(57)【要約】  本発明は、がん治療や他のアルギニン依存性疾患の治療のためのアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質（ＡＡＤ）を含有する医薬組成物を提供する。ＡＡＤ融合たんぱく質は、粗たんぱく質の可溶性画分と不溶性画分との双方から精製でき、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合し、がん細胞におけるアルギニンの効果的に枯渇させるために長い半減期で高活性である。野生型ＡＤＩおよび本発明のＡＡＤの特異的な活性は、それぞれ８．４と９．２Ｕ／ｍｇ（生理的ｐＨ）である。本発明で用いＡＡＤは、種々のがん（たとえば、膵臓がん、白血病、頭頸部がん、大腸がん、肺がん、乳がん、上咽頭がん、食道がん、前立腺がん、胃がん、脳がん）の治療に用いることができ、アルギニン依存性疾患を治療することもできる。組成物は単独で用いても、がん治療および／もしくは転移防止の相乗効果を与えるために少なくとも一の化学療法剤と併用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質がアルギニンデイミナーゼの活性を保持し、血清アルブミンにも結合できるようなアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質を形成するために、アルブミン結合ドメイン、アルブミン結合ペプチドまたはアルブミン結合たんぱく質から選択される１つまたは２つの構成成分を含む第１の部位を、アルギニンデイミナーゼを含む第２の部位と融合するアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質。
【請求項２】
前記２つの構成成分が同じである、請求項１に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質。
【請求項３】
前記２つの構成成分が異なる請求項１に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質。
【請求項４】
前記アルブミン結合ドメインが配列番号４６，４７，４８，４９またはそれらの活性部位である請求項１に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質。
【請求項５】
前記アルブミン結合ペプチドが配列番号４６，４７，４８，４９またはそれらの活性部位である請求項１に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質。
【請求項６】
前記アルブミン結合たんぱく質が配列番号４６，４７，４８，４９またはそれらの活性部位である請求項１に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質。
【請求項７】
前記融合が１つまたは１つ以上のリンカー分子を含む請求項１に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質。
【請求項８】
前記リンカー分子が配列番号５０，５１，５２，５３またはセリン−グリシン−セリン（ＳＧＳ）アミノ酸配列から選択される配列を含む請求項７に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質。
【請求項９】
ポリ−Ｎまたはヒスチジンタグの少なくとも１つをさらに含む請求項１に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質。
【請求項１０】
前記融合が前記第１の部位と前記第２の部位との間のインテイン介在たんぱく質ライゲーションの残りの部位を含む請求項１に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質。
【請求項１１】
前記インテイン介在たんぱく質がキチン結合ドメインを含む請求項１０に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質。
【請求項１２】
前記アルギニンデイミナーゼがマイコプラズマ属、ラクトコッカス属、シュードモナス属、連鎖球菌属、大腸菌属、マイコバクテリウム属またはバチルス属の微生物から生産されるアルギニンデイミナーゼより選択される請求項１に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質。
【請求項１３】
前記アルギニンデイミナーゼがマイコプラズマ・アルギニニ、ラクトコッカス・ラクティス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・セレウス、マイコプラズマ・アルスリチジス、マイコプラズマ・ホミニス、化膿性連鎖球菌、Streptococcus pneumonia、肺炎レンサ球菌、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、シュードモナス病原因菌、シュードモナス・プチダ、緑膿菌またはこれらの組み合わせから生産される請求項１２に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質。
【請求項１４】
前記アルギニンデイミナーゼが配列番号３６，３７，３８，３９，４０，４１または４３から選択される配列を含む請求項１に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質。
【請求項１５】
前記アルギニンデイミナーゼと前記アルブミン結合ドメインが共有結合によって結合するように、前記アルブミン結合ドメインのＣ末端で、Ｎ末端にシステイン残基を有する前記アルギニンデイミナーゼと反応性チオエステルとの反応によって前記融合たんぱく質が形成される請求項１に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質。
【請求項１６】
前記アルギニンデイミナーゼと前記アルブミン結合ドメインが共有結合によって結合するように、アルギニンデイミナーゼのＣ末端でＮ末端にシステイン残基を有する前記アルブミン結合ドメインと反応性チオエステルとの反応によって前記融合たんぱく質が形成される請求項１に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質。
【請求項１７】
前記アルギニンデイミナーゼと前記アルブミン結合ドメインが共有結合によって結合するように、融合部位が配列番号４２および４３を使用し、前記アルブミン結合ドメインのＣ末端でＮ末端にシステイン残基を有する前記アルギニンデイミナーゼと反応性チオエステルとの反応によって前記融合たんぱく質が形成される請求項１に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質。
【請求項１８】
循環するアルギニンの利用可能性を減らすために臨床上有効量の融合たんぱく質を患者に投与する、患者のがん治療のための薬剤の処方において、請求項１から１７のいずれか１つに記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質の使用。
【請求項１９】
前記がんが、膵臓がん、白血病、頭頸部がん、大腸がん、肺がん、乳がん、肝臓がん、上咽頭がん、食道がん、前立腺がん、胃がんまたは脳がんである請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
循環するアルギニンの利用可能性を減らすために、臨床上有効量の融合たんぱく質を患者に投与する、患者のアルギニン依存性疾患の治療のための薬剤の処方において、請求項１から１７のいずれか１つに記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質の使用。
【請求項２１】
前記アルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質をコードする融合遺伝子を構築し、前記融合遺伝子をベクターに挿入し、前記ベクターを宿主生物に挿入し、請求項１に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質を含有するたんぱく質を発現させることを含む請求項１に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質の作製方法。
