(57)【要約】  一態様において、本開示は、改変グリコシル化パターンを有する抗体、前記抗体を作製する方法、およびその使用方法に関する。一部の実施形態において、抗体は、セツキシマブである。
2016513105.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１を含む重鎖；および
（ｂ）配列番号２を含む軽鎖；
を含み、非乳房細胞培養物中で産生されるグリコシル化抗体よりも少ないガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分を有する、グリコシル化抗体。
【請求項２】
前記非乳房細胞培養物がマウス骨髄腫細胞培養物である、請求項１記載のグリコシル化抗体。
【請求項３】
前記より少ないガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分が、前記重鎖の可変領域中に局在する、請求項１または２記載のグリコシル化抗体。
【請求項４】
前記より少ないガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分が、配列番号１に示される前記重鎖の１０７位に局在する、請求項１〜３いずれか１項記載のグリコシル化抗体。
【請求項５】
ガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分を欠く、請求項１記載のグリコシル化抗体。
【請求項６】
乳腺上皮細胞において産生されたものである、請求項１〜５いずれか１項記載のグリコシル化抗体。
【請求項７】
非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳腺上皮細胞において産生されたものである、請求項１〜６いずれか１項記載のグリコシル化抗体。
【請求項８】
前記非ヒト哺乳動物が、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウスまたはラマである、請求項７記載のグリコシル化抗体。
【請求項９】
前記非ヒト哺乳動物がヤギである、請求項７記載のグリコシル化抗体。
【請求項１０】
キメラ、ヒト化または完全ヒト抗体である、請求項１〜９いずれか１項記載のグリコシル化抗体。
【請求項１１】
セツキシマブである、請求項１〜１０いずれか１項記載のグリコシル化抗体。
【請求項１２】
請求項１〜１１いずれか１項記載のグリコシル化抗体、および薬学的に許容可能な担体を含む組成物。
【請求項１３】
グリコシル化抗体の集団を含む組成物であって、前記グリコシル化抗体が、
（ａ）配列番号１を含む重鎖；および
（ｂ）配列番号２を含む軽鎖；
を含み、
前記抗体の集団が、非乳房細胞培養物中で産生されるグリコシル化抗体の集団よりも少ないガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分を有する、組成物。
【請求項１４】
前記非乳房細胞培養物がマウス骨髄腫細胞培養物である、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
前記より少ないガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分が、前記重鎖の可変領域中に局在する、請求項１３または１４記載の組成物。
【請求項１６】
前記より少ないガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分が、配列番号１に示される前記重鎖の１０７位に局在する、請求項１３〜１５いずれか１項記載の組成物。
【請求項１７】
前記グリコシル化抗体が、ガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分を欠く、請求項１３記載の組成物。
【請求項１８】
前記グリコシル化抗体の集団が、乳腺上皮細胞において産生されたものである、請求項１３〜１７いずれか１項記載の組成物。
【請求項１９】
前記グリコシル化抗体の集団が、非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳腺上皮細胞において産生されたものである、請求項１３〜１８いずれか１項記載の組成物。
【請求項２０】
前記非ヒト哺乳動物が、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウスまたはラマである、請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
前記非ヒト哺乳動物がヤギである、請求項１９記載の組成物。
【請求項２２】
前記集団中のグリコシル化抗体が、キメラ、ヒト化または完全ヒト抗体である、請求項１３〜２１いずれか１項記載の組成物。
【請求項２３】
前記集団中のグリコシル化抗体がセツキシマブ抗体である、請求項１３〜２２いずれか１項記載の組成物。
【請求項２４】
乳汁をさらに含む、請求項１３〜２３いずれか１項記載の組成物。
【請求項２５】
薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１３〜２４いずれか１項記載の組成物。
【請求項２６】
モノクローナル抗体を含む組成物であって、前記モノクローナル抗体が、
（ａ）配列番号１を含む重鎖；および
（ｂ）配列番号２を含む軽鎖；
を含み、
該組成物がトランスジェニックヤギの乳腺において産生されたものである、組成物。
【請求項２７】
モノクローナル抗体を含む組成物であって、前記モノクローナル抗体が、
（ａ）配列番号１を含む重鎖；
（ｂ）配列番号２を含む軽鎖；および
を含み、
前記モノクローナル抗体がガラクトース−α−１，３−ガラクトースを欠く、組成物。
【請求項２８】
産生されるグリコシル化抗体の集団が非乳房細胞培養物中で産生されるグリコシル化抗体の集団よりも少ないガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分を含むように、乳腺上皮細胞においてグリコシル化抗体の集団を産生させる工程を含み、前記グリコシル化抗体が、配列番号１を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含む、方法。
【請求項２９】
前記非乳房細胞培養物がマウス骨髄腫細胞培養物である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記グリコシル化抗体の集団が、ガラクトース−α−１，３−ガラクトースを欠く、請求項２８または２９記載の方法。
【請求項３１】
前記グリコシル化抗体の集団を回収する工程をさらに含む、請求項２８〜３０いずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
前記産生をインビトロで行う、請求項２８〜３１いずれか１項記載の方法。
【請求項３３】
前記産生をインビボで行う、請求項２８〜３１いずれか１項記載の方法。
【請求項３４】
前記産生を非ヒトトランスジェニック哺乳動物において行う、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記非ヒト哺乳動物が、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウスまたはラマである、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記非ヒト哺乳動物がヤギである、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
前記グリコシル化抗体の集団を精製する工程をさらに含む、請求項２８〜３６いずれか１項記載の方法。
【請求項３８】
前記グリコシル化抗体の集団中に存在するガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分の数と、非乳房細胞培養物中で産生されるグリコシル化抗体の集団中に存在するガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分の数とを比較する工程をさらに含む、請求項２８〜３７いずれか１項記載の方法。
【請求項３９】
請求項２８〜３８いずれか１項記載の方法により産生されたグリコシル化抗体の集団。
【請求項４０】
請求項１〜１１いずれか１項記載の抗体を産生する、乳腺上皮細胞。
【請求項４１】
配列番号３を含む核酸および配列番号４を含む核酸を含む、請求項４０記載の乳腺上皮細胞。
【請求項４２】
配列番号３を含む核酸および配列番号４を含む核酸が連結している、請求項４１記載の乳腺上皮細胞。
【請求項４３】
請求項４０〜４２いずれか１項記載の乳腺上皮細胞を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項４４】
請求項１３〜２７いずれか１項記載の抗体の集団を産生する、乳腺上皮細胞。
【請求項４５】
配列番号３を含む核酸および配列番号４を含む核酸を含む、請求項４４記載の乳腺上皮細胞。
【請求項４６】
配列番号３を含む核酸および配列番号４を含む核酸が連結している、請求項４５記載の乳腺上皮細胞。
【請求項４７】
請求項４４〜４６いずれか１項記載の乳腺上皮細胞を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項４８】
ヤギである、請求項４３または４７記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項４９】
有効量の請求項１〜１１いずれか１項記載の抗体または請求項１２〜２７いずれか１項記載の組成物を、必要とする対象に投与する工程を含む方法。
【請求項５０】
前記対象が癌を有する、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
前記癌が、頭頸部癌または結腸直腸癌である、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
少なくとも１つの追加の治療剤を投与する工程をさらに含む、請求項４９〜５１いずれか１項記載の方法。
【請求項５３】
前記少なくとも１つの追加の治療剤が、イリノテカン、ロイコボリンカルシウム、フルオロウラシル、またはそれらの組合せである、請求項５２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、全開示が参照により全体として本明細書に組み込まれる、２０１３年２月１３日に出願された標題「Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ｗｉｔｈ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」の米国仮特許出願第６１／７６４，４４６号明細書の米国特許法第１１９条第（ｅ）項の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、一部には、改変グリコシル化パターンを有する抗体、その作製方法、および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）は、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の細胞外ドメインに結合する組換えキメラモノクローナル抗体であり、特定の形態の癌を治療するために診療所で使用される。残念ながら、一部の患者は、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）により治療された場合、アレルギー応答、一部の症例において、アナフィラキシーショックおよび死亡が認められた。このアレルギー応答は、市販形態のセツキシマブ、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）上に存在するガラクトース−α−１，３−ガラクトースグリコシル化分子を認識するＩｇＥにより引き起こされることが示されている（非特許文献１）。ガラクトース−α−１，３−ガラクトースの付加は、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）を市販用に作製するために使用される哺乳動物（ネズミ骨髄腫）細胞培養系の結果であることが考えられる。チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるタンパク質の産生も、タンパク質上のガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分をもたらし得る（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃ．Ｃｈｕｎｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ  ａｎｄ  ＩｇＥ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｇａｌａｃｔｏｓｅ−ａｌｐｈａ−１，３−ｇａｌａｃｔｏｓｅ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ（２００８）；３５８：１１０９−１７
【非特許文献２】Ｂｏｓｑｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．２８：１１５３−１１５６，２０１０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
哺乳動物の乳房上皮細胞、例えば、乳汁中に抗体を分泌するように操作されたトランスジェニック動物の哺乳動物乳房上皮細胞において産生される抗体は、検出可能なガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分を有さないことが見出された。従って、態様において、本開示は、ガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分を有さない抗体およびその組成物を提供する。このような抗体を作製する方法およびその使用方法も提供される。
【０００６】
一態様において、本開示は、
（ａ）配列番号１を含む重鎖；
（ｂ）配列番号２を含む軽鎖；
を含むグリコシル化抗体において、
非乳房細胞培養物中に産生されるグリコシル化抗体よりも少ないガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分を有するグリコシル化抗体を提供する。
【０００７】
