(57)【要約】  胎盤物質由来の製剤並びにその製造及び使用方法であって、当該製剤は、コラゲナーゼ中で消化された胎盤膜から成る第１の製剤、コラゲナーゼ消化胎盤膜に由来し、接着培養でコンフルエントを超えて増殖させた複能性細胞から成る第２の製剤、及びヒアルロン酸を含む液体に再懸濁された粉砕された胎盤膜を含む第３の製剤を含む。製剤は、結合組織、神経組織、筋肉組織、皮膚組織、軟骨組織及び骨組織などの損傷した又は欠陥のある組織を再生するために使用することができる。製剤は、皮膚充填剤として化粧品及び形成外科用途にも用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラゲナーゼ中で胎盤膜を消化することを含む、製剤の製造方法。
【請求項２】
胎盤膜が、羊膜、絨毛膜、又は、羊膜と絨毛膜との両者を含む、請求項１に記載の方法。 
【請求項３】
トリプシンを用いた消化の前に、胎盤膜から上皮層を除去することをさらに含む、請求項1、2又は3のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
胎盤膜のコラーゲン構造の消化が、細胞、タンパク質、及びヒアルロン酸などの、胎盤膜の他の成分を含む粘性、ゲル様物質をもたらす、請求項１、２又は３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
胎盤膜の放射線照射、胎盤膜の高張液への浸漬、又はその両方から成る群より選択されるプロセスを用いて胎盤膜の細胞を溶解することをさらに含む、請求項１、２、３又は４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
製剤を、コラーゲン、ヒアルロン酸、フィブリン、ゼラチン、１種以上の薬理学的化合物、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される生体適合性材料と組み合わせることをさらに含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
胎盤膜をＣａ＋＋及びＭｇ＋＋不含ＰＢＳ中で洗浄し、胎盤膜をトリプシン中に入れ、胎盤膜をインキュベートし、その後、
胎盤膜をＣａ＋＋及びＭｇ＋＋不含ＰＢＳ中で洗浄し、胎盤膜をコラゲナーゼ溶液中に入れ、胎盤膜を小片に細かく刻み、その後、
胎盤膜の小片をインキュベートし、その後、
胎盤膜の小片をピペット中で上下にピペッティングし、胎盤膜の小片をセルストレーナーメッシュを通過させ、その後、
胎盤膜の小片を遠心して上清とペレットを形成し、ペレットをＰＢＳで洗浄し、上清を吸引する
ことをさらに含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
消化された胎盤膜から複能性細胞を抽出し、複能性細胞を、接着培養でコンフルエントを超えて増殖させることを含む、製剤の製造方法。
【請求項９】
製剤は、ＨＡ、コラーゲン、成長因子及びタンパク質を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
培養フラスコ中で接着培養物を増殖させることをさらに含む、請求項８及び９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
胎盤膜を粉砕し、それにより胎盤膜粒子を形成することと、胎盤膜粒子をヒアルロン酸を含む液体に再懸濁することを含む、製剤の製造方法。
【請求項１２】
粉砕をクライオミル中で実施する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
製剤に、コラーゲン、フィブリン、絹タンパク質、ケラチン及びそれらの組み合わせからなる群より選択される生体適合性材料を添加することをさらに含む、請求項１１及び１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
製剤が、羊水又は胎盤組織から単離された細胞を含む、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
患部の損傷した又は欠陥のある組織を再生するために、哺乳動物の患部に、請求項１から１４のいずれか１項に記載の製剤を導入することを含む、哺乳動物を治療する方法。
【請求項１６】
患部の直接注入により、損傷した若しくは病変した腱、靭帯又は結合組織に請求項１から１４のいずれか１項に記載の製剤を注入することを含む、哺乳動物を治療する方法。
【請求項１７】
関節包中に、又は、結合組織の修復手術後の修復部位に、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製剤を注入することを含む、哺乳動物を治療する方法。
【請求項１８】
手術に使用される移植材料中に請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製剤を注入することを含み、移植材料は、自家移植材料、同種移植片材料、異種移植片材料及び合成材料から成る群より選択される、哺乳動物を治療する方法。 
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製剤を管状導管に導入し、損傷した神経を修復するために、神経欠陥を横断して管状導管を置くことを含む、哺乳動物を治療する方法。
【請求項２０】
多孔質充填材料を製剤で浸漬し、充填材料を管状導管中に入れることをさらに含む、請求項１９に記載の方法。 
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製剤を神経に注入することを含む、哺乳動物を治療する方法。
【請求項２２】
治癒を刺激するために、創傷床中に、又はその周囲に、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製剤を注入することを含む、哺乳動物を治療する方法。
【請求項２３】
