(57)【要約】  本発明は新規なマトリプターゼインヒビターに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Iの化合物、その医薬的に許容できる溶媒和物、塩、互変異性体、立体異性体またはそれらの任意の比の混合物：
式（I）
2016504396.tif 000041
（式中、
R1はA又は(CH2)nHetを表し、
R2はA、(CH2)nHet又は(CH2)3NHC(=NH)NH2を表し、
R3はA、(CH2)nHet又は(CH2)nArを表し、
Aは、非分枝又は分枝の1、2、3、4、5若しくは6つの炭素原子を有するアルキルを表し、
Arはフェニルを表し、
Hetは未置換又は(CH2)nNH2、COOH、COOA若しくはArによって一置換された、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、トリアゾリル又はテトラゾリルを表し、
nは0、1、2又は3である）。
【請求項２】
Hetが、未置換又は(CH2)nNH2、COOH、COOA若しくはArによって一置換された、トリアゾリル又はイミダゾリルを表す、請求項1に記載の化合物、その医薬的に許容できる溶媒和物、塩、互変異性体、立体異性体または任意の比のそれらの混合物。
【請求項３】
天然に存在しない置換基をR1、R2及び／又はR3位に有する、式（I）の化合物。
【請求項４】
R1、R2及び／又はR3がC1−C4低級アルキル又はアリールアルキルから選択される、請求項1に記載の変異SFTI。
【請求項５】
以下から成る群から選択される、請求項1に記載の変異STFI：
化合物1
2016504396.tif 000042
化合物2
2016504396.tif 000043
化合物3
2016504396.tif 000044
化合物4
2016504396.tif 000045
化合物5
2016504396.tif 000046
化合物6
2016504396.tif 000047
化合物7
2016504396.tif 000048
化合物8
2016504396.tif 000049
化合物9
2016504396.tif 000050
化合物10
2016504396.tif 000051
化合物11
2016504396.tif 000052
化合物12
2016504396.tif 000053
化合物13
2016504396.tif 000054
化合物14
2016504396.tif 000055
化合物15
2016504396.tif 000056
化合物16
2016504396.tif 000057
化合物17
2016504396.tif 000058
化合物18
2016504396.tif 000059
化合物19
2016504396.tif 000060
化合物20
2016504396.tif 000061
化合物21
2016504396.tif 000062
化合物22
2016504396.tif 000063
化合物42
2016504396.tif 000064
化合物43
2016504396.tif 000065
化合物44
2016504396.tif 000066
【請求項６】
請求項1から5のいずれかに記載の変異SFTI及び医薬的に許容できる賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項７】
請求項4に記載の医薬組成物の癌治療のための使用。
【請求項８】
請求項4に記載の医薬組成物のマトリプターゼプロテアーゼ機能不全関連疾患の治療のための使用であって、前記疾患が、癌、慢性閉塞性肺疾患、末梢若しくは中枢神経系の異常又は心脈管系異常から選択され、前記使用によってマトリプターゼ機能不全関連疾患の症状が緩和される、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリプシン様セリンプロテアーゼであるマトリプターゼの新規で極めて強力なペプチド性インヒビターに関する。本発明の好ましい分子であるSDMI-1及び2は、医薬的に関係があるプロテアーゼ、マトリプターゼの生理学的pH付近で強力なインヒビターであり、したがって、治療法又は診断で用途を見出すことができる。
【背景技術】
【０００２】
トリプシンは、脊椎動物の小腸に普遍的に見出されるもっとも重要な消化酵素の1つである[1]。その興味深い分子フレームワークは、周知の触媒三残基Asp-His-Serをそのタンパク分解活性を実行する中核的特色として含む[2]。このタンパク分解性構造及び塩基性残基の後ろでペプチド結合を切断する能力は、トリプシン様セリンプロテアーゼと称される生物性触媒の全クラスの構造的及び機能的下地を構成する[3]。この酵素ファミリーのメンバーは多様な生物学的プロセスに関与し、可溶形で又は膜係留物として存在する[4]。II型トランスメンブレンセリンプロテアーゼ（TTSP）は、例えばN-末端を介して細胞表面と結合し、多様なエフェクター分子の細胞周囲の前進及び活性化の重要な媒介因子として特徴付けられている[3−5]。ペプチドホルモン、増殖及び分化因子、受容体、酵素及び接着分子の活性形は、特異的TTSPによる内部タンパク分解切断を介して不活性前駆体から生成される[4]。したがって、TTSPは細胞の発達及び恒常性の維持に決定的な役割を果たす[3]。
【０００３】
医薬的に関係がある膜係留トリプシン様セリンプロテアーゼで研究が進んでいる例はマトリプターゼである[6]。マトリプターゼは、健康な組織の上皮細胞表面で広範囲に発現され、そこでは、マトリプターゼのタンパク分解活性は天然のプロテアーゼ阻害因子（例えば肝細胞増殖因子阻害因子-1及び2（HAI-1、HAI-2））によって厳密に調節される[6c,6f]。しかしながら、この生理学的阻害因子-プロテアーゼ均衡の調節不全は病理学的プロセスを進行させると考えられる。実際、多くの研究が、マトリプターゼの過剰発現を上皮性腫瘍や変形性関節症及びアテローム硬化症の発生及び進行と結びつけて考えている[6g−6k]。Nappらは、ネズミの正常位膵臓腫瘍モデルで顕著なin vivoマトリプターゼ活性を観察し、活性部位インヒビター投与が当該基質分析物のタンパク分解を顕著に低下させることを示した[6d]。したがって、強力で選択的なマトリプターゼインヒビターは治療的に極めて重要であり、それらの開発は挑戦的な仕事である。今日まで、一桁のナノモル濃度からナノモル濃度未満の阻害定数を示す多数の小さな合成有機化合物が大きな抗体フラグメントと同様に報告されている[7]。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、トリプシン様セリンプロテアーゼであるマトリプターゼの新規で極めて強力なペプチド性インヒビターに関する。本発明のSDMI-1及び2の好ましい分子は、医薬的に関係があるプロテアーゼ、マトリプターゼの生理学的pH付近で強力なインヒビターであり、したがって、治療法又は診断で用途を見出すことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】前駆体スキャホールド23、24、25のマイクロ波支援Fmoc-SPPS合成を示す。
【図２】以下を示す：d）与えられたアルキン成分（5eq）、CuSO4・5H2O（20mol％）、アスコルビン酸ナトリウム（20mol％）及びDMF中のN,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIEA, 8eq）を周囲温度（一晩）で用いる樹脂上CuAAC；b）TFA/H2O/アニソール/TES（47:1:1:1、v:v:v:v）及びジチオスレイトール（DTT）を用いる固体支持体からの酸分解切断；c）100mMの（NH4)2CO3水溶液（pH8.4）中で1mgペプチド/mLにて空気媒介酸化による大環状化；e）100mMの（NH4)2CO3水溶液（pH7.7）中で1mgペプチド/mLにて空気媒介酸化による大環状化。
【図３】a）マイクロ波支援Fmoc-SPPSを示す。スキャホールド26の合成。
