少なくとも１つの非カノニカルヌクレオチドの存在下で鋳型核酸からポリヌクレオチドを合成することにより製造され得、これにより非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが生成される。ポリヌクレオチド（例、第１鎖ｃＤＮＡ）への非カノニカルヌクレオチドの組込み頻度は、本明細書で提供される方法を用いて製造されたフラグメントのサイズと関連している。これは、本明細書で記載したように、非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドにおける非カノニカルヌクレオチド間の間隔が、使用される反応条件とともに、非カノニカルヌクレオチドからの脱塩基部位の生成および脱塩基部位でのバックボーンの開裂から生じるフラグメントのおおよそのサイズを決定し得るためである。フラグメントの望ましいサイズ範囲は、大規模並列配列決定に好適な配列決定ライブラリの生成など、ダウンストリーム・アプリケーションの必要条件にしたがって変化させ得る。
【００５９】
本明細書で示したように、ポリヌクレオチドは、改変および／または修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間結合、リボヌクレオチドなどを含み得るが、本明細書で提供される方法により生成されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であり得、このｃＤＮＡは、鋳型核酸と相補的である。
【００６０】
鋳型核酸からのポリヌクレオチド（例、１本鎖ＤＮＡおよび２本鎖ＤＮＡ）の合成方法は、当業界では周知であり、例としては、限定される訳ではないが、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ（商標））、Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡ（商標）、ＰＣＲ、逆転写、プライマー伸長、限定プライマー伸長、複製（ローリングサークル複製を含む）、鎖置換型増幅（ＳＤＡ）、ニック翻訳、多置換型増幅（ＭＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）および、例えば、少なくとも１つの非カノニカルヌクレオチドがポリヌクレオチドに組み込まれ得るように鋳型核酸配列の相補体の合成をもたらす任意の方法がある。例えば、Ｋｕｒｎ、米国特許第６，２５１，６３９号、Ｋｕｒｎ、国際公開０２／００９３８、Ｋｕｒｎ，米国特許第６，９４６，２５１号、Ｋｕｒｎ、米国特許第６，６９２，９１８号、Ｍｕｌｌｉｓ、米国特許第４，５８２，８７７号、Ｗａｌｌａｃｅ、米国特許第６，０２７，９２３号、米国特許第５，５０８，１７８、５，８８８，８１９、６，００４，７４４、５，８８２，８６７、５，７１０，０２８、６，０２７，８８９、６，００４，７４５、５，７６３，１７８、５，０１１，７６９号、また、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、第２版、Ａｕｓｅｂｅｌ（１９８７、および最新版）“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｍｕｌｌｉｓ（１９９４）“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”も参照。当業界で既知の１つまたはそれより多くの方法を用いることにより、非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを生成することができる。非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖または部分的２本鎖であり得ること、および２本鎖ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖は非カノニカルヌクレオチドを含み得ることが理解される。便宜上、「ＤＮＡ」は、本明細書においてポリヌクレオチドを記載（および例示）するのに使用され得る。ＤＮＡ、したがってポリヌクレオチドは、鋳型核酸に相補的なヌクレオチド鎖を製造することにより生成された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であり得る（例、ＲＮＡ鋳型から第１および／または第２鎖合成により製造されたｃＤＮＡまたは鋳型ＤＮＡを用いて伸長または複製反応から製造されたｃＤＮＡ）。好適な方法には、非カノニカルヌクレオチドを含む１つの１本鎖または２本鎖ポリヌクレオチドをもたらす方法（例えば、逆転写、２本鎖ｃＤＮＡの製造、単一ラウンドのＤＮＡ複製）、ならびに多数の１本鎖または２本鎖コピーまたは鋳型の相補体のコピーをもたらす方法（例えば、単一プライマー等温増幅またはＲｉｂｏ−ＳＰＩＡ（商標）またはＰＣＲ）がある。場合によっては、非カノニカルヌクレオチドを含む１本鎖ポリヌクレオチドが、単一プライマー等温増幅を用いて合成されることもある。Ｋｕｒｎら、米国特許第６，２５１，６３９および６，６９２，９１８号を参照。
【００６１】
非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、必要ならば、好適な酵素およびプライマーを含む、ポリヌクレオチドの合成に好適な反応条件のもと４つの全カノニカルヌクレオチドおよび少なくとも１つの非カノニカルヌクレオチドの存在下で鋳型から生成され得る。非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを合成するための、プライマーを含む、反応条件および試薬は、当業界では既知であり、本明細書でもさらに検討されている。好適な非カノニカルヌクレオチドは、当業界では周知であり、例えば、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシイノシン三リン酸（ｄＩＴＰ）、５−ヒドロキシメチルデオキシシチジン三リン酸（５−ＯＨ−Ｍｅ−ｄＣＴＰ）がある。例えば、Ｊｅｎｄｒｉｓａｋ、米国特許第６，１９０，８６５  Ｂ１号、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ（１９９２）２５１−６を参照。２つまたはそれより多くの異なる非カノニカルヌクレオチドは、本明細書で提供されたＤＮＡポリメラーゼにより鋳型核酸から合成されるポリヌクレオチドに組み込まれ得、それにより少なくとも２つの異なる非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが生成され得る。
【００６２】
場合によっては、非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、本明細書で提供された非カノニカルヌクレオチドの存在下で１鋳型核酸または複数の鋳型核酸からの逆転写により生成されることもあり、ここで鋳型核酸はＲＮＡであるものとする。場合によっては、非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、鋳型核酸からの逆転写により生成される第１鎖ｃＤＮＡを用いて本明細書で提供される要領で非カノニカルヌクレオチドの存在下での第２鎖合成反応により生成されることもあり、ここで鋳型核酸はＲＮＡであるものとする。場合によっては、逆転写に使用されるプライマーは、ランダムプライマーを含むこともあり、このランダムプライマーは、１つまたはそれより多くのＲＮＡ鋳型に対して指向したランダム配列を含む。場合によっては、逆転写に使用されるプライマーは、標的ＲＮＡまたはＲＮＡの群に対して特異的な配列を含むこともある。ＲＮＡの群は、実質的に全ての転写物を含み得る。標的とされたＲＮＡの群は、構造的ＲＮＡ、例えばリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を除く全ＲＮＡであり得る。場合によっては、第２鎖合成に使用されるプライマーは、ランダムプライマーを含み、このランダムプライマーは、第１鎖ｃＤＮＡ合成に使用された１つまたはそれより多くのＲＮＡ鋳型に対して指向したランダム配列を含むものとする。場合によっては、第２鎖合成に使用されるプライマーは、第１鎖ｃＤＮＡ合成に使用された標的ＲＮＡまたはＲＮＡの群に特異的な配列を含む。ＲＮＡの群は、実質的に全ての転写物を含み得る。標的とされたＲＮＡの群は、構造的ＲＮＡ、例えばリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を除く全ＲＮＡであり得る。場合によっては、第１鎖ｃＤＮＡまたは第２鎖ｃＤＮＡ、またはその両方の合成に使用される単数または複数のプライマーは、単数または複数のポリヌクレオチド鋳型上の特異的標的とハイブリダイズさせるにように設計され得る。
【００６３】
場合によっては、本明細書で提供される要領で非カノニカルヌクレオチドの存在下で非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、鋳型核酸からのプライマー伸長反応により生成されることもあり、この場合鋳型核酸はＤＮＡである。ＤＮＡはｄｓＤＮＡであり得る。ｄｓＤＮＡは、プライマー伸長反応前に当業界で既知の任意の方法により変性され得る。プライマーは、ランダム配列または特異的な標的配列または配列群に対して指向した配列を含み得る。場合によっては、非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、ｄｓＤＮＡにおける１鎖のホスホジエステルバックボーンにおけるニックまたは破断からの伸長により生成されることもある。単一鋳型核酸が簡便さのために使用されるが、このプライマー伸長反応は、１つまたはそれより多くの鋳型核酸またはその混合物で行われ得、それによりプライマー伸長反応から１つまたはそれより多くの生成物が生成され得ることが理解される。
【００６４】
場合によっては、非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、本明細書で提供される要領で非カノニカルヌクレオチドの存在下、１鋳型核酸または複数の鋳型核酸からの鎖置換型増幅反応により生成されることがあり、この場合鋳型核酸はＤＮＡである。ＤＮＡは、本明細書記載の方法のいずれかにより生成されるｄｓＤＮＡまたはゲノムＤＮＡであり得る。ｄｓＤＮＡは、ニッキング酵素またはエンドヌクレアーゼで処理され得る。ニッキング酵素は、ｄｓＤＮＡ鋳型（例、ゲノムＤＮＡ）における１鎖のホスホジエステルバックボーンに破断を生じさせ得、それにより遊離３’ヒドロキシル（ＯＨ）が生成され得る。この遊離３’ＯＨは、本明細書で提供される要領で鎖置換活性を含むＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長され得、このｄｓＤＮＡ鋳型の他方の鎖は鋳型として使用され得る。ニッキング酵素は、鎖特異的または非鎖特異的であり得る。本明細書で提供される方法で使用するためのニッキング酵素またはエンドヌクレアーゼには、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓにより提供されるものを含め、当業界で既知の任意のニッキング酵素が含まれ得る。ニッキングエンドヌクレアーゼの例としては、限定される訳ではないが、トップ鎖開裂性Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＳａｐＩまたはＮｔ．ＣｖｉＰＩＩ、またはボトム鎖開裂性Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、またはＮｂ．ＢｓｒＤＩが挙げられる。ニッキングエンドヌクレアーゼは、例えばＮｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、またはＮｂ．Ｍｖａ１２６９Ｉであり得る。
【００６５】
図４は、鎖置換型増幅を用いて、ゲノムＤＮＡ鋳型から非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを生成させる具体例としての方法を示す。２本鎖ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）をニッキング酵素で処理して、ｄｓＤＮＡ鋳型の１鎖にニック（例、１つまたはそれより多い）を生じさせる。ニッキング酵素で処理後ｄｓＤＮＡの１鎖におけるニックは、それにより１つまたはそれより多くの３’ヒドロキシル（ＯＨ）を生じさせ得る。場合により、ニッキング酵素は、センス選択的であり得、それにより鋳型ＤＮＡの鎖性が維持され得る。次いで、１鎖にニック（例、１つまたはそれより多い）を含むｄｓＤＮＡは、４つの全ｄＮＴＰ（例、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ）、および非カノニカルヌクレオチド（例、ｄＵＴＰ）を含む反応混合物の存在下で鎖置換活性を含むＤＮＡポリメラーゼにより処理され得、ここで、このＤＮＡポリメラーゼは、ニッキング酵素により生成される前述の１つまたはそれより多くの３’ＯＨを用いて、鋳型としてｄｓＤＮＡの他方の鎖または非ニック鎖を用いる伸長反応を行わせ、それによりウラシル塩基を含む１本鎖生成物またはポリヌクレオチド（例、１つまたはそれより多い、または複数）を生成させ得る。次いで、ウラシル塩基を含む１本鎖生成物またはポリヌクレオチドを、本明細書で提供される要領で熱またはポリアミン（ＤＭＥＤ）と組み合わせてＵＤＧで処理することにより３’末端にブロックを含む多数または複数の１本鎖ポリヌクレオチドが生成され得る。ウラシル塩基を含む１本鎖生成物へのｄＵＴＰの組込み頻度は、３’末端ブロックを含む多数のフラグメントが開裂作用因子（例、ＵＤＧおよび熱またはＤＭＥＤ）での処理後に生成されるように、本明細書で提供される要領で制御され得る。
【００６６】
非カノニカルヌクレオチドの制限された、および／または制御された組込みのための条件は、当業界では既知である。例えば、Ｊｅｎｄｒｉｓａｋ、米国特許第６，１９０，８６５  Ｂ１号、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ（１９９２）２５１−６、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９３）２１１：１６４−９を参照、また、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、第２版、Ａｕｓｅｂｅｌ（１９８７、および最新版）“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”も参照。得られる非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドにおける非カノニカルヌクレオチドの頻度（または間隔）や、したがって本明細書で提供される方法（すなわち、非カノニカルヌクレオチドの塩基部分の開裂、および非カノニカルヌクレオチドでのホスホジエステルバックボーンの開裂後）を用いて生成されたフラグメントの平均サイズは、鋳型における非カノニカルヌクレオチド（複数も可）に対応するヌクレオチド（複数も可）の頻度（または配列のヌクレオチド含有量の他の尺度、例えば平均Ｇ−Ｃ含有量など）、反応混合物中に存在する非カノニカルヌクレオチドに対するカノニカルヌクレオチドの比率、ポリメラーゼが非カノニカルヌクレオチドを組み込む能力、非カノニカルヌクレオチド対カノニカルヌクレオチドの相対的組込み効率などを含む、当業界で既知の変数により制御され得る。また、平均フラグメント化サイズも、本明細書で提供されるように、フラグメント化中に使用される反応条件と関連し得る。反応条件は、例えば、本明細書で提供される方法を用いて生じた平均フラグメントサイズを評価することにより経験的に決定され得る。
【００６７】
本明細書で提供される非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを生成させるための方法を用いることにより、得られた非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドにおいて、正確に５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６５、７５、８５、１００、１２３、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、または６５０ヌクレオチド離して、前記列挙の数値のヌクレオチドより多く離して、前記列挙の数値のヌクレオチドより少なく離して、少なくとも前記列挙の数値のヌクレオチド離して、多くとも前記列挙の数値のヌクレオチド離して、または約前記列挙の数値のヌクレオチドごとに、非カノニカルヌクレオチドを組み込むことができる。非カノニカルヌクレオチドは、約２００ヌクレオチドごと、約１００ヌクレオチドごと、または約５０ヌクレオチドごとに組み込まれ得る。非カノニカルヌクレオチドは、約５０〜約２００ヌクレオチドごとに組み込まれ得る。場合によっては、ｄＵＴＰとｄＴＴＰとの１：５の比率が反応混合物中で使用されることもある。他の具体例としての比率は、正確に１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０または１：５０、約前記列挙の比、前記列挙の比より大、前記列挙の比より小、少なくとも前記列挙の比、または多くとも前記列挙の比のｄＵＴＰ対ｄＴＴＰ比であり得る。
【００６８】
鋳型核酸（これとともに非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが合成される）は、いかなる供給源からのいかなる鋳型核酸でもよい。鋳型核酸としては、精製形態または非精製形態の任意の供給源からの２本鎖、部分的２本鎖、および１本鎖核酸があり、ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ）またはＲＮＡ、例えばｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡおよびＲＮＡ、クロロプラストＤＮＡおよびＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはこれらの混合物、遺伝子、染色体、プラスミド、微生物、例えば細菌、酵母、ウイルス、ウイロイド、カビ、真菌、植物、動物、ヒトなどの生物材料のゲノム、およびそのフラグメントであり得る。核酸の入手および精製は当業界での標準的技術を使用する。ＲＮＡは、当業界での標準的技術を用いて入手および精製され得る。ＤＮＡ鋳型（ゲノムＤＮＡ鋳型を含む）は、ＲＮＡ形態で転写され得、これは、Ｋｕｒｎ、米国特許第６，２５１，６３９  Ｂ１号に開示された方法および当業界で既知の他の技術（発現系など）を用いて達成され得る。一般にゲノムＤＮＡのＲＮＡコピーは、イントロン、調節および制御エレメントなど、一般的にｍＲＮＡからは見い出されない非転写配列を含む。ＲＮＡ鋳型のＤＮＡコピーは、Ｋｕｒｎ、米国特許第６，９４６，２５１号に記載された方法または当業界で既知の他の技術を用いて合成され得る。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドからの非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成は、ハイブリッドを変性させてｓｓＤＮＡおよび／またはＲＮＡを得ること、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡを開裂することができる作用因子での開裂、および当業界で既知の他の方法により達成され得る。場合によっては、鋳型ＲＮＡを、合成された非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのフラグメント化と同時に開裂することもある。鋳型は、生物試料などの複合混合物の小さな画分に過ぎないものでよく、当業界で周知の手順により様々な生物材料から入手され得る。鋳型は既知または未知のものであり得、興味の対象である１つより多い所望の特異的核酸配列を含み得、これらはそれぞれ互いに同じまたは異なるものであり得る。したがって、本明細書で提供される方法は、非カノニカルヌクレオチドを含む１つの特異的ポリヌクレオチドを製造するためだけでなく、同時に非カノニカルヌクレオチドを含む複数の異なる特異的ポリヌクレオチドを製造するためにも有用であり得る。鋳型ＤＮＡは、核酸の部分集団、例えばサブトラクティブ・ハイブリダイゼーションプローブ、全ゲノムＤＮＡ、制限フラグメント、ｃＤＮＡライブラリ、全ｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡ、クローン化ライブラリ、または本明細書記載の鋳型のいずれかの増幅生成物であり得る。場合によっては、鋳型核酸配列の一部分の相補体の合成の最初の工程は、鋳型変性である。変性工程は、熱変性または当業界で既知の任意の他の方法、例えばアルカリ処理であり得る。他の場合には、鋳型核酸配列の一部分の相補体の合成の最初の工程は、ニッキング工程である。２本鎖鋳型のニッキングは、酵素反応により、または物理的もしくは化学的手段により実施され得る。
【００６９】
非カノニカルヌクレオチド（例、ｄＵＴＰ）を含むポリヌクレオチドまたは第１鎖ｃＤＮＡは、単一核酸として記載される。このポリヌクレオチドは、単一ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの集団（数個のポリヌクレオチドから多数〜非常に多数のポリヌクレオチド）であり得ることが理解される。さらに、非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、多数または複数（少数から非常に多数まで）の異なるポリヌクレオチド分子であり得ることが理解される。かかる集団は、配列（例、遺伝子ファミリーまたはスーパーファミリーの構成員）または配列の非常な多様性（例、全ｍＲＮＡから生成、全ゲノムＤＮＡから生成など）の点で関連し得る。ポリヌクレオチドはまた、単一配列（既知遺伝子の一部または全部、例えばコーディング領域、ゲノム部分などであり得る）に対応し得る。特異的ポリヌクレオチド配列および多数または複数のポリヌクレオチド配列を生成するための方法、試薬および反応条件は、当業界では既知である。
【００７０】
非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの好適な合成方法は、（本明細書で概括的に記載したとおり、非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが核酸鋳型に沿って合成されるという意味で）鋳型依存的であり得る。非カノニカルヌクレオチドが、鋳型非依存的方法の結果としてポリヌクレオチド中に組み込まれ得ることが理解される。例えば、１つまたはそれより多くのプライマー（複数も可）は、１つまたはそれより多くの非カノニカルヌクレオチドを含むように設計され得る。例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓ、米国特許第６，０３７，１５２、５，４２７，９２９および５，８７６，９７６号を参照。プライマーに非カノニカルヌクレオチドを含めることは、単一プライマー等温増幅などの方法にとって特に好適であり得る。Ｋｕｒｎ、米国特許第６，２５１，６３９  Ｂ１号、Ｋｕｒｎ、ＷＯ０２／００９３８、Ｋｕｒｎ、米国特許公開第２００３／００８７２５１  Ａ１号を参照。非カノニカルヌクレオチド（複数も可）はまた、非カノニカルヌクレオチドを含む第２ポリヌクレオチドのテーリングまたはライゲーションなどの鋳型非依存的方法によりポリヌクレオチドに付加され得る。テーリングおよびライゲーションの方法は、当業界では周知である。
【００７１】
Ｖ．第１鎖ｃＤＮＡからの定方向性ライブラリの生成
非カノニカルヌクレオチドの塩基部分を開裂することにより脱塩基部位を作製
場合によっては、非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを、非カノニカルヌクレオチドの塩基部分を全般的に、特異的にまたは選択的に開裂することができる酵素などの作用因子で処理して、脱塩基部位を作製することもある。本明細書で使用される「脱塩基部位」は、例えば、非カノニカルヌクレオチドの塩基部分の開裂を行うことができる作用因子（例、酵素、酸性条件、または化学試薬）での（ポリヌクレオチド鎖に存在する）非カノニカルヌクレオチドの処理により、ヌクレオチドの塩基部分を開裂することができる作用因子で塩基部分（塩基全体を含む）を除去した後に残る化学的構造全てを包含する。一部の実施形態では、この作用因子（酵素など）は、非カノニカルヌクレオチドの塩基部分と非カノニカルヌクレオチドにおける糖との間の結合の加水分解を触媒することにより、ヘミアセタール環を含み、塩基を欠く脱塩基部位（互換的に「ＡＰ」部位と呼ばれる）を生成させるが、他の開裂生成物も本明細書で提供される方法での使用について考えられる。非カノニカルヌクレオチドの塩基部分の開裂に好適な作用因子および反応条件は、当業界では既知であり、Ｎ−グリコシラーゼ（「ＤＮＡグリコシラーゼ」または「グリコシダーゼ」とも呼ばれる）、例えばウラシルＮ−グリコシラーゼ（「ＵＮＧ」、ｄＵＴＰを特異的に開裂する）（「ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ」と互換的に呼ばれる）、ヒポキサンチン−Ｎ−グリコシラーゼ、およびヒドロキシ−メチルシトシン−Ｎ−グリコシラーゼ、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ、３−または７−メチルグアニンＤＮＡグリコシラーゼ、ヒドロキシメチルウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶが挙げられる。例えば、Ｌｉｎｄａｈｌ、ＰＮＡＳ（１９７４）７１（９）：３６４９−３６５３、Ｊｅｎｄｒｉｓａｋ、米国特許第６，１９０，８６５  Ｂ１号を参照。場合によっては、ＵＮＧを用いて、本明細書で提供される方法により生成されたポリヌクレオチドにおけるｄＵＴＰ組込みの塩基部分を開裂することもある。
【００７２】