損傷した若しくは病変した骨の再生、融合及び／又は治癒を促進するために、損傷した若しくは病変した骨の中、又は周囲に、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製剤を注入することを含む、哺乳動物を治療する方法。
【請求項２４】
損傷した又は病変した筋肉の治癒を促進するために、損傷した又は病変した筋肉に、請求項１から１４のいずれか１項に記載の製剤を注入することを含む、哺乳動物を治療する方法。
【請求項２５】
化粧品及び／又は形成外科用途のために、請求項１から１４のいずれか１項に記載の製剤を皮膚充填剤として哺乳動物の真皮に注入することを含む、哺乳動物を治療する方法。
【請求項２６】
製剤がヒアルロン酸を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
椎間板の治癒及び回復、又は椎間板変性疾患の治療を促進するために、哺乳動物の椎間板へ請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製剤を注入することを含む、哺乳動物を治療する方法。
【請求項２８】
注射により生じた椎間板の穴を密閉するためにフィブリンシーラント又は他の接着マトリクスを注入することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１３年３月１５日に出願された“胎盤物質由来の製剤並びにその製造方法及び使用方法”の名称の米国仮特許出願No. 61/789,785を基礎とする優先権を主張し、その全ての内容が参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、胎盤物質（placental materials）由来の製剤（preparation）に関する。特に、本発明は胎盤物質由来の製剤並びにその製造方法及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
胎盤は、妊娠中、胎児を取り囲んでおり、他の組織とともに、胎児に面している内側の羊膜層、及び、概して非弾性の外殻あるいは絨毛膜から構成される。胎盤は、胎児を子宮壁に固定し、母親の血液供給を介した栄養の摂取、老廃物の除去、及びガス交換を可能にする。さらに、胎盤は、母親による免疫応答から胎児を保護する。胎盤からは、羊膜及び絨毛膜層を含む完全な（intact）胎盤膜を他の組織から分離することができる。羊膜及び絨毛膜層は、一緒に使用してもよいし、物理的に分離して個別に使用してもよい。
【０００４】
臨床医は、早くも１９１０年から、医療処置において羊膜及び絨毛膜層を含む完全な胎盤膜を使用している（Davis, J.S.、John Hopkins Med. J. 15, 307 (1910)）。羊膜は、完全な胎盤膜から分離された場合も、その有益な臨床特性のために使用され得る（Niknejad Hら、EurCell Mater 15, 88-99 (2008)）。胎盤膜は、その特定の特性のために、医学界における使用が魅力的なものとなっている。そのような特性としては、限定されるものでは無いが、その抗接着性、抗菌及び抗炎症特性；創傷保護；上皮化誘導能；及び痛みの軽減が挙げられる（Mermet Iら、Wound Repair and Regeneration、15：459 (2007)）。
【０００５】
胎盤膜の他の用途としては、細胞及び組織の再成長のため足場又は構造を提供するための使用が挙げられる。足場における胎盤膜の重要な利点は、羊膜が上皮層を含むことである。この層に由来する上皮細胞は、幹細胞と類似しており、その周囲の細胞種に分化できる。幹細胞に類似した多能性細胞（pluripotent cells）は、羊膜本体内にも含まれている。また、羊膜は、瘢痕化及び炎症を防止し、治癒をサポートするために有用である場合がある、上皮、インスリン様、及び線維芽細胞増殖因子などの様々な成長及び栄養因子、ならびに高濃度のヒアルロン酸を含む。このように、胎盤膜は、様々な有益な医療用途を提供する。
【０００６】
細胞療法は、組織の修復及び再生のための大きな可能性を有している。これらの細胞療法にマトリクス又は足場を加えることにより改善された結果がもたらされている（Krishnamurithy Gら、J Biomed Mater Res Part A 99A, 500-506 (2011)）。理想的には、使用される材料は、免疫応答をほとんど又は全く誘発しないように生体適合性であり、生体分解性であり、実用化するのに十分な量が入手可能である。胎盤膜は、臨床におけるこの役割を実質的に満たす可能性があるものと長い間認識されてきたが、その成果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験に限定され、ｉｎ  ｖｉｖｏ技術としては実用的でないか、成果がいまひとつであった。さらに、足場が使用される条件は治療効果に劇的な影響を与える場合がある。
【０００７】
数多くの胎盤膜生成物が文献で研究され、あるいは臨床的に使用されてきたが、これまでのところ、これらは２つの主要カテゴリーに分類される。第１のカテゴリーは、生の、又は、乾燥、凍結乾燥、凍結保存、又はグリセロール若しくはアルコール中に保存された完全な膜を使用することを含む。この処方では、膜は多くの目的のために有用であるが、注入、又は、膜そのものの薄い平板の形状に適合しない空間の充填などの他の用途には適さない場合がある。
【０００８】
第２のカテゴリーは、膜を粉砕（grind）、微粉化（pulverize）、及び／又は均質化し、溶液中に再懸濁し得る小さな粒子にすることを含む。このような技術は、例えば、米国特許出願番号11/528,902；11/528,980；11/529,658；及び11/535,924に記載されている。この粉砕は、乾式又は湿式で行うことができ、また、粉砕中の温度は、低温粉砕（cryogrinding）の場合のように制御しても良いし、制御しなくても良い。この方法を用いて製造された生成物は、数多くの用途に有用であり、また、適切な条件下で注入することができる。しかしながら、それらは特定の用途に対してはいくつかの欠点を有する。第１に、胎盤膜に含まれる細胞が粉砕工程中に破壊されることになる。第２に、粉砕された粒子のその後の任意の洗浄又はその他の処理を含む当該プロセス中に、膜中のタンパク質及び成長因子が浸出する又は失われる可能性がある。実際、成長因子などの潜在的な血管新生因子の除去がこの種の処理の目的である場合がある。第３に、これらの小粒子を、生理食塩水などの典型的な生理的溶液へ再懸濁することにより、低粘度の自由流動性の流動物がもたらされる。この流動物は、注射又は留置に際して、所望の治療部位に残らず、むしろ消失する場合がある。
