(57)【要約】  結腸直腸腺腫を評価する方法、プローブおよびキット。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の結腸直腸腺腫の予後を判定する方法であって、
ハイブリダイゼーション条件下で、前記患者から得た結腸直腸腺腫の試料をＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）の遺伝子座特異的プローブ、ＤＣＣ（結腸直腸癌欠失）の遺伝子座特異的プローブ、ＣＥＰ１８（１８番染色体の染色体計数プローブ）、１３ｑ１４（１３番染色体のｑアーム上のバンド１４）の遺伝子座特異的プローブおよびＭＹＣ（ｃ−ｍｙｃ癌遺伝子）の遺伝子座特異的プローブを含む検出可能に標識されたプローブと接触させるステップと、
染色体異常の存在または非存在を決定するステップと
を含み、
染色体異常がないことは、結腸直腸腺腫の再発のリスクが低いことおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが低いことを示し、
ＥＧＦＲのコピー数増加は、結腸直腸腺腫の再発のリスクが増加していることおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが増加していることを示し、
ＣＥＰ１８に対するＤＣＣのコピー数減少は、結腸直腸腺腫の再発のリスクが増加していることおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが増加していることを示し、
ＣＥＰ１８に対するＤＣＣのコピー数減少、１３ｑ１４のコピー数増加およびＭＹＣのコピー数増加とさらに組み合わせたＥＧＦＲのコピー数増加は、結腸直腸腺腫の再発のリスクが高いことおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが高いことを示し、
もって患者の結腸直腸腺腫の予後が判定される、方法。
【請求項２】
結腸直腸腺腫の試料が、患者からの新鮮試料である、患者から得る時に凍結される、または患者から得たときにホルマリン固定され、パラフィン包埋される（ＦＦＰＥ）、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
結腸直腸腺腫の試料が患者から得た結腸直腸腺腫の試料から単離した上皮細胞の試料である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上皮細胞の試料が、
（ａ）結腸直腸腺腫の新鮮な試料または解凍した新鮮凍結試料を室温で、ハンクス緩衝液中ですすぐステップと、
（ｂ）前記すすいだ試料を、２０ｍＭ  ＤＴＴおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む予熱したハンクス緩衝液に３７℃で約５分間浸漬するステップと、
（ｃ）前記すすいで浸漬した試料を、２０ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、５ｍＭ  ＣａＣｌ２および１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含むハンクス緩衝液に移し、約５秒から約１０秒間混合するステップと、
（ｄ）約１０００×ｇで約１０分間の遠心分離によって細胞をペレット化するステップと、
（ｅ）（ｄ）からの上清を捨てて、前記ペレット化細胞を残留上清に再懸濁するステップと、
（ｆ）（ｅ）からの再懸濁細胞を、約３０重量％から約６０重量％のメタノール、約４０重量％から約７０重量％の水、緩衝液および保存剤を含む溶液に入れ、この溶液を一晩室温に保つステップと
を含む方法により得られる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（ｇ）（ｆ）からの細胞を細胞診スライドに移すステップと、
（ｈ）前記スライドを９５％エタノールに室温で約１５分間浸漬するステップと、
（ｉ）前記スライドをカーノイズ溶液（３：１メタノール：酢酸固定液）に室温で３０分間浸漬するステップと、
（ｊ）前記スライドを室温で乾燥させるステップと
をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
結腸直腸腺腫の試料が、検出可能に標識されたプローブのセットと接触させる前に、細胞診スライドに固定される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
結腸直腸腺腫の試料中の上皮細胞の存在が、前記細胞を標識抗ＣＡＭ５．２抗体と接触させることによって確認される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
検出可能に標識されたプローブが、ＳＴＡＴ１（シグナル伝達性転写因子１）の遺伝子座特異的プローブおよび／またはＡＵＲＫＡ（オーロラキナーゼＡ）の遺伝子座特異的プローブをさらに含む、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＥＧＦＲの遺伝子座特異的プローブ、ＤＣＣの遺伝子座特異的プローブ、１８番染色体の染色体計数プローブ（ＣＥＰ１８）、１３ｑ１４の遺伝子座特異的プローブおよびＭＹＣの遺伝子座特異的プローブを含むプローブのセット。
【請求項１０】
ＳＴＡＴ１の遺伝子座特異的プローブおよび／またはＡＵＲＫＡの遺伝子座特異的プローブをさらに含む、請求項９に記載のプローブのセット。
【請求項１１】
（ａ）患者の結腸直腸腺腫の予後を可能にするプローブのセットであって、ＥＧＦＲの遺伝子座特異的プローブ、ＤＣＣの遺伝子座特異的プローブ、ＣＥＰ１８（１８番染色体の染色体計数プローブ）、１３ｑ１４の遺伝子座特異的プローブおよびＭＹＣの遺伝子座特異的プローブを含むプローブのセットと、
（ｂ）患者の結腸直腸腺腫の予後を判定するための指示であって、前記患者から得た結腸直腸腺腫の試料で染色体異常の存在または非存在を決定することを含む指示と
を含むキットにおいて、
染色体異常がないことは、結腸直腸腺腫の再発のリスクが低いことおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが低いことを示し、
ＥＧＦＲのコピー数増加は、結腸直腸腺腫の再発のリスクが増加していることおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが増加していることを示し、
ＣＥＰ１８に対するＤＣＣのコピー数減少は、結腸直腸腺腫の再発のリスクが増加していることおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが増加していることを示し、
ＣＥＰ１８に対するＤＣＣのコピー数減少、１３ｑ１４のコピー数増加およびＭＹＣのコピー数増加とさらに組み合わせたＥＧＦＲのコピー数増加は、結腸直腸腺腫の再発のリスクが高いことおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが高いことを示す、キット。
【請求項１２】
プローブのセットがＳＴＡＴ１の遺伝子座特異的プローブおよび／またはＡＵＲＫＡの遺伝子座特異的プローブをさらに含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
腺腫の試料から上皮細胞を単離する方法であって、
（ａ）腺腫の新鮮な試料または解凍した新鮮凍結試料を室温で、ハンクス緩衝液中ですすぐステップと、
（ｂ）前記すすいだ試料を、２０ｍＭ  ＤＴＴおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む予熱したハンクス緩衝液に３７℃で約５分間浸漬するステップと、
（ｃ）前記すすいで浸漬した試料を、２０ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、５ｍＭ  ＣａＣｌ２および１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含むハンクス緩衝液に移し、約５秒から約１０秒間混合するステップと、
（ｄ）約１０００×ｇで約１０分間の遠心分離によって細胞をペレット化するステップと、
（ｅ）（ｄ）からの上清を捨てて、前記ペレット化細胞を残留上清に再懸濁するステップと、
（ｆ）（ｅ）からの再懸濁細胞を、約３０重量％から約６０重量％のメタノール、約４０重量％から約７０重量％の水、緩衝液および保存剤を含む溶液に入れ、この溶液を一晩室温に保つステップと
を含む方法。
【請求項１４】
（ｇ）（ｆ）からの細胞を細胞診スライドに移すステップと、
（ｈ）前記スライドを９５％エタノールに室温で約１５分間浸漬するステップと、
（ｉ）前記スライドをカーノイズ溶液（３：１メタノール：酢酸固定液）に室温で３０分間浸漬するステップと、
（ｊ）前記スライドを室温で乾燥させるステップと
をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
使用するまで−２０℃で保存することができる、請求項１３または１４に記載の方法により腺腫の試料から単離した上皮細胞を含む細胞診スライド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１４日に出願され、これにより全体が参照により組み込まれる米国特許仮出願第６１／７８６０６２号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、進行のリスクを含む予後、治療剤による治療に対する潜在的反応性の評価、再発の監視および癌、特に結腸直腸腺癌の治療的処置の有効性の評価、染色体異常（例えば、ＤＮＡコピー数の変化）の検出の方法、新鮮、新鮮凍結またはホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）哺乳動物、例えば、ヒト組織から上皮細胞を単離する方法およびインサイツハイブリダイゼーション法、ならびにこのような方法に有用なプローブのセットおよびキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
腺腫から癌への進行中に生じる特徴のはっきりした分子イベントにもかかわらず（Ｍｅｉｊｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．５１：９０１−９０９（１９９８））、結腸癌は、世界中の死亡率の主要な原因のままである。結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、欧州および米国における第３の最も代表的な癌および癌死亡の第２の最も主要な原因であり、毎年３０００００の新たな件数および２０００００件の死亡がある（Ｍｉｄｇｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３５３：３９１−３９９（１９９９））。結腸直腸上皮が発癌性形質転換して浸潤癌を形成することは、腫瘍特異的遺伝子異常および染色体異数性の連続的な獲得によって駆動される（Ｆｅａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６１：７５９−７６７（１９９０）；Ｒｉｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １５：２３４−２４５（１９９６））。
【０００４】
腺起源の良性腫瘍、即ち、腺腫は、徐々に悪性になり得、この時点で腺癌と呼ばれる。全ての腺腫が腺癌に進行するわけではない。実際、腺腫のほんの一部だけが腺癌に進行する。
【０００５】
ゲノム不安定性が腺腫から腺癌への進行の主要な構成要素である。進行の約１５％で、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩまたはＭＩＮと示される。）につながるＤＮＡミスマッチの修復の欠損が存在する（ｄｉ  Ｐｉｅｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２９：１０４７−１０５９（２００５））。進行の残り８５％で、染色体レベルの異数性（ＣＩＮと示される。）が存在する。ＤＮＡコピー数の変化が特異的パターンで生じ、異なる臨床的挙動に関連していることが現在確立されている（Ｈｅｒｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２３：１１０９−１１１９（２００２））。
【０００６】
４、５、７、８、１３、１５、１７、１８および２０番染色体に関する染色体異常がＣＲＣで頻繁に報告されている。報告によれば、腺腫から腺癌への進行は、８ｐ、１３ｑおよび２０ｑ増加ならびに８ｐ、１５ｑ、１７ｐおよび１８ｑ消失に関連している（Ｈｅｒｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）、上記）。ＣＲＣで最も頻繁に観察される染色体異常は、２０ｑの増加であり、報告によればこれはＣＲＣ症例の６５％超で発生している（Ｍｅｉｊｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）、上記）。報告によれば、２０ｑ、特に２０ｑ１２−ｑ１３の増加が、ＣＲＣの予後不良と関連している。
【０００７】
Ｓｉｅｎｎａら（２００９年１２月２２日に発行された米国特許第７６３５５７０号明細書）は、ＣＲＣ試料における蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子のコピー数の決定を開示している。この方法は、ＥＧＦＲ遺伝子のコピー数の増加がある場合など、ＥＧＦＲに結合する薬剤がＣＲＣを治療するのに効果的かどうかを予測するのに有用であることが開示されている。この方法はまた、ＣＲＣの治療の有効性を評価するのに有用であることが開示されており、ここでは治療後のＥＧＦＲ遺伝子のコピー数の減少は治療が有効であることを示す。Ｓｉｅｎｎａらは、ＥＧＦＲの過剰発現が癌の予後と相関し得るかどうかについての当技術分野における矛盾する報告を開示している。
【０００８】
Ｐｅｒｕｃｈｏら（２００６年８月１５日に発行された米国特許第７０９０９７８号明細書）は、結腸癌などの腫瘍を同定するための任意プライムＰＣＲ（ＡＰ−ＰＣＲ）による、突然変異、具体的には挿入および欠失の検出を開示している。Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎら（１９９６年７月２日に発行された米国特許第５５３２１０８号明細書、１９９７年１２月３０日に発行された米国特許第５７０２８８６号明細書および１９９８年１１月１０日に発行された米国特許第５８３４１９０号明細書）は、ＴＮＭ（Ｔは原発腫瘍を表し、Ｎは所属リンパ節併発を表し、Ｍは転移を表す、国際対がん連合（ＵＩＣＣ）により開発された病期分類システム）ＩＩ期およびＩＩＩ期結腸直腸癌の患者の予後における染色体１８ｑ消失の決定を開示している。染色体１８ｑ上などの多形遺伝子マーカーは、標準的なホルマリン固定、パラフィン包埋腫瘍組織から増幅される。Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎらは、ＤＣＣ（結腸直腸癌欠失）遺伝子を具体的に同定している。
【０００９】
Ｃｏｉｇｎｅｔら（２００９年１月２０日に発行された米国特許第７４７９３７０号明細書）は、単離リンパ球において１３ｑ１４の欠失を検出する方法を開示している。報告によれば、欠失は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）と関連している。
【００１０】
Ｇａｚｄａｒら（１９９０年１月９日に発行された米国特許第４８９２８２９号明細書）は、ヒト形質細胞株を開示している。この細胞株は、再配列ｃ−ｍｙｃ癌原遺伝子（８ｑ２４）を有している。
【００１１】