本明細書で提供される方法により生成される非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに存在する非カノニカルヌクレオチドの塩基部分の開裂は、非カノニカルヌクレオチドの塩基部分を全般的、特異的または選択的に開裂することができる作用因子（酵素など）が、特定の非カノニカルヌクレオチドの塩基部分を開裂するという意味で、全般的、特異的または選択的開裂であり得、この開裂された塩基部分の約９８％、約９５％、約９０％、約８５％、または約８０％を超える塩基部分は、非カノニカルヌクレオチドの塩基部分であるものとする。しかしながら、開裂の程度はさらに小さいこともあり得る。したがって、特異的開裂への言及は例示的である。全般的、特異的または選択的開裂は、３’末端にブロックを含むポリヌクレオチドフラグメント（すなわち、脱塩基部位でのバックボーンの開裂により生成されるフラグメント）を生成するための本明細書で提供される方法におけるフラグメントサイズの制御に望ましいものであり得る。反応条件は、脱塩基部位（複数も可）が作製される反応が完了するまで続き得るように選択され得る。
【００７３】
本明細書で提供される方法により生成された非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、非カノニカルヌクレオチドを伴うポリヌクレオチドの合成後に精製され得る（例えば、反応混合物中に存在し得る残留遊離非カノニカルヌクレオチドを排除するため）。場合によっては、非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成と後続工程（非カノニカルヌクレオチドの塩基部分の開裂および脱塩基部位でのホスホジエステルバックボーンの開裂など）との間の中間精製が無いこともある。
【００７４】
本明細書で示すように、便宜上、非カノニカルヌクレオチドの塩基部分の開裂（これにより脱塩基部位が生成される）は別々の工程として記載されてきた。この工程が非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成（本明細書で提供される要領で）、および脱塩基部位でのバックボーンの開裂（フラグメント化）と同時に行われ得ることが理解される。さらに、非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成および非カノニカルヌクレオチドの開裂による脱塩基部位の生成の工程が同時に行われ得、脱塩基部位でのバックボーンの開裂が後続の工程で実施され得ることが理解される。脱塩基部位でのバックボーンの開裂は、鋳型核酸の変性を含む工程と同時に実施され得るか、または２つの工程は、連続的に実施され得る。
【００７５】
特定の非カノニカルヌクレオチドが、非カノニカルヌクレオチドの塩基部分を開裂することができる特定の酵素により認識される程度まで、非カノニカルヌクレオチドの選択が、非カノニカルヌクレオチドの塩基部分の開裂に使用される酵素の選択を決定づけ得ることが理解される。少なくとも１つの非カノニカルヌクレオチドの選択については、使用されたＤＮＡポリメラーゼによる非カノニカルヌクレオチドを含む合成されたポリヌクレオチドへの組込み効率によりさらに決定づけられ得る。
【００７６】
脱塩基部位またはその付近でのバックボーンの開裂によるポリヌクレオチドフラグメントの生成
本明細書で提供される方法により生成された脱塩基部位を含むポリヌクレオチドのバックボーンは、ブロックされた３’末端をもつポリヌクレオチドフラグメントを生成する作用因子により脱塩基部位またはその付近で開裂され得る。ヌクレオチドの塩基部分の開裂により脱塩基部位が作製され、ポリヌクレオチドバックボーンの開裂が同時に実施され得ることが理解される。しかしながら、便宜上、これらの反応は別々の工程として記載される。
【００７７】
ヌクレオチド、例えば本明細書で生成されたポリヌクレオチドに存在する非カノニカルヌクレオチドの塩基部分の開裂による脱塩基部位の生成後、ポリヌクレオチドのバックボーンは、脱塩基部位でバックボーンの開裂を行うことによりブロックされた３’末端を含むポリヌクレオチドフラグメントを生成することができる作用因子により、脱塩基部位またはその付近、例えば非カノニカルヌクレオチドの組込み部位（非カノニカルヌクレオチドの塩基部分の開裂後、脱塩基部位とも呼ばれる）で開裂され得る。ポリヌクレオチドバックボーンの開裂（「フラグメント化」とも呼ばれる）の結果、少なくとも２つのフラグメント（脱塩基部位を含むポリヌクレオチドに存在する脱塩基部位の数、および開裂の程度に左右される）が生じ得、そのうちの１つはブロックされた３’末端を含まない。
【００７８】
脱塩基部位でのバックボーンの開裂により、ブロックされた３’末端を含むポリヌクレオチドフラグメントを生成することができる好適な作用因子（例えば、酵素、化学物質および／または熱などの反応条件）は、当業界では周知であり、加熱処理および／または化学的処理（塩基性条件、酸性条件、アルキル化条件、または脱塩基部位のアミンによる開裂を含む）がある。例えば、ＭｃＨｕｇｈおよびＫｎｏｗｌａｎｄ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９５）２３（１０）：１６６４−１６７０、Ｂｉｏｏｒｇａｎ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ（１９９１）７：２３５１、Ｓｕｇｉｙａｍａ、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．（１９９４）７：６７３−８３、Ｈｏｒｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，（１９８８）１６：１１５５９−７１）を参照。本明細書で使用される「作用因子」または「開裂作用因子」は、熱などの反応条件を包含する。場合によっては、開裂はポリアミン、例えばＮ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン（ＤＭＥＤ）で行われる。例えば、ＭｃＨｕｇｈおよびＫｎｏｗｌａｎｄ、前出を参照。場合によっては、開裂は、酵素の組み合わせで行われる。本明細書で提供される方法で使用するための酵素の組み合わせの一例は、ＵＳＥＲ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓからのＵＮＧとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩとの組み合わせ）である。
【００７９】
開裂は、脱塩基残基に対し３’に隣接したヌクレオチドと脱塩基残基との間で行われ得る。当業界で周知のとおり、脱塩基部位が得られるフラグメントの３’末端に位置するように、開裂は、脱塩基部位に対して３’であり得る（例、脱塩基残基のデオキシリボース環および３’リン酸基と隣接ヌクレオチドのデオキシリボース環との間の開裂により、隣接ヌクレオチドのデオキシリボース環に遊離５’リン酸基が生じる）。塩基性条件下またはアミン（Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンなど）による処理の結果、脱塩基部位に対し３’に隣接したホスホジエステルバックボーンの開裂が起こり、ブロックされた３’末端をもつポリヌクレオチドフラグメントが生成し得る。さらに、開裂のより複雑な形態、例えばホスホジエステルバックボーンの開裂および脱塩基ヌクレオチド（の一部分）の開裂が起こるような開裂も可能である。例えば、ある一定の条件下、化学的処理および／または熱処理を用いる開裂は、脱塩基部位デオキシリボース環とその３’リン酸間の結合の開裂をもたらすβ排除工程を含み得、標識され得るか、またはさらなる開裂および閉環反応が行われ得る反応性α，β−不飽和アルデヒドが生じる。例えば、Ｓｕｇｉｙａｍａ、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．（１９９４）７：６７３−８３、Ｈｏｒｎ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９８８）１６：１１５５９−７１を参照。多数の異なるタイプのブロックされた３’末端を含む開裂生成物をもたらす２つまたはそれより多くの異なる方法を含む、１つより多い開裂方法が使用され得ることが理解される。
【００８０】
脱塩基部位でのバックボーンの開裂は、全般的、特異的または選択的開裂であり得、その約９８％、約９５％、約９０％、約８５％、または約８０％を超える開裂が脱塩基部位で行われる。しかしながら、開裂の程度はそれより少ないこともあり得る。したがって、特異的開裂への言及は例示である。全般的、特異的または選択的開裂は、本明細書で提供される定方向性ポリヌクレオチドライブラリの生成のためのブロックされた３’末端を含むポリヌクレオチドフラグメントを生成する方法におけるフラグメントサイズの制御に望ましいものであり得る。開裂反応が、かなり過剰の試薬の存在下で行われ、ポリヌクレオチドの過剰な開裂についての懸念が最小限である状態で（すなわち、上記の合成工程中、組み込まれた非カノニカルヌクレオチドの間隔により判定され得る、所望のフラグメントサイズを維持しながら）完了まで続行され得るように、反応条件は選択され得る。一端に一脱塩基部位およびポリヌクレオチドフラグメント内またはその内部（すなわち、末端ではない）に脱塩基部位（複数も可）を含むポリヌクレオチドフラグメントが生成され得るように、開裂の程度はさらに低いものであり得る。
【００８１】
本明細書で示したとおり、非カノニカルヌクレオチドの存在下で合成されたポリヌクレオチドにおける非カノニカルヌクレオチドの塩基部分の開裂により脱塩基部位が生成される実施形態では、非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドにおける非カノニカルヌクレオチド間の間隔、ならびに選択された反応条件により、得られるフラグメント（脱塩基部位が生成される、非カノニカルヌクレオチドの塩基部分の開裂、および本明細書記載の脱塩基部位でのバックボーンの開裂後）のおおよそのサイズが決定されるため、ポリヌクレオチドへの非カノニカルヌクレオチドの組込みの頻度は、本明細書で提供される方法を用いて製造されたフラグメントのサイズに関連している。高い効率および忠実度でフラグメント標的全体に沿ったポリメラーゼ活性を可能にするため、フラグメントが第２鎖合成のための鋳型としての役割を果たすときに脱塩基部位を欠くフラグメントを生成するために、脱塩基部位（複数も可）でバックボーンの完全な開裂を実施することが一般的に望ましい。
【００８２】
定方向性ポリヌクレオチドライブラリを生成するための本明細書で提供される方法について、好適なフラグメントサイズは、正確に５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６５、７５、８５、１００、１２３、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０のヌクレオチド長、前記列挙の数値より多いヌクレオチド長、前記列挙の数値より少ないヌクレオチド長、少なくとも前記列挙の数値のヌクレオチド長、多くとも前記列挙の数値のヌクレオチド長、または約前記列挙の数値のヌクレオチド長であり得る。場合によっては、フラグメントは約２００ヌクレオチド長、約１００ヌクレオチド長、または約５０ヌクレオチド長であり得る。他の場合には、フラグメントの集団のサイズは約５０〜２００ヌクレオチドであり得る。特にフラグメントの集団が生成されるとき、非カノニカルヌクレオチドの組込み（開裂後のフラグメントサイズに関連する）は鋳型ごとに、また同じ鋳型のコピー間でも異なり得るため、フラグメントサイズが概数であることが理解される。したがって、同じ出発材料（単一ポリヌクレオチド鋳型など）から生成されたフラグメントは、依然として同じおおよそのサイズまたはサイズ範囲を有しながらも、異なる（および／または重複）配列を有し得る。
【００８３】
脱塩基部位でのポリヌクレオチドバックボーンの開裂後、脱塩基部位を欠き得る、３’最上位（３’−ｍｏｓｔ）フラグメント以外のどのフラグメントも１つの脱塩基部位を含み得る（開裂が完全に有効である場合）。他のフラグメントは全て３’脱塩基部位（ブロックされた３’末端）を含み得る。場合によっては、本明細書で提供される方法により生成される脱塩基部位の１本鎖ｃＤＮＡまたはポリヌクレオチドのバックボーンのフラグメント化により、ブロックされた３’末端、および５’末端のリン酸を含むフラグメントが生成され得る。
【００８４】
ポリヌクレオチドフラグメントに付加されたアダプターのポリメラーゼ伸長
場合によっては、本明細書で提供される方法により調製される、ブロックされた３’末端および場合により５’リン酸を含むポリヌクレオチドの３’末端にオリゴヌクレオチドを付加することもある。このオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端に存在する１本鎖ＤＮＡを、ブロックされた３’末端を含むポリヌクレオチドの３’末端にアニーリングすることにより付加され得る。場合によっては、本明細書で提供される方法により調製される、ブロックされた３’末端および場合により５’リン酸を伴うポリヌクレオチドを、３’ヒドロキシル（ＯＨ）基をもつオーバーハングを含むオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションし、鋳型依存的ポリメラーゼでオリゴヌクレオチドの３’ＯＨ基から伸長させることもあり、この３’ＯＨをもつオーバーハングはポリヌクレオチドフラグメントの３’末端にアニーリングするものとする。オリゴヌクレオチドは、アダプターまたはプライマーであり得る。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその組み合わせを含み得る。オリゴヌクレオチドは、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００または２００のヌクレオチド長、約前記列挙の数値より少ないヌクレオチド長、または約前記列挙の数値より多いヌクレオチド長であり得る。オリゴヌクレオチドは、部分的デュプレックスを含むか、または１本鎖であり得る。場合によっては、オリゴヌクレオチドは、部分的デュプレックスアダプターを含むこともあり、この部分的デュプレックスは、長鎖および短鎖を含むものとする。場合によっては、部分的デュプレックスアダプターを含むオリゴヌクレオチドは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のヌクレオチド、前記列挙の数値より多いヌクレオチド、前記列挙の数値より少ないヌクレオチドまたは少なくとも前記列挙の数値のヌクレオチドのオーバーハングを有することもある。オーバーハングは、３’オーバーハングであり得る。場合によっては、オーバーハングは３’オーバーハングであり、このオーバーハングは少なくとも６、７、８または９個のヌクレオチドを含むものとする。場合によっては、オリゴヌクレオチドの３’オーバーハングが、本明細書記載の方法により生成されるブロックされた３’末端を含むポリヌクレオチドの３’末端に存在する配列とハイブリダイズさせることもある。場合によっては、オリゴヌクレオチドはデュプレックス状配列を含むこともある。場合によっては、オリゴヌクレオチドは、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、２００またはそれより多いか、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、２００またはそれより多いかよりも多いか、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、２００またはそれより多いかよりも少ないか、または少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、２００またはそれより多くの塩基対合またはデュプレックス状配列を含むこともある。場合によっては、部分的デュプレックスおよび３’オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドに存在する部分的デュプレックスが、本明細書で提供される方法により生成される３’末端ブロックを含むポリヌクレオチドに存在する内部配列とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを妨げる役割を果たすこともある。本明細書記載の部分的デュプレックスおよび３’オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドのデュプレックス部分は、３’末端にブロックを含むポリヌクレオチドに存在する内部配列とのハイブリダイゼーションではなく、３’末端にブロックを含むポリヌクレオチドの３’末端とのオリゴヌクレオチドの３’オーバーハングの優先的ハイブリダイゼーションを可能にし得る。優先的ハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドのデュプレックス部分により誘発される立体障害およびスタッキング効果に起因し得る。場合によっては、オリゴヌクレオチドは１本鎖である。場合によっては、１本鎖アダプターは、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、または２００ヌクレオチド長、前記列挙の数値より多いヌクレオチド長、前記列挙の数値より少ないヌクレオチド長、または少なくとも前記列挙の数値のヌクレオチド長を含むこともある。場合によっては、オリゴヌクレオチドは、本明細書で提供される方法により生成されるブロックされた３’末端を含むポリヌクレオチドの３’末端にある配列とハイブリダイゼーション可能な３’部分、およびハイブリダイゼーション不可能な５’部分を含む１本鎖テイルドプライマーである。さらに、ハイブリダイゼーション不可能な部分は、識別子配列（例、バーコード、ＴｒｕＳｅｑ配列など）を含み得る。場合によっては、１本鎖オリゴヌクレオチドは、３’オーバーハングを含むステムループまたはヘアピン構造を形成することがあり、この３’オーバーハングは、本明細書記載の方法により生成されるブロックされた３’末端を含むポリヌクレオチドの３’末端に存在する配列とハイブリダイズさせる。場合によっては、ヘアピンのステムが、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００またはそれより多くのヌクレオチド長、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００またはそれより多いよりも少ないヌクレオチド長、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００またはそれより多いよりも多いヌクレオチド長であることもある。場合によっては、ヘアピンのループ配列は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれより多くのヌクレオチド長、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれより多いよりも少ないヌクレオチド長、または約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれより多いよりも多いヌクレオチド長であることもある。場合によっては、ステムループ構造を含むオリゴヌクレオチドが、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド、前記列挙の数値より多いヌクレオチド、前記列挙の数値より少ないヌクレオチド、または少なくとも前記列挙の数値のヌクレオチドの３’オーバーハングを有することもある。場合によっては、オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれより多くのバーコードを含むこともある。場合によっては、１つまたはそれより多くのバーコードは、オリゴヌクレオチドのステムおよび／またはループにある。ステムループを含むオリゴヌクレオチドは、さらにループ内に制限エンドヌクレアーゼ部位を含み得る。ステムループを含むオリゴヌクレオチドは、さらにステム内に制限エンドヌクレアーゼ部位を含み得る。３’末端にブロックを含むポリヌクレオチドの３’末端に存在する配列に対して指向した３’オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドは、さらに３’オーバーハングの３’末端以外の任意および／または全ての他の末端にブロックを含み得る。さらにオリゴヌクレオチドは、既知または普遍的配列（例、配列Ａ）を含み得、そのため普遍的または既知配列のための配列特異的プライマーの生成および／または使用が可能となり得る。この工程のためのアダプターまたはプライマーのいくつかの例を図２に示す。ｄｓＤＮＡ部分を形成する２本の鎖は、ループによりさらに連結され得る２つのオリゴヌクレオチドであり得る。ループまたはリンカーは、オリゴヌクレオチド、非ヌクレオチドリンカーまたはその組み合わせを含み得る。ループまたはリンカーはまた、ヌクレオチド類似体を含み得る。場合によっては、オリゴヌクレオチドは、平滑末端を含む第１末端および３’オーバーハングを含む第２末端を含む部分的デュプレックスを含むこともあり、この部分的デュプレックスは長鎖と短鎖との間に形成され、長鎖は、短鎖とデュプレックスを形成する既知または普遍的配列（例、配列Ａ）および３’オーバーハングを含むものとする。短鎖は、３’および／または５’末端にブロックを有し得る。長鎖は５’末端にブロックを有し得る。３’または５’ブロックは、本明細書で提供される任意のブロックまたはブロッキング基を含み得る。３’オーバーハングは、本明細書で提供される方法により生成された非カノニカルヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの３’ブロック末端に存在する配列と相補的な配列を含み得る。１本鎖３’オーバーハングは、ランダム配列を含み得る。場合によっては、ランダム配列を含む３’オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドのプールまたは複数のオリゴヌクレオチドは、本明細書で提供される方法のいずれかにより生成されるブロックされた３’末端を含む複数のポリヌクレオチドの３’末端にアニーリングされることもある。場合によっては、オリゴヌクレオチドのプールまたは複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれのランダム配列が、異なるランダム配列を含むこともある。場合によっては、オリゴヌクレオチドのプールまたは複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれのランダム配列が、同じランダム配列を含むこともある。場合によっては、オリゴヌクレオチドのプールまたは複数のオリゴヌクレオチドが、同じ普遍的または既知配列（例、配列Ａ）を含むこともある。場合によっては、オリゴヌクレオチドのプールまたは複数のオリゴヌクレオチドが、異なる普遍的または既知配列を含むこともある。場合によっては、オリゴヌクレオチド（例、第１アダプター）の１本鎖３’オーバーハングが、本明細書で提供される方法により生成されるブロックされた３’末端を含む実質的に全てのポリヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズさせることもある。場合によっては、オリゴヌクレオチド（例、第１アダプター）のプールまたは複数のオリゴヌクレオチド（例、第１アダプター）により提供される１本鎖３’オーバーハングのプールまたは複数の１本鎖３’オーバーハング（ここで、オリゴヌクレオチド（例、第１アダプター）のプールまたは複数のオリゴヌクレオチド（例、第１アダプター）の各オリゴヌクレオチド（例、第１アダプター）は、異なるランダム配列を含む３’オーバーハングを含むものとする）が、本明細書で提供される方法のいずれかにより生成される３’ブロック化末端を含む実質的に全てのポリヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズさせることもある。オリゴヌクレオチド（例、第１アダプター）の１本鎖３’オーバーハングは、本明細書で提供される方法により生成される３’ブロック化末端を含むポリヌクレオチドの１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９
％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または１００％を超える％、前記列挙の％より少ない％、少なくとも前記列挙の％、多くとも前記列挙の％、または約前記列挙の％とハイブリダイズさせることができる。場合によっては、１本鎖３’オーバーハングは、本明細書で提供される方法により生成される３’ブロック化末端を含むポリヌクレオチドの１〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、９５〜９９％または９０〜１００％の３’末端にハイブリダイズさせることもある。場合によっては、１本鎖３’オーバーハングは、本明細書で提供される方法により生成される３’ブロック化末端を含むポリヌクレオチドの約１〜約１０％、約１０〜約２０％、約２０〜約３０％、約３０〜約４０％、約４０〜約５０％、約５０〜約６０％、約６０〜約７０％、約７０〜約８０％、約８０〜約９０％、または約９０〜約１００％の３’末端にハイブリダイズさせることもある。オリゴヌクレオチド（例、第１アダプター）のプールまたは複数のオリゴヌクレオチド（例、第１アダプター）により提供される１本鎖３’オーバーハングのプールまたは複数の１本鎖３’オーバーハング（ここで、オリゴヌクレオチド（例、第１アダプター）のプールまたは複数のオリゴヌクレオチド（例、第１アダプター）の各オリゴヌクレオチド（例、第１アダプター）は、異なるランダム配列を含む３’オーバーハングを含むものとする）は、本明細書で提供される方法により生成される３’ブロック化末端を含むポリヌクレオチドの１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または１００％を超える％、前記列挙の％より少ない％、少なくとも前記列挙の％、多くとも前記列挙の％、または約前記列挙の％とハイブリダイゼーションし得る。場合によっては、オリゴヌクレオチド（例、第１アダプター）のプールまたは複数のオリゴヌクレオチド（例、第１アダプター）により提供される１本鎖３’オーバーハングのプールまたは複数の１本鎖３’オーバーハング（ここで、オリゴヌクレオチド（例、第１アダプター）のプールまたは複数のオリゴヌクレオチド（例、第１アダプター）の各オリゴヌクレオチド（例、第１アダプター）は、異なるランダム配列を含む３’オーバーハングを含むものとする）が、本明細書で提供される方法により生成される３’ブロック化末端を含むポリヌクレオチドの１〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、９５〜９９％または９０〜１００％の３’末端にハイブリダイズさせることもある。場合によっては、オリゴヌクレオチド（例、第１アダプター）のプールまたは複数のオリゴヌクレオチド（例、第１アダプター）により提供される１本鎖３’オーバーハングのプールまたは複数の１本鎖３’オーバーハング（ここで、オリゴヌクレオチド（例、第１アダプター）のプールまたは複数のオリゴヌクレオチド（例、第１アダプター）の各オリゴヌクレオチド（例、第１アダプター）は、異なるランダム配列を含む３’オーバーハングを含むものとする）が、本明細書で提供される方法により生成される３’ブロック化末端を含むポリヌクレオチドの約１〜約１０％、約１０〜約２０％、約２０〜約３０％、約３０〜約４０％、約４０〜約５０％、約５０〜約６０％、約６０〜約７０％、約７０〜約８０％、約８０〜約９０％、または約９０〜約１００％の３’末端にハイブリダイズさせることもある。場合によっては、オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれより多くのバーコードを含むこともある。場合によっては、１つまたはそれより多くのバーコードは、ステムおよび／またはループにある。場合によっては、バーコードは、バーコードが付加された本明細書記載の方法により生成された個々のポリヌクレオチドにユニークなマーキングをするのに有用なランダム配列を含むこともある。場合によっては、バーコードは、ランダムに付加され、それが付加されたフラグメントについてユニークなものであることもある。これらのバーコードを、鋳型核酸の試料に特異的なバーコードと組み合わせることができる。
