(57)【要約】本発明は、組み換えタンパク質の生産の分野に関する。グリコフォリンタンパク質の細胞外領域に由来する新規のペプチドが提供され、これは、該新規のペプチドと一緒に融合ペプチドとして発現させられたときの目的のタンパク質またはペプチドの発現速度を向上させる。本発明は、第１の局面において、プロモーター領域、発現エレメントおよび必要に応じて転写終結領域を含む発現カセットを提供し、ここにおいてこの発現エレメントは、グリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分をコードする核酸配列を含み、そしてここにおいて、この発現カセットはこのグリコフォリンタンパク質全体をコードする核酸配列を含まない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーター領域と、発現エレメントと、必要に応じて転写終結領域とを含む発現カセットであって、ここにおいて該発現エレメントが、グリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分をコードする核酸配列を含み、そしてここにおいて該発現カセットが、該グリコフォリンタンパク質の全体をコードする核酸配列を含まない、発現カセット。
【請求項２】
前記グリコフォリンタンパク質の膜貫通領域および／または細胞質領域をコードする核酸配列を含まない、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項３】
前記グリコフォリンタンパク質が哺乳類のグリコフォリンタンパク質であり、好ましくはヒトグリコフォリンタンパク質である、請求項１または請求項２に記載の発現カセット。
【請求項４】
前記グリコフォリンタンパク質がグリコフォリンＡであり、好ましくはヒトグリコフォリンＡである、請求項１から請求項３までのいずれか１項に記載の発現カセット。
【請求項５】
前記グリコフォリンタンパク質の前記細胞外領域が、配列番号１の１位〜７２位のアミノ酸配列またはそれのホモログを有する、請求項１から請求項４までのいずれかの１項に記載の発現カセット。
【請求項６】
前記グリコフォリンタンパク質の前記細胞外領域が、配列番号１の１位〜４０位のアミノ酸配列またはそれのホモログの少なくとも２０個の連続するアミノ酸を含む、請求項５に記載の発現カセット。
【請求項７】
前記グリコフォリンタンパク質の前記細胞外領域またはそれの部分が、配列番号１のアミノ酸２〜３８を含み、そして特に、配列番号１のアミノ酸２〜３８からなる、請求項１から請求項６までのいずれかの１項に記載の発現カセット。
【請求項８】
５’エンハンサー領域、５’非翻訳領域、ポリアデニル化シグナル、３’非翻訳領域および３’エンハンサー領域からなる群から選択されるエレメントをさらに１つ以上含む、請求項１から請求項７までのいずれかの１項に記載の発現カセット。
【請求項９】
転写の方向において、機能的に互いに関連する、
（ｉ）必要に応じて５’エンハンサー領域と、
（ｉｉ）プロモーター領域と、
（ｉｉｉ）必要に応じて５’非翻訳領域と、
（ｉｖ）発現エレメントと、
（ｖ）必要に応じて３’非翻訳領域と、
（ｖｉ）必要に応じてポリアデニル化部位と、
（ｖｉｉ）必要に応じて転写終結領域と、
（ｖｉｉｉ）必要に応じて３’エンハンサー領域と、
を含む、請求項８に記載の発現カセット。
【請求項１０】
前記発現エレメントが、細胞外局在シグナルを好ましくは含むシグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１から請求項９までのいずれかの１項に記載の発現カセット。
【請求項１１】
前記発現エレメントが、クローニング部位をさらに含む、請求項１から請求項１０までのいずれかの１項に記載の発現カセット。
【請求項１２】
前記発現エレメントが、目的のペプチドをコードする核酸配列をさらに含み、ここにおいて該目的のペプチドと、前記グリコフォリンタンパク質の前記細胞外領域またはそれの部分が、該発現エレメントを発現するとき融合ペプチドを形成する、請求項１から請求項１１までのいずれかの１項に記載の発現カセット。
【請求項１３】
前記目的のペプチドが糖タンパク質またはそれの部分である、請求項１２に記載の発現カセット。
【請求項１４】
前記発現エレメントが、好ましくは、
（ｉ）前記グリコフォリンタンパク質の前記細胞外領域またはそれの部分をコードする前記核酸配列と、
（ｉｉ）前記クローニング部位または目的のペプチドをコードする前記核酸配列と、
の間に位置付けられる、プロテアーゼ認識配列をコードする核酸配列をさらに含む発現カセットであって、ここにおいて該グリコフォリンタンパク質の該細胞外領域またはそれの部分と、該プロテアーゼ認識配列と、必要に応じて該目的のペプチドとが、該発現エレメントを発現するとき融合ペプチドを形成する、請求項１１から請求項１３までのいずれかの１項に記載の発現カセット。
【請求項１５】
前記発現エレメント中に含まれる前記核酸配列が、以下の順番で転写の方向において機能的に互いに関連し：
（ｉ）必要に応じて、目的のペプチドをコードする核酸配列；
（ｉｉ）前記クローニング部位または目的のペプチドをコードする核酸配列；
（ｉｉｉ）必要に応じて、プロテアーゼ認識部位をコードする核酸配列；
（ｉｖ）前記グリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分をコードする核酸配列；
ここにおいて該エレメント（ｉ）〜（ｉｖ）が、もし存在する場合、該発現エレメントを発現するとき融合ペプチドを形成する、請求項１から請求項１４までのいずれかの１項に記載の発現カセット。
【請求項１６】
前記発現エレメントの中に含まれる核酸配列が、以下の順番で転写の方向において機能的に互いに関連し：
（ｉ）必要に応じて、シグナルペプチドをコードする核酸配列；
（ｉｉ）前記グリコフォリンタンパク質の前記細胞外領域またはそれの部分をコードする核酸配列．
（ｉｉｉ）必要に応じて、プロテアーゼ認識部位をコードする核酸配列；
（ｉｖ）前記クローニング部位または目的のペプチドをコードする核酸配列；
ここにおいて該エレメント（ｉ）〜（ｉｖ）が、もし存在する場合、該発現エレメントを発現させるとき融合ペプチドを形成する、請求項１から請求項１４までのいずれかの１項に記載の発現カセット。
【請求項１７】
前記発現エレメントが、目的のペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項１５または請求項１６に記載の発現カセット。
【請求項１８】
真核細胞、好ましくは哺乳類細胞、より好ましくはヒト細部、の中での発現のために適応させられている請求項１から請求項１７までのいずれかの１項に記載の発現カセット。
【請求項１９】
請求項１から請求項１８までのいずれか１項に記載の発現カセットを含む、ベクター。
【請求項２０】
請求項１７に記載の発現カセットを含む、ベクター。
【請求項２１】
請求項１から請求項１８までのいずれか１項に記載の発現カセットあるいは請求項１９または請求項２０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１７に記載の発現カセットまたは請求項２０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２３】
哺乳類細胞であり、好ましくはヒト細胞である、請求項２１または請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
