(57)【要約】  本発明の対象は、Trichophyton属菌に感染している可能性のあるヒト又は動物の皮膚及び皮膚付属器のサンプル中の、ジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、スブチリシン様プロテアーゼ7、ロイシンアミノペプチダーゼ1及びロイシンアミノペプチダーゼ2から選択される少なくとも一つのプロテアーゼの存在を判定する工程を含む、皮膚及び皮膚付属器の真菌症に関与する少なくとも一種のTrichophyton属菌の存在を検出する方法である。また、本発明は、特に、ジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、若しくはロイシンアミノペプチダーゼ2を標的とするモノクローナル抗体、又はジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、若しくはロイシンアミノペプチダーゼ2にそれぞれ結合することができるこの抗体のフラグメント、及びこの抗体を含むキットにも関する。
2016511390.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一種のTrichophyton属菌の存在を検出するための方法であって、Trichophyton属菌に感染している可能性のあるヒト又は動物から得られる皮膚若しくは皮膚付属器のサンプル中のジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、スブチリシン様プロテアーゼ7、ロイシンアミノペプチダーゼ1、及びロイシンアミノペプチダーゼ2から選択される少なくとも一つのプロテアーゼの存在を判定する工程を含む、方法。
【請求項２】
Trichophyton interdigitale及び/又はTrichophyton rubrumを検出するための、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルが、爪床を削り取ることによって、又はマイクロドリルを用いて爪に穴を開けることによって得られる爪のサンプルであることを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも一種のTrichophyton属菌への感染に関連する疾患のスクリーニング、治療的経過観察、及び/又は診断のための、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
爪真菌症のスクリーニング、治療的経過観察、及び/又は診断のための、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプル中のジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、及びロイシンアミノペプチダーゼ2から選択される少なくとも一つのプロテアーゼの存在を判定するための免疫学的試験の実施を含むことを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記免疫学的試験が、ジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、若しくはロイシンアミノペプチダーゼ2を標的とする少なくとも一つのモノクローナル抗体、又はジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、若しくはロイシンアミノペプチダーゼ2にそれぞれ結合することができる前記抗体のフラグメントの使用を含むことを特徴とする、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
定量的質量分析法により行われる、少なくとも一つの前記プロテアーゼの存在を判定する工程を含むことを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも一つの前記プロテアーゼの存在を判定する前記工程が、定量的質量分析法により、前記プロテアーゼの一つに属する少なくとも一つのペプチド配列を特定することから構成されることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも一つの前記プロテアーゼの存在を判定する前記工程が、定量的質量分析法により、少なくとも一つの以下のペプチド配列:
・配列番号1: LSVAEGVGLFNVLQEK
・配列番号2: ALVSHDGTFVGSSK
・配列番号3: GGVGIWISDAK
・配列番号4: INFVGYGQSTTK
・配列番号5: TLYVTAEDHATGK
・配列番号6: AAGAIVYNNVPGSLAGTLGGLDK
・配列番号7: VSFGIITDNVNANLTK
・配列番号8: LIVGFVTELAK
・配列番号9: HANAVNAMIATLSK
・配列番号10: KPGGTTYYYDPSAGK
・配列番号11: MANDVIQSPGEGTTGK
・配列番号12: VLDCDGSGSNSGVIK
・配列番号13: ADFSNYGAVVDVYAPGK
・配列番号14: SVMNMSLGGPR
・配列番号15: QMAIDVIQNPGASTTSK
を特定することから構成されることを特徴とする、請求項8又は9に記載の方法。
【請求項１１】
請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法を実施するために使用可能な、ジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、若しくはロイシンアミノペプチダーゼ2を標的とするモノクローナル抗体、又はジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、若しくはロイシンアミノペプチダーゼ2にそれぞれ結合することができる前記抗体のフラグメント。
【請求項１２】
少なくとも一種のTrichophyton属菌への感染に関連した皮膚及び/又はその付属器の疾患を診断するためのキットであって、少なくとも一つの請求項11に記載のモノクローナル抗体を含むことを特徴とする、キット。
【請求項１３】
少なくとも一つの請求項11に記載のモノクローナル抗体を含むことを特徴とする、爪真菌症を診断するためのキット。
【請求項１４】
