(57)【要約】【課題】ＫＩＲ３ＤＬ１の機能サブ群に特徴的な一塩基多型  （ＳＮＰｓ）が開示されている。また、ゲノミックＤＮＡからの群特異的ＳＮＰｓを同定するためにユニークに設計された一連のオリゴヌクレオチドプライマー及びＰＣＲ反応条件を用いることにより、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子を分類する方法も開示されている。【解決手段】ここに開示した組成物及び方法は、臨床設定及び研究室において有用であり、種々の疾病の予後の予想及びＨＣＴのための最も適切なドナーの選択を可能にする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼ連鎖反応  （ＰＣＲ）に基づきＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子を分類するためのキットであって、
リバースプライマーであり、位置１９３にＧを含む、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン３の領域に特異的に結合する第１のプライマーと；  
フォワードプライマーであり、位置１９３にＡを含む、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン３の領域に特異的に結合する第２のプライマーと；  
リバースプライマーであり、位置６０７にＴを含む、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン４の領域に特異的に結合する第３のプライマーと；
フォワードプライマーであり、位置１９３にＡ及び位置２０２にＡを含む、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン３の領域に特異的に結合する第４のプライマーと；
フォワードプライマーであり、位置２０２にＧを含む、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン３の領域に特異的に結合する第５のプライマーと；
リバースプライマーであり、位置６０７にＣを含む、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン４の領域に特異的に結合する第６のプライマーと；
リバースプライマーであり、位置１０２０にＣ及び位置１０２１にＧを含む、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン７の領域に特異的に結合する第７のプライマーと；  
ＰＣＲ反応を行うための指示書とを含む、前記キット。
【請求項２】
フォワードプライマーであり、エクソン３中の位置１９３の上流の、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子の保存領域に結合する第８のプライマーをさらに含む請求項１記載のキット。
【請求項３】
フォワードプライマーであり、ＫＩＲ３ＤＬ１のイントロン６内の保存領域に結合する第９のプライマーをさらに含む、請求項２記載のキット。
【請求項４】
前記指示書は、５つのＰＣＲ反応を行うためのプライマーのペアリングを掲載し、前記第１のプライマーと前記第８のプライマーとが第１のＰＣＲ反応のためのプライマーペアを与え；
前記第２のプライマーと前記第３のプライマーとが第２のＰＣＲ反応のためのプライマーペアを与え；  
前記第４のプライマーと前記第６のプライマーとが第３のＰＣＲ反応のためのプライマーペアを与え；  
前記第５のプライマーと前記第６のプライマーとが第４のＰＣＲ反応のためのプライマーペアを与え；
前記第９のプライマーと前記第７のプライマーとが第５のＰＣＲ反応のためのプライマーペアを与える、
請求項３記載のキット。
【請求項５】
前記指示書は、ＰＣＲ反応の産物に基づきＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子を同定するための指示をさらに掲載し、指示書は、
第１のＰＣＲ反応の増幅産物の存在がＫＩＲ３ＤＬ１無対立遺伝子の存在を示し；
第２のＰＣＲ反応の増幅産物の存在がＫＩＲ３ＤＬ１＊００５−群低対立遺伝子の存在を示し；
第３のＰＣＲ反応の増幅産物の存在がＫＩＲ３ＤＬ１＊００１−群高対立遺伝子の存在を示し；
第４のＰＣＲ反応の増幅産物の存在がＫＩＲ３ＤＬ１＊０１５−群高対立遺伝子、ＫＩＲ３ＤＬ１＊００７−群低対立遺伝子及びＫＩＲ３ＤＳ１対立遺伝子のうちの１つの存在を示し；
第５のＰＣＲ反応の増幅産物の存在がＫＩＲ３ＤＬ１＊００７−群低対立遺伝子の存在を示す、
請求項４記載のキット。
【請求項６】
前記指示書は、ＰＣＲ産物のサイズに基づき、ＫＩＲ３ＤＳ１  対立遺伝子の存在からＫＩＲ３ＤＬ１＊０１５−群高対立遺伝子の存在を区別することをさらに掲載している請求項５記載のキット。
【請求項７】
前記第１のプライマーが、位置１９３にＧ、及び位置２０２にＡを含む、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン３の領域に特異的に結合する、請求項１記載のキット。
【請求項８】
前記第１のプライマーがＴＧＴＧＧＡＴＴＣＣ  （配列番号１２）の塩基配列を含む、請求項７記載のキット。
【請求項９】
前記第２のプライマーが、位置１９３にＡ、及び位置２０２にＡを含む、請求項１記載のキット。
【請求項１０】
前記第２のプライマーが、ＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡ  （配列番号１４）の塩基配列を含む、請求項１記載のキット。
【請求項１１】
前記第３のプライマーが、ＧＡＴＡＧＧＡ  （配列番号１３）の塩基配列を含む、請求項１記載のキット。
【請求項１２】
前記第４のプライマーが、ＡＧＡＡＴＣＣＡＣＡ  （配列番号１９）の塩基配列を含む、請求項１記載のキット。
【請求項１３】
前記第５のプライマーが、位置１９３  にＡ、及び位置２０２にＧを含む、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン３の領域に特異的に結合する、請求項１記載のキット。
【請求項１４】
前記第５のプライマーが、ＡＧＡＡＴＣＣＡＣＧ  （配列番号２１）の塩基配列を含む、請求項１記載のキット。
【請求項１５】
前記第６のプライマーが、位置６０７にＣ、及び位置６２４にＴを含む、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン４の領域に特異的に結合する、請求項１記載のキット。
【請求項１６】
前記第６のプライマーがＡＣＴＧＡＴＡＧＧＧ  （配列番号２３）の塩基配列を含む、請求項１記載のキット。
【請求項１７】
前記第７のプライマーが、位置１０２０にＣ、位置１０２１にＧ、及び位置１０２６にＧを含む、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン７の領域に特異的に結合する、請求項１記載のキット。
【請求項１８】
前記第７のプライマーが、ＣＡＧＡＡＣＧ  （配列番号２６）の塩基配列を含む、請求項１記載のキット。
【請求項１９】
対象におけるＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子を分類する方法であって、前記対象からのゲノミックＤＮＡを含む試料を得ること、
前記試料中のゲノミックＤＮＡを鋳型として、及び請求項４記載のキットにより提供される５つのプライマーペアを用いて５つのＰＣＲ反応を行うこと；並びに
５つの反応の増幅産物の検出に基づき、対象中のＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子を決定することを含み、
第１のＰＣＲ反応の増幅産物の存在がＫＩＲ３ＤＬ１無対立遺伝子の存在を示し；
