(57)【要約】  【解決手段】  絹フィブロインとヒアルロン酸とを有する多孔性の自己集合性生体材料、及びそのような生体材料を調製するための方法が開示される。前記多孔性の自己集合性生体材料を利用するデバイスもまた、提供される。  【選択図】      図９
2016528007.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
損傷組織を治療するための亜大気圧装置であって、
ａ．カバーと治療される前記組織との間に配置されるように構成される非吸収性材料、及び
ｂ．前記非吸収性材料の分解を防止するように構成され、かつ前記非吸収性材料に近接して配置される組織保護材料であって、前記非吸収性材料と治療される前記組織との間に配置されるように構成され、絹フィブロインとヒアルロン酸との混合物を有する多孔性の生体吸収性クリオゲルを有する、前記保護材料
を有し、前記保護材料及び前記非吸収性材料は、治療される前記組織への亜大気圧の分布を可能にするように、気体連通している、装置。
【請求項２】
請求項１記載の装置において、前記非吸収性材料が多孔性である、装置。
【請求項３】
請求項１または２記載の装置において、前記保護材料が注射可能である、装置。
【請求項４】
先行する請求項のいずれか一項記載の装置において、前記非吸収性材料が発泡材またはスポンジを有する、装置。
【請求項５】
先行する請求項のいずれか一項記載の装置において、前記絹フィブロインとヒアルロン酸との混合物が、少なくとも約１．５：１から１０：１の絹フィブロイン対ヒアルロン酸比を有する、装置。
【請求項６】
先行する請求項のいずれか一項記載の装置において、前記絹フィブロインとヒアルロン酸との混合物が、少なくとも約１．５：１から３：１の絹フィブロイン対ヒアルロン酸比を有する、装置。
【請求項７】
先行する請求項のいずれか一項記載の装置において、前記絹フィブロインとヒアルロン酸との混合物が、少なくとも約２：１の絹フィブロイン対ヒアルロン酸比を有する、装置。
【請求項８】
先行する請求項のいずれか一項記載の装置において、前記保護材料が少なくとも約２０００％から約２５００％の水結合潜在能力を有する、装置。
【請求項９】
先行する請求項のいずれか一項記載の装置において、前記保護材料が少なくとも約２２５０％から約２３５０％の水結合潜在能力を有する、装置。
【請求項１０】
先行する請求項のいずれか一項記載の装置において、前記保護材料が少なくとも約２から８ｋＰａの弾性率を有する、装置。
【請求項１１】
先行する請求項のいずれか一項記載の装置において、前記保護材料が少なくとも約４から６ｋＰａの弾性率を有する、装置。
【請求項１２】
先行する請求項のいずれか一項記載の装置において、前記保護材料が少なくとも約４．５から５．５ｋＰａの弾性率を有する、装置。
【請求項１３】
先行する請求項のいずれか一項記載の装置において、前記保護材料が少なくとも約１５から２０μｍの細孔サイズを有する、装置。
【請求項１４】
先行する請求項のいずれか一項記載の装置において、前記非吸収性材料が合成ポリマーを有する、装置。
【請求項１５】
先行する請求項のいずれか一項記載の装置において、前記非吸収性材料が合成ポリマーを有し、かつ前記合成ポリマーがポリウレタンを有する、装置。
【請求項１６】
先行する請求項のいずれか一項記載の装置において、前記保護材料がシリコンを有する、装置。
【請求項１７】
先行する請求項のいずれか一項記載の装置において、前記多孔性の生体吸収性クリオゲルは自己集合性したものである、装置。
【請求項１８】
先行する請求項のいずれか一項記載の装置において、前記保護材料が前記非吸収性材料の近隣に配置される、装置。
【請求項１９】
先行する請求項のいずれか一項記載の装置において、前記保護材料が前記非吸収性材料の選択される表面に配置される、装置。
【請求項２０】
先行する請求項のいずれか一項記載の装置において、前記保護材料の一部が前記非吸収性材料内で散在するように、前記保護材料が前記非吸収性材料と接触している、装置。
【請求項２１】
先行する請求項のいずれか一項記載の装置において、前記非吸収性材料が穿孔を有する、装置。
【請求項２２】
先行する請求項のいずれか一項記載の装置であって、前記非吸収性材料及び前記保護材料と気体連通する吸引源を有する、装置。
【請求項２３】
組織保護クリオゲルと非吸収性発泡材とを有する組織修復材料を調製するための方法であって、
ａ．ヒアルロン酸と絹フィブロインとの溶液を形成する工程と、
ｂ．前記組織修復材料を得るために、前記ヒアルロン酸と絹フィブロインとの溶液を、前記組織保護クリオゲルとして、前記非吸収性発泡材に適用する工程と
を有する、方法。
【請求項２４】
請求項２３記載の方法であって、生絹から絹フィブロインを抽出し、かつ精製することによって、絹フィブロインを調製する工程を有する、方法。
【請求項２５】
請求項２３または２４記載の方法において、前記ヒアルロン酸の濃度が少なくとも約３０から４０重量％である、方法。
【請求項２６】
請求項２３〜２５のいずれか一項記載の方法において、前記ヒアルロン酸と絹フィブロインとの溶液を前記組織保護クリオゲルとして適用する工程が、前記ヒアルロン酸と絹フィブロインとの溶液を前記非吸収性発泡材の表面上で凍結乾燥する工程を有する、方法。
【請求項２７】
請求項２３〜２５のいずれか一項記載の方法において、前記ヒアルロン酸と絹フィブロインとの溶液を前記組織保護クリオゲルとして適用する工程が、前記組織保護クリオゲルを前記非吸収性発泡材の表面で注射する工程を有する、方法。
【請求項２８】
請求項２３〜２７のいずれか一項記載の方法であって、ソニケーターを用いて前記ヒアルロン酸と絹フィブロインとの溶液を超音波処理する工程を有する、方法。
【請求項２９】
