(57)【要約】本発明は、プラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターを含むキット、ならびにこれらのベクターの混合物およびそれらの使用、ならびに、該キットおよび該ベクターを用いて植物または植物組織または植物細胞において2種またはそれ以上のポリペプチドを同時に作製するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)第1のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター、および
(b)第2のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター
を含むキットであって、
(i)該第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターおよび該第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターが、異なる植物ウイルスに由来し、かつ
(ii)該第1のベクターの由来元である該ウイルスのコートタンパク質ORFが、該第1のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターにおいて完全に欠失しており、かつ
(iii)該第2のベクターの由来元である該ウイルスのコートタンパク質ORFが、該第2のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターにおいて完全に欠失しており、かつ
(iv)該第1のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが、該第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元である該ウイルスの機能的コートタンパク質ORFを含み、かつ
(v)該第2のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが、該第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元である該ウイルスの機能的コートタンパク質ORFを含み、かつ
(vi)該第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターおよび該第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターが、植物細胞において複製することができるRNAレプリコンを含む、
キット。
【請求項２】
(a)前記第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元である前記ウイルスの前記コートタンパク質ORFが、前記第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元である前記ウイルスの前記機能的コートタンパク質ORFで置換されており、かつ/または
(b)該第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元である該ウイルスの前記コートタンパク質ORFが、該第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元である該ウイルスの前記機能的コートタンパク質ORFで置換されている、
請求項1に記載のキット。
【請求項３】
前記第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターおよび前記第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元である前記ウイルスが、異なるウイルス型に、好ましくは異なるウイルス属に、より好ましくは異なるウイルス科に属する、請求項1または2に記載のキット。
【請求項４】
(a)前記第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元である前記ウイルスが、ポテックスウイルス、特にPVXウイルス(ジャガイモウイルスX)であり、かつ/または
(b)前記第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元である前記ウイルスが、トバモウイルス、特にTMVウイルス(タバコモザイクウイルス)である、
請求項1〜3のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５】
(a)前記第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターおよび/もしくは前記第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターが機能的異種ORFを含み、かつ/または
(b)該第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターおよび/もしくは該第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターが機能的異種ORFを含まない、請求項1〜4のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６】
(a)(i)少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが、少なくとも1種の機能的異種ORFを含み、かつ
(ii)該少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターが、前記第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターもしくは前記第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターと同じ植物ウイルスに由来し、かつ
(iii)該少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元である該ウイルスのコートタンパク質ORFが、該少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターにおいて完全に欠失している、
該少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター、
および/または
(b)(i)少なくとも1種の追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが、少なくとも1種の機能的異種ORFを含み、かつ
(ii)該少なくとも1種の追加のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターが、該第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターもしくは該第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターと同じ植物ウイルスに由来する、
該少なくとも1種の追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター
をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７】
(i)前記少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが、該少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元である前記ウイルスの機能的な移動タンパク質ORFを欠いており、好ましくは、該少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元である該ウイルスの機能的な移動タンパク質ORFが完全に欠失しており、
かつ/または
(ii)該第3のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元である該ウイルスが、ポテックスウイルス、特にPVXウイルス(ジャガイモウイルスX)であり、
かつ/または
(iii)該少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが、
(a)請求項1に記載の第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターもしくは第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの特徴を備え、かつ
(b)少なくとも1種の機能的異種ORFを含み、かつ
(c)該第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターもしくは該第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの一方もしくは両方が機能的異種ORFを含む場合には、それらのベクターの機能的異種ORFとは該少なくとも1種の機能的異種ORFが異なり、
好ましくは、該第3のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元である該ウイルスが、ポテックスウイルス、特にPVXウイルス(ジャガイモウイルスX)であり、かつ該第3のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターが、ポテックスウイルスの機能的な移動タンパク質ORFを欠いているか、
または
好ましくは、前記少なくとも1種の追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが、機能的異種ORFによって該第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターもしくは該第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターとは異なるか、
または
好ましくは、該少なくとも1種の追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが、
(a)該第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターもしくは該第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元である該ウイルスのコートタンパク質、移動タンパク質、およびRNA依存性RNAポリメラーゼを含み、かつ
(b)少なくとも1種の機能的異種ORFを含む、
請求項6に記載のキット。
【請求項８】
(a)2種もしくはそれ以上の異なる第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターおよび/もしくは追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが、異なる機能的異種ORFを含み、
かつ/または
(b)少なくとも1種の該第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターおよび/もしくは該追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが、1種の機能的異種ORFを含む、
請求項6または7に記載のキット。
【請求項９】
以下のベクター(a)〜(c)のうちの2種、3種、またはそれ以上の異なるベクターを含む混合物:
(a)請求項1〜8のいずれか一項で定義された少なくとも1種の第1のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター、
(b)請求項1〜8のいずれか一項で定義された少なくとも1種の第2のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター、
(c)請求項6〜8のいずれか一項で定義された少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターおよび/または追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター。
【請求項１０】
(a)(i)請求項1〜8のいずれか一項で定義された少なくとも1種の第1のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター、ならびに
(ii)請求項1〜8のいずれか一項で定義された少なくとも1種の第2のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター、ならびに
(iii)任意で、請求項6〜8のいずれか一項で定義された少なくとも1種の第3の追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターおよび/もしくは少なくとも1種の追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター
を含むか、
または
(b)(i)請求項6〜8のいずれか一項で定義された少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターおよび/もしくは追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター、ならびに
(ii)請求項1〜8のいずれか一項で定義された少なくとも1種の第1のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター、および/もしくは請求項1〜8のいずれか一項で定義された少なくとも1種の第2のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター
を含む、
請求項9に記載の混合物。
【請求項１１】
(a)請求項1〜8のいずれか一項で定義された少なくとも1種の第1のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターおよび少なくとも1種の第2のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター、ならびに任意で、請求項6〜8のいずれか一項で定義された少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターおよび/または追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターを含む、
植物または植物細胞。
【請求項１２】
複数の組織中の複数の植物細胞が、
(a)少なくとも1種の第1のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターおよび少なくとも1種の第2のプラスセンス一本鎖RNAベクター、ならびに任意で、少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターおよび/もしくは追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターを含み、
