(57)【要約】  本開示は、植物材料中の異種ＤＮＡを検出するシステムおよび方法に関する。
2016511002.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物ＤＮＡを含むサンプルにおいて複数の異種核酸のうち１つまたは複数を同定する方法であって、それぞれの前記異種核酸が、５’から３’方向に、前記複数のメンバーのすべての間で同一であるヌクレオチド配列を有する第１のポリヌクレオチド；前記複数のメンバーのすべての中で固有であるヌクレオチド配列を有する第２のポリヌクレオチド；および前記複数のメンバーのすべての間で同一であるヌクレオチド配列を有する第３のポリヌクレオチドを含むアンプリコンを含み、前記方法が、
植物ＤＮＡを含む前記サンプルを提供するステップと；
前記植物ＤＮＡを、第１および第３のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする一対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップと；
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、前記サンプル中の異種核酸に存在するそれぞれの前記アンプリコンを増幅させるステップと；
前記アンプリコンを、第２のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む少なくとも１種のプローブ分子と接触させるステップであって、第２のポリヌクレオチドを含むアンプリコンへの前記プローブの特異的ハイブリダイゼーションが検出可能なシグナルを生成する、ステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記複数の異種核酸のそれぞれが目的の遺伝子を含み、第２のポリヌクレオチドが、前記複数の異種核酸のそれぞれにおいて前記目的の遺伝子の外側にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１のポリヌクレオチドと第３のポリヌクレオチドが両方とも、前記複数の異種核酸のそれぞれにおいて前記目的の遺伝子の外側にある、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記プローブ分子がフルオロフォアおよびクエンチャーを含み、オリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第２のポリヌクレオチドを含むアンプリコンのＰＣＲ増幅がプローブ分子中のクエンチャーからフルオロフォアを遊離し、それによって検出可能な蛍光シグナルが生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アンプリコンがそれぞれ約７０ヌクレオチド長から約８０ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第２のポリヌクレオチドがそれぞれ約１５ヌクレオチド長から約２５ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第２のポリヌクレオチドが、それぞれのアンプリコン内の第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドに直接隣接している、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記植物ＤＮＡを前記オリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップ、それぞれの前記アンプリコンを増幅させるステップ、および前記アンプリコンを前記プローブ分子（複数可）と接触させるステップがエンドポイントＰＣＲ反応で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記植物ＤＮＡを前記オリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップ、それぞれの前記アンプリコンを増幅させるステップ、および前記アンプリコンを前記プローブ分子（複数可）と接触させるステップがリアルタイムＰＣＲ反応で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルが、前記サンプル中のＤＮＡの総量と比較して少なくとも約８．３３×１０−８％の量で異種核酸を含み、検出可能なシグナルが、前記プローブの前記異種核酸内の前記アンプリコンへの特異的ハイブリダイゼーションによって生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記異種核酸が目的の作物栽培遺伝子であり、前記サンプルが、前記目的の作物栽培遺伝子を導入するための形質遺伝子移入プログラムにおける植物由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプルが前記異種核酸を含まないことを特定するために実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
遺伝子組換え植物において複数の異種核酸のうち１つまたは複数を検出するためのシステムであって、
植物発現ベクターのセットであって、それぞれのベクターが、５’から３’方向に、
第１のポリヌクレオチド、
セットのベクターのすべての中で固有であるヌクレオチド配列を有する第２のポリヌクレオチド、および
第３のポリヌクレオチド
を含む異種核酸を含む発現カセットを含む、植物発現ベクターのセットと；
第１のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする普遍的フォワードプライマーオリゴヌクレオチドと；
第３のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする普遍的リバースプライマーオリゴヌクレオチドと
を含む、システム。
【請求項１４】
前記システムがプローブ分子のセットをさらに含み、それぞれのプローブ分子が、前記セット中のベクターの１種のみの第２のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含み、第２のポリヌクレオチドを含むアンプリコンへの前記プローブの特異的ハイブリダイゼーションが検出可能なシグナルを生成する、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記発現カセットが、前記目的の遺伝子に作動可能に連結されている１つまたは複数の制御因子を含む、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１６】
前記発現カセットのそれぞれが目的の遺伝子を含み、第２のポリヌクレオチドが、複数の異種核酸のそれぞれにおいて前記目的の遺伝子の外側にある、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１７】
第１のポリヌクレオチドと第３のポリヌクレオチドの両方が、前記発現カセットのそれぞれにおいて前記目的の遺伝子の外側にある、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１８】
前記プローブ分子がフルオロフォアおよびクエンチャーを含み、また、前記オリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第２のポリヌクレオチドを含む異種核酸のＰＣＲ増幅が前記プローブ分子中の前記クエンチャーから前記フルオロフォアを遊離し、それによって検出可能な蛍光シグナルを生成する、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１９】
前記異種核酸がそれぞれ約７０ヌクレオチド長から８０ヌクレオチド長である、請求項１３に記載のシステム。
【請求項２０】
第２のポリヌクレオチドがそれぞれ約１５ヌクレオチド長から２５ヌクレオチド長である、請求項１３に記載のシステム。
【請求項２１】
第２のポリヌクレオチドが、それぞれの異種核酸内の第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドに直接隣接している、請求項１３に記載のシステム。
【請求項２２】
前記発現ベクターのセットの少なくとも１つで形質転換された植物由来のＤＮＡを含む少なくとも１種のサンプルをさらに含む、請求項１３に記載のシステム。
【請求項２３】
遺伝子組換え植物において複数の異種核酸のうち１つまたは複数を検出する方法であって、
請求項２２に記載のシステムを提供するステップと；
植物由来のＤＮＡを、普遍的フォワードプライマーおよび普遍的リバースプライマーと接触させるステップと；
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、セット中のベクター由来の異種核酸を増幅させるステップと；
第２のポリヌクレオチドのうち１つまたは複数を検出するステップと
を含む、方法。
【請求項２４】
前記セット中の前記ベクター由来の複数の前記異種核酸が増幅される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
第２のポリヌクレオチドのうち１つまたは複数を検出するステップが前記増幅核酸を１つまたは複数のプローブ分子と接触させるステップを含み、それぞれのプローブ分子が、前記セット中の前記ベクターの１種のみの第２のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含み、第２のポリヌクレオチドを含むアンプリコンへのプローブの特異的ハイブリダイゼーションが検出可能なシグナルを生成する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＤＮＡを前記普遍的フォワードプライマーおよび前記普遍的リバースプライマーと接触させるステップ、前記異種核酸を増幅させるステップ、ならびに前記増幅異種核酸を前記プローブ分子（複数可）と接触させるステップが加水分解プローブＰＣＲアッセイにおいて実施される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
第２のポリヌクレオチドのうち１つまたは複数を検出するステップが、前記増幅核酸を配列決定するステップを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
配列番号１〜２１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む核酸。
【請求項２９】
配列番号２２〜４２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２８に記載の核酸。
【請求項３０】
遺伝子組換え生物において外来性核酸を検出するためのシステムであって、
前記システムが、
配列番号１〜２１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む少なくとも１種の核酸と；
前記システムにおいて前記少なくとも１種の核酸（複数可）のそれぞれに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む少なくとも１種のプローブ分子と
を含む、システム。
【請求項３１】
配列番号１〜２１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む前記核酸が、配列番号２２〜４２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項３０に記載のシステム。
【請求項３２】
配列番号１〜２１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む前記核酸に特異的にハイブリダイズする２種のプライマーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項３０に記載のシステム。
【請求項３３】
配列番号２２〜４２からなる群から選択される前記ヌクレオチド配列内の部位で前記核酸に特異的にハイブリダイズする２種のプライマーオリゴヌクレオチドをさらに含み、前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号１〜２１からなる群から選択される前記ヌクレオチド配列内の部位で前記核酸に特異的にハイブリダイズしない、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３４】
植物ＤＮＡを含むサンプルにおいて複数の異種核酸のうち１つまたは複数を同定する方法であって、それぞれの異種核酸が、５’から３’方向に、前記複数のメンバーのすべての間で同一であるヌクレオチド配列を有する第１のポリヌクレオチド；前記複数のメンバーのすべての中で固有であるヌクレオチド配列を有する第２のポリヌクレオチド；および前記複数のメンバーのすべての間で同一であるヌクレオチド配列を有する第３のポリヌクレオチドを含むアンプリコンを含み、前記方法が、
植物ＤＮＡを含む前記サンプルを提供するステップと；
前記植物ＤＮＡを、第１および第３のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする一対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップと；
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、前記サンプル中の異種核酸に存在するそれぞれのアンプリコンを増幅させるステップと；
前記増幅アンプリコンを配列決定して、前記固有の第２のポリヌクレオチドのうち１つまたは複数の存在を判定するステップと
