(57)【要約】  ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）生成のための微生物コンソーシアムを選別し且つ選別された微生物コンソーシアムを維持することを１ステップのみによって同時に行う方法であって、前記微生物コンソーシアムに少なくとも１種の易生分解性炭素基質が供給され、前記方法が、混合生物反応器中で前記微生物コンソーシアムを好気培養する第１のステップを含む、方法。本発明によれば、好気培養する前記第１のステップにおいて、前記微生物コンソーシアムの比細胞成長速度μ１が目標値に固定され、易生分解性炭素基質取込み速度ｑＳ１が前記固定された比細胞成長速度μ１と不均衡であるような栄養制限下で、好気培養する前記第１のステップが実施される。
2016504911.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）生成のための微生物コンソーシアムを選別し且つ選別された微生物コンソーシアムを同時に維持する方法であって、前記微生物コンソーシアムに少なくとも１種の易生分解性炭素基質が供給され、前記方法が、混合生物反応器中で前記微生物コンソーシアムを好気培養する第１のステップを含み、
好気培養する前記第１のステップにおいて、前記微生物コンソーシアムの比細胞成長速度μ１が目標値に固定され、易生分解性炭素基質取込み速度ｑＳ１が前記固定された比細胞成長速度μ１と不均衡であるような栄養制限下で、好気培養する前記第１のステップが実施される、方法。
【請求項２】
前記比細胞成長速度μ１と前記易生分解性炭素基質取込み速度ｑＳ１との間の比μ１／ｑＳ１が、０．０１から０．５の間の範囲の生成されるバイオマス（ｇ）／消費される易生分解性炭素基質（ｇ）、好ましくは０．０５から０．２５の間の範囲の生成されるバイオマス（ｇ）／消費される易生分解性炭素基質（ｇ）で含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の好気培養ステップ中における前記比細胞成長速度μ１の前記固定が、前記混合生物反応器中での前記微生物コンソーシアムの滞留時間の制御によって達成される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物コンソーシアムの前記比細胞成長速度μ１が、０．０１ｈ−１から０．１ｈ−１の間、好ましくは０．０３ｈ−１から０．０８ｈ−１の間に固定される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記比細胞成長速度μ１が、前記目標値前後で、５０％を超えて変動せず、好ましくは２０％を超えて変動しない、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
成長制限が、Ｐ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｋ、Ｍｇ、Ｆｅまたはこれらの組合せの中から選択される少なくとも１つの栄養性易生分解性炭素基質富化ストリームの制限によって達成される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記制限される栄養が、好ましくはＰであり、前記固定された比細胞成長速度μ１が、０．０１ｈ−１から０．０５ｈ−１の間に含まれるとき、Ｐ／Ｃモル比が０．０００２から０．０００５の間に含まれる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記比成長速度μ１が０．０５ｈ−１から０．１ｈ−１の間に含まれるとき、前記Ｐ／Ｃモル比が０．０００５から０．００５の範囲内にある、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記成長制限が、前記易生分解性炭素基質および制限栄養を別々に添加することにある、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物コンソーシアム中のＰＨＡ含有量およびＰＨＡ組成を連続的にモニタリングするステップをさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物反応器中の易生分解性炭素基質残留濃度をモニタリングするステップをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
連続式の前記生物反応器中の易生分解性炭素基質蓄積量、ＰＨＡ細胞含有量の減少量、ＰＨＡ細胞含有量の所定の値への減少量またはこれらの組合せの中から選択されるパラメータによって開始される制御ループをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
好気培養する前記第１のステップが、連続式または半連続式の混合生物反応器中で単一の段階で行われる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
好気培養する前記第１のステップが、少なくとも１つ以上の付加的な段階をさらに含み、前記付加的な段階のそれぞれが、それまでの段階よりも厳しい栄養制限下で行われ、それぞれの段階の前記比細胞成長速度が、それまでの段階の前記固定された比細胞成長速度よりも小さく、それぞれの段階が連続式、半連続式、バッチ式、またはフェドバッチ式の混合生物反応器のいずれかの中で行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
易生分解性炭素基質富化廃液の総ＣＯＤが、少なくとも５０％のＲＢＣＯＤ基質および少なくとも３０％のＶＦＡ、好ましくは少なくとも５０％のＲＢＣＯＤ基質および少なくとも５０％のＶＦＡを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法を実施するための水処理プラントであって、Ｐ源廃液および易生分解性炭素基質富化廃液を少なくとも第１の連続式または半連続式の混合生物反応器に注入する手段と、固液分離装置とを備える、水処理プラント。
【請求項１７】
連続モード、半連続モード、バッチモードまたはフェドバッチモードのいずれかで操作される、連結して配置された少なくとも１つ以上の付加的な混合生物反応器をさらに備え、それぞれの付加的な生物反応器中における前記栄養制限がそれまでの生物反応器中におけるものよりも強い、請求項１６に記載の水処理プラント。
【請求項１８】
それぞれの付加的な生物反応器が、前記第１の連続式の混合生物反応器と前記固液分離装置との間に位置するか、または前記固液分離装置の下流側に位置する、請求項１７に記載の水処理プラント。
【請求項１９】
それぞれの付加的な生物反応器が固液分離装置に接続されている、請求項１８に記載の水処理プラント。
【請求項２０】
前記第１の連続式の混合生物反応器およびそれぞれの付加的な生物反応器が、ケモスタット、分離装置と連携したケモスタット、膜生物反応器（ＭＢＲ）または固定式バイオフィルム反応器を含む群から選択される、細胞再循環ループを有する生物反応器である、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の水処理プラント。
【請求項２１】
前記第１の連続式の混合生物反応器および／またはそれぞれの付加的な生物反応器が、前記微生物コンソーシアム中のＰＨＡ含有量および／または易生分解性炭素基質濃度をモニタリングする手段を備える、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の水処理プラント。
【請求項２２】
前記易生分解性炭素基質富化廃液を注入する手段および前記Ｐ源廃液を注入する手段が別々である、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の水処理プラント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、様々な微生物を含む天然源からポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）産生微生物を選別するプロセスに関する。本発明は、このような選別された微生物によってＰＨＡを生成するプロセスにも関する。
【背景技術】
【０００２】
プラスチックは、最も一般的には、石油化学製品に由来する有機モノマーの重合によって製造される。しかし、石油は希少になりつつあり、プラスチック製造は温室効果ガスの排出および気候変動の一因となっており、さらには、非常に自然分解(natural degradation)しにくいプラスチックが環境に著しく蓄積することは、大きな懸念となっている。したがって、バイオプラスチックを生成するための代替的なプロセスが開発されている。これらの代替的なプロセスのうちの１つは、微生物による、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）などのバイオベースのポリマーの生成に関し、ＰＨＡは、その後バイオプラスチック生成のための原材料として使用することができる。ＰＨＡ産生微生物には、野生型天然ＰＨＡ産生株（カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）など）、改変大腸菌などの組換え生物、さらには生物学的廃水処理系に存在するものなどの微生物コンソーシアム(consortium)が含まれる。
【０００３】
不均衡成長条件下において、細菌は、ＰＨＡを合成することによって過剰な炭素を細胞内備蓄物の形態で貯蔵する。次いでその後、細胞内ＰＨＡ顆粒は、細胞によって炭素源およびエネルギー源として使用され得る。このような不均衡条件は、栄養もしくは電子受容体の制限または細胞内成長の必要物の欠如（長期の飢餓期間後）の結果である、細胞成長速度に対して過剰な炭素取込みフラックス(flux)を設定することによって発生させることができる。
【０００４】
ＰＨＡは、ヒドロキシアルカノエートモノマーの直鎖状ポリエステルのファミリーであり、その組成によって、異なる興味深い熱的特性および機械的特性を示す。特に、ＰＨＡ組成は、ＰＨＡ蓄積のための基質として使用される炭素源および細菌株に著しく依存する。とりわけ、これらは熱可塑性であり、延性であり、多少(more or less)弾性があり、ＵＶ安定性であり、水および空気に対して低い浸透性を示す。よって、ＰＨＡは、ポリプロピレンなどの従来のポリオレフィンの代替として、非常に有望な解決策であると思われる。
【０００５】
バイオプラスチックは、バイオベース(biobased)、すなわち、再生可能な天然の原材料から作製される、かつ／または生分解性のプラスチックとして定義することができる。いくつかの現在利用可能なバイオプラスチックは、バイオベースであるが生分解性ではないもの（例えば、石油化学処理に由来する結合(petrochemically derived graft)を有するデンプンベースのポリマー）である。また、合成ベースのポリマーも存在し、これは生分解性基準(biodegradability standard)を満たすように改変することができる。ＰＨＡは、バイオベースでありなおかつ生分解性であるという利点を有し、よって、閉じたループの生産−使用−廃棄のライフサイクルを可能にする。
【０００６】
さらに、ＰＨＡはバイオベースでありなおかつ生分解性であるので、短い製品ライフサイクルを可能にし、これは、製品が汚染される（例えば、廃棄物収集）使い捨て用途または自然環境と直接接触する用途にとって理想的である。ＰＨＡの生産は、持続可能と考えられる。これらすべての理由により、ＰＨＡは、学会および化学工業において多大な関心を集めている。
【０００７】
微生物によるＰＨＡの生成について、今のところ２つの主な戦略が提示されており、以下に分類することができる。
−  野生型または遺伝子改変された効率的なＰＨＡ産生株の純粋培養系、および通常は高価な使い捨ての炭素基質（グルコース、スクロースまたはコーンスティーブリカーなど）を使用する、工業的バイオテクノロジーのアプローチと、
