(57)【要約】  本発明は、ツバキ科（Theacea）植物に由来する生物活性画分を含有する単離された生物活性組成物に関する。本発明はまた、生物活性組成物を含有する生物活性局所製剤に関する。本発明はさらに、例えば、哺乳動物の皮膚組織における炎症活性を阻害する方法、紫外線により誘発される損傷から哺乳動物の皮膚組織を保護する方法、および哺乳動物の皮膚組織における皮膚障害を正常化する方法を含む、本発明の生物活性組成物を使用する方法に関する。本発明はまた、ツバキ科（Theacea）植物の細胞汁または細胞壁構成成分に由来する生物活性画分を単離する方法に関する。生物活性組成物は、とりわけ、飲料、機能性食品、栄養補給品、サプリメントなどにおける使用に適している。
2016513099.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ツバキ科（Theacea）植物に由来する単離された生物活性画分
を含み、前記生物活性画分が、細胞壁画分、細胞壁画分抽出物、膜画分、膜画分抽出物、細胞質画分、細胞質画分抽出物、細胞汁漿液、およびそれらの組合せからなる群から選択される、生物活性組成物。
【請求項２】
前記生物活性画分が細胞壁画分である、請求項１に記載の生物活性組成物。
【請求項３】
前記生物活性画分が細胞壁画分抽出物である、請求項１に記載の生物活性組成物。
【請求項４】
前記細胞壁画分抽出物が、乾燥物質１グラム当たり約２．１から約４．５ミリグラムの間の総カテキン含有量を有する、請求項３に記載の生物活性組成物。
【請求項５】
前記細胞壁画分抽出物が、
前記細胞壁画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約２．０から約３．０ミリグラムの間の（＋）−カテキン、
前記細胞壁画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約０．００５から約０．０２ミリグラムの間の（−）−エピカテキン、
前記細胞壁画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約０．００５から約０．０２ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピガロカテキン、および
前記細胞壁画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約０．００３から約０．０１ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピカテキン
を含む、カテキン含有量プロファイルを有する、請求項３に記載の生物活性組成物。
【請求項６】
前記生物活性画分が膜画分である、請求項１に記載の生物活性組成物。
【請求項７】
前記生物活性画分が膜画分抽出物である、請求項１に記載の生物活性組成物。
【請求項８】
前記膜画分抽出物が、乾燥物質１グラム当たり約１５．０から約３０．５ミリグラムの間の総カテキン含有量を有する、請求項７に記載の生物活性組成物。
【請求項９】
前記膜画分抽出物が、
前記膜画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約１．７から約３．３ミリグラムの間の（−）−エピガロカテキン、
前記膜画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約６．１から約１０．２ミリグラムの間の（＋）−カテキン、
前記膜画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約０．３から約１．１ミリグラムの間の（−）−エピカテキン、
前記膜画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約６．２から約１２．５ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピガロカテキン、
前記膜画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約０．００７から約０．０３ミリグラムの間の（−）−没食子酸ガロカテキン、
前記膜画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約１．３から約３．３ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピカテキン
を含む、カテキン含有量プロファイルを有する、請求項７に記載の生物活性組成物。
【請求項１０】
前記生物活性画分が細胞質画分である、請求項１に記載の生物活性組成物。
【請求項１１】
前記生物活性画分が細胞質画分抽出物である、請求項１に記載の生物活性組成物。
【請求項１２】
前記生物活性画分が細胞汁漿液である、請求項１に記載の生物活性組成物。
【請求項１３】
前記細胞汁漿液が、乾燥物質１グラム当たり約８．０から約２０．０ミリグラムの間の総カテキン含有量を有する、請求項１２に記載の生物活性組成物。
【請求項１４】
前記細胞汁漿液が、
前記細胞汁漿液の乾燥物質１グラム当たり約２．１から約４．４ミリグラムの間の（−）−エピガロカテキン、
前記細胞汁漿液の乾燥物質１グラム当たり約４．２から約８．６ミリグラムの間の（＋）−カテキン、
前記細胞汁漿液の乾燥物質１グラム当たり約０．２から約２．０ミリグラムの間の（−）−エピカテキン、
前記細胞汁漿液の乾燥物質１グラム当たり約１．２から約３．２ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピガロカテキン、
前記細胞汁漿液の乾燥物質１グラム当たり約０．０１から約０．１ミリグラムの間の（−）−没食子酸ガロカテキン、
前記細胞汁漿液の乾燥物質１グラム当たり約０．２から約１．３ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピカテキン
を含む、カテキン含有量プロファイルを有する、請求項１２に記載の生物活性組成物。
【請求項１５】
前記ツバキ科（Theacea）植物が、ツバキ属（Camellia）植物またはヒサカキ属（Eurya）植物である、請求項１に記載の生物活性組成物。
【請求項１６】
前記ツバキ属（Camellia）植物が、チャノキ（Camellia sinensis）、ヤブツバキ（Camellia japonica）、トウツバキ（Camellia reticulate）、およびサザンカ（Camellia sasanqua）からなる群から選択される、請求項１５に記載の生物活性組成物。
【請求項１７】
前記ヒサカキ属（Eurya）植物が、エウリア・サンドウィチエンシス（Eurya sandwicensis）である、請求項１５に記載の生物活性組成物。
【請求項１８】
安定剤をさらに含む、請求項１に記載の生物活性組成物。
【請求項１９】
前記安定剤が、乳化剤、防腐剤、酸化防止剤、ポリマーマトリクス、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１８に記載の生物活性組成物。
【請求項２０】
哺乳動物への局所適用に適した生物活性局所製剤であって、
局所的に有効な量の請求項１に記載の生物活性組成物、および
局所的に許容される担体
を含む、生物活性局所製剤。
【請求項２１】
前記局所的に許容される担体が、親水性クリーム基剤、親水性ローション基剤、親水性界面活性剤基剤、親水性ゲル基剤、親水性溶液基剤、疎水性クリーム基剤、疎水性ローション基剤、疎水性界面活性剤基剤、疎水性ゲル基剤、および疎水性溶液基剤からなる群から選択される、請求項２０に記載の生物活性局所製剤。
【請求項２２】
前記生物活性組成物が、前記生物活性局所製剤の総重量の約０．００１パーセントから約９０パーセントの間の範囲の量で存在する、請求項２０に記載の生物活性局所製剤。
【請求項２３】
少なくとも１つの請求項１に記載の生物活性組成物を含む飲料。
【請求項２４】
液体中に分散された少なくとも１つの生物活性組成物を含む、請求項２３に記載の飲料。
【請求項２５】
前記液体が、水、ショットドリンク、機能性飲料、緑茶、ウーロン茶、紅茶、白茶、フレーバーティー、ソフトドリンク、コーヒー、ミルク、シェーキ、アルコール飲料、ノンアルコール飲料、スポーツドリンク、フルーツジュース、野菜ジュース、人工甘味料入りのジュース、発泡水、パンチ、サイダー、および栄養補助飲料からなる群から選択される、請求項２４に記載の飲料。
【請求項２６】
前記ツバキ科（Theacea）植物が、ツバキ属（Camellia）植物またはヒサカキ属（Eurya）植物である、請求項２３に記載の飲料。
【請求項２７】
前記ツバキ属（Camellia）植物が、チャノキ（Camellia sinensis）、ヤブツバキ（Camellia japonica）、トウツバキ（Camellia reticulate）、およびサザンカ（Camellia sasanqua）からなる群から選択され、前記ヒサカキ属（Eurya）植物が、エウリア・サンドウィチエンシス（Eurya sandwicensis）である、請求項２６に記載の飲料。
【請求項２８】
少なくとも１つの請求項１に記載の生物活性組成物を含む治療用飲料。
【請求項２９】
液体中に分散された前記少なくとも１つの生物活性組成物を含む、請求項２８に記載の治療用飲料。
【請求項３０】
前記液体が、水、ショットドリンク、機能性飲料、緑茶、ウーロン茶、紅茶、白茶、フレーバーティー、ソフトドリンク、コーヒー、ミルク、シェーキ、アルコール飲料、ノンアルコール飲料、スポーツドリンク、フルーツジュース、野菜ジュース、人工甘味料入りのジュース、発泡水、パンチ、サイダー、および栄養補助飲料からなる群から選択される、請求項２９に記載の治療用飲料。
【請求項３１】
前記ツバキ科（Theacea）植物が、ツバキ属（Camellia）植物またはヒサカキ属（Eurya）植物である、請求項２８に記載の治療用飲料。
【請求項３２】
前記ツバキ属（Camellia）植物が、チャノキ（Camellia sinensis）、ヤブツバキ（Camellia japonica）、トウツバキ（Camellia reticulate）、およびサザンカ（Camellia sasanqua）からなる群から選択され、前記ヒサカキ属（Eurya）植物が、エウリア・サンドウィチエンシス（Eurya sandwicensis）である、請求項３１に記載の治療用飲料。
【請求項３３】
少なくとも１つの請求項１に記載の生物活性組成物を含む栄養補給製品。
【請求項３４】
前記ツバキ科（Theacea）植物が、ツバキ属（Camellia）植物またはヒサカキ属（Eurya）植物である、請求項３３に記載の栄養補給製品。
【請求項３５】
前記ツバキ属（Camellia）植物が、チャノキ（Camellia sinensis）、ヤブツバキ（Camellia japonica）、トウツバキ（Camellia reticulate）、およびサザンカ（Camellia sasanqua）からなる群から選択され、前記ヒサカキ属（Eurya）植物が、エウリア・サンドウィチエンシス（Eurya sandwicensis）である、請求項３４に記載の栄養補給製品。
【請求項３６】
請求項１に記載の少なくとも１つの生物活性組成物を含む機能性食品。
【請求項３７】
前記ツバキ科（Theacea）植物が、ツバキ属（Camellia）植物またはヒサカキ属（Eurya）植物である、請求項３６に記載の機能性食品。
【請求項３８】
前記ツバキ属（Camellia）植物が、チャノキ（Camellia sinensis）、ヤブツバキ（Camellia japonica）、トウツバキ（Camellia reticulate）、およびサザンカ（Camellia sasanqua）からなる群から選択され、前記ヒサカキ属（Eurya）植物が、エウリア・サンドウィチエンシス（Eurya sandwicensis）である、請求項３７に記載の機能性食品。
【請求項３９】
飲料を調製するためにツバキ科（Theacea）植物由来の少なくとも１つの生物活性組成物を液体中に分散させる装置であって、
半透膜を含む濾過ポーチまたはバッグ、および
前記濾過ポーチまたはバッグ内に含有される少なくとも１つの請求項１に記載の生物活性組成物
を含む、装置。
【請求項４０】
前記液体が、水、ショットドリンク、機能性飲料、緑茶、ウーロン茶、紅茶、白茶、フレーバーティー、ソフトドリンク、コーヒー、ミルク、シェーキ、アルコール飲料、ノンアルコール飲料、スポーツドリンク、フルーツジュース、野菜ジュース、人工甘味料入りのジュース、発泡水、パンチ、サイダー、および栄養補助飲料からなる群から選択される、請求項３９に記載の装置。
【請求項４１】
前記飲料が治療用飲料である、請求項３９に記載の装置。
【請求項４２】
前記ツバキ科（Theacea）植物が、ツバキ属（Camellia）植物またはヒサカキ属（Eurya）植物である、請求項３９に記載の装置。
【請求項４３】
前記ツバキ属（Camellia）植物が、チャノキ（Camellia sinensis）、ヤブツバキ（Camellia japonica）、トウツバキ（Camellia reticulate）、およびサザンカ（Camellia sasanqua）からなる群から選択され、前記ヒサカキ属（Eurya）植物が、エウリア・サンドウィチエンシス（Eurya sandwicensis）である、請求項４２に記載の装置。
【請求項４４】
飲料を調製する方法であって、
請求項３９に記載の装置を準備するステップ、
前記装置の前記少なくとも１つの生物活性組成物を前記液体中に分散させるのに有効な条件下で前記装置を液体と接触させ、それにより前記少なくとも１つの生物活性組成物を含む飲料を得るステップ
を含む、方法。
【請求項４５】
前記少なくとも１つの生物活性組成物の低分子量および還元された非酸化構成成分を前記液体中に分散させるのに有効な条件下で前記装置を前記液体と接触させる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記液体が、水、ショットドリンク、機能性飲料、緑茶、ウーロン茶、紅茶、白茶、フレーバーティー、ソフトドリンク、コーヒー、ミルク、シェーキ、アルコール飲料、ノンアルコール飲料、スポーツドリンク、フルーツジュース、野菜ジュース、人工甘味料入りのジュース、発泡水、パンチ、サイダー、および栄養補助飲料からなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記飲料が治療用飲料である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記ツバキ科（Theacea）植物が、ツバキ属（Camellia）植物またはヒサカキ属（Eurya）植物である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記ツバキ属（Camellia）植物が、チャノキ（Camellia sinensis）、ヤブツバキ（Camellia japonica）、トウツバキ（Camellia reticulate）、およびサザンカ（Camellia sasanqua）からなる群から選択され、前記ヒサカキ属（Eurya）植物が、エウリア・サンドウィチエンシス（Eurya sandwicensis）である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ツバキ科（Theacea）植物由来の少なくとも１つの生物活性組成物の全身または局所投与のための製剤であって、
少なくとも１つの請求項１に記載の生物活性組成物を含む、溶液、懸濁液、分散液、ペースト、または乾燥粉末
を含む、製剤。
【請求項５１】
前記ツバキ科（Theacea）植物が、ツバキ属（Camellia）植物またはヒサカキ属（Eurya）植物である、請求項５０に記載の製剤。
【請求項５２】
前記ツバキ属（Camellia）植物が、チャノキ（Camellia sinensis）、ヤブツバキ（Camellia japonica）、トウツバキ（Camellia reticulate）、およびサザンカ（Camellia sasanqua）からなる群から選択され、前記ヒサカキ属（Eurya）植物が、エウリア・サンドウィチエンシス（Eurya sandwicensis）である、請求項５１に記載の製剤。
【請求項５３】
機能性飲料を生産するために液体と混合する際に使用するための乾燥粉末を含む、請求項５０に記載の製剤。
【請求項５４】
機能性飲料を生産するために液体と混合する際に使用するための前記少なくとも１つの生物活性組成物の濃縮溶液を含む、請求項５０に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年２月８日に出願された、米国仮特許出願第６１／７６２，５４５号の優先権の利益を主張し、その開示はその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、生物活性組成物、ツバキ科（Theacea）植物からそれらを生産するプロセス、およびそれらの組成物の使用に関する。生物活性組成物は、とりわけ、飲料、機能性食品、栄養補給品、サプリメントなどにおける使用に適している。
【背景技術】
【０００３】
ツバキ科（Theacea）（茶樹）には、約４０の属および６００の種を含む、高木または低木が含まれる。チャノキ（Camellia sinensis）はツバキ科（Theacea）において特殊な位置を占める。なぜなら、この特定の植物の種は、３種の基本的な種類の茶：緑茶、ウーロン茶、および紅茶のすべてを生産するための単一の原料源として主に使用されるからである（本明細書において、まとめて「茶樹」と称される）。いくつかの情報源によれば、第４の種類の茶、すなわち、いわゆる「白茶」が存在し、それは茶樹の芽または先端からのみ生産される。
【０００４】
茶の３つの基本的な形状は、同じ柔らかい若い茶葉が関与している、加工の程度によって決まる。葉は、摘み取り、分類し、きれいにして、さまざまに酸化してから、蒸すかまたは乾燥させる。「発酵」という用語が、茶の加工を説明するために頻繁に使用されるが、「酸化」という用語の方が、生じる化学変換をより正確に説明している。
【０００５】
加工には差がいくらかあるものの、緑茶が最も低い酸化度を有し、紅茶が最も高い酸化度を有することが一般に認められている。ウーロン茶は部分的に酸化されているとみなされ、よって緑茶と紅茶の間に位置する。加工に関して、緑茶と白茶との間に差はほとんどない（または差は全くない）。
【０００６】
緑茶は、新鮮な葉を蒸して萎れさせ、その後直ちに乾燥して作られる。紅茶は、葉を萎れさせ、ローラーで砕き、次いでそれらを数時間酸化させてから、乾燥して作られる、葉から作製される。ウーロン茶は、葉を部分的にのみ酸化させて、その後乾燥して作られる。
【０００７】
世界的には茶は２番目（水の次）に多く消費されている液体であり、米国では６番目（水、ソフトドリンク、コーヒー、ビール、およびミルクの次）に多く消費されている液体である。茶の消費量は、特にこの液体の健康上の利点に関する大衆の意識が増大しているために、世界的に増加し続けている。茶およびその成分の抗血管新生特性、抗菌特性、抗癌特性、抗炎症特性、抗突然変異特性、抗酸化特性、消毒特性、および解毒特性を示唆する出版物の数が増加している。茶の利点の一覧には、関節リウマチの危険性の減少、コレステロールレベルの低下、および抗糖尿病特性もまた含まれる。これらの利点のすべてが統計的に有意であると証明されているとは限らない。それにもかかわらず、茶の利点の範囲が非常に広いことは、新鮮な植物葉に存在し、従来の茶の加工に耐える非常に強力な生物学的に活性な物質の特有の組成を反映している。
【０００８】
特に、チャノキ（Camellia sinensis）の新鮮な葉は、２２．２％のポリフェノール、１７．２％のタンパク質、４．３％のカフェイン、２７．０％の粗繊維、０．５％のデンプン、３．５％の還元糖、６．５％のペクチン、２．０％のエーテル抽出物、および５．６％の灰分を含有することが報告されている（Duke, J. A., Handbook of Energy Crops (1983), www.hort.purdue.edu/newcrop/duke_energy/Camellia_sinensis.htmlを参照のこと）。１００ｇ当たり、葉は、８．０ｇのＨ２Ｏ、２４．５ｇのタンパク質、２．８ｇの脂肪、５８．８ｇの総炭水化物、８．７ｇの繊維、５．９ｇの灰分、３２７ｍｇのＣａ、３１３ｍｇのＰ、２４．３ｍｇのＦｅ、５０ｍｇのＮａ、２７００μｇのβ−カロテン等価物、０．０７ｍｇのチアミン、０．８ｍｇのリボフラビン、７．６ｍｇのナイアシン、および９ｍｇのアスコルビン酸を含有することが報告されている。別の報告では、８．０ｇのＨ２Ｏ、２８．３ｇのタンパク質、４．８ｇの脂肪、５３．６ｇの総炭水化物、９．６ｇの繊維、５．６ｇの灰分、２４５ｍｇのＣａ、４１５ｍｇのＰ、１８．９ｍｇのＦｅ、６０ｍｇのＮａ、８４００μｇのβ−カロテン等価物、０．３８ｍｇのチアミン、１．２４ｍｇのリボフラビン、４．６ｍｇのナイアシン、および２３０ｍｇのアスコルビン酸と計算している。さらに別の報告では、８．１ｇのＨ２Ｏ、２４．１ｇのタンパク質、３．５ｇの脂肪、５９．０ｇの総炭水化物、９．７ｇの繊維、５．３ｇの灰分、３２０ｍｇのＣａ、１８５ｍｇのＰ、３１．６ｍｇのＦｅ、８４００μｇのβ−カロテン等価物、０．０７ｍｇのチアミン、０．７９ｍｇのリボフラビン、７．３ｍｇのナイアシン、および８５ｍｇのアスコルビン酸とされている（J. A. Duke and A. A. Atchley, “Proximate Analysis,” In: Christie, B. R. (ed.), The Handbook of Plant Science in Agriculture, CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla. (1984)）。
【０００９】
葉はまた、カロテン、リボフラビン、ニコチン酸、パントテン酸、およびアスコルビン酸を含有する。なかでも、カフェインおよびタンニンは、より活性のある構成要素である（Council for Scientific and Industrial Research, 1948-1976）。新鮮な葉に存在するアスコルビン酸は紅茶を作る際に破壊される。リンゴ酸およびシュウ酸（oxatic acid）が、ケンフェロール、クエルシトリン、テオフィリン、テオブロミン、キサンチン、ヒポキサンチン、アデニン、ガム、デキストリン、およびイノシトールと共に存在する。揮発油（葉の０．００７〜０．０１４％生重量）の主な構成成分は、ヘキセナール、ヘキセノール、および低級アルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブテルアルデヒド（isobuteraldehyde）、イソバレルアルデヒド、ならびにｎ−ヘキシル、ベンジル、およびフェニルエチルアルコール、フェノール、クレゾール、ヘキサン酸、ｎ−オクチルアルコール、ゲラニオール、リナロール、アセトフェノン、ベンジルアルコール、およびシトラールである。
【００１０】
新鮮な茶葉は、葉の乾燥物質の最大３０％に到達し得る、ポリフェノール（カテキン）の非常に高レベルのフラバノール群を有することが見出された。カテキンには、主に、（−）−エピカテキン、（−）−没食子酸エピカテキン、（−）−エピガロカテキンおよび（−）−没食子酸エピガロカテキンが含まれる。さらに、茶に特有の３−ガロイルキナ酸（テオガリン）および特有のアミノ酸テアニン（５−Ｎ−エチルグルタミン）が存在する（Duke, J. A., Handbook of Energy Crops (1983), www.hort.purdue.edu/newcrop/duke_energy/Camellia_sinensis.htmlを参照のこと）。
【００１１】
茶葉は高レベルのポリフェノール−オキシダーゼおよびペルオキシダーゼを含有する。最初の酵素はカテキンの好気的酸化を触媒し、このプロセスは、葉の細胞構造の完全性が破壊されると、開始する。フェノール−オキシダーゼは、紅茶において抽出可能な物質の最大の質量を構成する、ビスフラバノール、テアフラビン、エピテアフラビン酸、およびテアルビゲン（thearubigen）の生成に関与する。これらの化合物のほとんどは、新鮮な葉において有意なレベル（乾燥物質の２〜４％）を有する、カフェインとの複合体を容易に形成する。ペルオキシダーゼはプロアントシアニジンとの上記の複合体の生成において重要な役割を果たす。カテキンキノンはまた、紅茶の芳香族画分に見出される数百もの多さの揮発性化合物の形成を引き起こす。さらに、低い溶解度のアグリコンへの比較的可溶性の配糖体の変換が生じる。
【００１２】
上記のプロセスのすべての複雑なカスケードは、葉の細胞構造の破壊によって開始し、酸化の時間と共に強まる。結果として、通常、激しい回転または切断および比較的長時間の酸化により加工される、紅茶の組成は、新鮮な葉の組成とはるかに異なる。緑茶（および白茶）は最小限の酸化で加工され、その組成は新鮮な葉の組成とほとんど同様であるが、非酵素的変化および酵素的に触媒される変化が摘み取り後に極めて迅速に起こり、新たな揮発性物質が乾燥段階で生産される。したがって、比較的穏やかな緑茶の加工でさえも、元の新鮮な植物の組成からの逸脱をある程度引き起こし、新鮮な茶の植物の葉の治療的価値および他の潜在的利点を減少させ得る。
【００１３】
