(57)【要約】  ポジトロン放出断層撮影(PET)又は単光子放出コンピューター断層撮影(SPECT)イメージングのための新規な放射性トレーサーが記載されている。特に、本発明は、上皮成長因子受容体(EGFR、erbB1)及びヒト上皮成長因子受容体2(Her2、erbB2)を画像化するPET又はSPECTトレーサーとして適している18F-標識アファチニブ、その合成に用いるための前駆体化合物、18F-標識アファチニブを調製する方法、並びにEGFR(erbB1)及びHer2(erbB2)の突然変異状態に基づく生体内診断、腫瘍イメージング又は患者の層別化におけるその使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)
【化１】
2016511754.tif 000025
(式中、
R2は、ジメチルアミノ-、ジエチルアミノ-、モルホリノ-、[1,4]オキサゼパン-4-イル-を表し、
R4は、テトラヒドロフラン-3-イル-オキシ-、テトラヒドロフラン-2-イル-メトキシ-、テトラヒドロフラン-3-イル-メトキシ-、テトラヒドロピラン-4-イル-オキシ-、又はテトラヒドロピラン-4-イル-メトキシ-を表す)
のフッ素-18標識化合物。
【請求項２】
R2がジメチルアミノ-を表す、請求項1に記載の放射性標識化合物。
【請求項３】
R4が
【化２】
2016511754.tif 000026
を表す、請求項1又は2に記載の放射性標識化合物。
【請求項４】
【化３】
2016511754.tif 000027
及び
【化４】
2016511754.tif 000028
より選ばれる、請求項1に記載の放射性標識化合物。
【請求項５】
式(II)
【化５】
2016511754.tif 000029
(式中、
R2及びR4は、請求項1、2、3又は4で定義されている)
の中間体化合物。
【請求項６】
請求項1、2、3又は4に記載の放射性標識化合物を調製する方法であって:
放射性標識
【化６】
2016511754.tif 000030
と式(II)
【化７】
2016511754.tif 000031
(式中、
R2及びR4は、請求項1、2、3又は4で定義されている)
の化合物を反応させる工程、及び
得られた式(I)の化合物を分離する工程
を含む、前記方法。
【請求項７】
請求項5に記載の式(II)の中間体化合物を調製する方法であって:
式(III)
【化８】
2016511754.tif 000032
(式中、
R4は、請求項1、2、3又は4で定義されている)
の化合物と式(IV)
【化９】
2016511754.tif 000033
(式中、
R2は、請求項1、2、3又は4で定義されており、Z1は、離脱基又はヒドロキシ基である)
の化合物を反応させる工程を含む、前記方法。
【請求項８】
EGFR(erbB1)の突然変異状態に基づいて生体内診断、腫瘍イメージング又は患者の層別化に用いるための請求項1、2、3又は4のいずれか1項に記載の放射性標識化合物又はその医薬的に許容され得る塩。
【請求項９】
請求項1、2、3又は4のいずれか1項に記載の一般式(I)の放射性標識化合物又はその医薬的に許容され得る塩を含み、必要により1つ以上の不活性担体及び/又は希釈剤と一緒に含んでもよい、放射性医薬組成物。
【請求項１０】
請求項1、2、3又は4のいずれか1項に記載の放射性標識化合物又はその医薬的に許容され得る塩の使用を含むEGFR(erbB1)の突然変異状態に基づく生体内診断、腫瘍イメージング又は患者の層別化のための方法であって、PET又はSPECTに用いられ、患者の腫瘍内に存在するTKの突然変異状態を評価する、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、上皮成長因子受容体(EGFR、erbB1)及びヒト上皮成長因子受容体2(Her2、erbB2)を画像化するPET又はSPECTトレーサーとして適している式(I)
【０００２】
【化１】
2016511754.tif 000002
【０００３】
の放射性標識化合物及びEGFR(erbB1)及びHer2(erbB2)の突然変異状態に基づく生体内診断、腫瘍イメージング又はがん患者の層別化におけるその使用に関する。本発明は、また、放射性トレーサーを調製する前駆体化合物及び方法を記載する。本発明は、非小細胞肺がん(NSCLC)、頭頸部扁平上皮がん(HNSCC)、乳がん、食道がん、胃がん、腎がん、子宮頸がん、卵巣がん、膵臓がん、肝細胞がん、悪性神経膠腫、前立腺がん、大腸がん(CRC)のようなこれらに限定されない無秩序なヒト上皮成長因子受容体(HER/ヒトEGFR)によって影響されるか又は誘導される任意のがんに関連がある。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ポジトロン放出断層撮影法(PET)及び単光子放出コンピューター断層撮影法(SPECT)は、身体の機能プロセスの画像を作成する核医学イメージング技術である。放射性トレーサーは、診断ツールとして及び対象の分子の組織濃度を画像化するためにPET又はSPECTにおいて用いられる。
式(I)の化合物は、例えば良性又は悪性の腫瘍、特に上皮及び神経上皮由来の腫瘍の治療に適している、EGFR(erbB1)及びHer2(erbB2)受容体チロシンキナーゼの二重阻害剤として国際公開第02/50043号パンフレット、同第2004/074263号パンフレット及び同第2005/037824号パンフレットにおいて開示されている。化合物の医薬製剤は、引用された文献において及び国際公開第2009/147238号パンフレットに開示されている。
治療すべき適応症及び併用治療は、国際公開第2007/054550号パンフレット及び同第WO2007/054551号パンフレットに開示されている。
Oncogene 2008, 4702-4711には、EGFRの異なるタイプの活性化突然変異のために異なる生体外及び生体内効力を示す不可逆阻害剤が記載されている。
Lung Cancer 2012, 123-127及びLancet Oncology 2012, 539-548には、肺がんにおいて野生型(WT)EGFRを発現する患者と比較してEGFRの突然変異を含んでいる患者における不可逆阻害剤の強力な効果が記載されている。
上述した不可逆阻害剤は、第一世代の治療が標的にしたEGFR(erbB1)突然変異に対してもこの標準的治療に感受性がないものに対しても活性がある。
