(57)【要約】  イメージャ、及び、フローセル上のデオキシリボ核酸（DNA）フラグメントを撮影するイメージャによって使用するための配列方法、が開示される。該イメージャは、該フローセルにおける基準位置を有する各々のタイルを備えたタイル中のDNAフラグメントビーズ位置における強度値を捕捉する。フローセルは、第一撮影セッション中、各々のタイルの暗視野画像を取得すること、第一撮影セッション中に２つの別々のタイル内のビーズ位置の暗視野集団を同定すること、第二撮影セッション中に相当する集団を同定すること、該相当する集団における線形オフセットに対して補正するための該第二撮影セッション中に少なくとも一つのタイルの該基準位置を変更すること、並びに、該相当する集団のオフセットから決定される角度オフセットに対して補正するための該フローセルにおける該ビーズ位置に対する該イメージャから強度値を読み取るための少なくとも一つの補正因子を適用すること、によって配列されてもよい。
2016513459.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フローセル上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）フラグメントを撮影するイメージャによる使用のための整列方法であって、該イメージャは、該フローセル中の基準位置を有する各々のタイルを用いて、タイル中のＤＮＡフラグメントビーズ位置での強度値を捕捉するものであって、該方法は：
第一撮影セッション中に各々のタイルの暗視野画像を取得すること；
第一撮影セッション中に、第一タイル内のビーズ位置の第一暗視野集団、及び、第二タイル内のビーズ位置の第二暗視野集団を同定すること；
第二撮影セッション中に、該第一及び第二暗視野集団に相当する集団を同定すること；
該相当する第一暗視野集団において、該第二撮影セッション中に、線形オフセットのために補正するために、少なくとも一つのタイルの該基準位置を変更すること；及び、
該相当する第一及び第二暗視野集団のオフセットより決定される角度オフセットのために補正するための該フローセルにおいて、該ビーズ位置のための該イメージャから強度値を読み取るための少なくとも一つの補正因子を適用すること、
を含む、方法。
【請求項２】
基準位置を変更する該工程は、第一撮影セッション及び第二撮影セッションの間の該フローセルの線形オフセットのために補正する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該少なくとも一つの補正因子を適用する該工程は、該第一撮影セッション及び該第二撮影セッションの間の該フローセルの角度オフセットのために補正する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該第二撮影セッション中に、該フローセルの各々のタイルに対して、蛍光視野画像を取得すること：
該適用された少なくとも一つの補正因子によって補正されるような該暗視野画像にて同定された該ビーズ位置における該蛍光像の該強度値を読み取ること、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該フローセルの各々のタイルに対する蛍光視野画像を得る該工程が：
該タイルの該変更された基準位置を基に蛍光撮影するための該フローセルを配置すること；
第一色彩の光で該タイルを照射すること；
該タイルから放出された光を捕捉すること；
該暗視野画像において相当する位置に対して該放出された光の位置を一致することによって、少なくとも一つの追加的な補正因子を決定すること；
強度値を読み取るために、少なくとも一つの追加的な補正因子を適用すること；
を含み、
ここで、該強度値が、少なくとも一つの補正因子及び少なくとも一つの追加的な補正因子によって補正されるように読み取られる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
各々のタイルに対する蛍光視野画像を取得するための該工程が：
第二色彩の光で該タイルを照射すること；
該暗視野画像において相当する位置に対して、該放出された光の位置を照合することによって、少なくとも一つ追加的な補正因子を決定すること；
強度値を読み取るために、少なくとも一つの追加的な補正因子を適用すること；
をさらに含み、ここで、
第二色彩の光で該タイルを照射することと関連した該強度値が、該少なくとも一つの補正因子及び該少なくとも一つの追加的な補正因子によって補正されるように読み取られる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該フローセルが、各列に２４タイルを有する３列を含む７２タイルで撮影されるものであって、該第一及び第二タイルが、該中心列であって、該第二タイルが、該第一タイルから少なくとも５タイル離れている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該第二タイルが、該第一タイルから少なくとも９タイル離れている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
フローセル上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）フラグメントを撮影するためのイメージャによって使用するための配列方法であって、該イメージャが、該フローセルにおける基準位置を有する各々のタイルを備えたタイル中のＤＮＡフラグメントビーズ位置における強度値を捕捉するものであって、該方法は：
第一撮影セッション中に、該イメージャによる撮影のための該フローセルを配置すること；
第一撮影セッション中に、該イメージャによって撮影するための暗視野画像を取得すること；
