(57)【要約】  ヒトＩＬ−１βの活性のモジュレーションに関連する（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）疾患の処置または予防に使用することができる治療用組成物が記載されている。ある特定の態様では、開示されている態様は、ヒトＩＬ−１βに結合しその機能を減弱させることが可能であるヘテロダイマータンパク質アセンブリーの工学的作製に基づいている。ヘテロダイマータンパク質アセンブリーは、ヒトＩＬ１−Ｒ１およびヒトＩＬ−１ＲＡｃＰの細胞外部分、またはその機能的断片を含む。ＩＬ１−Ｒ１部分およびＩＬ−１ＲＡｃＰ部分はそれぞれ、ヒトＩｇガンマ−１のＦｃ部分の別個の突然変異体と融合している。ヘテロダイマータンパク質アセンブリー中の２つの別個のＦｃ突然変異体は、任意のホモマーアセンブリーよりも２つのＦｃ突然変異体間のヘテロマーのダイマー形成を優先するように工学的に作製される。哺乳動物細胞中でポリペプチドを過剰産生させるためのＤＮＡ発現ベクターおよび発現系も提供される。
2016513106.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩＬ−１βに結合することが可能なヘテロダイマータンパク質組成物であって、
ヒトＩＬ１−Ｒ１のアミノ酸１８から３３３を含む第１のアミノ酸配列、および
ヒト免疫グロブリンガンマ−１ＦｃのＦｃ部分の第１の突然変異体を含む第２のアミノ酸配列
を含む第１のポリペプチドと、
ヒトＩＬ１−ＲＡｃＰのアミノ酸２１から３５８を含む別の第１のアミノ酸配列、および
ヒト免疫グロブリンガンマ−１ＦｃのＦｃ部分の第２の突然変異体を含む別の第２のアミノ酸配列
を含む第２のポリペプチドと
を含み、
前記第１および第２の突然変異体が、任意のホモダイマーアセンブリーよりも前記第１および第２の突然変異体間のヘテロダイマーアセンブリーを優先するように選択されるタンパク質組成物。
【請求項２】
ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＥＣ５０が約５０ｎｇ／ｍｌであるヒトＩＬ−１β結合活性を示す、請求項１に記載のタンパク質組成物。
【請求項３】
前記第１のポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質組成物。
【請求項４】
ヒトＩＬ−１βに結合することが可能なヘテロダイマータンパク質組成物を含む治療用組成物であって、前記ヘテロダイマータンパク質組成物が、
ヒトＩＬ１−Ｒ１のアミノ酸１８から３３３を含む第１のアミノ酸配列、および
ヒト免疫グロブリンガンマ−１ＦｃのＦｃ部分の第１の突然変異体を含む第２のアミノ酸配列
を含む第１のポリペプチドと、
ヒトＩＬ１−ＲＡｃＰのアミノ酸２１から３５８を含む別の第１のアミノ酸配列、および
ヒト免疫グロブリンガンマ−１ＦｃのＦｃ部分の第２の突然変異体を含む別の第２のアミノ酸配列
を含む第２のポリペプチドと
を含み、
前記第１および第２の突然変異体が、任意のホモダイマーアセンブリーよりも前記第１および第２の突然変異体間のヘテロダイマーアセンブリーを優先するように選択される治療用組成物。
【請求項５】
５ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した後のマウスの全身循環における前記ヘテロダイマータンパク質組成物の半減期が、ヒトＦｃＥＬＩＳＡによってアッセイすると少なくとも約８８時間である、請求項４に記載の治療用組成物。
【請求項６】
配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、および配列番号２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含むヘテロダイマータンパク質組成物を含む治療用組成物。
【請求項７】
配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離核酸。
【請求項８】
配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離核酸。
【請求項９】
コドン使用が、哺乳動物細胞中で前記ポリペプチドを高発現させるのに最適化されている、請求項７または８に記載の核酸。
【請求項１０】
核酸配列が配列番号５の配列を含む、請求項７に記載の核酸。
【請求項１１】
核酸配列が配列番号６の配列を含む、請求項８に記載の核酸。
【請求項１２】
前記核酸が発現ベクターを含む、請求項１０または１１に記載の核酸。
【請求項１３】
配列番号７の単離核酸。
【請求項１４】
配列番号３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする核酸配列、および配列番号４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする別の核酸配列を含む発現ベクターを保有する異種発現系。
【請求項１５】
前記発現ベクターが哺乳動物細胞中に保有されている、請求項１４に記載の発現系。
【請求項１６】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１５に記載の発現系。
【請求項１７】
配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、および配列番号２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含むヘテロダイマータンパク質を発現させることが可能であり、前記ヘテロダイマータンパク質の発現のレベルが細胞培養物１リットル当たり少なくとも３００ｍｇである、請求項１５に記載の発現系。
【請求項１８】
ヒトＩＬ−１βの活性のモジュレーションに関連する疾患を処置または予防するための医薬を製造するための物質の使用であって、前記物質が、配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、および配列番号２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含むヘテロダイマータンパク質を含む使用。
【請求項１９】
前記疾患が関節炎である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記疾患が痛風である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
前記疾患が関節リウマチである、請求項１８に記載の使用。
【請求項２２】
前記疾患がクリオピリン関連周期性症候群（ＣＡＰＳ）である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２３】
前記疾患が強皮症である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２４】
前記疾患が糖尿病である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２５】
前記疾患がアテローム性動脈硬化である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２６】
前記疾患がドライアイ疾患である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２７】
前記疾患が眼アレルギーである、請求項１８に記載の使用。
【請求項２８】
前記疾患がブドウ膜炎である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２９】
ヒトＩＬ−１βの活性のモジュレーションに関連する疾患または状態を処置または予防する方法であって、ヒトＩＬ−１βの活性のモジュレーションに関連する疾患の処置または予防を必要とする患者に、配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、および配列番号２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含むヘテロダイマータンパク質を含む治療有効量の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項３０】
前記疾患が関節炎である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記疾患が痛風である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記疾患が関節リウマチである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記疾患がクリオピリン関連周期性症候群（ＣＡＰＳ）である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記疾患が強皮症である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記疾患が糖尿病である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記疾患がアテローム性動脈硬化である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記疾患がドライアイ疾患である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
前記疾患が眼アレルギーである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
前記疾患がブドウ膜炎である、請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
ヒトＩＬ−１βに結合することが可能なヘテロダイマータンパク質組成物であって、ヒトＩＬ−１βでのヒト肺線維芽細胞の処置に応答した線維芽細胞中のヒトＩＬ−６産生を阻害することが可能であり、前記阻害が約２．３ｐＭのＩＣ５０値を有するタンパク質組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
