(57)【要約】  被験者からメラニン誘導体を得る非侵襲的方法。本方法は、対象とする皮膚面を粘着剤と接触させて、生体物質の試料を提供することと、この生体物質の試料からメラニン誘導体を得ることと、を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラニン誘導体を得る非侵襲的方法であって、
ａ．対象とする皮膚面を粘着剤と接触させて、生体物質の試料を収集することと、
ｂ．前記生体物質の試料からメラニン誘導体を得ることと、
ｃ．前記メラニン誘導体を用いて、化粧品を開発又は評価することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記メラニン誘導体が、ピロール−２，３，５−トリカルボン酸、５−Ｓ−システイニルドーパ、６−ヒドロキシ−５−メトキシインドール−２−カルボン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシフェニルアニン、３−アミノ−４−ヒドロキシフェニルアラニン、２，３−ジカルボン酸、６−（２−アミノ−２−カルボキシエチオール）−２−カルボキシ−４−ヒドロキシベンゾチアゾール、７−（２−アミノ−２−カルボキシエチオール）−２−カルボキシ−４−ヒドロキシベンゾチアゾールからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粘着剤が、基質上に配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生体物質が、ケラチン産生細胞を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
ＰＴＣＡが、前記ケラチン産生細胞から得られる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記メラニン誘導体を得ることが、前記生体物質の試料をダイジェスティングする（digesting）ことを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記メラニン誘導体を得ることが、液液抽出を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記メラニン誘導体を得ることが、逆相高性能液体クロマトグラフィーを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記メラニン誘導体を得ることが、前記試料に内部標準物質を添加することを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象とする皮膚面が、色素過剰部分又は低色素部分を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
被験者が、フィッツパトリックスケールのタイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、又はタイプＩＶと分類される皮膚タイプを有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記粘着剤が、少なくとも１秒間、前記皮膚と接触したままである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記メラニン誘導体の量を、前記皮膚に存在するメラニンの量と相関させることを更に含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ｅ．皮膚の第２の部分を前記粘着剤と接触させて、生体物質の第２の試料を収集することと、
ｆ．前記生体物質の第２の試料から第２のメラニン誘導体を得ることと、
ｇ．前記第２の試料から得た前記第２のメラニン誘導体の量を決定することと、
ｈ．前記第１のメラニン誘導体の前記量を前記第２のメラニン誘導体の前記量と比較して、前記皮膚の第１及び第２の部分のうちの少なくとも１つに存在するメラニンの相対量を決定することと、を更に含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書の方法は、概して、皮膚中に存在するメラニンの量を定量することに関する。より具体的には、本方法は、皮膚細胞を非侵襲的に収集してその皮膚細胞からメラニンの誘導体を得ることに関し、このメラニンの誘導体が、皮膚細胞中に存在するメラニンの量と相関させられ得る。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、外界からの刺激に対する防御の最前線を提供するように協働する複数の特殊組織を含む、優れた器官である。しかしながら、経時的には、内因性及び外因性劣化因子が皮膚組織に損傷を与えることがあり、皮膚の劣化及び／又は変色を引き起こし得る。例えば、日光からの紫外線照射が皮膚の劣化を引き起こすことが知られており、「光による劣化」と称されることもある。時間の経過のみに依存する経時的劣化とは異なり、光による劣化は、ヒトが生涯を通して日光に曝される程度の関数である。光による劣化のプロセスは累積的なものであり、紫外線照射が徐々に皮膚に損傷を与える一連の複雑な分子反応を引き起こし、小皺及び皺、雀卵斑、黒子、色素沈着過度、低色素沈着、及び不均一な色調をもたらし得る。皮膚変色の出現を望ましくないと感じる人々も存在する。結果として、加齢に関連した種々の認識された皮膚の欠陥を処置するために、数多くの化粧品が開発されている。しかしながら、これらの化粧品のうちの多くが、根底にある変色の原因に対処するのではなく、例えば、変色した皮膚の部分を被覆するか、又はそれを付近の皮膚の色に合わせるようになじませることによって、欠陥を単に隠すだけのものである。それゆえ、単に、変色した皮膚の部分を隠すか、又はそれを周囲の皮膚になじませるのではなく、望ましくない変色を弱めるか、又は取り除くことが望ましい。しかしながら、皮膚変色の根底にある生物学的プロセスは、複雑であり、完全に理解されていない。
【０００３】