本明細書に提供されるグリコシル化抗体の実施形態の一部において、非乳房細胞培養物は、マウス骨髄腫細胞培養物である。本明細書に提供されるグリコシル化抗体の実施形態の一部において、より少ないガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分は、重鎖の可変領域中に局在する。本明細書に提供されるグリコシル化抗体の実施形態の一部において、より少ないガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分は、配列番号１に示される重鎖の１０７位に局在する。本明細書に提供されるグリコシル化抗体の実施形態の一部において、グリコシル化抗体は、ガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分を欠く。本明細書に提供されるグリコシル化抗体の実施形態の一部において、グリコシル化抗体は、乳腺上皮細胞において産生される。本明細書に提供されるグリコシル化抗体の実施形態の一部において、グリコシル化抗体は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳腺上皮細胞において産生される。一部の実施形態において、非ヒト哺乳動物は、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウスまたはラマである。一部の実施形態において、非ヒト哺乳動物はヤギである。本明細書に提供されるグリコシル化抗体の実施形態の一部において、抗体は、キメラ、ヒト化または完全ヒト抗体である。本明細書に提供されるグリコシル化抗体の実施形態の一部において、抗体はセツキシマブである。
【０００８】
一態様において、本開示は、本明細書に提供されるグリコシル化抗体のいずれか、および薬学的に許容可能な担体を含む組成物を提供する。
【０００９】
一態様において、本開示は、グリコシル化抗体の集団を含む組成物において、グリコシル化抗体が、
（ａ）配列番号１を含む重鎖；
（ｂ）配列番号２を含む軽鎖；
を含み、
抗体の集団が、非乳房細胞培養物中で産生されるグリコシル化抗体の集団よりも少ないガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分を有する組成物を提供する。
【００１０】
本明細書に提供される組成物の実施形態の一部において、非乳房細胞培養物は、マウス骨髄腫細胞培養物である。本明細書に提供される組成物の実施形態の一部において、より少ないガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分は、重鎖の可変領域中に局在する。本明細書に提供される組成物の実施形態の一部において、より少ないガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分は、配列番号１に示される重鎖の１０７位に局在する。本明細書に提供される組成物の実施形態の一部において、グリコシル化抗体は、ガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分を欠く。本明細書に提供される組成物の実施形態の一部において、グリコシル化抗体の集団は、乳腺上皮細胞において産生される。本明細書に提供される組成物の実施形態の一部において、グリコシル化抗体の集団は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳腺上皮細胞において産生される。一部の実施形態において、非ヒト哺乳動物は、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウスまたはラマである。
【００１１】
一部の実施形態において、非ヒト哺乳動物はヤギである。
【００１２】
本明細書に提供される組成物の実施形態の一部において、集団中のグリコシル化抗体は、キメラ、ヒト化または完全ヒト抗体である。本明細書に提供される組成物の実施形態の一部において、集団中のグリコシル化抗体は、セツキシマブ抗体である。本明細書に提供される組成物の実施形態の一部において、組成物は、乳汁をさらに含む。本明細書に提供される組成物の実施形態の一部において、組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。
【００１３】
一態様において、本開示は、モノクローナル抗体を含む組成物において、モノクローナル抗体が、
（ａ）配列番号１を含む重鎖；
（ｂ）配列番号２を含む軽鎖；
を含み、
トランスジェニックヤギの乳腺中に産生される組成物を提供する。
【００１４】
一態様において、本開示は、モノクローナル抗体を含む組成物において、モノクローナル抗体が、
（ａ）配列番号１を含む重鎖；
（ｂ）配列番号２を含む軽鎖；
を含み、
モノクローナル抗体が、ガラクトース−α−１，３−ガラクトースを欠く組成物を提供する。
【００１５】
一態様において、本開示は、産生されるグリコシル化抗体の集団が非乳房細胞培養物中で産生されるグリコシル化抗体の集団よりも少ないガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分を含むように、乳腺上皮細胞においてグリコシル化抗体の集団を産生させる工程を含む方法において、
グリコシル化抗体が、配列番号１を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含む方法を提供する。
【００１６】
本明細書に提供される方法の実施形態の一部において、非乳房細胞培養物は、マウス骨髄腫細胞培養物である。本明細書に提供される方法の実施形態の一部において、グリコシル化抗体の集団は、ガラクトース−α−１，３−ガラクトースを欠く。本明細書に提供される方法の実施形態の一部において、方法は、グリコシル化抗体の集団を回収する工程をさらに含む。本明細書に提供される方法の実施形態の一部において、産生をインビトロで行う。本明細書に提供される方法の実施形態の一部において、産生をインビボで行う。本明細書に提供される方法の実施形態の一部において、産生を非ヒトトランスジェニック哺乳動物において行う。一部の実施形態において、非ヒト哺乳動物は、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウスまたはラマである。一部の実施形態において、非ヒト哺乳動物はヤギである。
【００１７】
本明細書に提供される方法の実施形態の一部において、方法は、グリコシル化抗体の集団を精製する工程をさらに含む。本明細書に提供される方法の実施形態の一部において、方法は、グリコシル化抗体の集団中に存在するガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分の数と、非乳房細胞培養物中で産生されるグリコシル化抗体の集団中に存在するガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分の数とを比較する工程をさらに含む。
【００１８】
一態様において、本開示は、本明細書に提供される方法のいずれかにより産生されるグリコシル化抗体の集団を提供する。
【００１９】
一態様において、本開示は、本明細書に提供される抗体のいずれかを産生する乳腺上皮細胞を提供する。本明細書に提供される乳腺上皮細胞の一部の実施形態において、乳腺上皮細胞は、配列番号３を含む核酸および配列番号４を含む核酸を含む。本明細書に提供される乳腺上皮細胞の一部の実施形態において、配列番号３を含む核酸および配列番号４を含む核酸は連結している。
【００２０】
一部の実施形態において、本開示は、本明細書に開示の乳腺上皮細胞のいずれかを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。一部の実施形態において、非ヒト哺乳動物はヤギである。
【００２１】
一態様において、本開示は、本明細書に開示の抗体の集団のいずれかを産生する乳腺上皮細胞を提供する。本明細書に提供される乳腺上皮細胞の一部の実施形態において、乳腺上皮細胞は、配列番号３を含む核酸および配列番号４を含む核酸を含む。本明細書に提供される乳腺上皮細胞の一部の実施形態において、配列番号３を含む核酸および配列番号４を含む核酸は連結している。
【００２２】
一態様において、本開示は、本明細書に開示の乳腺上皮細胞のいずれかを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。
【００２３】
一態様において、本開示は、有効量の本明細書に提供される抗体のいずれかを、それが必要とされる対象に投与する工程を含む方法を提供する。
【００２４】
一態様において、本開示は、有効量の本明細書に提供される組成物のいずれかを、それが必要とされる対象に投与する工程を含む方法を提供する。
【００２５】
一部の実施形態において、対象は癌を有する。一部の実施形態において、癌は、頭頸部癌または結腸直腸癌である。本明細書に提供される方法の一部の実施形態において、方法は、少なくとも１つの追加の治療剤を投与する工程をさらに含む。一部の実施形態において、少なくとも１つの追加の治療剤は、イリノテカン、ロイコボリンカルシウム、フルオロウラシル、またはそれらの組合せである。
【００２６】
図面を最初に記載する。図面は、例示的なものであり、本発明の実施可能性に要求されないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１−１】セツキシマブの重鎖（ＨＣ）のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図１−２】図１−１の続き。
【図２−１】セツキシマブの軽鎖（ＬＣ）のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図２−２】図２−１の続き。
【図３】セツキシマブの重鎖（ＨＣ）の核酸配列（配列番号３）を示す。
【図４】セツキシマブの軽鎖（ＬＣ）の核酸配列（配列番号４）を示す。
【図５Ａ】プラスミドＢＣ２５５３ＬＣセツキシマブ（軽鎖）を示す。
【図５Ｂ−１】プラスミドＢＣ２５５３ＬＣセツキシマブ（軽鎖）の核酸配列（配列番号５）を示す。
【図５Ｂ−２】図５Ｂ−１の続き。
【図５Ｂ−３】図５Ｂ−２の続き。
【図５Ｂ−４】図５Ｂ−３の続き。
【図５Ｂ−５】図５Ｂ−４の続き。
【図５Ｂ−６】図５Ｂ−５の続き。
【図５Ｂ−７】図５Ｂ−６の続き。
【図５Ｂ−８】図５Ｂ−７の続き。
【図５Ｂ−９】図５Ｂ−８の続き。
【図５Ｂ−１０】図５Ｂ−９の続き。
【図６Ａ】プラスミドＢＣ２５５４ＨＣセツキシマブ（重鎖）を示す。
【図６Ｂ−１】プラスミドＢＣ２５５４ＨＣセツキシマブ（重鎖）の核酸配列（配列番号６）を示す。
【図６Ｂ−２】図６Ｂ−１の続き。
【図６Ｂ−３】図６Ｂ−２の続き。
【図６Ｂ−４】図６Ｂ−３の続き。
【図６Ｂ−５】図６Ｂ−４の続き。
【図６Ｂ−６】図６Ｂ−５の続き。
【図６Ｂ−７】図６Ｂ−６の続き。
【図６Ｂ−８】図６Ｂ−７の続き。
【図６Ｂ−９】図６Ｂ−８の続き。
【図６Ｂ−１０】図６Ｂ−９の続き。
【図６Ｂ−１１】図６Ｂ−１０の続き。
【図６Ｂ−１２】図６Ｂ−１１の続き。
【図６Ｂ−１３】図６Ｂ−１２の続き。
【図７Ａ】重鎖を担持するプラスミドＢＣ２５８４ピューロマイシンベータカゼインベクターを示す。
【図７Ｂ−１】重鎖を担持するプラスミドＢＣ２５８４ピューロマイシンベータカゼインベクターの核酸配列（配列番号７）を示す。
【図７Ｂ−２】図７Ｂ−１の続き。
【図７Ｂ−３】図７Ｂ−２の続き。
【図７Ｂ−４】図７Ｂ−３の続き。
【図７Ｂ−５】図７Ｂ−４の続き。
【図７Ｂ−６】図７Ｂ−５の続き。
【図７Ｂ−７】図７Ｂ−６の続き。
【図７Ｂ−８】図７Ｂ−７の続き。
【図７Ｂ−９】図７Ｂ−８の続き。
【図７Ｂ−１０】図７Ｂ−９の続き。
【図７Ｂ−１１】図７Ｂ−１０の続き。
【図７Ｂ−１２】図７Ｂ−１１の続き。
【図８】２匹のマウス系統（＃１５および＃２７）の乳汁中でのセツキシマブの発現のレベルを有するウエスタンブロットを示す。
【図９】乳汁産生セツキシマブおよび市販セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））中のα−１，３−ｇａｌのレベルを検出するために使用されたウエスタンブロットを示す。
【図１０】ヤギ＃１および＃２の乳汁中に産生されたセツキシマブのウエスタンブロットを示す。
【図１１】ヤギの乳汁中に産生されたセツキシマブの精製を示す。
【図１２】ヤギにおいて産生されたセツキシマブ（レーン２、ヤギ＃１、およびレーン３、ヤギ＃２）、および市販品Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）に対する抗α−１，３ガラクトースモノクローナル抗体染色を示すウエスタンブロットである。
【図１３】精製Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、ヤギ＃１の乳汁中に産生された精製セツキシマブ、およびヤギ＃２の乳汁中に産生された精製セツキシマブの質量スペクトル（ＬＣ／ＭＳ）である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）は、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の細胞外ドメインに結合するヒト／マウスキメラ組換え抗体であり、癌を治療するために診療所で使用される。Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）の構造の研究により、重鎖のフレームワーク３領域中に存在する１つのＮ結合グリコシル化部位がガラクトース−α−１，３−ガラクトース（本明細書において、「ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ」または「α−１，３−ｇａｌ」とも称される）により占有されることが示されている：Ｊｕｎ  Ｑｉａｎ，ｅｔ  ａｌ．：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｏｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｈｙｂｒｉｄ  ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６４（２００７）８−１８）を参照。このｇａｌ−α−１，３−ｇａｌの存在は、市販Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）が、ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌをＮ結合グリコシル化部位上に付加することが公知のマウス骨髄腫細胞において産生されるという事実に起因すると考えられる。