【００８５】
場合によっては、本方法は、さらに伸長反応の実施を含み得る。伸長反応は、当業界で既知のいずれかの数の方法を用いて実施され得るもので、限定される訳ではないが、鎖置換活性をもつＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼおよび４つの全ｄＮＴＰ（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ）（ここで、ｄＮＴＰは非修飾である）の使用が含まれる。場合によっては、伸長反応は、ＤＮＡポリメラーゼおよび非修飾ｄＮＴＰ（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ）により実施されることもある。場合によっては、伸長反応は、ブロックされた３’末端を含むポリヌクレオチドの３’ブロック化末端に見い出される相補的配列にアニーリングされた３’オーバーハングを伸長させることもあり、それにより非相補的末端を含む２本鎖ポリヌクレオチドが生成され、ここで、この３’ブロックを含むポリヌクレオチドは鋳型ポリヌクレオチドとしての役割を果たすものとする。非相補的末端を含む２本鎖ポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチドの一方の端にあるオリゴヌクレオチドからの既知または普遍的配列（例、配列Ａ）および反対端にある伸長反応のための鋳型としての役割を果たしたブロックされた３’末端を含むポリヌクレオチドの５’末端に相補的な配列を含み得る。伸長反応により生成された２本鎖ポリヌクレオチドは、鋳型ポリヌクレオチドのフラグメントを含む第１鎖、および鋳型ポリヌクレオチドのフラグメントに相補的な配列および既知または普遍的配列（例、配列Ａ）を含む第２鎖を含み得、ここで既知配列は、第２鎖の５’末端に存在し、第１鎖の３’末端は、既知または普遍的配列（例、配列Ａ）に相補的な配列と鋳型ポリヌクレオチドからの３’ブロックとの間のホスホジエステルバックボーンにギャップを含むものとする。既知または普遍的配列（例、配列Ａ）は、既知または普遍的配列（例、配列Ａ）を含む鎖をマーキングする役割を果たし得る。非カノニカルヌクレオチドが第１鎖ｃＤＮＡ合成中に組み込まれる場合、本明細書で提供される方法によるマーキングされた鎖の生成により、鋳型核酸の配列を表すマーキングされた鎖が製造される。非カノニカルヌクレオチドが第２鎖ｃＤＮＡ合成中に組み込まれる場合、本明細書で提供される方法によるマーキングされた鎖の生成により、鋳型核酸に相補的な配列を表すマーキングされた鎖が製造される。
【００８６】
場合によっては、非相補的末端を含む２本鎖ポリヌクレオチド（ここで、一方の末端は、１末端に既知または普遍的配列（例、配列Ａ）を含む）は、伸長反応後に末端修復されることもある。末端修復は、平滑末端、非平滑末端（すなわち、スティッキーまたは付着末端）、または単一塩基オーバーハングの生成、例えば３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼによる２本鎖核酸生成物の３’末端への単一ｄＡヌクレオチドの付加を含み得る。場合によっては、末端修復を、一方の端に既知または普遍的配列（例、配列Ａ）を含む２本鎖ポリヌクレオチドで行うことにより、既知配列を含む一方の端と反対端に平滑末端が生成されることもあり、この一方の端は、既知または普遍的配列（例、配列Ａ）を含み、反対端は、３’ＯＨを伴う平滑末端を含むものとする。末端修復は、当業界で既知のいずれかの数の酵素および／または方法を用いて実施され得る。オーバーハングは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド、前記列挙の数値より多いヌクレオチド、前記列挙の数値より少ないヌクレオチド、または少なくとも前記列挙の数値のヌクレオチドを含み得る。
【００８７】
本方法は、一方の端に配列Ａおよび反対端に３’ＯＨを含む２本鎖ポリヌクレオチドにアダプターを付加することをさらに含み得る。場合によっては、本明細書で提供される方法により生成された３’ブロックを含むポリヌクレオチドにアニーリングされたアダプターは第１アダプターであり、一方の端に第１アダプター配列を含む２本鎖ポリヌクレオチドの反対端に付加されたアダプターは、第２アダプターである。ライゲーションは、平滑末端ライゲーションまたはスティッキーもしくは付着末端ライゲーションであり得る。第２アダプターの付加は、ライゲーションによって行われ得る。ライゲーションは、ライゲーション実施のための当業界で既知の酵素のいずれか（例、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）により実施され得る。第２アダプターは、当業界で既知のいずれのタイプのアダプターでもよく、限定される訳ではないが、慣用的なデュプレックスまたは２本鎖アダプターが挙げられる。アダプターは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせを含み得る。第２アダプターは、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、または２００ヌクレオチド長、約前記列挙の数値より少ないヌクレオチド長、または約前記列挙の数値より多いヌクレオチド長であり得る。第２アダプターは、デュプレックスアダプター、部分的デュプレックスアダプター、または１本鎖アダプターであり得る。場合によっては、第２アダプターはデュプレックスアダプターである。場合によっては、このデュプレックスアダプターは、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、または２００ヌクレオチド長、約前記列挙の数値より少ないヌクレオチド長、または約前記列挙の数値より多いヌクレオチド長であり得る。場合によっては、第２アダプターは、部分的デュプレックスアダプターであり、この場合アダプターは、長鎖および短鎖を含むものとする。場合によっては、部分的デュプレックスアダプターを含む第２アダプターは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド、前記列挙の数値より多いヌクレオチド、前記列挙の数値より少ないヌクレオチド、または少なくとも前記列挙の数値のヌクレオチドのオーバーハングを有することもある。場合によっては、このオーバーハングは、５’オーバーハングである。場合によっては、このオーバーハングは、３’オーバーハングである。場合によっては、第２アダプターの部分的デュプレックスが、約５、６、７、８、９、１０、１２、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、２００またはそれより多くの塩基対合またはデュプレックス状配列、５、６、７、８、９、１０、１２、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、２００またはそれより多いよりも多い塩基対合また���デュプレックス状配列、５、６、７、８、９、１０、１２、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、２００またはそれより多いよりも少ない塩基対合またはデュプレックス状配列、または少なくとも５、６、７、８、９、１０、１２、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、２００またはそれより多くの塩基対合またはデュプレックス状配列を含むこともある。場合によっては、アダプターは、１本鎖アダプターを含むこともある。場合によっては、１本鎖アダプターは、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、または２００のヌクレオチド長、前記列挙の数値より多いヌクレオチド長、前記列挙の数値より少ないヌクレオチド長、または少なくとも前記列挙の数値のヌクレオチド長を含むことがある。場合によっては、１本鎖アダプターは、ステムループまたはヘアピン構造を形成することがある。場合によっては、ヘアピンアダプターのステムが、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００またはそれより多くのヌクレオチド長、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００またはそれより多いよりも少ないヌクレオチド長、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００またはそれより多いよりも多いヌクレオチド長であることもある。場合によっては、ヘアピンアダプターのループ配列が、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれより多くのヌクレオチド長、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれより多いよりも少ないヌクレオチド長、または約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれより多いよりも多いヌクレオチド長であることもある。第２アダプターは、さらに既知または普遍的配列（例、配列Ｂ）を含み得、したがって、普遍的または既知配列についての配列特異的プライマーが生成および／または使用され得る。ステムループを含む第２アダプターは、さらにループ内に制限エンドヌクレアーゼ部位を含み得る。ステムループを含む第２アダプターは、さらにステム内に制限エンドヌクレアーゼ部位を含み得る。本明細書で提供される方法では、本明細書で提供される第２アダプターの既知または普遍的配列は、本明細書で提供される第１アダプターの既知または普遍的配列とは同じかまたは異なり得る。第１アダプターが配列Ａを含み、第２アダプターが配列Ｂを含む場合もあり、その場合、配列Ｂは配列Ａと異なるかまたは非相補的である。場合によっては、第２アダプターが１つまたはそれより多くのバーコードを含むこともある。場合���よっては、１つまたはそれより多くのバーコードは、ステムおよび／またはループにある。
【００８８】
場合によっては、一方の端に既知または普遍的配列（例、配列Ａ）および反対端に３’ＯＨを含む２本鎖ポリヌクレオチドへの第２アダプターの付加は、平滑末端ライゲーションによることもある。場合によっては、第２アダプターの付加は、付着またはスティッキー末端ライゲーションによることもあり、この場合、第２アダプターにおけるオーバーハングは、このオーバーハングに対し相補的な配列を含む２本鎖ポリヌクレオチドにおけるオーバーハングとハイブリダイズさせる。場合によっては、第２アダプターは、一方の端に既知または普遍的配列（例、配列Ａ）および反対端に３’ＯＨを含む２本鎖ポリヌクレオチドの５’末端へのライゲーションが可能なライゲーション鎖または第１鎖および一方の端に既知または普遍的配列（例、配列Ａ）および反対端に３’ＯＨを含む２本鎖ポリヌクレオチドのいずれの末端にもライゲーションできない非ライゲーション鎖または第２鎖を含むこともある。場合によっては、第２アダプターは、一方の端に既知または普遍的配列（例、配列Ａ）および反対端に３’ＯＨを含む２本鎖ポリヌクレオチドの３’末端へのライゲーションが可能なライゲーション鎖または第１鎖および一方の端に既知または普遍的配列（例、配列Ａ）および反対端に３’ＯＨを含む２本鎖ポリヌクレオチドのいずれの末端にもライゲーションできない非ライゲーション鎖または第２鎖を含むこともある。第２アダプターは、部分的デュプレックスアダプターである場合もあり、この場合、アダプターは長鎖および短鎖を含み、長鎖はライゲーション鎖または第１鎖であり、短鎖は非ライゲーション鎖または第２鎖である。短鎖は、３’および／または５’末端にブロックを有し得る。長鎖は、３’または５’末端にブロックを有し得る。３’または５’ブロックは、本明細書で提供される任意のブロックまたはブロッキング基を含み得る。部分的デュプレックスは、等しくない長さの鎖を有する場合もある。場合によっては、部分的デュプレックスは、アダプターの一方の端にオーバーハングおよびアダプターの別の端に平滑末端を含むこともある。オーバーハングは、３’末端または５’末端にあり得る。場合によっては、部分的デュプレックスは、アダプターの各末端にオーバーハングを含むこともある。オーバーハングは、長さが等しい場合も等しくない場合もあり得る。ライゲーション鎖の５’末端は、５’リン酸基を含まない場合もある。場合によっては、ライゲーション鎖の５’末端は、５’リン酸を含むこともあり、この場合ポリヌクレオチドの３’末端は遊離３’ヒドロキシルを欠く。場合によっては、第２アダプターは、３’オーバーハングを含む長鎖および短鎖と部分的デュプレックスを形成する既知配列（例、配列Ｂ）を含むこともあり、この場合、短鎖は３’末端にブロックを含み、長鎖は一方の端に既知または普遍的配列（例、配列Ａ）および反対端に３’ＯＨを含む２本鎖ポリヌクレオチドの前述の反対端にある３’ＯＨにライゲーションされ、それにより両端に既知または普遍的配列を含む２本鎖ポリヌクレオチドが生成される。さらにこれらの場合に対し、両端に既知または普遍的配列を含む２本鎖ポリヌクレオチドは、５’末端に本明細書記載のようにブロックされた３’末端を含むポリヌクレオチドにアニーリングされ、伸長されたオリゴヌクレオチドに由来する既知または普遍的配列および第２アダプターのライゲーションに由来する既知または普遍的配列を含む１鎖を含む。場合によっては、この１鎖は、５’末端に配列Ａおよび３’末端に配列Ｂを含むこともある。場合によっては、第２アダプターは、５’オーバーハングを含む長鎖および短鎖と部分的デュプレックスを形成する既知配列（例、配列Ｂ）を含むこともあり、この場合、短鎖は５’末端にブロックを含み、長鎖は一方の端に既知または普遍的配列（例、配列Ａ）および反対端に３’ＯＨを含む２本鎖ポリヌクレオチドのこの反対端にある５’リン酸にライゲーションされ、それにより両端に既知または普遍的配列を含む２本鎖ポリヌクレオチドが生成される。さらにこれらの場合に対し、一方の端に既知または普遍的配列（例、配列Ａ）および反対端に３’ＯＨを含む２本鎖ポリヌクレオチドへの第２アダプターのライゲーションにより、一方の端に本明細書記載のようにブロックされた３’末端を含むポリヌクレオチドにアニーリングされ、伸長されたオリゴヌクレオチドに由来する既知または普遍的配列（例、配列Ａ）および反対端に第２アダプターに由来する既知または普遍的配列（例、配列Ｂ）を含む２本鎖ポリヌクレオチドが生成され、この本明細書記載のようにブロックされた３’末端を含むポリヌクレオチドにアニーリングされ、伸長されたオリゴヌクレオチドに由来する既知または普遍的配列（例、配列Ａ）は一方の端の５’末端にあり、第２アダプターに由来する既知または普遍的配列（例、配列Ｂ）は反対端の５’末端にあるものとする。場合によっては、この１鎖は、１鎖の５’末端に配列Ａおよび別の鎖の５’末端に配列Ｂを含むこともあり、配列Ａを含む鎖の３’末端は鋳型として配列Ｂを用いて伸長され、それにより一方の端の５’末端に配列Ａを、そして反対端の３’末端に配列Ｂと相補的な配列Ｂ’を含む１つまたはそれより多くの２本鎖ポリヌクレオチドが生成される。
【００８９】
場合によっては、本方法はさらに変性工程を含むこともあり、本明細書で提供される方法により生成された反対端に非相補的な既知または普遍的配列を含む２本鎖ポリヌクレオチドが変性される。変性は、限定される訳ではないが、加熱変性、および／または化学的変性が含まれ得る当業界で既知の方法のいずれかを用いて達成され得る。加熱変性は、本明細書で提供される方法により生成された反対端に非相補的な既知または普遍的配列を含むポリヌクレオチドの融解温度を超えるまで反応混合物の温度を上昇させることにより実施され得る。融解温度は、約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５℃、前記で列挙した温度より高温、前記で列挙した温度より低温、または少なくとも前記で列挙した温度であり得る。温度は、融解温度を約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０℃上まわる温度、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０℃より多く上まわる温度、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０℃より少なく上まわる温度、または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０℃上まわる温度に高められ得る。化学的変性は、塩基（すなわち、ＮａＯＨ）、および／または競合的変性剤（すなわち、尿素またはホルムアルデヒド）を用いて実施され得る。場合によっては、変性により、本明細書で提供される方法により生成された反対端に非相補的な既知または普遍的配列を含む１本鎖ポリヌクレオチドが生成されることもある。
【００９０】
変性後、本明細書で提供される方法により生成された反対端に非相補的な既知または普遍的配列を含む１本鎖ポリヌクレオチドを増幅することにより、定方向性ポリヌクレオチドライブラリが生成される。本明細書記載のように、一方の端または第１端の既知または普遍的配列は第１アダプターに由来し得、他方の端または第２端の既知または普遍的配列は第２アダプターに由来し得る。増幅は、反対端に存在する非相補的既知または普遍的配列に対して指向したプライマー対を用いて実施され得る。増幅は、当業界で既知の増幅方法を用いて実施され得、例としては、限定される訳ではないが、ＰＣＲまたは単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）が挙げられる。場合によっては、５’末端に配列Ａを、そして３’末端に配列Ｂを含む１本鎖ポリヌクレオチドは、プライマー対を用いて増幅されることもあり、このプライマー対の第１プライマーは配列Ｂの一部分に相補的な配列を含み、プライマー対の第２プライマーは配列Ａの相補体である配列Ａ’の一部分に相補的な配列を含む。場合によっては、１鎖の５’末端に配列Ａを、そして３’末端に配列Ｂ’を含む１本鎖ポリヌクレオチドは、プライマー対を用いて増幅されることもあり、このプライマー対の第１プライマーは配列Ｂ’の一部分に相補的な配列を含み、プライマー対の第２プライマーは配列Ａの相補体である配列Ａ’の一部分に相補的な配列を含む。場合によっては、第１および／または第２プライマーは、さらに１つまたはそれより多くの識別子配列を含み得る。場合によっては、識別子配列は、第１および／または第２プライマー上にハイブリダイゼーション不可能なテイルを含むこともある。識別子配列は、バーコード配列、フローセル配列、インデックス配列、またはそれらの組み合わせであり得る。インデックス配列は、Ｉｌｌｕｍｉｎａにより製造された次世代配列決定プラットフォームと適合し得るＴｒｕｓｅｑプライマー配列である場合もある。場合によっては、第１および／または第２プライマーは固体表面に結合し得る。固体表面は、平面状表面またはビーズであり得る。平面状表面は、チップ、マイクロアレイ、ウェルまたはフローセルの表面であり得る。場合によっては、第１および／または第２プライマーは、固体表面への増幅反応の１つまたはそれより多くの配列エレメント生成物（すなわち、増幅生成物）を含むこともあり、その１つまたはそれより多くの配列は、固体表面に結合された１つまたはそれより多くの捕捉プローブと相補的である。他の大規模並列処理次世代配列決定プラットフォームと適合し得る当業界で既知の他の配列エレメントは、テイル配列に組み込まれ得る。
【００９１】
配列決定は、本明細書記載の次世代配列決定（ＮＧＳ）法を全て含め、任意の配列決定方法であってよい。ＮＧＳ法は、合成による配列決定を含む場合もある。一部の実施形態では、配列決定は、ポリヌクレオチドに付加されたアダプターにより本明細書で提供される方法により生成されるポリヌクレオチドに導入された既知または普遍的配列に対して指向したプライマーで行われる。場合によっては、配列決定は、反対端に非相補的既知または普遍的配列を含む１本鎖ポリヌクレオチドを増幅するために使用された第１および／または第２プライマーによりポリヌクレオチドに導入された識別子配列に対して指向したプライマーで行われることもある。識別子配列は、バーコード配列、フローセル配列、および／またはインデックス配列であり得る。インデックス配列は、Ｉｌｌｕｍｉｎａにより製造された次世代配列決定プラットフォームと適合し得るＴｒｕｓｅｑプライマー配列である場合もある。
【００９２】
ＲＮＡ試料から定方向性ポリヌクレオチドライブラリを生成するために本明細書記載の方法を用いる具体例としての作業の流れを描く概略図を図３に示す。工程Ｉは、試料から全ＲＮＡを単離し、第１鎖プライマーを全ＲＮＡにアニーリングすることから出発する。第１鎖プライマーは、ランダム配列または特異的転写物または転写物の群に特異的な配列を含み得る。第１鎖プライマーは、ある種の転写物（例、ｒＲＮＡおよび／またはミトコンドリアＲＮＡ）を除く全ての転写物をプライミングするように設計され得る。工程ＩＩでは、工程Ｉからの第１鎖プライマーを用いて工程Ｉで単離された全ＲＮＡに対し第１鎖ｃＤＮＡ合成を行う。第１鎖ｃＤＮＡ合成反応は、全４ｄＮＴＰおよび非カノニカルｄＮＴＰであるｄＵＴＰを含む反応混合物の存在下で行われる。工程ＩＩＩは、ＵＤＧを用いてｄＵを含む第１鎖ｃＤＮＡを開裂することにより脱塩基部位を生成すること、およびＵＤＧにより生成された脱塩基部位でホスホジエステルバックボーンを開裂することができる開裂作用因子を必然的に伴う。開裂作用因子はＤＭＥＤまたは熱であり得る。工程ＩＩＩは、３’末端にブロックおよび任意選択で５’リン酸を含むポリヌクレオチドを生じさせる。工程ＩＩが所望の密度でウラシル塩基を含む第１鎖ｃＤＮＡを製造するように、工程ＩＩ中におけるｄＵＴＰの組込みは、反応混合物内におけるｄＵＴＰの量または他のｄＮＴＰに対するｄＵＴＰの比率を制御することにより制御され得、工程ＩＩＩでは、所望のサイズの３；末端にブロックを含むポリヌクレオチドをが生成される。所望のサイズは、例えば特異的次世代配列決定プラットフォームのようなダウンストリーム・アプリケーションにより決定され得る。工程Ｉからの鋳型全ＲＮＡを工程ＩＶで分解し、工程ＩＩＩで生成されたポリヌクレオチドを工程Ｖで精製する。鋳型ＲＮＡの分解は、リボヌクレアーゼ（例、リボヌクレアーゼＨまたはリボヌクレアーゼＩ）または加熱処理を用いて実施され得る。精製後、ランダム配列を含む３’オーバーハングを含む第１アダプターを、工程ＩＩＩで生成されたポリヌクレオチドの３’末端に存在する配列にアニーリングする。第１アダプターは、１本鎖であり得、３’オーバーハングに加えてヘアピン構造を含み得る。第１アダプターは、複数の第１アダプターであり得、この複数の第１アダプターはそれぞれ異なるランダム配列を含み、それらはそれぞれ同じ普遍的配列を含む。第１アダプターは、部分的デュプレックスを形成する２つのオリゴヌクレオチドを含み得、一方の鎖は３’末端にある他方の鎖より長く、そのため３’オーバーハングを含む。第１アダプターは、さらに第１普遍的配列を含み得る。一旦アニーリングされると、工程ＩＩＩで生成されたポリヌクレオチドの３’末端にアニーリングされたオーバーハングの３’末端は、ＤＮＡポリメラーゼで伸長され、第２鎖ｃＤＮＡが製造される。新たに生成された第２鎖の末端は、工程ＶＩＩＩでＴ４ポリメラーゼを用いて研磨され、次いで工程ＩＸで精製され得る。最終的に、第２アダプターを、工程ＶＩＩの２本鎖ポリヌクレオチド生成物にライゲーションされる。第２アダプターは、第２普遍的配列を含み得る。工程Ｘの生成物は、第１末端と第２末端との間に元のＲＮＡ鋳型の一部分を表す配列を含む挿入物を伴って一方の端に第１普遍的配列および第２の反対端に第２普遍的配列をもつ１鎖を含む２本鎖ポリヌクレオチドを含み得る。次いで、工程Ｘの生成物を工程ＸＩで精製し、工程ＸＩＩにおいて工程Ｘの生成物に付加された第１および第２普遍的配列に対して指向したプライマーでのＰＣＲに付す。このプライマーは、当業界で既知の次世代配列決定プラットフォームのいずれにも適したものであり得、さらに当業界で既知のバーコードおよび／または任意の他の識別子配列を含み得る。
【００９３】