請求項２３〜２８のいずれか一項記載の方法であって、ボルテクサーを用いて前記ヒアルロン酸と絹フィブロインとの溶液をボルテックスする工程を有する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広くは生体材料としての使用のための多孔性の自己集合性ヒドロゲルに関し、またより具体的には、排他的にではないが、絹フィブロインとヒアルロン酸とを有する多孔性クリオゲルを組み込むデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
組織修復特性を有する生体材料は、外科的適用、とくにデバイス−組織境界面において、関心対象である。例えば、いくらかの現在の材料は、治療終了後のデバイス除去に際して組織を損傷するかもしれず、かつ／または、組織部位において分解し材料の断片を置き去りにするかもしれない。これらの断片は、除去を要しうる。従って、生体材料及びデバイスは、１）デバイス−組織境界面に配置された場合、組織を治療するためのデバイスの機能及び構造が保持または改善されることを可能にし、２）デバイスの除去の間の組織損傷を減少させつつ、組織部位からのデバイスの除去の容易さを増強し、かつ３）デバイスの使用中及びデバイスが除去された後の修復を促進する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明の態様の１つにおいては、本発明は、組織修復デバイスにおける使用のためにデバイス−組織境界面に配置されるように構成された組織保護材料を含む方法、材料、及びデバイスを提供することにより、本分野に存在する需要に応える。
【０００４】
例えば、本発明は、カバーと治療される組織との間に配置されるように構成された非吸収性材料を有する、損傷組織を治療するための亜大気圧装置を提供しうる。本装置は、また、非吸収性材料の分解を防止するように構成され、かつ非吸収性材料に近接して配置される、組織保護材料をも含みうる。保護材料は、また、非吸収性材料と治療される組織との間に配置されるようにも構成されうる。保護材料は、絹フィブロインとヒアルロン酸の混合物を有する、多孔性の生体吸収性クリオゲルを有しうる。さらに、治療される組織への亜大気圧の分布の可能性を与えるように、保護材料及び非吸収性材料は互いに気体が往来する状態にありうる。保護材料は、また、注射可能であってもよい。絹フィブロインとヒアルロン酸との混合物は、少なくとも約１．５：１から１０：１、または少なくとも約１．５：１、または好ましくは少なくとも約２：１の絹フィブロイン対ヒアルロン酸比を有しうる。保護材料は、少なくとも約１５から２０μｍの細孔サイズを有してもよく、また穿孔を含んでもよい。
【０００５】
非吸収性材料は多孔性であってもよく、また発泡材またはスポンジを有してもよい。非吸収性材料は合成ポリマーを有してもまたよく、またより具体的には、合成ポリマーは、ポリウレタンを有してもよく、また穿孔を含んでもよい。保護層はシリコンをさらに有しうる。さらに、本装置は、非吸収性材料及び保護材料との間で気体が往来する状態にある、吸引源を有しうる。
【０００６】
本発明の一定の要素の配置に関しては、非吸収性材料と保護材料とは、様々な方法で関連付けられうる。例えば、保護材料は非吸収性材料の近隣に配置されうる。保護材料は、非吸性材料の選択された表面に配置されてもよい。さらに、保護材料の一部分が非吸収性材料内で散在するまたは嵌合するように、保護材料が非吸収性材料と接触していてもよい。実際、本発明の一定の態様においては、また非吸収性材料と保護材料との両者の化学的及び構造的性質ゆえ、保護材料の一部が非吸収性材料中へと伸び、これにより保護材料を非吸収性材料と混合してもよい。非吸収性材料と保護材料との間のそのような相互作用は、本発明の非分解特性を増強しうる。
【０００７】
本発明のデバイス及び方法に関してより一般的には、亜大気圧療法の組織への適用は、従来型の方法と比較してより大きい治癒速度を提供しうる（米国特許第５，６４５，０８１号、第５，６３６，６４３号、第７１９８，０４６号、第７，２１６，６５１号、第８，２６７，９６０号、及び第８，３７７，０１６号、並びに米国特許出願公開第２００３／０２２５３４７号、第２００４／００３９３９１号、第２００４／０１２２４３４号、第２００９／０１８７２５９号、及び第２０１０／０１２１２２９号において述べられる通りであり、これらの内容は本参照により本明細書に組み込まれる）。
【０００８】
本発明の態様のまた別の１つにおいては、本発明は、組織保護クリオゲルと非吸収性材料とを有する組織修復材料を調製するための方法を含みうる。本方法は、ヒアルロン酸と絹フィブロインとの溶液を形成するステップを含みうる。本方法は、組織修復材料を得るため、ヒアルロン酸と絹フィブロインとの溶液を組織保護クリオゲルとして、非吸収性材料に適用するステップもまた含みうる。
【０００９】
本方法の一実施形態においては、ヒアルロン酸と絹フィブロインとの溶液を組織保護クリオゲルとして適用するステップは、ヒアルロン酸と絹フィブロインとの溶液を非吸収性材料の表面上へと凍結乾燥する工程を有しうる。別の一実施形態においては、本方法は、生絹から絹フィブロインを抽出しかつ精製する工程により、絹フィブロインを調製するステップを有しうる。さらに、ヒアルロン酸と絹フィブロインとの溶液中のヒアルロン酸濃度は、少なくとも約３０から４０重量％でありうる。本発明の方法は、超音波処理するステップ、及び／またはボルテックスするステップもまた含みうる。
【００１０】
本発明の少なくとも１つの態様においては、本発明は、１）デバイス−組織境界面に配置された場合、組織及び／または損傷組織を治療するためのデバイスの機能及び構造が保持または改善されることを可能にし、２）デバイスの除去の間の組織損傷を減少させつつ、組織修復部位からのデバイスの除去の容易さを増強し、かつ／または３）デバイスの使用中及びデバイスが除去された後の修復を促進しうる、生体材料、及びそれらの生体材料を利用するデバイスを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
