(57)【要約】  本発明は、一つの反応器内で、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを利用してＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造する工程と、ガラクトースまたはガラクトース誘導体にシアル酸を結合させるシアル酸（ノイラミン酸）誘導体を製造する工程をともに行うことを特徴とするシアル酸誘導体の製造方法に関する。本発明によれば、高価なシチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）を反応器内でリサイクルすることができ、反応に投入されるシチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）の量を減少させ、低価なＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとピルビン酸を基質とし、シアル酸誘導体を製造することができ、より高効率でシアル酸誘導体を製造することができる効果がある。
2016519952.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のステップを含むシアル酸誘導体の製造方法：
（ａ）単一の反応器で、シチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）、アセチルホスフェート、ＮＴＰ、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ピルビン酸、ガラクトース残基を含む化合物を基質として添加し、シチジン５’−一リン酸キナーゼ（ＣＭＫ）、アセテートキナーゼ（ＡＣＫ）、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素（ＮＥＵ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（ＮＡＮＥ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（ＮＡＮ）およびシアル酸転移酵素を添加した反応液を反応させて、シアリルラクトースまたはガラクトース残基を含む化合物のシアル酸誘導体を製造するステップ；及び
（ｂ）前記製造されたシアリルラクトースまたはガラクトース残基を含む化合物のシアル酸誘導体を取得するステップ。
【請求項２】
前記シアル酸転移酵素はα-２，３−シアル酸転移酵素、α-２，６−シアル酸転移酵素及びα-２，８−シアル酸転移酵素からなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記α-２，３−シアル酸転移酵素は配列番号２〜６のいずれか一つのアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記α-２，６−シアル酸転移酵素は配列番号１４〜１８のいずれか一つのアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記反応は２５〜３８℃で行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
反応液のｐＨは７〜９であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（ＮＡＮＥ）は配列番号２５のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ガラクトース残基を含む化合物は、単糖、オリゴ糖、リンカー、フラボノイド、抗癌剤、抗生剤、免疫抑制剤および抗体で構成される群から選択される化合物のガラクトースを含む誘導体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一つの反応器内で、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ、ＧｌｃＮＡｃ）からＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を製造する工程と、ラクトースなど、ガラクトースを含む誘導体にシアル酸を結合させるシアル酸（ノイラミン酸）誘導体を製造する工程をともに行うことを特徴とするシアル酸誘導体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖（ｓｕｇａｒ）は、自然界で最も広く豊富に存在する生体分子の一つであり、細胞において認識および信号伝逹に係る最も一般的な分子である。ほとんどの糖構成単位は核酸により活性化する際にアグリコン（ａｇｌｙｃｏｎ）に付加されることができる。ヌクレオチド糖（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｓｕｇａｒ）は、単糖類の活性化した形態であり、糖転移酵素（ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）による糖転移反応において供与体としての役割をする。しかし、糖転移は、依然として糖転移酵素の反応性が弱く、活性化したグリカン（ｇｌｙｃａｎ）構成単位の活用が制限的な点などの問題点を有している。
【０００３】
近年、糖鎖に関する構造および機能に関する研究が急速に進められて生理活性を有するオリゴ糖、糖脂質、糖タンパク質などの医薬品または機能性素材としての用途開発が活発に行われている。そのうち、末端にＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）を含むシアル酸含有糖鎖は、細胞接着やウイルス感染の際に受容体となるなど、重要な機能を有する糖鎖である。
【０００４】
シアル酸含有糖鎖は、一般的にシアル酸転移酵素の触媒作用により合成される。シアル酸転移酵素は、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を糖供給体として糖鎖などの受容体にシアル酸を伝達する酵素である。しかし、糖供給体として使用するＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸は、非常に高く、量的にも試薬水準の少ない量にしか供給されないことが現実である。
【０００５】
ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造方法としては、シチジン５’−三リン酸（ＣＴＰ）とＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）を基質とし、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ（ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）の触媒により合成する方法が知られているが、原料となるＣＴＰおよびＮｅｕＡｃが高価であるため直接原料として合成されたＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸も高価である。
【０００６】
ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）の生産方法としては、（１）Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ（ｌｙａｓｅ）またはＮ−アセチルノイラミン酸シンテターゼを使用して、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓａｍｉｎｅ、ＭａｎＮＡｃ）から製造する方法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１０：６４８１，１９８８；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１０：７１５９，１９８８；日本公開特許平第１０−４９６１号）、（２）アルカリ条件下でＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）をＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）に変換させ、これにＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼまたはＮ−アセチルノイラミン酸シンテターゼを添加してＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）を製造する方法（日本公開特許平第５−２１１８８４号；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６６：２，１９９９；Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２０，１９９７）、（３）ＧｌｃＮＡｃからＭａｎＮＡｃへの変換を触媒するＮ−アセチルグルコサミン（ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）（ＧｌｃＮＡｃ）２−エピメラーゼ（ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）と、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼまたはＮ−アセチルノイラミン酸シンテターゼを使用してＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）からＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）を製造する方法（ＷＯ９５／２６３９９；日本公開特許平３−１８０１９０号；日本公開特許２００１−１３６９８２号）、（４）大腸菌と酵母菌体を利用してＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を合成する方法（ＷＯ２００４／００９８３０）などが報告されている。
【０００７】
しかし、（１）の方法は、原料であるＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）が高価であり、（２）の方法は、安価のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を原料とする方法ではあるが、ＧｌｃＮＡｃとＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）の混合物でＭａｎＮＡｃを精製する工程が複雑であるという問題がある。また、（３）の方法で使用するＧｌｃＮＡｃ２−エピメラーゼは、ＡＴＰ（アデノシントリホスフェート）を必要とすることから高価なＡＴＰを添加するか、微生物を使用してＡＴＰの前駆体であるアデニンでＡＴＰを生成させなければならないという欠点があり、（４）の方法は、大腸菌と酵母菌体を利用する方法が工程において複雑であるという問題がある。
【０００８】
韓国公開特許第１０−２００６−００１０７０６号では、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造方法として、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼをコードする遺伝子およびＮ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼをコードする遺伝子を含む共発現ベクターが導入された形質転換体に、シチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、ピルビン酸（Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ）および酵母を添加してノイラミン酸を合成した後、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素を添加するか、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼをコードする遺伝子およびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素をコードする遺伝子を含む共発現ベクターが導入された形質転換体に、シチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、ピルビン酸および酵母を添加してＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造する方法を開示しているが、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造するにあたり、様々なステップを経る必要があり、基質として使用されるシチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）がシチジン５’−三リン酸（ＣＴＰ）に転換される収率が低いという問題点があった。
