(57)【要約】  配偶子形成に選択的に関与する標的遺伝子を破壊するための遺伝子改変を含む遺伝子改変家畜動物であって、標的遺伝子の破壊が、動物の機能的配偶子の形成を妨害する遺伝子改変家畜動物、ならびにそれを作製および使用する方法。ドナー遺伝的特徴を有する子孫を作出する動物、ならびにそれを作製および使用する方法。配偶子形成に選択的に関与する標的遺伝子を破壊するための遺伝子改変を有する細胞、ならびにその細胞を作製および使用する方法。
2016525890.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配偶子形成に選択的に関与する標的遺伝子を破壊するための遺伝子改変を含む遺伝子改変家畜動物であって、前記標的遺伝子の前記破壊が、前記動物の機能的配偶子の形成を妨害する遺伝子改変家畜動物。
【請求項２】
前記標的遺伝子の前記破壊が、誘導性系の制御下にある、請求項１に記載の家畜動物。
【請求項３】
前記標的遺伝子が、ＤＡＺＬ、ｖａｓａ、ＣａｔＳｐｅｒ、ＫＣＮＵ１、ＤＮＡＨ８、および精巣発現遺伝子１１（Ｔｅｘ１１）からなる群から選択される、請求項１に記載の動物。
【請求項４】
前記標的遺伝子が、Ｘ染色体、Ｙ染色体、または常染色体上に存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の動物。
【請求項５】
前記標的遺伝子の前記破壊が、雄配偶子または雌配偶子の形成を選択的に阻害する、請求項１に記載の動物。
【請求項６】
前記標的遺伝子が、ＴＥＮＲ、ＡＤＡＭ１ａ、ＡＤＡＭ２、ＡＤＡＭ、アルファ４、ＡＴＰ２Ｂ４遺伝子、ＣａｔＳｐｅｒ遺伝子サブユニット、ＣａｔＳｐｅｒ１、ＣａｔＳｐｅｒ２、ＣａｔＳｐｅｒ３、Ｃａｔｓｐｅｒ４、ＣａｔＳｐｅｒベータ、ＣａｔＳｐｅｒガンマ、ＣａｔＳｐｅｒデルタ、クラメジン、コンプレキシン−Ｉ、セルトリ細胞アンドロゲン受容体、Ｇａｓｚ、Ｒａ１７５、Ｃｉｂ１、Ｃｎｏｔ７、Ｚｍｙｎｄ１５、ＣＫｓ２、およびＳｍｃｐからなる群から選択される、請求項１に記載の動物。
【請求項７】
前記標的遺伝子が、精子形成に必要であり、前記遺伝子の破壊が、精子形成を選択的に阻害する、請求項１に記載の動物。
【請求項８】
前記標的遺伝子が、精巣発現遺伝子１１（Ｔｅｘ１１）を含む、請求項７に記載の動物。
【請求項９】
前記標的遺伝子が、精子運動性、精子先体融合、または精子配偶子合体に必要であり、前記標的遺伝子の破壊が、精子運動性、精子先体融合、または精子配偶子合体の１つ以上を選択的に阻害する、請求項１に記載の動物。
【請求項１０】
前記標的遺伝子の破壊が、精子運動性を選択的に阻害し、かつ前記遺伝子が、ＴＥＮＲ、ＡＤＡＭ１ａ、ＡＤＡＭ３、Ａｔｐ１ａ４、およびＡＴＰ２Ｂ４からなる群から選択される、請求項９に記載の動物。
【請求項１１】
前記標的遺伝子の破壊が、精子先体融合を選択的に阻害し、かつ前記遺伝子が、ＡＤＡＭ２、ＡＤＡＭ３、ＣａｔＳｐｅｒ、クラメジン、およびコンプレキシン−Ｉからなる群から選択される、請求項９に記載の動物。
【請求項１２】
非ヒト脊椎動物、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、および魚類からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の動物。
【請求項１３】
機能的精子を生産し得ない、請求項１に記載の動物。
【請求項１４】
前記標的遺伝子が、ＤＡＺＬを含む、請求項１３に記載の動物。
【請求項１５】
ドナーの単相ドナー染色体対を有する機能的ドナー精子を生じさせるドナー細胞のレシピエントである、請求項１に記載の動物。
【請求項１６】
非ヒト細胞および非ヒト胚からなる群から選択される生物中に、前記細胞の染色体標的部位に特異的に結合し、遺伝子を破壊して配偶子形成を選択的に破壊する薬剤を導入することを含み、前記薬剤が、標的化エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ、およびリコンビナーゼ融合タンパク質からなる群から選択される、動物の細胞を調製する方法。
【請求項１７】
前記薬剤が、前記標的化されるエンドヌクレアーゼであり、かつ前記染色体標的部位に特異的に結合するための配列を含むＴＡＬＥＮまたはＴＡＬＥＮペアを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
核酸を前記生物中に導入することをさらに含み、前記核酸配列を、前記生物のゲノム中に前記染色体標的部位において導入する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、インビトロ細胞、インビトロ初代細胞、接合子、卵母細胞、配偶子形成細胞、精細胞、卵母細胞、幹細胞、および接合子からなる群から選択される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
核酸テンプレートを前記細胞中に導入することをさらに含み、前記テンプレートは、分解により生産される末端と実質的に相同である末端を有し、核酸テンプレート配列を、前記生物のゲノム中に前記染色体標的部位において導入する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記動物が、非ヒト脊椎動物、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択される、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記破壊される遺伝子が、ＤＡＺＬ、ｖａｓａ、ＣａｔＳｐｅｒ、ＫＣＮＵ１、ＤＮＡＨ８、および精巣発現遺伝子１１、ＴＥＮＲ、ＡＤＡＭ１ａ、ＡＤＡＭ２、ＡＤＡＭ、アルファ４、ＡＴＰ２Ｂ４遺伝子、ＣａｔＳｐｅｒ遺伝子サブユニット、ＣａｔＳｐｅｒ１、ＣａｔＳｐｅｒ２、ＣａｔＳｐｅｒ３、Ｃａｔｓｐｅｒ４、ＣａｔＳｐｅｒベータ、ＣａｔＳｐｅｒガンマ、ＣａｔＳｐｅｒデルタ、クラメジン、コンプレキシン−Ｉ、セルトリ細胞アンドロゲン受容体、Ｇａｓｚ、Ｒａ１７５、Ｃｉｂ１、Ｃｎｏｔ７、Ｚｍｙｎｄ１５、ＣＫｓ２、およびＳｍｃｐからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
細胞の染色体標的部位に特異的に結合し、二本鎖ＤＮＡ分解を引き起こして遺伝子を破壊して配偶子形成を選択的に破壊する薬剤を含み、前記薬剤が、標的化エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ、およびリコンビナーゼ融合タンパク質からなる群から選択されるインビトロ細胞。
【請求項２４】
前記薬剤が、前記染色体標的部位に特異的に結合するための配列を含み、かつ前記遺伝子の前記二本鎖分解を作出するＴＡＬＥＮまたはＴＡＬＥＮペアである、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
前記薬剤が、前記標的化ヌクレアーゼを含み、かつ亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、Ｔａｌエフェクターヌクレアーゼ、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ、およびメガヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２６】
前記染色体が、Ｙ染色体である、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２７】
前記動物が、非ヒト脊椎動物、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択される、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２８】
Ｙ染色体のゲノム改変を含み、前記改変が、前記染色体の１つ以上の塩基の挿入、欠失、または置換を含む遺伝子改変家畜動物。
【請求項２９】
染色体上の外因性遺伝子を含み、前記遺伝子が、配偶子形成において選択的に活性化される遺伝子発現エレメントの制御下にある遺伝子改変家畜動物。
【請求項３０】
前記外因性遺伝子が、雄子孫の生産に選択的に要求される遺伝子を不活性化させ、かつ前記動物の有性生殖が、雌子孫のみを生産する、請求項２９に記載の動物。
【請求項３１】
前記外因性遺伝子が、雌子孫の生産に選択的に要求される遺伝子を不活性化させ、かつ前記動物の有性生殖が、雄子孫のみを生産する、請求項２９に記載の動物。
【請求項３２】
前記外因性遺伝子が、細胞に致死的であり、それにより雄配偶子のみまたは雌配偶子のみを破壊する因子を発現する、請求項３０または３１に記載の動物。
【請求項３３】
遺伝的不妊性である雄または雌であり、前記外因性遺伝子が、精子形成または卵子形成にそれぞれ選択的である第２の遺伝子に干渉し、それにより前記動物による良好な有性生殖を妨害する因子を発現する、請求項３０または３１に記載の動物。
【請求項３４】
前記第２の遺伝子への干渉が、精子運動性、精子先体融合、または精子配偶子合体を選択的に阻害する、請求項３３に記載の動物。
【請求項３５】
機能的天然精子の生産なしで機能的ドナー精子を生成する遺伝的に受精不能な雄家畜動物を含む遺伝子改変動物。
【請求項３６】
前記ドナーの子孫を有性生殖する、請求項３５に記載の動物。
【請求項３７】
非ヒト脊椎動物、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択される、請求項３５または３６に記載の動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年５月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／８２９，６５６号明細書および２０１３年８月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／８７０，５５８号明細書の優先権を主張し、これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府支援に関する記述
本明細書に記載の研究の諸側面は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）からの助成金１Ｒ４３ＲＲ０３３１４９−０１Ａ１号および農務省（ＵＳＤＡ）−飲食農業研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）のバイオテクノロジーリスク評価プログラム競争的助成金第２０１２−３３５２２−１９７６６号による支援を受けた。米国政府は本発明において一定の権利を有し得る。
【０００３】
本技術分野は、遺伝子改変動物、例えば、配偶子形成遺伝子がノックアウトされている家畜動物の作出に関する。
【背景技術】
【０００４】
家畜は、慣用的には、有性生殖により作出され、慣用の放牧および食餌の実施、または集約農業の実施（ブタについて一般的になりつつある）のいずれかにより農場で性的に成熟するまで育成される。有性生殖は、農業従事者にとってコスト効率的であり、効率的なプロセスである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一実施形態は、配偶子形成に選択的に関与する標的遺伝子を破壊するための遺伝子改変を含む遺伝子改変家畜動物であって、標的遺伝子の破壊が、動物の機能的配偶子の形成を妨害する遺伝子改変家畜動物である。
【０００６】
本発明の一実施形態は、家畜細胞および家畜胚からなる群から選択される生物中に、細胞の染色体標的部位に特異的に結合し、二本鎖ＤＮＡ分解を引き起こして遺伝子を破壊して配偶子形成を選択的に破壊する薬剤を導入することを含み、薬剤が、標的化されるエンドヌクレアーゼ、ＲＮＡ、およびリコンビナーゼ融合タンパク質からなる群から選択される、家畜動物の細胞を調製する方法である。
【０００７】
本発明の一実施形態は、細胞の染色体標的部位に特異的に結合し、二本鎖ＤＮＡ分解を引き起こして遺伝子を破壊して配偶子形成を選択的に破壊する薬剤を含み、薬剤が、標的化されるエンドヌクレアーゼおよびリコンビナーゼ融合タンパク質からなる群から選択されるインビトロ細胞である。
【０００８】
本発明の一実施形態は、Ｙ染色体のゲノム改変を含み、改変が、染色体の１つ以上の塩基の挿入、欠失、または置換を含む遺伝子改変家畜動物である。
【０００９】
本発明の一実施形態は、染色体上の外因性遺伝子を含み、遺伝子が、配偶子形成において選択的に活性化される遺伝子発現エレメントの制御下にある遺伝子改変家畜動物である。
【００１０】
本発明の一実施形態は、機能的天然精子の生産なしで機能的ドナー精子を生成する遺伝的に受精不能な雄家畜動物を含む遺伝子改変動物である。
【００１１】
本発明の一実施形態は、染色体上の外因性遺伝子を含み、遺伝子が、動物の子孫の性を制御する因子を発現し、一方の性のみの子孫を生産する遺伝子改変家畜動物である。
【００１２】
本発明の一実施形態は、複数の前記動物を含む動物集団である。
【００１３】
以下の特許出願は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれ、矛盾する場合、本明細書が優先する：米国特許出願公開第２０１０／０１４６６５５号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０１０５１４０号明細書、米国特許出願公開第２０１１／００５９１６０号明細書、および米国特許出願公開第２０１１／０１９７２９０号明細書。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】遺伝的不妊性である動物を作製および使用してドナーの遺伝子を普及させる方法の説明である。
【図２】配偶子形成の間にＹ染色体による因子の発現により性および受精能を制御する方法の説明である。
【図３Ａ】配偶子形成の破壊のための遺伝子を示し、発現は、３’ＵＴＲに結合するマイクロＲＮＡにより制御される。
【図３Ｂ】配偶子形成の破壊のためのマイクロＲＮＡを示し、発現は、３’ＵＴＲおよび後期精子形成プロモーターに結合するマイクロＲＮＡにより制御される。
【図４】脊椎動物Ｙ染色体の改変についての実験結果を示す。
【図５】イボイノシシからのｐ６５Ｓ５３１Ｐ突然変異を慣用のブタ中に遺伝子移入するために使用されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲを示す実施例６および７の実験結果のモンタージュである。パネルａ）は、Ｓ５３１Ｐミスセンス突然変異を示し、パネルｂ）は、形質移入されたＬａｎｄｒａｃｅ線維芽細胞のＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを示し、パネルｃおよびｄ）は、３および１０日目に試料採取された細胞のＲＦＬＰ分析を示す。パネルａの配列の最上段の行および最下段の行は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（配列番号１を有するＰ６５＿Ｇ１Ｓおよび配列番号２を有するＰ６５＿Ｇ２Ａ）である。２段目の行は、野生型（Ｗｔ）Ｐ６５配列、配列番号３である。３段目の行は、本実験において使用されたＨＤＲテンプレート、配列番号４である。左側ＴＡＬＥＮ（配列番号５）および右側ＴＡＬＥＮ（配列番号６）を示す。
【図６】ブタＡＰＣにおけるＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲの比較を示す実験結果のモンタージュである。パネルａ）は、野生型ＡＰＣ配列に対するＡＰＣ１４．２ＴＡＬＥＮおよびｇＲＮＡ配列ＡＰＣ１４．２Ｇ１ａを示す。下に、新規ＨｉｎｄＩＩＩ部位をもたらす４ｂｐ挿入（下線文字）を送達するＨＤＲオリゴを示す。パネルｂ）は、ＲＦＬＰおよびＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ結果を示すチャートを示す。パネルａの最上段の行は、ＡＰＣ１４．２ＴＡＬＥＮ配列、配列番号７である。２段目の行は、野生型ＡＰＣＳ配列、配列番号８である。第３行は、ｇＲＮＡ配列Ｇ１ａ、配列番号９を示す。最下段の配列は、ＨＤＲテンプレート、配列番号１０である。
【図７】ＴＡＬＥＮおよびプラスミド相同性テンプレートを使用する２つの部位（ＡＭＥＬＹおよびＳＲＹ）中の脊椎動物Ｙ染色体を標的化する遺伝子を示す。相同性アームの外側の遺伝子座特異的プライマーおよび相同性テンプレート内のトランス遺伝子特異的プライマーを使用して個々のコロニーをスクリーニングする。相同性テンプレートの遺伝子座および配向を、それらの対応するウェル上部に示し、陽性対照を（＋）で示す。
【図８】ＴＡＬＥＮおよびプラスミド相同性カセットによるクローン中のＹ標的化の分析結果を示す表である。
【図９】Ｙ染色体中の３つの部位へのユビキチンＥＧＰＦの短鎖相同性標的化である。ＳＲＹの３’ジャンクションについてのプライマーは、ＴＡＬＥＮの有無にかかわらず非特異的バンドパターンも与えた。
【図１０】ＴＡＬＥＮならびにＡＭＥＬＹおよびＳＲＹ部位に特異的な短鎖相同性テンプレートにより処理された細胞中のＥＧＦＰマーカーの発現を示す棒グラフである。
【図１１】ＥＧＦＰマーカーを発現するクローンのジャンクション分析である。
【図１２】ＤＡＺＬおよびＡＰＣのＨＤＲアレルによりクローン化されたブタを示す実験結果のモンタージュである。パネルａ）は、それぞれ、ＤＡＺＬおよびＡＰＣ改変ｌａｎｄｒａｃｅおよびＯｓｓａｂａｗ線維芽細胞に由来するクローン化された仔ブタのＲＦＬＰ分析である。パネルｂ）は、８頭のＤＡＺＬファウンダーのうち３頭、および６頭のＡＰＣファウンダーのうち６頭中のＨＤＲアレルの存在を裏付ける配列分析である。ドナーテンプレート（ＨＤＲ）中のＨＤＲアレルの再切断を阻害することが意図される遮断突然変異を枠により囲み、挿入塩基を円により囲む。最上段のＷＴ配列中の太文字は、ＴＡＬＥＮ結合部位を示す。パネルｃ）は、ＤＡＺＬ（左側）およびＡＰＣ（右側）ファウンダー動物の写真を提供する。アラインされた配列の１４の行が存在し、それぞれの行は、それぞれ配列番号１１〜配列番号２４と番号付与された別個の配列である。
【図１３】ＤＡＺＬノックアウト（ＫＯ）ブタは、精子形成を欠き、生殖細胞を有さないことを示す画像の顕微鏡モンタージュである。パネルａは、精原細胞の完全な不存在を示す精巣の内側部分からのＤＡＺＬ  ＫＯ精細管のＨ＆Ｅ染色である。パネルｂは、同様に精原細胞の完全な不存在を示す精巣の外側部分からのＤＡＺＬ  ＫＯ精細管のＨ＆Ｅ染色である。パネルｃは、野生型ブタ精巣中に存在する精原細胞のマーカーのユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ−ＬＩ）を使用する。パネルｄにおいて、ＵＣＨ−ＬＩはＤＡＺＬ  ＫＯ精巣中に不存在であり、このことは、精原細胞の不存在を示す。パネルｅにおいて、アセチル化ａ−チューブリンが野生型ブタ精巣の精細管中に存在し、このことは、精原細胞の存在を示す。パネルｆにおいて、ＤＡＺＬ  ＫＯブタ精細管はアセチル化ａ−チューブリンについて陰性であり、このことは、それらの動物中の生殖細胞の欠落を実証する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
遺伝的不妊性動物、または一方の性の子孫のみを生産し得る動物を作製および使用するための実施形態が本明細書に記載される。本明細書に記載の遺伝的不妊性動物の利用可能性およびそれらの作出のための容易な技術は、遺伝子改変動物および慣用の家畜の新たな生産方法、および新たな生産機会を提供する。一部の実施形態は、レシピエント雄がドナー精子を生産し、種付けの雄として使用してドナー動物の子孫を作製することができるように、ドナー組織を遺伝的不妊性レシピエント雄中に配置することを含む。この技術により、所望の遺伝的形質、例として、遺伝子操作形質を普及させるための有性生殖の使用が可能となる。
【００１６】
他の実施形態を使用して有価形質を保護し：例えば、１つ以上の所望の形質を有するように交配および／または遺伝子改変された動物を、それが不妊性になり、または一方の性のみの子孫を有するように改変することもでき、こうしてそれらの有価形質が流用されることも、封じ込めから流出することもないことが確保される。
【００１７】
慣用の動物生産および遺伝子改変動物生産方法は、受精能および生存率を強調する。非効率的な家畜生殖は、家畜生産に対して大きな悪影響を有する。生殖の成功を増加させるために使用することができる技術の数が増加するにもかかわらず、生殖サイクルの損失が一般的である。洗練された技術、例として、クローン化が公知であるが、有性生殖よりも効率がかなり低く、家畜の大量生産に向いていない。極めて重要な遺伝的特徴を有する動物において、人工授精または胚移植を使用してその遺伝子の子孫への伝達を最大化することができることもある。クローン化技術、例えば、体細胞核移植またはクロマチン移植は、有性生殖と同等でなく、遺伝子改変動物の定型的な生産に好適でない低効率を有する。胚性幹細胞を使用するクローン化は、核移植由来胚性幹細胞（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）（ＮＴＥＳＣ）と呼ばれ、家畜については現在可能ではない。これは、家畜胚性幹細胞の誘導は、今日まで不成功であるためである。
【００１８】
遺伝子改変家畜を作出するための遺伝子操作の使用により、所望の形質を有する家畜の作出が加速される。慣習的な家畜交配は、遺伝的形質の慎重な選択および世代生殖のための長時間の待機を含む高価で時間を要するプロセスである。慎重な形質選択を用いた場合でも、有性生殖の変動は所望の形質の組合せの開拓および伝播においてかなりの困難を提供する。
【００１９】
所望の遺伝的形質の迅速な普及、ならびに所有権管理の保護および形質の封じ込めを可能とする動物生殖についての実施形態が本明細書に提示される。実施形態は、供与される遺伝子材料のための宿主として機能し得る遺伝的およびゲノム的に不妊性の動物の生産を含む。宿主による性交は、ドナーの遺伝子材料の生殖をもたらす。遺伝的不妊性動物の群を使用して有性生殖により単一ドナーからの同一の生殖質を広範囲に普及させることができ、その結果、多くのドナー子孫を急速に生成することができる。実施形態は、一方の性の動物のみを生産するように改変されているドナーを含み、その結果、動物を受容する使用者がその形質を有する動物を流用し得ず、それらの封じ込めも損失し得ない。