本発明は、EGFR(erbB1)の突然変異を含んでいる患者において生体内診断又は腫瘍イメージングのためのPET又はSPECTトレーサーとしてEGFR(erbB1)及びHer2(erbB2)に選択的な放射性リガンドを提供することを意図する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の説明
本発明の第1の態様は、式(I)
【０００６】
【化２】
2016511754.tif 000003
【０００７】
(式中、
R2は、ジメチルアミノ-、ジエチルアミノ-、モルホリノ-、[1,4]オキサゼパン-4-イル-を表し、
R4は、テトラヒドロフラン-3-イル-オキシ-、テトラヒドロフラン-2-イル-メトキシ-、テトラヒドロフラン-3-イル-メトキシ-、テトラヒドロピラン-4-イル-オキシ-、又はテトラヒドロピラン-4-イル-メトキシ-を表す)
の放射性標識化合物である。
本発明の第1の態様の他の実施態様は、
R2がジメチルアミノ-を表す
上で定義した放射性標識化合物に関する。
本発明の第1の態様の更に他の実施態様は、
R4が、
【０００８】
【化３】
2016511754.tif 000004
【０００９】
を表す、上で定義した放射性標識化合物に関する。
本発明の第1の態様の他の実施態様は、詳細には
【００１０】
【化４】
2016511754.tif 000005
【００１１】
(INN: アファチニブ)及び
【００１２】
【化５】
2016511754.tif 000006
【００１３】
より選ばれる上で定義した放射性標識化合物に関する。
本発明の第2の態様は、式(II)
【００１４】
【化６】
2016511754.tif 000007
【００１５】
(式中、R2及びR4は、上で定義されている)
の中間体化合物に関する。
上で定義した一般式(I)の放射性標識化合物は、下記の方法、例えば:
既知の放射性標識文献化合物
【００１６】
【化７】
2016511754.tif 000008
【００１７】
(J Label Compd Radiopharm 2005, 48, 829-843)
と式(II)
【００１８】
【化８】
2016511754.tif 000009
【００１９】
(式中、
R2及びR4は、上で定義されている)
の化合物を反応させ、
得られた式(I)の化合物を分離することによって調製され得る。
反応は、必要により、溶媒又は溶媒の混合物、例えばN-メチルピロリジン(NMP)、アセトニトリル(MeCN)、テトラヒドロフラン(THF)、ジクロロメタン(DCM)、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)又はtert-ブタノール中で及び必要により無機塩基又は有機塩基、例えば2,3,4,6,7,8,9,10-オクタヒドロピリミド[1,2-a]アゼピン(DBU)、トリエチルアミン、ジエチルイソプロピルアミン、ジイソプロピルアミン又はカリウム-tert-ブトキシドの存在下でもよく及び必要によりベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-tris-(ジメチルアミノ)-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(BOP)又は(ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ)トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyBOP)又は6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-tris-ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyClock)又はブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyBrop)又は1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)又はN-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)の存在下でもよく、一実施態様においては-50℃と250℃の間の温度で、他の実施態様においては0℃と200℃の間の温度で、更に他の実施態様においては50℃と150℃の間の温度で行われてもよい。
【００２０】
得られた式(I)の化合物は、必要により、クロマトグラフィ、HPLCクロマトグラフィ又は固相抽出(SPE)によって精製されてもよい。HPLCクロマトグラフィは、必要により、固相として逆相材料、例えばC18、C18-EPS又はC8及び溶離剤として溶媒又は溶媒の混合物、例えばメタノール、エタノール、アセトニトリル又は水を用いて行われてもよく、必要により緩衝液、酸又は塩基、例えばリン酸二水素アンモニウム、リン酸、トリフルオロ酢酸又はジイソプロピルアミンの存在下でもよい。精製されたHPLC生成物の組成変更には、ヒトへの注射が許容されない溶媒を除去することが必要である。それ故、固体相抽出(SPE)は、必要により、固相、例えばC18、tC18、シリカ及び溶離剤としての溶媒、例えば、最大限で12-容積パーセントに希釈される場合に、生体内注射に適しているエタノールを用いて行われてもよい。
上で定義した式(II)の中間体化合物は、下記の方法、例えば:
式(III)
【００２１】
【化９】
2016511754.tif 000010
【００２２】
(式中、
R4は、上で定義されている)
の化合物と式(IV)
【００２３】
【化１０】
2016511754.tif 000011
【００２４】
(式中、
R2は、上で定義されており、Z1は、脱離基、例えばハロゲン原子、例えば塩素原子又は臭素原子、又はヒドロキシ基である)
の化合物を反応させることによって調製され得る。
反応は、必要により、溶媒又は溶媒の混合物、例えばジクロロメタン、N,N-ジメチルホルムアミド、N-メチルピロリジン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、テトラヒドロフラン、ベンゼン/テトラヒドロフラン又はジオキサン中で、必要により無機塩基又は有機塩基の存在下でもよく及び必要により脱水剤の存在下でもよく、一実施態様においては-50℃と150℃の間の温度で、他の実施態様においては-20℃と80℃の間の温度で行われてもよい。