本発明の前述の概要及び以下の代表的な実施形態の詳細な開示は、添付の図面（図面においては終始、類似要素には同様の番号がつけられている）と併せて読まれる場合、さらに理解されうる。
【図１】図１は、（Ａ）ＳＦ−ＨＡクリオゲル、（Ｂ）ヒアルロン酸（ＨＡ）、及び（Ｃ）絹フィブロイン（ＳＦ）の特性を示す、３つのＦＴＩＲスペクトルを図示的に表わす。
【図２】図２は、ＳＦ−ＨＡクリオゲルの弾性率の評価を図示的に表わす。具体的には、力（ｎＮ）が、ＳＦ−ＨＡクリオゲル中に残される凹み（μｍ）と比較される。さらに、生じる実験データはＨｅｒｔｚモデルフィッティングを用いて評価される。
【図３】図３は、倍率１μｍにおいて１５〜２０μｍの細孔を有する多孔性構造を示す、ＳＦ−ＨＡクリオゲル発泡材の走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）を表わす。
【図４】図４は、純粋なフィブロインと比較したＳＦ−ＨＡクリオゲル発泡材の走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）を表わし、パネル（Ａ）はｘ２３０倍率でのＳＦ−ＨＡクリオゲル発泡材を示し、パネル（Ｂ）はｘ９００倍率でのＳＦ−ＨＡクリオゲル発泡材を示し、パネル（Ｃ）はｘ２３０倍率での純粋なフィブロインを示し、またパネル（Ｄ）はｘ９００倍率での純粋なフィブロインを示す。
【図５】図５は、ＳＦ−ＨＡクリオゲルで被覆された多孔性材料またはスポンジ（例えば、ポリウレタン発泡材）の流体除去能力を試験するために使用される、自由流動システムを図式的に例証する。
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、ポリウレタン（ＰＵ）発泡材（対照）またはＳＦ−ＨＡクリオゲルで被覆されたＰＵ発泡材（ＳＦ−ＨＡ被覆）から構成されるスポンジにおける、流体除去の自由流動システム実験の結果を図示的に示す。
【図７】図７は、肝臓組織に対するｅｘ  ｖｉｖｏ亜大気圧創傷療法モデルにおいて、ＳＦ−ＨＡ被覆のポリウレタン（ＰＵ）スポンジの性能を試験するためのデバイスを、図式的に例証する。
【図８】図８は、ｅｘ  ｖｉｖｏモデルにおいて肝臓組織に亜大気圧を適用した結果を例証し、ここではＳＦ−ＨＡクリオゲル被覆のＰＵスポンジが、無被覆のＰＵスポンジ（対照）及びシリコン膜で被覆されたＰＵスポンジと比較された。パネル（Ａ）は１０分間の亜大気圧適用（−１２５ｍｍＨｇにて）後に調査された組織を示し、またパネル（Ｂ）は−１２５ｍｍＨｇにおける７２時間の亜大気圧適用後のスポンジの除去の際のそれを示す。
【図９】図９は、ｉｎ  ｓｉｔｕでの本発明の代表的な装置の、部分断面図での側立面図を図式的に例証し、体の表面における組織の治療を示す。ここで、代表的な装置は保護材料を含む。
【図１０】図１０は、ｉｎ  ｓｉｔｕでの本発明の別の１つの代表的な装置の、部分断面図での上立面図を図式的に例証し、体内における組織の治療を示す。ここで、その代表的な装置は保護材料を含む。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
創傷治癒特性を有する生体材料は、医学的適用、及び特に外科的または組織治癒適用において、興味対象である。実際、医療デバイスと、治療中のまたは治療を待っている組織との間の境界面において、そのような生体材料への需要が存在する。本発明の態様の１つにおいて、本発明はそれらの需要に応える。
【００１３】
本発明の材料は、好ましくはヒドロゲルを含み、（１）デバイス−組織境界面における組織損傷を防止して外科的デバイスの容易な除去を可能にし、かつ（２）デバイスがデバイス−組織境界面に配置された場合に、デバイスの機能及び構造が保持または改善されることを可能にしうる、多孔性の生体適合性、生体組み込み性、かつ／または生体再吸収性の層を形成しうる。本明細書で用いられる「生体吸収性」、「生体再吸収性」、または「生体組み込み性」の材料は、組織中で分解しうる材料、あるいは組織中に実質上区別不能な成分として組み込まれまたは吸収されうる材料である。
【００１４】
本発明のヒドロゲルは、発泡材及びスポンジの形態の、自己集合した多孔性材料を含む。より好ましくは、本発明のヒドロゲルはクリオゲルである。本明細書で用いられる「クリオゲル」は、０℃より低い温度にて水溶液中で形成されるヒドロゲルを指す。好ましくは、自己集合した多孔性材料（例えば、ヒドロゲル、クリオゲル）は、絹フィブロイン（ＳＦ）及びヒアルロン酸（ＨＡ）を含む。
【００１５】
本発明の生体材料は、注射可能であってもまたよい。実際、本発明の生体材料は、異なる水取込み度において使用されるかもしれず、また付属の針有りまたは無しで注射器または他の注射デバイスを使用して組織部位に適用されてもよい。異なる水取込み度は、組織の位置またはヒドロゲルにて必要とされる粘度を維持する可能性を与えうる。従って、本発明の材料は、以前に適用された本発明の材料またはデバイスを補足するために、局所的に注射されうる、注射可能なヒドロゲルを含みうる。そのような局所注射の部位は、例えば、損傷組織、創傷、または手術部位を含みうる。
【００１６】
本発明の材料成分に関しては、亜大気圧療法システムと関連する埋め込み式発泡材またはスポンジに適用されうるヒドロゲル複合物のための基本成分として、ＨＡが使用されうる。ＨＡは創床への創傷治癒特性と増強された組織修復を提供するが、ＨＡ単独では、亜大気圧により提供される機械的変形ゆえ、亜大気圧と組み合わせた直接的使用に適する十分な構造的完全性に欠けうる。しかしながら、ＨＡは追加の複合材料とブレンドされまたは混合されうる。追加の複合材料は、例えば、絹フィブロイン（ＳＦ）を含みうる。ＳＦは、ベータシートを形成するという点で独特なタンパク質である。ヒドロゲルは、ＨＡとＳＦとの組合せから調製されうる。さらに、ＳＦとＨＡとを組み合わせた後、本発明のヒドロゲルは、ヒドロゲル内でＨＡを封入するＳＦのベータシートを示しうる。
【００１７】
