(57)【要約】  本発明は、新型ビンブラスチン誘導体及びその新型応用、並びにその調製方法を提供する。前記ビンブラスチン誘導体は、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物と、ビンブラスチン類ジペプチド誘導体とを含む。前記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物は、ビンブラスチン類化合物又はその塩とヒドラジン水和物を反応し得た化合物であり、前記ビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物とＮ−ベンジルオキシカルボニル−グリシル−プロリンを縮合し得た化合物である。本発明は、さらに、前記ビンブラスチン誘導体又はその薬物組成物の、抗腫瘍、糖尿病性網膜症と関節リウマチの予防又は治療における応用、又は血管新生阻害剤又は血管遮断剤としての応用を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビンブラスチン類ジペプチド誘導体が、以下に示されるＢＸ−ＣＣＸＪ、ＢＸ−ＣＣＪ、ＢＸ−ＣＣＲＢ又は ＢＸ−ＣＣＦＮ
【化１】
2016511251.tif 000027
であり、Ｚ−ＧＰ−は、下記の構造
【化２】
2016511251.tif 000028
を有するベンジルオキシカルボニル−グリシル−プロリンを表す、ビンブラスチン類ジペプチド誘導体又はその生理学的に許容される塩。
【請求項２】
請求項１に記載の前記ビンブラスチン類ジペプチド誘導体の調製方法であって、
（１）ビンブラスチン類化合物又はその塩をヒドラジン水和物と反応させ、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物を得るステップと、
（２）ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物とベンジルオキシカルボニル−グリシル−プロリンを、カップリング剤の作用下に反応させ、前記ビンブラスチン類ジペプチド誘導体を得るステップと、を含み、
前記ビンブラスチン類化合物は、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンフルニン、ビノレルビン、又はそれらの塩であり、前記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物は、下記に示されたＪＪ−ＣＣＸＪ、ＪＪ−ＣＣＪ、ＪＪ−ＣＣＲＢ、又はＪＪ−ＣＣＦＮ
【化３】
2016511251.tif 000029
2016511251.tif 000030
である調整方法。
【請求項３】
前記カップリング剤は、クロロギ酸エチル、１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート及び１−クロロ−Ｎ，Ｎ’，２−トリメチルプロペから選択された一種又は一種以上の混合物であることを特徴とする請求項２に記載の調製方法。
【請求項４】
以下に示されるＪＪ−ＣＣＸＪ又はＪＪ−ＣＣＦＮ
【化４】
2016511251.tif 000031
であるヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物、又はその生理学的に許容される塩。
【請求項５】
ビンブラスチン誘導体の抗腫瘍薬物の調製における応用であって、
前記ビンブラスチン誘導体は、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物、ビンブラスチン類ジペプチド誘導体、又はそれらの生理学的に許容される塩であり、
前記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物は、請求項４に記載のヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物であり、
前記ビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、請求項１に記載のビンブラスチン類ジペプチド誘導体であり、
前記腫瘍は、胃癌、肺癌、上咽頭癌、乳癌、結腸癌、肝臓癌、白血病、リンパ腫、前立腺癌、子宮頸癌、黒色腫、卵巣癌、神経芽細胞腫、上咽頭癌、ウィルムス腫瘍、又は多剤耐性腫瘍であることが好ましい、応用。
【請求項６】
請求項１に記載のビンブラスチン類ジペプチド誘導体又はその生理学的に許容される塩の、腫瘍の間質性線維芽細胞活性化プロテアーゼα（ＦＡＰα）の特有な加水分解基質の薬物の調製における応用であることを特徴とする請求項５に記載の応用。
【請求項７】
ビンブラスチン誘導体の、糖尿病性網膜症又は関節リウマチの治療又は予防用薬物の調製における応用であって、
前記ビンブラスチン誘導体は、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物、ビンブラスチン類ジペプチド誘導体、又はそれらの生理学的に許容される塩であり、
前記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物は、ＪＪ−ＣＣＦＮ、ＪＪ−ＣＣＪ、ＪＪ−ＣＣＲＢ、ＪＪ−ＣＣＸＪ、又はそれらの生理学的に許容される塩から選択され、
前記ビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、請求項１に記載のビンブラスチン類ジペプチド誘導体である、応用。
【請求項８】
ビンブラスチン誘導体の、血管新生阻害剤又は血管遮断剤として用いられる薬物の調製における応用であって、
前記ビンブラスチン誘導体は、ＪＪ−ＣＣＦＮ、ＪＪ−ＣＣＪ、ＪＪ−ＣＣＲＢ、ＪＪ−ＣＣＸＪ、ＢＸ−ＣＣＪ、 ＢＸ−ＣＣＦＮ、ＢＸ−ＣＣＲＢ、ＢＸ−ＣＣＸＪ、又はそれらの生理学的に許容される塩から選択される、応用。
【請求項９】
前記生理学的に許容される塩は、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩、酒石酸塩、又はクエン酸塩であることを特徴とする請求項１〜８の何れか１項に記載の応用。
【請求項１０】
請求項１に記載のビンブラスチン類ジペプチド誘導体又はその生理学的に許容される塩、あるいは請求項４に記載のヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物又はその生理学的に許容される塩を含むことを特徴とする薬物組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新型ビンブラスチン類誘導体及びその製造方法、並びにその応用に関し、医薬分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
血管の新生は、各方面で緊密に調節されたプロセスである。成熟した哺乳類の生物において、生理的血管は、卵巣、子宮又は又は胎盤中にだけ存在し、その他の組織には血管が新生後に高い安定性を維持し、数多くの正と負の調節因子により規制され、よって動的平衡状態を維持する。病理学上の血管新生は、創傷治癒、又は悪性腫瘍、糖尿病性網膜症及び関節リウマチ等疾患の治療プロセスにかかる（Ｐｅｔｅｒ Ｂ, ｅｔａｌ. ＣｕｒｒＯｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ,２００５,１５: １０２−１１１）。
【０００３】
２０世紀７０年代初頭に、Ｊｕｄａｈ  Ｆｏｌｋｍａｎ は、悪性腫瘍の成長、転移がいずれも腫瘍血管の新生と密切に関連し、多くの腫瘍は直径２〜３ｍｍにまで成長したら栄養と酸素とを供給するのに新生血管が必要となる（Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ. Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ, １９７１, ２８５: １１８２−１１８６）ことを、最初に提案した。腫瘍組織と比較すれば、正常組織の血管内皮細胞は、静止状態となっていて、血管が成熟し安定している。但し、腫瘍組織の血管細胞は、素早く増殖し、血管グレーディングが不規則となり、ネットワークが混乱しているいるなどの特徴がある（Ｄｉｅｔｍａｒ Ｗ, ｅｔ ａｌ. Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ, ２０１１, ３７: ６３−７４）。従って、腫瘍の血管システムは、とても重要な治療標的となっている。現在、多くの文献によれば、血管標的剤を血管新生阻害剤（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｄｒｕｇｓ又はａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ＡＩｓ）と血管遮断剤（ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ，ＶＤＡｓ）（Ｐａｔｈｅｒｓｏｎ ＤＭ, ｅｔ ａｌ. Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ （Ｒ Ｃｏｌｌ Ｒａｄｉｏ１）, ２００７, １９: ４４３−４５６）に分けられる傾向がある。ＡＩｓは、主に基質の分解を抑制し、血管新生因子の活化を抑制し、また腫瘍血管内皮細胞の増殖に影響する（Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ. Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ. ２００７, ６: ２７３−２８６）等の方式で、腫瘍の血管新生を抑制する。大量の臨床データで確認されたように、ＡＩｓは血管の新生を抑制することで腫瘍の悪化を有効に抑制することができ、腫瘍転移の発生を有効に減らすことができる（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ Ｇ, ｅｔ ａｌ. Ｎａｔ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ Ｏｎｃｏｌ. ２００５, ２: ５６２−５７７）。そして、ＶＤＡｓは、既に形成した腫瘍血管を高速、大規模にダメージを与え、腫瘍内部虚血で大面積を壊死させ、それにより腫瘍の成長を抑制することができる（ Ｐｈｉｌｉｐ ＥＴ. Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ, ２００４, １０: ４１５−４２７）。従って、腫瘍血管新生を抑制することと、形成した腫瘍血管にダメージを与えることは、抗腫瘍薬物の研究開発の有効な戦略となってきた。
【０００４】
糖尿病性網膜症は、糖尿病の一種深刻な合併症であり、真剣に糖尿病患者の生活の質に影響を与える（Ｍａｌｏｎｅ ＪＩ, ｅｔ ａｌ. Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ, ２００１, ２４: ５２２−５２６; Ｒａｍａｖａｔ ＰＲ, ｅｔ ａｌ. Ｊ Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｒｅｓ, ２０１３, ７: １３８７−１３９０）。現在、糖尿病性網膜症の確実な原因はまだ完全に明らかではないが、網膜新生血管の形成が疾患の過程に関与することが記載されている（Ｊａｅ ＳＹ, ｅｔ ａｌ. Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｔａｂ Ｊ, ２０１３, ３７: ２６２−２６９）。近年では，ベバシズマブは、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）受容体拮抗薬として、糖尿病性網膜症患者の網膜血管の新生の治療に用いられることが臨床上において見出され、そして、一定の効果を達成した（Ｚｈａｏ ＬＱ, ｅｔ ａｌ. Ｂｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ, ２０１１, ９５: １２１６−１２２２）。しかし、ＶＥＧＦ受容体拮抗薬は、糖尿病性網膜症患者の網膜血管の新生を完全に抑制することができなかった（Ｗａｔａｎａｂｅ Ｄ, ｅｔ ａｌ. Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ, ２００５, ３５３: ７８２−７９２）。よって、糖尿病性網膜症をより効果的に抑制できる薬物を見つけることは、重要である。
【０００５】
その一方、関節リウマチは、自身免疫性疾患であり、慢性滑膜炎と軟骨の侵食との合併によって、最終的に骨と関節の破壊を特徴とする難治疾患に繋がった。関節リウマチの病因はいまだに完全に解明されていなく、有効な治療法もない。炎症性細胞浸潤と伴い滑膜血管新生することは、関節リウマチ血管翳形成と関節ダメージの重要な病理上特徴であると報告された（Ｌｉｏｔe Ｆ. Ｒｅｖ Ｐｒａｔ, １９９３, ４３: ２２３９−２２４５; Ｒｏｃｃａｒｏ ＡＭ, ｅｔ ａｌ. Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｉｎｆｌａｍｍ Ａｌｌｅｒｇｙ, ２００５, ４: ２７−３０; Ｈｉｒｏｈａｔｓ Ｓ, ｅｔ ａｌ. Ｌａｎｃｅｔ, １９９９, ３５３:１３３１−１３３４）。関節リウマチ患者の滑膜血管新生を抑制することは、現在関節リウマチの効果的な治療戦略の一つとなっている。