【０００９】
したがって、様々な外科的用途に胎盤膜の利益をもたらすことを可能にする製剤が未だに必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、胎盤物質由来の製剤に関する。特に、本発明は、胎盤物質由来の製剤並びにその製造及び使用方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一実施形態では、例えば、羊膜、絨毛膜、又はその両者等の胎盤膜を、トリプシンによる前処理をして又は前処理なしで、コラゲナーゼを用いて消化する。これにより、細胞、タンパク質、及びヒアルロン酸等の膜の残成分を含む粘性、ゲル様の物質を残したまま、膜のコラーゲン構造が消化される。処理は、成長因子等の膜のタンパク質含量を可能な範囲で維持するように実施される。次いでこの材料を、手術部位に注入、噴霧又は留置することができる。
【００１２】
別の実施形態では、驚くべきことに、胎盤膜から培養され、接着培養でコンフルエントを超えて増殖させた複能性細胞（multipotent cells）が、主にＨＡ及びコラーゲンからなり、成長因子及びその他のタンパク質を含むと考えられる、特有の生体材料を生成することが発見された。このような材料は、細胞を除去せずに若しくは除去して、細かく刻まれた形態若しくは固体の形態で組織修復用途に用いることができ、又は、当該技術分野で確立されている技術に従って粉砕することにより、若しくは本明細書に開示されるコラーゲン消化により、注射可能な製剤に調製することもできる。
【００１３】
本明細書に開示される注射可能な製剤は、神経修復、骨治癒、皮膚科及び形成外科用途のための皮膚充填剤として、損傷した筋肉又は心筋組織の治療、並びに十字靱帯（ＡＣＬ）修復や腱板修復などの組織修復法の促進のためなど、様々な用途に用いることができる。
【００１４】
別の実施形態では、胎盤膜は、当該技術分野で知られている技術を用いて粉砕してもよく、得られた粒子を、ヒアルロン酸を含む液中に再懸濁させてもよい。そのような処理は、成長因子等の膜のタンパク質含量を可能な範囲で維持するように行うべきである。好ましくは、粉砕は、クライオミル中のように温度管理された条件下で行うべきである。ヒアルロン酸（ＨＡ）又はヒアルロナンは、反復二糖β−１，４−Ｄグルクロン酸−β−１，３−Ｎ−アセチルＤグルコサミンの交互単位からなる直鎖多糖である。ＨＡは、眼の硝子体から様々な組織の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）まで、体中に認められる。ＨＡは、ＥＣＭの必須成分であり、細胞内シグナル伝達、創傷修復、形態形成、及びマトリクス組織化に関与すると考えられている。さらに、ＨＡは、数時間から数日の半減期で、ヒアルロニダーゼによって、体内で迅速に代謝回転（turned over）される。ＨＡ及びその誘導体は、様々な用途で臨床的に使用されてきた。例えば、注射可能な形態のＨＡは、眼科手術において、皮膚用充填剤として、及び滑膜関節の関節炎の治療において、日常的に使用されている。得られる製剤は、選択されるＨＡの分子量に応じて、注射可能であるが粘性である。この注射可能な生成物は、次いで、椎間板の再生及び椎間板の高さの保持を促すことによる、椎間板変性の治療に用いることができる。
【００１５】
明細書の残りの部分を参照することによって、本発明の性質及び利点の更なる理解が実現されるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の組成物、物品、デバイス、及び／又は方法を開示及び記載するに先立ち、他に特に規定がない限り、それらは特定の方法に又は特定の試薬に限定されるものではなく、変更されてもよいことが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのみに使用され、限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。
【００１７】
この出願は様々な刊行物を参照する。この出願が関連する技術分野の状況をより完全に説明するために、これらの刊行物はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。開示される刊行物はまた、その刊行物が用いられる文中において説明される刊行物中の内容を参照することにより、個別に及び具体的に本明細書に組み込まれる。
【００１８】
Ａ．胎盤膜製剤及びその製造方法 
１．初期処理及び胎盤膜の特定層の除去
胎盤膜シートは、米国食品医薬品局によって公布されたＣｕｒｒｅｎｔ  Ｇｏｏｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅガイドラインに従って、同意を得たドナーから採取した胎盤から製造することができる。
【００１９】
特に、帝王切開によるヒト乳児の誕生直後に完全な胎盤を回収し、胎盤から胎盤膜を切り離す。その後、胎盤膜の残留血液を取り除き、滅菌液漕に置き、氷上で保存し、加工のために輸送する。加工業者が受け取ったら、残りの血塊をすべて除去するために胎盤膜をリンスし、所望により抗生剤リンス液でさらにリンスする（Diaz-Prado SMら、Cell Tissue Bank 11, 183-195 (2010)）。
【００２０】
