(57)【要約】  本発明は、１種又は２種以上の肺がん細胞によって発現されたＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１の少なくとも１種に対する細胞傷害性Ｔリンパ球特異的な免疫応答を生じさせる、組換え腫瘍関連抗原を取り込んだ抗原提示細胞を用いた、肺がんの診断及び処置のための組成物及び方法を包含する。
2016514094.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１の少なくとも１種の腫瘍関連抗原を提示するようにロードされている、単離された抗原提示細胞であって、それぞれ１種又は２種以上の肺がん細胞によって発現された前記ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１の少なくとも１種に対する細胞傷害性Ｔリンパ球特異的な免疫応答を生じさせる前記抗原提示細胞を含む、肺がんの処置のための組成物。
【請求項２】
抗原提示細胞が、樹状細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
抗原提示細胞が、自己樹状細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
抗原提示細胞にロードされたＮＹＥＳＯ−１、ＸＡＧＥ−１、ＡＤＡＭ２９及びＭＡＧＥＣ１抗原の少なくとも１種をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
組換えＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１腫瘍関連抗原をコードするヌクレオチド配列を含み、かつ前記組換えＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１が、抗原提示細胞で発現される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
肺がんを有する疑いがある、又は少なくとも肺がんを発症するリスクを有するヒト対象を同定するための方法であって、
前記対象から試料を得るステップと、
抗ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１の少なくとも１種に特異的な、前記試料中の特異的免疫グロブリンの存在又は非存在を決定するステップであって、前記試料中の抗ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１特異的免疫グロブリンの少なくとも１種の存在が、前記対象が肺がんに罹患しているか又は少なくとも肺がんを発症するリスクがあることを示す、ステップと
を含む、前記方法。
【請求項７】
がんに罹っている個体の腫瘍マーカープロファイルの決定のための方法であって、
前記個体から体液の試料を得るステップと、
前記個体からの前記体液の試料を、ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１腫瘍関連抗原の少なくとも１種と接触させるステップと、
前記体液の試料中に存在する１種又は２種以上の自己抗体に結合した前記ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１腫瘍関連抗原の少なくとも１種の複合体の存在又は非存在を決定するステップであって、前記１種又は２種以上の自己抗体が、前記ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１腫瘍関連抗原の少なくとも１種に免疫学的に特異的であり、前記複合体の存在が、前記個体の前記腫瘍マーカープロファイルを提供し、前記腫瘍マーカープロファイルが、疾患の経過の指標として決定される、ステップと、
前記個体に、前記ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１の少なくとも１種に特異的な抗原提示細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞を提供するステップと
を含む、前記方法。
【請求項８】
複合体の存在が、がんの検出を示す、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
がんが、肺がんである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
１種又は２種以上の肺がん細胞に特異的なＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を生成することが可能な、ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１腫瘍関連抗原の少なくとも１種を含む、がんの処置のための免疫療法用組成物。
【請求項１１】
少なくとも１種の抗原提示細胞をさらに含む、請求項１０に記載の免疫療法用組成物。
【請求項１２】
抗原提示細胞が、樹状細胞である、請求項１１に記載の免疫療法用組成物。
【請求項１３】
少なくとも１種の抗原提示細胞が、ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１腫瘍関連抗原をコードするペプチド又は発現構築物でパルスされているか、又はそれらをロードしている、請求項１０に記載の免疫療法用組成物。
【請求項１４】
ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１腫瘍関連抗原の少なくとも１種が、非小細胞肺がんから単離される、請求項１０に記載の免疫療法用組成物。
【請求項１５】
対象において肺がんを検出するための方法であって、
前記対象から試料を得るステップと、
前記試料中のＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１の存在又は非存在を決定するステップであって、前記試料中の前記ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１の存在が、前記対象が肺がんに罹患しているか又は少なくとも肺がんを発症するリスクがあることを示す、ステップと、
個体に、前記ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１の少なくとも１種に特異的な抗原提示細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞を提供するステップと
を含む、前記方法。
【請求項１６】
試料が、血液試料である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
免疫刺激抗原を発現した核酸ベクターを含む組成物であって、前記抗原が、ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１肺がん関連抗原の少なくとも１種をコードするヌクレオチド配列を含む、前記組成物。
【請求項１８】
抗原が、ペプチド抗原である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
がんの処置のための方法であって、
それを必要とする哺乳動物に、希釈剤、媒体、賦形剤、又は不活性成分の少なくとも１種に加えて、相乗的な治療有効量の肺がん抗原を投与するステップと、
前記肺がん抗原から、特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を生成するステップと、
前記特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球で１種又は２種以上の腫瘍細胞を標的化するステップと
を含む、前記方法。
【請求項２０】
肺がん抗原が、ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１である、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の一実施形態は、一般的に肺がんの検出及びその免疫療法の分野に関し、詳細には肺がんの診断及び処置のための方法及び組成物に関する。
【０００２】
コンパクトディスクで提出された資料の参照による組み込み
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を包含する。＿＿＿＿＿に作製された前記ＡＳＣＩＩコピーは、＿＿＿＿＿と名付けられ、＿＿＿＿＿キロバイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
本発明の範囲を限定することなく、本発明の背景は、肺がんの診断及び処置のための方法及び組成物に関して記載される。
【０００４】
肺がんは、世界的にがん関連死の主な原因である。米国では、２０１２年に、およそ２２６，１６０件の新規症例と１６０，３４０人の死亡が見込まれている（Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics, 2012. CA Cancer J Clin. 2012;62:10-29）。世界保健機関は、肺がんを、４つの主要な組織型：（１）扁平上皮がん（ＳＣＣ， squamous cell carcinoma）、（２）腺がん、（３）大細胞がん、及び（４）小細胞肺がん（ＳＣＬＣ， small cell lung carcinoma）に分類している。非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ， non-small cell lung carcinoma）という用語は、扁平上皮、腺がん及び大細胞がんを包含する。
【０００５】
米国では乳がんの発生は若干多く起こるが、肺がんは、男性にとっては前立腺がんに次いで２位であり、女性にとっては乳がん及び結腸直腸がんに次いで３位である。肺がんは、依然としてがん死の最も一般的な原因である。典型的には、肺がんを診断するのにＸ線と喀痰細胞診との組合せが使用される。残念ながら、がんは、その症状のために患者が医療の助けを求めるころには通常治療不能な進行した状態にある。
【０００６】
肺がんの症例の大多数（８５％）は非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）型に属しており、ＮＳＣＬＣと診断された全患者の５年生存率は、２０％未満と推定される。ＮＳＣＬＣの標準的な処置としては、化学療法、放射線療法、外科手術又はこれらの処置の組合せが挙げられる。残念ながら、これらの治療的介入は顕著な副作用を伴い（Chrischilles EA, Pendergast JF, Kahn KL, Wallace RB, Moga DC, Harrington DP, et al. Adverse events among the elderly receiving chemotherapy for advanced non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 2010;28:620-7）、一般的に限られた利益しか患者にもたらさない（Gadgeel SM. The optimal chemotherapy for stage III non-small cell lung cancer patients. Curr Oncol Rep. 2011;13:272-9）。近年、本発明者らの医療装備に分子標的療法が追加されたが、より最近になって、ＮＳＣＬＣに対する医療装備に標的療法が追加されている。残念ながら、これらの薬剤、例えばモノクローナル抗体であるベバシズマブをベースとしたものは、治療上の利点があるにもかかわらず、化学療法のレシピエントの１６．５％にしか使用できない（Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics, 2012. CA Cancer J Clin. 2012;62:10-29、Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics, 2012. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 2012;62:10-29）。ＮＳＬＣは、それでもなお世界中でがん関連死の主な原因である。それゆえに、この破壊的な疾患に罹っている患者にとってより有効な療法を開発する緊急の必要性がある。
【０００７】
「Lung cancer marker」という表題の米国特許第５，７７３，５７９号明細書は、ヒト肺がん細胞に特異的な新規のタンパク質に対する単離及び精製された核酸配列並びに対応するアミノ酸配列を開示している。この遺伝子は、これらの細胞において、テストされた正常な肺細胞、他の正常な組織及び他の腫瘍細胞株の場合よりもかなり高いレベルで発現される。またこの遺伝子及びタンパク質の３種の追加の組換え形態も開示されており、その第１の２種のケースでは、膜貫通領域が除去されており、第３のケースでは、インビトロでの変異誘発によってアミノ酸が変化している。
【０００８】
「Lung Cancer Diagnosis」という表題の米国特許出願公開第２０１２／０１００５５８号明細書は、症状の発症前の対象における肺がんの診断を対象としており、ここで、その方法は、ＬＡＭＲ１、並びに場合によっては、それに加えて若しくはその代わりにアネキシンＩ及び／若しくは１４−３−３−シータを含む１種又は２種以上の診断前肺がん指標タンパク質、並びに／又は規定された抗原としてそこで開示されているような他の診断前肺がん指標タンパク質に特異的な自己抗体の存在に関して、対象からの生体液をスクリーニングすることを包含する。
【０００９】
「Cancer-testis antigens」という表題の米国特許出願公開第２０１１／０１７７０７９号明細書は、がん精巣抗原及びそれらをコードする核酸分子を開示している。この発明はまた、がんなどの疾患の診断及び処置のための方法及び組成物における、核酸分子、ポリペプチド及びそれらの断片の使用にも関する。より詳細には、この発明は、新規のがん精巣（ＣＴ， cancer-testis）抗原の発見に関する。
【００１０】
「Composition for Treating Lung Cancer, Particularly of Non-Small Lung Cancers (NSCLC)」という表題の米国特許出願公開第２０１０／０２９１１５６号明細書は、哺乳動物において（適応）免疫応答を惹起することが可能な少なくとも２種の（好ましくは異なる）抗原をコードする少なくとも１種のＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを含む活性（免疫刺激）組成物を対象とする。またこの発明は、前記活性（免疫刺激）組成物を含むワクチン、並びに（ワクチン調製のための）前記活性（免疫刺激）組成物の使用、及び／又は肺がん、特に好ましくは３つの主要なサブタイプ、すなわち扁平上皮肺がん、腺がん及び大細胞肺がんから選択される非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、又はそれに関連する障害の処置のための（適応）免疫応答を惹起するためのワクチンの使用を教示するとも述べられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５，７７３，５７９号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１２／０１００５５８号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１１／０１７７０７９号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１０／０２９１１５６号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics, 2012. CA Cancer J Clin. 2012;62:10-29
【非特許文献２】Chrischilles EA, Pendergast JF, Kahn KL, Wallace RB, Moga DC, Harrington DP, et al. Adverse events among the elderly receiving chemotherapy for advanced non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 2010;28:620-7
【非特許文献３】Gadgeel SM. The optimal chemotherapy for stage III non-small cell lung cancer patients. Curr Oncol Rep. 2011;13:272-9
【非特許文献４】Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics, 2012. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 2012;62:10-29
