(57)【要約】  本発明は、2以上の質量標識体のセットであって、該セット中の各質量標識体が該セット中の他の全ての標識体と同じ整数質量を有し、該セット中の各質量標識体が該セット中の他の全ての質量標識体の質量と異なる精密質量を有し、その結果、該セット中の全ての質量標識体が質量分析によって互いに区別可能となる、セットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
2以上の質量標識体のセットであって、該セット中の各質量標識体が該セット中の他の全ての標識体と同じ整数質量を有し、該セット中の各質量標識体が該セット中の他の全ての質量標識体の質量と異なる精密質量を有し、その結果、該セット中の全ての質量標識体が質量分析によって互いに区別可能となる、前記セット。
【請求項２】
各質量標識体がレポーター部分を含み、前記セット中の各質量標識体が該セット中の他の全ての標識体のレポーター部分の精密質量と異なる精密質量を有するレポーター部分を有し、その結果、該レポーター部分が質量分析によって区別可能となる、請求項1記載の2以上の質量標識体のセット。
【請求項３】
各質量標識体がレポーター部分を含み、前記セット中の各質量標識体が該セット中の他の全ての標識体のレポーター部分の整数質量と異なる整数質量を有するレポーター部分を有し、その結果、該レポーター部分が質量分析によって区別可能となる、請求項1記載の2以上の質量標識体のセット。
【請求項４】
前記質量標識体のうちの少なくとも2つの精密質量の差が、100ミリダルトン未満、好ましくは、50ミリダルトン未満である、請求項1又は2記載の2以上の質量標識体のセット。
【請求項５】
前記セット中の各質量標識体が、該セット中の他の全ての質量標識体のアイソトポログである、請求項1〜4のいずれか一項記載の2以上の質量標識体のセット。
【請求項６】
前記精密質量の差が、異なる数又はタイプの重同位体置換によってもたらされる、請求項1〜5のいずれか一項記載の2以上の質量標識体のセット。
【請求項７】
n個の質量標識体を含み、ここで、m番目の質量標識体が、第1の重同位体の(n-m)個の原子、及び該第1のものとは異なる第2の重同位体の(m-1)個の原子を含み、ここで、mが、1〜nの値を有する、請求項1〜6のいずれか一項記載の2以上の質量標識体のセット。
【請求項８】
前記重同位体が、2H、13C、又は15Nである、請求項7記載のセット。
【請求項９】
前記第1の重同位体が13Cであり、前記第2の重同位体が15Nである、請求項7又は8記載のセット。
【請求項１０】
n個の質量標識体を含み、ここで、m番目の質量標識体が、18O又は34Sから選択される第1の重同位体の(n-m)個の原子、及び2H又は13C又は15Nから選択される該第1のものとは異なる第2の重同位体の(2m-2)個の原子を含み、ここで、mが、1〜nの値を有する、請求項1〜6のいずれか一項記載の2以上の質量標識体のセット。
【請求項１１】
各標識体が、式:
X-L-M
(式中、Xはレポーター部分であり、Lは、質量分析計における衝突によって開裂可能なリンカーであり、Mは質量修飾因子である)を含み、ここで、各質量標識体は、該質量標識体を分析物に付着させるための反応性官能基Reを更に含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の2以上の質量標識体のセット。
【請求項１２】
各質量標識体の前記レポーター部分が重同位体を含まない、請求項11記載の2以上の質量標識体のセット。
【請求項１３】
各質量標識体が、一般式:
X-(L)k1-M-(L)k2-Re又はM-(L)k1-X-(L)k2-Re;
(式中、k1及びk2は、独立に、0〜10の整数である)
を含む、請求項11又は12記載の2以上の質量標識体のセット。
【請求項１４】
前記リンカーLがアミド結合を含む、請求項11〜13のいずれか一項記載の2以上の質量標識体のセット。
【請求項１５】
前記レポーター部分が質量マーカー部分であり、前記質量修飾因子が質量正規化部分であり、ここで、該質量正規化部分は、各質量標識体が所望の整数質量又は精密質量を有することを保証する、請求項11〜14のいずれか一項記載の2以上の質量標識体のセット。
【請求項１６】
前記セット中の各質量標識体が、以下の一般構造のうちの1つを有する、請求項11〜15のいずれか一項記載の2以上の質量標識体のセット:
【化１】
2016525677.tif 000070
(式中、*は、酸素が18Oであるか、炭素が13Cであるか、窒素が15Nであるか、又は水素が2Hであることを表し、ここで、該セット中の該各標識体は、1以上の*を含み、その結果、n個のタグのセットにおいて、m番目のタグは、第1の重同位体の(n-m)個の原子及び第1のものとは異なる第2の重同位体の(m-1)個の原子を含み、mは1〜nであり、nは2以上であり;ここで、環状ユニットは、芳香族又は脂肪族であり、かつ任意の2つの隣接する原子間に独立に0〜3個の二重結合を含み;各Zは、独立に、N、N(R1)、C(R1)、CO、CO(R1)(すなわち、-O-C(R1)-もしくは-C(R1)-O-)、C(R1)2、O、又はSであり; Xは、N、C、又はC(R1)であり;各R1は、独立に、H、置換もしくは非置換直鎖又は分岐状C1-C6アルキル基、置換もしくは非置換脂肪族環式基、置換もしくは非置換芳香族基、又は置換もしくは非置換ヘテロ環基、或いはアミノ酸側鎖であり; aは、0〜10の整数であり; bは少なくとも1であり、cは少なくとも1である)。
【請求項１７】
前記セット中の各質量標識体が、以下の構造のうちの1つを有する、請求項16記載の2以上の質量標識体のセット:
【化２】
2016525677.tif 000071
2016525677.tif 000072
2016525677.tif 000073
(式中、*は、酸素がO18であるか、炭素がC13であるか、もしくは窒素がN15であることを表し、又は該ヘテロ原子が水素化されている部位において、*はH2を表すことができ、ここで、該セット中の該各標識体は、1以上の*を含み、その結果、n個の質量標識体のセットにおいて、m番目の質量標識体は、第1の重同位体の(n-m)個の原子及び第1のものとは異なる第2の重同位体の(m-1)個の原子を含み、mは1〜nの値を有し、nは2以上である)。
【請求項１８】
以下の質量標識体を含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の2以上の質量標識体のセット:
【化３】
2016525677.tif 000074
。
【請求項１９】
以下の質量標識体を含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の質量標識体のセット:
【化４】
2016525677.tif 000075
。
【請求項２０】
以下の質量標識体を含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の質量標識体のセット:
【化５】
2016525677.tif 000076
。
【請求項２１】
以下の質量標識体を含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の質量標識体のセット:
【化６】
2016525677.tif 000077
。
【請求項２２】
以下の質量標識体を含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の質量標識体のセット:
【化７】
2016525677.tif 000078
。
【請求項２３】
以下の質量標識体を含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の質量標識体のセット:
【化８】
2016525677.tif 000079
。
【請求項２４】
以下の質量標識体を含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の質量標識体のセット:
【化９】
2016525677.tif 000080
。
【請求項２５】
以下の質量標識体を含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の質量標識体のセット:
【化１０】
2016525677.tif 000081
。
【請求項２６】
以下の質量標識体を含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の質量標識体のセット:
【化１１】
2016525677.tif 000082
。
【請求項２７】
前記セット中の各質量標識体が、以下の一般構造のうちの1つを有する、請求項1〜15のいずれか一項記載の2以上の質量標識体のセット:
【化１２】
2016525677.tif 000083
。
【請求項２８】
請求項1〜27のいずれか一項記載の質量標識体の2以上のセットを含む、質量標識体のアレイ。
【請求項２９】
前記アレイ中のいずれか1つのセットの質量標識体の各々の整数質量が、該アレイ中の他の全てのセットの質量標識体の各々の整数質量と異なる、請求項28記載の質量標識体のアレイ。
【請求項３０】
セット中の各質量標識体が、該セットの他の全てのメンバーとアイソケミックであるが、前記アレイ中の他の全てのセット中の各質量標識体とアイソケミックではない、請求項28又は請求項29記載のアレイ。
【請求項３１】
前記整数質量の差が、質量系列修飾基の存在によってもたらされる、請求項29又は請求項30記載のアレイ。
【請求項３２】
前記アレイ中の質量標識体の各セットが、異なるk1+k2値を有する、請求項29〜31のいずれか一項記載のアレイ。
【請求項３３】
前記整数質量の差が、異なる数又はタイプの重同位体置換によってもたらされる、請求項29記載のアレイ。
【請求項３４】
質量標識体の第1のセット及び質量標識体の第2のセットを含み、質量標識体の該第1のセットのm番目の質量標識体と(m+1)番目の質量標識体の精密質量の差がd1であり、質量標識体の該第2のセットのm番目の質量標識体と(m+1)番目の質量標識体の精密質量の差がd2であり、d1がd2と等しくない、請求項33記載の質量標識体のアレイ。
【請求項３５】
質量標識体の第1のセットであって、該第1のセット中の各質量標識体が、分析物中の第1の反応基と反応することができる第1の反応性官能基を含む、前記質量標識体の第1のセット、及び質量標識体の第2のセットであって、該第2のセット中の各質量標識体が、分析物中の第2の反応基と反応することができる第2の反応性官能基を含む、前記質量標識体の第2のセットを含む、請求項28〜34のいずれか一項記載のアレイ。
【請求項３６】
前記質量標識体が、イオントラップ型質量分析計、好ましくは、分解能60,000超、質量電荷比400のイオントラップ型質量分析計、最も好ましくは、分解能100,000超、質量電荷比400の質量分析計で区別可能である、請求項1〜35のいずれか一項記載の質量標識体のセット又はアレイ。
【請求項３７】
質量分析の方法であって、分析物と関連付けることができる質量標識体又は質量標識体の組合せを質量分析によって同定することにより、該分析物を検出することを含み、ここで、該質量標識体が、請求項1〜36のいずれか一項記載の質量標識体のセット又はアレイ由来の質量標識体である、前記方法。
【請求項３８】
a.各試料が質量標識体又は質量標識体の組合せで示差標識される複数の試料を提供すること(ここで、該質量標識体は、請求項1〜37のいずれか一項記載の質量標識体のセット又はアレイに由来するものである);
b.該複数の標識試料を混合して、標識分析物を含む分析混合物を形成させること;
c.任意に、該標識分析物を質量分析計で検出すること;
d.該標識分析物を該質量分析計で解離させて、質量標識体及び/又はインタクトな質量標識体を含む分析物フラグメントを形成させること;
e.該質量標識体及び/又はインタクトな質量標識体を含む分析物フラグメントを検出すること;
f.任意に、該質量標識体を該質量分析計で解離させて、レポーター部分を放出させ、該レポーター部分を検出すること;
g.任意に、工程fで形成された該レポーター部分を解離させて、フラグメントを形成させ、該フラグメントを検出すること;
h.該標識分析物の質量スペクトル;並びに/又は該質量標識体及び/もしくはインタクトな質量標識体を含む分析物フラグメントの質量スペクトル;並びに/又は該レポーター部分もしくはレポーター部分のフラグメントの質量スペクトルに基づいて該分析物を同定すること
を含む、請求項37記載の質量分析の方法。
【請求項３９】
前記分析物が、前記標識分析物の質量スペクトルに基づいて同定される、請求項38記載の質量分析の方法。
【請求項４０】
前記分析物が、該質量標識体及び/又はインタクトな質量標識体を含む分析物フラグメントの質量スペクトルに基づいて同定される、請求項38記載の質量分析の方法。
【請求項４１】
インタクトな質量標識体を含む前記分析物フラグメントが、インタクトな質量標識体を含むb系列イオン、好ましくは、b1イオンである、請求項40記載の質量分析の方法。
【請求項４２】
前記分析物が、前記レポーター部分又はレポーター部分のフラグメントの質量スペクトルに基づいて同定される、請求項38記載の質量分析の方法。
【請求項４３】
a.各試料が質量標識体又は質量標識体の組合せで示差標識される複数の試料を提供すること(ここで、該質量標識体は、請求項1〜42のいずれか一項記載の質量標識体のセット又はアレイに由来するものである);
b.該複数の標識試料を混合して、標識分析物を含む分析混合物を形成させること;
c.該標識分析物を質量分析計で検出すること;
d.該標識分析物を該質量分析計で解離させて、レポーター部分を放出させ、該分析物又は該分析物のフラグメントに付着した該質量標識体の残りの部分を含む相補イオンを検出すること;
e.任意に、工程dで形成された該相補イオンを解離させて、フラグメントを形成させ、該フラグメントを検出する1以上の更なる工程;
f.該標識分析物の質量スペクトル並びに/又は該相補イオン及び/もしくはそのフラグメントの質量スペクトルに基づいて該分析物を同定すること
を含む、請求項37記載の質量分析の方法。
【請求項４４】
前記解離が質量分析計における衝突誘起解離である、請求項38〜43のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
分解能60,000超、質量電荷比400、好ましくは、分解能100,000超、質量電荷比400、最も好ましくは、分解能250,000超、質量電荷比400の質量分析計で実施される、請求項38〜44のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
工程dにおいて、前記相補イオンが、前記リンカーLからの一酸化炭素のニュートラルロスによって形成される、請求項43〜45のいずれか一項記載の方法。
【請求項４７】
前記質量標識体が、請求項6〜35のいずれか一項記載の質量標識体のセット又はアレイに由来するものであり、ここで、各質量標識体について、重同位体が前記レポーター部分に存在せず、各質量標識体の重同位体が全て、前記分析物又は前記分析物のフラグメントに付着した該質量標識体の残りの部分に存在する、請求項43〜46のいずれか一項記載の方法。
【請求項４８】
工程a)において、各試料が、質量標識体の第1のセットに由来する質量標識体で示差標識され、該第1のセット中の各質量標識体が、分析物中の第1の反応基と反応することができる第1の反応性官能基を含み、工程a)における該第1のセット由来のm番目の質量標識体で標識された分析物と(m+1)番目の質量標識体で標識された分析物の精密質量の差が、該分析物中の第1の反応基の数を示し、該質量の差が、単一の第1の反応基を有する分析物についてはd1、n1個の第1の反応基を有する分析物についてはn1d1であり、ここで、n1が、第1の反応基の数である、請求項38〜47のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９】
各試料を質量標識体の第2のセット由来の質量標識体と反応させることを更に含み、該第2のセット中の各質量標識体が、前記分析物中の第2の反応基と反応することができる第2の反応性官能基を含み;ここで、質量標識体の該第2のセットのm番目の標識体は、該第1のセットのm番目の標識体と同じ試料と反応させられ、該第1のセット由来のm番目の質量標識体と該第2のセット由来のm番目の質量標識体で標識された分析物と該第1のセット由来の(m+1)番目の質量標識体と該第2のセット由来の(m+1)番目の質量標識体で標識された分析物の精密質量の差はn1d1+n2d2であり、ここで、n1は第1の反応基の数であり、n2は、第2の反応基の数であり、d1は、該第1のセットのみに由来するm番目の質量標識体で標識された分析物と(m+1)番目の質量標識体で標識された分析物の精密質量の差であり、d2は、該第2のセットのみに由来するm番目の質量標識体で標識された分析物と(m+1)番目の質量標識体で標識された分析物の精密質量の差であり、d1はd2と等しくない、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
前記第1の反応基が遊離チオール基であり、前記第2の反応基が遊離アミノ基である、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
前記分析物を同定する工程が:
i.試料中に存在すると予測される1以上の分析物について、一連の質量標識体、電荷、及び分析物質量依存的同位体分布テンプレートを計算すること(ここで、該予測される分析物中に存在する荷電状態、分析物の質量、及び質量標識体の数の各々の予測される組合せについてのテンプレートが存在する);
ii.該質量及び電荷依存的同位体分布テンプレートを、標識分析物の分析によって生成される質量スペクトル中のイオンに対して、任意に、予想される最大数の質量標識体、及び荷電状態についてのテンプレートから始めて連続的に適用して、該同位体テンプレートと一致する該質量スペクトル中のピークを見出すこと;
iii.任意に、予想同位体分布のモデルをテンプレートマッチング手順によって同定された分析物イオンにフィットさせて、工程iiにおける該分析物の予備的同定を確認し、それにより、該分析物の荷電状態及び該分析物と反応した質量標識体の数を同定すること
を含む、請求項38〜50のいずれか一項記載の方法。
【請求項５２】
前記分析物が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、ポリヌクレオチド、アミノ酸、及び核酸から選択される、請求項38〜51のいずれか一項記載の方法。
【請求項５３】
前記分析物が、タンパク質又はタンパク質の混合物の酵素的消化によって産生されたペプチドである、請求項38〜52のいずれか一項記載の方法。
【請求項５４】
前記酵素が、LysC又はトリプシンである、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
前記ペプチドの同位体分布テンプレートが、タンパク質のアミノ酸配列を取得すること、該アミノ酸配列のコンピュータシミュレーションによる酵素消化を実行して、予測されるペプチド及びその対応質量のリストを作成すること、該予測されるペプチドを質量に従って選別すること、並びに同位体分布をこれらの質量と既知の荷電状態及び質量標識体の数とに基づいて作成することにより決定される、請求項51〜54のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドを標識するための有用な反応性標識、並びに質量スペクトルをデコンボリューション又は簡略化して、ペプチドを同定及び定量する方法に関する。より具体的には、本発明は、調査中の試料由来のイオンから生じるスペクトル中のピーク、及びバックグラウンド放射線、ノイズ、又は他の非データ源から生じるピークの同定方法に関する。特に、この方法は、特異的な同位体変種分布を有するピークを同定する。したがって、本発明は、予め決定しておいた同位体分布テンプレートとの比較によって、特徴的な同位体分布を有するイオンを迅速に同定することができる。これらの方法は、高分解能及び高質量精度質量分析計、例えば、オービトラップ型及び飛行時間型質量分析計によって得られたデータの分析に特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
(背景:)
質量分析法は、大きい生体分子の分析、特に、ペプチド及びタンパク質の分析のための好ましいツールとして頭角を現している。例えば、Mannとその共同研究者らは、ペプチドの衝突誘起解離によって決定することができる、単一のペプチドの質量とそれに付随する部分的な配列情報が、もとのタンパク質を同定するのに十分であり得ることを示した(1)。結果として、特定のペプチドが混合物中の各タンパク質から単離される新しい方法が開発されている。概念的には、複合ポリペプチド混合物の分析に対する最も簡単なアプローチは、ポリペプチドの混合物がプロテアーゼで消化され、全ての消化ペプチドが液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)によって分析されるMudPIT法に見られる(2,3)。MudPIT法は、これらのペプチド全ての分離を高分解能多次元クロマトグラフィーを用いて試みることにより、試料の複雑性の問題を克服するものであるが、多くのペプチドがクロマトグラフィーカラムから同時に溶出することは珍しくない。液体クロマトグラフィー分離は、通常、エレクトロスプレーイオン化源による質量分析と併用される。エレクトロスプレーイオン化法は、液相中のイオンを気相中に取り込むための非常に「穏やかな」手法であるが、大きい生体分子のイオン化は複数の荷電状態に存在するイオンを生じ、結果として生じる質量スペクトルを複雑にする傾向がある(4)。したがって、MudPITとエレクトロスプレー質量分析の組合せから生じる質量スペクトルは、非常に複雑である。
【０００３】
更に、この15年間、質量分析による生体分子の定量分析を可能にし、それを改良するために、重同位体置換を有する様々な化学質量タグが開発されてきた。タグの設計によって、タグセットのメンバーは、同一の化学構造を有するが絶対質量は異なるアイソケミックタグ、又は構造も絶対質量も同一であるアイソバリックタグのどちらかである。アイソケミックタグは、通常、MSモードでの定量に使用されており、一方、アイソバリックタグは、固有の質量を有するレポーターフラグメントを放出するためにMS/MSモードでフラグメント化されなければならない。これまで、同位体ドープされた質量タグは、タンパク質及び核酸の分析に主に利用されている。
【０００４】
アイソケミック質量タグの初期の例は、同位体コード化親和性タグ(ICAT)であった(5)。ICAT試薬は、一方の(重い)タグに重同位体が示差的に取り込まれ、もう一方の(軽い)タグには置換が存在しない1対の質量タグである。2つの試料を重いタグ又は軽いタグのどちらかで標識し、次いで、混合した後、LC-MSによって分析する。両方の試料中に存在するペプチドは、重同位体原子置換数に比例して質量が異なる1対のプリカーサーイオンを提供する。
【０００５】
ICAT法は、「サンプリング」方法の例となるものでもあり、該方法は、生成される質量スペクトルの複雑性を低下させるために小さいペプチド集団を取り扱う一方で、その成分を同定するためにもとの試料に関する十分な情報を保持する必要性を両立させる方法として有用である。ICAT法で使用される「同位体コード化親和性タグ」は、システインをその中に含むペプチドをトラップするための、チオールに反応する1対のビオチンリンカー同位体を含む。通常、プロテオーム中の90〜95％のタンパク質は、少なくとも1つのシステイン含有ペプチドを有し、通常、システイン含有ペプチドは、全体で10個に約1個のペプチドに相当するため、システイン含有ペプチドの分析は、試料に関する重大な情報を失うことなく、試料の複雑性を大きく低下させる。したがって、ICAT法では、ある源由来のタンパク質の試料を「軽」同位体ビオチンリンカーと反応させ、一方、第2の源由来のタンパク質の試料を、通常、軽同位体よりも4〜8ダルトン重い「重」同位体ビオチンリンカーと反応させる。その後、2つの試料をプールし、エンドペプチダーゼで切断する。その後、ビオチン化システイン含有ペプチドを質量分析による次の分析のためにアビジン化ビーズ上で単離することができる。2つの試料を定量的に比較することができ:対応するペプチド対が相互標準としての役割を果たし、それらの比を定量することが可能になる。ICATサンプリング法は、MudPITよりも複雑性の低い源試料となるペプチド混合物を生成させるが、多数のペプチドは依然として単離されており、LC-MS/MSによるそのペプチド分析によって複雑なスペクトルが生成される。2つのICATタグを用いると、質量スペクトル中のペプチドイオンの数は、標識なしの分析と比較して2倍になる。アイソケミックタグの更なる例としては、最大4つの異なる試薬を提供するICPL試薬が挙げられ、ICPLを用いると、質量スペクトル中のペプチドイオンの数は、標識なしの分析と比較して4倍になる。このため、簡単な重同位体タグ設計で非常に高レベルの多重化を開発することが実際に役立つ可能性は低い。
【０００６】
アイソケミックタグは、プロテオミクス研究における定量を可能にし、実験の再現性を助けるが、これは、質量スペクトルの複雑性を高めることを犠牲にして達成される。この限界を克服するために、及びタンデム質量分析のより大きな特異性を利用するために、アイソバリック質量タグが開発された。2000年のその導入(WO 01/68664号)以来、アイソバリック質量タグは、タンパク質及びペプチド中のアミン官能基を満遍なく標識した後に複数の試料を混合し、同時に分析することにより、プロテオミクス発現プロファイリングの手段の改善をもたらした。このタグは、同じ質量を有する、アイソバリックなものなので、これによって、質量スペクトルの複雑性が高まることはない。なぜなら、同じペプチドの全てのプリカーサーが、クロマトグラフィー分離において正確に同じ点で出現し、同じ凝集質量を有するからである。分子がフラグメント化された後にタンデム質量分析にかけられる場合にのみ、固有の質量レポーターが放出され、それにより、もとの試料の各々に存在するペプチドの相対量又は絶対量を計算することが可能になる。
【０００７】
US 7,294,456号には、アイソバリック質量タグの根本的な原理が記載されており、分子内の様々な特定の原子がそれぞれ13C及び15Nを含む重同位体形態と置換されている好適なタグの具体例が提供されている。US 7,294,456号には、全重化率を増加させるための複数のアイソバリックセットを、個々のタグのサイズを過度に増大させることなく利用可能にするオフセット質量の使用が更に記載されている。WO 2004/070352号には、更なるアイソバリック質量タグのセットが記載されている。WO 2007/012849号には、3-[2-(2,6-ジメチル-ピペリジン-1-イル)-アセチルアミノ]-プロパン酸-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル)-エステル(DMPip-βAla-OSu)を含む更なるアイソバリック質量タグのセットが記載されている。
【０００８】
これまでに開示されているアイソバリック質量タグの大きな利益にもかかわらず、これらのアイソバリック質量タグは、ペプチドを定量するためにMS/MS分析を必要とし、ペプチドは、通常、個別に分析され、これは、単一のMS/MS可能な機械によって一定量の時間で分析することができるペプチドの数に有限の限度があることを意味する。通常の分析では、分析が望まれるペプチドの数は、通常、装置の処理能力を超える。
【０００９】
MSモードのペプチド分析は、複数のペプチドを同時に分析し、処理量を増加させることができるという点で有用である。更に、高質量精度の場合、多くのペプチドを、いわゆる、精密質量タグ(AMT)分析を通じて、その質量のみによって同定することができる(6,7)。したがって、高質量精度MSモード分析では、任意の所与のプロテオームの非常に大きな割合を比較的迅速に同定することが可能である。しかしながら、MSモードタグは更なる複雑性及び多義性をAMTデータベース検索に持ち込むので、MSモードタグ及びAMTアプローチを用いてプロテオームを同定及び定量することが可能であるということは一般には示されていない。