第２のＰＣＲ反応の増幅産物の存在がＫＩＲ３ＤＬ１＊００５−群低対立遺伝子の存在を示し；
第３のＰＣＲ反応の増幅産物の存在がＫＩＲ３ＤＬ１＊００１−群高対立遺伝子の存在を示し；
第４のＰＣＲ反応の増幅産物の存在がＫＩＲ３ＤＬ１＊０１５−群高対立遺伝子、ＫＩＲ３ＤＬ１＊００７−群低対立遺伝子及びＫＩＲ３ＤＳ１対立遺伝子のうちの１つの存在を示し；
第５のＰＣＲ反応の増幅産物の存在がＫＩＲ３ＤＬ１＊００７−群低対立遺伝子の存在を示す、
前記方法。
【請求項２０】
５つの反応の増幅産物の検出に基づき、対象をＫＩＲ３ＤＬ１機能群に割り当て、ここで、前記機能群は、ＫＩＲ３ＤＬ１−Ｎ、ＫＩＲ３ＤＬ１−Ｌ及びＫＩＲ３ＤＬ１−Ｈから成る群より選ばれる、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
第１の反応の増幅産物の存在に基づき、対象をＫＩＲ３ＤＬ１−Ｎ  機能群に割り当てる、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
第１の反応の増幅産物の欠如及び第２の反応の増幅産物の存在に基づき、対象をＫＩＲ３ＤＬ１−Ｌ  機能群に割り当てる、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
第１及び第２の反応の増幅産物の欠如、第４の反応の増幅産物の存在及びサイズ並びに第５の反応の増幅産物の存在に基づき、対象をＫＩＲ３ＤＬ１−Ｌ  機能群に割り当てる、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
第２及び第５の反応の増幅産物の欠如並びに第３の反応の増幅産物の存在に基づき、対象をＫＩＲ３ＤＬ１−Ｈ  機能群に割り当てる、請求項１９記載の方法。
【請求項２５】
第４の反応の増幅産物の存在及びサイズ、並びに第１、第２及び第５の反応の増幅産物の欠如に基づき対象をＫＩＲ３ＤＬ１−Ｈ  機能群に割り当てる、請求項１９記載の方法。
【請求項２６】
リバースプライマーであり、位置１９３にＧを含む、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン３の領域に特異的に結合する、第１のプライマー。
【請求項２７】
フォワードプライマーであり、位置１９３にＡを含む、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン３の領域に特異的に結合する、第２のプライマー。
【請求項２８】
リバースプライマーであり、位置６０７にＴを含む、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン４の領域に特異的に結合する、第３のプライマー。
【請求項２９】
フォワードプライマーであり、位置１９３にＡ、及び位置２０２にＡを含む、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン３の領域に特異的に結合する、第４のプライマー。
【請求項３０】
フォワードプライマーであり、位置２０２にＧを含む、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン３の領域に特異的に結合する、第５のプライマー。
【請求項３１】
リバースプライマーであり、位置６０７にＣを含む、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン４の領域に特異的に結合する、第６のプライマー。
【請求項３２】
リバースプライマーであり、位置１０２０にＣ、及び位置１０２１にＧを含む、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン７の領域に特異的に結合する、第７のプライマー。
【請求項３３】
請求項２６記載の第１のプライマーと、フォワードプライマーであり、エクソン３中の位置１９３の上流の、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子の保存領域に結合する第８のプライマーとを含む、第１のＰＣＲ反応のためのプライマーペア。
【請求項３４】
請求項２７記載の第２のプライマー及び請求項２８記載の第３のプライマーを含む、第２のＰＣＲ反応のためのプライマーペア。
【請求項３５】
請求項２９記載の第４のプライマーと、請求項３１記載の第６のプライマーとを含む、第３のＰＣＲ反応のためのプライマーペア。
【請求項３６】
請求項３０記載の第５のプライマーと、請求項３１記載の第６のプライマーとを含む、第４のＰＣＲ反応のためのプライマーペア。
【請求項３７】
第９のプライマーと、請求項３２記載の第７のプライマーとを含み、前記第９のプライマーは、フォワードプライマーであり、ＫＩＲ３ＤＬ１のイントロン６中の保存領域に結合する、第５のＰＣＲ反応のためのプライマーペア。
【請求項３８】
対象におけるＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子の対立遺伝子群を決定する方法であって、
前記対象からゲノミックＤＮＡを含む試料を得ること、
前記試料中のゲノミックＤＮＡを鋳型として、及び請求項３３−３７のいずれかに記載の１つのプライマーペアを用いて少なくとも１つのＰＣＲ反応を行うこと；並びに
ＰＣＲ反応の増幅産物の検出に基づき、対象中に存在するＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子を決定することを含み、
行ったＰＣＲ反応が請求項３３に記載される第１のＰＣＲ反応である場合には、増幅産物の存在は、ＫＩＲ３ＤＬ１−無対立遺伝子の存在を示し；
行ったＰＣＲ反応が請求項３４に記載される第２のＰＣＲ反応である場合には、増幅産物の存在は、ＫＩＲ３ＤＬ１−低対立遺伝子の存在を示し；
行ったＰＣＲ反応が請求項３５に記載される第３のＰＣＲ反応である場合には、増幅産物の存在は、  ＫＩＲ３ＤＬ１−高対立遺伝子の存在を示し；
行ったＰＣＲ反応が請求項３６に記載される第４のＰＣＲ反応である場合には、増幅産物の存在は、ＫＩＲ３ＤＬ１−高対立遺伝子、ＫＩＲ３ＤＬ１−低対立遺伝子及びＫＩＲ３ＤＳ１対立遺伝子の１つの存在を示し；並びに
行ったＰＣＲ反応が請求項３７に記載される第５のＰＣＲ反応である場合には、増幅産物の存在は、ＫＩＲ３ＤＬ１−低対立遺伝子の存在を示す、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１３年３月１５日出願の米国仮特許出願第６１／７９１，０１３号の優先権の利益を主張し、この文献の内容全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
連邦支援研究又は開発に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた、契約第ＡＩ０６９１９７号、第ＨＬ０８８１３４号に基づく政府支援を利用してなされた。政府は本発明に所定の権利を有する。
【０００３】
