(57)【要約】本発明は、プロピオン酸塩によって誘導可能なプロモーターによって所定の遺伝子の調節された発現を行う、微生物を使用したアミノ酸及びケト酸の製造方法に関する。
2016519949.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オペレーター活性を有するポリヌクレオチドを複製可能な形態で含むコリネバクテリウム属細菌を培地内で発酵させることによってＬ−ロイシン、Ｌ−バリン及びＬ−イソロイシンから選択されるＬ−アミノ酸又はα−ケトイソ吉草酸、α−ケトメチル吉草酸及びα−ケトイソカプロン酸から選択されるα−ケト酸を製造する方法であって、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１、２又は３の位置１〜１２１の配列と少なくとも８５％の相同性を有する配列を有し、前記ポリヌクレオチドには、ＰｒｐＲ活性化因子が結合しており、プロモーター活性を有し、アセト乳酸合成酵素のサブユニットをコードするｉｌｖＢ及びｉｌｖＮ遺伝子を有する第２のポリヌクレオチドが３’末端に存在し、前記ポリヌクレオチドは、ＰｒｐＲ活性化因子の添加によってｉｌｖＢＮ遺伝子の転写を調節し、前記方法は、所望のＬ−アミノ酸又はα−ケト酸が前記培地又は細胞内において濃縮される条件下で、誘導物質を使用しない第１段階（増殖段階）の後の第２段階において前記培地にプロピオン酸塩又は２−メチルクエン酸を誘導物質として添加し、所望のＬ−アミノ酸又はα−ケト酸を合成することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記オペレーター活性を有するポリヌクレオチドが、配列番号１、２又は３の位置２２〜４９の配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２、９４又は９６％、特に好ましくは１００％の相同性を有する配列を有するポリヌクレオチド（「ＩＲ  １」）と、配列番号１、２又は３の位置７７〜１０５の配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２、９４又は９６％、特に好ましくは１００％の相同性を有する配列を有するポリヌクレオチド（「ＩＲ  ２」）と、を含み、前記オペレーター活性を有するポリヌクレオチドが、好ましくは、配列番号１、２又は３の位置１〜１２１の配列と、少なくとも９０、９２、９４又は９６％、特に好ましくは１００％の相同性を有する配列を有するポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロモーター活性を有するポリヌクレオチドが、配列番号４の位置１２２〜２０６の配列と、少なくとも９０、９２、９４又は９６％、好ましくは少なくとも９７、９８又は９９％、特に好ましくは１００％の相同性を有する配列を有するポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｉｌｖＢ遺伝子が、配列番号９の配列と、少なくとも９０、９２、９４又は９６％、好ましくは少なくとも９７、９８又は９９％、特に好ましくは１００％の相同性を有する配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、前記ｉｌｖＮ遺伝子が、配列番号１０の配列と、少なくとも９０、９２、９４又は９６％、好ましくは少なくとも９７、９８又は９９％、特に好ましくは１００％の相同性を有する配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
所望のＬ−アミノ酸又はα−ケト酸の生合成経路の酵素が増幅された状態（特に、過剰発現した状態）で存在する微生物及び／又は所望のＬ−アミノ酸又はα−ケト酸の生成を減少させるように代謝経路が少なくとも部分的に弱められた微生物を使用することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
Ｌ−バリンを合成することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
培養段階において、使用するコリネバクテリウム属細菌が少なくとも１６世代、好ましくは少なくとも２４世代にわたって培養され、発酵が、少なくとも４段階を含み、好ましくは振盪フラスコ、プレシード発酵槽、シード発酵槽及び製造発酵槽からなることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
オペレーター活性を有し、配列番号１、２又は３の位置１〜１２１の配列と少なくとも８５％の相同性を有する配列を有するポリヌクレオチドの、アセト乳酸合成酵素をコードするｉｌｖＢＮ遺伝子、好ましくはｉｌｖＢＮ遺伝子及びｉｌｖＢＮ遺伝子の上流のプロモーターの発現を調節するための使用。
【請求項９】
オペレーター活性を有し、配列番号１、２又は３の位置１〜１２１の配列と少なくとも８５％の相同性を有する配列を有するポリヌクレオチドと、好ましくは配列番号４の位置１２２〜２０６の配列と少なくとも９０％の相同性を有する配列を有する下流のプロモーターと、アセト乳酸合成酵素をコードするｉｌｖＢＮ遺伝子と、を含むことを特徴とする発現カセット。
【請求項１０】
請求項９に記載の発現カセットを含むことを特徴とするベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載の発現カセット又は請求項１０に記載のベクターの、微生物、好ましくはコリネバクテリウム属細菌におけるｉｌｖＢＮ遺伝子の発現のための使用。
【請求項１２】
請求項９に記載の発現カセット又は請求項１０に記載のベクターを複製可能な形態で含む、微生物、好ましくはコリネバクテリウム属細菌、特に好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカム。
【請求項１３】
前記発現カセットが前記微生物の染色体に組み込まれていることを特徴とする、請求項１２に記載の微生物。
【請求項１４】
Ｌ−ロイシン、Ｌ−バリン及びＬ−イソロイシンから選択されるＬ−アミノ酸、好ましくはＬ−バリン又はケトイソ吉草酸、ケトメチル吉草酸及びケトイソカプロン酸から選択されるα−ケト酸を生成することを特徴とする、請求項１２又は１３に記載の微生物。
【請求項１５】
Ｌ−バリンを生成すると共に、Ｌ−バリンの生合成経路の酵素が増幅された状態、特に過剰発現した状態で存在する、及び／又はＬ−バリンの生成を減少させる代謝経路が少なくとも部分的に弱められていることを特徴とする、請求項１４に記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロピオン酸塩によって誘導可能なプロモーターによって所定の遺伝子の調節された発現を行う、微生物を使用したアミノ酸及びケト酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸及びケト酸は、ヒト用医薬品や、製薬業界、化粧品業界、食品業界及び動物栄養における用途に使用されている。
【０００３】
これらの化合物の多くは、コリネ型細菌株、特にコリネバクテリウム・グルタミカムの発酵によって製造されている。これらの化合物は非常に重要であるため、製造プロセスの改良が絶え間なく行われている。製造プロセスの改良としては、例えば、酸素の撹拌及び供給等の発酵手段の改良や、発酵時の糖濃度等の栄養培地の組成の改良、イオン交換クロマトグラフィー等によって製品の得るための手段の改良、微生物の固有の特性の改良が含まれる。
【０００４】
微生物の特性を改良するために、突然変異生成、選別及び突然変異体選別が使用されている。これにより、例えば、バリン類似体の２−チアゾールアラニン又はロイシン類似体の４−アザロイシン又は５，５，５−トリフルオロロイシン等の代謝拮抗剤耐性を有し、Ｌ−アミノ酸であるＬ−バリン又はＬ−ロイシン等の化合物を生成する株を得ている。
【０００５】
例えば、各アミノ酸生合成遺伝子を増幅又は弱めると共に、生成時に遺伝子発現を一時的に調節し、化合物の生成に対する影響を調べることにより、Ｌ−アミノ酸生成コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株を改良する遺伝子組換え技術が使用されている。
【０００６】
コリネバクテリウム・グルタミカムの生物学的、遺伝子学的及び生物工学的な説明は、非特許文献１及び２に記載されている。
【０００７】
コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノムのヌクレオチド配列は、非特許文献３及び４及び特許文献１に記載されている。
【０００８】
また、コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノムのヌクレオチド配列は、ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）（静岡県三島市）内のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（米国メリーランド州ベセスダ）のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）のデータベース又はＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＥＭＢＬ）（ドイツ・ハイデルベルグ及びイギリス・ケンブリッジ）のヌクレオチド配列データベースから入手することができる。
【０００９】
基本的に、遺伝子の発現には２つの可能性がある。連続的な発現では、遺伝子は構成的プロモーターによって連続的に発現し、対応するタンパク質が細胞内に蓄積する。
【００１０】
一方、誘導性発現では誘導性プロモーターを使用する。すなわち、標的遺伝子の発現を誘導物質によって誘導する（可能とする）。この方法は、（過剰）発現が生成生物に悪影響を与える場合に使用される。そのような悪影響の原因は、増殖段階における代謝リソースの高い負荷である。その結果、増殖が遅くなり、バイオリアクターの作動時間が増加し、工業的生産の場合にはコストが上昇する。また、誘導性発現は、細胞毒性生成物の場合にも有利である。自家中毒及び細胞死は発現の誘導後に生じる。従って、製造プロセスの経済性の点から、プロセスを増殖段階と生成段階に細分する試みがなされている。増殖段階では、できるだけ大量の細胞集団を生成し、生成段階では、プロモーターによる誘導によって標的タンパク質を生成する。これにより、収率を最大化し、経済性を向上させることができる。
【００１１】
調節可能な大腸菌のｌａｃ、ラムダＰＬ及びｔｒｐプロモーターは、様々な遺伝子の調節された発現のためにコリネ型細菌に対して使用することができることが示されている（非特許文献５）。
【００１２】
理想的な誘導性プロモーターは、入手が容易で安価な物質によって調節されるコリネ型プロモーターである。
【００１３】
特許文献２は、コリネバクテリウム属細菌に由来する誘導性プロモーター（イソクエン酸リアーゼ遺伝子）の、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ及びＩＣＬ等の酵素並びにインシュリン及びα−、β−又はγ−インターフェロン等の生理的活性タンパク質の製造のための使用を開示している。特許文献１に開示されたプロモーターは、糖とは異なる炭素源（Ｃ供給源）が培地に存在している場合にのみ遺伝子の発現を生じさせ、糖が存在する場合には遺伝子の発現は抑制される。しかしながら、糖はＣ供給源として通常の発酵媒体に使用されるため、糖の存在下であっても、安価な誘導物質を使用して遺伝子の発現を生じさせる調節可能なプロモーターを提供することが有益である。
【００１４】
特許文献３は、コリネバクテリウム属細菌に由来する誘導性プロモーター（リンゴ酸シンターゼ遺伝子ａｃｅＢ）の、タンパク質の製造のための使用を開示しており、誘導物質としては、炭素源である乳酸、ピルビン酸又は酢酸を使用している。
【００１５】
プロピオン酸塩の存在下での増殖のための主要なＣ供給源として必須であり。２−メチルクエン酸脱水酵素（ＰｒｐＤ２）、２−メチルイソクエン酸リアーゼ（ＰｒｐＢ２）及び２−メチルクエン酸シンターゼ（ＰｒｐＣ２）をコードする遺伝子を有するコリネバクテリウム・グルタミカムのｐｒｐＤＢＣ２オペロンのプロモーターが非特許文献６に記載されている。プロモーター試験ベクター構造の分析により、ＰｒｐＲ活性化因子によるプロピオン酸塩誘導転写に必要な、ｐｒｐＤＢＣ２オペロンの上流の１２１塩基対の長さのオペレーター領域が同定されている。ＥＭＳＡ研究によれば、２−メチルクエン酸がおそらくはＰｒｐＲのコアクチベーターとして機能することが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】欧州特許出願公開第１  １０８  ７９０号
【特許文献２】欧州特許第０５３０７６５  Ｂ１号（協和発酵）
【特許文献３】ドイツ特許第４４４０１１８  Ｃ１号（米国特許第５，９６５，３９１号（ユーリッヒ研究センター））
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ」（Ｅｄｓ．：Ｌ．Ｅｇｇｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍ．Ｂｏｔｔ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ，２００５），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｈｉｅｆ  Ｅｄｉｔｏｒ：Ａ．Ｐuｈｌｅｒ），「ｇＡ  Ｎｅｗ  Ｅｒａ  ｉｎ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０４／１−３，（２００３））
【非特許文献２】Ｔ．Ｓｃｈｅｐｅｒ（Ｍａｎａｇｉｎｇ  Ｅｄｉｔｏｒ），「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌ−Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ」（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７９，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２００３）
【非特許文献３】Ｉｋｅｄａ  ａｎｄ  Ｎａｋａｇａｗａ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６２，９９−１０９（２００３））
【非特許文献４】Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０４／１−３，（２００３））
【非特許文献５】Ｔｓｕｃｈｉｙａ  ａｎｄ  Ｍｏｒｉｎａｇａ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６（１９８８）４２８−４３１
【非特許文献６】Ｐｌａｓｓｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５９／１−２（２０１２））
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、Ｌ−アミノ酸（Ｌ−ロイシン、Ｌ−バリン又はＬ−イソロイシン、好ましくはＬ−バリン）又はα−ケト酸（α−ケトイソ吉草酸、α−ケトメチル吉草酸又はα−ケトイソカプロン酸）を、好ましくは高い収率及び／又は生成物の細胞内及び／又は培地内最終濃度で製造する新規な方法を提供することを目的とする。好ましくは、特定の収率（使用する炭素源に対する所望の生成物の収率）を向上させる。
【００１９】
上記方法は、培地の主要な炭素源とは無関係に、Ｌ−アミノ酸及び／又はα−ケト酸の生成を調節することができることが好ましい。
【００２０】
また、望ましくない副生成物の生成、特に、望ましくない副生成物であるアラニンの生成をできるだけ抑制することが好ましい。すなわち、望ましくない副生成物の分離には手間とコストがかかり、培養液の生成物純度及び炭素収率も悪影響を受けるためである。
【００２１】
さらに、使用するプロセスは、製造に使用する株の遺伝的安定性を向上させるものであることが好ましく、製造量を低下させることなく、発酵過程（培養段階及び主発酵槽）において世代数を増加させることを可能とするものであることが好ましい。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明の目的は、ＰｒｐＲ活性化因子が結合したオペレーターの、ｉｌｖＢＮ遺伝子の発現の調節のための使用によって達成される。
【００２３】
ｉｌｖＢＮ（ＥＣ  Ｎｏ．４．１．３．１８）は、アセト乳酸合成酵素のサブユニットをコードする遺伝子である。
【００２４】
本発明は、オペレーター活性を有するポリヌクレオチドを複製可能な形態で含むコリネバクテリウム属細菌を培地内で発酵させることによってＬ−ロイシン、Ｌ−バリン及びＬ−イソロイシンから選択されるＬ−アミノ酸、好ましくはＬ−バリン又はケトイソ吉草酸、ケトメチル吉草酸及びケトイソカプロン酸から選択されるα−ケト酸を製造する方法であって、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１、２又は３の位置１〜１２１の配列と、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０、９２、９４又は９６％、より好ましくは少なくとも９７、９８又は９９％、特に好ましくは１００％の相同性を有する配列を有し、前記ポリヌクレオチドには、ＰｒｐＲ活性化因子が結合しており、プロモーター活性を有し、アセト乳酸合成酵素のサブユニットをコードするｉｌｖＢ及びｉｌｖＮ遺伝子を有する第２のポリヌクレオチドが３  ｆ末端に存在し、前記ポリヌクレオチドは、活性化補助因子である２−メチルクエン酸によって活性化されるＰｒｐＲ活性化因子の添加によってｉｌｖＢＮ遺伝子の転写を調節し、前記方法は、所望のＬ−アミノ酸又はα−ケト酸が前記培地又は細胞内において濃縮される条件下で、誘導物質を使用しない第１段階の後の第２段階において前記培地にプロピオン酸塩又は２−メチルクエン酸を誘導物質として添加し、ｉｌｖＢＮ遺伝子を発現させ、所望のＬ−アミノ酸又はα−ケト酸を合成することを特徴とする方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢ（プラスミド）のマップである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
オペレーター活性を有するポリヌクレオチドは、コリネ型細菌内において２−メチルクエン酸脱水酵素の発現を調節するオペレーター又はそのようなオペレーターに由来するポリヌクレオチドであることが好ましい。
【００２７】
オペレーター活性を有するポリヌクレオチドは、配列番号１１の配列又は配列番号１、２又は３の位置２２〜４９の配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２、９４又は９６％、より好ましくは少なくとも９７、９８又は９９％、特に好ましくは１００％の相同性を有する配列を有するポリヌクレオチド（以下、「ＩＲ  １」ともいう）と、配列番号１２の配列又は配列番号１、２又は３の位置７７〜１０５の配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２、９４又は９６％、より好ましくは少なくとも９７、９８又は９９％、特に好ましくは１００％の相同性を有する配列を有するポリヌクレオチド（以下、「ＩＲ  ２」ともいう）と、を含むことが好ましい。好適な実施形態では、配列ＩＲ  １は、オペレーター活性を有するポリヌクレオチドの位置２２〜４９に存在し、配列ＩＲ  ２は、オペレーター活性を有するポリヌクレオチドの位置７７〜１０５に存在する。
【００２８】
本発明の好適な実施形態では、オペレーター活性を有するポリヌクレオチドは、より長鎖のポリヌクレオチド、好ましくは、配列番号１、２又は３の位置１〜１７７の配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２、９４又は９６％、より好ましくは少なくとも９７、９８又は９９％、特に好ましくは１００％の配列相同性を有するポリヌクレオチドの一部である。
【００２９】
ｉｌｖＢ遺伝子は、配列番号９のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２、９４又は９６％、より好ましくは少なくとも９７、９８又は９９％、特に好ましくは１００％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。
【００３０】
ｉｌｖＢ遺伝子は、配列番号８の位置４９９〜２３７９の配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２、９４又は９６％、より好ましくは少なくとも９７、９８又は９９％、特に好ましくは１００％の相同性を有する配列を有するポリヌクレオチドであることが特に好ましい。
【００３１】
ｉｌｖＮ遺伝子は、配列番号１０のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２、９４又は９６％、より好ましくは少なくとも９７、９８又は９９％、特に好ましくは１００％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。