【図４】9、11、13、15の合成を示す。d）：与えられたアルキン成分（5eq）、CuSO4・5H2O（20mol％）、アスコルビン酸ナトリウム（20mol％）及びDMF中のN,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIEA, 8eq）を周囲温度（一晩）で用いる樹脂上CuAAC；b）TFA/H2O/アニソール/TES（47:1:1:1、v:v:v:v）及びジチオスレイトール（DTT）を用いる固体支持体からの酸分解切断；c）100mMの（NH4)2CO3水溶液（pH8.4）中で1mgペプチド/mLにて空気媒介酸化による大環状化；e）100mMの（NH4)2CO3水溶液（pH7.7）中で1mgペプチド/mLにて空気媒介酸化による大環状化。固相上銅（I）触媒アジドアルキン環状付加（CuAAC）を、0.05mmoleの中間体26及び対応するアルキン成分（N-Boc-プロパルギルアミン、メチルプロピオレート又はフェニルアセチレン）を用い図4に示す模式図にしたがって実施した。5eqのアルキン溶液、1eqの硫酸銅（II）5水和物（CuSO4・5H2O）、1eqのアスコルビン酸ナトリウム（NaAsc）及び5mLのアルゴンフラッシュDMF中の8eq DIEAをペプチド樹脂に添加し、周囲温度で一晩震盪した。続いて、前記溶液をろ過によって除去し、ペプチド樹脂をメタノール（3ｘ）、DMF中の0.5％ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム（w/v, 3ｘ）、DMF（3ｘ）及びDCM（3ｘ）で洗浄して中間体36−38を得た。Fmoc保護基を記載された手順にしたがって除去した。残留N-末端残基を各トリアゾリル含有ペプチド樹脂に結合させて中間体39−41を得た。Fmoc脱保護、固体支持体からの酸分解切断、エーテル沈殿、及び酸化ジスルフィド形成後に、大環状化ペプチドを半調製用RP-HPLCにより単離した。これによって化合物9、11、13及び15が白色固体として得られた。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明者らは、構造に基づくリード化合物最適化のための出発点として堅固でかつ明瞭に定義されている、ヒマワリトリプシンインヒビター-1（SFTI-1）のテトラデカペプチド骨格を用いた。この分子スキャホールドは抗タンパク分解活性のための規範的（基質模倣）ループを有し、既にキモトリプシン、エラスターゼ、カテプシンG、β-トリプターゼ、プロテイナーゼK又はカリクレイン関連ペプチダーゼのインヒビターの創出のために首尾よく用いられてきた[10]。さらにまた、マトリプターゼに対してナノモル範囲（Ki＝1−150nM）の潜在的阻害活性が、TTSPの最適pH（pH〜8.5−9）で二環式ペプチドについて報告されている[11]。つい最近、我々は、この中程度の効能が生理学的パラメーター近辺の環境で本質的に低下することを示した（pH7.6でKi＝1.1μM）。このことは潜在的in vivo用途のためにはとくに重要である。治療用/診断用薬剤は、恒常性条件下で、又は腫瘍や炎症誘発低酸素症の事例ではより酸性条件下で高い活性を保持しなければならない[12]。
構造に基づくインクリメント最適化ストラテジーを用いて、我々は、トリプシン/マトリプターゼ選択性プロファイルの改善および一桁のナノモル濃度のKiを有するSFTI-1誘導体を作出することができた。
【０００７】
表1：マトリプターゼに対するpH7.6における化合物1−22の阻害定数の決定及びSFTI-1[1,14]と比べた結合/解離における自由エネルギーの計算により得た差異
2016504396.tif 000002
[a] 実施例の節に記載したように決定。[b] 相対活性は、対応する化合物のKi/SFTI-1[1,14]のKiの比として提供。[c] ΔBG(x)は化合物xの結合/解離における自由エネルギーを指す。ΔBGはΔBG＝-RTlnKi[14]を用いて対応するKiから計算。提供した差異ΔBG(x)-ΔBG(SFTI-1[1,14])の誤差は誤差伝播によって計算。[d] 以前の発表の通り。[e] SFTI-1[1,14]フレームワークの改変位置が提供される。
【０００８】
表2：マトリプターゼに対するpH7.6（8.5）における化合物42−44の阻害定数の決定、SFTI-1[1,14]と比べた結合/解離における自由エネルギーの計算により得た差異、及びpH7.6におけるトリプシン親和性と選択性[a]
2016504396.tif 000003
[a] 実験は表1の脚注及び実施例の節の記載のように実施。[b] 括弧内の値はpH8.5で決定されたKiと一致する。[c] 誤差は誤差伝播によって計算。[d]マトリプターゼに対するKi（pH7.6)/トリプシンに対するKi（pH7.6)の比として計算。[e] 以前に発表された通り。
【０００９】
もっとも好ましいアミノ酸置換とその後のC-末端切端の組み合わせによって、阻害定数が低いナノモル濃度から一桁のナノモル濃度の範囲にあるSFTI-1誘導マトリプターゼインヒビター-1及び2（SDMI-1及び2）が得られた。初期のペプチド/ペプチド模倣体ライブラリーの構造に基づく設計およびアミノ酸配列の短縮は、野生型化合物の有益な改変を目指すアイデア発生機として用いられるin silico実験によって顕著に触発された[6e]。したがって、わずかに12残基であるとともにマトリプターゼに優先的である、トリプシン-マトリプターゼ選択性が反対のインヒビターが開発された。
適用した“銅クリック”ケミストリーを用いる合成ストラテジーはトリアゾリル含有ペプチド模倣体1−16の大半のアッセンブリーに適用できたが、このストラテジーは10位に非天然のアミノ酸アジドアラニンを使用すること（化合物9、11、13及び15）とは両立しない。我々の以前の実験では、マイクロ波支援Fmoc-SPPSのために構築ブロックとしてFmoc-Aza-OHを用いる際に特に制限を認めることはなかった[15]。しかしながら、記載の条件下における未保護アジドの官能性による予期せぬ適用性制限を改変した合成経路によって回避した。
SFTI-1[1,14]の誘導体1−22を含む小化合物ライブラリーの設計及び合成：
【００１０】
【化１】
2016504396.tif 000004
【００１１】
【化２】
2016504396.tif 000005
【００１２】
【化３】
2016504396.tif 000006
【００１３】
27, 30, 33: R4=Gly-Arg（Pbf)-Cys（Trt)-Thr（tBu)-Lys（Boc)-Ser（tBu),
R5=Pro-Pro-Ile-Cys（Trt)-Phe-Pro-Asp（tBu), n=1
28, 31, 34: R4=Gly-Arg（Pbf)-Cys（Trt)-Thr（tBu)-Lys（Boc)-Ser（tBu)
R5=Pro-Pro-Ile-Cys（Trt)-Phe-Pro-Asp（tBu), n=2
29, 32, 35: R4=Gly-Arg（Pbf)-Cys（Trt)-Thr（tBu)-Lys（Boc)-Ser（tBu)-Ile-Pro-Pro
R5=Cys（Trt)-Phe-Pro-Asp（tBu), n=2
【００１４】
【化４】
2016504396.tif 000007
【００１５】
36-38: R5= Cys（Trt)-Phe-Pro-Asp（tBu)
39-41: R4=Gly-Arg（Pbf)-Cys（Trt)-Thr（tBu)-Lys（Boc)-Ser（tBu)-Ile-Pro-Pro
R5=Cys（Trt)-Phe-Pro-Asp（tBu)
【００１６】
SFTI-1[1,14]の誘導体1−22を含む小化合物ライブラリーの設計及び合成。A）トリアゾリル含有ペプチド1−16並びに規範的アミノ酸（リジン、アルギニン、アラニン、バリン、イソロイシン又はヒスチジン）による10位及び12位の一置換を含む変種17−22の収集物；B）前駆体23、24、25及び26並びにインヒビター17−22の合成；C）及びD）トリアゾリル含有ペプチド1−16を得る合成経路の模式図。条件：a）マイクロ波支援Fmoc-SPPS；b）TFA/H2O/アニソール/TES（47:1:1:1、v:v:v:v）及びジチオスレイトール（DTT）を用いる固体支持体からの酸分解切断；c）100mMの（NH4)2CO3水溶液（pH8.4）中で1mgペプチド/mLにて空気媒介酸化による大環状化；d）与えられたアルキン成分（5eq）、CuSO4・5H2O（20mol％）、アスコルビン酸ナトリウム（20mol％）及びDMF中のN,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIEA, 8eq）を周囲温度（一晩）で用いる樹脂上CuAAC；e）100mMの（NH4)2CO3水溶液（pH7.7）中で1mgペプチド/mLにて空気媒介酸化による大環状化。全ての化合物1−22は調製用逆相HPLCにより単離された。