【００２０】
ゲノム的に不妊性の動物は、常に不妊性であり、これはその動物が遺伝的に子孫を生産し得ないことを意味する。これに関して、不妊性という用語は、それ自体の遺伝子構造を有する子孫を生産するための有性生殖を使用し得ないことを意味する。したがって、ドナー動物の子孫を生産する動物は、不妊性と称されるが、それは別の動物についての機能的配偶子の作出において活性である。一部の例において、不妊性動物は、人工的な生殖プロセスにおいて除去および使用することができるそれ自体の配偶子を生産し；例えば、不動精子を作製する宿主動物を卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）により増殖させることができ、または宿主動物をクローン化により増殖させることができる。機能的配偶子は、良好な有性生殖に有用な配偶子である。ドナー配偶子形成細胞についての配偶子形成を受け入れるゲノム的に不妊性の動物を、調製することができる。配偶子形成という用語は、それぞれの親の生殖系列からの遺伝的相補体の２分の１をそれぞれ担持する半数体性細胞（卵子および精子）の生産を意味する。精子の生産は、配偶子形成である。受精の間の精子および卵子の融合は、２倍体ゲノムを有する接合子細胞をもたらす。配偶子形成細胞という用語は、卵子または精子の前駆細胞、典型的には、生殖細胞、卵原細胞、または精原細胞を指す。
【００２１】
本発明の実施形態は、動物中の配偶子形成または精子形成を妨害する染色体の遺伝子改変を有するゲノム的に不妊性の動物を含む。染色体は、Ｘ染色体、Ｙ染色体、または常染色体であり得る。改変としては、既存の遺伝子の破壊を挙げることができる。破壊は、既存の染色体遺伝子が発現され得ないようにその遺伝子を変更することにより、または遺伝子の転写もしくは翻訳を阻害する因子を遺伝的に発現させることにより作出することができる。遺伝的不妊性動物を作製するために使用される技術の一部は、遺伝的特徴またはドナーの遺伝的特徴が伝達される雄または雌の子孫のみを生産する動物を作製するために適用することもできる。
【００２２】
配偶子形成に選択的に関与する因子をコードする遺伝子のゲノム破壊を含む遺伝的不妊性動物の一実施形態（破壊について半接合またはホモ接合性の場合に動物が不妊性である）を、図１に説明する。破壊および不活性化という用語は、本明細書において互換的に使用される。遺伝子改変は、細胞または胚が、精子活性に選択的な遺伝子を不活性化するように作製される。１つの遺伝子改変のプロセスは、その遺伝子に特異的に結合し、それを分解するＴＡＬＥＮペアについてのｍＲＮＡの導入を含む。動物は、細胞から胚にクローン化し、または改変胚を代理母中で直接育成する。動物は、家畜動物または他の動物であり得る。破壊される精子活性は、受精に不可欠であるが、他の点ではその動物に不可欠ではない。したがって、動物は、それが有性生殖し得ないため不妊性であり：しかしながら、ＡＲＴを使用して改変精子から子孫を作出することができる。所望の遺伝的形質を有するドナー動物（交配および／または遺伝子操作の結果として）を選択する。説明は、筋肉肥大Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ雄牛ドナーを示す。精原細胞および／または精原組織をドナーから採取し、レシピエント不妊性動物中に移植する。精細管における移植により、ドナー細胞および組織が機能的精子を作製するように生殖することが可能となる（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ａｖａｒｂｏｃｋ，Ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｍａｌｅ  ｇｅｒｍ−ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．ＰＮＡＳ，１９９４，９１：１１２９８−１１３０２）。したがって、遺伝的不妊性動物は、ドナーの遺伝的特徴の普及のためのツールとされ、その動物と複数の雌との交尾は、所望の遺伝的形質の急速な拡散を提供する。
【００２３】
配偶子形成において選択的に活性化されるプロモーターの制御下にある外因性遺伝子を含む染色体を含む細胞を含む遺伝子改変家畜動物の一実施形態を、図２に説明する。図１について説明されるとおり、動物は、細胞または胚の遺伝子改変により作出する。図の実施形態において、染色体はＹ染色体である。外因性遺伝子により発現される因子は、配偶子形成に、または精子形成の段階に選択的なプロモーターの制御下にある。因子は、標的遺伝子、例えば、雄動物の発生に必要であるが、雌の発生に必要でない遺伝子、またはその逆の遺伝子を破壊し得る。またはこの遺伝子を、配偶子形成または精子形成において選択的に活性化されるプロモーターの転写制御下に置くことができ、因子は、細胞に破壊的または致死的であり、それにより雄の配偶子のみの発生を妨害し、または破壊し、それにより雌子孫のみを生産し、またはその逆を行う。プロモーターは、配偶子形成、精子形成、または卵子形成に特異的な細胞内部または組織中、例えば、精巣、精細管、もしくは精巣上体、または卵子形成の場合においては、卵巣、卵胞、卵母細胞、顆粒膜細胞もしくは黄体からなる群から選択される組織中で活性であり得る。雌配偶子形成についてのプロモーターとしては、例えば、Ｎｏｂｏｘ、Ｏｃｔ４、Ｂｍｐ１５、Ｇｄｆ９＝ＦｅｃＢ、オージェネシン（Ｏｏｇｅｎｅｓｉｎ）１およびオージェネシン２が挙げられる。
【００２４】
図３Ａおよび３Ｂは、外因性因子が、３’ＵＴＲ中に配置されたマイクロＲＮＡ結合配列の制御下でもあり、その結果、因子が、マイクロＲＮＡが発現される組織中で翻訳されないが、マイクロＲＮＡが発現されない組織中で因子が翻訳される上記のさらなる改変を記載し、例えば、組織は、精巣、精細管、または精巣上体からなる群から選択される。このアプローチは、ユビキタスまたは組織特異的プロモーターを使用し得る。第２の実施形態において、３’ＵＴＲは、精子または配偶子の発生に必要な遺伝子を標的化するマイクロＲＮＡ配列を含む。一実施形態は、ｍＲＮＡに関して発現される場合に転写を減衰させ、ｍＲＮＡを分解／安定化させ、ｍＲＮＡを局在化させるリガンドの結合についての標的を提供し得、または翻訳を抑制もしくは活性化し得る外因性遺伝子発現エレメントを含む染色体を含む細胞を含む遺伝子改変家畜動物である。リガンドとしては、ＲＮＡ結合タンパク質（タンパク質結合ドメインも含有するものおよび含有しないもの）、例えば、ＲＮＡ結合タンパク質データベース（ＲＢＰＤＢ）におけるもの、例として、限定されるものではないが、核酸認識ドメイン、ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）、Ｋ相同性ドメイン（ＫＨドメイン）、亜鉛フィンガードメイン、ＴＡＬＥ様リピート、ＰｕｍｉｌｉｏおよびＦＢＦ相同性（ＰＵＦ）リピートを含有するタンパク質、またはペンタトリコペプチドリピート（ＰＰＲ）タンパク質を挙げることができる。リガンドとしては、調節ＲＮＡ、例えば、トランスファーＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ、小分子干渉ＲＮＡ、トランス作用ｓｉＲＮＡ、リピート関連ｓｉＲＮＡを挙げることもできる。標的または調節リガンドのいずれかの発現は、配偶子形成、卵子形成または精子形成において選択的に活性化または抑制することができる。
【００２５】
改変のための遺伝子
ある家畜種中の遺伝子は、他の家畜種中、ならびにヒトおよびマウス中のオルソログを常に有する。ヒトおよびマウス遺伝子は、家畜、特にウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、およびウサギ中のオルソログを常に有する。これらの種および魚類間の遺伝子オルソログは、遺伝子機能に応じて一致することが多い。生物学者らは、遺伝子オルソログを見出す方法に精通しているため、オルソログを列記せずに種の１つに関して遺伝子を本明細書に記載することができる。したがって、遺伝子の破壊を記載する実施形態は、他の種中の同一または異なる名称を有するオルソログの破壊を含む。一般的な遺伝子データベースならびに遺伝子オルソログの同定に特殊化されたデータベースが存在する。破壊のための遺伝子としては、配偶子形成、特に精子形成に選択的な遺伝子が挙げられる。精子の配偶子を破壊せずに精子形成を不能とするためのモチーフは、精子の運動性、先体融合、または配偶子合体に干渉することである。標的遺伝子としては、ＴＥＮＲ、ＡＤＡＭ１ａ、ＡＤＡＭ２、ＡＤＡＭ、アルファ４、ＡＴＰ２Ｂ４遺伝子、ＣａｔＳｐｅｒ１、ＣａｔＳｐｅｒ２、ＣａｔＳｐｅｒ３、Ｃａｔｓｐｅｒ４、ＣａｔＳｐｅｒベータ、ＣａｔＳｐｅｒガンマ、ＣａｔＳｐｅｒデルタ、ＫＣＮＵ１、ＤＮＡＨ８、クラメジン（Ｃｌａｍｅｇｉｎ）、コンプレキシン−Ｉ、セルトリ細胞アンドロゲン受容体、Ｇａｓｚ、Ｒａ１７５、Ｃｉｂ１、Ｃｎｏｔ７、Ｚｍｙｎｄ１５、ＣＫｓ２、ＰＩＷＩＬ４、ＰＩＷＩＬ２、およびＳｍｃｐからなる群から選択されるものを挙げることができる。
【００２６】
精子運動性に干渉するために破壊することができる遺伝子の実施形態は、ＴＥＮＲ（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ  ＣＭ；Ｄｅａｒｔｈ  ＡＴ；Ｂｒａｕｎ  ＲＥ  Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｔｅｎｒ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｔｅｒａｔｏｓｐｅｒｍｉａ  ａｎｄ  ｍａｌｅ  ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２００５，２７８（１）：１３−２１）；ＡＤＡＭ１ａ（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｈ；Ｋｉｍ  Ｅ；Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  Ｔ；Ｂａｂａ  Ｔ  Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＤＡＭ１ａ／ＡＤＡＭ２  Ｆｅｒｔｉｌｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｐｐｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ＡＤＡＭ３  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｐｅｒｍ  ｓｕｒｆａｃｅ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４，２７９（３３）：３４９５７−３４９６２）；およびＡＤＡＭ３（Ｓｈａｍｓａｄｉｎ  Ｒ；Ａｄｈａｍ  ＩＭ；Ｎａｙｅｒｎｉａ  Ｋ；Ｈｅｉｎｌｅｉｎ  ＵＡ；Ｏｂｅｒｗｉｎｋｌｅｒ  Ｈ；Ｅｎｇｅｌ  Ｗ  Ｍａｌｅ  ｍｉｃｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ｇｅｒｍ−ｃｅｌｌ  ｃｙｒｉｔｅｓｔｉｎ  ａｒｅ  ｉｎｆｅｒｔｉｌｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，１９９９，６１（６）：１４４５−１４５１）である。アルファ４（Ａｔｐ１ａ４、ＡＴＰアーゼ、Ｎａ＋／Ｋ＋輸送アルファ４ポリペプチド）のノックアウトは、完全に不妊性の動物を作製し、精子運動性の重度の低減をもたらす（Ｊｉｍｅｎｅｚ  Ｔ；ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ  ＪＰ；Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｇ；Ｂｌａｎｃｏ  Ｇ  Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ  ａｌｐｈａ４  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｓｐｅｒｍ  ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０１１，１０８（２）：６４４−６４９）。精子尾部中で高度に濃縮される細胞膜カルシウム／カルモジュリン依存性カルシウムＡＴＰアーゼのアイソフォーム４（ＡＴＰ２Ｂ４遺伝子によりコードされるＰＭＣＡ４）の標的化遺伝子欠失を有する雄マウスは、重度に損傷した精子運動性に起因して受精不能である。Ｓｃｈｕｈ  Ｋ；Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ  ＥＪ；Ｊａｎｋｅｖｉｃｓ  Ｅ；Ｂｕｎｄｓｃｈｕ  Ｋ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎ  Ｊ；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＪＣ；Ａｒｍｅｓｉｌｌａ  ＡＬ；Ｅｍｅｒｓｏｎ  Ｍ；Ｏｃｅａｎｄｙ  Ｄ；Ｋｎｏｂｅｌｏｃｈ  ＫＰ；Ｎｅｙｓｅｓ  Ｌ  Ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｃａ２＋ＡＴＰａｓｅ  ４  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｓｐｅｒｍ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｍａｌｅ  ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４，２７９（２７）：２８２２０−２８２２６）。
【００２７】
精子先体融合および／または受精能獲得に干渉するために破壊することができる遺伝子の実施形態は、ＡＤＡＭ２またはＡＤＡＭ３（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｈ；Ｃｈｏ  Ｃ；Ｂｒａｎｃｉｆｏｒｔｅ  ＤＲ；Ｍｙｌｅｓ  ＤＧ；Ｐｒｉｍａｋｏｆｆ  Ｐ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｐｅｒｍ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｃｙｒｉｔｅｓｔｉｎ  ｏｒ  ｆｅｒｔｉｌｉｎ  ｂｅｔａ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２００１，２３３（１）：２０４−２１３）である。アルファ４（上記参照）のノックアウトも、卵を体外受精させ得ないそれらのマウスからの精子をもたらす。ＣａｔＳｐｅｒファミリー中の遺伝子を選択的に破壊して有性生殖により子孫を作出し得ない雄動物を作出することができる。ＣＡＴＳＰＥＲファミリー遺伝子は、精細胞の膜中に埋め込まれる膜貫通カルシウムチャネルタンパク質を提供する。カルシウムカチオンは、受精の間に精子が卵細胞の膜を通過するために必要な過剰活性に要求される。ＣａｔＳｐｅｒ遺伝子またはＣａｔｓｐｅｒによりコードされるチャネルのサブユニットを破壊して受精不能雄を作出することができる。ＣａｔＳｐｅｒ２について破壊された雄は完全に受精不能であり、それらの精子は卵に侵入し得ない（Ｑｕｉｌｌ  ＴＡ；Ｓｕｇｄｅｎ  ＳＡ；Ｒｏｓｓｉ  ＫＬ；Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ＬＫ；Ｈａｍｍｅｒ  ＲＥ；Ｇａｒｂｅｒｓ  ＤＬ  Ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｓｐｅｒｍ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ｄｒｉｖｅｎ  ｂｙ  ＣａｔＳｐｅｒ２  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００３，１００（２５）：１４８６９−１４８７４）。Ｃａｔｓｐｅｒ２またはＣａｔＳｐｅｒ３またはＣａｔｓｐｅｒ４の破壊は、類似の効果を有する（Ｑｉ  Ｈ；Ｍｏｒａｎ  ＭＭ；Ｎａｖａｒｒｏ  Ｂ；Ｃｈｏｎｇ  ＪＡ；Ｋｒａｐｉｖｉｎｓｋｙ  Ｇ；Ｋｒａｐｉｖｉｎｓｋｙ  Ｌ；Ｋｉｒｉｃｈｏｋ  Ｙ；Ｒａｍｓｅｙ  ＩＳ；Ｑｕｉｌｌ  ＴＡ；Ｃｌａｐｍａｎ  ＤＥ  Ａｌｌ  ｆｏｕｒ  ＣａｔＳｐｅｒ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｍａｌｅ  ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｒｍ  ｃｅｌｌ  ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００７）。マウス中のクラメジン（Ｃｌｇｎ）破壊により、精子が透明帯に侵入し得なくなる（Ｉｋａｗａ  Ｍ；Ｗａｄａ  Ｉ；Ｋｏｍｉｎａｍｉ  Ｋ；Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｄ；Ｔｏｓｈｉｍｏｒｉ  Ｋ；Ｎｉｓｈｉｍｕｎｅ  Ｙ；Ｏｋａｂｅ  Ｍ  Ｔｈｅ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｃａｌｍｅｇｉｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｓｐｅｒｍ  ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９７，３８７（６６３３）：６０７−６１１）。コンプレキシン−Ｉ（Ｃｐｌｘ１）欠損精子は、不完全な透明帯侵入に起因して低受精能を示す（Ｚｈａｏ  Ｌ；Ｒｅｉｍ  Ｋ；Ｍｉｌｌｅｒ  ＤＪ  Ｃｏｍｐｌｅｘｉｎ−Ｉ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｐｅｒｍ  ａｒｅ  ｓｕｂｆｅｒｔｉｌｅ  ｄｕｅ  ｔｏ  ａ  ｄｅｆｅｃｔ  ｉｎ  ｚｏｎａ  ｐｅｌｌｕｃｉｄａ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ，Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，２００８���１３６（３）：３２３−３３４）。カルシウムチャネルＫｃｎｕ１（ＮＣＢＩ遺伝子番号：１５７８５５、Ｋｃｎｍａ３、Ｓｌｏ３、ＫＣａ５、ＫＣａ５．１、ＫＣＮＭＣ１としても公知）の破壊は、受精能獲得を受け得ない精子を有する雄を作出し、その結果、受精は存在しない。ＤＮＡＨ８（遺伝子番号：１７６９、ｈｄｈｃ９としても公知）破壊は、鞭毛機構に干渉し、それにより移動に干渉することにより不動精子をもたらす。
【００２８】
Ｖａｓａは、ＲＮＡ依存性ヘリカーゼを有するＲＮＡ結合タンパク質である。ｖａｓａ遺伝子は、生殖細胞発生に不可欠である。Ｖａｓａヌル動物は、遺伝子ノックアウトにより、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によるＶａｓａ  ｍＲＮＡの低減により、およびアンチセンスモルホリノ処理（ノックダウン）によるＶａｓａタンパク質低減によりショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）およびマウスにおいて生成されている、Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｓｓｅｌ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，３２：６２６−６３７，２０１０。ヒトｖａｓａ遺伝子はＤｄｘ４である、Ｃａｓｔｒｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９７（１７）：９５８５−９５９０参照。動物モデルにおいて、全ｖａｓａコード領域を除去するヌル突然変異は、卵子形成の重度の欠陥、例として、異常な生殖系列分化および卵母細胞決定を有する雌不妊性をもたらす。部分的な機能損失アレルについてホモ接合性の雌は、受精させることができる卵を生産するが、得られる胚は生殖細胞を欠く。したがって、ｖａｓａ機能は、成体における配偶子形成の間に要求されるだけでなく、胚発生の間の生殖細胞系統の指定にも不可欠である（Ｃａｓｔｒｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）。マウスｖａｓａオルソログＭｖｈの標的化突然変異についてホモ接合性の雄マウスは不妊性であり、精子形成の重度の欠陥を示す一方、ホモ接合性雌は受精能を示す。本発明の実施形態は、ｖａｓａ遺伝子が破壊され、および誘導制御下で破壊性のｖａｓａ遺伝子を有する家畜動物を含む。
【００２９】