本開示は概して、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子を分類するためのキット及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ＫＩＲ３ＤＬ１のサブタイプとそのリガンド、ＨＬＡ−Ｂとの上位性相互作用は、ＨＩＶ（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３９：７３３−７４０（２００７））を有し造血幹細胞移植（ＨＣＴ）（Ｇｉｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０１２））を受けている患者の転帰を示差的に予測させる。ＫＩＲ３ＤＬ１の機能群は、ＨＬＡ−Ｂｗ４に対する高い阻害性相互作用及び低い阻害性相互作用を予測させ、造血細胞移植（ＨＣＴ）（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３９：７３３−７４０（２００７）；Ｇｉｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０１２））を受けているＨＩＶ患者及び白血病患者における臨床転帰に対して相関関係を有する。これまで、５９の既知の阻害性対立遺伝子が、ＮＫ細胞の表面上に発現されるそれらの密度に基づいて３つのサブ群に分類されてきた（Ｇａｒｄｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６６：２９９２−３００１（２００１）；Ｐａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７１：６６４０−６６４９（２００３）；Ｙａｗａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３）。活性化ＫＩＲ３ＤＳ１分子をコードする一群のＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子を原因とする、ＫＩＲ３ＤＬ１の追加的な１２の対立遺伝子がある。ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子が容易に同定できる一方で、研究の成果を臨床診療に移すために、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子評価のための簡便で費用効果的なプロトコルが開発されなければならない。
【発明の概要】
【０００５】
ＫＩＲ３ＤＬ１の７１の既知の対立遺伝子のコード配列を配列比較することによって、本発明者は、ＫＩＲ３ＤＬ１の機能サブ群に特有の一塩基多型（ＳＮＰ）を同定した。一連のユニークなオリゴヌクレオチドプライマー及びＰＣＲ反応条件を設計することによって、これらの群特異的ＳＮＰをゲノミックＤＮＡから増幅させることができる。本明細書に開示のプライマーセットと方法は、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子を効率的な方法で分類するのに有用であり、診療所及び研究所によって容易に採用することができ、そうして、ＨＩＶ及びＨＣＴの予測的な予後評価と、疾患過程におけるＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子の役割に関する遡及的な分析とを可能にする。ＫＩＲ３ＤＬ１と疾患の関係がさらに解読されるに従い、ＫＩＲ３ＤＬ１のアロタイピングが予後の確立において関連をもってくる。以下に限定されないが、がん、炎症性腸疾患、ＨＩＶに関連した状態又は感染、サイトメガロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、及びインフルエンザを含む、ＨＬＡ調節不全の疾患が、ＫＩＲ３ＤＬ１及びＨＬＡ−Ｂの化合物アロタイプに影響されると思われる。急性の骨髄性白血病患者及びＨＩＶ患者に対する同種ＨＣＴのために、最適な幹細胞ドナーの選定に関する情報が、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子型別を実施することによって、得られる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子に対する配列比較と群化の戦略。それぞれ１％超の発生頻度で存在する、ＫＩＲ３ＤＬ１の１１の最も一般的な対立遺伝子を、太字で示し、ＨＬＡ−Ｂｗ４との相互作用に関する既知の特性に従って、配列比較し層別化した。エクソン３及び４に存在する３つの多形性部位で、対立遺伝子を４つの機能サブ群に層別化することができた。エクソン７に存在する追加のＳＮＰが反応の発生を可能とし、以前は低（ＬＯＷ）と特徴付けられていたが０１５−群高（ｈｉｇｈ）対立遺伝子の間で増幅された対立遺伝子、ＫＩＲ３ＤＬ１＊００７の同定を可能とした。続いて、残る５９の既知のＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子配列を、これらのＳＮＰで高発生頻度の対立遺伝子との配列相同性に従って層別化した。無＊００４の配列と異ならないヌクレオチドを破線で示し、設計されたプライマーにおいて考慮されたＳＮＰを太字で示す。そして、各プライマーの結合部位を太字枠中に示す。ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子の間に保存される領域に結合するプライマーは示していない。種々の領域に示す配列は、次の配列番号で割り当てられる：エクソン３における目的の領域−無＊００４群、配列番号１；低＊００５群、配列番号２；高＊００２群、配列番号３；エクソン４における目的の領域−無＊００４群、配列番号４；低＊００５群、配列番号５；高＊００１群、配列番号６；＊０７３、配列番号７；エクソン７における目的の領域−無＊００４群、配列番号８；低＊００５群、配列番号９；高＊００１群、配列番号１０；低＊００７、配列番号１１。
【図２】対立遺伝子サブ群分析は配列データと一致している。健康な無関係のドナーのＰＢＭＣに由来するＤＮＡから得たＫＩＲ３ＤＬ１遺伝子の内容をゲノム配列決定によって決定した。続いて、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子サブ群分析を実施した。２つの反応が、ユニークなＳＮＰに基づいて無及び＊００７−低群を同定する。３つの追加の反応が対立遺伝子を残りの群、即ち００５群低対立遺伝子及び高対立遺伝子に下位区分され、００１−及び０１５−群対立遺伝子として下位区分される。１７４の無関係のドナーについて、アロタイプ型別の結果を、配列に基づく型別と比較することによって、ＫＩＲ３ＤＬ１アロタイプ型別の有効性を確認した。
【図３】ＫＩＲ３ＤＬ１機能群を決定するフロー図。対立遺伝子群化を反応１〜５より、順番に検討する。対立遺伝子群化の優先順位は、無＞低＞高＞３ＤＳ１である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
詳細な説明
本開示は、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づいて分類するためのキット及び方法を提供する。
ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子の分類
【０００８】
「ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子を分類する」とは、本明細書で開示されるキット及びＰＣＲに基づく方法を使用することにより、対象におけるＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子の対立遺伝子型を決定することができ、機能サブ群ＫＩＲ３ＤＬ１の割り当てを推定することができるということを意味する。
【０００９】
この開示に従って、ＫＩＲ３ＤＬ１−高、ＫＩＲ３ＤＬ１−低、ＫＩＲ３ＤＬ１−無、及びＫＩＲ−３ＤＳ１というＫＩＲ３ＤＬ１に関する４つの対立遺伝子型が存在する。これらの４つの対立遺伝子型は、本明細書でＫＩＲ３ＤＬ１に関する「対立遺伝子のサブ群」とも呼ばれる。
【００１０】