【００２９】
このｇａｌ−α−１，３−ｇａｌグリコシル化は、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）により治療される一部の患者においてアレルギー応答を生じさせることが示されている（Ｃｈｕｎｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ  ａｎｄ  ＩｇＥ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｇａｌａｃｔｏｓｅ−ａｌｐｈａ−１，３−ｇａｌａｃｔｏｓｅ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ（２００８）；３５８：１１０９−１７）。これらの患者は、抗体による治療時に過敏反応を生じさせるｇａｌ−α−１，３−ｇａｌに対する既存のＩｇＥ抗体を有することが示された。
【００３０】
さらに、ガラクトース−α−１，３−ガラクトースは、他の状況においてアレルギー応答を引き起こすことが示されている。例えば、ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌは赤肉上に存在し、赤肉の摂取後にアレルギー反応（例えば、アナフィラキシー）が認められる者は、ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌに特異的なＩｇＥ抗体を有することが見出された（Ｃｏｍｍｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｌａｙｅｄ  ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ，ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ，ｏｒ  ｕｒｔｉｃａｒｉａ  ａｆｔｅｒ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｄ  ｍｅａｔ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＩｇＥ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｇａｌａｃｔｏｓｅ−ａｌｐｈａ−１，３−ｇａｌａｃｔｏｓｅ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９  Ｆｅｂ；１２３（２）：４２６−３３；およびＣｏｍｍｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｔｔｓ−Ｍｉｌｌｓ，Ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ａ  ｎｅｗ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９  Ｏｃｔｏｂｅｒ；１２４（４）：６５２−６５７）。別の例において、別のアレルゲンのネコＩｇＡ上に存在するｇａｌ−α−１，３−ｇａｌは、ヒトにおいてＩｇＥにより結合され得ることが示された（Ｇｒｏｎｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｇａｌａｃｔｏｓｅ−ａｌｐｈａ−１，３−ｇａｌａｃｔｏｓｅ  ｉｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ＩｇＥ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｎ  ｃａｔ  ＩｇＡ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９  Ｍａｙ；１２３（５）：１１８９−９１）。従って、ガラクトース−α−１，３−ガラクトースの存在は、ヒトにおける治療的使用のための抗体および他の糖タンパク質の発生における潜在的な問題を提起する。
【００３１】
組換え抗体の産生は、十分確立された細胞株、例えば、ＮＳｏおよびＳｐ２／０を使用して細胞培養物中で実施されることが多い。これらの細胞株は、ガラクトースを組換え抗体にα−（１−３）結合で付加してｇａｌ−α−１，３−ｇａｌを形成することが示されている（Ｃｈｕｎｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ  ａｎｄ  ＩｇＥ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｇａｌａｃｔｏｓｅ−ａｌｐｈａ−１，３−ｇａｌａｃｔｏｓｅ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ（２００８）；３５８：１１０９−１７）。ヒトおよび高等霊長類において、α−（１−３）結合のガラクトースの付加を介してｇａｌ−α−１，３−ｇａｌを産生する遺伝子（α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ）は非機能的であり、従って、ヒトおよび高等霊長類は、一般に、ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌを産生しない。結果として、ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ陰性動物、例えば、ヒトは、ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌを「非自己」として認識する潜在性を有し、このオリゴ糖に特異的なＩｇＥおよびＩｇＧ抗体を生成し得て、潜在的に、上記のアレルギー反応を生じさせる。従って、ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ部分を欠く組換え治療抗体を作製する方法が必要とされる。
【００３２】
トランスジェニック技術を介して動物ゲノムを改変する技能は、改変グリコシル化パターンを有する組換え抗体の製造の代替法を提供する。トランスジェニック家畜の乳汁中でのヒト組換え医薬の産生は、微生物バイオリアクター（例えば、適切な翻訳後修飾の欠落、不適切なタンパク質フォールディング、高い精製コスト）または動物細胞バイオリアクター（例えば、高い資本コスト、高価な培養培地、低い収量）に伴う問題の多くを解決する。
【００３３】
驚くべきことに、本明細書に開示のとおり、乳房上皮細胞におけるセツキシマブの重鎖および軽鎖の発現を介してマウスおよびヤギの乳汁中に産生されたセツキシマブが、検出可能なｇａｌ−α−１，３−ｇａｌを有さないことが見出された（ＬＣ／ＭＳおよびウエスタンブロット分析により測定して）。このことは、少なくとも、マウス骨髄腫細胞において産生された市販セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））がｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ部分を含むため、驚くべきことである。さらに、ヤギ血清タンパク質も、ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ部分を示す。
【００３４】
従って、本開示の態様は、改変グリコシル化パターン、具体的には、細胞培養物中で産生されるグリコシル化抗体と比較して少ないｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ部分を有するグリコシル化抗体または抗体の集団に関する。一部の実施形態において、抗体は、セツキシマブである。本開示の他の態様は、細胞培養物中で産生されるグリコシル化抗体よりも少ないｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ部分を含むグリコシル化抗体または抗体の集団を産生させる方法を提供する。本開示のさらに別の態様は、改変グリコシル化パターン、具体的には、細胞培養物中で産生されるグリコシル化抗体と比較して少ないｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ部分を有する抗体の集団を産生し得る哺乳動物の乳房上皮細胞またはトランスジェニック動物に関する。一部の実施形態において、本明細書に提供されるグリコシル化抗体は、いかなる検出可能なレベルのｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ部分も有さない。
【００３５】
抗体およびその抗原結合断片
本明細書において使用される用語「抗体」は、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質を称し得る。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＨＣＶＲまたはＶＨと略記）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＬＣＶＲまたはＶＬと略記）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存されている領域が散在している相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに下位分類することができる。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端から配置されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。一部の実施形態において、抗原は、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の細胞外ドメインである。抗体の定常領域は、宿主組織または因子、例として、種々の免疫系の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。成熟機能抗体分子の形成は、２つのタンパク質が化学量論的量で発現され、適正な構成で自己集合する場合に達成することができる。
【００３６】
用語「抗体」は、その抗原結合断片を包含することも意味する。抗体および抗原結合断片を作製する方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｌｅｗｉｎ，“Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ”，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９０）、およびＲｏｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｇｏｗｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、国際公開第２００６／０４０１５３号、国際公開第２００６／１２２７８６号、および国際公開第２００３／００２６０９号参照）。本明細書において使用される抗体の「抗原結合断片」は、抗原、例えば、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の部分を称する。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片により実行され得ることが示されている。抗体の「抗原結合断片」という用語内に包含される結合断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により結合している２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；および（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片、ＶＬおよびＶＨの２つのドメインは別個の遺伝子によりコードされるが、組換え法を使用し、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価分子を形成する単一タンパク質鎖としてそれらを作製することを可能とする合成リンカーによりそれらを連結させることができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３参照）。このような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含されるものとする。これらの抗体断片は、従来の手順、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｊ．Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ９８−１１８（Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８３）に記載のタンパク質分解断片化手順を使用し、および当業者に公知の他の技術により得られる。断片は、インタクト抗体と同一の様式で有用性についてスクリーニングされる。
【００３７】
一部の実施形態において、抗体は、アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＤのものである。さらなる実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、ＩｇＥからなる群から選択され、またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤもしくはＩｇＥの免疫グロブリン定常および／もしくは可変ドメインを有する。他の実施形態において、抗体は、二重特異的または多重特異的抗体である。代替的な実施形態によれば、本開示の抗体は、二重特異的抗体、または多重特異的抗体の形態になるように改変することができる。用語「二重特異的抗体」は、（ａ）細胞表面抗原および（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体に結合し、またはそれらと相互作用する、２つの異なる結合特異性を有する任意の作用物質、例えば、タンパク質、ペプチド、またはタンパク質もしくはペプチド複合体を含むものとする。用語「多重特異的抗体」は、（ａ）細胞表面抗原、（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体、および（ｃ）少なくとも１つの他の構成成分に結合し、またはそれらと相互作用する、３つ以上の異なる結合特異性を有する任意の作用物質、例えば、タンパク質、ペプチド、またはタンパク質もしくはペプチド複合体を含むものとする。従って、本開示は、限定されるものではないが、細胞表面抗原に、およびエフェクター細胞上のＦｃ受容体に指向される二重特異的抗体、三重特異的抗体、四重特異的抗体、および他の多重特異的抗体を含む。用語「二重特異的抗体」は、ダイアボディをさらに含む。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上で発現されるが、短すぎて同一鎖上でのそれら２つのドメイン間の対合を可能としないリンカーを使用し、それにより、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと強制的に対合させ、２つの抗原結合部位を創成する二価二重特異的抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｉｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３参照）。