【請求項２２】
前記融合たんぱく質の精製をさらに含む請求項２１に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質の作製方法。
【請求項２３】
前記精製をクロマトグラフィによって行う請求項２２に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質の作製方法。
【請求項２４】
前記精製を粗たんぱく質の可溶性画分から行う請求項２２に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質の作製方法。
【請求項２５】
前記精製を粗たんぱく質の不可溶性画分から行う請求項２２に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質の作製方法。
【請求項２６】
アルブミン結合ドメイン、アルブミン結合ペプチドまたはアルブミン結合たんぱく質とアルギニンデイミナーゼを含む前記第２の部位との間のインテイン介在たんぱく質ライゲーションによる請求項１に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質の作製方法。
【請求項２７】
薬学的に許容され得るキャリア中に請求項１に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質を含有する医薬組成物。
【請求項２８】
前記組成物のｐＨが５．５から９．５の範囲内である請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記組成物のｐＨが７．４である請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記組成物のｐＨが６．５である請求項２７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、その開示全体が本明細書に参照によって引用される２０１３年３月６日に出願された米国仮特許出願第６１／７７３，２１４号及び２０１４年３月５日に出願された米国非仮特許出願第１４／１９７，２３６号の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、高活性で長い生体内半減期を有するもつ物質を作るために遺伝子組み換えをしたアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ（ＡＡＤ）融合たんぱく質に関する。本発明は、さらに異種のＡＡＤ融合たんぱく質を作るためのＤＮＡデザイン設計とプロテイン・エンジニアリングに関する。ＡＡＤ融合たんぱく質は、粗たんぱく質の可溶性画分およびや不溶性画分（封入体）から単離し、精製することができる。本発明は、さらにヒトおよびやその他の動物のがんのターゲティング治療やアルギニン依存性疾患の治療のためのアルブミン結合アルギニンデイミナーゼを含有する含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
世界人口中で、膵臓がん、大腸がん、肝臓がん、黒色腫、子宮頸がんの発生は増加している。これらの病気の効果的な治療が緊急に必要とされる。白血病、黒色腫、膵臓がん、大腸がん、腎細胞がん、肺がん、前立腺がん、胸がん、脳がん、子宮頸がん、および肝臓がんなど多くの型のがんでは、がん細胞は、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ）を発現しないためアルギニン栄養要求性であり、アルギニン枯渇療法の優れたターゲットとなっている。
【０００４】
アルギニンは、ヒトおよび他のほ乳類にとって準必須アミノ酸である。アルギニンは、尿素回路酵素であるアルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ）およびアルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）が触媒する２つの段階を経て、シトルリンから合成できる。アルギニンは、酵素アルギナーゼによってオルニチンに代謝することができ、オルニチンはミトコンドリア中のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＴＣ）によってシトルリンに転換することができる。シトルリンはアルギニンを再び合成するために利用できる。ＡＳＳとＡＳＬの触媒活性が活性なため、正常細胞は一般に成長のために外来性のアルギニンの供給を必要としない。対照的に、多くの型のがんでは、ＡＳＳを発現しないので、アルギニン栄養要求性である。がんの成長は、血液循環から得られるアルギニンにのみ依存する。したがって、アルギニン分解酵素を用いて循環するアルギニンをターゲットとすることは、ＡＳＳ陰性腫瘍の成長を妨げるために実行可能な戦略である[Feun  et  al.,  Curr.  Pharm.  Des.  14:1049-1057  (2008);  Kuo  et  al.,  Oncotarget.  1:246-251  (2010)]。
【０００５】
アルギニンは、アルギナーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）により分解することができる。これらの中で、アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）は、アルギニンに親和性が最も高いようにみえる（低Ｋｍ値）。ＡＤＩは、アルギニンを尿素回路の前記代謝生成物であるシトルリンとアンモニアに転換する。残念なことにＡＤＩは、たとえばマイコプラズマ属などの原核生物にのみ見いだされる。原核生物からのＡＤＩの単離と精製に関しては、いくつかの問題がある。中性ｐＨでは、その酵素活性が低いため、シュードモナス・プチダから単離されたＡＤＩは、生体内で効果を発揮することができない。大腸菌から産生されるＡＤＩは、酵素的に不活性であり、事後的に多様な変性と再生過程を要求し、事後的な生産費用が高くなる。
【０００６】
天然の野生型ＡＤＩは、微生物に見いだされるので、抗原性であり、患者の循環系から急速に取り除かれる。天然形態のＡＤＩは、ヒトの循環系への注射により、短い半減期（〜４時間）で免疫原性となり、中和抗体を誘発する［Ensor  et  al.,  Cancer  Res.  62:5443-5450（2002）；Izzo  et  al.,  J.  Clin.  Oncol.  22:1815-1822（2004）］。これらの欠点はペグ化によって改善できる。さまざまな型のペグ化ＡＤＩのうち、スクシンイミジルスクシナートを介してＰＥＧ（分子量２０，０００）と結合したＡＤＩ（ＡＤＩ−ＰＥＧ２０）が有効な剤型であることが見いだされている。しかし、ペグ化後のＡＤＩの活性は、約５０％ほど大きく減少する［Ensor  et  al.,  Cancer  Res.  62：5443-5450（2002）］。ペグ化ＡＤＩを作る以前の試みは、均質ではなく（たんぱく質表面のリシン残基へのＰＥＧのランダム付加による）、また特性を明らかにすることおよび製造プロセスの間で品質管理を実行することが困難な物質であるという結果になった。また、ＰＥＧもまた非常に高価であるので、製造コストが大きく上昇する。ペグ化ＡＤＩを生体内に静脈注射した後には、遊離のＰＥＧの漏れや分離が見られ、（ＰＥＧを有さない）ＡＤＩは、免疫原性の問題を惹起し得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Feun  et  al.,  Curr.  Pharm.  Des.  14:1049-1057  (2008);  Kuo  et  al.,  Oncotarget.  1:246-251  (2010)