抗生剤リンス液としては、限定されるものではないが、抗生物質：アミカシン、アミノグリコシド、アモキシシリン、アンピシリン、アンサマイシン、アルスフェナミン、アジスロマイシン、アズロシリン、アズトレオナム、バシトラシン、カプレオマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、カルベニシリン、セファクロル、セファドロキシル、セファレキシン、セファロチン、セファマンドール、セファゾリン、セフジニル、セフジトレン、セフェピム、セフィキシム、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフォキシチン、セフポドキシム、セフプロジル、セフタロリンフォサミル、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトビプロール、セフトリアキソン、セフロキシム、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、クロファジミン、クロキサシリン、コリスチン、シクロセリン、ダプソン、ダプトマイシン、デメクロサイクリン、ジクロキサシリン、ジリスロマイシン、ドリペネム、ドキシサイクリン、エノキサシン、エルタペネム、エリスロマイシン、エタンブトール、エチオナミド、フルクロキサシリン、ホスホマイシン、フラゾリドン、フシジン酸、ガチフロキサシン、ゲルダナマイシン、ゲンタマイシン、糖ペプチド、グレパフロキサシン、ハービマイシン、イミペネム又はシラスタチン、イソニアジド、カナマイシン、レボフロキサシン、リンコマイシン、リンコサミド、リネゾリド、リポペプチド、ロメフロキサシン、ロラカルベフ、マクロライド、マフェニド、メロペネム、メチシリン、メトロニダゾール、メズロシリン、ミノサイクリン、モノバクタム、モキシフロキサシン、ムピロシン、ナフシリン、ナリジクス酸、ネオマイシン、ネチルマイシン、ニトロフラン、ニトロフラントイン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オキサシリン、オキシテトラサイクリン、パロモマイシン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン、プラテンシマイシン、ポリミキシンＢ、ピラジナミド、キノロン、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、リファブチン、リファンピシン又はリファンピン、リファペンチン、リファキシミン、ロキシスロマイシン、スルファジアジン銀、スパルフロキサシン、スペクチノマイシン、スピラマイシン、ストレプトマイシン、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファ、スルファメトキサゾール、スルファニルアミド、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、スルホンアミドクリソイジン、テイコプラニン、テラバンシン、テリスロマイシン、テマフロキサシン、テモシリン、テトラサイクリン、チアンフェニコール、チカルシリン、チゲサイクリン、チニダゾール、トブラマイシン、トリメトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール（コトリモキサゾール）（ＴＭＰ−ＳＭＸ）、及びトロレアンドマイシン、トロバフロキサシン、又はバンコマイシンが挙げられる。
【００２１】
抗生剤リンス液としては、また、限定されるものでは無いが、抗真菌剤：アバファンジン、アルバコナゾール、アモロルフィン、アンホテリシンＢ、アニデュラファンギン、ビホナゾール、ブテナフィン、ブトコナゾール、カスポファンギン、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、フルコナゾール、イサブコナゾール、イソコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾールミカファンギン、ミコナゾール、ナフチフィン、ナイスタチン、オモコナゾール、オキシコナゾール、ポサコナゾール、ラブコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、テルビナフィン、テルコナゾール、チオコナゾール、ボリコナゾール、又は１種以上の抗真菌特性を持つ、他の薬剤又は化合物が挙げられる。
【００２２】
胎盤膜は、膜の１種以上の特定の層を除去するために処理することができる。絨毛膜は、当業者によく知られている機械的手法によって、胎盤膜から除去することができる。絨毛膜は、例えば、鈍的切開を用いて胎盤膜の残りの部分から絨毛膜を注意深く剥離することによって除去することができる（Jin CZら、Tiss Eng 13、693-702 (2007)）。胎盤膜からの上皮層の除去は、当業者によく知られたいくつかの方法を用いて行うことができる。上皮層は、保存してもよいし、所望の場合は、上皮細胞における壊死を誘導するために例えばトリプシンを使用して除去してもよい（Diaz-Prado SMら、Cell Tissue Bank 11, 183-195 (2010)）。 上皮層の除去は、例えば、０．１％トリプシン−エチレンジアミン四酢酸（EDTA）溶液を用いて３７℃で１５分処理し、その後、セルスクレーパーを用いて物理的に処理する工程を含んでもよい（Jin CZら、Tiss Eng 13, 693-702 (2007)）。
【００２３】
２．胎盤膜のコラゲナーゼ消化
一実施形態では、胎盤膜はコラゲナーゼ中で消化される。選択されるコラゲナーゼは、当該技術分野で知られているコラーゲン消化活性を有する１種以上の種々の分子であってよい。選択される膜は、羊膜、絨毛膜、又は両方をあわせたものであってよい。消化のために、上皮層が残っていてもよいし、トリプシン処理又は当該技術分野で知られている他の技術を用いて除去してもよい。コラゲナーゼ処理の前に、膜をヒモ又は小片にカットしてもよいし、細かく刻んでもよい。コラゲナーゼを適用することにより、細胞、タンパク質及びヒアルロン酸などの残成分を含む粘性、ゲル様の物質を残して、コラーゲン構造が消化されることになる。コラゲナーゼ処理後に生存している細胞を保存してもよい。あるいは、当該技術分野で知られている技術を用いて、例えば、放射線照射、又は膜の高張溶液への浸漬を用いて、コラゲナーゼ処理の前又は後に細胞を溶解してもよい。処理は、成長因子などの膜のタンパク質含量を可能な範囲で保存するように実施することができる。