該第一撮影セッション中に、第一タイル内のビーズ位置の第一暗視野集団、及び、第二タイル内のビーズ位置の第二暗視野集団を同定すること；
第二撮影セッション中に、該イメージャによって撮影するために、該フローセルを再配置すること；
該第二撮影セッション中に、該第一暗視野集団に相当する該第一タイル内の第三暗視野集団、及び、該第二暗視野集団に相当する該第二タイル内の該第四暗視野集団を同定すること；
該第一オフセットのために補正するための第二撮影セッション中に、少なくとも一つの第一タイルの該基準位置を変更すること；及び
該第一及び第二オフセットの間の違いに対して補正するための該フローセルにおける該ビーズ位置の該イメージャからの強度値を読み取るための、少なくとも一つの補正因子を適用すること、を含む方法。
【請求項１０】
該基準位置を変更する該工程が、該第一撮影セッション及び該第二撮影セッションの間の該フローセルの線形オフセットのために補正する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該少なくとも一つの補正因子が、該第一撮影セッション及び該第二撮影セッションの間の該フローセルの角度オフセットのために補正する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該第二撮影セッション中に、該フローセルの各々のタイルのために、蛍光視野画像を取得すること；
該適用された少なくとも一つの補正因子によって補正されるような該暗視野画像中で同定される該ビーズ位置において、該蛍光視野画像の該強度値を読み取ること、をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
該フローセルの各々のタイルのための蛍光視野画像を取得する該工程が：
該変更された該タイルの基準位置を基にした蛍光撮影のために、該フローセルを配置すること；
第一色彩の光で該タイルを照射すること；
該暗視野画像における相当する部分に対して、該放出された光の部分を照合することによって、少なくとも一つの追加的な補正因子を決定すること；
強度値を読み取るために、該少なくとも一つの追加的な補正因子を適用すること、を含み、ここで、該強度値は、該少なくとも一つの補正因子及び該少なくとも一つの追加的な補正因子によって補正されるように読み取られる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
フローセル上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）フラグメントを撮影するためのイメージャであって、該イメージャが、該フローセル中の基準位置を有する各々のタイルとともに、タイル中のDNAフラグメントビーズ位置の強度値を捕捉するものであって、該イメージャは：
該フローセルを支持するｘｙステージ；
フローセルの画像を捕らえるために構成されたカメラ；及び
該ｘｙステージ及び該カメラに接続されたプロセッサ、を含み、
該プロセッサが、第一撮影セッション中に、該ＸＹステージを配置し、各々のタイルの暗視野画像を取得する該カメラを制御するため；
第一撮影セッション中に第一タイル内のビーズ位置の第一暗視野集団帯美第二タイル内のビーズの位置の第二暗視野集団を同定するため；
該相当する第一暗視野集団における線形オフセットに対して補正するために該ＸＹステージを配置するときに、該第二撮影セッション中に、少なくとも一つのタイルの該基準位置を変更するため；並びに、
該相当する第一及び第二暗視野集団におけるオフセットから決定される角度オフセットに対して補正するために、該フローセル中の該ビーズ位置に対して、該カメラから強度値を読み取るための少なくとも一つの補正因子を適用するため、に構成されている、該イメージャ。
【請求項１５】
該プロセッサが、該第一撮影セッション及び該第二撮影セッションの間の該フローセルの線形オフセットのために対して補正するために、該基準位置を変更する、請求項１４に記載の該イメージャ。
【請求項１６】
該プロセッサが、該第一撮影セッション及び該第二撮影セッションの間の該フローセルの角度オフセットに対して補正するために、該少なくとも一つの補正因子を適用する、請求項１５に記載の該イメージャ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年３月１５日に提出された、表題「フローセル配列方法及びシステム」の米国出願番号１３／８３２，５０９の利益に関連し、主張するものであり、その内容は、完全に及び全ての目的のために参照により本明細書に取り入れられる。
【背景技術】
【０００２】
過去２５年に渡って、産生されてジーンバンク（ＧｅｎｅＢａｎｋ）に蓄積されたＤＮＡ配列情報の量は、指数関数的に成長してきた。多くの次世代配列決定技術は、合成による配列決定（ＳＢＳ）の形態を使用し、特に、制御された方法において、チップに結合された単鎖ＤＮＡの鋳型の配列を読み取るために、デザインされたヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼが使用される。他の次世代配列決定技術は、核酸配列を決定するために、天然ヌクレオチド及び／又はポリメラーゼ、あるいは、標識されたオリゴヌクレオチド及びライゲーション酵素が使用されうる。高スループットを達成するために、各々が単独又は複数の分子である、何百万ものこのような鋳型スポットが、配列決定チップ全体に配列され、それらの配列は独立して読み取られ、記録される。高スループット配列決定を実施するという欲求は、より速く処理し、コストを下げるという要求から生じる。しかしながら、商業的な高スループットシステムは、大規模な配列決定（例えば、１０〜１００ギガ塩基）のコストを下げる一方、より小規模な配列決定（例えば、１００メガ塩基〜１ギガ塩基）では、コストがかかり、不都合なものにする。
