(57)【要約】本発明は、哺乳動物でのがんの根治的又は対症的処置方法におけるサルフェストロール（ジエチルスチルベストロールサルフェート）の使用に関する。本発明者らは、サルフェストロールが、哺乳動物のがんの処置において有効な薬物として適宜利用できることを、予想外にも見出した。本発明者らは、サルフェストロールを、高用量においてすら重篤な副作用を引き起こすこともなく投与できることをさらに発見した。サルフェストロールの臨床使用に加え、本発明は、サルフェストロールを含む経口投与単位、及びサルフェストロールを含む、静脈内投与のための無菌液にも関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物でのがんの根治的又は対症的処置方法における使用のためのサルフェストロール（ジエチルスチルベストロールサルフェート）。
【請求項２】
がんがホルモン非依存性がんである、請求項１に記載の使用のためのサルフェストロール。
【請求項３】
ホルモン非依存性がんが、ホルモン依存性がんをホルモン療法により処置した後にホルモン非依存性となったものである、請求項２に記載の使用のためのサルフェストロール。
【請求項４】
ホルモン非依存性がんが、ホルモン依存性がんを抗エストロゲン、アロマターゼ阻害剤、抗アンドロゲン又は１７αヒドロキシラーゼ／Ｃ１７，２０リアーゼ（ＣＹＰ１７Ａ１）阻害剤により処置した後にホルモン非依存性となったものである、請求項３に記載の使用のためのサルフェストロール。
【請求項５】
がんが乳がん又は前立腺がんである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のためのサルフェストロール。
【請求項６】
方法が経口投与、静脈内投与、又はその組み合わせを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のためのサルフェストロール。
【請求項７】
方法が、少なくとも０．０３ｍｍｏｌの１日投与量でのサルフェストロールの経口投与を含む、請求項６に記載の使用のためのサルフェストロール。
【請求項８】
方法が、少なくとも０．２ｍｍｏｌの１日投与量でのサルフェストロールの経口投与を含む、請求項７に記載の使用のためのサルフェストロール。
【請求項９】
方法が、少なくとも０．０３ｍｍｏｌの１日投与量でのサルフェストロールの静脈内投与を含む、請求項６に記載の使用のためのサルフェストロール。
【請求項１０】
方法が、少なくとも０．２ｍｍｏｌの１日投与量でのサルフェストロールの静脈内投与を含む、請求項９に記載の使用のためのサルフェストロール。
【請求項１１】
サルフェストロールがモノ−サルフェストロール（ジエチルスチルベストロール−モノサルフェート）である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用のためのサルフェストロール。
【請求項１２】
サルフェストロールがジ−サルフェストロール（ジエチルスチルベストロール−ジサルフェート）である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用のためのサルフェストロール。
【請求項１３】
少なくとも０．００１ｍｍｏｌのサルフェストロールを含有する経口投与単位であって、サルフェストロールがジエチルスチルベストロールモノ［３５Ｓ］サルフェート又はジエチルスチルベストロールジ［３５Ｓ］サルフェートではない、経口投与単位。
【請求項１４】
サルフェストロールがモノ−サルフェストロール（ジエチルスチルベストロール−モノサルフェート）である、請求項１３に記載の経口投与単位。
【請求項１５】
サルフェストロールがジ−サルフェストロール（ジエチルスチルベストロール−ジサルフェート）である、請求項１３に記載の経口投与単位。
【請求項１６】
少なくとも０．０３ｍｍｏｌのサルフェストロールを含有する請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の経口投与単位。
【請求項１７】
錠剤又はカプセル剤である請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の経口投与単位。
【請求項１８】
ジエチルスチルベストロールモノ［３５Ｓ］サルフェート又はジエチルスチルベストロールジ［３５Ｓ］サルフェート以外の、少なくとも０．１μｍｏｌ／ｍｌのサルフェストロールを含有する、静脈内投与のための無菌水性液。
【請求項１９】
サルフェストロールがモノ−サルフェストロール（ジエチルスチルベストロール−モノサルフェート）である、請求項１８に記載の無菌水性液。
【請求項２０】
サルフェストロールがジ−サルフェストロール（ジエチルスチルベストロール−ジサルフェート）である、請求項１８に記載の無菌水性液。
【請求項２１】
２７０〜３１０ｍＯｓｍ／ｌのオスモル濃度を有する請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の無菌水性液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、例えば乳がん又は前立腺がんの処置における使用のためなど、哺乳動物のがんの根治的又は対症的処置におけるサルフェストロール（ジエチルスチルベストロールサルフェート）の使用に関する。
【０００２】
本発明は、サルフェストロールを含む経口投与単位及び静脈内用無菌液も提供する。
【発明の背景】
【０００３】
がんは未だに、西側世界における主要な死因の１つである。これは男性及び女性の双方に当てはまる。新たな医薬及び処置方法の研究が進められているおかげで、様々な型のがんを患う人々の平均余命は年々着実に伸びている。それにもかかわらず、医薬の改良及び処置方法の向上はなお必要とされている。
【０００４】
がんの処置に既に使用されている医薬に、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）がある。ＤＥＳは１９３８年に初めて合成された合成非ステロイド性エストロゲンであり、テストステロンを去勢レベルにするために設計された。テストステロンは前立腺がん増殖を誘発し、外科的去勢によりテストステロンを取り除いたのが、前立腺がんの処置における最初のホルモン除去治療であった。ＤＥＳは、精巣でのテストステロン産生を阻害することにより化学的去勢を実現するために開発された。
【０００５】
しかしながら血栓塞栓性の毒性を伴うために、ＤＥＳ経口投与の、前立腺がんの処置における役割は限定されてしまっている。例えばＤＥＳなどのエストロゲンは、経口的に与えると、腸及び肝での初回通過効果を受けて肝臓中のホルモン濃度を高めることになり、フィブリノーゲンなどの凝固タンパク質の合成を促進する。
【０００６】
１日あたり５ｍｇのＤＥＳ経口投与を受けている、前立腺がんを患う患者では、そのほとんどは心血管系に起因するがんに無関係の死亡が３６％上昇した（Ｂｙａｒ  Ｄ  Ｐ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ：  Ｔｈｅ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒｏｕｐ’ｓ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ．Ｃａｎｃｅｒ（１９７３）３２：１１２６〜３０頁）。より低用量のＤＥＳを評価した他の研究では、テストステロンを抑制する有効性は、５ｍｇの用量で得られるのとほぼ同等であったこと、及び血栓塞栓性の毒性は許容し得るものであったことが報告された。これにより、前立腺がんを処置するために最もよく使用されるＤＥＳ経口用量として、１日あたり３ｍｇが採用されるようになった。しかし副作用は依然として懸念され、ＤＥＳは前立腺がんにおける第一選択治療としては、リュープロリド及びタモキシフェンによる治療がほぼ同等の有効性を有し且つ副作用がより少ないことを示す研究が公表されると、これら２つに取って代わられた。
【０００７】
心血管系の副作用に関する懸念があったため、ＤＥＳに基づく、腸及び肝での初回通過効果をより受けにくい製剤が開発されることとなった。
【０００８】
ＧＢ７３２，２８６には、ＤＥＳジホスフェート（ホスフェストロール）の合成について記載されている。ホスフェストロールは、遊離ＤＥＳによる血栓塞栓性の副作用を引き起こさず安全にテストステロン産生を阻害するために、ＤＥＳのプロドラッグとして開発された。リン酸基を付加してＤＥＳを不活化し、それによって腸及び肝での初回通過効果を回避し、遊離ＤＥＳの循環レベルを減少させた。ホスフェストロールそれ自体は不活性であると考えられ、前立腺がん細胞では、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）の発現が増加していることが知られていた。ＤＥＳの作用部位近傍でＰＡＰがリン酸基を除去し、ＤＥＳを遊離させることになると考えられた。
【０００９】
ホスフェストロールは、１９５０年代にホンバン（Ｈｏｎｖａｎ）（登録商標）の名称のもとで市場に導入され、長年に渡り前立腺がんの処置に成功裏に利用されてきた。しかしホスフェストロールはＤＥＳと密接に関連しており、第一選択治療としてのＤＥＳが置き換えられた際に、ホスフェストロールもまた脇へと追いやられた。
【００１０】
ＤＥＳは低用量においてすら心血管系の副作用を生じる懸念があったため、腸及び肝での初回通過効果を迂回する製剤及びＤＥＳの送達経路が開発されることともなった。
【００１１】
ＷＯ２００８／０４５４６１Ａ２には、前立腺がんを処置するための方法であって、治療有効量のＤＥＳ又は薬学的に許容されるその塩若しくは錯体を、前立腺がんを患う対象に経皮投与することを含む方法が記載されている。経皮ＤＥＳは、前立腺がんを処置するための第一線での（ｆｒｏｎｔ  ｌｉｎｅ）ホルモン療法としても、又は第二選択のホルモン療法としても使用することができる。経皮投与は、経皮パッチ、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、噴霧剤、軟膏剤、点眼薬、点鼻薬、点耳薬、座剤及び／又は類似した経皮投与手法によって実現することができる。ＤＥＳは、少なくとも約０．１ｍｇ／日の用量で、とりわけ特に約５．０ｍｇ／日の用量で投与することができる。最大投与量は約２５ｍｇ／日である。用量は１日あたり単回用量でも、２４時間の期間に渡る投与について少なくとも２回分の単位投与量に分割しても、又は３日〜１０週間若しくは１〜１０週間などのより長い期間の単回連続用量でもよい。
