(57)【要約】  本願発明は、樹状細胞（ＤＣ）前駆細胞の機能的な抗原を提示する誘導されたＤＣ（ｉＤＣ）への自律分化を誘導する少なくとも１つのサイトカインおよび少なくとも１つの抗原を発現するように操作された細胞に関する。さらに、造血幹細胞の移植後に免疫系を再生するための当該ｉＤＣの治療的使用が記載される。当該ｉＤＣはまた、ヒト適応免疫応答の試験のための動物モデルとして使用することができる抗原特異的ＴおよびＢ細胞応答を生産する機能的な内在的に再生されたヒト化免疫系を有するマウスを産生するために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬としての使用のための、
ａ）ヒト樹状細胞（ＤＣ）前駆細胞のＤＣへの自律分化(self-differentiation)を誘導する少なくとも１つのサイトカイン；および
ｂ）少なくとも１つの抗原；
を発現するように操作された誘導された樹状細胞（ｉＤＣ）。
【請求項２】
造血幹細胞（ＨＳＣ）の移植後の免疫不全対象の免疫系の再生における使用のための、
ａ）ヒト樹状細胞（ＤＣ）前駆細胞のＤＣへの自律分化を誘導する少なくとも１つのサイトカイン；および
ｂ）少なくとも１つの抗原；
を発現するように操作された誘導されたｉＤＣ。
【請求項３】
ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項２に記載のｉＤＣ。
【請求項４】
レンチウイルスベクターがインテグラーゼ欠損型である、請求項３に記載のｉＤＣ。
【請求項５】
少なくとも１つの抗原を発現するｉＤＣがヒト樹状細胞（ＤＣ）前駆細胞のＤＣへの自律分化を誘導する少なくとも１つのサイトカインを発現する、請求項２から４のいずれかのｉＤＣ。
【請求項６】
サイトカインがＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１５、ＴＧＦ−Ｂ、ＴＮＦ−α、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ−３およびＣＤ４０Ｌからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ｉＤＣが（ｉ）ＦＬＴ３ＬおよびＩＬ−３；（ｉｉ）ＦＬＴ３ＬおよびＣＤ４０Ｌ；（ｉｉｉ）ＦＬＴ３ＬおよびＩＦＮα；（ｉｖ）ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−αおよびＩＬ−１５；（ｖ）ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−αおよびＴＮＦ−α；および（ｖｉ）ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−αおよびＴＧＦ−Ｂからなる群から選択されるサイトカインの組合せを発現する、請求項６に記載のｉＤＣ。
【請求項８】
ｉＤＣにより発現される１つの抗原が異種反応性(xeno-reactivity)、同種反応性(allo-reactivity)、新反応性(neo-reactivity)または自己免疫からなる群から選択される細胞傷害性または体液性免疫応答を誘導することができる抗原である、請求項２から７のいずれかに記載のｉＤＣ。
【請求項９】
対象の免疫不全が電離放射線によって引き起こされる免疫不全、少なくとも１つの細胞毒性薬の投与によって引き起こされる免疫不全、原発性免疫不全および病原体によって引き起こされる免疫不全からなる群から選択される免疫不全である、請求項２から８のいずれかのｉＤＣ。
【請求項１０】
造血幹細胞移植が自己である、請求項２から９のいずれかのｉＤＣ。
【請求項１１】
対象がヒトである、請求項２から１０のいずれかのｉＤＣ。
【請求項１２】
幹細胞移植が異種である、請求項２から９のいずれかのｉＤＣ。
【請求項１３】
対象がヒトである、請求項１２に記載のｉＤＣ。
【請求項１４】
ドナーおよびレシピエントが少なくとも２つの一次(primary)ＨＬＡ遺伝子座および／または少なくとも２つの二次(第２次)ＨＬＡ遺伝子座によって異なる、請求項１３に記載のｉＤＣ。
【請求項１５】
リンパ系に(lymphatically)広がる癌またはリンパ向性病原体により引き起こされる疾患の処置のための医薬としての使用のための、
ａ）ヒト樹状細胞（ＤＣ）前駆細胞のＤＣへの自律分化を誘導する少なくとも１つのサイトカイン；および
ｂ）少なくとも１つの抗原；
を発現するように操作されたｉＤＣ。
【請求項１６】
少なくとも１つのインテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクターを含むｉＤＣであって、当該ベクターは、
ａ）ヒト樹状細胞（ＤＣ）前駆細胞のＤＣへの自律分化を誘導する少なくとも１つのサイトカイン；および
ｂ）少なくとも１つの抗原
の発現を介在する、ｉＤＣ。
【請求項１７】
以下の工程
ａ）造血幹細胞を対象に移植すること；および
ｂ）少なくとも１つの抗原およびヒト樹状細胞（ＤＣ）前駆細胞のＤＣへの自律分化を誘導する少なくとも１つのサイトカインを発現するように操作された誘導された樹状細胞（ｉＤＣ）を対象に投与すること
を含む、免疫不全対象における免疫系を再生するための方法。
【請求項１８】
対象がマウスであり、ＨＳＣがヒトに由来する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
マウスが樹状細胞の内在性Ｔ細胞および内在性前駆細胞の存在により特徴付けられる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