目的のペプチドを生産するための方法であって、
（ａ）請求項２２に記載の宿主細胞を提供する工程と；
（ｂ）該宿主細胞が、該目的のペプチドと、前記グリコフォリンタンパク質の前記細胞外領域またはそれの部分とを含む融合ペプチドを発現する条件下で該宿主細胞を培養する工程と；
（ｃ）該目的のペプチドを取得する工程であって、必要に応じて、これが該融合ペプチドの形態である工程と、
を含む、方法。
【請求項２５】
工程（ｂ）と工程（ｃ）との間に、
（ｄ）前記目的のペプチドを単離する工程であって、必要に応じて、これが前記融合ペプチドの形態である工程、
をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記発現エレメントが、前記グリコフォリンタンパク質の前記細胞外領域またはそれの部分をコードする前記核酸配列と、前記目的のペプチドをコードする前記核酸配列との間に位置付けられるプロテアーゼ認識部位をコードする核酸配列を含む、方法であって；そして
ここにおいて該方法が、工程（ｂ）と工程（ｃ）との間に、好ましくは、工程（ｄ）と工程（ｃ）との間に、
（ｅ）該プロテアーゼ認識部位を認識できるプロテアーゼによって前記融合ペプチドを処理する工程であって、ここにおいて該融合ペプチドが、該目的のペプチドである第１の部分と、該グリコフォリンタンパク質の該細胞外領域またはそれの部分を含む第２の部分とに切断される工程と；
（ｆ）該融合ペプチドの該第２の部分から該目的のペプチドを分離する工程と、
をさらに含む、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
工程（ｃ）の後に
（ｇ）前記目的のペプチドを製剤化する工程であって、必要に応じて、これが、医薬組成物として、前記融合ペプチドの形態である工程、
をさらに含む、請求項２４から請求項２６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２４から請求項２７までのいずれか１項に記載の方法によって取得可能な融合ペプチドであって、グリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分と、目的のペプチドとを含む融合ペプチド。
【請求項２９】
グリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分をさらに含む融合ペプチドの部分として目的のペプチドを発現させる工程を含む、組み換え生産における目的のペプチドの収量を増加させるための方法。
【請求項３０】
組み換え生産における目的のペプチドの収量を増加させるための、該目的のペプチドと一緒での融合ペプチドの中におけるグリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は目的のタンパク質の生産収量を向上させるために使用され得る新規のペプチドに関する。このペプチドは、グリコフォリンタンパク質の細胞外ドメインに由来し、そして目的のタンパク質との融合タンパク質の部分として使用される。特に、本発明は、オープンリーディングフレームの部分としてこのようなペプチドを含む発現カセットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
組み換えタンパク質の生産は、今日の生物工学的産業の主要な側面である。これは、大量の高品質なタンパク質を要求する適用の数が市場で増加するにつれて、ますます重要性を増している。食糧生産および特に薬理学は、組み換えタンパク質に対する要求が着実に増加している２つの主要な領域である。最終産物のより高い生産効率およびその結果的としてのより低い費用が、商業的に実行可能なプロセスを取得するために要求されている。
【０００３】
しかし、同時に、高い製品品質およびヒトへの適用との適合性も本質的である。真核細胞における、特に高等真核細胞における、タンパク質の組み換え生産が要求される適用がますます多くなった。特に、糖化のような翻訳後修飾を有するタンパク質（糖タンパク質）は、それらをＥ．ｃｏｌｉのような原核細胞系の中で発現させたとき、またはそれらを特にヒト細胞株のような真核細胞系の中で発現させたときで有意に異なる。多くの場合、これらの違いは、生産されるタンパク質の生物学的活性および免疫原性に顕著に影響を与える。しかし、高等真核細胞株を使用する多くの発現系は、所望のタンパク質のかなり低い発現速度という欠点があり、組み換えタンパク質の低い収量および高い費用をもたらす。
【０００４】
したがって、特に真核性の発現細胞株を使用するときには、組み換えタンパク質生産の収量を増加させるための新規の手段および方法を提供することが当技術分野において必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
本発明者は、グリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分、に融合させられた融合タンパク質として異なるタンパク質が発現させられるとき、この異なるタンパク質の収量および生産速度が顕著に増加することを実証することができた。同じ発現ベクターを使用する同じ条件下での目的のタンパク質単独の発現と比較すると、この融合タンパク質の発現速度は１０倍まで増加する。目的のタンパク質のその後の適用のために、それは融合タンパク質として使用されてもよいし、あるいはこのグリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの一部は、この２つの融合パートナーの間に構築されたプロテアーゼ認識部位を使用してこの目的のタンパク質から切り離されてもよい。
【０００６】
上記の観点において、本発明は、第１の局面において、プロモーター領域、発現エレメントおよび必要に応じて転写終結領域を含む発現カセットを提供し、ここにおいてこの発現エレメントは、グリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分をコードする核酸配列を含み、そしてここにおいて、この発現カセットはこのグリコフォリンタンパク質全体をコードする核酸配列を含まない。特に、この発現カセットの発現エレメントは、さらに目的のペプチドをコードする核酸配列を含み、ここにおいて、この発現エレメントを発現するとき、この目的のペプチドと、このグリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分とは融合ペプチドを形成する。
【０００７】
さらなる局面において、本発明は、発現カセットを含み第１の局面に従うベクターおよび該発現カセットまたは該ベクターを含む宿主細胞を提供する。
別の局面において、本発明は目的のペプチドを生産するための方法であって、
（ａ）目的のペプチドをコードする核酸配列を含み第１の局面に従う発現カセットを含む宿主細胞を提供する工程と；
（ｂ）この宿主細胞が、この目的のペプチドと、このグリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分とを含む融合ペプチドを発現する条件下でこの宿主細胞を培養する工程と；
（ｃ）この目的のペプチドを取得する工程であって、これが必要に応じて該融合ペプチドの形態である工程と、
を含む方法を提供する。
【０００８】