少なくとも一種のTrichophyton属菌への感染に関連する疾患のスクリーニング、治療的経過観察、及び/又は診断の方法における使用のための、ジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、スブチリシン様プロテアーゼ7、ロイシンアミノペプチダーゼ1、及びロイシンアミノペプチダーゼ2から選択される少なくとも一つのプロテアーゼ。
【請求項１５】
爪真菌症のスクリーニング、治療的経過観察、及び/又は診断の方法における使用のための、ジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、スブチリシン様プロテアーゼ7、ロイシンアミノペプチダーゼ1、及びロイシンアミノペプチダーゼ2から選択される、少なくとも一つのプロテアーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト又は動物における、皮膚及びその付属器上の、トリコフィトン(Trichophyton)属の菌類の存在の検出に関する。
【０００２】
特に、本発明は、皮膚又は皮膚付属器のサンプル中の、5つの特定のプロテアーゼから選択される、少なくとも一つのプロテアーゼの存在を判定する工程を含む、Trichophyton属菌を検出するための方法に関する。また、本発明は、特に、これらのプロテアーゼを標的とするモノクローナル抗体及びそれらを包含する診断キットに関する。
【背景技術】
【０００３】
Trichophyton属菌は、ヒト又は動物において、皮膚、頭皮、又は爪上で発達し、皮膚糸状菌症を引き起こす、寄生性の真菌類である。ヒトにおいては、例えば、Trichophyton属菌は、皮膚では連環状白癬、頭皮では頭部白癬、髭部位では禿瘡又は白癬菌性毛瘡、及び爪では爪真菌症の原因となることがある。
【０００４】
これらの疾患は非常に煩わしく、他の深刻な病理学的合併症を引き起こす可能性がある。また、醜く、時には障害となるような外見も、罹患した人にとってかなりの負の心理社会的な影響を与える可能性がある。
【０００５】
現在のところ、ヒト又は動物において、Trichophyton属菌によって引き起こされる疾患を治療するための手段があるが、これらの治療は、下される診断の堅実性に密接に結びついている。
【０００６】
ここで、皮膚又はその付属器の真菌症は、酵母、カビ、又は他の皮膚糸状菌など、Trichophyton属菌以外の真菌病原体が原因である可能性があり、この場合は、異なる治療が必要になる。さらにそれらは、皮膚又はその付属器の、他の疾患又は負傷と混同される可能性がある。例えば、乾癬、外傷、爪腫瘍、扁平苔癬及び細菌感染などの爪の形成異常の臨床的兆候は、爪真菌症に似ており、混同の原因になり得る。
【０００７】
したがって、不正確さは、効果のない治療的解決法を開始することにつながるので、正確な診断ができることが必須である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第7,848,799号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Kohler G, Milstein C., (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. (5517): 495-7
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
今日、様々な診断手法があるが、どれも満足なものではない。特に、爪真菌症の場合は、6種類の異なる手法が知られており（Rothmundら、2012年）、そのうちの2つが一般的に使用されている：直接観察(不確実性により、必然的に誤診につながる)、及び、病原体の培養(長く、やや非実用的な手順であり、誰にでも利用可能という訳ではない)である。NISSHO CORPORATION社により製造される免疫キットもあり、迅速かつ使いやすいという利点を有するが、感度及び特に特異性を欠いている。要するに、皮膚糸状菌は、Trichophyton属菌の細胞壁に存在する多糖を検出する抗体を用いて、検出されているが、この多糖は多くの他の皮膚糸状菌の細胞壁にも同じく存在する。
【００１１】
したがって、迅速に、簡便に、かつ特異的に、皮膚又はその付属器、特に、爪のTrichophyton属菌の存在を検出するための解決策であって、現在の診断手法の欠点を克服する解決策の必要性が、依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の目的は、この必要性を満たすために、ジペプチジルペプチダーゼV (dipeptidyl-peptidase V)、スブチリシン様プロテアーゼ6 (subtilisin-like protease 6)、スブチリシン様プロテアーゼ7、ロイシンアミノペプチダーゼ1 (leucine aminopeptidase 1)、及びロイシンアミノペプチダーゼ2から選択される、少なくとも一つのプロテアーゼを使用することを提案することである。
【００１３】
したがって、本発明は、ヒト又は動物の皮膚若しくは皮膚付属器のサンプル中の、少なくとも一つのTrichophyton属菌の存在を検出するための、ジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、スブチリシン様プロテアーゼ7、ロイシンアミノペプチダーゼ1及びロイシンアミノペプチダーゼ2から選択される、少なくとも1つのプロテアーゼの使用に関する。
【００１４】
特に、本発明は、Trichophyton属菌に感染している可能性があるヒト又は動物から得られた皮膚又は皮膚付属器のサンプル中の、ジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、スブチリシン様プロテアーゼ7、ロイシンアミノペプチダーゼ1及びロイシンアミノペプチダーゼ2から選択される少なくとも1つのプロテアーゼの存在を判定する工程を含む、少なくとも一つのTrichophyton属菌の存在を検出するための方法に関する。
【００１５】
試験し、及び検出したTrichophyton属菌は、皮膚及び/又は皮膚付属器の疾患に関与している。
【００１６】
「付属器(appendage)」とは、本発明の意味において、体毛、頭髪、及び爪などの、高い割合のケラチンを含有する任意の保護表皮付属器、付属器(adnexa)、又は外皮を意味する。
【００１７】