【非特許文献２】Ensor  et  al.,  Cancer  Res.  62：5443-5450（2002）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、改良されたがん治療組成物、特に活性および生体内の半減期が向上した改良されたがん治療組成物が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明においては、がん細胞内のアルギニンを効果的に枯渇させるため、アルブミン結合アルギニンデイミナーゼ（ＡＡＤ）融合たんぱく質は、その活性を高め、血漿半減期を増大する。天然のＡＤＩは、微生物に見いだされ、抗原性であり、患者の循環系から急速に取り除かれる。本発明では、より長い生体内半減期（一度の投与後、少なくとも５日間のアルギニンの枯渇）で高い活性を維持するために、１つまたは２つのアルブミン結合タンパク質を有する異種のＡＡＤ融合たんぱく質を構築する。本発明において、ＡＡＤ融合たんぱく質産物中のアルブミン結合たんぱく質は、その特異的な酵素活性に影響せずに、むしろ循環系での半減期を延長するとみられる。野生型ＡＤＩおよび本発明のＡＡＤ融合たんぱく質の特異的な活性は、それぞれ８．４Ｕ／ｍｇおよび９．２Ｕ／ｍｇ（生理的ｐＨ７．４）である。
【００１０】
広義においては、本発明は、アルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質がアルギニンデイミナーゼの活性を保持し、血清アルブミンにも結合できるようなアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質を形成するために、アルブミン結合ドメイン、アルブミン結合ペプチドまたはアルブミン結合たんぱく質から選択される一つまたは二つの構成成分を含む第１の部分を、アルギニンデイミナーゼを含む第２の部分と融合するアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質を提供する。
【００１１】
本発明は、さらに、ヒトおよび他の動物のがん治療をターゲットとするアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ（ＡＡＤ）融合たんぱく質を含有する医薬組成物に関する。本発明の１つ目の側面は、がん細胞に対し高い活性を有する組み換えのＡＡＤ融合たんぱく質を構築することである。本発明の２つ目の側面は、粗たんぱく質から、高純度なＡＡＤ融合たんぱく質を精製することである。本発明の３つ目の側面は、循環系においてアルブミンに十分に結合できるように、ＡＡＤ融合たんぱく質の半減期を延ばすことである。本発明の４つ目の側面は、本発明のがん治療用のＡＡＤを含有する医薬組成物を、様々な腫瘍、がん、腫瘍あるいはがんに関連する疾患または他のアルギニン依存性疾患に患う必要とする被験者に投与することによる、がん治療のために本発明のがん治療用のＡＡＤを含有する医薬組成物を使用する方法を提供する。
【００１２】
本発明のＡＡＤ融合たんぱく質は、さらにより安定化され、循環系でより長い半減期を有するように、アルブミン結合たんぱく質とＡＤＩが分離することを回避するために、組み換えられる。ＡＤＩは、ＡＡＤ融合製品中のアルブミン結合ドメイン／ペプチド／たんぱく質と融合して、血漿半減期を延ばし、融合製品の免疫原性を減らす。アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）は、血液中のアルブミンと結合するペプチドである。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の親和性が異なるまたは改善された、異種のＡＢＤの変異体が存在する。異種のＡＢＤの変異体は、ＡＤＩから構築することができ、ＡＤＩに融合することができる。天然に存在しているＡＤＩと異なり、ＡＡＤ融合タンパク質のより長い半減期という特性ががん細胞、がん幹細胞および／またはがん前駆細胞中でアルギニンの効果的な枯渇を促進する。
【００１３】
ＡＡＤ融合たんぱく質を含有する医薬組成物は、静脈（ｉ.ｖ.)注射（速効性のある薬物の投与のために）および筋肉（ｉ.ｍ.）注射（かなりの速効性および持続性のある薬物の投与のために）に使用できる。本発明のＡＡＤ融合たんぱく質は、膵臓がん、白血病、頭頸部がん、大腸がん、肺がん、乳がん、前立腺がん、子宮頸がん、肝臓がん、上咽頭がん、食道がん、脳がんなど様々ながんの治療に適用できる。本発明は、ＡＡＤ融合たんぱく質、がん治療法、がん組織の治療および／または転移防止法、およびアルギニン欠乏性疾患の治療法に関する。
【００１４】
本発明の方法は、がん治療の相乗効果を与えるために、本発明のＡＡＤ融合たんぱく質と異なる化学療法剤および／またはもしくは放射線治療とを併用することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｄは、１つまたは２つのアルブミン結合ドメイン／ペプチド／たんぱく質を有する、３次元構造の異種のＡＡＤ融合タンパク質を構築するためのデザイン設計を示す。１つまたは２つのアルブミン結合ドメイン／ペプチド／たんぱく質は、ＡＡＤ融合たんぱく質を形成するために、ＡＤＩに融合することができる。アルブミン結合ドメイン／ペプチド／たんぱく質の位置は、ＡＤＩの活性化部位から離れている。アルブミン結合ドメイン／ペプチド／たんぱく質は、ＡＤＩのＮ末端または／およびＣ末端に融合することができる。本図の構造は、マイコプラズマ・アルギニニのＡＤＩの構造（Protein  Data  Bank：1LXY）に基づく。図１Ａは、天然のＡＤＩを示す。
【図１Ｂ】２つのＡＢＤまたはＡＢＤ１を有するＡＡＤ融合たんぱく質を示す。
【図１Ｃ】Ｎ末端において１つのＡＢＤまたはＡＢＤ１を有するＡＡＤ融合たんぱく質を示す。
【図１Ｄ】Ｃ末端において1つのＡＢＤまたはＡＢＤ１を有するＡＡＤ融合たんぱく質を示す。
【図２】マイコプラズマ・アルギニニ（配列番号２３）、ラクトコッカス・ラクティス（配列番号２４）、バチルス・セレウス（配列番号２５）、バチルス・リケニホルミス（配列番号２６）を含むいくつかの細菌種におけるＡＤＩの配列アラインメントを示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｅは、マイコプラズマ・アルギニニ（ＡからＥ）由来のおよびバチルス・セレウス由来のＡＡＤ融合たんぱく質（Ｆ)の異種のＡＡＤ融合たんぱく質のデザイン設計とアミノ酸配列を示す。図３Ａは、マイコプラズマ・アルギニニ由来のＡＡＤ融合たんぱく質（Ａ）のデザイン設計とアミノ酸配列を示す。
【図３Ｂ】マイコプラズマ・アルギニニ由来のＡＡＤ融合たんぱく質（Ｂ）のデザイン設計とアミノ酸配列を示す。
【図３Ｃ】マイコプラズマ・アルギニニ由来のＡＡＤ融合たんぱく質（Ｃ）のデザイン設計とアミノ酸配列を示す。
【図３Ｄ】マイコプラズマ・アルギニニ由来のＡＡＤ融合たんぱく質（Ｄ）のデザイン設計とアミノ酸配列を示す。
【図３Ｅ】マイコプラズマ・アルギニニ由来のＡＡＤ融合たんぱく質（Ｅ）のデザイン設計とアミノ酸配列を示す。
【図３Ｆ】バチルス・セレウス由来のＡＡＤ融合たんぱく質（Ｆ)のデザイン設計とアミノ酸配列を示す。
【図４Ａ】図４Ａ，４Ｂは、以下のスキームのもとで、インテイン融合たんぱく質と発現したたんぱく質ライゲーション（ＣＢＤ、キチン結合ドメイン）を用いた２つの態様（Ａ）と（Ｂ)によるＡＡＤ融合たんぱく質を示す。図４Ａは、インテイン融合たんぱく質と発現したたんぱく質ライゲーション（ＣＢＤ、キチン結合ドメイン）を用いる１つの態様を示す。
【図４Ｂ】インテイン融合たんぱく質と発現したたんぱく質ライゲーション（ＣＢＤ、キチン結合ドメイン）を用いる別の態様を示す。
【図４Ｃ】Ｃ末端融合を示す。
【図４Ｄ】Ｎ末端融合を示す。
【図４Ｅ】インテイン介在たんぱく質ライゲーションを示す。
【図５】ＡＡＤ融合たんぱく質を作るために構築した発現ベクターのプラスミドマップを示す。
【図６Ａ】Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ＡＤＩの遺伝子マップを示す。（ＡＤＩ：マイコプラズマ・アルギニニのＡＤＩ）
【図６Ｂ】Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ＡＤＩのヌクレオチド配列（配列番号４４）を示す。
【図６Ｃ】Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ＡＤＩのアミノ酸配列（配列番号４０）を示す。
【図７Ａ】Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ｂｃＡＤＩの遺伝子マップを示す。（ｂｃＡＤＩ：バチルス・セレウスのＡＤＩ）
【図７Ｂ】Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ｂｃＡＤＩのヌクレオチド配列（配列番号４５）を示す。