「ＫＩＲ３ＤＬ１−高（ｈ）」又は「ＫＩＲ３ＤＬ１−高（ｈｉｇｈ）」（「ｈｉｇｈ」としての「ｈ」）は、本明細書で使用される場合、（Ｚ２７又はＤＸ９などの）ＫＩＲ３ＤＬ１受容体に対する抗体を使用する細胞表面染色によって検出可能なＮＫ細胞の細胞表面上に高密度でＫＩＲ３ＤＬ１受容体を発現する対立遺伝子、又は表面染色でまだ特徴づけられていないが、細胞表面染色によって検出可能なＮＫ細胞の細胞表面上に高密度でＫＩＲ３ＤＬ１受容体を発現する対立遺伝子と実質的な配列類似性を有する対立遺伝子に関する。「実質的な配列類似性」とは、関連配列が、ヌクレオチドレベルで、少なくとも、約９０％、９５％、９８％、９９％、若しくはそれ以上の同一性、又はアミノ酸レベルで、少なくとも、約９０％、９５％、９８％、９９％若しくはそれ以上の類似性若しくは同一性を有することを意味する。本明細書でＫＩＲ３ＤＬ１−高対立遺伝子と見なされるＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子は、ＫＩＲ３ＤＬ１＊００１、＊００２、＊００８、＊０１５、＊０２０、＊０３３、及び＊０５２を含み、これらの全ては、細胞表面染色によって特徴づけられており；また、ＫＩＲ３ＤＬ１＊００９、＊０１６、＊０４３、＊０６７、＊０２６、＊０３４、＊０３５、＊０２２、＊０１７、＊０６６、＊０２９、＊０３８、＊０２５、＊０５４、＊０１８、＊０５１、＊０６８、＊０２３、＊０２８、＊０６２、＊０３０、＊０２４Ｎ、＊０３１、＊０４２、及び＊０５７も含み、これらは、表面染色でまだ特徴づけられていないが、高密度の細胞表面染色により特徴づけられるＫＩＲ３ＤＬ１−高対立遺伝子と実質的な配列類似性を有する。
【００１１】
「ＫＩＲ３ＤＬ１−低（ｌ）」又は「ＫＩＲ３ＤＬ１−低（ｌｏｗ）」対立遺伝子（「ｌｏｗ」としての「ｌ」）は、本明細書で使用される場合、（例えば、Ｚ２７又はＤＸ９の使用する）細胞表面染色によって検出可能なＮＫ細胞の細胞表面上に低密度でＫＩＲ３ＤＬ１受容体を発現する対立遺伝子、又は表面染色でまだ特徴づけられていないが、細胞表面染色によって検出可能なＮＫ細胞の細胞表面上に低密度でＫＩＲ３ＤＬ１受容体を発現する対立遺伝子と実質的な配列類似性を有する対立遺伝子に関する。本明細書でＫＩＲ３ＤＬ１−低対立遺伝子と見なされるＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子は、ＫＩＲ３ＤＬ１＊００５、＊００７、及び＊０５３を含み、これらの全ては、細胞表面染色によって特徴づけられており；また、ＫＩＲ３ＤＬ１＊０４４、及び＊０４１も含むが、これらは、表面染色でまだ特徴づけられていないが、低密度の細胞表面染色により特徴づけられるＫＩＲ３ＤＬ１−低対立遺伝子と実質的な配列類似性を有する。
【００１２】
「ＫＩＲ３ＤＬ１−無（ｎ）」又は「ＫＩＲ３ＤＬ１−無（ｎｕｌｌ）」対立遺伝子（「ｎｕｌｌ」としての「ｎ」）は、本明細書で使用される場合、細胞内に保持されており、（例えば、Ｚ２７又はＤＸ９を使用する）細胞表面染色によって検出できないＫＩＲ３ＤＬ１分子を発現する対立遺伝子、並びに、表面染色でまだ特徴づけられていないが、低密度の細胞表面染色により特徴づけられるＫＩＲ３ＤＬ１−無対立遺伝子と実質的な配列類似性を有する対立遺伝子に関する。本明細書でＫＩＲ３ＤＬ１−無対立遺伝子と見なされるＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子は、（表面染色の欠如により特徴づけられる）ＫＩＲ３ＤＬ１＊００４、＊０１９、及び＊０５６；並びに、（表面染色の欠如によりまだ特徴づけられていない）ＫＩＲ３ＤＬ１＊０２１、＊０３６、＊０３７、＊０３９、＊０５６、＊０７２、＊０６２、及び＊０４０を含む。
【００１３】
「ＫＩＲ３ＤＳ１」対立遺伝子は、ＤＸ９ではなくＺ２７を用いて表面染色することにより検出可能である、ＫＩＲ３ＤＳ１分子を発現する。ＫＩＲ３ＤＳ１対立遺伝子は、ＫＩＲ３ＤＳ１＊０１３、＊０４７、＊０１０、＊０１１、＊０１２、＊０１４、＊０４５、＊０４６、＊０４８、＊０４９Ｎ、＊０５０、＊０５５、及び＊０５８を含むが、これらに限定されるものではない。
【００１４】
基本的に、本明細書で開示されるプライマー及びＰＣＲ反応は、従来の配列解析を必要とせずに、対象における母系及び父系のＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子に関する対立遺伝子の同定を可能にする。対象における母系及び父系の対立遺伝子に関してＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子型が決定されると、対象の母系及び父系の対立遺伝子の組み合わせに基づいた以下に挙げるＫＩＲ３ＤＬ１機能サブ群の１つに対象を割り当てることができる。
ＫＩＲ３ＤＬ１          ＫＩＲ３ＤＬ１
機能サブ群              対立遺伝子の組み合わせ
ＫＩＲ３ＤＬ１−高      ＫＩＲ３ＤＬ１−高／−高、又はＫＩＲ３ＤＬ１−高／ＫＩＲ３ＤＳ１
ＫＩＲ３ＤＬ１−Ｌ      ＫＩＲ３ＤＬ１−低／−低、ＫＩＲ３ＤＬ１−低／−高、又はＫＩＲ３ＤＬ１−低／ＫＩＲ３ＤＳ１
ＫＩＲ３ＤＬ１−Ｎ      ＫＩＲ３ＤＬ１−無／−無、ＫＩＲ３ＤＬ１−無／−高、ＫＩＲ３ＤＬ１−無／−低、又はＫＩＲ３ＤＬ１−無／ＫＩＲ３ＤＳ１
群分けのストラテジー及びプライマーの設計
【００１５】
ＫＩＲ３ＤＬ１−高、−低、−無及びＫＩＲ３ＤＳ１対立遺伝子のそれぞれに特異的な一塩基多型（ＳＮＰ）を含むＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子の領域を増幅するために、本明細書でオリゴヌクレオチドプライマーが提供される。
【００１６】
用語「一塩基多型」は、ゲノム中の単一ヌクレオチドが生物種のメンバー間で異なる場合に生じる核酸配列の変異を示し、当分野でよく理解されている。本発明において、発明者は、ＫＩＲ３ＤＬ１−高、−低、−無及びＫＩＲ３ＤＳ１対立遺伝子のそれぞれに特有であり、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子どうしを区別するＰＣＲ産物を生成するためのプライマーペアのデザインを可能にするようなＳＮＰを同定してきた。
【００１７】
特に、ＳＮＰは、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン３の位置１９３及び２０２、エクソン４の位置６０７、及びエクソン７の位置１０２０、１０２１及び１０２６で同定されている。表１は、ＳＮＰ及びＳＮＰに関連する対立遺伝子群を示す。ヌクレオチドの位置の番号付けは、イントロンの無いタンパク質のコード領域内のヌクレオチドの位置を表している（すなわち、エクソン１における開始コドンのＡＴＧに対するヌクレオチドの番号付けは、Ａ、Ｔ及びＧに対して、それぞれ、１、２及び３である）。
【００１８】
【表１】
2016512682.tif 000002
【００１９】
本開示に従って、用語「無＊００４群」又は「００４無群」は、ＫＩＲ３ＤＬ１無対立遺伝子＊００４、＊０１９、＊０２１、＊０３６、＊０３７、＊０３９、＊０４０、＊０５６、＊０６３及び＊０７２を含む。
【００２０】
用語「低＊００５群」又は「００５低群」は、ＫＩＲ３ＤＬ１低対立遺伝子＊００５、＊０４１、＊０４４及び＊０５３を含む。
【００２１】
用語「高＊００１群」又は「００１高群」は、ＫＩＲ３ＤＬ１高対立遺伝子＊００１、＊０１６、＊０２６、＊０２７、＊０４３、＊０５２、＊０５９、＊０６０、＊０６１、＊０６４、＊０６５、＊０６７及び＊０７５を含む。
【００２２】
用語「高＊００２群」又は「００２高群」は、ＫＩＲ３ＤＬ１高対立遺伝子＊００２、＊００８、＊０１５、＊０２０、＊００６、＊００９、＊０１７、＊０１８、＊０２２、＊０２３、＊０２４Ｎ、＊０２５、＊０２８、＊０２９、＊０３０、＊０３１、＊０３４、＊０３５、＊０３８、＊０５１、＊０５４、＊０５７、＊０６２、＊０６６、＊０７４、＊０７６、及び＊０７７を含む。
【００２３】
用語「低＊００７群」又は「００７低群」は、ＫＩＲ３ＤＬ１低対立遺伝子＊００７、＊０３２及び＊０３３を含む。
【００２４】
