(57)【要約】  本発明は、天然のヒトPYYに比べた場合に治療プロファイルが改善されている、PYYの新規の類縁体に関する。これらの新規のPYY類縁体は、肥満、糖尿病及び他の障害の治療において有用である。【選択図】図1
2016519130.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列:
ProLysProGluXaa1ProGlyXaa2AspAlaSerXaa3GluGluXaa4Xaa5Xaa6TyrTyrAla
Xaa7LeuArgXaa8TyrXaa9AsnTrpXaa10ThrArgGlnArgTyr(配列番号1)
を含むポリペプチド又はその塩
[式中、
Xaa1は、Ala、His又はSerであり、
Xaa2は、Glu又はLysであり、
Xaa3は、Pro又はAlaであり、
Xaa4は、Leu又はTrpであり、
Xaa5は、Asn、Ala又はThrであり、
Xaa6は、Arg又はLysであり、
Xaa7は、Ser、Asp又はAlaであり、
Xaa8は、His又はLysであり、
Xaa9は、Leu又はIleであり、
Xaa10は、Val又はLeuである]。
【請求項２】
アミノ酸配列:
ProLysProGluXaa1ProGlyXaa2AspAlaSerXaa3GluGluXaa4Xaa5
Xaa6TyrTyrAlaXaa7LeuArgXaa8TyrXaa9AsnTrpXaa10ThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号2)
を含むポリペプチド又はその塩
[式中、
Xaa1は、Ala、His又はSerであり、
Xaa2は、Glu又はLysであり、
Xaa3は、Pro又はAlaであり、
Xaa4は、Leu又はTrpであり、
Xaa5は、Asn、Ala又はThrであり、
Xaa6は、Arg又はLysであり、
Xaa7は、Ser、Asp又はAlaであり、
Xaa8は、His又はLysであり、
Xaa9は、Leu又はIleであり、
Xaa10は、Val又はLeuである]。
【請求項３】
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluLeuAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号3)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluLeuAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgLysTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号4)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluLeuAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号5)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgLysTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号6)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号7)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgLysTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号8)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号9)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgLysTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号10)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号11)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgLysTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号12)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号13)、
ProLysProGluAlaProGlyGluAspAlaSerProGluGluLeuAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号14)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AlaLeuArgLysTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号15)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluLeuAsnLysTyrTyrAla
AlaLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号16)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluLeuAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号17)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluLeuAlaArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号18)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号19)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号20)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号21)、
ProLysProGluSerProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号22)、
ProLysProGluSerProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号23)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号24)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAlaLysTyrTyrAla
AlaLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号25)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号26)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgLysTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号27)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerAlaGluGluTrpAlaLysTyrTyrAla
AlaLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号28)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerAlaGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号29)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerAlaGluGluLeuAlaArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号30)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerAlaGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgLysTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号31)、
ProLysProGluSerProGlyLysAspAlaSerAlaGluGluTrpThrLysTyrTyrAla
AlaLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号32)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluLeuAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgLysTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号33)、
ProLysProGluHisProGlyGluAspAlaSerProGluGluTrpAlaLysTyrTyrAla
AlaLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号34)、
ProLysProGluAlaProGlyGluAspAlaSerAlaGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号35)、
ProLysProGluSerProGlyGluAspAlaSerProGluGluTrpThrLysTyrTyrAla
AlaLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号36)、及び
ProLysProGluAlaProGlyGluAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号37)
からなる群から選択される、請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項４】
アミノ酸配列:
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr(配列番号38)
を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５】
アミノ酸配列:
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr(配列番号38)
からなる、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６】
アミノ酸配列:
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号7)
からなる、請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチド及びエキセンジン-4を含む医薬組合せ。
【請求項８】
請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチド及びGLP-1を含む医薬組合せ。
【請求項９】
請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチド及び医薬的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項１０】
請求項1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチド又は医薬組合せを、それを必要とする対象に投与するステップを含む、ヒト対象の代謝障害の治療方法。
【請求項１１】
請求項1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチド又は医薬組合せを、それを必要とする対象に投与するステップを含む、ヒト対象の肥満の治療方法。
【請求項１２】
代謝障害の治療に使用するための医薬の調製に際する、請求項1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチド又は医薬組合せの使用。
【請求項１３】
肥満の治療に使用するための医薬の調製に際する、請求項1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチド又は医薬組合せの使用。
【請求項１４】
代謝障害の治療に使用するための、請求項1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチド又は医薬組合せ。
【請求項１５】
肥満の治療に使用するための、請求項1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチド又は医薬組合せ。
【請求項１６】
前記代謝障害が2型糖尿病である、請求項10、12又は14のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１７】
請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチド配列をコードする核酸分子。
【請求項１８】
請求項17に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１９】
請求項18に記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肥満及び代謝障害の治療において有用な治療ペプチドに関する。さらに具体的には、本発明は、ペプチドYY(PYY)の新規の類縁体及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
米国の肥満の患者数は増加の一途にあり、2009〜2010年では、成人の35.7%が肥満(BMI≧30)であると考えられ、68.8%が過体重(BMI≧25)であると考えられている。例えば、Flegal et al. (2012) JAMA 307(5):491-7を参照されたい。世界的には、3億人以上の人々が、肥満であると考えられている。その集団が重量を増してゆくにつれて、2型糖尿病、高血圧、心臓疾患、関節疾患及びある種のがんを含めた肥満関連疾患では、患者が増加している。
【０００３】
食事及び運動を通じた肥満の予防は、これらの傾向を制御するために決定的に重要であるものの、ひとたび患者が肥満になってしまうと、体重減少に対する身体の抵抗は甚だ大きなものとなり得る。食事と運動のみでは、重篤な肥満患者に大幅な体重変化をもたらすには不十分である場合があり、薬学的な治療と外科手術との両方が、体重減少のための追加的な助けとして有効であることが証明されている。肥満の予防及び治療は、慢性的な体重減少の治療法に現在利用可能な薬物療法が殆どない中で、アンメットメディカルニーズが高い分野である。
【０００４】
ペプチドYY(PYY)は、膵臓性ポリペプチド及び神経ペプチドYと共に、食欲を制御する役割を持つ、PP折り畳みファミリーのペプチド類に属する。例えば、Schwartz et al. (2002) Nature :418(6898):595-7を参照されたい。PYYは、36アミノ酸の直鎖ポリペプチドとして分泌され、次いでジペプジルペプチダーゼIVによって切断されてPYY(3-36)を生じる。胃バイパス手術後の病的な肥満者における絶食時及び食後のPYYの濃縮は、劇的な体重減少の役割を果たすものとして示唆されている。例えば、le Roux (2006) Ann Surg. 243(1):108-14を参照されたい。PYY(3-36)の末梢注入は、肥満対象及び痩身対象において、エネルギー消費と脂肪酸化率とを増大させることが示されている。例えば、Batterham et al. (2003) N Engl J Med. 349(10):941-8、及びSloth et al. (2007) Am J Physiol Endocrinol Metab.: 293(2):E604-9を参照されたい。PYY(3-36)の経鼻噴霧による投与は、肥満者の毎日のカロリー摂取を2713kJずつ低減し、その結果、6日間の検討期間にわたって、0.6Kgの体重減少を生じた。例えば、Gantz et al. (2007) J Clin Endocrinol Metab. 92(5):1754-7を参照されたい。これらの結果は、肥満対象がPYY(3-36)に対する感受性を維持することを実証しており、肥満における治療有用性が抵抗性によって限定されるレプチンとは対照的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、肥満及び肥満関連障害の治療において使用するための、改良されたPYY組成物が当技術分野で求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、天然のヒトPYYに比べた場合に治療プロファイルが改善されている、PYYの新規の類縁体に関する。これらの新規のPYY類縁体は、肥満、糖尿病及び他の障害の治療において有用である。
【０００７】
端的に述べれば、一態様では、本発明は、アミノ酸配列:
ProLysProGluXaa1ProGlyXaa2AspAlaSerXaa3GluGluXaa4Xaa5Xaa6TyrTyrAla