【００３２】
ｉｌｖＮ遺伝子は、配列番号８の位置２３９３〜２９１１の配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２、９４又は９６％、より好ましくは少なくとも９７、９８又は９９％、特に好ましくは１００％の相同性を有する配列を有するポリヌクレオチドであることが特に好ましい。
【００３３】
ｉｌｖＢ及びｉｌｖＮ遺伝子によってコードされるポリペプチドは凝集して機能的なアセト乳酸合成酵素を生成する。
【００３４】
プロピオン酸塩又はプロピオン酸を発現の誘導に使用することが好ましい。この場合、「プロピオン酸塩誘導」が生じる。プロピオン酸塩は、生体外において活性化補助因子である２−メチルクエン酸に転化する。誘導のために２−メチルクエン酸を直接使用することもできるが、入手性の点からプロピオン酸塩又はプロピオン酸の方が好ましい。本発明に関連して使用する「プロピオン酸塩誘導」という用語は２−メチルクエン酸による誘導も含む。
【００３５】
製造後、所望のＬ−アミノ酸又はα−ケト酸を単離することが好ましく、発酵液及び／又は細胞集団の他の構成物質の全て又は一部（＞０〜１００％）は単離された生成物に残留していてもよく、完全に除去されていてもよい。
【００３６】
本発明に係る方法では、細胞集団を得るための非誘導培養段階（増殖段階、第１段階）を最初に行う。非誘導培養段階では、アミノ酸又はケト酸が全く又はほとんど形成されない（＜５ｇ／Ｌ）ことが好ましい。その後の生成段階（誘導段階、第２段階）では、プロピオン酸塩又は２−メチルクエン酸によるｉｌｖＢＮ遺伝子の生合成の誘導によってアミノ酸又はケト酸を生成させる。培養段階は、好ましくは振盪フラスコ段階を介して培養発酵槽で培養を行う全ての培養工程を含む。また、培養段階は、主発酵の第１段階を含むことができる。培養段階は、遅くとも、主発酵を３〜１５時間、好ましくは５〜１０時間実施した後で完了することが好ましい。
【００３７】
誘導段階は、主発酵槽への播種から主発酵の完了までに０〜２０時間を含むことが好ましい。培養発酵槽内において早い時点で誘導を実施することが有利な場合があり、このような構成も本発明に係る方法の特定の実施形態である。
【００３８】
アミノ酸又はケト酸の合成の誘導を維持すると共に、プロピオン酸塩又は分解中間体（プロピオニル−ＣｏＡ、２−メチルクエン酸）の毒性作用を防止するために、生成段階におけるプロピオン酸濃度を正確に調節／測定することが必要である。誘導段階における好ましいプロピオン酸濃度は０．１〜１０ｇ／Ｌである。誘導段階では、プロピオン酸を連続的に添加するか、１以上のパルスとしてバッチ式に添加することができる。また、プロピオン酸を主発酵培地の構成成分として単回添加することもでき、このような構成も本発明に係る方法の特定の実施形態である。
【００３９】
アミノ酸又はケト酸の生成における大きな問題は、副生成物の生成である。生成された副生成物は炭素収率を減少させ、必要に応じて分離しなければならないため、手間とコストが大きく増加する。
【００４０】
副生成物の生成の例としては、バリンの生合成における副生成物であるアラニンの生成が挙げられる。アラニンの生成は、通常は構成的発現が生じる従来の製造方法では、細胞世代（経代）数に応じて増加する。
【００４１】
３段階プロセス（振盪フラスコ、培養発酵槽、主発酵槽）におけるサンプルの保持から製造発酵槽での収穫における世代数は約２０〜２５世代であり、４段階プロセス（振盪フラスコ、プレシード発酵槽、培養発酵槽、主発酵槽）における世代数は３０世代を超える。世代数が多い場合には、通常は副生成物の生成と細胞集団の生成は対応して大きく増加する。
【００４２】
しかしながら、本発明によれば、副生成物の生成と細胞集団の生成を大きく減少させることができることが判明した。また、本発明に係る製造方法における副生成物の生成と細胞集団の生成は世代数とは関係がないことが判明した。これは、本発明に係るプロセス管理によって使用する株の遺伝的安定性が向上することを示唆している。そのため、培養段階は原則として任意に延長することができ、プロセス管理には特に有利である。
【００４３】
従って、本発明に係る特に好ましい方法は、少なくとも４つの段階、すなわち、少なくとも３つの培養段階と製造段階とを含むことによって従来の方法とは区別される。培養は、振盪フラスコ、プレシード発酵槽及びシード発酵槽内での培養を含むことが好ましい。製造は、製造発酵槽内で行うことが好ましい。
【００４４】
本発明に係る特に好ましい方法は、使用する細菌が培養段階において少なくとも１６世代、好ましくは少なくとも２４世代を経ること、及び／又は発酵全体（培養及び製造を含む）において少なくとも２５世代、好ましくは少なくとも３０世代を経ることによって従来の方法とは区別される。
【００４５】
また、本発明は、オペレーター活性を有すると共にＰｒｐＲ活性化因子が結合したポリヌクレオチドであって、配列番号１、２又は３の位置１〜１２１の配列と、少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、好ましくは少なくとも９７％、特に好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、さらに好ましくは１００％の相同性を有する配列を有するポリヌクレオチドの、ｉｌｖＢＮ遺伝子（好ましくはｉｌｖＢＮ遺伝子及びｉｌｖＢＮ遺伝子の上流のプロモーター）の発現を調節するための使用に関する。
【００４６】
また、本発明は、オペレーター活性を有するポリヌクレオチドであって、配列番号１、２又は３の位置１〜１２１の配列と、少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、好ましくは少なくとも９７％、特に好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、さらに好ましくは１００％の相同性を有する配列を有するポリヌクレオチドと、下流のプロモーターと、アセト乳酸合成酵素をコードするｉｌｖＢＮ遺伝子と、を含む発現カセットに関する。
【００４７】
オペレーター活性を有するポリヌクレオチドは、上述した好ましい特性、特に、保存領域ＩＲ  １及びＩＲ  ２を有することが好ましい。
【００４８】
ｉｌｖＢＮ遺伝子の上流のプロモーター又はオペレーターの下流のプロモーターは、任意のプロモーターであってもよい。
【００４９】
コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて好ましく使用される本発明に係るプロモーターの例は、例えば、Ｐａｔｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０４（１−３），３１１−３２３（２００３））の図１に記載されている。また、Ｖａｓｉｃｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８１，６１８８−６１９１（１９９９））に記載されているｄａｐＡプロモーター、例えばプロモーターＡ２５の変異体も使用することができる。また、コリネバクテリウム・グルタミカムのギャッププロモーター（欧州特許出願第０６００７３７３号）も使用することができる。さらに、Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅｓ  ６９（２），３０１−３１５（１９８８））及びＡｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｂｒｏｓｉｕｓ（Ｇｅｎｅｓ  ４０（２−３），１８３−１９０（１９８５））に記載されている周知のプロモーターＴ３、Ｔ７、ＳＰ６、Ｍ１３、ｌａｃ、ｔａｃ及びｔｒｃも使用することができる。
【００５０】
好適な実施形態では、本発明において使用するプロモーターは、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドであって、配列番号４の位置１２２〜２０６の配列と、少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、好ましくは少なくとも９７％、特に好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、さらに好ましくは１００％の相同性を有する配列を有するポリヌクレオチドである。
【００５１】
本発明に係る発現カセットは、配列番号１３の配列を有する発現カセットであることが好ましい。
【００５２】
また、本発明は、本発明に係る発現カセットを含むベクターに関する。
【００５３】
Ｋｉｒｃｈｎｅｒ  ａｎｄ  Ｔａｕｃｈ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０４：２８７−２９９（２００３））には、コリネバクテリウム・グルタミカムに好ましく使用されるベクターが記載されている。
【００５４】
本発明に係るベクターを使用した相同組換えにより、本発明に係る発現カセットのための染色体上のＤＮＡ部分を置換し、ベクターによって細胞に導入することができる。ベクターの環状なＤＮＡ分子と染色体上の標的ＤＮＡとの間の効率的な組換えのために、本発明に係る発現カセットを含む置換対象のＤＮＡ領域は、標的部位に対して相同性を有するヌクレオチド配列を末端に有し、ベクターの組み込み部位又はＤＮＡの置換部位を特定できるようになっている。
【００５５】
本発明に係る発現カセットの導入は、ｉｌｖＢＮ遺伝子、好ましくはネイティブのｉｌｖＢＮ遺伝子のネイティブの遺伝子部位において行うことができ、必要に応じてｉｌｖＢＮ遺伝子のネイティブなプロモーターも本発明に係る発現カセットによって置換することができる。
【００５６】
あるいは、本発明に係る発現カセットは、コード機能を有していない染色体の遺伝子間領域又は好ましくは細胞成長及びアミノ酸又はケト酸の生成に必須ではない染色体上のヌクレオチド配列である遺伝子部位に導入することもできる。
【００５７】
また、好適な実施形態では、本発明に係る発現カセットは、複写染色体及び必要に応じて異なる遺伝子部位に導入することもできる。
【００５８】
本発明に係る発現カセットを染色体に導入する代わりに、本発明において使用するオペレーターを、プロモーターと共に、ｉｌｖＢＮ遺伝子のネイティブの遺伝子部位に導入することができ、好ましくは、ｉｌｖＢＮ遺伝子のネイティブのプロモーターを、オペレーターとプロモーターからなる構造によって置換する。
【００５９】
また、本発明に係る発現カセットを染色体に導入する代わりに、本発明に係る発現カセットを含む染色体外複製ベクターを使用することもできる。
【００６０】
また、本発明は、本発明に係る発現カセット及び／又は本発明に係るベクターを含む微生物、好ましくはコリネバクテリウム属細菌、特にＬ−ロイシン、Ｌ−バリン及びＬ−イソロイシンから選択されるＬ−アミノ酸又はケトイソ吉草酸、ケトメチル吉草酸及びケトイソカプロン酸から選択されるα−ケト酸を生成するコリネバクテリウム属細菌に関する。
【００６１】
例えば、微生物等の生体内におけるポリヌクレオチドの生化学及び化学的構造の詳細は、Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ（生化学）」，（Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（ドイツ・ベルリン），２００３；ＩＳＢＮ  ３−８２７４−１３０３−６）に記載されている。
【００６２】
ポリヌクレオチドが核酸塩基又は塩基（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ））を含むデオキシリボヌクレオチドモノマーからなる場合、デオキシリボポリヌクレオチド又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）について述べる。ポリヌクレオチドが核酸塩基又は塩基（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））を含むリボヌクレオチドモノマーからなる場合、リボポリヌクレオチド又はリボ核酸（ＲＮＡ）について述べる。上記ポリヌクレオチドでは、モノマーは３’→５’−ホスホジエステル結合によって互い共有結合している。
【００６３】
「オペレーター活性を有するポリヌクレオチド」又は「オペレーター」とは、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドによって転写されるポリヌクレオチドに機能的に結合し、様々な調節タンパク質（リガンド又はエフェクター分子と相互作用する活性化因子又はリプレッサー）との相互作用によってポリヌクレオチドの転写を調節するポリヌクレオチド、好ましくはデオキシリボポリヌクレオチド又は核酸、好ましくデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を意味する。
【００６４】
「プロモーター活性を有するポリヌクレオチド」又は「プロモーター」とは、転写されるポリヌクレオチドに機能的に結合し、ポリヌクレオチドの転写の開始点及び開始頻度を特定し、制御されたポリヌクレオチドの発現レベルに影響を及ぼすことができるポリヌクレオチド、好ましくはデオキシリボポリヌクレオチド又は核酸、好ましくデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を意味する。
【００６５】
ＤＮＡの二本鎖構造に関して、本発明は、配列番号１、２又は３の配列の相補鎖にも関する。
【００６６】
「転写」とは、ＤＮＡマトリックスから開始して相補的なＲＮＡ分子を生成するプロセスを意味する。ＲＮＡポリメラーゼ、シグマ因子及び転写調節タンパク質等のタンパク質がこのプロセスに関与する。合成されたＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ（ｍ−ＲＮＡ））は翻訳過程においてマトリックスとして機能し、ポリペプチド又はタンパク質が得られる。
【００６７】
遺伝子は、化学的観点から見た場合にはポリヌクレオチドである。タンパク質／ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、「遺伝子」という用語と同義に使用する。従って、「遺伝子」及び「コード領域」という用語並びに「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は同義に使用する。
【００６８】
「機能的な下流の結合（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ  ｏｒ  ｌｉｎｋａｇｅ）」とは、本発明に係るオペレーター活性を有するポリヌクレオチド、プロモーター活性を有する第２のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドの転写に寄与するオリゴ又はポリヌクレオチドの連鎖配列を意味する。
【００６９】
第２のポリヌクレオチドが、開始コドンで開始し、終止コドン及び転写ターミネーターを含むポリペプチドのコード領域からなるポリペプチド／タンパク質をコードするポリヌクレオチドである場合、「機能的な下流の結合」とは、第２のポリヌクレオチドの転写及び合成されたＲＮＡの翻訳が生じる連鎖配列を意味する。
【００７０】
第２のポリヌクレオチドは、１以上のポリペプチドをコードする。タンパク質／ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＡＴＧ、ＧＴＧ及びＴＴＧ、好ましくはＡＴＧ及びＧＴＧ、特に好ましくはＡＴＧからなる群から選択される、タンパク質をコードする配列の開始コドンと、ＴＡＡ、ＴＡＧ及びＴＧＡからなる群から選択される１以上の終止コドンと、から実質的になる。
【００７１】
第２のポリヌクレオチドが複数のタンパク質／ポリペプチドをコードする場合、各遺伝子の前にリボソーム結合部位が存在していてもよい。最後の遺伝子の後には、必要に応じてターミネーターが存在する。
【００７２】
第２のポリヌクレオチドは、アセト乳酸合成酵素のサブユニットをコードするｉｌｖＢ及びｉｌｖＮ遺伝子からなる（ＩｌｖＢＮ、ＥＣ  Ｎｏ．４．１．３．１８）。
【００７３】
また、本発明は、本発明に係る発現カセット又は本発明に係るベクターの、微生物内におけるｉｌｖＢＮ遺伝子の発現のための使用に関する。本発明に係る発現カセットにより、合成されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ（アセト乳酸合成酵素の２つのサブユニット）のポリペプチドへの転写及び翻訳を行うことができる。
【００７４】
本発明に係る発現カセットを使用して、微生物内においてｉｌｖＢＮ遺伝子を所望の時に発現又は過剰発現させることができる。
【００７５】
過剰発現とは、開始株（親株）又は野生型株と比較した場合の、リボ核酸、タンパク質（ポリペプチド）又は酵素の細胞内濃度又は活性の上昇を通常は意味する。開始株（親株）とは、過剰発現を生じさせる手段が適用させる株を意味する。
【００７６】
過剰発現の場合には、組換え型の過剰発現が好ましい。試験管内で調製したＤＮＡ分子を使用して微生物を製造する方法を使用することができる。そのようなＤＮＡ分子は、例えば、プロモーター、発現カセット、遺伝子、対立遺伝子、コード領域等を含む。これらは、形質転換、接合、形質導入等の方法によって所望の微生物に変換される。
【００７７】
本発明において使用するオペレーター及び／又は本発明に係る発現カセットを使用した過剰発現により、アセト乳酸合成酵素の活性又は濃度は、過剰発現を生じさせる手段を実施する前の株におけるポリペプチドの活性又は濃度に対して、通常は少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％又は５００％、好ましくは１０００％、２０００％、４０００％、１０，０００％又は２０，０００％増加する。
【００７８】
発現又は過剰発現の程度は、遺伝子によって転写されたｍＲＮＡの量の測定、ポリペプチドの量の測定及び酵素活性の測定によって判断することができる。
【００７９】
ｍＲＮＡの量の測定は、ノーザンブロット法及び定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して行うことができる。定量的ＲＴ−ＰＣＲでは、ポリメラーゼ連鎖反応の前に逆転写を行う。例えば、Ｊｕｎｇｗｉｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２８１，１９０−１９７（２００８））に記載されているように、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商品名）  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（ドイツ・マンハイム）製）を使用することができる。ゲル中のタンパク質の濃度は、適切な分析ソフトウェアを使用して、一次元及び二次元タンパク質ゲル分離及びタンパク質濃度の光学的同定を行うことによって測定することができる。コリネ型細菌を使用する場合のタンパク質ゲルの調製方法及びタンパク質の同定方法は、Ｈｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２２：１７１２−２３（２００１））に記載されている。また、タンパク質濃度は、検出対象のタンパク質に特異的な抗体を使用したウェスタンブロットハイブリダイゼーション（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ  Ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）及び適切な濃度測定ソフトウェアを使用した光学的評価（Ｌｏｈａｕｓ  ａｎｄ  Ｍｅｙｅｒ（１９９８）  Ｂｉｏｓｐｅｋｔｒｕｍ  ５：３２−３９；Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  ３２１：２６３０−２６４７（１９９９））によって測定することができる。集めたデータの統計的有意性はＴ試験によって決定する（Ｇｏｓｓｅｔ，Ｂｉｏｍｅｔｒｉｋａ  ６（１）：１−２５（１９０８））。
【００８０】
本発明において使用するオペレーターを使用するｉｌｖＢＮ遺伝子の過剰発現は、その他の過剰発現と適切に組み合わせることができる。
【００８１】
過剰発現は公知の様々な方法で達成することができる。例えば、遺伝子の発現を調節又は制御するヌクレオチド配列の変性や、コピー数の増加が挙げられる。
【００８２】
コピー数の増加は、微生物の細胞質内で複製するプラスミドによって行われる。遺伝子のコピー数の所望の増加を調節することができる、様々な微生物のための多くのプラスミドが公知である。コリネバクテリウム属細菌に適したプラスミドは、例えば、Ｔａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０４（１−３），２７−４０，（２００３））及びＳｔａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７１，５９２０−５９２８（２００５））に記載されている。
【００８３】
少なくとも１つのコピーによるコピー数の増加は、微生物の染色体にさらなるコピーを挿入することによっても行うことができる。コリネバクテリウム属細菌に適した方法は、例えば、国際公開第０３／０１４３３０号、国際公開第０３／０４０３７３号及び国際公開第０４／０６９９９６号に記載されている。
