(57)【要約】本発明は、インビボおよび／またはインサイチュで核酸を分解するための好熱性ヌクレアーゼの使用に関し、好熱性ヌクレアーゼは宿主細胞にとって異種であり、外因的に加えられるのではなく宿主によって産生される。本発明はさらに、上記の方法に従って作製された遺伝子改変細胞に関する。本発明は、特に、バイオマスまたはバイオマス由来の製品中の組換えＤＮＡの生物活性の不活性化において有益である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
好熱性ヌクレアーゼ遺伝子をコードする異種核酸配列を含む遺伝子改変細胞であって、前記細胞が通常増殖する温度において、前記好熱性ヌクレアーゼ遺伝子によって産生される好熱性ヌクレアーゼが潜在性であり、前記遺伝子改変細胞が１つまたは複数の最終産物を産生し、前記１つまたは複数の最終産物が前記好熱性ヌクレアーゼではない、遺伝子改変細胞。
【請求項２】
前記ヌクレアーゼがＤＮＡ分解性ヌクレアーゼである、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記ヌクレアーゼがＲＮＡ分解性ヌクレアーゼである、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
前記ＤＮＡ分解性ヌクレアーゼがＴａｑＩヌクレアーゼである、請求項２に記載の細胞。
【請求項５】
前記ＤＮＡ分解性ヌクレアーゼがＰｈｏＩヌクレアーゼである、請求項２に記載の細胞。
【請求項６】
前記遺伝子改変細胞が植物に由来する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
前記遺伝子改変細胞が動物に由来する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８】
前記遺伝子改変細胞が微生物に由来する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９】
前記微生物が、酵母、真菌、藻類、細菌、および古細菌からなる群から選択される、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記微生物が、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、モルチエレラ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、クリプテコディニウム属（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、およびトラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）からなる群から選択される、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種がヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
前記最終産物が、フィトエン、リコペン、ベータ−カロテン、アルファ−カロテン、ベータ−クリプトキサンチン、ルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、アドニルビン、ビオラキサンチン、アドニキサンチン、ユビキノン、ビタミンＫ、ビタミンＥ、レチノール、レチナール、レチノイン酸、パルミチン酸レチニル、およびこれらの修飾形態からなる群から選択される、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記好熱性ヌクレアーゼの前記遺伝子が、宿主細胞のコドン使用頻度バイアスに適合するようにコドン最適化される、請求項１に記載の細胞。
【請求項１４】
前記ＴａｑＩヌクレアーゼが、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項４に記載の細胞。
【請求項１５】
前記ＰｈｏＩヌクレアーゼが、配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項５に記載の細胞。
【請求項１６】
前記最終産物の前記産生が、前記異種核酸配列を含有しない細胞からの前記最終産物の産生と比較してほとんどまたは全く変化しない、請求項１に記載の細胞。
【請求項１７】
前記細胞が２つ以上の好熱性ヌクレアーゼ遺伝子の組み合わせを含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項１８】
好熱性ヌクレアーゼ遺伝子をコードする異種核酸配列を含む宿主細胞の核酸をインビボおよび／またはインサイチュで分解するための方法であって、
ａ）好熱性ヌクレアーゼが潜在性である温度で前記宿主細胞を増殖させるステップと、
ｂ）ステップ（ａ）の前記温度を前記好熱性ヌクレアーゼが活性である温度に変化させることによって、前記宿主細胞の前記核酸を分解するステップと
を含む方法。
【請求項１９】
前記ヌクレアーゼがＤＮＡ分解性ヌクレアーゼであり、前記核酸がＤＮＡである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記宿主細胞のＤＮＡが組換えＤＮＡを含有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヌクレアーゼがＲＮＡ分解性ヌクレアーゼであり、前記核酸がＲＮＡである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ａ）の前記温度が前記宿主細胞の増殖にとって最適である、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記分解が、前記好熱性ヌクレアーゼの前記最適温度の約±５℃の範囲内である温度で実行される、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記分解が、前記好熱性ヌクレアーゼの活性にとって最適である温度で実行される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記分解が、前記宿主細胞の低温殺菌の間に実行される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記分解が、４０℃〜１００℃の温度範囲内で実行される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＤＮＡ分解性ヌクレアーゼがＴａｑＩヌクレアーゼである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記分解が約６０℃〜約７０℃の範囲の温度で実行される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記分解が６５℃で実行される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＤＮＡ分解性ヌクレアーゼがＰｈｏＩヌクレアーゼである、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
前記分解が約７０℃〜約８０℃の範囲の温度で実行される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記分解が７５℃で実行される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記宿主細胞が植物に由来する、請求項１８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記宿主細胞が動物に由来する、請求項１８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記宿主細胞が微生物に由来する、請求項１８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記微生物が、酵母、真菌、藻類、細菌、および古細菌からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記微生物が、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、モルチエレラ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、クリプテコディニウム属（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、およびトラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種がヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記好熱性ヌクレアーゼの前記遺伝子が、前記宿主細胞のコドン使用頻度バイアスに適合するようにコドン最適化される、請求項１８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＴａｑＩヌクレアーゼが、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＰｈｏＩヌクレアーゼが、配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項４２】
前記宿主細胞に２つ以上の好熱性ヌクレアーゼ遺伝子が導入される、請求項１８に記載の方法。
【請求項４３】
前記組換えＤＮＡが、前記好熱性ヌクレアーゼの付加的な部位を含むように最適化される、請求項２０に記載の方法。
【請求項４４】
前記組換えＤＮＡが、５００以下のヌクレオチドにつき１つの切断部位を含むように最適化される、請求項２０に記載の方法。
【請求項４５】
宿主細胞の核酸をインビボおよび／またはインサイチュで分解するための好熱性ヌクレアーゼの使用であって、前記好熱性ヌクレアーゼが前記宿主細胞にとって異種である使用。
【請求項４６】
前記ヌクレアーゼがＤＮＡ分解性ヌクレアーゼであり、前記核酸がＤＮＡである、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
前記宿主細胞のＤＮＡが組換えＤＮＡを含有する、請求項４６に記載の使用。
【請求項４８】
前記ヌクレアーゼがＲＮＡ分解性ヌクレアーゼであり、前記核酸がＲＮＡである、請求項４５に記載の使用。
【請求項４９】
前記分解が、前記好熱性ヌクレアーゼの最適温度の約±５℃の範囲内である温度で実行される、請求項４５〜４８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５０】
前記分解が、前記好熱性ヌクレアーゼの活性にとって最適である温度で実行される、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
前記分解が、前記宿主細胞の低温殺菌の間に実行される、請求項４５〜４８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５２】
前記分解が、４０℃〜１００℃の温度範囲内で実行される、請求項４５〜４８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５３】
前記ＤＮＡ分解性ヌクレアーゼがＴａｑＩヌクレアーゼである、請求項４６に記載の使用。
【請求項５４】
前記分解が約６０℃〜約７０℃の温度で実行される、請求項５３に記載の使用。
【請求項５５】
前記分解が６５℃で実行される、請求項５４に記載の使用。
【請求項５６】
前記ＤＮＡ分解性ヌクレアーゼがＰｈｏＩヌクレアーゼである、請求項４６に記載の使用。
【請求項５７】
前記分解が約７０℃〜約８０℃の範囲の温度で実行される、請求項５６に記載の使用。
【請求項５８】
前記分解が７５℃で実行される、請求項５７に記載の使用。
【請求項５９】
前記宿主細胞が植物に由来する、請求項４５〜５８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６０】
前記宿主細胞が動物に由来する、請求項４５〜５８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６１】
前記宿主細胞が微生物に由来する、請求項４５〜５８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６２】
前記微生物が、酵母、真菌、藻類、細菌、および古細菌からなる群から選択される、請求項６１に記載の使用。
【請求項６３】
前記微生物が、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、モルチエレラ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、クリプテコディニウム属（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、およびトラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）からなる群から選択される、請求項６２に記載の使用。
【請求項６４】
ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種がヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、請求項６３に記載の使用。
【請求項６５】
前記好熱性ヌクレアーゼの遺伝子が、前記宿主細胞のコドン使用頻度バイアスに適合するようにコドン最適化される、請求項４５に記載の使用。
【請求項６６】
前記ＴａｑＩヌクレアーゼが、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項５３に記載の使用。
【請求項６７】
前記ＴａｑＩヌクレアーゼが、配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項５６に記載の使用。
【請求項６８】
前記好熱性ヌクレアーゼが２つ以上の好熱性ヌクレアーゼの組み合わせである、請求項４５に記載の使用。
【請求項６９】
前記組換えＤＮＡが、前記好熱性ヌクレアーゼの付加的な部位を含むように最適化される、請求項４７に記載の使用。
【請求項７０】
前記組換えＤＮＡが、５００以下のヌクレオチドにつき１つの切断部位を含むように最適化される、請求項４７に記載の使用。
【請求項７１】
活性核酸分子を含まないバイオマス産物の製造プロセスであって、前記バイオマス産物が、好熱性ヌクレアーゼ遺伝子をコードする異種核酸配列を含む宿主細胞の産物であり、前記プロセスが、
ａ）好熱性ヌクレアーゼが潜在性である温度で前記宿主細胞を発酵させるステップと、
ｂ）ステップ（ａ）の前記温度を前記好熱性ヌクレアーゼが活性である温度に変化させることによって、前記細胞の核酸を分解するステップと、
ｃ）前記バイオマス産物を回収するステップと、
を含み、ステップｂ）およびステップｃ）を実施する順序が交換され得るプロセス。
【請求項７２】
前記ヌクレアーゼがＤＮＡ分解性ヌクレアーゼであり、前記核酸がＤＮＡである、請求項７１に記載のプロセス。
【請求項７３】
前記宿主細胞のＤＮＡが組換えＤＮＡを含有する、請求項７２に記載のプロセス。
【請求項７４】
前記ヌクレアーゼがＲＮＡ分解性ヌクレアーゼであり、前記核酸がＲＮＡである、請求項７１に記載のプロセス。
【請求項７５】