Xaa7LeuArgXaa8TyrXaa9AsnTrpXaa10ThrArgGlnArgTyr(配列番号1)
を含むポリペプチド又はその塩を提供する
[式中、
Xaa1は、Ala、His又はSerであり、
Xaa2は、Glu又はLysであり、
Xaa3は、Pro又はAlaであり、
Xaa4は、Leu又はTrpであり、
Xaa5は、Asn、Ala又はThrであり、
Xaa6は、Arg又はLysであり、
Xaa7は、Ser、Asp又はAlaであり、
Xaa8は、His又はLysであり、
Xaa9は、Leu又はIleであり、
Xaa10は、Val又はLeuである]。
【０００８】
別の態様では、本発明は、
【０００９】
【化１】
2016519130.tif 000003
2016519130.tif 000004
及びその塩からなる群から選択されるポリペプチドを提供する。
【００１０】
別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【００１１】
さらに別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターを含有する宿主細胞を包含する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、本発明の新規のPYYポリペプチドとエキセンジン-4との医薬組合せを提供する。
【００１４】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の新規のPYYポリペプチドとGLP-1との医薬組合せを提供する。
【００１５】
追加の態様では、本発明は、本発明の新規のPYYポリペプチドと1種以上の医薬的に許容され得る賦形剤との医薬組成物を提供する。
【００１６】
さらなる態様では、本発明は、本発明の新規のPYYポリペプチド又は医薬組合せを、それを必要とする対象に投与するステップを含む、代謝障害又は肥満を治療する方法を包含する。
【００１７】
本発明はまた、肥満治療に使用するための医薬の調製に際する、本発明のポリペプチド又は医薬組合せの使用を提供する。
【００１８】
また、本発明は、代謝障害又は肥満の治療に使用するための本発明のポリペプチド又は医薬組合せを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】食事誘発性肥満(DIO)のLong Evans(LE)ラットにおける実施例5に示したペプチド(類縁体#5)、PYY(3-36)NH2(PYY3-36)及びエキセンジン-4単独、及び組合せの、体重変化への効果を示した図である。
【図２】DIO LEラットにおける実施例5に示したペプチド(類縁体#5)、PYY(3-36)NH2(PYY3-36)及びエキセンジン-4単独、及び組合せの、体組成変化への効果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、天然のヒトPYYに比べた場合に治療プロファイルが改善されている、PYYの新規の類縁体を提供する。本発明の新規のPYY類縁体は、天然のPYYに比べた場合に食餌摂取への効果の改善を示す。
【００２１】
一態様では、本新規PYY類縁体は、アミノ酸配列:
ProLysProGluXaa1ProGlyXaa2AspAlaSerXaa3GluGluXaa4Xaa5Xaa6TyrTyrAla
Xaa7LeuArgXaa8TyrXaa9AsnTrpXaa10ThrArgGlnArgTyr(配列番号1)
又はその塩を含む
[式中、
Xaa1は、Ala、His又はSerであり、
Xaa2は、Glu又はLysであり、
Xaa3は、Pro又はAlaであり、
Xaa4は、Leu又はTrpであり、
Xaa5は、Asn、Ala又はThrであり、
Xaa6は、Arg又はLysであり、
Xaa7は、Ser、Asp又はAlaであり、
Xaa8は、His又はLysであり、
Xaa9は、Leu又はIleであり、
Xaa10は、Val又はLeuである]。
【００２２】
本発明の新規のポリペプチドは、ヒトPYY(3-36)と比べた場合に、痩身及び/又は食事誘発性肥満のどちらかの動物モデルにおいて、食餌摂取量の低下の増大を統計的に有意に示す。好ましくは、本発明のポリペプチドは、痩身及び/又は食事誘発性肥満の動物モデルにおいて、少なくとも20%、少なくとも30%、又は少なくとも40%の食餌摂取量の低下を示す。さらに好ましくは、本ポリペプチドは、痩身及び/又は食事誘発性肥満の動物モデルにおいて、少なくとも50%の食餌摂取量の低下を示す。
【００２３】
別の態様では、本発明は、
【００２４】
【化２】
2016519130.tif 000005
2016519130.tif 000006
及びその塩からなる群から選択されるポリペプチドを提供する。
【００２５】
別段に示さない限り、本発明のポリペプチドは、アミノ酸鎖の末端に、カルボキサミドとカルボン酸のどちらかを有してもよい。
【００２６】
本発明は、医薬的に許容され得る塩を含めて、先に挙げたポリペプチドの塩を包含する。そのような塩の例としては、以下に限定されないが、無機及び有機の酸及び塩基が挙げられ、当該酸及び塩基としては、以下に限定されないが、硫酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酢酸塩、酸性酢酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチジン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グロクロン酸塩、糖酸塩、蟻酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、及びパモ酸塩[すなわち、1,1'-メチレンビス(2-ヒドロキシ-3-ナフトエート)]が挙げられる。また、挙げられるのは、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸や酒石酸などの、遊離アミノ基によって形成された塩である。また、挙げられるのは、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩、水酸化鉄塩、イソプロピルアミン塩、トリエチルアミン塩、2-エチルアミノエタノール塩、ヒスチジン塩やプロカイン塩などの、遊離カルボキシル基によって形成され得る塩である。
【００２７】
本発明のポリペプチドは、当分野で公知の標準的な組換え発現又は化学ペプチド合成手法を使用して調製されてもよい。例えば、Chan, Weng C.and Peter D. White, eds, Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, New York: Oxford UP, 2000、Howl, John, eds, Peptide Synthesis and Applications (Methods in Molecular Biology), Totowa、NJ: Humana、2005を参照されたい。
【００２８】
本発明の組成物及び医薬組合せは、例えば高血糖症、耐糖能異常、ベータ細胞欠損、糖尿病(1型糖尿病、2型糖尿病及び妊娠性糖尿病を含める)、非アルコール性脂肪肝疾患、脂肪肝、多嚢胞性卵巣症候群、高脂血症及びメタボリック症候群を含めた代謝障害の治療に有用である。本組成物及び医薬組合せは、肥満若しくは過食によって特徴付けられる疾患を治療するために、又は食欲の抑制のために、使用されてもよい。本方法は、治療有効量の本発明の組成物を、それを必要とする対象に、好ましくはヒト対象に投与するステップを含む。
【００２９】
本発明の組成物及び組合せを用いて治療される場合がある他の障害としては、以下に限定されないが、インスリン抵抗性、インスリン欠乏、高インスリン血症、高血糖症、脂質異常症、高脂血症、高ケトン血症、高グルカゴン血症、膵炎、膵新生物、心血管疾患、高血圧、冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、腎不全、神経障害(例えば自律神経障害、副交感神経障害及び多発神経障害)、糖尿病性網膜症、白内障、内分泌障害並びに睡眠時無呼吸、多嚢胞性卵巣症候群、乳房、結腸、前立腺、直腸及び卵巣の新生物、変形性関節炎、脂肪肝が挙げられる。
【００３０】
本発明は、本発明のコンジュゲート又は融合体を使用して、患者におけるインスリン応答性を調節する方法、並びに細胞によるグルコース取込みを増加させる方法及び細胞のインスリン感受性を調節する方法をさらに包含する。また、提供するのは、患者において、インスリンの合成及び放出を刺激する方法、インスリン取込みに対する脂肪、筋肉又は肝臓の組織の感受性を増強させる方法、グルコース取込みを刺激する方法、消化過程を遅延させる方法、胃排出の遅延方法、胃酸分泌の阻害方法、膵酵素分泌の阻害方法、食欲を低減させる方法、食餌摂取の阻害方法、エネルギー消費を修正する方法、又はグルカゴンの分泌を阻止する方法であり、これらの方法は、前記患者に本発明の組成物を投与するステップを含み、例えば、少なくとも1回の用量の組成物、例えば本願の発明の医薬組成物又は医薬組合せを投与するステップを含む。
【００３１】
本発明はまた、本明細書に記載したものなどの代謝疾患を治療するための医薬の製造における、本発明の組成物の使用を提供する。本発明はまた、療法で使用するための本発明に記載した任意の組成物の使用に関する。
【００３２】
本願の発明のポリペプチド及びその塩は、上記の状態を治療するために、単独で、又は他の治療剤と組合せて(医薬組合せ)利用されてもよい。幾つかの実施形態では、本願の発明のポリペプチド及び追加の治療剤又は複数の治療剤は、共に投与されるが、一方、他の実施形態では、本発明のポリペプチド及び追加の治療剤又は複数の治療剤は、別々に投与される。別々に投与される場合、投与は、同時に又は連続的に、任意の順番で発生してもよい。本願の発明のポリペプチド(複数可)及び他の治療剤(複数可)の量、並びに投与の相対的なタイミングは、所望の組合せの治療効果を達成するために選択されることになる。本願の発明の化合物と他の治療剤とを組み合わせた投与は、(1)両方の治療剤を含む単一の医薬組成物で、又は(2)それぞれが該治療剤のうち1種を含む別個の医薬組成物での、同時投与による組合せであってもよい。あるいは、当該組合せは、連続方式で別個に投与されてもよく、その場合は、1種の治療剤をまず投与して他方を2番目に、又はその逆である。そのような連続投与は、時間内に近づけても遠ざけてもよい。
【００３３】
一実施形態では、本発明の医薬組合せは、本発明によるポリペプチドと、エキセンジン-4ペプチド(例えば米国特許第5,424,286号を参照されたい)又はその断片若しくは類縁体とを含む。本願の発明に有用なエキセンジン-4(Ex-4)及びその類縁体としては、Byetta(登録商標)及びBydureon(登録商標)(エキセナチド)、Victoza(登録商標)(リラグルチド)、リキセナチド(lixisenatide)、LY2189265(デュラグルチド)、PF-4856883、ZYD-1及びHM11260C (LAPSエキセンジン)、並びにPCT特許公開WO99/25728(Beeleyら)、WO99/25727(Beeleyら)、WO98/05351(Youngら)、WO99/40788(Youngら)、WO99/07404(Beeleyら)及びWO99/43708(Knudsenら)に記載のものが挙げられる。
【００３４】
別の実施形態では、本発明の医薬組合せは、本発明によるポリペプチドと、GLP-1(例えばGutniak, M.ら(1992)、N. Engl. J. Bled.、326:1316-22を参照されたい)又はその断片若しくは類縁体、例えばGLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)、GLP-1(7-35)、GLP-1(7-38)、GLP-1(7-39)、GLP-1(7-40)、GLP-1(7-41)とを含む。
【００３５】
さらなるGLP-1類縁体は、国際特許出願第90/11299号に記載されており、この出願は、GLP-1(7-36)及びその機能性誘導体を含み、かつGLP-1(1-36)又はGLP-1(1-37)のインスリン分泌活性を超えるインスリン分泌活性を有するペプチド断片に関し、またインスリン分泌剤としてのその使用に関する(参照のために本明細書に、特に本発明に使用するための薬剤の例示として、組み入れられている)。
【００３６】
国際特許出願WO91/11457(Buckleyら)は、本発明によるGLP-1薬として有用ともなり得る活性型GLP-1ペプチドGLP-1(7-34)、GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)及びGLP-1(7-37)の類縁体を開示している(参照のために本明細書に、特に本発明に使用するための薬剤の例示として、組み入れられている)。
【００３７】
本発明の医薬組合せはまた、本発明によるポリペプチドとアルビグルチドとを含む。
【００３８】
別の実施形態では、医薬組合せは、本発明によるポリペプチドと、DPP-IV阻害剤(例えばシタグリプチン及び/又はサキサグリプチン)などのGLP-1作用増強剤とを含む。
【００３９】
他の実施形態では、本医薬組合せは、本願の発明のPYY類縁体と、メトフォルミン、胆汁酸捕捉剤(例えばコレスチポール、コレストリラミン及び/又はコレセベラム)、回腸胆汁酸輸送体(iBAT)阻害剤(例えばALBI-3309、AZD-7806、S-8921、SAR-58304又は米国特許出願公開第2013/0029938号に記載のもの)やSGLT-1阻害剤(例えばDSP-3235及び/又はLX-4211)などのGLP-1分泌の直接的又は間接的な刺激物質である1種以上の治療剤とを含む。
【００４０】
本発明は、「治療有効量」の本発明のポリペプチドが、そのような治療を必要とする対象に投与される、治療方法を提供する。「治療有効量」という用語は、そのような量を受けていない対応の対象と比べて、疾患、障害若しくは副作用の治療、治癒又は寛解を向上させ、疾患又は障害の進行する速度を低下させるという結果をもたらす、任意の量を意味する。当業者に認識されることになるように、治療有効量の薬剤は、患者の年齢及び体重、患者の健康状態、血糖値レベル、得られた体重レベル及び他の要因を含めた多数の要因によって変わることになる。
【００４１】
一実施形態では、治療有効量の本願の発明のポリペプチドは、対象において所望の程度まで食欲を抑制するのに必要な量である。化合物の一日当たりの有効な食欲抑制用量は、70kgの患者には、典型的には約0.01μg〜約500μg/日、好ましくは約0.05μg〜約100μg/日、さらに好ましくは約1μg〜約50μg/日、最も好ましくは約5μg〜約25μg/日であり、単回又は分割用量で投与されることになる。
【００４２】
一態様では、本発明は、本発明のポリペプチドと、医薬的に許容され得る担体、賦形剤又は希釈剤とを含む、医薬組成物を提供する。
【００４３】
本発明の医薬組成物及び医薬組合せは、静脈内、腹腔内、皮下及び筋肉内、経口、局所的、経粘膜を含めた任意の経路によって、又は肺吸入によって、投与され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、非経口(静脈内、筋肉内及び皮下を含める)、経鼻又は経口の投与に適した製剤の形態で提供され得る。
【００４４】
様々な投与経路用にポリペプチドを製剤化し送達する方法は、当分野に公知である。例えば、Swain et al. (2013) Recent Pat. Biotechnol. 1 Feb 2013 Epub ahead of print, Hovgaard, Lars, Sven Froklaer、Marco Van De Weert, eds. Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. 2nd ed. Boca Raton: CRC Press, 2012、Van Der Walle, Chris, ed. Peptide and Protein Delivery. London: Academic, 2011を参照されたい。
【００４５】
一実施形態では、本発明は、徐放製剤を包含する。そのような製剤は、治療有効量の治療ポリペプチド又は複数のポリペプチドを、皮下の間隙に注射又は送達してから多くの時間又は日数にわたって血流中に送達することを可能にする。
【００４６】
本発明の徐放製剤は、治療ポリペプチドの放出を遅延させるのに有用な1種以上のポリマーを含む。そのようなポリマーの非限定的な例としては、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)PLGA、ポリカプロラクタム、ポリジオキサノン、ポリトリメチレンカーボネート、ポリ無水物、PEG-PLGA、ポリグルタミン酸、ポリエチレングリコールテレフタラート/ポリブチレンテレフタラート/ポリブチレンテレフタラート、ポリ(アミノ酸)-Leu/Glu共重合体、ポリチロシンカーボネート、ポリエステルアミド、ポリ(アルファアミノ酸)ベースのポリマーミセル、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリアルキルシアノアクリレート、コラーゲン、ヒアルロン酸、アルブミン、カルボキシメチルセルロース、フレキシマー、キトサン、マルトデキストリン、デキストラン又は硫酸デキストランが挙げられる。
【００４７】