【００２４】
得られた材料は、羊水由来の細胞などの複能性細胞を添加して、又は添加することなく、凍結することにより低温保存（cryopreserve）することができる。あるいは、材料を、保存のために乾燥又は凍結乾燥し、生理溶液を用いて再構成することもできる。例えば、滅菌等張生理食塩水、又は滅菌緩衝生理食塩水（例えば、米国特許出願公開第2003-0187515）を使用することができる。材料はまた、当該技術分野において知られている技術を用いて、様々な温度で保管することができる。材料は、コラーゲン、ヒアルロン酸、フィブリン、ゼラチン、又は様々な薬理学的化合物など、他の生体適合性材料と組み合わせてもよい。生細胞の保存が望ましくない場合は、当該技術分野でよく知られているように、滅菌、典型的には放射線照射により滅菌することができる。例えば、およそ２５ｋＧｙのガンマ線を滅菌に使用することができる（Krishnamurithy G.ら、J Biomed Mater Res Part A 99A, 500-506 (2011)）。材料は、他の生体適合性材料又は溶剤を添加して、又は添加せずに、手術部位に、注射、噴霧、又は留置することができる。
【００２５】
単なる例示として、以下の手法を用いることができる。
１．膜を、滅菌液容器（basin）中のＣａ＋＋及びＭｇ＋＋不含ＰＢＳ中で３回洗浄する。
２．膜をＥＤＴＡ含有０．２５％トリプシン中に置き、細胞培養インキュベータにおいて３７℃で１５分間５０ｃｃチューブ中でインキュベートする。膜１６ｃｍ２毎に８ｍｌを使用する。
３．膜を取出し、滅菌液用容器中のＣａ＋＋及びＭｇ＋＋不含ＰＢＳ中で３回洗浄する。
４．膜を、膜１６ｃｍ２画分毎に８ｍＬのコラーゲンタイプＩＩ（Ｈｅｐｅｓ緩衝液含有ＤＭＥＭ中、タイプＩＩ２ｍｇ／ｍＬ）溶液中に置き、膜を鋏で小片に細かく刻む。インキュベータに置き、３７℃で３時間インキュベートする。
５．膜をインキュベータから取り出し、膜を上下に激しくピペッティングし、１００μｍセルストレーナーメッシュを通して５０ｃｃチューブに流し込む。
６．１０００ｒｐｍで５分間遠心する。
７．上清を吸引する。
８．ＰＢＳでペレットを洗う。
９．１０００ｒｐｍで５分間遠心する。
１０．上清を吸引する。
【００２６】
その後吸引後に残る材料を用いてもよいし、あるいは、さらに、保存若しくは本明細書に開示されるように処理してもよい。
【００２７】
３．消化された胎盤膜に由来するヒアルロン酸及びコラーゲンの調製
別の実施形態では、驚くべきことに、消化された胎盤膜に由来し、コンフルエントを超えて接着培養で増殖させた複能性細胞が、主にＨＡ及びコラーゲンから構成され、成長因子及びその他のタンパク質を含むと考えられる、特有の生体材料を生成することが発見された。培養により増殖した細胞は、通常コンフルエントに到達後接触阻害を示し、通常は、増殖し続けたり、マトリクス様材料を生成し続けたりすることはないため、このような発見は驚くべきことであった。接着培養物は、培養フラスコ中で増殖させてもよいし、又は当技術分野でよく知られている他の適切な培養構成を用いてもよい。得られた材料は、細胞を除去し又は除去することなく、細かく刻まれた形態又は固体の形態で、組織修復の用途のために使用することができ、あるいは、当技術分野において確立された技術に従って粉砕することにより、又は、本明細書において開示されるようにコラーゲン消化により、注射可能な形態に調製することもできる。
【００２８】
４．ＨＡに懸濁された胎盤膜粒子
別の実施形態では、胎盤膜を当技術分野で知られている技術を用いて粉砕し、得られた粒子をヒアルロン酸を含む液に再懸濁してもよい。このような処理は、成長因子等の膜のタンパク質含量を可能な範囲で維持するように行うことができる。好ましくは、粉砕は、クライオミルのような温度制御された条件下で行われるべきである。当該技術分野でよく知られているように、選択されるＨＡは様々な分子量を有するものであってよい。様々なヒト又は動物源由来であってもよいし、また、遺伝子改変細菌によるものなど、組み換え技術により生成してもよい。選択されたＨＡの分子量によって、得られる製剤は注射可能であるが粘性のものとなる。この注射可能な材料は、次いで、椎間板の変性を治療するために用いることができる。注射可能な材料は、例えば、コラーゲン、フィブリン、絹タンパク質、又はケラチンなどの他の生体適合性材料と組み合わせてもよい。注射可能な製剤と組み合わせて、又は注射可能な製剤の後に、注射により生成する椎間板の穴を密封するためのフィブリンシーラント又は他の接着剤マトリクスの注射を行っても良い。
【００２９】
Ｂ．胎盤膜製剤のための使用
本明細書に記載の製剤の実施形態は、損傷した又は欠陥のある組織を再生するために使用することができる。
【００３０】
１．結合組織の修復
外傷、酷使及びその他の理由により、靱帯、腱及び体内の他の結合組織が完全に又は部分的に断裂し、外科的修復が必要となる場合がある。一般的な例としては、膝十字及び内側側副靭帯、アキレス腱、肩の回旋筋腱板及び腰が挙げられる。これらの修復を行うために数々の外科的手法を用いることができるが、多くの場合、望まれるほど迅速にかつ完全に修復することはできない。回旋筋腱板の治癒は特に困難である。さらに、大規模な断裂がない場合でも、腱、靭帯及び他の結合組織は、顕微鏡レベルの損傷状態になる場合があり、痛みと衰弱状態をもたらす。開示された実施形態はそのような状態の治療に効果的に用いることができる。
【００３１】