最近の多くの研究から、茶の治療上の利点は以下の順に減少することが明らかに実証されている：白茶＞緑茶＞ウーロン茶＞紅茶。したがって、新鮮な茶の植物を調査することによって、従来の茶の加工の結果として観察される特定の活性の分解が妨げられる可能性がある。新鮮な柔らかいツバキ属（Camellia）の葉は、水分をおよそ８０％含有する。細胞の膨張および脱水は、細胞の堅い細胞壁によって妨げられている。細胞壁の構造を破壊することにより、新鮮な植物組織の脱水、その後の一連の望ましくない物理化学的および生化学的プロセス：浸透圧ショック、脱区画化（decompartmentalization）および酵素の破壊、加水分解および酸化、フェノールの重合、アグリコンへの配糖体の変換、メイラード反応産物の生成、異性化、ならびに微生物汚染が誘発される。したがって、新鮮なツバキ属（Camellia）は非常に広範囲の生物学的に活性な物質を含み、従来の抽出プロセスの間、それらの一部のみしか利用できていなかった。そのため、茶飲料を得るための湯によって、または生物学的に活性な構成成分の限られた部分（主にポリフェノールおよびフラボノイド）を得るための異なる溶媒による抽出では、細胞壁、異化産物、および安定な代謝産物しか抽出され得ない。
【発明の概要】
【００１４】
価値のある治療的および他の潜在的に有益な生物活性組成物の供給源としての新鮮な茶葉の潜在性を考慮して、それらの治療的および他の潜在的に有益な生物活性特性を最大化する方法を求めるために新鮮な茶葉の調査が必要とされる。
【００１５】
本発明は生物活性組成物に関する。一実施形態において、生物活性組成物は、ツバキ科（Theacea）植物に由来する単離された生物活性画分を含む。好適な生物活性画分には、限定されないが、細胞壁画分、細胞壁画分抽出物、膜画分、膜画分抽出物、細胞質画分、細胞質画分抽出物、細胞汁漿液、および／またはそれらの組合せが含まれ得る。
【００１６】
本発明はまた、哺乳動物への局所適用に適した生物活性局所製剤に関する。一実施形態において、生物活性局所製剤は、局所的に有効な量の本発明の生物活性組成物を含む。生物活性局所製剤は、局所的に許容される担体をさらに含むことができる。
【００１７】
本発明はまた、哺乳動物の皮膚組織における炎症活性を阻害する方法に関する。この方法は、本発明による生物活性組成物を準備するステップを含む。その方法は、皮膚組織における炎症活性を阻害するのに有効な量で生物活性組成物を皮膚組織に塗布するステップをさらに含む。
【００１８】
本発明はまた、紫外線により誘発される損傷から哺乳動物の皮膚組織を保護する方法に関する。この方法は、本発明の生物活性組成物を準備するステップを含む。その方法は、皮膚組織の紫外線により誘発される損傷を減少させ、皮膚組織の酸化的損傷を阻止するのに有効な量で生物活性組成物を皮膚組織に塗布するステップをさらに含む。
【００１９】
本発明はまた、哺乳動物の皮膚組織における皮膚障害を正常化する方法に関する。この方法は、本発明の生物活性組成物を準備するステップを含む。その方法は、皮膚組織における細胞傷害を正常化するのに有効な量で生物活性組成物を皮膚組織に塗布するステップをさらに含む。
【００２０】
本発明はまた、ツバキ科（Theacea）植物の細胞汁に由来する生物活性画分を単離する方法に関する。この方法は、ツバキ科（Theacea）植物を準備するステップを含む。次いでツバキ科（Theacea）植物は細胞汁および細胞壁構成成分に分けられる。次いで細胞汁は生物活性画分を得るのに有効な条件下で処理される。好適な生物活性画分には、限定されないが、膜画分、膜画分抽出物、細胞質画分、細胞質画分抽出物、および／または細胞汁漿液が含まれる。次いで生物活性画分は処理された細胞汁から単離される。本発明はさらに、この方法によって生産される単離された生物活性組成物に関する。
【００２１】
本発明はまた、ツバキ科（Theacea）植物の細胞壁構成成分に由来する生物活性画分を単離する方法に関する。この方法は、ツバキ科（Theacea）植物を準備するステップを含む。次いでツバキ科（Theacea）植物は細胞汁および細胞壁構成成分に分けられる。細胞壁構成成分は生物活性画分を得るのに有効な条件下で処理される。次いで生物活性画分は処理された細胞壁構成成分から単離される。本発明はさらに、この方法によって生産される単離された生物活性画分に関する。
【００２２】
本発明は、従来の茶の加工方法の欠陥、特に、従来の茶の加工が広範囲の有効な生物活性組成物を保存することができないことに対処するのに有用である。本発明によって提供されるように、発酵および過剰な熱処理を行わない新鮮なツバキ属（Camellia）バイオマスの加工は、従来の茶の加工による製品よりも強力で多様な生物活性組成物を得ることができる。
【００２３】
本発明はまた、本発明による少なくとも１つの生物活性組成物を含む、飲料、治療用飲料、機能性飲料などに関する。一実施形態において、飲料、治療用飲料、機能性飲料などは、液体中に分散される少なくとも１つの生物活性組成物を含む。特定の実施形態において、液体は、水、ショットドリンク、機能性飲料、緑茶、ウーロン茶、紅茶、白茶、フレーバーティー、ソフトドリンク、コーヒー、ミルク、シェーキ、アルコール飲料、ノンアルコール飲料、スポーツドリンク、フルーツジュース、野菜ジュース、人工甘味料入りのジュース、発泡水、パンチ、サイダー、および栄養補助飲料からなる群から選択される。
【００２４】
本発明はまた、本発明による少なくとも１つの生物活性組成物を含む栄養補給製品に関する。
【００２５】
本発明はまた、本発明による少なくとも１つの生物活性組成物を含む機能性食品に関する。
【００２６】
本発明はまた、飲料を調製するためにツバキ科（Theacea）植物由来の少なくとも１つの生物活性組成物を液体中に分散させるための装置であって、半透膜を含む濾過ポーチまたはバッグ、および濾過ポーチまたはバッグ内に含有される少なくとも１つの本発明による生物活性組成物を含む、装置に関する。一実施形態において、液体は、水、ショットドリンク、機能性飲料、緑茶、ウーロン茶、紅茶、白茶、フレーバーティー、ソフトドリンク、コーヒー、ミルク、シェーキ、アルコール飲料、ノンアルコール飲料、スポーツドリンク、フルーツジュース、野菜ジュース、人工甘味料入りのジュース、発泡水、パンチ、サイダー、および栄養補助飲料からなる群から選択される。特定の実施形態において、飲料は治療用飲料である。
【００２７】
本発明はまた、飲料を調製する方法であって、本発明による装置を準備するステップ、装置の少なくとも１つの生物活性組成物を液体中に分散させるのに有効な条件下で装置を液体と接触させ、それにより少なくとも１つの生物活性組成物を含む飲料を得るステップを含む、方法に関する。一実施形態において、装置は、少なくとも１つの生物活性組成物の低分子量および還元された非酸化構成成分を液体中に分散させるのに有効な条件下で液体と接触される。種々の実施形態において、液体は、水、ショットドリンク、機能性飲料、緑茶、ウーロン茶、紅茶、白茶、フレーバーティー、ソフトドリンク、コーヒー、ミルク、シェーキ、アルコール飲料、ノンアルコール飲料、スポーツドリンク、フルーツジュース、野菜ジュース、人工甘味料入りのジュース、発泡水、パンチ、サイダー、および栄養補助飲料からなる群から選択される。特定の実施形態において、飲料は治療用飲料である。
【００２８】
本発明はまた、ツバキ科（Theacea）植物由来の少なくとも１つの生物活性組成物の全身または局所投与のための製剤であって、本発明による少なくとも１つの生物活性組成物を含む、溶液、懸濁液、分散液、ペースト、または乾燥粉末を含む、製剤に関する。一実施形態において、製剤は、機能性飲料を生産するために液体と混合する際に使用するための乾燥粉末を含む。別の実施形態において、製剤は、機能性飲料を生産するために液体と混合する際に使用するための少なくとも１つの生物活性組成物の濃縮溶液を含む。
【００２９】
本発明の種々の態様によれば、本明細書に提供される生物活性組成物は、対象（限定されないが、ヒトおよび動物を含む）によって使用するための任意の経口、全身、または局所適用のための、任意の液体、ゲル、ローション、食品などにおける成分として粉末、濃縮および／または液体形態で使用され得る。特定の実施形態において、生物活性画分は、アルコールカクテル、ノンアルコール飲料、および本明細書に記載されているかまたは意図されている任意の他の液体を含む、任意の熱いまたは冷たい飲料と組み合わせて使用されてもよい。さらに、種々の実施形態において、本発明の生物活性組成物は、限定されないが、茶系飲料、非茶系飲料、炭酸飲料、カフェイン系飲料、美容飲料、ビタミン水、ティーショット、健康飲料、ショット、スポーツドリンク、および本明細書に記載されているかまたは意図されている任意の他の液体を含む、任意の市販の飲料と組み合わせてもよい。本発明の生物活性画分はまた、対象（限定されないが、ヒトおよび哺乳動物を含む）の皮膚、髪、および爪を改善するのに使用するためのサプリメントとして使用されてもよい。本発明の生物活性画分はまた、栄養補給または他の食事サプリメントとして使用されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の生物活性組成物を調製するプロセスの一実施形態を示す模式図である。
【図２】細胞壁画分および従来の茶の抽出物（希釈１：１０００）のＵＶ／ＶＩＳスペクトルを示すグラフである。
【図３】ツバキ属（Camellia）生物活性組成物（希釈１：４０００）のＵＶ／ＶＩＳスペクトルを示すグラフである。
【図４】Ｖｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）に塗布した細胞壁画分および従来の茶の抽出物の吸光度スペクトルを示すグラフである。乾燥物質レベルは均一化している。
【図５】Ｖｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）に塗布したツバキ属（Camellia）生物活性組成物の吸光度スペクトルを示すグラフである。乾燥物質レベルは均一化している。
【図６】Ｖｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）に塗布したツバキ属（Camellia）生物活性組成物および白茶抽出物の吸光度スペクトルを示すグラフである。
【図７Ａ】希釈溶液（１：２００）中で、Ｖｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）に塗布したツバキ属（Camellia）膜画分抽出物の吸光度スペクトルを示すグラフである。
【図７Ｂ】希釈溶液（１：２００）中で、Ｖｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）に塗布したツバキ属（Camellia）細胞汁漿液の吸光度スペクトルを示すグラフである。
【図８Ａ】希釈溶液（１：２００）中で、Ｖｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）に塗布したオオムギ（Barley）（オオムギ（Hordeum vulgare））細胞汁漿液の吸光度スペクトルを示すグラフである。
【図８Ｂ】希釈溶液（１：２００）中で、Ｖｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）に塗布したセージ（サルビア（Salvia officinalis））細胞汁漿液の吸光度スペクトルを示すグラフである。
【図９】Ｖｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）に対する広域スペクトルＵＶ照射の効果を示すグラフである。
【図１０】Ｖｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）に塗布した白茶抽出物に対する広域スペクトルＵＶ照射の効果を示すグラフである。
【図１１】Ｖｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）に塗布した細胞壁画分抽出物に対する広域スペクトルＵＶ照射の効果を示すグラフである。
【図１２】Ｖｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）に塗布したツバキ属（Camellia）膜画分抽出物に対する広域スペクトルＵＶ照射の効果を示すグラフである。
【図１３】Ｖｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）に塗布したツバキ属（Camellia）細胞汁漿液に対する広域スペクトルＵＶ照射の効果を示すグラフである。
【図１４】２４時間および４８時間培養したＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞に対する白茶抽出物の効果を示すグラフである。
【図１５】２４時間（対照）ならびに５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βの存在下で２４時間および４８時間培養したＭＣＦ−７細胞に対する白茶抽出物の効果を示すグラフである。
【図１６】２４時間および４８時間培養したＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞に対する細胞壁画分抽出物の効果を示すグラフである。
【図１７】２４時間（対照）ならびに５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βの存在下で２４時間および４８時間培養したＭＣＦ−７細胞に対する細胞壁画分抽出物の効果を示すグラフである。
【図１８】２４時間および４８時間培養したＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞に対する膜画分抽出物の効果を示すグラフである。
【図１９】２４時間（対照）ならびに５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βの存在下で２４時間および４８時間培養したＭＣＦ−７細胞に対する膜画分抽出物の効果を示すグラフである。
【図２０】２４時間および４８時間培養したＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞に対する細胞汁漿液の効果を示すグラフである。
【図２１】２４時間（対照）ならびに５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βの存在下で２４時間および４８時間培養したＭＣＦ−７細胞に対する細胞汁漿液の効果を示すグラフである。
【図２２】２４および４８時間培養したＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞に対する白茶抽出物の効果を示すグラフである。
【図２３】１０ｎＭのＰＭＡの存在下で２４時間および４８時間培養したＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞に対する白茶抽出物の効果を示すグラフである。
【図２４】２４時間および４８時間培養したＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞に対する細胞壁画分抽出物の効果を示すグラフである。
【図２５】１０ｎＭのＰＭＡの存在下で２４時間および４８時間培養したＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞に対する細胞壁画分抽出物の効果を示すグラフである。
【図２６】２４時間および４８時間培養したＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞に対する膜画分抽出物の効果を示すグラフである。
【図２７】１０ｎＭのＰＭＡの存在下で２４時間および４８時間培養したＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞に対する膜画分抽出物の効果を示すグラフである。
【図２８】２４時間および４８時間培養したＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞に対する細胞汁漿液の効果を示すグラフである。
【図２９】１０ｎＭのＰＭＡの存在下で２４時間および４８時間培養したＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞に対する細胞汁漿液の効果を示すグラフである。
【図３０】ＰＭＡ刺激したＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞によって分泌されたＭＭＰのレベルに対する白茶抽出物の効果を示すグラフである。
【図３１】ＰＭＡ刺激したＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞によって分泌されたＭＭＰのレベルに対する細胞壁画分抽出物の効果を示すグラフである。
【図３２】ＰＭＡ刺激したＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞によって分泌されたＭＭＰのレベルに対する膜画分抽出物の効果を示すグラフである。
【図３３】ＰＭＡ刺激したＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞によって分泌されたＭＭＰのレベルに対する細胞汁漿液の効果を示すグラフである。
【図３４】ツバキ属（Camellia）組成物の非存在下であるが、１０ｎＭのＰＭＡの非存在下（Ｕ）または存在下（Ｓ）で培養した細胞から回収した培養培地と共に、白茶抽出物に対するＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞の４８時間の曝露後に回収した培養培地のゼラチンザイモグラムである。
【図３５】ツバキ属（Camellia）組成物の非存在下であるが、１０ｎＭのＰＭＡの非存在下（Ｕ）または存在下（Ｓ）で培養した細胞から回収した培養培地と共に、細胞壁画分抽出物に対するＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞の４８時間の曝露後に回収した培養培地のゼラチンザイモグラムである。
【図３６】ツバキ属（Camellia）組成物の非存在下であるが、１０ｎＭのＰＭＡの非存在下（Ｕ）または存在下（Ｓ）で培養した細胞から回収した培養培地と共に、膜画分抽出物に対するＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞の４８時間の曝露後に回収した培養培地のゼラチンザイモグラムである。
【図３７】ツバキ属（Camellia）組成物の非存在下であるが、１０ｎＭのＰＭＡの非存在下（Ｕ）または存在下（Ｓ）で培養した細胞から回収した培養培地と共に、細胞汁漿液に対するＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞の４８時間の曝露後に回収した培養培地のゼラチンザイモグラムである。
【図３８】白茶抽出物（「ＷＴＥ」）中、ならびに本発明の細胞壁画分抽出物（「ＣＷＦＥ」）、膜画分抽出物（「ＭＦＥ」）、および細胞汁漿液（「ＣＪＳ」）中の種々のカテキンの含有量を比較した棒グラフである。
【図３９】Ｐｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）、紅茶および緑茶伝統的調製物のＥＬＳＤ絶対シグナル強度対保持時間を示すグラフである。
【図４０】Ｐｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）、紅茶および緑茶伝統的調製物のＥＬＳＤ相対シグナル強度対保持時間を示すグラフである。
【図４１】Ｐｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）のＬＣ−ＤＡＤ三次元クロマトグラムである。Ｘ軸：保持時間０〜１５分；Ｙ軸：波長２００〜４２０ｎｍ；Ｚ軸：強度０〜３４００。
【図４２】紅茶伝統的調製物のＬＣ−ＤＡＤ三次元クロマトグラムである。Ｘ軸：保持時間０〜１５分；Ｙ軸：波長２００〜４２０ｎｍ；Ｚ軸：強度０〜５８０。
【図４３】緑茶伝統的調製物のＬＣ−ＤＡＤ三次元クロマトグラムである。Ｘ軸：保持時間０〜１５分；Ｙ軸：波長２００〜４２０ｎｍ；Ｚ軸：強度０〜４８０。
【図４４】Ｐｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）、紅茶および緑茶伝統的調製物対市販の茶系飲料の相対ＯＲＡＣ活性を示す棒グラフである。Ｘ軸は、１とみなした最も低い活性の試験品（飲料Ｄ）に対する、相対ＯＲＡＣ活性（倍）である。
【図４５】ＯＲＡＣアッセイにおいて評価した、０．５％  Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳを有する美容液ジェルおよびＲｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳを有さない美容液ジェルベースの抗酸化活性を示す棒グラフである。これらの配合物は、それらの評価の前に２ヶ月間、室温および４５℃に維持した。これらの試験品の相対ＯＲＡＣ活性（％）を提示する。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は生物活性組成物に関する。一実施形態において、生物活性組成物は、ツバキ科（Theacea）植物に由来する単離された生物活性画分を含む。本明細書に使用される場合、「単離された生物活性画分」という用語は、いかなる従来の茶の加工（例えば、熱処理、酸化、発酵、乾燥）も受けていないツバキ科（Theacea）植物（例えば、ツバキ科（Theacea）植物の新鮮なバイオマス）から単離される画分を含むことを意味する。好適な単離された生物活性画分には、限定されないが、細胞壁画分、細胞壁画分抽出物、膜画分、膜画分抽出物、細胞質画分、細胞質画分抽出物、細胞汁漿液、および／またはそれらの組合せが含まれ得る。
【００３２】
本発明の生物活性組成物および生物活性画分は、以下に定義され、当該分野において周知の従来のカテキン診断法を使用して判定されているように、種々のカテキンプロファイルおよび総カテキン含有量を有することができる。本明細書に使用される場合、「カテキン」という用語は一般に、限定されないが、以下の特定の種類のカテキン：（ｉ）（−）−エピガロカテキン（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、ＣＡＳ番号９７０−７４−１を参照のこと）；（ｉｉ）（＋）−カテキン（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、ＣＡＳ番号７２９５−８５−４を参照のこと）；（ｉｉｉ）（−）−エピカテキン（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、ＣＡＳ番号４９０−４６−０を参照のこと）；（ｉｖ）（−）−没食子酸エピガロカテキン（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、ＣＡＳ番号９８９−５１−５を参照のこと）；（ｖ）（−）−没食子酸ガロカテキン（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、ＣＡＳ番号４２３３−９６−９を参照のこと）；および（ｖｉ）（−）−没食子酸エピカテキン（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、ＣＡＳ番号１２５７−０８−５を参照のこと）を含む、すべてのカテキンを指す。「総カテキン含有量」（本明細書に使用される場合）とは、本発明の特定の生物活性組成物または生物活性画分中に含有されるすべてのカテキンの合わせた含有量レベルを指し、単に本明細書上記に挙げられている特定の種類のカテキンの含有量レベルに限定することを意図していない。本明細書に使用される場合、「カテキン含有量プロファイル」という用語は、本発明の特定の生物活性組成物または生物活性画分中に含有される選択されたカテキンの量を表すために使用される。
【００３３】
本発明の生物活性組成物の一実施形態において、生物活性画分は細胞壁画分であり得る。
【００３４】
本発明の生物活性組成物の一実施形態において、生物活性画分は細胞壁画分抽出物であり得る。本発明の特定の実施形態において、細胞壁画分抽出物は、乾燥物質１グラム当たり約２．１から約４．５ミリグラムの間、特に乾燥物質１グラム当たり約２．６から約４．０ミリグラムの間、より特に乾燥物質１グラム当たり約３．０から約３．６ミリグラムの間の総カテキン含有量を有することができる。別の特定の実施形態において、細胞壁画分抽出物は、以下：（ｉ）細胞壁画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約２．０から約３．０ミリグラムの間の（＋）−カテキン；（ｉｉ）細胞壁画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約０．００５から約０．０２ミリグラムの間の（−）−エピカテキン；（ｉｉｉ）細胞壁画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約０．００５から約０．０２ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピガロカテキン；および（ｉｖ）細胞壁画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約０．００３から約０．０１ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピカテキンのようなカテキン含有量プロファイルを有することができる。より特には、細胞壁画分抽出物は、以下：細胞壁画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約２．２から約２．７ミリグラムの間の（＋）−カテキン；（ｉｉ）細胞壁画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約０．０１から約０．０１５ミリグラムの間の（−）−エピカテキン；（ｉｉｉ）細胞壁画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約０．０１から約０．０１５ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピガロカテキン；および（ｉｖ）細胞壁画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約０．００５から約０．００７ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピカテキンのようなカテキン含有量プロファイルを有することができる。