以下の化合物は本発明の好ましい実施態様を表し、化合物43及び44がもっとも好ましい。
【００１７】
配列SFTI-1[1,14]（野生型）
【化５】
2016504396.tif 000008
【００１８】
7位で置換（R1）、10位で置換（R2）及び12位で置換（R3）
【化６】
2016504396.tif 000009
【００１９】
【化７】
2016504396.tif 000010
【００２０】
化合物1
【化８】
2016504396.tif 000011
【００２１】
化合物2
【化９】
2016504396.tif 000012
【００２２】
化合物3
【化１０】
2016504396.tif 000013
【００２３】
化合物4
【化１１】
2016504396.tif 000014
【００２４】
化合物5
【化１２】
2016504396.tif 000015
【００２５】
化合物6
【化１３】
2016504396.tif 000016
【００２６】
化合物7
【化１４】
2016504396.tif 000017
【００２７】
化合物8
【化１５】
2016504396.tif 000018
【００２８】
化合物9
【化１６】
2016504396.tif 000019
【００２９】
化合物10
【化１７】
2016504396.tif 000020
【００３０】
化合物11
【化１８】
2016504396.tif 000021
【００３１】
化合物12
【化１９】
2016504396.tif 000022
【００３２】
化合物13
【化２０】
2016504396.tif 000023
【００３３】
化合物14
【化２１】
2016504396.tif 000024
【００３４】
化合物15
【化２２】
2016504396.tif 000025
【００３５】
化合物16
【化２３】
2016504396.tif 000026
【００３６】
化合物17
【化２４】
2016504396.tif 000027
【００３７】
化合物18
【化２５】
2016504396.tif 000028
【００３８】
化合物19
【化２６】
2016504396.tif 000029
【００３９】
化合物20
【化２７】
2016504396.tif 000030
【００４０】
化合物21
【化２８】
2016504396.tif 000031
【００４１】
化合物22
【化２９】
2016504396.tif 000032
【００４２】
化合物42
【化３０】
2016504396.tif 000033
【００４３】
化合物43
【化３１】
2016504396.tif 000034
【００４４】
化合物44
【化３２】
2016504396.tif 000035
【００４５】
新規化合物43及び44は、驚くべきことに生理学的pH近くのpH範囲でマトリプターゼの強力なインヒビターであり、したがって治療方法又は診断でその用途を見出すことができる。
したがって、本発明の好ましい実施態様は、下記式Iの化合物並びに前記の医薬的に許容できる溶媒和物、塩、互変異性体若しくは立体異性体、または任意の比のそれらの混合物である：
【００４６】
式（I）
【化３３】
2016504396.tif 000036
（式中、
R1はA又は（CH2)nHetを表し、
R2はA、（CH2)nHet又は（CH2)3NHC（=NH)NH2を表し、
R3はA、（CH2)nHet又は（CH2)nArを表し、
Aは、非分枝又は分枝の1、2、3、4、5若しくは6つの炭素原子を有するアルキルを表し、
Arはフェニルを表し、
Hetは、未置換又は（CH2)nNH2、COOH、COOA若しくはArによって一置換された、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、トリアゾリル又はテトラゾリルを表し、
nは0、1、2又は3である）。
【００４７】
特に好ましい実施態様は、Hetが未置換又は（CH2)nNH2、COOH、COOA若しくはArによって一置換された、トリアゾリル又はイミダゾリルテトラゾリルである、式1の化合物、並びにその医薬的に許容できる溶媒和物、塩、互変異性体及び立体異性体（任意の比の前記の混合物を含む）である。
さらに別の実施態様は、R1、R2及び／又はR3位に天然に存在しない置換を含む式（I）の化合物である。
特に好ましい実施態様は、R1、R2及び／又はR3はC1−C4低級アルキル又はアリールアルキルから選択される式1の変異SFTIである。
好ましいものは以下の化合物、特に42、43及び44であり、最良の実施態様は43及び44である。
これらの化合物は、本発明の変異SFTI及び医薬的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物で有用である。
そのような医薬組成物は癌の治療に有用である。
そのような医薬組成物のさらに別の好ましい使用は、マトリプターゼプロテアーゼ機能不全関連疾患の治療を含み、ここで前記疾患は、癌、慢性閉塞性肺疾患、末梢若しくは中枢神経系の異常又は心脈管系異常から選択され、前記使用によって該マトリプターゼ機能不全関連疾患の症状は緩和される。
【００４８】
工程1：個別の残基の親和性のチューニング（インクリメント）
トリプシンとマトリプターゼは非常に類似する基質スペクトルを共有する。したがって、我々は、SFTI-1[1,14]の規範領域内の置換は親和性改善に有害であろうということは理に適うと考えた。しかしながら、我々の分子設計の側鎖置換のための部位として我々はP2’位（Ile7）を含めた。マトリプターゼのヒスチジン40及び143はこの残基に極めて近接し、したがってそれらはリガンドとの好ましい水素結合相互作用の可能性を提供できる。
合成経費を削減し、適切な構造的及び機能的空間をカバーするために、我々は多様な合成手順を設定した。アジド保持ペプチドスキャホールド23及び24を、市場で入手できる構築ブロックFmoc-L-アジドアラニン（Fmoc-Aza-OH）及びFmoc-L-アジドホモアラニン（Fmoc-Aha-OH）を用いて固体支持体上でアッセンブリングした。種々のアルキン成分による樹脂上銅（I)触媒-アジドアルキン環状付加（CuAAC）は、アミン、カルボン酸、対応するメチルエステル及びフェニル官能性の7位への設置を容易にした。このコンビナトリアルアプローチは、以前にBurkと共同研究者らが記載した“連結フラグメント（tethered fragment）”ストラテジー[13]と極めて類似している。固体支持体からの酸分解切断、酸化的大環状化及びクロマトグラフィー単離によってSFTI-1[1,14]誘導体1−8が得られた。興味深いことに、遊離カルボン酸3及び4は、対応するメチルエステル5及び6と同様に、それぞれの開放鎖メチルエステル前駆体ペプチドから大環状化条件の選択により選択的にアクセスすることができた。メチルカルボキシレートはpH8.4でジスルフィド結合形成中に加水分解されて、遊離酸3及び4を生じた。しかしながら、pHを7.7に設定することによって、メチルエステル基を保存させて、対応するシステイン架橋生成物5及び6を生じさせることができた。
残念なことに、７位変種1−8のいずれも酵素阻害アッセイではSFTI-1[1,14]を超えるマトリプターゼ親和性改善を示さなかった（表1）。したがって、我々は、更なる実験の照準を10位及び12位の最適化に合わせた。
【００４９】
リガンド-受容体複合体においてSFTI-1[1,14]の残基10の側鎖は著しい負の極性をもつマトリプターゼの表面領域の方に向く。Asp96のβ-カルボキシル基はこの環境に顕著に寄与する。Yuanらは、該インヒビターの10位に低い配座自由度を有する短い塩基性側鎖の官能性（例えばアミノアラニン又はアミノホモアラニン）を組み込んで、好ましい静電気相互反応を樹立することを提唱した[6e]。それにもかかわらず、最初の分子モデルは、結晶構造に存在するその本来の配座を有するAsp96のβ-カルボキシル基に近接して塩基性官能性を配置するために、約4から5のメチレンユニットのリンカーが必要であることを示唆した（PDB-ID:3P8F）。したがって、我々は、適切な長さの平らで堅固なトリアゾリルリンカーを有するSFTI-1[1,14]誘導体9−16を設計し、リガンドと受容体との間の新規で好ましい相互作用の可能性について精査した。