−  ＰＨＡ貯蔵性(storing)生物を富化(enrich)しようとする天然源から選別される、混合培養系、または様々な微生物株から構成される微生物コンソーシアムを使用する、環境バイオテクノロジーのアプローチである。これらの株は、前処理段階後に複雑な供給材料（例えば、特に液体の廃液の形態である、産業廃棄物および副生成物）を使用することが可能である。通常、前処理段階は、ＰＨＡ蓄積のための炭素源としての、ＰＨＡ貯蔵に適切な前駆体である揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）で、廃液を富化するための酸性発酵ステップである。
【０００８】
純粋培養系の例は、米国特許第５８７１９８０号明細書に開示されている。この出願は、フェドバッチ式(fed-batch)反応器中におけるアルカリゲネス・ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）の培養によってＰＨＡを生成する方法に関する。不連続式のフェドバッチプロセスは、通常、２つの連続したフェーズ(phase)：
１）細胞密度を増加させ、これにより生産性を最大にするための、細胞成長最大化のフェーズ（非制限成長条件下）と、
２）制限栄養条件下におけるＰＨＡ蓄積のフェーズと
を含む。
【０００９】
この技法によれば、接種されたＰＨＡ産生株以外による夾雑(contamination)を防ぎ、これにより基質に対するＰＨＡ収率、ＰＨＡ含有量を最大化し、さらにＰＨＡ品質を制御するため、無菌条件下で細菌を培養する。実際、非貯蔵性生物による夾雑は、基質消費の競争(competition:競合)、得られる単位バイオマス当たりの最終ＰＨＡ比の減少、および生成されるＰＨＡの不均一化につながり得る。この文献では、Ｃ／Ｐ重量比は、成長段階において４０〜１００、蓄積段階において３００〜６００におよぶ。
【００１０】
純粋培養系は、細胞中における高いＰＨＡ含有量および高いＰＨＡ生成速度（最大２．８６ｇ／Ｌ／ｈ）を保証する。しかし、無菌条件下での作業は、高いエネルギーが要求されるため、劇的に生産コストを増加させる。さらに、使用される炭素供給材料はまた、重要なコスト要因を構成する（全ＰＨＡ生産コストの約４０％）［１］。この場合、これらの方法によるＰＨＡ生産の平均コストは、石油化学製品製の従来のプラスチックの価格の４〜９倍となる。この技法のもう１つの不利な点は、ＰＨＡ蓄積プロセスのために、炭素供給材料として食用作物を一般に使用する点である（例えば、トウモロコシ糖または菜種油）。燃料、化学物質およびポリマーの生産のために農業生産作物を使用することは、天然資源に対する圧力を増加させ、耕作地に対する競争を激化することにもつながり得る。まとめると、純粋培養系によって生成されたＰＨＡは、ポリオレフィンと比較して高い技術的代替可能性を有するものの［２］、従来のプラスチックに対して未だにコスト競争力を欠いている。
【００１１】
これらの欠点を克服するために、豊富−欠乏(feast and famine:飽食−飢餓)プロセスのような混合培養系が提案されている。様々な文献資料［３〜５］によれば、豊富−欠乏系は、２つの連続的なステップ：
１）連続モード下、より一般的には逐次バッチ式反応器（ＳＢＲ）中で操作が行われる、様々な微生物を含む第１の接種材料(inoculum)から、ＰＨＡ産生微生物を選別するステップ、ならびに
２）選別された微生物コンソーシアムを使用してフェドバッチモードで実施される、ＰＨＡ蓄積ステップ
を含む。
【００１２】
このプロセスの名称は、交互の豊富−欠乏条件によってなされる選別ステップに由来する。各ＳＢＲ操作サイクルは、豊富フェーズと欠乏フェーズとから構成される。各ＳＢＲサイクルは、発酵(ferment:富栄養化)した工業廃液またはこのような廃液を模した媒体のいずれかにおいて、好気条件下で微生物を培養することに本質を有する。豊富フェーズと呼ばれるこのフェーズ中、炭素源（典型的には、揮発性脂肪酸ＶＦＡ）が完全に利用可能である。豊富フェーズに次いで、外部炭素源は利用不可能だが炭素源以外の栄養は非制限条件で利用可能であるフェーズ（欠乏フェーズ）が続く。言い換えると、豊富フェーズ中、微生物は外部炭素源を使用してＰＨＡを合成し、その後、欠乏フェーズ中、貯蔵されたＰＨＡを細胞成長および／または細胞維持の必要物として使用することができる。この選別ステップは、具体的には、非ＰＨＡ貯蔵性微生物に対してＰＨＡ貯蔵性微生物を選別することを目的とする。より具体的には、課される豊富−欠乏条件により、ＰＨＡ貯蔵性生物にとって、２つの競争上の優位性、すなわち、過剰な炭素取込みをＰＨＡ貯蔵に向かわせる潜在能力に起因する、豊富期間中のより高速な基質取込み、および、欠乏期間中に貯蔵されたＰＨＡを元に成長を行う潜在能力がもたらされる。後者の利点は、欠乏中における細胞成長を可能にする、選別段階における過剰な栄養条件に依存する［６〜７］。
【００１３】
この種類の混合培養系において、２種類の豊富−欠乏プロセスが存在する。
−  微生物培養物が交互の豊富−欠乏条件に供され、炭素が炭素以外の栄養に比べて制限的である、従来型の豊富−欠乏プロセス。これらの系は一般に、ＰＨＡ産生生物で富化されるものの（総細菌数に対するＰＨＡ産生株の比が最大８８％であると述べられている［６］）、細菌組成が通常はＰＨＡ産生株とＰＨＡ非産生株の両方を含み、また、通常は１種以上のＰＨＡ産生種を含む［３、８〜９］という点で、相対的に多様である。さらに、一部の公開文献［１０］は、ＰＨＡ貯蔵機能は維持されるものの、操作時間にわたり個体群(population)構造が顕著に変動し、様々な個体群の相対的な割合が変動することを報告している。
−  欧州特許出願公開第２１３５９５４号明細書に記載されている、豊富−欠乏系。この文献によれば、選別ステップ中により強い選択圧(selection pressure)がバイオマスに適用される。特に、この強力な選別段階は、豊富−欠乏条件と過剰な栄養対炭素の比とに加えられる２つの圧力の組合せ、すなわち（１）供給期間の短縮と欠乏フェーズの延長（通常豊富−欠乏系について報告されているよりもさらに低い豊富対欠乏の比、すなわち、０．１未満を得る）および（２）長期の欠乏フェーズとの組合せで細胞更新(cell renewal)をＰＨＡ合成に完全に依存させる、バイオマス保持時間当たりの操作サイクル数の低減によってなされる。しかし、このプロセスは、なおも２つのステップを含んでいる。
【００１４】
一般に、豊富−欠乏に基づくプロセスは、第１のステップ（選別ステップ）において生成されたバイオマスをＰＨＡ蓄積ステップ（第２のステップ）で接種するという２ステップのプロセスを必要とするため、純粋培養系のプロセスより生産性がかなり低い。このことは、蓄積ステップにおける細胞濃度が選別ステップにおいて到達される細胞濃度によって制限されることを意味する。豊富−欠乏プロセスの蓄積ステップは、通常、純粋培養プロセスよりはるかに低い細胞密度（混合培養プロセスについては最大６ｇ／Ｌ、純粋培養物については１００ｇ／Ｌの範囲が報告されている）で操作される。豊富−欠乏選別プロセスに交互の豊富−欠乏フェーズが適用される動的な供給戦略によって内部成長制限（ＰＨＡ貯蔵の引き金となる）が促進され、これによって同様に低いバイオマス生産性がもたらされる。さらに、豊富−欠乏選別プロセスにおいて低い豊富−欠乏フェーズの長さ比(length ratio)を維持する必要があることにより、これらの系に高い負荷が掛かることが防がれ［９］、これにより、得られるバイオマス濃度を制限する。豊富−欠乏プロセスにおいて報告されている低い細胞密度は、最終的にこれらのプロセスの全体の生産性を制限し、さらにはバイオマス濃度および蓄積ステップ後の乾燥に対してより高いエネルギーの要求をもたらす。
【００１５】
豊富−欠乏プロセスにおける実際の競争上の優位性を維持するために、細胞内に貯蔵されたＰＨＡがバイオマス合成のための基質として効果的に使用される必要がある点を考慮することも重要である。したがって、炭素に対して過剰な栄養を使用することが、選別ステップ中に必要とされる。逆に、蓄積ステップ中は、細胞成長を制限してＰＨＡ貯蔵応答を最大化するために、栄養制限が課される。このように、このプロセスは２つの連続的なステップで実行する必要がある。
【００１６】
さらに、選別ステップは２つの反応フェーズを必要とする：
−  基質取込みとＰＨＡへの変換とを伴う豊富フェーズ、および、次いで
−  豊富期間より通常は３〜５倍、さらには１０倍長い欠乏フェーズ。欠乏フェーズ中、ＰＨＡは加水分解され、細胞成長および／または細胞維持のための炭素源およびエネルギー源として使用される。
【００１７】
このことは、このプロセスの生産性も、反応体積および欠乏フェーズを操作するのに必要とされる操作要件（例えば、エアレーション(aeration)）によって制約されることを意味する。
【００１８】
豊富−欠乏ＰＨＡ生成プロセスでは微生物選別段階とＰＨＡ生成段階とを切り離すことが必要であるという事実に関連する、もう１つの不利な点は、基質に対する全体収率の低下である。この全体収率の低下は、選別段階の豊富フェーズ中において、外部炭素源の一部分がＰＨＡに変換されることが必要であることに起因する。このため、ＰＨＡは後続の欠乏フェーズ中にバイオマスに変換され、これにより、その後最終的な蓄積段階において、生成されたバイオマスを、ＶＦＡをＰＨＡに変換するための生体触媒として使用することができる。
【００１９】
さらに、多数の様々なＰＨＡ貯蔵性株が選別されて同一反応器中で共に培養され得るため、ＰＨＡ品質の制御が困難となり得る。選別された微生物コンソーシアムの多様性の程度は、課される選択圧の効率に依存し、豊富−欠乏プロセスを制御するために使用される操作パラメータの数と共に、基質組成にも依存する。支配的な(dominant)ＰＨＡ貯蔵性の個体群だけではなく、顕著な数の非貯蔵性の隣接(flanking)の個体群も含む、相対的に多様な個体群が、ほとんどの豊富−欠乏プロセスについて報告されている。これらの系はまた、高度に発達した個体群動態(dynamic)を持続させることが実証されており、このことは、潜在的に組成および分子量の点で多様なポリマー品質につながり得る。
【発明の概要】
【００２０】
本発明は、先行技術の不利な点を克服することを意図する。より具体的には、本発明は、少なくとも１つの実施形態において、開放(open)培養系において安定なＰＨＡ産生微生物個体群を選別するためのより効率的な方法を提供することを意図する。
【００２１】
本発明はまた、少なくとも１つの実施形態において、先行技術の方法より安価なこのような方法を提供することを意図する。
【００２２】
本発明はまた、少なくとも１つの実施形態において、持続可能な開発の要件を少なくとも一部分満たす、ＰＨＡを生成する方法を提供することを意図する。
【００２３】
これらの目的は、以下に登場する他の目的と同様に、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）生成のための微生物コンソーシアムを選別し且つ選別された微生物コンソーシアムを同時に維持する方法であって、前記微生物コンソーシアムに少なくとも１種の易生分解性炭素基質が供給され、混合された生物反応器中で前記微生物コンソーシアムを好気培養する第１のステップを含む、方法に関する本発明によって達成される。
【００２４】
本発明によれば、好気培養する前記第１のステップにおいて、微生物コンソーシアムの比細胞成長速度μ１が目標値に固定され、好気培養する前記第１のステップが、易生分解性炭素基質取込み速度ｑＳ１が前記固定された細胞成長速度μ１と不均衡であるような栄養制限下で実施される。
【００２５】
「栄養」という用語は、本明細書において、細胞成長に寄与する、炭素源以外の任意の物質を含むと理解される。
【００２６】
「触媒バイオマス濃度」という用語は、バイオマス濃度または懸濁した固体濃度から細胞内ＰＨＡ含有量を差し引いたものとして定義され、以下のように計算できる。