一部の遺伝子、例えば、ＤＡＺファミリーの遺伝子ＤＡＺＬ、およびＤＡＺ１は、破壊される場合、精子形成を選択的に干渉し、配偶子の形成を妨害、または破壊する。ＤＡＺ１は、配偶子形成、特に精子形成に選択的であり、破壊は精子の不形成をもたらす。ＤＡＺ１は、Ｙ染色体上に存在する。アルファ１ｂは、アルファ１ｂアドレナリン受容体をコードし、ノックアウトは、低受精能を示し得、または精子形成を完全に欠き得る（Ｍｈａｏｕｔｙ−Ｋｏｄｊａ  Ｓ；Ｌｏｚａｃｈ  Ａ；Ｈａｂｅｒｔ  Ｒ；Ｔａｎｎｅｕｘ  Ｍ；Ｇｕｉｇｏｎ  Ｃ；Ｂｒａｉｌｌｙ−Ｔａｂａｒｄ  Ｓ；Ｍａｌｔｉｅｒ  ＪＰ；Ｌｅｇｒａｎｄ−Ｍａｌｔｉｅｒ  Ｃ  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｒｅ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｉｎ  ａｌｐｈａ１ｂ−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍａｌｅ  ｍｉｃｅ  Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，２００７，１９５（２）：２８１−２９２）。ＡＲ  ＤＮＡ結合ドメイン（ＡＲ−ＤＢＤ）におけるＸ染色体セルトリ細胞アンドロゲン受容体（Ａｒ）の破壊は、ＡＲ−ＤＢＤがＳＣ機能および減数分裂後の精子形成に不可欠であることを示し、通常のセルトリ細胞数にもかかわらず精子形成停止を示す受精不能雄を生産した（Ｌｉｍ  Ｐ；Ｒｏｂｓｏｎ  Ｍ；Ｓｐａｌｉｖｉｅｒｏ  Ｊ；ＭｃＴａｖｉｓｈ  ＫＪ；Ｊｉｍｅｎｅｚ  Ｍ；Ｚａｊａｃ  ＪＤ；Ｈａｎｄｅｌｓｍａｎ  ＤＪ；Ａｌｌａｎ  ＣＭ  Ｓｅｒｔｏｌｉ  ｃｅｌｌ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２００９，１５０（１０）：４７５５−４７６５；Ｋｒｕｔｓｋｉｋｈ  Ａ；Ｄｅ  Ｇｅｎｄｔ  Ｋ；Ｓｈａｒｐ  Ｖ；Ｖｅｒｈｏｅｖｅｎ  Ｇ；Ｐｏｕｔａｎｅｎ  Ｍ；Ｈｕｈｔａｎｉｅｍｉ  Ｉ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｅｐｉｄｉｄｙｍｉｓ  ｃａｕｓｅｓ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｈｙｐｏｔｒｏｐｈｙ  ａｎｄ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２０１１，１５２（２）：６８９−６９６も参照）。マウスにおけるＧａｓｚのノックアウトは、接合糸期−太糸期の精母細胞遮断をもたらし、雄不妊性欠陥が観察される（Ｍａ  Ｌ；Ｂｕｃｈｏｌｄ  ＧＭ；Ｇｒｅｅｎｂａｕｍ  ＭＰ；Ｒｏｙ  Ａ；Ｂｕｒｎｓ  ＫＨ；Ｚｈｕ  Ｈ；Ｈａｎ  ＤＹ；Ｈａｒｒｉｓ  ＲＡ；Ｃｏａｒｆａ  Ｃ；Ｇｕｎａｒａｔｎｅ  ＰＨ；Ｙａｎ  Ｗ；Ｍａｔｚｕｋ  ＭＭ  ＧＡＳＺ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｍａｌｅ  ｍｅｉｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｌｅ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ，ＰＬｏＳ，Ｇｅｎｅｔ，２００９，５（９）：ｅ１０００６３５）。Ｒａ１７５の両方のアレルを欠く雄マウス（Ｒａ１７５−／−）は受精不能を示し、乏精子・無力精子・奇形精子症を示し；成熟運動性精子は精子上体中ではほとんど見出されなかった（Ｆｕｊｉｔａ  Ｅ��Ｋｏｕｒｏｋｕ  Ｙ；Ｏｚｅｋｉ  Ｓ；Ｔａｎａｂｅ  Ｙ；Ｔｏｙａｍａ  Ｙ；Ｍａｅｋａｗａ  Ｍ；Ｋｏｊｉｍａ  Ｎ；Ｓｅｎｏｏ  Ｈ；Ｔｏｓｈｉｍｏｒｉ  Ｋ；Ｍｏｍｏｉ  Ｔ  Ｏｌｉｇｏ−ａｓｔｈｅｎｏ−ｔｅｒａｔｏｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ＲＡ１７５／ＴＳＬＣ１／ＳｙｎＣＡＭ／ＩＧＳＦ４Ａ，ａ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２００６，２６（２）：７１８−７２６）。Ｃｉｂ１の破壊により、精子形成の半数体相の破壊に起因して不妊性のマウスが作製された（Ｙｕａｎ  Ｗ；Ｌｅｉｓｎｅｒ  ＴＭ；ＭｃＦａｄｄｅｎ  ＡＷ；Ｃｌａｒｋ  Ｓ；Ｈｉｌｌｅｒ  Ｓ；Ｍａｅｄａ  Ｎ；Ｏ’ｂｒｉｅｎ  ＤＡ；Ｐａｒｉｓｅ  ＬＶ  ＣＩＢ１  Ｉｓ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２００６，２６（２２）：８５０７−８５１４）。Ｃｎｏｔ７破壊雄は、乏精子・無力精子・奇形精子症のために不妊性である（Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ；Ｙａｏ  Ｒ；Ｏｇａｗａ  Ｔ；Ｓｕｚｕｋｉ  Ｔ；Ｉｔｏ  Ｃ；Ｔｓｕｎｅｋａｗａ  Ｎ；Ｉｎｏｕｅ  Ｋ；Ａｊｉｍａ  Ｒ；Ｍｉｙａｓａｋａ  Ｔ；Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｙ；Ｏｇｕｒａ  Ａ；Ｔｏｓｈｉｍｏｒｉ  Ｋ；Ｎｏｃｅ  Ｔ；Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｔ；Ｎｏｄａ  Ｔ  Ｏｌｉｇｏ−ａｓｔｈｅｎｏ−ｔｅｒａｔｏｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  Ｃｎｏｔ７，ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２００４，３６（５）：５２８−５３３）。遺伝子ノックアウトによる、またはドミナントネガティブの発現によるＣｕｌ４Ａの破壊は、精子形成の欠陥を有する受精不能を引き起こした（Ｋｏｐａｎｊａ  Ｄ；Ｒｏｙ  Ｎ；Ｓｔｏｙａｎｏｖａ  Ｔ；Ｈｅｓｓ  ＲＡ；Ｂａｇｃｈｉ  Ｓ；Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ  Ｐ  Ｃｕｌ４Ａ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｌｅ  ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２０１１，３５２（２）：２７８−２８７）。ＺＭＹＮＤ１５は、ヒストンデアセチラーゼ依存性転写抑制因子として作用し、精子形成の間の半数体細胞遺伝子の通常の時間的発現を制御する。Ｚｍｙｎｄ１５の不活性化は、多数の重要な半数体遺伝子、例として、Ｐｒｍ１、Ｔｎｐ１、Ｓｐｅｍ１、およびＣａｔｐｓｅｒ３の転写の早期活性化；後期精子細胞の枯渇；および雄受精不能をもたらす（Ｙａｎ  Ｗ；Ｓｉ  Ｙ；Ｓｌａｙｍａｋｅｒ  Ｓ；Ｌｉ  Ｊ；Ｚｈｅｎｇ  Ｈ；Ｙｏｕｎｇ  ＤＬ；Ａｓｌａｎｉａｎ  Ａ；Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｌ；Ｖｅｒｄｉｎ  Ｅ；Ｃｈａｒｏ  ＩＦ  Ｚｍｙｎｄ１５  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｓｐｅｒｍｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｌｅ  ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，２８５（４１）：３１４１８−３１４２６）。
【００３０】
他の遺伝子は、雄および雌の両方についての全ての配偶子形成を破壊し、その結果、動物系統中のそれらの遺伝子の破壊により不妊性の子孫が生産される。１つのそのような遺伝子は、ＣＫｓ２ある。Ｃｋｓ２を欠くマウスは、生存したが両方の性において不妊性であった。不妊性は、雄および雌の両方の生殖細胞の第１減数分裂中期を過ぎた進行の不全に起因する。
【００３１】
一部の遺伝子は、受精不能を引き起こす１つ以上の効果を生産するために組合せで破壊され、例えば、Ａｃｒ／Ｈ１．１／Ｓｍｃｐ、Ａｃｒ／Ｔｎｐ２／Ｓｍｃｐ、Ｔｎｐ２／Ｈ１．１／Ｓｍｃｐ、Ａｃｒ／Ｈ１ｔ／Ｓｍｃｐ、Ｔｎｐ２／Ｈ１ｔ／Ｓｍｃｐの組合せである（Ｎａｙｅｒｎｉａ  Ｋ；Ｄｒａｂｅｎｔ  Ｂ；Ｍｅｉｎｈａｒｄｔ  Ａ；Ａｄｈａｍ  ＩＭ；Ｓｃｈｗａｎｄｔ  Ｉ；Ｍｕｌｌｅｒ  Ｃ；Ｓａｎｃｋｅｎ  Ｕ；Ｋｌｅｅｎｅ  ＫＣ；Ｅｎｇｅｌ  Ｗ  Ｔｒｉｐｌｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｇｅｎｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｍａｌｅ  ｍｉｃｅ，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，２００５，７０（４）：４０６−４１６）。実施形態は、示される遺伝子組合せおよび／または下位組合せがノックアウトされている最初の動物系列を含む。
【００３２】
遺伝子改変動物
マーカーを定位置に残し、動物外でのその交配を可能とする方法を使用し、または動物中にマーカーを配置しない方法により、染色体改変について単アレルまたは両アレル性の動物を作製することができる。例えば、本発明者らは、相同依存性組換え（ＨＤＲ）の方法を使用して動物の染色体の変化、または動物の染色体中への外因性遺伝子の挿入を作製した。ツール、例えば、ＴＡＬＥＮおよびリコンビナーゼ融合タンパク質、ならびに慣用の方法は、本明細書の他箇所で考察する。本明細書に開示の遺伝子改変を支持する実験データの一部を以下のとおりまとめる。本発明者らは、改変細胞の多遺伝子集団からクローン化する場合の例外的なクローン化効率を既に実証し、単離コロニーについての体細胞核移植（ＳＣＮＴ）によるクローン化効率の変動を回避するためにこのアプローチを推奨している（Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。しかしながら、さらに、ＴＡＬＥＮ媒介ゲノム改変、およびリコンビナーゼ融合分子による改変は、単一世代における両アレル変更の達成を提供する。例えば、ノックアウト遺伝子についてホモ接合性の動物は、ＳＣＮＴにより、ホモ接合性を生産するための同系交配なしで作製することができる。家畜、例えば、ブタおよびウシについての妊娠期間および生殖齢への成熟は、研究および生産に対する顕著な障壁である。例えば、クローン化および交配によるヘテロ接合性突然変異細胞（両方の性）からのホモ接合性ノックアウトの生成は、ブタおよびウシについてそれぞれ１６および３０ヵ月を要求する。一部は、遺伝子改変およびＳＣＮＴ（Ｋｕｒｏｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）の連続サイクルによりこの負荷を低減させているが、これは、技術的に困難であり、かなり費用を要する。ＳＣＮＴ前に両アレルＫＯ細胞を定型的に生成する能力は、大型動物の遺伝子操作において顕著な発展である。両アレルノックアウトは、他の方法、例えば、ＺＦＮおよび希釈クローン化を使用して不死細胞系において達成されている（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。別のグループは、市販のＺＦＮ試薬を使用してブタＧＧＴＡ１の両アレルＫＯを近年実証し（Ｈａｕｓｃｈｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、両アレルヌル細胞をＧＧＴＡ１依存性表面エピトープの不存在についてＦＡＣＳにより濃縮することができる。これらの研究は、ある有用な概念を実証する一方、研究者らは動物または家畜を改変することができることを示していない。これは、単一クローン希釈は一般に初代線維芽細胞単離株に適しておらず（線維芽細胞は、低密度における成長が不十分である）、ヌル細胞についての生物学的濃縮が大多数の遺伝子に利用可能でないためである。
【００３３】
本発明者らは、非トランスジェニック線維芽細胞と１５０個の細胞／ｃｍ２超の密度においてプレーティングした場合にトランスジェニック初代線維芽細胞を効率的に拡張させ、コロニーとして単離し、トランスポゾン同時選択技術を使用して薬物選択に供することができることを既に示している（Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、米国特許出願公開第２０１１／０１９７２９０号明細書）。６つのＴＡＬＥＮペアにより処理された細胞についてピューロマイシン耐性コロニーを単離し、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイまたは標的部位をフランキングするＰＣＲ産物の直接配列決定によりそれらの遺伝子型について評価したことがさらに示された（２０１２年２月２４日に出願された米国特許出願第１３／４０４，６６２号明細書参照）。一般に、インデル陽性クローンの比率は、３日目の改変レベルに基づきなされた予測と類似した。両アレルＫＯクローンを６つのＴＡＬＥＮペアの５つについて同定し、インデル陽性細胞の最大３５％で生じた。特に、大多数のＴＡＬＥＮペアについての両アレルＫＯクローンの頻度は、それぞれの染色体の開裂を独立イベントとして処理する場合に予測される頻度を超過する。
【００３４】
ＴＡＬＥＮ誘導相同組換えにより、選択マーカーの結合の必要性が排除される。ＴＡＬＥＮを使用して特異的アレルを相同性依存性修復（ＨＤＲ）により家畜ゲノム中に正確に移植することができる。パイロット試験において、特異的１１ｂｐ欠失（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅアレル）（Ｇｒｏｂｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｋａｍｂａｄｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）をウシＧＤＦ８遺伝子座中に導入した（２０１２年２月２４日に出願された米国特許出願第１３／４０４，６６２号明細書参照）。ｂｔＧＤＦ８．１ＴＡＬＥＮペアは、単独で形質移入した場合、標的遺伝子座における染色体の最大１６％を開裂した。１１ｂｐ欠失を保有するスーパーコイルド相同性ＤＮＡ修復テンプレートとの同時形質移入は、所望のイベントについての選択なしで３日目における最大５％の遺伝子変換頻度（ＨＤＲ）をもたらした。遺伝子変換は、スクリーニングされた単離コロニーの１．４％で同定された。これらの結果は、ＴＡＬＥＮを使用して選択マーカーの結合の支援なしでＨＤＲを効率的に誘導することができることを実証した。実施例１は、例えば、ＴＡＬＥＮを使用することによりＹ染色体、または他の染色体を遺伝的に変更することができることを示す実験データを提供する。ＴＡＬＥＮは、本明細書の他箇所でより詳細に考察する。
【００３５】
実施例１（図４参照）は、Ｙ染色体における標的に指向されるＴＡＬＥＮを記載する。３つのＴＡＬＥＮペアが活性を示した。したがって、Ｙ染色体上のインデルを有する細胞、およびその細胞からの動物を作製することができる。実施例２は、単一世代における両アレルノックアウトを達成するためのＴＡＬＥＮ媒介ゲノム改変の方法を提供する。ブタおよびウシについての妊娠期間および生殖齢への成熟は顕著であり；例えば、クローン化および交配によるヘテロ接合性突然変異細胞（両方の性）からのホモ接合性ノックアウトの生成は、ブタおよびウシについてそれぞれ１６および３０ヵ月を要求する。両アレルノックアウトは、ＺＦＮおよび希釈クローン化を使用して不死細胞系において達成されている（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。別のグループは、市販のＺＦＮ試薬を使用してブタＧＧＴＡ１の両アレルノックアウトを近年実証し（Ｈａｕｓｃｈｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、両アレルヌル細胞をＧＧＴＡ１依存性表面エピトープの不存在についてＦＡＣＳにより濃縮することができる。これらの他の研究は有用である一方、研究者らは単純なクローン希釈を使用する。このような方法は、大多数の初代線維芽細胞単離株に適しておらず、ヌル細胞についての生物学的濃縮は、大多数の遺伝子に利用可能でない。しかしながら、実施例２において、両アレルノックアウトをスクリーニングするための個々のコロニーの拡張を許容する方法に基づき初代細胞を使用した。実施例３は、クローン化動物の作製に有用な細胞を改変する代替法を実証する。実施例４は、クローン化のための細胞を作製する他の方法、特に、ＨＤＲテンプレートとしての一本鎖オリゴヌクレオチドを含む方法を実証する。実施例５は、一本鎖オリゴヌクレオチド法を使用してある種からの遺伝子を、マーカーを有さない効率的な方法で別の種に移動させる。
【００３６】
実施例６〜８は、遺伝子のＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ編集を記載する。実施例７および８は、目的部位における二本鎖分解の効率的な生産を示すＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ結果である。このような分解は、ＨＤＲテンプレート修復法による遺伝子編集のための機会を提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲは、３日目において６パーセントより低く、１０日目において検出未満であった（図５）。第２の遺伝子座ｓｓＡＰＣ１４．２におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導標的化の分析は、かなり効率的であったが、依然としてこの部位においてＴＡＬＥＮにより誘導されたＨＤＲのレベルに達することはなく、約３０％と６０％であった（図６）。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲは、それらの実験により示されるとおり、効率的なツールであった。
【００３７】
実施例９および１０は、プラスミドカセット（図７および８）または直鎖の短鎖相同性テンプレート（図９〜１１）によるＹ染色体の標的化を記載する。両方の技術は、ＴＡＬＥＮを使用して目的標的化部位における二本鎖分解を作出し、相同性テンプレートは目的遺伝子を標的局在に指向させた。効率は１および２４％の間であり、両方の方法は効率的であった。
【００３８】
実施例１１（図１２参照）は、破壊されたＤＡＺＬ遺伝子または破壊されたＡＰＣ遺伝子を有する動物を作製する方法を記載する。ＤＡＺＬのノックアウトは、不妊性動物を作出する。本明細書に説明されるとおり、動物は、ドナー細胞または組織により処理して有性生殖によりドナー動物の遺伝的特徴を分布させる配偶子を生産することができる。ＤＡＺＬノックアウトブタはこれらの技術により作製した。これらを実施例１２に記載する。
【００３９】
実施例１２（図１３参照）は、ＤＡＺＬ  ＫＯ動物の不妊性および生殖細胞不含表現型を記載する。ＤＡＺＬ遺伝子を破壊するように編集された動物または細胞は、生殖細胞移植によるヒト受精能の回復を研究するための、または遺伝子改変生殖系列細胞の移植による遺伝子改変子孫の生産のためのモデルとして有用である。目下のところ、この方法はＤＡＺＬについて確立されているため、配偶子形成を破壊する他の遺伝子について再現することができる。
【００４０】
実験結果は、標的化されるヌクレアーゼ系が目的コグネート部位におけるｄｓＤＮＡを効率的に切断していたことを示した。標的化されるヌクレアーゼ系としては、タンパク質−ＤＮＡ結合または核酸−ＤＮＡ結合のいずれかによりコグネートＤＮＡに結合するモチーフが挙げられる。本明細書に報告される効率は顕著である。本発明者らは、これらの効率をさらに増加させるさらなる技術を他箇所に開示した。
【００４１】
本発明の実施形態は、遺伝子改変動物を作製する方法であって、胚または細胞を、標的化ヌクレアーゼ（例えば、メガヌクレアーゼ、亜鉛フィンガー、ＴＡＬＥＮ、ガイド型ＲＮＡ、リコンビナーゼ融合分子）をコードするベクターまたはｍＲＮＡに曝露させること（標的化ヌクレアーゼは、胚または細胞中の標的染色体部位に特異的に結合して細胞染色体の変化を作出する）、細胞を代理母中でクローン化し、または胚を代理母中に移植することを含み、それにより代理母はレポーター遺伝子なしで、標的化される染色体部位においてのみ遺伝子改変されている動物を妊娠する方法を含む。標的化される部位は、本明細書に記載のもの、例えば、本明細書に記載の種々の遺伝子であり得る。
【００４２】
遺伝子編集アレルを有する生物医学モデル動物の生産
動物の生存を達成するためにブタゲノム中の２つの遺伝子編集遺伝子座ＡＰＣおよびＤＡＺＬを選択した。大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子中の突然変異は、家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）を担うだけでなく、大多数の散発性結腸直腸癌において律速的な役割も担う。ＤＡＺＬ（無精子症欠失様（ｄｅｌｅｔｅｄ  ｉｎ  ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ−ｌｉｋｅ））は、脊椎動物における生殖細胞分化に重要なＲＮＡ結合タンパク質である。ＤＡＺＬ遺伝子は受精能に関連しており、受精不能モデルおよび精子形成停止に有用である。ＤＡＺＬまたはＡＰＣのＨＤＲ編集アレルを有するコロニーをクロマチン移植によるクローン化のためにプールした。それぞれのプールは、３つの移植から２つの妊娠を生じさせ、そのうちの１つの妊娠をそれぞれ支援して命名した。合計８頭の仔ブタがＤＡＺＬ改変細胞から生まれ、そのそれぞれは、ＨＤＲアレル（ファウンダー１６５０、１６５１および１６５７）またはＮＨＥＪから生じる欠失のいずれかと一致する選択コロニーの遺伝子型を反映した（図５パネルａ）。ＤＡＺＬ仔ブタ２０３のうち３頭が死産であった。ＡＰＣ改変細胞からの６頭の仔ブタのうち、１頭が死産であり、３頭は１週間以内に死亡し、他は３週間後に死亡し、全てクローン化に関する不明の理由による可能性が高い。６頭全てのＡＰＣ仔ブタは目的ＨＤＲ編集アレルについてヘテロ接合性であり、１頭を除き全てが第２のアレル上の３ｂｐのインフレーム挿入または欠失を有した（図５パネルａおよびｂ）。残りの動物は、精子形成停止（ＤＡＺＬ−／−ファウンダー）または結腸癌の発生（ＡＰＣ＋／−ファウンダー）の表現型分析のために育成した。
【００４３】
テンプレートドライブ型の遺伝子移入法を本明細書に詳述する。本発明の実施形態は、ＡＰＣまたはＤＡＺＬアレルを非ヒト動物、または任意の種の細胞中に配置するための例えば、ＨＤＲテンプレートによるテンプレートドライブ型の遺伝子移入を含む。
【００４４】