用語「ＫＩＲ３ＤＳ１＊０１３群」は、ＫＩＲ３ＤＳ１対立遺伝子＊０１３、＊０４７、＊０１０、＊０１１、＊０１２、＊０１４、＊０４５、＊０４６、＊０４８、＊０４９Ｎ、＊０５０、＊０５５及び＊０５８を含む。
【００２５】
ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン３及び４に存在するＳＮＰが集まると、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子を４つの相互排他的な群に分けることが可能となる：
無＊００４群、
低＊００５群、
高＊００１群、及び
残りの対立遺伝子：高＊０１５群、低＊００７群、及びＫＩＲ３ＤＳ１＊０１３群。
図１及び表１を参照されたい。高＊０１５群及びＫＩＲ３ＤＳ１＊０１３群は、本明細書の以下でさらに説明するように、ＰＣＲ産物のサイズに基づいて区別され得る。＊００７低群は、エクソン６における追加のＳＮＰに基づいて同定され、＊０１５高群とこの群が区別される。
【００２６】
このＳＮＰに基づく群分けストラテジーが与えられると、プライマーが、本明細書で同定されるＳＮＰを標的とするように設計され、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子サブ群の同定を可能にするＰＣＲ産物を生成するためにペアにされる。
【００２７】
用語「プライマー」は、本明細書で使用される場合、核酸ハイブリダイゼーション分析又はポリメラーゼ連鎖反応で使用するために一般的に設計される、合成オリゴヌクレオチドを意味する。
【００２８】
用語「プライマーペア」は、ＰＣＲで使用するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーの組み合わせを意味する。
【００２９】
ＰＣＲでの使用に適したプライマーは、それらの標的ＤＮＡへのプライマーの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする長さを有する必要がある。一般に、本明細書の方法で使用するのに適したプライマーは、少なくとも７、８、９もしくは１０ヌクレオチド、または好ましくは少なくとも１１、１２、１３もしくは１４ヌクレオチド、またはより好ましくは少なくとも１５、１６、１７もしくは１８ヌクレオチドの長さを有する必要がある。１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド以上の長さを有するより長いプライマーも本明細書で使用するのに適している。典型的には、プライマーは、５０ヌクレオチドより長くなく、好ましくは４０、３５、または３０ヌクレオチドより長くない。
【００３０】
本開示に従って、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子について同定されたＳＮＰを標的または選択するように、７個のプライマーをデザインする。「ＳＮＰを標的とするプライマー」とは、ＳＮＰ位置で特定のヌクレオチドを含む核酸は、当該プライマーを使用して増幅し、ＳＮＰ位置で異なるヌクレオチドを有する核酸は、当該プライマーを使用して増幅しないような特定の様式で、プライマーがＳＮＰを含む核酸領域に結合することを意味する。
【００３１】
例えば、第１のプライマーは、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン３で位置１９３のＳＮＰを標的とするリバースプライマーとしてデザインする。位置１９３でＧを有するエクソン３の領域、ｎｕｌｌ＊００４群対立遺伝子に特有のＳＮＰに特異的に結合するように、当該プライマーをデザインする。したがって、当該第１のプライマーをＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子の保存領域に結合するフォワードプライマーと組み合わせると、得られるＰＣＲ産物は、対象においてｎｕｌｌ＊００４群対立遺伝子の存在をポジティブに同定することができる。改善された特異性のために、プライマー配列の３’末端にできるだけ近い、例えば、１〜３ヌクレオチド以内に、ＳＮＰ（Ｇ１９３）を標的とする（または塩基ペアリングする）ヌクレオチドを有するように、当該第１のプライマーをデザインすることができる。特定の実施形態では、当該第１のプライマーは、位置１９３のその３’末端で終了する（すなわち、３’末端塩基のヌクレオチドが位置１９３のＧとペアになる）。いくつかの実施形態では、位置２０２のＡも標的とするように当該第１のプライマーをデザインし、つまり、プライマーはＧ１９３とＡ２０２の両方を含むエクソン３の領域に特異的に結合する。第１のプライマーの例として、例えば、ＣＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＧＡＡＴＧＴＧＧＡＴＴＣＣ（配列番号１３）等の配列ＴＧＴＧＧＡＴＴＣＣ（配列番号１２）を含む任意のプライマーが挙げられる。
【００３２】
第２のプライマーは、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン３で位置１９３のＳＮＰを標的とするフォワードプライマーである。位置１９３でＡを有するエクソン３の領域に特異的に結合するように、当該プライマーをデザインする。Ａ１９３はいくつかの対立遺伝子の下位群（ｌｏｗ＊００５、ｈｉｇｈ＊００１、ｈｉｇｈ＊０１５、ｌｏｗ＊００７およびＫＩＲ３ＤＳ１）の間で共有されるため、追加のＳＮＰを標的とするプライマーは、以下にさらに述べるように、これらの対立遺伝子群を区別するために利用される。第１のプライマーのデザインと同様に、第２のプライマーも、プライマー配列の３’末端にできるだけ近い、例えば、１〜３ヌクレオチド以内に、ＳＮＰ（Ａ１９３）を標的とする（または塩基ペアリングする）ヌクレオチドを有するようにデザインする。特定の実施形態では、当該プライマーは、位置１９３のその３’末端で終了する（すなわち、３’末端塩基のヌクレオチドがＡ１９３とペアになる）。いくつかの実施形態では、位置２０２でＡも標的とするように、第２のプライマーをデザインし、つまり、プライマーはＡ１９３とＡ２０２の両方を含むエクソン３の領域に特異的に結合する。第２のプライマーの具体例として、例えば、ＣＡＡＴＴＴＣＡＴＧＣＴＡＴＡＣＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡ（配列番号１５）等の配列ＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡ（配列番号１４）を含む任意のプライマーが挙げられる。
【００３３】
第３のプライマーは、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン４で位置６０７のＳＮＰを標的とするリバースプライマーである。位置６０７でＴを有するエクソン４の領域に特異的に結合するように当該プライマーをデザインする。第２のプライマー（Ａ１９３を標的とする）とＴ６０７を標的とする第３のプライマーを組み合わせると、このプライマーペアは、＊００５を除いて全群を除外する（ｎｕｌｌ群に対する特異性は、フォーワードプライマー（１９３のＳＮＰ）によってもたらされる）。第１と第２のプライマーのデザインと同様に、第３のプライマーもプライマー配列の３’末端にできるだけ近い、例えば、１〜３ヌクレオチド以内に、ＳＮＰ（Ｔ６０７）を標的とする（または塩基ペアリングする）ヌクレオチドを有するようにデザインする。特定の実施形態では、当該プライマーは、位置６０７のその３’末端で終了する。第３のプライマーの具体例として、例えば、（Ｇ／Ａ）ＧＣＴＧＡＣＡＡＣＴＧＡＴＡＧＧＡ（配列番号１７）およびＧＧＧ（Ｇ／Ａ）ＧＣＴＧＡＣＡＡＣＴＧＡＴＡＧＧＡ（配列番号１８）等の配列ＧＡＴＡＧＧＡ（配列番号１６）を含む任意のプライマーが挙げられる。
【００３４】