触媒バイオマス濃度＝バイオマス濃度−細胞内ＰＨＡ含有量。
【００２７】
比細胞成長速度は「ｈ−１」で表現される。易生分解性炭素基質取込み速度ｑＳ１は、バイオマスが易生分解性炭素基質を消費する速度である。別の言い方をすれば、ｑＳ１は、単位時間当たり及びバイオマス濃度の単位質量当たりの触媒バイオマスによって消費される基質量（炭素源（ｇ）／時間／触媒バイオマス（ｇ））によって定義される。
【００２８】
易分解性炭素基質は、以後、「炭素源」「ＲＢＣＯＤ基質」、「炭素基質」および「炭素流入」と示されることがある。ＲＢＣＯＤ（readily biodegradable chemical oxygen demand:易分解性化学的酸素要求量）基質という用語は、本明細書において、容易に生物学的に分解され得る、水中の任意の物質を含むと理解される。ＲＢＣＯＤとしては、揮発性脂肪酸、アルコールおよび糖などの、多様な単純な有機炭素分子が挙げられる。
【００２９】
以下の記述の表現を明瞭にするために、特に、「ステップ」および「段階」という用語が同じ文中にあるとき、「ステップ」という用語は、ここではバイオマス選別、バイオマス成長またはＰＨＡ生成などの動作を指す。「段階」という用語は、本明細書において、プロセス中に実装される反応器の数などの、プロセスの実施の「物質的」レベルを指す(reserve)。
【００３０】
本発明の方法は、栄養制限と比細胞成長速度の精密な制御との組合せにより、先行技術で開発された方法とは対照的に、ＰＨＡ貯蔵性微生物コンソーシアムの選別および連続式の培養を１ステップのみで可能にする。言い換えれば、豊富−欠乏法とは対照的に、ＰＨＡ産生株の選別、細菌成長およびＰＨＡ生成（中間レベルまたは完全最大蓄積容量まで）が同じ反応器内で同時に発生する。別の言い方をすれば、従来の方法とは対照的に、本発明の方法により、ＰＨＡ産生株の選別、細菌成長およびＰＨＡ生成が、同時に１ステップのみで可能になる。
【００３１】
本発明による方法は、開放微生物培養物を効率的なＰＨＡ貯蔵性生物で富化することを目的とした、微生物コンソーシアム選別プロセスを実施するために使用される。このような選別プロセスにより、プロセスを開始するために使用された接種材料の組成にかかわらず、最初に、高いＰＨＡ貯蔵能力によって特徴付けられる単純化され特化された微生物コンソーシアムの選別が実現する。その後、課された同じ操作条件を維持することで、選別されたＰＨＡ貯蔵性個体群を恒久的に選別および連続的に培養することができる。
【００３２】
成長と栄養の両方の制限を適用することで、恒久的な選別に好適な条件をもたらす。しかし、これはまた、本発明の方法は単一のステップで培養物選別およびＰＨＡ生成を操作することを可能にするので、化学量論的および動力学的性能の点で生産プロセスと相性がよい。
【００３３】
連続操作下において安定な微生物コンソーシアムが確実に生じる強い選択圧が課されることを前提とすると、本発明は、無菌化を必要とすることなく連続的に操作することを可能にする。したがって、無菌化に関する制約は回避される。
【００３４】
さらに、本発明の方法の培養物選別戦略は、観察される豊富フェーズ／欠乏フェーズの長さ比が重要な要素である豊富−欠乏戦略に基づいていないため、本発明の方法は、先行技術の混合培養法よりも高い負荷による操作を可能にする。実際、先に述べたように、先行技術の混合培養法は、適用される有機物負荷速度の点で、今もなお強く制限を受けている。
【００３５】
より具体的には、豊富−欠乏駆動(driven)プロセスでは、平均細胞成長速度は周期的なバイオマスの採取によって制御される。バイオリアクター中では一定の比細胞成長速度μを観察することができない。これに対し、動的供給（交互の豊富−欠乏サイクル）は、操作サイクル中の異なる時点で異なる応答を有する、変動する細胞応答から始まる。豊富フェーズ中、細胞成長は制限されるかまたはまったく生じず、ＰＨＡ貯蔵応答が支配的に生じる。早期の欠乏フェーズ中、ＰＨＡ脱重合(depolymerisation)および細胞成長が生じる。最後に、晩期の欠乏フェーズ中、ＰＨＡ脱重合および細胞維持が生じるが細胞成長は生じず、すなわち、細菌はＰＨＡを使用して生存するが増殖はしない。このことは：
−  比細胞成長速度μがサイクル時間によって変動すること、および
−  ＰＨＡ産生株が他の細菌種に対して実際に競争上の優位性を有するには、生成されたＰＨＡが細胞成長のための内部基質として消費される必要があるということ
を意味する。細菌による生存のためのこのようなＰＨＡの消費は、無益な(futile)ＰＨＡサイクリングと呼ばれる。
【００３６】
これと対照的に、本発明の方法は、瞬間(instant)の比細胞成長速度を一定に保ち、これにより過剰な基質取込みを連続的にＰＨＡ貯蔵に転換する。よって、本発明のバイオリアクター中で貯蔵されたＰＨＡは、細胞成長を支援するために再消費されることは決してない。細胞内ＰＨＡ含有量をさらに増すために第２の段階が追加されたとしても、既に蓄積されたポリマーに対して漸増しながらポリマー含有量は増加し続ける。豊富−欠乏プロセスでは、ＰＨＡが循環され（生成され再消費され）ない場合、ＰＨＡ産生株は最終的にその競争上の優位性を失い、系は不安定になる。したがって、豊富−欠乏プロセスが成功するためには、貯蔵されたＰＨＡの一部分が細菌によって再消費されなければならない。この点が、豊富−欠乏法では産業レベルでＰＨＡ生産を実施できない理由である。
【００３７】
さらに、本発明の方法は、以下を前提とした場合に、先行技術の混合培養法よりも高い生産性をもたらす。
（１）バイオマス細胞濃度に直接影響のある、課され得る有機物負荷速度が、低い豊富フェーズ／欠乏フェーズの長さ比を維持する必要性によって制限されない。
（２）欠乏期間を確保するための反応器容積またはエアレーションの要求が必ずしも必要でない。最終的に、先行技術の混合培養法について通常報告されるよりも狭小(narrower)微生物構造を有する安定な微生物コンソーシアムをもたらす、本発明の方法の高い選別効率は、その後の用途における製品品質に対して潜在的な利益を有する、より均一なＰＨＡ生成物をもたらす。
（３）強い選択圧が課されることを前提にすると、培養物富化のための時間が、豊富−欠乏プロセスについて一般的に記載されている時間よりもかなり短い。
【００３８】
よって、本発明の方法は、安定なＰＨＡ産生細菌コンソーシアムの選別および維持を１ステップで行う方法であって、非無菌条件下で効率的なＰＨＡ生成プロセスを持続させる方法を提供する。
【００３９】
提案する選別の方法は、任意の起源の活性汚泥を接種することができる、連続的に操作される微生物培養系に対し、炭素および栄養に対する二重の制限を課すことによってなされる。この二重の制限は細胞成長制限を含み、これは、バイオマス保持時間（または細胞保持時間ＣＲＴ）を課すことと栄養制限とによって制御することができる。例えば、このような栄養制限は、栄養取込みの炭素基質取込みに対する比（消費された栄養／消費されたＣ）の制御によって達成することができる。ここで、基質取込み速度と細胞成長との間の不均衡が、細胞成長速度および栄養制限の制御によって実施することができる本発明の方法のパラメータである点を強調することが重要である。この戦略は、二重制限条件（Ｃおよび炭素以外の１種の栄養）を課すこととして設計されている。二重制限条件を確実に行うのに必要とされるＣ／制限栄養比は、課される細胞成長速度によって変動し、そのため、課される比細胞成長速度とは別に固定することはできない。このことにより、実際には、課されるＣ／制限栄養比は、課される比細胞成長速度によって変動することを暗示する。二重制限条件が課されるそれぞれの対（μ；Ｃ／制限栄養比）を確保するために、当業者は、Ｃと制限栄養の両方が反応器に入ったときに直ちに消費されること（このことは、それら各々の残留濃度が無視できるほどわずかであることを意味する）を確認してもよい。
【００４０】
当業者は、課される二重制限条件（ＣおよびＣ以外の栄養）によってこのような不均衡が発生することを、炭素源と制限栄養の両方の残留混合液濃度を測定することによって確認することが可能である。これは、直接分析（炭素源のモニタリングについてはＧＣ、ＨＰＬＣ、高速検出比色分析キット；栄養のモニタリングについてはＩＣまたは高速検出比色分析キット）または、反応器中でのＶＦＡ形成に付随するｐＨの減少などの間接的なパラメータのいずれかによって行うことができる。このような方法は、当業者の常識である。
【００４１】
この二重制限に供されるＰＨＡ貯蔵性微生物は、ＰＨＡ貯蔵に向けられる外部炭素基質のフローを最大化する。過剰な炭素基質をＰＨＡ貯蔵に向かわせることにより、ＰＨＡ貯蔵性生物は、非貯蔵性生物よりも高い速度で炭素基質を取り込むことができ、このため、課される具体的な成長速度および栄養制限によって基質取込み速度が制限される。よって、課された二重制限条件によって促進された高いＰＨＡ貯蔵応答は、ＰＨＡ貯蔵性生物に非貯蔵性生物に対する競争上の優位性を与える。さらに、課された二重制限条件は、生細胞分裂(viable cell division)に適合する課された比細胞成長速度μにおいて、高いＰＨＡ貯蔵応答に有利に働くため、開放培養コンソーシアムをこれらの条件で連続的に供することが可能であり、これにより、効率的なＰＨＡ貯蔵性生物に対して高く安定した選択圧がもたらされる。高い選択圧を課すと、開放微生物コンソーシアムは、プロセスを開始するために使用されるどんな活性汚泥接種材料でも、迅速にＰＨＡ産生生物で富化される。
【００４２】
さらに、一度選別を行うと、すなわち、微生物コンソーシアムが１種または複数の微生物種から構成される特定のＰＨＡ産生培養物へと発達したとき、恒久的な選択圧により、経時的なコンソーシアムの安定性が確保される。したがって、本発明の方法は、選別された培養物によって持続される、安定で効率的なＰＨＡ生産プロセスを可能にする。よって、ＰＨＡ生成を同じ培養系で直ちに実現することができ、そして、この培養系を使用して、炭素基質に対するより良好なＰＨＡ収率および良好な生産性を有する連続的なＰＨＡ蓄積プロセスを持続させる。
【００４３】
本発明の方法によれば、非無菌条件下で任意の多様な細菌接種材料が接種され、ＲＢＣＯＤ基質流入液(influent)が供給された好気微生物培養系を、ＰＨＡ貯蔵への機能特化を目的として選択圧を適用するような方式で操作することができる。選別法では、好気培養する前記第１のステップで二重制限が課されることが必要とされ、これには、課される微生物の比細胞成長速度μ１を十分に制御することと、課される栄養制限を十分に制御することとが含まれる。この二重制限は、ＲＢＣＯＤ取込みフラックスと前記固定された細胞成長速度μ１を維持するために必要な栄養フラックスとの間の不均衡を発生させることによってなされ、前者が後者に対して過剰であり、したがって、微生物に対して外部炭素基質取込みをＰＨＡ貯蔵に向けるように強制し、これにより、ＰＨＡ産生微生物株に競争上の優位性を与える。
【００４４】
好ましくは、易生分解性炭素基質は揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）である。好ましい炭素源としての揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）は、廃水処理による副生成物および廃液の発酵によって得ることができる。これらは高コストの基質に対する必要性を代替する。よって、開放培養系および低コストの炭素基質を使用することで、先行技術の純粋培養法に対してＰＨＡ生産コストを著しく減少させることができる。
【００４５】
言い換えれば、本発明の基本原則は、炭素基質取込みフラックス、好ましくはＶＦＡフラックスと、細胞成長速度μ１を固定された目標値前後で一定に維持するために必要とされる栄養フラックスとの間の不均衡を発生させることによる、ＰＨＡ産生株の選別と、ＰＨＡ生成を最大化して、課される細胞保持時間（ＣＲＴ）に適合する生細胞更新および細胞分裂速度を維持することの両方を可能にする、培養パラメータの慎重な選択に依存している。