かつ/または
(b)請求項6〜8のいずれか一項で定義された少なくとも2種の異なる第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターもしくは追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターのORFにコードされる異種ポリペプチドを含む、
請求項11に記載の植物。
【請求項１３】
ヘテロオリゴマーポリペプチドおよび/または2種もしくはそれ以上のポリペプチドを植物または植物組織または植物細胞において作製するための方法であって、少なくとも1つの植物細胞に、
(i)請求項1〜8のいずれか一項で定義された少なくとも1種の第1のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター、ならびに
(ii)請求項1〜8のいずれか一項で定義された少なくとも1種の第2のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター、ならびに
(iii)任意で、請求項6〜8のいずれか一項で定義された少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターおよび/または追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター
を供給する段階を含み、
(a)該第1のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターおよび該第2のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが機能的異種ORFを含まない場合、少なくとも2種の第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが、少なくとも1つの植物細胞に供給され、
かつ
(b)(i)〜(iii)に記載のウイルスベクターのうちの少なくとも2種が、異なる異種ORFを含む、
方法。
【請求項１４】
(a)植物、植物組織、または植物細胞から前記ヘテロオリゴマーポリペプチドおよび/または2種もしくはそれ以上のポリペプチドを単離する段階が続き、かつ/あるいは
(b)該植物の全体的感染が達成され、かつ/あるいは
(c)該ヘテロオリゴマーポリペプチドが免疫グロブリン、特に抗体または抗体断片である、
請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
ヘテロオリゴマーポリペプチドおよび/または2種もしくはそれ以上のポリペプチドを植物または植物組織または植物細胞において作製するための方法であって、
植物または植物組織または植物細胞に、少なくとも2種のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターを供給する段階
を含み、
(a)該少なくとも2種のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが、同じウイルスに由来し、かつ
(b)少なくとも2種のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが、異なる機能的異種ORFを含み、かつ
(c)該少なくとも2種のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが、それらのベクターの由来元である該ウイルスの機能的コートタンパク質ORFを欠いており、かつ
(d)該少なくとも2種のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが、植物細胞において複製することができるRNAレプリコンを含む、
方法。
【請求項１６】
(a)アグロ感染によって、DNA、特にウイルスゲノムのcDNAを含むDNAを用いるトランスフェクションによって、RNA、特に該ウイルスゲノムに対応するRNAを用いるトランスフェクションによって、もしくはウイルス粒子による感染によって、前記少なくとも2種のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが供給され、かつ/または
(b)該少なくとも2種のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターの由来元である該ウイルスが、ポテックスウイルス、特にPVXウイルス(ジャガイモウイルスX)であり、かつ/または
(c)該少なくとも2種のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターの由来元である該ウイルスのコートタンパク質ORFが、該少なくとも2種のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターにおいて完全に欠失している、
請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
アグロバクテリウム(Agrobacterium)細胞、特にアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)細胞の混合物であって、
(a)複数のアグロバクテリウム細胞が、少なくとも1種の機能的異種ORFを含む少なくとも1種のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターを含み、
(i)該少なくとも1種のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが、機能的コートタンパク質ORFを欠いており、かつ
(ii)該少なくとも1種のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが、植物細胞において複製することができるRNAレプリコンを含み、
かつ、
(b)少なくとも2つのアグロバクテリウム細胞が、異なる機能的異種ORFを含む異なるプラスセンス一本鎖RNAベクターを含み、かつ
(c)異なる機能的異種ORFを含む異なる該プラスセンス一本鎖RNAベクターが、同じウイルスに由来しており、
好ましくは、
(i)該プラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターの由来元である該ウイルスが、ポテックスウイルス、特にPVXウイルス(ジャガイモウイルスX)であり、かつ/または
(ii)該プラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターの由来元である該ウイルスのコートタンパク質ORFが、該プラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターにおいて完全に欠失している、
混合物。
【請求項１８】
(a)PVXウイルスの機能的コートポリペプチドORFが完全に欠失しており、かつ
(b)PVXウイルスベクターが、植物細胞において複製することができるRNAレプリコンを含み、かつ
(c)該PVXウイルスベクターが、少なくとも1種の機能的異種ORFを任意で含み、かつ
(d)該PVXウイルスベクターが、異なるウイルスの機能的コートポリペプチドORFを任意で含む、
該PVXウイルスベクター。
【請求項１９】
ポリペプチド、特にヘテロオリゴマーポリペプチドを作製するための、請求項1〜8のいずれか一項に記載のキットの使用、または請求項9もしくは10に記載の混合物の使用、または請求項18に記載のPVXウイルスベクターの使用、または請求項11に記載の植物もしくは植物細胞の使用、または請求項12に記載の植物の使用、または請求項17に記載のアグロバクテリウム細胞の混合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターを含むキット、ならびにこれらのベクターの混合物およびそれらの使用、ならびに該キットおよび該ベクターを用いて植物または植物組織または植物細胞において2種またはそれ以上のポリペプチドを同時に作製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物におけるタンパク質の組換え作製に関して、ウイルスベクターの使用は、トランスジェニック植物の作製に代わる有望な方法である。ウイルスベクターは、効率的な複製により植物細胞中に高濃度でそれらのゲノムが存在するため、関心対象のタンパク質の高収量を可能にする。さらに、宿主植物のある特定の発達段階が完了し、また、より多量の生物量が使用可能となるまで、感染しその後に産生して待つことが可能である。しかしながら、同じ細胞における異なる組換えタンパク質の作製は、同じゲノムに由来する異なるウイルスベクターを用いる場合に問題となる。特に、これは、複数のポリペプチド鎖を含む複雑なタンパク質を作製すべき場合に問題である。2種の異なる外来タンパク質のコード配列を有する、1種のウイルス種に由来する2種のベクターが1つの植物に同時に接種される場合、それら2種のベクターは感染の過程で空間的に離れる。このジレンマを図1に示す。最初に感染させた細胞の領域においてのみ、両方のベクターが検出され得る数個の細胞を見出すことができる。全体にわたって感染した植物では、複数のベクターのうちの一方だけが存在するか、または、その一方のベクターもしくは他方のベクターのいずれかのみが存在する領域を見出すことができる。したがって、ウイルスベクターを用いて同じ植物細胞において異なるタンパク質を発現させることは、やはり難題である。さらに、多数の植物ウイルスが、機械的にまたは昆虫の助けを借りて伝達される。したがって、植物に全体にわたって感染する能力を有する全ウイルスゲノムが、自然環境中に放出され得る。
【０００３】
これらの問題を克服するための既存のアプローチは、タバコモザイクウイルス(TMV)およびジャガイモウイルスX(PVX)として非競合的ウイルスベクターを使用して、非常に速く高度な作製を目指すものである(US 2009/0111145 A1(特許文献1); EP 1 686 176 A1(特許文献2))(図2を参照されたい)。しかしながら、より複雑なタンパク質を作製するためには、さらに別の非競合的ウイルスベクターが必要になると考えられるが、これは感染した植物にとってさらなる負担となると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】US 2009/0111145 A1
【特許文献２】EP 1 686 176 A1
【発明の概要】
【０００５】
したがって、植物細胞において2種またはそれ以上のポリペプチドを同時に組換え作製することを可能にし、かつ同時にバイオセーフティ封じ込めを徹底する、使用可能なキットおよび方法を作製することが本発明の目的であった。
【０００６】
1つの態様において、
(a)第1のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター、および
(b)第2のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター
を含み、
(i)第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターおよび第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターが、異なる植物ウイルスに由来し、かつ
(ii)第1のベクターの由来元であるウイルスのコートタンパク質ORFが、第1のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターにおいて完全に欠失しており、かつ
(iii)第2のベクターの由来元であるウイルスのコートタンパク質ORFが、第2のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターにおいて完全に欠失しており、かつ
(iv)第1のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが、第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元であるウイルスの機能的コートタンパク質ORFを含み、かつ
(v)第2のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが、第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元であるウイルスの機能的コートタンパク質ORFを含み、かつ
(vi)第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターおよび第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターが、植物細胞において複製することができるRNAレプリコンを含む、
キットによって、本目的は解決される。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
驚くべきことに、実施例1に示すように、そのような第1のベクターおよび第2のベクターを含むキットによって、単細胞の全体的な共感染が可能になり、両方の遺伝子産物が存在することが判明した。
【０００８】
コートタンパク質ORFの完全欠失およびそれぞれの他のウイルスのコートタンパク質ORFの挿入の寄与により、全体的な共感染および共発現を可能にするキットが作製される。同時に、単一のベクターを自然環境中に放出した後に健常な植物が全体的に感染することは不可能であるため、封じ込め系が得られる。組み合わされた全体的感染のおかげで、すべての植物部分に個別に感染させる必要があるとは限らないため、感染に必要とされる装置に関する複雑性ははるかに低い。好ましくは、コートタンパク質は相互に交換される。すなわち、第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元であるウイルスのコートタンパク質ORFが、第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元であるウイルスの機能的コートタンパク質ORFで置換されており、逆もまた同様である。これによって全体的なウイルスゲノム構成が乱されることがなく、過剰な追加のゲノム量が生じることがないため、このような置換は好ましい。
【０００９】
したがって、キットの好ましい態様において、第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元であるウイルスのコートタンパク質ORFが、第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元であるウイルスの機能的コートタンパク質ORFで置換されている。
【００１０】
さらなる好ましい態様において、第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元であるウイルスのコートタンパク質ORFが、第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元であるウイルスの機能的コートタンパク質ORFで置換されている。
【００１１】