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一実施形態において、本発明は、肺がんの処置のための組成物であって、少なくとも１種のＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１腫瘍関連抗原を提示するようにロードされており、それぞれ１種又は２種以上の肺がん細胞によって発現されたＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１の少なくとも１種に対する細胞傷害性Ｔリンパ球特異的な免疫応答を生じさせる、単離された抗原提示細胞を含む、組成物を包含する。一態様において、抗原提示細胞は、樹状細胞である。別の態様において、抗原提示細胞は、自己樹状細胞である。別の態様において、本組成物は、ＮＹＥＳＯ−１、ＸＡＧＥ−１、ＡＤＡＭ２９及びＭＡＧＥＣ１抗原の少なくとも１種をさらに含む。別の態様において、本組成物は、組換えＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１腫瘍関連抗原をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、肺がんを有する又は少なくとも肺がんを発症するリスクを有する疑いがあるヒト対象を同定するための方法であって、前記対象から試料を得るステップと、抗ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１の少なくとも１種に特異的な、前記試料中の特異的免疫グロブリンの存在又は非存在を決定するステップであって、前記試料中の抗ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１特異的免疫グロブリンの少なくとも１種の存在が、前記対象が肺がんに罹患しているか又は少なくとも肺がんを発症するリスクがあることを示す、ステップとを含む、方法を包含する。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、がんに罹っている個体の腫瘍マーカープロファイルの決定のための方法であって、前記個体から体液の試料を得るステップと、前記個体からの前記体液の試料を、ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１腫瘍関連抗原の少なくとも１種と接触させるステップと、前記体液の試料中に存在する１種又は２種以上の自己抗体に結合した前記ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１腫瘍関連抗原の少なくとも１種の複合体の存在又は非存在を決定するステップであって、前記１種又は２種以上の自己抗体が、前記ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１腫瘍関連抗原の少なくとも１種に免疫学的に特異的であり、前記複合体の存在が、前記個体の前記腫瘍マーカープロファイルを提供し、前記腫瘍マーカープロファイルが、疾患の経過の指標として決定される、ステップとを含む、方法を包含する。一態様において、複合体の存在は、がんの検出を示す。別の態様において、がんは、肺がんである。
【００１６】
本発明のさらに別の実施形態は、１種又は２種以上の肺がん細胞に特異的なＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を生成することが可能なＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１腫瘍関連抗原の少なくとも１種を含む、がんの処置のための免疫療法用組成物を包含する。一態様において、本組成物は、少なくとも１種の抗原提示細胞をさらに含む。一態様において、抗原提示細胞は、樹状細胞である。別の態様において、少なくとも１種の抗原提示細胞は、ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１腫瘍関連抗原をコードするペプチド又は発現構築物でパルスされているか、又はそれをロードしている。別の態様において、ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１腫瘍関連抗原の少なくとも１種は、非小細胞肺がんから単離される。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、対象において肺がんを検出するための方法であって、前記対象から試料を得るステップと、前記試料中のＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１の存在又は非存在を決定するステップであって、前記試料中の前記ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１の存在が、前記対象が肺がんに罹患しているか又は少なくとも肺がんを発症するリスクがあることを示す、ステップとを含む、方法を包含する。一態様において、試料は、血液試料である。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、免疫刺激抗原を発現した核酸ベクターを含む組成物であって、前記抗原が、ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１肺がん関連抗原の少なくとも１種をコードするヌクレオチド配列を含む、組成物を包含する。別の態様において、抗原は、ペプチド抗原である。
【００１９】
本発明のさらに別の実施形態は、がんの処置のための方法であって、それを必要とする哺乳動物に、希釈剤、媒体、賦形剤、又は不活性成分の少なくとも１種に加えて、相乗的な治療有効量の肺がん抗原を投与するステップと、前記肺がん抗原から、特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ， cytotoxic T lymphocyte）を生成するステップと、前記特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球で１種又は２種以上の腫瘍細胞を標的化するステップとを含む、方法を包含する。一態様において、肺がん抗原は、ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
本発明の特徴及び利点をより十分に理解するために、ここで添付の図面と共に発明の詳細な説明について述べる。
【図１Ａ−１Ｃ】がん／精巣抗原（ＣＴＡ， Cancer/testis antigen）の発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す画像である。
【図２】示された抗体及び対応するアイソタイプ対照と共にインキュベートした細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図３】ＮＳＣＬＣ細胞株であるＣＲＬ−５９２８、ＣＲＬ−５９２２、正常な気管支上皮に由来する細胞であるＣＲＬ−２５０３、及び１人の代表的な患者で行われた免疫蛍光法を示す。
【図４Ａ−４Ｃ】循環するＣＴＡ特異的ＩｇＧを検出するための酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ， enzyme linked immunosorbent assay）データのグラフである。
【図５Ａ−５Ｆ】細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性及び特異性の分析のグラフである。
【図６Ａ−６Ｆ】示されたサイトカインのレベルに関して分析したＥＬＩＳＡと、患者のＣＴＬと自己腫瘍細胞とを共培養することによるＩＦＮ−γ発現のELISPOT分析とを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下で本発明の様々な実施形態の作製及び使用を詳細に論じるが、本発明は、多種多様の具体的な状況において具体化できる多くの適用可能な発明概念を提供することが理解されるものとする。本明細書で論じられた具体的な実施形態は、本発明を作製及び使用するための具体的な方法の単なる例示にすぎず、本発明の範囲を限定しない。
【００２２】
本発明を理解しやすくするために、以下でいくつかの用語を定義する。本明細書で定義された用語は、本発明に関連する分野の当業者に一般的に理解されるような意味を有する。「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「この（the）」などの用語は、単数形の実体のみを指すことは意図されず、一般的な分類を包含し、その具体的な例は、例示のために使用される可能性がある。本明細書に記載の用語は、本発明の具体的な実施形態を説明するのに使用されるが、それらの使用は、特許請求の範囲で概説される場合を除いて、本発明を限定しない。
【００２３】
用語「抗原」及び用語「エピトープ」は、本明細書で使用される場合、免疫応答を刺激できる分子又は物質を指す。一例において、エピトープとしては、これらに限定されないが、ポリペプチド及びポリペプチドをコードする核酸が挙げられ、この場合、核酸がポリペプチドに発現されると、ポリペプチドがプロセシングされて主要組織適合複合体（ＭＨＣ， Major Histocompatibility Complex）分子に提示されたときに免疫応答を刺激できる。一般的に、エピトープは、それらがＴ細胞受容体及びそれぞれのＴ細胞のアクセサリー分子と相互作用できるように、ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩの結合溝に非共有結合で結合した細胞の表面に提示されたペプチドを包含する。しかしながら、抗原の特異的構造に結合する抗体の抗原結合部分を論じる場合、抗原及びエピトープも当てはまる。
【００２４】
抗原のタンパク質分解性プロセシング。ＭＨＣによって抗原提示細胞に表示されたエピトープは、それより大きいペプチド又はタンパク質抗原前駆体の切断ペプチド又は切断生成物である。ＭＨＣ  Ｉエピトープの場合、タンパク質抗原は、細胞中にあるプロテアソームによって消化されることが多い。細胞内プロテアソームによる消化は、約３〜２３アミノ酸長のペプチド断片を産生し、次いでこれらはＭＨＣタンパク質上にロードされる。これらの断片はさらに、細胞内の、又は細胞外環境における追加のタンパク質分解活性によってトリミング及びプロセシングされる可能性がある。ＭＨＣクラスＩＩエピトープのプロセシングは、一般的に、リソソーム／エンドソーム区画からの細胞内プロテアーゼを介して起こる。本発明は、一実施形態において、免疫応答の強化が求められるペプチドを抗原提示細胞に指向させる、抗ＣＤ４０抗体（又はそれらの断片）に結合されている予めプロセシングされたペプチドを包含する。
【００２５】
免疫原性化合物として潜在的に有効なエピトープを同定するために、ＭＨＣ結合単独の予測が有用であるが、不十分であることが多い。本発明は、抗原提示細胞及びレスポンダーＴ細胞の特異的な供給源を探索する免疫応答をもたらす可能性が最も高い抗原内のエピトープを特異的に同定するための方法を包含する。
【００２６】
本発明は、患者自身の抗原提示細胞及びＴ細胞レパートリーを使用して望ましい免疫応答を起こす可能性が最も高いエピトープを同定するための、迅速で簡単なアッセイを可能にする。本発明の組成物及び方法はいかなるタンパク質配列にも適用可能であり、それにより使用者は、ＭＨＣに結合して、抗原に応答すると予想されるＴ細胞に適切に提示させることができるエピトープの同定が可能である。したがって、本発明は、いかなる特定の標的又は病状に限定されることはなく、その代わりにいかなる有用な供給源からのＭＨＣエピトープも包含する。
【００２７】
ここ数年にわたり、免疫療法は、黒色腫、腎細胞がん、より近年には肺がんなどの数種のタイプのがんにとって有望な療法として存在し続けてきた（Mellman I, Coukos G, Dranoff G. Cancer immunotherapy comes of age. Nature. 2011;480:480-9）。特異的な腫瘍関連抗原に対する抗腫瘍免疫応答の発生は、正常な組織に有害な作用をほとんど起こさず、最小の傷害性で、新生細胞死を促進する潜在性を有する（Mellman I, Coukos G, Dranoff G. Cancer immunotherapy comes of age. Nature. 2011;480:480-9）。がん／精巣抗原（ＣＴＡ）は、発現が精巣に限定されており、正常な組織ではごくわずかしか発現しないタンパク質のファミリーである。興味深いことに、ＣＴＡは、多くの腫瘍においてｍＲＮＡ及びタンパク質レベルで頻繁に発現される（Chiriva-Internati M, Yu Y, Mirandola L, D'Cunha N, Hardwicke F, Cannon MJ, et al. Identification of AKAP-4 as a new cancer/testis antigen for detection and immunotherapy of prostate cancer. Prostate. 2012;72:12-23、Caballero OL, Chen YT. Cancer/testis (CT) antigens: potential targets for immunotherapy. Cancer Sci. 2009;100:2014-21、Chiriva-Internati M. Sperm protein 17: clinical relevance of a cancer/testis antigen, from contraception to cancer immunotherapy, and beyond. Int Rev Immunol. 2011;30:138-49、Mathieu MG, Miles AK, Li G, McArdle SE, Rees RC. Cancer/testis antigens for therapeutic use. J Buon. 2009;14:S97-102、Mirandola L, M JC, Cobos E, Bernardini G, Jenkins MR, Kast WM, et al. Cancer testis antigens: novel biomarkers and targetable proteins for ovarian cancer. Int Rev Immunol. 2011;30:127-37）。つい最近になって、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の原発腫瘍においてＣＴＡであるＮＹ−ＥＳＯ−１及びＭＡＧＥ−Ａ２／３／４／６が検出され、それらの免疫原性は、それらが潜在的に有効な肺がんワクチンにとっての有望な標的であることを示唆し暗示するものである（Bhan S, Negi SS, Shao C, Glazer CA, Chuang A, Gaykalova DA, et al. BORIS binding to the promoters of cancer testis antigens, MAGEA2, MAGEA3, and MAGEA4, is associated with their transcriptional activation in lung cancer. Clin Cancer Res. 2011;17:4267-76、Chinnasamy N, Wargo JA, Yu Z, Rao M, Frankel TL, Riley JP, et al. A TCR targeting the HLAA* 0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer. J Immunol. 2011;186:685-96、Kim SH, Lee S, Lee CH, Lee MK, Kim YD, Shin DH, et al. Expression of cancer-testis antigens MAGE-A3/6 and NY-ESO-1 in non-small-cell lung carcinomas and their relationship with immune cell infiltration. Lung. 2009;187:401-11、Rao M, Chinnasamy N, Hong JA, Zhang Y, Zhang M, Xi S, et al. Inhibition of histone lysine methylation enhances cancer-testis antigen expression in lung cancer cells: implications for adoptive immunotherapy of cancer. Cancer Res. 2011;71:4192-204）。