有利には、皮膚又はその付属器の層における少なくとも一つのこれらのプロテアーゼの存在は、Trichophyton属菌の存在にのみ特異的である。この判定は、使いやすく、Trichophyton属菌に特異的であり、それゆえに効果的で的を絞った治療を非常に迅速に開始することができるような、迅速な診断手法の目的となり得る様々な手段によって行うことができる。2つの手段が特に適している：質量分析による判定、及び免疫検出による判定である。
【００１８】
また、この第二の手段を実施するために、特定の目的によれば、本発明は、ジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、若しくはロイシンアミノペプチダーゼ2を標的とするモノクローナル抗体、又はジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、若しくはロイシンアミノペプチダーゼ2にそれぞれ結合することができる、この抗体のフラグメント、及びそのような抗体を含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ジペプチジルペプチダーゼVの定量限界を記述する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以降、本発明を詳細に説明する。
【００２１】
したがって、本発明は、ヒト又は動物の皮膚若しくは皮膚付属器のサンプル中において、皮膚及び/又は皮膚付属器の真菌症に関与する、少なくとも一つのTrichophyton属菌の存在を検出するための、ジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、スブチリシン様プロテアーゼ7、ロイシンアミノペプチダーゼ1、及びロイシンアミノペプチダーゼ2から選択される、少なくとも1つのプロテアーゼの使用に関する。
【００２２】
好ましくは、この使用は、Trichophyton属菌に感染している可能性のあるヒト又は動物の皮膚若しくは皮膚付属器のサンプル中の、ジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、スブチリシン様プロテアーゼ7、ロイシンアミノペプチダーゼ1、及びロイシンアミノペプチダーゼ2から選択される、少なくとも1つのプロテアーゼの存在を判定する工程を含む、皮膚及び/又は皮膚付属器の真菌症に関与する少なくとも一つのTrichophyton属菌の存在を検出するための方法を実施することから構成される。
【００２３】
少なくとも一つのプロテアーゼの存在の判定は、皮膚、又はその付属器のサンプルから開始し、in vitroで行うが、そのサンプルを採取した人又は動物の皮膚若しくはその付属器の層における、in vivoでのこのプロテアーゼの存在を反映する。
【００２４】
本発明を実施するために使用するサンプルは、任意の適切な手段によって得られる。サンプルが、爪のサンプルである場合、好ましくは、爪床を削り取ることによって、又はマイクロドリルを使用して、爪に穴を開けることによって得られる。この最後に述べたサンプル採取法は、特に米国特許第7,848,799号明細書に記述されている。サンプルが、皮膚の真菌性病変からのものである場合、好ましくはキュレットを用いて削り取ることによって得られる。
【００２５】
本発明によれば、サンプル中に、ジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、スブチリシン様プロテアーゼ7、ロイシンアミノペプチダーゼ1、及びロイシンアミノペプチダーゼ2から選択される少なくとも一つのプロテアーゼが存在するということは、少なくとも一つのTrichophyton属菌への感染と同義である。実際、これらは、Trichophyton属菌により特異的に分泌されるプロテアーゼであり、ケラチンを消化する役割を担い、さらに本発明によれば、少なくとも一つのTrichophyton属菌に感染した皮膚及びその付属器の層に見つかる。
【００２６】
本発明による使用は、ヒト又は動物における皮膚及び/若しくは皮膚付属器の真菌症に関与する任意のTrichophyton属菌、特に、Trichophyton bullosum、Trichophyton circumvolutum、Trichophyton concentricum、Trichophyton eboreum、Trichophyton equinum、Trichophyton eriotrephon、Trichophyton fischeri、Trichophyton gourvilii、Trichophyton interdigitale、Trichophyton kanei、Trichophyton krajdenii、Trichophyton longifusum、Trichophyton megninii、Trichophyton mentagrophytes、Trichophyton phaseoliforme、Trichophyton quinckeanum、Trichophyton raubitschekii、Trichophyton rubrum、Trichophyton schoenleinii、Trichophyton soudanense、Trichophyton sp. CZ-2011、Trichophyton sp. FSU 10097、Trichophyton sp. IFM 41172、Trichophyton sp. LM 10725、Trichophyton terrestre、Trichophyton thuringiense、Trichophyton tonsurans、Trichophyton vanbreuseghemii、Trichophyton verrucosum、Trichophyton violaceum、及びTrichophyton yaoundeiを、複数の株が存在していてもそれに関係なく、検出するのに適している。
【００２７】
本発明による使用は、非常に具体的には、Trichophyton interdigitale及び/又はTrichophyton rubrumを、よりいっそう好ましくは、Trichophyton rubrumを、株を問わず検出するのに適している。
【００２８】
本発明による、ジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、スブチリシン様プロテアーゼ7、ロイシンアミノペプチダーゼ1、及びロイシンアミノペプチダーゼ2から選択される少なくとも一つのプロテアーゼを判定することによる、Trichophyton属菌の存在の検出は、ヒト又は動物における疾患、特にTrichophyton属菌感染に関連する真菌症のスクリーニング、治療的経過観察、及び/又は診断のために特に使用され得る。
