(57)【要約】  本発明は、新規なコッコミクサ属藻類、特にC-IR3-4Cと呼ばれる新種の藻類、及び水性媒体、特に放射性媒体から金属を捕捉するためのその使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
18SリボソームRNA-ITS1-5.8SリボソームRNA-ITS2-28SリボソームRNA遺伝子における、配列番号１の配列と少なくとも96％の同一性を有する配列の存在によって規定されるコッコミクサ属の単細胞緑藻。
【請求項２】
2013年１月29日に番号CCAP 216/26でCCAPに寄託されたコッコミクサ株の特徴を有する、請求項１に記載の単細胞緑藻。
【請求項３】
2013年１月29日に番号CCAP 216/26でCCAPに寄託されたコッコミクサ株であることを特徴とする、請求項１に記載の単細胞緑藻。
【請求項４】
Cs、Ag、Co、Mn、Sr、Cu、Cr、Zn、Ni、Fe、Sb、U、アクチニド、ランタニド及びレアアース、例えばSc、Y、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Luから選択される少なくとも１つの放射性若しくは非放射性元素並びに/又は放射性同位体14C及び3Hの少なくとも一方を、該元素及び/又は該放射性同位体を溶液状態で含有する水性媒体から捕捉する方法であって、前記捕捉が前記水性媒体中で、コッコミクサ・コダティイ及び請求項１又は２に規定される緑藻から選択されるコッコミクサ属の単細胞緑藻をインキュベートすることによって行われることを特徴とする方法。
【請求項５】
Sr及びCuから選択される少なくとも１つの放射性又は非放射性元素を、該元素を溶液状態で含有する水性媒体から捕捉する方法であって、前記捕捉が前記水性媒体中で、コッコミクサ属の単細胞緑藻をインキュベートすることによって行われることを特徴とする方法。
【請求項６】
前記水性媒体が放射性媒体であることを特徴とする、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記水性媒体が非放射性媒体であることを特徴とする、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項８】
Ag、Co、Cs、U、Mn、Cu及びSrから選択される金属を捕捉するためであり、前記金属が放射性同位体の形態にあるか、又は同位体の混合物の形態にあることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記緑藻が少なくとも１つの他の微生物及び/又は少なくとも１つの多細胞植物と組み合わされることを特徴とする、請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
コッコミクサC-IR3-4C種及び/又はコッコミクサ・コダティイ種の緑藻の増殖が前記水性媒体の照明を調節することにより制御されることを特徴とする、請求項４〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
捕捉される放射性又は非放射性元素がCs、Ag、Co、Mn、Sr、Cu、Cr、Zn、Ni、Fe、Sb、アクチニド、ランタニド及びレアアース、例えばSc、Y、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Luから選択され、該元素を藻から回収する工程を含んでなることを特徴とする、請求項４〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
水性媒体のpHが１〜６の間であることを特徴とする、請求項４〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
Cs、Ag、Co、Mn、Sr、Cu、Cr、Zn、Ni、Fe、Sb、アクチニド、ランタニド及びレアアースから選択される少なくとも１つの放射性若しくは非放射性元素並びに/又は放射性同位体14C及び3Hの少なくとも一方を含有する水性媒体を浄化するための、コッコミクサ・コダティイ及び請求項１又は２に規定される緑藻から選択されるコッコミクサ属の緑藻の使用。
【請求項１４】
前記媒体が放射性であることを特徴とする、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
Sr及びCuから選択される少なくとも１つの放射性又は非放射性元素を含有する水性媒体を除染するためのコッコミクサ属の緑藻の使用。
【請求項１６】
前記緑藻が少なくとも１つの他の放射線抵抗性若しくは放射線許容性微生物及び/又は少なくとも１つの放射線抵抗性若しくは放射線許容性多細胞植物と組み合わされることを特徴とする、請求項１４又は１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規藻類、水性環境から、特に放射性環境から金属を捕捉するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
放射性排液は主として原子力発電所から生じる。放射性排液は、主に、使用済み核燃料プールの水、除染タンクの水、核施設冷却系の水又は環境中に放出される最終排液である(これらは、結局のところ、放射線による不活性化合物の活性化又は放射性化合物の放出及び溶解に起因して放射性化合物を含有する)。放射性排液の他の源として、核医学、放射線化学療法を提供する病院及び放射性物質を使用する研究施設が挙げられる。或る種の非核産業(例えばレアアース採鉱)による排液もまた本発明の対象である。
【０００３】
放射性化合物を含有する排液(特に水)は、種々の物理的及び化学的方法により精製することができる。しかし、これら方法は、稼動及び設備費用が高く、重整備を必要とし、大量の放射性廃棄物を生じる。更に、その応用分野はしばしば限定される。例えば、イオン交換樹脂を用いて、核施設からの水中で低導電率を維持する。イオン交換樹脂には放射性イオンが付着し、飽和したイオン交換樹脂は、適切な再処理プロセスを待つ間貯蔵するか、又は有毒若しくは高反応性化合物を用いる条件下で貯蔵する。
【０００４】
更に、細菌、真菌、酵母又は植物を利用して、例えば、(放射性又は非放射性)有毒生成物が混入した媒体(産業排液、天然媒体など)を精製する既存の生物学的方法もある。これら方法は、生存生物を利用して、汚染化合物を濃縮し、同化し、(化学形態を改変して)その毒性を低減させるか、又は生存していないバイオマス若しくは生存している生物に由来する派生物を利用して、汚染物質を生物吸収させる。
生物学的方法は、一般に、物理学的及び化学的方法より広い応用分野を有する。生物学的方法は、化学試薬又は生成物の添加を必要とせず、一般には、処理を低価にする(したがって経済的利点をもたらす)。
【０００５】
植物は特に、良好な土壌又は水の精製装置である。なぜならば、植物は、有毒化合物を、場合に応じて固定化し、植物の外部若しくは内部でキレートし、特異的若しくは非特異的移入経路を介して種々の量で取り込み、細胞内に隔離し、その種分化(speciation)を改変できる(ひいては、該化合物を無害化又は低毒化し、低溶解性にし、液胞中に非毒性形態で貯蔵するなどする)ようにする代謝物、タンパク質、酵素、移入機構、膜チャネル、内部構造などからなる全体システムを有するからである。
【０００６】
研究により、或る種の微生物は、希薄溶液中の金属イオン、例えばAg、Al、Au、Co、Cd、Cu、Cr、Fe、Hg、Mn、Ni、Pb、Pd、Pt、U、Th、Znなどを生物吸収を介して濃縮する能力を有することが示されている(Whiteら，International Biodeterioration & Biodegradation，35：17-40，1995；米国特許第6,355,172号)。生物吸収は、細胞表面に位置する側壁化合物の官能基との相互作用を介する代謝的に不活性な物理化学的機構によって重金属と結合するバイオマスの能力である。例えば、細菌及び微生物混合物を利用して、重金属を非選択的に生物吸収できることが開示されている(米国特許第7,479,220号；PCT出願WO 03/011487)。