を含む、方法。
【請求項３５】
前記複数の異種核酸のそれぞれが目的の遺伝子を含み、第２のポリヌクレオチドが、複数の異種核酸のそれぞれにおいて前記目的の遺伝子の外側にある、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
第１のポリヌクレオチドと第３のポリヌクレオチドが両方とも、前記複数の異種核酸のそれぞれにおいて前記目的の遺伝子の外側にある、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記アンプリコンがそれぞれ約７０ヌクレオチド長から約８０ヌクレオチド長である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
第２のポリヌクレオチドがそれぞれ約１５ヌクレオチド長から約２５ヌクレオチド長である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
第２のポリヌクレオチドが、それぞれのアンプリコン内の第１のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドに直接隣接している、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記植物ＤＮＡを前記オリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップ、それぞれの前記アンプリコンを増幅させるステップ、および前記アンプリコンを前記プローブ分子（複数可）と接触させるステップがエンドポイントＰＣＲ反応で実施される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記植物ＤＮＡを前記オリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップ、それぞれのアンプリコンを増幅させるステップ、および前記アンプリコンを前記プローブ分子（複数可）と接触させるステップがリアルタイムＰＣＲ反応で実施される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
前記サンプルが、前記サンプル中のＤＮＡの総量と比較して少なくとも約８．３３×１０−８％の量で異種核酸を含み、検出可能なシグナルが、前記プローブの異種核酸内のアンプリコンへの特異的ハイブリダイゼーションによって生成される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
前記異種核酸が目的の作物栽培遺伝子であり、前記サンプルが、前記目的の作物栽培遺伝子を導入するための形質遺伝子移入プログラムにおける植物由来である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４４】
前記サンプルが前記異種核酸を含まないことを特定するために実施される、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本願は、固有外来性遺伝因子のセットについて植物材料を分析するためのシステムおよび方法（SYSTEM AND METHOD FOR ANALYSIS OF PLANT MATERIAL FOR SET OF UNIQUE EXOGENOUS GENETIC ELEMENTS）に関する、２０１３年３月１５日出願の米国仮特許出願第６１／７９９，３３０号の利益を主張する。
【０００２】
本開示は、植物の生物工学に関する。本開示の実施形態は、遺伝子組換え植物およびそれから得られる産物の産生および商品化を経てトランスジェニック事象（transgenic event）を検出および追跡するためのシステムおよび方法における固有外来性遺伝因子の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）、例えば、遺伝子組換え植物は、通常、移植生物体への異種遺伝子構築物の挿入が関与する少なくとも１つの形質転換事象と定義される。異種遺伝子構築物は、典型的には、少なくとも１つの目的の遺伝子と遺伝子発現の調節を行うための制御領域とを含む、いくつかの因子から構成されている。さらに、構築物は、クローニングベクター由来のＤＮＡ配列に隣接させることができる。大部分の遺伝子組換え植物は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター（Ｐ−３５Ｓ）および／またはＣａＭＶ  ３５Ｓターミネーター（Ｔ−３５Ｓ）、またはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ノパリンシンターゼターミネーター（Ｔ−Ｎｏｓ）を含有する構築物で形質転換されている。最も一般的に使用されているクローニングベクターは、アンピシリン（ｂｌａ）抗生物質に対する耐性をコードしている遺伝子を含有するｐＢＲ３２２、およびネオマイシン／カナマイシン（ｎｐｔｌｌ）抗生物質に対する耐性をコードしている遺伝子を含有するベクターに由来する。
【０００４】
多くの理由によりＧＭＯの検出が切望されている。例えば、定性的検出は、認可されていないＧＭＯ材料またはこうした材料の使用の同定に使用することができる。さらに、検出では、安全材料もしくは危険材料を同定すること、または同一性が保存されている材料の純度を認定することが切望されている。定量的検出は、ＧＭＯ混入の法的な、または契約上合意された閾値を順守するために（例えば、有機農法またはシードロット証明の場合などで高純度の生成物が望まれる場合）使用することができる。また検出は、ＧＭＯ材料の追跡が可能になることによって安全性評価とリスク管理での役割を果たすことができる。前述の用途のほとんどにおいて、検出方法に対し高感度であることが求められている。
【０００５】
分析時間と関連コストを低減する、導入遺伝子の検出およびＧＭＯの同定を行う有効な分析方法の開発が長年にわたり極めて盛んな研究分野であった。Morriset et al. (2008) Eur. Food Res. Technol. 227:1287-97。しかし未だに、目下の使用において多数の異種遺伝子構築物および形質転換事象に適切な検出能力を提供する適切な攻略は考案されていない。ＤＮＡは、種子、飼料または高度加工食品サンプルからの抽出後、効率よく検出することができるとの理由から、ＧＭＯのルーチン的な実験室での検出および定量に選択される分析物である。
【０００６】
現在の好ましい導入遺伝子検出方法は、トランスジェニック植物における事象特異的因子（例えば、導入遺伝子配列）を検出する。トランスジェニック事象において統合された一般的な遺伝因子のほとんど（例えば、プロモーター、レポーター遺伝子、ターミネーター）は複数のベクターにおいて頻繁に使用されているので、これらの遺伝因子によって特定の事象を追跡することは困難になる。
【０００７】
検出アッセイに対して所望される感度があるため、ＤＮＡは、典型的には、まず、こうしたアッセイのサンプルからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される。ＰＣＲ系のＧＭＯ検出方法は、それらの特異性のレベルによって分類することができる。それぞれのカテゴリーは、ＰＣＲ反応で増幅されるＤＮＡの同一性に対応する：（１）スクリーニング標的；（２）遺伝子特異的標的；（３）構築物特異的標的；および（４）事象特異的標的。
【０００８】
ＰＣＲ法の第１のカテゴリー（すなわち、スクリーニング標的、例えば、Ｐ−３５Ｓ、Ｔ−３５Ｓ、Ｔ−Ｎｏｓ、ｂｌａ、およびｏｒｎｐｔｌｌ遺伝因子の増幅）は、形質転換材料を検出するための幅広い用途を有する。Matsuoka et al. (2002) J. Agric. Food Chem. 93:35-8。しかし、ＧＭＯ由来のＤＮＡの存在は必ずしもスクリーニング標的の存在から得られるものではないことから、これらの方法はＧＭＯの同定に使用することができない。例えば、Ｐ−３５ＳまたはＴ−３５Ｓの供給源は、天然ＣａＭＶであり得る。Wolf et al. (2000) Eur. Food Res. Technol. 210:367-72。
【０００９】
ＰＣＲ法の第２のカテゴリー（すなわち、目的の遺伝子、例えば、ＣｒｙＩＡ遺伝子の増幅）は、第１のカテゴリーの方法よりも特異的である。Vaitilingom et al. (1999) J. Agric. Food Chem. 47:5261-6。利用可能な（また一般に使用されている）プロモーターおよびターミネーターよりも目的の遺伝子では多くの多様性があり、通常、特定導入遺伝子を増幅するための正のシグナルは、ＧＭ由来ＤＮＡがサンプル中に存在することを意味する。しかし、これらの方法は、目的の同じ遺伝子、例えば、除草剤耐性遺伝子などを含み得る様々なＧＭＯを区別することができない。通常の導入遺伝子が他の遺伝子と共にスタックされ、特に特定のＧＭＯの特性である組み合わせであるので、この欠点は、今後、一層問題化する。
【００１０】
ＰＣＲ法標的の第３のカテゴリー（すなわち、異種遺伝子構築物の隣接する因子間の、例えば、プロモーターと目的の遺伝子の間の結合の増幅）は、今日の技術の限界内において、形質転換事象の唯一の固有シグネチャーを提供する。Zimmerman et al. (1998) Lebensm. -Wiss u Technol. 31: 664-7。残念なことに、事象特異的な方法でさえもそれらに限界がある。例えば、２種のＧＭＯ（例えば、２種の異なるＧＭトウモロコシ、例えば、Ｔ２５およびＭｏｎ８１０）が交雑された場合、得られたハイブリッドの結果は両事象の特性を含んでいる可能性があり、したがって、ＰＣＲ試験でその２種の親を判別することができない。これらの検出方法に関する困難なさらなる限界は、それぞれのＧＭＯの同定に特異的プライマー対が必要とされることである。さらに、構築物の挿入部位に関する情報がプライマーの設計と検出アッセイの実施に必要であるが、このことによって特性決定されていないＧＭＯの検出は不可能である。
【００１１】
新しい手法は、サンプル中に存在する特定のＧＭＯを探索し、同定するための最適なセットの異なる検出方法の選択を含む、一般的な方策に準拠する。Querci et al. (2010) Anal. Bioanal. Chem. 396:1991-2002。最近、多くのＧＭＯに挿入されている特定のＤＮＡ配列と隣接する因子を含む、特定のＧＭＯに対する最適な検出方法についての情報を提供するデータベースが提供された。Dong et al. (2008) BMC Bioinformatics 9:260。新しいＧＭＯが導入され、ＧＭＯ検出に関与する実体についての集合的タスクとして検出方法が調査された場合、データベースは更新され増やされることになっている。このデータベースは、ＧＭＯ試験を実施する分析実験室にとっての有用なツールとなることが期待されている。
【００１２】
しかし、将来、承認されたＧＭＯ植物の数が増加し、そのそれぞれがその独自の最適な検出方法を有することになることから、この一般通念によるＧＭＯ検出は非常に経費がかかるようになる。さらに、単一のＧＭＯに複数の農業形質を組み合わせることがますます一般的になっていく（「遺伝子スタッキング」）。Taverniers et al. (2008) Environ. Biosafety Res. 7:197-218。遺伝子スタッキングは、ＧＭＯ検出に困難な課題をもたらす。単一種子または個々の植物に由来する組織の試験を除き、既存の検出方法は、２種以上の単一形質ＧＭＯ由来の材料の組み合わせ存在と単一のスタックＧＭＯを十分に識別することができない。Akiyama et al. (2005) J. Agric. Food Chem. 55:5942-7；Holst-Jensen et al. (2006) J. Agric. Food Chem. 54:2799-809；Taverniers et al. (2008)、上掲。
【００１３】
近年、マイクロアレイ／チップおよびマルチプレックスＰＣＲを含むＤＮＡ系検出方法について、検出アッセイの感度およびアウトプットを高め、スタックＧＭＯを同定することに関する可能性が調査された。例えば、Tengs et al. (2007) BMC Biotechnol. 7:91を参照されたい。例えば、Peano et al. (2005) Anal. Biochem. 346:90-100およびPrins et al. (2008) BMC Genomics 9:584では、導入遺伝子特異的連結反応、連結オリゴヌクレオチドのＰＣＲ増幅、ハイブリダイゼーションおよびマイクロアレイ検出を組み合わせる手法が報告された。この手法では、増幅したライゲーション産物を標的としたマイクロアレイ表面に固定されている複数のオリゴヌクレオチドタグを使用し、マルチプレックス機能を提供した。このような検出方法およびマルチプレックス手段は、ＧＭＯ検出方法の開発に現在使用されている手法が、異なった多数の事象を含む複雑なサンプルから、将来高感度検出が必要とされるであろうという予測に応えるものであることを示している。
【発明の概要】
【００１４】
本明細書では、多数の固有のトランスジェニック事象の存在を判定するための高特異的かつ高感度の単一ＰＣＲ系検出アッセイを提供するシステムについて記載する。いくつかの実施形態において、本システムおよびその方法は、方法の実施にトランスジェニック事象の組込み部位に関するいかなる情報も必要でない。いくつかの実施例において、一対のオリゴヌクレオチドプライマー（普遍的プライマー対）を使用して、多数の異なる外来性構築物由来のポリヌクレオチドを増幅させ、その後、これを単一アッセイによって特異的に検出することができる。本明細書の実施形態は、類似の熱力学的特性を有し得る固有のヌクレオチド配列（ベクターのセット内）を利用するが、この配列（本明細書の一部の箇所では「固有外来性遺伝因子」または「ＵＧＥ」と呼ぶ）は、特定の導入遺伝子に固有に関連しており、しかも、実質的に、ベクターのセット内の他のこうした固有ヌクレオチドと同じアッセイで検出され得る。本明細書のシステムおよび方法は、複数の導入遺伝子を検出／スクリーニングする単一の手段を提供することができ、その結果、外因存在試験に必要とされる検出アッセイの全体的な数を減らすことができる。