マイクロアレイに基づく遺伝子発現プロファイリング（Ｈａｂｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ＆Ｃａｎｃｅｒ  ４６（１）：１０−２６（２００７））および比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）（Ｍｅｉｊｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）、上記；およびＨｅｒｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２３：１１０９−１１１９（２００２））が結腸直腸腺腫から癌への進行経路を提供することが報告されている。より最近では、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分析が、結腸直腸腺腫から腺癌への進行中にｍｉＲ−１７−９２クラスターの発現増加が起こることおよび発現増加が１３ｑ３１上のｍｉＲ１７−９２遺伝子座のＤＮＡコピー数増加およびｃ−ｍｙｃ発現と関連することを証明することが報告されている。
【００１２】
Ｒａｖａら（２０１３年２月７日に公開された米国特許出願公開第２０１３／００３４５４６号明細書）は、試験試料中の対象となる配列のコピー数多型（ＣＮＶ）を決定する方法を開示している。この方法は、試験試料中の核酸の配列読み取りの計算解析を伴う。この解析は、配列読み取りと対象となる染色体部分、例えば、１つ以上の癌遺伝子および／または１つ以上の腫瘍抑制遺伝子を含むことが知られている部分の比較を伴う。異数性は、２０ｑ１３、１９ｑ１２、１ｑ２１−１ｑ２３、８ｐ１１−８ｐ１２および１７ｑ１２などの１つ以上の領域の増幅を含むことができ、ＭＹＣ、ＥＲＢＢ２、ＣＣＮＤ１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＭＹＢ、ＭＤＭ２、ＣＣＮＥ、ＫＲＡＳ、ＭＥＴ、ＥＲＢＢ１、ＣＤＫ４、ＭＹＣＢ、ＡＫＴ２、ＭＤＭ２およびＣＤＫ４などの遺伝子を含むことができる。癌は結腸直腸癌であり得る。
【００１３】
Ｃｏｗｅｎｓら（２０１１年４月２８日に公開された米国特許出願公開第２０１１／００９７７５９号明細書）は、結腸直腸癌と診断された対象で臨床成績を予測する方法を開示している。この方法は、１つ以上の予測ＲＮＡ転写産物またはこの発現産物の発現の証拠を決定するステップを含む。
【００１４】
Ｐｉｎｔｏ  Ｍｏｒａｉｓ  ｄｅ  Ｃａｒｖａｌｈｏら（２０１１年９月２９日に公開された米国特許出願公開第２０１１／０２３６３９６号明細書）は、マーカー遺伝子のセットの発現レベルを測定することによって、染色体２０ｑ上の染色体異常を伴う結腸直腸腺癌またはこのような腺癌を発症する素因を診断するための方法および組成物を開示している。この方法は、試料中の少なくともマーカー遺伝子ＲＮＰＣ１およびＴＣＦＬ５の発現レベル上昇を検出するステップを含む。
【００１５】
Ｍｅｉｊｅｒら（２０１０年１２月２日に公開された米国特許出願公開第２０１０／０３０４３７４号明細書）は、結腸直腸腺癌細胞の存在を検出するインビトロ法を開示している。この方法は、試験試料中の共に染色体２０ｑ上で生じる少なくともマーカー遺伝子ＮＭ＿０１７４９５およびＮＭ＿００６６０２の発現上昇を検出するステップを含む。この方法は、全て染色体２０ｑ上で生じるＮＭ＿０１８８４０、ＮＭ＿００３６００、ＮＭ＿０１８２７０、ＮＭ＿００７００２およびＮＭ＿０１６３９７の発現上昇を検出するステップをさらに含むことができる。この方法は、試験試料中の表１の少なくとも１２個、表１７の少なくとも１個、表２（８ｐ）の２個以上、表３（８ｑ）の１個以上、表４（１３ｑ）の３個以上、表５（１５ｑ）の１個以上、表６（１７ｐ）の１個以上、表７（１８ｑ）の３個以上、表８（２０ｑ）の９個以上、表９（２０ｑ）の２個以上または表２（８ｐ）、表３（８ｑ）、表４（１３）、表５（１５ｑ）、表６（１７ｐ）、表７（１８ｑ）の少なくとも１個、および表８または９（２０ｑ）のいずれかなどのマーカー遺伝子の種々の他の組み合わせの発現上昇を検出するステップを含むことができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第７６３５５７０号明細書
【特許文献２】米国特許第７０９０９７８号明細書
【特許文献３】米国特許第５５３２１０８号明細書
【特許文献４】米国特許第５７０２８８６号明細書
【特許文献５】米国特許第５８３４１９０号明細書
【特許文献６】米国特許第７４７９３７０号明細書
【特許文献７】米国特許第４８９２８２９号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２０１３／００３４５４６号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２０１１／００９７７５９号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２０１１／０２３６３９６号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２０１０／０３０４３７４号明細書
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｍｅｉｊｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．５１：９０１−９０９（１９９８）
【非特許文献２】Ｍｉｄｇｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３５３：３９１−３９９（１９９９）
【非特許文献３】Ｆｅａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６１：７５９−７６７（１９９０）
【非特許文献４】Ｒｉｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １５：２３４−２４５（１９９６）
【非特許文献５】ｄｉ  Ｐｉｅｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２９：１０４７−１０５９（２００５）
【非特許文献６】Ｈｅｒｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２３：１１０９−１１１９（２００２）
【非特許文献７】Ｈａｂｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ＆Ｃａｎｃｅｒ  ４６（１）：１０−２６（２００７）
【非特許文献８】Ｈｅｒｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２３：１１０９−１１１９（２００２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
望ましくは外科的介入なしで、早期治療を可能にするために、可能な限り早期に結腸直腸腺腫から腺癌への進行を同定することが臨床的に重要である。前記に照らして、予後を判定する、例えば、結腸直腸腺腫の進行のリスクを評価するための材料および方法を提供することが本開示の目的である。材料および関連する方法を使用して、治療剤による治療に対する潜在的反応性を評価し、これによって標的治療のための治療剤の選択を可能にすること、再発を監視することおよび結腸直腸腺癌の治療的処置の有効性を評価することができる。他の目的および利点ならびに発明の特徴は、本明細書に提供される発明を実施すための形態から明らかとなるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
患者の結腸直腸腺腫の予後を判定する方法が提供される。この方法は、ハイブリダイゼーション条件下で、患者から得た結腸直腸腺腫の試料（上皮細胞の試料などの細胞の試料）をＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）の遺伝子座特異的プローブ、ＤＣＣ（結腸直腸癌欠失）の遺伝子座特異的プローブ、１８番染色体の染色体計数プローブ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅ）（ＣＥＰ１８）、１３ｑ１４（１３番染色体のｑアーム上のバンド１４）の遺伝子座特異的プローブおよびＭＹＣ（ｃ−ｍｙｃ癌遺伝子）の遺伝子座特異的プローブを含む検出可能に標識されたプローブと接触させるステップと、染色体異常の存在または非存在を決定するステップとを含む。
【００２０】
染色体異常がないことは、結腸直腸腺腫の再発のリスクが低いことおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが低いことを示す。ＥＧＦＲのコピー数増加は、結腸直腸腺腫の再発のリスクが増加していることおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが増加していることを示す。ＣＥＰ１８に対するＤＣＣのコピー数減少は、結腸直腸腺腫の再発のリスクが増加していることおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが増加していることを示す。ＣＥＰ１８に対するＤＣＣのコピー数減少、１３ｑ１４のコピー数増加およびＭＹＣのコピー数増加とさらに組み合わせたＥＧＦＲのコピー数増加は、結腸直腸腺腫の再発のリスクが高いことおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが高いことを示す。
【００２１】
検出可能に標識されたプローブは、ＳＴＡＴ１（シグナル伝達性転写因子１）の遺伝子座特異的プローブおよび／またはＡＵＲＫＡ（オーロラキナーゼＡ）の遺伝子座特異的プローブなどの１つ以上の他の遺伝子座特異的プローブおよび／または動原体プローブ（ＣＥＰ）をさらに含むことができる。ＳＴＡＴ１のコピー数増加および／またはＡＵＲＫＡのコピー数増加は、結腸直腸腺腫の再発のリスクが増加していることおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが増加していることを示す。
【００２２】
細胞、例えば、上皮細胞の試料などの試料を、結腸直腸腺腫から得ることができ、好ましくは得られ、試料は、新鮮であるか、患者から得たときに凍結され、または患者から得たときにホルマリン固定され、パラフィン包埋される（ＦＦＰＥ）。好ましくは、上皮細胞を、
（ａ）結腸直腸腺腫の新鮮な試料または解凍した新鮮凍結試料を室温で、ハンクス緩衝液中ですすぐステップと、
（ｂ）すすいだ試料を、２０ｍＭ  ＤＴＴおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む予熱したハンクス緩衝液に３７℃で約５分間浸漬するステップと、
（ｃ）すすいで浸漬した試料を、２０ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、５ｍＭ  ＣａＣｌ２および１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含むハンクス緩衝液に移し、約５秒から約１０秒間混合するステップと、
（ｄ）約１０００×ｇで約１０分間の遠心分離によって細胞をペレット化するステップと、
（ｅ）（ｄ）からの上清を捨てて、ペレット化細胞を残留上清に再懸濁するステップと、
（ｆ）（ｅ）からの再懸濁細胞を、約３０重量％から約６０重量％のメタノール、約４０重量％から約７０重量％の水、緩衝液および保存剤を含む溶液に入れ、この溶液を一晩室温に保つステップと
を含む方法により、結腸直腸腺腫から得る。この方法は、
（ｇ）（ｆ）からの細胞を細胞診スライドに移すステップと、
（ｈ）スライドを９５％エタノールに室温で約１５分間浸漬するステップと、
（ｉ）スライドをカーノイズ溶液（３：１メタノール：酢酸固定液）に室温で３０分間浸漬するステップと、
（ｊ）スライドを室温で乾燥させるステップと
をさらに含むことができる。
【００２３】
細胞、例えば、上皮細胞の試料などの試料を、検出可能に標識されたプローブのセットと接触させる前に、上記方法によるなどして細胞診スライドに固定することができ、好ましくは固定する。上皮細胞の存在は、細胞を標識抗ＣＡＭ５．２抗体と接触させることによって確認することができる。
【００２４】
プローブのセットがさらに提供される。プローブのセットは、ＥＧＦＲの遺伝子座特異的プローブ、ＤＣＣの遺伝子座特異的プローブ、１８番染色体の染色体計数プローブ（ＣＥＰ１８）、１３ｑ１４の遺伝子座特異的プローブおよびＭＹＣの遺伝子座特異的プローブを含む。プローブのセットは、ＳＴＡＴ１の遺伝子座特異的プローブおよび／またはＡＵＲＫＡの遺伝子座特異的プローブなどの１つ以上の他の遺伝子座特異的プローブおよび／または動原体プローブ（ＣＥＰ）をさらに含むことができる。
【００２５】
キットがなおさらに提供される。このキットは、（ａ）患者の結腸直腸腺腫の予後を可能にするプローブのセットと、（ｂ）患者の結腸直腸腺腫の予後を判定するための指示とを含む。プローブのセットは、ＥＧＦＲの遺伝子座特異的プローブ、ＤＣＣの遺伝子座特異的プローブ、１８番染色体の染色体計数プローブ（ＣＥＰ１８）、１３ｑ１４の遺伝子座特異的プローブおよびＭＹＣの遺伝子座特異的プローブを含む。プローブのセットは、ＳＴＡＴ１の遺伝子座特異的プローブおよび／またはＡＵＲＫＡの遺伝子座特異的プローブなどの１つ以上の他の遺伝子座特異的プローブおよび／または動原体プローブ（ＣＥＰ）をさらに含むことができる。指示は、患者から得た結腸直腸腺腫から得た、細胞、例えば、上皮細胞の試料などの試料で染色体異常の存在または非存在を決定することを含む。染色体異常がないことは、結腸直腸腺腫の再発のリスクが低いことおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが低いことを示す一方で、ＥＧＦＲのコピー数増加は、結腸直腸腺腫の再発のリスクが増加していることおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが増加していることを示し、ＣＥＰ１８に対するＤＣＣのコピー数減少は、結腸直腸腺腫の再発のリスクが増加していることおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが増加していることを示し、ＣＥＰ１８に対するＤＣＣのコピー数減少、１３ｑ１４のコピー数増加およびＭＹＣのコピー数増加とさらに組み合わせたＥＧＦＲのコピー数増加は、結腸直腸腺腫の再発のリスクが高いことおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが高いことを示す。
【００２６】
ＳＴＡＴ１のコピー数増加および／またはＡＵＲＫＡのコピー数増加は、結腸直腸腺腫の再発のリスクが増加していることおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが増加していることを示す。
【００２７】
腺腫の試料から上皮細胞を単離する方法がなおまたさらに提供される。この方法は、
（ａ）腺腫の新鮮な試料または解凍した新鮮凍結試料を室温で、ハンクス緩衝液中ですすぐステップと、
（ｂ）すすいだ試料を、２０ｍＭ  ＤＴＴおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む予熱したハンクス緩衝液に３７℃で約５分間浸漬するステップと、
（ｃ）すすいで浸漬した試料を、２０ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、５ｍＭ  ＣａＣｌ２および１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含むハンクス緩衝液に移し、約５秒から約１０秒間混合するステップと、
（ｄ）約１０００×ｇで約１０分間の遠心分離によって細胞をペレット化するステップと、
（ｅ）（ｄ）からの上清を捨てて、ペレット化細胞を残留上清に再懸濁するステップと、
（ｆ）（ｅ）からの再懸濁細胞を、約３０重量％から約６０重量％のメタノール、約４０重量％から約７０重量％の水、緩衝液および保存剤を含む溶液に入れ、この溶液を一晩室温に保つステップと
を含む。この方法は、
（ｇ）（ｆ）からの細胞を細胞診スライドに移すステップと、
（ｈ）スライドを９５％エタノールに室温で約１５分間浸漬するステップと、
（ｉ）スライドをカーノイズ溶液（３：１メタノール：酢酸固定液）に室温で３０分間浸漬するステップと、
（ｊ）スライドを室温で乾燥させるステップと
をさらに含むことができる。
【００２８】