本発明者らはこれまでに、卵巣がん、多発性骨髄腫、及び前立腺がんにおける潜在的な免疫療法標的としての、ＣＴＡであるＳＰ１７、ＡＫＡＰ４、ロッポリン（Ropporin）、及びＰＴＴＧ１を検証してきた（Chiriva-Internati M, Yu Y, Mirandola L, D'Cunha N, Hardwicke F, Cannon MJ, et al. Identification of AKAP-4 as a new cancer/testis antigen for detection and immunotherapy of prostate cancer. Prostate. 2012;72:12-23、Chiriva-Internati M, Mirandola L, Yu Y, Jenkins MR, Gornati R, Bernardini G, et al. Cancer testis antigen, ropporin, is a potential target for multiple myeloma immunotherapy. J Immunother. 2011;34:490-9、Chiriva-Internati M, Yu Y, Mirandola L, Jenkins MR, Chapman C, Cannon M, et al. Cancer testis antigen vaccination affords long-term protection in a murine model of ovarian cancer. PLoS One. 2010;5、Chiriva-Internati M, Ferrari R, Prabhakar M, Yu Y, Baggoni L, Moreno J, et al. The pituitary tumor transforming gene 1 (PTTG-1): an immunological target for multiple myeloma. J Transl Med. 2008;6:15）。肺がんの免疫療法のための潜在的な標的として活用できる新規の抗原を同定しようとする努力において、本発明者らは本明細書において、ＮＳＣＬＣ細胞株及びＮＳＣＬＣ患者からの原発腫瘍試料におけるＳＰ１７、ＡＫＡＰ４及びＰＴＴＧ１のＲＮＡ及びタンパク質の発現パターン、加えて肺がん患者の血清中のＣＴＡ特異的抗体（Ａｂ， antibody）の存在を測定することによってそれらの免疫原性を実証し、さらに自己末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ， peripheral blood mononucleated cell）を使用してインビトロでのＣＴＡ特異的な細胞傷害性の抗腫瘍応答を起こす実行可能性を実証する。
【００２８】
ＮＳＣＬＣは、歴史的に腫瘍浸潤Ｔ細胞の頻度が低いために弱い免疫原性しかないと考えられてきたが（Kim J, Raz D, Jablons D. Unmet need in lung cancer: can vaccines bridge the gap? Clin Lung Cancer. 2008;9:S6-12）、マウスＮＳＣＬＣモデルを使用した研究から、ＤＣベースのアプローチを利用して有効な免疫応答を活性化する可能性があることが示された（Miller PW, Sharma S, Stolina M, Butterfield LH, Luo J, Lin Y, et al. Intratumoral administration of adenoviral interleukin 7 gene-modified dendritic cells augments specific antitumor immunity and achieves tumor eradication. Hum Gene Ther. 2000;11:53-65、Yasumoto K, Hanagiri T, Takenoyama M. Lung cancer-associated tumor antigens and the present status of immunotherapy against non-small-cell lung cancer. Gen Thorac Cardiovasc Surg. 2009;57:449-457）。加えて、腫瘍抗原特異的なＴ細胞応答は、ＮＳＣＬＣを有する患者で検出されており（Yasumoto K, Hanagiri T, Takenoyama M. Lung cancer-associated tumor antigens and the present status of immunotherapy against non-small-cell lung cancer. Gen Thorac Cardiovasc Surg. 2009;57:449-457）、これは、特異的なＮＳＣＬＣ関連抗原を同定して、それらを最適な様式で免疫系に提示させることが、一般的にこの疾患においては存在しないか又は不活性な腫瘍特異的なエフェクターＴ細胞を生成することになり得るということを示す（Raez LE, Fein S, Podack ER. Lung cancer immunotherapy. Clin Med Res. 2005;3:221-8）。患者の生存を向上させ、標準的な処置に関連する罹患率の低下における免疫療法の潜在的な役割が、近年のＮＳＣＬＣ患者における臨床的なワクチン試験のメタ分析によって実証されてきた（Wang J, Zou ZH, Xia HL, He JX, Zhong NS, Tao AL. Strengths and weaknesses of immunotherapy for advanced non-small-cell lung cancer: a meta-analysis of 12 randomized controlled trials. PLoS One. 2012;7:5）。免疫療法ベースの抗がん戦略を研究する際、ワクチンによって標的化しようとする抗原の選択は、重要なステップである（Mellman I, Coukos G, Dranoff G. Cancer immunotherapy comes of age. Nature. 2011;480:480-9）。理想的な標的は、がん細胞では選択的に発現されるが正常細胞では発現されない高度に免疫原性なタンパク質であると予想される（Mellman I, Coukos G, Dranoff G. Cancer immunotherapy comes of age. Nature. 2011;480:480-9、Mirandola L, M JC, Cobos E, Bernardini G, Jenkins MR, Kast WM, et al. Cancer testis antigens: novel biomarkers and targetable proteins for ovarian cancer. Int Rev Immunol. 2011;30:127-37）。ＣＴＡは、それらの高度に腫瘍に限定された発現パターンとそれらの免疫原性のために、腫瘍の免疫療法にとって特に好適な腫瘍関連抗原である（Caballero OL, Chen YT. Cancer/testis (CT) antigens: potential targets for immunotherapy. Cancer Sci. 2009;100:2014-21、Mathieu MG, Miles AK, Li G, McArdle SE, Rees RC. Cancer/testis antigens for therapeutic use. J Buon. 2009;14:S97-102）。
【００２９】
本発明は、ＮＳＣＬＣの免疫療法における３種のＣＴＡ、すなわちＳＰ１７、ＡＫＡＰ４、及びＰＴＴＧ１の使用を提供する。本発明者らは、正常組織、３種のＮＳＣＬＣ細胞株、１種の正常な気管支細胞株、１７人のＮＳＣＬＣ患者からの原発腫瘍細胞、及び８人の健常な対象からの気管支上皮細胞のパネルにおいて、３種のＣＴＡ、すなわちＳＰ１７、ＡＫＡＰ４、及びＰＴＴＧ１の差次的な発現を初めて分析した。精巣を除いて、いずれの非腫瘍性組織も選択されたＣＴＡのＲＮＡレベルを発現しなかった（Caballero OL, Chen YT. Cancer/testis (CT) antigens: potential targets for immunotherapy. Cancer Sci. 2009;100:2014-21、Mirandola L, M JC, Cobos E, Bernardini G, Jenkins MR, Kast WM, et al. Cancer testis antigens: novel biomarkers and targetable proteins for ovarian cancer. Int Rev Immunol. 2011;30:127-37）。ＮＳＣＬＣ細胞株は、ＳＰ１７、ＡＫＡＰ４、並びにＰＴＴＧ１の転写物及びタンパク質を発現したが、一方で正常な気管支上皮細胞株は、ＳＰ１７のＲＮＡ発現だけを弱く示した。これは、ＳＰ１７が気道上皮などの線毛を有する体細胞上皮で発現されることを示した本発明者らの以前の報告と一致する（Grizzi F, Chiriva-Internati M, Franceschini B, Bumm K, Colombo P, Ciccarelli M, et al. Sperm protein 17 is expressed in human somatic ciliated epithelia. J Histochem Cytochem. 2004;52:549-54）。興味深いことに、独立した前臨床研究から、１４のＳＰ１７に向けられた免疫療法は、線毛細胞においてＳＰ１７発現に関するいかなる毒性も生じないことが強く示唆されている（Chiriva-Internati M, Yu Y, Mirandola L, Jenkins MR, Chapman C, Cannon M, et al. Cancer testis antigen vaccination affords long-term protection in a murine model of ovarian cancer. PLoS One. 2010;5、Song JX, Cao WL, Li FQ, Shi LN, Jia X. Anti-Sp17 monoclonal antibody with antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity and complement-dependent cytotoxicity activities against human ovarian cancer cells. Med Oncol. 2011;24:24、Dadabayev AR, Wang Z, Zhang Y, Zhang J, Robinson WR, Lim SH. Cancer immunotherapy targeting Sp17: when should the laboratory findings be translated to the clinics? Am J Hematol. 2005;80:6-11）。患者に由来する全ての肺がん組織が、転写及び翻訳レベルでのＳＰ１７発現を実証したが、一方で検体の大部分はＡＫＡＰ４及びＰＴＴＧ１発現も示した。タンパク質発現の結果をフローサイトメトリーと免疫蛍光法で独立して確認したところ、結果が一致した。１７人のＮＳＣＬＣ対象のうち１６人からの腫瘍が、研究された３種のＣＴＡの少なくとも２種の発現を示したことから、これら２種は、この疾患において潜在的重要性を有することが示唆される。タンパク質を免疫療法のための標的として役立たせるには、免疫原性として知られている特徴である強く測定可能な免疫応答の惹起を可能にすべきである。本発明者らは、ＮＳＣＬＣ患者の血清の大部分が少なくとも２種のＣＴＡ特異的抗体に関して陽性であり、５番の患者だけが抗ＳＰ１７を示し、抗ＡＫＡＰ４又は抗ＰＴＴＧ１ＩｇＧを示さなかったことを見出した。腫瘍組織におけるｍＲＮＡ及びタンパク質発現データは完全に一致したが、血清中の抗ＣＴＡ抗体として測定された体液性抗腫瘍応答はより不均質な結果となった。例えば、３人のＮＳＣＬＣ患者（２番、１３番、１４番）は抗ＳＰ１７陰性と分類されたが、それらの腫瘍はＳＰ１７を発現した。興味深いことに、全てのＡＫＡＰ４陽性又はＰＴＴＧ１陽性患者も��それらの血清中で対応する特異的な自己抗体を示した。Shan Q et al.による近年の研究は（Shan Q, Lou X, Xiao T, Zhang J, Sun H, Gao Y, et al. A cancer/testis antigen microarray to screen autoantibody biomarkers of non-small cell lung cancer. Cancer letters. 2012）、７２種のＣＴＡを含有する低密度タンパク質マイクロアレイを作製し、それをＮＳＣＬＣ患者及び健常な対象からの血清で探索した。これらの研究者は、ＮＳＣＬＣ患者の血清においてＮＹＥＳＯ−１、ＸＡＧＥ−１、ＡＤＡＭ２９及びＭＡＧＥＣ１抗体（Ａｂ）が検出されたことを報告した。これらの発見は、抗ＣＴＡ抗体は、ＮＳＣＬＣにおける診断ツールとして活用できることを示す。
【００３０】
ＳＰ１７、ＡＫＡＰ４、及びＰＴＴＧ１の免疫原性がＣＴＡ／腫瘍特異的なＣＴＬ応答を生じさせる可能性があるのかどうかを決定するために、本発明者らは、ＣＴＡをロードした樹状細胞（ＤＣ）に対するＴ細胞応答を試験した。ＤＣの適用は、腫瘍抗原特異的なＴ細胞応答の刺激ための広く認識された方法であり、本発明者らはこれまで、この技術をＭＭ、子宮頸がん及び前立腺がんで使用してきた（Chiriva-Internati M, Yu Y, Mirandola L, D'Cunha N, Hardwicke F, Cannon MJ, et al. Identification of AKAP-4 as a new cancer/testis antigen for detection and immunotherapy of prostate cancer. Prostate. 2012;72:12-23、Chiriva-Internati M, Mirandola L, Yu Y, Jenkins MR, Gornati R, Bernardini G, et al. Cancer testis antigen, ropporin, is a potential target for multiple myeloma immunotherapy. J Immunother. 2011;34:490-9、Santin AD, Hermonat PL, Ravaggi A, Chiriva-Internati M, Zhan D, Pecorelli S, et al. Induction of human papillomavirus-specific CD4(+) and CD8(+) lymphocytes by E7-pulsed autologous dendritic cells in patients with human papillomavirus type 16- and 18-positive cervical cancer. J Virol. 1999;73:5402-10、Chiriva-Internati M, Wang Z, Salati E, Wroblewski D, Lim SH. Successful generation of sperm protein 17 (Sp17)-specific cytotoxic T lymphocytes from normal donors: implication for tumour-specific adoptive immunotherapy following allogeneic stem cell transplantation for Sp17-positive multiple myeloma. Scand J Immunol. 2002;56:429-33）。ＰＢＭＣからのＣＴＡ特異的ＣＴＬ生成の実行可能性を研究するために、本発明者らは、腫瘍細胞におけるＳＰ１７、ＡＫＡＰ４、又はＰＴＴＧ１タンパク質発現に関して陽性と出た５人の患者を選択した。患者のＰＢＭＣが、自己肺がん細胞及びＮＳＣＬＣ由来細胞株に対して有意な溶解活性を示すＣＴＡを提示するＤＣで刺激された。観察された細胞傷害性効果は、抗ＨＬＡクラスＩＩ抗体ではなく抗ＨＬＡクラスＩで遮断されたことから、ＨＬＡクラスＩ陽性標的に限定された。ＣＴＡ陰性ＣＲＬ−２５０３細胞に対して、又は非パルス化ＤＣ若しくはＨＰＶ  Ｅ７抗原をロードしたＤＣのいずれかに晒された後に、ＣＴＬが細胞傷害性応答を生じさせることができないことによって、ＣＴＬ溶解活性に関する抗原特異性が確認された。