先ず初めに、SFTI-1[1,14]変種1−8に用いたアプローチの改変として9−16のための合成経路を考案した。このストラテジーにより変種10、12、14及び16には容易にアクセスできたが、化合物9、11、13及び15はこの態様では合成できなかった。ペプチド-樹脂25のAza10アナローグの固体支持体上でのアッセンブリングの試みは明確でない副生成物の混合物を生じた（データは示されていない）。それにもかかわらず、我々は、記載のように樹脂結合ペンタペプチド中間体26を介して化合物9、11、12及び15を合成することができた。
【００５０】
興味深いことに、SFTI-1[1,14]を超えるマトリプターゼ親和性の顕著な増加が8つのトリアゾリル含有ペプチド模倣体9−16のうち4つについて観察された（表1）。インヒビター9、10、13及び15のセット内でもっとも強い強化は、アミノメチル官能化1,2,3-トリアゾール9について観察された。化合物9とSFTI-1[1,14]との間の結合/解離の自由エネルギーの差異ΔBGは3.9kJ/molと計算された。したがって、さらに追加される好ましい静電気的なインヒビター-酵素相互作用は、10位に塩基性官能性をペプチドに付与することによって首尾よく樹立された。しかしながら、たった1つのメチレンユニットによってトリアゾリルリンカーの長さが増加しただけで（10）、この魅力的な寄与は顕著に低下する。さらにまた、この位置に酸性カルボキシ基を据え付けることはマトリプターゼ阻害に有害である（11、12）。重要なことには、SFTI-1[1,14]と比べてインヒビターの性能の有意な増加はまた構造式上非荷電のメチルエステル誘導体13についても観察されたが、アミノ官能化変種9の事例ほど強くはない。
さらにまた、我々は、10位の塩基性アミノ酸、リジン及びアルギニンのマトリプターゼ親和性における影響を精査した（17及び18）。驚くべきことに、可撓性脂肪族リンカーを備えた化合物18は、表1に列挙したSFTI-1[1,14]変種1−22のうち最高の性能を示した。対応するアミノ酸側鎖の固有の配座自由度のために、著しいエントロピーペナルティーが化合物17及び18について予想された[6e]。実際、ε-アミノ官能化誘導体17は、類似する長さのより堅個で拘束されたリンカーモチーフを有するインヒビター9よりもわずかに性能が低かった。しかしながら、6.5kJ/molによるΔBGの増加に対応する二桁のナノモル濃度のKiは、ただ1つのアミノ酸置換から生じた（18）。
【００５１】
最後に、我々は、マトリプターゼ親和性に対するSFTI-1[1,14]の12位における改変の影響を精査した。Yuanらは、酵素のS4サブサイトを形成するPhe97及びPhe99の側鎖によって引き起こされる配座の拘束のために、SFTI-1[1,14]のPhe12に対する著しく望ましくないエントロピー効果を記載した[6e]。結果として、大きな芳香族側鎖をもつ非天然アミノ酸によるPhe12の置換は生物活性に有害な影響を有する[11b]。したがって、我々は、本来のフェニルアラニン残基を、複素芳香族と同様により小さな脂肪族で疎水性のアミノ酸、アラニン、バリン、イソロイシン及びヒスチジンで置き換えることを決定した（図2A）。対応する化合物19−22は、日常的なマイクロ波支援Fmoc-SPPSとその後に続く酸化的大環状化及びクロマトグラフィー単離により合成された。実際、我々は、Phe12His置換（22）と同様にPhe12Ile置換（21）の有益な影響を我々のin vitroアッセイで観察した。特に、12位のイミダゾール官能性（22）は、SFTI-1フレームワークと約3kJ/molの酵素の表面との間の相互作用の改善を促進させた。
【００５２】
工程2：有益なインクリメント改変の組み合わせ
化合物9、18及び22について観察されたマトリプターゼ親和性の強化に勇気づけられて、我々は、10位（9、18）の1つずつの改変を記載のPhe12His置換（22）と一緒にした。得られた構築物42及び43は、マイクロ波支援Fmoc-SPPSを介するか（42）、又は化合物9−16について記載したストラテジーと類似の方法を用いることにより（42）合成された。インヒビター42及び43は、SFTI-1[1,14]誘導体9、18及び22と比べてマトリプターゼ親和性の更なる増加を示した（表2）。我々の計算は、ΔBGの観察される改善はもっぱら付加的効果に依るものであることを示唆している。化合物18及び22の決定された個々の好ましい寄与は合わせて9.6±0.6kJ/molになるが、一方、43とSFTI-1[1,14]との間の結合/解離自由エネルギーの差異は10.3±0.4kJ/molと計算された。これら2つの値の差異は相乗的作用と説明することができよう[14]。しかしながら、観察された影響は、対応する概算の不確実性を考慮すれば無視し得る。インヒビター42の事例では、計算で得られたΔBGの増加がインクリメント改善の合計よりも小さかったので、望ましくない非付加部分さえも導入した改善として検出された（表2）。それにもかかわらず、テトラデカペプチド43（我々はSFTI-1誘導マトリプターゼインヒビター-1（SDMI-1）と称する）は、生理学的pH近くで11nMという低い阻害定数を保有する。さらにまた、マトリプターゼの最適pH（pH＝8.5）近くで実施した酵素アッセイでは、一桁のナノモル濃度のKi（1.1nM）が観察された。
【００５３】
工程3：最も有望な変種の切端
つい最近の研究で、我々は、いくつかの単環式トリアゾール架橋SFTI-1誘導体の構造分析をin silicoで実施した。得られた結果は、マトリプターゼ親和性に対する末端領域の著しい影響を示した。親の二環式ペプチドのPhe12の該酵素の芳香族側鎖の固定によって引き起こされるエントロピー的不利益は、提示の研究で既に記載し強調されている[6e]。しかしながら、二次ループを形成するPro13及びAsp14残基の追加的な立体配置的拘束は、マトリプターゼとの結合時にエントロピー的に望ましくない寄与を引き起こし得る。我々の計算にしたがえば、トリプシンとの相互作用はこの態様では影響を受けない。結果として、2つのC末端残基の切端はマトリプターゼ阻害に有益な影響を有するかもしれない。
【００５４】
さらにまた、我々は、C-末端アミドの導入による末端カルボキシ基の陰性荷電の除去は標的酵素とインヒビターとの間の全体的な電荷相補性を強化するかもしれないと合理的に考えた。これらの考えに力を得て、我々は、実施例の節に記載するように単環式ドデカペプチド44を合成した。実際、我々は、6.2±1.2nMのKiをもたらす、インヒビター性能の追加的な小さな改善を観察した。このSFTI-1誘導マトリプターゼインヒビター-2（SDMI-2）は、pH8.5で2.3±0.8nMの阻害定数を示し、マトリプターゼ（6倍）に対してトリプシンを超える選択性の改善を示す。我々の情報では、43及び44は、報告された小さな有機化合物と比べて、今日まで阻害活性を示すと記載された最強のボーマン-バークマトリプターゼインヒビターである[7a]。
最後に我々は、上記に記載したSFTI-1[1,14]とマトリプターゼのin silico座標（図1参照）を基にしてSDMI-2（44）のためのインヒビター-プロテアーゼ複合体モデルを作製した[ref]。第一に、アミノ酸交換Ile10Arg及びPhe12Hisを親モデルに導入した。続いて、残基Pro13及びAsp14をC-末端アミドに取り替えた。側鎖の幾何学における最適化及びその後のエネルギー最少化によって対応するSFTI-1共結晶体と極めて類似する構造が得られた（3P8F、図3A）。それにもかかわらず、44とマトリプターゼとの間で追加的な好ましい相互作用が観察された（図3B）。Asp96の側鎖は再配向し、Arg10のグアニジニル官能性とともに二座配位水素結合を形成した。さらにまた、Asp96の骨格のカルボニル酸素とHis12のε2-窒素との間でプロトンのドナー-アクセプター相互作用の可能性が検出された。しかしながら、予想されたin silico座標が妥当か否かを疑いもなく立証するために、SDMI-2マトリプターゼ複合体のX-線構造が必要である。Yuanらは、10位に短い塩基性残基（例えばアミノホモアラニン）を用いて、Asp96との有効な静電気的相互作用を樹立させ、一方延長された可撓性リンカーから生じるエントロピー的不利益を少なくすることを提唱した[6e]。しかしながら、Asp96のカルボキシル基に近接して塩基性官能性を配置するためにそのような短い側鎖で十分か否かを試験する必要性は依然として残る。
【００５５】
本発明に至る実験で用いた全ての化学品及び溶媒は以下から購入した（Bachem, Iris Biotech, Novabiochem, Sigma-Aldrich, Rapp Polymere, Roth又はVarian（Agilant））。