さらに、本発明は、グリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分、および目的のペプチドを含む融合ペプチドを提供し、これは本発明に従う目的のペプチドを生産するための方法によって取得可能である。
【０００９】
別の局面において、本発明は、組み換え生産において目的のペプチドの収量を増加させるための方法を提供し、グリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分をさらに含む融合ペプチドの部分として目的のペプチドを発現させる工程を含む。さらに、組み換え生産において目的のペプチドの収量を増加させるために、融合ペプチドの中においてグリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分を該目的のペプチドと一緒に使用することもまた本発明によって提供される。
【００１０】
上記の局面は組み合わせられ得る。本発明の他の目的、特徴、利点および局面は以下の記載および添付の特許請求の範囲から当業者に明らかになる。しかし、適用の好ましい実施形態を示す以下の記載、添付の特許請求の範囲および具体的な実施例は、単に例証の手段によって与えられていることが理解されるべきである。開示される発明の精神および範囲の中における様々な変更および改変は、以下を読むことから当業者に容易に明らかになる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義
本明細書中で使用されるとき、以下の表現は、それらが使用される文脈がそうではないと示す範囲以外では、以下で説明される通りの意味を好ましくは有することが概して意図されている。
【００１２】
「含む」という表現は、本明細書中で使用されるとき、その文字通りの意味に加えて、また「本質的にからなる」および「からなる」という表現を含み、そして具体的にこれを指す。したがって、「含む」という表現は、具体的にリストされた要素を「含む」目的物がさらなる要素を含まない実施形態、および具体的にリストされた要素を「含む」目的物がさらなる要素を含包してもよく、そして／または実際に含包する実施形態を指す。同様に、「有する」という表現は、「含む」という表現として理解されるべきであり、また「本質的にからなる」および「からなる」という表現を含み、そして具体的にこれを指す。
【００１３】
「発現カセット」とは核酸コンストラクトであって、そのような配列と適合する宿主における構造遺伝子の発現に影響を与え得る核酸エレメントを用いて生成されたか、またはこれを合成的に有するコンストラクトである。発現カセットは、少なくともプロモーターを含み、そして必要に応じて転写終結シグナルを含む。典型的には、この発現カセットは、転写されるべき核酸およびプロモーターを含む。発現に影響を与えるのに役立つ追加の因子もまた、本明細書中に記載される通り使用され得る。例えば、発現カセットは、発現されたタンパク質の宿主細胞からの分泌を方向付けるシグナル配列をコードするヌクレオチド配列もまた含み得る。好ましくは、発現カセットは発現ベクターの部分である。転写されるべき核酸の発現のために使用されるべき宿主細胞は、発現ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトされる。このコンストラクトを含む形質転換細胞の選択を可能とするために、従来的には、選択マーカー遺伝子が発現ベクターの中に含められ得る。当業者は、このベクターの構成要素が、その機能に実質的に影響を与えずに改変され得ることを認識する。
【００１４】
「機能的に互いに関連する」という表現は、発現カセットの該エレメントが、それらの機能が協調し、そしてそのコード配列（例えば、発現エレメント）を発現させるような方法で、互いに関連していることを意味する。例えば、コード配列の発現を確認することができるとき、プロモーターは該コード配列と機能的に関連している。本発明に従う発現カセットの構築およびそれの様々なエレメントのアセンブリは、当業者に周知の技術を使用して遂行され得、この技術には特にＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｏｌａｎ  Ｃ．ｅｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）の中で記載されるものがある。
【００１５】
標的核酸配列またはアミノ酸配列の「ホモログ」は、該標的核酸配列またはアミノ酸配列と、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％または少なくとも９７％のホモロジーまたは同一性を共有する。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の「ホモロジー」または「同一性」は、好ましくは、標的配列の全長にわたってか、または標的配列の示される部分の全長にわたって本発明に従って決定される。
【００１６】
本明細書中で使用されるとき、「ペプチド」とは、少なくとも５個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖を指す。好ましくは、ペプチドは、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個または少なくとも３５個のアミノ酸を含む。本明細書中で使用されるとき、「ペプチド」という用語はまたタンパク質をも指し、翻訳後修飾されたペプチドおよびタンパク質を含む。特に、ペプチドという用語は糖化ペプチドおよび糖タンパク質を含む。
【００１７】
ペプチドまたはタンパク質の部分は、好ましくは、該ペプチドまたはタンパク質の連続するアミノ酸少なくとも３個を含み、好ましくは、該タンパク質の連続するアミノ酸少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個または少なくとも２０個を含む。
【００１８】
「医薬組成物」という用語および類似の用語は、特に、ヒトに投与するために適した組成物、すなわち薬学的に受容可能である構成要素を含む組成物、を指す。好ましくは、医薬組成物は、担体、希釈剤または医薬品添加物（例えば、緩衝剤、保存料および浸透圧調整剤）と一緒に活性化合物またはそれの塩もしくはプロドラッグ、を含む。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は、プロモーター領域、発現エレメントおよび必要に応じて転写終結領域、を含む発現カセットに関し、ここにおいてこの発現エレメントは、グリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分をコードする核酸配列を含む。この発現カセットは、宿主細胞において目的のペプチドを発現するように設計される。この目的のペプチドをコードする核酸配列は、本発明に従う発現カセットの発現エレメントの中にすでに存在していてもよいし、または該発現エレメントの中にクローニングされてもよい。この目的のペプチドと、このグリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分とは、この発現エレメントの中で機能的に互いに関連しているので、それらは融合ペプチドとして発現させられる。
【００２０】
しかし、目的のペプチドはグリコフォリンタンパク質の残りの部分ではなく、そして発現カセットはこのグリコフォリンタンパク質全体をコードする核酸配列を含まない。特に、この発現カセットは、このグリコフォリンタンパク質の膜貫通領域および／または細胞質領域をコードする核酸配列を含まない。
