(57)【要約】  本開示は、ポリペプチドの融合体を含むポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、免疫診断試薬、キットおよびＨＣＶ抗体の存在を検出する使用のための免疫測定法に関する。さらに具体的には、本発明は、抗ＨＣＶ抗体の検出に使用することができる特異的ＮＳ３抗原を記載する。
2016512241.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリカーゼのドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩのそれぞれを含むＮＳ３ヘリカーゼ配列を含有している組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原であって、ここでは、前記抗原が、Ｃ３３抗原と比較して試験試料由来のＨＣＶ抗体に対して増大した免疫反応性を有し、ここでは、前記組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原が：
野生型ＮＳ３ヘリカーゼのＡＴＰ結合活性と比較して低下したＡＴＰ結合活性
野生型ＮＳ３ヘリカーゼのＡＴＰ結合活性と比較した野生型ＮＳ３と比較して低下したＡＴＰａｓｅ活性、および
野生型ＮＳ３ヘリカーゼの酸化還元安定性と比較して増大した酸化還元安定性
からなる群より選択される１つ以上の特徴を含む、
組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項２】
前記抗原が、前記ＮＳ３ヘリカーゼのＣ末端に少なくとも１つのシステイン残基の付加をさらに含む、請求項１に記載の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項３】
前記抗原が、前記ＮＳ３ヘリカーゼのＣ末端に２つのシステイン残基の付加を含む、請求項２に記載の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項４】
前記野生型ＨＣＶ  ＮＳ３が配列番号８７の配列を含み、前記抗原が配列番号８７の配列と比較して少なくとも１つの突然変異を含む、請求項１に記載の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項５】
前記突然変異が、前記配列番号８７の１つ以上のシステイン残基の任意の他のアミノ酸への突然変異を含む、請求項４に記載の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項６】
前記突然変異が、前記１つ以上のシステイン残基の対応するセリン残基への突然変異を含む、請求項４に記載の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項７】
前記突然変異が、ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼのドメインＩＩＩ由来のシステイン残基の１つ以上の突然変異を含む、請求項６に記載の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項８】
前記システイン残基の突然変異が、配列番号８７のＣ２９２、Ｃ３６８、Ｃ３７４、Ｃ４９９およびＣ５２５からなる群より選択される１つ以上のシステイン残基の突然変異を含む、請求項５に記載の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項９】
前記抗原が、少なくとも２つの前記システイン残基が対応するセリン残基によって置き換えられているＨＣＶ  ＮＳ３突然変異体である、請求項５に記載の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項１０】
前記抗原が、前記ＮＳ３ヘリカーゼのＣ末端に少なくとも１つのシステイン残基の付加をさらに含む、請求項５に記載の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項１１】
ＡＴＰ結合を減少させるかまたはＡＴＰａｓｅ活性を低下させる前記突然変異が、配列番号８７のＫ２１０、Ｓ２１１、Ｔ２１２、Ｙ２４１、Ｄ２９０、Ｅ２９１、Ｈ２９３、Ｔ４１９、Ｑ４６０、Ｒ４６４、Ｒ４６７およびＷ５０１からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸残基の任意の他のアミノ酸残基での置き換えである、請求項４に記載の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項１２】
前記突然変異が、配列番号８７と比較してＫ２１０Ｎ、Ｓ２１１Ａ、Ｔ２１２Ｅ、Ｙ２４１Ｓ、Ｄ２９０Ｎ、Ｅ２９１Ｑ、Ｈ２９３Ａ、Ｔ４１９Ｇ、Ｑ４６０Ｈ、Ｒ４６４Ａ、Ｒ４６７ＫおよびＷ５０１Ａからなる群より選択される、請求項１１に記載の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項１３】
前記抗原が、前記配列番号８７の１つ以上のシステイン残基の任意の他のアミノ酸への突然変異をさらに含む、請求項１１に記載の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項１４】
前記配列番号８７の１つ以上のシステイン残基の前記突然変異が、配列番号８７のＣ２９２、Ｃ３６８、Ｃ３７４、Ｃ４９９およびＣ５２５からなる群より選択される１つ以上のシステイン残基の突然変異を含む、請求項１３に記載の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項１５】
前記抗原が、前記ＮＳ３ヘリカーゼのＣ末端に少なくとも１つのシステイン残基の付加をさらに含む、請求項１１に記載の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項１６】
前記抗原が、前記ＮＳ３ヘリカーゼのＣ末端に少なくとも１つのシステイン残基の付加をさらに含む、請求項１４に記載の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項１７】
前記ＮＳ３ヘリカーゼのＣ末端でのシステイン残基の前記付加が、ＧＧＣＳＧＧＡ、ＤＥＣＨＳＴＤおよびＳＫＫＫＣＤＥからなる群より選択される配列の前記ＮＳ３ヘリカーゼのＣ末端への付加を含む、請求項１５に記載の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項１８】
前記ＮＳ３ヘリカーゼのＣ末端でのシステイン残基の前記付加が、ＧＧＣＳＧＧＡ、ＤＥＣＨＳＴＤおよびＳＫＫＫＣＤＥからなる群より選択される配列の前記ＮＳ３ヘリカーゼのＣ末端への付加を含む、請求項１６に記載の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項１９】
前記ＮＳ３ヘリカーゼのＣ末端での少なくとも１つのシステイン残基の前記付加が、ＧＳＧＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＧＧＣＳＧＧＡＲＳＧＣ、ＧＳＧＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＤＥＣＨＳＴＤＲＳＧＣおよびＧＳＧＣＧＨＨＨＨＨＨＨＨＧＧＣＳＧＧＡからなる群より選択される配列の付加を含む、請求項１５に記載の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項２０】
前記ＮＳ３ヘリカーゼのＣ末端での少なくとも１つのシステイン残基の前記付加が、ＧＳＧＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＧＧＣＳＧＧＡＲＳＧＣ、ＧＳＧＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＤＥＣＨＳＴＤＲＳＧＣおよびＧＳＧＣＧＨＨＨＨＨＨＨＨＧＧＣＳＧＧＡからなる群より選択される配列の付加を含む、請求項１６に記載の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項２１】
前記Ｃ末端配列が、シグナルを発生する部分への結合により修飾されている、請求項１８、１９、または２０のいずれか一項に記載の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項２２】
前記抗原がヒスチジンタグをさらに含む、請求項１５に記載の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項２３】
前記抗原がヒスチジンタグをさらに含む、請求項１６に記載の組換え体。
【請求項２４】
前記ヒスチジンタグが配列番号８７のＣ末端と前記付加された配列のＮ末端との間に配置されている、請求項２２に記載の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項２５】
前記ヒスチジンタグが配列番号８７のＣ末端と前記付加された配列のＮ末端との間に配置されている、請求項２３に記載の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項２６】
前記抗原がビオチニル化されている、請求項１から２５のいずれかに記載の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項２７】
前記ビオチニル化が前記抗原のＮ末端にある、請求項２６に記載の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項２８】
前記ビオチニル化が前記抗原のＣ末端にある、請求項２６に記載の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項２９】
前記ビオチニル化が部位特異的ビオチニル化である、請求項２６に記載の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項３０】
請求項１から２９のいずれかに記載の組換えＨＣＶ抗原をコードする単離された核酸。
【請求項３１】
請求項３０に記載の単離された核酸を含有している発現ベクター。
【請求項３２】
請求項３１に記載の発現ベクターで形質転換されたかまたはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項３３】
前記宿主細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
請求項１から２９のいずれかに記載の組換えＨＣＶ抗原を含有している免疫診断試薬。
【請求項３５】
固体支持体をさらに含有している、請求項３４に記載の免疫診断試薬。
【請求項３６】
前記固体支持体が微粒子であり、前記組換え抗原が前記微粒子に結合させられている、請求項３４に記載の免疫診断試薬。
【請求項３７】
前記組換え抗原が蛍光標識で検出可能であるように標識されている、請求項３４に記載の免疫診断試薬。
【請求項３８】
請求項３４に記載の免疫診断試薬を含有しており、抗ＨＣＶ抗体と免疫反応性であるエピトープを含有しているさらなる単離されたＨＣＶ抗原をさらに含有している、キット。
【請求項３９】
前記さらなるＨＣＶ抗原がＨＣＶコア抗原である、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
前記組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原と前記さらなるＨＣＶ抗原が同じ固相上に一緒にコーティングされる、請求項３８に記載のキット。
【請求項４１】
前記組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原と前記コア抗原が別の固相上にコーティングされる、請求項３８に記載のキット。
【請求項４２】
ヒト抗体の検出のための抗体をさらに含有している、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
検出可能な標識を含有してもよい抗ＨＣＶ抗体をさらに含有している、請求項４１に記載のキット。
【請求項４４】
試験試料中の抗ＨＣＶ抗体の存在を決定する免疫測定法であって、前記試験試料中の前記組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原と前記抗ＨＣＶ抗体との間で複合体を形成させる条件下で、前記試験試料を請求項３４に記載の免疫診断薬と接触させる工程、および前記複合体の存在を検出する工程を含み、ここでは、前記複合体の存在が前記試験試料中の抗ＨＣＶ抗体の指標となる、免疫測定法。
【請求項４５】
前記複合体の形成の前記検出が、標識された抗ヒト抗体の前記複合体に対する結合の決定により検出される、請求項４４に記載の免疫測定法。
【請求項４６】
前記標識された抗ヒト抗体が蛍光標識で標識される、請求項４５に記載の免疫測定法。
【請求項４７】
前記標識された抗ヒト抗体がアクリジニウムで標識される、請求項４５に記載の免疫測定法。
【請求項４８】
組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原が微粒子上にコーティングされる、請求項４４に記載の免疫測定法。
【請求項４９】
前記方法が、ＨＣＶコア抗原に対する抗体の存在を決定するために前記試験試料をアッセイする工程をさらに含む、請求項４４に記載の免疫測定法。
【請求項５０】
前記組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原と前記ＨＣＶコア抗原が同じ微粒子上に一緒にコーティングされる、請求項４９に記載の免疫測定法。
【請求項５１】
前記組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原と前記ＨＣＶコア抗原が別の微粒子上にコーティングされる、請求項４９に記載の免疫測定法。
【請求項５２】
試験試料が患者から得られ、方法が、患者の治療的／予防的処置の有効性を診断、予後判定、または評価する工程をさらに含み、ここでは、方法が患者の治療的／予防的処置の有効性を評価する工程をさらに含む場合は、方法は、有効性を改善することが必要な患者の治療的／予防的処置を改変する工程をさらに含んでもよい、請求項４９に記載の免疫測定法。
【請求項５３】
方法が、自動化システムまたは半自動化システムでの使用に適合させられる、請求項４９に記載の免疫測定法。
【請求項５４】
ヘリカーゼのドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩのそれぞれを含む、ＮＳ３ヘリカーゼ配列を含有している組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原であって、前記抗原が、Ｃ３３抗原と比較して血清由来のＨＣＶ抗体に対して増大した免疫反応性を有し、前記組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原が、野生型ＮＳ３ヘリカーゼの酸化還元安定性と比較して増大した酸化還元安定性を含む、組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【請求項５５】
ヘリカーゼのドメインＩおよびＩＩのそれぞれを含む、ＮＳ３ヘリカーゼ配列を含有している組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原であって、前記抗原が、Ｃ３３抗原と比較して血清由来のＨＣＶ抗体に対して増大した免疫反応性を有し、前記組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原が、野生型ＮＳ３ヘリカーゼの酸化還元安定性と比較して増大した酸化還元安定性を含む、組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年３月１４日に提出された米国特許仮出願番号第６１／７８４，８２２号および２０１３年３月１４日に提出された米国特許仮出願番号第６１／７８４，８２２号の優先権の利点を主張するＰＣＴ特許出願として提出される。上記出願の本文全体が、この全体において参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、ポリペプチドの融合体を含むポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、免疫診断試薬、キットおよびＨＣＶ抗体の存在を検出する使用のための免疫測定法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＷＨＯの統計によると、世界中で１億７千万人もの多くの人が肝臓のウイルス感染症であるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染する。ＨＣＶに感染した人の７５から８５％は慢性感染へと進行し、これらの症例のおよそ２０％が、肝硬変または肝細胞癌を含む慢性Ｃ型肝炎の合併症を、感染の２０年後に発症する。ＨＣＶ感染症について現在推奨されている処置は、インターフェロンとリバビリン薬物の併用である。しかし、処置は全ての症例に有効ではなく、肝臓移植が、Ｃ型肝炎に関連する末期の肝臓疾患には必要である。現在、ＨＣＶ感染を予防するために利用できるワクチンは存在せず、従って、感染を避けるためにはあらゆる予防策をとらなければならない。
【０００４】
従って、患者の管理、ならびに血液および血液製剤による、または密接な個人的接触によるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の伝染の予防には、感度の高い検出分析を使用する相当の警戒が必要である。この相当の警戒は、ＨＣＶのキャリアおよびＨＣＶが混入している血液または血液製剤をスクリーニングおよび同定するための特別な方法の必要性につながる。ＨＣＶへの曝露の血清学的決定は、ヒトの血漿または血清中に存在する抗ＨＣＶ抗体の検出に頼る。これらの抗ＨＣＶ抗体は、ウイルスによりコードされる多数の異なる構造タンパク質および非構造タンパク質に向けられている。
【０００５】
ＨＣＶウイルスは、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科のＨｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ属の（＋）センス一本鎖エンベロープＲＮＡウイルスである。ウイルスゲノムはおよそ１０ｋｂの長さであり、３０１１アミノ酸のポリタンパク質前駆体をコードする。ＨＣＶゲノムは、特有のポリタンパク質をコードする大きな１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。このポリタンパク質は、細胞性プロテアーゼおよびウイルスのプロテアーゼにより、３つの構造タンパク質（即ち、コア、Ｅ１およびＥ２）、および少なくとも６個の非構造ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂタンパク質に、翻訳と同時および翻訳後にプロセシングされる（Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：３５９−３６２（１９８９））。
【０００６】
被験体がＨＣＶに曝されているかどうかを決定するアッセイが市販されている。これらの血清学的アッセイは、典型的には、抗ＨＣＶ抗体が固相上に存在する組換えＨＣＶ抗原により捕捉され、続いて、標識された抗ヒト抗体結合体により抗ＨＣＶ抗体が検出される間接的な形式を使用する。ＨＣＶの幾つかの抗原性領域が同定されているが、これらの領域由来のペプチドおよび組換えタンパク質は、ＨＣＶキャリアの検出および診断において様々な程度の感度および選択性を示す。
【０００７】
例えば、ＨＣ４３は、ヒトの血清または血漿中のＨＣＶ抗体の検出に使用される１つのこのような組換えタンパク質である。ＨＣ４３は、ＮＳ３タンパク質のＣ３３領域（ＨＣＶ−１アミノ酸１１９２−１４５７）と、コアまたはヌクレオキャプシド構造タンパク質（ＨＣＶ−１アミノ酸１−１５０）を含む。ＨＣ４３は、バクテリオファージラムダのｐＬプロモーターを含有しているプラスミド（ｐＫＲＲ８２６）（米国特許第６，８４６，９０５号明細書に記載されている。）を使用し、ＨＣＶ  Ｈ株由来のコドン最適化配列（即ち、ＨＣＶ−１；Ｏｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：３３９２−３３９６（１９９１））を利用することにより、融合タンパク質として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中で発現される。２つの非ＨＣＶコードアミノ酸が、ＮＳ３とコア配列とを隔てている。このような融合タンパク質を使用する抗ＨＣＶアッセイが市販されている。この融合タンパク質の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での温度誘導性システムを介する発現は、不溶性封入体の形成を生じる。これらは、免疫測定法において（固相抗体捕捉試薬として）使用される純粋な単量体タンパク質を得るために、尿素、還元剤およびＳＤＳで可溶化されなければならない。Ａｂｂｏｔｔが所有する米国特許の中で開示されているこのタンパク質の誘導体（例えば、９ＭＢ３１）は短縮型コアタンパク質配列を含み、温度誘導性システムにおいて発現されて、不溶性であるタンパク質を生じる。
【０００８】
抗ＨＣＶ抗体の検出に使用される別のこのような組換えタンパク質はＣ１００である。この組換えタンパク質は、ＨＣＶゲノムのＮＳ３およびＮＳ４領域（ＨＣＶアミノ酸１５６９−１９３１）に由来し、５２７アミノ酸のＮ末端スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）融合体とともに酵母の中で発現される（例えば、米国特許第５，３５０，６７１号を参照のこと）。ＨＣＶゲノムの３６３アミノ酸は組換えタンパク質中に存在するが、複数の研究により、抗体結合の大部分がＮＳ４領域内の２つのさらに小さい領域で起こることが明らかにされている。第１の領域は５−１−１領域であり、５−１−１領域はＨＣＶアミノ酸１６９１−１７３３を含み、第２の領域はＨＣＶアミノ酸１９２１−１９４０からなるＣ１００領域である。
【０００９】
免疫測定法の開発に使用される他のＮＳ３ヘリカーゼ構築物は、Ｊｉｎ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｒ  Ｂｉｏｃｈ  Ｂｉｏｐｈｙｓ，１９９５，３２３：４７−５３；Ｓａｌｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，７７：２７２１−２７２８；Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２８：２１９−２２４）に記載されているが、これらの構築物は残基１２０７−１６１２を含み、全長のヘリカーゼ（１２０７−１６５７）を含まれない。加えて、上記タンパク質は再び不溶性形態で発現され、変性条件下で精製され、免疫測定法でのそれらの使用の前に、酵素活性を再度獲得させるためのタンパク質折り畳み技術が必要である。
【００１０】
多くのＨＣＶ診断アッセイが様々な形態でＮＳ３抗原を利用する。ＨＣＶ  ＮＳ３は、このＮ末端の３分の１内にセリンプロテアーゼドメインおよびこのＣ末端の３分の２内にＮＴＰａｓｅ／ヘリカーゼドメインを含有している多機能性タンパク質である。全てのＮＴＰおよびｄＮＴＰを加水分解することができる、ポリヌクレオチドにより刺激されたＮＴＰａｓｅ活性が示されているが、ＡＴＰと二価イオンを必要とするＲＮＡヘリカーゼ活性もまた同定されている。ＮＳ３のＣ末端ドメインは、３’から５’方向に、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡおよびＤＮＡ−ＤＮＡ基質を巻き戻すことができる。
【００１１】
ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼの結晶構造の分析は、この酵素が３つのドメインからなることを示している。ドメインＩ（およそ、ＮＳ３の残基１８１−３２６）とドメインＩＩ（およそ、ＮＳ３の残基３２７−４８１）はほとんど配列同一性を有しないが、α−へリックスが隣接している大きな中央のβ−シートからなる構造において類似性を共有しており、ＲｅｃＡタンパク質の中心領域と構造が相同である。ドメインＩＩＩ（およそ、ＮＳ３の残基４８２−６３１）は大部分がα−へリックスであり、一本鎖核酸結合部位の一部を含む。ドメインＩおよびＩＩＩは、ドメインＩＩを共有する以上に、より広範囲にわたる境界面を共有する。従って、ドメインＩおよびＩＩＩは強固なユニットを形成するが、ドメインＩＩは、ドメインＩＩの非常に大きい相対的な回転を支えることができる、溶媒に曝されているポリペプチドセグメントにより、ドメインＩおよびＩＩＩにつながれている。特に、普通ではない分子の特徴は、ドメインＩＩの中心のβ−シートからドメインＩＩＩへと伸びる長い逆並行β−ループであり、ここでは、ループの末端はドメインＩＩＩ構造の組み込まれた部分となる。従って、他のヘリカーゼと同様に、ドメインの動きは、ＨＣＶヘリカーゼの活性に特徴的である（Ｇｕ＆Ｒｉｃｅ，ＰＮＡＳ，２０１０，１０７：５２１−５２８およびこの中の参考文献を参照のこと）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第６，８４６，９０５号明細書
【特許文献２】米国特許第５，３５０，６７１号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：３５９−３６２（１９８９）
【非特許文献２】Ｏｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：３３９２−３３９６（１９９１）
【非特許文献３】Ｊｉｎ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ．，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｒ  Ｂｉｏｃｈ  Ｂｉｏｐｈｙｓ，１９９５，３２３：４７−５３
【非特許文献４】Ｓａｌｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，７７：２７２１−２７２８
【非特許文献５】Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２８：２１９−２２４