上記方法に照らして、細胞診スライドも提供される。このスライドは、上記方法により腺腫の試料から単離した上皮細胞を含む。スライドは、所望であれば、使用するまで−２０℃で保存することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】１０、２０および３０個の異常な細胞のカットオフを用いた、患者結腸腫瘍試料中で検出された１３個のプローブについての遺伝子コピー数変化を有する症例割合を示すプローブ（増加（＋）または消失（−））対異常なＦＩＳＨの％のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本開示は、進行のリスクを含む予後、治療剤による治療に対する潜在的反応性の評価、再発の監視、および癌、特に結腸直腸腺癌の治療的処置の有効性の評価の方法、ならびにこのような方法に有用なプローブのセットおよびキットを提供する。
【００３１】
用語
以下の用語が本開示に関連する：
「約」は所定の値からのおよそ＋／−１０％の変動を指す。具体的な言及をしているかいないかによらず、本明細書で提供されるいずれの所与の値にも変動が常に含まれることを理解すべきである。
【００３２】
「腺腫」は腺起源の良性腫瘍である。「腺腫」、「結腸腺腫（ｃｏｌｏｎ  ａｄｅｎｏｍａ）」、「結腸の腺腫」および「結腸腺腫（ｃｏｌｏｎｉｃ  ａｄｅｎｏｍａ）」は、本明細書において結腸内の腺腫を指すために使用され、この腺腫は腺腫性ポリープとも呼ばれる。腺腫性ポリープは、一般的に結腸鏡検査によって発見され、悪性になる傾向があるので除去される。
【００３３】
「腺癌」、「結腸腺癌（ｃｏｌｏｎ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）」、「結腸の腺癌」および「結腸腺癌（ｃｏｌｏｎｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）」は、本明細書において結腸内の悪性増殖（即ち、癌）を指すために使用される。
【００３４】
「ＡＵＲＫＡ」は、本明細書においてヒト２０番染色体上のｑ１３に位置するオーロラキナーゼＡ遺伝子を指すために使用される。Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅおよびＨＧＮＣ細胞遺伝学的バンドは２０ｑ１３であるが、Ｅｎｓｅｍｂｌ細胞遺伝学的バンドは２０ｑ１３．２である。ＡＵＲＫＡの同義語には、ＡＲＫ１、ＢＴＡＫ、ＳＴＫ１５、ＳＴＫ６、ＡｌＫ、ＰＰＰ１Ｒ４７、ＳＴＫ７、セリン／トレオニンキナーゼ６、オーロラ２、オーロラ関連キナーゼ１、オーロラ／ＩＰＬ１関連キナーゼ１、乳房腫瘍増幅キナーゼ、セリン／トレオニン−プロテインキナーゼ１５、セリン／トレオニン−プロテインキナーゼ６、セリン／トレオニン−プロテインキナーゼオーロラＡ、ＡＲＫ−１、ＡＵＲＡ、ｈＡＲＫ１、ＡＵＲＯＲＡ２、ＡｕｒＡ、セリン／トレオニンキナーゼ１５、オーロラ／ＩＰＬ１様キナーゼ、乳房腫瘍増幅キナーゼ、ＩＰＬ１関連キナーゼ、プロテインホスファターゼ１調節サブユニット４７、セリン／トレオニンプロテインキナーゼ１５、ＡＩＲＫ１、ＡＹＫ１、ＥＣ２．７．１１．１およびＩＡＫ１が含まれる。「ＡＵＲＫＡ」はまた、本明細書においてコピー数の増加などのＡＵＲＫＡに関連する染色体異常を決定するために使用されるプローブまたはプローブのセットを指すために使用される。ＦＩＳＨなどのインサイツハイブリダイゼーションにより、ＡＵＲＫＡのコピー数、ＡＵＲＫＡに関連するコピー数の比またはＡＵＲＫＡの増加割合などのＡＵＲＫＡに関連するパラメータを検出するためのプローブは、好ましくはＡＵＲＫＡ遺伝子を含む２０番染色体のｑ１３領域（２０ｑ１３）とハイブリダイズする。ＤＮＡ基準配列には、これだけに限らないが、ＮＣ＿００００２０．１０およびＮＴ＿０１１３６２．１０が含まれる。
【００３５】
米国国立衛生研究所によって定義される「バイオマーカー」は、「通常の生物学的過程、病的過程または治療的介入に対する薬理的反応の指標として客観的に測定および評価される特性」である。
【００３６】
「染色体計数プローブ（ＣＥＰ）」または「動原体プローブ」は、細胞内の特定の染色体の数を数え上げることを可能にする任意のプローブである。染色体計数プローブは、典型的には特定の染色体の動原体の近く（「動原体周囲」と呼ばれる。）または動原体の領域、典型的には反復ＤＮＡ配列（例えば、アルファサテライトＤＮＡ）を認識し、これに結合する。染色体の動原体は細胞分裂中の忠実な分離に必要とされるので、この動原体は典型的にはこの染色体を表すと考えられる。特定の染色体領域の欠失または増幅を、特定の遺伝子座に対応するシグナルの数（コピー数）を動原体に対応するシグナルの数と比較することによって、欠失または増幅が通常存する染色体全体の消失または増加（異数染色体）から識別することができる。この比較を行う１つの方法は、遺伝子座を表すシグナルの数を動原体を表すシグナルの数で割るというものである。１未満の比は遺伝子座の相対的消失または欠失を示し、１より大きい比は遺伝子座の相対的増加または増幅を示す。同様に、同じ染色体上、例えば、染色体の２本の異なるアーム上の２つの異なる遺伝子座間の比較を行って、染色体内の不均衡な増加または消失を示すことができる。染色体の動原体プローブの代わりに、当業者であれば、染色体アームプローブを代わりに使用して染色体全体の消失または増加を近似することができることを認識するであろう。しかしながら、このようなプローブについてのシグナルの消失はいつも染色体全体の消失を示すとは限らないために、このようなプローブは染色体を数え上げることにおいてそれほど正確ではない。染色体計数プローブの例としては、Ａｂｂｏｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．、Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ、ＩＬ（以前はＶｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）から商業的に入手可能なＣＥＰ（Ｒ）プローブが挙げられる。
【００３７】
「コピー数」は、単一遺伝子座、１つ以上の遺伝子座またはゲノム全体のいずれにせよ、ＤＮＡの大きさである。２つの「コピー数」は、ヒトにおける「野生型」である（性染色体を除いて、二倍性のため）。（性染色体を除いて）ヒトにおける２つ以外の「コピー数」は、野生型からはずれる。このような逸脱には、増幅、即ち、コピー数の増加および欠失、即ちコピー数の減少ならびにコピー数の非存在さえ含まれる。
【００３８】
「ＤＣＣ」は、本明細書においてヒト１８番染色体上の領域ｑ２１に位置する結腸直腸癌欠失遺伝子を指すために使用される。Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ細胞遺伝学的バンドは１８ｑ２１．３であるが、Ｅｎｓｅｍｂｌ細胞遺伝学的バンドは１８ｑ２１．２であり、ＨＧＮＣ細胞遺伝学的バンドは１８ｑ２１．１である。同義語には、ＩＧＤＣＣ１、結腸直腸癌抑制因子、免疫グロブリンスーパーファミリーＤＣＣサブクラスメンバー１、腫瘍抑制タンパク質ＤＣＣ、ＣＲＣ１８、ＣＲＣＲ１、結腸直腸腫瘍抑制因子、結腸直腸癌欠失タンパク質およびネトリン受容体ＤＣＣが含まれる。「ＤＣＣ」はまた、本明細書においてＤＣＣコピー数の消失などのＤＣＣに関連する染色体異常を決定するために使用され得るプローブまたはプローブのセットを指すために使用され得る。ＦＩＳＨなどのインサイツハイブリダイゼーションにより、ＤＣＣのコピー数、ＤＣＣに関連するコピー数の比またはＤＣＣの増加割合などのＤＣＣに関連するパラメータを検出するためのプローブは、好ましくはＤＣＣ遺伝子を含む１８番染色体のｑ２１領域（１８ｑ２１）とハイブリダイズする。ＤＮＡ基準配列には、これだけに限らないが、ＮＣ＿００００１８．９およびＮＴ＿０１０９６６．１４が含まれる。
【００３９】
「ＥＧＦＲ」は、本明細書においてヒト７番染色体上の領域ｐ１２に位置する上皮成長因子受容体遺伝子を指すために使用される。Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ細胞遺伝学的バンドおよびＨＧＮＣ細胞遺伝学的バンドは７ｐ１２であるが、Ｅｎｓｅｍｂｌ細胞遺伝学的バンドは７ｐ１１．２である。同義語には、トリ赤芽球性白血病ウイルス（ｖ−ｅｒｂ−ｂ）癌遺伝子ホモログ、ＥＲＢＢ、ＥＲＢＢ１、癌原遺伝子ｃ−ＥｒｂＢ−１、受容体チロシンプロテインキナーゼｅｒｂＢ−１、ＨＥＲ１、ＥＣ２．７．１０．１、ＰｌＧ６１、細胞成長阻害タンパク質４０、細胞増殖誘導タンパク質６１、ｍＥＮＡおよびＥＣ２．７．１０が含まれる。「ＥＧＦＲ」はまた、本明細書においてＥＧＦＲコピー数の増加などのＥＧＦＲに関連する染色体異常を決定するために使用され得るプローブまたはプローブのセットを指すために使用され得る。ＦＩＳＨなどのインサイツハイブリダイゼーションにより、ＥＧＦＲのコピー数、ＥＧＦＲに関連するコピー数の比またはＥＧＦＲの増加割合などのＥＧＦＲに関連するパラメータを検出するためのプローブは、好ましくはＥＧＦＲ遺伝子を含む７番染色体のｐ１２領域（７ｐ１２）とハイブリダイズする。ＤＮＡ基準配列には、これだけに限らないが、ＮＣ＿０００００７．１３、ＮＴ＿０３３９６８．６およびＮＴ＿０７９５９２．２が含まれる。
【００４０】
「標識された」、「検出可能な標識で標識された」および「検出可能に標識された」は、本明細書において実体（例えば、プローブ）を検出することができることを示すために互換的に使用される。「標識」および「検出可能な標識」は、標的配列に結合してプローブを検出可能にするためのプローブに結合する部分などの、実体を検出可能にするために実体に結合する部分を意味する。部分これ自体は検出可能でなくてもよく、さらに別の部分と反応して検出可能となってもよい。「検出可能に標識された」という用語の使用は、このような標識化を包含することを意図している。検出可能な標識は、標識がシグナルを産生し、このシグナルを測定することができ、このシグナルの強度が結合した実体の量に比例するように選択することができる。核酸などの分子を標識および／または検出するための多種多様なシステム、例えば、プローブは周知である。標識された核酸は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、化学的または他の手段によって直接または間接的に検出可能な標識を組み込むまたは標識と抱合することによって調製することができる。適した検出可能な標識には、放射性同位元素、発蛍光団、発色団、化学発光剤、微粒子、酵素、磁性粒子、電子密度の高い粒子、マスラベル（ｍａｓｓ  ｌａｂｅｌ）、スピンラベル、ハプテンなどが含まれる。発蛍光団および化学発光剤が本明細書において好まれる。
【００４１】
「遺伝子座特異的プローブ」および「遺伝子座特異的識別子（ＬＳＩ）」は、本明細書において染色体上の領域の特定の遺伝子座、例えば、転移において増加／消失を受けることが決定されている遺伝子座に選択的に結合するプローブを指すために互換的に使用され得る。プローブは、エクソン、イントロンおよび／または制御配列、例えば、プロモータ配列などを含む、コード領域もしくは非コード領域または両者を標的化することができる。
【００４２】
「ＭＹＣ」は、本明細書において８番染色体上のｑ２４の領域に位置するｃ−ｍｙｃ癌遺伝子を指すために使用される。Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅおよびＥｎｓｅｍｂｌ細胞遺伝学的バンドは８ｑ２４．２１であるが、ＨＧＮＣ細胞遺伝学的バンドは８ｑ２４である。同義語には、ｖＨＬＨｅ３９、ｃ−Ｍｙｃ、ｖ−ｍｙｃトリ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子ホモログ、クラスＥ塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質３９、癌原遺伝子ｃ−Ｍｙｃ、転写因子ｐ６４、ＭＲＴＬ、トリ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子ホモログ、ｍｙｃ癌原遺伝子タンパク質、ｍｙｃ関連翻訳／局在化調節因子およびＢＨＬＨＥ３９が含まれる。ＭＹＣはまた、本明細書においてＭＹＣコピー数の増加などのＭＹＣに関連する染色体異常を決定するために使用され得るプローブまたはプローブのセットを指すために使用され得る。ＦＩＳＨなどのインサイツハイブリダイゼーションにより、ＭＹＣのコピー数、ＭＹＣに関連するコピー数の比またはＭＹＣの増加割合などのＭＹＣに関連するパラメータを検出するためのプローブは、好ましくはＭＹＣ遺伝子を含む８番染色体のｑ２４領域（８ｑ２４）とハイブリダイズする。ＤＮＡ基準配列には、これだけに限らないが、ＮＣ＿０００００８．１０およびＮＴ＿００８０４６．１６が含まれる。
【００４３】
「核酸試料」は、核またはこのような核から単離もしくは精製された核酸を含む試料などの、プローブとのハイブリダイゼーションに適した形態の核酸を含む試料を指す。核酸試料は、全もしくは部分（例えば、特定の染色体）ゲノムＤＮＡ、全もしくは部分ｍＲＮＡ（例えば、特定の染色体もしくは遺伝子）または選択された配列を含み得る。凝縮染色体（間期または中期に存在するようなもの）が、ＦＩＳＨなどのインサイツハイブリダイゼーションに標的として使用するのに適している。
【００４４】
「所定のカットオフ」および「所定のレベル」は、一般的にアッセイ結果を所定のカットオフ／レベルに対して比較することによって診断／予後／治療有効性結果を評価するために使用されるカットオフ値を指し、所定のカットオフ／レベルは種々の臨床的パラメータ（例えば、疾患の重症度、進行／非進行／改善等）と既に連動または関連している。
【００４５】
本開示の文脈における「プローブ」は、選択的ハイブリダイゼーションを可能にするまたは促進する条件下で標的配列の少なくとも一部と選択的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。一般に、プローブは、ＤＮＡのコードもしくはセンス（＋）鎖と相補的であり得る、またはＤＮＡの非コードもしくはアンチセンス（−）鎖と相補的であり得る（時々、「逆相補的」と呼ばれる。）。プローブは長さが有意に異なり得る。約１５から約７５ヌクレオチド、例えば、約１５から約５０ヌクレオチドなどの約１０から約１００ヌクレオチド長が幾つかの用途では好まれ得るが、約５０−１×１０５ヌクレオチド長が染色体プローブに好まれ、約２５０００から約８０００００ヌクレオチド長が遺伝子座特異的プローブに好まれ得る。
【００４６】
「予後」は、回復の見込みなどの、疾患のあり得る経過および／または結果の予測である。従って、予後は、疾患状態の改善、疾患状態の悪化および疾患状態の変化なしを包含する。
【００４７】
「ＲＢ１」は、本明細書においてヒト１３番染色体上のｑ１４の領域に位置する網膜芽細胞腫遺伝子を指すために使用される。Ｅｎｔｒｅｚ、ＥｎｓｅｍｂｌおよびＨＧＮＣ細胞遺伝学的バンドは１３ｑ１４．２である。同義語には、ＯＳＲＣ、ＲＢ、ｐ１０５−Ｒｂ、ｐＲｂ、ｐｐ１１０、骨肉腫、網膜芽細胞腫感受性タンパク質、網膜芽細胞腫関連タンパク質およびＲｂが含まれる。「ＲＢ１」は、本明細書において「１３ｑ１４」と互換的に使用され得る。「ＲＢ１」または「１３ｑ１４」はまた、本明細書においてＲＢ１または１３ｑ１４コピー数の増加などのＲＢ１または１３ｑ１４に関連する染色体異常を決定するために使用され得るプローブまたはプローブのセットを指すために使用され得る。ＦＩＳＨなどのインサイツハイブリダイゼーションにより、ＲＢ１もしくは１３ｑ１４のコピー数、ＲＢ１もしくは１３ｑ１４に関連するコピー数の比またはＲＢ１もしくは１３ｑ１４の増加割合などのＲＢ１または１３ｑ１４に関連するパラメータを検出するためのプローブは、好ましくはＲＢ１遺伝子を含む１３番染色体のｑ１４領域（１３ｑ１４）とハイブリダイズする。ＤＮＡ基準配列には、これだけに限らないが、ＮＣ＿００００１３．１０およびＮＴ＿０２４５２４．１４が含まれる。
【００４８】
「進行のリスク」は、本明細書において疾患状態の悪化を指すために使用される。
【００４９】