【図７Ｃ】Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ｂｃＡＤＩのアミノ酸配列（配列番号４１）を示す。
【図８Ａ】ＡＡＤ融合たんぱく質の発現と精製を示し、２０℃で発現する場合、ＡＡＤは〜９０％溶解性であり（レーン２と３）、３７℃で発現する場合、〜９０％不溶性（封入体）である（レーン４と５）。
【図８Ｂ】ＡＡＤ融合たんぱく質の発現と精製を示し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のゲル中で精製したＡＡＤ融合たんぱく質：レーン１、精製したＡＡＤ融合たんぱく質（５２．８ｋＤａ)；レーン２、分子量マーカー。
【図９】ヒト黒色腫（Ａ３７５）、ヒト結腸がん（ＨＣＴ１１６）、ヒト膵臓がん（ＰａｎｃＩ）を含む試験管内組織培養研究において、ＡＡＤ融合たんぱく質がアルギニンを効果的に枯渇させ、種々のヒトのがん培養細胞株の成長を抑制することを示す。
【図１０Ａ】ＡＡＤ融合たんぱく質のアルブミン結合の結果を示し、ＡＡＤ融合たんぱく質（アミノ酸配列は配列番号３６、図３Ａ）の量が増加するよう添加する場合に、ＨＳＡ＋ＡＡＤ複合体の量の増加を示す、未変性のネイティブなポリアクリルアミドゲル（１２％）を示す。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とのモル比：レーン３−６のＡＡＤは、それぞれ１：１、１：２、１：５、１：１５である。レーン１と２は、ＨＳＡとＡＡＤがそれぞれ６，３０ｐｍｏｌｅを示す。
【図１０Ｂ】ＡＡＤ融合たんぱく質のアルブミン結合の結果を示し、ＡＡＤ融合たんぱく質（配列番号４０、図３Ｅ）に基づく別の実験で、アルブミン：ＡＡＤの比が１：８は、存在するすべてのアルブミンと結合するために十分である。
【図１１】マウスの血漿アルギニンレベルに対するＡＡＤ融合たんぱく質の用量反応を示すグラフである。ＡＡＤ１００μｇの投与は、少なくとも５日間は血漿アルギニンを枯渇させるのに十分である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
「がん幹細胞」という用語は、生体内で腫瘍の成長を引き起こし維持させることができる新生物クローン内で生物学的に区別できる細胞（すなわち発癌性細胞）をいう。
【００１７】
アルギニンは、ヒトおよび他のほ乳類にとって準必須アミノ酸である。アルギニンは、尿素回路酵素であるアルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ）およびアルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）に触媒される２つの段階を経てシトルリンから合成できる。アルギニンは、酵素アルギナーゼによってオルニチンに代謝でき、オルニチンは、ミトコンドリア中のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＴＣ）によってシトルリンに転換できる。シトルリンは、アルギニンを再び合成するために利用できる。正常細胞は、ＡＳＳとＡＳＬの触媒作用が活性なため、一般には成長のために外来性のアルギニンの供給を必要としない。対照的に、多くの型のがんは、ＡＳＳを発現しないため、アルギニン栄養要求性である。がんの成長は、循環系からの中のアルギニンにのみ依存する。したがって、アルギニン分解酵素を用いて循環系のアルギニンにターゲットをあてることは、ＡＳＳ陰性腫瘍の成長を妨げるために実行可能な戦略である。
【００１８】
アルギニンは、アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）によって分解できる。ＡＤＩは、アルギニンを尿素回路の前記代謝産物であるシトルリンとアンモニア転換する。残念ながら、ＡＤＩは、たとえばマイコプラズマ属などの原核生物にのみ見いだされる。原核生物からのアルギニンデイミナーゼの単離と精製に関しては多くの問題が存在する。シュードモナス・プチダから単離されたＡＤＩは、中性ｐＨでの酵素活性が低いため、生体内で効果を発揮しない。大腸菌から産生されるＡＤＩは、酵素的に不活性であり、事後的に多様な変性と再生過程を要求し、事後的な生産費用が高くなる。天然型ＡＤＩの血漿内半減期は、ヒトの血液循環系中に注入されると短い（〜４時間）［Ensor  et  al.,  Cancer  Res.  ６２：５４４３−５４５０  （２００２）；Izzo  et  al.,  J.  Clin.  Oncol.  ２２：１８１５−１８２２  （２００４）］。これらの欠点は、ペグ化によって一部改善できる。さまざまな型のペグ化ＡＤＩのうち、スクシンイミジルスクシナートを介してＰＥＧ（分子量２０，０００）と結合したＡＤＩ（ＡＤＩ−ＰＥＧ２０）が有効な剤型であることが見いだされている。しかし、ペグ化後のＡＤＩの活性は、大幅に減少する（〜５０％）［Ensor  et  al.,  Cancer  Res.  ６２：５４４３−５４５０（２００２）；Wang  et  al.,  Bioconjug.  Chem.  １７：１４４７−１４５９（２００６）］。また、スクシンイミジルスクシナートＰＥＧリンカーは、容易に加水分解し、たんぱく質から分離して、体内での短期間の利用の後に免疫原性の原因となる。したがって、改良されたがん治療組成物、特に活性を高めた改良されたがん治療組成物が必要である。
【００１９】
シュードモナス・プチダから単離したＡＤＩは、中性ｐＨでは酵素活性がほとんどなく、実験動物の血液循環系から速やかに除去されるため、生体内で効果を発揮することができない。マイコプラズマ・アルギニニ由来のＡＤＩについては、たとえばTakaku et al,  Int.  J.  Cancer,  ５１：２４４−２４９（１９９２）およびU.S.  Pat.  No. ５，４７４，９２８に記述されている。しかし、このような異種たんぱく質を臨床に使用することに関する問題は、その抗原性にある。シアヌル酸塩化物連結基を介したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とマイコプラズマ・アルギニニ由来からのＡＤＩとの化学修飾については、Takaku  et  al.,  Jpn.  J.  Cancer  Res.,  ８４：１１９５−１２００（１９９３）に記述されている。しかし、修飾たんぱく質は、代謝されると、シアヌル酸塩化物連結基からシアン化合物が遊離するため有毒であった。対照的に、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０においてさえ、ＰＥＧリンカーは、容易に加水分解し、たんぱく質から分離して、体内での短期間の利用の後に免疫原性の原因となる。したがって、非必須アミノ酸を分解し、先行技術に関連する問題を有さない組成物が必要である。
【００２０】
黒色腫、膵臓がん、大腸がん、白血病、乳がん、前立腺がん、腎細胞がんおよび肝臓がんを含む多くの型のがんでは、がん細胞は、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ）が発現しないので、アルギニン栄養要求性であり、アルギニン枯渇療法の優れたターゲットとなっている。本発明において、アルブミン結合アルギニンデイミナーゼ（ＡＡＤ）融合たんぱく質は、がん細胞中のアルギニンを効果的に枯渇させるために、長い半減期で高い活性を有する。
【００２１】
