(57)【要約】ビタミンＢ１２結合タンパク質である内因子に関して、キュビリン受容体を標的とする癌細胞検出系。Ｂ１２結合体と内因子とを、患者の血中に注入する。内因子のキュビリンへの結合により、受容体を介するエンドサイトーシスおよび癌細胞による細胞の内在化が可能になり、それにより、造影を介する検出または処置が可能になる。
2016528299.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非経腸投与用の医薬製剤であって、内因子および、Ｂ１２またはその類似体、ならびに非経腸投与用の無菌の薬学的に許容される担体を含み、該Ｂ１２またはその類似体が検出可能な標識および/または治療剤に結合している、医薬製剤。
【請求項２】
静脈内投与用の医薬製剤であって、内因子および、Ｂ１２またはその類似体、ならびに静脈内投与用の薬学的に許容される担体を含み、Ｂ１２またはその類似体が検出可能な標識および/または治療剤に結合している、医薬製剤。
【請求項３】
内因子がＢ１２またはその類似体に結合している、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
検出可能な標識が放射性核種である、請求項１または２記載の組成物。
【請求項５】
放射性核種が銅-６４、ジルコニウム-８９、イットリウム-８６、イットリウム-９０、テクネチウム-９９ｍ、ヨウ素-１２５、ヨウ素-１３１、ルテチウム-１７７、レニウム-１８６およびレニウム-１８８からなる群から選択される、請求項１または２記載の組成物。
【請求項６】
放射性核種が治療剤でもある、請求項４記載の組成物。
【請求項７】
１種以上の薬学的に許容される希釈剤、賦形剤および/または担体を含む、請求項１または２記載の組成物。
【請求項８】
Ｂ１２の結合の部位が、ｅ位、ｂ位、リボシル基上の５’ヒドロキシル残基およびコバルトの位置からなる群から選択される、請求項１または２記載の組成物。
【請求項９】
リンカーをさらに含む、請求項１または２記載の組成物。
【請求項１０】
対象における腫瘍の検出方法であって:
a)  該対象に内因子およびＢ１２を含む組成物を投与することを含み、ここで、該Ｂ１２は検出可能な標識に結合しており;
b)  対象において、該組成物がキュビリンに結合していることを検出するために検出可能な標識を検出することを含み、ここで、典型的にはキュビリンを発現しない組織中に検出可能な標識が存在することが、該対象に腫瘍が存在することを示す、方法。
【請求項１１】
対象における腫瘍の検出方法であって:
a)  内因子およびＢ１２を含む組成物を対象に投与することを含み、ここで、該Ｂ１２は検出可能な標識に結合しており;
b)   対象において該組成物がキュビリンに結合していることを検出するために検出可能な標識を検出することを含み、ここで、キュビリンを発現することが知られている細胞を含む組織において検出可能な標識が非対称に存在することが、該対象に腫瘍が存在することを示す、方法。
【請求項１２】
腫瘍が肺癌を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
腫瘍が腎細胞癌を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
該腫瘍がキュビリンを発現する、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１５】
投与が静脈内投与を含む、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１６】
検出可能な標識が放射性核種である、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１７】
検出が、ポジトロン放出断層撮影、単一光子放射断層撮影、ガンマカメライメージングまたは直線形スキャンを用いて放射性核種標識を検出することを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
工程（ａ）より前または同時に遊離のＢ１２が投与される、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１９】
該組成物が腎臓中の腎細胞に結合することを防ぐために、工程（ａ）より前または同時にＬ−リジンが投与される、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項２０】
転移性の腎細胞癌の検出を可能にするために、工程（ａ）より前または同時にＬ−リジンが投与される、請求項１３記載の方法。
【請求項２１】
対象における腫瘍を処置する方法であって、内因子およびＢ１２を含む組成物を対象に投与することを含み、該Ｂ１２が治療剤に結合している、方法。
【請求項２２】
該腫瘍が、肺癌および腎細胞癌からなる群から選択される腫瘍を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該腫瘍が腎細胞癌を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
該腫瘍がキュビリンを発現する、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
投与が静脈内投与を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２６】
該治療剤が放射性核種である、請求項２１記載の方法。
【請求項２７】
該組成物の投与より前または同時に、遊離のＢ１２が投与される、請求項２１記載の方法。
【請求項２８】
腎臓中の腎細胞に該組成物が結合することを防ぐために、該組成物の投与の前または同時に、Ｌ−リジンが投与される、請求項２１記載の方法。
【請求項２９】
転移性腎細胞癌の検出を可能にするために、該組成物の投与の前または同時に、Ｌ−リジンが投与される、請求項２３記載の方法。
【請求項３０】
対象においてキュビリンを発現する細胞にＢ１２を送達する方法であって、ＩＦおよび
Ｂ１２の複合体を対象に静脈内投与することを含む、方法。
【請求項３１】
細胞が癌細胞である、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
Ｂ１２が検出可能な標識および/または治療剤に結合している、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
キュビリンの機能を調節する方法であって、ＩＦおよびＢ１２の複合体を該対象に静脈内投与することを含む、方法。
【請求項３４】
Ｂ１２が治療剤に結合している、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
キュビリンの機能が遮断されている、請求項３３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互引用
本出願は、米国仮出願第６１/８６８,８４１号（２０１３年８月２２日出願）に基づく優先権を主張するものであり、その全体は引用により本明細書に包含される。
【０００２】
本発明は、放射性標識されたＢ１２結合体および内因子を含む、非経口投与用の、診断および/治療用組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
腎がん学会によれば、米国では、２０１２年に、１３０万人を超える人が癌と診断された。これらの人々のうち、５００００人が腎がんに罹患していると診断され、腎細胞癌(ＲＣＣ)が最も一般的な種類である。ＲＣＣは、初期段階ではごく僅かしか症状を示さないため、腫瘍が大きく成長するか、または腫瘍細胞が体の他の部分に転移するまで、検出されないことがしばしばである。ＲＣＣ患者の３０〜４０％は、転移した腫瘍を有し、未処置の転移腫瘍を有する患者の５年生存率は最大で１８％であることから、初期の検出が非常に重要である。
【０００４】
腫瘍組織の部位特異的な薬物標的化は、処置応答を高める大きな可能性があり、同時に、副作用を軽減させる可能性がある。Ｂ１２取り込み経路は、特異的に薬物を送達する可能性があるため、ここ数年間で関心が高まっている。Ｂ１２は、ＤＮＡのメチル化およびメチオニンの産生において機能するため、細胞成長および増殖に重要な、非毒性の水溶性ビタミンである。
【０００５】
従来の診断用造影技術は、潜在的に腫瘍を有している可能性のあるブタ、マウス、イヌおよびヒトにおけるＢ１２要求の増大を追うために、単一光子放射断層撮影(ＳＰＥＣＴ) を用いていた。これは、インジウム-１１１およびテクネチウム-９９ｍで標識したＢ１２結合体を用いて行った。ＰＥＴ画像法は近年、ＴＣＩＩ/ＣＤ３２０ エンドサイトーシスを介したＢ１２-Ｃｕ６４の細胞取り込みを検出するのに用いられている。
【０００６】
がん細胞は、その過剰増殖のために、栄養素をより多く必要とする特徴がある。これらの栄養素にはビタミンＢ１２ (Ｂ１２)が含まれる。Ｂ１２は、消化の間に吸収され、３つの結合タンパク質：ハプトコリン(ＨＣ)、トランスコバラミンＩＩ (ＴＣＩＩ)および内因子 (ＩＦ)を介して血漿に輸送される。血中に入ると、Ｂ１２は、ＴＣＩＩまたはＨＣに結合する。該ＴＣＩＩ受容体によって、Ｂ１２を細胞内に取り込むことが可能になる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
Ｂ１２標識されたＣｕ６４は、ＴＣＩＩ受容体である、ＣＤ３２０を標的とするのに用いられている。しかし、ＴＣＩＩ受容体は全身で発現するため、造影では高いバックグラウンドが観察された。したがって、高いバックグラウンドという問題を解決し、それにより癌を正確に検出するための新しい造影技術が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
局面の一において、本明細書は、非経腸投与用の医薬製剤を含む。該医薬製剤は、内因子およびＢ１２またはその類似体ならびに非経腸投与用の薬学的に許容される担体を含み、ここで、Ｂ１２またはその類似体は、検出可能な標識および/または治療剤に結合している。
【０００９】
他の局面において、本明細書は、静脈内投与用の医薬製剤を含む。該医薬製剤は、内因子およびＢ１２またはその類似体、ならびに、静脈内投与用の薬学的に許容される担体を含み、ここで、該Ｂ１２またはその類似体は、検出可能な標識および/または治療剤に結合している。
【００１０】
さらに他の局面において、本明細書は、対象における腫瘍の検出方法を含む。該方法は、内因子およびＢ１２を含む組成物を対象に投与することおよび、対象におけるキュビリンへの該組成物の結合を検出することを含み、ここで、Ｂ１２は検出可能な標識に結合しており、典型的にはキュビリンを発現しない組織における、検出可能な標識の存在は、該対象中に腫瘍が存在することを示す。
【００１１】
なおさらなる他の局面において、本明細書は、対象における腫瘍の検出方法を含む。該方法は、該対象に内因子およびＢ１２を含む組成物を投与することおよび、対象中のキュビリンへの該組成物の結合を検出することを含み、ここで、Ｂ１２は検出可能な標識に結合しており、キュビリンを発現することが知られている細胞を含む組織に検出可能な標識が非対称に存在することは、対象に腫瘍が存在することを示す。
【００１２】
異なる局面において、本明細書は、対象における腫瘍の処置方法を含む。該方法は、内因子およびＢ１２を含む組成物を対象に投与することを含み、ここで、Ｂ１２は治療剤に結合している。
【００１３】
他の局面において、本明細書は、対象において、キュビリンを発現する細胞にＢ１２を送達する方法を含む。該方法は、ＩＦおよびＢ１２の複合体を対象に静脈内投与することを含む。
【００１４】
さらなる局面において、本明細書は、キュビリンの機能を遮断する方法を含む。該方法は、ＩＦおよびＢ１２の複合体を対象に静脈内投与することを含む。
【００１５】
本願ファイルは、少なくとも１つの、カラーで出力された図を含む。カラー図を含むこの出願公開の複製は、要求に応じて、必要な費用を支払えば特許庁より提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】コリン環の４つの窒素原子、ジメチルベンゾイミダゾール(ＤＭＢ)および、シアニド、メチルまたはデオキシアデノシル基であってよい、Ｘ基で配位されているＣｏ (ＩＩＩ)原子を示すビタミンＢ１２の構造を示す。
【図２】Ｂ１２の摂食による取り込み経路を示すスキームを表す(ＨＣ=ハプトコリン、ＩＦ=内因子、ＣＢ=キュビリン、ＡＭ=アムニオンレス、ＭＲＰ１=多剤耐性関連タンパク質１、ＭＧ=メガリン)。
【図３】ＩＦ-Ｂ１２プローブ合成のスキームを表す。
【図４】１,１-ビスチアゾレート-(１,４)-ジアミノブタン反応のスキームを表す。i. １６時間、アルゴン下、無水ＤＣＥ中のＮａＢＨ(ＣＯＯＣＨ３)３; ii. ３時間、水中の１０％ ＴＦＡ、１０％ ＭｅＯＨ。
【図５】Ｔｒ （４.３９分間）を用いた、ＲＰ−ＨＰＬＣトレースを表す。
【図６】４００MHz NMRによる、Ｄ２Ｏ中の１の１Ｈ−ＮＭＲを表す。‡はＭｅＯＨ不純物である。
【図７】Ｔｒ （１１.９分間）を用いた、２のＲＰ−ＨＰＬＣを表す。
【図８】０.１％ ＴＦＡを添加したＣＨＣＡマトリクス (１０mg/mL ＣＨＣＡ)を用いた２のＭＡＬＤＩ-ＴｏＦを表す。予測したm/zは１６４０m/zであり、実際のm/zは１６３９.９２３であった。
【図９】４００MHz ＮＭＲ機器による、Ｄ２Ｏ中の２の１Ｈ−ＮＭＲを表す。Ｂ１２についての特徴的な５つのピークが６〜７.５ ppmに存在する。
【図１０】Ｔｒ （５.２８分間）を用いた、２’のＲＰ−ＨＰＬＣを表す。
【図１１】０.１％ ＴＦＡを添加したＣＨＣＡマトリクス(１０mg/mL ＣＨＣＡ)を用いた、２’のＭＡＬＤＩ-ＴｏＦを表す。予測されるm/zは１９０７m/zであり、実際のm/z値は１９０７.６１５m/zであった。
【図１２】４８８nmで発光し、λmaxが５６６nmであるときの、２’の発光プロファイルを表す。スリットの幅は４nmであった。
【図１３】対象に投与する前に、内因子に事前に結合していてよい放射性標識したＢ１２結合体の態様のスキームを表す。
【図１４】金属とキレート化しているＬ−プロパルギルグリシンの構造を表す。「Ｍ」は、９９ｍＴｃであってよい。
【図１５】５’−ＯＨリボースが結合した、Ｂ１２結合体の構造を示す。
【図１６】ｂ位に結合を有するＢ１２結合体の構造を示す。
【図１７】コバルト-Ｃ結合を有する、Ｂ１２結合体の構造を示す。
【図１８】種々のＢ１２結合体の構造を示す。(Ａ)１は、リボースの５’−ＯＨ上で修飾されたＢ１２結合体の構造である。(Ｂ) ２は、コバルトイオン上で修飾されたＢ１２結合体の構造である。（Ｃ）３は、ｂ位で修飾されたＢ１２結合体の構造である。(Ｄ) ４は、リボースの５’−ＯＨ上で修飾されたＢ１２結合体の構造である。
【図１９】＞１６０kDaのＢ１２結合体系の、受容体介在性の取り込みを示す。(Ａ)蛍光性のタグを付した抗キュビリン抗体を用いた免疫染色。(Ｂ) CypHer 5E蛍光色素でタグ付けした１ (１Ｃ５Ｅ)の取り込み。(Ｃ) １Ｃ５Ｅ (赤) とＩＦ４０５ (青)の共局在。共局在の領域は紫で示される。(Ｄ) ＢｅＷｏ細胞における２Ｃ５Ｅ (赤) およびＩＦ４０５ (青)の取り込み。共局在の領域は紫で示される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、キュビリン/ＩＦ介在取り込みシステムを用いた、キュビリン発現細胞を標的とするための組成物を含む。とりわけ、ＩＦおよびＢ１２結合体を含む組成物は、対象の血液を介して投与される。該組成物は、癌細胞の造影および/または処置に使用し得る。本出願以前には、ＩＦ-Ｂ１２を非経口経路（すなわち静脈内）で投与し、キュビリンに有効に結合させ得ることは知られていなかった。Ｂ１２の摂食による取り込み経路において、Ｂ１２は口腔内で食物から放出されるときに、ハプトコリン (ＨＣ) がＢ１２に結合し、胃を通って小腸まで輸送する。ｐＨの上昇およびプロテアーゼの存在により、ＨＣはＢ１２を放出し、次いで、Ｂ１２に内因子 (ＩＦ)が結合する。その後、該ＩＦ-Ｂ１２は、十二指腸内の回腸細胞上に見られるキュビリン受容体に結合するまで小腸を移動する。Ｂ１２取り込み経路において、ＩＦが血中に存在することはなく; ＩＦは消化管内にのみ存在する。したがって、静脈内投与したＩＦ-Ｂ１２が消化管の外側に存在し、キュビリン（すなわち非回腸キュビリン）に結合できることは予期できないことであった。
【００１８】
本発明の発明者は、キュビリン受容体に結合することができる、ＩＦに事前に結合した標識化Ｂ１２プローブが、標的特異性ならびにバックグラウンド発光の有意な低下の両方を達成することを見出した。キュビリンはトランスコバラミン（ＩＩ）（ＴＣＩＩ）と異なり、全ての組織には発現しないため、部位特異的な取り込みについて、キュビリン受容体を標的化することにより、従来のＢ１２受容体介在性取り込み系よりも特異性が上昇し得る。例えば、ＩＦに結合していないＢ１２プローブは、体中に存在するＴＣＩＩに結合することにより高いバックグラウンドをもたらし、特異性が低い。
【００１９】
I. 組成物
本発明は、内因子およびＢ１２またはその類似体を含む組成物を含み、ここで、Ｂ１２またはその類似体は、検出可能な標識および/または治療剤に結合している。Ｂ１２類似体は、非修飾バージョンと比較して、生体利用可能性、可溶性、安定性、扱いやすさまたはそれらの組み合わせを改善するために修飾されていてよい。したがって、他の局面において、本発明の組成物は、修飾された、Ｂ１２またはＢ１２類似体を含む。さらに他の局面において、本発明の組成物は、Ｂ１２またはＢ１２類似体のプロドラッグを含む。
【００２０】
本発明の組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤をさらに含んでいてよい。さらに本発明の組成物は、保存料、溶解剤、安定化剤、塩（本発明の物質は、それ自体が薬学的に許容される塩の形態で提供されてよい）、緩衝剤または抗酸化剤を含んでいてよい。
【００２１】
(a) ビタミンＢ１２ (コバラミン)
ビタミンＢ１２は、高度に複雑な構造を有する水溶性のビタミンであり、中心コバルト(III)原子に結合する４つのピロリンエレメントで構成される中央平面コリン環を含む。本明細書を通じて、ビタミンＢ１２、Ｂ１２およびコバラミンは、互変可能的に用いてよく、これを図１に表す。
【００２２】
ビタミンＢ１２の構造において、中心コバルト(III)原子は６配位性であり、エクアトリアル位がコリン巨大環の窒素原子で占められている。「下位」、「α」軸部位は(通常)、５’,６’-ジメチルベンズイミダゾール (ＤＭＢ) 塩基由来のイミダゾール窒素原子が占めており、一方、「上位」「β」軸部位は、種々のＸ基(例えばＣＮ−、ＣＨ３−、Ａｄｏ−、ＳＣＮ−、ＳｅＣＮ−、ＳＯ３−およびチオ尿素)が占めていてよい。該コリン環は、７つのアミド側鎖、３つのアセトアミド(ａ、ｃ、ｇ) および４つのプロピオンアミド(ｂ、ｄ、ｅ、ｆ)を取り込む。４つのピロール環は、通常、図１に示すように、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤと示される。