【００２１】
グリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分
グリコフォリンタンパク質は、グリコフォリンタンパク質ファミリーの任意のメンバーであり得る。好ましくは、このグリコフォリンタンパク質は哺乳類または齧歯類のグリコフォリンタンパク質であり、より好ましくは、ヒトグリコフォリンタンパク質である。このグリコフォリンタンパク質は、特に、グリコフォリンＡ、グリコフォリンＢ、グリコフォリンＣおよびグリコフォリンＥからなる群から選択され、そして好ましくはグリコフォリンＡである。特に好ましい実施形態において、このグリコフォリンタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトグリコフォリンＡである。ヒトグリコフォリンＡは、ＭＮシアロ糖タンパク質、ＰＡＳ−２、シアロ糖タンパク質アルファおよびＣＤ２３５ａとしてもまた公知である。
【００２２】
グリコフォリンタンパク質は、Ｎ−末端の細胞外領域、膜貫通領域およびＣ−末端の細胞質領域から構成される。さらに、このグリコフォリンタンパク質は、発現後に切り離される（そうすることによって成熟グリコフォリンタンパク質を形成する）Ｎ−末端の局在シグナルペプチドとともに発現される。そうではないと示されるとき以外は、本明細書中で使用されるとき、「グリコフォリンタンパク質」という用語は、局在シグナルペプチドを含まない成熟グリコフォリンタンパク質を指す。この成熟グリコフォリンタンパク質は該局在シグナルペプチドを含まない。この局在シグナルペプチドはこのグリコフォリンタンパク質の細胞外領域の部分を形成しない。したがって、グリコフォリンタンパク質の細胞外領域は、成熟グリコフォリンタンパク質のＮ−末端で始まり、そしてその膜貫通領域のＮ−末端に直接的に位置付けられるアミノ酸で終わる。全てのタンパク質の、特に全てのグリコフォリンタンパク質の、膜貫通領域は、例えば、適切な配列解析手段を使用して、当業者によって容易に検出され得る。公知のグリコフォリンタンパク質について、その膜貫通領域は、一般的に利用可能なタンパク質データベース（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔコンソーシアムのＵｎｉＰｒｏｔＫＢタンパク質知識データベース、ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇを参照のこと）においてもまた示されている。例えば、ヒトグリコフォリンＡの膜貫通領域は配列番号１のアミノ酸７３〜９５からなる。したがって、ヒトグリコフォリンＡの細胞外領域は配列番号１のアミノ酸１〜７２からなる。
【００２３】
本明細書中で使用されるとき、グリコフォリンタンパク質の細胞外領域の部分とは、本明細書中で定義される通りのグリコフォリンタンパク質の細胞外領域の連続するアミノ酸少なくとも１０個を含むペプチドを指す。好ましくは、グリコフォリンタンパク質の細胞外領域の連続するアミノ酸少なくとも１５個、より好ましくは少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個または少なくとも３５個を含む細胞外領域の部分。好ましい実施形態において、この細胞外領域の部分は、この細胞外領域のＮ−末端領域の中に位置するアミノ酸を含む。特に、この細胞外領域の部分は、この細胞外領域の初めの４０個のアミノ酸の少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個または少なくとも３５個、の連続するアミノ酸を有する。ヒトグリコフォリンＡの場合において、これは、該ヒトグリコフォリンＡの細胞外領域の部分が、配列番号１の１位〜４０位のアミノ酸配列の少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個または少なくとも３５個、の連続するアミノ酸を含むことを意味する。
【００２４】
特定の実施形態において、「グリコフォリンタンパク質の細胞外領域」という用語は、それのホモログもまた含有する。該ホモログは、このグリコフォリンタンパク質の細胞外領域に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する。好ましくは、この配列同一性は、少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％である。この配列同一性はこのグリコフォリンタンパク質の細胞外領域全体にわたって決定される。具体的な実施形態において、このグリコフォリンタンパク質の細胞外領域は、ヒトグリコフォリンＡの細胞外領域のホモログもまた含み、ここにおいて、該ホモログは、配列番号１の１位〜７２位のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有する。同様に、特定の実施形態において、グリコフォリンタンパク質の細胞外領域の部分とは、グリコフォリンタンパク質の細胞外領域のホモログの部分をもまた指す。好ましい実施形態において、このホモログと、上述される通りの細胞外領域との間の配列同一性は、この細胞外領域の部分にもまた適用する。したがって、この細胞外領域のホモログの部分は、このグリコフォリンタンパク質の細胞外領域の対応する部分に対して少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％、のアミノ酸配列同一性を有する。
【００２５】
特に好ましい実施形態において、グリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分は、配列番号１のアミノ酸１〜３８または配列番号１のアミノ酸２〜３８を含み、そして特に配列番号１のアミノ酸１〜３８または配列番号１のアミノ酸２〜３８からなる。
【００２６】
好ましくは、目的のペプチドが、グリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分を有する融合ペプチドとして発現させられた場合、特に、本明細書中に記載される宿主細胞における場合、このグリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分は、該目的のペプチドの生産速度および収量を増加させることができる。
【００２７】
発現エレメント
本発明に従う発現カセットの発現エレメントは、この発現カセットによって発現させられるべき核酸配列を含む。この発現エレメントの核酸配列の発現はプロモーター領域によって制御される。この発現カセット（必要に応じてベクターの中に存在する）が適切な宿主細胞の中に導入されるとき、該宿主細胞は、この発現エレメントの核酸配列によってコードされるペプチドを生産する。
【００２８】