マウス血統が（ＴおよびＢ細胞を含む）適応免疫系の機能不全または欠損に至る原発性免疫不全を有する、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
マウスがＮＯＤ−Ｒａｇ１ｎｕｌｌＩＬ２Ｒｙｎｕｌｌ−ＮＲＧ、ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒｙｎｕｌｌ−ＮＳＧおよびＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒｙｎｕｌｌ−ＮＯＧからなる血統の群から選択される、請求項１８から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
ベクターが抗原ｐｐ６５およびサイトカイン（ｉ）ＧＭ−ＣＳＦおよび（ｉｉ）インターフェロン−αおよび／またはインターロイキン−４の発現を介在する、請求項１７から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
請求項１８から２２のいずれかに記載の方法により生産される再生された免疫系を有するマウス。
【請求項２４】
ヒト免疫系の試験のための、またはヒトにおける使用のための薬物、インプラントまたはデバイスの試験のための、請求項２３に記載のマウスの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、樹状細胞（ＤＣ）前駆細胞の機能的な抗原を提示する誘導されたＤＣ（ｉＤＣ）への自律分化を誘導する少なくとも１つのサイトカインおよび少なくとも１つの抗原を発現するように操作された細胞に関する。さらに、造血幹細胞の移植後に免疫系を再生するための当該ｉＤＣの治療的使用が記載される。当該ｉＤＣはまた、ヒト適応免疫応答の試験のための動物モデルとして使用することができる抗原特異的ＴおよびＢ細胞応答を生産する機能的な内在的に再生されたヒト化免疫系を有するマウスを産生するために有用である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、ドナー移植片の長期造血生着および移植片対白血病効果によって慢性骨髄性白血病（８０％）および急性骨髄性白血病（６５％）に対して高い臨床的成功率である、種々の悪性造血障害のための標準治療アプローチとなっている。しかしながら、ＨＳＣＴ後の対象は、移植後の最初の１００日間深刻な細胞免疫不全に苦しみ、ＨＳＣＴ後の１年後になって完全なＴおよびＢ細胞再構成に達する。長期の細胞免疫不全は、日和見性ウイルスおよび真菌感染症および再発に対する危険性の後の増加のリスクと関連する（最大４０％）（Seggewiss, R., and H. Einsele, 2010, “Immune reconstitution after allogeneic transplantation and expanding options for immunomodulation: an update.” Blood 115: 3861-3868; Roncarolo, M. G. et al., 2011, “Clinical tolerance in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.” Immunological reviews 241: 145-163; Mori, T., and J. Kato, 2010, “Cytomegalovirus infection/disease after hematopoietic stem cell transplantation” International journal of hematology 91: 588-595）。したがって、広範なレパートリーのＴ細胞およびＢ細胞応答を有するリンパ球プールの回復を促進し、ＨＳＣＴ後の移植された対象において最適なウイルス免疫を誘導する戦略が必要とされる。
【０００３】
受動および能動免疫化に基づく免疫不全宿主において免疫再構成を誘導する新規の先進的治療アプローチは、過去１０年の間に開発されている。それにもかかわらず、かかる治療の有効性およびバイオセーフティーに取り組むための適当なインビボ実験モデルは、いまもなお開発下にある。インビボでＨＳＣＴ後のヒト免疫再構成を実験的に繰り返すために、亜致死的全身照射（ＴＢＩ）後に共通のインターロイキン−２受容体ガンマ鎖（ＩＬ２Ｒγ）を欠いている種々の免疫不全マウス血統（ＮＯＤ−Ｒａｇ１ｎｕｌｌＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ−ＮＲＧ、ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ／ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ−ＮＳＧ、またはＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ−ＮＯＧ）にＣＤ３４＋ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）を移植し、ＣＤ３４＋細胞移植後の８から１０週にヒト造血系の再構成を引き起こす（Ishikawa, Fら, 2005, “Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor γ chainnull mice.” Blood 106: 1565-1573）。