【０００７】
死亡バイオマス又は生存生物の培養物に起源を有する誘導化合物を利用して、金属含有媒体を除染する方法もある。用いられる方法として、生物学的に不活性な物理化学的機構、例えば、(例えば細胞壁に存在する多糖を用いる)イオン交換、錯体化又は吸着が挙げられる。
藻(例えば藻の細胞壁)由来のバイオマスを用いて廃液中に含まれる金属が精製されている(米国特許第4,769,223号；PCT出願WO 86/07346；米国特許第5,648,313号；PCT出願WO 2006/081932)。
【０００８】
放射性化合物で汚染された媒体の処理のために生存生物に頼る方法はほとんどない。実際、放射性化合物が混入した水又は放射線源近傍に位置する水の場合、混入物の化学的及び放射線学的毒性に耐え、産業的除染プロセスに関して使用するに十分な量でこれら混入物と結合する能力を有する放射線許容性又は放射線抵抗性生物を用いる必要がある。
核排液中の放射性核種の生物学的除染方法は存在しない。しかし、2011年３月11日の福島原発事故により、日本では、脱水化微細藻類パラクロレラ・バイノス(Parachlorella sp. binos)から構成される材料を用いるこのタイプの解決策が検討された(WO 2010/024367)。５グラムのこの微細藻類は、福島原子炉からの水に類似する組成の水１リットルを除染することができた。米国は、長年、生物学的方法による放射性核種精製の実現可能性に関心を寄せている。ストロンチウムを取り込む藻であるクロステリウム・モニリフェルム(Closterium moniliferum)の使用が検討されたが、この藻の蓄積能力は放射性同位体についても放射性核種についても調べられていない(Krejci M.R.ら，ChemSusChem，4:470-473，2011；Lovett R.A.，Nature，doi:10.1038/news.2011.195，2011)。
【０００９】
天然環境で、放射性化合物を蓄積する生物は、一般に、低放射能に曝されている。例えば、チェルノブイリ事故直後、水域環境に関して、原子炉冷却槽内の水の外部電離放射線線量率は100μGy/hを超えず、1986年の年間最大蓄積線量は0.01Gyであった。発電所30km圏内に位置するプリピャチ川の沈降物上に堆積した放射性核種からの線量率は、事故直後、時には0.4mGy/hまで上昇した(Kryshev and Sazykina，Journal of Environmental Radioactivity，28：91-103，1995)。
【００１０】
ほとんどの場合、放射能汚染物質若しくは排液の浄化及び/又は放射性化合物の濃縮に提案された微生物の電離放射線に対する抵抗性は、調べられていない。実際、これら微生物はウラニウム(U)及びトリウム(Th)の抽出に使用されるが、主要同位体の活性は低い(例えば、10μg/lの238U又は235Uを含有する溶液の活性はそれぞれ0.13又は0.8Bq/lである)。米国特許第4,320,093号は、排水中に含まれるウラニウム又はトリウムを抽出するためのリゾプス(Rhizopus)属真菌の使用を開示する。英国特許第1,472,626号は、ウラニウムに予め慣らせた単細胞緑藻のＸ線照射により得られた単細胞緑藻変異体の使用を開示し、英国特許第1507003号は、海水中に天然に存在するウラニウムを濃縮するための種々の微生物、特に真菌たる黒色アスペルギルス(Aspergillus niger)及びオスキラトリア属(Oscillatoria)藍細菌の使用を開示する。米国特許第7,172,691号は、濃度約０〜20ppmのウラニウムを含有する水性媒体(238U及び235Uに関してそれぞれ260及び1600Bq/lの活性を表す)からの放射性混入物、特にウラニウムの濃縮のための、クロレラ(Chlorella)属、セネデスムス(Scenedesmus)属、オオキスチス(Oocystis)属及びクラミドモナス(Chlamydomonas)属の生存光合成藻類の使用を開示する。これに対し、(本発明の微細藻類の生存環境を構成する)使用済み燃料プールの水の活性は、約300,000Bq/lである。
【００１１】
今日までに記載された最も放射線抵抗性である生物は、原核生物である。デイノコッカス・ラディオデュランス(Deinococcus radiodurans)種は、電離放射線に対する抵抗性に関して並外れた能力を有し、60Gy/hの照射下で増殖し、15kGyの線量で生存する。
しかし、放射線許容性と放射性核種又は金属の顕著な蓄積との間に関連はない。放射性媒体の精製装置としての放射線抵抗性細菌デイノコッカス・ラディオデュランスの使用には、この細菌を遺伝子改変して、興味対象の金属の蓄積を可能とする遺伝子を導入する必要がある。例えば、核廃棄物処理場のインサイチュ・バイオレメディエーションの目的で、有機化合物、金属又は放射性核種を解毒又は代謝する能力を有する酵素を発現するように遺伝子改変したデイノコッカス属細菌を用いることが提案された(PCT出願WO 01/23526)。最近になって、キネオコッカス・ラディオトレランス(Kineococcus radiotolerans)種の細菌が高放射性廃棄物処理場から単離、精製された。これら細菌は、10Gy/hより高い線量率の電離放射線の存在下で有機混入物を分解する能力を有すると記載され、生物吸収による放射性核種の非選択的浄化についてその使用が提案されたが、証明されていない(米国特許第7,160,715号)。
【００１２】
これら２つの生物は、非独立栄養細菌という欠点を有し、したがって培養物の使用を可能にするには炭素栄養分の外部供給を必要とする。加えて、培養物は、(リッチでなく、細菌混入感受性が低い培養培地で済む)独立栄養生物の培養物より混入感受性が高い。
２つの放射線許容性独立栄養生物が記載されている。６kGyのLD50で電離放射線を許容する緑藻綱の微細藻類が研究されている(Farhi E.ら，J. Phys. Condens. Matt.，20：104216，2008)。微細藻類の新規な種であるコッコミクサ・アクチナビオチス(Coccomyxa actinabiotis)も同定され、これは10kGyのLD50で電離放射線を許容する(PCT出願WO 2011/098979)。この放射線許容レベルは、特に藻類では、稀である。一般に、藻類は、電離放射線に対する抵抗性について30〜1200GyのLD50値を有する(International Atomic Energy Agency，IAEA，「Effects of ionizing radiation on aquatic organisms and ecosystems」 Technical Reports Series No. 172，1976)。
【００１３】
PCT出願WO 2011/098979に記載された藻類コッコミクサ・アクチナビオチスは、水性媒体中の溶液状態の放射性又は非放射性金属イオンを取り込んで濃縮することができ、放射性媒体中で増殖することができる。
例えば、この藻類を含む実サイズのプールの精製試験により、等価効率で、核施設からの水を精製する従来法に使用されるイオン交換樹脂の廃棄物の約1/100の体積の廃棄物が生じた(Rivasseauら，Energy Environ. Sci.，6，1230-1239，2013)。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、今回、コッコミクサ属の他の微細藻類が、水性媒体中の溶液状態の放射性イオンを取り込んで濃縮することができ、更に放射性媒体中で増殖することができることを見出した。
