(57)【要約】  本発明は、結腸直腸ガンの処置に使用するための抗クローディン１抗体に関する。特に、本発明は、それを必要とする被験体における結腸直腸ガンを処置する方法であって、治療有効量の抗クローディン１（ＣＬＤＮ１）抗体を該被験体に投与することを含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする被験体における結腸直腸ガンを処置する方法であって、治療有効量の抗クローディン１（ＣＬＤＮ１）抗体を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２】
抗体が、モノクローナル抗体、Ｆａｂ’抗体、Ｆａｂ抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、単一ドメイン抗体、ＴａｎｄＡｂ二量体抗体、Ｆｖ抗体、ｓｃＦｖ抗体、ｄｓＦｖ抗体、ｄｓ−ｓｃＦｖ抗体、Ｆｄ抗体、直鎖状抗体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメント、バイボディ、トリボディ；ｓｃダイアボディ；カッパ（ラムダ）ボディ（ｓｃＦｖ−ＣＬ融合体）；ＢｉＴＥ抗体；ＤＶＤ−Ｉｇ；ＳＩＰ抗体；ＳＭＩＰ抗体；ＤＡＲＴ抗体；１つ以上のＣＤＲを含む小抗体模倣物などからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
抗体が、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３１、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３２、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３３、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３４、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３５、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３６、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３７及びＤＳＭ  ＡＣＣ２９３８からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
抗体が、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３１、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３２、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３３、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３４、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３５、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３６、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３７及びＤＳＭ  ＡＣＣ２９３８からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞株から得ることが可能な抗体のヒト化型である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
抗体が、Ｈ−ＣＤＲ１領域に配列番号：２、Ｈ−ＣＤＲ２領域に配列番号：３及びＨ−ＣＤＲ３領域に配列番号：４を含む重鎖可変領域と、Ｌ−ＣＤＲ１領域に配列番号：６、Ｌ−ＣＤＲ２領域に配列番号：７及びＬ−ＣＤＲ３領域に配列番号：８を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
抗体が抗体薬物コンジュゲートである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
抗体が細胞毒性薬にコンジュゲートされている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
抗体が、化学療法剤、プロドラッグ変換酵素、放射性同位体又は化合物及び毒素からなる群より選択される治療剤にコンジュゲートされている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞毒性薬が、抗チューブリン剤、オーリスタチン、ＤＮＡマイナーグルーブ結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸剤、代謝拮抗物質、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール、プレフォーミング化合物、プリン代謝拮抗物質、プロマイシン、放射線増感剤、ストロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤及びビンカアルカロイドからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞毒性薬が、アンドロゲン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、アスパラギナーゼ、５−アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブサルファン、ブチオニン、スルホキシミン、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン、ＣＣ−１０６５、クロランブシル、シスプラチン、コルヒシン、シクロホスファミド、シタラビン、シチジンアラビノシド、シトカラシンＢ、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エストロゲン、５−フルオロデオキシウリジン、リン酸エトポシド（etopside phosphate）、５−フルオロウラシル、グラミシジンＤ、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、ミトマイシンＣ、ミトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルビジン、ストレプトゾトシン、テノポシド、６−チオグアニン、チオＴＥＰＡ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビンからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
細胞毒性薬が、ドキソルビシン、パクリタキセル、メルファラン、ビンカアルカロイド、メトトレキサート、ミトマイシンＣ又はエトポシドからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
細胞毒性薬が、オーリスタチンＥ又はその誘導体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
抗体がプロドラッグ変換酵素にコンジュゲートされている、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
プロドラッグ変換酵素が、カルボキシペプチダーゼＧ２、β−グルクロニダーゼ、ペニシリン−Ｖ−アミダーゼ、ペニシリン−Ｇ−アミダーゼ、β−ラクタマーゼ、β−グルコシダーゼ、ニトロレダクターゼ及びカルボキシペプチダーゼＡからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
抗体を使用して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
抗体が単一ドメイン抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
抗体が、ＣＬＤＮ１に対する第１の結合部位と、エフェクター細胞上の活性化トリガー分子に対する第２の結合部位（binding side）とからなる二重特異性抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
エフェクター細胞上の活性化トリガー分子が、Ｔ細胞上のＣＤ３、ナチュラルキラー細胞、単球及びマクロファージ上のＣＤ１６、好中球及び単球／マクロファージ上のＣＤ８９及びＣＤ６４、並びに樹状細胞上のＤＥＣ−２０５からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、結腸直腸ガンの処置に使用するための抗クローディン１抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
ＣＬＤＮは、タイトジャンクション（ＴＪ）に関連する内在性膜タンパク質である。ＴＪは、上皮細胞の外側膜及び内皮シートの最先端領域にある。それら２つの主要機能は、細胞極性を維持するフェンス機能、及び溶質の拡散をレギュレーションする傍細胞バリア機能である（Tsukita and Furuse, 2006）。ＣＬＤＮは、２つの異なる方法で（膜の面に対して横方向に（ヘテロメリック相互作用）、又は隣接細胞間のヘッドツーヘッド結合で（ヘテロタイプ相互作用））相互作用する。それらは、オクルディン及び／又はＪＡＭと複合体を形成し得る。それらは、短い細胞内Ｎ末端ドメインと、４つの膜貫通ドメインと、２つの細胞外ループと、リン酸化部位、及びクローディンが細胞質足場タンパク質（例えば、ＴＪ関連タンパク質ＭＵＰＰ１、ＰＡＴＪ、ＺＯ−１、ＺＯ−２及びＺＯ−３並びにＭＡＧＵＫ）と直接的に相互作用することを可能にするＰＤＺドメイン結合モチーフを含有する細胞内Ｃ末端ドメインとを有する（Lal-Nag and Morin, 2009）。これらのタンパク質は、タイトジャンクションストランドの細胞質表面でアダプターとして機能して、細胞骨格分子及びシグナル伝達分子を含む他のタンパク質をリクルートし得る（Tsukita et al., 2001）。調節タンパク質Ｒａｂ３ｂ、Ｒａｂ１３、ＰＴＥＮのような腫瘍抑制因子、ＺＯＮＡＢ及びＨｕＡＳＨ１のような転写因子を含む多数の他の細胞質タンパク質及び核タンパク質も、タイトジャンクション複合体と直接的又は間接的に相互作用することが示されている（Singh et al., 2010）。
【０００３】
ＣＬＤＮ１は、２４メンバーの密接に関連した膜貫通タンパク質からなるクローディンタンパク質ファミリーに属する。ＣＬＤＮ１は、結腸直腸ガンの新たな治療ターゲットである（Kominsky, 2006）。いくつかの研究（本発明者らの研究を含む）において、ＣＬＤＮ１は、腫瘍組織では、正常な結腸粘膜と比較して過剰発現しており、腫瘍進行に関連することが見出された（Miwa et al., 2001; Dhawan et al., 2005; Grone et al., 2007; Huo et al., 2009）。新生物へのＣＬＤＮ１の関与は、ＣＬＤＮ１の異常な組織発現によるＴＪの構造及び機能の変化によって、又は細胞シグナル伝達経路におけるＣＬＤＮ１の関与によって説明され得る（Singh et al., 2010）。Dhawan及び共同研究者は、結腸腫瘍組織ではＣＬＤＮ１が増加しており、それと同時に、ＣＬＤＮ１が膜から細胞質及び核に非局在化していることを報告している（Dhawan et al., 2005）。ＣＬＤＮ１は２つの役割（膜内にある場合には細胞接着、及び細胞質又は核に局在している場合にはシグナル伝達）を有し得ることも示唆された（Singh et al., 2010）。従来技術では、腫瘍進行中に、ＣＬＤＮ１は膜から非局在化していると明記されているので、当業者は、抗ＣＬＤＮ１抗体に基づく免疫療法が信頼できるものであると予想することができなかった。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、結腸直腸ガンの処置に使用するための抗クローディン１抗体に関する。特に、本発明は、特許請求の範囲によって定義される。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
発明の詳細な説明：
本発明者らは、免疫組織化学によって、結腸直腸ガン由来の組織切片におけるＣＬＤＮ１の発現を調査した。文献と一致して、本発明者らは、ＣＬＤＮ１発現が、腫瘍性組織では、正常結腸粘膜と比較して増加していたことを示した。しかしながら、従来技術とは反対に、本発明者らは、腺ガンのほとんどが膜染色を示したので、ＣＬＤＮ１陽性ガンの免疫療法のターゲットとしてＣＬＤＮ１を使用することは信頼できることを実証した。本発明者らは、モノクローナル抗体（すなわち、６Ｆ６Ｃ３）をこのように選択及び特性評価し、このようなモノクローナル抗体を用いて抗腫瘍効果を得ることが可能であるという概念を証明した。
【０００６】
したがって、本発明の態様は、それを必要とする被験体における結腸直腸ガンを処置するための方法に使用するための抗ＣＬＤＮ１抗体に関する。
【０００７】
「クローディン−１」又は「ＣＬＤＮ１」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、タイトジャンクションに関連する内在性膜タンパク質クローディン１を指す。ＣＬＤＮ１は、単離されたニワトリ肝臓接合画分に由来する２２ｋＤのポリペプチドとして最初に同定され、それらのマウスホモログをコードするｃＤＮＡがクローニングされた（Furuse et al., 1998）。ＣＬＤＮ１（エイリアス＝ＳＥＭＰ１）のヒトｃＤＮＡがクローニング及び配列決定された（Swisshelm et al., 1999）。それは、６３６ヌクレオチドを含む４つのエクソンを含有する。翻訳されると、２１１個のアミノ酸残基の産物が生じる。ＣＬＤＮ１は、４つの膜貫通領域を有するテトラスパン膜トポロジーを有する。細胞内では、ＣＬＤＮ１は、７個のＮ末端アミノ酸、１２個のループアミノ酸及び２７個のＣ末端アミノ酸を示す。細胞外ループ（ＥＣＬ）１は５３個のアミノ酸からなり、２個の保存されたシステインを有する。ＥＣＬ２は、２７個のアミノ酸を有する。「ヒトクローディン−１又はヒトＣＬＤＮ１」という用語は、ＮＣＢＩアクセッションナンバーＮＰ＿０６６９２４に示されている配列を有するタンパク質、又はＨＣＶ許容ヒト集団に一般に見られる任意の天然に存在する変異体を指す。クローディン−１の「細胞外ドメイン」又は「外部ドメイン」という用語は、細胞外空間（すなわち、細胞外の空間）に及ぶクローディン−１配列の領域を指す。
【０００８】
いくつかの実施態様では、本発明の抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、又は抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）による毒性を提供するために使用される。いくつかの実施態様では、抗ＣＬＤＮ１抗体は、腫瘍細胞の生存及び腫瘍成長が制限又は阻害されるように、（例えば、ＣＬＤＮ１のインターナリゼーションを誘発することによって）細胞表面におけるＣＬＤＮ１の発現を妨げるのに適切であり得る。
【０００９】
本発明は、抗ＣＬＤＮ１抗体の抗体又はフラグメントを包含する。
【００１０】
本発明によれば、抗体又は抗体フラグメントは、ＣＬＤＮ１の細胞外ドメインの全部又は一部を対象とする。いくつかの実施態様では、抗体又は抗体フラグメントは、ＣＬＤＮ１の細胞外ドメインを対象とする。
【００１１】
したがって、「抗体」という用語は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を指すために使用され、この用語は、抗原結合ドメイン、例えばＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、ＴａｎｄＡｂ二量体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、Ｆｄ、直鎖状抗体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメント、バイボディ（bibody）、トリボディ（tribody）（それぞれ、ｓｃＦｖ−Ｆａｂ融合体、二重特異性又は三重特異性）；ｓｃ−ダイアボディ；カッパ（ラムダ）ボディ（ｓｃＦｖ−ＣＬ融合体）；ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（Bispecific T-cell Engager）、Ｔ細胞を誘引するためのｓｃＦｖ−ｓｃＦｖタンデム）；ＤＶＤ−Ｉｇ（二重可変ドメイン抗体、二重特異性フォーマット）；ＳＩＰ（小免疫タンパク質、ミニボディの一種）；ＳＭＩＰ（「小モジュラー免疫薬」）ｓｃＦｖ−Ｆｃ二量体；ＤＡＲＴ（不安定化ダイアボディ「二重親和性再ターゲティング」）；１つ以上のＣＤＲを含む小抗体模倣物などを含む抗体フラグメントを含む。様々な抗体ベースの構築物及びフラグメントを調製及び使用するための技術は、当技術分野で周知である（Kabat et al., 1991（これは、参照により本明細書に明確に組み込まれる）を参照のこと）。特に、ダイアボディは、欧州特許出願公開第４０４，０９７号及び国際公開公報第９３／１１１６１号にさらに記載されているのに対して、直鎖状抗体はZapata et al. (1995)にさらに記載されている。抗体は、従来の技術を使用してフラグメント化され得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体をペプシンで処理することにより作製され得る。得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントを処理してジスルフィド架橋を還元し、Ｆａｂ’フラグメントを生産し得る。パパイン消化は、Ｆａｂフラグメントの形成をもたらし得る。Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ＴａｎｄＡｂ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特性抗体フラグメント並びに他のフラグメントはまた、リコンビナント技術によって合成され得るか、又は化学的に合成され得る。抗体フラグメントを生産するための技術は当技術分野で周知であり、十分に説明されている。例えば、Beckman et al., 2006; Holliger & Hudson, 2005; Le Gall et al., 2004; Reff & Heard, 2001 ; Reiter et al., 1996;及びYoung et al., 1995はそれぞれ、有効な抗体フラグメントの生産をさらに説明しており、それを可能にする。
【００１２】