【００１０】
最近、オービトラップ(8,9)、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴(FT-ICR)質量分析計(10)、及び高分解能飛行時間型(TOF)質量分析計(11)などの高質量分解能質量分析計によって可能になった質量精度及び質量分解能の劇的な改善により、イオン質量電荷比間のミリダルトンの差を分解することが可能になった。この高分解能は、見掛け上アイソバリックなレポーターイオンに6.3ミリダルトンの差を生じさせる15Nに代わる13Cの重核子置換を用いてアイソバリックタンデム質量タグの多重化を増大させるために利用されている(12,13)。同様に、ミリダルトンの質量差を含むリジン同位体を用いた代謝的標識を高分解能質量分析によって分解することができ、試料の多重化及び相対定量が酵母で可能になることが示されている(14)。著者らは、MSモードのペプチド分析のためのミリダルトンの差を含む化学タグが有用であると提唱しているが、具体的なタグを提案していない。互いに関連する標識イオン、例えば、異なる試料由来の対応するペプチドが、容易に認識し得る非常に独特でかつ非天然の同位体パターンを有する同じイオンエンベロープ中で密にクラスター化し、かつ標識ペプチドのイオンクラスターが、非標識種が占めるのと本質的に同じ質量スペクトル中の空間を占めるイオンエンベロープを含むため、他の異なるペプチドの同定を妨害する可能性がはるかに低いという点で、ごくわずかな質量差を含むタグは有用である。
【００１１】
したがって、セット中のタグがごくわずかな質量差によって区別されるペプチド及び他の生体分子を標識するためのアイソケミック反応性タグのセットを提供することが本発明の目的である。
【００１２】
更に、ごくわずかな質量差を含むアイソケミックタグは、極めて独特な質量スペクトルを生じるが、そのようなスペクトルを手作業で分析すれば、特に、複雑な試料については、非常に時間がかかるであろう。したがって、これらの複雑なスペクトル、特に、ペプチド混合物のエレクトロスプレーイオン化によって生成されるスペクトルを迅速かつ自動的にデコンボリューションするための及び該スペクトル中の特定のイオンクラスを同定するためのソフトウェアが必要とされる。ペプチドは、その炭素、窒素、酸素、及び水素の分布が比較的予測可能であるため、特徴的な同位体分布を有する。ある元素、例えば、ハロゲン原子は、通常、ペプチドには存在しないが、他の元素、例えば、硫黄及びリンは、時々存在する。これらの様々な原子組成は、一般的にペプチドを構成する元素の同位体の存在比に天然の差異がある、ペプチドについての特徴的な同位体組成を生じる。そのような分布は、原理上は、質量スペクトルデータ中に検出することができるが、この目的のための有効なソフトウェアはすぐには利用できない。同様に、ペプチドをごくわずかな質量差によって分離される本発明のタグで標識することにより、改変された分布を作り出すことができる。しかしながら、特徴的な同位体存在比分布を有するイオンを複雑なスペクトル中で同定するための、スペクトルの自動処理にすぐに利用できるソフトウェアはない。
【００１３】
したがって、スペクトルをデコンボリューション及び/又は簡略化するために、ごくわずかな質量差を含むアイソトポログ質量標識体で標識された生体分子から生じる質量スペクトル中のピークと、そうでないピークとを区別する方法を提供することが本発明の更なる目的である。特に、特徴的な同位体分布を有するイオンが幅広く異なる質量を有し得、かつ複数の荷電状態で存在し得る場合であっても、該イオンを質量スペクトル中で同定する方法を提供することが本発明の目的である。
【００１４】
スペクトルを解釈して、該スペクトル中に存在するイオンを同定及び定量する自動化された方法を提供することが本発明の更なる目的である。特に、標識ペプチドの具体的な特徴を同定して、該ペプチドの同定を助ける方法を提供することが目的である。
【発明の概要】
【００１５】
(発明の記述)
本発明は、2以上の質量標識体のセットであって、該セット中の各質量標識体が該セット中の他の全ての標識体と同じ整数質量を有し、該セット中の各質量標識体が該セット中の他の全ての質量標識体の質量と異なる精密質量を有し、その結果、該セット中の全ての質量標識体が質量分析によって互いに区別可能となる、セットを提供する。
【００１６】
この文脈で使用される質量標識体という用語は、決定される分析物を標識するのに好適な部分を指すことが意図される。標識体という用語は、タグという用語と同義である。
【００１７】
質量標識体の精密質量は、質量標識体の理論上の質量であり、かつ分子の個々の同位体の精密質量の合計であり、例えば、12C=12.000000、13C=13.003355、H1=1.007825、16O=15.994915である。この質量は、質量欠損を考慮したものである。整数質量は、ノミナル質量としても知られ、分子を構成する各核の各同位体の整数質量の合計であり、例えば、12C=12、13C=13、1H=1、16O=16である。同位体の整数質量は、同位体の核を構成する陽子と中性子の合計である、すなわち、12Cは、6個の陽子と6個の中性子を含み、一方、13Cは、6個の陽子と7個の中性子を含む。これは、同位体の原子質量数又は核子数と呼ばれることもある。
【００１８】
2以上の質量標識体のセットの一実施態様において、各質量標識体はレポーター部分を含み、該セット中の各質量標識体は、該セット中の他の全ての標識体のレポーター部分の精密質量と異なる精密質量を有するレポーター部分を有し、その結果、該レポーター部分は質量分析によって区別可能となる。
【００１９】
2以上の質量標識体のセットの別の実施態様において、各質量標識体はレポーター部分を含み、該セット中の他の全ての標識体のレポーター部分の整数質量と異なる整数質量を有するレポーター部分を有し、その結果、該セット中の各質量標識体は、該レポーター部分は質量分析によって区別可能となる。
【００２０】
少なくとも2つの該質量標識体間の精密質量の差は、通常、100ミリダルトン未満、好ましくは、50ミリダルトン未満、最も好ましくは、20ミリダルトン(mDa)未満である。通常、セット中の少なくとも2つの該質量標識体間の精密質量の差は、下の表4に示すように同位体置換が共通であるため、2.5mDa、2.9mDa、6.3mDa、8.3mDa、9.3mDa、又は10.2mDaである。例えば、第1の標識体が13C同位体を含み、第2の標識体において、この13C同位体が12Cに置き換えられ、14N同位体が15N同位体に置き換えられる場合、これら2つの標識体の間の精密質量の差は、6.3mDaとなる。
【００２１】
2以上の質量標識体のセットの好ましい実施態様において、該セット中の各質量標識体は、該セット中の他の全ての質量標識体のアイソトポログである。アイソトポログは、その分子の同位体組成のみが異なる化学種である。例えば、水は、3つの水素関連アイソトポログ: HOH、HOD、及びDOD(ここで、Dは、重水素(2H)を表す)を有する。アイソトポログは、同じ数の各同位体を有するが、位置が異なる異性体であるアイソトポマー(同位体異性体)とは区別される。本発明は、2以上のアイソトポログ質量標識体のセットを提供するものであり、ここで、タグは、同じ整数質量を有するが、ごくわずかな質量の差によって互いに区別され、その結果、個々のタグは、通常100ミリダルトン未満の差で最も近いタグと区別される。
【００２２】
通常、精密質量の差は、異なる数又はタイプの重同位体置換によってもたらされる。
【００２３】
好ましい実施態様において、該セットは、n個の質量標識体を含み、ここで、m番目の質量標識体は、第1の重同位体の(n-m)個の原子、及び該第1のものとは異なる第2の重同位体の(m-1)個の原子を含み、ここで、mは、1〜nの値を有する。通常、重同位体は、2H、13C、又は15Nである。好ましくは、該第1の重同位体は13Cであり、該第2の重同位体は15Nである。
【００２４】
別の実施態様において、該セットは、n個の質量標識体を含み、ここで、m番目の質量標識体は、18O又は34Sから選択される第1の重同位体の(n-m)個の原子、及び2H又は13C又は15Nから選択される該第1のものとは異なる第2の重同位体の(2m-2)個の原子を含み、ここで、mは、1〜nの値を有する。
【００２５】
2以上の質量標識体のセットの一実施態様において、各標識体は、式:
X-L-M
(式中、Xはレポーター部分であり、Lは、質量分析計における衝突によって開裂可能なリンカーであり、Mは質量修飾因子である)を含み、ここで、各質量標識体は、該質量標識体を分析物に付着させるための反応性官能基Reを更に含む。
【００２６】
レポーター部分という用語は、通常は開裂の後、質量分析によって独立に検出される部分を指すために使用されるが、相補イオンとして分析物に付着している質量標識体の残りの部分も本発明の方法で検出され得ることが理解されるであろう。該質量修飾因子は、質量標識体が所望の精密質量を有することを保証するために質量標識体に取り込まれる部分である。各質量標識体のレポーター部分は、重同位体を含まない場合もある。
【００２７】
いくつかの実施態様において、該反応性官能基Reは、X基を介して連結され得るが、他の実施態様においては、該反応性官能基Reは、以下のようなM基:
X-M-Re又はM-X-Re
を介して連結され得る。
【００２８】
通常、各質量標識体は、一般式:
X-(L)k1-M-(L)k2-Re又はM-(L)k1-X-(L)k2-Re;
(式中、k1及びk2は、独立に、0〜10の整数である)
を含む。
【００２９】
1以上の該部分X、M、L、又はReを重同位体で修飾して、所望の精密質量及び/又は整数質量を達成することができる。
【００３０】
好ましい実施態様において、該リンカーLは、アミド結合を含む。
【００３１】
最も好ましい実施態様において、該レポーター部分は、質量マーカー部分であり、該質量修飾因子は、質量正規化部分であり、ここで、該質量正規化部分は、各質量標識体が所望の整数質量又は精密質量を有することを保証する。この文脈で使用される質量マーカー部分という用語は、質量分析によって検出される部分を指すことが意図される。
【００３２】
この文脈で使用される質量正規化部分という用語は、質量分析によって必ずしも検出されるわけではないが、質量標識体が所望の凝集質量を有することを保証するために存在する部分を指すことが意図される。しかしながら、該質量正規化部分は、相補イオンの一部として検出され得る(下記参照)。該質量正規化部分は、構造的に、特に限定されるものではなく、単に質量標識体の全体質量を変化させる役割を果たす。
【００３３】
一実施態様において、該質量標識体は、WO 01/68664号に定義されているタンデム質量タグのアイソトポログである。
【００３４】
通常、該セット中の各質量標識体は、以下の一般構造のうちの1つを有する:
【化１】
2016525677.tif 000002
(式中、*は、酸素が18Oであるか、炭素が13Cであるか、窒素が15Nであるか、又は水素が2Hであることを表し、ここで、該セット中の該各標識体は、1以上の*を含み、その結果、n個のタグのセットにおいて、m番目のタグは、第1の重同位体の(n-m)個の原子及び第1のものとは異なる第2の重同位体の(m-1)個の原子を含み、mは1〜nであり、nは2以上であり;ここで、環状ユニットは、芳香族又は脂肪族であり、かつ任意の2つの隣接する原子間に独立に0〜3個の二重結合を含み;各Zは、独立に、N、N(R1)、C(R1)、CO、CO(R1)(すなわち、-O-C(R1)-もしくは-C(R1)-O-)、C(R1)2、O、又はSであり; Xは、N、C、又はC(R1)であり;各R1は、独立に、H、置換もしくは非置換直鎖又は分岐状C1-C6アルキル基、置換もしくは非置換脂肪族環式基、置換もしくは非置換芳香族基、又は置換もしくは非置換ヘテロ環基、或いはアミノ酸側鎖であり; aは、0〜10の整数であり; bは少なくとも1であり、cは少なくとも1である)。
【００３５】
本発明の一実施態様において、該セット中の各質量標識体は、以下の構造のうちの1つを有する:
【化２】
2016525677.tif 000003
2016525677.tif 000004
2016525677.tif 000005
2016525677.tif 000006
(式中、*は、酸素がO18であるか、炭素がC13であるか、もしくは窒素がN15であることを表し、又は該ヘテロ原子が水素化されている部位において、*はH2を表すことができ、該セット中の該各標識体は、1以上の*を含み、その結果、n個の質量標識体のセットにおいて、m番目の質量標識体は、第1の重同位体の(n-m)個の原子及び第1のものとは異なる第2の重同位体の(m-1)個の原子を含み、mは1〜nの値を有し、nは2以上である)。
【００３６】
本発明の質量標識体のセットは、以下の質量標識体を含むことができる:
【化３】
2016525677.tif 000007
。
【００３７】
質量標識体のセットは、以下の質量標識体を含むことができる:
【化４】
2016525677.tif 000008
。
【００３８】
質量標識体のセットは、以下の質量標識体を含むことができる:
【化５】
2016525677.tif 000009
。
【００３９】
質量標識体のセットは、以下の質量標識体を含むことができる:
【化６】
2016525677.tif 000010
。
【００４０】
質量標識体のセットは、以下の質量標識体を含むことができる:
【化７】
2016525677.tif 000011
。
【００４１】
質量標識体のセットは、以下の質量標識体を含むことができる:
【化８】
2016525677.tif 000012
。
【００４２】
質量標識体のセットは、以下の質量標識体を含むことができる:
【化９】
2016525677.tif 000013
。
【００４３】
質量標識体のセットは、以下の質量標識体を含むことができる:
【化１０】
2016525677.tif 000014
。
【００４４】
質量標識体のセットは、以下の質量標識体を含むことができる:
【化１１】
2016525677.tif 000015
。
【００４５】
本発明の更なる態様において、提供されるのは、上で定義されているような質量標識体の2以上のセットを含む、質量標識体のアレイである。一実施態様において、該アレイ中のいずれか1つのセットの質量標識体の各々の整数質量は、該アレイ中の他の全てのセットの質量標識体の各々の整数質量と異なる。一例において、セット中の各質量標識体は、該セットの他の全てのメンバーとアイソケミックであるが、該アレイの他の全てのセット中の各質量標識体とアイソケミックではない。整数質量の差は、質量系列修飾基の存在によってもたらされることができる。アレイ中の各セットは、異なる数の同じ質量系列修飾基及び/又は異なるタイプの質量系列修飾基を有することができる。該質量系列修飾基の化学構造は、それによって、質量標識体のセットが所望の整数質量を有することが保証されるならば、特に限定されるものではない。質量系列修飾基の例は、WO 2011/036059号に記載されている。一実施態様において、該アレイ中の質量標識体の各セットは、異なる数のリンカーLを有する、すなわち、異なるk1+k2値を有する。
【００４６】
該アレイの別の実施態様において、整数質量の差は、異なる数又はタイプの重同位体置換によってもたらされる。
【００４７】
本発明の更なる実施態様において、質量標識体のアレイは、質量標識体の第1のセット及び質量標識体の第2のセットを含み、ここで、質量標識体の該第1のセットのm番目の質量標識体と(m+1)番目の質量標識体の精密質量の差はd1であり、質量標識体の該第2のセットのm番目の質量標識体と(m+1)番目の質量標識体の精密質量の差はd2であり、d1はd2と等しくない。例えば、d1は6.3mDaであり得、d2は9.3mDaであり得る。d1及びd2の値は、第1のセット及び第2のセット由来の標識の様々な組合せで標識された分析物の同位体パターンが質量分析によって区別することができるようなものであるべきである。
【００４８】
該アレイは、質量標識体の第1のセットであって、該第1のセット中の各質量標識体が、分析物中の第1の反応基と反応することができる第1の反応性官能基を含む、該質量標識体の第1のセット、及び質量標識体の第2のセットであって、該第2のセット中の各質量標識体が、分析物中の第2の反応基と反応することができる第2の反応性官能基を含む、該質量標識体の第2のセットを含む。
【００４９】
上で定義されている質量標識体のセット又はアレイにおいて、通常、該質量標識体は、分解能60,000超、質量電荷比400、好ましくは、分解能100,000超、質量電荷比400、最も好ましくは、分解能250,000超、質量電荷比400の質量分析計で区別可能である。該質量分析計は、Orbitrap Velos Pro質量分析計(Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA)などのオービトラップ型質量分析計であってもよい。
【００５０】
更なる態様において、本発明は、質量分析の方法であって、分析物と関連付けることができる質量標識体又は質量標識体の組合せを質量分析によって同定することにより、該分析物を検出することを含み、ここで、該質量標識体が、任意の前述のクレームに定義されているような質量標識体のセット又はアレイ由来の質量標識体である、方法を提供する。
【００５１】
一実施態様において、本方法は:
a.各試料が質量標識体又は質量標識体の組合せで示差標識される複数の試料を提供すること(ここで、該質量標識体は、上で定義されているような質量標識体のセット又はアレイに由来するものである);
b.該複数の標識試料を混合して、標識分析物を含む分析混合物を形成させること;
c.任意に、該標識分析物を質量分析計で検出すること;
d.該標識分析物を該質量分析計で解離させて、質量標識体及び/又はインタクトな質量標識体を含む分析物フラグメントを形成させること;
e.該質量標識体及び/又はインタクトな質量標識体を含む分析物フラグメントを検出すること;
f.任意に、該質量標識体を該質量分析計で解離させて、レポーター部分を放出させ、該レポーター部分を検出すること;
g.任意に、工程fで形成されたレポーター部分を解離させて、フラグメントを形成させ、該フラグメントを検出すること;
h.該標識分析物の質量スペクトル;並びに/又は該質量標識体及び/もしくはインタクトな質量標識体を含む分析物フラグメントの質量スペクトル;並びに/又は該レポーター部分もしくはレポーター部分のフラグメントの質量スペクトルに基づいて分析物を同定すること
を含む。
【００５２】
分析物は、標識分析物の質量スペクトルに基づいて同定することができる。高分解能質量分析計の出現により、質量標識体で標識された分析物間のmDaの質量差を工程cにおいてMSスペクトル中で分解することができる。そのような質量差は、工程d〜gのMSn実験において、標識分析物の解離産物中で分解することもできる。質量標識体及び結果としてその対応する分析物をMSスペクトルとMSnスペクトルの両方において同定することにより、分析物同定の精度を大きく向上させることができる。分析物は、質量標識体及び/又はインタクトな質量標識体を含む分析物フラグメントの質量スペクトルに基づいて同定することができる。好ましい実施態様において、インタクトな質量標識体を含む分析物フラグメントは、インタクトな質量標識体を含むb系列イオン、好ましくは、b1イオンである。分析物は、レポーター部分又はレポーター部分のフラグメントの質量スペクトルに基づいて同定することもできる。
【００５３】
別の実施態様において、本方法は:
a.各試料が質量標識体又は質量標識体の組合せで示差標識される複数の試料を提供すること(ここで、該質量標識体は、任意の前述のクレームに定義されているような質量標識体のセット又はアレイに由来するものである);
b.該複数の標識試料を混合して、標識分析物を含む分析混合物を形成させること;
c.該標識分析物を質量分析計で検出すること;
d.該標識分析物を該質量分析計で解離させて、レポーター部分を放出させ、該分析物又は該分析物のフラグメントに付着した該質量標識体の残りの部分を含む相補イオンを検出すること;
e.任意に、工程dで形成された相補イオンを解離させて、フラグメントを形成させ、該フラグメントを検出する1以上の更なる工程;
f.該標識分析物の質量スペクトル並びに/又は該相補イオン及び/もしくはそのフラグメントの質量スペクトルに基づいて該分析物を同定すること
を含む。
【００５４】
好ましい実施態様において、工程dにおいて、該相補イオンは、該リンカーLからの一酸化炭素のニュートラルロスによって形成される。
【００５５】
一実施態様において、該質量標識体は、上で定義された質量標識体のセット又はアレイに由来するものであり、ここで、各質量標識体について、重同位体は、該レポーター部分に存在せず、各質量標識体の重同位体は全て、該分析物又は該分析物のフラグメントに付着した該質量標識体の残りの部分に存在する。
【００５６】
通常、該解離は質量分析計における衝突誘起解離である。
【００５７】
本発明の方法は、通常、分解能60,000超、質量電荷比400、好ましくは、分解能100,000超、質量電荷比400、最も好ましくは、分解能250,000超、質量電荷比400の質量分析計で実施される。
【００５８】
本発明の好ましい方法において、工程a)において、各試料は、質量標識体の第1のセットに由来する質量標識体で示差標識され、該第1のセット中の各質量標識体は、分析物中の第1の反応基と反応することができる第1の反応性官能基を含み、工程a)における該第1のセット由来のm番目の質量標識体で標識された分析物と(m+1)番目の質量標識体で標識された分析物の精密質量の差は、該分析物中の第1の反応基の数を示し、該質量の差は、単一の第1の反応基を有する分析物についてはd1、n1個の第1の反応基を有する分析物についてはn1d1であり、ここで、n1は、第1の反応基の数である。
【００５９】
本方法は、各試料を質量標識体の第2のセット由来の質量標識体と反応させることを更に含むことができ、該第2のセット中の各質量標識体は、該分析物中の第2の反応基と反応することができる第2の反応性官能基を含み;ここで、質量標識体の該第2のセットのm番目の標識体は、該第1のセットのm番目の標識体と同じ試料と反応させられ、該第1のセット由来のm番目の質量標識体及び該第2のセット由来のm番目の質量標識体で標識された分析物と該第1のセット由来の(m+1)番目の質量標識体及び該第2のセット由来の(m+1)番目の質量標識体で標識された分析物の精密質量の差はn1d1+n2d2であり、ここで、n1は第1の反応基の数であり、n2は、第2の反応基の数であり、d1は、該第1のセットのみに由来するm番目の質量標識体で標識された分析物と(m+1)番目の質量標識体で標識された分析物の精密質量の差であり、d2は、該第2のセットのみに由来するm番目の質量標識体で標識された分析物と(m+1)番目の質量標識体で標識された分析物の精密質量の差であり、d1はd2と等しくない。
【００６０】
好ましい実施態様において、該第1の反応基は遊離チオール基であり、該第2の反応基は遊離アミノ基である。
【００６１】
分析物を同定する工程は:
i.試料中に存在すると予測される1以上の分析物について、一連の質量標識体、電荷、及び分析物質量依存的同位体分布テンプレートを計算すること(ここで、該予測される分析物中に存在する荷電状態、分析物の質量、及び質量標識体の数の各々の予測される組合せについてのテンプレートが存在する);
ii.該質量及び電荷依存的同位体分布テンプレートを、標識分析物の分析によって生成される質量スペクトル中のイオンに対して、任意に、予想される最大数の質量標識体、及び荷電状態についてのテンプレートから始めて連続的に適用して、該同位体テンプレートと一致するピークを質量スペクトル中で見出すこと;
iii.任意に、予想同位体分布のモデルをテンプレートマッチング手順によって同定された分析物イオンにフィットさせて、工程iiにおける該分析物の予備的同定を確認し、それにより、該分析物の荷電状態及び該分析物と反応した質量標識体の数を同定すること
を含むことがでできる。
【００６２】
分析物は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、ポリヌクレオチド、アミノ酸、及び核酸から選択することができる。好ましくは、分析物は、タンパク質又はタンパク質の混合物の酵素的消化によって産生されたペプチドである。本発明で使用される一般的な酵素は、LysC又はトリプシンである。
【００６３】
ペプチドの同位体分布テンプレートは、タンパク質のアミノ酸配列を取得すること、該アミノ酸配列のコンピュータシミュレーションによる酵素消化を実行して、予測されるペプチド及びその対応する質量のリストを作成すること、該予測されるペプチドを質量に従って選別すること、並びに同位体分布をこれらの質量と既知の荷電状態及び質量標識体の数とに基づいて作成することにより決定される。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
(発明の詳細な説明)
次に、以下の図面を参照しながら、本発明をより詳細に論じる。
【図１】図1は、本発明の方法で使用されたデータ分析工程を説明するフローチャートを示している。
【図２】図2は、m/z=x及び強度yなどを有するピーク(ここで、ピークのm/z比は既知である)で構成されたスペクトルSを含む、本発明の方法による分析のためのスペクトルを作成するために使用される一連の典型的な前処理工程を示している。
【図３】図3は、次第に低くなる荷電状態に対して本方法を繰り返すことを示す、同位体テンプレートを質量スペクトルに適用する際に使用される一般的な工程を示すフローチャートを示している。
【図４】図4は、本発明の方法によって得られる複数の荷電状態のデータを、全てのイオンが同じ荷電状態(好ましくは、+1)で存在していた場合に得られたであろうスペクトルに対応するデータに変換する方法を示している--したがって、このフローチャートは、イオンのリストの荷電状態を、既知の質量電荷比及び既知の荷電状態を有するモノアイソトピックイオンピークのヒットリストにおいてデコンボリューションするために使用される一般的な工程を示している。
【図５】図5aは、適度な質量を有する+1の荷電状態のペプチドについてのペプチド同位体比の理論上の分布を示している。図5bは、イオン到達時間のガウスモデルを飛行時間型質量分析計で用いて導出される3つの異なる質量を有するいくつかの異なる荷電状態のペプチドについてのいくつかの平均予想同位体存在比分布を示している。
【図６】図6aは、異なるペプチド同位体ピークの強度の比がペプチドの質量によってどれほど変化するかを示している;図6bは、下記の高速テンプレートフィッティングプロセスの概念を示している。
【図７】図7は、後に質量分析計での衝突誘起解離を受ける小ペプチドを標識するための実施例セット7の質量標識体1の使用の概略図である。
【図８】図8は、標識ペプチドのMS/MS/MS分析後にレポーターイオンとして検出されるよう設計された本発明の質量標識体の使用を示すプロセスの模式図を示している。この図は、本発明の実施例セット8の質量標識体1及び2(図8において、それぞれ、1及び2と印が付けられている)によるペプチド
【化１２】
2016525677.tif 000016
の標識を示している。
【図９】図9は、示されたMMT-NN及びMMT-CCで標識されたペプチド
【化１３】
2016525677.tif 000017
の1:1混合物のMS/MSスペクトルを示している。レポーターイオンに、印が付けられている。
【図１０】図10a〜10eは、それぞれ、b1、b2、b3、b4、及びb5イオンの1:1の比のペプチド混合物の拡大されたスペクトルを示している。