サイトカイン発現分析から、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの増加並びにＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−１０レベルの減少によって確認されたように、本発明者らのＤＣベースのＣＴＬ生成プロトコールが、刺激されたＰＢＭＣにおいて強いＴｈ−１の極性化を誘導したことが解明された（Chiriva-Internati M, Yu Y, Mirandola L, D'Cunha N, Hardwicke F, Cannon MJ, et al. Identification of AKAP-4 as a new cancer/testis antigen for detection and immunotherapy of prostate cancer. Prostate. 2012;72:12-23、Chiriva-Internati M, Yu Y, Mirandola L, Jenkins MR, Chapman C, Cannon M, et al. Cancer testis antigen vaccination affords long-term protection in a murine model of ovarian cancer. PLoS One. 2010;5、Chiriva-Internati M, Wang Z, Salati E, Bumm K, Barlogie B, Lim SH. Sperm protein 17 (Sp17) is a suitable target for immunotherapy of multiple myeloma. Blood. 2002;100:961-5、Chiriva-Internati M, Wang Z, Salati E, Wroblewski D, Lim SH. Successful generation of sperm protein 17 (Sp17)-specific cytotoxic T lymphocytes from normal donors: implication for tumour-specific adoptive immunotherapy following allogeneic stem cell transplantation for Sp17-positive multiple myeloma. Scand J Immunol. 2002;56:429-33、Chiriva-Internati M, Ferrari R, Yu Y, Hamrick C, Gagliano N, Grizzi F, et al. AKAP-4: a novel cancer testis antigen for multiple myeloma: Br J Haematol. 2008 Feb;140(4):465-8���Chiriva-Internati M, Liu Y, Weidanz JA, Grizzi F, You H, Zhou W, et al. Testing recombinant adeno-associated virus-gene loading of dendritic cells for generating potent cytotoxic T lymphocytes against a prototype self-antigen, multiple myeloma HM1.24. Blood. 2003;102:3100-7）。ＮＳＣＬＣ患者は、免疫療法に対する重要な応答（Ortegel JW, Staren ED, Faber LP, Warren WH, Braun DP. Modulation of tumor-infiltrating lymphocyte cytolytic activity against human non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 2002;36:17-25）に悪影響を与える異常なＴｈ−２−タイプのサイトカインパターンを示すことから（Asselin-Paturel C, Echchakir H, Carayol G, Gay F, Opolon P, Grunenwald D, et al. Quantitative analysis of Th1, Th2 and TGF-beta1 cytokine expression in tumor, TIL and PBL of non-small cell lung cancer patients. Int J Cancer. 1998;77:7-12）、Ｔ−ヘルパーＴｈ−１プロファイルを刺激するＣＴＡをロードしたＤＣの能力は、臨床的に意義がある可能性がある（ただし本発明を限定しない）（Bremnes RM, Al-Shibli K, Donnem T, Sirera R, Al-Saad S, Andersen S, et al. The role of tumor infiltrating immune cells and chronic inflammation at the tumor site on cancer development, progression, and prognosis: emphasis on non-small cell lung cancer. J Thorac Oncol. 2011;6:824-33）。さらにエフェクターＴリンパ球の活性化は、ＣＴＡをロードしたＤＣで刺激され自己腫瘍細胞に晒されたＰＢＭＣにおいて高頻度のＩＦＮ−γ発現細胞を明らかにしたELISPOT分析によって実証された。ＩＦＮ−γは、ＮＳＣＬＣ成長において有意な阻害作用を及ぼすことが示されているために（Chen J, Hou J, Zhang J, An Y, Zhang X, Yue L, et al. Atorvastatin synergizes with IFN-gamma in treating human non-small cell lung carcinomas via potent inhibition of RhoA activity. Eur J Pharmacol. 2012;682:161-70）、この発見は意義がある。インビトロで活性なＣＴＡ特異的免疫応答を生じさせる実行可能性は、ＮＳＣＬＣ細胞によるＣＴＡ発現は治療的関連性を有し、この疾患に対する新規の免疫療法戦略を設計するための基準として役立つ可能性があることを示す。さらに、エフェクターＴ細胞にＣＴＡが効果的に提示されるようにインビトロで操作されたＤＣは、ＮＳＣＬＣ腫瘍の微環境で見られる免疫抑制を克服する可能性があることから、この疾患に対する有効なワクチン接種戦略の開発が可能になる（Schneider T, Hoffmann H, Dienemann H, Schnabel PA, Enk AH, Ring S, et al. Non-small cell lung cancer induces an immunosuppressive phenotype of dendritic cells in tumor microenvironment by upregulating B7-H3. J Thorac Oncol. 2011;6:1162-8、Holt GE, Podack ER, Raez LE. Immunotherapy as a strategy for the treatment of non-small-cell lung cancer. Therapy. 2011;8:43-54、Dubinett S, Sharma S. Towards effective immunotherapy for lung cancer: simultaneous targeting of tumor-initiating cells and immune pathways in the tumor microenvironment: Immunotherapy. 2009 Sep;1(5):721-5）。
【００３１】
本発明は、ＣＴＡ：ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、及びＰＴＴＧ１は、ＮＳＣＬＣで選択的に発現されること、及びそれらの発現は、特異的なＣＴＬ介在抗腫瘍応答を生じさせるのに活用できることを提供する。多発性骨髄腫、卵巣及び前立腺がんにおける（Chiriva-Internati M, Yu Y, Mirandola L, D'Cunha N, Hardwicke F, Cannon MJ, et al. Identification of AKAP-4 as a new cancer/testis antigen for detection and immunotherapy of prostate cancer. Prostate. 2012;72:12-23、Chiriva-Internati M, Yu Y, Mirandola L, Jenkins MR, Chapman C, Cannon M, et al. Cancer testis antigen vaccination affords long-term protection in a murine model of ovarian cancer. PLoS One. 2010;5、Chiriva-Internati M, Ferrari R, Prabhakar M, Yu Y, Baggoni L, Moreno J, et al. The pituitary tumor transforming gene 1 (PTTG-1): an immunological target for multiple myeloma. J Transl Med. 2008;6:15、Chiriva-Internati M, Wang Z, Salati E, Bumm K, Barlogie B, Lim SH. Sperm protein 17 (Sp17) is a suitable target for immunotherapy of multiple myeloma. Blood. 2002;100:961-5、Chiriva-Internati M, Wang Z, Salati E, Wroblewski D, Lim SH. Successful generation of sperm protein 17 (Sp17)-specific cytotoxic T lymphocytes from normal donors: implication for tumour-specific adoptive immunotherapy following allogeneic stem cell transplantation for Sp17-positive multiple myeloma. Scand J Immunol. 2002;56:429-33、Chiriva-Internati M, Ferrari R, Yu Y, Hamrick C, Gagliano N, Grizzi F, et al. AKAP-4: a novel cancer testis antigen for multiple myeloma: Br J Haematol. 2008 Feb;140(4):465-8）、さらに現在ではＮＳＣＬＣにおける、ＳＰ１７、ＡＫＡＰ４、及びＰＴＴＧ１の発現及び免疫原性は、ＣＴＡによって推進されるワクチン接種戦略でのこれらのＣＴＡを発現する腫瘍の標的化の使用を暗示するものである。
【００３２】
ＮＳＣＬＣ細胞株であるＣＲＬ−５９２８（扁平上皮がん）、ＣＲＬ−５９２２（腺がん）、及び不死化した非腫瘍形成性ヒト気管支上皮細胞株であるＣＲＬ−２５０３（複製欠損ＳＶ４０ラージＴプラスミドでのトランスフェクションにより確立された）を、American Type Culture Collection（Manassas、VA、USA）から得て、１０％Ｖ／ＶのＦＢＳ（Invitrogen社製、Carlsbad、CA、USA）を補充したRPMI-1640培地（Invitrogen社製、Carlsbad、CA、USA）中で、３７℃及び５％ＣＯ２で保持した。
【００３３】
本発明者らは、外科手術に由来する１７種のＮＳＣＬＣ腫瘍試料と、気管支生検を受けた健常な対象からの８種の試料とを評価した。慣例的な血液テストのときに、既報のとおり（Chiriva-Internati M, Yu Y, Mirandola L, D'Cunha N, Hardwicke F, Cannon MJ, et al. Identification of AKAP-4 as a new cancer/testis antigen for detection and immunotherapy of prostate cancer. Prostate. 2012;72:12-23）血清を収集した。地域倫理委員会の承認と患者のインフォームドコンセントのもとに、ヒト対象からの材料を得た。パンチ生検を細かく刻み、組織断片を完全培地（１０％ＦＢＳ、２０ｍＭのHEPES緩衝液、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したRPMI-1640培地）中にプレーティングした。分析前に、細胞を５％ＣＯ２中及び３７℃で２４時間保持した。正常組織パネルをApplied Biosystems社（Foster City、CA）から得た。ＳＰ１７：５’Ｓｐ１７  ＰＣＲ配列番号１−5’-GGC AGT TCT TAC CAA GAA GAT-3’；３’Ｓｐ１７  ＰＣＲ配列番号２−5’-GGA GGT AAA ACC AGT GTC CTC-3’；ＡＫＡＰ４：配列番号３−5’-GCG TAC TCT GAT ACT ACA ATG ATG-3’及び配列番号４−5’-GGG 6 GTT TTG GGT AAA GTC A-3’；ＰＴＴＧ１：配列番号５−5’-GGT TTA AAC CAG GAG TGC CGC-3’及び配列番号６−5’-AAT TCA ACA TCC AGG GTC GAC AG-3’；β−アクチン：配列番号７−5’-CGT CTT CCC CTC CAT CG-3’及び配列番号８−5’-CTC GTT AAT GTC ACG CAC-3’（３５サイクル、５５℃のアニーリング温度）。エチジウムブロマイドアガロースゲル上でＰＣＲ産物を期待されるサイズのＤＮＡバンドとして可視化した。３回の独立したＲＴ−ＰＣＲ実験で全ての結果を確認した。
【００３４】
およそ４００，０００個の細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、緩衝化したパラホルムアルデヒド（１×ＰＢＳ中４％Ｗ／Ｖ、ｐＨ＝７．４）で固定した。次いで透過化緩衝液（ＰＢＳ中０．３％Ｖ／Ｖサポニン）を用いて氷上で５分間細胞を透過性にし、特異的な一次Ａｂ：ヤギ抗ヒトＳＰ１７、ヤギ抗ヒトＡＫＡＰ４（両方ともSanta Cruz Biotechnology社製、Santa Cruz、CA、USA）、又はウサギ抗ヒトＰＴＴＧ１（Novus Biologicals社製、LLC, Littleton、CO、USA）と共にインキュベートした。等量の適合するアイソタイプＡｂ（Novus Biologicals社製、LLC, Littleton、CO、USA）と共にインキュベートした細胞を用いて、陰性対照を得た。氷上で１時間インキュベートした後、細胞を透過化緩衝液で３回洗浄し、次いで適切なＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体（BD Biosciences社製、San Jose、CA、USA）と共に氷上で２０分間インキュベートした。FACS-Cantoフローサイトメーター（BD社製）を使用して蛍光強度を測定した。
【００３５】
これまでに述べられたようにして（Chiriva-Internati M, Mirandola L, Yu Y, Jenkins MR, Gornati R, Bernardini G, et al. Cancer testis antigen, ropporin, is a potential target for multiple myeloma immunotherapy. J Immunother. 2011;34:490-9）ＣＴＡ発現の免疫蛍光法の評価を行った。２０，０００個の細胞をサイトスピンにかけ、SlideRite（Fisher社製）で固定し、一晩風乾させた。各試料を０.１%Triton X-100クエン酸ナトリウム緩衝液中で４℃で１５分間かけて透過性にし、次いで細胞を、加湿したチャンバー中で、フローサイトメトリー法で説明した特異的な一次抗体（ＰＢＳ／ＢＳＡ  ０.１％で１：１００希釈）と共に、次いでフィコエリトリンコンジュゲートウサギＩｇＧ二次抗体（１：５００希釈、７、Abcam社製）と共に４℃で一晩インキュベートした。結果を倒立蛍光顕微鏡（Olympus社製のレーザーを備えたIX71倒立顕微鏡）で分析し、６０×の対物倍率で写真を撮った。標準的なＤＡＰＩ染色を使用して核を検出した。