上記に説明したように、本発明のキットは、非競合的ウイルスベクターである。したがって、さらに別の好ましい態様において、第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターおよび第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元であるウイルスは、異なるウイルス型に、好ましくは異なるウイルス属に、より好ましくは異なるウイルス科に属する。
【００１２】
非競合的なTMVウイルスおよびPVXウイルスを用いることが特に好ましい。TMVウイルスおよびPVXウイルスに基づくそのようなキットは、実施例1において成功裡に使用された。
【００１３】
TMVゲノムは、少なくとも4種のタンパク質:126kDaおよび183kDaのレプリカーゼタンパク質、30kDaの細胞間移動タンパク質(MP)、ならびに17.5kDaのコートタンパク質(CP)をコードしている。MPおよびCPは、ゲノムRNAの3'末端と共通の末端を有する(co-terminal)サブゲノムRNAにコードされる(図2を参照されたい)。
【００１４】
PVXゲノムは、少なくとも5種のタンパク質:RNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)、トリプルジーンブロック(triple gene block)タンパク質1〜3(TGBp25、TGBp12、TGBp8)、および25kDaのコートタンパク質(CP)。TGBタンパク質およびCPは、ゲノムRNAの3'末端と共通の末端を有するサブゲノムRNAにコードされる(図2を参照されたい)。
【００１５】
ポテックスウイルスおよびトバモウイルスは、プラスセンス一本鎖ゲノムを有する植物RNAウイルスである。それらのゲノムは、1つの部分からなる(monopartite)。
【００１６】
したがって、本発明の前記ウイルスベクターは、前記RNAレプリコンであるかもしくは前記RNAレプリコンを含むRNAであってよく、または前記RNAレプリコンをコードするDNAであってよい。
【００１７】
RNAレプリコンは、本発明のキットのウイルスベクターのエレメントを構成する。典型的には、さらに別の遺伝子エレメントが、複製および発現のために前記レプリコン上に存在する。RNAレプリコンであるために、すなわち、植物細胞において自律複製するために、前記RNAレプリコンは、RdRpまたはその機能的誘導体をコードする。
【００１８】
好ましくは、前記RNAレプリコンは、前記RdRpに結合するため、および前記RNAレプリコンを複製するために、前記RNAレプリコンの5'非翻訳領域または3'非翻訳領域中に、ウイルスの、特にトバモウイルスまたはポテックスウイルスの5'非翻訳領域または3'非翻訳領域およびプロモーター配列をさらに有する。
【００１９】
前記RNAレプリコンは、CP(coat protein)、MP(movement protein)、もしくはTGB(triple gene block protein)の発現のため、または適用可能な場合、機能的異種ORFタンパク質の発現のためのサブゲノムRNAを発生させるためにサブゲノムプロモーターをさらに有していてもよい。
【００２０】
前記ウイルスベクターがDNAである場合、典型的にはそれは、植物におけるインビトロまたはインビボでの前記RNAレプリコンの転写による感染性RNA生成を可能にするためのプロモーターを有すると考えられる。植物におけるDNAからの前記RNAレプリコンの転写を可能にするプロモーターの例は、植物バイオテクノロジーにおいて広く使用されているカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターである。
【００２１】
ウイルスベクター中で使用されるRdRpは、天然のRdRpに対して少なくとも50％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも80％、および最も好ましくは少なくとも90％の配列同一性を有するタンパク質をその配列がコードする場合、ウイルスRdRpの機能的変種とみなされてよい。
【００２２】
本発明のウイルスベクターを操作するのに使用され得るプラスセンス一本鎖RNAウイルスの一覧表が、下記に提供される。
科:ブロモウイルス科(Bromoviridae)、
属:アルファモウイルス、基準種:アルファルファモザイクウイルス、
属:イラルウイルス、基準種:タバコ条斑病ウイルス、
属:ブロモウイルス、基準種:ブロムモザイクウイルス、
属:ククモウイルス、基準種:キュウリモザイクウイルス。
科:クロステロウイルス科(Closteroviridae)、
属:クロステロウイルス、基準種:ビート萎黄ウイルス、
属:クリニウイルス、基準種:レタス伝染性黄斑ウイルス。
科:コモウイルス科(Comoviridae)、
属:コモウイルス、基準種:ササゲモザイクウイルス、
属:ファバウイルス、基準種:ソラマメウイルトウイルス1、
属:ネポウイルス、基準種:タバコリングスポットウイルス。
科:ポティウイルス科(Potyviridae)、
属:ポティウイルス、基準種:ジャガイモウイルスY、プラムポックスウイルス;タバコエッチウイルス;クローバー葉脈黄化ウイルス;タバコ葉脈斑紋ウイルス(tobacco vein mottling virus)、
属:リモウイルス、基準種:ライグラスモザイクウイルス、
属:ビモウイルス、基準種:オオムギ縞萎縮ウイルス。
科:セキウイルス科(Sequiviridae)、
属:セキウイルス、基準種:パースニップ黄斑ウイルス、
属:ワイカウイルス、基準種:イネツングロスフェリカルウイルス。
科:トンブスウイルス科(Tombusviridae)、
属:カルモウイルス、基準種:カーネーション斑紋ウイルス、
属:ダイアンソウイルス、基準種:カーネーションリングスポットウイルス、
属:マクロモウイルス、基準種:メイズクロロティックモットルウイルス、
属:ネクロウイルス、基準種:タバコ壊死ウイルス、
属:トンブスウイルス、基準種:トマトブッシースタントウイルス。
割り当てられていない属のssRNAウイルス:
属:カピロウイルス、基準種:リンゴステムグルービングウイルス、
属:カルラウイルス、基準種:カーネーション潜在ウイルス、
属:エナモウイルス、基準種:ピーエネーションモザイクウイルス、
属:フロウイルス、基準種:土壌伝染性コムギモザイクウイルス、
属:ホルデイウイルス、基準種:オオムギ斑葉モザイクウイルス、
属:イダエオウイルス、基準種:ラズベリブッシィドワーフウイルス、
属:ルテオウイルス、基準種:オオムギ黄化萎縮ウイルス、
属:マラフィウイルス、基準種:メイズラヤドフィノウイルス、
属:ポテックスウイルス、基準種;ジャガイモウイルスX、
属:ソベモウイルス、基準種;インゲンマメ南部モザイクウイルス、
属:テヌイウイルス、基準種;イネしま葉枯ウイルス、
属:トバモウイルス、基準種:タバコモザイクウイルス、
属:トブラウイルス、基準種:タバコ茎壊疽ウイルス、
属:トリコウイルス、基準種:リンゴクロロティックリーフスポットウイルス、
属:ティモウイルス、基準種:カブ黄斑モザイクウイルス、
属:ウムブラウイルス、基準種:ニンジンモットルウイルス。
【００２３】
したがって、さらに別の好ましい態様において、第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元であるウイルスは、ポテックスウイルス、特にPVXウイルス(ジャガイモウイルスX)である。
【００２４】
さらに別の好ましい態様において、第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元であるウイルスは、トバモウイルス、特にTMVウイルス(タバコモザイクウイルス)である。
【００２５】
実施例1において、第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターおよび第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターは、異種ORFを含む。したがって、そのような第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターおよび第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターを用いて植物細胞において2種の異なる異種タンパク質を作製することが可能である(図3を参照されたい)。実施例1で使用される好ましいベクターの構造は、PVX-CP(TMV)-ORFおよびTMV-CP(PVX)-ORFである。
【００２６】
しかしながら、これらのベクターがこのような異種ORFを含むことは必要とされない。もっと正確に言えば、1つの好ましい態様において、プラスセンス一本鎖ウイルスベクターは、単に補完的ベクターとして使用され得る。このような態様においては、これらのベクターのいずれかまたは両方が、異種ORFを含まない。好ましいウイルスベクターの組合せは、次の構造を有するベクターの組合せである:(a)PVX-CP(TMV)およびTMV-CP(PVX);(b)PVX-CP(TMV)-ORFおよびTMV-CP(PVX);(c)PVX-CP(TMV)およびTMV-CP(PVX)-ORF、ならびにPVX-CP(TMV)-ORFおよびTMV-CP(PVX)-ORF(図3に示す)。
【００２７】
したがって、本発明の別の好ましい態様において、第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターおよび/または第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターは、機能的異種ORFを含む。ORFは同じでも異なってもよく、好ましくは異なっている。このような態様において、これらのベクターは補完的ベクターとして使用され、さらに、関心対象の異種ORFを発現させるために使用される。
【００２８】
植物または植物組織においてウイルスベクターから発現可能となるためには、機能的異種ORFを含む前記ウイルスベクターは、1つまたは複数のサブゲノムプロモーターならびに発現に必要とされる他の配列、例えば、リボソーム結合部位および/または配列内リボソーム進入部位(IRES)を含む。
【００２９】
したがって、本発明の別の好ましい態様において、第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターおよび/または第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターは、機能的異種ORFを含まない。この態様において、キットは補完的ウイルスベクターキットとして使用され、後述するような、コートタンパク質を含まない機能的異種ORFを含む別のウイルスベクターを追加するのに使用され得る。
【００３０】
驚くべきことに、実施例1で説明するように、補完的ベクターのペアPVX-CP(TMV)-ORFおよびTMV-CP(PVX)-ORFならびにコートタンパク質欠損ベクターPVX-ΔCP-ORFを用いることにより、すべてのORFの発現を実現できることが見出された。したがって、驚くべきことに、補完的ベクターおよび異種ORFを有しコートタンパク質が完全に欠失している1つまたは複数の別のベクターに基づいて、同じ植物細胞において別の異種ORFを発現させ得ることが見出された。完全欠失が原因で、ウイルスのゲノム量はかなり少なくなっており、これら別のベクターのコートタンパク質欠損は、さらなる封じ込めを含む(図3および4)。
【００３１】
「PVX-CP(TMV)-ORF」は、天然のコートタンパク質がTMVのコートタンパク質で置換されており、機能的異種ORFを含む、PVXをベースとするウイルスベクターとして理解されている。
【００３２】
「TMV-CP(PVX)-ORF」は、天然のコートタンパク質がPVXのコートタンパク質で置換されており、機能的異種ORFを含む、TMVをベースとするウイルスベクターとして理解されている。
【００３３】
「PVX-ΔCP-ORF」は、天然のコートタンパク質ORFが完全に欠失しており、機能的異種ORFを含む、PVXをベースとするウイルスベクターとして理解されている(図4も参照されたい)。
【００３４】
「PVX-ΔCP-ΔMP-ORF」は、天然のコートタンパク質ORFが完全に欠失しており、機能的な移動タンパク質を欠いており、かつ機能的異種ORFを含む、PVXをベースとするウイルスベクターとして理解されている(図5も参照されたい)。好ましい態様において、移動タンパク質は完全に欠失している。
【００３５】
「PVX-ORF」は、機能的異種ORFを含む、PVXをベースとするウイルスベクターとして理解されている。
【００３６】
「TMV-ORF」は、機能的異種ORFを含む、TMVをベースとするウイルスベクターとして理解されている。
【００３７】
「機能的異種ORF」は、各未改変ウイルスには存在せず、発現されて機能的な遺伝子産物を生じ得るオープンリーディングフレーム(ORF)として理解されている。このような遺伝子産物は、RNAまたはタンパク質であり得、好ましくはタンパク質である。好ましくは、機能的異種ORFは、使用されるすべてのウイルスベクターに対して異種である。典型的には、機能的異種ORFは、適切なサブゲノムプロモーターまたはリボソーム結合部位もしくはIRESの制御下にある。
【００３８】
したがって、1つの特に好ましい態様において、このさらなるウイルスベクターは、以下の特徴を有する第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターである。
【００３９】
特に好ましい態様において、キットは、
(a)(i)少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターが、少なくとも1種の機能的異種ORFを含み、かつ
(ii)少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターが、第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターもしくは第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターと同じ植物ウイルスに由来し、かつ
(iii)少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターの由来元であるウイルスのコートタンパク質ORFが、少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターにおいて完全に欠失している、
少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター、および/または
(b)(i)少なくとも1種の追加のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターが、少なくとも1種の機能的異種ORFを含み、かつ
(ii)少なくとも1種の追加のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターが、第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターもしくは第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターと同じ植物ウイルスに由来する、