第４のプライマーは、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン３で位置１９３および位置２０２のＳＮＰを標的とするフォワードプライマーである。位置１９３のＡおよび位置２０２のＡを有するエクソン３の領域に特異的に結合するように、当該プライマーをデザインする。Ａ１９３とＡ２０２は、ｌｏｗ＊００５とｈｉｇｈ＊００１群間で共有されるため、位置６０７でＳＮＰを標的とするリバースプライマー（以下、第６のプライマー）は、以下にさらに述べるように、これらの対立遺伝子の群を区別するために利用される。プライマー配列の３’末端にできるだけ近い、例えば、１〜３ヌクレオチド以内に、２０２（Ａ２０２）を標的とする（または塩基ペアリングする）ヌクレオチドを有するように、第４のプライマーをデザインする。特定の実施形態では、当該プライマーは、位置２０２のその３’末端で終了する（すなわち、３’末端塩基のヌクレオチドが位置２０２のＡとペアになる）。第４のプライマーの具体例として、例えば、ＧＣＴＡＴＡＣＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡＧＡＡＴＣＣＡＣＡ（配列番号２０）等の配列ＡＧＡＡＴＣＣＡＣＡ（配列番号１９）を含む任意のプライマーが挙げられる。
【００３５】
第５のプライマーはフォワードプライマーであり、エクソン３で位置２０２のＳＮＰを標的とするようにデザインされ、すなわち、当該プライマーは位置２０２のＧを有するＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン３の領域に特異的に結合するようにデザインされる。Ｇ２０２は、ｈｉｇｈ＊０１５、ｌｏｗ＊００７、およびＫＩＲ３ＤＳ１群の間で共有される。したがって、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン７でＳＮＰを標的とするリバースプライマーは、ｌｏｗ＊００７群の対立遺伝子を同定するために利用される。ｈｉｇｈ＊０１５群およびＫＩＲ３ＤＳ１群は、ＰＣＲ産物における異なるサイズに基づいて区別することができる。プライマー配列の３’末端にできるだけ近い、例えば、１〜３ヌクレオチド以内に、２０２（Ｇ２０２）を標的とする（または塩基ペアリングする）ヌクレオチドを有するように第５のプライマーをデザインする。特定の実施形態では、当該プライマーは、位置２０２のその３’末端で終了する（すなわち、３’末端塩基のヌクレオチドが位置２０２のＧとペアになる）。いくつかの実施形態では、位置１９３のＡも標的とするように、第５のプライマーをデザインする。第５のプライマーの具体例として、ＣＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡＧＡＡＴＣＣＡＣＧ（配列番号２２）等の配列ＡＧＡＡＴＣＣＡＣＧ（配列番号２１）を含む任意のプライマーが挙げられる。
【００３６】
第６のプライマーはリバースプライマーであり、エクソン４の位置６０７でＳＮＰを標的とするようにデザインされる。特に、当該第６のプライマーは、位置６０７のＣを含むＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン４の領域に特異的に結合するようにデザインされる。プライマー配列の３’末端にできるだけ近い、例えば、１〜３ヌクレオチド以内に、Ｃ６０７を標的とする（または塩基ペアリングする）ヌクレオチドを有するように当該プライマーをデザインする。特定の実施形態では、当該プライマーは、位置６０７のその３’末端で終了する（すなわち、３’末端塩基のヌクレオチドが位置６０７のＣとペアになる）。いくつかの実施形態では、第６のプライマーは、位置６２４のＴも標的とするようにデザインされる。第６のプライマーの具体例として、例えば、ＡＧＣＴＧＡＣＡＡＣＴＧＡＴＡＧＧＧ（配列番号２４）およびＧＧＧＡＧＣＴＧＡＣＡＡＣＴＧＡＴＡＧＧＧ（配列番号２５）等の配列ＡＣＴＧＡＴＡＧＧＧ（配列番号２３）を含む任意のプライマーが挙げられる。
【００３７】
第７のプライマーはリバースプライマーであり、エクソン７の位置１０２０および１０２１でＳＮＰを標的とするようにデザインされる。当該プライマーは、位置１０２０にＣ、および位置１０２１にＧを有し、並びに、位置１０２６にＧを有してもよいＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子のエクソン７の領域に特異的に結合するようにデザインされる。当該プライマーは、ｌｏｗ＊００７群を、ｈｉｇｈ＊０１５群およびＫＩＲ３ＤＳ１＊０１３群の対立遺伝子と区別するのに有用である。第７のプライマーの例として、例えば、ＧＡＧＧＴＣＣＣＡＡＴＣＡＧＡＡＣＧ（配列番号２７）等の配列ＣＡＧＡＡＣＧ（配列番号２６）を含む任意のプライマーが挙げられる。
【００３８】
プライマーペアリングおよびＰＣＲ反応の性能を可能にするように、追加の有用なプライマーをデザインすることができる。例えば、フォワードプライマーであり、第１のプライマーが結合する領域のＫＩＲ対立遺伝子の上流の保存領域と結合し、ＰＣＲ反応で第１のプライマーと組み合わせて使用される、第８のプライマーもデザインする。ＫＩＲ３ＤＬ１のイントロン６内の保存領域に結合し、ＰＣＲ反応で第７のプライマーと組み合わせて使用される、第９のプライマーをフォワードプライマーとしてデザインする。「保存領域」とは、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子が配列において異ならない、または多形性を示さないＫＩＲ３ＤＬ１の領域を意味する。
【００３９】
他の有用なプライマーとして、ＰＣＲ反応におけるインターナルコントロールとして使用されるものが挙げられる。例えば、ＨＬＡ−ＤＲから６５０ｂｐの領域を増幅するコントロールプライマーを各反応に多重化することができる。
プライマーペアリングおよびＰＣＲ反応
【００４０】
上述のプライマーを以下のようにペアにし、５つのＰＣＲ反応に使用される５つのプライマーペアを提供し、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子の同定を可能にする。
【００４１】
【表２】
2016512682.tif 000003
【００４２】
５つの各反応の条件は、アニーリング温度、伸長時間およびサイクル数によって変化させることができる。反応１〜５に適したアニーリング温度の例は、それぞれ、６６．９、６５．６、６８．５、６４．２、６４．２である。アニーリング温度の許容変動は−０．２５〜＋０．７５℃である。温度は、使用する特定のＰＣＲ装置によって変化し得、機械間で変化し得る電流キャリブレーション、ＤＮＡ調製物の質、またはＴａｑ、ｄＮＴＰおよび特定のＰＣＲ緩衝液等の試薬によって変化し得る。反応１〜５に適した伸長時間の例は、それぞれ、３分３０秒、３分３０秒、３分４５秒、４分、３分４５秒である。反応時間は−３０秒の程度で変化し得、いつまでも長くなった。反応時間は、ＰＣＲ装置の「ランプ速度」（温度間で変化する速度）、ＰＣＲ反応の量およびＤＮＡの質に基づいて変化する。反応１〜５のサイクルの例は、それぞれ、３０、３０、３５、３５、３５である。これらの例は、ＤＮＡを良好に分解するために、最適化されたサイクル数を表す。しかし、サイクル数は−１０〜無制限に変えることができる。サイクル数は入力されたＤＮＡの質および量によって変化させることができ、検出試薬およびイメージング閾値が使用するサイクル数に影響を及ぼし得る。
【００４３】
ＰＣＲ反応を実施するために、ゲノミックＤＮＡを含む試料は、試験対象から採取する。試料は組織または血液試料を含むことができ、これらに限定されないが、血液、血液の画分、末梢血細胞、皮膚または組織生検、口腔拭き取り検体、および臍帯血が挙げられる。いくつかの実施形態では、試料は、ＰＣＲ反応のための鋳型として働くゲノミックＤＮＡを、富化または単離するために処理される。ＫＩＲ３ＤＬ１遺伝子型が周知の対象に由来するゲノミックＤＮＡを対照として使用することができる。