【０００９】
糖タンパク質、糖脂質にシアリルオリゴ糖とフコース（ｆｕｃｏｓｅ）糖が含まれたグリカンは、生物学的過程で各種の非常に重要な役割をする。
【００１０】
しかし、従来公知となっているシアル酸と生理活性物質誘導体を結合させる反応は、高価なＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を出発物質とし、シアル酸転移酵素（Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）により製造され、製造効率もまた低いという欠点があり、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを出発物質とし、シアル酸誘導体を製造した技術も存在したが、シアル酸転移酵素の活性範囲と活性に劣り、シアル酸誘導体の製造効率が低いという欠点があった（キム・デヒ、鮮文大学大学院理学博士学位論文、２０１１）。
【００１１】
そのため、本発明者らが、より経済的で且つ高い効率で生理活性物質のシアル酸誘導体を製造する方法を開発するために鋭意研究を重ねた結果、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとシチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）を出発物質とし、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造するステップと、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸からシアル酸と結合した生理活性物質誘導体を製造するステップを、シアル酸転移酵素変異株を利用して単一の反応器で行う場合、高価な原料であるシチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）のリサイクルが可能であり、高収率で生理活性物質のシアル酸誘導体を製造することができるということを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の目的は、高収率と低コストでシアル酸誘導体を製造する方法を提供することにある。
【００１３】
前記目的を達成するために、本発明は、（ａ）単一の反応器で、シチジン５’−一リン酸（Ｃｙｔｉｄｉｎｅ  ５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＣＭＰ）、ＮＴＰ（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ピルビン酸、ガラクトース残基を含む化合物を基質として添加し、シチジン５’−一リン酸キナーゼ（ｃｙｔｉｄｉｎｅ  ５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ、ＣＭＫ）、アセテートキナーゼ（ａｃｅｔａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ、ＡＣＫ）、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＮＥＵ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−２−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ、ＮＡＮＥ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（ＮｅｕＡｃ  ａｌｄｏｌａｓｅ、ＮＡＮ）およびシアル酸転移酵素を添加した反応液を反応させて、シアリルラクトース（Ｓｉａｌｙｌｌａｃｔｏｓｅ）またはガラクトース残基を含む化合物のシアル酸誘導体を製造するステップと、（ｂ）前記製造されたシアリルラクトースまたはガラクトース残基を含む化合物のシアル酸誘導体を取得するステップと、を含むシアル酸誘導体の製造方法を提供する。
【００１４】
本発明の他の特徴および具現例は、下記の詳細な説明および添付の特許請求の範囲からより明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明によるワンポット（Ｏｎｅ−ｐｏｔ、一体型回分式）反応により２，３−シアリルラクトースおよび２，６−シアリルラクトースを製造する合成過程を示す図である。
【図２】２，３シアル酸転移酵素変異体の２，６シアル酸転移副反応を確認した図であり、（ａ）はｐＨ４．５〜６．０の条件での結果を示す図であり、（ｂ）はｐＨ６．５〜７．０の条件での結果を示す図である。
【図３】本発明のワンポット反応により合成された２，３−シアリルラクトースをＬＣとＭａｓｓで確認した結果を示す図である。
【図４】本発明のワンポット反応により合成された２，６−シアリルラクトースをＬＣとＭａｓｓで確認した結果を示す図である。
【図５】本発明によるワンポット反応によりシアリルガラクトースを製造する合成過程を示す図である。
【図６】本発明のワンポット反応により合成されたシアリルガラクトースをＴＬＣおよびＭａｓｓで確認した結果を示す図である。
【図７】ラクトースと結合されたリンカーのシアル酸誘導体の合成過程を示す図である。
【図８】本発明のワンポット反応により合成されたラクトースと結合されたリンカーのシアル酸誘導体（ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌ  ｌｉｎｋｅｒ  ２，３−ｓｉａｌｙｌｌａｃｔｏｓｅ）をＴＬＣおよびＭａｓｓで確認した結果を示す図である。
【図９】フラボノイドＣＳＨ−Ｉ−５４のガラクトース残基を含む誘導体のシアル酸誘導体の合成過程を示す図である。
【図１０】本発明のワンポット反応により合成された２，３−シアリルラクトース−ＣＳＨ−Ｉ−５４をＬＣおよびＭａｓｓで確認した結果を示す図である。
【図１１】免疫抑制剤タクロリムス（ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）ガラクトース誘導体のシアル酸誘導体の合成過程を示す図である。
【図１２】本発明のワンポット反応により合成された２，３−シアリルラクトース−タクロリムスをＬＣおよびＭａｓｓで確認した結果を示す図である。
【図１３】抗癌剤タキソール（ｔａｘｏｌ）ガラクトース誘導体のシアル酸誘導体の合成過程を示す図である。
【図１４】本発明のワンポット反応により合成された２，３−シアリルラクトース−タキソールをＬＣおよびＭａｓｓで確認した結果を示す図である。
【図１５】抗生剤バンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）のガラクトース誘導体のシアル酸誘導体の合成過程を示す図である。
【図１６ａ】本発明のワンポット反応により合成された２，３−シアリルラクトース−バンコマイシンをＬＣで確認した結果を示す図である。
【図１６ｂ】本発明のワンポット反応により合成された２，３−シアリルラクトース−バンコマイシンをＭａｓｓで確認した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
他に定義されない限り、本明細書で使用されたすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者が通常理解しているものと同一の意味を有する。一般的に、本明細書で使用された命名法は、本技術分野において公知となっており、通常使用されるものである。
【００１７】
本発明は、（ａ）シチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）、アセチルホスフェート、ＮＴＰ、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、ピルビン酸およびガラクトースまたはガラクトース残基を含む化合物を基質として添加し、シチジン５’−一リン酸キナーゼ（ＣＭＫ）、アセテートキナーゼ（ＡＣＫ）、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ（ＮＥＵ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（ＮＡＮＥ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（ＮＡＮ）およびシアル酸転移酵素を添加した反応液を反応させてシアリルラクトースまたはガラクトース残基を含む化合物のシアル酸誘導体を製造するステップと、（ｂ）前記製造されたシアリルラクトースまたはガラクトース残基を含む化合物のシアル酸誘導体を取得するステップと、を含むシアル酸誘導体の製造方法に関するものである。
【００１８】
本発明のシアル酸誘導体の製造方法によれば、一つの反応器内で、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンからＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造する工程と、ガラクトースを含む誘導体にシアル酸を結合させるシアル酸（ノイラミン酸）誘導体を製造する工程をともに行い、高価な基質であるシチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）をリサイクルすることができ、且つ高収率でシアル酸誘導体を製造することができる。
【００１９】
従来、シアル酸誘導体の製造方法は、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を出発物質とし、シアル酸転移酵素によりラクトースまたはガラクトースを含む誘導体にシアル酸を結合させる工程であったが、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸が非常に高価な物質であるため、シアル酸誘導体の生産に高い費用がかかった。
【００２０】
本発明者らは、かかる問題点を解決するために鋭意研究を重ねた結果、バクテロイデスフラジリスＮＣＴＣ９３４３（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＮＣＴＣ９３４３）由来の新規Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ酵素を利用して、シチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）および極少量のＮＴＰと様々な基質と酵素を使用して、高収率でＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造する方法を開発した（韓国登録特許第０８８８５１３号）。
【００２１】
ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸とラクトースをシアル酸転移酵素と反応させると、ラクトースにシアル酸が転移されて、シアリルラクトースとシチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）が生成される。従来のシアリルラクトースの製造工程では、シチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）を基質としてＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造する工程とシアル酸転移工程が異なる容器で行われ、前記生成されるシチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）をリサイクルすることができなかった。