一般に、本発明は、生物医薬品ならびに炎症性障害に関連する状態（例えば、関節リウマチ、クローン病など）、糖尿病、心血管疾患および痛風におけるその使用の分野に関する。より具体的には、本発明は、ＩＬ−１βサイトカインを阻害することが可能であるヘテロダイマーＩＬ−１Ｒ１／ＩＬ−１ＲＡｃＰ由来組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−１（ＩＬ−１）サイトカインファミリーは、ヒトおよびマウスにおいて１１種の別個の遺伝子によってコードされる１１種のタンパク質（ＩＬ−１Ｆ１〜ＩＬ−１Ｆ１１）を含む。ＩＬ−１型サイトカインは、自然免疫反応の主なメディエーターであり、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ）による創始メンバーＩＬ−１またはＩＬ−１βの遮断は、いくつかのヒト自己炎症性疾患において中心的役割を示している。ＩＬ−１またはＩＬ−１βは、複数の異なる細胞型において何百もの遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ発現を急速に増大させる。ＩＬ−１およびＩＬ−１βの強力な炎症促進活性は、３つの主なレベル：（ｉ）合成および放出、（ｉｉ）膜受容体、ならびに（ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達で制限される。この経路は、ＩＬ−１応答を増幅しまたは終結させる正および負のフィードバック機構を含めたＩＬ−１またはＩＬ−１βの細胞外および細胞内シグナリングを集約する。受容体とリガンドの結合に応答して、複雑な一連のリン酸化およびユビキチン化を組み合わせた事象の結果、核因子カッパ−ＢシグナリングならびにＪＮＫおよびｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路が活性化され、このことが、協調して、転写および翻訳後の機構によるカノニカルＩＬ−１標的遺伝子（ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＣＯＸ−２、ＩＢ、ＩＬ−１、ＩＬ−１β、ＭＫＰ−１など）の発現を誘導する。注目すべきことに、ＩＬ−１に対する細胞応答に関与するほとんどの細胞内構成成分は、他のサイトカイン（ＩＬ−１８およびＩＬ−３３）、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、および多数の形態の細胞毒性ストレスに対する応答も媒介する（その教示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Weber A, et al., Sci Signal., 2010 Jan 19;3(105)を参照）。
【０００３】
ＩＬ−１およびＩＬ−１βは、普遍的に発現するＩ型ＩＬ−１受容体（ＩＬ−１Ｒ１）に独立に結合する。第３の特異的リガンドであるＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ）は、類似した特異性および親和性でＩＬ−１ＲＩに結合するが、受容体を活性化せず、下流のシグナリングを誘発しない。ＩＬ−１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ−１ＲＡｃＰ）は、ＩＬ−１／ＩＬ−１ＲＩ複合体のシグナル伝達に必要な共受容体として働き、この共受容体は、他のＩＬ−１ファミリーメンバー、特にＩＬ−１８およびＩＬ−３３によるＩＬ−１Ｒ１の活性化にも必要である。ＩＩ型ＩＬ−１受容体（ＩＬ−１Ｒ２）は、ＩＬ−１およびＩＬ−１βに結合するが、シグナリングの能力がある細胞質ゾル部分を欠き、したがってデコイ受容体として働く。ＩＬ−１ＲＡ、原形質膜に係留されたＩＬ−１Ｒ２、および細胞外ＩＬ−１受容体鎖それぞれの天然に存在する「脱落」ドメイン（ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩおよびｓＩＬ−１ＲＡｃＰと称し、ここで「ｓ」は可溶性を表す）は、細胞外空間におけるＩＬ−１シグナリングの誘導性の負の制御因子を提供し、その豊富さは、転写の増大および放出の調節の組合せによって制御され、ＩＬ−１の効果を限定しまたは終結させることができる。
【０００４】
ＩＬ−１シグナル伝達における最初のステップは、ＩＬ−１ＲＩの第１の細胞外ドメインにおいてリガンドによって誘導されるコンフォメーション変化であり、ＩＬ−１ＲａｃＰの動員を促す。ＴｏｌｌおよびＩＬ−１Ｒ様（ＴＩＲ）ドメインと呼ばれる、保存されている細胞質ゾル領域を通じて、トリマー複合体が、２つの細胞内シグナリングタンパク質、ミエロイド分化一次応答遺伝子８８（ＭＹＤ８８）およびインターロイキン−１受容体活性化プロテインキナーゼ（ＩＲＡＫ）４を急速にアセンブルする。ＭＹＤ８８またはＩＲＡＫ４を欠くマウスは、ＩＬ−１シグナリングにおける重度の欠陥を示す。同様に、ＩＲＡＫ４遺伝子に突然変異があるヒトは、ＩＬ−１ＲＩおよびＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）シグナリングに欠陥を有する。ＩＬ−１、ＩＬ−１ＲＩ、ＩＬ−ＲＡｃＰ、ＭＹＤ８８、およびＩＲＡＫ４は、ＩＬ−１によって誘導される安定な第１のシグナリングモジュールを形成する。これはＩＲＡＫ４の（自己）リン酸化に並行し、このリン酸化は続いてＩＲＡＫ１およびＩＲＡＫ２をリン酸化し、次いでこの後に腫瘍壊死因子関連因子（ＴＲＡＦ）６の動員およびオリゴマー化が起こる。ＩＲＡＫ１および２はアダプターとしてもプロテインキナーゼとしても機能して、下流シグナルを伝える。ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２、およびＴＲＡＦ６の複合体は、最初の受容体複合体から解離し、これらのタンパク質を欠く細胞は、転写因子である核因子カッパ−Ｂ（ＮＦ−カッパ−Ｂ）および活性化タンパク質１（ＡＰ−１）の活性化が損なわれている。
【０００５】
ＩＬ−１の過剰産生は、多数の炎症性障害の原因である。例えば、ＩＬ−１は、糖尿病、心血管疾患、痛風およびある特定の型の関節炎｛例えば、関節リウマチ（ＲＡ）｝の病理と連関している。
【０００６】
リロナセプトは、ヒトＩＬ１−ＲＡｃＰの細胞外ドメインのＩＬ−１結合部分、ヒトＩＬ−１ＲＩの細胞外ドメインのＩＬ−１結合部分、およびマルチマー化構成成分を含むＩＬ−１特異的融合タンパク質を含むＩＬ−１アンタゴニストである。このＩＬ−１特異的融合タンパク質は、米国特許第６，４７２，１７９号、２００３年７月３１日に公開された米国特許公開第２００３／０１４３６９７号、米国特許第７，３６１，３５０号、および２００５年９月８日に公開された米国特許公開第２００５／０１９７２９３号に記載されている（これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。商品名ＡＲＣＡＬＹＳＴであるリロナセプトは、成人および１２歳以上の小児における家族性寒冷自己炎症性症候群（Ｆａｍｉｌｉａｌ  Ｃｏｌｄ  Ａｕｔｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＦＣＡＳ）およびマックル−ウェルズ症候群（ＭＷＳ）を含めたクリオピリン関連周期性症候群（Ｃｒｙｏｐｙｒｉｎ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｅｒｉｏｄｉｃ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）（ＣＡＰＳ）の処置について米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）により承認を受けた。リロナセプトのさらなる臨床試験が、すなわち痛風について現在進行中である。
【発明の概要】
【０００７】
この概要は、詳細な説明（Ｄｅｔａｉｌｅｄ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）において以下でさらに説明される単純化された形での概念の選択を導入するために提供される。この概要は、特許請求に係る主題の鍵となる特徴または本質的な特徴を特定するものでもなく、特許請求に係る主題の範囲を決定する際の補助として使用されるものでもない。
【０００８】
ある特定の態様では、本発明は、ヒトＩＬ−１β（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＨ０８６７８．１）に結合することが可能なヘテロダイマータンパク質組成物を提供する。そのタンパク質組成物は、ヒトＩＬ１−Ｒ１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＭ８８４２３．１）のアミノ酸１８から３３３を含有する第１のアミノ酸配列、およびヒト免疫グロブリンガンマ−１Ｆｃ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｊ００２２８．１）のＦｃ部分の第１の突然変異体を含有する第２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドを含む。そのタンパク質組成物は、ヒトＩＬ１−ＲＡｃＰ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ２５４２１．１）のアミノ酸２１から３５８を含有する別の第１のアミノ酸配列、およびヒト免疫グロブリンガンマ−１ＦｃのＦｃ部分の第２の突然変異体を含有する別の第２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドも含む。そのタンパク質組成物において、第１および第２の突然変異体は、任意のホモダイマーアセンブリーよりも第１および第２の突然変異体間のヘテロダイマーアセンブリーを優先するように選択される。そのタンパク質組成物は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＥＣ５０が約５０ｎｇ／ｍｌであるヒトＩＬ−１β結合活性を示すことが可能であり得る。タンパク質組成物の第１のポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を含有し得、一方で第２のポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を含有し得る。
【０００９】