【非特許文献６】Ｇｕ＆Ｒｉｃｅ，ＰＮＡＳ，２０１０，１０７：５２１−５２８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ＮＳ３抗原を使用するＨＣＶ感染の血清学的決定のためのアッセイが幾つか市販されているが、これらのアッセイには、ＨＣＶ感染ウインドウ内のより早い時期での検出にそれらを使用できるようにするための改良がなお必要である。従って、ＨＣＶ抗体のセロコンバージョンのウインドウを小さくすることにより増大した感度を有しているさらなるアッセイが依然必要である。
【００１５】
本発明は、このような血清学的アッセイにおける抗ＮＳ３の検出について改善された感度を提供することによりこの必要性に取り組む。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
好ましい実施形態では、本発明は、ＮＳ３ヘリカーゼ配列を含有している組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原に関し、組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原は上記ヘリカーゼのドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩのそれぞれを含み、上記抗原は、Ｃ３３抗原と比較して血清由来のＨＣＶ抗体に対して増大した免疫反応性を有し、上記組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原は、以下からなる群より選択される１つ以上の特徴を含む：
野生型ＮＳ３ヘリカーゼのＡＴＰ結合活性と比較して低下したＡＴＰ結合活性
野生型ＮＳ３ヘリカーゼのＡＴＰ結合活性と比較して、野生型ＮＳ３と比較して低下したＡＴＰａｓｅ活性、および
野生型ＮＳ３ヘリカーゼの酸化還元安定性と比較して増大した酸化還元安定性。
【００１７】
本発明の特に好ましい抗原は、上記ＮＳ３ヘリカーゼのＣ末端に少なくとも１つのシステイン残基の付加をさらに含む。本発明の状況では、野生型ＨＣＶ  ＮＳ３は配列番号８７の配列を含み、ここでは本発明の組換え抗原は、配列番号８７の配列と比較して少なくとも１つの突然変異を含む。さらに、特に、突然変異は上記配列番号８７の１つ以上のシステイン残基の任意の他のアミノ酸への突然変異を含む。さらに具体的には、突然変異は、上記１つ以上のシステイン残基の対応するセリン残基への突然変異を含む。さらに特別な実施形態では、突然変異は、ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼのドメインＩＩＩ由来のシステイン残基の１つ以上の突然変異を含む。なおさらに具体的には、好ましい実施形態では、システイン残基の突然変異は、配列番号８７のＣ２９２、Ｃ３６８、Ｃ３７４、Ｃ４９９およびＣ５２５からなる群より選択される１つ以上のシステイン残基の突然変異を含む。本発明の幾つかの抗原においては、ＨＣＶ  ＮＳ３突然変異体は、上記システイン残基の少なくとも２つが対応するセリン残基によって置き換えられている突然変異体である。
【００１８】
本発明の別の態様では、ＨＣＶ  ＮＳ３抗原はさらに、上記ＮＳ３ヘリカーゼのＣ末端に少なくとも１つのシステイン残基の付加をさらに含む。特定の特別な実施形態では、ＨＣＶ  ＮＳ３抗原は、上記ＮＳ３ヘリカーゼのＣ末端に２つのさらなるシステイン残基を含む。さらなる実施形態では、ＮＳ３抗原は、ＡＴＰ結合を減少させるかまたはＡＴＰａｓｅ活性を低下させる、配列番号８７のＫ２１０、Ｓ２１１、Ｔ２１２、Ｙ２４１、Ｄ２９０、Ｅ２９１、Ｈ２９３、Ｔ４１９、Ｑ４６０、Ｒ４６４、Ｒ４６７およびＷ５０１からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸残基の任意の他のアミノ酸残基での置き換えである突然変異を含む。例示的な突然変異として、配列番号８７と比較して、Ｋ２１０Ｎ、Ｓ２１１Ａ、Ｔ２１２Ｅ、Ｙ２４１Ｓ、Ｄ２９０Ｎ、Ｅ２９１Ｑ、Ｈ２９３Ａ、Ｔ４１９Ｇ、Ｑ４６０Ｈ、Ｒ４６４Ａ、Ｒ４６７ＫおよびＷ５０１Ａからなる群より選択される突然変異が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００１９】
突然変異が配列番号８７のＫ２１０、Ｓ２１１、Ｔ２１２、Ｙ２４１、Ｄ２９０、Ｅ２９１、Ｈ２９３、Ｔ４１９、Ｑ４６０、Ｒ４６４、Ｒ４６７およびＷ５０１の別のアミノ酸での突然変異を含む任意の実施形態では、抗原は、配列番号８７の１つ以上のシステイン残基の任意の他のアミノ酸への突然変異をさらに含み得る。さらに具体的には、上記配列番号８７の１つ以上のシステイン残基のうちの１つ以上の突然変異が、配列番号８７のＣ２９２、Ｃ３６８、Ｃ３７４、Ｃ４９９およびＣ５２５からなる群より選択される１つ以上のシステイン残基の突然変異を含む。抗原は、上記ＮＳ３ヘリカーゼのＣ末端に少なくとも１つのさらなるシステイン残基の付加をさらに含むことが有利であり得る。例えば、このようなさらなるシステイン残基は、上記ＮＳ３ヘリカーゼのＣ末端でのシステイン残基の付加により導入され得、ＧＧＣＳＧＧＡ、ＤＥＣＨＳＴＤおよびＳＫＫＫＣＤＥからなる群より選択される配列の上記ＮＳ３ヘリカーゼのＣ末端への付加を含む。他の特異的な実施形態では、抗原は２つのさらなるシステイン残基を含み得る。特別な実施形態では、２つのさらなるシステイン残基が、ＧＳＧＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＧＧＣＳＧＧＡＲＳＧＣ、ＧＳＧＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＤＥＣＨＳＴＤＲＳＧＣおよびＧＳＧＣＧＨＨＨＨＨＨＨＨＧＧＣＳＧＧＡからなる群より選択される配列の付加により導入される。他の例示的なさらなるシステイン残基は、ＧＳＧＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＧＧＣＳＧＧＡ、ＧＳＧＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＤＥＣＨＳＴＤ、ＧＳＧＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＳＫＫＫＣＤＥおよびＧＳＧＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＳＫＫＫＣＤＥＲＳＧＣを含むＣ末端配列により導入される。
【００２０】
さらなる実施形態では、Ｃ末端配列がシグナルを発生する部分への結合により修飾され得る。
【００２１】
なおさらなる実施形態では、抗原はヒスチジンタグをさらに含み得る。より具体的には、ヒスチジンタグが配列番号８７のＣ末端と上記付加された配列のＮ末端との間に配置され得る。
【００２２】
本発明の任意の好ましい抗原はビオチニル化され得る。好ましくは、ビオチニル化は上記抗原のＮ末端、またはＣ末端に存在する。代替えの実施形態では、ビオチニル化は部位特異的ビオチニル化である。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、本発明の組換えＨＣＶ抗原をコードする単離された核酸に関する。加えて、本発明はさらに、このような単離された核酸を含有している発現ベクターを含む。さらに、本発明は、このような発現ベクターで形質転換されたまたはトランスフェクトされた宿主細胞を含み、例えば、宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞であり得る。
【００２４】
本発明はさらに免疫診断試薬に関し、それらの１つ以上が本発明の組換えＨＣＶ抗原を含有している。幾つかの実施形態では、免疫診断試薬はさらに固体支持体を含み得る。例えば、固体支持体は微粒子であり得、組換え抗原が上記微粒子上にコーティングされる。
【００２５】
さらなる実施形態では、組換え抗原が、比色定量標識、化学発光標識、または蛍光標識（しかしこれらに限定されるわけではない。）で検出可能であるように標識され得る。
【００２６】
本発明の任意の１つ以上の抗原は、免疫診断試薬を含有しており、抗ＨＣＶ抗体と免疫反応性であるエピトープを含有しているさらなる単離されたＨＣＶ抗原をさらに含有しているキットにおいて提供され得る。例示的な実施形態では、さらなるＨＣＶ抗原はＨＣＶコア抗原である。特異的な実施形態では、キットは、本発明の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原と、同じ固相上に一緒にコーティングされたさらなるＨＣＶ抗原を含む。他の実施形態では、本発明の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原とコア抗原は別の固相上にコーティングされる。
【００２７】
本発明のキットは、好ましくは、ヒト抗体の検出用の抗体をさらに含む。加えて、キットはさらに、検出可能な標識を含有していてもよい抗ＨＣＶ抗体を含み得る。
【００２８】
試験試料中の抗ＨＣＶ抗体の存在を決定する免疫測定法もまた、本発明により考えられる。この方法は、上記試験試料を本発明の免疫診断薬と、上記試験試料中の上記組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原と上記抗ＨＣＶ抗体との間での複合体の形成を可能にする条件下で接触させる工程、および上記複合体を検出する工程を含む。ここでは、上記複合体の存在が上記試験試料中の抗ＨＣＶ抗体の指標である。好ましい実施形態では、複合体の形成の検出は、複合体に対する標識された（例えば、蛍光標識された）抗ヒト抗体の結合の決定により検出される。特異的な実施形態では、蛍光標識は好ましくはアクリジニウムである。
【００２９】
好ましい実施形態では、組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原が微粒子上にコーティングされる。
【００３０】
本発明の免疫測定法では、上記方法にさらに、ＨＣＶコア抗原に対する抗体の存在を決定するために試験試料をアッセイする工程が含まれ得る。本発明の免疫測定法では、本発明の抗原、ならびに例えばコア抗原のようなさらなる抗原が、同じ微粒子上に一緒にコーティングされるか、または、このような抗原が別の微粒子上にコーティングされる場合がある。
【００３１】
本発明の任意の免疫測定法が試験試料について使用され得、ここでは、試験試料は患者から得られ、上記方法は患者の治療的／予防的処置の有効性を診断、予後判定、または評価をさらに含み、上記方法が患者の治療的／予防的処置の有効性を評価する工程をさらに含む場合は、上記方法は、有効性を改善することが必要な患者の治療的／予防的処置を改変する工程をさらに含んでもよい。
【００３２】
本発明の抗原を利用する任意の免疫測定法は、自動化システムまたは半自動化システムでの使用に容易に適合させられ得る。
【００３３】
好ましい実施形態では、本発明はまた、ＮＳ３ヘリカーゼのドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩのそれぞれを含むＮＳ３ヘリカーゼ配列を含有している組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原にも関する。ここでは、上記抗原は、Ｃ３３抗原と比較して血清由来のＨＣＶ抗体に対して増大した免疫反応性を有し、上記組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原は、野生型ＮＳ３ヘリカーゼの酸化還元安定性と比較して増大した酸化還元安定性を含む。
【００３４】
なお別の実施形態では、好ましい抗原は、ＮＳ３ヘリカーゼのドメインＩおよびＩＩのそれぞれを含むＮＳ３ヘリカーゼ配列を含有している組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原である。ここでは、上記抗原は、Ｃ３３抗原と比較して血清由来のＨＣＶ抗体に対して増大した免疫反応性を有し、上記組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原は、野生型ＮＳ３ヘリカーゼの酸化還元安定性と比較して増大した酸化還元安定性を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、本発明のＨＣＶ  ＮＳ３組換え抗原の位置を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
上記のように、試料のＨＣＶ感染を検出するために使用され得る感度の高い血清学的アッセイのためのさらなる試薬を創生することが必要である。本発明は、ＨＣＶ１  ＮＳ３のヘリカーゼによりコードされる配列からなる組換え抗原、および可溶性形態での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での発現のための方法を記載する。抗原は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによる精製を容易にするために、それらのＣ末端にポリヒスチジンタグを含む。
【００３７】
特定の実施形態では、本発明は、酵素処理によるビオチンの共有結合の標的であるアミノ酸配列をＮ末端またはＣ末端のいずれかに保有しているＨＣＶ１  ＮＳ３の特異的突然変異体を作製する。これらのタグのインビボビオチニル化は細胞の内側で起こり、ここでは、ビオチンリガーゼ酵素が同時発現され、ビオチンが培養培地に添加される。この様式では、本発明の抗原が固体支持体に結合させられ得、沈澱させられ得るか、またはアビジン（または、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、抗ビオチン抗体もしくはこのビオチン結合断片、または任意のビオチン捕捉部分）のビオチンとの相互作用の使用により別の方法でモニターされ得る。
【００３８】
さらなる実施形態では、システインコドンが単独でまたは組み合わせでのいずれかで、セリンコドンにより置き換えられたＮＳ３遺伝子の突然変異体が作製された。システイン−セリン突然変異体の作製により抗原の酸化に対する耐性を可能にし、それにより、エピトープの提示、および結果として、免疫反応性を妨げる。
【００３９】
加えて、全長のヘリカーゼ酵素（ＨＣＶアミノ酸１２０７−１６５７）の、ヌクレオチド三リン酸（例えば、ＡＴＰ）に結合する能力を破壊し、それにより開いた立体構造または伸びた立体構造でタンパク質を維持するこれらのＣｙｓからＳｅｒへの突然変異の少なくとも１つおよび他の突然変異体が作製される（Ｇｕ＆Ｒｉｃｅ，ＰＮＡＳ，２０１０，１０７：５２１−５２８およびこの中の参考文献を参照のこと）。これらの突然変異体の幾つかは、野生型の全長ヘリカーゼと比較して増強された免疫反応性を示す。特定の理論または作用機構にとらわれず、ヘリカーゼの伸びた立体構造を生じる溶媒曝露によって、より免疫反応性が高いタンパク質が生じる可能性がある。結果として、システイン残基のセリン残基への改変により、または他の突然変異により、アッセイされる試料中に抗体に対する結合についてエピトープをより良好に提示する、より免疫反応性が高い伸びた立体構造のヘリカーゼが生じ得る。
【００４０】
加えて、本発明は、全長のヘリカーゼタンパク質のＣ末端に付加された１つ以上のシステイン残基を含有している短いアミノ酸タグ配列を含む、突然変異体のさらなるシリーズを考慮する。抗原のＣ末端での少なくとも１つのこのようなさらなるシステイン残基の付加は、部位特異的または部位優先的様式でのシグナルを発生する部分の結合を可能にする。驚くべきことに、２つのシステイン残基を含むアミノ酸タグ配列の付加により、組換え抗原の増強された精製後安定性が生じることが明らかになっている。このようなさらなるシステイン残基を持って製造された抗原は、有利には、原則として単量体であり、またシグナルを発生する部分へのその後の結合のためのチオールを保有しているタンパク質である。この様式では、抗原は、マレイミド化学のような周知の技術を使用して、シグナルを発生する部分で直接標識することができる。追加の利用できるシステイン残基の存在により作製されるシグナルを発生する部分のためのさらなる部位は、増大したシグナルが抗原から生じることを可能にする。さらに、ヘリカーゼのＣ末端にあるこれらの高度に溶媒曝露されたシステインを含有している配列タグの含有により、部位特異的標識が可能になり、これにより、非特異的標識により免疫学的に不活性になり得る重要なエピトープを保有している可能性がある他の部位での標識が回避される。２つのさらなるシステイン残基の導入に使用されるＨｉｓタグを含む特に好ましいタグは、ＧＳＧＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＧＧＣＳＧＧＡＲＳＧＣ、ＧＳＧＳＧＨＨＨＨＨＨＨＨＤＥＣＨＳＴＤＲＳＧＣおよびＧＳＧＣＧＨＨＨＨＨＨＨＨＧＧＣＳＧＧＡである。
【００４１】
本発明で抗原として使用される精製された組換えタンパク質がアクリジニウムで、またはマレイミドおよびＮＨＳ活性基を含有しているヘテロ二官能性リンカーを使用してアクリジニル化ＢＳＡにより標識されることに留意されたい。高い結合反応効率を達成するためには、精製されたＮＳ３抗原タンパク質は、結合の前に化学的に還元され、脱塩されなければならない。サイズ排除クロマトグラフィーによる研究では、Ｃ末端にさらなるシステイン残基を有している本発明の組成物が、Ｃ末端タグの中に１つのシステインを保有しているＨＣＶ  ＮＳ３ｈ構築物と比較して、低い凝集（または多量体化）の程度を有していることが見られた。このようにオリゴマー（多量体または凝集体）が存在しないことは、最大感度（マスクされたエピトープがない。）および特異性（非特異的結合がより少ない。）および安定性（時間依存性の多量体化、オリゴマー化、凝集がない。）に有利である。特定の理論および作用機構にとらわれず、Ｃ末端タグ内のシステイン側鎖の末端チオールの導入により、鎖内ジスルフィド結合の形成が可能となり、これにより各チオールを酸化（即ち分子酸素との反応）から保護することが可能となる。このジスルフィド結合は酸化の前に容易に還元され、これにより、例えばマレイミド化学のような直接標識技術を使用する標識に、チオールが利用できるようになる。
【００４２】
ＮＳ３をベースとする抗原の使用について記載している全てのこれまでのアッセイとは異なり、本明細書中に記載されるＮＳ３抗原は、部位特異的にビオチン標識されており、可溶性であり、単量体であり、低下した酸化感度を示し、なおも抗体検出アッセイに使用されるための十分な免疫反応性を示す。さらに、本発明は、ＮＳ３のＣ末端部分によってコードされるヘリカーゼタンパク質領域全体を含む。これは、改善されたセロコンバージョンの感度のために、抗体検出に全長の可溶性ヘリカーゼタンパク質を使用することの最初の実証である。本明細書中に記載されるこれらのＮＳ３抗原、ならびに、カオトロープまたは界面活性剤の非存在下でのＮＳ３抗原の可溶性の発現および精製により、効率的な、および十分に管理された結合が可能となる。これらの抗原は、その後、以下に記載されるように全長のヘリカーゼタンパク質を使用することによるＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼに特異定な抗体の検出のための非常に強力な（即ち、感度の高い）免疫測定法での使用に適応させることができる。
【００４３】
発現された抗原は、ＩＭＡＣおよびイオン交換クロマトグラフィーを使用して２工程で精製された。ＮＳ３タンパク質および突然変異体の大部分の可溶性の発現の理由から、変性条件（例えば、尿素、ＳＤＳなどの使用）は必要なかった。加えて、システイン残基を含有している抗原の免疫反応性を、タンパク質の精製および保存の際に二価陽イオンキレート剤（ＥＤＴＡまたはＤＴＰＡ）を含めることにより保存できることが発見された。特定の理論または作用機構にとらわれず、本発明の抗原がＣ３３抗原よりも試験試料中の抗体によりさらに容易に検出される（即ち、より免疫反応性が高い）ことが明らかにされている。本発明の抗原のこの増大した免疫反応性は、これらの溶解度および／または本明細書中でのこれらの改変／突然変異に理由があると考えられる。例えば、本発明の突然変異は、抗原をさらに免疫反応性にする以下の１つ以上の特徴を抗原の中に生じる：（ａ）ヘリカーゼドメイン中のシステインからセリンへの突然変異の存在が、抗原の酸化に対する耐性を可能にし、これによりエピトープの提示、および結果として免疫反応性を保存する；（ｂ）エピトープの供給を拡大するためのドメインの付加；および（ｃ）既存のエピトープ認識の増強。免疫反応性に特異的ではない他のシステイン残基の突然変異は、マレイミド試薬を使用する化学結合によるタンパク質の制限部位特異的修飾を手助けする。
【００４４】
定義
本発明は、試験試料中の抗ＨＣＶ抗体の検出のための試薬を提供する。明細書を通して特定の用語が頻繁に使用され、このようなものとして、以下のセクションはこれらの用語のさらなる定義を提供する。用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」（Ａｂ）および「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」（Ａｂｓ）は以下を指す：モノクローナル抗体（ｍＡｂ（単数形）またはｍＡｂｓ（複数形））、ポリクローナル抗体（ｐＡｂｓ（複数形））、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体（完全にまたは部分的にヒト化されている；ヒト抗体の改変された可変領域を含有しているポリペプチド（ここでは、可変領域の一部が非ヒト配列由来の対応する配列により置換されており、改変された可変領域はヒト抗体の定常領域の少なくとも一部に連結されている。）、動物抗体（例えば、鳥類（例えば、アヒルまたはガチョウ）、サメ、クジラおよび非霊長類を含む哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウスなど）、または非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジーなど）であるが、これらに限定されるわけではない。）、組換え抗体、キメラ抗体（ｃＡｂ；別の宿主種由来の抗体定常領域の少なくとも一部に連結された１つの宿主種由来の抗体の重鎖および軽鎖可変領域全体またはこの一部を含有しているポリペプチド）、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ断片（「ｓｃＦｖ」）、ジスルフィド結合されたＦｖ断片（「ｓｄＦｖ」）、ｄＡｂ断片、二重特異性抗体、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）および抗イディオタイプ（「抗Ｉｄ」）抗体、二官能性または二重ドメイン抗体（例えば、二重可変ドメイン抗体、またはＤＶＤ−ＩｇＧｓ）、ならびに上記のいずれかの機能的に活性なエピトープ結合断片（または抗原的に反応性である断片）。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性である（または抗原的に反応性である）断片、即ち、本明細書中で（ｎ）にさらに記載されるような分析物結合部位を含む分子、および本明細書中で（ａｃ）にさらに記載されるような変異体を含む。免疫グロブリン分子は任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、またはサブクラスであり得る。バイオティスプレイを使用して調製された組み合わせ抗体ライブラリーのスクリーニングによりこの親和性（即ち、ＫＤ、ｋｄ、またはｋａ）が増大しているまたは改善された抗体は、「親和性成熟抗体」と呼ばれる。わかりやすくするために、分析物に対する抗体は本明細書中では、頻繁に「抗分析物抗体」または単に「分析物抗体」（例えば、抗ＨＣＶ抗体またはＨＣＶ抗体）のいずれかと呼ばれる。抗体の変異体は本明細書中で（ｘ）に記載されるとおりである。
【００４５】
本発明では、アッセイの「構成成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」、「構成成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）」、および「少なくとも１つの構成成分」は一般に、本明細書中に記載される方法および当該分野で公知の他の方法に従って、患者の尿、血清、または血漿試料のような試験試料のアッセイのためのキットに含めることができる、捕捉抗体、検出または結合抗体、対照、検量用試料、検量用試料のシリーズ、感度パネル、容器、緩衝液、希釈剤、塩、酵素、酵素の補因子、検出試薬、前処理試薬／溶液、基質（例えば、溶液として）、停止液などをいう。従って、本開示の状況では、「少なくとも１つの構成成分」、「構成成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」および「構成成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）」には、場合により固体支持体上に固定される、本明細書中に記載されるポリぺプチドが含まれ得る。幾つかの構成成分は溶液中に存在し得、また、アッセイでの使用のための再構成用に凍結乾燥させられた状態であってもよい。
【００４６】
本発明のアッセイの実行においては、対照を使用することが有用であり得る。「対照」は、抗ＨＣＶ抗体を含まないことがわかっている組成物（「陰性対照」）、または抗ＨＣＶ抗体を含むことがわかっている組成物（「陽性対照」）をいう。陽性対照は、既知の濃度の抗ＨＣＶ抗体を含有し得る。「対照」、「陽性対照」および「検量用試料」は、既知の濃度の抗ＨＣＶ抗体を含有している組成物をいうために、本明細書中で互換的に使用され得る。「陽性対照」は、アッセイの性能の特徴を確立するために使用することができ、試薬（例えば、分析物）の一貫性についての有用な指標である。
【００４７】
本発明のＮＳ３抗原は、このような抗体が本発明のＮＳ３抗原の中に含まれるエピトープを認識するので、試験試料中の抗ＨＣＶ抗体の検出のための血清学的アッセイにおいて有用である。「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」、「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅｓ）」および「目的のエピトープ」は、任意の分子（この場合は、本明細書中に記載されるＮＳ３抗原）上の、抗体またはこの抗原的に反応性である断片のような特異的結合パートナー上の相補性部位を認識し、特異的結合パートナー上の相補性部位に結合することができる部位（単数または複数）をいう。エピトープは、特異的結合パートナー上の相補性部位に結合することがわかっている抗原（またはこの断片）の１つの領域の正確なアミノ酸残基からなる。抗原性断片は２つ以上のエピトープを含み得る。
【００４８】