ＲＮＡ鋳型から定方向性ポリヌクレオチドライブラリを生成するための本明細書記載の方法の実施形態の具体例を示す概略図を図１Ａに示す。図１Ａの工程Ｉで説明するように、プライマーを鋳型ＲＮＡにハイブリダイズさせる。本明細書で提供されるように、プライマーは、ランダム配列、転写物特異的配列、および／またはオリゴｄＴを含み得る。工程ＩＩでは、プライマーをｄＵＴＰの存在下で伸長させて、第１鎖ｃＤＮＡまたはポリヌクレオチド伸長生成物を製造する。この伸長は、本明細書で提供されるところのＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施され得る。工程ＩＩＩでは、鋳型ＲＮＡの分解後、ウラシル塩基を含むポリヌクレオチドを、ＵＮＧおよび熱またはポリアミン（ＤＭＥＤ）を用いて分解することにより、３’ブロック化末端を含む多数のフラグメントを製造する。鋳型ＲＮＡの分解は、リボヌクレアーゼ（例、リボヌクレアーゼＨまたはリボヌクレアーゼＩ）を用いて実施され得る。別法として、ＲＮＡ鋳型ポリヌクレオチドを、限定される訳ではないが、加熱またはアルカリｐＨ処理を含む他の方法または様々な方法の組み合わせにより分解することもできる。また、ＲＮＡ鋳型の分解のための加熱処理は、脱塩基部位を含む相補的ＤＮＡのバックボーンの開裂にも使用され得、したがって、単一工程で相補的ＤＮＡおよびＲＮＡ鋳型のフラグメント化が達成され得る。工程ＩＶでは、第１アダプターを、工程ＩＩＩで生成されたポリヌクレオチドの３’ブロック化末端に存在する配列にアニーリングする。第１アダプターは、３’末端にランダム配列を含む３’オーバーハングを含み、それにより、この３’オーバーハングは、工程ＩＩＩで生成されたポリヌクレオチドの３’ブロック化末端にある相補的配列に結合する。第１アダプターは、複数の第１アダプターであり得、この複数の第１アダプターはそれぞれ、異なるランダム配列を含み、この複数の第１アダプターの１つにあるランダム配列は、工程ＩＩＩで生成されたポリヌクレオチドの１つまたはそれより多くの３’末端に存在する相補的配列にアニーリングし得る。この複数の第１アダプターはそれぞれ配列Ａを含み得る。第１アダプターのアニーリングされた３’オーバーハングの３’末端を、工程Ｖにおいてブロックされた３’末端を含むポリヌクレオチドに沿って伸長させることにより、２本鎖ポリヌクレオチドの１鎖の５’末端に付加された配列Ａを伴う２本鎖ポリヌクレオチドが生成される。配列Ａに相補的な配列Ａ’は、工程ＩＩＩで生成された３’ブロックゆえに、工程Ｖで生成された２本鎖ポリヌクレオチドの他方の鎖には付加されない。工程ＶＩでは、第２アダプターを、配列Ａを含む末端とは反対側にある、工程Ｖで生成された２本鎖ポリヌクレオチドの末端にライゲーションする。第２アダプターは、配列Ｂを含む長鎖と配列Ｂの相補体Ｂ’の一部分を含む短鎖との間に形成された、部分的デュプレックスを含む。長鎖はさらに３’オーバーハングを含み、短鎖はさらに３’末端にブロックを含む。このブロックは、本明細書で提供されるいずれのブロックまたはブロッキング基でもよい。工程ＶＩでは、長鎖はライゲーション鎖としての役割を果たし、短鎖は非ライゲーション鎖としての役割を果たすため、長鎖の５’末端は、その５’末端に配列Ａを含む工程Ｖで製造された２本鎖ポリヌクレオチドの鎖の３’末端にライゲーションされ、それにより非相補的末端を含む２本鎖ポリヌクレオチドが生成される。ライゲーションは、限定される訳ではないが、工程Ｖで生成された２本鎖ポリヌクレオチドの末端での平滑末端の生成および平滑末端ライゲーションの実施を含め、本明細書で提供される方法の何れを用いても実施され得る。工程ＶＩで生成された２本鎖ポリヌクレオチドの１鎖は、５；末端に配列Ａおよび３’末端に配列Ｂを含む鎖特異的なポリヌクレオチドを含む。鎖特異的ポリヌクレオチドは、本明細書で提供される増幅方法の何れを用いても増幅され得る。場合によっては、増幅は、配列Ｂに対して指向した第１プライマーおよび配列Ａの相補体Ａ’に対して指向した第２プライマーを用いての増幅反応の実施を含むこともある（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ  ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ）。第１プライマーまたは第２プライマーのいずれか、または両方は、さらにハイブリダイゼーション不可能なテイルを含み得、このテイルは、逆フローセル配列、ＴｒｕＳｅｑプライマー配列、バーコード配列および／または本明細書記載のダウンストリーム・アプリケーションに有用な任意の他の望ましい配列を含むものとする。第１プライマーおよび第２プライマーでの増幅後、ライゲーションされたアダプターに由来する各末端に非相補的アダプター配列およびフローセル配列が付加された２本鎖ポリヌクレオチド配列を含む増幅生成物が生成される。増幅生成物は、本明細書で提供される次世代配列決定プラットフォームのいずれとも適合し得る。
【００９４】
図１Ｂは、ＲＮＡ鋳型から定方向性ポリヌクレオチドライブラリを生成するための本明細書記載の方法の実施形態の具体例としての概略図を示す。図１Ｂの工程ＩからＶは、図１Ａの工程ＩからＶと同一である。図１Ａと同様、図１Ｂの工程ＶＩの第２アダプターは、配列Ｂを含む長鎖と配列Ｂの相補体Ｂ’の一部分を含む短鎖との間に形成された、部分的デュプレックスを含む。図１Ａとは対照的に、図１Ｂの工程ＶＩの第２アダプターの長鎖は５’オーバーハングを含み、短鎖はさらに５’末端にブロックを含む。このブロックは、本明細書で提供されるいずれのブロックまたはブロッキング基でもよい。工程ＶＩでは、長鎖はライゲーション鎖としての役割を果たし、短鎖は非ライゲーション鎖としての役割を果たすため、長鎖の５’末端は、その５’末端に配列Ａを含む工程Ｖで製造された２本鎖ポリヌクレオチドの反対鎖の５’末端にライゲーションされ、それにより非相補的末端を含む２本鎖ポリヌクレオチドが生成される。ライゲーションは、限定される訳ではないが、工程Ｖで生成された２本鎖ポリヌクレオチドの末端での平滑末端の生成および平滑末端ライゲーションの実施を含め、本明細書で提供される方法の何れを用いても実施され得る。５’末端にあるブロック故に、短鎖は、５’末端に配列Ａを含む工程Ｖで生成された２本鎖ポリヌクレオチドの鎖にライゲーションされず、この場合ギャップが存在する。工程ＶＩＩでは、工程ＶＩで生成された２本鎖ポリヌクレオチドに対し、フィルイン反応を行い、これにより、その５’末端に配列Ａを含む鎖の３’末端を、鋳型として配列Ｂを用いて本明細書で提供される鎖置換活性を含むＤＮＡポリメラーゼを用いることにより伸長させる。別法として、ライゲーションされていない鎖は、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により除去され得る。工程ＶＩＩにより、５；末端に配列Ａおよび３’末端に配列Ｂ’を含む鎖特異的ポリヌクレオチドを含む２本鎖ポリヌクレオチドの１鎖を含む２本鎖ポリヌクレオチドが生成される。場合によっては、工程ＩＶの第２アダプターは、２本鎖アダプターを含むこともあり、この第１鎖は配列Ｂを含み、第２鎖は配列Ｂ’を含み、第１鎖は両端にブロックを含み、第２鎖は３’末端にブロッキング基を含む。これらの場合において、第２アダプターのライゲーションにより、工程ＶＩＩを必要とせずに、５；末端に配列Ａおよび３’末端に配列Ｂ’を含む鎖特異的ポリヌクレオチドを含む２本鎖ポリヌクレオチドの１鎖を含む２本鎖ポリヌクレオチドが生成される。鎖特異的ポリヌクレオチドは、本明細書で提供される増幅方法の何れを用いても増幅され得る。場合によっては、増幅は、配列Ｂ’に対して指向した第１プライマーおよび配列Ａの相補体Ａ’に対して指向した第２プライマーを用いての増幅反応を含むこともある。第１プライマーまたは第２プライマーのいずれか、または両方は、さらにハイブリダイゼーション不可能なテイルを含み得、このテイルは、逆フローセル配列、ＴｒｕＳｅｑプライマー配列、および／またはバーコード配列を含むものとする。第１プライマーおよび第２プライマーでの増幅後、ライゲーションされたアダプターに由来する各末端に非相補的アダプター配列およびフローセル配列が付加された２本鎖ポリヌクレオチド配列を含む増幅生成物が生成される。増幅生成物は、本明細書で提供される次世代配列決定プラットフォームと適合し得る。
【００９５】
ＳＰＩＡを用いて本明細書で提供される方法により生成されたポリヌクレオチドを増幅するための本明細書記載の方法の実施形態の具体例を示す概略図を図５に示す。工程Ｉでは、キメラ増幅プライマーを、本明細書で提供される方法により生成された５’末端に配列Ａおよび３’末端に配列Ｂを含むポリヌクレオチドとハイブリダイズさせる。キメラ増幅プライマーは、配列Ｃを含む３’ＤＮＡ部分および配列Ｄを含む５’ＲＮＡ部分を含み得、配列Ｃは配列Ｂの一部分と相補的な配列を含み、配列Ｄは上記のポリヌクレオチドとハイブリダイゼーション不可能な配列を含む。工程ＩＩでは、ＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ活性を含むＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行い、ここで配列Ｃの３’末端を、鋳型として上記のポリヌクレオチドを用いて伸長させ、ポリヌクレオチドの配列Ｂの３’末端を、鋳型として配列Ｄを用いて伸長させることにより、一方の端に配列Ａおよびその相補体Ａ’ならびに他方の端にＲＮＡ配列ＤおよびそのＤＮＡ相補体Ｄ’を含むヘテロデュプレックスを含む２本鎖ポリヌクレオチドが生成される。工程ＩＩＩでは、配列Ｄを、リボヌクレアーゼＨを用いて開裂し、そこで一方の端に配列Ａおよびその相補体Ａ’ならびに他方の端に配列Ｃを含む３’１本鎖ＤＮＡオーバーハングを含む２本鎖ポリヌクレオチドが生成される。工程ＩＶでは、配列Ｄ’に相補的な５’ＲＮＡ部分を含む増幅キメラプライマーを、配列Ｄ’にアニーリングし、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長させ、そこでＤＮＡポリメラーゼは、３’末端に配列Ａ’および５’末端に配列Ｃを含む１本鎖増幅生成物を置き換え、一方の端に配列Ａおよびその相補体Ａ’ならびに他方の端にＲＮＡ配列ＤおよびそのＤＮＡ相補体Ｄ’を含むヘテロデュプレックスを含む２本鎖ポリヌクレオチドが新たに生成される。次いで、工程ＩＩＩおよびＩＶを反復することにより、増幅生成物のプールが生成される。
【００９６】
ＶＩ．オリゴヌクレオチド
「オリゴヌクレオチド」の語は、典型的には２００未満の残基長、例えば１５〜１００ヌクレオチド長のポリヌクレオチド鎖を指し得るが、それより長いポリヌクレオチド鎖も包含するものとする。オリゴヌクレオチドは、１本鎖状または２本鎖状であり得る。「プライマー」および「オリゴヌクレオチドプライマー」の語は、相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズさせることができるオリゴヌクレオチドを指し得る。「オリゴヌクレオチド」の語は、「プライマー」、「アダプター」および「プローブ」の語と互換的に使用され得る。
【００９７】
「ハイブリダイゼーション」／「ハイブリダイズさせる」および「アニーリング（する）」の語は、互換的に使用され得、相補的な核酸の対合を指し得る。
【００９８】
「プライマー」の語は、鋳型（標的ポリヌクレオチド、標的ＤＮＡ、標的ＲＮＡまたはプライマー伸長生成物など）とハイブリダイズさせることができ、また鋳型に相補的なポリヌクレオチドの重合を促進することができる、一般的に遊離３’ヒドロキシル基をもつオリゴヌクレオチドを指し得る。プライマーは、プライマーのテイルを構成する非ハイブリダイゼーション性配列を含み得る。プライマーは、その配列が標的と完全に相補的なわけではない場合があるとしても、依然として標的とハイブリダイズさせるものであり得る。
【００９９】
プライマーは、例えばＰＣＲまたはｃＤＮＡ合成におけるように、ポリヌクレオチド鋳型に沿ったポリメラーゼによる伸長反応で使用され得るオリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドプライマーは、１本鎖状であり、標的ポリヌクレオチドの配列とハイブリダイズさせることができる配列をその３’末端に含む、合成ポリヌクレオチドであり得る。通常、標的核酸とハイブリダイズさせるプライマーの３’領域は、配列またはプライマー結合部位と少なくとも８０％、９０％、９５％、または１００％の相補性を有する。
【０１００】
プライマーは、２次構造および自己ハイブリダイゼーションを回避するために既知パラメータにしたがって設計され得る。種々のプライマー対は、別のプライマー対と例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０℃以内でのほぼ同じ温度で、アニーリングおよび融解することができる。場合によっては、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、５００、１０００、５０００、１０，０００またはそれより多くのプライマーが最初に使用されることもある。かかるプライマーは、本明細書記載の遺伝的標的とハイブリダイズさせることが可能であり得る。場合によっては、約２〜約１０，０００、約２〜約５，０００、約２〜約２，５００、約２〜約１，０００、約２〜約５００、約２〜約１００、約２〜約５０、約２〜約２０、約２〜約１０、または約２〜約６のプライマーが使用されることもある。
【０１０１】
プライマーは、当業界で周知の方法を用いる適切な配列のクローニングおよび直接的化学合成を含む、様々な方法により調製され得る（Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０（１９７９）、Ｂｒｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９（１９７９））。プライマーはまた、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓｉｇｍａ、およびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなどの販売元から入手され得る。プライマーは、同一の融解温度を有し得る。プライマーの融解温度は、約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８１、８２、８３、８４、または８５℃、前記で列挙した温度より高い温度、前記で列挙した温度より低い温度、または少なくとも前記で列挙した温度であり得る。場合によっては、プライマーの融解温度は、約３０〜約８５℃、約３０〜約８０℃、約３０〜約７５℃、約３０〜約７０℃、約３０〜約６５℃、約３０〜約６０℃、約３０〜約５５℃、約３０〜約５０℃、約４０〜約８５℃、約４０〜約８０℃、約４０〜約７５℃、約４０〜約７０℃、約４０〜約６５℃、約４０〜約６０℃、約４０〜約５５℃、約４０〜約５０℃、約５０〜約８５℃、約５０〜約８０℃、約５０〜約７５℃、約５０〜約７０℃、約５０〜約６５℃、約５０〜約６０℃、約５０〜約５５℃、約５２〜約６０℃、約５２〜約５８℃、約５２〜約５６℃、または約５２〜約５４℃である。
【０１０２】
プライマーの長さを５’末端または３’末端で伸ばすか、または短くすることにより、所望の融解温度をもつプライマーを製造することができる。プライマー対のプライマーの一方は、他方のプライマーより長いものであり得る。プライマーの３’アニーリング長は、プライマー対内で異なり得る。また、各プライマー対のアニーリング位置は、プライマー対の配列および長さが所望の融解温度をもたらすように設計され得る。２５塩基対より小さいプライマーの融解温度を求める等式は、Ｗａｌｌａｃｅ法則（Ｔｄ＝２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ））である。また、限定される訳ではないが、Ａｒｒａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｒｒａｙｉｔ  Ｉｎｃ．）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏ．）、ＮｅｔＰｒｉｍｅｒ、およびＤＮＡｓｉｓ（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ製）を含む、コンピュータプログラムを用いてプライマーを設計することもできる。各プライマーのＴＭ（融解またはアニーリング温度）は、Ｎｅｔ  Ｐｒｉｍｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｍｉｅｒｂｉｏｓｏｆｔ．ｃｏｍ／ｎｅｔｐｒｉｍｅｒ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌでの無料ウェブに基づくプログラム）などのソフトウェアプログラムを用いて計算され得る。限定される訳ではないが、約サイクル１、２、３、４、５、約サイクル６〜約サイクル１０、約サイクル１０〜約サイクル１５、約サイクル１５〜約サイクル２０、約サイクル２０〜約サイクル２５、約サイクル２５〜約サイクル３０、約サイクル３０〜約サイクル３５、または約サイクル３５〜約サイクル４０を含む、何サイクルかの増幅の後、プライマーのアニーリング温度を再計算して増加させることができる。最初の増幅サイクル後、プライマーの５’半分は、興味の対象である各遺伝子座からの生成物に組み込まれ得、したがって、ＴＭは、各プライマーの５’半分および３’半分の両配列に基づいて再計算され得る。
【０１０３】
限定される訳ではないが、約サイクル１、２、３、４、５、約サイクル６〜約サイクル１０、約サイクル１０〜約サイクル１５、約サイクル１５〜約サイクル２０、約サイクル２０〜約サイクル２５、約サイクル２５〜約サイクル３０、約サイクル３０〜約サイクル３５、または約サイクル３５〜約サイクル４０を含む、何サイクルかの増幅の後、プライマーのアニーリング温度を再計算し、増加させることができる。最初の増幅サイクル後、プライマーの５’半分は、興味の対象である各遺伝子座からの生成物に組み込まれ得、したがって、ＴＭは、各プライマーの５’半分および３’半分の両配列に基づいて再計算され得る。
【０１０４】
「相補的な」は、配列の全体または一部分のみに対する相補性を指し得る。特異的オリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーション可能な配列におけるヌクレオチドの数は、そのオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーションに使用されるストリンジェンシー条件が過度のランダムな非特異的ハイブリダイゼーションを阻害することになるようなものとするべきである。通常、オリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーション部分におけるヌクレオチドの数は、そのオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズさせる標的ポリヌクレオチド上の規定された配列と少なくとも同じ大きさ、すなわち、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも約２０ヌクレオチド、および一般的には約６〜約１０または６〜約１２または（ｏｆ）１２〜約２００ヌクレオチド、通常約１０〜約５０ヌクレオチドとなる。標的ポリヌクレオチドは、先に記載したオリゴヌクレオチドプライマー（複数も可）より大きいものであり得る。
【０１０５】
場合によっては、標的ポリヌクレオチド配列の同一性は既知であり、ハイブリダイゼーション可能なプライマーは、正確に前述の標的ポリヌクレオチド配列のアンチセンス配列にしたがって合成され得る。他の場合において、標的ポリヌクレオチド配列が未知であるとき、オリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーション可能な配列はランダム配列であり得る。ランダム配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーは、以下に記載するように「ランダムプライマー」と称され得る。さらに他の場合において、第１プライマーまたは第２プライマーなどのオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば第１プライマーのセットまたは第２プライマーのセットなど、プライマーのセットを含む。場合によっては、第１プライマーまたは第２プライマーのセットは、複数（例、約２、３、４、６、８、１０、２０、４０、８０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、８００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、１０，０００、２０，０００、または２５，０００、前記列挙の数値より多い数値、前記列挙の数値より少ない数値、または少なくとも前記列挙の数値）の標的配列とハイブリダイズさせるように設計されたプライマーの混合物を含み得る。場合によっては、この複数の標的配列は、１群の関連配列、ランダム配列、全トランスクリプトームまたはその画分（例、実質的画分）、またはｍＲＮＡなどの配列の任意の群を含み得る。本明細書で提供される方法で使用するためのプライマーは、それぞれ表３および表４で列挙した第１アダプター配列および第２アダプター配列に対して指向している、表１および表２に列挙したプライマーのいずれかであり得る。
【０１０６】
【表１−１】
2016511007.tif 000003
【０１０７】
【表１−２】
2016511007.tif 000004
【０１０８】
【表１−３】
2016511007.tif 000005
【０１０９】
【表２−１】
2016511007.tif 000006
【０１１０】
【表２−２】
2016511007.tif 000007
【０１１１】
「アダプター」の語は、興味の対象である標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチド鎖へのそのライゲーションにより、興味の対象である標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチド鎖の即増幅可能な生成物の生成を可能にする、既知配列のオリゴヌクレオチドを指し得る。様々なアダプター設計が使用され得る。好適なアダプター分子としては、１本鎖または２本鎖核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその組み合わせ）分子またはその誘導体、ステムループ核酸分子、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０塩基またはそれより長い１つまたはそれより多くの１本鎖オーバーハングを含む２本鎖分子、タンパク質、ペプチド、アプタマー、有機分子、小有機分子、または２本鎖核酸フラグメントに、例えばライゲーションなどにより、共有結合的または非共有結合的に結合され得る当業界で既知の任意のアダプター分子がある。アダプターは、２本鎖核酸（またはオーバーハングを伴う２本鎖核酸）生成物にライゲーションされ得る２本鎖部分を含むように設計され得る。
【０１１２】
アダプターオリゴヌクレオチドは、少なくともそれらを構成する１つまたはそれより多くの配列エレメントを受け入れるのに十分である、任意の好適な長さを有し得る。一部の場合には、アダプターは、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、２００またはそれより多くのヌクレオチド長、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、２００またはそれより多いよりも少ないヌクレオチド長、または約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、２００またはそれより多いよりも多いヌクレオチド長である。一部の場合には、アダプターは、ステムループまたはヘアピンアダプターであり、ヘアピンアダプターのステムは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００またはそれより多くのヌクレオチド長、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００またはそれより多いよりも少ないヌクレオチド長、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００またはそれより多いよりも多いヌクレオチド長である。ステムは、ヘアピンアダプター上の相補的領域間にハイブリダイゼーションをもたらす様々な異なる配列を用いて設計され得、２本鎖ＤＮＡの局所領域がもたらされ得る。例えば、均等なＧ：ＣおよびＡ：Ｔ塩基対を表す１５〜１８ヌクレオチド長であるステム配列が使用され得る。かかるステム配列は、それらの予測された融解温度約４５℃を下回る温度で安定したｄｓＤＮＡ構造を形成すると予測される。ヘアピンのステムに加わる配列は、ワトソン−クリック塩基対合規則にしたがってステムにおける１領域の各塩基がステムにおける他領域の各塩基と水素結合を介してハイブリダイズさせるように、完全に相補的であり得る。別法として、ステムにおける配列は、完全な相補性から逸脱することがある。例えば、ワトソン−クリック塩基対合規則に従わない対向塩基により作製されたステム構造内には誤対合および・またはバルジがあり得、および／または、ステムの１領域には、ステムに加わっている他領域における１つまたはそれより多くの対応する塩基位置を有しない１つまたはそれより多くのヌクレオチドがあり得る。誤対合配列は、誤対合を認識する酵素を用いて開裂され得る。ヘアピンのステムは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含み得る。場合によっては、ヘアピンのステムおよび／またはループ、またはヘアピンのステムを形成するハイブリダイゼーション可能な配列の一方または両方が、例えば、限定される訳ではないが、エンドヌクレアーゼおよびグリコシラーゼを含む酵素による開裂についての基質であるヌクレオチド、結合、または配列を含むこともある。ステムの組成は、ステムを形成するハイブリダイゼーション可能な配列の１つのみが開裂されるように決定され得る。例えば、リボヌクレアーゼＨなど、ＲＮＡ−ＤＮＡデュプレックスにおけるＲＮＡを開裂する酵素による開裂により、ＲＮＡを含む配列のみが開裂されるように、ステムを形成する配列の１つはＲＮＡを含み得、ステムを形成する他の配列はＤＮＡから成る。ヘアピンのステムおよび／またはループの一方の鎖または両方の鎖は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０、前記列挙の数値より多い数値、前記列挙の数値より少ない数値、または少なくとも前記列挙の数値の非カノニカルヌクレオチド（例、ウラシル）、および／またはメチル化ヌクレオチドを含み得る。一部の場合には、ヘアピンアダプターのループ配列は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれより多くのヌクレオチド長、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれより多いよりも少ないヌクレオチド長、または約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれより多いよりも多いヌクレオチド長である。