【００２９】
また、本発明は、少なくとも一つのTrichophyton属菌の感染に関連する疾患のスクリーニング、治療的経過観察、及び/又は診断の方法における使用のための、ジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、スブチリシン様プロテアーゼ7、ロイシンアミノペプチダーゼ1、及びロイシンアミノペプチダーゼ2から選択される少なくとも一つのプロテアーゼに関する。
【００３０】
例えば、ヒトにとって、連環状白癬、頭部白癬、禿瘡、白癬性毛瘡、又は爪真菌症に関係する問題であり得る。本発明は、非常に具体的には、爪真菌症のスクリーニング、治療的経過観察、及び/又は診断に関する。
【００３１】
従って、また、本発明は、爪真菌症のスクリーニング、治療的経過観察、及び/又は診断の方法における使用のための、ジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、スブチリシン様プロテアーゼ7、ロイシンアミノペプチダーゼ1、及びロイシンアミノペプチダーゼ2から選択される、少なくとも一つのプロテアーゼに関する。
【００３２】
「治療的経過観察」は、本発明による使用、より具体的にはTrichophyton属菌の感染の治療の進行を把握するために、ヒト又は動物の皮膚、若しくはその付属器のサンプル中のTrichophyton属菌の存在を検出するための方法を意味する。
【００３３】
第1の変型例によると、本発明による使用、より具体的にはヒト又は動物の皮膚若しくはその付属器のサンプル中にTrichophyton属菌の存在を検出するための方法は、ジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、スブチリシン様プロテアーゼ7、ロイシンアミノペプチダーゼ1、及びロイシンアミノペプチダーゼ2から選択される少なくとも一つのプロテアーゼを、定量的質量分析(MRM:多重反応モニタリング)により判定する工程を含む。
【００３４】
MRM法は、所与のタンパク質のペプチドを標的とし、それのみを検出して定量化することができる質量分析装置を使用することで、複合混合物中の所与のタンパク質の検出及び定量を可能にする。質量分析解析は、好ましくは、基本的に、上流にnano-HPLCを連結し、MS/MSモードで種々の質量スペクトルを用いて行う。また、ペプチドのアッセイは、MALDI型の種々の（イオン化）ソースを用いても実施することができる。
【００３５】
本発明によれば、この工程は、特に、定量的質量分析により、前記プロテアーゼの一つに属する、少なくとも一つのペプチド配列、好ましくは以下のペプチド配列の一つを特定することで構成される:
- 配列番号1: LSVAEGVGLFNVLQEK
- 配列番号2: ALVSHDGTFVGSSK
- 配列番号3: GGVGIWISDAK
- 配列番号4: INFVGYGQSTTK
- 配列番号5: TLYVTAEDHATGK
- 配列番号6: AAGAIVYNNVPGSLAGTLGGLDK
- 配列番号7: VSFGIITDNVNANLTK
- 配列番号8: LIVGFVTELAK
- 配列番号9: HANAVNAMIATLSK
- 配列番号10: KPGGTTYYYDPSAGK
- 配列番号11: MANDVIQSPGEGTTGK
- 配列番号12: VLDCDGSGSNSGVIK
- 配列番号13: ADFSNYGAVVDVYAPGK
- 配列番号14: SVMNMSLGGPR
- 配列番号15: QMAIDVIQNPGASTTSK
【００３６】
配列1から5は、ジペプチジルペプチダーゼVに特異的であり、配列6は、ロイシンアミノペプチダーゼ2に特異的であり、配列7から9は、ロイシンアミノペプチダーゼ1に特異的であり、配列10から14は、スブチリシン様プロテアーゼ6に特異的であり、配列15は、スブチリシン様プロテアーゼ7に特異的である。
【００３７】
ジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、スブチリシン様プロテアーゼ7、ロイシンアミノペプチダーゼ1、又はロイシンアミノペプチダーゼ2に属するペプチド配列の少なくとも1つを検出することは、サンプル中のTrichophyton属菌の存在、及び結果としてこのTrichophyton属菌の存在に関連する疾患の存在に特有である。
【００３８】
この方法により、存在するTrichophyton属菌を高感度で、高特異的に、及び高選択的に検出することができる。また、別の利点によれば、これにより、検出されたプロテアーゼを定量することができ、結果として、サンプル中に存在するTrichophyton属菌を定量することができる。
【００３９】
別の変形例によれば、本発明による使用、より具体的には、ヒト又は動物の皮膚若しくはその付属器のサンプル中のTrichophyton属菌の存在を検出するための方法は、サンプル中の、ジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、スブチリシン様プロテアーゼ7、ロイシンアミノペプチダーゼ1、又はロイシンアミノペプチダーゼ2から選択される少なくとも一つのプロテアーゼ、好ましくはジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、及びロイシンアミノペプチダーゼ2から選択される少なくとも一つのプロテアーゼの存在を判定するための免疫学的試験の実施を含む。
【００４０】
特に好適には、この免疫学的試験は、ジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、若しくはロイシンアミノペプチダーゼ2を標的とする少なくとも一つのモノクローナル抗体、又はジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、若しくはロイシンアミノペプチダーゼ2にそれぞれ結合することができる、この抗体のフラグメントの使用を含む。
【００４１】
この抗体は、特に免疫検出系、例えば液相免疫検出(例えばELISA)、若しくは半固体相検出、又は側方流動(ラテラルフロー)系に基づく方法によるジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、又はロイシンアミノペプチダーゼ2の存在の検出及び特定に使用され得る。類似の系は周知であり、例えばA群ベータ溶血性連鎖球菌咽頭炎の迅速診断(Streptatest)として周知である。
