(57)【要約】  ＶＩ型コラーゲンα１のＮ末端球状ドメイン内部アミノ酸配列−ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ−（配列番号１）に含まれるエピトープに結合する抗体、ならびに生体試料を前記抗体と接触させることおよび前記抗体の結合量を決定することによる、生体試料において、ＶＩ型コラーゲンα１のＮ末端球状ドメイン内部アミノ酸配列−ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ−（配列番号１）に含まれるエピトープを検出するためのイムノアッセイの方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＩ型コラーゲンα１のエピトープに結合する抗体であって、前記エピトープが、Ｎ末端球状ドメイン内部アミノ酸配列−ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ−（配列番号１）に含まれる、抗体。
【請求項２】
モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体、または抗体断片である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ヒトまたは齧歯類ＶＩ型コラーゲンα１のＮ末端球状ドメイン内部アミノ酸配列−ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ−（配列番号１）に含まれるエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
生体試料中の、ＶＩ型コラーゲンα１のＮ末端球状ドメイン内部アミノ酸配列−ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ−（配列番号１）に含まれるエピトープを検出するためのイムノアッセイの方法であって、ＶＩ型コラーゲンα１の前記Ｎ末端球状ドメイン内部アミノ酸配列−ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ−（配列番号１）に含まれる前記エピトープを含む生体試料を、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体と接触させるステップと、前記抗体の結合量を決定するステップとを含む、方法。
【請求項５】
生体液中の、アミノ酸配列ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ（配列番号１）を含むインタクトなＶＩ型コラーゲンα１およびその断片の量を定量化するために使用される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記生体液が、血清または血漿である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記イムノアッセイが、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記イムノアッセイが、ラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着アッセイである、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
ＶＩ型コラーゲンα１と関連する疾患の重症度を評価するために、前記方法によって決定された、アミノ酸配列ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ（配列番号１）を含むインタクトなＶＩ型コラーゲンα１およびその断片の量を、既知の疾患重症度の標準的な疾患試料と関連付けるステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法によって決定された、前記アミノ酸配列ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ（配列番号１）を含むインタクトなＶＩ型コラーゲンα１およびその断片の量を、ＭＲＩによって決定された筋肉体積と関連付けるステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
生体試料中の、前記アミノ酸配列ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ（配列番号１）を含むインタクトなＶＩ型コラーゲンα１およびその断片の量を決定するためのアッセイキットであって、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体と、
−  ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート
−  ビオチン化ペプチドであるビオチン−Ｌ−ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ（配列番号２）（式中、Ｌは、任意選択のリンカーである）
−  サンドイッチイムノアッセイにおいて使用するための二次抗体
−  前記抗体に結合する、前記配列ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ（配列番号１）またはその一部分を含むキャリブレーターペプチド
−  抗体ビオチン化キット
−  抗体ＨＲＰ標識キット
−  抗体放射性標識キット
−  アッセイ可視化キット