【００４６】
炭素源と栄養の両方に制限を課すことによって、本発明の方法は以下のメカニズムを確保する。（１）栄養制限が、微生物におけるＰＨＡの生成および貯蔵を誘発し、（２）制限栄養のフローが、成長速度μ１と触媒バイオマス濃度の両方を制御する。まとめると、これらの要因は細胞代謝をＰＨＡ蓄積および炭素枯渇に強制するが、一方で、連続的に成長する培養物を持続させるために十分なバイオマスを生成するようにも強制する。よって、このように操作される系は、ＰＨＡ産生株についての選別系になる。一部の炭素源がＰＨＡ蓄積に向けられるという炭素および栄養の二重の制限の効果は、栄養取込みを制限することによる細胞成長の制限の度合（制限度）によって直接制御することができる。
【００４７】
さらに、炭素制限開放培養プロセスでは、微生物の競合は、基質取込み速度に少なくとも部分的に基づいている。本発明の方法は、高い動力学特性を有し、工業生産プロセスにとって最も効率的であり、プロセス生産性に高いポジティブな影響を有するＰＨＡ産生微生物の選別を可能にする。さらに、高い選択圧を課すことが培養物選別とＰＨＡ生成段階を切り離すことによってのみ可能である混合培養系とは対照的に、本発明の方法は高い選別効率を示し、これを単一段階のプロセスで連続的に適用することができる。
【００４８】
この特徴は、本発明の方法が、効率的なＰＨＡ貯蔵性株のみで構成される限定されたコンソーシアムの選別を可能にするという点で、先行技術の従来型混合培養系とは異なる。別の言い方をすれば、先行技術の従来型混合培養系は、様々な株からなるコンソーシアムに含まれ、非ＰＨＡ産生株を含む、広範囲の動力学効率を有するより広範な種類のＰＨＡ貯蔵性株の選別を可能にする。
【００４９】
加えて、ＰＨＡ組成はバイオマスに供給される炭素源と株の種類の両方に依存するので、限定されたコンソーシアムによるＰＨＡ生成は、先行技術の混合培養系で得られるものよりも均一なＰＨＡ組成をもたらす。
【００５０】
本発明の方法のもう１つのパラメータは、細胞成長速度μ１の固定であり、これは選別またはＰＨＡ産生バイオマスに必要とされる初期の特定の成長速度である。残余細胞成長および細胞分裂を維持するために、μ１を固定し、目標値前後で一定に維持して、高動力学性能のＰＨＡ貯蔵性バイオマスの一定の更新およびその高い動力学性能を確保する。事実、生成されたＰＨＡの量は、反応器中のＰＨＡ貯蔵性細胞の数（これは供給される炭素基質の量に依存する）と共に増加する。選択圧を確保し、なおかつ最適化されたＰＨＡ生成プロセスのための操作条件を課すように操作される単一段階の系では、選別パラメータを慎重に固定および制御することで、（１）最も効率的なＰＨＡ貯蔵性株の強力な選別と、一方で（２）高いプロセス生産性と一貫性のある触媒バイオマス濃度をもたらす細胞増殖速度の維持とを、（３）成長のための炭素取込みを炭素同化の総容量に調整することにより細胞中のＰＨＡ貯蔵の最適化をもたらす条件で、同時に行うことを可能にしなければならない。
【００５１】
言い換えれば、選別ステップを、ＰＨＡ生成ステップと同時にかつ同じ反応器中で実施することは、
−  任意の活性汚泥接種材料から高度に効率的なＰＨＡ貯蔵性微生物の限定されたコンソーシアムをもたらす、選択圧を適用することと、
−  選別された微生物のＰＨＡ貯蔵応答を最大化する操作条件を適用することと、
−  ＰＨＡ貯蔵性生物のみの残余成長を維持することと
を可能にする。
【００５２】
加えて、本発明の方法は無菌条件で実施する必要がないので、現在利用可能な他のバイオプラスチック（ＰＬＡなど）や、さらには従来のプラスチックに対抗できる価格でＰＨＡが生産される。
【００５３】
有利な実施形態では、好気的に混合された生物反応器におけるｐＨ値は、５．５〜９の間、好ましくは６．５〜８の間に固定される。ＰＨＡを蓄積しない他の微生物の選別を回避するために、ｐＨをこれらの値内に維持すべきである。
【００５４】
有利な解決法によれば、比細胞成長速度μ１と易生分解性炭素基質の取込み速度ｑＳ１との間の比μ１／ｑＳ１は、０．０１から０．５の間の範囲の生成されるバイオマス（ｇ）／消費される易生分解性炭素基質（ｇ）、好ましくは０．０５から０．２５の間の範囲の生成されるバイオマス（ｇ）／消費される易生分解性炭素基質（ｇ）に含まれる。
【００５５】
有利な解決法によれば、好気培養する前記第１のステップは、連続式または半連続式の混合生物反応器中で、単一段階で実施される。
【００５６】
実際に、本発明の方法は、先行技術のプロセスとは対照的に、選別ステップとＰＨＡ生成ステップとを単一の生物反応器中で１ステップのみで行うことを可能にする。
【００５７】
別の有利な解決法によれば、好気培養する前記第１のステップは１つまたは複数の付加的な段階をさらに含み、前記付加的な段階のそれぞれがそれまでの段階よりも厳しい栄養制限下で行われ、それぞれの段階の比細胞成長速度がそれまでの段階の固定された比細胞成長速度よりも小さく、それぞれの段階が連続式、半連続式、バッチ式、またはフェドバッチ式の混合生物反応器のいずれかの中で行われる。
【００５８】
この場合、第１の段階は、安定なＰＨＡ産生コンソーシアムをもたらす選択圧を確保する段階であり、後続のすべての段階は、ＰＨＡ含有量やプロセス生産性を最大化する、またはＰＨＡ組成を操作するために使用される。しかし、後続の段階は、微生物コンソーシアムの組成にいかなる影響も与えない。これらの後続の段階の好気培養を、連続モードまたはバッチ／フェドバッチモードのいずれかで行うことができる点に留意することもまた重要である。本発明の方法を単一段階プロセスで適用するかまたは多段階プロセスで適用するかの選択は、目標ＰＨＡ細胞含有量、所望のＰＨＡ組成、目標生産性、およびプロセス制御のために使用される方法の複雑さに基づくことになる。
【００５９】
さらに、栄養制限の異なる影響がＨＢおよびＨＶの合成速度に対して観察されるので、第２の段階を使用して、生成されるＰＨＡのＰＨＡ組成を制御することもできる。より厳重な制限条件を使用することで、ＨＶ／ＨＢ合成速度をそれぞれ制御し、これにより、Ｐ（ＨＢ−ｃｏ−ＨＶ）コポリマー中のＨＶの割合を制御することができ、これはその後、ＰＨＡモノマー組成によって変動する、ポリマーの熱的特性および機械的特性に影響を与える。
【００６０】
有利な解決法では、第１の連続培養ステップ中における細胞成長速度の固定は、細胞保持時間（ＣＲＴ）の制御によって達成される。この特徴は、第１の好気培養ステップが単一段階または２段階以上のどちらで行われる場合にも当てはまる。
【００６１】
細胞滞留時間(cell residence time)は、以下の式によって計算される：ＣＲＴ１＝１／μ１。ケモスタット(chemostat)のような連続的に操作される反応器系の場合、ＣＲＴは、反応器容積に対する流入液流量の比である希釈率（Ｄ１＝μ１＝Ｑ／Ｖ）の適用によって固定することができる。バイオフィルム型反応器、細胞再循環式反応器または連続バッチ式反応器などの、水理学的(hydraulic)保持時間と細胞滞留時間とが連動していない系の場合、パージ速度の固定によって同様に細胞滞留時間を固定することができる。ＣＲＴは、プロセス中の固体の乾燥質量を、単位時間当たりにプロセスから除かれた固体の乾燥質量で除した値として定義される。
【００６２】
別な言い方をすれば、好気的に混合された生物反応器を固定された細胞保持時間（例えば、ケモスタットの場合、細胞保持時間は希釈率の逆数である）で操作し、これにより固定された細胞分裂速度を課す。これにより、栄養制限条件において細胞分裂することが可能な微生物の成長を促進する。
【００６３】
好ましい実施形態では、前記微生物の細胞成長速度μ１は、０．０１ｈ−１から０．１ｈ−１の間、好ましくは０．０３ｈ−１から０．０８ｈ−１の間に固定される。細胞増殖を低レベルに維持することは、ＰＨＡ貯蔵を最大化するのに役立つ。これは特に、本発明の方法を単一段階で、すなわち、単一の反応器中で行う場合に当てはまる。
【００６４】
同様に好ましい実施形態では、プロセスが２段階で行われる場合、第１の段階における前記微生物の細胞成長速度μ１は、０．０１ｈ−１よりも大きい一定の値に固定され、上限は、固定された細胞成長速度においてＣおよび栄養の制限を維持する可能性によって決定される。この代替的な実施形態（２段階操作）では、第２の段階における前記微生物の細胞成長速度μ２は、０．０１ｈ−１から０．１ｈ−１の間、好ましくは０．０１ｈ−１から０．０５ｈ−１の間に固定される。
【００６５】
より好ましい実施形態では、比細胞成長速度μ１は前記固定された目標値前後で５０％を超えて変動せず、より好ましくは前記固定された目標値前後で２０％以下で変動する。言い換えれば、比細胞成長速度μ１は［目標値−５０％；目標値＋５０％］の範囲内、より好ましくは［目標値−２０％；目標値＋２０％］の範囲内に含まれる。選別されたバイオマスによってＰＨＡの生成と貯蔵とを同時に可能にする一方で、固定された比細胞成長速度を目標値前後に一定に保ち、一定の選択圧を維持するために、固定された比細胞成長速度を精密に制御することが重要である。
【００６６】
有利な解決法では、成長制限は、Ｐ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｋ、Ｍｇ、Ｆｅまたはこれらの組合せの中から選択される少なくとも１つの栄養の制限によって達成される。
【００６７】
好ましくは、制限される栄養はＰであり、比細胞成長速度μ１が０．０５ｈ−１から０．０１ｈ−１の間に含まれるとき、Ｐ／Ｃモル取込み比が０．０００２から０．０００５の間に含まれる。
【００６８】
好ましくは、制限される栄養はＰであり、比細胞成長速度μ１が０．１ｈ−１から０．０５ｈ−１の間に含まれるとき、Ｐ／Ｃモル取込み比が０．０００５から０．００５の間に含まれる。このことは、本発明の方法を２段階のプラントで行う場合に特に当てはまる。２段階の実施形態では、第１の段階のＰ／Ｃモル取込み比は０．００１から０．０１の間に含まれ、第２の段階のＰ／Ｃモル取込み比は０．０００２から０．００５の間に含まれる。
【００６９】
二重制限の条件である場合、Ｐ／Ｃ供給フローモル比によってこのパラメータを制御することができる。Ｐの制限により細胞成長が減速し、ＰＨＡ貯蔵が開始(trigger)される。本発明者らは、０．０００２から０．００５の間に含まれるＰ／Ｃモル比がＰＨＡ貯蔵を開始させ、一方で反応器中の残余成長を維持することを見出した。さらに、本発明者らは、この特定の範囲のＰ／Ｃモル比が最大理論収率付近のＰＨＡ貯蔵収率を与えることを見出した。二重基質（炭素および栄養）制限条件を確実とするために、このパラメータを精密に制御しなければならない。成長制限と栄養制限とを同時に課す必要性があることを前提にすると、栄養制限および細胞成長制限は対で定義される必要があり、すなわち、固定された比細胞成長速度μ１およびＰ／Ｃモル比が一緒に定義される必要がある。０．１から０．０５ｈ−１の間の課される比細胞成長速度μ１に対し、課されるＰ／Ｃモル比は、０．００５から０．０００５の範囲内にあるべきであり、一方、０．０５から０．０１の範囲の固定された細胞成長速度に対し、課されるＰ／Ｃモル比は０．０００２から０．０００５の範囲内にあるべきである。
【００７０】
フロック(floc)に吸着された栄養および細胞内栄養濃度を希釈することにより、十分な栄養制限条件を迅速に課すことが必要である。
【００７１】