好ましくは、本発明に従う発現カセットの発現エレメントは、クローニング部位または目的のペプチドをコードする核酸配列を含む。このクローニング部位または目的のペプチドをコードする核酸配列は、転写の方向において、グリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分をコードする核酸配列の前または後ろに位置し得る。この目的のペプチドをコードする核酸配列は、この発現エレメントの中に、このグリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分をコードする核酸配列とともにインフレームで存在する。この目的のタンパク質をコードする核酸配列の３ヌクレオチドフレームは、グリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分をコードする核酸配列のそれと同じものである。これらの核酸配列の翻訳の間、１つのポリペプチド鎖は、この目的のペプチドと、このグリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分とを含んで生産される。この目的のペプチドと、このグリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分と、は、この発現エレメントを発現するとき融合ペプチドを形成する。この融合ペプチドにおいて、このグリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分は、この目的のペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に位置し得る。
【００２９】
目的のペプチドは任意のペプチドであり得、タンパク質を含む。このペプチドは、任意の起源、例えば、哺乳類由来ペプチドおよびヒト由来ペプチドならびに人工ペプチド、のものであり得る。好ましくは、このペプチドは１箇所以上の糖化部位を含み、そして特に、糖タンパク質のような糖化ペプチドである。
【００３０】
この発現エレメントの中に存在するクローニング部位は、この発現エレメントの中に目的のペプチドをコードする核酸を導入するために適している。特に、このクローニング部位は、目的のペプチドをコードする核酸の導入を可能とするために、この目的のペプチドをコードする核酸配列と、グリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分をコードする核酸配列と、が上述の通りインフレームになるような様式で、設計される。別の核酸分子、例えば、発現カセットまたはベクター、の中に核酸断片を導入するための適切なクローニング部位および方法は当技術分野において一般的に知られている。好ましくは、このクローニング部位は、少なくとも１箇所、好ましくは、少なくとも２箇所、少なくとも３箇所、少なくとも４箇所または少なくとも５箇所、の制限酵素の認識配列を含む。適切な制限酵素およびそれらの認識配列は当技術分野において公知である。代表的な制限酵素は、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＰｖｕＩである。
【００３１】
特定の実施形態において、発現エレメントは、細胞外局在シグナルを好ましくは含むシグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む。特に、このシグナルペプチドは、この発現エレメントにコードされる融合ペプチドの分泌性の発現を誘導する。好ましくは、このシグナルペプチドは、発現の間に残りの融合ペプチドから切り離される。好ましくは、このシグナルペプチドは、転写の方向において、この発現エレメントの中に含まれる他のコード核酸配列の前に、特にこの発現エレメントの始まりに、位置付けられる。さらに、好ましくは、このシグナルペプチドをコードする核酸配列は、この発現エレメントの中に含まれる他のコード核酸配列とインフレームで位置付けられる。
【００３２】
さらなる実施形態において、発現エレメントは、プロテアーゼの認識部位をコードする核酸配列をさらに含む。好ましくは、このプロテアーゼの認識部位をコードする核酸配列は、
（ｉ）グリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分をコードする核酸配列と、
（ｉｉ）クローニング部位または目的のペプチドをコードする核酸配列と、
の間に位置づけられる。
【００３３】
プロテアーゼの認識部位をコードする核酸配列は、上述の通りに、グリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分をコードする核酸配列と、そして必要に応じて、この目的のペプチドをコードする核酸配列とにもまた、インフレームで位置付けられる。このグリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分と、このプロテアーゼの認識部位と、必要に応じてこの目的のペプチドとは、この発現エレメントを発現するとき融合ペプチドを形成する。このような融合ペプチドをそれぞれのプロテアーゼと接触させるとき、このプロテアーゼはその認識部位でこの融合ペプチドを切断し、この融合ペプチドのこの目的のペプチドを含む一つの部分と、この融合ペプチドのこのグリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分を含む別の部分とを形成する。適切なプロテアーゼおよびそれらの認識部位は当技術分野において公知である。好ましくは、このプロテアーゼはエンドペプチダーゼである。代表的なプロテアーゼはトロンビンおよび第Ｘａ因子である。
【００３４】
好ましくは、この発現エレメントの中に含まれる核酸配列は、転写の方向において以下の順番で機能的に互いに関連する：
（ｉ）必要に応じて、シグナルペプチドをコードする核酸配列；
（ｉｉ）クローニング部位または目的のペプチドをコードする核酸配列；
（ｉｉｉ）必要に応じて、プロテアーゼの認識部位をコードする核酸配列；
（ｉｖ）グリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分をコードする核酸配列；
【００３５】
あるいは、発現エレメントの中に含まれる核酸配列は、好ましくは、転写の方向において以下の順番で機能的に互いに関連する：
（ｉ）必要に応じて、シグナルペプチドをコードする核酸配列；
（ｉｉ）グリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分をコードする核酸配列；
（ｉｉｉ）必要に応じて、プロテアーゼの認識部位をコードする核酸配列；
（ｉｖ）クローニング部位または目的のペプチドをコードする核酸配列；
【００３６】
エレメント（ｉ）〜（ｉｖ）は、もし存在する場合、好ましくは、発現エレメントを発現するとき融合ペプチドを形成する。
【００３７】
この発現エレメントのエレメント、特に、シグナルペプチドをコードする核酸配列と、グリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分をコードする核酸配列と、プロテアーゼ認識部位をコードする核酸配列と、目的のペプチドをコードする核酸配列と、は全て一緒にオープンリーディングフレームを形成する。それは特に、これらのエレメントが全て互いに同じコードフレームの中にあり、そして該コードフレームの中の該エレメントの間に終止コドンがないことを意味する。好ましくは、この発現エレメントの最初のコドンはメチオニンをコードする開始コドンであり、そしてこの発現エレメントの最後のコドンは終止コドンである。
【００３８】
特に好ましい実施形態において、発現エレメントは目的のペプチドをコードする核酸配列を含む。
【００３９】
発現カセットのさらなるエレメント