天然抗体では、２本の重鎖がジスルフィド結合によって互いに連結しており、各重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖に連結している。ラムダ（ｌ）及びカッパ（ｋ）という２種類の軽鎖がある。抗体分子の機能活性を決定する主要な５つの重鎖クラス（又はアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥがある。各鎖は、別個の配列ドメインを含有する。軽鎖は、２個のドメイン（可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ））を含む。重鎖は、４個のドメイン（可変ドメイン（ＶＨ）及び３個の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３。Ｈと総称される））を含む。軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域は、抗原に対する結合認識及び特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、重要な生物学的特性、例えば抗体鎖の会合、分泌、経胎盤移動性、補体結合、及びＦｃレセプター（ＦｃＲ）に対する結合を付与する。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部分であり、１本の軽鎖及び１本の重鎖の可変部分から構成される。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造的相補性にある。抗体結合部位は、超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）に主に由来する残基から構成される。時には、非超可変領域又はフレームワーク領域（ＦＲ）に由来する残基が全体的なドメイン構造、したがって結合部位に影響を与える。相補性決定領域又はＣＤＲは、ネイティブな免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性及び特異性を共に規定するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖はそれぞれ、３個のＣＤＲ（それぞれＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３及びＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３と称される）を有する。したがって、抗原結合部位は、重鎖及び軽鎖Ｖ領域のそれぞれに由来するＣＤＲセットを含む６個のＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲ間に介在するアミノ酸配列を指す。
【００１３】
「Ｆａｂ」という用語は、約５０，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、ＩｇＧをプロテアーゼ（パパイン）で処理することによって得られるフラグメントのうち、Ｈ鎖のＮ末端側のほぼ半分及びＬ鎖全体がジスルフィド結合によって共に結合している抗体フラグメントを意味する。
【００１４】
「Ｆ（ａｂ’）２」という用語は、約１００，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、ＩｇＧをプロテアーゼ（ペプシン）で処理することによって得られるフラグメントのうち、ヒンジ領域のジスルフィド結合によって結合している、Ｆａｂよりもわずかに大きな抗体フラグメントを指す。
【００１５】
「Ｆａｂ’」という用語は、約５０，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる抗体フラグメントを指す。
【００１６】
一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、通常、ペプチドコードリンカーによって連結されたＶＨ及びＶＬコード遺伝子を含む遺伝子融合体から発現される共有結合ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合によって安定化されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。二価抗体フラグメント及び多価抗体フラグメントは、一価ｓｃＦｖの会合によって自然に形成し得るか、又はペプチドリンカーによって一価ｓｃＦｖをカップリングすることによって作製され得る（例えば、二価ｓｃ（Ｆｖ）２）。
【００１７】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントであって、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が同じポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結されたもの（ＶＨ−ＶＬ）を含む小さな抗体フラグメントを指す。同じ鎖上の２個のドメイン間のペアリングを可能にするには短過ぎるリンカーを使用することによって、前記ドメインを別の鎖の相補的ドメインと強制的にペアリングさせて、２つの抗原結合部位を作る。
【００１８】
モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein (Nature, 256:495, 1975)の方法を使用して作製され得る。本発明に有用なモノクローナル抗体を調製するために、抗原型ＣＬＤＮ１を用いて、マウス又は他の適切な宿主動物を適切な間隔で（例えば、週２回、週１回、月２回又は月１回）免疫する。屠殺の１週間以内に、最終「追加免疫」の抗原を動物に投与し得る。免疫中、免疫アジュバントを使用することが望ましいことが多い。適切な免疫アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン、Ｒｉｂｉアジュバント、HunterによるTitermax、サポニンアジュバント、例えばＱＳ２１若しくはＱｕｉｌＡ、又はＣｐＧ含有免疫刺激オリゴヌクレオチドが挙げられる。他の適切なアジュバントは、当技術分野で周知である。皮下経路、腹腔内経路、筋肉内経路、静脈内経路、鼻腔内経路又は他の経路によって、動物を免疫し得る。複数の形態の抗原を用いて、複数の経路によって、所定の動物を免疫し得る。
【００１９】
簡潔に言えば、リコンビナントＣＬＤＮ１は、リコンビナント細胞株による発現によって提供され得る。ＣＬＤＮ１は、ＣＬＤＮ１をその表面に発現するヒト細胞の形態で提供され得る。リコンビナント型ＣＬＤＮ１は、任意の以前に記載されている方法を使用して提供され得る。免疫レジメンの後、動物の脾臓、リンパ節又は他の臓器からリンパ球を単離し、ポリエチレングリコールなどの薬剤を使用して適切な骨髄腫細胞株と融合して、ハイブリドーマを形成する。融合後、記載されているように（Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, 3rd edition, Academic Press, New York, 1996）、標準的な方法を使用して、融合パートナーではなくハイブリドーマの成長を許容可能な培地中に細胞を置く。ハイブリドーマの培養後、所望の特異性（すなわち、抗原に選択的に結合する）抗体の存在について、細胞上清を分析する。適切な分析技術としては、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫沈降及びウエスタンブロッティングが挙げられる。他のスクリーニング技術は、当技術分野で周知である。好ましい技術は、コンフォメーションがインタクトでありネイティブにフォールディングされた抗原に対する抗体の結合を確認するもの、例えば非変性ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー及び免疫沈降である。
【００２０】
重要なことには、当技術分野では周知のように、抗体分子のほんの一部（パラトープ）が、そのエピトープに対する抗体の結合に関与する（一般に、Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxfordを参照のこと）。Ｆｃ’及びＦｃ領域は、例えば、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合には関与しない。ｐＦｃ’領域が酵素的に切断されたか、又はｐＦｃ’領域を伴わずに生産された抗体（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと称される）は、インタクトな抗体の両方の抗原結合部位を保持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に切断されたか、又はＦｃ領域を伴わずに生産された抗体（Ｆａｂフラグメントと称される）は、インタクトな抗体分子の一方の抗原結合部位を保持する。さらに続けると、Ｆａｂフラグメントは、共有結合抗体軽鎖及び抗体重鎖の一部（Ｆｄと称される）からなる。Ｆｄフラグメントは、抗体特異性の主要な決定基であり（単一のＦｄフラグメントは、抗体特異性を変化させずに最大１０個の異なる軽鎖と会合し得る）、Ｆｄフラグメントは、単独でエピトープ結合能を保持する。
【００２１】
当技術分野で周知であるように、抗体の抗原結合部分内には、抗原のエピトープと直接的に相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）と、パラトープの三次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）とが存在する（一般に、Clark, 1986; Roitt, 1991を参照のこと）。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖Ｆｄフラグメント及び軽鎖の両方において、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲＳ）によってそれぞれ分離された４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）がある。ＣＤＲ、特にＣＤＲＳ領域、より具体的には重鎖ＣＤＲＳは、抗体の特異性に主に関与する。
【００２２】
元の抗体のエピトープ特異性を保持しながら、哺乳動物の抗体の非ＣＤＲ領域を同種抗体又は異種特異的抗体の類似領域で置換し得ることは、当技術分野では現在十分に確立されている。これは、機能的抗体を生産するために非ヒトＣＤＲがヒトＦＲ及び／又はＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合された「ヒト化」抗体の開発及び使用において最も明確に現れている。
【００２３】
いくつかの実施態様では、抗体は、ヒト化抗体である。本明細書で使用される「ヒト化」は、ＣＤＲ領域外のアミノ酸の一部、大部分又は全部が、ヒト免疫グロブリン分子に由来する対応するアミノ酸で置換された抗体を表す。ヒト化の方法としては、限定されないが、米国特許第４，８１６，５６７号、米国特許第５，２２５，５３９号、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，６９３，７６２号及び米国特許第５，８５９，２０５号（これらは、参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているものが挙げられる。上記米国特許第５，５８５，０８９号及び米国特許第５，６９３，７６１号並びに国際公開公報第９０／０７８６１号では、ヒト化抗体の設計に使用され得る４つの可能な基準も提案されている。第１案は、アクセプターの場合、ヒト化すべきドナー免疫グロブリンと通常は相同的な特定のヒト免疫グロブリン由来のフレームワークを使用すること、又は多くのヒト抗体由来のコンセンサスフレームワークを使用することであった。第２案は、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク中のアミノ酸が通常のものではなく、その位置のドナーアミノ酸がヒト配列に典型的なのものである場合、アクセプターではなくドナーアミノ酸を選択し得ることであった。第３案は、ヒト化免疫グロブリン鎖中の３つのＣＤＲに直接隣接する位置において、アクセプターアミノ酸ではなくドナーアミノ酸を選択し得ることであった。第４案は、抗体の三次元モデルにおいて、アミノ酸がＣＤＲの３Ａ以内に側鎖原子を有すると予測され、ＣＤＲと相互作用することができると予測されるフレームワーク位置にドナーアミノ酸残基を使用することであった。上記方法は、当業者がヒト化抗体の作製に用いることができるいくつかの方法の単なる例示である。当業者であれば、他の抗体ヒト化方法を熟知しているであろう。
【００２４】
いくつかの実施態様では、ＣＤＲ領域外のアミノ酸の一部、大部分又は全部がヒト免疫グロブリン分子に由来するアミノ酸で置換されているが、１つ以上のＣＤＲ領域内のアミノ酸の一部、大部分又は全部は不変である。アミノ酸のわずかな付加、欠失、挿入、置換又は改変は、それらが、所定の抗原に対する抗体の結合能を抑制しない限り許容可能である。適切なヒト免疫グロブリン分子としては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＭ分子が挙げられる。「ヒト化」抗体は、元の抗体と類似の抗原特異性を保持する。しかしながら、特定のヒト化方法を使用して、抗体の結合の親和性及び／又は特異性を、Wu et al., /. Mol. Biol. 294:151, 1999（その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）によって記載されている「指向性進化」方法を使用して増加させ得る。
【００２５】
いくつかの実施態様では、抗体は、国際公開公報第２０１００３４８１２号に記載されているものの中から選択される。特に、抗体は、２００８年７月２９日にDSMZ (Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkuturen GmbH, Inhoffenstrase 7 B, 38124 Braunschweig, Germany)に寄託されたハイブリドーマ細胞株の８個に由来する。それらは、アクセッションナンバーＤＳＭ  ＡＣＣ２９３１、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３２、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３３、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３４、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３５、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３６、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３７及びＤＳＭ  ＡＣＣ２９３８が割り当てられた。典型的には、抗体は、前記ハイブリドーマ細胞株から得られ得る抗体のヒト化であり得る。
【００２６】
いくつかの実施態様では、抗体は、欧州特許出願公開第１１６７３８９号又は米国特許第６，６２７，４３９号に記載されているものである。
【００２７】
いくつかの実施態様では、抗体は、Ｈ−ＣＤＲ１領域に配列番号：２、Ｈ−ＣＤＲ２領域に配列番号：３及びＨ−ＣＤＲ３領域に配列番号：４を含む重鎖可変領域と、Ｌ−ＣＤＲ１領域に配列番号：６、Ｌ−ＣＤＲ２領域に配列番号：７及びＬ−ＣＤＲ３領域に配列番号：８を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００２８】
また、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座の大部分についてトランスジェニックなマウスを免疫することによって、完全ヒトモノクローナル抗体を調製し得る。例えば、米国特許第５，５９１，６６９号、米国特許第５，５９８，３６９号、米国特許第５，５４５，８０６号、米国特許第５，５４５，８０７号、米国特許第６，１５０，５８４号及びそこで引用されている参考文献（その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。これらの動物は、内因性（例えば、マウス）抗体の産生が機能的に欠失するように遺伝子的に改変されている。これらの動物を免疫すると目的の抗原に対する完全ヒト抗体が産生されるように、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するように前記動物をさらに改変する。これらのマウス（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Abgenix）、ＨｕＭＡｂマウス（Medarex/GenPharm））の免疫後、標準的なハイブリドーマ技術にしたがって、モノクローナル抗体を調製し得る。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有するので、ヒトに投与した場合にヒト抗マウス抗体（ＫＡＭＡ）応答を誘発しない。ヒト抗体を生産するためのin vitro方法も存在する。これらとしては、ファージディスプレイ技術（米国特許第５，５６５，３３２号及び米国特許第５，５７３，９０５号）及びヒトＢ細胞のin vitro刺激（米国特許第５，２２９，２７５号及び米国特許第５，５６７，６１０号）が挙げられる。これらの特許の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２９】
したがって、当業者には明らかであるように、本発明はまた、Ｆ（ａｂ’）２Ｆａｂ、Ｆｖ及びＦｄフラグメント；Ｆｃ及び／又はＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同的なヒト配列又は非ヒト配列によって置換されているキメラ抗体；ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同的なヒト配列又は非ヒト配列によって置換されているキメラＦ（ａｂ’）２フラグメント抗体；ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同的なヒト配列又は非ヒト配列によって置換されているキメラＦａｂフラグメント抗体；並びに、ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２領域が、相同的なヒト配列又は非ヒト配列によって置換されているキメラＦｄフラグメント抗体を提供する。本発明はまた、いわゆる一本鎖抗体を含む。
【００３０】
様々な抗体分子及びフラグメントは、限定されないが、ＩｇＡ、分泌ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭを含む一般的に公知の免疫グロブリンクラスのいずれかに由来し得る。ＩｇＧサブクラスも当業者に周知であり、限定されないが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４が挙げられる。
【００３１】
いくつかの実施態様では、抗体は、抗体−薬物コンジュゲートである。本明細書で使用される「抗ＣＬＤＮ１抗体−薬物コンジュゲート」は、治療剤にコンジュゲートされている本発明の抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体を指す。このような抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体−薬物コンジュゲートは、被験体に投与した場合に、ＣＬＤＮ１発現腫瘍細胞に対する臨床的に有用な効果をもたらす。
【００３２】
いくつかの実施態様では、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体は、得られる抗体−薬物コンジュゲートが、ＣＬＤＮ１発現腫瘍細胞に取り込まれ、又はインターナリゼーションされると、前記細胞に対する細胞毒性効果又は細胞増殖抑制効果を発揮するように、細胞毒性薬にコンジュゲートされている。抗体にコンジュゲートするのに特に適切な部分は、化学療法剤、プロドラッグ変換酵素、放射性同位体若しくは化合物又は毒素である。例えば、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体は、細胞毒性薬、例えば化学療法剤又は毒素（例えば、細胞増殖抑制剤又は細胞破壊剤、例えばサポリン、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素又はジフテリア毒素など）にコンジュゲートされ得る。