分析用及び半調製用RP-HPLCは、それぞれバリアン（Varian）920-LC系及びバリアン940-LC系でそれぞれ実施した。フェノメネックスハイパーシル（Phenomenex Hypersil）5u BDS C18 LCカラム（150ｘ4.6mm、5μm、130Å）及びフェノメネックスルナ（Phenomenex Luna）5u C18 LCカラム（250ｘ12.20mm、5μm、100Å）を静止相として用いた。溶離液系は、溶離液A（0.1％TFA水溶液）及び溶離液B（0.1％TFAを含む90％アセトニトリル水溶液)から成っていた。
ESI質量スペクトルは島津LCMS-2020で記録し、フェノメネックスジュピター5u C4 LCカラム（50ｘ1mm、5μm、300Å）とともに溶離液A（0.1％蟻酸水溶液、LC-MS級）及び溶離液B（0.1％蟻酸を含む100％アセトニトリル、LC-MS級）から成る二元性溶離液系を用いた。
ペプチドは、Fmocストラテジーにしたがい、ディスカバーSPSマイクロ波ペプチド合成装置プラットフォーム（CEM）でリバティー（Liberty）12チャネル自動ペプチド合成装置を用いて合成した。
【実施例１】
【００５６】
ペプチド合成の全般的手順
C末端カルボン酸をもつ全てのペプチドは、Fmoc-L-Asp（tBu)をプレロードしたTentaGel S AC樹脂（Rapp Polymere）又は2-クロロトリチルクロリド樹脂（Iris Biotech）上でアッセンブリングされた。対応するペプチドアミドはAmphiSpheres 40 RAM樹脂（Agilent）上でアッセンブリングされた。
2-クロロトリチルクロリド樹脂のローディングは以下のように手動で実施した：最小量のジクロロメタン（DCM）中の103mgのFmoc-L-Asp（tBu)-OH（0.25mmol）及び34μLのN,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIEA、1mmol）の溶液を樹脂に添加した。得られた混合物を2時間周囲温度で震盪した。前記溶液をろ過によって除去し、ロードされた樹脂をDCM/メタノール/DIEA（17:2:1、3ｘ)、DCM（3ｘ）、ジメチルホルムアミド（DMF、3ｘ）及びDCM（3ｘ）で洗浄した。
規範的アミノ酸の結合は、4eqの対応するアミノ酸、3.9eqの2-（1H-ベンゾトリアゾール-1-yl)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HBTU）及び8eqのDIEA、又はシステインの事例では3−4eqの2,4,6-トリメチルピリジン（collidine）を用いて二重及び三重カップリングによって実施した。アルギニン及びシステインのカップリングは、それぞれ以下の二工程マイクロ波プログラムを用いて実施した：1. RT, 0W, 25分; 2. 75℃, 25 W, 0.5分（Arg）及び1. RT, 0W, 2分; 2. 50℃, 25W, 4分（Cys）。他の全てのアミノ酸のカップリングは標準的なマイクロ波プログラム（75℃, 21W, 5分）を用いて実施した。
非天然のアジド保持構築ブロックFmoc-L-Aza-OH及びFmoc-L-Aha-OHは、2eqの対応するアミノ酸、1.9eqのHATU及び4eqのDIEA並びに2工程マイクロ波プログラム（1. 60℃, 30W, 45分, 2. 75℃, 20W, 5分）を用いる二重カップリングにより結合させた。
【００５７】
Fmoc脱保護は以下の二工程で達成した：DMF中の20％ピペリジンとの反応、75℃、42W、0.5分（最初の脱保護）、続いてDMF中の20％ピペリジンによる75℃、42W、3分の第二の脱保護。
固体支持体からのペプチドの切断及び側鎖保護基の除去は、標準的切断カクテル（以下から成る：トリフルオロ酢酸（TFA) /H2O/アニソール/トリエチルシラン（TES）（47:1:1:1, v:v:v:v））及びDTTを用いて酸分解により達成され、望ましくない酸化が抑制された。得られた反応混合物を3時間室温で震盪し、続いて沈殿させ、その後メチル三級ブチルエーテル（MTBE）で3回洗浄し粗雑な線状ペプチドを得た。
前記粗ペプチドの空気媒介酸化マイクロ波環状化を100mMの（NH4)2CO3水溶液（1mg/mL、pH8.4）中で実施し、分析用RP-HPLCで追跡監視した。完全な変換後（1−7日）、溶媒を凍結乾燥で除去して粗ペプチドを得た。化合物5、6、13及び14のメチルエステルの望ましくない鹸化を抑制するために、100mMの（NH4)2CO3水溶液の緩衝液（pH7.7）を用いた（図2）。
【実施例２】
【００５８】
トリアゾリル含有ペプチド1−8、10、12、14及び16
アジド保持ペプチド樹脂23、24及び25を、記載した手順にしたがい0.25mmolの規模でTentaGel S AC-Asp（t-Bu) Fmoc樹脂（ローディング：0.21mmol/g）上でアッセンブリングし、洗浄し（DCMで3回及びエーテルで3回）、乾燥装置で乾燥させた。図1は詳細を示す。
固相上銅（I）触媒アジドアルキン環状付加（CuAAC）は、0.05mmolの中間体23、24及び25、並びに対応するアルキン成分（プロパルギルアミン、メチルプロピオレート又はフェニルアセチレン）を用い、図2Cに記す模式図にしたがって実施した。5eqのアルキン、1eqの硫酸銅（II)5水和物（CuSO4・5H2O）、1eqのアスコルビン酸ナトリウム（NaAsc）及び5mLのアルゴンフラッシュDMF中の8eq DIEAの溶液をペプチド樹脂に添加し、周囲温度で一晩震盪した。続いて、前記溶液をろ過によって除去し、ペプチド樹脂をメタノール（3ｘ）、DMF中の0.5％ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム（w/v, 3ｘ）、DMF（3ｘ）及びDCM（3ｘ）で洗浄して中間体27−35を得た。
Fmoc脱保護、固体支持体からの酸分解切断、エーテル沈殿及び酸化的ジスルフィド形成の後、大環状ペプチドを半調製用RP-HPLCにより単離した。前記によって化合物1〜8、10、12、14及び16が以下の収量で白色固体として得られた：1: 13.5 mg （17％); 2: 14.9 mg （18.6％); 3: 9.3 mg （11.6％); 4: 6.3 mg （7.8％); 5: 2.4 mg （3％); 6: 2 mg （2.5％); 7: 0.5 mg （0.6％) of 7; 8: 5.1 mg （6.2％); 10: 4.6 mg （5.8％); 12: 4 mg （5％); 14: 4 mg （4.9％); 16: 2 mg （2.4％)
【実施例３】
【００５９】
トリアゾリル含有ペプチド1−8、10、12、14及び16
アジド保持ペプチド樹脂26を、記載した手順にしたがい0.25mmolの規模でTentaGel S AC-Asp（t-Bu) Fmoc樹脂（ローディング：0.21mmol/g）上でアッセンブリングし、洗浄し（DCMで3回及びエーテルで3回）、乾燥装置で乾燥させた。
固相上銅（I）触媒アジドアルキン環状付加（CuAAC）は、0.05mmolの中間体26、及び対応するアルキン成分（N-Boc-プロパルギルアミン、メチルプロピオレート又はフェニルアセチレン）を用い、図2Dに記す模式図にしたがって実施した。5eqのアルキン、1eqの硫酸銅（II)5水和物（CuSO4・5H2O）、1eqのアスコルビン酸ナトリウム（NaAsc）及び5mLのアルゴンフラッシュDMF中の8eq DIEAの溶液をペプチド樹脂に添加し、周囲温度で一晩震盪した。続いて、前記溶液をろ過によって除去し、ペプチド樹脂をメタノール（3ｘ）、DMF中の0.5％ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム（w/v, 3ｘ）、DMF（3ｘ）及びDCM（3ｘ）で洗浄して中間体36−38を得た。
Fmoc保護基を記載した手順にしたがって除去した。残留するN-末端残基を各々トリアゾリル含有ペプチド樹脂に結合させて中間体39〜41を得た。Fmoc脱保護、固体支持体からの酸分解切断、エーテル沈殿及び酸化的ジスルフィド形成の後、大環状ペプチドを半調製用RP-HPLCにより単離した。前記によって化合物9、11、13及び15が以下の収量で白色固体として得られた：9: 16.8 mg （21.2％); 11: 6.6 mg （8.2％); 13: 4.1 mg （5.1％); 15: 4.2 mg （5.1％)。
【実施例４】