【００２２】
本発明では、シチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）からＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸が製造される反応と、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸とラクトースなどのガラクトースを含む誘導体にシアル酸転移酵素によりシアル酸誘導体とシチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）が生成される反応が同一の反応器で行われることから、シアル酸転移反応により生成されたシチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）をＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造反応にリサイクルすることができる。
【００２３】
本発明による単一容器での２，３−シアリルラクトースおよび２，６−シアリルラクトースを製造する合成過程を図１に示した。
【００２４】
本発明の一様態において、シアリルラクトースは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで安価の基質であるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ピルビン酸、シチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）などからワンポット反応で生産する。７．５ｍＭ／ｈｒ〜８．５ｍＭ／ｈｒのＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の生成速度下でシアリルラクトースの転換率は、シチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）を基準として６５０％であり、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）から８１％である。９８％以上の純度を有するシアリルラクトースの精製収率は７５％である。Ｉｎ  ｓｉｔｕのシチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）再使用システムによるシアリルラクトース生産は、細胞抽出液酵素を利用して成功的に行われた。
【００２５】
本発明の他の様態では、本発明によるワンポットシアリルラクトース生産方法と、既存のツーポット（ｔｗｏ−ｐｏｔ）シアリルラクトース製造方法を比較したところ、本発明のワンポットシアリルラクトース生産方法が、添加するシチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）の濃度が１／５に減少しても、生産されるシアリルラクトースの量は２倍増加することを確認した（表４参照）。
【００２６】
本発明において、シアル酸転移酵素としては、２，３−シアル酸転移酵素、２，６−シアル酸転移酵素または２、８−シアル酸転移酵素を使用することができ、好ましくは、２，３−シアル酸転移酵素または２，６−シアル酸転移酵素を使用することができる。
【００２７】
本発明の一様態では、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸が製造される反応に係る酵素であるシチジン５’−一リン酸キナーゼ（ＣＭＫ）、アセテートキナーゼ（ＡＣＫ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（ＮＡＮ）、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ（ＮＥＵ）およびＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（ＮＡＮＥ）と同一の活性条件でも高い活性を示すシアル酸転移酵素を開発するために、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）由来の２，３−シアル酸転移酵素とフォトバクテリウム・ダムセラ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅ）菌株由来の２，６−シアル酸転移酵素を変異させて、前記他の酵素と同一条件で高い活性を有する変異酵素を開発した。
【００２８】
したがって、本発明の２，３−シアル酸転移酵素は、配列番号２〜６のいずれか一つのアミノ酸配列を有する２，３−シアル酸転移酵素の変異酵素であることを特徴とすることができ、本発明の２，６−シアル酸転移酵素は、配列番号１４〜１８のいずれか一つのアミノ酸配列を有する２，６−シアル酸転移酵素の変異酵素であることを特徴とすることができる。
【００２９】
本発明のシアル酸誘導体の製造反応は、反応に係る各酵素の活性温度を勘案して、２５〜３８℃で行うことが好ましく、反応に係る各酵素の活性ｐＨを勘案して、ｐＨ７〜９で行うことが好ましい。
【００３０】
本発明において、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（ＮＡＮＥ）は、バクテロイデスフラジリスＮＣＴＣ９３４３由来のＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ酵素である配列番号２５のアミノ酸配列を有する酵素を使用することが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３１】
本発明において、ガラクトース残基を含む化合物は、単糖、オリゴ糖、リンカー、フラボノイド、抗癌剤、抗生剤、免疫抑制剤および抗体で構成される群から選択される化合物のガラクトースを含む誘導体であることを特徴とする。
【００３２】
本発明において、前記単糖は、グルコース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、マンノースなどであってもよく、前記リンカーは、エステルまたはアミド結合を活用して連結することができる官能基であってもよく、例えば、ホルミル（Ｆｏｒｍｙｌ）、アセチル基、プロピオニル（ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ）基、ブチル基、アクリル基、エチルスクシニル（ｅｔｈｙｌｓｕｃｃｉｎｙｌ）基、スクシニル（ｓｕｃｃｉｎｙｌ）基、アミノヘキシル（ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌ）基などを連結することができるリンカーを意味する。
【００３３】
本発明に用いられた２，６−シアル酸転移酵素の変異株は、フォトバクテリウム・ダムセラ菌株から由来し、糖転移酵素の構造折り畳みと配列から見たときにパスツレラから由来した２，３−シアル酸転移酵素のようなＧＴ  ｆａｍｉｌｙ  ８０に属する。フォトバクテリウム由来の２，６−シアル酸転移酵素の場合にも、最近、２，６シアリダーゼとシアル酸転移酵素の活性が明らかになったが、このような副反応の活性が２，６−シアル酸転移の活性より非常に微細であることから（１５０倍以上）シアル酸転移の活性がほとんどであると見ることができる。２，６−シアル酸転移酵素の場合、副反応がほとんどなく、２，６−シアル酸転移の活性がほとんどであり、基質特異性が多様であるという利点を有している一方、酵素活性の差がパスツレラ由来の２，３−シアル酸転移酵素より５〜６倍以上低いという欠点を有している。
【００３４】
２，３および２，６結合を有する様々なシアリルオリゴ糖の生産効率を増加させるためには、上記で明示した基質特異性が多様な２，３および２，６−シアル酸転移酵素の機能が向上した変異株を生成し、これらをシアリルオリゴ糖の生産に応用する必要がある。
【００３５】
シアル酸転移酵素のシアル酸供与体であるＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の５種の酵素による生合成は、中性ｐＨで最適の生産性を示す反面、２，３−転移酵素によるシアル酸転移反応は、ｐＨ８〜９で最適の反応性を示す。これは、２，３−シアル酸転移酵素が広い範囲のｐＨ内で活性を示すが、中性ｐＨ以下で副反応を示す多機能的特性に起因する。中性ｐＨ以下では、２，３−シアル酸転移酵素により２，６−シアリルラクトースが付加的に生成されるため、既存の反応では、中性ｐＨでＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を生産し、緩衝液をｐＨ８〜９に転換するステップを経て、２，３−シアル酸転移酵素を適用する２ステップの反応を行った。したがって、２，３−シアル酸転移酵素の場合、副反応の生成を抑制することにより回分式一体型反応を可能とし触媒反応を速くして、２，３−シアリルラクトースを含む様々な２，３−シアリル誘導体の生産性および効率を向上させることができる。
【００３６】
本発明では、シアル酸転移酵素の変異株を生成するために、ハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）、すなわち、セミ−ラショナル（ｓｅｍｉ−ｒａｔｉｏｎａｌ）方法を使用した。この方法は、定向進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）と論理的予測（ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ）方法を結合したものであって、良質の少数の変異株ライブラリーのみを確保するためである。この方法は、タンパク質の標的となる部分を分析し、タンパク質の配列、構造と機能およびコンピュータープログラムを利用して特定のアミノ酸の残基を選択して変異を行うことを意味する。
【００３７】
本発明において、シアル酸転移酵素は、ルロアール糖転移酵素であり、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸からＮ−アセチルノイラミン酸を受容体糖物質に転移する酵素を意味する。受容体基質の一つであるラクトースは、Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ（ガラクトースとグルコースがβ１，４結合により連結される）で構成されたオリゴ糖である。
【００３８】
２，３−および２，６−シアリルオリゴ糖は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）がガラクトース部分にａ２，３またはａ２，６結合により連結されたオリゴ糖を意味し、ガラクトースまたはグルコースに他の糖がさらに結合することができる。２，３−および２，６−シアリルラクトースは、Ｎｅｕ５Ａｃａ２，３／２，６Ｇａｌβ、４Ｇｌｃ（シアル酸がラクトースのガラクトースにα２，３またはα２，６結合により連結される）で構成された三炭糖（ｔｒｉｏｓｅ）物質を意味する。
【００３９】
本発明において、全細胞反応は、特定の酵素を含む細胞を破砕して細胞内容物を利用するか、または酵素を分離精製することなく完全な細胞全体を利用した反応を意味し、本発明の反応は、全細胞反応で行うこともでき、精製されたそれぞれの酵素を独立して添加して行うことができ、それぞれの酵素を精製してビーズ状に固定して行うこともできる。
【００４０】
本発明において、位置指定突然変異（ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）は、遺伝子の指定された位置に指定された塩基配列の変化を導入することを意味し、飽和変異（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）は、遺伝子の指定された位置に様々な塩基配列の変化を導入することを意味する。飽和変異は、鋳型鎖に結合する相補的な配列のプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）上に変異させようとする配列の代わり、ＮＮＫコドン（ｃｏｄｏｎ）を挿入してＰＣＲにより変異を挿入させることを意味する。この際、ＮＮＫコドンにおいて、Ｎは、ヌクレオチドのＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃを意味し、Ｋは、Ｔ、Ｇを意味する。
【００４１】