【００３３】
細胞毒性薬の有用なクラスとしては、例えば、抗チューブリン剤、オーリスタチン、ＤＮＡマイナーグルーブ結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤（例えば、白金錯体、例えばシスプラチン、単核（白金）、二核（白金）及び三核白金錯体、並びにカルボプラチン）、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸剤、代謝拮抗物質、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール、プレフォーミング化合物、プリン代謝拮抗物質、プロマイシン、放射線増感剤、ストロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどが挙げられる。
【００３４】
個々の細胞毒性薬としては、例えばアンドロゲン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、アスパラギナーゼ、５−アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブサルファン、ブチオニン、スルホキシミン、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ＣＣ−１０６５（Li et al., Cancer Res. 42:999-1004, 1982）、クロランブシル、シスプラチン、コルヒシン、シクロホスファミド、シタラビン、シチジンアラビノシド、シトカラシンＢ、ダカルバジン、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ダウノルビシン、デカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エストロゲン、５−フルオロデオキシウリジン、リン酸エトポシド（etopside phosphate）（ＶＰ−１６）、５−フルオロウラシル、グラミシジンＤ、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、ミトマイシンＣ、ミトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルビジン、ストレプトゾトシン、テノポシド（ＶＭ−２６）、６−チオグアニン、チオＴＥＰＡ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビンが挙げられる。
【００３５】
特に適切な細胞毒性薬としては、例えば、ドラスタチン（例えば、オーリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ）、ＤＮＡマイナーグルーブ結合剤（例えば、エンジイン及びレキシトロプシン）、デュオカルマイシン、タキサン（例えば、パクリタキセル及びドセタキセル）、ピューロマイシン、ビンカアルカロイド、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８（７−エチル−１０−ヒドロキシ−カンプトテシン）、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、エチノマイシン、コンブレタスタチン、ネトロプシン、エポチロンＡ及びＢ、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、メイタンシノイド、ディスコデルモリド、エリュテロビン並びにミトキサントロンが挙げられる。
【００３６】
いくつかの実施態様では、細胞毒性薬は、従来の化学療法剤、例えばドキソルビシン、パクリタキセル、メルファラン、ビンカアルカロイド、メトトレキサート、ミトマイシンＣ又はエトポシドなどである。加えて、ＣＣ−１０６５類似体、カリケアミシン、メイタンシンドラスタチン１０の類似体、リゾキシン及びパリトキシンなどの強力な薬剤を抗ＣＬＤＮ１発現抗体に連結し得る。
【００３７】
特定のバリエーションでは、細胞毒性薬又は細胞増殖抑制剤は、オーリスタチンＥ（当技術分野でドラスタチン１０としても公知である）又はその誘導体である。典型的には、オーリスタチン誘導体は、例えば、オーリスタチンＥとケト酸との間で形成されるエステルである。例えば、オーリスタチンＥをパラアセチル安息香酸又はベンゾイル吉草酸と反応させて、ＡＥＢ及びＡＥＶＢをそれぞれ生成し得る。他の典型的なオーリスタチン誘導体としては、ＡＦＰ（ジメチルバリン−バリン−ドライソロイイン−ドラプロリン−フェニルアラニン−ｐ−フェニレンジアミン）、ＭＭＡＦ（ドバリン−バリン−ドライソロイニン−ドラプロリン−フェニルアラニン）及びＭＡＥ（モノメチルオーリスタチンＥ）が挙げられる。オーリスタチンＥ及びその誘導体の合成及び構造は、米国特許出願公報第２００３００８３２６３号；国際公開公報第２００２／０８８１７２号及び国際公開公報第２００４／０１０９５７号；並びに米国特許第６，８８４，８６９号；米国特許第６，３２３，３１５号；米国特許第６，２３９，１０４号；米国特許第６，０３４，０６５号；米国特許第５，７８０，５８８号；米国特許第５，６６５，８６０号；米国特許第５，６６３，１４９号；米国特許第５，６３５，４８３号；米国特許第５，５９９，９０２号；米国特許第５，５５４，７２５号；米国特許第５，５３０，０９７号；米国特許第５，５２１，２８４号；米国特許第５，５０４，１９１号；米国特許第５，４１０，０２４号；米国特許第５，１３８，０３６号；米国特許第５，０７６，９７３号；米国特許第４，９８６，９８８号；米国特許第４，９７８，７４４号；米国特許第４，８７９，２７８号；米国特許第４，８１６，４４４号；及び米国特許第４，４８６，４１４号に記載されている。
【００３８】
他のバリエーションでは、細胞毒性薬は、ＤＮＡマイナーグルーブ結合剤である（例えば、米国特許第６，１３０，２３７号を参照のこと）。例えば、いくつかの実施態様では、マイナーグルーブ結合剤は、ＣＢＩ化合物である。いくつかの実施態様では、マイナーグルーブ結合剤は、エンジインである（例えば、カリケアマイシン）。
【００３９】
いくつかの実施態様では、抗体−薬物コンジュゲートは、抗チューブリン剤を含む。抗チューブリン剤の例としては、例えば、タキサン（例えば、Taxol（登録商標）（パクリタキセル）、Taxotere（登録商標）（ドセタキセル））、Ｔ６７（Tularik）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン及びビノレルビン）並びにドラスタチン（例えば、オーリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ）が挙げられる。他の抗チューブリン剤としては、例えば、バッカチン誘導体、タキサン類似体（例えば、エポチロンＡ及びＢ）、ノコダゾール、コルチシン及びコルシミド、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、マイタンシノイド、コンブレタスタチン、ディスコデルモリド並びにエリュテロビンが挙げられる。いくつかの実施態様では、細胞毒性薬は、他のグループの抗チューブリン剤であるメイタンシノイドである。例えば、特定の実施態様では、メイタンシノイドは、メイタンシン又はＤＭ−１である（ImmunoGen, Inc.; また、Chari et al., Cancer Res. 52:127-131, 1992を参照のこと）。
【００４０】
いくつかの実施態様では、細胞毒性薬は、代謝拮抗剤である。代謝拮抗剤は、例えば、プリンアンタゴニスト（例えば、アゾチオプリン又はミコフェノレートモフェチル）、ジヒドロフォレートレダクターゼ阻害剤（例えば、メトトレキサート）、アシクロビル、ガンシクロビル、ジドブジン、ビダラビン、リババリン、アジドチミジン、シチジン、アラビノシド、アマンタジン、ジデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、ポスカルネット又はトリフルリジンであり得る。
【００４１】
いくつかの実施態様では、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体は、プロドラッグ変換酵素にコンジュゲートされている。プロドラッグ変換酵素は、公知の方法を使用して、抗体に組換え融合又は化学的にコンジュゲートされ得る。例示的なプロドラッグ変換酵素は、カルボキシペプチダーゼＧ２、β−グルクロニダーゼ、ペニシリン−Ｖ−アミダーゼ、ペニシリン−Ｇ−アミダーゼ、β−ラクタマーゼ、β−グルコシダーゼ、ニトロレダクターゼ及びカルボキシペプチダーゼＡである。
【００４２】
分子を抗体にコンジュゲートするための技術は、当技術分野で周知である（例えば、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery,” in Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Deiker, Inc., 2nd ed. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,” in Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985); “Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985);及びThorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照のこと。例えば、ＰＣＴ出願国際公開公報第８９／１２６２４号も参照のこと。典型的には、核酸分子は、それぞれＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル又はマレイミド官能基を介して、抗体のリジン又はシステインに共有結合される。コンジュゲートの均一性を改善するために、人工システイン又は非天然アミノ酸の組み込みを使用したコンジュゲーション方法が報告されている（Axup, J.Y., Bajjuri, K.M., Ritland, M., Hutchins, B.M., Kim, C.H., Kazane, S.A., Halder, R., Forsyth, J.S., Santidrian, A.F., Stafin, K., et al. (2012). Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 16101-16106.; Junutula, J.R., Flagella, K.M., Graham, R.A., Parsons, K.L., Ha, E., Raab, H., Bhakta, S., Nguyen, T., Dugger, D.L., Li, G., et al. (2010). Engineered thio-trastuzumab-DM1 conjugate with an improved therapeutic index to target humanepidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer. Clin. Cancer Res.16, 4769-4778.）。Junutulaら(2008)は、従来のコンジュゲーション方法と比較して改善された治療指数を示すと言われているシステインベースの部位特異的コンジュゲーション（「ＴＨＩＯＭＡＢ」（ＴＤＣ）と称される）を開発した。ＡＤＣについては、抗体に組み込まれている非天然アミノ酸へのコンジュゲーションも検討されている；しかしながら、このアプローチの一般性は、未だ確立されていない（Axup et al., 2012）。特に、当業者であれば、ポリペプチド工学によって（例えば、ポリペプチド上でのアミノ酸の欠失、挿入、置換又は突然変異によって）反応性にされている、アシル供与体グルタミン含有タグ（例えば、Ｇｉｎ含有ペプチドタグ又はＱ−タグ）又は内因性グルタミンで操作されたＦｃ含有ポリペプチドも想到することができる。次いで、トランスグルタミナーゼがアミン供与剤（例えば、反応性アミンを含む小分子、又は反応性アミンに結合している小分子）と共有結合架橋して、アシル供与体グルタミン含有タグ又はアクセス可能な／曝露された／反応性の内因性グルタミンを介してＦｃ含有ポリペプチドと部位特異的にコンジュゲートされているアミン供与剤との人工Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートの安定かつ均一な集団を形成し得る（国際公開公報第２０１２０５９８８２号）。抗体をコンジュゲートするための他の方法も国際公開公報第２０１３／０９２９９８号及び国際公開公報第２０１３０９２９８３号に記載されている。
【００４３】
例えば、抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を増強するために、エフェクター機能に関して本発明の抗体を改変することが望ましい場合もある。これは、１つ以上のアミノ酸置換を抗体のＦｃ領域に導入することによって達成され得る。あるいは又は加えて、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にし得る。このようにして作製されたホモ二量体抗体は、改善されたインターナリゼーション能力、並びに／又は増加した補体媒介性細胞殺傷及び／若しくは抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有し得る（Caron PC. et al. 1992; and Shopes B. 1992）。
【００４４】
いくつかの実施態様では、本発明の抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導するのに使用される。ＡＤＣＣでは、モノクローナル抗体がターゲット細胞（例えば、ガン細胞）に結合し、モノクローナル抗体に対するレセプターを発現する特定のエフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、単球、顆粒球）がモノクローナル抗体／ターゲット細胞複合体に結合して、ターゲット細胞の死がもたらされる。
【００４５】
したがって、いくつかの実施態様では、エフェクター機能を有するＦｃ領域を含む抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体は、ＣＬＤＮ１発現細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導するのに使用される。ＡＤＣＣを誘導するための方法は、一般に、ＣＬＤＮ１発現細胞と、ＡＤＣＣ活性を有するＦｃ領域を含む有効量の抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体とを接触させることを含み、前記接触工程は、細胞溶解活性を有するＦｃレセプターを発現する細胞溶解性免疫エフェクター細胞の存在下にある。細胞溶解性Ｆｃレセプター（例えば、ＦｃγＲＩＩＩα又はＣＤ１６）を発現する免疫エフェクター細胞としては、例えば、ＮＫ細胞及び特定のＣＤ８＋Ｔ細胞が挙げられる。ＣＤＣを誘導するための方法は、一般に、ＣＬＤＮ１発現細胞と、ＣＤＣ活性を有するＦｃ領域を含む有効量の抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体とを接触させることを含み、前記接触工程は、補体の存在下にある。関連の実施態様では、本明細書に記載されるようなエフェクター機能を有するＦｃ領域を含む抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体は、患者を処置するのに使用される。このような方法は、一般に、ＡＤＣＣ活性を有するＦｃ領域を含む有効量の抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体を被験体に投与することを含む。
【００４６】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、単一ドメイン抗体である。「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）又は「ＶＨＨ」という用語は、本来的に軽鎖を欠くラクダ科哺乳動物に見られ得る種類の抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。このようなＶＨＨは、「nanobody（登録商標）」とも称される。本発明によれば、ｓｄＡｂは、特にラマｓｄａｂであり得る。
【００４７】
いくつかの実施態様では、抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性又はそれ以上の多重特異性であり得る。本明細書に記載される方法を実施するのに有用な多重特異性抗体（二重特異性抗体及び三重特異性抗体を含む）は、ＣＬＤＮ１と、ＡＤＣＣ、ファゴサイトーシス及び／又はＣＤＣを媒介する第２の細胞表面レセプター又はレセプター複合体（例えば、ＣＤ１６／ＦｃｇＲＩＩＩ、ＣＤ６４／ＦｃｇＲＩ、キラー阻害若しくは活性化レセプター、又は補体コントロールタンパク質ＣＤ５９）との両方に免疫特異的に結合する抗体である。典型的な実施態様では、第２の細胞表面分子又はレセプター複合体に対する多重特異性抗体の一部の結合は、抗ＣＬＤＮ１抗体又は他のＣＬＤＮ１結合剤のエフェクター機能を増強する。いくつかの実施態様では、抗ＣＬＤＮ１抗体は、二重特異性抗体である。「二重特異性抗体」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、腫瘍細胞上のターゲット抗原に対する第１の結合部位と、エフェクター細胞上の活性化トリガー分子（例えば、Ｔ細胞上のＣＤ３、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球及びマクロファージ上のＣＤ１６、好中球及び単球／マクロファージ上のＣＤ８９（ＦｃαＲＩ）及びＣＤ６４（ＦｃｙＲＩ）、並びに樹状細胞上のＤＥＣ−２０５）に対する第２の結合部位（binding side）とからなる任意の分子を指す。本発明によれば、二重特異性抗体は、ＣＬＤＮ１に対する結合部位を含む。好ましいエフェクター細胞集団の特異的リクルートとは別に、エフェクター細胞上のトリガー分子に対する選択された結合部位が、Ｆｃ結合エピトープとオーバーラップしない場合、二重特異性抗体は、内因性免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）との競合を回避する。加えて、全長免疫グロブリンに代えて一本鎖Ｆｖフラグメントを使用することにより、前記分子が、非細胞傷害性細胞上のＦｃレセプター（例えば、血小板及びＢ細胞上のＦｃγＲＩＩ）に、細胞傷害性細胞を活性化しないＦｃレセプター（多形核白血球（ＰＭＮ）上のＦｃｙＲｌｌｌｂを含む）に、及び阻害Ｆｃレセプター（例えば、単球／マクロファージ上のＦｃｙＲｌｌｂ）に結合するのを防ぐ。二重特異性抗体を作製するための方法は、当技術分野で公知である。全長二重特異性抗体の伝統的な生産は、２本の鎖が異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアの同時発現に基づくものである（例えば、Milstein et al., 1983, Nature 305:537-39を参照のこと）。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな取り合わせにより、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を産生するが、この中の１種のみが正しい二重特異性構造を有する。国際公開公報第９３／０８８２９号及びTraunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-59では、同様の手順が開示されている。二重特異性抗体の他の例としては、人工二重特異性モノクローナル抗体のクラスである二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（Bi-specific T-cell engagers）（ＢｉＴＥ）が挙げられる。ＢｉＴＥは、異なる抗体の２つの一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）からなる融合タンパク質であるか、又は約５５キロダルトンの単一ペプチド鎖上の４つの異なる遺伝子由来のアミノ酸配列からなる融合タンパク質である。ｓｃＦｖの一方は、腫瘍抗原（すなわち、ＣＬＤＮ１）に結合し、他方は一般に、ＣＤ３レセプターを介してエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）に結合する。他の二重特異性抗体は、国際公開公報第２００６０６４１３６号に記載されているものである。特に、二重特異性抗体は、国際公開公報第２００６０６４１３６号に記載されているＦａｂフォーマットであって、ＣＬＤＮ１に対して特異的な１つのＶＨ又はＶＨＨと、エフェクター細胞に対して特異的な１つのＶＨ又はＶＨＨとを含むＦａｂフォーマットである。