具体的には、使用済み核燃料プール内で、電離放射線に富み、栄養分が非常に乏しいこの環境下で自発的に増殖する新規なコッコミクサ種を見出した。
本発明者らは、この新規な種(以下、コッコミクサC-IR3-4Cと呼ぶ)を単離し、特徴付けた。コッコミクサ・アクチナビオチスと同様、この藻類は放射線許容性で、放射性核種の蓄積装置でもある。この微細藻類は、2013年１月29日に、ブダペスト条約に従ってCulture Collection of Algae and Protozoa(CCAP，Scottish Association for Marine Science，Dunstaffnage Marine Laboratory，GB-Oban，Argyll，PA37 1QA，英国)に番号CCAP 216/26で寄託された。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】藻集団の細胞密度の変化を培養時間の関数として示す。
【図２】異なるpH値に応じた微細藻類の光合成収量の値を示す。
【図３】pH１〜pH９の培地での藻集団の細胞密度の変化をpHに応じ、経時的に示す。
【図４】光学顕微鏡及び透過型電子顕微鏡で観察した単離微細藻類の写真である。
【図５】２つの独立の培養物から単離したDNAを用いて得た増幅産物の配列を示す。
【図６】18S rRNAに相当するDNA配列の整列(BLASTN)後に得られる系統樹を表す。
【図７】急性照射の３日後に測定したコッコミクサC-IR3-4Cの死亡率パーセンテージを、照射線量の関数として示す。
【図８】pH６の10-6Ｍレアアースに曝露したコッコミクサCCAP 216/26微細藻類のａ)細胞密度及びｂ)光合成収量の変化を示す。
【図９】pH６の10-6Ｍ金属に曝露したコッコミクサCCAP 216/26微細藻類が蓄積したレアアースのパーセンテージ(％)を示す。
【図１０】pH２の10-2Ｍレアアースに曝露したコッコミクサCCAP 216/26微細藻類のａ)細胞密度及びｂ)光合成収量の変化を示す。
【図１１】pH２の10-2Ｍ金属に曝露したコッコミクサCCAP 216/26微細藻類が蓄積したレアアースの量(μmol/g乾燥物)を示す。
【図１２】pH１又は２の10-2Ｍ金属に曝露したコッコミクサCCAP 216/26微細藻類のａ)細胞密度及びｂ)光合成収量の変化を示す。
【図１３】pH１又は２の10-2Ｍ金属に曝露されたコッコミクサCCAP 216/26微細藻類が蓄積したレアアースの量(任意単位)を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
コッコミクサC-IR3-4C種の藻類は、特に、18SリボソームRNA-ITS1-5.8SリボソームRNA-ITS2-28SリボソームRNA(start)に相当する遺伝子が、配列番号１の配列と少なくとも96％、好ましくは少なくとも97％、98％又は99％の同一性を有する配列を含む点で特徴付けられる。
上記のパーセント同一性は、BLAST(登録商標)ツールを用いて配列整列後に配列番号１の全体配列からなる比較ウィンドウにわたって算出する。
【００１７】
コッコミクサC-IR3-4C種の藻類は、ITS1-5.8S rRNA-ITS2に相当する領域が配列番号１の配列の対応する領域と少なくとも96％の同一性を有する点で特徴付けることもできる。この閾値は、コッコミクサC-IR3-4C及び他のコッコミクサのこの領域間で最大95％の同一性を証明し、互いに比較した他のコッコミクサのITS1-5.8S rRNA-ITS2間で最大88％の同一性を証明した本発明者らの観察に基づき、96％と見積もられた。
コッコミクサC-IR3-4CのリボソームRNA遺伝子の配列は、具体的には、そのITS1及びITS2遺伝子の性質がコッコミクサ属の他の種のものとは異なる。
【００１８】
コッコミクサC-IR3-4Cは放射性媒体中で増殖することができ、これにより、このコッコミクサは、金属以外の放射性化合物を取り込んで代謝することが可能となり、加えて放射性又は非放射性水性媒体中の溶液状態の放射性又は非放射性金属イオンを取り込んで濃縮することもできる。金属以外の放射性化合物として、例えば、3H又は14Cが挙げられる。後者は、光合成の間にCO2、炭酸塩又は炭酸水素塩の無機形態で又は種々の藻類代謝プロセス中に有機形態(例えば、酢酸塩)で代謝され得る。
本発明者らは、コッコミクサの別の種コッコミクサ・コダティイ(Coccomyxa chodatii)(ゲッティンゲン大学の藻類カルチャーコレクションのSAG株番号216-2)(これも放射線許容性である)が放射性核種を濃縮することができることも見出した。
【００１９】
結果として、本発明の主題は、コッコミクサ属緑藻、特に上記のコッコミクサC-IR3-4C種及び/又はコッコミクサ・コダティイの、アンチモン(Sb)及び以下の金属：Cs、Ag、Co、Mn、Sr、Cu、Cr、Zn、Ni、Fe、アクチニド(例えばウラニウム)、ランタニド及びレアアース(例えば、Sc、Y、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu)から選択される少なくとも１つの放射性若しくは非放射性元素並びに/又は放射性同位体14C及び3Hの少なくとも一方を、該元素及び/又は該放射性同位体を溶液状態で含有する水性媒体から捕捉するための使用である。
【００２０】
より具体的には、本発明の主題は、Cs、Ag、Co、Mn、Sr、Cu、Cr、Zn、Ni、Fe、Sb、アクチニド、ランタニド及びレアアースから選択される少なくとも１つの放射性若しくは非放射性元素並びに/又は放射性同位体14C及び3Hの少なくとも一方を、該元素及び/又は該放射性同位体を溶液状態で含有する水性媒体から捕捉する方法であって、前記捕捉が前記水性媒体中で、コッコミクサ属緑藻、特にコッコミクサC-IR3-4C及び/又はコッコミクサ・コダティイをインキュベートすることによって行われることを特徴とする方法である。
有利には、前記元素は、Ag、Co、Cs、U、Mn、Cu及びSr、並びにレアアースから選択される金属である。
【００２１】
１つの特定の実施形態によれば、本発明は、Sr及びCuから選択される少なくとも１つの放射性又は非放射性元素を、該元素を溶液状態で含有する水性媒体から捕捉する方法であって、前記捕捉が前記水性媒体中で、コッコミクサ属の単細胞緑藻をインキュベートすることによって行われることを特徴とする方法に関する。
本発明の１つの好適な実施形態によれば、前記水性媒体は放射性媒体、すなわち前記藻類が数μGy/hから数kGy/hまでの範囲の線量率に曝される媒体である。この実施形態の１つの好適なアレンジによれば、捕捉される元素は、安定若しくは放射性同位体の形態又は同位体の混合物の形態の、上記のものから選択される金属である。
【００２２】
本発明の別の１つの好適な実施形態によれば、前記水性媒体は非放射性媒体である。捕捉される元素は、好ましくは、レアアースから選択される金属である。
本発明の別の１つの実施形態によれば、前記水性媒体は酸性媒体である。これは、都市廃棄物の溶解に使用する溶液が一般に高酸性(pH１又はpH２)であるため、特に有利である。本発明者らは、単細胞緑藻コッコミクサCCAP 216/26がpH１で生存しレアアースを取り込むことができたことを示した(実施例7.4)。捕捉する元素は、好ましくはレアアースから選択される金属である。よって、コッコミクサ属の単細胞緑藻は、本発明に関し、pH１の、pH１〜２の、pH２〜３の又はpH３〜６の酸性水性媒体の浄化に有利に使用することができる。
【００２３】