ある特定の態様では、本発明は治療用組成物を提供する。治療用組成物は、ヒトＩＬ−１βに結合することが可能なヘテロダイマータンパク質組成物を含む。そのタンパク質組成物は、ヒトＩＬ１−Ｒ１のアミノ酸１８から３３３を含有する第１のアミノ酸配列、およびヒト免疫グロブリンガンマ−１ＦｃのＦｃ部分の第１の突然変異体を含有する第２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドを含む。そのタンパク質組成物は、ヒトＩＬ１−ＲＡｃＰのアミノ酸２１から３５８を含有する別の第１のアミノ酸配列、およびヒト免疫グロブリンガンマ−１ＦｃのＦｃ部分の第２の突然変異体を含有する別の第２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドも含む。そのタンパク質組成物において、第１および第２の突然変異体は、任意のホモダイマーアセンブリーよりも第１および第２の突然変異体間のヘテロダイマーアセンブリーを優先するように選択される。治療用組成物は、ヒトＦｃＥＬＩＳＡによってアッセイすると少なくとも約８８時間の、５ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した後のマウスの全身循環におけるヘテロダイマータンパク質組成物の半減期を示し得る。治療用組成物は、配列番号１のアミノ酸配列を含有する第１のポリペプチド、および配列番号２のアミノ酸配列を含有する第２のポリペプチドからなるヘテロダイマータンパク質組成物を含み得る。
【００１０】
ある特定の態様では、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。その核酸のコドン使用は、哺乳動物細胞中でそのポリペプチドを高発現させるのに最適化することができる。１．その核酸は配列番号５の配列を含有し得る。その核酸は発現ベクターを含み得る。
【００１１】
ある特定の態様では、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。その核酸のコドン使用は、哺乳動物細胞中でそのポリペプチドを高発現させるのに最適化することができる。その核酸は配列番号６の配列を含有し得る。その核酸は発現ベクターを含み得る。
【００１２】
ある特定の態様では、本発明は、配列番号７の単離核酸を提供する。
【００１３】
ある特定の態様では、本発明は異種発現系を提供する。その発現系は、配列番号３のアミノ酸配列を含有する第１のポリペプチドをコードする核酸配列、および配列番号４のアミノ酸配列を含有する第２のポリペプチドをコードする別の核酸配列を含む発現ベクターを保有する。その発現系の発現ベクターは、哺乳動物細胞中に保有され得る。哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞であり得る。その発現系は、配列番号１のアミノ酸配列を含有する第１のポリペプチド、および配列番号２のアミノ酸配列を含有する第２のポリペプチドを含むヘテロダイマータンパク質を発現させることが可能であり得る。ヘテロダイマータンパク質の発現のレベルは、細胞培養物１リットル当たり少なくとも３００ｍｇであり得る。
【００１４】
ある特定の態様では、本発明は、ヒトＩＬ−１βの活性のモジュレーションに関連する疾患を処置または予防するための医薬を製造するための物質の使用を提供する。物質は、配列番号１のアミノ酸配列を含有する第１のポリペプチド、および配列番号２のアミノ酸配列を含有する第２のポリペプチドからなるヘテロダイマータンパク質を含む。ヒトＩＬ−１βの活性のモジュレーションに関連する疾患は、関節炎、痛風、関節リウマチ、クリオピリン関連周期性症候群（ＣＡＰＳ）、強皮症、糖尿病、アテローム性動脈硬化、ドライアイ疾患、眼アレルギーまたはブドウ膜炎であり得る。
【００１５】
ある特定の態様では、本発明は、ヒトＩＬ−１βの活性のモジュレーションに関連する疾患または状態を処置または予防する方法を提供する。その方法は、ヒトＩＬ−１βの活性のモジュレーションに関連する疾患の処置または予防を必要とする患者に、治療有効量の医薬組成物を投与することを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）。医薬組成物は、配列番号１のアミノ酸配列を含有する第１のポリペプチド、および配列番号２のアミノ酸配列を含有する第２のポリペプチドからなるヘテロダイマータンパク質を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）。ヒトＩＬ−１βの活性のモジュレーションに関連する疾患は、関節炎、痛風、関節リウマチ、クリオピリン関連周期性症候群（ＣＡＰＳ）、強皮症、糖尿病、アテローム性動脈硬化、ドライアイ疾患、眼アレルギーまたはブドウ膜炎であり得る。
【００１６】
ある特定の態様では、本発明は、ヒトＩＬ−１βに結合することが可能なヘテロダイマータンパク質組成物を提供する。そのタンパク質組成物は、ヒトＩＬ−１βでのヒト肺線維芽細胞の処置に応答した線維芽細胞中のヒトＩＬ−６産生を阻害することが可能である。その阻害は、約２．３ｐＭのＩＣ５０値によって特徴付けられる。
【００１７】
以下の図面および説明は、本発明の理解を助けるために示される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、柔軟なリンカー（ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｌｉｎｋｅｒ）を介してＩｇＧ−Ｆｃドメイン（Ｆｃ−ＩＩ）と融合したＩＬ１−Ｒ１の細胞外部分、および別の柔軟なリンカーを介して別のＩｇＧ−Ｆｃドメイン（Ｆｃ−Ｖ）と融合したＩＬ１−ＲＡｃＰの細胞外部分を含む本教示のヘテロダイマータンパク質アセンブリーを例示的に示す。
【図２】図２は、本発明のポリペプチドのクローニングにおいて使用されるＰＫＮ０１２プラスミドおよび注釈付き配列の地図を模式的に示す。
【図３】図３は、本発明のポリペプチドを発現させるための安定細胞株を作製するためのプロセスにおいて得られた代表的なトランスフェクション増殖曲線を示す。
【図４】図４は、陰イオン交換クロマトグラフィー精製工程後の、配列番号１のポリペプチドおよび配列番号２のポリペプチドを含むヘテロダイマーを含有する試料のサイズ排除ＨＰＬＣ分析クロマトグラムを示す（ｓｈｏｗｎ）。
【図５】図５は、陰イオン交換クロマトグラフィー精製工程後の、配列番号１のポリペプチドおよび配列番号２のポリペプチドを含むヘテロダイマーを含有する試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図６】図６は、市販のヒトＩＬ−１βを使用したＥＬＩＳＡアッセイにおける、配列番号１のポリペプチドおよび配列番号２のポリペプチドを含むヘテロダイマーを含有する精製試料の典型的な結合曲線を示す。
【図７】図７は、ＩＬ−１抗体媒介ＩＬ−６産生阻害アッセイ実験で得られた検量線を示す。
【図８】図８は、ＭＲＣ５細胞を５０ｐｇ／ｍｌ終濃度のＩＬ−１βと共に２４時間インキュベートしたか（ＩＬ−１単独）、または処置しなかった（細胞対照）、培養培地から得られる、ＩＬ−１β媒介ＩＬ−６産生およびＩＬ−６回収の結果を示し、細胞に曝露しなかった培養培地にＩＬ−６を２０ｐｇ／ｍｌの終濃度でスパイク（ｓｐｉｋｅ）してＩＬ−６回収を評価した。
【図９】図９は、ＭＲＣ５細胞を５０ｐｇ／ｍｌの終濃度のＩＬ−１βと共に２４時間インキュベートしたか（ＩＬ−１単独）、または処置しなかった（細胞対照）、培養培地からの得られる、ＩＬ−１β媒介ＩＬ−６産生およびＩＬ−６回収の測定の結果を示す。細胞に曝露しなかった培養培地にＩＬ−６を２０ｐｇ／ｍｌの終濃度でスパイクしてＩＬ−６回収を評価した。
【図１０】図１０は、本教示のＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩヘテロダイマーと共に実施したＩＬ−６産生阻害アッセイで得られた検量線を示す。
【図１１】図１１は、ＭＲＣ５細胞を５０ｐｇ／ｍｌの終濃度のＩＬ−１βと共に２４時間インキュベートしたか（ＩＬ−１単独）、または処置しなかった（細胞対照）、培養培地からの得られる、ＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩヘテロダイマーによるＩＬ−１β媒介ＩＬ−６産生の阻害測定およびＩＬ−６回収の結果を示し、細胞に曝露しなかった培養培地にＩＬ−６を３０ｐｇ／ｍｌの終濃度でスパイクしてＩＬ−６回収（ＲＰＨ−１０＋３０ｐｇ／ｍｌ  ＩＬ６）を評価した。この実験に使用した２つの細胞培養プレート間の一貫性を確保するために、両方のプレートから得られるＩＬ−６産生に対するＩＬ−１の効果を比較した（プレート１および２に対してそれぞれＩＬ−１単独およびＩＬ１単独プレート２）。ＩＬ−６産生に対する最高濃度（２０μｇ／ｍｌ）のＩＬ−１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩヘテロダイマーの効果も試験した（ＲＰＨ−１０単独）。２つのプレート間のデータの均一性を実証するために２０４．８ｎｇ／ｍｌの終濃度に相当するＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩヘテロダイマー希釈物も含めた（ＲＰＨ１Ｏプレート２）