【００１５】
いくつかの実施形態は、植物または植物材料（例えば、種子）中の異種核酸を同定する方法であって、異種核酸が５’ポリヌクレオチド、ＵＧＥ、および３’ポリヌクレオチドを含む、方法を提供する。特定の実施形態において、こうした方法は、植物または植物材料由来のＤＮＡを含むサンプルを提供するステップと；５’および３’ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする一対のオリゴヌクレオチドプライマーをＤＮＡと接触させるステップと；５’ポリヌクレオチド、ＵＧＥ、および３’ポリヌクレオチドを含むアンプリコンを増幅させるステップと；特異的プローブを使用して（例えば、蛍光系ＰＣＲアッセイ、例えば、加水分解プローブアッセイにおいて）ＵＧＥを検出するステップとを含む。特定の実施形態において、こうした方法は、５’ポリヌクレオチド、ＵＧＥおよび３’ポリヌクレオチドを含む増幅断片を配列決定することによりＵＧＥを検出するステップを含む。本明細書でのいくつかの実施例によって証明されているように、特定の実施形態による方法は、一般的にいうＧＭＯ検出方法において先例がない驚くべき特異性を提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態は、植物または植物材料の少なくとも１種の異種核酸を検出するためのシステムを提供する。いくつかのシステムは、５’ポリヌクレオチド、ＵＧＥおよび３’ポリヌクレオチドを含有する異種核酸をそれぞれ含むベクターのセットを含み、ここで、５’ポリヌクレオチドおよび３’ポリヌクレオチドがベクターのセットにおいて普遍的であり（すなわち、全部に共通であり）、かつ、それぞれのベクターのＵＧＥがセットに固有である。いくつかのシステムは、５’ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする普遍的フォワードプライマーオリゴヌクレオチドと、３’ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする普遍的リバースプライマーオリゴヌクレオチドを含み得る。特定のシステムは、プローブ分子のセットを含んでいてもよく、ここで、それぞれのプローブ分子はベクターセット中のＵＧＥ１つにだけ特異的にハイブリダイズする。
【００１７】
本明細書のシステムおよび方法は、以前は利用不可能であった特異性および一般化可能性のレベルで、スタック導入遺伝子によるものを含む、ＧＭＯ植物における莫大な数のトランスジェニック事象の存在の同定に使用することができる。いくつかの例において、本明細書のシステムおよび方法は、非常に経費のかかる手法となり得る、異なる事象に対する検出アッセイを独立して開発し、良好なＧＭＯの有効範囲を得る個別の検出方法を組み合わせる必要性を省く。
【００１８】
目的の多重遺伝子は、ＵＧＥおよび普遍的プライマー部位を含む植物転換ベクターへ導入することができ、また、これらのベクターを使用してトランスジェニック植物を得ることができる。その結果、多重遺伝子は形質転換され、単一ＵＧＥ特異的検出アッセイを使用してトランスジェニック植物で追跡され得る。これらの構築物で形質転換されたトランスジェニック植物は、さらなる用途のためのトランスジェニック植物の同定に必要とされるアッセイ数をこれまで利用可能な技術と比較して著しく減らすバルク分離分析手法を使用して試験することができる。さらに、本明細書のシステムおよび方法は、目的の形質の存在、ならびに目的以外の形質の非存在（外因存在）に関する圃場サンプルの分析を容易にすることによって、形質遺伝子移入プログラムの商業的進出の決定を支援することができる。
【００１９】
前述のおよび他の態様は、添付の図面を参照しながら進める、いくつかの実施形態に関する以下の詳細な説明からより一層明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】それぞれ、プラスミドｐＥＰＰ１１３５〜ｐＥＰＰ１１４０由来の６つの例示的なＵＧＥ含有ポリヌクレオチド（配列番号５５〜６０）間の配列アライメントの概要を示す図である。Ｆ−プライマーおよびＲ−プライマーは、普遍的フォワードおよびリバースＰＣＲプライマーを表わす。
【図２】ＵＧＥ特異的ＰＣＲアッセイから得た検出結果を挙げる図である。ＵＧＥ特異的プラスミドＤＮＡを陽性対照（円で示す）として使用し、非トランスジェニックコーンＤＮＡおよび鋳型無しの対照サンプルを陰性対照として使用した。サンプルは三連で実施した。
【図３】非常に低濃度の標的ＵＧＥ  ＤＮＡは、それに特異的にハイブリダイズするように設計された加水分解プローブを使用して検出することができることを示す検出結果を示す図である。０．００００００１ｎｇ〜１ｎｇの範囲の鋳型（プラスミドＤＮＡ）濃度をエンドポイントＰＣＲにおいて試験した（左から右への配向を示す）。鋳型無しの対照は、特異性がないことを試験するため、含めた（円で示す）。
【図４】蛍光系加水分解ＰＣＲアッセイを使用する非トランスジェニックコーンゲノムＤＮＡバックグラウンドに標的ＵＧＥ（配列番号３）を含むプラスミドの検出結果を示す図である。融解曲線分析および標的に対するサイクル数および内部対照クロスポイント（Ｃｐ）を示している。
【図５】蛍光系加水分解ＰＣＲアッセイを使用する非トランスジェニックコーンゲノムＤＮＡバックグラウンドに標的ＵＧＥ（配列番号８）を含むプラスミドの検出結果を示す図である。融解曲線分析および標的に対するサイクル数および内部対照クロスポイント（Ｃｐ）を示している。
【図６】ＵＧＥクローニングの方策を示す概略図である。概略図において、「ＰＴＵ」は植物形質転換ユニットを表わし、「ＺＰ」はＵＧＥを含むアンプリコンを表わす。「ＬＢ」および「ＲＢ」はそれぞれ、Ｔ−ＤＮＡの左境界配列および右境界配列を表わす。
【図７】農業形質プロジェクト用のＵＧＥクローニングの方策の例を示す概略図である。この例は、選択可能マーカー（ＯｓＡｃｔ１−ＡＡＤ１−ＺｍＬｉｐ）と目的の作物栽培遺伝子の間にＵＧＥがクローニングされたことを示す。
【図８】Ｔ１トランスジェニックコーン種子中のＵＧＥ配列の検出を示すデータを挙げる図である。陽性対照：ＵＧＥ配列を含有するプラスミドＤＮＡ；陰性対照：非トランスジェニックコーンゲノムＤＮＡ；８Ａ：ＵＧＥ２を含有するトランスジェニックコーン種子；８Ｂ：ＵＧＥ３を含有するトランスジェニックコーン種子。
【図９】ホモ接合トランスジェニックコーン種子サンプル中のＵＧＥ配列（ＵＧＥ３）の検出を示すデータを示す図である。陰性対照−非トランスジェニックコーンＤＮＡ；陽性対照−ＺＣＺ００００００３プラスミドＤＮＡ；サンプル−ＵＧＥ３を発現するトランスジェニックＴ２コーン種子ＤＮＡ（ｐＤＡＢ１０８５２６、ｐＤＡＢ１０８５２７、ｐＤＡＢ１０８５２８；表９に記載したように、６つの異なる種子供給源を使用した）。
【図１０】トランスジェニックトウモロコシ（ＵＧＥ３）由来のＵＧＥ検出の感度を示すデータを示す図である。陰性対照−非トランスジェニックコーンＤＮＡ；陽性対照−ＺＣＺ００００００３プラスミドＤＮＡサンプル−トランスジェニックＴ２コーン種子ＤＮＡの希釈（ｐＤＡＢ１０８５２６−供給源ＩＤ＃  ＺＱ１１ＬＱ１９９０８８．００１６．０１６）。
【図１１】スパイクしたトランスジェニック種子サンプル中のＵＧＥの加水分解プローブＰＣＲアッセイによる検出を示すデータを示す図である。陰性対照−非トランスジェニックコーンＤＮＡ；陽性対照−１％のゲノムＤＮＡ；サンプル−スパイクコーン種子由来の３６のＤＮＡサンプル（９９個の非トランスジェニック種子中に１個のトランスジェニック種子）−１２回の生物学的な繰り返しと３回の技術的な繰り返し。
【００２１】
配列表
添付の配列表に列記された核酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２において規定されたように、ヌクレオチド塩基についての標準的な文字省略を使用して示している。各核酸配列の一方の鎖のみを示すが、相補鎖は表示した鎖をすべて考慮することにより含まれるものと理解する。添付の配列表において：
【００２２】
配列番号１〜２１は、（同一の）ＵＧＥポリヌクレオチド（それぞれ、「ＵＧＥ１」〜「ＵＧＥ２１」）に特異的にハイブリダイズするように設計された例示的なオリゴヌクレオチドプローブを示す。
【００２３】
配列番号２２〜４２は、アンプリコン（「アンプリコン１〜２１」）を示し、それぞれ、例示のＵＧＥと普遍的ＰＣＲフォワードプライマーおよびリバースプライマーに対する５’および３’結合部位を含む。
【００２４】
配列番号４３〜４６は、加水分解プローブアッセイによるＵＧＥ検出用のアンプリコンを生成するための特定のＵＧＥ蛍光系ＰＣＲアッセイにおいて有用なプライマーを示す。
【００２５】
配列番号４７は、ＰＣＲと加水分解プローブ反応条件を実証するための特定の実施形態において陽性対照として使用可能なトウモロコシインベルターゼ遺伝子を示す。
【００２６】
配列番号４８は、ＰＣＲと加水分解プローブ反応条件を実証するための特定の実施形態において陽性対照として使用可能なトウモロコシＺＳＳＩＩｂ遺伝子を示す。
【００２７】
配列番号４９〜５０は、トウモロコシインベルターゼ遺伝子の一部の増幅に有用であるプライマーを示す。
【００２８】
配列番号５１は、トウモロコシインベルターゼ遺伝子の検出に使用可能なプローブオリゴヌクレオチドを示す。
【００２９】
配列番号５２〜５３は、トウモロコシＺＳＳＩＩｂ遺伝子の一部の増幅に有用であるプライマーを示す。
【００３０】
配列番号５４は、トウモロコシＺＳＳＩＩｂ遺伝子の検出に使用可能なプローブオリゴヌクレオチドを示す。
【００３１】
配列番号５５〜６０は、植物形質転換ベクターのセット（ｐＥＰＰ１１３５〜ｐＥＰＰ１１４０）のメンバー由来のＵＧＥ含有ポリヌクレオチドを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
Ｉ．いくつかの実施形態の概要
高感度で確実な検出方法が遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）のモニタリングに必要とされている。既存のＤＮＡ検出方法は、トランスジェニック植物におけるスクリーニング因子、植物特異的因子または事象特異的因子を標的とすることを対象としている。本明細書では、固有の合成非コード合成ＤＮＡ配列（ＵＧＥ）の使用について記載しており、これは、植物形質転換ベクターへ組み込まれた場合、確固たる普遍的アッセイ開発用の標的として機能を果たすことによりトランスジェニック植物をモニタリングするのを支援することができる。いくつかのＵＧＥ配列について蛍光系アッセイ開発の容易性を試験し、トランスジェニック植物のモニタリングにおけるそれらの有用性を証明した。普遍的プライマー部位に隣接されているＵＧＥを含む構築物を植物形質転換ベクターに導入したところ、特異的加水分解プローブ検出アッセイがそれぞれの形質転換ベクターを速やかに追跡することが示された。
【００３３】
ＩＩ．略語
［０００１］  ＡＢＣ−トランスポーター  ＡＴＰ−結合カセットトランスポーター
［０００２］  ＡＰ  外因存在
［０００３］  ＢＨＱ２  Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）−２
［０００４］  ＦＡＭ  ６−カルボキシフルオレセインアミダイト
［０００５］  ＦＥＴ  蛍光エネルギー転移
［０００６］  ＨＥＸ  ヘキサクロロ−フルオレセイン
［０００７］  ＭＧＢＮＦＱ  Ｍｉｎｏｒ  Ｇｒｏｏｖｅ  Ｂｉｎｄｅｒ非蛍光クエンチャー
［０００８］  ＰＣＲ  ポリメラーゼ連鎖反応
［０００９］  ＵＧＥ  固有外来性遺伝因子
【００３４】
ＩＩＩ．用語
外因存在：本明細書で使用される場合、「外因存在」（ＡＰ）とは、植物材料サンプル中の極微量のトランスジェニック材料が意図的ではなく偶発的に混入していることを意味する。外因存在は、例えば、全体的に非トランスジェニック材料から構成されていると考えられるサンプル中の極微量のトランスジェニック材料の存在によって例証することができるか、または、全体的に異なるタイプのトランスジェニック材料から構成されていると考えられる材料のサンプル中の極微量のあるタイプのトランスジェニック材料の存在によって例証することができる。
【００３５】
戻し交配：戻し交配方法は、植物への核酸配列の導入に使用することができる。戻し交配技術は、植物に新しい形質を導入するのに数十年間幅広く使用されてきた。Jensen, N., Ed. Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988。代表的な戻し交配プロトコルにおいて、目的のオリジナルの変種（反復戻し交配親）は、移そうとする目的の遺伝子を担持するもう１つの変種（非反復戻し交配親）に交配される。次いで、この交配から得られる後代が再度反復戻し交配親に交配され、非反復戻し交配親由来の移入遺伝子に加えて、本質的にすべての所望する反復性植物の形態学的特性および生理学的特性が転換植物において回収される植物が得られるまで、この方法は繰り返される。
【００３６】