ステップ（ａ）の前記温度が前記宿主細胞の増殖にとって最適である、請求項７１〜７４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７６】
前記分解が、前記好熱性ヌクレアーゼの前記最適温度の約±５℃の範囲内である温度で実行される、請求項７１〜７４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７７】
ステップ（ａ）の前記温度が、前記好熱性ヌクレアーゼの活性にとって最適である温度に変化される、請求項７６に記載のプロセス。
【請求項７８】
前記分解が、前記バイオマスの低温殺菌の間に実行される、請求項７１に記載のプロセス。
【請求項７９】
前記分解が、４０℃〜１００℃の温度範囲内で実行される、請求項７１に記載のプロセス。
【請求項８０】
前記ＤＮＡ分解性ヌクレアーゼがＴａｑＩヌクレアーゼである、請求項７２に記載のプロセス。
【請求項８１】
前記分解が約６０℃〜約７０℃の範囲の温度で実行される、請求項７７に記載のプロセス。
【請求項８２】
前記分解が６５℃で実行される、請求項８１に記載のプロセス。
【請求項８３】
前記ＤＮＡ分解性ヌクレアーゼがＰｈｏＩヌクレアーゼである、請求項７２に記載のプロセス。
【請求項８４】
前記分解が約７０℃〜約８０℃の範囲の温度で実行される、請求項８３に記載のプロセス。
【請求項８５】
前記分解が７５℃で実行される、請求項８４に記載のプロセス。
【請求項８６】
前記宿主細胞が植物に由来する、請求項７１〜８５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項８７】
前記宿主細胞が動物に由来する、請求項７１〜８５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項８８】
前記宿主細胞が微生物に由来する、請求項７１〜８５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項８９】
前記微生物が、酵母、真菌、藻類、細菌、および古細菌からなる群から選択される、請求項８８に記載のプロセス。
【請求項９０】
前記微生物が、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、モルチエレラ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、クリプテコディニウム属（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、およびトラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）からなる群から選択される、請求項８９に記載のプロセス。
【請求項９１】
ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種がヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、請求項９０に記載のプロセス。
【請求項９２】
前記好熱性ヌクレアーゼの遺伝子が、前記宿主細胞のコドン使用頻度バイアスに適合するようにコドン最適化される、請求項７１に記載のプロセス。
【請求項９３】
前記ＴａｑＩヌクレアーゼが、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項８０に記載のプロセス。
【請求項９４】
前記ＰｈｏＩヌクレアーゼが、配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項８３に記載のプロセス。
【請求項９５】
前記宿主細胞に２つ以上の好熱性ヌクレアーゼ遺伝子が導入される、請求項７１に記載のプロセス。
【請求項９６】
前記組換えＤＮＡが、前記好熱性ヌクレアーゼの付加的な部位を含むように最適化される、請求項７２に記載のプロセス。
【請求項９７】
前記組換えＤＮＡが、５００以下のヌクレオチドにつき１つの切断部位を含むように最適化される、請求項７２に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、特に宿主細胞が組換えＤＮＡを含む場合に、異種好熱性ヌクレアーゼを用いて、宿主細胞の核酸をインビボおよび／またはインサイチュで分解するための方法に関する。本発明は、バイオマス中の組換えＤＮＡの生物活性の不活性化において有益である。組換えＤＮＡの生物活性の不活性化は、活性組換えＤＮＡ分子が、バイオマスから単離された最終産物またはバイオマス自体に残存するのを防止するのに役立つ。さらに、組換えＤＮＡの生物活性の不活性化は、活性組換えＤＮＡ分子が環境に放出されるのを防止するのに役立つ。
【０００２】
［発明の背景］
生物工学的製造プロセスは、生体化合物およびファインケミカルを得るためにますます使用されている。分子生物学的技術の進歩は、タンパク質、抗体、多糖、抗生物質、アミノ酸、ビタミン、アルコールなどの様々な種類の生体化合物およびファインケミカルの大量生産を可能にする。多くの場合、製造効率を高めるために、所望の最終産物を産生する遺伝子は遺伝子改変され、および／または異種生物に導入される。次に、現代の制御技術によって制御される発酵において所望の最終産物の産生が起こる。最終産物は細胞自体であるか、細胞から抽出されるか、または化合物がその中に見出される（能動的または受動的な分泌プロセスまたは細胞溶解によって）場合には細胞培養ブロスから採取される。
【０００３】
一般的に、発酵プロセスの最後に生じたバイオマスは所望の最終産物を含有するが、活性ＤＮＡ分子も含有することが分かる。多くの場合、活性ＤＮＡ分子は組換えＤＮＡである。処理せずに放置すると、組換えＤＮＡ分子は単離した最終産物中に残存する可能性があり、環境に放出される可能性もある。作物および食品中の残存組換えＤＮＡ材料がヒトの健康に与える可能性のある悪影響について、一般の人々により大きな懸念が生じている。さらに、組換えＤＮＡの環境に対する潜在的な影響についての懸念によって、ほとんどの国の当局および機関は、発酵プロセスで生じる廃棄物を環境への放出前に不活性化することを要求する法定要件および規制を公布している。
【０００４】
核酸を不活性化するための方法はいくつかある。例えば、核酸は、物理的に、最も一般的には熱によって不活性化することができる。米国特許第５，４１７，８６２号明細書には、酸の存在下でＤＮＡを６０〜１００℃に加熱することによる、ＤＮＡの生物活性の不活性化方法が報告されている。加熱および酸の組み合わせによってＤＮＡを分解する同様の方法が米国特許第５，１１８，６０３号明細書に報告されている。加熱方法はかなりの量のエネルギーを必要とし、これは、大規模発酵プロセスにおける最終産物のコストを増大させる。さらに、最終産物の性質によっては、厳しい加熱（および／または酸性）条件は前記産物の完全性および活性にとって有害であり得る。
【０００５】
また核酸は、他の物理的手段によって不活性化することもできる。米国特許第６，１６５，７１１号明細書には、生物学的に活性なタンパク性材料中の核酸を分解するためにレーザービームを用いる方法が報告されている。別の例として、高強度パルス多色光を用いて微生物を不活性化するための方法が米国特許出願第０９／８１８，２５６号明細書（現在は放棄されている）に報告されている。この方法は、複雑な発光装置の使用および定常的な保守を必要とし、それによりコストが高くなる。光ビームは核酸だけでなく、他の生物学的物質または活性化合物も分解して、その所望の特性の喪失を引き起こし得る。
【０００６】
また核酸は、酸またはアルカリによって化学的に不活性化することもできる。例えば、米国特許第７，４３５，５６７号明細書には、微生物において核酸の自己消化を誘発するために次亜塩素酸を用いる方法が報告されている。上記の米国特許第５，４１７，８６２号明細書および米国特許第５，１１８，６０３号明細書は、核酸の分解のために他のタイプの酸を使用する。これらの方法は核酸の破壊を引き起こすが、酸およびアルカリ条件は過酷である。過酷な条件は、タンパク質などの特定の生体化合物の望ましくない変性を引き起こし得る。使用される酸およびアルカリの量は比較的大量である可能性があり、それにより、この方法は産業生産の観点からも不利になる。
【０００７】
ヌクレアーゼの使用などにより、酵素的に生物の核酸を不活性化しようとする試みがなされている。米国特許出願第１３／１２７，８２５号明細書には、ワクチン製造に関連して宿主細胞の核酸を分解するための方法が報告されており、この方法は、精製ヌクレアーゼを細胞培養物に添加することによる核酸分解ステップを含む。米国特許出願第１０／６０７，９０３号明細書には、核酸を分解するのに有効な量の異種ヌクレアーゼ遺伝子を発現する遺伝子導入細菌株の構築が報告されている。米国特許出願第１３／１２７，８２５号明細書に報告される方法などのヌクレアーゼをインビトロで添加する方法は核酸の破壊を引き起こすが、大量のヌクレアーゼが必要とされるためにコストが高く、インビトロで添加されると宿主細胞の細胞壁がヌクレアーゼによる核酸への接近を遮断するために分解の効率が低い。米国特許出願第１０／６０７，９０３号明細書に報告されるものなどの遺伝子導入アプローチは、ヌクレアーゼが宿主細胞により同時発現され、それによりインビボでの宿主核酸への接近を得ることを可能にする。しかしながら、メチル化などの保護機構が全くなしにヌクレアーゼを細胞内で同時発現させると、細胞に著しくストレスがかかり、その結果細胞増殖が弱くなり、最終産物の産生が低下する。
【０００８】
従って、本発明の根底にある問題は、特に産業生産規模で、生体化合物およびファインケミカルを産生する宿主細胞の核酸を分解するための費用効果の高い方法を提供することである。本発明の根底にあるさらなる問題は、核酸分解プロセスが制御可能であり、宿主細胞における所望の最終産物の産生を妨害しない方法を提供することである。上記の問題は、本発明に従って、本特許請求の範囲の主題により解決される。
【０００９】
［発明の概要］
驚くことに、本発明者らは、制御された方法で核酸をインビボおよび／またはインサイチュで分解するために好熱性ヌクレアーゼを使用可能であることをこれまでに見出した。本発明は、宿主生物の核酸を分解するための新規の方法に関し、宿主生物は、１つまたは複数の異種の好熱性ヌクレアーゼ遺伝子によって改変または形質転換される。本発明で開示される好熱性ヌクレアーゼは、所望の産物を産生するために細胞培養物が通常増殖される温度で潜在性であるが、より高い温度では選択的に活性化され、従っていったん活性化されると、宿主生物の核酸および／または宿主生物に組み込まれた組換え核酸を分解することができる。活性化は、産物の形成が既に完結した場合の細胞培養物の回収時など、任意の所望の時点で引き起こすことができる。制御が容易であることに加えて、本発明のプロセスの適用は、インビボおよび／またはインサイチュで作用し、それによって酵素反応の効率を改善するという利点を有し、既存の物理的または化学的な方法の欠点および問題を回避する。従って、開示される本発明の適用によって、細胞の活性核酸内容物、特に組換えＤＮＡが分解および不活性化されたインタクト細胞の形態の生体化合物およびファインケミカルを得ることが可能になった。
【００１０】
本発明の実施は、微生物および高等真核細胞培養物、特に市販用の最終産物の大規模製造において使用される産業用菌株に対して広く適用可能である。
【００１１】
本発明の１つの態様は、宿主細胞の核酸をインビボおよび／またはインサイチュで分解するための方法に関し、宿主細胞は、好熱性ヌクレアーゼ遺伝子をコードする異種核酸配列を含み、本発明は、ａ）好熱性ヌクレアーゼが潜在性である温度で宿主細胞を増殖させるステップと、ｂ）ステップ（ａ）の温度を好熱性ヌクレアーゼが活性である温度に変化させることによって、宿主細胞の核酸を分解するステップとを含む。
【００１２】
また本発明は、上記の好熱性ヌクレアーゼ遺伝子の１つまたは複数をコードする異種核酸配列を含む遺伝子改変細胞も提供する。一実施形態では、遺伝子改変細胞は、１つまたは複数の最終産物を産生し、遺伝子改変細胞によって産生される最終産物は上記の好熱性ヌクレアーゼではない。一実施形態では、遺伝子改変細胞は、１つまたは複数の上記の異種好熱性ヌクレアーゼ遺伝子を宿主細胞に導入することによって作製される。この宿主細胞は、遺伝子改変されていない細胞、あるいは前もって遺伝子改変された細胞のいずれかであり得る。この宿主細胞は、１つまたは複数の異種好熱性ヌクレアーゼ遺伝子によって改変される前に、１つまたは複数の最終産物を産生し、前記１つまたは複数の最終産物は好熱性ヌクレアーゼではない。別の実施形態では、上記の宿主細胞は、まず１つまたは複数の好熱性ヌクレアーゼ遺伝子によって改変されて遺伝子改変細胞が作製され、遺伝子改変細胞は次に１つまたは複数の他の最終産物を産生するように遺伝子操作される。
【００１３】
本発明の別の態様は、宿主細胞の核酸をインビボおよび／またはインサイチュで分解するための好熱性ヌクレアーゼの使用に関し、好熱性ヌクレアーゼは、宿主細胞にとって異種である。
【００１４】
本発明のさらに別の態様は、活性核酸分子を含まないバイオマス産物の製造プロセスに関し、バイオマス産物は、好熱性ヌクレアーゼ遺伝子をコードする異種核酸配列を含む宿主細胞の産物であり、本プロセスは、ａ）好熱性ヌクレアーゼが潜在性である温度で宿主細胞を発酵させるステップと、ｂ）ステップ（ａ）の温度を好熱性ヌクレアーゼが活性である温度に変化させることによって、細胞の核酸を分解するステップと、ｃ）バイオマス産物を回収するステップとを含み、ステップｂ）およびステップｃ）を実施する順序は交換され得る。
【００１５】
一実施形態では、発明の上記態様で言及されるヌクレアーゼはＤＮＡ分解性ヌクレアーゼであり、宿主細胞の核酸はＤＮＡである。１つの特定の実施形態では、宿主細胞のＤＮＡは組換えＤＮＡを含有する。別の実施形態では、ヌクレアーゼはＲＮＡ分解性ヌクレアーゼであり、宿主細胞の核酸はＲＮＡである。
【００１６】
一実施形態では、上記のプロセス発明および方法発明のステップ（ａ）の温度は、宿主細胞の増殖にとって最適である。一実施形態では、分解は、前記好熱性ヌクレアーゼの最適温度の約±５℃の範囲内である温度で実行される。特定の実施形態では、分解は、前記好熱性ヌクレアーゼの最適温度で実行される。別の実施形態では、分解は、宿主細胞の低温殺菌の間に実行される。別の実施形態では、分解は、４０℃〜１００℃の温度範囲内で実行される。
【００１７】
一実施形態では、ＤＮＡ分解性ヌクレアーゼはＴａｑＩヌクレアーゼである。一実施形態では、分解は、約６０℃〜約７０℃の範囲の温度で実行される。特定の実施形態では、分解は６５℃で実行される。一実施形態では、ＴａｑＩヌクレアーゼは、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。別の実施形態では、ＴａｑＩヌクレアーゼの遺伝子は、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
【００１８】
一実施形態では、ＤＮＡ分解性ヌクレアーゼはＰｈｏＩヌクレアーゼである。一実施形態では、分解は、約７０℃〜約８０℃の範囲の温度で実行される。特定の実施形態では、分解は７５℃で実行される。一実施形態では、ＰｈｏＩヌクレアーゼは、配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。別の実施形態では、ＰｈｏＩヌクレアーゼの遺伝子は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
【００１９】