【００１２】
米国特許出願公開２０１１／０１８９２８８号には、有効量のＤＥＳと、８〜１６のＨＬＢを有する吸収促進剤とを含む水溶性マトリックスを含むバッカル医薬組成物を使用することにより、初回通過効果を回避する手段が記載されている。この米国特許出願には、患者において前立腺又は乳がんを処置するための方法であって、患者の口の口腔粘膜に、前記医薬組成物を水溶性マトリックスとして投与することを含む方法も記載されている。前立腺がん及び乳がんのいずれの処置においても、用量あたり０．１ｍｇ〜１５ｍｇのＤＥＳを、１日に１回〜３回投与する。
【００１３】
要約すると、ＤＥＳは、１日３ｍｇの低経口用量で与えるか、ホスフェストロールプロドラッグとして与えるか、又は経皮又はバッカル経路で与えるならば、安全に投与することができる。
【００１４】
ＤＥＳの発癌性及びエストロゲンとしての特性を探るために、インビトロでのＤＥＳの効果が研究された。Ｂｒａｎｄｅｓら（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｕｂｃｌｏｎｅｓ  ｏｆ  ＭＣＦ−７  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ  Ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  Ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ、ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４３、２８３１〜２８３５頁、１９８３年６月）は、乳がんの処置にＤＥＳを使用する可能性について探るために、ＭＣＦ−７乳がん細胞に対する、ＤＥＳのエストロゲンとしての効果を調べた。ＤＥＳが、予想外にも細胞増殖をインビトロで低減することを示したのは、彼らが最初だった。
【００１５】
Ｈａｒｔｌｅｙ−Ａｓｐら（Ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｍｅｔａｐｈａｓｅ  ａｒｒｅｓｔ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１４３（１９８５）２３１〜２３５頁）は、ＤＥＳの発癌効果を明らかにしようとして、ＤＵ−１４５前立腺がん細胞に対するＤＥＳの効果を調べた。彼らは、微小管形成の阻害による、ＤＥＳの前記前立腺がん細胞における細胞毒性効果を示した。
【００１６】
Ｓｃｈｕｌｚら（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｍｏｎｏ−  ａｎｄ  Ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｔｏｗａｒｄｓ  Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８（１９８８）２８６７〜２８７０頁）は、１００ｎｇ／ｍｌまでの範囲のＤＥＳ濃度は前立腺がん細胞増殖に影響しないこと、及びこれらの細胞において細胞毒性効果を誘導する最小のＤＥＳ濃度が１μｇ／ｍｌであることを示した。
【００１７】
本発明の１つの目的は、アンドロゲンの欠乏及び／又は細胞毒性効果を誘導することにより最高の有効性をもたらし、副作用は許容し得るものである、哺乳動物でのがんの処置方法を提供することである。
【発明の概要】
【００１８】
本発明者らは、サルフェストロール（Ｓｕｌｆｅｓｔｒｏｌ）（ジエチルスチルベストロールサルフェート）が、哺乳動物のがんの処置において有効な薬物として適宜利用できることを、予想外にも見出した。さらに本発明者らは、サルフェストロールを、高用量においてすら重篤な副作用を引き起こすこともなく投与できることを発見した。
【００１９】
理論に拘束されることを望むものではないが、経口投与されたＤＥＳ（１日約３ｍｇ）について過去に観察された毒性効果は、ＤＥＳそれ自体によるということはそれほどなく、むしろ酸化されたＤＥＳ代謝物によって引き起こされると仮定される。ＤＥＳは、経口投与されると肝臓に蓄積し、そこで酸化される。したがって肝臓によるＤＥＳの代謝を迂回することが、血栓塞栓性の副作用を低減するための鍵となる。
【００２０】
理論に拘束されることを望むものではないが、サルフェストロールはＤＥＳのプロドラッグであり、ＤＥＳよりも腸及び肝での初回通過効果を受けにくいと仮定される。したがってサルフェストロールは投与後に貯蔵され、肝臓でサルファターゼ（アリールサルファターゼＣ）により少なくとも部分的にＤＥＳに変換されるか、又は癌腫部位で、腫瘍細胞が発現するサルファターゼ酵素によりＤＥＳに変換されるかのいずれかである。肝臓サルファターゼから遊離したＤＥＳは循環に入り、肝臓でのＤＥＳ蓄積は最小限となる。
【００２１】
サルフェストロールは比較的多量投与して細胞毒性効果が得られるようにすることが重要であると信じられている。
【００２２】
ＤＥＳの硫酸エステルは先行技術に記載されている。
【００２３】
Ｇｉａｃｏｍｅｌｌｉら（ＴＥＲＡＰＩＡ  ＡＳＳＯＣＩＡＴＡ  ＯＲＭＯＮＩＣＡ−ＣＨＩＲＵＲＧＩＣＡ−ＲＡＤＩＯＬＯＧＩＣＡ  ＤＥＬ  ＣＡＮＣＲＯ  ＩＮＯＰＥＲＡＢＩＬＥ  ＤＥＬＬＡ  ＭＡＭＭＥＬＬＡ、Ｔｕｍｏｒｉ、Ｉｔ．第２１巻（１９４７）、３３８〜３４５頁）は、手術不能の乳がんを有する女性にジエチルスチルベストロール−ジサルフェート（ｄｉｅｔｈｙｌｅｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ−ｄｉｓｕｌｐｈａｔｅ）を静脈内投与した治験について記載している。前記著者らは、放射線治療及び外科手術と併用したこの処置が良好な影響を与えたことを報告した。
【００２４】
Ｃａｖａｌｌｉｎｉ（ＵＮ  ＮＵＯＶＯ  ＤＥＲ１ＶＡＴＯ  ＳＴ１ＬＢＥＮＩＣＯ  ＩＮＩＥＴＴＡＢＩＬＥ  ＰＥＲ  ＶＩＡ  ＥＮＤＯＶＥＮＯＳＡ、Ｂｏｌｌｅｔｔｉｏｎ  ｄｅｌｌａ  ｓｏｃｉｅｔａ  Ｉｔａｌｉａｎａ  ｄｉ  ｂｉｏｌｏｇｉａ  ｓｐｅｒｉｍｅｔｎａｌｅ、Ｎａｐｏｌｉ、ＩＴ、ｖｏｌ．（１９４７）、２１４〜２１６頁）は、ジエチルスチルベストロール−ジサルフェートはエストロゲン活性を有し、水溶性で、静脈内注射が可能で、且つマウスにおいて良く忍容されると結論している。
【００２５】
Ｃａｖａｌｌｉｎｉら（ＴＥＲＡＰＩＡ  ＤＥＬ  ＣＡＮＣＲＯ  Ｅ  ＳＯＳＴＡＮＺＥ  Ａ  ＢＡＳＳＡ  ＡＴＴＩＶＩＴＡ  ＥＳＴＲＯＧＥＮＡ、Ｉｌ  Ｆａｒｍａｃｏ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｆｒａｎｃｅ、Ｅｄｉｔｉｏｎｓ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅｓ  ｅｔ  ｍｅｄｉｃａｌｅｓ、ＩＴ、第３巻、（１９４８）、３００〜３０３頁）は、４．４’−ジオキシ−ベンゾイン、４−４’−ジオキシデスオキシベンゾイン、４−４’−ジオキシ−エチルデスオキシベンゾイン、３，４−ジ（ｐ．オキシフェニル）ｎ−ヘサン３−オール（３，４−ｄｉ  （ｐ．ｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｎ−ｈｅｓａｎ３−ｏｌ）の二硫酸エステル（ナトリウム塩）のエストロゲン活性について、これらの物質を含有するオリーブ油を卵巣切除雌ラットに注射することによって調べた。
【００２６】
Ｂｉｓｈｏｐら（Ｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ  ｓｕｌｐｈａｔｅ，  ｏｅｓｔｒｏｎｅ，  ａｎｄ  ｅｑｕｉｌｉｎ：  ｆｕｒｔｈｅｒ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｅｓｔｒｏｇｅｎｓ、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ、１９５１年、４月１３日；８１８〜８２０頁）は、一連のサルフェート化エストロゲンのエストロゲンとしての効果を研究した。前記研究は、以前の結果により、エストロンサルフェートを含有する調製物が親化合物のエストロンよりも高いエストロゲン活性を有することが示されていたので、開始された。サルフェートの形態のスチルベストロールも、よりエストロゲン様であると判明するだろうかと前記著者らは思った。この研究では、スチルベストロールサルフェートを１日２ｍｇの用量で経口投与した。スチルベストロールサルフェートはスチルベストロールの４４％のエストロゲン活性を有することが前記研究により示された。
【００２７】
Ｄｅｍｏｌら（Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｄｅｓ  ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ｓｅｘｕｅｌｓ  ｓｕｒ  ｌａ  ｃｒｏｉｓｓａｎｃｅ  ｄｕ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍａｍｍａｉｒｅ  Ｔ．Ｍ．２２９０  Ａ．Ａ．Ｌ．ｃｈｅｚｅ  ｌｅｓ  ｓｏｕｒｉｓ  ｍａｌｅｓ  ｄｅ  ｌａ  ｒａｃｅ  Ｏ２０  Ａ．Ａ．Ｌ”、ＡＮＮＡＬＥＳ  Ｄ’ＥＮＤＯＣＲＩＮＯＬＯＧＩＥ、ＭＡＳＳＯＮ、ＰＡＲＩＳ、ＦＲ、第１６巻、（１９５５）９３２〜９３７頁）は、メッシュで捕らえた腫瘍組織の懸濁液を皮下注射することにより、腫瘍を雄マウス（去勢した、又は去勢していない）に導入した研究について記載している。続いてマウスを、以下の２つの異なる投与方法でジエチルスチルベストロールの二硫酸エステル二ナトリウムに曝露した：皮下注射（１２×０．１６ｍｇ）、又は飲料水への添加（０．０４、０．１及び０．２ｍｇ／日）。
【００２８】