発現エレメントに加え、本発明に従う発現カセットは、少なくとも、この発現エレメントの転写を開始することができるプロモーター領域をさらに含む。このプロモーター領域はＲＮＡポリメラーゼ結合部位、転写開始部位および転写因子結合部位を含む。必要に応じて、このプロモーターは、この発現エレメントの転写を制御する制御エレメントをさらに含み得る。好ましくは、このプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＢＲＯＡＤ３プロモーター、マウスｒｏｓａ２６プロモーター、ｐＣＥＦＬプロモーターおよびβ−アクチンプロモーターからなる群から選択される。
【００４０】
さらに、好ましくは、本発明に従う発現カセットは、転写における遺伝子の終了点を標識する遺伝子配列の区間である転写終結領域を含む。特に、この転写終結因子は、ＲＮＡポリメラーゼを停止させ、そしてＤＮＡ鎖からこれを解離させる。
【００４１】
好ましい実施形態において、本発明に従う転写カセットは、５’エンハンサー領域、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、ポリアデニル化シグナルおよび３’エンハンサー領域からなる群から選択される１つ以上のエレメントをさらに含む。特に、本発明に従う転写カセットは、転写の方向において、機能的に互いに関連する、
（ｉ）必要に応じて５’エンハンサー領域と、
（ｉｉ）プロモーター領域と、
（ｉｉｉ）必要に応じて５’非翻訳領域と、
（ｉｖ）発現エレメントと、
（ｖ）必要に応じて３’非翻訳領域と、
（ｖｉ）必要に応じてポリアデニル化部位と、
（ｖｉｉ）必要に応じて転写終結領域と、
（ｖｉｉｉ）必要に応じて３’エンハンサー領域と、
を含む。
【００４２】
エンハンサー領域とは、発現エレメントの転写レベルを向上させることができるＤＮＡの短い領域である。このエンハンサー領域は、その後その遺伝子の転写を始めさせるＲＮＡポリメラーゼおよび基本転写因子をリクルートする活性化タンパク質（トランス活性化因子）によって結合され得る。エンハンサー領域は、プロモーター−発現エレメント複合体の上流（５’エンハンサー領域）または下流（３’エンハンサー領域）に位置し得る。
【００４３】
５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）は、プロモーター領域と、発現エレメントとの間に位置し、そして好ましくは、調節エレメントという手段によって遺伝子発現を制御するためのエレメントを含む。例えば、この５’ＵＴＲは、翻訳開始を促進するかまたは阻害する配列と、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を与え得るタンパク質のための結合部位とを含み得る。
【００４４】
３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）は、発現エレメントと、ポリアデニル化部位との間に位置し、そしてｍＲＮＡの安定性または細胞内の局在に影響を与え得るタンパク質のための結合部位を含み得る。５’ＵＴＲと、３’ＵＴＲとの両方は発現エレメントと一緒に転写され、そして生産されるｍＲＮＡの部分を形成する。
【００４５】
ポリアデニル化部位とは、転写されたＲＮＡに対するポリ（Ａ）鎖の合成を開始させる配列モチーフ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｍｏｔｉｖｅ）である。このポリアデニル化部位は、３’ＵＴＲの終わりにか、または３’ＵＴＲの内部に位置し得る。
【００４６】
好ましくは、発現カセットは、真核細胞、好ましくは哺乳類細胞、より好ましくはヒト細胞、の中での発現に適応させられる。
【００４７】
発現カセットを含むベクター
一つの局面において、本発明は、本発明に従う発現カセットを含むベクターに関する。このベクターは、宿主細胞の中にこの発現カセットを移入させるのに適した任意のベクターであり得る。それぞれのベクターは当技術分野において公知である。特に、このベクターは、真核細胞、好ましくは哺乳類細胞、より好ましくはヒト細胞、の中への移入のために適応させられる。
【００４８】
発現カセットに加え、本発明に従うベクターはさらなるエレメントを含み得る。例えば、このベクターは１つ以上の選択マーカーを含み得る。好ましくは、少なくとも１つの選択マーカーは、このベクターを含まない宿主細胞に対してこのベクターを含む宿主細胞を選択するために適しており、この宿主細胞は、特に真核宿主細胞、好ましくは哺乳類宿主細胞、より好ましくはヒト宿主細胞である。この選択マーカーの適切な例には、抗生物質化合物に対する抵抗性を提供する遺伝子がある。さらに、このベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のような原核宿主細胞の中でこれを増幅するのに適したエレメントを含み得る。例えば、このようなエレメントは、Ｃｏｌ  Ｅ１  Ｏｒｉのような複製の起点と、殺菌剤（例えば、アンピシリン）に対しての抵抗性を提供する遺伝子のような原核生物の選択マーカーと、を含む。
【００４９】
好ましくは、ベクターは、環状または直鎖状の２本鎖ＤＮＡであり、特に環状２本鎖ＤＮＡである。
【００５０】
特定の好ましい実施形態において、ベクターは、目的のペプチドをコードする核酸配列を含む発現エレメントを有する発現カセットを含む。
【００５１】
発現カセットまたはベクターを含む宿主細胞
さらなる局面において、本発明は、本発明に従う発現カセットまたは本発明に従うベクターを含む宿主細胞を提供する。この宿主細胞は、この発現カセットまたはベクターを用いるトランスフェクションのために適しており、そして特に、目的のペプチドの生産のために適した任意の細胞であり得る。好ましくは、この宿主細胞は、確立された発現細胞株に由来する。この宿主細胞は、好ましくは、真核細胞、より好ましくは哺乳類細胞、最も好ましくはヒト細胞である。好ましい実施形態において、この宿主細胞はヒト骨髄性白血病細胞に由来する。宿主細胞の具体的な例は、Ｋ５６２、ＮＭ−Ｆ９、ＮＭ−Ｄ４、ＮＭ−Ｈ９Ｄ８、ＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６、ＮＭ  Ｈ９Ｄ８−Ｅ６Ｑ１２、ＧＴ−２Ｘ、ＧＴ−５ｓおよび該宿主細胞のいずれか１つに由来する細胞である。Ｋ５６２は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４３）において存在するヒト骨髄性白血病細胞株である。残りの細胞株は、Ｋ５６２細胞に由来し、そして特定の糖化の特徴について選択されている。Ｋ５６２に由来する細胞株は、周知のＫ５６２に適した環境下で培養され、そして維持され得る。Ｋ５６２細胞以外の全てのこれらの細胞株はブダペスト条約に従って寄託された。この寄託についての情報は、本明細書の最後に見出され得る。
【００５２】
代表的な宿主細胞は、例えば、国際公開第２００８／０２８６８６号においてもまた記載されている。好ましい実施形態において、この宿主細胞は、特定の糖化パターンを有する糖タンパク質の発現のために最適化される。好ましくは、発現エレメントおよび／またはプロモーターならびに発現カセットまたはベクターのさらなるエレメント、におけるコドン出現頻度は、使用される宿主細胞の型に適合し、そしてより好ましくは、使用される宿主細胞の型ために最適化される。
【００５３】
特定の実施形態において、この宿主細胞は単離された宿主細胞である。好ましくは、この宿主細胞はヒトまたは動物の体の中に存在しない。
【００５４】
特定の好ましい実施形態において、宿主細胞は、目的のペプチドをコードする核酸配列を含む発現エレメントを有する発現カセットを含むベクターを用いてトランスフェクトされる。