一態様では、本発明のポリペプチドは、長期間の継続的又は断続的な薬剤注入を提供するために設計された、移植可能な注入ポンプなどの小型のデバイスを介して送達されてもよい。そのようなデバイスは、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、髄膜内、硬膜外又は脳室内の経路を介して、本発明の治療ポリペプチドを投与するために使用することができる。そのようなデバイスは、被浸食性、非浸食性及び/又は耐久性があってもよい。そのようなデバイスの非限定的な例としては、Durasert(商標)デバイス(pSivida)、DUROS(登録商標)浸透圧送達装置(Intarcia Therapeutics)、MedLaunch(商標)ポリマー技術(Endo Health)が挙げられる。
【００４８】
本願の発明による使用し得る他のデバイスとしては、SnychroMed(登録商標)ポンプ(Medtronic)及びCodman(登録商標)3000注入ポンプ(Johnson & Johnson)、V-Go(登録商標)送達装置(Valeritas)、OmniPod(登録商標)ポンプ(Insulet)及びJewelPump(商標)(Debiotech)が挙げられる。
【００４９】
本発明のポリペプチドは、in situのゲル製剤に投与されてもよい。そのような製剤は、典型的には、水混和性の有機溶媒の消散と、マトリックス中に存在する疎水性ドメインの凝集とのどちらかによってゲルを形成する、液体として投与される。非限定的な例としては、FLUID CRYSTAL技術(Camurus)及びSABER技術(Durect)、並びに米国特許第5,612,051号、第5,714,159号、第6,413,539号、第6,004,573号及び第6,117,949号に記載の製剤が挙げられる。
【００５０】
本発明の治療ポリペプチドはまた、皮下注射に適したミクロスフェアベースの医薬製剤内に被包されてもよい。ペプチドの送達用のミクロスフェアベースの製剤の非限定的な例としては、Chroniject(商標)(Oakwood Labs)、Medusa(登録商標)(Flamel's)、Q-Sphera(Q-CHIP)、並びに米国特許第4,675,189号、第6,669,961号及びAminet al.(2001) J of Controlled Release 73: 49-57に記載の製剤が挙げられる。
【００５１】
本製剤は、メタクレゾール、ベンジルアルコール、パラベン類(メチル、プロピル、ブチル)、クロロブタノール、フェノール、酢酸塩、ホウ酸塩や硝酸塩などのフェニル水銀塩、又はソルビン酸などの抗菌剤又は抗真菌剤を含有してもよい。
【００５２】
この発明の組成物は、保存のために凍結乾燥することができ、使用前に適当な担体中に再生することができる。任意の適当な凍結乾燥方法(例えば噴霧乾燥、ケーキ乾燥)及び/又は再生手法が利用され得る。特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載したような凍結乾燥した(凍結し乾燥した)ポリペプチドを含む組成物を提供する。
【００５３】
ある種の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸及びそのような核酸を含有する組換え発現ベクターを提供する。本発明の組換え発現ベクターは、もう1種の発現制御エレメント、例えばプロモーターなどへ動作可能に連結された、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含む。
【００５４】
本発明のポリペプチドをコードする核酸又は組換え発現ベクターを含む宿主細胞もまた含まれる。本発明による適当な宿主細胞は、原核宿主細胞と真核宿主細胞の両方を含む。想定され得る宿主細胞としては、以下に限定されないが、哺乳類宿主細胞、バクテリア宿主細胞(例えばE.coli)、酵母宿主細胞及び植物宿主細胞が挙げられる。
【００５５】
本発明のポリペプチドをコードする核酸及び組換え発現ベクターは、例えば形質転換、形質導入、電気穿孔又は感染などの選択された宿主細胞に適切な方法を使用して、適当な宿主細胞に導入して、組換え宿主細胞を作り出すことができる。幾つかの実施形態では、当該核酸又は組換え発現ベクターは、宿主細胞のゲノム中に組み込まれる。結果として生じる組換え宿主細胞は、発現に適した条件下で(例えば、誘発剤の存在下で、適当な動物において、適切な塩、成長因子、抗生物質、栄養補助物質などを補われた適当な培養培地において)維持することができ、それによって、コードされたポリペプチドが生産される。所望であれば、コードされたペプチド又はポリペプチドは、単離され得るか回収され得る。
【００５６】
本発明は、本願の発明のポリペプチドを生産するための方法をさらに提供し、ここで、本法は、本発明のポリペプチドをコードする核酸又は組換え発現ベクターを含む先に記載したような宿主細胞を、前記核酸又は組換え発現ベクターの発現に適した条件下で維持するステップを含む。宿主細胞におけるポリペプチドの組換え発現のための方法は、当分野に周知されている。例えば、Rosalyn M. Bill, ed. Recombinant Protein Production in Yeast: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 866), Humana Press 2012、James L. Hartley, ed. Protein Expression in Mammalian Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press 2012、Loic Faye and Veronique Gomord, eds. Recombinant Proteins From Plants: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press 2008及びArgelia Lorence, ed. Recombinant Gene Expression (Methods in Molecular Biology), Humana press 2011を参照されたい。
【００５７】
ある特定の実施形態では、本発明の核酸は、「単離されている」。「単離されている」として本明細書に言及された核酸は、本来の環境中(例えば、細胞内又はライブラリなどの核酸の混合物中)で他の材料(例えば、ゲノムDNA、cDNA及び/又はRNAなどの他の核酸)から分離されている核酸である。単離されている核酸は、組換え発現ベクターの一部として単離され得る。
【００５８】
以下の実施例は、例示を意図しているに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５９】
[実施例]
実施例では、以下の略称を使用する。
amu  原子質量単位
Fmoc  9-フルオレニルメトキシカルボニル
HBTU  2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
HCTU  2-(6-クロロ-1-H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート
DMF  N,N-ジメチルホルムアミド
NMM  N-メチルモルホリン
DIPEA  N,N-ジイソプロピルエチルアミン
TFA  トリフルオロ酢酸
Trt  トリチル
t-Bu  tert-ブチル
Boc  tert-ブチルカルボニル
Pbf  2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロ-ベンゾフラン-5-スルホニル
MAL  マレイミド
PBS  リン酸緩衝生理食塩水
ivDde  1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル
MALDI  マトリックス支援レーザー脱離/イオン化
BMPS  N-β-マレイミドプロピルオキシスクシンイミドエステル
DODT  2,2'-(エチレンジオキシ)ジエタンチオール
TIPS  トリイソプロピルシラン
MPA  メルカプトプロピオン酸
rt  保持時間
RPM  毎分回転数
【００６０】
ペプチド合成
以下の実施例に示すペプチドを、固相法によって、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)中における2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)又は2-(6-クロロ-1-H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート(HCTU)の活性化(5倍モル過剰量)、及び塩基としてN-メチルモルホリン(NMM)、Fmoc脱保護用の20%ピペリジン/DMFを用いたFmoc戦略を使用して、自動ペプチド合成機(Prelude又はOvertureモデル、Protein Technologies、Tucson、AZ)上で合成した。樹脂は、Rink Amide MBHA LL(Novabiochem)又はRink Amide AM LL(Novabiochem)とし、20〜400μmolスケールで0.29〜0.38mmol/gをロードした。使用した側鎖保護基は、Asn、Gln、Cys及びHis用にはTrtであり、Ser、Thr及びTyr用にはt-Buであり、Lys及びTrp用にはBocであり、Asp及びGlu用にはOt-Buであり、Arg用にはPbfであった。ペプチド-樹脂の切断を、トリフルオロ酢酸(TFA):アニソール:水:トリイソプロピルシラン(88:5:5:2)の混合物を用いて完了させた。粗ペプチドを冷ジエチルエーテル中に沈殿させ、該ジエチルエーテルをデカントし、固形物を冷ジエチルエーテルで再度摩砕した。次いで粗固形物を、逆相HPLCによって、Waters XBridge(商標)BEH 130、C18、10μm、130Å、30×250mm内径カラム上で、流速30mL/分、λ - 215nmで、0.1%TFAを含む5〜75%アセトニトリル/水の範囲内の30〜45分間にわたる勾配を使用して精製した。
【００６１】
LC/MS条件
方法A:Phenomenex UPLC Aeris(商標)Peptide XB C18カラム、1.7μm、2.1×100 mm又はACQUITY BEH300若しくはBEH130 C18カラム、1.77μm、2.1×100 mmを使用し、0.05%TFAを含む5〜65%アセトニトリル/水を使用して、30分間にわたって、流速0.5mL/分、λ - 215nm、280nmで行った。
【００６２】
C18 HPLC条件
方法A:Waters XBridge(商標)BEH130 C18カラム、5μm、4.6×250mmを使用し、0.1%TFAを含む5〜70%アセトニトリル/水を用いて、15分間にわたって、流速1.5mL/分、40℃、λ - 215nm、280nmで行った。
【００６３】
方法B:Waters XBridge(商標)BEH130 C18カラム、5μm、4.6×250mmを使用し、0.1%TFAを含む5〜75%アセトニトリル/水を用いて、20分間にわたって、流速1.5mL/分、λ - 215nm、280nmで行った。
【００６４】
方法C:Waters XBridge(商標)BEH130 C18カラム、5μm、4.6×250mmを使用し、0.1%TFAを含む20〜37.5%アセトニトリル/水を用いて、15分間にわたって、流速1.0mL/分、60℃、λ - 215nm、280nmで行った。
【００６５】
方法D:Waters XBridge(商標)BEH130 C18カラム、5μm、4.6×250mmを使用し、0.1%TFAを含む5〜70%アセトニトリル/水を用いて、15分間にわたって、流速1.5mL/分、λ - 215nm、280nmで行った。
【００６６】
[実施例1]
PKPEAPGKDASPEELNRYYASLRHYLNWVTRQRY-NH2(配列番号3)
実施例1を、一般的な方法を使用して、35μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4105amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1369amu及び(M+4)/4-1027amuによって確定した(ESI-MS、LC/MS法A)。単離したペプチド(8トリフルオロ酢酸塩として25mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=8.90分)によって決定した。
【００６７】
[実施例2]
PKPEAPGKDASPEELNRYYASLRKYLNWLTRQRY-NH2(配列番号4)
実施例2を、一般的な方法を使用して、35μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4111amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1371amu及び(M+4)/4-1028amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(8トリフルオロ酢酸塩として20mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=9.46分)によって決定した。
【００６８】
[実施例3]
PKPEAPGKDASPEELNRYYASLRHYLNWLTRQRY-NH2(配列番号5)
実施例3を、一般的な方法を使用して、35μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4120amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1374amu及び(M+4)/4-1031amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(8トリフルオロ酢酸塩として16mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=9.42分)によって決定した。
【００６９】
[実施例4]
PKPEAPGKDASPEEWNRYYADLRKYLNWLTRQRY-NH2(配列番号6)
実施例4を、一般的な方法を使用して、35μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4212amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1405amu及び(M+4)/4-1054amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(8トリフルオロ酢酸塩として18mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=9.54分)によって決定した。
【００７０】
[実施例5]
PKPEAPGKDASPEEWNRYYADLRHYLNWLTRQRY-NH2(配列番号7)
実施例5を、一般的な方法を使用して、6×50μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4221amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1407amu及び(M+4)/4-1056amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(8トリフルオロ酢酸塩として180mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=9.27分)によって決定した。
【００７１】