【００２３】
いくつかの官能基は、Ｂ１２上での修飾に容易に利用可能であり、該官能基としては、プロピオンアミド、アセトアミド、ヒドロキシル基、コバルト(III)イオンおよびリン酸基が挙げられる。したがって、本発明のＢ１２結合体は、Ｂ１２がＩＦに結合するものであれば、プロピオンアミド、アセトアミド、ヒドロキシル基、コバルト（ＩＩＩ）イオンおよびリン酸基上で修飾されていてよい。本発明のＢ１２結合体の修飾部位の非限定的な例としては、Ａ環上のａ位またはｂ位、Ｂ環上のｃ位またはｄ位、Ｃ環上のｅ位、Ｄ環上のｇ位、ｆ位、リン酸基、リボース上の５’−または２’−ヒドロキシルおよびコバルトイオンが挙げられる。修飾の好ましい部位としては、Ａ環上の部位、例えばｂ位、Ｃ環上の部位、例えばｅ位、リボースユニット上の部位、例えば５’−ヒドロキシル基、およびコバルトカチオンが挙げられる。特に、該ｅ位は、ＩＦとの相互作用が可能になるように修飾されていてよい。あるいは、該ｂ位は、ＴＣＩＩ結合を特異的に妨害するように修飾されていてよい。しかし、Ｂ１２のＩＦに対する結合親和性が維持されていれば、他の修飾部位を用いてもよい。好ましい修飾は、ＩＦに対する結合親和性は維持するが、ＴＣＩＩに対する結合親和性を低下させるものであり得る。例えば、Ｂ１２とＴＣＩＩの間の相互作用は、ｂ−モノカルボン酸の修飾後のｂ-プロピオンアミド部位を用いることによって妨害し得る。該修飾は、健康な細胞への、ＦＣＩＩベースの結合体の取り込みの割合を低下させ得る。
【００２４】
Ｂ１２を修飾する方法は当該分野で公知である。修飾方法の非限定的な例を次に示す。合成化学の分野で一般的である他の修飾方法も使用し得ることが考えられる。例えば、酸性条件下における、注意深く制御されたシアノコバラミンの部分的な加水分解により、所望のｂおよびｅの酸を得ることができる。５’−ＯＨの官能化の方法は、不安定なエーテルを提供する、シアノコバラミン ((ＣＮ)Ｃｂｌ) と無水物の反応によるものであってよい。結合の他の方法はRussell-Jones (国際公開第１９９９/０６５３９０号、引用によりその全体が本明細書に包含される)が記載しているように、カルバメートまたはカルボネート方法であってよい。端的には、５’位のヒドロキシル基が最初にカルボニル基等価物−１,１’−カルボニルジイミダゾール(ＣＤＩ)または１,１’−カルボニルビス(１,２,４−トリアゾール) (ＣＤＴ)−と反応した後、アミンまたはアルコールで処理することで、リボーステイルの５’−位にそれぞれカルバメートおよびカルボネートが得られる。あるいは、該５’−ＯＨ基は、２-ヨードキシ安息香酸(ＩＢＸ) / ２-ヒドロキシピリジン(ＨＹＰ)系を酸化剤として用いて、相当するカルボン酸に酸化した後、アミンと結合させてよい。他の有効な方法は、[１,３]双極子環状付加によるものであってよい。該５’−ＯＨは、好ましい脱離基に変換された後、アジドで置換される。得られた「クリック可能な」アジドは安定であり、アルキンへの銅触媒性およびストレイン促進[１,３]双極子環状付加(ＣｕＡＡＣまたはＳＰＡＡＣ)において高い活性を示す。この方法は、Chrominski et al, Chem Eur J 2013; 19: 5141-5148に詳述されており、当該文献は引用によりその全体が本明細書に包含される。特定の態様において、該５’−ＯＨはアジドに変換される。その後、アルキン含有グリシンを、「クリック」化学を用いて付加し、これを次いで、金属とキレート化させてよい。他の特定の態様において、アルキン含有グリシンをｂ位に付加し、これを金属とキレート化させてよい。さらになお他の特定の態様において、アルキル鎖リンカーを、金属キレート化に重要な基の前に付加してよい。
【００２５】
遷移金属の電子対供与体として作用させ、二金属錯体を得るために、コバルトイオンの官能化をアルキル化またはシアニド配位子性を用いて行ってよい。有機金属種の合成には、コバルト(ＩＩＩ) のコバルト(Ｉ) Ｂ１２への還元およびそれに続く、求電子剤: ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アシル、マイケル受容体、エポキシド等の反応が必要である。あるいは、還元は必要でない場合もあり、その代わりに、Ｃｕ（Ｉ）塩の存在下における、(ＣＮ)Ｃｂｌと末端アルキンとの直接の反応により、優れた収率でアセチリドを提供することができる。この方法により、２つの部分がＢ１２に結合することが可能になり、さらなる詳細はChrominski et al, J Org Chem 2014; 79: 7532-7542に記載されており、当該文献は引用によりその全体が本明細書に包含される。したがって、２つの検出可能な標識および/または治療剤がＢ１２に結合し得ることが考えられる。端的には、この方法を用いて、[１,３] 双極子アジド-アルキン環状付加を介したさらなる官能化に有用な要素である、「ダブルクリック可能な」ビタミンＢ１２を製造することができる。ＡＡＣ (ＣｕＡＡＣおよびＳＰＡＡＣ) をカルバメート法と組み合わせることにより、中心コバルトイオンおよび５’−位の両方での結合が可能になる。特定の態様において、アルキンを含むグリシンを、コバルトイオン上で付加してよく、これを、金属とキレート化させてよい。他の特定の態様において、アルキル鎖リンカーを、金属キレート化に機能する基の前に付加してもしなくてもよい。
【００２６】
Ｂ１２またはその類似体および検出可能な標識および/または治療剤は: i) 互いに直接結合している; ii) Ｂ１２またはその類似体と、検出可能な標識および/または治療剤との間に距離をおくために「リンカー」によって離されているか; またはiii) 担体内で、結合していない所望の検出可能な標識および/または治療剤と結合することのできる担体に結合している。検出可能な標識および治療剤のさらなる詳細は、セクションI(b) およびセクションI(c)にそれぞれ記載する。
【００２７】
局面の一において、Ｂ１２またはその類似体は、共有結合を介して直接的にまたは電子間相互作用を介して間接的に、検出可能な標識および/または治療剤に結合していてよい。電子間相互作用の非限定的な例としては、イオン結合、疎水性結合、水素結合またはファンデルワールス力が挙げられる。Ｂ１２またはその類似体が検出可能な標識および/または治療剤に直接結合している態様において、リンカーを用いてもまたは用いなくてもよい。
【００２８】
他の局面において、Ｂ１２またはその類似体は、担体内で、結合していない、所望の検出可能な標識および/または治療剤と結合することのできる担体に結合していてよい。適当な担体の非限定的な例としては、キレート剤が挙げられる。例えば、Ｂ１２またはその類似体は、所望の検出可能な標識および/または治療剤と結合できるキレート剤と結合していてよい。該キレート剤は、Ｂ１２またはその類似体に直接結合していても、またはＢ１２またはその類似体に結合しているリンカーに結合していてもよい。本明細書において、「キレート剤」は、単一の金属原子と複数の化学結合を形成する分子である。結合の形成前には、該基キレート剤は、１対を超える非共有原子対を有する。原子対を金属原子と共有することによって結合が形成される。
【００２９】
キレート剤の例としては、イミノジカルボキシルおよびポリアミノポリカルボキシル反応基、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(ＤＴＰＡ)、１,４,７,１０-テトラアザシクロドデカン-１,４,７,１０-テトラ酢酸 (ＤＯＴＡ)、テトラメチルヘプタンジオネート (ＴＭＨＤ)、２,４-ペンタンジオン、エチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム塩(ＥＤＴＡ)、エチレングリコール-Ｏ,Ｏ’-ビス(２-アミノエチル)-Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’-テトラ酢酸(ＥＧＴＡ)、Ｎ-(２-ヒドロキシエチル)エチレンジアミン-Ｎ,Ｎ’,Ｎ’-トリ酢酸三ナトリウム塩(ＨＥＤＴＡ)、ニトリロトリ酢酸 (ＮＴＡ)、および１,４,８,１１-テトラアザシクロテトラデカン-Ｎ,Ｎ’,Ｎ”,Ｎ’’’-テトラ酢酸(ＴＥＴＡ)、デフェロキサミン(ＤＦＯ)、１,４,７-トリアザシクロノナン-１,４,７-トリ酢酸 (ＮＯＴＡ)、有機酸およびアミノ酸、例えばクエン酸、酒石酸、グルコン酸およびグリシンならびにその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
キレート剤は、当該分野で一般的に知られている方法を用いてＢ１２またはその類似体に結合させてよい。キレート剤を結合する方法の非限定的な例を次に示す。合成化学の分野で一般的な、他の種々のキレート剤の結合方法も使用し得ると考えられる。例えば、Ｂ１２またはその類似体は、Ｂ１２またはその類似体の遊離アミノ基を、キレート剤の適当な官能基、例えばカルボキシル基または活性化エステルと反応させることにより、キレート剤に結合し得る。例えば、Ｂ１２またはその類似体は、エチレン鎖上でカルボキシル置換基により官能化されているときは、配位化学でよく用いられるキレート剤である、エチレンジアミンテトラ酢酸 (EDTA)に結合し得る。この種類のＥＤＴＡ誘導体の合成は、Arya et al., (Bioconjugate Chemistry. 2:323, 1991)により報告されており、ここで、配位している４カルボキシル基は、それぞれ、ｔ−ブチル基で遮断され、一方、エチレン鎖上のカルボキシル置換基は、Ｂ１２またはその類似体のアミノ基と自由に反応でき、それにより結合体を形成する。
【００３１】
Ｂ１２またはその類似体は、ペプチド性である、すなわち、固相ペプチド合成と競合性である金属キレート剤成分に結合していてよい。この場合、該キレート剤は、上述のＥＤＴＡと同じ方法でＢ１２またはその類似体に結合していてよい。
【００３２】
Ｂ１２またはその類似体は、結合しているキレート剤を介して、検出可能な標識と複合体化してよく、それによい、間接的に標識されたＢ１２またはその類似体との結合体が得られる。同様に、細胞傷害剤または治療剤も、キレート基を介してＢ１２またはその類似体に結合してよい。したがって、該キレート剤は、検出可能な標識または治療剤に直接結合していてよい。あるいは、介入するアミノ酸配列またはリンカーを用いて検出可能な標識または治療剤を該キレート剤に結合させてもよい。
【００３３】
他の局面において、Ｂ１２またはその類似体ならびに検出可能な標識および/または治療剤は、Ｂ１２またはその類似体と検出可能な標識および/または治療剤との間に距離ができるようにリンカーによって離されていてよい。Ｂ１２またはその類似体の、検出可能な標識および/または治療剤に対する結合は、Ｂ１２またはその類似体のＩＦに対する結合または検出可能な標識および/または治療剤の機能のいずれかに有害な影響を与えないものであることは、理解されるべきことである。適当なリンカーとしては、例えばＢ１２またはその類似体ならびに検出可能な標識および/または治療剤の両方に結合できるように反応性の基によって官能化されたアミノ酸鎖およびアルキル鎖が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
態様の一において、該リンカーは、アミノ酸側鎖を含んでいてよく、これはペプチドリンカーと称する。したがって、Ｂ１２またはその類似体を都合良く検出可能な標識および/または治療剤または担体に付加することができるリンカーを得る目的で、アミノ酸残基をＢ１２またはその類似体に付加してよい。アミノ酸残基のリンカーは、通常、少なくとも１残基であり、４０残基以上であってよく、１〜１０残基であることがしばしばである。連結に用いられる典型的なアミノ酸残基は、チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸およびアスパラギン酸等である。
【００３５】
他の態様において、アルキル鎖連結基は、Ｂ１２またはその類似体に、例えば、Ｂ１２またはその類似体のアミノ基の、該アルキル鎖上の最初の官能基、例えばカルボキシル基または活性化エステルとの反応によって結合していてよい。続けて、キレート剤をアルキル鎖に結合させて、アルキル鎖上の第二の官能基をキレート剤上の適当な基と反応させることにより、複合体の形成を完了させてよい。アルキル鎖の第二の官能基は、キレート剤上の官能基とは反応性を示すが、Ｂ１２またはその類似体とは反応性でない置換基から選択される。例えば、キレート剤が官能基、例えばカルボキシル基または活性化エステルを取り込むとき、該アルキル鎖連結基の第二の官能基はアミノ基であってよい。結合体の形成が、所望しない生成物の形成を避けるために、存在する官能基の保護および脱保護を必要とする場合があることは理解されることである。保護および脱保護は、有機合成の分野で一般的である保護基、反応剤および手法を用いて行われる。あるいは、連結基は最初にキレート剤に結合した後、Ｂ１２またはその類似体に結合してもよいことは理解される。アルキル鎖連結基は、炭素１〜４０個またはそれ以上の長さであってよく、炭素１〜１０個の長さであることがしばしばである。特定の態様において、アルキル鎖連結基は、１、２、３、４、５、６または７炭素原子の長さであってよい。他の特定の態様において、アルキル鎖連結基は、３炭素原子の長さであってよい。さらなる他の特定の態様において、アルキル鎖連結基は４炭素原子の長さであってよい。なおさらに他の特定の態様において、アルキル鎖連結基は５炭素原子の長さであってよい。
【００３６】
アルキル鎖に対する他の化学連結基は、ポリエチレングリコール (ＰＥＧ)であり、これは、上述の、アルキル鎖の結合体への取り込みと同じ方法により官能化される。Ｂ１２またはその類似体は、全身性の半減期の改善および投与の頻度を低下させるためにＰＥＧ化していてよい。態様の一において、ＰＥＧをリンカーに付加してよい。したがって、Ｂ１２またはその類似体は、リンカーおよびＰＥＧを含んでいてよい。例えば、Ｂ１２またはその類似体は、アルキルリンカー、１種以上のキレート剤およびＰＥＧを含んでいてよい。
【００３７】
(b) 検出可能な標識
局面の一において、Ｂ１２またはその類似体は、検出可能な標識に結合していてよい。検出可能な標識は、Ｂ１２またはその類似体に直接結合していても、またはＢ１２またはその類似体に間接的に結合していてもよい。態様の一において、検出可能な標識は、Ｂ１２またはその類似体に結合しているキレート剤と複合体化していてよい。他の局面において、検出可能な標識は、Ｂ１２またはその類似体と結合しているリンカーと結合しているキレート剤と複合体化していてよい。さらに他の態様において、検出可能な標識は、Ｂ１２またはその類似体に結合しているリンカーに結合していてよい。なおさらに他の態様において、検出可能な標識は、該標識の、第二の分子によって特異的に結合される性質によって、Ｂ１２またはその類似体に間接的に結合していてよい。この種類の、間接的に結合した標識の一例としては、第二の分子であるストレプトアビジンが特異的に結合することのできるビオチン標識が挙げられる。単一の、二重のまたは多数の標識が有用である場合もある。
【００３８】
本明細書において、「検出可能な標識」とは、Ｂ１２またはその類似体に結合したときに、Ｂ１２またはその類似体を検出可能なものにする任意の種類の標識である。検出可能な標識はまた、細胞に対して毒性を示すか、または細胞毒性を示すものであってもよい。したがって、検出可能な標識はまた、治療剤であっても細胞毒性剤であってもよい。一般的に、検出可能な標識としては、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、フルオロフォア、蛍光クエンチング剤、有色分子、放射性同位体、放射性核種、シンチラント、巨大標識、例えば金属原子 (質量変化による検出用)、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体またはその断片、Ｇｒｂ２、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、重金属、酵素、アルカリンホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、電子供与体/受容体、アクリジニウムエステルおよび比色分析基質が挙げられる。当業者は、上述していないが、本発明の実施に用い得る他の有用な標識を容易に認識できる。
【００３９】
検出可能な標識は、シグナル伝達機構によって検出可能なシグナルを発する。例えば検出可能な標識が放射性核種であるような場合において、検出可能な標識はシグナルを自発的に発することができる。他の場合、例えば、検出可能な標識が緩和金属である場合には、外場から刺激を受けた結果として、検出可能な標識がシグナルを放出する。シグナルの例としては、γ線、X線、可視光、赤外線エネルギーおよび電波が挙げられるが、これらに限定されない。シグナル伝達機構の例としては、ガンマカメラ、例えばＳＰＥＣＴ/ＣＴデバイス、ＰＥＴスキャナー、蛍光光度計および磁気共鳴画像法(ＭＲＩ) 機器が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、検出可能な標識は、磁気共鳴画像法、シンチグラフィーイメージング、超音波または蛍光を用いて検出することのできる標識を含む。特定の態様において、検出可能な標識は、ポジトロン放出断層撮影、単一光子放射断層撮影、ガンマカメライメージングまたは直線形スキャンを用いて検出し得る標識を含む。
【００４０】
適当なフルオロフォアとしては、フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)、フルオレセインチオセミカルバジド、ローダミン、Texas Red、CyDye (例えばCy3、Cy5、Cy5.5)、Alexa Fluor (例えばAlexa488、Alexa555、Alexa594; Alexa647)、近赤外 (ＮＩＲ) (７００〜９００nm) 蛍光色素およびカルボシアニンおよびアミノスチリル色素が挙げられるが、これらに限定されない。Ｂ１２またはその類似体は、当該分野でよく知られている技術を用いて、フルオロフォアを用いて該剤を標識することにより、蛍光検出のための標識化を行ってもよい (例えば、Lohse et al., Bioconj Chem 8:503-509 (1997)参照)。例えば、多くの公知の色素が、ＮＨ２-末端基に結合することができる。あるいは、蛍光色素、例えばフルオロセインを、ペプチドリンカーのリジン残基に結合させてよい。特定の態様において、アルキン修飾色素、例えばAlexa Fluor色素を、例えばSharpless click chemistry (Kolb et al., Angew Chem Int Ed 2001; 40: 2004-2021、引用により全体が本明細書に包含される)を用いてアジド修飾Ｂ１２にクリック結合させてよい。