皮膚中のメラニンの過剰生成が、皮膚変色の原因の１つである。メラニンは、ほとんどの生物に見られる普遍的な天然色素である。最も一般的な生物学的メラニンは、ユーメラニンであり、それは、ジヒドロキシインドールカルボン酸の茶色がかった黒色のポリマー及びその還元型である。メラニンの別の一般的な型は、フェオメラニンであり、それは、赤毛及び雀卵斑に大きな役割を果たしているベンゾチアジン単位のシステイン含有の黄色がかった赤い褐色のポリマーである。メラニンは、基礎水準で酵素チロシナーゼとアミノ酸Ｌ−チロシンとの相互作用に関与するメラニン産生細胞内の一連の複雑な反応によって生成される。チロシナーゼは、Ｌ−チロシンのＤＯＰＡ（Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）への変換及びＤＯＰＡのドーパキノンへの変換を触媒する。ドーパキノンは、更なる変換を受けてメラニンを形成する。メラニンは、樹状突起として知られるメラニン産生細胞の細長いフィラメントに沿ってケラチン産生細胞へ移動されるメラノソームとして知られる細胞小器官内で凝集する。チロシナーゼの生成及びその活性は、産生されるメラニンの量を部分的に決定する。ケラチン産生細胞へ移動されるメラニンの量及び種類は、それらに関する限り、ヒトの皮膚の目に見える色素沈着の程度を決定する。若年の皮膚では、メラニンは均一に分布され、メラニン産生細胞の活性は低く、構成的色素沈着の生成のみに制限される。年齢を重ねた皮膚では、過度なメラニン形成及びそれに続くメラニン輸送は、最終的に、加齢によるシミ（黒子）又は拡散した色素沈着過度若しくは不均一な皮膚色調として見えるのに十分な寸法及びコントラストを有した、恒久的な局所的変色を生じさせる可能性がある。
【０００４】
メラニン生成、特にユーメラニンが種々の皮膚変色状態に関係していると考えられるため、皮膚の変色した部分に存在するメラニンの量に従って異なる皮膚状態の表現型を比較するために、皮膚組織試料又は皮膚の固有の部分に存在するユーメラニンの量を定量することが望ましい場合がある。しかしながら、皮膚組織試料などの試料中に存在するユーメラニンの量を直接定量しようと試みることは、ユーメラニンの化学構造が正確に知られていないため、困難である。加えて、メラニンの化学特性、例えば広範囲のｐＨにわたるメラニンの不溶性、メラニンの構造特性における不均一性など、及びメラニンポリマーをそのモノマー単位に分離させる方法の欠如は、直接測定を困難にする。更には、メラニンを定量するための多くの従来式の方法は、組織試料からのメラニンの単離を必要とする上に、ユーメラニンとフェオメラニンとの区別ができない。
【０００５】
試料中に存在するユーメラニンの量とフェオメラニンの量を区別するために、組織試料中のメラニンを定量する比較的迅速な方法が、Ｗａｋａｍａｔｓｕらによって紹介されており、それにより、メラニン色素の単離が不要になった（Ｗａｋａｍａｔｓｕら、「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｅｌａｎｉｎ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ」ＰＩＧＭＥＮＴ  ＣＥＬＬ  ＲＥＳ  １５：１７４〜１８３．２００２）。Ｗａｋａｍａｔｓｕによって紹介された方法は、ユーメラニンの過マンガン酸塩酸化によるピロール−２，３，５−トリカルボン酸（「ＰＴＣＡ」）の形成及びフェオメラニンのヨウ化水素酸還元性加水分解によるアミノヒドロキシフェニルアラニン（「ＡＨＰ」）異性体の形成に基づいている。ＰＴＣＡ及びＡＨＰ分解生成物は、ＨＰＬＣによって決定される。ＰＴＣＡは、紫外線検出によって定量され、ＡＨＰは、電気化学検出によって定量される。Ｗａｋａｍａｔｓｕによる方法が、メラニンを定量する速度及びユーメラニンとフェオメラニンとの量を区別する能力を改善した一方で、Ｗａｋａｍａｔｓｕによる方法は、メラニン量を決定するために生皮膚細胞の使用に依存しており、それは、従来の生検手順を用いてドナーから一般的に得られる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一般的に、生検は、試験される組織の部分をドナーから侵襲的に剥離することを含む。生検（又は他の侵襲的手順）を用いて生体物質を収集することに関連する欠点としては、死亡率及び疾病率のリスク増加、望ましくない皮膚の状態の影響、大規模集団における遂行に関する困難、参加者に与える不快感、及び感染症のリスク増加が挙げられる。生検は試験用に生物学的試料を収集する手段を提供できるが、皮膚中のメラニン含有量を定量するために生物学的試料を得る非侵襲的方法を提供することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の問題点に解決策を提供するために、本明細書における少なくとも１つの実施形態は、被験者からメラニン誘導体を得る非侵襲的方法を開示する。本方法は、対象とする皮膚面を粘着剤と接触させて、生体物質の試料を提供することと、生体物質の試料からメラニン誘導体を得ることと、を含む。メラニン誘導体を分析して、試料中のメラニンの量を決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】試料収集装置の一例の側面図である。
【図１Ｂ】試料収集装置の一例の側面図である。
【図１Ｃ】試料収集装置の一例の側面図である。
【図２】本方法に従って実例化され得る顔面の領域を示す。
【図３】本方法に従って実例化され得る耳の後ろ近くの領域を示す。
【図４】顔面の様々な領域から収集された試料から得たＰＴＣＡの量を示す。
【図５Ａ】５名の被験者からの３つの異なる皮膚の部分のＰＴＣＡ濃度を示す。
【図５Ｂ】５名の被験者からの３つの異なる皮膚の部分のＰＴＣＡ濃度を示す。
【図５Ｃ】５名の被験者からの３つの異なる皮膚の部分のＰＴＣＡ濃度を示す。
【図６】同じ被験者からの異なる皮膚の部分の試料から得たＰＴＣＡの量を示す。
【図７Ａ】２名の異なる被験者からのフォンタナ・マッソン染色化皮膚の試料を示す。
【図７Ｂ】２名の異なる被験者からのフォンタナ・マッソン染色化皮膚の試料を示す。
【図８】図７Ａ及び７Ｂと同一の個人から収集した試料から得たＰＴＣＡの量を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
全ての百分率は、特に記載のない限り、組成物の重量による。全ての比は、特に記述のない限り、重量比である。全ての重量は、それらが列記される成分に関連する際、活性成分のレベルに基づき、それゆえ、商業的に入手可能な材料に含まれ得る担体又は副生成物を含まない。全ての数値範囲は、より狭い範囲を包含し、区切られた上下の範囲限界は互換性があり、明示的に区切られていない更なる範囲を作る。有効数字の数は、指示されている量を限定するものでもなく、測定の精度を限定するものでもない。全ての測定は、約２５℃及び周囲条件で行われると理解され、「周囲条件」とは、約１気圧及び相対湿度約５０％という条件を意味する。
【００１０】
特に断らない限り、冠詞「１つ（a）」、「１つ（an）」、及び「ｔｈｅ」は、「１つ以上」を意味する。本明細書で使用するとき、「含む（comprising）」とは、最終結果に影響を及ぼさない他の工程及び他の成分を加えることができることを意味し、用語「〜からなる」及び「〜から本質的になる」を包含する。本発明の組成物及び本発明の方法／プロセスは、本明細書に記載した本発明の必須要素及び制限事項、並びに本明細書に記載した追加又は任意の成分、構成成分、工程、又は制限事項のいずれをも含むことができ、これらからなることができ、及びこれらから本質的になることができる。
【００１１】