【００４２】
質量分析と同様に、この方法により、高感度で、高特異的にTrichophyton属菌の存在を検出することができる。有利なことに、この方法は、誰でも使用でき、迅速に、一般的には15分以内に、結果を得ることができる。
【００４３】
また、この方法の実施にあたって、本発明は、ジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、若しくはロイシンアミノペプチダーゼ2を直接標的とするモノクローナル抗体、又はジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、若しくはロイシンアミノペプチダーゼ2にそれぞれ結合することができる、これらの抗体のフラグメントにも関する。これらの抗体は、例えば、ジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、又はロイシンアミノペプチダーゼ2のげっ歯類への接種に基づく古典的な方法によって得られる。このタンパク質、又は、精製した、若しくは遺伝子操作により得られた組換え体のこれらのタンパク質のフラグメントを、免疫原として使用する。
【００４４】
最後の目的によれば、本発明は、少なくとも一つのTrichophyton属菌の感染と関連した、皮膚及び/又はその付属器の疾患を診断するためのキットであって、ジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、若しくはロイシンアミノペプチダーゼ2を直接標的とする少なくとも一つのモノクローナル抗体、又はジペプチジルペプチダーゼV、スブチリシン様プロテアーゼ6、若しくはロイシンアミノペプチダーゼ2にそれぞれ結合することができる、これらの抗体のフラグメントを含むキットに関する。特に好適な実施態様によれば、キットは爪真菌症の迅速な診断のためのキットである。
【００４５】
以降、本発明は、本発明を説明し、特に感染した対象におけるTrichophyton属菌の存在の検出に関するその高い特異性を示す、非限定的な試験の実施例を用いて説明される。爪又は皮膚のサンプルに基づき、ある試験は質量分析によって行われ、他の試験は免疫検出によって行われた。
【実施例】
【００４６】
[I.  各種試験に適用可能な試料の分析のためのプロトコル]
[I.1タンパク質の抽出]
健康なヒトの皮膚のサンプルは、生検によって得られ、DPPVが存在しないことを立証するためのネガティブコントロールを構成する。
【００４７】
ヒトの爪からのサンプルは、爪真菌症又は他の爪障害の患者の爪床を削り取ることによって得られる。
【００４８】
各サンプルについて：タンパク質を抽出し、50mM重炭酸アンモニウム及び0.1％非イオン性界面活性剤ALS-400(Proteabio参照）を含む、質量分析法による分析に適合した溶液中で可溶化した。Thermo mixer(Eppendorf)中で、1400rpmの速度で撹拌しながら、4℃、2時間抽出を行った。可溶化されたタンパク質を含む上清を遠心分離（14000rpm、4℃、10分間）により回収した。不溶性の残骸を、14000rpm、4℃、10分間の遠心分離により、0.22μmのフィルター(Millipore, Billerica, United States, ref: UFC30GVNB)で濾過して取り除いた。
【００４９】
[I.2免疫検出：ウエスタンブロット]
ウエスタンブロット分析を、以下のプロトコルに従い、SDS-PAGEでタンパク質を分離した後に行う。 
1. iBlot(商標) Gel Transfer Device system (Invitrogen, US)を用いて、タンパク質をゲルからニトロセルロースメンブレンにトランスファーする。
2. 1×PBSを用いてメンブレンを5分間湿らせる。
3. Odysseyブロッキングバッファーを用いて、室温で1時間、メンブレンの非特異的部位をブロックする(0.4 ml/cm2)。
4. 一次抗体(総血清抗プロテアーゼ)を、Odysseyブロッキングバッファー(LI-COR Biosciences, Germany)中で1:3000に希釈する。穏やかに攪拌しながら、一晩インキュベートする。
5. メンブレンを0.1%Tween 20を含む1×PBSで10分間洗浄する(3回連続洗浄)。
6. 遮光しながら、IRDye 800CWで標識した二次抗体を、Odysseyブロッキングバッファー中で1:5000に希釈する。
7. 遮光しながら、60分間インキュベートする。
8. 遮光しながら、メンブレンを0.1%Tween 20を含む1×PBSで10分間洗浄する。3回洗浄する。
9. 遮光しながら、Tween20を取り除くためにメンブレンを1×PBSで10分間洗浄する。
10. 赤外線検出のために膜をスキャンする(Odyssey LI-COR, Germany)。
【００５０】
[I.3質量分析]
質量分析は、トリプル四重極のQSTAR(登録商標) XL (APPLIED BIOSYSTEMS)を用い、基本的には、上流にnano-HPLCを連結したMS/MSモードで行った。
【００５１】
質量分析のためのサンプル調製は、タンパク質のジスルフィド架橋の還元及びアルキル化工程、その後の酵素消化の工程（トリプシンが現在最も使用されている）を含む。消化により得たペプチドを、その後、質量分析によって分析する。
【００５２】
酵素消化は、ゲルの中で直接行ってもよく:「ゲル内消化(in-gel digestion)」、又は溶液中で行ってもよい。「ゲル内消化」の場合、タンパク質を事前にSDS-PAGEで分離しておく。一方、溶液中での消化では、全てのタンパク質の消化を、全く同一のタンパク質画分内で行うことができる。この方法は、サンプルがそれほど複雑でない場合、又はサンプルがSDS-PAGEでの分離に適合しない場合に、一般的に用いられる。SDS-PAGEとゲル内消化との組み合わせは、タンパク質を変性及び分離させることにより、非常に多量に存在して立体障害により質量分析を妨害するタンパク質の影響を制限するという利点を示す。
【００５３】
消化の方法の選択は、主に、分析するサンプルの量と複雑さに依存する。 
【００５４】
溶液中での直接消化： 