【０００６】
ビンブラスチン類化合物は、キョウチクトウ植物であるツルニチニチソウから分離し得たビンブラスチン及びビンクリスチン、並びにそれらの誘導体ビノレルビンとビンフルニンを含み、それらは、ビスインドールアルカロイドに属する。ビンブラスチン（ＶＬＢ）とビンクリスチン（ＶＣＲ）は、天然起源のビスインドールアルカロイドである（Ｂｅｅｒ ＭＴ. Ｂｒ Ｅｍｐ Ｃａｎｃｅｒ Ｃａｍｐａｉｇｎ, １９５５, ３３: ４８７−４８９; Ｇｏｒｍａｎ Ｍ, ｅｔ ａｌ. Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ, １９５９, ８１: ４７４５−４７４６）。薬理作用の研究に示されるように、ビンブラスチン及びその類似物又は誘導体は、細胞毒性薬物に属し、主に、チューブリンの重合を抑制し、紡錘体微小管の形成を阻害し、細胞核の分裂を中期に沈滞させる（Ｏｌｍｓｔｅｄ Ｊ Ｂ, ｅｔ ａｌ. Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ,１９７３, ４２: ５０７−５０９）。ビンブラスチン及びその誘導体は、広域スペクトラム抗腫瘍活性を有し，臨床上に主にホジキン病、絨毛上皮腫の治療に用いられ、急性白血病、乳癌、卵巣癌、精巣癌、頭頸部癌、口腔咽頭癌、単球性白血病に対しても一定的な治療有効性を有する（Ｗｉｌｓｏｎ Ｌ. Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ,１９７５, ２５３: ２１３−２１４）。近年では、Ａｎｇｅｌｏ Ｖａｃｃａ らの研究に見出したように、非毒性量のビンブラスチンは細胞程度で血管の新生を有意に抑制することができる（Ａｎｇｅｌｏ Ｖ, ｅｔ ａｌ. Ｂｌｏｏｄ, １９９９, ９４: ４１４３−４１５５）。Ｇｉａｎｎｏｕｌａ Ｋｌｅｍｅｎｔらの研究に表明されているように、継続的に低用量のビンブラスチンを投与すると、腫瘍血管の新生を抑制することができる （Ｇｉａｎｎｏｕｌａ Ｋ, ｅｔ ａｌ. Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ, ２０００, １０５: Ｒ１５−２４）。Ｊａｍｅｓ Ｍｏｏｒｅらによれば、ビンクリスチンは腫瘍新生血管の成長を抑制することができると証明した（Ｊａｍｅｓ Ｍ, ｅｔ ａｌ. Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｓｕｒｇ, ２００１, ３６: １２７３−１２７６）。その一方、Ａｎｎａ Ｋｒｕｃｚｙｎｓｋｉａ らの研究によれば、ビンフルニンは制腫瘍血管の新生を抑制すると共に、新生した腫瘍血管にダメージを与えることもでき、実験性悪性腫瘍の転移に対しても有意な抑制作用を有することを証明した。（Ａｎｎａ Ｋ, ｅｔ ａｌ. Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ, ２００６, ４２: ２８２１−２８３２）。しかしながら、ビンブラスチン類化合物の糖尿病性網膜症及び関節リウマチ等方面の応用と研究について、いまだに報告されていない。
【０００７】
多くの臨床上において使用される化学療法薬物と同様に、ビンブラスチン類薬物は、疾患治療過程において、多くの深刻な副作用を現し、例えば、骨髄抑制、筋肉痛、及び悪性嘔吐などの副作用（Ｍａｇｎｕｓ Ｐ, ｅｔ ａｌ. Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，１９８７, １０９: ７９２９−７９３０）により、その臨床上の適用が極めて制限された。該類薬物の副作用を軽減するための一つの有効な方法として、該薬物について構造修飾して前駆体薬物にし、腫瘍組織と正常組織との間の分子生物学差を利用して、病変の標的細胞上の遺伝子、酵素、又はシグナル伝達因子に選択的に作用させ、標的療法の目的を達成させる。近年では、大量の研究により示されるように、線維芽細胞活性化プロテアーゼα（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ α, ＦＡＰα）は、カルスと９０％以上の腫瘍組織に活性化された線維芽細胞及び周皮細胞表面（Ｔｅｒｅｓａ ＲＭ, ｅｔ ａｌ. Ｏｎｃｏｇｅｎｅ, ２００４, ２３: ５４３５−５４４６）に特異的に発現し、骨関節炎の軟骨細胞表面にも（Ｊｅｎｎｉｆｅｒ ＭＭ, ｅｔ ａｌ. Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ, ２００６, ８: Ｒ２３）発現し、硝子体網膜症組織の筋線維芽細胞表面にも有意に発現する（Ｊｅｎｎｉｆｅｒ ＭＭ, ｅｔ ａｌ. Ａｃｔａ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ, ２０１１, ８９: １１５−１２１）。そのため、本発明は、標的性、弱毒化、効率アップの目的を達成するために、ビンブラスチン類化合物を化学的に修飾して酵素活性化前駆体薬物とした。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ビンブラスチン類薬物のターゲティングを達成し、従来技術における該類薬物が有する不利点で深刻な副作用を克服し、該薬物の有効性を改善するために、本発明は、新型ビンブラスチン誘導体（ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物とビンブラスチン類ジペプチド誘導体を含む）及びその生理学的に許容される塩を提供し、具体的な発明技術案は下記のとおりである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ビンブラスチン類ジペプチド誘導体又はその生理学的に許容される塩を提供し、その中、前記ビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、下記のように示される、それぞれＢＸ−ＣＣＸＪ、ＢＸ−ＣＣＪ、ＢＸ−ＣＣＲＢ又はＢＸ−ＣＣＦＮと称する構造から選ばれる一種である。
【００１０】
【化１】
2016511251.tif 000002
その中、Ｚ−ＧＰ−は、下記に表示された構造を有するベンジルオキシカルボニル−グリシル−プロリンである：
【化２】
2016511251.tif 000003
【００１１】
本発明は、上記ビンブラスチン類ジペプチド誘導体の調製方法を提供する。その合成ルートは、下記のとおりであるである：
【化３】
2016511251.tif 000004
【００１２】
具体的に、下記のステップを含む： 
Ｓ１：ビンブラスチン類化合物又はその塩を有機溶剤に溶解してからヒドラジン水和物を添加して、暗所、窒素下で１０〜６０時間撹拌しながら加熱反応させ、反応温度は４０℃〜１２０℃の範囲内にコントロールして、反応終了後に分離と精製とを行って、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物（Ｒ−ＮＨＮＨ２）を得た。 
Ｓ２：ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物（Ｒ−ＮＨＮＨ２）、ベンジルオキシカルボニル−グリシル−プロリン（Ｚ−ＧＰ−ＯＨ）及びカップリング剤を、−１０℃〜５０℃下、暗所で攪拌しながら反応させ、反応終了後に水を加えてクエンチしてから分離と精製とを行って、ビンブラスチン類ジペプチド誘導体（Ｚ−ＧＰ−ＮＨＮＨ−Ｒ）を得た。
【００１３】
好ましい実施態様として、Ｓ１において、前記ヒドラジン水和物は、４０ｗｔ％〜８０ｗｔ％のヒドラジン水和物であり、前記ビンブラスチン類化合物とヒドラジン水和物とのモル配合比は、１:５〜１２００である。Ｓ１において、前記有機溶剤は、メタノールである。
【００１４】
好ましい実施態様として、Ｓ２中の前記カップリング剤は、クロロギ酸エチル、１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）、Ｎ,Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１Ｈ−ベンゾトリアゾール-１-イルオキシトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢＯＰ）、及び１−クロロ−Ｎ，Ｎ’，２−トリメチルプロペから選ばれた一種又は一種以上の混合物である。
【００１５】
好ましい実施態様として、Ｓ２中のヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物、ベンジルオキシカルボニル−グリシル−プロリン（Ｚ−ＧＰ−ＯＨ）、及びカップリング剤の配合モル比は、１:１.０５〜３.０:１.０５〜３.０である。
【００１６】
その中、前記ビンブラスチン類化合物は、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンフルニン、ビノレルビン、又はそれらの塩であり、前記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物は、下記に示されたＪＪ−ＣＣＸＪ、ＪＪ−ＣＣＪ、ＪＪ−ＣＣＲＢ又はＪＪ−ＣＣＦＮである。
【化４】
2016511251.tif 000005
【００１７】
本発明のその他の目的は、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物又はその生理学的に許容される塩を提供することであり、前記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物は、上記に示されたＪＪ−ＣＣＸＪ、ＪＪ−ＣＣＪ、ＪＪ−ＣＣＲＢ又はＪＪ−ＣＣＦＮである。
【００１８】
本発明は、前記ビンブラスチン類ジペプチド誘導体からなるビンブラスチン類ジペプチド誘導体の生理学的に許容される塩の調製方法を提供する。
【００１９】
好ましい実施態様として、前記ビンブラスチン類ジペプチド誘導体の生理学的に許容される塩は、表１から選ばれた何れか一種の塩である：
【表１】
2016511251.tif 000006
【００２０】
本発明の前記ビンブラスチン類ジペプチド誘導体又はその生理学的に許容される塩は、医薬品用とする場合、遊離状態で存在することができる。
【００２１】
前記ビンブラスチンジペプチド誘導体又はその生理学的に許容される塩の調製方法であって、ビンブラスチン類ジペプチド誘導体を、１.０５〜３.０モル量の酸（ＨＡ）を含有する有機溶剤に溶解し、−１０℃〜４０℃温度で攪拌しながら３〜２０時間反応させ、固体化合物を分離し洗浄した後に、固体化合物を再度に水に溶解し凍結乾燥して製品を得ることが特徴とする。
【００２２】
好ましい実施態様として、前記酸は、塩酸、硫酸、酢酸、酒石酸、又はクエン酸であり、前記有機溶剤は、メタノールとジクロロメタンとの体積比1：1の溶液である。
【００２３】
本発明は、前記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物、ビンブラスチン類ジペプチド誘導体又はその生理学的に許容される塩の、抗腫瘍薬物の調製における応用を提供し、好ましくは、前記腫瘍は、胃癌、肺癌、上咽頭癌、乳癌、結腸癌、肝臓癌、白血病、リンパ腫、前立腺癌、子宮頸癌、黒色腫、卵巣癌、神経芽細胞腫、上咽頭癌、ウィルムス腫瘍、又は多剤耐性腫瘍である。
【００２４】
本発明は、前記ラジン分解ビンブラスチン類化合物、ビンブラスチン類ジペプチド誘導体又はその生理学的に許容される塩の、糖尿病性網膜症又は関節リウマチの予防又は治療用薬物の調製における応用を提供する。
【００２５】
本発明は、前記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物、ビンブラスチン類ジペプチド誘導体又はその生理学的に許容される塩の血管新生阻害剤又は者血管遮断剤の薬物の調製における応用を提供する。
【００２６】
本発明は、薬物組成物を提供し、当該薬物組成物は、前記ビンブラスチン類ジペプチド誘導体又はその生理学的に許容される塩、又は前記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物又はその生理学的に許容される塩を含む。
【００２７】
その中、前記生理学的に許容される塩は、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩、酒石酸塩、又はクエン酸塩である。
【００２８】
前記応用では、前記ビンブラスチン類ジペプチド誘導体がＦＡＰα特有な加水分解の基質とすることが好ましい。
【発明の効果】
【００２９】
従来技術と比較すれば、本発明は、以下の効果を奏する：