本明細書中に記載されるアッセイでは、アッセイの１つまたは他の構成成分が検出可能な標識を含有し得る。用語「標識」および「検出可能な標識」は、抗体および分析物のような特異的結合対のメンバーの間での反応を検出できるようにするために、抗体または分析物のような特異的結合パートナーに対して付着させられる部分を意味し、このように標識された、例えば、抗体または分析物のような特異的結合パートナーは、「検出可能であるように標識された」と言われる。標識は、視覚的手段または機器的手段によって検出可能なシグナルを生じることができる。様々な標識が、色素原、蛍光化合物、化学発光化合物、放射性化合物などのようなシグナルを生じる物質を含む。標識の代表例としては、光を生じる部分（例えば、アクリジニウム化合物）および蛍光を生じる部分（例えば、フルオレセイン）が挙げられる。他の標識は、本明細書中に記載されている。これに関して、上記部分自体は検出可能であるように標識されていない場合があるが、さらに別の部分と反応すると検出可能になり得る。「検出可能であるように標識された」の使用は、後者のタイプの検出可能な標識を含むように意図される。
【００４９】
「連結配列（ｌｉｎｋｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、目的の１つ以上のポリペプチド配列（例えば、全長、断片など）につながれている天然のポリペプチド配列または人工的なポリペプチド配列をいう。用語「つながれた（ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）」は、目的のポリペプチド配列に対する連結配列の結合をいう。このようなポリペプチド配列は好ましくは、１つ以上のペプチド結合により連結される。連結配列は約４から約５０のアミノ酸までの長さを有し得る。好ましくは、連結配列の長さは約６から約３０アミノ酸までである。天然の連結配列はアミノ酸置換、付加、または欠失により改変されて、人工的な連結配列が作製され得る。例示的な連結配列として以下が挙げられるが、これらに限定されるわけではない：（ｉ）ヒスチジン残基（Ｈｉｓタグ）（例えば、６個のヒスチジン残基を含む６×Ｈｉｓタグが、目的のポリペプチドおよび抗体の単離および精製を容易にするための連結配列として有用である。）。（ｉｉ）Ｈｉｓタグのようなエンテロキナーゼ切断部位が、目的のタンパク質および抗体の単離および精製に使用される。多くの場合、エンテロキナーゼ切断部位は、目的のタンパク質および抗体の単離および精製において、Ｈｉｓタグとともに使用される。様々なエンテロキナーゼ切断部位が当該分野で知られている。（ｉｉｉ）様々なものからなる（Ｍｉｓｃｅｌｌａｎｅｏｕｓ）配列が、単鎖可変領域断片の軽鎖および／または重鎖可変領域を連結するまたはつなぐために使用され得る。他の連結配列の例は、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）の中で見ることができる。連結配列はまた、薬物の付着または固体支持体への付着のようなさらなる機能のために修飾され得る。本開示の状況では、例えばｍＡｂが、Ｈｉｓタグのような連結配列、エンテロキナーゼ切断部位、または両方を含み得る。
【００５０】
「患者」および「被験体」は、動物（例えば、鳥類（例えば、アヒルまたはガチョウ）、サメ、クジラおよび非霊長類を含む哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラットおよびマウス）および霊長類（例えば、サル、チンパンジーおよびヒト）を指すように本明細書中で互換的に使用され得る。好ましくは、患者または被験体はヒト、例えば、ＨＣＶ感染のリスクがあるヒトまたはＨＩＶに感染したヒトである。
【００５１】
本明細書中に記載される免疫測定法の結果の分析においては、カットオフレベルとしての一定の検出レベルを含めることが有用であり得る。「予め決定されたカットオフ」および「予め決定されたレベル」は一般に、予め決定されたカットオフ／レベルに対してアッセイの結果を比較することにより、診断／予後判定／治療の有効性の結果を評価するために使用されるアッセイのカットオフ値をいう。ここでは、予め決定されたカットオフ／レベルはすでに、様々な臨床的パラメーター（例えば、疾患の重篤度、進行／進行がないこと／改善など）と連関または関連している。本開示は例示的な予め決定されたレベルを提供し得るが、カットオフ値が免疫測定法の性質（例えば、利用される抗体など）に応じて変化し得ることは周知である。さらに、本開示に基づくこれらの他の免疫測定法のための免疫測定法特異的カットオフ値を得るために、他の免疫測定法に本明細書中の開示を適応することは十分に当業者の能力の範囲内である。予め決定されたカットオフ／レベルの正確な値はアッセイごとに変化し得るが、本明細書中に記載されるような相関関係が一般的に適用可能であるはずである。
【００５２】
以下に記載されるように、試験試料の前処理を提供することが、本発明の幾つかの実施形態において望まれる場合がある。本明細書中に記載される診断アッセイにおいて使用されるような「前処理試薬」（例えば、溶解、沈澱および／または可溶化試薬）は、試験試料中に存在する任意の細胞を溶解させる、および／または任意の分析物を可溶化するものである。前処理は、本明細書中にさらに記載されるように、全ての試料について必要というわけではない。中でも、分析物（即ち、抗ＨＣＶ抗体）の可溶化には、試料中に存在する任意の内因性の結合タンパク質からの分析物の放出が必然的に伴う。前処理試薬は、均質である（分離工程は必要ない）場合も、また不均質である（分離工程が必要である）場合もある。不均質な前処理試薬を使用する場合は、アッセイの次の工程に進む前に、試験試料からの任意の沈澱した分析物結合タンパク質の除去が行われる。前処理試薬は、場合により、（ａ）１つ以上の溶媒および塩、（ｂ）１つ以上の溶媒、塩および界面活性剤、（ｃ）界面活性剤、（ｄ）界面活性剤および塩、または（ｅ）細胞溶解および／または分析物の可溶化に適している任意の試薬または試薬の組み合わせを含み得る。
【００５３】
アッセイはまた、厳しい品質管理が行われ得る。「品質管理試薬」は、本明細書中に記載される免疫測定法およびキットの状況では、検量用試料、対照および感度パネルを含むが、これらに限定されるわけではない。「検量用試料」または「標準物質」が、典型的には、抗体または分析物のような、分析物の濃度の内挿のための検量線（標準曲線）を確立するために、（例えば、１つ以上、例えば、複数）使用される。または、予め決定されたポジティブ／ネガティブなカットオフに近い１つの検量用試料が使用されてもよい。複数の検量用試料（即ち、２つ以上の検量用試料または様々な量の検量用試料（単数または複数））を組み合わせて、「感度パネル」を含むかのように使用することができる。
【００５４】
用語「試料」、「試験試料」および「患者試料」は本明細書中で互換的に使用され得る。尿、血清、血漿、羊水、脳脊髄液、胎盤細胞もしくは組織、内皮細胞、白血球、または単球の試料のような試料は、患者から得られた状態のまま直接使用することができ、または本明細書中で考察される幾つかの様式もしくは当該分野で公知である別の様式で試料の特性を改変するために、例えば、濾過、蒸留、抽出、濃縮、遠心分離、干渉成分の不活性化および試薬の添加などにより前処理することができる。好ましくは、試料は尿、血清、または血漿である。
【００５５】
幾つかのアッセイでは、アッセイの較正を提供することが所望され得る。「較正用組成物のシリーズ」は、既知の濃度の抗ＨＣＶ抗体を含有している複数の組成物を指し、ここでは、これらの組成物のそれぞれが、抗ＨＣＶ抗体の濃度がシリーズの中の他の組成物とは異なる。
【００５６】
本明細書全体を通して、ＮＳ３抗原および／または他の試薬が固体支持体または固相（これらの用語の両方が互換的に使用される。）に結合させられ得ることに留意されたい。用語「固相」は、不溶性であるか、またはその後の反応によって不溶性になり得る任意の材料をいう。固相は、捕捉剤を誘引および固定するこの固有の能力について選択され得る。代わりに、固相は、これに、捕捉剤を誘引および固定する能力を有する連結剤を付着させることができる。連結剤は、例えば、捕捉剤自体または捕捉剤に結合した帯電物質に関して逆に帯電した帯電物質を含むことができる。一般に、連結剤は、固相上に固定された（固相に付着させられた）および結合反応を通じて捕捉剤を固定する能力を有する任意の（好ましくは特異的な）結合パートナーであり得る。連結剤によって、アッセイの実施の前またはアッセイの実施の間に、捕捉剤を固相材料に間接的に結合させることが可能になる。固相は、例えば、プラスチック、誘導体化されたプラスチック、磁性金属もしくは非磁性金属、ガラスまたはケイ素であり得、これには例えば、試験管、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップおよび当業者に公知である他の構成などが含まれ得る。
【００５７】
本明細書中で記載されるアッセイの特定の記述においては、特異的結合パートナーとしてＮＳ３抗原またはＨＣＶ抗体のいずれかをいうことが有用であり得る。「特異的結合パートナー」は特異的結合対のメンバーである。特異的結合対は、化学的手段または物理的手段により互いに特異的に結合する２つの異なる分子を含む。従って、一般的な免疫測定法の抗原と抗体の特異的結合対に加えて、他の特異的結合対としては、ビオチンとアビジン（またはストレプトアビジン）、炭水化物とレクチン、相補的なヌクレオチド配列、エフェクター分子と受容体分子、補因子と酵素、酵素阻害剤と酵素などを挙げることができる。さらに、特異的結合対は、もとの特異的結合メンバーのアナログ、例えば、分析物アナログであるメンバーを含み得る。免疫反応性である特異的結合メンバーとしては、抗原、抗原断片および抗体（モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む。）、ならびにこれらの複合体、断片および変異体（変異体の断片を含む。）（単離されたものであるか、または組換えにより生産されたものであるかは問わない。）が挙げられる。用語「特異的」および「特異性」は、特異的結合対のメンバー（例えば、抗原（またはこの断片）と抗体（またはこの抗原的に反応性である断片））間での相互作用の状況においては、相互作用の選択的再活性をいう。表現「…に特異的に結合する」および同様の表現は、抗体（またはこの抗原的に反応性である断片）の、所定の抗原（またはこの断片）に特異的に結合し、他のものには特異的には結合しない能力をいう。
【００５８】
本発明の抗原
本明細書中に記載されるＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質およびこの突然変異体は主に２つの主要なタンパク質をいい、第１のタンパク質は、Ｐ２６６６４のＨＣＶポリタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ、配列番号８８として本明細書中で複製された；Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １９９１）のナンバリングに従うとアミノ酸１１９２−１４５７に相当し、Ｃ３３（Ｃｈｉｒｏｎにより最初に記載された。）として、または「９ＮＢ４９Ｈ」としても知られている。第２の主要なＮＳ３タンパク質はアミノ酸１１９２−１６５７に相当し、ＮＳ３ヘリカーゼまたは「ＮＳ３ｈ」としても知られている。
【００５９】
Ｃ３３抗原は、市販されている免疫測定法において以前から使用されている。しかし、Ｃ３３抗原が熱に不安定であることが認識されている。この熱不安定性は、Ｃ３３抗原がタンパク質分解、凝集（溶液中および／またはビーズ上）および立体構造の変化、またはこれらの３つ全ての組み合わせを受けるという事実が原因であると考えられる。結果として、Ｃ３３は、試験試料中のＮＳ３結合抗体の存在を決定するために設計された免疫測定法のための抗原としては適切ではない。本発明の抗原は、Ｃ３３と比較して、試験試料中の抗体に対して増大した安定性および免疫反応性を有し、結果としてより感度の高いアッセイを生じる。
【００６０】
Ｎ末端またはＣ末端配列が改変された、Ｃ３３およびＮＳ３ヘリカーゼタンパク質の変異体が作製された。幾つかの実施形態では、システインからセリンへの突然変異を含む抗原が作製された。これらの突然変異は、抗原の酸化に対する増大した耐性を可能にし、これにより、エピトープの提示、結果として免疫反応性を保存する。さらに、システインからセリンに置換された突然変異体の少なくとも幾つか、および他の非システイン突然変異体は、全長のヘリカーゼ酵素（ＨＣＶのａａ１１９２−１６５７）のヌクレオチド三リン酸（例えばＡＴＰ）に結合する能力を破壊する。これは、開いた立体構造または伸びた立体構造でタンパク質を維持し（Ｇｕ＆Ｒｉｃｅ，ＰＮＡＳ，２０１０，１０７：５２１−５２８およびこの中の参考文献を参照のこと）、増強された免疫反応性を生じることが本発明において示される。
【００６１】
加えて、本発明の抗原は、カルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかでビオチニル化タグ（ｂｔ）をコードするようにさらに改変された。これらのタグは「Ｃｂｔ」または「Ｎｂｔ」と命名され、ここでは、タグはそれぞれＣ末端またはＮ末端に位置している。生産の目的のために、組換えタンパク質が、２５℃で、ＩＰＴＧ誘導システムを介して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  ＢＬ２Ｌ（ＤＥ３）細胞中で発現させられた。ＣｂｔタグまたはＮｂｔタグでのインサイチュビオチニル化は、ＨＣＶ  ＮＳ３発現プラスミドと、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のビオチンリガーゼ酵素をコードするＢｉｒＡ遺伝子（Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＆Ｐｕｒｉｆ，１４：７５１−７５５；Ｓｃｈａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１１３８−１１４３）を含有している第２のプラスミドでの、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の同時形質転換により達成される。ＮＳ３タンパク質の最終的な精製は、金属が触媒する酸化およびタンパク質の凝集を妨げることが示されている二価陽イオンキレート剤の存在下で行われる。タンパク質安定性は、ＥＤＴＡまたは関連する二価陽イオンキレート剤が精製の際に使用される緩衝液に、および最終的な保存緩衝液または免疫測定法で使用される緩衝液に添加されると、有意に改善される。
【００６２】
ビオチニル化は、本発明のアッセイにおける目的の分子の捕捉に使用される１つの方法である。本明細書全体を通じて示されるように、本発明の方法は典型的には免疫測定法である。例示的な実施形態では、このような方法は、（例えば、試験試料中に存在する特異的抗体、または試験試料中に存在し得る特異的抗原のような）目的の分子を単離するための方法を含む。このような単離を容易にするために、目的の分子は、タグ結合パートナーと接触する精製タグを含むか、または精製タグに誘引される。従って、精製タグとタグ結合パートナーの会合が、分子の混合物から目的の分子を分離するために使用され得る。精製タグは、同じ構造または類似する構造を持つ部分を含み得る。特定の実施形態では、親和性タグのタグ化部分を、単結合により直接、または安定な化学結合の連結を介して、代わりに場合により、単結合、二重結合、三重結合、芳香族炭素−炭素結合、ならびに炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合、炭素−硫黄結合、リン−酸素結合、リン−窒素結合およびこれらの任意の組み合わせを含む直鎖の、分岐した、または環状の配置で、機能性タグと会合させることができる。特定の実施形態では、タグ化部分と機能性タグとの間での会合は、エーテル、チオエーテル、カルボキシアミド、スルホアミド、尿素、またはウレタン部分を含む。好ましい実施形態では、連結はポリアルキレン鎖、即ち、直鎖または分岐した配置の炭素−炭素結合を含む。他の実施形態では、連結は、ポリエチレングリコール部分を含むポリアルキレンオキサイド鎖を含む。親和性タグの例として、ビオチン、ジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、亜鉛フィンガー、フッ素化ポリマーおよびポリヒスチジンモチーフのようなポリペプチド配列が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００６３】
幾つかの実施形態では、親和性タグは、親和性タグおよび親和性タグに誘引されるかもしくは親和性タグに結合する官能基の結合または誘引に頼ることにより、目的の分子を単離するために有利に使用される。幾つかの実施形態では、この固体基盤の中にタグに対して親和性を有している固体基盤がタグ結合パートナーで誘導体化される。幾つかの実施形態では、結合パートナーは親和性基盤上に固定され得る。用語「親和性基盤」は、分子の精製タグと強力な、好ましくは可逆的な相互作用を形成することができる結合パートナーに結合させられた動かせないマトリックスまたは支持体をいうことができる。親和性基盤としては、樹脂、ビーズ、粒子、膜、ゲルを挙げることができる。結合パートナーは精製タグを特異的に認識するか、または精製タグに特異的に結合する。特異的結合パートナーは親和性タグに依存するが、帯電した部分と、受容体−リガンド、抗体−抗原、炭水化物−レクチンおよびビオチン−ストレプトアビジン（またはアビジン、ニュートラアビジン、または抗ビオチン抗体）のような結合対の１つのメンバーを含む。
【００６４】
以下の表１は、本発明の例示的な改変されたＮＳ３ｈ抗原を示す。
【００６５】
【表１】
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【００６６】
ＨＣＶ  ＮＳ３抗原の生産
本発明のＮＳ３抗原分子は一般に、組換えにより生産される。様々なＨＣＶ抗原の組換えによる生産が記載されている。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，３５０，６７１号明細書；Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第９３／００３６５号パンフレット；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開第９４／０１７７８号パンフレットを参照のこと。本発明がＨＣＶ検出分析に使用される特異的ＮＳ３抗原を記載していることを前提とし、ＨＣＶ抗原の組換えによる生産のための技術が当業者に公知であることを前提とすると、このような技術が、ここでは、改良された免疫測定法のための抗原を有利に生産するために使用され得る。
【００６７】
このような組換えによる生産についての一般的な記述が単に提供されるだけで、当業者は、本発明とともに使用されるＮＳ３  ＨＣＶ抗原をコードするポリヌクレオチドを、分子生物学の標準的な技術を使用して作成できることを理解するであろう。例えば、上記分子をコードするポリヌクレオチド配列を、組換え方法を使用して、例えば、遺伝子を発現する細胞からｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、または遺伝子を含むことがわかっているベクターから遺伝子を導くことにより、得ることができる。さらに、所望される遺伝子は、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，３５０，６７１号明細書の中で記載されている技術のような当該分野で記載されている技術を使用して、ウイルスの核酸分子から直接単離することができる。目的の遺伝子はまた、クローニングされるのではなく合成によっても生産することができる。分子は、特定の配列について適切なコドンを持たせて設計することができる。その後、完全な配列が、標準的な方法により調製された重複しているオリゴヌクレオチドからアセンブリされ、完全なコード配列へとアセンブリされる。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９；およびＪａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１を参照のこと。
【００６８】
従って、特定のヌクレオチド配列が、（本明細書中に記載される突然変異を含む）所望される配列を保有しているベクターから得ることができる、または、部位特異的突然変異誘発および適切である場合は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術のような当該分野で公知である様々なオリゴヌクレオチド合成技術を使用して完全にまたは一部を合成することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）を参照のこと。Ｊａｙａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４０８４−４０８８もまた参照のこと。加えて、オリゴヌクレオチド特異的合成（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ５４：７５−８２）、既存のヌクレオチド領域のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７、およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６）、ならびにＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用するギャップを含むオリゴヌクレオチドの酵素によるフィルイン（Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３）を、変更されたまたは増強された抗体結合能力、および／または低下した免疫原性を有している分子を提供するために、本発明において使用することができる。
【００６９】
一旦、コード配列が調製されるか、または単離されると、このような配列を、任意の適切なベクターまたはレプリコンにクローニングすることができる。多数のクローニングベクターが当業者に公知であり、適切なクローニングベクターの選択は選択できる事項である。適切なベクターとして、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、またはウイルス（これらは、適切な制御エレメントと会合すると複製することができる。）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００７０】
その後、コード配列が、発現に使用されるシステムに応じた適切な制御エレメントの制御下に配置される。従って、コード配列が、プロモーター、リボソーム結合部位（細菌での発現のため）、および場合によりオペレーターの制御下に配置され得、この結果、目的のＤＮＡ配列は適切な形質転換体によりＲＮＡに転写される。コード配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列を含んでよく、または含まなくてもよい。シグナルペプチドまたはリーダー配列は、翻訳後プロセシングにおいて宿主によって後で除去され得る。例えば、米国特許第４，４３１，７３９号明細書；同第４，４２５，４３７号明細書；同第４，３３８，３９７号明細書を参照のこと。
【００７１】
制御配列に加えて、宿主細胞の増殖に関連して配列の発現の制御を可能にする調節配列を付加することが所望される場合がある。調節配列は当業者に公知であり、例として、化学的刺激または物理的刺激（調節化合物の存在を含む。）に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフにするものが挙げられる。他のタイプの調節エレメントもまたベクター中に存在し得る。例えば、エンハンサーエレメントが、構築物の発現レベルを増大させるために本明細書中で使用され得る。例として、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：７６１）、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ）の長末端反復（ＬＴＲ）由来のエンハンサー／プロモーター（Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６７７７）、およびヒトＣＭＶ由来のエレメント（Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４１：５２１）、例えば、ＣＭＶイントロンＡ配列に含まれるエレメント（米国特許第５，６８８，６８８号明細書）が挙げられる。発現カセットはさらに、適切な宿主細胞中での自律複製のための複製起点、１つ以上の選択マーカー、１つ以上の制限酵素部位、高コピー数および強いプロモーターの可能性を含み得る。
【００７２】
発現ベクターは、特定のコード配列が適切な調節配列とともにベクター中に配置されるように構築され、制御配列に対するコード配列の位置および方向は、コード配列が制御配列の「制御」下で転写される（即ち、制御配列でＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼがコード配列を転写する）。この目的を達成するために目的の分子をコードしている配列の改変が所望される場合がある。例えば、幾つかの場合は、制御配列を適切な方向で付着できるように、即ち、リーディングフレームを維持するために、配列を改変することが必要な場合がある。制御配列および他の調節配列は、ベクターへの挿入の前にコード配列に連結され得る。代わりに、コード配列を、すでに制御配列と適切な制限酵素部位を含んでいる発現ベクターに直接クローニングすることができる。
【００７３】
分子は、昆虫、哺乳動物、細菌、ウイルスおよび酵母の発現システム（全てが当該分野で周知である。）を含む多種多様なシステムにおいて発現させることができる。
【００７４】
例えば、バキュロウイルスシステムのような昆虫細胞発現システムは当業者に公知であり、例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）の中で記載されている。バキュロウイルス／昆虫細胞発現システムについての材料および方法は、特に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆ．からキットの形態（「ＭａｘＢａｃ」キット）で市販されている。同様に、細菌および哺乳動物細胞の発現システムは当該分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（前出）に記載されている。酵母発現システムもまた当該分野で公知であり、例えば、Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．編，１９８９）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｌｏｎｄｏｎ．に記載されている。
【００７５】
上記システムとともに使用される多数の適切な宿主細胞もまた公知である。例えば、哺乳動物細胞株が当該分野で公知であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手することができる不死化された細胞株（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト胚腎臓細胞、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、マディン−ダービーウシ腎臓（「ＭＤＢＫ」）細胞などであるが、これらに限定されるわけではない。）が挙げられる。同様に、細菌宿主（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）は、本発明の発現構築物との使用が見いだされるであろう。本発明において有用な酵母宿主としては、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、およびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターとともに使用される昆虫細胞としては、特に、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｍｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉが挙げられる。
【００７６】
本発明のＮＳ３抗原をコードするヌクレオチド配列を含有している核酸分子は、宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれ得るか、または当該分野で周知の様々な遺伝子送達技術を使用して適切な宿主細胞中の安定なエピソームエレメント上で維持され得る。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号明細書を参照のこと。
【００７７】
選択される発現システムおよび宿主に応じて、分子は、タンパク質が発現される条件下で、上記発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を増殖させることにより産生される。その後、発現されたタンパク質が宿主細胞から単離され、精製される。発現システムがタンパク質を増殖培地中に分泌する場合は、生成物を培地から直接精製することができる。タンパク質が分泌されない場合は、生成物は細胞溶解物から単離され得る。適切な増殖条件および回収方法の選択は当業者の能力の範囲内である。
【００７８】
免疫診断試薬
特定の実施形態では、上記ＮＳ３抗原は免疫診断試薬としての使用が考えられる。本発明の抗原が増大した安定性、およびＣ３３抗原と比較してＮＳ３抗体との増大した免疫反応性を有することが本明細書中で示される。本発明の免疫診断試薬は、単独で、または、ＨＣＶの別の部分（ＨＣＶのＮＳ３領域、ＨＣＶのコア抗原、ＨＣＶのＮＳ４領域、またはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されるわけではない。）に特異的に結合する抗体と免疫反応性である１つ以上のエピトープを含有している他の単離されたまたは精製されたポリペプチドとの組み合わせにおいてのいずれかで、ＨＣＶのＮＳ３領域に特異的に結合する抗体と免疫反応性であるエピトープを含有している上記抗原ポリペプチドからなるであろう。このポリペプチドが免疫診断試薬に含まれるポリペプチドは、例えば、微粒子（例えば、磁性粒子）、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、メンブレン、足場分子、薄膜、濾紙、ディスク、またはチップのような固体支持体にコーティングされ得るが、必ずしもそうである必要はない。これに関して、免疫診断試薬が本発明のＮＳ３抗原をさらなる抗原との組み合わせにおいて含む場合は、本発明の抗原とさらなる抗原を同じ固体支持体上に一緒にコーティングすることができるか、または別の固体支持体上にコーティングすることができる（用語「固体支持体」と「固相」は本明細書中では互換的に使用される。）。抗原が同じ固体支持体上に一緒にコーティングされる場合は、好ましくは、本発明のＮＳ３抗原とさらなる抗原は、約１：２から約１：６の比で一緒にコーティングされ、ここで、本発明のＮＳ３抗原とさらなる抗原が約１：２の比で同じ固体支持体上に一緒にコーティングされる場合は、本発明のＮＳ３抗原の濃度は少なくとも約４０μｇ／ｍＬであり、さらなる抗原の濃度は少なくとも約８０μｇ／ｍＬである。
【００７９】
とりわけ、免疫診断試薬は、検出可能な標識で標識された、または捕捉または検出を可能にする特異的パートナーで標識された、本発明の抗原を含むであろう。例えば、標識は、蛍光色素分子、放射活性部分、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光標識などのような検出可能な標識であり得る。このような標識は以下にさらに詳細に記載される。
【００８０】
キット
本発明の抗原を含有している免疫診断試薬と、抗ＨＣＶ抗体の検出のための免疫測定法における免疫診断試薬の使用についての説明書とを含有しているキットがなおさらに提供される。例えば、キットは、免疫測定法によりＨＣＶ抗体について試験試料をアッセイするための説明書を含み得る。好ましい実施形態は、試験試料をアッセイするために化学発光微粒子免疫測定法を利用するが、本発明の抗原が試験試料中のＨＣＶ抗体の存在を決定するための当業者に公知の任意の他の免疫測定法において使用され得ることが理解されるものとする。説明書は、書面の形態であってよく、または、ディスク、ＣＤ、ＤＶＤなどのようなコンピュータで読み取りが可能な形態であってもよい。代わりに、または加えて、キットは、検量用試料または対照、例えば、精製された、および場合により凍結乾燥させられた抗ＨＣＶ抗体、ならびに／またはアッセイを実行するための少なくとも１つの容器（例えば、チューブ、マイクロタイタープレートまたは細片（これは免疫診断試薬ですでにコーティングされていてよい。））、ならびに／または緩衝液（例えば、アッセイ緩衝液または洗浄緩衝液（これらのいずれか一方は濃縮された溶液として提供され得る。））、検出可能な標識（例えば、酵素標識）の基質溶液、または停止液を含み得る。好ましくは、キットは、アッセイの実施に必要な全ての構成成分、即ち、試薬、標準物質、緩衝液、希釈剤などを含む。説明書はまた、検量線を作製するための説明書、または抗ＨＣＶ抗体の定量化の目的のための参照基準を含み得る。
【００８１】
キットの中に提供される任意の抗体（例えば、抗ＩｇＧ抗体および抗ＩｇＭ抗体）は、蛍光色素分子、放射活性部分、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光標識などのような検出可能な標識を取り込むことができるか、またはキットは、抗体もしくは抗体を検出するための試薬（例えば、検出抗体）を標識するための試薬、および／または分析物もしくは分析物を検出するための試薬を標識するための試薬を含み得る。抗体、検量用試料および／または対照は別の容器の中で提供され得るか、代わりに、適切なアッセイ形式に、例えば、マイクロタイタープレートに分注されて提供され得る。
【００８２】
場合により、キットは、品質管理用の構成成分（例えば、感度パネル、検量用試料および陽性対照）を含む。品質管理用の試薬の調製は当該分野で周知であり、様々な免疫診断用製品のインサートシートに記載されている。感度パネルのメンバーが、場合により、アッセイの性能の特徴を確立するために使用され、さらに場合により、感度パネルのメンバーは免疫測定法のキットの試薬の一貫性およびアッセイの標準化についての有用な指標である。
【００８３】
キットはまた、場合により、診断アッセイを行うため、または品質管理評価を容易にするために必要な他の試薬、例えば、緩衝液、塩、酵素、酵素補因子、基質、検出試薬などを含む。他の構成成分、例えば、試験試料の単離および／または処理（例えば、前処理試薬）のための緩衝液および溶液もまた、キットに含まれ得る。キットは、１つ以上の他の対照をさらに含むことができる。キットが凍結乾燥させられた構成成分の再構成に適している試薬をさらに含むことができる場合には、キットの１つ以上の構成成分を凍結乾燥させることができる。
【００８４】
キットの様々な構成成分は、場合により、必要に応じて適切な容器、例えば、マイクロタイタープレートの中に提供される。キットはさらに、試料を保持するまたは保存するための容器（例えば、試料用の容器またはカートリッジ）を含むことができる。適切である場合は、キットはまた場合により、試薬または試験試料の調製を容易にする反応容器、混合容器および他の構成成分を含むことができる。キットはまた、注射器、ピペット、鉗子、計量スプーンなどのような、試験試料を得る手助けとなる１つ以上の計器を含むことができる。
【００８５】
検出可能な標識が少なくとも１つのアクリジニウム化合物である場合は、キットは、少なくとも１つのアクリジニウム−９−カルボキサミド、少なくとも１つのアクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステル、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。検出可能な標識が少なくとも１つのアクリジニウム化合物である場合は、キットはまた、緩衝液、溶液および／または少なくとも１つの塩基性溶液のような、過酸化水素の供給源を含み得る。免疫診断試薬中では、本発明のＮＳ３抗原は検出可能であるように標識されている場合があること、さらなる抗原もまた検出可能であるように標識されている場合があること、およびこのような試薬とともに使用されるキットの中に提供される任意の抗体もまた、検出可能であるように標識されている場合があることが理解されるものとする。
【００８６】
所望される場合は、キットは、固体支持体相、例えば、磁性粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、メンブレン、足場分子、薄膜、濾紙、ディスクまたはチップを含み得る。
【００８７】
試験試料中の抗ＨＣＶ抗体の存在、量、または濃度を決定する方法
本開示は、試験試料中の抗ＨＣＶ抗体の存在、量、または濃度を決定するための方法を提供する。当該分野で公知の任意の適切なアッセイを、このようなアッセイが１つ以上の本発明のＮＳ３抗原を使用する限りは、本開示の方法において使用することができる。例として、サンドイッチ免疫測定法（例えば、放射性同位体の検出（放射免疫測定法（ＲＩＡ）を含む。）および酵素検出（酵素免疫測定法（ＥＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（例えば、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  ａｓｓａｙ，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．））を含むモノクローナル−ポリクローナルサンドイッチ免疫測定法）、競合阻害免疫測定法（例えば、正方向および逆方向）、蛍光分極免疫測定法（ＦＰＩＡ）、競合的酵素免疫分析法（ＥＭＩＴ）、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）およびホモジニアス化学発光定量法などのような免疫測定法が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００８８】
免疫測定法の特異的な実施形態では、組換えＮＳ３抗原が、捕捉試薬として（例えば、抗原のアミノ末端またはカルボキシ末端がビオチンタグを含む試薬を使用することにより）、または本発明の抗原が、例えばアクリジニウムで、直接または間接的にのいずれかで検出可能であるように標識されている検出（結合体）試薬）として、使用され得る。間接的な標識には、例えば、ＳＭＣＣタイプのリンカーを介してＮＳ３タンパク質内の対合していないシステイン残基の遊離のチオールに共有結合したアクリジニル化ＢＳＡ（または類似している検出可能である部分）の使用が必要である。このような間接的な標識を促すために、本発明の抗原の幾つかは、Ｃ末端にさらなるシステイン残基を含むようにさらに改変されている。さらなる実施形態では、本発明者らは、ヘリカーゼ抗原のＣ末端に２つのシステイン残基を含むことにより抗原の直接の標識が容易になり得ることを明らかにした。
【００８９】
典型的には、免疫測定法が、１工程または２工程の形式で行われる。１工程のアッセイにおいては、溶液中に形成した免疫複合体の捕捉のための固相試薬は、抗ビオチンモノクローナル抗体、ストレプトアビジン、またはニュートラアビジン、または他のビオチン結合部分を含む。
【００９０】
ＳＥＬＤＩをベースとする免疫測定法においては、抗ＨＣＶ−抗体に特異的に結合する捕捉試薬が質量分析用プローブ（例えば、予め活性化させられたタンパク質チップアレイ）の表面に付着させられる。その後、抗ＨＣＶ抗体がバイオチップ上に特異的に捕捉され（本発明においては、このような捕捉は１つ以上の本発明の抗原を使用して達成され得る。）、捕捉された抗ＨＣＶ抗体が質量分析により検出される。代わりに、抗ＨＣＶ抗体を捕捉試薬から溶離させることができ、従来のＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化）により、またはＳＥＬＤＩにより検出することができる。
【００９１】
化学発光微粒子免疫測定法、特に、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）自動分析器（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，Ｉｌｌ．）を利用するものが、本発明の抗原が容易に利用され得る好ましい免疫測定法の一例である。凝集アッセイ、例えば、受動血球凝集アッセイもまた使用することができる。凝集アッセイでは、抗原−抗体反応が、凝集またはクランピングにより検出される。受動血球凝集アッセイにおいては、赤血球は抗原でコーティングされ、コーティングされた赤血球が凝集アッセイにおいて使用される。
【００９２】
尿、血液、血清および血漿、ならびに他の体液を回収する、取り扱う、および処理するための当該分野で周知の方法が、例えば、本開示のポリペプチドが免疫診断試薬として、および／または抗ＨＣＶ抗体免疫測定法のキットにおいて利用される場合に、本開示の実施において使用される。試験試料は、目的のポリペプチド、例えば、抗体、抗原、ハプテン、ホルモン、薬物、酵素、受容体、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドに加えてさらなる部分を含み得る。例えば、試料は、被験体から得られた全血試料であり得る。試験試料、特に全血が、本明細書中に記載されるような免疫測定法の前に、例えば、前処理試薬で処理されることが必要であり得るかまたは所望され得る。前処理が必要ない場合（例えば、ほとんどの尿試料の場合）でもなお、前処理を、場合により単なる利便性のために（例えば、市販されているプラットフォームについてのレジュメの一部として）行うことができる。
【００９３】
前処理試薬は、本発明の免疫測定法およびキットとともに使用されるために適している任意の試薬であり得る。前処理には、場合により、（ａ）１つ以上の溶媒（例えば、メタノールおよびエチレングリコール）および塩、（ｂ）１つ以上の溶媒、塩および界面活性剤、（ｃ）界面活性剤、または（ｄ）界面活性剤および塩が含まれる。前処理試薬は当該分野で公知であり、このような前処理は、文献（例えば、Ｙａｔｓｃｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｂｂｏｔｔ  ＴＤｘ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｓｓａｙ  Ｅｖａｌｕａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  ｉｎ  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｌｏｏｄ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３６：１９６９−１９７３（１９９０）、およびＷａｌｌｅｍａｃｑ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  ＡｘＳＹＭ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ａｓｓａｙ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ＴＤｘ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ＥＭＩＴ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ａｓｓａｙｓ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：４３２−４３５（１９９９）を参照のこと）に記載されているように、および／または市販されているように、例えば、Ａｂｂｏｔｔ  ＴＤｘ、ＡｘＳＹＭ（Ｒ）、およびＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）分析器（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，Ｉｌｌ．）上でのアッセイに使用されるように、利用され得る。加えて、前処理を、Ａｂｂｏｔｔの米国特許第５，１３５，８７５号明細書、欧州特許第０４７１２９３号明細書、２００６年１２月２９日に提出された米国仮特許出願番号第６０／８７８，０１７号明細書および米国特許出願公開第２００８／００２０４０１号明細書（前処理に関するこの技術についてのこの全体が引用により組み込まれたものとされる。）に記載されているように行うことができる。前処理試薬は不均質な薬剤であってよく、または均質な薬剤であってもよい。
【００９４】
前処理試薬の使用により、アッセイは、試験試料中の予め形成している／既存の免疫複合体またはウイルス粒子の崩壊により、さらに感度が高くなる。このような前処理工程には、試験試料に対する前処理試薬の添加による、任意の妨害する分析物結合タンパク質の除去が含まれる。このようなアッセイでは、抗体捕捉工程の直前には、いずれの結合タンパク質も含まない混合物の上清が、アッセイにおいて使用される。
【００９５】
幾つかの他の実施形態では、前処理の使用によりこのような分離工程が必要ない。試験試料と前処理試薬との完全な混合物を、標識された本発明の抗原のような、抗ＨＣＶ抗体についての標識された特異的結合パートナーと接触させる。このようなアッセイに利用される前処理試薬は、典型的には、第１の特異的結合パートナーによる捕捉の前またはこの間のいずれかに、予め処理された試験試料混合物中に希釈される。このような希釈にもかかわらず、一定の量の前処理試薬（例えば、５Ｍのメタノールおよび／または０．６メチレングリコール）が、捕捉の際の試験試料混合物中になおも存在する（または残る。）。
【００９６】
不均質な形式では、試験試料が被験体から得られた後、第１の混合物が調製される。混合物には、抗ＨＣＶ抗体および第１の特異的結合パートナーについて評価される試験試料が含まれる。ここでは、試験試料中に含まれる第１の特異的結合パートナーと任意の抗ＨＣＶ抗体が、第１の特異的結合パートナー−抗ＨＣＶ抗体複合体を形成する。好ましくは、第１の特異的結合パートナーは本発明のＮＳ３抗原であり、好ましくは、表１に、および上記本明細書中の実施例に示される任意の１つ以上の抗原である。
【００９７】
試験試料と第１の特異的結合パートナーを、混合物を形成させるために添加する順序は重要ではない。好ましくは、第１の特異的結合パートナーが固相上に固定される。免疫測定法において（第１の特異的結合パートナー、および場合により、第２の特異的結合パートナーについて）使用される固相は、当該分野で公知の任意の固相であり得、例えば、磁性粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、メンブレン、足場分子、薄膜、濾紙、ディスクおよびチップであり得るが、これらに限定されるわけではない。
【００９８】
第１の特異的結合パートナー−抗ＨＣＶ抗体複合体を含有している混合物が形成させられた後、全ての結合していない抗ＨＣＶ抗体が、当該分野で公知の任意の技術を使用して複合体から除去される。例えば、結合していない抗ＨＣＶ抗体を洗浄により除去することができる。しかし望ましくは、第１の特異的結合パートナーは、試験試料中に存在する任意の抗ＨＣＶ抗体を上回る量で存在し、この結果、試験試料中に存在する全ての抗ＨＣＶ抗体が第１の特異的結合パートナーに結合される。
【００９９】
全ての結合していない抗ＨＣＶ抗体が除去された後、第２の特異的結合パートナーが混合物に添加されて、第１の特異的結合パートナー−抗ＨＣＶ抗体−第２の特異的結合パートナー複合体が形成させられる。第２の特異的結合パートナーは、好ましくは、抗ＩｇＧ抗体と抗ＩｇＭ抗体の組み合わせである。さらにまた好ましくは、第２の特異的結合パートナーは、上記のような検出可能な標識で標識されるか、または上記のような検出可能な標識を含む。
【０１００】
当該分野で公知であるような任意の適切な検出可能な標識を使用することができる。例えば、検出可能な標識は、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐおよび３３Ｐ）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ペルオキシダーゼ、グルコース６−ホスフェートデヒドロゲナーゼなど）、化学発光標識（例えば、アクリジニウムエステル、チオエステル、またはスルホンアミド；ルミノール、イソルミノール、フェナントリジニウムエステルなど）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン（例えば、５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３’６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロ−フルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートなど））、ローダミン、フィコビリタンパク質、Ｒ−フィコエリスリン、量子ドット（例えば、硫化亜鉛でキャップされたセレン化カドミウム）、温度測定に関する標識（ｔｈｅｒｍｏｍｅｔｒｉｃ  ｌａｂｅｌ）、または免疫ポリメラーゼ連鎖反応標識であり得る。標識、標識手順および標識の検出についての序論は、Ｐｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｎｏｏｒｄｅｎ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９９７）、およびＨａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９６）（これは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．により出版されているハンドブックおよびカタログと組み合わせられる。）の中に見られる。蛍光標識はＦＰＩＡにおいて使用され得る（例えば、米国特許第５，５９３，８９６号明細書、同第５，５７３，９０４号明細書、同第５，４９６，９２５号明細書、同第５，３５９，０９３号明細書および同第５，３５２，８０３号明細書（これらは、これらの全体が引用により本明細書中に組み込まれたものとされる。）を参照のこと）。アクリジニウム化合物は、ホモジニアス化学発光定量法において検出可能な標識として使用され得る（例えば、Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１６：１３２４−１３２８（２００６）；Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：２３１３−２３１７（２００４）；Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４：３９１７−３９２１（２００４）；およびＡｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．５：３７７９−３７８２（２００３）を参照のこと）。
【０１０１】
好ましいアクリジニウム化合物はアクリジニウム−９−カルボキサミドである。アクリジニウム９−カルボキサミドを調製する方法は、Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．６：１０７−１１４（１９９１）；Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３：５６３６−５６３９（１９９８）；Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５５：１０８９９−１０９１４（１９９９）；Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．１：７７９−７８１（１９９９）；Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１１：７１４−７２４（２０００）；Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｄｙｋｅ，Ｋ．Ｖ．Ｅｄ．；ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ｐｐ．７７−１０５（２００２）；Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．５：３７７９−３７８２（２００３）；ならびに米国特許第５，４６８，６４６号明細書、同第５，５４３，５２４号明細書および同５，７８３，６９９号明細書（これらのそれぞれが、それぞれに関するこの教示についてこの全体が引用により本明細書中に組み込まれたものとされる。）に記載されている。
【０１０２】