Ｓａｒｕｔａら（Ｔｈｅ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、ＪＡＰＡＮＥＳＥ  ＣＩＲＣＵＬＡＴＩＯＮ  ＪＯＵＲＮＡＬ、第３６巻、第６号、（１９７２）、６１１〜６１６頁）は、経口避妊薬中のエストロゲンがラットにおける高血圧に与える影響について議論している。前記論文には、筋肉内への０．２ｍｇのエストリオールと併用での、２ｍｇのスチルベストロールジサルフェートの雄ラットへの腹腔内注射について記載されている。
【００２９】
Ｃｕｒｔｉｓ及び彼の共同研究者らはその研究において、アリールサルファターゼＣ及びアリールサルフェートエステルのインビボでの挙動を明らかにするために、３５−Ｓ放射性標識化ＤＥＳサルフェートを使用した。より詳細には、Ｇｒｅｇｏｒｙら（Ｔｈｅ  ｆａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｌｐｈａｔｅ  ｅｓｔｅｒｓ  ｏｆ  ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｏｅｓｔｒｏｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９７１年１２月；１２５（３）：７７〜７８頁）及びＢｒａｄｆｏｒｄら（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｆａｔｅｓ  ｏｆ  Ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｏｅｓｔｒｏｌ  Ｓｕｌｐｈａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒａｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９７７年；１６４：４２３〜４３０頁）は、なかでもＤＥＳ［３５Ｓ］モノサルフェート及びＤＥＳ［３５Ｓ］ジサルフェートをモデル化合物として使用した。放し飼いの成熟雄ラット及び雌ラットにＤＥＳ［３５Ｓ］ジサルフェートを注射した。加えてＤＥＳ［３５Ｓ］モノサルフェートを、胆管及び尿管カニューレを用いて麻酔下のラットに投与した。前記著者らは、いずれの化合物も、代謝によりさらに修飾されることなく胆汁排泄され、したがって、その代謝の研究によりアリールサルファターゼＣの活性を解明する上で理想的なモデル化合物であることを見出した。
【００３０】
アリールサルファターゼＣは肝臓に特異的に見出されることから、前記著者らは、肝臓がＤＥＳジサルフェート及びＤＥＳモノサルフェートの双方の主要な代謝部位であると特定した。
【００３１】
サルフェストロールの臨床使用に加え、本発明は、サルフェストロールを含む経口投与単位、及びサルフェストロールを含む、静脈内投与のための無菌液にも関する。
【発明の詳細な説明】
【００３２】
本発明の第１の態様は、哺乳動物でのがんの根治的又は対症的処置方法における使用のためのサルフェストロール（ジエチルスチルベストロールサルフェート）に関する。
【００３３】
本明細書で使用される「サルフェストロール」という用語は、別段の指定がない限り、水酸基のうちの少なくとも１つがサルフェート化されているジエチルスチルベストロール部分を指す。したがって、本明細書で使用されるサルフェストロールは、モノ−サルフェストロール（ジエチルスチルベストロールモノサルフェート又は４−（４−（４−オキシドフェニル）ヘキサ−３−エン−３−イル）フェニルサルフェート）、ジ−サルフェストロール（ジエチルスチルベストロールジサルフェート又は４，４’−（ヘキサ−３−エン−３，４−ジイル）ビス（４，１−フェニレン）ジサルフェート）及びそれらの混合物を含む。モノ−サルフェストロールの残りの水酸基は、例えばリン酸基などでエステル化されてもよい。「サルフェストロール」という用語は、サルフェストロールの薬学的に許容される塩をも包含する。
【００３４】
本明細書で使用される「薬学的に許容される塩」という用語は、哺乳動物で使用するのに安全且つ有効で、所望の生物活性を有する、本発明の化合物の塩を意味する。医薬化合物の薬学的に許容される塩のための対イオンについての記載は、Ｐ．Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  Ｓｔａｈｌ、Ｃａｍｉｌｌｅ  Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（編）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ，  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ、Ｗｉｌｅｙ  ＶＣＨ（２００２）に見出すことができる。
【００３５】
本発明のサルフェストロール中のジエチルスチルベストロール部分は、トランス型でもシス型でもよい。当然、トランス型及びシス型の混合物を利用することもできる。
【００３６】
本明細書で使用される「がん」という用語は、無秩序な細胞増殖を伴う悪性新生物を指す。がんでは、細胞がコントロールされずに分裂及び増殖して、悪性腫瘍を形成し、体内の、近くの部位に浸潤する。
【００３７】
本明細書で使用される「根治的処置」という用語は、疾患を治癒させる、又は疾患に関連する症状を改善することを目的とした処置を指す。
【００３８】
本明細書で使用される「対症的処置」という用語は、疾患を治癒させることではなく、むしろ緩和させることを目的とする処置又は治療を指す。
【００３９】
本明細書で使用される「経口」という用語は、別段の指定がない限り、「経口による」と同義である。
【００４０】
本明細書で使用される「投与量」という用語は、哺乳動物に投与する医薬活性物質の量を指す。したがって「投与量」という用語は、投与しようとする「投与単位」の一部であるいかなる担体又は他の薬学的に許容される添加剤も含まない。
【００４１】
本書類及び特許請求の範囲では、「含む」という動詞及びその活用型は、その非限定的な語義で使用して、具体的に言及されていない項目を排除することなしに、この語に後続する項目が含まれることを意味する。加えて、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」による、ある要素への言及は、文脈によってその要素が１つ且つ１つのみ在ることが明確に要請されない限り、その要素が１つより多く存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【００４２】
ホルモン依存性がんとは、特定のホルモン存在下でより速く増殖する型のがんを指す。この型のがんは通常、ホルモン療法により処置する。ホルモン療法は、これらのホルモンのインビボでの産生又は作用を遮断しようとするものである。したがってホルモン療法は、実際には抗ホルモン療法である。前立腺、乳房、子宮頸部、子宮内膜及び卵巣のがんはホルモン依存性がんの可能性があり、本発明の方法に従って処置することができる。
【００４３】
ホルモン依存性前立腺がんの場合、前立腺がん増殖を停止又は限定するために、アンドロゲン除去治療（例えば、精巣摘出術、ＬＨＲＨ類似体又はＬＨＲＨアンタゴニストによる処置）を第一選択処置として使用して、アンドロゲン、特にテストステロンの産生を減少させる。アンドロゲンは前立腺腫瘍増殖の主要な促進因子である。アンドロゲン除去治療は血漿アンドロゲンレベルを低減し、それによって前立腺腫瘍の増殖能を低減する。アンドロゲン除去治療はある期間の間は奏功するものの、前立腺腫瘍は全て、この処置アプローチに対し抵抗性となる。アンドロゲン除去治療が失敗した後、抗アンドロゲンによる二次的ホルモン処置を使用して前立腺腫瘍増殖を遅らせる。
【００４４】
乳がんは一般にその受容体の状態に基づいて分類される。乳がん細胞は多くの異なる型の受容体を有することも有さないこともあり、現行の分類における最も重要な３つは、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）及びＨＥＲ２／ｎｅｕである。ＥＲ／ＰＲ陽性乳がんは抗ホルモン処置に非常に良く応答するので、最も良好な臨床成績を有する。これら受容体のうちの１つを腫瘍が発現していないと、ホルモン療法の効果は低下する。２つの受容体のいずれも発現していないと、腫瘍はホルモン処置に対し非感受性となり、がんは「ホルモン非依存性」と呼ばれる。乳がんは、ＥＲ及びＰＲ以外にＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質を発現することもある。ＨＥＲ２／ｎｅｕの発現は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陰性腫瘍と比べより高侵襲性の腫瘍及びより低い臨床成績と相関する。上記３つのマーカーが全て発現していないと、乳がんは「トリプルネガティブ」と呼ばれる。
【００４５】
ホルモン療法をある時間受けさせた後、前述したがんの型のほとんどは、ホルモンなしで増殖する能力を獲得し、「ホルモン非依存性」と呼ばれるようになる。これらのがんがホルモン非依存性になると、処置は通常、化学療法へと移行する。ホルモン非依存性前立腺がんは、ホルモン不応性又は去勢抵抗性前立腺がんとも呼ばれる。これら用語は以降、互換的に使用し、「去勢抵抗性前立腺がん」の意味を有するものと考える。最近は「去勢抵抗性」という用語により、「ホルモン不応性」は置き換えられた。その理由は、これらの前立腺がんは去勢処置（利用できるアンドロゲン／テストステロンの低減）に対してはもはや応答性ではないが、一方で、アンドロゲン受容体活性化については依然としていくらかのホルモン依存を示すためである。
【００４６】
本発明は、ホルモン依存性及びホルモン非依存性がんの処置を包含する。本方法は、とりわけホルモン非依存性がんの処置、特に、ホルモン依存性がんをホルモン療法により処置した後に発展したホルモン非依存性がんの処置に適している。本方法は、ホルモン依存性がんを抗エストロゲン、アロマターゼ阻害剤、抗アンドロゲン又は１７αヒドロキシラーゼ／Ｃ１７，２０リアーゼ（ＣＹＰ１７Ａ１）阻害剤により処置した後に発展したホルモン非依存性がんの処置に特に適している。