（１）本発明のビンブラスチン類ジペプチド誘導体によれば、正常細胞毒性及び体内毒性をかなり減らすことができ、また体内外において、ＦＡＰα酵素による特有な加水分解でジペプチド部分（Ｚ−ＧＰ）を切除し、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物をリリースすることができる。
（２）前記ビンブラスチン誘導体は、種々の腫瘍細胞株の体外増殖、及び担癌マウスの体内腫瘍の成長をかなり抑制することができる。
（３）本発明の前記ビンブラスチン誘導体は、新しい血管新生の抑制作用及び既に形成した新生血管のダメージ作用を有する。
（４）本発明の前記ビンブラスチン誘導体は、ＨＵＶＥＣｓ細胞の侵害能力、転移能力、及びＨＵＶＥＣｓルーメンの形成に対して良好な抑制作用を有し、角膜マイクロポケット血管新生、滑膜血管新生、及び以及マトリゲル塞栓モデル血管新生などについても良好な抑制作用を有する。また、既に形成されたＨＵＶＥＣｓルーメン、角膜マイクロポケット血管、滑膜血管、及びマトリゲル栓塞血管に対して、ダメージ作用を有する。
（５）体内外で薬効試験結果に示されたように、本発明の前記ビンブラスチン誘導体は、悪性腫瘍、糖尿病性網膜症、及び関節リウマチなど疾患の治療また予防に応用することができる。特に、本発明は、前記ビンブラスチン誘導体が悪性腫瘍、糖尿病性網膜症及び関節リウマチ等疾患の治療また予防に応用される場合、ビンブラスチン類化合物と比較すれば、より良好な薬理効果を有し、両者の差が有意差であることを見出した。
（６）本発明の合成方法は、穏やかな反応条件、簡単な実験プロセス、高収率、高製品純度、経済実用など特徴を有する。特に、本発明の前記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物は、前記ビンブラスチン類ジペプチド誘導体の合成中間体とすることができるだけではなく、その自身も良好な生理学的活性を有し、活性成分としてかかる薬物の調製に応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、組み換えヒトＦＡＰαのビンブラスチン類ジペプチド誘導体に対する酵素加水分解効率を示す図である。
【図２】図２は、腫瘍組織ＦＡＰαのビンブラスチン類ジペプチド誘導体に対する酵素加水分解効率を示す図である。
【図３】図３は、ビンブラスチン誘導体のＨＵＶＥＣｓ細胞の侵害能力に対する抑制作用を示す図である。
【図４】図４は、ビンブラスチン誘導体のＨＵＶＥＣｓ細胞転移能力に対する抑制作用を示す図である。
【図５】図５は、ビンブラスチン誘導体のＨＵＶＥＣｓルーメン形成に対する抑制作用を示す図である。
【図６】図６は、ビンブラスチン誘導体の既に形成したＨＵＶＥＣｓルーメンに対するダメージ作用を示す図である。
【図７】図７は、ビンブラスチン誘導体の鶏胚漿尿膜血管増殖に対する抑制作用を示す図である。
【図８】図８は、ビンブラスチン誘導体の既に形成した鶏胚漿尿膜血管に対するダメージ作用を示す図である。
【図９】図９は、ビンブラスチン誘導体のラット胸部大動脈環微小血管新生に対する抑制作用を示す図である。
【図１０】図１０は、ビンブラスチン誘導体の既に形成したラット胸部大動脈環微小血管に対するダメージ作用を示す図である。
【図１１】図１１は、ビンブラスチン誘導体のマトリゲル塞栓モデル血管新生に対する抑制作用を示す図である。
【図１２】図１２は、ビンブラスチン誘導体の既に形成したマトリゲル塞栓モデル血管に対するダメージ作用を示す図である。
【図１３】図１３は、ビンブラスチン誘導体のラット角膜マイクロポケット血管新生に対する抑制作用を示す図である。
【図１４】図１４は、ビンブラスチン誘導体の既に形成したラット角膜マイクロポケット血管に対するダメージ作用を示す図である。
【図１５】図１５は、ビンブラスチン誘導体のＣＩＡマウス滑膜血管の新生に対する抑制作用を示す図である。
【図１６】図１６は、ビンブラスチン誘導体の既に形成したＣＩＡマウス滑膜血管に対するダメージ作用を示す図である。その中、図３−１６において、*は、Ｐ<０.０５を表し、**は、Ｐ<０.０１を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、具体的な実施例を参考しながら、本発明をさらに詳しく説明する、但し、本発明は、下記の実施態様に限られるものではない。
【００３２】
実施例１  ビンブラスチン誘導体の調製及び分離と精製
１.１.１  ビンブラスチンのヒドラジン分解：ビンブラスチン硫酸塩１８２ｍｇ（０.２ｍｍｏｌ）を秤量し、３５ｍＬの厚肉耐圧配管に入れて、８ｍＬのメタノールと０.９ｍＬの８０％ヒドラジン水和物（２３ｍｍｏｌ）を加えた。先に、５ｍｉｎ間超音波をかけて、溶液中に含まれる空気を除去するために窒素を充填してからプラグを差し込んた。そして、アルミホイルで包んで光を遮断して、６０℃のオイルバスにいれて２４ｈ攪拌しながら反応させた。反応終了後に水を添加し希釈して，ジクロロメタン（ＤＣＭ）にて数回抽出して、有機相を合併して、水と飽和ＮａＣｌ溶液にて順番に洗浄して、無水Ｎａ２ＳＯ４により乾燥させてから、減圧により溶剤を蒸発させた。得られた混合物をＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相分取高速液体クロマトグラフィー）によって分離と精製とをして（移動相として、ＭｅＯＨ:Ｈ２Ｏ:Ｅｔ３Ｎ＝７０:３０:０.００５，Ｖ/Ｖ/Ｖ），薄黄色粉末状固体化合物１１６ｍｇを得た。収率は７６.１％であった。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３） δ: ８.１９（ｓ, １Ｈ）, ８.０３（ ｓ, １Ｈ）, ７.５１ （ｄ, Ｊ ＝ ９.０Ｈｚ, １Ｈ）, ７.０７〜７.２２（ｍ, ３Ｈ）, ６.５４（ｓ, １Ｈ）, ６.０９ （ｓ, １Ｈ）, ５.７４〜５.８８（ｍ, ２Ｈ）, ４.１３（ｍ, ２Ｈ）, ３.８４〜４.００ （ｍ, ３Ｈ）, ３.７８（ｓ, ３Ｈ）, ３.６０（ｓ, ３Ｈ）, ３.４５〜３.５６ （ｍ, ２Ｈ）, ３.３４ （ｄ, Ｊ ＝ ６.０ Ｈｚ, １Ｈ）, ３.２９（ｄ, Ｊ ＝ ６.０Ｈｚ, １Ｈ）, ３.１２〜３.２７（ｍ, ３Ｈ）, ２.８１〜２.９３（ｍ, ３Ｈ）, ２.７８（ｓ, ３Ｈ）, ２.６１ （ｓ, １Ｈ）, ２.３９〜２.５４ （ｍ, ３Ｈ）, ２.２６〜２.３８ （ｍ, ２Ｈ）, １.９４〜２.０８（ｍ, ２Ｈ）, １.６４〜１.８０（ｍ, ４Ｈ）, １.４３〜１.５８（ｍ, ３Ｈ）, １.３２〜１.４５（ｍ, ４Ｈ）, ０.８１〜０.９６（ｍ, ６Ｈ）; １３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３） δ: １７５.３, １７３.４, １５８.０, １５２.５, １３５.０, １３１.４, １３０.４, １２９.３, １２３.９, １２３.７, １２２.５, １２２.３, １２０.０, １１８.９, １１８.４, １１６.７, １１０.５, ９３.４, ８４.１, ８０.５, ７３.７, ６９.３, ６６.４, ６４.０, ５５.８, ５５.７, ５３.３, ５２.４, ５０.４, ５０.２, ４９.７, ４７.７, ４５.１, ４２.２, ４１.０, ４０.８, ３８.３, ３４.５, ３２.８, ２９.７, ２２.６, ８.６, ６.９；ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ/ｚ）: ７６９.９[Ｍ+Ｈ]+。上記のデータによって、産物がヒドラジン分解ビンブラスチン（ＪＪ−ＣＣＪ）であることを証明し、その構造は、下記のとおりである。
【化５】
2016511251.tif 000007
【００３３】
１.１.２  ビノレルビン的ヒドラジン分解：ビノレルビン酒石酸塩１８５.６ｍｇ（０.２ｍｍｏｌ）を秤量し、３５ｍＬ厚肉耐圧配管中に入れて、その中にメタノール８ｍＬと８０％ヒドラジン水和物９ｍＬ（０.２３ｍｏｌ）を加えた。先に、５ｍｉｎ間超音波をかけて、溶液中に含まれる空気を除去するために窒素を充填してからプラグを差し込んた。そして、アルミホイルで包んで光を遮断して、５２℃のオイルバスにいれて６０ｈ攪拌しながら反応させた。反応終了後に水を添加し希釈して、ＤＣＭにて数回抽出して、有機相を水と飽和ＮａＣｌ溶液にて順番に洗浄して、無水Ｎａ２ＳＯ４により乾燥させてから溶剤を除去させた。ＨＰＬＣによって分離及び精製した結果（ＭｅＯＨ:Ｈ２Ｏ:Ｅｔ３Ｎ＝７０:３０:０.００５，Ｖ/Ｖ/Ｖ）、８９.８ｍｇの黄色粉末状固体化合物を得、収率は６１％であった。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３） δ: ８.６１（ｓ, １Ｈ）, ８.２２（ｂｒ ｓ, １Ｈ）, ８.０２ （ｄ, Ｊ ＝６.０Ｈｚ, １Ｈ）, ７.１６〜７.２５（ｍ, ２Ｈ）, ６.２７（ｓ, １Ｈ）, ６.０９ （ｓ, １Ｈ）, ５.７９〜５.９２ （ｍ, ２Ｈ）, ５.７１（ｄ, Ｊ ＝ ９.０Ｈｚ, １Ｈ）, ４.９２ （ｄ, Ｊ ＝ １５.０ Ｈｚ, １Ｈ）, ４.５２（ｄ, Ｊ ＝ １５.０ Ｈｚ, １Ｈ）, ４.１９（ｄ, Ｊ ＝ １５.０ Ｈｚ, １Ｈ）, ４.０２（ｓ, １Ｈ）, ３.８４ （ｓ, ３Ｈ）, ３.７０ （ｓ, ３Ｈ）, ３.６５ （ｓ, １Ｈ）, ３.４０〜３.５５（ｍ, ３Ｈ）, ３.３０（ｄｄ, Ｊ ＝ ３.０, １５.０ Ｈｚ, １Ｈ）, ３.１０〜３.２３（ｍ, ２Ｈ）, ２.９３ （ｄ, Ｊ＝１５.０ Ｈｚ, １Ｈ）, ２.８５（ｓ, １Ｈ）, ２.８０（ｓ, １Ｈ）, ２.７５（ｄ, Ｊ＝３.０ Ｈｚ, １Ｈ）, ２.６０〜２.７３ （ｍ, ３Ｈ）, ２.３６〜２.５９ （ｍ, ３Ｈ）, ２.００〜２.１４ （ｍ, ４Ｈ）, １.８８〜１.９９ （ｍ, ２Ｈ）, １.６５〜１.８４ （ｍ, ４Ｈ）, １.２２〜１.３４ （ｍ, ４Ｈ）, １.１０ （ｔ, Ｊ ＝ ９.０, ３Ｈ）, ０.８４ （ｔ, Ｊ＝９.０ Ｈｚ, ３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３） δ: １７４.２, １５８.１, １５２.９, １３４.７, １３４.４, １３１.３, １３０.０, １２８.２, １２４.７, １２４.０, １２３.４, １２３.０, １２２.４, １２１.４, １１９.２, １１７.３, １１０.６, １０４.８, ９３.０, ８３.７, ７３.９, ６５.０, ５５.７, ５４.４, ５３.４, ５３.３, ５３.０, ５０.１, ４８.９, ４７.２, ４４.７, ４３.５, ４２.１, ３７.７, ３４.５, ３１.８, ２９.７, ２７.６, ２７.３, １１.９, ８.５；ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ/ｚ）: ７３７.５[Ｍ+Ｈ]+。上記のデータによって、産物がヒドラジン分解ビノレルビン（ＪＪ−ＣＣＲＢ）であることを証明し、その構造は、下記のとおりである。
【化６】
2016511251.tif 000008
【００３４】
１.１.３  ビンクリスチンのヒドラジン分解：ビンクリスチン硫酸塩４６１ｍｇ（０.５ｍｍｏｌ）を秤量して１００ｍＬ厚肉耐圧配管中に入れて、その中にさらにメタノール２０ ｍＬと８０％ヒドラジン水和物２０ｍＬ（０.５１ｍｏｌ）を加えた。先に、５ ｍｉｎ間超音波をかけて、溶液中に含まれる空気を除去するために窒素を充填してからプラグを差し込んた。そして、アルミホイルで包んで光を遮断して、６０℃のオイルバスにいれて２４ｈ攪拌しながら反応させた。反応終了後に水を添加し希釈して，ジクロロメタン（ＤＣＭ）にて数回抽出して、有機相を水と飽和ＮａＣｌ溶液にて順番に洗浄して、無水Ｎａ２ＳＯ４により乾燥させてから、減圧により溶剤を蒸発させた。ＨＰＬＣによって分離及び精製した結果（Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ: Ｈ２Ｏ: Ｅｔ３Ｎ＝５５: ４５: ０.００５，Ｖ/Ｖ/Ｖ）、３２４ ｍｇの淡黄色粉末状固体化合物を得、収率は８６％であった。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３） δ: ９.７７ （ｓ, １Ｈ）, ８.０６ （ ｓ, １Ｈ）, ７.５１ （ｄ, Ｊ＝９.０Ｈｚ, １Ｈ）, ７.０５〜７.１９ （ｍ, ３Ｈ）, ６.６０ （ｓ, １Ｈ）, ６.２０ （ｓ, １Ｈ）, ５.７６〜５.９４ （ｍ, ３Ｈ）, ５.６５ （ｄ, Ｊ＝９.０Ｈｚ, １Ｈ）, ５.４８ （ｓ, １Ｈ）, ４.００ （ｓ, １Ｈ）, ３.８５〜３.９６ （ｍ, １Ｈ）, ３.８３ （ｓ, １Ｈ）, ３.７２ （ｓ, ３Ｈ）, ３.５８ （ｓ, ３Ｈ）, ３.２５〜３.４７ （ｍ, ４Ｈ）, ３.０４〜３.２４ （ｍ, ３Ｈ）, ２.７２〜２.８８ （ｍ, ３Ｈ）, ２.３５〜２.５２ （ｍ, ３Ｈ）, ２.２７ （ｄ, Ｊ＝１５.０Ｈｚ, １Ｈ）, ２.０２〜２.１５ （ｍ, ２Ｈ）, １.９８ （ｓ, ３Ｈ）, １.７９〜１.９３ （ｍ, １Ｈ）, １.４８〜１.６５ （ｍ, ２Ｈ）, １.３６〜１.４８ （ｍ, ２Ｈ）, ０.８〜１.００ （ｍ, ８Ｈ）; ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ/ｚ）: ７５５.６（[Ｍ+Ｈ]+）。上記のデータによって、産物がヒドラジン分解ビンクリスチン（ＪＪ−ＣＣＸＪ）であることを証明し、その構造は、下記のとおりである。