【００８４】
また、遺伝子発現の増加は、複数のプロモーターを所望の遺伝子の前に配置するか、発現させる遺伝子に機能的に結合させることによって行うことができる。そのような方法は、国際公開第２００６／０６９７１１号に記載されている。
【００８５】
伸長速度はコドンの使用によって影響を受ける。開始株における転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）に対するコドンの使用により、翻訳を増加させることができる。また、多くの微生物（大腸菌の７７％）において最も頻繁に生じるコドンＡＴＧによる開始コドンの交換は、大きく翻訳を増加させる。すなわち、ＲＮＡレべルでは、コドンＡＵＧは、例えば、コドンＧＵＧ及びＵＵＧよりも２〜３倍効果的である（Ｋｈｕｄｙａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２３２（２）：３６９−７１  （１９８８）；Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ  ８２（１７）：５６５６−６０（１９８５））。また、開始コドンと隣接領域との間の相互作用を考慮して、開始コドンの配列環境を最適化することができる（Ｓｔｅｎｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２７３（２）：２５９−６５（２００１）；Ｈｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３（３）：６２３−９（１９８４））。
【００８６】
ＤＮＡの取り扱い、ＤＮＡの消化及び連結、形質転換体の変換及び選択に関する説明は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている。
【００８７】
本発明の好適な実施形態では、所望のＬ−アミノ酸又はα−ケト酸の生合成経路の遺伝子が増幅された状態（特に、過剰発現した状態）で存在する微生物を使用する。
【００８８】
Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、α−ケトイソ吉草酸、α−ケト−β−メチル吉草酸又はα−ケトイソカプロン酸の生成に関して、好ましくは、以下の群から選択される、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、α−ケトイソ吉草酸、α−ケト−β−メチル吉草酸又はα−ケトイソカプロン酸の生合成の酵素をコードする１以上の遺伝子又はポリヌクレオチドをさらに過剰発現させることができ、イソロイシン及びバリンには、遺伝子ｈｏｍ、ｉｌｖＡ、ｉｌｖＣ、ｉｌｖＤ及びｉｌｖＥが特に好ましく、α−ケトイソ吉草酸（ＫＩＶ）及びα−ケト−β−メチル吉草酸（ＫＭＶ）には遺伝子ｉｌｖＣ及びｉｌｖＤが特に好ましく、α−ケトイソカプロン酸（ＫＩＣ）には、遺伝子ｉｌｖＣ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＡ、ｌｅｕＢ、ｌｅｕＣ及びｌｅｕＤが特に好ましい。
ａ）イソメロレダクターゼ（ＩｌｖＣ、ＥＣ  Ｎｏ．１．１．１．８６）をコードするポリヌクレオチド（ｉｌｖＣ遺伝子）
ｂ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＩｌｖＤ、ＥＣ  Ｎｏ．４．２．１．９）をコードするポリヌクレオチド（ｉｌｖＤ遺伝子）
ｃ）トランスアミナーゼ（ＩｌｖＥ、ＥＣ  Ｎｏ．２．６．１．４２）をコードするポリヌクレオチド（ｉｌｖＥ遺伝子）
ｄ）トレオニンデヒドラターゼ（ＩｌｖＡ、ＥＣ  Ｎｏ．４．３．１．１９）をコードするポリヌクレオチド（ｉｌｖＡ遺伝子）
ｅ）ホモセリンデヒドロゲナーゼ（Ｈｏｍ、ＥＣ  Ｎｏ．１．２．１．１１）をコードするポリヌクレオチド（ｈｏｍ遺伝子）
ｆ）ホモセリンキナーゼ（ＴｈｒＢ、ＥＣ  Ｎｏ．２．７．１．３９）をコードするポリヌクレオチド（ｔｈｒＢ遺伝子）
ｇ）トレオニンシンターゼ（ＴｈｒＣ、ＥＣ  Ｎｏ．４．２．３．１）をコードするポリヌクレオチド（ｔｈｒＣ遺伝子）
ｈ）イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ＬｅｕＡ、ＥＣ  Ｎｏ．２．３．３．１３）をコードするポリヌクレオチド（ｌｅｕＡ遺伝子）
ｉ）イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＬｅｕＢ、ＥＣ  Ｎｏ．１．１．１．８５）をコードするポリヌクレオチド（ｌｅｕＢ遺伝子）
ｊ）イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ（ＬｅｕＣ、ＥＣ  Ｎｏ．４．２．１．３３）をコードするポリヌクレオチド（ｌｅｕＣ遺伝子）
ｋ）イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ（ＬｅｕＤ、ＥＣ  Ｎｏ．４．２．１．３３をコードするポリヌクレオチド（ｌｅｕＤ遺伝子）
【００８９】
好適な実施形態では、所望のＬ−アミノ酸又はα−ケト酸の生成を減少させる代謝経路が少なくとも部分的に弱められた微生物を使用する。
【００９０】
バリン又はケトイソ吉草酸の生成が好ましい場合には、イソロイシン（前駆体α−ケト酪酸の生成用：ｉｌｖＡ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｈｏｍ）及び／又はロイシン（ｌｅｕＡ、ｌｅｕＢ、ｌｅｕＣＤ）の代謝経路を弱めることができる。イソロイシン又はケトメチル吉草酸の生成が好ましい場合には、ロイシンの生合成経路を弱めることができる。ロイシン又はケトイソカプロン酸の生成が好ましい場合には、イソロイシン（又は前駆体α−ケト酪酸）の生合成経路を弱めることができる。
【００９１】
ここで、代謝経路等を「弱める」とは、細菌中の適切なＤＮＡによってコードされる１以上の酵素（タンパク質）の細胞内活性を、例えば、弱いプロモーターを使用するか、低い活性を有する適切な酵素をコードするか、適切な遺伝子又は酵素（タンパク質）を不活化する遺伝子又は対立遺伝子するか、これらの手段を必要に応じて組み合わせることにより、低下又はオフにすることを意味する。各標的遺伝子は、例えば、遺伝子を完全又は部分的に削除するか、構造遺伝子、プロモータ領域又はリボソーム結合部位に点突然変異を挿入することにより、完全又は部分的に弱めることができる。また、遺伝子発現は、長鎖のアンチセンスＲＮＡの合成のため短鎖のオリゴデオキシヌクレオチド又はベクターを標的細胞に導入する（接触させる）アンチセンス法によって低下させることもできる。アンチセンスＲＮＡは特異的ｍＲＮＡの相補部分に結合し、それらの安定性を低下させるか、翻訳を防止することができる。アンチセンス法の例は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０００  Ｏｃｔ；６６（１０）：４３６６-４３７１）に記載されている。アンチセンス法は、本発明に係るオペレーター／プロモーターを使用して実施することもでき、この場合には、標的遺伝子に続く「アンチセンス」方向でクローニングを行う。誘導物質であるプロピオン酸塩を添加した後、弱める標的遺伝子の相補鎖のｍＲＮＡの生成を誘導する。アンチセンスｍＲＮＡを標的遺伝子のｍＲＮＡに追加することにより、標的遺伝子の発現を減少させることができる。ｉｌｖＢＮ遺伝子の調節された発現又は過剰発現又はＬ−アミノ酸及び／又はα−ケト酸の生成は、コリネバクテリウム属細菌内で実施することが好ましい。コリネバクテリウム属細菌としては、コリネバクテリウム・エフィシェンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）（ＤＳＭ４４５４９として寄託）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）（ＡＴＣＣ１３０３２として寄託）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）（ＡＴＣＣ６８７１として寄託）に基づく株が好ましい。これらのうち、コリネバクテリウム・グルタミカムが特に好ましい。
【００９２】
コリネバクテリウム・グルタミカムは別の名称でも知られている。それらの例としては、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）（ＡＴＣＣ１３８７０）、コリネバクテリウム・リリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｌｉｕｍ）（ＤＳＭ２０１３７）、コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）（ＡＴＣＣ１７９６５）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）（ＡＴＣＣ１４０６７）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）（ＡＴＣＣ１３８６９）及びブレビバクテリウム・ディバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）（ＡＴＣＣ１４０２０）が挙げられる。
【００９３】
また、コリネバクテリウム・グルタミカムはミクロコッカス・グルタミカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ）とも呼ばれている。コリネバクテリウム・エフィシェンスは、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９等）としても知られている。
【００９４】
本発明に係る方法において使用する微生物又は株（開始株）は、所望のＬ−アミノ酸又はα−ケト酸を培養液に分泌して、蓄積させる能力を持っていることが好ましい。本願明細書においては、「生成」という表現はこのような場合についても使用する。特に、本発明において使用する株は、誘導後に、所望のＬ−アミノ酸又はα−ケト酸を細胞又は培養液内で少なくとも（≧）０．５ｇ／Ｌ＊ｈ、好ましくは少なくとも１．０又は２．０ｇ／Ｌ＊ｈに濃縮又は蓄積させる能力を有することが好ましい。開始株は、突然変異生成及び選別、遺伝子組換え技術又はこれらの組み合わせによって生成された株であることが好ましい。
【００９５】
また、コリネバクテリウム・グルタミカム型株（ＡＴＣＣ１３０３２又はＡＴＣＣ１４０６７）等の野生株に、所望の遺伝子の調節された発現のために本発明において使用するオペレーターを適用し、先行技術で記載された遺伝子的手法によって細菌にアミノ酸又はケト酸を生成させることにより、本発明に係る方法に適した微生物を得ることもできる。
【００９６】
Ｌ−バリンを生成又は分泌するコリネ型細菌としては、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１７６３）（米国特許第５，１８８，９４８号を参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３００７）（米国特許第５，５２１，０７４号を参照）、コリネバクテリウム・グルタミカム（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３００６）（米国特許第５，５２１，０７４号を参照）及びコリネバクテリウム・グルタミカム（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１７６４）（米国特許第５，１８８，９４８号を参照）が挙げられる。
【００９７】
Ｌ−バリンを生成する微生物は、通常はフィードバック抵抗製又は脱感作アセト乳酸合成酵素（ＡＨＡＳ、ＥＣ４．１．３．１８）を有する。上記酵素は、イソロイシン、バリン及びロイシンの合成の平行な代謝経路の第１段階の酵素である（Ｕｍｂａｒｇｅｒ，Ｈ．Ｅ．  １９８７，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｒａｎｃｈｅｄ−ｃｈａｉｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，ｐｐ．３５２−３６７，ｉｎ  Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｊ．Ｌ．Ｉｎｇｒａｈａｍ，Ｋ．Ｂ．Ｌｏｗ，Ｂ．Ｍａｇａｓａｎｉｋ，Ｍ．Ｓｃｈａｅｃｈｔｅｒ，ａｎｄ  Ｈ．Ｅ．Ｕｍｂａｒｇｅｒ（ｅｄ．），Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．）  ホロ酵素は、常に２つの大サブユニットと２つの小サブユニットとからなる。ＡＨＡＳ大サブユニットは、触媒領域を形成し、ｉｌｖＢによってコードされる。調節ドメインとして機能する小サブユニットは、ｉｌｖＮによってコードされる。フィードバック耐性アセト乳酸合成酵素とは、野生型と比較して、分枝アミノ酸（バリン、ロイシン、イソロイシン又はそれらの混合物）による阻害に対して低い感度を有するアセト乳酸合成酵素を意味する。コリネバクテリウム・グルタミカムのアセト乳酸合成酵素の場合、ＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１４０６７（ブレビバクテリウム・フラバム）又はＡＴＣＣ１３８６９（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）が適当な野生型である。
【００９８】
アセト乳酸合成酵素をコードするコリネバクテリウム・グルタミカムのｉｌｖＢＮ遺伝子は、例えば、Ｋｅｉｌｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７５（１７）：５５９５−６０３（１９９３））又は欧州特許第１１０８７９０号に記載されている。遺伝子の配列は、アクセッション番号Ｌ０９２３２（ＧｅｎＢａｎｋ、ＮＣＢＩ）として寄託されている。
【００９９】
分枝アミノ酸（ロイシン、バリン、イソロイシン）によるフィードバック阻害を受けないＡＨＡＳの酵素変異体は、例えば、Ｍｅｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３２５，２７５−２８４（２００３））、Ｅｌｉｓａｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７１，２０７−２１３（２００５））、Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７２（１１），２９５９−２９６５，（２００８））及び欧州特許出願公開第１４９１６３４号に記載されている。フィードバック耐性アセト乳酸合成酵素の変異体としては、ｉｌｖＮによってコードされる小サブユニット内に、Ｌ−アスパラギン酸によるアミノ酸配列の位置２０のグリシンの置換、Ｌ−アスパラギン酸によるアミノ酸配列の位置２１のＬ−イソロイシンの置換、Ｌ−フェニルアラニンによるアミノ酸配列の位置２２のＬ−イソロイシンの置換、位置４２のタンパク質を構成するアミノ酸がＬ−アラニン、好ましくＬ−バリン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−ロイシン、特に好ましくはＬ−バリンを除く、必要に応じて、Ｌ−ロイシンによる位置４７のＬ−ヒスチジンの置換からなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を有するものが好ましい（ドイツ特許出願公開第１０２０１１１１８０１９  Ａ１号を参照）。
【０１００】
Ｌ−イソロイシンを生成又は分泌するコリネ型細菌としては、例えば、ブレビバクテリウム・フラバム（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６０）（米国特許第４，６５６，１３５号を参照）、ブレビバクテリウム・フラバム（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２１５）（米国特許第５，２９４，５４７を参照）及びコリネバクテリウム・グルタミカム（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５８）（米国特許第４，６５６，１３５を参照）が挙げられる。
【０１０１】
α−ケト酸を分泌又は生成する株としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３０３２）、ブレビバクテリウム・フラバム（ＡＴＣＣ１４０６７）及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（ＡＴＣＣ１３８６９）が挙げられる。
【０１０２】
本発明は、Ｌ−ロイシン、Ｌ−バリン及びＬ−イソロイシンから選択されるＬ−アミノ酸又はα−ケトイソ吉草酸、α−ケトメチル吉草酸及びα−ケトイソカプロン酸から選択されるα−ケト酸を生成する微生物であって、本発明において使用するオペレーターの使用により、アセト乳酸合成酵素をコードするｉｌｖＢＮ遺伝子の調節された発現を可能とする微生物に関する。
【０１０３】
また、本発明は、Ｌ−ロイシン、Ｌ−バリン及びＬ−イソロイシンから選択されるＬ−アミノ酸又はα−ケトイソ吉草酸、α−ケトメチル吉草酸及びα−ケトイソカプロン酸から選択されるα−ケト酸の発酵による製造方法であって、以下の工程を含む方法に関する。
ａ）本発明に係る微生物を適当な培地内において培養して発酵液を得る工程。
ｂ）工程ａ）で得られた発酵液又は微生物の細胞内においてＬ−アミノ酸又はα−ケト酸を濃縮する工程。
【０１０４】
Ｌ−アミノ酸又はα−ケト酸又はＬ−アミノ酸又はα−ケト酸を含む液体又は固体生成物は、Ｌ−アミノ酸又はα−ケト酸を含む発酵液から得ることが好ましい。
【０１０５】
微生物は、例えば、国際公開第０５／０２１７７２号に開示されているように連続的に培養するか、回分培養処理、流加培養処理（ｆｅｄ  ｂａｔｃｈ  ｐｒｏｃｅｓｓ）又は繰り返し流加培養処理（ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｆｅｄ  ｂａｔｃｈ  ｐｒｏｃｅｓｓ）によって回分式に培養して所望の有機化学化合物を生成することができる。公知の培養方法の概要は、Ｃｈｍｉｅｌ（Ｂｉｏｐｒｏｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ  １，Ｅｉｎｆuｈｒｕｎｇ  ｉｎ  ｄｉｅ  Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ  ［Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］（Ｇｕｓｔａｖ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，１９９１））又はＳｔｏｒｈａｓ（Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ  Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ［Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ］（Ｖｉｅｗｅｇ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，１９９４））に記載されている。
【０１０６】
使用する培地又は発酵培地は、各株に関する要件を適切に満たしていなければならない。様々な微生物に使用する培地については、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１）に記載されている。なお、「培地」及び「発酵培地」という用語は、互いに置き替え可能である。
【０１０７】
使用する炭素源としては、糖及び糖質、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、砂糖大根又はサトウキビの処理によって得られるスクロース含有溶液、でんぷん、でんぷん加水分解物、セルロース、油脂、例えば、大豆油、ひまわり油、落花生油及びココナツ油、脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸、アルコール、例えば、グリセリン、メタノール及びエタノール、有機酸、例えば、酢酸及び乳酸が挙げられる。
【０１０８】
使用する窒素源としては、ペプトン等の有機含窒素化合物、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、コーンスティープリカー、大豆、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム等の無機化合物が挙げられる。これらの窒素源は、１種単独又は２種以上の混合物として使用することができる。
【０１０９】
使用するリン源としては、リン酸、リン酸アンモニウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム及び対応するナトリウム含有塩が挙げられる。
【０１１０】
培地は、増殖に必要な、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄等の金属の塩化物又は硫酸塩等の塩、例えば、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄をさらに含む。上述した物質に加えて、増殖に必須の物質、例えば、アミノ酸、例えば、ホモセリン及びビタミン、例えば、チアミン、ビオチン又はパントテン酸を使用することができる。