別の好ましいアクリジニウム化合物はアクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルである。式ＩＩのアクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルの一例は、１０−メチル−９−（フェノキシカルボニル）アクリジニウムフルオロスルホネート（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．から市販されている。）である。アクリジニウム９−カルボン酸アリールエステルを調製するための方法は、ＭｃＣａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．４：１１１１−２１（１９６５）；Ｒａｚａｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  １５：２４５−２４９（２０００）；Ｒａｚａｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  １５：２３９−２４４（２０００）；および米国特許第５，２４１，０７０号明細書（これらのそれぞれが、それぞれに関するこの教示についてこの全体が引用により本明細書中に組み込まれたものとされる。）に記載されている。このようなアクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルは、シグナルの強度および／またはシグナルの迅速性に関して、少なくとも１種のオキシダーゼによる分析物の酸化において生産された過酸化水素についての効率的な化学発光指示薬である。アクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルについての化学発光の放射の経過は迅速に、即ち１秒以内に完了し、一方、アクリジニウム−９−カルボキサミドの化学発光の放射は２秒を超える。しかし、アクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルは、タンパク質の存在下でこの化学発光特性を失う。従って、この使用には、シグナル生成および検出の間にタンパク質が存在しないことが求められる。試料中のタンパク質を分離または除去するための方法は当業者に周知であり、限外濾過、抽出、沈澱、透析、クロマトグラフィーおよび／または消化が挙げられるが、これらに限定されるわけではない（例えば、Ｗｅｌｌｓ，Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（２００３）を参照のこと）。試験試料から除去または分離されるタンパク質の量は、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％であり得る。アクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルおよびこの使用に関するさらなる詳細は、２００７年４月９日に提出され、２００８年１０月９日に米国特許出願公開番号第２００８／０２４８４９３号として公開された米国特許出願番号第１１／６９７，８３５号明細書に示されている。アクリジニウム−９−カルボン酸アリールエステルは、任意の適切な溶媒、例えば、脱気された無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはコール酸ナトリウム水溶液中に溶解させることができる。
【０１０３】
化学発光アッセイは、Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ５７９（１）：６１−６７（２００６）に記載されている方法に従って行うことができる。任意の適切なアッセイ形式を使用することができるが、マイクロプレートケミルミノメーター（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）（Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ−９４０，Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，ＬＬＣ，Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ，Ｔｅｎｎ．）は、複数の少量の試料の迅速なアッセイを可能にする。ケミルミノメーターは、９６ウェルブラックポリスチレンマイクロプレート（９６−ｗｅｌｌ  ｂｌａｃｋ  ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ）（Ｃｏｓｔａｒ  ＃３７９２）を使用する、複数の試薬用のインジェクター（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｉｎｊｅｃｔｏｒ）を備えることができる。それぞれの試料を別のウェルに添加することができ、続いて、利用されるアッセイのタイプにより決定される他の試薬の同時の／連続しての添加が行われ得る。望ましくは、例えば、酸性化により、アクリジニウムアリールエステルを利用する、中性または塩基性溶液中での疑似塩基の形成が回避される。その後、化学発光応答がウェルごとに記録される。これに関して、化学発光応答を記録するための時間は、試薬の添加の間の遅延と利用される特定のアクリジニウムに一部依存するであろう。
【０１０４】
試験試料と特異的結合パートナー（単数または複数）が化学発光アッセイのための混合物を形成させるために添加される順序は重要ではない。第１の特異的結合パートナーがアクリジニウム化合物で検出可能であるように標識されている場合は、検出可能であるように標識されている第１の特異的結合パートナー−抗ＨＣＶ抗体複合体が形成する。代わりに、第２の特異的結合パートナーが使用され、第２の特異的結合パートナーがアクリジニウム化合物で検出可能であるように標識されている場合は、検出可能であるように標識されている第１の特異的結合パートナー−抗ＨＣＶ抗体−第２の特異的結合パートナー複合体が形成する。任意の結合していない特異的結合パートナーは、標識されているかまたは標識されていないかにかかわらず、洗浄のような当該分野で公知の任意の技術を使用して混合物から除去することができる。
【０１０５】
過酸化水素は、混合物中で、インサイチュで生成され得るか、代わりに、上記アクリジニウム化合物の添加の前、添加と同時、もしくは添加後に、混合物に対して提供されるか、または供給され得る。過酸化水素は、当業者に明らかであるような多数の方法で、インサイチュで生成させることができる。
【０１０６】
代わりに、過酸化水素の供給源を混合物に単純に添加することができる。例えば、過酸化水素の供給源は、過酸化水素を含有することがわかっている１つ以上の緩衝液または他の溶液であり得る。これに関して、過酸化水素の溶液を単純に添加することができる。
【０１０７】
試料に対して少なくとも１つの塩基性溶液を同時にまたは続けて添加すると、検出可能なシグナル、即ち、抗ＨＣＶ抗体の存在の指標となる化学発光シグナルが発生する。塩基性溶液は、少なくとも１種の塩基を含み、１０以上のｐＨを、好ましくは、１２以上のｐＨを有する。塩基性溶液の例として、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウムおよび重炭酸カルシウムが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。試料に添加される塩基性溶液の量は、塩基性溶液の濃度に依存する。使用される塩基性溶液の濃度に基づいて、当業者は、試料に添加する塩基性溶液の量を容易に決定することができる。
【０１０８】
生じる化学発光シグナルは、当業者に公知である日常的に行われている技術を使用して検出することができる。生じるシグナルの強度に基づいて、試料中の抗ＨＣＶ抗体の量を定量化することができる。具体的には、試料中の抗ＨＣＶ抗体の量は、生じるシグナルの強度に比例する。存在する抗ＨＣＶ抗体の量は、抗ＨＣＶ抗体の検量線に対して生じた光の量を比較することにより、または参照標準との比較により定量化することができる。検量線は、質量分光測定法、重量法および当該分野で公知の他の技術により、既知の濃度の抗ＨＣＶ抗体の段階希釈物または溶液を使用して作成することができる。
【０１０９】
抗ＨＣＶ抗体免疫測定法を当該分野で公知の任意の適切な形式を使用して行うことができる。一般的に言うと、抗ＨＣＶ抗体について試験される（例えば、抗ＨＣＶ抗体を含有していると疑われる）試料を捕捉抗原および少なくとも１つの検出抗体（第２の検出抗体または第３の検出抗体であってもよい。）（例えば、標識された抗ＩｇＧ抗体および抗ＩｇＭ抗体）と、同時に、または連続して任意の順序でのいずれかで接触させることができる。例えば、試験試料を少なくとも１つの捕捉抗原と最初に接触させ、その後、少なくとも１つの検出抗体と（続けて）接触させることができる。代わりに、試験試料を少なくとも１つの検出抗体と最初に接触させ、その後、少なくとも１つの捕捉抗体と（続けて）接触させることができる。なお別の代替えにおいては、試験試料を捕捉抗原および検出抗体と同時に接触させることができる。
【０１１０】
サンドイッチアッセイ形式では、抗ＨＣＶ抗体（またはこの断片）を含有していると疑われる試料が、少なくとも１つの第１の捕捉抗原と、第１の捕捉抗原／抗ＨＣＶ抗体複合体の形成を可能にする条件下で最初に接触させられる。２以上の捕捉抗原が使用される場合は、複数の第１の捕捉抗原／抗ＨＣＶ抗体複合体が形成する。サンドイッチアッセイでは、抗原（単数または複数）、好ましくは、少なくとも１種の捕捉抗原が、試験試料中に予想される抗ＨＣＶ抗体の最大量を上回るモル過剰量で使用される。例えば、緩衝液（例えば、微粒子をコーティングする緩衝液）１ｍＬあたり約５μｇから約１ｍｇが使用され得る。
【０１１１】
小さい分析物を測定するために頻繁に使用される競合阻害免疫測定法は、連続形式および古典形式を含む。連続競合阻害免疫測定法では、目的の抗体（即ち、抗ＨＣＶ抗体）に対する捕捉抗原（即ち、本明細書中で記載されるようなポリペプチド、および好ましくは１対のポリペプチド）がマイクロタイタープレートのウェルにコーティングされる。目的の抗体を含有している試料がウェルに添加されると、目的の抗体が捕捉抗原に結合する。洗浄後、既知の量の標識された（例えば、ビオチンまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））抗体がウェルに添加される。酵素標識の基質は、シグナルを発生させるためには不可欠である。ＨＲＰについての適切な基質の例は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である。洗浄後、標識された抗体により生じたシグナルが測定され、シグナルは試料中の抗体の量に反比例する。古典的な競合阻害免疫測定法では、目的の抗体について抗原がマイクロタイタープレートのウェルにコーティングされる。しかし、連続競合阻害免疫測定法とは異なり、目的の抗体（即ち抗ＨＣＶ抗体）を含有している試料と、標識された抗体が同時にウェルに添加される。試料中の任意の抗体は、捕捉抗原に対する結合について標識された抗体と競合する。洗浄後、標識された分析物により生じたシグナルが測定され、シグナルは、試料中の分析物の量と反比例する。
【０１１２】
場合により、試験試料を少なくとも１つの捕捉抗原（例えば、第１の捕捉抗原）と接触させる前に、少なくとも１つの捕捉抗原を、試験試料からの第１の抗原／抗ＨＣＶ抗体複合体の分離を容易にする固体支持体に結合させることができる。捕捉抗原が結合している基質が、試料からの捕捉抗原−抗ＨＣＶ抗体複合体の分離を容易にする任意の適切な固体支持体または固相であり得る。例として、マイクロタイタープレートのようなプレートのウェル、試験管、多孔性ゲル（例えば、シリカゲル、アガロース、デキストラン、またはゼラチン）、高分子フィルム（例えば、ポリアクリルアミド）、ビーズ（例えば、ポリスチレンビーズまたは磁性ビーズ）、フィルター／メンブレン（例えば、ニトロセルロースまたはナイロン）の細片、微粒子（例えば、ラテックス粒子、着磁可能な微粒子（例えば、酸化第二鉄または酸化クロムコアと、ホモポリマーまたはヘテロポリマーの被覆および約１から１０ミクロンの半径を有している微粒子））が挙げられる。基材は、抗原を結合するための適切な表面親和性、および検出抗体による評価を可能にするための十分な多孔性を持つ適切な多孔性材料を含み得る。微孔性材料が一般的に好ましいが、水和された状態においてゼラチン状である材料を使用することができる。このような多孔性基材は、好ましくは、約０．０１から約０．５ｍｍ、好ましくは約０．１ｍｍの厚みを有しているシートの形態である。孔の大きさはかなり変化し得るが、好ましくは、孔の大きさは、０．０２５から約１５ミクロン、より好ましくは約０．１５から約１５ミクロンである。このような基材の表面は、基材に対する抗体の共有結合を生じる化学的処理により活性化され得る。不可逆的な結合は、一般的には、基質に対する抗原の、疎水性力を通じた吸着によって生じるか、または、化学的カップリング剤または他の手段を、このような結合により抗ＨＣＶ抗体に結合する抗原の能力を妨害しない限りにおいて、基材に対して抗原を共有結合させるために使用することができる。
【０１１３】
代わりに、試験試料由来の抗ＨＣＶ抗体を、抗原で予めコーティングされている微粒子と結合させることができる。所望される場合は、１種以上の捕捉試薬、例えば、本明細書中に記載されるような一対のポリペプチド（このそれぞれに抗ＨＣＶ抗体が結合することができる。）を、様々な物理的またはアドレス指定可能な位置に（例えば、バイオチップの構成において）固相に付着させることができる（例えば、米国特許第６，２２５，０４７号明細書、国際特許出願公開番号第ＷＯ９９／５１７７３号；米国特許第６，３２９，２０９号明細書；国際特許出願公開番号第ＷＯ００／５６９３４号および米国特許第５，２４２，８２８号明細書を参照のこと）。捕捉試薬が固体支持体としての質量分析用プローブに付着させられる場合は、プローブに結合した抗ＨＣＶ抗体の量をレーザー脱着イオン化質量分析により検出することができる。代わりに、１つのカラムに様々なビーズを充填することができ、これらを１種以上の捕捉試薬で誘導体化し、これにより１つの場所に抗ＨＣＶ抗体を捕捉することができる（抗体で誘導体化される、ビーズをベースとする技術、例えば、ＬｕｍｉｎｅｘのｘＭＡＰ技術（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘ．）を参照のこと）。
【０１１４】
抗ＨＣＶ抗体についてアッセイされている試験試料が少なくとも１つの捕捉抗原（例えば、第１の捕捉抗原）と接触させられた後、混合物が、第１の抗原（または複数の抗原）−抗ＨＣＶ抗体（またはこの断片）複合体の形成を可能にするためにインキュベートされる。インキュベーションは、約４．５から約１０．０までのｐＨで、約２℃から約４５℃までの温度で、少なくとも約１分から約１８時間までの期間、好ましくは約１から約２４分まで、最も好ましくは約４から約１８分間行われ得る。本明細書中に記載される免疫測定法は、１工程で（試験試料、少なくとも１つの捕捉抗体および少なくとも１つの検出抗体が全て、反応容器に連続してまたは同時に添加されることを意味している。）または２以上の工程で、例えば、２工程、３工程などで行われ得る。
【０１１５】
（第１のまたは複数の）捕捉抗原／抗ＨＣＶ抗体複合体の形成後、次に、複合体は少なくとも１つの検出抗体と（（第１のまたは複数の）捕捉抗原／抗ＨＣＶ抗体／第２の抗体検出複合体の形成を可能にする条件下で）接触させられる。少なくとも１つの検出抗体は、免疫測定法で使用される第２の、第３の、第４の抗体などであり得る。捕捉抗原／抗ＨＣＶ抗体複合体が２以上の検出抗体と接触させられると、（第１のまたは複数の）捕捉抗原／抗ＨＣＶ抗体／（複数の）検出抗体複合体が形成される。捕捉抗原（例えば、第１の捕捉抗原）を用いるので、少なくとも第２の（およびこれ以上の）検出抗体が捕捉抗原／抗ＨＣＶ抗体複合体と接触させられる場合は、上記と類似する条件下でのインキュベーションの期間が、（第１のまたは複数の）捕捉抗原／抗ＨＣＶ抗体／（第２のまたは複数の）検出抗体複合体の形成に必要である。好ましくは、少なくとも１つの検出抗体が検出可能な標識を含む。検出可能な標識を、（第１のまたは複数の）捕捉抗原／抗ＨＣＶ抗体／（第２のまたは複数の）検出抗体複合体の形成の前に、形成と同時に、または形成後に、少なくとも１つの検出抗体（例えば、第２の検出抗体）に結合させることができる。当該分野で公知の任意の検出可能な標識を使用することができる（Ｐｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｎｏｏｒｄｅｎ（１９９７）およびＨａｕｇｌａｎｄ（１９９６）を含む上記を参照のこと）。
【０１１６】
検出可能な標識を直接、またはカップリング剤を介してのいずれかで、抗体に結合させることができる。使用することができるカップリング剤の一例は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．から市販されているＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ヒドロクロリド）である。使用できる他のカップリング剤は当該分野で公知である。抗体に検出可能な標識を結合させる方法は当該分野で公知である。加えて、抗体に対する検出可能な標識のカップリングを容易にする、ＣＰＳＰ−アクリジニウムエステル（即ち、９−［Ｎ−トシル−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）］−１０−（３−スルホプロピル）アクリジニウムカルボキサミド）またはＳＰＳＰ−アクリジニウムエステル（即ち、Ｎ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキサミド）のような末端基をすでに含む多くの検出可能な標識を購入することができるか、または合成することができる。
【０１１７】
（第１のまたは複数の）捕捉抗原／抗ＨＣＶ抗体／（第２のまたは複数の）検出抗体複合体は、標識の定量化の前に試験試料の残りから分離することができるが、これは必ずしも必要ではない。例えば、少なくとも１つの捕捉抗原（例えば、第１の捕捉抗原）が固体支持体（例えば、ウェルまたはビーズ）に結合させられている場合は、分離を、固体支持体との接触から（試験試料の）流体を除去することにより達成することができる。代わりに、少なくとも第１の捕捉抗原が固体支持体に結合させられている場合は、第１の捕捉抗原を、抗ＨＣＶ抗体を含有している試料および少なくとも１つの第２の検出抗体と、第１の（複数の）抗原／抗ＨＣＶ抗体／第２の（複数の）抗体複合体を形成させるために同時に接触させることができ、続いて、固体支持体との接触から流体（試験試料）が取り除かれ得る。少なくとも１つの第１の捕捉抗原が固体支持体に結合していない場合は、（第１のまたは複数の）捕捉抗原／抗ＨＣＶ抗体／（第２のまたは複数の）検出抗体複合体は、標識の量の定量化のために試験試料から取り除かれる必要はない。
【０１１８】
標識された捕捉抗原／抗ＨＣＶ抗体／検出抗体複合体（例えば、第１の捕捉抗原／抗ＨＣＶ抗体／第２の検出抗体複合体）の形成後、複合体中の標識の量が当該分野で公知の技術を使用して定量化される。例えば、酵素標識が使用される場合は、標識された複合体が、発色のような定量化可能な反応をもたらす標識の基質と反応させられる。標識が放射性標識である場合は、標識は、シンチレーションカウンターを使用して定量化される。標識が蛍光標識である場合は、標識は、１色の光で標識を刺激すること（「励起波長」として知られている。）、および刺激に反応して標識から放射される別の色（「発光波長」として知られている。）を検出することにより定量化される。標識が化学発光標識である場合は、標識は、視覚的に、または、ルミノメーター、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム（ｈｉｇｈ  ｓｐｅｅｄ  ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｆｉｌｍ）、ＣＣＤカメラなどを使用することによるかいずれかで放射された光を検出することにより定量化される。一旦、複合体中の標識の量が定量化されると、試験試料中の抗ＨＣＶ抗体の濃度が、既知の濃度の抗ＨＣＶ抗体の段階希釈物を使用して作製されている検量線の使用により決定される。抗ＨＣＶ抗体の段階希釈物を使用する以外に、検量線は、重量測定により、質量分光測定法により、および当該分野で公知の他の技術により作製することができる。
【０１１９】
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）分析器を利用する化学発光微粒子アッセイでは、結合体希釈剤のｐＨは約６．０＋／−０．２でなければならず、微粒子コーティング緩衝液は室温で（即ち、約１７から約２７℃で）維持されなければならず、微粒子コーティング緩衝液のｐＨは約６．５＋／−０．２でなければならず、微粒子希釈剤のｐＨは約７．８＋／−０．２でなければならない。固形分は、好ましくは、約０．２％未満、例えば、約０．１５％未満、約０．１４％未満、約０．１３％未満、約０．１２％未満、または約０．１１％未満、例えば約０．１０％である。
【０１２０】
ＦＰＩＡは、競合結合免疫測定法の原理に基づく。蛍光標識された化合物は、直線偏光により励起されると、この回転率に反比例する角度を持つ蛍光を放射する。蛍光標識されたトレーサー−抗体複合体が直線偏光により励起される場合は、放射光は、蛍光色素分子が、光が吸収される時間と光が放射される時間との間の回転により拘束されるので、高度に偏向されたままである。「遊離の」トレーサー化合物（即ち、抗体に結合しない化合物）が直線偏光により励起される場合は、この回転は、競合結合免疫測定法において生じる対応するトレーサー−抗体結合体よりもはるかに速い。ＦＰＩＡは、特別な取り扱いおよび処理が必要な放射性物質が存在しない限りは、ＲＩＡよりも有利である。加えて、ＦＰＩＡは、容易におよび迅速に行うことができる均質なアッセイである。
【０１２１】
市販されている抗ＨＣＶ抗体、ならびに抗ＩｇＧ抗体および抗ＩｇＭ抗体を、アッセイの方法およびこのキットにおいて使用することができる。市販されている抗体として、Ａｂｎｏｖａ（Ｗａｌｎｕｔ，Ｃａｌｉｆ．，ａｎｄ  Ｔａｉｗａｎ）およびＧｅｎＷａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）から市販されている抗体が挙げられる。抗ＨＣＶ抗体の調製に関しては、欧州特許出願番号第ＥＰ２０９９８２５Ａ２号明細書もまた参照のこと。
【０１２２】
任意の適切な対照組成物を抗ＨＣＶ抗体免疫測定法において使用することができる。対照組成物は一般に、抗ＨＣＶ抗体および任意の所望される添加剤を含む。
【０１２３】
従って、上記から、試験試料中の抗ＨＣＶ抗体の存在、量、または濃度を決定する方法が提供される。上記方法は、アッセイにより抗ＨＣＶ抗体について試験試料をアッセイする工程を含む：
（ｉ）本発明の組換えＮＳ３抗原を含有している少なくとも単離または精製されたポリペプチドおよび少なくとも１つの検出可能な標識を含有している免疫診断試薬を利用する工程、ならびに試験試料中の抗ＨＣＶ抗体の存在、量、または濃度の直接的または間接的指標としての検出可能な標識により生じたシグナルを、対照もしくは検量用試料（これは場合により、検量用試料のそれぞれが抗ＨＣＶ抗体の濃度に関してこのシリーズ中の他の検量用試料とは異なる検量用試料のシリーズの一部である。）中の抗ＨＣＶ抗体の存在、量、または濃度の直接的または間接的指標として生じたシグナルに対して比較する工程。上記方法は以下の工程を含み得る：
（ｉ）試験試料中に存在し得るＨＣＶ抗体とともに第１の特異的結合パートナー／抗ＨＣＶ抗体複合体を形成するように、試験試料を、本発明の１つ以上の組換えＮＳ３抗原を含有している免疫診断試薬と接触させる工程、
（ｉｉ）第１の特異的結合パートナー／抗ＨＣＶ抗体／第２の特異的結合パートナー複合体を形成するように、第１の特異的結合パートナー／抗ＨＣＶ抗体複合体を、抗ＨＣＶ抗体（例えば、抗ＩｇＧ抗体および抗ＩｇＭ抗体または本明細書中に記載されるポリペプチド）についての少なくとも１つの検出可能であるように標識されている第２の特異的結合パートナーと接触させる工程、および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で形成した第１の特異的結合パートナー／抗ＨＣＶ抗体／第２の特異的結合パートナー複合体中の検出可能な標識により生じたシグナルを検出または測定することにより、試験試料中の抗ＨＣＶ抗体の存在、量、または濃度を決定する工程。
【０１２４】
代わりに、上記方法は以下の工程を含み得る：
（ｉ）試験試料を、１つ以上の本発明の組換えＮＳ３抗原を含有している免疫診断試薬と接触させる工程、および、同時にまたはいずれかの順序で連続して、試験試料を、第１の特異的結合パートナーの少なくとも１つの対に対する結合について抗ＨＣＶ抗体と競合し得る、および検出可能であるように標識されている抗ＨＣＶ抗体を含む少なくとも１つの検出可能であるように標識されている第２の特異的結合パートナーと接触させる工程であって、ここでは、試験試料中に存在する任意の抗ＨＣＶ抗体と少なくとも１つの検出可能であるように標識されている第２の特異的結合パートナーとが、第１の特異的結合パートナー／抗ＨＣＶ抗体複合体および第１の特異的結合パートナー／第２の特異的結合パートナー複合体をそれぞれ形成するように互いに競合する、工程、ならびに、
（ｉｉ）（ｉｉ）で形成した第１の特異的結合パートナー／第２の特異的結合パートナー複合体中の検出可能な標識により生じたシグナルを検出または測定することにより、試験試料中の抗ＨＣＶ抗体の存在、量、または濃度を決定する工程であって、ここでは、第１の特異的結合パートナー／第２の特異的結合パートナー複合体中の検出可能な標識により生じたシグナルが、試験試料中の抗ＨＣＶ抗体の量または濃度に反比例する、工程。免疫診断試薬に含まれる組換えＮＳ３抗原が微粒子上にコーティングされ得る。これに関して、免疫診断試薬に含まれるＮＳ３抗原を、さらなるＨＣＶ抗原として同じ微粒子上に一緒にコーティングすることができる。免疫診断試薬に含まれるポリペプチドが同じ微粒子上に一緒にコーティングされる場合は（例えば、４％の固形分を含有している微粒子懸濁液（４重量％／容積の微粒子または４ｇｒの微粒子／１００ｍＬの微粒子懸濁液））、好ましくは、ポリペプチドが、約１：２から約１：６の比で同じ微粒子上に一緒にコーティングされる。ここでは、ポリペプチドが約１：２の比で同じ微粒子上に一緒にコーティングされる場合は、本発明の単離または精製されたＮＳ３抗原（例えば、表１に記載されるもの）の濃度は少なくとも約４０μｇ／ｍＬであり、他の単離または精製されたポリペプチドの濃度は少なくとも約８０μｇ／ｍＬである。試験試料が患者から得られた場合は、上記方法にはさらに、患者の治療的／予防的処置の有効性を診断する、予後判定する、または評価する工程が含まれ得る。上記方法が患者の治療的／予防的処置の有効性を評価する工程をさらに含む場合は、上記方法は、有効性を改善する必要がある患者の治療的／予防的処置を改変する工程をさらに含んでもよい。上記方法は、自動化システムまたは半自動化システムでの使用に適応させることができる。