あるいは、実施例5を、15℃に冷却したジャケット付250mL反応槽を使用して、人手による合成を介して調製した。Rink Amide AM Resin LL(100〜200メッシュ、13.8g、0.29mmol/gをロード)を、DMF(50mL)を用いて、窒素分散下で各回10分間、3回膨潤させた。Fmoc基を、DMF中20%ピペリジン(200mL)を用いて、窒素分散下で5分間にわたって除去し、続いてDMF中20%ピペリジン(200mL)を用いて、窒素分散下で12分間にわたって除去した。次いで、樹脂をDMF(100mL)で洗浄し、次いで2回、DMF(100mL)を用いて窒素分散下で1分間洗浄した。Fmoc脱保護とDMF洗浄に続いて、最初のアミノ酸(100mL、200mM DMF溶液)を添加し、続いてDIPEA溶液(50mL、800mM DMF溶液)を添加した。DMF中HCTU溶液(50mL、400mM)を、ペリスタポンプを介して12分間にわたって添加した。最短で15分後、樹脂のアリコートのカイザー試験を行い、反応を完了させるようにした。次いで、樹脂をDMF(100mL)で洗浄し、次に2回、DMF(100mL)を用いて、窒素分散下で1分間洗浄した。この一連(20%ピペリジン/DMFを用いたFmoc脱保護、洗浄、アミノ酸カップリング、カイザー試験、洗浄)を、24位のヒスチジンを除くペプチドの残りの配列について行った。アミノ酸(His)及びDIPEAの溶液を約10℃に冷却して、反応槽に添加した。反応槽冷却器を5℃に設定し、反応混合物を6.3℃に約15分間冷却した。冷却した(約10℃)DMF中HCTU溶液(50mL)を、ペリスタポンプを介して25分間にわたって2mL/分で滴下し、その間に溶液を7.8℃に加温した。15分後、カイザー試験は、完全な反応が行われたことを示した。残りのアミノ酸を、標準的なプロトコールを使用してカップリングさせた。合成が完了した(プロリン1をカップリングさせた)際に、次いで樹脂をDMF(100mL)で2回、窒素分散下で1分間洗浄し、次いでDCM(200mL)で3回、窒素分散下で5分間洗浄し、次いで最後に、メタノール(200mL)で3回、窒素分散下で5分間洗浄した。樹脂を窒素分散下、30分間乾燥し、37.5gの乾燥樹脂を得た。樹脂を塊に切り分けた。10gの樹脂を、120mLのDMFで、窒素分散下で45分間膨潤させた。DMFを排出し、最後のN末端Fmocを、DMF中20%ピペリジン(150mL)を用いて、窒素分散下で5分間にわたって除去し、続いて、DMF中20%ピペリジン(150mL)を用いて、窒素分散下で12分間にわたって除去した。次いで、樹脂をDMF(100mL)で洗浄し、DMF(100mL)で窒素分散下、1分間で2回洗浄し、次いでDCM(120mL)で窒素分散下、5分間で3回洗浄し、次いで最後に、メタノール(120mL)で窒素分散下、5分間で3回洗浄した。樹脂を窒素分散下で30分間にわたって乾燥させた。樹脂からのペプチドの切断を、100〜120mLの切断カクテル、すなわちTFA:フェノール:DODT水:TIPS(90:2.5:2.5:2.5:2.5)を使用して、2.5〜3時間行った。濾液をベッセル内に分割して、冷ジエチルエーテルで処理した。ベッセルを、3000RPMで10分間遠心分離し、上清を注ぎ出した。材料を、再度冷ジエチルエーテルを用いて処理して、振盪し、次いで3000RPMでさらに10分間遠心分離した。上清を再度注ぎ出した。ベッセル由来の固体を、0.1%水性TFAを使用して合一し、凍結乾燥してバッチ1を得た。同じ手順を使用して、樹脂を2番目の切断に付して、バッチ2を得た。この工程(Fmoc脱保護、洗浄、樹脂からの切断、粉砕、再懸濁、及び凍結乾燥)を、約9gの樹脂に3回繰り返して、凍結乾燥後に総計約11gの粗ペプチドを得た。この材料を、0.1%水性TFAに溶解して、およそ75mg/mLの濃度を得、該材料を、複数回注入(それぞれ2mLと3mLとの間)を使用した逆相HPLCによって、以下の工程の勾配を使用して精製した。すなわち、75分にわたる、0.1%TFAを含む5〜41.25%アセトニトリル/水、XBridge(商標)Prep C18、50×250mm、10μm、流速50mL/分である。純度>93%(HPLCの方法C)の生成物を含有する画分を合一した。不純物がある画分(純度〜88〜93%)も採集して、精製条件に再度付した。全ての純粋画分(>93%)を、次いで合一し、凍結乾燥して、所望のペプチドを白い固体として得た。純度>93%を、単離されたペプチド(2.8g、8トリフルオロ酢酸塩として)について、C18 HPLC(C18 HPLCの方法C、rt=14.12分)によって決定した。
【００７２】
ペプチド合成機及び人手による合成によって調製された実施例5を使用する、TFAからHOAcへの塩交換は、2×60mLのAgilent StratoSpheres(商標)PL-HCO3 MP SPEカラムを使用して行った。カラムを、まず50mLのMeOHで処理することによって、続いて50mLのDI水で処理することによって平衡化した。次いで、カラムを、2×50mLの1N HOAcと、次いで2×50mLの0.1N HOAcとで処理し、濾液をモニターしてpH〜3とした(pH試験紙)。実施例5(先に記載したように調製した2.8gと、以前に調製したバッチ由来の0.7gとを含む〜3.5g)の0.1N HOAc溶液を、SPEカラムに等量に分割し、次いで5×50mLの0.1N HOAcで溶離させた。次いで、カラムを5×50mLのMeOHで洗浄した。生成物(HPLCの方法Cによって決定した)を含有するメタノール画分を、ロータリーエバポレータを介して〜40mLに濃縮し、0.1N HOAc洗浄に付した。該溶液を3日にわたって凍結乾燥し、所望の単離されたペプチドを白色固体として得た。単離したペプチド(8酢酸塩として2.95g)について、純度>95%を、C18 HPLC(C18 HPLC法C、rt=14.14分)によって決定した。
【００７３】
[実施例6]
PKPEAPGKDASPEEWNRYYASLRKYLNWLTRQRY-NH2(配列番号8)
実施例6を、一般的な方法を使用して、35μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4184amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1395amu及び(M+4)/4-1047amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(8トリフルオロ酢酸塩として18mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=9.45分)によって決定した。
【００７４】
[実施例7]
PKPEAPGKDASPEEWNRYYASLRHYLNWLTRQRY-NH2(配列番号9)
実施例7を、一般的な方法を使用して、35μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4193amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1398amu及び(M+4)/4-1049amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(8トリフルオロ酢酸塩として27mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=9.47分)によって決定した。
【００７５】
[実施例8]
PKPEAPGKDASPEEWNRYYADLRKYLNWVTRQRY-NH2(配列番号10)
実施例8を、一般的な方法を使用して、35μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4198amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1400amu及び(M+4)/4-1050amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(8トリフルオロ酢酸塩として21mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=9.35分)によって決定した。
【００７６】
[実施例9]
PKPEAPGKDASPEEWNRYYADLRHYLNWVTRQRY-NH2(配列番号11)
実施例9を、一般的な方法を使用して、35μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4207amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1403amu及び(M+4)/4-1052amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(8トリフルオロ酢酸塩として22mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=9.36分)によって決定した。
【００７７】
[実施例10]
PKPEAPGKDASPEEWNRYYASLRKYLNWVTRQRY-NH2(配列番号12)
実施例10を、一般的な方法を使用して、35μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4170amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1391amu及び(M+4)/4-1043amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(8トリフルオロ酢酸塩として23mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=9.23分)によって決定した。
【００７８】
[実施例11]
PKPEAPGKDASPEEWNRYYASLRHYLNWVTRQRY-NH2(配列番号13)
実施例11を、一般的な方法を使用して、35μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4179amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1393amu及び(M+4)/4-1045amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(8トリフルオロ酢酸塩として22mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=9.24分)によって決定した。
【００７９】
[実施例12]
PKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNWVTRQRY-NH2(配列番号14)
実施例12を、一般的な方法を使用して、35μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4106amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1369amu及び(M+4)/4-1027amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(7トリフルオロ酢酸塩として22mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=9.60分)によって決定した。
【００８０】
[実施例13]
PKPEHPGKDASPEEWNRYYAALRKYLNWVTRQRY-NH2(配列番号15)
実施例13を、一般的な方法を使用して、35μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4220amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1407amu及び(M+4)/4-1056amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(9トリフルオロ酢酸塩として22mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=9.46分)によって決定した。
【００８１】
[実施例14]
PKPEHPGKDASPEELNKYYAALRHYLNWVTRQRY-NH2(配列番号16)
実施例14を、一般的な方法を使用して、35μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4128amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1377amu及び(M+4)/4-1033amuによって確定した(ESI-MS、LC/MS法A)。単離したペプチド(9トリフルオロ酢酸塩として27mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLC法A、rt=8.88分)によって決定した。
【００８２】
[実施例15]
PKPEHPGKDASPEELNRYYASLRHYINWVTRQRY-NH2(配列番号17)
実施例15を、一般的な方法を使用して、35μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4172amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1391amu及び(M+4)/4-1044amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(9トリフルオロ酢酸塩として29mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=8.77分)によって決定した。
【００８３】
[実施例16]
PKPEHPGKDASPEELARYYASLRHYLNWVTRQRY-NH2(配列番号18)
実施例16を、一般的な方法を使用して、35μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4129amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1377amu及び(M+4)/4-1033amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(9トリフルオロ酢酸塩として30mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=8.89分)によって決定した。
【００８４】
[実施例17]
PKPEHPGKDASPEEWNRYYASLRHYINWVTRQRY-NH2(配列番号19)
実施例17を、一般的な方法を使用して、35μmolスケールで白色固体として調製した。単離した粗固形物を、8mLの25%酢酸中で数時間撹拌して、樹脂から切断される間に形成されるトリプトファンCO2付加体を最小限に抑えた。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4245amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1416amu及び(M+4)/4-1062amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(9トリフルオロ酢酸塩として35mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=8.88分)によって決定した。
【００８５】
[実施例18]
PKPEHPGKDASPEEWNRYYADLRHYINWVTRQRY-NH2(配列番号20)
実施例18を、一般的な方法を使用して、35μmolスケールで白色固体として調製した。単離した粗固形物を、8mLの25%酢酸中で数時間撹拌して、樹脂から切断される間に形成されるトリプトファンCO2付加体を最小限に抑えた。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4273amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1425amu及び(M+4)/4-1069amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(9トリフルオロ酢酸塩として17mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=8.98分)によって決定した。
【００８６】
[実施例19]
PKPEHPGKDASPEEWNRYYADLRHYLNWVTRQRY-NH2(配列番号21)
実施例19を、一般的な方法を使用して、35μmolスケールで白色固体として調製した。単離した粗固形物を、8mLの25%酢酸中で数時間撹拌して、樹脂から切断される間に形成されるトリプトファンCO2付加体を最小限に抑えた。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4273amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1425amu及び(M+4)/4-1069amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(9トリフルオロ酢酸塩として34mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=8.98分)によって決定した。
【００８７】
[実施例20]
PKPESPGKDASPEEWNRYYADLRHYINWVTRQRY-NH2(配列番号22)
実施例20を、一般的な方法を使用して、35μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4223amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1408amu及び(M+4)/4-1057amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(8トリフルオロ酢酸塩として28mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=8.30分)によって決定した。
【００８８】
[実施例21]
PKPESPGKDASPEEWNRYYADLRHYLNWVTRQRY-NH2(配列番号23)
実施例21を、一般的な方法を使用して、35μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4223amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1408amu及び(M+4)/4-1057amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(8トリフルオロ酢酸塩として28mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=8.68分)によって決定した。
【００８９】
[実施例22]
PKPEHPGKDASPEEWNRYYADLRHYLNWLTRQRY-NH2(配列番号24)