【０１１３】
アダプターは、共有結合で連結された少なくとも２つのヌクレオチドを含み得る。本明細書で使用されるアダプターは、ホスホジエステル結合を含み得るが、場合によっては、下記で概説するように、例えば、ホスホルアミド（Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９（１０）：１９２５（１９９３）およびそこに出てくる参考文献、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００（１９７０）、Ｓｐｒｉｎｚｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９（１９７７）、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３４８７（１９８６）、Ｓａｗａｉら、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５（１９８４）、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）およびＰａｕｗｅｌｓら、Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ  ２６：１４１  ９１９８６））、ホスホロチオエート（Ｍａｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：１４３７（１９９１）および米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１（１９８９））、Ｏ−メチルホスホロアミダイト連結（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照）、およびペプチド核酸（本明細書では「ＰＮＡ」とも称す）バックボーンおよび連結（Ｅｇｈｏｌｍ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５（１９９２）、Ｍｅｉｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８（１９９２）、Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６（１９９３）、Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：２０７（１９９６）を参照、これらについては、出典明示で援用する）を含む、代替的バックボーンを有し得る核酸類似体も含まれる。他の類似体核酸には、ロックト核酸（本明細書では「ＬＮＡ」とも称す）を含む二環式構造を有するもの（Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０．１３２５２  ３（１９９８））、正のバックボーンを有するもの（Ｄｅｎｐｃｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６０９７（１９９５））、非イオン性バックボーンを有するもの（米国特許第５，３８６，０２３，５，６３７，６８４，５，６０２，２４０，５，２１６，１４１および４，４６９，８６３号、Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ  ３０：４２３（１９９１）、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  １３：１５９７（１９９４）、第２および３章、ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”、Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ編、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５（１９９４）、Ｊｅｆｆｓら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎ��Ｒ  ３４：１７（１９９４）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９６））ならびに、米国特許第５，２３５，０３３および５，０３４，５０６号、ならびに第６および７章、ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ編、に記載されたものを含む、非リボースバックボーンを有するものがある。また、１つまたはそれより多くの炭素環状糖を含む核酸も、核酸の定義内に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．（１９９５）ｐｐ１６９  １７６を参照）。幾つかの核酸類似体は、Ｒａｗｌｓ、Ｃ  ＆  Ｅ  Ｎｅｗｓ  １９９７年６月２日号３５頁に記載されている。「ロックト核酸」もまた、核酸類似体の定義の範囲内に含まれる。ＬＮＡは、リボース環が２’−Ｏ原子を４’−Ｃ原子と連結するメチレン架橋により「ロックされた」核酸類似体の１つのクラスである。これらの参考文献は全て、出典明示により援用する。リボース−リン酸バックボーンのこれらの修飾を行うことにより、生理学的環境における上記分子の安定性および半減期を増加させることができる。例えば、ＰＮＡ：ＤＮＡおよびＬＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは、さらに高い安定性を呈し得るため、場合によっては使用されることもあり得る。アダプターは、明記したように１本鎖状または２本鎖状であり得、または２本鎖配列や１本鎖配列の両方の部分を含み得る。適用法によって、アダプターは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはハイブリッドであり得、この場合、アダプターは、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの任意の組み合わせ、およびウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン（ｘａｔｈａｎｉｎｅ）、ヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｔｈａｎｉｎｅ）、イソシトシン、イソグアニンなどを含む、塩基の任意の組み合わせを含む。
【０１１４】
図２で説明するように、本明細書で提供される第１アダプターは、３’オーバーハングを含む２本鎖核酸または１本鎖核酸であり得る。図２のＩで示すように、第１アダプターは、２つのオリゴヌクレオチド間の部分的デュプレックスを含み、第１のオリゴヌクレオチドは、５’末端に既知配列Ａおよび３’オーバーハングを含む長鎖を含み、第２のオリゴヌクレオチドは、３’末端に配列Ａと相補的な配列、Ａ’を含む短鎖を含む。図２のＩにおける短鎖は、さらに３’末端および５’末端にブロックを含み、これがライゲーションを阻害する役割を果たし得る。場合によっては、長鎖が５’末端にブロックを含むこともあり、それによりライゲーションが阻害される。図２のＩＩで示すように、第１アダプターは１本鎖オリゴヌクレオチドを含み、そのオリゴヌクレオチドの５’末端は、オリゴヌクレオチドの３’末端付近に位置する既知配列Ａに結合し、５’末端は、配列Ａに相補的な配列、Ａ’を含み、その結合により３’オーバーハングが生成される。図２のＩＩにおける１本鎖オリゴヌクレオチドアダプターの５’末端および３’末端は、リンカーを通して連結され得る。このリンカーは、ステムループ、非ヌクレオチドリンカー、またはその組み合わせであり得る。ステムループは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド類似体、またはその組み合わせを含み得る。図２のＩＩにおける１本鎖オリゴヌクレオチドアダプターの５’末端は５’ブロックを含み得、これがライゲーションを阻害し得る。有用な第２アダプターのための様々な構築物が予想される。本明細書で提供される定方向性ポリヌクレオチドライブラリを製造するための方法を実施するのに有用な第２アダプターは、本明細書で提供される方法により製造されたｄｓＤＮＡ生成物の末端へのライゲーションに好適な１末端をもつｄｓＤＮＡ、部分的デュプレックスまたはステムループアダプターなどであり得る。場合によっては、第２アダプターは、２つのオリゴヌクレオチド間に部分的デュプレックスを含むこともあり、この場合、第１のオリゴヌクレオチドは、既知配列、Ｂを含む長鎖を含み、第２のオリゴヌクレオチドは、配列Ｂの一部分と相補的な配列、Ｂ’を含む短鎖を含み、長鎖および短鎖間の結合により、３’オーバーハングが生成する。第２アダプターの短鎖は、さらに３’末端および／または５’末端にブロックを含み得、これがライゲーションを阻害する役割を果たし得る。長鎖の３’末端は、３’末端にブロックを含み得る。場合によっては、第２アダプターは、２つのオリゴヌクレオチド間に部分的デュプレックスを含むこともあり、この場合、第１のオリゴヌクレオチドは、既知配列、Ｂを含む長鎖を含み、第２のオリゴヌクレオチドは、配列Ｂの一部分と相補的な配列、Ｂ’を含む短鎖を含み、長鎖および短鎖間の結合により、５’オーバーハングが生成する。第２アダプターの短鎖は、さらに５’末端にブロックを含み得、これがライゲーションを阻害する役割を果たし得る。長鎖の３’末端および／または５’末端はブロックを含み得、これがライゲーションを阻害し得る。本明細書で提供される任意のアダプターにおけるブロックは、本明細書で提供されるブロックの何れであってもよい。本明細書で提供される方法において使用するためのアダプターは、表３および表４に列挙した第１アダプターおよび／または第２アダプターの何れであってもよい。
【０１１５】
【表３−１】
2016511007.tif 000008
【０１１６】
【表３−２】
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【０１１７】
【表３−３】
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【０１１８】
【表３−４】
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【０１１９】
【表４−１】
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【０１２０】
【表４−２】
2016511007.tif 000013
【０１２１】
【表４−３】
2016511007.tif 000014
【０１２２】
様々なライゲーションプロセスおよび試薬が当業界では既知であり、本明細書で提供される方法の実施に有用であり得る。例えば、平滑末端ライゲーションが使用され得る。同様に、単一ｄＡヌクレオチドは、３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼにより２本鎖ＤＮＡ生成物の３’末端に付加され得、ｄＴオーバーハングを含むアダプターにアニーリングし得る（またはこの逆）。この設計により、ハイブリダイズされた成分を続いて（例、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼにより）ライゲーションさせることが可能となる。他のライゲーション戦略および対応する試薬は当業界では既知であり、有効なライゲーション反応を実施するためのキットおよび試薬は市販されている（例、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｒｏｃｈｅから）。
【０１２３】
ＶＩＩ．ブロッキング基
本明細書で提供される要領で定方向性ポリヌクレオチドライブラリを生成するための方法で使用されるアダプターおよび／またはプライマーはいずれも、５’末端および／または３’末端にブロッキング基を含み得る。デュプレックスまたは部分的デュプレックスを含むアダプターおよび／またはプライマーは、デュプレックスまたは部分的デュプレックスを形成する一方または両方の鎖の５’末端および／または３’末端にブロックを含み得る。本明細書で提供されるアダプターまたはプライマーのいずれにおいてもブロックされた末端は、酵素的に非反応性となり得るためアダプター二量体形成および／またはライゲーションを阻止することができる。ブロッキング基は、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＣＭＰ、ｄｄＡＭＰ、ｄｄＴＭＰ、またはｄｄＧＭＰ）、様々な修飾ヌクレオチド（例、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド）、または非ヌクレオチド化学的部分であり得る。場合によっては、ブロッキング基は、ブロッキング部分を含むヌクレオチド類似体を含むこともある。ブロッキング部分は、ヌクレオチド類似体が第２のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と共有連結を形成するのを阻害または阻止するヌクレオチド類似体の一部を意味し得る。例えば、ペントース部分を有するヌクレオチド類似体の場合、可逆性のブロッキング部分は、ヌクレオチドの３’酸素と第２ヌクレオチドの５’リン酸間におけるホスホジエステル結合の形成を阻止し得る。可逆性ブロッキング部分としては、ホスフェート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、チオリン酸エステルおよび炭素エステルを挙げることができる。場合によっては、ブロッキング部分は、ヌクレオチド類似体のペントース部分の３’位または２’位に結合され得る。可逆性ブロッキング部分は、脱ブロッキング剤で除去され得る。５’末端および／または３’末端にあるブロッキング基は、スペーサー（Ｃ３ホスホロアミダイト、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、光開裂性ヘキサエチレングリコール）、逆方向ジデオキシ−Ｔ、ビオチン、チオール、ジチオール、ヘキサンジオール、ジゴキシゲニン、アジド、アルキン、またはアミノ修飾因子であり得る。ビオチンブロッキング基は、光開裂性ビオチン、ビオチン−トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、ビオチン−ｄＴ、デスチオビオチン−ＴＥＧ、ビオチン−アジド、またはデュアルビオチンであり得る。５’末端におけるブロックは、５’リン酸を欠く５’末端でのヌクレオチドを含み得る。５’末端は、酵素での処理により除去され得る。酵素はホスファターゼであり得る。３’末端におけるブロックは、遊離３’ヒドロキシルを欠くヌクレオチドを含み得る。末端（すなわち、５’末端および／または３’末端）はさらにホスホチオエート結合を含み得る。ホスホチオエート結合は、ホスホチオエート結合を含む任意のアダプターまたはプライマーを保護する役割を果たし得る。この保護はヌクレアーゼ分解からであり得る。
【０１２４】
ＶＩＩＩ．ＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ
本明細書で提供される方法および組成物で使用するためのＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼは、本明細書で提供される方法にしたがってプライマーの伸長を実施することができるものであり得る。したがって、ＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼは、少なくとも大部分はリボヌクレオチドから成る核酸鋳型に沿って核酸プライマーを伸長させることができるものであり得る。本明細書で提供される方法、組成物およびキットでの使用に好適なＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼには、逆転写酵素（ＲＴ）が含まれる。ＲＴは、当業界ではよく知られている。ＲＴの例としては、限定される訳ではないが、モロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、ラウス関連ウイルス（ＲＡＶ）逆転写酵素、および骨髄芽球症関連ウイルス（ＭＡＶ）逆転写酵素または他のトリ肉腫−白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）逆転写酵素、ならびにそこから誘導される修飾ＲＴがある。例えば、米国特許第７０５６７１６号を参照。多くの逆転写酵素、例えばトリ骨髄芽球症ウイルス由来の逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）、およびモロニーネズミ白血病ウイルス由来の逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）などは、複数の活性（例えば、ポリメラーゼ活性およびリボヌクレアーゼ活性）を含み、２本鎖ｃＤＮＡ分子の形成において機能し得る。しかしながら、場合によっては、リボヌクレアーゼＨ活性を欠くか、または実質的に低減させたＲＴを使用することが好ましいこともある。リボヌクレアーゼＨ活性を欠くＲＴは当業界では既知であり、突然変異によりリボヌクレアーゼＨ活性が排除されている野生型逆転写酵素の突然変異を含むものが含まれる。リボヌクレアーゼＨ活性が低減されたＲＴの例は、例えば米国特許出願公開第２０１００２０３５９７号に記載されている。これらの場合において、大腸菌から単離されたものなど、他の供給源からのリボヌクレアーゼＨの添加は、出発ＲＮＡ試料の分解および２本鎖ｃＤＮＡの形成に使用され得る。また、異なる非突然変異体ＲＴの組み合わせ、異なる突然変異体ＲＴの組み合わせ、および１つまたはそれより多くの非突然変異体ＲＴと１つまたはそれより多くの突然変異体ＲＴの組み合わせを含む、ＲＴの組み合わせも考えられ得る。
【０１２５】
ＩＸ．ＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ
本明細書で提供される方法および組成物で使用するためのＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼは、遊離３’ヒドロキシルを含む核酸の伸長を実施することができるものであり得る。遊離３’ヒドロキシルを含む核酸は、本明細書で提供されるプライマーおよび／またはアダプター上にあり得る。遊離３’ヒドロキシルを含む核酸は、ニッキング酵素によるｄｓＤＮＡ（例、ゲノムＤＮＡ）の処理により生成されるｄｓＤＮＡ（例、ゲノムＤＮＡ）の鎖上にあり得る。ＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ鋳型の存在下またはＲＮＡ鋳型の選択的除去後、第１鎖ｃＤＮＡに沿って遊離３’ＯＨを伸長させることができるものであり得る。本明細書で提供される方法に好適なＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼの例としては、限定される訳ではないが、３’−エキソヌクレアーゼを伴うかまたは伴わないＫｌｅｎｏｗポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａポリメラーゼ、．ｐｈｉ．２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔ４ポリメラーゼ、および大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１、その誘導体、またはポリメラーゼの混合物がある。場合によっては、ポリメラーゼは、５’−エキソヌクレアーゼ活性を含まないこともある。他の場合には、ポリメラーゼは、５’−エキソヌクレアーゼ活性を含むこともある。場合によっては、遊離３’ＯＨの伸長は、例えば、Ｂｓｔポリメラーゼなど、強い鎖置換活性を含むポリメラーゼを用いて実施され得る。他の場合には、遊離３’ＯＨの伸長は、弱い鎖置換活性を含むかまたは鎖置換活性を含まないポリメラーゼを用いて実施され得る。当業者であれば、本明細書で提供される方法における任意の伸長工程中における鎖置換活性の使用の利点および不利点、およびどのポリメラーゼが鎖置換活性を提供すると予測され得るかを認識できる（例、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓを参照）。例えば、鎖置換活性は、ランダムプライミングおよび伸長工程中における全トランスクリプトーム適用範囲を確保するか、またはニッキング酵素によるゲノムＤＮＡの処理後の伸長工程中における全ゲノム適用範囲を確保するのに有用であり得る。
【０１２６】
場合によっては、本明細書記載の方法により生成された２本鎖生成物またはフラグメントを末端修復することにより、本明細書記載のアダプターライゲーション適用のための平滑末端を作製することができる。２本鎖生成物での平滑末端の生成については、例えばエキソヌクレアーゼ１、エキソヌクレアーゼ７またはその組み合わせなどの１本鎖特異的ＤＮＡエキソヌクレアーゼを使用して、２本鎖生成物のオーバーハング状１本鎖末端を分解することにより生成が行われ得る。別法として、２本鎖生成物は、１本鎖特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えば、限定される訳ではないが、緑豆エンドヌクレアーゼまたはＳ１エンドヌクレアーゼの使用により平滑末端にされ得る。別法として、２本鎖生成物は、１本鎖エキソヌクレアーゼ活性を含むポリメラーゼ、例えばＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、１本鎖エキソヌクレアーゼ活性を含む任意の他のポリメラーゼ、またはその組み合わせを使用して２本鎖生成物またはフラグメントのオーバーハング状１本鎖末端を分解することにより平滑末端にされ得る。場合によっては、１本鎖エキソヌクレアーゼ活性を含むポリメラーゼを、１つまたはそれより多くのｄＮＴＰを含むかまたは含まない反応混合物中でインキュベーションしてもよい。他の場合には、１本鎖核酸特異的エキソヌクレアーゼおよび１つまたはそれより多くのポリメラーゼの組み合わせを用いて、伸長反応の２本鎖生成物を平滑末端にすることができる。さらに他の場合には、本明細書で提供される伸長反応の生成物は、２本鎖生成物のオーバーハング状１本鎖末端にフィルイン（ｆｉｌｌｉｎｇ  ｉｎ）することにより平滑末端状にされ得る。例えば、フラグメントを、１つまたはそれより多くのｄＮＴＰの存在下でポリメラーゼ、例えばＴ４  ＤＮＡポリメラーゼまたはＫｌｅｎｏｗポリメラーゼまたはその組み合わせとインキュベーションすることにより、２本鎖生成物の１本鎖部分にフィルインすることができる。別法として、２本鎖生成物またはフラグメントは、エキソヌクレアーゼおよび／またはポリメラーゼを用いる１本鎖オーバーハング分解反応、および１つまたはそれより多くのｄＮＴＰの存在下１つまたはそれより多くのポリメラーゼを用いるフィルイン反応の組み合わせにより平滑化され得る。
【０１２７】
別の実施形態において、本明細書記載のアダプターライゲーション適用は、アダプターの１鎖（例、非ライゲーション鎖）と２本鎖生成物またはフラグメントの１鎖の間にギャップを残し得る。これらの場合には、ギャップ修復またはフィルイン反応は、アダプターの他方の鎖（例、ライゲーション鎖）に相補的な配列を伴う２本鎖生成物またはフラグメントの付加に使用され得る。ギャップ修復は、任意の数の本明細書記載のＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼにより実施され得る。場合によっては、ギャップ修復は、鎖置換活性をもつＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼにより実施され得る。場合によっては、ギャップ修復は、弱い鎖置換活性をもつかまたは鎖置換活性をもたないＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施され得る。場合によっては、アダプターのライゲーション鎖は、ギャップ修復またはフィルイン反応についての鋳型としての役割を果たし得る。場合によっては、ギャップ修復は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施され得る。
【０１２８】
Ｘ．開裂作用因子