注射可能な実施形態は、患部への直接注入により、腱、靭帯、及び結合組織の損傷を治療するために使用することができる。同様に、関節包中、又は、例えばＡＣＬ修復や回旋筋腱板修復などの修復手術後の修復部位中に、１回以上の注射を行うことは、移植片の取り込み（graft incorporation）及び治癒を速めるのに有益であるはずである。あるいは、外科手術の前、又は外科手術中に、注射可能な実施形態を修復部位、又は、外科手術に用いられる移植材料注入してもよく、移植材料は、自家移植片、同種移植片、異種移植片、又は合成由来であってもよい。
【００３２】
２．末梢神経修復
外傷関連の神経欠陥の治療は困難である。神経自家移植がゴールドスタンダードであるが、運動及び感覚神経のソースは限られており、移植により、ドナー側で必然的に神経障害が生じる。先行研究では、損傷を受けた神経は、欠陥部を横断する管状導管（tubular conduit）を用いて外科的に修復することができることが示されており、また、加工した同種移植片神経も当該目的のために成功裡に使用されている。しかしながら、治癒が遅く、特に大きな神経間隙においては十分な機能回復をもたらさないことが多い。従って、管状導管に適切な生体材料を含ませることにより、機能的帰結（functional outcome）を向上し得ることが示唆されている（Sierpinski, Paulinaら、The Use of Keratin Biomaterials Derived from Human Hair for the Promotion of Rapid Regeneration of Peripheral Nerves. Biomaterials 29 (2008) 118-128)。同様に、処理したヒト又は動物神経に神経栄養因子を添加することにより、神経移植片の性能が向上する場合がある。羊水物質は、神経の成長を促進することが示されている（Schroeder, Alice, ら、Effects of the Human Amniotic Membrane on Axonal Outgrowth of Dorsal Root Ganglia Neurons in Culture、Current Eye Research、(2007) 32:731-738)。開示される実施形態は、そのような目的のために効果的に用いることができる。
【００３３】
具体的には、導管を用いる手術において、修復手術の間に、導管を充填するために注射可能な実施形態を導入することができる。導管自体、又は、高多孔性充填剤を注射可能な実施形態に浸漬することができる。あるいは、培養においてオーバーコンフルエントの胎盤細胞から生成された生体材料の固体又は細かく刻まれた形態のものを導管用充填剤として用いてもよい。処理した神経を用いる手術においては、神経自体に注射可能な実施形態を注射してもよい。
【００３４】
３．創傷及び熱傷のケア
広範囲の熱傷及び非治癒性の創傷の治療は非常に困難である。多くの治療の選択肢があるが、創傷の一部は治療抵抗性であり、多くの場合十分に治癒しない結果となる。少なくとも１９１０年代から、羊膜は火傷及び慢性創傷の治療に用いられている。従って、開示された発明は、非治癒性創傷及び火傷の治療に有益に用いることができると考えられる。具体的には、注射可能な実施形態では、創傷床の周囲又は中に注入し、治癒を刺激することができる。
【００３５】
４．骨成長と融合
粉砕された羊膜を含む生成物としては、市販品としては、ＮｕＣｅｌ（登録商標）（バーミンガム、アラバマ州のNuTech Medical Inc.から入手可能なヒト羊膜及び羊水由来の同種移植片）、ＢｉｏＤＦａｃｔｏｒ（登録商標）（メンフィス、テネシー州のBioD, LLCから入手可能な、ヒト胎盤組織由来の凍結保存注射用同種移植片）、及びＯｖａｔｉｏｎ（登録商標）（ハモサビーチ、カリフォルニア州のMatrix Biosurgical, Incから入手可能な、胎盤間葉由来の細胞修復マトリクス）が挙げられ、椎体間固定術（interbody fusion of the spine）において等、骨の成長及び融合を促進するのに臨床的成功を収めて使用されている。そのような生成物は、マトリクスを使用しないと所定の位置にとどまるには粘度が十分ではないため、典型的には、使用の前に親水性マトリクスと組み合わせなければならない。しかし、骨の成長又は融合の促進が必要とされる一部の外科用途では、液体の生成物を吸収する適切なマトリクス又はキャリアの留置が不可能であるか又は望ましくない場合があるため、粘度が高いことが望ましい。本明細書に記載の注射可能な実施形態は、そのような用途において代替物として適宜用いることができる。
【００３６】
５．骨格筋及び心筋の治療 
外傷、虚血、及び種々の疾患状態等の様々な因子が、ヒト筋肉組織の損傷を引き起こし、あるいは筋肉の正常な機能に影響を及ぼし得る。特に注目すべきは、心筋が、心臓血管系の閉塞により虚血性障害を非常に受けやすいことである。羊膜生成物及び細胞は、筋肉の修復及び回復に有益であることが示されてきた。従って、開示された実施形態は、単独で又は他の材料と組み合わせて、骨格及び心臓筋系に対する損傷又はそれらの疾患の治療に用いることができる。 
【００３７】
６．皮膚充填剤
皮膚の外観を復元するめに皮膚充填剤が使用される場合のある化粧品及び形成外科用途が非常に沢山ある。使用される製品は、注射可能であるが、注射後にその場所に留まるように十分な粘性を有することが望ましい。様々な製品が開発され、臨床使用されている（Kontis, Theda C.、Contemporary Review of Injectable Facial Fillers, Facial Plast Surg. 2013; 15(1): 58-64）。羊膜材料は、皮膚及び結合組織の修復及び治癒を助けることが示されている。望ましい実施液体では、例えばヒアルロン酸等の他の材料を添加して、又は添加せずに、注射可能な皮膚充填剤として適宜使用することができる。
【００３８】
７．椎間板変性症