【００４７】
本処置方法は、抗エストロゲン、アロマターゼ阻害剤又は１７αヒドロキシラーゼ／Ｃ１７，２０リアーゼ（ＣＹＰ１７Ａ１）阻害剤による処置に応答しない乳がんを処置するために利用するのが有利である。
【００４８】
本方法は、抗アンドロゲン又は１７αヒドロキシラーゼ／Ｃ１７，２０リアーゼ（ＣＹＰ１７Ａ１）阻害剤による処置に応答しない前立腺がん、特に１７αヒドロキシラーゼ／Ｃ１７，２０リアーゼ（ＣＹＰ１７Ａ１）阻害剤による処置、とりわけ特にアビラテロンによる処置に応答しない前立腺がんを処置するために利用するのが有利なこともある。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態では、処置するがんは前立腺がん、特に去勢抵抗性前立腺がんである。
【００５０】
別の好ましい実施形態では、本方法で処置するがんは乳がん、特にＥＲ／ＰＲ陰性乳がんである。さらに別の有利な実施形態では、処置方法はトリプルネガティブ乳がんの処置を指す。
【００５１】
好ましい実施形態では、サルフェストロールはモノ−サルフェストロールである。さらに好ましい実施形態では、モノ−サルフェストロールはＤＥＳグルクロニドサルフェートではない。モノ−サルフェストロールのジエチルスチルベストロール部分の水酸基のうち少なくとも１つは、エステル化されていないのが好ましい。
【００５２】
別の好ましい実施形態では、サルフェストロールがジ−サルフェストロールである。
【００５３】
本明細書中で既に説明したように、本発明の文脈においてサルフェストロールは、サルフェストロールの薬学的に許容される塩も包含する。薬学的に許容される塩には、ナトリウム、リチウム及びカリウムなどのアルカリ金属、並びにカルシウム及びマグネシウムなどのアルカリ土類金属の陽イオンから形成される塩が含まれる。
【００５４】
好ましい実施形態では、サルフェストロールはアルカリ金属塩、とりわけナトリウム及び／又はカリウム塩である。サルフェストロールがカリウム塩の形態であるのがより好ましい。
【００５５】
本処置方法は、幾種類かの哺乳動物、例えばヒト、ウマ、ウシなどを処置するために使用することができる。本方法は、ヒトの処置に特に適している。
【００５６】
サルフェストロール投与量は、特定の状態及び処置を受けている患者に応じて変更することができる。前記化合物の、治療有効投与量は、臨床的に意味のある結果をもたらす長期処置レジメン内での反復用量とすることができる。
【００５７】
前記化合物の実際の投与量は、対象における疾患の指標及び特定の状況など、例えば年齢、サイズ、健康、症状の程度及び感受性因子などの因子、並びに投与時間及び経路、同時に投与している他の薬物又は処置などの他の因子に応じて変更することになる。投与レジメンは、最適の治療効果が得られるように調整することができる。
【００５８】
本方法は通常、サルフェストロールを少なくとも０．００１ｍｍｏｌ、より好ましくは少なくとも０．０１ｍｍｏｌ、さらにより好ましくは少なくとも０．０３ｍｍｏｌ、まださらにより好ましくは少なくとも０．１ｍｍｏｌ、最も好ましくは少なくとも０．２ｍｍｏｌの１日投与量で投与することを含む。サルフェストロールの１日投与用量は、好ましくは１５ｍｍｏｌを超えず、より好ましくは５ｍｍｏｌを超えず、最も好ましくは２ｍｍｏｌを超えない。
【００５９】
異なる表現を用いれば、サルフェストロールを体重１ｋｇあたり少なくとも０．０１３μｍｏｌの１日量で投与するのが好ましく、より好ましくは体重１ｋｇあたり少なくとも０．１３μｍｏｌ、さらにより好ましくは体重１ｋｇあたり少なくとも０．４μｍｏｌ、最も好ましくは体重１ｋｇあたり少なくとも１．３μｍｏｌの１日量で投与する。サルフェストロールの１日投与量は、好ましくは体重１ｋｇあたり２００μｍｏｌを超えず、より好ましくは体重１ｋｇあたり８０μｍｏｌを超えず、最も好ましくは体重１ｋｇあたり２６μｍｏｌを超えない。
【００６０】
本処置方法の期間は通常７日間を超える。より詳細には、本方法は少なくとも１４日間、特に、少なくとも２８日間の期間を有する。
【００６１】
本発明では、サルフェストロールは経口、静脈内、局所又は経粘膜投与するのが好ましい。当然、これらの投与方式の組み合わせを利用することもできる。特に好ましい実施形態では、サルフェストロールは経口及び／又は静脈内投与する。サルフェストロールは経口投与するのが最も好ましい。
【００６２】
本発明の特に好ましい実施形態では、サルフェストロールを少なくとも０．００１ｍｍｏｌ、より好ましくは少なくとも０．０１ｍｍｏｌ、さらにより好ましくは少なくとも０．０３ｍｍｏｌ、まださらにより好ましくは少なくとも０．１ｍｍｏｌ、最も好ましくは少なくとも０．２ｍｍｏｌの１日投与量で経口投与する。経口投与の１日投与量は、好ましくは１５ｍｍｏｌを超えず、より好ましくは５ｍｍｏｌを超えず、最も好ましくは２ｍｍｏｌを超えない。
【００６３】
サルフェストロールを体重１ｋｇあたり少なくとも０．０１３μｍｏｌの１日量で経口投与するのがさらに好ましく、より好ましくは体重１ｋｇあたり少なくとも０．１３μｍｏｌ、さらにより好ましくは体重１ｋｇあたり少なくとも０．４μｍｏｌ、最も好ましくは体重１ｋｇあたり少なくとも１．３μｍｏｌの１日量で経口投与する。サルフェストロール経口投与の１日量は通常、体重１ｋｇあたり２００μｍｏｌを超えず、より好ましくは体重１ｋｇあたり８０μｍｏｌを超えず、最も好ましくは体重１ｋｇあたり２６μｍｏｌを超えない。
【００６４】
上述の１日投与量は１日１回投与してもよいし、ある程度定期的に間隔を置いた２回以上の個別の用量の形態で投与してもよい。特に好ましい実施形態では、本処置方法は、各回がサルフェストロールを少なくとも０．００１ｍｍｏｌの用量で１日あたり少なくとも２回経口投与することを含み、より好ましくは、サルフェストロールを少なくとも０．００１ｍｍｏｌの用量で１日あたり少なくとも３回経口投与することを含む。後者の用量は、その各回がサルフェストロールを少なくとも０．０１ｍｍｏｌ含有するのが好ましく、より好ましくは少なくとも０．０３ｍｍｏｌ、最も好ましくは少なくとも０．０５ｍｍｏｌ含有する。
【００６５】
別の好ましい投与経路は、静脈内投与、すなわちサルフェストロール含有医薬製剤を直接静脈へ注入することである。他の投与経路と比べ、静脈経路は、薬剤を体中にくまなく送達する最も迅速な手段である。
【００６６】
本方法は通常、サルフェストロールを少なくとも０．００１ｍｍｏｌ、より好ましくは少なくとも０．０１ｍｍｏｌ、さらにより好ましくは少なくとも０．０３ｍｍｏｌ、まださらにより好ましくは少なくとも０．１ｍｍｏｌ、最も好ましくは少なくとも０．２ｍｍｏｌの１日投与量で静脈内投与することを含む。サルフェストロール静脈内投与の１日量は通常１５ｍｍｏｌを超えず、より好ましくは５ｍｍｏｌを超えず、最も好ましくは２ｍｍｏｌを超えない。
【００６７】
異なる表現を用いれば、サルフェストロールを体重１ｋｇあたり少なくとも０．０１３μｍｏｌの１日量で静脈内投与するのが好ましく、より好ましくは体重１ｋｇあたり少なくとも０．１３μｍｏｌ、さらにより好ましくは体重１ｋｇあたり少なくとも０．４μｍｏｌ、最も好ましくは体重１ｋｇあたり少なくとも１．３μｍｏｌの１日量で静脈内投与する。サルフェストロールの１日投与量は、体重１ｋｇあたり２００μｍｏｌを超えないのが好ましく、より好ましくは体重１ｋｇあたり８０μｍｏｌを超えず、最も好ましくは体重１ｋｇあたり２６μｍｏｌを超えない。
【００６８】
サルフェストロールの静脈内投与は通常、少なくとも０．００１ｍｍｏｌ、より好ましくは少なくとも０．０１ｍｍｏｌ、さらにより好ましくは少なくとも０．０３ｍｍｏｌ、まださらにより好ましくは少なくとも０．１ｍｍｏｌ、最も好ましくは少なくとも０．２ｍｍｏｌの静脈内用量での投与を含む。静脈内用量は通常１５ｍｍｏｌを超えず、より好ましくは２ｍｍｏｌを超えない。本処置方法は、１日あたり少なくとも１回分の静脈内用量でのサルフェストロールの投与を含むのが好ましい。
【００６９】
本発明の別の態様は、ＤＥＳモノ［３５Ｓ］サルフェート又はＤＥＳジ［３５Ｓ］サルフェート以外の、少なくとも０．００１ｍｍｏｌ、好ましくは少なくとも０．０１ｍｍｏｌ、より好ましくは少なくとも０．０３ｍｍｏｌ、最も好ましくは少なくとも０．１ｍｍｏｌのサルフェストロールを含む経口投与単位に関する。経口投与単位は通常、ＤＥＳモノ［３５Ｓ］サルフェート又はＤＥＳジ［３５Ｓ］サルフェート以外の、１５ｍｍｏｌを超えず、より好ましくは５ｍｍｏｌを超えず、最も好ましくは２ｍｍｏｌを超えないサルフェストロールを含む。
【００７０】
本明細書で使用されるＤＥＳモノ［３５Ｓ］サルフェート及びＤＥＳジ［３５Ｓ］サルフェートという用語は、３５Ｓ原子で同位体標識したモノ−サルフェストロール及びジ−サルフェストロールを指す。経口投与単位中に、可能な種々のＳ同位体がそれらの天然での（相対）存在量で在るのが好ましい。
【００７１】
本発明の経口投与単位は、本明細書で既に規定した、がんの根治的又は対症的処置方法に有利に利用することができる。
【００７２】
経口投与単位は、錠剤、顆粒剤、カプセル剤及び散剤並びに液剤からなる群から選択されるのが好ましい。経口投与単位は錠剤又はカプセル剤であるのがさらにより好ましい。
【００７３】
経口投与単位は通常０．１〜２ｇ、より好ましくは０．１５〜１．０ｇ、最も好ましくは０．２〜０．５ｇの間の重量を有する。
【００７４】
経口投与単位は通常、１０〜９５ｗｔ％の間の、着色剤、香味剤又は矯味剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、安定剤、界面活性剤、滑剤、可塑剤、保存剤及び甘味剤から選択される薬学的に許容される１つ又は複数の添加剤を含む。
【００７５】
添加剤は、ラクトース、無水ラクトース、クロスポビドン、クロスカルメロースナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポラクリリンカリウム、アルファ化デンプン、微結晶セルロース及びそれらの組み合わせからなる群から選択するのが有利である。好ましい実施形態では、経口投与単位は５ｗｔ％までの、好ましくは２〜４ｗｔ％の崩壊剤を含む。
【００７６】