この方法、および一般に本明細書の方法は、細胞および動物を指す。これらは、非ヒト脊椎動物、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択することができる。家畜という用語は、食料または生物学的材料のために商品として育成する飼育動物を意味する。偶蹄目という用語は、それぞれの足に通常２本または４本のこともある偶数の指を有する偶蹄目（Ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）の有蹄の哺乳動物を意味し、それとしては、ウシ、シカ、ラクダ、カバ、ヒツジ、およびヤギが挙げられる。
【００４５】
配偶子形成および配偶子形成プロモーター
配偶子形成は、生殖系列前駆細胞が細胞分裂および分化を受けて成熟半数体配偶子を形成する生物学的プロセスを指す。動物は、性腺中の減数分裂を介して配偶子を生産する。始原生殖細胞（ＰＧＣ）は、発生の間に生殖原細胞を形成する。雌生殖原細胞は、卵母細胞形成、卵子細胞形成（ｏｏｔｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ）および卵子を形成するための成熟（卵子形成と称されることもある）の下位プロセスを有する卵子形成を受ける。雄生殖原細胞は、精子形成を受ける。生殖原細胞は、一次精母細胞（二倍体）を生じさせる精原細胞（二倍体）を生産するための減数分裂を受ける雄一次精細胞（二倍体）の前駆体である。一次精母細胞は、減数分裂を受け、精細胞としても公知の成熟精子（半数体）に発達する精子細胞（半数体）を形成する二次精母細胞（半数体）を形成する。精巣の精細管は、このプロセスのための出発点であり、内管壁に隣接する幹細胞は壁から開始して求心方向で分裂し、最も内側の部分に進行して精子細胞を生産する。精子細胞の成熟は、精巣上体中で生じる。マウスまたはラットにおける研究は、第１の動物の精細管がドナー動物からの組織および／または精原細胞を受容し得、その結果、供与された細胞が機能的な精子に成熟することを示している。レシピエントの精細管は、ドナー細胞についての精子形成プロセスを効率的に受け入れ得る。
【００４６】
配偶子形成プロモーターは、配偶子形成プロセスに選択的なプロモーターである。一部の配偶子形成プロモーターは、配偶子形成の減数分裂段階前に作用する一方、他のものは配偶子形成のプロセスの種々の時点において特異的に活性化される。
【００４７】
実施形態は、配偶子形成に選択的な、または卵母細胞形成、卵子細胞形成、卵母細胞成熟、精子形成、精原細胞への成熟、一次精母細胞への成熟、二次精母細胞への成熟、精子細胞への成熟、および精細胞への成熟からなる群から選択される１つ以上の配偶子形成下位プロセスの間に選択的に活性化されるプロモーターの制御下にある細胞または胚中に配置された外因性遺伝子を含む。一部のプロモーターは一般に配偶子形成の間に活性である一方、他のものはある下位プロセスにおいて開始して活性化されるが、配偶子形成の他の期を通して継続し得る。実施形態は、配偶子形成プロセスに選択的な組織特異的プロモーターの制御下にある細胞または胚中に配置された外因性遺伝子をさらに含み：例えば、組織特異的プロモーターは、精巣、精細管、および精巣上体からなる群から選択される組織中で選択的に活性である。
【００４８】
サイクリンＡ１プロモーターは、太糸期の精母細胞中だけでなく、より早期の精子形成においても活性である（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｔｉｄｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２００３  Ｍａｒ，１１（３）：３１１−３１５，Ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｃｌｉｎ  Ａ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ）。
【００４９】
ＳＰ−１０のプロモーター（−４０８／＋２８または−２６６／＋２８；ＳＰ−１０プロモーターと称される）は、精子細胞特異的転写にのみ指向される。実際、トランスジェニックマウスにおいて、ｐａｎ活性ＣＭＶエンハンサーに隣接するトランス遺伝子統合にかかわらず、−４０８／＋２８プロモーターは、精子細胞特異性を維持し、トランス遺伝子の異所性発現は得られない（Ｐ  Ｒｅｄｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｅｒｍａｔｉｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＳＰ−１０  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｓ  ａｎ  ｉｎｓｕｌａｔｏｒ  ｉｎ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００３）２６２（１）：１７３−１８２）。レチノイン酸遺伝子８（Ｓｔｒａ８）プロモーター（Ｓｔｒａ８プロモーターとして称される）により刺激される４００ｂｐ調節領域は、減数分裂および減数分裂後生殖細胞中で選択的に活性であり、未分化生殖細胞中では活性でない（Ａｎｔｏｎａｎｇｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ａ  ４００−ｂｐ  Ｓｔｒａ８  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ；Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（２００９）７２（１１）：８１６−８２２）。
【００５０】
本発明者らは、農業に、研究ツールに、または生物医学目的に有用な、ほぼ別々の家畜細胞および／または動物中の種々の遺伝子の正確な高頻度の編集を開発した。これらの家畜遺伝子編集方法は、例えば、プラスミド、ｒＡＡＶおよびオリゴヌクレオチドテンプレートを使用するＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９刺激相同性指向修復（ＨＤＲ）を含む。レポーターおよび／または選択マーカーなしで遺伝子変化を作製することができるほど高い効率を達成するためのこれらの方法が、本発明者により開発された。さらに、この方法は、目的部位における目的変化のみを有する遺伝子改変動物を作製するためのファウンダー生成において使用することができる。例えば、ヌクレアーゼの標的化のための方法およびデータは、参照により本明細書に組み込まれる２０１４年１月１４日に出願された米国特許出願第１４／１５４，９０６号明細書に提供される。
【００５１】
相同性指向修復（ＨＤＲ）
相同性指向修復（ＨＤＲ）は、ｓｓＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）損傷を修復するための細胞中の機序である。この修復機序は、損傷部位と顕著な相同性を有する配列を有するＨＤＲテンプレートが存在する場合に細胞により使用され得る。特異的結合は、生物学分野において一般に使用される用語であり、非標的組織と比較して相対的に高い親和性で標的に結合し、一般に複数の非共有相互作用、例えば、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などを含む分子を指す。特異的ハイブリダイゼーションは、相補的配列を有する核酸間の特異的結合の形態である。タンパク質も、例えば、ＴＡＬＥＮもしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系において、またはＧａｌ４モチーフによりＤＮＡに特異的に結合し得る。アレルの遺伝子移入は、テンプレートガイド型プロセスにより内因性アレルを上回って外因性アレルをコピーするプロセスを指す。内因性アレルは実際に切り出され、一部の状況において外因性核酸アレルにより置き換えられ得るが、現在の理論は、このプロセスはコピー機序であるということである。アレルは遺伝子ペアであるため、それらの間には顕著な相同性が存在する。アレルは、タンパク質をコードする遺伝子であり得、またはそれは他の機能、例えば、生物活性ＲＮＡ鎖をコードすることまたは調節タンパク質もしくはＲＮＡを受容するための部位を提供することを有し得る。
【００５２】
ＨＤＲテンプレートは、遺伝子移入されているアレルを含む核酸である。テンプレートは、ｄｓＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）であり得る。ｓｓＤＮＡテンプレートは、好ましくは、約２０〜約５０００残基であるが、他の長さを使用することができる。当業者は、明示範囲内の全ての範囲および値が企図されることを直ちに認識し；例えば、５００〜１５００残基、２０〜１００残基などである。テンプレートは、内因性アレルに隣接するＤＮＡまたは置き換えるべきＤＮＡとの相同性を提供するフランキング配列をさらに含み得る。テンプレートは、標的化されるヌクレアーゼ系に結合される配列も含み得、したがって、その系のＤＮＡ結合メンバーについてのコグネート結合部位である。コグネートという用語は、典型的には、相互作用する２つの生体分子、例えば、受容体およびそのリガンドを指す。ＨＤＲプロセスに関して、生体分子の一方は目的の、すなわち、コグネートＤＮＡ部位またはタンパク質部位と結合する配列を用いて設計することができる。
【００５３】
標的化されるヌクレアーゼ系
ゲノム編集ツール、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）および亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、バイオテクノロジー、遺伝子療法および多くの生物における機能的ゲノム研究の分野に影響を与えた。ごく最近、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）が、相補的ＲＮＡ分子によりその標的部位に指向される。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ系は、ＲＥＧＥＮである。ｔｒａｃｒＲＮＡは、別のそのようなツールである。これらは、標的化されるヌクレアーゼ系の例であり：これらの系は、ヌクレアーゼを標的部位に局在化させるＤＮＡ結合メンバーを有する。次いで、部位はヌクレアーゼにより切断される。ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮは、ＤＮＡ結合メンバーに融合しているヌクレアーゼを有する。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲは、標的ＤＮＡ上で互いに遭遇するコグネートである。ＤＮＡ結合メンバーは、染色体ＤＮＡ中のコグネート配列を有する。ＤＮＡ結合メンバーは、典型的には、目的部位においても、その近くにおいても核酸分解作用が生じないように目的コグネート配列に照らして設計される。ある実施形態は、全てのそのような系、限定されるものではないが、例として、ヌクレアーゼ再開裂を最小化する実施形態、目的残基において正確にＳＮＰを作製するための実施形態、およびＤＮＡ結合部位において遺伝子移入されているアレルの配置に適用可能である。
【００５４】
部位特異的ヌクレアーゼ系
ゲノム編集ツール、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）および亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、バイオテクノロジー、遺伝子療法および多くの生物における機能的ゲノム研究の分野に影響を与えた。ごく最近、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）が、相補的ＲＮＡ分子によりその標的部位に指向される。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ系は、ＲＥＧＥＮである。ｔｒａｃｒＲＮＡは、別のそのようなツールである。これらは、標的化されるヌクレアーゼ系の例であり：これらの系は、ヌクレアーゼを標的部位に局在化させるＤＮＡ結合メンバーを有する。次いで、部位はヌクレアーゼにより切断される。ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮは、ＤＮＡ結合メンバーに融合しているヌクレアーゼを有する。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲは、標的ＤＮＡ上で互いに遭遇するコグネートである。ＤＮＡ結合メンバーは、染色体ＤＮＡ中のコグネート配列を有する。ＤＮＡ結合メンバーは、典型的には、目的部位における、またはその近くの核酸分解作用を得るように目的コグネート配列に照らして設計される。ある実施形態は、全てのそのような系、限定されるものではないが、例として、ヌクレアーゼ再開裂を最小化する実施形態、目的残基において正確にＳＮＰを作製するための実施形態、およびＤＮＡ結合部位において遺伝子移入されているアレルの配置に適用可能である。
【００５５】
ＴＡＬＥＮ
本明細書において使用されるＴＡＬＥＮという用語は広義であり、別のＴＡＬＥＮからの支援なしで二本鎖ＤＮＡを開裂し得るモノマーＴＡＬＥＮを含む。ＴＡＬＥＮという用語は、同一部位においてＤＮＡを開裂するために一緒に機能するように遺伝子操作されたＴＡＬＥＮのペアの一方または両方のメンバーを指すためにも使用される。一緒に機能するＴＡＬＥＮは、ＤＮＡまたはＴＡＬＥＮペアの掌性を参照する左側ＴＡＬＥＮおよび右側ＴＡＬＥＮと称することができる。
【００５６】
それぞれのＤＮＡ結合リピートが標的ＤＮＡ配列中の１つの塩基対の認識を担うＴＡＬについての暗号が報告されている（ＰＣＴ公開国際公開第２０１１／０７２２４６号パンフレット）。残基は、ＤＮＡ配列を標的化するようにアセンブルすることができる。手短に述べると、ＴＡＬＥＮの結合のための標的部位を決定し、ヌクレアーゼおよび標的部位を認識する一連のＲＶＤを含む融合分子を作出する。結合時、ヌクレアーゼがＤＮＡを開裂し、その結果、細胞修復機構が作動して切断末端における遺伝子改変を作製することができる。ＴＡＬＥＮという用語は、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含むタンパク質を意味し、それ自体、機能的なモノマーＴＡＬＥＮおよび別のモノマーＴＡＬＥＮとのダイマー化を要求する他のものを含む。ダイマー化は、両方のモノマーＴＡＬＥＮが同一である場合にはホモダイマーＴＡＬＥＮをもたらし得、またはモノマーＴＡＬＥＮが異なる場合にはヘテロダイマーＴＡＬＥＮをもたらし得る。ＴＡＬＥＮは、２つの主要な真核ＤＮＡ修復経路、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同性指向修復により不死化ヒト細胞における遺伝子改変を誘導することが示されている。ＴＡＬＥＮは、ペアで使用されることが多いが、モノマーＴＡＬＥＮも公知である。ＴＡＬＥＮ（および他の遺伝子ツール）における処理のための細胞としては、培養細胞、不死化細胞、初代細胞、初代体細胞、接合子、生殖細胞、始原生殖細胞、胚盤胞、または幹細胞が挙げられる。一部の実施形態において、ＴＡＬエフェクターを使用して他のタンパク質ドメイン（例えば、非ヌクレアーゼタンパク質ドメイン）を特異的ヌクレオチド配列に標的化することができる。例えば、ＴＡＬエフェクターは、限定されるものではないが、ＤＮＡ２０相互作用酵素（例えば、メチラーゼ、トポイソメラーゼ、インテグラーゼ、トランスポゼース、またはリガーゼ）、転写活性化因子もしくは抑制因子、または他のタンパク質、例えば、ヒストンと相互作用し、またはそれを改変するタンパク質からのタンパク質ドメインに連結させることができる。このようなＴＡＬエフェクター融合物の適用としては、例えば、エピジェネティック調節エレメントの作出または改変、ＤＮＡ中の部位特異的挿入、欠失、または修復の作製、遺伝子発現の制御、およびクロマチン構造の改変が挙げられる。
【００５７】
ヌクレアーゼという用語は、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼを含む。エンドヌクレアーゼという用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、好ましくは、ＤＮＡ分子内の核酸間の結合の加水分解（開裂）を触媒し得る任意の野生型またはバリアント酵素を指す。エンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄｌＩＩ、ＮｏｔＩ、ＢｂｖＣｌ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ、およびＡｌｗＩが挙げられる。エンドヌクレアーゼは、典型的には約１２〜４５塩基対（ｂｐ）長、より好ましくは、１４〜４５ｂｐのポリヌクレオチド認識部位を有する場合にレアカットエンドヌクレアーゼも含む。レアカットエンドヌクレアーゼは、規定の遺伝子座におけるＤＮＡ二本鎖分解（ＤＳＢ）を誘導する。レアカットエンドヌクレアーゼは、例えば、標的化されるエンドヌクレアーゼ、遺伝子操作された亜鉛フィンガードメインと、制限酵素、例えば、ＦｏｋＩおよび化学的エンドヌクレアーゼの触媒ドメインとの融合物から得られるキメラ亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であり得る。化学的エンドヌクレアーゼにおいて、化学またはペプチド性開裂因子は、核酸のポリマーまたは特異的標的配列を認識する別のＤＮＡのいずれかにコンジュゲートされ、それにより開裂活性を特異的配列に標的化する。化学的エンドヌクレアーゼは、特異的ＤＮＡ配列に結合することが公知のオルトフェナントロリン、ＤＮＡ開裂分子、および三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）の合成ヌクレアーゼ様コンジュゲートも包含する。このような化学的エンドヌクレアーゼは、本発明による用語「エンドヌクレアーゼ」に含まれる。このようなエンドヌクレアーゼの例としては、Ｉ−ＳｅｅＩ、Ｉ−ＣｈｕＬＩ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、ＰＩ−ＳｅｅＬＰＩ−ＴｔｉＬＰＩ−ＭｔｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＳｅｅＩＬ１−ＳｅｅＩＩＩ、ＨＯ、ＰＩ−ＣｉｖＩ、ＰＩ−ＣｔｒＬＰＩ−ＡａｅＩ、ＰＩ−ＢｓｕＩ、ＰＩ−ＤｈａＩ、ＰＩ−ＤｒａＬＰＩ−ＭａｖＬＰＩ−ＭｅｈＩ、ＰＩ−ＭｆｕＬＰＩ−ＭｆｌＩ、ＰＩ−ＭｇａＬＰＩ−ＭｇｏＩ、ＰＩ−ＭｉｎＬＰＩ−ＭｋａＬＰＩ−ＭｌｅＩ、ＰＩ−ＭｍａＩ、ＰＩ−３０ＭｓｈＬＰＩ−ＭｓｍＩ、ＰＩ−ＭｔｈＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｘｅＩ、ＰＩ−ＮｐｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＬＰＩ−ＲｍａＩ、ＰＩ−ＳｐｂＩ、ＰＩ−ＳｓｐＬＰＩ−ＦａｅＬＰＩ−ＭｊａＩ、ＰＩ−ＰｈｏＬＰＩ−ＴａｇＬＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｋｏＩ、ＰＩ−ＴｓｐＩ、Ｉ−ＭｓｏＩが挙げられる。
【００５８】
ＴＡＬＥＮまたは他のツールにより作製される遺伝子改変は、例えば、挿入、欠失、外因性核酸断片の挿入、および置換からなるリストから選択することができる。挿入という用語は、染色体中への文字どおりの挿入または修復のためのテンプレートとしての外因性配列の使用のいずれかを意味するために広義で使用される。一般に、標的ＤＮＡ部位を同定し、その部位に特異的に結合するＴＡＬＥＮペアを作出する。ＴＡＬＥＮは、細胞または胚に、例えば、タンパク質、ｍＲＮＡとして、またはＴＡＬＥＮをコードするベクターにより送達する。ＴＡＬＥＮは、ＤＮＡを開裂して二本鎖分解を作製し、次いでそれを修復し、多くの場合にインデルの作出がもたらされ、または染色体中に挿入され、もしくは改変配列による分解の修復のためのテンプレートとして機能する同伴する外因性核酸中に含有される配列もしくは多型が取り込まれる。このテンプレートドライブ型の修復は、染色体を変化させる有用なプロセスであり、細胞染色体の効率的な変化を提供する。
【００５９】
外因性核酸という用語は、細胞または胚に添加される核酸を意味し、核酸が細胞中に天然に存在する核酸配列と同一か異なるかを問わない。核酸断片という用語は広義であり、染色体、発現カセット、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはそれらの一部を含む。細胞または胚は、例えば、非ヒト脊椎動物、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択することができる。
【００６０】
一部の実施形態は、ＴＡＬＥＮペアを家畜および／または偶蹄目細胞または胚中に導入し、ＴＡＬＥＮペアにより特異的に結合される部位における細胞または胚のＤＮＡの遺伝子改変を作製し、細胞から家畜／偶蹄目を生産することを含む、遺伝子改変家畜動物および／または偶蹄目を作製する組成物または方法を含む。直接注入を細胞または胚に、例えば、接合子、線維芽細胞、または胚中に使用することができる。あるいは、タンパク質、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、またはベクターの導入のための多くの公知技術のいずれかを使用してＴＡＬＥＮおよび／または他の因子を細胞中に導入することができる。遺伝子改変動物は、公知の方法、例えば、妊娠宿主中への胚の移植、または種々のクローン化法により胚または細胞から作製することができる。語句「ＴＡＬＥＮにより特異的に結合される部位における細胞のＤＮＡの遺伝子改変」などは、ＴＡＬＥＮがその標的部位に特異的に結合している場合、ＴＡＬＥＮ上のヌクレアーゼにより切断される部位において遺伝子改変が作製されることを意味する。ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮペアが結合する場所を正確に切断するのではなく、２つの結合部位間の規定部位において切断する。
【００６１】