水性媒体中での藻類のインキュベーション時間は、特には第一に問題の元素及び第二に捕捉を行わなければならない水性媒体の性質に応じて、変化し得る。インキュベーション時間は、一般に、少なくとも１時間であり、数ヶ月間まで(或いは数年間までさえ)の範囲である。例えば、Ag又はCs又はUの捕捉が望ましい場合、約24時間のインキュベーション時間がその主要部分の捕捉に十分であり得る。
想定できる最大のインキュベーション時間は、実際には、水性媒体中での藻類の増殖及び生存の能力に主に依存する。
光及び二酸化炭素(周囲大気との接触、培養物の撹拌又は通気により導入される)の存在下、コッコミクサ属藻類、特にコッコミクサC-IR3-4C種及びコッコミクサ・コダティイの藻類は、僅かにミネラル化した水(導電率１〜２μS/cm)中で、pH６〜７及び温度20〜30℃で非常に長期間増殖し生存することができる。これら緑藻は、光合成を行って有機物を産生するために光を必要とするので、その増殖は暗所に置いけば停止する。
【００２４】
よって、本発明に従う方法の１つの実施形態によれば、コッコミクサC-IR3-4C種及びコッコミクサ・コダティイの緑藻類の増殖は、該藻類を含む水性媒体の照明の調節によって制御することができる。
コッコミクサC-IR3-4C藻類は、0.1mGy/h以下の放射線に曝される弱放射性媒体中で数年間増殖し生存することもできる。
本発明に従う方法を実施するため、藻類は、捕捉を行わなければならない水性媒体中に懸濁状態で、凝集予防のために撹拌しながら使用することができる。藻類は、水性媒体中に置かれた滑らかな多孔性固体支持体又はビーズに結合させることもできる。
本方法は移送型であり得る。すなわち、藻類を、核施設から離れた封入容器中の浄化すべき媒体と接触させる。又は、インサイチュで本方法を実行する；後者の場合、藻類を浄化すべき媒体中に直接移植する。
【００２５】
本発明に関して、用語「浄化」及び「除染」は同義であり、放射性又は非放射性元素について交換可能に用いることができる。インサイチュ型の捕捉又は除染法の場合、藻類は、施設の稼動に干渉しない限り、該施設内に残すことができる。例として、藻類の増殖は、照明の強度(無照明又は弱照明)又はランプ波長の選択(例えば、光化学作用のない黄緑色光)によって制御することができる。加えて、水をろ過し、懸濁している藻類を捕捉することによって藻類の増殖を制御することができる。藻類を除去する必要性が判明すれば、(例えば４g/l過酸化水素を１〜７日間用いる)酸化により藻類を完全に破壊することもできる。この操作は金属の放出を伴うので、好ましくは施設内でセクションごとに、或る濃度の金属を含有する排液を回収しながら、行うべきである。
移送型方法又はインサイチュ型方法の場合、インキュベーション終了時に、金属を捕捉した藻類を慣用手段(ろ過、デンカント、遠心分離など)により採集する。その後、金属を捕捉した藻類は、含有する金属を予め抽出することなく、場合によっては乾燥及び/又は燃焼後に、廃棄物として廃棄することができる。
【００２６】
有利には、藻類により捕捉された元素は、再利用のために回収することができる。この回収は任意の適切な手段により行うことができる。
具体的には、元素は藻類の破壊後に回収することができる。この破壊は、例えば、藻類の溶菌により、有利には(例えば４g/lの過酸化水素を１〜７日間用いる)酸化による溶菌により行うことができる。回収は藻類の灰化により行うこともできる。
元素は、錯化剤、例えばエチレンジアミン四酢酸(EDTA)の添加又は酸の添加により回収することができる。
本発明に従う方法は、採鉱操作のため又は水性排液(特に放射性排液)の浄化のために、水性媒体から放射性又は非放射性元素、特に上記のものを抽出することが望ましい全ての場合で実施することができる。
【００２７】
上記の元素(Cs、Ag、Co、Mn、Sr、Cu、Cr、Zn、Ni、Fe、Sb、アクチニド、ランタニド及びレアアース、例えばSc、Y、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu；放射性か非放射性かにかかわらず)を特異的に捕捉及び濃縮する強力な能力に加えて、コッコミクサ属藻類、特にコッコミクサC-IR3-4C種及びコッコミクサ・コダティイの藻類は、カチオンを錯体化する性質を有する多糖からなる細胞外粘液にとりわけ起因して、他の元素、特に金属を非特異的に取り込む性質も有する。
したがって、本発明に従う方法は、放射性又は非放射性金属が混入した水性媒体又は土壌(泥炭地、低湿地)、より具体的には放射性媒体、例えば、貯蔵プールの水又は原子力発電所若しくは原子炉の二次冷却系の軽水、又は環境中に放出される原子力発電所の排液、又は病院設備の排液を浄化するため及び除染するために特に適切である。
【００２８】
本発明は、コッコミクサC-IR3-4C種若しくはコッコミクサ・コダティイの単細胞緑藻又はコッコミクサ属に属する別の藻類或いはこれらの混合物を用いてのみならず、コッコミクサ属に属する少なくとも１つの単細胞緑藻、特にコッコミクサC-IR3-4C種又はコッコミクサ・コダティイ種の微細藻類と、好ましくは放射線抵抗性又は放射線許容性であり、溶液状態の金属イオンを濃縮し及び/又は金属以外の放射性化合物(例えば、3H又は14C)を捕捉し代謝する能力を有する、少なくとも１つの微生物、特に細菌、真菌、酵母、別の単細胞藻類、及び/又は多細胞植物とを含んでなる微生物の混合物を用いても実施可能である。コッコミクサ属の単細胞緑藻との組合せで使用できる多細胞微生物及び植物は、具体的には、上記のものであり、特に放射線抵抗性又は放射線許容性のものである。本発明を放射性の水性媒体に適用する場合、微生物の混合物のインキュベーション時間は、混合物を構成する微生物の個々の抵抗性に依存する。同様に、培養条件は、混合物を構成する１以上の微生物の増殖を促進するように調整してもよい。
本発明は、コッコミクサC-IR3-4C種の単離及び特徴付け、放射性水性媒体を除染するためのその使用、及びコッコミクサ・コダティイの放射性核種取り込み特性の特徴付けを説明する実施例に言及する以下の更なる説明からより明確に理解されよう。
【実施例】
【００２９】
実施例１：コッコミクサC-IR3-4Cの単離及び特徴付け
微細藻類を使用済み核燃料プールから採集した。このプールに含まれる水は６〜７のpH、１〜２μS/cmの導電率を有し、周囲大気と接触し、溶解した放射性元素を含む。温度は22〜28℃で変化し、平均25℃である。プール内の放射能は、測定点に応じて、弱い〜非常に強いまで変化に富む。
このプールの壁及び種々の表面で緑色有機物の膜の存在が観察された。サンプルを採取し、顕微鏡下で観察すると、これは単細胞緑色微細藻類と判明した。
【００３０】
培養条件
サンプルを保存し、明所にて栄養寒天上で滅菌環境下温度20〜23℃で培養した。栄養培地は(純粋な又は脱塩水に希釈した)ボールド基本培地(BBM，Sigma)である。BBMは緑藻類の培養に伝統的に使用される。培養培地はpH6.4である。組成を下記表Ｉに示す。
【００３１】
【表１】
2016519927.tif 000002
【００３２】
藻類を固体BBM寒天上での培養状態に置いた。コロニーを単離後、希釈して、単離細胞を寒天培養培地に散布した。この操作を５回繰り返してコッコミクサ株C-IR3-4Cを得た。配列を決定した。
この培養物のサンプルを、ブダペスト条約に従い、2013年１月29日にCulture Collection of Algae and Protozoa(CCAP)に番号CCAP 216/26で寄託した。
液体BBM中で、コッコミクサ株C-IR3-4C微細藻類は、指数増殖期でもって増えた。微細藻類の増殖は、21±１℃に維持したInfors Multitronインキュベーター内で100rpmの振盪及び90±10PARの連続照明にて1:2希釈したBBM中で培養した３サンプルの藻類について、藻集団の細胞密度を経時的に計数して測定した。Malassez計数チャンバを顕微鏡下(対物×40倍)で用いて計数した。増殖曲線を図１に示す。図１は、藻集団の細胞密度の変化を培養時間の関数として示す。