ＡＤＩ単量体の大きさは、約４５ｋＤａであり、二量体（約９０ｋＤａ）で存在する［Das  et  al.,  Structure.  １２：６５７−６６７（２００４）］。ＡＡＤ融合タンパク質の構造を図１に示す。配列番号４６−４９に示すリンカーを有するまたは有さない１つあるいは２つのアルブミン結合ドメイン／ペプチド／たんぱく質は、ＡＡＤ融合タンパク質を形成するために、ＡＤＩと融合する。１つあるいは２つの特定のアルブミン結合ドメイン／ペプチド／たんぱく質の選択が、ターゲットとなるがん組織の型、融合たんぱく質の望ましい大きさと半減期、およびドメインあるいはたんぱく質全体を選択するかどうかに応じて行われることは特筆すべきである。さらに、選択されたアルブミン結合物質は同一であっても、異なっていてもよい。すなわち、結果として得られる分子がＡＤＩの活性を保持して、融合タンパク質の一の部分の機能が融合タンパク質の他の部分により妨げられずに血清アルブミンと結合できる限り、１つのたんぱく質と１つのペプチドは、融合でき、２つのたんぱく質、２つのドメイン、１つのドメインと１つのペプチドなどが融合できる。アルブミン結合ドメイン／ペプチド／たんぱく質の位置は、活性部位から離れている。アルブミン結合ドメイン／ペプチド／たんぱく質は、ＡＤＩのＮ末端または/およびＣ末端に融合できる。異なるあるいは改良されたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の親和力を示す異種のＡＢＤの変異体がある。異種のＡＢＤの変異体は、構築することができ、ＡＤＩに融合することができる。ＡＤＩを備えるいくつかの微生物（たとえばシュードモナス属細菌）は、その潜在的な病原性と発熱性のために使用することができない。ＡＤＩのソースは、限定されるものではないが、異なる微生物、たとえばマイコプラズマ属（たとえばマイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・アルスリチジス、マイコプラズマ・ホミニス）、ラクトコッカス属（たとえばラクトコッカス・ラクティス）、シュードモナス属（たとえばシュードモナス病原因菌、シュードモナス・プチダ、緑膿菌）、連鎖球菌属（たとえば化膿性連鎖球菌、Streptococcus  pneumonia、肺炎レンサ球菌）、大腸菌属、マイコバクテリウム属（たとえばマイコバクテリウム・ツベルクローシス）およびバチルス属（たとえばバチルス・リケニホルミス、バチルス・セレウス）などである。ＡＤＩは、マイコプラズマ・アルギニニ、ラクトコッカス・ラクティス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・セレウス、またはこれらの組み合わせからクローン化されているのが好ましい。配列番号２３−３５のこれらのアミノ酸配列および図２のアミノ酸配列のうちいくつかの配列アライメントは、本発明および文献に記述されている［Das  et  al.,  Structure.  12:657-667（2004）；Wang  et  al.,  Bioconjug.  Chem.  17:1447-1459（2006）；Ni  et  al.,  Appl.  Microbiol.  Biotechnol.  90:193-201  (2011)］。
【００２２】
（Ａ）天然のマイコプラズマ・アルギニニＡＤＩたんぱく質（配列番号２３）、（Ｂ）マイコプラズマ・アルギニニＡＤＩ（配列番号３６−４０）由来の異種のＡＡＤ融合たんぱく質、および（Ｃ）バチルス・セレウスＡＤＩ（配列番号４１）由来のＡＡＤ融合たんぱく質のデザインとアミノ酸配列を図３に示す。異種のＡＡＤ融合たんぱく質を上手く構築している。これらの実施形態において、リンカーをアルブミン結合たんぱく質とＡＡＤ融合タンパク質中のＡＤＩとの間に挿入する。
【００２３】
一方、新規なＡＡＤ融合たんぱく質は、インテイン融合たんぱく質を利用して作り、たんぱく質ライゲーションを発現する（図４）。新規なＡＡＤ融合たんぱく質は、ＡＤＩとＡＢＤが共有結合によって結合するように、（１）ＡＢＤのＣ末端で、Ｎ末端にシステイン残基を有するADIを反応性チオエステルとの反応によって、または（２）ＡＤＩのＣ末端で、Ｎ末端にシステイン残基を有するＡＢＤを反応性チオエステルとの反応によって形成することができる。図４Ｅにおいて、Ｎ末端にシステイン残基を有するＡＤＩは、ＡＢＤのＣ末端で反応性チオエステルと反応する。ＡＢＤのＣ末端におけるチオエステルタグとＡＤＩのＮ末端におけるα−システインがたんぱく質ライゲーションを促進するために要求される。これらのフラグメントは、ｐＴＷＩＮ１ベクター（New  England  Biolabs）を利用し、製造マニュアルにしたがって生産する。特に、ＡＢＤ−インテイン−ＣＢＤ融合たんぱく質をコードする遺伝子を合成し、大腸菌で発現させるためにＴ７プロモーターの制御下でベクターにクローン化する（図４Ｃ）。生産したＡＢＤ−インテイン−ＣＢＤ融合たんぱく質は、カラム中でキチンと結合する。ＡＢＤ−インテイン−ＣＢＤ（配列番号４２）のアミノ酸配列を図４Ａに示す。チオール誘導性開裂とカラムからの溶出の後、Ｃ末端に反応性チオエステルを有するＡＢＤを得る（図４Ｃ）。一方で、ＣＢＤ−インテイン−ＡＤＩ融合たんぱく質をコードする遺伝子を合成し、大腸菌で発現させるためにＴ７プロモーターの制御下でベクターにクローン化する（図４Ｄ）。生産されたＣＢＤ−インテイン−ＡＤＩ融合たんぱく質は、カラム中でキチンと結合する。ＣＢＤ−インテイン−ＡＤＩ（配列番号４３）のアミノ酸配列を図４Ｂに示す。ｐＨ７、２５℃で開裂し、カラムから溶出した後、Ｎ末端にα−システインを有するＡＤＩを得る（図４Ｄ）。最終的に、ＡＡＤ融合たんぱく質は、図４Ｅに示すように、たんぱく質ライゲーションにより生産する。
【００２４】
重要なことは、ＡＡＤ融合たんぱく質が簡便な方法で生産でき、精製できることである。たとえば、ＡＡＤ融合たんぱく質は、大腸菌で上手く発現され、可溶性画分と不可溶性画分との双方から精製され、この結果を図８に示す。さらに、図８は、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分析された精製ＡＡＤ融合たんぱく質を示す。精製ＡＡＤ融合たんぱく質の大きさは、５２．８ｋＤａとして測定される。
【００２５】
本発明の医薬組成物は、がん治療においてがん細胞中のアルギニンを枯渇させるために高い活性をもつＡＡＤ融合たんぱく質を含有する。精製したＡＡＤ融合たんぱく質の特異的な活性は、野生型ＡＤＩの特異的な活性と似ていることがわかっている。ＩＣ５０は、最大半減抑制濃度であり、これはすなわちがん細胞株を５０％抑制するために必要なＡＡＤ融合たんぱく質の濃度を表す。前記ＩＣ５０は、薬物の有効性の基準である。異なるがん細胞株（ヒト黒色腫A375  &  SK-mel-28、ヒト結腸がんHCT116、ヒト膵臓がんPancI、ヒト肝臓がんSk-hep1、ヒト子宮頸がんC-33A）に対するＡＡＤ融合たんぱく質（アミノ酸配列を図３Ｅの配列番号４０に示す）のＩＣ５０を表１に示す。異なるがん細胞株でのＡＡＤ融合たんぱく質の生体外の有効性を図９に示す。これは、ＡＡＤ融合たんぱく質がヒト黒色腫、ヒト結腸がんおよび膵臓がんの細胞株を含む多くの型のがんを殺傷できることを示している。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
アルブミン結合の研究のために、我々は、操作されたＡＡＤ融合たんぱく質がヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合できることを成功裡に示している。図１０は、ＡＡＤ融合たんぱく（アミノ酸配列を図３Ｅ、配列番号４０に示す）がＨＳＡと容易に結合することを示している。モル比１：５あるいは１：１５で、ＨＳＡ−ＡＡＤ複合体の形成は、図１の構成に従い、リンカー分子デザインを利用して行う。血液中を循環するＡＡＤ融合たんぱく質の半減期は、非共有ＨＳＡ−ＡＡＤ複合体の形成によって増加することが期待される。したがって、長続きする半減期を有する型のＡＡＤ融合たんぱく質を成功裡に作り出す。
【００２８】
本発明において調整されたＡＡＤ融合たんぱく質を含有する医薬組成物と比較して高い有効性を示す市販の製品は無い。がん治療に使用するために、本発明の医薬組成物を含有するＡＡＤ融合たんぱく質は、腫瘍細胞中のアルギニンを枯渇するための抗がん剤として提供される。ＡＡＤ融合たんぱく質は、他の分子をターゲットとした薬剤または細胞毒性薬と併用するためのよい候補である。
【実施例】
【００２９】
次の実施例は、如何なる意味でも本発明の範囲を限定することを意図せず、本発明の特定の実施態様を説明するものとして提供される。
【００３０】
下記のいくつかの実施例は、アルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質の生産方法に関する。クローニングおよびインテイン媒介性たんぱく質連結を含む様々な技術を利用できる。ここで使用されるように、「クローニング」の語は、幅広く用いられ、アルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質コードする融合遺伝子を構築して、融合遺伝子をベクターに挿入し、ベクターを宿主に挿入し、アルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質を含有するたんぱく質を発現することを含む。この技術の数多くの変形を実行できるが、本発明によって検討されたクローニング内に含まれる。