一実施形態では、宿主細胞は植物に由来する。別の実施形態では、宿主細胞は動物に由来する。さらに別の実施形態では、宿主細胞は微生物に由来する。一実施形態では、微生物は、酵母、真菌、藻類、細菌、および古細菌からなる群から選択される。別の実施形態では、微生物は、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、モルチエレラ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、トリコデルマ属（ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、クリプテコディニウム属（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、およびトラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）からなる群から選択される。特定の実施形態では、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種はヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。
【００２０】
一実施形態では、宿主細胞は、好熱性ヌクレアーゼではない１つまたは複数の最終産物を産生する。一実施形態では、最終産物は、フィトエン、リコペン、ベータ−カロテン、アルファ−カロテン、ベータ−クリプトキサンチン、ルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、アドニルビン、ビオラキサンチン、アドニキサンチン、ユビキノン、ビタミンＫ、ビタミンＥ、レチノール、レチナール、レチノイン酸、パルミチン酸レチニル、およびこれらの修飾形態からなる群から選択される。
【００２１】
一実施形態では、好熱性ヌクレアーゼの遺伝子は、宿主細胞のコドン使用頻度バイアスに適合するようにコドン最適化される。一実施形態では、コドン最適化好熱性ヌクレアーゼ遺伝子は、配列番号１の核酸配列を含む。別の実施形態では、コドン最適化好熱性ヌクレアーゼ遺伝子は、配列番号８の核酸配列を含む。
【００２２】
一実施形態では、２つ以上の好熱性ヌクレアーゼ遺伝子が宿主細胞に導入される。別の実施形態では、組換えＤＮＡは、好熱性ヌクレアーゼの付加的な部位を含むように最適化される。一実施形態では、組換えＤＮＡは、５００以下のヌクレオチドにつき１つの切断部位を含むように最適化される。
【００２３】
一実施形態では、本発明で使用される異種好熱性ヌクレアーゼ遺伝子は、宿主細胞の最終産物の産生効率に影響を与えない。
【００２４】
［配列の一覧表］
添付の配列表に記載される核酸配列は、ヌクレオチド塩基の標準的な文字略語を用いて示される。各核酸配列の１本の鎖のみが示されるが、相補鎖は、表示される鎖に対する任意の参照により含まれると理解される。添付の配列表では、以下の通りである。
【００２５】
配列番号１は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のために最適化された、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＴａｑＩヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列であり、クローニングのための制限部位および５’リボソーム結合部位を含む。
配列番号１：
【化１】
2016512035.tif 000003
【００２６】
配列番号２は、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＴａｑＩヌクレアーゼをコードする非最適化ＤＮＡ配列である。
配列番号２：
【化２】
2016512035.tif 000004
【００２７】
配列番号３は、配列番号１から推定される、ＴａｑＩヌクレアーゼのアミノ酸配列である。
配列番号３：
【化３】
2016512035.tif 000005
【００２８】
配列番号４は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株により包含される異種ｃａｒＢオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列である。
配列番号４：ｃａｒＢ遺伝子
【化４】
2016512035.tif 000006
【００２９】
配列番号５および６は、配列番号４内の５２９ｂｐ断片のための５’および３’ＰＣＲプライマーである。
配列番号５：プライマーＭＯ４６４１：
【化５】
2016512035.tif 000007
配列番号６：プライマーＭＯ４６４２：
【化６】
2016512035.tif 000008
【００３０】
配列番号７は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株により包含される異種ｃｒｔＺ−ＤｃオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列である。
配列番号７：ｃｒｔＺ−Ｄｃ遺伝子：
【化７】
2016512035.tif 000009
【００３１】
配列番号８は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のために最適化された、パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）ＯＴ３由来のＰｈｏＩヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列であり、クローニングのための制限部位および５’リボソーム結合部位を含む。
配列番号８：
【化８】
2016512035.tif 000010
【００３２】
配列番号９は、パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）ＯＴ３由来のＰｈｏＩヌクレアーゼをコードする非最適化ＤＮＡ配列である。
配列番号９：
【化９】
2016512035.tif 000011
【００３３】
配列番号１０は、配列番号８から推定される、ＰｈｏＩヌクレアーゼのアミノ酸配列である。
配列番号１０：
【化１０】
2016512035.tif 000012
【００３４】
配列番号１１は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における発現のために最適化された、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＴａｑＩヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列であり、クローニングのための制限部位を含む。
配列番号１１：
【化１１】
2016512035.tif 000013
【００３５】
配列番号１２および１３は、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）における発現のために鋳型としてｐＭＢ６７３６を用いてｔａｑＩを増幅するために使用される５’および３’ＰＣＲプライマーである。プライマーはクローニングのための制限部位を含む。
配列番号１２：プライマーＭＯ９３１５：
【化１２】
2016512035.tif 000014
配列番号１３：プライマーＭＯ９３１６：
【化１３】
2016512035.tif 000015
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ｔａｑＩヌクレアーゼ遺伝子を有するまたは有さないＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株におけるＤＮＡ分解活性の時間経過を示す。
【図２】ｔａｑＩヌクレアーゼ遺伝子を有するまたは有さないＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株における異なる温度でのＤＮＡ分解活性を示す。
【図３】ＰＣＲ結果に基づいたＤＮＡ分解の完全性を示す。
【図４】ｔａｑＩヌクレアーゼ遺伝子を有するまたは有さないＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株におけるアスタキサンチンおよびその前駆体の産生を示す。
【図５】ｔａｑＩヌクレアーゼ遺伝子を有するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株におけるゼアキサンチンおよびその前駆体の産生を示す。
【図６】発酵槽内でアスタキサンチンおよびゼアキサチンを産生するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株におけるＤＮＡの分解の時間経過を示す。
【図７】Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中のＴａｑＩおよびＰｈｏＩヌクレアーゼのそれぞれの最適温度を中心とした温度範囲を示す。
【図８】ＴａｑＩヌクレアーゼ遺伝子を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＴａｑＩヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を示す。
【図９】ＴａｑＩヌクレアーゼ遺伝子を発現するＣ．グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）におけるＴａｑＩヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を示す。
【図１０】Ｃ．グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）におけるＴａｑＩヌクレアーゼの最適温度を中心とした温度範囲を示す。［発明の詳細な説明］
【００３７】
本発明は、異種好熱性ヌクレアーゼを用いて核酸をインビボおよび／またはインサイチュで分解する方法を提供する。本方法は、最終産物の産生の間の任意の段階で、生物のデオキシリボ核酸、特に組換えＤＮＡを分解し、それによりデオキシリボ核酸の生物活性を不活性化することが意図される。本発明によると、異種好熱性ヌクレアーゼ遺伝子は、核酸を分解することが意図される生物に導入される。好熱性ヌクレアーゼは生物の通常の増殖温度で潜在性であるが、温度を上昇させる、好ましくは好熱性ヌクレアーゼの最適温度を中心とした範囲まで上昇させることによって活性化され得る。
【００３８】
本発明において、好熱性ヌクレアーゼは、宿主生物の核酸の生物活性を不活性化するために使用される。「核酸の生物活性を不活性化する」という用語は、本発明による核酸の分解を指すと考えられる。核酸は、複製、転写または翻訳の役割を果たすことがもはやできないように切断される場合に、生物学的に不活性化されると考えられる。好ましくは、核酸は組換えＤＮＡである。好ましくは、核酸は、５００塩基対以下である単位に切断され得る。
【００３９】
本発明において、好熱性ヌクレアーゼは、外因的に加えられるのではなく宿主細胞によって産生され、それによって宿主細胞の核酸をインビボおよび／またはインサイチュで分解する。「インビボ」という用語は、細胞によって産生される好熱性ヌクレアーゼによる宿主細胞内部の核酸の分解を指し、細胞は、分解の時点で生存可能であってもそうでなくてもよい。「インサイチュ」という用語は、宿主細胞の細胞壁が（完全または部分的に）破壊された後に宿主細胞によって産生される好熱性ヌクレアーゼによる核酸の分解を指す。例えば、インサイチュ分解は、細胞が溶解されてその内容物が放出される発酵プロセスの最後に実施され得る。分解は、細胞が溶解された後、あるいは溶解ブロスのいくらかの付加的なプロセシングが既に生じた後、直ちに実施され得る。
【００４０】
本発明に関連して、「核酸」という用語は、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を示す。
【００４１】
「遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、一般的に、１つまたは複数の遺伝子産物（すなわち、ＲＮＡまたはタンパク質）の発現に影響を与え得る特定の調節エレメントを任意選択で含む、ポリペプチドをコードする核酸を指す。例えば、本発明に従う好熱性ヌクレアーゼ遺伝子は、好熱性ヌクレアーゼのポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を指し、そして、ヌクレアーゼ遺伝子の発現に影響するためにＯＲＦの上流に位置する特定のプロモーター、および／または転写の終結のための領域、および／または他の調節エレメントと一緒に、好熱性ヌクレアーゼのＯＲＦをコードする核酸配列も指す。
【００４２】
「異種」という用語は、本明細書で使用される場合、それが発現されている生物中に天然には存在しない遺伝子またはポリペプチドを指す。異種ポリペプチドが宿主細胞において発現される予定であれば、多くの場合、宿主細胞のコドン選択に適応させるように、および／またはコード化配列を宿主細胞において活性な調節エレメントと連結するように調整されたポリペプチドをコードする核酸配列を用いるのが望ましいことが理解される。例えば、宿主細胞がヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株（例えば、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））であれば、多くの場合、このようなヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株のコドン選択とより緊密に適合するように、所与のポリペプチドをコードする遺伝子配列を変更することが望ましいであろう。特定の実施形態では、所与のポリペプチドをコードする遺伝子配列は、宿主細胞に関連する種のコドン選択とより緊密に適合するように変更される。このような実施形態は、実験的（例えば、クローニング）および／または他の理由で、所与のポリペプチドをコードする遺伝子配列が、宿主細胞のコドン選択に適合するように最適化するのが困難である場合に有利である。特定の実施形態では、所与のポリペプチドをコードする遺伝子配列は、このような遺伝子配列が宿主細胞自体（従って、異種でない）に由来する場合でも最適化される。例えば、対象のポリペプチドをコードする遺伝子配列は、このような遺伝子配列が宿主細胞株から単離されるとしても、所与の宿主細胞における発現のためにコドン最適化され得る。このような実施形態では、遺伝子配列は、宿主細胞のコドン選択を構成するようにさらに最適化され得る。あるいは、（異種でない）遺伝子配列はコドン最適化されないこともあり得るが、代わりに、その独自のもの以外の調節エレメント（その調節エレメントがその宿主の別の遺伝子に由来するか、あるいは別の種に由来するかにかかわらず）に連結され得る。当業者は、宿主細胞のコドン選択を認識し、かつ本明細書に開示される本発明の方法および組成物を使用して、宿主細胞における所与のポリペプチドの発現を最適化できるであろう。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」は、核酸構築物または発現ベクターの導入を受け入れることができる任意の細胞型を意味する。核酸構築物または発現ベクターの導入の手段は、形質転換、トランスフェクション、形質導入などの形態であり得る。「宿主細胞」という用語は、複製の間に発生する突然変異のために親細胞と同一でない親細胞のあらゆる子孫を包含する。好ましい実施形態では、宿主細胞は、所望の生体化合物またはファインケミカルである１つまたは複数の最終産物を産生する。宿主細胞は産業用菌株であることが好ましい。宿主細胞は、遺伝子改変細胞、または最初は遺伝子改変されていなかった天然細胞であり得る。遺伝子改変宿主細胞は、多くの場合特定の生体化合物またはファインケミカルを過剰発現させるように改変、操作、または処置された宿主細胞を指す。