Z1が脱離基を示す一般式(IV)の化合物については、反応は、必要により、溶媒又は溶媒の混合物、例えばジクロロメタン、N,N-ジメチルホルムアミド、N-メチルピロリジン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、テトラヒドロフラン、ベンゼン/テトラヒドロフラン又はジオキサン中で、便利には、第三級有機塩基、例えばトリエチルアミン、ピリジン又は4-ジメチルアミノピリジンの存在下で、ジイソプロピルエチルアミン(ヒューニッヒ塩基)の存在下で、これらの有機塩基は同時に溶媒として作用してもよく、又は無機塩基、例えば炭酸ナトリウム、炭酸カリウム又は水酸化ナトリウム溶液の存在下で、一実施態様においては-50℃と150℃の間の温度で、他の実施態様においては-20℃と80℃の間の温度で行われてもよい。
【００２５】
Z1がヒドロキシ基を示す一般式(IV)の化合物については、反応は、必要により、脱水剤の存在下で、例えばクロロギ酸イソブチル、塩化チオニル、塩化オキサリル、トリメチルクロロシラン、三塩化リン、五酸化リン、ヘキサメチルジシラザン、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド/N-ヒドロキシスクシンイミド、1-ヒドロキシ-ベンゾトリアゾール、N,N'-カルボニルジイミダゾール又はトリフェニルホスフィン/四塩化炭素の存在下で、便宜上、溶媒、例えばジクロロメタン、N-メチルピロリジン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、トルエン、クロロベンゼン、N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エチレングリコールジエチルエーテル又はスルホラン中で及び必要により反応促進剤、例えば4-ジメチルアミノピリジン又はN,N-ジメチルホルムアミドの存在下でもよく、一実施態様においては-50℃と150℃の間の温度で、他の実施態様においては-20℃と80℃の間の温度で行われてもよい。
上で定義した一般式(I)の放射性標識化合物又はその生理的に許容され得る塩は、必要により、EGFR(erbB1)の突然変異状態に基づいて生体内診断、腫瘍イメージング又は患者の層別化に用いられてもよい。突然変異した腫瘍における一般式(I)の放射性標識化合物の取り込みは、PET又はSPECTによって定量され得る。11C-エルロチニブによるこの原理の例は、Memon et al, British Journal of Cancer, 2011, 1850-1855及びBahce et al, Clinical Cancer Research, 2012, doi: 10.1158/1078-0432.CCR-12-0289(掲載が決定)に発表されている。滅菌した、発熱物質を含まない且つ等張である水性製剤は、必要により、上で述べたエタノール溶出液を医薬的に許容され得る緩衝液、例えば0.9%塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム 0.9% 塩化ナトリウム中7.09mM又はクエン酸緩衝液、医薬的に許容され得る可溶化剤、例えばエタノール、トゥイーン又はリン脂質及び/又は医薬的に許容され得る安定剤又は抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、ゲンチシン酸又はp-アミノ安息香酸で希釈することによって調製されてもよい。最終製剤は、最大限で12-容積パーセントの溶離剤を含有しなければならない。患者は、典型的には150〜500MBqの静脈内注射によって投与される。
【００２６】
一般式(I)の放射性標識化合物は、有利には、EGFR(erbB1)アップレギュレートされた腫瘍を生体内画像化する診断用薬として使用することができ、例えば、Memon et al, British Journal of Cancer, 2011, 1850-1855及びBahce et al, Clinical Cancer Research, 2013, 183-193 doi: 10.1158/1078-0432.CCR-12-0289には11C-エルロチニブで示されている。
一般式(I)の放射性標識化合物は、有利には、10〜30%の患者集団だけがEGFR阻害剤による治療に応答するので非小細胞肺がん患者の層別化に使用し得る。一般式(I)の放射性標識化合物は、生体内でポジトロン放出断層撮影法(PET)又は単光子放出コンピューター断層撮影法(SPECT)で求められるように放射性トレーサーの腫瘍蓄積の増加によってこれらの患者を識別するために使用し得る。
更にまた、一例として、非小細胞肺がん(NSCLC)においては、NSCLCに限定されないが、EGF受容体のいくつかの突然変異体が既知であり、治療の異なる臨床結果と関連付けられている。例としては、低分子チロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性増加につながるEFG受容体(L858R)のエクソン21における点突然変異、第一世代チロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性につながるエクソン20(T790M)における点突然変異及び低分子チロシンキナーゼ阻害剤に感受性を与えるエクソン19欠失が挙げられるが、これらに限定されない。一般式(I)の放射性標識化合物は、有利には、PET又はSPECTによって評価される場合に一般式(I)の放射性標識化合物のより高い蓄積が生体内チロシンキナーゼの突然変異状態を特定するのでこれらのタイプの突然変異を識別するために使用し得る。
生体内診断用の放射性トレーサーのための他の選択は、式(V)
【００２７】
【化１１】
2016511754.tif 000012
【００２８】
(式中、
R2は、ジメチルアミノ-、ジエチルアミノ-、モルホリノ-、[1,4]オキサゼパン-4-イル-を表し;
R4は、テトラヒドロフラン-3-イル-オキシ-、テトラヒドロフラン-2-イル-メトキシ-、テトラヒドロフラン-3-イル-メトキシ-、テトラヒドロピラン-4-イル-オキシ-、又はテトラヒドロピラン-4-イル-メトキシ-を表す)
の放射性標識化合物である。
生体内診断用の放射性トレーサーのための他の選択は、
R2がジメチルアミノ-を表す、
上で定義した放射性標識化合物に関する。
生体内診断用の放射性トレーサーのための更に他の選択は、
R4が
【００２９】
【化１２】
2016511754.tif 000013
【００３０】
を表す、上で定義した放射性標識化合物に関する。