【００３８】
用語「抗体」は、様々なタイプの抗体、例えば、組換え抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体もしくはキメラ抗体、またはそれらの混合物も包含する。
【００３９】
一部の実施形態において、抗体は、組換え抗体である。本明細書において使用される用語「組換え抗体」は、組換え手段により調製、発現、創成または単離される抗体、例えば、別種の免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物から単離される抗体、宿主細胞中にトランスフェクトされる組換え発現ベクターを使用して発現される抗体、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離される抗体、または免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により調製、発現、創成もしくは単離される抗体を含むものとする。
【００４０】
さらに他の実施形態において、抗体は、キメラまたはヒト化抗体であり得る。本明細書において使用される用語「キメラ抗体」は、非ヒト（例えば、マウス、ラット、ウサギ）抗体の一部とヒト抗体の一部とを組み合わせる抗体を称する。本明細書において使用される用語「ヒト化抗体」は、ヒトフレームワーク領域を伴い、親抗体からの抗原結合ＣＤＲのみを保持する抗体を称する（Ｗａｌｄｍａｎｎ，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１６５７参照）。ネズミ抗体の結合特異性を保持するこのようなキメラまたはヒト化抗体は、本開示による診断、予防または治療用途のためにインビボで投与した場合に低減した免疫原生を有することが予測される。一部の実施形態において、抗体は、セツキシマブである。
【００４１】
ある実施形態において、抗体は、ヒト抗体である。本明細書において使用される用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する抗体を含むものとする。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロでランダムもしくは部位特異的突然変異誘発により、またはインビボで体細胞突然変異により導入される突然変異）。しかしながら、本明細書において使用される用語「ヒト抗体」は、別の哺乳動物種、例えば、マウスの生殖系列(germline)に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体（本明細書において「ヒト化抗体」と称される）を含まないものとする。ヒト抗体は、マウス免疫系ではなくヒト免疫系の一部を担持するトランスジェニックマウスを使用して作製される。完全ヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の大部分についてトランスジェニックであるマウスを免疫化することにより調製することもできる。例えば、内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５９１，６６９号明細書、米国特許第５，５９８，３６９号明細書、米国特許第５，５４５，８０６号明細書、米国特許第５，５４５，８０７号明細書、米国特許第６，１５０，５８４号明細書、およびそれらに引用されている参照文献参照。これらの動物は、内因性（例えば、ネズミ）抗体の産生が機能的に欠失するように遺伝子操作されている。動物は、それらの動物の免疫化が目的抗原に対する完全ヒト抗体の産生をもたらすようにヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有するようにさらに改変される。これらのマウス（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ）、ＨｕＭＡｂマウス（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＧｅｎＰｈａｒｍ））の免疫化後、モノクローナル抗体を標準的なハイブリドーマ技術に従って調製する。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有し、従って、ヒトに投与した場合にヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を誘発しない。ヒト抗体は、本明細書に提供される抗体のいずれかと同様に、モノクローナル抗体であり得る。
【００４２】
一部の実施形態において、抗体は、完全長抗体である。一部の実施形態において、完全長抗体は、重鎖および軽鎖を含む。一部の実施形態において、重鎖は、配列番号１を含み、軽鎖は、配列番号２を含む。一部の実施形態において、重鎖は、配列番号１からなり、軽鎖は、配列番号２からなる。一部の実施形態において、抗体は、セツキシマブである。
【００４３】
一部の実施形態において、抗体は、グリコシル化抗体である。グリコシル化抗体は、本明細書により詳細に記載される。一部の実施形態において、グリコシル化抗体は、配列番号１を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、グリコシル化抗体は、配列番号１からなる重鎖および配列番号２からなる軽鎖を含む。一部の実施形態において、グリコシル化抗体は、非乳房細胞培養物中で産生されるグリコシル化抗体よりも少ないガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分を有する。一部の実施形態において、より少ないガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分は、グリコシル化抗体の重鎖の可変領域中に局在する。一実施形態において、より少ないガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分は、配列番号１に示される重鎖の１０７位に局在する（図１に強調）。
【００４４】
グリコシル化
グリコシル化は、治療糖タンパク質の正確なフォールディング、標的化、生物活性およびクリアランスに重要である。グリコシル化は、天然状態の種々の最終タンパク質形態を産生し得る翻訳後修飾である。グリコシル化パターンは、様々な動物間、例えば、マウスとヒトとの間で異なる。炭水化物構造のある改変も、抗体機能、耐性(tolerance)、または治療有効性に影響し得る。例えば、上記のとおり、ある糖部分、例えば、ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌは、ヒトにおいてアレルギー反応を引き起こし得る。
【００４５】
ヒトおよび高等霊長類だけでなく、多くの動物はα−１，３−ｇａｌをＮ結合糖上に取り込む。例えば、治療タンパク質の産生に使用されるＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞株は、低レベルのα−１，３−ｇａｌを同一部位上に付加する。さらに、治療抗体セツキシマブの産生に使用されるマウス骨髄腫細胞株も、α−１，３−ｇａｌ部分を取り込む。
【００４６】
驚くべきことに、本明細書に開示のとおり、トランスジェニックマウスおよびヤギの両方の乳腺中で産生された組換えセツキシマブは、検出可能なｇａｌ−α−１，３−ｇａｌを有さなかった。さらに上記のとおり、この結果は、少なくとも、マウス骨髄腫細胞において産生されたセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））がｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ糖を含有することが公知であるため、驚くべきことである（Ｊｕｎ  Ｑｉａｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｏｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｈｙｂｒｉｄ  ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６４（２００７）８−１８）。
【００４７】
従って、一部の態様において、本開示は、改変グリコシル化パターンを有するグリコシル化抗体またはグリコシル化抗体の集団を提供する。一部の実施形態において、本開示は、細胞培養物中で産生されるグリコシル化抗体またはグリコシル化抗体の集団よりも少ないｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ部分を含むグリコシル化抗体またはグリコシル化抗体の集団を提供する。一部の実施形態において、より高レベルのｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ部分の産生をもたらす細胞培養物は、非乳房細胞培養物である。本明細書に記載の「非乳房細胞培養物」は、使用される細胞が乳房組織起源のものでない細胞培養系(cell culture system)を意味する。一部の実施形態において、非乳房細胞培養物は、哺乳動物の細胞培養物である。一部の実施形態において、非乳房細胞培養物は、マウス細胞培養物である。一部の実施形態において、非乳房細胞培養物は、マウス骨髄腫細胞培養物である。
【００４８】
一部の実施形態において、本開示は、ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ部分を欠くグリコシル化抗体またはグリコシル化抗体の集団を提供する。本明細書において使用される「ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ部分を欠くグリコシル化抗体またはグリコシル化抗体の集団」は、全抗体内にｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ部分を含有しない抗体もしくは抗体の集団、または抗体内の規定位置に検出可能なｇａｌ−α−１，３−ｇａｌを有さない抗体のいずれかを説明する。ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌを検出する方法は当分野において周知であり、本明細書にも記載される。一部の実施形態において、本開示のグリコシル化抗体またはグリコシル化抗体の集団は、配列番号１を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、本明細書に開示のグリコシル化抗体またはグリコシル化抗体の集団は、セツキシマブ抗体である。
【００４９】
他の態様において、本開示は、改変グリコシル化パターンを有するグリコシル化抗体を作製する方法を提供する。一部の実施形態において、本開示は、細胞培養物中で産生されるグリコシル化抗体よりも少ないｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ部分を含むグリコシル化抗体を作製する方法を提供する。一部の実施形態において、より少ないガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分は、グリコシル化抗体の重鎖の可変領域中に局在する。一実施形態において、より少ないガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分は、配列番号１のアミノ酸１０７位に局在する。一部の実施形態において、細胞培養物は、非乳房細胞培養物である。一部の実施形態において、非乳房細胞培養物は、哺乳動物の細胞培養物である。一部の実施形態において、非乳房細胞培養物は、マウス細胞培養物である。一部の実施形態において、非乳房細胞培養物は、マウス骨髄腫細胞培養物である。一部の実施形態において、本開示は、ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ部分を欠くグリコシル化抗体を作製する方法を提供する。一部の実施形態において、上記の方法は、配列番号１を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含むグリコシル化抗体を産生させる工程を含む。一部の実施形態において、上記の方法は、セツキシマブの産生を含む。
【００５０】
一部の実施形態において、グリコシル化抗体またはグリコシル化抗体の集団は、細胞培養物、例えば、非乳房細胞培養物中で産生されるグリコシル化抗体またはグリコシル化抗体の集団よりも少ないｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ部分を含む。一部の実施形態において、グリコシル化抗体またはグリコシル化抗体の集団は、細胞培養物、例えば、非乳房細胞培養物中で産生されるグリコシル化抗体またはグリコシル化抗体の集団よりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％少ないｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ部分を含む。グリコシル化パターン、例えば、ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ部分の数は、当分野において公知の多くの方法、例えば、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ／ＭＳ）またはタンデム質量分析により測定することができる。例えば、炭水化物上のタンパク質を分析する方法は、米国特許出願第２００６／００５７６３８号明細書および米国特許出願第２００６／０１２７９５０号明細書に記載されている。タンパク質上の炭水化物を分析する方法は、参照により本明細書に組み込まれる。従って、抗体または抗体の集団中のｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ部分の量を計測し、別の抗体または抗体の集団と比較することができ、一方の集団中のｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ部分が他方の集団に対して少ないか否かを決定する。