【００４４】
宿主細胞は、原核生物（細菌または古細菌）または真核生物における生体化合物および／またはファインケミカルの組換え産生において有用な任意の細胞でよい。
【００４５】
「生体化合物」という用語は当該技術分野において知られており、生命体において天然に見出される化合物を含む。生体化合物の例としては、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、核酸、ヌクレオチド、炭水化物、および脂質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
「ファインケミカル」という用語は当該技術分野において知られており、例えば、製薬産業、農業、化粧品、食品および飼料産業などであるがこれらに限定されない種々の産業部門において使用される化合物を含む。これらの化合物には、有機酸、例えば、酒石酸、イタコン酸およびジアミノピメリン酸など、脂質、飽和および不飽和脂肪酸（例えば、アラキドン酸）、ジオール（例えば、プロパンジオールおよびブタンジオール）、芳香族化合物（例えば、芳香族アミン、バニリンおよびインジゴ）、カロテノイド、ビタミンおよび補因子が含まれる。
【００４７】
高等動物は、ビタミン、カロテノイド、補因子および栄養補助剤を合成する能力を失っており、従ってこれらを摂取する必要があるが、これらは、細菌などの他の生物によって広範囲に合成される。これらの分子は生物活性分子自体であるか、あるいは生物活性物質の前駆体であり、いくつかの代謝経路において電子伝達体または中間体としての機能を果たす。これらの化合物はその栄養価に加えて、着色剤、酸化防止剤および触媒または他の加工助剤としての顕著な産業的価値も有する。「ビタミン」という用語は当該技術分野において知られており、正常な機能のために生物により必要とされるが、この生物自身で合成することができない栄養分を含む。ビタミンの群は、補因子および栄養補助剤化合物を含み得る。「補因子」という用語は、正常な酵素活性の発生のために必要な非タンパク質化合物を含む。これらの化合物は有機でも無機でもよく、本発明の補因子分子は好ましくは有機である。「栄養補助剤」という用語には、生物および動物、特にヒトの健康を促進する食品添加剤が含まれる。このような分子の例は、ビタミン、酸化防止剤であり、そして同様に、特定の脂質（例えば、多価不飽和脂肪酸）である。
【００４８】
ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の生物において産生され得る好ましいファインケミカルまたは生合成産物は、例えば、フィトエン、リコペン、ベータ−カロテン、アルファ−カロテン、ベータ−クリプトキサンチン、ルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、アドニルビン、ビオラキサンチン、アドニキサンチン、および／またはこれらの修飾形態（これらの化合物の異性化、エステル化、グリコシル化、および分解産物を含むがこれらに限定されない）などのカロテノイド；例えば、ユビキノン（補酵素Ｑ１０およびＱ５〜Ｑ９キノン化合物を含むがこれらに限定されない）、ビタミンＫ化合物、およびビタミンＥ化合物などのキノン由来の化合物；ならびに例えば、レチノール、レチナール、レチノイン酸、およびパルミチン酸レチニルなどのレチノール系（ｒｅｔｉｎｏｌｉｃ）化合物である。
【００４９】
原核宿主細胞は、任意のグラム陽性またはグラム陰性細菌であり得る。グラム陽性細菌には、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が含まれるが、これらに限定されない。グラム陰性細菌には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）およびパラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
細菌宿主細胞は、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、ブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コーアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の細胞を含むがこれらに限定されない、任意のバチルス目（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）の細胞であり得る。
【００５１】
また細菌宿主細胞は、ストレプトミセス・アクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトミセス・エバミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、およびストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）の細胞を含むがこれらに限定されない、任意のストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の細胞であってもよい。
【００５２】
また細菌宿主細胞は、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、パラコッカス・ベルスタス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｖｅｒｓｕｔｕｓ）、パラコッカス・カロティニファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｏｔｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、パラコッカス・マルクシイ（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｃｕｓｉｉ）、およびパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）の細胞を含むがこれらに限定されない、任意のパラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）の細胞であってもよい。
【００５３】
また宿主細胞は、哺乳類、昆虫、植物、藻類、または真菌細胞などの真核生物でもあり得る。
【００５４】
藻類宿主細胞は、クリプテコディニウム・コーニー（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ）、シゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）またはトラウストキトリウム種（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）の細胞などの、クリプテコディニウム属（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、およびトラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）の細胞であり得る。
【００５５】
宿主細胞は、真菌細胞であってもよい。「真菌」は、本明細書で使用される場合、子嚢菌門（ｐｈｙｌｕｍ  Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（ｐｈｙｌｕｍ  Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（ｐｈｙｌｕｍ  Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、および接合菌門（ｐｈｙｌｕｍ  Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫによって定義される）、ならびに卵菌門（ｐｈｙｌｕｍ  Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（上記のＨａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，１７１頁に引用される）および全ての栄養胞子形成菌（上記のＨａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ，１９９５）を含む。
【００５６】
真菌宿主細胞は、糸状菌細胞であり得る。「糸状菌」は、真菌亜門（ｓｕｂｄｉｖｉｓｉｏｎ  Ｅｕｍｙｃｏｔａ）および卵菌亜門（ｓｕｂｄｉｖｉｓｉｏｎ  Ｏｏｍｙｃｏｔａ）の全ての糸状形態を含む（上記のＨａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ，１９９５により定義される）。糸状菌は、一般的に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複合多糖で構成される菌糸体壁によって特徴付けられる。栄養生長は菌糸伸長によるものであり、炭素異化は偏性好気性である。対照的に、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母による栄養生長は単細胞性葉状体の出芽によるものであり、炭素異化は発酵性であり得る。
【００５７】
糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシディウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ビルカンデラ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオルス属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア属（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロミセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プレウロタス属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の細胞であり得る。
【００５８】
例えば、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ビルカンデラ・アドゥスタ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ  ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・スブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ルクノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クイーンズランディクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トロピクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナタム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｚｏｎａｔｕｍ）、コプリナス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、コリオルス・ヒルスタス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・カルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レティクラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サムバシナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕ���ｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミーヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・パープロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビア・ラディアタ（Ｐｈｌｅｂｉａ  ｒａｄｉａｔａ）、プレウロタス・エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテス・ビローサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・ベルシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）の細胞であり得る。
【００５９】
また真菌宿主細胞は、酵母細胞でもあり得る。「酵母」は、本明細書で使用される場合、子嚢胞子形成（ａｓｃｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ）酵母（エンドミケス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、担子胞子形成（ｂａｓｉｄｉｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ）酵母、および不完全菌類（Ｆｕｎｇｉ  Ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉ）（ブラストミケス綱（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））に属する酵母を含む。酵母の分類は将来変化し得るため、本発明の目的では、酵母は、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ（Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｆ．Ａ．，Ｐａｓｓｍｏｒｅ，Ｓ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，Ｒ．Ｒ．，ｅｄｓ，Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．９，１９８０）に記載されるように定義されるものとする。
【００６０】
酵母宿主細胞は、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ディアスタテッカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ダグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・オビフォーミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）またはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の細胞などの、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、またはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の細胞であり得る。