タンパク質サンプルについて、ジスルフィド架橋を還元し、アルキル化し、その後トリプシンによる消化を行った。この工程は、還元剤のジチオスレイトール(DTT, Sigma Aldrich)、及びアルキル化剤のヨードアセトアミドを用いて行った。最初に、臨床サンプルを、100 mM重炭酸アンモニウム緩衝液中、10 mMジチオスレイトール存在下で56℃、45分間、攪拌しながらインキュベートし、その後、55 mMヨードアセトアミドと共に、遮光しながら、室温で30分間インキュベートした。
【００５５】
タンパク質を「切断」してペプチドにするために、トリプシンを使用し、その後質量分析によって分析した。
【００５６】
トリプシンは、リジン及びアルギニンのアミノ酸の後のC末端側のペプチド結合を、その次のアミノ酸がプロリンでない場合、特異的に加水分解する(Lys-|-Xaa又はArg-|-Xaa)。トリプシンの量は、酵素の濃度が高すぎる場合に起こるトリプシンの自己消化を回避するために、又はトリプシンの濃度が低すぎる場合に起こるタンパク質の不十分な加水分解を回避するために、1/10から1/100の間の比率(酵素/基質)で用いた。
【００５７】
トリプシンによる溶液中での消化を、あらかじめ1mM HCl溶液中で希釈したトリプシンの溶液(1 mg/ml)に基づいて、1/100から1/10の間の酵素/基質比で行った。インキュベーションを、攪拌しながら37℃で一晩行った。
【００５８】
「ゲル内」消化： 
「ゲル内」消化の前に、臨床サンプルにおいて、「溶液中での直接消化」の節に記載したプロトコルに従って、ジスルフィド架橋の還元、その後アルキル化を行った。「ゲル内」消化を以下の工程に従って進めた:
1. 外科用メスを用いて、目的のストリップを、染色されたゲルのみが含まれるように気をつけながら、1-1.5 mmの大きさの等しい断片にゲルから切り出した。
2. 切り出したゲル片を2mlのプラスチックチューブ(Eppendorf, France)に入れた。
3. ゲル片を、40％アセトニトリル(ACN)を含む120 mM重炭酸アンモニウム200 μlに浸し、その後37℃で30分間インキュベートした。溶液を取り除いた。
4. 工程3を1回繰り返した。
5. SpeedVac (Eppendorf, France)を用いてゲル片を15分間乾燥した。
6. トリプシン溶液(0.6 μg)を、ゲルを入れたチューブに加えた。ゲルが浸るように加える酵素の量を調整した。
7. 9% ACNを含む40 mM重炭酸アンモニウム約50μlを、ゲル片が浸るようにチューブに加えた。
8. 37℃で一晩インキュベーションを行った。
9. インキュベーション後、ペプチドを含有する溶液を、新しいチューブに移した。
10. 0.1％ギ酸を含む50％ACN溶液50 μlを、ゲル片の入ったチューブに、37℃で30分間、攪拌しながら加えた。
11. 抽出されたペプチドを含有する溶液を、Ultrafree-MC 0.22 μmフィルター(Millipore, United States)を用いて1750 rpm、2分間遠心濾過し、残ったゲル片を取り除いた。
12. 工程11で回収した濾液を、SpeedVac (Eppendorf Concentrator 5301, France)で60分間濃縮した。
13. 0.1％ギ酸を含む10％ACN溶液20 μlをチューブに加え、その後溶液を質量分析による分析のための特別なチューブに移した。
【００５９】
[I-4ナノHPLC - QSTAR（登録商標）XL（MS / MS）カップリング]
HPLCシステム(LC Packing/DIONEX)は、ナノ流量(200 nanoL/分のオーダー)を送達するための分配器を備えたUltimateポンプ、(96ウェルプレートとしても設定可能な)Famosサンプルインジェクター、並びにサンプルの予備濃縮及び質量分析による検出を妨げ得る塩の除去ができるSwitchosポンプから構成されている。
【００６０】
移動相は、相A(95体積の水、5体積のACN及び0.1体積のギ酸)及び相B(95体積のACN、5体積の水、及び0.1体積のギ酸)から構成され、流量は200 nL/分で、ペプチドを分離するためのグラジエントに従う。クロマトグラフィー分離は、3 μmの粒度分布を有するAtlantis C18, Watersカラム(75 μm×15 cm)上で行われる。
【００６１】
サンプルの予備濃縮を長さ5 mm、直径300 μm、粒度分布5 μmのC18 LcPakingカラム上で行う。予備濃縮のための移動相は、相C(97体積の水、3体積のACN、及び0.1体積のギ酸)から構成され、流量は30 μL/分である。注入後、3分後にバルブの切り替えを行う。注入量は1μLであるが、分析の種類により、10 μLまで増量してもよい。
【００６２】
質量分析： 
質量分析装置は、ナノエレクトロスプレーソース(nanoESI)から構成され、ニードル電圧は1000Vから2000Vの間であり、キャリブレーション時に設定される。分解能は質量879.9 amu(原子質量単位)で11000から13000の間であり、カーテンガスのレベルは30である。全てのスペクトルは、陽イオン反射モードで取得された。
【００６３】
四重極分析器を、アルゴン衝突セル内でフラグメント化を生じさせるために使用した。400amuより大きく、1200amuより小さく、電荷状態が2amuから3amuの間であり、アバンダンスが10カウントより大きいイオンに対して、フラグメント化を行う。イオンは、捕捉から20秒後、4.0amuのウインドウで排除され、各MS/MSで取得されるスキャン数は1又は2である。ラン(分析実行)の継続時間は、サンプルに依って80分から90分まで変動し、およそ10ラン毎に、グルタミン酸デヒドロゲナーゼの分解物を50フェムトモルの濃度で注入することにより、品質管理を行う。グルタミン酸デヒドロゲナーゼの分解物が、Mascotソフトウェアを用いて5より多い顕著なペプチドにおいて特定されれば、分析は有効であると考えられる。
【００６４】
データ取得のため、及び機器の制御のためにAnalyst QS 1.0ソフトウェア(Applied Biosystems)を使用した。
【００６５】
[II.  免疫検出により実施した試験]
本発明による有用なプロテアーゼの検出特異性を、特に、Trichophyton属菌の一種(Trichophyton rubrum)から分泌されることが知られている他のプロテアーゼや、サンプル中に存在する可能性がある他のプロテアーゼと対比して、実証するための試験を行った。
【００６６】
これらの試験は:
・爪真菌症の人のTrichophyton rubrumに感染した爪
・負傷した爪
のサンプルを用いたウエスタンブロット法により行った。
【００６７】
試験したプロテアーゼは:
・ジペプチジルペプチダーゼIV（DDPIV）、 
・ジペプチジルペプチダーゼV（DDPV）、
・スブチリシン様プロテアーゼ3（SUB3）、 
・スブチリシン様プロテアーゼ4（SUB4）、 
・スブチリシン様プロテアーゼ6（SUB6）、 
・スブチリシン様プロテアーゼ7（SUB7）、 
・ロイシンアミノペプチダーゼ2（LAP2）、及び 
・金属カルボキシペプチダーゼ（M14A） 
である。
【００６８】
得られた結果を以下の表に示す:
【００６９】
【表１】
2016511390.tif 000003
【００７０】
これらの結果は、Trichophyton属菌に感染した爪において、ウエスタンブロットにより、プロテアーゼDPPV、SUB6、SUB7、及びLAP2のみが検出されていることを示す。
【００７１】
さらに、これらのプロテアーゼは、Trichophyton属菌に感染していない、負傷した爪には存在していないことがわかる。
【００７２】
Trichophyton属菌に感染していない肌又は爪の他のサンプルと対比して、Trichophyton属菌に感染した爪の層でのプロテアーゼDPPV、SUB6、SUB7、及びLAP2の存在の特異性を実証するために、他の試験を実施した。
【００７３】
これらの試験は:
・爪真菌症の人のTrichophyton rubrumに感染した爪 
・健康な皮膚 
・健康なヒトの皮膚の角質層（上皮の表面層） 
・負傷した爪、及び
・乾癬に罹患した爪
のサンプルを用いたウエスタンブロット法により行った。
【００７４】
得られた結果を以下の表に示す:
【００７５】
【表２】
2016511390.tif 000004
【００７６】
これらの結果も、また、Trichophyton属菌に感染した爪のサンプルにおけるプロテアーゼDPPV、SUB6、SUB7、及びLAP2の存在の特異性を示す。
【００７７】
[III.  定量的質量分析により実施した試験]
本発明による有用なプロテアーゼの検出特異性を、別の判定手段を用いて実証するために、追加試験を行った。
【００７８】
これらの試験は、 
・爪真菌症の人におけるTrichophyton rubrumに感染した爪、及び
・負傷した爪 
のサンプルを用い、質量分析法により行った。
【００７９】
試験したプロテアーゼは: 
・ジペプチジルペプチダーゼIV（DDPIV）、 
・ジペプチジルペプチダーゼV（DDPV）、 
・スブチリシン様プロテアーゼ3（SUB3）、 
・スブチリシン様プロテアーゼ4（SUB4）、 
・スブチリシン様プロテアーゼ6（SUB6）、 
・スブチリシン様プロテアーゼ7（SUB7）、 
・ロイシンアミノペプチダーゼ1（LAP1）、 
・ロイシンアミノペプチダーゼ2（LAP2）、及び 
・ 金属カルボキシペプチダーゼ（M14A）
である。
【００８０】
得られた結果を以下の表に示す:
【００８１】
【表３】
2016511390.tif 000005
【００８２】
これらの結果は、Trichophyton属菌に感染した爪において、例えばTrichophyton rubrumなどのTrichophyton属菌によって分泌されることが知られている、他のプロテアーゼと対比して、プロテアーゼDPPV、SUB6、SUB7、LAP2、及びLAP1のみが、質量分析により検出されていることを示す。
【００８３】
さらに、これらのプロテアーゼDPPV、SUB6、SUB7、LAP2及びLAP1は、Trichophyton属菌に感染していない、負傷した爪には存在していないことがわかる。
【００８４】
他の皮膚糸状菌に感染した爪、他の疾患を呈する爪、又は負傷した爪と対比して、Trichophyton属菌に感染した爪の層での、本発明による有用なプロテアーゼの一つ、すなわちSUB6の存在の特異性を実証するために、他の試験を実施した。
【００８５】
これらの試験は、以下の表に示す爪のサンプルを用いて質量分析により実施した。
【００８６】
【表４】
2016511390.tif 000006
【００８７】
質量分析法によって試験される、SUB6の存在を反映する配列は、以下の通り:
・配列番号11: MANDVIQSPGEGTTGK
・配列番号12: VLDCDGSGSNSGVIK
【００８８】
サンプル中のSUB6の検出について得られた結果を、以下の表に示す: 
【００８９】
【表５】
2016511390.tif 000007
【００９０】
これらの結果は、プロテアーゼSUB6の検出が、試験したサンプル中の少なくとも1種のTrichophyton属菌の存在に特異的であることを再度確認する。
【００９１】
[IV -ジペプチジルペプチダーゼVの免疫検出(ELISA)]
Trichophyton rubrumに特異的なジペプチジルペプチダーゼV(配列のUniprotコード: Q9UW98)を、組換えタンパク質の形で取得し、精製した。
【００９２】
精製後の組換えジペプチジルペプチダーゼVのSDS-PAGE解析により、このタンパク質は、見かけの分子量が約80 kDaで、分解されていない単一のタンパク質の形であることが示された。
【００９３】
ジペプチジルペプチダーゼVの精製された、変性していない形態は、古典的な方法によりマウスでモノクローナル抗体を生産するための抗原として機能し、その方法は、https://secure.eurogentec.com/EGT/files/Pro-monoclon DEV-0409-V2.pdf(Eurogentec, France)に記載される方法に従う;又は参考文献Kohler G, Milstein C., (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. (5517): 495-7に従う。
【００９４】
クローンを、「antibody pair buffer kit」(InVitrogen, ref. CNB0011)のプロトコルに従って選択した。
【００９５】
簡単に述べると、MAXISORPプレートにASSAY BUFFERで希釈した2μg/mLの濃度のDPPVを、ウェルあたり50μl入れ、300 rpmで攪拌しながら37℃で3時間インキュベートする。
【００９６】
WASH BUFFER 200 μL/ウェルで4回プレートを洗浄する。
【００９７】