【００３３】
コッコミクサ株C-IR3-4C微細藻類は、広範囲のpHにわたる液体培地で生存する能力を有する。藻類を、HCl又はKOHの添加によりpHを目標値に調整した脱塩水で培養した。培養物は、21±１℃に維持したInfors Multitronインキュベーター内で100rpmの振盪及び90±10PARの連続照明にて増殖させる。培地のpHを毎日検査し、必要であれば再調整する。培地のpHに応じた藻類の状態は、光合成収量(細胞の生理学的状態全体の指標)により評価する。光合成収量は、PAM 103フルオロメータを用いて測定する。図２は、異なるpH値に応じた微細藻類の光合成収量の値を示す。この図は、微細藻類がpH１〜pH９(試験したpH範囲)の培地中で生存可能であることを示す。図２は、微細藻類が脱塩水から構成される培地で良好な生理学的状態を保持し、良好な生理学的状態をpHに関わらず保持することを示す。
コッコミクサ株C-IR3-4C微細藻類は、広範なpHにわたる液体培地で増殖する能力も有する。図３は、pH１〜pH９の培地での藻集団の細胞密度の変化をpHに応じ、経時的に示す。培養条件は図２のものと同一である。細胞密度の計数は、Malassez計数チャンバを顕微鏡下(×40倍)で用いて行った。迅速な増殖及び高い微細藻類密度を得るため、４〜８のpH範囲を用いる。
【００３４】
形態学的及び生化学的特徴
光学顕微鏡及び電子顕微鏡で観察した単離微細藻類は、単細胞で、楕円体であり、有核である(図4A及び4B)。図4A及び4Bは、それぞれ光学顕微鏡(Zeiss Axioplan 2ビノキュラ顕微鏡、1300倍)及び透過型電子顕微鏡(JEOL 1200EX及びPhilips CM 120)で観察したこれら微細藻類の写真である。Philips CM 120 TEMでの観察は、Technological Center for Microstructures (Claude Bernard University Lyon 1)にて行った。微細藻類は、クロロフィルを含み、光合成の場である葉緑体(おそらく数個)を含有する。他の小器官、特に液胞が細胞の残りの部分を占めている。
この生物のUV-可視光吸収スペクトルは、クロロフィルａ(吸収ピーク663nm)、クロロフィルｂ(吸収ピーク647nm)及びカロテノイド(吸収ピーク470nm)の存在を示す。
【００３５】
リボソームDNA遺伝子の増幅及び配列決定
上記のとおり単離したC-IR3-4C微細藻類のトータルDNAを、Wizard Genomic DNA精製キット(Promega)を用いて抽出した。
18S rRNA-ITS1-5.8S rRNA-ITS2-28S rRNA(最初の500塩基)リボソームDNA遺伝子を包含するゲノム領域をPCRにより増幅した。
用いたプライマーは、微細藻類のrRNA遺伝子の増幅に伝統的に使用するEAF3：TCGACAATCTGGTTG ATCCTGCCAG(配列番号２)及びITS055R：CTCCTTGGTC CGTGTTTCAAGACGGG(配列番号３)である。
【００３６】
２つの独立の培養物から単離したDNAを用いて得た増幅産物を配列決定したところ、それは3101塩基である。これら増幅産物の配列を図５に示し、添付の配列表に配列番号１として掲載する。この配列は、藻類コッコミクサC-IR3-4Cの18S rRNA-ITS1-5.8S rRNA-ITS2-28S rRNA(start)リボソームDNA遺伝子を包含するゲノム領域の配列を表す。18S rRNAに相当する部分は下線を付してイタリック体で表し、ITS1は太字で表し、5.8S rRNAには下線を付し、ITS2はイタリック体で表し、28S rRNAは太字で表し下線を付している。
BLASTNアルゴリズム(Altschulら，Nucleic Acids Research，25：3389-3402，1997)を用い、配列番号１の配列と最大の同一性を有するリボソームRNA遺伝子配列についてデータベースを検索した。この検索により、微細藻類C-IR3-4Cに最も類似すると特徴付けられる種がコッコミクサ属に属することが明らかとなった。
【００３７】
微細藻類C-IR3-4Cの小リボソームサブユニットのRNA(18S rRNA)に相当する配列(1807bp)とデータベースに掲載された他のコッコミクサ種のものとの比較を、BLAST(登録商標)アルゴリズムを用いて複数の配列を整列させることによって行った。下記表IIはこの配列比較の結果を表す。他の種の配列はGenBankデータベースにおいて入手可能である。対応するアクセッション番号も表IIに示す。
【００３８】
【表２−１】
2016519927.tif 000003
【表２−２】
2016519927.tif 000004
【００３９】
この配列比較により、株C-IR3-4Cに最も類似する種は、コッコミクサ・レイシエ(Coccomyxa rayssiae)株UTEX273、コッコミクサ株CCAP 216/24、シュードコッコミクサ・シンプレックス(Pseudococcomyxa simplex)株SAG 216-9a、コッコミクサ・コダティイ株SAG 216-2、シュードコッコミクサ・シンプレックス株UTEX 274、コッコミクサ・ペルティゲラ(Coccomyxa peltigerae)株SAG 216-5、シュードコッコミクサ・シンプレックス株CAUP H 102、コッコミクサ株KN-2011-E4、コッコミクサ株CCAP 211/97、並びにコッコミクサ属に属し、99％の配列同一性を有する他の株、コッコミクサ属に依然として属し、98％の配列同一性を有する他の株、例えばコッコミクサ株CPCC 508又はコッコミクサ株SAG 2325、97％の配列同一性を有する他のコッコミクサ、例えばコッコミクサ・グラロネンシス(Coccomyxa glaronensis)株CCALA 306、コッコミクサ種(Coccomyxa sp.) Flensburg fjord 2又はコッコミクサ・ムシゲナ(Coccomyxa mucigena)株SAG 216-4であることが示される。
【００４０】
コッコミクサ属との比較でコッコミクサ株C-IR3-4Cについて得られたこれら高い同一性スコアは、コッコミクサ配列を互いに比較して得られるスコア(96〜99％)に近く、別の種に属する単細胞微細藻類(クラミドモナス種(Chlamydomonas sp.) CCMP681 (EF106784.1))との配列比較について得られるスコア(93％の同一性)とはかけ離れている。このことは、株CCAP 216/26がコッコミクサ属の一因であることを示している。
更に、株C-IR3-4CのITS領域配列と他のコッコミクサのものとの比較も行った。下記表IIIは、ITS1-5.8S rRNA-ITS2領域のこの配列比較の結果を表す。他の種の配列は、GenBankデータベースから入手可能であり、対応するアクセッション番号を表IIIに示す。
【００４１】
【表３−１】
2016519927.tif 000005
【表３−２】
2016519927.tif 000006
【００４２】
この配列比較により、株C-IR3-4Cの配列は、参照した他のコッコミクサ株と83％〜95％の同一性を有し、参照したコッコミクサのITS領域を互いに比較して得られるスコア(78％〜99％)と同じオーダーであり、他の属との比較について得られたスコア(約30％〜50％)とはかけ離れていることが示される。
よって、この株は、従来言及された全てのコッコミクサ種と異なるコッコミクサ種である。これら結果は、事実、単離された微細藻類がコッコミクサ属の一員であるが、そのDNAはデータベースに列挙されたコッコミクサの他の種の者とは特にITS1及びITS2 DNAに関して十分に異なり、新規な種とみなせることを示す。この新規な種を本明細書でコッコミクサC-IR3-4Cと呼ぶ。