【００６１】
真菌細胞は、当業者に既知の方法におけるプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、および細胞壁の再生を含むプロセスによって形質転換され得る。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の宿主細胞の形質転換のための適切な手順は、欧州特許第２３８０２３号明細書およびＹｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１４７０−１４７４に記載されている。フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種を形質転換するために適切な方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９８９，Ｇｅｎｅ  ７８：１４７−１５６、および国際公開第９６／００７８７号パンフレットにより記載されている。酵母は、Ｂｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ  Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，ｐｐ  １８２−１８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３−１６８、およびＨｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２９−１９３３により記載される手順を用いて形質転換され得る。
【００６２】
異種好熱性ヌクレアーゼ遺伝子を有する宿主細胞株を構築するために、組換え好熱性ヌクレアーゼ遺伝子構築物は、宿主における最適な遺伝子発現を可能にする宿主特異的ベクターに挿入される。ベクターは、“Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”（Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）において周知である。ベクターは、プラスミドだけを意味するのではなく、当業者に知られている全ての他のベクター、例えば、ファージ、ウィルス（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルスおよびアデノウィルスなど）、トランスポゾン、ＩＳエレメント、プラスミド、コスミド、および線状または環状ＤＮＡなども意味すると理解されるべきである。これらのベクターは、宿主生物において自律的に、あるいは染色体的に複製され得る。
【００６３】
本発明に従うベクターは、例えば少なくとも１つの本発明に従うベクターにより形質転換され、好熱性ヌクレアーゼを産生するために使用可能な組換え生物の作製を可能にする。本発明に従う上記の組換え構築物は、有利に、宿主生物のゲノムに導入され、発現される。対象の発現系において好熱性核酸の発現をもたらすために、当業者に知られている通常のクローニングおよびトランスフェクション方法を使用するのが好ましい。適切な系は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９７に記載されている。
【００６４】
いくつかの実施形態では、改変された宿主細胞は異種好熱性ヌクレアーゼ遺伝子を保有するプラスミドを含有し、プラスミドは、宿主生物内で自律的に複製する。
【００６５】
ＤＮＡは、組換えＤＮＡ技術の適用によって生じる場合に、「組換え」であると考えられる。組換え技術の例としては、クローニング、変異誘発、形質転換などが挙げられるが、これらに限定されない。組換えＤＮＡ技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ，ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）に開示されている。
【００６６】
「ヌクレアーゼ」という用語は、核酸内のヌクレオチドの５’リン酸基と隣接ヌクレオチドの３’ヒドロキシ基との間のエステル結合の加水分解による切断をもたらし、それによってＤＮＡまたはＲＮＡ分子の分解を達成する酵素を示す。ヌクレアーゼは、多数の生物から分かっている。ヌクレアーゼは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかを切断して、より小さい単位またはさらにそのモノマーにする。
【００６７】
好ましい実施形態では、本発明に従う好熱性ヌクレアーゼはＤＮＡ分解性ヌクレアーゼであり、好熱性ヌクレアーゼが分解する核酸は、二本鎖または一本鎖ＤＮＡである。特定の実施形態では、分解されるＤＮＡは組換えＤＮＡである。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態はＤＮＡの不活性化に関するが、あらゆる核酸分子の不活性化を達成することができる。これには、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、または核酸−タンパク質結合体の不活性化が含まれる。
【００６９】
「ＤＮＡ分解性ヌクレアーゼ」は、ＤＮＡ分子をより小さい単位またはモノマーに切断することができるヌクレアーゼを意味する。このような酵素は、最先端では「ＤＮａｓｅ」とも呼ばれる。「ＲＮＡ分解性ヌクレアーゼ」は、ＲＮＡ分子をより小さい単位またはモノマーに切断することができるヌクレアーゼである。このような酵素は、最先端では「ＲＮａｓｅ」とも呼ばれる。
【００７０】
ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼであり得る。エンドヌクレアーゼは、鎖の内部の位置から核酸鎖を分解する酵素である。反対に、エキソヌクレアーゼは、鎖の一方または両方の端部から核酸鎖を分解する酵素である。ヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼであることが好ましい。
【００７１】
「好熱性ヌクレアーゼ」は、４５℃以上の温度でその最適活性を有するヌクレアーゼを意味する。前記最適活性は、ヌクレアーゼの活性に最適である温度において観察される。最適温度は、当業者によって決定されるように、意図される用途に関連して適切な基質を用いて、およびアッセイ条件（培地組成、アッセイ時間などに関して）下で本発明に従う組換え宿主においてヌクレアーゼが発現されるインビトロアッセイまたはインビボアッセイにおいてヌクレアーゼに対して決定され得る。一例として、ＴａｑＩなどのヌクレアーゼの最適温度は、通常、精製ＴａｑＩヌクレアーゼを用いてインビトロで決定される。ある範囲の温度（通常、２５〜８５℃）に保持された５０マイクロリットルの反応において１時間、定量の酵素を１マイクログラムのラムダＤＮＡと共にインキュベートすることができる。最適温度は、最大の消化が観察される（例えば、得られるラムダＤＮＡＴａｑＩ制限酵素断片のゲル電気泳動によってアッセイされる場合に）温度である。あるいは、１単位の酵素は、５０マイクロリットルの反応において最適温度で１時間に１マイクログラムのラムダＤＮＡを完全に消化するために必要とされるタンパク質の量として定義される。従って、最適温度は、完全な消化を達成するために必要とされるタンパク質の量が最少である温度である。細胞内の最適温度を定義するために、ＤＮＡ基質に対する酵素の定義された比率（インビトロアッセイにおいて使用される場合）を保証することはできない。代わりに、より実用的なアプローチがとられる。インビボの最適温度がおそらくインビトロと同様であると考えると、インビトロで定義された最適温度を指針として使用することができる。ヌクレアーゼによるヌクレアーゼ酸消化は、インビトロの最適温度またはその付近で調査される。最適温度は、最大の消化が観察される温度である。いくつかのヌクレアーゼについては、ゲノムＤＮＡの完全な消化は温度範囲を通して観察され得るため、インビボ最適温度は一点ではなく温度の範囲である。
【００７２】
本出願で開示される好熱性ヌクレアーゼは、天然の好熱性ヌクレアーゼ、および好熱性ヌクレアーゼ活性を有するその任意の相同体または変異体の両方を含む。本発明で使用される好熱性ヌクレアーゼを得るための手段には、好熱菌からの単離、合理的な酵素工学および／または定向進化により好熱活性を獲得するためおよび／または熱耐性を増大するための相同ヌクレアーゼの改変が含まれるが、これらに限定されない。細胞の大部分とは異なり、好熱菌は熱を好む生物であり、最適増殖温度は５０℃以上である。対照的に、ほとんどの細胞はより低温で増殖し、好熱菌が好む高温では生存できない。例えば、一般的な微生物は２５〜４０℃の温度で増殖し、哺乳類細胞培養物は約３７℃で増殖し、植物および昆虫培養物は、当該技術分野で知られているそれぞれの低温で増殖する。好熱性ヌクレアーゼはその最適温度の範囲外では活性を失い、一般的な微生物および細胞培養物が増殖する温度ではより低い活性を有する。低温における各好熱性ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性のレベルは異なり、従って、個々に決定されなければならない。本発明では、ヌクレアーゼ活性が、ヌクレアーゼの最適反応温度におけるピーク活性の２０％未満にまで低減されれば、好熱性ヌクレアーゼは低温において潜在性であると考えられる。
【００７３】
本発明の方法は、広範囲の好熱性ヌクレアーゼを受け入れることができる。宿主微生物または真核細胞培養物の通常の増殖温度で潜在性であるが、その独自の最適反応温度において（高度に）活性であるあらゆるヌクレアーゼが、本発明における使用に適している。
【００７４】
いくつかの好熱性ヌクレアーゼは、他のものよりもあまり本発明に適していない。例えば、いくつかの好熱性ヌクレアーゼは、２５〜３７℃の低温で低レベルのヌクレアーゼ活性を有する。宿主細胞の増殖温度におけるこのような残留活性は宿主細胞の増殖を抑制することがあり、従ってその最終産物の産生を妨害し得る。いくつかの好熱性ヌクレアーゼはその最適温度において強力なヌクレアーゼ活性を有さないことがあり、従って核酸の分解において不十分である。従って、本発明において最もよく機能する好熱性ヌクレアーゼを選択するためにスクリーニングプロセスが実施され得る。
【００７５】
最良の好熱性ヌクレアーゼ候補は、そのヌクレアーゼ活性が、通常の増殖温度において宿主生物に有意なストレスを与えないように十分に低く、そして最適反応温度において宿主の核酸の効率的な分解を実施するために十分に高いものである。
【００７６】
通常の宿主生物が増殖する温度範囲から外れた温度で核酸分解活性を示すという特性のために、本発明に従う好熱性ヌクレアーゼは、宿主細胞の核酸を制御された方法で分解する際に有利に使用することができる。例えば、一実施形態では、本発明は、異種好熱性ヌクレアーゼ遺伝子が宿主細胞に導入され、それにより宿主細胞の核酸を分解するために使用されることを開示する。本発明によると、好熱性ヌクレアーゼ遺伝子は、その核酸が分解される予定の宿主細胞に導入される。宿主細胞は、異種好熱性ヌクレアーゼが潜在性であるその最適増殖温度で増殖される。宿主細胞が細胞の回収時などの特定の段階になるまで一定の期間増殖されたら、温度をヌクレアーゼ活性に最適な温度に切り換えることによって、宿主呼び出し内の好熱性ヌクレアーゼの活性が活性化され得る。好熱性ヌクレアーゼを活性化することにより、宿主細胞のＤＮＡおよび／またはＲＮＡはヌクレアーゼにより分解され、これにより宿主細胞のＤＮＡおよび／またはＲＮＡの活性が除去される。
【００７７】
本発明によると、天然好熱性ヌクレアーゼの任意の相同体または変異体は、相同体または変異体が好熱性ヌクレアーゼ活性を有する限り、天然好熱性ヌクレアーゼの代わりに使用され得る。
【００７８】
別の実施形態では、異種好熱性ヌクレアーゼ遺伝子を使用する代わりに、本発明に従う方法は、合理的な酵素工学および／または定向進化などの方法を用いて好熱性にされた宿主細胞ヌクレアーゼの相同体または変異体を使用し得る。
【００７９】
一実施形態では、１つの好熱性ヌクレアーゼが宿主細胞に導入され、それにより宿主細胞の核酸を分解するために使用される。別の実施形態では、２つ以上の好熱性ヌクレアーゼが宿主細胞に導入される。付加的な好熱性ヌクレアーゼの導入は、例えば、核酸の分解の効率を高め得る。
【００８０】
別の実施形態では、分解される組換えＤＮＡの配列は、好熱性ヌクレアーゼの付加的な切断部位を含むように最適化される。切断部位の付加は、組換えＤＮＡの完全な分解を保証するのに役立つ。分解される組換えＤＮＡは、ヌクレアーゼ遺伝子自体を含むことができる。特定の実施形態では、組換えＤＮＡの配列は、５００以下のヌクレオチドにつき１つの切断部位を含むように操作される。切断部位は、単一のヌクレアーゼまたは複数のヌクレアーゼによって認識されるように設計され得る。別の特定の実施形態では、組換えＤＮＡの配列は、得られるタンパク質のアミノ酸配列が変化されないような方法で切断部位を含むように操作される。
【００８１】
核酸分解の上記の方法は、実験台から商業規模の発酵に及ぶ任意の規模で実行することができる。本出願の背景セクションに記載されるように、宿主細胞のＤＮＡ、特に組換えＤＮＡは、産物回収よりも前（例えば、発酵プロセスの最後）に分解されるのが好ましい。本発明は、バイオマス中の組換えＤＮＡを分解し、それによりあらゆる組換えＤＮＡを不活性化するためのプロセスを提供する。バイオマスは、例えば、微生物の培養または高等真核細胞培養から回収された細胞であり得る。
【００８２】
特定の実施形態では、本発明は、バイオマス中の組換えＤＮＡが不活性化される発酵プロセスを提供する。このようなプロセスの方法論的なステップは以下のように例証される。第１に、本発明に従う好熱性ヌクレアーゼをコードする遺伝子が宿主細胞に導入される。好熱性ヌクレアーゼの遺伝子を含有する核酸構築物の宿主細胞への組込みは、染色体内または染色体外で起こり得る。第２に、宿主細胞の増殖および／または産生プロセスに最適な温度において発酵槽内で宿主細胞が増殖される。第３に、発酵プロセスの最後に、発酵槽の温度が、好熱性ヌクレアーゼの最適温度まで上昇され、それによりヌクレアーゼが活性化される。宿主細胞におけるＤＮＡ（組換えまたは非組換え）の十分な分解を可能にする時間の間、より高い温度が保持される。続いて、バイオマスが採取され、任意選択で、最終産物（バイオマス自体でなければ）を精製するためにさらに処理される。
【００８３】
別の実施形態では、バイオマス中のＤＮＡを分解する代わりに、本発明で開示される方法は、部分精製産物中のＤＮＡを分解するために使用することもできる。例えば、上記の発酵プロセスにおいて、バイオマスの採取の前に好熱性ヌクレアーゼを活性化する代わりに、ヌクレアーゼの活性化は、バイオマスが採取され、部分精製最終産物を得るためにさらに処理される後まで保留され得る。次に、好熱性ヌクレアーゼが活性化されて、部分精製最終産物中に含有されるＤＮＡが分解され、必要に応じて、これは次にさらに精製され得る。最初の（部分）精製プロセスにおいて、ヌクレアーゼの活性を保持することは必須である。実際、バイオマス採取後のプロセスの間に好熱性ヌクレアーゼの活性が保存される限り、宿主細胞のＤＮＡの分解は、バイオマスが採取された後の任意の段階で実施することができる。
【００８４】