「メラニンの誘導体」とは、化学的又は物理的プロセスによるメラニン（すなわち、ユーメラニン又はフェオメラニン）由来の化合物を意味する。本方法における使用に好適なメラニン誘導体は、それが得られた試料中に存在するメラニンに量に相関できる必要がある。メラニン誘導体のいくつかの非限定的な例としては、ピロール−２，３，５−トリカルボン酸（ユーメラニン），５−Ｓ−システイニルドーパ（フェオメラニン）、６−ヒドロキシ−５−メトキシインドール−２−カルボン酸（ユーメラニン）、４−アミノ−３−ヒドロキシフェニルアニン（フェオメラニン）、３−アミノ−４−ヒドロキシフェニルアラニン（フェオメラニン）、２，３−ジカルボン酸（ユーメラニン）、６−（２−アミノ−２−カルボキシエチオール）−２−カルボキシ−４−ヒドロキシベンゾチアゾ−ル（フェオメラニン）、７−（２−アミノ−２−カルボキシエチオール）−２−カルボキシ−４−ヒドロキシベンゾチアゾ−ル（フェオメラニン）が挙げられる。メラニンの誘導体を得るために使用され得るプロセスのいくつかの非限定的な例としては、化学的ダイジェスチョン（digestion）、化学分解、及び酵素ダイジェスチョン（digestion）が挙げられる。
【００１２】
「フィッツパトリックスケール」とは、公知の皮膚の色素のための数値分類系を指し、紫外線に対する異なるタイプの皮膚の反応を分類する方法として、元々、ハーバードの皮膚病学者、Ｔｈｏｍａｓ  Ｂ．Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋにより１９７５年に開発された。フィッツパトリックスケールは、次の異なる６タイプに皮膚を分類する：タイプＩ（０〜７スコア）淡く青白い−常に赤くなるが全く日焼けしない、タイプＩＩ（８〜１６スコア）白、色白−通常赤くなり辛うじて日焼けする、タイプＩＩＩ（１７〜２４スコア）中程度の白からオリーブ色−時折軽度に赤くなり、徐々にオリーブ色に日焼けする。タイプＩＶ（２５〜３０スコア）オリーブ、適度な褐色−ほとんど赤くならず適度な褐色に容易に日焼けする。タイプＶ（３０スコア超）褐色、暗褐色−ごく稀にしか赤くならず容易に日焼けする。タイプＶＩ黒、極めて暗褐色〜黒−全く赤くならず容易に日焼けし、深く沈着している。
【００１３】
「侵襲的」とは、皮膚を通すか又は身体開口部中への器具又は装置の挿入をさせた被験者から生体物質を収集する及び／又は単離させるために使用される手順を指す。侵襲的手順のいくつかの非限定的な例としては、生検（例えば、パンチ生検、針生検）、レーザキャプチャマイクロダイセクション、注射器で採取された血液、及び吸引ブリスタが挙げられる。
【００１４】
「メラニン」とは、ユーメラニン及び／又はフェオメラニンを意味する。
【００１５】
「非侵襲的」とは、皮膚又は身体開口部を通す器具又は装置の挿入を必要としない被験者から生体物質を収集する及び／又は単離させる手順を指し、皮膚の破壊を生じさせず、及び／又は粘膜に直接接触しない。非侵襲的手順の非限定的な例としては、テープ剥離、毛髪を摘むこと、毛髪を切り取ること及び軽く切り抜くことが挙げられる。
【００１６】
「ＰＴＣＡ」とは、ピロール−２，３，５−トリカルボン酸を意味し、ユーメラニンの誘導体である。
【００１７】
「皮膚」は、角化細胞、線維芽細胞及びメラニン産生細胞などの細胞から構成される、哺乳類の最外保護被覆を意味する。皮膚は、外側の表皮層及びその下の真皮層を含む。皮膚には、毛髪及び爪、並びに一般に皮膚に関連付けられる、例えば、筋細胞、メルケル細胞、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、幹細胞、脂腺細胞、神経細胞及び脂肪細胞などのその他の種類の細胞も含まれる。
【００１８】
「皮膚色調」は、皮膚の色素沈着及び着色の均一性を指す。
【００１９】
「テープ剥離」とは、基質上に配置された粘着剤の使用を含む生体物質を収集する非侵襲方法を意味する。例えば、生体物質が粘着剤に粘着するように、テープ剥離を用いて、好適な粘着剤含有基質を皮膚の表面と接触させることによって皮膚の表面から生体物質を収集することができる。
【００２０】
一般的に、ヒトの皮膚が、２つの主な層である下部の真皮層及びその下の表皮層を含むことが認識されている。真皮内の細胞の大部分は、線維芽細胞であり、それは、余分な細胞マトリックスを形成するのに役立つ。表皮内の細胞は、主にケラチン産生細胞であり、分化した細胞の層として配置されている。表皮には、分化したケラチン産生細胞の４つの層が存在する（手のひら及び足の裏には５つの層）。最も外側から最も内側にかけて、それら層は、一般的に：１）角質層（その下の真皮に対して最上部の層）、２）透明層（手のひら及び足の裏にのみ存在する）、３）顆粒層（手のひら及び足の裏を除いて角質層に近接する）、４）有棘層、及び５）基底層（stratum basale）（基底層（stratum germinativum）とも呼ばれ、真皮の最も近くに位置する）と称される。
【００２１】
ケラチン産生細胞に加えて、表皮は、メラニン産生細胞も含み、一般的に、それは、表皮の基底層内に位置している。メラニン産生細胞は、メラニン形成を担っており、それは、生成、パッケージング、及びケラチン産生細胞へのメラニンの分布に関与している。大部分の表皮メラニンが、基底層（及びかなり少ない程度ではあるが有棘層）において、メラニン産生細胞によってメラノソーム内にパッケージ化されている。その後、メラノソームを含有するメラニンが、樹状プロセスによって表皮の基底層のケラチン産生細胞に分布される。
【００２２】
皮膚では、メラニンが、表皮下組織への種々の波長の光の浸透を減少させる光学及び化学光保護フィルタとして機能する。ヒトの皮膚に影響する電磁放射は、いくつかの相互作用を受けることがあり得る。例えば、電磁放射は、角質層の表面によって反射され得る、その移動の方向における微妙な変化の後に角質層に入ることができる、特に、より明るめの皮膚を持った個人（例えば、フィッツパトリックＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、又はＩＶの皮膚タイプ）の角質層に持続するメラノソームの分解生成物であると考えられる「メラニンダスト」と相互作用して、部分吸収又は全体吸収をもたらすことができる、より深い層を横断し、可能な更なる散乱を感じることができる、又は、小胞にパッケージ化されたメラニンに合う生存表皮（すなわち、基底層）に入ることができる。いくつかの例では（例えば、より明るめの皮膚を持った個人）、表皮メラニンは、放射と異なって相互作用する、皮膚内の異なる部位で異なる形態を有する。これら全ての部位では、メラニンは、散乱によって放射を減弱させる光フィルタとして機能することができる。また、光化学作用によって生成される化合物を吸収することができる安定したフリーラジカルとしてのその機能を介して化学フィルタとしても作用することができるが、それが毒性又は発癌性であるであろう。よって、高度にメラニン化した皮膚の優れた光保護は、吸収と散乱とによって達成され、それは、表皮の基底及び副基底層のケラチン産生細胞内のメラノソームの密度及び分布によって、及び角質層のメラニンダストの小片の存在によって、影響される。