【００４１】
放射性核種は、γ−放射性の放射性核種、オージェ電子放射性の放射性核種、β-放射性の放射性核種、α-放射性の放射性核種または陽電子放射性の放射性核種であってよい。放射性核種は、検出可能な標識および/または治療剤であってよい。適当な放射性核種の非限定的な例としては、炭素-１１、窒素-１３、酸素-１５、フッ素-１８、フルオロデオキシグルコース-１８、リン-３２、スカンジウム-４７、銅-６４、６５および６７、ガリウム-６７および６８、臭素-７５、７７および８０ｍ、ルビジウム-８２、ストロンチウム-８９、ジルコニウム-８９、イットリウム-８６および９０、ルテニウム-９５、９７、１０３および１０５、レニウム-９９ｍ、１０１、１０５、１８６および１８８、テクネチウム-９９ｍ、ロジウム-１０５、水銀-１０７、パラジウム-１０９、インジウム-１１１、銀-１１１、インジウム-１１３ｍ、ランタニド-１１４ｍ、スズ-１１７ｍ、テルル-１２１ｍ、１２２ｍおよび１２５ｍ、ヨウ素-１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１３１および１３３、プラセオジム-１４２、プロメチウム-１４９、サマリウム-１５３、ガドリニウム-１５９、ツリウム-１６５、１６７および１６８、ジスプロシウム-１６５、ホルミウム-１６６、ルテチウム-１７７、レニウム-１８６および１８８、イリジウム-１９２、白金-１９３および１９５ｍ、金-１９９、タリウム-２０１、チタン-２０１、アスタチン-２１１、ビスマス-２１２および２１３、鉛-２１２、ラジウム-２２３、アクチニウム-２２５ならびに、それ由来のニトリドまたはオキシド形態が挙げられる。特定の態様において、放射性核種は、銅-６４、ジルコニウム-８９、イットリウム-８６、イットリウム-９０、テクネチウム-９９ｍ、ヨウ素-１２５、ヨウ素-１３１、ルテチウム-１７７、レニウム-１８６およびレニウム-１８８からなる群から選択される。
【００４２】
種々の金属原子を、検出可能な標識として使用し得る。該金属原子は、一般的に、２０以上の原子数を有する金属を含む金属原子の群から選択してよい。例えば、該金属原子は、カルシウム原子、スカンジウム原子、チタン原子、バナジウム原子、クロム原子、マンガン原子、鉄原子、コバルト原子、ニッケル原子、銅原子、亜鉛原子、ガリウム原子、ゲルマニウム原子、ヒ素原子、セレン原子、臭素原子、クリプトン原子、ルビジウム原子、ストロンチウム原子、イットリウム原子、ジルコニウム原子、ニオブ原子、モリブデン原子、テクネチウム原子、ルテニウム原子、ロジウム原子、パラジウム原子、銀原子、カドミウム原子、インジウム原子、スズ原子、アンチモン原子、テルル原子、ヨウ素原子、キセノン原子、セシウム原子、バリウム原子、ランタン原子、ハフニウム原子、タンタル原子、タングステン原子、レニウム原子、オスミウム原子、イリジウム原子、白金原子、金原子、水銀原子、タリウム原子、鉛原子、ビスマス原子、フランシウム原子、ラジウム原子、アクチニウム原子、セリウム原子、プラセオジム原子、ネオジム原子、プロメチウム原子、サマリウム原子、ユーロピウム原子、ガドリニウム原子、テルビウム原子、ジスプロシウム原子、ホルミウム原子、エルビウム原子、ツリウム原子、イッテルビウム原子、ルテチウム原子、トリウム原子、プロトアクチニウム原子、ウラン原子、ネプツニウム原子、プルトニウム原子、アメリシウム原子、キュリウム原子、バークリウム原子、カリホルニウム原子、アインスタイニウム原子、フェルミウム原子、メンデレビウム原子、ノーベリウム原子またはローレンシウム原子であってよい。いくつかの態様において、該金属原子は、２０を超える原子数を有するアルカリ金属を含む群から選択してよい。他の態様において、該金属原子は、２０を超える原子数を有するアルカリ土類金属を含む群から選択してよい。態様の一において、該金属原子は、ランタノイドを含む金属の群から選択してよい。他の態様において、該金属原子は、アクチニドを含む金属の群から選択してよい。さらに他の態様において、該金属原子は、遷移金属を含む金属の群から選択してよい。さらに他の態様において、該金属原子は、貧金属を含む金属の群から選択してよい。他の態様において、該金属原子は、金原子、ビスマス原子、タンタル原子およびガドリニウム原子を含む群から選択してよい。好ましい態様において、該金属原子は、原子番号５３ (すなわちヨウ素) 〜８３ (すなわちビスマス)の金属を含む群から選択してよい。他の態様において、該金属原子は、磁気共鳴画像法に適当な原子であってよい。他の態様において、該金属原子は、ＣＴのｘ−線エネルギーバンドにＫ-エッジを有する金属からなる群から選択してよい。好ましい金属原子としては、マンガン、鉄、ガドリニウム、金およびヨウ素が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
該金属原子は、＋１、＋２または＋３酸化状態の形態の金属イオンであってよい。例えば、非限定的な例としては、Ｂａ２＋、Ｂｉ３＋、Ｃｓ＋、Ｃａ２＋、Ｃｒ２＋、Ｃｒ３＋、Ｃｒ６＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、Ｃｕ３＋、Ｇａ３＋、Ｇｄ３+、Ａｕ＋、Ａｕ３＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｆ３＋、Ｐｂ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｎ３＋、Ｍｎ４＋、Ｍｎ７＋、Ｈｇ２＋、Ｎｉ２＋、Ｎｉ３＋、Ａｇ＋、Ｓｒ２＋、Ｓｎ２＋、Ｓｎ４＋およびＺｎ２＋が挙げられる。該金属原子は、金属酸化物を含んでいてよい。例えば、金属酸化物の非限定的な例としては、酸化鉄、酸化マンガンまたは酸化ガドリニウムが挙げられる。さらなる例としては、マグネタイト、マグヘマイトまたはその組み合わせが挙げられる。
【００４４】
局面の一において、キレート剤に直接的または間接的に結合しているＢ１２またはその類似体は、放射性核種または金属原子を取り込み得る。放射性核種または金属原子の、Ｂ１２またはその類似体-キレート剤複合体への取り込みは、配位化学の分野で一般的な種々の方法により行ってよい。例えば、該金属がテクネチウム-９９ｍである場合、以下の一般的な手法を用いて、テクネチウム複合体を形成してよい。Ｂ１２またはその類似体-キレート剤複合体溶液は、該複合体を最初に水性アルコール、例えばエタノールに溶解させることにより形成する。その後、該溶液を脱気して酸素を除き、次いで適当な反応剤、例えば水酸化ナトリウムを用いてチオール保護基を除いた後、有機酸、例えば酢酸 (ｐＨ６.０〜６.５)で中和する。標識工程において、化学量論的に過剰な、モリブデンジェネレーターより得られた過テクネチウム酸ナトリウムを、テクネチウムを減少させるのに十分な量の還元剤、例えば塩化第一スズとともに、該複合体の溶液に添加し、加熱する。該標識化複合体は、クロマトグラフィー、例えばC-18 Sep Pak cartridgeによって混入物である９９ｍＴｃＯ４−およびコロイド性９９ｍＴｃＯ２から分離し得る。
【００４５】
他の方法において、標識は、トランスキレート反応によって行ってよい。テクネチウム源は、選択したキレート剤との配位子交換を促進する不安定な配位子と複合体化したテクネチウム溶液である。トランスキレート化に適当な配位子としては、グリシン、タータレート、シトレートおよびヘプタグルコネートが挙げられる。この場合、好ましい還元剤は、亜ジチオン酸ナトリウムである。該複合体は、上述の技術を用いて標識しても、あるいは、キレート剤自体が標識され、次いでＢ１２またはその類似体に結合して複合体を形成してよく; この過程は「前標識配位子(prelabeled ligand)」法と称される。
【００４６】
本発明の複合体を標識する他の方法は、Ｂ１２またはその類似体-キレート剤複合体を、金属のキレート化に伴って切断される結合によって固相支持体上に固定することを含む。これは、キレート剤が該支持体上の官能基に、複合体化原子の１つによって結合する場合に行われる。好ましくは、複合体化硫黄原子を、硫黄保護基、例えばマレイミドで官能化された支持体に結合する。
【００４７】
他の局面において、検出可能な標識は、キレート剤を用いずに、Ｂ１２またはその類似体に直接的または間接的に結合していてよい。例えば、検出可能な標識は、Ｂ１２またはその類似体に直接的に結合している。あるいは、検出可能な標識は、Ｂ１２またはその類似体に結合しているリンカーに結合している。例えば、放射活性ヨウ素標識(例えば１２２Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉまたは１３１Ｉ) は、それぞれ、ペプチドリンカー中に存在するＤ-もしくはＬ-ＴｙｒまたはＤ-もしくはＬ-４-アミノ-Ｐｈｅ残基に結合することができる。態様の一において、ペプチドリンカーのチロシン残基は、ハロゲン化されていてよい。ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素およびアスタチンが挙げられる。該ハロゲン化Ｂ１２またはその類似体は、該ハロゲンが放射性同位体、例えば１８Ｆ、７５Ｂｒ、７７Ｂｒ、１２２Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１２９Ｉ、１３１Ｉまたは２１１Ａｔである場合、検出可能なように標識されていてよい。ハロゲン化Ｂ１２またはその類似体は、ペプチドリンカー中に存在する少なくとも１つのアミノ酸、好ましくはＤ-Ｔｙｒ残基に共有結合したハロゲンを含む。
【００４８】
(c) 治療剤
局面の一において、Ｂ１２またはその類似体は、治療剤に、該治療剤がキュビリン発現細胞を選択的に標的とするように結合していてよい。特定の態様において、該治療剤は、キュビリンを発現する腫瘍細胞を選択的に標的とし得る。該治療剤は、Ｂ１２またはその類似体に直接的に結合していても、またはＢ１２またはその類似体に間接的に結合していてもよい。態様の一において、該治療剤は、Ｂ１２またはその類似体に結合したキレート剤と複合体化してよい。他の局面において、該治療剤は、Ｂ１２またはその類似体に結合しているリンカーに結合しているキレート剤と複合体化してよい。さらに他の態様において、該治療剤は、Ｂ１２またはその類似体に結合しているリンカーに結合していてよい。なおさらに他の態様において、該治療剤は、検出可能な標識と複合体化しており、Ｂ１２と結合しているキレート剤と結合しているリンカーと結合していてよい。
【００４９】
「治療剤」は、症状または疾患の検出、診断または処置に用いられる、当該分野で公知である任意の化合物である。該化合物は、天然起源であっても、修飾されていてもまたは合成されていてもよい。治療剤の非限定的な例としては、天然の形態または、細胞への取り込みまたは吸着を亢進するために、疎水基または荷電された基で誘導体化された薬物、治療化合物、遺伝物質、金属(例えば放射活性同位体)、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、ステロイド、核酸ベースの物質、またはその誘導体、類似体または組み合わせが挙げられる。該治療剤は、水溶性であっても、または疎水性であってもよい。治療剤の非限定的な例としては、免疫関連剤、甲状腺薬、呼吸器用製品、抗悪性腫瘍薬、駆虫薬、抗マラリア薬、有糸分裂阻害剤、ホルモン、抗原虫薬、抗結核薬、心血管用製品、血管用製品、生体応答修飾物質、抗真菌剤、ビタミン、ペプチド、抗アレルギー薬、抗凝固薬、循環器系作用薬、代謝増強薬、抗ウイルス薬、抗狭心症薬、抗生物質、抗炎症薬、抗リウマチ薬、麻薬、強心性配糖体、神経筋遮断薬、鎮静薬、局所麻酔薬、全身麻酔薬または放射性原子またはイオンが挙げられる。治療剤の非限定的な例は後に示す。特定の態様において、治療剤は、癌の検出、診断または処置に使用される化合物であってよい。該治療剤は、腫瘍の成長を低下させるかもしくは妨げるか、あるいは、体内または器官内の腫瘍の影響を低下させるのが好ましい。腫瘍による症状を軽減させるか、または腫瘍の成長を低下させる治療剤が、本発明に適当である。さらに、腫瘍細胞の成長に関連のある症状を軽減する任意の治療剤が、本発明の目的に有用である。
【００５０】
Ｂ１２またはその類似体は、１、２、３、４または５種の治療剤に結合していてよい。Ｂ１２またはその類似体に治療剤を結合するのに、リンカーを用いても用いなくてもよい。一般的に、該結合体は、内因子のＢ１２またはその類似体への結合体を妨げるべきではなく、また、Ｂ１２-ＩＦのキュビリンへの結合を妨げるべきではない。いくつかの場合において、Ｂ１２またはその類似体は、Ｂ１２またはその類似体と、治療剤の間に切断可能な連結を有していてよい。該リンカーは、特定の細胞の部位における治療剤の放出を可能にし得る。
【００５１】
本発明の治療剤は、低分子治療剤、治療用抗体、治療用核酸または化学療法剤であってよい。治療用抗体の非限定的な例としては、ムロモナブ（muromomab）、アブシキシマブ、リツキシマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、エタネルセプト、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、イブリツモマブ（ibritomomab）、アダリムマブ、アレファセプト、オマリズマブ、トシツモマブ、エファリズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、ナタリズマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、エクリズマブおよびセルトリズマブが挙げられる。代表的な治療用核酸は、生体内で免疫応答および/または抗血管新生応答を起こすことのできるポリペプチドをコードしていてよい。免疫刺激効果を有する代表的な治療用タンパク質としては、サイトカイン (例えばインターロイキン (ＩＬ)、例えばＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ１２、インターフェロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ-ＣＳＦ)、腫瘍壊死因子α(ＴＮＦ-α))、免疫調節細胞表面タンパク質(例えばヒト白血球抗原(ＨＬＡタンパク質)、共刺激分子および腫瘍関連抗原が挙げられるが、これらに限定されない。Kirk＆Mule, 2000; Mackensen et al., 1997; Walther & Stein, 1999; および当該文献中の引用文献を参照のこと。本明細書に記載の事項にしたがって使用できる、抗血管新生活性を有する代表的な化合物としては: トロンボスポンジンI (Kosfeld & Frazier, 1993; Tolsma et al., 1993; Dameron et al., 1994)、メタロスポンジンタンパク質(Carpizo & Iruela-Arispe, 2000)、クラスＩインターフェロン(Albini et al., 2000)、ＩＬ１２ (Voest et al., 1995)、プロタミン(Ingber et al., 1990)、アンジオスタチン(O’Reilly et al., 1994)、ラミニン(Sakamoto et al., 1991)、エンドスタチン(O’Reilly et al., 1997)およびプロラクチン断片(Clapp et al., 1993)が挙げられる。さらに、いくつかの抗血管新生ペプチドが、これらのタンパク質より単離されている(Maione et al., 1990; Eijan et al., 1991; Woltering et al., 1991)。免疫調節活性および抗血管新生活性の両方を有する代表的なタンパク質としては、ＩＬ１２、インターフェロン-γまたはケモカインが挙げられる。他の、癌治療に有用であり得る治療用核酸としては、癌抑制遺伝子産物/抗原、代謝拮抗薬、自殺遺伝子産物をコードする核酸およびその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
化学療法剤は、癌の処置に有用な化合物を指す。該化合物は、一般的に、急速に分裂する細胞に影響を与える細胞毒性剤であっても、または癌細胞の制御されていないタンパク質に影響を与える標的化治療剤であってもよい。細胞毒性剤は、腫瘍細胞に対して毒性を示す、天然起源の、修飾された、または合成された任意の化合物である。該剤は、新生物の処置および、細胞増殖または過剰活性細胞集団により特徴付けられる他の症状または疾患の処置に有用である。化学療法剤は、アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、抗細胞骨格剤、トポイソメラーゼ阻害剤、抗ホルモン剤、標的化治療剤、光線力学治療剤またはその組み合わせであってよい。例示的な態様において、該化学療法剤は、リポソーム性ドキソルビシンおよびナノ粒子アルブミンドセタキセルからなる群から選択される。
【００５３】
適当なアルキル化剤の非限定的な例としては、アルトレタミン、ベンゾドーパ(benzodopa)、ブスルファン、カルボプラチン、カルボコン、カルムスチン(ＢＣＮＵ)、クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド (cholophosphamide)、クロロゾトシン、シスプラチン、シクロホスファミド (cyclosphosphamide)、ダカルバジン(ＤＴＩＣ)、エストラムスチン、ホテムスチン、イホスファミド、インプロスルファン、リポプラチン、ロムスチン(ＣＣＮＵ)、マホスファミド、マンノスルファン、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、メツレドーパ (meturedopa)、ムスチン(メクロレタミン)、ミトブロニトール、ニムスチン、ノベンビチン (novembichin)、オキサリプラチン、フェネステリン、ピポスルファン、プレドニムスチン、ラニムスチン、サトラプラチン、セムスチン、テモゾロミド、チオテパ、トレオスルファン、トリアジコン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド(ＴＥＰＡ)、トリエチレンチオホスホラミド(チオテパ)、トリメチロールメラミン (trimethylolomelamine)、トロホスファミド、ウラシルマスタードおよびウレドーパ (uredopa)が挙げられる。