【００３５】
本発明の生物活性組成物の一実施形態において、生物活性画分は膜画分であり得る。
【００３６】
本発明の生物活性組成物の一実施形態において、生物活性画分は膜画分抽出物であり得る。本発明の特定の実施形態において、膜画分抽出物は、乾燥物質１グラム当たり約１５．０から約３０．５ミリグラムの間、特に乾燥物質１グラム当たり約１８．０から約２７．５ミリグラムの間、より特に乾燥物質１グラム当たり約２１．０から約２４．５ミリグラムの間の総カテキン含有量を有することができる。別の特定の実施形態において、膜画分抽出物は、以下：（ｉ）膜画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約１．７から約３．３ミリグラムの間の（−）−エピガロカテキン；（ｉｉ）膜画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約６．１から約１０．２ミリグラムの間の（＋）−カテキン；（ｉｉｉ）膜画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約０．３から約１．１ミリグラムの間の（−）−エピカテキン；（ｉｖ）膜画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約６．２から約１２．５ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピガロカテキン；（ｖ）膜画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約０．００７から約０．０３ミリグラムの間の（−）−没食子酸ガロカテキン；および（ｖｉ）膜画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約１．３から約３．３ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピカテキンのようなカテキン含有量プロファイルを有することができる。より特には、膜画分抽出物は、以下：（ｉ）膜画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約２．０から約３．０ミリグラムの間の（−）−エピガロカテキン；（ｉｉ）膜画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約７．０から約９．０ミリグラムの間の（＋）−カテキン；（ｉｉｉ）膜画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約０．５から約０．９ミリグラムの間の（−）−エピカテキン；（ｉｖ）膜画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約８．０から約１０．０ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピガロカテキン；（ｖ）膜画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約０．０１から約０．０２ミリグラムの間の（−）−没食子酸ガロカテキン；および（ｖｉ）膜画分抽出物の乾燥物質１グラム当たり約１．８から約２．８ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピカテキンのようなカテキン含有量プロファイルを有することができる。
【００３７】
本発明の生物活性組成物の一実施形態において、生物活性画分は細胞質画分であり得る。
【００３８】
本発明の生物活性組成物の一実施形態において、生物活性画分は細胞質画分抽出物であり得る。
【００３９】
本発明の生物活性組成物の一実施形態において、生物活性画分は細胞汁漿液であり得る。特定の実施形態において、細胞汁漿液は、乾燥物質１グラム当たり約８．０から約２０．０ミリグラムの間、特に乾燥物質１グラム当たり約１０．０から約１８．０ミリグラムの間、より特に乾燥物質１グラム当たり約１２．０から約１６．０ミリグラムの間の総カテキン含有量を有することができる。別の特定の実施形態において、細胞汁漿液は、以下：（ｉ）細胞汁漿液の乾燥物質１グラム当たり約２．１から約４．４ミリグラムの間の（−）−エピガロカテキン；（ｉｉ）細胞汁漿液の乾燥物質１グラム当たり約４．２から約８．６ミリグラムの間の（＋）−カテキン；（ｉｉｉ）細胞汁漿液の乾燥物質１グラム当たり約０．２から約２．０ミリグラムの間の（−）−エピカテキン；（ｉｖ）細胞汁漿液の乾燥物質１グラム当たり約１．２から約３．２ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピガロカテキン；（ｖ）細胞汁漿液の乾燥物質１グラム当たり約０．０１から約０．１ミリグラムの間の（−）−没食子酸ガロカテキン；および（ｖｉ）細胞汁漿液の乾燥物質１グラム当たり約０．２から約１．３ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピカテキンのようなカテキン含有量プロファイルを有することができる。より特には、細胞汁漿液は、以下：（ｉ）細胞汁漿液の乾燥物質１グラム当たり約３．０から約３．５ミリグラムの間の（−）−エピガロカテキン；（ｉｉ）細胞汁漿液の乾燥物質１グラム当たり約５．０から約７．０ミリグラムの間の（＋）−カテキン；（ｉｉｉ）細胞汁漿液の乾燥物質１グラム当たり約０．７から約１．５ミリグラムの間の（−）−エピカテキン；（ｉｖ）細胞汁漿液の乾燥物質１グラム当たり約１．７から約２．７ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピガロカテキン；（ｖ）細胞汁漿液の乾燥物質１グラム当たり約０．０３から約０．０７ミリグラムの間の（−）−没食子酸ガロカテキン；および（ｖｉ）細胞汁漿液の乾燥物質１グラム当たり約０．５から約１．０ミリグラムの間の（−）−没食子酸エピカテキンのようなカテキン含有量プロファイルを有することができる。
【００４０】
一実施形態において、ツバキ科（Theacea）植物の新鮮なバイオマスは、本発明の生物活性組成物を単離するために使用され得る。新鮮なバイオマスは、ツバキ属（Camellia）および／またはヒサカキ属（Eurya）であるツバキ科（Theacea）植物から得られ得る。本発明に使用するためのツバキ属（Camellia）の好適な種には、限定されないが、チャノキ（Camellia sinensis）、ヤブツバキ（Camellia japonica）、トウツバキ（Camellia reticulate）、およびサザンカ（Camellia sasanqua）が含まれ得る。本発明に使用するためのヒサカキ属（Eurya）の好適な種には、限定されないが、エウリア・サンドウィチエンシス（Eurya sandwicensis）が含まれ得る。
【００４１】
本発明の生物活性組成物は安定剤をさらに含むことができる。好適な安定剤は当該分野において一般に使用されているものである。特に好適な安定剤には、限定されないが、乳化剤、防腐剤、酸化防止剤、ポリマーマトリクス、および／またはそれらの混合物が含まれ得る。
【００４２】
本発明の一態様において、生物活性画分は少なくとも１つの哺乳動物細胞画分において調節活性を有することができる。このような調節活性には、例えば、細胞成長阻害活性、細胞成長刺激活性、酵素分泌活性、酵素阻害活性、抗酸化活性、ＵＶ保護活性、抗炎症活性、創傷治癒活性、および／またはそれらの活性の組合せが含まれ得る。細胞成長阻害活性に関して、このような活性はがん細胞の成長阻害に関与し得る。本発明の生物活性画分によって成長することを阻害され得る好適ながん細胞には、限定されないが、乳がん細胞および／または結腸がん細胞が含まれ得る。記載されている細胞成長阻害活性はまた、白血病細胞の成長阻害も含むことができる。本発明の生物活性画分によって成長することを阻害され得る好適な白血病細胞には、限定されないが、単球性白血病細胞が含まれ得る。
【００４３】
別の実施形態において、生物活性組成物は、皮膚細胞の望ましくない過剰増殖または増殖低下（hypo-proliferation）を阻害し、かつ／または皮膚細胞における望ましくない非協調性酵素活性もしくは酵素分泌プロセスを阻害する際に有効であり得る。
【００４４】
別の実施形態において、本発明の生物活性組成物は、当該分野において一般に使用される全身または局所投与のための送達系をさらに含むことができる。
【００４５】
本発明はまた、哺乳動物への局所適用に適した生物活性局所製剤に関する。一実施形態において、生物活性局所製剤は、局所的に有効な量の本発明の生物活性組成物を含む。生物活性局所製剤は、局所的に許容される担体をさらに含むことができる。好適な局所的に許容される担体には、限定されないが、親水性クリーム基剤、親水性ローション基剤、親水性界面活性剤基剤、親水性ゲル基剤、親水性溶液基剤、疎水性クリーム基剤、疎水性ローション基剤、疎水性界面活性剤基剤、疎水性ゲル基剤、および／または疎水性溶液基剤が含まれ得る。一実施形態において、生物活性組成物は、生物活性局所製剤の総重量の約０．００１パーセントから約９０パーセントの間の範囲の量で存在することができる。
【００４６】
本発明はまた、哺乳動物の皮膚組織における炎症活性を阻害する方法に関する。この方法は、本発明による生物活性組成物を準備するステップを含む。その方法は、皮膚組織における炎症活性を阻害するのに有効な量で生物活性組成物を皮膚組織に塗布するステップをさらに含む。この方法の一実施形態において、生物活性組成物は、安定剤（その好適な例は本明細書に記載されている）をさらに含むことができる。この方法の別の実施形態において、生物活性組成物は、局所的に許容される担体（その好適な例は本明細書に記載されている）をさらに含むことができる。
【００４７】
本発明はまた、紫外線により誘発される損傷から哺乳動物の皮膚組織を保護する方法に関する。この方法は、本発明の生物活性組成物を準備するステップを含む。その方法は、皮膚組織の紫外線により誘発される損傷を減少させ、皮膚組織の酸化的損傷を阻止するのに有効な量で皮膚組織に生物活性組成物を塗布するステップをさらに含む。一実施形態において、その方法は、約３２０から約４００ナノメートルの間の範囲の紫外線によって引き起こされる、紫外線により誘発される損傷から皮膚組織を保護するのに有用である。この方法の別の実施形態において、生物活性組成物は、安定剤（その好適な例は本明細書に記載されている）をさらに含むことができる。この方法の別の実施形態において、生物活性組成物は、局所的に許容される担体（その好適な例は本明細書に記載されている）をさらに含むことができる。
【００４８】
本発明はまた、哺乳動物の皮膚組織における皮膚障害を正常化する方法に関する。この方法は、本発明の生物活性組成物を準備するステップを含む。その方法は、皮膚組織における細胞傷害を正常化するのに有効な量で生物活性組成物を皮膚組織に塗布するステップをさらに含む。この方法の一実施形態において、生物活性組成物は、安定剤（その好適な例は本明細書に記載されている）をさらに含むことができる。この方法の別の実施形態において、生物活性組成物は、局所的に許容される担体（その好適な例は本明細書に記載されている）をさらに含むことができる。
【００４９】
本発明はまた、ツバキ科（Theacea）植物の細胞汁に由来する生物活性画分を単離する方法に関する。この方法は、ツバキ科（Theacea）植物（例えば、新鮮なバイオマスの形態で）を準備するステップを含む。この方法に使用するための好適なツバキ科（Theacea）植物は本明細書上記に記載されている。次いでツバキ科（Theacea）植物（例えば、新鮮なバイオマス）は細胞汁および細胞壁構成成分に分けられる。次いで細胞汁は生物活性画分を得るのに有効な条件下で処理される。好適な生物活性画分には、限定されないが、膜画分、膜画分抽出物、細胞質画分、細胞質画分抽出物、および／または細胞汁漿液が含まれる。次いで生物活性画分は処理した細胞汁から単離される。一実施形態において、この方法によって生産される種々の好適な生物活性画分は本明細書に記載されている通りである。本発明はさらに、この方法によって生産される単離された生物活性組成物に関する。
【００５０】
本発明はまた、ツバキ科（Theacea）植物の細胞壁構成成分に由来する生物活性画分を単離する方法に関する。この方法は、ツバキ科（Theacea）植物（例えば、新鮮なバイオマスの形態で）を準備するステップを含む。次いでツバキ科（Theacea）植物（例えば、新鮮なバイオマス）は細胞汁および細胞壁構成成分に分けられる。細胞壁構成成分は生物活性画分を得るのに有効な条件下で処理される。次いで生物活性画分は処理した細胞壁構成成分から単離される。一実施形態において、この方法によって生産される種々の好適な生物活性画分は本明細書に記載されている通りである。本発明はさらに、この方法によって生産される単離された生物活性画分に関する。
【００５１】
例として、（本明細書上記に記載されている）本発明の生物活性画分を調製するための全体のプロセスが図１に模式的に示される。加工ステップの詳細は実施例（以下）にさらに記載される。図１に示されるように、ツバキ科（Theacea）植物の新鮮なバイオマス１０（例えば、新鮮な植物バイオマス）は、剛性細胞壁を破壊し、それにより植物細胞汁３０および細胞壁３２を得るのに有効な条件下で、破砕、離解、および圧搾２０に供される。新鮮なバイオマス１０はまた、比較試験および評価のための陽性対照１５０を生産するために、従来の茶の加工２２のために使用される。細胞汁３０は、新鮮な植物バイオマス１０の膜画分構成成分の定量的凝固を達成するために凝固４０（例えば、マイクロ波処理）に供される。凝固４０は、細胞汁３０の他の凝固していない構成成分から、凝固した膜画分の後の分離を可能にするのに十分である。図１に示されるように、このような分離の一実施形態は、クロロフィルおよびリン脂質などの特定の葉緑体膜構成成分を含まない、膜画分（沈殿）５０および上清６０を得るために、冷却および遠心分離４２によって達成される。
【００５２】
細胞壁画分抽出物（すなわち、組成物Ａ  １１０）を生産するために、細胞壁３２は乾燥３４（例えば、数回の後のマイクロ波処理）および次いで従来の茶を調製するために一般に使用される条件下で、乾燥した材料と水との混合３６（例えば、８５℃での水中での混合）に供される。
【００５３】
膜画分抽出物（すなわち、組成物Ｂ  １２０）を生産するために、膜画分５０は、溶媒との混合５２ならびに次いで上清５６および組成物Ｂ  １２０を得るために遠心分離５４に供される。
【００５４】
細胞質画分抽出物（すなわち、組成物Ｃ  １３０）を生産するために、上清６０は、大部分の可溶性細胞質タンパク質を含有する細胞質画分（沈殿）７０を得るために凝固６２（例えば、等電沈殿）および遠心分離６４に供される。次いで細胞質画分（沈殿）７０は、上清７６および次いで組成物Ｃ  １３０を得るために溶媒との混合７２、続いて遠心分離７４に供される。
【００５５】
細胞汁漿液（すなわち、組成物Ｄ  １４０）を生産するために、上清６０は、細胞汁漿液（上清）６６および次いで組成物Ｄ  １４０を得るために凝固６２（例えば、等電沈殿）および遠心分離６４に供される。
【００５６】
新鮮なバイオマス１０の従来の茶の加工２２は、例えば、（例えば、白茶、緑茶、ウーロン茶および紅茶を含む、さまざまな茶の）陽性対照１５０を生産するために使用される。
【００５７】
次いで組成物Ａ  １１０、組成物Ｂ  １２０、組成物Ｃ  １３０、組成物Ｄ  １４０、および陽性対照１５０は濾過および試験８０のために使用され得る。
【００５８】
本発明はまた、生物活性組成物の低分子量および還元された非酸化構成成分を液体中に選択的に分散させるための装置に関する。一実施形態において、装置は本発明の生物活性組成物を含む。生物活性組成物は濾過ポーチに含まれてもよい。好適な濾過ポーチは、生物活性組成物の低分子量および還元された非酸化構成成分を液体中に選択的に分散させるのに有効なものであり得る。一実施形態において、ポーチは、ポーチ内から液体中への生物活性組成物の低分子量および還元された非酸化構成成分の分散を可能にする選択膜を含むが、その膜は、ポーチ内から液体中への高分子量および酸化構成成分の分散を阻害する。本明細書に使用される場合、「低分子量および還元された非酸化構成成分」という用語は、約５，０００ダルトン以下である本発明の生物活性組成物の構成成分を含む。この方法の一実施形態において、生物活性組成物は、安定剤（その好適な例は本明細書に記載されている通りである）をさらに含むことができる。この方法の別の実施形態において、生物活性組成物は、局所的に許容される担体（その好適な例は本明細書に記載されている通りである）をさらに含むことができる。
【００５９】
本発明はまた、低分子量および還元された非酸化生物活性組成物を含有する治療用飲料を作製する方法に関する。この方法は、本発明の方法に従って生産される装置を準備するステップを含む。装置は、生物活性組成物の低分子量および還元された非酸化構成成分を液体中に分散させるのに有効な条件下で液体と接触する。この方法の一実施形態において、生物活性組成物は、安定剤（その好適な例は本明細書に記載されている）をさらに含むことができる。この方法の別の実施形態において、生物活性組成物は、局所的に許容される担体（その好適な例は本明細書に記載されている）をさらに含むことができる。この方法に使用するための好適な液体には、限定されないが、水が含まれ得る。水は熱くても、冷たくてもよい。本発明はさらに、この方法に従って生産される治療用飲料に関連する。
【実施例】
【００６０】
［実施例１］
チャノキ（Camellia sinensis）植物に由来する生物活性組成物の調製
本発明の生物活性組成物を調製する方法の一実施形態の模式図を図１に示す。以下は、本発明の方法の一実施形態の関連する態様の記載である。
【００６１】
バイオマス調製。十分な量の新鮮ツバキ属（Camellia）（チャノキ（Camellia sinensis））植物バイオマス（芽を含む、最上部の柔らかい若葉組織のみ）をおよそ１００ｋｇの乾燥物質を得るために収集した。新鮮バイオマス中の乾燥物質レベルは２１．７０％であると算出され、乾燥物質１００ｋｇを得るためにおよそ４６１ｋｇの新鮮植物バイオマスの収集を必要とする。植物バイオマスの本来の水分含量を保存し、水分を失って萎れることを回避するために注意した。収集は、フェノールオキシダーゼおよびペルオキシダーゼによって触媒される内在性酵素反応を引き起こす、葉細胞構造の破壊を回避するために回収したバイオマスを刻む、すりつぶすおよび砕くことを回避するまたは最少にするためのやり方で実施した。これらの反応が酸化時間で強化されることから、すべてのステップは可能な限り短い時間で完了させた。例えば、収集したバイオマスは切ってから１０分間未満で処理のために送達した。これは、日光、高温および他の否定的な環境要因への植物バイオマスの曝露を最少化するために行った。洗浄ステップは、さらなる処理の前に土壌粒子および他のデブリを植物から除去するために実行した。この洗浄は、収集した植物を≦５分間、水圧≦１ｋｇ／ｃｍ２で洗浄することによって達成した。残りの水洗浄はいかなる緑または茶色の色素も含有せず、適切な水圧および洗浄時間を示している。過剰な水を洗浄した植物バイオマスから除去した。
【００６２】
植物バイオマスの破砕（Grinding）、離解（Maceration）および圧搾（Pressing）。植物バイオマスを収集、回収および洗浄後、次いで植物を、細胞内内容物（すなわち、植物細胞汁）を抽出するためおよびそれを繊維に富む細胞壁画分（細胞壁画分）から分離するために破砕、離解および圧搾した。１０ＨＰエンジンおよびふるい一式を備えるハンマーミル（Ｍｏｄｅｌ  ＶＳ  ３５、Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｆｌａ．）を最短の時間で、バイオマス温度の顕著な上昇を伴わずに適切に小さなサイズの植物組織粒子を得るためにバイオマスを破砕するために使用した。ハンマーミルを、≦１０秒間の処置で離解植物粒子の最大サイズ≦０．５センチメートルを産生するように設定した。バイオマス温度は≦５℃だけ上昇した。水平連続スクリュープレス（Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｐｒｅｓｓ「ＣＰ−６」、Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｆｌａ．）を植物から植物細胞汁を抽出するために直ちに使用した。スクリュープレスのコーンでの圧力を２４ｋｇ／ｃｍ２のレベル、スクリュー速度１２ｒｐｍおよび温度上昇≦５℃だけに維持した。この処置は、乾燥物質レベル４１．３９％を有する細胞壁画分１８５ｋｇおよび乾燥物質レベル８．４９％を有する植物細胞汁２７６ｋｇをもたらした。
【００６３】
細胞壁画分抽出物（組成物Ａ）の調製。初期乾燥物質レベル４１．３９％を有する細胞壁画分のアリコートをマイクロ波フードコンビネーション（Ｍｏｄｅｌ  ＧＨ９１１５ＸＥ、Ｗｈｉｒｌｐｏｏｌ）で３０秒間乾燥させ、次いで３０秒間冷ました。この処置を細胞壁画分における乾燥物質レベルが９６．５２％に達するまで数回反復した。温度８５℃の脱イオン水６６．０ｌを乾燥細胞壁画分４．０ｋｇに加え、高撹拌で５分間撹拌した。これらの条件は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるD'Amelio, F. S., Botanicals. A Phytocosmetic Desk Reference, Boca Raton, London, New York, Washington, D.C.: CRC Press, p. 361 (1999)に記載されている茶調製手順と一致する（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるwww.leaftea.com、www.divinitea.com、www.equatorcoffee.comにおける考察も参照のこと）。混合物を４層のナイロン布を通して濾過し、次いで０．８μｍ多孔性を有するフィルターを通した。得られた細胞壁抽出物のｐＨは５．２４に等しく、乾燥物質レベルは０．８４％に等しかった。この抽出物をその活性の試験のためにさらに使用した。
【００６４】
細胞汁からの膜画分の分離。乾燥物質レベル８．４９％を有する初期植物細胞汁は小さな繊維粒子を含有し、４層のナイロン布を通す濾過によって、または低速遠心分離バイオマスを使用することによって除去した。濾過した植物細胞汁を温度プローブ制御を使用してマイクロ波処置に曝露した。この処置は、細胞汁の温度が６０℃に達するまで継続した。凝固が誘導されたら、処置した細胞汁を４０℃に直ちに冷やした。凝固した細胞汁からの膜画分の分離は、３，０００ｇ以上、２０分間以上での遠心分離を使用することによって達成した。これは、膜画分（沈殿）ならびに細胞質画分および細胞漿液画分（すなわち、低分子量可溶性構成成分）を含有する細胞汁上清を生じた。乾燥物質レベル３２．８９％を有する膜画分を、膜由来生物活性組成物の抽出物を調製するために使用した。細胞汁上清を細胞質画分および細胞汁漿液を得るためのさらなる処理に使用した。
【００６５】
膜画分抽出物（組成物Ｂ）の調製。膜画分の１パート（１０．０ｋｇ）およびジメチルスルホキシドの２パート−（２０．０ｋｇ）を継続的に撹拌しながら室温、１時間混合した。次いで材料を４，０００ｇ以上で４５分間以上遠心分離した。沈殿物を処分し、上清を０．８μｍ多孔性を有するフィルターを通して濾過した。乾燥物質レベル６．８３％を有するこの濾過物−膜画分抽出物（組成物Ｂ）をその活性のさらなる試験のために使用した。
【００６６】
細胞汁上清からの細胞質画分の分離。細胞質画分を分離除去するために、細胞汁上清を等電点沈殿に供した。細胞質画分の沈殿は、細胞汁上清のｐＨを４．０にするために５．０Ｎ塩酸（ＨＣｌ）を利用する滴定法を使用して誘導した。乾燥物質レベル１４．５％を有する沈殿した細胞質画分の上清からの分離を３，０００ｇ以上、２０分間以上での遠心分離によって達成した。
【００６７】
細胞質画分（組成物Ｃ）の抽出物の調製。細胞質画分の１パート（１０．０ｋｇ）およびジメチルスルホキシドの２パート−（２０．０ｋｇ）を継続的に撹拌しながら室温で１時間混合した。次いで材料を４，０００ｇ以上で４５分間以上遠心分離した。沈殿物を処分し、上清を０．８μｍ多孔性を有するフィルターを通して濾過した。乾燥物質レベル３．５０％を有するこの濾過物−細胞質画分の抽出物（組成物Ｃ）をその活性のさらなる試験のために使用することができる。
【００６８】
細胞汁漿液（組成物Ｄ）の調製。細胞質画分の分離後、上清は懸濁された粒子を含有した。これらの粒子を分離除去するために、上清を７，５００ｇ以上で３０分間以上遠心分離した。透明な上清−細胞汁漿液を０．８μｍ多孔性を有するフィルターを通して濾過した。乾燥物質レベル５．６９％を有するこの濾過物（組成物Ｄ）をその活性のさらなる試験のために使用した。
【００６９】
従来の茶抽出物の調製−対照。組成物Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの調製のために使用した新鮮ツバキ属（Camellia）葉の同じロットを従来の白茶および紅茶を産生するために使用した。