【図１２】図１２は、ＭＲＣ５細胞を、様々な濃度のＬＩＲ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩヘテロダイマーと事前に混合したＩＬ−１βまたはＩＬ−１βと共にインキュベートしたＬＩＲ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩヘテロダイマー実験の滴定曲線測定の結果を示す。ＩＬ−６産生をＱｕａｎｔａｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡによって測定し、４パラメータフィットアルゴリズムを使用してデータを分析した。得られた等式の係数Ｃは、０．３ｎｇ／ｍｌまたは約２．４ｐＭのＩＣ５０値と数値的に等しい。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書で開示されている教示は、一部は、ヒトＩＬ−１βに結合しその機能を減弱させることが可能であるヘテロダイマータンパク質アセンブリーの工学的作製に基づいている。本教示のヘテロダイマータンパク質アセンブリーは、ＩＬ１−Ｒ１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＭ８８４２３．１）およびＩＬ−１ＲＡｃＰ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ２５４２１．１）の細胞外部分、またはその機能的断片を含む。ＩＬ１−Ｒ１部分およびＩＬ−１ＲＡｃＰ部分はそれぞれ、ヒトＩｇガンマ−１（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｊ００２２８．１）のＦｃ部分の別個の突然変異体と融合している。ヘテロダイマータンパク質アセンブリー中の２つの別個のＦｃ突然変異体は、任意のホモマーアセンブリーよりも２つのＦｃ突然変異体間のヘテロマーのダイマー形成を優先するように工学的に作製される。本教示のヘテロダイマータンパク質アセンブリーの組換え産生を可能にするために、異種タンパク質発現系においてヘテロダイマータンパク質アセンブリーを過剰産生させるためのＤＮＡ発現ベクターが構築されており、高い発現レベルへとヘテロダイマータンパク質アセンブリーを安定に発現する哺乳動物細胞が調製されている。本教示のヘテロダイマータンパク質アセンブリーの生理学的に重要である実質的に純粋な調製物を得ることを可能にするタンパク質精製手順が考案されている。こうして精製されたタンパク質分子は、ヒトＩＬ−１β（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＨ０８６７８．１）を使用したインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において高度の比活性を示す。予想外なことに、タンパク質分子は、皮下動物投与に対して許容可能な薬物動態プロファイルを示すが、体重減少または有害な臨床的事象をもたらさない。
【００２０】
本明細書で使用される用語は、一般に、本発明の場面内で、各用語が使用される具体的な場面において、当技術分野におけるその通常の意味を有する。本発明の組成物および方法ならびにどのようにそれらを作製および使用するかを説明する際に実施者にさらなる案内を提供するために、特定の用語について、以下でまたは本明細書の他の箇所で論じる。用語の任意の使用の範囲または意味は、その用語が使用される具体的な場面から明らかであろう。「約（ａｂｏｕｔ）」および「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、一般に、測定値の性質または正確性を考慮して、測定された量について許容可能な程度の誤差を意味するものとする。典型的には、例示的な誤差の程度は、所与の値または値の範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内である。あるいは、特に生物系において、「約」および「およそ」という用語は、所与の値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内である値を意味し得る。本明細書において与えられる数量は、特に指定しない限りおおよそのものであり、明示的に指定されないときには「約」または「およそ」という用語が推察され得ることを意味する。
【００２１】
本発明の方法は、野生型配列と１つまたは複数の突然変異体（配列変異体）を含めた、配列を互いに比較するステップを含み得る。そのような比較は、典型的には、例えば当技術分野で周知である配列アラインメントプログラムおよび／またはアルゴリズム（例えば、いくつか挙げると、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＭＥＧＡＬＩＧＮ）を使用したポリマー配列のアラインメントを含む。当業者なら、突然変異が残基の挿入または欠失を含有するそのようなアラインメントにおいて、配列アラインメントが、挿入または欠失した残基を含有しないポリマー配列中に「ギャップ」（典型的にはダッシュ記号または「Ａ」で表される）を導入することを容易に認識することができる。
【００２２】
本発明の方法は、統計計算、例えばＩＣ５０またはＥＣ５０値の決定などを含み得る。当業者なら、そのようなことが、市販されているソフトウェア、例えばＰＲＩＳＭ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）または類似のものを使用して行うことができることを容易に認識することができる。
【００２３】
全てのその文法的な形およびつづりの変化形において、「相同な（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」は、同じ種の生物におけるスーパーファミリーのタンパク質、ならびに異なる種の生物の相同なタンパク質を含めた、「共通の進化的起源」を所有する２つのタンパク質間の関係を指す。そのようなタンパク質（およびそれをコードする核酸）は、パーセント同一性の点からであれ特定の残基またはモチーフおよび保存されている位置の存在によってであれ、その配列類似性により反映される配列相同性を有する。しかし、一般的な使用および本出願において、「相同な」という用語は、「高度に」などの副詞で修飾されたとき、配列類似性を指し得、共通の進化的起源に関連していてもよく、またはしていなくてもよい。
【００２４】
全てのその文法的な形において、「配列類似性」という用語は、核酸またはアミノ酸配列間の同一性または一致の程度を指し、その配列は、共通の進化的起源を共有していてもよく、またはしていなくてもよい。
【００２５】
「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は互換的に使用される。本明細書に記載のポリペプチドは、２つ以上の連続するアミノ酸鎖からなってもよく、それによってダイマーが形成され、または他のオリゴマー形成がなされる。一般に、哺乳動物中で使用するための本教示のポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｔｉｄｅｓ）は、ＣＨＯまたはＨＥＫ２９３細胞株など、適当な翻訳後修飾を可能にする哺乳動物細胞中で発現されるが、他の哺乳動物発現細胞株も同様に有用であることが予想される。したがって、本教示のポリペプチドを、その生物学的機能に実質的に影響を及ぼさずに翻訳後修飾できることが予期される。
【００２６】
ある特定の態様では、本教示のヘテロダイマータンパク質アセンブリーの機能的変異体は、ヒトＩＬ１−Ｒ１もしくはＩＬ−１ＲＡｃＰの少なくとも生物学的に活性な部分またはその機能的断片、および１つまたは複数の融合ドメインを有する融合タンパク質を含む。そのような融合ドメインの周知の例には、それだけに限らないが、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（例えばＦｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはヒト血清アルブミンがある。融合ドメインは、所望の特性を付与するように選択することができる。例えば、ＩＬ１−Ｒ１またはＩＬ−１ＲＡｃＰポリペプチド部分を、ＩＬ１−Ｒ１またはＩＬ−１ＲＡｃＰポリペプチドをインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で安定化させるドメイン（「安定化」ドメイン）と、適宜適切なペプチドリンカーを介して融合することができる。「安定化させる」という用語は、これが破壊の低下、クリアランスの低下、または他の薬物動態効果のためであるかどうかに関わらず、全身循環においてポリペプチドの半減期を増大させるものを意味する。免疫グロブリンのＦｃ部分との融合は、ある特定のタンパク質に対して望ましい薬物動態特性を付与することが知られている。同様に、ヒト血清アルブミンとの融合も望ましい特性を付与することができる。選択することができる他の型の融合ドメインには、マルチマー化（例えばダイマー化、テトラマー化）ドメイン、および追加の生物学的機能、例えばインビボで標的とする作用部位での蓄積を促進する機能を付与する機能的ドメインがある。
【００２７】
ある特定の態様では、本教示のヘテロダイマータンパク質アセンブリーは、ＩｇＧ−Ｆｃドメインと融合したＩＬ１−Ｒ１の細胞外部分、またはその機能的断片、および別のＩｇＧ−Ｆｃドメインと融合したＩＬ−１ＲＡｃＰの細胞外部分、またはその機能的断片を含む。ＩｇＧ−Ｆｃドメインおよび別のＩｇＧ−Ｆｃドメインは、任意のホモダイマータンパク質アセンブリーよりもヘテロダイマータンパク質アセンブリーを優先するように選ばれる。ＩＬ１−Ｒ１の細胞外部分は、柔軟なリンカーを介してＩｇＧ−Ｆｃドメインと融合させることができ、一方でＩＬ−１ＲＡｃＰ、またはその機能的断片は、同じアミノ酸配列の柔軟なリンカーを介して、または別の柔軟なリンカーを介して別のＩｇＧ−Ｆｃドメインと融合させることができる。
【００２８】
図１に例示的に示されている例となる実施形態では、柔軟なリンカーを介してＩｇＧ−Ｆｃドメイン（Ｆｃ−ＩＩ）と融合したＩＬ１−Ｒ１の細胞外部分は、配列番号１のアミノ酸配列を含み得、一方で柔軟なリンカーを介して別のＩｇＧ−Ｆｃドメイン（Ｆｃ−Ｖ）と融合したＩＬ−１ＲＡｃＰは、配列番号２のアミノ酸配列を含み得る。
ｈＩＬ１−Ｒ１−ｈＩｇＧ１−Ｆｃポリペプチド（配列番号１）
【化１】
2016513106.tif 000003
ｈＩＬ−１ＲＡｃＰ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃポリペプチド（配列番号２）
【化２】
2016513106.tif 000004
【化３】
2016513106.tif 000005
【００２９】
ある特定の態様では、本教示は、柔軟なリンカーを介してＩｇＧ−Ｆｃドメイン（Ｆｃ−ＩＩ）と融合したヒトＩＬ１−Ｒ１の先頭の３３３アミノ酸を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する組換えＤＮＡ分子、および柔軟なリンカーを介して別のＩｇＧ−Ｆｃドメイン（Ｆｃ−Ｖ）と融合したヒトＩＬ−１ＲＡｃＰの先頭の３５８アミノ酸を含む別のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する別の組換えＤＮＡ分子を提供する。
【００３０】