【００４８】
投与のために、抗体は、医薬組成物として製剤化される。抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体又は抗体−薬物コンジュゲートを含む医薬組成物は、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って製剤化され得、それにより、治療分子は、薬学的に許容し得る担体との混合物で組み合わされる。組成物は、その投与がレシピエント患者に許容され得る場合、「薬学的に許容し得る担体」と言われる。滅菌リン酸緩衝生理食塩水は、薬学的に許容し得る担体の一例である。他の適切な担体は、当技術分野で周知である（例えば、Gennaro (ed.), Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995)を参照のこと）。バイアル表面のタンパク質のロスを防止するなどのために、製剤は、１つ以上の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、アルブミンをさらに含み得る。
【００４９】
医薬組成物の形態、投与経路、用量及びレジメンは、当然のことながら、処置すべき状態、病気の重篤度、患者の年齢、体重及び性別などに依存する。
【００５０】
本発明の医薬組成物は、局所投与、経口投与、非経口投与、鼻内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与又は眼内投与などのために製剤化され得る。
【００５１】
典型的には、医薬組成物は、注射可能な製剤のための薬学的に許容し得るビヒクルを含有する。これらは、特に、等張滅菌生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウム又は二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムなど又はこのような塩の混合物）、又は乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であり得、これは場合に応じて滅菌水又は生理学的食塩水が追加されると、注射液の構成が可能となる。
【００５２】
投与に使用される用量は、様々なパラメータに応じて、特に、使用される投与様式、関連する病変、あるいは所望の処置期間に応じて適合され得る。
【００５３】
医薬組成物を調製するために、有効量の抗体を薬学的に許容し得る担体又は水性媒体に溶解又は分散し得る。
【００５４】
注射用途に適切な医薬形態としては、滅菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び滅菌注射液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、形態は滅菌されていなければならず、容易にシリンジで扱える程度に流動性でなければならない。それは製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して防腐されていなければならない。
【００５５】
遊離塩基又は薬理学的に許容し得る塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びその混合物中で及び油中で調製され得る。通常の保存及び使用条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含む。
【００５６】
本発明の抗体は、中性形態又は塩形態の組成物に製剤化され得る。薬学的に許容し得る塩としては、無機酸（例えば、塩酸又はリン酸）又は有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）と共に形成される（タンパク質の遊離アミノ基と共に形成される）酸付加塩が挙げられる。遊離カルボキシル基と共に形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化鉄）及び有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導され得る。
【００５７】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、適切なその混合物、及び植物油を含む、溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物作用の抑制は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に使用することによってもたらされ得る。
【００５８】
必要に応じて上に列挙されている様々な他の成分と一緒に、必要量の活性化合物を適切な溶媒に組み込み、続いて滅菌ろ過することによって、滅菌注射液を調製する。一般的に、基本分散媒体と上に列挙されている必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに様々な滅菌有効成分を組み込むことによって、分散液を調製する。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌ろ過したその溶液から有効成分と任意のさらなる所望の成分との粉末が得られる真空乾燥及び凍結乾燥技術である。
【００５９】
より濃縮された又は高濃縮された直接注射用溶液の調製も企図され、この場合、極めて迅速な浸透をもたらして高濃度の活性薬剤を小さな腫瘍領域に送達するために、溶媒としてＤＭＳＯを使用することが想定される。
【００６０】
製剤化したら、投与製剤と適合性の方法及び治療上有効である量で溶液を投与する。製剤は、上記注射液型などの様々な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども用いることができる。
【００６１】
水溶液での非経口投与の場合、例えば、必要の場合には前記溶液を適切に緩衝化し、十分な生理食塩水又はグルコースを用いて液体希釈剤を最初に等張にすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適切である。これに関して、当業者であれば、本開示を考慮して、用いられ得る滅菌水性媒体を理解するであろう。例えば、１投与量を等張ＮａＣｌ溶液１mlに溶解し、皮下輸液１０００mlに追加し得るか、又は推奨注入部位に注射し得る（例えば、“Remington’s Pharmaceutical Sciences” 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照のこと）。処置される被験体の症状に応じて、投与量のいくらかの変更が必ず生じるであろう。いずれにしても、投与責任者は、個々の被験体に適切な用量を決定するであろう。
【００６２】
本発明の抗体は、１用量当たり約０．０００１〜１．０ミリグラム又は約０．００１〜０．１ミリグラム又は約０．１〜１．０又はさらには約１０ミリグラムほどを含むように治療混合物内に製剤化され得る。複数回用量も投与され得る。
【００６３】
静脈内又は筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化された化合物に加えて、他の薬学的に許容し得る形態としては、例えば、錠剤又は経口投与のための他の固体；徐放性カプセル；及び現在使用されている任意の他の形態が挙げられる。
【００６４】
いくつかの実施態様では、抗体を宿主細胞に導入するために、リポソーム及び／又はナノ粒子の使用が企図される。リポソーム及び／又はナノ粒子の形成及び使用は、当業者に公知である。
【００６５】
ナノカプセルは、一般に、化合物を安定かつ再現可能な方法で捕捉し得る。細胞内のポリマーオーバーローディングによる副作用を回避するために、一般に、in vivoで分解可能なポリマーを使用して、このような超微細粒子（約０．１μmのサイズ）を設計する。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリラートナノ粒子が本発明における使用に企図され、このような粒子は容易に作製され得る。
【００６６】
水性媒体に分散されて多層状で同心円状の二層ベシクル（多層ベシクル（ＭＬＶ）とも称される）を自然に形成するリン脂質から、リポソームが形成される。ＭＬＶは、一般に、２５nm〜４μmの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理により、２００〜５００Åの範囲の直径を有する小単層ベシクル（ＳＵＶ）であって、コアに水溶液を含有する小単層ベシクルが形成される。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度及び二価カチオンの存在に依存する。
【００６７】
以下の図面及び実施例によって、本発明をさらに説明する。しかしながら、これらの実施例及び図面は、決して本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１Ａ】図１は、結腸臨床サンプルのＣＬＤＮ１免疫化学を示す。Ａ）３種類の結腸組織（ＮＭ＝正常粘膜；ＡＤ＝腺腫；ＡＤＫ＝腺ガン（Ｘ１００））におけるＣＬＤＮ１染色の例。Ｂ）標識強度又はＣ）標識細胞の％として評価したＣＬＤＮ１発現。Ｄ）４５人の結腸直腸患者の各組織について、ＣＬＤＮ１の局在性を示す。Ｅ）１３個の適合組織サンプルのＣＬＤＮ１発現のウエスタンブロット分析。ＮＭ＝正常粘膜；ＰＴ＝原発腫瘍。Ｆ）２個の原発腫瘍サンプルの細胞内分画。Ｃ＝細胞質、Ｍ＝膜、Ｎ＝核。β−チューブリン、ＣＤ７１及びヒストンＨ３を細胞内マーカーとして使用した。
【図１Ｂ】図１は、結腸臨床サンプルのＣＬＤＮ１免疫化学を示す。Ａ）３種類の結腸組織（ＮＭ＝正常粘膜；ＡＤ＝腺腫；ＡＤＫ＝腺ガン（Ｘ１００））におけるＣＬＤＮ１染色の例。Ｂ）標識強度又はＣ）標識細胞の％として評価したＣＬＤＮ１発現。Ｄ）４５人の結腸直腸患者の各組織について、ＣＬＤＮ１の局在性を示す。Ｅ）１３個の適合組織サンプルのＣＬＤＮ１発現のウエスタンブロット分析。ＮＭ＝正常粘膜；ＰＴ＝原発腫瘍。Ｆ）２個の原発腫瘍サンプルの細胞内分画。Ｃ＝細胞質、Ｍ＝膜、Ｎ＝核。β−チューブリン、ＣＤ７１及びヒストンＨ３を細胞内マーカーとして使用した。
【図１Ｃ】図１は、結腸臨床サンプルのＣＬＤＮ１免疫化学を示す。Ａ）３種類の結腸組織（ＮＭ＝正常粘膜；ＡＤ＝腺腫；ＡＤＫ＝腺ガン（Ｘ１００））におけるＣＬＤＮ１染色の例。Ｂ）標識強度又はＣ）標識細胞の％として評価したＣＬＤＮ１発現。Ｄ）４５人の結腸直腸患者の各組織について、ＣＬＤＮ１の局在性を示す。Ｅ）１３個の適合組織サンプルのＣＬＤＮ１発現のウエスタンブロット分析。ＮＭ＝正常粘膜；ＰＴ＝原発腫瘍。Ｆ）２個の原発腫瘍サンプルの細胞内分画。Ｃ＝細胞質、Ｍ＝膜、Ｎ＝核。β−チューブリン、ＣＤ７１及びヒストンＨ３を細胞内マーカーとして使用した。
【図１Ｄ】図１は、結腸臨床サンプルのＣＬＤＮ１免疫化学を示す。Ａ）３種類の結腸組織（ＮＭ＝正常粘膜；ＡＤ＝腺腫；ＡＤＫ＝腺ガン（Ｘ１００））におけるＣＬＤＮ１染色の例。Ｂ）標識強度又はＣ）標識細胞の％として評価したＣＬＤＮ１発現。Ｄ）４５人の結腸直腸患者の各組織について、ＣＬＤＮ１の局在性を示す。Ｅ）１３個の適合組織サンプルのＣＬＤＮ１発現のウエスタンブロット分析。ＮＭ＝正常粘膜；ＰＴ＝原発腫瘍。Ｆ）２個の原発腫瘍サンプルの細胞内分画。Ｃ＝細胞質、Ｍ＝膜、Ｎ＝核。β−チューブリン、ＣＤ７１及びヒストンＨ３を細胞内マーカーとして使用した。
【図１Ｅ】図１は、結腸臨床サンプルのＣＬＤＮ１免疫化学を示す。Ａ）３種類の結腸組織（ＮＭ＝正常粘膜；ＡＤ＝腺腫；ＡＤＫ＝腺ガン（Ｘ１００））におけるＣＬＤＮ１染色の例。Ｂ）標識強度又はＣ）標識細胞の％として評価したＣＬＤＮ１発現。Ｄ）４５人の結腸直腸患者の各組織について、ＣＬＤＮ１の局在性を示す。Ｅ）１３個の適合組織サンプルのＣＬＤＮ１発現のウエスタンブロット分析。ＮＭ＝正常粘膜；ＰＴ＝原発腫瘍。Ｆ）２個の原発腫瘍サンプルの細胞内分画。Ｃ＝細胞質、Ｍ＝膜、Ｎ＝核。β−チューブリン、ＣＤ７１及びヒストンＨ３を細胞内マーカーとして使用した。
【図１Ｆ】図１は、結腸臨床サンプルのＣＬＤＮ１免疫化学を示す。Ａ）３種類の結腸組織（ＮＭ＝正常粘膜；ＡＤ＝腺腫；ＡＤＫ＝腺ガン（Ｘ１００））におけるＣＬＤＮ１染色の例。Ｂ）標識強度又はＣ）標識細胞の％として評価したＣＬＤＮ１発現。Ｄ）４５人の結腸直腸患者の各組織について、ＣＬＤＮ１の局在性を示す。Ｅ）１３個の適合組織サンプルのＣＬＤＮ１発現のウエスタンブロット分析。ＮＭ＝正常粘膜；ＰＴ＝原発腫瘍。Ｆ）２個の原発腫瘍サンプルの細胞内分画。Ｃ＝細胞質、Ｍ＝膜、Ｎ＝核。β−チューブリン、ＣＤ７１及びヒストンＨ３を細胞内マーカーとして使用した。
【図２】図２は、選択した３つのハイブリドーマのＣＬＤＮ１に対する反応性を示す。ＣＬＤＮ１陽性細胞株（ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１及びＳＷ６２０ｓｈＬＵＣ）に対する選択したハイブリドーマの結合を示すＦＡＣＳヒストグラム。
【図３Ａ】図３は、ＣＬＤＮ１に対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの反応性及び特異性を示す。Ａ）異なる結腸直腸細胞株におけるウエスタンブロッティングによって評価したＣＬＤＮ１発現。Ｂ）Ｓｙｎｇｅｎｅ製のＧｅｎｅＳｎａｐを使用してＧＡＰＤＨに対して正規化したＣＬＤＮ１発現。Ｃ）ＦＡＣｓ実験によって決定した、陰性ＣＬＤＮ１細胞株及び陽性ＣＬＤＮ１細胞株に対する精製６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ（１０μg/ml）の反応性。Ｄ）６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ結合の蛍光強度を、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＤとして示す。Ｅ）ＳＷ４８０及びＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１由来のＣＬＤＮ１の６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂによる免疫沈降；ＪＡＹ−８抗ＣＬＤＮ１抗体によって、複合体を明らかにした（ＩＰ＝免疫沈降、ＦＴ＝フロースルー）。Ｆ）一次抗体として６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂを使用して、免疫蛍光実験を実施した。Leica倒立顕微鏡で６３ＸＮＡ対物レンズを使用して、画像を記録した。Ｇ）ＣＬＤＮ１膜抽出物における６Ｆ６Ｃ３及び無関連抗体の相互作用の表面プラズモン共鳴測定。ＰＢＳ中、２５℃でBiacore 3000機器によって、６Ｆ６Ｃ３及び無関連抗体の結合を実施した。製造業者の仕様書に従って、膜抽出物を２６００RUでＨＰＡセンサーチップ表面上に固定化した。流速２μL／分で１０分間にわたって、無関連抗体及び６Ｆ６Ｃ３抗体を６６０nMで固定化ＬＰＳに注入し、次いで、ＰＢＳランニング緩衝液による解離工程を６００秒間行った。
【図３Ｂ】図３は、ＣＬＤＮ１に対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの反応性及び特異性を示す。Ａ）異なる結腸直腸細胞株におけるウエスタンブロッティングによって評価したＣＬＤＮ１発現。Ｂ）Ｓｙｎｇｅｎｅ製のＧｅｎｅＳｎａｐを使用してＧＡＰＤＨに対して正規化したＣＬＤＮ１発現。Ｃ）ＦＡＣｓ実験によって決定した、陰性ＣＬＤＮ１細胞株及び陽性ＣＬＤＮ１細胞株に対する精製６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ（１０μg/ml）の反応性。Ｄ）６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ結合の蛍光強度を、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＤとして示す。Ｅ）ＳＷ４８０及びＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１由来のＣＬＤＮ１の６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂによる免疫沈降；ＪＡＹ−８抗ＣＬＤＮ１抗体によって、複合体を明らかにした（ＩＰ＝免疫沈降、ＦＴ＝フロースルー）。Ｆ）一次抗体として６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂを使用して、免疫蛍光実験を実施した。Leica倒立顕微鏡で６３ＸＮＡ対物レンズを使用して、画像を記録した。Ｇ）ＣＬＤＮ１膜抽出物における６Ｆ６Ｃ３及び無関連抗体の相互作用の表面プラズモン共鳴測定。ＰＢＳ中、２５℃でBiacore 3000機器によって、６Ｆ６Ｃ３及び無関連抗体の結合を実施した。製造業者の仕様書に従って、膜抽出物を２６００RUでＨＰＡセンサーチップ表面上に固定化した。流速２μL／分で１０分間にわたって、無関連抗体及び６Ｆ６Ｃ３抗体を６６０nMで固定化ＬＰＳに注入し、次いで、ＰＢＳランニング緩衝液による解離工程を６００秒間行った。