これは、流入液に炭素流入を有するが栄養流入を有さない前記好気培養系を最初に操作することによってなされる。例えば、制限栄養がリンであるとき、リン流入を希釈するために、吸着されたＰ  １ｍｇにつき約０．２ｇの触媒バイオマスが合成されなければならない。従来の活性汚泥（ポリホスフェート蓄積汚泥ではない）では、吸着されたＰのレベルは、約１ｍｇ[Ｐ／揮発性浮遊固形物（ＶＳＳ:volatile suspended solid）(ｇ)］である。これは、吸着されたＰを洗い落とすために、接種されたバイオマス１ｇ当たり０．２ｇの新規バイオマスを生成する（これは約１／５の細胞保持時間を意味する）ことが必要であることを意味する。一方、細胞内のリンを希釈するために、Ｐレベルを２〜４％から約０．５％に減少させなければならない。Ｐレベルを４〜８倍に希釈するために必要な時間は、細胞倍加時間(cell doubling time)の２〜４倍の時間であり、したがって、課される細胞成長速度に直接的に依存することになる。この期間の持続時間は、細胞成長速度に依存することになる。
【００７２】
低すぎるリン濃度は細菌成長を阻害し、生物反応器系を不安定にし、流出(wash out:流亡)のリスクが生じるため、低すぎるリン濃度になるのを防ぐことが非常に重要である。本発明の一実施形態では、ＣおよびＰの供給フローは、目標細胞内Ｐ制限濃度に達したらすぐにＰの供給フローを開始することができるように、別々に行われるべきである。この後の方の時点は、酸素取込み速度およびｐＨプロファイルに基づいて決定することができる。本発明の実施形態では、バルクでの目標Ｐ制限濃度の段階的な減少を課すことができる。これは流亡を防ぐのに役立つ。
【００７３】
好ましい実施形態では、前記成長制限を、易生分解性炭素基質および枯渇した栄養を別々に添加することによって行う。より好ましくは、廃棄物系(waste-based)供給材料のように、易生分解性炭素基質流入物の組成が不確かなので、それらから選択された栄養を枯渇させるために、前記易生分解性炭素基質流入物を前処理することができる。
【００７４】
有利な実施形態では、炭素基質濃度を増加させるために、易生分解性炭素基質廃液を生物反応器中へ注入する前に濃縮することができる。これにより、得られる触媒バイオマス濃度をより高めることが可能になり、よって、プロセス生産性を改善するのに役立つ。
【００７５】
好ましくは、炭素基質廃液は、少なくとも３０％のＶＦＡ、より好ましくは少なくとも５０％のＶＦＡを含む。より具体的には、炭素基質富化(substrate-rich)廃液の総ＣＯＤは、少なくとも５０％のＲＢＣＯＤ基質および少なくとも３０％のＶＦＡ、好ましくは少なくとも５０％のＲＢＣＯＤ基質および少なくとも５０％のＶＦＡを含む。「ＣＯＤ」は、「化学的酸素要求量(chemical oxygen demand)」を意味する。
【００７６】
ＶＦＡは様々な起源からなっていてよく、好ましくは、工業廃液、廃水、都市固形廃棄物の有機物画分(fraction)、市場および収集再生工場からの浸出水等のような、廃棄物または副生成物系供給材料に由来していてもよい。これらの供給材料のいくつかは、元からＶＦＡに富んでいる。しかし、より一般的には、これらの種類の供給材料は、様々な炭素基質が存在することによって特徴付けられる。複雑な廃棄物系供給材料からのＰＨＡ生成のためにＶＦＡ前躯体を使用することは、通常、これらのストリーム中に存在する有機物を生物学的、物理−化学的にＶＦＡに変換する段階を含む。本発明の変形では、本発明は、廃棄物系供給材料の有機物画分をＶＦＡに変換するための予備的段階を含んでいてもよい。前記予備的段階は、嫌気条件下における酸性発酵、および、促進酸化法や熱処理法などの物理−化学プロセスの中から選択することができる。
【００７７】
有利な実施形態では、本発明の方法は、前記微生物コンソーシアム中のＰＨＡ含有量およびＰＨＡ組成を連続的にモニタリングするステップをさらに含む。ＰＨＡ含有量の連続的なモニタリングは、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、ＦＩＴＲ（フーリエ変換赤外線）分光法によるオンラインモニタリング、乾燥した試料の熱重量分析（ＴＧＡ）またはｐＨ変動のモニタリングにより、直接的または間接的に行うことができる。
【００７８】
達成されるＰＨＡ含有量は課された選択圧の直接的な結果であるため、ＰＨＡ含有量のモニタリングは選別効率を直接評価する役割を果たし得る。ＰＨＡ含有量の減少は、流入液Ｃ対選択された栄養の比の変化による選択圧の喪失を直接示し、よって、速やかに検出および解決することができる。実際に、高く安定した選別効率を一定に維持するために生成プロセスを精密に調節することは、本発明の態様である。
【００７９】
有利な実施形態では、本発明の方法は、生物反応器中の残留易生分解性炭素基質濃度をモニタリングするステップをさらに含む。この特徴は、ＲＢＣＯＤ基質が主にＶＦＡから構成されている場合に特に重要である。実際、残留ＶＦＡ濃度をモニタリングすることは、一部の場合に非常に低い残留基質濃度に対してでさえ生じる、ＶＦＡ基質による阻害を防ぐのに役立つ。これは、非常に低い阻害定数を有するプロピオン酸の場合にとりわけ当てはまる。
【００８０】
基質（電子供与体）の蓄積は、制限が強すぎること、および微生物培養物がもはや過剰な炭素取込みフラックスを持続できないことを示す。ＶＦＡの蓄積は、細胞成長阻害およびＰＨＡ貯蔵応答の減少につながる。速やかな検出により、制御ループを通じて即座に修正を行い、これにより一定の選別効率を維持することが可能になる。ＶＦＡ濃度のモニタリングに適した技法は、ｐＨ測定、近赤外線分光（ＮＩＲ）分析、呼吸係数または酸素取込み速度のモニタリングを含む。
【００８１】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、前記連続式生物反応器中の易生分解性炭素基質蓄積量、ＰＨＡ細胞含有量の減少量、ＰＨＡ細胞含有量の所定の値への減少量またはこれらの組合せの中から選択されるパラメータによって開始される制御ループをさらに含む。特に、所定の値は、到達させる目標または所望のＰＨＡ含有量とすることができる。所定の値は、プロセスの所望の効率に従って選択することができる、最低ＰＨＡ含有量値とすることもできる。より具体的には、反応器中のＶＦＡ蓄積量は、制限が強すぎること、すなわち、取込みと成長との間の不均衡が強すぎることを示し、細胞はもはや炭素基質の流入を取り込むことができず、したがって、消費されないＶＦＡが反応器中に蓄積する。一方、課される制限が十分に強くない場合、ＰＨＡ貯蔵は効果的に始まらず、よって、制限が不十分であることをＶＦＡ蓄積量が示すことなく、ＰＨＡ含有量は減少する。
【００８２】
細胞内でのＰＨＡの生成および蓄積を再開し、阻害または強すぎる制限を防ぐために、プロセスパラメータ（細胞希釈率、細胞滞留時間、栄養または炭素源廃液のいずれかの供給の停止）を改変することができる。この特徴は、本発明の方法を微調節するのに役立つ。
【００８３】
これらの理由のすべてに対して、本発明は、持続可能で、より効率的で、実施することがより容易で、先行技術の方法よりも安価なＰＨＡ生成プロセスを提供する。別の言い方をすれば、本発明の方法は、純粋培養系の利点（高性能：生産性、収率）と混合培養系の利点（非無菌条件、低コスト基質）とを兼ね備え、一方でそれらの不利な点を制限し、さらには回避している。したがって、本発明の方法によって生成されたＰＨＡは、他のバイオプラスチック、さらには石油系プラスチックに対抗し得る。
【００８４】
本発明の別の目的は、Ｐ源廃液および易生分解性炭素基質富化廃液を少なくとも第１の混合生物反応器中に注入する手段と、固液分離装置(liquid-solid separator)とを備える、本発明の方法を実施するための水処理プラントに関する。
【００８５】
本発明の方法によれば、選別および生成段階を、少なくとも第１の連続式または半連続式の混合生物反応器中で実施する。固液分離装置は、細胞滞留時間（ＣＲＴ）を水理学的滞留時間（ＨＲＴ）から切り離すために、前記連続式の混合生物反応器中の細胞保持時間を調節するのに役立つ。したがって、細胞成長速度を、ＶＦＡの負荷および水理学的保持時間または液体希釈率から独立して固定することができる。
【００８６】
固液分離装置は、連続式混合生物反応器の下流側とすることも、反応器と一体化することもできる。ＰＨＡ産生微生物は、排出路(overflow)を介して固液分離装置中を通過する。
【００８７】
細胞滞留時間は、以下の式によって計算される：ＣＲＴ＝１／μ［式中、μは反応器中における比細胞成長速度である］。したがって、固液分離装置は、比細胞成長速度μの調節および維持に役立つ。
【００８８】
好ましい実施形態では、本発明の水処理プラントは、連続式、半連続式、バッチ式またはフェドバッチ式のいずれかのモードで動作する、連結して配置された少なくとも１つ以上の付加的な混合生物反応器をさらに備え、それぞれの付加的な生物反応器中における栄養制限がそれまでの生物反応器中におけるよりも強い。
【００８９】
実際、厳しすぎる制限を突然課すことは、細胞分裂および代謝能力を危機にさらし得る。したがって、ＰＨＡ貯蔵量を最大化するために栄養制限の程度を徐々に高め、それによって後続の段階で第１の段階よりも高いＰＨＡ含有量を得、これにより第１の段階を恒久的な選択圧、細胞更新能力を維持する手段として維持し、生産性を最大化し（より低いＰＨＡ含有量でより高い動力学を得る）、後続の段階を使用してＰＨＡ含有量を最大化し、かつ／またはＰＨＡ組成を操作することは、興味深いことであり得る。
【００９０】
これはまた、培養物の流亡につながり得る、強い制限条件に近すぎる選別系の操作によらずに、系の頑強性(robustness:構造安定性)を増加させることにも役立ち得る。後半の段階では、これらの段階は細胞更新を確保することを意図したものではなく、それまでの選別されたコンソーシアム中におけるＰＨＡ細胞含有量を最大化することのみを意図したものであるため、このリスクはもはや存在しない。
【００９１】
さらに、課される制限の度合の段階的な増加は、第２の段階において細胞更新と適合し得ない制限の度合を課すのにも役立ち得る。この後続の段階は、第１の段階に対して連続的に配置された連続式バイオリアクター中で、またはバッチもしくはフェドバッチモードで実施することができる。さらに、ＨＶ合成に対するＶＦＡ前躯体（プロピオネートおよびバレレート(valerate)など）が存在することを前提とすると、厳しいＰの制限およびさらには完全な枯渇は、ＨＢよりも高いＨＶ合成速度をもたらすので（よって、コポリマーのＨＶ含有量を増加させる）、制限の度合を使用してポリマー組成を操作することができることが示された。したがって、このような構成では、第１の段階を使用して、バイオマスおよびＰＨＡにおいて高いプロセス生産性を維持することができ、一方で、後続の段階を使用してＰＨＡ含有量を最大化し、特定のＰＨＡ組成に目標を定めることができる。
【００９２】
本発明の代替法では、それぞれの付加的な生物反応器が、第１の連続式混合生物反応器と固液分離装置との間に位置するか、または固液分離装置の下流側に位置する。
【００９３】
この代替法によれば、それぞれの付加的な生物反応器は、固液分離装置に接続されている。それぞれの固液分離装置は、下流側に位置させることも、それぞれの付加的な生物反応器と一体化させることもできる。好適な固液分離装置は、篩、メンブレンフィルター、沈降槽(settler)または遠心分離機を含む群から選択することができる。
【００９４】
好ましくは、第１の連続式混合生物反応器およびそれぞれの付加的な生物反応器は、ケモスタット、分離装置と連携したケモスタット、膜生物反応器（ＭＢＲ）、固定床バイオフィルム反応器または粒子反応器を含む群から選択される、細胞再循環ループ(cell recirculation loop)を有する生物反応器である。細胞再循環ループは、ＣＲＴ、そしてそれぞれの生物反応器中における細胞成長速度μの精密な調節を可能にする。より好ましくは、第１の連続式混合生物反応器は、ケモスタットまたは分離装置と連携したケモスタットであり、細胞再循環ループを備える。
【００９５】