本発明に従うプロセスは、発酵に加えて、多数の他の技術分野において使用することができる。例えば、本発明に従うプロセスは、ワクチンの製造中に宿主細胞のＤＮＡを不活性化するために使用することができる。
【００８５】
ウィルスまたはウィルス抗原を含有するワクチンを製造する細胞培養ベースの方法は、ウィルスワクチンの商業生産においてますます使用されている。しかしながら、ワクチン製造のために細胞培養を使用することに関連するリスクの１つは、ワクチン接種者が宿主細胞の汚染残留細胞ＤＮＡにさらされることであることが当該技術分野において知られている。宿主細胞系で製造されたワクチンの最終製剤からあらゆる宿主細胞ＤＮＡが除去され、それにより最終製品からあらゆる潜在的な癌遺伝子を除去することに関心がある。本発明に従うプロセスは、細胞培養によって製造されたそのウィルスまたはウィルス抗原に関連する宿主細胞核酸を分解するために実行することができる。プロセスは、（ａ）好熱性ＤＮＡヌクレアーゼの遺伝子を宿主細胞培養物に導入し、それにより新しい宿主株を作製するステップと、（ｂ）新しい宿主株の集団にウィルスを播種するステップと、（ｃ）ウィルスが複製できるように宿主細胞の集団を培養する（培養は好熱性ヌクレアーゼが潜在性である温度で実行される）ステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の温度を好熱性ＤＮＡヌクレアーゼが活性である温度に変化させることによって、宿主細胞のＤＮＡを分解するステップと、（ｅ）製造されたウィルスを採取し、それによりウィルス回収を提供するステップと、（ｆ）ウィルスを単離するステップとを含む。ステップ（ｄ）〜（ｆ）の順番は交換可能である。ウィルスは、例えば、インフルエンザウィルスであり得る。しかしながら、本発明に従って、あらゆるウィルスまたはウィルス抗原を製造することができる。
【００８６】
本発明に従うプロセスは、遺伝子改変作物の核酸を不活性化するために使用することもできる。例えば、本発明に従う好熱性ヌクレアーゼは、遺伝子改変作物に導入することができる。作物は、田畑において通常は５０℃以下の温度で成長される。作物は、収穫された後、例えば、作物の核酸を分解するために上記好熱性ヌクレアーゼの最適温度で処理することができる。
【００８７】
本発明に従うプロセスは、細胞ライセートの粘度を低下させるために使用することもできる。細胞が溶解されると、細胞からＤＮＡが放出され、それにより細胞ライセートが粘性になることは当該技術分野において知られている。これは、細胞ライセートのさらなるプロセシングを妨害する。好熱性ＤＮＡ分解性ヌクレアーゼは、ＤＮＡを小さいオリゴヌクレオチド断片に切断し、従って制御された方法でＤＮＡ内容物により生じる粘性を取り除くことによって作用する。
【００８８】
本発明に従って使用される好熱性ヌクレアーゼは、例えば、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＴａｑＩエンドヌクレアーゼであり得る。ＴａｑＩは６５℃の最適温度を有する。他の好熱性ヌクレアーゼは、その本発明での使用の適合性について試験することができる。付加的な好熱性ヌクレアーゼの例としては、６５℃の最適温度を有するＴｓｐ５０９Ｉ、６０℃の最適温度を有するＭｗｏＩ、７５℃の最適温度を有するＰｈｏＩ、６０℃の最適温度を有するＢｓａＪＩ、および５０℃の最適温度を有するＢｓｐＱＩが挙げられる。
【００８９】
基本的には、最先端で知られている任意の既存の好熱性ヌクレアーゼ、またはまだ同定されていない任意の好熱性ヌクレアーゼは、このような好熱性ヌクレアーゼがその最適反応温度において高核酸切断活性を有するが、宿主微生物または細胞培養物が通常増殖するそれよりも低い温度において潜在性である限り、本発明に従って使用することができる。
【００９０】
本発明の範囲内で、核酸を分解するための温度は、特定の好熱性ヌクレアーゼの最適活性を有することが分かっている温度であるのが好ましい。例えば、ＴａｑＩは６５℃で最も活性であることが分かっているため、好熱性ヌクレアーゼＴａｑＩを用いて宿主細胞の核酸を分解するための１つの好ましい温度は６５℃である。しかしながら、本発明に従う最適温度は、単一の温度点に限定されない。本発明によると、核酸を分解するための温度は、好熱性ヌクレアーゼの既知の最適温度の±５℃の範囲内の任意の温度であることも好ましい。ＴａｑＩの場合、例えば、好ましい温度は、６０℃〜７０℃に含まれる任意の温度である。別の例では、ＰｈｏＩは７５℃で最も活性であることが分かっている。ＰｈｏＩの好ましい温度は、７０℃〜８０℃に含まれる任意の温度である。好熱性ヌクレアーゼの既知の最適温度の±１℃、±２℃、±３℃、または±４℃の範囲内に含まれる温度が、好熱性ヌクレアーゼを活性化するための温度であることは特に好ましい。従って、一実施形態では、好熱性ヌクレアーゼ活性を活性化するために使用される温度は、好熱性ヌクレアーゼの既知の最適温度の±５℃以内である。
【００９１】
好熱性ヌクレアーゼ活性を活性化するために使用される温度が、選択される好熱性ヌクレアーゼの既知の最適温度の±５℃以内である温度範囲だけに限定されないことは当業者には明白である。代替例として、好熱性ヌクレアーゼ活性を活性化するために使用される温度は、宿主細胞は活性に増殖しないが好熱性ヌクレアーゼは活性な酵素活性を有する任意の温度であり得る。例えば、ＴａｑＩを活性化するために使用される温度は、宿主細胞は活性な増殖を行わないが好熱性ヌクレアーゼはまだ酵素活性を有する７５℃であってもよい。一実施形態では、好熱性ヌクレアーゼ活性を活性化するために使用される温度は、好熱性ヌクレアーゼがその最適酵素活性の２０％以上を有する温度または温度範囲である。別の実施形態では、好熱性ヌクレアーゼ活性を活性化するために使用される温度は、宿主細胞がその最適増殖速度の２０％以下で増殖するか、あるいは全く増殖せず、好熱性ヌクレアーゼがその最適酵素活性の２０％以上を有する温度または温度範囲である。別の実施形態では、好熱性ヌクレアーゼ活性を活性化するために使用される温度は、４０℃〜１００℃の温度である。
【００９２】
核酸の分解が、その効率を損なうことのない温度範囲で実施され得る限り、好ましい温度は、最終産物の力価、最終産物の安定性、最終産物の純度、最終産物の収量、次のプロセシングステップのための材料の取扱いの容易さなどを含むがこれらに限定されない、他の検討事項との最適なバランスをとる温度範囲内の任意の温度である。
【００９３】
従って、好熱性ヌクレアーゼ活性を活性化するために核酸の効率的な分解を可能にする任意の温度が選択され得ることは、本発明の範囲に含まれる。時には、このような温度は最良の好熱性ヌクレアーゼ活性を提供しないこともあるが、いくつかの付加的な因子との組み合わせで最良の全体効率を提供し得る。例えば、好熱性ヌクレアーゼの加熱活性化ステップの代わりに加熱低温殺菌が使用されてもよい。低温殺菌の間にバイオマスを徐々に加熱することによって、宿主細胞の低温殺菌および細胞内の好熱性ヌクレアーゼ活性の活性化の両方を１段階で実行し、それによりコスト削減をもたらすことができる。このような場合、最適温度または温度範囲は、低温殺菌温度への軌跡と交差する。
【００９４】
本発明に従う核酸分解プロセスは、比較的急速に実行され得る。本発明の実施形態によると、核酸分解のプロセスは、好熱性ヌクレアーゼの最適温度において４８時間未満、２４時間未満、１時間未未満、４０分間未満、３０分間未満、または２０分間未満の持続期間で実行される。最適な時間の長さは、各好熱性ヌクレアーゼについて、そして特定の実験条件下で、実験的に決定することができる。
【００９５】
本発明は、任意の宿主細胞において使用することができる。宿主細胞の例としては、微生物および高等真核細胞、例えば、農作物または動物細胞などが挙げられる。本発明によると、微生物は、例えば、原核細胞（例えば、細菌または古細菌など）、または真核細胞（例えば、酵母、下等もしくは高等真菌、藻類、または原生動物など）であり得る。好ましい実施形態によると、微生物は、細菌細胞、真菌細胞または酵母、または微細藻類細胞である。
【００９６】
本発明の特定の実施形態では、本発明の方法に従ってその核酸が分解され得る生物は、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、モルチエレラ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、クリプテコディニウム属（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、およびトラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）などであるがこれらに限定されない属に由来の微生物である。
【００９７】
本発明の一実施形態では、本発明に従う宿主細胞は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の利点としては、例えば、扱いやすい遺伝的性質および分子生物学、ゲノムの配列の有効性、種々の費用効果の高い増殖条件への適合性、高細胞密度に増殖する能力、および安全使用の歴史が挙げられる。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を用いて既に広範な商業経験がある。
【００９８】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）は、最も一般的に使用される細菌株であるため有用である。これは、組換えＤＮＡのキャリア株として通常使用されている。
【００９９】
またサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）も、特に、その経験的な取扱いやすさ、および研究者がこの生物を用いて蓄積した幅広い経験のために、本発明に従う有用な宿主細胞である。
【０１００】
本発明に従う宿主細胞は高等真核細胞も含む。「高等真核細胞」という用語は、例えば動物または植物生物において生じるものなどの高度の進化状態の真核細胞を意味する。高等真核細胞は、生命維持に必要な全ての生化学的および代謝機能を独立して実施せず、従って、細胞培養物として増殖され得る。本発明に従う高等真核細胞は、特に、哺乳類、植物、昆虫、または鳥類に由来する全ての細胞を含む。本発明の一実施形態によると、高等真核細胞は哺乳類に由来する。本発明の別の実施形態によると、高等真核細胞は植物に由来する。本発明の別の実施形態によると、高等真核細胞は昆虫に由来する。
【０１０１】
本発明の一実施形態によると、宿主細胞の核酸の分解は、宿主細胞の他の細胞成分に対する影響が全くないかあるいは最小限で実行される。好ましい実施形態では、宿主細胞の核酸の分解は、宿主細胞が産生するように操作された生体化合物および／またはファインケミカルの産生に対する影響が全くないかあるいは最小限で実行される。一実施形態では、宿主細胞はヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株であり、産生するように遺伝子操作された生体化合物には、フィトエン、リコペン、ベータ−カロテン、アルファ−カロテン、ベータ−クリプトキサンチン、ルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、アドニルビン、ビオラキサンチン、アドニキサンチン、ユビキノン、ビタミンＫ、ビタミンＥ、レチノール、レチナール、レチノイン酸、パルミチン酸レチニル、および／またはこれらの修飾形態（これらの化合物の異性化、エステル化、グリコシル化、および分解産物を含むがこれらに限定されない）が含まれる。一実施形態では、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株は、遺伝子改変ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株である。特定の実施形態では、好熱性ヌクレアーゼ遺伝子が導入された遺伝子改変ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株の細胞は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株ＭＬ１２９２４であり、産生される生体化合物はアスタキサンチンである。別の実施形態では、好熱性ヌクレアーゼ遺伝子が導入された遺伝子改変ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株の細胞は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株ＭＬ１２９２１であり、産生される生体化合物はゼアキサンチンである。別の実施形態では、好熱性ヌクレアーゼ遺伝子が導入された遺伝子改変ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株の細胞は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株ＭＬ１２８０５であり、産生される生体化合物はリコペンである。
【０１０２】
本発明の一実施形態では、コドン最適化は、宿主細胞における異種ヌクレアーゼ遺伝子の発現を高めるために実施される。非天然遺伝子の発現は、宿主生物と比較して、そのそれぞれのコドン使用頻度パターンの変化の存在によって妨害されることが当該技術分野において知られている。これらの問題を克服するために、本発明に従うコドン最適化は、遺伝子が宿主細胞に導入される前に、宿主コドン使用頻度に適合するために好熱性ヌクレアーゼ遺伝子において実施される。このプロセスは、元のアミノ酸配列と１００％の同一性またはほぼ１００％の同一性を保持しながら宿主コドン使用頻度バイアスに厳密に適合するために、ヌクレアーゼ遺伝子のＤＮＡ配列内の稀なコドンの置換を包含する。またこのコドン最適化プロセスは、ＧＣ含量の変化に起因し得る予測ｍＲＮＡの二次構造の同時改変も可能にする。
【０１０３】
本発明の好熱性ヌクレアーゼにおいて、コドン使用頻度パターンは、コード化アミノ酸配列を変更することなくコドンを修正するために、好熱性ヌクレアーゼ遺伝子に特有なものから変更される。多数の好熱性ヌクレアーゼ遺伝子の核酸配列が知られている。配列が最初は未知である場合、当業者に既知の方法（ＤＮＡおよびＲＮＡ配列決定を含むがこれらに限定されない）によって情報を得ることができる。本発明によると、好熱性ヌクレアーゼ遺伝子セグメントは、同一の翻訳配列を有するが代替のコドン使用頻度を有する配列に変換された。
【０１０４】
本発明の一実施形態では、天然好熱性ヌクレアーゼＴａｑＩ（配列番号２）のコドン使用頻度パターンは、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のコドンバイアスに対して最適化される。得られたコドン改変ＴａｑＩ遺伝子は、配列番号１で規定される。別の実施形態では、天然好熱性ヌクレアーゼＴａｑＩ（配列番号２）のコドン使用頻度パターンは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコドンバイアスに対して最適化される。得られたコドン改変ＴａｑＩ遺伝子は、配列番号１１で規定される。配列番号１、配列番号２、および配列番号１１によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号３で規定される。
【０１０５】