【００３６】
ポリスチレン９６−ウェルプレートを、５０μＬの炭酸コーティング緩衝液（１０μｇ／ウェル）中で２３℃で２時間、穏やかにかき混ぜながら、ヒト組換えタンパク質（ＳＰ１７、ＡＫＡＰ４又はＰＴＴＧ１、全てNovus Biologicals社製、LLC, Littleton、CO、USA）でコーティングした。１００μＬのＰＢＳで２回洗浄した後、非特異的な結合部位を、ＰＢＳ中１％Ｗ／ＶのＢＳＡで、２３℃で１時間ブロッキングした。次いでＢＳＡを除去し、５０μＬの血清を添加した（ＰＢＳで１：５に希釈）。３４℃で１時間インキュベートした後、プレートを１００μＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ中０．０５％Ｖ／ＶのTween-20）で２回洗浄し、ＨＲＰ結合マウス抗ヒトＩｇＧ（Abcam社製、ＰＢＳで１：４，０００に希釈）と共にインキュベートした。暗所にて２２℃で１時間インキュベートした後、プレートを１００μＬの洗浄緩衝液で２回洗浄し、次いで暗所にてＨＲＰ基質溶液（Kpl ABST（登録商標）ペルオキシダーゼ基質システム）と共に２２℃で５分間インキュベートした。４０５ｎｍで吸光度を読み取った（０．１秒／ウェル）。血清と共にインキュベートしたウェルで得られた吸光度から、陰性対照（市販の抗体と共にインキュベートした抗原非含有のウェル）の吸光度を差し引いた。
【００３７】
ヘパリン添加した血液をFicoll-Hypaque密度勾配で遠心分離して、５人の患者からＰＢＭＣを分離した。６−ウェル培養プレートに、ＰＢＭＣを、３ｍＬのRPMI-1640培地及び１０％ＦＢＳと共に細胞８〜１０×１０６個／ウェルで播種した。３７℃及び５％ＣＯ２で２時間後、本発明者らは非付着細胞を除去し、１０％ＦＢＳ、１０００ＩＵ／ｍＬインターロイキン４（ＩＬ−４）及び８００ＩＵ／ｍＬ顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子８（ＧＭ−ＣＳＦ， granulocytes-macrophage colony-stimulating factor）を補充したRPMI-1640中で付着細胞を培養した。１週間培養した後、ＤＣを回収し、記載されているようにして（Chiriva-Internati M, Yu Y, Mirandola L, D'Cunha N, Hardwicke F, Cannon MJ, et al. Identification of AKAP-4 as a new cancer/testis antigen for detection and immunotherapy of prostate cancer. Prostate. 2012;72:12-23、Chiriva-Internati M, Mirandola L, Yu Y, Jenkins MR, Gornati R, Bernardini G, et al. Cancer testis antigen, ropporin, is a potential target for multiple myeloma immunotherapy. J Immunother. 2011;34:490-9）、ヒト組換えＳＰ１７、ＡＫＡＰ４又はＰＴＴＧ１でパルスした。
【００３８】
ＤＣを２回洗浄し、５０ｍＬのポリプロピレンチューブ中に置いた。組換えタンパク質を、カチオン脂質ＤＯＴＡＰ（Roche社製、Mannheim、Germany）と室温で２０分間かけて混合し、３７℃で３時間かけて時々かき混ぜながらＤＣに添加した。
【００３９】
抗原でパルスされたＤＣを、新鮮な自己ＰＢＭＣと共に、１０％自己血清、１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７を含むRPMI-1640で１：１０の比率で、３７℃、５％ＣＯ２で培養した（Chiriva-Internati M, Yu Y, Mirandola L, D'Cunha N, Hardwicke F, Cannon MJ, et al. Identification of AKAP-4 as a new cancer/testis antigen for detection and immunotherapy of prostate cancer. Prostate. 2012;72:12-23）。放射線照射した自己ＰＢＭＣフィーダー細胞及び組換えＣＴＡ（５０μｇ／ｍＬ）を週１回添加し、ＩＬ−２を３日毎に添加した。ToxinSensorクロモジェニックLALエンドトキシンアッセイキット（GenScript USA社製、08854、NJ）で行われた内毒素検出アッセイによって確認したところ、組換えＣＴＡは内毒素非含有であった。
【００４０】
ＣＴＡで刺激されたＴ細胞の細胞傷害性活性をテストするために、本発明者らは、製造元の指示（Perkin Elmer社、USA）に従って、DELFIA（登録商標）EuTDAシステムを使用したEUROPIUMベースの細胞傷害性アッセイを行った。標的細胞には、自己ＤＣ（刺激されていない、又は肺がんとは関係のないＨＰＶ−Ｅ／抗原でパルスされた）、及び自己腫瘍細胞（エフェクター標的細胞との比率は４０：１、２０：１、又は１０：１）が包含されていた。ＨＬＡクラスＩに対する抗体（Ｗ６／３２）及びＨＬＡクラスＩＩに対する抗体（Ｌ２４３）を、２５μｇ／ｍＬの濃度で添加して、固定された２０：１のエフェクター：標的の比率で、ＨＬＡ拘束性細胞傷害性を評価した。
【００４１】
活性化されたＰＢＭＣと自己腫瘍細胞とを４時間共培養したもの（２０：１のエフェクター：標的の比率）の上清に対してＥＬＩＳＡを行った。ヒトＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、インターフェロン（ＩＦＮ， interferon）−γ、及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ， tumor necrosis factor）−αの検出のために、製造元の指示に従って、U-CyTechサンドイッチＥＬＩＳＡキット（U-CyTech社製、Utrecht、The Netherlands）を使用した。TMBマイクロウェル基質を添加することによって反応を進行させ、２ＭのＨ２ＳＯ４の添加によって反応を止めた。４５０ｎｍで吸光度を読み取った。データは、活性化ＰＢＭＣを用いて測定されたＯＤを、抗原なしで自己ＤＣと共にインキュベートしたＰＢＭＣを用いて得られたＯＤで割ったもの（ＯＤ比）として表示される。
【００４２】
本発明者らが他所で記載したように製造元の指示に従ってELISPOTアッセイ（UCyTech社製、Utrecht、The Netherlands）、を使用して、患者のＣＴＬ（２０：１のエフェクター：標的の比率）によるＩＦＮ−γ発現を評価した（Chiriva-Internati M, Mirandola L, Yu Y, Jenkins MR, Gornati R, Bernardini G, et al. Cancer testis antigen, ropporin, is a potential target for multiple myeloma immunotherapy. J Immunother. 2011;34:490-9）。AID ELISPOTリーダーシステム（Cell Technology社製、Columbia、MD）を用いてスポットの計数を行った。
【００４３】
図１Ａ〜１Ｃは、ＣＴＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す画像である。図１Ａは、正常組織パネルから調製されたｃＤＮＡにおけるＰＣＲを示すゲルの画像である。図１Ｂは、ＮＳＣＬＣ細胞株であるＣＲＬ−５９２８（Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics, 2012. CA Cancer J Clin. 2012;62:10-29）、ＣＲＬ−５９２２（Chrischilles EA, Pendergast JF, Kahn KL, Wallace RB, Moga DC, Harrington DP, et al. Adverse events among the elderly receiving chemotherapy for advanced non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 2010;28:620-7）、又は正常な気管支上皮に由来する細胞であるＣＲＬ−２５０３（Gadgeel SM. The optimal chemotherapy for stage III non-small cell lung cancer patients. Curr Oncol Rep. 2011;13:272-9）からのｃＤＮＡにおけるＰＣＲを示すゲルの画像である。図１Ｃは、ＮＳＣＬＣ原発腫瘍からのｃＤＮＡにおけるＰＣＲを示すゲルの画像である。陽性対照は、精巣から調製されたｃＤＮＡであり、一方で陰性対照は、事前の逆転写を行わないＲＮＡを用いて行われたＰＣＲ（ＲＴなし）、及びテンプレートを用いずに行われたＰＣＲ（テンプレートなし）であった。β−アクチンを使用して、成功した逆転写を確認した。ＳＰ１７／ＡＫＡＰ４／ＰＴＴＧ１のＲＮＡは、ＮＳＣＬＣ細胞株及び原発腫瘍によって選択的に発現されたが、非腫瘍性の細胞株及び組織では選択的に発現されなかったことが見出された。ＳＰ１７、ＡＫＡＰ４、及びＰＴＴＧ１の遺伝子発現を、図１Ａに見られるように正常組織のパネルからのＲＮＡを使用したＲＴ−ＰＣＲで決定した。図１Ｂに、３種の細胞株（２種はＮＳＣＬＣに由来し、１種は正常な気管支上皮に由来する）を示し、図１Ｃに、新たにＮＳＣＬＣと診断された１７人の患者のコホートを示す。本発明者らは、陽性対照として、精巣におけるＣＴＡ発現を分析し（Chiriva-Internati M, Yu Y, Mirandola L, D'Cunha N, Hardwicke F, Cannon MJ, et al. Identification of AKAP-4 as a new cancer/testis antigen for detection and immunotherapy of prostate cancer. Prostate. 2012;72:12-23、Chiriva-Internati M, Yu Y, Mirandola L, Jenkins MR, Chapman C, Cannon M, et al. Cancer testis antigen vaccination affords long-term protection in a murine model of ovarian cancer. PLoS One. 2010;5、Chiriva-Internati M, Ferrari R, Prabhakar M, Yu Y, Baggoni L, Moreno J, et al. The pituitary tumor transforming gene 1 (PTTG-1): an immunological target for multiple myeloma. J Transl Med. 2008;6:15）、一方で陰性対照は、逆転写を受けていない（混入したゲノムＤＮＡが増幅する可能性を排除するため）テンプレートなしでＲＴ−ＰＣＲを行ったＲＮＡのプールを使用して得られた。ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４及びＰＴＴＧ１の検出可能なＲＮＡレベルを発現した正常組織はなかったが（図１Ａ参照）、正常な気管支細胞株であるＣＲＬ−２５０３は、ＳＰ１７のＲＮＡの弱い発現を実証した（図１Ｂ参照）。ＮＳＣＬＣ細胞株であるＣＲＬ−５９２８及びＣＲＬ−５９２２は、評価された３種のＣＴＡの有意なＲＮＡ発現を実証した（図１Ｂ参照）。さらに、１７人全てのＮＳＣＬＣ患者からの腫瘍はＳＰ１７に関して陽性であったが、腫瘍の６５％がＡＫＡＰ４を発現し（１７人中１１人）、５９％がＰＴＴＧ１を発現した（１７人中１０人）（図１Ｃ参照）。
【００４４】
図２は、示された抗体（有色のヒストグラム）又は対応するアイソタイプ対照（黒色のヒストグラム）と共にインキュベートした細胞のフローサイトメトリー分析を示す。FACS-Cantoフローサイトメーター（BD社製）を使用してＦＬ１チャネル（対数スケール）中のFSC／SSCでゲーティングした細胞（１０，０００の事象）の蛍光強度を測定した。プロットは、細胞株及び患者の初代試料中のＳＰ１７、ＡＫＡＰ４及びＰＴＴＧ１に従って整列させる。ＳＰ１７、ＡＫＡＰ４及びＰＴＴＧ１は、ＮＳＣＬＣ細胞株と患者の初代試料によってタンパク質レベルで発現されるが、正常な気管支上皮では発現されない。ＣＴＡパネルの発現をタンパク質レベルで研究するために、本発明者らは、透過性細胞のＣＴＡ特異的抗体染色によるフローサイトメトリー分析を行った。図２は、ＳＰ１７、ＡＫＡＰ４及びＰＴＴＧ１は、ＮＳＣＬＣ由来細胞株によっては発現されるが、正常気管支由来細胞株によっては発現されないことを示す。注目すべきことに、非腫瘍性ＣＲＬ−２５０３細胞は、ＳＰ１７遺伝子が弱く発現されていたにもかかわらず、ＳＰ１７タンパク質に関して陰性であった（図１Ｂ及び２）。本発明者らが患者由来ＮＳＣＬＣ腫瘍／組織に類似の分析を行ったところ、ＲＴ−ＰＣＲデータと完全に一致した。図２は、３人の患者からの代表的な結果を示す。ＣＴＡ発現の特異性を、評価された健常な個体のうち１人に由来する組織中のＳＰ１７、ＡＫＡＰ４、及びＰＴＴＧ１の陽性染色の非存在によって確認した（Bhan S, Negi SS, Shao C, Glazer CA, Chuang A, Gaykalova DA, et al. BORIS binding to the promoters of cancer testis antigens, MAGEA2, MAGEA3, and MAGEA4, is associated with their transcriptional activation in lung cancer. Clin Cancer Res. 2011;17:4267-76）（例えば、図２に代表的な結果を示す）。腫瘍及び正常細胞における選択されたＣＴＡの発現をさらに評価するために、本発明者らは、サイトスピンしたＮＳＣＬＣ細胞株、正常な気管支細胞株、及び原発腫瘍に由来する細胞の免疫蛍光法分析を行った。
【００４５】
図３は、ＮＳＣＬＣ細胞株であるＣＲＬ−５９２８、ＣＲＬ−５９２２、正常な気管支上皮に由来する細胞であるＣＲＬ−２５０３、及び１人の代表的な患者で行われた免疫蛍光法を示す。代表的な免疫蛍光法は、ＮＳＣＬＣ細胞株であるＣＲＬ−５９２８、ＣＲＬ−５９２２、正常な気管支上皮に由来する細胞であるＣＲＬ−２５０３、及び１人の代表的な患者（７番）に行われた。本発明者らは、細胞質中でのＳＰ１７、ＡＫＡＰ４、及びＰＴＴＧ１の陽性染色（緑色のシグナル）を示す。倒立蛍光顕微鏡（Olympus社製のIX71）により６０×の倍率で写真を撮った。ＳＰ１７、ＡＫＡＰ４、及びＰＴＴＧ１に対して起こり得る体液性応答を測定するために、本発明者らは、間接ＥＬＩＳＡによって、ＮＳＣＬＣ患者からの血清中の循環するＣＴＡ特異的ＩｇＧ自己抗体のレベルを健常な対象からのものと比較した。ＥＬＩＳＡシグナルが健常な対象に見出される中央値のシグナルよりも少なくとも３高い標準偏差を有する場合、対象を陽性とみなした（Santin AD, Bellone S, Palmieri M, Zanolini A, Ravaggi A, Siegel ER, et al. Human papillomavirus type 16 and 18 E7-pulsed dendritic cell vaccination of stage IB or IIA cervical cancer patients: a phase I escalating-dose trial. J Virol. 2008;82:1968-79）。
【００４６】
図４Ａ〜４Ｃは、ＳＰ１７、ＡＫＡＰ４、及びＰＴＴＧ１に関する循環するＣＴＡ特異的ＩｇＧを検出するためのＥＬＩＳＡデータのグラフである。図４Ａ〜４Ｃは、循環するＣＴＡ特異的ＩｇＧを検出するためのＥＬＩＳＡである。グラフは、３連で実行された研究から計算された平均ＯＤ値を表示する（四角、ＮＳＣＬＣ患者の血清；ひし形、健常な対象の血清）。水平線は、健常な対照グループから得られた中央値の３倍として計算された陽性カットオフを表す。ＲＴ−ＰＣＲ、フローサイトメトリー及び免疫蛍光法からの発現データと一致して、図４Ａ〜４Ｃは、ＮＳＣＬＣ患者の大部分がＣＴＡ特異的な循環する自己抗体を提示したことを示す。
【００４７】