ＰＣＲ反応からの結果に基づいたＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子の同定
【００４４】
本開示に従って、第１のＰＣＲ反応からの増幅産物の検出はＫＩＲ３ＤＬ１ｎｕｌｌ＊００４群対立遺伝子の存在を示し、第２のＰＣＲ反応からの増幅産物の検出は、ＫＩＲ３ＤＬ１＊００５−群の低対立遺伝子の存在を示し、第３のＰＣＲ反応からの増幅産物の検出は、ＫＩＲ３ＤＬ１＊００１−群の高対立遺伝子の存在を示し、第４のＰＣＲ反応からの増幅産物の検出は、ＫＩＲ３ＤＬ１＊０１５−群の高対立遺伝子、ＫＩＲ３ＤＬ１＊００７−群の低対立遺伝子、またはＫＩＲ３ＤＳ１対立遺伝子の一つの存在を示し、第５のＰＣＲ反応からの増幅産物の検出は、ＫＩＲ３ＤＬ１＊００７−群の低対立遺伝子の存在を示す。例えば、約０．６ｋＢのＨＬＡ−ＤＲコントロールバンドを提供するように、コントロールプライマーをデザインすることができ、したがって１．４〜２．１ｋｂで予想されるサイズの産物等の、特定の反応について予想される増幅産物の観察では、その反応について陽性を示す。
【００４５】
反応の結果に基づいた対象における対立遺伝子の同定によって、対象を上述のように、機能群の一つに分類することができる。より具体的には、第１のＰＣＲ反応からの増幅産物の検出は、対象がＫＩＲ３ＤＬ１−Ｎ機能群に割り当てられる場合、ＫＩＲ３ＤＬ１−ｎ（無）対立遺伝子の存在を示す。
【００４６】
第２の反応からの増幅産物の検出は、ＫＩＲ３ＤＬ１−ｌ（低）対立遺伝子の存在を示す。対象が第１の反応についてネガティブである場合、対象をＫＩＲ３ＤＬ１−Ｌ機能群に割り当てる。第２の反応から増幅産物が検出されない場合、第３および第４の反応の結果を評価する。増幅産物が第３のＰＣＲ反応から検出される場合、対象はＫＩＲ３ＤＬ１−ｈ（高）対立遺伝子を発現し、第１、第２、および第５の反応から増幅産物が検出されない場合（すなわち、無または低対立遺伝子についてネガティブである）、対象をＫＩＲ３ＤＬ１−Ｈ機能群に割り当てる。増幅産物が第４の反応から検出される場合、増幅産物のサイズを検討し、長い産物はＫＩＲ３ＤＳ１対立遺伝子の存在を示し、短い産物は第５の反応の結果をさらに評価することになり、第５の反応の増幅産物は、ＫＩＲ３ＤＬ１−ｌ（低）対立遺伝子の存在を示し、対象をＫＩＲ３ＤＬ１−Ｌに割り当て、第５の反応からの産物の欠如は、ＫＩＲ３ＤＬ１−ｈ（高）対立遺伝子の存在を示し、対象をＫＩＲ３ＤＬ１−Ｈに割り当てる。図３は５つの反応の結果に基づいて対象を分類するプロセスを示すフローチャートである。
【００４７】
本発明は上記のプライマーを含むキットも提供する。キットは、プライマーペアリングの指示書を含み、またはプライマーペアが別々の区画に供給され、適切に標識されるように編成することができる。キットはまた、対象をＫＩＲ３ＤＬ１に分類することができるように、ＰＣＲ反応および結果の解釈のための指示書を含むことができる。
【００４８】
ＫＩＲ３ＤＬ１機能群を対象に割り当てる方法も本発明の一部である。当該方法のステップは完全に上述されており、以下の実施例および図３でも説明する。
【００４９】
本明細書に開示したＫＩＲ３ＤＬ１を分類する方法、組成物およびキットは予後の確立に有用である。ＨＬＡが調節解除される疾患、以下に限定されないが、がん、炎症性腸疾患、ＨＩＶ関連病態または感染、サイトメガロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルスおよびインフルエンザは、ＫＩＲ３ＤＬ１およびＨＬＡ−Ｂの化合物アロタイプによる影響を受けている可能性がある。本明細書に開示するＫＩＲ３ＤＬ１を分類する方法、組成物およびキットはまた、急性骨髄性白血病患者のために、同種ＨＣＴについて最も適切な幹細胞ドナーの選択に有用である。
【００５０】
いかなるときも限定するものとして解釈されるべきではない以下の実施例によって、本明細書をさらに説明する。全ての引用文献（参考文献、発行された特許、および本明細書全体で引用される公開特許出願を含む）の内容は、参照により本明細書に明確に援用される。
【実施例】
【００５１】
実施例１
材料と方法
ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子コード配列
ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子コード配列をＥＭＢＬ−ＥＢＩ  ＩＰＤ  ＫＩＲデータベースからダウンロードした。コード配列の入手できる全ての対立遺伝子を本配列比較分析に含め、イントロン領域内で排他的に異なるサブ対立遺伝子をその基準の対立遺伝子を用いて分類した。遺伝子配列比較をＭａｃ  Ｖｅｃｔｏｒソフトウェアバージョン１２．０を用いて行い、配列比較した関連のあるエクソン領域を図１に示す。
【００５２】
群化戦略及びプライマー設計
４２６のドナーのＫＩＲ３ＤＬ１アロタイプをゲノム配列決定（Ｂｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ７１：４３４−４３９（２００８）；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ７６（１）：６４−６（２０１０）；Ｌｅｂｅｄｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，ＨＩＭ  ６８：７８９−７９６（２００７）；Ｌｅｖｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ  ９：２４９−２５８（２００８））によって決定した。このコホートの間では、１１の対立遺伝子が９８％より高い発生頻度の原因であり、したがって、サブ群特異的ＳＮＰの評価において優先された。
【００５３】
ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子サブ群は、それらとＨＬＡ−Ｂｗ４対立遺伝子との相互作用に相関した特長である、Ｚ２７及びＤＸ９抗体が結合する密度に基づいて分類した。無対立遺伝子（＊００４、＊０１９）は細胞内に保持され、いずれの抗体（４）での表面染色によっても検出できない。ＫＩＲ３ＤＬ１の低（＊００５、００７）及び高（＊００１、００２、００８、０１５、０２０）対立遺伝子は、それぞれ高密度と低密度のＤＸ９及びＺ２７抗体の両方と結合する（Ｇａｒｄｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６６：２９９２−３００１（２００１）；Ｙａｗａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３：６３３−６４５（２００６））。そして、ＫＩＲ３ＤＬ１＊０１３で型を表される活性化ＫＩＲ３ＤＳ１対立遺伝子は、Ｚ２７によってのみ弱く結合され、ＤＸ９によっては結合されない（Ｐａｓｃａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７９：１６２５−１６３３（２００７）；Ｔｒｕｎｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７：７８０−７８７（２００７））。
【００５４】
２つの多形性領域は、エクソン３及び４に存在し、一緒になって、ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子を４つの相互排他的な群に区分することを可能にした（図１）。このスキームに基づき、低対立遺伝子の＊００７群を、高対立遺伝子の＊０１５群の間で増幅させた。したがって、第５の反応を発生させて、「低」群対立遺伝子としてそれらを陽性に同定することを可能とした（Ｙａｗａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３：６３３−６４５（２００６））。