図６は、18S rRNAに相当するDNA配列の整列(BLASTN)後に得られる系統樹を表す。バーは１％(0.01)の置換率を示す。
【００４３】
実施例２：電離放射線に対するコッコミクサC-IR3-4Cの抵抗性
コッコミクサC-IR3-4C藻類の電離放射線に対する抵抗性を、崩壊中の使用済み燃料からの種々の線量のガンマ放射線への曝露により試験した。生体染色(ナチュラルレッド)により照射後の死亡率を測定した。
図７は、急性照射の３日後に測定したコッコミクサC-IR3-4Cの死亡率パーセンテージを、照射線量の関数として示す。集団の半数を殺傷する電離放射線線量は、２〜６kGyである。
【００４４】
実施例３：コッコミクサC-IR3-4Cを用いる核施設からの水の除染
使用済み燃料プール水の組成に典型的な組成を有する水を、コッコミクサC-IR3-4Cと照明下に24時間接触させた。先ず液体BBM中で培養し、Milli-Q水で予め３回濯いだ新鮮な100mg塊のコッコミクサC-IR3-4C藻類を、β線放射性の放射性核種3H(200,000Bq/l)及び14C(1000Bq/l)並びに下記表IVに列挙したγ線放射性の放射性核種を当初に含有する50mlの水と接触させた。
【００４５】
【表４】
2016519927.tif 000007
【００４６】
接触の24時間後の水及び藻類のγ-分光アッセイにより、水のγ活性の81％が除去されることが示される。
24時間で藻類に結合したγ線放射性の放射性核種のパーセンテージを下記表Ｖに示す。
【００４７】
【表５】
2016519927.tif 000008
110mAg、137Cs及び238Uの全て又は実質的に全て並びに54Mn及び60Coの半分が水から精製された。
【００４８】
実施例４：インサイチュ作用でのコッコミクサC-IR3-4Cを用いる貯蔵プール水の除染
使用済み核燃料プールに存在するコッコミクサC-IR3-4C微細藻類は、該プールに存在する放射性核種を除染する。前記プールはpH６〜７、導電率１〜２μS/cm、平均温度25℃の水で満たされ、該プール内に貯蔵されている物質に起因する放射性金属元素を含有する。プール水は大気に接し、ネオン光照明下にある。
【００４９】
これら条件下で、コッコミクサC-IR3-4Cは、プール内の貯蔵ラックにコロニーを形成することができ、数年間そこで生存し繁殖することが可能である。
γ分光により得たカウントによって、約１ｇの新鮮な藻類塊により濃縮される各γ線放射性物質の性質及び活性並びに総活性の測定が可能となった。活性を下記表VIに示す。微細藻類の活性は、この表において、１ｇの新鮮な藻類塊の活性(Bq)対(藻類が生存している)１mlの水の活性の比として規定される。
【００５０】
【表６】
2016519927.tif 000009
【００５１】
これら結果は、藻類が、生存している水より最大104倍活性が高く、よって事実として放射性元素60Co、66Cu、92Sr、110mAg、134Cs及び137Csを濃縮したことを示す。
藻類コッコミクサC-IR3-4Cは、約20,000のセシウム-137(137Cs)濃度係数(藻類に結合したCsの濃度(原子/ｇ新鮮物) 対 水中のCs濃度(原子/ml)の比として規定)を有する。
【００５２】
実施例５：コッコミクサ・コダティイを用いる核施設からの水の除染
コッコミクサ・コダティイ(株SAG 216/2)藻類の電離放射線抵抗性の測定により、集団の半数を殺傷する電離放射線線量は約1.5kGyであると示される(Rivasseauら，2013，前出)。藻類の電離放射線抵抗性のLD50は、一般に、30〜1200Gyである(IAEA，1976，前出)。
コッコミクサ属に属する微細藻類の放射線許容性は、デイノコッカス(Deinococcus)属に属する全ての細菌が高い放射線許容性を有することと同様、他の属に属する藻類のものより高いようであり、コッコミクサ・アクチナビオチスによる許容性は並外れている。
【００５３】
コッコミクサ・コダティイがコッコミクサ・アクチナビオチス及びコッコミクサC-IR3-4Cの元素取り込み能力を共有するかどうかを決定するため、使用済み核燃料プール水の組成に典型的な組成を有する水をコッコミクサ・コダティイと照明下に24時間接触させた。先ず液体BBM中で培養し、Milli-Q水で予め３回濯いだ新鮮な110mg塊のコッコミクサ・コダティイ藻類を、β線放射性の放射性核種3H(200,000Bq/l)及び14C(1000Bq/l)並びに上記表IVに列挙したγ線放射性の放射性核種を当初に含有する50mlの水と接触させた。
接触の24時間後の水及び藻類のアッセイにより、水のγ活性の80％が除去されることが示される。
24時間で藻類に結合したγ線放射性の放射性核種のパーセンテージを下記表VIIに示す。
【００５４】
【表７】
2016519927.tif 000010
110mAg、54Mn、137Cs及び238Uの全て又は実質的に全て並びに60Coの半分が水から精製された。
【００５５】
実施例６：微細藻類の増殖又は除去の制御
微細藻類は光合成をする。微細藻類は、光合成を行い、有機物を産生するために光を必要とする。よって、種々の非常に低栄養性の培地中及び原子力発電所の排液中で、その増殖は照明を介して制御可能である。微細藻類を所与のスポットで増殖させるためには照明を当てれば十分である。増殖は、光合成をほとんど又は全く可能にしない光、例えば光化学作用のない黄緑色光の照射によっても制御可能である。
水を濾過して、懸濁している藻類を捕捉することにより増殖を制御することができる。
【００５６】
化学的方法、例えば酸化(例えば過酸化水素での酸化)を使用して、微細藻類を完全に除去できる。５ミリリットルの20g/l過酸化水素を、20mlの微細藻類細胞懸濁液を含有する媒体に添加する(すなわち、最終H2O2濃度４g/l)。１日後、培養物は褐色/白色物質の凝集物を含有し、緑色が消失する。１週間後には顕微鏡下で何も観察できない。
よって、過酸化水素による藻類の崩壊は、急速、漸進性で、完全であり、有機物残渣は残らない。
この解決策を使用して、或る媒体から別の媒体へ移行する放射性部分を清浄化し、新たな媒体への藻類混入を回避するか、又は空のプールの壁を清浄化することができる。
【００５７】
実施例７：コッコミクサCCAP 216/26によるレアアース取り込みを利用する生物学的方法
本実施例は図８〜13に言及する。これら図の短い説明を下記に示す。
図８：pH６の10-6Ｍレアアース(生物学的精製の最適条件)に曝露されたコッコミクサCCAP 216/26微細藻類のａ)細胞密度及びｂ)光合成収量の変化(ｎ=３の生物学的複製物)。４種のレアアース(Gd、Nd、Eu及びTb)及び２種の化学形態(カチオン及びクエン酸錯体)を並列に試験した。* = 並列に試験しなかった、複製でないコントロールサンプル。これら値は妥当性の指標として示す。第２のサンプルは、６日間ではなく５日間の曝露後に採取した。純粋のpHは７±１である。
【００５８】
図９：pH６の10-6Ｍ金属(生物学的精製の最適条件)に曝露されたコッコミクサCCAP 216/26微細藻類により蓄積されたレアアースのパーセンテージ(％)(ｎ=３の生物学的複製物)。４種のレアアース(Gd、Nd。Eu及びTb)及び２種の化学形態(カチオン及びクエン酸錯体)を並列に試験した(平均±標準偏差)。
図10：pH２の10-2Ｍレアアース(金属取込みの最適条件)に曝露されたコッコミクサCCAP 216/26微細藻類のａ)細胞密度及びｂ)光合成収量の変化(ｎ=５の生物学的複製物)。４種のレアアース(Gd、Nd、Eu及びTb)及び２種の化学形態(カチオン及びクエン酸錯体)を並列に試験した。* = 並列に試験しなかった、複製でないコントロールサンプル。これら値は妥当性の指標として示す。第３のサンプルは、７日間ではなく５日間の曝露後に採取した。純粋のpHは７±１である。