【００５４】
適当な代謝拮抗薬としては、アミノプテリン、アンシタビン、アザシチジン、８-アザグアニン、６-アザウリジン、カペシタビン、カルモフール(１-ヘキシルカルボモイル-５-フルオロウラシル)、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン(シトシンアラビノシド(Ａｒａ-Ｃ))、デシタビン、デノプテリン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、フルダラビン、５-フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア(ヒドロキシカルバミド)、ロイコボリン(フォリン酸)、６-メルカプトプリン、メトトレキサート、ナフォキシジン、ネララビン、オブリメルセン、ペメトレキセド、プテロプテリン、ラルチトレキセド、テガフール (tegofur)、チアゾフリン、チアミプリン、チオグアニン（チオグアニン） (tioguanine (thioguanine))およびトリメトレキサートが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
適当な抗腫瘍抗生物質の非限定的な例としては、アクラシノマイシン (aclacinomysin)、アクラルビシン、アクチノマイシン、アドリアマイシン、アウロスタチン (aurostatin) (例えば、モノメチルオーリスタチンＥ)、オースラマイシン (authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン（carabicin）、カミノマイシン (caminomycin)、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポキソミシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミスラマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、プリカマイシン、ポトフィロマイシン (potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン（rodorubicin）、スパルソマイシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、バルルビシン、ウベニメクス、ジノスタチンおよびゾルビシンが挙げられる。
【００５６】
適当な抗細胞骨格剤の非限定的な例としては、カバジタキセル、コルヒチン、デメコルチン、ドセタキセル、エポチロン、イクサベピロン、マクロマイシン(macromycin)、オマセタキシン メペサクシネート、オルタタキセル、パクリタキセル (例えばDHA-パクリタキセル)、タキサン、テセタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンが挙げられる。
【００５７】
適当なトポイソメラーゼ阻害剤としては、アムサクリン、エトポシド(VP-16)、イリノテカン、ミトキサントロン、RFS 2000、テニポシドおよびトポテカンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
適当な抗ホルモン剤の非限定的な例としては、アミノグルテチミド、抗エストロゲン剤、アロマターゼ阻害４(５)-イミダゾール、ビカルタミド、フィナステリド、フルタミド、フルベストラント、ゴセレリン、４-ヒドロキシタモキシフェン、ケオキシフェン、リュープロリド、LY117018、ミトタン、ニルタミド、オナプリストン、ラロキシフェン、タモキシフェン、トレミフェンおよびトリロスタンが挙げられる。
【００５９】
標的化治療剤の例としては、モノクローナル抗体、例えばアレムツズマブ、カツマキソマブ (cartumaxomab)、エドレコロマブ、エプラツズマブ、ゲムツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、グレムバツムマブ ベドチン、イブリツモマブ チウキセタン、レディタクス、リツキシマブ、トシツモマブおよびトラスツズマブ; プロテインキナーゼ阻害剤、例えばベバシズマブ、セツキシマブ、クリゾニブ (crizonib)、ダサチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、ムブリチニブ、ニロチニブ、パニツムマブ、パゾパニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、トセラニブおよびバンデタニブが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
血管新生阻害剤の非限定的な例としては、アンジオスタチン、ベバシズマブ、デニロイキンジフチトクス、エンドスタチン、エベロリムス、ゲニステイン、インターフェロンα、インターロイキン-２、インターロイキン-１２、パゾパニブ、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ラパマイシン (シロリムス)、テムシロリムスおよびサリドマイドが挙げられる。
【００６１】
成長阻害ポリペプチドの非限定的な例としては、ボルテゾミブ (bortazomib)、エリスロポエチン、インターロイキン (例えばＩＬ-１、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-６)、白血病抑制因子、インターフェロン、ロミデプシン、トロンボポエチン、ＴＮＦ-α、ＣＤ３０リガンド、４-１ＢＢリガンドおよびＡｐｏ-１リガンドが挙げられる。
【００６２】
光力学療法剤の非限定的な例としては、アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、レチノイド (アリトレチノイン、タミバロテン、トレチノイン)およびテモポルフィンが挙げられる。
【００６３】
他の抗腫瘍剤としては、アナグレリド、亜ヒ酸、アスパラギナーゼ、ベキサロテン、ブロピリミン、セレコキシブ、化学結合Ｆａｂ、エファプロキシラル、エトグルシド、フェルギノール、ロニダミド（lonidamide）、マソプロコール、ミルテホシン、ミトグアゾン、タランパネル(talapanel)、トラベクテジンおよびボリノスタットが挙げられる。
【００６４】
上述の任意の剤の薬学的に許容される塩、または誘導体もまた含まれる。該化学療法剤の用量は、該剤および腫瘍または新生物の種類によって変動し得る。医師は、該化学療法剤の適当な用量を決定することができる。
【００６５】
他の治療剤は、ウイルスまたはウイルスゲノム、例えば腫瘍溶解性ウイルスを含んでいてよい。腫瘍溶解性ウイルスは、細胞に入ったときに、標的組織中の細胞を（例えば溶解によって）殺傷することができる天然起源のウイルスを含む。
【００６６】
(d) 内因子
内因子 (ＩＦ)は、胃粘膜および膵臓から分泌されるグリコシル化タンパク質である。ＩＦは、ピコモルの親和性でＢ１２に結合する(Kd：約１pM)。Ｂ１２取り込み経路において、該ＩＦタンパク質は、腸管の腸細胞を介したＢ１２の輸送を促進し、これは、頂端側に発現するＩＦ−Ｂ１２受容体（キュビリン）で、受容体を介したエンドサイトーシスにより起こる。キュビリンは、アンカータンパク質であるアムニオンレス (Ａｍ)と協調して、Ｂ１２の輸送に機能する。経細胞輸送の後、最初の摂取の２.５〜４時間後に、Ｂ１２は、第三の輸送タンパク質である、トランスコバラミンＩＩ(ＴＣＩＩ)に結合した状態で、血漿中に現れる。上述のＢ１２取り込み経路に基づけば、ＩＦは血中には存在せず、腸管にのみ存在する。したがって、従来、ＩＦ-Ｂ１２が非経口経路（すなわち血流）を介して投与してよく、キュビリンに効果的に結合できることは知られていなかった。したがって、本発明の発明者が、静脈内投与されたＩＦ-Ｂ１２が、腸管の外側のキュビリン（すなわち、非回腸キュビリン）に結合できることを見出したことは、予期できないことである。
【００６７】
局面の一において、ＩＦは、Ｂ１２または本発明のＢ１２結合体に結合し、それにより複合体を形成する。該ＩＦは、Ｂ１２またはその類似体が検出可能な標識および/または治療剤に結合する前後に、Ｂ１２またはその類似体に結合していてよい。特定の態様において、ＩＦは、Ｂ１２またはその類似体が検出可能な標識および/または治療剤に結合した後に、Ｂ１２またはその類似体に結合してよい。態様の一において、ＩＦは、溶液中で、該結合体にＩＦを結合させることによって、Ｂ１２またはＢ１２結合体に事前に結合していてよい。非限定的な例としては、Ｂ１２またはＢ１２結合体は、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）またはＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５.５）または水（ｐＨ８）の中、約２５℃〜３７℃の温度でＩＦと結合し得る。結合するために、ＩＦをＢ１２またはＢ１２結合体と少なくとも３０分間接触させてよい。あるいは、ＩＦは、Ｂ１２またはＢ１２結合体に、少なくとも１５分間、少なくとも３０分間、少なくとも４５分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間または少なくとも６時接触させてよい。ＩＦと、Ｂ１２またはＢ１２結合体を事前に結合させる種々の条件は、当業者が決定し得るものである。
【００６８】
ＩＦとＢ１２またはＢ１２結合体を事前に結合させるためには、ＩＦおよび、Ｂ１２またはＢ１２結合体を、溶液中で結合させてよい。ＩＦは、Ｂ１２またはＢ１２結合体に１対１で結合する。したがって、溶液に添加したＢ１２またはＢ１２結合体に対するＩＦの比率は、１:１であってよい。しかし、ＩＦのＢ１２またはＢ１２結合体での飽和を促進するためには、Ｂ１２またはＢ１２結合体に対して、より多くの量のＩＦを溶液に添加してもよい。例えば、Ｂ１２またはＢ１２結合体に対するＩＦの比率は、１.１:１、１.２:１、１.３:１、１.４:１、１.５:１、２:１、２.５:１、３:１、３.５:１、４:１、４.５:１、５:１、６:１、７:１、８:１、９:１、１０:１、１５:１、２０:１、２５:１、３０:１、３５:１、４０:１、４５:１、５０:１、６０:１、７０:１、８０:１、９０:１または１００:１であってよい。特定の態様において、Ｂ１２またはＢ１２結合体に対するＩＦの比率は、１.１:１、１.２:１、１.３:１、１.４:１、１.５:１、２:１、２.５:１、３:１、３.５:１、４:１、４.５:１、５:１、６:１、７:１、８:１、９:１または１０:１であってよい。他の態様において、Ｂ１２またはＢ１２結合体に対する５％以上過剰のＩＦを溶液に添加してよい。例えば、Ｂ１２またはＢ１２結合体に対して、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％過剰のＩＦを溶液に添加してよい。特定の態様において、Ｂ１２またはＢ１２結合体に対して、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％過剰のＩＦを溶液に添加してよい。いくつかの態様においては、Ｂ１２またはＢ１２結合体に対して過剰のＩＦを溶液に添加することが好ましい。しかし、結合していないＩＦを減少させるか、または除くために、ＩＦに対して、より多量のＢ１２またはＢ１２結合体を添加することが必要な場合もある。したがって、ＩＦに対するＢ１２またはＢ１２結合体の比率は、１.１:１、１.２:１、１.３:１、１.４:１、１.５:１、２:１、２.５:１、３:１、３.５:１、４:１、４.５:１、５:１、６:１、７:１、８:１、９:１、１０:１、１５:１、２０:１、２５:１、３０:１、３５:１、４０:１、４５:１、５０:１、６０:１、７０:１、８０:１、９０:１または１００:１であってよい。特定の態様において、ＩＦに対するＢ１２またはＢ１２結合体の比率は、１.１:１、１.２:１、１.３:１、１.４:１、１.５:１、２:１、２.５:１、３:１、３.５:１、４:１、４.５:１、５:１、６:１、７:１、８:１、９:１または１０:１であってよい。他の態様において、ＩＦに対して、５％以上過剰のＢ１２またはＢ１２結合体を溶液に添加してもよい。例えば、ＩＦに対して５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％過剰のＢ１２またはＢ１２結合体を、溶液に添加してよい。特定の態様において、ＩＦに対して、５％、６％、７％、８％、９％��１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％過剰のＢ１２またはＢ１２結合体を溶液に添加してよい。本発明の組成物を投与する前に、結合していないＩＦおよび/または結合していないＢ１２またはＢ１２結合体を除くことが必要な場合もある。造影の場合、バックグラウンドを低下させるために、結合していないＢ１２またはＢ１２結合体を除くことが必要な場合もある。
【００６９】
本発明のＩＦは、標準的な方法によって発現および精製してよい。特定の態様において、ＩＦは、トランスジェニック植物、例えばシロイヌナズナから発現および精製を行ってよい。発現させ、精製したＩＦは、Ｂ１２またはＢ１２結合体およびヒトキュビリンに結合するものであれば、任意の種由来であってよい。当業者は、種々の生物種でＩＦが見られることを理解できる。非限定的な例としては、ヒト (ＮＰ_００５１３３.２)、マウス (Ｐ５２７８７.２)、ラット(ＮＰ_０５８８５８.１)、イヌ (Ｑ５ＸＷＤ５.１)、ネコ (ＸＰ_００３９９３４６６.１)、ウシ (ＮＰ_００１１９３１６８.１)、非ヒト霊長類 (ＥＨＨ５６２０３.１、ＸＰ_００４０５１３０５.１)およびウマ(ＸＰ_００８５０８１１７.１)が挙げられる。本発明が、他の生物におけるＩＦのホモログに関するものであり、ヒトタンパク質に限定されるものではないことは理解されることである。ホモログは、当該分野で公知の方法により、他の生物種で見つけることができる。例えば、配列類似性は、典型的には適合率を最も高くするために、少数のギャップを導入することのできる、慣用されるアルゴリズムを用いて決定することができる。具体的には、２つのポリペプチドまたは２つの核酸配列の「％同一性」は、Karlin and Altschulのアルゴリズム (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1993) を用いて決定される。該アルゴリズムは、Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990) によるBLASTNおよびBLASTXプログラムに取り込まれている。本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、BLASTヌクレオチド検索を、BLASTNプログラムを用いて行ってよい。同様に、本発明のポリペプチドに相同のアミノ酸配列を得るために、BLASTタンパク質検索を、BLASTXプログラムを用いて行ってよい。比較目的のために、ギャップのある配列比較を得るために、Gapped BLASTをAltschul et al. (Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)に記載のように使用する。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを用いるとき、それぞれのプログラム(例えばBLASTXおよびBLASTN)のデフォルトのパラメーターを使用する。詳細については、www.ncbi.nlm.nih.gov参照のこと。いくつかの態様において、ホモログは、ヒトＩＦと、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％または８９％の同一性を有する。他の態様において、ホモログは、ヒトＩＦと、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％の同一性を有する。例えば、ホモログは、ヒトＩＦと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％または８９％の同一性を有する。他の態様において、ホモログは、ＩＦ配列アクセス番号ＮＰ_００５１３３.２と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％の同一性を有する。
【００７０】
特定の態様において、該ＩＦは、アクセス番号ＮＰ_００５１３３.２に記載の配列を含む。他の態様において、該ＩＦは、アクセス番号ＮＰ_００５１３３.２に記載の配列を含むが、１〜１０の、保存的なアミノ酸置換を含む。例えば、該ＩＦは、アクセス番号ＮＰ_００５１３３.２に記載の配列を含むが、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の保存的なアミノ酸置換を含む。本明細書において、「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置きかえられる置換を指す。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野において規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非電荷極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖を有するアミノ酸 (例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、ヒスチジン)が挙げられる。該置換を含む、得られたペプチドは、類似した特徴または性質、例えばサイズ、疎水性等を有するため、該ペプチドの全体的な官能性が有意には変わらない。Ｂ１２に結合したＩＦの構造は当該分野で公知であるため、当業者は、Ｂ１２またはＢ１２結合体に対する結合を確実にするために、Ｂ１２結合に必須なアミノ酸を決定することができる。
【００７１】
(e) 医薬製剤
本明細書はまた、非経腸投与用の医薬製剤を提供する。該医薬製剤は、活性成分としての内因子およびＢ１２またはＢ１２結合体ならびに、少なくとも１つの、非経腸投与用の薬学的に許容される担体を含む。本明細書で用いる「非経腸」という語は、皮下、静脈内、筋肉内、真皮内、動脈内、骨内、腹腔内またはくも膜下腔内注射または点滴技術を含む。態様の一において、本発明は、静脈内投与用の製剤であって、活性成分としての内因子およびＢ１２またはＢ１２結合体ならびに少なくとも１つの、静脈内投与用の薬学的に許容される担体を含む製剤を含む。
【００７２】