【００７０】
次の手順を白茶を産生するために使用した。２１．７０％乾燥物質を含有する新鮮バイオマスを内在性酵素−フェノールオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを不活性化するために２０秒間、沸騰水に置いた。この手順の際に葉をナイロンスクリーンバッグ中に保持した。次いで処置した葉をマイクロ波で、３０秒間乾燥させ、次いで３０秒間冷やした。この処置をバイオマス中の乾燥物質レベルが９３．７４％に達するまで数回反復した。次いで温度８５℃の脱イオン水６６．０ｌを乾燥葉４．０ｋｇに加え、高撹拌で５分間撹拌した。これらの条件は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるD'Amelio, F. S., Botanicals. A Phytocosmetic Desk Reference, Boca Raton, London, New York, Washington, D.C.: CRC Press, p. 361 (1999)に記載されている茶調製手順と一致する（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、www.leaftea.com、www.divinitea.comおよびwww.equatorcoffee.comにおける考察も参照のこと）。混合物を４層のナイロン布を通して濾過し、０．８μｍ多孔性を有するフィルターで濾過した。得られた細胞壁画分抽出物のｐＨは５．５２に等しく、乾燥物質レベルは１．１０％に等しかった。この抽出物をその活性の試験のためにさらに使用した。
【００７１】
次の手順を紅茶を産生するために使用した。２１．７０％乾燥物質を含有する新鮮バイオマスを乾燥物質レベルが３５％に達するまで周期的な（１時間「オン」および１時間「オフ」）通気を伴って２５℃に保った。次いで葉をサイズ２〜３ｍｍを有する粒子に破砕した（砕いた）。この手順は、バイオマス温度のおよそ３０℃への上昇を導く。破砕したバイオマスを９０分間、２５℃での発酵（酸化）のために層（高さ２インチ）の形態のプラスチックコンベアベルトに置いた。茶色（ｂｒｏｗｎ）になった発酵したバイオマスを、１３０℃で３０分間、乾燥物質レベル９７．５％に達するように乾燥させた。次いで温度８５℃の脱イオン水６６．０ｌを乾燥葉４．０ｋｇに加え、高撹拌で５分間撹拌した。これらの条件は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるD'Amelio, F. S., Botanicals. A Phytocosmetic Desk Reference, Boca Raton, London, New York, Washington, D.C.: CRC Press, p. 361 (1999)に記載されている茶調製手順と一致する（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるwww.leaftea.com、www.divinitea.com、www.equatorcoffee.comにおける考察も参照のこと）。混合物を４層のナイロン布を通して濾過し、０．８μｍ多孔性を有するフィルターで濾過した。得られた細胞壁画分抽出物のｐＨは４．９６に等しく、乾燥物質レベルは１．３８％に等しかった。この抽出物をその活性の試験のためにさらに使用した。
【００７２】
［実施例２］
チャノキ（Camellia sinensis）、ヤブツバキ（Camellia japonica）、トウツバキ（Camellia reticulate）、サザンカ（Camellia sasanqua）およびエウリア・サンドウィチエンシス（Eurya sandwicensis）由来の生物活性組成物の調製に関する乾燥物質の配分
生物活性組成物の産生の際に回収される種々の画分を分析し、乾燥物質の配分について比較した。表１は、茶植物の分画の産物中の乾燥物質１００ｋｇの配分を示す。本発明のプロセスが、初期バイオマス乾燥物質の約２０から３０％の範囲で、抽出された収量の植物細胞汁への変換を可能にすることを判定した。膜画分の乾燥物質の収量は、初期バイオマス乾燥物質の５％から１０％の範囲および細胞汁乾燥物質の２５％から３５％であった。表１は、細胞質画分乾燥物質の収量が初期バイオマス乾燥物質の１．０％を、次に細胞汁上清乾燥物質の２．５％を超えなかったことを示す。大部分の細胞汁上清乾燥物質は、細胞汁漿液に濃縮された。細胞壁画分、膜画分および細胞質画分を、生物活性組成物として分類されるそれらの抽出物の調製のための供給源として使用した。細胞汁漿液を外来性溶媒を含まない続く生物活性組成物として「そのまま」直接使用した。
【００７３】
【表１】
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【００７４】
３種の選択された材料が、新鮮植物組織に存在するすべての機能性構造の最も多様化した表示であることに留意されたい。可溶性細胞汁漿液だけが、一般に使用されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験系に直接投与できる物理化学的特性を有する。細胞壁画分、膜画分および細胞質画分は、溶媒での抽出のための原料として使用できた。細胞壁画分が従来の茶植物産物に構造的に類似していることから、この画分を従来の茶との最良の比較のために水で抽出した。膜画分を葉緑体およびミドコンドリア構造に組み込まれた疎水性および親水性構成成分の両方の有効な可溶化を促進するジメチルスルホキシドで抽出した。細胞質画分は水で抽出した。細胞汁漿液は「そのまま」使用した。
【００７５】
表２は、試験した４種すべての生物活性組成物の収量を示す：細胞壁画分抽出物（組成物Ａ）、膜画分抽出物（組成物Ｂ）、細胞質画分の抽出物（組成物Ｃ）、細胞汁漿液（組成物Ｄ）および対照−初期バイオマス乾燥物質１００ｋｇ由来の白茶抽出物または紅茶抽出物。
【００７６】
【表２】
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【００７７】
表２は、チャノキ（Camellia sinensis）の乾燥物質１００ｋｇ由来の生物活性組成物Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの総収量が、従来の茶のプロセスの収量−１５．１４．．．１９．３６％を顕著に超える３３．３％に等しかったことを示している。
【００７８】
［実施例３］
組成物Ａ（細胞壁画分抽出物）と従来の茶抽出物との比較
同じバッチの新鮮チャノキ（Camellia sinensis）から得られた生物活性組成物Ａならびに従来の白茶および紅茶抽出物の種々のパラメーターを測定し、次にこれらの結果を表３に示す（使用した実験方法は実施例９および２０ならびに、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３／０１７５２３５号に記載されている）。
【００７９】
【表３】
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【００８０】
表３は、細胞壁画分抽出物が従来の白茶および紅茶抽出物と比較して低レベルの乾燥物質、電解質および溶解固体を有することを示している。ＵＶ／ＶＩＳスペクトルデータは、細胞壁画分抽出物がスペクトル曲線下面積の最も高い具体的な値を有する、すなわちこの具体的なツバキ属（Camellia）産物（組成物Ａ）が乾燥物質単位あたり最も高いレベルの光学活性構成要素を有することを示している。追加的に細胞壁画分抽出物は、より低い酸化還元電位を有し、この組成物が従来の白茶および紅茶抽出物よりも酸化されていないことを示している。細胞壁画分抽出物は、スーパーオキシド除去活性を実証し、白茶および紅茶抽出物よりもさらに低い濃度でチトクロムＣ還元の５０％阻害（ＩＣＲ５０）を生じた。質的記述的分析（「ＱＤＡ」）試験法を、茶飲料の受容性を決定する色、風味および口当たりに基づいて茶を体系的に特徴付け、定量するために選択した。ＱＤＡ法は、所与の参考基準と比較して茶飲料の上記性状を定量するために熟練の試食者の訓練された一団を用いる。茶の色、風味および口当たりの比較評価は、細胞壁画分抽出物が従来の茶の同じ特徴を顕著に超えることを実証した。
【００８１】
したがって、いかなる発酵（酸化）および加熱処置も伴わない新鮮ツバキ属（Camellia）バイオマスから得られた細胞壁画分は、他のすべての茶とは異なっている（Wilson et al., eds., Tea: Cultivation to Consumption, London: Chapman Hall (1992)、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。追加的に、鍵となるツバキ属（Camellia）酵素（フェノールオキシダーゼおよびペルオキシダーゼ）は、従来の茶に常に保持されている。代わりに本発明は、これらの酵素によって豊富になる細胞壁画分および細胞汁への新鮮ツバキ属（Camellia）葉の分離を含み、それにより細胞壁画分は内在性フェノールオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを含有しない。したがって、細胞壁画分は、白茶、緑茶、ウーロン茶および紅茶と比較して基本的な差異を有する新しい茶類として分類されなければならない。この新規細胞壁画分茶は、広範囲のドリンク、飲料および栄養補給食品および機能性食品への添加物を調製するためにバッグに入れない（loose）もしくはバッグに入れた形態または他の形のいずれでも使用できる。
【００８２】
［実施例４］
さまざまな適用のための生物活性組成物の調製
すべての生物活性組成物は、全身または局所投与のための種々の製剤中に組み入れられる溶液、懸濁液、分散液、ペーストまたは乾燥粉末として使用できる。組成物の可溶化形態は、完全に可溶化されていない小粒子および内在性微生物を完全に除去するために０．２μｍ多孔性を有するフィルターを通して濾過できる。滅菌濾過前後の生物活性組成物中の乾燥物質レベルを表４に表す。
【００８３】
【表４】
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【００８４】
表４は、すべての生物活性組成物中の乾燥物質レベルが滅菌濾過後に減少したことを示す。しかしこの減少は、それらの生物学的活性のいかなる消失または顕著な低減を導かず、２〜１４％の範囲であった。したがって組成物の大部分は、可溶性生物活性成分によるものである。
【００８５】
新鮮ツバキ属（Camellia）葉は、比較的低分子量（還元、非酸化）の成分を含有する。従来の茶の製造における酸化およびポリマー化プロセスの結果として、上記の強力な成分は比較的低い活性を有する高分子量物質の部分に転換される。
【００８６】
本発明の生物活性組成物は、発酵（酸化）および過度の加熱処置を受けずに得られる。これは結果として新鮮植物活性の不可逆的消失を妨げ、例えば、新規ティーバッグまたは類似の送達系を使用して最大強度を有して送達できる。すべての可溶性茶成分が大きなポアを通じて周囲の水に移動できるようにする従来の紙のティーバッグの代わりに、新規ティーバッグは半透膜でできている。このバッグは、内部に生物活性組成物を含有し、特定の膜カットオフ（例えば、５，０００ダルトン）より低い分子量を有する成分だけを周囲の水相に浸透できるようにする。高い分子量を有する成分は、バッグの内部に残り、それにより飲料には含まれない。
【００８７】
したがって、特定のレベルを超える分子量を有する成分のカットオフは、生物活性組成物のすべての酸化成分が特定のレベルを超える分子量を有し、袋の内部に残ることから、酸化成分を含まない飲料の産生を可能にする。新規ティーバッグ設計は、ピラミッド形ティーバッグ構築に基づくことができ、透析膜チューブを利用する。新規ティーバッグの設計は、内部に生物活性組成物を有し、半透膜からできた２つの透明な表面を有する薄いプラスチックフレームを含むことができる。具体的な膜カットオフ値の選択は、生物活性組成物の種類によって決定されるが、一般に、組成物の乾燥物質のより高いパーセント、より低い酸化還元電位の周囲の水相への放出を可能にする高いカットオフは好ましい。
【００８８】
［実施例５］
細胞汁漿液に由来する局所成分ＳＦの調製
細胞汁漿液（組成物Ｄ）は、安定性の欠如ならびに色および匂いの変質のために局所産物の活性成分として使用できない。記載の手順は、安定で活性な局所成分ＳＦを得るための細胞汁漿液画分の改良を可能にする（この手順は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３／０１７５２３５号に既に記載のものに類似している）。細胞汁漿液の改良は、次のステップ：加熱処置、冷却、濾過および安定化を含む。改良は、実施例１に記載の細胞質画分からの細胞汁漿液の分離直後に実行した。細胞汁漿液を温度プローブ制御を使用するマイクロ波処置に曝露した。この処置は、細胞汁漿液の温度が９９℃に達するまで継続した（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３／０１７５２３５号に既に記載のとおり９０℃が必要であった）。凝固が誘導されたら、処置した細胞汁漿液を直ちに１０℃に冷やした。凝固した細胞汁漿液を多孔性０．８μｍを有するフィルターを通して真空濾過した（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．２フィルター二重層が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３／０１７５２３５号において使用された）。沈殿物を処分し、得られた細胞汁漿液濾過物をさらなる処理（すなわち、安定化）に使用した。細胞汁漿液濾過物の安定化は、防腐剤を添加し（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３／０１７５２３５号に既に記載のとおり、外来性抗酸化物は必要とされなかった）、完全な可溶化が達成されるまで混合物をインキュベートすることによって達成された。使用した防腐剤は、次の：０．１％ソルビン酸カリウム、０．１％安息香酸ナトリウム、０．１％メチルパラベンナトリウムおよび０．１％クエン酸を含んで使用された。この調製物は、局所成分ＳＦの乾燥物質収量１６．３ｋｇ（またはおよそ２８６リットル）の産物を生じ、その物理化学的および生物活性品質の特徴付けのために使用した。局所成分ＳＦについて推奨される保存条件は、光から保護される密閉容器で、温度１５℃から２５℃の間での保存を含む。
【００８９】
［実施例６］
細胞汁漿液画分に由来する局所成分ＳＦの産物特定
局所成分ＳＦを実施例５において上に記載のプロセスにより調製した。局所成分ＳＦの分析をその種々の物理化学的、微生物的、細胞傷害性および生物活性特徴を決定するために下に記載のとおり実施した。局所成分ＳＦは、淡黄色茶色で薄い特徴的な匂いを有する透明の液体である。溶媒（すなわちグリコール、油または水）は担体媒体に加えなかった。表５は、局所成分ＳＦの物理的および化学的データを要約する。
【００９０】
【表５】
2016513099.tif 000007
【００９１】
表６は局所成分ＳＦに関するＵＶスペクトルデータを記載する。
【００９２】
【表６】
2016513099.tif 000008
【００９３】
次の手順（ＵＳＰ＜６１＞）により実施した微生物分析は、局所成分ＳＦが試料１ｇあたり１００個未満のコロニー形成単位を含有し、病原体（大腸菌（E. coli）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、シュードモナス菌種（Pseudomonas sp.）および黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus））を含まないことを実証した。このデータは、局所成分ＳＦが局所産物の成分についての産業上の必要を満たすことを実証している。
【００９４】
局所成分ＳＦは、光から保護される密閉容器で、１５から２５℃の間の温度で保存された場合少なくとも１２〜１８ヶ月間安定である（すなわち、物理的および化学的完全性を維持している）ことが実証された。局所成分ＳＦは、生分解性産物である。管理された臨床評価において局所成分は、表７に要約される生物学的活性を実証した。
【００９５】
【表７】
2016513099.tif 000009
【００９６】
表７は、局所成分ＳＦがスーパーオキシド除去能力を実証したことを示す。管理された臨床評価において局所成分ＳＦは、１ｍｌあたり乾燥物質６９．５μｇの濃度でチトクロムＣ還元（ＩＣＲ５０）の５０％阻害を実証した。陽性対照（ロスマリン酸）のＩＣＲ５０＝２６．５μｇ／ｍｌ。抗酸化物質特性に加えて局所成分ＳＦは、ペプチドヒドロラーゼ、例えばエラスターゼ、ゼラチナーゼＢまたはいわゆるマトリクスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）およびトリプシンに対する抗タンパク質分解活性を実証した。これらの酵素において、特有の位置はエラスターゼおよびＭＭＰ−９に属し、相乗的に作用し、皮膚炎症において非常に重要な役割を演じる。ＭＭＰ−９およびエラスターゼの両方が白血球細球（好中球）によって分泌され、これらの酵素が炎症を導く最終経路における鍵となる酵素であることに留意されたい。調製物が両方の酵素（エラスターゼおよびＭＭＰ−９）を阻害できる場合、そのような調製物が炎症プロセスを処置するために非常に有効であると考えられることは一般に認められる。
【００９７】
皮膚加齢プロセス、日光皮膚炎、創傷および瘢痕の形成がＭＭＰ−９およびエラスターゼの両方が関与する全く同じ炎症機序を有することに留意されたい。したがって上の酵素の両方を阻害できる局所成分ＳＦは、非常に幅広い適用スペクトルを有しその中には次の理由で炎症性傷害がある：
ａ．これら２つの酵素はヒト組織の細胞外マトリクスのすべての構成成分を分解するために協同でき、
ｂ．エラスターゼはＭＭＰ−９に対する身体自体の抑制防御を不活性化でき、
ｃ．ＭＭＰ−９がエラスターゼに対する身体自体の抑制防御を不活性化できる。
局所成分ＳＦの抗炎症性と抗酸化物質特性の組合せは、生物活性組成物Ｄに基づくこの親水性調製物が非常に基本的な皮膚障害問題に全身性に作用できることを示唆する。
【００９８】
［実施例７］
膜画分に由来する局所成分ＭＦの調製
新鮮に得られた膜画分は、強い色および特異的な匂いを有するペーストである。この画分は、葉緑体によって主に表され、その組成物は主にリン脂質、膜タンパク質、クロロフィル、およびカロテノイドを含む。膜画分の乾燥は、局所成分としての膜画分の調査のために必要である多数の貴重な特性の不可逆的消失を生じる。乾燥させないと、不安定な膜画分は、強い非特徴的な匂いを有する暗色の非分散性不溶性の集合体にすぐに転換される。結果としてそのような材料は、局所成分として使用できない。下に記載の手順は、新鮮に得られた膜画分の安定で活性な局所成分への転換を可能にする（この手順は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３／０１７５２３５号に既に記載のものに類似している）。
【００９９】
実施例１において上に記載のプロセスによる細胞汁からの膜画分の分離の直後に、膜画分を安定化させ、ポリマーマトリクスに組み込んだ。局所成分ＭＦおよそ１００グラムを調製するために、細胞膜画分を非イオン性乳化剤ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）および抗酸化物質（Ｔｅｎｏｘ４）と混合することによって安定化させた。具体的には、新鮮膜画分２０グラムをＴｗｅｅｎ８０  ３．５グラムおよびＴｅｎｏｘ４（油中のブチル化ヒドロキシアニソールおよびブチル化ヒドロキシトルエンの溶液）０．１グラムと混合の際に通気を避けながら均一になるまで激しく混合した。
【０１００】
安定化したら膜画分をポリマーマトリクスに組み込んだ（すなわち、ポリマー性乳化剤の分散液、アクリル酸／Ｃ１０〜Ｃ３０アクリル酸クロスポリマー）。ポリマーマトリクスを温脱イオン水６９．２グラム中にペムレンＴＲ−２  ０．９グラムを分散させ、通気を避けながら穏やかな撹拌を使用して均一になるまで混合することによって調製した。並行してグリセリン５グラムおよびフェノニップ（フェノキシエタノール（および）メチルパラベン（および）ブチルパラベン（および）エチルパラベン（および）プロピルパラベンの混合物）１．０グラムを別の容器で組み合わせ、均一になるまで混合した。穏やかな撹拌で、フェノニップと共にペムレンおよびグリセリンを含有する相を組み合わせ、均一になるまで混合した。膜画分をポリマーマトリクスに組み込むために、膜画分、Ｔｗｅｅｎ８０およびＴｅｎｏｘ４を含有する相をペムレン、グリセリンおよびフェノニップを含有する相に加え、次いで通気を避けながら激しい撹拌で混合した。膜画分混合物の安定化は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の１８％水溶液で中和し、５．０±０．４のｐＨを有する均一な系を産生するよう激しく混合することによって達成した。新鮮ツバキ属（Camellia）バイオマス（２１．７％乾燥物質を有する新鮮葉およそ４６１ｋｇ）１００ｋｇから出発したこの調製物は、局所成分ＭＦの乾燥物質収量１１．８５ｋｇ（またはおよそ１７２リットル）の産生を生じ、その物理化学的および生物活性品質の特徴付けのために使用した。局所成分ＭＦについて推奨される保存条件は、光から保護される密閉容器での温度２から８℃の間での保存を含む。
【０１０１】
［実施例８］
膜画分に由来する局所成分ＭＦの産物特定
局所成分ＭＦを実施例７において上に記載のプロセスにより調製した。局所成分ＭＦの分析をその種々の物理化学的、微生物的、細胞傷害性および生物活性特徴を決定するために下に記載のとおり実施した。局所成分ＭＦは、緑茶色で薄い特徴的な匂いを有する不透明のゲルである。局所成分ＭＦを、最も高いレベルの純度均一性、適合性、安定性、安全性および有効性を保証するためにポリマーでゲル化した天然細胞汁構成要素を使用して製剤した。
【０１０２】
表８は、局所成分ＭＦの物理的および化学的データを記載する。
【０１０３】
【表８】
2016513099.tif 000010
【０１０４】
表９は、局所成分ＭＦに関するＬ＊ａ＊ｂ＊値データを要約する。
【０１０５】
【表９】
2016513099.tif 000011
【０１０６】
微生物分析は、局所成分ＭＦがＣＦＵおよび病原体の不在に関して局所成分についての産業上の必要を満たすことを実証した（ＵＳＰ＜６１＞）。
【０１０７】
局所成分ＭＦは、光から保護される密閉容器で、２から８℃の間の温度で保存された場合少なくとも１２〜１８ヶ月間安定である（すなわち、物理的および化学的完全性を維持している）ことが実証された。局所成分ＭＦは、生分解性産物である。管理された臨床評価において局所成分ＭＦは、エラスターゼ阻害活性およびトリプシン阻害活性を実証する。表１０は局所成分ＭＦについての特定の生物活性結果を要約している。
【０１０８】
【表１０】
2016513099.tif 000012
【０１０９】
表１０は、局所成分ＭＦが局所成分ＳＦに類似の特性を実証したことを示す（実施例６を参照のこと）。局所成分ＭＦはスーパーオキシド除去活性を有さないが、局所成分ＳＦよりも高い特異的酵素阻害活性を実証する。したがって生物活性組成物Ｂに基づく局所成分ＭＦは、皮膚障害の処置に対して幅広い適用を有する強力な多相性抗炎症性成分として考えられるべきである。
【０１１０】
［実施例９］
チャノキ（Camellia sinensis）植物に由来する生物活性組成物のスペクトル分析
スペクトル分析概論。紫外線（ＵＶ）照射は、ヒト皮膚への損傷効果を有する。短期効果は、日焼けおよび日光皮膚炎を含み、一方累積的ＵＶ曝露の長期効果は皮膚の光老化および皮膚がんの危険の増加を含む。紫外線皮膚傷害は、酸化損傷によって媒介され、抗酸化活性を有する多数の植物抽出物が保護薬剤としての将来性を示している：ブドウ種子抽出物（Carini et al., “Protective Effect of Procyanidines from Vitis vinifera Seeds on UV-Induced Photodamage: In vitro and In vivo Studies,” Proceedings of the 19th IFSCC Congress 3:55-63 (1996)、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、リコペン（Di Mascio et al., “Lycopene as the Most Efficient Biological Carotenoid Singlet Oxygen Quencher,”Archives of Biochemistry and Biophysics 274:532-8 (1989)、およびRibaya-Mercado et al., “Skin Lycopene is Destroyed Preferentially Over β-Carotene During Ultraviolet Irradiation in Humans,” Journal of Nutrition 125:1854-9 (1995)、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、シリマリン（Morazzoni et al., “Silybum marianum (Carduus marianus),” Fitoterapia 66:3-42 (1995)、Katiyar et al., “Protective Effects of Silymarin Against Photocarcinogenesis in a Mouse Skin Model,” Journal of the National Cancer Institute 89:556-66 (1997)、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）ならびに特に、他の植物供給源から産生された抽出物と比較して高い効能を有する緑茶抽出物（Katiyar et al., “Protection Against Ultraviolet-B Radiation-Induced Local and Systemic Suppression of Contact Hypersensitivity and Edema Responses in C3H/HeN Mice by Green Tea Polyphenols,” Photochemistry and Photobiology 62:855-61 (1995)、Ruch et al., “Prevention of Cytotoxicity and Inhibition of Intercellular Communication by Antioxidant Catechins Isolated from Chinese Green Tea,” Carcinogenesis 10:1003-8 (1989)、Wang et al., “Protection Against Ultraviolet B Radiation-Induced Photocarcinogenesis in Hairless Mice by Green Tea Polyphenols,” Carcinogenesis 12:1527-30 (1991)、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１１１】