のうちの少なくとも１つとを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＶＩ型コラーゲンα１のエピトープに結合する抗体、ならびにＶＩ型コラーゲンα１を検出および定量化するためのイムノアッセイの方法におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、タンパク質の凝集体を形成する能力を有し、これにより細胞を互いに連結する三次元網目構造の動的な足場を形成する、超分子構造である。この足場が、プロテアーゼの上方調節および下方調節によって、細胞−マトリックス相互作用および細胞の運命を制御する［１］。ＥＣＭは、様々な量および組合せの、コラーゲン、ラミニン、プロテオグリカン、および他の糖タンパク質からなり、これにより、プロテアーゼによって修飾されて特定の機能を有する足場を生成し、個々の組織の必要性を満たすことができる、様々な生体成分をもたらす［２］。
【０００３】
＜コラーゲン＞
細胞外マトリックス中で最も存在量の多いタンパク質は、コラーゲンファミリーのメンバーである。コラーゲンは、細胞外足場形成に寄与する特徴的なフィブリル状構造を有するタンパク質の一群であり、すべての結合組織の主要な構造要素である。また、コラーゲンは事実上すべての実質器官の間質組織において見出され、組織および器官の安定性に寄与し、それらの構造的完全性を維持している。コラーゲンファミリーのすべてのメンバーは、三量体コラーゲン三重らせんの形成に関与する、プロリンに富むトリペプチドＧｌｙ−Ｘ−Ｙの繰返しを含むドメインを含有する。
【０００４】
コラーゲンの分子構造、生合成、構築およびターンオーバーについての知識は、多くのヒト疾患と関連する病理学的過程を理解する上で重要である。様々なコラーゲン型の発現および機能の探求もまた、コラーゲン遺伝子の分子欠損に基づく疾患をよりよく理解することに貢献する。
【０００５】
＜ＶＩ型コラーゲン＞
ＶＩ型コラーゲンは、短い三重らせんドメインと延在した球形末端とを有する３つの異なるα鎖（α−１、α−２、α−３）からなる、ヘテロ三量体である［３］［４］。細胞外マトリックス中への分泌後、ＶＩ型コラーゲンはフィラメントへと凝集し、骨を除く事実上すべての結合組織において、独立したマイクロフィブリル状ネットワークを形成する［５］［６］［７］。ＶＩ型コラーゲンフィブリルは、超微細構造レベルにおいて、微細フィラメント、マイクロフィブリルまたは１１０ｎｍ周期のかすかな横縞を有するセグメントのように見える［７］〜［１２］。対応するＶＩ型コラーゲン遺伝子の欠損は、これまでに広範な先天性筋ジストロフィー表現型、とりわけ、限定されないが、ベスレムミオパチーおよびウールリッヒミオパチーと関連付けられているに過ぎないものの、このことは、筋肉組織における不可欠な役割を示している［１３］。
【０００６】
生体試料においてＶＩ型コラーゲンの量を正確に定量化する方法は、ＶＩ型コラーゲンの病理、または筋肉量もしくは筋肉組織のターンオーバーなどのＶＩ型コラーゲンのターンオーバーに影響を与える生理学的過程について、よりよく理解することを可能にし得る。よって、そのような方法が明らかに求められている。
【０００７】
ＷＯ２０１３／０１１０５６は、生体液においてＶＩ型を含むコラーゲンのネオエピトープを検出および定量化する方法、ならびにこれを使用して病態を評価する方法を開示している。
【０００８】
ＷＯ２０１０／１１５７４９は、イムノアッセイを実施して、ＶＩ型コラーゲンに由来しうる、生体液試料中に天然に存在するネオエピトープ含有タンパク質断片を測定すること、および患者における前記測定値の正常レベルを超えた上昇を、線維症の存在または程度と関連付けることを含む、線維症を診断および定量化する方法を開示している。
【０００９】
ＥＰ２０５１０７３は、とりわけＶＩ型コラーゲンを認識することができるモノクローナル抗体を含む、早期子宮頸部軟化の予測において有用なイムノアッセイの方法およびキットを開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本明細書に記載される発明は、ＶＩ型コラーゲンα１のＮ末端球状ドメイン内部アミノ酸配列−ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ−中のエピトープに対する抗体、ならびにアミノ酸配列−ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ−（配列番号１）を含むインタクトなＶＩ型コラーゲンα１およびその断片を検出およびそれらの量を定量化するためのイムノアッセイの方法に関する。
【００１１】
上記で引用された技術は、いずれも、特定のアミノ酸配列ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ（配列番号１）もしくはその部分配列、または前記配列および／もしくはその部分配列に特異的な抗体を開示していない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
第１の態様では、本発明は、ＶＩ型コラーゲンα１のエピトープに結合する抗体であって、前記エピトープが、Ｎ末端球状ドメイン内部アミノ酸配列−ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ−（配列番号１）に含まれる、抗体に関する。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態では、前記抗体は、ＶＩ型コラーゲンα１のＮ末端球状ドメイン内部アミノ酸配列−ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ−（配列番号１）に含まれるエピトープと特異的に反応する。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態では、前記抗体は、モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体、または抗体断片である。