デバイス−組織境界面の適用において使用されるヒドロゲル及びクリオゲルは、安定性及び機能的完全性を保ちつつ、著しい量のＨＡを要しうる。本明細書では、異なるＨＡとＳＦとの比を有する材料が開発され、かつその物理的特性が調べられた。
【００１８】
本発明のヒドロゲルに目を向けると、ヒドロゲルがＳＦとＨＡとの混合物を有する場合、ＳＦの量は好ましくはＨＡの量より大きい。さらに、本発明のＳＦ−ＨＡヒドロゲルは、少なくとも約１．５：１から１０：１のＳＦ：ＨＡ比を有しうる。適用によっては、ＳＦ−ＨＡヒドロゲルは好ましくは少なくとも約１．５：１から３：１のＳＦ：ＨＡ比を有してもよく、またはより好ましくは、ＳＦ−ＨＡヒドロゲルは約２：１のＳＦ：ＨＡ比を有してもよい。実際、一定の適用においては、２：１のＳＦ：ＨＡ比を有するクリオゲルは、埋め込み式の非吸収性材料とともに使用されるクリオゲル被覆または発泡材の生産に最適でありうる。本明細書で用いられる「非吸収性」材料は、生体適合性ではありうるが、生体吸収性、生体組み込み性、または生体再吸収性ではない材料と定義される。本発明の非吸収性材料は、発泡材またはスポンジを形成しうる。本発明の非吸収性材料は、ポリウレタンを有しうる。
【００１９】
一定の非吸収性材料は、創傷及び／または組織部位において挿入されるが、２つの弱点を有しうる。例えば、一定の非吸収性材料は、デバイスの除去に際し組織部位にストレスまたは損傷を引き起こすかもしれず、かつ／あるいは、分解して、組織治療の停止及び／または創傷閉鎖の前に除去を要する非吸収性材料の断片を組織部位に置き去りにするかもしれない。
【００２０】
生成した本発明のＳＦ−ＨＡクリオゲルは、ＦＴＩＲにより特性が示され、ＳＦ及びＨＡの両者と比較された（図１）。本発明のヒドロゲルは、一連の有利な特性を有した。ヒドロゲルは水に非常によく結合し、著しい機械的完全性及び安定性を有し、かつ、ＰＵ発泡材の表面を本発明のクリオゲルで被覆した後にＰＵ発泡材の流体除去機能を損なわない。
【００２１】
本発明のヒドロゲルは、水に非常に良く結合する。実際、本明細書で開示されるヒドロゲルにおいては、ＳＦとＨＡとの混合物が、少なくとも１５００重量％の水結合潜在能力を提供する比に調和させられうる。高度の水結合は、ゆるい水溶液状態を提供し、修復中の組織において細胞の容易な遊走及び増殖を可能にする。好ましくは、本発明のヒドロゲルは、少なくとも約２０００％から約２３５０％の水結合潜在能力を有する。より好ましくは、水結合潜在能力は、少なくとも約２２５０％から約２３５０％である。例として、１：１のＳＦ−ＨＡ比を有する複合ヒドロゲルの水結合潜在能力は、１５倍（１５００％）の水結合潜在能力を生じる。これに比べ、約２：１のＳＦ−ＨＡ比を有する本発明のクリオゲルは、およそ２３倍（２３００％）である水結合潜在能力を提供する。
【００２２】
本発明のヒドロゲルの妥当な生体材料としての適否を決定するため、本発明のヒドロゲルの機械的特性が調べられた。本明細書において開示されるヒドロゲルは、顕著な安定性及び機械的完全性を有した。これは、そのヒドロゲルの弾性率により決定された。好ましくは、本発明のヒドロゲルは、少なくとも約２から８ｋＰａの弾性率を有する。より好ましくは、弾性率は少なくとも約４から６ｋＰａである。最も好ましくは、弾性率は少なくとも約４．５から５．５ｋＰａである。例えば、本発明のクリオゲル（２：１のＳＦ−ＨＡ比）は、４．９７ｋＰａの弾性率を有した。これは、原子間力顕微鏡法（ＡＭＦ）により決定された（図２を参照）。
【００２３】
本発明のヒドロゲルの構造に関しては、ヒドロゲル材料は、多孔性であり、また少なくとも約１５から２０μｍの細孔サイズを有しうる。さらに、本発明の好ましいヒドロゲルは、自己集合した多孔性ヒドロゲルでありうる。自己集合の態様に関しては、ゲル化に際し、本発明の材料は多孔性の足場またはマトリックスを自然発生的に形成しうる。例えば、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）により、本発明のクリオゲルは１５から２０μｍの範囲にある細孔サイズを有することが分かった（図３及び４）。
【００２４】
自由流動システムを使用して、ＰＵ発泡材の流体除去機能に対するＳＦ−ＨＡクリオゲル被覆の影響を決定するため、本発明の材料はＰＵ発泡材への適用後にもまた試験された（図５）。自由流動システムは、フィルター、細胞、及び／または組織により制御されないシステムを用いて流体除去を試験する方法を提供する。図５に関して、多孔性材料またはスポンジは、ＳＦ−ＨＡクリオゲルで被覆されており、多孔性のホルダーに配置される。次に、被覆された多孔性の材料またはスポンジの下流での亜大気圧の適用により、被覆された多孔性の材料またはスポンジを通して、流体が引き抜かれる。被覆された多孔性の材料またはスポンジを経る流体の通過を調べることにより、被覆された多孔性の材料またはスポンジを経る流体除去の減損またはその欠如が決定されうる。さらに、図６Ａは、対照スポンジとＳＦ−ＨＡ被覆のスポンジとの間で流体除去の速度が比較された、流体除去グラフを示す。ここで、ＳＦ−ＨＡ被覆スポンジは、対照スポンジと比較して流体除去を損なわず、より一貫しより変動が少ない流体流動もまた示した。図６Ｂは、上端、上位四分位値、メジアン、下位四分位値、及び下端の図中の位置を注解することにより、図６Ａにおける流体除去グラフを理解するための手がかりを提供する。従えば、自由流動システムを用いた測定によると、ＰＵ発泡材を介する流体除去はクリオゲル被覆の存在によっては損なわれなかった（図５、６Ａ、及び６Ｂ）。ゆえに、自由流動システムにおける流体は、試験用発泡材に浸入する前は、制限のない流れを有する。
【００２５】