【００５９】
図11：pH２の10-2Ｍ金属(金属取込みの最適条件)に曝露されたコッコミクサCCAP 216/26微細藻類により蓄積されたレアアースの量(μmol/g乾燥物)(ｎ=３の生物学的複製物)。４種類のレアアース(Gd、Nd、Eu及びTb)及び２種の化学形態(カチオン及びクエン酸錯体)を並列に試験した。
図12：pH１又は２の10-2Ｍ金属に曝露されたコッコミクサCCAP 216/26微細藻類のａ)細胞密度及びｂ)光合成収量の変化(ｎ=５の生物学的複製物)。２つの曝露条件を並列に試験した。* = 並列に試験しなかった、複製でないコントロールサンプル。これら値は妥当性の指標として示す。第３のサンプルは、７日間ではなく５日間の曝露後に採取した。純粋のpHは７±１である。
図13：pH１又は２の10-2Ｍ金属に曝露されたコッコミクサCCAP 216/26微細藻類により蓄積されたレアアースの量(任意単位)(pH１の10-2Ｍ Gd3+条件下についてはｎ=３の生物学的複製物；pH２の10-2Ｍ Gd3+条件下についてはｎ=２の生物学的複製物)。２つの曝露条件を並列に試験した。
【００６０】
7.1．実験プロトコル
7.1.1．材料及び方法
藻類を培養しつつ滅菌条件を達成するため、本プロトコルは、層流フード下、バーナー火炎で作出した滅菌領域内で作業して行った。使用した材料及び溶液は事前にオートクレーブで滅菌した。培養容器はガス交換が可能なようにアルミホイルで覆った。他方、藻類を金属に曝露する実験は非滅菌条件下で行った。
遠心分離は、TX-400ローター(Thermo Scientific)を備えるMegafuge 16R遠心分離機(Thermo Scientific)で行った。15又は50mlのFalconディスポーザブル遠心分離管(パーツ番号734-0451及び734-0448，VWR)に含まれるサンプルを遠心分離するため、適切なアダプター(パーツ番号75003683及び75003682，Thermo Scientific)を使用した。
【００６１】
微細藻類は、×20及び×40倍対物レンズを備えたOptiphot光学顕微鏡(Nikon)を用いて観察した。細胞密度は、0.0025mm2の小正方形、深さ0.200mmのアルミニウム被覆Malassez計数チャンバ(パーツ番号0640630，Marienfeld)で12μlの藻類懸濁液を計数することにより測定した。カウントが50〜100細胞/平方になるよう、必要があればサンプルを事前に希釈した。
光合成収量は、PAM-103クロロフィルフルオロメータ(Walz)を用いて暗所で測定した。
レアアースは、Hewlett-Packard 4500 ICP-MSシステムを用いて、プラズマトーチに結合した質量分析装置により、液体及び藻類中でアッセイした。使用したプロトコル及び選択した同位体は7.1.4で説明する。
【００６２】
7.1.2．藻類の調製
液体培地での継代培養
懸濁藻類を穏やかな条件(100ｇ、25分間、４℃、加速及び減速２)下での遠心分離により採集した。次いで、ペレットに含まれる藻類を滅菌Milli-Q水の添加により洗浄し、続いて遠心分離した後、新鮮な滅菌培養培地に５×106細胞/mlの初期細胞密度で懸濁した。
藻類の培養
コッコミクサCCAP 216/26藻類を、２リットルの光バイオリアクターにおいて、Milli-Q水中に1:2希釈したBBM(B5282，Sigma-Aldrich)(0.5×)からなる1.5リットルの滅菌培養培地中で培養した。温度及び明度をそれぞれ22±１℃及び90±10μmol/m2/sに維持した。連続曝気により細胞を撹拌し、通気した。藻類の初期濃度は約５×106細胞/mlである。細胞の成育を助けるため、培養２週目以降、15ミリリットルの濃縮(50×)BBMを３〜４日ごとに加えた。光バイオリアクターはバッチモードで用い、一月ごとにリフレッシュした。100×106細胞/mlを超える最大細胞密度(定常状態)に達した藻類を使用した。
【００６３】
藻類の採集及び洗浄
遠心分離(100ｇ、25分間、４℃、加速及び減速２)による採集後、滅菌Milli-Q水を添加して遠心分離し(100ｇ、10分間、４℃、加速及び減速２)、上清を除去して藻類を３回洗浄した。次いで、洗浄した藻類を滅菌Milli-Q水に取り、Inforsインキュベーター内のErlenmeyerフラスコに入れ、そこで、温度及び明度を一定(22±１℃及び90±10μmol/m2/s)に維持し、振盪(100rpm)により通気する。
藻類の定量
洗浄した藻類の３つの４ml〜５ml懸濁サンプルを、孔サイズ1.2μmの予め秤量したニトロセルロースフィルター(パーツ番号512-0267，VWR)でろ過した。フィルターを70℃にて30分間乾燥後、秤量して乾燥物の見かけの濃度を測定した。この値を測定することで、比例性により、懸濁液の乾燥物の有効濃度の推定が可能となり、結果として0.50±0.1g/l乾燥物の濃度が得られるような懸濁液の希釈が可能となった。希釈後の懸濁液の乾燥物濃度は、この３つの４ml〜５mlサンプルを100℃にて24時間乾燥させ、その後残留物を秤量することによって制御した。
【００６４】
7.1.3．藻類の金属取込実験
藻類の金属への曝露
各実験について、洗浄済み藻類の30ml懸濁液を100mlのErlenmeyerフラスコに入れた。藻類の濃度は0.5±0.1g/l乾燥物である。次いで、KOH又は濃HClを加えてpHを設定点に調整した。藻類が該pHに適応するよう、サンプルをInforsインキュベーター内に一晩置いた。t0で、300μlのLnCl3溶液(Ln=調べるランタニド)(所望の最終濃度より100倍高い濃度)をサンプルに加えた。秤量して添加量を検証した。毎日pHを設定点に再調整した。
生理学的モニタリング
細胞密度及び光合成収量を測定して、藻類の生理学的状態をモニターした。
【００６５】
上清のサンプリング
藻類懸濁液の1.2mlサンプルを採取した。２回の連続遠心分離(100ｇ、10分間、４℃、加速及び減速３)により上清を藻類から分離した(遠心分離、上清のサンプリング、次いで該上清の遠心分離)。１mlの上清を４mlの1.25％ HNO3に希釈後(各希釈を秤量により検証)、得られた溶液を、ICP-MSによる溶液状態の金属のアッセイまで、４℃に維持した。
ペレットのサンプリング
藻類懸濁液の３mlサンプルを採取した。遠心分離(500ｇ、10分間、４℃、加速及び減速４)により藻類を採集した。次いで、４mlのMilli-Q水に取り、遠心分離(500ｇ、10分間、４℃、加速及び減速４)し、上清を除去して、藻類を１又は２回洗浄した。藻類ペレットを、ミネラル化及び取り込まれた金属のICP-MSによるアッセイまで、４℃に維持した。
【００６６】
7.1.4．金属アッセイ
藻類のミネラル化
藻類を、1.5mlの180℃の王水(65％ HNO3/30％ HCl、2:1v/v)で乾燥ミネラル化した。残留物を１mlの10％ HNO3(市販の超純粋65％ HNO3溶液を希釈して調製した溶液)に取り、次いで滅菌Milli-Q水で1:10希釈した。各希釈は秤量により検証した。
希釈及び金属アッセイ
標準範囲内の金属濃度が得られるよう、上清サンプルから又は藻類のミネラル化から生じた溶液を１％ HNO3に希釈した。これらサンプルをICP-MSにより、Analabが提供する溶液を用いて調製した標準範囲と比較することでアッセイした。各希釈を秤量により検証した。金属濃度は種々の同位体で得られた測定値の平均として算出した。
藻類曝露用に使用したレアアースストック溶液もまアッセイした。
分析した各元素について、標準範囲及び測定した同位体を表にまとめる。
【００６７】
【表８】
2016519927.tif 000011