【００５５】
生産方法
本発明は、目的のペプチドを生産するための方法であって、
（ａ）本発明に従う宿主細胞を提供する工程と；
（ｂ）この宿主細胞が、この目的のペプチドと、グリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分とを含む融合ペプチドを発現する条件下で、この宿主細胞を培養する工程と；
（ｃ）目的のペプチドを取得する工程であって、必要に応じて、これが該融合ペプチドの形態である工程と、
を含む方法を提供する。
【００５６】
特に、この方法において使用される宿主細胞は、本発明に従うベクターまたは発現カセットを用いてトランスフェクトされ、ここにおいて、それらの発現エレメントは目的のペプチドをコードする核酸配列を含む。この宿主細胞を培養し、そして融合タンパク質を発現させるのに適した条件は、この方法において使用される特定の宿主細胞、ベクターおよび発現カセットに依存する。当業者は、適切な条件を容易に決定することができ、そしてそれらは複数の宿主細胞については当技術分野においてまたすでに公知でもある。好ましい実施形態において、この融合ペプチドは、この宿主細胞によって培養培地の中に分泌される。これらの実施形態において、好ましくは、この発現エレメントは、細胞外局在シグナルを含むシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む。
【００５７】
目的のペプチドを生産するための方法は、好ましくはさらに、
（ｄ）目的のペプチドを単離する工程であって、必要に応じて、それが該融合ペプチドの形態である工程、を含む。
好ましくは、工程（ｄ）は、工程（ｂ）と工程（ｃ）との間に実行される。
【００５８】
特に、目的のペプチドの単離とは、細胞培養物の残りの構成要素からの目的のペプチドの分離を指す。例えば、この目的のペプチドが宿主細胞によって分泌される場合において、この目的のペプチドの単離は、例えば、遠心分離による、この宿主細胞からの細胞培養培地の分離と、例えば、クロマトグラフ的な方法による、この細胞培養培地のいくらかまたは大部分の構成要素からのこの目的のペプチドの分離と、を含む。この目的のペプチドを単離するのに適した方法および手段は当技術分野において公知であり、そして当業者によって容易に適用され得る。
【００５９】
好ましい実施形態において、本発明に従う方法において使用される宿主細胞は、本発明に従うベクターまたは発現カセットを用いてトランスフェクトされ、ここにおいて、それらの発現エレメントは、目的のペプチドをコードする核酸配列と、グリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分をコードする核酸配列およびこの目的のペプチドをコードする核酸配列の間に位置付けられるプロテアーゼ認識部位をコードする核酸配列と、を含む。これらの実施形態において、この方法は、好ましくはさらに、
（ｅ）このプロテアーゼ認識部位を認識できるプロテアーゼによってこの融合ペプチドを処理する工程であって、ここにおいてこの融合ペプチドが、この目的のペプチドである第１の部分と、このグリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分を含む第２の部分とに切断される工程と；
（ｆ）この融合ペプチドの第２の部分からこの目的のペプチドを分離する工程と、
を含む。
【００６０】
工程（ｅ）および（ｆ）は、好ましくは、工程（ｂ）と工程（ｃ）との間に、より好ましくは、工程（ｄ）と工程（ｃ）との間に実行される。これらの実施形態において、好ましくは、目的のペプチドは、単一のペプチドとして取得され、そして融合ペプチドとしては取得されない。
【００６１】
適切なプロテアーゼは本明細書中で上述されている。プロテアーゼ消化のために適した条件は使用される具体的なプロテアーゼに依存し、そして本技術分野において公知である。融合ペプチドの第２の部分からの目的のペプチドの分離は、公知の方法によって、例えば、クロマトグラフィー的な方法またはサイズ排除濾過によって、実行され得る。
【００６２】
さらなる実施形態において、目的のペプチドを生産するための方法は、好ましくはさらに、
（ｇ）目的のペプチドを製剤化する工程であって、必要に応じて、医薬組成物として、該融合ペプチドの形態で製剤化する工程、を含む。
好ましくは、工程（ｇ）は工程（ｃ）の後に実行され、特に、この方法の最終工程として実行される。
【００６３】
好ましくは、目的のペプチドを医薬組成物として製剤化することは、目的のペプチドを含む組成物の緩衝液または緩衝液中構成要素を交換することを含む。さらに、この製剤化の工程は、この目的のペプチドの凍結乾燥を含み得る。特に、この目的のペプチドは、薬学的に受容可能な成分のみを含む組成物の中に移入される。
【００６４】
本発明は、グリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分と、目的のペプチドとを含む融合ペプチドをさらに提供し、これは本発明に従う方法によって取得可能である。さらに、本発明は、グリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分と、目的のペプチドとを含む融合ペプチドを含む医薬組成物を提供し、これは本発明に従う方法によって取得可能である。
【００６５】
生産収量における増加
さらなる局面において、本発明は、組み換え生産における目的のペプチドの収量を増加させるための方法を提供し、グリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分をさらに含む融合ペプチドの部分としてこの目的のペプチドを発現させる工程を含む。このような融合ペプチドとしてのこの目的のペプチドの発現のために、本発明に従う発現カセット、ベクター、宿主細胞および／または生産方法が好ましくは使用される。
【００６６】
さらに、本発明は、組み換え生産における目的のペプチドの収量を増加させるための該目的のペプチドと一緒の融合ペプチドの中におけるグリコフォリンタンパク質の細胞外領域またはそれの部分の使用を提供する。このような融合ペプチドとしてのこの目的のペプチドの該組み換え生産のために、本発明に従う発現カセット、ベクター、宿主細胞および／または生産方法が好ましくは使用される。
【００６７】
上述される全ての実施形態および特徴は、本発明に従う方法および使用にもまた同様に適用する。
【００６８】
本明細書中に記載される数的範囲は、その範囲を規定する数を含む。本明細書中に提供される表題は、本発明の様々な局面または実施形態の限定ではなく、それらはその全体が本明細書への参考として読まれ得る。一つの実施形態に従うと、方法の場合には特定の工程を含むように本明細書中に記載される目的物、または組成物の場合には特定の成分を含むように本明細書中に記載される目的物は、それぞれの工程または成分からなる目的物を指す。本明細書中に記載される好ましい局面および実施形態を選択し、そして組み合わせることは好ましく、そして好ましい実施形態のそれぞれの組み合わせから生じる特定の目的物もまた本開示に属する。
【実施例】
【００６９】
実施例１：エリスロポエチン単独の発現または融合タンパク質としてのエリスロポエチンの発現の比較