単離された：「単離された」生体成分（例えば、核酸またはタンパク質）は、その成分が天然に存在する生物体の細胞中の他の生体成分（すなわち、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにタンパク質）から、成分内で化学的変化または機能的変化をもたらしながら（例えば、核酸は、染色体中の残りのＤＮＡに核酸を連結している化学結合を破壊することにより、染色体から単離することができる）、実質的に分離され、隔てて産生され、または離して精製されたものである。「単離された」核酸分子およびタンパク質は、標準の精製法によって精製された核酸分子およびタンパク質を含んでいる。またこの用語は、宿主細胞において組換え発現によって調製される核酸およびタンパク質、ならびに、化学的に合成される核酸分子、タンパク質およびペプチドを包含している。
【００３７】
核酸分子：本明細書で使用される場合、用語「核酸分子」とは、重合形態のヌクレオチドを意味するものであってよい。これには、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方と、上記の合成形態および混合ポリマーが包含され得る。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態を意味するものであってよい。本明細書で使用される場合の「核酸分子」とは、「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同義である。核酸分子は、別段の定めがない限り、通常、少なくとも１０塩基長である。この用語は、一本鎖および二本鎖の形態のＤＮＡが包含されている。核酸分子は、天然および／または非天然ヌクレオチド結合によって相互に連結されている天然ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドのいずれかまたは両方を包含し得る。
【００３８】
核酸分子は、当業者によって容易に認識されるように、化学的または生化学的に修飾されていてもよく、あるいは、非天然ヌクレオチド塩基または誘導体化ヌクレオチド塩基を含有していてもよい。こうした修飾としては、例えば、標識、メチル化、１つまたは複数の天然ヌクレオチドの類似体による置換、ヌクレオチド間の修飾（例えば、非荷電結合：例えば、メチルホスホン酸、リン酸トリエステル、ホスホロアミド酸、カルバミン酸など；荷電結合：例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど；ペンダント部分：例えば、ペプチド；インターカレーター：例えば、アクリジン、ソラレンなど；キレート剤；アルキル化剤；および修飾結合：例えば、アルファアノマー核酸など）が挙げられる。また用語「核酸分子」には、任意の位相幾何学的高次構造、例えば、一本鎖、二本鎖、部分的二重鎖、三重鎖、ヘアピン、環状、および施錠型の高次構造が含まれる。
【００３９】
外来性：本明細書で核酸（例えば、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび遺伝子）に適用される場合の用語「外来性」とは、それらの特定の環境または状況には通常存在しない、１つまたは複数の核酸（複数可）を意味する。例えば、宿主細胞が自然界の非形質転換宿主細胞では生じない核酸で形質転換される場合、その核酸は宿主細胞に対し外来性である。また、本明細書で使用される場合の用語外来性とは、宿主細胞中に既に存在する核酸と配列は同一であるが、宿主細胞内に既に存在する同一配列を有する核酸とは異なる細胞またはゲノムの状況で配置されている、１つまたは複数の核酸（複数可）を意味する。例えば、同一配列を有する核酸とは異なる場所で宿主細胞のゲノムに組み込まれる核酸は、通常、宿主細胞のゲノムに組み込まれた場合、宿主細胞に対し外来性である。さらに、同一配列を有する核酸が宿主細胞のゲノム中にのみ通常存在する場合、宿主細胞中のプラスミドまたはベクター中に存在する核酸（例えば、ＤＮＡ分子）は、宿主細胞に対して外来性である。
【００４０】
異種性：本明細書で核酸（例えば、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび遺伝子）に適用される場合の用語「異種性」とは、異なる起原を意味する。例えば、宿主細胞が自然界の非形質転換宿主細胞では生じない核酸で形質転換される場合、その核酸は宿主細胞対し異種性（および外来性）である。さらに、形質転換している核酸の異なる因子（例えば、プロモーター、エンハンサー、コード配列、ターミネーターなど）は、相互に、かつ／または形質転換宿主に対し、異種性で有り得る。また、本明細書で使用される場合の用語異種性とは、宿主細胞中に既に存在する核酸と配列は同一であるが、異なる追加配列に現在連結されており、かつ／または異なるコピー数で存在するなどの１つまたは複数の核酸（複数可）に適用され得る。
【００４１】
配列同一性：本明細書で使用される場合の用語「配列同一性」または「同一性」とは、２つの核酸またはポリペプチド配列の状況において、特定の比較ウィンドウにわたって、最大の一致となるように整列された場合に同一である２つの配列中の残基を意味し得る。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「配列同一性の割合」とは、比較ウィンドウにわたって、２つの最適に整列された配列（例えば、核酸配列およびアミノ酸配列）を比較することにより決定される値を意味し得る。ここで、比較ウィンドウにおける配列の一部は、この２つの配列の最適アライメントの（付加または欠失を含まない）参照配列と比較した場合に、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてもよい。前記割合は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸の残基が両方の配列に生じる位置の数を決定して、マッチした位置の数を算出し、マッチした位置の数を、比較ウィンドウにおける位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性の割合を算出することにより計算される。
【００４３】
比較のために配列を整列させる方法は、当分野において公知である。様々なプログラムおよびアライメントアルゴリズムが、例えば、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482；Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443；Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444；Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44；Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3；Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90；Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65；Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31；Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50に記載されている。配列アライメント法および相同性算出の詳細な考察は、例えば、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10で確認することができる。
【００４４】
国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ベーシックローカルアライメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ（商標）；Altschul et al. (1990)）は、複数の配列分析プログラムと連結して使用するために、複数の供給元、例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から、および、インターネット上で入手可能である。このプログラムを使用する配列同一性の決定方法の説明は、インターネット上で、ＢＬＡＳＴ（商標）の「ｈｅｌｐ」欄で利用可能である。核酸配列の比較において、ＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ２配列」機能を、デフォルトパラメーターを用いて使用することができる。参照配列に対しより一層大きな類似性を有する核酸配列は、この方法により評価された場合、同一性の割合が高くなることを示すであろう。
【００４５】
本明細書で使用される場合、用語「実質的に同一の」とは、８５％を超えて同一であるヌクレオチド配列を意味し得る。例えば、実質的に同一のヌクレオチド配列は、参照配列に対して少なくとも８５．５％；少なくとも８６％；少なくとも８７％；少なくとも８８％；少なくとも８９％；少なくとも９０％；少なくとも９１％；少なくとも９２％；少なくとも９３％；少なくとも９４％；少なくとも９５％；少なくとも９６％；少なくとも９７％；少なくとも９８％；少なくとも９９％；または少なくとも９９．５％同一であり得る。
【００４６】
プローブ：いくつかの実施形態において、サンプル中の特定の核酸（例えば、ＵＧＥ）の存在は、核酸プローブを使用することによって検出することができる。プローブは、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であってよい。プローブは、特定の核酸のヌクレオチド配列の全部または一部を含有していてよく、また、少なくとも１つの追加のヌクレオチド配列および／または標識（複数可）を任意選択でさらに含有していてもよい。
【００４７】
オリゴヌクレオチドプローブ配列は、合成的に、またはクローニングによって調製することができる。適切なクローニングベクターは、当業者には公知である。オリゴヌクレオチドプローブは、標識化されていてもよいし、標識されていなくてもよい。核酸分子を標識する様々な技術が存在し、例えば、限定するものではないが、ニックトランスレーション法による放射性標識；ランダムプライミング；末端デオキシトランスフェラーゼによる尾部付加などが挙げられ、この場合、使用されるヌクレオチドは、例えば、放射性３２Ｐで標識される。使用可能な他の標識としては、例えば、限定するものではないが、フルオロフォア（例えば、単独使用で、またはクエンチャー併用）；酵素；酵素基質；酵素補因子；酵素阻害剤などが挙げられる。あるいは、単独でまたは他の反応性薬剤と併せて、検出可能なシグナルを発生する標識の使用は、受容体が結合するリガンドに置き換えてもよく、この場合、受容体は、単独または他の試薬と併せるいずれかによって、検出可能なシグナルを発生するように（例えば、上記の標識により）標識されている。例えば、Leary et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4045-9を参照されたい。
【００４８】
またプローブは、検出しようとする特定の核酸（すなわち、標的）に「特異的にハイブリダイズ可能な」または「特異的に相補的である」核酸分子であってよい。「特異的にハイブリダイズ可能な」および「特異的に相補的である」とは、プローブと標的との間で安定した特異的結合が起こるような十分な相補性の程度を示す用語である。核酸分子は、特異的にハイブリダイズ可能であるためには、その標的配列に１００％相補的である必要はない。核酸分子は、特異的結合が望ましい条件下で、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、核酸が非標的配列へ非特異的結合するのを回避する程度の十分な相補性がある場合、特異的にハイブリダイズ可能である。
【００４９】
特定のストリンジェンシーの程度をもたらすハイブリダイゼーション条件は、選択するハイブリダイゼーション法の性質およびハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに応じて変動する。一般的に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーションバッファーのイオン強度（特に、Ｎａ＋および／またはＭｇ＋＋濃度）がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定するが、洗浄回数もまたストリンジェンシーに影響する。ストリンジェンシーの特定の程度を得るのに必要とされるハイブリダイゼーション条件に関する計算は当業者に公知であり、例えば、Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11;およびHames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985で論じられている。核酸のハイブリダイゼーションに関するさらなる詳細な指示とガイダンスは、例えば、Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993；およびAusubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995で確認することができる。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション分子とＤＮＡ標的の間のミスマッチが２５％未満である場合にだけハイブリダイゼーションが生じる条件を含む。「ストリンジェントな条件」は、特定レベルのストリンジェンシーをさらに包含する。したがって、本明細書で使用される場合、「穏やかなストリンジェンシー」条件は、配列ミスマッチが２５％を超える分子はハイブリダイズしない条件下のものであり、「中間のストリンジェンシー」はミスマッチが１５％を超える分子はハイブリダイズしないという条件下のものであり；「高ストリンジェンシー」条件は、ミスマッチが１０％を超える配列はハイブリダイズしないという条件下のものである。「超高ストリンジェンシー」の条件は、ミスマッチが６％を超える配列はハイブリダイズしないという条件下のものである。