本発明の一実施形態では、天然好熱性ヌクレアーゼＰｈｏＩ（配列番号９）のコドン使用頻度パターンは、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のコドンバイアスに対して最適化される。得られたコドン改変ｐｈｏＩ遺伝子は配列番号８で規定される。配列番号８および配列番号９によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号１０で規定される。
【０１０６】
配列番号１および配列番号８で示されるコドン改変ｔａｑＩおよびｐｈｏＩ遺伝子は、多数の可能性のあるコドン改変ｔａｑＩおよびｐｈｏＩ遺伝子、または他の好熱性ヌクレアーゼ遺伝子の例としての役割を果たすだけである。本発明に従う好熱性ヌクレアーゼ遺伝子を改変するために任意の適切なコドン改変方法が使用される可能性があり、異なるコドン改変方法の使用から得られる配列が異なり得ることは、当業者に明らかである。ここで本発明は一般的に説明されたが、他に規定されない限り、説明のために本明細書中に含まれ、限定されることは意図されない以下の特定の実施例を参照することによって、本発明はさらに容易に理解されるであろう。
【０１０７】
以下の実施例は本発明を説明する。
【０１０８】
［実施例］
以下の表１は、以下の例証において使用される特定のヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を記述する。
【０１０９】
【表１】
2016512035.tif 000016
【０１１０】
米国特許第７，８５１，１９９Ｂ２号明細書に記載されるようにＭＬ３５０およびＡＴＣＣ２０１２４９から出発して数世代の交雑を伴って、構成的プロモーター（例えば、ＴＥＦ１）の制御下で、異種遺伝子の導入によって、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株ＭＬ８１９５、ＭＬ１２８０５、ＭＬ１１９５６、ＭＬ１２９２４、ＭＬ１１２１８、ＭＬ１２９２１およびＭＬ１３２７０を構築した。ＧＧＳ遺伝子および切断型ＨＭＧ遺伝子（「ＨＭＧ−ｔｒ」）はヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）配列に由来し、それぞれ天然ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼおよびヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子に相当する。ｃａｒＲＰおよびｃａｒＢ遺伝子はムコール・キルキネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）に由来し、それぞれ二官能性フィトエンシンターゼ／リコペンシクラーゼおよびフィトエンデヒドロゲナーゼをコードする。ｃｒｔＷ遺伝子は、パーブラークラ・バームデンシス（Ｐａｒｖｕｌａｒｃｕｌａ  ｂｅｒｍｕｄｅｎｓｉｓ）のカロテンケトラーゼをコードするように合成した。ｃｒｔＺ遺伝子は、キサントバクター・アウトトロフィクス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ（Ｘａ）から増幅するか、あるいは腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）細菌ＤＣ４０４（Ｄｃ）に由来のカロテンヒドロキシラーゼをコードするように合成した（配列番号７）。これらの遺伝子は、栄養要求性マーカー（ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＵＲＡ２、ＬＹＳ１、ＡＤＥ１）またはＨｙｇＲ（ハイグロマイシン耐性）マーカーのレムナントのｌｏｘＰ部位に関連されることも時にはあるが、常にではない。
【０１１１】
［実施例１：ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株構築物のためのプラスミドの作製］
表２に記載されるようにヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）におけるＴａｑＩ好熱性ヌクレアーゼの発現のためにプラスミドを作製した。配列番号１で規定されるようにＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドンバイアスを用いて、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のｔａｑＩヌクレアーゼ遺伝子の配列（配列番号２）に基づいて、コドン最適化ｔａｑＩヌクレアーゼＯＲＦ配列を新規に合成した。このコドン最適化ｔａｑＩヌクレアーゼＯＲＦを、ＮｈｅＩおよびＭｌｕＩを用いて切断し、ＮｈｅＩおよびＭｌｕＩで切断されたｐＭＢ５０８２に連結して、ｐＭＢ６７２２を作製した。得られたｐＭＢ６７２２のコード化ＴａｑＩタンパク質は、配列番号３で規定される。
【０１１２】
第２のプラスミドにおいて、同じｔａｑＩヌクレアーゼ遺伝子配列をプラスミドｐＭＢ６７２２から切除し、異なるプラスミド骨格ｐＭＢ６１５７にクローニングして、新しいプラスミドｐＭＢ６７３６を作製した。
【０１１３】
表２に記載されるように、ＰｈｏＩ好熱性ヌクレアーゼの発現のためのプラスミドを作製した。配列番号８で規定されるようにＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドンバイアスを用いて、パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）ＯＴ３のｐｈｏＩヌクレアーゼ遺伝子の配列（配列番号９）に基づいて、コドン最適化ｐｈｏＩヌクレアーゼＯＲＦ配列を新規に合成した。このコドン最適化ｐｈｏＩヌクレアーゼＯＲＦを、ＮｈｅＩおよびＭｌｕＩを用いて切断し、ＮｈｅＩおよびＭｌｕＩで切断されたｐＭＢ６７７１に連結して、ｐＭＢ６８６８を作製した。得られたｐＭＢ６８６８のコード化ＰｈｏＩタンパク質は、配列番号１０で規定される。
【０１１４】
プラスミドの構築は、基礎的な分子生物学およびＤＮＡ操作手順に基づいて実施した。この実施例および他の実施例で記載される基礎的な分子生物学およびＤＮＡ操作手順は全て、一般的に、ＳａｍｂｒｏｏｋらまたはＡｕｓｕｂｅｌら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ（ｅｄｓ）．１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ，Ｂｒｅｎｔ  Ｒ，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ  ＲＥ，Ｍｏｏｒｅ  ＤＤ，Ｓｅｉｄｍａｎ  ＪＧ，Ｓｍｉｔｈ  ＪＡ，Ｓｔｒｕｈｌ  Ｋ（ｅｄｓ）．１９９８．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に従って実施される。
【０１１５】
【表２】
2016512035.tif 000017
【０１１６】
［実施例２：ＴａｑＩヌクレアーゼを発現するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のヌクレアーゼ活性の実証］
この実施例では、ＴａｑＩヌクレアーゼをコードする遺伝子をＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の宿主株に導入した。宿主株におけるＴａｑＩヌクレアーゼ活性を試験した。
【０１１７】
プラスミドｐＭＢ６７２２をＸｂａＩで切断し、宿主株ＭＬ８１９５に形質転換した（表１）。ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株ＭＬ８１９５は、リコペンを産生するように既に遺伝子改変された菌株である。０．１２ｍＭのアデニンが補充されたＹＮＢグルタメートプレートにおいて異種ｔａｑＩヌクレアーゼ遺伝子が導入された形質転換体を選択した。１つのこのようなコロニーを選択し、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株ＭＬ１２８０５と指定した。１２５ｍＬフラスコ中の２０ｍＬのＹＰＤ培地において、ＭＬ１２８０５を３０℃、２５０ｒｐｍで３日間インキュベートした。培養物を分割し、１．５ｍＬアリコートを６５℃または２５℃で５分間〜２４時間インキュベートした。
【０１１８】
株ＭＬ８１９５およびＭＬ１２８０５からＤＮＡを抽出し、６５℃または２５℃におけるインキュベーションの後に分析した。ＤＮＡは、「Ｓｍａｓｈ  ａｎｄ  Ｇｒａｂ」酵母ゲノムＤＮＡ抽出プロトコルを用いて抽出した。本質的に、１．５ｍＬの３日培養物をペレット化し、上清をデカントし、細胞を０．５ｍＬの水中に再懸濁させた。細胞を１０秒間ペレット化し、上清をデカントした。ペレットを０．２ｍＬのＳｍａｓｈ  ａｎｄ  Ｇｒａｂ溶液（１％のＳＤＳ、２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）中に再懸濁させ、０．２ｍＬのフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール、および０．３ｇのガラスビーズを添加した。マルチチューブホルダーを用いて管を５分間ボルテックスした。混合物に、０．２ｍＬのＴＥ  ｐＨ８．０（１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ）を添加し、５分間遠心分離した。水相を新しい管に移し、１．０ｍＬの冷エタノールを添加し、混合して、ＤＮＡを沈殿させた。５分間の遠心分離の後、上清を除去した。７５μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅＡを含む０．４ｍＬのＴＥ中にペレットを再懸濁させ、室温で５分間インキュベートした。１０μＬの４Ｍ酢酸アンモニウムおよび１．０ｍＬのエタノールを添加した。氷上で５分間のインキュベーションおよび１０分間の遠心分離の後、上清を廃棄した。ペレットを０．５ｍＬの７０％エタノールで洗浄し、１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを風乾し、次に、１００μＬのＴＥ中に再懸濁させた。１×Ｔｒｉｓ−酢酸−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）中の０．８％アガロースゲルにおいて１．５時間にわたり１００Ｖで緩衝液を走らせる電気泳動法によって、上記抽出プロセスから得られたＤＮＡを分析した。
【０１１９】
図１に示されるように、ｔａｑＩヌクレアーゼ遺伝子を有さないＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の宿主株（ＭＬ８１９５）は、６５℃または２５℃のいずれでもＤＮＡ分解活性を示さなかった。ｔａｑＩヌクレアーゼ遺伝子を包含するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の宿主株（ＭＬ１２８０５）は６５℃でＤＮＡ分解活性を示したが、２５℃では示さなかった。分解活性は早くも細胞培養物を６５℃でインキュベートした２０分後に観察された。２４時間インキュベートした後でも、ＭＬ１２８０５株は２５℃でＤＮＡ分解活性を全く示さなかった。これは、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株のＴａｑＩヌクレアーゼが２５℃で潜在性であることを示す。
【０１２０】
［実施例３：ＴａｑＩの温度活性プロファイル］
この実施例では、ＴａｑＩヌクレアーゼの活性を異なる温度で調査した。
【０１２１】
実施例２に記載されるように、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株ＭＬ１２８０５およびＭＬ８１９５を３日間増殖させた。ＭＬ１２８０５およびＭＬ８１９５細胞の１．５ｍＬのアリコートを２５℃、３０℃、４０℃、５０℃および６５℃の温度で１．５時間インキュベートし、実施例２に記載されるようにＤＮＡを抽出し、分析した。
【０１２２】
図２に示されるように、株ＭＬ１２８０５およびＭＬ８１９５の両方において、ＤＮＡの分解は２５℃、３０℃、４０℃、および５０℃の温度では観察されなかった。実施例２で示されたように、６５℃では株ＭＬ１２８０５においてのみＤＮＡの分解が観察された。結果は、ＴａｑＩヌクレアーゼが５０℃以下の温度で潜在性であることを示す。
【０１２３】
［実施例４：インビボでＴａｑＩ消化されたｇＤＮＡのＰＣＲ分析］
この実施例では、組換えＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株における異種ｃａｒＢ遺伝子の分解を調査した。
【０１２４】
ｃａｒＢ遺伝子は１７４０ヌクレオチドの長さであり、カロテノイド生合成経路内の酵素であるフィトエンデヒドロゲナーゼをコードする。ｃａｒＢ遺伝子は、カロテノイドの産生を可能にするためにＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に導入されている。実施例２に記載されるように、ＭＬ８１９５はいずれの好熱性ヌクレアーゼも有さないリコペン産生株であり、ＭＬ１２８０５は、ｔａｑＩヌクレアーゼ遺伝子を含有するＭＬ８１９５の誘導体である。従って、いずれの株もｃａｒＢ遺伝子を含有する。
【０１２５】
ｃａｒＢ遺伝子の存在を株ＭＬ８１９５およびＭＬ１２８０５において２５℃および６５℃の両方で調査した。２５℃または６５℃で２４時間インキュベートしたＭＬ１２８０５からのゲノムＤＮＡの連続希釈を作製した。ｃａｒＢ遺伝子の５２９ｂｐ断片を増幅するように設計されたプライマーを用いて、上記サンプルにおいてＰＣＲを実施した。プライマーＭＯ４６４１の配列は、配列番号５で規定される。プライマーＭＯ４６４２の配列は、配列番号６で規定される。オリゴＭＯ４６４１およびＭＯ４６４２間のｃａｒＢ遺伝子のＤＮＡ断片は、２つのＴａｑＩ部位を含有する。
【０１２６】
ＰＣＲは、以下に記載される条件下で実施した。各２５μＬの反応において、１μＬの希釈ｇＤＮＡを０．５μＬの各プライマー（１０μΜの原液）、０．５μＬの水および２２．５μＬのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｓｕｐｅｒ  Ｍｉｘと混ぜ合わせた。反応パラメータは、９４℃で２分間を１サイクル、その後９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間および７２℃で６０秒間を４５サイクルであった。ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＴＣ−２２５  Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒにおいて、７２℃で５分間の最後の１サイクルによりＰＣＲを終了させた。反応全体に１×ローディング色素を加えたものを、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウム含む１×ＴＡＥゲル中２％アガロースにロードし、１００Ｖで１．５時間走らせた。
【０１２７】
図３に示されるように、ｔａｑＩヌクレアーゼ遺伝子が導入されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株（ＭＬ１２８０５）について、２５℃でインキュベートしたサンプル中にｃａｒＢの５２９ｂｐのＰＣＲ産物が観察されたが、６５℃でインキュベートしたサンプルでは観察されなかった（当業者には知られているように、アッセイの感受性を実証するためにＰＣＲ鋳型の連続希釈を実施した）。これらの結果は、６５℃でインキュベートした場合に、株ＭＬ１２８０５においてＴａｑＩヌクレアーゼが組換えＤＮＡ（ｃａｒＢ遺伝子）を分解したことを示す。また図３は、株ＭＬ１２８０５内の外来性ＤＮＡが分解のために標的化され得ること、そして切断が完全であり、その結果約５００ヌクレオチドの検出可能な断片を全く生じないことを説明する。