例となる実施形態では、柔軟なリンカーを介してＩｇＧ−Ｆｃドメイン（Ｆｃ−ＩＩ）と融合したヒトＩＬ１−Ｒ１の先頭の３３３アミノ酸を含むポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。それと対応するＤＮＡ分子は、配列番号４のヌクレオチド配列を含み得る。柔軟なリンカーを介して別のＩｇＧ−Ｆｃドメイン（Ｆｃ−Ｖ）と融合したヒトＩＬ−１ＲＡｃＰの先頭の３５８アミノ酸を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）別のポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含み得る。それと対応するＤＮＡ分子は、配列番号６のヌクレオチド配列を含み得る。
ｈＩＬ１−Ｒ１−ｈＩｇＧ１−Ｆｃポリペプチド（配列番号３）
【化４】
2016513106.tif 000006
【化５】
2016513106.tif 000007
ｈＩＬ１−Ｒ１−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ  ＤＮＡ（配列番号４）
【化６】
2016513106.tif 000008
【化７】
2016513106.tif 000009
ｈＩＬ−１ＲＡｃＰ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃポリペプチド（配列番号５）
【化８】
2016513106.tif 000010
ｈＩＬ−１ＲＡｃＰ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ  ＤＮＡ（配列番号６）
【化９】
2016513106.tif 000011
【化１０】
2016513106.tif 000012
【００３１】
ある特定の態様では、本発明は、柔軟なリンカーを介してＩｇＧ−Ｆｃドメイン（Ｆｃ−ＩＩ）と融合したヒトＩＬ１−Ｒ１の先頭の３３３アミノ酸を含むポリペプチドを高発現させるための組換え哺乳動物（ｍａｍａｌｉａｎ）発現プラスミド、および柔軟なリンカーを介して別のＩｇＧ−Ｆｃドメイン（Ｆｃ−Ｖ）と融合したヒトＩＬ−１ＲＡｃＰの先頭の３５８アミノ酸を含む別のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する別の組換えＤＮＡ分子を提供する。このプラスミドは、それぞれその後に転写終結配列およびポリアデニル化配列が続く、前記ポリペプチドおよび前記別のポリペプチドをコードする２つの遺伝子の転写を推進する２つのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む。そのプラスミドは、細菌中でのプラスミド増殖および選択を支援するための複製起点、およびアンピシリン耐性を付与する遺伝子も含有する。そのプラスミドは、安定なＣＨＯＫ１およびＮＳＯ細胞株を樹立するのに広く使用される選択可能マーカーであるグルタチオンシンセターゼの遺伝子をさらに含有する。本発明のプラスミドは、図２に例示的に示されている。
【００３２】
例となる実施形態では、本教示の哺乳動物発現プラスミドは、配列番号７のヌクレオチド配列を含む。
ｈＩＬ１−Ｒ１−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ−ＩＩ／ＩＬ−１ＲＡｃＰ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ−Ｖ発現プラスミド（配列番号７）
【化１１】
2016513106.tif 000013
【化１２】
2016513106.tif 000014
【化１３】
2016513106.tif 000015
【化１４】
2016513106.tif 000016
【化１５】
2016513106.tif 000017
【化１６】
2016513106.tif 000018
【化１７】
2016513106.tif 000019
【化１８】
2016513106.tif 000020
【００３３】
ある特定の態様では、本教示は、柔軟なリンカーを介してＩｇＧ−Ｆｃドメイン（Ｆｃ−ＩＩ）と融合したヒトＩＬ１−Ｒ１のアミノ酸残基１８から３３３を含むポリペプチド、および柔軟なリンカーを介して別のＩｇＧ−Ｆｃドメイン（Ｆｃ−Ｖ）と融合したヒトＩＬ−１ＲＡｃＰのアミノ酸残基２１から３５８を含む別のポリペプチドを含むヘテロダイマータンパク質アセンブリーを産生するための哺乳動物発現系を提供する。
【００３４】
例となる実施形態では、本発明の哺乳動物発現系は、配列番号７のヌクレオチド配列を含むプラスミドを保有するチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）を含む。
【００３５】
ある特定の態様では、本教示は、ＩＬ−１βモジュレーションに関連する以下の障害：関節炎、痛風、関節リウマチ、クリオピリン関連周期性症候群（ＣＡＰＳ）、強皮症、糖尿病、アテローム性動脈硬化、ドライアイ疾患、眼アレルギー、またはブドウ膜炎によって影響を受けている哺乳動物を処置する方法を提供する。
【実施例】
【００３６】
以下の実施例は、本教示の上記態様および他の態様を例示する。これらの非限定的な実施例は、本出願で特許請求される化合物、組成物、物品、デバイスおよび／または方法がどのように創作され、評価されるかに関する例示的実施形態を当業者に提示するように記載される。実施例は、本明細書に開示する本発明を単に例示することを意図し、本発明者らがその発明としてみなす範囲を限定する意図はない。数字（例えば、量、温度など）に関する正確度を保証するために努力がなされているが、ある程度の誤差および偏差が考慮されるべきである。
【実施例１】
【００３７】
本発明のポリペプチドを発現させるためのプラスミドの構築。
ＩＬ−１Ｒ１の残基アミノ酸残基１〜３３３またはＩＬ−１ＲＡｃＰの残基１〜３５８をコードする配列を含む最適化された遺伝子配列を化学的に合成した。得られた断片をＦｃ−ＶまたはＦｃ−ＩＩをコードする配列を含むレシピエント中間体ベクター中にＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｐＥＩ制限部位を介してインフレームで（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）クローニングした。得られた陽性クローンをＤＮＡシークエンシングによって確認した。生じたコンストラクトをそれぞれＰＫＮ００１’−ＩＬ−１Ｒ−ＦｃＶおよびＰＫＮ００１’−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩと称した。
【００３８】
次いで、ＩＬ−１Ｒ１−Ｆｃ−Ｖをコードする遺伝子を、ＰＫＮ００２と称する第２の中間体ベクター中にＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を介してクローニングした。陽性クローンを二重消化によってスクリーニングし、正しいプラスミドの挿入配列をＤＮＡシークエンシングによって確認した。生じたコンストラクトをＰＫＮ００２−ＩＬ−１Ｒ−ＦｃＶと称した。
【００３９】
最後に、ＰＫＮ００１’−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩからのＲＡｃＰ−ＦｃＩＩの発現カセットをＰＫＮ００２−ＩＬ−１Ｒ−ＦｃＶプラスミド中にＮｏｔＩおよびＳａｌＩ制限部位を介して組み込み、ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩおよびＩＬ−１Ｒ−ＦｃＶの両方の発現エレメントを含有した新たな組換えコンストラクトを生成した。生じたクローンをＮｏｔＩおよびＳａｌＩ二重消化、次いでＤＮＡゲル電気泳動によってスクリーニングし、正しいクローンは、一つのバンドがおよそ８ｋｂのＤＮＡ断片として移動し、別のバンドがおよそ４ｋｂのＤＮＡ断片として移動することを示していた。最終的なプラスミドをＰＫＮ０１２−ＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩと称した。
【００４０】
組換えプラスミドＰＫＮ０１２−ＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩは、ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩおよびＩＬ−１Ｒ−ＦｃＶの両方の発現カセットを組み合わせたものである。このプラスミドを使用して、ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩおよびＩＬ−１Ｒ−ＦｃＶタンパク質をＣＭＶプロモーターの制御下、１対１の比で共発現させることができる。次いで、これらの２つの融合タンパク質の大部分が、分泌された後にＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ／ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩヘテロダイマーを形成することになる。このプラスミドはさらに、ＳＶ４０プロモーターを介してグルタミン合成酵素（ＧＳ）タンパク質を発現し、このタンパク質は、ＩＬ−１Ｒ−ＦｃＶ／ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩヘテロダイマーを産生する安定細胞株を作製するための選択マーカーとして使用することができる。図２にＰＫＮ０１２−ＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩのプラスミド地図を例示的に示す。
【実施例２】
【００４１】
本発明のポリペプチドを発現させるための安定細胞株の作製。
配列番号１のｈＩＬ１−Ｒ１−ｈＩｇＧ１−Ｆｃポリペプチドおよび配列番号２のｈＩＬ−１ＲＡｃＰ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃポリペプチドを共発現させるＣＨＯ−Ｋ１細胞の安定クローンを標準的な細胞生物学プロトコールに従って作製した。実施例１に記載した発現プラスミドＰＫＮ０１２−ＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩを使用して、前記ポリペプチドを高発現させるための安定細胞株を作製した。複数のクローンにおける前記ポリペプチドの発現レベルは、７日の回分培養において約１００ｍｇ／Ｌまたはそれを超えた。あるクローン細胞株が、振盪フラスコ回分培養において約３００ｍｇ／Ｌまたはそれを超える発現レベルを示した。