実施例22を、一般的な方法を使用して、40μmolスケールで白色固体として調製した。単離した粗固形物を、8mLの25%酢酸中で数時間撹拌して、樹脂から切断される間に形成されるトリプトファンCO2付加体を最小限に抑えた。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4287amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1430amu及び(M+4)/4-1073amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(9トリフルオロ酢酸塩として24mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=9.65分)によって決定した。
【００９０】
[実施例23]
PKPEHPGKDASPEEWAKYYAALRHYINWVTRQRY-NH2(配列番号25)
実施例23を、一般的な方法を使用して、40μmolスケールで白色固体として調製した。単離した粗固形物を、8mLの25%酢酸中で数時間撹拌して、樹脂から切断される間に形成されるトリプトファンCO2付加体を最小限に抑えた。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4158amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1386amu及び(M+4)/4-1040amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(9トリフルオロ酢酸塩として20mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=9.28分)によって決定した。
【００９１】
[実施例24]
PKPEAPGKDASPEEWNRYYADLRHYINWVTRQRY-NH2(配列番号26)
実施例24を、一般的な方法を使用して、40μmolスケールで白色固体として調製した。単離した粗固形物を、8mLの25%酢酸中で数時間撹拌して、樹脂から切断される間に形成されるトリプトファンCO2付加体を最小限に抑えた。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4207amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1403amu及び(M+4)/4-1053amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(8トリフルオロ酢酸塩として28mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=9.22分)によって決定した。
【００９２】
[実施例25]
PKPEHPGKDASPEEWNRYYASLRKYLNWVTRQRY-NH2(配列番号27)
実施例25を、一般的な方法を使用して、40μmolスケールで白色固体として調製した。単離した粗固形物を、8mLの25%酢酸中で数時間撹拌して、樹脂から切断される間に形成されるトリプトファンCO2付加体を最小限に抑えた。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4236amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1412amu及び(M+4)/4-1060amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(9トリフルオロ酢酸塩として21mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=9.09分)によって決定した。
【００９３】
[実施例26]
PKPEHPGKDASAEEWAKYYAALRHYINWVTRQRY-NH2(配列番号28)
実施例26を、一般的な方法を使用して、20μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4132amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1378amu及び(M+4)/4-1034amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(9トリフルオロ酢酸塩として19mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=9.44分)によって決定した。
【００９４】
[実施例27]
PKPEAPGKDASAEEWNRYYASLRHYLNWVTRQRY-NH2(配列番号29)
実施例27を、一般的な方法を使用して、20μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4153amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1385amu及び(M+4)/4-1039amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(8トリフルオロ酢酸塩として16mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=9.31分)によって決定した。
【００９５】
[実施例28]
PKPEHPGKDASAEELARYYASLRHYLNWVTRQRY-NH2(配列番号30)
実施例28を、一般的な方法を使用して、20μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4103amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1368amu及び(M+4)/4-1027amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(9トリフルオロ酢酸塩として14mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=9.27分)によって決定した。
【００９６】
[実施例29]
PKPEAPGKDASAEEWNRYYASLRKYLNWVTRQRY-NH2(配列番号31)
実施例29を、一般的な方法を使用して、20μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4144amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1382amu及び(M+4)/4-1037amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(8トリフルオロ酢酸塩として27mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=9.31分)によって決定した。
【００９７】
[実施例30]
PKPESPGKDASAEEWTKYYAALRHYINWVTRQRY-NH2(配列番号32)
実施例30を、一般的な方法を使用して、20μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4112amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1371amu及び(M+4)/4-1029amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(8トリフルオロ酢酸塩として33mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=9.59分)によって決定した。
【００９８】
[実施例31]
PKPEAPGKDASPEELNRYYASLRKYLNWVTRQRY-NH2(配列番号33)
実施例31を、一般的な方法を使用して、35μmolスケールで白色固体として調製した。単離した粗固形物を、8mLの25%酢酸中で数時間撹拌して、樹脂から切断される間に形成されるトリプトファンCO2付加体を最小限に抑えた。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4097amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1366amu及び(M+4)/4-1025amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(8トリフルオロ酢酸塩として21mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=8.93分)によって決定した。
【００９９】
[実施例32]
PKPEHPGEDASPEEWAKYYAALRHYINWVTRQRY-NH2(配列番号34)
実施例32を、一般的な方法を使用して、20μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4159amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1387amu及び(M+4)/4-1041amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(8トリフルオロ酢酸塩として9.4mg)について、純度>90%を、LC/MS(LC/MSの方法A、rt=13.58分)によって決定した。
【０１００】
[実施例33]
PKPEAPGEDASAEEWNRYYASLRHYLNWVTRQRY-NH2(配列番号35)
実施例33を、一般的な方法を使用して、20μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4154amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1385amu及び(M+4)/4-1039amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(7トリフルオロ酢酸塩として7.7mg)について、純度>90%を、LC/MS(LC/MSの方法A、rt=13.35分)によって決定した。
【０１０１】
[実施例34]
PKPESPGEDASPEEWTKYYAALRHYINWVTRQRY-NH2(配列番号36)
実施例34を、一般的な方法を使用して、20μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4139amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1381amu及び(M+4)/4-1036amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(7トリフルオロ酢酸塩として8.2mg)について、純度>90%を、LC/MS(LC/MSの方法A、rt=13.98分)によって決定した。
【０１０２】
[実施例35]
PKPEAPGEDASPEEWNRYYADLRHYLNWLTRQRY-NH2(配列番号37)
実施例35を、一般的な方法を使用して、20μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4222amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1408amu及び(M+4)/4-1056amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(7トリフルオロ酢酸塩として7.5mg)について、純度>90%を、LC/MS(LC/MSの方法A、rt=13.84分)によって決定した。
【０１０３】
実施例36〜43では、以下の中間体に言及する。
中間体1
【０１０４】
【化３】
2016519130.tif 000007
中間体2
【０１０５】
【化４】
2016519130.tif 000008
中間体3
【０１０６】
【化５】
2016519130.tif 000009
中間体4
【０１０７】
【化６】
2016519130.tif 000010
中間体5
【０１０８】
【化７】
2016519130.tif 000011
中間体6
【０１０９】
【化８】
2016519130.tif 000012
中間体7
【０１１０】
【化９】
2016519130.tif 000013
中間体8
【０１１１】
【化１０】
2016519130.tif 000014
中間体9
【０１１２】
【化１１】
2016519130.tif 000015
中間体10
【０１１３】
【化１２】
2016519130.tif 000016
中間体11
【０１１４】
【化１３】
2016519130.tif 000017
【０１１５】
[実施例36]
【０１１６】
【化１４】
2016519130.tif 000018
【０１１７】
中間体1を、一般的な方法を使用して、400μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4128amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1377amu及び(M+4)/4-1033amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(7トリフルオロ酢酸塩として76mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法B、rt=10.98分)によって決定した。
【０１１８】
3.5mLのpH7.4の1×PBS緩衝液中の、中間体1(24.1mg、4.89μmol)及び中間体2(NOF Corporation、ME-400MA、226mg、5.14μmol)の混合物を、45分間撹拌し、その時間の間に、反応物を均一にした。該反応物を、次いで0.1M水性HCl中20%MeOH溶液に希釈し、イオン交換クロマトグラフィ(Sepharose FF Media、5カラム容量超の20%methanol/10 mM水性HCl中5〜50%1M NaCl、流速5mL/分、λ - 254nm)によって精製した。精製したコンジュゲートを、サイズ排除クロマトグラフィ(GE HiPrep 26/10脱塩カラム、0.1M酢酸、λ - 254nm)を使用して脱塩し、凍結乾燥後に白色固体を得た。単離したペプチドの分子量を、47379amuに頂点を伴う陽フラグメントイオンの分布(MALDI)によって確定した。実施例36(7酢酸塩として107mg)は、サイズ排除HPLC(Phenomenex BioSep-SEC-S3000カラム、7.8×300mm、5μm、0.5%TFAを含む50%アセトニトリル/水を20分間、流速0.75mL/分、λ - 220nm)を使用して、9.95分に等しい保持時間を与えた。
【０１１９】
[実施例37]
【０１２０】
【化１５】
2016519130.tif 000019
【０１２１】
中間体3は、ペプチドの8位のリジンをivDde基で保護し、かつ1位のプロリンをBocで保護したことを除き、一般的な方法を使用して、40μmolスケールで白色固体として調製した。最後のアミノ酸(プロリン1)のカップリング後に、DMF中4%ヒドラジンの処理を繰り返すことによって、ivDdeを除去し、Fmoc-Cys(Trt)-OHをカップリングした。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4390amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1464amu及び(M+4)/4-1098amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(9トリフルオロ酢酸塩として32mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法D、rt=9.61分)によって決定した。
【０１２２】
5mLのpH7.4の1×PBS緩衝液中の、中間体3(10mg、1.85μmol)及び中間体2(JenKem Technology USA Inc.、74mg、1.85μmol)の混合物を、一晩撹拌し、その時間の間に、反応物を均一にした。該反応物を、次いで5mLの10mM水性HCl中20%MeOH溶液に希釈し、イオン交換クロマトグラフィ(Sepharose FF Media、7カラム容量超の20%methanol/10mM水性HCl中0〜60%1M NaCl、流速5mL/分、λ - 254nm)によって精製した。精製したコンジュゲートを、サイズ排除クロマトグラフィ(Sephadex G 25 Fine脱塩カラム、0.1M酢酸、λ - 254nm)を使用して脱塩し、凍結乾燥後に白色固体を得た。単離したペプチドの分子量を、44568amuに頂点を伴う陽フラグメントイオンの分布(MALDI)によって確定した。実施例37(9酢酸塩として35mg)は、サイズ排除HPLC(Phenomenex BioSep-SEC-S3000カラム、7.8×300mm、5μm、30mM PBS中0.15mM NaClを20分間、pH6.8、流速0.75mL/分、λ - 215nm)を使用して、11.58分に等しい保持時間を与えた。
【０１２３】
[実施例38]
【０１２４】
【化１６】
2016519130.tif 000020
【０１２５】