【化７】
2016511251.tif 000009
【００３５】
１.１.４  ビンフルニンのヒドラジン分解：ビンフルニン１６３.２ｍｇ（０.２ｍｍｏｌ）を秤量し、３５ｍＬの厚肉耐圧配管に入れて、８ｍＬのメタノールと０.９ｍＬの８０％ヒドラジン水和物を加えた。先に、５ｍｉｎ間超音波をかけて、溶液中に含まれる空気を除去するために窒素を充填してからプラグを差し込んた。そして、アルミホイルで包んで光を遮断して、５２℃のオイルバスにいれて６０ｈ攪拌しながら反応させた。反応終了後に水を添加し希釈して，ＤＣＭにて数回抽出して、有機相を水と飽和ＮａＣｌ溶液にて順番に洗浄して、無水Ｎａ２ＳＯ４により乾燥させてから、減圧により溶剤を蒸発させた。ＨＰＬＣによって分離及び精製した結果（Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ:Ｈ２Ｏ:Ｅｔ３Ｎ＝５５:４５:０.００５），８０.５ ｍｇの淡黄色粉末状固体化合物を得、全収率は５２％であった。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３）: δ ９.５３（ｂｒ ｓ, １Ｈ）, ８.４８（ｓ, １Ｈ）, ８.２８（ｓ, １Ｈ）, ７.７２（ｄ, Ｊ＝６.０Ｈｚ, １Ｈ）, ７.１８（ｍ, ３Ｈ）, ６.３２（ｓ, １Ｈ）, ６.０８（ｓ, １Ｈ）, ５.５５〜５.９０（ｍ, ３Ｈ）, ４.４８〜４.６４（ｍ, ２Ｈ）, ４.０６（ｓ, １Ｈ）, ３.８０（ｓ, ３Ｈ）, ３.６９（ｓ, ３Ｈ）, ３.３７〜３.４５（ｍ, ３Ｈ）, ３.２３〜３.３７（ｍ, ２Ｈ）, ３.１３〜３.２２（ｍ, １Ｈ）, ２.８９〜３.１２（ｍ, ２Ｈ）, ２.７９（ｓ, ３Ｈ）, ２.６６（ｄ, Ｊ＝６.０Ｈｚ, １Ｈ）, ２.６１（ｓ, １Ｈ）, ２.５１（ｓ, １Ｈ）, ２.２９〜２.４７（ｍ, ２Ｈ）, １.９１〜２.０５（ｍ, ３Ｈ）, １.７９〜１.９１（ｄ, Ｊ＝１２.０Ｈｚ, １Ｈ）, １.５３〜１.７８（ｍ, ６Ｈ）, １.２２〜１.３６（ｍ, ２Ｈ）, １.０９ 〜１.２３ （ｍ, １Ｈ）, ０.８１（ｔ, Ｊ＝９.０Ｈｚ, ３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３）: δ １７４.７, １７３.５, １５７.８, １５２.５, １３４.６, １３３.３, １３０.２, １２８.５, １２４.０, １２２.８, １２２.７, １２２.４, １２０.０, １１９.０, １１８.３, １１０.６, １０９.２, ９２.９, ８３.８, ８０.４, ７３.７, ６５.５, ５５.６, ５５.３, ５３.４, ５３.１, ５２.７, ５０.２, ４９.３, ４７.０, ４６.３, ４４.７, ４２.０, ３７.９, ３３.７, ３２.０, ２９.９, ２８.５, ２２.５, ２１.５, ８.４；ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ/ｚ）: ７７５.４ [Ｍ+Ｈ]+。上記のデータによって、産物がヒドラジン分解ビンフルニン（ＪＪ−ＣＣＦＮ）であることを証明し、その構造は、下記のとおりである。
【化８】
2016511251.tif 000010
【００３６】
１.２.１  Ｚ−ＧＰ−ＮＨＮＨ−ビンブラスチン（ＢＸ−ＣＣＪ）の調製：３６.７ ｍｇ（０.１２ ｍｍｏｌ）Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−グリシル−プロリンを秤量し５ｍＬアセトニトリルに溶解して、ゴム栓で密閉して、氷浴において５ｍｉｎ攪拌した。そして、０.０３１ｍＬ（０.２ｍｍｏｌ）ＤＩＣをとって反応システムに入れて、氷浴において攪拌しながら２０ｍｉｎ反応させた。別途で７６.８ｍｇ（０.１ｍｍｏｌ）ＪＪ−ＣＣＪを秤量し、１ｍＬ ＤＣＭに溶解して、氷浴の条件下に上記反応溶液にゆっくり滴下して、徐々に室温まで上げた後に室温で２４時間撹拌しながら反応させた。反応終了後に水でクエンチして、ＤＣＭにて数回抽出して、有機相を合併し水と飽和ＮａＣｌ溶液にて順番に洗浄して、無水Ｎａ２ＳＯ４により乾燥させて溶剤を蒸発させた。得られた混合物をＲＰ−ＨＰＬＣによって分離及び精製（溶離液  ＭｅＯＨ : Ｗａｔｅｒ : Ｅｔ３Ｎ ＝ ７０ : ３０ : ０.００５，Ｖ/Ｖ/Ｖ）した結果、標的化合物８６.６ ｍｇ（淡黄色粉末状固体）を得、収率は８２.２％であった。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３） δ: ８.０４（ｂｒ, １Ｈ）, ７.５３ （ｄ, Ｊ ＝ ９.０ Ｈｚ １Ｈ）, ７.２７〜７.３８ （ｍ, ５Ｈ）, ７.０５〜７.２１（ｍ, ３Ｈ）, ６.５４ （ｓ, １Ｈ）, ６.０８ （ｓ, １Ｈ）, ５.６１〜５.８４ （ｍ, ２Ｈ）, ５.００〜５.２０ （ｍ, ２Ｈ）, ４.６３ （ｄ, Ｊ ＝ ６.０Ｈｚ, １Ｈ）, ３.８１〜４.０９ （ｍ, ４Ｈ）, ３.７６ （ｓ, ３Ｈ）, ３.６０ （ｓ, ３Ｈ）, ３.５６ （ｓ, ２Ｈ）, ３.２５〜３.４９ （ｍ, ４Ｈ）, ３.０８〜３.２４ （ｍ, ３Ｈ）, ３.０４ （ｄｄ, Ｊ ＝ ６.０, １５.０ Ｈｚ, １Ｈ）, ２.８６ （ｓ, ２Ｈ）, ２.８１ （ｓ, ３Ｈ）, ２.６０ （ｓ, １Ｈ）, ２.３７〜２.５４ （ｍ, ２Ｈ）, ２.２４〜２.３７ （ｍ, ２Ｈ）, １.９０〜２.１０ （ｍ, ４Ｈ）, １.５８〜１.７９ （ｍ, ２Ｈ）, １.４０〜１.５３ （ｍ, ２Ｈ）, １.１４〜１.３９ （ｍ, ８Ｈ）, ０.８１〜１.００ （ｍ, ８Ｈ）; １３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３） δ: １７５.１, １７１.２, １６９.６, １６８.８, １５８.０, １５６.５, １５２.８, １３６.５, １３４.９, １３１.４, １３０.３, １２９.３, １２８.４, １２８.０, １２４.０, １２３.５, １２２.４, １２２.３, １１９.８, １１８.９, １１８.３, １１６.４, １１０.５, ９３.５, ８３.４, ８０.８, ７３.７, ６９.４, ６６.８, ６６.２, ６３.６, ５８.８, ５５.８, ５５.７, ５３.４, ５３.２, ５２.４, ５０.３, ４９.６, ４７.３, ４６.３, ４５.３, ４４.８, ４３.４, ４２.３, ４０.８, ３８.６, ３４.５, ３２.７, ２９.６, ２９.４, ２８.２, ２７.４, ２４.８, １４.１, ８.７, ８.６, ６.８; ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ/ｚ）: １０５７.９[Ｍ+Ｈ]+。上記のデータによって、産物がＺ−ＧＰ−ＮＨＮＨ−ビンブラスチン（ＢＸ−ＣＣＪ）であることを証明し、その構造は、下記のとおりである。
【化９】
2016511251.tif 000011
【００３７】
１.２.２  Ｚ−ＧＰ−ＮＨＮＨ−ビノレルビン（ＢＸ−ＣＣＲＢ）の調製：３３.７ｍｇ（０.１１ｍｍｏｌ）Ｚ−ＧＰ−ＯＨをを秤量し、５ｍＬアセトニトリルに溶解して、ゴム栓で密閉して、氷浴において５ｍｉｎ攪拌した。そして、０.０３１ｍＬ（０.２ｍｍｏｌ）ＤＩＣをとって反応システムに入れて、氷浴において攪拌しながら２０ｍｉｎ反応させて、反応液Ａを得た。そして、別途で７３.６ｍｇ（０.１ｍｍｏｌ）ＪＪ−ＣＣＲＢを秤量し、１ｍＬ ＤＣＭに溶解して、氷浴の条件下に反応液Ａにゆっくり滴下して、徐々に室温まで上げた後に室温で２４時間撹拌しながら反応させた。反応終了後に水でクエンチして、ＤＣＭにて数回抽出して、有機相を水と飽和ＮａＣｌ溶液にて順番に洗浄して、無水Ｎａ２ＳＯ４により乾燥させて溶剤を蒸発させた。ＨＰＬＣによって分離及び精製した結果（ＭｅＯＨ : Ｈ２Ｏ : Ｅｔ３Ｎ ＝ ７０ : ３０ : ０.００５，Ｖ/Ｖ/Ｖ）、８０.２ｍｇ白色粉末状固体化合物を得た。収率は７％であった。ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３） δ: ８.６９ （ｓ, １Ｈ）, ８.４３ （ｂｒ, １Ｈ）, ７.８４ （ｓ, １Ｈ）, ７.１４〜７.４０ （ｍ, ９Ｈ）, ６.４１ （ｓ, １Ｈ）, ６.３２ （ｓ, １Ｈ）, ６.０８ （ｓ, １Ｈ）, ５.７９ （ｓ, ２Ｈ）,５.６０ （ｄ, Ｊ ＝ ９.０Ｈｚ, １Ｈ）, ５.００〜５.１８ （ｍ, ２Ｈ）, ４.９４ （ｄ, Ｊ ＝ １５.０ Ｈｚ １Ｈ）, ４.６１ （ｓ, １Ｈ）, ４.４６ （ｄ, Ｊ ＝ １２.０Ｈｚ, １Ｈ）, ３.８８〜４.１１ （ｍ, ４Ｈ）, ３.８１ （ｓ, ３Ｈ）, ３.６９ （ｓ, ３Ｈ）, ３.４８〜３.６５ （ｍ, ４Ｈ）, ３.３６ （ｍ, ４Ｈ）, ２.９８〜３.２７ （ｍ, ８Ｈ）, ２.８７ （ｍ, １Ｈ）, ２.８３ （ｓ, ３Ｈ）, ２.６７ （ｍ, ２Ｈ）, ２.５２ （ｔ, Ｊ ＝ １２.０ Ｈｚ, ２Ｈ）, ２.１４〜２.３０ （ｍ, １Ｈ）, １.８３〜２.１４ （ｍ, ６Ｈ）, １.６６〜１.８１ （ｍ, １Ｈ）, １.５０〜１.６６ （ｍ, １Ｈ）, １.３０ （ｔ, Ｊ ＝ ９.０ Ｈｚ, ３Ｈ）, １.０９ （ｔ, Ｊ ＝ ９.０Ｈｚ, ３Ｈ）, ０.７９ （ｍ, ３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３） δ: １７４.４, １７１.１, １７０.０, １６８.５, １６７.９, １５７.９, １５６.５, １５３.０, １３６.４, １３４.６, １３４.２, １３１.７, １３０.２, １２８.２, １２８.１, １２７.７, １２７.６, １２４.３, １２３.３, １２３.１, １２２.６, １２２.４, １２０.６, １１８.５, １１７.３, １１０.５, １０５.６, ９２.８, ８２.８, ８０.５, ７３.８, ６６.４, ６４.５, ５８.７, ５５.６, ５４.３, ５２.９, ５２.７, ５２.１, ４９.９, ４８.９, ４６.１, ４６.０, ４５.１, ４４.２, ４３.２, ４２.８, ４２.２, ３８.０, ３４.４, ３１.５, ２８.６, ２７.４, ２７.１, ２４.４, １１.７, ８.３, ８.１；ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ/ｚ）: １０２５.６[Ｍ+Ｈ]+。上記のデータによって、産物がＺ−ＧＰ−ＮＨＮＨ−ビノレルビン（ＢＸ−ＣＣＲＢ）であることを証明し、その構造は、下記のとおりである。
【化１０】
2016511251.tif 000012
【００３８】
１.２.３  Ｚ−ＧＰ−ＮＨＮＨ−ビンクリスチン（ＢＸ−ＣＣＸＪ）の調製：１３７.７ｍｇ（０.４５ｍｍｏｌ）Ｚ−ＧＰ−ＯＨを秤量し、７.５ｍＬアセトニトリル溶解して、ゴム栓で密閉して、氷浴において５ｍｉｎ攪拌した。０.０９ｍＬ（０.６ｍｍｏｌ）ＤＩＣをとって反応システムに入れて、氷浴において攪拌しながら２０ｍｉｎ反応させて、反応液Ａを得た。そして、別途で３３９.０ｍｇ（０.４５ｍｍｏｌ）ＪＪ−ＣＣＸＪを秤量し、４.５ｍＬＤＣＭに溶解して、氷浴の条件下に反応液Ａにゆっくり滴下して、徐々に室温まで上げた後に室温で２４時間撹拌しながら反応させた。反応終了後に水でクエンチして、ＤＣＭにて数回抽出して、有機相を水と飽和ＮａＣｌ溶液にて順番に洗浄して、無水Ｎａ２ＳＯ４により乾燥させて溶剤を蒸発させた。ＨＰＬＣによって分離及び精製した結果（ＭｅＯＨ : Ｈ２Ｏ : Ｅｔ３Ｎ ＝ ８０ : ２０ : ０.００５，Ｖ/Ｖ/Ｖ）、２８６.１ ｍｇ淡黄色粉末状固体化合物を得、収率は６１％であって、該化合物はＢとする。
【００３９】