【０００３】
近年、従来のデバイスよりも小さい規模で配列決定を実施するための装置が開発されている。より小さな規模の配列決定操作を実施するための代表的な装置や方法は、米国特許公報第２０１０／０３２３３５０（出願通し番号第１２／７１９，４６９、２０１０年３月８日提出）、第２０１０／０１５２０５０（出願通し番号第１２／７０４，８４２、２０１０年２月１２日提出）及び、第２００９／０２９８１３１（出願通し番号１２／３７０，１２５、２００９年２月１２日提出）に記載されている。前述のものは、参照によって、本明細書に取り込まれる。このような装置は、「組み立てライン」型システムを利用するものであり、単鎖ＤＮＡ鋳型を含む比較的小さい数多くのフローセルを同時に処理するために、回転台の形態に配置されてもよい。操作中、各々のフローセルは、一連の処理ステーション中を物理的に移動する。これらの処理ステーションの一部は、フローセルを一掃し、新しい試薬でそれが満たされ、一方で他のものは、フローセルを撮影するため、又は、実質的な処理を伴わないフローセルが保持された働いていないステーションとして、使用される。他の処理ステーションもまた提供されうる。これらの装置は、高スループットＳＢＳ運用を提供する一方で、試薬や他の処理コストを有意に節約することを提供する。この新世代の装置は、以前のデバイスが提供できたものよりもさらに迅速に好転し、低減したコストで、様々な目的のために使用するためのＳＢＳ操作に対して、公衆のアクセスが拡大することが期待されている。
【０００４】
配列決定装置、特に、小規模配列決定操作のための可動式フローセルを使用する装置の技術の状態を改善する必要性が引き続き存在する。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本発明は、イメージャにておいて具現化され、フローセル上のデオキシリボ核酸（DNA）フラグメントを撮影するイメージャに使用するための配列方法が開示される。該イメージャは、フローセル中の基準位置を有する各々のタイルを用いて、タイルのDNAフラグメントビーズ位置における強度値を捕捉する。
【０００６】
第一撮影セッション中、各々のタイルの暗視野画像を取得すること、第一撮影セッション中に、第一タイル内のビーズ位置の第一暗視野集団、及び、第二タイル内のビーズ位置の第二暗視野集団を同定すること、第二撮影セッション中に第一及び第二暗視野集団に相当する集団を同定すること、第二撮影セッション中に、相当する第一暗視野集団の線形オフセットに対して補正するために、少なくとも一つのタイルの基準位置を変更すること、そして、相当する第一及び第二暗視野集団のオフセットから決定される角度オフセットに対して補正するために、該フローセルにおけるビーズ位置に対して、イメージャから強度値を読み取るため、少なくとも一つの補正因子を適用ことによって、フローセルは配列されてもよい。
【０００７】
イメージャは、該フローセルを支持するｘｙステージ、フローセルタイルの画像を捕らえるために構成されたカメラ、及び該ｘｙステージ及び該カメラと結合されたプロセッサを含んでもよい。第一撮影セッション中に、各々のタイルの暗視野画像を得るためにＸＹステージを配置するため及びカメラをコントロールするため、第一撮影セッション中に第一タイル内のビーズ位置の第一暗視野集団及び第二タイル内のビーズ位置の第二暗視野集団を同定するため、第二撮影セッション中に第一及び第二暗視野集団に相当する集団を同定するため、相当する第一暗視野集団における線形オフセットに対して補正するためにＸＹステージを配置する時に第二撮影セッション中に少なくとも一つのタイルの基準位置を変更するため、並びに、相当する第一及び第二暗視野集団におけるオフセットから決定された角度のオフセットに対して補正するためのフローセルにおけるビーズ位置に対してカメラからの強度値を読み取るための少なくとも一つの補正因子を適用するために、該プロセッサが構成されてもよい。
【０００８】
同じ参照数字を有する同様な構成とともに、添付図面に関連して読まれる時、以下の詳細な記述から、本発明は最もよく理解される。複数の同様な要素が提示される場合、一つの参照番号は、特定の要素を参照する小文字記号を伴う複数の同様な要素に割り当てられうる。全体的に該要素に対して、または、非特異的な１又は数個の要素に対して言及するとき、該小文字記号は、落とされてもよい。矢印を有しない構成要素に繋がっている線は、これらの構成要素の間で両方向の交換を意味しうる。これは、共通の慣習に従って、図面の様々な特徴は、スケールが描かれていないことを強調する。逆に、様々な特徴の寸法は、明確にするために、任意に拡張され、又は、減縮される。図面に含まれるものは、以下の図である：
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の態様に従ったイメージャのブロック図である；
【図２】図２は、本発明の態様に従ったイメージャの透視図である；
【図３】図３は、図２のイメージャ内のフローセルの側面図であり、暗視野LEDライトを反射するDNAフラグメントビーズを描いている；
【図４】図４は、図２のイメージャ内のフローセルの正面図であって、フローセルを撮影するための仮想タイルを描いている；
【図５】図５は、本発明の態様に従ったフローセルを撮影するためのタイミング図である；
【図６】図６は、本発明の態様に従ったフローセルの撮影のための工程のフローチャートであって；そして、
【図７】図７は、本発明の態様に従った、タイル基準位置を変更し、DNAフラグメントビーズ位置を登録するための工程のフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の詳細な記述