本開示の文脈における「選択的にハイブリダイズする」（ならびに「選択的ハイブリダイゼーション」、「特異的にハイブリダイズする」および「特異的ハイブリダイゼーション」）は、核酸分子のストリンジェントな条件下での優先的な特定のヌクレオチド配列との結合、二重化またはハイブリダイズを指す。「ストリンジェントな条件」という用語は、プローブが優先的にこの標的配列とハイブリダイズし、他の非標的配列とより少ない程度でハイブリダイズするまたはハイブリダイズを全くしない条件を指す。核酸ハイブリダイゼーション（例えば、アレイ、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーションまたはＦＩＳＨのように）の文脈における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、異なる条件下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションの広範な手引きは、例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈ．２，「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮＹ（１９９３）に見られる。一般的に、高ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、定義されたイオン強度およびｐＨで、特異的配列についての熱融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるよう選択される。Ｔｍは、（定義されたイオン強度およびｐＨ下で）標的配列の５０％が完全に整合したプローブとハイブリダイズする温度である。極めてストリンジェントな条件は、特定のプローブについてのＴｍと等しくなるよう選択される。サザンまたはノーザンブロットでのアレイまたはフィルタ上で１００個超の相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、標準的なハイブリダイゼーション溶液を用いて４２℃である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，３Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｖｏｌ．  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，３Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，３ＮＹ（２００１）参照）。
【００５０】
「ＳＴＡＴ１」は、本明細書においてヒト２番染色体上のｑ３２に位置するシグナル伝達性転写因子１遺伝子を指すために使用される。Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅおよびＥｎｓｅｍｂｌ細胞遺伝学的バンドは２ｑ３２．３であるが、ＨＧＮＣ細胞遺伝学的バンドは２ｑ３２．２−ｑ３２．３である。ＳＴＡＴ１の同義語には、ＳＴＡＴ−１、ＩＳＧＦ−３、ＳＴＡＴ９１、転写因子ＩＳＧＦ−３成分ｐ９１／ｐ８４、ＣＡＮＤＦ７およびシグナル伝達性転写因子１−α／βが含まれる。「ＳＴＡＴ１」はまた、本明細書においてコピー数の増加などのＳＴＡＴ１に関連する染色体異常を決定するために使用されるプローブまたはプローブのセットを指すために使用される。ＦＩＳＨなどのインサイツハイブリダイゼーションにより、ＳＴＡＴ１のコピー数、ＳＴＡＴ１に関連するコピー数の比またはＳＴＡＴ１の増加割合などのＳＴＡＴ１に関連するパラメータを検出するためのプローブは、好ましくはＳＴＡＴ１遺伝子を含む２番染色体のｑ３２領域（２ｑ３２）とハイブリダイズする。ＤＮＡ基準配列には、これだけに限らないが、ＮＣ＿０００００２．１１およびＮＴ＿００５４０３．１７が含まれる。
【００５１】
「標的配列」、「標的領域」および「核酸標的」は、例えば、消失および／または増加を決定している特定の染色体位置に存するヌクレオチド配列を指す。
【００５２】
本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを記載する目的のためのものであり、限定的であることを意図していない。
【００５３】
方法
患者の結腸直腸腺腫の予後を判定する方法が提供される。この方法は、ハイブリダイゼーション条件下で、患者から得た結腸直腸腺腫の試料（細胞、例えば、上皮細胞の試料など）をＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）の遺伝子座特異的プローブ、ＤＣＣ（結腸直腸癌欠失）の遺伝子座特異的プローブ、１８番染色体の染色体計数プローブ（ＣＥＰ１８）、１３ｑ１４（１３番染色体のｑアーム上のバンド１４）の遺伝子座特異的プローブおよびＭＹＣ（ｃ−ｍｙｃ癌遺伝子）の遺伝子座特異的プローブを含む検出可能に標識されたプローブと接触させるステップと、染色体異常の存在または非存在を決定するステップとを含む。検出可能に標識されたプローブは、ＳＴＡＴ１（シグナル伝達性転写因子１）の遺伝子座特異的プローブおよび／またはＡＵＲＫＡ（オーロラキナーゼＡ）の遺伝子座特異的プローブなどの１つ以上の他の遺伝子座特異的プローブおよび／または動原体プローブ（ＣＥＰ）をさらに含むことができる。染色体異常がないことは、結腸直腸腺腫の再発のリスクが低いことおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが低いことを示す一方で、ＥＧＦＲのコピー数増加は、結腸直腸腺腫の再発のリスクが増加していることおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが増加していることを示し、ＣＥＰ１８に対するＤＣＣのコピー数減少は、結腸直腸腺腫の再発のリスクが増加していることおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが増加していることを示し、ＣＥＰ１８に対するＤＣＣのコピー数減少、１３ｑ１４のコピー数増加およびＭＹＣのコピー数増加とさらに組み合わせたＥＧＦＲのコピー数増加は、結腸直腸腺腫の再発のリスクが高いことおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが高いことを示す。
【００５４】
ＳＴＡＴ１のコピー数増加および／またはＡＵＲＫＡのコピー数増加は、結腸直腸腺腫の再発のリスクが増加していることおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが増加していることを示す。
【００５５】
細胞、例えば、上皮細胞の試料などの試料を、結腸直腸腺腫から得ることができ、好ましくは得られ、試料は、新鮮であるか、患者から得たときに凍結され、または患者から得たときにホルマリン固定され、パラフィン包埋される（ＦＦＰＥ）。好ましくは、上皮細胞を、
（ａ）結腸直腸腺腫の新鮮な試料または解凍した新鮮凍結試料を室温で、ハンクス緩衝液中ですすぐステップと、
（ｂ）すすいだ試料を、２０ｍＭ  ＤＴＴおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む予熱したハンクス緩衝液に３７℃で約５分間浸漬するステップと、
（ｃ）すすいで浸漬した試料を、２０ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、５ｍＭ  ＣａＣｌ２および１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含むハンクス緩衝液に移し、約５秒から約１０秒間混合するステップと、
（ｄ）約１０００×ｇで約１０分間の遠心分離によって細胞をペレット化するステップと、
（ｅ）（ｄ）からの上清を捨てて、ペレット化細胞を残留上清に再懸濁するステップと、
（ｆ）（ｅ）からの再懸濁細胞を、約３０重量％から約６０重量％のメタノール、約４０重量％から約７０重量％の水、緩衝液および保存剤を含む溶液に入れ、この溶液を一晩室温に保つステップと
を含む方法により、結腸直腸腺腫から得る。この方法は、
（ｇ）（ｆ）からの細胞を細胞診スライドに移すステップと、
（ｈ）スライドを９５％エタノールに室温で約１５分間浸漬するステップと、
（ｉ）スライドをカーノイズ溶液（３：１メタノール：酢酸固定液）に室温で３０分間浸漬するステップと、
（ｊ）スライドを室温で乾燥させるステップと
をさらに含むことができる。
【００５６】
細胞、例えば、上皮細胞の試料などの試料を、検出可能に標識されたプローブのセットと接触させる前に、上記方法によるなどして細胞診スライドに固定することができ、好ましくは固定する。上皮細胞の存在は、細胞を標識抗ＣＡＭ５．２抗体と接触させることによって確認することができる。
【００５７】
当技術分野で既知の任意の適切な検出法を用いて、上記方法を行うことができる。好ましくは、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）などのインサイツハイブリダイゼーションを用いて、上記方法を行う。好ましくは、各プローブを検出可能に標識し、２つ以上のプローブを同じ試料で同時にまたは順次使用する場合、好ましくは、各プローブを異なる発蛍光団などの異なる標識で検出可能に標識する。
【００５８】
各プローブを発蛍光団で標識する（２つ以上のプローブを同じ試料で同時にまたは順次使用する場合、異なって標識する）ＦＩＳＨなどの、各プローブを検出可能に標識する（２つ以上のプローブを同じ試料で同時にまたは順次使用する場合、異なって標識する）インサイツハイブリダイゼーションによって上記方法を行う場合、この方法を新鮮な腺腫から得た上皮細胞の試料などの細胞の試料で行い（新鮮な細胞を１から３日培養することができ、コルセミドなどの阻害薬を培養液に添加して、染色体が高度に凝縮し、可視化され得る中期で細胞を阻害することができる。）、凍結または固定（例えば、ホルマリン固定およびパラフィン包埋（ＦＦＰＥ））し、（例えば、ＲＮアーゼおよびペプシンで）処理して標的核酸（例えば、ＤＮＡ）の接近性を高め、非特異的結合を減らし、次いで、１つ以上のプローブとのハイブリダイゼーションに供し、洗浄して任意の未結合プローブを除去し、ハイブリダイズしたプローブを検出することができる。例えば、凍結結腸組織試料を室温で解凍し、ハンクス緩衝液中ですすぎ、２０ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオトレイトール）および５ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含む予熱したハンクス緩衝液に３７℃で約５分間浸漬することがき、その後、組織を振盪溶液２ｍＬ（４℃の２０ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含むハンクス緩衝液）を含む１０ｍＬファルコンチューブに移すことができ、チューブを５から１０秒間ボルテックスすることができる。次いで、実施例１に示されるように、組織を除去し、ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ溶液（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を含むＴｈｉｎＰｒｅｐバイアルに移すために、上清を１０００×ｇで１０分間遠心分離して細胞をペレット化することができる。次いで、製造業者の指示に従って、ＴｈｉｎＰｒｅｐ  Ｔ−２０００プロセッサ（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いてスライドを調製することができる。スライドを２×ＳＳＣに７３℃で２分間入れ、ペプシン（０．５ｍｇ／ｍＬ）と共に３７℃で１０分間インキュベートし、１×ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に室温で５分間、１％ＮＢＦ（中性緩衝ホルマリン）に室温で５分間および１×ＰＢＳに室温で５分間入れることができる。スライドを７０％エタノール、８５％エタノールおよび１００％エタノールにそれぞれ１分間入れることによって脱水し、次いで、風乾することができる。プローブおよびカバーガラスを適用し、カバーガラスを密閉し、スライドをＴｈｅｒｍｏＢｒｉｔｅ中７２℃で２分間および３７℃で１２から１８時間（一晩）共変性（ｃｏ−ｄｅｎａｔｕｒｅ）させることができる。実施例２に示されるように、翌日、スライドを０．４×ＳＳＣ／０．３％ＮＰ−４０により７３℃で２分間および２×ＳＳＣ／０．１％ＮＰ−４０により室温で１分間処理し、次いで、風乾し、４’６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩水和物（ＤＡＰＩ）Ｉ退色防止溶液（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．、Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ、ＩＬ）を乗せ、カバーガラスで覆うことができる。
【００５９】
腺腫細胞のホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料の切片（厚さ約５μｍ）を、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓの正に帯電したスライド（ＴｈｅｒｍｏＳｈａｎｄｏｎ、ピッツバーグ、ＰＡから入手可能）などのスライド上に乗せ、５６℃で一晩焼き出し、脱パラフィン処理し、１×生理食塩水クエン酸ナトリウム、ｐＨ６から９に８０℃で約３５分間浸し、水中で３分間洗浄することができる。３７℃で１０から３０分間のプロテアーゼ消化（０．１から０．２Ｎ  ＨＣｌ中１から４ｍｇペプシン／ｍＬ）後、切片を水中で３分間すすぎ、段階的エタノールに通し、乾燥させることができる。
【００６０】
ＦＦＰＥ切片または細胞懸濁液を含むスライド（即ち、細胞診スライド）を用いる上記の１つ以上のプローブとのハイブリダイゼーションを、製造業者の指示に従って、自動化共変性機器（ＨＹＢｒｉｔｅまたはＴｈｅｒｍｏＢｒｉｔｅ  Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ／Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．、Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ、ＩＬ）において３７℃で１６から１８時間行うことができる（このような方法は、典型的にはプローブおよび標的核酸の変性を伴う）。ハイブリダイゼーション後、切片または細胞診スライドを洗浄緩衝液（２×生理食塩水クエン酸ナトリウム／０．３％ＮＰ４０；Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．から入手可能）に室温で２から１０分間入れてカバーガラスを除去し、次いで、７３℃洗浄緩衝液に２分間浸し、乾燥させ、ＤＡＰＩ  Ｉ退色防止溶液（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ）を乗せることができる。好ましくは、スライドを、シングルバンドパスフィルタ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）を備える落射蛍光顕微鏡で分析する。
【００６１】
検出前に、細胞試料を場合により見かけの細胞学的異常に基づいて前選択してもよい。前選択は、疑わしい細胞を同定し、これによってスクリーニングがこれらの細胞に焦点を当てることを可能にする。前選択により、より速いスクリーニングが可能になり、陽性の結果を見逃さない可能性が高くなる。生体試料の細胞を顕微鏡スライドに乗せ、形成異常細胞および新生細胞に一般的に関連する細胞学的異常について視覚的にスキャンすることができる。このような異常には、通常、プローブとこの標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション後に、核を、ヨウ化プロピジウムまたはＤＡＰＩ  Ｉなどの核酸染色または色素で対比染色することによって評価される核の大きさ、核の形状および核染色の異常が含まれる。典型的には、新生細胞は、増大した、不規則な形状のおよび／またはまだらの染色パターンを示す核を持つ。約０．４μｇ／ｍｌから約５μｇ／ｍｌの濃度で典型的に使用されるヨウ化プロピジウムは、６１４ｎｍの発光ピーク波長で観察することができる赤色蛍光ＤＮＡ特異的色素である。典型的には約１２５ｎｇ／ｍｌから約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で典型的に使用されるＤＡＰＩは、低倍率でＤＡＰＩフィルタによって４５２ｎｍの発光ピーク波長で観察することができる青色蛍光ＤＮＡ特異的染料である。この場合、検出用に前選択された細胞のみを染色体消失および／または増加についての計数に供する。好ましくは、ＤＡＰＩフィルタを用いて異常な核を有する多くの細胞が存在するように見える場合、少なくとも１００個程度および好ましくはさらに多くの前選択された細胞を、染色体消失および／または増加を評価するために選択する。