【００２３】
皮膚のメラニンの量を定量する能力は、スキンケア研究及び皮膚病診断、特に美容スキンケアの分野で、長期にわたって有用なツールとなっている。具体的には、皮膚のメラニンを測定するために便利なツールを特定して、望ましくない皮膚色調状態（例えば、黒皮症、加齢によるシミ）の処置に有用な化粧品を開発し評価するために、美容業界による相当な量の研究が行われている。過去には、皮膚のメラニン含有量を正確に決定するためには、メラニン形成が起こる表皮の基底層から組織試料を得る必要があるということが一般通念であった。換言すれば、生体細胞が必要であると考えられていた。角質層に存在する生体物質を非侵襲的に（例えば、テープ剥離による）得ることができるということが知られていたが、主に角化ケラチン産生細胞（すなわち、非生体細胞）を含む角質層からのみ得られた組織試料からは、メラニンが正確に定量できないと考えられた。驚くべきことに、ＰＴＣＡなどのメラニン誘導体が、テープ剥離などの非侵襲的方法によって収集された生体物質（例えば、皮膚細胞）の試料から得ることができることが明らかになっている。このような方法で得られたメラニン誘導体は、その後、定量することができ、試料中に存在するメラニンの量と相関させることができる。本明細書に開示される非侵襲的方法は、侵襲的試料採取と関連する欠点のうちのいくつかを克服する。例えば、テープ剥離試料は、時間のかかる高価な生検試料の収集とは反対に、大集団の人々から容易に収集することができる。
【００２４】
本方法は、被験者から生体物質を収集することと、試料（例えば、ダイジェスチョン（digestion）による）からＰＴＣＡなどのメラニン（特にユーメラニン）誘導体を得ることと、の非侵襲的手段を提供する。本方法は、化粧品の分野において使用するために特に好適である。いくつかの実施形態では、本方法は、任意に、メラニン誘導体を分析して、生体物質の試料中に存在するメラニン誘導体の量を決定することを含み得る。その後、メラニン誘導体の量を、試料中に存在するメラニン量と相関させ得る。本明細書の例示的な実施形態は、テープ剥離について説明することができるが、被験者からメラニン及び／又はメラニン誘導体を得る他の非侵襲的方法も、企図されることが理解される。例えば、綿球（例えば、綿棒）、ブラシ、又は皮膚の表面の軽い剥離を使用して、分析（例えば、ダイジェスチョン（digestion）及び定量）用の皮膚細胞を収集することができる。
【００２５】
試料収集
生体物質の試料は、非侵襲的に、身体のいかなる部位にも存在する皮膚から得ることができる（例えば、顔面、腕、足、胸、胃、背中、肩）。特定の実施形態では、試料は、対象とする皮膚面を粘着剤と接触させて、その後、任意の生体物質（例えば、皮膚細胞）と一緒にそこに粘着している粘着剤を除去することによって、収集することができる。安全（すなわち、人にいかなる重大な副作用も引き起こさない）かつ皮膚から好適な量の生体物質を収集するのに十分な粘着性のある粘着剤を提供することが望ましい場合がある。好適な量の皮膚細胞を収集できるが、皮膚と接触させたとき及び／又は皮膚から除去したときに望まない水準の不快感を引き起こさない粘着剤の粘着性のバランスを取ることも望ましい場合がある。例えば、不快感を引き起こすことなく見た目に炎症を起こしている皮膚にさえ適用でき、そこから除去できる弱めの粘着剤を使用することが望ましい場合がある。皮膚に使用するために、当該技術分野で既知の任意の好適な粘着剤が本明細書で使用され得る。本明細書で使用するのに好適であり得る粘着剤のいくつかの非限定的な例としては、医療用粘着剤、シリコーン系粘着剤、ポリオレフィン粘着剤、ブロックコポリマー粘着剤、及び感圧性粘着剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、粘着剤は、好適なアプリケータ（例えば、基質）を用いて、対象とする皮膚面に適用又はそこから除去されてもよい。
【００２６】
いくつかの実施形態では、基質の粘着剤を含有している側が都合よく皮膚の表面と接触でき、その後に除去することができるように、粘着剤は、基質の一方又は両側に配置することができる。かかる構成は、従来の粘着テープにおいて、広く用いられている。基質は、粘着剤（複数可）の比較的安定した支持及びその上に配置される他の選択的な要素（例えば、剥離層又は被覆シート）を提供する。また、粘着剤含有基質は、特に粘着剤を皮膚と接触させたとき及びその後にそれを除去するときに、装置を把持及び操作するための便利な手段も含む。例えば、粘着剤を含まない把持可能な「タブ」が提供されるように、粘着剤は、基質の一部にのみ配置されてもよい。特定の実施形態では、タブは、長方形基質の一方の端部若しくは両端部、又は円形若しくは楕円形基質の周長の全体若しくは周辺の一部に提供され得る。
【００２７】
基質は、加工及び使用中の不要な変形及び引裂に耐えるように好適な物理特性を有する、硬性、柔軟性、及び／又は圧縮性のある物質の１つ以上の層を含んでもよい。基質は、１つ以上の任意の組成物を含んで基質の特定の特性（例えば、粘着性の増加又は低下、液体及び／又は蒸気不透過性、硬性の増加、引張強度の増加、感触の改善（例えば、より温かい、より軟らかい、より滑らか、及び／又はより粗い）、グリップ能力の増加及び／又は改質された外観（例えば、反射率、透明性、透過性及び／又は不透明度））を改善するように、改質されてもよい（例えば、表面が改質されている）。基質は、広範囲の物質から作製することができ、それは、当該技術分野で既知である。本明細書での使用に好適な粘着剤含有基質のいくつかの非限定的な例としては、ＣｕＤｅｒｍ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸから入手可能なＳｅｂｕｔａｐｅ（商標）（アクリルポリマー粘着剤フィルム）、ＣｕＤｅｒｍから入手可能なＤ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）商標のポリアクリレートエステル粘着テープ、３Ｍ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａから入手可能なＤｕｒａｐｏｒ（商標）商標の医療用テープ、Ｎａｓｈｕａ  ｔａｐｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓｌから入手可能なＴｅｇａｄｅｒｍ（商標）３３３商標のダクトテープ、３Ｍ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮから入手可能なＳｃｏｔｃｈ（登録商標）８１０商標のテープ、オランダのＳｅｌｌｏｔａｐｅ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能なＤｉａｍｏｎｄ（商標）商標のテープ、及びオランダのＳｅｎｔｅｇａ  Ｅｉｋｅｔｔｅｎ  ＢＶから入手可能なＳｅｎｔｅｇａ（商標）商標のポリプロピレン粘着テープなどの市販の粘着テープが挙げられる。