好ましい実施形態では、第１の連続式混合生物反応器および／またはそれぞれの付加的な生物反応器は、微生物中のＰＨＡ含有量および／または残留易生分解性炭素基質濃度をモニタリングする手段を備える。より好ましい実施形態では、第１の連続式混合生物反応器のみが、微生物中のＰＨＡ含有量および／またはＶＦＡ濃度をモニタリングする手段を備える。ＰＨＡ含有量および／またはＶＦＡ濃度は、細胞の生理状態およびプロセスの性能の指標である。所与の比細胞成長速度において、生物反応器中の高いＶＦＡ濃度は、制限が厳しすぎることを示す。ＶＦＡの蓄積が観察されることなくＰＨＡ含有量がそれまでの値より減少することは、栄養制限を増加させるべきであることの指標である。ＶＦＡ濃度およびＰＨＡ含有量は、ｐＨモニタリング、ＮＩＲ、ＦＴＩＲおよびＴＧＡなどの当技術分野で公知の任意の方法によってモニタリングすることができる。
【００９６】
別の好ましい実施形態では、本発明の水処理プラントは、易生分解性炭素基質富化廃液を注入する手段およびＰ源廃液を別のストリームとして注入する手段をさらに備える。よって本発明のプラントは、炭素源およびリンの利用可能性をより良好に調節することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】本発明による１段階ＰＨＡ生成ユニットを含む、工業廃液の処理プラントを示す図である。
【図２】Ｐの制限に関する結果またはＰＨＡ生成量を表すグラフである。
【図３Ａ−３Ｃ】培養の７日目から７２日目までの、１段階ＰＨＡ生成ユニット中における微生物コンソーシアムの発達を表す写真である。
【図３Ｄ】１段階ＰＨＡ生成ユニット中における微生物コンソーシアムの発達を表すグラフである。
【図４】１段階生成ユニット中における本発明の方法によるＰＨＡ生成の結果を表すグラフである。
【図５】２段階ＰＨＡ生成ユニットを備える廃水処理プラントの構成の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００９８】
本発明の基本的な原理は、炭素基質取込みフラックス、好ましくはＶＦＡフラックスと細胞成長速度μ１を維持するために必要とされる栄養のフラックスとの間の不均衡を発生させることによる、ＰＨＡ産生株の選別と、ＰＨＡ生成量を最大化し、課される細胞保持時間（ＣＲＴ）と調和する生細胞更新および細胞分裂速度を維持することとの両方を可能にする、培養パラメータの慎重な選択に依存している。栄養制限は、細胞にストレスを生じさせ、微生物中におけるＰＨＡ細胞内蓄積を開始させる。一方、維持された残余細胞分裂速度により、バイオマス生成が確保される。
【００９９】
別な言い方をすれば、本発明の原理は、最も効率的なＰＨＡ貯蔵性微生物のみを選別するために、好気培養系に恒久的な選択圧を適用することに依存する。選別ステップと生成ステップとが異なる反応器中で連続して行われる先行技術の方法とは対照的に、ここでは選別ステップと生成ステップとが、ＰＨＡ生成ステップと同じ生物反応器中で同時に恒久的に実施される。より具体的には、選択圧は、代謝がＰＨＡ貯蔵に向けられる一方、残余細胞成長および分裂を維持するといったものである。本発明の方法は、一定の残余活性細胞更新を課すことによって、細胞中のＰＨＡ貯蔵を最大化する。
【０１００】
これらの目的は、パラメータの慎重な選択によって達成される。そのパラメータは、
−  固定された比細胞成長速度μ１の適用、
−  好気的な連続式または半連続式生物反応器中での培養、
−  栄養制限、および
−  ＰＨＡ貯蔵性細胞による炭素源取込みとそれらの増殖速度との間の不均衡を発生させるための、これらすべてのパラメータの制御
である。
【０１０１】
他の重要なパラメータは、無視できない量の接種材料濃度が含まれる反応器の始動中における選別プロトコールの厳重な観察、栄養枯渇期間（ＲＢＣＯＤ基質のみが添加される）の観察、栄養制限の軌跡(trajectory)の選択（例えば、Ｐ／Ｃ供給モル比の段階的な減少と並行した、課される細胞成長速度の段階的な減少）、固定された細胞滞留時間の選択、および連続操作の後続のフェーズにおいての栄養／Ｃ比である。
【０１０２】
本発明およびその様々な利点は、本発明の方法を実施するための水処理プラントを図式的に示す後続の図に関して示す、本発明の非限定的な実施形態についての以下の記述を読むことでより容易に理解されるはずである。
【実施例】
【０１０３】
＜実施例１  本発明の方法による、工業廃液に価値を与えるための１段階ＰＨＡ生成系＞
図１を参照すると、本発明の方法を実施するための水処理プラントが開示されている。図１は、本発明の方法がどのように機能するかについての略図または概略を示すものであって、装置が空間的にどのように構成されなければならないかを限定するものではない。
【０１０４】
任意の種類の工業廃液１１は、ＶＦＡ生成ユニット２に入る。ＶＦＡ生成ユニットはタンクであり、その中で熱加水分解、酸化または酸性発酵などの、当業者に公知の任意の方法によってＶＦＡが生成される。したがって、廃液１２はＶＦＡで富化される。このＶＦＡ富化廃液１２は固液分離装置３０に入り、この中で浮遊固形物がＶＦＡ富化廃液から取り除かれ、これにより清澄化されたＶＦＡ富化廃液１３と浮遊固形物ストリーム３１とが生成される。固液分離は、任意の従来法、すなわち、沈降、膜濾過、フロック形成および顆粒またはバイオフィルム反応器によって実施することができる。
【０１０５】
清澄化されたＶＦＡ富化廃液を、リン沈殿ユニット４中でリン沈殿ステップに供する。Ｐ沈殿は、浮遊物質がほとんどない液体廃液に対する化学沈殿またはイオン交換プロセスなどの、当業者に公知の任意の方法によって実施することができる。このステップにより、リンＰが枯渇したＶＦＡ富化廃液を生成することが可能になる。よって、供給する廃液の組成および微生物に課される二重制限を制御することがより容易になる。ストリーム３３中に除外されたフロックに吸着された凝集剤であるリンを、ＶＦＡに富みＰに乏しいストリーム１５から分離するために、第２の固液分離ステップを、沈降槽または遠心分離機などの固液分離装置３２中で行う。
【０１０６】
ストリーム１５とＰ源６の両方をＰＨＡ生成ユニットに別々に添加する。炭素源および栄養源を別々に添加することにより、細胞による供給の制御、したがって課される二重制限の制御がより容易になる。実際、本発明の方法の実施には、供給パラメータが精密に設定および制御されることが重要である。好ましくは、Ｐ源流入物は天然源に由来し、より好ましくは、ストルバイト(struvite)など、廃棄物系Ｐ回収プロセスに由来する。反応器１のＰ／Ｃモル比は、０．００２〜０．００５の間に固定および維持される。
【０１０７】
ＰＨＡ生成ユニットは、連続式または半連続式混合生物反応器５である。この反応器はエアブロワー(air blower)などの酸素処理手段５１によって完全にエアレート(aerate:曝気)され、プロペラなどの機械式撹拌機５４が備えられている。反応器は、接種材料として活性汚泥を収容する。細胞成長速度μ１は、０．０５分裂／時に固定される。
【０１０８】
連続式生物反応器５は、温度センサー５２およびｐＨセンサー５３をさらに備える。温度およびｐＨセンサー（５２、５３）は、すべて制御ユニット９に電気的に接続されている。細胞呼吸係数(cell respiratory coefficient)を制御するために、生物反応器５の排出口１７に気体測定システムを設けることもできる。
【０１０９】
生物反応器５は、生物反応器５と固液分離装置３４とを接続するパイプライン１７をさらに備える。固液分離装置３４は、排出される液体廃液を除去するための排出口３５を備える。固液分離装置３５の主な役割は、ＰＨＡ貯蔵性細胞を生物反応器５にリサイクルし、細胞滞留時間ＣＲＴ１を制御することである。制御ＣＲＴ１は、固定された細胞成長速度μ１と反比例するので、前記固定された細胞成長速度の制御は、必要なときに反応器５をパージすることによって実現することができる。
【０１１０】
沈降槽３４からの固液分離により、濃縮されたＰＨＡ富化バイオマスストリーム１８もまた生成され、これが下流加工ユニットＤＳＰユニット７へと送られ、ここでさらなる濃縮（例えば、遠心分離による）および回収されたバイオマスの乾燥が行われる。ＤＳＰユニットは、ＰＨＡ富化の乾燥バイオマス２０を生成し、これから溶媒抽出などの任意の従来法によってＰＨＡを回収する。
【０１１１】
濃縮されたＰＨＡ富化バイオマスの一部１９を混合生物反応器５に再送して、ＰＨＡを富化することができる点は注目に値する。この細胞再送ループは、ＰＨＡ生成系をより頑強なものとし、その基質またはバイオマス組成の変動に対する依存性をより低下させる。
【０１１２】
生物反応器５は、パイプラインに組み込まれたパージ排出口５５を備える。生物反応器１のパージを制御して、細胞滞留時間ＣＲＴ１を固定された値に維持することで、比細胞成長速度を固定する。パージからの細胞を採取して、任意の従来法によってＰＨＡを回収する。しかし、周期的にパージから試料を集める。バイオマスを乾燥機５６中で乾燥させ、ＦＴＩＲまたはＴＧＡライン分析５７を実施して、ＰＨＡ含有量を評価する。分析の結果は、制御ユニット９に送信される。
【０１１３】
生物反応器５の操作時、ｐＨおよび温度は、オンラインでモニタリングされる。これらのパラメータの値は、制御ユニット９に伝送される。ＰＨＡ含有量は、ＦＩＴＲ分析によって、例えば１日２回、周期的に評価される。次いで、ＦＩＴＲ分析の結果を制御ユニット９に入力することができ、これがＰおよびＶＦＡの流入（それぞれ９２および９１）を調節する。プロセスの微調節のための決定則は、以下の通りである：
１．推測されたＰＨＡ含有量が所望の最低限のＰＨＡ含有量よりも低く、同時にＶＦＡ蓄積が記録されていない場合（ＶＦＡ阻害が観察されないことを意味する）、Ｐ／Ｃモル比は減少させなければならず、ＶＦＡ富化流入物を増加させるか、またはＰ源流入物を減少させなければならない。
２．推測されたＰＨＡ含有量が目標値よりも度合がかなり高い場合、これは系が過度に制限されつつあるリスクにあることを意味する。したがって、Ｐ源流入物を増加させるか、またはＶＦＡ富化流入物を減少させることによって、制限度を低下させることができる。
３．ｐＨが減少する場合、酸ＶＦＡ蓄積が生じており、このことは、Ｐ／Ｃ制限を弱めなければならないこと、すなわち、Ｐ富化流入物を増加させるか、またはＶＦＡ富化流入物を減少させなければならないことを意味する。反応器中に基質の蓄積が存在していたため、後者の選択肢が最善であり、蓄積されたＶＦＡが再消費されるまで流入するフローを減少させることがより良い。
４．ＰＨＡ含有量およびｐＨ値が安定化したｐＨおよびＰＨＡ含有量値と少なくとも等しい場合、適用された条件を維持する。
【０１１４】
＜実施例２  本発明の方法による、工業廃液に価値を与えるための１段階ＰＨＡ生成系＞
２つの開放培養系に、廃水処理プラントに由来する２つの異なる活性汚泥が播種されている。これらの開放培養系は、ＶＦＡユニットもＰ沈殿ユニットも設けられていないという点を除いて、実施例１に記載したものと類似している。両方の培養物は、類似の条件下で操作されている。培養プロセスを持続させて本発明の方法を行うために、５Ｌのバイオリアクターをケモスタットとして操作した。
【０１１５】
ＶＦＡ富化廃液は、酢酸溶液およびリン酸塩溶液のＰ源ストリームからなる。生成される、ＰＨＡの１種であるポリヒドロキシブチレートＰＨＢの細胞含有量は、生物反応器中における、全バイオマス（Ｘｔｏｔ）の重量に対する細胞中に貯蔵されたＰＨＢの重量の比によって計算される。Ｐ／Ｃの制限は、生物反応器中における、消費された酢酸（ＡＡ）の重量に対する消費されたリンの比によって計算される。このパラメータは、ＡＡ取込みと、制限されたＰ取込みによって制限された成長速度との間の不均衡を反映する。結果を図２に示す。
【０１１６】
最初の７２ｈの間、いかなるＰ源をも供給せず、ＡＡ供給ストリームのみを供給することにより、吸着されたＰおよび細胞内Ｐの流亡を微生物培養物に強制的に与えた。その後、最初の２６日間、各培養物を非成長制限条件（課された成長速度は０．１ｈ−１）で培養した。この予備的ステップにより、培養物選別プロセスを開始する前に細菌個体群を増殖させることが可能になる。１２日間の培養後、細胞の増殖を減速するために、細胞を第１のＰ制限度（約３．５×１０−３から２．５×１０−３［Ｐ（ｇ）／消費されたＡＡ（ｇ）］への減少）に供した。