【０１２５】
また、上記から、試験試料中の抗ＨＣＶ抗体の存在、量、または濃度を決定する方法が提供される。上記方法には、アッセイにより抗ＨＣＶ抗体について試験試料をアッセイする工程が含まれる：
（ｉ）提示される本発明の少なくとも１つのＮＳ３抗原、少なくとも１つの検出可能な標識を含有している免疫診断試薬を利用する工程、および
（ｉｉ）試験試料中の抗ＨＣＶ抗体の存在、量、または濃度の直接的または間接的指標としての検出可能な標識により生じたシグナルを、対照もしくは検量用試料（これは場合により、検量用試料のそれぞれが抗ＨＣＶ抗体の濃度に関してこのシリーズ中の他の検量用試料とは異なる検量用試料のシリーズの一部である。）中の抗ＨＣＶ抗体の存在、量、または濃度の直接的または間接的指標として生じたシグナルに対して比較する工程。上記方法は以下の工程を含み得る：
（ｉ）第１の特異的結合パートナー／抗ＨＣＶ抗体複合体を形成するように、試験試料を、本発明の少なくとも１つの組換えＮＳ３抗原を含有している免疫診断試薬と接触させる工程、
（ｉｉ）第１の特異的結合パートナー／抗ＨＣＶ抗体／第２の特異的結合パートナー複合体を形成するように、第１の特異的結合パートナー／抗ＨＣＶ抗体複合体を、抗ＨＣＶ抗体（例えば、抗ＩｇＧ抗体および抗ＩｇＭ抗体または本明細書中に記載されるポリペプチド）についての少なくとも１つの検出可能であるように標識されている第２の特異的結合パートナーと接触させる工程、および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で形成した第１の特異的結合パートナー／抗ＨＣＶ抗体／第２の特異的結合パートナー複合体中の検出可能な標識により生じたシグナルを検出または測定することにより、試験試料中の抗ＨＣＶ抗体の存在、量、または濃度を決定する工程。代わりに、上記方法は以下の工程を含み得る：
（ｉ）試験試料を、少なくとも１つの本発明の組換えＮＳ３抗原を含有している免疫診断試薬と接触させる工程、および、同時にまたはいずれかの順序で連続して、試験試料を、第１の特異的結合パートナーの少なくとも１つの対に対する結合について抗ＨＣＶ抗体と競合し得る、および検出可能であるように標識されている抗ＨＣＶ抗体を含む少なくとも１つの検出可能であるように標識されている第２の特異的結合パートナーと接触させる工程であって、ここでは、試験試料中に存在する任意の抗ＨＣＶ抗体と少なくとも１つの第２の特異的結合パートナーとが、第１の特異的結合パートナー／抗ＨＣＶ抗体複合体および第１の特異的結合パートナー／第２の特異的結合パートナー複合体をそれぞれ形成するように互いに競合する、工程、ならびに、
（ｉｉ）（ｉｉ）で形成した第１の特異的結合パートナー／第２の特異的結合パートナー複合体中の検出可能な標識により生じたシグナルを検出または測定することにより、試験試料中の抗ＨＣＶ抗体の存在、量、または濃度を決定する工程であって、ここでは、第１の特異的結合パートナー／第２の特異的結合パートナー複合体中の検出可能な標識により生じたシグナルが、試験試料中の抗ＨＣＶ抗体の量または濃度に反比例する、工程。免疫診断試薬に含まれるポリペプチドが微粒子上にコーティングされ得る。これに関して、免疫診断試薬に含まれるポリペプチドを同じ微粒子上に一緒にコーティングすることができる。免疫診断試薬に含まれるポリペプチドが同じ微粒子上に一緒にコーティングされる場合は（例えば、４％の固形分を含有している微粒子懸濁液（４重量％／容積の微粒子または４ｇｒの微粒子／１００ｍＬの微粒子懸濁液））、好ましくは、ポリペプチドが、約１：２から約１：６の比で同じ微粒子上に一緒にコーティングされる。ここでは、ポリペプチドが約１：２の比で同じ微粒子上に一緒にコーティングされる場合は、本発明の組換えＮＳ３抗原を含有している単離または精製されたポリペプチドの濃度は少なくとも約４０μｇ／ｍＬであり、他の単離または精製されたポリペプチドの濃度は少なくとも約８０μｇ／ｍＬである。試験試料が患者から得られた場合は、上記方法にはさらに、患者の治療的／予防的処置の有効性を診断する、予後判定する、または評価する工程が含まれ得る。上記方法が患者の治療的／予防的処置の有効性を評価する工程をさらに含む場合は、上記方法は場合により、有効性を改善する必要がある患者の治療的／予防的処置を改変する工程をさらに含み得る。上記方法は、自動化システムまたは半自動化システムでの使用に適応させることができる。
【０１２６】
一般的には、予め決定されたレベルを、抗ＨＣＶ抗体について試験試料をアッセイした際に得られた結果を評価するためのこれに対するベンチマークとして利用することができる。一般的には、このような比較を行う際には、予め決定されたレベルが、分析物の存在、量、または濃度の疾患、障害、または症状（例えば、子癇前症または心血管疾患）の特定の段階または終点との、または特定の兆候との連関もしくは関係が構築され得るように、十分な回数および適切な条件下で特定のアッセイを実行することにより得られる。典型的には、予め決定されたレベルが、参照被験体（または被験体の集団）のアッセイにより得られる。
【０１２７】
特に、疾患の進行および／または処置をモニターするために利用される予め決定されたレベルに関して、抗ＨＣＶ抗体の量または濃度は、「変化しない」、「好ましい」（もしくは「好ましく変化した」）または「好ましくない」（もしくは「好ましくなく変化した」）であり得る。「上昇した」または「増大した」は、典型的なまたは正常なレベルまたは範囲（例えば、予め決定されたレベル）より高い、または別の参照レベルまたは範囲（例えば、より早い段階の試料またはベースライン試料）より高い、試験試料中の量または濃度をいう。用語「低くなった（ｌｏｗｅｒｅｄ）」または「低下した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」は、典型的なまたは正常なレベルまたは範囲（例えば、予め決定されたレベル）を下回る、または別の参照レベルまたは範囲（例えば、より早い段階の試料またはベースライン試料）より低い、試験試料中の量または濃度をいう。用語「変化した」は、典型的なもしくは正常なレベルまたは範囲（例えば、予め決定されたレベル）を上回って、または、別の参照レベルまたは範囲（例えば、より早い段階の試料またはベースライン試料）を上回って変化した（増大したまたは低下した）試料中の量または濃度をいう。
【０１２８】
抗ＨＣＶ抗体についての典型的なまたは正常なレベルまたは範囲は、標準的な実施に従って定義される。幾つかの場合には抗ＨＣＶ抗体のレベルが非常に低いので、いわゆる変化したレベルまたは変化は、実験誤差または試料のバリエーションにより説明することができない、典型的なもしくは正常なレベルもしくは範囲、または参照レベルもしくは範囲と比較した任意の正味の変化が存在する場合に起こったとみなすことができる。従って、特定の試料中で測定されたレベルは、いわゆる正常な被験体由来の類似する試料において決定されたレベルまたはレベルの範囲と比較されるであろう。この状況では、「正常な被験体」は、検出可能な肝炎を持たない個体であり、例えば、「正常な」（時として「対照」と呼ばれる）患者または集団は、例えば、検出可能な肝炎を示さない患者または集団（単数または複数）である。さらに、抗ＨＣＶ抗体が日常的には、ヒト集団の大部分においては高いレベルでは見られないことを考えると、「正常な被験体」は、実質的に検出可能な抗ＨＣＶ抗体の増大したまたは上昇した量または濃度を持たない個体と考えることができ、「正常な」（時として「対照」と呼ばれる）患者または集団は、実質的に検出可能な増大したまたは上昇した量または濃度の抗ＨＣＶ抗体を示さない患者または集団（単数または複数）である。「見かけ上正常な被験体」は、抗ＨＣＶ抗体が評価されないかまたは評価されていない被験体である。分析物のレベルは、分析物が通常は検出されない場合（例えば、正常なレベルがゼロであるか、または正常な集団の約２５から約７５パーセントまでの範囲にある。）が、試験試料においては検出される場合、ならびに、分析物が、正常なレベルよりも高いレベルで試験試料中に存在する場合には、「上昇した」と言われる。従って、とりわけ、例えば本開示は本明細書中で定義されるように、肝炎を有しているか、または肝炎を有するリスクがある被験体についてのスクリーニング方法を提供する。
【０１２９】
従って、本明細書中に記載される方法はまた、被験体が肝炎を有しているかまたは肝炎を発症するリスクがあるかどうかを決定するために使用することができる。具体的には、このような方法は以下の工程を含み得る：
（ａ）被験体由来の試験試料中の抗ＨＣＶ抗体の濃度または量を（例えば、本明細書中に記載される方法または当該分野で公知の方法を使用して）決定する工程；および
（ｂ）工程（ａ）で決定した抗ＨＣＶ抗体の濃度またな量を予め決定したレベルと比較する工程であって、ここでは、工程（ａ）で決定した抗ＨＣＶ抗体の濃度または量が予め決定されたレベルに対して好ましい場合には、被験体を、肝炎を有していないまたは肝炎のリスクがないと決定する。しかし、工程（ａ）で決定した抗ＨＣＶ抗体の濃度または量が予め決定されたレベルに対して好ましくない場合は、被験体を、肝炎を有しているまたは肝炎のリスクがあると決定する。
【０１３０】
加えて、被験体の疾患の進行をモニタリングする方法が本明細書中で提供される。随意に、上記方法は以下の工程を含む：
（ａ）被験体由来の試験試料中の抗ＨＣＶ抗体の濃度または量を決定する工程；
（ｂ）被験体由来の後の時点の試験試料中の抗ＨＣＶ抗体濃度または量を決定する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）で決定した抗ＨＣＶ抗体の濃度または量を、工程（ａ）で決定した抗ＨＣＶ抗体の濃度または量と比較する工程であって、ここでは、工程（ｂ）で決定した濃度または量が、工程（ａ）で決定した抗ＨＣＶ抗体の濃度または量と比較して、変化していないかまたは望ましくない場合は、被験体の疾患を、継続している、進行している、または悪化していると決定する。比較により、工程（ｂ）で決定した抗ＨＣＶ抗体の濃度または量が工程（ａ）で決定した抗ＨＣＶ抗体の濃度または量と比較して好ましい場合は、被験体の疾患を、継続していない、退行している、または改善していると決定する。
【０１３１】
場合により、上記方法にはさらに、工程（ｂ）で決定した抗ＨＣＶ抗体の濃度または量を、例えば、予め決定されたレベルと比較する工程が含まれる。さらに場合により、上記方法には、比較が、工程（ｂ）で決定した抗ＨＣＶ抗体の濃度または量が、例えば、予め決定されたレベルに対して好ましくなく変化したことを示す場合は、被験体を、１種以上の薬学的組成物で、一定期間処置する工程が含まれる。
【０１３２】
なおさらに、上記方法は、１種以上の薬学的組成物での処置を受けている被験体において処置をモニターするために使用することができる。具体的には、このような方法には、被験体に１種以上の薬学的組成物が投与される前に、被験体由来の第１の試験試料を提供する工程が含まれる。次に、被験体由来の第１の試験試料中の抗ＨＣＶ抗体の濃度または量が（例えば、本明細書中に記載される方法を使用して、または当該分野で公知であるように）決定される。抗ＨＣＶ抗体の濃度または量が決定された後、場合により、次に、抗ＨＣＶ抗体の濃度または量が予め決定されたレベルと比較される。第１の試験試料中で決定された抗ＨＣＶ抗体の濃度または量が予め決定されたレベルより低い場合は、被験体は１種以上の薬学的組成物で処置されない。しかし、第１の試験試料中で決定された抗ＨＣＶ抗体の濃度または量が予め決定されたレベルより高い場合は、被験体は１種以上の薬学的組成物で一定期間処置される。被験体が１種以上の薬学的組成物で処置される期間は、当業者により決定され得る（例えば、期間は約７日から約２年、好ましくは約１４日から約１年であり得る。）。
【０１３３】
１種以上の薬学的組成物での処置の経過の間に、第２の試験試料およびさらに続く試験試料が、次いで、被験体から得られる。試験試料の数、および上記試験試料が被験体から得られる時間は重要ではない。例えば、第２の試験試料を、被験体に１種以上の薬学的組成物が最初に投与された７日後に得ることができ、第３の試験試料を、被験体に１種以上の薬学的組成物が最初に投与された２週間後に得ることができ、第４の試験試料を、被験体に１種以上の薬学的組成物が最初に投与された３週間後に得ることができ、第５の試験試料を、被験体に１種以上の薬学的組成物が最初に投与された４週間後に得ることができるなどである。
【０１３４】
第２の試験試料またはこれに続く試験試料のそれぞれを被験体から得た後、抗ＨＣＶ抗体の濃度または量を、第２の試験試料またはこれに続く試験試料中で（例えば、本明細書中に記載される方法を使用して、または当該分野で公知であるように）決定する。次に、第２の試験試料またはこれに続く試験試料のそれぞれにおいて決定した抗ＨＣＶ抗体の濃度または量を、第１の試験試料（例えば、場合により、最初に予め決定されたレベルと比較した試験試料）中で決定した抗ＨＣＶ抗体の濃度または量と比較する。工程（ｃ）で決定した抗ＨＣＶ抗体の濃度または量が工程（ａ）で決定した抗ＨＣＶ抗体の濃度または量と比較して好ましい場合は、被験体の疾患が、継続していない、退行している、または改善していると決定し、被験体には、工程（ｂ）の１種以上の薬学的組成物の投与が継続されるはずである。しかし、工程（ｃ）で決定した濃度または量が、工程（ａ）で決定した抗ＨＣＶ抗体の濃度または量と比較して変化していないかまたは好ましくない場合は、被験体の疾患を、継続している、進行している、または悪化していると決定し、被験体は、さらに高濃度の、工程（ｂ）で被験体に投与された１種以上の薬学的組成物で処置されるはずであるか、または被験体は、工程（ｂ）で被験体に投与された１種以上の薬学的組成物とは異なる１種以上の薬学的組成物で処置されるはずである。具体的には、被験体を、上記被験体の抗ＨＣＶ抗体レベルを低下させるまたは下げるために被験体にこれまで投与されていた１種以上の薬学的組成物とは異なる１種以上の薬学的組成物で処置することができる。
【０１３５】
一般的には、反復試験を行うことができるアッセイ（例えば、疾患の進行および処置に対する応答のモニタリング）のために、第２の試験試料またはこれに続く試験試料が、第１の試験試料が被験体から得られた後、一定の時間で得られる。具体的には、被験体由来の第２の試験試料は、第１の試験試料が被験体から得られた後、数分、数時間、数日、数週間、または数年で得ることができる。例えば、第２の試験試料を、被験体由来の第１の試験試料が得られた後、約１分、約５分、約１０分、約１５分、約３０分、約４５分、約６０分、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１３週間、約１４週間、約１５週間、約１６週間、約１７週間、約１８週間、約１９週間、約２０週間、約２１週間、約２２週間、約２３週間、約２４週間、約２５週間、約２６週間、約２７週間、約２８週間、約２９週間、約３０週間、約３１週間、約３２週間、約３３週間、約３４週間、約３５週間、約３６週間、約３７週間、約３８週間、約３９週間、約４０週間、約４１週間、約４２週間、約４３週間、約４４週間、約４５週間、約４６週間、約４７週間、約４８週間、約４９週間、約５０週間、約５１週間、約５２週間、約１．５年、約２年、約２．５年、約３．０年、約３．５年、約４．０年、約４．５年、約５．０年、約５．５．年、約６．０年、約６．５年、約７．０年、約７．５年、約８．０年、約８．５年、約９．０年、約９．５年、または約１０．０年の期間で被験体から得ることができる。疾患の進行をモニターするために使用される場合は、上記アッセイを、急性の症状に罹患している被験体の疾患の進行をモニターするために使用することができる。急性の症状は、救命救急診療の症状としても知られ、例えば、心血管システムまたは排泄システムに関係がある急性の生命にかかわる疾患または他の重大な医学的症状をいう。典型的には、救命救急診療の症状は、病院の設定（救急処置室、集中治療室、外傷センター、または他の救急医療の設定を含むがこれらに限定されるわけではない。）における急な医学的介入、または、救急救命士または他のその場の医療従事者による投与が必要なこのような症状をいう。救命救急診療の症状については、モニタリングの反復が、一般的には、短い時間枠、即ち、数分間、数時間、または数日間（例えば、約１分間、約５分間、約１０分間、約１５分間、約３０分間、約４５分間、約６０分間、約２時間、約３時間、約４時間、４、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、または約７日間）の中で行われ、同様に、最初のアッセイが、一般的には、短い時間枠、例えば、疾患もしくは症状の発症から約数分間、数時間、または数日間内に行われる。
【０１３６】
アッセイはまた、慢性または非急性の症状に罹患している被験体において疾患の進行をモニターするためにも使用することができる。救命救急診療の対象ではない症状、または非急性の症状は、例えば、心血管システムまたは排泄システムに関係がある急性の生命にかかわる疾患または他の重大な医学的症状以外の症状をいう。典型的には、非急性の症状には、長期間に及ぶものまたは慢性的な期間のものが含まれる。非急性の症状について、モニタリングの反復は、一般的には、より長い時間枠で、例えば、数時間、数日間、数週間、数か月間、または数年間（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１３週間、約１４週間、約１５週間、約１６週間、約１７週間、約１８週間、約１９週間、約２０週間、約２１週間、約２２週間、約２３週間、約２４週間、約２５週間、約２６週間、約２７週間、約２８週間、約２９週間、約３０週間、約３１週間、約３２週間、約３３週間、約３４週間、約３５週間、約３６週間、約３７週間、約３８週間、約３９週間、約４０週間、約４１週間、約４２週間、約４３週間、約４４週間、約４５週間、約４６週間、約４７週間、約４８週間、約４９週間、約５０週間、約５１週間、約５２週間、約１．５年、約２年、約２．５年、約３．０年、約３．５年、約４．０年、約４．５年、約５．０年、約５．５．年、約６．０年、約６．５年、約７．０年、約７．５年、約８．０年、約８．５年、約９．０年、約９．５年、または約１０．０年）行われ、同様に、最初のアッセイは一般に、より長い時間枠、例えば、疾患または症状の発症から約数時間、数日間、数か月間、または数年間行われる。
【０１３７】
さらに、上記アッセイは、被験体から得られた第１の試験試料を使用して行うことができる。ここでは、第１の試験試料は、尿、血清、または血漿のような１つの供給源から得られる。その後、場合により上記アッセイを、被験体から得られた第２の試験試料を使用して繰り返すことができる。ここでは、第２の試験試料は別の供給源から得られる。例えば、第１の試験試料が尿から得られた場合は、第２の試験試料を血清または血漿から得ることができる。第１の試験試料を使用したアッセイにより得られた結果と、第２の試験試料を使用したアッセイにより得られた結果とを比較することができる。比較は、被験体の疾患の状態または症状を評価するために使用することができる。
【０１３８】
さらに、本開示はまた、肝炎の素因があるか、または肝炎に罹患している被験体が処置により恩恵を受けるかどうかを決定する方法に関する。特に、本開示は、ＨＣＶの比較診断方法および製品に関する。従って、本明細書中に記載される「被験体の疾患の処置をモニタリングする」方法にはさらに、随意に、治療のための候補を選択または同定する工程もまた含まれ得る。
【０１３９】
従って、特定の実施形態では、本開示はまた、肝炎を有しているかまたは肝炎のリスクがある被験体が治療の候補であるかどうかを決定する方法を提供する。一般的には、被験体は、肝炎の幾つかの症候を経験した被験体、または肝炎を有しているかもしくは肝炎のリスクがあると実際に診断されている被験体、および／または本明細書中に記載されるように、好ましくない抗ＨＣＶ抗体もしくはこの断片の濃度または量を示す被験体である。
【０１４０】
上記方法は場合により、分析物が、１種以上の薬学的組成物で（例えば、特に、ＨＣＶが関与している作用機構に関連している医薬品で）、免疫抑制療法で、または免疫吸着治療（ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）による、抗血管新生療法での被験体の処置の前および後に評価される、または、分析物がこのような処置の後に評価され、分析物の濃度または量が予め決定されたレベルに対して比較される、本明細書中に記載されるアッセイを含む。処置後に観察された分析物の量の好ましくない濃度により、被験体にはこれ以上の処置または処置の継続を行うことによる恩恵はないことを確認するが、一方、処置後に観察された分析物の好ましい濃度または量によっては、被験体に、さらなる処置または処置の継続を行うことによる恩恵があるであろうことを確認する。この確認は、臨床研究の管理、および改良された患者のケアの提供に役立つ。
【０１４１】
キットおよび方法の適応
本明細書中に記載される免疫測定法により試験試料中の抗ＨＣＶ抗体の濃度を決定するキット（またはこの構成成分）ならびに方法は、例えば、米国特許第５，０８９，４２４号明細書および同第５，００６，３０９号明細書に記載されているような、ならびに例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）としてＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，Ｉｌｌ．）市販されているような、様々な自動化システムおよび半自動化システム（固相が微粒子を含有するシステムを含む。）での使用に適応させることができる。
【０１４２】
非自動化システム（例えば、ＥＬＩＳＡ）と比較した自動化システムまたは半自動化システムとの間での相違の幾つかとして、第１の特異的結合パートナー（例えば、抗原）を付着させる基質（サンドイッチの形成、および分析物の再活性化に影響を与え得る。）、ならびに、捕捉、検出および／または任意の随意の洗浄工程の長さおよびタイミングが挙げられる。ＥＬＩＳＡのような非自動化形式には、試料と捕捉試薬との比較的長いインキュベーション時間（例えば、約２時間）が必要であり得るが、自動化形式または半自動化形式（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ），Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は比較的短いインキュベーション時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）についてはおよそ１８分間）を有し得る。同様に、ＥＬＩＳＡのような非自動化形式では、結合体試薬のような検出抗体を比較的長いインキュベーション時間（例えば、約２時間）インキュベートし得るが、自動化形式または半自動化形式（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ））は比較的短いインキュベーション時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）についてはおよそ４分間）を有し得る。
【０１４３】
Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手することができる他のプラットフォームとして、ＡｘＳＹＭ（Ｒ）、ＩＭｘ（Ｒ）（例えば、この全体が引用により本明細書中に組み込まれたものとされる米国特許第５，２９４，４０４号明細書を参照のこと）、ＰＲＩＳＭ（Ｒ）、ＥＩＡ（ビーズ）およびＱｕａｎｔｕｍ．（ＴＭ）ＩＩ、ならびに他のプラットフォームが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。加えて、アッセイ、キットおよびキットの構成成分を、他の形式、例えば、電気化学的アッセイシステム、または他の携帯型もしくは看護拠点アッセイシステムで利用することができる。本開示は、例えば、サンドイッチ免疫測定法を実行する市販されているＡｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（Ｒ），Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）電気化学的免疫測定システムに適応させることができる。免疫センサーおよびこれらの製造方法および使い捨ての試験装置における操作は、例えば、米国特許第５，０６３，０８１号明細書、米国特許出願公開番号第２００３／０１７０８８１号明細書、米国特許出願公開番号第２００４／００１８５７７号明細書、米国特許出願公開番号第２００５／００５４０７８号明細書および米国特許出願公開番号第２００６／０１６０１６４明細書（これらは、この操作についてのこれらの教示が引用により全体において本明細書中に組み込まれたものとされる。）に記載されている。
【０１４４】
特に、Ｉ−ＳＴＡＴ（Ｒ）システムへのアッセイの適用に関しては、以下の構成が例である。微細加工されたシリコンチップが、金アンペロメトリック型作用電極と銀−塩化銀参照電極の対を用いて製造される。作用電極の一方の上には、捕捉抗体が固定されているポリスチレンビーズ（０．２ｍｍの直径）が、電極を覆うパターン化されたポリビニルアルコールのポリマーコーティングに付着させられる。このチップが、免疫測定法に適している流体工学的形式でＩ−ＳＴＡＴ（Ｒ）カートリッジに組み立てられる。カートリッジの試料を保持するチャンバーの壁の一部の上には、アルカリホスファターゼ（または他の標識）で標識された検出抗体を含有している層が存在する。ｐ−アミノフェノールホスフェートを含む水性の試薬が、カートリッジの流体パウチ内に存在する。
【０１４５】
運転中には、抗ＨＣＶ抗体を含有していると疑われる試料が試験カートリッジの保持チャンバーに添加され、カートリッジがＩ−ＳＴＡＴ（Ｒ）リーダーに挿入される。検出抗体が試料に溶解させられた後、カートリッジ内のポンプ部が試料を、チップを含むコンジットへと追いやる。ここでは、カートリッジ内のポンプ部は、捕捉抗原、抗ＨＣＶ抗体および標識された検出抗体の間でのサンドイッチの形成を促進するために往復させられる。アッセイの最後から２番目の工程では、流体がパウチの外へ、コンジットの中に追いやられて、チップが試料で洗浄されて、廃棄チャンバーへと追いやられる。アッセイの最終工程では、アルカリホスファターゼ標識はｐ−アミノフェノールホスフェートと反応してホスフェート基を切断し、遊離したｐ−アミノフェノールが作用電極で電気化学的に酸化されることを可能にする。測定された電流に基づいて、リーダーは、埋め込まれたアルゴリズムおよび工場で決定された較正曲線により試料中の抗ＨＣＶ抗体の量を計算することができる。