【０１１１】
プロピオン酸塩は、好ましくは塩として培地に添加するが、プロピオン酸として添加することもできる。適当なプロピオン酸塩としては、プロピオン酸マグネシウム、プロピオン酸ナトリウム、プロピオン酸カルシウム、プロピオン酸アンモニウム及びプロピオン酸カリウムが挙げられる。プロピオン酸塩は、遊離酸又はプロピオン酸塩アニオンとして溶解した状態で培地内に存在する。
【０１１２】
上述した物質は、培地に同時に添加するか、培養時に適当な方法で添加することができる。
【０１１３】
培養物のｐＨは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、水酸化アンモニウム又はアンモニア水等の塩基性化合物又はリン酸又は硫酸等の酸性化合物を使用して調節することができる。ｐＨは、通常は６．０〜８．５、好ましくは６．５〜８に調節する。泡を抑制するために、例えば、脂肪酸ポリグリコールエステル等の消泡剤を使用することができる。プラスミドの安定性を維持するために、例えば、抗生物質等の適当な選択的作用物質を培地に添加することができる。発酵は、好気性条件下で実施することが好ましい。好気性条件を維持するために、酸素又は含酸素気体混合物（空気等）を培養物に添加する。過酸化水素を含む液体を使用することもできる。本発明の特定の実施形態では、酸素制限条件下で発酵を実施する。必要に応じて、例えば、０．０３〜０．２ＭＰａ等の過圧下で発酵を実施する。培養物の温度は、通常は２０〜４０℃、好ましくは２５〜４０℃、特に好ましくは３０〜３７℃である。回分培養処理又は流加培養処理では、所望の有機化学化合物が回収に十分な量となるまで培養を継続する。この場合、培養時間は通常は１０〜１６０時間である。連続培養処理では、培養時間をさらに長くしてもよい。微生物の活性により、発酵培地及び／又は微生物の細胞内で有機化学化合物の濃縮（蓄積）が生じる。
【０１１４】
適当な発酵培地の例は、米国特許第５，７７０，４０９号、米国特許第５，９９０，３５０号、米国特許第５，２７５，９４０号、国際公開第２００７／０１２０７８号、米国特許第５，８２７，６９８号、国際公開第２００９／０４３８０３号、米国特許第５，７５６，３４５号及び米国特許第７，１３８，２６６号に開示されている。
【０１１５】
発酵時における一回以上の濃度決定のためのＬ−アミノ酸の分析は、イオン交換クロマトグラフィー、好ましくはカチオン交換クロマトグラフィーと、ニンヒドリンを使用したポストカラム誘導体化によるＬ−アミノ酸の分離によって実施することができる（例えば、Ｓｐａｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１１９０−１２０６（１９５８））を参照）。ニンヒドリンの代わりに、オルトフタルジアルデヒドをポストカラム誘導体化に使用することもできる。イオン交換クロマトグラフィーについては、Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ（ＬＣ・ＧＣ（Ｍａｇａｚｉｎｅ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）  ７（６），４８４−４８７（１９８９））を参照されたい。
【０１１６】
また、例えば、オルトフタルジアルデヒド又はフェニルイソチオシアネートを使用したプレカラム誘導体化を実施し、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）（好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））によって得られたアミノ酸誘導体を分離することもできる。そのような方法は、例えば、Ｌｉｎｄｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５１：１１６７−１１７４（１９７９））に記載されている。
【０１１７】
検出は光分析（吸収率、蛍光）によって行う。
【０１１８】
アミノ酸分析に関する包括的な説明は、「Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ」，Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ  ａｎｄ  Ｚｏｒｂａｓ（Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ  １９９８）に記載されている。
【０１１９】
発酵時における一回以上の濃度決定のためのα−ケト酸の分析は、スルホン化スチレン・ジビニルベンゼン重合体（Ｈ＋）（例えば、０．０２５Ｎ硫酸を使用し、２１５ｎｍ（又は２３０又は２７５ｎｍでのＵＶ検出）を使用したイオン交換クロマトグラフィー、好ましくはカチオン交換クロマトグラフィーによるケト酸及びその他の排出物の分離によって実施することができる。好ましくは、ＲＥＺＥＸ  ＲＦＱ−Ｆａｓｔ  Ｆｒｕｉｔ  Ｈ＋カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を使用することができる。その他の分離相（例えば、ＢｉｏＲａｄ社製Ａｍｉｎｅｘ）を使用することもできる。同様な分離手法は、供給業者の適切な応用例に記載されている。
【０１２０】
発酵時における一回以上の濃度決定のためのプロピオン酸の分析は、ＨＰＬＣによる有機酸の分離によって実施することができる。例えば、ＶＡＲＩＡＮ  ＭｅｔａＣａｒｂ  Ｈ＋  ３００×７．８ｍｍ  Ａ５２１５（長さ：３００ｍｍ、直径：７．８ｍｍ）をカラムとして使用した。硫酸とアセトニトリルの混合物（２１５ｍＬの０．５Ｍ硫酸、５０ｍＬのアセトニトリル、５Ｌの蒸留水）を溶離液として使用した。０．００５Ｍ硫酸をサンプルの溶媒として使用した。無細胞サンプルを１：２０で希釈した。
【０１２１】
分離パラメーターとしては、流量：０．４ｍＬ／分、サンプル注入量：２０μＬ、温度：３５℃とした。検出は、２１５ｎｍで光学的（ＵＶ検出）に行った。プロピオン酸の滞留時間は３０．２５８分とした。測定可能範囲は、０．０９〜７．５１４ｇ／Ｌだった。
【０１２２】
本発明によれば、濃度（生成した化合物の体積あたりの量）、収率（生成した化合物の消費された炭素源あたりの量）、生成量（生成した化合物の体積及び時間あたりの量）、特定の生成量（生成した化合物の細胞乾燥質量又は生体乾燥質量あたりの量又は生成した化合物の細胞タンパク質及び時間あたりの量）、その他のプロセスパラメータ及びそれらの組み合わせに対する本発明に係る方法又は発酵方法の性能は、本発明に係る発現カセットを使用しない、微生物を使用する方法又は発酵方法と比較して、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも１．５％又は少なくとも２％向上することが好ましい。これは、大規模なプロセスでは非常に有益である。
【０１２３】
発酵により、所望のアミノ酸又はケト酸を含む発酵液が得られる。
【０１２４】
次に、液体又は固体中にアミノ酸又はケト酸を含む生成物を回収又は製造又は抽出する。
【０１２５】
発酵液とは、微生物を所定の時間にわたって所定の温度で培養した発酵培地又は培養液を意味する。発酵時に使用する発酵培地は、所望の化合物の生成並びに通常は複製又は生存を可能とする、全ての物質又は成分を含む。
【０１２６】
発酵によって得られる発酵液は、以下の成分を含む。
ａ）微生物の細胞の複製によって得られた微生物の細胞集団。
ｂ）発酵時に生成された所望のアミノ酸又はケト酸。
ｃ）発酵時に任意に生成された有機副生成物。
ｄ）発酵によって消費されないビオチン等のビタミン又は硫酸マグネシウム等の塩等の、発酵培地の成分又は原料。
【０１２７】
有機副生成物は、発酵に使用した微生物によって生成され、任意に排出された所望の化合物以外の物質を含む。
【０１２８】
培養容器又は発酵容器から発酵液を取り出し、任意に回収を行った上で、液体又は固体のアミノ酸又はケト酸を含む製品を調製するために使用する。この場合にも、「純粋な化学物質含有製品を得る」という表現を使用する。最も単純な場合には、発酵容器から取り出した純粋な化学物質含有発酵液は製品として使用することができる。
【０１２９】
以下の群から選択される１以上の手段により、発酵液から所望の有機化学化合物を濃縮又は精製することができる。
ａ）水の部分的（＞０％〜＜８０％）、完全（１００％）又はほぼ完全（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％又は≧９９％）な除去。
ｂ）（必要に応じて非活性化させた）細胞集団の部分的（＞０％〜＜８０％）、完全（１００％）又はほぼ完全（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％又は≧９９％）な除去。
ｃ）発酵時に生成した有機副生成物の部分的（＞０％〜＜８０％）、完全（１００％）又はほぼ完全（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、≧９９．３％又は≧９９．７％）な除去。
ｄ）発酵時に消費されなかった発酵培地の成分又は原料の部分的（＞０％〜＜８０％）、完全（１００％）又はほぼ完全（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、≧９９．３％又は≧９９．７％）な除去。
【０１３０】
これにより、所望の化合物含有量を有する製品を単離することができる。
【０１３１】
水の部分的（＞０％〜＜８０％）、完全（１００％）又はほぼ完全（≧８０％〜＜１００％）な除去（手段ａ））は乾燥ということができる。
【０１３２】
一変形例においては、純粋（≧８０重量％又は≧９０重量％）又は非常に純粋（≧９５％重量、≧９７重量％又は≧９９重量％）な所望の有機化学化合物、好ましくはＬ−アミノ酸を、水、細胞集団、有機副生成物及び消費されなかった発酵培地の成分を完全又はほぼ完全に除去して得る。手段ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）に関しては、多くの技術的説明が存在する。
【０１３３】
コリネバクテリウム属細菌を使用してＬ−アミノ酸（Ｌ−ロイシン、Ｌ−バリン又はＬ−イソロイシン）又はα−ケト酸（ケトイソ吉草酸、ケトメチル吉草酸又はケトイソカプロン酸）を製造する場合には、発酵液の成分を含まない製品を得ることが好ましい。得られた製品は、ヒト用医薬品や、製薬業界及び食品業界における用途に使用することができる。
【０１３４】
本発明に係る方法によれば、Ｌ−アミノ酸（Ｌ−ロイシン、Ｌ−バリン又はＬ−イソロイシン）又はα−ケト酸（ケトイソ吉草酸、ケトメチル吉草酸又はケトイソカプロン酸）を発酵によって製造することができる。
【０１３５】
また、本発明は、本発明に係る微生物の、Ｌ−アミノ酸（Ｌ−ロイシン、Ｌ−バリン又はＬ−イソロイシン）又はα−ケト酸（ケトイソ吉草酸、ケトメチル吉草酸又はケトイソカプロン酸）の発酵による製造のための使用に関する。
【実施例】
【０１３６】
以下、実施例を参照して本発明についてさらに詳細に説明する。
【０１３７】
実施例１
【０１３８】
ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢ（置換構造）のクローニング
【０１３９】
Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ドイツ・ダルムシュタット）のコリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１４０６７）のゲノム配列から開始して、以下の成分からなるＤＮＡ断片（サイズ：１３９０ｂｐ）を合成した（配列番号５）。
・ｉｌｖＢの上流の相同ＤＮＡ領域
・コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１４０６７）のＰｐｒｐＤ２プロモーター
・コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１４０６７）のギャップ遺伝子のリボソーム結合部位
・ｉｌｖＢ遺伝子の相同領域（ＧＴＧ開始コドンの代わりにＡＴＧ開始コドンを含む）
【０１４０】
末端に導入された切断部位ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（制限酵素）を使用して切断し、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを使用して同様に切断したベクターｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢのライゲーションを行って断片をクローニングした。プラスミドをｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢと呼ぶ。これにより、ｉｌｖＢの遺伝子のネイティブプロモーターが削除され、誘導性プロモーターＰｐｒｐＤ２によって置換された突然変異体を生成することができる。また、ネイティブの開始コドン（ＧＴＧ）は、リボソームによって好ましい開始コドンＡＴＧで置換される。
【０１４１】
実施例２
【０１４２】
ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿ｉｌｖＮ（Ｍ１３）（置換構造）の構築
【０１４３】
Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ドイツ・ダルムシュタット）のコリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１４０６７）のゲノム配列から開始して、ｉｌｖＢの遺伝子の一部、ｉｌｖＢ遺伝子とｉｌｖＮ遺伝子との間の遺伝子間領域及びｉｌｖＮ遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片（サイズ：１４２１ｂｐ）を合成した（配列番号１４）。ｉｌｖＮ遺伝子のネイティブ配列「ＧＧＡＡＴＣＡＴＴ」（ｉｌｖＮ遺伝子の開始点（＋１）の下流の＋５８〜＋６６ｂｐ）を「ＧＡＴＧＡＣＴＴＴ」に変更した。これにより、ＩｌｖＮタンパク質のアミノ酸配列の位置２０、２１及び２２がＧｌｙ（２０）、Ｉｌｅ（２１）、Ｉｌｅ（２２）からＡｓｐ（２０）、Ａｓｐ（２１）、Ｐｈｅ（２２）に変更される。
【０１４４】
末端に導入された切断部位ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（制限酵素）を使用して切断し、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを使用して同様に切断したベクターｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢのライゲーションを行って断片のライゲーションを行った。プラスミドをｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿ｉｌｖＮ（Ｍ１３）と呼ぶ。これにより、ネイティブ遺伝子配列「ＧＧＡＡＴＣＡＴＴ」（ｉｌｖＮ遺伝子の開始点（＋１）の下流の＋５８〜＋６６ｂｐ）を「ＧＡＴＧＡＣＴＴＴ」に変更した突然変異体を生成することができる。
【０１４５】
実施例３
【０１４６】
突然変異体であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７＿ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢＮ、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７＿ｉｌｖＮ（Ｍ１３）＿ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢＮ及びコリネバクテリウム・グルタミカムＶＰＳ＿ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢＮの構築
【０１４７】
実施例１のベクターｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢを、Ｌｉｅｂｌ  ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ６５，２９９−３０４（１９８９））のプロトコルに従ったエレクトロポレーションによってコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７に導入し、バリン生成株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７＿ｉｌｖＮ（Ｍ１３）（実施例４を参照）及びバリン生成株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＶＰＳに導入した。ベクターｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ又はｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢは、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７＿ｉｌｖＮ（Ｍ１３）及びコリネバクテリウム・グルタミカムＶＰＳにおいて独自に複製することはできず、組換えによって染色体に導入された場合に細胞内に保持されるのみである。ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿ＰｐｒｐＤ２＿ｉｌｖＢを含むクローンの選別は、１５ｍｇ／Ｌのカナマイシンと５０ｍｇ／ｍＬのナリジキシン酸を添加したＬＢ培地内で接合バッチ（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｂａｔｃｈ）を平板培養することによって行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）。融合したクローンを２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地プレートに移し、３３℃で１６時間培養した。２回目の組換えによってプラスミドが除去された突然変異体の選別のために、クローンをＬＢ液体媒体内で２０時間にわたって非選択的に培養し、１０％のスクロースを含むＬＢ培地に移した後、２４時間培養した。
【０１４８】
プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢ及び開始材料のプラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢは、カナマイシン耐性遺伝子に加えて、枯草菌のレバンスクラーゼをコードするｓａｃＢ遺伝子化のコピーを含む。スクロース誘導発現により、コリネバクテリウム・グルタミカムに対する毒性を有する生成物であるレバンの合成を促進するレバンスクラーゼが生成する。従って、スクロースを含むＬＢ培地では、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢが除去されたクローンのみが成長する。プラスミドと共に、野生型プロモータ領域を含むｉｌｖＢ遺伝子の完全な野生型コピー又はＰｐｒｐＤ２プロモーターを含むｉｌｖＢ遺伝子の組換え型のコピーが除去される。
【０１４９】
約４０〜５０個のコロニーに対して、表現型「スクロースの存在下での成長」及び「カナマイシンの存在下での非成長」についてテストを行った。組換え型ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢ対立遺伝子が染色体に残っていることを立証するために、表現型「スクロースの存在下での成長」及び「カナマイシンの存在下での非成長」を含む約２０個のコロニーを、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）の標準的なＰＣＲ法に従ったポリメラーゼ連鎖反応によって調べた。組換え型ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢ対立遺伝子の修飾領域を有するＤＮＡ断片をコロニーの染色体ＤＮＡから増幅した。以下のプライマーオリゴヌクレオチドをＰＣＲ用に選択した。
【０１５０】
試験プライマー１（配列番号６）
５’−ＡＡＡ  ＧＣＣ  ＴＧＣ  ＡＴＣ  ＧＣＧ  ＧＡＧ  ＡＣ-３’
試験プライマー２（配列番号７）
５’−ＴＧＧ  ＴＧＡ  ＴＧＣ  ＣＧＣ  ＧＧＡ  ＴＡＴ  ＣＧ-３’
【０１５１】
これらのプライマーにより、組換え型ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢＮ遺伝子座を含むクローンにおいてＤＮＡ断片（サイズ：約８８０ｂｐ）を増幅することができる。野生型ＰｉｌｖＢＮ−ｉｌｖＢＮ遺伝子座を含むクローンでは、約１１３６ｂｐのサイズを有するＤＮＡ断片が増幅される。
【０１５２】