このアッセイにおいて、モデルタンパク質であるヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）の発現に対する、グリコフォリンＡの細胞外領域の部分との融合の影響を試験した。ＥＦ−１αプロモーターと、選択マーカーとしてジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子とを含む、真核性の発現のための標準的なベクターの中に、ＥＰＯをコードする核酸配列をクローニングした。ＩｇＫまたはＧＭ−ＣＳＦのリーダー配列（細胞外発現シグナル）を、ＥＰＯの分泌された発現のために存在させた。さらに、成熟ヒトグリコフォリンＡ（ＧＹＰＡ  ｅｘ．ｒｅｇ．）のアミノ酸１〜３８をコードする核酸配列を、ベクターの中に、細胞外発現シグナルとＥＰＯとの間かまたはＥＰＯの後ろかのいずれかに、インフレームでクローニングした。対照ベクターにおいては、このグリコフォリンコンストラクトを挿入せず、そしてこの細胞外発現シグナルおよびＥＰＯのみをコードさせた。このアッセイにおいて使用したコンストラクトは以下の通りであった：
【数１】
2016504047.tif 000002
【００７０】
異なるベクターを、２種類の異なるヒト白血病由来宿主細胞株の中にそれぞれトランスフェクトした。これらの細胞はメトトレキサートを使用して陽性トランスフェクタントとして選択し、そして結果として生じたトランスフェクト細胞を細胞増殖およびＥＰＯ生産力についてスクリーニングした。細胞毎、日毎（ｐｃｄ）のピコグラムＥＰＯで、これらの細胞の生産速度を、２つの異なる濃度の選択剤メトトレキサートについて決定した。ＥＰＯ生産力が最初のスクリーニングにおいてとても低かったので、対照２のコンストラクトを用いた細胞をさらに解析した。異なる発現細胞の最大生産速度を以下の表にまとめる。
【表１】
2016504047.tif 000003
【００７１】
データは、グリコフォリンＡの細胞外領域断片の導入が目的のタンパク質、すなわちＥＰＯ、の生産速度を有意に増加させることを実証する。この生産速度における増加はグリコフォリン断片の位置に非依存的である。Ｎ−末端融合およびＣ−末端融合は同等の高生産速度を提供する。異なるメトトレキサート濃度を２つの設定条件のために使用したことを無視したときさえ、生産速度における約１０倍の増加が、グリコフォリン断片融合コンストラクトを使用して取得される。２００ｎＭメトトレキサート濃度群の中で、すなわち複数のベクターのコピーを有するトランスフェクト細胞に対するより高い選択圧があるとき、２０倍〜約４０倍までの増加が実証された。さらに、本発明に従う融合コンストラクトは、使用する発現細胞株に非依存的な生産速度の増加もまた示す。
【００７２】
実施例２：第ＶＩＩ因子単独の発現または融合タンパク質としての第ＶＩＩ因子の発現の比較
さらなる標的タンパク質第ＶＩＩ因子の生産に対する、グリコフォリンの細胞外領域断片の影響もまた解析した。コンストラクトを設計し、そしてアッセイは、グリコフォリンの細胞外領域タグが成熟ヒトグリコフォリンＡのアミノ酸２〜３８からなる以外は、実施例１において記載した通りに実行した。シグナルペプチドとして、第ＶＩＩ因子のリーダー配列を使用した。さらなる対照として、ヘモグロビンタグ（ＨＢ−タグ）を第ＶＩＩ因子のＮ−末端に融合した。以下のコンストラクトを使用した：
【数２】
2016504047.tif 000004
このアッセイにおいて取得した平均生産速度を以下の表にリストする：
【表２】
2016504047.tif 000005
【００７３】
データは、グリコフォリンＡの細胞外領域断片の導入が、目的とする異なるタンパク質の生産速度を有意に増加させることを再度実証する。第ＶＩＩ因子の平均生産速度は、対照コントラストと比較して６５％までだけ増加する。再度、この生産速度は、グリコフォリン断片の位置にかかわらず両方のコンストラクトについて増加する。Ｎ−末端融合およびＣ−末端融合は同等の高生産速度を提供する。しかし、ヘモグロビンタンパク質に由来する対照の融合タグは、生産の増加を示さず、むしろ大幅に生産速度の低下をもたらした。
【００７４】
第ＶＩＩ因子については選び取ったクローン全ての平均生産速度を決定したが、ＥＰＯについては（実施例１）それぞれのクローンの異なる生産速度の範囲を示していることに留意されたい。したがって、上述したＥＰＯについては生産収量におけるはるかに大きな増加が、異なるコンストラクトを用いて取得される最大の可能な生産速度に言及するが、第ＶＩＩ因子については全てのクローンの平均生産速度のみを比較した。さらなる生産プロセスのために最高の生産力を有するクローンを選択しているので、該最高生産クローンの比較は、生産収量における実際の増加をより適切に反映している。
【００７５】
寄託された生物学的材料の身元証明
細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６０６およびＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６０５は、Ｎｅｍｏｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ，Ｒｏｂｅｒｔ−Ｒｏｅｓｓｌｅ−Ｓｔｒ．１０，１３１２５  Ｂｅｒｌｉｎ（ＤＥ）によってＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ（ＤＥ）に寄託された。これらはＮｅｍｏｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧからＧｌｙｃｏｔｏｐｅ  ＧｍｂＨへ譲渡されている期間であったので、グリコトープはこれらの生物学的材料を参照する権利を与えられていた。
【００７６】
細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２８０６、ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２８０７、ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２８５６、ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２８５８およびＤＳＭ  ＡＣＣ  ３０７８は、Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ  ＧｍｂＨ，Ｒｏｂｅｒｔ−Ｒｏｅｓｓｌｅ−Ｓｔｒ．１０，１３１２５  Ｂｅｒｌｉｎ  （ＤＥ）によってＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａβｅ  ７Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ（ＤＥ）に寄託された。
【数３】
2016504047.tif 000006
【数４−１】
2016504047.tif 000007
【数４−２】
2016504047.tif 000008
【数４−３】
2016504047.tif 000009
【数４−４】
2016504047.tif 000010
【数４−５】
2016504047.tif 000011
【配列表】
2016504047000001.app
【国際調査報告】
2016504047.tif 000012
2016504047.tif 000013
2016504047.tif 000014
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