本明細書で提供される方法により生成された非カノニカルｄＮＴＰを含むポリヌクレオチドの選択的除去または開裂は、ポリヌクレオチドの酵素処理の使用を通して達成され得る。本明細書で提供される方法により生成されたマーキングされた鎖の開裂に使用され得る酵素としては、ｄＵＴＰの塩基部分を選択的に分解することができるウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）などのグリコシラーゼを挙げることができる。本明細書で提供される１つまたはそれより多くの非カノニカルヌクレオチドおよびそれらの非カノニカルまたは修飾ヌクレオチド基質を含む第１鎖ｃＤＮＡまたはポリヌクレオチドの生成に使用され得るさらなるグリコシラーゼには、ＤＮＡバックボーンから５−メチルシトシン（５−ＭｅＣ）の塩基部分を開裂することができる５−メチルシトシンＤＮＡグリコシラーゼ（５−ＭＣＤＧ）（Ｗｏｌｆｆｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：５８９４−５８９６，１９９９）、ＤＮＡバックボーンから３−メチルアデノシンの塩基部分を開裂することができる３−メチルアデノシン−ＤＮＡグリコシラーゼＩ（例、Ｈｏｌｌｉｓら（２０００）Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．４６０：２０１−２１０を参照）および／またはＤＮＡバックボーンから３−メチルアデノシン、７−メチルグアニン、７−メチルアデノシン、および／３−メチルグアニンの塩基部分を開裂することができる３−メチルアデノシンＤＮＡグリコシラーゼＩＩがある。ＭｃＣａｒｔｈｙら（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：５４５−５５０を参照。５−ＭＣＤＧの多官能形態および単官能形態については記載されている。Ｚｈｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：５０３１−６、２００１、Ｚｈｕら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２８：４１５７−４１６５、２０００およびＮｅｄｄｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｂ．Ｃ．２７１：１２７６７−７４、１９９６（二官能性５−ＭＣＤＧを記載、ＶａｉｒａｐａｎｄｉおよびＤｕｋｅｒ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １３：９３３−９３８、１９９６、Ｖａｉｒａｐａｎｄｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７９：２４９−２６０、２０００（５−ＭＣＤＧ活性を含む単官能性酵素を記載）を参照。場合によっては、５−ＭＣＤＧは、完全メチル化ポリヌクレオチド部位（例、ＣｐＧジヌクレオチド）を優先的に開裂することもあれば、他の場合には、５−ＭＣＤＧは半メチル化ポリヌクレオチドを優先的に開裂することもある。例えば、単官能性ヒト５−メチルシトシンＤＮＡグリコシラーゼは、完全メチル化ＣｐＧ部位にあるＤＮＡを特異的に開裂し、半メチル化ＤＮＡに対しては比較的不活性であり得る（ＶａｉｒａｐａｎｄｉおよびＤｕｋｅｒ、前出、Ｖａｉｒａｐａｎｄｉら、前出）。反対に、雛胚５−メチルシトシンＤＮＡグリコシラーゼは、半メチル化されたメチル化部位に向けられたより大きな活性を有し得る。場合によっては、５−ＭＣＤＧの活性は、組換え体高ＣｐＧ  ＲＮＡ、ＡＴＰ、ＲＮＡヘリカーゼ酵素、および増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）などの副因子で強化（増加または増強）されることもある。米国特許公開第２００２０１９７６３９  Ａ１号を参照。１つまたはそれより多くの作用因子が使用され得る。場合によっては、��つまたはそれより多くの作用因子が同じメチル化ヌクレオチドの塩基部分を開裂することもある。他の場合には、１つまたはそれより多くの作用因子は、異なるメチル化ヌクレオチドの塩基部分を開裂することもある。２つまたはそれより多くの作用因子での処理は連続的または同時であり得る。
【０１２９】
場合によって、本明細書で提供される方法により生成された第１鎖ｃＤＮＡのＤＮＡバックボーンにおける脱塩基部位については、続いて脱塩基部位にあるバックボーンのフラグメント化または開裂が行われ得る。脱塩基部位のバックボーンを開裂することができる好適な作用因子（例えば、酵素、化学物質および／または熱などの反応条件）には、加熱処理および／または化学的処理（塩基性条件、酸性条件、アルキル化条件、または脱塩基部位のアミン介在開裂を含む）（例、ＭｃＨｕｇｈおよびＫｎｏｗｌａｎｄ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９５）２３（１０）：１６６４−１６７０、Ｂｉｏｏｒｇａｎ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）７：２３５１、Ｓｕｇｉｙａｍａ、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．（１９９４）７：６７３−８３、Ｈｏｒｎ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９８８）１６：１１５５９−７１を参照）、および／または脱塩基部位でのポリヌクレオチドの開裂を触媒する酵素の使用がある。例えば、脱塩基部位でのポリヌクレオチドの開裂を触媒する酵素は、ＡＰエンドヌクレアーゼ（別名、「脱プリン脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ」）（例、大腸菌エンドヌクレアーゼＩＶ、ウィスコンシン、マディソンのＥｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈ．，Ｉｎｃから入手可能）、大腸菌エンドヌクレアーゼＩＩＩまたはエンドヌクレアーゼＩＶ、カルシウムイオン存在下での大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩであり得る。例えば、Ｌｉｎｄａｈｌ，ＰＮＡＳ（１９７４）７１（９）：３６４９−３６５３、Ｊｅｎｄｒｉｓａｋ、米国特許第６，１９０，８６５  Ｂ１号、Ｓｈｉｄａ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９６）２４（２２）：４５７２−７６、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）２７３（１３）：２１２０３−２０９、Ｃａｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）３８：１６５５３−６０、Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌ（１９９４）７：６７３−６８３を参照。本明細書で使用される「作用因子」の語は、加熱などの反応条件を包含する。場合によっては、ＡＰエンドヌクレアーゼ（大腸菌エンドヌクレアーゼＩＶ）は、脱塩基部位でのホスホジエステルバックボーンまたはホスホジエステル結合の開裂に使用されることもある。場合によっては、開裂は、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン（ＤＭＥＤ）などのアミンによることもある。例えば、ＭｃＨｕｇｈおよびＫｎｏｗｌａｎｄ、前出を参照。
【０１３０】
場合によっては、１つまたはそれより多くの脱塩基部位を含むポリヌクレオチド（例、第１鎖ｃＤＮＡ）は、求核基または塩基で処理され得る。場合によっては、求核基は、第１級アミン、第２級アミン、または第３級アミンなどのアミンである。例えば、脱塩基部位は、ピペリジン、モルホリンまたはそれらの組み合わせで処理され得る。場合によっては、熱ピペリジン（例、９０℃で１Ｍ）を用いて、１つまたはそれより多くの脱塩基部位を含むポリヌクレオチドを開裂し得る。場合によっては、モルホリン（例、３７℃または６５℃で３Ｍ）を用いることにより、１つまたはそれより多くの脱塩基部位を含むポリヌクレオチドを開裂することができる。別法として、ポリアミンを用いて、１つまたはそれより多くの脱塩基部位を含むポリヌクレオチドを開裂することができる。好適なポリアミンには、例えば、スペルミン、スペルミジン、１，４−ジアミノブタン、リシン、トリペプチドＫ−Ｗ−Ｋ、ＤＭＥＤ、ピペラジン、１，２−エチレンジアミン、またはそれらの任意の組み合わせがある。場合によっては、１つまたはそれより多くの脱塩基部位を含むポリヌクレオチドは、ベータ脱離反応、デルタ脱離反応またはそれらの組み合わせの実施に好適な試薬で処理され得る。場合によっては、本明細書で提供される方法は、カノニカルまたは非修飾ヌクレオチドに影響を及ぼすことがなく、それ故本方法の生成物の配列完全性を維持し得る単一反応混合物における緩やかな条件下での酵素または酵素の組み合わせおよびＤＭＥＤなどのポリアミンの使用を提供する。好適な緩やかな条件は、中性ｐＨまたは中性付近のｐＨでの条件を含み得る。他の好適な条件には、約４．５またはそれより高いｐＨ、５またはそれより高いｐＨ、５．５またはそれより高いｐＨ、６またはそれより高いｐＨ、６．５またはそれより高いｐＨ、７またはそれより高いｐＨ、７．５またはそれより高いｐＨ、８またはそれより高いｐＨ、８．５またはそれより高いｐＨ、９またはそれより高いｐＨ、９．５またはそれより高いｐＨ、１０またはそれより高いｐＨ、または約１０．５またはそれより高いｐＨがある。さらに他の好適な条件としては、約４．５〜１０．５、約５〜１０．０、約５．５〜９．５、約６〜９、約６．５〜８．５、約６．５〜８．０、または約７〜８．０がある。好適な緩やかな条件はまた、室温または室温付近の条件を含み得る。他の好適な条件としては、約１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、または７０℃またはそれより高い温度が含まれる。さらに他の好適な条件としては、約１０℃〜約７０℃、約１５℃〜約６５℃、約２０℃〜約６０℃、約２０℃〜約５５℃、約２０℃〜約５０℃、約２０℃〜約４５℃、約２０℃〜約４０℃、約２０℃〜約３５℃、または約２０℃〜約３０℃がある。場合によっては、緩やかな開裂条件の使用により、最終生成物収率が高められ、配列完全性が維持され、または本明細書で提供される方法をより自動化に適したものにし得る。
【０１３１】
フラグメント化を含む実施形態では、脱塩基部位を含むポリヌクレオチドのバックボーンは、脱塩基部位で開裂され得、そこでポリヌクレオチドの２つまたはそれより多くのフラグメントが生成され得る。少なくともフラグメントの１つは、本明細書に記載のように、脱塩基部位を含み得る。脱塩基部位のポリヌクレオチドのホスホジエステルバックボーンまたはホスホジエステル結合を開裂する作用因子が、本明細書では提供される。一部の実施形態では、この作用因子は、大腸菌ＡＰエンドヌクレアーゼＩＶなどのＡＰエンドヌクレアーゼである。他の実施形態では、作用因子はＤＭＥＤである。他の実施形態では、作用因子は、熱、塩基性条件、酸性条件、またはアルキル化剤である。さらに他の実施形態では、脱塩基部位のホスホジエステルバックボーンを開裂する作用因子は、ヌクレオチドの塩基部分を開裂して脱塩基部位を形成する作用因子と同じである。例えば、本明細書で提供される方法のグリコシラーゼは、グリコシラーゼ活性およびリアーゼ活性の両方を含み得、そこでグリコシラーゼ活性はヌクレオチド（例、修飾ヌクレオチド）の塩基部分を開裂して脱塩基部位を形成し、リアーゼ活性はこうして形成された脱塩基部位にあるホスホジエステルバックボーンを開裂する。場合によっては、グリコシラーゼが、グリコシラーゼ活性およびＡＰエンドヌクレアーゼ活性の両方を含むことがある。
【０１３２】
脱塩基部位でのバックボーンの開裂に作用することにより、本明細書記載の方法にしたがって３’末端が第１アダプターとハイブリダイゼーションしたときにポリメラーゼにより伸長し得ないブロックされた３’末端を含むフラグメントを生成させ得る作用因子または条件を使用することが望ましいものであり得る。
【０１３３】
本明細書で提供される方法にしたがって非カノニカルヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドの塩基部分の開裂を実施するのに適切な反応媒体および条件は、非カノニカルヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドの塩基部分の開裂を可能にするものである。かかる媒体および条件は、当業者には既知であり、様々な出版物、例えば、Ｌｉｎｄａｈｌ、ＰＮＡＳ（１９７４）７１（９）：３６４９−３６５３およびＪｅｎｄｒｉｓａｋ、米国特許第６，１９０，８６５  Ｂ１号、米国特許第５，０３５，９９６号、および米国特許第５，４１８，１４９号に記載されている。一実施形態では、ＵＤＧ（ウィスコンシン、マディソンのＥｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、核酸合成反応混合物に添加し、３７℃で２０分間インキュベーションする。一実施形態では、反応条件は、非カノニカルヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの合成および非カノニカルヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドの塩基部分の開裂の場合と同じである。別の実施形態では、異なる反応条件が、これらの反応に使用される。一部の実施形態では、ポリメラーゼが開裂生成物の末端を伸長するのを阻止するためにＵＮＧの前または同時にキレート試薬（ｒｅｇｅｎｔ）（例、ＥＤＴＡ）を添加する。
【０１３４】
一実施形態では、選択は、合成されたポリヌクレオチドの１鎖への少なくとも１つの修飾ヌクレオチドの組込みにより為され、選択的除去は、その少なくとも１つの修飾ヌクレオチドに対して特異的な活性を呈する酵素での処理により行われる。場合によっては、合成されたポリヌクレオチドの１鎖に組み込まれている修飾ヌクレオチドが、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）であり、選択的開裂がＵＮＧにより行われることもある。ＵＮＧは、ｄＵＴＰを選択的に分解する一方で、他のｄＮＴＰおよびそれらの類似体に対しては中性である。ＵＮＧでの処理により、Ｎ−グリコシル結合が開裂され、ｄＵ残基の塩基部分が除去され、脱塩基部位が形成される。一実施形態では、ＵＮＧ処理は、脱プリン／脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ（ＡＰＥ）の存在下で行われ、脱塩基部位にニックが作製される。したがって、ＵＮＧ／ＡＰＥで処理されたｄＵＴＰが組み込まれたポリヌクレオチド鎖が開裂され得る。別の場合には、ニック生成および開裂は、ＤＭＥＤなどのポリアミンでの処理、または加熱処理により達成される。
【０１３５】
ＸＩ．適用方法
本明細書記載の方法、組成物およびキットは、大規模並列配列決定法（すなわち、次世代配列決定法）またはハイブリダイゼーション・プラットフォームなどのダウンストリーム・アプリケーションのための即増幅可能な生成物を生成するのに有用であり得る。増幅方法は、当業界では周知である。使用され得るＰＣＲ技術の例としては、限定される訳ではないが、定量ＰＣＲ、定量的蛍光ＰＣＲ（ＱＦ−ＰＣＲ）、マルチプレックス蛍光ＰＣＲ（ＭＦ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、シングルセルＰＣＲ、制限酵素断片長多型ＰＣＲ（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ／ＲＴ−ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ホットスタートＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕポロニーＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ブリッジＰＣＲ、ピコタイターＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、ドロップレット・デジタルＰＣＲ、およびエマルジョンＰＣＲがある。他の好適な増幅方法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅、分子内反転プローブ（ＭＩＰ）ＰＣＲ、自家持続配列複製、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅、共通配列プライムポリメラーゼ連鎖反応（ＣＰ−ＰＣＲ）、任意プライムポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）、変性オリゴヌクレオチドプライムＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）および核酸に基づく配列増幅（ＮＡＢＳＡ）、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ、例えば、米国特許第６，２５１，６３９号を参照）、Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡ、またはそれらの組み合わせがある。本発明で使用され得る他の増幅方法には、米国特許第５，２４２，７９４、５，４９４，８１０、４，９８８，６１７および６，５８２，９３８号に記載されたものがある。標的核酸の増幅は、ビーズ上で行われ得る。他の実施形態では、増幅はビーズ上では行われない。増幅は、等温増幅、例えば等温線形増幅によるものであり得る。反応をポリメラーゼ添加前に２分間９５℃に加熱するか、またはサイクル１における最初の加熱工程までポリメラーゼを不活性状態で保ち得るホットスタートＰＣＲが実施され得る。ホットスタートＰＣＲを用いることにより、非特異的増幅を最小限にすることができる。増幅についての他の戦略および実施態様は、例えば、２０１０年７月８日に公開された、米国特許公開第２０１０／０１７３３９４  Ａ１号に記載されており、本明細書では出典明示で援用する。場合によっては、増幅方法は、例えば、普通にはｃＤＮＡ生成のために行われるような、数ラウンドのみの増幅（例、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０など）ですむように限定的条件下で実施され得る。増幅のラウンド数は、約１〜３０、１〜２０、１〜１５、１〜１０、５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、２０〜３０、１０〜３０、１５〜３０、２０〜３０、または２５〜３０であり得る。
【０１３６】
標的および参照配列の増幅技術は、当業界では既知であり、例えば、米国特許第７，０４８，４８１号に記載の方法が挙げられる。簡単に述べると、これらの技術は、試料を小滴に分離し、場合によっては、それぞれが各小滴につき平均して約５、４、３、２または１個を下回る標的核酸分子（ポリヌクレオチド）を含有するものとし、各小滴中の核酸配列を増幅し、標的核酸配列の存在を検出することを伴う方法および組成物を含み得る。場合によっては、増幅される配列は、ゲノムＤＮＡそれ自体ではなく、ゲノムＤＮＡに対するプローブ上に存在することもある。場合によっては、少なくとも２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または０の小滴の有する標的核酸のコピーが０であることもある。
【０１３７】
ＰＣＲは、変性、オリゴヌクレオチドプライマーアニーリング、および好熱性鋳型依存的ポリヌクレオチドポリメラーゼによるプライマー伸長の反復サイクルに基づいたインビトロ増幅を伴い得、その結果、プライマーが両側に隣接するポリヌクレオチド分析質の所望の配列コピーが指数的に増加し得る。場合によっては、ＤＮＡの反対鎖にアニーリングする２つの異なるＰＣＲプライマーは、一方のプライマーのポリメラーゼ触媒による伸長生成物が他方のための鋳型鎖としての役割を果たし得るように配置され得、長さがオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端間の距離により規定される異なる２本鎖フラグメントが蓄積されることになる。
【０１３８】
ＬＣＲは、前形成された核酸プローブの対を連結させるためにリガーゼ酵素の使用を伴い得る。プローブは、核酸分析質（存在するとすれば）の各相補鎖とハイブリダイゼーションし得、リガーゼは、プローブの各対を一緒に結合するのに使用され得、次サイクルで役割を果たすことにより特定の核酸配列を反復させ得る２つの鋳型が得られる。
【０１３９】
ＳＤＡ（Ｗｅｓｔｉｎら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１８、１９９−２０２、Ｗａｌｋｅｒら、１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０、７、１６９１−１６９６）は、ＨｉｎｃＩＩまたはＢｓｏＢＩなどの制限エンドヌクレアーゼがその認識部位のヘミホスホロチオエート形態の非修飾鎖にニックを入れる能力、およびＫｌｅｎｏｗ  ｅｘｏ  ｍｉｎｕｓポリメラーゼ、またはＢｓｔポリメラーゼなどのエキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼがニックにある３’末端を伸長させ、下流ＤＮＡ鎖を置き換える能力に基づいた等温増幅を含み得る。指数的増幅は、センス反応から置き換えられた鎖がアンチセンス反応についての標的としての役割を果たす（逆も可能）センスおよびアンチセンス反応のカップリングにより生じる。
【０１４０】
本明細書記載の方法の幾つかの実施態様は、核酸またはポリヌクレオチドの線形増幅を使用し得る。線形増幅は、核酸またはポリヌクレオチド分子、通常核酸またはポリヌクレオチド分析質の１鎖のみの相補体の１つまたはそれより多くのコピーの形成を含む方法を指し得る。したがって、線形増幅と指数的増幅間の主な差異は、後者のプロセスでは、生成物がさらなる生成物の形成のための基質としての役割を果たし、前者のプロセスでは、出発配列が生成物の形成のための基質であるが、反応、すなわち、出発鋳型の複製の生成物は生成物の生成のための基質ではないことである。形成される生成物の量が時間の指数関数である指数的増幅とは反対に、線形増幅では、形成される生成物の量は、時間の一次関数として増加する。
【０１４１】
場合によっては、増幅は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡの特異的２本鎖配列の酵素的増幅では指数的である。他の実施形態では、増幅方法は線形である。他の実施形態では、増幅方法は等温である。
【０１４２】
ＸＩＩ．適用法
本明細書で開示された方法および組成物の一実施態様は、それらが、興味の対象である生物材料の損失を最小限に抑えて、次世代配列決定またはハイブリダイゼーション・プラットフォームなどの下流解析に効率的および経済的に使用され得ることである。本明細書記載の方法は、それぞれ全ゲノムまたは全トランスクリプトーム解析のための鋳型ＤＮＡまたはＲＮＡからのハイスループット配列決定ライブラリの生成に特に有用であり得る。
【０１４３】
例えば、本明細書記載の方法は、米国特許第５，７５０，３４１、６，３０６，５９７および５，９６９，１１９号に記載されたように、Ｉｌｌｕｍｉｎａにより商品化された方法による配列決定に有用であり得る。定方向性（鎖特異的）核酸ライブラリは、本明細書記載の方法を用いて調製され得、選択された１本鎖核酸は、例えば、ＰＣＲにより増幅される。次いで、得られた核酸を変性させ、１本鎖増幅されたポリヌクレオチドを、フローセルチャンネルの内側表面に無作為に結合させ得る。非標識ヌクレオチドを付加して、固相ブリッジ増幅を開始させることにより、２本鎖ＤＮＡの稠密なクラスターを製造することができる。第１塩基配列決定サイクルを開始させるため、４つの標識可逆性ターミネータ、プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼが添加され得る。レーザー励起後、フローセル上の各クラスターからの蛍光を画像化する。次いで、各クラスターについての第１塩基の同一性を記録する。配列決定サイクルを実施することにより、一度でフラグメント配列１塩基（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｎｅ  ｂａｓｅ）を決定することができる。
【０１４４】
場合によっては、本明細書記載の方法は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより商品化されたライゲーション方法（例、ＳＯＬｉＤシーケンシング）による配列決定法で配列決定するための標的ポリヌクレオチドの調製に有用であり得る。定方向性（鎖特異的）核酸ライブラリは、本明細書記載の方法を用いて調製され得、次いで、選択された１本鎖核酸は、ポリスチレンビーズと一緒に油中水エマルジョン中に投入され、例えばＰＣＲにより増幅され得る。場合によっては、本明細書で提供される方法のいずれかなど、代替的増幅方法が、油中水エマルジョンで使用され得る。エマルジョンにより形成された各水微小滴中の増幅生成物は、その微小滴中に存在する１つまたはそれより多くのビーズと相互作用、結合またはハイブリダイゼーションし、それにより実質的に１つの配列の複数の増幅生成物を伴うビーズが得られる。エマルジョンが破壊されたとき、ビーズは試料の上部へ浮遊し、アレイへ配列される。本方法は、ビーズに結合した核酸を鎖状または部分的１本鎖状にする工程を含み得る。次いで、配列決定プライマーを、４つの異なる蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブの混合物と一緒に加える。このプローブが、配列決定プライマーの直接的な隣接位置および３’の配列決定されるポリヌクレオチドにおける２塩基に特異的に結合することにより、４塩基のどれがそれらの位置にあるかが決定される。洗浄および投入された第１のプローブからの（ｆｏｒｍ）蛍光シグナルの読み取り後、リガーゼを添加する。リガーゼは、オリゴヌクレオチドプローブを第５塩基および第６塩基の間で開裂し、配列決定されるポリヌクレオチドから蛍光染料を除去する。この配列における介入位置が全て画像化されるまで異なる配列プライマーを用いて全プロセスを繰り返す。このプロセスにより、「大規模並列」的に何百万ものＤＮＡフラグメントの同時読み取りが可能となる。この「ライゲーションによる配列決定」技術は、１つだけではなく２塩基をコードするプローブを使用するもので、シグナル誤対合によるエラー認識を可能にするため、塩基決定精度が増すことになる。
【０１４５】
他の実施形態では、本方法は、限定される訳ではないが、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ（２００５）４３７：３７６−３８０（２００５）および米国特許第７，２４４，５５９、７，３３５，７６２、７，２１１，３９０、７，２４４，５６７、７，２６４，９２９、および７，３２３，３０５号に記載された方法および装置を含む、４５４／Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより商品化された方法を用いた合成による配列決定のための標的ポリヌクレオチドの調製に有用である。定方向性（鎖特異的）核酸ライブラリは、本明細書記載の方法を用いて調製され得、選択された１本鎖核酸は、例えばＰＣＲにより増幅され得る。次いで、増幅された生成物は、ビーズに固定化され、ＰＣＲによる増幅に好適な油中水エマルジョン中で画分化され得る。場合によっては、例えば本明細書で提供される方法のいずれかなど、ＰＣＲ以外の代替的増幅方法が、油中水エマルジョンで使用され得る。エマルジョンが破壊されたとき、増幅されたフラグメントは、ビーズに結合したままであり得る。本方法は、ビーズに結合した核酸を１本鎖状または部分的１本鎖状にする工程を含み得る。ビーズは、濃縮され、各ウェルにおおよそ１ビーズがあるように光ファイバースライドのウェルに加えられ得る。ヌクレオチドを、ポリメラーゼ、スルフヒドロラーゼおよびルシフェラーゼの存在下、固定順序でウェル全域およびその中へ流入させ得る。標的鎖に相補的なヌクレオチドの付加により、カメラなどにより記録され得る化学発光シグナルがもたらされ得る。プレート全域で作製されたシグナル強度と位置情報の組み合わせにより、ソフトウェアでＤＮＡ配列を決定することが可能となり得る。