【００５１】
特定の実施形態において、ストリンジェントな条件は、６×生理食塩水クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）バッファー、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、および１００μｇ剪断サケ精巣ＤＮＡ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、続いて２×ＳＳＣバッファーおよび０．５％ＳＤＳ中、続いて１×ＳＳＣバッファーおよび０．５％ＳＤＳ中、最後に０．２×ＳＳＣバッファーおよび０．５％ＳＤＳ中、６５℃での１５〜３０分の連続洗浄である。
【００５２】
作動可能に連結された：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係がある場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列に作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。組換え的に産生される場合、作動可能に連結された核酸配列は通常連続しており、必要に応じて、同一リーディングフレーム内で２種のタンパク質コード領域を連結させる。しかし、因子は、作動可能に連結されるのに連続している必要はない。
【００５３】
プロモーター：転写に必要とされる、一般に上流（遺伝子の５’領域方向）に配置されているＤＮＡの領域である。プロモーターは、それらが調節する遺伝子を適切に活性化または抑制することができる。プロモーターは、転写因子によって認識される特定配列を含有する。これらの因子はプロモーターＤＮＡ配列に結合し、遺伝子のコード領域からＲＮＡを合成する酵素である、ＲＮＡポリメラーゼを漸増させる。いくつかの実施形態において、組織特異的プロモーターが使用される。組織特異的プロモーターは、生物の他の組織よりもプロモーターが特異的である組織において、関連遺伝子の高レベルの転写を指示するＤＮＡ配列である。組織特異的プロモーターの例としては、タペータム特異的プロモーター；葯特異的プロモーター；花粉特異的プロモーター（例えば、米国特許第７，１４１，４２４号および国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９９／０４２５８７号を参照されたい）；胚珠特異的プロモーター（例えば、米国特許出願第２００１／０４７５２５  Ａ１号を参照されたい）；果実特異的プロモーター（例えば、米国特許第４，９４３，６７４号および同第５，７５３，４７５号を参照されたい）；ならびに種子特異的プロモーター（例えば、米国特許第５，４２０，０３４号および同第５，６０８，１５２号を参照されたい）が挙げられる。いくつかの実施形態において、発生段階特異的プロモーター、例えば、発生後期段階で活性のあるプロモーターもまた使用される。
【００５４】
形質転換される：ウイルスまたはベクターは、それが核酸分子を細胞に移す場合、細胞を「形質転換する」か、「形質導入する」。核酸分子の細胞ゲノムへの組込み、またはエピソーム複製のいずれかにより核酸分子が細胞により安定的に複製される場合、細胞は、細胞内に形質導入された核酸分子により「形質転換」される。本明細書で使用される場合、用語「形質転換」は、核酸分子をこうした細胞内に導入することができるすべての技術を含む。例としては、限定するものではないが、ウイルスベクターによるトランスフェクション、プラスミドベクターによる形質転換、エレクトロポレーション（Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3）、リポフェクション（Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7）、マイクロインジェクション（Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85）；アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介による移入（Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7）、ＤＮＡ直接取り込み、および微粒子銃（Klein et al. (1987) Nature 327:70）が挙げられる。
【００５５】
導入遺伝子：外来性核酸配列。一例において、導入遺伝子は、遺伝子配列（例えば、除草剤耐性遺伝子）、産業的または製薬的に有用な化合物をコードしている遺伝子、または所望する農業上の形質をコードしている遺伝子である。さらに別の例において、導入遺伝子はアンチセンス核酸配列であって、この場合、アンチセンス核酸配列の発現が標的核酸配列の発現を阻害する。導入遺伝子は、この導入遺伝子に作動可能に連結している制御配列（例えば、プロモーター）を含有し得る。
【００５６】
ベクター：本明細書で使用される場合、用語「ベクター」とは、少なくとも１つの核酸セグメント（複数可）を細胞に移入することができるポリヌクレオチドまたは他の分子を意味する。ベクターは、ベクター維持を媒介し、かつ／またはその目的の使用を可能にする成分／因子（例えば、複製、薬剤耐性もしくは抗生物質耐性を付与する遺伝子、多重クローニング部位、および／または、クローン化遺伝子を発現させることができる作動可能に連結されているプロモーター／エンハンサー因子に必要な配列）を任意選択で含むことができる。ベクターは、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、または植物もしくは動物ウイルスに由来するものであってよい。「クローニングベクター」、「シャトルベクター」または「サブクローニングベクター」は、一般に、クローニングステップまたはサブクローニングステップを容易にするための作動可能に連結されている因子を含む（例えば、複数の制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する多重クローニング部位）。
【００５７】
発現ベクター：本明細書で使用される場合の用語「発現ベクター」とは、特定の宿主生物でコード配列の発現を促進し得る、作動可能に連結されているポリヌクレオチド配列を含むベクターを意味する。例えば、細菌の発現ベクターは、細菌でコード配列の発現を促進し得る。同様に、植物発現ベクターは、植物細胞でコード配列の発現を促進し得る。原核生物で発現を促進するポリヌクレオチド配列としては、例えば、限定するものではないが、プロモーター；オペレーター；およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核生物の発現ベクター（例えば、植物発現ベクター）は、例えば、プロモーター；エンハンサー；終止コドン；および原核生物の発現ベクターにおいて使用されるものとは通常異なるポリアデニル化シグナル（および他の配列）を含み得る。
【００５８】
形質または表現型：用語「形質」と「表現型」は、本明細書では同義に使用される。本開示の目的において、特定に興味深い形質としては、例えば、作物において発現され得る場合、作物学的に重要な形質を包含している。
【００５９】
固有外来性遺伝因子（ＵＧＥ）：ＵＧＥは、植物形質転換ベクターに組み込まれた場合に、ＤＮＡ検出アッセイの標的として機能する、固有の合成ＤＮＡ配列である。まず、１つの固有の事前確認済みＵＧＥを植物形質転換ベクターに導入する。次に、ＵＧＥ含有植物形質転換ベクターを、同一プロモーターによって駆動される多重遺伝子のクローニングに使用する。ＵＧＥ特異的蛍光系ＰＣＲアッセイは、比較的に容易にそれぞれの形質転換ベクターを追跡するために急速に開発されている。これらの構築物に由来するトランスジェニック植物は、バルク分離分析手法を使用して試験しアッセイの数を有意に減らすことができる。
【００６０】
ＩＶ．固有外来性遺伝因子
本明細書の実施形態は、核酸のＵＧＥ特異的検出の普遍的方法を開発するために使用することができる、固有の合成非コード合成ＤＮＡ配列（本明細書では「固有外来性遺伝因子」または「ＵＧＥ」と呼ばれる）を包含する。ＵＧＥは、セットのそれらのすべてがハイブリダイゼーションアッセイにおけるオリゴヌクレオチドと同様の熱力学的特性を有するように設計することができる。例えば、生物体へ導入するための核酸のセットのうち、別個の／固有のＵＧＥのセットは、そのセットの核酸に目的のさらなる核酸（複数可）と共に包含され、特異的に識別可能な方法で、特定の会社または研究所からの構築物、特定のクラスの遺伝子または遺伝因子を含有する構築物、および／またはこうした構築物を含むＧＭＯ（例えば、植物）を同定することができる。
【００６１】
いくつかの実施形態において、ＵＧＥは、このセットに普遍的である、通常プライマーに隣接され増幅される固有の同定マーカーであり、その結果、ＵＧＥを含む核酸を、例えば、ＤＮＡ配列分析、ハイブリダイゼーション、および蛍光系ＰＣＲ分析によって、普遍的かつ特異的に同定することができる。いくつかの例において、ＧＭＯ中のＵＧＥを含む異種核酸は、ＵＧＥに特異的にハイブリダイズする固有の消光可能な蛍光標識プローブ（例えば、加水分解プローブ）と共に、蛍光系リアルタイムＰＣＲ方法を使用して同定することができる。例えば、ＵＧＥオリゴヌクレオチドそのものは、標識プローブ分子に組み込むことができる。普遍的ＰＣＲプライマーおよびＵＧＥは、多数の異なる導入遺伝子を含む複合ＧＭＯ材料に対し、単一アッセイで高特異的かつ高効率の増幅および蛍光系検出を提供することができる。いくつかの例において、ＧＭＯ中のＵＧＥを含む異種核酸は、サンプル中に存在するＵＧＥの同一性が判定されるように、普遍的プライマーに隣接されている増幅ＤＮＡ断片を配列決定することにより同定することができる。
【００６２】
蛍光結合ＰＣＲは、特定の実施形態において検出アッセイとして利用される。こうしたＰＣＲ系アッセイは、当技術分野で公知である。米国特許第５，２１０，０１５号および同第５，４８７，９７２号。例えば、特定の実施形態は、３つのオリゴヌクレオチド：フォワードプライマー；リバースプライマー；および蛍光発生プローブが関与するＰＣＲ反応を利用する。蛍光発生プローブとしては、例えば、限定するものではないが、リポーター蛍光色素により５’末端で標識されているオリゴヌクレオチド（例えば、ＦＡＭおよびＨＥＸ）と、クエンチャー色素により３’末端で標識されているオリゴヌクレオチド（例えば、ＭＧＢＮＦＱおよびＢＨＱ２）を挙げることができる。こうした例示的プローブ分子において、特定波長（４８８ｎｍ）におけるリポーター蛍光色素の励起は、クエンチャー色素に対し空間的に近接した結果によるＦＥＴ抑制によって蛍光は誘導されない。加水分解プローブＰＣＲアッセイの際、プローブはプライマーと最初に標的ＤＮＡにハイブリダイズする。伸長段階において、プライマー間に配置されているプローブはポリメラーゼと接触し、そのエキソヌクレアーゼ活性によって加水分解される。プローブの加水分解は蛍光リポーターをＦＥＴ抑制から解放し、リポーターの蛍光はＰＣＲ産物の蓄積に応じて各々のＰＣＲサイクルで増加する。
【００６３】
いくつかの実施形態において、ＵＧＥは、オリゴヌクレオチドプローブがセット中のそれぞれのＵＧＥに特異的にハイブリダイズするように設計され得るように、ＵＧＥを含むセット内の適切な配列多様性を提供するのに十分な長さを有するように設計される。例えば、ＵＧＥは、例えば、限定するものではないが、約１０を超える；約１５を超える；約２０を超える；約２５を超える；約１０〜約２５；約１５〜約２５；約１０〜約２０；約１５〜約２０のヌクレオチド長であるように設計することができる。特定の実施形態において、ＵＧＥは、ＵＧＥ１〜ＵＧＥ２１（配列番号１〜２１）からなる群から選択される。
【００６４】
いくつかの実施形態において、ＵＧＥは、隣接する普遍的プライマーをさらに含む増幅可能な核酸（アンプリコン）に含まれていてもよい。いくつかの例において、隣接する普遍的プライマーはＵＧＥに直接隣接していてもよく；すなわち、任意のさらなるヌクレオチド配列により分離されない。ＵＧＥおよび隣接する普遍的プライマーを含むアンプリコンは、ＰＣＲ反応において増幅可能なように十分な長さであり得る。例えば、限定するものではないが、こうしたアンプリコンは、約１５０未満；約１３０未満；約１１０未満；約１００未満；約９０未満；約８５未満；約８０未満；約６０〜約１００；約６０〜約９０；約６０〜約８０；約７０〜約１００；約７０〜約９０；約７０〜約８０のヌクレオチド長であってよい。特定の実施形態において、ＵＧＥおよび隣接するプライマー部位を含むアンプリコンは、アンプリコン１〜２１（配列番号２２〜４２）からなる群から選択される。
【００６５】
いくつかの実施形態において、ＵＧＥ（例えば、隣接する普遍的プライマーをさらに含むアンプリコン中のもの）は、例えば、例えば限定するものではないが線状プラスミドおよび閉鎖環状プラスミドをはじめとするベクターシステムに含まれ得る。特定の例において、ベクターは発現ベクターであってもよい。特定の実施形態によるＵＧＥを含むアンプリコンは、例えば、核酸配列が１つまたは複数の制御配列に作動可能に連結されるようベクターに挿入することができる。多数のベクターをこの目的に利用することができ、特定のベクターの選択は、例えば、ベクターに挿入しようとする核酸のサイズ、ベクターで形質転換される特定の宿主細胞、および／または発現されることが望まれる融合タンパク質の量に依存し得る。ベクターは、典型的には様々な成分を含有しており、その同一性は、ベクターの機能（例えば、ＤＮＡの増幅およびＤＮＡの発現）ならびにベクターが適合する特定の宿主細胞に依存する。
【００６６】