図５Ａ〜５Ｆは、ＣＴＬ活性及び特異性の分析のグラフである。ヒストグラムは、指示された様々な条件下での非放射性EUROPIUMベースのアッセイを介して得られた特異的溶解のパーセンテージを示す。左のパネルは、エフェクター（Ｅ）：標的２２（Ｔ）細胞の様々な比率におけるＣＴＬ活性を示す。バーは、３連で実行された実験の平均を表し、エラーバーは、標準偏差を表す。右のパネルは、ＣＴＬ特異性の分析を示す。バーは、選択された５人の患者で実行された実験から得られた平均値を表し、一方でエラーバーは、標準偏差を表す。ＨＬＡ拘束性細胞傷害性を評価するために、ＨＬＡクラスＩに対する抗体（Ｗ６／３２）及びＨＬＡクラスＩＩに対する抗体（Ｌ２４３）を２５μｇ／ｍＬの濃度で添加した。ＣＴＬは、細胞傷害性Ｔリンパ球を示し；ＤＣは、樹状細胞を示し；ＨＬＡは、ヒト白血球抗原を示し；Ｅ７は、ＨＰＶＥ７抗原を示し；ＰＢＭＣは、末梢血単核細胞を示す。図５Ａ〜Ｆの左列に見られるように、本発明者らは、５人の患者からの自己腫瘍細胞を効率的に死滅させることができるＣＴＬの生成に成功した。この分析のために、本発明者らは、それらの腫瘍細胞においてタンパク質レベルで特異的なＣＴＡ発現を示した患者を選択した。細胞傷害性効果の特異性は、自己腫瘍細胞及びＮＳＣＬＣ由来細胞株の溶解の高いパーセンテージ（４０％〜８０％超）によって裏付けられたが、それに対して非腫瘍細胞（ＤＣ、関係のないＨＰＶ−Ｅ７抗原、及び正常気管支由来細胞株ＣＲＬ−２５０３でパルスされたＤＣ）の溶解は１０％未満であった（図５Ａ〜Ｆ、右）。ＨＬＡクラスＩ拘束性は、図５Ａ〜Ｆの右列に見られるように、単一構造のＨＬＡクラスＩ分子には向かうがＨＬＡクラスＩＩ分子には向かわない抗体１２での溶解阻害によって示された。
【００４８】
図６Ａ、６Ｃ及び６Ｅは、提示されたサイトカインのレベルに関して分析したＥＬＩＳＡであり、図６Ｂ、６Ｄ及び６Ｆは、患者のＣＴＬと自己腫瘍細胞とを共培養することによるＩＦＮ−γ発現のELISPOT分析である。図６Ａ、６Ｃ及び６Ｅは、自己腫瘍細胞と、ＣＴＡでパルスされたＤＣ又は未改変ＤＣで刺激したＰＢＭＣとの共培養（２０：１のエフェクター：標的の比率）からの上清のＥＬＩＳＡであり、示されたサイトカインのレベルに関して分析された。全ての測定を３連で実行した。結果は、活性化ＰＢＭＣで測定された平均ＯＤを、抗原なしで自己ＤＣと共にインキュベートしたＰＢＭＣを用いて得られた平均ＯＤで割ったもの（ＯＤ４５０比）として表示される。図６Ｂ、６Ｄ及び６Ｆは、患者のＣＴＬと自己腫瘍細胞とを共培養することによる（２０：１エフェクター：標的の比率）ＩＦＮ−γ発現のELISPOT分析であり、材料及び方法の章で詳述したようなELISPOTアッセイを使用して評価した。AID ELISPOTリーダーシステム（Cell Technology社製、Columbia、MD）を用いてスポットの計数を行い、１０６個のＰＢＭＣ当たりに標準化した。結果は、３連で実行されたアッセイの平均±標準偏差を表す。Ｔｈ１エフェクター表現型へのＴ細胞の活性化及び極性化が、サイトカイン発現のＥＬＩＳＡベースの測定によって示された：ＣＴＡでパルスされたＤＣで刺激して腫瘍細胞と共培養した後、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αのレベルが５０倍より多く増加したが、それに対してＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−１０は実質的に変わらなかった（図６Ａ、６Ｃ及び６Ｅ参照）。さらにＩＦＮ−γに関するELISPOTの結果から、自己腫瘍細胞と共培養されたロッポリン提示ＤＣで活性化されたＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−γ産生細胞の高発生頻度の増加が確認された（図６Ａ、６Ｃ及び６Ｅ）。
【００４９】
ＳＰ１７／ＡＫＡＰ４／ＰＴＴＧ１のＲＮＡは、ＮＳＣＬＣ細胞株及び原発腫瘍によって選択的に発現されるが、非腫瘍性の細胞株及び組織ではそうではない。
【００５０】
ＳＰ１７、ＡＫＡＰ４、及びＰＴＴＧ１の遺伝子発現を、正常組織（図１Ａ）、３種の細胞株（２種はＮＳＣＬＣに由来し、１種は正常な気管支上皮に由来する、図１Ｂ）、及び新たにＮＳＣＬＣと診断された１７人の患者のコホート（図１Ｃ）のパネルからのＲＮＡを使用したＲＴ−ＰＣＲで決定した。陽性対照として、本発明者らは、精巣におけるＣＴＡ発現を分析し（Chiriva-Internati M, Yu Y, Mirandola L, D'Cunha N, Hardwicke F, Cannon MJ, et al. Identification of AKAP-4 as a new cancer/testis antigen for detection and immunotherapy of prostate cancer. Prostate. 2012;72:12-23、Chiriva-Internati M, Yu Y, Mirandola L, Jenkins MR, Chapman C, Cannon M, et al. Cancer testis antigen vaccination affords long-term protection in a murine model of ovarian cancer. PLoS One. 2010;5、Chiriva-Internati M, Ferrari R, Prabhakar M, Yu Y, Baggoni L, Moreno J, et al. The pituitary tumor transforming gene 1 (PTTG-1): an immunological target for multiple myeloma. J Transl Med. 2008;6:15）、一方で陰性対照は、逆転写を受けていない（混入したゲノムＤＮＡが増幅する可能性を排除するため）テンプレートなしでＲＴ−ＰＣＲを行ったＲＮＡのプールを使用して得た（図１Ａ〜Ｃ）。ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４及びＰＴＴＧ１の検出可能なＲＮＡレベルを発現した正常組織はなかったが（図１Ａ）、正常な気管支細胞株であるＣＲＬ−２５０３は、ＳＰ１７のＲＮＡの弱い発現を実証した（図１Ｂ）。ＮＳＣＬＣ細胞株であるＣＲＬ−５９２８及びＣＲＬ−５９２２は、評価された３種のＣＴＡの有意なＲＮＡ発現を実証した（図１Ｂ）。さらに、１７人全てのＮＳＣＬＣ患者からの腫瘍はＳＰ１７に関して陽性であったが、腫瘍の６５％がＡＫＡＰ４を発現し（１７人中１１人）、５９％がＰＴＴＧ１を発現した（１７人中１０人）（図１Ｃ）。
【００５１】
ＳＰ１７／ＡＫＡＰ４／ＰＴＴＧ１は、ＮＳＣＬＣ細胞株と患者の初代試料によってタンパク質レベルで発現されるが、正常な気管支上皮では発現されない。
【００５２】
本発明者らのＣＴＡパネルの発現をタンパク質レベルで研究するために、本発明者らは、透過性細胞のＣＴＡ特異的抗体染色によるフローサイトメトリー分析を行った。図２は、ＳＰ１７／ＡＫＡＰ４／ＰＴＴＧ１は、ＮＳＣＬＣ由来細胞株によっては発現されるが、正常気管支由来細胞株によっては発現されないことを示す。注目すべきことに、非腫瘍性ＣＲＬ−２５０３細胞は、ＳＰ１７遺伝子が弱く発現されていたにもかかわらず、ＳＰ１７タンパク質に関して陰性であった（図１Ｂ及び２）。次いで本発明者らは、患者に由来するＮＳＣＬＣ腫瘍／組織に類似の分析を行ったところ、ＲＴ−ＰＣＲデータと完全に一致した。図２は、３人の患者からの代表的な結果を示す。ＣＴＡ発現の特異性を、評価された健常個体のうち１人に由来する組織中のＳＰ１７／ＡＫＡＰ４／ＰＴＴＧ１陽性染色の非存在によって確認した（図２に代表的な結果を示す）。腫瘍及び正常細胞における選択されたＣＴＡの発現をさらに評価するために、本発明者らは、サイトスピンしたＮＳＣＬＣ細胞株、正常な気管支細胞株、及び原発腫瘍に由来する細胞の免疫蛍光法分析を行った。図３は、腫瘍細胞におけるＳＰ１７／ＡＫＡＰ４／ＰＴＴＧ１の細胞質内局在化を示すが、フローサイトメトリーからの結果によれば正常な気管支細胞株であるＣＲＬ−２５０３におけるシグナルは存在しないか基準に満たない。
【００５３】
ＮＳＣＬＣ患者の血清において、循環するＣＴＡ特異的自己抗体は検出可能である。
【００５４】
ＳＰ１７／ＡＫＡＰ４／ＰＴＴＧ１に対して起こり得る体液性応答を測定するために、本発明者らは、間接ＥＬＩＳＡによって、ＮＳＣＬＣ患者からの血清中の循環するＣＴＡ特異的ＩｇＧ自己抗体のレベルを健常な対象からのものと比較した。ＥＬＩＳＡシグナルが健常な対象に見出される中央値のシグナルよりも少なくとも３高い標準偏差を有する場合、対象を陽性とみなした（Santin AD, Bellone S, Palmieri M, Zanolini A, Ravaggi A, Siegel ER, et al. Human papillomavirus type 16 and 18 E7-pulsed dendritic cell vaccination of stage IB or IIA cervical cancer patients: a phase I escalating-dose trial. J Virol. 2008;82:1968-79）。ＲＴ−ＰＣＲ、フローサイトメトリー及び免疫蛍光法からの発現データと一致して、図４Ａ〜Ｃは、ＮＳＣＬＣ患者の大部分が、ＣＴＡ特異的な循環する自己抗体を提示したことを示す。
【００５５】
患者のＰＢＭＣからのＣＴＡ特異的ＣＴＬの生成
本発明者らは、５人の患者からの自己腫瘍細胞を効率的に死滅させることができるＣＴＬの生成に成功した（図５Ａ〜Ｆ、左）。この分析のために、本発明者らは、それらの腫瘍細胞でタンパク質レベルで特異的なＣＴＡ発現を示した患者を選択した。細胞傷害性効果の特異性は、自己腫瘍細胞及びＮＳＣＬＣ由来細胞株の溶解の高いパーセンテージ（４０％〜８０％超）によって裏付けられたが、それに対して非腫瘍細胞（ＤＣ、関係のないＨＰＶ−Ｅ７抗原、及び正常な気管支に由来する細胞株ＣＲＬ−２５０３でパルスされたＤＣ）の溶解は１０％未満であった（図５Ａ〜Ｆ、右）。ＨＬＡクラスＩ拘束性は、単一構造のＨＬＡクラスＩ分子には向かうがＨＬＡクラスＩＩ分子には向かわない抗体での溶解阻害によって示された（図５Ａ〜Ｆ、右）。Ｔｈ１エフェクター表現型へのＴ細胞の活性化及び極性化が、サイトカイン発現のＥＬＩＳＡベースの測定によって示された：ＣＴＡでパルスされたＤＣで刺激して腫瘍細胞と共培養した後、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αのレベルが５０倍より多く増加したが、それに対してＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−１０は実質的に変わらなかった（図６Ａ〜Ｆ、左）。さらにＩＦＮ−γに関するELISPOTの結果から、自己腫瘍細胞と共培養されたロッポリン提示ＤＣで活性化されたＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−γ産生細胞の高発生頻度の増加が確認された（図６Ａ〜Ｆ、右）。
【００５６】
ＮＳＣＬＣは、歴史的に腫瘍浸潤Ｔ細胞の頻度が低いために弱い免疫原性しかないと考えられてきたが（Kim J, Raz D, Jablons D. Unmet need in lung cancer: can vaccines bridge the gap? Clin Lung Cancer. 2008;9:S6-12）、マウスＮＳＣＬＣモデルを使用した研究から、ＤＣベースのアプローチを利用して有効な免疫応答を活性化することができることが示された（Miller PW, Sharma S, Stolina M, Butterfield LH, Luo J, Lin Y, et al. Intratumoral administration of adenoviral interleukin 7 gene-modified dendritic cells augments specific antitumor immunity and achieves tumor eradication. Hum Gene Ther. 2000;11:53-65、Yasumoto K, Hanagiri T, Takenoyama M. Lung cancer-associated tumor antigens and the present status of immunotherapy against non-small-cell lung cancer. Gen Thorac Cardiovasc Surg. 2009;57:449-457）。加えて、腫瘍抗原特異的なＴ細胞応答は、ＮＳＣＬＣを有する患者で検出されており（Yasumoto K, Hanagiri T, Takenoyama M. Lung cancer-associated tumor antigens and the present status of immunotherapy against non-small-cell lung cancer. Gen Thorac Cardiovasc Surg. 2009;57:449-457）、これは、特異的なＮＳＣＬＣ関連抗原を同定して、それらを最適な様式で免疫系に提示させることが、一般的にこの疾患においては存在しないか又は不活性な腫瘍特異的なエフェクターＴ細胞を生成することになり得るということを示す（Raez LE, Fein S, Podack ER. Lung cancer immunotherapy. Clin Med Res. 2005;3:221-8）。患者の生存を向上させ、標準的な処置に関連する罹患率を低下させることにおける免疫療法の潜在的な役割が、近年のＮＳＣＬＣ患者における１２の臨床的なワクチン試験のメタ分析によって実証されてきた（Wang J, Zou ZH, Xia HL, He JX, Zhong NS, Tao AL. Strengths and weaknesses of immunotherapy for advanced non-small-cell lung cancer: a meta-analysis of 12 randomized controlled trials. PLoS One. 2012;7:5）。免疫療法ベースの抗がん戦略を研究する際、ワクチンによって標的化しようとする抗原の選択は、重要なステップである（Mellman I, Coukos G, Dranoff G. Cancer immunotherapy comes of age. Nature. 2011;480:480-9）。理想的な標的は、がん細胞では選択的に発現されるが正常細胞では発現されない高度に免疫原性なタンパク質であると予想される（Mellman I, Coukos G, Dranoff G. Cancer immunotherapy comes of age. Nature. 2011;480:480-9、Mirandola L, M JC, Cobos E, Bernardini G, Jenkins MR, Kast WM, et al. Cancer testis antigens: novel biomarkers and targetable proteins for ovarian cancer. Int Rev Immunol. 2011;30:127-37）。ＣＴＡは、それらの高度に腫瘍に限定された発現パターンとそれらの免疫原性のために、腫瘍の免疫療法にとって特に好適な腫瘍関連抗原である（Caballero OL, Chen YT. Cancer/testis (CT) antigens: potential targets for immunotherapy. Cancer Sci. 2009;100:2014-21、Mathieu MG, Miles AK, Li G, McArdle SE, Rees RC. Cancer/testis antigens for therapeutic use. J Buon. 2009;14:S97-102）。
【００５７】