茶植物（チャノキ（Camellia sinensis））の葉が、（−）−エピカテキン、（−）−エピカテキン−３−没食子酸、（−）−エピガロカテキンおよび（−）エピガロカテキン−３−没食子酸を含む抗酸化活性を有するポリフェノールの高い含有量を有することが見出された。緑茶抽出物は、過酸化水素およびスーパーオキシドラジカルに対する抗酸化活性および酸化性細胞傷害性の予防が示されている。抽出物は、細胞間情報伝達の阻害、腫瘍促進の可能性がある機構も予防できる。ＵＶ誘導免疫抑制と皮膚がんの発生との間には密接な関連があり、緑茶抽出物はＵＶ−Ｂ照射によって生じる炎症および免疫抑制に対する保護が見出されている。飲料水中で経口的に与えられるまたは局所的に適用される緑茶抽出物は、動物モデルにおいてＵＶ−Ｂ誘導皮膚発がんを保護する。これらの結果は、経口的に摂取された緑茶抽出物が皮膚がんを予防することを助ける可能性があることを示している。
【０１１２】
ツバキ属（Camellia）産物のＵＶ保護特性は確立されているが、日光損傷に対する皮膚の有効な保護のための供給源としての茶植物の大きな可能性は、限定的な比較的狭い範囲の活性成分：主にカテキンに限定されて注目が向けられている、従来の技術の限界のために完全には調査されていない。
【０１１３】
「新規」と「従来」のツバキ属（Camellia）産物間での本明細書に記載の比較ＵＶ保護特性研究は、「新鮮ツバキ属（Camellia）分画」の技術がさらに強力な産物を得ることができることをここで実証した。比較は、溶液のスペクトル特性およびｉｎ−ｖｉｔｒｏ日焼け止め指数（ＳＰＦ）を決定するために一般に使用される方法を利用して行った。
【０１１４】
方法Ａ：ＵＶ／ＶＩＳスペクトル。ツバキ属（Camellia）産物の２００〜４５０ｎｍ領域でのＵＶ／ＶＩＳスペクトルを局方遵守Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ  Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ４３００  Ｐｒｏ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌｔｄ．、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用して得た。蒸留水中に希釈したツバキ属（Camellia）産物のスペクトルパラメーターをＵＳＰ＜１９７＞に記載の手順により決定した。
【０１１５】
方法Ｂ：吸光度スペクトル。ツバキ属（Camellia）産物の２５０〜４５０ｎｍ領域での吸光度スペクトルをＵＶ−１０００Ｓ  Ｔｒａｎｓｍｉｔｔａｎｃｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｌａｂｓｐｈｅｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｔｈ  Ｓｕｔｔｏｎ、Ｎ．Ｈ．）およびヒト皮膚の表面特性を模倣しているＶｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）を使用して得た。それは、最適化したタンパク質および脂質構成成分の両方を含有し、ヒト皮膚に類似のトポグラフィー、ｐＨ、臨界表面張力およびイオン強度を有するように設計されている。
【０１１６】
ツバキ属（Camellia）試料を予め水和させた基質（適用用量＝２．０μｌ／ｓｑ．ｃｍ）の表面に均一に塗った。適用の１５分後、初期吸光度スペクトルを５回（５）複製を介して取った。次いで産物を適用した基質を３００ワットキセノンランプを備えた広域スペクトル太陽光シミュレーター（Ｍｏｄｅｌ  １６Ｓ−３００  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐｏｒｔ、Ｓｏｌａｒ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．）によって照射した。用量制御系ＰＭＡ  ２１００−ＤＣＳは、試料に送達される用量の正確な制御を可能にした。
【０１１７】
照射（照射用量＝６０ジュール／ｓｑ．ｃｍ）直後に同じ場所からの吸光度スペクトルを５回複製（５）で取った。照射前後での試料の吸光度スペクトルを統計解析のために使用した。
【０１１８】
試料。実施例１において上に記載のプロセスにより調製した次の生物活性組成物を評価した：組成物Ａ（０．８４％乾燥物質を有する細胞壁画分抽出物）、組成物Ｂ（６．８３％乾燥物質を有する膜画分抽出物）、組成物Ｄ（５．６９％乾燥物質を有する細胞汁漿液）。１．１０％乾燥物質を有する従来の白茶抽出物および１．３８％乾燥物質を有する従来の紅茶抽出物を対照として使用した。すべての試料は、Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ  Ｔｅａ  Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、ＳＣで回収した新鮮ツバキ属（Camellia）の同じバッチから得た。これらの試料は、いかなる添加物も含まなかった。
【０１１９】
分析。すべてのツバキ属（Camellia）試料が高いＵＶ吸光度値を有することが見出され、それによりそれらを蒸留水で希釈した。希釈したツバキ属（Camellia）産物のＵＶ−ＶＩＳスペクトルを図２および３に示す。
【０１２０】
すべての液体試料のスペクトルは、ある種の類似性を有する。例えば、ピークの位置は、λ最大１＝２６９〜２７４ｎｍおよびλ最大２＝２０５〜２０８ｎｍの比較的狭い範囲で変動し、試験したすべての試料における芳香族環およびσ−π結合の共役系の存在を示している。しかし、ピークの頂端値、各ピーク下面積および積分スペクトル曲線下総面積は異なっており（表１１）、試験した試料が光学活性構成要素の異なる組成を有することを示唆している。
【０１２１】
【表１１】
2016513099.tif 000013
【０１２２】
２００ｎｍから４５０ｎｍで得られた積分スペクトル曲線下面積の比較は、膜画分抽出物（組成物Ｂ）および細胞汁漿液（組成物Ｄ）がより高い吸光値を有することを明確に実証している（表１１）。比「スペクトル下面積：乾燥物質」は、試料の特異的吸光値が次の順で増加していることを示している：紅茶抽出物＞白茶抽出物＞細胞壁画分抽出物＞細胞汁漿液＞膜画分抽出物（表１２）。
【０１２３】
【表１２】
2016513099.tif 000014
【０１２４】
吸光度値の比較に基づいて、新規生物活性組成物が従来の白茶および紅茶の抽出物よりも日光損傷に対する皮膚のさらに有効な保護物質であると考えられる。ツバキ属（Camellia）産物のＵＶ保護特性が２９０ｎｍから４００ｎｍの領域に関連する吸光データを使用してより良く推定されるはずであることは、スペクトルのこの特定の部分が皮膚のＵＶ誘導損傷の原因であることから、指摘されるべきである（Sayre et al., “A Method for the Determination of UVA Protection for Normal Skin,”Journal of American Academy of Dermatology 23: 429-40 (1990)、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。試験した液体試料の２９０〜４００ｎｍ領域の吸光度は総ＵＶ／ＶＩＳ吸光度の約１０％に寄与するだけだが、新規ツバキ属（Camellia）組成物は同様に上のスペクトル領域でさらに高い吸光度を有する。
【０１２５】
したがって、ツバキ属（Camellia）試料の希釈溶液に関連するデータは、試験した産物のＵＶ保護強度の初期推定を提供し、Ｖｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）を使用してさらに評価された。結果を図４〜１３に示す。新規ツバキ属（Camellia）組成物ならびに従来の白茶および紅茶の抽出物が、乾燥物質レベルに関して等しくした濃度で基質に適用された後でも、異なるスペクトル特徴を有することが見出された（図４および５）。
【０１２６】
Ｖｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）に適用したツバキ属（Camellia）試料のスペクトルは、異なる頂端値を有する４個から２個の特徴的ピークを含んだ（表１３）。
【０１２７】
【表１３】
2016513099.tif 000015
【０１２８】
溶液中のツバキ属（Camellia）産物の特徴的ピークのパラメーター（表１１）が、Ｖｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）に適用されたツバキ属（Camellia）産物の特徴と比較して非常に異なっていたことは指摘されるべきである（表１３）。対照実験が示すとおり、Ｖｉｔｒｏ−Ｓｉｎ（登録商標）表面の低いｐＨレベル（約５．５）が、上の差異の原因であるとは考えられず、ツバキ属（Camellia）産物とＶｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）基質の調製のために使用された成分との間の化学的相互作用の結果であると考えられる。したがってＶｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）は、ツバキ属（Camellia）フェノール性構成要素と化学的に相互作用できるタンパク質および脂質構成成分の両方を含有する。試験した産物のスペクトル特性におけるシフトが、すべての生物活性組成物および従来の茶の抽出物について観察されたことに留意されたい。
【０１２９】
試験試料のさまざまな乾燥物質の含有物を考慮しつつ、新規ツバキ属（Camellia）組成物および従来のツバキ属（Camellia）産物の抽出物「そのまま」のスペクトルも比較した。等容量でＶｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）に適用したツバキ属（Camellia）産物の吸光度スペクトルを図６に示す。
【０１３０】
細胞壁画分抽出物および白茶抽出物のスペクトルの間にはいくらかの類似性があるが、第１の産物は、領域２５０〜２８０ｎｍおよび近ＵＶ領域においてさらに高い吸光度を有する。より高い吸光度が、細胞壁画分抽出物（０．８４％）と比較して白茶抽出物（１．１０％）において高い乾燥物質レベルと対応しないことに留意されたい。これら２つの試料の組成は同一でなく、細胞壁画分抽出物が、高い吸光度の原因となる、さらに多い非解離光学的活性成分からなる、さらに低い伝導率も有する（表３に示すデータを参照のこと）ことが示唆される。
【０１３１】
追加的に、膜画分抽出物（組成物Ｂ）および細胞汁漿液（組成物Ｄ）のスペクトルが細胞壁画分抽出物（組成物Ａ）および白茶抽出物のスペクトルとは異なっていることが見出された。したがって、膜画分抽出物および細胞汁漿液スペクトルは、これらの産物が白茶抽出物および細胞壁画分抽出物とは異なる組成を有することを再び示している。同時にスペクトルデータは、膜画分抽出物および細胞汁漿液の組成が同一でないことを示唆している。例えば、膜画分抽出物は、２６０ｎｍ、２８６ｎｍおよび３９４ｎｍに３つの特徴的ピークを有する。細胞汁漿液スペクトルは、２６０ｎｍおよび２８６ｎｍに２つのピークを含有する。
【０１３２】
これら２つのスペクトルの比較は、膜画分抽出物は細胞汁漿液よりもおよそ２倍高い吸光度を有するが、乾燥物質レベルにおける差異は約１％だけであることを示している。それにより、試験した４個のツバキ属（Camellia）産物は、領域２５０〜４５０ｎｍにおいて光学的に活性である構成要素の顕著に異なる組成を有する。
【０１３３】
ツバキ属（Camellia）産物の定量的比較に関するデータを表１４に表す。
【０１３４】
【表１４】
2016513099.tif 000016
【０１３５】
表１４は、領域２５０〜４５０ｎｍおよび領域２９０〜４００ｎｍにおける試料の吸光度が次の順で増加することを示している：白茶抽出物＞細胞壁画分抽出物＞細胞汁漿液＞膜画分抽出物。この順序は、希釈溶液中で試験したツバキ属（Camellia）産物の特異的吸光度値の順序に完全に一致している（表１２）。２５０〜４００ｎｍ領域における吸光度の２５０ｎｍから４５０ｎｍで取られたスペクトルの吸光度への寄与は、試験した試料がＶｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）に適用された場合に約５５〜６０％に達した。
【０１３６】
希釈溶液中と、Ｖｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）基質へのそれらの適用後での新規ツバキ属（Camellia）組成物のスペクトルが著しく異なることに留意されたい。これらの差異は、膜画分抽出物および細胞汁漿液について定量的および定性的の両方である。したがって、２５０ｎｍから４５０ｎｍの範囲において溶液中の膜画分抽出物は、２７４ｎｍでピークになる。同じ膜画分抽出物は、Ｖｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）に適用された場合に、上の波長でいかなる特徴的なピークも示さず、代わりに２６０ｎｍおよび２８６ｎｍに２つの特徴的なピークを有した（図７Ａ）。
【０１３７】
スペクトル特性において類似のパターンが細胞汁漿液について観察され、約３６０ｎｍでの追加的吸光度がＶｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）に適用された試料において同定されたが、そのような現象は溶液中の同じ組成物のＵＶ／ＶＩＳスペクトルにおいては記録されなかった（図７Ｂ）。
【０１３８】
スペクトル間の上の差異が新規ツバキ属（Camellia）組成物と、タンパク質および脂質構成成分を有し、ヒト皮膚を模倣しているＶｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）の表面との間の化学的相互作用の結果である可能性があることは指摘されるべきである。これらの相互作用は、ＵＶ照射の損傷効果の原因であるスペクトル領域における吸光度の劇的な増加を生じる、すなわち新規ツバキ属（Camellia）組成物は、顕著なＵＶ保護特性を有する。オオムギ（オオムギ（Hordeum vulgare））（図８Ａ）およびセージ（セージ（Salvia officinalis））（図８Ｂ）細胞汁漿液での対照実験は、同じ試料の溶液中およびそれらのＶｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）での適用後におけるスペクトルの差異がツバキ属（Camellia）以外の植物供給源について観察されなかったことを示している。したがって、Ｖｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）への適用後のツバキ属（Camellia）産物におけるスペクトルシフトは、特異的相互作用が新規ツバキ属（Camellia）産物とヒト皮膚を模倣している基質との間だけで存在することを示している。
【０１３９】
予め水和させた基質での対照実験は、照射後にＶｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）の吸光度が特に２６０〜３３０ｎｍの範囲で顕著に減少したことを実証した（図９）。この効果は、広域スペクトル太陽光の高用量で照射された非保護基質の比較的低い光安定性を反映している。
【０１４０】
適用された白茶抽出物を含む基質の照射は、非保護Ｖｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）のスペクトル変化と似ている、吸光度スペクトルにおける変化を開始させた（図１０）。基質の寄与を除いた場合、非照射および照射試料のスペクトルはいくらかの類似性を示すが、全体として同一の挙動は実証しなかった。例えば、範囲２９０〜３１０ｎｍでの吸光度は減少し、３６０ｎｍでの幅広いピークが形成され始めた。
【０１４１】
細胞壁画分抽出物の照射（図１１）は、特に、基質寄与の除外（減算）後に得られた曲線に関して、吸光度スペクトルにおける類似の変化を導いた。
【０１４２】
白茶抽出物および細胞壁画分抽出物の組成は同一ではないが、それらのスペクトルにおける照射誘導修飾の様式は非常に類似している。白茶抽出物および細胞壁画分抽出物の両方が照射の破壊作用に対して基質を完全には保護できず、結果としてＶｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）の吸光度が、この基質が全く保護されなかった条件とほとんど同程度に減少する（図９）ことに留意されたい。長波長では吸光度におけるいくらかの増加が観察されるが、それは範囲２５０ｎｍ〜３３０ｎｍにおいて特に明らかである。
【０１４３】
膜画分抽出物の照射は、その吸光度スペクトルに非常に異なる効果を産生した（図１２）。例えば照射は、スペクトル範囲２５０〜２８５ｎｍではいかなる変化も開始させなかった。考察のとおり、スペクトルのこの具体的な範囲は、照射されたＶｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）の破壊によって非常に顕著な影響を受け、したがってスペクトルの比較は、基質の破壊がその表面の膜画分抽出物の存在によって完全に妨害されたことを示唆する。
【０１４４】
しかし、膜画分抽出物スペクトルにおける特定の変化が記録された。例えば吸光度は、範囲２９０〜３２０ｎｍにおいてわずかに減少し、長波長での吸光度の少しの増加を伴っていた。続いて核酸および芳香族アミノ酸が２６０ｎｍおよび２８０ｎｍに特徴的ピークを有するスペクトル範囲において膜画分抽出物が非常に有効であることが証明されたことは特に指摘されるべきである。したがって、膜画分抽出物の効果は、この産物の局所適用のための将来的なＵＶ保護成分としての使用を可能にする。
【０１４５】
照射後の漿液画分は、その吸光度スペクトルにおいて特定の変化を実証した（図１３）。
【０１４６】
一般にこれらの変化は、範囲２５０〜３４０ｎｍにおける吸光度のわずかな減少および範囲３４０〜４５０ｎｍにおける吸光度のわずかな増加として記載できる。Ｖｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ（登録商標）試験基質（ＩＭＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）（非照射漿液画分の初期スペクトルを超えるスペクトル上の赤曲線を参照のこと）の光破壊によって提供される可能性のある寄与の除外が、基質がその表面への漿液画分の適用によって有効に保存されたことを明確に示したことに留意されたい。
【０１４７】
観察および結論。上の結果は、従来のツバキ属（Camellia）産物の最高のもの−白茶抽出物−が、ＵＶ照射の破壊作用に対して比較的弱い保護を提供することを明白に示している。細胞壁画分抽出物は、白茶抽出物に類似の特性を実証したが、膜画分抽出物および細胞汁漿液はさらに強力なＵＶ保護特性を有する。
【０１４８】
ツバキ属（Camellia）産物のＵＶ保護特性は次の順で増加していることが見出された：白茶抽出物＝細胞壁画分抽出物＞細胞汁漿液＞膜画分抽出物。
【０１４９】
ツバキ属（Camellia）産物のスペクトル特性およびＵＶ照射後のこれらの特性の変化の様式が白茶抽出物（対照）、細胞壁画分抽出物、膜画分抽出物および細胞汁漿液中の構成要素の組成がすべて異なり、特有の活性を提示するという強い証拠を提供することに留意されたい。これが、上に記載のＵＶ活性が白茶抽出物においてと同様にはポリフェノールに帰することができない新規ツバキ属（Camellia）組成物の場合における具体的な目的である。
【０１５０】
［実施例１０］
ツバキ属（Camellia）産物の比較評価：概要
実施例１０から１９は、本発明のチャノキ（Camellia sinensis）由来の生物活性組成物による細胞機能の調節に関する生物学的活性の範囲を評価するために実施された実験に関する方法、結果および分析を記載している。主な目的は、本発明の方法から得られた産物の生物学的活性の範囲を評価することおよびこれらを、陽性対照として検証され、本発明の次の生物活性組成物：（１）新鮮葉の細胞壁画分抽出物（組成物Ａ、本明細書で参照される）、（２）膜画分抽出物（組成物Ｂ、本明細書で参照される）および（３）細胞汁漿液（組成物Ｄ、本明細書で参照される）と比較された従来の（伝統的）茶技術によって得られた最良の産物−白茶抽出物の活性と比較することである。
【０１５１】
試験を３種のヒト細胞株：単球性白血病細胞の特徴を有する骨髄株（Ｍｏｎｏ  Ｍａｃ  ６）ならびに、ｉｎ  ｖｉｖｏで悪性腫瘍の初期ステージの特徴を有する２種の乳がん株（ＭＣＦ−７）および進行がんの特徴を有するさらに高い侵襲性、転移性およびエストロゲン非感受性の株（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ）の増殖様式へのこれらのツバキ属（Camellia）生物活性組成物の効果を評価するために実施した。
【０１５２】
従来の白茶抽出物が、いくつかの腫瘍細胞の転移活性へのある種の阻害効果を実証したことが見出された。しかしそのような阻害の程度は、そのような阻害が検出された場合でも試験した細胞のすべての種類に対して顕著ではなく、それは一般に完全にではなく、むしろ最少または少量であった。細胞壁画分抽出物は、白茶抽出物のものの特性に類似した特性を実証した。
【０１５３】
細胞汁誘導体の両方：膜画分抽出物および細胞汁漿液が、さまざまな刺激の存在下および非存在下で培養された、試験したすべての細胞株の代謝機能のさらに強力な阻害剤であったことは注目に値する。例えば膜画分抽出物は、より大きな阻害強度を明確に実証し、その効果は０．００１％の用量で確実に測定できた。細胞汁漿液は、複合的応答：低用量での刺激および高用量での阻害を実証した。
【０１５４】
壊死性細胞溶解を誘導するよりもむしろ、膜画分抽出物および細胞汁漿液は、腫瘍細胞においてプログラムされた、またはアポトーシス性細胞死の経路を開始すると考えられることに留意されたい。実験データは、この経路がミトコンドリア機能の消失に寄与し、検出されるまで２４から４８時間の曝露を必要とする場合があることを示している。
【０１５５】
生物活性組成物への曝露の結果として、試験したすべての腫瘍細胞株：ＭＣＦ−７、初期ステージヒト乳がんのモデル、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、進行乳がんのモデル、およびＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６、単球性白血病のモデルの代謝機能は、膜画分抽出物によって最も有効におよび細胞汁漿液によってあまり強くなくさらに選択的に阻害された。注目すべきことに白茶抽出物および細胞壁画分抽出物は、不活性であるまたは上の組成物ＢおよびＤよりもあまり強力でないことが証明された。この傾向は、さまざまな条件下で試験された細胞：形質転換増殖因子の非存在および存在下でのＭＣＦ−７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞ならびに刺激されたおよび刺激されていない両方の単球性Ｍｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞について明確に証明された。
【０１５６】
これらの結果は、ツバキ属（Camellia）植物の強度を劇的に増加させ、従来の茶技術の最良の産物についてさえ同定されていない活性を実証する非常に優れた新規産物を産生する本発明の方法の能力の強力な証拠を提供する。
【０１５７】