１.１ｍｏｌ無水酢酸をとって、その中に０.５ｍｏｌのギ酸を加えて、充分に均一に攪拌して１１:５の溶液を配合して用意した。２０８ｍｇ（０.２ｍｍｏｌ）化合物Ｂを秤量し、３ｍＬのＤＣＭに溶解して、その中適量の無水酢酸ギ酸溶液を加えて、室温下に攪拌しながら２時間反応させた。反応終了したら溶剤を蒸発させて、ＨＰＬＣによって分離及び精製（ＭｅＯＨ: Ｈ２Ｏ: Ｅｔ３Ｎ＝６５: ３５: ０.００５）の結果、７０.３ｍｇ淡黄色粉末状固体化合物を得、全収率は３２.９％であった。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ, ＣＤ３ＯＤ） δ: ８.５０ （ｍ, １Ｈ）, ７.４３ （ｄ, Ｊ＝６.０Ｈｚ, ２Ｈ）, ７.２０〜７.５７ （ｍ, １１Ｈ）, ７.１５ （ｄ, Ｊ＝６.０Ｈｚ, １Ｈ）, ７.０８ （ｔ, Ｊ＝６.０Ｈｚ, ２Ｈ）, ７.００ （ｔ, Ｊ＝６.０Ｈｚ, ２Ｈ）, ６.５４ （ｓ, １Ｈ）, ６.２７ （ｓ, １Ｈ）, ５.８０ （ｍ, ２Ｈ）, ５.５６〜５.７２ （ｍ, ２Ｈ）, ５.００〜５.１４ （ｍ, ４Ｈ）, ４.４２〜４.６１ （ｍ, ２Ｈ）, ３.９０〜４.１０ （ｍ, ９Ｈ）, ３.７７〜３.８９ （ｍ, ３Ｈ）, ３.７２〜３.７５ （ｍ, １Ｈ）, ３.７３ （ｓ, ３Ｈ）, ３.６１〜３.６８ （ｍ, ４Ｈ）, ３.６０ （ｓ, ３Ｈ）, ３.４９〜３.５７ （ｍ, ３Ｈ）, ３.４４ （ｄ, Ｊ＝６.０Ｈｚ, １Ｈ）, ３.３５〜３.４１ （ｍ, １Ｈ）, ３.２９〜３.３３ （ｍ, ４Ｈ）, ３.１６〜３.２９ （ｍ, ６Ｈ）, ３.００〜３.１５ （ｍ, ３Ｈ）, ２.７０〜２.８７ （ｍ, ５Ｈ）, ２.６３ （ｄ, Ｊ＝１２.０Ｈｚ, １Ｈ ）, ２.３９〜２.５２ （ｍ, ４Ｈ）, ２.２１〜２.３８ （ｍ, ４Ｈ）, ２.０５〜２.２１ （ｍ, ７Ｈ）, １.９２〜２.０５ （ｍ, ４Ｈ）, １.８０〜２.０２ （ｍ, ２Ｈ）, １.６２〜１.７４ （ｍ, １Ｈ）, １.４４〜１.６１ （ｍ, ４Ｈ）, １.２０〜１.４４ （ｍ, １３Ｈ）, ０.６６〜１.００ （ｍ, １７Ｈ）; １３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ, ＣＤ３ＯＤ） δ: １７７.３, １７４.０, １７３.９, １７３.３, １７０.３, １７０.２, １５９.３, １５８.９, １５８.５, １５１.４, １３８.１, １３６.９, １３６.５, １３２.１, １３１.８, １３１.１, １３０.４, １３０.２, １２９.４, １２９.０, １２８.９, １２８.８, １２６.４, １２５.４, １２５.２, １２４.０, １２３.３, １２０.６, １１９.９, １１９.１, １１８.２, １１７.６, １１２.０, １１１.３, １０２.４, ９４.３, ８２.８, ８１.７, ７５.７, ７５.０, ６９.５, ６９.３, ６９.０, ６７.７, ６４.０, ６０.４, ６０.３, ６０.１, ５７.５, ５６.９, ５６.６, ５６.３, ５４.４, ５４.０, ５３.０, ５２.９, ５１.９, ５１.８, ４７.６, ４４.７, ４４.１, ４３.５, ４１.１, ４０.９, ３５.８, ３３.６, ３３.３, ３３.０, ３０.７, ３０.５, ３０.４, ２７.７, ２５.８, ２３.７, １４.４, ９.０, ７.３; ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ/ｚ）: １０７１.５ （[Ｍ+Ｈ]+）。上記のデータによって、産物がＺ−ＧＰ−ＮＨＮＨ−ビンクリスチン（ＢＸ−ＣＣＸＪ）であることを証明し、その構造は、下記のとおりである。
【化１１】
2016511251.tif 000013
【００４０】
１.２.４  Ｚ−ＧＰ−ＮＨＮＨ−ビンフルニン（ＢＸ−ＣＣＦＮ）の調製：３０.６ｍｇ（０.１ｍｍｏｌ）Ｚ−ＧＰ−ＯＨ(Ｎ−ｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙｇｌｙｃｙｌ  ｐｒｏｌｉｎｅ)を秤量し、５ｍＬアセトニトリルに溶解して、ゴム栓で密閉して、氷浴において５ｍｉｎ攪拌した。０.０３１ｍＬ（０.２ｍｍｏｌ）ＤＩＣをとって反応システムに入れて、氷浴において攪拌しながら２０ｍｉｎ反応させた。７７.４ ｍｇ（０.１ｍｍｏｌ）ＪＪ−ＣＣＦＮを秤量し、１ｍＬのＤＣＭに溶解して、氷浴の条件下に反応液Ａにゆっくり滴下して、徐々に室温まで上げた後に室温で２４時間撹拌しながら反応させた。反応終了後に水でクエンチして、ＤＣＭにて数回抽出して、有機相を水と飽和ＮａＣｌ溶液にて順番に洗浄して、無水Ｎａ２ＳＯ４により乾燥させて溶剤を蒸発させた。ＨＰＬＣによって分離及び精製した結果（ＭｅＯＨ : Ｈ２Ｏ : Ｅｔ３Ｎ ＝ ７５ : ２５ : ０.００５）、淡黄色粉末状固体化合物を得、全収率は７４％であった。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３） δ ８.５４（ｓ, １Ｈ）, ７.７３（ｄ, Ｊ＝６.０Ｈｚ, １Ｈ）, ７.２６〜７.３８（ｍ, ５Ｈ）, ７.１８（ｍ, ３Ｈ）, ６.３１（ｓ, １Ｈ）, ６.０７（ｓ, １Ｈ）, ５.７９（ｄｄ, Ｊ＝３.０, ９.０Ｈｚ, １Ｈ）, ５.６４（ｄ, Ｊ＝１２.０Ｈｚ, １Ｈ）, ５.０１〜５.１６（ｍ, ２Ｈ）, ４.４４〜４.７５（ｍ, ２Ｈ）, ３.８５〜４.１３（ｍ, ２Ｈ）, ３.７９（ｓ, ３Ｈ）, ３.６８（ｓ, ３Ｈ）, ３.５１〜３.６５（ｍ, ２Ｈ）, ３.３１〜３.５０（ｍ, ３Ｈ）, ３.２６（ｄｄ, Ｊ＝３.０, １５Ｈｚ, １Ｈ）, ３.０７〜３.１９（ｍ, １Ｈ）, ２.９０〜３.０７ （ｍ, ３Ｈ）, ２.８２（ｓ, ３Ｈ）, ２.７８（ｓ, １Ｈ）, ２.６４（ｄｄ, Ｊ＝６.０, １５.０Ｈｚ, １Ｈ）, ２.５５（ｓ, １Ｈ）, ２.３３〜２.４９（ｍ, ２Ｈ）, １.６５〜１.７３（ｍ, ２Ｈ）, １.５９〜１.６８（ｍ, ３Ｈ）, １.３１〜１.４３（ｍ, １Ｈ）, １.２０〜１.３１（ｍ, ５Ｈ）, １.０６〜１.２０（ｍ, ２Ｈ）, ０.８２〜０.９２（ｍ, １Ｈ）, ０.８０（ｔ, Ｊ＝９.０Ｈｚ, １Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３）: δ １７４.６, １７３.３, １７１.２, １７０.０, １６８.６, １５７.８, １５６.５, １５５.７, １５３.０, １３６.４, １３４.６, １３３.５, １３０.３, １２８.５, １２８.４, １２７.９, １２７.８, １２４.３, １２２.９, １２２.５, １２２.４, １２０.１, １１８.８, １１８.３, ９３.１, ８３.１, ８０.７, ７３.８, ６６.７, ６５.３, ５８.７, ５５.６, ５５.３, ５３.１, ５２.７, ５０.２, ４９.５, ４９.４, ４９.２, ４６.４, ４６.３, ４５.８, ４５.０, ４４.５, ４３.３, ４２.３, ３８.２, ３３.６, ３２.０, ２９.６, ２８.６, ２８.１, ２４.７, ２２.５, ８.６, ８.３；ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ/ｚ）: １０６３.４ [Ｍ+Ｈ]+。上記のデータによって、産物がＺ−ＧＰ−ＮＨＮＨ−ビンフルニン（ＢＸ−ＣＣＦＮ）であることを証明し、その構造は、下記のとおりである。
【化１２】
2016511251.tif 000014
【００４１】
１.３.１  ＢＸ−ＣＣＪ硫酸塩の調製：１０６.０ｍｇ（０.１ｍｍｏｌ）ＢＸ−ＣＣＪを、１２ｍｌの０.０１ｍｏｌ/Ｌ硫酸（０.１２ｍｍｏｌ）を含有する１:１メタノール/ジクロロメタン溶液に溶解して、０℃下に攪拌しながら３ｈ反応させて、室温下に減圧して溶剤を蒸発させ、得られた固体化合物を冷たいエーテルにて三回洗浄して、遠心分離でエーテルを除去した。固体化合物を合併して再度に水に溶解させて、凍結乾燥の結果、製品１１１.４ ｍｇを得、収率は９６.２％であった。
【００４２】
１.３.２  ＢＸ−ＣＣＲＢ酒石酸塩の調製：１０２.５ｍｇ（０.１ｍｍｏｌ）ＢＸ−ＣＣＲＢを、１５ｍＬの０.０１ｍｏｌ/Ｌ酒石酸（０.１５ｍｍｏｌ）を含有する１:１メタノール/ジクロロメタン溶液に溶解して、０℃下で攪拌しながら３ｈ反応させて、室温下に減圧して溶剤を蒸発させ、得られた固体化合物を冷たいエーテルにて三回洗浄して、遠心分離でエーテルを除去した。固体化合物を合併して再度に水に溶解させて、凍結乾燥の結果製品１１５.１ｍｇを得、収率は９８％であった。
【００４３】
実施例２  ビンブラスチン誘導体の体外細胞成長抑制の活性実験
実験方法：対数増殖期細胞（Ａ５４９（ヒト非小細胞肺癌細胞）、ＬＯＶＯ（ヒト結腸癌細胞）、ＣＮＥ−２（ヒト鼻咽頭癌細胞）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝細胞癌細胞）、Ｈｅｌａ（ヒト子宮頚癌細胞）、ＭＣＦ−７（ヒト乳癌細胞）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト乳癌細胞）、ＮＣＩ−Ｎ８７（ヒト胃癌細胞）、ＰＣ−３（ヒト前立腺癌細胞）、ＤＵ１４５（ヒト前立腺癌細胞）、Ｋ５６２（ヒト白血病細胞）、Ａ３７５（ヒトメラノーマ細胞）、ＳＨ−ＳＹ５Ｈ（ヒト神経芽腫細胞）、ヒト前骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０）、ＢＥＬ−７４０２/５−Ｆｕ（ヒト肝細胞癌のフルオロウラシル耐性株）、ＨｅｐＧ２/ＡＤＭ（ヒト肝癌ドキソルビシン耐性株）、ＭＣＦ−７/ＡＤＲ（ヒト乳癌のアドリアマイシン耐性株））を取って、それぞれ適量なＲＰＭＩ １６４０培養液（ＦＢＳ１０％、ペニシリン１００Ｕ/ｍＬ）を加えて、細胞濃度が５×１０５個/ｍＬとなるように調製して、９６ウェル培養プレートに播種して、各ウェルに腫瘍細胞のサスペンション液１００μＬを播種した。そして、５％ＣＯ２のインキュベーターに置いて、３７℃で２４ｈ培養した後に、調製したテスト用薬物を加えて（対照群について薬物を添加しないとした）、さらに７２ｈ培養した。その後に、各ウェルに５ｍｇ/ｍＬ ＭＴＴ [３−（４,５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２,５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ] の溶液３０μＬを加えて、３７℃で４ｈインキュベーションして、上澄みを取り除いて、さらに各ウェルにＤＭＳＯ １００μＬにて溶解し得たホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）を添加して、酵素標識器具を利用して（Ｔｈｅｒｍｏ製品）５７０ｎｍでＯＤ値を測定した。
【００４４】
細胞成長抑制率は、下記の式のとおりに計算した：
【数１】
2016511251.tif 000015
【００４５】
サンプルの濃度を横軸として、細胞成長抑制率を縦軸としてカーブをプロットした。当該細胞成長抑制カーブによって、５０％阻害濃度ＩＣ５０値を計算した。
【００４６】
実験結果：表２−１と２−２とから分かるように、本実験で測定したビンブラスチン類化合物、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物、及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、広域スペクトル抗腫瘍活性を持っていた。ＦＡＰα酵素発現陰性の腫瘍細胞株において、ビンブラスチン類化合物の細胞成長抑制活性は、対応のヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物のと近かかったが、ビンブラスチン類化合物及びその対応のヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物の細胞成長抑制活性は、何れも対応のビンブラスチン類ジペプチド誘導体のより優れていた。その一方、ＦＡＰα酵素発現陽性のＬＯＶＯ細胞において、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物の細胞成長抑制活性は対応するビンブラスチン類ジペプチド誘導体とほぼ一致していて、これは、ビンブラスチン類ジペプチド誘導体はＦＡＰα酵素に切断され、対応するヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物を発生することができると判明した。
【００４７】
【表２−１−１】
2016511251.tif 000016
【表２−１−２】
2016511251.tif 000017
【００４８】
【表２−２−１】
2016511251.tif 000018
【表２−２−２】
2016511251.tif 000019
【００４９】
実施例３  ビンブラスチン誘導体の正常細胞に対する体外毒性実験
実験方法：実施例２の方法と同様に、ビンブラスチン類化合物、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物、及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体の、人正常肝癌細胞ＬＯ２及びヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣ対する体外細胞毒性について測定した。
【００５０】
実験結果：ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物、及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、ＬＯ２とＨＵＶＥＣに対する細胞毒性が、対応するビンブラスチン類化合物（表３を参照）よりはるかに低くなった。これは、標的修飾された化合物の細胞毒性が大幅に減少されたことを表す。
【００５１】
【表３】
2016511251.tif 000020
【００５２】
実施例４  組み換えヒトＦＡＰαによるビンブラスチン類ジペプチド誘導体の特異性酵素分解の実験