増幅されたＤＮＡ断片は、０．８％アガロースゲル内における電気泳動によって特定する。これにより、株は染色体上に修飾された組換え型ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢＮ対立遺伝子を有することが分かった。株は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７＿ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢＮ、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７＿ｉｌｖＮ（Ｍ１３）＿ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢＮ及びコリネバクテリウム・グルタミカムＶＰＳ＿ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢＮと呼ぶ。
【０１５３】
実施例４
【０１５４】
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７＿ｉｌｖＮ（Ｍ１３）の構築
【０１５５】
実施例２のベクターｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿ｉｌｖＮ（Ｍ１３）を、実施例３に記載した方法と同様な方法によるエレクトロポレーションによってコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７に導入した。クローンの選別は、実施例３に記載した培養法によって行った。陽性クローンの検出は、２０個のクローンから単離した染色体ＤＮＡに基づき、試験プライマー３及び４を使用したポリメラーゼ連鎖反応による９４７ｂｐの生成物を増幅し、ＰＣＲ産物の配列解析を行うことによって行った。
【０１５６】
試験プライマー３（配列番号１５）
５’−ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＡ  ＣＴＴ  Ｃ−３’
試験プライマー４（配列番号１６）
５’−ＣＡＧ  ＣＧＴ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＡＡＡ  ＧＣ-３’
【０１５７】
実施例５
【０１５８】
Ｌ−バリンの生成に関するコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７＿ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢＮの性能試験
【０１５９】
Ｌ−バリンを生成する能力を調べるために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７＿ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢＮの５つのクローンとコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７（参照）を１０ｍＬの試験培地内において３３℃で１６時間予め培養した。生成試験では、開始時のＯＤ６００（６００ｎｍにおける光学濃度）が０．１となるように、１０ｍＬの試験培地に培養物を播種した。各クローンは３個の振盪フラスコで試験を行い、代表株は合計１５個の振盪フラスコの結果によって表わされる。
【０１６０】
試験培地は、Ｋｅｉｌｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９９３）１７５：５５９３−５６０３）に記載されたＣｇＸＩＩ培地と同様に調製したが、７．５ｇ／Ｌの酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ社（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）製（ハイデルベルグ））をさらに添加した。試験培地の組成を表１に示す。バリン合成の誘導のための試験培地は、プロピオン酸塩を（遊離酸に対して）０．６ｇ／Ｌの濃度でさらに含んでいた。
【０１６１】
【表１】
2016519949.tif 000003
【０１６２】
培養は、１００ｍＬの振盪フラスコ内において３３℃、２００ｒｐｍで行った。シェーカーの移動は５ｃｍとした。２４時間後及び４８時間後、培養物からサンプルを取り出し、グルコースの含有量及びＬ−バリンの含有量の光学濃度を測定し、細胞に対して短時間遠心処理を行った（ベンチ遠心機５４１５Ｄ（エッペンドルフ）、１３，０００ｒｐｍ、１０分、室温）。
【０１６３】
光学濃度は、６６０ｎｍの波長においてＧＥＮｉｏｓミクロピペットプレートフォトメータ（Ｔｅｃａｎ社（英国・レディング）製）を使用して測定した。サンプルは、測定前に脱塩水で希釈（１：１００）した。
【０１６４】
グルコースは、ＮＡＤＨの生成により、共役酵素試験（ヘキソキナーゼ／グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ）を使用して測定した。
【０１６５】
細胞外アミノ酸濃度は、逆相ＨＰＬＣ（Ｌｉｎｄｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）５１：１１６７−１１７４）により、培養上清から定量的に測定した。蛍光検出器（Ｇ１３２１Ａ）を備えたＨＰ１１００（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ社（ドイツ・ヴァルトブロン）製）のＨＰＬＣ装置を使用した。システム制御及びデータ分析は、ＨＰ  Ｃｈｅｍ−Ｓｔａｔｉｏｎ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ社製）を使用して行った。１μＬの分析対象のアミノ酸溶液を、自動プレカラム誘導体化装置内において、２０μＬのオルトフタルアルデヒド／２−メルカプトエタノール試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｅｕｒｏｐｅ社（オランダ・アウト＝ベイエルラント）製）を混合した。蛍光を発するチオ置換イソインドール（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（１９８３）２６６：４７１−４８２）を、プレカラム（４０×４ｍｍ、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＯＤＳ  ５）及びメインカラム（Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＯＤＳ  ５、ＣＳ−Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅ社（ドイツ・ランガーヴェーエ）製）により、非極性相（メタノール）が増加する勾配プログラムを使用して分離した。酢酸ナトリウム（０．１Ｍ、ｐＨ：７．２）を極性溶離液として使用し、流量は０．８ｍＬ／分とした。誘導体化アミノ酸の蛍光検出は、２３０ｎｍの励起波長及び４５０ｎｍの発光波長で行った。バリン濃度は、外部標準との比較によって算出した。
【０１６６】
収率の算出では、生成したＬ−バリンの量を消費されたグルコースの量で除算した。
【０１６７】
表２Ａ及び表２Ｂに示す結果から明らかなように、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７＿ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢＮは、培地内にプロピオン酸塩が存在する場合にバリンを著しく生成（排出）するが、プロピオン酸塩を使用しない場合には、あらゆる条件下においてバリンを著しく生成しないコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７（対照株）との差は見られなかった。
【０１６８】
【表２Ａ】
2016519949.tif 000004
【０１６９】
【表２Ｂ】
2016519949.tif 000005
【０１７０】
実施例６
【０１７１】
バリン生成コリネバクテリウム・グルタミカム株を使用した性能試験
【０１７２】
振盪フラスコシステムを使用し、実施例５と同様にして、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７＿ｉｌｖＮ（Ｍ１３）＿ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢＮ及びコリネバクテリウム・グルタミカムＶＰＳ＿ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢＮについて調べた。
【０１７３】
Ｌ−バリンを生成する能力を調べるために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７＿ｉｌｖＮ（Ｍ１３）＿ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢＮ及びコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７＿ｉｌｖＮ（Ｍ１３）（参照）又はコリネバクテリウム・グルタミカムＶＰＳ＿ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢＮ及びコリネバクテリウム・グルタミカムＶＰＳ（参照）を１０ｍＬの試験培地（表３）内において３３℃で１６時間予め培養した。生成試験では、開始時のＯＤ６００（６００ｎｍにおける光学濃度）が０．１となるように、１０ｍＬの試験培地に培養物を播種した。各クローンは３個の振盪フラスコで試験を行い、代表株は合計１５個の振盪フラスコの結果によって表わされる。
【０１７４】
【表３】
2016519949.tif 000006
【０１７５】
バリン合成の誘導のための試験培地は、プロピオン酸塩を（遊離酸に対して）０．６ｇ／Ｌの濃度でさらに含んでいた。
【０１７６】
培養条件並びに細胞集団、グルコース及びバリン濃度の測定は、実施例５と同様にして行った。
【０１７７】
表４Ａ及び表４Ｂに示す結果から明らかなように、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７＿ｉｌｖＮ（Ｍ１３）＿ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢＮ及びコリネバクテリウム・グルタミカムＶＰＳ＿ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢＮは、培地内にプロピオン酸塩が存在する場合に、修飾されていないコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７＿ｉｌｖＮ（Ｍ１３）及びコリネバクテリウム・グルタミカムＶＰＳと比較して、炭素源に対するバリンの収率が高かった。
【０１７８】
【表４Ａ】
2016519949.tif 000007
【０１７９】
【表４Ｂ】
2016519949.tif 000008
【０１８０】
実施例７
【０１８１】
コリネバクテリウム・グルタミカムＶＰＳ＿ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢＮ及びコリネバクテリウム・グルタミカムＶＰＳを使用したバリン安定性試験
【０１８２】
１０ｍＬの液体培地（実施例６を参照）内において安定性試験を行った。
【０１８３】
コリネバクテリウム・グルタミカムＶＰＳ及びコリネバクテリウム・グルタミカムＶＰＳ＿ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢＮの予備培養
【０１８４】
５０μＬのグリセリン連続培養物を、１００ｍＬの振盪フラスコ（バッフル付）内の１０ｍＬの液体培養物に播種し、２２時間培養を行った（３３℃、２００ｒｐｍ、振幅：５ｃｍ）。培養物の光学濃度を測定した後、１．５ｍＬの培養物をグリセリン（グリセリン最終濃度：１０％）で処理し、ねじ蓋付容器内において−８０℃で凍結した。５０μＬの培養物を１０ｍＬの別の液体培養物に播種し、振盪しながら３３℃で２２時間培養を行った。上記手順をさらに２回繰り返し、各グリセリン培養物を４つの連続した液体培養物として培養した。各培養は、約８細胞世代に対応する。そのため、液体培養物は３０（約３２）を超える細胞世代に対応する。
【０１８５】
コリネバクテリウム・グルタミカムＶＰＳ及びコリネバクテリウム・グルタミカムＶＰＳ＿ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢＮの主培養
【０１８６】
１０ｍＬの液体培地に（振盪フラスコを使用して培養した）連続培養物又は凍結培養物を播種した（開始時のＯＤ：０．１）。次に、２４時間培養を行った。各培養は二重反復測定（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）で行った。培養終了時（２４時間後）にサンプルを取り出し、光学濃度、バリン滴定濃度及び残存糖濃度の分析を行った。分析は実施例５と同様にして行った。
【０１８７】
性能試験の結果（表５）、コリネバクテリウム・グルタミカムＶＰＳを使用した場合には、コリネバクテリウム・グルタミカムＶＰＳ＿ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢＮを使用した場合と比較して、バリン滴定濃度（相対変化（％））、バリン／細胞集団比率（バリン／ＯＤ）及び収率（生成物（ｇ）／消費された基質（ｇ））が低かった。これは、集団内において、生成物の生成に対して陰性であり、細胞集団の生成に対して陽性である突然変異が生じたことを示している。２回の培養段階（１５．６世代）後、コリネバクテリウム・グルタミカムＶＰＳは、培養試験（主培養結果）における性能データの低下を示した。そのため、４段階プロセス（３培養段階＋１生成段階）では、性能データ（滴定濃度、収率及び細胞集団特異的生成）の大幅な低下が生じると思われる。一方、本発明に係るコリネバクテリウム・グルタミカムＶＰＳ＿ＰｐｒｐＤ２−ｉｌｖＢＮの場合には、（３０世代を超える）４つの培養段階を経る場合でもこのような性能データの大幅な低下は生じない。細胞集団特異的バリン生成（バリン／ＯＤ）はわずかな増加も示す。そのため、少なくとも４段階生成プロセス（３培養段階＋１主培養段階）をシミュレートしており、要件を凌ぐ場合もある。
【０１８８】
【表５】
2016519949.tif 000009
【符号の説明】
【０１８９】
図１における略語及び名称の意味は以下のとおりである。
ｏｒｉＶ：ｐＭＢ１のＣｏｌＥ１様起源
ｓａｃＢ：タンパク質レバンスクロースをコードするｓａｃＢ遺伝子
ＲＰ４ｍｏｂ：ＲＰ４起動部位（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）
Ｋａｎ：カナマイシンの耐性遺伝子
ＰｐｒｐＤ２：プロピオン酸塩誘導性プロモーター
’ｉｌｖＢ：ｉｌｖＢ遺伝子の５’領域
ＨｉｎｄＩＩＩ：制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの切断部位
ＥｃｏＲＩ：制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部位
(配列表)
SEQUENCE LISTING
<110>  Evonik Industries AG
<120>  Method for producing l-leucine, l-valine, l-isoleucine, alpha-ketoisovalerate, alpha-keto-beta-methylvalerate, or alpha-ketoisocaproate using recombinant corynebacteria that contain the ilvbn operon which can be induced by propionate
<130>  201100446
<160>  16    
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  177
<212>  DNA
<213>  Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>  repeat_region
<222>  (22)..(49)
<223>  IR1
<220>
<221>  repeat_region
<222>  (77)..(105)
<223>  IR2
<400>  1
ctccagcgtc cacgaatatg cccccgcgcg ccgggtgggg agcgaaggga acccccaagg       60
aattggcgtt gaggtggcga ttttgcatgt tttactcaaa attactttgg tggtcacaaa      120
attacacaac ttttacagtg acctagatcg ctttttaaag aattagcgtg gtgtgca         177
<210>  2
<211>  177
<212>  DNA
<213>  Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>  repeat_region
<222>  (22)..(49)
<223>  IR1
<220>
<221>  repeat_region
<222>  (77)..(105)
<223>  IR2
<400>  2
ctccagcgtc caagaatatg cccccgcgcg ccgggtgggg agcgaaggga acccccaagg       60
aattggcgtt gaggtggtga ttttgcatgt tttactcaaa atcactttga tggtcacaaa      120
attacacaac ttttacagtg acctacattg ctttttaaag aattagtgtg gtgtgca         177
<210>  3
<211>  177
<212>  DNA
<213>  Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>  repeat_region
<222>  (22)..(49)
<223>  IR1
<220>
<221>  repeat_region
<222>  (77)..(105)
<223>  IR2
<400>  3
ctccagcgtc caagaatatg cccccgcgcg ccgggtgggg agcgaaggga acccccaagg       60
aattggcgtt gaggtggcga ttttgcatgt tttactcaaa atcactgtga tggtcacaaa      120
attacacaac ttttacagtg acctagatcg ctttttaaag aattagcgtg gtgtgca         177
<210>  4
<211>  902
<212>  DNA
<213>  Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>  promoter
<222>  (1)..(177)
<223>  PprpD2
<220>
<221>  RBS
<222>  (178)..(206)
<223>  gap RBS
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (207)..(209)
<223>  atg-start codon
<220>
<221>  gene
<222>  (207)..(902)
<223>  ilvB-coding region 5´-region
<400>  4
ctccagcgtc cacgaatatg cccccgcgcg ccgggtgggg agcgaaggga acccccaagg       60
aattggcgtt gaggtggcga ttttgcatgt tttactcaaa attactttgg tggtcacaaa      120
attacacaac ttttacagtg acctagatcg ctttttaaag aattagcgtg gtgtgcatgc      180
atatttatcg cgagaggaga cacaacatga atgtggcagc ttctcaacag cccactcccg      240
ccacggttgc aagccgtggt cgatccgccg cccctgagcg gatgacaggt gcacaggcaa      300
ttgttcgatc gctcgaggag cttaacgccg acatcgtgtt cggtattcct ggtggtgcgg      360
tgctaccggt gtatgacccg ctctattcct ccacaaaggt gcgccacgtc ctggtgcgcc      420
acgagcaggg cgcaggccac gcagcaaccg gctacgcgca ggttactgga cgcgttggcg      480
tctgcattgc aacctctggc ccaggcgcaa ccaacttggt taccccaatc gctgatgcaa      540
acttggactc cgttcccatg gttgccatca ccggccaggt cggaagtggc ctgctgggta      600
ccgatgcttt ccaggaagcc gatatccgcg gcatcaccat gccagtgacc aagcacaact      660