生体内診断用の放射性トレーサーのための他の選択は、詳しくは
【００３１】
【化１３】
2016511754.tif 000014
【００３２】
(INN: アファチニブ)及び
【００３３】
【化１４】
2016511754.tif 000015
【００３４】
より選ばれる上で定義した放射性標識化合物に関する。
4-[123I]ヨード-3-クロロアニリンは、3-クロロアニリンから当業者が文献手順に従って4-(テトラ-n-アルキル)-3-クロロアニリンの酸化的[123I]ヨウ素化又は求電子的[123I]ヨウ素化によって得ることができ、式(II)の化合物と反応させて、式(V)の化合物を得ることができる。
従って、本発明は、EGFR(erbB1)陽性腫瘍の生体内診断又はイメージングだけでなく、本発明の上記放射性標識化合物(I)を患者に投与することを含む、被検者、好ましくはヒトにおける腫瘍中の前記受容体の突然変異状態の確認及び分布のための方法に関する。このことにより、本発明は、また、分子イメージングに基づくEGFR阻害剤による治療に対する感受性の(EGFRに依存する)がん患者の層別化のための診断法を提供する。化合物の投与は、好ましくは、化合物又はその塩又は溶媒和物及び1つ以上の医薬的に許容され得る賦形剤をヒトへ静脈内投与に適している形で含む放射性医薬製剤である。放射性医薬製剤は、好ましくは、更に医薬的に許容され得る緩衝液、医薬的に許容され得る可溶化剤、例えばエタノール、トゥイーン又はリン脂質であるがこれらに限定されない、医薬的に許容され得る安定剤溶液及び/又は抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、ゲンチシン酸又はp-アミノ安息香酸であるがこれらに限定されない、を含む滅菌した、等張の及び発熱物質を含まない水溶液である。最終製剤は、最大限で12-容積パーセントの溶離剤を含有しなければならない。患者は、典型的には150〜500MBqの生成物を静脈内注射によって投与される。
従って、本発明は、生体内診断法として又はイメージング方法の範囲内での用途に適している、一般式(I)の放射性標識化合物を含む放射性医薬製剤であって、該方法が、好ましくはポジトロン放出断層撮影法(PET)又は単光子放出コンピューター断層撮影法(SPECT)である、前記放射性医薬製剤に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図1は、PET試験において用いられる腫瘍異種移植片の免疫組織化学的染色を示す写真である。
【図２】図2は、A549(n=3、6個の腫瘍)、H1975(n=3、6個の腫瘍)及びHCC827(n=3、6個の腫瘍)担がんマウスにおける[18F]アファチニブの体内分布を示すグラフである。棒は、器官につきグラム当たりの注入量のパーセント(%ID/g)を示すグラフである。誤差は、平均値の標準誤差(SEM)である。
【図３】図3〜図7はヌードマウスにおける3種のがん異種移植片(A549、H1975及びHCC827)系で行われる動的PETイメージングの結果を示すグラフであり、[11C]エルロチニブによる比較イメージング試験が含まれる。結果は細胞系ごとに分けられている。図3〜図5の左の2枚のパネルは、[18F]アファチニブ時間活性曲線(TAC)(上: 遮断されていない、下: タリキダールで遮断されている)であり、右は[11C]エルロチニブスキャン(上: 遮断されていない、下: タリキダールで遮断されている)である。  図3は、A549 - 野生型で得られた結果を示すグラフである。
【図４】図4は、H1975 - L858R/T790M - 獲得耐性で得られた結果を示すグラフである。
【図５】図5は、HCC827 - エクソン19欠失で得られた結果を示すグラフである。
【図６】図6は、[18F]アファチニブの脳への取り込みに関し、P-gpが活性である場合には[18F]アファチニブが脳から流失し、遮断条件下では脳内に残存していることを示している。
【図７】図7は、治療量を模倣する試みにおいて[18F]アファチニブ注射に添加される種々の量の冷アファチニブの存在下に画像化する結果を示すグラフである。すでに100ngの冷投与量を添加している場合、腫瘍への取り込みはバックグラウンドレベルに低下した。このことは、腫瘍のイメージングが高比活性で行われなければならないことを示している。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
代謝産物分析
6匹のBalb/Cマウスに20〜30MBqの[18F]アファチニブをイソフルラン麻酔(2%/1L・min-1)下で眼神経叢に注入した。注射の15分後(n=4)と45分後(n=4)にマウスを犠牲にした。これらの時点で、心臓穿刺によって約1.5mLの血液を集めた。血液をヘパリンチューブに集め、4000r.p.m.(Hettich universal 16、Depex B.V.、オランダ)で5分間遠心分離した。血漿を血球から分離し、1mLの血漿を2mLの0.1M塩酸で希釈し、tC2 Sep-Pakカートリッジに装填し、それぞれ3mLのMeOH及び6mLの水で溶離して予め活性化した。カートリッジを5mLのH2Oで洗浄して、極性放射性代謝産物を集めた。その後、tC2 Sep-Pakカートリッジを2mLのMeOH及び1mLのH2Oで溶離して、無極性代謝産物の混合物を集めた。HPLCを用いて無極性代謝産物の混合物を分析して、そのままの[18F]アファチニブのパーセントを定量した。1mLのループを備えたDionex Ultimate 3000システムによりHPLCを行った。固定相としてPhenomenex Gemini C18、250×10mm、5μmを用いた。移動相は、A =アセトニトリル及びB = H2O中0.1% DiPAの勾配とした。溶離剤Bの濃度を0%から10%へ4ml.min-1の流速で増加してHPLC勾配を12.5分間行った。結果として表1に示される代謝プロファイルにより、トレーサーの優れた生体内安定性が実証される。
【００３７】
表1: 代謝産物分析
2016511754.tif 000016
【００３８】
異種移植片選択及びシークエンシング
腫瘍ターゲティングを評価するために3種の潜在的ヒトNSCLC異種移植片を選択した。各腫瘍型は、Li et al (oncogene 2008)によれば異なる突然変異状態でEGFRを発現するとともにアファチニブによる治療に対して異なる感受性を有する。
【００３９】
表2: 選択された細胞系及び関連付けられた変異パターン.