【図３Ｃ】図３は、ＣＬＤＮ１に対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの反応性及び特異性を示す。Ａ）異なる結腸直腸細胞株におけるウエスタンブロッティングによって評価したＣＬＤＮ１発現。Ｂ）Ｓｙｎｇｅｎｅ製のＧｅｎｅＳｎａｐを使用してＧＡＰＤＨに対して正規化したＣＬＤＮ１発現。Ｃ）ＦＡＣｓ実験によって決定した、陰性ＣＬＤＮ１細胞株及び陽性ＣＬＤＮ１細胞株に対する精製６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ（１０μg/ml）の反応性。Ｄ）６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ結合の蛍光強度を、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＤとして示す。Ｅ）ＳＷ４８０及びＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１由来のＣＬＤＮ１の６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂによる免疫沈降；ＪＡＹ−８抗ＣＬＤＮ１抗体によって、複合体を明らかにした（ＩＰ＝免疫沈降、ＦＴ＝フロースルー）。Ｆ）一次抗体として６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂを使用して、免疫蛍光実験を実施した。Leica倒立顕微鏡で６３ＸＮＡ対物レンズを使用して、画像を記録した。Ｇ）ＣＬＤＮ１膜抽出物における６Ｆ６Ｃ３及び無関連抗体の相互作用の表面プラズモン共鳴測定。ＰＢＳ中、２５℃でBiacore 3000機器によって、６Ｆ６Ｃ３及び無関連抗体の結合を実施した。製造業者の仕様書に従って、膜抽出物を２６００RUでＨＰＡセンサーチップ表面上に固定化した。流速２μL／分で１０分間にわたって、無関連抗体及び６Ｆ６Ｃ３抗体を６６０nMで固定化ＬＰＳに注入し、次いで、ＰＢＳランニング緩衝液による解離工程を６００秒間行った。
【図３Ｄ】図３は、ＣＬＤＮ１に対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの反応性及び特異性を示す。Ａ）異なる結腸直腸細胞株におけるウエスタンブロッティングによって評価したＣＬＤＮ１発現。Ｂ）Ｓｙｎｇｅｎｅ製のＧｅｎｅＳｎａｐを使用してＧＡＰＤＨに対して正規化したＣＬＤＮ１発現。Ｃ）ＦＡＣｓ実験によって決定した、陰性ＣＬＤＮ１細胞株及び陽性ＣＬＤＮ１細胞株に対する精製６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ（１０μg/ml）の反応性。Ｄ）６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ結合の蛍光強度を、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＤとして示す。Ｅ）ＳＷ４８０及びＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１由来のＣＬＤＮ１の６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂによる免疫沈降；ＪＡＹ−８抗ＣＬＤＮ１抗体によって、複合体を明らかにした（ＩＰ＝免疫沈降、ＦＴ＝フロースルー）。Ｆ）一次抗体として６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂを使用して、免疫蛍光実験を実施した。Leica倒立顕微鏡で６３ＸＮＡ対物レンズを使用して、画像を記録した。Ｇ）ＣＬＤＮ１膜抽出物における６Ｆ６Ｃ３及び無関連抗体の相互作用の表面プラズモン共鳴測定。ＰＢＳ中、２５℃でBiacore 3000機器によって、６Ｆ６Ｃ３及び無関連抗体の結合を実施した。製造業者の仕様書に従って、膜抽出物を２６００RUでＨＰＡセンサーチップ表面上に固定化した。流速２μL／分で１０分間にわたって、無関連抗体及び６Ｆ６Ｃ３抗体を６６０nMで固定化ＬＰＳに注入し、次いで、ＰＢＳランニング緩衝液による解離工程を６００秒間行った。
【図３Ｅ】図３は、ＣＬＤＮ１に対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの反応性及び特異性を示す。Ａ）異なる結腸直腸細胞株におけるウエスタンブロッティングによって評価したＣＬＤＮ１発現。Ｂ）Ｓｙｎｇｅｎｅ製のＧｅｎｅＳｎａｐを使用してＧＡＰＤＨに対して正規化したＣＬＤＮ１発現。Ｃ）ＦＡＣｓ実験によって決定した、陰性ＣＬＤＮ１細胞株及び陽性ＣＬＤＮ１細胞株に対する精製６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ（１０μg/ml）の反応性。Ｄ）６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ結合の蛍光強度を、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＤとして示す。Ｅ）ＳＷ４８０及びＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１由来のＣＬＤＮ１の６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂによる免疫沈降；ＪＡＹ−８抗ＣＬＤＮ１抗体によって、複合体を明らかにした（ＩＰ＝免疫沈降、ＦＴ＝フロースルー）。Ｆ）一次抗体として６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂを使用して、免疫蛍光実験を実施した。Leica倒立顕微鏡で６３ＸＮＡ対物レンズを使用して、画像を記録した。Ｇ）ＣＬＤＮ１膜抽出物における６Ｆ６Ｃ３及び無関連抗体の相互作用の表面プラズモン共鳴測定。ＰＢＳ中、２５℃でBiacore 3000機器によって、６Ｆ６Ｃ３及び無関連抗体の結合を実施した。製造業者の仕様書に従って、膜抽出物を２６００RUでＨＰＡセンサーチップ表面上に固定化した。流速２μL／分で１０分間にわたって、無関連抗体及び６Ｆ６Ｃ３抗体を６６０nMで固定化ＬＰＳに注入し、次いで、ＰＢＳランニング緩衝液による解離工程を６００秒間行った。
【図３Ｆ】図３は、ＣＬＤＮ１に対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの反応性及び特異性を示す。Ａ）異なる結腸直腸細胞株におけるウエスタンブロッティングによって評価したＣＬＤＮ１発現。Ｂ）Ｓｙｎｇｅｎｅ製のＧｅｎｅＳｎａｐを使用してＧＡＰＤＨに対して正規化したＣＬＤＮ１発現。Ｃ）ＦＡＣｓ実験によって決定した、陰性ＣＬＤＮ１細胞株及び陽性ＣＬＤＮ１細胞株に対する精製６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ（１０μg/ml）の反応性。Ｄ）６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ結合の蛍光強度を、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＤとして示す。Ｅ）ＳＷ４８０及びＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１由来のＣＬＤＮ１の６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂによる免疫沈降；ＪＡＹ−８抗ＣＬＤＮ１抗体によって、複合体を明らかにした（ＩＰ＝免疫沈降、ＦＴ＝フロースルー）。Ｆ）一次抗体として６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂを使用して、免疫蛍光実験を実施した。Leica倒立顕微鏡で６３ＸＮＡ対物レンズを使用して、画像を記録した。Ｇ）ＣＬＤＮ１膜抽出物における６Ｆ６Ｃ３及び無関連抗体の相互作用の表面プラズモン共鳴測定。ＰＢＳ中、２５℃でBiacore 3000機器によって、６Ｆ６Ｃ３及び無関連抗体の結合を実施した。製造業者の仕様書に従って、膜抽出物を２６００RUでＨＰＡセンサーチップ表面上に固定化した。流速２μL／分で１０分間にわたって、無関連抗体及び６Ｆ６Ｃ３抗体を６６０nMで固定化ＬＰＳに注入し、次いで、ＰＢＳランニング緩衝液による解離工程を６００秒間行った。
【図３Ｇ】図３は、ＣＬＤＮ１に対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの反応性及び特異性を示す。Ａ）異なる結腸直腸細胞株におけるウエスタンブロッティングによって評価したＣＬＤＮ１発現。Ｂ）Ｓｙｎｇｅｎｅ製のＧｅｎｅＳｎａｐを使用してＧＡＰＤＨに対して正規化したＣＬＤＮ１発現。Ｃ）ＦＡＣｓ実験によって決定した、陰性ＣＬＤＮ１細胞株及び陽性ＣＬＤＮ１細胞株に対する精製６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ（１０μg/ml）の反応性。Ｄ）６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ結合の蛍光強度を、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＤとして示す。Ｅ）ＳＷ４８０及びＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１由来のＣＬＤＮ１の６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂによる免疫沈降；ＪＡＹ−８抗ＣＬＤＮ１抗体によって、複合体を明らかにした（ＩＰ＝免疫沈降、ＦＴ＝フロースルー）。Ｆ）一次抗体として６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂを使用して、免疫蛍光実験を実施した。Leica倒立顕微鏡で６３ＸＮＡ対物レンズを使用して、画像を記録した。Ｇ）ＣＬＤＮ１膜抽出物における６Ｆ６Ｃ３及び無関連抗体の相互作用の表面プラズモン共鳴測定。ＰＢＳ中、２５℃でBiacore 3000機器によって、６Ｆ６Ｃ３及び無関連抗体の結合を実施した。製造業者の仕様書に従って、膜抽出物を２６００RUでＨＰＡセンサーチップ表面上に固定化した。流速２μL／分で１０分間にわたって、無関連抗体及び６Ｆ６Ｃ３抗体を６６０nMで固定化ＬＰＳに注入し、次いで、ＰＢＳランニング緩衝液による解離工程を６００秒間行った。
【図４Ａ】図４は、いくつかのガン細胞株のＣＬＤＮ１発現及び６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの反応性を示す。Ａ）ポリクローナル抗ＣＬＤＮ１抗体（ＪＡＹ−８）を使用してウエスタンブロットによって決定した全ＣＬＤＮ１発現。ヒストグラムは、発現を正規化するためのＣＬＤＮ１／ＧＡＰＤＨ比に相当する。Ｂ）細胞株に対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ（灰色）又は無関連Ａｂ（点線）の反応性。６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ及び無関連抗体のＧｍｅａｎ比を使用して、定量を行った。
【図４Ｂ】図４は、いくつかのガン細胞株のＣＬＤＮ１発現及び６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの反応性を示す。Ａ）ポリクローナル抗ＣＬＤＮ１抗体（ＪＡＹ−８）を使用してウエスタンブロットによって決定した全ＣＬＤＮ１発現。ヒストグラムは、発現を正規化するためのＣＬＤＮ１／ＧＡＰＤＨ比に相当する。Ｂ）細胞株に対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ（灰色）又は無関連Ａｂ（点線）の反応性。６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ及び無関連抗体のＧｍｅａｎ比を使用して、定量を行った。
【図５Ａ】図５は、他のＣＬＤＮに対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの交差反応性分析を示す。Ａ）ウエスタンブロッティングによって、ＳＷ４８０又はＣＬＤＮトランスフェクションＳＷ４８０由来の細胞溶解物を試験した。Ｂ）異なるＣＬＤＮに対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ（１０μg/mL−灰色のヒストグラム）又は６Ｆ６Ｃ３なしのコントロール（破線のヒストグラム）又は無関連抗体３５Ａ７（黒色のヒストグラム）の結合のＦＡＣＳヒストグラム。
【図５Ｂ】図５は、他のＣＬＤＮに対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの交差反応性分析を示す。Ａ）ウエスタンブロッティングによって、ＳＷ４８０又はＣＬＤＮトランスフェクションＳＷ４８０由来の細胞溶解物を試験した。Ｂ）異なるＣＬＤＮに対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ（１０μg/mL−灰色のヒストグラム）又は６Ｆ６Ｃ３なしのコントロール（破線のヒストグラム）又は無関連抗体３５Ａ７（黒色のヒストグラム）の結合のＦＡＣＳヒストグラム。
【図６Ａ】図６は、細胞株の生存に対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂのin vitro効果を示す。Ａ）Ｃａｃｏ−２結腸直腸細胞株のクローン原性アッセイ：２５０個の細胞を６ウェルプレートに播種し、３７℃で一晩付着させる。次いで、抗体（最終濃度５０又は１００μg/ml）を含む又は含まないＲＰＭＩ １ミリリットルを追加し、６日間インキュベーションした。フリー培地中でさらに６日間経過した後、プレートを洗浄した；コロニーを固定（エタノール／酢酸）し、クリスタルバイオレット（０．５％w/v）で染色し、実体顕微鏡を使用してカウントした。Ｂ）処置あり及び処置なしのＣａｃｏ２細胞株のコロニーの割合。Ｃ）１００μg/mlの６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂで処置した又は処置しなかったいくつかの細胞株のクローン原性アッセイ；ヒストグラムは、阻害％（処置しなかったウェルの％コロニー−処置したウェルの％コロニー）を表す。
【図６Ｂ】図６は、細胞株の生存に対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂのin vitro効果を示す。Ａ）Ｃａｃｏ−２結腸直腸細胞株のクローン原性アッセイ：２５０個の細胞を６ウェルプレートに播種し、３７℃で一晩付着させる。次いで、抗体（最終濃度５０又は１００μg/ml）を含む又は含まないＲＰＭＩ １ミリリットルを追加し、６日間インキュベーションした。フリー培地中でさらに６日間経過した後、プレートを洗浄した；コロニーを固定（エタノール／酢酸）し、クリスタルバイオレット（０．５％w/v）で染色し、実体顕微鏡を使用してカウントした。Ｂ）処置あり及び処置なしのＣａｃｏ２細胞株のコロニーの割合。Ｃ）１００μg/mlの６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂで処置した又は処置しなかったいくつかの細胞株のクローン原性アッセイ；ヒストグラムは、阻害％（処置しなかったウェルの％コロニー−処置したウェルの％コロニー）を表す。
【図６Ｃ】図６は、細胞株の生存に対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂのin vitro効果を示す。Ａ）Ｃａｃｏ−２結腸直腸細胞株のクローン原性アッセイ：２５０個の細胞を６ウェルプレートに播種し、３７℃で一晩付着させる。次いで、抗体（最終濃度５０又は１００μg/ml）を含む又は含まないＲＰＭＩ １ミリリットルを追加し、６日間インキュベーションした。フリー培地中でさらに６日間経過した後、プレートを洗浄した；コロニーを固定（エタノール／酢酸）し、クリスタルバイオレット（０．５％w/v）で染色し、実体顕微鏡を使用してカウントした。Ｂ）処置あり及び処置なしのＣａｃｏ２細胞株のコロニーの割合。Ｃ）１００μg/mlの６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂで処置した又は処置しなかったいくつかの細胞株のクローン原性アッセイ；ヒストグラムは、阻害％（処置しなかったウェルの％コロニー−処置したウェルの％コロニー）を表す。
【図７】図７は、３Ｄ細胞株成長に対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの効果を示す。処置細胞を５０μg/mlのｍＡｂ（６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ又は無関連ｍＡｂ）と共に２時間インキュベーションしてから、播種した。超低接着性プレートで成長させたスフェロイドの代表的な画像を、成長の９６時間後に撮影した。
【図８Ａ】図８は、ボイデンチャンバーを使用した遊走アッセイを示す。Ａ）１００μg/ml細胞の６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂによって処置した又は処置しなかったＨＵＨ−７細胞の、ボイデンチャンバー膜の下側からの写真。Ｂ）１００μg/mlの６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ又は無関連ｍＡｂで処置した４種の細胞株に関する３回の独立した実験における遊走細胞の数。細胞をｍＡｂと共に１時間プレインキュベーションしてから、ロードした。
【図８Ｂ】図８は、ボイデンチャンバーを使用した遊走アッセイを示す。Ａ）１００μg/ml細胞の６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂによって処置した又は処置しなかったＨＵＨ−７細胞の、ボイデンチャンバー膜の下側からの写真。Ｂ）１００μg/mlの６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ又は無関連ｍＡｂで処置した４種の細胞株に関する３回の独立した実験における遊走細胞の数。細胞をｍＡｂと共に１時間プレインキュベーションしてから、ロードした。
【図９】図９は、１２５Ｉ  ６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの生体内分布を示す。尾静脈を介して５００μCiの１２５Ｉ  ６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂを移植マウスに静脈内注射し、注射２日後及び３日後に画像を取得した。
【図１０Ａ】図１０は、無胸腺ヌードマウスにおけるＳＷ６２０異種移植片の成長に対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂのin vivo効果の研究を示す。Ａ）週２回１５mg/kg（灰色の線）若しくは週３回１５mg/kg（暗灰色の線）の６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂによって処置した又は処置しなかった（黒色の線）ＳＷ６２０担持異種移植マウスの腫瘍成長速度。腫瘍が１００mm3に達したら、処置を開始した。Ｂ）腫瘍が１５００mm3の測定体積に達するのに要した時間を使用した適合Kaplan-Meier曲線。黒色の実線はＮＴ（非処置）に対応し、灰色の実線は第１の実験に対応し、灰色の点線は第２の実験に対応する。
【図１０Ｂ】図１０は、無胸腺ヌードマウスにおけるＳＷ６２０異種移植片の成長に対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂのin vivo効果の研究を示す。Ａ）週２回１５mg/kg（灰色の線）若しくは週３回１５mg/kg（暗灰色の線）の６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂによって処置した又は処置しなかった（黒色の線）ＳＷ６２０担持異種移植マウスの腫瘍成長速度。腫瘍が１００mm3に達したら、処置を開始した。Ｂ）腫瘍が１５００mm3の測定体積に達するのに要した時間を使用した適合Kaplan-Meier曲線。黒色の実線はＮＴ（非処置）に対応し、灰色の実線は第１の実験に対応し、灰色の点線は第２の実験に対応する。