【００２８】
図１Ａ、１Ｂ、及び１Ｃは、本明細書の方法に従って試料を収集するのに好適な装置１００の例を示す。図１Ａに示されるように、装置１００は、その上に配置される粘着剤１２０の連続層を有する基質１１０を含んでもよい。粘着剤１２０は、装置１００を把持及び操作するためのタブとして使用することができる、粘着剤を含まない部分１３０が、基質１１０の各端部に提供されるように配置されてもよい。図１Ｂは、基質１１０が粘着剤１２０の不連続層を含む一実施形態の一例を示す。図１Ｃは、粘着剤１２０の不要な混入を阻止するのに役立ち得る、取り外し可能なカバー層１４０を有する装置１００を示す。
【００２９】
いくつかの実施形態では、粘着剤は、フィルム形成ポリマーであってもよい。フィルム形成ポリマーは、液体、半固体、ペースト、又はゲルなどの形態で、対象とする皮膚面に適用され得、それが好適なフィルムを形成する（例えば、フィルム形成材料が硬化又は乾燥する）までその状態で留まることができる。フィルムは、所定の時間の間（例えば、１秒〜１５分、１０秒〜１０分、３０秒〜５分、又は更には約３分）皮膚上にその状態で留まることができる。この方法で、対象とする皮膚領域の表面上の生体物質は、例えば、フィルムに粘着するか又はフィルムのマトリックス内に捕捉されることによって、フィルムによって収集される。その後、フィルムは、下記により詳細に説明される方法のような、メラニン誘導体を得る及び／又はメラニン誘導体を分析するための好適なプロセスに供されてもよい。フィルム形成ポリマーの特徴（例えば、粘着性又は他の化学若しくは静電相互作用）は、十分な生体物質の収集を可能にして、試料中に存在するメラニン誘導体の定量を可能にするべきである。
【００３０】
いくつかの実施形態では、メラニン含有量を決定する皮膚の固有の部分を特定することが望ましい場合がある。例えば、色素過剰（例えば、黒子又は黒皮症）又は低色素（例えば、白斑）の皮膚の一部のメラニン含有量を決定することが望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、皮膚の別の部分の皮膚色調とは異なる皮膚色調を含む皮膚の領域を特定することが望ましい場合がある。この例では、粘着剤は、皮膚の２つの部分（すなわち、皮膚色調において違いを呈している２つの領域の皮膚）に適用することができ、それぞれの領域に存在する決定されたメラニンの量を、他の領域及び／又は対照と比較することができる。この例を続けてみると、一般に紫外線照射に曝される皮膚の一部（例えば、顔面、肩、又は前腕）に存在するメラニンの量を、紫外線照射に典型的には曝されない皮膚の領域（例えば、内腕、脚の内側、又は臀部）と比較することができる。いくつかの実施形態では、顔面の眼窩周囲部などの変色に一般に関連する皮膚の領域に存在するメラニンの量を決定することが望ましい場合がある。
【００３１】
いくつかの実施形態では、経時的に皮膚の特定の領域のメラニンの変化を決定することが望ましい場合がある。例えば、美白製品などのパーソナルケア製品で処置される、対象とする皮膚面のメラニン含有量の変化を測定することが望ましい場合がある。この例では、対象とする皮膚面のメラニン含有量は、初回（例えば、適用の直前）に決定することができ、その後、所定の時間（例えば、４時間〜９６時間、８時間〜４８時間、又は１２時間〜２４時間）が経過した後に再度決定することができる。比較測定は、所定の時間の間（例えば、１週間〜６ヶ月）周期的に行って、パーソナルケア製品の皮膚色調の利益的特性を評価することできる。場合によっては、メラニン含有量は、パーソナルケア製品を用いて所定の処置回数（例えば、毎日の処置）に基づいて決定され得る（例えば、１〜１００回の処置、５〜９０回の処置、１０〜７５回の処置、又は３０〜６０回の処置）。
【００３２】
いくつかの実施形態では、内因性又は外因性因子（例えば、紫外線照射、汚染及びたばこ煙、並びに天然由来の活性酸素種などの環境ストレッサ）のため、皮膚の一部のメラニンの変化を決定することが望ましい場合がある。例えば、かかる因子によるメラニンの変化に関連し得るより段階的な変化のため、パーソナルケア製品の使用と比較して、長期にわたるメラニンの変化を監視することが重要であり得る。したがって、この例では、１週間に２回、毎週、１ヶ月に３回、２週間毎、毎月、又は更には２ヶ月毎に１ヶ月〜７０年（例えば、３ヶ月〜１年）にかけてメラニン含有量を決定することが望ましい場合がある。
【００３３】
図２及び３は、メラニン含有量を決定するための生体物質の試料を収集することが望ましいであろうヒトの顔面１０の領域を示す。図２に示されるように、額１２、上眼瞼１４、下眼瞼１６、頬１８、首２０、顎２２、及び／又は耳の後ろ３０の又はそれらの付近の皮膚の領域を試料採取することが望ましい場合がある。例えば、被験者が特定の種類の眼窩周囲皮膚色異常を呈するかどうかを決定するために、顔面１０の上眼瞼１４及び下眼瞼１６領域に配置される皮膚のメラニン含有量を決定することが望ましい場合がある。別の例では、頬１８及び／又は額１２に存在するメラニンの量と顎２２、首２０、及び／又は耳の後ろ３０に存在するメラニンの量とを比較して、２つ以上のこれらの領域間のメラニン含有量に差があるかどうかを決定することが望ましい場合がある。
【００３４】
生体物質の試料を収集するとき、粘着剤を、十分な時間の間皮膚と接触させて、生体物質の試料を収集する。粘着剤が好適な基質に配置される場合、圧力が基質の非粘着剤含有側に適用されて、粘着剤に対して粘着しているが被験者に不快感を引き起こさない尤度生体物質を改善するのに役立ち得る。粘着剤は、少なくとも１秒（例えば、１秒〜５分、１０秒〜２分、３０秒〜１分）間皮膚上に残しておいてよい。粘着剤が、所望の時間の間皮膚と接触した後に、試料（すなわち、例えば、テープ剥離又はテープディスクを用いるときの粘着剤プラス生体物質又は粘着剤含有基質プラス生体物質）は、除去して貯蔵及び／又は後の試験用に好適な貯蔵容器に移動させることができるか、又は試料は、以下により詳細に説明される、ＰＴＣＡを単離するためのプロセスに直ちに供されてもよい。テープ剥離又はテープディスクなどの基質上に粘着剤が配置されるとき、粘着剤含有基質の大きさ及び／又は形状は、試料採取される皮膚の一部と相関させるように選択され得る。例えば、１４ｍｍ直径のＤ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）商標の粘着剤ディスクは、人の顔面の皮膚を試料採取するのに好適であり得る。
【００３５】
メラニン誘導体を得ること