【００６２】
または、あるレベルの形成異常または疑わしい病変を証明する組織中の領域を、低倍率でＤＡＰＩフィルタを用いて限局化し、いずれかのプローブの異常なコピー数を持つ核の存在について徹底的に検査することができる。正常な細胞では、所与のプローブの２つのコピーが検出される。異常な細胞では、所与のプローブのより多いまたはより少ないコピーが検出される。好ましくは、最も有意なコピー数変化を有する領域を数え上げのために選択する。可能な場合はいつでも、多数の異常な領域を選択し、各異常な領域中、少なくとも約１０個のランダムな核を高出力下（６４×または１００×対物レンズ）で分析して、少なくとも約１００個の核を分析するようにする。好ましくは、核は重複しておらず、十分に明るいシグナルを持つ。
【００６３】
または、検出用の細胞を、細胞学的または組織学的特徴から独立に選択してもよい。例えば、顕微鏡スライド上の所与の領域中の全ての非重複細胞を染色体消失および／または増加について評価してもよい。さらなる例として、スライド上の細胞、例えば、顕微鏡スライド上で連続順で見える数の、少なくとも約５０個およびより好ましくは少なくとも約１００個程度の変化した形態を示す細胞を染色体消失および／または増加について評価するために選択してもよい。
【００６４】
ＥＧＦＲ（７ｐ１２）、ＤＣＣ（１８ｑ２１）、ＣＥＰ１８、１３ｑ１４およびＭＹＣ（８ｑ２４）のコピーを数える。ＳＴＡＴ１の遺伝子座特異的プローブおよび／またはＡＵＲＫＡの遺伝子座特異的プローブなどの１つ以上の他の遺伝子座特異的プローブおよび／または動原体プローブ（ＣＥＰ）を使用する場合、それぞれの遺伝子座および／または染色体のコピーも数える。
【００６５】
従って、このような方法は、患者から得た結腸直腸腺腫の試料（細胞、例えば、上皮細胞など）、例えば、核酸試料を、ＥＧＦＲ（７ｐ１２）の遺伝子座特異的プローブ、ＤＣＣ（１８ｑ２１）の遺伝子特異的プローブ、１８番染色体（ＣＥＰ１８）の染色体計数プローブ、１３ｑ１４の遺伝子座特異的プローブおよびＭＹＣ（８ｐ２４）の遺伝子座特異的プローブを含む検出可能に標識されたプローブと、プローブがこの標的核酸と選択的に結合し、安定なハイブリダイゼーション複合体を形成することを可能にする（または促進する）条件下で接触させるステップを含む  。検出可能に標識されたプローブは、ＳＴＡＴ１の遺伝子座特異的プローブおよび／またはＡＵＲＫＡの遺伝子座特異的プローブなどの１つ以上の他の遺伝子座特異的プローブおよび／または動原体プローブ（ＣＥＰ）をさらに含むことができる。このような方法は、ハイブリダイゼーション複合体の形成を検出するステップと、ハイブリダイゼーション複合体の数を数えるステップとをさらに含む。検出可能に標識されたプローブが、ＳＴＡＴ１の遺伝子座特異的プローブおよび／またはＡＵＲＫＡの遺伝子座特異的プローブなどの１つ以上の他の遺伝子座特異的プローブおよび／または動原体プローブ（ＣＥＰ）をさらに含む場合、これらの方法は、このようなプローブを含むハイブリダイゼーション複合体の形成を検出するステップと、このような追加のプローブを含むハイブリダイゼーション複合体の数を数えるステップとをさらに含む。この方法は、ＥＧＦＲ（７ｐ１２）、ＤＣＣ（１８ｑ２１）、ＣＥＰ１８、１３ｑ１４およびＭＹＣ（８ｑ２４）を含むハイブリダイゼーション複合体の数に照らして、ＥＧＦＲ（７ｐ１２）のコピー数、ＣＥＰ１８に対するＤＣＣ（１８ｑ２１）のコピー数、１３ｑ１４のコピー数およびＭＹＣ（８ｑ２４）のコピー数を決定するステップをさらに含む。この方法は、ＳＴＡＴ１の遺伝子座特異的プローブおよび／またはＡＵＲＫＡの遺伝子座特異的プローブなどの１つ以上の他の遺伝子座特異的プローブおよび／または動原体プローブ（ＣＥＰ）をさらに含むハイブリダイゼーション複合体の数に照らして、ＳＴＡＴ１のコピー数および／またはＡＵＲＫＡのコピー数などのそれぞれの遺伝子座および／または染色体のコピー数を決定するステップをさらに含む。所望であれば、コピー数を、予想されるまたは「正常な」数のコピー数（即ち、２つのコピー）と比較することができ、２より大きいコピー数（即ち、増加）および２未満のコピー数（即ち、消失）および／または適切にＬＳＩプローブのコピー数と動原体プローブ（本明細書において染色体計数プローブ（ＣＥＰ）とも呼ばれる。）のコピー数の比較に基づいて比較した相対的消失は、細胞がＦＩＳＨによって異常であることを示す。２つ以上の遺伝子座の２つより多いコピーの存在は多染色体性を示している。単一遺伝子座の２つより多いコピーなどの単一遺伝子座のコピー数増加は、単一遺伝子座増加を示している。脱パラフィン処理中に、当技術分野で既知の方法に従って前処理、染色および慣例のスライド洗浄を行うこともできるが、ＶＰ２０００  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．、Ｄｅｓ  Ｐｌａ���ｎｅｓ、ＩＬ）などの自動化システムの使用によって評価のためにスライドを調製するために必要とされる時間の量が減らされる。標準的なコプリンジャーをハイブリダイゼーション後洗浄に使用する場合、スライドを小さなバッチ（例えば、４枚のスライド）と対照的に大きなバッチ（例えば、５０枚のスライド）で調製することができる。さらに、自動化画像法を用いてスライドのスコアリングを完全に自動化し、これによって標本分析に要する実際の時間の量を減らすことができる。完全自動化により、より多くの異常な細胞をより頻繁におよび一貫して捕捉する画像化アルゴリズムの使用も可能になる。また、当技術分野で既知のスライド調製のいずれの適当な方法も使用することができるが、好ましくはより均一で一貫した細胞単層を作製するＴｈｉｎＰｒｅｐ  ２０００（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いてスライドを調製する。
【００６６】
当技術分野で既に既知のまたは現在開発中の他の方法は、ホルマリン固定およびパラフィン包埋された細胞以外の、腺腫から得た細胞、例えば、上皮細胞の試料、例えば、新鮮な細胞もしくは凍結細胞、均質化細胞、溶解細胞、または腺腫から得た上皮細胞（本明細書で使用される「上皮細胞の試料」はコピー数および増加／消失の測定を可能にする腺腫から得た上皮細胞から単離または精製された核酸を含む、腺腫から得た上皮細胞の試料の全ての形態を包含することを意図している。）からの単離もしくは精製核酸（例えば、ＤＮＡなどの「核酸試料」）などの試料の使用を要し得るまたは好み得る。核をパラフィン包埋標本の厚い切片から抽出して切断人為産物を減らし、外来性の包埋材料を排除することができる。典型的には、生体試料をいったん得たら、当技術分野で既知の標準法を用いてハイブリダイゼーション前に回収および処理する。このような処理には、典型的にはプロテアーゼ処理およびホルムアルデヒドなどのアルデヒド溶液への追加の固定が含まれる。
【００６７】
本明細書で使用することができる方法の例としては、これだけに限らないが、場合によりコピー数を測定する遺伝子および／または染色体領域の前増幅を用いた、定量ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）、リアルタイムＱ−ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、ＰＣＲ産物の比重走査、デジタルＰＣＲ（例えば、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９６：９２３６−９２４１（１９９９）；米国特許出願公開第２００５／０２５２７７３号明細書；および米国特許出願公開第２００９／００６９１９４号明細書参照）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ；例えば、Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：８１８−８２１（１９９２）；および国際特許出願公開ＷＯ９３／１８１８６参照）、マイクロサテライトまたはサザン対立形質分析、ドットブロット、アレイ、マイクロアレイ（Ｃａｒｔｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３９：Ｓ１６−Ｓ２１（２００７年７月））、多重増幅プローブハイブリダイゼーション（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ａｍｐｌｉｆｉａｂｌｅ  ｐｒｏｂｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（ＭＡＰＨ）、多重ライゲーション依存プローブ増幅（ＭＬＰＡ；例えば、Ｓｃｈｏｕｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：ｅ５７（２００２）参照）、変性高速液体クロマトグラフィー（ｄＨＰＬＣ；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６４（３）：２２６−２３４（２００５））、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、くし分けしたゲノムＤＮＡ上の蛍光プローブの長さを測定する（Ｈｅｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９７（１）：２２２−２２７（２０００））、基準クエリピロシーケンス（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｑｕｅｒｙ  ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＲＱＰＳ；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｐｒｏｔｏｃ．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５４９１（２０１０））、基準配列上でのフォスミド末端のマッピング（キャピラリーに基づく技術）、微小電気泳動およびナノポアシーケンシング（例えば、Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１１：１５４４−１５４６（２００６）；およびＳｈｅｎｄｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．５：３３５−３４４（２００４）参照）などが挙げられる。
【００６８】
インサイツハイブリダイゼーションおよび同様の方法による分析のための核酸標的の変性は、典型的には細胞形態を保護するように行う。例えば、染色体ＤＮＡを、高ｐＨ、熱（例えば、約７０から９５℃の温度）、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）およびこれらの組み合わせによって変性することができる。他方、プローブを熱によって短時間で変性することができる。
【００６９】
変性後にハイブリダイゼーションを行う。プローブとこの核酸標的を特異的にハイブリダイズさせるための条件には、一般的に当業者によって容易に決定され得る、特異的ハイブリドを産生する所与のハイブリダイゼーション手順に使用可能な条件の組み合わせが含まれる。このような条件は、典型的には制御された温度、液相およびプローブと標的との間の接触を含む。ハイブリダイゼーション条件は、プローブ濃度、標的長さ、標的とプローブのＧ−Ｃ含量、溶媒組成、温度およびインキュベーションの期間を含む多くの因子に応じて変化する。少なくとも１つの変性ステップが、プローブと標的の接触に先行することができる。または、プローブおよび標的を、互いに接触させながらまたはプローブと生体試料をその後接触させて、変性条件に一緒に供することができる。ハイブリダイゼーションを、例えば、２から４×ＳＳＣとホルムアミドの約５０：５０体積比の液相中、約２５から約５５℃の範囲の温度で例示的に約０．５から約９６時間の範囲の時間、またはより好ましくは約３２から約４０℃の温度で約２から約１６時間の範囲の時間のプローブ／試料のその後のインキュベーションで達成することができる。特異性を高めるために、米国特許第５７５６６９６号明細書（この内容の全体がおよびブロッキング核酸の使用の記載について具体的に参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されている未標識ブロッキング核酸などのブロッキング剤を使用することができる。当業者に容易に明らかとなるように、プローブと試料中に存在するこの核酸標的を特異的にハイブリダイズするために他の条件を容易に使用することができる。ハイブリダイゼーションプロトコルは、例えば、Ｐｉｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：９１３８−９１４２（１９８８）；Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．  ３３、Ｃｈｏｏ，ｅｄ．、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ（１９９４）；およびＫａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：５３２１−５３２５（１９９２）に記載されている。
【００７０】
適切なインキュベーション期間が完了したら、一連の洗浄によって、染色体プローブと試料ＤＮＡの非特異的結合を除去することができる。所望のストリンジェンシーのために温度および塩濃度を適切に選択する。要求されるストリンジェンシーのレベルは、ゲノム配列に対する特異的プローブ配列の複雑度に依存し、プローブと既知の遺伝子組成の試料を系統的にハイブリダイズすることによって決定することができる。一般に、高ストリンジェンシー洗浄は、約６５から約８０℃の範囲の温度で、約０．２×から約２×ＳＳＣおよび約０．１％から約１％の非イオン性界面活性剤、例えば、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ４０）を用いて行うことができる。低ストリンジェンシー洗浄が要求される場合、洗浄をより低温度で、塩濃度を増加させて行うことができる。
【００７１】
発蛍光団標識プローブまたはプローブ組成物を使用する場合、検出法は、蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリーまたはプローブハイブリダイゼーションを測定するための他の手段を含むことができる。任意の適した顕微鏡画像化法を、複数の発蛍光団を観察するために本明細書に記載される方法と合わせて使用することができる。蛍光顕微鏡法を使用する場合、ハイブリダイズした試料を、各発蛍光団の励起に適した光の下で、適切なフィルタを使用して見ることができる。または、ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ、ＢｉｏＶｉｅｗまたはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓなどの自動化デジタル画像化システムをシグナルエニュメレーションおよびデータ取得アルゴリズムと一緒に使用することができる。
【００７２】