椎間板は、脊椎における椎体間のスペースを占有する線維軟骨組織である。椎間板は、脊柱に可動性を与えながら、１つの椎骨から次の椎骨へ力を伝達する。椎間板の構造的特性は、主に、水を引き付け保持する能力に依存する。椎間板中のプロテオグリカンは圧縮荷重に耐える浸透“膨張圧”を発揮する。椎間板の変性は、人間の老化に特徴的な生理学的プロセスである。年齢とともに、椎間板は様々な変化を受けるが、最も注目されるべきは、浸透圧の減少、並びに、椎間板の高さ及び負荷伝達能力の減少を生ずる、プロテオグリカン量の減少である。椎間板変性は、ほとんどの首及び背中の痛みの主要因である脊髄疾患の重要かつ直接的な原因である。
【００３９】
関連する軟骨及び腱細胞の場合と同様に、羊膜の成分は、椎間板及び関連細胞の治癒及び回復を促進し得る。開示された発明は、変性椎間板疾患の治療に有益に用いることができると考えられる。具体的には、注射可能な実施形態を椎間板に注入することができる。この実施形態は、胎盤膜由来の生細胞を含んでもよいし、含まなくてもよい。同じドナーの羊水から当該技術分野において知られている技術を用いて単離された追加の細胞を添加してもよいし、添加しなくてもよい。注射可能な材料は、例えば、ヒアルロン酸、コラーゲン、フィブリン、絹タンパク質、又はケラチンなどの他の生体適合性材料と組み合わせてもよい。注射可能な製剤と組み合わせて、又はその後に、注射によって生成する椎間板の穴を密封するために、フィブリンシーラント又は他の接着剤マトリクスの注射を行ってもよい（Buser Zら、Biological and Biomechanical Effects of Fibrin Injection into Porcine Intervertebral Discs. Spine (2011) 36(18) 1201-1209）。
【手続補正書】
【提出日】平成27年12月21日(2015.12.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
抗生剤リンス液としては、限定されるものではないが、抗生物質：アミカシン、アミノグリコシド、アモキシシリン、アンピシリン、アンサマイシン、アルスフェナミン、アジスロマイシン、アズロシリン、アズトレオナム、バシトラシン、カプレオマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、カルベニシリン、セファクロル、セファドロキシル、セファレキシン、セファロチン、セファマンドール、セファゾリン、セフジニル、セフジトレン、セフェピム、セフィキシム、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフォキシチン、セフポドキシム、セフプロジル、セフタロリンフォサミル、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトビプロール、セフトリアキソン、セフロキシム、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、クロファジミン、クロキサシリン、コリスチン、シクロセリン、ダプソン、ダプトマイシン、デメクロサイクリン、ジクロキサシリン、ジリスロマイシン、ドリペネム、ドキシサイクリン、エノキサシン、エルタペネム、エリスロマイシン、エタンブトール、エチオナミド、フルクロキサシリン、ホスホマイシン、フラゾリドン、フシジン酸、ガチフロキサシン、ゲルダナマイシン、ゲンタマイシン、糖ペプチド、グレパフロキサシン、ハービマイシン、イミペネム／シラスタチン、イソニアジド、カナマイシン、レボフロキサシン、リンコマイシン、リンコサミド、リネゾリド、リポペプチド、ロメフロキサシン、ロラカルベフ、マクロライド、マフェニド、メロペネム、メチシリン、メトロニダゾール、メズロシリン、ミノサイクリン、モノバクタム、モキシフロキサシン、ムピロシン、ナフシリン、ナリジクス酸、ネオマイシン、ネチルマイシン、ニトロフラン、ニトロフラントイン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オキサシリン、オキシテトラサイクリン、パロモマイシン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン、プラテンシマイシン、ポリミキシンＢ、ピラジナミド、キノロン、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、リファブチン、リファンピシン又はリファンピン、リファペンチン、リファキシミン、ロキシスロマイシン、スルファジアジン銀、スパルフロキサシン、スペクチノマイシン、スピラマイシン、ストレプトマイシン、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファ、スルファメトキサゾール、スルファニルアミド、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、スルホンアミドクリソイジン、テイコプラニン、テラバンシン、テリスロマイシン、テマフロキサシン、テモシリン、テトラサイクリン、チアンフェニコール、チカルシリン、チゲサイクリン、チニダゾール、トブラマイシン、トリメトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール（コトリモキサゾール）（ＴＭＰ−ＳＭＸ）、及びトロレアンドマイシン、トロバフロキサシン、又はバンコマイシンが挙げられる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラゲナーゼ中で胎盤膜を消化することを含む、製剤の製造方法。
【請求項２】
胎盤膜が、羊膜、絨毛膜、又は、羊膜と絨毛膜との両者を含む、請求項１に記載の方法。 
【請求項３】
トリプシンを用いた消化の前に、胎盤膜から上皮層を除去することをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
胎盤膜のコラーゲン構造の消化が、細胞、タンパク質、及びヒアルロン酸からなる群より選択される胎盤膜の他の成分を含む粘性、ゲル様物質をもたらす、請求項１、２又は３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