tcatggtcac cgaccccaac gacattccac aggcattggc tgaggcattc cacctcgcga      720
ttactggtcg ccctggccct gttctggtgg atattcctaa ggatgtccaa aacgctgaat      780
tggatttcgt ctggccacca aagatcgacc tgccaggcta ccgcccagtt tctactccgc      840
atgctcgaca gattgagcag gctgtcaaac tgatcggtga agccaaaaag ccagtccttt      900
ac                                                                     902
<210>  5
<211>  1390
<212>  DNA
<213>  Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (494)..(521)
<223>  IR1
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (549)..(577)
<223>  IR2
<220>
<221>  RBS
<222>  (665)..(678)
<223>  RBS gap
<220>
<221>  gene
<222>  (679)..(1380)
<223>  ilvB 5´-region
<400>  5
cgaattcgtg caatcgtgcg aattttggtc gcgcgcatgg tgatctcaat gacggtgcct       60
tcgacaacga tgccgttgcc ctcaaaacgc acccagtcac ccacgccgaa ttgcttttcc      120
gtcaggatga aaaatccggc caagaagtcc gcaacaatcg actgcgcacc aaggccaatg      180
gcagctgacg caatggttgc cggaatcgca gcgcccgcga gagagaaacc aaaagcctgc      240
atcgcggaga cggcaagcat gaaaaacgcc acaatttgcg cgatataaac gccaacgcca      300
gcgaacgcga gctggttctt agtggtgtcc gcatcggctg cagactccac tcgccgcttg      360
ataatacgca tggccagtcg gccgatacgt ggaatcaaaa acgccaagac caggataatt      420
gctacatcaa aaccggtatc gacaatccaa ttccacaatg aatagagcaa atctccagcg      480
tccacgaata tgcccccgcg cgccgggtgg ggagcgaagg gaacccccaa ggaattggcg      540
ttgaggtggc gattttgcat gttttactca aaattacttt ggtggtcaca aaattacaca      600
acttttacag tgacctagat cgctttttaa agaattagcg tggtgtgcat gcatatttat      660
cgcgagagga gacacaacat gaatgtggca gcttctcaac agcccactcc cgccacggtt      720
gcaagccgtg gtcgatccgc cgcccctgag cggatgacag gtgcacaggc aattgttcga      780
tcgctcgagg agcttaacgc cgacatcgtg ttcggtattc ctggtggtgc ggtgctaccg      840
gtgtatgacc cgctctattc ctccacaaag gtgcgccacg tcctggtgcg ccacgagcag      900
ggcgcaggcc acgcagcaac cggctacgcg caggttactg gacgcgttgg cgtctgcatt      960
gcaacctctg gcccaggcgc aaccaacttg gttaccccaa tcgctgatgc aaacttggac     1020
tccgttccca tggttgccat caccggccag gtcggaagtg gcctgctggg taccgatgct     1080
ttccaggaag ccgatatccg cggcatcacc atgccagtga ccaagcacaa cttcatggtc     1140
accgacccca acgacattcc acaggcattg gctgaggcat tccacctcgc gattactggt     1200
cgccctggcc ctgttctggt ggatattcct aaggatgtcc aaaacgctga attggatttc     1260
gtctggccac caaagatcga cctgccaggc taccgcccag tttctactcc gcatgctcga     1320
cagattgagc aggctgtcaa actgatcggt gaagccaaaa agccagtcct ttacattggc     1380
ggcaagcttg                                                            1390
<210>  6
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(20)
<223>  test primer 1
<400>  6
aaagcctgca tcgcggagac                                                   20
<210>  7
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(20)
<223>  test primer 2
<400>  7
tggtgatgcc gcggatatcg                                                   20
<210>  8
<211>  3411
<212>  DNA
<213>  Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>  CDS
<222>  (500)..(2380)
<223>  coding region ilvB
<220>
<221>  CDS
<222>  (2394)..(2912)
<223>  coding region ilvN
<400>  8
gtatcgacaa tccaattcca caatgaatag agcaaatatt gaatgggtac gcctaaaatc       60
atgagccaag attagcgctg aaaagtagcg ggagcctgcc tgaactttgt gagaatcctg      120
attccttaac cgaagtgggg gagttttggg ggtgggaatt ttcgtgcgtt gtggaattgg      180
aaactcgatg tgtgtagcat gacacaccat gaccattatt cgacttgtag tagtaaccgc      240
gcggcgcctg ccgtaacggc cttccaagtc gtctcgtcaa gcgccctcga caacactcac      300
cacagtgttg gaacgagggc tttcttgttg gttatgaccc aagtagccaa ctttgcaaca      360
gacatctgtc gcactgcgtg cacacgcatc cgcgtcggaa caattttaaa tgagggcttt      420
gtctttaggc tgagttgaaa tcggcttggc ttggacgggt cctgtgaaaa tccttattta      480
gtaaaggagc cagaaagtc gtg aat gtg gca gct tct caa cag ccc act ccc       532
Val Asn Val Ala Ala Ser Gln Gln Pro Thr Pro          
1               5                   10               
gcc acg gtt gca agc cgt ggt cga tcc gcc gcc cct gag cgg atg aca        580
Ala Thr Val Ala Ser Arg Gly Arg Ser Ala Ala Pro Glu Arg Met Thr           
15                  20                  25                    
ggt gca aag gca att gtt cga tcg ctc gag gag ctt aac gcc gac atc        628
Gly Ala Lys Ala Ile Val Arg Ser Leu Glu Glu Leu Asn Ala Asp Ile           
30                  35                  40                        
gtg ttc ggt att cct ggt ggt gcg gtg cta ccg gtg tat gac ccg ctc        676
Val Phe Gly Ile Pro Gly Gly Ala Val Leu Pro Val Tyr Asp Pro Leu           
45                  50                  55                            
tat tcc tcc aca aag gtg cgc cac gtc ttg gtg cgc cac gag cag ggc        724
Tyr Ser Ser Thr Lys Val Arg His Val Leu Val Arg His Glu Gln Gly           
60                  65                  70                  75            
gca ggc cac gca gca acc ggc tac gcg cag gtt act gga cgc gtt ggc        772
Ala Gly His Ala Ala Thr Gly Tyr Ala Gln Val Thr Gly Arg Val Gly           
80                  85                  90                
gtc tgc att gca acc tct ggc cca gga gca acc aac ttg gtt acc cca        820
Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Thr Pro           
95                  100                 105                   
atc gct gat gca aac ttg gac tcc gtt ccc atg gtt gcc atc acc ggc        868
Ile Ala Asp Ala Asn Leu Asp Ser Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly           
110                 115                 120                       
cag gtc gga agt ggc ctg ctg ggt acc gac gct ttc cag gaa gcc gat        916
Gln Val Gly Ser Gly Leu Leu Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Ala Asp           
125                 130                 135                           
atc cgc ggc atc acc atg cca gtg acc aag cac aac ttc atg gtc acc        964
Ile Arg Gly Ile Thr Met Pro Val Thr Lys His Asn Phe Met Val Thr           
140                 145                 150                 155           
aac cct aac gac att cca cag gca ttg gct gag gca ttc cac ctc gcg       1012
Asn Pro Asn Asp Ile Pro Gln Ala Leu Ala Glu Ala Phe His Leu Ala           
160                 165                 170               
att act ggt cgc cct ggc cct gtt ctg gtg gat att cct aag gat gtc       1060
Ile Thr Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Val           
175                 180                 185                   
cag aac gct gaa ttg gat ttc gtc tgg cca cca aag atc gac ctg cca       1108
Gln Asn Ala Glu Leu Asp Phe Val Trp Pro Pro Lys Ile Asp Leu Pro           
190                 195                 200                       
ggc tac cgc cca gtt tca aca cca cat gct cgc cag atc gag cag gca       1156
Gly Tyr Arg Pro Val Ser Thr Pro His Ala Arg Gln Ile Glu Gln Ala           
205                 210                 215                           
gtc aag ctg atc ggt gag gcc aag aag ccc gtc ctt tac gtt ggt ggt       1204
Val Lys Leu Ile Gly Glu Ala Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly           
220                 225                 230                 235           
ggc gta atc aag gct gac gca cac gaa gag ctt cgt gcg ttc gct gag       1252
Gly Val Ile Lys Ala Asp Ala His Glu Glu Leu Arg Ala Phe Ala Glu           
240                 245                 250               
tac acc ggc atc cca gtt gtc acc acc ttg atg gct ttg ggt act ttc       1300
Tyr Thr Gly Ile Pro Val Val Thr Thr Leu Met Ala Leu Gly Thr Phe           
255                 260                 265                   
cca gag tct cac gag ctg cac atg ggt atg cca ggc atg cat ggc act       1348
Pro Glu Ser His Glu Leu His Met Gly Met Pro Gly Met His Gly Thr           
270                 275                 280                       
gtg tcc gct gtt ggt gca ctg cag cgc agc gac ctg ctg att gct atc       1396
Val Ser Ala Val Gly Ala Leu Gln Arg Ser Asp Leu Leu Ile Ala Ile           
285                 290                 295                           
ggc tcc cgc ttt gat gac cgc gtc acc ggt gac gtt gac acc ttc gcg       1444
Gly Ser Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Asp Val Asp Thr Phe Ala           
300                 305                 310                 315           
cct gac gcc aag atc att cac gcc gac att gat cct gcc gaa atc ggc       1492
Pro Asp Ala Lys Ile Ile His Ala Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly           
320                 325                 330               
aag atc aag cag gtt gag gtt cca atc gtg ggc gat gcc cgc gaa gtt       1540
Lys Ile Lys Gln Val Glu Val Pro Ile Val Gly Asp Ala Arg Glu Val           
335                 340                 345                   
ctt gct cgt ctg ctg gaa acc acc aag gca agc aag gca gag acc gag       1588
Leu Ala Arg Leu Leu Glu Thr Thr Lys Ala Ser Lys Ala Glu Thr Glu           
350                 355                 360                       
gac atc tcc gag tgg gtt gac tac ctc aag ggc ctc aag gca cgt ttc       1636
Asp Ile Ser Glu Trp Val Asp Tyr Leu Lys Gly Leu Lys Ala Arg Phe           
365                 370                 375                           
ccg cgt ggc tac gac gag cag cca ggc gat ctg ctg gca cca cag ttt       1684
Pro Arg Gly Tyr Asp Glu Gln Pro Gly Asp Leu Leu Ala Pro Gln Phe           
380                 385                 390                 395           
gtc att gaa acc ctg tcc aag gaa gtt ggc ccc gac gca att tac tgc       1732
Val Ile Glu Thr Leu Ser Lys Glu Val Gly Pro Asp Ala Ile Tyr Cys           
400                 405                 410               
gcc ggc gtt ggc cag cac caa atg tgg gca gct cag ttc gtt gac ttt       1780
Ala Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Val Asp Phe           