本発明の投与単位は適宜、圧縮錠剤の形にしてもよい。このような錠剤は、例えば被覆で包む前に、本明細書に規定するサルフェストロールを芯部に含んでいるなど、組成の異なる２つ以上の層を適宜含んでいてもよい。
【００７７】
本発明の投与単位は打錠機で作製するのが好都合である。錠剤を鋳型から容易に取り除くことができるようにするため、投与単位は通常、０．５〜４ｗｔ％の間の滑沢剤又は滑り剤（ｇｌｉｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含有する。滑沢剤又は滑り剤は、タルク、ナトリウムステアリルフマレート、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、硬化ヒマシ油、硬化ダイズ油、ポリエチレングリコール、デンプン、無水コロイドシリカ及びそれらの組み合わせからなる群から選択するのが好ましい。
【００７８】
本発明の別の態様は、ＤＥＳモノ［３５Ｓ］サルフェート又はＤＥＳジ［３５Ｓ］サルフェート以外の、少なくとも０．１μｍｏｌ／ｍｌ、好ましくは少なくとも０．５μｍｏｌ／ｍｌ、さらにより好ましくは少なくとも３μｍｏｌ／ｍｌ、最も好ましくは少なくとも１０μｍｏｌ／ｍｌのサルフェストロールを含有する、静脈内投与のための無菌液に関する。無菌液は通常、ＤＥＳモノ［３５Ｓ］サルフェート又はＤＥＳジ［３５Ｓ］サルフェート以外の、１，２００μｍｏｌ／ｍｌを超えず、より好ましくは７００μｍｏｌ／ｍｌを超えず、最も好ましくは４００μｍｏｌ／ｍｌを超えないサルフェストロールを含む。
【００７９】
静脈内投与のための前記液に含有されるＤＥＳジサルフェート中に、可能な種々のＳ同位体がそれらの天然での（相対）存在量で在るのが好ましい。
【００８０】
本発明の静脈内投与のための無菌液は、本明細書で既に規定した、がんの根治的又は対症的処置方法に有利に利用することができる。
【００８１】
静脈内投与のための無菌液は、サルフェストロール及び他の薬学的に許容される添加剤を液状不活性担体に溶解させることにより調製する。適切な不活性液状担体は注射用水である。
【００８２】
加えて、浸透圧をヒト血液と同じ値に調整するための浸透圧剤、例えば、約１〜８ｍｇ／ｍｌの量の塩化ナトリウムなどの存在も必要である。一般に、製剤のオスモル濃度はヒト血液のオスモル濃度に類似する。無菌液のオスモル濃度は通常２７０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲、より好ましくは２７５〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲、最も好ましくは２８０〜２９０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内である。
【００８３】
無菌液のｐＨは好ましくは４〜８の範囲、より好ましくは５〜７の範囲内である。
【００８４】
静脈用製剤に適した他の添加剤の非限定的な例は、エタノール、グリセリン及びプロピレングリコールなどの溶媒、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）及びクエン酸などの安定剤、ベンジルアルコール、メチルパラベン及びプロピルパラベンなどの抗菌性保存剤、クエン酸／クエン酸ナトリウム、酢酸／酢酸ナトリウム及びリン酸／リン酸二水素カリウムなどの緩衝剤、並びに塩化ナトリウム、マンニトール及びデキストロースなどの浸透圧調節剤である。
【００８５】
当業者なら、静脈内投与のための製剤に適用される制限について承知している。製剤は、血液中に入ると有害反応を引き起こすことになる添加剤を含有すべきではない。さらに、製剤は血液中に入ったら、有効成分の可溶性を維持できなければならない。制限についてのこのリストは網羅的なものではなく、こうした必要性を満たす適切な添加剤の選択は、当業者の技術のうちである。
【００８６】
以下の実施例は、本発明の範囲を限定しないようにしつつ、本発明及びその好ましい実施形態のさらなる例示を意図するものである。
【実施例】
【００８７】
実施例１：
【００８８】
この実施例に記載する実験の目的は、モノ−サルフェストロール及びジ−サルフェストロールの双方を１０〜２５ｇ合成することであった。
【００８９】
これらの化合物のミリグラムスケールでの合成は、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９７７）、１６４、４２３〜４３０頁に公表されている。この公表物に記載されている、ＤＥＳのジサルフェートの合成は、ＣｌＳＯ３Ｈ、ＣＳ２及びＮ，Ｎ−ジメチルアニリンの−５℃での混合から始まり、この後にジエチルスチルベストロールを室温で添加する。
【００９０】
これらの条件を用いた試験反応は、モノ−及びジサルフェートの混合物を与えた。ジエチルスチルベストロールを添加したピリジン中のＣｌＳＯ３Ｈ及びＤＭＡＰを使用すると、ＤＥＳのモノ−及びジサルフェートの混合物がやはり得られた。
【００９１】
しかし反応をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で過剰量のピリジン−ＳＯ３錯体を反応物として使用して行うと、ＤＥＳがそのジサルフェートにほぼ完全に変換されるのが観察された。残存する出発物質は、反応混合物をＥｔ２Ｏ（ジエチルエーテル）で洗浄することにより取り除いた。続いて水から結晶化し、次に水性ＫＯＨ溶液から生成物を結晶化させると、残存モノ−サルフェート及びピリジン残留物は残らず取り除かれ、２７ｇのＤＥＳジサルフェートが対応する二カリウム塩として得られた。
ジ−サルフェストロールの合成
【００９２】
ジ−サルフェストロールの合成を以下のように行った：
【００９３】
ジエチルスチルベストロール（３０ｇ、１１２ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（乾燥、１００ｍｌ）に溶解した。この溶液に三酸化硫黄ピリジン錯体（７１．２ｇ、４４７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を周囲温度で３時間撹拌した。
【００９４】
白色固体が沈殿し、試料は濾別した。この試料に対して行ったＬＣＭＳ（ＰＥＶＡ３９−０１３−３）から、モノ−サルフェストロールと、ジ−サルフェストロールと、さらにいくらかの出発物質との混合物であることが示された。
【００９５】
残りの沈殿は、濾別した後に濾紙上でエタノール（２×２００ｍｌ）を用いて洗浄した。ＬＣＭＳから、モノ−サルフェストロール（６％）とジ−サルフェストロール（９４％）との混合物であることが示された。５００ｍｌの２５％ＫＯＨ溶液から固体を再結晶し、白色結晶として粗ジ−サルフェストロールを得た。結晶を濾別、真空乾燥して、残存溶媒を残らず取り除いた。
【００９６】
ＬＣＭＳから、＞９９％を超える純度及び正しい質量（ｍ／ｚ＝２１３（４２８−２Ｈ＋／２））を有する生成物であることが示された。
【００９７】
１Ｈ−ＮＭＲは構造と一致した。全ての芳香族シグナルは１つの大きな一重線として現れた。１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）は７つのピークを示し、その全てがジ−サルフェストロールの構造と一致した。
【００９８】
モノサルフェートの合成は、ＤＭＦ中の、０．４〜０．５当量のピリジン−ＳＯ３を使用して達成し得る。この結果ジサルフェートは、副生成物として微量生じるのみであった。Ｅｔ２Ｏで反応混合物を洗浄するとやはり、未反応の出発物質は残らず取り除かれた。混合物をＨ２Ｏから結晶化させると、モノサルフェートが良好な純度で得られた。
【００９９】
しかし生成物を水性ＫＯＨ溶液で処理してピリジン残留物を取り除くと、副生成物が生成した。この未知の副生成物を、結晶化又は洗浄により完全に取り除こうとする試みは成功せず、９０％をわずかに超える、二カリウム塩としてのモノ−サルフェストロールの純度が得られた。
モノ−サルフェストロールの合成
【０１００】
モノ−サルフェストロールの合成を以下のように行った：
【０１０１】
ジエチルスチルベストロール（４０ｇ、１４９ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（乾燥、５０ｍｌ）に溶解した。この溶液に三酸化硫黄ピリジン錯体（９．４９ｇ、５９．６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を周囲温度で３時間撹拌した。固体が沈殿し、これを濾別した。この試料に対して行ったＬＣＭＳから、３０％がモノ−サルフェストロールに変換されたこと、及びジ−サルフェストロールはほとんど存在しないことが示された。
【０１０２】
真空中で残りの沈殿から溶媒を蒸発させ、粗モノ−サルフェストロールを白色固体として得た。この粗生成物を部分的に熱水（８０〜９０℃）に再溶解し、熱時濾過した。濾液を周囲温度まで冷却し、濾過した。残渣試料に対してＬＣＭＳを行ったところ、モノ−サルフェストロールとＤＥＳ出発物質との８５：１５の混合物であることが示された。
【０１０３】
残りの残渣はエタノール中で撹拌し、濾過した。次いで濾液を１０％ＫＯＨ溶液中で１０分間撹拌し、固体は濾別した。この粗生成物を、２つのバッチでエタノールからもう一度再結晶し、それぞれ２１０ｍｇ及び１．７５グラムのモノ−サルフェストロールを二カリウム塩として得た。ＬＣＭＳ分析から、２１０ｍｇのバッチは約９２％の純度を有すること、及びいくらかのエタノールがなおも存在することが示された。１．７５グラムのバッチは約９１％のＬＣＭＳ純度を有していた。
【０１０４】
実施例２
【０１０５】
ホルモン依存性（ＬＮＣａＰ）及びホルモン非依存性（ＤＵ−１４５）前立腺がん細胞株における、ＤＥＳ、モノ−サルフェストロール及びジ−サルフェストロールのインビトロでの直接の細胞毒性を試験した。
【０１０６】