【図１１】図11a上は、1:1(MMT-NN:MMT-CC)の比のペプチド混合物のb1イオンを示し、一方、図11a下は、同じ比の126/127レポーターイオンを示している。図11b上は、2:1(MMT-NN:MMT-CC)の比のペプチド混合物のb1イオンを示し、一方、図11b下は、同じ比の126/127レポーターイオンを示している。図11c上は、4:1(MMT-NN:MMT-CC)の比のペプチド混合物のb1イオンを示し、一方、図11c下は、同じ比の126/127レポーターイオンを示している。図11d上は、8:1(MMT-NN:MMT-CC)の比のペプチド混合物のb1イオンを示し、一方、図11d下は、同じ比の126/127レポーターイオンを示している。図11e上は、16:1(MMT-NN:MMT-CC)の比のペプチド混合物のb1イオンを示し、一方、図11e下は、同じ比の126/127レポーターイオンを示している。図11f上は、1:2(MMT-NN:MMT-CC)の比のペプチド混合物のb1イオンを示し、一方、図11f下は、同じ比の126/127レポーターイオンを示している。図11g上は、1:4(MMT-NN:MMT-CC)の比のペプチド混合物のb1イオンを示し、一方、図11g下は、同じ比の126/127レポーターイオンを示している。図11h上は、1:8(MMT-NN:MMT-CC)の比のペプチド混合物のb1イオンを示し、一方、図11h下は、同じ比の126/127レポーターイオンを示している。図11i上は、1:16(MMT-NN:MMT-CC)の比のペプチド混合物のb1イオンを示し、一方、図11i下は、同じ比の126/127レポーターイオンを示している。
【図１２】図12aは、m/z 484.96のペプチドのMSモードスペクトルを示している。MMT-NNで標識された試料由来のペプチドからの親イオンは、MMT-CCで標識された試料由来のペプチドから明確に分けることができる。MMT-NNで標識された試料由来のペプチドは、MMT-CCで標識された試料よりも5倍低い存在比で存在するように見える。この比は、重同位体を含まないペプチド＋2個のタグに対応するイオン(図12b)において及び1×13C核を有するネイティブな構造のペプチド＋2個のタグに対応するイオンピーク(図12c)において及び2×13C核を有するネイティブな構造のペプチド＋2個のタグに対応するイオンピーク(図12d)において観察することができる。
【図１３】図13は、図12に示されるペプチドイオンのPQDによって得られたMS/MSスペクトルを示している。このスペクトルは、1つはN末端アミノ基にあり、1つはリジンのεアミノ基にある2つのタグ(MMT-NN又はMMT-CCのどちらか)を有するペプチド配列
【化１４】
2016525677.tif 000018
と一致し、図12に示される親イオンの質量に対応する。
【図１４】図14は、ピペラジン伸張タグ1の合成経路を示している。
【図１５】図15は、ピペラジン伸張タグ2の合成経路を示している。
【図１６】図16は、m/z 596.9で二重荷電されていると予想されるピペラジン伸張タグ1で標識された合成ペプチドのMSモードスペクトルを示している。
【図１７】図17は、m/z 603.9で二重荷電されていると予想されるピペラジン伸張タグ2で標識された同じ合成ペプチドのMSモードスペクトルを示している。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
本発明の1つの方法は、ポリペプチドの複合混合物の2以上の試料を分析する方法であって、以下の工程:
1.ポリペプチドの複合混合物の各試料を配列特異的切断剤で消化して、ペプチドの複合混合物を生じさせる工程
2.ペプチドの複合混合物の各試料を、これらのペプチド中の1以上の反応性官能基と特異的に反応する本発明の異なる質量タグと反応させる工程(ここで、該タグは、タグ化ペプチドの質量電荷比のわずかな変化をもたらし、その結果、ペプチドの複合混合物の各試料由来の対応するペプチドは、明瞭に分解可能な質量電荷比を有する);
3.任意に、異なる又は同じセットのアイソケミック質量タグを用いて工程2を繰り返すが、各試料が同じ規模の質量のタグで標識されるように、ペプチドの複合混合物の各試料をペプチド中の異なる官能基と反応するタグ上の異なる反応基を含む質量タグと反応させる工程
4.任意に、標識される反応基を有するペプチドを同定する目的でピークを分離するために、同じ対のタグを全ての異なる試料に用いて、ペプチドの複合混合物中の異なる反応基を互いに質量が異なる1対のアイソケミックタグで標識する工程
5.標識された試料をまとめてプールする工程
6.任意に、標識され、プールされたペプチドの試料を1以上のクロマトグラフィー分離技術によって分離する工程
7.プールされたペプチドの試料を質量分析によって分析して、標識ペプチドの高分解能質量スペクトルを決定する工程
8.該質量スペクトルを分析して、異なる試料を本発明の異なる質量タグで標識することにより得られる異なる試料中の対応するペプチドのアイソトポログの強度を検出及び決定する工程
9.任意に、1以上のイオンを選択し、該1以上のイオンをフラグメント化して、これらのペプチドの配列情報を決定する工程
を含む、方法である。この任意の工程において、配列決定用のイオンを選択する基準は、標識ペプチド上の特定のタグの存在に基づくことができ、その存在は、工程(8)の分析から推測することができる。
【００６６】
本発明の好ましい実施態様において、質量スペクトルを分析して、異なる試料中の対応するペプチドのアイソトポログの強度を検出及び決定する工程は、以下の工程:
i.スペクトル中の1以上のイオンについて、一連のタグ、電荷、及び質量依存的同位体分布テンプレートを計算する工程(ここで、該ペプチド中に存在する荷電状態、質量範囲、及びタグの数の各々の予測される組合せについてのテンプレートが存在する);
ii.質量及び電荷依存的同位体分布テンプレートを、タグ化ペプチドの分析によって生成される質量スペクトル中のイオンに対して、予想される最大数のタグ、及び荷電状態についてのテンプレートから始めて連続的に適用して、該同位体テンプレートと一致する質量スペクトルの領域を見出す工程;
iii.任意に、予想同位体分布のモデルをテンプレートマッチング手順によって同定されたペプチドイオンにフィットさせて、予備的同定を確認し、それにより、該ペプチドの荷電状態及び該ペプチドと反応したタグの数を同定する工程
を含む。
【００６７】
本発明のこの態様の好ましい実施態様において、複雑なポリペプチド混合物を消化する工程は、トリプシン又はLysCなどの配列特異的エンドプロテアーゼを用いて実施されることが好ましい。エンドプロテアーゼLysCは、リジン残基のすぐC-末端のアミド結合で切断し、したがって、LysCが使用される実施態様においては、切断によって得られるペプチドの大部分は、単一のC-末端リジン残基と単一のαN-末端アミノ基、すなわち、アミン反応性タグと反応させることができる2つのアミノ基を有する。したがって、アミン反応性タグを用いると、LysCによって切断されたペプチドは全て、2つのタグで標識されることになる。対照的に、トリプシンは、アルギニンとリジンの両方のすぐC-末端のアミド結合で切断し、したがって、トリプシンが使用される実施態様においては、C-末端リジンを有し、2つのタグで標識されるペプチドもあれば、C-末端アルギニンを有し、αアミノ基において単一のタグでしか標識されないペプチドもある。
【００６８】
更に、本発明は、複雑なポリペプチド混合物の2以上の試料を標識し、プールすることによって生成される1以上の質量スペクトルからのデータを処理する方法であって:
(a)該質量スペクトル中の第1のピークを選択すること;
(b)第1の荷電状態を有する第1のモノアイソトピック参照イオン(該第1の参照イオンは、第1のピークを生じることができる)を選択すること;
(c)該第1の参照イオンの1以上の他の同位体形態について、該質量スペクトル中の1以上の更なる予想ピークを決定すること;
(d)1以上の該決定された更なる予想ピークを該質量スペクトルと比較して、該1以上の決定された更なる予想ピークと一致する1以上のピークがスペクトル中に存在するかどうかを決定すること;
(e)1以上の該決定された更なる予想ピークが該質量スペクトル中の1以上のピークと一致する場合、第1のピークをデータピークとして指定し、任意に、該スペクトル中に存在する、該1以上の決定された更なる予想ピークと一致する1以上のピークをデータピークとして指定すること;
(f)該決定された更なる予想ピークが該質量スペクトル中のピークに一致しない場合、1以上の更なる荷電状態の1以上の更なる参照イオンを用いて工程(b)〜(e)を繰り返すこと;
(g)任意に、第1のピークを、第1の荷電状態の参照イオンの、又は更なる荷電状態の更なる参照イオンのデータピークとして指定することができない場合、該第1のピークを非データピークとして指定すること;
(h)任意に、該質量スペクトル中の1以上の更なるピークについて、工程(a)〜(g)を繰り返すこと
を含む、方法を提供する。
【００６９】
工程(a)において、質量スペクトルからの第1のピークを検討用に選択又は同定する。本方法を実施するとき、スペクトル中の任意のピークを最初に選択することができる。しかしながら、スペクトル中の最小質量及び/又は最高荷電状態に対応するピークを選択することが好ましい。なぜなら、一般に、そのようなピークは、スペクトロメーターによって最も高精度に分解されることが多いからである。最高精度を維持するために、全ての質量/電荷比が最も大きいm/zと関連付けられることが好ましい。必要であれば、スペクトルデータを前処理して、スペクトル中のピークの同定を、例えば、スムージングによって助けることができる。
【００７０】
上記の予備的な分析の後、望ましい場合、モデルを指定されたデータピークにフィットさせることができる。ピークは特定の幅及び高さを有しており、それにより、ピークに特徴的な形状が与えられる。この形状は、利用されるスペクトロメーターの性質を含む、いくつかの因子によって決まる。したがって、同一のイオンが全て、正確に同じm/z値で記録されるとは限らない。飛行時間型分析計では、あるものが、他のものよりもわずかに早く到達したり、わずかに遅く到達したりする。これこそが、ピークに特徴的な形状を与える。この形状は、任意の適当な関数を用いてモデリングすることができるが、以下で説明されるような、ガウス関数、ローレンツ関数、及びフォークト関数が好ましい。このモデリングから、より正確なピーク形状を決定することができ、これにより更に、より正確なm/z値を各ピークについて決定することが可能になる。これにより、以下で記載されるその後のピーク分析及びスペクトル帰属が大いに助けられる。
【００７１】
選択される参照イオンは、理論上第1のピークの原因となり得る特定の質量及び荷電状態を有する任意のイオンであることができる。参照イオンは、そのようなイオンのデータベースから選択することができ、又は処理時に計算することができる。この段階で、選択されるイオンは、その最も一般的な同位体中に存在するその構成原子の各々を有することが好ましい。なぜなら、このイオンは、当然ながら、可能性のある同位体の中で最も豊富に存在し、したがって、スペクトルに最も大きく寄与するからである。そのようなイオンは、本発明の文脈において、モノアイソトピックイオンと呼ばれる。場合によっては、第1のピークの原因となり得る複数のモノアイソトピックイオンが存在し、同じ荷電状態のものもあれば、異なる荷電状態のものもある。本発明では、同じ荷電状態(通常、最高の荷電状態)のモノアイソトピックイオンが最初に考慮され、他の荷電状態は、本方法を1回以上更に繰り返す間に個別に検討されることが好ましい。
【００７２】
第1のイオンをそのモノアイソトピック形態で選択した後、そのイオンの同位体分布を決定することができる。その構成原子の各々の異なる同位体は、自然界に異なる存在比で存在し、これらの存在比は、同じ化学構造を有するが、異なる同位体を有する、存在する全ての可能性のあるイオンの量に影響を及ぼす。個々のイオンに存在する同位体が一般的でなければないほど、対応するモノアイソトピックイオンと比較してそのイオンが存在することは少なくなる。同じ化学構造を有するが、異なる同位体分布を有する各イオンは、本発明の文脈において、同じイオンファミリーに属すると言われる。
【００７３】
イオンファミリーを構成する同位体の質量が異なるため、イオンファミリーは、最も強い(最も強度の大きい)ピークの周辺に密集した様々なピークを質量スペクトル中に生じさせる。より小さい分子について、分子内の全ての核が構成原子の最も軽い安定形態にある「軽いピーク」である最小質量ピークは、イオン同位体エンベロープ中の最も強度の大きいイオンであり、モノアイソトピックピークと呼ばれる。しかしながら、分子内の原子の数が増大するにつれて、任意の所与の原子が重同位体となる可能性は、軽いピークが最も強度の大きいピークでなくなるまで増大する。ペプチドの場合、ひとたびペプチドが約20アミノ酸長になれば、最も豊富に存在するピークは、少なくとも1つの重核を有する分子に対応するピークであり、該重核は、15N及び重水素同位体が比較的低い天然存在比を有するので、通常は13Cである。約30個のアミノ酸では、少なくとも2つの重核に対応するイオンが、1つの重核を有するイオンと同じくらい豊富に存在するようになる。
【００７４】
その存在比に差異があるため、他のピークは、その天然同位体の存在比に応じた強度を有するはずであり、この強度は、天然の同位体存在比が周知であるので計算することができる。これらは、スペクトル中の決定された更なる予想ピークである。これらは、データベース中の、例えば、イオンについてのピークのテンプレートの形態にある、予め計算された情報との比較によって決定することができ、又は望ましい場合、リアルタイムでの計算によって決定することができる。複数のモノアイソトピックイオンがピークの原因となり得る場合、存在すると考えられる各イオンの相対的比率を用いて、各イオン同位体についてのピーク強度の加重平均を生み出すことができる。例えば、存在し得る2つのモノアイソトピックイオン(2つのイオンファミリー)がある場合、これらは等量(50:50の比)で存在すると仮定することができ、その場合、各ファミリーについての計算された更なる予想ピークは、単一のイオンファミリーしか存在しないピークと比較して、強度が半分になるであろう。60:40の比については、一方のファミリーが3/5の強度となり、もう一方が2/5の強度となる、などである。これらの比は、試料の源に基づいて推測することができ−ある化合物は、他の化合物よりも生体試料中に存在する可能性が高い。
【００７５】
上述のように、この計算はリアルタイムで行われてもよいし、又は以前に行われたものであってもよい。イオンが最初にデータベースから選択される場合、イオンファミリーについての予め計算されたテンプレートを利用してもよく、このテンプレートは、同位体ピークをその計算された分布で含む。複数のイオンファミリーについて、イオンが存在すると考えられる比率がどのようなものであっても、テンプレートを重ね合せることができる。
【００７６】
その後、計算されたピーク及び/又はテンプレートをスペクトルと比較して、該ピークと一致するピークが該スペクトル中に存在するかどうかを確かめる。「真の」ピーク周辺の同位体分布が真のデータの特徴を示すのに対し、ノイズ、宇宙線、装置アーティファクト、又は他の干渉物によって生じる偽のピークは、そのような分布を示さない。したがって、「データ」ピークは、「非データ」ピークと分離することができる。マッチングプロセスは、予想ピーク間の分離及び/又は予想ピークの相対強度をスペクトル中のピークと比較し得ることが好ましく、ある閾値に達した場合、一致が記録される。該閾値は、使用者がこの方法にどれくらいの感度を要求するかによって変化し得る。望ましい場合、ピークの幅又は形状などの他のパラメータを比較に用いることができる。そのようなパラメータをモデリングするための関数は当技術分野で周知であり、以下で論じられている。
【００７７】
本発明の文脈において、以下で言及されるテンプレートマッチングプロセスは、実際の質量分析計で記録されたスペクトル中のピークから決定された一連のパラメータを既知のイオンクラス由来のピークの予想パラメータと一致させるプロセスを意味し、この場合、該マッチングプロセスに自由パラメータは存在しない。
【００７８】
また本発明の文脈において、モデルフィッティングプロセスは、一連の自由パラメータを評価することによって、既知のイオンクラスから導出されるモデルを質量スペクトルからの一連のピークにフィットさせて、モデルと実際のデータとの間の局所最小誤差を見出そうとするプロセスを意味し、この場合、該誤差は、費用関数を用いて決定される。費用関数は、データができる限り密接にモデルに当てはまることを保証するように選択される。これらの数学的方法は当技術分野で周知であり、信号処理テキストで広範囲に論じられている。
【００７９】
第1のピークに対する手順を、それが真のデータピークとして同定されるまで、又は一致が見られなくなるまで反復することができ、後者の場合、該ピークは、スペクトルを帰属させるときに検討事項から外してもよい。反復は、通常、次の荷電状態の新しい参照イオンを全ての荷電状態が検討されるまで選択することを含む。ひとたびこれが行われると、その第1のピークについての反復が終了する。その後、全手順を、まだデータピークとして指定されていないピークについて、例えば、第2のピーク、第3のピーク、第4のピークなどについて、全てのピークが検討されるまで、又は望む限り多くのものが検討されるまで反復することができる。好ましくは、利用されているスペクトロメーターで分解可能な最高の一般的荷電状態で、質量ピークが最小のものを最初に使用する。ピークは、質量/電荷比(m/z)として測定されるので、これは、最小のm及び最大のzで始まり、zを毎回1単位小さくして、zの最小値に達するまで反復することを含む。その後、スペクトル中の次のピークを選択し、手順を反復する。一般に、飛行時間(TOF)型スペクトロメーターについては、分解される最高の荷電状態は+6であるが、場合によっては、+8もあり得る。したがって、好ましくは、本方法は、+8の荷電状態から始まり、+1まで徐々に進む。より好ましくは、本方法は、+6の荷電状態から始まり、+1まで徐々に進む。或いは、陰イオンの形態を利用してもよい。この場合、-8から始まり、-1まで進むか、又は-6から-1まで進む。
【００８０】
ひとたびスペクトルが処理され、データピークが同定されると、該スペクトルを、同じ荷電状態、好ましくは、+1又は-1の状態で存在するイオンを代表するスペクトルに変換することが望ましい場合がある。したがって、本発明のいくつかの実施態様において、本方法は、同じ分子種の異なる荷電状態がスペクトル中に存在するかどうかを決定し、これらの複数の荷電状態から生じるピークを単一の荷電状態から得られるピークにまで減少させる更なる工程を含む。新たに形成されるピークの強度は、その分子種の個々の荷電状態からの寄与の強度の合計である。このようにして、スペクトル中のピークの数を大きく減少させ、ピークの帰属を容易にする。同じイオンの複数のアイソトポマー由来のピークに関して、同様のアプローチを取ることができる。これらの減少により、化学的及び生物学的観点からは重要ではない電荷又は同位体の違いに関係なく、存在する各化学種の量の直接的な比較が可能になる。
【００８１】
ひとたびデータピークが決定されると、スペクトルの最終的な帰属を非常に簡略化された方法で実行することができる。
【００８２】
本発明は、質量スペクトルからのデータを処理するためのコンピュータプログラムを利用することができ、このコンピュータプログラムは:
(a)第1の荷電状態を有する第1のモノアイソトピック参照イオン(この第1の参照イオンは、質量スペクトル中の第1のピークに寄与し得る)を選択する工程;
(b)該第1の参照イオンの1以上の他の同位体形態について、該質量スペクトル中の1以上の更なる予想ピークを決定する工程;
(c)1以上の該決定された更なる予想ピークを該質量スペクトルと比較して、該1以上の決定された更なる予想ピークと一致する1以上のピークが該スペクトル中に存在するかどうかを決定する工程;
(d)1以上の該決定された更なる予想ピークが該質量スペクトル中の1以上のピークと一致する場合、第1のピークをデータピークとして指定し、任意に、該スペクトル中に存在する、該1以上の決定された更なる予想ピークと一致する1以上のピークをデータピークとして指定する工程
を実施するように配置されている。
【００８３】
好ましくは、該コンピュータプログラムは、データ処理手段に上記の工程の一部又は全てを実施させるための指令を含む。
【００８４】
本発明はまた、試料から生成される質量スペクトルを解釈する方法であって:
(a)該質量スペクトルからのデータを上で定義された方法に従って処理すること;及び
(b)該スペクトルをデータピークのみに基づいて解釈すること
を含む、方法を含む。
【００８５】
本発明はまた、上で定義された質量スペクトルを解釈する方法を含むデータ依存的分析手順を実施する方法、及び上で定義された質量スペクトルを解釈する方法を含むデータ非依存的分析手順を実施する方法を提供する。
【００８６】
本発明はまた、複雑なポリペプチド混合物の分析のためのキットであって、
1)本発明の質量標識体の1以上のセット
2)本発明の方法を複雑なポリペプチド混合物のセットに適用することにより生成される質量スペクトルを分析するためのコンピュータ可読媒体上のソフトウェア
を含む、キットを提供する。
【００８７】
本発明は、質量スペクトル中で特徴的な同位体存在比分布を有する本発明の質量タグで標識された分子種に対応するイオンファミリーを同定する方法を提供するものであり、ここで、該質量スペクトルは、既知の質量電荷比を有するイオンに対応する同定されたピークのリストを含み、本方法は、以下の工程:
1.スペクトル中の1以上のピークについて、異なる所定のクラスのイオンに対応するピークの同定において使用されるこれらの所定のクラスのイオンに特徴的な電荷、タグ、及び質量依存的同位体存在比分布テンプレートを計算する工程;
2.計算された一連の質量及び電荷依存的同位体分布テンプレートを、最高予想荷電状態から始まるスペクトル中の各標識イオンに対応するテンプレートから始めて連続的に適用して、該同位体テンプレートと一致する該質量スペクトルの領域を迅速に同定する工程(ここで、該一連のテンプレートは、所定のクラスのイオンに対する個々のテンプレートを含む);
3.予想同位体分布のモデルをテンプレートマッチング手順によって同定されるイオンにフィットさせて、予備的同定を確認する工程;並びに
4.任意に、単一の標識イオン種の異なる荷電状態に対応するピークを単一の荷電状態にまで減少させ、該標識イオン種の異なるアイソトポログの強度を記録する工程
5.任意に、同じ分子種の異なる荷電状態が該スペクトル中に存在するかどうかを決定し、これらを、その強度がその分子種の組み合わされた荷電状態の強度の合計となる単一の荷電状態にまで減少させる工程
を含む。
【００８８】
本発明の典型的な実施態様において、提供されるのは、標識された生体分子イオンが高分解能質量分析計データ中で特徴的な同位体分布を有するような本発明の質量タグで標識された生体分子イオンを同定する方法であって、以下の工程:
1.高分解能質量分析計からのデータを取得して、特定の質量電荷比を有する標識された生体分子イオンの数を表すデータを含む少なくとも1つの観察された質量スペクトルを生成させる工程;
2.該観察された質量スペクトル中で、質量ピークに対応する該データの部分を認識する工程;
3.本発明のタグで標識された生体分子イオンに特徴的な所定の電荷及び質量依存的同位体分布テンプレートを用いて、所定のクラスの標識イオンを同定する工程;
4.予想同位体分布のモデルをテンプレートマッチング手順によって同定される標識イオンにフィットさせて、予備的同定を確認する工程;
5.任意に、単一のイオンの複数のアイソトポマーに対応するピークを単一のモノアイソトピックピークにまで減少させる工程
6.任意に、同じ分子種の異なる荷電状態が該スペクトル中に存在するかどうかを決定し、これらを、その強度がその分子種の組み合わされた荷電状態の強度の合計となる単一の荷電状態にまで減少させる工程
を含む、方法である。
【００８９】
本発明は、各コンピュータ可読記憶媒体がプロセッサの集団のうちの1つに取り付けられ、各プロセッサが通信手段によって該集団内の他の全てのプロセッサに連結されているコンピュータ可読記憶媒体での質量スペクトルの解釈のための複数コピーのコンピュータプログラムを提供することができる。該集団内のプロセッサは全て、ネットワークを通じてマスタープロセッサにも連結されている。マスタープロセッサは、コンピュータ可読記憶媒体にも接続されており、該媒体上には、質量スペクトルをサブスペクトルに分割し、これらをクラスター内でコンピュータに分配するためのプログラムがある。更に、マスタープロセッサに取り付けられたコンピュータ可読記憶媒体上のプログラムは、解釈されたサブスペクトルが前述の集団内のプロセッサによって分析された後、それらを再アセンブルすることができる。
【００９０】
本発明は、特定のアミノ酸を含むペプチドを質量スペクトル中に同定する方法であって:
1.任意に、ポリペプチドの複合混合物を配列特異的切断剤で消化して、ペプチドの複合混合物を生じさせる工程
2.ペプチドの複合混合物を、これらのペプチド中の1以上の反応性官能基と特異的に反応する本発明のタグと反応させる工程(ここで、該タグは、そのタグ化ペプチドの同位体分布を変化させる);
3.スペクトル中の1以上のイオンについて、一連のタグ、電荷、及び質量依存的同位体分布テンプレートを計算する工程(ここで、該ペプチド中に存在する荷電状態、質量範囲、及びタグの数の各々の予想される組合せについてのテンプレートが存在する);
4.該質量及び電荷依存的同位体分布テンプレートを、タグ化ペプチドの分析によって生成される質量スペクトル中のイオンに対して、予想される最大数のタグ、及び荷電状態についてのテンプレートから始めて連続的に適用して、該同位体テンプレートと一致する該質量スペクトルの領域を見出す工程;
任意に、予想同位体分布のモデルをテンプレートマッチング手順によって同定されるペプチドイオンにフィットさせて、予備的同定を確認し、それにより、該ペプチドの荷電状態及び該ペプチドと反応したタグの数を同定する工程
を含む、方法を更に提供することができる。
【００９１】
(ミリダルトンの差を示すタグによるペプチドの標識:)
本発明の特徴の一部を説明するために、単一のリジン及び遊離αアミノ基を含む精密質量700.00000の架空のペプチドを考える。また、該ペプチドが存在し、4つのアミン反応性質量タグのセットで標識されているポリペプチドの複合混合物の4つの試料を考える。この場合、最も軽いタグは、300.00000ダルトンの反応残基質量(すなわち、標識体をペプチドとコンジュゲートさせたときに、該ペプチドに加えられる質量変化)を有し、セット中のタグは、6.3ミリダルトンずつ異なる。したがって、このペプチドは、εアミノ基で1回とα-アミノ基で1回の2回、加えられたアミン反応性質量タグで標識されていると考えられる。
【００９２】
上記の300.00000ダルトンのタグを用いた二重標識種は、1300.00000の質量を有し、+1のイオンは、1301.00867の質量電荷比を有する(1個の陽子を含む−陽子質量=1.00867)。同様に、+6の荷電状態の二重標識種は、形成することができれば、217.67534の質量電荷比を有する(6個の陽子を含む−陽子質量=1.00867)。6+のイオンについて、最も軽いタグで標識された全ペプチドのうちの主要な第2の天然同位体(これは、ペプチド構造中の単一の13C(13Cと12Cの質量差は1.00336Daである)の存在に対応する)は、217.84256で生じる。このアイソトポログのより軽いアイソトポログと比べた存在比又は強度は、ペプチド中の炭素原子の数によって決まり、この数は、その配列から分かる。ペプチド中の単一の15Nに対応する重いアイソトポログ及び構造中の単一の重水素に対応する重いアイソトポログも計算することができるが、これらは、通常、13Cアイソトポログよりもはるかに低い存在比で存在し、そのため、これらは、望ましい場合、無視することもできる。同様に、最も軽いタグで標識された全ペプチドのうちの第3の天然同位体(これは、ペプチド構造中の2つの13C核の存在に対応する)は、218.00979で生じる。この場合も、第3の天然同位体について、ペプチド構造中の2個の15N核の存在もしくはペプチド構造中の1×15N核及び1×13C核の存在もしくはペプチド構造中の単一の18O核の存在に対応する重いアイソトポログ、又は重水素及び/もしくは硫黄の対応する組合せが存在する。これらの可能なものの大部分は、非常に低い存在比で生じ、大部分無視することができるが、質量分析計の質量分解能がこれらの種を分解するのに十分であれば、可能な限り高い精度を目的として、これらを含めることができる。