【００３１】
実施例１
アルブミン結合ドメイン／ペプチド／たんぱく質（ＡＢＤ）の遺伝子コーディングの構築
【００３２】
ＡＢＤの遺伝子コーディングはポリメラーゼ連鎖反応を二巡することにより構成される。一巡目ではポリメラーゼ連鎖反応混合物（総量２５μｌ）は次の物質を含む。
１×ｉＰｒｏｏｆ  ＰＣＲ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）
５０  &micro;Ｍ  ｄＮＴＰ  混合物
０．５単位のｉＰｒｏｏｆ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）
各１０ｎＭの下記オリゴ
ＡＢＤ−Ｆ１  フォワードプライマー（配列番号０１）：
5’-CATGATGCGAATTCCTTAGCTGAAGCTAAAGTCTTAGCTAACAGAGAACT-3’
ＡＢＤ−Ｒ２  リバースプライマー（配列番号０２）：
5’-TAGTCACTTACTCCATATTTGTCAAGTTCTCTGTTAGCTAAGACTTTAGC-3’
ＡＢＤ−Ｆ３  フォワードプライマー（配列番号０３）：
5’-GAACTTGACAAATATGGAGTAAGTGACTATTACAAGAACCTAATCAACAA-3’
ＡＢＤ−Ｒ４  リバースプライマー（配列番号０４）：
5’-TACACCTTCAACAGTTTTGGCATTGTTGATTAGGTTCTTGTAATAGTCAC-3’
ＡＢＤ−Ｆ５  フォワードプライマー  （配列番号０５）：
5’-GCCAAAACTGTTGAAGGTGTAAAAGCACTGATAGATGAAATTTTAGCTGC-3’
ＡＢＤ−Ｒ６  リバースプライマー  （配列番号０６）：
5’-AGCTACGATAAGCTTAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATCTATCAGTG-3’
以下のＰＣＲプログラムが用いられる：
９８°Ｃ  ３０秒；  ２０サイクルの｛９８℃  １０秒、５０℃  ２０秒、７２℃  ２０秒｝
【００３３】
ＰＣＲポリメラーゼ連鎖反応の２ラウンド二巡目において、ＰＣＲポリメラーゼ連鎖反応混合物（総量５０ｎμｌ）は次の材料物質を含む：
１×ｉＰｒｏｏｆ  ＰＣＲ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）；
５０μＭ  ｄＮＴＰ混合物；
１μｌのＤＮＡテンプレートとしての１ラウンド目のＰＣＲ反応物；
１単位のｉＰｒｏｏｆ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）；
各２００ｎＭの下記オリゴ：
ＡＢＤ−Ｆ７  フォワードプライマー（配列番号０７）：
5’-CATGATGCGAATTCCTTAGCTGAAGCTAAAGTCTTAGCTAACAGAGAACT-3’
ＡＢＤ−Ｒ８  リバースプライマー（配列番号０８）：
5’-AGCTACGATAAGCTTAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATCTATCAGTG-3’
以下のＰＣＲプログラムが用いられる：
９８℃  ３０秒；３５サイクルの{９８℃  １０秒、６０℃  ２０秒、７２℃  ２０秒｝；  ７２℃  ５分
【００３４】
ＡＢＤのＤＮＡ配列（１６９塩基対）を含むＰＣＲ産物を得て、クローニングの目的でＱｉａｇｅｎのＤＮＡ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔによって精製する。
【００３５】
実施例２Ａ
ＡＡＤ融合たんぱく質の融合遺伝子コーディングの構築
【００３６】
１回目のＰＣＲにおいて、ＰＣＲ混合物（総量５０μｌ）は、以下の材料を含む：
１×ｉＰｒｏｏｆ  ＰＣＲ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）；
５０μＭ  ｄＮＴＰ混合物;
２５ｎｇのマイコプラズマ・アルギニニゲノムＤＮＡ;
１単位のｉＰｒｏｏｆ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）；
各２００ｎＭの下記オリゴ：
ＡＤＩＮｄｅ−Ｆ  フォワードプライマー（配列番号０９）：
5’-ATCGATCGATGTCTGTATTTGACAGTAAATTTAAAGG-3’
ＡＤＩｈｉｓ−Ｒ  リバースプライマー（配列番号１０）：
5’-AGCTAAGGAATTCGCATCATGATGGTGATGGTGGTGGCTACCCCACTTAAC-3’
以下のＰＣＲプログラムが用いられる：
９８℃  １分；３５サイクルの｛９８℃  １０秒、５０℃  ２０秒、７２℃  ４０秒｝；７２℃  ５分
１２８０塩基対の長さを持つＰＣＲ産物を得て、Ｑｉａｇｅｎ製のＤＮＡ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔによって精製する。その後、２回目のＰＣＲを行う。ＰＣＲ混合物（総量５０μｌ）は以下の物質を含む：
１×ｉＰｒｏｏｆ  ＰＣＲ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）；
５０μＭ  ｄＮＴＰ混合物；
１０ｎｇの１２８０塩基対のＰＣＲ産物；
１０ｎｇの１６９塩基対のＰＣＲ産物；
１単位のｉＰｒｏｏｆ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）；
各２００ｎＭの下記オリゴ：
ＡＤＩＮｄｅ−Ｆ  フォワードプライマー（配列番号１１）：
5’-ATCGATCGATGTCTGTATTTGACAGTAAATTTAAAGG-3’
ＡＢＤ−Ｒ１０  リバースプライマー（配列番号１２）：
5’-AGCTACGATAAGCTTAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATCTATCAGTG-3’
以下のＰＣＲプログラムが用いられる：
９８℃  １分；３５サイクルの｛９８℃  １０秒、５０℃  ２０秒、７２℃  ４５秒｝；７２℃  ５分
【００３７】
塩基対１４２８のＰＣＲ産物を得て、Ｑｉａｇｅｎ製のＤＮＡ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔによって精製する。その後、制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで分解し、同酵素であらかじめ分解したプラスミドｐＲＥＳＴ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）とライゲーションする。ライゲーション産物は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換する。構築した融合遺伝子の配列は、ＤＮＡシークエンシングによって確認する。
【００３８】
実施例２Ｂ
Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ＡＤＩのクローンニング
【００３９】
Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ＡＤＩの構築（図３Ｅ中、配列番号４０）は、オーバーラップＰＣＲの２つの段階を経て行われ、最終段階で得られるＰＣＲフラグメントをベクターｐＥＴ３ａのＮｄｅＩとＢａｍＨＩサイトの間に挿入する。Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ＡＤＩの遺伝子マップ、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図６に示す。
Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ＡＤＩの構築に含まれるプライマー：
ｈｉｓＡＢＤＮｄｅ−Ｆ  フォワードプライマー（配列番号１３）：
5’-GGAGATATACATATGCATCATCACCATCACCATGATGAAGCCGTGGATG-3’
ＡＢＤｎｎ−Ｒ１  リバースプライマー（配列番号１４）：
5’-TTGTTATTATTGTTGTTACTACCCGAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATC-3’