細胞は、１０％（ｖ／ｖ）の熱失活したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び２ｍＭのＬ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ１６４０（増殖培地）で３７℃、５％ＣＯ２及び加湿条件下、インビトロで維持した。細胞を回収し、洗浄し、増殖培地に再懸濁し、計数した。細胞を、ＤＵ−１４５細胞については０．５×１０５個／ｍｌで、ＬＮＣａＰ細胞については１×１０５個／ｍｌでアッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１％（ｖ／ｖ）の熱失活したＦＢＳ＋及び２ｍＭのＬ−グルタミン）に再懸濁し、５０μｌ／ウェルの分取量で９６ウェルアッセイプレート（コーニング、黒壁プレート）に播種した。
【０１０７】
プレートは化合物添加前に、加湿した５％ＣＯ２下、３７℃で一晩インキュベートした。３つの化合物（ＤＥＳ、モノ−サルフェストロール及びジ−サルフェストロール）を、６０ｍＭのストック濃度で１００％ＤＭＳＯに溶解した。
【０１０８】
次いで、全ての化合物のストックを連続希釈した。細胞を曝露した終濃度は３００、１５０、７５、３７．５、１８．７５、９．４、４．７、２．３、１．２及び０．６μＭであった。陽性対照はタキソテールとした。タキソテールを１００％ＤＳＭＯで希釈して１ｍＭのストック濃度とし、ストックを連続希釈した。細胞を曝露した終濃度は１０００、３３３．３、１１１．１、３７．０、１２．３、４．１、１．４、０．５、及び０．２ｎＭであった。
【０１０９】
プレートは化合物添加後に、加湿した５％ＣＯ２下、３７℃で７２時間インキュベートした。生細胞率を、セルタイターブルー（Ｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  ｂｌｕｅ）（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）アッセイにより評価した。１０μｌのセルタイターブルー（商標）試薬を各試験ウェル／ブランクウェルに添加した。プレートは分析前に、加湿した５％ＣＯ２下、３７℃で３時間インキュベートした。蛍光はフレックスＩＩステーションプレートリーダー（Ｆｌｅｘ  ＩＩ  ｓｔａｔｉｏｎ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）を用いて測定した。励起波長を５７０ｎｍ、発光波長を６００ｎｍ、カットオフを５９０ｎｍとした。生データをグラフパッドプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）で処理し、平均値、標準偏差値及びＩＣ５０値を算出した。
【０１１０】
ＤＥＳ、モノ−サルフェストロール、ジ−サルフェストロール及びタキソテールに曝露した細胞株の生細胞率についての結果を表１に示す。
【０１１１】
【表１】
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【０１１２】
結論：
これらの結果から、ＤＥＳには、ＬＮＣａＰ及びＤＵ−１４５前立腺がん細胞において、インビトロで細胞毒性があることが示される。モノ−サルフェストロール及びジ−サルフェストロールはいずれも不活性であった。
【０１１３】
実施例３
【０１１４】
ホルモン依存性（ＭＣＦ−７）及びホルモン非依存性（ＭＤＡ−ＭＢ３２１）トリプルネガティブ乳がん細胞株における、ＤＥＳ、モノ−サルフェストロール及びジ−サルフェストロールのインビトロでの直接の細胞毒性を試験した。
【０１１５】
細胞は、１０％（ｖ／ｖ）の熱失活したＦＢＳ及び２ｍＭのＬ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ１６４０（増殖培地）で３７℃、５％ＣＯ２及び加湿条件下、インビトロで維持した。細胞を回収し、洗浄し、増殖培地に再懸濁し、計数した。細胞を、０．５〜１×１０５個／ｍｌ（細胞の型による）でアッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１％（ｖ／ｖ）の熱失活したＦＢＳ＋及び２ｍＭのＬ−グルタミン）に再懸濁し、５０ｕｌ／ウェルの分取量で９６ウェルアッセイプレート（コーニング、黒壁プレート）に播種した。
【０１１６】
プレートは化合物添加前に、加湿した５％ＣＯ２下、３７℃で一晩インキュベートした。３つの化合物（ＤＥＳ、モノ−サルフェストロール及びジ−サルフェストロール）を、６０ｍＭのストック濃度で１００％ＤＭＳＯに溶解した。次いで、全ての化合物のストックを連続希釈した。細胞を曝露した終濃度は３００、１５０、７５、３７．５、１８．７５、９．４、４．７、２．３、１．２及び０．６μＭであった。陽性対照はシスプラチンとした。シスプラチンを１％ＦＢＳ培地で希釈して１ｍＭのストック濃度とし、次いでシスプラチンのストックを連続希釈した。細胞を曝露した終濃度は１００、５０、２５、１２．５、６．３、３．１、１．６、０．８、０．４、０．２μＭであった。
【０１１７】
プレートは化合物添加後に、加湿した５％ＣＯ２下、３７℃で７２時間インキュベートした。生細胞率を、セルタイターブルー（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）アッセイにより評価した。１０μｌのセルタイターブルー（商標）試薬を各試験ウェル／ブランクウェルに添加した。プレートは分析前に、加湿した５％ＣＯ２下、３７℃で３時間インキュベートした。蛍光はフレックスＩＩステーションプレートリーダーを用いて測定した。励起波長を５７０ｎｍ、発光波長を６００ｎｍ、カットオフを５９０ｎｍとした。生データをグラフパッドプリズムで処理し、平均値、標準偏差値及びＩＣ５０値を算出した。
【０１１８】
ＤＥＳ、モノ−サルフェストロール、ジ−サルフェストロール及びシスプラチンに曝露した細胞株の生細胞率についての結果を表２に示す。
【０１１９】
【表２】
2016511218.tif 000003
【０１２０】
結論：
ＤＥＳ及びモノ−サルフェストロールには、ＭＣＦ７及びＭＤＡ−ＭＢ２３１乳がん細胞株において、インビトロで細胞毒性がある。ＤＥＳが最も活性な化合物で、モノ−サルフェストロールがこれに続く。ジ−サルフェストロールはこれらの細胞においては不活性である。
【０１２１】
実施例４
【０１２２】
ＤＥＳ、モノ−サルフェストロール及びジ−サルフェストロールの、多血小板血漿（ＰＲＰ）において血小板凝集を誘導する効果を調べた。
【０１２３】
ＰＲＰを作製するのに必要な血液を、４人の健常ヒト志願者から得た。各提供者からの１００ｍｌの新鮮な静脈血を、抗凝固剤であるクエン酸三ナトリウム（３．２％ｗ／ｖ）を１／１０体積含有するチューブへ直接分けて採った。血液及び抗凝固剤を直ぐに混合して、クエン酸三ナトリウムの終濃度を０．０１０６Ｍとした。
【０１２４】
ＰＲＰは、抗凝固血液を室温で１８０ｇ、１０分間遠心分離することにより調製した。血小板を含有する黄色い濁った上清を取り出し、清潔なポリプロピレンチューブに入れた。乏血小板血漿（ＰＰＰ）は、残りの試料を室温で１，２００ｇ、２０分間遠心分離することにより調製した。ＰＲＰは、ＰＰＰを添加することにより、適切な血小板数及び６３０ｎｍにおける吸光度に調整した。
【０１２５】
３つの化合物は全て１００％ＤＭＳＯに溶解して６０ｍＭのストック濃度とした。ストックを連続希釈し、血小板を曝露した終濃度は１５０、７５、３７．５、１８．７５、９．４、４．７及び２．３μＭであった。試験した終濃度は１００、３３、１１．１、３．７、１．２、０．４及び０．１３３ｎＭであった。１００ｎＭのγトロンビン（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を血小板凝集の対照として使用した。９０μｌずつ分取したＰＲＰを９６ウェルプレートに添加した。ベースライン吸光度は６３０ｎｍで読取った。５μｌの化合物及びγトロンビン対照を、適切なＰＲＰに添加した。
【０１２６】
プレートをプレートシェーカー上で振盪し続けながら、室温で７分間インキュベートした。２回目の６３０ｎｍでの読取りを、７分間のインキュベーション後に行って、化合物により少しでも血小板凝集が誘導されないか測定した。生データをグラフパッドプリズムで処理し、平均及び標準偏差を算出した。このようにして得られた結果を表３に示す。
【０１２７】
【表３】
2016511218.tif 000004
【０１２８】
結論：
全ての化合物が、トロンビン対照に比べはるかに高い吸光度を示す。トロンビン濃度は１００ｎｇ／ｍｌとした。その理由は、これが血小板凝集を誘導する至適濃度だったからである。高い吸光度は低い凝集と相関するので、これらの結果から、前記化合物のいずれも血小板凝集を直接誘導しないことが示される。
【０１２９】
実施例５
【０１３０】
ＤＥＳ、モノ−サルフェストロール及びジ−サルフェストロールの、ヒト肝ミクロソームにおける、インビトロでの代謝経路を調べた。
【０１３１】
ステロイドサルファターゼ（ＳＴＳ）による脱サルフェート化、及びシトクロムＰ（ＣＹＰ）代謝による酸化を特に重視した。肝ミクロソーム（Ｃｅｌｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、体積６００μｌのリン酸緩衝液ｐＨ７．４中で、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した。エストロン−３−サルフェートを陽性対照として使用した。
【０１３２】
ＳＴＳ代謝をＣＹＰ代謝から区別するために、異なる状況下での異なる４つのインキュベーションを試験した。
１．何も添加しない；ＳＴＳは活性で、ＣＹＰ酵素は不活性である。
２．ＮＡＤＰＨを添加；ＳＴＳ及びＣＹＰ酵素は活性である。
３．ＳＴＳ阻害剤の６６７−クメート（６６７−Ｃｏｕｍａｔｅ）を添加；ＳＴＳ及びＣＹＰ酵素のいずれも不活性である。
４．６６７−クメート及びＮＡＤＰＨを添加；ＳＴＳは不活性で、ＣＹＰ酵素は活性である。
【０１３３】
５μＭの各化合物（試験及び対照化合物）を肝ミクロソームに添加し、混合物を３７℃で５、１０、２０、３０、５０、９０及び１２０分間インキュベートした。インキュベーション後、４５μｌを分取し、次いでこの分取物は１５０μｌ氷冷メタノールを用いてクエンチした。分取物を、タンパク質を沈殿させるために−２０℃で１時間以上インキュベートした。沈殿後、試料を遠心分離し、残った上清はＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析に使用した。化合物の半減期、代謝速度又は固有クリアランス（Ｃｌｉｎｔ）、並びにＣＹＰ代謝及びＳＴＳ代謝への寄与を、各時点で得られたデータに基づいて算出した。