図１は、本発明の一実施態様に従って、チップ１０２のフローセル上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）フラグメントのビーズ位置を撮影するためのイメージャ１００を描写する。さらに以下で詳細に述べるように、イメージャ１００は、フローセル中の基準位置を有する各々のタイルを用いて、タイル中のフローセルを撮影する。
【００１１】
トランスポート１０４とｘｙステージ１０６は、イメージャ１００によって撮影するためにチップ１０２を配置する。トランスポート１０４は、回転台又は他のタイプの搬送システムから該チップを取り除き、イメージャ１００内で撮影する目的でチップを配置するため、ｘｙステージ１０６を移動する。ｘｙステージ１０６は、個々のタイルの撮影のために、対物レンズ１０８の下の水平板に、チップ１０２を配置する。
【００１２】
イメージャ１００は、フローセル上のＤＮＡフラグメントを照射するために、１又は数個の暗視野ＬＥＤ１１０及び、少なくとも１つの蛍光ＬＥＤのバンク１１２を含んでいる。記述された実施態様において、暗視野LED１１０は、側面からチップ１０２を照射し、蛍光視野LED１１２は、レンズ１１３、励起フィルタ１１４及びダイクロイックミラー１１６を通して上部からチップ１０２を照射する。ダイクロイックミラー１１６は、１又は数個の周波数帯域における光を反射し、これらの周波数帯域（単数又は複数）ではない光は透過する。暗視野LED１１０は、赤色LEDであってもよい。蛍光視野LED１１２及び対応するフィルタ１１４は、所望の光の色でチップ１０２を照射するために選択されてもよい。
【００１３】
暗視野LED１１０がチップを照射するために使用されるとき、撮影軸１１１に沿ったフローセル中のビーズ位置によって反射される光が、対物レンズ１０８、放出フィルタ１０９、及びレンズシステム１０９を通過するように、ミラー１１６は経路から除かれてもよい。光はその後、捕捉される場所でカメラ１１８上に衝突する。蛍光視野LED１１２が使用される時、LED１１２由来の光は、フィルタ１１４を通過し、チップ１０２を向いた対物レンズ１０８を通ってミラー１１６によって反射される。ビーズ位置は、（異なる波長を有する放射される光を備えた）蛍光視野LED１１２からの光によって照射されることに反応して光を放出する。放射される光は、米国出願番号第１２／７１９，４６９に記述されるように、色素、又は、特にヌクレオチドに関連する他の組成物を蛍光させることによって産生されてもよい。放出される光は、カメラに衝突するために、対物レンズ１０８、ミラー１１６、放出フィルタ１０７及びレンズシステム１０９を通過する。カメラは、２４７２の電荷結合素子（ＣＣＤ）による３２９６であってもよい。蛍光視野ＬＥＤ１１２の一つのバンクが描かれているが、追加のLEDバンク及び対応するフィルタが、異なる色の光でチップを蛍光させるために使用されてもよい。例えば、４つの異なる光が産生されてもよく、例えば、青、緑、黄、及び赤である。
【００１４】
プロセッサ１２０は、チップの配置及びチップ上のフローセルの撮影を制御するために、様々な構成要素と結合される。メモリ１１２はプロセッサ１２０と結合される。プロセッサ１２０は、本明細書中で記載される１又は数個の工程を実施するための撮影システム１００を制御してもよい。メモリは、プロセッサ１２０によって実施され、本明細書中で記載される１又は数個の工程が実施される時、指示が保存される非一時的なコンピュータ可読媒体である。加えて、メモリは、撮影中に得られたビーズ位置の強度値のような、カメラ１１８からの画像情報を保存しうる。
【００１５】
図２は、さらに詳細に、チップ１０２上のｘｙステージ１０６を描いている撮影システム１００の透視図である。チップ１０２は、ＤＮＡフラグメントを含むフローセル２００を含む。ｘｙステージ１０６は、ｘステージ２０２及び対応するコントローラ２０４及びｙステージ２０６及び対応するコントローラ２０８を含む。プロセッサ１２０（図１）は、ｘコントローラ２０４とｙコントローラ２０８に結合している。プロセッサ１２０は、撮影軸１１１に対して垂直な第一軸（本明細書中では、ｘ軸として記載）に沿ったｘステージ２００（及びそれに沿ったフローセル）を移動するためにｘコントローラ２０４を制御する。プロセッサ１２０は、追加で、撮影軸１１１及び第一軸に垂直な第二軸（本明細書中では、ｙ軸として記載）に沿ってｙステージ２０６を移動するために、ｙコントローラ２０８を制御する。
【００１６】
図３は、暗視野ＬＥＤ１１０によって照射されているチップ１０２を斜めに切った一部を示す。フローセル２００は、ＤＮＡフラグメントをその上に載せたものを含んだ透明層３００を含む。透明層３００はガラスであってもよい。ＤＮＡフラグメントは、カメラ１１８に向けて、対物レンズ１０８を通して暗視野ＬＥＤ１１０からの光を反射し（図１）、それがその位置を同定する。ＤＮＡフラグメントのこれらの位置は、本明細書中では、ビーズ位置として言及される。実際の使用において、タイルごとに、より多くの状態のマグニチュードのビーズ位置が存在するであろうが、図３では、４つのビーズの位置を記述する（３０２ａ、ｂ、ｃ、ｄ）。実施態様において、ビーズ照射発生角度が変化しないように、対物レンズ１０８と暗視野ＬＥＤ１１２は、ｘｙ平面に定置する。
【００１７】