【００６８】
理想的には、金属アッセイは、サンプルが高蓄積パーセンテージを示したときには上清で、低蓄積パーセンテージが観察されたときにはペレットで行った。
7.1.5．Ln[クエン酸]錯体の調製
クエン酸錯体は、Milli-Q水に等モル量の金属及びクエン酸を溶液状態で入れることにより調製した。熱力学的データによれば、その後、錯体が自発的に形成される。
【００６９】
7.2．生物学的精製に最適な条件(10-6Ｍ金属、pH６)下での、コッコミクサCCAP 216/26による、遊離形態及び錯体化形態の４種類のレアアース ガドリニウム、ネオジム、ユーロピウム及びテルビウムの結合
7.2.1．行った実験
コッコミクサCCAP 216/26による、２つの化学形態(カチオン及びクエン酸錯体)の４種類のレアアース(Gd、Nd、Eu及びTb)の蓄積を、蓄積パーセンテージについて、最適条件(10-6Ｍレアアース、高pH)下で試験した。中心複合実験計画を用いpH２〜pH９のpH範囲及び10-2Ｍ〜10-6Ｍ金属の濃度範囲に適用して、pH条件及び初期濃度を最適化した。こうして、２種の元素(Gd及びNd)及び２種の化学形態(カチオン及びクエン酸錯体)ついて同一の最適条件が得られた。
【００７０】
実験計画により、カチオンについてpH６及びクエン酸錯体についてpH９の最適pHが明らかになった。しかし、錯体の蓄積に対するpHの効果は非常に低く、pH４、６又は８での蓄積は有意には異ならない。結果として、本実験の間、全ての試験をpH６±1. 10-6Ｍレアアースで行った。
中間信頼性を見積もるために、８つの対応する実験を並列に行い、３つの異なるバイオマスを用いて３週間にわたって３回繰り返した。
【００７１】
7.2.2．生理学的モニタリング
光合成収量及び細胞密度を測定することにより藻類の生理学的状態をモニターした(図８)。藻類は秀逸な生理学的状態のままである：本条件下でレアアースへの６日間の曝露後でさえ、細胞密度は増加し、光合成収量は60％近辺のままである。
7.2.3．金属蓄積のモニタリング
蓄積パーセンテージ(％)を測定するため、蓄積金属を上清でアッセイした。得られた値を表IX及び図９に示す。
・蓄積パーセンテージは、全てのレアアースについて同じオーダーである：90％〜95％。
・いずれの元素についても、藻類との接触の24時間後で、カチオン及びクエン酸錯体の蓄積に顕著な差なし。
・藻類が蓄積したレアアースカチオンの実質的に全てが、10-6Ｍ金属、pH６の曝露条件下、１時間以内に捕捉される。その後、24時間の接触まで変動はほとんどない。
・10-6Ｍ金属、pH６の条件下、クエン酸錯体形態のレアアースの蓄積には、少なくとも３時間の接触が必要である。蓄積パーセンテージは、３時間の接触〜24時間の接触の間に僅かに上昇し続ける。
【００７２】
【表９】
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【００７３】
7.3．金属取込みに最適な条件(10-2Ｍ金属、pH２)下での、コッコミクサCCAP 216/26による、遊離形態及び錯体化形態の４種類のレアアース ガドリニウム、ネオジム、ユーロピウム及びテルビウムの結合
7.3.1．行った実験
コッコミクサCCAP 216/26による、２つの化学形態(カチオン及びクエン酸錯体)の４種類のレアアース(Gd、Nd、Eu及びTb)の蓄積を、蓄積量について、最適条件(10-2Ｍレアアース、pH２)下で試験した。
7.3.2．生理学的モニタリング
光合成収量及び細胞密度を測定することにより藻類の生理学的状態をモニターした(図10)。レアアースの存在下又は不在下でpH２に曝露された藻類の増殖は完全に停止する。光合成収量は、10-2Ｍレアアース、pH２への６日間の曝露後に僅かに減少する。光合成収量は、２日間の曝露後には50％を超えたままであり、このことにより、最初の48時間の藻類の良好な生存能が証明される。
【００７４】
7.3.3．金属蓄積のモニタリング
レアアースの蓄積量(μmol/g乾燥物)を測定するため、王水でのミネラル化の後、藻類ペレットで金属をアッセイした。得られた値を表Ｘ及び図11に示す。
全体として、レアアースの蓄積量は、相対的に類似する。調べた元素にも化学形態にも関わらず、金属の蓄積量は、３時間又は24時間の接触時間後で40〜100μmol/g乾燥物である。詳細には、小さな差が観察される。
・10-2Ｍ金属、pH２の曝露条件下、異なる化学元素間で蓄積に顕著な差が存在する。ガドリニウム及びネオジムは、ユーロピウム及びテルビウムより容易に捕捉されるようである(Gd3+及びNd3+についてはそれぞれ101及び78μmol/g乾燥物の金属が24時間で捕捉された；Eu3+及びTb3+についてはそれぞれ43及び39μmol/g乾燥物の金属が24時間で捕捉された)。
・ガドリニウム及びネオジムの場合、カチオンの蓄積は、クエン酸錯体の蓄積より僅かに効率的であるようである。カチオンの最大蓄積は24時間以内の接触で達成される。バイオマスの状態に関わらず、反復性は24時間まで良好である(図11)。48時間の接触後、バイオマスの状態に応じて、毒性を生じ始めることがある。クエン酸錯体は最初の３時間の接触の間に急速に蓄積し、その後48時間の曝露までは、より緩徐に増加する。
・ユーロピウム及びテルビウムの場合、２つの化学形態間での蓄積の差が顕著に異なるようには見えない。藻類により捕捉される金属の大部分がわずか３時間以内に捕捉される。その後ほとんど変動は見られない。
【００７５】
【表１０】
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よって、或る種の元素の場合に藻類がより急速に捕捉し、試薬の点で安価であるカチオン形態のレアアースの使用が、金属回収について最適条件下で好ましいようである。
【００７６】
7.4．より低いpH条件(pH１)下でのコッコミクサCCAP 216/26によるGd3+イオンの結合
7.4.1．行った実験
都市廃棄物の溶解に使用される溶液にできる限り類似する条件下でのレアアースの結合を試験するため、コッコミクサCCAP 216/26によるGd3+の蓄積を、前出の試験条件より低いpH条件(pH１)下で試験した。
・10-2ＭのGd3+及びpH２
・10-2ＭのGd3+及びpH１
この２つの実験を並列に行った。
【００７７】
7.4.2．生理学的モニタリング
光合成収量及び細胞密度を測定することにより藻類の生理学的状態をモニターした(図12)。レアアースの存在下及び不在下でpH１及び２に曝露された藻類の増殖は、顕著に遅くなる。光合成収量は本実施例で試験した曝露条件により影響を受けるが、藻類は、10-2ＭのGd3+、pH１への曝露の間、48時間及び６日で依然として生存可能である。６日間の曝露後、10-2Ｍ Gd3+及びpH２に曝露された藻類の光合成収量は、50％近辺のままである。10-2Ｍ及びpH１に曝露された藻類の光合成収量は、６日で20％未満に低下する。
7.4.3．金属蓄積のモニタリング
レアアースの蓄積量(μmol/g乾燥物)を測定するため、王水でのミネラル化の後、藻類ペレットで金属をアッセイした。得られた値を表XI及び図12に示す。
藻類は、非常に低いpH(pH１)に48時間曝露されたときでさえ、Gd3+を蓄積することができる。蓄積量はpH２でpH１より高い。
最高蓄積は、藻類を10-2ＭのGd3+及びpH２に24時間曝露した後に観察される。その後、100μmol/g乾燥物に近い量が藻類により捕捉される。この条件は金属取込みについて最適条件のままである。
【００７８】
【表１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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