【００９３】
同様に、次に重いタグで標識された対応するペプチドイオンは、12.6ミリダルトン重く、+6のイオンは、217.67744の質量電荷比を有し、一方、対応する第2の天然13Cアイソトポログは、217.84466の質量電荷比を有し、その第3の天然13Cアイソトポログは、218.01189の質量電荷比を有する。表1には、4重セットのアイソケミック質量タグにカップリングした架空の700ダルトンのペプチドの二重タグ化種の最初の3つの13C天然同位体の最初の6つの荷電状態についての計算上の質量電荷比が列挙されており、ここで、最も軽い質量タグは、300ダルトンの反応残基質量を有し、これらのタグは、それら同士6.3ミリダルトンの質量差で分けられている。第1の13C天然同位体が、最も軽いペプチド、すなわち、0個の13C核を有するものに対応し、一方、第2の同位体が1×13C核を有し、第3の同位体が2×13C核を有することに留意されたい。
【表１】
2016525677.tif 000019
表1
【００９４】
各タグ化種の第1、第2、及び第3の13C天然同位体の相対強度は、ペプチド(タグを含まない)中の炭素原子の数及び各タグ化種の天然同位体の相対強度によって決定される、すなわち、表1の各列は、他の全ての列とほぼ同じであるはずである(とはいえ、各々のタグ自体は、重核のそれ自体の存在比に応じて、相対存在比を若干変化させる)ことに留意されたい。しかしながら、重核のタグ存在比は、実験の前に決定され、各標識種の第1、第2、及び第3の13C天然同位体の予想相対強度を計算するために使用することができる。
【００９５】
(質量タグ:)
したがって、第1の態様において、本発明は、2以上の質量標識体のセットを提供するものであり、ここで、タグは、同じ整数質量を有するが、ごくわずかな質量の差で互いに区別され、その結果、個々のタグは、100ミリダルトン未満の差で、最も近いタグから区別される、すなわち、質量標識体は、異なる精密質量を有する。
【００９６】
好ましい実施態様において、本発明のアイソケミックタグセットは、n個のタグを含み、ここで、x番目のタグは、第1の重同位体の(n-x)個の原子及び第1のものとは異なる第2の重同位体の(x-1)個の原子を含む。この好ましい実施態様において、xは、1〜nの値を有し、好ましい重同位体としては、2H又は13C又は15Nが挙げられる。
【００９７】
他の好ましい実施態様において、本発明のアイソケミックタグセットは、n個のタグを含み、ここで、x番目のタグは、18O又は34Sから選択される第1の重同位体の(n-x)個の原子及び2H又は13C又は15Nから選択される第1のものとは異なる第2の重同位体の(2x-2)個の原子を含む。この好ましい実施態様において、xは、1〜nの値を有する。
【００９８】
本発明の好ましい実施態様において、アイソケミックセット中の質量タグは、50ミリダルトン未満の差で区別される。
【００９９】
いくつかの実施態様において、アイソケミック質量タグの2以上のセットのアレイを併用し、ここで、各セットは、セット当たりn個のタグを含み、ここで、nは、上で定義されている通りであり、かつアレイ中の各セットについて独立した値を有することができ、タグの各セットは、上で定義されているようなタグ中のわずかな質量変化をもたらすために使用されるn-1個の核に加えて、p個の更なる重核をアイソケミック構造に付加することにより、該アレイ中の他のセットと異なる整数質量を有し、ここで、pは、該アレイ中の各セットについて独立した値を有し得る。
【０１００】
いくつかの実施態様において、質量タグの2以上のセットのアレイを併用し、ここで、タグの各セットのメンバーは、該セットの他のメンバーとアイソケミックであるが、該アレイ中の他のセットとアイソケミックではない。これは、上で定義されているようなリンカー基Lの数を、質量タグの異なるセット間で変えることによって達成することができる。
【０１０１】
(リンカー基)
上記及び下記の考察において、対象となる分子を本発明の質量標識体化合物に接続するために使用し得るリンカー基に言及する。本発明の質量標識体とその共有結合される分析物の間に導入し得る様々なリンカーが当技術分野で公知である。これらのリンカーのうちのいくつかは切断可能であり得る。オリゴエチレングリコールもしくはポリエチレングリコール又はこれらの誘導体をリンカーとして使用することができ、これには、例えば、Maskos, U. & Southern, E.M.の文献、Nucleic Acids Research 20: 1679-1684, 1992に開示されているものがある。コハク酸ベースのリンカーも広く使用されているが、これらは、通常、塩基に不安定であり、したがって、いくつかのオリゴヌクレオチド合成装置で使用される塩基媒介性脱保護工程と適合しないので、オリゴヌクレオチドの標識を伴う用途にはあまり好ましくない。
【０１０２】
プロパギル酸アルコールは、オリゴヌクレオチド合成の条件下で安定な結合を提供する二官能性リンカーであり、オリゴヌクレオチド用途に関して本発明とともに使用される好ましいリンカーである。同様に、6-アミノヘキサノールは、適切に官能化された分子を連結させるための有用な二官能性試薬であり、これも好ましいリンカーである。
【０１０３】
WO 00/02895号は、質量分析計の内部で切断し得る切断可能なリンカーとしてのビニルスルホン化合物を開示しており、該リンカーは、本発明とともに、特に、ポリペプチド、ペプチド、及びアミノ酸の標識を伴う用途で使用するために適用可能でもある。この出願の内容は、引用により組み込まれている。
【０１０４】
WO 00/02895号は、気相で塩基により切断可能なリンカーとしてのシリコン化合物の使用を開示している。これらのリンカーは、本発明とともに、特に、オリゴヌクレオチドの標識を伴う用途で使用するために適用可能でもある。この出願の内容は、引用により組み込まれている。
【０１０５】
(反応性官能基:)
下記の考察において、本発明の化合物を、レポーター基であれ、分析物分子であれ、他の化合物に連結させることを可能にする反応性官能基Reに言及する。様々な反応性官能基を本発明の質量標識体に導入することができる。
【０１０６】
下の表2には、分析物、典型的には、生体分子に見られる、反応基、典型的には、求核性官能基と反応させて、この2つの実体間に共有結合を生成させることができるいくつかの反応性官能基が列挙されている。合成オリゴヌクレオチドを伴う用途については、標識を可能にするために、1級アミン又はチオールを分子の末端に導入することが多い。下に列挙されている官能基のいずれかを本発明の化合物に導入して、質量マーカーが対象となる分子に付着するのを可能にすることができる。望ましい場合、反応性官能基を用いて、更なる反応性官能基を有する更なるリンカー基を導入することができる。表2は、包括的であることを意図するものではなく、本発明は、列挙されている官能基のみの使用に限定されるものではない。
表2
【表２】
2016525677.tif 000020
【０１０７】
オリゴヌクレオチドを本発明の質量マーカーで標識することを伴う用途において、上記の反応性官能基の一部又はその結果として得られる結合基は、オリゴヌクレオチド合成装置に導入される前に保護されなければならない場合があることに留意すべきである。保護されていないエステル、チオエーテル及びチオエステル、アミン、並びにアミド結合は、通常、オリゴヌクレオチド合成装置中で安定ではないので、好ましくは、これらを避けるべきである。結合を望ましくない副反応から保護するために使用することができる多種多様な保護基が当技術分野で公知である。
【０１０８】
下記の考察において、「電荷担持官能基」及び可溶化基に言及する。これらの基を、質量標識体に、例えば、レポーター部分、例えば、本発明の質量マーカー部分で導入して、イオン化及び可溶化を促進することができる。マーカーの選択は、陽イオン検出が使用されるのか、それとも陰イオン検出が使用されるのかによって決まる。下の表3には、陽イオン化又は陰イオン化のどちらかを促進するために質量マーカーに導入することができるいくつかの官能基が列挙されている。この表は、包括的リストであることを意図するものではなく、本発明は、列挙されている官能基のみの使用に限定されるものではない。
表3
【表３】
2016525677.tif 000021
【０１０９】
WO 00/02893号は、質量マーカーのイオン化を改善するためのクラウンエーテル又はポルフィリンなどの金属イオン結合部分の使用を開示している。これらの部分は、本発明の質量マーカーとともに使用するために適用可能でもある。
【０１１０】
本発明のいくつかの実施態様において、マーカーのフラグメンテーションの部位を衝突誘起解離によって容易に破壊される結合の導入によって制御することができるように、本発明の質量マーカーの成分は、フラグメンテーション抵抗性であることが好ましい。アリールエーテルは、本発明で使用し得るフラグメンテーション抵抗性化合物のクラスの一例である。これらの化合物はまた、化学的に不活性であり、かつ熱に安定である。WO 99/32501号は、質量分析におけるポリ-エーテルの使用をより詳細に論じており、この出願の内容は、引用により組み込まれている。
【０１１１】
これまで、アリールエーテルの一般的な合成方法は、銅粉の存在下、約200℃での、臭化アリールとフェノールとのウルマンカップリングに基づくものであった(代表的な参考文献: H. Stetter, G. Duveの文献、Chemische Berichte 87(1954)1699)。アリールエーテルのより穏やかな合成方法は、異なる金属触媒を用いて開発されているが、反応温度は、依然として、100〜120℃である(M. Iyoda, M. Sakaitani, H. Otsuka, M. Odaの文献、Tetrahedron Letters 26(1985)477)。これは、ポリエーテル質量標識体の好ましい産生経路である。別の公開されている方法は、初期の方法よりもずっと穏やかな条件下で実行されるので、ポリエーテル質量標識体の最も好ましい生成経路を提供する(D. E. Evans, J. L. Katz, T. R. Westの文献、Tetrahedron Lett. 39(1998)2937)。
【０１１２】
好ましくは、質量標識体のセットは、以下の一般構造のうちの1つを有する:
【化１５】
2016525677.tif 000022
(式中、*は同位体質量調整部分であり、かつ*は、酸素が18Oであるか、炭素が13Cであるか、もしくは窒素が15Nであることを表し、又は水素が存在する部位において、*は2Hを表すことができ、ここで、該セット中の該各標識体は、1以上の*を含み、その結果、n個のタグのセットにおいて、m番目のタグは、第1の重同位体の(n-m)個の原子及び第1のものとは異なる第2の重同位体の(m-1)個の原子を含む)。この好ましい実施態様において、mは1〜nの値を有し、nは2以上であり;ここで、環状ユニットは、芳香族又は脂肪族であり、かつ任意の2つの隣接する原子間に独立に0〜3個の二重結合を含み;各Zは、独立に、N、N(R1)、C(R1)、CO、CO(R1)(すなわち、-O-C(R1)-もしくは-C(R1)-O-)、C(R1)2、O、又はSであり; Xは、N、C、又はC(R1)であり;各R1は、独立に、H、置換もしくは非置換直鎖又は分岐状C1-C6アルキル基、置換もしくは非置換脂肪族環式基、置換もしくは非置換芳香族基、又は置換もしくは非置換ヘテロ環基、或いはアミノ酸側鎖であり; aは、0〜10の整数であり; bは少なくとも1であり、cは少なくとも1であり; Reは、質量標識体を生体分子に付着させるための反応性官能基である。
【０１１３】
上の一般式において、ZがC(R1)2であるとき、炭素原子上の各R1は、同じものであっても、異なるものであってもよい(すなわち、各R1は、独立している)。したがって、(R1)2基には、CH(R1)などの基が含まれ、ここで、一方のR1はHであり、もう一方のR1は、上記のR1の定義から選択される別の基である。
【０１１４】
上の一般式において、Xと非環状Zの間の結合は、この位置の選択されるX及びZ基に応じて、単結合であっても、二重結合であってもよい。例えば、XがN又はC(R1)であるとき、Xから非環状Zへの結合は、単結合でなければならない。XがCであるとき、Xから非環状Zへの結合は、選択される非環状Z基及び環状Z基に応じて、単結合であっても、二重結合であってもよい。非環状Z基がN又はC(R1)であるとき、非環状ZからXへの結合は単結合であり、又はyが0である場合、選択されるX基及び非環状Zが付着している基に応じて、二重結合であってもよい。非環状Zが、N(R1)、CO(R1)、CO、C(R1)2、O、又はSであるとき、Xとの結合は、単結合でなければならない。当業者は、正確な原子価(単結合又は二重結合による結合)を有する好適なX、Z、及び(CR12)a基を上の式に応じて容易に選択することができる。
【０１１５】
質量マーカー部分の置換基は、特に限定されるものではなく、任意の有機基、及び/或いは周期表のIIIA族、IVA族、VA族、VIA族、又はVIIA族のいずれかに由来する1以上の原子、例えば、B、Si、N、P、O、もしくはS原子、又はハロゲン原子(例えば、F、Cl、Br、もしくはI)を含むことができる。
【０１１６】
該置換基が有機基を含む場合、該有機基は、炭化水素基を含むことが好ましい。該炭化水素基は、直鎖、分岐鎖、又は環状基を含むことができる。独立に、該炭化水素基は、脂肪族又は芳香族基を含むことができる。また独立に、該炭化水素基は、飽和又は不飽和基を含むことができる。
【０１１７】
該炭化水素が不飽和基を含む場合、それは、1以上のアルケン官能基及び/又は1以上のアルキン官能基を含むことができる。該炭化水素が直鎖又は分岐鎖基を含む場合、それは、1以上の1級、2級、及び/又は3級アルキル基を含むことができる。該炭化水素が環状基を含む場合、それは、芳香環、脂肪族環、ヘテロ環基、及び/又はこれらの基の縮合環誘導体を含むことができる。したがって、該環状基は、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、インデン、フルオレン、ピリジン、キノリン、チオフェン、ベンゾチオフェン、フラン、ベンゾフラン、ピロール、インドール、イミダゾール、チアゾール、及び/又はオキサゾール基、並びに上記の基の位置異性体を含むことができる。
【０１１８】
該炭化水素基中の炭素原子の数は、特に限定されるものではなく、該炭化水素基は、1〜40個のC原子を含むことが好ましい。したがって、該炭化水素基は、低級炭化水素(1〜6個のC原子)であっても、高級炭化水素(7個以上のC原子、例えば、7〜40個のC原子)であってもよい。該環状基の環中の原子の数は、特に限定されるものではなく、該環状基の環は、3〜10個の原子、例えば、3個、4個、5個、6個、又は7個の原子を含むことが好ましい。
【０１１９】
上記のヘテロ原子を含む基、及び上で定義されている他の基のいずれかは、周期表のIIIA族、IVA族、VA族、VIA族、又はVIIA族のいずれかに由来する1以上のヘテロ原子、例えば、B、Si、N、P、O、もしくはS原子、又はハロゲン原子(例えば、F、Cl、Br、もしくはI)を含むことができる。したがって、該置換基は、有機化学における一般的な官能基、例えば、ヒドロキシ基、カルボン酸基、エステル基、エーテル基、アルデヒド基、ケトン基、アミン基、アミド基、イミン基、チオール基、チオエーテル基、スルフェート基、スルホン酸基、及びホスフェート基などのいずれかのうちの1つ又は複数を含むことができる。該置換基は、これらの基の誘導体、例えば、カルボン酸無水物及びカルボン酸ハロゲン化物を含むこともできる。
【０１２０】
更に、どの置換基も、上で定義されている置換基及び/又は官能基のうちの2つ又はそれより多くの組合せを含むことができる。
【０１２１】
上の構造において、反応性官能基は、以下のものから選択されることが好ましい:
【化１６】
2016525677.tif 000023
。
【０１２２】
好ましくは、反応性アイソケミック質量タグのセットは、以下の構造のうちのいずれか1つから選択されるn個の質量標識体を含む:
【化１７】
2016525677.tif 000024
2016525677.tif 000025
2016525677.tif 000026
2016525677.tif 000027
(式中、*は、酸素がO18であるか、炭素がC13であるか、もしくは窒素がN15であることを表し、又は該ヘテロ原子が水素化されている部位において、*はH2を表すことができ、該セット中の該各標識体は、1以上の*を含み、その結果、n個のタグのセットにおいて、m番目のタグは、第1の重同位体の(n-m)個の原子及び第1のものとは異なる第2の重同位体の(m-1)個の原子を含む)。この好ましい実施態様において、mは1〜nの値を有し、nは2以上である。
【０１２３】
本発明による同位体置換を用いて質量タグセットを設計する場合、特定の重同位体を別の重同位体の代わりに用いたときの質量差を考慮する価値がある。表4には、異なる重同位体の置換によって生じる質量差が列挙されている。
【表４】
2016525677.tif 000028
表4
【０１２４】
本発明の質量タグのアイソケミックセットの具体的な好ましい実施態様において、質量調整部分*は、13C又は15Nであり、該セットは、以下の構造を有する、n=4のアミノ反応性質量標識体を含む:
実施例セット1：
【化１８】
2016525677.tif 000029
。
【０１２５】
上の実施例セットにおいて、第1のタグでは、m(上で定義されている通り)は1であり、(n-m)=3であり、かつ(m-1)=0である。したがって、タグに取り込まれた、13Cである第1の重同位体の3個の原子、及び15Nである第2の重同位体の0個の原子が存在する。第2のタグでは、m=2、(n-m)=2、及び(m-1)=1であるので、タグ中に2×13Cと1×15Nが存在する。第3のタグでは、m=3、(n-m)=1、及び(m-1)=2であるので、タグ中に1×13Cと2×15Nが存在し、一方、第4のタグでは、m=4、(n-m)=0、及び(m-1)=3であるので、タグ中に0×13Cと3×15Nが存在する。計算精密質量から、各タグがその次のものと6.32ミリダルトン異なることが分かる。
【０１２６】
本発明の質量タグのアイソケミックセットの更なる具体的な好ましい実施態様において、質量調整部分*は、13C又は15Nであり、該セットは、以下の構造を有する、n=4のアミノ反応性質量標識体を含む:
実施例セット2：
【化１９】
2016525677.tif 000030
。
【０１２７】
上の実施例セットにおいて、(n-1)=3の核が各タグ中で交換されて、該セット中の各タグの質量にミリダルトンの変化を生じさせる。更に、その整数質量が415ダルトンである上のセットを、その整数質量が413ダルトンであるその前のセットとともに用いれば、先に論じられているようなタグのセットのアレイを作り出すことができる。そのようなアレイにおいて、413ダルトンのアイソケミックセットについては、更なる重核が基本的なタグ構造に付加されていないので、p(上で定義されている通り)は、この時、0の値を有するのに対し、415ダルトンのアイソケミックセットでは、2個の更なる13C核が415ダルトンのアイソケミックタグセット中の全てのタグに取り込まれているので、pは2である。
【０１２８】
本発明の質量タグのアイソケミックセットの更なる具体的な好ましい実施態様において、質量調整部分*は、13C又は15Nであり、該セットは、以下の構造を有する、n=4のアミノ反応性質量標識体を含む:
実施例セット3：
【化２０】
2016525677.tif 000031
。
【０１２９】
上の実施例セットにおいて、(n-1)=3の核が各タグ中で交換されて、該セット中の各タグの質量にミリダルトンの変化を生じさせる。更に、その整数質量が486ダルトンであり、かつその前の2つのタグセットと比較して更なるβ-アラニンリンカーを含む上のセットを、その整数質量がそれぞれ413ダルトン及び415ダルトンである該2つの前のセットのうちのどちらかとともに用いれば、先に論じられているような非アイソケミックタグのセットのアレイを作り出すことができる。上の実施例セットは、該アイソケミックセット中の全てのタグに付加されているp=2の更なる重13C核を含む。p=0である対応するタグセットを合成して、整数質量484のタグセットを生じさせることができる。484タグと486タグを作り出す場合、もし望ましいのであれば、これらを併用して、アイソケミックセットのアレイを作り出すことができる。
【０１３０】
本発明の質量タグのアイソケミックセットの更なる具体的な好ましい実施態様において、質量調整部分*は、13C又は2Hであり、該セットは、以下の構造を有する、n=4のアミノ反応性質量標識体を含む:
実施例セット4：
【化２１】
2016525677.tif 000032
。
【０１３１】
上の実施例セット4において、(n-1)=3の核が各タグ中で交換されて、該セット中の各タグの質量にミリダルトンの変化を生じさせる。更に、その整数質量が413ダルトンである上のセットを、13Cを15Nと交換することにより作り出される、その整数質量が同じく413ダルトンである実施例セット1とともに用いれば、4つのタグの非アイソケミックセットのアレイを作り出すことができる。なぜなら、該セット中の各タグの精密質量は、両方のセットに含まれるタグを除いて異なるからである。両方のセットに含まれるタグは、完全にアイソバリックであるので、3×15N核を有する。同様に、上のアイソケミック質量タグセットを上の415ダルトンのタグセットと組み合わせれば、アイソケミックセットのアレイを作り出すことができ、又は上のタグセットを486ダルトンのタグセットと組み合わせれば、非アイソケミックタグセットを作り出すことができる。用途がそのようなタグセットの組合せを必要とする場合、当業者がこれらのタグとその他のタグを様々なタグの組合せで組み合わせることができることは明らかであろう。
【０１３２】
本発明の質量タグのアイソケミックセットの更なる具体的な好ましい実施態様において、*は、13C又は15Nであり、該セットは、以下の構造を有する、n=4のアミノ反応性質量標識体を含む:
実施例セット5：
【化２２】
2016525677.tif 000033
。
【０１３３】
上の実施例セット5において、(n-1)=3の核が各タグ中で交換されて、該セット中の各タグの質量にミリダルトンの変化を生じさせる。更に、その整数質量が413ダルトンである上記の実施例セット5を、実施例セット4とともに用いれば、十分な質量分解能及び質量精度で分解することができる単一の大きな7重セットを形成させることができる(両方のセットに含まれるタグ4は同一であるので、7つのタグしか分解することができない)。実施例セット5のタグ1は、実施例セット4のタグ2と極めてよく似た質量を有しているので、これらのタグを併用するのは実用的ではない可能性があり、したがって、実施例セット4と5を組み合わせた場合、分解可能な6重セットが得られることになることにも留意されたい。当業者が、本発明に従って設計されるこれらのタグ及びその他のタグのアイソケミックタグセット、例えば、同じアイソケミック構造を有するが、18O置換を有するタグセットを組み合わせることができることは明らかであろう。そのようなアイソケミックセットを組み合わせて、タグセットを分析するために使用される質量分析計の分解能の限度内でより大きいアイソケミックセットを形成させることができる。
【０１３４】
本発明の質量タグのアイソケミックセットの更なる具体的な好ましい実施態様において、質量調整部分*は、2H又は15Nであり、該セットは、以下の構造を有する、n=4のチオール反応性質量標識体を含む:
実施例セット6：
【化２３】
2016525677.tif 000034
。
【０１３５】
本発明の衝突解離可能な質量タグのアイソケミックセットのまた更なる具体的な好ましい実施態様において、質量調整部分*は、13C又は15Nであり、該セットは、以下の構造を有する、n=4のアミン反応性質量標識体を含む。
実施例セット7：
【化２４】
2016525677.tif 000035
【０１３６】
実施例セット7において、タグは、破線で印が付けられた結合において、特異的なフラグメンテーションを受けることができる。これは、図7に例示されており、ここでは、実施例セット7由来のタグ1が小ペプチドを標識するために使用され、このペプチドが衝突誘起解離に供されている。
【０１３７】
本発明の衝突解離可能な質量タグのアイソケミックセットのまた更なる具体的な好ましい実施態様において、質量調整部分*は、13C又は15Nであり、該セットは、以下の構造を有する、n=4のアミン反応性質量標識体を含む:
実施例セット8：
【化２５】
2016525677.tif 000036
。
【０１３８】
(テンプレートのスペクトルへのフィッティング:)
本発明の第2及び第3の態様に従って、標識ペプチドに対する予測同位体テンプレートを用いて、非標識イオンの複雑なバックグラウンドが存在し得るこれらの標識ペプチドの質量スペクトル中で標識種を同定する。本発明のミリダルトンタグは、自動化された方法を用いて容易に同定することができる極めて不自然な同位体差(上の表1参照)を生じさせる。
【０１３９】
各々互いに6.3ミリダルトン異なり、最小質量タグが300.00000ダルトンの反応質量を有する本発明の4つの任意のアイソケミック質量タグを用いて、Lys-C切断性ポリペプチド混合物を標識する場合、α-アミノ基及びεアミノ基で標識される典型的なペプチドについて、テンプレートは、単一荷電種について、非標識イオンよりも600.00000ダルトン大きいm/zで見出される第1の標識種を予想する、すなわち、ペプチドの質量が2つの質量タグの質量(2×300.00000)だけ増大する。同様に、標識イオンピークは、単一荷電イオンについて、非標識種よりも600.01260、600.02520、及び600.03780ダルトン大きいm/z値で存在する(上の表1参照)。
【０１４０】
相当なフラグメンテーションノイズ並びに溶媒イオン及び低質量イオンクラスターなどの存在比の高い低質量イオンが存在するので、通常、テンプレートをスペクトルの非常に低い質量端にフィットさせることなはい。テンプレートフィッティングは、実際の状況では、200ダルトンから始まってもよい。したがって、質量スペクトルS(x,y)中のピークの選別されたリストから始めて、その質量電荷比が予め規定された閾値、例えば、200ダルトンを超える、該質量スペクトルのリスト中の最初のピークが選択される。他の実施態様において、望ましい場合、より低い閾値、例えば、100ダルトンを用いてもよい。
【０１４１】
測定されたスペクトルS(x,y)中の第1のピークに対するテンプレートを決定することができる方法は2つある。第1の方法では、アルゴリズムが、既知の関連のあるペプチド配列のデータベースから始め、例えば、ヒト癌試料を、本発明のタグ及び方法を用いて分析する場合、ヒトプロテオームの予想消化物のデータベースを用いて、テンプレートを計算し、本発明によって生成される質量スペクトルにフィットさせることができる。
【０１４２】
或いは、本発明のいくつかの実施態様において、配列データは、試料中のペプチドについて、同じペプチドの高分解能MSモードスペクトルの決定と同時に、又は該決定と連続して決定される。これらの「既知配列」実施態様において、テンプレートは、本発明のデータベース実施態様と若干異なる形で適用される。
【０１４３】
本発明の第3の態様のこれら2つの一般的な実施態様を以下でより詳細に論じる。
【０１４４】
(ペプチドデータベースを用いたテンプレートの計算及び質量スペクトルへのそのフィッティング:)