使用する方法に応じて、デジタル画像分析システムを使用して結果の表示を容易にし、蛍光強度の小さな差を検出する感度を改善することができる。代表的なシステムは、自動化ステージ、焦点制御およびフィルタホイールを備えた標準的な蛍光顕微鏡に基づく自動化画像分析システムであるＱＵＩＰＳ（定量画像処理システムの頭字語）である。励起波長を選択するために、フィルタホイールを顕微鏡の蛍光励起光路にはめる。二色性ブロックの特別なフィルタ（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ、ＶＴ）により、画像レジストレーションずれがなく、複数色素の励起が可能になる。顕微鏡は２つのカメラポートを有し、この一方はスライド上の興味深い領域を見つけるためならびに焦点を合わせるために使用される高感度高速ビデオ画像表示用の強調ＣＣＤカメラ（Ｑｕａｎｔｅｘ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を有する。他方のカメラポートは、高解像度および感度での実画像取得のために使用される冷却ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｌｔｄ．、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺによるモデル２００）を有する。冷却ＣＣＤカメラは、ＶＭＥバスを通してＳＵＮ４／３３０ワークステーション（ＳＵＮ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）と接続している。画像処理ソフトウェアパッケージＳＣＩＬ−Ｉｍａｇｅ（Ｄｅｌｆｔ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ、Ｄｅｌｆｔ、オランダ）を用いて、多色画像の全取得を制御する。
【００７３】
アレイＣＧＨ（ａＣＧＨ）では、プローブを基質上に別々の位置で固定し、標識しない（例えば、国際特許出願公開ＷＯ９６／１７９５８参照）。代わりに、標的核酸を含む試料核酸を標識する。試料核酸をハイブリダイゼーション前に標識するまたはハイブリダイゼーション複合体を検出可能に標識する。二色または多色ａＣＧＨでは、プローブアレイを異なって標識された標的核酸の２つ以上の収集物と同時にまたは連続的にハイブリダイズする。
【００７４】
従って、結腸直腸腺腫の予後、例えば、進行のリスクへの使用に加えて、上記方法を治療剤による治療に対する潜在的反応性の評価、再発の監視および結腸直腸腺癌の予防的または治療的処置の有効性の評価に使用することができる。従って、この方法は、治療または予防用の治療剤の選択、外科手術に対する積極的な監視または治療の選択およびこの選択を含む補助治療を使用することの決定などの治療決定を助けることができる。所望であれば、本明細書に記載される方法を、慣例の細胞学、組織学、抗原アッセイ、ノモグラム、メチル化、突然変異などの他の検査と合わせて使用することができる。この方法を使用して他の予後方法で以前にまたは同時に得られた結果を確認することができる。
【００７５】
例えば、患者の結腸直腸腺腫の予後を判定する上記方法を行う過程中で、ＥＧＦＲのコピー数増加が存在すると決定された場合、抗ＥＧＦＲ剤で患者を治療するという決定を行うことができるであろう。例えば、ヒトＥＧＦＲに結合し、報告によれば上皮成長因子（ＥＧＦ）とＥＧＦＲの結合を遮断し、これによって受容体シグナル伝達を遮断し、腫瘍細胞活性化および増殖を阻害することが示されている（例えば、国際特許出願公開ＷＯ９８／５０４３３および米国特許第６２３５８８３号明細書参照）ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であるパニツムマブ（ベクチビックス（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ））またはＫＲＡＳ変異ネガティブ、ＥＧＦＲ発現、転移性結腸直腸癌の治療に承認されているキメラｍＡｂであるセツキシマブ（アービタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ））などの抗ＥＧＦＲ抗体を患者に投与して腺腫から腺癌への進行を阻害するおよび／または腺腫の再発を阻害することができるであろう。さらにもしくはまたは、約１年患者にフォローアップ結腸鏡検査を行うという決定を行うことができるであろう。
【００７６】
同様に、患者の結腸直腸腺腫の予後を判定する上記方法を行う過程中で、ＤＣＣのコピー数減少が存在すると決定された場合、抗ＥＧＦＲ剤を含まない抗癌療法などの代替療法で患者を治療するという決定を行うことができるであろう。このような代替療法の例としては、これだけに限らないが、フルオロウラシル、シスプラチン、ドキソルビシンおよびシクロホスファミドが挙げられる。さらにもしくはまたは、約１年患者にフォローアップ結腸鏡検査を行うという決定を行うことができるであろう。
【００７７】
同様に、患者に結腸鏡検査を行う過程中で腺腫が発見され、腺腫性ポリープを除去する場合、上記方法を使用して腺腫の再発について患者を監視することができるであろう。同様に、患者の結腸直腸腺腫の予後を判定する上記方法を行う過程中で、染色体異常が存在しないと決定されるなど、患者の腺腫の再発のリスクが低いと決定された場合、約５年患者にフォローアップ結腸鏡検査を行うという決定を行うことができるであろう。
【００７８】
患者の結腸直腸腺腫の予後を判定する上記方法を行う過程中で、ＥＧＦＲ、ＭＹＣおよび１３ｑ１４のコピー数増加ならびにＣＥＰ１８に対するＤＣＣのコピー数減少が存在すると決定された場合、単独で、またはフルオロウラシル、シスプラチン、ドキソルビシンおよび／またはシクロホスファミドなどの代替または補助療法と組み合わせてペニツムマブおよび／またはセツキシマブなどの抗ＥＧＦＲ剤で患者を治療するという決定を行うことができるであろう。さらに、約６ヶ月患者にフォローアップ結腸鏡検査を行うという決定を行うことができるであろう。同様にさらにもしくはまたは、上記方法を使用して、経時的にこの方法を定期的に行い、経時的に結果を、例えば、ある時点からその後のまたは前の時点まで比較することによって、治療の有効性を評価することができるであろう。
【００７９】
上記方法を使用して試験試料を得た患者の治療の有効性を評価する場合、この方法は場合により、有効性を改善するために必要とされるように患者の治療的／予防的処置を修正するステップをさらに含む。この方法を自動化システムまたは半自動化システムに使用するために適合させることができる。
【００８０】
大まかに言うと、疾患進行および／または治療を監視する場合、染色体異常（存在またはレベル）は「不変である」、「好都合な」（もしくは「好都合に変化した」）または「不利な」（もしくは「不利に変化した」）であり得る。「上昇した」または「増加した」は、正常なもしくは典型的なレベルもしくは範囲よりも高いまたは別の基準レベルもしくは範囲（例えば、以前の試料もしくはベースライン試料）よりも高い、患者の腺腫から得た上皮細胞の試料中の染色体異常のレベルを指す。「低下した」または「減少した」は、正常なもしくは典型的なレベルもしくは範囲よりも低いまたは別の基準レベルもしくは範囲（例えば、以前の試料もしくはベースライン試料）よりも低い、腺腫から得た上皮細胞の試料中の染色体異常のレベルを指す。「変化した」は、正常なもしくは典型的なレベルもしくは範囲に対してまたは別の基準レベルもしくは範囲（例えば、以前の試料もしくはベースライン試料）に対して変化した（増加したもしくは減少した）、腺腫から得た上皮細胞の試料中の染色体異常のレベルを指す。
【００８１】
所与の染色体異常についての正常なもしくは典型的なレベルもしくは範囲は、標準的な実務に従って定義される。幾つかの例では染色体異常のレベルが極めて低いので、実験誤差または試料変動によって説明することができない典型的なもしくは正常なレベルもしくは範囲、または基準レベルもしくは範囲と比べた正味の変化があった場合に、いわゆる変化したレベルまたは変化が起こったとみなすことができる。従って、特定の試料で測定されたレベルを、いわゆる正常対象からの同様の試料で決定されたレベルまたはレベルの範囲と比較する。本文脈において、「正常対象」とは検出可能な疾患のない個体であり、「正常」もしくは「対照」患者または集団は、例えば、それぞれ検出可能な疾患を示さない者である。さらに、染色体異常がヒト集団の大多数において高レベルで日常的には見られないとすると、「正常対象」を所与の染色体の実質的に検出可能なレベル増加がない個体とみなすことができ、「正常」（しばしば、「対照」と呼ばれる）患者または集団は所与の染色体の実質的に検出可能なレベル増加を示さない者である。「明らかに正常な対象」は染色体異常が評価されていないまたは評価されていない者である。染色体異常が通常検出不可能であるが、試験試料で検出される場合、ならびに分析物が正常レベルより高レベルで試験試料中に存在する場合、所与の染色体異常のレベルが「上昇した」と言われる。
【００８２】
この方法はまた、他のマーカーの検出などを含むこともできる。
【００８３】
従って、患者の腺癌の治療の有効性を監視する場合、この方法は、
（ａ）治療剤での治療前に対象の腺癌の上皮細胞の試料中の染色体異常を測定するステップと；
（ｂ）治療剤での治療後に対象の腺癌の上皮細胞の後の試料中の染色体異常のレベルを測定するステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定される染色体異常のレベルとステップ（ａ）で測定される染色体以上のレベルを比較するステップと
を含むことができ、ステップ（ｂ）のレベルが、ステップ（ａ）で測定されるレベルと比べて不変であるまたは不利である場合、腺癌が対象において継続している、進行しているまたは悪化していると決定される。比較して、ステップ（ｂ）で測定されるレベルが、ステップ（ａ）で測定されるレベルと比べて好都合な場合、腺癌は対象において中断した、退行したまたは改善したと見られる。場合により、比較がステップ（ｂ）で測定されるレベルが、例えば、ステップ（ａ）で測定されるレベルに対して不利に変化していることを示した場合、この方法は、例えば、１種以上の他の治療剤、放射線および／またはホルモン療法で一定期間対象を治療するステップをさらに含む。対象を治療する期間は、当業者によって決定され得る（例えば、期間は約７日から約２年、好ましくは約１４日から約１年となり得る。）。
【００８４】
次いで、治療経過中、腺癌細胞の第２およびその後の試料を対象から得る。試料の数および前記試料を対象から得た時間は重要でない。例えば、第２の試料を、対象を最初に治療した７日後に得ることができ、第３の試料を、対象を最初に治療した２週間後に得ることができ、第４の試料を、対象を最初に治療した３週間後に得ることができ、第５の試料を、対象を最初に治療した４週間後に得ることができる等であるであろう。
【００８５】
各第２またはその後の試料を対象から得た後、第２またはその後の試料中の染色体異常のレベルを測定する（例えば、本明細書に記載されるまたは当技術分野で既知の方法を用いる。）。次いで、第２およびその後の試料の各々で測定されるレベルを、第１の試料（例えば、所定のレベルと当初場合により比較した試料）で測定されるレベルと比較する。ステップ（ｃ）で測定されるレベルが、ステップ（ａ）で測定されるレベルと比べて好都合な場合、腺癌は中断した、退行したまたは改善したと見られ、対象を治療し続けるべきである。しかしながら、ステップ（ｃ）で測定されるレベルが、ステップ（ａ）で測定されるレベルと比べて不変であるまたは不利である場合、腺癌が継続している、進行しているまたは悪化していると決定され、対象をより高い投与量の医薬組成物、放射線もしくはホルモンで治療すべきである、または対象を異なって治療すべきである。
【００８６】
一般的に、反復試験を行うことができるアッセイ（例えば、疾患進行および／または治療に対する反応を監視する。）については、第２またはその後の試験試料を、第１の試験試料を対象から得た後の期間で得る。具体的には、対象からの第２の試験試料を、第１の試験試料を対象から得た数分、数時間、数日、数週間または数年後に得ることができる。例えば、第２の試験試料を、対象から第１の試験試料を得た約１分、約５分、約１０分、約１５分、約３０分、約４５分、約６０分、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１３週間、約１４週間、約１５週間、約１６週間、約１７週間、約１８週間、約１９週間、約２０週間、約２１週間、約２２週間、約２３週間、約２４週間、約２５週間、約２６週間、約２７週間、約２８週間、約２９週間、約３０週間、約３１週間、約３２週間、約３３週間、約３４週間、約３５週間、約３６週間、約３７週間、約３８週間、約３９週間、約４０週間、約４１週間、約４２週間、約４３週間、約４４週間、約４５週間、約４６週間、約４７週間、約４８週間、約４９週間、約５０週間、約５１週間、約５２週間、約１．５年、約２年、約２．５年、約３．０年、約３．５年、約４．０年、約４．５年、約５．０年、約５．５年、約６．０年、約６．５年、約７．０年、約７．５年、約８．０年、約８．５年、約９．０年、約９．５年または約１０．０年後の期間で対象から得ることができる。
【００８７】
さらに、本開示はまた、腺腫または腺癌にかかりやすいまたは腺腫または腺癌を患っている対象が治療から利益を得るかどうかを決定する方法に関する。特に、本開示は、比較診断方法および製品に関する。従って、本明細書に記載される「対象の疾患の治療を監視する」方法は、場合により療法の候補を選択または同定するステップもさらに包含することができる。一般的に、対象は、疾患のある症状を経験したまたはこのような疾患のリスクを有するもしくはリスクがあると実際に診断された、および／または本明細書に記載される染色体異常の不利なレベルを示す者である。
【００８８】
本方法は、場合により本明細書に記載されるアッセイを含み、ここでは染色体異常のレベルを対象の治療前および後に評価する。治療後の染色体異常の不利なレベルの観察により、対象がさらなるまたは継続した治療を受けることから利益を得ないことが確認される一方で、治療後の染色体異常の有利なレベルの観察により、対象がさらなるまたは継続した治療を受けることから利益を得ることが確認される。この確認は、臨床研究の管理および改善した患者管理の提供を助ける。
【００８９】
プローブ
プローブのセットも提供される。プローブのセットは、ＥＧＦＲの遺伝子座特異的プローブ、ＤＣＣの遺伝子座特異的プローブ、１８番染色体の染色体計数プローブ（ＣＥＰ１８）、１３ｑ１４の遺伝子座特異的プローブおよびＭＹＣの遺伝子座特異的プローブを含む、またはこれらからなる。プローブのセットは、ＳＴＡＴ１の遺伝子座特異的プローブおよび／またはＡＵＲＫＡの遺伝子座特異的プローブをさらに含む、またはこれらからなることができる。
【００９０】
ＥＧＦＲのプローブの例は、Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．、Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ、ＩＬから入手可能なＶｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＥＧＦＲである。ＥＧＦＲ遺伝子は約１８８ｋｂである。プローブは、５’方向に約１ｋｂおよび３’方向に約１０６ｋｂ、遺伝子を越えて広がる。プローブ全体は約３００ｋｂである。
【００９１】
別の方法によりＥＧＦＲに関連するパラメータを検出するためのプローブは、ＦＩＳＨなどのインサイツハイブリダイゼーションに使用されるプローブよりも小さく、実質的にかなり小さくなり得、この場合、プローブは、好ましくはＥＧＦＲ遺伝子中の配列とハイブリダイズすることができる（配列情報はＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ）およびＧｅｎｅＣａｒｄｓ（Ｒ）（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ）からオンラインで入手可能である。）。「ＥＧＦＲ」は、本明細書においてコピー数、コピー数の比、増加割合など、ＥＧＦＲに関するパラメータを決定するために使用される特定の方法に関係なくパラメータを決定するために使用することができる任意のおよび全てのプローブを指すために使用される。
【００９２】