図４は、チップ１０２の平面図を示す。チップは、フローセル２００を含む。撮影する間、フローセル２００は、タイル４００において撮影される。記載された実施態様において、フローセル２００は、７２タイルを使用して撮影される（２４タイルの３列）。各々のタイルが、チップ上のタイルの位置に対応する基準位置を有する。以下でさらに記載されるように、少なくとも２つのタイル、例えば、タイプ４００ａ及び４００ｂ、が、撮影する間に、フローセル２００を配置する場合、及び、フローセル２００内の個々のタイル４００に対して捕らえられる画像強度を登録する場合に使用するために選択されてもよい。少なくとも２つのタイルは、フローセル中において、実質的にどこに配置されてもよい。実施態様において、タイルは、中心列、及び、他から少なくとも５タイル離れている、例えば、他から９タイル離れている。
【００１８】
各々のタイル内のビーズ位置の基準集団、例えば、４０２a及び４０２ｂは、配列及び登録の目的のために使用されてもよい。一実施態様において、一つの基準集団４０２aは、フローセルがイメージャ１００から取り除かれて、その次の撮影セッションに向けて戻して加えられるとき、タイル基準位置のオフセットを決定するために使用される。２又は数個の基準集団が他の実施態様で使用されてもよい。加えて、２つの集団に対するオフセットの違いは、強度値を読み取るときに、ビーズ位置の角度調整を計算するために使用されてもよい。
【００１９】
図５は、タイミング図５００を示し、図６は、本発明の態様に従ったフローセルを撮影するためのフローチャート６００を示す。タイミング図及びフローチャートは、図１〜４に関して記述されているが、本明細書中に記載される工程を実施するための他の最適な装置は、本明細書の記述から当業者によって理解されるものであり、また、本発明の範囲内で考慮されるものである。加えて、本明細書に記載される１又は数個の工程は、本発明の精神及び範囲から逸脱しない限り、省略されたり、異なる方法にて実施されてもよい。フローセル中の全てのタイルを撮影するための全時間は、６分のオーダーであってもよい。
【００２０】
工程６０２において、フローセル（FC）は、回転台等のフローセルキャリアから持ち上げられる。フローセルは、配列を撮影する間に、撮影するためのイメージャ１００の対物レンズの下の位置に対して、トランスポート１０４によって持ち上げられる。撮影するためにフローセルをキャリアからイメージャ１００へ動かすための運搬に、約７秒かかってもよい。
【００２１】
ブロック６０４において、フローセルはイメージャ内に配列される。フローセルがイメージャ内に配置されることが初めてであれば、第一タイルの暗視野画像、例えばタイル４００ａ、及び第二タイル、例えば４００ｂ、が得られ、そして、各々の画像におけるビーズ部分集合（ｓｕｂｓｅｔ）が同定される（本明細書中では、集団と述べる；：例えば、集団４０２ａ及び４０２ｂ）。その後、続く撮影セッションにおいて、第一タイル及び第二タイルの暗視野画像が得られ、一致する集団を同定して、位置において相当する違いを決定するために、現在のセッションの暗視野画像が、第一撮影セッションの暗視野画像と比較される。加えて、全てのタイルに対する暗視野画像は、このステージで得られてもよい。ステージを配列し、暗視野画像を得ることは、約２９秒又はそれ以上かかってもよい。
【００２２】
ブロック６０６において、フィルタとミラーは、蛍光視野撮影のために配置される。プロセッサ１０２は、フィルタ１１４とミラー１１６の配置を制御してもよく、例えば、追加の搬送装置（図示しない）であってもよい。フィルとミラーを動かすために約４秒かかってもよい。
【００２３】
ブロック６０８において、フローセルは、特別なタイル、例えば、タイル４００の上部左手隅に位置するタイル０、を撮影するために配置される（図４）。ブロック６０４にて変更されるような所望のタイルに相当する基準位置へフローセルを動かすために、プロセッサ１０２は、ｘコントローラ２０４とｙコントローラ２０８の使用を通して撮影するためにフローセルを配置してもよい（図２）。第一タイルにフローセルを配置するのに約７秒間かかってもよい。その後、撮影されるべき隣のタイルへ移動するために０．５秒かかってもよい。
【００２４】
ブロック６１０において、撮影システム１００は、カメラの上のフローセルタイルの鮮明な像を作るために、オートフォーカスする（ＡＴＦ）。プロセッサ１２０は、撮影軸１１１に沿って、カメラ１１８、対物レンズ１０８、又はチップ１０２の位置を調節することによって（例えば、トランスポート１０４を介して（図１））、オートフォーカスを実施してもよい。オートフォーカスを実施するのに、約０．２５秒かかってもよい。
【００２５】
ブロック６１２において、蛍光ＬＥＤが点灯される。プロセッサ１２０は、蛍光ＬＥＤ１１２を点灯してもよい。ＬＥＤ１１２を点灯するのに、約１２０ミリ秒かかってもよい。
【００２６】
ブロック６１４において、カメラが起動（ｔｒｉｇｇｅｒ）（スナップ（ｓｎａｐ）され、ブロック６１６において、撮影システムは同期される。カメラ１１８を用いて画像を撮り、それ自身を同期するために、プロセッサ１２０は、カメラ１１８を起動してもよい。カメラ１１８を起動することが約１１０ミリ秒、及び、同期するためには約２００ミリ秒かかってもよい。
【００２７】
ブロック６１８において、カメラは、フローセルタイルからの蛍光を撮影する（露光時間）。カメラ１１８は、フローセルからの光が捕らえられるまでの間、３５０ミリ秒の露光時間を有していてもよい。
【００２８】
ブロック６２０において、オプションの変換工程は、１次（１Ｄ）配列を２次（２Ｄ）配列へと画像を変換することを実施する。プロセッサ１２０は、変換を実施してもよい。この工程は、プログラミング変換として実施されてもよく、省略されてもよい。変換を実施することは、約４３ミリ秒かかってもよい。
【００２９】
ブロック６２２において、決定は、処理されるタイルに関して行われる。もし、処理するべき追加のタイルがある場合、隣のタイルと共にブロック６０８にて処理が実施され、並行して、現在のタイルから補足された光をさらに処理するとともにブロック６２４において処理が実施される。もし、追加のタイルがなければ、処理は、ブロック６２４でのみ実施される。