胎盤膜の放射線照射、胎盤膜の高張液への浸漬、又はその両方から成る群より選択されるプロセスを用いて胎盤膜の細胞を溶解することをさらに含む、請求項１、２、３又は４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
製剤を、コラーゲン、ヒアルロン酸、フィブリン、ゼラチン、１種以上の薬理学的化合物、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される生体適合性材料と組み合わせることをさらに含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
胎盤膜をＣａ＋＋及びＭｇ＋＋不含ＰＢＳ中で洗浄し、胎盤膜をトリプシン中に入れ、胎盤膜をインキュベートし、その後、
胎盤膜をＣａ＋＋及びＭｇ＋＋不含ＰＢＳ中で洗浄し、胎盤膜をコラゲナーゼ溶液中に入れ、胎盤膜を小片に細かく刻み、その後、
胎盤膜の小片をインキュベートし、その後、
胎盤膜の小片をピペット中で上下にピペッティングし、胎盤膜の小片をセルストレーナーメッシュを通過させ、その後、
胎盤膜の小片を遠心して上清とペレットを形成し、ペレットをＰＢＳで洗浄し、上清を吸引する
ことをさらに含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
消化された胎盤膜から複能性細胞を抽出し、複能性細胞を、接着培養でコンフルエントを超えて増殖させることを含む、製剤の製造方法。
【請求項９】
製剤は、ＨＡ、コラーゲン、成長因子及びタンパク質を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
培養フラスコ中で接着培養物を増殖させることをさらに含む、請求項８及び９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
胎盤膜を粉砕し、それにより胎盤膜粒子を形成することと、胎盤膜粒子をヒアルロン酸を含む液体に再懸濁することを含む、製剤の製造方法。
【請求項１２】
粉砕をクライオミル中で実施する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
製剤に、コラーゲン、フィブリン、絹タンパク質、ケラチン及びそれらの組み合わせからなる群より選択される生体適合性材料を添加することをさらに含む、請求項１１及び１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
製剤が、羊水又は胎盤組織から単離された細胞を含む、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
患部の損傷した又は欠陥のある組織を再生するために、哺乳動物の患部に導入するための薬剤の製造における、請求項１から１４のいずれか１項に記載の製剤の使用。
【請求項１６】
患部の直接注入により、損傷した若しくは病変した腱、靭帯又は結合組織に注入するための薬剤の製造における、請求項１から１４のいずれか１項に記載の製剤の使用。
【請求項１７】
関節包中に、又は、結合組織の修復手術後の修復部位に注入するための薬剤の製造における、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製剤の使用。
【請求項１８】
手術に使用される移植材料中に注入するための薬剤の製造における、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製剤の使用であって、移植材料は、自家移植材料、同種移植片材料、異種移植片材料及び合成材料から成る群より選択される、使用。
【請求項１９】
損傷した神経を修復するために、神経欠陥を横断して置かれる管状導管に導入するための、薬剤の製造における、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製剤の使用。
【請求項２０】
薬剤は、多孔質充填材料を製剤で浸漬し、充填材料を管状導管中に入れることにより管状導管に導入される、請求項１９に記載の使用。 
【請求項２１】
神経に注入するための薬剤の製造における、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製剤の使用。
【請求項２２】
治癒を刺激するために、創傷床中に、又はその周囲に注入するための薬剤の製造における、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製剤の使用。
【請求項２３】
損傷した若しくは病変した骨の再生、融合及び／又は治癒を促進するために、損傷した若しくは病変した骨の中に、又はその周囲に注入するための薬剤の製造における、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製剤の使用。
【請求項２４】
損傷した又は病変した筋肉の治癒を促進するために、損傷した又は病変した筋肉に注入するための薬剤の製造における、請求項１から１４のいずれか１項に記載の製剤の使用。
【請求項２５】
化粧品及び／又は形成外科用途のために、皮膚充填剤として哺乳動物の真皮に注入するための薬剤の製造における、請求項１から１４のいずれか１項に記載の製剤の使用。
【請求項２６】
製剤がヒアルロン酸を含む、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
椎間板の治癒及び回復、又は椎間板変性疾患の治療を促進するために、哺乳動物の椎間板に注入するための薬剤の製造における、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製剤の使用。
【請求項２８】
前記製剤の注入により生じた椎間板の穴を密閉するためにフィブリンシーラント又は他の接着マトリクスが注入される、請求項２７に記載の使用。 
【国際調査報告】
2016513728.tif 000002
2016513728.tif 000003
2016513728.tif 000004
2016513728.tif 000005