該組成物は、種々の剤形に製剤してよく、有効成分を治療上の有効量を送達する多数の異なる方法により投与することができる。該組成物は、慣用される非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバントおよびビヒクルを所望に応じて含む単位剤形で非経腸投与してよい。薬物の製剤は、例えばGennaro, A. R., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. (18th ed, 1995)およびLiberman, H. A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker Inc., New York, N.Y. (1980)において議論されている。
【００７３】
非経腸投与のためには、該製剤は、水性またはオイルベースの液剤であってよい。水性液剤は、無菌の希釈剤または賦形剤、例えば水、生理食塩水、薬学的に許容されるポリオール、例えばグリセロール、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤および/または抗真菌剤、例えばベンジルアルコール、メチルパラベン、クロロブタノール、フェノールおよびチメロサール等；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸；緩衝剤、例えばアセテート、シトレートまたはホスフェート; および/または浸透圧調節剤、例えば塩化ナトリウム、デキストロースまたはポリアルコール、例えばマンニトールまたはソルビトールが挙げられる。水性液剤のｐＨは、酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムを用いて調節してよい。オイルベースの液剤または懸濁剤は、ゴマ油、ピーナッツ油、オリーブ油または鉱油をさらに含んでいてよい。該組成物は、単位用量であっても多回用量の容器、例えば密封アンプルおよびバイアル中にあってもよく、凍結乾燥状態で、使用の直前に、無菌液体担体、例えば注射用の水を添加しさえすればよい状態で保存してよい。即時注射用液剤または懸濁剤は、無菌粉末、顆粒および錠剤から調製してよい。
【００７４】
特定の態様において、ＩＦおよびＢ１２結合体を含む組成物は、該化合物の標的細胞への送達への寄与、該組成物の安定性の上昇、または該組成物が毒性を有する可能性の最小化のために適当なビヒクル中に封入される。当業者には理解されることであるが、本発明の組成物の送達には、種々のビヒクルが適当である。適当な構造化流体送達系の非限定的な例としては、ナノ粒子、リポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、デンドリマーおよび他のリン脂質含有系が挙げられる。組成物を送達ビヒクルに取り込む方法は当該分野で公知である。
【００７５】
他の態様の一において、リポソーム送達用ビヒクルを用いてよい。リポソームは、その構造および化学的な性質から、態様によって、ＩＦおよびＢ１２結合体の送達に適当である。一般的に、リポソームは、リン脂質の二層膜を有する球形の小胞である。リポソームの脂質二重層は、他の二重層（例えば細胞膜）と融合し、それにより、該リポソームの内容物を細胞に送達し得る。この方法により、該ＩＦおよびＢ１２結合体は、標的細胞の膜と融合するリポソームに封入することによって細胞に選択的に送達し得る。
【００７６】
リポソームは、種々の長さの炭化水素鎖を有する種々のリン脂質を含んでいてよい。リン脂質は、一般的に、種々の極性基の１つにグリセロール３-リン酸を介して連結している２つの脂肪酸を含む。適当なリン脂質としては、ホスファチジン酸(ＰＡ)、ホスファチジルセリン (ＰＳ)、ホスファチジルイノシトール(ＰＩ)、ホスファチジルグリセロール(ＰＧ)、ジホスファチジルグリセロール(ＤＰＧ)、ホスファチジルコリン (ＰＣ)およびホスファチジルエタノールアミン(ＰＥ)が挙げられる。該リン脂質を含む脂肪酸鎖の長さは、約６〜約２６炭素原子の間で変動し、該脂質鎖は、飽和していても不飽和であってもよい。適当な脂肪鎖としては、ｎ-ドデカノエート(ラウレート)、ｎ-テトラデカノエート(ミリステート)、ｎ-ヘキサデカノエート(パルミテート)、ｎ-オクタデカノエート(ステアレート)、ｎ-エイコサノエート (アラキデート)、ｎ-ドコサノエート(ベヘナート)、ｎ-テトラコサノエート (リグノセラート)、cis-９-ヘキサデセノエート(パルミトレート)、cis-９-オクタデカノエート (オレアート)、cis,cis-９,１２-オクタデカンジエノアート(リノレアート)、all cis-９,１２,１５-オクタデカトリエノアート(リノレネート)およびall cis-５,８,１１,１４-エイコサテトラエノアート(アラキドネート)が挙げられる（括弧内は一般名を表す）。リン脂質の２つの脂肪酸鎖は同一であっても異なっていてもよい。許容可能なリン脂質としては、ジオレオイルＰＳ、ジオレオイルＰＣ、ジステアロイルＰＳ、ジステアロイルＰＣ、ジミリストイルＰＳ、ジミリストイルＰＣ、ジパルミトイルＰＧ、ステアロイル、オレオイルＰＳ、パルミトイルおよびリノレニルＰＳ等が挙げられる。
【００７７】
該リン脂質は、任意の天然起源であってよく、そのため、リン脂質の混合物を含んでいてよい。例えば、卵黄は、ＰＣ、ＰＧおよびＰＥが豊富であり、ダイズは、ＰＣ、ＰＥ、ＰＩおよびＰＡを含み、動物の脳または脊髄はＰＳが豊富である。リン脂質は、合成起源であってもよい。種々の比率を示す個々のリン脂質の混合物を用いてよい。異なるリン脂質の混合により、有利な活性または安定な活性性質を有するリポソーム組成物が得られる。上述のリン脂質を最適な比率でカチオン性脂質、例えばＮ−(１−(２,３−ジオレイルオキシ)プロピル)-Ｎ,Ｎ,Ｎ-トリメチル アンモニウムクロライド、１,１’−ジオクタデシル-３,３,３’,３’−テトラメチルインドカルボシアニンペルクロラート、３,３’−デヘプチルオキサカルボシアニンヨーダイド、１,１’−デドデシル-３,３,３’,３’−テトラメチルインドカルボシアニンペルクロラート、１,１’−ジオレイル-３,３,３’,３’−テトラメチルインド カルボシアニンメタンスルホネート、Ｎ−４−(デリノレイルアミノスチリル)−Ｎ−メチルピリジニウム ヨーダイドまたは１,１,-ジリノレイル-３,３,３’,３’−テトラメチルインドカルボシアニン ペルクロラートと混合してよい。
【００７８】
リポソームは、スフィンゴ脂質を含んでいてよく、スフィンゴ脂質では、スフィンゴシンは、グリセロールの構造上の対応物であり、動物の細胞膜の主要な成分であるホスホグリセリドまたはコレステロールの脂肪酸の１つである。リポソームは、ＰＥＧ化脂質を含んでいてよく、ＰＥＧ化脂質は、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)のポリマーに共有結合した脂質である。ＰＥＧのサイズは約５００〜約１０,０００ダルトンで変動してよい。
【００７９】
リポソームは、適当な溶媒をさらに含んでいてよい。該溶媒は、有機溶媒または無機溶媒であってよい。適当な溶媒としては、ジメチルスルホキシド (ＤＭＳＯ)、メチルピロリドン、Ｎ-メチルピロリドン、アセトニトリル、アルコール、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフランまたはその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
ＩＦおよびＢ１２結合体を保有する (すなわち、少なくとも１つのメチオニン化合物を有する) リポソームを、知られている任意の薬物送達用のリポソームの製造方法、例えば米国特許第４,２４１,０４６号、第４,３９４,４４８号、第４,５２９,５６１号、第４,７５５,３８８号、第４,８２８,８３７号、第４,９２５,６６１号、第４,９５４,３４５号、第４,９５７,７３５号、第５,０４３,１６４号、第５,０６４,６５５号、第５,０７７,２１１号および第５,２６４,６１８号（これらの文献の内容は引用によりその全体が本明細書に包含される）に記載の方法により製造してよい。例えば、リポソームは、脂質の水溶液中での超音波破砕、溶媒注入、脂質水和、逆相蒸散または凍結融解の繰り返しによる凍結乾燥により製造し得る。好ましい態様において、該リポソームは超音波破砕により形成される。該リポソームは、多層状であってタマネギのように多数の層を有していても、非多層状であってもよい。該リポソームは大きくても小さくてもよい。高せん断超音波破砕を続けることにより、より小さい単層リポソームが形成される傾向がある。
【００８１】
当業者には明らかなことであるが、リポソーム形成を制御する全てのパラメーターは、変動し得る。これらのパラメーターとしては、温度、ｐＨ、メチオニン化合物の濃度、脂質の濃度および組成、多価カチオンの濃度、混合速度、溶媒の有無および濃度が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
他の局面において、本発明の組成物は、マイクロエマルジョンとして細胞に送達され得る。マイクロエマルジョンは、水溶液、界面活性剤および「油」を含む、一般的に透明の熱力学的に安定の液体である。この場合、「油」は、超臨界流体層である。該界面活性剤は、油−水の界面に留まる。種々の界面活性剤のうちの任意のものが、本明細書に記載する、または当該分野で公知であるマイクロエマルジョン製剤で用いるのに適当である。本発明での使用に適当な水性マイクロドメインは、一般的に約５nm〜約１００nmの特徴的な構造寸法を有する。このサイズの凝集体は、可視光をあまり散乱させないため、これらの液体は、視覚的には透明である。当業者には理解されることであるが、マイクロエマルジョンは、球状、桿状またはディスク型の凝集体のような、多数の異なる顕微鏡的な構造をとり得る。態様の一において、該構造はミセルであってよく、これは、一般的に球形または円柱状である物体の最も単純なマイクロエマルジョン構造である。ミセルは、水中油滴状であり、逆ミセルは油中水滴状である。他の態様において、マイクロエマルジョン構造はラメラである。それは、界面活性剤の層により分離された、水と油の連続的な層を含む。マイクロエマルジョンの「油」は、リン脂質を含むのが最適である。リポソームについて上述したリン脂質のうち任意のものがマイクロエマルジョンに関する態様に適当である。該ＩＦおよびＢ１２結合体は、当該分野で一般的に知られている任意の方法によりマイクロエマルジョン中に封入されていてよい。
【００８３】
さらなる他の態様において、ＩＦおよびＢ１２結合体は、樹状の巨大分子すなわちデンドリマーで送達されてよい。一般的に、デンドリマーは、分岐した樹状の分子であり、ここで、各分枝は、特定の長さの後で２つの新しい分枝（分子）に分岐する、分子の連結鎖である。この分岐は、分枝（分子）が密集して、キャノピーが球状の形態を形成するまで続く。一般的に、デンドリマーの性質はその表面の官能基により決定される。例えば、親水性の末端基、例えばカルボキシル基は、典型的に、水溶性のデンドリマーをもたらす。あるいは、皮膚を介した吸収を促進するために、デンドリマーの表面にリン脂質を取り込んでよい。リポソーム性の態様における使用について詳述されている任意のリン脂質が、デンドリマーの態様での使用に適当である。当該分野で一般的に知られている任意の方法を、デンドリマーの作製および本発明の組成物の該デンドリマーへの封入に用いてよい。例えば、デンドリマーは、反応工程の反復により作製してよく、反復を繰り返すごとに、より高次のデンドリマーが得られる。結果として、デンドリマーは、サイズおよび形態が殆ど均一な、規則的な、高度に分岐した３Ｄ構造を持つ。さらに、デンドリマーの最終的なサイズは、典型的には、合成の間に用いられる反復的な工程の数により制御される。種々のデンドリマーのサイズが、本発明での使用に適当である。一般的に、デンドリマーのサイズは、約１nm〜約１００nmで変動してよい。
【００８４】
II. 方法
他の局面において、上述するように、本発明の組成物は、対象における癌および関連する疾患の処置、安定化および予防に使用し得る。「癌の処置、安定化または予防」は、腫瘍サイズの低下または癌細胞数の減少、腫瘍サイズの上昇または癌細胞増殖の遅延化または予防、腫瘍または他の癌が消滅してから、再発までの無病生存期間の増大、腫瘍または他の癌の初発または続発の予防または、腫瘍または他の癌に関連する有害な症状の低下を起こすことを指す。所望の態様において、処置を生き延びる腫瘍または癌細胞の％は、初期腫瘍または癌細胞数と比較して、任意の標準的な方法（例えばカスパーゼアッセイ、ＴＵＮＥＬおよびＤＮＡ）を用いて測定して、少なくとも２０、４０、６０、８０または１００％低い。本発明の組成物の投与により誘発される、腫瘍または癌細胞数の低下が、非腫瘍または非癌細胞数の低下の、少なくとも２、５、１０、２０または５０倍高いことが望ましい。本発明の方法は、腫瘍サイズまたは癌細胞の数において、標準的な方法で決定して、２０、４０、６０、８０または１００％の低下を起こすことが望ましい。処置を受ける対象の少なくとも２０、４０、６０、８０、９０または９５％が、腫瘍のエビデンスまたは癌が消滅する、完全な寛解を示すことが望ましい。該腫瘍または癌は、再発しないか、または少なくとも５、１０、１５または２０年間は再発しないことが望ましい。
【００８５】
本発明のＢ１２は、放射線照射および治療を、腫瘍部位に特異的に送達するために、上述の放射性核種または治療剤に間接的または直接的に結合していてよい。例えば、静脈内投与された該ＩＦ-Ｂ１２結合体は、消化管の外側でキュビリンに結合する。該ＩＦ-Ｂ１２結合体は、その後、内在化し、検出可能な標識および/または治療剤は、キュビリンを発現する細胞内に集積する。この機構によって、本発明の組成物を、放射線照射および治療を、腫瘍部位に特異的に送達するために用いてよい。さらに、本発明の組成物は、組み合わせ療法の一部であってよい。組み合わせ療法は、本発明の組成物を、放射線療法または化学療法過程とともに用いることを含むのが好ましい。
【００８６】
さらに他の局面において、本発明は、対象における腫瘍の検出方法を提供する。該方法は、該対象に、ＩＦおよびＢ１２を含む組成物を投与すること、および対象において該組成物のキュビリンへの結合を検出するために検出可能な標識を検出することを含み、ここで、該Ｂ１２は、検出可能な標識に結合しており、キュビリンを典型的には発現しない組織中の検出可能な標識の存在は、該対象に腫瘍が存在することを示す。他の態様において、該方法は、ＩＦおよびＢ１２を含む組成物を対象に投与することおよび、対象における該組成物のキュビリンへの結合を検出するために検出可能な標識を検出することを含み、ここで、該Ｂ１２は、検出可能な標識に結合しており、キュビリンを発現することが知られている組織において、検出可能な標識が非対称に存在することは、該対象に腫瘍が存在することを示す。好ましい態様において、該方法は、対象における癌または腫瘍の診断または造影に用いてよい。他の態様において、該方法は、対象における胃腸管の外側のキュビリン発現の造影に用いてよい。いくつかの態様において、腫瘍を検出する方法は、(a) 腫瘍の疑いがある部位の生検; (c) 本発明の組成物を試験管内で腫瘍の疑いがある部分と接触させること; および(d)典型的にはキュビリンを発現しない組織において検出可能な標識を検出することによって、腫瘍を診断すること、を含んでいてよい。
【００８７】
結合は、顕微鏡（蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡または電子顕微鏡）、磁気共鳴画像法(例えばＭＴＩ、ＭＲＳ、ＤＷＩおよびｆＭＲＩ)、シンチグラフィー画像診断(ＳＰＥＣＴ (単一光子放射断層撮影)、ＰＥＴ (ポジトロン放出断層撮影)、ガンマカメライメージングおよび直線形スキャン)、Ｘ線検査または超音波を用いて検出してよい。検出可能な標識は、組織内、生体内、生体外および試験管内で検出可能であってよい。
【００８８】
さらになお他の局面において、本発明は、対象における、キュビリンを発現する細胞にＢ１２を送達する方法を提供する。該方法は、ＩＦおよびＢ１２の複合体を、該対象に静脈内投与することを含む。したがって、ＩＦおよびＢ１２の複合体は、細胞上に存在するキュビリンに結合し、それにより、Ｂ１２を細胞に送達し得る。態様の一において、該Ｂ１２は、検出可能な標識および/または治療剤に結合している。該方法は、対象においてキュビリンを発現する細胞を検出または処置するのに用いてよい。
【００８９】
なおさらに他の局面において、本発明は、キュビリンの機能を調節する方法を提供する。該方法は、ＩＦおよびＢ１２の複合体を対象に静脈内投与することを含む。したがって、ＩＦおよびＢ１２の複合体は、細胞上に存在するキュビリンに結合し、それによりキュビリンの機能を調節し得る。調節という語は、キュビリンの活性を変化させることを指す。例えば、該複合体は、キュビリンの機能を遮断し、それによりキュビリンの活性を阻害し得る。静脈内投与を用いた場合、該方法は、濾過されたタンパク質、例えばアルブミン、トランスフェリン、ビタミンＤ結合タンパク質および他の重要な血漿担体の腎尿細管再吸収を調節し得る。例えば、ＩＦおよびＢ１２の複合体の投与は、キュビリン機能を調節し、それにより、腎毒性タンパク質の取り込みを低下または阻害し得る。腎毒性タンパク質の取り込みの低下または阻害は、急性腎障害を処置または予防し得る。本明細書において、「腎障害」という語は、腎機能の喪失を指す。当該分野で知られている腎障害の原因は数多くあるが、ネクローシス、虚血、血管損傷、腎臓に損傷を与える物質、例えば毒素、静脈造影剤、抗生物質、色素およびＬＰＳへの暴露、尿路の閉塞および腎臓の外傷または挫滅が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、「腎障害」は、ＡＫＩＮ（Acute Kidney Injury Network）基準(Metha et al. Cri Care 2007参照)にしたがって定義される、急性腎障害を指す。例えば、ＩＦおよびＢ１２の複合体は、腎毒性を低下または除去するために、腎毒性剤の投与の前、同時または後に投与してよい。態様の一において、該Ｂ１２は、検出可能な標識および/または治療剤に結合している。
【００９０】
組成物、Ｂ１２およびＩＦは、セクションIに上述する通りである。キュビリン、対象、癌および組成物の投与については以下に記載する。
【００９１】
(a) キュビリン
キュビリンは、ＩＦ-Ｂ１２複合体の消化管吸収および濾過されたタンパク質、例えばアルブミン、トランスフェリン、ビタミンＤ結合タンパク質および他の重要な血漿担体の近位尿細管再吸収などの多様な機能を果たす、大きいエンドサイトーシス受容体である。
【００９２】