本発明のツバキ属（Camellia）画分の細胞調節タンパク質分解活性への効果は、炎症性組織傷害ならびに腫瘍浸潤および転移に関連を有する。したがって乳がん細胞および白血病細胞は、本発明の生物活性組成物、最も注目すべきことには膜画分抽出物についての潜在的な標的として明確に示唆される場合がある。結腸癌由来細胞株ＣＯＬＯ２０５が顕著なレベルのＭＭＰ−２を放出し、次いで同様に細胞によって分泌されるトリプシン様酵素によって活性化されることが既に示されていることに留意されたい。これも、Ｍｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞での結果に基づいて本発明のツバキ属（Camellia）画分についての潜在的標的の１つである。
【０１５８】
これらの研究から、新鮮ツバキ属（Camellia）から単離された本発明の生物活性組成物が鍵となる細胞機能の優れた調節を生じる活性を有することが結論付けられた。観察された効果は、パーソナルケア製品から栄養補給品および潜在的には医薬品に至る有益な適用を有する可能性がある。
【０１５９】
本発明の非常に強力な生物活性組成物が単一の精製された構成成分ではなく、むしろ構成要素の単離された複合体であることにも留意されたい。膜画分抽出物（組成物Ｂ）および細胞汁漿液（組成物Ｄ）のさらなる分画は、天然医薬品の成長市場のための非常に強力な成分をもたらす可能性がある。
【０１６０】
［実施例１１］
ツバキ属（Camellia）産物の比較評価：試験組成物
次の生物活性組成物を実施例１０から１９に記載の実験において使用した：
（１）陽性対照：実施例１および４に記載の手順により調製した白茶抽出物
（２）組成物Ａ：実施例１および４に記載の手順により調製したツバキ属（Camellia）の新鮮葉の細胞壁画分抽出物
（３）組成物Ｂ：新鮮に処理したツバキ属（Camellia）の葉から得て、実施例１および４に記載の手順により調製した膜画分抽出物
（４）組成物Ｄ：新鮮に処理したツバキ属（Camellia）の葉から得て、実施例１および４に記載の手順により調製した細胞汁漿液。
【０１６１】
上の産物は、従来の白茶抽出物および本発明の３種の「並行」産物（組成物Ａ、ＢおよびＤ）を調製するために同じロットの新鮮ツバキ属（Camellia）から得た。
【０１６２】
ツバキ属（Camellia）葉の抽出物が幅広い生物学的活性を有し、キュアリングプロセスの際に形成されるポリフェノール性タンニンの顕著な濃縮に主に寄与したことを示唆する多数の報告が文献にある。これらのポリフェノール、およびエピガロカテキン−３−Ｏ−没食子酸（ＥＧＣＧ）などのポリマー性タンニンへの低分子量前駆体が、強力な抗酸化物質活性を示すことが報告されている。ツバキ属（Camellia）の乾燥葉から調製された茶の抗酸化物質だけでなく、抗血管新生、抗細菌性、抗新生物性、抗炎症性、抗変異原性、抗敗血性および解毒性の特性も示唆している刊行物は増え続けている。上の特性のすべてが統計的に有意な利益を与えると証明されてはいない。それらのいくつかだけが複数の試験系を使用した包括的な研究において確認されている。
【０１６３】
前記参考文献のとおり、本発明の技術を使用してツバキ属（Camellia）以外の多数の新鮮植物供給源から単離された生物活性組成物での過去の実験から、そのような組成物が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３／０１７５２３５号に既に記載された多数のパラメーターを使用して同じ乾燥植物から単離された従来の産物よりもさらに強力であると証明されたことは指摘されるべきである。例えば他の種類の植物（アルファルファ（Medicago sativa）、オオムギ（Hordeum vulgare）、ラベンダー（Lavandula angustifolia）、キンセンカ（Calendula officinalis）およびセージ（Salvia officinalis））において、本発明の方法を使用して調製された組成物のいくつかの優れた生物学的活性が、高抗エラスターゼおよび抗ゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ−９）活性、好中球呼吸性バーストの新規調節、ならびに反応性酸素種に対する顕著なスーパーオキシド除去活性を含んで同定および評価された。除去活性以外のこれらの活性は、ポリフェノールの混合物だけによるとは考えられていない。
【０１６４】
したがって、それは本発明のツバキ属（Camellia）組成物において検出できた活性範囲を、従来の（伝統的）ツバキ属（Camellia）技術を使用して同じ乾燥植物から得られた抽出物において存在する活性と比較するためのさらに包括的な手法を探索するために特に興味深かった。したがって、新鮮に回収されたツバキ属（Camellia）の葉から調製された細胞壁画分抽出物（組成物Ａ）、膜画分抽出物（組成物Ｂ）および細胞汁漿液（組成物Ｄ）による、生きている哺乳動物細胞における機能の調節がアッセイされた。これらの組成物は、乾燥ツバキ属（Camellia）葉から調製された従来の白茶の抽出物と比較された。
【０１６５】
従来のツバキ属（Camellia）産物の複数の研究より、白茶抽出物はさらに高い特異的活性を実証し、したがってこの種類の調製物が本発明の新規ツバキ属（Camellia）産物との比較のための代表的な陽性基準対照として選択されたことに留意されたい。
【０１６６】
［実施例１２］
ツバキ属（Camellia）産物の比較評価：細胞株の選択のための理論的根拠
細胞機能の調節のための試験系として、２種のヒト乳房癌由来株を新生物細胞のモデルとして使用し（ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ）、ヒト単球様株（Ｍｏｎｏ  Ｍａｃ  ６）を炎症性細胞のモデルとして使用した。上の細胞株は実施例２１に記載されている。
【０１６７】
ＭＣＦ−７は、初期またはあまり脱分化していない乳がんのモデルと考えられている。株は、エストロゲン感受性をまだ保持しており、比較的低い侵襲性表現型を有し、免疫不全動物モデルにおいて転移するその能力はとても少ない。以前の研究においてＭＣＦ−７細胞株は、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）への特徴的応答を提示することが示されており：ＴＧＦ−βの存在下での２４時間培養後、細胞は増加したレベルのタンパク質分解性酵素のマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）ファミリーおよび血管新生促進因子血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、増強された侵襲性および転移能の２つの異なるマーカーを分泌する。ＴＧＦ−βへのこの応答は、腫瘍およびいくつかの腫瘍細胞株の指標であり、増殖因子によって正常細胞において誘導される増殖抑止とは対照的である。本発明の生物活性組成物を評価するために、ＴＧＦ−βの非存在下および存在下で培養したＭＣＦ−７細胞を標的として使用した。
【０１６８】
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ株は、さらに高度に侵襲性、転移性およびエストロゲン非感受性である。このヒト癌腫由来細胞株は、ＴＧＦ−βへのいくらかの感受性を示すが、増殖因子の非存在下でさえ、それはＭＣＦ−７よりも高いレベルのＭＭＰおよびＶＥＧＦを自発的に放出し、さらなる進行がんのモデルとしての使用と一致する。本評価では、ＴＧＦ−βの不在下でだけ培養したＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞への生物活性組成物の効果を検討した。
【０１６９】
ヒト単球様株、Ｍｏｎｏ  Ｍａｃ  ６は、静止単球またはマクロファージのものと一致する多数のバイオマーカーを発現し、ホルボールミリステート酢酸（ＰＭＡ）などの炎症性促進性活性化刺激にヒト単球およびマクロファージと同様に応答する。ＰＭＡの非存在下および存在下で培養したＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞への生物活性組成物の静止および活性化単球／マクロファージのモデルとして役立つ効果を検討した。
【０１７０】
したがって上に記載の細胞株の選択された組み合わせは、ツバキ属（Camellia）生物活性組成物の抗腫瘍および抗炎症性強度の評価のための信頼できる根拠を提供する。選択された細胞株の多数の機能性プローブでの並行試験は、単一の試験標的または類似の感受性もしくは特定の刺激への類似の応答を有する標的の応答の調査よりも、産物の活性およびそれらの作用機序に関するさらに価値のある結論を導く機会を提供する。
【０１７１】
［実施例１３］
ツバキ属（Camellia）生物活性組成物の比較評価：アッセイの選択のための理論的根拠
初期評価は、２つの生存率アッセイおよび細胞機能のプローブに基づいた（実施例２０、「方法８」を参照のこと）。
【０１７２】
第１のアッセイは、細胞が溶解した場合にだけ細胞外培養培地中に放出されるサイトゾル性酵素、乳酸デヒドロゲナーゼのレベルを測定する。細胞膜完全性のそのような消失は、壊死性細胞死の徴候であると伝統的に考えられ、細胞傷害性様式を反映している。
【０１７３】
第２のアッセイは、テトラゾリウム塩のその有色のホルマザンへの還元によって反映されるミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ活性を測定する。ＭＴＳ試薬（テトラゾリウム塩）が生細胞に適用される場合、それは強色調の化合物（ホルマザン）に転換される。ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ活性の消失は、細胞死とも関連する場合があるが、典型的には、核が凝縮し、ミドコンドリアが機能を停止した後に細胞膜完全性が一般に十分保持されるプログラム細胞死、またはアポトーシス性、経路における初期ステップのマーカーである。
【０１７４】
乳酸デヒドロゲナーゼの漏出が、細胞溶解に関連する生存率の完全な消失を示す一方で、テトラゾリウム塩の還元の減少はミトコンドリアの活性の消失を示すが、細胞膜完全性または生存率の不可逆的消失は必ずしも示さない。
【０１７５】
細胞機能の追加的プローブとして、Ｍｏｎｏ  Ｍａｃ  ６株によって分泌されるタンパク質分解酵素のレベルへのツバキ属（Camellia）生物活性組成物の効果が検討されている（実施例２０、「方法９」を参照のこと）。この細胞株での以前の研究では、ＰＭＡとのインキュベーション後、Ｍｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞が２種のいわゆるゼラチン分解マトリクスメタロプロテイナーゼ、ＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）およびＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）を分泌することが観察された。これらのＭＭＰは、多数の腫瘍によっておよびそれらの周囲の間質によっても分泌され、炎症性組織傷害ならびに腫瘍浸潤および転移に関わる。抗炎症性および抗腫瘍薬として開発されているいくつかの薬剤（調査された薬剤は、炎症性組織破壊ならびに腫瘍細胞株の浸潤および転移を減少させることが周知である）が、ＭＭＰタンパク質分解活性のいくらかの直接阻害に加えて、細胞によって産生されるＭＭＰのレベルを低減すると考えられることも以前示された。これらの研究における目的は、本発明のツバキ属（Camellia）生物活性組成物が、活性化されたＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞によって放出されるＭＭＰのレベルを減少させる類似の能力を有することができる可能性を評価することであった。
【０１７６】
したがって、選択されたアッセイは、代謝プロセスの広域スペクトルを確実に評価し、特定のツバキ属（Camellia）生物活性組成物によって引き起こされる作用の機序を明らかにできる重要なデータを有効に得られるようにする。
【０１７７】
［実施例１４］
ツバキ属（Camellia）産物の比較評価：乳房腫瘍細胞株へのツバキ属（Camellia）生物活性組成物の効果
これらの研究を通じて、ミトコンドリア機能をテトラゾリウム塩ＭＴＳのそのホルマザンへの還元のアッセイだけを通じて測定した。さらに高い濃度の本発明のツバキ属（Camellia）組成物のいくつかの内在性能力が、いかなる生細胞の非存在下でＭＴＳを直接還元することを観察し、本明細書で報告するすべての結果では、細胞の非存在下でのホルマザンのそのようなバックグラウンド形成は、細胞の存在下で観察される還元酵素活性のレベルから減算されていることに留意されたい。
【０１７８】
図１４から２１は、０．０１％または０．０２％（ｗ／ｖ、培養物培地中の最終濃度、ツバキ属（Camellia）組成物の固体の乾燥重量に基づく）から０．０００１％の範囲の４種のツバキ属（Camellia）組成物それぞれの種々の用量の添加後２４時間および４８時間で、５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−βの非存在下および存在下で培養されたＭＣＦ−７細胞、ならびにＴＧＦ−βの非存在下でだけ培養されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞の還元酵素活性の大きさを例示する。
【０１７９】
［実施例１５］
ツバキ属（Camellia）生物活性組成物の比較評価：ＭＣＦ−７細胞
ＴＧＦ−βの非存在下で、試験した最も高い濃度（０．０１％）の組成物Ａおよび白茶抽出物（陽性対照）は、ＭＣＦ−７細胞によるＭＴＳ還元に顕著な効果を有した。その濃度で、ツバキ属（Camellia）組成物Ａへの２４時間曝露後に還元酵素活性の顕著だが不完全な阻害があった（約５０〜７０％阻害）。還元酵素活性の類似の阻害が白茶抽出物への２４時間曝露後に検出された。
【０１８０】
対照的に、ツバキ属（Camellia）細胞汁から調製された２種のツバキ属（Camellia）生物活性組成物（膜画分抽出物および細胞汁漿液）は、ＴＧＦ−βの非存在下でＭＣＦ−７細胞における還元酵素活性のさらに強力な阻害剤であった。膜画分抽出物（組成物Ｂ）は、いくらか大きな強度を除いて用量依存性で白茶抽出物に似ており、試験した最も高い用量である０．０１％で実質的に完全な阻害をもたらしている。細胞汁漿液（組成物Ｄ）も０．０１％で実質的に完全な阻害をもたらしているが、０．００２５％の低い用量では、還元酵素活性の刺激のいくつかの証拠があった。低用量の組成物Ｄは、顕著な効果はなかった。
【０１８１】
ＭＣＦ−７細胞が増殖因子ＴＧＦ−βの存在下で培養された場合、ツバキ属（Camellia）組成物へのそれらの感受性は顕著に変化した。細胞壁画分抽出物および白茶抽出物への２４時間または４８時間曝露後、白茶抽出物の最も高い用量（０．０１％）での２０％未満の穏やかな阻害を除いていずれの用量でも還元酵素活性への刺激または阻害効果のいずれの証拠もなかった。
【０１８２】
対照的に、ＴＧＦ−β処置ＭＣＦ−７細胞の用量０．０２％の膜画分抽出物への２４時間曝露は、還元酵素活性の７０％阻害を生じ、４８時間後に、還元酵素活性は実質的に完全に減少した。さらに穏やかな阻害が２４時間後に膜画分抽出物の低用量で検出できたが、４８時間後に、還元酵素活性の顕著な活性化が検出された。低用量の細胞汁漿液による還元酵素活性の同じ活性化および、高用量（０．０２％）での顕著な阻害が曝露４８時間後に検出されたが、この組成物は用量に関わらず２４時間のさらに限定的な曝露後にＴＧＦ−β−処置ＭＣＦ−７細胞において還元酵素活性への最少の効果だけを有した。
【０１８３】
評価において、いずれかのツバキ属（Camellia）組成物の最も高い用量にさえ２４時間曝露されたＭＣＦ−７細胞の培養物培地への乳酸デヒドロゲナーゼの顕著な放出は検出されなかった。これらの細胞におけるミトコンドリア機能の消失は、細胞の壊死性溶解によって付随されないと考えられる。曝露の最初の４８時間の際に細胞が実際に死ぬ場合、それはプログラム細胞死、またはアポトーシス性、経路が開始されたと考えられる。この結論は、細胞はいくらか丸くなるが、曝露の経過の際にデブリまたは膜断片の形成はないことを明らかにする光学顕微鏡的観察によって支持される。
【０１８４】
したがってミトコンドリア機能の阻害は、試験したすべてのツバキ属（Camellia）産物の作用の主な様式であると考えられ、放出された乳酸脱水素酵素のレベルによって示される細胞傷害または壊死を実証しなかった。
【０１８５】
［実施例１６］
ツバキ属（Camellia）生物活性組成物の比較評価：ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞
ツバキ属（Camellia）組成物へのＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞の応答の様式は、ＭＣＦ−７細胞のものに似ており、最も強力な組成物は、膜画分抽出物（組成物Ｂ）が細胞汁漿液（組成物Ｄ）よりもいくらか大きな強度を示している組成物ＢおよびＤであった。膜画分抽出物だけが、曝露わずか２４時間後に顕著な還元酵素活性の阻害をもたらした。阻害は、０．０１％の最も高い用量で対照還元酵素値の−７０％に達したが、−１０％の穏やかな阻害が注目に値する濃度−０．０００１％の最も低い用量においてさえ確実に検出できた。試験した他の組成物は、曝露２４時間に、試験した最も高い用量でだけ穏やかな阻害効果を有しただけであった。
【０１８６】
曝露４８時間後、還元酵素活性は各組成物の存在下で用量依存的様式で阻害されたが、最も高い用量の組成物での強度は膜画分抽出物を除いて１００％近くの阻害に達しなかった。この組成物は、０．００１％、４８時間後に還元酵素活性を−５０％まで阻害した。白茶抽出物および細胞壁画分抽出物も４８時間曝露後にＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞に対して顕著な阻害活性を有し、細胞汁漿液のものよりも実際に大きかった。いずれの調製物の用量も曝露の期間にかかわらず、この細胞株において還元酵素活性の活性化を誘導しなかった。
【０１８７】
高度に侵襲性、転移性およびエストロゲン非感受性株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓへの影響が、２４時間後だけではほとんど観察されないことに留意されたい。したがって、２４および４８時間後の組成物Ｂの効果はかなり注目に値し、この調製物が顕著な活性を有することを示している。
【０１８８】
［実施例１７］
ツバキ属（Camellia）生物活性組成物の比較評価：単球様細胞へのツバキ属（Camellia）組成物の効果
ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ活性：乳房腫瘍細胞株での予備研究によって明らかにされた特定の傾向は、Ｍｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞の試験した４種のツバキ属（Camellia）組成物への応答と一致することを証明した。膜画分抽出物（組成物Ｂ）および細胞汁漿液（組成物Ｄ）は、この炎症性細胞株において細胞壁画分抽出物（組成物Ａ）および白茶抽出物（陽性対照）よりもＭＴＳ還元酵素活性のさらに強力な阻害剤であり、膜画分抽出物（組成物Ｂ）が最も大きな阻害強度を明確に有した。刺激されていないままの細胞および１０ｎＭ  ＰＭＡで刺激されたものにおけるＭＴＳ還元酵素の効果を検討し、ツバキ属（Camellia）組成物への２４および４８時間曝露後の還元酵素活性を評価した。Ｍｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞でのＭＴＳ還元酵素活性へのこれらの組成物の効果を図２２から３３に示す。
【０１８９】
白茶抽出物は、ＰＭＡ刺激細胞への曝露４８時間後に還元酵素活性の弱いけれども用量依存的阻害を示し、ＰＭＡの非存在下では曝露の用量または長さに関わらず還元酵素活性の顕著な消失はなく、ＰＭＡ処置細胞への２４時間曝露後にいずれの用量のいかなる効果もなかった。細胞壁画分抽出物は、曝露の用量または時間に関わらず、細胞がＰＭＡで刺激されていないまたは刺激されたかに関わらずＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞への効果を有さなかった。
【０１９０】
新鮮ツバキ属（Camellia）葉の細胞汁漿液は、刺激されていないＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞還元酵素活性を２４または４８時間曝露後に用量依存的様式で穏やかに阻害した。０．０１％（ｗ／ｖ、培養物培地中最終濃度、出発調製物の固体の乾燥重量に基づく）の最も高い用量での最大阻害は、対照活性の約２０〜３０％だけであった。ＰＭＡ刺激細胞の阻害は、対照活性の５０％に達したが、組成物Ｄ（０．０１％）の最も高い用量においてだけ、および４８時間曝露後だけであった。
【０１９１】
新鮮に収集したツバキ属（Camellia）の膜画分抽出物（組成物Ｂ）は、乳房腫瘍細胞株に対してと同様にＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞還元酵素活性の阻害において試験した調製物で最も強力であると証明された。ＰＭＡ刺激の効果または組成物への曝露時間は、阻害にほとんど効果を有さず、ＰＭＡの存在または不在において用量依存的であり、２４時間または４８時間曝露後ではおおよそ同じであった。還元酵素活性は、ＰＭＡの存在下で−７０％まで、およびＰＭＡの非存在下で０．０２％の最も高い用量において−８０〜９０％まで阻害されたが、低いレベルの阻害（−１５％）は０．００１％の用量で確実に測定できた。サイトゾル性酵素の放出の測定は、還元酵素活性の消失が壊死性細胞溶解と関連していないことを確認するためには行われていないが、膜断片化の証拠は０．０２％、４８時間でいずれかの生物活性組成物に曝露されたＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞の光学顕微鏡検査によって見ることができなかった。さらに、下に示すとおり、細胞は、ＭＴＳの還元が著しく減少する条件下で少なくとも１つのＭＭＰをまだ分泌できると考えられる。
【０１９２】
これらの結果は、これらの細胞および乳房腫瘍細胞株において、還元酵素活性の消失がミトコンドリア機能の比較的選択的な消失に関連し、プログラム細胞死またはアポトーシスの経路の開始を反映する可能性があることを示唆している。
【０１９３】
ＭＭＰの分泌。２つの異なるアッセイをＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞によって放出される２種のゼラチナーゼ、ＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）およびＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）のレベルを測定するために使用した。これらのＭＭＰは、炎症性組織損傷ならびに腫瘍浸潤および転移に関わっている。ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９に対して用いた酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、１０ｎＭ  ＰＭＡおよび３種のツバキ属（Camellia）生物活性組成物のさまざまな用量ならびに陽性対照の存在下で４８時間培養されたＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞の培養物培地中の２種の酵素の総レベルを推定するために最初に使用された。
【０１９４】
この細胞株は、刺激されない場合にＭＭＰ−２だけを分泌するが、活性化された場合にＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の両方を分泌する（２４時間後に放出されたＭＭＰのレベルは通常確実に検出するためには低すぎる）。
【０１９５】
ＥＬＩＳＡ測定の結果を図３４から３７に示す。Ｍｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞によるＭＴＳ還元への細胞壁画分抽出物および白茶抽出物の効果について観察されたとおり、これらの抽出物のいずれの用量でもＭＭＰ−２またはＭＭＰ−９分泌のレベルにおける顕著な変化はなかった。膜画分抽出物および細胞汁漿液の最も高い用量（０．０１％ｗ／ｖ）で、ＭＭＰ−２のレベルは減少されたことが、膜画分抽出物がこの用量での最も高い強度を表して観察された。ＭＭＰ−２放出の明らかにわずかな刺激が組成物Ｂ（０．００１％）および組成物Ｄ（０．００２％）の次に高い用量で観察されたことに留意されたい。この刺激は、これらの組成物の同様の用量でのＴＧＦ−β処置ＭＣＦ−７細胞におけるＭＴＳ還元酵素活性の刺激を連想させる。
【０１９６】
ＥＬＩＳＡによって検出されたＭＭＰ−２レベルの用量依存的減少は、ＭＭＰ−９レベルへの膜画分抽出物および細胞汁漿液の効果と同等ではない。これらのレベルは、最も高い用量で増加した（細胞汁漿液によって明らかに著しく）が、試験した低用量では変化しなかった。わずか２４時間にＭＴＳ還元酵素活性の顕著な阻害を産生するツバキ属（Camellia）調製物の用量に４８時間曝露されたＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞によって分泌されたＭＭＰ−９の未変化または増加したレベルの検出は、ツバキ属（Camellia）の膜画分抽出物または細胞汁漿液に曝露されたＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞におけるミトコンドリア機能の消失が壊死性細胞溶解を反映しないことのさらなる証拠であり、その場合ＭＭＰ分泌は突然停止する。
【０１９７】
Ｍｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞によるＭＭＰ分泌へのツバキ属（Camellia）組成物の効果のさらなる証拠として、ゼラチン酵素電気泳動の技術をＥＬＩＳＡ測定のために上に記載のとおり回収した培養物培地を検討するために使用した。本方法では、培養物培地をタンパク質を分子量に基づいて分離するためにドデシル硫酸ナトリウムの存在下でのゼラチン−浸透性ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に最初に供する。次いでＳＤＳを、存在する任意の酵素の少なくとも一部を再生させるためにゲルから洗浄除去し、ゲルをＭＭＰ活性を最大化する媒体中でインキュベートする。ＭＭＰは、どこに存在していてもゼラチンを溶解する。タンパク質染色したゲルのバルクにおいて未消化ゼラチンを視覚化した後、染色されたバックグラウンドに対して透明な領域として現れるＭＭＰと共にゲルをスキャンする。陰性画像を本明細書に示し、ＭＭＰは明るいバックグラウンドに対して暗い領域として現れる。
【０１９８】
ＭＭＰがほとんどの細胞によって不活性前駆体として分泌され、次いで細胞外で活性化されることに留意されたい。しかし、酵素電気泳動において用いられる変性および再生の連続のために、ＭＭＰのいわゆる不活性プロ形態でさえゼラチン分解活性を獲得し、透明な領域を産生する。図３４から３７は、Ｍｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞のさまざまなツバキ属（Camellia）生物活性組成物への４８時間曝露後に回収した培養培地のゼラチン酵素電気泳動像の陰性画像を、１０ｎＭ  ＰＭＡの非存在下（Ｕ）または存在下（Ｓ）だがツバキ属（Camellia）組成物の非存在下で培養した細胞から回収した培養培地と共に例示する。
【０１９９】
組成物Ａおよび陽性対照の効果は、調製物の最も低い用量（０．０００１％、「ｌｏ」（低））および最も高い用量（０．０１％、「ｈｉ」（高））についてだけ評価し、一方組成物ＢおよびＤの効果は、０．００１％（「ｍｅｄ」（中））の中間用量でも評価した。Ｍｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞がＰＭＡの非存在下ではＭＭＰ−２（約６７ｋＤ）だけを放出し、この酵素が主にプロ形態で見出されることは４個のパネルから明らかである。１０ｎＭ  ＰＭＡでの処置は、ＭＭＰ−９分泌（約９２ｋＤ）および顕著なレベルの２種のＭＭＰのプロ形態をそれらのわずかに低分子量の活性形態に変換するさらなるタンパク質分解性活性の誘導を生じる。
【０２００】
ＥＬＩＳＡ結果と一致して、ＰＭＡ刺激Ｍｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞の細胞壁画分抽出物および白茶抽出物への曝露は、ゼラチン酵素電気泳動によって視覚化された２つのＭＭＰのいずれのプロまたは活性型のいずれのレベルにも検出可能な効果を有さなかった。対照的に組成物ＢおよびＤの最も高い用量への曝露は、ゼラチン酵素電気泳動によって視覚化されたＭＭＰ−２のレベルの顕著な減少を生じたが、ＭＭＰ−９のレベルには明確な変化は生じなかった。
【０２０１】
組成物ＢおよびＤの最も高い用量で処置した細胞から回収した培地中に見られるＭＭＰ−９のプロおよび活性型、ならびにＭＭＰ−２の活性型に対応するかすかだが認識可能なバンドの出現は、これらの組成物の効果が主にＭＭＰ−２の放出の調節であり、これらの培養細胞におけるＭＭＰ活性化機構への追加的効果を含まないことを示唆している。
【０２０２】
［実施例１８］
ツバキ属（Camellia）生物活性組成物の比較評価：結果の要約
実験データは、ツバキ属（Camellia）生物活性組成物がＭＴＳ還元酵素活性の用量依存的消失を引き起こし、一般にミトコンドリア機能の消失に寄与していることを示している。この阻害は、検出されるまで４８時間もの長さの曝露を必要とする場合があり、少なくとも最初の２４時間についてサイトゾル性酵素の測定可能な放出はなく、壊死性細胞溶解を誘導するよりもむしろ生物活性組成物が腫瘍細胞におけるプログラムされた、またはアポトーシス性の細胞死の経路を開始することを示唆している。
【０２０３】
ＭＣＦ−７細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞の応答の時間および用量依存性における差異、ならびにＭＣＦ−７細胞のＴＧＦ−β処置の効果は、最初の２４時間以内の曝露での還元酵素活性の比較的穏やかな消失によって明らかであるとおり、さらに侵襲性で転移性の表現型の、白茶抽出物、細胞壁画分抽出物およびある程度細胞汁漿液への幾分増加した耐性をすべて指している。しかし膜画分抽出物のより大きな強度の傾向は、ＴＧＦ−β処置ＭＣＦ−７細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞において２４時間以内にＭＴＳ還元酵素活性を阻害する能力によって証明されている。
【０２０４】
ヒト単球／マクロファージのモデル、Ｍｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞株への試験したツバキ属（Camellia）生物活性組成物の効果は、乳房腫瘍細胞株において観察された効果にある程度の類似性を有する。乳房腫瘍細胞株の培養物培地における乳酸デヒドロゲナーゼの非存在およびＭｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞の培養物培地中のＭＭＰ−９分泌の正常から増加したレベルの存在に基づいて、これらの組成物が、試験した最も高い用量（０．０１％ｗ／ｖ）においてでさえ壊死性細胞溶解を誘導しないことが結論付けられた。
【０２０５】
しかし、２種の生物活性組成物（膜画分抽出物および細胞汁漿液）は、ミトコンドリアの還元酵素活性の用量依存的阻害を誘導し、Ｍｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞におけるプログラム細胞死のアポトーシス性経路の開始を反映する。さらに、これらの炎症性細胞の膜画分抽出物および細胞汁漿液への曝露は、ゼラチン分解酵素、ＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）のレベルの選択的減少を生じる。ゼラチン酵素電気泳動は、「プロ形態」または酵素前駆体活性化の機構がツバキ属（Camellia）生物活性組成物によって影響されないことを示し、媒体中のＭＭＰ−２レベルの減少がタンパク質分解性破壊の増強を反映しているとは全く考えられない。
【０２０６】
したがって、試験したすべての細胞株（すなわち、初期ステージヒト乳がんのモデル、進行乳がん細胞のモデルおよび単球性白血病のモデル）の代謝活性は、膜画分抽出物（組成物Ｂ）によっておよび大部分の場合細胞汁漿液（組成物Ｄ）によって有効に阻害された。注目すべきことに、細胞壁茶抽出物（組成物Ａ）および白茶抽出物（陽性対照）は不活性であるまたは上の組成物ＢおよびＤよりも強力でないことが証明された。
【０２０７】
この傾向は、形質転換増殖因子の非存在下および存在下で試験したすべてのＭＣＦ−７ヒトがん細胞について、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ進行ヒト乳がん細胞について、ならびに刺激されたおよび刺激されていない単球様Ｍｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞について明確に証明された。生物活性ツバキ属（Camellia）組成物の試験および評価の要約に関連するデータを表１５に示す。
【０２０８】
【表１５】
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【０２０９】
表１５は、用量依存的様式で細胞機能を調節するツバキ属（Camellia）調製物の能力が次の順序で増加することを示している：白茶抽出物＝細胞壁画分抽出物＞細胞汁漿液＞膜画分抽出物。実験データは、新鮮植物組織の細胞汁由来膜画分抽出物（組成物Ｂ）および細胞汁漿液（組成物Ｄ）への処理によって調製された新規生物活性ツバキ属（Camellia）組成物が細胞に対していかなる明白な壊死性毒性も引き起こさないことを示唆している。
【０２１０】
したがって本発明の技術は、ツバキ属（Camellia）生物活性組成物の強度を劇的に増加させ、従来のツバキ属（Camellia）技術によって産生された最良の産物（例えば、白茶抽出物）において提示できなかった活性をヒト生細胞に提示する非常に優れた新規産物を産生する能力を示す。
【０２１１】
［実施例１９］
ツバキ属（Camellia）生物活性組成物の比較評価：将来研究への影響
本発明のツバキ属（Camellia）生物活性組成物の細胞調節タンパク質分解性活性への効果は、炎症性組織傷害ならびに腫瘍浸潤および転移へ影響を有する。したがって、乳がん細胞および単球性白血病細胞は、本発明のツバキ属（Camellia）生物活性組成物、なかでも注目すべきは組成物Ｂ（膜画分抽出物）についての将来的な標的として明確に示唆される可能性がある。結腸癌由来細胞株ＣＯＬＯ２０５は、細胞によって同様に分泌されるトリプシン様酵素によって次いで活性化される顕著なレベルのＭＭＰ−２を放出することが以前示された。この種類の腫瘍細胞は、Ｍｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞での結果に基づいて、本発明のツバキ属（Camellia）生物活性組成物についての多数の潜在的標的の１つである。
【０２１２】
これらの研究から、本発明の新鮮ツバキ属（Camellia）から単離された生物活性組成物が、顕著な活性を有し、鍵となる細胞機能の優れた調節を生じることを確信できる。観察された効果は、パーソナルケア製品から栄養補給品および潜在的には医薬品に至る有益な適用を有する。
【０２１３】
［実施例２０］
生物活性組成物の特定の特徴を決定するために使用したプロトコール
下は、生物活性組成物の特定の特徴を決定するために使用した種々の方法である。これらの方法は、上の実施例全体を通じて参照される。下の「試験産物」または「試験試料」は生物活性組成物を指す。
【０２１４】
方法１：固体含有量を決定するための方法。固体含有量を決定するための手順は、水の完全な蒸発までの１００℃の水浴中での試験生物活性組成物の蒸発、１０５℃、３時間の試料の乾燥機貯蔵、室温への冷却および固体物質を含む容器の重量の即時決定を含んだ。
【０２１５】
方法２：不揮発性残渣の決定のための方法。不揮発性残渣の決定のための手順は、１０５℃、５時間の試験生物活性組成物の乾燥機貯蔵、冷却および固体物質を含む容器の重量の即時決定を含んだ。
【０２１６】
方法３：Ｌ＊ａ＊ｂ＊値の決定のための方法。Ｌ＊ａ＊ｂ＊値の決定のための手順は、０°／４５°の配置の測定を含むＨｕｎｔｅｒ  Ｌａｂｓｃａｎ固定形状比色計（Ｈｕｎｔｅｒ  Ｌａｂｓｃａｎ  ｆｉｘｅｄ  ｇｅｏｍｅｔｒｙ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｅｒ）を利用した。上を向いたのぞき窓を備える標準的光源Ｄ６５を使用した。試験生物活性組成物を含む容器をのぞき窓上に置き、底を通して測定した。次のＣＩＥＬＡＢ方程式を使用した：
【０２１７】
【数１】
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【０２１８】
方法４：総カロテノイド含有量およびルテイン含有量の決定のための方法。試験生物活性組成物をアセトンで抽出した。均一化および真空濾過後、すべての抽出物をメタノール中の３０％水酸化カリウムでけん化した。カロテノイドは、生物活性組成物から石油エーテルで上手く抽出された。追加的処置およびエタノール中での再可溶化後、すべての試料を４４６ｎｍで測定した。
【０２１９】
ルテイン含有量を決定するために、各試料抽出物から追加的な乾燥試料を高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）分析のために使用した。乾燥試料をＭＴＢＥおよびメタノール中に再可溶化した。（２５０×４．６０ｍｍ  Ｉ．Ｄ．）５μｍＣ１８カラム（「Ｖｙｄａｃ」）を備える逆相ＨＰＬＣ系を使用した。ルテインの同一性を確証的標準品の同時クロマトグラフィーによって確認した。ルテインのエタノール中のモル吸光計数は１４４，８００ｃｍ−１ｍｏｌ−１である。
【０２２０】
方法５：エラスターゼ阻害活性の決定のための方法。試験生物活性組成物のエラスターゼ阻害活性を、好中球エラスターゼ（「Ｅｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」によって生産された精製酵素調製物）および、「Ｓｉｇｍａ」によって産生された合成ペプチド可溶性基質メトキシサクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐ−ニトロアニリドを用いるアッセイを使用して決定した。基質の酵素切断は、経時的に高まる黄色（４０５ｎｍ）の生成を生じ、色生成の速度は阻害活性を含有する試験生物活性組成物の濃度の増加によって減少する。阻害の濃度依存性の分析は、５０％阻害（ＩＣ５０）を達成するために必要な各試験生物活性内の乾燥物質の濃度として表される阻害活性の強度の定量を可能にするだけでなく、阻害の様式に関連する情報も提供する。
【０２２１】
ＩＣ５０の決定のためのエラスターゼの濃度は２．５μｇ／ｍｌであり、基質の濃度は１５０μＭであった。Ｋｉの決定のための基質の濃度は１００μＭおよび２００μＭであった。
【０２２２】
方法６：ゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ−９）阻害活性の決定のための方法。免疫認識によってゼラチナーゼＢを特異的にマルチウェルマイクロプレートに捕捉する、商業的に流通されているアッセイ（「Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ」によって生産されたＭＭＰ−９  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ＥＬＩＳＡ）を、他のタンパク質分解酵素を洗浄除去した後に使用した。酵素活性をゼラチナーゼＢのための低分子量合成基質：ＡＰＭＡの加水分解によって４０５ｎｍで検出した。阻害の濃度依存性の分析を試験生物活性組成物乾燥物質の強度を決定するために使用した。
【０２２３】
方法７：スーパーオキシド除去活性の決定のための方法。キサンチン酸化酵素（「Ｓｉｇｍａ」によって生産された精製酵素調製物）を使用する酵素系を、スーパーオキシドアニオンを高収量で制御された様式で生成するために使用した。この酵素によるキサンチンのハイドロキサンチンへの変換は、スーパーオキシドアニオンの量を生成し、フェリチトクロムｃのフェロチトクロムｃへの還元をスーパーオキシドレベルの高感度尺度として使用した。反応系に試験生物活性組成物を加えた場合のフェロチトクロムｃレベル（５５０ｎｍ）の測定は、それらのスーパーオキシド除去活性の決定を可能にする。１ウェルあたりの最終濃度はチトクロムｃ  ７５μＭ、キサンチン４２５μｍ／Ｌ、およびキサンチン酸化酵素１０ｍＵ／ｍｌであった。
【０２２４】
方法８：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性およびアポトーシスの決定のための方法。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ＡｓｓａｙおよびＣｙｔｏＴｏｘ  ９６Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙならびに続くプロトコールを調査した（両アッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓによって生産された）。
【０２２５】
第１のアッセイは、テトラゾリウム化合物（３−（４，５−ジメチルチアゾール（dimethylthiaazol）−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内塩、ＭＴＳおよび電子結合試薬（メト硫酸フェナジン、ＰＭＳ）を調べる生細胞の数を決定するための比色法である。ＭＴＳは、４９０μｍに最大吸光度を有する組織培養培地に可溶性のホルマザン産物に細胞によって生体還元される。ＭＴＳの水性、可溶性ホルマザンへの変換は、代謝的に活性な細胞において見出されるデヒドロゲナーゼ酵素によって達成され、ホルマザン産物の量は培養物中の生細胞の数に直接比例する。
【０２２６】
第２のアッセイは、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、細胞溶解で放出される安定サイトゾル性酵素を定量的に測定する。細胞培養上清中に放出されたＬＤＨを、テトラゾリウム塩（ＩＮＴ）の赤ホルマザン産物への変換を生じる３０分間共役酵素アッセイで測定した。形成される色の量は、融解した細胞の数に比例する。
【０２２７】
方法９：刺激された細胞によって分泌された酵素のレベルの決定のための方法。ＰＭＡとのインキュベーション後、Ｍｏｎｏ  Ｍａｃ  ６細胞は、２種のゼラチン分解マトリクスメタロプロテイナーゼ、ＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）およびＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）を分泌する。試験生物活性組成物の存在下でのこれらの酵素のレベルを２次元ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定した。
【０２２８】
［実施例２１］
ツバキ属（Camellia）産物の特定の生物活性特徴を試験するために使用された細胞株
進行乳がんのモデルであると考えられている細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１２９）から得た。この細胞株を次のＡＴＣＣ培地中３７℃で培養した：０．０１ｍｇ／ｍｌインスリン、９０％；ウシ胎児血清、１０％を補充した２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含むリーボビッツＬ−１５培地。
【０２２９】
初期またはあまり脱分化していない乳がんのモデルと考えられている細胞株ＭＣＦ−７は、ＡＴＣＣ（番号ＨＴＢ−２２）から得て、次のＡＴＣＣ培地中で３７℃で培養した：２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含む最小必須培地（イーグル）および１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸および１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有するように調製し、０．０１ｍｇ／ｍｌウシインスリン、９０％；ウシ胎児血清、１０％を補充したアールＢＳＳ。
【０２３０】
分化したヒト単球によく似ている細胞株ＭｏｎｏＭａｃ６（ＭＭ６、ｔｈｅ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓから得た）（Ziegler-Heitbrock et al., “Establishement of a Human Cell Line (Mono Mac 6) with Characteristics of Mature Monocytes,” International Journal of Cancer 41:456-461 (1988)、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。細胞を２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０％ＦＣＳ、非必須アミノ酸、９μｇ／ｍｌインスリンおよび１ｍＭオキサル酢酸を補充したＲＰＭＩ１６４０で維持した。アッセイ条件のために０．２％グルコースも加えた。
【０２３１】
［実施例２２］
ツバキ属（Camellia）産物のカテキン分析
本発明の細胞壁画分抽出物、膜画分抽出物および細胞汁漿液を、種々のカテキンの含有量について分析した。白茶試料を対照として使用した。次のカテキンをアッセイした：（−）−エピガロカテキン、（＋）−カテキン、（−）−エピカテキン、（−）−没食子酸エピガロカテキン、（−）−没食子酸ガロカテキンおよび（−）−没食子酸エピカテキン。
【０２３２】
試料を０．１％Ｈ３ＰＯ４および約１５分間の超音波処理を使用して抽出した。遠心分離後、抽出物をＨＰＬＣに注入した。Ｃ−１８逆相カラムを固定相として使用した。０．１％リン酸およびアセトニトリルを移動相として使用した。検出は２８０ｎｍであった。算出は、その純粋標準品と共に列挙した各カテキンの面積を比較することに基づく。結果を図３８および表１６（下）に示す。
【０２３３】
【表１６】
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【０２３４】
［実施例２３］
特定のツバキ属（Camellia）産物の機能性飲料およびパーソナルケア適用
序論：生きている茶植物の能力の応用
皮膚は、ヒト身体で最も大きな器官であり、他者に最も目に見えるものである。その外観は、外側損傷および局所ケアだけでなく、その人の健康状態および良好状態（well being）を反映する。Ｅｐｓｔｅｉｎによる近年の概説により健康な代謝を、特にインスリン感受性、血液糖レベルおよびアミノ酸の適切な摂取に関して、維持することは、より若く見える皮膚を維持するために重要である。同時に、酸化損傷および炎症の悪循環を制御することは極めて重要なままである。［１］
【０２３５】
Ｌｅｓｌｅｙ  Ｅ．Ｒｈｏｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．による近年の研究は、緑茶化合物の潜在的な健康上の利益に、経口的に摂取された場合の緑茶カテキンを加える。緑茶カテキン代謝産物がヒト皮膚に組み込まれ、炎症性促進性エコサノイド１２−ヒドロキシエイコサテトラエン酸の産生の低減に関連してＵＶ照射誘導皮膚炎症に対して保護し、日光皮膚炎症および潜在的には長期ＵＶＲ調節損傷に対する保護に寄与できる可能性があることが発見された。［２］
【０２３６】
したがって茶植物、チャノキ（Camellia sinensis）は、内側からおよび外側から皮膚健康に取り組むことを助ける可能性がある。
【０２３７】
生きているチャノキ（Camellia sinensis）からＺｅｔａ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ（商標）技術を介してパーソナルケア適用可能性のために開発された成分、Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳ、およびその多機能性活性はKoganov et al. in the November 2012 issue of Personal Care magazineによって以前記載された。［３］
【０２３８】
この実施例２３は、構想「内側からの美」を潜在的に支持できる機能性飲料のためにおよび抗酸化物質特性を有する局所パーソナルケア製剤のために、生きている茶植物の能力を適用することに関する継続的研究を包含する。さらにこの実施例２３は、この成分に基づく飲料調製物対伝統的緑茶および紅茶調製物ならびに市販の茶をベースとする飲料の比較評価を含有する。
【０２３９】
構想「内側からの美」を支持する機能性飲料のための−Ｐｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）
Ｚｅｔａ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ（商標）技術を機能性飲料適用、Ｐｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）、および局所化粧用適用、Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳ植物漿液画分の両方のための潜在的成分を開発するために使用した。
【０２４０】
パーソナルケア用成分、Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳ［３］と、機能性飲料適用のための潜在的成分として開発されたＰｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）との間の差異は、製造レジームおよび具体的な適用のために好適な保存系に関連する。
【０２４１】
Ｐｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）対紅茶および緑茶伝統的調製物
Ｐｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）、緑茶および紅茶伝統的調製物は、米国サウスカロライナ州の中心のＷａｄｍａｌａｗ島に位置するＣｈａｒｌｅｓｔｏｎ  Ｔｅａ  Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎで２０１２年６月に収集された同じ茶栽培品種から得た。同じ栽培品種の使用は、茶植物からの異なる調製物の正確な比較のために非常に重要であり、Ｋａｒｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．によって栽培品種型が茶産物の特性に顕著な影響を与える場合があることが示されており［４］、したがって同じ栽培品種の使用は栽培品種型に関する変動を除く。
【０２４２】
Ｐｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）調製物：Ｐｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）を、その開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＫｏｇａｎｏｖ  ＵＳ７，４７３，４３５、８，０４３，６３５および８，３１８，２２０に記載のプロセスにより調製した。［５〜７］
【０２４３】
紅茶伝統的調製物：脱イオン水を約９９℃に加熱し、ｔｉｎ等級の袋に入れていない紅茶２．０ｇをビーカーに入れ、水が望ましい温度に達したら、水を茶が入ったビーカーに注ぎ、ビーカーに蓋をし、磁気撹拌器に４分間置き、４分間経ったら、ビーカーを攪拌機から外し、紅茶調製物を濾し器を通して注ぎ、室温に冷ました。
【０２４４】
緑茶伝統的調製：脱イオン水を約８５℃に加熱し、ｔｉｎ等級の袋に入れていない緑茶２．０ｇをビーカーに入れ、水が標的温度に達したら、水を茶が入ったビーカーに注ぎ、ビーカーに蓋をし、磁気撹拌器に２分間置き、２分間過ぎた後、ビーカーを攪拌機から外し、緑茶調製物を濾し器を通して注ぎ、冷ました。
【０２４５】
分析評価
生きている茶植物由来のＰｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）対紅茶および緑茶伝統的調製物の物理化学的パラメーターを下の表１７に示す。
【０２４６】
【表１７】
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【０２４７】
Ｐｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）、紅茶および緑茶伝統的調製物のＬＣ（液体クロマトグラフィー）−ＥＬＳＤ（蒸発光散乱検出器）評価を実施した。
【０２４８】
ＥＬＳＤ絶対シグナル強度対保持時間を図３９に示し、ＥＬＳＤ相対シグナル強度対保持時間を図４０に示す。
【０２４９】
図３９でのピーク高さの差異は、試験品中の個々の構成成分の濃度における差異を示している。
【０２５０】
図４０に、同じデータをピークの位置およびそれらのサイズの比を示すためにそれぞれのシグナル強度の「０」が最小値であり、「１」が最大値であるように合わせた。
【０２５１】
ＬＣ（液体クロマトグラフィー）−ＤＡＤ（ダイオードアレイ検出器）評価も実施した。それぞれのＬＣ−ＤＡＤ３次元クロマトグラムを図４１〜４３に示す。
【０２５２】
これらの特徴付けおよびフィンガープリント法からのデータは、緑茶および紅茶伝統的調製物と比較してＰｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）の組成物において注目に値する質的差異を示している。Ｐｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）は、さらに高い固体含有量、特定のピークのより良い提示および化合物のさらに広い多様性を有する。全体として、Ｐｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）は伝統的紅茶および緑茶伝統的調製物よりもさらに高い濃度を有し、さらなる構成要素を含有し、その特徴付けは継続中である。
【０２５３】
ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析）によって分析されたＬ−テアニン濃度
Ｌ−テアニンは、茶植物の葉においてほとんど排他的に見出され、サプリメントとして経口的に摂取された場合に種々の健康的利益を提供する非必須アミノ酸である。［８］スキンケア製品を生産しているいくつかの企業は、彼らの化粧品にＬ−テアニンを含め始めている。例えばダーマスクリプティブ（Dermascriptive）は、ストレスを受けた皮膚に潤いを与え、栄養を与えるためにＬ−テアニンをナイトクリームに含んでいる。［９］
【０２５４】
３種の試料におけるＬ−テアニンの量を下の表１８に示す。
【０２５５】
【表１８】
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【０２５６】
液体クロマトグラフィー−質量分析は、Ｐｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）が伝統的紅茶および緑茶調製物よりもさらに高いＬ−テアニンの濃度を有することを示している。
【０２５７】
Ｐｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）対紅茶、緑茶伝統的調製物および市販の茶をベースとする飲料の抗酸化活性
市販の茶をベースとする飲料の成分（ラベル情報）および物理化学的パラメーターを下の表１９に表す。
【０２５８】
【表１９】
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【０２５９】
Ｐｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）、紅茶および緑茶伝統的調製物対市販の茶をベースとする飲料の相対的ＯＲＡＣ活性を図４４に表す。
【０２６０】
ＯＲＡＣ試験は、試験した商業的に生産された緑茶飲料のものを示し、最も高いＯＲＡＣ値は、最も低いもののおよそ５倍高い。試験した伝統的茶調製物の活性は、この範囲内に入る。しかし飲料の抗酸化活性が、クエン酸およびアスコルビン酸などの茶以外の供給源およびいくつかの場合ではハーブ抽出物に一部由来することに留意されたい。Ｐｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）の活性は、試験した市販の緑茶飲料の最良の性能よりも２０倍を超えて高く、５％Ｐｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）調製物でさえ試験した市販の飲料に勝っている。これは、Ｐｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）が既存の飲料に抗酸化活性を加えるため、またはそれをベース活性成分として使用して機能性飲料を作るための強力な成分である可能性があることを示唆している。
【０２６１】
抗酸化物質特性を有するパーソナルケア製剤
パーソナルケア製剤を表２０に示すとおり、それらの抗酸化物質特性について研究した。
【０２６２】
【表２０】
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【０２６３】
０．５％Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳを含む美容液ジェルおよびＲｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳを含まない美容液ジェルベースの抗酸化活性をＯＲＡＣアッセイで評価した。これらの製剤をそれらの評価の前に室温および４５℃に２ヶ月保存した。相対ＯＲＡＣ活性、これらの試験品の％を図４５に表す。
【０２６４】
パーソナルケアプロトタイプについてのデータが示すとおり、Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳの抗酸化物質効果がベース美容液ジェル製剤の効果を注目に値して超えていることを示している。４５℃、２ヶ月で実施された加速安定性試験の際に、製剤の抗酸化物質の効果は、美容液ジェルベースについて約１１％まで減少し、Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳを含む美容液ジェルについては約４％までだけであった。データは、Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳがパーソナルケアジェルプロトタイプ中でその活性を保持しており、製剤の他の構成成分の抗酸化活性を保つことを助けることを実証している。
【０２６５】
方法
浸透圧、単位質量溶液あたりの溶質粒子の数（例えば、１キログラムあたりのミリオスモル）を、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ（Ｎｏｒｗｏｏｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）からの凝固点降下浸透圧計Ｍｏｄｅｌ  ３２５０を装置の説明書に基づいた手順により使用して測定した。
【０２６６】
屈折率、ｎＤ、ある媒体から他へ通過する場合に光線がどのように曲がるかを決定する、真空中の光の速度と他の媒体中での光の速度の比をＲｅｉｃｈｅｒｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｄｅｐｅｗ、ＮＹ、ＵＳＡ）からのＲｅｉｃｈｅｒｔ  Ａｒｉａｓ  ５００  Ｒｅｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒを装置の説明書に基づいた手順により使用して２０℃で測定した。
【０２６７】
密度、単位体積あたりの質量の測定（例えば１立方センチメートルあたりのグラム数）をＭｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ  ＬＬＣ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ、ＵＳＡ）からのＤｅｎｓｉｔｏ  ３０  ＰＸ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒを使用して周囲条件で、装置の説明書に基づいた手順により使用して測定した。
【０２６８】
乾燥物質、水および揮発性化合物を１０５℃、２４時間で試料から蒸発させた後に残っている質量の百分率として、Ｏｈａｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  （Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）からのＯｈａｕｓ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  Ｅ００６４０  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ＢａｌａｎｃｅおよびＳＰＸ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）からのＬｉｎｄｂｅｒｇ  Ｂｌｕｅ  Ｍ  Ｇｒａｖｉｔｙ  Ｏｖｅｎを一般的研究室業務での手順により使用して決定した。
【０２６９】
ＬＣ（液体クロマトグラフィー）−ＥＬＳＤ（蒸発光散乱検出器）またはＤＡＤ（ダイオードアレイ検出器）。３種の試料を正味各４μｌ注入で逆相Ｃ１８カラム（Ｋｉｎｅｔｅｘ  Ｃ１８  Ｃｏｒｅｓｈｅｌｌ、４．６ｍｍ  ｉ．ｄ．×１０ｃｍ、２．６μｍ粒子サイズ、および１００Åポアサイズ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＵＳＡ）を備えるＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＬＣ系、４０℃で分離した。溶媒勾配を溶媒Ａ（０．１％ギ酸を含む１００％水）および溶媒Ｂ（０．１％ギ酸を含む１００％アセトニトリル）を流速０．８ｍＬ／分で混合することによって作った。２５分間ＬＣ勾配を次のとおり作った：０〜０．５分に５％溶媒Ｂ（均一濃度）、０．５〜６．５分に５％〜３０％溶媒Ｂ（比例）、６．５〜１３．５分に３０％〜１００％溶媒Ｂ（比例）、１３．５〜１８．５分に１００％溶媒Ｂ（均一濃度）、１８．５〜２０分に１００％〜５％溶媒Ｂ（比例）、２０〜２５分に５％溶媒Ｂ（均一濃度）。データはＥＬＳＤ（Ｍｏｄｅｌ  ３００Ｓ、ＳｏｆＴＡ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗｅｓｔｍｉｎｓｔｅｒ、ＣＯ、ＵＳＡ）およびＤＡＤ（１０４０Ａ、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）によって複数の波長（ＵＶ＝２０４ｎｍ、２５４ｎｍ、２７０ｎｍ、２８０ｎｍ、３２０ｎｍ、３５０ｎｍおよび４１０ｎｍ）で回収した。
【０２７０】
Ｌ−テアニン分析のためのＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析）。試料をＬＣ−ＭＳ分析の前に希釈した：Ｐｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）を１００倍希釈した。紅茶および緑茶伝統的調製物を１０倍希釈した。定量のための検量線を作成するために、Ｌ−テアニン標準物を種々の濃度で調製した。Ａｑｕａ  Ｃ１８カラム（４．６μｍ  ｉ．ｄ．×１５ｃｍ、５μｍ粒子サイズおよび１２５Åポアサイズ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＵＳＡ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００ＬＣ系を、均一濃度の溶媒Ａ（０．１％ギ酸を含む８０％水および２０％アセトニトリル）、流速０．８ｍＬ／分、４分間で試料を分離するために使用した。ＬＣ系をエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）供給源（ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ，Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を介して飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析器につなぎ、ＭＳスペクトルをｍ／ｚ５０〜５００ｍ／ｚ（ポジティブモード）の走査範囲について取得した。Ｌ−テアニンは約１．９分の保持時間で溶出され、その特徴的イオン１７５．２ｍ／ｚによって定量した。
【０２７１】
酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）。抗酸化活性を、ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）からのＳｙｎｅｒｇｙ  ２マイクロプレートリーダーでの使用のために変更された（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｄｏｃｓ／ＯＲＡＣ＿Ａｓｓａｙ＿Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ＿Ｎｏｔｅ．ｐｄｆ）で利用可能なＢｉｏＴｅｋからのアプリケーションノート「Ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  Ｃａｐａｃｉｔｙ（ＯＲＡＣ）Ａｓｓａｙｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ  Ｍｕｌｔｉ−Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ」に記載されている方法を使用してＯＲＡＣ試験によって決定した。このアッセイでは、ＡＡＰＨ（２，２’−アゾビズ２−アミノ−プロパン）が蛍光プローブ（フルオレセインナトリウム）を損傷する反応性酸素種を生成する。（Ｒ）−トロロクスメチルエーテルなどの抗酸化物質がこの損傷を妨害するまたは遅くし、それらの効果は蛍光測定によって定量できる。蛍光読み値は、励起波長設定４８５ｎｍおよび発光波長設定５２８ｎｍ、反応容積２００μｌ、ＡＡＰＨ濃度５５ｍＭ、フルオレセインナトリウム濃度１．３３μＭおよび（Ｒ）−トロロクスメチルエーテル濃度範囲８０μＭから２μＭで２時間、３７℃で継続的に取得された。フルオレセインナトリウム（Ｆｌｕｋａ  ４６９６０）、ＡＡＰＨ（Ｓｉｇｍａ  ４４０９１４）および（Ｒ）−トロロクスメチルエーテル（Ｆｌｕｋａ  ９３５０９）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得た。ＡＵＣ（曲線下面積）値は、比（ウェルの現在の蛍光読み値をウェルの最初の蛍光読み値で割る）の合計として算出した。脱イオン水を含むウェルのＡＵＣ値の平均を、抗酸化物質による蛍光の保存に対応するＡＵＣを得るために、（Ｒ）−トロロクスメチルエーテルを含むウェルおよび試験品を含むウェルのＡＵＣから減算した。検量線を（Ｒ）−トロロクスメチルエーテル重量等量ＯＲＡＣ活性を示す、ウェルの抗酸化物質関連ＡＵＣの関数として作成した。試料の希釈は、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ（Ｂｏｈｅｍｉａ、ＮＹ）からのＶｏｒｔｅｘ  Ｇｅｎｉｅ  ２を使用して脱イオン水中で調製した。美容液ジェル試料を２５％から３．１２５％のｗ／ｗ濃度で希釈し、従来の茶調製物を１０％から０．３１％の間のｗ／ｗ濃度で希釈し、Ｐｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）を２％から０．１３％の間のｗ／ｗ濃度で希釈した。試験品についてのＯＲＡＣ活性を、より少ない数がより高いＯＲＡＣ活性を示して、１単位重量の（Ｒ）−トロロクスメチルエーテルによって産生されるものと同等の抗酸化物質効果を達成するために必要な試験品の単位重量として算出した。
【０２７２】
結論
適用した特徴付けおよびフィンガープリンティング法からのデータは、緑茶および紅茶伝統的調製物と比較した場合に注目すべき定量的差異を、Ｚｅｔａ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ（商標）技術を使用して得たＰｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）の組成物において示す。Ｐｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）は、さらに高い固体含有量、特定のピークのより良い提示、および化合物のより広い多様性を有する、さらに、伝統的紅茶および緑茶調製物よりもさらに高いＬ−テアニン濃度を有する。全体としてＰｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）は、伝統的紅茶および緑茶伝統的調製物よりもさらに高い濃度を有し、さらなる構成要素を含有する。Ｐｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）の活性は、試験した市販の緑茶飲料の最良の性能よりも２０倍を超えて高く、５％Ｐｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）飲料プロトタイプでさえ試験したすべての市販の飲料に勝っている。これは、Ｐｕｒｅｃｅｎｔｉａ（商標）チャノキ（Camellia sinensis）が既存の飲料に抗酸化活性を加えるため、またはそれをベース活性成分として使用して機能性飲料を作るための強力な成分である可能性があることを示唆している。化粧用成分Ｒｅｃｅｎｔｉａ（登録商標）ＣＳは、パーソナルケアジェルプロトタイプ中でその抗酸化活性を保持しており、製剤の他の構成成分の抗酸化活性を保つことを助ける。
【０２７３】
実施例２３のための参考文献
下は実施例２３において引用された参考文献である：
[1]  Howard A. Epstein. The challenges of formulating “beauty from within” products for skincare. Monographic supplement series: Anti-Aging&Beauty Inside. Household and Personal care Today n 1/2012 & AgroFOOD Industry hi-tech vol 23 n 1 January/February 2012, pp. 23-2;
[2]  Lesley E. Rhodes, Gemma Darby, Karen A. Massey, Kayleigh A. Clarke, Tristan P. Dew, Mark D. Farrar, Susan Bennett, Rachel E. B. Watson, Gary Williamson and Anna Nicolaou. Oral green tea catechin metabolites are incorporated into human skin and protect against UV radiation-induced cutaneous inflammation in association with reduced production of pro-inflammatory eicosanoid 12-hydroxyeicosatetraenoic acid. British Journal of Nutrition, available on CJO2013. doi:10.1017/S0007114512006071;
[3]  Michael Koganov, Olga Dueva-Koganov, Artyom Duev, Paul Recht, Steven Micceri. Managing the effects of photoaging of skin. Personal Care, November 2012, pp. 89-92;
[4]  Karori, S. M., Wachira, F. N., Wanyoko, J. K. and Ngure, R. M. Antioxidant capacity of different types of tea products. African Journal of Biotechnology Vol. 6 (19), pp. 2287-2296, 4 October 2007;
[5]  Koganov, M., U.S. Patent No. 7,473,435. Bioactive compositions form Theacea plants and processes for their production and use;
[6]  Koganov, M., U.S. Patent No. 8,043,635. Bioactive compositions form Theacea plants and processes for their production and use;
[7]  Koganov, M., U.S. Patent No. 8,318,220. Bioactive compositions form Theacea plants and processes for their production and use;
[8]  www.bigelowtea.com/health/articles/l-theanine-how-a-unique-anxiety-reducer-and-mood-enhancer-increases-alpha-waves-and-alertness-.aspx; and
[9]  www.livestrong.com/article/103022-benefits-using-l-theanine/.
【０２７４】
本明細書に記載の参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明への先行技術であることの承認として解釈されるべきではない。本明細書に引用のすべての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２７５】
好ましい実施形態が本明細書において詳細に描かれ、記載されているが、種々の修飾、付加、置換などを本発明の精神から逸脱することなく作製することができ、したがってこれらが続く特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると考えられることは当業者に明らかである。
【図１】
2016513099.tif 000024
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2016513099.tif 000029
【図７Ａ】
2016513099.tif 000030
【図７Ｂ】
2016513099.tif 000031
【図８Ａ】
2016513099.tif 000032
【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2016513099.tif 000036
【図１２】
2016513099.tif 000037
【図１３】
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【図１４】
2016513099.tif 000039
【図１５】
2016513099.tif 000040
【図１６】
2016513099.tif 000041
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
2016513099.tif 000061
【図３７】
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【図３８】
2016513099.tif 000063
【図３９】
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【図４０】
2016513099.tif 000065
【図４１】
2016513099.tif 000066
【図４２】
2016513099.tif 000067
【図４３】
2016513099.tif 000068
【図４４】
2016513099.tif 000069
【図４５】
2016513099.tif 000070
【国際調査報告】
2016513099.tif 000071
2016513099.tif 000072