この研究において、本発明者らは、ＮＳＣＬＣの免疫療法における３種のＣＴＡ、すなわちＳＰ１７、ＡＫＡＰ４、及びＰＴＴＧ１の使用を示す。本発明者らは、正常組織、３種のＮＳＣＬＣ細胞株、１種の正常な気管支細胞株、１７人のＮＳＣＬＣ患者からの原発腫瘍細胞、及び８人の健常な対象からの気管支上皮細胞のパネルにおいて、３種のＣＴＡ、すなわちＳＰ１７、ＡＫＡＰ４、ＰＴＴＧ１の差次的な発現を初めて分析した。予想通りに、精巣を除いて、いずれの非腫瘍性組織も選択されたＣＴＡのＲＮＡレベルを発現しなかった（Caballero OL, Chen YT. Cancer/testis (CT) antigens: potential targets for immunotherapy. Cancer Sci. 2009;100:2014-21、Mirandola L, M JC, Cobos E, Bernardini G, Jenkins MR, Kast WM, et al. Cancer testis antigens: novel biomarkers and targetable proteins for ovarian cancer. Int Rev Immunol. 2011;30:127-37）。ＮＳＣＬＣ細胞株は、ＳＰ１７／ＡＫＡＰ４／ＰＴＴＧ１転写物及びタンパク質を発現したが、一方で正常な気管支上皮細胞株は、ＳＰ１７のＲＮＡ発現だけを弱く示した。これは、ＳＰ１７が気道上皮などの線毛を有する体細胞上皮で発現されることを示した本発明者らの以前の報告と一致する（Grizzi F, Chiriva-Internati M, Franceschini B, Bumm K, Colombo P, Ciccarelli M, et al. Sperm protein 17 is expressed in human somatic ciliated epithelia. J Histochem Cytochem. 2004;52:549-54）。興味深いことに、独立した前臨床研究から、ＳＰ１７に向けられた免疫療法は、線毛細胞においてＳＰ１７発現に関するいかなる毒性も生じないことが強く示唆されている（Chiriva-Internati M, Yu Y, Mirandola L, Jenkins MR, Chapman C, Cannon M, et al. Cancer testis antigen vaccination affords long-term protection in a murine model of ovarian cancer. PLoS One. 2010;5、Song JX, Cao WL, Li FQ, Shi LN, Jia X. Anti-Sp17 monoclonal antibody with antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity and complement-dependent cytotoxicity activities against human ovarian cancer cells. Med Oncol. 2011;24:24、Dadabayev AR, Wang Z, Zhang Y, Zhang J, Robinson WR, Lim SH. Cancer immunotherapy targeting Sp17: when should the laboratory findings be translated to the clinics? Am J Hematol. 2005;80:6-11）。患者に由来する全ての肺がん組織が、転写及び翻訳レベルでＳＰ１７発現を実証したが、一方で検体の大部分はＡＫＡＰ４及びＰＴＴＧ１発現も示した。タンパク質発現の結果をフローサイトメトリーと免疫蛍光法で独立して確認したところ、結果が一致した。１７人のＮＳＣＬＣ対象のうち１６人からの腫瘍が、研究された３種のＣＴＡの少なくとも２種の発現を示したことから、これら２種は、この疾患において潜在的重要性を有することが示唆される。タンパク質を免疫療法のための標的として役立たせるには、免疫原性として知られている特徴である強く測定可能な免疫応答の惹起を可能にすべきである。本発明者らは、ＮＳＣＬＣ患者の血清の大部分が少なくとも２種のＣＴＡ特異的抗体に関して陽性であり、５番の患者だけが抗ＳＰ１７を示し、抗ＡＫＡＰ４又は抗ＰＴＴＧ１  ＩｇＧを示さなかったことを見出した。腫瘍組織におけるｍＲＮＡ及びタンパク質発現データは完全に一致したが、血清中の抗ＣＴＡ抗体として測定された体液性抗腫瘍応答はより不均質な結果となった。例えば、３人のＮＳＣＬＣ患者（２番、１３番、１４番）は抗ＳＰ１７陰性と分類されたが、それらの腫瘍はＳＰ１７を発現した。興味深いことに、全てのＡＫＡＰ４陽性又はＰＴＴＧ１陽性患者も、それらの血清中で対応する特異的な自己抗体を示した。Shan Q et al.による近年の研究は（Shan Q, Lou X, Xiao T, Zhang J, Sun H, Gao Y, et al. A cancer/testis antigen microarray to screen autoantibody biomarkers of non-small cell lung cancer. Cancer letters. 2012）、７２種のＣＴＡを含有する低密度タンパク質マイクロアレイを作製し、それをＮＳＣＬＣ患者及び健常な対象からの血清で探索した。これらの研究者は、ＮＳＣＬＣ患者の血清においてＮＹＥＳＯ−１、ＸＡＧＥ−１、ＡＤＡＭ２９及びＭＡＧＥＣ１抗体が検出されたことを報告した。これらの発見は、抗ＣＴＡ抗体は、ＮＳＣＬＣにおける診断ツールとして活用できることを示す。
【００５８】
ＳＰ１７／ＡＫＡＰ４／ＰＴＴＧ１の免疫原性がＣＴＡ／腫瘍特異的なＣＴＬ応答を生じさせる可能性があるのかどうかを決定するために、本発明者らは、ＣＴＡをロードした樹状細胞（ＤＣ）に対するＴ細胞応答を試験した。ＤＣの適用は、腫瘍抗原特異的なＴ細胞応答の刺激ための広く認識された方法であり、本発明者らはこれまで、この技術をＭＭ、子宮頸がん及び前立腺がんで使用してきた（Chiriva-Internati M, Yu Y, Mirandola L, D'Cunha N, Hardwicke F, Cannon MJ, et al. Identification of AKAP-4 as a new cancer/testis antigen for detection and immunotherapy of prostate cancer. Prostate. 2012;72:12-23、Chiriva-Internati M, Mirandola L, Yu Y, Jenkins MR, Gornati R, Bernardini G, et al. Cancer testis antigen, ropporin, is a potential target for multiple myeloma immunotherapy. J Immunother. 2011;34:490-9、Santin AD, Hermonat PL, Ravaggi A, Chiriva-Internati M, Zhan D, Pecorelli S, et al. Induction of human papillomavirus-specific CD4(+) and CD8(+) lymphocytes by E7-pulsed autologous dendritic cells in patients with human papillomavirus type 16- and 18-positive cervical cancer. J Virol. 1999;73:5402-10、Chiriva-Internati M, Wang Z, Salati E, Wroblewski D, Lim SH. Successful generation of sperm protein 17 (Sp17)-specific cytotoxic T lymphocytes from normal donors: implication for tumour-specific adoptive immunotherapy following allogeneic stem cell transplantation for Sp17-positive multiple myeloma. Scand J Immunol. 2002;56:429-33）。ＰＢＭＣからのＣＴＡ特異的ＣＴＬ生成の実行可能性を研究するために、本発明者らは、腫瘍細胞におけるＳＰ１７、ＡＫＡＰ４、又はＰＴＴＧ１タンパク質発現に関して陽性と出た５人の患者を選択した。予想通りに、患者のＰＢＭＣが、自己肺がん細胞及びＮＳＣＬＣ由来細胞株に対して有意な溶解活性を示すＣＴＡを提示するＤＣで刺激された。観察された細胞傷害性効果は、抗ＨＬＡクラスＩＩ抗体ではなく抗ＨＬＡクラスＩで遮断されたことから、ＨＬＡクラスＩ陽性標的に限定された。ＣＴＡ陰性ＣＲＬ−２５０３細胞に対して、又は非パルス化ＤＣ若しくはＨＰＶＥ７抗原をロードしたＤＣのいずれかに晒された後に、ＣＴＬが細胞傷害性応答を生じさせることができないことによって、ＣＴＬ溶解活性に関する抗原特異性が確認された。サイトカイン発現分析から、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの増加並びにＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−１０レベルの減少によって確認されたように、本発明者らのＤＣベースのＣＴＬ生成プロトコールが、刺激されたＰＢＭＣにおいて強いＴｈ−１の極性化を誘導したことが解明された（Chiriva-Internati M, Yu Y, Mirandola L, D'Cunha N, Hardwicke F, Cannon MJ, et al. Identification of AKAP-4 as a new cancer/testis antigen for detection and immunotherapy of prostate cancer. Prostate. 2012;72:12-23、Chiriva-Internati M, Yu Y, Mirandola L, Jenkins MR, Chapman C, Cannon M, et al. Cancer testis antigen vaccination affords long-term protection in a murine model of ovarian cancer. PLoS One. 2010;5、Chiriva-Internati M, Wang Z, Salati E, Bumm K, Barlogie B, Lim SH. Sperm protein 17 (Sp17) is a suitable target for immunotherapy of multiple myeloma. Blood. 2002;100:961-5、Chiriva-Internati M, Wang Z, Salati E, Wroblewski D, Lim SH. Successful generation of sperm protein 17 (Sp17)-specific cytotoxic T lymphocytes from normal donors: implication for tumour-specific adoptive immunotherapy following allogeneic stem cell transplantation for Sp17-positive multiple myeloma. Scand J Immunol. 2002;56:429-33、Chiriva-Internati M, Ferrari R, Yu Y, Hamrick C, Gagliano N, Grizzi F, et al. AKAP-4: a novel cancer testis antigen for multiple myeloma: Br J Haematol. 2008 Feb;140(4):465-8、Chiriva-Internati M, Liu Y, Weidanz JA, Grizzi F, You H, Zhou W, et al. Testing recombinant adeno-associated virus-gene loading of dendritic cells for generating potent cytotoxic T lymphocytes against a prototype self-antigen, multiple myeloma HM1.24. Blood. 2003;102:3100-7）。ＮＳＣＬＣ患者は、免疫療法に対する重要な応答（Ortegel JW, Staren ED, Faber LP, Warren WH, Braun DP. Modulation of tumor-infiltrating lymphocyte cytolytic activity against human non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 2002;36:17-25）に悪影響を与える異常なＴｈ−２−タイプのサイトカインパターンを示すことから（Asselin-Paturel C, Echchakir H, Carayol G, Gay F, Opolon P, Grunenwald D, et al. Quantitative analysis of Th1, Th2 and TGF-beta1 cytokine expression in tumor, TIL and PBL of non-small cell lung cancer patients. Int J Cancer. 1998;77:7-12）、ＣＴＡをロードしたＤＣは、Ｔ−ヘルパーＴｈ−１プロファイルを刺激する能力を有することが可能であるが、本発明を限定しない（Bremnes RM, Al-Shibli K, Donnem T, Sirera R, Al-Saad S, Andersen S, et al. The role of tumor infiltrating immune cells and chronic inflammation at the tumor site on cancer development, progression, and prognosis: emphasis on non-small cell lung cancer. J Thorac Oncol. 2011;6:824-33）。さらにエフェクターＴ細胞の活性化は、ＣＴＡをロードしたＤＣで刺激され自己腫瘍細胞に晒されたＰＢＭＣにおいて高頻度のＩＦＮ−γ発現細胞を明らかにしたELISPOT分析によって実証された。ＩＦＮ−γは、ＮＳＣＬＣ成長において有意な阻害作用を及ぼすことが示されているために（Chen J, Hou J, Zhang J, An Y, Zhang X, Yue L, et al. Atorvastatin synergizes with IFN-gamma in treating human non-small cell lung carcinomas via potent inhibition of RhoA activity. Eur J Pharmacol. 2012;682:161-70）、この発見は意義がある。
【００５９】
インビトロで活性なＣＴＡ特異的免疫応答を生じさせる実行可能性は、ＮＳＣＬＣ細胞によるＣＴＡ発現は治療的関連性を有し、この疾患に対する新規の免疫療法戦略を設計するための基準として役立つ可能性があることを示す。さらに、エフェクターＴ細胞にＣＴＡが効果的に提示されるようにインビトロで操作されたＤＣは、ＮＳＣＬＣ腫瘍の微環境で見られる免疫抑制を克服する可能性があることから、この疾患に対する有効なワクチン接種戦略の開発が可能になる（Schneider T, Hoffmann H, Dienemann H, Schnabel PA, Enk AH, Ring S, et al. Non-small cell lung cancer induces an immunosuppressive phenotype of dendritic cells in tumor microenvironment by upregulating B7-H3. J Thorac Oncol. 2011;6:1162-8、Holt GE, Podack ER, Raez LE. Immunotherapy as a strategy for the treatment of non-small-cell lung cancer. Therapy. 2011;8:43-54、Dubinett S, Sharma S. Towards effective immunotherapy for lung cancer: simultaneous targeting of tumor-initiating cells and immune pathways in the tumor microenvironment: Immunotherapy. 2009 Sep;1(5):721-5）。インビボでＣＴＡ特異的ＣＴＬ応答を生じさせて、この疾患で観察された免疫寛容を克服するかどうかを決定するために、ＮＳＣＬＣのためのＣＴＡ依存性免疫療法を開発できる（O'Callaghan DS, O'Donnell D, O'Connell F, O'Byrne KJ. The role of inflammation in the pathogenesis of non-small cell lung cancer. J Thorac Oncol. 2010;5:2024-36、Sautes-Fridman C, Dieu-Nosjean MC, Damotte D, Fisson S, Fridman WH. The immune microenvironments of lung and intraocular tumors. Bull Cancer. 