【００５１】
別の態様において、本開示は、グリコシル化抗体またはグリコシル化抗体の集団の組成物を提供する。一態様において、本開示は、グリコシル化抗体の集団を含む組成物において、グリコシル化抗体が
（ａ）配列番号１を含む重鎖；
（ｂ）配列番号２を含む軽鎖；
を含み、
抗体の集団が、非乳房細胞培養物中で産生されるグリコシル化抗体の集団よりも少ないガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分を有する組成物を提供する。
【００５２】
別の態様において、本開示は、モノクローナル抗体を含む組成物において、モノクローナル抗体が、
（ａ）配列番号１を含む重鎖；
（ｂ）配列番号２を含む軽鎖；
を含み、
トランスジェニックヤギの乳腺中で産生される組成物を提供する。
【００５３】
さらに別の態様において、本開示は、モノクローナル抗体を含む組成物において、モノクローナル抗体が、
（ａ）配列番号１を含む重鎖；
（ｂ）配列番号２を含む軽鎖；
を含み、
モノクローナル抗体が、ガラクトース−α−１，３−ガラクトースを欠く組成物を提供する。
【００５４】
上記の抗体または抗体の集団の組成物は、本明細書に記載の任意のさらなる限定を有し得る。例えば、一部の実施形態において、組成物は、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、ヤギの乳腺中で産生される。一部の実施形態において、組成物は、乳汁をさらに含む。他の実施形態において、組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。一部の実施形態において、抗体または抗体の集団は、細胞培養物、例えば、非乳房細胞培養物中で産生されるグリコシル化抗体よりも少ないｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ部分を含む。他の実施形態において、抗体または抗体の集団は、ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ部分を欠く。
【００５５】
哺乳動物の乳腺上皮細胞およびトランスジェニック動物
一態様において、本開示は、グリコシル化抗体を産生する哺乳動物の乳房上皮細胞に関する。本明細書において、哺乳動物の乳房上皮細胞においてグリコシル化抗体を産生させる方法が提供される。
【００５６】
一部の実施形態において、産生は、細胞培養物中での産生により達成する（すなわち、インビトロまたはエクスビボ）。乳房組織起源の細胞の例としては、限定されるものではないが、乳腺上皮細胞、乳房上皮細胞、乳癌細胞（例えば、乳房癌腫細胞）が挙げられる。乳房組織起源の細胞は、初代細胞、不死化細胞、または形質転換細胞であり得る。
【００５７】
一部の実施形態において、産生は、トランスジェニック動物における産生により達成する（すなわち、インビボ）。一部の実施形態において、哺乳動物の乳腺上皮細胞は、トランスジェニック動物中に存在する。一部の実施形態において、哺乳動物の乳腺上皮細胞は、トランスジェニック動物、例えば、マウスまたはヤギの乳汁中に組換え抗体を発現するように操作されている。このことを達成するため、組換えタンパク質をコードする遺伝子の発現は、例えば、ヤギβ−カゼイン調節エレメントの制御下であり得る。マウスおよびヤギ乳汁の両方における組換えタンパク質、例えば、抗体の発現は、既に確立されている（例えば、米国特許出願公開第２００８−０１１８５０１号明細書参照）。一部の実施形態において、発現は、乳汁タンパク質を産生する個々の乳管上皮細胞について最適化される。
【００５８】
組換え抗体を産生し得るトランスジェニック動物は、当技術分野において公知の方法に従って作製することができる（例えば、米国特許第５，９４５，５７７号明細書および米国特許出願公開第２００８−０１１８５０１号明細書参照）。トランスジェニック発現に好適な動物としては、限定されるものではないが、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、バッファロー、ウマ、ラット、マウスまたはラマが挙げられる。好適な動物としては、ウシ属、ヤギ属、ヒツジ属およびイノシシ属も挙げられ、それらはそれぞれウシ、ヤギ、ヒツジおよびブタ（または畜豚）の種々の種に関する。好適な動物としては、有蹄動物も挙げられる。本明細書において使用される「有蹄動物」は、有蹄の典型的には草食の四肢哺乳動物、例として、限定されるものではないが、ヒツジ、畜豚、ヤギ、畜牛およびウマのものまたはそれらに関する。好適な動物としては、乳畜、例えば、ヤギおよび畜牛、またはマウスも挙げられる。一部の実施形態において、トランスジェニック発現に好適な動物はヤギである。
【００５９】
一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、目的構築物(construct)を含む初代細胞の作製とそれに続く除核卵母細胞中への初代細胞核の核移植により作製する。目的構築物を含む初代細胞は、初代細胞に目的抗体、例えば、セツキシマブの重鎖および軽鎖のコード配列を含む単一構築物を注射もしくはトランスフェクトすることにより、または初代細胞に抗体、例えば、セツキシマブの重鎖および軽鎖のコード配列を含む別個の構築物を同時トランスフェクションもしくは同時注入することにより作製する。次いで、これらの細胞を増殖させ、特徴付けして、導入遺伝子コピー数、導入遺伝子構造統合性(transgene structural integrity)および染色体組込み部位(chromosomal integration site)を評価する。次いで、所望の導入遺伝子コピー数、導入遺伝子構造統合性および染色体組込み部位を有する細胞を核移植に使用してトランスジェニック動物を作製する。本明細書において使用される「核移植」は、ドナー細胞からの核を除核卵母細胞中に移植する、クローニングの方法を称する。
【００６０】
哺乳動物の乳房上皮細胞において発現させるべき対象の抗体のコード配列は、配列データベース、例えば、ＮＣＢＩ、Ｇｅｎｂａｎｋからの選択動物（例えば、ヒト、畜牛またはマウス）に由来するゲノム材料もしくは逆翻訳メッセンジャーＲＮＡのライブラリーをスクリーニングすることにより、または当技術分野において公知の方法、例えば、ペプチドマッピングを使用して抗体の配列を得ることにより得ることができる。配列は、適切なプラスミドベクター中にクローニングし、好適な宿主生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で増幅させることができる。本明細書において使用される「ベクター」は、異なる遺伝子環境間の輸送のためまたは宿主細胞での発現のために制限およびライゲーションによってその中に所望の配列が挿入され得る多数の核酸のいずれであってもよい。ベクターは、典型的には、ＤＮＡから構成されるが、ＲＮＡベクターも利用可能である。ベクターとしては、限定されるものではないが、プラスミドおよびファージミドが挙げられる。クローニングベクターは、宿主細胞中で複製することができ、および１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位をさらに特徴とするものであり、そのエンドヌクレアーゼ制限部位でベクターを特定可能な様式で切断することができ、かつ新たな組換えベクターが宿主細胞中で複製する能力を保持するようにその部位に所望のＤＮＡ配列をライゲーションさせることができる。発現ベクターは、その中に、所望のＤＮＡ配列が、それが調節配列に作動可能に連結するように制限およびライゲーションにより挿入され、さらにそこでＲＮＡ転写物として発現され得るものである。ベクターは、ベクターにより形質転換またはトランスフェクトされ、またはされなかった細胞の同定における使用に好適な１つ以上のマーカー配列をさらに含有し得る。マーカーとしては、例えば、抗生物質または他の化合物に対する耐性または感受性のいずれかを増加または減少させるタンパク質をコードする遺伝子、活性が当技術分野において公知の標準的アッセイにより検出可能である酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）をコードする遺伝子、および形質転換またはトランスフェクトされる細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型に可視的に影響する遺伝子が挙げられる。
【００６１】
抗体または目的抗体の重鎖および軽鎖のコード配列は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳汁中でのコード配列の発現を可能とする制御配列に作動可能に結合させることができる。ベクターの増幅後、ＤＮＡ構築物を制限酵素で消化し、ベクターの残部から精製し、さらに受精胚に導入して、トランスジェニック動物を作製することができる。トランスジェニック動物は、そのゲノム中に組み込まれた所望のトランスジェニックタンパク質を有する。
【００６２】
産生をトランスジェニック動物の乳汁に方向付ける好適なＤＮＡ配列は、天然由来の乳汁タンパク質に由来する５’−プロモーター領域を担持し得る。このプロモーターは、結果的に、ホルモンおよび組織特異的因子の制御下であり、泌乳する乳房組織中で最も活性である。一部の実施形態において、使用されるプロモーターは、乳汁特異的プロモーターである。本明細書において使用される「乳汁特異的プロモーター」は、タンパク質を乳汁中に分泌する細胞（例えば、乳房上皮細胞）での遺伝子の発現を自然に導くプロモーターであり、例えば、カゼインプロモーター、例えば、α−カゼインプロモーター（例えば、α−Ｓ−１カゼインプロモーターおよびα−Ｓ２−カゼインプロモーター）、β−カゼインプロモーター（例えば、ヤギベータカゼイン遺伝子プロモーター（ＤｉＴｕｌｌｉｏ，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  １０：７４−７７，１９９２）、γ−カゼインプロモーター、κ−カゼインプロモーター、乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）プロモーター（Ｇｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ５：１１８３−１１８７，１９８７）、β−ラクトグロブリンプロモーター（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ７：４８７−４９２，１９８９）およびα−ラクトアルブミンプロモーター（Ｓｏｕｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  ＬＥＴＴＳ．２９７：１３，１９９２）が挙げられる。乳房組織中で特異的に活性化されるプロモーター、例えば、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーターなどもこの定義に含まれる。一部の実施形態において、プロモーターは、ヤギ属ベータカゼインプロモーターである。
【００６３】
乳房上皮全体に亘りトランスジェニックタンパク質の分泌を乳汁中に向けるタンパク質リーダー配列の産生を導くＤＮＡ配列に、プロモーターを作動可能に結合させてもよい。本明細書において使用されるコード配列および調節配列（例えば、プロモーター）は、それらがコード配列の発現または転写を調節配列の影響または制御下に置くように結合している場合、「作動可能に連結している」または「作動可能に結合している」ことになる。本明細書において使用される「リーダー配列」または「シグナル配列」は、タンパク質分泌シグナルをコードする核酸配列であり、トランスジェニックタンパク質をコードする下流の核酸分子に作動可能に結合したときに分泌を導く。リーダー配列は、天然ヒトリーダー配列であっても人工由来リーダーであってもよく、あるいは導入遺伝子コード配列の転写を導くために使用されるプロモーターと同一の遺伝子から得たものであっても、または、例えば哺乳動物の乳房上皮細胞のような細胞から普通に分泌される別のタンパク質から得たものであってもよい。一部の実施形態において、３’−配列を付加してｍＲＮＡの安定性を改善することができ、その３’−配列は天然に分泌される乳汁タンパク質に由来するものであってよい。
【００６４】
一部の実施形態において、核移植によるトランスジェニックヤギの作製において使用される構築物（例えば、セツキシマブ抗体をコードする）を含有する初代細胞株を作製するため、重鎖および軽鎖構築物を初代ヤギ皮膚上皮細胞中にトランスフェクトすることができ、その細胞を拡大させ、さらに完全に特徴付けして、導入遺伝子コピー数、導入遺伝子構造統合性および染色体組込み部位を評価する。本明細書において使用される「核移植」は、ドナー細胞からの核を除核卵母細胞中に移植するクローニングの方法を称する。
【００６５】
クローニングは、目的の抗体または他の遺伝子構築物をそれぞれ産生し得るトランスジェニック動物の多重性をもたらす。産生方法は、クローン動物およびその動物の子孫の使用を含む。クローニングは、胎児の核移植、核移植、組織および臓器移植、ならびにキメラ子孫の創成も包含する。クローニングプロセスの１つの工程は、目的導入遺伝子を含有する細胞、例えば、初代細胞のゲノムを除核卵母細胞中に移行させる工程を含む。本明細書において使用される「導入遺伝子(transgene)」は、細胞、またはその祖先中に人工的に挿入され、その細胞から発生する動物のゲノムの一部になる任意の核酸分子片を称する。このような導入遺伝子は、トランスジェニック動物に対して部分的もしくは全体的に外因性（すなわち、外来）である遺伝子を含んでいてよく、またはその動物の内因性遺伝子に対して同一性を有する遺伝子であってもよい。卵母細胞の好適な哺乳動物供給源としては、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウサギ、モルモット、マウス、ハムスター、ラット、非ヒト霊長類などが挙げられる。好ましくは、卵母細胞は、有蹄動物、最も好ましくは、ヤギまたは畜牛から得る。卵母細胞を単離する方法は、当技術分野において周知である。本質的には、このプロセスは、哺乳動物、例えば、ヤギの卵巣または生殖器官から卵母細胞を単離する工程を含む。有蹄動物卵母細胞の容易に利用可能な供給源は、ホルモン誘導される雌性動物からのものである。遺伝子操作、核移植およびクローニングのような技術の良好な使用のため、卵母細胞を、好ましくは、インビボで成熟させてから、その細胞を核移植のためのレシピエント細胞として使用することができ、それを精細胞により受精させて胚に発達させた。インビボで成熟された第２減数分裂中期の卵母細胞は、核移植技術において良好に使用されている。本質的には、成熟した第２減数分裂中期の卵母細胞は、非過排卵動物または過排卵動物のいずれかから、発情期の発生からまたはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）もしくは類似のホルモンの注射から数時間後に外科的に回収する。