実験方法：ＨＰＬＣクロマトグラフの条件は、下記のとおりである：
高速液体クロマトグラフィーＡｇｉｌｅｎｔ １２００；
コラムＣｏｓｍｏｓｉｌ Ｃ１８逆相カラム（４.６×２５０ｍｍ２，５μｍ）；
移動相[０ｍｉｎ，５５％メタノールと４５％水（２ｍＭギ酸アンモニウムを含有）；１０ｍｉｎ，６５％メタノールと３５％水（２ｍＭギ酸アンモニウムを含有）；１５ ｍｉｎ，７５％メタノール和２５％水（２ｍＭギ酸アンモニウムを含有）；３０ｍｉｎ，８５％メタノール和１５％水（２ｍＭギ酸アンモニウムを含有）；４０ｍｉｎ，８５％メタノール和１５％水（２ｍＭギ酸アンモニウムを含有）]；
流速：１ｍＬ/ｍｉｎ；
検出波長：２５４ｎｍ；
注入量：２μＬ。
【００５３】
ビンブラスチン類ジペプチド誘導体の測定用標準曲線の構築方法は、下記のとおりである：ビンブラスチン類ジペプチド誘導体を酵素反応緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１.０Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７.４）に溶解させて、５つの濃度勾配を設定して、それぞれは、６.２５、１２.５、２５、５０、１００μＭであった。ピーク面積を縦軸とし（Ｙ）、化合物濃度（μＭ）を横軸（Ｘ）として標準曲線をプロットした。本実験を３回重複した。最終濃度は５０μＭとなるようにビンブラスチン類ジペプチド誘導体をぞれぞれ５μｇ/ｍＬの組み換えヒトＦＡＰαを含有する酵素分解反応緩衝液中にインキュベートして、３７℃の水浴にて反応させた。０、０.５、１、２、４、８、１２及び２４ｈのときに、それぞれの上澄みを取って、ＨＰＬＣ法によって酵素分解産物を測定して、酵素分解率を計算した。その中、Ａ: ＢＸ−ＣＣＪ；Ｂ: ＢＸ−ＣＣＲＢ；Ｃ: ＢＸ−ＣＣＦＮ；Ｄ: ＢＸ−ＣＣＸＪである。
【００５４】
実験結果：組み換えヒトＦＡＰαは、ビンブラスチン類ジペプチド誘導体を時間依存性分解することを示した（図１を参照）。
【００５５】
実施例５ 腫瘍組織におけるＦＡＰαによるビンブラスチン類ジペプチド誘導体の特異性酵素分解の実験
実験方法：ヌードマウスに移植瘤を接種した２１日後に、ＣＯ２で麻酔してから頚椎脱臼によって殺して、皮下腫瘍をストリップした。生理食塩水で洗浄し脂肪組織を取り除いて、紙で表面の水分を吸収し除去した。約２ｇの腫瘍組織を秤量して、はさみで小さな組織ブロックとなるように切ってからガラスホモジナイザーに移して、１０ｍＬの酵素分解緩衝液を入れて破砕した。破砕液を収集して、２００メッシュに通した。１０ｍＬの破砕液を正確に量って、化合物の最終濃度は５０μＭとなるように、１０μＬの濃度５０ ｍＭのビンブラスチン類ジペプチド誘導体の保存液に添加して、３７℃の水浴にて反応させた。０、２、８、１２及び２４ｈ後に、それぞれ２ｍＬの破砕液を取り１５ｍＬの遠心分離管に入れて、５ｍＬの抽出剤（アセトニトリル/ジクロロエタン＝１ : ４）を添加して、ボルテックスにより１ｍｉｎ間ミックスして、２５００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した。下層の有機相を取って、窒素下にブロー乾燥して、２００μＬのメタノールを添加し残留物を溶解させた。０.２２μｍ濾過膜によって不純物を除去して、ＨＰＬＣ法によって酵素分解産物を測定して、酵素分解率を計算した。その中、Ａ: ＢＸ−ＣＣＪ；Ｂ: ＢＸ−ＣＣＲＢ；Ｃ: ＢＸ−ＣＣＦＮ；Ｄ: ＢＸ−ＣＣＸＪである。
【００５６】
実験結果：腫瘍組織において、ＦＡＰαは、ビンブラスチン類ジペプチド誘導体を時間依存性分解することを示した（図２を参照）。
【００５７】
実施例６ ビンブラスチン類ジペプチド誘導体の急性毒性実験
実験方法：体重１８〜２２ｇの昆明種マウス（広東省の動物センターから購入）を用意して、ランダムにグループ化して、各グループは１０匹とした。それぞれ異なる用量のＶＬＢ（ビンブラスチン）及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体を腹腔内注射して、マウスの生存状況に基づいて、半数致死量ＬＤ５０を計算した。
【００５８】
半数致死量は、下記の式によって計算した：
【数２】
2016511251.tif 000021
【００５９】
実験結果：結果に表示されたように、ＢＸ−ＣＣＪのＬＤ５０は約１０ｍｇ/ｋｇであって、ＢＸ−ＣＣＲＢのＬＤ５０は約１２ｍｇ/ｋｇであって、ＢＸ−ＣＣＦＮのＬＤ５０は約１５ｍｇ/ｋｇであって、ＢＸ−ＣＣＸＪのＬＤ５０は約１０ｍｇ/ｋｇであった。そして、ＶＬＢにとっては、４ｍｇ/ｋｇの投薬量で、既に半分のマウスが死亡したことを確認した。
【００６０】
実施例７  ビンブラスチン誘導体の体内抗腫瘍実験
実験方法：対数増殖期のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をダイジェストして、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）を用いて２回洗浄した。細胞密度が１×１０７個となるように調整して、各ＢＡＬＢ/ｎｕ/ｎｕ雌性ヌードマウスに皮下に０.１ｍＬを接種した。腫瘍が７０〜１００ ｍｍ３ までに成長したら、ヌードマウスをランダムに生理食塩水群（対照群）、ビンブラスチン類化合物（ＶＬＢ、ＣＣＲＢ、ＣＣＦＮ、ＣＣＸＪ）並びにビンブラスチン誘導体ＪＪ−ＣＣＪ、ＢＸ−ＣＣＪ、ＪＪ−ＣＣＲＢ、ＢＸ−ＣＣＲＢ、ＪＪ−ＣＣＦＮ、 ＢＸ−ＣＣＦＮ、ＪＪ−ＣＣＸＪ及びＢＸ−ＣＣＸＪ群に分かれて、各群毎に６匹とした。各ヌードマウスについて、それぞれ１日おきで１ｍｇ/ｋｇの上記薬物を腹腔内に注射した。総計８回投薬して、１日あけてヌードマウスの体重及び腫瘍のサイズを測定した。実験終了した後に、ヌードマウスを殺して、ピール腫瘍塊とオルガンオルガンを剥離した。上記実験中の腫瘍体積計算式は、Ｖ＝１/２ ａｂ２）であって、その中、ａ、ｂはそれぞれ腫瘍塊の長径を表す。
【００６１】
ＨｅｐＧ２、ＬＯＶＯ、Ｋ５６２及びＨＬ−６０細胞の裸ヌードマウス移植瘤モデルの構築は、上記に記載のと同様であった。
【００６２】
実験結果：１ｍｇ/ｋｇの投薬量で、ビンブラスチン類化合物及びビンブラスチン誘導体は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨｅｐＧ２、ＬＯＶＯ、Ｋ５６２及びＨＬ−６０細胞のヌードマウス移植瘤成長に対して、何れも強い抑制作用を有して、且つ効果は明らかであった（表４−表８を参照）。１ｍｇ/ｋｇの投薬量で，ビンブラスチン類ジペプチド誘導体の毒性は、対応するビンブラスチン類化合物及びヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物のより低かった。生理食塩水群と比較すれば、ビンブラスチン類ジペプチド誘導体群の体重、各オルガンオルガンにも有意な差がなかったが、対応するビンブラスチン類化合物及びヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物の群は、体重が明らかに下がり、かつ、肝臓及び脾臓及び他の臓器損傷も現れた。
【００６３】
【表４】
2016511251.tif 000022
【００６４】
【表５】
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【００６５】
【表６】
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【００６６】
【表７】
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【００６７】
【表８】
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【００６８】
実施例８  ビンブラスチン誘導体のヒト血管内皮細胞ＨＵＶＥＣｓの侵害能力に対する抑制作用
実験方法：対数増殖期のＨＵＶＥＣｓ細胞をダイジェストして、遠心分離しカウントして、５×１０６/ｍＬとなるようにマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（ＢＤ公司）被覆Ｔｒａｎｓｗｅｌｌシステムに接種して、各ウェルに０.１ｍＬとし、５％ＣＯ２を含有して、３７℃である細胞インキュベーターに２４時間培養した。そして、ブランコ対照群と投薬群に分かれて、投薬群にそれぞれビンブラスチン類化合物及びビンブラスチン誘導体を投薬して、薬物の最終濃度は何れも１００ｐｍｏｌ/Ｌであった。２４時間培養したら、培養液を除去しＰＢＳで１回洗浄して、４％（Ｗ/Ｖ）パラホルムアルデヒドで１５分間固着して、ギムザ染料を用いて３０分間着色して、さらにＰＢＳで１回洗浄した。顕微鏡で観測し細胞数を計数した結果を図３に示した。
【００６９】
実験結果に示されたように、ビンブラスチン類化合物、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物、及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、何れもＨＵＶＥＣｓ細胞の侵害作用を抑制することができた。そして、ビンブラスチン類化合物と比較すれば、前記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物とビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、さらに明らかにＨＵＶＥＣｓ細胞の侵害作用を抑制した。
【００７０】
実施例９  ビンブラスチン誘導体の人血管内皮細胞ＨＵＶＥＣｓの転移能力に対する抑制作用
実験方法：対数増殖期のＨＵＶＥＣｓ細胞を用意して、ＰＢＳで洗浄し遠心分離して、細胞を無血清培地に再度にサスペンションした。２×１０６個/ｍＬの細胞をＴｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーに接種して、各ウェルに１００μＬとした。そして、ブランコ対照群と投薬群に分かれて、投薬群にそれぞれビンブラスチン類化合物ビンブラスチン（ＣＣＪ）、ビノレルビン（ＣＣＲＢ）、ビンフルニン（ＣＣＦＮ）、及びビンクリスチン（ＣＣＸＪ）、並びにビンブラスチン誘導体ヒドラジン分解ビンブラスチン（ＪＪ−ＣＣＪ）、ビンブラスチンジペプチド（ＢＸ−ＣＣＪ）、ヒドラジン分解ビノレルビン（ＪＪ−ＣＣＲＢ）、ビノレルビンジペプチド（ＢＸ−ＣＣＲＢ）、ヒドラジン分解ビンフルニン（ＪＪ−ＣＣＦＮ）、ビンフルニンジペプチド（ＢＸ−ＣＣＦＮ）、ヒドラジン分解ビンクリスチン（ＪＪ−ＣＣＸＪ）及びビンクリスチンジペプチド（ＢＸ−ＣＣＸＪ）、を投薬して、薬物の最終濃度は何れも１００ｐｍｏｌ/Ｌであった。そして、下チャンバーに７００μＬの１０％新生仔ウシ血清を含有する１６４０培養液を添加して、５％ＣＯ２を含有し３７℃である細胞インキュベーターに２４時間培養した。その後、培養液を取り除いて、４％パラホルムアルデヒドで４℃の条件下に３０ｍｉｎ間固着して、水で２回ゆっくり洗浄した。ギムザ染料を用いて３０分間着色してから、綿棒で膜上の細胞を拭き除いて、さらに水でゆっくり洗浄した。顕微鏡で観測し細胞数を計数した結果を図４に示した。
【００７１】
実験結果：ビンブラスチン類化合物と比較すれば、実施例１で調製し得たビンブラスチン誘導体は、ＨＵＶＥＣｓ細胞の転移能力をより強く抑制した。当実験結果から分かるように、ビンブラスチン類化合物、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、何れもＨＵＶＥＣｓ細胞の転移能力に対して抑制作用を有した。また、ビンブラスチン類化合物と比較して、上記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体が、ＨＵＶＥＣｓ細胞の転移能力をより強く抑制することができた。
【００７２】
実施例１０  ビンブラスチン誘導体の人血管内皮細胞ＨＵＶＥＣｓルーメン形成に対する抑制作用
実験方法： マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）を予め冷やした４８ウェルプレートに設置して、各ウェルに１００μＬを添加して、３７℃である細胞インキュベーターに２０分間培養した。マトリゲルが固化したら、１×１０５個ＨＵＶＥＣｓ細胞/ウェルで培養液を添加した。細胞の培養液は、予めビンブラスチン類化合物ビ及びンブラスチン誘導体ＪＪ−ＣＣＪ、ＢＸ−ＣＣＪ、ＪＪ−ＣＣＲＢ、ＢＸ−ＣＣＲＢ、ＪＪ−ＣＣＦＮ、 ＢＸ−ＣＣＦＮ、ＪＪ−ＣＣＸＪ及びＢＸ−ＣＣＸＪ（最終濃度：１００ｐｍｏｌ/Ｌ）並びに血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（最終濃度：１００ｎｇ/ｍＬ）を添加した。薬物及びＶＥＧＦを添加していなかったウェルは、ブランク対照群とした。継続的に８ｈ間培養してから、倒立顕微鏡下にルーメンの形成状況を観測し撮影して、結果を図５に示した。
【００７３】