【図１１Ａ】図１１は、肝転移の形成に対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂのin vivo効果を示す。Ａ）非処置マウス及び６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ処置マウス由来の肝臓における代表的なＳＷ６２０転移性腫瘍；実験終了時（手術から５週間）に、画像を撮影した。Ｂ）両群間における転移数の分布及び中央値の比較（ｐ＝０．０８、Mann-Whitney）。Ｃ）肝転移の数に応じたマウスの再区分。＜１＝転移なし、又は１個の微小転移；１〜１０＝１個超かつ１０個未満の転移；＞１０＝１０個超の転移。
【図１１Ｂ】図１１は、肝転移の形成に対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂのin vivo効果を示す。Ａ）非処置マウス及び６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ処置マウス由来の肝臓における代表的なＳＷ６２０転移性腫瘍；実験終了時（手術から５週間）に、画像を撮影した。Ｂ）両群間における転移数の分布及び中央値の比較（ｐ＝０．０８、Mann-Whitney）。Ｃ）肝転移の数に応じたマウスの再区分。＜１＝転移なし、又は１個の微小転移；１〜１０＝１個超かつ１０個未満の転移；＞１０＝１０個超の転移。
【図１１Ｃ】図１１は、肝転移の形成に対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂのin vivo効果を示す。Ａ）非処置マウス及び６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ処置マウス由来の肝臓における代表的なＳＷ６２０転移性腫瘍；実験終了時（手術から５週間）に、画像を撮影した。Ｂ）両群間における転移数の分布及び中央値の比較（ｐ＝０．０８、Mann-Whitney）。Ｃ）肝転移の数に応じたマウスの再区分。＜１＝転移なし、又は１個の微小転移；１〜１０＝１個超かつ１０個未満の転移；＞１０＝１０個超の転移。
【実施例】
【００６９】
材料及び方法
１−結腸臨床サンプルのＣＬＤＮ１の免疫化学
以前に記載されているように（Granci et al., 2008）、５２人の患者由来の結腸ガン、適合正常粘膜及び適合腺腫の３つの組織コア（各直径０．６mm）を使用して、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を構築した。ＴＭＡの薄いミクロン切片３μmを脱パラフィン処理し、段階的なアルコールで再水和した。続いて、ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ９）を含む水浴中に浸漬することによって、スライドを熱誘導エピトープ（epitote）回復に供した。内因性ペルオキシダーゼ活性を中和した後、ＴＭＡ切片をポリクローナル抗ＣＬＤＮ１抗体（JAY-8, Zymed laboratories Inc, CA, USA）又は希釈剤のみと共に６０分間インキュベーションした。Dako autostainer（登録商標）（Dako, Glostrup, Denmark）を備えるEnvision（登録商標）システムを使用して、一次抗体の結合を可視化した。抗体希釈剤と共にインキュベーションしたスライドでは、染色が観察されなかった。サンプリングした５２症例のうち、適合正常組織、腺腫及び腫瘍を有する４５個のサンプルは、免疫組織化学後においても依然として評価可能である。マークされた細胞の割合について、及び染色強度について、各スポットを個々に割り当てた（０：なし；１：弱；２：中；３強）。
【００７０】
２−細胞株
使用したヒト結腸直腸ガン細胞株は、ＳＷ４８０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２２８）、ＳＷ６２０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２２７）、Ｃａｃｏ−２（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３７）、Ｄｉｆｉ（(Olive et al., 1993)。Dr Montagutより寄贈）、ＨＣＴ１１６（ＣＣＬ−２４７）、ＬＳ１７４Ｔ（ＡＴＣＣ  ＣＬ−１８８）であった。
【００７１】
使用した他のガン細胞株は、膵臓ガンＰＡＮＣ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４６９）、ＢＸＰＣ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６８７）、卵巣ガンＳＫＯＶ−３（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−７７）、ＩＧＲＯＶ１（Benard et., al 1985）及び肝細胞ガンＨｕＨ−７（ＪＣＲＢ０４０３）であった。
【００７２】
ＣＬＤＮ１陽性ＳＷ４８０細胞株（ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１）を得るために、本発明者らは、jetPRIME（商標）トランスフェクション試薬（Polyplus-transfection Inc., France）を使用して、ヒトＣＬＤＮ１  ｃＤＮＡクローン（Invitrogen MGC collection, ref 4500534, pCMV-SPORT6）でＳＷ４８０細胞株を安定トランスフェクションした。選択試薬としてジェネティシンを使用して、安定クローンを作製した。ｐＳＩＲＥＮベクターのレトロウイルス遺伝子トランスダクションによって、ルシフェラーゼ（ＳＷ６２０ｓｈＬＵＣ）又はＣＬＤＮ１（ＳＷ６２０ｓｈＣＬＤＮ１）をターゲティングするＳｈＲＮＡを発現するＳＷ６２０細胞株を得た。ターゲティング配列は、ＳｈＬｕｃ（RNAi-Ready pSIREN-RetroQ vector kitより、Clontech Mountain View, CA, USA）である。トランスダクションから２４時間後に、１μg/mLのピューロマイシンで細胞を選択し、安定クローンをプールした。
【００７３】
完全培地（すなわち、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び２mM Ｌ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地）中、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下で、全ての細胞株を３７℃で成長させ、トリプシン（０．５mg/mL）ＥＤＴＡ（０．２mg/mL）を使用したトリプシン処理によって継代した。全ての培養培地サプリメントは、Life Technologies, Inc. (Gibco BRL, Gaithersburg, MD)から購入した。トランスフェクションした細胞について、ジェネティシン（０．６７％）を培地に追加した。
【００７４】
３−モノクローナル抗体：
抗ＣＬＤＮ１ｍＡｂ：．１回目の注射では、ＣＬＤＮ１で一過性トランスフェクションした４百万個のマウスＮＩＨ細胞（ＮＩＨ−ＣＬＤＮ１と称される）の完全フロイントアジュバント（Sigma）溶液を、その後の注射では、その不完全フロイントアジュバント（Sigma）溶液をＢＡＬＢ／ｃマウスに２週間間隔で５回腹腔内（ｉ．ｐ．）免疫することによって、マウスハイブリドーマを作製した。５回目の免疫の３カ月後に、ＮＩＨ−ＣＬＤＮ１の静脈内（ｉ．ｖ．）追加免疫注射を行った。３日後、免疫したマウス由来の脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ．８．６５３と融合させた。ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１を使用して蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣｓ）によって、新たに作製したクローン由来の上清をスクリーニングした。ＳＷ６２０結腸直腸細胞株のようなＣＬＤＮ１陽性細胞において、上清のＣＬＤＮ１特異性を確認した。
【００７５】
コントロールとして使用したｍＡｂ：コントロール実験では、（CEA Gold 2エピトープに対して特異的な）抗ＣＥＡモノクローナル抗体３５Ａ７（Haskell et al., 1983; Hammarstrom et al., 1989）及び無関連正常マウスＩｇＧ３（sc-3880, Santa Cruz Biotechnology）。
【００７６】
４−ウエスタンブロット分析
Mixer Mill（登録商標）MM 300 (Qiagen, Valencia, CA)を使用して、溶解緩衝液（ＮａＣｌ １５０mM、１０mMトリス、ｐＨ７．４、１mM、ＥＤＴＡ、１mM ＥＧＴＡ、１％ＳＤＳ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５％ＮＰ−４０、２mM ＰＭＳＦ、１００mM ＮａＦ、１０mMオルトバナジウム酸ナトリウム、１０mlに１錠のカクテルプロテアーゼ阻害剤）中で患者の組織サンプルを直接破砕した。Bradfordアッセイ（Pierce Coomassie Plus Protein Assay）によって、タンパク質濃度を決定した。次いで、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって全タンパク質５０μgを分離し、ニトロセルロース膜（Whatman（登録商標）Protran（登録商標）、孔径０．４５μm）に転写した。５％（ｗｔ／ｖｏｌ）脱脂乳ＰＢＳ−Ｔ溶液（０．１％（vol/vol）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で非特異的結合部位を室温で１時間ブロッキングし、次いで、ポリクローナル抗ＣＬＤＮ１抗体（ＪＡＹ−８）と共に４℃で一晩インキュベーションした。次いで、膜を洗浄し、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ（horeradish peroxidase）結合二次抗体と共に１時間インキュベーションした。化学発光システム（Amersham Biosciences）を用いて、顕色を実施した。β−チューブリン発現を正規化に使用した。
【００７７】
５−組織サンプルからの細胞内タンパク質の抽出
各サンプルについて、cryotomeを用いて厚さ２０μmのスライドを切断し、混合し、液体窒素中に回収し、マイクロペストルを用いて穏やかに粉砕した。細胞内タンパク質の抽出のために、製造業者の説明書（Calbiochem）に従って、ProteoExtract Subcellular Proteome Extraction Kitを使用した。各細胞内画分１０μgを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。上記のように、イムノブロッティングを行った。以下の一次抗体を使用した：抗ＣＬＤＮ１（ＪＡＹ−８）、抗ＣＤ７１（Invitrogen）、抗ヒストンＨ３（Pierce）及び抗β−チューブリン（Sigma T4026）。
【００７８】
６−フローサイトメトリー実験
FACScan蛍光活性化細胞選別装置（Quanta apparatus, Beckman Coulter）を用いて、ハイブリドーマ又はｍＡｂの結合を決定した。細胞を２５cm2フラスコ（細胞２×１０５個／フラスコ）に接種した。４８時間の静止後、１００万個の細胞をペレット化し、ＰＢＳ−１％ＢＳＡで洗浄し、ハイブリドーマ又はｍＡｂと共に氷上で１時間インキュベーションした。洗浄後、適切な抗マウスＦＩＴＣ結合モノクローナル抗体（１：６０希釈；（Invitrogen））を（氷上で４５分間にわたって）追加して、一次抗体を検出した。バックグラウンドを測定するために、細胞と二次抗体との直接インキュベーションを使用した（ネガティブコントロール）。
【００７９】
７−免疫沈降研究
ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１及びＳＷ４８０細胞の培養皿を冷ＰＢＳで洗浄し、次いで、冷溶解緩衝液（２５mMトリス−ＨＣｌ、１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１％ＮＰ４０及び１錠のプロテアーゼ阻害剤）を使用して、付着細胞をスクラッピングした。遠心分離後、細胞溶解物２００μgを６Ｆ６Ｃ３ハイブリドーマ培養上清（culture supernactant）１ml及びＧセファロースビーズ１００μlと混合した。溶解物ビーズ混合物を回転撹拌しながら４℃で２時間インキュベーションした。ビーズから複合体を溶出し、ウエスタンブロット用のゲル上で泳動した。市販の抗ＣＬＤＮ１抗体（ＪＡＹ−８）を使用して、ＣＬＤＮ１の顕色を行った。
【００８０】
８−免疫蛍光研究
１２mmガラスカバースリップを含有する培養皿に細胞をプレーティングした。プレーティングの翌日に、カバースリップ上の細胞を４％パラホルムアルデヒド（paraformaldhehyde）／ＰＢＳによって室温で１０分間固定し、５％ＢＳＡを含有するＰＢＳによって３７℃で３０分間ブロッキングした。細胞を６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ（１０μg/ml）と共に１時間インキュベーションした。二次抗体は、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Invitrogen）であった。ＤＡＰＩを使用して、核を染色した。染色した細胞をMoviolにマウントし、Leica倒立顕微鏡で６３ＸＮＡ対物レンズを使用して、画像を記録した。
【００８１】
９−膜抽出物
氷上で、ＳＷ４８０−Ｃｌｄｎ１細胞（約１０７個／７５cm2）を冷ＰＢＳで３回洗浄し、トリス１０mM（ｐＨ７．２）１mlと共に３０分間インキュベーションした。次いで、細胞をスクラッピングし、５秒間にわたって４回超音波処理した。タンパク質抽出物を７０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を２０００００ｇで１５分間超遠心分離した。ペレットを超音波処理し、ＰＢＳに再懸濁した。ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬（Pierce）によって、タンパク質濃度を評価した。
【００８２】
１０−三次元スフェロイドの樹立
超低付着性９６ウェル丸底プレート（Costar）を使用して、スフェロイドを形成した。細胞５×１０４個／ウェル（ＳＷ４８０、ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１、ＳＷ６２０）又は細胞２×１０４個／ウェル（ＨｕＨ−７）の密度で、細胞をプレーティングした。細胞は凝集し、２４〜４８時間以内に、スフェロイド構造の三次元（３Ｄ）球になった。１０又は５対物レンズを使用して位相差顕微鏡によって、ウェルの画像を撮影した。
【００８３】
１１−ボイデンチャンバーにおける腫瘍細胞遊走のアッセイ
ボイデンチャンバーにおいて、細胞遊走を研究した。簡潔に言えば、細胞をトリプシン処理し、無血清培地で３回洗浄し、５００００個（ＩＧＲＯＶ、ＢＸＰＣ３）又は１０００００個の細胞（Ｃａｃｏ２、ＨｕＨ−７）を細孔８μmのトランスウェルインサート（BD Falcon（登録商標）HTS Fluoroblok（商標）Inserts）に追加した。１０％ＦＣＳを補充した培地をチャンバーの下側のウェルに充填した。２１時間インキュベーションした後、４μg/mlのカルセイン（Sigma-Aldrich 17783-AM）で遊走細胞を１時間染色した。ImageJソフトウェア（sowftware）を使用して１２個の異なる視野において、蛍光遊走細胞の数をカウントした。
【００８４】
１２−放射性標識及びＳＰＥＣＴ−ＣＴイメージング
Perkin Elmerから１２５Ｉを入手し、ＳＰＥＣＴイメージングのために、以前に記載されているように（Santoro et al., 2009）IODO-GEN (Pierce Chemical Co.)法を使用して、６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂを３７０MBq/mgの比活性で放射性標識した。フランス政府のガイドライン及び実験動物研究に関するInstitut National de la Sante et de la Recherche Medicaleの基準（協定CEEA-LR-12052）にしたがって、全ての動物実験を実施した。
【００８５】
Harlan (Gannat, France)からヌードマウス（６〜８週齢の雌性無胸腺ヌードマウス）を購入し、実験で使用する前に１週間順化させた。１２時間の明暗サイクル、２２℃及び湿度５５％で、それらを飼育した。食料及び水は、自由に利用可能であった。イメージングの前日に、ルゴール液をマウスに摂取させ、実験期間全体にわたって、安定ヨウ素を飲料水に追加した。
【００８６】
ＳＰＥＣＴ−ＣＴイメージング：１６MBq／５０マイクログラムの放射性標識１２５Ｉ−６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂを尾静脈に注射した後の様々な時点（４８時間、７２時間及び９６時間）において、全身ＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像を取得した。２％イソフルランでマウスを麻酔し、4-head multiplexing multipinhole NanoSPECT camera (Bioscan Inc., Washington, USA)のベッドに配置した。エネルギーウィンドウは２８keV±２０％幅に中心があり、２４投影の各投影で３００００カウントが得られるように、取得時間を規定した。専用ソフトウェアInvivoscope（登録商標）（Bioscan, Inc., Washington,USA）及びMediso InterViewXP（登録商標）（Mediso, Budapest Hungary）を使用して、画像及び最大強度投影（ＭＩＰ）を再構築した。ＳＰＥＣＴデータと解剖学的に重ね合わせるために、同時マイクロＣＴ全身イメージングを実施した。ＳＰＥＣＴ及びＣＴから再構成したデータを可視化し、Invivoscope（登録商標）を使用して重ね合わせた。
【００８７】
１３−脾臓内肝臓コロニー形成モデル
ＳＷ６２０−ＬＵＣ細胞（ルシフェラーゼを発現するＳＷ６２０細胞）２００万個を６〜８週齢の雌性無胸腺ヌードマウス２０匹の脾臓に注射した。細胞の注射後、脾臓を摘出した。１日目に、マウスを２群（それぞれマウス１０匹）に無作為に分けた。１５mg/kgの６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂを第１の群に腹腔内注射し、ビヒクル０．９％ＮａＣｌのみを第２の群に腹腔内注射した。６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂによる処置は、週３回１５mg/kgの注射から構成されていた。転移形成及び播種を評価するために、ルシフェリンの注射後に発光イメージングによって、ルシフェラーゼ発現を週１回モニタリングした。手術から５週間の時点にマウスを屠殺し、肝臓表面上の転移の数及びサイズを記録した。
【００８８】
結果：
１−結腸組織におけるＣＬＤＮ１発現