重要なことには、ＨＳＣの供給源および細胞移植の方法にかかわらず、ヒト化マウスは、ＴおよびＢ成熟リンパ球再構成の準最適レベル、抗原特異的細胞性および体液性不応答および全体的なアネルギー(anergy)を示した（Lepus, C. Mら, 2009, “Comparison of Human Fetal Liver, Umbilical Cord Blood, and Adult Blood Hematopoietic Stem Cell Engraftment in NOD-scid/γc−/−, Balb/c-Rag1−/−γc−/−, and C.B17-scid/bg Immunodeficient Mice.” Human immunology 70: 790-802; Andre, M. Cら, 2010, “Long-term human CD34+ stem cell-engrafted nonobese diabetic/SCID/IL-2R gamma(null) mice show impaired CD8+ T cell maintenance and a functional arrest of immature NK cells.” J Immunol 185: 2710-2720）。ヒト化マウスにおいて非効率的なリンパ発達を決定する因子は、ヒト組織適合性分子の不存在、胸腺機能障害および乏しいヒトサイトカイン環境を含む。
【０００４】
この問題を解決する試みは、サイトカインの送達（O'Connell, R. Mら, 2010, “Lentiviral Vector Delivery of Human Interleukin-7 (hIL-7) to Human Immune System (HIS) Mice Expands T Lymphocyte Populations.” PLoS One 5; Chen, Qら, 2009, “Expression of human cytokines dramatically improves reconstitution of specific human-blood lineage cells in humanized mice.” Proc Natl Acad Sci U S A 106: 21783-21788）、ＨＰＣと共に胎児のリンパ組織の移植（Hu, Z., and Y. G. Yang, 2012, “Human lymphohematopoietic reconstitution and immune function in immunodeficient mice receiving cotransplantation of human thymic tissue and CD34+ cells” Cell Mol Immunol 9: 232-236; Biswas, Sら, 2011, “Humoral immune responses in humanized BLT mice immunized with West Nile virus and HIV-1 envelope proteins are largely mediated via human CD5+ B cells.” Immunology 134: 419-433）および主要組織適合性分子（ＭＨＣ）クラスＩ（Shultz, L. Dら, 2010, “Generation of functional human T-cell subsets with HLA-restricted immune responses in HLA class I expressing NOD/SCID/IL2rγnull humanized mice.” Proc Natl Acad Sci U S A 107: 13022-13027）およびＨＬＡクラスＩＩ（Danner, Rら, 2011, “Expression of HLA Class II Molecules in Humanized NOD.Rag1KO.IL2RgcKO Mice Is Critical for Development and Function of Human T and B Cells” PLoS One 6）を構成的に発現するトランスジェニック血統の使用を含んだか、または重要な造血サイトカイン（Willinger, Tら, 2011, “Human IL-3/GM-CSF knock-in mice support human alveolar macrophage development and human immune responses in the lung” Proc Natl Acad Sci U S A 108: 2390-2395）が最近記載されている。これらの戦略は、ヒトウイルス攻撃に対するＢおよびＴ細胞応答において限定された改良を可能にした。重要なことには、ほんのわずかなレポートがＨＳＣを移植されたマウスにおいて再構成されたリンパ組織の存在を記載している（Singh, Mら, 2012, “An Improved Protocol for Efficient Engraftment in NOD/LTSZ-SCIDIL-2RγNULL Mice Allows HIV Replication and Development of Anti-HIV Immune Responses” PLoS One 7; Marodon, Gら, 2009, “High diversity of the immune repertoire in humanized NOD.SCID.gamma c-/- mice” European journal of immunology 39: 2136-2145; Sun, Zら, 2007, “Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4+ T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1” J Exp Med 204: 705-714）。ヒト臍帯血または胎児の肝臓からの高品質のＣＤ３４＋ＨＰＣを使用し、それにより高いヒト細胞生着率および合理的水準のヒトのリンパ細胞に達したが、リンパ節（ＬＮ）はほとんど観察されなかった。これらのデータは、リンパ器官再生の欠如はヒト化マウスモデルにおいて観察される乏しいリンパ球細胞再構成における重要な役割を果たし得ることを示唆する。