一部の実施形態は、動物のクローン化に使用される細胞の組成物または処理を含む。細胞は、家畜および／または偶蹄目細胞、培養細胞、初代細胞、初代体細胞、接合子、生殖細胞、始原生殖細胞、または幹細胞であり得る。例えば、実施形態は、ＴＡＬＥＮタンパク質または１つもしくは複数のＴＡＬＥＮをコードする核酸に培養物中の複数の初代細胞を曝露することを含む、遺伝子改変を作出する組成物または方法である。ＴＡＬＥＮは、ｍＲＮＡまたはベクター中のＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質として、または核酸断片として導入することができる。
【００６２】
亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ開裂ドメインに融合させることにより生成される人工的制限酵素である。亜鉛フィンガードメインは、所望のＤＮＡ配列を標的化するように遺伝子操作することができ、これにより、亜鉛フィンガーヌクレアーゼが複合体ゲノム内のユニーク配列を標的化することが可能となる。内因性ＤＮＡ修復機構を利用することにより、これらの試薬を使用して高等生物のゲノムを変更することができる。ＺＦＮは、遺伝子を不活性化させる方法において使用することができる。
【００６３】
亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインは、約３０アミノ酸を有し、安定的構造にフォールドする。それぞれのフィンガーは、主としてＤＮＡ基質内のトリプレットに結合する。キー位置におけるアミノ酸残基は、ＤＮＡ部位との配列特異的相互作用のほとんどに寄与する。これらのアミノ酸は、残りのアミノ酸を維持して必要な構造を保存しながら変化させることができる。より長いＤＮＡ配列への結合は、いくつかのドメインをタンデムで連結させることにより達成される。他の機能性、例えば、非特異的ＦｏｋＩ開裂ドメイン（Ｎ）、転写活性化因子ドメイン（Ａ）、転写抑制因子ドメイン（Ｒ）およびメチラーゼ（Ｍ）を、ＺＦＰに融合させてそれぞれのＺＦＮ、亜鉛フィンガー転写活性化因子（ＺＦＡ）、亜鉛フィンガー転写抑制因子（ＺＦＲ、亜鉛フィンガーメチラーゼ（ＺＦＭ）を形成することができる。遺伝子改変動物の作製のために亜鉛フィンガーおよび亜鉛フィンガーヌクレアーゼを使用するための材料および方法は、例えば、米国特許第８，１０６，２５５号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０１９２２９８号明細書、米国特許出願公開第２０１１／００２３１５９号明細書、および米国特許出願公開第２０１１／０２８１３０６号明細書に開示されている。
【００６４】
ベクターおよび核酸
ノックアウト目的のため、遺伝子の不活性化のため、遺伝子の発現を得るため、または他の目的のために、種々の核酸を細胞中に導入することができる。本明細書において使用される核酸という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および核酸アナログ、および二本鎖または一本鎖（すなわち、センスまたはアンチセンス一本鎖）である核酸を含む。核酸アナログは、例えば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度を改善するように塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格において改変することができる。デオキシリボースリン酸骨格は、それぞれの塩基部分が６員モルホリノ環に連結しているモルホリノ核酸、またはデオキシリン酸骨格がシュードペプチド骨格により置き換えられており、４つの塩基が保持されるペプチド核酸を生産するように改変することができる。
【００６５】
標的核酸配列は、調節領域、例えば、プロモーターに作動可能に連結させることができる。調節領域は、ブタ調節領域であり得、または他の種からのものであり得る。本明細書において使用される、作動可能に連結させるとは、標的核酸の転写を可能とし、または容易にするような核酸配列に対する調節領域の位置決めを指す。
【００６６】
一般に、あるタイプのプロモーターを標的核酸配列に作動可能に連結させることができる。プロモーターの例としては、限定されるものではないが、組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、および特定の刺激に応答性または不応答性のプロモーターが挙げられる。一部の実施形態において、顕著な組織または時間的特異性なしで核酸分子の発現を容易にするプロモーターを使用することができる（すなわち、構成的プロモーター）。例えば、ベータ−アクチンプロモーター、例えば、ニワトリベータ−アクチン遺伝子プロモーター、ユビキチンプロモーター、ミニＣＡＧプロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、または３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを使用することができるとともに、ウイルスプロモーター、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを使用することができる。一部の実施形態において、ニワトリベータアクチン遺伝子プロモーターおよびＣＭＶエンハンサーの融合物をプロモーターとして使用することができる。例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１２：５６３；およびＫｉｗａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，７：８２１参照。
【００６７】
核酸構築物において有用であり得る追加の調節領域としては、限定されるものではないが、ポリアデニル化配列、翻訳制御配列（例えば、内部リボソーム進入セグメント、ＩＲＥＳ）、エンハンサー、誘導性エレメント、またはイントロンが挙げられる。このような調節領域は、必須であり得ないが、それらはｍＲＮＡの転写、安定性、翻訳効率などに影響することにより発現を増加させ得る。このような調節領域は、細胞中の核酸の最適な発現を得ることが望まれる核酸構築物中に含めることができる。しかしながら、十分な発現をそのような追加のエレメントなしで得ることができることもある。
【００６８】
シグナルペプチドまたは選択マーカーをコードする核酸構築物を使用することができる。コードされるポリペプチドが特定の細胞局在（例えば、細胞表面）に指向されるようにシグナルペプチドを使用することができる。選択マーカーの非限定的な例としては、ピューロマイシン、ガンシクロビル、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ、Ｇ４１８、ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスフトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、およびキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が挙げられる。このようなマーカーは、培養物中の安定的な形質転換体の選択に有用である。他の選択マーカーとしては、蛍光ポリペプチド、例えば、緑色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質が挙げられる。
【００６９】
一部の実施形態において、選択マーカーをコードする配列をリコンビナーゼ、例えば、ＣｒｅまたはＦｌｐなどについての認識配列によりフランキングさせることができる。例えば、選択マーカーは、選択マーカーを構築物から切り出すことができるようにｌｏｘＰ認識部位（Ｃｒｅリコンビナーゼにより認識される３４ｂｐ認識部位）またはＦＲＴ認識部位によりフランキングさせることができる。Ｃｒｅ／ｌｏｘ技術の概説についてはＯｒｂａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９２）８９：６８６１、およびＢｒａｎｄ  ａｎｄ  Ｄｙｍｅｃｋｉ，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ（２００４）６：７参照。選択マーカー遺伝子により中断されるＣｒｅまたはＦｌｐ活性化可能トランス遺伝子を含有するトランスポゾンを使用してトランス遺伝子の条件的発現を有するトランスジェニック動物を得ることもできる。例えば、マーカー／トランス遺伝子の発現をドライブするプロモーターは、ユビキタスまたは組織特異的のいずれかであり得、それはＦ０動物（例えば、ブタ）におけるマーカーのユビキタスまたは組織特異的発現をもたらす。トランス遺伝子の組織特異的活性化は、例えば、マーカー中断トランス遺伝子をユビキタスに発現するブタと、ＣｒｅもしくはＦｌｐを組織特異的に発現するブタとを掛け合わせることにより、またはマーカー中断トランス遺伝子を組織特異的に発現するブタと、ＣｒｅもしくはＦｌｐリコンビナーゼをユビキタスに発現するブタとを掛け合わせることにより達成することができる。トランス遺伝子の発現の制御またはマーカーの切り出しの制御により、トランス遺伝子の発現が可能となる。
【００７０】
一部の実施形態において、外因性核酸は、ポリペプチドをコードする。ポリペプチドをコードする核酸配列は、コードされるポリペプチドの後続の操作を容易にするため（例えば、局在化または検出を容易にするため）に設計された「タグ」をコードするタグ配列を含み得る。タグ配列は、コードされるタグがポリペプチドのカルボキシまたはアミノ末端のいずれかにおいて局在するようにポリペプチドをコードする核酸配列中に挿入することができる。コードされるタグの非限定的な例としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびＦＬＡＧ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）が挙げられる。
【００７１】
核酸構築物は、ＳｓｓＩ  ＣｐＧメチラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用してメチル化することができる。一般に、核酸構築物は、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびＳｓｓＩ  ＣｐＧ−メチラーゼと緩衝液中で３７℃においてインキュベートすることができる。高メチル化は、構築物を１単位のＨｉｎＰ１Ｉエンドヌクレアーゼと３７℃において１時間インキュベートし、アガロースゲル電気泳動によりアッセイすることにより確認することができる。
【００７２】
核酸構築物は、任意のタイプの胚、胎児または生体偶蹄目／家畜細胞、例として、例えば、生殖細胞、例えば、卵母細胞または卵、前駆細胞、成体または胚性幹細胞、始原生殖細胞、腎細胞、例えば、ＰＫ−１５細胞、島細胞、ベータ細胞、肝細胞、または線維芽細胞、例えば、皮膚線維芽細胞中に種々の技術を使用して導入することができる。技術の非限定的な例としては、トランスポゾン系、細胞に感染し得る組換えウイルス、もしくはリポソームまたは核酸を細胞に送達し得る他の非ウイルス法、例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、もしくはリン酸カルシウム沈殿の使用が挙げられる。
【００７３】
トランスポゾン系において、核酸構築物の転写単位、すなわち、外因性核酸配列に作動可能に連結している調節領域は、トランスポゾンの反転リピートによりフランキングされている。いくつかのトランスポゾン系、例として、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（米国特許第６，６１３，７５２号明細書および米国特許出願公開第２００５／０００３５４２号明細書参照）；Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ（Ｍｉｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３１：６８７３）；Ｔｏｌ２（Ｋａｗａｋａｍｉ（２００７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ７；Ｍｉｎｏｓ（Ｐａｖｌｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ２）；Ｈｓｍａｒ１（Ｍｉｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７））Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２７：４５８９）；およびＰａｓｓｐｏｒｔが、核酸を細胞、例として、マウス、ヒト、およびブタ細胞中に導入するために開発されている。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンが特に有用である。トランスポゼースは、外因性核酸と同一の核酸構築物上でコードされるタンパク質として送達することができ、別個の核酸構築物上で導入することができ、またはｍＲＮＡ（例えば、インビトロ転写およびキャップ化ｍＲＮＡ）として提供することができる。
【００７４】
核酸は、ベクター中に取り込むことができる。ベクターは、担体から標的ＤＮＡ中に移動するように設計された任意の規定のＤＮＡセグメントを含む広義の用語である。ベクターは、発現ベクター、またはゲノムもしくは他の標的化されるＤＮＡ配列、例えば、エピソーム、プラスミド、もしくはさらにはウイルス／ファージＤＮＡセグメント中へのＤＮＡ挿入を生じさせるために必要とされる構成要素のセットであるベクター系と称することができる。動物における遺伝子送達に使用されるベクター系、例えば、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび統合ファージウイルス）、および非ウイルスベクター（例えば、トランスポゾン）は、２つの基本構成要素を有する：１）ＤＮＡ（またはｃＤＮＡに逆転写されるＲＮＡ）を含むベクターおよび２）トランスポゼース、リコンビナーゼ、またはベクターおよびＤＮＡ標的配列の両方を認識し、ベクターを標的ＤＮＡ配列中に挿入する他のインテグラーゼ酵素。ベクターは、１つ以上の発現制御配列を含む１つ以上の発現カセットを含有することが最も多く、発現制御配列は、それぞれ別のＤＮＡ配列またはｍＲＮＡの転写および／または翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列である。
【００７５】
多くの異なるタイプのベクターが公知である。例えば、プラスミドおよびウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターが公知である。哺乳動物発現プラスミドは、典型的には、複製起点、好適なプロモーターおよび任意選択のエンハンサー、ならびにさらには任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、ならびに５’フランキング非転写配列を有する。ベクターの例としては、プラスミド（別のタイプのベクターの担体でもあり得る）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（例えば、改変ＨＩＶ−１、ＳＩＶまたはＦＩＶ）、レトロウイルス（例えば、ＡＳＶ、ＡＬＶまたはＭｏＭＬＶ）、およびトランスポゾン（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、Ｐエレメント、Ｔｏｌ−２、Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ、ｐｉｇｇｙＢａｃ）が挙げられる。
【００７６】
本明細書において使用される、核酸という用語は、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方、例として、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成（例えば、化学合成）ＤＮＡ、ならびに天然存在および化学修飾核酸、例えば、合成塩基または代替骨格を指す。核酸分子は、二本鎖または一本鎖（すなわち、センスまたはアンチセンス一本鎖）であり得る。トランスジェニックという用語は、本明細書において広義に使用され、遺伝子操作技術を使用して遺伝子材料が変更された遺伝子改変生物または遺伝子操作生物を指す。したがって、ノックアウト偶蹄目は、外因性遺伝子または核酸がその動物またはその子孫中で発現されるか否かにかかわらず、トランスジェニックである。
【００７７】
遺伝子改変動物
動物は、ＴＡＬＥＮまたは他の遺伝子操作ツール、例として、リコンビナーゼ融合タンパク質、または公知の種々のベクターを使用して改変することができる。このようなツールにより作製される遺伝子改変は、遺伝子の破壊を含み得る。遺伝子の破壊という用語は、機能的遺伝子産物の形成の妨害を指す。遺伝子産物は、それがその通常の（野生型）機能を実行する場合にのみ機能的である。遺伝子の破壊は、遺伝子によりコードされる機能的因子の発現を妨害し、遺伝子によりコードされる配列中ならびに／または動物中の遺伝子の発現に必要なプロモーターおよび／もしくはオペレーターの１つ以上の塩基の挿入、欠失、または置換を含む。破壊される遺伝子は、例えば、動物のゲノムからの遺伝子の少なくとも一部の除去、遺伝子によりコードされる機能的因子の発現を妨害するための遺伝子の変更、干渉ＲＮＡ、または外因性遺伝子によるドミナントネガティブ因子の発現により破壊することができる。遺伝子改変動物の材料および方法は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる２０１２年２月２４日に出願された米国特許出願第１３／４０４，６６２号明細書、２０１２年５月９日に出願された米国特許出願第１３／４６７，５８８号明細書、および２００９年１１月１０日に出願された米国特許出願第１２／６２２，８８６号明細書にさらに詳述されており、矛盾する場合、本明細書が優先する。トランス作用という用語は、異なる分子からの標的遺伝子に対して（すなわち、分子間）作用するプロセスを指す。トランス作用エレメントは、通常、遺伝子を含有するＤＮＡ配列である。この遺伝子は、標的遺伝子の調節において使用されるタンパク質（またはマイクロＲＮＡもしくは他の拡散性分子）をコードする。トランス作用遺伝子は、標的遺伝子と同一の染色体上に存在し得るが、活性は、中間タンパク質またはそれがコードするＲＮＡを介するものである。トランス作用遺伝子の実施形態は、例えば、標的化エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子である。ドミナントネガティブを使用する遺伝子の不活性化は、一般に、トランス作用エレメントを含む。シス調節またはシス作用という用語は、タンパク質もＲＮＡもコードしない作用を意味し；遺伝子不活性化に関して、これは、一般に、遺伝子のコード部分、または機能的遺伝子の発現に必要なプロモーターおよび／もしくはオペレーターの不活性化を意味する。
【００７８】
当技術分野において公知の種々の技術を使用して遺伝子を不活性化してノックアウト動物を作製し、および／または核酸構築物を動物中に導入してファウンダー動物を生産し、ノックアウトまたは核酸構築物がゲノム中に統合されている動物系列を作製することができる。このような技術としては、限定されるものではないが、前核マイクロインジェクション（米国特許第４，８７３，１９１号明細書）、生殖系列中へのレトロウイルス媒介遺伝子導入（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：６１４８−１６５２）、胚性幹細胞中への遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｅｌｌ，５６：３１３−３２１）、胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３：１８０３−１８１４）、精子媒介遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１４２３０−１４２３５；Ｌａｖｉｔｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．，１８：１９−２３）、および体細胞、例えば、卵丘もしくは乳腺細胞、または生体、胎児、もしくは胚性幹細胞のインビトロ形質転換とそれに続く核移植（Ｗｉｌｍｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ，３８５：８１０−８１３；およびＷａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ，３９４：３６９−３７４）が挙げられる。前核マイクロインジェクション、精子媒介遺伝子導入、および体細胞核移植が特に有用な技術である。ゲノム改変されている動物は、細胞の全て、例として、生殖系列細胞が遺伝子改変を有する動物である。遺伝子改変がモザイクである動物を生産する方法を使用する場合、動物を同系交配することができ、ゲノム改変されている子孫を選択することができる。細胞が胚盤胞状態において改変される場合、例えば、クローン化を使用してモザイク動物を作製することができ、単一細胞が改変される場合、ゲノム改変が生じ得る。性的に成熟しないように改変されている動物は、使用される規定のアプローチに応じて改変についてホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。特定の遺伝子がノックアウト改変により不活性化される場合、ホモ接合性が通常要求される。特定の遺伝子がＲＮＡ干渉またはドミナントネガティブ方針により不活性化される場合、ヘテロ接合性が適切であることが多い。
【００７９】