４５人の結腸直腸ガン患者由来のＴＭＡ（各患者について、正常粘膜、腺腫及び腺ガンサンプルを含む）を使用して、ＣＬＤＮ１発現を決定した。本発明者らは、ＣＬＤＮ１染色が正常粘膜から腺腫（ｐ＜０．００１）、腺ガン（ｐ＜０．００１）の順に、及び腺腫から腺ガン（それぞれ標識細胞又は強度について、ｐ＝０．０４７又はｐ＝０．００１）の順に統計的に有意に増加していることを示した（図１）。評価基準（標識細胞の％（図１Ａ）又は標識強度の平均（図１Ｂ））が何であれ、この結果は同じであった：膜だけではなく腫瘍細胞の細胞質においても、ＣＬＤＮ１の免疫組織化学シグナルが見られた。正常粘膜（患者３９人／４５人）及び半数の腺腫（１８／４５）では細胞質において、ＣＬＤＮ１染色のみが見られたが、もう半数の腺腫（２５／４５）及び腺ガン（３６／４５）では、本発明者らは、膜染色及び細胞質染色の両方を観察した。さらに、腺ガンの９％（４／４５）は、膜染色のみを示した（図１Ｃ）。これらの結果は、位置の変化と共に、結腸ガンではＣＬＤＮ１発現が増加していることを示している。
【００８９】
２−ヒトＣＬＤＮ１に対するｍＡｂの選択
ＣＬＤＮ１に対するｍＡｂを選択するために、本発明者らは、ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１細胞（全長ＣＬＤＮ１  ｃＤＮＡによる安定トランスフェクション後にＣＬＤＮ１発現を獲得したＳＷ４８０）を作製し、陽性ターゲットとして使用した。ネガティブコントロールとしてＳＷ４８０を使用したＦＡＣｓ実験によって、ｍＡｂのスクリーニングを実施した。ＳＷ６２０細胞及びＳＷ６２０−ｓｈＣＬＤＮ１細胞において、確認スクリーニングを実施した。最初に、ＣＬＤＮ１発現について、ウエスタンブロットによって、全てのこれらの株をチェックした。このスクリーニングに基づいて、本発明者らは、ＣＬＤＮ１に対するｍＡｂを分泌する３つのハイブリドーマを選択した。続いて、希釈の制限によってクローニングした後、本発明者らは、６Ｆ６Ｃ３、１４Ｂ７Ｄ４及び１５Ｅ７Ｂ１０という名称の３つのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を得た（図２Ｂ）。抗体アイソタイプの決定により、６Ｆ６Ｃ３はＩｇＧ３ｋであり、１４Ｂ７Ｄ４及び１５Ｅ７Ｂ１０はＩｇＭであることが明らかになった。
【００９０】
３−６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの反応性及び特異性の分析
ディファレンシャルなＣＬＤＮ１発現を有する結腸直腸細胞株を使用してフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって、６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの特異性を分析した。ＳＷ４８０、ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１、ＳＷ６２０、ＳＷ６２０ｓｈＬＵＣ、ＳＷ６２０−ｓｈＣＬＤＮ１、ＨＣＴ１１６、ＬＳ１７４Ｔ及びＣａｃｏ２を含む結腸直腸ガン細胞株由来の全細胞溶解物を使用して、ウエスタンブロッティング実験を実施した。最初に、市販の抗ＣＬＤＮ１抗体を使用して、本発明者らは、細胞株における全ＣＬＤＮ１発現を評価し（図３Ａ、３Ｂ）、４つの細胞株はＣＬＤＮ１を発現していたが（ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１、ＳＷ６２０、ＳＷ６２０ｓｈＬＵＣ及びＣａｃｏ２）、４つはＣＬＤＮ１発現をほとんど又は全く示さなかったことを示した（ＳＷ４８０、ＳＷ６２０−ｓｈＣＬＤＮ１、ＬＳ１７４Ｔ  ＨＣＴ１１６）。次いで、本発明者らは、ＦＡＣＳによって、これらの細胞株に対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの結合を試験した（図３Ｃ、３Ｄ）。６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂは、ＣＬＤＮ１を発現する結腸ガン細胞株とのみ反応した。さらに、６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂは親ＳＷ４８０細胞と反応しなかったが、ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１とのその反応性は大きく増加した。反対に、ＣＬＤＮ１特異的ｓｈＲＮＡのトランスダクションによってＣＬＤＮ１発現をノックダウンすると、６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂとＳＷ６２０結腸直腸細胞との反応性は少なくとも８５％減少した。
【００９１】
ＣＬＤＮ１に対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの結合をさらに評価するために、ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１及びＳＷ４８０から細胞溶解物を調製し、次いで、免疫沈降分析に供した。その結果、ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１溶解物においてのみ、６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂはＣＬＤＮ１を特異的に沈降させた（図３Ｅ）。
【００９２】
免疫蛍光研究によって、本発明者らは、６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂは非透過性ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１の表面に結合することができるが、ＳＷ４８０細胞の表面に結合することができないことを示した（図３Ｆ）。要するに、これらの結果は、６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂがＣＬＤＮ１に対して特異的であることを示唆している。
【００９３】
最後に、BIACORE分析によって、６Ｆ６Ｃ３のＣＬＤＮ１結合を確認した（図３Ｇ）。Cancer Research Institute Montpellier (PP2I platform, M. Pugnieres)にある相互作用施設を使用して、BIACORE分析を実施した。BIACORE 3000機器（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）を使用して表面プラズモン共鳴によって、ＣＬＤＮ１と６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂとの相互作用を決定した。ＣＬＤＮ１膜抽出物をＨＰＡセンサーチップ表面上に固定化した。６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂとの特異的相互作用のみが見られ、無関連抗体との特異的相互作用は見られなかった（図３Ｇ）。
【００９４】
本発明者らはまた、ＣＬＤＮ１発現について、他のガン細胞株（卵巣、膵臓、乳房及び前立腺）を試験した。最初に、本発明者らは、市販の抗ＣＬＤＮ１抗体を使用してウエスタンブロッティングによって、全ＣＬＤＮ１発現を評価した（図４Ａ）。したがって、本発明者らは、ＦＡＣｓによって、６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの反応性を試験した。ＣＬＤＮ１を過剰発現する４つの細胞株（ＢＸＰＣ３、ＰＡＮＣ−１、ＳＫＯＶ−３及びＩＧＲＯＶ−１）は、６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂによって認識されたのに対して、ＣＬＤＮ１陰性細胞株では、いくらかの反応性が見られた（図４Ｂ）。これらの結果により、６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂのヒトＣＬＤＮ１特異性が確認された。加えて、これらの細胞株を使用して、他の種類のガンに対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの生物学的効果を試験し得る。
【００９５】
４−他のＣＬＤＮとの交差反応性の分析
ＣＬＤＮ８のヒトｃＤＮＡクローン（sc320974, Origene technologies, USA）及びＣＬＤＮ１のマウスｃＤＮＡクローン（IRAVp968A105D, LifeScience）でＳＷ４８０細胞を一過性トランスフェクションした後、本発明者らは、ＦＡＣｓによって、６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの交差反応性を分析した。図５Ａに示されているように、全てのトランスフェクションは、トランスフェクションしたＣＬＤＮの過剰発現を示し、既に記載されているように、ＳＷ４８０は、ＣＬＤＮ７並びにＣＬＤＮ３及びＣＬＤＮ４を発現した（Dhawan et al., 2011）。６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂは、ＳＷ４８０−ｍＣＬＤＮ１及びＳＷ４８０−ＣＬＤＮ８及びＳＷ４８０のいずれとも反応しなかった（図５Ｂ）。これらの結果は、６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂが、ＣＬＤＮ８、ＣＬＤＮ７並びにおそらくはＣＬＤＮ３及びＣＬＤＮ４を認識しなかったことを示している。さらに、６Ｆ６Ｃ３は、細胞外レベルでヒトＣＬＤＮ１と９４％及び９２％の同一性を有するマウスＣＬＤＮ１と交差反応しなかった（表１）。
【表１】
2016525558.tif 000002
【００９６】
５−ｍＡｂ６Ｆ６Ｃ３のin vitro生物学的効果
生存。単一細胞がコロニーに成長する能力に基づくクローン原性アッセイ（Franken et al., 2006）によって、細胞の生存に対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの効果を試験した。Ｃａｃｏ２結腸直腸ガン細胞の場合、６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂによる処置は、コロニー形成細胞の数を減少させた（図６Ａ）。この減少は、５０μg/mlの６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂでは３７％であり、１００μg/mlでは６８％であったことから、濃度依存的であった（図６Ｂ）。観察された効果がＣＬＤ１に特異的なものであることを確認するために、本発明者らは、ＣＬＤＮ１を過剰発現する６つの他の細胞株（ＢＸＰＣ３、ＰＡＮＣ−１、ＳＫＯＶ−３、ＩＧＲＯＶ−１、ＨｕＨ−７及びＳＷ６２０）及びＳＷ４８０（ネガティブコントロールとして）において、クローン原性アッセイを実施した。図６Ｃに示されているように、６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂは、ＣＬＤＮ１陰性細胞株ＳＷ４８０を除く全ての細胞株のコロニー形成を阻害することができたが、これは、この効果が、６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂによるＣＬＤＮ１結合に特異的なものであることを示している。
【００９７】
成長。細胞成長に対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの効果を３Ｄ培養で研究した。使用した細胞株に応じて、３Ｄ球体の形状は変化した。ＳＷ４８０及びＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１は、タイトで球形の規則的な単一のスフェロイドを形成し、ＨｕＨ−７も同様だがやや不規則であり、小さなスフェロイドを伴っており、一方でＳＷ６２０は凝集体を形成した（図７）。細胞を６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂと共にインキュベーションしたところ、本発明者らは、３つのＣＬＤＮ１陽性細胞株では、球のサイズが、非処置細胞、又は無関連ｍＡｂで処置した細胞と比較して減少していることを観察した（図７）。ＣＬＤ１陰性細胞株ＳＷ４８０では、いくらかの効果が示された。これらの結果により、６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂは、ＣＬＤＮ１陽性細胞株の細胞成長に影響を及ぼすことが実証された。
【００９８】
遊走。ボイデンチャンバーアッセイによって、遊走に対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの効果を測定した。６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ又は無関連ｍＡｂによって、細胞を処置した。その結果、６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂは、試験した全てのＣＬＤＮ１陽性細胞株の遊走に有意な影響を与えることができたことが示された（図８）。
【００９９】
要するに、膜のＣＬＤＮ１に対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの結合は、ＣＬＤＮ１陽性細胞株の成長及び生存、並びにそれらの遊走能に影響を与える。
【０１００】
６−体内分布
６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの腫瘍取り込み、及び６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂがin vivoでＣＬＤＮ１を特異的にターゲティングする能力を決定するために、本発明者らは、小動物ＳＰＥＣＴ／ＣＴ研究（単一光子放射型コンピュータ断層撮影法）（M. Busson, Plate-forme Imagerie du Petit Animal par Bioluminescence et Scintigraphie, IRCM）を実施した。ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１（３．１０６個）細胞を右脇腹に注射し、ＳＷ４８０を左脇腹に注射することによって、２匹の雌性無胸腺ヌードマウスに皮下移植した。腫瘍が１００mm3に達したら、１２５Ｉ標識６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂ ５０μg（５００μCi）の静脈内注射を実施した。次いで、注射４８時間後、７２時間後及び９６時間後に、ＣＴ及びＳＰＥＣＴスキャンを取得した。４８時間の時点で、本発明者らは、ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１移植腫瘍及び胃及びラダーにおいて、１２５Ｉ標識６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの強い局在性を観察したが、ＳＷ４８０移植腫瘍では観察しなかった。注射７２時間後のＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングでは、ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１移植腫瘍においてのみ、１２５Ｉ標識６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの高度かつ特異的な取り込みが示された（図９）。この結果は、in vivoにおける６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂのヒトＣＬＤＮ１特異性を裏付けている。
【０１０１】
７−in vivo腫瘍成長阻害研究：
実験動物研究に関するフランスのガイドライン（協定CEEA-LR-12053）に従って、全てのin vivo実験を実施した。Harlan (Gannat, France)からヌードマウス（６〜８週齢の雌性無胸腺ヌードマウス）を購入した。
【０１０２】
ＳＷ６２０（３．１０６個）細胞を培養培地に懸濁し、無胸腺ヌードマウスの右脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍がほぼ同じ体積（１００mm3）に達したら、腫瘍担持マウスを異なる群に無作為に分けた。０．９％ＮａＣｌ又はｍＡｂ６Ｆ６Ｃ３の腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によって、マウスを処置した。注射したｍＡｂの量は、第１の実験では、注射１回当たり１５mg/Kgを３週間連続で週２回注射し、第２の実験では１５mg/Kgを週３回注射した。
【０１０３】
キャリパーを用いて腫瘍の大きさを週２回測定し、式：Ｄ１×Ｄ２×Ｄ３／２によって体積を計算した。
【０１０４】
異種移植マウスの腫瘍成長速度によって結果を表したところ（図１０Ａ）、ｍＡｂ６Ｆ６Ｃ３処置群では、成長が、コントロール群と比較して有意に（ｐ＝０，０１８）減少していたことが示された。加えて、本発明者らは、第１の実験と第２の実験との間で成長の有意差（ｐ＝０．０１１）を観察したことから、この効果は用量依存的であった。
【０１０５】
腫瘍が１５００mm3の測定体積に達するのに要した時間を使用した適合Kaplan-Meier生存曲線（図１０Ｂ）により、処置群では、遅延の中央値は、コントロールＮａＣｌ群と比較して７日間長いことが示された（遅延の中央値を、マウスの５０％が、測定体積に達する腫瘍を有した時点と定義した）。
【０１０６】
８−脾臓内肝臓コロニー形成
肝臓における転移形成に対するｍＡｂ６Ｆ６Ｃ３の効果を評価するために、脾臓内／門脈経路によって、ＳＷ６２０−ＬＵＣ細胞をマウスに注射した。６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂでマウスを処置したか、又は処置しなかった。実験終了時に肝臓を検査し、両群における転移の数を決定した。以前の報告（Dhawan et al., 2005）と一致して、ＳＷ６２０は肝臓に転移した。コントロール群では、肝臓は、処置群と比較して速い速度で浸潤されることが示された（図１１Ａ）。実際、コントロール群では、転移数の中央値が増加した（図１１Ｂ）。さらに、コントロール群では、全てのマウスが転移を有しており、５０％が１０個超の肝臓転移を有していたが、処置群のマウスの３０％は、転移を有していなかったか、又は微小転移のみを有していた（図１１Ｃ）。
【０１０７】
９−ｍＡｂ６Ｆ６Ｃ３の配列：
本発明者らは、前記６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの軽鎖及び重鎖の可変ドメインをクローニング及び特性決定することにより、前記抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を決定した。このモノクローナル抗体は、ＩｇＧ３重鎖及びカッパ軽鎖からなる免疫グロブリンである（表２）。
【表２】
2016525558.tif 000003
【０１０８】
参考文献：
本出願を通して、様々な参考文献が、本発明が関係する最先端技術を説明している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
Aro K, Rosa LE, Bello IO, Soini Y, Makitie AA, Salo T, Leivo I. (2011) Expression pattern of claudins 1 and 3-an auxiliary tool in predicting behavior of mucoepidermoid carcinoma of salivary gland origin. Virchows Arch. 458:341-8. 