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態では、前記抗体は、ヒトまたは齧歯類ＶＩ型コラーゲンα１のＮ末端球状ドメイン内部アミノ酸配列−ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ−（配列番号１）に含まれるエピトープに結合する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、生体試料において、ＶＩ型コラーゲンα１のＮ末端球状ドメイン内部アミノ酸配列−ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ−（配列番号１）に含まれるエピトープを検出するためのイムノアッセイの方法であって、ＶＩ型コラーゲンα１の前記Ｎ末端球状ドメイン内部アミノ酸配列−ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ−（配列番号１）に含まれる前記エピトープを含む前記生体試料を、本発明の抗体と接触させるステップと、前記抗体の結合量を決定するステップとを含む、方法に関する。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態では、前記イムノアッセイの方法は、生体液において、アミノ酸配列ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ（配列番号１）を含むインタクトなＶＩ型コラーゲンα１およびその断片の量を定量化するために使用され、前記生体液は、限定されないが、血清または血漿であってもよい。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態では、前記イムノアッセイの方法は、限定されないが、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイであってもよい。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態では、前記イムノアッセイの方法は、限定されないが、ラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着アッセイであってもよい。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態では、前記イムノアッセイの方法は、ＶＩ型コラーゲンα１と関連する疾患の重症度を評価するために、前記方法によって決定された、前記アミノ酸配列ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ（配列番号１）を含むインタクトなＶＩ型コラーゲンα１およびその断片の量を、既知の疾患重症度の標準的な疾患試料と関連付けるステップをさらに含む。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態では、前記イムノアッセイの方法は、前記方法によって決定された、前記アミノ酸配列ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ（配列番号１）を含むインタクトなＶＩ型コラーゲンα１およびその断片の量を、ＭＲＩによって決定された筋肉体積と関連付けるステップをさらに含む。
【００２２】
別の態様では、本発明は、生体試料において、アミノ酸配列ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ（配列番号１）を含むインタクトなＶＩ型コラーゲンα１およびその断片の量を決定するためのアッセイキットであって、本明細書において記載される抗体と、
−  ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート
−  ビオチン化ペプチドである、ビオチン−Ｌ−ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ（配列番号２）（式中、Ｌは、任意選択のリンカーである）
−  サンドイッチイムノアッセイにおいて使用するための二次抗体
−  前記抗体に結合する、前記配列ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ（配列番号１）またはその一部分を含むキャリブレーターペプチド
−  抗体ビオチン化キット
−  抗体ＨＲＰ標識キット
−  抗体放射性標識キット
−  アッセイ可視化キット
のうちの少なくとも１つとを含む、キットに関する。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
＜定義＞
「ＩＣ６」は、本明細書に記載されるＶＩ型コラーゲンα１アッセイを、当技術分野において公知のＶＩ型コラーゲンα１アッセイと区別するために使用される。
【００２４】
「抗体」とは、本明細書において使用される場合、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、もしくは、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、もしくはｓｃＦｖ断片などの抗体断片、またはこれらのいずれかの化学的に修飾された誘導体を指す。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ヒト血清、ヒト血漿およびラット血清を使用した競合ＥＬＩＳＡの、較正曲線および阻害を示す。
【図２】４パラメータ数学的フィッティング（ｙ＝（Ａ−Ｄ）／（１＋（ｘ／Ｃ＾Ｂ）＋Ｄ））モデルを使用してプロットされた、ＩＣ６  ＥＬＩＳＡ較正曲線を示す。
【図３】ＭＲＩによって決定された筋肉体積に対してプロットされた、本明細書に記載されるＩＣ６  ＥＬＩＳＡによって決定されたＶＩ型コラーゲンα１を示す。
【実施例】
【００２６】
＜材料および概説＞