【００５５】
低い発生頻度のＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子の表面密度及びシグナル伝達能力は不明である。しかしながら、これらの対立遺伝子が影響したのは本患者コホートの２％未満であり、管理された群割り当ては可能でもなくその理由もなかった。代わりに、残るＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子を、示した領域内で配列類似性に基づいて対立遺伝子群に層別化した（図１）。この方法で低発生頻度の対立遺伝子を区分することにより、それらと高発生頻度対立遺伝子との系統発生的関連と一致した群が得られた（Ｐａｒｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８７：１１−１９（２０１１））。
【００５６】
対立遺伝子サブ群の間で一致した、ＳＮＰを標的とするプライマーのペアを同定し、ＫＩＲ３ＤＬ１に対するそれらの特異性をＮＣＢＩプライマーブラスト（ｂｌａｓｔ）を用いて確認した。０．６ｋｂの対照バンドは、ＨＬＡ−ＤＲの保存領域から誘導し、各反応へと多重化した（表３）（Ｖｉｌｃｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ７５：４１５−４２２（２００７））。
【００５７】
ＰＣＲ反応の最適化
ＰＣＲ条件をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００とＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｅｐＧｒａｄｉｅｎｔサーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）を用いて最適化した。製造者（Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）の指示書に従って、５０ｎｇのＤＮＡを各２５μＬの反応に含め、Ｔａｑポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及びＰＣＲ緩衝液で調製した。対照と対立遺伝子特異的プライマーの濃度を、各反応用に別個に最適化し、最大限の特異性と、一貫性のある対立遺伝子群特異的増幅とを提供した（表３）。ＫＩＲ３ＤＬ１アロタイプがゲノム配列決定（Ｇｉｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０１２））から知られているＤＮＡを用いて、反応条件を最適化した。
【００５８】
結果及び確認
ドナーＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子サブ群の同定を、５つのＰＣＲ反応を用いて達成した（図２）。結果の組合せにより、ドナーに存在する対立遺伝子のそれぞれの対立遺伝子サブ群を同定する。２つ以上の阻害性対立遺伝子を発現する患者では、機能群を階層的排他（ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）で決定することができ、以前の臨床所見に従えば、無の順位が最高で、続いて低、次いで高である（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３９：７３３−７４０（２００７）；Ｇｉｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０１２））。
【００５９】
群定義ＳＮＰによる対立遺伝子の無及び＊００７機能群の同定
ユニークなＧ→Ｔ  ＳＮＰ（位置１９３）に対して選定するリバースプライマーを、ＫＩＲの上流の保存領域を標的とするフォワードプライマーと連結して用いて対立遺伝子の無群を同定した。同様に、低対立遺伝子の＊００７群を、位置１０２０でエクソン７に存在するユニークなＳＮＰを用いて同定した。この短いエクソンに隣接している大きいイントロンのために、保存非コード領域に特異的なプライマーを用いた。群化の優先順位が高密度対立遺伝子よりも低密度対立遺伝子に与えられたことと、＊００７−群対立遺伝子が高と＊００７の両方に陽性反応を起こすものであることを考慮して、無対立遺伝子の不存在下で＊００７を発現すると分かったドナーは、低として分類した。
【００６０】
ＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子の低＊００５及び高機能サブ群の同定
位置２０２及び６０７で低、高、及び３ＤＳ１対立遺伝子の間で重複する相同性は、残っているＫＩＲ３ＤＬ１対立遺伝子サブ群を同定するために単一ＳＮＰを標的とすることを、妨げた。代わりに、本発明者は、フォワードプライマーもリバースプライマーもサブ群特異的ではないが、所与の対立遺伝子群内の対立遺伝子だけが単一反応中の両方のプライマーの標的となる、排他的方法を適用した。
【００６１】
まず、＊００５−群低対立遺伝子の同定は、高、３ＤＳ１、及び００５−群低対立遺伝子に存在するＳＮＰを標的とするフォワードプライマーを利用した。＊００５−群低対立遺伝子に対する特異性を、無及び００５−群低対立遺伝子とハイブリダイズされたリバースプライマーと組み合わせて提供した。
【００６２】
２つの反応を用いて高発現対立遺伝子サブ群を同定する。まず１つ目は、特異性が対立遺伝子の＊００１、＊００５、及び無群と共有されるフォワードプライマーを用いた。全ての高及びＫＩＲ３ＤＳ１対立遺伝子を標的とするリバースプライマーとの組み合わせで、得られた産生物は、高発現対立遺伝子の＊００１群を陽性に同定した。＊０１５群高対立遺伝子及びＫＩＲ３ＤＳ１を、このサブ群に特異的なフォワードプライマーと同じリバースプライマーを一緒に用いて、同定した。エクソン３及び４を離しているイントロンのサイズが活性化及び阻害性対立遺伝子の間で３００ｂｐ違うことにより、ＫＩＲ３ＤＬ１高及びＫＩＲ３ＤＳ１対立遺伝子が、それぞれ１．７及び２．０ｋｂアンプリコンとして容易に識別された。
【００６３】
特異的反応マスターミックス及び条件の例を下に示す。
表３．ＫＩＲ３ＤＬ１機能対立遺伝子サブ群の同定のためのプライマー及び反応条件
５つの反応により、ドナーを無、低、及び高阻害群に割り当てることが可能となる。対照プライマーは、ＨＬＡ−ＤＲに特異的であり、ＰＣＲ反応の厳密性を向上させるために、ＤＮＡ付加対照及び競争反応として各反応の中に多重化される。反応は＊０１５−群高対立遺伝子及びＫＩＲ３ＤＳ１の両方を標的としているが、しかし、これらの対立遺伝子は、大きいイントロンにより活性化対立遺伝子の間で容易に識別される。
【００６４】
【表３】
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【００６５】
【表４】
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【００６６】
【表５】
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【００６７】
【表６】
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【００６８】
【表７】
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【００６９】
【表８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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