【０１３４】
このようにして得られた結果を表４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄに示す。
【０１３５】
【表４】
2016511218.tif 000005
【０１３６】
【表５】
2016511218.tif 000006
【０１３７】
【表６】
2016511218.tif 000007
【０１３８】
【表７】
2016511218.tif 000008
【０１３９】
結論：
これらの結果から、ＤＥＳはＣＹＰ代謝によってのみ処理され、酸化代謝物を生ずることが示される。モノ−サルフェストロールはＳＴＳ及びＣＹＰ酵素の双方によって代謝される。モノ−サルフェストロールはＳＴＳ酵素により代謝されるとＤＥＳを生成し、次いでＤＥＳはＣＹＰ酵素によりさらに代謝される。モノ−サルフェストロールはＣＹＰ酵素による直接の代謝も受け、モノ−サルフェストロールの酸化代謝物が生じる。ジ−サルフェストロールはＳＴＳ酵素によってのみ代謝される。ジ−サルフェストロールはモノ−サルフェストロールへとほぼ完全に転換され、次いでモノ−サルフェストロールはＳＴＳ及びＣＹＰ酵素によりさらに代謝される。
【０１４０】
実施例６
【０１４１】
血漿中のモノ−サルフェストロール及びジ−サルフェストロールの代謝物を、雄スプラーグドーリーラットで測定した。代謝物は、化合物の経口及び静脈内投与後に同定した。
【０１４２】
各群は３匹のラットからなり、動物は合計で１２匹となった。化合物は、経口及び静脈内投与のいずれについても１０ｍｇ／ｋｇで投与した。０．９％生理食塩水を、経口及び静脈内投与のためのビヒクルとして使用した。
【０１４３】
静脈内投与に先立ち、溶液は０．２２μＭフィルターで濾過した。経口投与は強制経口投与法を用いて行った。静脈内投与には尾静脈注射を使用した。
【０１４４】
投与後０．５、１、２、４、６及び８時間に０．２５ｍｌの血液を前記動物から採ると直ぐに、４μｌのＫ２−ＥＤＴＡを含有する予め冷却しておいた微量遠心チューブに移して、凝固しないようにした。血漿を遠心分離することにより血漿を得、分析するまで−７０℃で保存した。以下の予定に従って、各々のラットから採った血漿を貯留した：
【０１４５】
【表８】
2016511218.tif 000009
【０１４６】
貯留した試料はＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して分析し、貯留した試料中の各代謝物の相対的割合（％）を、血漿中の親化合物及びその代謝物の質量分析でのピーク面積に基づいて測定した。
【０１４７】
このようにして得られた結果を表５ａ及び５ｂに示す。
【０１４８】
【表９】
2016511218.tif 000010
【０１４９】
【表１０】
2016511218.tif 000011
【０１５０】
結論：
これらの結果から、循環モノ−サルフェストロールは最小限の代謝過程を経ることが示される。加えて、血漿モノ−サルフェストロールレベルを最も高めるには、モノ−サルフェストロールの経口投与が静脈内投与よりも好ましい。モノ−サルフェストロールは、いくらかの酸化代謝は検出されるものの代謝物レベルは低い。ジ−サルフェストロールはモノ−サルフェストロールへとほとんど転換され、後者はジ−サルフェストロールの最も豊富な循環代謝物である。いくらかの酸化代謝及びグルクロン酸抱合は検出されるものの、低レベルである。
【０１５１】
実施例７
【０１５２】
実施例６に記載した、貯留した試料中のモノ−サルフェストロール濃度を、ＬＣ−ＵＶ定量により定量した。
【０１５３】
校正標準液は、適量のモノ−サルフェストロールを２０％アセトニトリル／０．１％ギ酸水溶液に添加することにより、１０，０００ｎｇ／ｍＬで調製した。標準液及び試料のピーク面積を、波長を２００〜３６０ｎｍに設定して測定した。モノ−サルフェストロールの濃度レベルは、標準及び未知試料のピーク面積（面積）並びに標準の濃度（濃度標準）を用いて以下の式により推定した：
面積未知／面積標準＝濃度未知／濃度標準
濃度未知＝濃度標準・（面積未知／面積標準）
結果を表６に示す。
【０１５４】
【表１１】
2016511218.tif 000012
【０１５５】
実施例８
【０１５６】
ＤＥＳ及びジ−サルフェストロールのエストロゲン活性を、雄スプラーグドーリーラットで測定した。エストロゲン活性は、体重及び血漿コレステロールレベルを測定することにより決定した。
【０１５７】
１８匹のスプラーグドーリーラットを無作為に３つの群（ビヒクル、ＤＥＳ及びジ−サルフェストロール、ｎ＝６）に分けた。各動物に連続１４日間、ビヒクル又は試験化合物を１日３回投与した（１回目の投与は７：３０〜８：００、２回目の投与は１２：３０〜１３：００、３回目の投与は１７：００〜１７：３０）。ＤＥＳは１回の投与あたり０．５ｍｇ／ｋｇを投与し、合計用量は１日あたり１．５ｍｇ／ｋｇであった。ジ−サルフェストロールは１回の投与あたり１ｍｇ／ｋｇを投与し、合計用量は１日あたり３ｍｇ／ｋｇであった。
【０１５８】
体重は０、２、４、６、８、１０、１２及び１４日目において１３：３０〜１３：００の間に測定した。
【０１５９】
１４日間の処置後、最後の投与の４時間後に心臓穿刺により動物から血液を採取して、血漿コレステロールレベルを分析した。血液は、抗凝固剤である０．５ＭのＥＤＴＡを含有するチューブに直ぐに移し、穏やかに混合し、４℃で１０００×ｇ、１５分間遠心分離した。血漿は、遠心分離した血液試料から吸引し、ドライアイス上で急速凍結し、後の使用のために−８０℃で保存した。
【０１６０】
血漿コレステロールレベルは、ＮｏｖａＴｅｉｎＢｉｏ（ＢＧ−ＲＡＴ１１２６２）から入手した市販のエライザキットを使用して決定した。キットに付属の標準プロトコールを、変更を加えずに使用した。
【０１６１】
体重及び血漿コレステロール測定の結果を表７ａ及び７ｂに示す。
【０１６２】
【表１２】
2016511218.tif 000013
【０１６３】
【表１３】
2016511218.tif 000014
【０１６４】
結論：
ＤＥＳ及びジ−サルフェストロールのいずれも、ラットにおいて体重及びコレステロールレベルを減少させることによりエストロゲン活性を示す。しかしＤＥＳとは異なり、インビトロ細胞毒性データから示されたように（実施例２及び３を参照されたい）、ジ−サルフェストロールには、乳がん及び前立腺がん細胞株において、インビトロで細胞毒性はなかった。
【０１６５】
このデータから、ジ−サルフェストロールはラットにおいて脱サルフェート化され、それによりＤＥＳが遊離し、対応するエストロゲン活性の発現をもたらすことが示される。同様に、ジ−サルフェストロールがインビボで脱サルフェート化されると、ＤＥＳの細胞毒性活性の発現がもたらされる。
【０１６６】
実施例９
【０１６７】
モノ−サルフェストロールのインビボでの有効性を決定するために実験を行う。
【０１６８】
実証されているインビボ乳がんモデルを用いて、モノ−サルフェストロールの腫瘍増殖及び進行に対する効果を決定した。この目的のために、動物、好ましくはマウスの群において腫瘍を増殖させる。
【０１６９】
腫瘍が確立されたら、経口的にモノ−サルフェストロール及びジ−サルフェストロールによる処置を開始する。処置の間、腫瘍サイズをモニタリングする。
【０１７０】
実験結果から、モノ−サルフェストロールは適切な用量で投与するならば、乳がんを処置するために使用できることが示される。
【０１７１】
実施例１０
【０１７２】
ジ−サルフェストロールのインビボでの有効性を決定するために実験を行う。
【０１７３】
実証されているインビボ前立腺がんモデルを用いて、ジ−サルフェストロールの腫瘍増殖及び進行に対する効果を決定した。この目的のために、動物の群において腫瘍を増殖させる。
【０１７４】
腫瘍が確立されたら、経口的にジ−サルフェストロールによる処置を開始する。処置の間、腫瘍サイズをモニタリングする。動物の全体的な生存率を使用して処置の有効性を測定する。
【０１７５】
実験結果から、ジ−サルフェストロールは適切な用量で投与するならば、前立腺がんを処置するために使用できることが示される。
【０１７６】
実施例１１
【０１７７】
５０ｍｇのモノ−サルフェストロールを含有する２５０ｍｇの錠剤の、１ｋｇバッチを以下のように調製した。
【０１７８】
２００グラムのモノ−サルフェストロール、１６０グラムのケイ化微結晶セルロース、５７０グラムのラクトース一水和物及び５０グラムのクロスカルメロースナトリウムをそれぞれ別個に７１０ミクロンの篩に通した。篩にかけた物質はタンブルブレンダーに入れ、２０分間混合した。一方、２０グラムのステアリン酸マグネシウムは、５００ミクロンの篩を通した。この物質を前記タンブルブレンダーに加え、さらに５分間混合を継続した。
【０１７９】
重量２５０ｍｇの錠剤は、直径９．５ｍｍの丸パンチを使用してコーシュ（Ｋｏｒｓｃｈ）ＥＫ０で調製した。
【０１８０】
実施例１２
【０１８１】
５０ｍｇのジ−サルフェストロールを含有するカプセル剤は、５０グラムのジ−サルフェストロール、４０グラムの微結晶セルロース、１４０グラムのラクトース一水和物及び４グラムのコロイドシリカを測り取ることにより調製した。全ての物質を別個に７１０ミクロンの篩に通した後、物質はＶブレンダーに移し、１５分間混ぜ合わせた。
【０１８２】
サイズ２のゼラチン硬カプセルを、２３４ｍｇの平均充填重量で調製した。
【０１８３】
実施例１３
【０１８４】
モノ−サルフェストロール及びジ−サルフェストロールの腫瘍進行に対する効果を、雌ＭＦ−１ヌードマウスの乳房脂肪パッド（ＭＦＰ）に注射した生物発光ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  Ｄｌｕｘを使用して、同所性自然転移乳房モデル（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｂｒｅａｓｔ  ｍｏｄｅｌ）において決定した。