2016511754.tif 000017
【００４０】
免疫組織化学的染色
EGFR、HER-2及びP-gp発現を評価するために凍結異種移植片(A549、HCC827)の切片を免疫染色した。抗体を、1%ウシ血清アルブミンを有するPBS(リン酸緩衝食塩水)で希釈した。EFGRをセツキシマブ(Merck)、HER2をトラスツズマブ(Roche、バーゼル、スイス)、及びP-gpをウサギポリクローナル抗-P-gp(AB103477、ITK diagnostics BV、オイトホルン、オランダ)で染色した。二次抗体として、ウサギ抗ヒト西洋わさびペルオキシダーゼ(P0214、Dako、Glostrup、デンマーク)又はブタ抗ウサギ西洋わさびペルオキシダーゼ(P0217、Dako)を用いた。新鮮凍結(腫瘍)組織の凍結切片(5μm)を風乾し、引き続いてPBS中2%パラホルムアルデヒドで10分間固定した。切片を正常ウサギ血清(トラスツズマブ又はセツキシマブの場合)又は正常ブタ血清(抗-P-gpの場合)で遮断し、引き続いてセツキシマブ10μg/ml(EGFR)、トラスツズマブ10μg/ml(HER2)又は抗-P-gp 5μg/mlで染色した。発色現像をジアミノベンジジン(DAB)で行い、対比染色をヘマトキシリンで行った(図1、モノクロにした)。
【００４１】
標的の発現を免疫組織化学的染色によって確認し、突然変異をシークエンシングによって確認した。アファチニブ治療に対する反応性は、EGFR過剰発現を有するNSCLC患者において一般に見出される突然変異を活性化することによって決定される。臨床的に関連した3種の細胞系を[18F]アファチニブの評価のために選択した。非反応性モデルについては、WT EGFRを発現するA549細胞系が選択され、これはアファチニブに対して反応性を示さないことが報告されている。反応性細胞系としてEGFRの突然変異した変異体を発現するHCC827が選択された。この突然変異は、前臨床モデルにおいてアファチニブ感受性を与えるエクソン19欠失変異体に関する。3つ目には、二重突然変異、第1にエクソン20(l858r)の感受性突然変異及び第2にTKI治療に対して獲得耐性と関連付けられた突然変異(T790M)を含んでいるH1975細胞系が選択された。すべての系を、更に、標的(EGFR及びHER2)の発現に対して免疫組織化学的染色を用いて確認した。結果は双方の細胞系がEGFRを発現することを示したが、HCC827はより強い程度までそのように発現している(図1)。HER2は、双方の細胞系が同様の程度まで発現されている。全体として、免疫組織化学的染色は標的発現レベルを求める半定量的方法であるが、EGFR発現はアファチニブによる治療に最も感受性があるHCC827が最も強かった。更にまた、細胞について、P-gp、腫瘍に対する薬剤耐性と関連付けられる周知の薬剤排出輸送体の発現を染色した。3種のすべて系がこの排出ポンプを発現するが、得られたIHC染色に基づきHCC827腫瘍がP-gpの最も強い発現を示した。
【００４２】
体内分布試験
同じ異種移植系の2個の腫瘍(A549、H1975又はHCC827細胞の注射によって得られた)を左右のわき腹上にもったヌードマウス(nu/nu)に尾静脈を経て15〜25MBq[18F]アファチニブを注射した。注射の5、30、60及び120分後にマウスを犠牲にして解剖した。血液、尿、皮膚、左の腫瘍、右の腫瘍、筋肉、心臓、肺、肝臓、腎臓及び脳を集め、計量し、Wallac Compugamma 1210カウンターで放射能を計数した(各時点に対してn = 3)。体内分布データは、各器官に対して組織1グラム当たりの注入量のパーセント(%ID/g)として表される(図2)。
[18F]アファチニブは、低分子PET-トレーサーが非常にしばしば見られるように代謝器官(腎臓及び肝臓)の迅速で高い取り込みを示した。更にまた、最初の高い取り込みは、心臓及び肺のような高度潅流組織に見られた。急速な排出のため、トレーサーの血中濃度は、注射の5分後には非常に低かった(A549: 2.17%ID/g; H1975: 1.59%ID/g; HCC827: 1.56%ID/g)。調べた腫瘍のタイプは、最初に良好な取り込みを示した。更に、関連したバックグラウンド組織、例えば血液や筋肉は、放射能が急速に取り除かれたが、腫瘍は良好な活性維持を示した(注射の120分後の腫瘍には約1%ID/gが残存した)。これにより、中程度/高程度の腫瘍対血液比(注射の120分後にA549: 2.26; H1975: 注射の120分後に2.11; HCC827: 注射の120分後に2.59)及び高程度の腫瘍対筋肉比(A549: 注射の120分後に6.37; H1975: 注射の120分後に3.48; HCC827: 注射の120分後に3.83)がもたらされた。
【００４３】
PET-イメージング試験
ヌードマウスにおいて3種のがん異種移植(A549、H1975及びHCC827)系で動的PETイメージングを行った。各マウス(n=3)は同じがん異種移植系の1つの腫瘍を担持し、左又は右のわき腹に位置した。LSO/LYSO二重層高解像度リサーチトモグラフ(HRRT; CTI/Siemens、Knoxville、TN、USA)を用いて120分間イメージングを行った。誘導と維持のために1L・min-1の酸素中それぞれ4%及び2%のイソフルランでマウスを麻酔した。最初に、減衰及び散乱修正のために、740-MBq二次元(2D)ファンコリメート137Cs(662keV)移動点源を用いて透過スキャンを獲得した。次に、各動物に4〜6MBq[18F]アファチニブ(SA 223±38 GBq/□mol)又は6〜8MBqの[11C]エルロチニブ(SA: 合成の終わりに184〜587GBq/□mol)を投与(I.V.眼神経叢)した直後に動的放射スキャンを獲得した。ポジトロン放射スキャンをリストモードで獲得し、下記のフレーム配列に再結合した: 10×60、4×300、及び9×600。120分後、[18F]FDGをマウスに投与(I.V.眼神経叢)し、続いて更に60分間スキャンした。崩壊、不感時間、散乱及び無作為の修正後、反復性3D秩序サブセット加重最小二乗分析(3D-OSWLS)を用いてスキャンを再構築した。点源分解能は、長軸断方向では約2.3から3.2mmに半値全幅及び軸方向では2.5から3.4mmに視野全体に変動した。再構築後にポストフィルタリングを行わなかった。入手自由なAMIDE-ソフトウェア版0.9.3(医用画像処理データ検査)を用いてPET画像を分析した。完全な動物の上にボックスを抜き出し、画像誘導注入量(IDID)を得た。腫瘍組織だけでなく腫瘍細胞がないだけの正確な同じ組織を含有する動物の対向するわき腹に抜き出し、リファレンス領域を含有するROIを[18F]FDGデータを用いて抜き出した。引き続き[18F]アファチニブ又は[11C]エルロチニブで得られた対応する画像を重ね合わせた。腫瘍だけでなくレファレンス領域双方に対して時間活性曲線をプロットした。ガウス曲線(2mm)を用いて画像を平滑化した。