実験結果に示されたように、ビンブラスチン類化合物、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、何れもＶＥＧＦに誘導されたＨＵＶＥＣｓルーメンの形成に対して抑制作用を用した。また、ビンブラスチン類化合物に比べて、上記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、ＶＥＧＦに誘導されるＨＵＶＥＣｓルーメンの形成をより強く抑制することができた。
【００７４】
実施例１１  ビンブラスチン誘導体の既に形成したＨＵＶＥＣｓルーメンに対するダメージ作用
実験方法：文献（Ｚｈｉ−Ｔｉｎｇ Ｄｅｎｇ, ｅｔ ａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２０１１, ８２:１８３２−４２.）に記載の方法を参考し改良して、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）を予冷した４８ウェルプレートに設置して、各ウェルに１００μＬを添加して、３７℃である細胞インキュベーターに２０分間培養した。マトリゲルが固化したら、１×１０５個ＨＵＶＥＣｓ細胞/ウェルとなるように細胞培養液を添加して、さらに４ｈ培養した。ＨＵＶＥＣｓルーメンが形成した後に、細胞培養液をビンブラスチン類化合物、ビンブラスチン誘導体ＪＪ−ＣＣＪ、ＢＸ−ＣＣＪ、ＪＪ−ＣＣＲＢ、ＢＸ−ＣＣＲＢ、ＪＪ−ＣＣＦＮ、ＢＸ−ＣＣＦＮ、ＪＪ−ＣＣＸＪ及びＢＸ−ＣＣＸＪ（最終濃度：１００ｐｍｏｌ/Ｌ）並びに血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（最終濃度：１００ｎｇ/ｍＬ）を添加した培養液に入れ替えた。薬物及びＶＥＧＦを添加していなかったウェルは、ブランク対照群とした。継続的に８ｈ間培養してから、倒立顕微鏡下にルーメンの形成状況を観測し撮影して、結果を図６に示した。
【００７５】
実験結果に示されたように、ビンブラスチン類化合物、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、何れもＶＥＧＦに誘導された既に形成したＨＵＶＥＣｓルーメンにダメージを与えることができた。また、ビンブラスチン類化合物と比べて、上記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、ＶＥＧＦに誘導された既に形成したＨＵＶＥＣｓルーメンをより効果的にダメージ与えるを与えた。
【００７６】
実施例１２  ビンブラスチン誘導体の鶏胚漿尿膜血管増殖に対する抑制作用
実験方法：文献（Ｃｈｏ ＳＧ, ｅｔ ａｌ. Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ２００９, ６９（１７）: ７０６２−７０７０）に記載の方法を参考して、６０個の５日齢種卵をランダムにＰＢＳ群、ビンブラスチン類化合物群、並びにビンブラスチン誘導体ＪＪ−ＣＣＪ群、ＢＸ−ＣＣＪ群、ＪＪ−ＣＣＲＢ群、ＢＸ−ＣＣＲＢ群、ＪＪ−ＣＣＦＮ群、ＢＸ−ＣＣＦＮ群、ＪＪ−ＣＣＸＪ群、及びＢＸ−ＣＣＸＪ群に分け、各群は１０個とした。種卵を消毒した後に、空気チャンバーを上向け、３７℃のインキュベーターに入れた。８日間培養したら、ハサミやピンセットを利用して空気チャンバーに口を切り開いて（１.５ｃｍ×１.５ｃｍ）、卵殻膜を剥離して、鶏胚漿尿膜を露出させた。薬物含有濾紙を鶏胚漿尿膜の血管の少ないところに置いた。パラフィルムを用いて空気チャンバーの口をシールして、インキュベーターにおいてさらに１日間培養した後に、パラフィルムを取り外して、メタノールとアセトンの混合液（１:１, Ｖ/Ｖ）を注入して、室温で１５ｍｉｎ間固着した。血管が凝固したら、濾紙を中心として膜を切り取って、少量な水を盛っていた皿において展開して、ろ紙上にタイルに設置した。その後に、ろ紙と膜を一緒に水から取り出して、眼科用顕微鏡を利用して実験部周辺５ｍｍの範囲内の血管を観測し計数して、撮影した。結果を図７に示した。
【００７７】
実験結果に示されたように、ビンブラスチン類化合物、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物、及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、何れも鶏胚漿尿膜の血管新生を抑制することができた。また、ビンブラスチン類化合物と比較して、上記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、鶏胚漿尿膜の血管新生をより効果的に抑制することができた。
【００７８】
実施例１３  ビンブラスチン誘導体の既に形成した鶏胚漿尿膜血管に対するダメージ作用
実験方法：６０個の５日齢種卵をランダムにビンブラスチン類化合物組、並びにビンブラスチン誘導体ＪＪ−ＣＣＪ群、ＢＸ−ＣＣＪ群、ＪＪ−ＣＣＲＢ群、ＢＸ−ＣＣＲＢ群、ＪＪ−ＣＣＦＮ群、ＢＸ−ＣＣＦＮ群、ＪＪ−ＣＣＸＪ群、及びＢＸ−ＣＣＸＪ群に分け、各群は１０個とした。種卵を消毒した後に、空気チャンバーは上向け、３７℃のインキュベーターに入れた。８日間培養したら、ハサミやピンセットを利用して空気チャンバーに口を切り開いて（１.５ｃｍ×１.５ｃｍ）、卵殻膜を剥離して、鶏胚漿尿膜を露出させた。ＶＥＧＦ（１００ｎｍｏｌ）を含有する濾紙を鶏胚漿尿膜の血管少ないところに置いた。パラフィルムを用いて空気チャンバーの口をシールして、インキュベーターにおいてさらに１日間培養した後に、パラフィルムを取り外して、濾紙にそれぞれビンブラスチン類化合物並びにビンブラスチン誘導体ＪＪ−ＣＣＪ、ＢＸ−ＣＣＪ、ＪＪ−ＣＣＲＢ、ＢＸ−ＣＣＲＢ、ＪＪ−ＣＣＦＮ、ＢＸ−ＣＣＦＮ、ＪＪ−ＣＣＸＪ及びＢＸ−ＣＣＸＪを各１ｎｍｏｌ落下して、パラフィルムで再度に空気チャンバーの口をシールして、インキュベーターにおいてさらに1日間培養した。その後に、パラフィルムを取り外して、メタノールとアセトンの混合液（１:１, Ｖ/Ｖ）を注入して、室温で１５ｍｉｎ間固着した。血管が凝固したら、濾紙を中心として膜を切り取って、少量の水を盛った皿において展開して、ろ紙上にタイルに設置した。その後に、ろ紙と膜を一緒に水から取り出して、眼科用顕微鏡を利用して実験部周辺５ｍｍの範囲内の血管を観測し計数して、撮影した。結果を図８に示した。
【００７９】
実験結果に示されたように、ビンブラスチン類化合物、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物、及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、何れもＶＥＧＦ誘導された新生鶏胚漿尿膜血管にダメージを与えることができた。また、ビンブラスチン類化合物と比べて、上記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、より効果的にＶＥＧＦ誘導された新生鶏胚漿尿膜血管にダメージを与えることができた。
【００８０】
実施例１４  ビンブラスチン誘導体のラット動脈環微小血管新生に対する抑制作用
実験方法：文献（Ｓｒｉｎｉｖａｓ Ｒｅｄｄｙ Ｂｏｒｅｄｄｙ, ｅｔ ａｌ. ＰＬｏＳ Ｏｎｅ. ２０１１, ６（１０）: ｅ２５７９９）に記載の方法を参考して、１００μＬの予冷し溶解したマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）を予冷した４８ウェルプレートに添加して、３７℃である細胞インキュベーターに３０分間培養して、マトリゲルを完全に固化させた。この間に、ＳＤラットをＣＯ２によって安楽死させた後に、７５％のアルコールで３ｍｉｎ間浸けて、無菌台上にラットの胸腔を切り開いて、胸部大動脈を分離した。分離し得た胸部大動脈をＰＢＳで血痕のないまでに洗浄して、ＤＭＥＭ/Ｆ１２完全培養液に移した。その後、はさみや鉗子で大動脈周りに脂肪組織と結合組織を取り除いて、そして、眼科ハサミで胸部大動脈を約１ミリメートルの小片に切断して、マトリゲルに接種した。血管リングに再度に１００μＬの予冷したマトリゲルを設置して、再度に３７℃である細胞インキュベーターに３０分間培養した。その後、ブランク対照群と投薬群に分けて、投薬群に対してウェルに２ｎｍｏｌ/Ｌビンブラスチン類化合物並びにビンブラスチン誘導体ＪＪ−ＣＣＪ、ＢＸ−ＣＣＪ、ＪＪ−ＣＣＲＢ、ＢＸ−ＣＣＲＢ、ＪＪ−ＣＣＦＮ、ＢＸ−ＣＣＦＮ、ＪＪ−ＣＣＸＪ及びＢＸ−ＣＣＸＪのそれぞれを含有したＤＭＥＭ/Ｆ１２完全培養液（１００ｎｇ/ｍＬ ＶＥＧＦを含有）を添加した。１日おきに液を入れ替えて、液を４回入れ替えたら、倒立顕微鏡下で撮影して、発芽管を計数した。結果は図９に示した。
【００８１】
実験結果に示されたように、ビンブラスチン類化合物、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物、及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、いずれも、ラット動脈環微小血管の新生を抑制することができた。また、ビンブラスチン類化合物と比べると、上記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、より効果的にラット動脈環微小血管の新生を抑制することができた。
【００８２】
実施例１５  ビンブラスチン誘導体の既に形成したラット胸部大動脈環微小血管に対するダメージ作用
実験方法：文献（Ｄｅｎｇ ＺＴ, ｅｔ ａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２０１１, ８２:１８３２−４２）に記載の方法を参考し改良して、１００ μＬの予冷し溶解したマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）を予冷した４８ウェルプレートに添加して、３７℃である細胞インキュベーターに３０分間培養して、マトリゲルを完全に固化させた。この間に、ＳＤラットをＣＯ２によって安楽死させた後に、７５％のアルコールで３ｍｉｎ間浸けて、無菌台上にラットの胸腔を切り開いて、胸部大動脈を分離した。分離し得た胸部大動脈をＰＢＳで血痕のないまでに洗浄して、ＤＭＥＭ/Ｆ１２完全培養液に移した。その後、はさみや鉗子で大動脈周りに脂肪組織と結合組織を取り除いて、そして、眼科ハサミで胸部大動脈を約１ミリメートルの小片に切断して、マトリゲルに接種した。血管リングに再度に１００μＬの予冷したマトリゲルを設置して、再度に３７℃である細胞インキュベーターに３０分間培養した後に、ＤＭＥＭ/Ｆ１２完全培養液（１００ｎｇ/ｍＬ ＶＥＧＦを含有）を加えた。１日おきで液を入れ替えて、微小血管が形成されたら、ウェルに２ ｎｍｏｌ/Ｌ ビンブラスチン類化合物、又はビンブラスチン誘導体ＪＪ−ＣＣＪ、ＢＸ−ＣＣＪ、ＪＪ−ＣＣＲＢ、ＢＸ−ＣＣＲＢ、ＪＪ−ＣＣＦＮ、 ＢＸ−ＣＣＦＮ、ＪＪ−ＣＣＸＪ、ＢＸ−ＣＣＸＪをそれぞれ含有したＤＭＥＭ/Ｆ１２完全培養液を添加して、２４ｈ後に倒立顕微鏡下で撮影して、発芽管を計数した。結果は図１０に示した。
【００８３】
実験結果に示されたように、ビンブラスチン類化合物、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物、及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、何れも既に形成したラット動脈環微小血管にダメージを与えることができた。また，ビンブラスチン類化合物と比べて、上記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、より効果的に既に形成したラット動脈環微小血管にダメージを与えることができた。
【００８４】
実施例１６  ビンブラスチン誘導体のマトリゲル塞栓モデル血管新生に対する抑制作用
実験方法：文献（Ｎａｓｉｍ Ａｋｈｔａｒ, ｅｔ ａｌ. Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ. ２００２, ５: ７５−８０）に記載の方法を参考して、５００μＬの予冷したマトリゲルを用意して，５００ｎｇのＶＥＧＦと１５０単位のヘパリンを添加して、ビンブラスチン類化合物並びにビンブラスチン誘導体ＪＪ−ＣＣＪ、ＢＸ−ＣＣＪ、ＪＪ−ＣＣＲＢ、ＢＸ−ＣＣＲＢ、ＪＪ−ＣＣＦＮ、ＢＸ−ＣＣＦＮ、ＪＪ−ＣＣＸＪ及びＢＸ−ＣＣＸＪのそれぞれ１:１（Ｖ/Ｖ）比率で混合して、薬物最終濃度が１００ｐｍｏｌ/Ｌとなるように、６週齢のＢＡＬＢ/Ｃ ｎｕ/ｎｕヌードマウスの背部皮下に接種した。ＰＢＳ群をブランク対照群として用意して、各群は６匹とした。通常のように１４日間育種した後に、ヌードマウスをＣＯ２で安楽死させた。マトリゲル塞栓を慎重に剥離した直後に、４％のパラホルムアルデヒドで固着した。２４ ｈ後に、パラフィン切片とＨ＆Ｅ染色を行って、切片について倒立顕微鏡下で血管形成状況を観測し撮影して、新生血管の数を計数した。その結果は、図１１に示した。
【００８５】