Benard J, Da Silva J, De Blois MC, Boyer P, Duvillard P, Chiric E, Riou G. (1985) Characterization of a human ovarian adenocarcinoma line, IGROV1, in tissue culture and in nude mice. Cancer Res.45:4970-9.
Chao, Y.-C., Pan, S.-H., Yang, S.-C., Yu, S.-L., Che, T.-F., Lin, C.-W., Tsai, M.-S., Chang, G.-C., Wu, C.-H., Wu, Y.-Y., et al. (2009). Claudin-1 Is a Metastasis Suppressor and Correlates with Clinical Outcome in Lung Adenocarcinoma. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 179, 123-133.
de Aquino AR, de Carvalho CH, Nonaka CF, Freitas Rde A, de Souza LB, Pinto LP. (2012) Immunoexpression of claudin-1 and Nm23-H1 in metastatic and nonmetastatic lower lip squamous-cell carcinoma. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 20:595-601. 
De Oliveira, S.S., De Oliveira, I.M., De Souza, W., and Morgado-Diaz, J.A. (2005). Claudins upregulation in human colorectal cancer. FEBS Lett 579, 6179-6185.
Dhawan, P., Ahmad, R., Chaturvedi, R., Smith, J.J., Midha, R., Mittal, M.K., Krishnan, M., Chen, X., Eschrich, S., Yeatman, T.J., et al. (2011). Claudin-2 expression increases tumorigenicity of colon cancer cells: role of epidermal growth factor receptor activation. Oncogene 30, 3234-3247.
Dhawan, P., Singh, A.B., Deane, N.G., No, Y., Shiou, S.-R., Schmidt, C., Neff, J., Washington, M.K., and Beauchamp, R.D. (2005). Claudin-1 regulates cellular transformation and metastatic behavior in colon cancer. J Clin Invest 115, 1765-1776.
Dos Reis, P.P., Bharadwaj, R.R., Machado, J., Macmillan, C., Pintilie, M., Sukhai, M.A., Perez-Ordonez, B., Gullane, P., Irish, J., and Kamel-Reid, S. (2008). Claudin 1 overexpression increases invasion and is associated with aggressive histological features in oral squamous cell carcinoma. Cancer 113, 3169-3180.
English DP, Santin AD. Claudins Overexpression in Ovarian Cancer: Potential Targets for Clostridium Perfringens Enterotoxin (CPE) Based Diagnosis and Therapy. (2013) Int J Mol Sci. 17:10412-37. 
Fevre Montange M, Vasiljevic A, Bergemer Fouquet AM, Bernier M, Champier J,Chretien F, Figarella-Branger D, Kemeny JL, Lechapt-Zalcman E, Michalak S, Miquel C, Mokthari K, Pommepuy I, Quintin Roue I, Rousseau A, Saint-Pierre G, Salon C, Uro-Coste E, Varlet P, Kratzer I, Ghersi-Egea JF, Jouvet A. (2012)Histopathologic and ultrastructural features and claudin expression in papillary tumors of the pineal region: a multicenter analysis. Am J Surg Pathol. 36:916-28.
Franken, N.A.P., Rodermond, H.M., Stap, J., Haveman, J., and Van Bree, C. (2006). Clonogenic assay of cells in vitro. Nat Protoc 1, 2315-2319.
Furuse, M., Fujita, K., Hiiragi, T., Fujimoto, K., and Tsukita, S. (1998). Claudin-1 and -2: novel integral membrane proteins localizing at tight junctions with no sequence similarity to occludin. J. Cell Biol. 141, 1539-1550.
Granci, V., Bibeau, F., Kramar, A., Boissiere-Michot, F., Thezenas, S., Thirion, A., Gongora, C., Martineau, P., Del Rio, M., and Ychou, M. (2008). Prognostic significance of TRAIL-R1 and TRAIL-R3 expression in metastatic colorectal carcinomas. Eur. J. Cancer 44, 2312-2318.
Grone, J., Weber, B., Staub, E., Heinze, M., Klaman, I., Pilarsky, C., Hermann, K., Castanos-Velez, E., Ropcke, S., Mann, B., et al. (2007). Differential expression of genes encoding tight junction proteins in colorectal cancer: frequent dysregulation of claudin-1, -8 and -12. Int J Colorectal Dis 22, 651-659.
Hammarstrom, S., Shively, J.E., Paxton, R.J., Beatty, B.G., Larsson, A., Ghosh, R., Bormer, O., Buchegger, F., Mach, J.P., and Burtin, P. (1989). Antigenic sites in carcinoembryonic antigen. Cancer Res. 49, 4852-4858.
Haskell, C.M., Buchegger, F., Schreyer, M., Carrel, S., and Mach, J.P. (1983). Monoclonal antibodies to carcinoembryonic antigen: ionic strength as a factor in the selection of antibodies for immunoscintigraphy. Cancer Res. 43, 3857-3864.
Huo, Q., Kinugasa, T., Wang, L., Huang, J., Zhao, J., Shibaguchi, H., Kuroki, M., Tanaka, T., Yamashita, Y., Nabeshima, K., et al. (2009). Claudin-1 protein is a major factor involved in the tumorigenesis of colorectal cancer. Anticancer Res 29, 851-857.
Hsueh C, Chang YS, Tseng NM, Liao CT, Hsueh S, Chang JH, Wu IC, Chang KP. (2010)Expression pattern and prognostic significance of claudins 1, 4, and 7 in nasopharyngeal carcinoma. Hum Pathol. 41:944-50.
Kinugasa, T., Akagi, Y., Yoshida, T., Ryu, Y., Shiratuchi, I., Ishibashi, N., and Shirouzu, K. (2010). Increased claudin-1 protein expression contributes to tumorigenesis in ulcerative colitis-associated colorectal cancer. Anticancer Res. 30, 3181-3186.
Kinugasa, T., Huo, Q., Higashi, D., Shibaguchi, H., Kuroki, M., Tanaka, T., Futami, K., Yamashita, Y., Hachimine, K., Maekawa, S., et al. (2007). Selective up-regulation of claudin-1 and claudin-2 in colorectal cancer. Anticancer Res 27, 3729-3734.
Kominsky, S.L. (2006). Claudins: emerging targets for cancer therapy. Expert Rev Mol Med 8, 1-11.
Kondoh A, Takano K, Kojima T, Ohkuni T, Kamekura R, Ogasawara N, Go M, Sawada N, Himi T. (2011) Altered expression of claudin-1, claudin-7, and tricellulin regardless of human papilloma virus infection in human tonsillar squamous cell carcinoma. Acta Otolaryngol. 2011 131:861-8
Krause, G., Winkler, L., Mueller, S.L., Haseloff, R.F., Piontek, J., and Blasig, I.E. (2008). Structure and function of claudins. Biochimica Et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 1778, 631-645.
Lal-Nag, M., and Morin, P.J. (2009). The claudins. Genome Biol 10, 235-235.
Leotlela, P.D., Wade, M.S., Duray, P.H., Rhode, M.J., Brown, H.F., Rosenthal, D.T., Dissanayake, S.K., Earley, R., Indig, F.E., Nickoloff, B.J., et al. (2007). Claudin-1 overexpression in melanoma is regulated by PKC and contributes to melanoma cell motility. Oncogene 26, 3846-3856.
Liu T, Cheng W, Lai D, Huang Y, Guo L. (2010) Characterization of primary ovarian cancer cells in different culture systems. Oncol Rep. 23:1277-84.
Lu, S., Singh, K., Mangray, S., Tavares, R., Noble, L., Resnick, M.B., and Yakirevich, E. (2012). Claudin expression in high-grade invasive ductal carcinoma of the breast: correlation with the molecular subtype. Modern Pathology.
Miwa, N., Furuse, M., Tsukita, S., Niikawa, N., Nakamura, Y., and Furukawa, Y. (2001). Involvement of claudin-1 in the beta-catenin/Tcf signaling pathway and its frequent upregulation in human colorectal cancers. Oncol. Res 12, 469-476.
Myal Y, Leygue E, Blanchard AA. (2010) Claudin 1 in breast tumorigenesis: revelation of a possible novel “claudin high” subset of breast cancers. J Biomed Biotechnol 2010:956897.
Nakanishi K, Ogata S, Hiroi S, Tominaga S, Aida S, Kawai T. (2008) Expression of occludin and claudins 1, 3, 4, and 7 in urothelial carcinoma of the upper urinary tract. Am J Clin Pathol. 130:43-9. 
Nemeth, J., Nemeth, Z., Tatrai, P., Peter, I., Somoracz, A., Szasz, A.M., Kiss, A., and Schaff, Z. (2010). High expression of claudin-1 protein in papillary thyroid tumor and its regional lymph node metastasis. Pathol. Oncol. Res. 16, 19-27.
Olive, M., Untawale, S., Coffey, R.J., Siciliano, M.J., Wildrick, D.M., Fritsche, H., Pathak, S., Cherry, L.M., Blick, M., and Lointier, P. (1993). Characterization of the DiFi rectal carcinoma cell line derived from a familial adenomatous polyposis patient. In Vitro Cell. Dev. Biol. 29A, 239-248.
Ouban A, Hamdan H, Hakam A, Ahmed AA. (2012) Claudin-1 expression in squamous cell carcinomas of different organs: comparative study of cancerous tissues and normal controls. Int J Surg Pathol. 20:132-8. 
Santoro, L., Boutaleb, S., Garambois, V., Bascoul-Mollevi, C., Boudousq, V., Kotzki, P.-O., Pelegrin, M., Navarro-Teulon, I., Pelegrin, A., and Pouget, J.-P. (2009). Noninternalizing monoclonal antibodies are suitable candidates for 125I radioimmunotherapy of small-volume peritoneal carcinomatosis. J. Nucl. Med. 50, 2033-2041.
Shin HI, Kim BH, Chang HS, Kim CI, Jung HR, Park CH. (2011) Expression of claudin-1 and -7 in clear cell renal cell carcinoma and its clinical significance. Korean J Urol. 52:317-22.
Singh, A.B., Sharma, A., and Dhawan, P. (2010). Claudin family of proteins and cancer: an overview. J Oncol 2010, 541957.
Soini Y, Kinnula V, Kahlos K, Paakko P. (2006) Claudins in differential diagnosisbetween mesothelioma and metastatic adenocarcinoma of the pleura. J Clin Pathol. 59:250-4. 
Swisshelm, K., Machl, A., Planitzer, S., Robertson, R., Kubbies, M., and Hosier, S. (1999). SEMP1, a senescence-associated cDNA isolated from human mammary epithelial cells, is a member of an epithelial membrane protein superfamily. Gene 226, 285-295.
Szabo, I., Kiss, A., Schaff, Z., and Sobel, G. (2009). Claudins as diagnostic and prognostic markers in gynecological cancer. Histol. Histopathol 24, 1607-1615.
Szasz, A.M., Nyirady, P., Majoros, A., Szendroi, A., Szucs, M., Szekely, E., Tokes, A.-M., Romics, I., and Kulka, J. (2009). beta-catenin expression and claudin expression pattern as prognostic factors of prostatic cancer progression. BJU Int.
Takala H, Saarnio J, Wiik H, Soini Y. (2007) Claudins 1, 3, 4, 5 and 7 in esophageal cancer: loss of claudin 3 and 4 expression is associated with metastaticbehavior. APMIS. 115:838-47. 
Tsukahara M, Nagai H, Kamiakito T, Kawata H, Takayashiki N, Saito K, Tanaka A. (2005)Distinct expression patterns of claudin-1 and claudin-4 in intraductal papillary-mucinous tumors of the pancreas. Pathol Int. 55:63-9.
Tsukita, S., and Furuse, M. (2006). The Structure and Function of Claudins, Cell Adhesion Molecules at Tight Junctions. Annals of the New York Academy of Sciences 915, 129-135.
Tsukita, S., Furuse, M., and Itoh, M. (2001). Multifunctional strands in tight junctions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 285-293.
Weber CR, Nalle SC, Tretiakova M, Rubin DT, Turner JR. (2008) Claudin-1 and claudin-2 expression is elevated in inflammatory bowel disease and may contribute to early neoplastic transformation. Lab Invest. 88:1110-20. 
Wu, Y.-L., Zhang, S., Wang, G.-R., and Chen, Y.-P. (2008). Expression transformation of claudin-1 in the process of gastric adenocarcinoma invasion. World J. Gastroenterol. 14, 4943-4948.
Yoon, C.-H., Kim, M.-J., Park, M.-J., Park, I.-C., Hwang, S.-G., An, S., Choi, Y.-H., Yoon, G., and Lee, S.-J. (2009). Claudin-1 acts through c-abl-pkcdelta signaling and has a causal role in the acquisition of invasive capacity in human liver cells. J. Biol. Chem.
【図１Ａ】
2016525558.tif 000004
【図１Ｆ】
2016525558.tif 000005
【図３Ａ】
2016525558.tif 000006
【図３Ｂ】
2016525558.tif 000007
【図３Ｆ】
2016525558.tif 000008
【図５Ａ】
2016525558.tif 000009
【図６Ａ】
2016525558.tif 000010
【図１Ｂ】
2016525558.tif 000011
【図１Ｃ】
2016525558.tif 000012
【図１Ｄ】
2016525558.tif 000013
【図１Ｅ】
2016525558.tif 000014
【図２】
2016525558.tif 000015
【図３Ｃ】
2016525558.tif 000016
【図３Ｄ】
2016525558.tif 000017
【図３Ｅ】
2016525558.tif 000018
【図３Ｇ】
2016525558.tif 000019
【図４Ａ】
2016525558.tif 000020
【図４Ｂ】
2016525558.tif 000021
【図５Ｂ】
2016525558.tif 000022
【図６Ｂ】
2016525558.tif 000023
【図６Ｃ】
2016525558.tif 000024
【図７】
2016525558.tif 000025
【図８Ａ】
2016525558.tif 000026
【図８Ｂ】
2016525558.tif 000027
【図９】
2016525558.tif 000028
【図１０Ａ】
2016525558.tif 000029
【図１０Ｂ】
2016525558.tif 000030
【図１１Ａ】
2016525558.tif 000031
【図１１Ｂ】
2016525558.tif 000032
【図１１Ｃ】
2016525558.tif 000033
【配列表】
2016525558000001.app
【国際調査報告】
2016525558.tif 000034
2016525558.tif 000035
2016525558.tif 000036
2016525558.tif 000037