【０１４６】
他の実施形態では、本方法は、米国特許出願第１１／１６７，０４６号、および米国特許第７，５０１，２４５、７，４９１，４９８、７，２７６，７２０号、および米国特許出願公開第ＵＳ２００９００６１４３９、ＵＳ２００８００８７８２６、ＵＳ２００６０２８６５６６、ＵＳ２００６００２４７１１、ＵＳ２００６００２４６７８、ＵＳ２００８０２１３７７０、およびＵＳ２００８０１０３０５８号に記載された、Ｈｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（マサチューセッツ、ケンブリッジ）により商品化された方法による配列決定のための標的ポリヌクレオチド（複数も可）の調製に有用である。定方向性（鎖特異的）核酸ライブラリは、本明細書記載の方法を用いて調製され得、選択された１本鎖核酸は、例えばＰＣＲにより増幅される。次いで、増幅生成物は、フローセル表面に固定化され得る。本方法は、フローセル表面に結合した核酸を鎖状または部分的１本鎖状にする工程を含み得る。次いで、ポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドは、固定化されたＤＮＡ全体に流し込まれ得る。蛍光標識ヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ鎖に組み込まれた後、表面をレーザーで照明し、画像を捕捉し、処理することにより単一分子組込み事象を記録して配列データを作製することができる。
【０１４７】
場合によっては、本明細書記載の方法は、米国特許第７４６２４５２、７４７６５０４、７４０５２８１、７１７００５０、７４６２４６８、７４７６５０３、７３１５０１９、７３０２１４６、７３１３３０８号および米国特許出願公開第ＵＳ２００９００２９３８５、ＵＳ２００９００６８６５５、ＵＳ２００９００２４３３１およびＵＳ２００８０２０６７６４号に記載された、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより商品化された方法による配列決定に有用であり得る。定方向性（鎖特異的）核酸ライブラリは、本明細書記載の方法を用いて調製され得、選択された１本鎖核酸は、例えばＰＣＲにより増幅される。次いで、核酸は０モード導波管アレイに固定化され得る。本方法は、導波管アレイに結合した核酸を１本鎖状または部分的１本鎖状にする工程を含み得る。ポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドを反応混合物に添加し、ヌクレオチド組込みをヌクレオチドの末端リン酸基に結合された蛍光標識により視覚化することができる。蛍光標識を、ヌクレオチド組込みの一部として切り取ることができる。場合によっては、環状鋳型を用いることにより、単一分子での多数のリードが可能となる。
【０１４８】
本明細書記載の方法で使用され得る配列決定技術の別の例は、ナノポア配列決定法である（例、Ｓｏｎｉ  Ｇ  ＶおよびＭｅｌｌｅｒ  Ａ．（２００７）Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５３：１９９６−２００１を参照）。ナノポアは、直径１ナノメートル程度の小さな穴であり得る。導電性流体にナノポアを浸漬し、その全域に電位を適用すると、ナノポアを通るイオンの伝導ゆえに微弱電流が生じ得る。流れる電流の量は、ナノポアのサイズに感受性である。ＤＮＡ分子がナノポアを通過すると、ＤＮＡ分子上の各ヌクレオチドは、ナノポアを異なる度合いで塞ぐ。したがって、ＤＮＡ分子がナノポアを通過するときのナノポアを通る電流の変化が、ＤＮＡ配列の読み取りを表し得る。
【０１４９】
本明細書記載の方法で使用され得る配列決定技術の別の例は、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｏｌｏｇｙのＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔにより提供される半導体配列決定法である（例、Ｉｏｎ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｃｈｉｎｅ（ＰＧＭ）を使用する）。Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ技術は、多層、例えば微細加工ウェルを伴う層、イオン感受性層、およびイオンセンサー層を有する半導体チップを使用し得る。核酸がウェルに導入され得、例えば、単一核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）のクローン集団が単一ビーズに結合され得、ビーズはウェルに導入され得る。ビーズ上の核酸の配列決定を開始するため、１タイプのデオキシリボヌクレオチド（例、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、またはｄＴＴＰ）がウェルに導入され得る。１つまたはそれより多くのヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼにより組み込まれたとき、プロトン（水素イオン）がウェルで放出され得、これがイオンセンサーにより検出され得る。次いで、半導体チップを洗浄し、このプロセスを異なるデオキシリボヌクレオチドで反復し得る。複数の核酸が、半導体チップのウェルで配列決定され得る。半導体チップは、ＤＮＡを配列決定するための化学的感受性電界効果トランジスタ（ｃｈｅｍＦＥＴ）アレイを含み得る（例えば、米国特許出願公開第２００９００２６０８２号に記載）。配列決定プライマーの３’末端にある新たな核酸鎖への１つまたはそれより多くの三リン酸の組込みは、ｃｈｅｍＦＥＴによって電流の変化により検出され得る。アレイは、多数のｃｈｅｍＦＥＴセンサーを有し得る。
【０１５０】
本明細書記載の方法で使用され得る配列決定技術の別の例は、ＤＮＡナノボール配列決定法（例えば、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓにより実施されている、例えば、Ｄｒｍａｎａｃら（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７：７８−８１を参照）である。ＤＮＡが、単離され、フラグメント化され、サイズ選択され得る。例えば、ＤＮＡは、約５００ｂｐの平均長に（例、音波処理により）フラグメント化され得る。アダプター（Ａｄｌ）は、フラグメントの末端に結合され得る。アダプターを用いて、配列決定反応のためのアンカーとのハイブリダイゼーションを行うことができる。アダプターが各末端に結合したＤＮＡが、ＰＣＲ増幅され得る。アダプター配列は、相補的１本鎖末端が互いに結合して環状ＤＮＡを形成するように修飾され得る。ＤＮＡは、それを後続工程で使用されるＩＩＳタイプ制限酵素による開裂から保護するためにメチル化され得る。アダプター（例、右アダプター）は、制限認識部位を有し得、制限認識部位は非メチル化状態のままであり得る。アダプターにおける非メチル化制限認識部位は、制限酵素（例、Ａｃｕｌ）により認識され得、ＤＮＡは、右アダプターの右方１３ｂｐでＡｃｕｌにより開裂され、線状２本鎖ＤＮＡを形成し得る。第２ラウンドの右および左アダプター（Ａｄ２）は、線状ＤＮＡのどちらかの末端にライゲーションされ得、両アダプターが結合した全ＤＮＡは、（例、ＰＣＲにより）ＰＣＲ増幅され得る。Ａｄ２アダプターは、それらが互いに結合し、環状ＤＮＡを形成するように修飾され得る。ＤＮＡはメチル化され得るが、制限酵素認識部位は、左Ａｄ１アダプター上で非メチル化状態のままであり得る。制限酵素（例、Ａｃｕｌ）が適用され得、ＤＮＡは、Ａｄ１の左方１３ｂｐで開裂されて線状ＤＮＡフラグメントを形成し得る。第３ラウンドの右および左アダプター（Ａｄ３）は、線状ＤＮＡの右側隣接および左側隣接にライゲーションされ得、得られたフラグメントはＰＣＲ増幅され得る。このアダプターは、それらが互いに結合し、環状ＤＮＡを形成し得るように修飾され得る。ＩＩＩタイプ制限酵素（例、ＥｃｏＰ１５）が加えられ得、ＥｃｏＰ１５が、Ａｄ３の左方２６ｂｐおよびＡｄ２の右方２６ｂｐでＤＮＡを開裂し得る。この開裂により、ＤＮＡの大きな断片が除去され得、ＤＮＡが再度線形にされ得る。第４ラウンドの右および左アダプター（Ａｄ４）がＤＮＡにライゲーションされ得、そのＤＮＡが（例、ＰＣＲにより）増幅され得、それらが互いに結合し、完成した環状ＤＮＡ鋳型を形成するように修飾され得る。ローリングサークル複製（例、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用）を用いることにより、ＤＮＡの小さなフラグメントを増幅することができる。４つのアダプター配列は、ハイブリダイゼーションし得るパリンドローム配列を含み得、１本鎖がそれ自体折り重なって、平均直径がおおよそ２００〜３００ナノメートルであり得る、ＤＮＡナノボール（ＤＮＢ（ＴＭ））を形成することができる。ＤＮＡナノボールは、マイクロアレイ（配列決定用フローセル）に（例、吸着により）結合され得る。フローセルは、二酸化ケイ素、チタンおよびヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）およびフォトレジスト材料で被覆され��シリコンウェハーであり得る。配列決定は、ＤＮＡに蛍光プローブをライゲーションすることによる非連鎖配列決定法により実施され得る。目的の（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅｄ）位置の蛍光の色は、高解像度カメラにより可視化され得る。アダプター配列間のヌクレオチド配列の同一性が決定され得る。
【０１５１】
場合によっては、本配列決定技術は、順方向および逆方向の両鋳型鎖が配列決定され得るペアエンド配列決定法を含み得る。場合によっては、本配列決定技術は、メイトペアライブラリ配列決定法を含み得る。メイトペアライブラリ配列決定法では、ＤＮＡはフラグメントであり得、２〜５ｋｂのフラグメントが（例、ビオチン標識ｄＮＴＰで）末端修復され得る。ＤＮＡフラグメントは環状化され得、非環状化ＤＮＡは消化により除去され得る。環状ＤＮＡは、フラグメント化され、（例、ビオチン標識を用いて）精製され得る。精製されたフラグメントは、末端修飾され、配列決定用アダプターにライゲーションされ得る。
【０１５２】
場合によっては、配列リードは、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、または３０００塩基、約前記列挙の数値より多い塩基、約前記列挙の数値より少ない塩基、または少なくとも約前記列挙の数値の塩基である。場合によっては、配列リードは、約１０〜約５０塩基，約１０〜約１００塩基，約１０〜約２００塩基，約１０〜約３００塩基，約１０〜約４００塩基，約１０〜約５００塩基，約１０〜約６００塩基，約１０〜約７００塩基，約１０〜約８００塩基，約１０〜約９００塩基，約１０〜約１０００塩基，約１０〜約１５００塩基，約１０〜約２０００塩基，約５０〜約１００塩基，約５０〜約１５０塩基，約５０〜約２００塩基，約５０〜約５００塩基，約５０〜約１０００塩基，約１００〜約２００塩基，約１００〜約３００塩基，約１００〜約４００塩基，約１００〜約５００塩基，約１００〜約６００塩基，約１００〜約７００塩基，約１００〜約８００塩基，約１００〜約９００塩基、または約１００〜約１０００塩基である。
【０１５３】
試料からの配列リードの数は、約１００、１０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００、または１０，０００，０００、約前記列挙の数値より多い数値、約前記列挙の数値より少ない数値、または少なくとも約前記列挙の数値であり得る。
【０１５４】
試料の配列決定の深度は、約１×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１１×、１２×、１３×、１４×、１５×、１６×、１７×、１８×、１９×、２０×、２１×、２２×、２３×、２４×、２５×、２６×、２７×、２８×、２９×、３０×、３１×、３２×、３３×、３４×、３５×、３６×、３７×、３８×、３９×、４０×、４１×、４２×、４３×、４４×、４５×、４６×、４７×、４８×、４９×、５０×、５１×、５２×、５３×、５４×、５５×、５６×、５７×、５８×、５９×、６０×、６１×、６２×、６３×、６４×、６５×、６６×、６７×、６８×、６９×、７０×、７１×、７２×、７３×、７４×、７５×、７６×、７７×、７８×、７９×、８０×、８１×、８２×、８３×、８４×、８５×、８６×、８７×、８８×、８９×、９０×、９１×、９２×、９３×、９４×、９５×、９６×、９７×、９８×、９９×、ｌ００×、１１０×、１２０×、１３０×、１４０×、１５０×、１６０×、１７０×、１８０×、１９０×、２００×、３００×、４００×、５００×、６００×、７００×、８００×、９００×、ｌ０００×、１５００×、２０００×、２５００×、３０００×、３５００×、４０００×、４５００×、５０００×、５５００×、６０００×、６５００×、７０００×、７５００×、８０００×、８５００×、９０００×、９５００×、または１０，０００×、約前記列挙の数値より多い数値、約前記列挙の数値より少ない数値、または少なくとも約前記列挙の数値であり得る。試料の配列決定の深度は、約１×〜約５×、約１×〜約１０×、約１×〜約２０×、約５×〜約１０×、約５×〜約２０×、約５×〜約３０×、約１０×〜約２０×、約１０×〜約２５×、約１０×〜約３０×、約１０×〜約４０×、約３０×〜約１００×、約１００×〜約２００×、約１００×〜約５００×、約５００×〜約１０００×、約１０００×、〜約２０００×、約１０００×〜約５０００×、または約５０００×〜約１０，０００×であり得る。配列決定の深度は、ある配列（例、ゲノム）が配列決定される回数であり得る。場合によっては、Ｌａｎｄｅｒ／Ｗａｔｅｒｍａｎ等式をカバレッジのコンピュータ演算に使用する。一般式は、Ｃ＝ＬＮ／Ｇ（式中、Ｃ＝カバレッジ、Ｇ＝半数体ゲノム長、Ｌ＝リード長、およびＮ＝リード数）であり得る。
【０１５５】
場合によっては、異なるバーコードが、本明細書記載の方法により鋳型核酸から生成されたポリヌクレオチドに（例、プライマーおよび／またはアダプターを用いることにより）付加され得、ここで鋳型核酸は異なる試料に由来するものとし、異なる試料はプールされ、マルチプレックスアッセイで分析され得る。バーコードは、鋳型核酸の起源となる試料の判定を可能にし得る。様々な試料から生成されたライブラリのプールは、バーコードを付加する段階によって、バーコード配列付加後の異なる段階で実施され得る。
【０１５６】
ＸＩＩＩ．組成物および反応混合物
本方法は、さらに１つまたはそれより多くの組成物または反応混合物を提供する。場合によっては、反応混合物は、（ａ）鋳型ＲＮＡ、（ｂ）ランダム配列を含むプライマー、（ｃ）逆転写酵素、（ｄ）非修飾ｄＮＴＰおよび非カノニカルｄＮＴＰ（例、ｄＵＴＰ）の混合物、（ｅ）３’オーバーハングおよび既知配列Ａを含む長鎖および短鎖を含む第１アダプター、（ｆ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｇ）非修飾ｄＮＴＰの混合物、（ｈ）３’オーバーハングおよび既知配列Ｂを含む長鎖および３’末端にブロックを含む短鎖を含む第２アダプターを含むこともある。場合によっては、反応混合物は、さらに（ｅ）第２アダプターのライゲーションおよび場合により本明細書記載の第２アダプター配列を含むポリヌクレオチドの末端の伸長の後にポリヌクレオチドの各末端に作製されたユニークなプライミング部位に指向した増幅プライマーを含むこともある。場合によっては、反応混合物は、さらに（ｆ）本明細書で提供される方法により生成されたポリヌクレオチドの末端に付加されたアダプター配列の１つまたはそれより多くに存在する配列に対して指向した配列決定用プライマーを含むこともある。一部の実施形態では、プライマー（ｂ）は、構造的ＲＮＡ（ｒＲＮＡなど）以外の全転写物と優先的にハイブリダイズさせるプライマーなど、望ましい群の鋳型への優先的ハイブリダイゼーションについて選択された配列を含む。一部の実施形態では、第１アダプター（ｅ）は、ランダム配列を含む３’オーバーハングを伴うステム−ループオリゴヌクレオチドを含む。
【０１５７】
ＸＩＶ．キット
本明細書記載の組成物はいずれもキット中に含まれ得る。非限定的な例において、キットは、好適な容器中に、１アダプターまたは幾つかのアダプター、１つまたはそれより多くのオリゴヌクレオチドプライマーおよびライゲーション、プライマー伸長および増幅用の試薬を含む。キットはまた、ビーズ懸濁液などの精製手段、および核酸修飾酵素を含み得る。
【０１５８】
キットの容器は、一般的に、成分を中に、好適には一定分量で入れることができる少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器または他の容器を含むことになる。キット中に複数の成分がある場合、キットはまた、一般的に、追加的成分を別々に入れることができる第２、第３または他の追加的容器を含むことになる。しかしながら、成分の様々な組み合わせは、１つの容器に含まれ得る。
【０１５９】
キットの成分が１つまたはそれより多くの液状溶液で提供されるとき、その液状溶液は水溶液であり得る。しかしながら、キットの成分は、乾燥粉末（複数も可）として提供され得る。試薬および／または成分が乾燥粉末として提供されるとき、粉末は、好適な溶媒の添加により再構成され得る。
【０１６０】
本方法は、本明細書記載の１つまたはそれより多くの組成物および本明細書記載の方法の実施に適した他の好適な試薬を含むキットを提供する。本明細書記載の方法は、例えば、臨床研究室または犯罪研究室用の診断キット、または核酸増幅、またはＲＮＡ−ｓｅｑライブラリ調製キット、または一般研究室用の分析キットを提供する。したがって、本方法は、本明細書記載の方法を実施するための試薬、例えば試料調製試薬、オリゴヌクレオチド、結合分子、原液、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、酵素、正および負の制御オリゴヌクレオチドおよび標的配列、試験管またはプレート、フラグメント化もしくは開裂試薬、検出試薬、精製マトリックス、および使用説明書の一部または全部を含むキットを含む。場合によっては、キットは、３’末端にランダム配列を含む第１鎖相補的ＤＮＡプライマーを含むこともある。場合によっては、キットに含まれる第１鎖ｃＤＮＡプライマーは、ｒＲＮＡ以外の全転写物など、選択された標的の群とハイブリダイゼーション可能な配列を含むこともある。場合によっては、キットは、修飾ヌクレオチドまたは非カノニカルヌクレオチドを含むこともある。好適な修飾ヌクレオチドまたは非カノニカルヌクレオチドは、限定される訳ではないが、ｄＵＴＰを含む本明細書で提供される任意のヌクレオチドを包含する。場合によっては、キットは、開裂作用因子を含むこともある。場合によっては、開裂作用因子は、グリコシラーゼおよび化学的作用因子、または酵素であり得る。グリコシラーゼは、ＵＮＧであり得る。化学的作用因子は、ポリアミンであり得る。ポリアミンは、ＤＭＥＤであり得る。酵素は、エンドヌクレアーゼであり得る。エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩまたはＡＰＥであり得る。場合によっては、キットは、第１の普遍的配列および３’オーバーハングを含む第１アダプター／プライマーを含むこともあり、この３’オーバーハングは、３’末端ブロックを含むポリヌクレオチドの３’末端に存在する配列に対して指向した配列を含む。場合によっては、キットは、３’オーバーハングを含む１つまたはそれより多くのオリゴヌクレオチド第１アダプター（ｏｎｅ  ｏｆ  ｍｏｒｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を含むこともあり、この３’オーバーハングはランダム配列を含む。場合によっては、第１プライマーは、ステム−ループオリゴヌクレオチドを含むこともある。場合によっては、第１アダプターは、さらにバーコード配列および普遍的配列を含むこともある。場合によっては、キットは、第２の普遍的配列を含む第２のアダプターを含むこともある。場合によっては、キットは、第１アダプターに存在する普遍的配列に相補的な配列の一部分に対して指向した第１プライマーおよび第２アダプターに存在する普遍的配列に対して指向した配列またはその相補体を含む第２プライマーを含むこともある。
【０１６１】
場合によっては、キットは、１つまたはそれより多くの反応混合物成分、または反応混合物成分の１つまたはそれより多くの混合物を含み得る。場合によっては、反応混合物成分またはその混合物は、例えば１．１×、１．５×、２×、２．５×、３×、４×、５×、６×、７×、１０×、１５×、２０×、２５×、３３×、５０×、７５×、１００×またはそれより高い倍率に濃縮された原液などの、濃縮原液として提供され得る。反応混合物成分は、限定される訳ではないが、緩衝液、塩類、二価カチオン、共沸混合物、カオトロピック、ｄＮＴＰ、標識ヌクレオチド、非カノニカルヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド、染料、発蛍光団、ビオチン、酵素（エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、グリコシラーゼなど）またはそれらの任意の組み合わせを含む、本明細書で提供される組成物のいずれかを含み得る。
【０１６２】
場合によっては、キットは、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドプライマーなど、１つまたはそれより多くのオリゴヌクレオチドプライマーを含み得る。例えば、キットは、本明細書で提供される方法により生成されたポリヌクレオチドの末端に付加されたアダプター配列に指向した配列を含む、１つまたはそれより多くのオリゴヌクレオチドプライマーを含み得る。場合によっては、キットは、標的核酸（例、第１および／または第２アダプター配列に存在する配列）とハイブリダイゼーション可能な３’部分および標的核酸とはハイブリダイゼーションできない５’部分を含むテイルドプライマーを含み得る。場合によっては、テイルドプライマーの５’部分は、１つまたはそれより多くのバーコード配列または他の識別子配列を含むこともある。場合によっては、識別子配列は、フローセル配列、ＴｒｕＳｅｑプライマー配列、および／または第２のリードバーコード配列を含むこともある。
【０１６３】
場合によっては、キットは、１つまたはそれより多くのポリメラーゼ、またはその混合物を含み得る。場合によっては、その１つまたはそれより多くのポリメラーゼまたはその混合物は、鎖置換活性を含み得る。好適なポリメラーゼとしては、本明細書で提供されるポリメラーゼの任意のものが挙げられる。キットは、例えばｄＮＴＰ、非カノニカルヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体など、１つまたはそれより多くのポリメラーゼ基質をさらに含み得る。
【０１６４】
場合によっては、キットは、所望の生成物からフラグメント化生成物を除去する、核酸生成物の精製のための１つまたはそれより多くの手段、または上記の組み合わせを含み得る。核酸生成物の精製に好適な手段としては、限定される訳ではないが、１本鎖特異的エキソヌクレアーゼ、アフィニティーマトリックス、核酸精製カラム、スピンカラム、限外濾過または透析試薬、または限定される訳ではないが、アクリルアミドまたはアガロースを含む電気泳動試薬、またはこれらの任意の組み合わせがある。
【０１６５】
場合によっては、キットは、平滑末端を作製するための１つまたはそれより多くの試薬を含み得る。例えば、キットは、１つまたはそれより多くの、限定される訳ではないが、エキソヌクレアーゼ１またはエキソヌクレアーゼ７を含む１本鎖ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼ、緑豆エキソヌクレアーゼまたはＳ１エキソヌクレアーゼなどの１本鎖ＤＮＡ特異的エンドヌクレアーゼ、１つまたはそれより多くの、例えばＴ４  ＤＮＡポリメラーゼまたはＫｌｅｎｏｗポリメラーゼなどのポリメラーゼ、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。別法として、キットは、１つまたはそれより多くの１本鎖ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼおよび１つまたはそれより多くのポリメラーゼを含み得、この場合、試薬は混合物としては提供されない。さらに、平滑末端を作製するための試薬は、ｄＮＴＰを含み得る。
【０１６６】
場合によっては、キットは、アダプター分子へのライゲーションのための２本鎖生成物を調製するための１つまたはそれより多くの試薬を含み得る。例えば、本キットは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰまたはこれらの任意の混合物を含み得る。場合によっては、キットは、例えばＴ４ポリヌクレオチドキナーゼなどのポリヌクレオチドキナーゼを含み得る。さらに、キットは、平滑末端化された２本鎖ＤＮＡフラグメントからの３’伸長部を作製するのに適したポリメラーゼを含み得る。好適なポリメラーゼ、例えば、ｅｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼが含まれ得る。
【０１６７】