本発明の第3の態様の第1の典型的な実施態様に従って、質量及び電荷依存的テンプレートのリストが計算される。本発明のいくつかの具体的な実施態様において、テンプレートは、異なる質量及び荷電状態を有する多数の異なるペプチドについて、同位体の存在比又は強度の平均分布を決定することにより計算することができる。ペプチドの同位体存在比分布は、そのペプチドを構成する原子の天然同位体の存在比及び異なる天然同位体が分子の集団に分配され得る様式の数によって決定される。あるペプチドのこの同位体存在比分布は、そのペプチドの原子組成を計算し、その後、異なる同位体変種を含むと予想されるペプチド分子集団の比率を決定するために、組合せ確率モデルを適用することにより決定することができる。そのようなモデルを用いて、ペプチド原子組成及び既知の天然同位体存在比からペプチド同位体存在比分布を計算する方法は、Gayらによって記載されている(15)。所与のモノアイソトピック質量のペプチドの平均同位体存在比分布を決定するためには、その質量の多数の異なるペプチドの同位体分布の決定が必要である。所与の質量の多数のペプチド配列は、配列をランダムに作成し、そのモノアイソトピック質量を計算し、その後、配列を同じ質量を有する群に分類することによって作成することができる。その後、各質量のペプチドのこの計算されたリストを用いて、平均ペプチド同位体分布を決定することができる。
【０１４５】
或いは、本発明の好ましい実施態様において、ペプチドは通常、起源が分かっている試料の酵素的消化によってタンパク質から生成されるので、多数のペプチドを、所与のプロテアーゼ、例えば、LysC又はトリプシンによる消化のシミュレーションによって、対象となる生物体について決定されたタンパク質配列の公的データベース、例えば、SWISS-PROT(16-18)又はタンパク質情報資源(Protein Information Resource)(19,20)から作成することができる予想ペプチド配列を計算することにより作製することができる。予測フラグメントを質量によって分類することができ、これらのペプチドの予想同位体分布を計算することができる。公的データベースは天然のアミノ酸の存在比及び配列を反映しているので、この後者の方法が好ましい。該データベースを生物体別に検索して、それに由来するペプチドを決定し得る所与の生物体のタンパク質を提供することができ、したがって、生物体特異的なアミノ酸分布を反映させることができる。同様に、標識生体分子の原子組成のデータベースを既存のデータベースから容易に導き出すことができ、例えば、標識ペプチドの原子組成を、予想標識アミノ酸の原子組成を未修飾ペプチドの配列に代入することにより決定することができる。同位体テンプレートを定義するのに重要なので、データベース中の所与の質量電荷比のイオンについての同位体強度の予測変動範囲も決定されることに留意すべきである。同様に、本発明とともに使用される質量分析計によって記録される同位体強度の変動範囲も、テンプレートの計算において考慮することができる。
【０１４６】
ペプチドの質量は、同位体分布の形状を決定する。図5a及び5bは、公的に利用可能なデータベースから得られたペプチドの典型的な平均同位体分布を示しており、ペプチドの質量及び荷電状態が、分布の形状に劇的な影響を有することが分かる。明らかに、荷電状態が増加するにつれて、同位体変種間の質量電荷比の差はそれに従い小さくなり、2+状態について、第1の同位体ピークと第2の同位体ピークの間のm/zの差はm/z単位の半分となり、一方、3+状態について、第1の同位体ピークと第2の同位体ピークの差はm/z単位の3分の1となる。また、ペプチドの質量が増加するにつれて、より質量の大きい同位体変種の優勢度が増加する。質量スペクトルをスクリーニングする目的のために、TOF型又はオーブトラップ型質量分析計では、装置分解能に限界があり、トリプシン又はLysC消化物からの予想ペプチドサイズに基づく形成の可能性にも限界があるので、+6よりも大きい荷電状態は、通常は観察されないことが分かっており、したがって、計算される必要があるテンプレートの数は、装置の能力によって決定され、要求される演算処理量は、それに応じて調整可能である。
【０１４７】
実際のテンプレートは、第1のピークの高さに対する様々な同位体ピーク最高値の強度比を決定することにより、平均同位体分布から決定される。
【０１４８】
第1のピークの強度とより高次の同位体種の強度の比に対するペプチド質量増加の影響が図6aに示されている。この図は、もう一つの重要な点、すなわち、予想同位体強度の範囲も決定されるということを示している。同位体強度の変動範囲も図6aに示されている。したがって、各荷電状態及び質量に対するテンプレートは、実際には、許容すべき平均値からの同位体存在比の予想偏差を伴う同位体ピーク分離及び同位体存在比の予想差を含み、各同位体ピークに対する質量電荷比の予想差と組み合わされる。同位体強度の計算偏差よりもわずかに大きい偏差を許容して、実測値の無作為変動を考慮すべきである。同様に、装置の質量精度を、互いに関連する各同位体ピークの位置の決定において考慮しなければならない。テンプレートの概念及び許容公差は、図6bにグラフで示されている。
【０１４９】
図3は、データベースから決定された質量及び電荷依存的テンプレートがどのように質量スペクトルS(x,y)に適用されるかを示すフローチャートを提供する。スペクトルS(x,y)は、その測定質量電荷比の順に分類された、質量電荷比をx、強度をyとするイオンリストを含む。質量電荷比が測定されたスペクトル中の各イオンピークに対して、一連のテンプレートが計算され、この場合、該一連のものは、質量電荷比が測定されたイオンの各々の異なる可能な荷電状態に対するテンプレートを含み;本発明の標識ペプチドの場合、テンプレートは、タグの数が様々であることを考慮して、各々の可能性のある標識種に対して計算される。データベースを使用する場合、質量電荷比が測定された、所与の荷電状態の(及び標識ペプチドの場合、所与の数のタグを有する)イオンを生じさせることができる、データベース中の全てのエントリーが、各テンプレートの計算に使用され、このテンプレートは、上で論じられているような強度及びピーク分離の予想変動を伴う、所与のピークを生じさせることができるイオンの予想同位体存在比分布を表す。予想最高荷電状態に対応するテンプレートが最初にスペクトルに適用される。イオンは、記録された最も質量電荷比の低いイオンから始めて、質量スペクトルS(x,y)から選択される。
【０１５０】
所与のイオンをテンプレートと比較するために、スペクトルS(x,y)を照合し、次のイオンが、許容公差の範囲内で、テンプレート中に第2の同位体ピークの差に相当する質量電荷比の差を有するかどうかを決定する。S(x,y)中の次のイオンが適切な質量電荷比を有する場合、第2のピークに対する第1のピークの強度の比を計算する。これがテンプレートの許容範囲内に収まる場合、S(x,y)からの次のイオンを同様にテンプレートに対してテストして、それが第3の同位体ピークに相当するかどうかを検討する。通常、最初の3つの同位体ピークの強度の比のみを照合する必要があるが、望ましい場合、より多くのピークを使用することがきる。したがって、最初の3つのイオンがテンプレートの基準を満たせば、それらを予備的ヒットリスト(Hp)に追加する。その後、第1のテンプレートに対して全てのイオンが照合されるまで、このプロセスを、S(x,y)中の次のイオンに対して繰り返す。このようにして、スペクトルS(x,y)を、所定の特徴を有するイオンを含む領域について迅速にスクリーニングすることができる。
【０１５１】
その後、ヒットリストHp中の潜在的なイオンファミリーを、より洗練された同位体分布のモデルを適用して確認することができる。このモデルでは、各イオンに対して記録されたピークにおける測定偏差が考慮される。このモデリング工程はより多くの時間を要するので、上記のより速いテンプレートスキャニング手順が必要となる。しかしながら、フィットされたモデルは、スペクトル中に存在する対応するイオンの量を定量するのに不可欠な、ピークの測定質量電荷比及びピーク面積などの、スペクトル中の各々のフィットされたピークの重要なパラメータを決定するために使用されるので、正確なモデリングが重要である。TOFスペクトル中の各ピークは、例えば、同じ原子組成のイオンを含むと仮定される。検出器におけるその到達時間は、イオンに与えられるエネルギーによって異なり、記録される到達時間に広がりが生じる。イオンエネルギーの分布は、ガウス密度関数によって概算することができる。或いは、ローレンツ又はフォークト関数を用いて、イオンピーク形状をモデリングすることができる。同様に、異なる装置構成により、イオンエネルギー分布によって通常は異なる特徴的な形状を有するイオンピークが生じる。イオンエネルギー分布は、イオン化方法と質量分析機構の相互作用から生じる複雑な関数である。これらのイオンピーク形状は、ほとんどの場合、ガウス関数、ローレンツ関数、又はフォークト関数のパラメータを推測することにより、モデリングすることができる。したがって、対象となるイオンに対応し得るスペクトルの領域を前述のテンプレートを用いて同定した後、これらの予備的同定は、より正確なイオンピーク形状モデルで確認される。
【０１５２】
本発明の好ましい実施態様において、同位体分布のガウスモデルをスペクトルS(x,y)中の各ピーク(予備的ヒットリストHpから同定される)にフィットさせ、最小二乗誤差を計算して、測定データがこのモデルにどのくらいよくフィットするかどうかを決定する。これらの正確なモデルのグラフを図5bに示す。誤差が予め定義された閾値よりも小さければ、予備的ヒットを容認する。その後、より洗練されたモデリングの基準を満たすHpからのピークを確認済ヒットHcの第2のリストに移す。Hcに追加されたピークに対するデータもスペクトルS(x,y)から除去される。Hcだけが各ピークのモノアイソトピック質量と同位体強度の合計を記録するように、Hc中のより高い同位体ピークの面積を第1の同位体に追加する。各ピークについてのフィットされたモデルによって決定される質量電荷比及びピーク面積などのパラメータをモノアイソトピックイオンとともにHcに記録する。更に、同位体ピークが一致したテンプレート又はモデルによって決定された荷電状態をモノアイソトピック強度とともに記録する。
【０１５３】
ひとたび所与の荷電状態に対するテンプレートがテストされてしまうと、+1の荷電状態のテンプレートが照合されてしまうまで、次の最も低い荷電状態に対するテンプレートが質量スペクトルに連続的に適用される。テンプレートによって同定された確認済イオンファミリーが確認済ヒットリストHcに追加され、該イオンファミリーに対応するピークがスペクトルS(x,y)から除去される。ひとたび所与のイオンに対する全てのテンプレートがテストされてしまうと、スペクトル中の次のイオンが同様に分析される。このプロセスの最終結果は、既知の質量電荷比、荷電状態、及び強度を有する確認済モノアイソトピックイオンのリストである。
【０１５４】
本発明のいくつかの実施態様において、任意の分子種の複数の荷電状態がスペクトル中に存在するかどうかを決定するために、同定されたモノアイソトピックイオン種のスペクトルを分析する。これを行う方法は、図4のフローチャートに示されており、これは、本発明の第1の態様のテンプレートマッチング手順によって生成される確認済モノアイソトピックイオンピークのヒットリストHcから始まる。最終質量リストMが、Hcを用いて初期化される。最終質量リストは、荷電状態+1にある、Hcからのイオンを用いて初期化される。Mに追加されたイオンデータはHcから除去される。その後、この方法は、Hc中の最も高い荷電状態が検出されたイオンから始まる。最も高い荷電状態の各イオンについて、+1の状態の同じイオンの予想質量電荷比が計算される。その後、この+1の荷電状態に対応するイオンが(より小さいイオン質量の質量電荷比の決定において予め定義された誤差の範囲内で)存在するかどうかを決定するために、最終質量リストが検索される。そのようなイオンが最終質量リストM中に見出された場合、それは、より高い荷電状態と同じ分子種に対応すると仮定される。より高い荷電状態の種のイオン強度が決定され、その後、M中の一致する+1種に追加され、このより高い荷電状態の種がヒットリストHcから除去される。
【０１５５】
イオン強度の決定は装置に依存しており、四重極では、例えば、強度は、単に各々のゲートを掛けられた種のイオンカウントであり、一方、TOF型又はオービトラップ型質量分析計では、各イオンのピーク面積が積分されなければならない。+1の状態が見出されなければ、一致していない種の荷電状態が+1の状態に変えられ、より高い状態がHcから除去される。すなわち、高い荷電状態の種が+1の状態の同じ強度のイオンを有する種と置き換えられ、これがMに追加される。このプロセスは、スペクトルからの次により低い荷電状態のイオンのリストを用いて、+2の荷電状態を有するイオンに至るまで繰り返される。最終結果は、全て+1の荷電状態のモノアイソトピック種を含む最終質量リストMであり、該電荷状態の強度は、そのイオンの荷電状態エンベロープを含む全てのイオンの強度の合計に相当する。この荷電状態のデコンボリューションプロセスは、イオンを特徴付ける更なる情報を提供し、いくつかの実施態様において、所与のイオンの各荷電状態の強度は、+1の荷電状態のデコンボリューションされたモノアイソトピック種とともに記録される。この荷電状態エンベロープデータは、特に、クロマトグラフィー分離から溶出する試料材料から複数のスペクトルが生成される液体クロマトグラフィー分析でスペクトルを比較するために用いることができる。所与のイオンのより高い荷電状態の質量電荷比は、質量分析計でより正確に測定される可能性が高い。なぜなら、ほとんどの装置の質量精度は、質量電荷比がより低い種に対して、より大きいからである。したがって、慎重な荷電状態デコンボリューションによって、+1の状態の質量電荷比の測定の改善が可能になり得る。
【０１５６】
本発明のいくつかの実施態様において、同位体存在比分布テンプレートは、「臨機応変に(on-the-fly)」、すなわち、必要になったときに計算される。他の実施態様において、該テンプレートは事前に計算され、かつ必要な場合にそれにアクセスすることができる形態で保存されることができる。例えば、ペプチドが分析され、テンプレートがペプチド配列のデータベースから計算される場合、これが可能となる。なぜなら、データベース中には、所与の質量電荷比を有するイオンを生じることができる種が一定数しか存在しないからである。したがって、ペプチドのデータベース中の全てのエントリーの全ての予想荷電状態に対応するテンプレートが予め計算されることができる。
【０１５７】
本発明がどのくらいうまく機能するかという例において、326.00867という正確に決定された質量電荷比がスペクトルS(x,y)中で測定された架空のペプチドを考え、これが、S(x,y)中のイオンの分類されたリスト中の最初のイオンであると考える。この例において、このペプチドが由来したポリペプチドの4つの試料を、最も軽いタグが300.00000ダルトンの反応残基質量(すなわち、標識体をペプチドとコンジュゲートさせたときに、該ペプチドに加えられる質量変化)を有し、セット中のタグが6.3ミリダルトンずつ異なる4つのアミン反応性質量タグのセットで標識した。異なる標識ペプチド配列の予測同位体が計算されているペプチドのデータベースを考える。326.00867の質量電荷比をそのデータベースに対して検索して、(装置の予想測定誤差の範囲内で)一致する質量を有する任意のイオンを見出す。表1は、その質量が正確に700.00000であり、単一のリジン及び遊離のαアミノ基を含む架空のペプチドについてのこのペプチドデータベース中のエントリーと考えることができる。上の例において、このペプチドは、適用された質量タグで2回標識されていると考えられる。したがって、上の300.00000ダルトンのタグを用いた二重標識種は、1300.00000の質量を有し、セット中の最も軽いタグで標識されたこの種の+4イオンは、S(x,y)中の決定質量と一致する326.00867の予想質量電荷比を有する。したがって、700.00000ダルトンのペプチドの様々な標識形態についてのイオンピークの計算されたデータベース中のこのエントリーは、S(x,y)中の記録されたイオンと一致する候補である。表1において、一致している質量が、二重標識ペプチドの第1の天然13C同位体の4+の荷電状態に対応することが分かる。したがって、本発明のテンプレートフィッティングアルゴリズムは、第2の天然13C同位体に対応する更なるイオンを326.25951の質量電荷比で、及び第3の天然13C同位体に対応する第3のイオンを326.51035の質量電荷比で見出すことを予想している。同様に、該ペプチドは、4つのタグで標識されていることが分かっているので、このペプチドの4+の荷電状態の他のタグ化形態に対応する9個のイオンがS(x,y)中に存在すると予想され、S(x,y)は、これらの対応するイオンを見出して、これらの質量電荷比が予測されたペプチドが、S(x,y)中の記録されたピークと本当に一致するものであるかどうかを確認するために検索される。同様に、各タグ化種の第1、第2、及び第3の13C天然同位体の相対強度を、ペプチド(タグを含まない)中の炭素原子の数及び各タグ化種の天然同位体の相対強度によって決定することができる、すなわち、表1の各列は、他の全ての列とほぼ同じはずである(とはいえ、各々のタグ自体は、重核のそれ自体の存在比によって、相対存在比を若干変化させる)。しかしながら、重核のタグ存在比は実験の前に決定され、公知のGayの方法(15)を用いて、各標識種の第1、第2、及び第3の13C天然同位体の予想相対強度を計算するために使用することができる。したがって、各タグ化種の各天然同位体の相対存在比を用いて、データベース由来のペプチド一致とS(x,y)中のピークのセットとの一致を更に確認することができる。
【０１５８】
本発明の質量タグは、複雑なポリペプチド混合物の異なる試料に由来する対応するペプチドの量を定量するために使用されることに留意すべきである。したがって、そのもとのポリペプチドがもとの試料中で発現されていない場合、あるペプチドがある試料中に存在しない場合がある。したがって、スペクトルS(x,y)に対するテンプレートのスコアリングは、一部のイオンが存在しない確率を考慮に入れなければならない。該イオンの全て又は大部分に対応する予想ピークが存在する場合、記録されるイオンは、データベース中に一致するイオンを含む潜在的ヒットを有するものとして記録することができる。
【０１５９】
その後、テンプレートと分析中の実際のスペクトルS(x,y)の領域との類似性を決定することができる。テンプレートのスペクトルへのフィットのスコアリングは、様々な方法を用いて行うことができる。通常、これは、テンプレートT(x,y)とS(x,y)との相互相関によって行われる(21)。
【０１６０】
ひとたびデータベース中の潜在的な一致が見出されると、ペプチドの他の荷電状態がスペクトル中に存在すると予想され、したがって、再び表1を用いて、アルゴリズムは、4+イオンに対応する3+イオンを探すことができる。すなわち、表1の質量電荷比が434.34200〜435.02351の範囲にある12個の3+イオン種が、S(x,y)に対して交差照合される。それらが存在すれば、ペプチドの同一性が更に確認されることになる。同様に、2+イオン及び1+イオンも一致させる。その後、各荷電状態に対するイオンをS(x,y)から除去し、潜在的ヒットリストHpに追加する。
【０１６１】
或いは、イオンをS(x,y)中のイオンの分類済リストから抽出するとき、S(x,y)中の各ピークをデータベースに対して検索することができる。この場合、S(x,y)中のその記録された質量電荷比が対応するデータベースエントリーと一致すれば、異なる荷電状態由来のイオンはデータベース中の同じエントリーに対してヒットすると予想される。これらのヒットは、それらがデータベースに対して検索される順番でHpに追加される。
【０１６２】
分析の最後から第2の段階では、Hpを分析して、各々の種についての異なる同位体ピークを関連させる。すなわち、各天然同位体の強度をまとめて追加して、第1の天然同位体の質量電荷比に対応する単一のエントリーとして記録する。すなわち、スペクトルHp(x,y)を脱同位体化する。データの種類によっては、上で論じられているように、これらの候補同位体の各々についてのピークをガウスモデルなどの好適なモデルとフィットさせ、次いで、ピーク面積を積分して、そのピークに対してより正確な強度値を与えることができる。モデルフィッティング及び積分の後、所与の荷電状態の各天然同位体の強度をまとめて追加して、各タグ化種の各荷電状態の異なる同位体についての合計シグナルを確認済ヒットHc(x,y)の新しいスペクトル中に記録し、その場合、各タグ化イオンの各荷電状態に対する最も低いモノアイソトピック種のみを記録する。
【０１６３】
分析の最終段階では、Hcを分析し、同じペプチドの異なる荷電状態を関連させて、単一のモノアイソトピック非荷電ペプチドイオンにし、各荷電状態由来の各タグ化種についてのイオンカウントの合計を単一の値として記録し、これを最終質量リストM(x,y)中に記録する。
【０１６４】
(ペプチド配列が実験的に決定される場合のテンプレートの計算及び質量スペクトルへのそのフィッティング:)
テンプレートをスペクトルS(x,y)にフィットさせる第2の方法において、アルゴリズムはイオンの既知の配列から始まる。ピークの配列は、該ピークがMS/MS分析用にも選択されたことがある場合、既知である可能性がある。このMS/MS分析では、イオンがフラグメント化され、その配列からペプチドの配列が決定される。ペプチドの複合混合物についてのMSモードのデータとMS/MSモードのデータの両方を決定するための典型的な方法は、以下で論じられており、これには、複雑なペプチド混合物のデータ依存的分析(DDA)又は複雑なペプチド混合物のデータ非依存的分析(DIA)が含まれる。したがって、以下で論じられるようなDDAデータセット又はDIAデータセットを用いて、質量スペクトルS(x,y)中の多くのピークは、MS/MS分析によって実験的に決定され、それらと関連付けられたペプチド配列を有することができる。この場合、ペプチドの正確な組成が分かることになり、本発明の異なる質量タグで標識された標識配列に対応する予想スペクトルを計算することができる。
【０１６５】
この場合、S(x,y)は、配列決定イオンを最初に用いて分析される。したがって、分析される第1のイオンは、それについて配列データが決定されている質量電荷比が最も低いイオンである。したがって、第1のテンプレートは、S(x,y)からの第1の配列決定イオンの配列から計算される。したがって、荷電状態、及びタグの数も、決定された配列によって決定される。例えば、表1を再び例として用いて、S(x,y)からの質量電荷比434.34200のイオンは、例えば、DDA分析から、及び対応する予想イオン質量電荷比が予想標識種について計算されている、それについての関連配列を有する。
【０１６６】
したがって、S(x,y)中の第1のイオンにフィットさせられる第1のテンプレートは、ペプチドの4つの異なる質量タグ化種に対して+3の荷電状態の天然同位体という12の質量電荷比に対応する。こうした質量電荷比の差は極めて不自然であり、したがって、標識イオンに極めて特徴的である。同様に、各タグ化種の第1、第2、及び第3の13C天然同位体の相対強度は、ペプチド(タグを含まない)中の炭素原子の数によって決定され、各タグの天然同位体の相対強度は、同じであるはずである(とはいえ、各々のタグ自体は、重核のそれ自体の存在比に応じて、相対存在比を若干変化させる)。しかしながら、タグの重核の存在比を実験の前に決定し、テンプレートに組み入れることができる。したがって、3+イオンに対するテンプレートは、各タグ化種が各天然同位体間で特徴的な相対強度を有する、12のイオンが可能な3+イオンを表1から見出すと予想する。
【０１６７】
その後、テンプレートと分析中の実際のスペクトルS(x,y)の領域との類似性を決定することができる。テンプレートのスペクトルへのフィットのスコアリングは、様々な方法を用いて実施することができる。通常、これは、テンプレートT(x,y)とS(x,y)との相互相関によって行われる(Smith, S. W.の文献、科学者とエンジニアのデジタル信号処理ガイド(The Scientist and Engineer's Guide to Digital Signal Processing): California Technical Publishing, 1997を参照されたい)。S(x,y)中のイオンがテンプレートと一致すれば、該イオンをS(x,y)から除去し、潜在的ヒットHp(x,y)の新たなスペクトルに帰属させる。
【０１６８】
その後、S(x,y)を、第1の配列決定ペプチドの更なる荷電状態について検索することができ、これらをS(x,y)から除去し、Hpに追加することができる。MSモードスペクトルS(x,y)中の第1の配列決定イオンをテンプレートに対してスコアリングし、その全ての対応する荷電状態をS(x,y)から除去した後、S(x,y)中の次の配列決定イオンを分析し、アルゴリズムは、テンプレートをこの配列決定イオンにフィットさせるよう試みる。このプロセスは、スペクトルS(x,y)中の全ての配列決定イオンがS(x,y)から除去されるまで継続する。
【０１６９】
いくつかの実施態様において、例えば、生物体についてのプロテオームデータが利用可能でない場合、S(x,y)中の配列決定イオンのみを分析する。それ以外の場合は、ひとたび全ての配列決定イオンが分析されると、S(x,y)を、上で論じられているような候補テンプレートデータベースに対して検索することができる。
【０１７０】
その後、データベースに対するS(x,y)の検索について上で論じられているように、Hpを分析して、Hcを得る。同様に、データベースに対するS(x,y)の検索について上で論じられているように、Hcを分析して、各タグ化種の合計強度とともに最終質量リストMを得る。
【０１７１】
(HPLCで分離された標識ペプチドの溶出プロファイル:)
本発明の好ましい実施態様において、標識ペプチドの複合混合物を、1以上のクロマトグラフィー分離を適用してこれらのペプチドを最初に分離することにより分析する。通常、最終分離は、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)であり、これは、HPLCカラムからの溶出材料の質量分析検出と同調して実施することができる。通常、HPLC溶出物は、エレクトロスプレーイオン源に直接噴霧され、そこで、溶出ペプチドがイオン化し、質量分析計に送られ、MSモード及びMS/MSモードスペクトルが収集される。その後、ペプチドを分離し、質量分析計に溶出する連続フローがMS装置によってサンプリングされ、該MS装置が、HPLCからの溶出の間の別々の時点でスペクトルを収集する。このように、一連のスペクトルが収集され、任意の時点でHPLCカラムから溶出してくるもののスナップショットを提供する。カラムでのペプチドの分離は、完全には別々ではなく、任意の所与のペプチドは、その溶出プロファイルによって広範な時間にわたって溶出する。すなわち、長い時間をかけて溶出してくる材料の量は、通常、ガウス形態を取り、ペプチドがHPLCカラムから溶出するにつれて、そのシグナルが徐々に増加し、その後、減少する。通常、より分解能の低いHPLCでは、溶出が30秒から1分かけて起こり得るが、より分解能の高い装置では、ペプチドが20秒未満で溶出し得る。MS装置は、装置に応じて、10ms毎又は100ms毎又は1秒毎にスペクトルを収集することができるが、通常、MS装置は、複数のスペクトルを、任意の所与のペプチドが溶出するのにかかる時間にわたって収集する。これは、任意の所与のペプチドが複数の連続スペクトル中に存在し、イオンの強度が、ペプチドがHPLCカラムから溶出するときのその濃度を反映することを意味する。したがって、一連の連続的な質量スペクトルにわたって、イオン強度がピークまで増大し、その後、ガウスプロファイルに従って減少する。
【０１７２】