ベクターは、一本鎖、二本鎖、環状または超らせんＤＮＡまたはＲＮＡからなるポリヌクレオチドを意味し、組み換えタンパク質を生産できるように適切な距離で作動的に連結されている構成要素を含むことができる。
【００４２】
このような構成要素には、複製オリジン、プローモーター、エンハンサー、５’ｍＲＮＡリーダー配列、リボソーム結合部位、核酸カセット、終結およびポリアデニル化部位、または選別可能なラベル形式などが含まれることができ、前記構成要素は、特異的な用途に応じて、一つまたはそれ以上が排除されてもよい。核酸カセットは、発現する組み換えタンパク質の挿入のための制限酵素部位を含むことができる。機能的ベクターにおいて、核酸カセットは、翻訳開始および終結部位を含む発現される核酸配列を含み、必要に応じて、ベクター内に二種のカセットを挿入することができるベクターを使用することもあり、上述の機能が付加的に配列化されることができる。
【００４３】
組み換えベクターに挿入された遺伝子は、発現用大腸菌ＢＷ２５１１３（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）などを使用することができるが、挿入されたベクターの種類に応じて異なりうる。このようなベクターおよび発現菌株は、当業者であれば容易に選択することができる。
【００４４】
本発明の他の様態では、ラクトース誘導体としてＬａｃＮＡｃを使用し、Ｌｅｗｉｓ  Ｘを成功的に得ることができた。本発明によれば、ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ｘ（ＳＬｅＸ）のような様々な機能性オリゴ糖を生産することができる。
【００４５】
本発明のさらに他の様態では、シアリルバンコマイシン誘導体を合成するためにβ１，４−ＧａｌＴとα２，３−ＳｉａＴの２種の糖転移酵素を利用した酵素的な接近方法を使用しており、バンコマイシンと擬バンコマイシン（ｐｓｅｕｄｏ−ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）のグルコース部分にガラクトースとシアル酸の結合を証明した。さらに、ＭＩＣ試験の結果、ガラクトースを含む誘導体のＭＲＳＡとＶＳＥＦに対する抗生剤活性は、ガラクトース／シアル酸を含む誘導体より高いか同一であった。本発明による基質特異性を有するシアル酸転移酵素は、他のグリコペプチド（ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ）抗生剤やポリケチド（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ）と非リボソームペプチド（ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）のような糖が結合された自然界の小さい分子のシアリレーション（ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ）に適用することができる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例により制限されるものと解釈されないことは当業界において通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【００４７】
≪実施例１：シアル酸転移酵素の変異株の製造≫
本発明で使用される２，３−シアル酸転移酵素は、結晶構造から基質結合ポケット部分を確認しており、２，６−シアル酸転移酵素は、他のフォトバクテリウム由来の２，６−シアル酸転移酵素の結晶構造を鋳型としたモデル構造から基質結合部分を確認した。ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸と受容体基質から５〜２０Å以内に位置する残基をそれぞれの２，３−シアル酸転移酵素と２，６−シアル酸転移酵素から選択した。
【００４８】
本発明で使用した野生型２，３−シアル酸転移酵素は、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｓｉｄａ（ＡＴＣＣ１５７４２）由来であり、野生型２，６−シアル酸転移酵素は、フォトバクテリウム・ダムセラ（ＡＴＣＣ２９６９０）由来である。
【００４９】
本発明では、生物情報学の配列情報を利用した多重配列整列（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を行っており、タンパク質構造内に特定位置のアミノ酸残基を保存しているものは変異残基として排除した。基質結合残基の中で上記で選択された残基のうち、飽和変異を行う機能残基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ）を選択するためにアラニンで位置指定突然変異を行った。アラニンへの置換は、残基が除去されたものと同様、特定の残基が基質との作用によって重要な触媒活性に寄与をするか否かを解釈することができる。アラニンで置換した後、酵素活性を比色法で測定し、野生株との活性の差を比較した。
【００５０】
また、本発明では、野生株と比較して発現されたタンパク質の折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）程度を維持するアラニン置換変異株を選択した。つまり、各２，３および２，６−シアル酸転移酵素のアラニン置換変異株のうち、野生株に比べて３０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上の活性を示し、タンパク質の折り畳みを維持する残基を次のステップである飽和変異を行う機能残基として選択した。
【００５１】
触媒反応において基質との相互作用に必須に寄与する、すなわちシアル酸転移の主な活性に寄与する残基はそのまま維持し、酵素の折り畳みおよび本来の活性を維持するアラニン置換変異株の残基に飽和変異を行うことにより、酵素の「中立的動き（ｎｅｕｔｒａｌ  ｄｒｉｆｔ）」を誘導して、飽和変異により野生株より基質にさらに適合する活性型の酵素−基質複合体を生成させることができる。
【００５２】
１−１：シアル酸転移酵素の機能残基に対する飽和変異遂行および変異株探索
２，３−シアル酸転移酵素のアミノ酸位置３１３および２６５に該当するＡＧＡおよびＡＣＣ配列をランダムに置換したＮＮＫ配列（ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴであり、Ｋは、ＧまたはＴである配列）が導入されたプライマーを利用してベクター全体をＰＣＲしてライブラリーを構築した。本発明の２，３−シアル酸転移酵素は、Ｎ末端に２４個のアミノ酸が除去された形態であるため、最初のメチオニン配列から２５番目がメチオニンとなる。
【００５３】
２，６−シアル酸転移酵素のアミノ酸位置４１１および４３３に該当するＡＴＴおよびＣＴＧ配列をランダムに置換したＮＮＫ配列（Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴであり、Ｋは、ＧまたはＴである配列）が導入されたプライマーを利用してベクター全体をＰＣＲしてライブラリーを構築した。本発明の２，６−シアル酸転移酵素は、最初のメチオニン配列から数える場合、メチオニンが１番となる。ベクター配列を含むシアル酸転移酵素の増幅された遺伝子は、本来のプラスミドを除去するためにＤｐｎ酵素処理後、大腸菌ＤＨ５ａに形質転換させた。発生したすべてのコロニーから変異遺伝子を抽出し、これを大腸菌ＢＷ２５１１３（ＤＥ３）に形質転換した。形質転換されたそれぞれのコロニーを９６−ウェル上でアンピシリンが含まれたＬＢ培地５００μＬに接種して３０〜３７℃で１８〜２４時間振とう培養した後、培養液の一部を１００μｇ  ｍＬ−１アンピシリンとＩＰＴＧが含まれた新たなＬＢ培地５００μＬに接種して１８〜３０℃で１８〜４０時間を培養した。培養された細胞は、遠心分離した後、細胞を１〜１０ｍＭトリス緩衝液１００μＬに再懸濁させた後、このうち１０μＬの全細胞を変異株探索反応に使用するか、または細胞を５０μＬのバグブースター（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ）タンパク質抽出試薬で再懸濁させて遠心分離した後、細胞抽出物を取得し、このうち１０μＬを変異株探索反応に使用した。９０μＬの反応液は、１〜１０ｍＭトリス緩衝液、１〜５ｍＭ  ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸とラクトース、０．１〜１ｍＭのｐＨ指示薬を含み、シアル酸転移酵素の全細胞または細胞抽出液１０μＬを添加すると同時に反応を進めて、１分の時間間隔で１０〜３０分間の反応速度を野生株と比較して観察した。
【００５４】
大腸菌ＢＷ２５１１３（ＤＥ３）に形質転換されたシアル酸転移酵素の野生株および変異株は、５０ｍＬの培養容積でインデューサであるＩＰＴＧを利用して発現した後、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを利用して純粋タンパク質のみを精製し、固有活性度および動力学変数を測定した。
【００５５】
２，３および２，６−シアル酸転移酵素の単一アミノ酸置換変異株の固有活性度は、それぞれ同一量のタンパク質を使用して前記ｐＨ指示薬を利用した酵素活性分析方法により分析しており、反応は、５〜１０分間進めて初期の受容体基質濃度に対して１０〜２５％の転換収率を示したときの酵素ｍｇ当たり活性（ｕｎｉｔ）で計算しており、これを表１に示した。
【００５６】
２，３−シアル酸転移酵素の選択された機能残基に対してＮＮＫコドンを使用してＰＣＲにより飽和変異を行った後、変異株ライブラリーに対してｐＨ指示薬を利用した比色法によりスクリーニングを行った。野生株に比べて時間に対する吸光度の変化が増加した変異株を１次的に探索した後、これらの変異株を培養して取得した細胞抽出物を利用して初期反応速度を細胞抽出物の容積（ｍＬ）当たり活性で計算した。
【００５７】
２，３−シアル酸転移酵素変異株の場合、Ｒ３１３のアルギニンはラクトースのグルコース近くのループ（ｌｏｏｐ）上に位置している。Ｒ３１３の変異株に対して、アラニンとグリシンのような小さいサイズのアミノ酸へ置換された変異株は、野生株に比べて中立的な活性を示し、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸、アスパラギン、ヒスチジンのような親水性アミノ酸で置換された変異株は、野生株に比べて１．５倍以上の活性を示した。
【００５８】
ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の２０Å以内に位置するＴ２６５変異株に対してはグリシン、セリン、アスパラギンで置換された変異株が、野生株に類似するか高い活性を有するものと探索された。
【００５９】
Ｒ３１３変異株に対する野生型に対して相対的な固有活性度を比較した結果、Ｒ３１３は相対的に様々な変異株を受け入れることができ、そのうちＲ３１３Ｎの固有活性度が野生株に対して２３１％と、単一変異株のうち最も高かった。また、Ｔ２６５変異株に対する野生型に対して相対的な固有活性度を表１に示した。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
一方、２，６−シアル酸転移酵素の選択された機能残基に対しても同様にＮＮＫコドンを使用してＰＣＲにより飽和変異を行った後、変異株ライブラリーに対してｐＨ指示薬を利用した比色法によりスクリーニングを行った。Ｉ４１１とＬ４３３は、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸から５〜２０Å距離内に位置している。１４３３の変異株のうちＬ４３３ＳとＬ４３３Ｔが野生型に対して３倍の増加した活性を示した。Ｉ４１１の変異株の中ではＩ４１１Ｔが野生型に対して２倍の活性を示すことが探索された。野生型２，６−シアル酸転移酵素の場合、ｐＥＴ１５ｂベクターよりｐＥＴ２８ａベクターでの発現が増加しているところ、探索された変異株などｐＥＴ２８ａベクターにクローニングしてこれらの固有活性度を確認した（表１）。
【００６２】
１−２：２，３−シアル酸転移酵素のシアル酸転移酵素の変異株特性分析
本発明において、２，３−シアル酸転移酵素のＲ３１３の単一アミノ酸置換変異株Ｒ３１３Ｎは、配列番号２のアミノ酸配列を示し、３１３番目のアミノ酸位置に親水性アミノ酸配列を有するタンパク質であり、配列番号２のタンパク質を暗号化するＤＮＡは、配列番号８であり、前記のアミノ酸を暗号化するすべてのＤＮＡ配列も含むことができる。