場合によっては、キットは、本明細書で提供されるアダプター分子のいずれかなど、１つまたはそれより多くのアダプター分子を含み得る。好適なアダプター分子には、１本鎖または２本鎖核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）分子またはその誘導体、ステム−ループ核酸分子、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０塩基またはそれより長い１つまたはそれより多くの１本鎖オーバーハングを含む２本鎖分子、タンパク質、ペプチド、アプタマー、有機分子、小有機分子、または２本鎖ＤＮＡフラグメントに、例えばライゲーションなどにより、共有結合的または非共有結合的に結合され得る当業界で既知の任意のアダプター分子がある。場合によっては、キットはアダプターを含むこともあり、このアダプターはデュプレックスアダプターであり得、この一方の鎖は既知または普遍的配列を含み、他方の鎖は５’および／または３’ブロックを含むものとする。長鎖はまた、５’または３’ブロックを含み得る。さらなる実施形態では、デュプレックスアダプターは、部分的デュプレックスアダプターである。場合によっては、部分的デュプレックスアダプターは、既知または普遍的配列を含む長鎖、および５’および３’ブロックを含む短鎖を含むこともある。長鎖はまた、５’または３’ブロックを含み得る。場合によっては、３’ブロックは、末端ジデオキシヌクレオチド（ｄｉｄｅｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）でブロックされていることもある。
【０１６８】
場合によっては、キットは、本明細書記載の方法のアダプター（複数も可）および２本鎖生成物間で形成されたライゲーション複合体でギャップまたはフィルイン修復を実施するための１つまたはそれより多くの試薬を含み得る。キットは、ギャップ修復の実施に好適なポリメラーゼを含み得る。好適なポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが含まれ得る。
【０１６９】
キットは、キットの使用についての使用説明書をさらに含み得る。例えば、キットは、限定される訳ではないが、例えばパイロシーケンシング、合成による配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、単一分子配列決定、ナノポア配列決定、およびライゲーション、高密度ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、大規模並列Ｑ−ＰＣＲによる配列決定、本明細書記載の方法により生成された増幅核酸生成物の特徴決定、またはこれらの任意の組み合わせを含む、大規模解析に有用なトランスクリプトームまたはゲノムの全体または一部を表す定方向性ポリヌクレオチドライブラリまたは定方向性ｃＤＮＡライブラリを生成するための使用説明書を含み得る。本キットは、１つまたはそれより多くの反応混合物成分を混合して、本明細書記載の方法に好適な１つまたはそれより多くの混合物を生成するための使用説明書をさらに含み得る。本キットは、１つまたはそれより多くのオリゴヌクレオチドプライマーを核酸鋳型にハイブリダイゼーションさせるための使用説明書をさらに含み得る。本キットは、例えばポリメラーゼおよび／または修飾ｄＮＴＰで１つまたはそれより多くのオリゴヌクレオチドプライマーを伸長させるための使用説明書をさらに含み得る。本キットは、ＤＮＡ生成物を開裂作用因子で処理するための使用説明書をさらに含み得る。場合によっては、開裂作用因子は、グリコシラーゼおよび化学的作用因子、または酵素である。グリコシラーゼは、ＵＮＧであり得る。化学的作用因子はポリアミンであり得る。ポリアミンはＤＭＥＤであり得る。酵素はエンドヌクレアーゼであり得る。エンドヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩまたはＡＰＥであり得る。キットは、本明細書で提供される方法の工程のいずれかにより提供される生成物のいずれかの精製についての使用説明書をさらに含み得る。本キットは、例えば１本鎖ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼまたはこれらの任意の組み合わせで、例えば１本鎖オーバーハングを除去するか、または１本鎖オーバーハングをフィルインすることによる、平滑末端化フラグメントを作製するための使用説明書をさらに含み得る。キットは、本明細書記載の方法により作製された２本鎖ＤＮＡフラグメントの５’末端をリン酸化するための使用説明書をさらに含み得る。キットは、１つまたはそれより多くのアダプター分子を２本鎖ＤＮＡフラグメントにライゲーションするための使用説明書をさらに含み得る。
【０１７０】
キットは、キットに含まれていない任意の他の試薬の使用に加えてキット成分を使用するための使用説明書を含むことになる／含み得る。使用説明書は、実行され得る変形を含み得る。
【０１７１】
特に断らない限り、本明細書で使用されている遺伝学、分子生物学、生化学および核酸の用語および記号は、例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、ニューヨーク、１９９２）、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ニューヨーク、１９７５）、ＳｔｒａｃｈａｎおよびＲｅａｄ、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第２版（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、ニューヨーク、１９９９）、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編集、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９１）、Ｇａｉｔ編集、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８４）など、本分野における標準学術論文およびテキストに記載のものに従うものとする。
【実施例】
【０１７２】
実施例１：１００ｎｇ全ＲＮＡ投入からの鎖ライブラリ調製
図３に記載されたプロセスを用いて、図３におけるプロセスの作業の流れにしたがってＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＵＨＲ）全ＲＮＡ試料（１００ｎｇ）から鎖ｃＤＮＡ配列決定ライブラリを生成した。
【０１７３】
ａ．）ｄＵを含む第１鎖ｃＤＮＡの合成：２μｌのＦｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ（ＮｕＧＥＮ、０３３４−３２）および２μｌのＨ２Ｏを、２μｌのＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ（５０ｎｇ／μｌ、Ａｇｉｌｅｎｔ）に加えた。この混合物を５分間６５℃でインキュベーションし、氷上で冷却した。以下の混合物を上記のものに加えた：２．５μｌのＦｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｍｉｘ（ＮｕＧＥＮ、０３３４−３２）、０．５μｌのＦｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（ＮｕＧＥＮ、０３３４−３２）、０．３７５μｌの１ｍＭ  ｄＵＴＰおよび０．６２５μｌのＨ２Ｏ。第１鎖ｃＤＮＡ合成を４０℃で３０分間実施した後、７０℃で１０分間インキュベーションした。
【０１７４】
ｂ．）第１鎖ｃＤＮＡのフラグメント化：０．５μｌのＵＳＥＲ  Ｅｎｚｙｍｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を、上記の第１鎖ｃＤＮＡ合成反応混合物に加え、反応混合物を３７℃で３０分間インキュベーションした後、９５℃で１０分間インキュベーションした。
【０１７５】
ｃ．）ＲＮＡ加水分解：２μｌの１Ｎ  ＮａＯＨを上記ｃＤＮＡフラグメント化反応混合物に加え、反応混合物を９５℃で１５分間インキュベーションし、次いで冷却した反応混合物に２μｌの１Ｎ  ＨＣｌを添加して反応混合物を中和することにより投入されたＲＮＡを加水分解した。
【０１７６】
ｄ．）精製：製造業者の使用説明書にしたがってｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、フラグメント化された第１鎖ｃＤＮＡを精製し、精製されたフラグメント化第１鎖ｃＤＮＡを１０μｌのＨ２Ｏ中で溶離した。
【０１７７】
ｅ．）一端に第１アダプターが付加されたｄｓＤＮＡへの第１鎖ｃＤＮＡの全フラグメントの変換：１０μｌの精製フラグメント化および３’ブロック化第１鎖ｃＤＮＡを、１．５μｌの１０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、１．５μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、フラグメント化第１鎖ｃＤＮＡのブロックされた３’末端とハイブリダイゼーション可能な０．５μｌの１０μＭ第１アダプター（ランダム配列の８−塩基３’オーバーハングを伴う３３ｂｐのｄｓＤＮＡ）および１μｌのＨ２Ｏと混合した。混合物を６５℃で５分間インキュベーションし、氷上で冷却した。０．５μｌのＢｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、（Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を添加し、反応混合物を２５℃で１５分間、３７℃で１５分間、次いで７０℃で１０分間インキュベーションすることにより、第１鎖ｃＤＮＡフラグメントに沿ってハイブリダイゼーションした第１アダプターの伸長を実施した。
【０１７８】
ｆ．）ＤＮＡ末端の研磨：上記反応混合物を０．５μｌのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）と合わせ、反応混合物を２５℃で３０分間、次いで７０℃で１０分間インキュベーションした。
【０１７９】
ｇ．）上記で作製されたｄｓ  ｃＤＮＡの平滑末端への第２アダプターのライゲーション：上記反応混合物に以下のものを添加することにより、ライゲーションを実施した：６μｌの５×Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、２．５μｌの２０μＭ第２アダプター、１．５μｌのＱｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、および５μｌのＨ２Ｏ。反応混合物を２５℃で３０分間、次いで７０℃で１０分間インキュベーションした。
【０１８０】
ｈ．）精製：ライゲーション生成物（第１アダプターが一端に付加され、他方の端に第２アダプターが付加されたｄｓＤＮＡ）を、０．８倍体積のＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて精製し、２５μｌ中で溶離した。
【０１８１】
ｉ．）ＰＣＲ増幅：上記で調製した第１アダプターおよび第２アダプターが付加された鎖ｃＤＮＡ生成物のライブラリを、第１アダプターおよび第２アダプターに特異的な配列、およびマルチプレックス配列決定を可能にするバーコードを含むプライマーで、以下のＰＣＲプログラムを用いた１７サイクルにわたって、ＰＣＲ増幅した：７０℃５分、１７×（９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分）７２℃５分。
【０１８２】
ｊ．）精製：ＰＣＲ産物（増幅された鎖ｃＤＮＡライブラリ）を、製造業者の使用説明書に従って１倍体積のＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて精製した。
【０１８３】
１００ｎｇのＵＨＲ全ＲＮＡから生成された一方向性配列決定ライブラリのサイズ分布を、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて分析した。前記ライブラリのサイズ分布を図６に示す。
【０１８４】
実施例２：１ｎｇ全ＲＮＡ投入からの鎖ｃＤＮＡライブラリの生成
ａ．）ｄＵを含む第１鎖ｃＤＮＡの合成：２μｌのＦｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ（ＮｕＧＥＮ、０３３４−３２）および２μｌのＨ２Ｏを、２μｌのＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ（０．５ｎｇ／μｌ、Ａｇｉｌｅｎｔ）に加えた。この混合物を５分間６５℃でインキュベーションし、氷上で冷却した。以下の混合物を上記のものに加えた：２．５μｌのＦｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｍｉｘ（ＮｕＧＥＮ、０３３４−３２）、０．５μｌのＦｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（ＮｕＧＥＮ、０３３４−３２）、０．３７５μｌの１ｍＭ  ｄＵＴＰおよび０．６２５μｌのＨ２Ｏ。第１鎖ｃＤＮＡ合成を４０℃で３０分間実施した後、７０℃で１０分間インキュベーションした。
【０１８５】
ｂ．）第１鎖ｃＤＮＡのフラグメント化：０．５μｌのＵＳＥＲ  Ｅｎｚｙｍｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を、上記の第１鎖ｃＤＮＡ合成反応混合物に加え、反応混合物を３７℃で３０分間インキュベーションした後、９５℃で１０分間インキュベーションした。
【０１８６】
ｃ．）ＲＮＡ加水分解：２μｌの１Ｎ  ＮａＯＨを上記ｃＤＮＡフラグメント化反応混合物に加え、反応混合物を９５℃で１５分間インキュベーションし、次いで冷却した反応混合物に２μｌの１Ｎ  ＨＣｌを添加して反応混合物を中和することにより投入されたＲＮＡを加水分解した。
【０１８７】
ｄ．）精製：製造業者の使用説明書にしたがってｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、フラグメント化された第１鎖ｃＤＮＡを精製し、精製されたフラグメント化第１鎖ｃＤＮＡを１０μｌのＨ２Ｏ中で溶離した。
【０１８８】
ｅ．）一端に第１アダプターが付加されたｄｓＤＮＡへの第１鎖ｃＤＮＡの全フラグメントの変換：１０μｌの精製フラグメント化および３’ブロック化第１鎖ｃＤＮＡを、１．５μｌの１０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、１．５μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、フラグメント化第１鎖ｃＤＮＡのブロックされた３’末端とハイブリダイゼーション可能な０．５μｌの１０μＭ第１アダプター（ランダム配列の８−塩基３’オーバーハングを伴う３３ｂｐのｄｓＤＮＡ）および１μｌのＨ２Ｏと混合した。混合物を６５℃で５分間インキュベーションし、氷上で冷却した。０．５μｌのＢｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、（Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を添加し、反応混合物を２５℃で１５分間、３７℃で１５分間、次いで７０℃で１０分間インキュベーションすることにより、第１鎖ｃＤＮＡフラグメントに沿ってハイブリダイゼーションした第１アダプターの伸長を実施した。
【０１８９】
ｆ．）ＤＮＡ末端の研磨：上記反応混合物を０．５μｌのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）と合わせ、反応混合物を２５℃で３０分間、次いで７０℃で１０分間インキュベーションした。
【０１９０】
ｇ．）精製：ＤＮＡを、１．５倍体積のＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて精製し、１８μｌのＨ２Ｏで溶離した。
【０１９１】
ｈ．）上記で作製されたｄｓ  ｃＤＮＡの平滑末端への第２アダプターのライゲーション：上記精製ＤＮＡ生成物に以下のものを添加することにより、ライゲーションを実施した：５μｌの５×Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、０．６２５μｌの２０μＭ第２アダプター、および１．５μｌのＱｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）。反応混合物を２５℃で３０分間、次いで７０℃で１０分間インキュベーションした。
【０１９２】
ｉ．）精製：ライゲーション生成物（第１アダプターが一端に付加され、他方の端に第２アダプターが付加されたｄｓＤＮＡ）を、０．８倍体積のＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて精製し、２５μｌのＨ２Ｏ中で溶離した。
【０１９３】
ｊ．）２工程の間に精製工程を挟んで２工程でＰＣＲ増幅を行った。
【０１９４】
以下のＰＣＲプログラムを用いて、１８サイクルにわたって第１工程ＰＣＲを実施した：７０℃５分、１８×（９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分）７２℃５分。
【０１９５】
この工程からのＰＣＲ産物を、０．８倍体積のＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて精製した。
【０１９６】
精製したＰＣＲ産物を、さらに以下のＰＣＲプログラムを用いて７サイクルにわたって増幅した：７×（９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分）７２℃５分。
【０１９７】
この２つの工程のＰＣＲは、プライマー−二量体アーチファクトの潜在的発生を減少させる目標を持って着手された。
【０１９８】
ｋ．）精製：製造業者の使用説明書にしたがって１倍体積のＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いることにより、ＰＣＲ産物（増幅された鎖ｃＤＮＡライブラリ）を精製した。
【０１９９】
実施例３：ＲＮＡ鎖保持効率およびトランスクリプトーム配列決定品質。
【０２００】
本明細書で提供される方法を用いた鎖保持効率を、ヒトｍＲＮＡのコーディングエキソン、３’−ＵＴＲおよび５’−ＵＴＲ領域ならびにｒＲＮＡに対しマッピングする配列リードの鎖バイアスを評価することにより実験的に確認した。本明細書で提供される方法および組成物にしたがって生成された定方向性ｃＤＮＡライブラリを、実施例１および２で記載されたように、１００ｎｇおよび１ｎｇの全ＵＨＲ  ＲＮＡから生成した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩを用いて、単一末端４０ヌクレオチドリードを生成した。配列決定データおよび鎖保持効率の結果を図９に要約した。図９は、１００ｎｇ（試料１、ｓ４＿Ｌ２ＤＲ１４、試料２、ｓ４＿Ｌ２ＤＲ１５）および１ｎｇの全ＵＨＲ  ＲＮＡ（試料３、ＢＣ１４）から生成されたライブラリについて９５％を超える鎖保持性およびｒＲＮＡから生成される極小のリードを示した。
【０２０１】
本明細書で提供される方法および組成物を用いることによる、実施例１および２に記載された定方向性ｃＤＮＡライブラリから生成されたトランスクリプトーム配列決定の品質を、配列決定データからさらに立証した。１００ｎｇ（試料１、ｓ４＿Ｌ２ＤＲ１４、試料２、ｓ４＿Ｌ２ＤＲ１５、図７）および１ｎｇの全ＵＨＲ  ＲＮＡ（試料３、ＢＣ１４、図１０）から生成されたライブラリについて示されたように、５’−３’表示の解析により、非バイアスの全トランスクリプトーム配列決定が立証される。さらに、実施例１および２で記載された定方向性ｃＤＮＡ配列決定ライブラリの生成に使用される第１鎖ｃＤＮＡプライマーの選択により、ｒＲＮＡの表示が最小であるライブラリが生成される。
【０２０２】
本明細書で提供される方法および組成物により、図８に示されるように、実施例１記載の要領で生成されたライブラリｓ４＿Ｌ２ＤＲ１４およびｓ４＿Ｌ２ＤＲ１５についての配列決定データ、１００万当たりの１キロベース転写物当たりのリード数（ＲＰＫＭ）の相関関係により示されるように、全ＲＮＡ試料からの定方向性ｃＤＮＡ配列決定ライブラリを用いた高度に再生可能な遺伝子発現プロファイリングが得られる。
【０２０３】
実施例４：単細胞から単離された全ＲＮＡからの鎖ライブラリ調製：
図１に示されたプロセスを、単細胞からＲＮＡを単離した後、図３でのプロセスの作業の流れに従った単細胞から単離された全ＲＮＡからの鎖ｃＤＮＡ配列決定ライブラリの生成に使用する。
【０２０４】
ａ．）単細胞を細胞溶解緩衝液中で溶解する。
【０２０５】
ｂ．）ｄＵを含む第１鎖ｃＤＮＡの合成：２μｌのＦｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ（ＮｕＧＥＮ、０３３４−３２）および２μｌのＨ２Ｏを、細胞溶菌液に加える。この混合物を５分間６５℃でインキュベーションし、氷上で冷却する。以下の混合物を上記のものに加える：２．５μｌのＦｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｍｉｘ（ＮｕＧＥＮ、０３３４−３２）、０．５μｌのＦｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（ＮｕＧＥＮ、０３３４−３２）、０．３７５μｌの１ｍＭ  ｄＵＴＰおよび０．６２５μｌのＨ２Ｏ。第１鎖ｃＤＮＡ合成を４０℃で３０分間実施した後、７０℃で１０分間インキュベーションする。
【０２０６】
ｂ．）第１鎖ｃＤＮＡのフラグメント化：０．５μｌのＵＳＥＲ  Ｅｎｚｙｍｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を、上記の第１鎖ｃＤＮＡ合成反応混合物に加え、反応混合物を３７℃で３０分間インキュベーションした後、９５℃で１０分間インキュベーションする。
【０２０７】
ｃ．）ＲＮＡ加水分解：２μｌの１Ｎ  ＮａＯＨを上記ｃＤＮＡフラグメント化反応混合物に加え、反応混合物を９５℃で１５分間インキュベーションし、次いで冷却した反応混合物に２μｌの１Ｎ  ＨＣｌを添加して反応混合物を中和することにより投入されたＲＮＡを加水分解する。
【０２０８】
ｄ．）精製：製造業者の使用説明書にしたがってｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、フラグメント化された第１鎖ｃＤＮＡを精製し、精製されたフラグメント化第１鎖ｃＤＮＡを１０μｌのＨ２Ｏ中で溶離する。
【０２０９】
ｅ．）一端に第１アダプターが付加されたｄｓＤＮＡへの第１鎖ｃＤＮＡの全フラグメントの変換：１０μｌの精製フラグメント化および３’ブロック化第１鎖ｃＤＮＡを、１．５μｌの１０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、１．５μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、フラグメント化第１鎖ｃＤＮＡのブロックされた３’末端とハイブリダイゼーション可能な０．５μｌの１０μＭ第１アダプター（ランダム配列の８−塩基３’オーバーハングを伴う３３ｂｐのｄｓＤＮＡ）および１μｌのＨ２Ｏと混合する。混合物を６５℃で５分間インキュベーションし、氷上で冷却する。０．５μｌのＢｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、（Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を添加し、反応混合物を２５℃で１５分間、３７℃で１５分間、次いで７０℃で１０分間インキュベーションすることにより、第１鎖ｃＤＮＡフラグメントに沿ってハイブリダイゼーションした第１アダプターの伸長を実施する。
【０２１０】
ｆ．）ＤＮＡ末端の研磨：上記反応混合物を０．５μｌのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）と合わせ、反応混合物を２５℃で３０分間、次いで７０℃で１０分間インキュベーションする。
【０２１１】
ｇ．）上記で作製されたｄｓ  ｃＤＮＡの平滑末端への第２アダプターのライゲーション：上記反応混合物に以下のものを添加することにより、ライゲーションを実施する：６μｌの５×Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、２．５μｌの２０μＭ第２アダプター、１．５μｌのＱｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、および５μｌのＨ２Ｏ。反応混合物を２５℃で３０分間、次いで７０℃で１０分間インキュベーションする。
【０２１２】
ｈ．）精製：ライゲーション生成物（第１アダプターが一端に付加され、他方の端に第２アダプターが付加されたｄｓＤＮＡ）を、０．８倍体積のＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて精製し、２５μｌ中で溶離する。
【０２１３】
ｉ．）ＰＣＲ増幅：上記で調製した第１アダプターおよび第２アダプターが付加された鎖ｃＤＮＡ生成物のライブラリを、第１アダプターおよび第２アダプターに特異的な配列、およびマルチプレックス配列決定を可能にするバーコードを含むプライマーで、以下のＰＣＲプログラムを用いた１７サイクルにわたって、ＰＣＲ増幅する：７０℃５分、１７×（９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分）７２℃５分。
【０２１４】
ｊ．）精製：製造業者の使用説明書にしたがって１倍体積のＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いることにより、ＰＣＲ産物（増幅された鎖ｃＤＮＡライブラリ）を精製する。
【０２１５】
本発明の好ましい実施形態を本明細書で示し、説明したが、かかる実施形態が例として挙げられたものに過ぎないことは、当業者には明らかなはずである。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、数多くの変形、変更および置き換えを想到することになろう。本明細書記載の本発明の実施形態に対する様々な代替形態が本発明を実践するにあたり使用され得ることは、理解される。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を規定するもので、これらの特許請求の範囲に含まれる方法および構造ならびにそれらの均等内容のものもそこに包含されるものとする。
【図２】
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【図８】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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