【０００５】
ＤＣは、適応免疫応答の誘導において中心的役割を果たす。重要なことには、ＤＣは、リンパの三次構造の再生およびリモデリングを引き起こし、能動免疫応答中のＬＮの機能を維持することにおいて基本的な役割を果たす。
【０００６】
レンチウイルス（ＬＶ）媒介遺伝子導入を使用して、我々は、癌免疫療法のための高度に生存可能な強力なＤＣを産生する方法を開発した（Pincha, Mら, 2011, “Lentiviral vectors for induction of self-differentiation and conditional ablation of dendritic cells” Gene therapy 18: 750-764; Koya, R. Cら, 2007 “Lentiviral vector-mediated autonomous differentiation of mouse bone marrow cells into immunologically potent dendritic cell vaccines” Molecular Therapy 15: 971-980）。ＬＶ誘導ＤＣは、高レベルの生着およびインビボで黒色腫に対して抗原特異的応答を刺激し、保護する強力な能力を示した。最近、我々は、ヒト単球へのヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターフェロン（ＩＦＮ）−αのインテグラーゼ欠損型（ＩＤ）ＬＶ遺伝子送達が自律分化され、高度に生存可能な樹状細胞をもたらすことを証明した（Daenthanasanmak, Aら, 2012, “Integrase-defective lentiviral vectors encoding cytokines induce differentiation of human dendritic cells and stimulate multivalent immune responses in vitro and in vivo” Vaccine 30: 5118-5131）。
【０００７】
したがって、本願発明の根底にある問題は、造血幹細胞の移植後の免疫系の再生を改善する手段および方法の提供と見なすことができる。
【０００８】
当該問題は、特許請求の範囲および以下の記載に記載されている態様により解決される。
【発明の概要】
【０００９】
１つの局面において、本願発明は、医薬としての使用のための、
ａ）ヒトＤＣ前駆細胞のＤＣへの自律分化（self-differentiation）を誘導する少なくとも１つのサイトカイン；および
ｂ）少なくとも１つの抗原；
を発現するように操作された誘導された樹状細胞（ｉＤＣ）に関する。
【００１０】
他の局面において、本願発明は、ＨＳＣの移植後の免疫不全対象の免疫系の再生における使用のための、
ａ）ヒトＤＣ前駆細胞のＤＣへの自律分化を誘導する少なくとも１つのサイトカイン；および
ｂ）少なくとも１つの抗原；
を発現するように操作されたｉＤＣに関する。
【００１１】
さらに他の局面において、本願発明は、リンパ系に(lymphatically)広がる癌またはリンパ向性病原体により引き起こされる疾患の処置のための医薬としての使用のための、
ａ）ヒトＤＣ前駆細胞のＤＣへの自律分化を誘導する少なくとも１つのサイトカイン；および
ｂ）少なくとも１つの抗原；
を発現するように操作されたｉＤＣに関する。
【００１２】
さらに他の局面において、本願発明は、以下の工程
ａ）造血幹細胞を対象に移植すること；および
ｂ）少なくとも１つの抗原およびＤＣ前駆細胞のＤＣへの自律分化を誘導する少なくとも１つのサイトカインを発現するように操作されたｉＤＣを対象に投与すること
を含む、免疫不全対象における免疫系を再生するための方法に関する。
【００１３】
さらに他の局面において、本願発明は、本願発明の方法により生産される機能的な異種免疫系を有する動物モデルに関する。
【００１４】
さらに他の局面において、本願発明は、ヒト免疫系の試験のための、またはヒトにおける使用のための薬物、インプラントまたはデバイスの試験のための、本願発明の方法により生産されるヒト化免疫系を有するマウスの使用に関する。
【００１５】
さらに他の局面において、本願発明は、少なくとも１つのインテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクターを含むｉＤＣであって、当該ベクターは、
ａ）ヒトＤＣ前駆細胞のＤＣへの自律分化を誘導する少なくとも１つのサイトカイン；および
ｂ）少なくとも１つの抗原
の発現を介在する、ｉＤＣに関する。
【００１６】
さらに他の態様において、本願発明は、以下の工程
ａ）適当なドナーに由来するサンプルから前駆細胞を単離すること；
ｂ）ヒト樹状細胞（ＤＣ）前駆細胞のＤＣへの自律分化を誘導する少なくとも１つのサイトカインおよび少なくとも１つの抗原の発現をなし遂げるように、細胞を操作すること
を含む、ｉＤＣを産生するための方法に関する。
【００１７】
発明の詳細な説明