中間体4は、ペプチドの8位のリジンをivDde基で保護し、かつ1位のプロリンをBocで保護したことを除き、一般的な方法を使用して、40μmolスケールで白色固体として調製した。最後のアミノ酸(プロリン1)のカップリング後に、DMF中4%ヒドラジンの処理を繰り返すことによって、ivDdeを除去し、活性化スクシンイミドエステル試薬中間体5、N-β-マレイミドプロピルオキシスクシンイミドエステルを使用して、活性化剤(HCTU)又は塩基(NMM)を使用することなく、リンカーをカップリングした。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4323amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1442amu及び(M+4)/4-1082amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(8トリフルオロ酢酸塩として29mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=8.79分)によって決定した。
【０１２６】
5mLのpH7.4の1×PBS緩衝液中の、中間体4(10mg、1.91μmol)及び中間体6(JenKem Technology USA Inc.、76mg、1.91μmol)の混合物を、一晩撹拌し、その時間の間に、反応物を均一にした。該反応物を、次いで5mLの10mM水性HCl中20%MeOH溶液に希釈し、イオン交換クロマトグラフィ(Sepharose FF Media、7カラム容量超の20%methanol/10mM水性HCl中0〜60%1M NaCl、流速5mL/分、λ-254nm)によって精製した。精製したコンジュゲートを、サイズ排除クロマトグラフィ(Sephadex G 25 Fine脱塩カラム、0.1M酢酸、λ-254nm)を使用して脱塩し、凍結乾燥後に白色固体を得た。単離したペプチドの分子量を、44346amuに頂点を伴う陽フラグメントイオンの分布(MALDI)によって確定した。実施例38(8酢酸塩として27mg)は、サイズ排除HPLC(Phenomenex BioSep-SEC-S3000カラム、7.8×300mm、5μm、30mM PBS中0.15mM NaClを20分間、pH6.8、流速0.75mL/分、λ-215nm)を使用して、12.19分に等しい保持時間を与えた。
【０１２７】
[実施例39]
【０１２８】
【化１７】
2016519130.tif 000021
【０１２９】
中間体7は、ペプチドの8位のリジンをivDde基で保護し、かつ1位のプロリンをBocで保護したことを除き、一般的な方法を使用して、40μmolスケールで白色固体として調製した。最後のアミノ酸(プロリン1)のカップリング後に、DMF中4%水性ヒドラジンの処理を繰り返すことによって、ivDdeを除去し、Fmoc-Gly-OH及びFmoc-Cys(Trt)-OHをカップリングした。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4298amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1433amu及び(M+4)/4-1075amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(8トリフルオロ酢酸塩として28.4mg)について、純度>90%を、LC/MS(LC/MSの方法A、rt=13.68分)によって決定した。
【０１３０】
10mLのpH7.4の1×PBS緩衝液中の、中間体7(10.1mg、1.94μmol)及び中間体2(JenKem Technology USA Inc.、78mg、1.94μmol)の混合物を、一晩撹拌した。該反応物を、次いで10mLの10mM水性HCl中20%MeOH溶液に希釈し、イオン交換クロマトグラフィ(Sepharose FF Media、7カラム容量超の20%methanol/10mM水性HCl中0〜60%1M NaCl、流速5mL/分、λ - 215nm)によって精製した。精製したコンジュゲートを、サイズ排除クロマトグラフィ(Sephadex G 25 Fine、50×130mmカラム、0.1M酢酸、λ - 254nm)を使用して脱塩し、凍結乾燥後に白色固体を得た。単離したペプチドの分子量を、44384amuに頂点を伴う陽フラグメントイオンの分布(MALDI)によって確定した。実施例39(8酢酸塩として26.7mg)では、サイズ排除HPLC(Phenomenex BioSep-SEC-S3000カラム、7.8×300mm、5μm、30mM PBS中0.15mM NaClを20分間、pH6.8、流速0.75mL/分、λ - 215nm)を使用して12.30分に等しい保持時間、及びC18 HPLC(C18 HPLCの方法A)によって12.31分に等しい保持時間を得た。
【０１３１】
[実施例40]
【０１３２】
【化１８】
2016519130.tif 000022
【０１３３】
中間体8は、ペプチドの8位のリジンをivDde基で保護し、かつ1位のプロリンをBocで保護したことを除く、一般的な方法を使用して、40μmolスケールで白色固体として調製した。最後のアミノ酸(プロリン1)のカップリング後に、DMF中4%水性ヒドラジンの処理を繰り返すことによって、ivDdeを除去し、Fmoc-Gly-OH及びFmoc-Cys(Trt)-OHをカップリングした。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4318amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1440amu及び(M+4)/4-1080amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(9トリフルオロ酢酸塩として39mg)について、純度>90%を、LC/MS(LC/MSの方法A、rt=13.16分)によって決定した。
【０１３４】
10mLのpH7.4の1×PBS緩衝液中の、中間体8(10.43mg、1.95μmol)及び中間体2(JenKem Technology USA Inc.、86mg、2.15μmol)の混合物を、2時間撹拌した。該反応物を、次いで10mLの10mM水性HCl中20%MeOH溶液に希釈し、イオン交換クロマトグラフィ(Sepharose FF Media、7カラム容量超の20%methanol/10mM水性HCl中0〜60%1M NaCl、流速5mL/分、λ-215nm)によって精製した。精製したコンジュゲートを、サイズ排除クロマトグラフィ(Sephadex G 25 Fine、50×130mmカラム、0.1M酢酸、λ-254nm)を使用して脱塩し、凍結乾燥後に白色固体を得た。単離したペプチドの分子量を、44514amuに頂点を伴う陽フラグメントイオンの分布(MALDI)によって確定した。実施例40(9酢酸塩として35mg)では、サイズ排除HPLC(Phenomenex BioSep-SEC-S3000カラム、7.8×300mm、5μm、30mM PBS中0.15mM NaClを20分間、pH6.8、流速0.75mL/分、λ-215nm)を使用して14.90分に等しい保持時間、及びC18 HPLC(C18 HPLCの方法A)によって12.08分に等しい保持時間を得た。
【０１３５】
[実施例41]
【０１３６】
【化１９】
2016519130.tif 000023
【０１３７】
中間体9は、一般的な方法を使用して、40μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4220amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1407amu及び(M+4)/4-1056amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(8トリフルオロ酢酸塩として30mg)について、純度>90%を、C18 HPLC(C18 HPLCの方法A、rt=8.98分)によって決定した。
【０１３８】
5mLのpH7.4の1×PBS緩衝液中の、中間体9(13.2mg、2.57μmol)及び中間体2(JenKem Technology USA Inc.、113mg、2.83μmol)の混合物を、1時間撹拌し、その時間の間に、反応物を均一にした。該反応物を、次いで5mLの10mM水性HCl中20%MeOH溶液に希釈し、イオン交換クロマトグラフィ(Sepharose FF Media、7カラム容量超の20%methanol/10mM水性HCl中0〜60%1M NaCl、流速5mL/分、λ-254nm)によって精製した。精製したコンジュゲートを、サイズ排除クロマトグラフィ(Sephadex G 25 Fine脱塩カラム、0.1M酢酸、λ-254nm)を使用して脱塩し、凍結乾燥後に白色固体を得た。単離したペプチドの分子量を、44239amuに頂点を伴う陽フラグメントイオンの分布(MALDI)によって確定した。実施例41(8酢酸塩として41mg)は、サイズ排除HPLC(Phenomenex BioSep-SEC-S3000カラム、7.8×300mm、5μm、30mM PBS中0.15mM NaClを20分間、pH6.8、流速0.75mL/分、λ-215nm)を使用して、9.20分に等しい保持時間を与えた。
【０１３９】
[実施例42]
【０１４０】
【化２０】
2016519130.tif 000024
【０１４１】
中間体10は、ペプチドの8位のリジンをivDde基で保護し、かつ1位のプロリンをBocで保護したことを除き、一般的な方法を使用して、40μmolスケールで白色固体として調製した。最後のアミノ酸(プロリン1)のカップリング後に、DMF中4%水性ヒドラジンの処理を繰り返すことによって、ivDdeを除去し、Trt-メルカプトプロピオン酸(MPA)をカップリングした。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4246amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1416amu及び(M+4)/4-1062amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(8トリフルオロ酢酸塩として22.2mg)について、純度>90%を、LC/MS(LC/MSの方法A、rt=13.88分)によって決定した。
【０１４２】
10mLのpH7.4の1×PBS緩衝液中の、中間体10(10.2mg、1.98μmol)及び中間体2(JenKem Technology USA Inc.、87mg、2.18μmol)の混合物を、一晩撹拌した。該反応物を、次いで10mLの10mM水性HCl中20%MeOH溶液に希釈し、イオン交換クロマトグラフィ(Sepharose FF Media、7カラム容量超の20%methanol/10mM水性HCl中0〜60%1M NaCl、流速5mL/分、λ-215nm)によって精製した。精製したコンジュゲートを、サイズ排除クロマトグラフィ(Sephadex G 25 Fine、50×130mmカラム、0.1M酢酸、λ - 254nm)を使用して脱塩し、凍結乾燥後に白色固体を得た。単離したペプチドの分子量を、44392amuに頂点を伴う陽フラグメントイオンの分布(MALDI)によって確定した。実施例42(8酢酸塩として32.2mg)では、サイズ排除HPLC(Phenomenex BioSep-SEC-S3000カラム、7.8×300mm、5μm、30mM PBS中0.15mM NaClを20分間、pH6.8、流速0.75mL/分、λ - 215nm)を使用して13.83分に等しい保持時間、及びC18 HPLC(C18 HPLCの方法A)によって12.06分に等しい保持時間を得た。
【０１４３】
[実施例43]
【０１４４】
【化２１】
2016519130.tif 000025
【０１４５】
中間体11は、一般的な方法を使用して、35μmolスケールで白色固体として調製した。単離ペプチドの分子量を、親の分子量の4133amuを有するペプチドに相当するフラグメントイオン(M+3)/3-1378amu及び(M+4)/4-1034amuによって確定した(ESI-MS、LC/MSの方法A)。単離したペプチド(8トリフルオロ酢酸塩として13mg)について、純度>90%を、LC/MS(LC/MSの方法A、rt=13.77分)によって決定した。
【０１４６】
10mLのpH7.4の1×PBS緩衝液中の、中間体11(9.54mg、1.89μmol)及び中間体2(JenKem Technology USA Inc.、83mg、2.08μmol)の混合物を、周囲温度で一晩撹拌した。該反応物を、次いで10mLの10mM水性HCl中20%MeOH溶液に希釈し、イオン交換クロマトグラフィ(Sepharose FF Media、7カラム容量超の20%methanol/10mM水性HCl中0〜60%1M NaCl、流速5mL/分、λ - 215nm)によって精製した。精製したコンジュゲートを、サイズ排除クロマトグラフィ(Sephadex G 25 Fine、50×130mmカラム、0.1M酢酸、λ-254nm)を使用して脱塩し、凍結乾燥後に白色固体を得た。単離したペプチドの分子量を、44117amuに頂点を伴う陽フラグメントイオンの分布(MALDI)によって確定した。実施例43(8酢酸塩として32mg)では、サイズ排除HPLC(Phenomenex BioSep-SEC-S3000カラム、7.8×300mm、5μm、30mM PBS中0.15mM NaClを20分間、pH6.8、流速0.75mL/分、λ - 215nm)を使用して10.65分に等しい保持時間、及びC18 HPLC(C18 HPLCの方法A)によって12.10分に等しい保持時間を得た。
【０１４７】
生物学的実施例
ヒト神経ペプチドY受容体2型におけるPYY類縁体の効能
ヒト神経ペプチドY受容体2型におけるPYY類縁体の相対的な効能は、基本的にJayawickremeら(2005)、Current Protocols in Pharmacology、12.9.1〜12に記載の黒色素胞アッセイを使用して決定した。
【０１４８】
食餌摂取量へのPYY類縁体の効果
PYY類縁体について、痩身(モデルA)と食事誘発性肥満(DIO)(モデルB)のどちらかのC57BL/6マウスにおける6時間後の累積食餌摂取量を、食餌摂取の継続的なモニタリングのためのBioDaQ装置(Research Diets Inc.、New Brunswick、NJ)にて決定した。10週齢の雄C57BL/6マウス(Taconic、Germantown、New York)を利用したモデルAには、通常食(Purina PMI 5001)を給餌し、一方、25週齢の雄C57BL/6マウスを利用したモデルBには、45%の高脂肪食を20週間給餌した(Research Diets D12451)。マウスは、単独でBioDaqケージ内に置き、最低6日間順応させて、食餌と水に自由にアクセスさせた。消灯のおよそ1時間前に、ビヒクル(20mM酢酸緩衝液、pH4.9若しくは水中20%DMSO)又はビヒクルに溶解した類縁体のどちらかを用いて、動物に皮下的に投与した(1mg/kg)(群あたり8頭)。全ての動物に投与し終えたところで、給餌器のゲートを開いて、食餌に自由にアクセスさせた。継続的な食餌摂取量を、15時間の間モニターし収集した。毎時の食餌摂取量並びに6時間及び15時間の累積食餌摂取量を、ビヒクル対照に対する阻害率%としてまとめた。ヒトPYY(3-36)NH2を用いて処理した群に対するプールされた変動のt検定を使用して、JMP6.0.0(SAS Institute、Cary、NC)にてデータを解析した。P値<0.05は、処理群間の有意差を示すと見なされた。
【０１４９】
表1は、実施例1〜35に示したPYY類縁体のヒト神経ペプチドY受容体における効能及び食餌摂取量の低下を示す。
【０１５０】
【表１】
2016519130.tif 000026
【０１５１】
表2は、6時間の時点で、ヒト神経ペプチドY受容体における効能を有するものの、ヒトPYY(3-36)NH2を超える食餌摂取量の低下を示さない、PYY類縁体の例を示す。
【０１５２】
【表２】
2016519130.tif 000027
【０１５３】
エキセンジン-4と組み合わせた実施例5の体重、体組成及び食餌摂取量の低下に及ぼす影響
慢性的な(41日間)in vivo有効性試験を、肥満用の齧歯類モデル(食事誘発性肥満(DIO)Long Evansラット)にて実施し、単独及びエキセンジン-4と組み合わせた実施例5の、抗肥満剤としての有効性及び忍容性を検討した。
【０１５４】
雄の食事誘発性肥満(DIO)Long Evans(LE)ラット(Harlan Laboratories, Inc.、Indianapolis、IN)を使用し、離乳初期(約3週齢)に、ラットに高脂肪食(Teklad TD 95217、脂肪由来40%kcal、Harlan Laboratories、Madison、WI)を給餌した。本検討の開始時には、ラットは17週齢であった。ラットは、ケージあたり1頭を収容し、TD.95217食及び水に自由にアクセスさせて、21℃、50%の相対湿度で、午前5時から午後5時までの12時間の明期/暗期のサイクルに維持して、ベースライン測定前に少なくとも7日間順応させた。ベースライン脂肪量及び非脂肪量の測定は、ペプチド注入を開始する少なくとも3日前及び処理40日目に、QMR機器(Echo Medical Systems、Houston、TX)を使用して行った。ラットは体脂肪量の百分率に従って、(1)ビヒクル(滅菌水、n=8)、(2)エキセンジン-4(ED50=0.15mg/kg/日、n=8)、(3)実施例5(ED50=0.03mg/kg/日、n=8)、(4)PYY(3-36)NH2(1.5mg/kg/日、n=8)、(5)エキセンジン-4+実施例5(n=8)及び(6)Exendin-4+PYY(3-36)NH2(n=8)の6群に無作為化した。AlZET(登録商標)小型浸透圧ポンプ(6週間、Model 2006、Durect Corporation、Cupertino、CA)を、外科手術の1日前に、滅菌条件下でビヒクル又はペプチドのどちらかで満たした。各ラットに、処理群に応じてビヒクル又はペプチドを含有する2つの浸透圧ポンプを、肩甲骨領域に皮下移植した。体重及び食餌摂取を、41日間の処理期間の3日前から、週に2回測定した。処理41日目に、イソフルラン麻酔下で、心臓穿刺によって全血を採集した。次いで血漿及び血清を、血清化学分析用に全血から調製した。全てのデータは、中間値±SEMとして供した。該データは、Prism(GraphPad Software, Inc.、La Jolla、CA)と、スチューデントのT検定を使用したExcelとのどちらかにて解析して、各群を適切な対照群と比較した。P値<0.05は、処理群間の有意差を示すと見なされた。