【００４４】
TKI-PET-トレーサーとして[18F]アファチニブの可能性を評価するために徹底的なPET-イメージング試験を行った。トレーサー取り込みに影響するいくつかの要因を評価することが目的であった。これを目的として、数種の異なる投与量の同時注入される冷化合物で、更にP-gpを遮断しつつ画像化した。P-gpは、細胞からゼノバイオティックスを能動的に除去する薬剤排出輸送体である。免疫組織化学的染色を用いて、この輸送体の発現を求め、HCC827細胞が明らかにこのポンプを高程度まで表現することが判明した。最後に、[11C]エルロチニブとの比較的イメージングを行った。
適切なバックグラウンド組織の選択は、極めて重要である。最初に、マウスの各わき腹に腫瘍を異種移植したが、この左側は選択を制限して、適切なバックグラウンド組織を選んだ。バックグラウンド組織には2つの重要な考慮すべき問題がある: 生命維持に必要な器官は存在してはならず、高度に潅流された正常組織を含有しなければならない。このため、尾部及び尾部自体の近くの動物の端が選ばれたが、いずれにしても、このことは、現実的でない極めて高い腫瘍対バックグラウンド比をもたらした。それ故、1個の腫瘍だけを有するマウスを異種移植し且つバックグラウンド組織(PETスキャンにおいて同じ切片/位置)としてもう一方のわき腹に同じ領域を用いることが選ばれた。この解決策によって、良好なバックグラウンド及び得られたPET-画像に対応する代表的な時間-活性-曲線(TAC)がもたらされた。
【００４５】
PET-実験を各細胞系の3匹のマウスで行った。マウスに麻酔し、カニューレを挿入し、スキャナ内に置いた。遮断実験の場合、スキャンを開始する20分前にタリキダールを投与した。最初に、約4〜6MBqの[18F]アファチニブ又は6〜8MBqの[11C]エルロチニブをマウスに投与し、動的スキャンをそれぞれ120分間又は90分間続けた。次に、マウスを調べ、5MBqの[18F]FDGを投与し、動的スキャンを60分間続けた。スキャン後、マウスを回収した。
AMIDE(バージョン0.9.2)を用いてPET-画像を処理した。FDGスキャンを用いて、腫瘍及びバックグラウンド組織に対する関心領域(ROI)を求めた。[18F]アファチニブスキャンを上に重ね、合計投与量ボックスを全体の動物の上に抜き出した。1グラム当たりの注入量をこれらのROI(ROIにおけるカウント)から誘導して、腫瘍の画像誘導注入量及び動物の各々のバックグラウンドを得た。
実験の結果を細胞系毎にグループに分ける(図3〜図5)。左の2枚のパネルは、[18F]アファチニブ時間活性曲線(TAC)(上: 遮断せず、下: タリキダールで遮断)及び右は[11C]エルロチニブスキャン(上部: 遮断せず、下: タリキダールで遮断)である。
遮断が行われない場合に[11C]-エルロチニブと比較すると、[18F]アファチニブは同様のイメージング特性を示す。取り込みは感受性細胞系に見られ(HCC827、図5)、活性の絶対量(%ID/g)は[11C]-エルロチニブより少ないが、腫瘍対バックグラウンド比はより大きい(注入の120分後の2.3と注入の90分後の1.9)。絶対取り込みの差は、2つのトレーサーの間の速度論の差に最も関係があるようである。[18F]アファチニブ蓄積は非常に急速であり、約3〜4分後に最大に達するが、[11C]エルロチニブは約15〜20分間まで蓄積を保っている。非感受性細胞系(A549及びH1975)は、双方のトレーサーにも同様の傾向を示し、バックグラウンドと比較して腫瘍における取り込みの増加はほとんどない。この結果は、[18F]アファチニブが[11C]エルロチニブと同様の方法で治療反応性腫瘍を区別することができることを示している。
【００４６】
スキャンの間、P-gpが遮断される場合に重要な差が見られる。P-gpの実際の遮断を確認するために、関心領域が脳上に抜き出され、[18F]アファチニブの取り込みを求めた。このことにより、P-gpが活性[18F]アファチニブであった場合に脳から流失し、遮断条件下で脳内に残存することが示された(図6)。
P-gpの遮断を確認したので、我々は遮断しつつ同じスキャン実験を行った。最も重要な効果は、腫瘍への絶対取り込みがほとんどすべての細胞系で([11C]エルロチニブに対するH1975を除いて)双方のトレーサーに対して増加し、双方のトレーサーが基質であるので規則的PET-実験の間に送り出されることを確認したことであった。腫瘍とバックグラウンド間の感受性があるHCC827細胞の差は、双方のトレーサーに対して更に増加し、この細胞系上のPgPの発現に従っている。P-gp遮断の後の[18F]アファチニブが、おそらくATP結合部位への非可逆的結合のため、流失をほとんど示さないので、重要な差は[18F]アファチニブと[11C]エルロチニブの間に見出すことができる。この結果は、P-gp遮断せずにこの傾向が見られないので、P-gp排出がEGFRへの非可逆性的結合より速くなり得ることを示すことになる。
最後に、我々は、また、治療量を模倣する試みにおいて[18F]アファチニブ注射に添加される種々の量の冷アファチニブの存在下で画像化した(図7)。このことにより、100ngの冷投与量を添加したときに既に腫瘍への取り込みがバックグラウンドレベルに低下することが示された。腫瘍のイメージングは高比活性で行わなければならないことが示された。
【００４７】
中間体の調製
略号のリスト
bm  -  幅広い多重線
BOP  -  ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-tris-(ジメチルアミノ)-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
bs  -  幅広い一重線
d  -  二重線
DBU  -  2,3,4,6,7,8,9,10-オクタヒドロピリミド[1,2-a]アゼピン
DIPA  -  ジイソプロピルエチルアミン
DMF  -  ジメチルホルムアミド
ESI  -  エレクトロスプレーイオン化
EtOAc  -  酢酸エチル
g  -  グラム
h  -  時間
HPLC  -  高性能液体クロマトグラフィ
HR-MS  -  高分解能質量分析
Hz  -  ヘルツ
M  -  モル
m  -  多重線
m/z  -  質量電荷比