少なくとも1種の追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター
をさらに含む。
【００４０】
さらに、第3のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの移動タンパク質をさらに欠失させ、それによってウイルスのゲノムサイズをさらに小さくすることが可能である。
【００４１】
したがって、特に好ましい態様において、少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターは、少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元であるウイルスの機能的な移動タンパク質ORFを欠いており、好ましくは、少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元であるウイルスの機能的な移動タンパク質ORFが完全に欠失している(図4も参照されたい)。
【００４２】
したがって、好ましい態様において、第3のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元であるウイルスは、ポテックスウイルス、特にPVXウイルス(ジャガイモウイルスX)であり、かつ第3のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターは、ポテックスウイルスの機能的な移動タンパク質ORFを欠いている。
【００４３】
実施例１に示すように、PVX-ΔCP-ORFを第3のウイルスベクターとして用いて、補完が実現された。このようなベクターは、本発明によるキットのために好ましいベクターである。
【００４４】
さらなる態様において、PVXの移動タンパク質が欠失していてよい。このようなベクターの構造は、PVX-ΔCP-ΔTGB-ORFである。
【００４５】
このような欠失の作製は、実施例1において説明される。
【００４６】
したがって、特に好ましい態様において、第3のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元であるウイルスは、ポテックスウイルス、特にPVXウイルス(ジャガイモウイルスX)である。PVX-ΔCP-ΔTGB-ORFおよび/またはPVX-ΔCP-ORFの構造を有するベクターが、さらにより好ましい。
【００４７】
したがって、本発明の特に好ましい態様において、第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元であるウイルスは、ポテックスウイルス、特にPVXウイルス(ジャガイモウイルスX)であり、かつ第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元であるウイルスは、トバモウイルス、特にTMVウイルス(タバコモザイクウイルス)であり、かつ第3のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元であるウイルスは、ポテックスウイルス、特にPVXウイルス(ジャガイモウイルスX)である。
【００４８】
さらにより好ましい態様において、キットは、
(A)(i)PVX-CP(TMV)およびTMV-CP(PVX)の構造を有するベクター;または
(ii)PVX-CP(TMV)-ORFおよびTMV-CP(PVX)の構造を有するベクター;または
(iii)PVX-CP(TMV)およびTMV-CP(PVX)-ORFの構造を有するベクター;または
(iv)PVX-CP(TMV)-ORFおよびTMV-CP(PVX-ORF)の構造を有するベクター、ならびに
(B)PVX-ΔCP-ΔTGB-ORFまたはPVX-ΔCP-ORFの構造を有するベクター
を含むかまたは包含する。
【００４９】
実施例１において、補完的ベクターもまた異種ORFを含む。しかしながら、補完的ベクターのウイルスベクターサイズを小さくするために、少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターだけが異種ORFを含むこともまた、可能である。また、過剰なウイルスゲノムサイズを小さくするために、1種のウイルスベクターがただ1種の異種ORFを含むことが好ましい。
【００５０】
さらに別の好ましい態様において、少なくとも1種の追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターは、前述の第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターまたは第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの特徴を備え、かつ第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターまたは第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの一方または両方が機能的異種ORFを含む場合にはそれらの機能的異種ORFとは異なる、少なくとも1種の機能的異種ORFを含む。
【００５１】
このような追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターは、第1のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターまたは第2のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターにおいて機能的異種ORFを置換(機能的異種ORFが存在する場合)または導入(機能的異種ORFが存在しない場合)することによって、得ることができる。
【００５２】
したがって、好ましい態様において、好ましくは少なくとも1種の追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターは、機能的異種ORFによって第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターまたは第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターとは異なる。
【００５３】
さらに別の好ましい態様において、少なくとも1種の追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターは、第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターまたは第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元である同じウイルスに由来し、少なくとも1種の機能的異種ORFを含む。特に好ましい態様において、そのような追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターを得るために、野生型(wt)ウイルスベクターが、少なくとも1種の機能的異種ORFを導入するために使用され得る。別の特に好ましい態様において、少なくとも1種の追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターは、第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターまたは第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターの由来元であるウイルスのコートタンパク質、移動タンパク質、およびRNA依存性RNAポリメラーゼ、ならびに少なくとも1種の機能的異種ORFを含む。このような少なくとも1種の機能的異種ORFは、第1のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターまたは第2のプラスセンス一本鎖ウイルスベクターと(それらがこのような機能的異種ORFを含む場合)同じまたは異なる機能的異種ORFであってよく、好ましくは異なる。
【００５４】
したがって、好ましくは、2種またはそれ以上の異なる第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターおよび/または追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターは、異なる機能的異種ORFを含む。
【００５５】
さらなる好ましい態様において、少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターおよび/または追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターは、1種の機能的異種ORFを含む。
【００５６】
前記ウイルスベクターは、例えば、そのようなウイルス、特にトバモウイルスまたはポテックスウイルスに由来する遺伝子構成要素を用いることにより、天然のプラスセンス一本鎖ウイルスに基づいて構築され得る。本発明のまたは本発明のキットの前記ウイルスベクターは、ウイルスをコードするウイルスベクター中に前記異種ORF配列を挿入することにより、かつ前述したようにCPをコードする配列を置換することにより、得られ得る。しかしながら、天然ウイルスの様々な遺伝子構成要素に、例えば、ポテックスウイルスのRdRp遺伝子、またはポテックスウイルスの5'もしくは3'非翻訳領域に、様々な改変が加えられ得る。
【００５７】
そのようなウイルスベクターの混合物を得るために、本発明のキットのウイルスベクターは混合されてよい。このような混合物は、例えば、乾燥固形物もしくは凍結乾燥固形物などの固形形態で、または液体で、例えば、水溶液、懸濁液、もしくは分散系として、またはゲルとして存在する。このような混合物が、植物、植物細胞、または植物組織に感染させるのに使用され得る。
【００５８】
したがって、本発明はまた、以下のベクター(a)〜(c)のうちの2種、3種、またはそれ以上の異なるベクターを含む混合物にも関する:
(a)上記に定義された少なくとも1種の第1のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター、
(b)上記に定義された少なくとも1種の第2のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター、
(c)上記に定義された少なくとも1種の追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターおよび/または第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター。
【００５９】
実施例１において、PVX-ΔCP-ORF、PVX-CP(TMV)-ORF、およびTMV-CP(PVX)-ORFの混合物が、感染のために成功裡に使用された。
【００６０】
好ましい態様において、混合物は、
(i)上記に定義された少なくとも1種の第1のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター、ならびに
(ii)上記に定義された少なくとも1種の第2のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター、ならびに
(iii)任意で、上記に定義された少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターおよび/または追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター
を含む。
【００６１】
さらなる好ましい態様において、混合物は、
(i)上記に定義された少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターおよび/または追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター、ならびに
(ii)上記に定義された少なくとも1種の第1のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター、および/または上記に定義された少なくとも1種の第2のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター
を含む。
【００６２】
本発明のキットおよび混合物は、植物または植物細胞に前述のベクターを成功裡に感染させるのに使用され得る。
【００６３】
したがって、本発明はまた、上記に定義された少なくとも1種の第1のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターおよび少なくとも1種の第2のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター、ならびに任意で、上記に定義された少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターおよび/または追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターを含む、植物または植物細胞にも関する。
【００６４】
初めて、植物RNAウイルスベクターを用いて複数の組織中の複数の植物細胞において、これらベクターの異なる異種ORFを全体的に同時に共発現させることが今や可能である。
【００６５】
したがって、好ましくは、複数の組織中の複数の植物細胞は、上記に定義されたような、少なくとも1種の第1のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターおよび少なくとも1種の第2のプラスセンス一本鎖RNAベクター、ならびに任意で、少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターおよび/または追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターを含む。
【００６６】
したがって、別の好ましい態様において、複数の組織中の複数の植物細胞は、本明細書において定義された少なくとも2種の異なる第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターおよび/または追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターのORFにコードされる異種ポリペプチドを含む。
【００６７】
本発明のキットおよび混合物は、異種タンパク質の発現のために使用され得る。特に、キットによって、商業的用途のために、ウイルスベクターを用いて全体的に感染させた植物においてヘテロオリゴマータンパク質を封じ込め(contained)作製することが初めて可能になる。
【００６８】
したがって、1つの態様において、本発明は、ヘテロオリゴマーポリペプチドおよび/または2種もしくはそれ以上のポリペプチドを植物または植物組織または植物細胞において作製するための方法であって、少なくとも1つの植物細胞に、
(i)本明細書において定義された少なくとも1種の第1のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター、ならびに