【０１５５】
全ての手順は、農務省の法令である動物福祉法を遵守して実施し、グラクソ・スミスクライン動物管理使用委員会によって認可された。
【０１５６】
DIOラットでは、体重減少を生じるED50にて、実施例5を40日間投与した結果、ビヒクルに対して-6.1%(p<0.05)の体重減少がもたらされ、一方、該ED50での天然のPYY(3-36)NH2では、-1.3%(p=0.46)の体重減少がもたらされた(図1)。組み合わせたED50用量で実施例5とエキセンジン-4とを40日間組み合わせた結果、ビヒクルに対して-30.9%の持続的かつ大幅な体重低下がもたらされ(p<0.05)、これは、単独で投与した場合のエキセンジン-4及び実施例5の体重減少(それぞれ-11.3%及び-6.1%であり、予測される相加体重減少は-17.4%である)に基づき、期待された相加効果を遥かに上回った。一方で、天然のPYY(3-36)NH2をエキセンジン-4と組み合わせた結果、ビヒクルに対して-10.2%の体重低下がもたらされ、これは、単独で投与した場合のエキセンジン-4及びPYY(3-36)NH2の体重減少(-11.3%及び-1.3%であり、予測される相加体重減少は-12.6%である)に基づき、準相加効果であった。
【０１５７】
体組成の変化は、全ての処理群において、主に体脂肪量の減少によって変動し、非脂肪量に多少の変化を伴い、体重変化を反映した(図2)。特に、処理期間の間に、実施例5で処理した動物は、ビヒクル対照より-34.2グラムの脂肪量を損失し(p<0.05)、PYY(3-36)NH2動物は、-10.9グラムの脂肪量を損失し(ビヒクル対照に対してp=0.12)、エキセンジン-4で処理した動物は、-55.8グラムの脂肪量を損失した(ビヒクル対照に対してp<0.05)。実施例5+エキセンジン-4の組合せは、脂肪量への相加効果を超える効果があり、この組合せは-110.1グラムを損失し(ビヒクル対照に対してp<0.05)、これは予想された相加的な値である-90グラム(p<0.05)を大幅に上回っていた(図3)。これに対して、エキセンジン-4と組み合わせたPYY(3-36)NH2は、ビヒクルに対し、予想された相加的な値である-66.7グラムよりも少ない、-54.0グラムの脂肪量減少をもたらした(p<0.05)。
【０１５８】
また、実施例5をエキセンジン-4と共投与した際に、-57.1%の累積食餌摂取の阻害(ビヒクル対照に対してp<0.05)が観察され、これに比してPYY(3-36)NH2+エキセンジン-4の組合せでは、-18.8%の阻害(ビヒクル対照に対してp=0.87)であった。単独投与された各ペプチドの食餌摂取阻害(それぞれ-11.5%及び-20.1%であり、予測される相加的な食餌摂取阻害は-31.6%である)に基づくき、実施例5+エキセンジン-4の組合せには、相加効果を超える効果があると思われる。これに対して、天然のPYY(3-36)NH2+エキセンジン-4の組合せは、単独で投与された各ペプチドの食餌摂取阻害[PYY(3-36)NH2については-0.7%、エキセンジン-4については-20.1%であり、予測される相加的な食餌摂取阻害は-20.8%である]に基づき、準相加的な食餌摂取阻害をもたらした。
【０１５９】
エキセンジン-4と組み合わせた実施例23は、糖尿病のZDFマウスにおいて、グルコースパラメーターへの相加効果を超える効果を引き起こす
慢性的な(26日間)in vivo有効性試験を、糖尿病用の齧歯類モデル[Zucker糖尿病肥満(ZDF)ラット]に実施し、単独及びエキセンジン-4と組み合わせた実施例23の、抗糖尿病剤としての有効性及び忍容性を検討した。
【０１６０】
雄ZDFラットは、本検討の開始時に12週齢であった(Charles River, Inc.、Boston、MA)。ZDFラットは、ケージあたり1頭を収容し、食事(Purina PMI5008)及び水に自由にアクセスさせて、21℃、50%の相対湿度で、午前5時から午後5時までの12時間の明期/暗期のサイクルに維持して、ベースライン測定前の少なくとも6日間と、外科手術前の10日間に、順応させた。ベースライン脂肪量及び非脂肪量の測定は、ペプチド注入を開始する3日前及び処理26日目に、QMR機器(Echo Medical Systems、Houston、TX)を使用して行った。血液試料は、薬剤の投薬開始の2日前に、尾の断片を介して採取し、摂餌グルコース値及びHbA1c値%を測定した。このデータを使用して、動物を、(1)痩身のビヒクル対照(滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH4.9、n=8)、(2)ZDFビヒクル対照(滅菌PBS、pH4.9、n=8)、(3)エキセンジン-4(ED20=0.0055mg/kg/日、n=8)、(4)実施例23(ED20=0.02mg/kg/日、n=8)、(5)PYY(3-36)NH2(ED20=0.02mg/kg/日、n=8)、(6)エキセンジン-4+実施例23(n=4)、及び(7)エキセンジン-4+PYY(3-36)NH2(n=8)の7群に無作為化した。ALZET(登録商標)小型浸透圧ポンプ(4週間、モデル2006、Durect Corporation、Cupertino、CA)を、外科手術の1日前に、滅菌条件下でビヒクルとペプチドのどちからで満たした。小型ポンプの同様の外科移植を、DIOラットについて先に記載したように[動物にリドカイン(0.1mLの0.125%リドカイン)をID注射したことを除いて]行った。体重及び食餌摂取を、26日間の処理期間の3日前から、週に2回測定した。治療26日目に、イソフルラン麻酔下で、心臓穿刺によって全血を採集した。全血を使用してHbA1c%を決定し、血清を使用してグルコースを測定した。データは、Prism(GraphPad Software, Inc.、La Jolla、CA)と、スチューデントのT検定を使用したExcelとのどちらかにて解析して、各群を適切な対照群と比較した。P値<0.05は、処理群間の有意差を示すと見なされた。
【０１６１】
全ての手順は、農務省の法令である動物福祉法を遵守して実施し、グラクソ・スミスクライン動物管理使用委員会によって認可された。
【０１６２】
表3は、実施例23、PYY(3-36)NH2若しくはエキセンジン-4を単独で又は組み合わせて慢性的な処理(26日間)を行った後の、グルコース及びグリコシル化HbA1cの、ベースラインから、及びビヒクル対照ZDF動物(ΔΔ)からの変化を示す。単独の場合、エキセンジン-4及び実施例23のみが、PYY(3-36)NH2(ΔΔ-33.1、p=0.11)に比べて、ビヒクル対照からの統計的に有意なグルコース低下(それぞれΔΔ-53.9及び-54.5mg/dL、p>0.05)を達成した。HbA1cを26日間低下させるED20投与量を組み合わせた、実施例23及びエキセンジン-4の組合せによる治療は、ΔΔ-152.3mg/dLの有意なグルコース低下をもたらし(ビヒクル対照に対してp<0.05)、この値は、単独で投与した際のエキセンジン-4及び実施例23のグルコース低下(ΔΔ-53.9及び-54.5mg/dLであり、ビヒクル対照に対する予測された相加グルコース低下は-108.4mg/dLである)に基づいて、期待される相加効果を超えた。ΔΔ%HbA1cレベルは、全治療群におけるグルコース変化を密に反映したが、統計的に有意とみなされた群はなかった。
【０１６３】
【表３】
2016519130.tif 000028
【図１】
2016519130.tif 000029
【図２】
2016519130.tif 000030
【配列表】
2016519130000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年1月5日(2016.1.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列:
ProLysProGluXaa1ProGlyXaa2AspAlaSerXaa3GluGluXaa4Xaa5Xaa6TyrTyrAla
Xaa7LeuArgXaa8TyrXaa9AsnTrpXaa10ThrArgGlnArgTyr(配列番号1)
を含むポリペプチド又はその塩
[式中、
Xaa1は、Ala、His又はSerであり、
Xaa2は、Glu又はLysであり、
Xaa3は、Pro又はAlaであり、
Xaa4は、Leu又はTrpであり、
Xaa5は、Asn、Ala又はThrであり、
Xaa6は、Arg又はLysであり、
Xaa7は、Ser、Asp又はAlaであり、
Xaa8は、His又はLysであり、
Xaa9は、Leu又はIleであり、
Xaa10は、Val又はLeuである]。
【請求項２】
アミノ酸配列:
ProLysProGluXaa1ProGlyXaa2AspAlaSerXaa3GluGluXaa4Xaa5
Xaa6TyrTyrAlaXaa7LeuArgXaa8TyrXaa9AsnTrpXaa10ThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号2)
を含むポリペプチド又はその塩
[式中、
Xaa1は、Ala、His又はSerであり、
Xaa2は、Glu又はLysであり、
Xaa3は、Pro又はAlaであり、
Xaa4は、Leu又はTrpであり、
Xaa5は、Asn、Ala又はThrであり、
Xaa6は、Arg又はLysであり、
Xaa7は、Ser、Asp又はAlaであり、
Xaa8は、His又はLysであり、
Xaa9は、Leu又はIleであり、
Xaa10は、Val又はLeuである]。
【請求項３】
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluLeuAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号3)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluLeuAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgLysTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号4)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluLeuAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号5)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgLysTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号6)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号7)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgLysTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号8)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号9)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgLysTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号10)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号11)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgLysTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号12)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号13)、
ProLysProGluAlaProGlyGluAspAlaSerProGluGluLeuAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号14)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AlaLeuArgLysTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号15)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluLeuAsnLysTyrTyrAla
AlaLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号16)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluLeuAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号17)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluLeuAlaArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号18)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号19)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号20)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号21)、
ProLysProGluSerProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号22)、
ProLysProGluSerProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号23)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号24)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAlaLysTyrTyrAla
AlaLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号25)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号26)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgLysTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号27)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerAlaGluGluTrpAlaLysTyrTyrAla
AlaLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号28)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerAlaGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号29)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerAlaGluGluLeuAlaArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号30)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerAlaGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgLysTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号31)、
ProLysProGluSerProGlyLysAspAlaSerAlaGluGluTrpThrLysTyrTyrAla
AlaLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号32)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluLeuAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgLysTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号33)、
ProLysProGluHisProGlyGluAspAlaSerProGluGluTrpAlaLysTyrTyrAla
AlaLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号34)、
ProLysProGluAlaProGlyGluAspAlaSerAlaGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号35)、
ProLysProGluSerProGlyGluAspAlaSerProGluGluTrpThrLysTyrTyrAla
AlaLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号36)、及び
ProLysProGluAlaProGlyGluAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号37)
からなる群から選択される、請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項４】
アミノ酸配列:
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr(配列番号38)
を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５】
アミノ酸配列:
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr(配列番号38)
からなる、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６】
アミノ酸配列:
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号7)
からなる、請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項6に記載のポリペプチドの塩形態。
【請求項８】
前記塩が酢酸塩である。請求項7に記載のポリペプチドの塩形態。
【請求項９】
請求項1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチド及びエキセンジン-4又はGLP-1を含む医薬組合せ。
【請求項１０】
請求項1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチド及び医薬的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリペプチド又は医薬組合せを、それを必要とする対象に投与するステップを含む、ヒト対象の代謝障害、例えば肥満又は2型糖尿病の治療方法。
【請求項１２】
代謝障害、例えば肥満又は2型糖尿病の治療に使用するための医薬の調製に際する、請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリペプチド又は医薬組成物又は医薬組合せの使用。
【請求項１３】
代謝障害、例えば肥満又は2型糖尿病の治療に使用するための、請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリペプチド又は医薬組成物又は医薬組合せ。
【請求項１４】
請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチド配列をコードする核酸分子。
【請求項１５】
請求項14に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１６】
請求項15に記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６３】
【表３】
2016519130.tif 000031
本発明の実施形態として例えば以下を挙げることができる。
［実施形態１］
アミノ酸配列:
ProLysProGluXaa1ProGlyXaa2AspAlaSerXaa3GluGluXaa4Xaa5Xaa6TyrTyrAla
Xaa7LeuArgXaa8TyrXaa9AsnTrpXaa10ThrArgGlnArgTyr(配列番号1)
を含むポリペプチド又はその塩
[式中、
Xaa1は、Ala、His又はSerであり、
Xaa2は、Glu又はLysであり、
Xaa3は、Pro又はAlaであり、
Xaa4は、Leu又はTrpであり、
Xaa5は、Asn、Ala又はThrであり、
Xaa6は、Arg又はLysであり、
Xaa7は、Ser、Asp又はAlaであり、
Xaa8は、His又はLysであり、
Xaa9は、Leu又はIleであり、
Xaa10は、Val又はLeuである]。
［実施形態２］
アミノ酸配列:
ProLysProGluXaa1ProGlyXaa2AspAlaSerXaa3GluGluXaa4Xaa5
Xaa6TyrTyrAlaXaa7LeuArgXaa8TyrXaa9AsnTrpXaa10ThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号2)
を含むポリペプチド又はその塩
[式中、
Xaa1は、Ala、His又はSerであり、
Xaa2は、Glu又はLysであり、
Xaa3は、Pro又はAlaであり、
Xaa4は、Leu又はTrpであり、
Xaa5は、Asn、Ala又はThrであり、
Xaa6は、Arg又はLysであり、
Xaa7は、Ser、Asp又はAlaであり、
Xaa8は、His又はLysであり、
Xaa9は、Leu又はIleであり、
Xaa10は、Val又はLeuである]。
［実施形態３］
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluLeuAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号3)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluLeuAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgLysTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号4)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluLeuAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号5)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgLysTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号6)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号7)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgLysTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号8)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号9)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgLysTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号10)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号11)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgLysTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号12)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号13)、
ProLysProGluAlaProGlyGluAspAlaSerProGluGluLeuAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号14)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AlaLeuArgLysTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号15)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluLeuAsnLysTyrTyrAla
AlaLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号16)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluLeuAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号17)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluLeuAlaArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号18)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号19)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号20)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号21)、
ProLysProGluSerProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号22)、
ProLysProGluSerProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号23)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号24)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAlaLysTyrTyrAla
AlaLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号25)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号26)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgLysTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号27)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerAlaGluGluTrpAlaLysTyrTyrAla
AlaLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号28)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerAlaGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号29)、
ProLysProGluHisProGlyLysAspAlaSerAlaGluGluLeuAlaArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号30)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerAlaGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgLysTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号31)、
ProLysProGluSerProGlyLysAspAlaSerAlaGluGluTrpThrLysTyrTyrAla
AlaLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号32)、
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluLeuAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgLysTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号33)、
ProLysProGluHisProGlyGluAspAlaSerProGluGluTrpAlaLysTyrTyrAla
AlaLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号34)、
ProLysProGluAlaProGlyGluAspAlaSerAlaGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
SerLeuArgHisTyrLeuAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号35)、
ProLysProGluSerProGlyGluAspAlaSerProGluGluTrpThrLysTyrTyrAla
AlaLeuArgHisTyrIleAsnTrpValThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号36)、及び
ProLysProGluAlaProGlyGluAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号37)
からなる群から選択される、実施形態2に記載のポリペプチド。
［実施形態４］
アミノ酸配列:
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr(配列番号38)
を含む、実施形態1に記載のポリペプチド。
［実施形態５］
アミノ酸配列:
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr(配列番号38)
からなる、実施形態1に記載のポリペプチド。
［実施形態６］
アミノ酸配列:
ProLysProGluAlaProGlyLysAspAlaSerProGluGluTrpAsnArgTyrTyrAla
AspLeuArgHisTyrLeuAsnTrpLeuThrArgGlnArgTyr-NH2(配列番号7)
からなる、実施形態2に記載のポリペプチド。
［実施形態７］
実施形態1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチド及びエキセンジン-4を含む医薬組合せ。
［実施形態８］
実施形態1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチド及びGLP-1を含む医薬組合せ。
［実施形態９］
実施形態1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチド及び医薬的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
［実施形態１０］
実施形態1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチド又は医薬組合せを、それを必要とする対象に投与するステップを含む、ヒト対象の代謝障害の治療方法。
［実施形態１１］
実施形態1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチド又は医薬組合せを、それを必要とする対象に投与するステップを含む、ヒト対象の肥満の治療方法。
［実施形態１２］
代謝障害の治療に使用するための医薬の調製に際する、実施形態1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチド又は医薬組合せの使用。
［実施形態１３］
肥満の治療に使用するための医薬の調製に際する、実施形態1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチド又は医薬組合せの使用。
［実施形態１４］
代謝障害の治療に使用するための、実施形態1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチド又は医薬組合せ。
［実施形態１５］
肥満の治療に使用するための、実施形態1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチド又は医薬組合せ。
［実施形態１６］
前記代謝障害が2型糖尿病である、実施形態10、12又は14のいずれか一項に記載の方法又は使用。
［実施形態１７］
実施形態1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチド配列をコードする核酸分子。
［実施形態１８］
実施形態17に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
［実施形態１９］
実施形態18に記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
【国際調査報告】
2016519130.tif 000032
2016519130.tif 000033
2016519130.tif 000034