本発明の方法の更なる実施態様において、テンプレートをMSモードスペクトルに適用して、標識イオンを見出した後、標識ペプチドの複合混合物の分析から生成された連続スペクトルを分析して、連続スペクトル中で同じ種を同定することができる。イオンが複数の連続スペクトル中に存在する場合、及びその溶出プロファイルがガウス分布である場合、このデータによって、イオンの同一性が更に確認される。
【０１７３】
本発明の更なる実施態様において、MSモードスペクトルとMS/MSモードスペクトルが、例えば、以下で論じられる、MSEで交互に収集される場合、フラグメントスペクトルは、インタクトな親イオンと同じ溶出プロファイルを有するはずなので、標識ペプチドの溶出プロファイルを用いて、MS/MSスペクトル中のフラグメントをMSモードスペクトル中のそのインタクトな親イオンに戻って関連付けることができる。フラグメント又はプロダクトイオンをプリカーサーイオンに帰属させる方法は、例えば、US 6,717,130号に論じられている。
【０１７４】
(ペプチドイオンを質量分析によって分析する方法:)
(ペプチドのデータ依存的分析:)
本発明の好ましい実施態様において、本発明の質量タグで標識されたペプチドの分析は、プールされた一連のポリペプチドの複合混合物の試料由来の標識ペプチドのデータ依存的分析(DDA)を用いて行われる。DDAは、ペプチドのショットガンシークエンシングとしても知られている。DDAは、多次元タンパク質同定技術(MUDPIT;(2))によって例示される。試料中のタンパク質発現を決定するための典型的なDDA又はショットガンシークエンシングアプローチでは、生物学的源由来のタンパク質試料を、変性条件下で還元及びアルキル化する。その後、タンパク質をトリプシンで処理して、トリプシン消化物を生成させる。その後、このトリプシン消化物を2回以上のクロマトグラフィー分離に供する。通常、イオン交換クロマトグラフィーを利用して、ペプチドを所定の数の画分に分離する。その後、これらの画分を、エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析(ESI-MS/MS)によるインライン分析を伴う逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)によって個々に分析する。すなわち、ペプチドがRP-HPLC分離から溶出すると同時に、それらを質量分析計に噴霧する(MUDPITでは、イオン交換樹脂をHPLC樹脂に直接詰めて、分離を一体化する(hyphenate))。
【０１７５】
できる限り多くのペプチドの配列を決定するために、質量分析計は、混合物をMSモードで交互に分析して、イオンを検出し、その後、次にMS/MSモードで配列を決定するためにMSモードスペクトル中のイオンを選択するようにプログラムされる。典型的な「データ依存的」選択戦略は、最初は、存在比及び質量に基づく。例えば、所与のMSモードスペクトルについて、質量分析計は、最も大きい強度を有する3つのイオンを選択し、その場合、これらのイオンは、特定のm/z閾値も超えなければならず、また、分析の最終サイクルで分析されるイオンと異ならなければならない(又は最後の2回、3回、もしくはそれより多くのサイクルと異ならなければならない)。したがって、試料中に存在するイオンの比較的恣意的なサブセットが、最も豊富なイオンを生じるタンパク質の過剰提示を伴って分析される。
【０１７６】
本発明の文脈において、一連のポリペプチドの複合混合物の試料をトリプシン又はLysCで消化し、その後、分画する前に、本発明の質量タグで標識する。その後、標識ペプチドを、任意の標準的なDDAプロトコルを用いて分析することができるが、MSモード検出は、Orbitrap Elite(Thermo Scientific)などの適切な装置で超高分解能及び質量精度検出を用いて実行されなければならない。Orbitrap Eliteは、本発明の実施に有利である。なぜなら、このOrbitrap Elite装置は、オービトラップ型質量分析計と同調した、独立した検出器セットを備えたVelos線形イオントラップ(LIT)を含むからである。したがって、この装置は、高精度MSモード質量分析をオービトラップで行うことができ、一方、LITによってMS/MS分析が行われ、個々のイオンの配列が決定される。
【０１７７】
DDAのために、オービトラップは、次のような分析サイクルを実施する:1)逆相HPLCカラムから分画されるイオンをLIT内に噴霧し、そこで、該イオンを冷却し、更に冷却するためのC-トラップに送り、その後、該イオンを精密質量分析のためにオービトラップに注入して、第1の精密MSモード質量スペクトルを決定する。2)第1の精密MSモード質量スペクトルをオービトラップによって決定した後、第2のバッチのイオンを高精度質量分析のためにオービトラップに注入する。3)オービトラップが第2のバッチのイオンを分析している間、LITが更なるバッチのイオンを収集し、第1の精密MSモード質量スペクトルからのデータに基づくDDA選択法を用いて決定されたイオンを選択する。4)選択されたイオンをフラグメント化して配列情報を決定し、イオンを同定する。5)LITは、第1の精密MSモード質量スペクトルからのデータに基づくDDA選択法を用いて決定された1以上の更なるイオンを配列決定用に選択することができる。6)その後、LITは、更なるバッチのイオンを収集し、冷却し、C-トラップを介してオービトラップに注入し、オービトラップに注入された第2のバッチのイオン由来の精密MSモード質量スペクトルからのDDA選択に基づくイオンの配列決定を開始する。7)このプロセスは、それ以上装置に分画されるペプチドがなくなるまで続く。通常の分析では、フラクションをHPLCカラムから90分〜2時間収集する。
【０１７８】
DDA法を用いると、本発明のタグ及び方法を用いてペプチドの相対量を決定するための複雑なペプチド混合物の精密MSモードデータと混合物中のペプチドの少なくともサブセットの同一性を決定するためのMS/MSデータの両方を得ることが可能であることが分かる。
【０１７９】
試料の1回のDDA又はショットガン分析では、試料中のペプチドのサブセットしか同定することができないが、質量精度の高い分析と再現性のあるクロマトグラフィーを用いれば、配列データが、正確に決定されたペプチドのMSモード質量に帰属されられることも注目に値する。本発明の文脈において、MSモードデータは、非標識材料から容易に同定及び区別することができる、極めて不自然なMSモードスペクトルも有する。したがって、大規模研究におけるヒト癌生検などの類似試料を一連のDDA分析で分析する場合、ペプチドの様々なサブセットが各試料中で同定される可能性が高く、独立した分析からの対応するイオンを精密質量タグを用いて互いに比較して、標識イオンとして同定されたが、あるDDA分析で配列決定されていないイオンを、異なるDDA分析で配列データが決定された同じ質量及び溶出時間を有する対応するイオンと関連付けることを可能にすることができる。
【０１８０】
複数のDDA分析が実施される大規模研究において、試料の第1のセットをDDAによって分析し、その後、次の試料で「除外リスト」を適用することが望ましい場合がある。除外リストは、既に配列が決定され、そのため、次のDDA分析で再び配列を決定する必要がないペプチドのリストであり、したがって、第1の分析でも第2の分析でも配列が決定されないペプチドの配列を次のDDA分析で決定することができる。したがって、より多くの試料の配列が決定されるにつれて、試料中の実質的に全てのペプチドの配列が決定されるまで「除外リスト」を拡大することができる。このアプローチは、各試料由来の対応するイオンを適切に帰属させることを保証する参照試料が各DDA分析で使用される場合、特に有効である。
【０１８１】
(ペプチドのデータ非依存的分析:)
本発明の更なる好ましい実施態様において、本発明の質量タグで標識されたペプチドの分析は、プールされた一連のポリペプチドの複合混合物の試料由来の標識ペプチドのデータ非依存的分析(DIA)を用いて行われる。DIAは、上で論じられているショットガン法又はDDA法よりも良くなる可能性がある複雑なタンパク質試料の分析のためのプロテオーム分析における新しいアプローチである。いわゆる「データ非依存的取得」法は、ショットガン分析の限界の一部に対処するものである。
【０１８２】
ペプチドの配列を決定する方法は時が経つとともに良くなり、特に、質量分析計の質量精度は、非常に大幅に向上し、ペプチドをフラグメントからより速く同定することが可能になった。質量精度の向上は、今や、複数のペプチドの配列を同時に決定するのに十分である。すなわち、複数のペプチドを同時に選択することができ、まとめてフラグメント化することができる。複数のペプチドの同時分析は、新しい「データ非依存的分析」法の開発を可能にした。この方法では、DDAで見られるような狭義のサブセットではなく、今や、質量分析計に注入された潜在的に全てのイオンをMS/MSによって分析することができ、低存在比のイオンを確実に検出するのは依然として難しいが、プロテオームの「カバレージ」が大きく改善されている。
【０１８３】
ペプチドのこの同時分析は、フラグメントイオンをその対応するプリカーサーイオンにうまく帰属させることにかかっており、これは現在でも非常に困難である。これを達成するために、2つのアプローチが発表されている。いわゆる、MSE法(Silva JCらの文献、Mol Cell Proteomics. 5(1):144-56. Epub 2005 Oct 11、「LC-MSEによるタンパク質の絶対定量:同時並行MS取得の価値」、2006)では、溶出するペプチドを連続的に分析して、MSモードデータを「エレベーテッドMS(Elevated MS)」(MSE)で交互に収集し、この場合、機械に進入する全てのイオンを高フラグメンテーションエネルギーに曝して、機械に進入する集団全体からフラグメントイオンを生成させる。すなわち、低衝突エネルギースペクトルと高衝突エネルギースペクトルを質量分析計に進入するイオンのほぼ全ての質量範囲にわたって収集する。分析全体のデータを収集し、分析用に保存する。MSEスペクトルからのフラグメントイオンは、クロマトグラフィー分離時のその共溶出に基づいて、MSモードデータからのプリカーサーイオンに暫定的に帰属させられる。すなわち、フラグメントは、その対応するプリカーサーと同じ溶出プロファイルを有するはずである。その後、暫定的に帰属させられたイオンをフィルタリングし、各プリカーサーイオンに対する予測配列と比較して、起こりそうな一致を見出す。
【０１８４】
本発明の文脈において、一連のポリペプチドの複合混合物の試料をトリプシン又はLysCで消化して、その後、分画する前に、本発明の質量タグで標識する。次に、標識ペプチドをMSE分析にかけて分析することができる。この分析では、HPLCカラムから分画されるペプチドを、MSモードスペクトルと高フラグメンテーションエネルギーモードスペクトルを交互に収集することにより分析する。その後、MSモードデータを、本発明の方法を用いて分析し、標識イオンを同定し、これらの標識イオンを定量することができ、一方、MS/MSデータを用いて、ペプチドを同定する。
【０１８５】
別のアプローチの、いわゆる、SWATH法(Gillet LCらの文献、Mol Cell Proteomics. 11(6):O111.016717.「データ非依存的取得によって生成されたMS/MSスペクトルの標的化データ抽出:一貫性のある正確なプロテオーム分析の新しいコンセプト(Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: a new concept for consistent and accurate proteome analysis.)」、doi: 10.1074/mcp.O111.016717. Epub 2012 Jan 18, 2012)では、その代わりに、質量分析計に溶出するペプチドをMSモードで分析し、MS/MSで、典型的には、約25ダルトンの32の狭い重複域の高衝突エネルギーで、m/z範囲にわたって高速スキャニングし、その結果、400〜1200ダルトンの範囲内の実質的に全てのペプチドが高衝突エネルギーで分析される。この場合も、複数のペプチドが任意の所与の衝突エネルギー域内に存在し得るので、フラグメントイオンをプリカーサーイオンに帰属させなければならない。SWATH法では、これは、各衝突エネルギー域に存在するフラグメントイオンを、MSモードデータ中のプリカーサーイオンに対する既知の可能性のあるスペクトルと比較することによって達成される。
【０１８６】
本発明の文脈において、一連のポリペプチドの複合混合物の試料をトリプシン又はLysCで消化し、その後、分画する前に、本発明の質量タグで標識する。その後、標識ペプチドをSWATH分析にかけて分析することができる。この分析では、HPLCカラムから分画されるペプチドを、所定の衝突エネルギー域について、MSモードスペクトルと一連の高フラグメンテーションエネルギーモードスペクトルを交互に収集することにより分析する。その後、MSモードデータを、本発明の方法を用いて分析し、イオンを同定及び定量する。
【０１８７】
DIA法を用いると、本発明のタグ及び方法を用いてペプチドの相対量を決定するための複雑なペプチド混合物の精密MSモードデータと混合物中のペプチドの少なくともサブセットの同一性を決定するためのMS/MSデータの両方を得ることが可能であることが分かる。理論上、DIA法は、低存在比のイオンを分解することができると仮定して、混合物中の実質的に全てのペプチドの同定を可能にするはずである。
【０１８８】
(MSモードスペクトルにおけるより存在比の低いイオンの基準ピークの抑制及び増強:)
標識ペプチドの複合混合物に対するMSモードスペクトルを収集したとき、あるイオンが他のイオンよりも豊富に存在することがよくある。一部の装置、特に、TOF型装置では、より存在比の高いイオンがより存在比の低いイオンの検出を限定する。したがって、第1のMSモードスペクトルを収集し、最も豊富なイオンを同定し、存在する最も豊富なイオンなしで更なるMSモードスペクトルを収集するよう装置に指令を出すことが望ましい場合がある。このプロセスを次に最も豊富なイオンに対して繰り返す、などとすることができる。四重極飛行時間型装置(Q-TOF)では、TOFは、複数のTOFスペクトル(10秒〜100秒)を収集することによって完全なMSモードスペクトルを構築し、それらを平均化する。何らかの形のリアルタイム検出を伴うQ-TOFでは、第1の四重極を広帯域イオンガイドとして用いて、実質的に全てのイオンを源から検出器に送達することにより、最初の数個のスペクトルを全質量範囲について収集することができる。いくつかの(10〜20個の)スペクトルを収集した後、最も豊富なイオンを同定することができ、その後、他のイオンを収集するように、四重極を設定することができる。したがって、20個のスペクトルを収集した後に、質量電荷比800の単一荷電イオンが基準ピークであることが分かれば、あるスペクトルについては1〜799の範囲で並びに第2のスペクトルについては803(800のイオンの同位体エンベロープを避けるため)及びそれを上回る範囲でイオンをTOFに伝達するように、Q-TOFの第1の四重極を設定することができる。該第1の四重極は、更に20個のスペクトルについて、これら2つの範囲でのイオンの伝達を繰り返し、それにより、800のイオンを避けることができる。その後、次に最も豊富なイオンを同定することができ、最も豊富なイオンと2番目に豊富なイオンの両方を避ける範囲のイオンを伝達するように四重極を設定することができる。このプロセスを繰り返して、より存在比の低いイオンに有利に働くスペクトルを収集し、それにより、MSモードの検出のダイナミックレンジを向上させることができる。或いは、該第1の四重極は、全質量範囲の一連の重複するサブ範囲の伝達を反復することができる。すなわち、この装置は、1〜100、その後、90〜200、その後、190〜300などを伝達して、全質量範囲を網羅し、この場合も、より存在比の低いイオンがMSモードスペクトル中で抑制される可能性を低下させることができる。
【０１８９】
(MS/MSによるタグ化ペプチドの分析:)
図7は、本発明の実施例セット7のタグ1(図7の印1)によるペプチド
【化２６】
2016525677.tif 000037
の標識を示している。ネイティブな非プロトン化
【化２７】
2016525677.tif 000038
ペプチド(図7の印2)は、841.50215ダルトンの質量を有する。実施例セット7のタグ1とカップリングさせ、質量分析計でイオン化及び検出した後、2+の荷電状態の標識ペプチド(図7の印3)は、626.90821の質量電荷比を有する。実施例セット7のタグ2、3、及び4で標識された同じペプチドの対応する質量電荷比は、それぞれ、626.905045、626.901885、及び626.898725の質量電荷比を有する。高質量分解能でのMSモード測定は、これらのイオンの分解を可能にするはずであり、したがって、ペプチド
【化２８】
2016525677.tif 000039
を含む4つの試料を標識することができ、これら4つの試料について相対量を決定することができる。しかしながら、いくつかの状況では、質量分析計の質量分解能が3.16ミリダルトン離れたイオンを分解するのに十分でない場合があるか、又は異なる荷電状態の別の異なる標識ペプチドイオンが
【化２９】
2016525677.tif 000040
の標識形態と偶然にHPLC分離から共溶出する場合があり、かつ
【化３０】
2016525677.tif 000041
の2+の荷電状態と重複するある荷電状態の同位体エンベロープを偶然に有し、MSモードでのイオン信号のデコンボリューションを難しくする場合がある。どちらの状況でも、MS/MSによる測定を行うことが有用であり得る。標識ペプチド
【化３１】
2016525677.tif 000042
のMS/MS分析では、標識イオンを選択し、4つの試料が実施例セット7の4つの異なる質量タグで標識されていれば、これらのイオンを衝突誘起解離(CID)のために共選択することができる。本発明のタグセットにおけるわずかな質量差は、MS/MSのための共選択を非常に好都合なものにする。本発明のタグは、これに関して、望ましくないイオンを更なる分析から除外するために小さい選択ウィンドウを使用する場合でも共選択可能であるという点において、アイソバリック質量タグと非常によく似ている。
【０１９０】
図7には、図7の標識種3のCIDによって生じる予想フラグメンテーション経路のうちの1つが示されている。標識種3は、単一荷電ジメチルピペリジンフラグメント(種4と印が付けられている)の損失、一酸化炭素(種5と印が付けられている)のニュートラルロスを経て、タグの全ての重同位体を含む標識ペプチドイオン(図7の印6)が残る。ペプチドの他のフラグメンテーションが、特にペプチド内部で起こり、ペプチドに関する配列情報を生じる可能性も高い。種7は、Wuhrらの文献(22)で論じられているアイソバリック質量タグのCIDから生成される相補イオンと同様の疑似アイソバリック相補イオンと呼ばれることもある。実施例セット7のタグ1で標識されたペプチド
【化３２】
2016525677.tif 000043
、7の相補イオンは、MSモードで測定された標識種3と比較して電荷を1つ損失しており、この時、1099.69377の質量電荷比を有する。実施例セット7のタグ2、3、及び4で標識された同じペプチドの相補イオンの対応する質量電荷比は、それぞれ、1099.68745、1099.68113、及び1099.67481の質量電荷比を有する。図7の種3と比較した種7の荷電状態の変化は、この時、実施例セット7の4つのタグで標識されたイオンが、この時、質量電荷比において6.32ダルトンずつ異なり、したがって、この時、イオン間の間隔が、MSモードで測定が行われる場合の2倍になるので、イオンの分解がより容易になることを意味する。同様に、異なる荷電状態を有する2つのイオンがMSモードで重複する同位体エンベロープを有する場合、フラグメンテーションによる荷電状態の変化によって、MS/MSスペクトル中でイオンが分離され、この場合も、これらのイオンの分解が可能になる。
【０１９１】
本発明のテンプレートフィッティング法を、MSモードスペクトルが収集されるときに、該スペクトルにリアルタイムで適用すれば、MSモードで適切に分解されないイオンを同定することが可能であり、その後、これらのイオンを、修正されたデータ依存的選択戦略でMS/MS用に選択することができる。
【０１９２】
同様に、イオンが、低衝突エネルギーで、次に、高衝突エネルギーで交互に分析される、上で論じられたMSEなどのデータ非依存的分析技術により、同じ標識ペプチドから2つのデータセットが収集されることも想定される。低エネルギースペクトル、すなわち、MSモードスペクトルでのペプチドの分析が、イオンの重複のために困難であるか、又は装置がその分解能の限度で稼働するために、不十分にしか分解されない場合、本発明のテンプレートフィッティング法を用いる高エネルギースペクトルの分析によって、低エネルギースペクトルの障壁となっているイオンの一部を分解することが可能であり得る。
【０１９３】
したがって、解離可能である本発明の質量タグは、異なるタグを区別するために使用される全ての重同位体が、CIDの後、図7に示すように、インタクトなペプチド上に残存するように解離するよう設計されている場合、標識フラグメントイオンの極めて有用なMS/MS分析を可能にすることが明らかであろう。
【０１９４】
(MS/MS/MSによるタグ化ペプチドの分析:)
図8は、本発明の実施例セット8のタグ1及び2(それぞれ、図8の印1及び2)によるペプチド
【化３３】
2016525677.tif 000044
の標識を示している。ネイティブな非プロトン化
【化３４】
2016525677.tif 000045
ペプチド(図7の印3)は、841.50215ダルトンの質量を有する。実施例セット8のタグ1とカップリングさせ、質量分析計でイオン化及び検出した後、2+の荷電状態の標識ペプチド
【化３５】
2016525677.tif 000046
(図8の印5)は、498.310915の質量電荷比を有する。実施例セット8のタグ2で標識された同じペプチド(図8の印6)の対応する質量電荷比は、498.314075の質量電荷比を有する。
【０１９５】
高質量分解能でのMSモード測定は、これらのイオンの分解を可能にするはずであり、したがって、ペプチド
【化３６】
2016525677.tif 000047
を含む2つの試料を標識することができ、これら2つの試料について相対量を決定することができる。しかしながら、上で論じられているように、一部の装置における、特に、より大きいペプチドの場合の、質量分解能の限度、又は同位体エンベロープの重複のために、MS/MS/MSによる標識ペプチドの分析が望ましくなる場合がある。
【０１９６】
標識ペプチド
【化３７】
2016525677.tif 000048
のMS/MS/MS分析の第1段階では、該標識イオンを選択し、両方の標識イオン(5及び6)を衝突誘起解離(CID)のために共選択することができる。上で論じられているように、本発明のタグセットにおけるごくわずかな質量差は、MS/MS/MSの共選択を非常に好都合なものにする。
【０１９７】
図8には、図8の標識種5及び6のCIDによって生じる予想フラグメンテーション経路のうちの1つが示されている。標識種5及び6は、ペプチド配列中のプロリン残基とそのすぐN-末端のロイシン残基の間で容易なフラグメンテーションを受け、プロリン及びアルギニンを含む単一荷電y-イオン(図8の印9)と、インタクトなタグを含むペプチドの残りの部分を有する1対の単一荷電b-イオン(図8の印7及び8)とを生成させると予想される。これらのb-イオン及びy-イオンは、該標識ペプチドのフラグメンテーションスペクトル中で容易に観察される可能性が高い。次に、インタクトなタグを有する7及び8の印が付された種を、イオントラップなどのMS/MS/MSが可能な装置での更なる分析のために選択することができる。この目的のための好適な装置は、オービトラップ型高質量分解能質量分析計に連結されたイオントラップを含むOrbitrap Eliteである。7と8は非常によく似た質量を有するので、これらを再度、実質的に全ての他のイオンを除外しつつ、容易に共選択することができる。ひとたび他のイオンから単離されれば、7と8を更にフラグメント化することができる。この場合、図8の10及び13の印が付された2つのレポーターイオンが生成され、これらは、高質量分解能分析によって容易に区別される。種10は、質量電荷比127.12476のイオンを生じ、一方、種13は、質量電荷比127.13108のイオンを生じる。標識ペプチドのMS/MS分析の場合と同様、MS/MS/MSによる、比較的質量の小さい単一荷電レポーターイオン10及び13の分解は、MSモードでの二重荷電標識ペプチド種5及び6の分解よりも容易に実施することができる。なぜなら、ほとんどの質量分析計は、質量電荷比がより低いイオンに対してより高い分解を達成することができ、その上、1+のレポーターイオンの質量電荷比の差は、2+の標識親イオンでは2倍の差になり、3+及び4+イオンではもっと大きくなるからである。したがって、MS/MS/MSによるレポーターイオンの検出は、ペプチド
【化３８】
2016525677.tif 000049
を含む2つの試料の相対定量を可能にするが、MS/MS/MSアプローチは、MSモード分析だけでは分解することが難しい、より大きな、荷電状態がより高いイオンの分解も容易にする。
【０１９８】
レポーターイオン10及び13も、種5及び6の衝突誘起解離から生成されるMS/MSスペクトル中に存在することに留意すべきである。本発明のいくつかの実施態様において、これらのレポーターイオンを用いて、その源試料中のペプチド
【化３９】
2016525677.tif 000050
の相対定量をもたらすことができるが、標識ペプチド
【化４０】
2016525677.tif 000051
と重複する標識イオン同位体エンベロープが存在する場合、重複する標識ペプチドは、
【化４１】
2016525677.tif 000052
と共選択され、同じレポーターイオンを生じ、それにより、
【化４２】
2016525677.tif 000053
の定量測定をゆがめる。この問題は、アイソバリック質量タグで注目されており(23)、フラグメントイオンがなおもインタクトなタグを含む場合のMS/MSスペクトルからのフラグメントイオンのMS/MS/MS分析がアイソバリックタグの定量における不正確さを解決すると報告されている。類推により、本発明によって提供される疑似アイソバリックタグは、MS/MSとMS/MS/MSの両方で、非常によく似た様式で挙動し、したがって、フラグメントイオンがなおもインタクトなタグを含む場合のMS/MSスペクトルからのフラグメントイオンのMS/MS/MS分析は、MSモード検出だけでは分解することが難しいイオンの高精度定量をもたらす。
【０１９９】
(高分解能質量スペクトルデータの処理)
本発明の第1の態様で提供された方法を質量スペクトルデータに適用するために、データは、この方法にとって意味のある形式でなければならない。データは、既知の質量電荷比を伴うイオン強度のリストを含む必要がある。異なるタイプの質量分析計は、異なる形態の生データを作成し、これは、その質量電荷比を伴うイオン強度のリストを作成するように処理されなければならない。
【０２００】
飛行時間型質量分析計は、高分解能、高質量精度データを取得することができるタイプの質量分析計の例である。同様に、オービトラップ型質量分析計は、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計と同様の高分解能質量分析計である。
【０２０１】
オービトラップ型質量分析計は、クアドロ対数(quadro-logarithmic)ポテンシャル分布を有する静電場を形成する外側バレル様電極及び同軸内側スピンドル様電極からなる(8,9)。動的にトラップされたイオンからのイメージ電流が検出され、デジタル化され、フーリエ変換を用いて、周波数領域データに変換され、その後、質量スペクトルに変換される。イオンがオービトラップに注入され、そこで、イオンは、内側電極周囲の軌道経路に落ち着く。内側電極周囲の軌道振動の周波数がイメージ電流として記録され、それに対して、フーリエ変換アルゴリズムが適用されると、周波数領域信号を超高分解能の質量スペクトルに変換することができる。