いくつかの実施形態は、普遍的プライマー部位に隣接されているＵＧＥと、少なくとも１つの制御配列に作動可能に連結されている目的の遺伝子を含む植物形質転換ベクターを包含し得る。目的の遺伝子は、制御配列（複数可）のコントロール下において、植物細胞、組織または生物体で発現させ、融合タンパク質を産生させることができる。こうした制御配列は、宿主植物細胞において機能するプロモーター配列であってよい。
【００６７】
いくつかの実施形態による核酸分子での使用に適したプロモーターは、誘導性、ウイルス性、合成、または構成的であるものが挙げられ、それらのすべては当技術分野で公知である。本発明の実施形態において有用であり得るプロモーターの非限定的な例は、以下によって提供される：米国特許第６，４３７，２１７号（トウモロコシＲＳ８１プロモーター）；同第５，６４１，８７６号（イネアクチンプロモーター）；同第６，４２６，４４６号（トウモロコシＲＳ３２４プロモーター）；同第６，４２９，３６２号（トウモロコシＰＲ−１プロモーター）；同第６，２３２，５２６号（トウモロコシＡ３プロモーター）；同第６，１７７，６１１号（構成的トウモロコシプロモーター）；同第５，３２２，９３８号、第５，３５２，６０５号、第５，３５９，１４２号および第５，５３０，１９６号（３５Ｓプロモーター）；同第６，４３３，２５２号（トウモロコシＬ３オレオシンプロモーター）；同第６，４２９，３５７号（イネアクチン２プロモーター、およびイネアクチン２イントロン）；同第６，２９４，７１４号（光誘導性プロモーター）；同第６，１４０，０７８号（塩誘導性プロモーター）；同第６，２５２，１３８号（病原体誘導性プロモーター）；同第６，１７５，０６０号（亜リン酸欠損誘導性プロモーター）；同第６，３８８，１７０号（双方向性プロモーター）；同第６，６３５，８０６号（ガンマ−コイキシン（coixin）プロモーター）；および米国特許出願第０９／７５７，０８９号（トウモロコシ葉緑体アルドラーゼプロモーター）。
【００６８】
追加の例示的なプロモーターとしては、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター（Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9）；オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の腫瘍誘発プラスミド上に担持されているもの）；カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓプロモーターなどのカリモウイルスプロモーター（Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24）；ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（Odell et al. (1985) Nature 313:810-2）；ゴマノハグサ（figwort）モザイクウイルス３５Ｓ−プロモーター（Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8）；スクロースシンターゼプロモーター（Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8）；Ｒ遺伝子複合体プロモーター（Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-83）；クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモーター；ＣａＭＶ３５Ｓ（米国特許第５，３２２，９３８号、同第５，３５２，６０５号、同第５，３５９，１４２号、および同第５，５３０，１９６号）；ＦＭＶ３５Ｓ（米国特許第６，０５１，７５３号、および同第５，３７８，６１９号）；ＰＣ１ＳＶプロモーター（米国特許第５，８５０，０１９号）；ＳＣＰ１プロモーター（米国特許第６，６７７，５０３号）；およびＡＧＲｔｕ．ｎｏｓプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｖ０００８７、Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73；Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7）が挙げられる。
【００６９】
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は組織特異的プロモーターを含んでいてもよい。組織特異的プロモーターは、生物のその他の組織と比べて、プロモーターが特異的である組織において作動可能に連結されているヌクレオチド配列の高レベルの転写を指示するヌクレオチド配列である。組織特異的プロモーターの例としては、限定するものではないが、タペート組織特異的プロモーター；葯特異的プロモーター；花粉特異的プロモーター（例えば、米国特許第７，１４１，４２４号および国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９９／０４２５８７号を参照されたい）；胚珠特異的プロモーター（例えば、米国特許出願第２００１／０４７５２５  Ａ１号を参照されたい）；果実特異的プロモーター（例えば、米国特許第４，９４３，６７４号および同第５，７５３，４７５号を参照されたい）；および種子特異的プロモーター（例えば、米国特許第５，４２０，０３４号および同第５，６０８，１５２号を参照されたい）が挙げられる。いくつかの実施形態において、発生段階特異的プロモーター（例えば、発生の後期段階で活性のあるプロモーター）は、本発明の組成物または方法において使用することができる。
【００７０】
いくつかの実施形態において核酸分子に作動可能に連結され得る追加の制御配列としては、プロモーター配列と翻訳リーダー配列として機能するコード配列の間に位置している５’ＵＴＲが挙げられる。翻訳リーダー配列は完全にプロセシングされたｍＲＮＡに存在しており、一次転写物のプロセシングおよび／またはＲＮＡ安定性に影響を及ぼし得る。翻訳リーダー配列の例としては、トウモロコシおよびペチュニア熱ショックタンパク質リーダー（米国特許第５，３６２，８６５号）、植物ウィルスコートタンパク質リーダー、植物ルビスコリーダー、ならびに他が挙げられる。例えば、Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36を参照されたい。５’ＵＴＲの非限定的な例は、ＧｍＨｓｐ（米国特許第５，６５９，１２２号）；ＰｈＤｎａＫ（米国特許第５，３６２，８６５号）；ＡｔＡｎｔ１；ＴＥＶ（Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7）；およびＡＧＲｔｕｎｏｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｖ０００８７；およびBevan et al. (1983)、上掲）により提供される。
【００７１】
また、いくつかの実施形態において核酸分子に作動可能に連結され得る追加の制御配列としては、３’非翻訳配列、３’転写終止領域、またはポリアデニル化領域が挙げられる。これらは、ヌクレオチド配列の下流に位置している遺伝因子であって、ポリアデニル化シグナル、および／または転写もしくはｍＲＮＡプロセシングに影響を及ぼし得る他の制御シグナルを提供するポリヌクレオチドが挙げられる。ポリアデニル化シグナルは、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸ヌクレオチドの付加を引き起こすように植物において機能する。ポリアデニル化配列は、様々な植物遺伝子に、またはＴ−ＤＮＡ遺伝子に由来し得る。３’転写終止領域の非限定的な例は、ノパリンシンターゼ３’領域である（ｎｏｓ  ３’；Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7）。異なる３’非翻訳領域の使用の例は、Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell 1:671-80で提供されている。ポリアデニル化シグナルの非限定的な例としては、エンドウ（Pisum sativum）ＲｂｃＳ２遺伝子（Ｐｓ．ＲｂｃＳ２−Ｅ９；Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9）およびＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号E01312）由来のものが挙げられる。
【００７２】
特定の実施形態において有用であり得る制御配列に関する追加の情報は、例えば、Goeddel (1990) "Gene Expression Technology," Methods Enzymol. 185, Academic Press, San Diego, CAに記載されている。
【００７３】
本発明の組換え核酸分子またはベクターは、形質転換細胞、例えば植物細胞などに選択可能な表現型を付与する選択可能マーカーを含んでいてもよい。また、選択可能マーカーを使用して、本発明の核酸分子を含む植物または植物細胞を選択することもできる。マーカーは、殺生物剤耐性、抗生物質耐性（例えば、カナマイシン、ジェネテシン（Ｇ４１８）、ブレオマイシン、およびハイグロマイシン）、または除草剤耐性（例えば、グリホサート）をコードしていてよい。選択可能マーカーの例としては、限定するものではないが、カナマイシン耐性を付与し、また、例えば、カナマイシンおよびＧ４１８を使用するために選択することができるｎｅｏ遺伝子；ビアラホス耐性を付与するｂａｒ遺伝子；グリホサート耐性を付与する変異ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子；ブロモキシニルに対する耐性を付与するニトリラーゼ遺伝子；イミダゾリノンまたはスルホニル尿素耐性を付与する変異アセト乳酸シンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）；およびメトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子が挙げられる。化学薬剤、例えば、限定するものではないが、アンピシリン；ブレオマイシン；クロラムフェニコール；ゲンタマイシン；ハイグロマイシン；カナマイシン；リンコマイシン；メトトレキサート；ホスフィノトリシン；ピューロマイシン；スペクチノマイシン；リファンピシン；ストレプトマイシン；およびテトラサイクリンに対する耐性を付与する複数の選択可能マーカーを利用することができる。こうした選択可能マーカーの例は、例えば、米国特許第５，５５０，３１８号；同第５，６３３，４３５号；同第５，７８０，７０８号および同第６，１１８，０４７号に説明されている。
【００７４】
また、もしくは代わりに、本発明の核酸分子またはベクターは、スクリーニング可能マーカーを含んでいてもよい。スクリーニング可能なマーカーを使用して発現をモニターすることができる。例示的なスクリーニング可能なマーカーとしては、様々な発色基質が知られている酵素をコードするβ−グルクロニダーゼまたはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）（Jefferson et al. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405）；植物組織においてアントシアニン色素（赤色）の生成を制御する産物をコードするＲ−ｌｏｃｕｓ遺伝子（Dellaporta et al. (1988) "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac." In 18th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson and R. Appels, eds., Plenum, NY (pp. 263-82)）；β−ラクタマーゼ遺伝子（Sutcliffe et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41）；様々な発色基質が知られている酵素をコードする遺伝子（例えば、ＰＡＤＡＣ、発色セファロスポリン）；ルシフェラーゼ遺伝子（Ow et al. (1986) Science 234:856-9）；発色カテコールを変換するカテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子（Zukowski et al. (1983) Gene 46(2-3):247-55）；アミラーゼ遺伝子（Ikatu et al. (1990) Bio/Technol. 8:241-2）；チロシンをＤＯＰＡおよびドパキノンへと酸化し、次いでメラニンへ縮合させることができる酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子（Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14）；およびα−ガラクトシダーゼが挙げられる。
【００７５】