ＤＣＣのプローブの例にＡｂｎｏｖａ  ＤＣＣがある。Ａｂｎｏｖａ  ＤＣＣはＡｂｎｏｖａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、台湾によって製造されており、カタログ番号８９−０２８−９６３でＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、ピッツバーグ、ＰＡによって供給されている。
【００９３】
別の方法によりＤＣＣに関連するパラメータを検出するためのプローブは、ＦＩＳＨなどのインサイツハイブリダイゼーションに使用されるプローブよりも小さく、実質的にかなり小さくなり得、この場合、プローブは、好ましくはＤＣＣ遺伝子中の配列とハイブリダイズすることができる（配列情報はＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ）およびＧｅｎｅＣａｒｄｓ（Ｒ）（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ）からオンラインで入手可能である。）。「ＤＣＣ」は、本明細書においてコピー数、コピー数の比、増加割合など、ＤＣＣに関するパラメータを決定するために使用される特定の方法に関係なくＣＥＰ１８に対するＤＣＣなどのパラメータを決定するために使用することができる任意のおよび全てのプローブを指すために使用される。
【００９４】
１３ｑ１４またはＲＢ１のプローブの例は、Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．、Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ、ＩＬから入手可能なＶｙｓｉｓ  ＬＳＩ１３（１３ｑ１４）である。ＬＳＩ１３（１３ｑ１４）は、ＲＢ１遺伝子および隣接領域を含む重複クローンのセットからなる。ＲＢ１遺伝子は１８０ｋｂである。プローブは、５’方向に約１１０から１７０ｋｂおよび３’方向に約１２０ｋｂ、遺伝子を越えて広がる。プローブ全体は約４４０ｋｂの大きさであり、７ｐ１１領域とハイブリダイズする。
【００９５】
別の方法により１３ｑ１４またはＲＢ１に関連するパラメータを検出するためのプローブは、ＦＩＳＨなどのインサイツハイブリダイゼーションに使用されるプローブよりも小さく、実質的にかなり小さくなり得、この場合、プローブは、好ましくは１３ｑ１４またはＲＢ１遺伝子中の配列とハイブリダイズすることができる（配列情報はＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ）およびＧｅｎｅＣａｒｄｓ（Ｒ）（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ）からオンラインで入手可能である。）。「１３ｑ１４またはＲＢ１」は、本明細書においてコピー数、コピー数の比、増加割合など、１３ｑ１４またはＲＢ１に関するパラメータを決定するために使用される特定の方法に関係なくパラメータを決定するために使用することができる任意のおよび全てのプローブを指すために使用される。
【００９６】
ＭＹＣのプローブの例は、Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．、Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ、ＩＬから入手可能なＶｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＭＹＣ（８ｑ２４）である。ＭＹＣ遺伝子は４．４ｋｂである。プローブは、５’方向に約３８２ｋｂおよび３’方向に約４３４ｋｂ、遺伝子を越えて広がる。プローブ全体は約８２１ｋｂの大きさであり、８ｑ２４領域とハイブリダイズする。
【００９７】
別の方法によりＭＹＣに関連するパラメータを検出するためのプローブは、ＦＩＳＨなどのインサイツハイブリダイゼーションに使用されるプローブよりも小さく、実質的にかなり小さくなり得、この場合、プローブは、好ましくはＭＹＣ遺伝子中の配列とハイブリダイズすることができる（配列情報はＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ）およびＧｅｎｅＣａｒｄｓ（Ｒ）（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ）からオンラインで入手可能である。）。「ＭＹＣ」は、本明細書においてコピー数、コピー数の比、増加割合など、ＭＹＣに関するパラメータを決定するために使用される特定の方法に関係なくパラメータを決定するために使用することができる任意のおよび全てのプローブを指すために使用される。
【００９８】
ＳＴＡＴ１のプローブは、当技術分野で入手可能な配列情報を用いて当業者に既知の方法に従って調製することができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ）から入手可能な寄託番号ＮＧ＿００８２９４．１の基準配列およびこの中で引用されているＨａｄｄａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．８３（１−２）：５８−５９（１９９８）を参照されたい。さらなる配列情報も、寄託番号ＡＣ０６７９４５．４としてＧｅｎＢａｎｋから入手可能なＢＡＣクローンＲＰ１１−６２９Ｂ４として入手可能である。
【００９９】
別の方法によりＳＴＡＴ１に関連するパラメータを検出するためのプローブは、ＦＩＳＨなどのインサイツハイブリダイゼーションに使用されるプローブよりも小さく、実質的にかなり小さくなり得、この場合、プローブは、好ましくはＳＴＡＴ１遺伝子中の配列とハイブリダイズすることができる（配列情報はＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ）およびＧｅｎｅＣａｒｄｓ（Ｒ）（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ）からオンラインで入手可能である。）。「ＳＴＡＴ１」は、本明細書においてコピー数、コピー数の比、増加割合など、ＳＴＡＴ１に関するパラメータを決定するために使用される特定の方法に関係なくパラメータを決定するために使用することができる任意のおよび全てのプローブを指すために使用される。
【０１００】
ＡＵＲＫＡのプローブの例は、Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．、Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ、ＩＬから入手可能なＶｙｓｉｓ  ＡＵＲＫＡ  ＦＩＳＨプローブである。
【０１０１】
別の方法によりＡＵＲＫＡに関連するパラメータを検出するためのプローブは、ＦＩＳＨなどのインサイツハイブリダイゼーションに使用されるプローブよりも小さく、実質的にかなり小さくなり得、この場合、プローブは、好ましくはＡＵＲＫＡ遺伝子中の配列とハイブリダイズすることができる（配列情報はＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ）およびＧｅｎｅＣａｒｄｓ（Ｒ）（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃａｒｄｓ．ｏｒｇ）からオンラインで入手可能である。）。「ＡＵＲＫＡ」は、本明細書においてコピー数、コピー数の比、増加割合など、ＡＵＲＫＡに関するパラメータを決定するために使用される特定の方法に関係なくパラメータを決定するために使用することができる任意のおよび全てのプローブを指すために使用される。
【０１０２】
染色体プローブとして使用するのに適したプローブは、染色体の動原体に関連する反復ＤＮＡとハイブリダイズする。霊長類染色体の動原体は、α−サテライトＤＮＡと呼ばれる約１７１塩基対（ｂｐ）の単量体反復長で構成されるＤＮＡの長いタンデム反復の複雑なファミリーを含む。染色体プローブは、典型的には約５０から１×１０５ヌクレオチド長である。より長いプローブは、典型的には約１００から５００ヌクレオチド長のより小さい断片を含む。
【０１０３】
染色体領域またはサブ領域を標的化する染色体計数プローブ（ＣＥＰ）および遺伝子座特異的プローブは、商業的に得ることができるまたは当業者が容易に調製することができる。このようなプローブは、Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．（Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ、ＩＬ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）またはＣｙｔｏｃｅｌｌ（Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、英国）から商業的に得ることができる。染色体プローブは、例えば、タンパク質核酸（ＰＮＡ）、プラスミドなどのクローンニングヒトＤＮＡ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）およびヒトＤＮＡ配列の挿入を含むＰｌ人工染色体（ＰＡＣ）から調製することができる。対象となる領域をＰＣＲ増幅またはクローニングを介して得ることができる。別の実施形態では、染色体プローブがオリゴプローブであり得る。または、染色体プローブを当技術分野で既知の方法に従って合成的に調製することができる。
【０１０４】
特定の遺伝子座を標的化することが望まれる場合、標的化遺伝子の全長に沿ってハイブリダイズするプローブが要求されないが好まれ得る。遺伝子座特異的プローブを、この遺伝子異常が転移と相関する癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子、例えば、ＭＹＣとハイブリダイズするよう設計することができる。
【０１０５】
プローブを当技術分野で既知の任意の方法によって調製することができる。プローブを合成または組換え産生することができる。このようなプローブは、約２５０００塩基対から約８０００００塩基対の長さに及び得る。
【０１０６】
好ましくは、プローブを検出可能に標識し、２つ以上のプローブを同じ試料で同時にまたは順次使用する場合、好ましくは、各プローブを異なって標識する。好ましくは、プローブを発蛍光団で検出可能に標識する。好ましい発蛍光団の例としては、これだけに限らないが、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、リサミンローダミンＢ、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸、テトラメチルローダミン−５−イソチオシアネート、テトラメチルローダミン−６−イソチオシアネート、５−カルボキシルテトラメチルローダミン、６−カルボキシルテトラメチルローダミン、７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸、Ｎ−４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−３−インダセンプロピオン酸、エオシン−５−イソチオシアネート、エリスロシン−５−イソチオシアネート、ＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ（商標）（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｏｌｄ（商標）（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ（商標）（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ（商標）（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ（商標）（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．、Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ、ＩＬ）、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）、ルシファーイエローおよびＣＡＳＣＡＤＥブルーアセチルアジド（（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。使用する特定の標識は重要ではないが、望ましくは、特定の標識がプローブのインサイツハイブリダイゼーションおよび他のプローブ上の標識の検出を妨害しない。標識は、望ましくはアッセイの感度を最大化し、背景シグナルより上で検出可能となることを可能にするくらい低いコピー数で検出可能である。同様に望ましくは、標識が高度に局在化したシグナルを提供し、これによって高い程度の空間分解能を提供する。
【０１０７】
発蛍光団と核酸プローブの結合は当技術分野で周知であり、任意の入手可能な手段によって達成することができる。例えば、ニックトランスレーション、ランダムプライミング（Ｒｉｇｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１３：２３７（１９９７））、ＰＣＲ標識、末端標識、シトシン残基などの特定の残基の化学修飾による直接標識（米国特許第５４９１２２４号明細書）などの標準的な技術を用いて、発蛍光団を特定のヌクレオチドに共有結合し、標識したヌクレオチドをプローブに組み込むことができる。または、発蛍光団を、例えば、アミノ基転移したプローブのデオキシシチジンヌクレオチドに対するリンカーを介してプローブに組み込まれた活性化リンカーアームによりヌクレオチドに共有結合することができる。プローブを標識する方法は、共にこのプローブを標識する記載について参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５４９１２２４号明細書およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第２章、「Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ」、ｐ．２１−４０、Ｆａｎ，Ｅｄ．、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００２）に記載されている。
【０１０８】
当業者であれば、標識含有部分として発蛍光団の代わりに他の剤または色素を使用することができることを認識するであろう。発光剤には、例えば、放射線発光、化学発光、生物発光およびリン光標識含有部分が含まれる。可視光で検出可能な剤にはシアニン色素が含まれる。または、間接的な手段によって可視化される検出部分を使用することができる。例えば、プローブを、当技術分野で既知の慣例の方法を用いてビオチンまたはジゴキシゲニンで標識し、次いで、検出のためにさらに処理することができる。ビオチン含有プローブの可視化は、検出可能なマーカーと抱合したアビジンのその後の結合を介して達成することができる。検出可能なマーカーは発蛍光団であり得、この場合、プローブの可視化および識別を下記の通り達成することができる。
【０１０９】
または、標的領域とハイブリダイズした染色体プローブを、不溶性着色生成物を製造するのに適した基質を有する標識部分の酵素反応によって可視化することができる。各プローブを、別個の標識部分の選択によってセット内の他のプローブから識別することができる。セット内のビオチン含有プローブを、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）または西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と抱合したアビジンおよび適した基質と共にその後インキュベートすることによって検出することができる。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートおよびニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）がアルカリホスファターゼの基質として働き、ジアミノベンゾエートがＨＲＰの基質として働く。
【０１１０】
キット