【００６３】
また、Ｒ３１３Ｈは、配列番号３のアミノ酸配列を示し、３１３番目のアミノ酸位置に親水性アミノ酸配列を有するタンパク質およびこの変異体配列が含まれた９７％以上の相同性を有し、シアル酸転移の活性を有する酵素もいずれも可能である。配列番号３のタンパク質を暗号化するＤＮＡは、配列番号９であり、前記のアミノ酸を暗号化するすべてのＤＮＡ配列も含まれることができる。
【００６４】
また、Ｔ２６５Ｓは、配列番号４のアミノ酸配列を示し、２６５番目のアミノ酸位置に親水性アミノ酸配列を有するタンパク質およびこの変異体配列が含まれた９７％以上の相同性を有し、シアル酸転移の活性を有する酵素もいずれも可能である。配列番号３のタンパク質を暗号化するＤＮＡは、配列番号１０であり、前記のアミノ酸を暗号化するすべてのＤＮＡ配列も含まれることができる。
【００６５】
また、Ｒ３１３ＮとＴ２６５Ｓの組み合わせ変異株は、配列番号５のアミノ酸配列を示し、Ｒ３１３ＨとＴ２６５Ｓの組み合わせ変異株は、配列番号６のアミノ酸配列を示す。また、３１３番目のアミノ酸位置または２６５番目のアミノ酸位置に親水性アミノ酸配列を有するタンパク質およびこの変異体配列が含まれた９７％以上の相同性を有し、シアル酸転移の活性を有する酵素もいずれも可能である。配列番号５のタンパク質を暗号化するＤＮＡは、配列番号１１であり、配列番号６のタンパク質を暗号化するＤＮＡは、配列１２であり、前記のアミノ酸を暗号化するすべてのＤＮＡ配列も含まれることができる。
【００６６】
前記明示した２，３−シアル酸転移酵素の変異体と９７％以上の相同性を有する例としては、前記変異体の変異された配列を含んでおり、２，３−シアル酸転移酵素の活性を有すると規定、または予測される配列として、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）の属（ｇｅｎｕｓ）、特に、そのうち、ムルトシダ（ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）種（ｓｐｅｃｉｅｓ）由来の配列が含まれることができる。
【００６７】
本発明では、また高い固有活性度を有する２，３−シアル酸転移酵素のＲ３１３の単一アミノ酸置換変異株とＴ２６５の単一アミノ酸置換変異株に対してそれぞれの組み合わせ変異株を作製し、組み合わせ変異株のうち、Ｒ３１３Ｈ／Ｔ２６５ＳとＲ３１３Ｎ／Ｔ２６５Ｓが野生株に対してそれぞれ２３７％と２１６％の高い固有活性度を示した。基質供与体と受容体に対してそれぞれの変異が及ぼす影響を調べるために単一アミノ酸置換変異株と組み合わせ変異株に対して動力学変数を測定した。
【００６８】
動力学変数の測定は、前記比色法を利用した変異株探索方法により分析しており、反応は、室温で５〜１０分間行い、３０秒の間隔おきに初期受容体基質濃度に対して１０〜２５％の転換収率を示したときの初期反応速度を測定した。動力学変数の測定は、供与体基質であるＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸と受容体基質であるラクトースの両方に対して測定しており、基質濃度は０．１から３０ｍＭまでの範囲を使用した。ｋｃａｔとＫｍの動力学変数は、シグマプロット（ＳｉｇｍａＰｌｏｔ）プログラムを使用してミカエリス−メンテン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ）方程式の非線形回帰分析により得た。２，３−シアル酸転移酵素の野生株と変異株に対する動力学変数は表２に示した。
【００６９】
【表２】
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【００７０】
単一アミノ酸置換変異株であるＲ３１３ＮとＲ３１３Ｈは、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸とラクトースに対してｋｃａｔ値が増加しており、二つの基質に対するＲ３１３ＮおよびＲ３１３Ｈのｋｃａｔ／Ｋｍは、野生株に対してそれぞれ約１．４倍および約１．２倍増加した。組み合わせ変異体であるＲ３１３Ｎ／Ｔ２６５ＳとＲ３１３Ｈ／Ｔ２６５Ｓは、二つの基質に対してｋｃａｔ値が増加しており、二つの組み合わせ変異体は、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸に対してｋｃａｔ／Ｋｍが約１．６倍増加した。また、Ｒ３１３Ｎ／Ｔ２６５ＳとＲ３１３Ｈ／Ｔ２６５Ｓは、ラクトースに対するｋｃａｔ／Ｋｍが野生株に対してそれぞれ約１．５倍および約１．８倍増加した。
【００７１】
本発明ではまた、２，３−シアル酸転移酵素の３１３番目のアミノ酸位置にアルギニンの代わりに他の親水性アミノ酸（Ｎ、Ｄ、Ｙ、Ｔ、Ｈ）に転換されたときに酵素の固有活性度が増加することを確認するとともに、これらの変異株に対して２，６−シアル酸転移副反応を確認した。２，６−シアル酸転移副反応が発生するｐＨ４．５〜７．０でＲ３１３Ｎ、Ｒ３１３Ｄ、Ｒ３１３Ｙ、Ｒ３１３Ｔ、Ｒ３１３Ｈおよび組み合わせ変異株であるＲ３１３Ｎ／Ｔ２６５ＳとＲ３１３Ｈ／Ｔ２６５Ｓの２，６−シアル酸転移副反応を測定した結果、ｐＨ４．５〜６．０（図２のａ）では、２，６−シアリルラクトースの生成量が野生株に比べて４〜３０倍減少しており、ｐＨ６．５〜ｐＨ７．０（図２のｂ）では、２，６−シアリルラクトースの生成量がＲ３１３Ｙ（１５倍減少）以外はいずれも無くなったことを確認することができ、これは図２に示した。
【００７２】
１−３：２，６−シアル酸転移酵素のシアル酸転移酵素の変異株特性分析
本発明において、２，６−シアル酸転移酵素のＩ４１１の単一アミノ酸置換変異株Ｉ４１１Ｔは、配列番号１４のアミノ酸配列を示し、４１１番目のアミノ酸位置に小さいサイズまたは親水性アミノ酸配列を有するタンパク質およびこの変異体配列が含まれた５５％以上の相同性を有し、シアル酸転移の活性を有する酵素もいずれも可能である。配列番号１４のタンパク質を暗号化するＤＮＡは、配列番号２０であり、前記のアミノ酸を暗号化するすべてのＤＮＡ配列も含むことができる。
【００７３】
また、Ｌ４３３Ｓは、配列番号１５のアミノ酸配列を示し、Ｌ４３３Ｔは、配列番号１６のアミノ酸配列を示し、４３３番目のアミノ酸位置に親水性アミノ酸配列を有するタンパク質およびこの変異体配列が含まれた５５％以上の相同性を有し、シアル酸転移の活性を有する酵素もいずれも可能である。配列番号１５および１６のタンパク質を暗号化するＤＮＡは、配列番号２１および２２であり、前記のアミノ酸を暗号化するすべてのＤＮＡ配列も含まれることができる。
【００７４】
また、Ｉ４１１ＴとＬ４３３Ｓの組み合わせ変異株は、配列番号１７のアミノ酸配列を示し、Ｉ４１１ＴとＬ４３３Ｔの組み合わせ変異株は、配列番号１８のアミノ酸配列を示す。また、４１１番目のアミノ酸位置または４３３番目のアミノ酸位置に小さいサイズまたは親水性アミノ酸配列を有するタンパク質およびこの変異体配列が含まれた５５％以上の相同性を有し、シアル酸転移の活性を有する酵素もいずれも可能である。配列番号１７のタンパク質を暗号化するＤＮＡは配列番号２３であり、配列番号１９のタンパク質を暗号化するＤＮＡは、配列番号２４であり、前記のアミノ酸を暗号化するすべてのＤＮＡ配列も含まれることができる。
【００７５】
前記明示した２，６−シアル酸転移酵素の変異体と５５％以上の相同性を有する例としては、前記変異体の変異された配列を含んでおり、２，６−シアル酸転移酵素の活性を有すると規定、または予測される配列として、フォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、特に、そのうち、ダムセラ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅａｌｅ）、レイオグナシー（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ）種由来の配列が含まれることができる。また、本発明の２，６−シアル酸転移酵素と５５％の相同性を有することにより、本発明のタンパク質モデル構造を形成する鋳型タンパク質となるフォトバクテリウムＪｔ−Ｉｓｈ−２２４、α−２，６−シアル酸転移酵素の配列が含まれることができる。
【００７６】
本発明では、高い固有活性度を有する２，６−シアル酸転移酵素のＩ４１１Ｔの単一アミノ酸置換変異株とＬ４３３ＳおよびＬ４３３Ｔの単一アミノ酸置換変異株に対してそれぞれの組み合わせ変異株を作製し、組み合わせ変異株のうち、Ｉ４１１Ｔ／Ｌ４３３ＳとＩ４１１Ｔ／Ｌ４３３Ｔが野生株に対してそれぞれ１９４％と５１０％の高い固有活性度を示した。基質供与体と受容体に対してそれぞれの変異が及ぼす影響を調べるために単一アミノ酸置換変異株と組み合わせ変異株に対して動力学変数を測定しており、これを表３に示した。
【００７７】
【表３】
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【００７８】
受容体基質であるラクトースに対して、すべての変異株が、基質との結合力は減少したのに対し、ｋｃａｔ値を増加させており、野生株に比べてｋｃａｔ値が６倍から最大２７倍まで増加した。単一変異株であるＩ４１１Ｔ、Ｌ４３３ＳとＬ４３３Ｔのｋｃａｔ／Ｋｍは、野生株に対して、それぞれ１．８倍、３倍と２．６倍増加しており、組み合わせ変異株であるＩ４１１Ｔ／Ｌ４３３ＳとＩ４１１Ｔ／Ｌ４３３Ｔのｋｃａｔ／Ｋｍは野生株に対して、それぞれ２．７倍と３．９倍増加した。
【００７９】
一方、供与体基質であるＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸に対しては、Ｉ４１１ＴとＬ４３３Ｓ単一アミノ酸置換変異株の場合、ｋｃａｔ／Ｋｍは、野生株に対してそれぞれ２．４倍と２．６倍増加しており、Ｌ４３３Ｔは、基質との親和力もともに増加して、ｋｃａｔ／Ｋｍが野生株に対して６．７倍増加した。Ｉ４１１Ｔ／Ｌ４３３ＳとＩ４１１Ｔ／Ｌ４３３Ｔの組み合わせ変異株の場合、ｋｃａｔが野生株に対して４．５倍増加しており、ｋｃａｔ／Ｋｍは、それぞれ２倍と８倍増加した。
【００８０】
本発明により生産した２，３および２，６−シアル酸転移酵素の変異株は、前記言及したラクトース受容体基質だけでなく、二糖類受容体基質である、Ｎ−アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）、アジドβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１−４）−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＬａｃβＮ３）、３−アジドプロピルβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１−４）−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＬａｃβＰｒｏＮ３）、メチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１−４）−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＬａｃβＯＭｅ）を含み、ガラクトース部分を含む様々なオリゴ糖基質に適用することができる。
【００８１】
また、本発明により生産した２，３および２，６−シアル酸転移酵素の変異株は、前記言及したＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸供与体基質だけでなく、シチジン一リン酸ジアミノノイラミン酸（ＣＭＰ−ＫＤＮ、ＣＭＰ−Ｄｅａｍｉｎｏｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、シチジン一リン酸−Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ｇｃ、ＣＭＰ−Ｎ−ｇｌｙｃｏｌｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）を含む様々な誘導体基質に適用することができる。
【００８２】
≪実施例２：ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸合成のための酵素の製造≫