生体物質の試料からメラニン誘導体を得るために、試料を、メラニン誘導体を所望のメラニン誘導体に変換するための好適な化学又は物理プロセスに供する。例えば、ＰＴＣＡは、皮膚細胞を含む試料から、過酸化水素、及びメラニンをＰＴＣＡに変換する好適な塩基（例えば、水酸化ナトリウム）の好適な量及び濃度で試料を化学的にダイジェスティング（digesting）することによって得ることができる。しかしながら、試料をダイジェスティング（digesting）及び／又は試料を他の破壊的プロセスに供する前に、総タンパク質含有量を測定するなどの非破壊的試験を最初に行うことが望ましいであろうことを理解されたい。加えて又は代替的に、内部標準物質（例えば、好適な同位体又は関心の誘導体と同様の構造の化合物）などのダイジェスト（digest）において任意の化合物を含むことが望ましい場合があり、それを使用してＰＴＣＡの量を正規化し、例えば、試料損失又は分析的機器の多様性を修正することができる。試料から得られたメラニン誘導体は、当該技術分野で知られているような好適な液液抽出手順によるダイジェスト（digest）から抽出され得る。例えば、ダイジェスト（digest）からＰＴＣＡを抽出するときに、好適な溶解性を有する水不混和性溶媒（例えば、メチル−ｔ−ブチルエーテル、ジエチルエーテル、クロロホルム、塩化メチレン、ヘキサン、又は他の好適な溶媒）が使用されてもよい。いくつかの実施形態では、メラニン誘導体は、ダイジェスチョン（digested）された試料中で直接分析されてもよい。ダイジェスチョン（digested）された試料及び／又は抽出された分析物は、所望のメラニン誘導体の検出に十分な特異性及び感受性を提供する分析的分析法に供されてもよい。例えば、これに限定されないが、タンデム質量分析などの感受性及び選択的検出方法を伴う好適な逆相高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）カラムは、ＰＴＣＡなどの特定のメラニン誘導体を検出するのに特に好適であり得る。
【００３６】
メラニン誘導体の分析
特定の実施形態では、メラニン誘導体の検出及び定量は、下記の実施例により詳細に説明されるように、複数の反応監視条件の下で動作するタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）によって行われ得る。生体物質の試料における任意の破壊試験（例えば、ダイジェスチョン（digestion））のいかなる実行にも先立って、試料の総タンパク質含有量を決定することが望ましい場合がある。例えば、試料がテープ剥離によって得られた場合、生体物質試料の総タンパク質含有量は、好適なスキャナ（例えば、ドイツのＨｅｉｌａｎｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ＧｍｂＨから入手可能なＤ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）Ｓｃａｎ（商標）８５０商標のスキャナ又は同等のもの）を用いて決定されてもよい。いくつかの実施形態では、特定の試料のために決定されたタンパク質の量を使用して、その試料において測定されたメラニン誘導体の量を正規化することができる。正規化を使用して、テープ剥離によって皮膚面から除去された生体物質の量における差を修正することができる。
【００３７】
試料中に存在するメラニン誘導体の量は、既知の標準曲線からの補間によって決定され得る。例えば、テープ剥離ダイジェスト（digest）からＰＴＣＡを抽出することによって得たＰＴＣＡの量は、既知のＰＴＣＡ較正基準から構築された標準曲線からの補間によって決定することができる。この例では、定量の公称範囲は、テープ剥離当たり０．１５〜１００ｎｇのＰＴＣＡであり得る。この例を続けてみると、最終結果は、そのテープ剥離に関して見つけられたタンパク質の量で割った所与のテープ剥離から見つけられたＰＴＣＡの質量として報告され得る（すなわち、試料当たりのタンパク質の総重量（μｇ）当たりの分析物の総質量（ｎｇ又はμｇ））。
【実施例】
【００３８】
次の実施例は、粘着剤含有基質を用いて被験者の顔面から試料を収集することを説明する。当然であるが、本方法が、所望の通り、粘着剤を身体の任意の領域と接触させる任意の好適な手段を用いて実施され得ることを理解されたい。
【００３９】
（実施例１）
２０〜４５歳の５５名の女性試験パネリストを選び、本研究に参加してもらった。これらのパネリストらは、試験の開始の少なくとも８時間前であれば、試験前に通常通り洗顔及び／又は通常のスキンケアレジメンを行うことができた。試験の日の朝、パネリストらに、眼にいかなるスキンケア／メーク用製品も適用せず、水だけで洗顔するように求めた。到着時に、各パネリストに、Ｏｌａｙ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ（登録商標）商標のウェットワイプで顔面を消毒するように求めた。その後、パネリストの皮膚を乾燥させた。清潔なピンセットを用いて、１４ｍｍ直径のＤ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）商標のポリアクリレートエステル粘着テープディスクを、顔面の次の領域：耳の後、頬、顎、額、下眼瞼、及び上眼瞼のそれぞれに置いた。テープディスクが皮膚としっかりと接触する（例えば、皺がよらない）ことを確実にするために、テープの表面（すなわち、テープの粘着剤を含有していない側）にわたって手袋をした指を動かす。その後、医療用の先端に綿が付いたアプリケータを用いて、テープディスクの粘着剤を含有していない表面を、５回こする。清潔なピンセットを用いて、被験者からテープディスクを徐々に除去する。テープディスクを好適な容器（例えば、４８ウェルの培養プレート、ガラス管、合成樹脂製チューブ）中に置き、適切な密封材で密封する。テープディスクを注意深く取り扱い、試料を不注意に混入させることを避ける。具体的には、テープの粘着剤の側を他の表面（例えば、容器の側面）又は考えられる混入源と接触させることを避ける。その後、収集された試料及び容器を、好適な長期間の貯蔵装置（例：−７０℃の冷凍室）に移動させるまで、ドライアイス上に置いておく。このプロセスを、各パネリストの下眼瞼、頬、額、及び耳の後ろに関して繰り返した。
【００４０】
上述の内容に加えて、実験室の業務に関する一般的な公衆衛生法に従うことは重要である。例えば、テープディスクを扱うときには（試料収集の前及び後）、好適な手袋を常に着用しなければならない。また、テープディスクが粘着剤の側を下にして任意の表面に落ちた場合は、試料採取部位の異なる部分で新しいテープディスクを用いて手順を最初から行わなければならない。更には、ピンセットは、試料採取間で洗浄されなければならず、テープディスクに触れる前に完全に乾燥していなければならない。
【００４１】