宿主細胞の形質転換に適した方法としては、例えば、限定するものではないが、プロトプラストの形質転換によって（例えば、米国特許第５，５０８，１８４号を参照されたい）；脱水／阻害媒介型のＤＮＡ組込みによって（例えば、Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8を参照されたい）；エレクトロポレーションによって（例えば、米国特許第５，３８４，２５３号を参照されたい）；炭化珪素繊維を用いた撹拌によって（例えば、米国特許第５，３０２，５２３号および同第５，４６４，７６５号を参照されたい）；アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換によって（例えば、米国特許第５，５６３，０５５号、同第５，５９１，６１６号、同第５，６９３，５１２号、同第５，８２４，８７７号、同第５，９８１，８４０号、および同第６，３８４，３０１号を参照されたい）；ならびにＤＮＡ被覆粒子の加速によって（例えば、米国特許第５，０１５，５８０号、同第５，５５０，３１８号、同第５，５３８，８８０号、同第６，１６０，２０８号、同第６，３９９，８６１号、および同第６，４０３，８６５号を参照されたい）、ＤＮＡを細胞内に導入することができる任意の方法が挙げられる。このような技法を適用することによって、実質的にいかなる種の細胞も安定的に形質転換することができる。いくつかの実施形態において、形質転換しているＤＮＡは宿主細胞のゲノムに組み込まれる。多細胞種の場合、トランスジェニク細胞はトランスジェニック生物に再生させることができる。これらの技法のいずれかを使用して、例えば、トランスジェニック植物のゲノムに本発明の１つまたは複数の核酸配列を含むトランスジェニック植物を産生することができる。
【００７６】
植物に発現ベクターを導入するための最も幅広く利用されている方法は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）の天然形質転換システムに基づいている。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）は、植物細胞に遺伝的形質転換を起こす植物病原性土壌細菌である。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）のそれぞれのＴｉおよびＲｉプラスミドは、植物の遺伝的形質転換の原因となり得る遺伝子を担持している。Ｔｉ（腫瘍誘発性）−プラスミドは、Ｔ−ＤＮＡとして知られている大きなセグメントを含有しており、これが形質転換植物に移入される。Ｔｉプラスミドの別のセグメントであるｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡ移入に関与している。Ｔ−ＤＮＡ領域は、それぞれ末端反復ヌクレオチド配列で構成されている左側および右側ボーダーに隣接している。いくつかの改変バイナリーベクターにおいては、腫瘍誘発性遺伝子は欠失されており、ｖｉｒ領域の機能を利用して、Ｔ−ＤＮＡボーダー配列に隣接している外来ＤＮＡを移入する。またＴ−領域は、例えば、トランスジェニック植物および細胞を効率的に回収する選択可能なマーカー、ならびに本発明の融合タンパク質をコードしている核酸などを移入するための挿入配列に関する複数のクローニング部位を含有していてもよい。
【００７７】
したがって、いくつかの実施形態においては、植物形質転換ベクターは、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）のＴｉプラスミド（例えば、米国特許第４，５３６，４７５号、同第４，６９３，９７７号、同第４，８８６，９３７号、および同第５，５０１，９６７号、ならびに欧州特許ＥＰ  ０  １２２  ７９１を参照されたい）、またはＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）のＲｉプラスミドに由来する。追加の植物形質転換ベクターとしては、例えば、限定するものではないが、Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209-13；Bevan et al. (1983)、上掲；Klee et al. (1985) Bio/Technol. 3:637-42；および欧州特許ＥＰ  ０  １２０  ５１６に記載されているベクター、ならびに前述のいずれかに由来するものが挙げられる。植物と自然的に相互作用する他の細菌、例えば、シノリゾビウム（Sinorhizobium）、根粒菌（Rhizobium）、およびメソリゾビウム（Mesorhizobium）などは、多くの様々な植物への遺伝子移入を媒介するように改変することができる。これらの植物関連共生細菌は、解除されたＴｉプラスミドと適切なバイナリーベクターの両方を獲得することによって遺伝子移入用のコンピテントが作製され得る。
【００７８】
レシピエント細胞に外来性ＤＮＡを提供した後、形質転換細胞は、一般に、さらなる培養と植物再生のために同定される。形質転換細胞を同定する能力を改善するため、前述のように、形質転換体の作製に使用されるベクターと共に、選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を使用することが望まれ得る。選択可能なマーカーを使用する場合、形質転換細胞は、この細胞を１つまたは複数の選択的薬剤に曝露することによって、潜在的形質転換細胞群内で同定される。スクリーニング可能なマーカーを使用する場合、細胞は、所望のマーカー遺伝子形質についてスクリーニングすることができる。
【００７９】
選択的薬剤への曝露で生存する細胞、またはスクリーニングアッセイにおいてポジティブスコア化された細胞は、植物の再生をサポートする培地で培養することができる。いくつかの実施形態において、任意の適切な植物組織培養培地（例えば、ＭＳおよびＮ６培地）は、さらなる物質、例えば、成長調節物質などを含むことにより改変することができる。組織は、植物再生の取組みを開始するのに十分な組織が入手できるまで、またはマニュアル選択の繰り返しラウンドに続いて、この組織の形態が再生に適するようになるまで（例えば、少なくとも２週間）、成長調節物質を含む基本培地上に維持され、次いで、苗条形成を促進する培地に移され得る。培養物は、十分な苗条形成が得られるまで定期的に移される。苗条が形成されたならば、根形成を促進する培地に移される。十分な根が形成されたならば、植物をさらに成長および成熟させるため、土壌に移すことができる。
【００８０】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）依存性形質転換法を使用して形成されるトランスジェニック植物は、典型的には、１つの染色体に挿入される単一組換えＤＮＡ配列を含有する。単一組換えＤＮＡ配列は、「トランスジェニック事象」または「組込み事象」と呼ばれる。こうしたトランスジェニック植物は、挿入ＤＮＡ配列に対してヘテロ接合性である。いくつかの実施形態において、導入遺伝子に関してホモ接合性であるトランスジェニック植物は、単一外来性遺伝子配列を含有する独立した分離個体トランスジェニック植物をそれ自体に、例えば、Ｆ０植物に性別的に交配させ（自家受粉）、Ｆ１種子を産生することによって得られる。産生されたＦ１種子の４分の１は、導入遺伝子に関してホモ接合性である。Ｆ１種子が出芽すると、典型的には、ヘテロ接合体とホモ接合体を区別することができるＳＮＰアッセイまたは熱増幅アッセイ（すなわち、接合性アッセイ）を使用して、ヘテロ接合性について試験することができる植物が得られる。
【００８１】
本発明の核酸分子による植物または植物細胞の直接的形質転換に加えて、トランスジェニック植物は、少なくとも１つのトランスジェニック事象を有する第１の植物とこうした事象を欠失している第２の植物とを交雑させることによって、いくつかの実施形態において調製することができる。例えば、ＵＧＥを含む核酸分子を、形質転換に適している第１の植物系統に導入してトランスジェニック植物を産生することができ、そのトランスジェニック植物を第２の植物系統と交雑させて、ＵＧＥを含む核酸分子を第２の植物系統に移入させることができる。
【００８２】
本明細書のいくつかの実施形態において、任意のＧＭＯを分析することができる。特定の実施形態において、ＧＭＯは遺伝子組換え植物である。本明細書の特定のシステムおよび方法を使用して分析される植物材料サンプルは、異なる多数の外来性核酸、例えば、限定するものではないが、遺伝子組換え植物に特異的であるか、または遺伝子組換え植物起原を有する外来性核酸を含み得る任意の物質であってよい。いくつかの例において、サンプルは、食品、食品成分、食品添加物および／またはＧＭＯ由来の材料を含み得る固体もしくは液体状の抽出物であってよい。いくつかの例において、核酸は、分析前に、植物材料サンプルから抽出することができる。
【００８３】
遺伝子組換え植物は、双子葉植物または単子葉植物の植物種であってよい。本発明の特定の実施形態によって分析され得る双子葉植物からの植物細胞の非限定的な例としては、次のものが挙げられる：アルファルファ；マメ；アブラナ；ブロッコリー；キャベツ；キャノーラ；ニンジン；カリフラワー；セロリ；ハクサイ；ワタ；キュウリ；ナス；レタス；メロン；エンドウ；トウガラシ；ピーナッツ；ジャガイモ；カボチャ；ラディッシュ；ナタネ；ホウレンソウ；ダイズ；カボチャ；テンサイ；ヒマワリ；タバコ；トマト；およびスイカ。本発明の特定の実施形態によって分析され得る単子葉植物からの植物細胞の非限定的な例としては、次のものが挙げられる：トウモロコシ；タマネギ；イネ；モロコシ；コムギ；ライムギ；キビ；サトウキビ；オートムギ；ライコムギ；スイッチグラス；およびターフグラス。
【００８４】
以下の実施例は、ある特定の態様および／または実施形態を説明するために提供されている。実施例は、例示されている特定の態様または実施形態に本開示を限定するものと解釈されるべきではない。
［実施例］
【実施例１】
【００８５】
トランスジェニック植物産生のための固有遺伝因子を含むベクターの設計および構築物
１５〜２５ｂｐのランダムヌクレオチド配列を含む固有合成遺伝因子（ＵＧＥ）をＥｘｃｅｌ（登録商標）（ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ）アプリケーションでマクロを使用して作製した。乱数系列は、数字１から４の所望の長さで作製した。それぞれの数字を指定したヌクレオチド塩基に対応させ（例えば、１＝Ａ；２＝Ｃ；３＝Ｇ；および４＝Ｔ）、その後、クローニング操作用の市販ベンダーによって合成されるポリヌクレオチドを作製した。
【００８６】
ＵＧＥは、それぞれ、普遍的ＰＣＲフォワードプライマーおよびリバースプライマーの結合用フランキング配列を含む７０〜８０ｂｐ長の配列（本明細書ではアンプリコンと呼ばれる）に組み入れた。２１種のＵＧＥおよび２１種の関連アンプリコン（それぞれ、ＵＧＥ配列および隣接する普遍的プライマー結合部位を含む）を設計し、民間会社によって高コピープラスミドに合成された（ＤＮＡ  ２．０；  Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，  ＣＡ）。表１に２１種のＵＧＥの配列と対応するアンプリコンを記載する。
【００８７】
【表１】
2016511002.tif 000003
2016511002.tif 000004
【００８８】
改良した高コピー植物形質転換ベクターのセットは、前駆体植物形質転換ベクター（アグロバクテリウム（Agrobacterium）バイナリーベクター）のＮａｒＩＩＩ部位とＡｓｉＳＩ部位に、（セットに固有の）ＵＧＥを含む、選択アンプリコン断片をクローニングすることにより構築した。アンプリコン断片は、一般に、植物選択可能マーカーとして機能するように設計された遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子）のプロモーター領域と目的の第１の遺伝子の（逆方向）プロモーター領域の間に配置した。多くの場合、他の目的の遺伝子もまた、Ｔ−ＤＮＡ境界の間に含まれていた。
【実施例２】
【００８９】
トウモロコシゲノムＤＮＡの抽出
単一トウモロコシ種子サンプルから得たゲノムＤＮＡは、改良ＦａｓｔＩＤ（商標）法を使用して抽出した（ＦａｓｔＩＤ（商標）ゲノムＤＮＡ９６ウェル抽出キット；ＧＥＮＥＴＩＣ  ＩＤ、Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ、ＩＡ）。種子サンプルは、４ｍＬのポリカーボネートバイアル（ＯＰＳ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＬＬＣ、Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＪ）中で９．６５ｃｍのステンレス鋼球を使用し、ＧＥＮＯ／ＧＲＩＮＤＥＲ（商標）２０１０（ＳＰＥＸ  ＳＡＭＰＬＥＰＲＥＰ、Ｍｅｔｕｃｈｅｎ、ＮＪ）で２分間、１５００ｒｐｍにて粉砕した。プロテイナーゼＫを含有する１ｍＬ溶解バッファー（ＦａｓｔＩＤ（商標）ゲノムＤＮＡキット）を単一種子粉砕粉末に加え、スラリーを１５００ｒｐｍで２０秒間さらにホモジナイズした。バイアルを３分間１４５０×ｇで遠心分離にかけ、２００μＬの上清を、磁気ビーズ（ＭＡＧＡＴＴＲＡＣＴ（商標）サスペンションＧ；Ｑｉａｇｅｎ）と共に結合バッファーを含有するＫＩＮＧＦＩＳＨＥＲ（商標）９６ウェルディープウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）に移した。
【００９０】
あるいは、バルク粉砕粉末に外因存在試験を行う予定である実験において、６００μＬの溶解バッファーを添加し、スラリーをＧＥＮＯ／ＧＲＩＮＤＥＲ（商標）２０１０で５分間１３６０ｒｐｍにてホモジナイズした。サンプルを６８００×ｇで５分間遠沈し、２００μＬの上清を、磁気ビーズと共に結合バッファーを含有するＫＩＮＧＦＩＳＨＥＲ（商標）プレートに移した。
【００９１】
両場合（単一種子およびバルク粉砕種子）において、磁気ビーズに結合しているＤＮＡを洗浄し、ＫＩＮＧＦＩＳＨＥＲ（商標）自動ＤＮＡ抽出プラットフォームを使用して溶出させた。ＤＮＡを２００μＬの１×ＴＥバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣＬ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶出させ、その後使用するまで４℃で保存した。抽出したＤＮＡの量は、ＱＵＡＮＴ−ＩＴ（商標）ＰＩＣＯ  ＧＲＥＥＮ  ＤＮＡアッセイキット（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ；  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して計量し、バッファーを１０ｎｇ／μＬの最終濃度まで添加した。