【００６６】
従って、一態様において、本開示は、本開示の抗体または組成物を産生する乳腺上皮細胞を提供する。一部の実施形態において、抗体は、配列番号３を含む核酸および配列番号４を含む核酸を含む。一部の実施形態において、配列番号３を含む核酸および配列番号４を含む核酸は連結している。「連結している(connected)」は、本明細書において、例えば、同一ベクター内で、またはほぼ同一のゲノム位置内で核酸が物理的に結合していることを意味するために使用される。一部の実施形態において、上記の乳房上皮細胞は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物中に存在する。一部の実施形態において、トランスジェニック非ヒト哺乳動物はヤギである。
【００６７】
別の態様において、本開示は、トランスジェニック抗体、ならびにその変異体(variant)および断片を産生する方法において、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳汁中で、核酸構築物によりコードされるトランスジェニック抗体を発現させる工程を含む方法を提供する。一部の実施形態において、本開示の抗体を産生する方法は、
（ａ）非ヒト哺乳動物細胞を、セツキシマブ抗体をコードする導入遺伝子ＤＮＡ構築物でトランスフェクトする工程；
（ｂ）前記セツキシマブ導入遺伝子ＤＮＡ構築物がゲノム中に挿入された細胞を選択する工程；および
（ｃ）第１の核移植手順を実施して、セツキシマブ抗体に関してヘテロ接合体でありかつそれを乳汁中で発現し得る非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作製する工程
を含む。
【００６８】
一部の実施形態において、導入遺伝子ＤＮＡ構築物は、配列番号３および／または配列番号４を含む。一部の実施形態において、非ヒトトランスジェニック哺乳動物はヤギである。
【００６９】
別の態様において、本開示は、
（ａ）セツキシマブ抗体を発現するように操作された非ヒトトランスジェニック哺乳動物を提供する工程、
（ｂ）非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁中でセツキシマブ抗体を発現させる工程；および
（ｃ）乳汁中で発現されたセツキシマブ抗体を単離する工程
の方法を提供する。
【００７０】
一部の実施形態において、セツキシマブ抗体は、配列番号１を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含む。乳腺中で発現された組換えタンパク質の量および質を予測するために使用されるツールの１つは、泌乳の誘導を介する（Ｅｂｅｒｔ  ＫＭ，１９９４）。誘導泌乳は、少なくとも１年後である妊娠から生じる最初の天然泌乳からではなく、トランスジェニック産生の初期からのタンパク質の発現および分析を可能とする。泌乳の誘導は、ホルモンにより、または手作業により行うことができる。
【００７１】
一部の実施形態において、本明細書に提供されるグリコシル化抗体の組成物は、乳汁をさらに含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される方法は、トランスジェニック動物の乳汁から抗体の集団を単離する工程を含む。トランスジェニック動物の乳汁から抗体を単離する方法は、当分野において公知であり、例えば、Ｐｏｌｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２３１，Ｉｓｓｕｅｓ  １−２，１０  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９９９，Ｐａｇｅｓ  １４７−１５７に記載されている。一部の実施形態において、本明細書に提供される方法は、所望量のｇａｌ−α−１，３−ｇａｌを有するグリコシル化抗体を精製する工程を含む。
【００７２】
医薬組成物、投与量、および投与
一態様において、本開示は、ある量の目的抗体または薬学的に許容可能な前記抗体の塩、および薬学的に許容可能なビヒクル、希釈剤または担体を含む医薬組成物を提供する。
【００７３】
別の態様において、本開示は、対象が有しまたは有するリスクのある疾患を治療するのに有効な量で提供される組成物を対象に投与する工程を含む、対象を治療する方法を提供する。一実施形態において、対象はヒトである。別の実施形態において、対象は、非ヒト動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギまたは霊長類である。一部の実施形態において、疾患は癌である。一部の実施形態において、癌は、ＥＧＦＲを発現する癌細胞を含む。一部の実施形態において、癌は、野生型ＫＲＡＳ遺伝子を有する細胞を含む。一部の実施形態において、癌は頭頸部癌である。一部の実施形態において、頭頸部癌は扁平上皮細胞癌である。一部の実施形態において、癌は結腸直腸癌である。一部の実施形態において、結腸直腸癌は転移性結腸直腸癌である。
【００７４】
一部の方法は、公知の癌医薬品または治療法、例えば、化学療法剤、免疫療法剤、癌ワクチン、ホルモン療法、生体応答調節剤、外科手術、または放射線療法との組合せ療法を考慮する。本開示の抗体または組成物の投与および別の医薬品または療法の施行は、同時にまたは非同時に行うことができることを理解すべきである。一実施形態において、組合せ療法は、本明細書に提供される抗体および組成物を放射線療法と組み合わせて投与する工程を含む。
【００７５】
別の実施形態において、対象に、追加の癌医薬品をさらに投与する。一実施形態において、追加の癌医薬品は、化学療法剤である。一部の実施形態において、化学療法剤は、フルオロウラシル（５−フルオロウラシルまたは５−ＦＵとも称される）である。一部の実施形態において、化学療法剤は、イリノテカンである。一部の実施形態において、組合せ療法は、
（ａ）本開示の抗体または医薬組成物（例えば、セツキシマブ）；
（ｂ）ロイコボリンカルシウム；
（ｃ）フルオロウラシル；および
（ｄ）イリノテカン塩酸塩
を含む。
（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）の組合せは、当分野においてＦＯＬＦＩＲＩと称される。従って、一部の実施形態において、治療方法は、本開示の抗体または医薬組成物およびＦＯＬＦＩＲＩを投与する工程を含む。
【００７６】
治療が必要とされる対象に治療有効量の本明細書に提供される抗体を投与する工程を含む実施形態によれば、「治療有効」または「治療するために有効な量」は、病状を阻害し、または反転させるため（例えば、癌増殖の低減または阻害）に必要とされる抗体または組成物の量を示す。治療有効量の決定は、具体的には、医薬品の毒性および効力のような因子に依存する。これらの因子は、他の因子、例えば、効能、相対的バイオアベイラビリティ、患者の体重、副作用の重症度および好ましい投与方式に応じて異なる。毒性は、当技術分野において周知の方法を使用して測定することができる。効力は、同一の指針を利用して測定することができる。効力は、例えば、標的組織、例えば腫瘍の質量の減少により計測することができる。従って、薬学的有効量は、毒性学的に耐性であり、さらには有効であると臨床医により判断される量である。
【００７７】
投与量は、投与方式に応じて局所または全身の所望の薬物レベルを達成するように適切に調整することができる。このような用量において対象における応答が不十分な事象において、さらに高い用量（または異なるより局所的な送達経路により有効なより高い用量）を患者耐性が許容する程度で用いることができる。１日当たりの複数回投与が、抗体の適切な全身レベルを達成するために考慮される。適切な全身レベルは、例えば、薬物の患者のピークまたは持続血漿レベルの計測により特定することができる。「用量」および「投与量」は、本明細書において互換的に使用される。
【００７８】
一部の実施形態において、対象に投与される抗体または医薬組成物の量は、１週間当たり５０から５００ｍｇ／ｍ２、１００から４００ｍｇ／ｍ２、または２００から３００ｍｇ／ｍ２である。一実施形態において、対象に投与される抗体または医薬組成物の量は、１週間当たり２５０ｍｇ／ｍ２である。一部の実施形態において、４００ｍｇ／ｍ２の初回用量を第１週に対象に投与し、次いで翌週にその対象に２５０ｍｇ／ｍ２を投与する。一部の実施形態において、投与速度は、１０ｍｇ／分未満である。一部の実施形態において、対象への抗体または医薬組成物の投与は、別の治療剤、例えば５−ＦＵまたはＦＯＬＦＩＲＩによる治療の少なくとも１時間前に行う。一部の実施形態において、前治療は、抗体または医薬組成物の投与前に施す。一実施形態において、前治療は、Ｈ１アンタゴニストの投与である。一実施形態において、Ｈ１アンタゴニストはジフェンヒドラミンである。
【００７９】
一部の実施形態において、提供される組成物は、インビボ用途に用いられる。意図されるインビボの投与方式に応じて、使用される組成物は、固体、半固体または液体の剤形、例えば、錠剤、ピル剤、散剤、カプセル剤、ゲル剤、軟膏剤、液剤、懸濁液などであり得る。好ましくは、組成物は、正確な投与量の単回投与に好適な単位剤形で投与する。組成物は、所望される配合物に応じて、動物またはヒト投与のための医薬組成物を配合するために一般に使用される水系ビヒクルとして定義される薬学的に許容可能な担体または希釈剤も含み得る。希釈剤は、目的ヒト組換えタンパク質の生物学的活性に影響しないように選択される。このような希釈剤の例は、蒸留水、生理食塩水、リンガー液、デキストローズ溶液、およびハンクス液である。同一の希釈剤を使用して凍結乾燥された目的組換えタンパク質を再構成することができる。さらに、医薬組成物は、他の薬剤、医薬剤、担体、助剤、非毒性、非治療、非免疫原性安定剤なども含み得る。このような希釈剤または担体の有効量は、構成成分の溶解度、生物学的活性などに関して薬学的に許容可能な配合物を得るために有効な量である。一部の実施形態において、本明細書に提供される組成物は、無菌である。
【００８０】
インビボ治療の間における投与は、経口、非経口、筋肉内、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、眼、膣、および直腸経路を含む、任意数の経路によるものであってよい。嚢内、静脈内、および腹腔内の投与経路を用いることもできる。当業者は、投与経路が治療すべき疾患に応じて変動することを認識する。例えば、本明細書の組成物または抗体は、例えば頭頸部癌または結腸直腸癌のような抗癌治療のために、経口、非経口または局所投与、およびそうでなければ全身形態で、対象に投与することができる。一実施形態において、本明細書の組成物または抗体は、静脈内注入により投与される。
【００８１】
化合物は、それを全身送達することが望まれる場合、注射による、例えばボーラス注射または連続注入による、非経口投与用に配合することができる。注射用の配合物は、単位剤形で、例えば、アンプル中または複数回投与容器(multi-dose containers)中において、保存剤を添加して提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、液剤またはエマルションなどのような形態であってよく、配合剤、例えば、懸濁化剤、可溶化剤および／または分散剤を含有し得る。
【００８２】
非経口投与用の医薬組成物としては、水溶性形態の活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに、活性化合物の懸濁液を、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油、例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリド、またはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有し得る。場合により、懸濁液は、高濃縮溶液の調製を可能とするために好適な安定剤または化合物の溶解度を増加させる薬剤も含有し得る。あるいは、活性化合物は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、滅菌発熱性物質除去蒸留水で構成するための、粉末の形態であり得る。
【００８３】