【００４２】
材料
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）をＡＴＣＣから凍結ストック（ＣＣＬ−６１（商標））として入手した。この細胞を自社で（ｉｎ  ｈｏｕｓｅ）ＣＤ  ＣＨＯ培地に順応させた。培地および試薬は市販の供給源から入手した。十分に順応させると、細胞を数回の継代の間、高密度になるまで増殖させた。生じた細胞をサブクローニングした。倍加時間が２０時間未満であり、形態が良好である生じたクローンのうちの一つを親細胞株として選択した。
【００４３】
方法
継代数４のＣＨＯ−Ｋ１細胞を６ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含有するＣＤ−ＣＨＯ既知組成培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。細胞は、４×１０６個／ｍｌの細胞密度に達した後、１：３の継代比率（ｓｐｌｉｔ）で維持した。細胞を遠心分離によって沈降させ、１ｍｌのＣＤ−ＣＨＯ既知組成培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁させた。
【００４４】
以下のエレクトロポレーションプロトコールを利用した。
−  １００ｕｌの滅菌ＴＥ緩衝液中の４０ｕｇプラスミドＤＮＡをエレクトロポレーションに使用した。トランスフェクションの日に、細胞の生存率は少なくとも９５％であった。
−  細胞を８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を１０ｍｌのＣＤ  ＣＨＯ培地に再懸濁させ、再び遠心分離した。
−  上清を除去し、細胞を少容量のＣＤ  ＣＨＯ培地に再懸濁させて１.４３×１０７個／ｍｌとした。
−  ０．７ｍｌの細胞（１０７個）をＤＮＡに添加し、ピペッティングによって泡が発生しないように穏やかに混合した。
−  直ちに、各キュベットに３００ボルト、９００ｕＦの単一パルスを送ることにより細胞をエレクトロポレーションした。
−  直ちに、エレクトロポレーションした細胞に５０ｍｌのＣＤ  ＣＨＯ（Ｌ−グルタミンなし）を添加し、穏やかに混合した。
−  細胞懸濁液を１０枚の９６ウェルプレートに５０ｕｌ／ウェルで分配した。翌日、各ウェルに３３．３ｕＭ  ＭＳＸを含有する１５０ｕｌのＣＤ  ＣＨＯを添加した。
【００４５】
可能性のあるＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩ発現細胞株を作製するプロセスにおいて、ＣＨＯ−Ｋ１細胞でいくつものトランスフェクションを実施した。代表的なトランスフェクション増殖曲線を図３に示し、そのデータを表１に示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質発現レベルを分析した。タンパク質過剰発現が高レベルである細胞株は、見かけの分子量約１８０ｋＤａの強いバンドを示す。予備的な分析に基づいて、４つのクローンをさらなる分析のために選択し、その分析で発現レベルをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＥＬＩＳＡによってさらに評価した。十分に発現しているクローンを１２５ｍｌの振盪フラスコ中に接種し、細胞を増殖させ、凍結させた。
【００４６】
選ばれた最高生産の細胞株を選択し、ＣＤ−ＣＨＯ中に解凍した。この細胞株に対して増殖曲線を評価し、細胞数、細胞生存率およびＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩの生産性を求めるために試料を毎日採取した。これらの試験に基づいて、選択された最高生産性の細胞株は、量産を支援するのに必要な量のＣＤ−ＣＨＯ培地中でＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩヘテロダイマーを発現していることが決定された。精製後のヘテロダイマーの収率は少なくとも約３００ｍｇ／Ｌであった（生産最適化は行われず）。
【００４７】
【表１】
2016513106.tif 000021
【実施例３】
【００４８】
本発明のポリペプチドの精製。
配列番号１のｈＩＬ１−Ｒ１−ｈＩｇＧ１−Ｆｃポリペプチドおよび配列番号２のｈＩＬ−１ＲＡｃＰ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃポリペプチドを、本質的に上記実施例２に記載の通りＣＨＯ−Ｋ１において共発現させた。十分に確立されたプロトコールを利用して細胞を収集し、溶解させた。細胞溶解物の清澄化後、発現したｈＩＬ１−Ｒ１−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ／ｈＩＬ−１ＲＡｃＰ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃポリペプチドを約０．４ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で含有する上清をプロテインＡアフィニティーカラムにアプライした。表２に概説されている手順に従ってアフィニティー精製工程を実施した。ｐＨ約３．５〜３．７のｈＩＬ１−Ｒ１−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ／ｈＩＬ−１ＲＡｃＰ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃを含有するプロテインＡ溶出液を４５〜６０分間インキュベートして、潜在的に存在する汚染物質を不活性化する。
【００４９】
物質をｐＨ３．６、室温で約４５分間インキュベートした後、そのｐＨは２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．５によって約７．９〜８．１に調整される（約３．５％ｖ／ｖの希釈ＰｒｏＡ溶出液）。低ｐＨ処理プロテインＡ溶出液は、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０を使用して約８．０のｐＨにｐＨ調整される。必要に応じて、伝導率は脱イオン水（ｄＨ２Ｏ）で約５．５ｍＳ／ｃｍに調整される。
【００５０】
ＤＮＡ、ＨＣＰ、内毒素および潜在的なウイルス汚染物質の各含有量を減少させるために、ｐＨ調整されたプロテインＡカラム溶出液を、Ｑセファロースを利用した陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＩＥＸ）によってさらに精製した。ＡＩＥＸ工程は、表３に概説される工程−溶出手順に従って操作される。プールされた溶出ピーク画分は、精密濾過によって約２０ｍｇ／ｍｌの濃度に濃縮された後、２０％スクロース原液をスクロース終濃度約１％（ｗ／ｖ）まで添加し、−８０℃で凍結させる。
【００５１】
こうして精製されたタンパク質の試料をサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元および非還元）によって分析した。それぞれ分析の結果を図４および図５に示す。図５では、レーン１、３はｈＩＬ１−Ｒ１−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ／ｈＩＬ−１ＲＡｃＰ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃの非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、レーン４、６は、その還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン２、５は分子量マーカーを示す。ｈＩＬ１−Ｒ１−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ／ｈＩＬ−１ＲＡｃＰ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃヘテロダイマーは、見かけ分子量がいずれも約９０ｋＤａのジスルフィド結合した２つのモノマーからなる約１８０ｋＤａの見かけ分子量を有する。
【００５２】
表４にＳＥＣ−ＨＰＬＣ操作手順を概説する。添加する試料は、移動相で約５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に達するまで希釈される。ｈＩＬ１−Ｒ１−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ／ｈＩＬ−１ＲＡｃＰ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃヘテロダイマーの生体関連形態は、保持時間ＲＴ＝１４．９７９ｍｉｎの主ピークによって表される。
【００５３】
【表２】
2016513106.tif 000022
【００５４】
【表３】
2016513106.tif 000023
【００５５】
【表４】
2016513106.tif 000024
【００５６】
本質的に本実施例に記載の通り発現され精製されたこの精製試料の活性は、市販のヒトＩＬ−１β（ＰｒｉｍＧｅｎｅ、上海、中国；カタログ番号：１０１−０１Ｂ）を使用して標準的なＥＬＩＳＡアッセイで試験した。図６に、このアッセイで得られた典型的な結合曲線を示す。曲線分析に基づいて、計算されたＥＣ５０値は、約５０ｎｇ／ｍｌである。
【実施例４】
【００５７】
ヒト細胞におけるＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩヘテロダイマーによるＩＬ−１β誘発ＩＬ−６産生の阻害の特徴付け。