2011;98:58-61、Becker S, Markova B, Wiewrodt R, Hoffarth S, Hahnel PS, Pleiner S, et al. Functional and clinical characterization of the putative tumor suppressor WWOX in non-small cell lung cancer. J Thorac Oncol. 2011;6:1976-83、Xiang R, Mizutani N, Luo Y, Chiodoni C, Zhou H, Mizutani M, et al. A DNA vaccine targeting surviving combines apoptosis with suppression of angiogenesis in lung tumor eradication. Cancer Res. 2005;65:553-61. 21 ）。すなわちこれらの結果から、ＣＴＡであるＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、及びＰＴＴＧ１は、ＮＳＣＬＣで選択的に発現されること、及びそれらの発現は、特異的なＣＴＬ媒介抗腫瘍応答を生じさせるのに活用できることが実証される。本発明者らがこれまでに、多発性骨髄腫、卵巣及び前立腺がんにおける（Chiriva-Internati M, Yu Y, Mirandola L, D'Cunha N, Hardwicke F, Cannon MJ, et al. Identification of AKAP-4 as a new cancer/testis antigen for detection and immunotherapy of prostate cancer. Prostate. 2012;72:12-23、Chiriva-Internati M, Yu Y, Mirandola L, Jenkins MR, Chapman C, Cannon M, et al. Cancer testis antigen vaccination affords long-term protection in a murine model of ovarian cancer. PLoS One. 2010;5、Chiriva-Internati M, Ferrari R, Prabhakar M, Yu Y, Baggoni L, Moreno J, et al. The pituitary tumor transforming gene 1 (PTTG-1): an immunological target for multiple myeloma. J Transl Med. 2008;6:15、Chiriva-Internati M, Wang Z, Salati E, Bumm K, Barlogie B, Lim SH. Sperm protein 17 (Sp17) is a suitable target for immunotherapy of multiple myeloma. Blood. 2002;100:961-5、Chiriva-Internati M, Wang Z, Salati E, Wroblewski D, Lim SH. Successful generation of sperm protein 17 (Sp17)-specific cytotoxic T lymphocytes from normal donors: implication for tumour-specific adoptive immunotherapy following allogeneic stem cell transplantation for Sp17-positive multiple myeloma. Scand J Immunol. 2002;56:429-33、Chiriva-Internati M, Ferrari R, Yu Y, Hamrick C, Gagliano N, Grizzi F, et al. AKAP-4: a novel cancer testis antigen for multiple myeloma: Br J Haematol. 2008 Feb;140(4):465-8）、さらに現在ではＮＳＣＬＣにおけるＳＰ１７、ＡＫＡＰ４、及びＰＴＴＧ１の発現及び免疫原性を確認したという事実���、ＣＴＡによって推進されるワクチン接種戦略でＣＴＡを発現する腫瘍を標的化できることを示す。
【００６０】
本明細書で論じられたいかなる実施形態も、本発明のいかなる方法、キット、試薬、又は組成物に対して実施できることが考慮され、その逆も同様である。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するのに使用できる。
【００６１】
本明細書で記載した特定の実施形態は、本発明の限定としてではなく例証として示されていることが理解される。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく様々な実施形態で採用され得る。当業者であれば、最低限の慣例的な実験を使用して、本明細書に記載した特定の手法に相当する多数の均等物を認識するか、又はそれらを確認することが可能である。このような均等物は本発明の範囲内であるとみなされ、特許請求の範囲に包含される。
【００６２】
明細書に記載された全ての出版物及び特許出願は、本発明が関与する分野の当業者の能力のレベルを示す。全ての出版物及び特許出願は、それぞれ個々の出版物又は特許出願が具体的且つ個々に提示されて参照により組み込まれたのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６３】
「１つの（a）」又は「１つの（an）」という言葉の使用は、特許請求の範囲及び／又は明細書中で「〜を含む」という用語と共に使用される場合、「１つの」を意味する場合があるが、「１つ又は２つ以上の」、「少なくとも１つの」、及び「１つの、又は１つより多くの」という意味とも一致する。特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、選択肢のみを指すか、又は選択肢が相互排他的であると明確に指定されない限り、「及び／又は」を意味するのに使用されるが、本開示は、選択肢のみと「及び／又は」を指すという定義を支持する。本出願全体にわたり、用語「約」は、値が、その値を決定するのに採用される装置や方法にとって固有の誤差の変動、又は研究対象間に存在する変動を包含することを示すのに使用される。
【００６４】
本明細書及び特許請求の範囲で使用されるように、「〜を含む（comprising）」（及びcomprisingの任意の形態、例えば「comprise」及び「comprises」）、「〜を有する（having）」（及びhavingの任意の形態、例えば「have」及び「has」）、「〜を包含する（including）」（及びincludingの任意の形態、例えば「includes」及び「include」）又は「〜を含有する（containing）」（及びcontainingの任意の形態、例えば「contains」及び「contain」）という言葉は、包括的であるか又はオープンエンドであり、追加の列挙されていない要素又は方法ステップを排除しない。
【００６５】
用語「又はそれらの組合せ」は、本明細書で使用される場合、その用語の前に列挙された項目の全ての順列及び組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はそれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、又はＡＢＣの少なくとも１つを包含することが意図され、特定の状況において順番が重要である場合、さらにＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、又はＣＡＢも包含することが意図される。この例で続けると、１又は２以上の項目又は用語の反復を含有する組合せ、例えばＢＢ、ＡＡＡ、ＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなども明示的に包含される。当業者であれば、文脈からそうではないことが明らかでない限り、典型的には、いかなる組合せにおける項目又は用語の数には制限がないことを理解する。
【００６６】
本明細書で開示され特許請求された組成物及び／又は方法は全て、余計な実験を行うことなく、本発明の開示を考慮して作製及び実施が可能である。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態に関して記載してきたが、本発明の概念、本質及び範囲から逸脱することなく、本明細書で記載された組成物及び／又は方法に対して変更を施してもよいし、本明細書で記載された方法のステップにおいて、又は本明細書で記載された方法のステップの順序において変更を施してもよいことは、当業者には明らかである。当業者には明らかなこのような全ての類似の置き換え及び改変は、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の本質、範囲及び概念の範囲内とみなされる。
【００６７】
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【図１Ａ−１Ｃ】
2016514094.tif 000003
【図２】
2016514094.tif 000004
【図３】
2016514094.tif 000005
【図４Ａ−４Ｃ】
2016514094.tif 000006
【図５Ａ−５Ｆ】
2016514094.tif 000007
【図６Ａ−６Ｆ】
2016514094.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成27年10月26日(2015.10.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１の少なくとも１種の腫瘍関連抗原を提示するようにロードされている、単離された抗原提示細胞であって、それぞれ１種又は２種以上の肺がん細胞によって発現された前記ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１の少なくとも１種に対する細胞傷害性Ｔリンパ球特異的な免疫応答を生じさせる前記抗原提示細胞を含む、肺がんの処置のための組成物。
【請求項２】
抗原提示細胞が、樹状細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
抗原提示細胞が、自己樹状細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
抗原提示細胞にロードされたＮＹＥＳＯ−１、ＸＡＧＥ−１、ＡＤＡＭ２９及びＭＡＧＥＣ１抗原の少なくとも１種をさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
組換えＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１腫瘍関連抗原をコードするヌクレオチド配列を含み、かつ前記組換えＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１が、抗原提示細胞で発現される、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
肺がんを有する疑いがある、又は少なくとも肺がんを発症するリスクを有するヒト対象を同定するためのデータを収集する方法であって、
抗ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１の少なくとも１種に特異的な、前記対象から得られた試料中の特異的免疫グロブリンの存在又は非存在を決定するステップであって、前記試料中の抗ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１特異的免疫グロブリンの少なくとも１種の存在が、前記対象が肺がんに罹患しているか又は少なくとも肺がんを発症するリスクがあることを示す、ステップ
を含む、前記方法。
【請求項７】
がんに罹っている個体の腫瘍マーカープロファイルの決定のためのデータを収集する方法であって、
前記個体から得られた体液の試料を、ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１腫瘍関連抗原の少なくとも１種と接触させるステップと、
前記体液の試料中に存在する１種又は２種以上の自己抗体に結合した前記ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１腫瘍関連抗原の少なくとも１種の複合体の存在又は非存在を決定するステップであって、前記１種又は２種以上の自己抗体が、前記ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１腫瘍関連抗原の少なくとも１種に免疫学的に特異的であり、前記複合体の存在が、前記個体の前記腫瘍マーカープロファイルを提供し、前記腫瘍マーカープロファイルが、疾患の経過の指標として決定される、ステップと、
を含む、前記方法。
【請求項８】
複合体の存在が、がんの検出を示す、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
がんが、肺がんである、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
１種又は２種以上の肺がん細胞に特異的なＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を生成することが可能な、ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１腫瘍関連抗原の少なくとも１種を含む、がんの処置のための免疫療法用組成物。
【請求項１１】
少なくとも１種の抗原提示細胞をさらに含む、請求項１０に記載の免疫療法用組成物。
【請求項１２】
抗原提示細胞が、樹状細胞である、請求項１１に記載の免疫療法用組成物。
【請求項１３】
少なくとも１種の抗原提示細胞が、ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１腫瘍関連抗原をコードするペプチド又は発現構築物でパルスされているか、又はそれらをロードしている、請求項１０〜１２のいずれかに記載の免疫療法用組成物。
【請求項１４】
ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１腫瘍関連抗原の少なくとも１種が、非小細胞肺がんから単離される、請求項１０〜１３のいずれかに記載の免疫療法用組成物。
【請求項１５】
対象において肺がんを検出するためのデータを収集する方法であって、
前記対象から得られた試料中のＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１の存在又は非存在を決定するステップであって、前記試料中の前記ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１の存在が、前記対象が肺がんに罹患しているか又は少なくとも肺がんを発症するリスクがあることを示す、ステップ
を含む、前記方法。
【請求項１６】
試料が、血液試料である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
免疫刺激抗原を発現した核酸ベクターを含む組成物であって、前記抗原が、ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１肺がん関連抗原の少なくとも１種をコードするヌクレオチド配列を含む、前記組成物。
【請求項１８】
抗原が、ペプチド抗原である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
非ヒト哺乳動物におけるがんの処置のための方法であって、
それを必要とする非ヒト哺乳動物に、希釈剤、媒体、賦形剤、又は不活性成分の少なくとも１種に加えて、相乗的な治療有効量の肺がん抗原を投与するステップと、
前記肺がん抗原から、特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を生成するステップと、
前記特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球で１種又は２種以上の腫瘍細胞を標的化するステップと
を含む、前記方法。
【請求項２０】
肺がん抗原が、ＳＰ１７、ＡＫＡＰ−４、又はＰＴＴＧ１である、請求項１９に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2016514094000001.app
【国際調査報告】
2016514094.tif 000009
2016514094.tif 000010
2016514094.tif 000011
2016514094.tif 000012
2016514094.tif 000013