典型的には、前核マイクロインジェクションにおいて、核酸構築物を受精卵中に導入し；精子頭部および卵からの遺伝子材料を含有する前核が原形質内で可視的であるため、１または２つの細胞受精卵を使用する。前核段階の受精卵は、インビトロまたはインビボ（すなわち、ドナー動物の卵管から外科的に回収する）で得ることができる。体外受精卵は、以下のとおり生産することができる。例えば、ブタ卵巣を食肉処理場において回収し、輸送の間２２〜２８℃において維持することができる。卵巣を洗浄し、卵胞吸引のために単離することができ、４〜８ｍｍに及ぶ卵胞を５０ｍＬのコニカル遠心管中に１８ゲージ針を使用して真空下で吸引することができる。卵胞液および吸引された卵母細胞は、市販のＴＬ−ＨＥＰＥＳ（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）によりプレフィルターに通してリンスすることができる。コンパクトな卵丘塊により包囲される卵母細胞を選択し、０．１ｍｇ／ｍＬのシステイン、１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子、１０％のブタ卵胞液、５０μＭの２−メルカプトエタノール、０．５ｍｇ／ｍｌのｃＡＭＰ、１０ＩＵ／ｍＬの妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のそれぞれが補給されたＴＣＭ−１９９卵母細胞成熟培地（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）中に加湿空気中で３８．７℃および５％のＣＯ２において約２２時間配置することができる。続いて、卵母細胞をｃＡＭＰも、ｍＰＭＳＧも、ｈＣＧを含有しない新たなＴＣＭ−１９９成熟培地に移動させ、さらに２２時間インキュベートすることができる。成熟卵母細胞をそれらの卵丘細胞から、０．１％のヒアルロニダーゼ中の１分間のボルテックス処理により剥がすことができる。
【００８０】
ブタについて、成熟卵母細胞を５００μｌのＭｉｎｉｔｕｂｅ  ＰＯＲＣＰＲＯ  ＩＶＦ培地系（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）中においてＭｉｎｉｔｕｂｅ５ウェル受精ディッシュ中で受精させることができる。体外受精（ＩＶＦ）についての調製において、新たに回収され、または冷凍された雄ブタ精液を洗浄し、ＰＯＲＣＰＲＯ  ＩＶＦ培地中で４×１０５個の精子に再懸濁させることができる。精子濃度は、コンピュータ支援精液分析（ＳＰＥＲＭＶＩＳＩＯＮ，Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）により分析することができる。最終的な試験管内授精は、雄ブタに応じて１０μｌの容量で約４０個の運動性精子／卵子の最終濃度において実施することができる。全ての受精卵母細胞を、５．０％のＣＯ２雰囲気中で３８．７℃において６時間インキュベートする。授精の６時間後、推定接合子をＮＣＳＵ−２３中で２回洗浄し、０．５ｍＬの同一培地に移動させることができる。この系は、ほとんどの雄ブタにわたり、１０〜３０％の多精子授精率で２０〜３０％の胚盤胞を定型的に生産し得る。
【００８１】
直鎖化核酸構築物を前核の１つの中に注入することができる。次いで、注入された卵をレシピエント雌に（例えば、レシピエント雌の卵管中に）移植し、レシピエント雌中で発育させてトランスジェニック動物を生産することができる。特に、体外受精胚は、１５，０００×ｇにおいて５分間遠心分離して脂質を沈降させ、前核の可視化を可能とすることができる。胚は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＦＥＭＴＯＪＥＴ注入器を使用して注入することができ、胚盤胞形成まで培養することができる。胚分割および胚盤胞形成の速度ならびに質を記録することができる。
【００８２】
胚は、非同期レシピエントの子宮中に外科的に移植することができる。典型的には、５．５インチＴＯＭＣＡＴ（登録商標）カテーテルを使用して１００〜２００（例えば、１５０〜２００）個の胚を卵管の膨大部−峡部境界中に配置することができる。術後、妊娠のリアルタイム超音波試験を実施することができる。
【００８３】
体細胞核移植において、上記の核酸構築物を含むトランスジェニック偶蹄目細胞（例えば、トランスジェニックブタ細胞またはウシ細胞）、例えば、胚割球、胎児線維芽細胞、成体耳線維芽細胞、または顆粒膜細胞を、除核卵母細胞中に導入して複合細胞を樹立することができる。卵母細胞は、極体付近で部分的に透明帯を切開し、次いで切開区域において細胞質を押し出すことにより除核することができる。典型的には、鋭く斜めに切られた先端部を有する注入ピペットを使用してトランスジェニック細胞を、第２減数分裂において停止させた除核卵母細胞中に注入する。一部の慣用例において、第２減数分裂において停止させた卵母細胞を卵と称する。ブタまたはウシ胚を生産した後（例えば、卵母細胞の融合および活性化により）、活性化の約２０〜２４時間後に胚をレシピエント雌の卵管に移植する。例えば、Ｃｉｂｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０：１２５６−１２５８および米国特許第６，５４８，７４１号明細書参照。ブタについて、レシピエント雌は、胚の移植約２０〜２１日後に妊娠について確認することができる。
【００８４】
標準的な交配技術を使用して最初のヘテロ接合性ファウンダー動物からの外因性核酸についてホモ接合性の動物を作出することができる。しかしながら、ホモ接合性は、要求されないこともある。本明細書に記載のトランスジェニックブタは、他の目的のブタと交配することができる。
【００８５】
一部の実施形態において、目的核酸および選択マーカーは、別個のトランスポゾン上で提供し、不等量で胚または細胞のいずれかに提供することができ、選択マーカーを含有するトランスポゾンの量は、目的核酸を含有するトランスポゾンを大幅に超過する（５〜１０倍過剰）。目的核酸を発現するトランスジェニック細胞または動物は、選択マーカーの存在および発現に基づき単離することができる。トランスポゾンはゲノム中に正確に、および非連鎖で統合するため（独立転移イベント）、目的核酸および選択マーカーは、遺伝的に連鎖させず、標準的な交配を介する遺伝的分離により容易に分離することができる。したがって、公衆安全性の観点からの一部の懸念事項である、後続の世代における選択マーカーの保持が拘束されないトランスジェニック動物を生産することができる。
【００８６】
トランスジェニック動物を生成したら、標準的技術を使用して外因性核酸の発現を評価することができる。初回スクリーニングは、サザンブロット分析により達成して構築物の統合が生じたか否かを決定することができる。サザン分析の記載については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ；ＮＹのセクション９．３７〜９．５２参照。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を初回スクリーニングにおいて使用することもできる。ＰＣＲは、標的核酸を増幅させる手順または技術を指す。一般に、目的領域の末端またはその外側からの配列情報を用いて増幅させるべきテンプレートの逆鎖と配列が同一または類似のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。ＰＣＲを使用してＤＮＡおよびＲＮＡからの特異的配列、例として、全ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡからの配列を増幅させることができる。プライマーは、典型的には、１４〜４０ヌクレオチド長であるが、１０ヌクレオチドから数百ヌクレオチド長に及び得る。ＰＣＲは、例えば、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５に記載されている。核酸は、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、自律配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、または増幅核酸配列ベース増幅により増幅させることもできる。例えば、Ｌｅｗｉｓ（１９９２）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ，１２：１；Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１８７４；およびＷｅｉｓｓ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１２９２参照。胚盤胞段階において、胚は、ＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーションおよびスプリンケレットＰＣＲによる分析のために個々に処理することができる（例えば、Ｄｕｐｕｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００２）９９：４４９５参照）。
【００８７】
トランスジェニックブタの組織中のポリペプチドをコードする核酸配列の発現は、例えば、動物から得られた組織試料のノザンブロット分析、インサイチューハイブリダイゼーション分析、ウエスタン分析、免疫アッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ、および逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられる技術を使用して評価することができる。
【００８８】
干渉ＲＮＡ
種々の干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）が公知である。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、相同遺伝子転写物の配列特異的分解を誘導する。ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）は、ｄｓＲＮＡを小さい２１〜２３ヌクレオチドの小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に代謝する。ＲＩＳＣは、二本鎖ＲＮアーゼ（ｄｓＲＮアーゼ、例えば、ダイサー）およびｓｓＲＮアーゼ（例えば、Ａｒｇｏｎａｕｔ２またはＡｇｏ２）を含有する。ＲＩＳＣは、開裂可能な標的を見出すためのガイドとしてアンチセンス鎖を利用する。ｓｉＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の両方が公知である。遺伝子改変動物中の遺伝子を破壊する方法は、標的遺伝子および／または核酸の発現が低減するように標的遺伝子および／または核酸に対するＲＮＡ干渉を誘導することを含む。
【００８９】
例えば、外因性核酸配列は、ポリペプチドをコードする核酸に対するＲＮＡ干渉を誘導し得る。例えば、標的ＤＮＡと相同な二本鎖小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または小分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用してそのＤＮＡの発現を低減させることができる。ｓｉＲＮＡのための構築物は、例えば、Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８０６；Ｒｏｍａｎｏ  ａｎｄ  Ｍａｓｉｎｏ（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６：３３４３；Ｃｏｇｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）ＥＭＢＯ  Ｊ．，１５：３１５３；Ｃｏｇｏｎｉ  ａｎｄ  Ｍａｓｉｎｏ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ，３９９：１６６；Ｍｉｓｑｕｉｔｔａ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：１４５１；およびＫｅｎｎｅｒｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｈｅｗ（１９９８）Ｃｅｌｌ，９５：１０１７に記載のとおり生産することができる。ｓｈＲＮＡのための構築物は、ＭｃＩｎｔｙｒｅ  ａｎｄ  Ｆａｎｎｉｎｇ（２００６）ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１により記載されているとおりに生産することができる。一般に、ｓｈＲＮＡは、アニールし、短鎖ヘアピンを形成し得る相補的領域を含有する一本鎖ＲＮＡ分子として転写される。
【００９０】
特異的遺伝子に指向される単一の個々の機能的ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを見出す確率は、高い。例えば、ｓｉＲＮＡの特異的配列の予測可能性は、約５０％であるが、少なくとも１つが効率的な良好な信頼性を有する多数の干渉ＲＮＡを作製することができる。
【００９１】
実施形態は、遺伝子、例えば、発生段階に選択的な遺伝子に対して指向されるＲＮＡｉを発現するインビトロ細胞、インビボ細胞、および遺伝子改変動物、例えば、家畜動物を含む。例えば、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＲＩＳＣおよびｍｉＲＮＡからなる群から選択することができる。
【００９２】
誘導性系
誘導性系を使用して遺伝子の発現を制御することができる。遺伝子の発現の時空間的制御を可能とする種々の誘導性系が公知である。いくつかは、トランスジェニック動物中でインビボで機能的であることが証明されている。誘導性系という用語は、慣習的なプロモーターおよび誘導性遺伝子発現エレメントを含む。
【００９３】
誘導性系の一例は、核酸の転写を調節するために使用することができるテトラサイクリン（ｔｅｔ）−ｏｎプロモーター系である。この系においては、突然変異Ｔｅｔ抑制因子（ＴｅｔＲ）を単純ヘルペスウイルスＶＰ１６トランス活性化因子タンパク質の活性化ドメインに融合させてテトラサイクリン制御性転写活性化因子（ｔＴＡ）を作出し、これはｔｅｔまたはドキシサイクリン（ｄｏｘ）により調節される。抗生物質の不存在下では転写は最小限である一方、ｔｅｔまたはｄｏｘの存在下では転写が誘導される。代替的な誘導性系としては、エクジソンまたはラパマイシン系が挙げられる。エクジソンは、エクジソン受容体およびウルトラスピラクル遺伝子（ＵＳＰ）の産物のヘテロ二量体により生産が制御される昆虫脱皮ホルモンである。発現は、エクジソンまたはエクジソン類似体、例えば、ムリステロンＡによる処理により誘導される。誘導性系を惹起するために動物に投与される薬剤は、誘導剤と称される。
【００９４】
より一般に使用される誘導性系には、テトラサイクリン誘導性系およびＣｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系（構成的または誘導性のいずれか）がある。テトラサイクリン誘導性系は、テトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）／リバースｔＴＡ（ｒｔＴＡ）を含む。これらの系をインビボで使用する方法は、２つの系統の遺伝子改変動物を生成することを含む。１つの動物系統は、選択されたプロモーターの制御下で活性化因子（ｔＴＡ、ｒｔＴＡ、またはＣｒｅリコンビナーゼ）を発現する。トランスジェニック動物の別のセットは、目的遺伝子（または改変すべき遺伝子）の発現がｔＴＡ／ｒｔＴＡトランス活性化因子についての標的配列の制御下にある（またはｌｏｘＰ配列によりフランキングされている）アクセプターを発現する。２つのマウス株の交配は、遺伝子発現の制御を提供する。
【００９５】
テトラサイクリン依存性調節系（ｔｅｔ系）は、２つの構成要素、すなわち、テトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡまたはｒｔＴＡ）および下流ｃＤＮＡの発現を制御するｔＴＡ／ｒｔＴＡ依存性プロモーターにテトラサイクリン依存的に頼る。テトラサイクリンまたはその誘導体（例えば、ドキシサイクリン）の不存在下では、ｔＴＡはｔｅｔＯ配列に結合し、ｔＴＡ依存性プロモーターの転写活性化を可能とする。しかしながら、ドキシサイクリンの存在下では、ｔＴＡはその標的と相互作用し得ず、転写は生じない。ｔＴＡを使用するｔｅｔ系は、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンが転写下方調節を可能とするため、ｔｅｔ−ＯＦＦと称される。テトラサイクリンまたはその誘導体の投与により、インビボでのトランス遺伝子発現の時間的制御が可能になる。ｒｔＴＡは、ドキシサイクリンの不存在下では機能的でないが、トランス活性化のためにリガンドの存在を要求するｔＴＡのバリアントである。したがって、このｔｅｔ系はｔｅｔ−ＯＮと称される。ｔｅｔ系は、例えば、レポーター遺伝子、癌遺伝子、またはシグナリングカスケードに関与するタンパク質をコードするいくつかのトランス遺伝子の誘導性発現にインビボで使用されている。
【００９６】
Ｃｒｅ／ｌｏｘ系はＣｒｅリコンビナーゼを使用し、これは、２つの区別されるＣｒｅ認識配列、すなわち、ｌｏｘＰ部位の間で入れ換わることによる部位特異的組換えを触媒する。２つのｌｏｘＰ配列の間に導入されたＤＮＡ配列（フロックスＤＮＡと称される）がＣｒｅ媒介組換えにより切り出される。空間的制御（組織特異的または細胞特異的プロモーターによる）または時間的制御（誘導性系による）のいずれかを使用するトランスジェニック動物におけるＣｒｅ発現の制御は、２つのｌｏｘＰ部位間のＤＮＡの切り出しの制御をもたらす。１つの適用は、条件的遺伝子不活性化（条件的ノックアウト）である。別のアプローチは、フロックス終止コドンがプロモーター配列および目的ＤＮＡ間に挿入されるタンパク質過剰発現である。遺伝子改変動物は、Ｃｒｅが発現されてフロックス終止コドンの切り出しがもたらされるまでトランス遺伝子を発現しない。この系は、組織特異的腫瘍形成およびＢリンパ球中のアンチジーン（ａｎｔｉｇｅｎｅ）受容体発現の制御に適用されている。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼも開発されている。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼは、外因性リガンドの投与によってのみ活性化される。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼは、元のＣｒｅリコンビナーゼおよび特異的リガンド結合ドメインを含有する融合タンパク質である。Ｃｒｅリコンビナーゼの機能的活性は、融合タンパク質中のこの特異的ドメインに結合し得る外部リガンドに依存的である。
【００９７】
実施形態は、誘導性系の制御下にある遺伝子を含むインビトロ細胞、インビボ細胞、および遺伝子改変動物、例えば家畜動物を含む。動物の遺伝子改変は、ゲノミックまたはモザイクであり得る。誘導性系は、例えば、Ｔｅｔ−Ｏｎ、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ、Ｃｒｅ−ｌｏｘ、およびＨｉｆ１アルファからなる群から選択することができる。一実施形態は、例えば、ＤＡＺＬ、ｖａｓａ、ＣａｔＳｐｅｒ、ＫＣＮＵ１、ＤＮＡＨ８、および精巣発現遺伝子（Ｔｅｓｔｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｇｅｎｅ）１１（Ｔｅｘ１１）からなる群における本明細書に記載の遺伝子である。
【００９８】
ドミナントネガティブ
したがって、遺伝子は、除去またはＲＮＡｉ抑制だけでなく、その遺伝子産物の通常の機能に対して阻害効果を有するタンパク質のドミナントネガティブバリアントの作出／発現によっても破壊することができる。ドミナントネガティブ（ＤＮ）遺伝子の発現は、表現型の変更をもたらし得、ａ）タイトレーション効果；（ＤＮは、同一の活性を構成せずに内因性遺伝子の協調的因子または通常標的のいずれかについて内因性遺伝子産物と受動的に競合する）、ｂ）ドミナントネガティブ遺伝子産物が通常の遺伝子機能に要求されるプロセスと能動的に干渉するポイズンピル（またはモンキーレンチ）効果、ｃ）ＤＮが遺伝子機能の負の調節因子を能動的に刺激するフィードバック効果により発揮される。
【００９９】
ファウンダー動物、動物系統、形質、および生殖
ファウンダー動物は、クローン化および本明細書に記載の他の方法により生産することができる。ファウンダーは、接合子または初代細胞がホモ接合性の改変を受ける場合のように、遺伝子改変についてホモ接合性であり得る。同様に、ヘテロ接合性のファウンダーを作製することもできる。ファウンダーはゲノム的に改変されていてもよく、このことは、そのゲノムにおける細胞の全てが改変を受けていることを意味する。ファウンダーは、ベクターを胚における複数の細胞の１つに、典型的には胚盤胞段階において導入する場合に起こり得るように、改変についてモザイクであり得る。モザイク動物の子孫を試験してゲノム的に改変されている子孫を同定することができる。有性生殖させることができ、または生殖補助技術により生殖させることができ、異種またはホモ接合性の子孫が常に改変を発現する動物のプールが作出された場合、動物系統が樹立される。
【０１００】
家畜において、多くのアレルが、種々の形質、例えば、生産形質、体型形質、作業性形質、および他の機能的形質に結びつけられることが公知である。当業者はこれらの形質を監視し、定量化することに慣れている、例えば、Ｖｉｓｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４０（１９９４）１２３−１３７、米国特許第７，７０９，２０６号明細書、米国特許出願公開第２００１／００１６３１５号明細書、米国特許出願公開第２０１１／００２３１４０号明細書、および米国特許出願公開第２００５／０１５３３１７号明細書。動物系統は、生産形質、体型形質、作業性形質、受精能形質、母性形質、および疾患耐性形質からなる群の形質から選択される形質を含み得る。さらなる形質としては、組換え遺伝子産物の発現が挙げられる。
【０１０１】