実験において使用したすべての試薬は、Ｍｅｒｃｋ（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）およびＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）などの企業による、高水準の化学物質である。モノクローナル抗体の生成および検証のために使用した合成ペプチドは、１）免疫原性ペプチド：ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ−ＧＧＣ−ＫＬＨ（スカシガイヘモシアニン）（配列番号３）、２）スクリーニングペプチド：ビオチン−ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ（配列番号２）、および３）選択ペプチド：ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ（配列番号１）であった。すべての合成ペプチドは、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａから購入したものである。
【００２７】
［実施例１］
＜モノクローナル抗体の生成＞
抗原ペプチドアミノ酸配列を、コンセンサスＶＩ型コラーゲンα１配列（ＮＰ＿００１８３９）から生成した。これはＮ末端球状ドメインに対するものであり、他のヒトタンパク質に対する相同性を最小にするために、および免疫原性の最適化のために選択されたものである。得られたエピトープアミノ酸配列は、ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ（配列番号１）であった。２００μｌの乳化抗原と、スカシガイヘモシアニンにコンジュゲートされた５０μｇのＶＩ型コラーゲンα１エピトープ配列ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ−ＧＧＣ−ＫＬＨ（配列番号３）とを用いて、４〜５週齢Ｂａｌｂ／Ｃマウスを皮下免疫することにより、モノクローナル抗体の生成を惹起した。安定な血清力価レベルに達するまで、２週間ごとに免疫を繰り返した。血液試料を２回目の免疫時に採取した。それぞれの血液サンプリング時に、血清力価を決定し、最大の抗血清力価を有するマウスを融合のために選択した。４回目の免疫後、このマウスを１カ月間休息させ、次いで、細胞融合のための脾臓の摘出の３日前に、１００μｌの０．９％塩化ナトリウム溶液中の５０μｇのＣＯ６−ＭＭＰ（［１４］に記載）を用いて、静脈内で追加免疫処理した。融合手順を、Ｇｅｆｔｅｒら［１５］によって記載されている通りに実施した。簡潔に述べると、マウス脾細胞を、ＳＰ２／０骨髄腫融合パートナー細胞と融合させた。半流動培地法を使用してハイブリドーマ細胞をクローニングし、さらなる増殖のために９６ウェルマイクロタイタープレート中に移し、ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。標準的な限界希釈法を使用して、単クローン性の増殖を促進させた。上清を、ストレプトアビジン被覆プレートを使用した間接ＥＬＩＳＡにおいて、キャリブレーターペプチドおよび天然の材料に対する反応性についてスクリーニングした。ビオチン−ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ（配列番号２）をスクリーニングペプチドとして使用し、同時に遊離ペプチドＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ（配列番号１）をキャリブレーターとして使用して、クローンのさらなる特異性について試験した。
【００２８】
＜クローンの特性評価＞
ペプチドの本来の反応性および親和性を、ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート上に対するビオチン化ペプチド被覆物および増殖中のモノクローナルハイブリドーマ細胞から得られた上清を使用した予備的なＥＬＩＳＡにおいて、ヒト血清、ヒト血漿およびラット血清などの異なる生体材料を使用して評価した。クローンの遊離ペプチド（ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＡＩＳＱ（配列番号１））に対する特異性を試験した。Ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰキット、カタログ番号５３００−０５（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ、ＵＳＡ）を使用して、モノクローナル抗体のアイソタイピングを実施した。選別されたクローンを、製造業者の取扱説明書（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）に従って、プロテインＧカラムを使用して精製した。選別されたモノクローナル抗体を、製造業者（Ｉｎｎｏｖａｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂａｂｒａｈａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）の取扱説明書に従って、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  ｌｉｎｋ  ＨＲＰ標識キットを使用して、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨRP）によって標識した。
【００２９】
＜クローンの選別＞
このサブタイプは、ＩｇＧ１サブタイプであると決定された。ヒト血清、ヒト血漿およびラット血清に対して本来の反応性が見られた（図１）。競合ＥＬＩＳＡのシグナルは、１：２から１：１６までの希釈を使用して阻害された。天然の材料の希釈は、キャリブレーター曲線と同じ希釈パターンに概ね従った。
【００３０】
［実施例２］
ＩＣ６酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
＜ＥＬＩＳＡアッセイの構築／最適化＞