【実施例３】
【００９２】
トランスジェニックトウモロコシ植物の産生
胚が約１．８〜２．４ｍｍの長さになった時、未成熟胚をトウモロコシ（Zea mays）近交系Ｂ１０４の穂から単離した。胚を、アセトシリンゴンおよび界面活性剤ＢＲＥＡＫ  ＴＨＲＵ（商標）Ｓ−２３３含有のアグロバクテリウム懸濁液と２０〜３０分間、１．０の吸光度でインキュベートし、次いで、胚盤向けの同時培養培地に入れた。
【００９３】
同時培養ステップを３〜４日間継続し、次いで、胚を抗生物質含有の植物組織培養培地上に７日間移し、アグロバクテリウム（Agrobacterium）増殖を抑制しカルス形成を開始させた。カルスを、適切な選択剤を含有する培地に移し、３週間、非形質転換組織の増殖を抑制し、次いで、７日間、植物成長ホルモン含有の選択培地に入れ、不定胚の発芽を誘導した。植物成長ホルモン培地に暴露した１週間後、カルスを選択と同時に植物再生培地に置いた。
【００９４】
植物は、典型的には、植物再生培地に移した後１〜２週間以内に形成され、小植物体に成長した時に植物成長培地に移した。それぞれの植物から得た１０〜１５ｍｇの葉組織を、１週間前に選択可能なマーカー遺伝子（ＡＡＤ１；米国特許第７，８３８，７３３号）の加水分解プローブＰＣＲ分析用にサンプリングし、一構築物当たり３０〜４０個の少ないコピー数の事象（すなわち、１〜３個のコピー選択可能なマーカー遺伝子）を移植用の温室に移し、温室内で増殖させた。Ｔ０の事象のすべてに対して雄穂が取り除かれ、Ｔ１を採種するためＢ１０４花粉を用いて授粉させた。Ｔ１植物とＴ２植物を自家受粉させ、ホモ接合性種子を得た。
【実施例４】
【００９５】
ベクターセットに含まれる固有遺伝因子の検出
ＵＧＥアンプリコンを含有するプラスミドＤＮＡ中の個々のＵＧＥは、固有の加水分解オリゴヌクレオチドプローブを用いてＰＣＲ方法を使用して検出した。普遍的プライマーは、構築物の異なる群からのＵＧＥを増幅および検出用ＰＣＲアッセイで使用した。表１に記載したアンプリコンの増幅に使用される普遍的プライマーを表２に示す。消光可能な蛍光系ＰＣＲ加水分解プローブは、標的ＵＧＥに特異的にハイブリダイズすることができるように設計され、ＦＡＭ蛍光リポーター色素（クエンチャーとしてのＭＧＢＮＦＱ）により標識した。加水分解プローブオリゴヌクレオチドは、検出しようとするＵＧＥと同一のヌクレオチド配列を含んでいた。
【００９６】
ＵＧＥの事前検証は、ＵＧＥ含有プラスミドＤＮＡそのものの連続希釈と、様々な濃度のＵＧＥ含有プラスミドＤＮＡでスパイクした非トランスジェニックコーンゲノムＤＮＡを試験することにより実施した。したがって、プライマーおよび加水分解プローブも、増幅して標的コーン内部対照、ＺＳＳＩＩｂ（配列番号４８）およびインベルターゼ（配列番号４７）に特異的にハイブリダイズするように設計した。表３。これらの対照プローブは、ＨＥＸ蛍光リポーター色素（クエンチャーとしてのＢＨＱ２）により標識した。プライマーおよびプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）またはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）から入手した。ＰＣＲ試薬は、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）から入手した。
【００９７】
【表２】
2016511002.tif 000005
【００９８】
【表３】
2016511002.tif 000006
【００９９】
加水分解プローブＰＣＲアッセイによる検証によって、個々のＵＧＥが高精度で、特異的かつ効率よく検出されたことが明らかになった。エンドポイントＰＣＲ技術およびリアルタイムＰＣＲ技術は、表４〜５の条件に従って、プラスミドおよびコーンゲノムＤＮＡからのＵＧＥの検出に利用した。Ｂｉｐｌｅｘ  ＰＣＲアッセイ（ＴＡＱＭＡＮ（登録商標））は、標的（ＵＧＥ）と内部対照（インベルターゼまたはＺＳＳＩＩｂ）の両方を検出するために実施した。
【０１００】
【表４】
2016511002.tif 000007
【０１０１】
ＰＣＲミックスを作製した後（表４）、７μＬのミックス（３８４ウェルプレートに対して）または１２μＬのミックス（９６ウェルプレートに対して）を各ウェルへ移し、３μＬのＤＮＡサンプル（一反応当たり３０ｎｇ以下）を添加した。ＰＣＲプレートをＦＬＥＸＩＳＥＡＬ（商標）膜を用いてシールし、反応をサーモサイクラーで実施した。
【０１０２】
ＵＧＥプラスミドが非トランスジェニックトウモロコシから調製したゲノムＤＮＡへスパイクされる場合（表５ｂ）、または、ＵＧＥがトランスジェニックトウモロコシから調製されたゲノムＤＮＡにおいてアッセイされる場合（表５ｃ）、様々なＰＣＲ条件をプラスミドサンプルにおけるＵＧＥの検出に利用した（表５ａ）。ＵＧＥプラスミドがトウモロコシゲノムＤＮＡへスパイクされ、ＵＧＥがトランスジェニックトウモロコシＤＮＡにおいてアッセイされる場合の実験において、ｂｉｐｌｅｘ加水分解プローブＰＣＲアッセイを実施し、ＵＧＥ遺伝子とトウモロコシ内部対照（参照）遺伝子（インベルターゼまたはＺＳＳＩＩｂ）の両方を検出した。エンドポイントＰＣＲ反応については、Ｃ１０００サーモサイクラー（ＢＩＯＲＡＤ）またはＰＥ９７００サーモサイクラー（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ）のいずれかを使用した。リアルタイムＰＣＲ反応については、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ＩＩサーモサイクラー（ＲＯＣＨＥ）を使用した。
【０１０３】
【表５】
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【０１０４】
［００１０］終了したＰＣＲプレートは、ＰＨＥＲＡＳＴＡＲ（商標）ＦＳ蛍光プレートリーダー（ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ；Ｃａｒｙ、ＮＣ）で読み取った。
【０１０５】
６つのＵＧＥ（表１；ＵＧＥ１〜ＵＧＥ６）の１つを含むアンプリコンを合成し、高コピー数プラスミドへクローニングし、適切なプラスミドＤＮＡ（すなわち、ｐＥＰＰ１１３５〜ｐＥＰＰ１１４０；それぞれＵＧＥ１〜ＵＧＥ６に対応）をＰＣＲ増幅の試験およびエンドポイントＰＣＲ反応における高効率、特異的および高感度の検出に使用した。６つのＵＧＥと隣接する因子を含むポリヌクレオチドの配列は、ヌクレオチド配列の違いを示すようにベクターＮＴＩに並べた。図１。
【０１０６】
ＵＧＥ検出の特異性
６つのＵＧＥを標的とする加水分解プローブ（ＦＡＭ蛍光色素で標識）を、それぞれのＵＧＥプラスミドＤＮＡ（ｐＥＰＰ１１３５〜ｐＥＰＰ１１４０）に対して試験した。６つの異なるＵＧＥの１つを標的とするように設計したそれぞれの加水分解プローブは、標的ＵＧＥ（円印）を特異的に増幅し、非特異的な増幅／交配の反応性は他のプローブからは確認されなかった。図２。加水分解プローブは、プラスミドＤＮＡ（ｐＥＰＰ１１３５〜ｐＥＰＰ１１４０）中にカセットを含有する６つのすべての異なるＵＧＥを区別することが示された。またプローブは、鋳型無しの対照および陰性対照のコーンＤＮＡに対しては非特異的結合を除外することも試験した。図２。
【０１０７】
ＵＧＥ検出の感度
それぞれのＵＧＥ含有プラスミドに対して適切なＵＧＥ鋳型／加水分解プローブの組み合わせを使用して、加水分解プローブアッセイエンドポイントＰＣＲ反応を実施し、方法の感度レベルを判定した。ＵＧＥを含有するプラスミドＤＮＡをＰＣＲ増幅用の鋳型として使用した。０．００００００１ｎｇ〜１ｎｇの濃度範囲のプラスミドＤＮＡを試験した。結果から、極低濃度のＵＧＥ含有鋳型ＤＮＡはすべての加水分解プローブで検出することができることが示された。図３。またプローブは、鋳型無しの対照および陰性対照のコーンＤＮＡに対しては非特異的結合を除外することも試験した。図３。
【実施例５】
【０１０８】
トウモロコシＤＮＡ中の固有遺伝因子の特異的および高感度な検出
非トランスジェニックトウモロコシゲノムＤＮＡ中のＵＧＥ  ＤＮＡの検出
ＵＧＥ（ＵＧＥ２、ＵＧＥ３、およびＵＧＥ７〜ＵＧＥ２１）は、トウモロコシゲノムＤＮＡのバックグラウンドへスパイクされた時にリアルタイム加水分解プローブＰＣＲによって検出した。０．００００００１ｎｇ〜１ｎｇの希釈範囲で試験した。リアルタイムＰＣＲは、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（商標）ＩＩサーモサイクラーを使用して実施した。融解曲線を分析し、それぞれの標的ＤＮＡ希釈に対して平均Ｃｐ値を計算した。試験したそれぞれのＵＧＥについて決定した検出限界を表６に記載する。それぞれのアッセイの例（ＵＧＥ３およびＵＧＥ４の検出）は、図４および図５にそれぞれ示す。これらのＰＣＲ結果は、ＵＧＥを高感度で検出することができる可能性を示し、このことは、ＵＧＥが植物形質転換構築物検出の新規手段を提供可能であることを示唆している。
【０１０９】
【表６】
2016511002.tif 000009
【０１１０】
トランスジェニックトウモロコシ植物の種子由来のゲノムＤＮＡ中のＵＧＥの検出。
ＵＧＥアンプリコンを、図６〜７に記載の手法に従って、植物形質転換ベクターへさらにクローニングした。ＵＧＥを含む１２のアンプリコンを、目的の異なる遺伝子を担持する３６６種の植物発現ベクターにおいて使用し、約８，０００のトランスジェニック事象が生じた。表７。
【０１１１】
【表７】
2016511002.tif 000010
【０１１２】
ＵＧＥ２およびＵＧＥ３含有構築物による形質転換によって得られたヘテロ接合Ｔ１トランスジェニック事象の種子から単離したゲノムＤＮＡをＵＧＥ検出試験に使用した（種子供給源は表８に示す）。前述のように、ゲノムＤＮＡが単離された。ゲノムＤＮＡの濃度を１０ｎｇ／μＬに調整し、合計３０ｎｇのゲノムＤＮＡをそれぞれのＰＣＲ反応に使用した。非トランスジェニックコーン種子ＤＮＡを陰性対照として使用した。
【０１１３】
【表８】
2016511002.tif 000011
【０１１４】
ＵＧＥ特異的エンドポイント加水分解プローブＰＣＲアッセイを実施し、サンプル番号に対する正規化蛍光の関数として結果を分析した。図８。結果から、トランスジェニックサンプル由来の標的ＵＧＥ配列の増幅および検出が高感度であり、非トランスジェニックコーンサンプル由来では増幅がないことが示された。これによって、検出方法の特異性が示唆された。
【実施例６】
【０１１５】
外因存在試験に対する固有遺伝因子の使用
外因存在の検出に対するＵＧＥの使用を試験するため、Ｔ２ホモ接合体種子を、ＵＧＥ３含有構築物による形質転換によって産生されたトランスジェニック植物から得た（種子供給源は表９に示す）。合計で、１事象当たり３５個のホモ接合トランスジェニック種子が選択され、ゲノムＤＮＡが単離された。
【０１１６】
【表９】
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【０１１７】
ＵＧＥ特異的エンドポイント加水分解プローブＰＣＲアッセイを実施し、結果を実施例５で述べたようにして分析した。結果から、ホモ接合トランスジェニックサンプルおよび陽性対照サンプルからの標的ＵＧＥ３配列の増幅が明らかであることと、非トランスジェニックトウモロコシサンプル（陰性対照）からは増幅がないことが示された。図９。
【０１１８】
トランスジェニック供給源ＩＤ番号ＺＱ１１ＬＱ１９９０８８．００１６．０１６（表９）の３５個のホモ接合種子から調製したトウモロコシゲノムＤＮＡのサンプルをプールし、連続希釈物（１００％、１０％、１％、０．５％および０．１％のトランスジェニックＤＮＡ）を、バックグラウンド（希釈剤）として非トランスジェニックトウモロコシゲノムＤＮＡを使用し生成した。それぞれのトランスジェニックＤＮＡ希釈は、エンドポイント加水分解プローブＰＣＲアッセイ（４０サイクル）において６回繰り返し行った。
【０１１９】
結果は、サンプル番号に対する相対蛍光の関数として分析した。図１０。測定した相対蛍光がすべての希釈から検出された。非特異的増幅は、陰性サンプル（鋳型無しの対照および非トランスジェニックＤＮＡ対照）からは確認されたかった。これらの結果により、ＵＧＥは、トランスジェニックトウモロコシ種子から調製したゲノムＤＮＡにおいて非常に高感度で正確に検出することができることが示唆される。
【０１２０】
１００個の種子のプールは、典型的には、１％の感度の要件に匹敵する、９９個の非トランスジェニック種子中に混入している１個のトランスジェニック種子を同定する適切な検出方法が必要とされる外因存在について試験される。ＵＧＥ（ＵＧＥ３）を含有する単一のトランスジェニックＴ２コーン種子（ｐＤＡＢ１０８５２６−供給源ＩＤ番号ＺＱ１１ＬＱ１９９０８８．００１６．０１６）を９９個の非トランスジェニックコーン種子のプールへ加えた。種子プールからの単離ＤＮＡについて、エンドポイント加水分解プローブＰＣＲを使用して試験した。結果から、混入種子はＵＧＥ特異的アッセイを使用して容易に検出できることが示唆された（図１１）。これは、ＵＧＥがＡＰ試験およびトランスジェニック事象のモニタリングに使用可能であるという論拠により一層の説得力を加えるものである。
【図１】
2016511002.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2016511002.tif 000025
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