【００３０】
ブロック６２４において、画像は、カメラからダウンロードされる。プロセッサ１２０は、カメラ１１９由来の画像を、例えば、プロセッサを伴ったランダムアクセスメモリ（RAM）へダウンロードしてもよい。画像をダウンロードすることは、約７００ミリ秒かかってもよい。
【００３１】
ブロック６２６において、ダウンロードした画像の後処理が実施される。プロセッサ１２０は処理を実施し、その結果をメモリ１２２に保存する。後処理は、ブロック６０４にて決定されたオフセットを基にして調節されるような、暗視野画像から決定されたビーズ位置とともに捕らえられた画像の登録を含んでもよい。ビーズ位置を有する画像を登録することは、約３６５ミリ秒かかってもよく、例えば、メモリ１２２での保存のために画素を抽出することは、約２５ミリ秒かかってもよい。
【００３２】
図７は、本発明の態様に従ったさらなる詳細において、フローセルの配列、及び、捕らえられた画像の登録を記述する工程のフローチャート７００を示す。フローチャート７００は、図１〜４に関して記述されているが、本明細書中で記述された工程を実施するための他の適切な装置は、本明細書の記述から当業者によって理解され、また、本発明の範囲内で考慮される。加えて、本明細書中に記載される１又は数個の工程は、本発明の精神又は範囲から逸脱しなければ、省略されてもよく、又は、異なる方法で実施されてもよい。
【００３３】
ブロック７０２において、フローセルは、第一撮影セッションのために配置される。チップ１０２上のフローセル２００は、第一撮影セッション中に撮影するために、プロセッサ１２０の制御の下、イメージャ１００の対物レンズの下の位置へ、トランスポート１０４によって持ち上げられてもよい。
【００３４】
ブロック７０４において、暗視野画像が得られ、撮影されるフローセルにおける各々のタイルに対して強度値が読み取られる。一実施態様において、フローセル２００内の２つの基準タイル４００に対して最初に得られ、そして、全タイル４００のための暗視野画像が、続いて得られる。他の実施態様において、全てのタイル４００に対する暗視野画像が、２つの基準タイルに対して他の暗視野画像を別々に得ることなく、最初に得られる。
【００３５】
各々のタイル４００に対する暗視野画像は、プロセッサ１２０の制御の下、ｘｙステージ１０６を使用して第一タイルと関連した第一基準位置へフローセル２００を移動すること、暗視野LED１１０を用いてフローセル２００の側部を照射すること、カメラ１１８を用いてDNAフラグメントによって反射された光を捕捉すること、そして、メモリ１２２に（DNAフラグメントビーズ位置の位置を代表する比較的高い強度値と共に）強度値を保存すること、によって得られてもよい。フローセル内のその後のタイルは、その後、各々のこれらのタイルに関連する各々の基準位置に繰り返してフローセルを移動すること、及び、捕捉する工程を繰り返すことによって撮影されてもよい。各々のフローセルの第一撮影セッション中、タイルに対する基準位置は、標準とする流体幾何学及びｘｙステージ１０６を基に確立された名目上の位置であってもよい。例えば、ｘｙステージ１０６は、ｘ及びｙ移動範囲の限界において、「ホーム」位置にて開始されてもよく、各々の名目上の位置は、対物レンズ１０８の直下の各々のタイルの中心に配置されることが期待されるホーム位置からの、ｘ及びｙの距離として予め決定されてもよい。この例において、タイル０は、ｘ０がホームｘの位置からの距離、及び、ｙ０がホームｙの位置からの距離である（ｘ０、ｙ０）とする探索テーブルに保存された名目上の位置を有するものであってもよく、各々の他のタイルは、同様の方法で保存された独自の名目上の位置を有してもよい（距離は、距離、モータ運動増加等として測定されてもよい）。
【００３６】
ブロック７０６において、ビーズ位置が決定される。比較的高い強度値を有する暗視野画像内の位置は、フローセル内のビーズ位置を表す。ビーズ位置（ＤＮＡフラグメントの位置を示している）は、プロセッサ１２０を用いて暗視野画像から強度値を解析すること、及び、ビーズの存在を示す値を超える強度値を有するものを選択することによって決定されてもよい。各々のビーズが、暗視野画像中に配置された後、ビーズのｘ及びｙの位置が保存され、期待されたビーズ位置としての後の撮影する工程で使用される。例えば、各々のビーズに相当するｘ、ｙ位置の配列は、各々のタイルに対して保存されてもよい。ｘ及びｙ位置の観点から同定されたビーズ位置を有しているので、フル解像度の画像そのものは、選択的に放棄されうる。
【００３７】
ブロック７０８において、暗視野基準集団は、少なくとも２つのタイル内で同定される。実施態様において、プロセッサ１２０は、２つの暗視野基準集団、−第一タイル内の第一暗視野基準集団及び第二タイル内の第二暗視野基準集団、を同定する。各々の暗視野基準集団は、各々のタイルの少なくとも一部内に位置する同定されたビーズ位置を含む。実施態様において、タイルの暗視野基準集団は、タイルの中心の約５００×５００ピクセル領域におけるビーズ位置である。暗視野基準集団は、暗視野基準集団が２つの基準タイルに対して得られた場合（つまり、工程７０４）、又は、別々に撮影する工程において同定されてもよい場合、決定されてもよい。
【００３８】
ブロック７１０において、蛍光視野画像は、撮影されるフローセルの各々のタイルに関して得られる。実施態様において、蛍光視野画像は、ｘｙステージ１０６を使用して第一タイルに関連した第一名目上の基準位置に対してフローセル２００を動かすこと、フィルタした蛍光視野ＬＥＤ１１２にてフローセル２００を照射すること、及び、カメラ１１８でＤＮＡフラグメントによって放射された光を捕らえることによって、得られる。フローセル内のその後のタイルは、その後、各々のこれらのタイルに関連する各々の名目上の基準位置にフローセルを繰り返し動かし、そして、捕捉工程を繰りかえすことによって撮影されてもよい。