経口投与用に、医薬組成物は、例えば、薬学的に許容可能な賦形剤、例えば、結合剤（例えば、α−化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を用いて従来の手段により調製される錠剤またはカプセル剤の形態をとり得る。錠剤は、当技術分野において周知の方法によりコーティングすることができる。経口投与用の液体製剤は、例えば、液剤、シロップ剤もしくは懸濁液の形態であってよく、またはそれは水もしくは他の好適なビヒクルを使用前に用いる構成のための乾燥製品として提供することができる。このような液体製剤は、薬学的に許容可能な添加剤、例えば、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用油脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分留植物油）；および保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル−またはソルビン酸）を用いて従来の手段により調製することができる。製剤は適宜、緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤も含有し得る。１つまたは複数の構成成分は、抗体の経口送達が有効になるように化学修飾することができる。一般に、考えられる化学修飾は、（ａ）タンパク質分解の阻害；および（ｂ）胃または腸からの血流中への取り込みを可能とする少なくとも１つの分子の抗体への付着である。抗体の全体的な安定性の増加および体内の循環時間の増加も望まれる。このような分子の例としては、ポリエチレングリコール、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびポリプロリンが挙げられる。Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，１９８１，“Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｄｄｕｃｔｓ”：Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ，Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．３６７−３８３；Ｎｅｗｍａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１８５−１８９。使用することができる他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソランおよびポリ−１，３，６−チオキソカン（ｔｉｏｘｏｃａｎｅ）である。上記の医薬使用にはポリエチレングリコール分子が好ましい。経口用組成物に関して、放出位置は、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸）、または大腸であり得る。当業者は、胃中で溶解しないが、材料を十二指腸または腸中の他の場所で放出する利用可能な配合物を有する。好ましくは、放出は、抗体の保護により、または例えば腸での放出のように胃環境を越えての生物活性材料の放出により、胃環境の有害作用を回避する。
【００８４】
口腔内投与(buccal administration)に関して、組成物は、従来の様式で配合される錠剤またはトローチ剤の形態をとり得る。
【００８５】
吸入投与に関して、本開示により使用される化合物は、好適な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガスを使用する加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾル噴霧による提供の形態で都合よく送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、定量を送達するようにバルブを設置することにより決定され得る。例えば、化合物と、例えばラクトースまたはデンプンのような適切な粉末基剤との混合物を含有する、吸入器または吹付器(insufflator)で使用されるゼラチン等のカプセル剤およびカートリッジを形成することができる。
【００８６】
本明細書において、肺送達も考慮される。組成物は、吸入している間に哺乳動物の肺に送達され、肺上皮内層を超えて血流に浸透する。限定されないが、ネブライザー、定量吸入器、および粉末吸入器等の治療薬の肺送達のために設計された広範囲の機械的装置が、本開示の実施における使用のために考えられ、当業者はその全てに精通している。
【００８７】
本開示の医薬組成物の鼻腔送達も考慮される。鼻腔送達は、肺における治療薬の堆積を必要とせずに、治療薬を鼻腔に投与した直後に、本開示の医薬組成物の血流への通過を可能とする。鼻腔送達用の配合物としては、デキストランまたはシクロデキストランを有するものが挙げられる。
【００８８】
化合物は、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を含有する、坐剤または滞留浣腸剤のような直腸または膣組成物に配合することもできる。
【００８９】
医薬組成物は、好適な固体またはゲル相担体または賦形剤も含み得る。このような担体または賦形剤の例としては、限定されるものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリマー、例えば、ポリエチレングリコールが挙げられる。
【００９０】
好適な液体または固体医薬製剤形は、例えば、吸入用の水溶液もしくは生理食塩水溶液であり、マイクロカプセル化されており、渦巻型化されており(encochleated)、微細金粒子上にコーティングされており、リポソーム中に含有されており、霧状化されており、エアロゾルであり、皮膚中への移植のためのペレットであり、または皮膚を切創可能な鋭利器具上で乾燥している。医薬組成物としては、顆粒剤、散剤、錠剤、コーティング錠、（マイクロ）カプセル剤、坐剤、シロップ剤、エマルション、懸濁液、クリーム剤、点滴剤または活性化合物の持続性放出を備える製剤も挙げられ、この製剤中で、上記のとおり、賦形剤および添加剤および／または助剤、例えば、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、滑沢剤、香味剤、甘味剤または安定剤が習慣的に使用される。医薬組成物は、種々の薬物送達系における使用に好適である。薬物送達に関する方法の簡単な概説については、参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３，１９９０参照。
【００９１】
抗体および場合により他の治療剤は、それ自体で（無希釈で）または薬学的に許容可能な塩の形態で投与することができる。医薬として使用される場合、塩は薬学的に許容可能でなければならないが、薬学的に許容可能でない塩を都合よく使用して薬学的に許容可能なその塩を調製することができる。このような塩としては、限定されるものではないが、以下の酸から調製されるものが挙げられる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸。また、このような塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類塩、例えば、カルボン酸基のナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩として調製することができる。
【００９２】
好適な緩衝剤としては、酢酸および塩（１〜２％ｗ／ｖ）；クエン酸および塩（１〜３％ｗ／ｖ）；ホウ酸および塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）；ならびにリン酸および塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）が挙げられる。好適な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）およびチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）が挙げられる。
【００９３】
本開示の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体中に含まれる有効量の抗体および場合により治療剤を含有する。薬学的に許容可能な担体という用語は、ヒトまたは他の脊椎動物への投与に好適である、１つ以上の適合性の固体または液体増量剤、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。担体という用語は、適用を容易にするために活性成分が組み合わされる天然または合成の有機または無機成分を示す。医薬組成物の構成成分はまた、所望の薬学的有効性を実質的に害する相互作用が存在しないような様式で、本開示の化合物と、および互いに混合され得る。
【００９４】
治療剤、例として、具体的には、限定されるものではないが、抗体は、粒子で提供することができる。本明細書において使用される粒子は、全体または一部において抗体または抗体とともに投与される他の治療剤からなり得るナノまたはマイクロ粒子（または一部の例においてはこれよりも大きい）を含む。粒子は、治療剤に加え、製薬および医学分野において定型的に使用されるそれらの材料のいずれか、例として、限定されるものではないが浸食性、非浸食性、生体分解性、もしくは非生体分解性材料またはそれらの組合せを含み得る。粒子は、抗体を溶液中でまたは半固体状態で含有するマイクロカプセルであり得る。粒子は、実質的に任意の形状であり得る。
【００９５】
作製方法
本開示の一態様は、グリコシル化抗体またはグリコシル化抗体の集団を作製する方法において、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳汁中で、核酸構築物によりコードされるグリコシル化抗体を発現させる工程を含む方法を提供する。一実施形態において、哺乳動物の乳房上皮細胞は、抗体を乳汁中に発現するように操作された非ヒト哺乳動物のものである。さらに別の実施形態において、哺乳動物の乳房上皮細胞は、培養物中の哺乳動物の乳房上皮細胞である。
【００９６】
別の実施形態において、方法は、
（ａ）抗体を発現するように操作された非ヒトトランスジェニック哺乳動物を提供する工程、
（ｂ）非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁中で抗体を発現させる工程；
（ｃ）乳汁中で発現された抗体を単離する工程；および
（ｄ）単離された抗体上のｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ部分の存在を検出する工程
を含む。
【００９７】
さらに別の実施形態において、方法は、産生されるグリコシル化抗体の集団が非乳房細胞培養物中で産生されるグリコシル化抗体の集団よりも少ないガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分を含むように乳腺上皮細胞においてグリコシル化抗体の集団を産生する工程を含み、グリコシル化抗体は、配列番号１を含む重鎖および配列番号２を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、この方法は、インビトロで実施する。他の実施形態において、この方法は、インビボで、例えばトランスジェニックヤギの乳腺中で実施する。
【００９８】
一部の実施形態において、上記の方法は、泌乳を誘導する工程をさらに含む。さらに他の実施形態において、方法は、追加の単離および／または精製工程をさらに含む。さらに他の実施形態において、方法は、得られた抗体のグリコシル化パターンを、細胞培養物、例えば、非乳房細胞培養物中で産生された抗体と比較する工程をさらに含む。さらなる実施形態において、方法は、得られた抗体のグリコシル化パターンと、非乳房上皮細胞により産生された抗体とを比較する工程をさらに含む。このような細胞は、細胞培養物の細胞であり得る。一部の実施形態において、グリコシル化パターンは、ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌパターン、例えば、抗体または抗体の集団上に存在するｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ部分の量である。一部の実施形態において、方法は、グリコシル化抗体の集団中に存在するガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分の数と、細胞培養物、例えば、非乳房細胞培養物中で産生されたグリコシル化抗体の集団中に存在するガラクトース−α−１，３−ガラクトース部分の数とを比較する工程をさらに含む。抗体のグリコシル化パターンを評価するための実験的技術は、当業者に公知のものまたは本明細書に提供されるもの、例えば、以下の実施例に提供されるもののいずれかであり得る。このような方法としては、例えば、液体クロマトグラフィー質量分析、タンデム質量分析、およびウエスタンブロット分析が挙げられる。
【００９９】
抗体は、一部の実施形態において、本明細書に提供されるとおりに産生されたトランスジェニック動物の乳汁から、または前記トランスジェニック動物の子孫から抗体を回収することにより得ることができる。一部の実施形態において、トランスジェニック哺乳動物により産生される抗体は、産生される乳汁１リットル当たり少なくとも１グラムのレベルで産生される。
【０１００】
特に本明細書に定義されない限り、本開示に関して使用される科学および技術用語は、当業者により一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈により特に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。本開示の方法および技術は、一般に、当技術分野において周知の従来の方法に従って実施する。一般に、本明細書に記載の生化学、酵素学、分子および細胞生物学、微生物学、遺伝学およびタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関して使用される命名法、およびそれらの技術は、当技術分野において周知であり、一般に使用されるものである。本開示の方法および技術は、特に明記のない限り、一般に、当技術分野において周知の従来の方法および本明細書にわたり引用および考察される種々の一般およびより具体的な参照文献に記載の方法に従って実施する。
【０１０１】
本開示を、以下の実施例によりさらに説明し、これらは決してさらに限定するものと解釈すべきでない。本出願にわたり引用される参照文献（文献の参照文献、登録特許、公開特許出願、および同時係属特許出願を含む）の全ての内容全体は、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１０２】
方法
【０１０３】
【表１】
2016513105.tif 000003
【０１０４】
セツキシマブをコードする遺伝子
セツキシマブ／Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）のアミノ酸配列は、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ  Ｍａｇｄｅｌａｉｎｅ−Ｂｅｕｚｅｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ６４（２００７）２１０−２２５に公開されており、それを市販Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）の配列の確認のための参照文献として使用した。
【０１０５】
ペプチドマップ