収集した試料を分析するために、テープディスクを貯蔵先から除去し、周囲温度に温め、その後、各テープディスクを、タンパク質の決定のためにＤ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）Ｓｃａｎ  ８５０Ａ機器内に置いた。テープディスクを、２２ｍｍ又は１４ｍｍのいずれかの（ＣｕＤｅｒｍ，Ｄ−１０１）Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）ディスクを収容するように２つの大きさで利用可能な１０のディスクカートリッジ内に、粘着剤側を上にして置く。Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）Ｓｃａｎ  ８５０Ａは、角質層試料を含有するＤ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）ディスクを通過し、非破壊的様式で光度の低下を測定する８５０ｎｍの波長で光のビームを放射する。８５０ｎｍの波長を使用することは、光散乱及び環境光を低下させ、分子吸光による誤差を最小限にし、角質層内の生体分子の熱変性を阻止する。Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）Ｓｃａｎ（商標）８５０Ａの測定範囲は、０．１％の分解能を伴う０〜４０％の吸収である。円形スリットの直径は、標準的な２２ｍｍのＤ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）皮膚試料採取ディスク（ＣｕＤｅｒｍ，Ｄ−１００から入手可能）の面積の４５％をカバーする１５ｍｍ（面積＝１．８ｃｍ2）である。未使用のＤ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）テープディスクの吸収を読み取り値から差し引いて、背景雑音を修正する。ＳｑｕａｍｅＳｃａｎ（商標）８５０Ａの読み取り値は、角質層タンパク質含有量に線形比例するため、各Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ（登録商標）ディスクに存在する角質層タンパク質の量を間接的に測定するために使用され得る。
【００４２】
総タンパク質測定の完了時に、ピンセットを用いて、各テープディスクを貯蔵容器から注意深く除去し、好適なダイジェスチョン容器（a suitable digestion container）（例えば、４ｍＬの極低温Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）商標の管）内に置く。テープディスクを、容器の壁、又は試料を混入する可能性のある若しくは試料が粘着する可能性がある任意の他の表面と接触させることを避ける。その後、テープディスクを、同量の２Ｍ水酸化アンモニウムと６％過酸化水素とで処置するが、この実施例では、それは、それぞれ、０．９ｍＬの水酸化アンモニウムと６％過酸化水素である。管にキャップをしてボルテックスし、その後ロッカ上に置いて２００Ｍｏｔ／分で３時間インキュベートしてメラニンのダイジェスチョン（digestion）を促進する。管をロッカから取り外し、注意深くキャップを外して、インキュベーション中に溜まった可能性のある全ての圧力を放出する。各管の液体含有量を、別個の１５ｍＬの円錐管に移して、処分のために元の容器内にテープディスクを残す。その後、３２μＬの１０％亜硫酸水素ナトリウムを各円錐管に添加して、その後、管にキャップをしてボルテックスする。ボルテックスした後に、キャップを取り外し、安定同位体内部標準物質溶液（２μｇ／ｍＬ）のアリコート（５０μＬ）を各管に添加して、抽出及び機器的反応を修正する。それぞれの溶液のｐＨを、１．０ｍＬの３７％塩酸の添加によって酸性にする。ｐＨ調整後、管にキャップをしてボルテックスする。次に、キャップを取り外し、１．０ｍＬの飽和硫酸アンモニウムを、２．０ｍＬのメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルと共に添加する。管にキャップをしてボルテックスして、遠心分離する。遠心分離後、各管の１．０ｍＬの有機層（ＰＴＣＡと内部標準物質とが位置するところ）を別個の液体クロマトグラフィーバイアルに移して、窒素下で乾燥させる。各バイアルの残基を、０．２５０ｍＬの１０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液で還元する。バイアルにキャップをしてボルテックスする。試料を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ製ポンプ及び勾配制御器、並びにＳｃｉｅｘ  ＡＰＩ  ５０００質量分析計を用いて、高性能液体クロマトグラフィー／質量分析／質量分析（ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって分析する。任意のＨＰＬＣ又は同等の性能を送達することができる質量分析系が使用されてもよいことを理解されたい。ＰＴＣＡ量を、前に測定された総タンパク質含有量に基づいて正規化することができる。
【００４３】
図４は、図４に示す部位で収集され、５５名の被験者全体で平均化された試料から得られたＰＴＣＡの量を示す。顔面の特定の領域が、典型的により濃くなり、日光への曝露が増加したため顔面の他の領域よりも多くのメラニンを含み、対応する紫外線（すなわち、紫外線照射）の増加が、メラニン生成物を誘発したことが、広く認識されている。具体的には、頬及び顎が、典型的に、最も多く紫外線曝露を受け、その後に、耳及び額が続く。驚くことでないが、耳の後ろに見られる皮膚の領域は、典型的には、最も少ない紫外線曝露を受ける。図４に示されるように、顔面の皮膚の異なる領域で測定されたＰＴＣＡは、メラニン含有量に関して典型的に予想されるものに対応する。具体的には、耳の後ろの皮膚の領域（図４の「ＢＥ」）から得られたテープ剥離試料は、最も少ない量のＰＴＣＡを提供するが、頬から得られたテープ剥離試料は、最も多くのＰＴＣＡを提供した。顎、額、及び眼（上眼瞼及び下眼瞼）付近の領域から得られたテープ剥離試料は、顔面のそれらの領域に存在すると予想されるメラニンの相対量に対応するＰＴＣＡの量を提供した。よって、図４に示されるデータは、本方法を使用して、非侵襲的試料採取によって得られた生体物質の試料に存在するメラニンの量を決定することができることを示す。
【００４４】
（実施例２）
この実施例は、異なる個人と個人との間のメラニン含有量の差を決定するための本方法の使用を示す。テープ剥離試料を、互いに異なる皮膚色調を有すると特定された５名の女性被験者の３つの位置から収集した。試料採取された場所は、上眼瞼、下眼瞼、及び耳の後ろであった。被験者１０２を、フィッツパトリックＩＶ皮膚タイプを有すると特定した。被験者１０５を、フィッツパトリックＩＩＩとＩＶとの間の皮膚タイプを有すると特定した。被験者１０３及び１０４を、両者ともＩＩとＩＩＩとの間のフィッツパトリック皮膚タイプを有すると特定したが、被験者１０４は、被験者１０３よりもやや濃い皮膚色調を有した。被験者１０１を、ＩとＩＩとの間のフィッツパトリック皮膚タイプを有すると特定した。テープ剥離試料を、ＰＴＣＡ測定が総タンパク質に基づいて正規化されなかったことを除いて、実施例１に上述のものと実質的に同じ方式で収集し分析した。