【００６０】
トリアゾリル含有ペプチド42
インヒビター42は、化合物9、11、13及び15について記載したストラテジーと類似する方法にしたがって合成された。第一のペプチド樹脂中間体Fmoc-Aza-Cys（Trt)-His（Trt)-Pro-Asp（tBu)-樹脂を、Fmoc-Asp（tBu)（ローディング：0.23mmol/g）をプレローディングした2-クロロトリチルクロリド樹脂上で0.05mmol規模にてアッセンブリングした。続いて、39mgのN-Boc-プロパルギルアミン（0.25mmol）、14mgのCuSO4・5H2O（0.05mmol）、10mgのNaAsc（0.05mmol）及び5mLのアルゴンフラッシュDMF中の70μLのDIEAの溶液をペプチド樹脂に添加し、周囲温度で一晩震盪した。前記溶液をろ過によって除去し、ペプチド樹脂をメタノール（3ｘ）、DMF中の0.5％ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム（w/v, 3ｘ）、DMF（3ｘ）及びDCM（3ｘ）で洗浄した。
Fmoc保護基を記載した手順にしたがって除去した。残留するN-末端残基をトリアゾリル含有ペプチド樹脂に結合させた。Fmoc脱保護、固体支持体からの酸分解切断、エーテル沈殿及び酸化的ジスルフィド形成の後、大環状ペプチド42を半調製用RP-HPLCにより単離した。前記によって0.9mg（1.2％）の純粋な42が白色固体として得られた。
【実施例５】
【００６１】
ペプチド17−22及び43
線状前駆体を、Fmoc-Asp（tBu)（ローディング：0.23mmol/g）をプレローディングした2-クロロトリチルクロリド樹脂上で0.05mmol規模にて合成した。固体支持体からの酸分解切断、エーテル沈殿及び酸化的ジスルフィド形成の後、大環状ペプチドを半調製用RP-HPLCにより単離した。前記によって化合物17−22及び43が白色固体として以下の収量で得られた：17: 3 mg （3.9％); 18: 6.2 mg （7.9％); 19: 17.4 mg （23.9％); 20: 11.2 mg （15.1％); 21: 23.2 mg （31％); 22: 9.2 mg （12.1％); 43: 0.9 mg （1.2％)。
【実施例６】
【００６２】
インヒビター44
44の線状前駆体を、AmphiSpheres 40 RAM樹脂（0.44mmol/g）上で0.1 mmol規模にて合成した。固体支持体からの酸分解切断、エーテル沈殿及び酸化的ジスルフィド形成の後、大環状ペプチドを半調製用RP-HPLCにより単離した。前記によって10.5mg（7.8％）の44が白色固体として得られた。
【実施例７】
【００６３】
in vitroアッセイ
酵素：組換え体作製、自己触媒性活性化及びマトリプターゼの精製は以前に記載されたように実施した。ウシトリプシンはシグマ-アルドリッチ（Sigma-Aldrich）から購入した。活性部位滴定及び発色基質Boc-QAR-pNAのためのミカエリス-メンテン定数KMの決定は以前に報告されたように実施した。
データの収集及び分析：全ての実験はトリプリケートで実施した。活性部位滴定マトリプターゼ（最終濃度：[E]＝0.9nM）又はトリプシン（最終濃度：[E]＝0.5nM）を種々の濃度[I]の対応するインヒビターとともにpH7.6又は8.5で30分インキュベートした。続いて、発色基質Boc-QAR-pNA（最終濃度：[S]＝250μM）を添加した。残留タンパク分解活性（v/v0）は、96ウェルプレート（NUNC、丸底、透明）で対応するサンプルの吸収を室温で30分にわたって60秒間隔で、テカン（Tecan）GENiosμプレートリーダーを用いて405nmで追跡監視することによって決定した。初期反応速度（定常状態）の勾配を計算し、Boc-QAR-pNAの非阻害酵素加水分解データに対して標準化した。決定されたv/v0値をインヒビター濃度に対してプロットした。得られた用量応答曲線を、等式1を用い又は堅固結合阻害の事例（トリプシン：42、pH8.5でのマトリプターゼ：43、pH7.6及び8.5でのマトリプターゼ：44）では等式2を用い非線形回帰により適合させた。
【００６４】
【数１】
2016504396.tif 000037
【００６５】
【数２】
2016504396.tif 000038
【００６６】
基質非依存阻害定数Kiは、対応するIC50値又は見かけの（基質依存）阻害定数Kiappからそれぞれ等式3及び4を用いて計算された。
【００６７】
【数３】
2016504396.tif 000039
【００６８】
【数４】
2016504396.tif 000040
【００６９】
誤差は誤差伝播により計算した（Tischler et al.と比較）[17]。
本発明の化合物は、上記のように決定したとき、好ましくは100nM未満、より好ましくは50nM未満、もっとも好ましくは12nM未満、理想的には10nM未満のKiを有する。
本発明の目的のためには、“アリール”という用語は単環式若しくは二環式芳香族ホモ又はヘテロ環を指し、前記環は0、1、2、3又は4つのN、O及び／又はS原子及び5、6、7、8、9又は10の骨格原子を有し、それらは未置換、又は互いに独立してR5’、R5”によって一置換若しくは二置換されていてもよい。
“アリール”は例えば未置換フェニル又はナフチルを指し、さらにまた好ましくは例えば、メチル、エチル、イソプロピル、フッ素、塩素、臭素、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ニトロ、シアノ、ホルミル、アセチル、プロピオニル、トリフルオロメチル、メタンスルホニル、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、カルボキシル、メトキシカルボニルによって一置換又は二置換された、フェニル又はナフチルである。
【００７０】
“アリール”はさらにまた以下を表す：フェニル、o-、 m-若しくはp-トリル、o-、m-若しくはp-エチル−フェニル、o-、m-若しくはp-プロピル−フェニル、o-、m-若しくはp-イソプロピルフェニル、o-、m-若しくはp-tert-ブチル−フェニル、o-、m-若しくはp-ヒドロキシ−フェニル、o-、m-若しくはp-ニトロ−フェニル、o-、m-若しくはp-アミノ−フェニル、o-、m-、若しくはp-（N-メチル−アミノ)−フェニル、o-、m-若しくはp-（N-メチル−アミノ−カルボニル)−フェニル、o-、m-若しくはp-アセトアミド−フェニル、o-、m-若しくはp-メトキシ−フェニル、o-、m-若しくはp-エトキシ−フェニル、o-、m-若しくはp-エトキシ−カルボニル−フェニル、o-、m-もしくはp-（N,N-ジ−メチル−アミノ)−フェニル、o-、m-若しくはp-（N,N-ジ−メチル−アミノカルボニル)−フェニル、o-、m-若しくはp-（N-エチル−アミノ)−フェニル、o-、m-若しくはp-（N,N-ジエチルアミノ)−フェニル、o-、m-若しくはp-フルオロ−フェニル、o-、m-若しくはp-ブロモ−フェニル、o-、m-若しくはp-クロロ−フェニル、o-、m-若しくはp-（メチル−スルホン−アミド)−フェニル、o-、m-若しくはp-（メチル−スルホン−イル)−フェニル、さらに好ましくは、2,3-、2,4-、2,5-、2,6-、3,4-若しくは3,5-ジ−フルオロ−フェニル、2,3-、2,4-、2,5-、2,6-、3,4-若しくは3,5-ジクロロ−フェニル、2,3-、2,4-、2,5-、2,6-、3,4-若しくは3,5-ジ−ブロモ−フェニル、2,4-若しくは2,5-ジニトロフェニル、2,5-若しくは3,4-ジ−メトキシ−フェニル、3-ニトロ-4-クロロ−フェニル、3-アミノ-4-クロロ-、2-アミノ-3-クロロ-、2-アミノ-4-クロロ-、2-アミノ-5-クロロ-若しくは2-アミノ-6-クロロ−フェニル、2-ニトロ-4-N,N-ジ−メチル−アミノ-若しくは3-ニトロ-4-N,N-ジメチル−アミノ−フェニル、2,3-ジアミノ−フェニル、p-ヨード−フェニル、4-フルオロ-3-クロロフェニル、2-フルオロ-4-ブロモフェニル、3-ブロモ-6-メトキシフェニル、3-クロロ-6-メトキシフェニル、3-フルオロ-4-メトキシ−フェニル、3-アミノ-6-メチル−フェニル。
【００７１】