シアリレーション（ｓｉａｙｌａｔｉｏｎ）反応の中間物質であるＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造のために、使用される酵素を製造した。
【００８３】
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンからＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造するステップに使用される酵素は、シチジン５’−一リン酸キナーゼ（ＣＭＫ）、アセテートキナーゼ（ＡＣＫ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（ＮＡＮ）、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ（ＮＥＵ）およびＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（ＮＡＮＥ）であり、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸とラクトースを反応させて２，３−シアリルラクトースを製造する酵素は、２，３−シアル酸転移酵素であり、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸とラクトースを反応させて２，６−シアリルラクトースを製造する酵素は、２，６−シアル酸転移酵素である。
【００８４】
前記Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンからＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を製造するステップに使用される前記酵素の製造方法は、韓国特許公開１０−２００８−００５５５８８に詳細に記載されている。
【００８５】
簡単に要約すると、次のとおりである。
【００８６】
（１）Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼの製造
バクテロイデスフラジリスＮＣＴＣ９３４３（ＮＣ_００３２２８）のゲノムからＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（配列番号２５）をコードするｎａｎＥ遺伝子をクローニングするために、バクテロイデスフラジリスＮＣＴＣ９３４３菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２６および配列番号２７のプライマーを使用してＰＣＲ法によりｎａｎＥ遺伝子を増幅した。
【００８７】
配列番号２６：５’−ｃｔ  ｇｃｃ  ａｔｇ  ｇｔｔ  ａｔｇ  ａａｔ  ａｃｔ  ａｃａ  ｇ
配列番号２７：５’−ａａｔ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ｔｔａ  ｔｔｔ  ｔｔｃ  ｔｇａ  ｃａｇ
【００８８】
前記増幅されたＰＣＲ産物を精製した後、制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断し、前記と同一の制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断したプラスミドｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）Ｔ４  ＤＮＡ（Ｔａｋａｒａ）にリガーゼを使用して連結し、組み換えベクターｐＮＡＮｅを作製した。前記組み換えベクターをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入し、これによりＥ．ｃｏｌｉ／ｐＮＡＮｅを取得した。
【００８９】
（２）Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（ＮｅｕＮＡｃ  ａｌｄｏｌａｓｅ）の製造
Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼをコードするｎａｎＡ遺伝子（配列番号２８）をクローニングするために、大腸菌Ｋ−１２（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２）Ｃ６００（ＫＣＴＣ１１１６）菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２９および配列番号３０のプライマーを使用してＰＣＲ法によりｎａｎＡ遺伝子を増幅した。
【００９０】
配列番号２９：５’−ｇｇｔａｔｃｃａｔｇｇｃａａｃｇａａｔｔｔａｃｇ
配列番号３０：５’−ｇｇｔａｇｇｃｔｃｇａｇｃｇａｇｇｇｇａａａｃ
【００９１】
前記増幅されたＰＣＲ産物を精製した後、制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで切断し、前記と同一の制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで切断したプラスミドｐＥＴ３２ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）Ｔ４  ＤＮＡ（Ｔａｋａｒａ）にリガーゼを使用して連結し、組み換えベクターｐＮＡＮａを作製した。前記ｐＮＡＮａをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入させて、Ｅ．ｃｏｌｉ／ｐＮＡＮａを取得した。
【００９２】
（３）シチジン５’−一リン酸キナーゼ（ＣＭＫ）の製造
シチジン５’５’−一リン酸キナーゼをコードするＣＭＫ遺伝子（配列番号３１）をクローニングするために、大腸菌Ｋ−１２（ＫＣＴＣ１１１６）菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３２および配列番号３３のプライマーを使用してＰＣＲ法によりＣＭＫ遺伝子を増幅した。
【００９３】
配列番号３２：５’−ｃａｔ  ａｔｇ  ａｃｇｇｃａ  ａｔｔ  ｇｃｃ  ｃｃｇ  ｇｔｔ  ａｔｔ  ａｃ
配列番号３３：５’−ｇａａ  ｔｔｃ  ｇｇｔ  ｃｇｃ  ｔｔａ  ｔｇｃ  ｇａｇ  ａｇｃ  ｃ
【００９４】
増幅されたＰＣＲ産物を精製し、制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、前記と同一の制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断したプラスミドｐＥＴ２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）Ｔ４  ＤＮＡ（Ｔａｋａｒａ）にリガーゼを使用して連結しており、組み換えベクターｐＣＭＫを製造した。前記ｐＣＭＫをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入させて、Ｅ．ｃｏｌｉ／ｐＣＭＫを取得した。
【００９５】
（４）アセテートキナーゼ（ＡＣＫ）の製造
アセテートキナーゼをコードするａｃｋ遺伝子（配列番号３４）をクローニングするために、大腸菌Ｋ−１２（ＫＣＴＣ１１１６）菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３５および配列番号３６のプライマーを使用して、ＰＣＲ法によりａｃｋ遺伝子を増幅した。
【００９６】
配列番号３５：５’−ｃａｔａｔｇｔｃｇａｇｔａａｇｔｔａｇｔｔｔｃｔｇ
配列番号３６：５’−ｇａａｔｃｃｔｃａｇｇｃａｇｔｃａｇｇｃｇｇｃｔｃｇｃｇｔｃ
【００９７】
増幅されたＰＣＲ産物を精製し、制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、前記と同一の制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断したプラスミドｐＥＴ２４ｍａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）Ｔ４  ＤＮＡ（Ｔａｋａｒａ）にリガーゼを使用して連結し、組み換えベクターｐＡＣＫａを製造した。
【００９８】
前記ｐＡＣＫａをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入して、Ｅ．ｃｏｌｉ／ｐＡＣＫａを作製した。
【００９９】
（５）ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ（ＣＭＰ−ＮｅｕＮＡｃ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＮＥＵ）の製造
【０１００】
ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ（ＣＭＰ−ＮｅｕＮＡｃ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）をコードするｎｅｕ遺伝子（配列番号３７）をクローニングするために、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｋｏｒａｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３８および配列番号３９のプライマーＤＮＡを使用してＰＣＲ法によりｎｅｕ遺伝子を増幅した。
【０１０１】
配列番号３８：５’−ａａｇｃａｔａｔｇｇａａａａａｃａａａａｔａｔｔｇｃｇ
配列番号３９：５’−ｇｔｇｇａａｔｔｃｔｔａｇｃｔｔｔｃｃｔｔｇｔｇ
【０１０２】
前記増幅されたＰＣＲ産物を精製し、制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、前記と同一の制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断したプラスミドｐＥＴ３２ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）Ｔ４  ＤＮＡ（Ｔａｋａｒａ）にリガーゼを使用して連結して、組み換えベクターｐＳＹＮｂを製造した。
【０１０３】
前記ｐＳＹＮｂをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入して、Ｅ．ｃｏｌｉ／ｐＳＹＮｂを作製した。
【０１０４】
前記形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ／ｐＮＡＮｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ／ｐＮＡＮａ、Ｅ．ｃｏｌｉ／ｐＣＭＫ、Ｅ．ｃｏｌｉ／ｐＡＣＫａおよびＥ．ｃｏｌｉ／ｐＳＹＮｂをＬＢ培地で培養した種菌５００ｍＬを本培養ＬＢ培地５Ｌに接種して、接種４時間後、発現誘導物質としてＩＰＴＧを１−２ｍＭ添加してタンパク質の高発現を誘導した。細胞の密度（ＯＤ６００）が約３〜５のときに細胞を取得した。前記取得された細胞を超音波破砕機またはフレンチプレスで破砕した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによりそれぞれの酵素発現程度を確認した。シチジン５’−一リン酸キナーゼ、アセテートキナーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼなどの酵素を硫酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ）を利用した沈殿およびイオン交換樹脂カラムで精製した（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｅｓ第２版、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００１）。
【０１０５】
≪実施例３：２，３−シアル酸転移酵素を利用したラクトースのワンポットシアリレーション≫
実施例１と２で製造した２，３−シアル酸転移酵素（ＰＳＴ２，３ｓｔ  Ｒ３１３Ｎ）、シチジン５’−一リン酸キナーゼ（ＣＭＫ）、アセテートキナーゼ（ＡＣＫ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（ＮＡＮ）、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ（ＮＥＵ）およびＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（ＮＡＮＥ）が混合された酵素反応液を利用して、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、ピルビン酸、ラクトースを基質とし、ラクトースのワンポットシアリレーションを行った。