バッファーの種類、被覆物濃度、抗体濃度およびインキュベーション条件を、標準的な方法を使用して最適化した。
【００３１】
＜ＩＣ６  ＥＬＩＳＡプロトコール＞
競合ＩＣ６  ＥＬＩＳＡ手順は、以下の通りであった。Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１９４０２７９による９６ウェルストレプトアビジン被覆ＥＬＩＳＡプレートを、６ｎｇ／ｍｌの被覆物バッファー（２５ｍＭ  ＰＢＳ−ＢＴＢ、ｐＨ７．４）１００μｌ中に溶解させたビオチン化ペプチド：ビオチン−ＡＤＷＧＱＳＲＤＡＥＥＩＡＩＳＱ（配列番号２）で被覆し、暗所において２０℃で３０分間インキュベートし、続いて、洗浄バッファー（２０ｍＭ  トリス、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で洗浄した。その後、２０μｌのペプチドキャリブレーターまたは試料を適当なウェルに添加した後、インキュベーションバッファー（２５ｍＭ  ＰＢＳ−ＢＴＢ、ｐＨ７．４）中に１９０ｎｇ／ｍｌで溶解させた１００μｌのＨＲＰコンジュゲートモノクローナル抗体（実施例１で記載されている）を添加した。プレートを４℃で２０時間インキュベートし、洗浄した。最後に、１００μｌのテトラメチルベンジニジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｄｉｎｉｚｉｎｅ）（ＴＭＢ）（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃカタログ番号：４３８０Ｈ）を添加し、プレートを暗所において２０℃で１５分間インキュベートし、１００μｌの停止溶液（１％  Ｈ２ＳＯ４）を添加することによって反応を停止させた。プレートを、６５０ｎｍを参照として用い、４５０ｎｍにおいてＥＬＩＳＡリーダーで分析した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ、ＣＡ、ＵＳＡ）。４パラメータ数学的フィッティング（ｙ＝（Ａ−Ｄ）／（１＋（ｘ／Ｃ＾Ｂ）＋Ｄ））モデルを使用して、較正曲線をプロットした（図２）。
【００３２】
＜ＩＣ６  ＥＬＩＳＡの技術的評価＞
プールされた血清試料および血漿試料の２倍希釈により、１００％試料の回収の百分率として、直線性を計算した。ラット試料の場合は１：２〜１：８の希釈範囲で、ヒト試料の場合は全範囲（１：１６の低さまで）にわたって、希釈回収率は１００＋／−２０％以内であった（表１）。
【００３３】
【表１】
2016519113.tif 000002
【００３４】
検出下限（ＬＤＬ）を、最低水準（ゼロ水準）の２１の測定値から計算し、平均＋３×標準偏差として計算した。アッセイについての低い方のＬＤＬは、０．０３２ｎｇ／ｍＬであった。アッセイ間変動およびアッセイ内変動を、５つのＱＣ試料による１０回の独立した実験（各実験は、試料について二重の測定値を与える、２回の同一の実験からなる）によって決定した。
【００３５】
【表２】
2016519113.tif 000003
【００３６】
アッセイ間変動およびアッセイ内変動は、それぞれ平均で１１．７５％および１１．０５％であった。各アッセイについて、較正のために、アミノ酸分析によって正確に定量化された合成ペプチドから調製された、マスターキャリブレーターを使用した。分析物安定性を、６つの血清試料（３つはラットで３つはヒト）に対して、１０回の凍結解凍サイクルについて決定した。分析物の安定性は、４回の連続する凍結／解凍サイクルに対して、１００＋／−２０％以内で許容可能であることが見出された。
【００３７】
［実施例３］
＜ＩＣ６  ＥＬＩＳＡ対筋肉体積評価＞
１０人の男性（表３）から血清試料を採取し、本明細書に記載された競合ＩＣ６  ＥＬＩＳＡを使用して、ＶＩ型コラーゲンα１エピトープ濃度を決定した。
【００３８】
【表３】
2016519113.tif 000004
【００３９】
ＭＲＩを使用して同じ１０人の男性のそれぞれの筋肉体積を決定し、これらの結果を、上記で決定された、ＩＣ６  ＥＬＩＳＡによって評価されたＶＩ型コラーゲンα１エピトープ濃度に対してプロットした（図３）。ＶＩ型コラーゲンα１エピトープ濃度は、筋肉体積と統計的に有意な相関を示した（Ｒ２＝０．６５２３、ｐ＝０．００４５）。
【００４０】
この明細書において、明示的に別の指示がなされない限り、「または」という単語は、述べられている条件のうちの一方のみを満たすことが必要とされる「排他的論理和」という演算子とは異なり、その条件のいずれかまたは両方を満たす場合に真値を返す演算子の意味で使用される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を意味するのではなく、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の意味で使用される。上記で事実と認められたすべての先行する教示は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において、いずれかの先行する公開文献を事実と認めることは、その教示が出願日においてオーストラリアまたは他の地域で技術常識であったことを認めるまたは表現していると解釈されるべきではない。
【００４１】
［文献］
【表４Ａ】
2016519113.tif 000005
【表４Ｂ】
2016519113.tif 000006
【表４Ｃ】
2016519113.tif 000007
【図１】
2016519113.tif 000008
【図２】
2016519113.tif 000009
【図３】
2016519113.tif 000010
【配列表】
2016519113000001.app
【国際調査報告】
2016519113.tif 000011
2016519113.tif 000012
2016519113.tif 000013
2016519113.tif 000014