キットも提供される。このキットは、（ａ）患者の結腸直腸腺腫の予後を可能にするプローブのセットと、（ｂ）患者の結腸直腸腺腫の予後を判定するための指示とを含む。従って、キットは、（ａ）患者の結腸直腸腺腫の予後を可能にするプローブのセットであって、ＥＧＦＲの遺伝子座特異的プローブ、ＤＣＣの遺伝子座特異的プローブ、１８番染色体（ＣＥＰ１８）の染色体計数プローブ、１３ｑ１４の遺伝子座特異的プローブおよびＭＹＣの遺伝子座特異的プローブを含む、またはからなるプローブのセットと、（ｂ）患者の結腸直腸腺腫の予後を判定するための指示であって、患者から得た結腸直腸腺腫の試料（細胞、例えば、上皮細胞など）で染色体異常の存在または非存在を決定することを含む指示とを含むことができる。プローブのセットは、ＳＴＡＴ１の遺伝子座特異的プローブおよび／またはＡＵＲＫＡの遺伝子座特異的プローブなどの１つ以上の他の遺伝子座特異的プローブおよび／または動原体プローブ（ＣＥＰ）をさらに含むことができる。染色体異常がないことは、結腸直腸腺腫の再発のリスクが低いことおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが低いことを示す一方で、ＥＧＦＲのコピー数増加は、結腸直腸腺腫の再発のリスクが増加していることおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが増加していることを示し、ＣＥＰ１８に対するＤＣＣのコピー数減少は、結腸直腸腺腫の再発のリスクが高いことおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが増加していることを示し、ＣＥＰ１８に対するＤＣＣのコピー数減少、１３ｑ１４のコピー数増加およびＭＹＣのコピー数増加とさらに組み合わせたＥＧＦＲのコピー数増加は、結腸直腸腺腫の再発のリスクが高いことおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが高いことを示す。
【０１１１】
ＳＴＡＴ１のコピー数増加および／またはＡＵＲＫＡのコピー数増加は、結腸直腸腺腫の再発のリスクが増加していることおよび／または結腸直腸腺腫から結腸直腸腺癌への進行のリスクが増加していることを示す。このようなキットは、ブロッキング剤または他のプローブ、プローブの検出を容易にするための種々の標識または標識化剤、ハイブリダイゼーション、中期スプレッド用の試薬（例えば、緩衝液）などをさらに含んでもよい。
【０１１２】
腺腫から上皮細胞を単離する方法
腺腫の試料から上皮細胞を単離する方法も提供される。この方法は、
（ａ）結腸直腸腺腫の新鮮な試料または解凍した新鮮凍結試料を室温で、ハンクス緩衝液中ですすぐステップと、
（ｂ）すすいだ試料を、２０ｍＭ  ＤＴＴおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む予熱したハンクス緩衝液に３７℃で約５分間浸漬するステップと、
（ｃ）すすいで浸漬した試料を、２０ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、５ｍＭ  ＣａＣｌ２および１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含むハンクス緩衝液に移し、約５秒から約１０秒間混合するステップと、
（ｄ）約１０００×ｇで約１０分間の遠心分離によって細胞をペレット化するステップと、
（ｅ）（ｄ）からの上清を捨てて、ペレット化細胞を残留上清に再懸濁するステップと、
（ｆ）（ｅ）からの再懸濁細胞を、約３０重量％から約６０重量％のメタノール、約４０重量％から約７０重量％の水、緩衝液および保存剤を含む溶液に入れ、この溶液を一晩室温に保つステップと
を含む。この方法は、
（ｇ）（ｆ）からの細胞を細胞診スライドに移すステップと、
（ｈ）スライドを９５％エタノールに室温で約１５分間浸漬するステップと、
（ｉ）スライドをカーノイズ溶液（３：１メタノール：酢酸固定液）に室温で３０分間浸漬するステップと、
（ｊ）スライドを室温で乾燥させるステップと
をさらに含むことができる。
【０１１３】
上記方法に照らして、細胞診スライドも提供される。このスライドは、上記方法により腺腫の試料から単離した上皮細胞を含む。スライドは、所望であれば、使用するまで−２０℃で保存することができる。
【実施例】
【０１１４】
以下の実施例は本開示を説明するのに役立つ。実施例は請求される発明の範囲を限定することを全く意図していない。
【０１１５】
［実施例１］
この実施例は、新鮮凍結した結腸組織試料からの上皮細胞の単離および細胞の起源の確認を記載するものである。
【０１１６】
凍結した結腸組織試料を室温で解凍した。組織を室温で、ハンクス緩衝液中ですすいだ。次いで、組織を２０ｍＭ  ＤＴＴおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む予熱したハンクス緩衝液に３７℃で５分間浸漬した。組織を振盪溶液２ｍＬ（４℃の２０ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０％ＤＭＳＯを含むハンクス緩衝液）を含む１０ｍＬ  Ｆａｌｃｏｎチューブに移し、チューブを５から１０秒間ボルテックスした。組織をＦａｌｃｏｎチューブから取り出した。上清を１０００×ｇで１０分間遠心分離して細胞を遠心沈殿し、その後、上清を捨てた。細胞を残留上清に再懸濁した。第１のチューブおよび第２のチューブからの細胞懸濁液を２０ｍＬ  ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ溶液を含むＴｈｉｎＰｒｅｐバイアルに別々に移した。細胞をＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ溶液中室温で一晩固定した。バイアルをスライド調製まで周囲温度で保存した。バイアルを長期間保管することが必要な場合、バイアルを２から８℃に置いた。
【０１１７】
製造業者の指示に従ってＴｈｉｎＰｒｅｐ  Ｔ−２０００プロセッサを用いてスライドを作製した。スライドを９５％エタノールに室温で１５分間浸漬し、次いで、直ちにスライドをカーノイズ溶液（３：１メタノール：酢酸固定液）に室温で３０分間移した。その後、スライドを垂直位置にして室温で乾燥させた。スライドを長期間保管することが必要な場合、スライドを使用するまで−２０℃で保存した。
【０１１８】
以下の手順に従って、免疫蛍光抗ＣＡＭ５．２抗体を用いて、新鮮、新鮮凍結、またはホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）などの組織からの上皮細胞の単離を確認した：
１．スライドを１×ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）ですすぐ。
２．ＰＢＳ中に調製した１％の新鮮なブロッキング試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）１００μＬをスライドに添加し、パラフィルムで覆う。
３．スライドを加湿ボックス中３７℃で２５分間インキュベートする。
４．パラフィルムを除去し、タッピングすることによってスライドの外に試薬を捨てる。
５．ＣＡＭ５．２−ＦＩＴＣ抗体１００μＬをスライドにアプライし、パラフィルムで覆う。
６．スライドを加湿ボックス中３７℃で１時間インキュベートする。
７．スライドを１×ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１×ＰＢＳ）中３７℃で５分間すすぎ、２回繰り返す。
８．ＤＡＰＩをアプライし、カバーガラスで覆う。
９．適したフィルタを用いて通常の蛍光顕微鏡でスライドを見る。
【０１１９】
顕微鏡評価によって、単離細胞の９５％以上が上皮起源のものであることが明らかになった。
【０１２０】
［実施例２］
この実施例は、実施例１のスライドで使用した蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）手順を記載するものである。
【０１２１】
スライドを２×ＳＳＣに７３℃で２分間入れ、その後、スライドをペプシン（０．５ｍｇ／ｍＬ）と共に３７℃で１０分間インキュベートした。その後、スライドを１×ＰＢＳに室温で５分間、１％ＮＢＦに室温で５分間および１×ＰＢＳに室温で５分間入れた。スライドを７０％エタノール、８５％エタノールおよび１００％エタノールにそれぞれ１分間入れることによって脱水し、次いで、風乾した。プローブ（１０μｌ）、次いで、カバーガラスをスライドに適用した。カバーガラスをゴム糊で密閉した。スライドをＴｈｅｒｍｏＢｒｉｔｅ中７２℃で２分間および３７℃で１２から１８時間（一晩）共変性した。翌日、スライドを７３℃で２分間０．４×ＳＳＣ／０．３％ＮＰ−４０および室温で１分間２×ＳＳＣ／０．１％ＮＰ−４０で処理した。次いで、スライドを風乾し、ＤＡＰＩ  Ｉ退色防止溶液（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．、Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ、ＩＬ）を乗せ、カバーガラスで覆った。
【０１２２】
ハイブリダイゼーション後、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｏｌｄ（商標）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ（商標）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ（商標）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ（商標）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ（商標）およびＤＡＰＩフィルタと共に蛍光顕微鏡を用いてスライドを評価した。細胞が以下：
ｉ）細胞１個当たり３つ以上のシグナルによって表される遺伝子コピー数増加、および／または
ｉｉ）１つまたは０のシグナルによって表される遺伝子コピー数消失、および／または
ｉｉｉ）１．０未満のＬＳＩプローブ対ＣＥＰプローブの比によって表される相対的消失
を有した場合に、細胞を染色体異常とみなした。
【０１２３】
５０個の細胞を各スライド上の指定された標的領域で数え上げ、各プローブのコピー数を記録した。
【０１２４】
結腸直腸癌（ＣＲＣ）に関連する１３個の遺伝子領域を６つのＣＲＣ標本およびそれぞれの正常な隣接組織（ＮＡＴ）で評価して、最も高い頻度の染色体異常を有するＦＩＳＨプローブを選択した。結果が、１０、２０および３０個の異常な細胞のカットオフを用いた、患者結腸腫瘍試料中で検出された１３個のプローブについての遺伝子コピー数変化を有する症例割合を示すプローブ（増加（＋）または消失（−））対異常なＦＩＳＨの％のグラフである図１に示される。この評価に基づいて、５つの候補プローブ（ＥＧＦＲ７ｐ１２、ＭＹＣ８ｑ２４、１３ｑ１４、ＤＣＣ１８ｑ２１およびＣＥＰ１８）を、結腸直腸腺腫と診断された２７個の凍結組織標本および３個の正常な隣接組織のセットでのさらなる試験のために選択した。２７の試験症例のうち、１１人の患者が同時発生の結腸癌と診断され、腺腫を有する１６人の患者が同時発生の結腸癌を有しなかった。各標本について、１人の観察者によって５０個の細胞／核についてＦＩＳＨパターンを記録し、染色体異常細胞の数を評価した。少なくとも１０個のＦＩＳＨ異常細胞のカットオフポイントを使用してＦＩＳＨ陽性を分類した。細胞がＥＧＦＲ、ＭＹＣおよび１３ｑ１４プローブについてのコピー数増加ならびにＣＥＰ１８に対するＤＣＣについてのコピー数消失を有した場合に、細胞を異常とみなした。結果は、結腸直腸腺腫症例で４つの異なるＦＩＳＨパターンが同定されることを示した：４つのプローブ全てが異常でない（二染色体）；ＤＣＣ遺伝子消失のみを有する；ＥＧＦＲ遺伝子増加のみを有する；および４つのプローブ全てが異常である、即ち、ＭＹＣ、１３ｑ１４およびＥＧＦＲ増幅ならびにＤＣＣ欠失（表１参照）。
【０１２５】
【表１】
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【０１２６】
この限られたセットの試料では、同時発生の結腸直腸癌を有する患者から得た腺腫標本の９１％がＦＩＳＨ陽性であることが分かった一方で、同時発生の癌を呈していない患者から得た場合、標本の３８％しかＦＩＳＨ陽性でなかった。
【０１２７】
この知見は、腺腫標本の異なる遺伝子プロファイルが個別化医療にとって臨床的な価値を有し得ることを示唆している。ＦＩＳＨ異常を有しない患者（ＦＩＳＨパターン１）は、ポリープ再発および／または進行のリスクが最低であり、最良の予後を有し得るので、治療を要さない。このような患者については、５年後などのフォローアップ結腸鏡検査が推奨され得る。対照的に、全てのプローブについて異常な結腸腺腫性ポリープを有する患者（ＦＩＳＨパターン４）は、ポリープ再発および／または進行のリスクが最高であるので、治療（例えば、抗ＥＧＦＲ剤）を要し得る。このような患者については、６ヶ月後などのフォローアップ結腸鏡検査が推奨され得る。ＥＧＦＲ増幅（ＦＩＳＨパターン２）は、ポリープ再発および／または進行のリスクが増加しているので、標的化薬物療法（例えば、抗ＥＧＦＲ剤）から利益を得ることができるであろう。このような患者については、１年後などのフォローアップ結腸鏡検査が推奨され得る。ＤＣＣ遺伝子消失の異常のみを有する患者の独特な群（ＦＩＳＨパターン３）は、ポリープ再発および／または進行のリスクが増加しているので、別の療法から利益を得ることができ、予後不良となり得る。このような患者については、１年後などのフォローアップ結腸鏡検査が推奨され得る。
【０１２８】
本明細書で言及される全ての特許、特許出願公開、雑誌論文、教科書および他の刊行物は、本開示に関する当業者の技能のレベルを示している。全てのこのような刊行物は、あたかも各個々の刊行物が参照により組み込まれることが具体的および個別的に示されているのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２９】
本明細書に例示的に記載される発明を、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素または制限の非存在下で適切に実施してもよい。従って、例えば、「含む」、「から本質的になる」および「からなる」という用語のいずれかの本明細書における各例を、他の２つの用語のいずれかで置き換えてもよい。同様に、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の意味を有することが明らかな場合を除き、複数参照を含む。従って、例えば、「方法」への言及は、本明細書に記載されるおよび／または本開示を読めば当業者に明らかになる型の１つもしくは複数の方法および／またはステップを含む。
【０１３０】
使用されている用語および表現は、説明の用語として使用されるものであって、限定の用語として使用されない。この点について、ある用語が「用語」の下に示され、そうでなければ「発明を実施すための形態」のいずれかで定義、記載、説明または議論されている場合、全てのこのような定義、記載、説明および議論はこのような用語に帰せられることが意図されている。このような用語および表現の使用において、示され、記載される特徴またはこの一部のいずれかの同等物を除外する意図もない。さらに、小見出し、例えば、「用語」が「発明を実施すための形態」で使用されるが、このような使用は参照の便宜のために過ぎず、ある節でなされる開示をこの節のみに限定することを意図しておらず、むしろ、ある小見出しの下になされるいずれの開示も、それぞれのおよび全ての他の小見出しの下の開示を構成することを意図している。
【０１３１】
請求される発明の範囲内で種々の修正が可能であることが認識される。従って、本発明を好ましい実施形態および任意の特徴の文脈で具体的に開示してきたが、当業者であれば本明細書に開示される概念の修正および変形を講じることができることを理解すべきである。このような修正および変形を本明細書で請求される発明の範囲内にあるとみなす。
【図１】
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【国際調査報告】
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