【００３９】
ブロック７１２において、補正因子（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ）は決定されて、適用される。プロセッサ１２０は、補正因子を決定してもよく、補正されたビーズ位置を得るために暗視野画像から期待されたビーズ位置に対してそれらを適用してもよい。
【００４０】
個々のタイルを撮影するためにｘｙステージがフローセルを動かすので、物理的動作によってエラーが導入されうる。オフセットを決定するための同じタイルの暗視野画像と、各々のタイルの蛍光視野画像の中心の周辺のテスト領域を比較するためにソフトウエアを使用し、そして、ビーズ位置における強度値を読み取る時に補正因子にオフセットを取り入れて、このエラーが調整されてもよい。テスト領域は、蛍光視野タイル像の中心にて５００×５００ピクセルであってもよい。工程は、暗視野撮影工程にて決定されたｘ、ｙビーズ位置の数字を同定すること、及び、総強度値を得るための５００×５００ピクセル蛍光視野テスト領域中の同じ領域の強度を集計することによって行われてもよい。次に、５００×５００ピクセル蛍光視野テスト領域は、ｘ及びｙ方向における所定の量、例えば、＋／−１０ピクセル繰り返し移動され、ｘ及びｙビーズ位置における強度がもう一度測定され、各々の反復のために合計される。最後に、テスト領域は、ビーズから放出された蛍光の強度が、暗視野撮影工程において同定されたｘ、ｙビーズ位置と重なる場所まで移動され、強度の合計はピーク値に達する。この場所において、オフセットは、ピーク強度を得るために必要とされる及びｙ移動距離として決定される。これらのｘ及びｙ値は、蛍光視野タイル像データを移動するための補正因子として使用され、これらにより、暗視野画像由来のビーズ位置を用いて全体の蛍光視野画像に渡って強度を配置する。
【００４１】
追加的な補正因子が決定されてもよい。これらの他の因子は、例えば、「針山（ｐｉｎｃｕｓｈｉｏｎ）」補正（暗視野ＬＥＤと比較して特定の波長の異なる回折角を説明するための補正）、レンズ異常として知られる所定の歪み補正、等、を含んでもよい。
【００４２】
ブロック７１４において、補正されたビーズ位置におけるタイルに対する補正された暗視野画像の強度値が読み取られる。プロセッサ１２０は、補正されたビーズ位置における強度値を読み取ってもよい。
【００４３】
他の色彩に対する蛍光視野画像が決定されるべき場合、工程は、各々の追加の色彩に対して、繰り返えされる工程７１０〜７１４をブロック７１０へ戻してもよい。フローセルは、その後、撮影ステーションから取り除かれる。
【００４４】
ブロック７１６において、フローセルは、第二撮影セッションに向けて再配置される。チップ１０２上のフローセル２００は、第二撮影セッション中、撮影に向けて、イメージャ１００の対物レンズ１０８の下の位置へ、トランスポート１０４によって上昇されてもよい。
【００４５】
ブロック７１８において、第一撮影セッション（ブロック７０８）中に、フローセルのために同定される暗視野基準集団に相当暗視野集団が決定される。実施態様において、プロセッサ１２０は、第一撮影セッション中に同定される暗視野基準集団に相当する２つの暗視野集団、第一タイル中の第一暗視野集団及び第二タイル中の第二暗視野集団、を同定する。そうするために、ｘｙステージ１０６は、集団が発見される、２つのタイルの各々に対する名目上のタイル位置へフローセル２００を移動して、各々の暗視野画像をとらえる。各々のタイル中の暗視野集団は、タイルの幾何学的中心にて５００×５００ピクセル内に配置されたビーズの位置であってもよい。
【００４６】
ブロック７２０において、第二撮影セッションにおける暗視野集団及び第一撮影セッション中のける暗視野基準集団の間のオフセットが決定される。タイルに対する集団の間のオフセットは、所定の量、例えば、ｘ及びｙ方向における＋／−  １０ピクセルによって、第二撮影セッション中の暗視野集団を複数回移動し、元の参照集団中で見出されるビーズ位置に一致するｘ、ｙ位置の暗視野画像の強度を評価することによって、決定されてもよい。オフセットは、オフセットを繰り返す期待されたビーズ位置にて、最大強度を生じる移動反復を用いて、各々の移動の反復における暗視野基準集団から決定される、期待されたｘ、ｙビーズ位置における暗視野画像の強度を総計することによって、決定されうる。これは、工程７１２にて上述されたように、本質的には同様のプロセスであってもよい。
【００４７】
一実施態様において、一つの暗視野集団は、一つの参照集団と比較され、該２つの間のオフセットが、その後の撮影のためにフローセルが再配置された時、導入されるｘ及び／又はｙ方向におけるフローセルの直線オフセットを確立するために使用されてもよい。実施態様において、第二の参照として第二集団を使用する場合、該システムは、フローセルがその後の撮影のために再配置されたときに、導入された角度のオフセットも計算できる。例えば、撮影ステーションの各々のその後の配置において、第一集団４０２aの新しい位置が決定されてもよく、第一オフセット参照ポイントとして使用されてもよく、第二集団４０２ｂの新しい位置が決定されてもよく、第二オフセット参照ポイントとして使用されてもよい。元の集団の位置に対して、第一および第二オフセット参照ポイントを比較することによって、フローセルの合計ｘ、ｙオフセット及び角度回転が決定される。
【００４８】