本発明のクリオゲルの好ましい調製に関しては、高濃度のＨＡを有する非水性溶解クリオゲルが調製された。一般に、（例えば水性溶剤処理法を使用して）絹からの抽出の後、ＳＦが得られた。フィブロインは、アミノ酸解析、分子量、及び官能基同定に基づいて同定された。フィブロインの０．５８％溶液が作成され、４℃に維持された。ＨＡ（６ｍｇ）が２ｍＬのフィブロイン溶液中に溶解させられた。均一溶液が得られ、クリオ鋳造のためにＰＵスポンジが上に配置された円筒形容器中で、クリオ鋳造された。発泡材複合物は一晩−８０℃に置かれ、それから２４時間凍結乾燥され、ＰＵスポンジの組織接触表面上にクリオゲル被覆を形成した。
【００２６】
本発明のヒドロゲル発泡材は、本分野において調製される他の材料とは異なる（例えばＨｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）を参照せよ）。実際、本発明のヒドロゲル発泡材においては、ＳＦとＨＡとの均一溶液は、エネルギー入力を引き起こして対象物中に分子相互作用を生成する主な超音波処理法ではなく、クリオゲル化法により作成された、安定なゲルを産生した。
【００２７】
さらに、１）ＳＦ−ＨＡクリオゲル層を有する非吸収性ＰＵスポンジ、２）クリオゲル層を有さないＰＵスポンジ、及び３）シリコン薄膜を有するＰＵスポンジを利用する亜大気圧デバイスにおける結果を比較するためには、ｅｘ−ｖｉｖｏ肝臓モデルが使用された。図７を参照して、ＳＦ−ＨＡ被覆のＰＵスポンジが、無被覆のＰＵスポンジ（対照）、及びシリコン薄膜で被覆されたＰＵスポンジと比較された。具体的には、スポンジが肝臓組織上に配置され、それから、スポンジ及び治療される組織の両者の上方にカバーが配置された。それから、治療される組織にスポンジを介して亜大気圧を提供するため、カバー下のスペースとの間で気体が往来するように亜大気圧源が配置された。亜大気圧は、−１２５ｍｍＨｇにて適用された。
【００２８】
ｅｘ−ｖｉｖｏ肝臓モデルシステム（図７）を使用して、亜大気圧−１２５ｍｍＨｇににおいて７２時間の期間では、無被覆またはシリコン被覆のＰＵスポンジと比較して、クリオゲル被覆のＰＵスポンジでは、より少ない組織変形が観察されたことが示された（図８）。実際、図８中の画像にしめされるように、ＳＦ−ＨＡクリオゲル被覆のＰＵスポンジを介して亜大気圧が肝臓組織に分布させられた場合、無被覆のＰＵスポンジまたはシリコン薄膜で被覆されたスポンジと比較して、肝臓組織に対してより少ない変形（組織治療部位における点刻）が観察された。さらに、またいかなる１つの作動原理にも限定されることなく、ＳＦ（強度の提供者）とＨＡ（組織修復の促進者）との混合物は、亜大気圧療法と併せて使用される場合に、組織修復を最適化すると仮定される。
【００２９】
示されるように、ＳＦは抽出され、それからクリオゲル化法を使用してＨＡと共に加工されうる。ＳＦのＨＡとの加工からは、ＳＦゲルと比較して非常に多孔性かつ均一な構造が生じる。本発明のＳＦ−ＨＡクリオゲルは、約２３００±３５０％（または、水取込みによる２３±３．５倍の重量増加）の吸収を伴う水結合能力を有する。弾性率は、約４．７９ｋＰａでありうる。本発明の材料に対する機能試験は、ＳＦ−ＨＡ被覆がないＰＵ発泡材と比較して同等の、ＳＦ−ＨＡ被覆を有するＰＵ発泡材の流体除去を示す。さらに、非吸収性ＰＵ発泡材はＳＦ−ＨＡ保護材料と共に容易に除去され、そのような保護材料がないＰＵ発泡材と比較すると、最小限の組織損傷を生じうる。実際、本発明は、ドレッシング材交換関連痛を減少させるため、また創傷床への二次的損傷を防止するために、亜大気圧治療療法において強力な組織保護材料として使用されうる、ＳＦとＨＡとから作製されるクリオゲルを示す。
【００３０】
次は図９を参照し、本発明は、負傷または損傷組織を治療するために亜大気圧を使用するデバイスを含む。ここで、本デバイスは、上で明らかにされたＳＦ−ＨＡクリオゲルを組み込む。本明細書で使用される「損傷」組織は、痛めた、障害が起きた、またはあらゆる他の方法で損なわれた組織を含むように定義され、例えば、外傷、病気、感染、外科的合併症、または他の病理的過程による損傷を含む。ＳＦ−ＨＡクリオゲルを利用する本発明の亜大気圧治療デバイス１の代表的な構成は、図９中に描写される。
【００３１】
亜大気圧治療デバイス１は、損傷組織４０に亜大気圧を送達し、かつ分布させうる。さらに、治療でバイス１は、組織４０などの治療される組織に近接して配置される、多孔性材料１０を有しうる。多孔性材料１０は、ポリウレタン（ＰＵ）発泡材またはスポンジなどの、非吸収性発泡材またはスポンジでありうる。多孔性材料１０は、組織保護材料２０と共に提供されうる。組織保護材料２０は、好ましくは多孔性材料１０に近接するＳＦ−ＨＡクリオゲル被覆または層であってもよく、また多孔性材料１０と治療される組織４０との間に配置されうる。多孔性材料１０及び保護材料２０の追加または代わりの配置様相に関しては、保護材料２０は、多孔性材料１０の近隣に配置されうる。保護材料２０は、多孔性材料１０の他の表面を除外または含有する多孔性材料１０の選択された表面に、配置されてもまたよい。例えば、保護材料２０は、選択される表面が特定の組織または器官と近接しているために、多孔性材料のそのような選択される表面に配置されうる。保護材料２０は、保護材料２０の一部が多孔性材料１０内に散在するまたは嵌合するように、多孔性材料１０と接触していてもまたよい。
【００３２】
実際、本発明の一定の態様においては、また多孔性材料と保護材料との両者の化学的及び構造的性質ゆえ、保護材料２０の一部は、多孔性材料１０中へと伸び、これにより保護材料２０を多孔性材料１０と混合してもよい。多孔性材料１０と保護材料２０との間のそのような相互作用は、保護材料２０の多孔性材料１０への粘着を増強しうる。また、ゆえに、多孔性材料１０の潜在的な分解からさらに保護する。
【００３３】
使用においては、本発明のデバイスは、体表面の下の組織及び／もしくは器官、または体表面上の損傷組織を治療するために配置されてもよく、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用されてもよい。
【００３４】