【０１１７】
２６日目から５８日目まで、各接種材料を、二重制限法の選別効率を実証することを意図した選別プロトコールに供した。この３２日の期間中、供給物のＰ／Ｃ比を減少させることにより（２．５×１０−３から１．５×１０−３へ、次いで１×１０−３［Ｐ（ｇ）／消費されたＡＡ（ｇ）］へのＰ／Ｃ取込み比の減少）、Ｐ制限度を段階的に増加させて、固定された細胞成長速度μ１を０．０５１分裂／ｈ−１に保ちつつ、微生物に対する選択圧を増強させた。本発明者らは、Ｐ／Ｃ制限度と共にＰＨＢ細胞含有量が急速に増加し、３２日でバイオマス全重量のおよそ７５％に達することを観察している（図２）。
【０１１８】
この期間中、顕微鏡観察によって微生物コンソーシアムの単純化を観察することができ、分子法によって確かめられた（図３Ａ〜Ｄ）。より具体的には、異なる培養時間（７日目から７５日目）において、細菌個体群の試料を連続式混合生物反応器から取り出した。これらの試料を、存在する種の数を評価することが可能な分子フィンガープリント法である、ＳＣＣＰ分析にかけた。図３Ｄに示すように、ＳＳＣＰプロファイルは単一培養物への発達を示した。さらにまた、培養物をペトリ皿に播種した。図３Ａ〜Ｃは、細菌個体群の発達を示し、これらにより、不均一な微生物個体群が限定された微生物コンソーシアムへと発達していることが確認される。
【０１１９】
バイオリアクター中で見出されたこれらの結果は、ＳＳＣＰ分析により同じであると確認された（図３Ｄ）。これらの結果に従うと、系に適用された高い選択圧により、多様なコンソーシアムから単一培養物へと発達する微生物培養物がもたらされた（同じ細菌株に属する細胞が約９９％）。したがって、この期間（期間Ｉ）中に課される条件を使用して、活性汚泥の多様な接種材料を高い機能特化(specialization)（ＰＨＡ貯蔵）を有する単一培養物へと単純化することが可能な選別法を持続させることができた。
【０１２０】
５１〜５８日目に観察される操作条件、すなわち、０．０５１ｈ−１の比細胞成長速度および１×１０−３[ｇ Ｐ／ｇ]の厳格なＰ制限により、６５〜７５％の間のＰＨＡ細胞含有量がもたらされる点は、注目に値する。このようなＰＨＡ細胞含有量は、経済的に価値のあるプロセスに適合し、よって、これらの条件を使用して、培養物の選別とＰＨＡ生成とを同時に行うための単一段階プロセスを操作することができる。７０％（ＰＨＡ（ｇ）／ＣＤＷ（ｇ））というＰＨＡ細胞含有量は、０．７ｇＰＨＡ／０．３ｇＸ（Ｘは０．０５１ｈ−１で成長している活性バイオマスである）のＰＨＡの割合に相当する。
【０１２１】
プロセス比生産性(process specific productivity)は、ＰＨＡの活性バイオマスに対する割合（２．３３ ＰＨＡ（ｇ）／Ｘ（ｇ））に比細胞成長速度（０．０５１ｈ−１）を乗ずることによって計算することができる。よって、これらの条件下で０．１２ｇＰＨＡ／ｇＸ．ｈ(つまり０．１２［ＰＨＡ(g)／Ｘ(g)］×ｈ)というプロセス比生産性を得ることができる。体積生産性は、目標バイオマス濃度（供給物中のＶＦＡ濃度、空気供給および酸素物質輸送の効率によって定義される）に依存することになるが、５ｇ／Ｌの活性バイオマス濃度（この種類のバイオリアクターでは妥当な濃度である）において０．７ｇＰＨＡ／Ｌ．ｈ(０．７［ＰＨＡ(g)］／Ｌ×ｈ)の体積生産性に達することができる点は注目に値し、この体積生産性は、欠乏−豊富プロセスなどの従来系において観察される値と比較して非常に高い。
【０１２２】
５８〜８８日目に、細胞をさらにいっそう厳格な二重制限条件に供した。比細胞成長速度μ２は０．０２３分裂／ｈ−１に低下し、Ｐ／Ｃ取込み比も、０．５×１０−３、次いで０．３×１０−３［Ｐ（ｇ）／消費されたＡＡ（ｇ）］という低さまで、２段階で低下した。再び細胞成長およびＰ制限と共に％ＰＨＢは増加し、バイオマス全重量の８０％超のＰＨＢに達した。ＰＨＡ含有量は、これらの条件下で完全に最大化される。
【０１２３】
これらの結果によれば、Ｐ制限がより強くなるほど、選別された微生物はより多くのＰＨＡを生成および貯蔵する。細菌試料のＰＨＡ含有量分析により、細胞中のＰＨＡ含有量が、７日目の１７％のＰＨＢから７５日目の８０％へと徐々に増加していることが明らかとなる。この観察は、２つの異なる接種材料Ｒ１およびＲ２によって再現されている（図４）。さらに、得られた結果は、非常に厳格な二重制限条件下においてでさえ、２０日間の期間にわたって安定な効率性が維持され、７５％超のＰＨＡ細胞含有量と共にバイオリアクター中で細胞更新が維持されることを示しており、一度コンソーシアムを選別したら恒久的な選択圧が維持され、コンソーシアムの安定化が確実になることを示している。系が単一培養物または限定されたコンソーシアムへと発達すると、生成されるＰＨＡの質はより一様になり、より良好に制御される。さらに、効率的なＰＨＡ貯蔵性微生物のみが選別されるので、プロセスの全体的な効率は改善される。
【０１２４】
プロセスの最後において、反応器中の細胞を回収および採取して、溶媒抽出によってＰＨＢを抽出および精製した。
【０１２５】
＜実施例３  本発明の方法を実施するための２段階水処理プラント＞
廃水処理プラントに統合された２段階ＰＨＡ生成ユニットの実施形態を、図５において概略的に示す。廃水処理プラントが１段階ＰＨＡ生成ユニットと一体化することもできる点に着目することは重要である。図５は、本発明の方法がどのように機能するかについての略図または概略を示すものであって、装置が空間的にどのように構成されなければならないかを限定するものではない。
【０１２６】
廃水１００は、沈降槽１０１に入り、ここで一次汚泥１１０と処理される水とが分離される。処理される水１０２は、例えば活性汚泥により、従来型生物学的処理ステップ１０３に最初に供される。生物学的に処理された水１０４は、第２の沈降槽１０５に入り、ここで、処理された水１０７は、第２の汚泥１０６から分離される。次いで、処理された水１０７は、殺菌処理された水１０９を生成するために、場合により第３の殺菌処理１０８に供することができる。
【０１２７】
一次および二次汚泥（１１０、１０６）は回収され、容器２００中において嫌気条件下でＶＦＡを生成するための酸性発酵に使用される。ＶＦＡフロー１２０は、固液分離装置３００に入り、清澄なＶＦＡフロー１３０をＶＦＡ生成のために使用される汚泥（１０６、１１０）中に含有されるバイオマスおよび浮遊固形物から分離する。沈降したバイオマスおよび浮遊固形物は、除去される（３１０）。そしてこの固液分離のステップは、以下のステップをこのバイオマスによる汚染から防ぐ。清澄化されたＶＦＡ富化ストリーム１３０は、例えば、ＭｇＯ２またはＭｇＣｌ２を用いた化学的沈殿のためのＰ枯渇ユニット４００に送られる。次いで、リンが完全に除去された清澄なＶＦＡ富化ストリーム１５０を、枯渇したリンを含有するストリーム３３０から分離するために、ＶＦＡ富化ストリーム１４０は、沈降槽３２０中で固液分離ステップに供される。場合により、このストリーム３３０を使用してＰ富化源を生成することができる。
【０１２８】
リンが枯渇したＶＦＡ富化ストリーム１５０は、実施例１で記述した生物反応器５と同一である第１の連続式混合生物反応器５００に送られる。パイプライン６００は、Ｐ富化源を供給する。第２の段階で課される制限度は、第１の段階で課される制限度と異なるので、モニタリングおよび調節を、先に記載したのと同じやり方であるが異なる目標操作条件において実施する。ここでの調節は清澄化のためではない。ＰＨＡ富化バイオマスストリーム１６０は、沈降槽３４０中で固液分離ステップに供される。液体でできている液相３５０は、廃水処理ラインへとリサイクルされる。ＰＨＡ富化バイオマスストリーム１７０は、第２の生物反応器５１０に入り、本発明の方法による第２の選別−ＰＨＡ生成ステップに供される。
【０１２９】
第２の生物反応器５１０は、第１の生物反応器５００と同じ種類のものであるが、第１の生物反応器５００の希釈率Ｄ１から低下した希釈率Ｄ２とし、したがって、第１の生物反応器５００の細胞成長速度μ１から低下した比細胞成長速度μ２とするために、類似またはより大きな体積を有する。好ましくは、μ２はμ１よりも小さい。
【０１３０】
Ｃ／Ｐモル比は、第１の生物反応器５００では２００〜２０００の間に固定され、第２の生物反応器５１０では２０００超に固定される。場合により、バイオマスに対する制限条件を強めるために、第２の生物反応器ではＰが完全に枯渇している。反応器５００と５１０の両方を好気条件および非無菌条件下で操作する。これらの反応器は、連続式または半連続式のいずれとすることもできる。
【０１３１】
第２の生物反応器中で生成されたＰＨＡ富化バイオマス１８０は、固液分離装置３６０に送られる。液相１９０は、廃水処理ラインに再送され、一方、ＰＨＡ富化バイオマスでできた固相３７０は、ＤＳＰユニット７００に送られ、ここでＰＨＡ富化バイオマスは、少量の培養液をすべて除去するために乾燥される。ＰＨＡは、乾燥されたＰＨＡ富化バイオマス７１０から任意の従来法によって回収される。
【０１３２】
第１の生物反応器中で生成されたＰＨＡ富化バイオマスを本発明の方法に再び供して、より強い二重制限条件を課すことにより、細胞中のＰＨＡ含有量の最大化を可能にする。また、製造者の必要性および要求に従って生成されるポリマーをカスタマイズするために、ＰＨＡ組成を改変するのにも役立つ。特に、細胞中のヒドロキシバレレート(hydroxyvalerate:ＨＶ)含有量を最大化するために、この第２の段階中に培養条件を固定することが可能である。
【０１３３】
＜実施例４  本発明の方法による、工業廃液に価値を与えるための２段階ＰＨＡ生成系＞
実施例２で記述したケモスタット実験で得られた結果は、二重段階選別／生成プロセスに対する本発明の選別法の適用についての推測を可能にする。バイオリアクターをより厳格でないＰ制限（例えば、３９日目から４８日目までで、１．５×１０−３Ｐ（ｇ）／ＡＡ（ｇ））で操作したとき、単純化された培養物と共に、３５％前後のＰＨＡ細胞含有量が得られた。
【０１３４】
次いで、５８日目から８８日目まで細胞を非常に厳格な二重制限条件に供した。比細胞成長速度μ２は０．０２３分裂／ｈ−１に低下し、Ｐ／Ｃ取込み比も、０．５×１０−３、次いで０．３×１０−３［Ｐ（ｇ）／消費されたＡＡ（ｇ）］という低さまで、２段階で低下した。細胞成長およびＰ制限と共に％ＰＨＢは再び増加し、バイオマス全重量の８０％超のＰＨＢに達した。ＰＨＡ含有量は、ＰＨＡ貯蔵収率（非常に少量のＣ取込みが活性化バイオマスの合成に使用されるので、観察される収率のほぼすべてがＰＨＡ合成からなる）と共に、これらの条件下で完全に最大化されたが、しかし、ＰＨＡ貯蔵速度もまた、これまでの成長速度（０．０５ｈ−１）において観察された速度よりも著しく低く、これにより、生成物の生産性が妨げられた。
【０１３５】
３９日目〜４８日目に適用される操作条件などのように、より高い比細胞成長速度と、より厳格でない栄養制限条件とを第１の段階において適用することによって、二重段階系を操作することができる。次いで、このように選別されたコンソーシアムを、５８日目から８８日目の間で観察されるものなどのように、より低い比細胞成長速度およびより厳重なＰ制限下で行われる後続のＰＨＡ含有量最大化段階に直接流すことができる。
【０１３６】
この二重段階構成において、細胞生産性は第１の段階で増進されるが、一方、ＰＨＡ細胞含有量および収率は、第１と第２の両方の段階で増進され、第２の段階で完全に最大化される。全体の生産性および収率を、１段階構成と比較して増加させることができる。
【０１３７】
［代替的な実施形態］
代替的な実施形態では、第２の段階の下流で第３の段階を操作することができる。このとき、第２の生物反応器は、第１および第２の連続式生物反応器と同じ種類のものである、第３の連続式生物反応器に接続される。しかし、第３の反応器は、第２の反応器と類似またはそれより大きい容積になると思われる。このとき、反応器３において固定される細胞成長速度μ３は、μ２より小さい。