(ii)本明細書において定義された少なくとも1種の第2のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター、ならびに
(iii)任意で、本明細書において定義された少なくとも1種の第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターおよび/または追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクター
を供給する段階を含み、
(a)第1のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターおよび第2のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが機能的異種ORFを含まない場合、少なくとも2種の第3のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターおよび/または追加のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが、少なくとも1つの植物細胞に供給され、かつ
(b)(i)〜(iii)に記載のウイルスベクターのうちの少なくとも2種が、異なる異種ORFを含む、
方法に関する。
【００６９】
特に好ましい態様において、この方法の後に、ヘテロオリゴマーポリペプチドおよび/または2種もしくはそれ以上のポリペプチドを植物、植物組織、または植物細胞から単離する段階が続く。
【００７０】
植物または植物細胞からタンパク質を単離するための方法は、当技術分野において公知である。1つの方法において、関心対象のタンパク質は、WO03/020938において説明されているようにして植物アポプラストから単離され得る。
【００７１】
驚くべきことに、すべてのベクターによる全体的感染が、キットのベクターを用いて達成され得る。したがって、好ましい態様において、植物の全体的感染が達成される。
【００７２】
この方法は、1つの細胞において作製されるべきであり、かつそのような細胞において組立てられて機能的タンパク質を生じるべきであるヘテロオリゴマータンパク質を作製するのに特に有用である。このようなヘテロオリゴマータンパク質の例は、免疫グロブリン、特に抗体もしくは抗体断片、またはIL-12のようなある種のインターロイキンである。
【００７３】
植物細胞へのウイルスベクターのアグロバクテリウム(Agrobacterium)を媒介した送達が、ウイルスベクターの供給のために使用され得る。また、植物の安定な形質転換のために通常使用される他の様々な方法、例えば、微粒子銃、エレクトロポレーション、またはPEGを媒介としたプロトプラストの形質転換を用いた、細胞中への核酸配列の直接的導入も、植物細胞へのウイルスベクターの供給のために使用され得る。アグロバクテリウムを媒介とした植物形質転換が好ましい。したがって、様々な技術によって、例えば、アグロバクテリウムが保有するTiプラスミドベクター(US5,591,616;US4,940,838;US5,464,763)、粒子銃または微粒子銃(US5,100,792;EP00444882 B1;EP 00434616 B1)によって、異種ヌクレオチド配列が植物細胞中にトランスフォームされ得る。原理的には、他の植物形質転換方法、例えば、マイクロインジェクション(WO 09/209696;WO 09/400583A1;EP 175966 B1)、エレクトロポレーション(EP00564595 B1;EP00290395 B1;WO 08/706614 A1)などもまた、使用され得る。とりわけて、形質転換方法の選択は、形質転換されるべき植物の種に左右される。例えば、微粒子銃が単子葉植物の形質転換のために好ましい場合があり、一方、双子葉植物の場合は、通常、アグロバクテリウムを媒介とした形質転換が、より優れた結果をもたらす。
【００７４】
本発明は好ましくは、多細胞性の高等植物を用いて実施される。本発明で使用するのに好ましい植物には、任意の植物種が含まれ、農学的および園芸学的に重要な種が好ましい。本発明において使用するための一般的な作物植物には、アルファルファ、オオムギ、マメ、キャノーラ、ササゲ、ワタ、トウモロコシ、クローバー、ハス、レンズマメ、ハウチワマメ、キビ、オートムギ、エンドウマメ、ピーナッツ、コメ、ライムギ、シナガワハギ、ヒマワリ、スイートピー、ダイズ、モロコシ ライコムギ、クズイモ、ハッショウマメ、カラスノエンドウ、コムギ、フジ、およびナッツ植物が含まれる。本発明を実施するのに好ましい植物種は、イネ科(Graminae)、キク科(Compositae)、ナス科(Solanacea)、およびバラ科(Rosaceae)の代表種が含まれるが、それらに限定されるわけではない。さらに、上記に特定したものに加えて、本発明において使用するのに好ましい種は、次の属に由来する植物である:シロイヌナズナ属(Arabidopsis)、コヌカグサ属(Agrostis)、ネギ属(Allium)、キンギョソウ属(Antirrhinum)、オランダミツバ属(Apium)、ラッカセイ属(Arachis)、アスパラガス属(Asparagus)、ベラドンナ属(Atropa)、カラスムギ属(Avena)、ホウライチク属(Bambusa)、アブラナ属(Brassica)、スズメノチャヒキ属(Bromus)、ルリマガリバナ属(Browaalia)、ツバキ属(Camellia)、アサ属(Cannabis)、トウガラシ属(Capsicum)、ヒヨコマメ属(Cicer)、アカザ属(Chenopodium)、キクニガナ属(Chichorium)、ミカン属(Citrus)、コーヒー属(Coffea)、ジュズダマ属(Coix)、キュウリ属(Cucumis)、カボチャ属(Curcubita)、ギョウギシバ属(Cynodon)、カモガヤ属(Dactylis)、チョウセンアサガオ属(Datura)、ダウクス属(Daucus)、ジギタリス属(Digitalis)、ヤマノイモ属(Dioscorea)、アブラヤシ属(Elaeis)、オヒシバ属(Eleusine)、ウシノケグサ属(Festuca)、オランダイチゴ属(Fragaria)、フクロソウ属(Geranium)、ダイズ属(Glycine)、ヒマワリ属(Helianthus)、ヘテロカリス属(Heterocallis)、パラゴムノキ属(Hevea)、オオムギ属(Hordeum)、ヒヨス属(Hyoscyamus)、イポメア属(Ipomoea)、アキノノゲシ属(Lactuca)、ヒラマメ属(Lens)、ユリ属(Lilium)、アマ属(Linum)、ドクムギ属(Lolium)、ミヤコグサ属(Lotus)、トマト属(Lycopersicon)、マヨラナ属(Majorana)、リンゴ属(Malus)、マンゴー属(Mangifera)、キャッサバ属(Manihot)、ウマゴヤシ属(Medicago)、ネメシア属(Nemesia)、タバコ属(Nicotiana)、オノブリキス属(Onobrychis)、イネ属(Oryza)、キビ属(Panicum)、ペラルゴニウム属(Pelargonium)、チカラシバ属(Pennisetum)、ペチュニア属(Petunia)、エンドウ属(Pisum)、インゲンマメ属(Phaseolus)、アワガエリ属(Phleum)、イチゴツナギ属(Poa)、サクラ属(Prunus)、キンポウゲ属(Ranunculus)、ダイコン属(Raphanus)、スグリ属(Ribes)、トウゴマ属(Ricinus)、キイチゴ属(Rubus)、サトウキビ属(Saccharum)、サルメンバナ属(Salpiglossis)、ライムギ属(Secale)、キオン属(Senecio)、セタリア属(Setaria)、シナピス属(Sinapis)、ナス属(Solanum)、モロコシ属(Sorghum)、イヌシバ属(Stenotaphrum)、テオブロマ属(Theobroma)、シャジクソウ属(Trifolium)、トリゴネラ属(Trigonella)、コムギ属(Triticum)、ソラマメ属(Vicia)、ササゲ属(Vigna)、ブドウ属(Vitis)、トウモロコシ属(Zea)、およびオリレア連(Olyreae)の植物、ファロイデ亜科(Pharoideae)の植物、ならびに他の多くの植物。
【００７５】
好ましい植物は、ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)およびニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)のようなタバコ属の種である。タバコ属の種以外の好ましい植物種は、ペチュニア(Petunia hybrida)、ブラシカ・カンペストリス(Brassica campestris)、カラシナ(B. juncea)、クレソン、キバナスズシロ、カラシ、イチゴ、ホウレンソウ、ケノポディウム・カピターツム(Chenopodium capitatum)、アルファルファ、レタス、ヒマワリ、ジャガイモ、およびキュウリである。
【００７６】
好ましいポテックスウイルスは、PVX、タケモザイクウイルス、パパイヤモザイクウイルス、アルテルナンテラモザイクウイルス、クローバー黄斑モザイクウイルス、オオバコウイルスX、シロツメクサモザイクウイルス、およびジャガイモ黄斑モザイクウイルス、特にジャガイモウイルスX(PVX)である。
【００７７】
本発明の主要な用途は、植物、植物葉、もしくは植物組織、または細胞培養における関心対象のタンパク質の作製である。本発明の方法が植物において実施される場合、ヒトまたは動物の食物連鎖に入らない、タバコ属の種のような植物が好ましい。ヒトまたは動物の食物連鎖に入らない植物は、露地で栽培され、前記ウイルスベクターの感染後、一定期間内に収穫されることができる。好ましくは、植物全体または植物の一部分は、所望のレベルの発現を実現するのに必要なインキュベーション期間の間、封じ込められた環境、例えば、温室または設計された栽培室(designed chamber)に閉じ込められるべきである。
【００７８】
さらなる態様において、本発明は、
(a)PVXウイルスの機能的コートポリペプチドORFが完全に欠失しており、かつ
(b)PVXウイルスベクターが、植物細胞において複製することができるRNAレプリコンを含み、かつ
(c)PVXウイルスベクターが、少なくとも1種の機能的異種ORFを任意で含み、かつ
(d)PVXウイルスベクターが、異なるウイルスの機能的コートポリペプチドORFを任意で含む、
PVXウイルスベクターに関する。
【００７９】
驚くべきことに、PVXコートタンパク質の完全な欠失により、上首尾の共感染が可能になることが判明した。最新技術では、コートタンパク質の欠失の結果、コートタンパク質の3'末端が依然として存在しているベクターが得られた。このようなベクターは、Komarova et al. (2006, Biochemistry (Mosc); 71: 846-850)およびTyulkina et al. (2011, Acta naturae; 3: 73-82)において説明されている。しかしながら、ORFのこのような部分的欠失は、共感染を達成するには不十分である。したがって、本発明の新規なPVXベクターは、特に、上記の本発明のキットの補完的ベクターとの共感染に驚くほど有用である。
【００８０】
本発明の別の態様において、自然環境の汚染の危険を伴わずに植物を感染させるためにコートタンパク質欠損ウイルスベクターを用いることもまた可能である。この態様において、天然のコートタンパク質を欠いている同じバックボーンを有する少なくとも2種のウイルスベクターが使用される。コートタンパク質の欠損が原因で、全体的感染および/または自然環境の汚染が不可能である。2種またはそれ以上の異なる異種ORFの発現のために同じバックボーンを使用することにより、ベクターを簡単に構築することが可能になる。さらに、コートタンパク質の欠失により、ウイルスのゲノムサイズを過度に増加させることなく異種ORFを導入することが可能になる。さらに、これらのベクターは植物細胞内で複製することができるため、A.ツメファシエンス(A.tumefaciens)細胞を用いた単純な一過性発現と比べて多いタンパク質発現収量が達成され得る(実施例2)。
【００８１】
したがって、別の態様において、本発明は、ヘテロオリゴマーポリペプチドおよび/または2種もしくはそれ以上のポリペプチドを植物または植物組織または植物細胞において作製するための方法であって、少なくとも2種のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターを植物または植物組織または植物細胞に供給する段階を含み、
(a)少なくとも2種のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが、同じウイルスに由来し、かつ
(b)少なくとも2種のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが、異なる機能的異種ORFを含み、かつ
(c)少なくとも2種のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが、それらベクターの由来元であるウイルスの機能的コートタンパク質ORFを欠いており、かつ
(d)少なくとも2種のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが、植物細胞において複製することができるRNAレプリコンを含む、
方法に関する。
【００８２】
特に好ましい態様において、コートタンパク質は完全に欠失している。したがって、好ましい態様において、少なくとも2種のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターの由来元であるウイルスのコートタンパク質ORFは、それら少なくとも2種のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターにおいて完全に欠失している。
【００８３】
さらなる好ましい態様において、少なくとも2種のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターの由来元であるウイルスは、ポテックスウイルス、特にPVXウイルス(ジャガイモウイルスX)である。
【００８４】
さらにより好ましい態様において、少なくとも2種のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターの由来元であるウイルスのコートタンパク質ORFは、それら少なくとも2種のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターにおいて完全に欠失しており、それら少なくとも2種のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターの由来元であるウイルスはポテックスウイルス、特にPVXウイルス(ジャガイモウイルスX)である。
【００８５】