MeCN  -  アセトニトリル
MeOH  -  メタノール
mg  -  ミリグラム
ml  -  ミリリットル
mm  -  ミリメートル
mmol  -  ミリモル
NMP  -  N-メチルピロリジン
NMR  -  核磁気共鳴
q  -  四重線
s  -  一重線
semi-prep  -  半分取用
SA  -  比活性
t  -  三重線
TLC  -  薄層クロマトグラフィ
v/v  -  容積比
ml  -  マイクロリットル
前駆体化合物(4)の調製をスキーム1に記載する:
【００４８】
【化１５】
2016511754.tif 000018
【００４９】
スキーム1
実施例(1)
6-ニトロ-7-(フェニルスルホニル)キナゾリン-4(3H)-オン(1)
【００５０】
【化１６】
2016511754.tif 000019
【００５１】
7-クロロ-6-ニトロキナゾリン-4(3H)-オン(2g、8.87mmol)及びベンゼンスルフィン酸ナトリウム塩(1.455g、8.87mmol)をDMF(30mL)に懸濁させ、90℃まで6h加熱した。反応混合物をH2O(30mL)で希釈し、沈殿を吸引濾過によって集めた。得られた固形物を真空中で乾燥して、6-ニトロ-7-(フェニルスルホニル)キナゾリン-4(3H)-オンを得た。1H-NMR (500,23 Mhz, [D6]DMSO) □: 12.97 (bs, 1H), 8.61 (s, 1H) 8.52 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 8.05 (d, J=7.66 Hz, 2H), 7.78 (t, J=7.41 Hz, 1H), 7.70 (t, J=7.81 Hz, 2H); 13C-NMR (125.78 Mhz, [D6]DMSO) □: 159.7, 151.7, 150.2, 144.7, 140.0, 138.3, 135.15, 132.1, 130.2, 128.6, 127.2, 124.8; HR-MS (ESI, 4500V): m/z C14H9N3NaO5S+ (M+Na+)の計算値: 354.0155, 実測値: 354.0146
【００５２】
実施例(2)
(S)-6-ニトロ-7-((テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)キナゾリン-4(3H)-オン(2)
【００５３】
【化１７】
2016511754.tif 000020
【００５４】
アルゴン下で撹拌したtert-ブタノール/DMF(25mL/5mL)中の、6-ニトロ-7-(フェニルスルホニル)キナゾリン-4(3H)-オン(2.0g、6.04mmol)及び(S)-テトラヒドロフラン-3-オール(0.627mL、7.85mmol)の溶液に、カリウムtert-ブトキシド(THF中1M、21.73mL、21.73mmol)を20℃で滴下した。6-ニトロ-7-(フェニルスルホニル)キナゾリン-4(3H)-オンの完全な消費をTLCが示すまで、この混合物を20℃で、次に45℃で16h撹拌した。すべての揮発性物質を真空中で除去して、粗生成物を得、これをフラッシュカラムクロマトグラフィ(MeOH/EtOAc、5:95v/v)で精製して、(S)-6-ニトロ-7-((テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)キナゾリン-4(3H)-オンを得た。1H-NMR (500,23 Mhz, [D6]DMSO) □: 12.55 (bs, 1H), 8.50 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.40 (s, 1H), 5.41 (t, J=4.64 Hz, 1H), 3.95 (bm, 4H), 2.31 (六重線, J=7.86, 13.90, 22.02 Hz, 1H), 2.03 (q, J=6.90, 12.45 Hz, 1H); 13C-NMR (125.78 Mhz, [D6]DMSO) □: 160.2, 154.4, 153.4, 149.4, 139.5, 124.5, 115.9, 112.3, 80.5, 72.5, 67.0, 32.9; HR-MS (ESI, 4500V): m/z C12H11N3NaO5+ (M+Na+)の計算値: 300.0591, 実測値: 300.0573
【００５５】
実施例(3)
(S)-6-アミノ-7-((テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)キナゾリン-4(3H)-オン(3)
【００５６】
【化１８】
2016511754.tif 000021
【００５７】
エタノール/水(27.5mL、10:1、v/v)中の(S)-6-ニトロ-7-((テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)キナゾリン-4(3H)-オン(1.2g、4.33mmol)及び酢酸(1.98mL、34.6mmol)の還流溶液(110℃)に鉄粉(967mg、17.31mmol)を添加し、この混合物を20分間還流(110℃)した。次に、この混合物を20℃に冷却し、セライトフィルターにかけ、エタノールで溶離し、画分を含有する生成物を濃縮して、粗生成物を得、フラッシュカラムクロマトグラフィ(MeOH/EtOAc、5:95、v/v)によって精製して、(S)-6-アミノ-7-((テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)キナゾリン-4(3H)-オン得た。1H-NMR (500,23 Mhz, [D6]DMSO) □: 12.78 (bs, 1H), 7.79 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 6.93 (s, 1H), 5.31 (s, 2H), 5.17 (t, J=4.6 Hz, 1H), 3.96 (m, 1H), 3.88 (m, 2H), 3.77 (m, 1H), 2.26 (六重線, J=7.44, 13.70, 21.6 Hz, 1H), 2.07 (q, J=6.8, 12.2 Hz, 1H); 13C-NMR (125.78 Mhz, [D6]DMSO) □: 160.7, 150.4, 141.9, 141.8, 139.1, 117.3, 108.7, 106.6, 78.5, 72.8, 67.1, 33.1; HR-MS (ESI, 4500V): m/z C12H13N3NaO3+ (M+Na+)の計算値: 270.0849, 実測値: 270.0832