本実施例により、ＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩヘテロダイマーがヒトＩＬ−１βを標的とする上での強力な機能（阻害）特性が実証される。機能比較物質（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）して、すでに特徴付けられたＩＬ−１βに対するマウスモノクローナル抗体を使用した。ヒト肺線維芽細胞ＭＲＣ５は、ＩＬ−１βによる処置に応答してＩＬ−６を産生する。ＭＲＣ５細胞におけるＩＬ−１β誘発ＩＬ−６産生の定量をアッセイ機能アウトプット（ａｓｓａｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｏｕｔｐｕｔ）として使用した。ＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩヘテロダイマーおよび対照の抗ＩＬ−１β抗体によるＩＬ−６産生の阻害は、ＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩヘテロダイマー調製物の阻害特性の定量的測度となる。
【００５８】
ＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩヘテロダイマーのポリペプチド（配列番号１および配列番号２）を、本質的に上記実施例に記載の通り共発現させ、精製した。使用した試料中の実質的に純粋なＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩヘテロダイマーのタンパク質濃度は、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、２５ｍＭアルギニン塩酸塩、１％スクロース；ｐＨ＝６．３中、０．９ｍｇ／ｍｌであった。
【００５９】
このアッセイにおいて以下の材料を使用した。
細胞：ＭＲＣ５細胞、ヒト肺線維芽細胞、ＡＴＣＣカタログ番号ＣＣＬ−１７１、ロット番号５９４７４７０７。
培地：ＤＭＥＭ、ダルベッコ変法イーグル培地、高グルコース（４．５ｇ／Ｌ）、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、カタログ番号１０−０１７−ＣＭ、ロット番号１００１７２０４、Ｌ−グルタミンおよび１×ペニシリン／ステレプトマイシンおよび１０％ウシ胎仔血清、Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＢ−０５、ロット番号１０５１０４を補充。
試薬：ＩＬ−１β、ヒト組換え体、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来、Ａｌａ１１７〜Ｓｅｒ２６９、受託番号ＮＰ０００５６７、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２０１−ＬＢ、ロット番号ＡＤＭ１４１１０６２；ヒトＩＬ−１βに対するモノクローナル抗体、クローン番号８５１６、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＭＡＢ２０１、ロット番号ＡＷＥ１０１１０８１；ヒトＩＬ−６Ｑｕａｎｔａｋｉｎｅイムノアッセイ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号Ｄ６０５０、ロット番号３０００７０。
【００６０】
このアッセイにおいて以下の手順を利用した。
細胞維持：
１．製造元の推奨に従って、Ｔ７５フラスコにおいて１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中でＭＲＣ５細胞を増殖させる。継代数を記録する。
２．細胞をトリプシン処理し、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中に再懸濁させる。
３．Ｇｕａｖａ  ＶｉａＣｏｕｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔを使用して細胞生存率を試験する。標準生存率は８５％を超えるべきであり、それよりも低い場合、その細胞バッチは使用しない。
４．細胞の希釈物を調製して、４８ウェルプレートの１ウェル当たり２×１０３個／ウェルまたは５×１０３個／ｍｌの所望の細胞密度で播種する。
５．細胞を３７℃、５％ＣＯ２で１６〜２４時間付着させ、次いで培地を除去する。
６．１０％ＦＢＳを補充した新たなＤＭＥＭ培地に、４８ウェルプレートに対して０．４ｍｌ／ウェルで交換し、５〜１０分間インキュベートし、再び同容量の培地に交換する。
７．ウェルにＩＬ−１β、ＩＬ−１βと事前に混合した試験物質、および適切な対照を添加する。
８．２４時間処置した後、細胞をインキュベートし、次いで上清を収集する。
９．上清を３００×ｇで１０分間遠心分離し、澄んだ上清を採取し、この上清をＥＬＩＳＡにそのまま使用するか、または適切な場合は３倍希釈して使用する。
【００６１】
ＥＬＩＳＡプロトコール：
アッセイの原理：アッセイでは定量的サンドイッチ酵素免疫測定法を使用する。マイクロプレートをＩＬ−６に特異的なモノクローナル抗体で事前にコーティングする。マイクロプレートのウェルに標準物質および試料をピペッティングし、存在するＩＬ−６は固定化抗体に結合させる。未結合の物質を洗い流した後、ウェルにＩＬ−６に特異的な酵素結合ポリクローナル抗体を添加する。洗浄して未結合の抗体−酵素試薬を除去した後、ウェルに基質溶液を添加し、結合したＩＬ−６の量に比例して発色させる。発色を停止し、色の強度を測定する。
【００６２】
アッセイ手順：
１．製造元のマニュアルに記載の通り、全ての試薬および使用標準物質を調製する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｎｄｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ＿ｒｅｓｕｌｔｓ．ａｓｐｘ？ｋ＝Ｄ６０５０）
２．過剰なマイクロプレートストリップをプレートフレームから外し、乾燥剤パックを収容するフォイルポーチに戻し、再び封をする。
３．各ウェルに１００μｌのアッセイ希釈液（Ａｓｓａｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ）ＲＤ１Ｗを添加する。
４．ウェル毎に１００μｌの標準物質、試料、または対照物質を添加する。用意されている接着ストリップで覆う。室温で２時間インキュベートする。プレートレイアウトを用意して、アッセイした標準物質および試料を記録する。
５．各ウェルを吸引および洗浄し、このプロセスを３回繰り返して計４回洗浄する。各ウェルに注入ボトル（ｓｑｕｉｒｔ  ｂｏｔｔｌｅ）、マニホールド分注器、またはオートウォッシャーを使用して洗浄緩衝液（Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ）（４００μＬ）を充填することによって洗浄する。各工程での液体の完全な除去が、性能を良好にするのに不可欠である。最後の洗浄後、残存した洗浄緩衝液を吸引またはデカントによって除去する。プレートを反転し、さらにきれいなペーパータオルで吸い取る。
６．各ウェルに２００μＬのＩＬ−６コンジュゲートを添加する。新しい接着ストリップで覆う。室温で２時間インキュベートする。
７．工程５と同様に吸引／洗浄を繰り返す。
８．各ウェルに２００μＬの基質溶液（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を添加する。室温で２０分間インキュベートする。光から保護する。
９．各ウェルに５０μＬの停止液（Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を添加する。ウェル中の色は、青色から黄色に変化すべきである。ウェル中の色が緑色であるか、または色が均一に現れない場合は、十分な混合を確保するためにプレートを穏やかにたたく。
１０．４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーを使用して、３０分以内に各ウェルの光学密度を決定する。波長補正が利用可能な場合は、５４０ｎｍまたは５７０ｎｍに設定する。波長補正が利用不可能な場合は、４５０ｎｍでの読取り値から５４０ｎｍまたは５７０ｎｍでの読取り値を差し引く。差し引くことにより、プレートの光学的欠陥が補正される。補正せずに４５０ｎｍで直接得られた読取り値は高くなり、正確性を欠く可能性がある。
【００６３】
得られた実験データは以下の通りである。
対照抗ＩＬ−１β抗体によるＩＬ−６産生の阻害：
１．ＭＲＣ５細胞（継代数５）を４８ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３５４８）に２×１０３個／ウェル、０．４ｍｌ／ウェルで播種し、２４時間インキュベートした。
２．アッセイの日に、ウェルから培地を吸引し、１０％ＦＢＳを補充した０．４ｍｌのＤＭＥＭに交換し、１０〜１５分間インキュベートし、同量の新たな同一の培地に再び交換した。
３．実験を通してＩＬ−１βを５０ｐｇ／ｍｌの終濃度で使用した。
４．抗ヒトＩＬ−１β抗体を０．１９２、０．９６、４．８、２４、１２０および６００ｎｇ／ｍｌの終濃度で使用した。
５．ＩＬ−１βおよび抗ヒトＩＬ−１β抗体の両方を１０×濃縮溶液として調製した。
６．細胞に試験物質を添加する前に、５５μｌの１０×ＩＬ−１βを、対応する５５μｌの１０×抗ヒトＩＬ−１β抗体溶液（または適切な対照）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。
７．インキュベート後、１００μｌの各混合物を、０．４ｍｌの増殖培地を含有するウェルに添加した。
８．細胞を試験物質の存在下で２４時間インキュベートし、上清を採取し、３００×ｇで１０分間遠心分離し、ＩＬ−６ＥＬＩＳＡアッセイに使用した。
９．抗ＩＬ−１β抗体の存在下でのＩＬ−６の回収について試験するために、抗ＩＬ−１β抗体を６００ｎｇ／ｍｌの終濃度で使用し、ＩＬ−６標準物質を２０ｐｇ／ｍｌの終濃度までスパイクした。
【００６４】
図７に、ＩＬ−１抗体媒介ＩＬ−６産生阻害アッセイで得られた検量線を示す。図８および図９に、実験における培養培地から得られた、ＩＬ−１β媒介ＩＬ−６産生およびＩＬ−６回収の測定の結果を示す。表５に、ＩＬ−６産生について得られた数値をその標準偏差と共に提示する。
【００６５】
【表５】
2016513106.tif 000025
【００６６】
上記の実験から、（１）対照の抗ＩＬ−１β抗体は、ＩＬ−１βシグナリング経路の非常に強力な阻害剤であり、ＩＣ５０が約２．１ｎｇ／ｍｌまたは約１４ｐＭであること、（２）アッセイ設定の２４時間前に、２×１０３個／ウェルの細胞密度で播種することは妥当であること、（３）培養培地に２０ｐｇ／ｍｌの終濃度でスパイクされたＩＬ−６の回収率は約１１４％であることが明らかとなった。