植物または植物組織または植物細胞にベクターを供給するための様々な方法が公知である。特に、アグロ感染によって、DNA、特にウイルスゲノムのcDNAを含むDNAを用いるトランスフェクションによって、RNA、特にウイルスゲノムに対応するRNAのトランスフェクションによって、それらは供給され得る。このような方法は、例えば、Fischer, R., et al. (2004; Plant-based production of biopharmaceuticals. Curr Opin Plant Biol 7, 152-158); Komarova, T.V. et al. (2010; Transient expression systems for plant-derived biopharmaceuticals. Expert Rev Vaccines 9, 859-876)およびLico, C. et al. (2012; The use of plants for the production of therapeutic human peptides. Plant Cell Rep 31, 439-451)において説明されている。
【００８６】
あるいは、ウイルスゲノムのクローン化されたcDNAが、インビトロでRNAを転写するのに使用され得、次いでこのRNAが感染のために使用される。
【００８７】
あるいは、ウイルスゲノムのクローン化されたcDNAは、ゲノムの転写を可能にする、プラスミドまたはDNA断片などの適切なベクター構築物中にクローニングされてもよい。特に、このような構築物は、適切なプロモーター配列およびターミネーター配列を含む。
【００８８】
アグロ感染の場合、ウイルスゲノムのcDNAがT-DNA中に導入され、次いでT-DNAが植物に供給される。やはり、このようなT-DNAは、ゲノムの転写を可能にするさらなる調節性DNA構成要素を含む。特に、このようなT-DNA構築物は、適切なプロモーター配列およびターミネーター配列を含む。
【００８９】
異なる機能的異種ORFを含む各自のウイルスベクターを含む異なるアグロバクテリウム細胞培養物が混合されてよく、感染のために植物に与えられてよい。
【００９０】
したがって、1つの態様において、本発明は、アグロバクテリウム細胞、特にアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)細胞の混合物であって、
(a)複数のアグロバクテリウム細胞が、少なくとも1種の機能的異種ORFを含む少なくとも1種のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターを含み、
(i)少なくとも1種のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが、機能的コートタンパク質ORFを欠いており、かつ
(ii)少なくとも1種のプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターが、植物細胞において複製することができるRNAレプリコンを含み、
かつ
(b)少なくとも2つのアグロバクテリウム細胞が、異なる機能的異種ORFを含む異なるプラスセンス一本鎖RNAベクターを含み、かつ
(c)異なる機能的異種ORFを含む異なるプラスセンス一本鎖RNAベクターが、同じウイルスに由来している、
混合物に関する。
【００９１】
本発明の好ましい態様において、少なくとも2個、3個、4個、5個、またはそれ以上のアグロバクテリウム細胞は、2個、3個、4個、5個、またはそれ以上、2個、3個、4個、5個、またはそれ以上を含み、さらにより好ましくは、混合物中の2個のアグロバクテリウム細胞は、異なるプラスセンス一本鎖RNAベクターを含む。さらにより好ましくは、混合物中の2個のアグロバクテリウム細胞は、1種のプラスセンス一本鎖RNAベクターをそれぞれ含む。
【００９２】
さらなる好ましい態様において、プラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターの由来元であるウイルスは、ポテックスウイルス、特にPVXウイルス(ジャガイモウイルスX)である。
【００９３】
さらなる好ましい態様において、プラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターの由来元であるウイルスのコートタンパク質ORFは、それらのプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターにおいて完全に欠失している。
【００９４】
本発明のさらに別の好ましい態様において、プラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターの由来元であるウイルスは、ポテックスウイルス、特にPVXウイルス(ジャガイモウイルスX)であり、かつプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターの由来元であるウイルスのコートタンパク質ORFは、それらのプラスセンス一本鎖RNAウイルスベクターにおいて完全に欠失している。
【００９５】
本発明を用いて、センスまたはアンチセンスの向きに発現させることができる関心対象のタンパク質またはその断片には、次のものが含まれる:デンプン修飾酵素(デンプン合成酵素、デンプンリン酸化酵素、脱分枝酵素、デンプン分枝酵素、デンプン分枝酵素II、顆粒結合デンプン合成酵素)、ショ糖リン酸合成酵素、スクロースホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ポリフルクタンスクラーゼ、ADPグルコースピロホスホリラーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、フルクトシルトランスフェラーゼ、グリコーゲン合成酵素、ペクチンエステラーゼ、アプロチニン、アビジン、細菌レバンスクラーゼ、大腸菌(E. coli)glgAタンパク質、MAPK4およびオルソログ、窒素同化/代謝酵素、グルタミン合成酵素、植物オスモチン、2Sアルブミン、タウマチン、部位特異的リコンビナーゼ/インテグラーゼ(FLP、Cre、Rリコンビナーゼ、Int、SSVIインテグラーゼR、インテグラーゼphiC31、またはそれらの活性な断片もしくは変種)、イソペンテニルトランスフェラーゼ、Sca M5(ダイズカルモジュリン)、甲虫タイプの毒素または殺虫活性断片、ユビキチン結合酵素(E2)融合タンパク質;脂質、アミノ酸、糖、核酸、および多糖類を代謝する酵素;スーパーオキシドジスムターゼ、不活性な酵素前駆体型のプロテアーゼ、植物タンパク質毒素、繊維生成植物の形質変更(traits altering)繊維、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)に由来する甲虫類の活性毒素(Bt2毒素、殺虫性結晶タンパク質(ICP)、CrylC毒素、デルタエンドトキシン、ポリオペプチド毒素、プロトキシンなど)、昆虫特異的毒素AalT、セルロース分解酵素、アシドサーマス・セルロティカス(Acidothermus celluloticus)由来のE1セルラーゼ、リグニン修飾酵素、シンナモイルアルコールデヒドロゲナーゼ、トレハロース-6-リン酸合成酵素、サイトカイニン代謝経路の酵素、HMG-CoA還元酵素、大腸菌無機ピロホスファターゼ、種子貯蔵タンパク質、エルウィニア・ヘルビコラ(Erwinia herbicola)のリコペン(lycopen)合成酵素、ACC酸化酵素、pTOM36にコードされるタンパク質、フィターゼ、ケトヒドロラーゼ、アセトアセチルCoA還元酵素、PHB(polyhydroxybutanoate)合成酵素、アシルキャリアータンパク質、ナピン、EA9、非高等植物のフィトエン合成酵素、pTOM5にコードされるタンパク質、ETR(ethylene receptor)、色素体のピルビン酸リン酸ジキナーゼ、線虫誘導性の膜孔タンパク質、植物細胞の光合成機能または色素体機能を増強する形質、スチルベン合成酵素、フェノールをヒドロキシル化することができる酵素、カテコールジオキシゲナーゼ、カテコール2,3-ジオキシゲナーゼ、クロロムコン酸シクロイソメラーゼ、アントラニル酸合成酵素、アブラナ属AGL15タンパク質、フルクトース1,6-ビホスファターゼ(biphosphatase)(FBPase)、AMV RNA3、PVYレプリカーゼ、PLRVレプリカーゼ、ポティウイルスコートタンパク質、CMVコートタンパク質、TMVコートタンパク質、ルテオウイルスレプリカーゼ、MDMVメッセンジャーRNA、変異体ジェミニウイルスレプリカーゼ、カリフォルニア月桂樹(Umbellularia californica)のC12:0選択性アシル-ACPチオエステラーゼ、植物のC10またはC12:0選択性アシル-ACPチオエステラーゼ、C14:0選択性アシル-ACPチオエステラーゼ(luxD)、植物合成酵素因子A、植物合成酵素因子B、6-デサチュラーゼ、植物細胞中のペルオキシソー��での脂肪酸酸化における酵素活性を有するタンパク質、アシル-CoAオキシダーゼ、3-ケトアシル-CoAチオラーゼ、リパーゼ、トウモロコシアセチルCoAカルボキシラーゼ、5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸合成酵素(EPSP)、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(BAR、PAT)、CP4タンパク質、ACCデアミナーゼ、リボザイム、翻訳後切断部位を有するタンパク質、Gal4転写活性化因子のDNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインからなるタンパク質融合物、オレオシンタンパク質と融合タンパク質を脂質相中にターゲティングできる関心対象のタンパク質との翻訳融合物、スルホンアミド耐性を与えるDHPS遺伝子、細菌ニトリラーゼ、2,4-Dモノオキシゲナーゼ、アセト乳酸合成酵素またはアセトヒドロキシ酸合成酵素(ALS、AHAS)、ポリガラクツロナーゼ、細菌ニトリラーゼ、色素体の内部の外被膜中に存在する成熟したリン酸輸送体タンパク質のアミノ末端疎水性領域と前記膜中にターゲティングされるべき関心対象のタンパク質との融合物など)。
【００９６】
任意のヒトタンパク質または動物タンパク質が、本発明の系を用いて発現され得る。とりわけ、このような関心対象のタンパク質の例には、薬学的関心対象の次のタンパク質が含まれる:免疫応答タンパク質(抗体、単鎖抗体、T細胞受容体など)、抗原、コロニー刺激因子、リラキシン、ポリペプチドホルモン、サイトカインおよびそれらの受容体、インターフェロン、増殖因子および凝固因子、酵素的に活性なリソソーム酵素、フィブリン溶解性ポリペプチド、血液凝固因子、トリプシノーゲン、1-アンチトリプシン(AAT)、ならびに上記タンパク質の融合物、変異型、および合成誘導体のような機能保存的タンパク質。
【００９７】
実施例に示し上記に説明したように、キット、混合物、ベクター、植物、および植物細胞は、ポリペプチド、特にヘテロオリゴマーポリペプチドを植物において発現させるのに特に有用である。
【００９８】
したがって、1つの態様において、本発明は、ポリペプチド、特にヘテロオリゴマーポリペプチドを作製するための、本発明のキットの使用、または本発明の混合物の使用、または本発明のPVXウイルスベクターの使用、または本発明の植物もしくは植物細胞の使用、または本発明の植物の使用、または本発明のアグロバクテリウム細胞の混合物の使用に関する。
【００９９】
「移動タンパク質」または「MP」という用語は、当業者に公知であり、トバモウイルスのMP ORFのように細胞間移動に必要とされるタンパク質として理解されている。
【０１００】
「トリプルジーンブロックタンパク質」または「TGB」という用語は、当業者に公知であり、ポテックスウイルスのTGB ORFのように細胞間移動に必要とされるタンパク質として理解されている。
【０１０１】
「コートタンパク質」という用語は、当業者に公知であり、ウイルスの外被を構築するタンパク質として理解されている。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】ウイルスベクターのバックボーンのジレンマを示す。個々のウイルスベクター、すなわち(同一のバックボーンを有する)PVXまたはTMVのいずれも、単一の植物細胞に共感染することはできない;それらは全体に移動する間に分離し、葉の表面の離れた部分(patch)においてのみ外来遺伝子を発現する。RdRp:RNA依存性RNAポリメラーゼ(RNA-dependent RNA polymerase);CP:コートタンパク質(coat protein);ORF:オープンリーディングフレーム(open reading frame);MP:移動タンパク質(movement protein)、TGB:トリプルジーンブロック(triple gene block)。矢印は、サブゲノムプロモーターを示す。
【図２】天然の援助ペア(helping pair)TMVおよびPVXを示す。両方のウイルスは単一細胞に共感染し、一緒に移動することができ、植物に全体的に感染することができる。RdRp:RNA依存性RNAポリメラーゼ;CP:コートタンパク質;ORF:オープンリーディングフレーム;MP:移動タンパク質、TGB:トリプルジーンブロック。矢印は、サブゲノムプロモーターを示す。
【図３】第1のプラス鎖ウイルスベクターおよび第2のプラス鎖ウイルスベクターを含む本発明のキットを示す。これらのウイルスベクターにおいて、コートタンパク質は相互に交換された。両方のウイルスは単一細胞に共感染することができ、植物に全体的に感染することができる。同時に、どちらも単独では植物に全体的に感染することができず、封じ込めが徹底される。RdRp:RNA依存性RNAポリメラーゼ;CP:コートタンパク質;ORF:オープンリーディングフレーム;MP:移動タンパク質、TGB:トリプルジーンブロック。矢印は、サブゲノムプロモーターを示す。A:ゲノム中に追加のORFが挿入されていない補完的ペアPVX-CP(TMV)およびTMV-CP(PVX)を示す。B:1つのORFが、補完的ペアのPVXベクター中に挿入されている。C:1つのORFが、補完的ペアのTMVベクター中に挿入されている。D:ORF1が補完的ペアのPVXベクター中に挿入され、ORF2が補完的ペアのTMVベクター中に挿入されている。
【図４】PVXをベースとする本発明のキットの第3のウイルスベクターの概略図を示す。このウイルスベクターはコートタンパク質を含まず;特に、コートタンパク質は完全に欠失している。さらに、このウイルスベクターは、異種ORFを含む(PVX-ΔCP-ORFx)。RdRp:RNA依存性RNAポリメラーゼ;ORF:オープンリーディングフレーム;TGB:トリプルジーンブロック。矢印は、サブゲノムプロモーターを示す。
【図５】本発明のキットの第3のウイルスベクターの概略図を示す。このウイルスベクターは、コートタンパク質も移動タンパク質も含まない。さらに、このウイルスベクターは、異種ORFを含む(PVX-ΔCP-ΔTGB-ORFx)。RdRp:RNA依存性RNAポリメラーゼ;ORF:オープンリーディングフレーム。矢印は、サブゲノムプロモーターを示す。
【図６Ａ】図6Aにおいて、ウイルスベクターPVX-mBananaΔCP、PVX-mCherry-CPTMV、およびTMV-GFP-CPPVXに全体的に共感染した植物に由来する植物葉を示す。写真は、通常光、GFP可視化のための紫外光、mCherry可視化のための緑色光および赤色フィルター、ならびにmBanana可視化のための青色光および黄色フィルターのもとで撮影された。