【０１２８】
［実施例５ａ：ｔａｑＩ好熱性ヌクレアーゼ遺伝子を包含するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株におけるアスタキサンチンの産生］
この実施例では、ｔａｑＩヌクレアーゼ遺伝子の導入の前後両方において、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の株におけるアスタキサンチンの産生を調査した。
【０１２９】
この実施例では、アスタキサンチンを産生するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の株（ＭＬ１１９５６）を使用した。ｔａｑＩヌクレアーゼ遺伝子（ＭＢ６７３６）を株ＭＬ１１９５６に導入することによって、第２の株（ＭＬ１２９２４）を構築した。アスタキサンチンおよびその前駆体の量を両方の株において測定した。測定は、細胞増殖期間の間の様々な時点で、および宿主株を６５℃でインキュベートした後に行った。
【０１３０】
流加プロセスを用いて株ＭＬ１１９５６およびＭＬ１２９２４を発酵槽内で増殖させた。発酵プロセス中の様々な時点でサンプルをとり、米国特許第７，８５１，１９９Ｂ２号明細書において以前に記載された方法に従ってカロテノイド分析を実施した。
【０１３１】
図４は、株ＭＬ１１９５６が増殖するにつれてアスタキサンチンの量が増大し、産生は最終的にプラトーに達したことを示す。ＭＬ１１９５６を６５℃でインキュベートした後、アスタキサンチンの量は変化しなかった。株ＭＬ１２９２４は、株ＭＬ１１９５６と同じように挙動した。株ＭＬ１２９２４によって産生されるアスタキサンチンの量は、発酵期間を通して、および６５℃のインキュベーションの後も株ＭＬ１１９５６の場合と同じであった。同様に産生されるアスタキサンチン前駆体の量も６５℃におけるインキュベーションの前後の株ＭＬ１１９５６およびＭＬ１２９２４において未変化のままであった。この結果は、ｔａｑＩヌクレアーゼ遺伝子の導入もその活性の活性化も、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）によって産生されるアスタキサンチンの量または純度に影響を与えないことを示す。
【０１３２】
［実施例５ｂ：ｔａｑＩ好熱性ヌクレアーゼ遺伝子を包含するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株におけるゼアキサンチンの産生］
この実施例では、ｔａｑＩヌクレアーゼ遺伝子を有するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の宿主株におけるゼアキサンチンの産生を調査した。
【０１３３】
この実施例では、ゼアキサンチンを産生するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の株（ＭＬ１１２１８）をｔａｑＩヌクレアーゼ遺伝子（ＭＢ６７３６）で形質転換した。得られたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株（ＭＬ１２９２１）において、産生されたゼアキサンチンおよびその前駆体の量を測定した。測定は細胞増殖期間の間の様々な時点で行い、および宿主株を６５℃でインキュベートした後にも行った。
【０１３４】
流加プロセスを用いて株ＭＬ１２９２１を発酵槽内で増殖させた。発酵プロセス中の様々な時点でサンプルをとり、米国特許第７，８５１，１９９Ｂ２号明細書において以前に記載された方法に従ってカロテノイド分析を実施した。
【０１３５】
図５は、株ＭＬ１２９２１が増殖するにつれてゼアキサンチンの量が増大し、産生は最終的にプラトーに達したことを示す。産生されたゼアキサンチンの量は、宿主細胞を６５℃でインキュベートした後変化しなかった。宿主細胞を６５℃でインキュベートした後のゼアキサンチン前駆体の量も同じままであった。対照株ＭＬ１１２１８（図示せず）において、ゼアキサンチンの産生は、全ての試験条件下でＭＬ１２９２１と同様であった。この結果は、ＴａｑＩヌクレアーゼの存在もその活性化も、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるゼアキサンチンの産生または純度に影響を与えないことを示す。
【０１３６】
［実施例５ｃ：アスタキサンチンまたはゼアキサンチンを産生する株におけるＴａｑＩヌクレアーゼ活性の実証］
この例では、実施例５ａおよび５ｂに記載されるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株ＭＬ１１９５６、ＭＬ１２９２４、およびＭＬ１２９２１のＴａｑＩヌクレアーゼ活性を調査した。
【０１３７】
株ＭＬ１１９５６、ＭＬ１２９２４、およびＭＬ１２９２１を発酵槽内で増殖させた。株ＭＬ１１９５６およびＭＬ１２９２４（より長い発酵でアスタキサンチンを産生する）について、接種の４６、１２１および２３６時間後にサンプルをとった。株ＭＬ１２９２１（より短い発酵でゼアキサンチンを産生する）については、接種の４６および６９時間後にサンプルをとった。発酵プロセス（アスタキサンチン株については２３６時間およびゼアキサンチン株については６９時間）の最後に、温度を６５℃に上昇させ、株をこの温度で６時間インキュベートした。より高い温度への移行の０分、１０分、３０分、２時間および６時間後にサンプルをとった。実施例２に記載されるように、ＤＮＡを抽出して分析した。
【０１３８】
図６に示されるように、ヌクレアーゼを有さない株ＭＬ１１９５６においてＤＮＡの分解は全く観察されなかった。株ＭＬ１２９２４およびＭＬ１２９２１の両方において、細胞を６５℃でインキュベートした後にＤＮＡの分解が観察された。上記結果により、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株においてＴａｑＩヌクレアーゼは発酵温度で潜在性であるが、６５℃では活性であり、所望の最終産物（アスタキサンチンまたはゼアキサンチン）の量または純度に影響を与えることのないＤＮＡ分解が可能であることが示される。
【０１３９】
［実施例６：ＴａｑＩおよびＰｈｏＩのそれぞれの最適温度を中心とした温度範囲］
この実施例では、ＴａｑＩおよびＰｈｏＩヌクレアーゼの活性を、その最適温度およびその付近において調査した。
【０１４０】
図７に示されるように、ｔａｑＩヌクレアーゼ遺伝子を包含するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の株（ＭＬ１２９２１）は６５℃でＤＮＡ分解活性を示したが、２５℃では示さなかった。ＭＬ１２９２１はさらに、６０℃および７０℃、すなわちＴａｑＩヌクレアーゼ活性の最適温度の６５℃±５℃でＤＮＡ分解活性を示した。同様に、ＰｈｏＩヌクレアーゼ遺伝子を有するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の宿主株（ＭＬ１３２７０）は７５℃でＤＮＡ分解活性を示したが、２５℃では示さなかった。またＭＬ１３２７０は、７０℃および８０℃、すなわちＰｈｏＩヌクレアーゼ活性の最適温度の７５℃±５℃でＤＮＡ分解活性を示した。結果は、外因性ヌクレアーゼ遺伝子で形質転換されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）宿主株において、宿主株のゲノムＤＮＡが、ヌクレアーゼ遺伝子の最適温度を中心とした少なくとも１０度の温度範囲内で分解され得ることを示す。この結果は、各ヌクレアーゼが異なる最適温度を有する２つの異なるヌクレアーゼで観察された。
【０１４１】
［実施例７：細菌の発現のためのプラスミドの作製］
表３に示されるように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＴａｑＩ好熱性ヌクレアーゼの発現のためにプラスミドを作製した。配列番号１１で規定されるように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドンバイアスを用いて、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のｔａｑＩヌクレアーゼ遺伝子の配列（配列番号２）に基づいて、コドン最適化ｔａｑＩヌクレアーゼＯＲＦ配列を新規に合成した。このコドン最適化ｔａｑＩヌクレアーゼＯＲＦを、ＮｃｏＩおよびＡｃｃ６５Ｉを用いて切断し、ＮｃｏＩおよびＡｃｃ６５Ｉで切断されたｐＭＢ４１２４（ＫａｎＲ  ｏｒｉＰ１５）に連結して、ｐＭＢ７２６８（ｔｒｃＰ−ｔａｑＩ）を作製した。得られたｐＭＢ７２６８のコード化ＴａｑＩタンパク質は、配列番号３で規定される。
【０１４２】
コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）におけるＴａｑＩ好熱性ヌクレアーゼの発現のために、オリゴＭＯ９３１５およびＭＯ９３１６ならびに鋳型としてｐＭＢ６７３６を用いるＰＣＲによって断片を作製し、ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩで切断し、ＮｃｏＩおよびＡｃｃ６５Ｉで切断したｐＭＢ４１２４に連結して、ｐＭＢ７２６３（ｔｒｃＰ−ｔａｑＩ）を作製した。得られたｐＭＢ７２６３のコード化ＴａｑＩタンパク質は、配列番号３で規定される。プライマーＭＯ９３１５の配列は、配列番号１２で規定される。プライマーＭＯ９３１６の配列は、配列番号１３で規定される。
【０１４３】
【表３】
2016512035.tif 000018
【０１４４】
［実施例８：ＴａｑＩヌクレアーゼを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のヌクレアーゼ活性の実証］
この実施例では、ＴａｑＩヌクレアーゼをコードする遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の宿主株に導入した。宿主株におけるＴａｑＩヌクレアーゼ活性を試験した。
【０１４５】
ｐＭＢ４１２４（ｔｒｃＰ−ｌａｃＺ）またはｐＭＢ７２６８（ｔｒｃＰ−ｔａｑＩ）のいずれかを包含する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α（Ｆ−φ８０ｌａｃＺΔＭ１５Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９ｒｅｃＡ１ｅｎｄＡ１ｈｓｄＲ１７（ｒＫ−，ｍＫ＋）ｐｈｏＡｓｕｐＥ４４ラムダ−ｔｈｉ−１ｇｙｒＡ９６ｒｅｌＡ１）を３０℃で対数期まで増殖させ、３７℃に変化させて１時間増殖させ、そして５００μΜのイソプロピルベータＤ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により２．５時間誘発した。次に、細胞を２５℃で４および１８時間、または６５℃で１．５、４、および１８時間インキュベートした。プロテイナーゼＫ消化のためのインキュベーション温度を２２℃に変えた点を除いて製造業者の推奨に従ってＱｉａｇｅｎ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＤＮｅａｓｙ  Ｋｉｔを用いて約１Ａ６００単位の細胞から全ＤＮＡを作製した。図８に示されるように、ｔｒｃＰ−ｔａｑＩ構築物を包含する細胞は６５℃で広範なＤＮＡ分解を示したが、２５℃では示さなかった。ｔｒｃＰ−ｔａｑＩ構築物を有さない対照細胞は、いずれの温度でも分解を示さない。
【０１４６】
［実施例９：ＴａｑＩヌクレアーゼを発現するＣ．グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）のヌクレアーゼ活性の実証］
この実施例では、ＴａｑＩヌクレアーゼをコードする遺伝子をＣ．グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の宿主株に導入した。宿主株におけるＴａｑＩヌクレアーゼ活性を試験した。
【０１４７】
Ｃ．グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ｇｐｄプロモーターにより駆動されるストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）ｈｏｍのフィードバック耐性対立遺伝子（Ｇ３６２Ｅ）を有するＡＴＣＣ１３０３２において天然ｈｏｍ（ｔｈｒＡ）−ｔｈｒＢオペロンを置換することによって、Ｃ．グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株ＭＡ４２８を構築した（米国特許出願第１０／８５８，７３０号明細書、現在は放棄されている）。この株をｐＭＢ７２６３（ｔｒｃＰ−ｔａｑＩ）で形質転換し、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充したＢＨＩ培地において３０℃でＫａｎＲコロニーを増殖させ、２５０μΜのＩＰＴＧにより一晩誘発させた。次に、細胞を２５、６０、６５または７０℃でインキュベートし、プロテイナーゼＫ消化のインキュベーション温度を２２℃に変えた点を除いてグラム陽性細菌についての製造業者の推奨に従ってＱｉａｇｅｎ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＤＮｅａｓｙ  Ｋｉｔを用いて、ＤＮＡを抽出した。ｔｒｃＰ−ｔａｑＩ構築物を包含する細胞を２５℃で５時間および６５℃で０．５、１、２．５および５時間インキュベートした。図９に示されるように、ｔｒｃＰ−ｔａｑＩ構築物を含有する細胞は６５℃で広範なＤＮＡ分解を示したが、２５℃では示さなかった。図１０は、活性の温度依存性を示す（インキュベーションは全て５時間であった）。宿主株Ｃ．グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）のゲノムＤＮＡは、ＴａｑＩヌクレアーゼの最適温度の６５℃を中心とした少なくとも１０度の温度範囲内で分解された。
【０１４８】
本明細書に記載される種々の態様、実施形態、および選択肢は全て、任意および全ての変化形態で結合され得る。
【０１４９】
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願がそれぞれ参照によって援用されることが明確かつ個別に示された場合と同じ程度まで参照によって本明細書中に援用される。
【図１】
2016512035.tif 000019
【図２】
2016512035.tif 000020
【図３】
2016512035.tif 000021
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2016512035.tif 000025
【図８】
2016512035.tif 000026
【図９】
2016512035.tif 000027
【図１０】
2016512035.tif 000028
【配列表】
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【国際調査報告】
2016512035.tif 000029
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