ASSAY BUFFERで1:1000に希釈した試験抗体を含有する溶液を、ウェルあたり50 μLの割合で加え、300 rpmで攪拌しながら、37℃、2時間インキュベートする。
【００９８】
WASH BUFFER 200 μL/ウェルで4回プレートを洗浄する。
【００９９】
ASSAY BUFFERで希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（抗マウスウサギ抗体）を100 μL/wellの割合で加え、300 rpmで攪拌しながら、室温で30分間インキュベートする。
【０１００】
WASH BUFFER 200 μL/ウェルで4回プレートを洗浄する。
【０１０１】
ウェルあたり100 μlの酵素基質3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB）を加え、青い着色が現れたら、1Mリン酸(停止緩衝液）50μLで反応を15分から30分停止する。450nmにおいて分光光度計で読み取る。
【０１０２】
この方法で複数のクローンを取得し、特性評価を行った。
【０１０３】
【表６】
2016511390.tif 000008
【０１０４】
ジペプチジルペプチダーゼV(DPPV)を、2μg/mlの濃度で使用した。DPPVタンパク質と接触させたクローンと、緩衝液のみと接触させたクローンとの間の光学濃度の差(デルタOD)は、モノクローナル抗体の免疫反応性を示している。ポジティブコントロールは、クローンを取得するためにマウスに免疫付与する目的で使用された血清(飽和バッファーで1/1000希釈)から構成されている。ブランクは、クローン無しの条件に対応する。
【０１０５】
InVitrogen(ref. CNB0011)の"antibody pair buffer kit"に記載されるプロトコルに従って、コンジュゲート-ビオチンのペアを特定するために、2つの異なるモノクローナル抗体及び組換えタンパク質に基づくサンドイッチELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）タイプの古典的なアッセイを使用した。
【０１０６】
簡単に述べると、PBS中2 μ/mLの濃度の捕捉抗体(ビオチン化されていない)が入ったMAXISORPプレートを4℃及び37℃で一晩インキュベートする。
【０１０７】
プレートを150 μLのASSAY BUFFERで満たし、その後300 rpmで攪拌しながら、37℃、3時間インキュベートする。
【０１０８】
WASH BUFFER 200 μL/ウェルで3回プレートを洗浄する。
【０１０９】
抗原をASSAY BUFFERで4μg/mL、2μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.001μg/mL、0.005μg/mL、0μg/mLの濃度に希釈したものをウェル当たり50μL入れる。
【０１１０】
300 rpmで攪拌しながら、37℃で3時間静置する。
【０１１１】
WASH BUFFER 200 μL/ウェルで4回プレートを洗浄する。
【０１１２】
二次抗体BUFFERの溶液を200μl/ウェル追加する。
【０１１３】
ASSAY BUFFERで1/1250に希釈したSTREPAVIDIN-HRP溶液を100 μL/ウェル加え、300 rpmで攪拌しながら、室温、30分間インキュベートする。
【０１１４】
WASH BUFFER 200 μL/ウェルで4回プレートを洗浄する。
【０１１５】
ウェルあたり100μlの酵素基質（TMB）を加え、青い着色が現れたら、1Mリン酸（停止緩衝液）50μLで反応を停止する。15分から30分。
【０１１６】
分光光度計で450nmにおいて読み取る。
【０１１７】
以下に示す実験では、次のサンドイッチELISAプロトコルを採用した:最初の「捕捉」抗体を2μg/mLの濃度で96ウェルプレート(Greiner)の底部に吸収させる。DPPVタンパク質を0.2μg/mLの濃度で用いる。ビオチンに結合した二次抗体(検出抗体)を、0.01μg/mLの濃度で用いる。
【０１１８】
ブランクは、OD = 0.06; ジペプチジルペプチダーゼV無しの対照：OD = 0.1、捕捉抗体無しの対照は、OD = 0.07と、測定される。
【０１１９】
【表７】
2016511390.tif 000009
【０１２０】
クローン8H4B11B12C10を捕捉抗体として、及びクローン6C4B12F12D9を検出抗体として含む抗体のペアが、サンドイッチELISAを実施するために最も有望であり、これを採用した。
【０１２１】
サンドイッチELISAを構築するために、異なる濃度のDPPVを使用することにより、アッセイ可能な最低濃度を判定することができた(図1参照)。
【０１２２】
ジペプチジルペプチダーゼVのELISA検出のための標準曲線に基づくと、得られたジペプチジルペプチダーゼVの定量限界は、0.0005μg/mlである。ブランク: OD= 0.11; DPPV 0.0005μg/ml: OD= 0.4
【０１２３】
Trichophyton rubrumに感染した爪由来の様々な生体サンプルについて、及び他の病原菌に感染した爪の生体サンプルについても、ジペプチジルペプチダーゼVを分析した。さらに、真菌陰性を示す(乾癬、負傷)爪のサンプル、及び健康な肌由来のサンプルも、使用した。タンパク質の抽出は上記に記載の通り行った。
【０１２４】
生体サンプルにおけるDPPVの検出は、標準的な範囲で記載される通りに(精製組換えDPPVタンパク質を使用して)実施した。生体サンプル中の総タンパク質濃度は、Bradford法により決定した。アッセイにより得られ、μg/mLで表されたDPPV濃度は、Bradford法により決定した総タンパク質濃度に対して標準化され、(DPPVのμg)/(総タンパク質のmg)で表された。
【０１２５】
【表８】
2016511390.tif 000010
【０１２６】
データは、ELISAの良好な感度及び高い特異性（Trichophyton属菌を含むサンプルのみがELISAで陽性である）を示す。
【図１】
2016511390.tif 000011
【配列表】
2016511390000001.app
【国際調査報告】
2016511390.tif 000012
2016511390.tif 000013
2016511390.tif 000014
2016511390.tif 000015
2016511390.tif 000016
2016511390.tif 000017