市販セツキシマブＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）を、重鎖および軽鎖のペプチドマップの作成を介して分析し、公開アミノ酸配列を確認した。ペプチドマップは、トリプシンおよびＡｓｐ−Ｎ消化と、それに続くＨＰＬＣおよび質量分析を介して作成した。次いで、市販セツキシマブのアミノ酸配列を使用して、トランスジェニック動物の乳汁中でのセツキシマブの発現のためのＤＮＡ発現配列を設計した。
【０１０６】
ベータカゼイン発現構築物
セツキシマブ重鎖および軽鎖のＤＮＡ配列を、ウシの系での発現に最適化した（配列番号３（重鎖）および４（軽鎖））。本明細書に記載の全ての構築物は、最適化配列を含有する。
【０１０７】
本明細書において使用される構築物は、セツキシマブのコード配列、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列およびベータカゼイン発現ベクター中へのクローニングを容易にするためのフランキングＸｈｏＩ部位を含む。この計画に使用される発現ベクターは、Ｂｃ４５０、Ｂｃ４５１、Ｂｃ８００、およびＢｃ３５０であり、これらは全てＡｍｐＲおよびＫａｎＲの両方を付与するｓｕｐｅｒｃｏｓバックグラウンドに存在する。
【０１０８】
プラスミドＢｃ２５５３（図５）は、ｓｕｐｅｒｃｏｓ骨格中にニワトリベータグロビンインシュレーター配列、６．２ｋｂの５’ベータカゼイン配列、ＸｈｏＩクローニング部位、および７．１ｋｂの３’ベータカゼインフランキング配列を含む発現ベクターＢｃ４５０中にセツキシマブ軽鎖ヌクレオチド配列（配列番号４）を含有する。ｓｕｐｅｒｃｏｓベクターは、フランキングＳａｌＩ部位を使用して除去することができる。
【０１０９】
プラスミドＢｃ２５５４（図６）は、同様にｓｕｐｅｒｃｏｓ骨格中に同一のニワトリベータグロビンインシュレーター配列、６．２ｋｂの５’ベータカゼイン配列、ＸｈｏＩクローニング部位、および７．１ｋｂの３’ベータカゼインフランキング配列を含み、追加のニワトリベータグロビンインシュレーター配列によりフランキングされているＮｅｏＲマーカーを付加した発現ベクターＢｃ８００中にセツキシマブ重鎖ヌクレオチド配列（配列番号３）を含有する。ｓｕｐｅｒｃｏｓベクターは、両末端に存在するＮｏｔＩ部位を使用して除去した。
【０１１０】
３つのＤＮＡ片をライゲーションしてプラスミドＢｃ２５８４を作製した（図７）。第１の片は、重鎖コード配列を、ＮｏｔＩによる下流ＳａｌＩ部位の置換を除き上記のＢｃ４５０と同一であるＢｃ３５０中に挿入することにより作製した。インシュレーター、ベータカゼイン、および重鎖配列を含有するこのＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片を、ピューロマイシン耐性遺伝子を含有するｐＧＬ７１のＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片、およびフランキングＳａｌＩ部位を有するｓｕｐｅｒｃｏｓ断片にライゲーションさせた。
【０１１１】
トランスジェニックマウスの作製
セツキシマブの重鎖および軽鎖を担持するベータカゼイン構築物（配列番号６および配列番号５；それぞれＢＣ２５５４およびＢＣ２５５３）を使用し、標準的な前核マイクロインジェクション技術を使用してトランスジェニックマウスを作製した。重鎖のためのインジェクション断片は、ＢＣ２５５４ＨＣ  Ｎｅｏから、ＮｏｔＩにより消化してｓｕｐｅｒｃｏｓ骨格を放出し、ベータカゼイン重鎖インジェクション断片を電気溶出させることにより単離した。同様に、ｓｕｐｅｒｃｏｓは、ベータカゼイン軽鎖断片から、ＳａｌＩにより消化し、次いでインジェクション断片を電気溶出させることにより除去した。
【０１１２】
トランスジェニックヤギの作製
トランスジェニックヤギを、体細胞核移植（Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＳＣＮＴ）またはクローニングにより作製した。所望の導入遺伝子を有する細胞培養物を選択するために、選択マーカーをベータカゼイン発現構築物に付加した。ピューロマイシン耐性遺伝子をベータカゼイン重鎖にライゲーションさせることによりマーカーを付加して、ＢＣ２５８４ＨＣ  ｐｕｒｏ（配列番号７；図７）を得た。このＤＮＡ構築物を使用して初代雌性繊維芽細胞をトランスフェクトした。選択後、クローンを特徴付けして、重鎖および軽鎖構築物の両方が組み込まれていることを確認した。ＳＣＮＴを実施し、２頭の雌ヤギをＧ１００細胞株から作製した。これらの２頭のヤギ＃１および＃２を、泌乳するように誘導してそれらの乳汁中にセツキシマブを産生させた。
【０１１３】
ＬＣ／ＭＳ
ヤギ＃１および＃２からの精製セツキシマブならびに市販Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）を、当分野において周知の方法を使用する液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ／ＭＳ）により分析した（図１３参照）。
【０１１４】
結果
ペプチドマップ
ペプチドマップにより、市販セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））の可変領域の配列がＣｈａｒｌｏｔｔｅ  Ｍａｇｄｅｌａｉｎｅ−Ｂｅｕｚｅｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ６４（２００７）２１０−２２５）に公開されているとおり正確であることを確認した。さらに、ペプチドマップにより、重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１であり、軽鎖がκ定常領域を担持することを確認した。
【０１１５】
マウスにおける発現
セツキシマブの重鎖および軽鎖構築物の両方をゲノム中に担持するいくつかのマウスの系統(lines)を同定した。マウスを成熟時に交配させ、分娩後に搾乳した。乳汁をセツキシマブの存在についてウエスタンブロットにより分析して発現のレベルを測定した。マウス系統の２つ（＃１５および＃２７）におけるセツキシマブの発現のレベルを図８に示す。
【０１１６】
セツキシマブをマウスの乳汁から精製し、ウエスタンブロット上で分析してα−１，３−ｇａｌが存在するか否かを決定した。図９に見られるとおり、マウス産生抗体中のα−１，３−ｇａｌの証拠は存在しない（レーン１０）。対照的に、市販セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））は、α−１，３−ｇａｌを示した（レーン２）。
【０１１７】
ヤギにおける発現
上記の方法を使用して細胞株Ｇ１００に由来するトランスジェニックヤギは、セツキシマブの重鎖および軽鎖の両方に結合しているベータカゼインベクターについてトランスジェニックであった。動物を生後３ヵ月において泌乳するように誘導した。乳汁を回収し、ウエスタンブロットにより分析してセツキシマブの発現のレベルを測定した。組換え抗体を検出するために抗ヒトＩｇＧ１を使用したウエスタンブロットにより示されるとおり、ヤギ＃１および＃２はそれぞれ、１０〜１５ｍｇ／ｍｌのセツキシマブをそれらの乳汁中に産生した（図１０）。
【０１１８】
グリコシル化分析
α−１，３−ｇａｌがヤギ乳汁産生セツキシマブ上に存在するか否かを決定するため、抗体を図１１に示されるとおり精製した。続いて、α−１，３−ｇａｌに特異的なモノクローナル抗体を使用してウエスタンブロットを実施した（図１２）。陽性対照として、ウシラミニンを使用した。ブロットは、市販Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）およびラミニンがα−１，３−ｇａｌモノクローナル抗体に結合するが、ヤギ＃１または＃２のいずれの乳汁中に産生されたセツキシマブ（レーン２および３）も、ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌモノクローナル抗体に結合しないことを示した。従って、ヤギ乳汁産生抗体は、Ｎ結合部位にα−１，３−ｇａｌを含まない。しかしながら、興味深いことに、マウスＩｇＧ（レーン９）、およびヤギ血清（図９；レーン８）は、ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌを示した。
【０１１９】
ヤギ＃１およびヤギ＃２の両方からの精製ヤギ乳汁産生セツキシマブをＬＣ／ＭＳによっても分析し、市販Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）と比較した。図１３に示されるとおり、α−１，３−ｇａｌはＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）上に存在したが、トランスジェニックヤギの乳汁中に産生されたセツキシマブ上には存在しなかった。従って、セツキシマブの重鎖可変領域中のグリコシル化部位は、ヤギの乳腺中で産生された場合、α−１，３−ｇａｌにより修飾されなかった。対照的に、マウス細胞において市販用に産生されたセツキシマブ（すなわち、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））は、α−１，３−ｇａｌグリコシル化を示す。従って、乳腺中での産生は、他の系、例えば、非乳房マウス細胞中でこのように通常修飾される部位にさえ、α−１，３−ｇａｌグリコシル化を含まない。
【０１２０】
他の実施形態
本明細書に開示の特性の全ては、任意の組合せで組み合わせることができる。本明細書に開示のそれぞれの特性は、同一、等価、または類似の目的に役立つ代替特性により置き換えることができる。従って、特に明示的に記載のない限り、開示のそれぞれの特性は、包括的な一連の等価または類似特性の一例にすぎない。
【０１２１】
上記の詳細な説明から、当業者は本発明の不可欠な特徴を、その趣旨および範囲から逸脱せずに容易に確認することができ、本発明の種々の変更および改変を、種々の使用法および条件に適応させることができる。従って、他の実施形態も特許請求の範囲内に存在する。
【図１−１】
2016513105.tif 000004
【図１−２】
2016513105.tif 000005
【図２−１】
2016513105.tif 000006
【図２−２】
2016513105.tif 000007
【図３】
2016513105.tif 000008
【図４】
2016513105.tif 000009
【図５Ａ】
2016513105.tif 000010
【図５Ｂ−１】
2016513105.tif 000011
【図５Ｂ−２】
2016513105.tif 000012
【図５Ｂ−３】
2016513105.tif 000013
【図５Ｂ−４】
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【図５Ｂ−５】
2016513105.tif 000015
【図５Ｂ−６】
2016513105.tif 000016
【図５Ｂ−７】
2016513105.tif 000017
【図５Ｂ−８】
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【図５Ｂ−９】
2016513105.tif 000019
【図５Ｂ−１０】
2016513105.tif 000020
【図６Ａ】
2016513105.tif 000021
【図６Ｂ−１】
2016513105.tif 000022
【図６Ｂ−２】
2016513105.tif 000023
【図６Ｂ−３】
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【図６Ｂ−４】
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【図６Ｂ−５】
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【図６Ｂ−６】
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【図６Ｂ−７】
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【図６Ｂ−８】
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【図６Ｂ−９】
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【図６Ｂ−１０】
2016513105.tif 000031
【図６Ｂ−１１】
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【図６Ｂ−１２】
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【図６Ｂ−１３】
2016513105.tif 000034
【図７Ａ】
2016513105.tif 000035
【図７Ｂ−１】
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【図７Ｂ−２】
2016513105.tif 000037
【図７Ｂ−３】
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【図７Ｂ−４】
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【図７Ｂ−５】
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【図７Ｂ−６】
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【図７Ｂ−７】
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【図７Ｂ−８】
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【図７Ｂ−９】
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【図７Ｂ−１０】
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【図７Ｂ−１１】
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【図７Ｂ−１２】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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