【０１３８】
第２または第３の反応器において栄養欠乏を課すことができ（残余成長がない）、このとき、細胞滞留時間は、目標とするＰＨＡ細胞含有量およびＰＨＡ貯蔵速度に基づいて定められる。
【０１３９】
この実施形態のもう１つの変形では、すべての生物反応器がそれぞれ固液分離装置に接続される。あるいは、最後の生物反応器のみが固液分離装置に連結される。
【０１４０】
これらの逐次的なステップは、ＰＨＡ貯蔵性微生物に対して段階的に選択圧を強めることを目的としている。したがって、高ＰＨＡ貯蔵性株による限定されたコンソーシアムが選別される。さらに、選択圧は、バイオマスによる全炭素取込みがＰＨＡの生成および貯蔵に向けられるような選択圧である。
【０１４１】
様々な段階により、
−  細胞中のＰＨＡ含有量をさらに増加させること、および
−  ＰＨＡの異なるモノマーの合成比に影響を与えるため、ポリマー化学組成を操作すること
が可能になる。
【０１４２】
より具体的には、プロセスの最終目的および適用される培養条件に従い、異なる構成の２段階系が可能である。
【０１４３】
２段階水処理プラントの第１の構成は、第１の連続式混合生物反応器からなり、先に記述したように、選別段階と生成段階とが同時に達成される。好ましくは、６５％以上のＰＨＡ含有量を実現するために、制限を強くする。次いで、ＰＨＡ産生バイオマスは、第２の混合生物反応器に移され、ここでは、細胞中のＰＨＡ含有量を最大化するために、Ｐが完全に枯渇しているかまたは存在せず、成長速度μ２は、第１の反応器中の成長速度より小さい。反応器間で成長速度を調節するために、固液分離装置を使用することができる。さらに、本発明者らは、適当な前躯体（プロピオネートまたはバレレート、奇数個の炭素原子を有するＶＦＡ）の存在下では、Ｐ制限がより強くなるほど、微生物はヒドロキシブチレート（ＨＢ）モノマーに対してより多くのヒドロキシバレレート（ＨＶ）を合成する傾向があり、ＨＢおよびＨＶの２種類のモノマー型から構成されるコポリマー、Ｐ（ＨＢ−ｃｏ−ＨＶ）中のＨＶモノマーの割合を増加させることを見出した。このようなコポリマーは、ＰＨＢホモポリマーよりも改善された機械的特性を有し、その熱的特性および機械的特性は、ＨＶ割合によって変動する。したがって、この構成は、細胞中のＰＨＡ含有量の最大化、およびバイオマスによって生成されるＰＨＡの最終組成の制御（例えば、ＰＨＡのＨＶ割合の最大化）に役立つ。
【０１４４】
２段階水処理プラントの第２の構成は、第１の連続式混合生物反応器からなり、実施例１で先に記述したように、選別段階と生成段階とが同時に達成される。しかし、単に２５〜３０％という細胞中のＰＨＡ含有量を実現するために、適用される制限はそれほど強くしない。次いで、ＰＨＡ産生バイオマスは、第２の混合生物反応器に移され、ここでは、細胞中のＰＨＡ含有量を最大化（６５％前後以上）するために、Ｐ制限はより強く、比細胞成長速度μ２は、第１の反応器中における比細胞成長速度より小さい。この構成は、第１の生物反応器中での流亡を回避するために好ましい可能性がある。
【０１４５】
３段階による水処理は、これら２つの前述した構成の利点を併せ持つ。すなわち、第１の生物反応器中でＰ制限を穏やかにすることができ、第２の反応器中で強くすることができ、第３の反応器中ではＰを不在とすることができる。このとき、ＰＨＡ含有量は、バイオマスがある反応器から次の反応器へと通過するにつれて増加する。さらに、漸進的なＰ制限のおかげで、生成されるＰＨＡの最終組成はＨＶで富化される。
【０１４６】
２段階または３段階で行う場合、すべての生物反応器を連続モードまたは半連続モードのいずれかで操作することができる。あるいは、第１の生物反応器のみを連続モードまたは半連続モードで操作し、第２および第３の生物反応器を連続モード、半連続モード、バッチモードまたはフェドバッチモードのいずれかで操作することができる。
【０１４７】
本発明の方法は、リン以外の他の栄養制限によって行うこともできる。
【０１４８】
［結論］
本発明の方法は、複数の細菌株を含む天然源から高産生微生物のみを選別することを可能にする。したがって、束縛のある無菌条件下で作業する必要はない。
【０１４９】
先行技術の方法とは異なり、培養物選別とＰＨＡ生成とが単一のステップで行われ、これを、単一の段階または制限度が増加するいくつかの連続する段階のいずれかで行うことができる。培養パラメータは、慎重に選択および調節されて、バクテリアによる炭素源取込みと課される細胞成長（固定された比細胞成長速度と課される栄養制限とによって制御される）による炭素要求量との間の不均衡を発生させる。炭素および栄養の二重の制限の影響は、上述した実施形態（実施例２を参照）において決定された。実施例２では、固定され、０．０５１ｈ−１前後に保たれた細胞成長速度μ１、および、制限栄養としてのＰを、異なるＣ／Ｐ制限度において試験した。Ｃ／Ｐ制限度によるＰＨＡ細胞含有量の漸進的変化を、図２に示す。そして、０．０２３ｈ−１というより低い希釈率も、異なるＣ／Ｐ比において試験した。より低い希釈率では、ＰＨＡ貯蔵の増強を開始させる成長制限に達するにはより高いＣ／Ｐ比が必要であった点には留意すべきである。
【０１５０】
効果的なＰＨＡ産生株の選別を確実に行うために、好気培養する前記第１の段階においてＣおよび栄養の二重の制限を課すことが必要である。本出願で例示された２つの実施形態（実施例１および実施例３）において、二重制限をもたらすＣ／Ｐ比の範囲は、課される希釈率Ｄ１によって変動することが示された。より大きな成長速度では、より多くのＰ／Ｃ取込みが必要とされ、このことは、大きな希釈率において高いＣ／Ｐは細胞成長に対して制限を与え得ることを意味する。逆に、より小さい細胞成長速度では、Ｐ／Ｃ取込み要求量は減少し、相対的に高いＣ／Ｐは、細胞成長にとってほんのわずかな制限にしかなり得ない。より小さい希釈率において、類似の成長制限度を得るためには、より大きい希釈率における場合よりもはるかに高いＣ／Ｐ比が要求される。二重制限条件は、系に供給されたすべてのＣおよび制限栄養の瞬間的な取込みをもたらし、このことは、混合液中の炭素および栄養の直接分析、または間接測定（例えば、上清中のＶＦＡ蓄積により即座にｐＨが低下し、制限栄養の蓄積によりＰＨＡ含有量が減少するが、これは赤外線分光法分析（ＮＩＲ；ＦＴＩＲ）によって評価することができる）によって実証することができる。
【０１５１】
このように、異なる一定の成長速度が課されると（実施例の場合、希釈率によって課される、Ｄ）、Ｃおよび栄養の二重の制限をもたらすＣ／Ｐの比は変動し、よって結果として、課され得る成長制限度および結果的に得られる最大ＰＨＡ含有量が変動する。
【０１５２】
系が二重制限領域（すなわち、炭素源および栄養の制限）からドリフト(drift)する場合、そのリスクは、
（ａ）細胞成長応答を制限する炭素以外の栄養が存在しなければ、細胞成長応答は供給されるＣ基質の量に直接依存することになるため、Ｃ制限のみが課される場合、細胞成長応答のみが優先され、
（ｂ）栄養のみの制限が非常に高いＣ／Ｐ比に対して生じると、これは非常に深刻な栄養の欠乏を引き起こし、細胞はこのような低い細胞内Ｐ含有量に耐えることができず（ＰはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＡＴＰ等に必要であるため）、系は流亡に曝され得ることには留意すべきである。
【０１５３】
単一段階操作は、ユニット操作数がより少ないこと（よって、投資および運用コストがより低い）を含めた数多くの利点を有する。プロセスが単一段階モードで操作される場合、生物培養を行う前記第１の段階において実現されるＰＨＡ含有量は、前記段階中に直ちに最大化される必要がある。よって、プロセスの経済的継続性を確保するために最低で５０％のＰＨＡ含有量を考える場合、実施例２の結果から、０．１ｈ−１未満、好ましくは０．０８ｈ−１未満の細胞成長速度が課されるべきであると結論付けることができる。
【０１５４】
しかし、二重段階プロセスは、より高い全体の生産性および収率などの別の利点をもたらし得る。さらに、最大成長速度と最大ＰＨＡ貯蔵速度との間の固有の関係を仮定すると、（第１の段階でより高い希釈率を適用することによる）大きい細胞成長速度を本来有しているが、（Ｃおよび栄養の二重の制限条件を課すことによる）外部的に細胞成長制限を受けているＰＨＡ産生株を選別することが、動力学的に効率的なＰＨＡ産生株を選別する最良の方法であることが示唆される。
【０１５５】
このような構成では、第１の段階は２つの目的：
−  効果的なＰＨＡ産生株の選別、および
−  後続の段階でより高いＰＨＡ生産性を促進するために、より高い細胞生産性を確保すること
に役立つ。
【０１５６】
第２段階の目的は、ＰＨＡ含有量の最大化（最大８０％）であると考えられる。低い残余細胞成長では（またはゼロ成長であっても）、基質に対するＰＨＡ収率は、単一段階系で観察される収率と比較して最大化されるので、より高い全体収率が得られると考えられる。２段階系では、全体収率は、第１および第２の段階の収率をまとめたものとなり、単一段階系におけるよりも高い全体収率になる。豊富−欠乏プロセスでは、第１のステップ（選別）が単なる選別ステップであり、後続のステップで生成が行われなければならない点に着目することが重要である。豊富−欠乏により選別されたバイオマスを欠乏フェーズの最後で採取して生成ステップにて接種するため、選別ステップで生成されたＰＨＡのいずれもが、バイオマスが採取されて後続の生成ステップにて接種するために使用される前に、再消費される。
【０１５７】
これとは対照的に、本発明のプロセスを２段階で行う場合、第１の段階で蓄積されたポリマーは、細胞と共に第２の段階へ送られるので、第１の段階は選別／生成ステップであり続ける。第１の段階で貯蔵されたＰＨＡの再消費は生じず（豊富−欠乏プロセスとは異なる）、第２の段階におけるＰＨＡ生成量は、第１の段階のＰＨＡ生成量と比較してますます増加する。このことは、二重段階連続プロセスでは、たとえ単一段階プロセスにおけるよりも低いＰＨＡ生成速度であっても、ＰＨＡ産生株の選別を第１段階で行うことができることを意味する。したがってこの場合、第１の段階では、Ｃおよび栄養の二重の制限下で課される希釈率に由来するＣ／Ｐ比と共に、一定の比細胞成長速度が課されることが必要とされる。この場合、第１の段階で課される比細胞成長速度は、二重制限条件を実現することができるならば上限はない。第２の段階では、第１の段階の比細胞成長速度よりも小さく、恐らく単一段階プロセスの比細胞成長速度よりさらに小さい、０．１ｈ−１未満、好ましくは０．０５ｈ−１未満の比細胞成長速度が必要とされる。
【０１５８】
炭素源取込みと細胞成長との間の不均衡（一方で、ある一定の成長は維持）は、ＰＨＡの生成および貯蔵のための最適条件（基質に対する最大ＰＨＡ収率（理論最大値に近い）および最大ＰＨＡ貯蔵速度）に本質を有する。したがって、本プロセスの基質に対する全体効率は、（ＰＨＡが貯蔵および再消費される選別ステップに対して要求される炭素を仮定すれば）基質に対するＰＨＡ収率がより有利でない先行技術の混合培養法と比較して改善される。また、純粋培養系と比較して、本プロセスは、著しくより低い運用コストで同様の機能安定性を示すと言えるはずである。
【０１５９】
したがって、本発明の方法は、低コストで高い選別効率と高いＰＨＡ貯蔵性能とを可能にする。言い換えれば、本発明の方法は、純粋培養系の利点と混合培養系の利点との組合せを、それら各々の不都合を伴うことなく可能にする。
【０１６０】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図３Ａ．３Ｂ．３Ｃ．３Ｄ】
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【国際調査報告】
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