【０１４６】
本明細書中に記載される方法およびキットは、免疫測定法を実行するための他の試薬および方法を含む。例えば、当該分野で公知であるような、および／または容易に調製することができるかもしくは利用のために最適化することができる様々な緩衝液、例えば、洗浄のための、結合体希釈剤としての、および／または検量用試料希釈剤としての緩衝液が含まれる。例示的な結合体希釈剤は、特定のキット（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，Ｉｌｌ．）において利用される、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、塩、タンパク質ブロッカー、抗微生物剤および界面活性剤を含有している、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）結合体希釈剤である。例示的な検量用試料希釈剤は、特定のキット（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，Ｉｌｌ．）において利用されるＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）ヒト検量用試料希釈剤であり、これは、ＭＥＳ、他の塩、タンパク質ブロッカーおよび抗微生物剤を含有している緩衝液を含む。加えて、２００８年１２月３１日に提出された米国特許出願番号第６１／１４２，０４８号明細書および米国特許出願番号第１２／６５０，２４１号明細書に記載されているように、例えば、Ｉ−ＳＴＡＴ（Ｒ）カートリッジ形式において、シグナル増幅器としてシグナル抗体に連結した核酸配列を使用して、改善されたシグナルの生成を得ることができる。
【実施例】
【０１４７】
［実施例１］
ＨＣＶ  ＮＳ３  ９ＮＢ４９Ｈのクローニングおよび発現
ＨＣＶのアミノ酸１１９２−１４５７（配列番号２）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現のためにコドン最適化し、改変されたｐＥＴ３２ａベクターにクローニングした。ここでは、チオレドキシン融合タンパク質をコードする配列を排除し、メチオニン（Ｍ）で置き換えた。加えて、カルボキシ末端のヘキサヒスチジンタグを固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製を容易にするために含めた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を精製したプラスミドＤＮＡで形質転換し、形質転換体をスクリーニングした。得られるプラスミドをｐ９ＮＢ４９Ｈと命名し、これから発現されるタンパク質を９ＮＢ４９Ｈと命名した。
【０１４８】
タンパク質の発現は、ｐ９ＮＢ４９Ｈで形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をｔｅｒｒｉｆｉｃ  ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地中で培養することにより達成した。細胞を振盪フラスコの中で０．５０のＯＤ６００ｎｍまで増殖させ、その後、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、２５℃から３７℃でおよそ３時間、およそ３．５のＯＤ６００ｎｍが得られるまで増殖させた。細胞を遠心分離により回収し、プロテアーゼ阻害剤を補充した溶解緩衝液（５０ｍＭのＫＰＯ４、３００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのイミダゾール（ｐＨ８．０））中に懸濁した。細胞懸濁液を凍結し、解凍し、ベンゾエートを添加し、細胞を氷上での超音波処理によって溶解させた。溶解物を遠心分離によって可溶性画分と不溶性画分に分けた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＮＳ３  ９ＮＢ４９Ｈタンパク質が可溶性画分に存在することを明らかにした。ＩＭＡＣ精製を、Ｎａｔｉｖｅ  ＩＭＡＣ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＫｉｔおよびＰｒｏｆｉｎｉｔｙ  ＩＭＡＣカートリッジ（ＢｉｏＲａｄ）を製造業者のプロトコールに従って使用して、溶解物の可溶性画分について行った。精製されたタンパク質のＰＢＳへの緩衝液交換を、脱塩カラムにより、または透析により行った。精製手順の間に使用した全ての緩衝液に、２０ｍＭのβ−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）を含めた。
【０１４９】
［実施例２］
ＨＣＶ  ＮＳ３  Ｎｂｔ−９ＮＢ４９Ｈのクローニングおよび発現
実施例１に記載したＮＳ３  ９ＮＢ４９Ｈタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、改変したｐＥＴ３２ａプラスミドにサブクローニングした。ここでは、オープンリーディングフレームは、ＮＳ３をコードする配列の上流にＧＳＧＳＮＳＭリンカー配列を持つアミノ末端のビオチニル化タグ（ＭＳＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）、後ろに続くカルボキシル末端のヘキサヒスチジンタグ、後ろに続く終結コドンをコードする。得られたプラスミドをｐＮｂｔ−９ＮＢ４９Ｈと命名した。Ｂｅｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，８（４）：９２１−９２９，１９９９）により記載されているビオチニル化タグは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  ＢｉｒＡ遺伝子によりコードされるビオチンリガーゼ酵素を介する部位特異的ビオチンの取り込みを可能にする。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に、ｐＮｂｔ−９ＮＢ４９Ｈ発現プラスミドおよびＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下でビオチンリガーゼを発現する第２のプラスミド（ｐＢｉｒＡｃｍ）を同時に形質転換した。細胞を、振盪フラスコの中、３７℃で、０．０５０ｍＭの最終濃度になるようにビオチンを添加したＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ中で０．５０のＯＤ６００ｎｍまで増殖させ、その後、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、２５℃で一晩増殖させた。その後、細胞を遠心分離により回収し、溶解緩衝液中に再懸濁し、超音波処理して細胞を破壊した。幾つかの場合には、高レベルの部位特異的ビオチニル化をさらに確実にするために、ＡＴＰおよびビオチンを溶解させた細胞に添加し（それぞれ、３ｍＭおよび０．２５ｍＭの最終濃度）、室温で２時間インキュベートした。次に、組換えタンパク質を実施例１に記載したようにＩＭＡＣにより精製した。
【０１５０】
［実施例３］
ＨＣＶ  ＮＳ３  ９ＮＢ４９Ｈ−Ｃｂｔのクローニングおよび発現
実施例１に記載したＮＳ３  ９ＮＢ４９Ｈタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、改変したｐＥＴ３２ａベクターにサブクローニングした。ここでは、オープンリーディングフレームは、Ｎ末端のメチオニン、後ろに続くＮＳ３、後ろに続くＧＳＧＳＧリンカーとヘキサヒスチジンタグ、後ろに続くＧＧリンカーおよびビオチニル化タグ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）、および最後に終結コドンをコードする。得られたプラスミドをｐ９ＮＢ４９Ｈ−Ｃｂｔと命名した。タンパク質発現およびビオチニル化は、実施例１および２に記載したように行った。
【０１５１】
［実施例４］
ＨＣＶ  ＮＳ３  ９ＮＢ４９Ｈ−Ｃｂｔ突然変異体のクローニングおよび発現
実施例３に記載した９ＮＢ４９Ｈ−Ｃｂｔをコードするヌクレオチド配列を、システインコドンをセリンコドンで置換するために部位特異的に突然変異させた。突然変異させた位置を以下の表に記載する。ここでは、ＨＣＶポリタンパク質配列のコドン（アミノ酸）番号はＫｕｉｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００６，４４（５）：１３５５−１３６１）により記載されている番号に基づく。組換えタンパク質の発現、精製およびビオチニル化は、実施例１および２に記載したように行った。
【０１５２】
【表２】
2016512241.tif 000009
【０１５３】
［実施例５］
ＨＣＶ  ＮＳ３ｈおよびこの変異体のクローニングおよび発現
組換えＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼ変異体を、以下の表に記載するように、および図１に示すように、ＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼの様々な領域に融合させたｐ９ＮＢ４９Ｈ（即ち、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１１９２−１２１５）により発現される同じアミノ末端を使用することにより構築した。ヘリカーゼ構築物をコードするヌクレオチド配列を、実施例１に記載したようなカルボキシル末端のＧＳＧＳＧ−ヘキサヒスチジンタグまたは実施例２に記載したようなカルボキシル末端のＧＳＧＳＧ−ヘキサヒスチジン−ＧＧ−ビオチニル化タグのいずれかを持つ改変したｐＥＴ３２ａベクター（マイナスチオレドキシン融合体）にクローニングした。ＮＳ３ヘリカーゼの第３のドメインを含有している全ての構築物は、カルボキシル末端のＳＧＳＧＳＧ−ヘキサヒスチジンタグ、またはカルボキシル末端のＳＧＳＧＳＧ−ヘキサヒスチジン−ＧＧ−ビオチニル化タグを含む。ビオチニル化されているタンパク質またはビオチニル化されていないタンパク質の発現および精製を、実施例１および２に記載したように行った。
【０１５４】
【表３】
2016512241.tif 000010
【０１５５】
［実施例６］
全長のＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼ変異体のクローニングおよび発現
実施例５に記載した全長のＮＳ３ｈ（ヘリカーゼ）タンパク質をコードするプラスミド（ｐＮＳ３ｈ−Ｃｂｔ）を、標準的な方法を使用して部位特異的に突然変異させて、選択したコドンを以下の表に記載するように置き換えた（即ち、置換した）突然変異体クローンを作製した。
【０１５６】
【表４】
2016512241.tif 000011
【０１５７】
得られた構築物は、実施例５に記載したようなカルボキシル末端のＳＧＳＧＳＧ−ヘキサヒスチジン−ＧＧ−リンカー−ビオチニル化タグを保有していた。タンパク質の発現およびビオチニル化は、個々のＮＳ３ヘリカーゼＣｂｔ突然変異体プラスミドと実施例３に記載したｐＢｉｒＡｃｍでの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の同時形質転換により行った。精製は実施例１および２に記載したように行った。
【０１５８】
［実施例７］
改変されたＣ末端を持つＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼ変異体のクローニングおよび発現
実施例５に記載した全長のＮＳ３ｈ（ヘリカーゼ）タンパク質をコードするプラスミド（ｐＮＳ３ｈ）を、ＮＳ３ｈをコードする領域（ＨＣＶ  ａａ１１９２−１６５７）の下流に、インフレームのＳＧＳＧＳＧに連結されたオクタヒスチジンタグ、この後ろに続く以下の表に記載するようなさらなるＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼ配列、この後ろに続く終結コドンをコードする配列を含むように改変した。
【０１５９】
【表５】
2016512241.tif 000012
【０１６０】
タンパク質の発現を、実施例１に記載したような個々の改変したＮＳ３ｈプラスミド（−ＸＣ１、−ＸＣ２、または−ＸＣ３）での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の形質転換の後に行った。Ｃ末端を改変したＮＳ３ｈタンパク質のタンパク質精製は実施例１に記載したように行った。
【０１６１】
［実施例８］
発酵、タンパク質の発現、および精製
ＮＳ３組換えタンパク質（例えば、９ＮＢ４９ＨもしくはＮＳ３ｈ、またはこれらの変異体）を、１０Ｌの発酵槽で培養した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中で発現させた。Ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ（ＳＢ）Ｍｅｄｉａ（炭素源としてグリセロールを含む富化培地）を含有している振盪フラスコの中で増殖させた１２０ｍＬの種培養物を使用して、ＳＢ培地を含有している１０Ｌの発酵槽に接種した。細胞を、８から１２の６００ｎｍでの光学密度に達するまで、３７℃で増殖させた。タンパク質の発現をイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を、１ｍＭの最終濃度になるように添加することにより誘導した。その後、培養物を２５から３７℃でさらに４時間増殖させた。その後、細胞を発酵槽から回収し、次に、中空繊維膜フィルターを通過させて、回収したものを１０Ｌの容積で出発して１から２Ｌに濃縮した。その後、濃縮した細胞を遠心分離によりペレット状にし、上清を除去し、得られたペレットをタンパク質精製に使用するまで−８０℃で保存した。
【０１６２】
アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれにビオチニル化タグ配列を含有している組換えＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質（実施例２および３を参照のこと）のインビボでのビオチニル化を、ビオチンをインキュベーション時に０．０５ｍＭの最終濃度になるように添加したことを除き、上記のように発酵を行うことにより達成した。その後、培養物をさらに４時間、２５から３７℃で増殖させ、上記段落に記載したように処理した。
【０１６３】
発現させた可溶性のＨＣＶ  ＮＳ３組換え抗原を含有している凍結させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のペレットを解凍し、その後、冷却した溶解緩衝液（４０ｍＭのＮａＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５％のグリセロール、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール（ｐＨ７．２））の中に再度懸濁し、続いて、０℃で４５分間の連続流超音波処理（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｆｌｏｗ  ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）により溶解させた。不溶性材料を除去するための遠心分離の後、ＧＥニッケルセファロースＦａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂を上清に添加し、２から８℃で一晩（１２５ｒｐｍで振盪させながら）一晩インキュベートした。その後、結合した抗原を含有している樹脂を洗浄緩衝液（４０ｍＭのＮａＰＯ４（ｐＨ７．２）、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのイミダゾール、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール）で穏やかな減圧下で洗浄し、結合した抗原を、４０ｍＭのＮａＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５００ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．２）を含有している緩衝液を使用して溶離させた。抗原を、以下のようにイオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。抗原を、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．４）中でＧＥ  Ｑ  ＨＰ陰イオン交換樹脂に結合させ、その後に続いて、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．４）、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡで勾配溶離させた。その後、溶離したタンパク質を、ＧＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムを使用して、１０ｍＭのホスフェート、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）を含有している最終的な緩衝液中に脱塩した。精製したＮＳ３タンパク質を−７０℃で保存した。
【０１６４】
［実施例９］
アクリジニウム−ウシ血清アルブミン（Ａｃｒ−ＢＳＡ）の調製
防腐剤として０．１％のアジ化ナトリウムを含有しているウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の３０％の溶液（３００ｍｇ／ｍＬ）を、商業的な供給業者（Ｐｒｏｌｉａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ａｎｋｅｎｙ，ＩＡ）から購入した。１ｍｌ（３００ｍｇ）の３０％のＢＳＡ溶液を、２．０ｍＬの０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ８．０）で希釈し、０．５から３．０ｍＬのＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に移し、２から８℃で一晩、０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ８．０）に対して透析した（２回の交換、６００ｍＬ／交換）。透析したＢＳＡ溶液の濃度は、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度に基づくと９７．１ｍｇ／ｍＬであった。２００ｍｇ（２．０６０ｍＬ、３．０ｕｍｏｌ、１．０ｍｏｌ等量）の９７．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液を、１０．１８１ｍＬの０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ８．０）を含有している琥珀色のガラスバイアルに添加した。この混合物に対して、ＤＭＦ［Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド］中の３９ｍｇ（１．０９２ｍＬ、４５ｕｍｏｌ、１５．０モル等量）のＳＰＳＰ−アクリジニウム活性エステルを添加した。反応バイアルに蓋をした。溶液を３５０ｒｐｍで３０分間撹拌することにより混合し、その後、室温に一晩（２０から２６時間）置いた。インキュベーション後、遊離のアクリジニウムおよび凝集物をクロマトグラフィーにより（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  ＨＲ  Ｓ−２００カラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＰＡ）、０．０１ＭのＰＢＳ／０．１％のＣＨＡＰＳ（ｐＨ６．３）ランニング緩衝液を使用して除去した。単量体Ａｃｒ−ＢＳＡ結合体に対応する画分をプールし、ＵＶ分光測定法（２４０から６００ｎｍのスキャン）により特性決定した。２８０ｎｍおよび３７０ｎｍでの吸光度の値を使用して、タンパク質濃度を決定し、ＢＳＡ分子あたりのアクリジニウムの取り込みを計算した。計算したタンパク質濃度は６．７７９ｍｇ／ｍＬであり、ＢＳＡ分子あたり６．２アクリジニウムの平均数を有していた。
【０１６５】
［実施例１０］
アクリジニウム−ＢＳＡ−９ＮＢ４９Ｈ結合体の調製
マレイミド活性化Ａｃｒ−ＢＳＡの調製。ＰＢＳ／０．１％のＣＨＡＰＳ（ｐＨ６．３）中のＡｃｒ−ＢＳＡ（実施例８；１３．５ｍｇ、２０２ｎｍｏｌ、１．０ｍｏｌ等量）１．９９ｍＬを琥珀色のガラスバイアルに添加し、０．２５４ｍＬの０．４Ｍのホスフェート／８ｍＭのＥＤＴＡ／１．６％のＣＨＡＰＳ（ｐＨ７．４）で処理して、反応物のｐＨを７．４に調整した。均質な溶液に対して、０．０４０ｍＬ（０．３５ｍｇ、４．０ｍｏｌ等量）の、スクシンイミジル４−（Ｎマレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ）の新鮮な０．０２Ｍの水溶液を添加した。反応バイアルに蓋をした。溶液を発泡させずに２０分間撹拌し、その後、暗所で６０から９０分間、室温で静的にインキュベートした。０．１ＭのＰＢＳ／０．１％のＣＨＡＰＳ／５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．７）で予め平衡化したＺｅｂａスピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ）を利用することにより、反応混合物を脱塩して取り込まれていないスルホ−ＳＭＣＣを取り除いた。溶離させたＡｃｒ−ＢＳＡ−Ｍａｌ試薬の吸光度を２８０ｎｍおよび３７０ｎｍで測定してタンパク質濃度を概算した。計算したタンパク質濃度は６．２８ｍｇ／ｍＬであった。Ａｃｒ−ＢＳＡ−ＭａｌをＨＣＶ  ＮＳ３抗原の結合にすぐに使用した。
【０１６６】
Ａｃｒ−ＢＳＡ−Ｍａｌに対する組換え９ＮＢ４９Ｈの結合。０．７８９ｍＬの０．１ＭのＰＢＳ／０．１％のＣＨＡＰＳ／５ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ６．７中のＡｃｒ−ＢＳＡ−Ｍａｌ（５．６ｍｇ、８４ｎｍｏｌ、２．０ｍｏｌ等量）をポリプロピレンチューブに添加した。これに対して、０．０１ＭのＰＢＳ／５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）中の１．２ｍｇ（１．３ｍＬ、４２ｎｍｏｌ、１．０ｍｏｌ等量）の組換え９ＮＢ４９Ｈ抗原を添加した。溶液を発泡させることなく３０分間撹拌し、その後、暗所で一晩、室温で静的にインキュベートした。結合体をこの段階で、または９ＮＢ４９Ｈ遊離システインのカルボキシメチル化の後のいずれかで精製した。カルボキシメチル化の場合は、粗結合体溶液を０．２７０ｍＬの０．５Ｍのホスフェート緩衝液（ｐＨ１１．０）で処理してｐＨを８．０に調整した。混合物を５分間撹拌し、その後、０．９４ｍｇ（０．０２０ｍＬ、１２０ｍｏｌ等量）の、１ＮのＮａＯＨ中の新鮮な０．２５Ｍのヨード酢酸（ＩＡＡ）溶液または０．２５Ｍのヨードアセトアミド（ＩＡＭ）水溶液を混合しながら添加して、９ＮＢ４９Ｈ遊離Ｃｙｓ−カルボキシのメチル化を行った。混合物を室温で、暗所で６０分間、静的に反応させ、その後、０．０１ＭのＰＢＳ／０．１％のＣＨＡＰＳ／５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．３）（３．０ｍＬの溶離容積）で平衡化したＰＤ１０カラムに通過させた。
【０１６７】
Ａｃｒ−ＢＳＡ−９ＮＢ４９Ｈ結合体タンパク質の濃度を、Ａｃｒ−ＢＳＡが原因である２８０ｎｍでの吸光度を引き算した後の結合体の２８０ｎｍでの吸光度から決定した。９ＮＢ４９Ｈの１％（ｗ／ｖ）溶液についての０．５２の吸光度を使用してタンパク質濃度を計算した。記載したように計算した９ＮＢ４９Ｈ濃度は、０．４０６ｍｇ／ｍＬであった。
【０１６８】
［実施例１１］
アクリジニウム−ＢＳＡ−ＮＳ３ｈ結合体の調製
（ＬＣ）マレイミド活性化Ａｃｒ−ＢＳＡの調製。ＰＢＳ／０．１％のＣＨＡＰＳ（ｐＨ６．３）中のＡｃｒ−ＢＳＡ（実施例８；３．０ｍｇ、０．４４３ｍＬ、４５ｎｍｏｌ、即ち１．０ｍｏｌ等量）を琥珀色のガラスバイアルに添加し、０．０５８ｍＬの０．４Ｍのホスフェート／８ｍＭのＥＤＴＡ／１．６％のＣＨＡＰＳ（ｐＨ７．４）緩衝液で処理して、反応物のｐＨを７．４に調整した。均質な溶液に対して、０．０１８ｍＬ（０．０８０ｍｇ、１８０ｎｍｏｌ、４．０ｍｏｌ等量）の、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中の０．０１Ｍのスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）（Ｌｏｎ  ＣｈａｉｎまたはＬＣ−ＳＭＣＣ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ）の新鮮な溶液を添加した。反応バイアルに蓋をした。溶液を発泡させずに２０分間撹拌し、その後、暗所で６０分間、室温で静的にインキュベートした。反応混合物を脱塩して、取り込まれていないＬＣ−ＳＭＣＣを、０．１ＭのＰＢＳ／０．１％のＣＨＡＰＳ／５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．７）で予め平衡化したＺｅｂａスピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ）を利用することにより取り除いた。溶離したＡｃｒ−ＢＳＡ−Ｍａｌ試薬の吸光度を２８０ｎｍおよび３７０ｎｍで測定してタンパク質濃度を概算した。計算したタンパク質濃度は５．２５ｍｇ／ｍＬであった。Ａｃｒ−ＢＳＡ−（ＬＣ）Ｍａｌを次の結合工程にすぐに使用した。
【０１６９】