【０１０６】
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンから２，３−シアリルラクトースまたは２，６−シアリルラクトースを生産する化学反応式は図１に示しており、単一の反応器内での遂行によって、高価な基質であるシチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）を再循環することができるということが示されている。
【０１０７】
反応混合液［５〜１０ｍＭシチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ、Ｓｈａｎｇｈａｉ  ＱＺＵ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２０〜８０ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｊｉｕｂａｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、４０〜１２０ｍＭピルビン酸（ＺＭＣ  Ｉｎｃ）、４０〜１２０ｍＭラクトース（Ｌａｃｔｏｓｅ、ＤＭＶ  Ｉｎｃ）、２０ｍＭ  Ｍｇｃｌ２・Ｈ２Ｏ（Ｄｕｋｓａｎ）、１ｍＭ  ＮＴＰ（ｓｉｇｍａ）、８０〜３００ｍＭアセチルホスフェート（Ａｃｅｔｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｓｉｇｍａ）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣlバッファー（ｐＨ７．０）、３７℃  ２Ｍ  ＮａＯＨを使用してｐＨ６．５〜８．０維持］をシチジン５’−一リン酸キナーゼ（ＣＭＫ）、アセテートキナーゼ（ＡＣＫ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（ＮＡＮ）、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ（ＮＥＵ）およびＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（ＮＡＮＥ）、２，３−シアル酸転移酵素（ＰＳＴ２，３ｓｔ  Ｒ３１３Ｎ）を混合した後、反応器で撹拌して５〜１２時間反応させた。
【０１０８】
ＬＣ、Ｍａｓｓ分析の結果、２，３−シアリルラクトースが合成されたということを確認することができた（図３）。ＬＣの場合、Ｄｉｏｎｅｘ  ＤＸ−５００  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｓｙｓｔｅｍを使用して行い、条件は次のとおりである。
【０１０９】
Ｃｏｌｕｍｎ：ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１００  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｐ／Ｎ０４３０５５）ｗｉｔｈ  ｇｕａｒｄ（Ｐ／Ｎ０４３０５４）
Ｆｌｏｗ：１ｍＬ／ｍｉｎ
Ｒｕｎ  ｔｉｍｅ：２０ｍｉｎ
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｖｏｌｕｍｅ：２５μＬ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＥＤ４０  ＥｌｅｃｔｒｏＣｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ｇｏｌｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）
Ｅｌｕｅｎｔ：１００ｍＭ  ＮａＯＨ／１００ｍＭ  ＮａＯＡｃ．
【０１１０】
２，３−シアリルラクトースのＭａｓｓ分析の結果、分子イオン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｏｎ）が［Ｍ−Ｈ］−形態でｍ／ｚ６３２．２に検出された。
【０１１１】
同一の方法で、前記反応液に、２，３−シアル酸転移酵素（２，３−Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の代わりに、２，６−シアル酸転移酵素（２，６−Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）である２，６−シアル酸転移酵素（２，６ＳＴＮ  Ｌ４３３Ｓ）を添加して、反応させた結果、２，６−シアリルラクトースを合成した（図４）。
【０１１２】
≪実施例４：ラクトースのワンポットシアリレーションと既存方法の比較≫
実施例３の方法と同一のワンポット方法で、表４の基質濃度を使用してシアルラクトースの製造した方法とのシアリルラクトース生産量と、既存のツーポット方法を使用したシアリルラクトースの製造した方法のシアリルラクトース生産量を比較した。
【０１１３】
既存のツーポット方法は、反応混合液［５０ｍＭシチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）、１００ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、１００ｍＭピルビン酸、２０ｍＭ  Ｍｇｃｌ２・Ｈ２Ｏ、１ｍＭ  ＮＴＰ、３００ｍＭアセチルホスフェート、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）７Ｌ、３７℃  ２Ｍ  ＮａＯＨを使用してｐＨ６．５〜８．０維持］を前記実施例２で製造したシチジン５’−一リン酸キナーゼ（ＣＭＫ）、アセテートキナーゼ（ＡＣＫ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（ＮＡＮ）、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ（ＮＥＵ）およびＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（ＮＡＮＥ）を混合した後、反応器で撹拌して５〜１２時間反応させて、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を合成した。
【０１１４】
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液に前記合成された約４０ｍＭ  ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸に１００ｍＭラクトースを入れ、２，３−シアル酸転移酵素を添加して反応させて、シアリルラクトースを生産しており、標準シアリルラクトース（ｓｉｇｍａ）の標準曲線と比較して、ＬＣでシアリルラクトース量を測定した。
【０１１５】
【表４】
2016519952.tif 000006
【０１１６】
その結果、表４に示されたように、本願発明のワンポットシアリルラクトース生産方法で製造する場合、添加するＣＭＰの濃度が１／５に減少しても、シアリルラクトースの生産量は２倍増加することを確認した。
【０１１７】
≪実施例５：ガラクトースのワンポットシアリレーション≫
単糖であるガラクトース（ｓｉｇｍａ）シアリレーションを行い、シアリレーション過程を図５に示した。
【０１１８】
反応混合液［５〜１０ｍＭシチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）、２０〜８０ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、４０〜１２０ｍＭピルビン酸、４０〜１２０ｍＭガラクトース２０ｍＭ  Ｍｇｃｌ２・Ｈ２Ｏ、１ｍＭ  ＮＴＰ、８０〜３００ｍＭアセチルホスフェート、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  バッファー（ｐＨ７．０）、３７℃  ２Ｍ  ＮａＯＨを使用してｐＨ６．５〜８．０維持］をシチジン５’−一リン酸キナーゼ（ＣＭＫ）、アセテートキナーゼ（ＡＣＫ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（ＮＡＮ）、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ（ＮＥＵ）およびＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（ＮＡＮＥ）、２，３−シアル酸転移酵素（ＰＳＴ２，３ｓｔ  Ｒ３１３Ｎ）を混合した後、反応器で撹拌して５〜１２時間反応させた。
【０１１９】
ＬＣ、ＭａｓｓおよびＴＬＣ分析の結果、シアリルガラクトースが合成されたということを確認することができ、Ｍａｓｓ分析の結果、分子イオンが［Ｍ−Ｈ］−形態でｍ／ｚ４７０．２に検出された（図６）。
【０１２０】
≪実施例６：リンカーのシアル酸誘導体の製造≫
ガラクトースを末端残基として含むアミノヘキシルリンカー（Ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌ  ｌｉｎｋｅｒ）のシアリレーションを行い、シアリレーション過程を図７に示した。
【０１２１】
反応混合液［５〜１０ｍＭシチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）、２０〜８０ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、４０〜１２０ｍＭピルビン酸、４０〜１２０ｍＭガラクトース末端のアミノヘキシルリンカー、２０ｍＭ  Ｍｇｃｌ２・Ｈ２Ｏ、１ｍＭ  ＮＴＰ、８０〜３００ｍＭアセチルホスフェート、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  バッファー（ｐＨ７．０）、３７℃  ２Ｍ  ＮａＯＨを使用してｐＨ６．５〜８．０維持］をシチジン５’−一リン酸キナーゼ（ＣＭＫ）、アセテートキナーゼ（ＡＣＫ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（ＮＡＮ）、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ（ＮＥＵ）およびＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（ＮＡＮＥ）、２，３−シアル酸転移酵素をそれぞれ混合した後、反応器で撹拌して５〜１２時間反応させた。
【０１２２】
ＴＬＣおよびＭａｓｓ分析の結果、２，３−シアリルラクトース−リンカーが合成されたということを確認することができ、Ｍａｓｓの場合、分子イオンが［Ｍ−Ｈ］−形態でｍ／ｚ７３１．３に検出された（図８）。
【０１２３】
≪実施例７：フラボノイドのシアル酸誘導体の製造≫
下記化学式１の構造を有するフラボノイドＣＳＨ−Ｉ−５４のラクトース誘導体のシアリレーションを行い、シアリレーション過程を図９に示した。
【０１２４】
【化１】
2016519952.tif 000007
【０１２５】
反応混合液［５〜１０ｍＭシチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）、２０〜８０ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、４０〜１２０ｍＭピルビン酸、４０〜１２０ｍＭフラボノイドＣＳＨ−Ｉ−５４のラクトース誘導体、２０ｍＭ  Ｍｇｃｌ２・Ｈ２Ｏ、１ｍＭ  ＮＴＰ、８０〜３００ｍＭアセチルホスフェート、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  バッファー（ｐＨ７．０）、３７℃  ２Ｍ  ＮａＯＨを使用してｐＨ６．５〜８．０維持］をシチジン５’−一リン酸キナーゼ（ＣＭＫ）、アセテートキナーゼ（ＡＣＫ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（ＮＡＮ）、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ（ＮＥＵ）およびＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（ＮＡＮＥ）、２，３−シアル酸転移酵素をそれぞれ混合した後、反応器で撹拌して５〜１２時間反応させた。