多孔性材料１０への亜大気圧の送達、並びに、多孔性材料１０及び保護材料２０を介する損傷組織４０への分布に目を向けると、管６０が、直接的または間接的に、多孔性材料１０との間で気体が往来するように、管６０の適用端６１において多孔性材料１０と連結していてもよい。管６０の適用端６１は、多孔性材料１０中に埋め込まれてもまたよく、あるいは多孔性材料１０の上方に配置されてもよい。管６０の適用端６１は、穿孔を有していてもまたよい。
【００３５】
亜大気圧源７０（例えば、真空ポンプ）は、管６０の源端６２に動作可能に結合されうる。このようにして、亜大気圧は、管６０を経て多孔性材料１０へ、そして保護材料２０を介して損傷組織４０へと伝導されうる。
【００３６】
亜大気圧源７０は、亜大気圧適用を調節するための制御装置８０を含みうる。実際、亜大気圧源７０は、連続的または断続的に亜大気圧を産生するように構成されうる。例えば、亜大気圧源７０はその循環サイクルがオンまたはオフにされてもよく、これにより亜大気圧の産生及び非産生の期間を提供する。亜大気圧の作動サイクルは、１から１０（オン／オフ）と１０から１（オン／オフ）との間の、亜大気圧の多様な産生及び非産生を提供しうる。さらに、亜大気圧は、定期的なまたは周期性の波形（例えば、正弦波）により適用されうる。一定の生理的状態を模倣するため、亜大気圧源７０は、最初の治療の後にサイクル化されてもまたよい。例えば、亜大気圧は、１分あたり数回にサイクル化されうる。さらに、亜大気圧は、必要に応じて、または損傷組織４０中の圧力を監視することにより決定される通りに、サイクルがオン−オフされてもよい。亜大気圧源７０は、大気圧と大気圧より１２５ｍｍＨｇ下（−１２５ｍｍＨｇ）との間の亜大気圧を送達するように構成されうる。
【００３７】
損傷組織４０における亜大気圧の維持を助けるためには、損傷組織４０の近くに亜大気圧維持の領域を提供するべく、損傷組織４０に近接してカバー５０が提供されてもよい。カバー５０はシートを有してもよく、かつ／または柔軟、硬質、半硬質、またはこれらの組合せであってもよい。さらに、カバー５０は、密封ドレッシング材を有してもまたよい。具体的には、損傷組織４０に近接する皮膚３０などの組織にカバー５０を粘着させることにより、損傷組織４０と保護材料２０を有する多孔性材料１０との上方にカバー５０が提供されうる。損傷組織４０と保護材料２０を有する多孔性材料１０との近くに、囲まれた領域を提供するためである。例えば、カバー５０は、粘着剤（例えば、フィブリン接着剤）を用いて、皮膚３０、他の組織、またはこれらの組合せに、接着させられうる。粘着剤は、自己重合性接着剤を有してもよく、かつ／または、望ましくは、粘着剤が治療部位近くの均整または不整な表面に合致することを可能にする、十分に嵩高い粘着剤を提供するための充填材含んでもよい。粘着剤は、別に提供されてもよく、または、自己粘着性カバー５０を提供するようにカバー５０と合体させられてもよい。実際、カバー５０は、シートの１つまたはそれより多い表面上に適切な粘着剤を含む、柔軟な自己粘着性シートを有しうる。
【００３８】
亜大気圧は、カバー５０と管６０との間の連携により、カバー５０の下に送達されうる。具体的には、カバー５０は、チューブ６０とカバー５０下スペースとの間に気体が往来するように管６０の適用端６１に結合する、固定された注入口（図示なし）を含みうる。ここで、カバー５０は、損傷組織４０と保護材料２０を有する多孔性材料１０との上方にある。管６０は、カバー５０下に維持される亜大気圧を乱すことなく、固定された注入口と接続され、または接続が断たれうる。あるいは、カバー５０は、貫通部５１を含みうる。ここで、管６０の適用端６１が損傷組織４０上方のカバー５０の下のスペースの内部へと配置され、かつ適用端６１とそのスペースとの間で気体が往来するように、管６０は貫通部５１を貫通する。さらに、多孔性材料１０及び保護材料２０により既に与えられる保護を超えて、カバー５０は損傷組織４０を外因性感染及び異物混入からさらに保護しうる。同様に、カバー５０は、損傷組織４０からの感染拡大から、周囲組織をさらに保護しうる。
【００３９】
本発明の態様のまた別の１つにおいては、本発明は、ＳＦ−ＨＡクリオゲル被覆を有する亜大気圧デバイスまたは装置を使用して、損傷組織を治療するための方法もまた提供する。特に、本方法は、多孔性材料１０の１つまたはそれより多い細孔と損傷組織４０との間で保護材料２０を介して気体が往来する状態を提供するために、保護材料２０（例えば、ＳＦ−ＨＡクリオゲル被覆）を有する多孔性材料１０を、損傷組織４０と近接して配置させる工程を有しうる。保護材料２０を有する多孔性材料１０は、損傷組織４０に近接して、ｉｎ  ｓｉｔｕでシールされうる。このようにして、損傷組織４０近くの領域において、亜大気圧が維持される。管６０は、管６０の適用端６１において、多孔性材料１０に連結させられうる。組織における亜大気圧を維持するための密封シールを提供するためには、カバー５０が配置されうる。本発明は、損傷組織９を包囲する組織（例えば、皮膚３０）に、カバー５０を粘着的にシールし粘着させる工程もまた含みうる。カバー５０は、損傷組織４０の上方に位置する、自己粘着性シート５０として配置されうる。このように、カバー５０をシールする工程は、損傷組織４０を包囲する組織に自己粘着性シート５０を粘着的にシールし粘着させる工程を含みうる。さらに、多孔性材料１０との間で気体が往来するように亜大気圧システム７０を多孔性材料１０と動作可能に接続する工程は、カバー５０を破ることなく亜大気圧源７０の乖離可能性を提供する、亜大気圧システム７０をカバー５０の固定された注入口と接続する工程を有しうる。
【００４０】