415                 420                 425                   
gaa aag cca cgc acc tgg ctc aac tcc ggt gga ctg ggc acc atg ggc       1828
Glu Lys Pro Arg Thr Trp Leu Asn Ser Gly Gly Leu Gly Thr Met Gly           
430                 435                 440                       
tac gca gtt cct gcg gcc ctt gga gca aag gct ggc gca cct gac aag       1876
Tyr Ala Val Pro Ala Ala Leu Gly Ala Lys Ala Gly Ala Pro Asp Lys           
445                 450                 455                           
gaa gtc tgg gct atc gac ggc gac ggc tgt ttc cag atg acc aac cag       1924
Glu Val Trp Ala Ile Asp Gly Asp Gly Cys Phe Gln Met Thr Asn Gln           
460                 465                 470                 475           
gaa ctc acc acc gcc gca gtt gaa ggt ttc ccc att aag atc gca cta       1972
Glu Leu Thr Thr Ala Ala Val Glu Gly Phe Pro Ile Lys Ile Ala Leu           
480                 485                 490               
atc aac aac gga aac ctg ggc atg gtt cgc caa tgg cag acc cta ttc       2020
Ile Asn Asn Gly Asn Leu Gly Met Val Arg Gln Trp Gln Thr Leu Phe           
495                 500                 505                   
tat gaa gga cgg tac tca aat act aaa ctt cgt aac cag ggc gag tac       2068
Tyr Glu Gly Arg Tyr Ser Asn Thr Lys Leu Arg Asn Gln Gly Glu Tyr           
510                 515                 520                       
atg ccc gac ttt gtt acc ctt tct gag gga ctt ggc tgt gtt gcc atc       2116
Met Pro Asp Phe Val Thr Leu Ser Glu Gly Leu Gly Cys Val Ala Ile           
525                 530                 535                           
cgc gtc acc aaa gcg gag gaa gta ctg cca gcc atc caa aag gct cga       2164
Arg Val Thr Lys Ala Glu Glu Val Leu Pro Ala Ile Gln Lys Ala Arg           
540                 545                 550                 555           
gag atc aac gac cgc cca gta gtc atc gac ttc atc gtc ggt gaa gac       2212
Glu Ile Asn Asp Arg Pro Val Val Ile Asp Phe Ile Val Gly Glu Asp           
560                 565                 570               
gca cag gta tgg cca atg gtg tct gct gga tca tcc aac tcc gat atc       2260
Ala Gln Val Trp Pro Met Val Ser Ala Gly Ser Ser Asn Ser Asp Ile           
575                 580                 585                   
cag tac gca ctc gga ttg cgc cca ttc ttt gat ggt gat gaa tct gca       2308
Gln Tyr Ala Leu Gly Leu Arg Pro Phe Phe Asp Gly Asp Glu Ser Ala           
590                 595                 600                       
gca gaa gat cct gcc gac att cac gaa gcc gtc agc gac att gat gcc       2356
Ala Glu Asp Pro Ala Asp Ile His Glu Ala Val Ser Asp Ile Asp Ala           
605                 610                 615                           
gcc gtt gaa tcg acc gag gca taa ggagagaccc aag atg gct aat tct        2405
Ala Val Glu Ser Thr Glu Ala                    Met Ala Asn Ser            
620                 625                                    630            
gac gtc acc cgc cac atc ctg tcc gta ctc gtt cag gac gta gac gga       2453
Asp Val Thr Arg His Ile Leu Ser Val Leu Val Gln Asp Val Asp Gly           
635                 640                 645               
atc att tcc cgc gta tca ggt atg ttc acc cga cgc gca ttc aac ctc       2501
Ile Ile Ser Arg Val Ser Gly Met Phe Thr Arg Arg Ala Phe Asn Leu           
650                 655                 660                   
gtg tcc ctc gtg tct gca aag acc gaa aca cac ggc atc aac cgc atc       2549
Val Ser Leu Val Ser Ala Lys Thr Glu Thr His Gly Ile Asn Arg Ile           
665                 670                 675                       
acg gtt gtt gtc gac gcc gac gag ctc aac att gag cag atc acc aag       2597
Thr Val Val Val Asp Ala Asp Glu Leu Asn Ile Glu Gln Ile Thr Lys           
680                 685                 690                           
cag ctc aac aag ctg atc ccc gtg ctc aaa gtc gtg cga ctt gat gaa       2645
Gln Leu Asn Lys Leu Ile Pro Val Leu Lys Val Val Arg Leu Asp Glu           
695                 700                 705                 710           
gag acc act atc gcc cgc gca atc atg ctg gtt aag gtc tct gcg gac       2693
Glu Thr Thr Ile Ala Arg Ala Ile Met Leu Val Lys Val Ser Ala Asp           
715                 720                 725               
agc acc aac cgt ccg cag atc gtc gac gcc gcg aac atc ttc cgc gcc       2741
Ser Thr Asn Arg Pro Gln Ile Val Asp Ala Ala Asn Ile Phe Arg Ala           
730                 735                 740                   
cga gtc gtc gac gtg gct cca gac tct gtg gtt att gaa tcc aca ggc       2789
Arg Val Val Asp Val Ala Pro Asp Ser Val Val Ile Glu Ser Thr Gly           
745                 750                 755                       
acc cca ggc aag ctc cgc gca ctg ctt gac gtg atg gaa cca ttc gga       2837
Thr Pro Gly Lys Leu Arg Ala Leu Leu Asp Val Met Glu Pro Phe Gly           
760                 765                 770                           
atc cgc gaa ctg atc caa tcc gga cag att gca ctc aac cgc ggt ccg       2885
Ile Arg Glu Leu Ile Gln Ser Gly Gln Ile Ala Leu Asn Arg Gly Pro           
775                 780                 785                 790           
aag acc atg gct ccg gcc aag atc taa acagcaatta atctgattgc             2932
Lys Thr Met Ala Pro Ala Lys Ile                                           
795                                                       
acctgctgca taaatgtgac tagtcaaaca ccgtctaatt acatgtgtgt ggtagaacaa     2992
taatgtagtt gtctgcccaa gcgagttaaa ctcccacgat ttacagtggg gggcagacat     3052
cttttcacca aaatttttac gaaaggcgag attttctccc atggctattg aactgcttta     3112
tgatgctgac gctgacctct ccttgatcca gggccgtaag gttgccatcg ttggctacgg     3172
ctcccagggc cacgcacact cccagaacct ccgcgattct ggcgttgagg ttgtcattgg     3232
tctgcgcgag ggctccaagt ccgcagagaa ggcaaaggaa gcaggcttcg aggtcaagac     3292
caccgctgag gctgcagctt gggctgacgt catcatgctc ctggctccag acacctccca     3352
ggcagaaatc ttcaccaacg acatcgagcc aaacctgaac gcaggcgacg cactgctgt      3411
<210>  9
<211>  626
<212>  PRT
<213>  Corynebacterium glutamicum
<400>  9
Val Asn Val Ala Ala Ser Gln Gln Pro Thr Pro Ala Thr Val Ala Ser 
1               5                   10                  15      
Arg Gly Arg Ser Ala Ala Pro Glu Arg Met Thr Gly Ala Lys Ala Ile 
20                  25                  30          
Val Arg Ser Leu Glu Glu Leu Asn Ala Asp Ile Val Phe Gly Ile Pro 
35                  40                  45              
Gly Gly Ala Val Leu Pro Val Tyr Asp Pro Leu Tyr Ser Ser Thr Lys 
50                  55                  60                  
Val Arg His Val Leu Val Arg His Glu Gln Gly Ala Gly His Ala Ala 
65                  70                  75                  80  
Thr Gly Tyr Ala Gln Val Thr Gly Arg Val Gly Val Cys Ile Ala Thr 
85                  90                  95      
Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Thr Pro Ile Ala Asp Ala Asn 
100                 105                 110         
Leu Asp Ser Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Gly Ser Gly 
115                 120                 125             
Leu Leu Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Ala Asp Ile Arg Gly Ile Thr 
130                 135                 140                 
Met Pro Val Thr Lys His Asn Phe Met Val Thr Asn Pro Asn Asp Ile 
145                 150                 155                 160 
Pro Gln Ala Leu Ala Glu Ala Phe His Leu Ala Ile Thr Gly Arg Pro 
165                 170                 175     
Gly Pro Val Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Val Gln Asn Ala Glu Leu 
180                 185                 190         
Asp Phe Val Trp Pro Pro Lys Ile Asp Leu Pro Gly Tyr Arg Pro Val 
195                 200                 205             
Ser Thr Pro His Ala Arg Gln Ile Glu Gln Ala Val Lys Leu Ile Gly 
210                 215                 220                 
Glu Ala Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly Val Ile Lys Ala 
225                 230                 235                 240 
Asp Ala His Glu Glu Leu Arg Ala Phe Ala Glu Tyr Thr Gly Ile Pro 
245                 250                 255     
Val Val Thr Thr Leu Met Ala Leu Gly Thr Phe Pro Glu Ser His Glu 
260                 265                 270         
Leu His Met Gly Met Pro Gly Met His Gly Thr Val Ser Ala Val Gly 
275                 280                 285             
Ala Leu Gln Arg Ser Asp Leu Leu Ile Ala Ile Gly Ser Arg Phe Asp 
290                 295                 300                 
Asp Arg Val Thr Gly Asp Val Asp Thr Phe Ala Pro Asp Ala Lys Ile 
305                 310                 315                 320 
Ile His Ala Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Ile Lys Gln Val 
325                 330                 335     
Glu Val Pro Ile Val Gly Asp Ala Arg Glu Val Leu Ala Arg Leu Leu 
340                 345                 350         
Glu Thr Thr Lys Ala Ser Lys Ala Glu Thr Glu Asp Ile Ser Glu Trp 
355                 360                 365             
Val Asp Tyr Leu Lys Gly Leu Lys Ala Arg Phe Pro Arg Gly Tyr Asp 
370                 375                 380                 
Glu Gln Pro Gly Asp Leu Leu Ala Pro Gln Phe Val Ile Glu Thr Leu 
385                 390                 395                 400 
Ser Lys Glu Val Gly Pro Asp Ala Ile Tyr Cys Ala Gly Val Gly Gln 
405                 410                 415     
His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Val Asp Phe Glu Lys Pro Arg Thr 
420                 425                 430         
Trp Leu Asn Ser Gly Gly Leu Gly Thr Met Gly Tyr Ala Val Pro Ala 
435                 440                 445             