所望の１つまたは複数の形質を有する動物を改変してそれらの生殖を妨害することができる。したがって、１つ以上の形質を有するように交配され、または改変された動物を被提供者に提供することができ、被提供者が動物を交配し、形質の価値を独占して流用するリスクが低減する。
【０１０２】
受精能または性的受精能を誘導するために化合物の投与が要求される動物の交配は、有利には処理施設において達成することができる。処理施設は、十分に管理される家畜に対して標準化されたプロトコルを実行して一貫した動物を効率的に生産し得る。動物子孫は、複数の育成場所に分配することができる。したがって、農場および農業従事者（牧場および牧場主を含む用語）は、規定範囲の年齢および／または体重および／または形質を有する所望の数の子孫を注文し、所望の時期および／または場所に送達させることができる。次いで、被提供者、例えば、農業従事者はその動物を育成し、所望により市場に出すことができる。
【０１０３】
実施形態は、有性生殖し得ないように遺伝子が破壊された遺伝子改変家畜動物を、（例えば、１つ以上の場所に、複数の農場に）送達することを含む。動物は１つ以上の形質（例えば、所望の形質または高価値の形質または新規形質または組換え形質を発現するもの）を有し得る。実施形態は、前記動物を提供することおよび／または前記動物を交配することをさらに含む。
【０１０４】
リコンビナーゼ
本発明の実施形態は、標的化されるヌクレアーゼ系をリコンビナーゼ（例えば、ＲｅｃＡタンパク質、Ｒａｄ５１）またはＤＮＡ組換えに関連する他のＤＮＡ結合タンパク質と投与することを含む。リコンビナーゼは、核酸断片とフィラメントを形成し、事実上、細胞ＤＮＡを探索してその配列と実質的に相同なＤＮＡ配列を見出す。例えば、リコンビナーゼは、ＨＤＲについてのテンプレートとして機能する核酸配列と組み合わせることができる。次いで、リコンビナーゼをＨＤＲテンプレートと組み合わせてフィラメントを形成し、細胞中に配置することができる。リコンビナーゼおよび／またはリコンビナーゼと組み合わさるＨＤＲテンプレートは、細胞または胚中に、タンパク質、ｍＲＮＡとして配置し、またはリコンビナーゼをコードするベクターにより配置することができる。米国特許出願公開第２０１１／００５９１６０号明細書（米国特許出願第１２／８６９，２３２号明細書）の開示が、本明細書により全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれ、矛盾する場合、本明細書が優先する。リコンビナーゼという用語は、細胞中で２つの比較的長いＤＮＡ鎖間の比較的短いＤＮＡ片の結合を酵素的に触媒する遺伝子組換え酵素を指す。リコンビナーゼとしては、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、ＲｅｃＡ、ＲＡＤ５１、Ｃｒｅ、およびＦＬＰが挙げられる。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位間のＤＮＡの部位特異的組換えを触媒するＰ１バクテリオファージからのＩ型トポイソメラーゼである。Ｈｉｎリコンビナーゼは、細菌のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）中に見出される１９８アミノ酸から構成される２１ｋＤのタンパク質である。Ｈｉｎは、ＤＮＡ開裂および組換えの開始を活性部位セリンに頼るＤＮＡインベルターゼのセリンリコンビナーゼファミリーに属する。ＲＡＤ５１はヒト遺伝子である。この遺伝子によりコードされるタンパク質は、ＤＮＡ二本鎖分解の修復を支援するＲＡＤ５１タンパク質ファミリーのメンバーである。ＲＡＤ５１ファミリーメンバーは、細菌ＲｅｃＡおよび酵母Ｒａｄ５１と相同である。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位によりフランキングされる規定の配列を欠失させるための実験において使用される酵素である。ＦＬＰは、パン酵母の出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２μプラスミドに由来するフリッパーゼ組換え酵素（ＦＬＰまたはＦｌｐ）を指す。
【０１０５】
本明細書において、「ＲｅｃＡ」または「ＲｅｃＡタンパク質」は、同一機能、特に：（ｉ）ＤＮＡポリメラーゼによる後続の伸長のため、オリゴヌクレオチまたはポリヌクレオチドをその相同性標的上に適切に位置決めする能力；（ｉｉ）ＤＮＡ合成のため、二重鎖核酸をトポロジー的に調製する能力；および（ｉｉｉ）相補的配列を効率的に見出してそれに結合するＲｅｃＡ／オリゴヌクレオチドまたはＲｅｃＡ／ポリヌクレオチド複合体の能力の本質的に全てまたはほとんどを有するＲｅｃＡ様組換えタンパク質のファミリーを指す。最良に特徴決定されたＲｅｃＡタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのものであり；このタンパク質の元のアレル形態に加え、いくつかの突然変異ＲｅｃＡ様タンパク質、例えば、ＲｅｃＡ８０３が同定されている。さらに、多くの生物、例として、例えば、酵母、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ヒトを含む哺乳動物、および植物が、ＲｅｃＡ様鎖転移タンパク質を有する。これらのタンパク質としては、例えば、Ｒｅｃ１、Ｒｅｃ２、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｂ、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｒａｄ５１Ｅ、ＸＲＣＣ２およびＤＭＣ１が挙げられる。組換えタンパク質の一実施形態は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質である。あるいは、ＲｅｃＡタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異ＲｅｃＡ−８０３タンパク質、別の細菌源由来のＲｅｃＡタンパク質または別の生物からの相同組換えタンパク質であり得る。
【０１０６】
組成物およびキット
本発明はまた、例えば、部位特異的エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ、Ｃａｓ９、ＺＮＦ、ＴＡＬＥＮ、ＲｅｃＡ−ｇａｌ４融合物をコードする核酸分子、そのポリペプチドを含有する組成物およびキット、そのような核酸分子もしくはポリペプチド、または遺伝子操作細胞系を含有する組成物を提供する。示されるアレルの遺伝子移入について効率的なＨＤＲを提供することもできる。このようなアイテムは、例えば、研究ツールとして、または治療的に使用することができる。
【実施例】
【０１０７】
材料および方法、例として、ＴＡＬＥＮを作製する方法は、一般に、特に記載のない限り、２０１２年８月２４日に出願された米国特許出願第１３／５９４，６９４号明細書に記載されているとおりである。
【０１０８】
実施例１：Ｙ染色体改変のためのＴＡＬＥＮ。
形質移入  −  線維芽細胞を培養し、既に記載されているヌクレオフェクションにより形質移入する（Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。トランスポゾンは、実験中の合計１μｇを構成する。相同性依存性修復（ＨＤＲ）分析のため、二本鎖分解（ＤＳＢ）誘導のための最良の実施条件を選択し、修復テンプレートをＴＡＬＥＮプラスミドに等量、３および１０倍過剰において添加する。細胞培養  −  個々のコロニーの単離は、所定密度における９６ウェルプレート中の選択により実施してウェルの３０〜５０％中のコロニーをもたらす。インデル検出集団  −  約５００ｂｐのアンプリコンをもたらすように標的部位をフランキングするプライマーを設計する。ＰＣＲアンプリコンをＳＵＲＶＥＹＯＲ（登録商標）ヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，Ｏｍａｈａ  ＮＥ）により提案のとおりにより処理し、８〜１０％のポリアクリルアミドゲル上で分解する。インデル陽性胚盤胞からのアンプリコンの一部をクローン化し、配列決定して突然変異を特徴決定した。インデル検出コロニー  −  上記で使用される標的部位をフランキングするプライマーを、高解像度融解分析ｑＰＣＲマスターミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する増幅に使用し、融解曲線分析を実施する。リアルタイムＰＣＲ産物の融解プロファイルの変動は、ＴＡＬＥＮ誘導突然変異を担持するクローンを野生型配列から区別する。アンプリコン由来非形質移入対照細胞の融解温度の通常の変動を参照として使用する。通常の変動外の融解プロファイルを有するアンプリコンをクローン化し、配列決定して突然変異を特徴決定する。Ｙ標的化検出  −  ＰＣＲアッセイを相同性アームの外側のプライマーおよびアーム内の１つのプライマーにより開発して相同組換えが生じた場合にのみ考えられる産物をもたらす。ＰＣＲ陽性コロニーをホールゲノム増幅サザンブロッティングにより検証する。Ｙ標的化を確認するためのＷＧＡサザンブロッティング  −  ＲＥＰＬＩ−ｇ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）の半反応を「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  ｏｒ  Ｃｅｌｌｓ」プロトコルに従って使用してＷＧＡを個々のクローンに対して実施する。サザンブロッティングのためのプローブをハイブリダイズさせて標的化される細胞の５’および３’ジャンクションを検証する。ＦＡＣＳ−ＸおよびＹ担持精細胞のソーティングのために、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２が６．２５ｕＭの濃度に添加された１ｍｌのＢＴＳ中に１５００万個の精子を装入することにより新たな精液を調製する。この調製物を３５℃において４５分間インキュベートする。精子ソーティングのための標準的な改変を有する改変フローサイトメーターを使用してＸおよびＹ担持精子をＤＮＡ含有率によりソーティングする（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｉｎｋｅｌ，１９８６）。ソーティングされた集団の精度は、ＸおよびＹ標的についての定量的ＰＣＲにより決定する。血清ホルモン計測  −  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）からの市販のＥＬＩＳＡキットを使用してテストステロンおよびＦＳＨの血清レベルを評価する。
【０１０９】
Ｙ染色体遺伝子付加についての２つの候補遺伝子座に対して指向される４つのＴＡＬＥＮペアを作製した（図４）。第１の候補は、２つの最大ランキングポリアデニル化シグナル外でＳＲＹの３’側１．７ｋｂで局在する。第２の候補遺伝子座は、ＡＭＥＬＹ遺伝子のＹ特異的イントロンである。これらの遺伝子座は、ウシとの比較およびブタ：ウシ比較遺伝子マッピングデータに基づきＳＳＣＹの偽常染色体境界の外側に存在すると予測される（Ｑｕｉｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｖａｎ  Ｌａｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。したがって、これらはＳＳＣＸまたは常染色体との組換えを受け得ず、したがって、多世代にわたりＳＳＣＹ上で維持されることが予測される。試験された４つのＴＡＬＥＮペアの３つにより、高い活性が明らかになった（図４）。
【０１１０】
実施例２  単および両アレルＫＯクローンの単離。
Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２は、トランスジェニック初代線維芽細胞を効率的に拡張させ、非トランスジェニック線維芽細胞（フィーダー細胞）と標準的密度（＞１５０個の細胞／ｃｍ２）においてプレーティングし、上記に適用されるトランスポゾン同時選択技術を使用する薬物選択に供した場合にコロニーとして単離する家畜における標的遺伝子の改変を記載している（Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．２０：１１２５および２０１２年５月９日に出願された米国特許出願公開第２０１２／０２２００３７号明細書）。これらの技術は、動物をクローン化するために使用することができる体細胞の遺伝子変化の作製に有用である。
【０１１１】
一例として、６つのＴＡＬＥＮペアにより処理された細胞についてピューロマイシン耐性コロニーを単離し、それらの遺伝子型を評価した。一般に、インデル陽性クローンの比率は、３日目の改変レベルに基づきなされた予測と類似した。両アレルノックアウトクローンは、７つの異なるＴＡＬＥＮペアの６つについて同定され、インデル陽性細胞の最大３５パーセント中で生じた。大多数の例において、インデルは、それぞれのアレル上のユニークなインデルではなくホモ接合性であり（それぞれのアレル上の同一のインデル）、このことは、姉妹染色分体テンプレート化修復が共通であることを示唆した。特に、改変クローンでは、大多数のＴＡＬＥＮペアについての両アレル改変の頻度（１７〜６０％）は、染色体開裂を独立イベントとして処理する場合、３日目の改変レベル（１０〜１７％）に基づく予測を超過する。
【０１１２】
実施例３  家畜細胞中のＨＤＲのための標的としてのＴＡＬＥＮ媒介ＤＮＡ開裂。
ブタ低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子の第４エキソンに標的化されるＴＡＬＥＮペア（ＬＤＬＲ４．２）を、ブタＬＤＬＲ遺伝子に対応する相同性アームおよびＨＤＲ時にネオマイシンホスホトランスフェラーゼの発現を可能とする遺伝子トラップを含有するスーパーコイルドプラスミドＬｄｌｒ−Ｅ４Ｎ−ｓｔｏｐと同時形質移入した。培養３日後、ＰＣＲ分析により、抗生物質選択なしでも、ＨＤＲイベントに対応するバンドを３０℃において標的化される遺伝子座において検出することができることが明らかになった。ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８）による１４日間の培養細胞の集団の選択は、ＨＤＲ細胞の顕著な濃縮をもたらした。
【０１１３】
実施例４  テンプレート化のための一本鎖ＤＮＡ。
Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１３は、遺伝子のテンプレートドライブ型改変の一本鎖ＤＮＡの使用を記載している。一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）は、ＴＡＬＥＮ刺激ＨＲのための効率的なテンプレートである。１１塩基対のＢｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅウシ突然変異をＷａｇｙｕ細胞中に遺伝子移入させるように遺伝子座を標的化した。１１塩基対を欠失するＢＢ  ＧＤＦ８遺伝子のセンスまたはアンチセンス鎖のいずれかを模倣するように２つの７６塩基対ｓｓＯＤＮを設計した。４マイクログラムのＴＡＬＥＮコードプラスミドをＷａｇｙｕ細胞中に形質移入し、０．３ｎＭｏｌのｓｓＯＤＮをＴＡＬＥＮ（Ｎ）と同時形質移入し、またはＭｉｒｕｓＬＴ１（Ｍ）試薬もしくはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ試薬（Ｌ）のいずれかによりＴＡＬＥＮヌクレオフェクションの２４時間後に送達した。３日目における半定量ＰＣＲは、ｓｓＯＤＮをＴＡＬＥＮ形質移入の２４時間後にＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ＬＴＸ試薬により送達した条件において最大５％のアレル変換頻度が送達されたことを示した。標的に対して設計されたセンスおよびアンチセンスｓｓＯＤＮ間でＰＣＲシグナルの差は観察されなかった。
【０１１４】
実施例５  オリゴＨＤＲを使用してブタ（Ｏｓｓａｂａｗ）細胞中に導入されるアレル。
Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）は、ある種中で天然に生じるアレルを別の種に配置する（種間移動）ためのｍＲＮＡコードＴＡＬＥＮおよび一本鎖オリゴヌクレオチドの組合せによる細胞の改変を記載している。ＰｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅＧＦＤ８ＳＮＰ  Ｃ３１３Ｙが、一例として選択され、Ｏｓｓａｂｏｗブタ細胞中に導入された。これらの細胞中では、いずれの段階においてもマーカーは使用されなかった。０．４ｎｍｏｌのｓｓＯＤＮにおいてＨＤＲの類似ピークがブタおよびウシ細胞間で観察されたが（示さず）、ＨＤＲは、Ｏｓｓａｂａｗ線維芽細胞中のより高濃度のｓｓＯＤＮによっては消失しなかった。
【０１１５】
実施例６  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９設計および生産。
遺伝子特異的ｇＲＮＡ配列をＣｈｕｒｃｈ実験室ｇＲＮＡベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ番号：４１８２４）中にその研究者らの方法に従ってクローン化した。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ｈＣａｓ９プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ番号：４１８１５）またはＲＣＩＳｃｒｉｐｔ−ｈＣａｓ９から合成されたｍＲＮＡのいずれかの同時形質移入により提供された。このＲＣＩＳｃｒｉｐｔ−ｈＣａｓ９は、ｈＣａｓ９プラスミド（ｈＣａｓ９ｃＤＮＡを包含）からのＸｂａＩ−ＡｇｅＩ断片の、ＲＣＩＳｃｒｉｐｔプラスミド中へのサブクローン化により構築した。ｍＲＮＡの合成は、上記のとおり実施したが、但し直鎖化はＫｐｎＩを使用して実施した。
【０１１６】
実施例７  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲを使用してイボイノシシからのｐ６５Ｓ５３１Ｐ突然変異を慣用のブタ中に遺伝子移入した。図５を参照すると、パネルａ）において、Ｓ５３１Ｐミスセンス突然変異をブタｐ６５（ＲＥＬＡ）のヌクレオチド１５９１におけるＴ−Ｃトランシジョンにより引き起こした。Ｓ−Ｐ  ＨＤＲテンプレートは、新規ＸｍａＩ部位を導入し、ＲＦＬＰスクリーニングを可能とする原因ＴＣトランシジョン突然変異（大文字）を含む。２つのｇＲＮＡ配列（Ｐ６５＿Ｇ１ＳおよびＰ６５＿Ｇ２Ａ）を、予備実験において使用されるｐ６５．８ＴＡＬＥＮとともに示す。パネルｂ）において、Ｌａｎｄｒａｃｅ線維芽細胞を、Ｓ−Ｐ−ＨＤＲオリゴ（２μＭ）、ｈＣａｓ９をコードする２つの量のプラスミド（０．５μｇと２．０μｇ）；５つの量のＧ２Ａ転写プラスミド（０．０５〜１．０μｇ）により形質移入した。それぞれの形質移入からの細胞を６０：４０に分け、それぞれ３０および３７℃において３日間培養してから１０日目まで３７℃において培養を延長した。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより、１６〜３０％に及ぶ活性が明らかになった。パネルｃおよびｄ）３および１０日目において試料採取された細胞のＲＦＬＰ分析。１９１および１１８ｂｐの予測開裂産物を黒色矢印により示す。ＤＳＢと標的ＳＮＰとの近接性にかかわらず、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲはＳ５３１Ｐの遺伝子移入についてＴＡＬＥＮより効率的でなかった。それぞれのｇＲＮＡ配列を使用して個々のコロニーも分析した。
【０１１７】
実施例８  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９。
ブタＡＰＣにおけるＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲの比較。図６を参照すると、パネルａ）において、ＡＰＣ１４．２ＴＡＬＥＮおよびｇＲＮＡ配列ＡＰＣ１４．２Ｇ１ａを、野生型ＡＰＣ配列に対して示す。最下段に、新規ＨｉｎｄＩＩＩ部位をもたらす４ｂｐ挿入（文字参照）を送達するＨＤＲオリゴを示す。次いで、２μＭのオリゴＨＤＲテンプレート、および１μｇのＴＡＬＥＮｍＲＮＡ、ｈＣａｓ９をコードする１μｇのそれぞれのプラスミドＤＮＡおよびｇＲＮＡ発現プラスミドのいずれか；またはｈＣａｓ９をコードする１μｇのｍＲＮＡおよび０．５μｇのｇＲＮＡ発現プラスミドにより形質移入されたブタ線維芽細胞を分け、３０または３７℃のいずれかにおいて３日間培養してから１０日目まで３７℃において拡張させた。パネルｂ）ＲＦＬＰおよびＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ結果を示すチャート。既に決定されたとおり、ＴＡＬＥＮ刺激ＨＤＲは３０℃において最も効率的であった一方、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲが３７℃において最も効率的であった。この遺伝子座について、ＴＡＬＥＮは、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイにより計測された類似ＤＮＡ切断頻度にかかわらずＨＤＲの刺激についてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系より効率的であった。ＴＡＬＥＮとは対照的に、ｈＣａｓ９をプラスミドに対してｍＲＮＡとして送達した場合にＨＤＲにほとんど差が存在しなかった。
【０１１８】
実施例９  Ｙ染色体の標的化。