局面の一において、キュビリンを発現することが知られている細胞を含む組織中に検出可能な標識が非対称に存在することは、対象中に腫瘍が存在することを示し得る。他の局面において、典型的にはキュビリンを発現しない細胞を含む組織における、検出可能な標識の存在は、対象中に腫瘍が存在することを示す。キュビリンを発現することが公知である細胞の非限定的な例としては、乳腺上皮細胞、腎近位尿細管細胞、胆嚢細胞、消化管細胞、刷子縁細胞、胎盤細胞、有足細胞ならびに内耳および卵黄嚢の上皮細胞が挙げられる。組織または細胞がキュビリンを発現することが公知であるか、または組織または細胞が典型的にはキュビリンを発現しないかを検知する方法は、当該分野で公知である。これらの方法に基づいて、組織を、検出可能な標識の非対称な存在について試験するのか、または検出可能な標識の存在について試験するのかを決定するのは、当業者がなし得ることの範囲内である。例えば、タンパク質発現を検出する方法は、当該分野でよく知られており、当業者に公知であるタンパク質発現量の適当な評価方法は全て、本発明の範囲内に含まれると考えられる。一般的に、該方法は、組織試料を得、該試料を試験管内で処理してタンパク質発現量を評価することを含む。タンパク質発現量の適当な評価方法の非限定的な例としては、エピトープ結合剤をベースとする方法および質量分析法をベースとする方法が挙げられる。いくつかの態様において、タンパク質発現の量を評価する方法は、エピトープ結合剤をベースとする方法である。本明細書において、「エピトープ結合剤」という語は、抗体、アプタマー、核酸、オリゴ核酸、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、代謝物、低分子または、キュビリンを認識し、結合することのできるその断片を指す。核酸としては、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび天然起源の、または合成された誘導体が挙げられる。
【００９３】
本明細書において、「抗体」という語は、一般的に、キュビリンのエピトープを認識し、結合することのできるポリペプチドまたはタンパク質を指す。本明細書において、抗体は、当該分野で理解されている完全抗体、すなわち、２つの重鎖および２つの軽鎖からなる完全抗体であっても、または、抗原結合領域を有する抗体様の分子であってもよく、抗体断片、例えばＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ’)２、単一ドメイン抗体、Ｆｖおよび一本鎖Ｆｖを含むが、これらに限定されない。抗体という語はまた、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体を指す。種々の抗体ベースのコンストラクトおよび断片を作製および使用する技術は当該分野でよく知られている。抗体を作製および特徴付けする方法もまた、当該分野でよく知られている(例えばAntibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988参照; 当該文献は引用によりその全体が本明細書に包含される)。
【００９４】
本明細書において、「アプタマー」という語は、生化学活性、分子認識または結合特性という意味で有用な生物学的活性を有するポリヌクレオチド、一般的にはＲＮＡまたはＤＮＡを指す。通常、アプタマーは、特定のエピトープ（領域）への標的分子の結合等の分子活性を有する。アプタマーはポリペプチドへの結合において特異性を示し、試験管内進化方法により合成および/または特定されてよいことは、一般的に受け入れられている。例えば体外進化法(in vitro evolution method)による、アプタマーの製造および特徴付けの方法は、当該分野でよく知られている (例えば米国特許第７,９３９,３１３号明細書参照; 当該文献は引用によりその全体が本明細書に包含される)。
【００９５】
一般的に、エピトープ結合剤をベースとした、タンパク質発現量の評価方法は、エピトープ結合剤とキュビリンの間に複合体が形成される程度に有効な条件下で、試料を、キュビリン特異的なエピトープ結合剤に接触させることを含む。エピトープ結合剤ベースの方法は、溶液中で行っても、またはエピトープ結合剤または試料を固体面に固定してもよい。適当な表面の非限定的な例としては、マイクロタイタープレート、試験管、レジンおよび他のポリマーが挙げられる。
【００９６】
エピトープ結合剤は、広範の方法で基質に結合でき、これは、当業者には理解できることである。該エピトープ結合剤は、最初に合成されて、次いで基質に結合しても、または、基質上で直接合成されてもよい。該基質およびエピトープ結合剤は、次いでその２つを結合させるために、化学官能基を用いて官能化されてもよい。例えば、該基質は、化学官能基、例えば非限定的な例としては、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基またはチオール基を用いて誘導体化されていてよい。これらの官能基を用いることによって、該エピトープ結合剤は、官能基を用いて直接結合しても、またはリンカーを用いて間接的に結合してもよい。
【００９７】
該エピトープ結合剤は、また、非共有結合によって基質に結合させてもよい。例えば、ビオチン化されたエピトープ結合剤を製造し、これをストレプトアビジンで共有結合によりコートされた表面に結合させることにより、結合させてもよい。あるいは、エピトープ結合剤を、光重合およびフォトリソグラフィーのような技術を用いて表面上で合成してもよい。エピトープ結合剤を固体面に結合するさらなる方法および基質上で生体分子を合成する方法は、当該分野でよく知られており、すなわち、AffymetrixのVLSIPS technologyである(例えば、米国特許第６,５６６,４９５号明細書およびRockett and Dix, Xenobiotica 30(2):155-177参照引用、これらの文献はともに引用によりその全体が本明細書に包含される)。
【００９８】
有効な条件下で、複合体が形成するのに十分な時間、該試料をエピトープ結合剤と接触させることは、一般的に、該エピトープ結合剤組成物を試料に添加し、エピトープ結合剤が存在する任意のキュビリンに結合できるだけの時間、該混合物をインキュベーションすることを伴う。この後、該複合体を洗浄し、該複合体は、当該分野でよく知られている任意の方法により検出し得る。該エピトープ結合剤−キュビリン複合体の検出方法は、一般的に、標識またはマーカーの検出に基づくものである。本明細書において、「標識」という語は、エピトープ結合剤または他の基質物質に結合し、それにより該基質が、検出方法により検出できる任意の物質を指す。適当な標識の非限定的な例としては、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、蛍光クエンチ剤、有色分子、放射性同位体、シンチラント（scintillant）、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体またはその断片、ポリヒスチジン、Ｎｉ２+、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、重金属、および酵素 (例えばアルカリンホスファターゼ、ペルオキシダーゼおよびルシフェラーゼ)が挙げられる。標識またはマーカーの検出に基づく、エピトープ結合剤−キュビリン複合体の検出方法は、当該分野でよく知られている。
【００９９】
いくつかの態様において、エピトープ結合剤ベースの方法は、ＥＬＩＳＡである。他の態様において、エピトープ結合剤ベースの方法は、放射性免疫アッセイである。さらに他の態様において、エピトープ結合剤ベースの方法は、免疫ブロットまたはウェスタンブロットである。異なる態様において、エピトープ結合剤ベースの方法は、免疫組織化学的検査(IＨＣ)である。他の態様において、エピトープ結合剤ベースの方法は、アレイである。他の態様において、エピトープ結合剤ベースの方法はフローサイトメトリーである。
【０１００】
「非対称」は、検出可能な標識が、組織を通じて均等に分散しているのではないことを指す。むしろ、非対称は、検出可能な標識が、組織の一部に集積していること、または組織の一部にランダムに局在していることを意味し得る。態様の一において、検出可能な標識が非対称に存在するということは、組織の残りの部分と比較して、シグナルが約５％以上異なることを意味し得る。例えば、検出可能な標識の非対称な存在は、組織の残りの部分と比較して、シグナルが約５％を超えて、約１０％を超えて、約１５％を超えて、約２０％を超えて、約２５％を超えて、約３０％を超えて、約３５％を超えて、約４０％を超えて、約４５％を超えて、約５０％を超えて、約５５％を超えて、約６０％を超えて、約６５％を超えて、約７０％を超えて、約７５％を超えて、約８０％を超えて、約８５％を超えて、約９０％を超えて、約９５％を超えてまたは約１００％、シグナルに差異があることを意味し得る。
【０１０１】
(b) 対象
本発明の方法は、ヒト、家畜動物、コンパニオン動物、実験動物または動物園の動物である対象における腫瘍を検出または処置するのに使用し得る。態様の一において、該対象は、齧歯類、例えばマウス、ラット、ハムスター等であってよい。他の態様において、該対象は、家畜動物であってよい。適当な家畜動物の非限定的な例としては、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラマおよびアルパカが挙げられる。さらに他の態様において、該対象はコンパニオン動物であってよい。コンパニオン動物の非限定的な例としては、ペット、例えばイヌ、ネコ、ウサギおよび鳥が挙げられる。さらに他の態様において、該対象は、動物園の動物であってよい。本明細書において、「動物園の動物」という語は、動物園で見られる動物を指す。該動物としては、非ヒト霊長類、大型ネコ科、オオカミおよびクマが挙げられる。好ましい態様において、該動物は実験動物である。実験動物の非限定的な例としては、齧歯類、イヌ、ネコおよび非ヒト霊長類が挙げられる。特定の態様において、該動物は齧歯類である。齧歯類の非限定的な例としては、マウス、ラット、ハムスター等が挙げられる。
【０１０２】
(c) 腫瘍
本発明の組成物は、新生物由来の腫瘍または癌の処置または認識に使用し得る。例えば、静脈内投与された該ＩＦ-Ｂ１２結合体は、消化管の外側でキュビリンに結合する。該ＩＦ-Ｂ１２結合体は、その後内在化し、検出可能な標識および/または治療剤が、キュビリン発現細胞に集積する。この機構により、本発明の組成物は、腫瘍の処置または認識に使用し得る。キュビリンは、ＩＦ-Ｂ１２複合体の消化管吸収および濾過されたタンパク質、例えばアルブミン、トランスフェリン、ビタミンＤ結合タンパク質および他の重要な血漿担体の近位尿細管再吸収などの多様な機能を果たす、大きいエンドサイトーシス受容体である。したがって、キュビリンは通常、腸管および腎臓に発現する。重要なことに、キュビリンの過剰発現は、肺癌および腎臓癌で見られている。したがって、例示的な態様において、本発明の方法は、肺癌および腎細胞癌の検出または処置に使用し得る。さらに、本発明の方法は、肺癌および腎細胞癌に関連のある転移の検出または処置に使用し得る。しかし、キュビリンを発現する他の任意の新生物もまた、本発明の方法に使用し得る。
【０１０３】
「新生物」は、過剰な細胞分裂の結果としての異常な成長に特徴付けられる任意の組織またはその細胞である。新生物は悪性であっても良性であってもよく、癌は原発性であっても転移性であってもよく；新生物または癌は、初期であっても後期であってもよい。処置または検出し得る新生物または癌の非限定的な例としては、次のものが挙げられるが、しかし、それらはキュビリンを発現するものである：急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、AIDS関連癌、AIDS関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星細胞腫(小児性小脳または大脳)、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍(小脳星細胞腫、大脳星細胞腫/悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原発性神経外胚葉腫瘍、視経路および視床下部膠腫)、乳癌、気管支腺腫/カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍(小児性、胃腸管系)、原発不明の癌、中枢神経系リンパ腫(原発性)、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫/悪性神経膠腫、子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、皮膚性Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、ユーイング腫瘍のユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞癌(小児性)、性腺外胚細胞癌、肝外胆管癌、眼癌 (眼球内黒色腫、網膜芽細胞腫)、胆嚢癌、胃(gastric (胃(stomach)))癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、胚細胞腫瘍(小児性頭蓋外、性腺外、卵巣)、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫 (成人性、小児脳幹、小児大脳星細胞腫、小児視経路および視床下部膠腫)、胃カルチノイド、有毛細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞 (肝臓)癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部および視経路膠腫 (小児性)、眼内黒色腫、膵島細胞癌、カポジ肉腫、腎臓癌 (腎細胞癌)、喉頭癌、白血病(急性リンパ芽球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、有毛細胞)、口唇癌および口腔癌、肝臓癌 (原発性)、肺癌 (非小細胞、小細胞)、リンパ腫 (AIDS関連性、バーキット、皮膚性T細胞性、ホジキン、非ホジキン、原発性中枢神経系)、マクログロブリン血症(ワルデンシュトレーム)、骨悪性線維性組織球腫/骨肉腫、髄芽腫(小児性)、黒色腫、眼内黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫(成人悪性、小児性)、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群(小児性)、多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成/骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病(慢性)、骨髄性白血病(成人急性、小児急性)、多発性骨髄腫、骨髄増殖性疾患(慢性)、鼻腔および副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫/骨悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌(表層上皮性−間質性腫瘍)、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵癌、膵癌 (島細胞)、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体星細胞腫、松果体胚腫、松果体芽腫およびテント上原発性神経外胚葉腫瘍(小児性)、下垂体腺腫、形質細胞腫瘍、胸膜肺芽細胞腫、中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌 (腎臓癌)、腎盂および尿管移行細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫(小児性)、唾液腺癌、肉腫 (ユーイング腫瘍、カポジ肉腫、軟部肉腫、子宮肉腫)、セザリー症候群、皮膚癌 (非黒色腫性、黒���腫性)、皮膚癌 (メルケル細胞)、小細胞肺癌、小腸癌、柔組織肉腫、扁平上皮癌、原発不明の頸部扁平上皮癌(転移性)、胃癌、テント上原発性神経外胚葉性腫瘍(小児性)、Ｔ細胞リンパ腫(皮膚性)、精巣癌、咽頭癌、胸腺腫(小児性)、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、甲状腺癌(小児性)、腎盂および尿管の移行上皮癌、絨毛性腫瘍(妊娠性)、原発不明の癌(成人性、小児性)、尿管および腎盂の移行細胞癌、尿道癌、子宮癌(子宮内膜)、子宮肉腫、腟癌、視経路および視床下部膠腫(小児性)、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症およびウィルムス腫瘍（小児性)。好ましい態様において、該癌は、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、食道癌、胃肉腫、神経膠腫、肺癌、リンパ腫、黒色腫、多発性骨髄腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、頭頸部腫瘍および固形腫瘍からなる群から選択される。
【０１０４】
(d) 投与
特定の局面において、薬理学的な有効量の本発明の組成物を対象に投与してよい。他の局面において、薬理学的な有効量のＩＦおよび薬理学的な有効量のＢ１２またはＢ１２結合体を、ＩＦおよびＢ１２もしくはＢ１２結合体が生体内で結合するように、対象に個別に投与する。非経腸投与は、標準的な有効な技術を用いて行う。非経腸投与としては、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、動脈内、骨内、腹腔内または髄腔内注射または点滴技術が挙げられるが、これらに限定されない。静脈内注射による、有効な非経腸全身送達は、対象への好ましい投与方法である。そのような注射に適当なビヒクルは、容易に理解できる。
【０１０５】
有効な投与用の医薬組成物は、選択した投与方法に適当なように計画的に設計されており、薬学的に許容される賦形剤、例えば適合性の分散剤、緩衝剤、界面活性剤、保存料、可溶化剤、等張剤、安定化剤等が適宜使用される。Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton Pa., 16Ed ISBN: 0-912734-04-3, 最新版（当該文献は、引用によりその全体が本明細書に包含される）には、一般的に専門家に知られている製剤技術の一覧が示されている。本発明で有用な組成物の可溶性の特性を変化させる、例えばリポソーム中に封入するか、または極性の基を遮断することによってより親油性にすることも実際に有用であり得る。
【０１０６】