ＡＢＤｎ−Ｒ２  リバースプライマー（配列番号１５）：
5’-AGAACCGCCGCTACCATTGTTATTATTGTTGTTACTACCCGA-3’
ＡＤｌｎ−Ｆ  フォワードプライマー（配列番号１６）：
5’-AATAATAACAATGGTAGCGGCGGTTCTGTATTTGACAGTAAATTTAAAGG-3’
ＡＤＩＢａｍ−Ｒ  リバースプライマー（配列番号１７）：
5’-TAGATCAATGGATCCTTACCACTTAACATCTTTACGTGATAAAG-3’
【００４０】
ＰＣＲの第１ラウンドにおいて、５０μｌの既知濃度の構成成分物質を含む反応ボリュームを２つのＰＣＲチューブ内に調整する。各チューブにおいて、ｄＮＴＰ、ｉＰｒｏｏｆ  緩衝液（ＢＩＯ−ＲＡＤ製）、ｉＰｒｏｏｆ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＩＯ−ＲＡＤ製））、プライマーおよびＤＮＡテンプレートを混合し、５０μｌまでｄｄＨ２Ｏを加える。反応で用いるＤＮＡテンプレートは、ＡＤＩ遺伝子のたんぱく質配列を変えずに、内部ＮｄｅＩサイト変異を除去したマイコプラズマ・アルギニニ由来のＡＤＩの遺伝子を含むｐＥＴ３ａベクターである。
【００４１】
２つの反応チューブは、（Ａ）１０ｐｍｏｌのｈｉｓＡＢＤＮｄｅ−Ｆ（配列番号１３）、０．５ｐｍｏｌのＡＢＤｎｎ−Ｒ１（配列番号１４）および１０ｐｍｏｌのＡＢＤｎ−Ｒ２（配列番号１５）、および（Ｂ）１０ｐｍｏｌのＡＤＩｎ−Ｆ（配列番号１６）および１０ ｐｍｏｌのＡＤＩＢａｍ−Ｒ（配列番号１７）のプライマー混合物をそれぞれ含む。
【００４２】
ＰＣＲプログラムは、マニュアルにて推奨される段階にしたがって、５０℃（２０秒）と７２℃（４０秒）それぞれでアニーリングと伸展の温度（時間）でセットする。２３７ｂｐと１２７８ｂｐの大きさを有する２つの産物をＰＣＲによって生成する。この産物を抽出し、次のラウンドのＰＣＲのテンプレートとして用いる。
【００４３】
２回目のオーバーラップ段階において、使用するテンプレートが１ラウンド目のＰＣＲより得られた１ｐｍｏｌの２３７ｂｐＰＣＲ産物と１ｐｍｏｌの１２７８ｂｐＰＣＲ産物の混合物であるということ以外は、１ラウンド目と同様に反応混合物を調整する。使用するプライマーは、１０ｐｍｏｌのｈｉｓＡＢＤＮｄｅ−Ｆ（配列番号１３）および１０ｐｍｏｌのＡＤＩＢａｍ−Ｒ（配列番号１７）に変更する。
【００４４】
アニーリングと伸展の温度（時間）は、それぞれ５０℃（２０秒）と７２℃（６０秒）である。１４８４ｂｐの大きさのＰＣＲ産物が反応により生じる。ＰＣＲ産物を精製し、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩによって分解し、あらかじめ分解されたｐＥＴ３ａプラスミドとライゲーションする。ライゲーション産物は、組換えたんぱく質の製造のために大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換する。
【００４５】
実施例２Ｃ
Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ｂｃＡＤＩのクローンニング
【００４６】
Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ｂｃＡＤＩの構築（図３Ｆ中、に示す配列番号４１）は、オーバーラップＰＣＲの２つの段階を経て行い、最終段階で得られるＰＣＲのフラグメントをベクターｐＥＴ３ａのＮｄｅＩとＢａｍＨＩサイトの間に挿入する。Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ｂｃＡＤＩの遺伝子マップ、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図７に示す。
Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ｂｃＡＤＩの構築に含まれるプライマー：
ｈｉｓＡＢＤＮｄｅ−Ｆ２  フォワードプライマー（配列番号１８）：
5’-GGAGATATACATATGCATCATCACCATCACCATGATGAAGCCGTGGATG-3’
ｂｃＡＢＤｎｎ−Ｒ１  リバースプライマー（配列番号１９）：
5’-TTGTTATTATTGTTGTTACTACCCGAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATC-3’
ｂｃＡＢＤｎ−Ｒ２  リバースプライマー（配列番号２０）：
5’-TTTACCGCCGCTACCATTGTTATTATTGTTGTTACTACCCGA-3’
ｂｃＡＤｌｎ−Ｆ  フォワードプライマー（配列番号２１）：
5’-AATAATAACAATGGTAGCGGCGGTAAACATCCGATACATGTTACTTCAGA-3’
ｂｃＡＤＩＢａｍ−Ｒ  リバースプライマー（配列番号２２）：
5’-TAGATCAATGGATCCCTAAATATCTTTACGAACAATTGGCATAC-3’
【００４７】
ポリメラーゼ連鎖反応の第１ラウンド目において、５０μｌの既知濃度の構成成分を含む反応ボリュームを２つのＰＣＲチューブ内に調整する。各チューブにおいて、ｄＮＴＰ、ｉＰｒｏｏｆ  ｂｕｆｆｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ製）、ｉＰｒｏｏｆ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（ＢＩＯ−ＲＡＤ製)、プライマーおよびＤＮＡテンプレートを混合し、５０μｌまでｄｄＨ２Ｏを加える。反応で用いるＤＮＡテンプレートは、ＡＤＩ遺伝子のたんぱく質配列を変えずに、内部ＮｄｅＩサイト変異を除去したセレウス菌由来のＡＤＩの遺伝子を含むｐＥＴ３ａベクターである。
【００４８】
２つの反応チューブは、（Ａ）１０ｐｍｏｌのｈｉｓＡＢＤＮｄｅ−Ｆ２（配列番号１８）、０．５ｐｍｏｌのｂｃＡＢＤｎｎ−Ｒ１（配列番号１９）および１０ｐｍｏｌのｂｃＡＢＤｎ−Ｒ２（配列番号２０）；および（Ｂ）１０ｐｍｏｌのｂｃＡＤＩｎ−Ｆ（配列番号２１）および１０ｐｍｏｌのｂｃＡＤＩＢａｍ−Ｒ（配列番号２２）のプライマー混合物をそれぞれ含む。ＰＣＲプログラムは、マニュアルにて推奨される段階にしたがってアニーリングと伸展の温度（時間）をそれぞれ５０℃（２０秒）と７２℃（４０秒）でセットする。２３７ｂｐと１２５０ｂｐの大きさの２つの産物がＰＣＲによって生成する。それらの産物を抽出し、次のラウンドのＰＣＲのテンプレートとして適用する。
【００４９】
２回目のオーバーラップ段階において、使用するテンプレートが一ラウンド目のＰＣＲにより得た１ｐｍｏｌの２３７ｂｐＰＣＲ産物と１ｐｍｏｌの１２５０ｂｐＰＣＲ産物の混合物であるということ以外は、１ラウンド目と同様に反応混合物を調整する。使用するプライマーは、１０ｐｍｏｌのｈｉｓＡＢＤＮｄｅ−Ｆ２（配列番号１８）および１０ｐｍｏｌのｂｃＡＤＩＢａｍ−Ｒ（配列番号２２）に変更する。
【００５０】
アニーリングと伸展の温度（時間）は、それぞれ５０℃（２０秒）と７２℃（６０秒）である。１５１２ｂｐの大きさのＰＣＲ産物が反応により生じる。ＰＣＲ産物を精製し、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩによって分解し、あらかじめ分解したｐＥＴ３ａプラスミドにライゲートする。ライゲート産物は、組換えたんぱく質の製造のために大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換する。
【００５１】
実施例３
ＡＡＤ融合たんぱく質の発現と精製
【００５２】
種培養の準備のために、ＡＡＤ融合たんぱく質（図５）をコードするプラスミドのキャリアである大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を５ｍｌの２×ＴＹ培地にて、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩培養する。一晩の種培養（２．５ｍｌ）に、３７℃、２５０ｒｐｍ、２．５時間（ＯＤ６００≒０．６〜０．７まで）で２５０ｍｌの２×ＴＹを加える。ＯＤ６００に到達した時点で、ＩＰＴＧを培地に加える（最終濃度０．２ｍＭ）。２０℃でさらに２２時間成長を続け、その後遠心分離によって細胞を回収する。細胞ペレットをｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液２５ｍｌに再懸濁する。細胞を超音波処理によって溶解する。遠心分離の後、可溶性部分を回収する。その後、融合たんぱく質（Ｈｉｓタグを含む）をニッケルアフィニティクロマトグラフィーによって精製する。表２は、培養温度が、発現した宿主から得られるＡＡＤ融合たんぱく質（アミノ酸配列を図３Ｅの配列番号４０に示す）の、溶解性に影響を与える重要な要因であることを示す。