【０２０２】
フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴(FTICR)質量分析では、イオンの試料がイオントラップのような空洞に保持されるが、FTICR MSでは、イオンが、交差電磁場によって高真空チャンバーにトラップされる(10,24)。電場は、箱の2つの側面を形成する1対のプレート電極によって形成される。この箱は、超伝導磁石の磁場に収容され、この超伝導磁石は、2枚のプレート、すなわち、トラッピングプレートとともに、注入されたイオンを、該トラッピングプレートの間にある、印加された磁場に直交する円形軌道に拘束する。箱の2つの更なる対向側面を形成する2枚の「送信プレート」に高周波パルスを印加することにより、イオンはより大きな軌道に励起される。イオンのサイクロイド運動によって、「受信プレート」を含む箱の残り2つの対向側面に対応する電場が発生する。励起パルスによって、イオンはより大きな軌道に励起されるが、この軌道は、イオンの固有運動が衝突によって失われるときに崩壊する。受信プレートによって検出された対応する信号は、フーリエ変換(FT)分析によって質量スペクトルに変換される。FTICR装置の質量分解能は、印加される磁場の強度とともに増加し、超高分解能分析を達成することができる(25)。
【０２０３】
誘起フラグメンテーション実験では、FTICR装置は、イオントラップと類似した様式で作動することができ−対象となる単一種を除く全てのイオンをFTICRキャビティから放出することができる。衝突ガスをFTICRキャビティに導入し、フラグメンテーションを誘起することができる。その後、フラグメントイオンを分析することができる。通常、フラグメンテーション生成物と浴ガスが組み合わさると、「受信プレート」により検出される信号のFT分析によって分析する場合に分解能が低くなるが、フラグメントイオンを該キャビティから放出させ、例えば、四重極型又は飛行時間型装置とのタンデム構成で分析することができる。
【０２０４】
飛行時間型質量分析計では、狭い運動エネルギー分布を有するイオンのパルスをフィールドフリードリフト領域に進入させる。装置のドリフト領域において、各パルスにおける異なる質量電荷比を有するイオンは、異なる速度で移動し、したがって、ドリフト領域の末端に位置するイオン検出器に異なる時間で到達する。到達イオンに応答して検出器によって生成されるアナログ信号は時間-デジタル変換器によってすぐにデジタル化される。イオン飛行時間の測定により、各到達イオンの質量電荷比が決定される。飛行時間型装置にはいくつかの異なる設計がある。この設計は、イオン源の性質によってある程度決定される。マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間(MALDI TOF)型質量分析では、イオンのパルスが、金属ターゲット上に結晶化された試料材料のレーザー励起によって生成される。これらのパルスは、それらが加速されるフライトチューブの一方の末端で発生する。
【０２０５】
エレクトロスプレーイオン源から質量スペクトルを取得するために、直交軸TOF(oaTOF)配置が使用される。エレクトロスプレーイオン源で生成されるイオンのパルスは、連続流から「パルサー」プレートによってサンプリングされる。このパルサープレートは、該源から直交配置されたフライトチューブにイオンを加速する一時的な電位差を用いて、イオンを飛行時間型質量分析計に注入する。質量電荷比に対するイオン到達数のヒストグラムを作成するために、パルサープレートから検出器までの飛行時間が記録される。このデータは、時間-デジタル変換器を用いてデジタルに記録される。
【０２０６】
MALDI-TOFとESI-oaTOFの両方において、通常、約100mSの全期間中に完全なスペクトルを取得するために、約1,000個のイオンパルスが分析される。各パルスからの信号がヒストグラムに追加され、それにより、生のデジタル化TOFスペクトルが生成される。
【０２０７】
本発明の第3の態様は、オービトラップ型又は飛行時間型質量分析計などの高分解能質量分析計によって生成された質量スペクトルデータを処理して、該データを対象となるイオンのリストにまで減少させる方法を提供する。図1は、提供される一般的なプロセスのフローチャートを示している。この分析方法は、生のデジタル化飛行時間データに効果がある。この方法には、生のTOFスペクトルを処理するための3つの一般的な工程がある。スペクトルを第2の工程に適合させるためのスペクトルの前処理。これは、スペクトル中の、予め決定しておいた同位体パターン及び荷電状態を有するイオンを同定する。このプロセスの最終工程は、スペクトル中に複数の荷電状態で存在するイオンを同定し、これらの状態を単一の+1の荷電状態にまでデコンボリューションする。この分析プロセスの最終産物は、+1の荷電状態のモノアイソトピックイオン強度のリストを含むスペクトルであり、この場合、これらのイオンは全て、該スペクトルに適用される同位体分布テンプレートの基準を満たす。
【０２０８】
飛行時間データの前処理は、通常、そのESI-TOF及びQ-TOF計装を操作するために、装置の製造業者によって提供されるソフトウェア、例えば、Micromass(Manchester, UK)によって提供されるMassLynxソフトウェアによって実施される。しかしながら、データをそのまま処理することができることが好ましいこともあり、本発明の方法に適合するようTOFデータを処理するために必要な一般的工程を図2に示す。以下で論じられる、いくつかの標準的なデジタル信号処理技術の概説については、例えば、「科学者とエンジニアのデジタル信号処理ガイド(The Scientist and Engineer's Guide to Digital Signal Processing)」(21)を参照されたい。
【０２０９】
通常、TOF型質量分析計からのデジタル信号には、低レベルのランダムなノイズが混入している。このノイズを更なる分析の前に除去することが好ましい。ノイズを除去する様々な方法が適用可能である。一般に、ノイズレベルは、イオン信号と比較して非常に低い。したがって、最も簡単なノイズ除去方法は、それよりも低い信号が無視される(又は除去される)閾値強度を設定することである。しかしながら、飛行時間型質量分析計のノイズレベルは、質量電荷比が増大するにつれて変化することが分かっているので、異なる質量電荷比に対して変動する閾値を適用する方がよい。標準的な閾値関数を、質量電荷比に対する所与の装置関連ノイズについて決定することができ、これを用いて、強度の閾値レベル未満の信号を除去することができる。しかしながら、より好ましい方法は、各スペクトルの異なる質量電荷比について、データ依存的ノイズの推定を行うことである。なぜなら、これによって、特定の装置での分析間のランダムな変動を説明することが可能になり、それにより、この方法が、使用される装置に左右されなくなるからである。これは、生のスペクトルをビン(bin)に分割し、各ビンでノイズを推定することにより行うことができる。その後、適切な曲線を記述する補間関数又はスプライン関数を、各ビンのノイズ推定値にフィットさせて、スペクトルの全質量電荷比範囲にわたって変化する適応閾値を提供することができる。その後、計算閾値未満の信号をスペクトルから除去する。
【０２１０】
ランダムなバックグラウンドノイズを除去した後、データ中のイオンピークを発見しようとする前に、デジタル信号をスムージングしなければならない。スムージングは、様々な方法によって達成することができる。通常、デジタルの質量スペクトルデータをローバンドパスフィルタでコンボリューションする。ローバンドパスフィルタは、通常、信号の移動平均を効果的に決定することにより、デジタル信号をスムージングする。これは、各イオンのデジタル化信号強度における小さなランダム変動に相当する超短波信号をデータから除去する。デジタル信号は、単純な二乗関数などの、スムージング効果を有するいくつかの異なるフィルタカーネルでコンボリューションすることができ、このフィルタカーネルは、移動平均が加えられた修正されたスペクトルを生成させ、その場合、移動平均の各点に対して均等に加重が行われる。より好ましいフィルタカーネルは、移動平均の中心点により大きい加重を加える。適切なフィルタカーネルとしては、窓処理シンク関数、ブラックマン窓、及びハミング窓から導き出されるフィルタが挙げられる。より好ましい実施態様において、TOFスペクトルは、ガウス関数から導き出されるフィルタカーネルを用いたコンボリューションによってスムージングされる。
【０２１１】
デジタル信号におけるピークの同定は、連続信号の場合と本質的に同じである。連続信号を用いて、シグナルの第1の差と第2の差が計算され;第1の差がゼロになる場合、信号の最大値と最小値、すなわち、ピークとトラフが同定され、一方、第2の差がマイナスになる場合、最大値が同定される。離散信号については、ラプラシアンフィルタが、デジタル信号におけるピークの検出を容易にする適切な対応する差分方程式を決定する。
【０２１２】
ひとたび、ピークのリストが、その対応する質量電荷比とともにTOFデータから同定されると、本発明の第1の態様によって提供される方法をこのピークのリストに適用することができる。このプロセスの最終結果は、既知の質量電荷比、荷電状態、及び強度を有する確認済モノアイソトピックイオンのリストである。
【０２１３】
図1に示されるTOFデータ処理の最終工程において、任意の分子種の複数の荷電状態がスペクトル中に存在するかどうかを決定するために、同定されたモノアイソトピックイオン種のスペクトルを分析する。これを行う方法は、図4のフローチャートに示されており、これは、本発明の第1の態様のテンプレートマッチング手順によって生成される確認済モノアイソトピックイオンピークのヒットリストHcから始まる。最終質量リストMが、Hcを用いて初期化される。最終質量リストは、荷電状態+1にある、Hcからのイオンを用いて初期化される。Mに追加されたイオンデータはHcから除去される。その後、この方法は、Hc中の最も高い荷電状態が検出されたイオンから始まる。最も高い荷電状態の各イオンについて、+1の状態の同じイオンの予想質量電荷比が計算される。その後、この+1の荷電状態に対応するイオンが(より小さいイオン質量の質量電荷比の決定において予め定義された誤差の範囲内で)存在するかどうかを決定するために、最終質量リストが検索される。そのようなイオンが最終質量リストM中に見出された場合、それは、より高い荷電状態と同じ分子種に対応すると仮定される。より高い荷電状態種のイオン強度は、TOFデータからのイオンのピーク面積を積分することにより決定される。その後、この積分されたピーク強度はM中の一致する+1種に追加され、より高い荷電状態種はヒットリストHから除去される。+1の状態が見出されなければ、一致していない種の荷電状態が+1の状態に変えられ、より高い状態がHから除去される。すなわち、高い荷電状態種は、+1の状態の同じ強度のイオンを有する種と置き換えられ、これがMに追加される。このプロセスは、スペクトルからの次により低い荷電状態のイオンのリストを用いて、+2の荷電状態を有するイオンに至るまで繰り返される。最終結果は、全て+1の荷電状態のモノアイソトピック種を含む最終質量リストMであり、該電荷状態の強度は、そのイオンの荷電状態エンベロープを含む全てのイオンの強度の合計に相当する。
【０２１４】
荷電状態デコンボリューションプロセス中の所与の分子イオン種の各荷電状態の強度を記録することが望ましい場合がある。なぜなら、このデータは、イオンを特徴付けるために、又はもとのスペクトルを再構築するために有用であり得るからである。
【０２１５】
(他の質量分析計)
本発明の方法は、飛行時間型質量分析計を含まない様々な装置で生成されるスペクトルに対して等しく適用可能であるが、より高い電荷(＞+4)を有するイオンの分解を可能にする高質量分解能を有するので、TOF型質量分析計が好ましい。四重極をベースにした装置は、通常、TOFをベースにした装置よりも低い質量分解能及び質量精度を有するが、生データを本発明の方法によって分析することができる。とはいえ、より高い荷電状態種は、これらの装置で十分に分解されない。四重極データの利点は、そのスペクトルが、通常、スムージングを必要としないことである。脱ノイズ化方法は、TOFについて記載されている方法と同様である。セクタ装置も高質量分解能を有し得るが、対応するTOF型質量分析計よりも感度が低い傾向にある。フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴(FT-ICR)型質量スペクトル及びオービトラップ型質量スペクトルも、本発明の方法を用いて分析することができる。これらの装置は、高い荷電状態の分解を可能にする超高分解能データを作成することができ、これらも、本発明とともに使用するのに好ましい。オービトラップとFT-ICRの両方においては、データのピーク形状も、通常、ガウス形態を取る。なぜなら、対象となる両方のタイプにおいて、イオン質量電荷比は、何らかの軌道中のイオンによって生成されるイメージ電流を測定することにより決定されるからである。両方のタイプの装置において、所与の質量電荷比のイオンは、通常は正規分布し、したがって、ガウスピーク形状をもたらす速度分布で軌道に乗る。これは、TOFデータについて論じられたようなピークフィッティングが、オービトラップ及びFTICRデータに等しく適用可能であるということを意味する。同様に、全ての電子検出系がランダムな電気ノイズに曝されるので、上で論じられているノイズ軽減戦略は、オービトラップ及びFTICRスペクトルデータに等しく適用可能である。
【０２１６】
(ソフトウェア)
本発明の好ましい実施態様において、質量スペクトルを解釈する方法は、コンピュータが本発明の方法を自動的に実行するのを可能にするコンピュータ可読媒体上のコンピュータプログラムの形態で提供される。
【０２１７】
(同位体テンプレートマッチングソフトウェアの並列化)
上で論じられているように、本発明の方法は、コンピュータプロセッサによって実施されるコンピュータ可読媒体上のプログラムとして実行することができる。単一のプロセッサコンピュータ上で作動するそのようなアルゴリズムの実行が達成されている。ソフトウェアにおけるこの種のアルゴリズムの実行は完全に機能的であるが、比較的遅く、数千個の独立したTOFスペクトルを生成させ得るペプチドの試料の典型的な液体クロマトグラフィー分析を処理するのにスペクトル当たり約1分かかる。したがって、分析時間が質量スペクトル分析システムの処理量の制限因子とならないように、分析速度を上げる手段を有することが望ましい。テンプレートマッチング手順は、同じソース分子の多くの荷電状態がスペクトル中に存在し得るとしても、各イオン種を独立の実体として処理し、したがって、これは、アルゴリズムを、処理されるべき各スペクトルの異なるサブ部分に対して、いくつかのプロセッサで並行して容易に適用することができることを意味する。同様に、異なるスペクトルを各プロセッサに分配することができる。一実施態様において、ソフトウェアは、LINUXクラスターに搭載され、これは、通常、ネットワーク、例えば、Ethernetスイッチを通じてフロントエンドと呼ばれる特殊なノードコンピュータに接続されたいくつかの異なるコンピュータ「ノード」を含む(「ノード」を「スレイブ」と呼び、「フロントエンド」を「マスター」と呼ぶこともある)。フロントエンドは、通常、人間とクラスターとのインターフェーシングを可能にするフロントエンドコンピュータに接続されたキーボード、モニター、及びマウスを含む。したがって、クラスターは、フロントエンドを通じて制御される。フロントエンドコンピュータは、処理される各質量スペクトルを、小さい範囲の質量電荷を含むサブスペクトルに分割するのに関与する。各サブスペクトルは、ネットワーク接続を通じて、本発明のソフトウェアをデータに適用する異なるコンピュータに送られる。各コンピュータがアルゴリズムの実行を完了すると、結果が、ネットワークを通じてマスターコンピュータに送られ、再アセンブルされて、テンプレートマッチングソフトウェアの基準を満たす全てのイオンが全質量スペクトルにわたって同定された単一のスペクトルになる。その後、マスターコンピュータは、再アセンブルされたスペクトル全体に対して行われなければならない荷電状態デコンボリューションなどの任意の追加の処理を実施する。
【０２１８】
LINUXクラスターなどのUNIXベースの並列処理システムでは、簡単な方法で並列化を達成することができ:質量スペクトルを処理するための本発明のソフトウェアのコピーをクラスターの各ノードにインストールする。追加のプログラムをフロントエンドコンピュータにインストールする。この追加のプログラムは、質量スペクトルをサブスペクトルに分割し、該サブスペクトルをノードに分配し、該ノードに、質量スペクトル処理ソフトウェアを実行するよう指令を出し、該ノードに、データを該フロントエンドに戻すよう指令を出す。これらの第1段階の実行後、該フロントエンド上のプログラムは、データが戻るのを待ち、その後、戻ったデータを合成して、単一のスペクトルにする。
【０２１９】
本発明のこの態様の別の実施態様において、イオン検出用のソフトウェアを、公的に利用可能な並列仮想計算機ソフトウェアパッケージをサポートする言語、例えば、Cで暗号化することができる(26)。もとはOak Ridge National Laboratory(Tennessee, USA)で開発されたこのソフトウェアパッケージは、ネットワークを通じて接続されたUnix及び/又はWindowsコンピュータの異種集合体を単一の巨大並列コンピュータとして使用することを可能にする。
【０２２０】
(本発明の質量タグの適用)
本発明は、ポリペプチドの複合混合物の2以上の試料を分析する方法であって、以下の工程:
1.ポリペプチドの複合混合物の各試料を配列特異的切断剤で消化して、ペプチドの複合混合物を生じさせる工程
2.ペプチドの複合混合物の各試料を、これらのペプチド中の1以上の反応性官能基と特異的に反応する本発明の異なる質量タグと反応させる工程(ここで、該タグは、タグ化ペプチドの質量電荷比のわずかな変化をもたらし、その結果、ペプチドの複合混合物の各試料由来の対応するペプチドは、明瞭に分解可能な質量電荷比を有する);
3.任意に、異なる又は同じセットのアイソケミック質量タグを用いて、ただし、各試料が同じ規模の質量のタグで標識されるように、ペプチド中の異なる官能基と反応する該タグ上の異なる反応基を用いて、工程2を繰り返す工程
4.任意に、標識される反応基を有するペプチドを同定する目的でピークを分離するために、全ての異なる試料に同じ対のタグを用いて、ペプチドの複合混合物中の異なる反応基を互いに質量が異なる1対のアイソケミックタグで標識する工程
5.標識された試料をまとめてプールする工程
6.任意に、標識され、プールされたペプチドの試料を1以上のクロマトグラフィー分離技術によって分離する工程
7.プールされたペプチドの試料を質量分析によって分析して、標識ペプチドの高分解能質量スペクトルを決定する工程
8.該質量スペクトルを分析して、異なる試料を本発明の異なる質量タグで標識することにより得られる異なる試料中の対応するペプチドのアイソトポログの強度を検出及び決定する工程
9.任意に、1以上のイオンを選択し、該1以上のイオンをフラグメント化して、これらのペプチドの配列情報を決定する工程
を含む方法を提供する。
【０２２１】
本発明のいくつかの実施態様において、望ましい場合、反応基を標識する任意の工程3又は4を消化前に行うことができる。
【０２２２】
(アミン反応性質量タグによるペプチドの標識:)
本発明の第2の態様の好ましい実施態様において、複雑なポリペプチド混合物を消化する工程は、トリプシン又はLysCなどの配列特異的エンドプロテアーゼを用いて実施されることが好ましい。エンドプロテアーゼLysCは、リジン残基のすぐC-末端のアミド結合で切断し、したがって、LysCが使用される実施態様においては、切断によって得られるペプチドの大部分は、単一のC-末端リジン残基と単一のαN-末端アミノ基、すなわち、アミン反応性タグと反応させることができる2つのアミノ基を有する。したがって、アミン反応性タグを用いると、LysCによって切断されたペプチドは、大部分は、2つのタグで標識されることになる。この規則には、いくつかの例外がある:
・リジンがポリペプチドのC-末端アミノ酸でない限り、該ポリペプチドのC-末端ペプチドはリジンを有さない、又は
・LysCはプロリン-リジン結合で切断しないため、プロリンリジン結合を含むペプチドは複数のリジンを有する。プロリン-リジン結合は、ポリペプチドのC-末端ペプチドでも生じ得る、又は
・ポリペプチドのα-アミノ基は、通常はアセチル化によって、ブロックされていることが多いため、ポリペプチドのN-末端ペプチドは、通常、(プロリン-リジン結合が存在しない限り)、リジンを1つしか有さない。
【０２２３】
実施例セット1のタグは、アミノ基と反応しやすいN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルで活性化される。したがって、上の実施例セット1を用いて、4つの異なる複雑なポリペプチド混合物のLys-C消化物由来のペプチドの4つの異なる試料を標識したとすると、大部分のペプチドは、2つのタグで標識されることになる。実施例セット1において、個々のタグは、互いに質量が6.3ミリダルトン異なる。これは、実施例セット1の異なるタグで標識された試料由来のペプチドが、それに結合した2つの質量タグを有する各々のペプチド間で12.6ミリダルトンの質量差を有することを意味する。単一の遊離アミノ基しか有さない標識ペプチドは、6.3ミリダルトンの質量差を有し、一方、プロリン-リジン結合を有するペプチドは、3以上の標識アミノ基を有し得る。これらのペプチドは、異なる試料間で(6.3×利用可能なアミノ基の数)となる質量差を有する。同様に、LysCの不完全な消化によって得られるペプチドは、標識するのに利用可能な3以上のアミノ基も有し得る。したがって、プールされた試料の質量が本発明の方法による質量分析によって決定される場合、2つのタグで標識されたペプチドから得られる質量スペクトルは、標識ペプチドのピーク間で異なる間隔を有することが明らかになるはずである。したがって、実施例セット1のタグで標識された、+1の荷電状態の、2つの質量タグを有するペプチドイオンは、12.6ミリダルトンの間隔が空き、一方、単一標識イオンは、6.3ダルトンの間隔が空き、その他のものは、本発明の質量タグで標識される利用可能なアミノ基の数に応じた間隔が空く。
【０２２４】
本発明の方法を用いて、異なるペプチドのクラスを適切な同位体テンプレートの計算によって同定し、これらを質量スペクトルを用いてコンボリューションして、標識イオンを同定することができる。したがって、2つのタグを有するペプチドの検出用のテンプレートを計算し、これらのペプチドがMSモードデータから選択的に同定されるのを可能にすることができる。その後、これらのペプチドの質量を、2つの利用可能なアミンを有するペプチドのデータベースに対して検索することができる。すなわち、検索すべきデータベースは、プロテオーム全体と比較して減少する。望ましい場合、LysCによる不完全な消化によって多くのペプチドが生じ得るとき、3以上のアミノ基を含むペプチドを無視してもよいし、又はこれらのペプチドを、プロリン-リジン結合、不完全な切断、及び任意の他の多重標識の可能性を有するペプチドを含む、3以上の利用可能なアミノ基を含む種の特定のデータベースに対して検索してもよい。
【０２２５】
一部の質量分析計では、6.3ミリダルトンの間隔は小さすぎて、ペプチドイオンを分解するために使用することができない可能性があり、したがって、場合によっては、2以上のタグを有するペプチドしか分離可能でないことに注目する価値がある。したがって、大部分のペプチドが少なくとも2つのタグを有することを保証するLysCの使用は、多くの場合、有利である。
【０２２６】
対照的に、トリプシンは、アルギニンとリジンの両方のすぐC-末端のアミド結合で切断し、したがって、トリプシンが使用される実施態様においては、一部のペプチドはC-末端リジンを有し、2つのタグで標識され、一部は、C-末端アルギニンを有し、これは、αアミノ基において、単一のタグでのみ標識される。LysCと同様、この規則にはいくつかの例外がある:
・リジンもしくはアルギニンがポリペプチドのC-末端アミノ酸でない限り、該ポリペプチドのC-末端ペプチドは、リジンもアルギニンも有さない、又は
・トリプシンは、プロリン-リジン結合でもプロリン-アルギニン結合でも切断しないため、プロリンリジン結合を含むペプチドは複数のリジンを有し、したがって、複数の利用可能なアミノ基を有する。プロリン-リジン結合は、ポリペプチドのC-末端ペプチドにも生じ得る、又は
・ポリペプチドのα-アミノ基は、通常はアセチル化によって、ブロックされていることが多いため、ポリペプチドのN-末端ペプチドは、通常、(プロリン-リジン結合が存在しない限り)、リジンを1つしか有さない。
【０２２７】
今、トリプシン消化物の4つの異なる試料由来のペプチドが、アミノ基において、実施例セット1の4つのタグのセットで標識されているとすると、リジンを有するペプチドは、主に、2つのタグを有し、アルギニンを含有するペプチドは、タグを1つしか有さない。
【０２２８】
この場合も、本発明の方法を用いて、異なるペプチドのクラスを適切な同位体テンプレートの計算によって同定し、これらを質量スペクトルを用いてコンボリューションして、標識イオンを同定することができる。したがって、2つのタグを有するペプチドの検出用のテンプレートを計算し、これらのペプチドがMSモードデータから選択的に同定されるのを可能にすることができる。その後、これらのペプチドの質量を、2つの利用可能なアミンを有するペプチドのデータベースに対して検索することができる。すなわち、主に単一のリジン及び遊離N-末端αアミノ基を有するペプチドが検索されるので、検索すべきデータベースは、プロテオーム全体と比較して減少する。同様に、タグを1つ有するペプチドを生の質量スペクトルからフィルタリングし、予想プロテオーム由来のペプチドのサブセットに対して検索することができる。このサブセットは、この時、単一の遊離アミノを有するペプチドを含み、このペプチドは、主として、アルギニンを含有するトリプシンペプチドである。この場合も、望ましい場合、3以上のタグを有するペプチドを無視してもよいし、又は適当なデータベースに対して検索してもよい。
【０２２９】
(ペプチド中の複数の反応基と複数の質量タグとの反応:)
本発明のいくつかの実施態様において、ペプチド中の複数の反応基を本発明のタグで標識する。例えば、複雑なポリペプチド混合物のいくつかの試料を、これらの試料中のポリペプチドの相対量を決定するために分析するとき、複雑なポリペプチド混合物の異なる試料中のポリペプチドの消化の前に、これらの試料を、トリス-カルボキシエチル-ホスフィン(TCEP)などの還元剤で還元することが望ましい場合がある。TCEPは、システイン残基間のジスルフィド結合を還元して、システイン残基に遊離チオールを残す。通常、これらの遊離チオールを試薬でブロックして、これらが更なる反応に対して不活性になるようにし、本発明のいくつかの実施態様においては、これが望ましい場合があり、ヨードアセトアミドなどの試薬がこの目的のために好適である。しかしながら、システインチオールを本発明のチオール反応性質量タグで標識することにより、複雑なペプチド混合物中のペプチドの精密質量タグ分析を向上させることができる。
【０２３０】
例えば、今、TCEPで還元されたトリプシン消化物の4つの異なる試料由来のペプチドを、システイン基上で、実施例セット6の4つのチオール反応性タグのセットで標識した場合、システイン含有ペプチドは、各試料について異なるタグで標識される。その後、このペプチドを同じ質量規模の実施例セット1のアミノ反応性タグで標識した場合、すなわち、実施例セット6のタグ1で標識された試料を実施例セット1のタグ1などで標識した場合、これらのペプチドにおいて、システイン残基だけでなく、リジンのεアミノ基及びN-末端α-アミノ基も標識される。様々な異なるカテゴリーの標識ペプチドは、下の表5に示すようなこの標識によって得られる:
【表５】
2016525677.tif 000054
2016525677.tif 000055
2016525677.tif 000056
表5
【０２３１】
表5から、一連のペプチド試料を、タグのセットのメンバー間で異なる質量差を有するアイソケミックタグの2つの異なるセットで標識すると、得られる標識ペプチドは、数多くの異なるカテゴリーに分類されることができ、かつ各カテゴリーのペプチドは、異なる試料由来の標識ペプチド間の特徴的な質量差によって同定可能であることが分かる。
【０２３２】
この場合も、本発明の方法を用いて、異なるペプチドのクラスを適切な同位体テンプレートの計算によって同定し、これらを質量スペクトルを用いてコンボリューションして、標識イオンを同定することができる。したがって、2つのアミノ反応性タグと1つのシステイン反応性タグを有するペプチドの検出用のテンプレートを計算し、これらのペプチドがMSモードデータから選択的に同定されるのを可能にすることができる。その後、これらのペプチドの質量を、2つの利用可能なアミンと1つのシステイン残基を有するペプチドのデータベースに対して検索することができる。すなわち、主に単一のリジン、遊離N-末端αアミノ基、及び単一のシステイン残基を有するペプチドが検索されるので、検索すべきデータベースは、プロテオーム全体と比較して大きく減少する。同様に、1つのアミノタグと単一のシステインを有するペプチドを生の質量スペクトルからフィルタリングし、予想プロテオーム由来のペプチドのサブセットに対して検索することができる。このサブセットは、この時、単一の遊離アミノを有するペプチドを含み、このペプチドは、主として、単一のシステイン残基を有するアルギニン含有トリプシンペプチドである。更に、2以上のシステイン残基を有するペプチドは、単一のシステインを有するペプチドよりも存在量が少なく、これらのペプチドの質量は、それらの対応するペプチド配列と容易に一致する可能性が高い。この場合も、望ましい場合、3以上のタグを有するペプチドを無視してもよいし、又は適当なデータベースに対して検索してもよい。
【０２３３】
したがって、本発明の質量タグ及び方法が、ペプチド同定に対する精密質量タグアプローチを大いに推し進めることができることが明らかであろう。
【０２３４】
(ホスホペプチド:)
リン酸化は、情報が細胞内で伝達される重要な過程であるので、ホスホペプチドは、研究者及び薬剤開発者の強い関心を引いている。したがって、ホスホペプチドの検出方法は、極めて重要である。
【０２３５】
ホスフェートの水酸化バリウム触媒β-脱離反応は、結果として生じるマイケル中心(Michael centre)の次の反応とともに、セリン及びトレオニンホスフェートを標識する方法として何年にもわたって知られている(27,28)。β脱離マイケル付加(BEMA)反応を用いて、ホスフェート基を、質量分析にとって有益であり得る代わりの基と交換することができる。脂肪族基によるセリン及びトレオニン中のホスフェートの置換は、非修飾ペプチドに使用されるような標準的な陽イオン交換及び/又は逆相クロマトグラフィー法を用いてホスホペプチドを分離することができることを意味する(29)。ホスホペプチド中のホスフェート基の置換は、特に、ホスホペプチドのマトリクス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)分析におけるホスホペプチドの検出を向上させることも報告されている(27、29〜31)。
【０２３６】
バリウム触媒BEMA反応は、本発明のタグとともに様々な実施態様において使用することができる。
【０２３７】
本発明の一般的なホスフェート標識実施態様において、ホスホペプチドを含むことが分かっている一連のポリペプチドの複合混合物の試料は、以下の工程:
1.任意に、各試料中の任意のシステイン残基を変性させ、還元し、アルキル化する工程
2.各試料由来のポリペプチド混合物を配列特異的エンドプロテアーゼで消化する工程
3.任意に、全ての試料が固有に分解可能な質量タグで標識されるように、各試料中の任意の遊離アミノ基を質量タグで標識する工程
4.各試料中のペプチド由来の任意のホスフェート基をβ-脱離させる工程
5.マイケル中心がジチオールリンカーの1つのチオールと反応し、ジチオールリンカー由来の残りのチオールが未反応のままになるように、ホスホセリン及びホスホトレオニン由来のホスフェート基のβ-脱離によって生じるマイケル中心を大過剰のジチオールリンカーと反応させる工程
6.各試料について、全ての試料が固有に分解可能な質量タグで標識されるように、ジチオールリンカー由来の遊離チオールを有するペプチドを本発明のチオール反応性質量タグと反応させる工程
7.標識された試料をまとめてプールする工程
8.任意に、標識され、プールされたペプチドの試料を1以上のクロマトグラフィー分離技術によって分離する工程
9.プールされたペプチドの試料を質量分析によって分析して、標識ペプチドの高分解能質量スペクトルを決定する工程
10.該質量スペクトルを分析して、異なる試料を本発明の異なる質量タグで標識することにより得られる異なる試料中の対応するペプチドのアイソトポログの強度を検出及び決定する工程
11.任意に、1以上のイオンを選択し、該1以上のイオンをフラグメント化して、これらのペプチドの配列情報を決定する工程
を含む方法で分析される。
【０２３８】
本発明のいくつかの具体的なホスフェート標識実施態様において、β-脱離は、水酸化バリウムで触媒される。好ましいβ-脱離マイケル付加の方法において、複雑なペプチド混合物由来のペプチドを、文献(32)に記載されている通りに、疎水性樹脂に不可逆的に固相化すると、β-脱離及びマイケル付加が起こると同時に、ペプチドが固体支持体に固相化される。
【０２３９】
本発明のいくつかの具体的なホスフェート標識実施態様において、ジチオールリンカーと反応させられるチオール反応性タグは、ヨードアセチミジルリンカーを含む。実施例セット6は、複雑なポリペプチド混合物の4セットの試料を標識するのに適切なタグの1つの可能性のあるアイソケミックセットを提供する。
【０２４０】
本発明のいくつかの具体的なホスフェート標識実施態様において、ペプチドのアミノ基と反応させられるアミン反応性タグは、NHS-エステルを含む。実施例セット1は、複雑なポリペプチド混合物の4セットの試料を標識するのに適切なタグの1つの可能性のあるアイソケミックセットを提供する。本発明の実施態様において、本発明の質量タグを用いて、わずかな質量シフトを導入する場合、試料を、β-脱離されるホスフェート部位を標識するのに使用されるチオール反応性標識と同じ質量規模で、アミノ基上で標識することが好ましい。本発明の好ましい具体的なホスフェート標識実施態様において、アミノ基とホスフェート基の両方を標識する場合、アミノ基を標識するのに使用されるタグのアイソケミックセットは、チオール反応性タグによって導入される質量差とは異なる質量差をペプチド間に生じさせるはずである。このように、表5に示されたものと類似した固有の質量分離を有するペプチドカテゴリーを生じさせ、異なるタイプのホスホペプチドが異なる試料中の対応する標識ペプチドイオン間の質量分離に基づいて同定されることが可能になる。
【０２４１】
(同位体存在比の改変:)
ペプチドは、特徴的な同位体存在比分布を有するが、具体的な特徴の同定を可能にするためにペプチドの同位体存在比分布を修飾することも価値があることが多い。例えば、ICAT法(5)は、混合物中の各タンパク質由来のペプチドの小さな特定の試料を取得する方法として、システイン含有ペプチドを生物学的材料から単離するものである。ICATにより、複雑なペプチド混合物の特徴付けに対するシステイン含有ペプチドの分析の有用性が示されている。システイン含有ペプチドの別の同定方法は、ペプチドに特徴的な同位体分布を与える標識体でシステインをタグ化することである。いくつかの標識体及びタグ化手順がこの目的のために開発されている(33〜37)。これらの文献に記載されている方法は全て、MSデータの手作業による解釈を必要としてきたように思われる。第4の態様により、本発明の方法は、そのような同位体タグ化種の質量スペクトルの解釈のための自動化手順を提供することができる可能性がある。したがって、本発明の第4の態様の一実施態様において、一連の複雑なポリペプチド混合物の試料中のシステイン含有ペプチドを同定及び定量する方法であって、以下の工程:
1.複雑なポリペプチド混合物の各試料を消化する工程
2.ペプチドの複合混合物の各試料中の非アミノ反応性官能基を、特徴的な同位体分布を有する単一の反応性タグでタグ化する工程
3.ペプチドの複合混合物中の各試料中のアミノ基を、本発明の異なるアミン反応性タグでタグ化する工程
4.分析される生物体についてのデータベースから得られたシステイン含有ペプチドに対するテンプレートを計算する工程(ここで、ペプチド中に存在する荷電状態、質量範囲、及びタグの数の各々の予想される組合せに対するテンプレートが存在する)
5.タグ、質量、及び電荷依存的同位体分布テンプレートを、標識ペプチドイオンを含む質量スペクトルに対して、スペクトル中の各イオンについての予想される最大数のタグ及び荷電状態に対するテンプレートから始めて、連続的に適用して、該同位体テンプレートと一致する質量スペクトルの領域を見出す工程
6.予想同位体分布をテンプレートマッチング手順によって同定されたペプチドイオンにフィットさせて、予備的同定を確認し、それにより、ペプチドの荷電状態及び該ペプチドと反応したタグの数を同定する工程
を含む方法が提供される。
【０２４２】
したがって、上の方法において、同位体タグは、ペプチド中の非アミノ反応基、例えば、システイン残基又はβ-脱離ホスフェート基又は糖に存在するアルデヒド基に導入される。この場合の同位体タグは、MSモード分析で認識し易くするために、標識産物の同位体分布を変化させるように選択される。例えば、システイン残基をジクロロベンジルヨードアセトアミドで標識することができる(34)。特徴的な同位体分布を有するタグを作製する簡単な方法は、選択された反応基と同時に反応させる混合物中のタグの2以上の同位体を使用することである。本発明の2以上のタグの混合物をこの目的のために使用することができるが、タグ間の質量差は非常にわずかであってもよい。或いは、所望の反応基と反応するタグの従来の重同位体及び軽同位体によって、特徴的な同位体シグナチャーが与えられる。したがって、システイン標識のために、ヨード酢酸の2つの同位体を使用することができ、例えば、軽ヨード酢酸及び重13C2-ヨード酢酸(SigmaAldrich)を、所定の比、例えば、50:50で混合し、システイン残基に適用することができる。1対の同位体タグを単一の試薬として用いれば、アミン標識のシグナルを、どんな質量差でも分離される2つのピークに分ける効果がある。
【０２４３】
(内部標準:)
本発明のいくつかの好ましい実施態様において、標識された内部標準を複雑なポリペプチド混合物の標識された試料に添加することが望ましい場合がある。内部標準は、通常、重要なポリペプチド又はペプチドの量が予め分かっている天然の試料又は人工的なペプチドもしくはポリペプチド混合物である。これは、特徴付けられていない試料中のペプチドについて記録された強度を内部標準試料中で測定された強度と関連させて、特徴付けられていない試料中のペプチドの絶対量を決定することを意味する。
【０２４４】
好ましい実施態様において、WO 2008/110581号に論じられているように、異なる所定濃度で存在する2以上の内部標準を用いて、較正曲線を試料について計算することを可能にすることが望ましい場合がある。
【実施例】
【０２４５】
(実施例:)
本発明の質量標識体の大部分の一般的な合成方法は以前に記載されている。(2,6-ジメチル-ピペリジン-1-イル)-酢酸及び対応するN-ヒドロキシスクシンイミド活性エステルの同位体の合成は、本出願人らにより、本発明者らの以前の特許出願(WO2007012849号)に記載されている。同様に、β-アラニン伸張構造の合成はWO2007012849号及び本発明者らのより最近の特許出願(WO2011036059号)に開示されている。
【０２４６】
下に示されている構造を有する1対のタグを合成した:
【化４３】
2016525677.tif 000057
。
【０２４７】
それぞれ、MMT-NN及びMMT-CCの調製に必要とされる非ドープ型(2,6-ジメチル-ピペリジン-1-イル)-酢酸及び単一の13C置換を有する対応する構造の合成は、WO2007012849号の実施例に開示されている:
【化４４】
2016525677.tif 000058
【０２４８】
β-アラニン同位体の15N-β-アラニンと13C1-βアラニンは市販されている(Cambridge Isotope Laboratories社、Tewksbury, MA, USA)。これらの市販のβ-アラニン構造を、WO2007012849号に開示されているようなベンジルエステルの調製により、カルボン酸で保護する。その後、ベンジルエステル保護β-アラニンを(2,6-ジメチル-ピペリジン-1-イル)-酢酸にカップリングさせ、WO2007012849号に開示されている通りに精製することができる。該ベンジルエステル保護基を除去し、ベンジルエステル保護β-アラニンを用いた該構造の更なる伸張サイクルを、HPLCによる精製とともに実施することができる。該分子のN-ヒドロキシスクシンイミドエステル形態の調製を、本質的にWO2007012849号に開示されている通りに実施する。
【０２４９】
2つの15N同位体で置換されたMMT-NNタグも、破線で印が付けられた結合でフラグメント化して、126ダルトンの整数質量を有するレポーターイオンを生じることができる。
【０２５０】
2つの13C同位体で置換されたMMT-CCタグも、破線で印が付けられた結合でフラグメント化して、127ダルトンの整数質量を有するレポーターイオンを生じることができる。
【０２５１】
これら2つのタグを用いて、合成ペプチド
【化４５】
2016525677.tif 000059
を標識した。該ペプチドの2つの標識形態を下の表6に示すような様々な比で混合した。
【表６】
2016525677.tif 000060
表6: MMT-NN標識ペプチドとMMT-CC標識ペプチドの混合物を示された比で調製した
【０２５２】
500fmolの各混合物を分離用のEasy nLCII液体クロマトグラフィーシステムに充填した。クロマトグラフィーカラムからエレクトロスプレーされたときのこれらの様々な混合物の高分解能質量スペクトルを、Orbitrap Velos Pro質量分析計(Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA)でのHCDフラグメンテーションの後、MSモード及びMS/MSモードで取得した。約100,000の分解能を用いた。
【０２５３】
MS/MSスペクトルでは、レポーターイオンが、126及び127の質量電荷比で見られる。MMT-NN及びMMT-CCで標識されたペプチド
【化４６】
2016525677.tif 000061
の1:1混合物のMS/MSスペクトルを図9に示す。レポーターイオンに、印が付けられている。更に、b-イオン系列は、インタクトなタグを含み、タグの比は、b-イオンから得ることができる。これは、図9には見られないが、図10a及び図11a上は、1:1の標識ペプチド混合物のb1イオンに対するMS/MSスペクトルの拡大部分を示している。図10aにおいて、この1:1の比は、質量スペクトルの微細構造中に見られ、ここで、ペプチドの各標識形態由来のb1イオンからのシグナルは、予想された12ミリダルトンの間隔を伴って出現している。この比を、b1、b2、b3、b4、b5イオンから得ることができることが分かった。b6イオンは検出不可能であり(図9)、b7イオンも同様に非常に弱く、現在の分析の分解能(100,000)では分解されない。図10a〜10eは、それぞれ、b1、b2、b3、b4、及びb5イオンの1:1の比のペプチド混合物の拡大されたスペクトルを示す。
【０２５４】
表6に示される比の完全なセットは、図11a〜11iに示される126/127レポーターイオン及びb1イオンから得ることができる。図11a上は、1:1(MMT-NN:MMT-CC)の比のペプチド混合物のb1イオンを示し、一方、図11a下は、同じ比の126/127レポーターイオンを示している。図11b上は、2:1(MMT-NN:MMT-CC)の比のペプチド混合物のb1イオンを示し、一方、図11b下は、同じ比の126/127レポーターイオンを示している。図11c上は、4:1(MMT-NN:MMT-CC)の比のペプチド混合物のb1イオンを示し、一方、図11c下は、同じ比の126/127レポーターイオンを示している。図11d上は、8:1(MMT-NN:MMT-CC)の比のペプチド混合物のb1イオンを示し、一方、図11d下は、同じ比の126/127レポーターイオンを示している。図11e上は、16:1(MMT-NN:MMT-CC)の比のペプチド混合物のb1イオンを示し、一方、図11e下は、同じ比の126/127レポーターイオンを示している。図11f上は、1:2(MMT-NN:MMT-CC)の比のペプチド混合物のb1イオンを示し、一方、図11f下は、同じ比の126/127レポーターイオンを示している。図11g上は、1:4(MMT-NN:MMT-CC)の比のペプチド混合物のb1イオンを示し、一方、図11g下は、同じ比の126/127レポーターイオンを示している。図11h上は、1:8(MMT-NN:MMT-CC)の比のペプチド混合物のb1イオンを示し、一方、図11h下は、同じ比の126/127レポーターイオンを示している。図11i上は、1:16(MMT-NN:MMT-CC)の比のペプチド混合物のb1イオンを示し、一方、図11i下は、同じ比の126/127レポーターイオンを示している。
【０２５５】
したがって、MMT-NNタグ及びMMT-CCタグを用いると、比は、レポーターイオンにより、m/z 126と127で、すなわち、MS2又はMS3による1ダルトンの分解能で、及び構造イオンにおいて、MS1又はMS2の高分解能で測定可能となる。
【０２５６】
複数のイオンからの比を決定する能力は、複数のイオンからのシグナルの平均化を可能にすることにより、定量測定の頑健さを向上させるはずである。タグがペプチドのN-末端に存在するときに、強いb1イオンをしばしば生成させることも本タグの有用な特徴であり、これにより、該b1イオンは、定期的スキャニング用の有用なレポーターイオンになる。他のフラグメントイオンからタグの比を決定する能力もまた、現在、文献(Tingらの文献、Nat Methods. 8(11):937-40、「MS3は、アイソバリックマルチプレックス化定量的プロテオミクスにおける比の歪みを除去する(MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics)、2011)に論じられているようなアイソバリック質量タグを用いた定量にとって問題となっている共選択の問題に対処するために有用である。なぜなら、定量的比の決定を可能にする分解可能なイオンが大部分のペプチドのMS/MSスペクトル中に存在する可能性が高いからである。
【０２５７】
更に、MMT-NN及びMMT-CC標識ペプチドは、Tingらによって、及び本発明者らの以前の特許出願(WO2009141310号)において提唱されたMS3法によって分析することもでき、この方法は、インタクトなタグを含む1以上のMS/MSフラグメントイオン、すなわち、
【化４７】
2016525677.tif 000062
ペプチドのb-イオンを選択し、該1以上のイオンを単離し、次いで、該イオンを衝突解離に供して、レポーターイオンをm/z 126及び127で放出させることを含む。特定の配列イオンを選択するので、及びMS2フラグメント由来の干渉イオンを共選択する可能性が大いに低下しているので、正確なレポーター量をMS3法によって決定することができる。
【０２５８】
(実施例2:)
更なる例において、100μgのマウス海馬タンパク質の2つの異なる試料を還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化し、トリプシンで一晩消化した。消化された試料の各々を徹底乾燥させ、MMT-NN又はMMT-CCのどちらかで標識した。MMT試薬をアセトニトリル(ACN)に溶解させ、その後、100mM重炭酸トリエチルアンモニウム(TEAB)に希釈して、MMTの濃度が17.5mM及びTEABの濃度が50mMの溶液を生じさせた。各々100μlのMMT溶液をすぐに用いて、消化されたペプチド試料を標識した。標識反応を、振盪させながら、室温で30分間進行させておいた。25μlの0.4％ヒドロキシルアミンを添加し、これを室温で15分間反応させておくことにより、反応をクエンチした。
【０２５９】
その後、試料を真空下で徹底乾燥させた。その後、乾燥した試料を、0.1％ギ酸を含む200μLの2％ACNに別々に溶解させた(〜1μg/μl全タンパク質/ペプチドに相当する)。NN-MMT及びCC-MMTで標識した等量の海馬試料を一緒に混合した。その後、この溶液を1:5に希釈し、5μl(〜1μg試料に相当)をナノHPLC-NSI-MS/MS分析(EASY-nLC II Orbitrap Velos Pro(Thermo)システム)に用いた。
【０２６０】
トラッピング及びクリーンアップ用の5μm ReproSil-Pur C18-AQ(Dr. Maisch GmbH)を詰めた2cm長(外形寸法(OD): 360μm、内形寸法(ID): 100μm)のキャピラリーカラムに、試料を充填する。合計115分間で、3μm ReproSil-Pur C18-AQ(Dr. Maisch GmbH)を詰めた15cm長(OD 360μm、ID 75μm)のキャピラリーカラム上での300nL/分の5〜30％アセトニトリルの90分間の分離勾配からなる勾配＋洗浄及び再平衡化を用いて、LCを行った。
【０２６１】
サーベイMSスキャンを、オービトラップ型分析計で、300〜1000Thの範囲で、100,000の分解能で実施した(自動利得制御目標106イオン、最大イオン充填時間500ms)。
【０２６２】
ポストQ解離(PQD)フラグメンテーション(分離幅2Th、規格化衝突エネルギー40、活性化Q 0.7、活性化時間0.1ms)及びイオントラップにおけるMS/MSスキャン読出し(通常のスキャンタイプ、予測イオン注入時間、最大イオン充填時間100ms、AGC目標10000)のために、MSサーベイスキャンにおける10個の最も強度の高いプリカーサーを選択する(FTマスタースキャンプレビューモード対応、モノアイソトピックプリカーサー選択、荷電状態1の拒絶、最小所要シグナル10000)。ロック質量として、m/z 445.12を用いて、獲得時の最終的な質量シフトについて補正した。動的除外リストを用いて、同じ分析物の配列決定の繰り返しを回避した(反復/除外持続時間30秒、質量幅20ppm)。
【０２６３】
図12aは、m/z 484.96のペプチドのMSモードスペクトルを示している。MMT-NNで標識された試料由来のペプチドからの親イオンは、MMT-CCで標識された試料由来のペプチドから明確に分解することができる。MMT-NNで標識された試料由来のペプチドは、MMT-CCで標識された試料よりも5倍低い存在比で存在するように見える。この比は、重同位体を含まないペプチド＋2個のタグに対応するイオン(図12b)において及び1×13C核を有するネイティブな構造のペプチド＋2個のタグに対応するイオンピーク(図12c)において及び2×13C核を有するネイティブな構造のペプチド＋2個のタグに対応するイオンピーク(図12d)において観察することができる。
【０２６４】
図13は、図12に示されるペプチドイオンのPQDによって得られたMS/MSスペクトルを示している。このスペクトルは、1つはN末端アミノ基にあり、1つはリジンのεアミノ基にある2つのタグ(MMT-NN又はMMT-CCのどちらか)を有するペプチド配列
【化４８】
2016525677.tif 000063
と一致し、図12に示される親イオンの質量に対応する。
【０２６５】
(実施例3:)
下の構造を有する2つのタグを合成した:
【化４９】
2016525677.tif 000064
【０２６６】
ピペラジン伸張タグ1及びピペラジン伸張タグ2を作製するための合成経路を、それぞれ、図14及び15に示す。精製されたタグを用いて、実施例1と同じ合成ペプチド
【化５０】
2016525677.tif 000065
を標識した。上に示したタグは、破線で印が付けられた結合でフラグメント化し、レポーターイオンを126のm/zで生じることができる。図16は、m/z 596.9で二重荷電されていると予想されるピペラジン伸張タグ1で標識された合成ペプチドのMSモードスペクトルを示し、一方、図17は、m/z 603.9で二重荷電されていると予想されるピペラジン伸張タグ2で標識された同じ合成ペプチドのMSモードスペクトルを示す。
(参考文献:)
【０２６７】
【化５１】
2016525677.tif 000066
2016525677.tif 000067
2016525677.tif 000068
2016525677.tif 000069
【図１】
2016525677.tif 000084
【図２】
2016525677.tif 000085
【図３】
2016525677.tif 000086
【図４】
2016525677.tif 000087
【図５ａ】
2016525677.tif 000088
【図５ｂ】
2016525677.tif 000089
【図６ａ−０１】
2016525677.tif 000090
【図６ａ−０２】
2016525677.tif 000091
【図６ａ−０３】
2016525677.tif 000092
【図６ａ−０４】
2016525677.tif 000093
【図６ｂ】
2016525677.tif 000094
【図７】
2016525677.tif 000095
【図８】
2016525677.tif 000096
【図９】
2016525677.tif 000097
【図１０ａ】
2016525677.tif 000098
【図１０ｂ】
2016525677.tif 000099
【図１０ｃ】
2016525677.tif 000100
【図１０ｄ】
2016525677.tif 000101
【図１０ｅ】
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【図１１ａ】
2016525677.tif 000103
【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
2016525677.tif 000105
【図１１ｄ】
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【図１１ｅ】
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【図１１ｆ】
2016525677.tif 000108
【図１１ｇ】
2016525677.tif 000109
【図１１ｈ】
2016525677.tif 000110
【図１１ｉ】
2016525677.tif 000111
【図１２ａ】
2016525677.tif 000112
【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１３】
2016525677.tif 000116
【図１４】
2016525677.tif 000117
【図１５】
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【図１６】
2016525677.tif 000119
【図１７】
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【国際調査報告】
2016525677.tif 000121
2016525677.tif 000122
2016525677.tif 000123