治療適用には、治療有効量の本発明の組成物を対象に投与する。「治療有効量」は、測定可能な生物学的腫瘍応答（例えば免疫刺激性、抗血管新生応答、細胞毒性応答または腫瘍退行）をもたらすのに十分な、治療用組成物の量であってよい。あるいは、「治療有効量」は、キュビリンの機能の測定可能な低下（例えば尿中のアルブミン増加、急性腎障害の予防、急性腎障害の処置、腎毒性タンパク質、例えば軽鎖、ミオグロビンおよびヘモグロビンの取り込みの予防、腎毒性タンパク質の取り込みの低下）をもたらすのに十分な治療組成物の量であってよい。本発明の治療用組成物中の有効成分の実際の用量レベルは、特定の対象の所望の治療応答を達成するのに有効な有効化合物を投与するために変動してよい。選択された用量レベルは、治療用組成物の活性、製剤、投与経路、他の薬物または処置との組み合わせ、腫瘍サイズおよび寿命、ならびに処置する対象の身体的な症状および病歴などの種々の因子に依存する。いくつかの態様において、最小限の用量を投与し、用量を限定する毒性がない場合、用量を増加させる。治療上有効量の決定および調節ならびに該調節をいつどのように行うかは、医薬分野の当業者には公知のことである。
【０１０７】
診断適用には、検出可能な量の本発明の組成物を対象に投与する。本明細書において、診断用の組成物に関する「検出可能な量」は、該組成物の存在が生体内または試験管内で決定できるような、該組成物の用量を指す。検出可能な量は、種々の因子、例えば非限定的な例としては、標識されている薬物の化学的な特徴、検出可能な標識、標識方法、造影の方法および関連するパラメーター、対象中の標識された薬物の代謝、標識の安定性(例えば、放射性核種標識の半減期)、造影の前に、薬物および/または標識したペプチドを投与した後の経過時間、薬物投与の経路、対象の身体的な症状および病歴、ならびに腫瘍または腫瘍と疑われるもののサイズおよび寿命によって変わり得る。したがって、検出可能な量は、変動し得るものであり、特定の適用に合わせることができる。本発明の試験後、かかる検出可能な量を決定することは、当該分野の当業者に可能なことである。
【０１０８】
ＩＦおよび、Ｂ１２またはＢ１２結合体を含む組成物を、約０.１pM〜約５００pMの濃度で投与してよい。例えば、ＩＦおよび、Ｂ１２またはＢ１２結合体を含む組成物は、約０.１pM、約０.２pM、約０.３pM、約０.４pM、約０.５pM、約０.６pM、約０.７pM、約０.８pM、約０.９pM、約１pM、約１.５pM、約２pM、約２.５pM、約３pM、約３.５pM、約４pM、約４.５pM、約５pM、約５.５pM、約６pM、約６.５pM、約７pM、約７.５pM、約８pM、約８.５pM、約９pM、約９.５pMまたは約１０pMの濃度で投与してよい。あるいは、ＩＦおよび、Ｂ１２またはＢ１２結合体を含む組成物は、約１５pM、約２０pM、約２５pM、約３０pM、約３５pM、約４０pM、約４５pM、約５０pM、約５５pM、約６０pM、約６５pM、約７０pM、約７５pM、約８０pM、約８５pM、約９０pM、約９５pM、約１００pM、約１５０pM、約２００pM、約２５０pM、約３００pM、約３５０pM、約４００pM、約４５０pMまたは約５００pMの濃度で投与してよい。特定の態様において、ＩＦおよび、Ｂ１２またはＢ１２結合体を含む組成物は、約１pMの濃度で投与してよい。他の特定の態様において、ＩＦおよび、Ｂ１２またはＢ１２結合体を含む組成物は、約４pMの濃度で投与してよい。さらに他の特定の態様において、ＩＦおよび、Ｂ１２またはＢ１２結合体を含む組成物は、約１pM〜約１０pMの濃度で投与してよい。なおさらに他の特定の態様において、ＩＦおよび、Ｂ１２またはＢ１２結合体を含む組成物は、約１０pM〜約５０pMの濃度で投与してよい。他の態様において、ＩＦおよび、Ｂ１２またはＢ１２結合体を含む組成物は、約５０pM〜約５００pMの濃度で投与してよい。
【０１０９】
ＩＦおよび、Ｂ１２またはＢ１２結合体が別に投与される態様において、ＩＦおよびＢ１２またはＢ１２結合体は、同じまたは異なる濃度で投与してよい。ＩＦおよび/またはＢ１２もしくはＢ１２結合体は、約０.１pM〜約５００pMの濃度で投与してよい。例えば、ＩＦおよび/またはＢ１２もしくはＢ１２結合体は、約０.１pM、約０.２pM、約０.３pM、約０.４pM、約０.５pM、約０.６pM、約０.７pM、約０.８pM、約０.９pM、約１pM、約１.５pM、約２pM、約２.５pM、約３pM、約３.５pM、約４pM、約４.５pM、約５pM、約５.５pM、約６pM、約６.５pM、約７pM、約７.５pM、約８pM、約８.５pM、約９pM、約９.５pMまたは約１０pMで投与してよい。あるいは、ＩＦおよび／またはＢ１２もしくはＢ１２結合体は、約１５pM、約２０pM、約２５pM、約３０pM、約３５pM、約４０pM、約４５pM、約５０pM、約５５pM、約６０pM、約６５pM、約７０pM、約７５pM、約８０pM、約８５pM、約９０pM、約９５pM、約１００pM、約１５０pM、約２００pM、約２５０pM、約３００pM、約３５０pM、約４００pM、約４５０pM、または約５００pMの濃度で投与してよい。特定の態様において、ＩＦおよび／またはＢ１２もしくはＢ１２結合体は、約１pMの濃度で投与してよい。他の特定の態様において、ＩＦおよび/またはＢ１２もしくはＢ１２結合体は、約４pMの濃度で投与してよい。さらに他の特定の態様において、ＩＦおよび/またはＢ１２もしくはＢ１２結合体は、約１pM〜約１０pMの濃度で投与してよい。なおさらに他の特定の態様において、ＩＦおよび/またはＢ１２またはＢ１２結合体は、約１０pM〜約５０pMの濃度で投与してよい。他の態様において、ＩＦおよび/またはＢ１２もしくはＢ１２結合体は、約５０pM〜約５００pMの濃度で投与してよい。異なる態様において、ＩＦに対して過剰量のＢ１２またはＢ１２結合体が投与される。
【０１１０】
典型的な用量レベルは変動し得るものであり、標準的な臨床技術を用いて決定および最適化してよく、部分的には、用いる検出可能な標識および/または治療剤および投与方法に依存する。
【０１１１】
投与の頻度は、症状を有効に処置するのに必要であれば、１日に１回、２回、３回またはそれ以上、１週間毎または１ヶ月毎であってよい。疾患に関する処置のための投与のタイミングそのものならびに、処置期間は、当該症例を取り巻く条件により決定される。処置は、傷害部位に、救急医療スタッフによって投与されるように、すぐ開始してよい。処置は、病院または診療所で開始しても、または退院後、もしくは外来診療所での診察後に開始してもよい。処置期間は、１回投与される単回投与から生涯にわたる治療過程までの範囲で変わり得る。
【０１１２】
前述の方法が、適当な適用による該組成物の投与に最も都合良く、最も適当および効果的であるように考えられるが、適切な処方が用いられるのであれば、投与のための他の有効な技術を用いてもよい。
【０１１３】
さらに、生分解性のフィルムおよびマトリクスまたは浸透圧ミニポンプまたはデキストランビーズ、アルギン酸またはコラーゲンに基づく送達系を用いて、徐放製剤を使用することが望ましい場合もある。
【０１１４】
(e) 付加的な投与
局面の一において、該方法は、遊離のＢ１２を投与することをさらに含んでいてよい。ＩＦとＴＣＩＩの間に結合したＢ１２の輸送は限定的である可能性が高いが、遊離のＢ１２の投与は、ＴＣＩＩを飽和させ、それにより、結合したＢ１２が、ＩＦからＴＣＩＩへ輸送されるのを、該輸送が低いレベルであっても阻止し得る。Ｂ１２の投与は当該分野では標準的である。典型的には、Ｂ１２は、経口、皮下、筋肉内または静脈内投与される。Ｂ１２は、約１〜２０００μgの用量で投与してよい。投与する用量は、投与経路および対象の病歴に依存し得る。非限定的な例としては、１０００μgを静脈内または筋肉内投与してよい。
【０１１５】
組成物の対象への投与は、本発明の組成物を投与する前、同時または後に、遊離Ｂ１２を投与することによって行ってよい。したがって、該遊離Ｂ１２は、いくつかの態様において、本発明の組成物または製剤の投与の０時間〜約２４時間前に投与され、いくつかの態様において、本発明の組成物または製剤の投与の約０時間〜約４時間前に投与される。
【０１１６】
他の局面において、該方法は、Ｌ−リジンをさらに投与することを含んでいてよい。腎臓の取り込みが高くなると、腹部の造影の感受性が低下する。Ｌ−リジンの投与は、当該分野で標準的であり、腎臓の取り込みを遮断するのに使用し得る。Ｌ−リジンの投与は、腎臓の取り込みによるバックグラウンドを低下させるのに使用してよく、転移の可視化を促進し得る。例えば、ＲＣＣが疑われる態様において、Ｌ−リジンは、本発明の組成物の、腎臓の腎細胞への結合を遮断し、さらに同時にＲＣＣ転移の検出を可能にするために投与してよい。典型的には、Ｌ−リジンは、経口または静脈内投与される。Ｌ−リジンは、約１００mg/kg〜約１０００mg/kgまたは約２００mg/kg〜約６００mg/kgの用量で投与してよい。
【０１１７】
組成物の対象への投与は、本発明の組成物の投与の前、同時または後に、Ｌ−リジンを投与することにより行ってよい。したがって、該Ｌ−リジンは、いくつかの態様では、該組成物の投与の０時間〜約２４時間前に投与され、いくつかの態様では、該組成物の投与の約０時間〜約４時間前に投与され、いくつかの態様では、該組成物の投与の約３０分〜１時間前に投与される。
【０１１８】
次の実施例は、本発明の好ましい態様を示すことを含むものである。代表的な技術による実施例に記載の技術は、本発明の実施によく機能することが本発明者によって明らかにされたものであり、そのため、本発明の実施の好ましい方法を構成すると考え得ることは当業者が理解するべきことである。しかし、本明細書に記載の特定の態様は、本発明の精神および範囲から離れなければ、多くの変更がなされてよく、類似の結果を得ることができるものであることは、本明細書の記載から当業者が理解するべきことである。
【実施例】
【０１１９】
実施例１. 内因子 (ＩＦ)−Ｂ１２イメージングプローブの原理および開発
ビタミンＢ１２は、コバラミンとも称され、多くの代謝プロセスの必須のコファクターである。図１は、Ｂ１２の構造を示す。該Ｃｏ (ＩＩＩ)原子は、コリン環に配位しており、該環は、この場合、７つのアミド側鎖 (ａ〜ｇ)を有する環である６。平面コリン環内には、４つの還元されたピロール環が存在する(Ａ〜Ｄと表す)６。該コリン環では、窒素とsp２炭素原子の間でπ原子非局在化が起こる６。+３状態のコバルト原子を有するコバラミンは、通常、ベースオン（base-on）形態でＸ位に配位子を有する正八面体形態を有し、このことは、ジメチルベンズイミダゾール基中の窒素がコバルトに配位していることを意味する６。
【０１２０】
Ｂ１２は口から体内に入り、口内で食物から分離され、約５８kDaのタンパク質であるハプトコリン（ＨＣ）が結合する (Kd = ０.０１ pM)６。次いで、該ＨＣ-Ｂ１２複合体は、胃へと移動し、ここで、胃の頂端細胞が、内因子 (ＩＦ)を放出する。ＨＣ−Ｂ１２が小腸に入ると、ｐＨの上昇によりＨＣが部分的にアンフォールディングし、その後、プロテアーゼにより分解され、Ｂ１２を放出する。血中において、ＨＣはコバラミンの約７５％に結合し、トランスコバラミンが残りに結合する９。
【０１２１】
ＩＦは、５０kDaのタンパク質であり、分解されたＨＣから放出されたときに、Ｂ１２に結合する(Kd = ０.００３ pM)６。その後、ＩＦ−Ｂ１２は、十二指腸に移動し、そこで高い親和性(Kd 約５nm)でキュビリン (ＣＵＢＮ) に結合する。ＣＵＢＮは、回腸突端の腸細胞の表面に発現する、４６０kDaのグリコシル化された末梢性の膜タンパク質である７。具体的には、ＩＦ-Ｂ１２は、Ｃａ２＋依存的に、ＣＵＢドメイン５〜８に結合する７。ＣＵＢＮは全部で２７のＣＵＢドメインを有し、これらは、ＩＦ-Ｂ１２とともに、アルブミン、トランスフェリンおよびビタミンＤ (Ｄ結合タンパク質に結合)に結合する１０。ＣＵＢＮは膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインを持たないため、エンドサイトーシスが可能であるためには、２つの異なる膜貫通タンパク質である、アムニオンレス (ＡＭＮ)およびメガリン/ＬＲＰ２が存在していなければならない７。回腸細胞の中に入ると、ＩＦはリソソームにより分解され、Ｂ１２にトランスコバラミンＩＩ (ＴＣＩＩ) (約４４kDa、Kd = ０.００４pM)が結合する６。図２は、Ｂ１２の摂食による取り込み経路を表す。
【０１２２】
コバラミンは細胞増殖過程に必要であり、さらに、水溶性であり細胞毒性が知られていないといった有用性を有することから、このビタミンをイメージングプローブとして用いることは、明らかに予測できることである。ハプトコリン(ＨＣ)および内因子 (ＩＦ)によるＢ１２の結合の結晶構造の研究に基づけば、天然の生物学的経路を妨害するのを避ける修飾に最も理想的な部位がＢ１２上に存在する。結合は、アミド側鎖の加水分解から生じるカルボン酸上またはリボシル基上の５’−ヒドロキシル残基上で起こり得る６。
【０１２３】
造影技術が非常に進歩する一方で、現在のイメージングプローブの最大の弱点は、バックグラウンド発光のレベルである。バックグラウンドという語は、造影を行うときに照射される試料中の、好ましい標的ではない任意の領域を表すのに用いられる。Ｂ１２は、腎臓および肝臓に集積する傾向があるために、造影の結果を歪曲させる。本質的には、Ｂ１２プローブについて見られるバックグラウンドは、全ての細胞が細胞増殖にＢ１２を必要とするために、ＴＣＩＩ受容体(ＭＧ、ＣＤ３２０)が全身に分布していることによるものである。この問題を回避するために、ＴＣＩＩではなくキュビリン受容体を標的とするＩＦ-Ｂ１２プローブを設計した。現在、キュビリン受容体を有する、最も研究されている細胞は、十二指腸の腸細胞および腎細胞である９。腎細胞受容体が、Ｌ−リジンの混注によって遮断でき、したがって、腎臓の大きなバックグラウンドとは対照的に、転移性の腫瘍のみの造影が可能であることも示されている１１。図３は、このプローブを合成するためのスキームを示す。
【０１２４】
実施例２.  １,１-ビスチアゾレート-(１,４)-ジアミノブタン (１)の合成
１,１-ビスチアゾレート-(１,４)-ジアミノブタン (１) を、無水ジクロロエタン(ＤＣＥ)中、室温、アルゴン下で３０分間、Ｎ-Ｂｏｃ-１,４-ブタンジアミン (３００mg、１.５mmol)をチアゾール-４-カルボキシアルデヒド(３mmol、３００mg)と反応させることにより合成した１２。この最初の工程の後、ＤＣＥ ５mLを、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(３mmol、６３６mg)とともに添加した。その後、この反応を１６時間続け、次いで溶媒を減圧下で除き、生成物を水中の１０％ メタノール、１０％ トリフルオロ酢酸（５ mL）に再懸濁した。Ｂｏｃ保護基を除くために、この反応を室温で３時間行った。その後、溶媒を減圧下で除き、生成物を１０％ 水中メタノールで再懸濁した。この反応は、９％の収率を示した。図４は、１,１-ビスチアゾレート-(１,４)-ジアミノブタン反応のスキームを表す。
【０１２５】
実施例３. １,１-ビスチアゾレート-(１,４)-ジアミノブタン (１)の精製および特徴付け
１,１-ビスチアゾレート-(１,４)-ジアミノブタンを、クォータナリポンプを備えたAgilent 1200シリーズの機器を用いて、ＵＶ検出２５４nmで、C18 column (Agilent Eclipse XDB-C18)上で精製した。溶媒Ａは、０.１％ ＴＦＡ/Ｈ２Ｏであり、溶媒Ｂはアセトニトリル(ＭｅＣＮ)であった。１,１-ビスチアゾレート-(１,４)-ジアミノブタンを精製するのに用いた勾配は、０〜５％ ＭｅＣＮ、３０秒間であり、その後、５％ ＭｅＣＮで５分間維持した。図５は、この精製のトレースを示す。その後、図６に示すように、１Ｈ−ＮＭＲを行って、１,１-ビスチアゾレート-(１,４)-ジアミノブタンの特徴付けを行った。
【０１２６】
実施例４.  Ｂ１２-ビスチアゾール (２)の合成
シアノコバラミン (１９６.５３mg) ０.１４５mmolを、無水ＤＭＳＯ ５mL中、５０℃で、１,１’-カルボニル-ジ-(１,２,４-トリアゾール) (ＣＤＴ) ０.７２５mmolによって１時間活性化させた。ＤＭＳＯ中の１,１-ビスチアゾレート-(１,４)-ジアミノブタン ０.１５９mmol (３７.７３８mg)を該反応液に添加し、１６時間反応させた。その後、生成物をエーテルおよびアセトンを用いて沈殿させた。この反応の収率を計算すると、０.５％であった。反応収率を上昇させるために、この反応を、無水ＤＭＳＯ中、５０℃で、ＣＤＴ (５９.３４mg) ０.３６mmolによって１時間１５分活性化させたシアノコバラミン(６０.９９mg) ０.０４５mmolを用いて繰り返した。その後、該反応液を室温に１５分間静置して冷却した。無水ＤＭＳＯ １mL中の１,１-ビスチアゾレート-(１,４)-ジアミノブタン ０.０５０mmol (１４mg)を該反応混合物に添加し、１６時間反応させた。この反応の収率は１.５％であった。該Ｂ１２-ビスチアゾール反応は、収率を上げるために最適化してよい。
【０１２７】
実施例５.  Ｂ１２-ビスチアゾールの精製および特徴付け
Ｂ１２-ビスチアゾールを、勾配として０〜５％ ＭｅＣＮ １０分間の後、５〜２０％ ＭｅＣＮ、６分間を用いて、クォータナリポンプを備えたAgilent 1100シリーズ機器を用いて、ＵＶ検出 ３６０nmで、C18 column (Agilent Eclipse XDB-C18) 上で精製した。溶媒Ａは０.１％ＴＦＡ/Ｈ２Ｏであり、溶媒Ｂはアセトニトリル(ＭｅＣＮ)であった。図７は、Ｂ１２ビスチアゾールのＲＰ−ＨＰＬＣトレースを示す。
【０１２８】
精製産物を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析(ＭＡＬＤＩ-ＴｏＦ)を用いて特徴付けした。図８は、１９０７.６１５m/zにおける該生成物を表すデータを示す。その後、Ｂ１２-ビスチアゾールを凍結乾燥し、Ｄ２Ｏ ５００μlに再懸濁し、図９に示すように、４００MHz １Ｈ−ＮＭＲで特徴付けを行った。
【０１２９】
実施例６.  予備プローブモデルとしてのレニウム標識Ｂ１２-ビスチアゾール
レニウムには、１８８Ｒｅおよび１８６Ｒｅの２つの同位体があり、これらは、造影目的で使用し得る。これらの同位体はともにβ−放射体であるが、放射の性質は異なる。１８８Ｒｅは、１８８Ｗ (t１/２= ６２日間)のβ崩壊を適用する発生装置から得られ、１６.２時間のt１/２および２.１MeVのEmaxを有する１３。しかし、１８６Ｒｅは、８９.２時間のt１/２および１.１MeVのEmaxを有する１３。
【０１３０】