組換えＮＳ３ｈのＡｃｒ−ＢＳＡ−（ＬＣ）Ｍａｌに対する結合。０．０２５Ｍのホスフェート／０．２５ＭのＮａＣｌ／５ｍＭのβ−メルカプトエタノール／５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中の２．６ｍｇ／ｍＬのＮＳ３ｈの溶液１．２０ｍＬ（３．１２ｍｇ）をＰＤ１０脱塩カラムに通過させて、β−メルカプトエタノールを除去した。ＮＳ３ｈタンパク質を２．５ｍＬの０．０１ＭのＰＢＳ／５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）で溶離させ、溶離液の濃度を２８０ｎｍでの吸光度により２．９ｍｇ／ｍＬであると計算した。ポリプロピレンチューブに、０．１ＭのＰＢＳ／０．１％のＣＨＡＰＳ／５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．７）中の１．５６ｍｇ（０．２９７ｍＬ、２３．４ｎｍｏｌ、２．０ｍｏｌ等量）のＡｃｒ−ＢＳＡ−（ＬＣ）Ｍａｌを添加し、続いて、０．０１ＭのＰＢＳ／５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）中の０．６０ｍｇ（０．５１８ｍＬ、１１．７ｎｍｏｌ、１．０ｍｏｌ等量）の組換えＮＳ３ｈ抗原を添加した。溶液を発泡させることなく３０分間撹拌し、その後、暗所で一晩、室温で静的にインキュベートした。結合体溶液に対して、０．０９３ｍＬの０．５Ｍのホスフェート緩衝液（ｐＨ１１．０）を添加して、混合物のｐＨを８．０に調整した。混合物を５分間撹拌し、その後、１ＮのＮａＯＨ中の０．２５Ｍのヨード酢酸（ＩＡＡ，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）の新鮮な溶液０．５６ｍｇ（０．０１２ｍＬ、１２０ｍｏｌ等量）を混合しながら添加して、ＮＳ３遊離Ｃｙｓ−カルボキシメチル化を行った。混合物を室温で、および暗所で６０分間、静的に反応させ、最終的な容積を０．０８０ｍＬの０．０１ＭのＰＢＳ／０．１％のＣＨＡＰＳ／５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．３）で１．０ｍｌに調整し、０．０１ＭのＰＢＳ／０．１％のＣＨＡＰＳ／５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．３）（２．５ｍＬの溶離容積）中で平衡化したＰＤ１０カラムに通した。次に、脱塩した結合体をＳＥＣクロマトグラフィー（ＴｏｓｏＨａａｓ  Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム，Ｔｏｓｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ，Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）により精製して、望ましくない凝集物を取り除いた。Ａｃｒ−ＢＳＡ−ＮＳ３ｈ結合体タンパク質の濃度を、Ａｃｒ−ＢＳＡが原因である２８０ｎｍでの吸光度を引き算した後の結合体の２８０ｎｍでの吸光度から決定した。ＮＳ３ｈの１％（ｗ／ｖ）の溶液についての０．９５の吸光度を、タンパク質濃度を計算するために使用した。
【０１７０】
［実施例１２］
磁性微粒子に基づく自動化された免疫測定法
ＨＣＶ  ＮＳ３由来タンパク質を、常磁性微粒子および化学発光結合体を利用する自動化された免疫分析装置（ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）システム；Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；「Ｂｕｌｋ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｒａｎｄｏｍ−Ａｃｃｅｓｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ：ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ  ｉ２０００」Ｆｒａｎｋ  Ａ．Ｑｕｉｎｎ，ｐａｇｅｓ  ３６３−３６７，Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，第３版、Ｄａｖｉｄ  Ｗａｒｄ編，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ；米国特許第５，７９５，７８４号明細書および米国特許第５，８５６，１９４号明細書を参照のこと）を使用して、抗ＨＣＶ  ＮＳ３抗体を検出するこれらの能力について試験した。試験したアッセイ形式には、２工程の形式または１工程の形式を含めた。一般的には、アッセイは、２つの形式：２工程および１工程（「疑」１工程とも記載される。）を含むと記載することができる。２工程の形式では、ヒト試料、アッセイ特異的希釈剤緩衝液、および組換え抗原をコーティングした常磁性微粒子を反応容器に混合し、ボルテックスし、１８分間インキュベートする。ここでは、組換え抗原に特異的な抗体が微粒子によって捕捉される。このインキュベーション後、微粒子／免疫複合体を、磁石を使用して反応容器の側面に停止させ、反応上清を取り出した。その後、微粒子を水／界面活性剤溶液で洗浄した。第２の工程では、微粒子に結合した試料由来の抗体が、アクリジニウムで標識された結合体を含有している緩衝液中での粒子の懸濁およびインキュベーション（４分）により検出される。結合体は、ヒト免疫グロブリン（単数または複数）に特異的なアクリジニウムで標識された抗体、またはアクリジニウムで標識された組換え抗原であり得る。結合体とのインキュベーションの後に、第２の洗浄工程、ならびに最終的には、アクリジニウムの活性化、および光の出力の同時の測定（これは、微粒子上に結合した結合体の量に比例する。）を続いて行う。
【０１７１】
１工程の形式では、ヒト試料、組換え抗原をコーティングした常磁性微粒子、およびアクリジニウムで標識された組換え抗原を含む結合体を含有しているアッセイ特異的希釈剤緩衝液を反応容器に混合する。１８分間のインキュベーションの後、ここでは、組換え抗原に特異的な抗体が同時に、磁性微粒子によって捕捉され、アクリジニウムで標識された組換え抗原に結合する。続いて、微粒子／免疫複合体を、磁石を使用して反応容器の側面に停止させ、水／界面活性剤混合物で洗浄した。その後、粒子を容器の壁から解放し、希釈剤中に懸濁し、４分間インキュベートした。インキュベーションの後には、第２の洗浄工程、ならびに最終的には、アクリジニウムの活性化、および光の出力の同時の測定（これは、微粒子上に結合した結合体の量に比例していた。）を続けて行った。
【０１７２】
ビオチン捕捉免疫測定法。Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ分析器でのビオチンの捕捉に媒介される免疫測定法では、ビオチニル化ＮＳ３タンパク質（例えば、実施例２から６に記載したＮｂｔもしくはＣｂｔ、または非部位特異的様式で化学的手法によりビオチンをカップリングさせたＮＳ３タンパク質）と、ビオチン捕捉タンパク質（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、または抗ビオチン抗体）をコーティングした常磁性粒子を使用した。この形式では、試料中に存在するＮＳ３抗体とビオチニル−ＮＳ３との間で形成した免疫複合体を、微粒子表面に固定化したビオチン捕捉タンパク質により微粒子表面上に捕捉した。アクリジニル化されたＮＳ３組換え抗原からなる結合体を第１の工程または第２の工程に加えて（即ち、捕捉工程に続いて）、捕捉された抗ＮＳ３を検出することができる。代わりに、抗ヒト抗体アクリジニウム結合体を第２の工程に加えて、捕捉された抗ＮＳ３を検出することができる。
【０１７３】
［実施例１３］
免疫測定法の形式
以下のアッセイ形式を使用した：
【０１７４】
【表６】
2016512241.tif 000013
【０１７５】
以下のヒト検体を使用した：
陰性対照試料は、再石灰化した非反応性ヒト血漿（ＨＢｓＡｇに対して非反応性、および抗ＨＣＶ、ＨＩＶ−１  ＲＮＡ、またはＨＩＶ−１  Ａｇ、抗ＨＩＶ  １／ＨＩＶ−２および抗ＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−ＩＩについては陰性）である。
【０１７６】
「パネルＢ」として知られている陽性対照試料は、Ｃｈｉｒｏｎ  ＲＩＢＡ  ＨＣＶ  ３．０  ＳＩＡにより決定された１つの抗ＨＣＶマーカーについて反応性である（２＋以上のｃ３３バンド強度、および他のバンドについては非反応性）ヒトの再石灰化したヒト血漿試料である。このパネルを、二ナトリウム−ＥＤＴＡおよびアジ化ナトリウムを含有している再石灰化した非反応性ヒト血漿（ＨＢｓＡｇに対して非反応性、および抗ＨＣＶ、ＨＩＶ−１  ＲＮＡ、またはＨＩＶ−１  Ａｇ、抗ＨＩＶ  １／ＨＩＶ−２および抗ＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−ＩＩについては陰性）中に希釈する。
【０１７７】
セロコンバージョンパネルと呼ばれる市販されているヒト血液試料のパネルを、ＳｅｒａＣａｒｅ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）およびＺｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）から入手した。各セロコンバージョンパネルは、ＨＣＶに感染した固体から得られた一連の血液試料からなる。
【０１７８】
アッセイ形式１：直接的１工程。第１の工程では、５０ｕＬのヒト試料、５０ｕＬの結合体（ｐＨ６．３の適切な緩衝液中で組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原に共有結合によりカップリングさせた、アクリジニウムで標識されたＢＳＡ）、および示した還元剤を含有しているｐＨ６．６の適切な緩衝液中でＨＣＶ  ＮＳ３組換え抗原でコーティングされた５０ｕＬの常磁性微粒子を反応容器に混合し、ボルテックスし、１８分間インキュベートした。インキュベーション後、微粒子を、磁石を使用して反応容器の側面に停止させ、反応上清を取り除いた。続いて微粒子を水／界面活性剤溶液で洗浄した。試料中に存在する、および微粒子上に捕捉された抗体は、洗浄工程の間保持された。第２の工程では、洗浄の直後に、５０ｕＬのアッセイ特異的洗浄緩衝液を反応容器に添加し、これをボルテックスし、次に４分間インキュベートした。インキュベーション後、微粒子を、磁石を使用して反応容器の側面に停止させ、反応上清を取り除いた。続いて、微粒子を水／界面活性剤溶液で洗浄した。洗浄した粒子を塩基性の過酸化水素を含有している溶液中に懸濁してアクリジニウムを活性化させ、同時に光の出力を測定した（相対的な光の単位、即ち、ＲＬＵで）。これは、微粒子上に結合した結合体の量に比例する。
【０１７９】
アッセイ形式２：間接的２工程。第１の工程では、１０ｕＬの試料、９０ｕＬのアッセイ特異的希釈剤緩衝液、および５０ｕＬのＨＣＶ  ＮＳ３をコーティングした常磁性微粒子（還元剤を含有しているｐＨ６．６の適切な緩衝液中に含まれる。）を反応容器に混合し、ボルテックスし、１８分間インキュベートした。このインキュベーション後、微粒子を、磁石を使用して反応容器の側面に停止させ、反応上清を取り除いた。続いて、微粒子を水／界面活性剤溶液で洗浄した。試料中に存在する、微粒子上に捕捉された抗体は、洗浄工程（単数または複数）の間保持された。第２の工程では、洗浄の直後に、結合体希釈剤中の５０ｕＬのアクリジニウムで標識された抗ヒトＩｇＧ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＩｇＭ（１ｎｇ／ｍＬ）マウスモノクローナル抗体を反応容器に添加し、これをボルテックスし、その後、４分間インキュベートした。インキュベーション後、微粒子を、磁石を使用して反応容器の側面に停止させ、反応上清を取り除いた。続いて、微粒子を水／界面活性剤溶液で洗浄した。洗浄した粒子を塩基性の過酸化水素を含有している溶液中に懸濁してアクリジニウムを活性化させ、同時に光の出力を測定した（相対的な光の単位、即ちＲＬＵで）。これは、微粒子に結合した結合体の量に比例する。
【０１８０】
アッセイ形式３：直接的１工程／Ｆｌｙ上での捕捉。第１の工程では、１１０ｕＬのヒト試料、５０から９０ｕＬの結合体（ビオチニル化された組換えＨＣＶ  ＮＳ３捕捉抗原、およびｐＨ６．３の適切な緩衝液中の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原に共有結合により結合させたアクリジニウムで標識されたＢＳＡ）、および粒子希釈剤（還元剤を含有しているｐＨ６．６の適切な緩衝液）中のストレプトアビジンでコーティングされた５０ｕＬの常磁性微粒子を反応容器に混合し、ボルテックスし、１８分間インキュベートした。このインキュベーション後、微粒子を、磁石を使用して反応容器の側面に停止させ、反応上清を取り除いた。続いて、微粒子を水／界面活性剤溶液で洗浄した。試料中に存在する、微粒子上に捕捉された抗体は、洗浄工程（単数または複数）の間保持された。第２の工程では、洗浄の直後に、さらに５０ｕＬのアッセイ特異的洗浄緩衝液を反応容器に添加し、これをボルテックスし、４分間インキュベートした。インキュベーション後、微粒子を、磁石を使用して反応容器の側面に停止させ、反応上清を取り除いた。続いて、微粒子を水／界面活性剤溶液で洗浄した。洗浄した粒子を塩基性の過酸化水素を含有している溶液中に懸濁してアクリジニウムを活性化させ、同時に光の出力を測定した（相対的な光の単位、即ちＲＬＵで）。これは、微粒子上に結合した結合体の量に比例する。
【０１８１】
アッセイ形式４：直接的２工程。第１の工程では、１１０ｕＬの試料、９０ｕＬのアッセイ特異的希釈剤緩衝液（ｐＨ８．４）、および粒子希釈剤（示した還元剤を含む／還元剤を含まないｐＨ６．６）中の固定化されたＨＣＶ  ＮＳ３抗原を含む５０ｕＬの常磁性微粒子を反応容器に混合し、ボルテックスし、１８分間インキュベートした。抗原を、（ａ）ＥＤＡＣを使用した共有結合または（ｂ）抗原に共有結合されたビオチンによる固定化されたストレプトアビジンへの結合により、粒子上に固定した。このインキュベーション後、微粒子を、磁石を使用して反応容器の側面に停止させ、反応上清を取り除いた。続いて、微粒子を水／界面活性剤溶液で洗浄した。試料中に存在する、微粒子上に捕捉された抗体は、洗浄工程（単数または複数）の間保持された。第２の工程では、洗浄の直後に、結合体希釈剤緩衝液中の組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原に結合させた５０ｕＬのアクリジニウムで標識されたＢＳＡを反応容器に添加し、ボルテックスし、その後、４分間インキュベートした。インキュベーション後、微粒子を、磁石を使用して反応容器の側面に停止させ、反応上清を取り除いた。続いて、微粒子を水／界面活性剤溶液で洗浄した。洗浄した粒子を塩基性の過酸化水素を含有している溶液中に懸濁してアクリジニウムを活性化させ、同時に光の出力を測定した（相対的な光の単位、即ち、ＲＬＵで）。これは、微粒子上に結合した結合体の量に比例する。
【０１８２】
アッセイ形式５：間接的２工程／Ｆｌｙ上での捕捉。第１の工程では、１０ｕＬの試料、ビオチニル化された組換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原を含有している９０ｕＬの検体希釈剤緩衝液、および還元剤を含有しているｐＨ６．６の適切な緩衝液中のストレプトアビジンでコーティングされた常磁性微粒子５０ｕＬを反応容器に混合し、ボルテックスし、１８分間インキュベートした。このインキュベーション後、微粒子を、磁石を使用して反応容器の側面に停止させ、反応上清を取り除いた。続いて、微粒子を水／界面活性剤溶液で洗浄した。試料中に存在する、微粒子上に捕捉された抗体は、洗浄工程（単数または複数）の間保持された。第２の工程では、洗浄の直後に、５０ｕＬの結合体（アクリジニウムで標識されたヒトＩｇＧ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびアクリジニウムで標識されたＩｇＭ（１ｎｇ／ｍＬ）マウスモノクローナル抗体を反応容器に添加し、これをボルテックスし、次に４分間インキュベートした。インキュベーション後、微粒子を、磁石を使用して反応容器の側面に停止させ、反応上清を取り除いた。続いて、微粒子を水／界面活性剤溶液で洗浄した。洗浄した粒子を、塩基性の過酸化水素を含有している溶液中に懸濁してアクリジニウムを活性化させ、同時に光の出力を測定した（相対的な光の単位、即ち、ＲＬＵで）。これは、微粒子上に結合した結合体の量に比例する。
【０１８３】
［実施例１４］
９ＮＢ４９ＨおよびＣｙｓからＳｅｒへの突然変異体の免疫反応性
９ＮＢ４９Ｈ組換え体およびこの突然変異体の相対的な免疫反応性を、還元剤の存在下および非存在下で測定した。アッセイは、既知の抗ＨＣＶ  ＮＳ３陽性血漿プール（パネルＢ）およびＨＣＶ抗体陰性の正常なヒト血清を使用し、実施例１３に記載したような様々なアッセイ形式を使用して行った。以下の表に示す結果は、シグナル対陰性比（Ｓ／Ｎ）として表す。システイン３のセリンでの置換により、野生型９ＮＢ４９Ｈと比較してアッセイ形式２の感度が改善した。システイン４のセリンでの置換により、野生型９ＮＢ４９Ｈと比較してアッセイ形式３の感度が改善した。システイン１または２のセリンでの置換によっては、全４種のアッセイ形式において感度に最大の負の影響があった。システイン３のセリンでの置換により、アッセイ形式２、３、および４においては、還元剤の存在下または非存在下の間で観察された相違が小さくなった。アッセイ形式３（直接的１工程／Ｆｌｙ上での捕捉）は、使用したＨＣＶタンパク質とは無関係に最大の全体的な感度を示した。システイン３のセリンでの置換は、アッセイ形式３においては、感度を維持しつつ、還元剤の影響を低下させた。
【０１８４】
【表７】
2016512241.tif 000014
【０１８５】
［実施例１５］
ＨＣＶ  ９ＮＢ４９Ｈ−Ｃｂｔ対９ＮＢ４９Ｈ−Ｃｂｔ−Ｃ３Ｓのセロコンバージョンの感度
実施例１４に示すように、アッセイ形式３（直接的１工程／Ｆｌｙ上での捕捉）は、ＨＣＶ抗体陽性血漿プールを試験することにより得たＳ／Ｎ値により測定すると、最大の全体的な感度を示した。加えて、９ＮＢ４９Ｈ突然変異体（ここでは、３番目のシステイン残基がセリンで置換されている。）は、還元剤に対して最大の耐性を示した。野生型およびＣ３Ｓ突然変異体の相対的な感度を、直接的１工程／Ｆｌｙ上での捕捉のアッセイ方法（形式３）を使用し、ＨＣＶに感染したヒト個体由来のセロコンバージョンパネル（パネル９１９および６２２８）を試験することにより決定した。１０．０のＳ／Ｎを陽性についてのカットオフとして使用した。従って、Ｓ／Ｎ≧１０．０を持つ試料を反応性と考え、Ｓ／Ｎ＜１０．０を持つ試料を非反応性と考える。各セロコンバージョンパネルによる血清学的陽性試料を（＋）で、非反応性を（−）で示す。パネルＢを陽性対照として使用した。結果を以下の表に示す。９ＮＢ４９Ｈ−Ｃ３Ｓ−Ｃｂｔタンパク質は一般的には、より高いＳ／Ｎ値を生じ、さらなるパネルのメンバーもまた野生型タンパク質と比較して陽性であると検出した。
【０１８６】
【表８】
2016512241.tif 000015
【０１８７】
［実施例１６］
ＮＳ３ｈドメイン変異体のセロコンバージョンの感度
ＨＣＶに感染した個体の間で免疫反応性に寄与しているＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼタンパク質（ＮＳ３ｈ）のドメインを特定するために、組換えタンパク質のコレクションを実施例５に記載したように作製した。これらの部位特異的ビオチニル化タンパク質をアッセイ形式５（間接的２工程／Ｆｌｙ上での捕捉、実施例１３）において使用して、ＨＣＶの陽性対照であるヒト血漿のプール（パネルＢ）と、ＨＣＶに感染したヒト個体由来のセロコンバージョンパネルのセット（パネル６２２４、６２２８、および９０４４）を使用することにより、それらの免疫反応性を測定した。１０．０のＳ／Ｎを陽性についてのカットオフとして使用した。従って、Ｓ／Ｎ≧１０．０を持つ試料を反応性と考え、Ｓ／Ｎ＜１０．０を持つ試料を非反応性と考える。パネルＢを陽性対照として使用した。Ｓ／Ｎ比として表した結果を以下の表に示す。ＮＳ３ｈ−Ｃｂｔ−Ｃ３Ｓは最大のセロコンバージョンの感度を生じ（最も反応性が高い採血物）、ＮＳ３ｈ−Ｃｂｔタンパク質がこの後に続く。ＮＳ３ｈ−Ｃｂｔ−Ｃ３Ｓは、９ＮＢ４９Ｈ−Ｃｂｔと比較して、パネルのメンバーに応じて２から１５倍大きいＳ／Ｎを生じた。ＮＳ３ｈ−Ｃｂｔは、９ＮＢ４９Ｈ−Ｃｂｔと比較して、パネルのメンバーに応じて３から１０倍大きいＳ／Ｎを生じた。ＮＳ３ｈ−ｄ１−Ｃｂｔ抗原は、９ＮＢ４９Ｈがｄ１−Ｃｂｔと表される領域を含むという事実にもかかわらず、９ＮＢ４９Ｈ−Ｃｂｔと比較して、パネルのメンバーに応じて、２倍大きいＳ／Ｎを示した。
【０１８８】
【表９】
2016512241.tif 000016
【０１８９】
［実施例１７］
９ＮＢ４９Ｈ、ＮＳ３ｈ、およびＮＳ３ｈ−Ｃ３Ｓの相対的免疫反応性
最も高い抗体検出アッセイ感度を提供したＮＳ３タンパク質の組み合わせを特定するために、ＨＣＶ  ＮＳ３組換えタンパク質の様々な組み合わせをアッセイ形式３（直接的１工程／Ｆｌｙ上での捕捉、実施例１３）を使用することにより試験した。ＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質をＡｃｒ−ＢＳＡ（アクリジニウムで標識されたＢＳＡ）で標識した、および／または部位特異的ビオチニル化捕捉タンパク質（即ち、Ｃ末端がビオチニル化されたタグ即ちＣｂｔを保有している。）として使用した。後者を、３種類の濃度で試験した。ＨＣＶの陽性対照であるヒト血漿プール（パネルＢ）を陽性対照として使用し、ＨＣＶ抗体について陰性であることがわかっている正常なヒト血漿のプールを陰性対照として使用した。結果を以下の表に示し、相対的な光の単位（ＲＬＵ）として表す。ＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質の全ての組み合わせが、陽性対照試料中に存在する抗体を検出した。しかし、ＮＳ３ｈ−ＣｂｔとＡｃｒ−ＢＳＡ−ＮＳ３ｈの組み合わせが最も高い感度を示した。
【０１９０】
【表１０】
2016512241.tif 000017
【０１９１】
［実施例１８］
９ＮＢ４９Ｈ、ＮＳ３ｈ、およびＮＳ３ｈ−Ｃ３Ｓのセロコンバージョンの感度
ＮＳ３組換え抗原の様々な組み合わせを、ＨＣＶに感染した個体由来のセロコンバージョンパネルのセット由来の個々の血清試料の間で、抗体を検出するそれらの能力について試験した。データはアッセイ形式３（直接的１工程／Ｆｌｙ上での捕捉、実施例１３）を使用して作成した。１０．０のＳ／Ｎを陽性についてのカットオフとして使用した。従って、Ｓ／Ｎ≧１０．０を持つ試料を反応性と考え、Ｓ／Ｎ＜１０．０を持つ試料を非反応性と考える。パネルＢを陽性対照として使用した。Ｓ／Ｎ比として表した結果を以下の表に示す。Ａｃｒ−ＢＳＡ−ＮＳ３ｈおよびＮＳ３ｈ−Ｃｂｔを使用したアッセイが、最大のセロコンバージョンの感度を生じた、即ち、最高のＳ／Ｎ値で検出された最も反応性が高いパネルのメンバーであった。
【０１９２】
【表１１】
2016512241.tif 000018
【０１９３】
［実施例１９］
ＮＳ３ｈ変異体の相対的な免疫反応性
ヒト抗ＮＳ３抗体に対する実施例６に記載したＮＳ３ｈ変異体の相対的な免疫反応性を比較するために、以下の方法を、ビオチニル化ＮＳ３タンパク質のストレプトアビジン微粒子捕捉における可能性がある相違を管理するために使用した。上記方法では、実施例１３に記載したアッセイ形式５を使用し、ここでは、試験しようとする精製されたＮＳ３組換え抗原を、試験前に同じタンパク質濃度になるように検体希釈剤緩衝液中に希釈した。希釈した抗原の同じセットを２つのアッセイで、いずれもアッセイ形式５を使用して試験する。ここでは、第１のアッセイ工程においてストレプトアビジン微粒子により捕捉されたＮＳ３タンパク質を、（ａ）ＮＳ３に特異的な抗体を含むことがわかっている抗ＨＣＶ  ＮＳ３陽性ヒト血漿プール（即ち、実施例１４に記載したパネルＢ）および（ｂ）この配列が存在し、ＮＳ３組換えタンパク質とこの変異体（即ち、９ＮＢ４９ＨおよびＮＳ３ｈ）の間で保存されているアミノ末端の直鎖エピトープに特異的な抗ＮＳ３マウスモノクローナル抗体により、試験する／調べる。結合した抗ＮＳ３ヒト抗体の量を、アクリジニル化抗ヒトＩｇＧ結合体を使用することにより決定した。粒子に結合した抗ＮＳ３モノクローナル抗体の量を同じアッセイ形式により決定したが、抗ヒトＩｇＧ結合体を、ヤギで惹起させ、アクリジニウムで標識した抗マウスポリクローナル抗体で置き換えた。２つのアッセイの間でのＲＬＵの比は、常磁性微粒子上のＮＳ３組換え抗原の量に対する抗ＮＳ３ヒト抗体免疫反応性の正規化のための手段を提供する。正規化された免疫反応性は、３３×抗マウスアッセイによるＲＬＵのｌｏｇ１０で抗ヒトアッセイによるＲＬＵのものを割り算することにより計算される。データのこの変換により、２つのアッセイの間での直接的な線形相関を確立することができた。
【０１９４】
１５０ｎｇ／ｍＬのそれぞれの組換えタンパク質を使用した実験の結果を以下の表に示す。正規化した結果を、９ＮＢ４９ＨまたはＮＳ３ｈのいずれかに対して示す。全てのＮＳ３ｈ変異体は、９ＮＢ４９Ｈと比較してパネルＢについてより高い反応性を示す。幾つかのＮＳ３ｈ変異体は、野生型ＮＳ３ｈと比較してより高い相対的免疫反応性を示し、ＡＴＰａｓｅまたはＡＴＰ結合に関与していることが明らかになっている残基への特定の突然変異が、より高い免疫反応性を持つＮＳ３ｈを生じ得ることを示唆している。Ｃｙｓ１４からＳｅｒへの突然変異は、単独で、または別の突然変異との組み合わせでのいずれにおいても、ＮＳ３ｈのはるかに低い免疫反応性を生じる。
【０１９５】
【表１２】
2016512241.tif 000019
【０１９６】
［実施例２０］
ＮＳ３ｈタンパク質の直接的標識対間接的標識の相対的感度
ＮＳ３ｈ組換え抗原を「間接的に」、即ち、実施例１１に記載したようなアクリジニウムで標識されたＢＳＡのシステイニル−チオールへの結合により、または実施例１１に記載したようなアクリジニウム−マレイミドを使用することにより「直接的に」標識した。
【０１９７】
データを、実施例１３に記載したようにアッセイ形式５（直接的２工程／Ｆｌｙ上での捕捉）を使用して作成した。１０．０のＳ／Ｎを陽性についてのカットオフとして使用した。従って、Ｓ／Ｎ≧１０．０を持つ試料を反応性と考え、Ｓ／Ｎ＜１０．０を持つ試料を非反応性と考える。パネルＢを陽性対照として使用した。結果を以下の表に示す。
【０１９８】
直接的標識方法の使用は、間接的に標識されたＮＳ３ｈ結合体と比較して、ＨＣＶ  ＮＳ３抗体を検出する能力が大幅に低下した結合体を生じる。
【０１９９】
【表１３】
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【図１】
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【配列表】
2016512241000001.app
【国際調査報告】
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