次は図１０を参照して、本発明のデバイスは、損傷組織４０、及び／または肝臓などの器官９０を治療するため、体１００の内部に配置されうる。本発明のそのような方法及びデバイスにおいては、損傷組織４０、及び／または治療される器官９０を露出するために、皮膚及び他の表面組織が切開されるだろう。実際、器官９０は損傷組織４０を含みうる。本発明のデバイスは、それから、例えば器官９０の損傷組織４０などの治療部位に配置されうる。そのデバイスは、組織保護材料２０を有する多孔性材料１０を含み、カバー５０を伴う。多孔性材料１０の１つまたはそれより多い細孔と損傷組織４０との間で保護材料２０を介して気体が往来する状態を提供するために、管６０が貫通部５１を介してカバー５０に配置されてもまたよい。さらに、管６０は、組織開口部５２を経て体１００の表面を貫通するように構成されうる。組織開口部５２は、管のために特に作成された（かつ適切な寸法に切られた）体における開口部であってもよく、あるいは、組織開口部５２は、損傷組織４０及び／または器官９０にアクセスするのに使用される開口部であってもよい。組織開口部５２は、縫合、ステープル、接着剤、または類似物を用いて、管６０の周りで閉じられうる。
【００４１】
図９及び１０に示される構成を含む一定の構成においては、亜大気圧源７０が作動させられると、損傷組織４０に亜大気圧を適用するため、管６０の源端６２は亜大気圧源７０に取り付けられうる。例えば、亜大気圧は、大気圧より約１２５ｍｍＨｇ下（−１２５ｍｍＨｇ）で維持されうる。あるいは、亜大気圧は、大気圧と大気圧より１２５ｍｍＨｇ下との間で変化しうる。治癒の選択された段階を達成するのに十分な時間、損傷組織４０において亜大気圧が維持され、または変化させられうる。本方法は、数時間かけて使用されてもよく、あるいは何日もかけて使用されてもよい。真空治療の最後に、望まれれば保護材料２０がとどまることを許容しつつ、多孔性材料１０は除去されうる。治療される組織が皮膚の下の器官である場合、保護材料２０を置き去りにしつつ、デバイス１は体から抽出されてもよい。しかしながら、治療される組織が表面創傷を含む場合、保護材料２０を置き去りにしてデバイス１が除去されてもよく、またそれから皮膚３０が閉じられてもよい。代わりの構成においては、多孔性材料１０及び保護材料２０は、皮膚封鎖の前に、１つのユニットとして、または別々のユニットとして除去されうる。
【００４２】
以下の実施例は、本発明をより詳細に開示するために提供される。これらの実施例は、例証目的のみのために提供され、また如何様に本発明を限定することも意図されない。
【実施例１】
【００４３】
亜大気圧治療システムにおいて有用である、ポリウレタン（ＰＵ）スポンジを被覆するためのクリオゲルを生成するための方法は、下記のように調製されうる。
【００４４】
絹フィブロイン（ＳＦ）は、まずＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ生絹から抽出されかつ精製された。絹フィブロインを抽出するには、ビーカー中で０．０２Ｍ炭酸ナトリウム溶液を作成するため、炭酸ナトリウム（１０６０ｇ）が脱イオン化蒸留水（２Ｌ）中に溶解させられた。ビーカーはアルミホイルで覆われ、溶液は沸騰させられた。沸騰中の炭酸ナトリウム溶液中に、生絹（１０ｇ）が３０分間配置された。残余のフィブロイン絹タンパク質が溶液から取り出され、また過剰の水を除去するために絞られ、それから水で洗浄された。絹フィブロインは湯（およそ２０ｍＬ／グラム絹）で２０分間ゆすがれた。ゆすぎは三回繰り返された。それからフィブロインは、ヒュームフード中で室温にて１２時間かけて乾燥させられた。フィブロインは、使用までの間、清潔なプラスチック製バッグ中で室温にて保管された。溶液を調製するためには、絹フィブロインは１００℃にて３時間かけて５．０Ｍ  ＣａＣｌ２中に溶解させられ、透明な琥珀色の溶液を得た。溶液は熱から下ろされ、冷却され、また１０００  ｘ  ｇにて２０分間かけて遠心機にかけられた。生じた上清は、セルロース膜（Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ：分画分子量１２，０００〜１４，０００）に移され、４８時間かけて徹底的に蒸留水に対して透析された。水は透析の間、６〜１０回交換された。透析の後、絹フィブロイン溶液は５０ｍＬコニカルチューブ中へと移動させられた。使用前は、ＳＦ溶液は４℃にて保管された。純度については、最終ＳＦが、分子量を決定するためのゲル電気泳動、及びアミノ酸組成を決定するための高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の後に、調べられた。ＳＦは、Ｔｇ（Ｔｇ＝１７８℃）及びＴｍ（Ｔｍ＝１９２〜２０３℃）を決定するため、示差走査熱量計を使用して熱特性に関してもまた試験された。（Ｒｏｃｋｗｏｏｄ，  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）を参照せよ）。
【００４５】
ヒアルロン酸（ＨＡ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入）は、虹彩はさみを使用して（サイズおよそ１ｍｍ掛ける１ｍｍの）断片へと切り刻まれ、重量が測定され、ＳＦの水溶液（０．５８％）中に溶解させられた。ＨＡの最終濃度は、３４％であった。ＨＡを溶解し、かつ均一なＳＦ−ＨＡ溶液を得るため、溶液は１時間２２℃を維持した。２４時間の凍結乾燥の後、クリオゲルが得られ、クリオゲルは約２：１のＳＦ／ＨＡ比を有した。
【００４６】
ＰＵスポンジの表面をＳＦ−ＨＡ材料で被覆する際、ＳＦ−ＨＡ溶液（６ｍＬ）が使用され、ペトリ皿上へと移された。ＰＵスポンジがＳＦ−ＨＡ溶液の上に配置され、皿全体が凍結乾燥にかけられた。ＳＦ−ＨＡ及びスポンジは、乾燥して集合したクリオゲル−スポンジ構成物を形成するまで、およそ２４時間かけて凍結乾燥された。
【実施例２】
【００４７】