“アリール”はさらにまた好ましくは以下を表す：未置換、又はメチル、エチル、イソプロピル、フッ素、塩素、臭素、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ニトロ、シアノ、ホルミル、アセチル、プロピオニル、トリフルオロメチル、メタンスルホニル、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、カルボキシル、メトキシカルボニルによって一置換若しくは二置換された、2-若しくは3-フリル、2-若しくは3-チエニル、1-、2-若しくは3-ピロリル、1-、2,4-若しくは5-イミダゾリル、1-、3-、4-若しくは5-ピラゾリル、2-、4-若しくは5-オキサゾリル、3-、4-若しくは5-イソキサゾリル、2-、4-若しくは5-チアゾリル、3-、4-若しくは5-イソチアゾリル、2-、3-若しくは4-ピリジル、2-、3-若しくは4-ピリジルメチル、2-、3-若しくは4-ピリジルエチル、2-、4-、5-若しくは6-ピリミジニル、2-、3-、5-若しくは6-ピラジン-1-若しくは4-イル、さらにまた好ましくは、1,2,3-トリアゾル-1-、-4-若しくは-5-イル、1,2,4-トリアゾル-1-、 -3-若しくは5-イル、1-若しくは5-テトラゾリル、1,2,3-オキサ−ジアゾル-4-若しくは-5-イル、1,2,4-オキサジアゾル-3-若しくは-5-イル、1,3,4-オキサジアゾル-2-イル、1,3,4-チアジアゾル-2-若しくは-5-yl、1,2,4-チアジアゾル-3-若しくは-5-yl、1,2,3-チアジアゾル-4-若しくは-5-イル、3-若しくは4-ピリダジニル、1-、2-、3-、4-、5-、6-若しくは 7-インドリル、2-、3-、4-、5-、6-若しくは7-インダゾリル、2-、3-、4-若しくは5-イソ−インドリル、2-、6-若しくは8-プリニル、1-、2-、4-若しくは5-ベンゾイミダゾリル、1-、3-、4-、5-、6-若しくは7-ベンゾ−ピラゾリル、2-、4-、5-、6-若しくは7-ベンゾオキサゾリル、3-、4-、5-、6-若しくは7-ベンゾイソキサゾリル、2-、4-、5-、6-若しくは7-ベンゾチアゾリル、2-、4-、5-、6-若しくは7-ベンゾイソチアゾリル、4-、5-、6-若しくは7-ベンゾ-2,1,3-オキサジアゾリル、1-、3-、4-、5-、6-、7-若しくは8-イソキノリニル、3-、4-、5-、6-、7-若しくは8-キノ−リニル、2-、4-、5-、6-、7-若しくは8-キナゾリニル、キノキサリン-2-、3-、4-若しくは5-イル、4-、5-若しくは6-フタラジニル、2-、3-、5-、6-、7-若しくは8-2H-ベンゾ-1,4-オキサジニル。
【００７２】
本明細書に引用した全ての刊行物及び特許は、参照によって組み入れられるためにあたかも個々の刊行物又は特許が具体的かつ個別に示されるかのように参照により本明細書に組み入れられ、さらに当該刊行物の引用に関係がある方法及び／又は材料を開示及び記載するために参照により本明細書に組み入れられる。いずれの刊行物の引用も本出願日前の前記の開示内容のためであり、本発明が先発明の理由でそのような刊行物に先行する権利をもたないということを容認するものと解されるべきではない。さらにまた、提供される刊行日は実際の刊行日とは異なり得る（前記は別個に確認する必要がある）。参照により本明細書に組み入れられた文書で設定された用語の定義が、本明細書で厳密に設定した用語の定義と矛盾する場合には、本明細書で設定した定義が優先する。
【００７３】
本発明の化合物はマトリプターゼのインヒビターとして活性を有し、特異的にマトリプターゼと結合する。より具体的には、好ましい化合物はマトリプターゼのセリンプロテアーゼドメインと結合し、その活性を阻害する。
これらの化合物は、癌症状がマトリプターゼの活性によって悪化する当該癌症状の予防及び治療に有用であろうと考えられる。
本発明の化合物の別の使用は、癌症状の進行及び同時に発生する細胞マトリックスの分解の抑制のための使用である。
本発明の化合物はマトリプターゼのセリンプロテアーゼ活性のインヒビターとして活性を有し、マトリプターゼ又はMTSPIのセリンプロテアーゼドメインと特異的に結合する。したがって、固形物/ゲル支持体と連結するために適切な部位を含むこれら化合物は、通常の親和性クロマトグラフィーの手順によりサンプルからマトリプターゼを精製するか、又はサンプルからマトリプターゼを除去するための親和性クロマトグラフィーにira vitroで用いることができる。これらの化合物は、直接的に又は適切なリンカー支持体を介して、通常的な方法により親和性クロマトグラフィーと結合又はカップリングされる。例えば以下を参照されたい：Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons （J.E.Coligan et al., eds, 1997）；及びProtein Purification Protocols, Humana Press（S.Doonan, ed., 1966）並びにそれらの引用文献。
【００７４】
マトリプターゼ又はMTSP1セリンプロテアーゼ阻害活性を有する本発明の化合物は、サンプル中のマトリプターゼ又はMTSP1の活性及びマトリプターゼ又はMTSP1の複合体対非複合体比を測定するin vitroアッセイで有用である。これらのアッセイは、組織サンプル（例えば生検由来）でマトリプターゼ又はMTSP1の活性レベルを追跡監視するために、又は任意の臨床状況（マトリプターゼ又はMTSP1活性の測定が助けとなる状況）のためにマトリプターゼ活性及びマトリプターゼの複合体対非複合体比を追跡監視するために用いることができる。サンプル中のセリンプロテアーゼ活性を決定するアッセイは、マトリプターゼの複合体対非複合体比を決定するために、マトリプターゼ又はMTSP1の総量（複合体又は非複合体に関係なく）を決定するELISAと組み合わせて用いることが可能である。
多様な動物モデルを用いて本発明の化合物の能力を評価して、原発性腫瘍の増殖を減少させるか、又は転移の発生を減少させることができる。
これらのモデルには、遺伝的に改変させたげっ歯類（トランスジェニック動物）、元々はげっ歯類又はヒトに由来しシンジェニック又は免疫低下宿主に移植された移植可能腫瘍細胞が含まれ得る。又はそれらモデルには特殊化モデル、例えば下記に記載するCAMモデルが含まれ得る。前記CAMモデルは、1つの化合物又は複数の化合物の血管増殖（血管形成）を阻害する能力を評価するために設計される（血管増殖は腫瘍の増殖に必須であると考えられる）。
他のモデルもまた利用することができる。
【００７５】
適切な動物モデルを選択して、本発明に記載した化合物のin vivo抗腫瘍活性を関連基準セットに基づいて評価する。例えば、ある基準は、試験される当該腫瘍によるマトリプターゼ又はMTSP1及び／又はマトリプターゼ又はMTSP1 mRNAの発現であり得る。この基準を満たす2つのヒト前立腺由来腫瘍はLnCap及びPC-3細胞株である。別の基準は、当該腫瘍が、通常高レベルのマトリプターゼ又はMTSP1を発現する腫瘍由来するということであり得る。
ヒト結腸癌はこの基準に適合する。第三の基準は、腫瘍の増殖及び／又は進行が、マトリプターゼ又はMTSP1の基質（例えばsc-u-PA）のプロセッシングに依存するということであり得る。ヒトの類上皮癌Hep-3はこの基準に適合する。別の基準は、腫瘍の増殖及び／又は進行が、マトリプターゼ又はMTSP1活性を必要とする生物学的又は病理学的プロセスに依存するということであり得る。別の基準は、当該腫瘍が、周囲組織によるマトリプターゼ又はMTSP1の発現を誘発するということであり得る。
他の基準もまた特有の動物モデルの選択に用いることができる。
【００７６】
いったん適切な腫瘍細胞を選択したら、被検化合物を該選択腫瘍細胞保持動物に投与し、該選択モデルに特有の所定の増殖期間の後で、腫瘍サイズ及び／又は転移拡散のその後の測定を実施する。
最初にOssowski（J.Cell Biol., 107: 2437-2445, 1988）が報告したCAMモデル（ニワトリ胚漿尿膜モデル）は、ある化合物の抗腫瘍及び抗血管形成活性を評価する別の方法を提供する。
多様な起源の腫瘍細胞を10日齢のCAM上に置き、一晩定着させることができる。続いてBrooksら（Brooks et al., Methods in Molecular Biology, 129: 257-269, 1999）が記載したように、被検化合物を静脈内注射することができる。腫瘍増殖又はCAM侵襲を阻害する化合物の能力を化合物を投与してから7日後に測定する。