Ｒｅ(Ｈ２Ｏ)３(ＣＯ)３Ｂｒは、事前に、ｄＨ２Ｏ中にＲｅ(ＣＯ)５Ｂｒを溶解し、１００℃を超える温度で２４時間還流することにより合成した９。その後、該溶液を冷却し、セライトプラグに通して濾過した９。Ｂ１２-ビスチアゾール (２) (０.１ mg、６ x １０-８ mol)およびＲｅ(Ｈ２Ｏ)３(ＣＯ)３Ｂｒ (０.０３mg、６ x １０-８mol) を、メタノール中、６０℃で３時間還流した９。反応が完了した後、溶媒を減圧下で除き、１０％ 水中ＭｅＯＨに再溶解した。この反応の収率は、３４％と算出された。Ｂ１２-ビスチアゾールの、Ｒｅ(Ｉ)による標識は、収率を上昇させるために最適化してよい。
【０１３１】
実施例７. Ｂ１２-ビスチアゾール-Ｒｅ(Ｉ) (２’)の精製および特徴付け
Ｂ１２-ビスチアゾール-Ｒｅ (Ｉ) (２’)を、クォータナリポンプを備えたAgilent １1100シリーズ機器によるＨＰＬＣを用いて、ＵＶ検出 ３６０nmで、C18 column (Agilent Eclipse XDB-C18)上で精製した。溶媒Ａは０.１％ＴＦＡ/H２Oであり、溶媒Ｂはアセトニトリルであった。用いた方法は、０〜１５％ Ｂ、５分間の後、１５〜２０％ Ｂ、５分間である。図１０は、５.２８分における、Ｂ１２-ビスチアゾール-Ｒｅ(Ｉ) のＴｒを用いたＲＰ−ＨＰＬＣトレースを表す。その後、Ｂ１２-ビスチアゾール-Ｒｅ(Ｉ) の特徴付けを、ＭＡＬＤＩ-ＴｏＦを用いて行った。予測されるm/zは１９０７であり、実測されたm/zは１９０７.６１５であった。図１１は、Ｂ１２-ビスチアゾール-Ｒｅ(Ｉ)のＭＡＬＤＩ-ＴｏＦスペクトルを示す。最後に、Ｂ１２-ビスチアゾール-Ｒｅ(Ｉ)についての蛍光スキャンを行い、質量変化を起こしたのはＲｅ(Ｉ)であり、Ｒｅ(Ｉ)が活性であることについての証拠を得た。図１２は、蛍光スキャンのトレースを示す。このイメージングプローブの組織分布を観察するために、ラットにおける生体内試験を行ってよい。
【０１３２】
実施例８. 放射性金属としての９９ｍＴｃ
９９ｍＴｃは、６６時間のｔ１/２を有するβ−−放射体である９９Ｍｏの崩壊を介して形成される１３。この２つの生成物は、電荷の違いにより、アルミナクロマトグラフィーカラムで容易に分離できる１３。９９ｍＴｃは、γ-放射体であるため、ガンマカメラを用いた造影に適用可能である１３。９９ｍＴｃの基底状態への遷移状態は、核スピン禁止遷移であるため、９９ｍＴｃの半減期は、６時間と比較的短く、患者における造影に最適な時間である１３。該γ-エネルギーは、１４０keVであり、これは、生物組織を貫通できる程度の大きさであるが、患者に対する負荷を最小化できる程度に小さい１３。Ｂ１２-ビスチアゾールは、９９ｍＴｃで標識される。次いで、イメージングプローブの組織分布を観察するために、ラットにおける生体内試験を行う。
【０１３３】
実施例９. ビタミンＢ１２結合体である、６４Ｃｕで同位体標識されたＢ１２-ｅｎ-Ｂｚ-ＮＯＴＡ
図１３に見られるように、同位体標識されたＢ１２結合体は、酸性条件(ｐＨ５.５)下で、６０℃で３０分間加熱して、６４Ｃｕで標識された、ビタミンＢ１２結合体Ｂ１２-ｅｎ-Ｂｚ-ＮＯＴＡを含んでいてよい。Ｂ１２-ｅｎ-Ｂｚ-ＮＯＴＡは、２段階のカップリング反応を介して、Ｂ１２をエチレンジアミン(ｅｎ) に共有結合させることにより合成でき、ここで、該５’−ＯＨ基は、キレート剤を取り込むためにアミン基で官能化されている。所望のＢ１２-ｅｎを、カチオン交換クロマトグラフィーを用いて、未反応のＢ１２から分離してよい。未反応のＢ１２を、１０mM ＮａＣｌ、３２分間で溶出しながら、フロースルーに溶出し得る。該ｐ-イソチオシアナートベンジル官能化ＮＯＴＡキレートを、Ｂ１２-ｅｎと、モル当量比１:１で反応させ; 所望の生成物である、Ｂ１２-ｅｎ-Ｂｚ-ＮＯＴＡは、Eclipse XDB-C18 columnで、保持時間１４.２分間で単離した。ＭＡＬＤＩ-ＴｏＦ ＭＳを用いて、該生成物が、Ｂ１２のシアノ基を除いたＢ１２-ｅｎ-Ｂｚ-ＮＯＴＡと一致する、１８６７m/zにピークを有することを確認するのに用いてよい。
【０１３４】
実施例１０. 結合したＢ１２のＩＦへの結合
ＩＦはＢ１２に対してピコモルレベルの親和性を示すために、これらをともに溶液中にいれると結合するため、同位体標識を選択しＢ１２に結合させたら、溶液中で該結合体をＩＦに結合させることにより、Ｂ１２結合体にＩＦを事前結合させてよい。例えば、放射性標識Ｂ１２系を、ＰＢＳ(ｐＨ７.４)またはＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５.５）中のＩＦと結合させてよい。ＩＦに事前に結合した放射性標識Ｂ１２結合体を、造影および/または処置の有効性を評価するために試験してよい。
【０１３５】
実施例１１. ＴＣＩＩおよびＨＣの存在下における、ＩＦおよびＢ１２の結合の維持率を決定するための試験管内試験
本発明の有効性を確認するために、２つの試験管内試験を用いてよい。最初に、ＩＦ vs ＴＣＩＩ/ＨＣ Ｂ１２結合アッセイを、１nM ＴＣＩＩ/ＨＣに添加した、３.３μM ＩＦ-Ｂ１２-ＡＦ６４７を用いて行ってよい。次に、１nM ＩＦ-Ｂ１２-ＡＦ６４７を１nM ＴＣＩＩ/ＨＣに添加する。Ｂ１２結合タンパク質が、Ｂ１２-Ｃｕ６４と競合するための時間が経過した後、免疫沈降により培地から個別に捕捉する。各結合タンパク質の単離は、磁気微粒子に結合した抗ヒトＩＦ/ＴＣＩＩ/ＨＣを用いて行う。各タンパク質をペレット化し、γカウンターを用いて、γ放出を測定する。各タンパク質に結合したＢ１２-Ｃｕ６４の濃度をカウント毎分 (cpm) で測定し、ホロ-ＩＦ/ＴＣＩＩ/ＨＣ-Ｂ１２-Ｃｕ６４のキャリブレーションと比較する。これにより、どれだけのＢ１２-Ｃｕ６４がＩＦ-Ｂ１２-Ｃｕ６４から除かれたかを決定することができる。
【０１３６】
Ｃｕ６４ ３.３μMは、約３.７MBq (１００μCi) に相当し、ＰＥＴ画像法で観察することのできる、検出可能な最も低いレベルである。ＴＣＩＩおよびＨＣは、血中に、pMの濃度で存在するため、Ｂ１２-Ｃｕ６４がＩＦ-Ｂ１２-Ｃｕ６４から除かれると、レベルが検出可能限界を下回り、すなわち、ＣＤ３２０によるバックグラウンド像は観察されなくなる。
【０１３７】
実施例１２. Ｂ１２-ＩＦプローブの生体内分布の決定のための生体内試験
本発明は、生体内試験によっても評価し得る。外来性のＢ１２による干渉を低下させるために、動物は、接種前２週間は、Ｂ１２を欠いた食餌を与えてよい。
【０１３８】
好ましくはラットを用いる第一の試験において、ＩＦ-Ｂ１２-Ｃｕ６４結合体を、尾静脈注射を介して３匹のラットに投与する。特定のタイムポイント(２、６および２４時間)において、該結合体の取り込みを定量するために、ＰＥＴ画像法によって該ラットをスキャンする。この試験の目的は、種々の組織にわたるキュビリンの生体内分布を観察することである。
【０１３９】
好ましくはラットを用いる競合阻害についての第二の試験において、予め決定した濃度の遊離Ｂ１２を、ＴＣＩＩおよびＨＣを血中で飽和させるために、前／共−注入する。その後、ＩＦ-Ｂ１２-Ｃｕ６４を、尾静脈注射により投与し、ＰＥＴ画像法を、２、６および２４時間の時点で行う。該結合体の生体内分布を第一のラット試験と比較する。
【０１４０】
好ましくはラットを用いる腫瘍取りこみについての第三の試験は、ｎ匹のラットからなる群Ａ、ＢおよびＣを用いて３回重複して行う必要がある。群Ａには、キュビリンを発現することが知られている腎臓腫瘍細胞株を移植する。群Ｂには、キュビリンを発現することが知られている肺癌細胞株を移植する。群Ｃは、キュビリンを発現しないことが知られている癌細胞株を移植する。
【０１４１】
該試験により、ＩＦ-Ｂ１２-Ｃｕ６４が、キュビリンを発現する転移性腎腫瘍に局在し得ることが示される。腫瘍造影において、従来の技術に対して、より特異性を示し、バックグラウンドが低下することが期待される。キュビリンは特定の組織、例えば腎臓および小腸で発現するため、これらの組織における取り込みおよび集積は、バックグラウンド像を形成し得る。したがって、該結合体の腎臓中での集積を、多数の方法で遮断してよい。最も一般的な方法である、カチオン性アミノ酸であるリジンの静脈注射は、従前に、腎臓の取り込みを遮断するか、または大幅に低下させるのに用いられて成功している。例えば、I１２５-標識した結合体の２分前に、Ｌ−リジン ５０mgを注射することにより、マウスにおける腎臓の取り込みが約９５％低下した。しかしながら、腎臓腫瘍の転移の最も一般的な部位の１つは肺であるため、腸内の集積が、腹部の上側領域の造影を妨げることはない。
【０１４２】
実施例１３. Ｌ−プロパルギルグリシンを用いた、標的化Ｂ１２結合体
Ｂ１２結合体は、Ｌ-プロパルギルグリシンを用いて作製してもよい。Ｌ-プロパルギルグリシンを、次いで、金属、例えば９９ｍＴｃとキレート化させてよい (図１４)。Ｌ-立体配置は、金属の結合にとくに重要である。例えば、５’−ＯＨは、好適な遊離基へと変換され、次いで、アジドで置換される。得られた「クリック可能」なアジドは、安定であり、アルキンへの銅触媒性[１,３]およびストレイン促進[１,３]双極子環状付加(ＣｕＡＡＣまたはＳＰＡＡＣ)において高い活性を示す。この方法は、Chrominski et al, Chem Eur J 2013; 19: 5141-5148に詳述されている。次いで、アルキン含有グリシンを「クリック」化学を用いて付加する(図１５)。さらに、４に示すように、グリシンより前にアルキル鎖リンカーを、付加してもよい(図１８Ｄ)。
【０１４３】
あるいは、酸性条件下における、注意深く制御されたシアノコバラミンの部分加水分解により、所望のｂおよびｅの酸が得られる。例えば、ｂ位におけるカルボン酸への変換の際に、アルキン含有グリシンを付加する(図１６)。一例において、３に示すように、グリシンより前に、アルキル鎖リンカーを付加する (図１８Ｃ)。
【０１４４】
さらに、Ｌ-プロパギルグリシンを用いて、コバルトイオンにＢ１２を結合させ、コバルト−Ｃ結合を有するＢ１２結合体を得てよい。例えば、(ＣＮ)Ｃｂｌを末端アルキンと、Ｃｕ(Ｉ)塩の存在下で直接反応させることにより、アセチリドを得ることができる。該生成物はさらに、[１,３]双極子アジド−アルキン環状付加によって官能化してよい。特に、Ｌ-プロパルギルグリシンを、アルキル鎖リンカーを用いてまたは用いずに付加してよい(図１７および図１８Ｂ)。
【０１４５】
実施例１４. ＞１６０kDaのビタミンＢ１２結合系の、受容体介在性の取り込み
本発明者は、キュビリンが大きいタンパク質の通過を促進できることを検討し、可視化することを望んでいた。Ｂ１２取り込み経路を用いた、結合体のサイズ限定は今日まで調べられていなかった。本実施例は、試験管内で、キュビリン受容体を介するＢ１２-破傷風トキソイド結合体(ＭＷ＞１６０kDa)の取り込みが見られたことを示し、このことは、該取り込み経路が大きいタンパク質を送達することができるものであることを示すものである。
【０１４６】
Ｂ１２を、無水ＤＭＳＯ中、６０℃で、ＣＤＴを用いて活性化した。該活性化Ｂ１２を、アリコートで、５０mM 炭酸緩衝液（ｐＨ９.６）中の破傷風毒素(ＴＴ)に１時間添加した。該ＴＴは、ＣＤＴの理想的な結合経路をつくりだすリジン残基が豊富である。２つの異なる量[１mg (０.００７mmol)または２０mg (０.０１４８mmol)] の活性化Ｂ１２を２４００LfのＴＴと反応させ、結合体２および１をそれぞれ得た。結合系の精製を、ゲル浸透クロマトグラフィーを用いて行った。Ｂ１２の異なる合成経路によって、同様のクロマトグラフィーの挙動が示され、ＴＴは、明らかに分離挙動の大部分を占めていた。
【０１４７】
ＴＴ自体の重量を最初に決定し、質量分析(ＭＡＬＤＩ-Ｔｏｆ)により、約１５８kDaと記録した。（アミノ酸配列に基づく）予測値である１５０ｋＤａより、８kDa大きいのは、不活化プロセスの間にホルマリンおよびリジンを取り込んだことによるものである可能性が最も高い。これにより、分子量のベースラインが得られ、これを、ＨＰＬＣ分離による新しいピークと比較するのに用いた。質量分析によっても、ＴＴ試料中に、遊離の分離した軽い鎖および重い鎖が存在することが示された。
【０１４８】
結合体１の分子量は約１７０kDaであった。これは観察されたＴＴの分子量より１２kDa高い。遊離のＴＴから結合しているＴＴへの質量の増加は、Ｂ１２ ９分子に相当する。Ｂ１２のＴＴに対する合成比率がより小さい反応を用いると、分子量１６３kDaが質量分析により観察された。結合体２については、遊離のＴＴと再び比較すると、分子量のシフトは５ kDaに過ぎなかった。これは、４分子のＢ１２の付加と一致する。
【０１４９】
該結合体の生物学的活性を確認するため、ＥＬＩＳＡを行った。ウサギポリクローナル抗ＴＴ抗体を９６ウェルプレートに結合させた。ＴＴ希釈標準をインキュベーションした後 (２４０〜０.００２Lf/mL)、種々の濃度のマウスモノクローナル抗-ＴＴ (１〜０.５μg/mL) をインキュベーションし、有効なアッセイに必要な適当な希釈率を決定した。次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した二次抗体を、ウェル内でインキュベーションした。該アッセイには、直線の較正曲線をもたらすことが明らかになっている１Lf/ml〜０.００５Lf/mLの範囲の濃度を用いた。しかし、該較正曲線が直線であるのは、ＴＴの濃度が約１０Lf/mLになるまでである。該結合体および対照のＥＬＩＳＡの結果が比較可能であることを確かめるために、各試料中のタンパク質濃度をブラッドフォードアッセイにより決定した。
【０１５０】
ブラッドフォードアッセイの結果とＥＬＩＳＡの結果を組み合わせることにより、該試料を、μgに対するLfの比率で表す。この値を、ＴＴ開始物質に対して行った、μgに対するLfの比率が０.３２という結果をもたらしたブラッドフォードアッセイと比較した。結合体におけるLf/μgの比率は、ＴＴ開始物質より低い。
【０１５１】
その後、両方の結合体を、ＩＦに暴露し、結合を、上述のように電子吸収分光によって経過観察した。両方の場合において、ＩＦ結合は、吸収の上昇によって示された。ゲル浸透クロマトグラフィーもまた、ＩＦ-結合体の結合と一致していた。
【０１５２】
ＢｅＷｏ細胞株におけるキュビリンの存在についてのベースラインを確立するために、キュビリンの免疫染色を行った。キュビリンに対する抗体を、Alexa Fluoro 405色素を用いてタグ付けした (ＣｕｂＡｂ４０５)。その後、該抗体を２４時間透析し、過剰の色素を除いた (その後ＨＰＬＣを行ったが、ここには示さない)。ＢｅＷｏ細胞を、ＣｕｂＡｂ４０５とともに４５分間３７℃でインキュベーションした後、共焦点顕微鏡を用いて試験した (図１９Ａ)。該細胞は、ＣｕｂＡｂ４０５の表面への結合および、いくらかの内在化を示した。該ＣｕｂＡｂ４０５をまた、チャイニーズハムスター卵巣細胞 (ＣＨＯ)とともにインキュベーションした。ＣＨＯ細胞はキュビリン受容体を発現しないため、適当な陰性対照である。該ＣｕｂＡｂ４０５は、ＣＨＯ細胞への結合または取り込みを示さなかった (データは示さない)。
【０１５３】
ＢｅＷｏ細胞において、ＴＴを介した取り込みがある可能性を排除するために、該ＴＴをAlexaFluoro 405タグ (ＴＴ４０５)に結合した。ＴＴ４０５を、ＩＦの存在下で、ＢｅＷｏ細胞株とともにインキュベーションした。該ＢｅＷｏ細胞はＴＴ４０５を取り込まず、Ｂ１２介在する取り込みについての仮説が支持された。該ＴＴ４０５は、わずかな膜相互作用を示したが、決定的な内在化は全く見られなかった。
【０１５４】
該細胞株がキュビリンを含むこと、ならびにＴＴが取り込みを促進しないことを確認し、１および２をCypHer 5E色素と結合し、蛍光結合体 (１Ｃ５Ｅ、２Ｃ５Ｅ)を作製した。これらの結合体についてCypHer 5Eを選択したのは、中性条件下において、該タグが蛍光反応を示さないことによる。該色素は、酸性ｐＨ、例えば５.５に暴露されたときに蛍光を示す。蛍光の観察により、取り込みが、受容体を介するエンドサイトーシスを介して進行していることが示される。１Ｃ５Ｅを、最初にＩＦとともに３０分間インキュベーションした後、ＢｅＷｏ細胞とともに１時間インキュベーションした。その後、遊離の結合体を洗い流し、非特異的な膜相互作用を低下させるために、細胞をＰＢＳ (ｐＨ７.４)で３回洗浄し、ｐＨ３.０で１回洗浄した。その後、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）を該細胞に添加し、共焦点顕微鏡で、取り込みおよび内在化が起こっているかどうかを試験した(図１９Ｂ参照)。１Ｃ５Ｅは明らかに、細胞への内在化を示す。
【０１５５】
ＩＦを介するＢ１２破傷風毒素結合体の取り込みを確認するために、蛍光標識タグＩＦ（ＩＦ４０５）を用いて共局在試験を行った。ＩＦをAlexa Fluor 405と１時間反応させた後、２４時間透析し、タグ付きＩＦ４０５系を得た。該ＩＦ４０５系を、Ｂ１２、１Ｃ５Ｅおよび２Ｃ５Ｅの結合体の存在下でインキュベーションした。Alexa Fluor 405フルオロフォアを選択したのは、励起および発光プロファイルがCypHer ５Eと重ならないためである。試験の間を通じて、少なくとも１０倍過剰のＩＦを使用した。Ｂ１２とインキュベーションしたＩＦ４０５は、ＢｅＷｏ細胞において取り込みを示す。
【０１５６】
ＩＦ４０５を１Ｃ５Ｅとともにインキュベーションしたとき、赤と青のシグナルの取り込みおよび共局在が見られ、このことにより、ＩＦおよびＴＴが一緒に存在することが確認された。青色のシグナルは、通常、結合体由来の赤色シグナルの周辺に存在する(図１９Ｃ)。これは、多数のＢ１２分子がＴＴの周辺に結合した後、ＩＦ４０５が結合することと一致する。該２Ｃ５Ｅ結合体はまた、取り込みおよび共局在を示したが、１Ｃ５Ｅについて顕著であったＩＦ４０５の封入効果は大幅に低下し、取り込みの上昇が観察された(図１９Ｄ)。これは、ＴＴに結合して２Ｃ５Ｅを形成するＢ１２の数が少なく、それによりＩＦ４０５の結合が低くなっていることと一致する。
【０１５７】
該１Ｃ５Ｅおよび２Ｃ５Ｅ結合体はともに、細胞内に内在化している様子が観察される。これらの結合体の蛍光は、ｐＨ感受性のCypHer 5E色素による、受容体を介するエンドサイトーシスの取り込みを示す。ＴＴＣ５Ｅ結合体が取り込みを全く示さないことは、ＴＴ単独では受容体介在性のエンドサイトーシスを誘発することができないことを示す。このことは、Ｂ１２結合が、該結合体のエンドサイトーシスに必要であることを示す。ＩＦ４０５が、該結合体系と共局在することにより、キュビリン受容体を介したエンドサイトーシスが起こっていることが支持される。本明細書に記載の実施例により、該取り込み経路が１７０kDaの結合体系を輸送することが可能であることが示される。
【０１５８】
実施例についての参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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