【０１８５】
雌ＭＦ−１ヌードマウス（ＨｓｄＯｌａ：ＭＦ１−Ｆｏｘｎ１ｎｕ、Ｈａｒｌａｎ、ＵＫ）を、それぞれ８匹のマウス（ｎ＝８）からなる群３つに分けた：
１）モノ−サルフェストロール
２）ジ−サルフェストロール
３）ビヒクル陰性対照
【０１８６】
マウスは研究開始時に５〜６週齡で、１２時間の明暗サイクル（０７．００点灯、１９．００消灯）になるような設定の蛍光灯で照明された、仕切られた区画の中の無菌アイソレーター内で維持した。部屋は、２３±２℃の空気温度範囲を維持するように空調した。滅菌照射した２０１９げっ歯類用飼料（Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ  ＵＫ、製品コードＱ２１９ＤＪ１Ｒ２）及びオートクレーブした水を、随意に摂取できるように与えた。
【０１８７】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｄｌｕｘ細胞は、２ｍＭのＬ−Ｇｌｕｔ及び（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＫ）及び１０％（ｖ／ｖ）の熱失活したウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ、Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）を含有するＲＰＭＩで、３７℃、５％ＣＯ２及び加湿条件下、インビトロで維持した。細胞は週に１回、ゼオシンにより０．４ｍｇ／ｍＬで処理した。
【０１８８】
開始日に、０．０５％のＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡを用いて、細胞をセミコンフルエントな単層から回収し、培地中で２回洗浄し、計数した。生細胞率が９０％超の細胞を、インビボ投与のために、１：１のＰＢＳ：マトリゲルに２×１０６個／０．１ｍＬで再懸濁した。注射前に細胞懸濁液をホモジナイズし、０．１ｍＬの細胞懸濁液を１ｍＬシリンジに取った。次いで細胞懸濁液を、同所的に、麻酔（メデトミジン／ケタミン）下の各マウスの左下側２番目の乳房脂肪パッドに注射した。
【０１８９】
開始後７日目、及びそれ以降６日毎に、マウスに１５０ｍｇ／ｋｇのＤ−ルシフェリンを注射した（皮下注射）。Ｄ−ルシフェリン投与後１０分に、マウスを麻酔し、投与後１５分にイメージングチャンバー（スペクトル  ＣＴ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ＣＴ））に入れ、発光イメージングを行った（腹側からの視野；全身及び原発腫瘍を遮蔽）。イメージは、リビングイメージ（Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ）４．３．１ソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬＳ、ＵＳ．）により取得及び処理した。
【０１９０】
開始後７日目に、マウスを、生物発光シグナルの平均が群間で同一になるように群に分けた。
【０１９１】
群に分けたら直ぐに、処置を開始した：
【０１９２】
群１：ＷＦＩ（注射用水）中の６０ｍｇ／ｋｇのモノ−サルフェストロールを１日１回経口投与した。
【０１９３】
群２：ＷＦＩ中の８０ｍｇ／ｋｇのジ−サルフェストロールを１日１回経口投与した。
【０１９４】
群３：注射用のＰＥＧ／水を、５０／５０混合物で１日１回経口投与した。
【０１９５】
得られた結果を表８に示す。この表には、上記の全身生物発光測定により決定した、測定された全光束（光子／秒）±標準偏差が１０９の単位で示されている。
【０１９６】
【表１４】
2016511218.tif 000015
【０１９７】
このデータから、モノ−サルフェストロール及びジ−サルフェストロールの双方が、シグナル強度を低減する効果を有することが分かる。このことから、いずれの化合物も、適切な用量でマウスに経口投与する場合、腫瘍進行を阻害する効果を有することが示される。
【手続補正書】
【提出日】平成26年11月19日(2014.11.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物での乳がん又は前立腺がんの根治的又は対症的処置方法における使用のためのモノ−サルフェストロール（ジエチルスチルベストロール−モノサルフェート）であって、モノ−サルフェストロールが４，４’−（ヘキサ−３−エン−３，４−ジイル）ビス（４，１−フェニレン）ジサルフェート以外の、４−（４−（４−オキシドフェニル）ヘキサ−３−エン−３−イル）フェニルサルフェート、該サルフェートの薬学的に許容される塩又は該サルフェートのエステルである、モノ−サルフェストロール（ジエチルスチルベストロール−モノサルフェート）。
【請求項２】
がんがホルモン非依存性がんである、請求項１に記載の使用のためのモノ−サルフェストロール。
【請求項３】
ホルモン非依存性がんが、ホルモン依存性がんをホルモン療法により処置した後にホルモン非依存性となったものである、請求項２に記載の使用のためのモノ−サルフェストロール。
【請求項４】
ホルモン非依存性がんが、ホルモン依存性がんを抗エストロゲン、アロマターゼ阻害剤、抗アンドロゲン又は１７αヒドロキシラーゼ／Ｃ１７，２０リアーゼ（ＣＹＰ１７Ａ１）阻害剤により処置した後にホルモン非依存性となったものである、請求項３に記載の使用のためのモノ−サルフェストロール。
【請求項５】
方法が経口投与、静脈内投与、又はその組み合わせを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のためのモノ−サルフェストロール。
【請求項６】
方法が、少なくとも０．０３ｍｍｏｌの１日投与量でのモノ−サルフェストロールの経口投与を含む、請求項５に記載の使用のためのモノ−サルフェストロール。
【請求項７】
方法が、少なくとも０．２ｍｍｏｌの１日投与量でのモノ−サルフェストロールの経口投与を含む、請求項６に記載の使用のためのモノ−サルフェストロール。
【請求項８】
方法が、少なくとも０．０３ｍｍｏｌの１日投与量でのモノ−サルフェストロールの静脈内投与を含む、請求項７に記載の使用のためのモノ−サルフェストロール。
【請求項９】
方法が、少なくとも０．２ｍｍｏｌの１日投与量でのモノ−サルフェストロールの静脈内投与を含む、請求項８に記載の使用のためのモノ−サルフェストロール。
【請求項１０】
少なくとも０．００１ｍｍｏｌのモノ−サルフェストロールを含有する経口投与単位であって、モノ−サルフェストロールがジエチルスチルベストロールモノ［３５Ｓ］サルフェートではない、経口投与単位。
【請求項１１】
少なくとも０．０３ｍｍｏｌのモノ−サルフェストロールを含有する請求項１０に記載の経口投与単位。
【請求項１２】
錠剤又はカプセル剤である請求項１０又は１１に記載の経口投与単位。
【請求項１３】
ジエチルスチルベストロールモノ［３５Ｓ］サルフェート以外の、少なくとも０．１μｍｏｌ／ｍｌのモノ−サルフェストロールを含有する、静脈内投与のための無菌水性液。
【請求項１４】
２７０〜３１０ｍＯｓｍ／ｌのオスモル濃度を有する請求項１３に記載の無菌水性液。
【手続補正書】
【提出日】平成27年6月16日(2015.6.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物での乳がん又は前立腺がんの根治的又は対症的処置のための投与単位であって、モノ−サルフェストロール（ジエチルスチルベストロール−モノサルフェート）を含み、モノ−サルフェストロールが４，４’−（ヘキサ−３−エン−３，４−ジイル）ビス（４，１−フェニレン）ジサルフェート以外の、４−（４−（４−オキシドフェニル）ヘキサ−３−エン−３−イル）フェニルサルフェート、該サルフェートの薬学的に許容される塩又は該サルフェートのエステルである、投与単位。
【請求項２】
がんがホルモン非依存性がんである、請求項１に記載の投与単位。
【請求項３】
ホルモン非依存性がんが、ホルモン依存性がんをホルモン療法により処置した後にホルモン非依存性となったものである、請求項２に記載の投与単位。
【請求項４】
ホルモン非依存性がんが、ホルモン依存性がんを抗エストロゲン、アロマターゼ阻害剤、抗アンドロゲン又は１７αヒドロキシラーゼ／Ｃ１７，２０リアーゼ（ＣＹＰ１７Ａ１）阻害剤により処置した後にホルモン非依存性となったものである、請求項３に記載の投与単位。
【請求項５】
モノ−サルフェストロールが経口、静脈内、又はその組み合わせにより投与されることを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の投与単位。
【請求項６】
モノ−サルフェストロールが、少なくとも０．０３ｍｍｏｌの１日投与量で経口投与されることを含む、請求項５に記載の投与単位。
【請求項７】
モノ−サルフェストロールが、少なくとも０．２ｍｍｏｌの１日投与量で経口投与されることを含む、請求項６に記載の投与単位。
【請求項８】
モノ−サルフェストロールが、少なくとも０．０３ｍｍｏｌの１日投与量で静脈内投与されることを含む、請求項５に記載の投与単位。
【請求項９】
モノ−サルフェストロールが、少なくとも０．２ｍｍｏｌの１日投与量で静脈内投与されることを含む、請求項８に記載の投与単位。
【請求項１０】
少なくとも０．００１ｍｍｏｌのモノ−サルフェストロールを含有する経口投与単位であって、モノ−サルフェストロールがジエチルスチルベストロールモノ［３５Ｓ］サルフェートではない、経口投与単位。
【請求項１１】
少なくとも０．０３ｍｍｏｌのモノ−サルフェストロールを含有する請求項１０に記載の経口投与単位。
【請求項１２】
錠剤又はカプセル剤である請求項１０又は１１に記載の経口投与単位。
【請求項１３】
ジエチルスチルベストロールモノ［３５Ｓ］サルフェート以外の、少なくとも０．１μｍｏｌ／ｍｌのモノ−サルフェストロールを含有する、静脈内投与のための無菌水性液。
【請求項１４】
２７０〜３１０ｍＯｓｍ／ｌのオスモル濃度を有する請求項１３に記載の無菌水性液。
【国際調査報告】
2016511218.tif 000016
2016511218.tif 000017