化合物の血管形成阻害能力を測定するモデルとして用いるときは、血管形成性因子（例えば塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）又は血管内皮細胞増殖因子（VEGF））を含むフィルター円盤を文献（Brooks et al., Methods in Molecular Biology, 129: 257-269, 1999）の記載にしたがって10日齢CAM上に置く。一晩のインキュベーション後に、被検化合物を静脈内に投与する。化合物を投与してから48時間後に血管の分枝量を計数することによって、血管形成量を測定する（（Methods in Molecular Biology, 129: 257-269, 1999）。
【００７７】
本発明の化合物は、マトリプターゼのセリンプロテアーゼ活性の低下によって緩和される病理学的状態の治療のためにin vivoで有用である。
これらの化合物は、転移の減少又は阻害、並びに腫瘍及び他の新形成の細胞外マトリックスの分解で有用であろうと考えられる。これらの化合物は、細胞外マトリックスの病理学的分解を特徴とする症状（本発明の背景及び序で上述したものを含む）の治療で治療薬剤として有用であろう。
本発明は、マトリプターゼ又はMTSP1のセリンプロテアーゼ活性の阻害によって軽減される症状を有すると疑われる哺乳動物で症状を予防又は治療する方法を含み、前記方法は、マトリプターゼのセリンプロテアーゼ活性を選択的に阻害する本発明の化合物又は医薬組成物の治療的有効量を前記哺乳動物に投与する工程を含む。
本発明の化合物は、in vivoで通常は哺乳動物（好ましくはヒト）に投与される。それらをin vivoで用いるとき、該化合物は、多様な態様で（経口、非経口、静脈内、皮下、筋肉内、経結腸、経直腸、経鼻、又は腹腔内を含む）、多様な剤形を用いて哺乳動物に投与できる。
本発明の方法を実施するとき、本発明の化合物は、単独で又は互いに組み合わせて、又は他の治療薬若しくはin vivo診断薬と組み合わせて投与される。
【００７８】
医療分野の業者には明白なように、本発明の化合物の“治療的に有効な量”は、治療される年齢、体重及び哺乳動物種、治療される疾患又は病理学的状態の病期、用いられる個々の化合物、個々の投与態様、並びに所望される効果及び治療指標に応じて変動するであろう。これらの要件及びこの量の決定とそれらとの関係は医療分野では周知であるので、治療的に有効な薬用量レベル、マトリプターゼ又はMTSP1セリンプロテアーゼ活性を阻害する所望の結果の達成に必要な量の決定は当業者の領域内であろう。
典型的には、本発明の化合物の投与はより低い投薬レベルで開始され、投薬レベルは、所望のマトリプターゼ活性阻害効果が所望の程度に達するまで増加されるであろう（前記が治療的に有効な量を規定するであろう）。本発明の化合物にとって、そのような用量は約0.01mg/kg体重から約100mg/kg体重、好ましくは約0.01から約10mg/kg体重である。
【００７９】
さらにまた、該化合物は以下を含む他の症状の治療に適切である（ただしこれらに限定されない）：不安定狭心症、難治性狭心症、心筋梗塞、一過性虚血性発作、血栓症発作、塞栓症発作、汎発性血管内凝固症候群（敗血症ショックの治療を含む）、肺塞栓症の予防又は冠状動脈再灌流の再閉塞若しくは再狭窄の治療における深部静脈血栓症。
さらにまた、これら化合物は、Xa因子/プロトロンビナーゼ複合体の生成及び／又は作用を必要とする疾患の治療又は予防に有用である。前記疾患には凝固カスケードが活性化される多数の血栓及び前血栓状態を含み、深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、卒中、外科手術における血栓塞栓性合併症、及び末梢動脈閉塞が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
上記に記載した疾患状態に加えて、本発明の化合物の投与によって治療できる又は予防できる他の疾患には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：閉塞性冠動脈血栓形成（血栓溶解治療又は経皮経管冠動脈形成術から生じる）、静脈系における血栓形成、汎発性血管内凝固障害、凝固因子の急速な消費が存在する症状、並びに広範な器官不全、出血発作、腎透析、血液酸素付加及び心カテーテル設置に至る微細血管系全体に生じる致死的な血栓形成を生じる全身性凝固。
【００８０】
本発明の化合物はまた他の治療薬又は診断薬と組み合わせて用いることができる。ある種の好ましい実施態様では、本発明の化合物は、一般的に許容されている医療慣行にしたがってこれらの症状のために典型的に処方される他の化合物と一緒に共投与され得る。前記他の化合物は、例えば抗凝固剤、血栓溶解剤、又は他の抗血栓薬（血小板凝集インヒビター、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヘパリン、アスピリン又はワルファリンを含む）である。
本発明の化合物は相乗的態様で作用し、首尾よい血栓溶解療法に続く再閉塞を予防し、及び／又は再灌流の機会を減少させることができる。これらの化合物はまた、用いられる血栓溶解剤の用量の削減を可能にし、したがって潜在的な出血の副作用を最小限にできる。本発明の化合物は、in vivoで、通常的には哺乳動物（例えば霊長類（例えばヒト）、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット及びマウス）で、又はin vitroで用いることができる。
本発明の化合物はまた生物学的サンプルの凝固を阻害する方法で有用であり、前記方法は本発明の化合物の投与を含む。
【００８１】
本発明の化合物はまた他の治療薬又は診断薬と組み合わせて用いることができる。ある種の好ましい実施態様では、本発明の化合物は、一般的に許容されている医療慣行にしたがってこれらの症状のために典型的に処方される他の化合物と一緒に共投与され得る。前記他の化合物は、例えば抗凝固剤、血栓溶解剤、又は他の抗血栓薬（血小板凝集インヒビター、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヘパリン、アスピリン又はワルファリンを含む）である。
本発明の化合物は相乗的態様で作用し、首尾よい血栓溶解療法に続く再閉塞を予防し、及び／又は再灌流の機会を減少させることができる。これらの化合物はまた、用いられる血栓溶解剤の用量の削減を可能にし、したがって潜在的な出血の副作用を最小限にできる。本発明の化合物は、in vivoで、通常的には哺乳動物（例えば霊長類（例えばヒト）、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット及びマウス）で、又はin vitroで用いることができる。
【００８２】
問題の化合物の有効量が治療で用いられる。治療のために適切な薬用量は当業者には明白であろう。本発明にしたがって用いられる化合物の薬用量は化合物及び治療される症状にしたがって変動する。年齢、除脂肪体重、総体重、体表面積、レシピエント患者の臨床症状、並びに治療を行う医師の経験及び判断がとりわけ薬用量の選択に影響する要件である。
他の要件には患者への投与ルート、患者の病歴、疾患プロセスの重篤度、及び個々の化合物の性能が含まれる。当該用量は、患者に対し許容不能の毒性をもたらすことなく、治療される疾患の症状又は徴候の緩和に十分であるべきである。
典型的には、当該薬用量は、治療結果が達成されるまで1日に少なくとも1回投与される。好ましくは、当該薬用量は1日に2回投与されるが、医師は前記より多い又は少ない投与を推奨することができる。いったん治療結果が達成されたら、当該薬剤を漸減させるか又は中止させることができる。稀に、副作用が治療の中止の根拠となる。一般的には、化合物の有効量は、症状の主観的緩和、又は医師若しくは他の有資格観察者が客観的に認識できる改善を提供する量である。
【００８３】
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[20]a) A.A.Canutescu, A.A.Shelenkov, R.L.Dunbrack, Protein Sci 2003, 12, 2001-2014; b) R.L.Dunbrack, F.E.Cohen, Protein Sci 1997, 6, 1661-1681.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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