【００６７】
ＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩヘテロダイマー調製物ＩＬ−６産生の阻害：
１．ＭＲＣ５細胞（継代数６）を４８ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３５４８）に２×１０３個／ウェル、０．４ｍｌ／ウェルで播種し、２４時間インキュベートした。
２．この実験のための播種はデュプリケートで実施した。各播種デュプリケートは、ＥＬＩＳＡプレートにおいてデュプリケートで測定した結果、１処置当たり４つの実験ポイントが得られた。
３．アッセイの日に、ウェルから培地を吸引し、１０％ＦＢＳを補充した０．４ｍｌのＤＭＥＭに交換し、１０〜１５分間インキュベートし、同量の新たな同一の培地に再び交換した。
４．実験を通してＩＬ−１βを５０ｐｇ／ｍｌの終濃度で使用した。
５．ＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩヘテロダイマーを０．０５３６、０．１３４、０．３３５、０．８３９、２．０９７、５．２４、１３．１、３２．８、８１．９、２０４．８、５１２、１２８０、３２００および２００００ｎｇ／ｍｌの終濃度で使用した。
６．ＩＬ−１βおよびＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩヘテロダイマーの両方を１０×濃縮溶液として調製した。
７．細胞に試験物質を添加する前に、１２０μｌの１０×ＩＬ−１β／ＩＬ−１Ｆ２を、対応する１２０μｌの１０×ＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩヘテロダイマー溶液（または適切な対照）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。
８．インキュベート後、１００μｌの各混合物を、０．４ｍｌの増殖培地を含有するウェルに添加した。
９．細胞を試験物質の存在下で２４時間インキュベートし、上清を採取し、３００×ｇで１０分間遠心分離し、ＩＬ−６ＥＬＩＳＡアッセイに使用した。
【００６８】
図１０に、ＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩヘテロダイマー媒介ＩＬ−６産生阻害アッセイで得られた検量線を示す。図１１および図１２に、実験における培養培地から得られた、ＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩヘテロダイマー媒介ＩＬ−６産生およびＩＬ−６回収の測定の結果を示す。表６に、ＩＬ−６産生について得られた数値をその標準偏差と共に提示する。
【００６９】
【表６】
2016513106.tif 000026
【００７０】
各実験ポイントについてデュプリケートで播種し、さらにＩＬ−６産生をデュプリケートで測定した結果、濃度ポイント１つ当たり４つの実験読取り値が得られた。得られたデータから、実験手順およびアッセイの再現性が高いことが実証された。上記の実験から、この実験におけるＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩヘテロダイマーのＩＣ５０値は、約０．３ｍｇ／ｍｌまたは約２．４ｐＭであることが明らかになった。
【実施例５】
【００７１】
マウスにおける皮下投与後のＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩヘテロダイマーの薬物動態（ＰＫ）。
ＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩヘテロダイマー（配列番号１および配列番号２）のポリペプチドを、本質的に上記実施例に記載の通り、共発現させ、精製した。動物への投与のために、ポリペプチドを以下の緩衝液：１％ｗ／ｖスクロース、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭ  Ｌ−アルギニン塩酸塩、２５ｍＭ重炭酸ナトリウム、ｐＨ６．３に配合した。使用した投薬用ストック濃度は、ポリペプチド０．５ｍｇ／ｍＬであった。
【００７２】
試験０日目に、１４匹の雌性Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスを体重に基づいて７群各２匹に無作為化した。０日目に単回処置のポリペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）を群１のマウス以外の全ての群の皮下（背側）に投与し、群１のマウスは試験０日目に心臓穿刺によって採血して血漿を調製した。試験の様々な時点で残りの群のマウスの眼窩静脈叢から血液試料を採取して血漿を調製した。
【００７３】
処置日（０日目）と、その後週３回、各群の最終日を含め、全てのマウスについて体重を記録した。
【００７４】
血漿調製のためにマウスの群を特定の時点で選んだ。用量投与の０時間および３６時間以内に試料採取のために選んだ群の体重変化は測定しなかった。他の全てのマウスは体重が増加し、試験期間を通して有害な臨床的徴候は報告されなかった。
【００７５】
試験の生存相（ｉｎ−ｌｉｆｅ  ｐｈａｓｅ）の後、血漿試料をＨｕ−Ｆｃタンパク質についてＥＬＩＳＡによって分析した。ＥＬＩＳＡによるマウス血漿試料中のＨｕ−Ｆｃの定量を、ポリペプチドの循環レベルの読取り値として使用した。試験における全てのマウスの試料に対してアッセイを実施した。
【００７６】
投与から１時間後のマウスの血漿中のポリペプチドを検出した。次いで、Ｐｒｉｓｍ  ５．０ｃ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した１フェーズ減衰モデル等式（Ｏｎｅ  Ｐｈａｓｅ  Ｄｅｃａｙ  Ｍｏｄｅｌ  ｅｑｕａｔｉｏｎ）を使用して、Ｈｕ−Ｆｃ  ＥＬＩＳＡによって検出されるポリペプチドの薬物動態を決定した。Ｈｕ−Ｆｃのピーク循環レベル（Ｃｍａｘ）は１．６５μｇ／ｍＬであると決定し、ピーク循環レベルまでの時間（Ｔｍａｘ）は処置後３６時間であった。半減期（Ｔ１／２）は８８．１５時間であり、速度定数（Ｋ）は０．００７９ｈｒ−１であった。未処置群１のマウスの血漿におけるＨｕ−Ｆｃレベルは無視できるレベルであった。この試験の結果を表７に要約した。
【００７７】
【表７】
2016513106.tif 000027
* Hu-Fcのレベルとして計算することができないSEMは、群中の試料の一つについてはELISAの検出限界に満たなかった。
ヒト-Fcタンパク質濃度は、Prismソフトウェアによってトリプリケート試料の平均吸光度に基づいて決定された。
^ 眼窩静脈叢からの採血
# 終末心臓穿刺による採血
【実施例６】
【００７８】
Ｃ５７ＢＬ６マウスにおける反復投薬２８日後のＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩヘテロダイマーの毒性の評価。
以下は、反復投薬マウス毒性評価試験結果の概要である。Ｃ５７ＢＬ６マウスにＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩヘテロダイマーのポリペプチド（配列番号１および配列番号２）試験物質を１０、３０および１００ｍｇ／ｋｇの用量レベルで皮下注射によって週２回処置したことは、この試験において良好な忍容性を示した。試験の完了前に予定外の死は起きなかった。試験物質の処置は、罹患率または毒性の臨床的徴候と関連付けられなかった。体重に対して性または処置に関係した一貫性のある効果は生じなかった。処置の可能性のある効果と考えられる飼料消費の増加が認められたが、これは有害であるとは考えられなかった。
【００７９】
臨床生化学に関係するパラメータの機能的変化の証拠が得られたが、一部では完全ではなかったもののこれらのパラメータの大部分で可逆性がある証拠が得られたので、これらは毒性学的意義があるとは考えられなかった。毒物動態評価なしでは、これらの差異の一部の明らかな非可逆性の意義を評価することは可能ではなかった。しかし、組織病理学的変化に関連付けられる差異も、有害であると考えられる差異も認められなかった。観察された差異は、典型的には可逆性である種類のものであったので、可逆性期間がこれを実証するのに十分ではなかった可能性がある。
【００８０】
したがって、ＩＬ１Ｒ−ＦｃＶ−ＲＡｃＰ−ＦｃＩＩヘテロダイマーのマウス２８日投薬試験における無毒性量（ＮＯＡＥＬ、Ｎｏ−Ｏｂｓｅｒｖｅｄ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｌｅｖｅｌ）は、１００ｍｇ／ｋｇであると考えられると結論付けされた。
【００８１】
本明細書で言及する全ての刊行物および特許は、それぞれの個々の刊行物または特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８２】
主題の特定の実施形態を議論してきたが、上記の明細書は例示であって限定するものではない。本明細書および以下の特許請求の範囲を検討すると、当業者には多くの変形形態が明らかとなろう。本発明の完全な範囲は、特許請求の範囲を均等物のその完全な範囲と共に、さらには本明細書をそのような変形形態と共に参照することによって決定すべきである。
【図１】
2016513106.tif 000028
【図２】
2016513106.tif 000029
【図３】
2016513106.tif 000030
【図４】
2016513106.tif 000031
【図５】
2016513106.tif 000032
【図６】
2016513106.tif 000033
【図７】
2016513106.tif 000034
【図８】
2016513106.tif 000035
【図９】
2016513106.tif 000036
【図１０】
2016513106.tif 000037
【図１１】
2016513106.tif 000038
【図１２】
2016513106.tif 000039
【配列表】
2016513106000001.app
【国際調査報告】
2016513106.tif 000040
2016513106.tif 000041
2016513106.tif 000042