ＴＡＬＥＮおよびプラスミド相同性カセットの組合せを使用してｍＣａｇｇｓ−ＥＧＦＰカセットをＹ染色体に標的化した。この実験目的のため、陽性配向は、トランス遺伝子カセットの両方および内因性遺伝子（ＳＲＹまたはＡＭＥＬＹ）が同一配向である場合であり、陰性配向は、それらを逆の配向である場合である。１マイクログラムのＴＡＬＥＮｍＲＮＡと５００ｎｇの相同性カセットを、単一の１００ｕｌのエレクトロポレーションで６００，０００個の細胞と混合した。ＮＥＯＮエレクトロポレーション系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して細胞を形質移入し、３０℃において３日間培養し、単一細胞由来コロニーの誘導のために低密度においてプレーティングした。相同性アームの外側の１つプライマーおよびトランス遺伝子カセット内の第２のプライマーを使用するジャンクションＰＣＲによりＹ染色体の正確な標的化についてコロニーを分析した。いくつかのコロニーを予測アンプリコンについて陽性であった。図８は、図７に示される結果のまとめである。Ｙ標的化について陽性のクローンは、６〜２４パーセントに及んだ。トランス遺伝子カセットの配向は、Ｙ標的化の効率に対するいくらかの効果を有すると考えられた。
【０１１９】
実施例１０  Ｙ染色体の短鎖相同性標的化。
プラスミド相同性カセットの代替法として、ＡＭＥＬＹおよびＳＲＹ部位を標的化するように短鎖（５０〜１００ｂｐ）相同性アームを有する直鎖テンプレートを開発した。相同性テンプレートは、カセットの５’および３’末端に結合したプライマーを使用するユビキチンＥＧＦＰカセットのＰＣＲ増幅により作出し、Ｏｒｌａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０（ＮＡＲ；２０１０  Ａｕｇ；３８（１５））に記載のとおり、想定ＴＡＬＥＮ誘導二本鎖分解の配列５’および３’に対応するテールを含んだ。プライマーは、内因性ヌクレアーゼによる分解を阻害するための第１の２つのヌクレオチド間のホスホルチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｔｈｉｏａｔｅ）結合を含んだ。２マイクログラムのＴＡＬＥＮｍＲＮＡ（または対照としての不使用）およびそれぞれの部位に特異的な１ｕｇの短鎖相同性テンプレートを、典型的な１００ｕｌのエレクトロポレーションに含めた。エレクトロポレーション後、細胞を３０または３３℃のいずれかにおける３日間の培養のために分割し、次いでジャンクションＰＣＲによりＹ標的化について試験した。３０または３３℃において培養された細胞は、Ｙ標的化が３０℃においてより効率的であることを産物強度が示唆するにもかかわらず、５’および３’ジャンクションの両方におけるＹ標的化について陽性であった。それぞれの部位について、正確なＹ標的化に対応するアンプリコンは、ＴＡＬＥＮに依存的であり、ＳＲＹ３’ジャンクション上段バンドが非特異的バックグラウンドシグナルであることに留意されたい。形質移入後１４日間培養された細胞集団は、非統合テンプレートをもはや発現しないはずである。ＥＧＦＰについてのＦＡＣｓを１４日目の集団に実施しＴＡＬＥＮと短鎖相同性テンプレートの組合せがテンプレート単独に対してＥＧＦＰ陽性細胞の比率を増加させるか否かを決定した。実際、ＥＧＦＰ陽性細胞は、ＴＡＬＥＮを含めた場合に約３倍濃縮されており、温度の効果はほとんど観察されなかった（図１０）。個々のＥＧＦＰ陽性コロニーを、Ｙ標的化についてゲノタイピングした。ＡＭＥＬＹについては、ＥＧＦＰ陽性コロニーの０／５（０％）および２／５（２０％）が３０または３３℃においてそれぞれ最初に培養された細胞からのＹ標的化についても陽性であった（図１１）。ＳＲＹについては、ＥＧＦＰ陽性コロニーの５／２４（２１％）および０／９（０％）が３０または３３℃においてそれぞれ最初に培養された細胞からのＹ標的化についても陽性であった（図１１）。
【０１２０】
実施例１１  ブタにおける遺伝子ノックアウトのためのＴＡＬＥＮ  ＨＤＲ。
カスタム設計されたノックアウトアレルを有するブタを生成するため、本発明者らは、ＴＡＬＥＮおよびＴａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３に記載のオリゴにより細胞を処理した。この実験のセットのため、それぞれブタＤＡＺＬまたはＡＰＣを標的化するようにＴＡＬＥＮおよびオリゴテンプレートを設計し、次いで単一コロニーを単離し、オリゴＨＤＲにより導入された新規制限部位についてスクリーニングした。図１２は、ＤＡＺＬおよびＡＰＣのＨＤＲアレルを有するクローン化ブタを示す実験結果のモンタージュである。パネルａ）は、ＤＡＺＬおよびＡＰＣ改変ｌａｎｄｒａｃｅおよびＯｓｓａｂａｗ線維芽細胞にそれぞれ由来するクローン化仔ブタの制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析である。ＤＡＺＬファウンダーの予測ＲＦＬＰ産物は、３１２、２４２、および７０ｂｐ（白色三角）であり、ＡＰＣについてのそれは３１０、２２１、および８９ｂｐ（黒色三角）である。ＷＴおよびＤＡＺＬファウンダー間の３１２ｂｐバンドのサイズの差は、予測欠失アレルを反映する。パネルｂ）８頭のＤＡＺＬファウンダーの３頭、および６頭のＡＰＣファウンダーの６頭中のＨＤＲアレルの存在を裏付ける配列分析。ドナーテンプレート（ＨＤＲ）における遮断突然変異を枠内に示し、挿入塩基を下線により示す。最上段のＷＴ配列中の太文字は、ＴＡＬＥＮ結合部位を示す。パネルｃ）ＤＡＺＬ（左側）およびＡＰＣ（右側）ファウンダー動物の写真。
【０１２１】
実施例１２  ＤＡＺＬ−ＫＯ雄ブタは、生殖細胞を欠く。
図１３は、ＤＡＺＬ  ＫＯブタが精子形成の欠落および生殖細胞の完全な不存在を示すことを示す顕微鏡写真モンタージュである。ａ．精巣の内側部分からのＤＡＺＬ  ＫＯ精細管のＨ＆Ｅ染色は、精原細胞の完全な不存在を示す。ｂ．精巣の外側部分からのＤＡＺＬ  ＫＯ精細管のＨ＆Ｅ染色も、精原細胞の完全な不存在を示す。ｃ．精原細胞のマーカーのユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ−ＬＩ）は、野生型ブタ精巣中に存在する。ｄ．ＵＣＨ−ＬＩはＤＡＺＬ  ＫＯ精巣中に不存在であり、このことは、精原細胞の不存在を示す。ｅ．アセチル化ａ−チューブリンが野生型ブタ精巣の精細管中に存在し、このことは、精原細胞の存在を示す。ｆ．ＤＡＺＬ  ＫＯブタ精細管はアセチル化ａ−チューブリンについて陰性であり、このことは、それらの動物中の生殖細胞の欠落を実証する。
【０１２２】
本明細書に記載の全ての刊行物、特許出願、および特許は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれ、矛盾する場合、本明細書が優先する。
【０１２３】
さらなる説明
実施形態は、例えば、参照のために番号付与された以下の全てを含む。１．配偶子形成に選択的に関与する標的遺伝子を破壊するための遺伝子改変を含む遺伝子改変動物であって、標的遺伝子の破壊が、動物の機能的配偶子の形成を妨害する遺伝子改変動物。２．遺伝子の破壊が、標的遺伝子をコードする配列および／またはそのシス調節エレメント中の１つ以上の塩基の挿入、欠失、または置換を含む、１の動物。３．破壊される遺伝子が、動物のゲノムからの遺伝子の少なくとも一部の除去、遺伝子によりコードされる機能的因子の発現を妨害するための遺伝子の変更、またはトランス作用因子により破壊される、１の動物。４．標的遺伝子が、トランス作用因子により破壊されており、前記トランス作用因子が、干渉ＲＮＡおよびドミナントネガティブ因子からなる群から選択され、前記トランス作用因子が、外因性遺伝子または内因性遺伝子により発現される、３の動物。トランス作用因子は、例えば、標的化されるヌクレアーゼであり得る。５．標的遺伝子の破壊が、誘導性系の制御下にある、１の動物。６．誘導性系が、Ｔｅｔ−Ｏｎ、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ、Ｃｒｅ−ｌｏｘ、Ｈｉｆ１アルファ、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ、エクジソン遺伝子スイッチ、およびクメート（ｃｕｍａｔｅ）遺伝子スイッチからなる群のメンバーを含む、５の動物。７．標的遺伝子が、ＤＡＺＬ、ｖａｓａ、ＣａｔＳｐｅｒ、ＫＣＮＵ１、ＤＮＡＨ８、および精巣発現遺伝子１１（Ｔｅｘ１１）からなる群から選択される、１の動物。８．標的遺伝子が、Ｘ染色体または常染色体上に存在する、１の動物。９．標的遺伝子が、Ｙ染色体上に存在する、１の動物。１０．標的遺伝子の破壊が、雄配偶子または雌配偶子の形成を選択的に阻害する、１の動物。１１．標的遺伝子が、ＴＥＮＲ、ＡＤＡＭ１ａ、ＡＤＡＭ２、ＡＤＡＭ、アルファ４、ＡＴＰ２Ｂ４遺伝子、ＣａｔＳｐｅｒ遺伝子サブユニット、ＣａｔＳｐｅｒ１、ＣａｔＳｐｅｒ２、ＣａｔＳｐｅｒ３、Ｃａｔｓｐｅｒ４、ＣａｔＳｐｅｒベータ、ＣａｔＳｐｅｒガンマ、ＣａｔＳｐｅｒデルタ、クラメジン、コンプレキシン−Ｉ、セルトリ細胞アンドロゲン受容体、Ｇａｓｚ、Ｒａ１７５、Ｃｉｂ１、Ｃｎｏｔ７、Ｚｍｙｎｄ１５、ＣＫｓ２、およびＳｍｃｐからなる群から選択される、１の動物。１２．標的遺伝子が、精子形成に必要であり、遺伝子の破壊が、精子形成を選択的に阻害する、１の動物。１３．標的遺伝子が、精巣発現遺伝子１１（Ｔｅｘ１１）を含む、１２の動物。１４．標的遺伝子が、精子運動性、精子先体融合、または精子配偶子合体に必要であり、標的遺伝子の破壊が、精子運動性、精子先体融合、または精子配偶子合体の１つ以上を選択的に阻害する、１の動物。１５．標的遺伝子の破壊が、精子運動性を選択的に阻害し、かつ遺伝子が、ＴＥＮＲ、ＡＤＡＭ１ａ、ＡＤＡＭ３、Ａｔｐ１ａ４、およびＡＴＰ２Ｂ４からなる群から選択される、１４の動物。１６．標的遺伝子の破壊が、精子先体融合を選択的に阻害し、かつ遺伝子が、ＡＤＡＭ２、ＡＤＡＭ３、ＣａｔＳｐｅｒ、クラメジン、およびコンプレキシン−Ｉからなる群から選択される、１４の動物。１７．非ヒト脊椎動物、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択される、１の動物。１８．不妊性の雄であり、および機能的精子を生産し得ない、１の動物。１９．標的遺伝子が、ＤＡＺＬを含む、１８の動物。２０．ドナーの単相ドナー染色体対を有する機能的ドナー精子を生じさせるドナー細胞のレシピエントである、１の動物。２１．ドナー細胞が、トランスジェニック組換えタンパク質の発現のための遺伝子をさらに含む、２０の動物。２２．生産形質、体型形質、作業性形質、受精能形質、母性形質、および疾患耐性形質からなる群から選択されるトランスジェニック形質を含む、１の動物。２３．細胞および胚からなる群から選択される生物中に、細胞の染色体標的部位に特異的に結合し、二本鎖ＤＮＡ分解を引き起こして遺伝子を破壊して配偶子形成を選択的に破壊する薬剤を導入することを含み、薬剤が、標的化されるエンドヌクレアーゼ、ＲＮＡ、およびリコンビナーゼ融合タンパク質からなる群から選択される、動物の細胞を調製する方法。２４．薬剤が、標的化されるエンドヌクレアーゼであり、かつＴＡＬＥＮまたはＴＡＬＥＮペアであり、ＴＡＬＥＮまたはＴＡＬＥＮペアが、染色体標的部位に特異的に結合するための配列を含み、かつ遺伝子中の二本鎖分解を作出し、または第２の二本鎖分解を作出するさらなるＴＡＬＥＮとの組合せで染色体中の二本鎖分解を作出し、遺伝子の少なくとも一部が、第１の分解および第２の分解の間で破棄される、２３の方法。２５．薬剤が、標的化ヌクレアーゼを含み、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９からなる群から選択される、２３の方法。２６．リコンビナーゼを生物中に標的化されるエンドヌクレアーゼと同時導入することをさらに含む、２４の方法。２７．薬剤の生物中への導入が、ペプチドとしての薬剤の直接注入、薬剤をコードするｍＲＮＡの注入、薬剤をコードするベクターへの生物の曝露、および薬剤をコードするプラスミドの生物中への導入からなる群から選択される方法を含む、２３の方法。２８．薬剤が、リコンビナーゼ融合タンパク質であり、標的化核酸配列を、融合タンパク質と導入することを含み、標的化核酸配列が、染色体部位への特異的結合のためにリコンビナーゼとフィラメントを形成する２３の方法。２９．リコンビナーゼ融合タンパク質が、リコンビナーゼおよびＧａｌ４を含む、２３の方法。３０．核酸を生物中に導入することをさらに含み、核酸を、生物のゲノム中に二本鎖分解の部位において、または第１の分解および第２の分解の間に導入する、２３の方法。例えば、相同性依存性修復（ＨＤＲ）は、例えば、オリゴベースＨＤＲによる導入のための機序であり得る。３１．細胞が、インビトロ細胞、インビトロ初代細胞、接合子、卵母細胞、配偶子形成細胞、精細胞、卵母細胞、幹細胞、および接合子からなる群から選択される、２３の方法。３２．細胞が、接合子または胚であり、接合子を代理母中に移植することを含む、３１の方法。３３．細胞をクローン化することを含む、３１の方法。３４．細胞のクローン化を、体細胞核移植およびクロマチン移植からなる群から選択される方法により実施する、３３の方法。３５．核酸テンプレートを細胞中に導入することをさらに含み、テンプレートが、分解により生産される末端と実質的に相同な末端を有する、２３の方法。さらに、テンプレートはガイドＨＤＲであり得る。３６．薬剤を、細胞により転写される核酸として導入して薬剤を作製する、２３の方法。３７．動物が、非ヒト脊椎動物、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択される、２３の方法。３８．遺伝子の破壊が、誘導性系の制御下にある、２３の方法。３９．破壊される遺伝子が、ＤＡＺＬ、ｖａｓａ、ＣａｔＳｐｅｒ、ＫＣＮＵ１、ＤＮＡＨ８、ＰＩＷＩＬ４（ＭＩＷＩ２）、ＰＩＷＩＬ２（ＭＩＷＩ）および精巣発現遺伝子１１（Ｔｅｘ１１）からなる群から選択される、２３の方法。４０．細胞の染色体標的部位に特異的に結合し、二本鎖ＤＮＡ分解を引き起こして遺伝子を破壊して配偶子形成を選択的に破壊する薬剤を含み、薬剤が、標的化エンドヌクレアーゼ、およびリコンビナーゼ融合タンパク質からなる群から選択されるインビトロ細胞。４１．薬剤が、ＴＡＬＥＮまたはＴＡＬＥＮペアであり、ＴＡＬＥＮまたはＴＡＬＥＮペアが、染色体標的部位に特異的に結合するための配列を含み、かつ遺伝子中の二本鎖分解を作出し、または第２の二本鎖分解を作出するさらなるＴＡＬＥＮとの組合せで染色体中の二本鎖分解を作出し、遺伝子の少なくとも一部が、第１の分解および第２の分解の間で破棄される、４０の細胞。さらに、薬剤が、標的化されるヌクレアーゼを含み、かつ亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、Ｔａｌ−エフェクターヌクレアーゼ、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）、メガヌクレアーゼからなる群から選択される、４０の細胞。４２．染色体が、Ｙ染色体である、４１の細胞。４３．Ｙ染色体のゲノム改変を含み、改変が、染色体の１つ以上の塩基の挿入、欠失、置換を含む遺伝子改変動物。例えば、動物は、非ヒト脊椎動物、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択される。４４．改変が、Ｙ染色体の遺伝子においてなされている、４３の動物。４５．改変が、Ｙ染色体を含む配偶子を不能とする因子をコードする外因性核酸の挿入を含む、４３の動物。４６．外因性核酸が、干渉ＲＮＡ、標的化されるヌクレアーゼ、およびドミナントネガティブからなる群から選択される因子を発現する、４３の動物。４７．外因性核酸が、アポトーシス因子およびエンドヌクレアーゼからなる群から選択される因子を発現する、４３の動物。４８．外因性核酸の発現が、誘導性系の制御下にある、４３の家畜動物。４９．染色体上の外因性遺伝子を含み、遺伝子が、配偶子形成において選択的に活性化される遺伝子発現エレメントの制御下にある遺伝子改変動物。例えば、動物は、非ヒト脊椎動物、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択される。５０．染色体が、Ｙ染色体である、４９の動物。５１．外因性遺伝子が、ヌクレアーゼをコードすることを含む、４９の動物。さらに、ヌクレアーゼが、標的化されるエンドヌクレアーゼである、５０の動物。５２．さらに、標的化されるヌクレアーゼが、ＴＡＬＥＮ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９からなる群から選択される、動物。さらに、標的化されるエンドヌクレアーゼは、標的遺伝子に特異的に結合し、それを開裂する。５３．標的遺伝子が、ＤＡＺＬ、ｖａｓａ、ＣａｔＳｐｅｒ、ＫＣＮＵ１、ＤＮＡＨ８、ＰＩＷＩＬ４、ＰＩＷＩＬ２、および精巣発現遺伝子１１（Ｔｅｘ１１）からなる群のメンバーである、５１の動物。５４．遺伝子発現エレメントが、プロモーター、例えば、サイクリンＡ１プロモーター、または遺伝子発現エレメントを含む、４９の動物。マイクロＲＮＡ部位を使用することができる。５５．遺伝子発現エレメントが、精子形成に選択的であり、ＳＰ−１０プロモーター、Ｓｔｒａ８プロモーター、Ｃ−Ｋｉｔ、ＡＣＥ、およびプロタミンからなる群から選択される、４９の動物。５６．遺伝子発現エレメントが、卵子形成に選択的であり、Ｎｏｂｏｘ、Ｏｃｔ４、Ｂｍｐ１５、Ｇｄｆ９、オージェネシン１およびオージェネシン２からなる群から選択される、４９の動物。５７．外因性遺伝子が、雄子孫の生産に選択的に要求される遺伝子を不活性化させ、かつ動物の有性生殖が、雌子孫のみを生産する、４９の動物。５８．外因性遺伝子が、雌子孫の生産に選択的に要求される遺伝子を不活性化させ、かつ動物の有性生殖が、雄子孫のみを生産する、４９の動物。５９．外因性遺伝子が、細胞に致死的であり、それにより雄または雌配偶子のみを破壊する因子を発現する、４９の動物。６０．因子が、アポトーシス因子または毒性遺伝子産物を含む、５９の動物。６１．因子が、アポトーシス性であり、かつ外因性遺伝子が、ＦＡＳ、ＢＡＸ、ＣＡＳＰ３、およびＳＰＡＴＡ１７からなる群から選択される、５９の動物。６２．因子が、毒性であり、かつ遺伝子が、毒素遺伝子、バルナーゼ、ジフテリア毒素Ａ、チミジンキナーゼ、およびリシン毒素からなる群から選択される、５９の動物。６３．因子が、エンドヌクレアーゼを含む、５９の動物。６４．（エンド）ヌクレアーゼが、ＲＮＡおよび／もしくはＤＮＡの一般的な分解についての広域スペクトルのヌクレアーゼであり、またはそうでなければ一般的な細胞活性を破壊するために有用であり、例えば、ダイサーである、６３の動物。６５．遺伝的不妊性である雄または雌であり、外因性
遺伝子が、精子形成または卵子形成にそれぞれ選択的である第２の遺伝子に干渉し、それにより動物による良好な有性生殖を妨害する因子を発現する、４９の動物。６６．因子が、標的化エンドヌクレアーゼ、例えば、ＴＡＬＥＮ、干渉ＲＮＡ、およびドミナントネガティブからなる群から選択される、６５の動物。６７．第２の遺伝子への干渉が、精子運動性、精子先体融合、または精子配偶子形成を選択的に阻害する、６５の動物および／または外因性遺伝子が、精子ダイニン干渉タンパク質（ＳＤＩＰ）を含む、６５の動物。６８．機能的天然精子の生産なしで機能的ドナー精子を生成する遺伝的に受精不能な雄家畜動物を含む遺伝子改変動物。例えば、動物は、非ヒト脊椎動物、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択される。６９．ドナーの子孫を有性生殖する、６８の動物。７０．ドナーのゲノムが、生産形質、体型形質、作業性形質、受精能形質、母性形質、疾患耐性形質からなる群から選択される形質をさらに含む、６８の動物。７１．複数の６８の動物を含む動物集団。７２．動物のドナー精子細胞が、遺伝子型的に同一の染色体を担持する（あるいは、同一の生殖質を担持する）、７１の動物集団。７３．染色体上の外因性遺伝子を含み、遺伝子が、動物の子孫の性を制御する因子を発現し、一方の性のみの子孫を生産する遺伝子改変動物。例えば、動物は、非ヒト脊椎動物、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、鳥類、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、実験動物、および魚類からなる群から選択される。７４．染色体が、Ｙ染色体である、７３の動物。７５．外因性遺伝子が、細胞に致死的であり、それにより雄または雌配偶子または胚のみを破壊する因子を発現する、７４の動物。７６．外因性遺伝子が、ヌクレアーゼをコードすることを含む、７５の動物。７７．ヌクレアーゼが、ＲＮＡおよび／もしくはＤＮＡの一般的な分解についての広域スペクトルのヌクレアーゼであり、またはそうでなければ一般的な細胞活性を破壊するために有用であり、例えば、ダイサーである、７６の動物。７８．ヌクレアーゼが、標的化エンドヌクレアーゼである、７６の動物。７９．因子が、アポトーシス因子または毒性遺伝子産物を含む、７５の動物。８０．因子が、アポトーシス性であり、かつ外因性遺伝子が、ＦＡＳ、ＢＡＸ、ＣＡＳＰ３、およびＳＰＡＴＡ１７からなる群から選択される、７７の動物。８１．因子が、毒性であり、かつ遺伝子が、毒素遺伝子、バルナーゼ、ジフテリア毒素Ａ、チミジンキナーゼ、およびリシン毒素からなる群から選択される、７９の動物。８２．外因性遺伝子が、因子およびマイクロＲＮＡの融合物をコードする、７５の動物。８３．因子が、染色体の標的配列に特異的に結合し、それを開裂する標的化されるヌクレアーゼを含む、７３の動物。８４．標的化されるエンドヌクレアーゼが、ＴＡＬＥＮ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、ガイド型ＲＮＡ標的化ヌクレアーゼ、ＲｅｃＡ融合タンパク質、およびメガヌクレアーゼからなる群から選択される、８３の動物。８５．因子が、標的化エンドヌクレアーゼ、例えば、ＴＡＬＥＮ、干渉ＲＮＡ、およびドミナントネガティブからなる群から選択される、７３の動物。８６．外因性遺伝子が、雄子孫の生産に選択的に要求される遺伝子を不活性化させ、かつ動物の有性生殖が、雌子孫のみを生産する、８３の動物。例えば、ＳＲＹまたはＭＩＳ（ミュラー管阻害物質）についての遺伝子を破壊することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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