ブロック７２２において、タイルに対する新しい基準位置は、撮影の第一ラウンドにおけるその位置と比較した時、フローセルの位置における任意の移動のために調整するために計算される。一実施態様において、プロセッサ１２０は、工程７０４で使用された各々の名目上のタイルの中心位置に対する幾何学補正因子を算出するために、一つの参照集団よりｘ、ｙオフセットを使用する。例えば、工程７１８で見出される集団が、参照された集団一から、＋５０ｘピクセル及び＋１００ｙピクセルオフセットされた時、各々の名目上の中心位置は、相当する−５０ｘ及び−１００ｙピクセルを相殺（オフセット）され、そして、さらなる撮影工程のための対物レンズの下に、直接（又は、ほとんと直接）各々のタイルの中心に配置するためにこれらの再度計算された位置まで、ｘｙステージが移動されうる。
【００４９】
他の実施態様において、プロセッサ１２０は、工程７０４で使用された、各々の名目上のタイル中心位置のために、幾何学補正値を計算するために、２つの参照集団からｘ、ｙオフセットを使用する。この場合、プロセッサ１２０は、対物レンズ１０８の下の各々のタイルの中心に正確に配置するために、各々の名目上のタイルの中心位置に対して、ｘ、ｙ及び角度補正因子を計算してもよい。フローセルの形状は、撮影システムへの連続した訪問の間では一定のままで有り、それ故、幾何学的補正因子の計算は、本明細書で記述される必要の無い基本的な幾何学の事柄（ｍａｔｔｅｒ）である。この工程は、先行の実施態様におけるような、ｘ、ｙオフセットを単に使用することより、より正確であることが期待されているが、第二集団を評価するためにより大きな処理時間のコストがかかる。先行の実施態様のように、新しい基準位置は、以下の工程のために、対物レンズ１０８の下で直接的（又は、ほぼ直接的に）各々のタイルの中心へ配置するために、ｘｙステージ１９０６を動かすために使用される。
【００５０】
ブロック７２４において、蛍光視野画像は、次の撮影セッション中に各々のタイルに対して得られる。蛍光視野は、ブロック７２２にて変えられたように、基準位置を使用してブロック７１０に関して上述されるように、決定されてもよい。
【００５１】
ブロック７２６において、補正因子（単数又は複数）は、蛍光視野画像に対して適用される。工程７２６において適用される補正因子は、ブロック７１２に関して上に記載されたように補正を含んでもよい（例えば、暗視野画像、針差し（ｐｉｎｃｕｓｈｉｏｎ）及び歪み補正等を一致するための画像を登録すること）。加えて、補正因子は、工程７２０に同定される任意の角度のオフセットを補正するための蛍光視野画像を回転するために適用されてもよい。補正に引き続き、蛍光視野タイル画像は、ｘ、ｙ方向にて適切に移動され、各々のタイルに対する元の暗視野撮影工程から決定されたビーズのｘ、ｙ位置に対して照射された場所及び領域を一致するために回転してもよい。
【００５２】
ブロック７２８において、補正されたビーズ位置における強度値は読み取られる。プロセッサ１２０は、補正されたビーズ位置において、強度値を読み取ってもよい。
【００５３】
他の色彩に対する蛍光視野画像が決定される場合、処理は、各々の追加の色彩に対して繰り返される工程７２４〜７２８を、ブロック７２４へ戻しても良い。フローセルは、その後、撮影ステーションより取り除かれる。フローセルが、さらに処理した後、追加の時間、撮影されるとき、処理は、ブロック７１６にて再開してもよい。
【００５４】
本発明の実施態様は、撮影システムに繰り返して載せる及び下ろす複数のフローセルを使用する、合成によって配列決定する（ＳＢＳ）装置に関連する重要な問題を解決することを助けるために使用されうることは、前述の例から認識されうる。その性質より、ＳＢＳ工程は、それらが配列を加える時、正確にヌクレオチドを同定するためには、正確に同じヌクレオチド鎖の繰り返した試験を必要とする。従来のシステムでは、固定されたフローセルが使用される。このようなシステムは、フローセルとカメラの間に非常に小さな自由な遊びを有し、それで、各々の連続した撮影工程の間、ほとんど正確に同じ位置において、カメラを配置することが比較的簡単である。反対に、撮影プラットフォーム上に繰り返して載せたり下ろしたりするフローセルを使用するシステムにおいては、自由な遊びがありすぎる。このようなデバイスでの自由な遊びは、載せる及び下ろす工程を自動化するために必要な間隙、一つのフローセルと隣等の間に作り出すばらつき等に由来する可能性がある。これらのシステムにおいて、撮影システムに連続的に訪れる間、正確に同じ場所にフローセルを適切に整列させることは非常に困難であることが見出されている。調べられているビーズが、直径、数百ミクロ（又は、それより小さい）しかないので、誤整列のわずかな量でさえ、連続し撮影工程から得られたデータの補正を不可能にする、デバイスを潜在的に役に立たなくする。上記の工程及びその変形は、この問題を克服するために使用され、可動式フローセルを使用するＳＢＳ装置において、迅速な化合取得及び処理を提供する。
【００５５】
発明は、特定の実施態様に関して、本明細書中に説明され、記載されているが、本発明は、詳細に示されるものへ限定される意図ではない。むしろ、クレームの同等の範囲（ｓｃｏｐｅ）及び射程（ｒａｎｇｅ）内であって、本発明から逸脱することなく、様々な変更が、細部において成されうる。
【図１】
2016513459.tif 000003
【図２】
2016513459.tif 000004
【図３】
2016513459.tif 000005
【図４】
2016513459.tif 000006
【図５】
2016513459.tif 000007
【図６】
2016513459.tif 000008
【図７】
2016513459.tif 000009
【国際調査報告】
2016513459.tif 000010