【図６Ｂ】図6Bにおいて、ウイルスベクターPVX-mBananaΔCP、PVX-mCherry-CPTMV、およびTMV-GFP-CPPVXに全体的に共感染した植物に由来する植物葉を示す。写真は、通常光、GFP可視化のための紫外光、mCherry可視化のための緑色光および赤色フィルター、ならびにmBanana可視化のための青色光および黄色フィルターのもとで撮影された。
【図７】異なるウイルスベクターを単独でまたは組み合わせて有する葉に由来する植物樹液のSDS-PAGEを示す。このSDS-PAGEの場合、プローブは煮沸されず、ゲル中で直接的に蛍光タンパク質を可視化した。ゲルは、クーマシー染色前に紫外光、緑色光および赤色フィルター、青色光および黄色フィルターのもとで、クーマシー染色後に通常光のもとで観察された。M:P7711Sラダー(NEB);ベンサミアナタバコ(N. benthamiana):感染していない/接種されていない植物に由来する植物樹液;PVX201:精製されたPVX201粒子(1μg)、TMV:精製されたTMV粒子(1μg)。
【図８】異なるウイルスベクターを単独でまたは組み合わせて有する葉に由来する植物樹液のウェスタンブロットを示す。これらの解析の場合、SDS-PAGEの前にプローブが煮沸された。ウェスタンブロットは、コートタンパク質を検出するポリクローナルPVXまたはTMV抗体、およびアルカリホスファターゼで標識されたヤギ抗ウサギ抗体と共にインキュベートされた。M:P7711Sラダー(NEB);ベンサミアナタバコ:感染していない/接種されていない植物に由来する植物樹液;PVX mCherry-2A-CP:mCherryオーバーコート粒子の感染物(infection)に由来する植物樹液;TMV-GFP:TMV発現GFPの感染物に由来する植物樹液。
【図９】コートタンパク質が欠損したPVXベクターを発現するベンサミアナタバコの葉を示す。PVX-GFPΔCP、PVX-mCherryΔCP、または両方のベクターが、これらの葉に接種された。写真は、接種後4日目(day post inoculation)(dpi)に撮影された。
【図１０】PVX-GFPΔCPおよびPVX-mCherryΔCPを共発現するベンサミアナタバコ植物を示す。写真は、接種後4、5、および6日目(dpi)に撮影された。
【図１１】異なるウイルスベクターを単独でまたは組み合わせて有するベンサミアナタバコの接種された葉を示す。写真は、通常光、GFP可視化のための紫外光、mCherry可視化のための緑色光および赤色フィルター、ならびにmBanana可視化のための青色光および黄色フィルターのもとで撮影された。これらの植物部分は、接種後13日目(dpi)に採取された。
【図１２】蛍光タンパク質の個々の励起を伴う、補完的ペアに感染した植物葉の顕微鏡写真を示す。A〜D:mCherry(テキサスレッドフィルター)およびGFP(GFPフィルター)の励起を伴う補完的ペア、E〜H:mCherryおよびmBanana(YFPフィルター)の励起を伴う補完的ペア。I〜L:mCherryおよびmBananaの励起を伴う、PVX-mBananaΔCPを加えた補完的ペア;A、E、I:透過光を用いて示された細胞、B、F、J:mCherryの励起、C;GFPの励起、G、K:mBananaの励起、D、H、L:示された感染に関する写真の重ね合わせ。
【図１３】補完的ペアおよび第3のベクター、すなわちコートタンパク質を欠いているPVXまたはTMVのいずれかに感染した植物葉を示す。補完的ペアPVX-mCherry-CPTMVおよびTMV-GFP-CPPVXの同時接種が、PVXまたはTMVのいずれかをベースとしていた、コートタンパク質を欠いている、mBanana発現第3ベクターを用いて調べられた。7dpi(接種された葉)および24dpi(全体的に感染した葉)の葉が示され、異なる蛍光タンパク質に対して個々の励起条件が適用された。
【図１４】補完的ペアおよび第3のベクター、すなわちコートタンパク質を欠いているPVXまたはTMVのいずれかに全体的に感染した葉のSDS-PAGEおよびウェスタンブロットを示す。ゲルは、蛍光タンパク質を可視化するために、クーマシー染色の前に、緑色光および赤色フィルター(上段の左)、青色光および黄色フィルター(上段の中央)、および紫外光(上段の右)のもとで示されている。下段では、クーマシー染色されたゲル(左)、ならびにPVX(α-PVX)のCPおよびTMV(α-TMV)のCPに対するウェスタンブロットが示されている。M:P7711Sタンパク質ラダー(NEB)、Nb:感染していないベンサミアナタバコ植物1:26dpiにおける補完的ペア、2:26dpiにおけるPVX-mBananaΔCPを加えた補完的ペア、3:33dpiにおける補完的ペア、4:33dpiにおけるPVX-mBananaΔCPを加えた補完的ペア、5:33dpiにおけるTMV-mBananaΔCPを加えた補完的ペア。P:PVX201精製(1μg)、T:TMV精製(1μg)。
【図１５】蛍光タンパク質の励起を伴う、PVXをベースとするCP欠損ベクターの感染物の植物葉の顕微鏡写真を示す。A〜D:感染していないベンサミアナタバコ植物。E〜H:PVX-GFPΔCPに感染した植物、I〜L:PVX-mCherryΔCPに感染した植物、M〜P:PVX-GFPΔCPおよびPVX-mCherryΔCPに共感染した植物。A、E、I、M:細胞は透過光と共に示す、B、F、J、N:mCherryに対する励起(テキサスレッドフィルター);C、G、K、O:GFPの励起(GFPフィルター)、D、H、L、P:示された感染に関する写真の重ね合わせ。
【実施例】
【０１０３】
実施例1:ベクターの作製および補完的ウイルスベクターを用いたいくつかの異種タンパク質の共発現
オーバーラップ伸長(SOE)PCR方法による遺伝子スプライシングを用いて、補完ベクター(complementation vector)を作製した。TMVのコートタンパク質を有するPVXを構築するために、3種のPCR産物を生成した。PCR1において、mCherry遺伝子をPVXゲノム中に挿入し(PVX-mCherry)、PVXコートタンパク質のサブゲノムプロモーターを、融合のためのオーバーラップ配列を含むプライマーmCherry-ClaIおよびSOE-TMVCP rvを用いて増幅した。PCR2では、2つのオーバーラップ配列、すなわちPCR産物1に相補的な5'末端およびPCR産物3に相補的な3'末端を含むプライマーSOE-TMVCP fwおよびSOE-TMVCP2 rvを用いて、ベクターpJL24(US 2010/0071085 A1)からサブゲノムプロモーターの一部分およびTMVコートタンパク質のORFを増幅した。PCR3によって、プラスミドバックボーンの複数の部分を含むPVXゲノムの3'部分を、プライマーSOE-TMVCP2-fwおよびM13ユニバース(universe)を用いてベクターPVX-mCherryから生成した。プライマーを欠く第4のPCRにおいて、すべてのPCR産物をオーバーラップ配列に基づいて融合し、プライマーmCherry-ClaIおよびM13ユニバースを用いるPCR5において再び増幅した。次いで、最終的なPCR産物をClaIおよびSalIで切断し、同じ酵素を用いて切断し子ウシ腸ホスファターゼ(CIP)を用いて脱リン酸化したPVXベクターに連結した。また、PVXベクターは、バイナリーベクターpTRAc(Mclean, 2007, J Gen Virol 88, 1460-1469)のプラスミドバックボーンからなる。UK3株のPVXゲノムを、T-DNAの左境界線と右境界線の間に組み込む。コートタンパク質のサブゲノムプロモーターをコピーし(duplicated)、制限酵素NheI、ClaI、およびSmaIによるマルチクローニング部位を組み込む(pPVX201、特許WO96/12027)。最終的なベクター構築物において、pPVX-mCherry-CPTMVは、ポテックスウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼおよびトリプルジーンブロックタンパク質、ならびに蛍光タンパク質mCherryおよびTMVのコートタンパク質に対応する異種遺伝子をコードする。mCherryおよびTMVコートタンパク質を発現させるためのサブゲノムプロモーターは、PVXコートタンパク質のコピーされたサブゲノム(sg)プロモーターである。
【０１０４】
（表１）補完ベクターの構築のために使用されるDNAオリゴマー
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【０１０５】
TMVベクターを構築するために、2種のPCR産物を生成した。PCR1では、プラスミドpJL24においてプライマーPacI-GFP-TMVおよびSOE2-CP rv(表1)を用いて緑色蛍光タンパク質の配列を増幅して、5'末端のPacI制限部位およびTMVのコートタンパク質サブゲノムプロモーターの一部分を追加した。第2のPCRにおいて、PVXのコートタンパク質配列をプライマーSOE2-CP fwおよびSOE2-CP-NotIを用いて増幅して、5'末端にTMVのサブゲノムプロモーターの一部分および3'末端にNotI制限部位を有する構築物を生成した。プライマーを用いない第3のPCRにおいて、これら2種のPCR産物を融合し、プライマーPacI-GFP-TMVおよびSOE2-CP NotIを用いて第4のPCRにおいて増幅した。最終的なPCR産物を酵素PacIおよびNotIで切断し、アガロースゲルを通して精製した。標的ベクターpTRBOG(US 2010/0071085 A1)を同じ制限酵素で処理し、CIPを用いて脱リン酸化した。PCR断片をTMVベクターに連結し、プラスミドpTMV-GFP-CPPVXを得た。
【０１０６】
完全なコートタンパク質融合物を有するPVXベクターを構築するために、2A配列を伴うN末端mBananaコートタンパク質融合物を有する既存のPVXベクターを使用した。例えば、PVX-mBanana-2A-CPは、アグロ感染に適合性のあるPVXベクターである。プラスミドのバックボーンは、バイナリーベクターpTRAcである。UK3株のPVXゲノムを、T-DNAの左境界線と右境界線の間に組み込む。選択されたベクターは、食品および口疾患ウイルス(Food and Mouth Disease Virus)(FMDV)の2A配列を伴う異なる蛍光タンパク質、例えば黄色蛍光タンパク質mBananaのコートタンパク質融合物を有する。PCRによってPVXゲノムの3'部分を増幅し、プライマー
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を用いて、融合ベクター中の2A配列の最初にも存在する制限部位BspEIを5'部分に追加した。プライマーM13ユニバースは、PVXゲノム外のベクターバックボーン内部に結合し、プライマー2ADelCpfwは、コートタンパク質コード配列の下流に直接結合し、BspEI部位を追加する。この産物をpCR2.1-Topoベクター(Lifetechnologies、Carlsbad、USA)にサブクローニングし、大腸菌(E. coli)SCS110中で増幅して、メチル化されていないプラスミドDNAを生成した。このpCR2.1ベクターをBspEIおよびXhoIで切断した。コートタンパク質融合物を有する標的ベクターを同じ酵素で処理し、そのようにして、2A配列およびPVXゲノムの3'末端を欠失させた。次いで、完全なコートタンパク質配列を有していない3'末端をPVXゲノムに連結し、配列決定によって確認した。
【０１０７】
本発明において、新規な封じ込め特徴を有する植物ウイルス発現系を開発した。この系では、2種の異なるウイルスベクターが、相互のコートタンパク質交換によって、互いの欠損した機能を補完する。これらの手段により、ウイルスベクターは単独では植物に全体的に感染することができない。本実施例において、機能的異種ORFとしてのGFPおよびPVXのコートタンパク質を有するTMVベクター(「第2のベクター」に相当する)、ならびに機能的異種ORFとしてのmCherryおよびTMVのCPを有するPVXベクター(「第1のベクター」に相当する)、ならびに機能的異種ORFとしてのmBananaを有しCPが完全に欠失しているPVXベクター(「第3のベクター」に相当する)を生成した。
【０１０８】
これらのウイルスベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス株GV3101:PVXベースのベクターの場合はpMP90RKにおよびTMVベースのベクターの場合はGV2260にトランスフォームした。抗生物質カルベニシリン(100mg/l)、リファンピシン(50mg/l)、およびカナマイシン(GV3101の場合50mg/l、GV2260の場合25mg/l)を含むYEB培地(0.5％牛肉エキス、0.1％酵母エキス、0.5％ペプトン、0.5％ショ糖、2mM MgSO4)において26℃でアグロバクテリアを増殖させた。24時間後、培養物に10μM MES(pH5.6)、10μMグルコース、および20μMアセトシリンゴンを補充し、もう1日インキュベートした。次いで、2×浸潤培地(infiltration media)(100g/lショ糖、3.6g/lグルコース、8.6g/lムラシゲおよびスクーグ(MS)の塩、pH5.6)を用いて培養物をOD600=1に設定し、200μMアセトシリンゴンを補充し、室温で30分間インキュベートした。2種またはそれ以上の異なる構築物を同時接種するために、各培養物のOD600が1となるように培養物を混合した。これらの混合物を、無針注射器を用いて約4週齢のベンサミアナタバコ葉に接種した。これらの植物を、26℃、一定の光(25000〜30000lux)のもとで12時間、および20℃、暗所で12時間、植物室中でさらにインキュベートした。
【０１０９】
これらの植物を、選択された蛍光タンパク質に対する特定の条件下で毎日モニターした(表2)。GFPの可視化のためには、手持ち式のUVランプ(7000μW、Novodirect、Kehl/Rhein、Germany)を、mCherryのためには、緑色LCDランプ(KL2500、Leica、Wetzlar、Germany)を、mBananaのためには、高輝度の青色LEDランプ(Optimax(商標)450 Spectroline、Spectronics corporation、New York、USA)を使用した。Nikon Coolpix 5400カメラ(Nikon Deutschland、Dusseldorf、Germany)を用いて写真を撮影した。
【０１１０】
（表２）
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【０１１１】
図11において、ウイルスベクターPVX-mBananaΔCP、PVX-mCherry-CPTMV、TMV-GFP-CPPVX、およびそれらの組合せを発現する接種された葉を示している。TMV ベクターは、そのコートタンパク質がなくても細胞間移動を依然としてすることができ、したがって、接種された葉は、GFPの良好な発現を既に示す。他のウイルスからコートタンパク質を補完されたベクターの組合せでは、接種された葉において効果が既に目に見える。PVXベクターは、TMVベクターとの組合せで、それらの異種ORFをより強く発現する。驚くべきことに、コートタンパク質を欠いている第2のPVXベクター(mBanana)もまた、第1のPVXベクター(mCherry)と同じ細胞においてはっきりと発現されている。