【０１２６】
２，３−シアリルラクトース−ＣＳＨ−Ｉ−５４の合成は、ＬＣとＭａｓｓで確認しており、ＬＣ分析条件は下記のとおりである。
【０１２７】
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｔｈｅｒｍｏ  ＯＤＳ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ（２５０＊４．６ｍＭ）
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ３４０ｎｍ
Ｔｅｍｐ．：Ｒ．Ｔ
Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：１ｍＬ／ｍｉｎ
Ｉｎｊ．Ｖｏｌｕｍｅ：２０μＬ
Ｍｏｂｉｌｅ  ｐｈａｓｅ：Ａ  ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＴＥＡＡ
Ｂ  ｂｕｆｆｅｒ：ＣＨ３ＣＮ
初期：Ｂ  ｃｏｎｃ．  ０％
１５ｍｉｎ            ７０％
２０ｍｉｎ            １００％
２２ｍｉｎ            １００％
２５ｍｉｎ            ０％
３０ｍｉｎ            ０％
【０１２８】
ＬＣおよびＭａｓｓ分析の結果、２，３−シアリルラクトース−ＣＳＨ−Ｉ−５４が合成されたということを確認することができ、Ｍａｓｓ分析の場合、分子イオンが［Ｍ−Ｈ］−形態でｍ／ｚ９１２．３に検出された（図１０）。
【０１２９】
≪実施例８：タクロリムスのシアル酸誘導体の製造≫
化学式２の構造を有する免疫抑制剤タクロリムスのガラクトース誘導体と化学式３の構造を有するリンカーを有するタクロリムスのガラクトース誘導体のシアリレーションを行い、シアリレーション過程を図１１に示した。
【０１３０】
タクロリムスのガラクトース誘導体
【０１３１】
【化２】
2016519952.tif 000008
【０１３２】
【化３】
2016519952.tif 000009
【０１３３】
反応混合液［５〜１０ｍＭシチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）、２０〜８０ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、４０〜１２０ｍＭピルビン酸、４０〜１２０ｍＭタクロリムスガラクトース誘導体、２０ｍＭ  Ｍｇｃｌ２・Ｈ２Ｏ、１ｍＭ  ＮＴＰ、８０〜３００ｍＭアセチルホスフェート、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  バッファー（ｐＨ７．０）、３７℃  ２Ｍ  ＮａＯＨを使用してｐＨ６．５〜８．０維持］をシチジン５’−一リン酸キナーゼ（ＣＭＫ）、アセテートキナーゼ（ＡＣＫ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（ＮＡＮ）、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ（ＮＥＵ）およびＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（ＮＡＮＥ）、２，３−シアル酸転移酵素をそれぞれ混合した後、反応器で撹拌して５〜１２時間反応させた。
【０１３４】
２，３−シアリルラクトース−タクロリムスの合成は、ＬＣとＭａｓｓで確認しており、ＬＣ分析条件は下記のとおりである（図１２）。
【０１３５】
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｔｈｅｒｍｏ  ＯＤＳ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ（２５０＊４．６ｍＭ）
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ２２５ｎｍ
Ｔｅｍｐ．：５５℃
Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：１ｍＬ／ｍｉｎ
Ｉｎｊ．Ｖｏｌｕｍｅ：２０μＬ
Ｍｏｂｉｌｅ  ｐｈａｓｅ：Ａ  ｂｕｆｆｅｒ：Ｈ２Ｏ
Ｂ  ｂｕｆｆｅｒ：ＣＨ３ＣＮ
初期：Ｂ  ｃｏｎｃ．  ３０％
５ｍｉｎ              ３０％
３５ｍｉｎ            ８０％
３６ｍｉｎ            ８０％
３８ｍｉｎ            １００％
４５ｍｉｎ            １００％
４６ｍｉｎ            ３０％
５０ｍｉｎ            ３０％
【０１３６】
Ｍａｓｓ分析の結果、化学式２のガラクトース−タクロリムスの場合、分子イオンが［Ｍ＋Ｎａ］＋形態でｍ／ｚ１５６４．３に検出され、化学式３のアミノヘキシルリンカーがある２，３−シアリルラクトース−タクロリムスの場合、分子イオンが［Ｍ−２Ｈ］２−形態でｍ／ｚ１６１６．８に検出された（図１２）。
【０１３７】
≪実施例９：抗癌剤タキソールのシアル酸誘導体の製造≫
化学式４の構造を有する免疫抑制剤タキソールのガラクトース誘導体のシアリレーションを行い、シアリレーション過程を図１３に示した。
【０１３８】
タキソールのガラクトース誘導体
【０１３９】
【化４】
2016519952.tif 000010
【０１４０】
反応混合液［５〜１０ｍＭシチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）、２０〜８０ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、４０〜１２０ｍＭピルビン酸、４０〜１２０ｍＭタキソールガラクトース誘導体、２０ｍＭ  Ｍｇｃｌ２・Ｈ２Ｏ、１ｍＭ  ＮＴＰ、８０〜３００ｍＭアセチルホスフェート、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  バッファー（ｐＨ７．０）、３７℃  ２Ｍ  ＮａＯＨを使用してｐＨ６．５〜８．０維持］をシチジン５’−一リン酸キナーゼ（ＣＭＫ）、アセテートキナーゼ（ＡＣＫ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（ＮＡＮ）、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ（ＮＥＵ）およびＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（ＮＡＮＥ）、２，３−シアル酸転移酵素をそれぞれ混合した後、反応器で撹拌して５〜１２時間反応させた。
【０１４１】
２，３−シアリルラクトース−タキソールの合成は、ＬＣとＭａｓｓで確認しており、ＬＣ分析条件は下記のとおりである（図１４）。
【０１４２】
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｔｈｅｒｍｏ  ＯＤＳ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ（４．６＊２５０ｍＭ）
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ２６０ｎｍ
Ｔｅｍｐ．：Ｒ．Ｔ
Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：１ｍＬ／ｍｉｎ
Ｉｎｊ．Ｖｏｌｕｍｅ：２０μＬ
Ｍｏｂｉｌｅ  ｐｈａｓｅ：Ａ  ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍ  ＴＥＡＡ
Ｂ  ｂｕｆｆｅｒ：ＣＨ３ＣＮ
初期：Ｂ  ｃｏｎｃ．  ３５％
３０ｍｉｎ            ６５％
３３ｍｉｎ            ６５％
３５ｍｉｎ            ３５％
３８ｍｉｎ            ３５％
【０１４３】
Ｍａｓｓ分析の結果、ガラクトース−タキソールの場合、分子イオンが［Ｍ＋Ｎａ］＋形態でｍ／ｚ１２５５．３に検出され、２，３−シアリルラクトース−タキソールの場合、分子イオンが［Ｍ＋Ｎａ］＋形態でｍ／ｚ１５６８．０に検出された（図１４）。
【０１４４】
≪実施例１０：抗生剤バンコマイシンのシアル酸誘導体の製造≫
化学式５の構造を有する抗生剤バンコマイシンのガラクトース誘導体のシアリレーションを行い、シアリレーション過程を図１５に示した。
【０１４５】
バンコマイシンのガラクトース誘導体
【０１４６】
【化５】
2016519952.tif 000011
【０１４７】
反応混合液［５〜１０ｍＭシチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）、２０〜８０ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、４０〜１２０ｍＭピルビン酸、４０〜１２０ｍＭバンコマイシンガラクトース誘導体、２０ｍＭ  Ｍｇｃｌ２・Ｈ２Ｏ、１ｍＭ  ＮＴＰ、８０〜３００ｍＭアセチルホスフェート、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）、３７℃  ２Ｍ  ＮａＯＨを使用してｐＨ６．５〜８．０維持］をシチジン５’−一リン酸キナーゼ（ＣＭＫ）、アセテートキナーゼ（ＡＣＫ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（ＮＡＮ）、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ（ＮＥＵ）およびＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（ＮＡＮＥ）、２，３−シアル酸転移酵素をそれぞれ混合した後、反応器で撹拌して５〜１２時間反応させた。
【０１４８】
２，３−シアリルラクトース−バンコマイシンの合成は、ＬＣとＭａｓｓで確認しており、ＬＣ分析条件は下記のとおりである（図１６ａ）。
【０１４９】
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＲＰ−１８ｅ、４．６×１００ｍＭ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ２６０ｎｍ
Ｔｅｍｐ．：Ｒ．Ｔ
Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：１ｍＬ／ｍｉｎ
Ｉｎｊ．Ｖｏｌｕｍｅ：２０μＬ
Ｍｏｂｉｌｅ  ｐｈａｓｅ：Ａ  ｂｕｆｆｅｒ：Ｈ２Ｏ
Ｂ  ｂｕｆｆｅｒ：ＣＨ３ＣＮ
初期：Ｂ  ｃｏｎｃ．  ５％
３ｍｉｎ              １０％
２０ｍｉｎ            ２０％
２５ｍｉｎ            ３０％
３０ｍｉｎ            ８０％
３５ｍｉｎ            ８０％
３７ｍｉｎ            ５％
４０ｍｉｎ            ５％
【０１５０】
Ｍａｓｓ分析の結果、２，３−シアリルラクトース−バンコマイシンの場合、分子イオンが［Ｍ＋４Ｈ］＋形態でｍ／ｚ１９０５．４に検出された（図１６ｂ）。
【産業上の利用可能性】
【０１５１】
本発明によれば、高価なシチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）を反応器内でリサイクルすることができ、反応に投入されるシチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）の量を減少させ、低価なＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとピルビン酸を基質とし、シアル酸誘導体を製造することができ、より高効率でシアル酸誘導体を製造することができる効果がある。
【０１５２】
以上、本発明における内容の特定の部分について詳細に記述したところ、当業者にとってこのような具体的技術は単に好ましい実施様態であって、これにより本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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