実験結果に示されたように、ビンブラスチン類化合物、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物、及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、いずれも、マトリゲル塞栓モデル血管の新生を抑制することができた。また、ビンブラスチン類化合物と比べて、上記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、より効果的にマトリゲル塞栓モデル血管の新生を抑制することができた。
【００８６】
実施例１７  ビンブラスチン誘導体の既に形成したマトリゲル塞栓モデル血管に対するダメージ作用
実験方法：文献（Ｎａｓｉｍ Ａｋｈｔａｒ, ｅｔ ａｌ. Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ. ２００２, ５: ７５−８０）に記載の方法を参考して、５００μＬの予冷したＭａｔｒｉｇｅｌを用意して，５００ｎｇのＶＥＧＦと１５０単位のヘパリンを添加して、６週齢のＢＡＬＢ/Ｃ ｎｕ/ｎｕヌードマウスの背部皮下に接種した。一週後に、１日おきでビンブラスチン類化合物並びにビンブラスチン誘導体ＪＪ−ＣＣＪ、ＢＸ−ＣＣＪ、ＪＪ−ＣＣＲＢ、ＢＸ−ＣＣＲＢ、ＪＪ−ＣＣＦＮ、ＢＸ−ＣＣＦＮ、ＪＪ−ＣＣＸＪ及びＢＸ−ＣＣＸＪのそれぞれを尾静脈注射した。薬物濃度は、何れも１ｍｇ/ｋｇであった。生理食塩水のをブランク対照群として設立して、各群は６匹とした。投薬７回後に、ヌードマウスをＣＯ２で安楽死させた。マトリゲル塞栓を慎重に剥離した直後に、４％のパラホルムアルデヒドで固着した。２４ｈ後に、パラフィン切片とＨ＆Ｅ染色を行って、切片について倒立顕微鏡下で血管形成状況を観測し撮影して、新生血管の数を計数した。その結果は、図１２に示した。
【００８７】
実験結果に示されたように、ビンブラスチン類化合物、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物、及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、いずれも既に形成したマトリゲル塞栓モデル血管にダメージを与えることができた。また、ビンブラスチン類化合物と比べて、上記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、より効果的に既に形成したマトリゲル塞栓モデル血管にダメージを与えることができた。
【００８８】
実施例１８  ビンブラスチン誘導体のラット角膜マイクロポケット血管新生に対する抑制作用
実験方法：文献（Ｙｉ ＺＦ, ｅｔ ａｌ. Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ. ２００９, １２４: ８４３−８５２）に記載の方法を参考して、ラット角膜マイクロポケットモデルを構築した。スクラルファートとＰｏｌｙ−ＨＥＭＡを用いてＶＥＧＦ２００ｎｇ/粒を含有する徐放性粒子を調製して，ＳＤラットを２％のペントバルビタールナトリウムで麻酔した後に、ＶＥＧＦ徐放性粒子を角膜マイクロポケットに注射して、手術後にクロラムフェニコールを用いて目を塗った。手術後の翌日に、ラットをランダムにＰＢＳ群、ビンブラスチン類化合物群、ＪＪ−ＣＣＪ群、 ＢＸ−ＣＣＪ群、ＪＪ−ＣＣＲＢ群、 ＢＸ−ＣＣＲＢ群、ＪＪ−ＣＣＦＮ群、ＢＸ−ＣＣＦＮ群、ＪＪ−ＣＣＸＪ群、及びＢＸ−ＣＣＸＪ群に分けて、各群は１０匹として、投薬量は、いずれも１ｍｇ/ｋｇであった。１日おきで、尾静脈投薬１回として、投薬７回後に、実体顕微鏡にて血管の成長状況を観測して、新生血管の長さ（ＶＬ）とクロックアワー数（ＣＮ）を計数して、下記の式で血管の面積を計算した：Ａｒｅａ （ｍｍ２） ＝ ０.２× π × ＶＬ（ｍｍ） × ＣＮ （ｍｍ）。結果は、図１３に示した。
【００８９】
実験結果に示されたように、ビンブラスチン類化合物、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物、及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、何れもラット角膜マイクロポケット血管の新生を抑制することができた。また、ビンブラスチン類化合物と比べて、上記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、より効果的にラット角膜マイクロポケット血管の新生を抑制することができた。
【００９０】
実施例１９  ビンブラスチン誘導体の既に形成したラット角膜マイクロポケット血管に対するダメージ作用
実験方法：文献（Ｙｉ ＺＦ, ｅｔ ａｌ. Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ. ２００９, １２４（４）: ８４３−８５２）に記載の方法を参考して、ラット角膜マイクロポケットモデルを構築した。スクラルファートとＰｏｌｙ−ＨＥＭＡを用いてＶＥＧＦ２００ｎｇ/粒を含有する徐放性粒子を調製して，ＳＤラットを２％のペントバルビタールナトリウムで麻酔した後に、ＶＥＧＦ徐放性粒子を角膜マイクロポケットに注射して、手術後にクロラムフェニコールを用いて目を塗った。手術後の翌日に、ラットをランダムにＰＢＳ群、ビンブラスチン類化合物群、ＪＪ−ＣＣＪ群、ＢＸ−ＣＣＪ群、ＪＪ−ＣＣＲＢ群、ＢＸ−ＣＣＲＢ群、ＪＪ−ＣＣＦＮ群、ＢＸ−ＣＣＦＮ群、ＪＪ−ＣＣＸＪ群、及びＢＸ−ＣＣＸＪ群に分けて、各群は、１０匹とした。まずは一週間フィードして、血管が新生した後に、１日おきで尾静脈投薬１回として、投薬量は、いずれも１ ｍｇ/ｋｇであった。投薬７回後に、実体顕微鏡にて血管の成長状況を観測して、新生血管の長さ（ＶＬ）とクロックアワー数（ＣＮ）を計数して、下記の式で血管の面積を計算した：Ａｒｅａ （ｍｍ２） ＝ ０.２ × π × ＶＬ （ｍｍ） × ＣＮ （ｍｍ）。結果は、図１４に示した。
【００９１】
実験結果に示されたように、ビンブラスチン類化合物、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物、及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、何れも既に形成した的ラット角膜マイクロポケット血管にダメージを与えることができた。また、ビンブラスチン類化合物と比べて、上記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、より効果的に既に形成した的ラット角膜マイクロポケット血管にダメージを与えることができた。
【００９２】
実施例２０  ビンブラスチン誘導体のＣＩＡマウス滑膜血管新生に対する抑制作用
実験方法：文献（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＩＫ， ｅｔ ａｌ. Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２０００， ３０: １５６８−１５７５）に記載の方法によってＣ５７マウスＣＩＡ （抗原誘導性関節炎）モデルを構築して、毎匹１００μＬの量で、尾根部から、１００μｇのＩＩ型コラーゲンを含有する乳液を皮内マルチポイント励起注射した。対照群について、モデル群と同様な方法で、生理食塩水を注射した。マウスがモデルを構築したらランダムにグループ化して、各群は１０匹とした。モデル構築の翌日に、一日おきで、尾静脈によりそれぞれＰＢＳ、ビンブラスチン類化合物、ＪＪ−ＣＣＪ、ＢＸ−ＣＣＪ、ＪＪ−ＣＣＲＢ、ＢＸ−ＣＣＲＢ、ＪＪ−ＣＣＦＮ、ＢＸ−ＣＣＦＮ、ＪＪ−ＣＣＸＪ又はＢＸ−ＣＣＸＪを注射して、投薬量は１.０ｍｇ/ｋｇであった。継続的に７回投薬したら実験を終了して、マウスをＣＯ２で安楽死させて、後ろ足の右膝を剥がし取って、滑膜組織を単離した。４％のパラホルムアルデヒドで固着した後に、通常免疫組織化学方法（Ｙａｊｕａｎ Ｓｏｎｇ， ｅｔ ａｌ. Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ. ２０１２, １５: ４２１−４３２）によって滑膜組織の血管新生を検出して、ＣＤ３１とラベルした。微小血管の評価基準は、文献（Ｔａｔｓｕｔａ Ｍ, ｅｔ ａｌ. Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ, １９９９, ８０: ３９６−３９９）を参考した：ブラウンも染められたシングル内皮細胞又は内皮細胞クラスターは、一つの血管として計数して、ルーメンが８個赤血球より大きくて、厚い筋層を有する血管エリアにおける血管について計数しないとした。計数方法：まずは低倍率（×１０）の顕微鏡によって３つの血管密度の高いエリアを選択して、そして高倍率（×４０）の顕微鏡の下で各エリアにおける微小血管の密度（ＭＶＤ）値を計数した。結果は、図１５に示した。
【００９３】
実験結果に示されたように、ビンブラスチン類化合物、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、いずれも、ＣＩＡモデルマウスの滑膜組織の血管新生を抑制することができた。また、ビンブラスチン類化合物と比べて、上記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、より効果的にＣＩＡモデルマウス滑膜組織の血管新生を抑制することができた。
【００９４】
実施例２１  ビンブラスチン誘導体の、既に形成したＣＩＡマウス滑膜血管に対するダメージ作用
実験方法：文献（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＩＫ, ｅｔ ａｌ. Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ, ２０００, ３０: １５６８−１５７５）に記載の方法によってＣ５７マウスＣＩＡ （抗原誘導性関節炎）モデルを構築して、毎匹１００μＬの量で、尾根部から、１００μｇのＩＩ型コラーゲンを含有する乳液を皮内マルチポイント励起注射した。対照群について、モデル群と同様な方法で、生理食塩水を注射した。マウスがモデルを構築したらランダムにグループ化して、各群は１０匹とした。モデルを構築した後にまずは７日間フィードフィードして、そして一日おきで、尾静脈によりそれぞれＰＢＳ、ビンブラスチン類化合物、ＪＪ−ＣＣＪ、ＢＸ−ＣＣＪ、ＪＪ−ＣＣＲＢ、ＢＸ−ＣＣＲＢ、ＪＪ−ＣＣＦＮ、ＢＸ−ＣＣＦＮ、ＪＪ−ＣＣＸＪ又はＢＸ−ＣＣＸＪを注射して、投薬量は１.０ｍｇ/ｋｇであった。継続的に７回投薬したら実験を終了して、マウスをＣＯ２で安楽死させて、後ろ足の右膝を剥がし取って、滑膜組織を単離した。４％のパラホルムアルデヒドで固着した後に、通常免疫組織化学方法（Ｙａｊｕａｎ Ｓｏｎｇ, ｅｔ ａｌ. Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ. ２０１２, １５: ４２１−４３２）によって滑膜組織の血管新生を検出して、ＣＤ３１とラベルした。微小血管の評価基準は、文献（Ｔａｔｓｕｔａ Ｍ, ｅｔ ａｌ. Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ, １９９９, ８０: ３９６−３９９）を参考した：ブラウンも染められたシングル内皮細胞又は内皮細胞クラスターは、一つの血管として計数して、ルーメンが８個赤血球より大きくて、厚い筋層を有する血管エリアにおける血管については計数しないこととした。計数方法：まずは低倍率（×１０）の顕微鏡によって３つの血管密度の高いエリアを選択して、そして高倍率（×４０）の顕微鏡の下で各エリアにおける微小血管の密度（ＭＶＤ）値を計数した。結果は、図１６に示した。
【００９５】
実験結果に示されたように、ビンブラスチン類化合物、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物、及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、いずれも、既に形成したＣＩＡモデルマウス滑膜組織の血管にダメージを与えることができた。また、ビンブラスチン類化合物と比べて、上記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、より効果的に既に形成したＣＩＡモデルマウス滑膜組織の血管にダメージを与えることができた。
【００９６】
上記の実験結果に証明されたように、本発明のビンブラスチン誘導体は、体内外いおいて悪性腫瘍、糖尿病性網膜症及び関節リウマチ等疾患の治療と予防に応用することができ、特に、上記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、悪性腫瘍、糖尿病性網膜症及び関節リウマチ等疾患に対してより良好な治療又は予防効果を有する。
【００９７】
上記実施例は、本発明を好ましい実施態様であり、本発明は上述した実施態様に限定されるものではなく、本発明の精神本質と旨から逸脱していない範囲内に行った変更、修飾、置換、組み合わせ、簡化は、何れも同等の置換方式と見なしべき、本発明の請求範囲内に含まれるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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