【０１１２】
26dpi後、これらの植物は、2種またはさらに3種の異なるウイルスベクターに全体的に感染していた。これにより、これらのウイルスベクターが互いの生得的コートタンパク質の欠損を補完し、次に、その他の欠損ウイルスベクターの全体的移動を支援できることが実証される。
【０１１３】
図6Aおよび6Bにおいて、ウイルスベクターTMV-GFP-CPPVXおよびPVX-mCherry-CPTMVに加えてPVX-mBananaΔCPを同時接種された全体的に感染した植物の葉を示している。
【０１１４】
可溶性タンパク質全体を単離するために、これらの葉を異なる時点に採取し、2体積量のPBS(pH7.4)を用いてホモジナイズした。13000rpm、4℃で10分間の遠心分離の間に、不溶性植物部分を分離した。可溶性タンパク質の総量を、Roti(登録商標)Quant試薬(Roth、Karlsruhe、Germany)を用いたBradfordアッセイ法によって測定した。
【０１１５】
蛍光を定量するために、単離した可溶性タンパク質全体を使用した。タンパク質全体のうちの50μgをPBS 100μl中に希釈し、マイクロタイタープレートリーダー(ELISA-Reader Infinite M200、TECAN Group Ltd、Mannedorf、Switzerland)において蛍光プロファイルを測定した。また、クーマシーブリリアントブルー染色の前に、蛍光タンパク質をSDSゲル中で可視化した。
【０１１６】
タンパク質解析のために、非連続的なSDS-PAGEおよびウェスタンブロット法を使用した。植物樹液に5×還元用試料緩衝液(62.5mM Tris-HCl pH 6.8、30％グリシン(glycin)、4％SDS、10％ 2-メルカプトエタノール、0.05％ブロモフェノールブルー)を補充し、ゲル中で蛍光を可視化するためにゲル上に直接載せるか、またはウェスタンブロット法のために5〜10分間煮沸した。次いで、プローブを12％SDSゲル上に載せ、電気泳動の後に、クーマシーブリリアントブルーで染色するか、またはウェスタンブロット解析のためにニトロセルロース膜上にブロットした。膜を、PBS中5％脱脂乳を用いて1時間ブロックし、次いで、PVX(DSMZ、Braunschweig、Germany)またはTMV(Bioreba AG、Reinach、Switzerland)のコートタンパク質に対するポリクローナル抗体と共に室温で少なくとも2時間インキュベートした。二次抗体として、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギモノクローナル抗体(Dianova、Hamburg、Germany)を使用し、塩化ニトロブルーテトラゾリウム/5-ブロモ-4-クロロ-3'-インドリ(indoly)ホスファートp-トルイジン塩(NBT/BCIP)(Roth、Karlsruhe、Germany)を用いてシグナルを可視化した。
【０１１７】
SDS-PAGEにおいて、異種タンパク質の上首尾の共発現が再び確認された(図7)。共感染した葉に由来する植物樹液において、異なる蛍光タンパク質が、特定の励起下で容易に視認できる。mCherryおよびmBananaの場合、これら2種の蛍光タンパク質の二量体化も視認でき、タンパク質単量体のサイズの2倍のタンパク質バンドが形成される。ウイルスベクターに由来する異なるコートタンパク質の発現およびそれら自身の生得的コートタンパク質の欠如が、TMVまたはPVXのコートタンパク質に対するポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット解析において証明された(図8)。
【０１１８】
これらのデータから、ウイルスの自身のコートタンパク質の欠如および外来コートタンパク質の発現ならびに共感染におけるコートタンパク質機能の異種補完が確認される。
【０１１９】
2種の異なるPVXベースのベクターによって同じ細胞においてmCherryおよびmBananaが共発現されることを確認するために、蛍光顕微鏡Biorevo BZ-9000(Keyence、Neu-Isenburg、Germany)を用いて、感染した葉を解析した。補完的ペアに感染した葉は、同じ細胞におけるmCherryおよびGFPの明瞭な共発現を示し(図12A〜D)、mBananaに対する励起に伴うシグナルは生じなかった(E〜H)。補完的ペアおよびPVX-mBananaΔCPに共感染した葉において、mBananaおよびmCherryの明瞭な共発現を認めることができる(I〜L)。これらの領域におけるGFP発現もまた、確認された(データ不掲載)。
【０１２０】
本発明者らは、CP遺伝子が欠損した第2のTMVベクターも本発明者らの補完的ペアと共に植物に共感染できるか、さらに解析した。しかしながら、感染は、感染した葉における2種の異なるPVXベースのベクターの共発現を示しただけであった(図13)。浸潤されたすべての葉においてmBanana発現を観察することができたため、一見、浸潤された葉は、第3のTMVベクターまたはPVXベクターと共にどちらの(either)補完的ペアも共発現するように思われた。全体的に感染した葉において、追加のPVXベクターとの組合せのみが、3種の蛍光タンパク質すべての共発現を示した。TMV-mBananaΔCPベクターとの組合せでは、補完的ペアしか、同じ領域に認めることができなかった。この組合せにおいて認めることができたmBanana発現の斑点は非常にまれであり、GFP発現とは決して重ならない。したがって、PVXによって発現されるCPTMVは、CP欠損TMVベクターを補完することができ、接種された葉の外への伝播を可能にしたが、2種の異なるTMVベースのベクターの共感染は観察されなかった。
【０１２１】
これらの知見は、SDS-PAGEおよびウェスタンブロット解析において確認された(図14)。ゲル中の蛍光タンパク質の可視化により、全体的に感染した葉において補完的ペアによるmCherryおよびGFPの共発現が示され、PVX-mBananaΔCPベクターとの共感染においてmBananaの共発現が示された。さらに、mCherryおよびmBananaが共発現される場合、それらの二量体化が観察され、細胞中にmBananaがない場合、mCherryはゲル中で、より低いバンドを示した。追加のTMV-mBananaΔCPに感染した植物では、少量のmBananaを葉中に見出すことができ、これらの葉中のGFPおよびmCherryの量は減少している。これらのベクターの共発現がないことが、このことの説明となり得る。補完的ペアは、これらの葉においてGFPおよびmCherryを共発現するが、mBananaを発現する第2のTMVベクターとは離れており、その結果、発現される組換えタンパク質の全体量は少なくなる。ウェスタンブロットにより、補完的ペアによるウイルスベクターのCPの発現が確認された。
【０１２２】
要約すれば、本発明者らは、補完的ペアとコートタンパク質を欠いている追加のPVXベースのベクターとの共発現を確認することができたが、第2のTMVベクターは、補完的ペアと共に植物に共感染することができなかった。これらのベクターを用いて、本発明者らが初めて、全体的に感染した葉における同じRNAウイルスをベースとする2種のウイルスベクターの共発現を示した。
【０１２３】
全体的移動および組換えタンパク質の同時作製を可能にし、同時にバイオセーフティ封じ込めを確実にする、コートタンパク質の補完能力は、本発明の利点を明瞭に示す。
【０１２４】
実施例2:移動不全PVXベクターを用いたタンパク質作製
1つのウイルス種に由来するウイルスベクターを用いて2種またはそれ以上の組換えタンパク質を発現させるために、コートタンパク質を欠くジャガイモウイルスX(PVX)ベクターを構築した。コートタンパク質のC末端コード領域の一部分が維持されている公知のベクターとは異なり、これらのベクターでは、コートタンパク質オープンリーディングフレーム全体が欠失していた。
【０１２５】
これらのウイルスベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス株GV3101:pMP90RKにトランスフォームし、抗生物質カルベニシリン(100mg/l)、リファンピシン(50mg/l)、およびカナマイシン(50mg/l)を含むYEB培地(0.5％牛肉エキス、0.1％酵母エキス、0.5％ペプトン、0.5％ショ糖、2mM MgSO4)において26℃で増殖させた。24時間後、培養物に10μM MES(pH5.6)、10μMグルコース、および20μMアセトシリンゴンを補充し、もう1日インキュベートした。次いで、2×浸潤培地(100g/lショ糖、3.6g/lグルコース、8.6g/lムラシゲおよびスクーグ(MS)の塩、pH5.6)を用いて培養物をOD600=1に設定し、200μMアセトシリンゴンを補充し、室温で30分間インキュベートした。2種またはそれ以上の異なる構築物を同時接種するために、各培養物のOD600が1となるように培養物を混合した。これらの混合物を、無針注射器を用いて約4週齢のベンサミアナタバコ葉に接種した。これらの植物を、26℃、一定の光(25000〜30000lux)のもとで12時間、および20℃、暗所で12時間、植物室中でさらにインキュベートした。
【０１２６】
これらの植物を、選択された蛍光タンパク質に対する特定の条件下で毎日モニターした(表3)。GFPの可視化のためには、手持ち式のUVランプ(7000μW、Novodirect、Kehl/Rhein、Germany)を、mCherryのためには、緑色LCDランプ(KL2500、Leica、Wetzlar、Germany)を使用した。Nikon Coolpix 5400カメラ(Nikon Deutschland、Dusseldorf、Germany)を用いて写真を撮影した。
【０１２７】
（表３）
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【０１２８】
これらの結果から、コートタンパク質のC末端コード領域がPVXベクターの複製のために厳密には必要とされないことがはっきりと示される。GFPおよびmCherryが、接種された植物細胞において産生されている(図9)。同時接種された葉において、これら2種の異なる組換えタンパク質の共発現ははっきりと目に見え、顕微鏡的調査において細胞レベルで証明されている(データ不掲載)。
【０１２９】
接種後4日目に、両方の蛍光タンパク質の良好な共発現が目に見え、発現は、この酵素組合せの場合、発現は、6dpiに最良の共発現レベルに達した(図10)。しかしながら、組換えタンパク質が異なれば条件も異なるため、他の作製期間もまた、可能および/または適切である。
【０１３０】
可溶性タンパク質全体を単離するために、これらの葉を異なる時点に採取し、2体積量のPBS(pH7.4)を用いてホモジナイズした。13000rpm、4℃で10分間の遠心分離の間に、不溶性植物部分を分離した。可溶性タンパク質の総量を、Roti(登録商標)Quant試薬(Roth、Karlsruhe、Germany)を用いたBradfordアッセイ法によって測定した。
【０１３１】
蛍光を定量するために、単離した可溶性タンパク質全体を使用した。タンパク質全体のうちの50μgをPBS 100μl中に希釈し、マイクロタイタープレートリーダー(ELISA-Reader Infinite M200、TECAN Group Ltd、Mannedorf、Switzerland)において蛍光プロファイルを測定した。また、クーマシーブリリアントブルー染色の前に、蛍光タンパク質をSDSゲル中で可視化した。
【０１３２】
タンパク質解析のために、非連続的なSDS-PAGEおよびウェスタンブロット法を使用した(Laemmli, 1970)。植物樹液に5×還元用試料緩衝液(62.5mM Tris-HCl pH 6.8、30％グリシン、4％ SDS、10％ 2-メルカプトエタノール、0.05％ブロモフェノールブルー)を補充し、ゲル中で蛍光を可視化するためにゲル上に直接載せるか、またはウェスタンブロット法のために5〜10分間煮沸した。次いで、プローブを12％SDSゲル上に載せ、電気泳動の後に、クーマシーブリリアントブルーで染色するか、またはウェスタンブロット解析のためにニトロセルロース膜上にブロットした。膜を、PBS中5％脱脂乳を用いて1時間ブロックし、次いで、PVX(DSMZ、Braunschweig、Germany)のコートタンパク質に対するポリクローナル抗体と共に室温で少なくとも2時間インキュベートした。二次抗体として、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギモノクローナル抗体 (Dianova、Hamburg、Germany)を使用し、塩化ニトロブルーテトラゾリウム/5-ブロモ-4-クロロ-3'-インドリ(indoly)ホスファートp-トルイジン塩(NBT/BCIP)(Roth、Karlsruhe、Germany)を用いてシグナルを可視化した。
【０１３３】
SDS-PAGEおよびウェスタンブロット解析を用いて、PVXベクターがコートタンパク質を発現しないことを証明することができた(データ不掲載)。以前の論文によって、PVX ベクターの複製にコートタンパク質のC末端コード領域が必要とされることが示唆されているが、本明細書において、コートタンパク質コード配列が完全に欠失していてもよいことを示すことができた。逆に、2種の異なる、潜在的により多くのPVXΔCPベクターの良好な共発現を示すことができた。
【０１３４】
同じ細胞における2種の異なるPVXベースのベクターの共発現を確認するために、蛍光顕微鏡Biorevo BZ-9000(Keyence、Neu-Isenburg、Germany)を用いて、感染した葉を解析した。これらの写真により、感染していないベンサミアナタバコ植物の場合はシグナルがないことが確認された(図15A〜D)。PVX-GFPΔCPまたはPVX-mCherryΔCPによる感染物において、発現された蛍光タンパク質のみを認めることができた(GFPについてはE〜H、mCherryについてはI〜L)。これらのベクターの共感染において、異なる蛍光タンパク質の共発現が、同一細胞において観察され得る(M〜P)。
【０１３５】
要約すれば、本発明者らは、アグロインフィルトレーションされた(agroinfiltrated)葉における、CPを欠く異なるPVXベースのベクターの共発現を確認することができた。この知見から、PVXベクターがCP機能のノックアウト後に共感染する能力を有することが示される。これは、ベクター中のMP遺伝子およびCP遺伝子の欠失後にさえ共感染することができない前述の公知のPVXベースのベクターおよびまたTMVベースのベクター(Julve et al., 2013)とは対照的である。
【０１３６】
コートタンパク質の欠失のおかげで、封じ込めが徹底される。さらに、本発明は、1つの細胞中に2種またはそれ以上のベクターが共存できないことを克服し、したがって、同じ植物細胞において異なるウイルスベクター上に位置する2種またはそれ以上の異種ORFの同時発現を可能にする。
【０１３７】
文献:
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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