Ala Leu Gly Ala Lys Ala Gly Ala Pro Asp Lys Glu Val Trp Ala Ile 
450                 455                 460                 
Asp Gly Asp Gly Cys Phe Gln Met Thr Asn Gln Glu Leu Thr Thr Ala 
465                 470                 475                 480 
Ala Val Glu Gly Phe Pro Ile Lys Ile Ala Leu Ile Asn Asn Gly Asn 
485                 490                 495     
Leu Gly Met Val Arg Gln Trp Gln Thr Leu Phe Tyr Glu Gly Arg Tyr 
500                 505                 510         
Ser Asn Thr Lys Leu Arg Asn Gln Gly Glu Tyr Met Pro Asp Phe Val 
515                 520                 525             
Thr Leu Ser Glu Gly Leu Gly Cys Val Ala Ile Arg Val Thr Lys Ala 
530                 535                 540                 
Glu Glu Val Leu Pro Ala Ile Gln Lys Ala Arg Glu Ile Asn Asp Arg 
545                 550                 555                 560 
Pro Val Val Ile Asp Phe Ile Val Gly Glu Asp Ala Gln Val Trp Pro 
565                 570                 575     
Met Val Ser Ala Gly Ser Ser Asn Ser Asp Ile Gln Tyr Ala Leu Gly 
580                 585                 590         
Leu Arg Pro Phe Phe Asp Gly Asp Glu Ser Ala Ala Glu Asp Pro Ala 
595                 600                 605             
Asp Ile His Glu Ala Val Ser Asp Ile Asp Ala Ala Val Glu Ser Thr 
610                 615                 620                 
Glu Ala 
625     
<210>  10
<211>  172
<212>  PRT
<213>  Corynebacterium glutamicum
<400>  10
Met Ala Asn Ser Asp Val Thr Arg His Ile Leu Ser Val Leu Val Gln 
1               5                   10                  15      
Asp Val Asp Gly Ile Ile Ser Arg Val Ser Gly Met Phe Thr Arg Arg 
20                  25                  30          
Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu Val Ser Ala Lys Thr Glu Thr His Gly 
35                  40                  45              
Ile Asn Arg Ile Thr Val Val Val Asp Ala Asp Glu Leu Asn Ile Glu 
50                  55                  60                  
Gln Ile Thr Lys Gln Leu Asn Lys Leu Ile Pro Val Leu Lys Val Val 
65                  70                  75                  80  
Arg Leu Asp Glu Glu Thr Thr Ile Ala Arg Ala Ile Met Leu Val Lys 
85                  90                  95      
Val Ser Ala Asp Ser Thr Asn Arg Pro Gln Ile Val Asp Ala Ala Asn 
100                 105                 110         
Ile Phe Arg Ala Arg Val Val Asp Val Ala Pro Asp Ser Val Val Ile 
115                 120                 125             
Glu Ser Thr Gly Thr Pro Gly Lys Leu Arg Ala Leu Leu Asp Val Met 
130                 135                 140                 
Glu Pro Phe Gly Ile Arg Glu Leu Ile Gln Ser Gly Gln Ile Ala Leu 
145                 150                 155                 160 
Asn Arg Gly Pro Lys Thr Met Ala Pro Ala Lys Ile 
165                 170         
<210>  11
<211>  28
<212>  DNA
<213>  Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>  repeat_region
<222>  (1)..(28)
<223>  IR1
<400>  11
ccccgcgcgc cgggtgggga gcgaaggg                                          28
<210>  12
<211>  29
<212>  DNA
<213>  Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>  repeat_region
<222>  (1)..(29)
<223>  IR2
<400>  12
gcgattttgc atgttttact caaaattac                                         29
<210>  13
<211>  2619
<212>  DNA
<213>  Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>  promoter
<222>  (1)..(177)
<223>  PprpD2
<220>
<221>  RBS
<222>  (178)..(206)
<223>  RBS gap
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (207)..(209)
<223>  atg-start codon
<220>
<221>  gene
<222>  (207)..(2087)
<223>  coding region ilvB
<220>
<221>  gene
<222>  (2101)..(2619)
<223>  coding region ilvN
<400>  13
ctccagcgtc cacgaatatg cccccgcgcg ccgggtgggg agcgaaggga acccccaagg       60
aattggcgtt gaggtggcga ttttgcatgt tttactcaaa attactttgg tggtcacaaa      120
attacacaac ttttacagtg acctagatcg ctttttaaag aattagcgtg gtgtgcatgc      180
atatttatcg cgagaggaga cacaacatga atgtggcagc ttctcaacag cccactcccg      240
ccacggttgc aagccgtggt cgatccgccg cccctgagcg gatgacaggt gcacaggcaa      300
ttgttcgatc gctcgaggag cttaacgccg acatcgtgtt cggtattcct ggtggtgcgg      360
tgctaccggt gtatgacccg ctctattcct ccacaaaggt gcgccacgtc ctggtgcgcc      420
acgagcaggg cgcaggccac gcagcaaccg gctacgcgca ggttactgga cgcgttggcg      480
tctgcattgc aacctctggc ccaggcgcaa ccaacttggt taccccaatc gctgatgcaa      540
acttggactc cgttcccatg gttgccatca ccggccaggt cggaagtggc ctgctgggta      600
ccgatgcttt ccaggaagcc gatatccgcg gcatcaccat gccagtgacc aagcacaact      660
tcatggtcac cgaccccaac gacattccac aggcattggc tgaggcattc cacctcgcga      720
ttactggtcg ccctggccct gttctggtgg atattcctaa ggatgtccaa aacgctgaat      780
tggatttcgt ctggccacca aagatcgacc tgccaggcta ccgcccagtt tctactccgc      840
atgctcgaca gattgagcag gctgtcaaac tgatcggtga agccaaaaag ccagtccttt      900
acgttggtgg tggcgtaatc aaggctgacg cacacgaaga gcttcgtgcg ttcgctgagt      960
acaccggcat cccagttgtc accaccttga tggctttggg tactttccca gagtctcacg     1020
agctgcacat gggtatgcca ggcatgcatg gcactgtgtc cgctgttggt gcactgcagc     1080
gcagcgacct gctgattgct atcggctccc gctttgatga ccgcgtcacc ggtgacgttg     1140
acaccttcgc gcctgacgcc aagatcattc acgccgacat tgatcctgcc gaaatcggca     1200
agatcaagca ggttgaggtt ccaatcgtgg gcgatgcccg cgaagttctt gctcgtctgc     1260
tggaaaccac caaggcaagc aaggcagaga ccgaggacat ctccgagtgg gttgactacc     1320
tcaagggcct caaggcacgt ttcccgcgtg gctacgacga gcagccaggc gatctgctgg     1380
caccacagtt tgtcattgaa accctgtcca aggaagttgg ccccgacgca atttactgcg     1440
ccggcgttgg ccagcaccaa atgtgggcag ctcagttcgt tgactttgaa aagccacgca     1500
cctggctcaa ctccggtgga ctgggcacca tgggctacgc agttcctgcg gcccttggag     1560
caaaggctgg cgcacctgac aaggaagtct gggctatcga cggcgacggc tgtttccaga     1620
tgaccaacca ggaactcacc accgccgcag ttgaaggttt ccccattaag atcgcactaa     1680
tcaacaacgg aaacctgggc atggttcgcc aatggcagac cctattctat gaaggacggt     1740
actcaaatac taaacttcgt aaccagggcg agtacatgcc cgactttgtt accctttctg     1800
agggacttgg ctgtgttgcc atccgcgtca ccaaagcgga ggaagtactg ccagccatcc     1860
aaaaggctcg agagatcaac gaccgcccag tagtcatcga cttcatcgtc ggtgaagacg     1920
cacaggtatg gccaatggtg tctgctggat catccaactc cgatatccag tacgcactcg     1980
gattgcgccc attctttgat ggtgatgaat ctgcagcaga agatcctgcc gacattcacg     2040
aagccgtcag cgacattgat gccgccgttg aatcgaccga ggcataagga gagacccaag     2100
atggctaatt ctgacgtcac ccgccacatc ctgtccgtac tcgttcagga cgtagacgga     2160
atcatttccc gcgtatcagg tatgttcacc cgacgcgcat tcaacctcgt gtccctcgtg     2220
tctgcaaaga ccgaaacaca cggcatcaac cgcatcacgg ttgttgtcga cgccgacgag     2280
ctcaacattg agcagatcac caagcagctc aacaagctga tccccgtgct caaagtcgtg     2340
cgacttgatg aagagaccac tatcgcccgc gcaatcatgc tggttaaggt ctctgcggac     2400
agcaccaacc gtccgcagat cgtcgacgcc gcgaacatct tccgcgcccg agtcgtcgac     2460
gtggctccag actctgtggt tattgaatcc acaggcaccc caggcaagct ccgcgcactg     2520
cttgacgtga tggaaccatt cggaatccgc gaactgatcc aatccggaca gattgcactc     2580
aaccgcggtc cgaagaccat ggctccggcc aagatctaa                            2619
<210>  14
<211>  1421
<212>  DNA
<213>  Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>  gene
<222>  (7)..(636)
<223>  3‘-region of the iLvB-gene
<220>
<221>  gene
<222>  (650)..(1168)
<223>  ilvN gene
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (707)..(715)
<223>  mutated gene section
<400>  14
gaattccaga tgtgggcagc tcagttcgtt gactttgaaa agccacgcac ctggctcaac       60
tctggcggcc tgggcaccat gggctacgca gttcctgcgg ctcttggagc aaaggctggc      120
gcacctgaca aggaagtctg ggctatcgac ggcgacggct gtttccagat gaccaaccag      180
gaactcacca ccgccgcagt tgaaggtttc cccattaaga tcgcactaat caacaacgga      240
aacctgggca tggttcgcca atggcagacc ctattctatg aaggacggta ctcaaatact      300
aaacttcgta accagggcga gtacatgccc gactttgtta ccctttctga gggacttggc      360
tgtgttgcca tccgcgtcac caaagcggag gaagtactgc cagccatcca aaaggctcga      420
gagatcaacg accgcccagt agtcatcgac ttcatcgtcg gtgaagacgc acaggtatgg      480
ccaatggtgt ctgctggatc atccaactcc gatatccagt acgcactcgg attgcgccca      540
ttctttgatg gtgatgaatc tgcagcagaa gatcctgccg acattcacga agccgtcagc      600
gacattgatg ccgccgttga atcgaccgag gcataaggag agacccaaga tggctaattc      660
tgacgtcacc cgccacatcc tgtccgtact cgttcaggac gtagacgatg acttttcccg      720
cgtatcaggt atgttcaccc gacgcgcatt caacctcgtg tccctcgtgt ctgcaaagac      780
cgaaacactc ggcatcaacc gcatcacggt tgttgtcgac gccgacgagc tcaacattga      840
gcagatcacc aagcagctca acaagctgat ccccgtgctc aaagtcgtgc gacttgatga      900
agagaccacc atcgcccgcg caatcatgct ggttaaggtc tctgcggata gcaccaaccg      960
tccgcagatc gtcgacgccg cgaacatctt ccgcgcccga gtcgtcgacg tggctccaga     1020
ctctgtggtt attgaatcca caggcacccc aggcaagctc cgcgcactgc ttgatgtgat     1080
ggaaccattc ggaatccgcg aactgatcca atccggacag attgcactca accgcggtcc     1140
gaagaccatg gctccggcca agatctaaac agcaattaat ctgattgcac ctgctgcata     1200
aatgtgacta gtcaaacacc gtctaattgc atgtgtgtgg tagaacaata atgtagttgt     1260
ctgcccaagc gagtttaact cccacgattt acagtggggg cagacatctt ttcaccaaaa     1320
tttttacgaa aggcgagatt ttctcccatg gctattgaac tgctttatga tgctgacgct     1380
gacctctcct tgatccaggg ccgcaaggtt gccataagct t                         1421
<210>  15
<211>  19
<212>  DNA
<213>  Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(19)
<223>  test primer 3
<400>  15
cccagtagtc atcgacttc                                                    19
<210>  16
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(20)
<223>  test primer 4
<400>  16
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【図１】
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【国際調査報告】
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