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、虹彩はさみを使用して（サイズおよそ１ｍｍ掛ける１ｍｍの）断片へと切り刻まれ、絹フィブロイン（ＳＦ）の水溶液（０．５８％）中に溶解させられた。ＨＡを絹フィブロイン（ＳＦ）溶液に溶解させるため、溶液は、ウルトラソニケーター（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ）を用いて３０秒間、３回にわたり超音波処理された。溶液は、過剰な泡を含有していた。均一なＳＦ−ＨＡ溶液が得られたら、クリオゲルを形成するため、溶液はペトリ皿に移され、クリオゲルを形成するように凍結乾燥された。具体的には、ＰＵスポンジがＳＦ−ＨＡで被覆され、ここではＳＦ−ＨＡ溶液がペトリ皿中に配置され、またＰＵスポンジが上に配置され、皿及び材料の全体がクリオゲル化にかけられた。いくらかの泡は時が経つにつれ消えたが、本方法は完全に被覆された表面をＰＵスポンジ上に形成するには、理想的ではなかった。
【実施例３】
【００４８】
本発明の材料を調製するためであって実施例２に類似の方法は、ＳＦ−ＨＡ溶液に、ウルトラ超音波処理ではなく、ボルテックスを適用する。実際、ボルテックス（Ｆｉｓｈｅｒ  ｖｏｒｔｅｘ、Ｇｅｎｉｅ２、スピード８）が３０秒間使用され、３回繰り返された。溶液は泡を含有した。具体的には、ＰＵスポンジがＳＦ−ＨＡで被覆され、ここではＳＦ−ＨＡ溶液がペトリ皿中に配置され、またＰＵスポンジが上に配置され、皿及び材料の全体がクリオゲル化にかけられた。本方法は、完全に被覆された表面をＰＵスポンジ上に形成するには理想的ではなかった。
【実施例４】
【００４９】
細胞に対する本発明のＳＦ−ＨＡ材料の影響を調べるため、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１７３０から得られたヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）が、ＳＦ−ＨＡ溶液が溶射被覆されたスライドガラス（実験群）上に蒔かれ、ポリスチレンプラスチック製の細胞培養プレート（対照群）と比較した、２４時間後の細胞生存率を評価した。細胞は、生／死染色で染色された。本実験が完了すると、生／死細胞染色に関しては、実験群と対照群との間には実質的には差がなかった。
【実施例５】
【００５０】
本発明のＳＦ−ＨＡクリオゲルに対する温度の影響を調べるため、ＳＦ−ＨＡクリオゲルが、２２℃（ｎ＝７）及び３７℃（ｎ＝６）の培養器におけるチャンバー付きスライドに移された。ガラスチャンバー付きスライドは、肉眼でゲルを調べる前に、２４時間放置された。２２℃及び３７℃におけるクリオゲル間には、ゲル形態に差はなかった。ＳＦ−ＨＡクリオゲルの液化は、観察されなかった。クリオゲルは半透明で、その２４時間の期間中に観察可能な変化はなかった。
【００５１】
本発明が関係する技術水準を開示するために、いくつもの特許及び非特許刊行物が本明細書において引用される。これらの刊行物のそれぞれの開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５２】
本発明の一定の実施形態が上に開示されかつ／または例示されてきたが、様々な他の実施形態が、前述の開示から当業者にとって明らかとなるであろう。本発明は、従って、開示されかつ／または例示された特定の実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲の範囲及び真髄からの逸脱なしに、かなりの変化及び修正が可能である。
【００５３】
さらに、移行句「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」、及び「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ」は、添付の特許請求の範囲において使用される場合、当初及び補正の形態において、列挙されない追加の請求項要素またはステップがもし存在するなら、そのいずれが請求項の範囲から除外されるかに関して、請求項の範囲を定義する。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は、包含的または開放型であるように意図され、またいかなる追加の列挙されない要素、方法、ステップ、または材料をも除外しない。用語「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ」は、請求項中で特定された要素、ステップ、または材料以外のあらゆる要素、ステップ、または材料を除外し、後者の場合においては特定された材料と通常関連する不純物である。用語「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」は、請求項の範囲を、特定された要素、ステップ、または材料、並びに請求項に係る発明の基本的及び新規の性質に実質的には影響しない要素、ステップ、または材料に限定する。本発明を体現するあらゆるデバイス及びそれを調製する方法は、代わりの実施形態においては、移行句「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」、及び「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ」のいずれによってもより明確に定義されうる。
【００５４】
参照文献
１．  Ｈｕ，  Ｘ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１０，  １１（１１），  ３１７８−３１８８．
２．  ＤｅＦｒａｎｚｏ，  Ａ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ２００１，  １０８（５），  １１８４−１１９１．
３．  Ｒｏｃｋｗｏｏｄ，  Ｄ．  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２０１１，  ６（１０），  １６１２−１６３１．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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2016528007.tif 000014