【００５８】
実施例(4)
(S,E)-4-(ジメチルアミノ)-N-(4-オキソ-7-((テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)-3,4-ジヒドロキナゾリン-6-イル)ブタ-2-エンアミド(4)
【００５９】
【化１９】
2016511754.tif 000022
【００６０】
不活性雰囲気下に触媒量のDMF(0.05mL)を含有するTHF(3mL)中の市販の(2E)-4-(ジメチルアミノ)ブタ-2-エン酸塩酸塩(50mg、0.4mmol)の懸濁液に塩化オキサリル(31.9□L、0.36mmol)を0℃で添加した。発泡が終わったときに、この混合物を25℃まで加熱し、この温度で90分間保持した。次にこの混合物を0℃に冷却し、N-メチルピロリジン(1mL)中の(S)-6-アミノ-7-((テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)キナゾリン-4(3H)-オン(50mg、0.2mmol)の溶液を流れとして添加した。この混合物をゆっくりと室温に戻し、次に無水ジイソプロピルエチルアミン(106□l、1.2mmol)を添加した。開始アミンの消費がTLCで認められたときに、反応物をNaHCO3水溶液(1mL)の添加によって急冷した。揮発性物質を回転式蒸発によって除去し、残部をフラッシュカラムクロマトグラフィ(勾配: MeOH:EtOAc = 5:95、v/v〜MeOH:EtOAc = 20:80、v/v)によって精製して、(S,E)-4-(ジメチルアミノ)-N-(4-オキソ-7-((テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)-3,4-ジヒドロキナゾリン-6-イル)ブタ-2-エンアミドを得た。1H-NMR (500,23 Mhz, [D6]DMSO) □: 12.22 (s, 1H), 9.32 (s, 1H), 8.85 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.13 (s, 1H), 6.76 (m, 1H), 6.64 (d, 1H), 5.76 (t, J=5.25 Hz, 1H), 3.95 (bm, 3H), 3.76 (六重線, J=4.9, 8.0, 13.0 Hz,1H), 3.11 (d, J=5.0 Hz, 2H), 2.30 (六重線, J=7.2, 13.7, 21.2 Hz, 1H), 2.20 (s, 6H), 2.16 (m, 1H); 13C-NMR (125.78 Mhz, [D6]DMSO) □: 164.1, 160.6, 153.7, 147.2, 145.7, 128.0, 126.9, 117.9, 116.2, 109.2, 79.5, 72.5, 67.2, 60.11, 45.5, 32.9.HR-MS (ESI, 4500V): m/z C18H23N4O4+ (M+H+)の計算値: 359.1714, 実測値: 359.1770.
【００６１】
最終化合物の調製
化合物(5)の調製をスキーム2に記載する:
【００６２】
【化２０】
2016511754.tif 000023
【００６３】
スキーム2
実施例(5)
[18F](S,E)-N-(4-((3-クロロ-4-フルオロフェニル)アミノ)-7-((テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)キナゾリン-6-イル)-4-(ジメチルアミノ)ブタ-2-エンアミド(5)
【００６４】
【化２１】
2016511754.tif 000024
【００６５】
1〜50Gbqの3-クロロ-4-[18F]フルオロアニリン(J Label Compd Radiopharm 2005、48、829-843)を、無水N-メチルピロリジン(NMP、1mL)中の(S,E)-4-(ジメチルアミノ)-N-(4-オキソ-7-((テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)-3,4-ジヒドロキナゾリン-6-イル)ブタ-2-エンアミド(2mg)、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-tris-(ジメチルアミノ)-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(BOP、5mg)、2,3,4,6,7,8,9,10-オクタヒドロピリミド[1,2-a]アゼピン(DBU、2.5□l)の溶液に添加する。このようにして得られた混合物を120℃まで30分間加熱し、その後20℃に冷却し、水(1mL)を添加して急冷し、分取用HPLCクロマトグラフィ(カラム: オルチマ-C18、5uM、10*250mm semi-prep、溶離剤: MeCN/H2O/DIPA、45/55/0.1、v/v/v、流量: 4ml/分)によって精製し、生成物の保持時間は、23〜26分である。
【００６６】
製剤化:
生成物を含有する分取用HPLCの集めた画分(23〜26分)を50mLの水で希釈し、全混合物をtC18 waters seppakカートリッジの上を通過させた。次に、カートリッジを20mLの滅菌水で洗浄し、その後1.5mLの96%滅菌エタノールでカートリッジから生成物を溶離した。エタノールを滅菌食塩水で10容積パーセントに希釈し、完全な溶液を20mLの滅菌蓋付きバイアルへMILLEX GV 0.22μmフィルターで濾過した。
生成物の分析を、分析用HPLC(カラム: プラチナ-C18、5uM、250×4.6mm分析用カラム、溶離剤: MeCN/H2O/DIPA、60/40/0.1、v/v/v、流量: 1ml/分)によって行った、生成物の保持時間は、9〜11分である。
【図３】
2016511754.tif 000034
【図４】
2016511754.tif 000035
【図５】
2016511754.tif 000036
【図６】
2016511754.tif 000037
【図７】
2016511754.tif 000038
【図１】
2016511754.tif 000039
【図２】
2016511754.tif 000040
【国際調査報告】
2016511754.tif 000041
2016511754.tif 000042
2016511754.tif 000043
2016511754.tif 000044
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