【００５３】
ＡＡＤ融合たんぱく質の可溶性画分を単離するために、細胞ペレットをｐＨ７．４、２５ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝液１０ｍＭに再懸濁する。細胞を超音波処理によって溶解する。可溶性部分を遠心分離の後、回収する。その後、ＡＡＤ融合たんぱく質（Ｈｉｓタグを含む）を、ニッケルアフィニティクロマトグラフィーによって精製する。
【００５４】
ＡＡＤ融合たんぱく質の不溶性画分を単離するために、トリトン−Ｘ−１００を１％含む、２０ｍＭトリス塩酸２５ｍｌ、ｐＨ７．４に細胞ペレットを再懸濁する。細胞を超音波処理によって溶解する。不溶性部分（封入体）を遠心分離によって回収する。たんぱく質を、６Ｍのグアニジン塩酸塩を含む２０ｍＭトリス塩酸１０ｍｌ、ｐＨ７．４によってアンフォールドし、溶解するまでボルテックスする。アンフォールドしたたんぱく質液を高速攪拌している２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液１００ｍｌ、ｐＨ７．４、に一滴ずつ加えることによって、たんぱく質を再びフォールドする。不溶性材料を遠心分離によって除去する。たんぱく質の塩析は、固体の硫酸アンモニウム粉末を７０％の飽和状態となるまで上澄みに加えることによって行う。不溶性部分を遠心分離によって回収し、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液１０ｍｌに再懸濁する。その後、ＡＡＤ融合たんぱく質（Ｈｉｓタグを含む）をニッケルアフィニティクロマトグラフィーにより精製する。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
実施例４
ＡＡＤ融合たんぱく質の酵素活性アッセイおよび酵素反応速度論
【００５７】
野生型ＡＤＩおよび本発明のＡＡＤ融合たんぱく質の酵素活性を測定するために、シトルリン検出のためのジアセチルモノオキシム（ＤＡＭ）−チオセミカルバジド（ＴＳＣ）アッセイを用いる。反応を以下に示す。
【数１】
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【００５８】
このアッセイは、ＤＡＭ−ＴＳＣ液に酸性塩化鉄溶液を混合して作られた呈色試薬を検体に加えることにより行う。簡単にいえば、２０ｍＭアルギニンおよび１０ｍＭリン酸ナトリウムとともに、ｐＨ７．４、３７℃で５分間、酵素を培養する。反応混合物を１００℃で５分間加熱すると、発色し、５４０ｎｍ（光路＝１ｃｍ）で読み取る。様々な濃度のシトルリンを用いて、標準曲線を作成する。ＡＤＩ天然酵素の一単位は、アッセイの条件下で、３７℃で１分間に１μｍｏｌのアルギニンを１μｍｏｌのシトルリンに転換する酵素活性量である。野生型ＡＤＩと本発明のＡＡＤ融合たんぱく質の特異的な活性は、それぞれ８．４Ｕ／ｍｇおよび９．２Ｕ／ｍｇ（ｐＨ７．４、生理的ｐＨ）である。異なるｐＨ範囲（ｐＨ５．５〜９．５）においても、野生型ＡＤＩと本発明のＡＡＤ融合たんぱく質の特異的な活性を測定し、最適なｐＨは６．５である。それゆえ、この結果は、アルブミン結合たんぱく質がＡＤＩの酵素活性に影響を与えないので、ＡＡＤ融合たんぱく質がアルギニンを効果的に枯渇させることを示している。
【００５９】
ミカエリス定数Ｋｍは、反応速度が最大速度の半分であるときの基質濃度であり、酵素に対する基質の親和性の逆の尺度である。Ｋｍの値が小さいことは、基質への親和性が高いことを示し、これは反応速度が最大反応速度により速く近づくことを意味する。酵素反応速度論またはＫｍの値を測定するために、異なる基質濃度のアルギニン（２０００μＭ、１０００μＭ、５００μＭ、２５０μＭ、１２５μＭ、６２．５μＭ）、ｐＨ７．４のもとで、野生型ＡＤＩおよびＡＡＤ融合たんぱく質の活性を測定する。図３Ｅに示す（配列番号４０、ＡＤＩたんぱく質はマイコプラズマ・アルギニニ由来である）ＡＡＤ融合たんぱく質および図３Ｆに示す（配列番号４１、ＡＤＩたんぱく質はバチルス・セレウス由来である）で測定したＫｍの値は、それぞれ０．００４１ｍＭおよび０．１３２ｍＭである。この結果は、ＡＢＤへの融合が異種のＡＡＤ融合たんぱく質のアルギニンに対する結合親和性に影響を与えないことを示唆する。
【００６０】
実施例５
がん細胞株上におけるＡＡＤ融合たんぱく質の細胞増殖アッセイおよび生体外での有効性
【００６１】
ＤＭＥＭ培地をヒト黒色腫Ａ３７５およびＳＫ−ｍｅｌ−２８、ヒト膵臓がんＰａｎｃＩならびにヒト子宮頸がんＣ−３３Ａ株の成長に用いる。ＥＭＥＭ培地をヒト肝臓がんＳＫ−ｈｅｐ１およびヒト子宮頸がんＣ−３３Ａ株の培養に使用する。培地１００μｌ中の細胞株（２〜５×１０３）を９６ウェルプレートのウェルに播種し、２４時間培養する。その培地を異なる濃度のＡＡＤ融合たんぱく質を含有する培地と交換する。プレートをさらに３日間、３７℃、９５％空気、５％ＣＯ２の雰囲気で培養する。製造指示書にしたがって、培地中の生細胞の数を、ＭＴＴアッセイで測定する。細胞成長を、５０％阻害を達成するのに必要な酵素の量をＩＣ５０と定義する。
【００６２】
表１および図９に示すとおり、結果は、ＡＡＤ融合たんぱく質は、アルギニンを効果的に枯渇させ、生体外の組織培養研究において様々な型のヒトがん細胞株の成長を阻害することを示す。たとえば、ヒト黒色腫、ヒト結腸がん、ヒト膵臓がん、ヒト肝臓がん、ヒト子宮頸がんすべてにおいて、これらのすべての型のがんは、ＡＡＤ融合たんぱく質によってただちに阻害されているので、ＩＣ５０の値が低い（表１参照）。予想どおり、ＡＡＤ融合たんぱく質はアルギニン依存性であるすべての型のがん（たとえばＡＳＳ陰性がん）を阻害する。
【００６３】
実施例６
生体内におけるＡＡＤ融合たんぱく質の半減期の測定
【００６４】
ｂaｌｂ／ｃマウス（生後５〜７週）を本研究に用い、マウスを実験の一週前に環境に順応させる。マウス（ｎ＝３）を４つの群に分け、０、１００、５００、１０００μｇのＡＡＤ融合たんぱく質（配列番号４０，図３Ｅ）を有する１００μｌのＰＢＳを腹腔内に注射する。各マウスの血液を０時間および１〜７日に得る。遠心分離後に血清を得る。血清を除たんぱくし、アルギニン用のアミノ酸分析によって分析する。
【００６５】
図１１に示すように、ＡＡＤ融合たんぱく質（配列番号４０、図３Ｅ）は、最も低い投与量である１００μｇであっても、１日、３日および５日目に血漿アルギニンを効果的に枯渇させており、ＡＡＤが生体内で少なくとも５日間は効果的にアルギニンを枯渇させることができることを示唆する。アルギニンのレベルは、６日および７日目にすべての処理群においてゆっくり正常に戻っている。
【００６６】
実施例７
異種移植したがん細胞におけるＡＡＤ融合たんぱく質の生体内効果
【００６７】
ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（生後５〜７週）を本研究に使用し、実験の一週前に環境に順応させる。２×１０６のがん細胞を有する新しい培地１００μｌをマウスに皮下接種する。１０日後、マウスを無作為に対照群と処理群に分ける。対照群にはＰＢＳ１００μｌを毎週腹腔内に投与し、処理群にはＡＡＤ融合たんぱく質１００μｌを毎週腹腔内に投与する。腫瘍の大きさをキャリパにより測定し、腫瘍の容積を式：（長さ×幅２）／２を用いて計算する。各処理後５日目にアルギニンの血漿測定のために採血する。
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図９】
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【図１１】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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