【００４５】
図５Ａは、各被験者の上眼瞼領域から取ったテープ剥離試料から得たＰＴＣＡの量を示す。図５Ａに示されるように、被験者１０２及び１０５は、最も高い量のＰＴＣＡを呈したが、これは、被験者らがより濃い皮膚を有し、恐らくより多くのメラニンが存在するためと予想される。同様に、被験者１０１、１０３、及び１０４から取った試料から得たＰＴＣＡの量は、個人の相対的な皮膚色調に基づくと予想されるであろうメラニンの相対量に対応した。
【００４６】
図５Ｂは、各被験者の下眼瞼領域から取ったテープ剥離試料から得たＰＴＣＡの量を示す。図５Ｂに示されるように、被験者１０２及び１０５は、予想通り、最も高い量のＰＴＣＡを再度示した。被験者１０１、１０３、及び１０４から取った試料から得たＰＴＣＡの量が、概して、予想されたものに対応していた一方で、これらの個人間のＰＴＣＡ水準における差は、上眼瞼試料のＰＴＣＡ水準と比較して、いくらか、あまり明確なものではなかった。これは、下眼瞼の領域が上眼瞼領域と比較して、受ける紫外線曝露の量が少ないためである可能性がある。顔面の下眼瞼領域は、鼻、眉、及び他の顔の特徴からの陰影効果に供される。よって、下眼瞼付近の顔面の領域のＰＴＣＡ水準においていくらかより小さい差が見られることは、驚くべきことではない。
【００４７】
図５Ｃは、各被験者の耳の後ろの近くの領域から取ったテープ剥離試料から得たＰＴＣＡの量を示す。図５Ｃに示されるように、被験者１０２は、最も高い量のＰＴＣＡを再度呈し、被験者１０１は、最も低い量を呈したが、それらは、両者とも、予想されたことである。しかしながら、被験者１０４から収集された試料は、予想外に、被験者１０２及び１０５よりも高いＰＴＣＡ水準を呈した。更なる調査時に、被験者１０４が他の被験者よりも短い髪であったことが分かった。被験者１０４の髪は、耳の後ろ近くの皮膚の対象とする領域を覆っていなかったが、他の被験者は、耳の後ろ近くの皮膚の対象とする領域を覆う長い髪を有していた。結果として、被験者１０４の耳の後ろの付近の皮膚の領域は、他の被験者よりも多くの紫外線曝露を受けた可能性が高く、そのことが、紫外線誘発のメラニン生成及びより高いＰＴＣＡ水準の増加をもたらした。よって、この更なる変数が含まれると、観察されたＰＴＣＡ水準は、一般に予想されるであろうものに実際に対応する。本実施例から分かるように、本方法は、視覚的評価が皮膚色調における差を容易に特定できない場合でも、異なる個人のＰＴＣＡ水準間を区別するのに十分な感受性を提供する。
【００４８】
（実施例３）
この実施例は、本方法をどのように使用してＰＴＣＡ水準、ひいては個別の被験者の異なる部分の皮膚のメラニン含有量における差を決定することができるかを示す。この実施例では、第１のテープ剥離試料を、色素過剰部分（すなわち、加齢によるシミ）を含む被験者の皮膚の対象とする領域から収集した。第２のテープ剥離試料を、正常な皮膚色調（すなわち、色素沈着過度又は低色素沈着が存在しない）を呈する身体の同じ領域の皮膚の直ぐ近くの部分から収集した。テープ剥離を、試料が総タンパク質に基づいて正規化されなかったことを除いて、実施例１に上述のものと実質的に同じ方法に従って収集し分析した。
【００４９】
図６は、色素沈着過度領域４０１から得たＰＴＣＡの量及び正常皮膚色調領域４０２から得たＰＴＣＡの量を示す。図６に示されるように、色素沈着過度の試料は、明らかに、より多くのＰＴＣＡの存在を有したが、これは、より多くのメラニンの存在に対応する。皮膚の色素過剰部分が、近くの正常な皮膚よりも多くのメラニンを含有することが十分に認識されているため、この結果は、本方法が単一個人の皮膚の異なる領域のメラニン含有量を決定するのに好適であるという結論を支持する。
【００５０】
実施例４この実施例は、試料のメラニン含有量を決定するための従来の組織学的分析において観察されるものに対応する本方法に従って得た結果を示す。生検試料を、２名の被験者から収集した。この試料を、処理し、試料中に存在するメラニンの量を定量するために、従来の方法に従ってフォンタナ・マッソン染色を用いて染色した。また、テープ剥離試料を、生検として身体の同じ領域において各被験者から収集した。テープ剥離試料を、実施例１に上述されたものと実質的に同じ方式で収集し分析した。
【００５１】
図７Ａ及び７Ｂは、２０倍の倍率での、染色した試料の顕微鏡写真を示す。図７Ａに示される試料は、図７Ｂに示される試料よりもはるかに多いフォンタナ・マッソンが陽性の集まり（小さい黒色点６０１として示される）を有するが、これは、図７Ａ中の試料がより多くのメラニンを含有することを示す。図８は、各テープ剥離試料のために得たＰＴＣＡの量を示す。図７Ａに示される試料は、図８中の試料１と識別され、図７Ｂに示される試料は、図８中の試料２と識別される。図８に見られるように、試料１用に測定されたＰＴＣＡは、試料２よりもはるかに高かった。よって、本方法の結果は、従来の組織学的分析において観察される結果に対応するが、それは、本方法が生体物質の試料のメラニン含有量を定量するのに好適であることを更に示す。
【００５２】
本明細書に開示される寸法及び値は、列挙された正確な数値に厳しく限定されるものとして理解されるべきでない。むしろ、別段の指定がない限り、かかる寸法の各々は、記載された値及びその値の周辺の機能的に同等な範囲の両方を意味するものとする。例えば、「４０ｍｍ」と開示される寸法は、「約４０ｍｍ」を意味することが意図される。
【００５３】
本発明の「発明を実施するための形態」で引用したすべての文献は、関連部分において本明細書に参考として組み込まれるが、いずれの文献の引用も、それが本発明に関して先行技術であることを容認するものとして解釈されるべきではない。本書における用語の任意の意味又は定義が、参照により援用された文献における同一の用語の任意の意味又は定義と相反する限りにおいては、本書においてその用語に与えられた意味又は定義の方を優先するものとする。
【００５４】
本発明の特定の実施形態を例示及び説明してきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱せずに、他の様々な変更及び修正を行うことができることは当業者には明白であろう。したがって、本発明の範囲内に含まれるそのような全ての変更及び修正は、添付の「特許請求の範囲」にて網羅することを意図したものである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【国際調査報告】
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