本願発明が以下に詳細に記載される前に、本願発明が、本明細書に記載されている特定の方法論、プロトコールおよび試薬が変化し得るとき、本明細書に記載されている特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されないと理解されるべきである。本明細書において使用される用語は、特定の態様のみを記載する目的のためであり、添付の特許請求の範囲のみにより限定される本願発明の範囲を限定することを意図しないと理解されるべきである。他に定義されていない限り、本明細書において使用される全ての専門および科学用語は、当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。好ましくは、本明細書において使用される用語は、“A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)”, Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)に記載されているとおりに定義される。
【００１８】
本願明細書および以下に続く特許請求の範囲にわたって、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む」なる用語、および「含み」および「含むこと」のような変形語は、記載された整数または工程または整数または工程の群の包含を意味するが、任意の他の整数または工程または整数または工程の群の排除を意味しないと理解する。
【００１９】
いくつかの文書が本願明細書の本文にわたって引用されている。上記または下記の本願明細書において引用されているそれぞれの文書（全ての特許、特許出願、科学出版物、製造業者の仕様書、指示書、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号配列寄託などを含む）を、出典明示によりその内容を本願明細書に包含させる。本願発明が以前の発明の理由でかかる記載に先行する権利がないと認めると解釈すべきでない。
【００２０】
本願発明のｉＤＣの記載
本願発明は、
ａ）ヒト樹状細胞（ＤＣ）前駆細胞のＤＣへの自律分化を誘導する少なくとも１つのサイトカイン；および
ｂ）少なくとも１つの抗原
を発現するように操作されたｉＤＣに関する。
【００２１】
本願において以下でさらに記載される方法および使用のために有用なｉＤＣは、少なくとも１つのサイトカインおよび少なくとも１つの抗原の発現によって自律分化する(self-differentiate)ように誘導される樹状細胞である。
【００２２】
樹状細胞の「自律分化」なる用語は、少なくとも１つのサイトカインおよび少なくとも１つの抗原の内在性発現によって刺激される適当な前駆細胞から樹状細胞の発達を示す。「自律分化」なる用語は、分化過程中の増殖培地へのサイトカインの添加を排除しない。しかしながら、ＤＣ前駆細胞のＤＣへの自律分化を誘導する少なくとも１つのサイトカインの内在性発現はこの過程のために必要とされる、すなわちｉＤＣが少なくとも１つのサイトカインの発現をなし遂げるように操作されないとき、自律分化は起こらない。ｉＤＣの操作は、好ましくは、インビトロで行われる処理である。
【００２３】
好ましい態様において、前駆細胞の樹状細胞への分化のために必要とされる全てのサイトカインおよび抗原は、前駆細胞および得られるｉＤＣによって内在的に発現される。
【００２４】
樹状細胞に分化することができるあらゆる細胞が、本願発明のｉＤＣに適当な前駆細胞である。したがって、「前駆細胞」なる用語は、多能性幹細胞および造血幹細胞を含む。好ましくは、樹状細胞に対する前駆細胞は単球、さらに好ましくは末梢血単球である。好ましくは、当該単球は、細胞表面上のＣＤ１４の存在により特徴付けられる。ＣＤ１４＋ＣＤ１６−であるヒト単球は古典的な単球と考えられ、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋細胞は非古典的な単球である。両方の型の単球が好ましい。単球は、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦに対する受容体およびケモカイン受容体ＣＣＲ１、ＣＣＲ２およびＣＣＲ５を発現する。したがって、前駆細胞は、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２およびＣＣＲ５からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現により定義される。さらに好ましくは、前駆細胞は、少なくとも２、３または４つの前記遺伝子の発現により特徴付けられる。さらに、好ましくは、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ５６はＴ−リンパ球、Ｂ−リンパ球およびナチュラルキラー細胞に対するマーカーであるため、前駆細胞はＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ５６を発現しない。受容体または表面マーカーの発現は、受容体または表面マーカーに特異的に結合する標識された抗体および標識の検出の使用を含む当該分野で既知の方法により決定することができる。標識は、共焦点顕微鏡または蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を含む種々の当該分野で既知の方法によって検出および／または定量され得る。
【００２５】
ｉＤＣに対する前駆細胞は、好ましくは、霊長類、齧歯動物、ネコ、イヌ、ブタ、ウシおよびヒツジからなる群から選択される生物体に由来する。霊長類は、好ましくは、ヒト、チンパンジーまたはマカクザル、より好ましくはヒトである。齧歯動物は、好ましくは、マウスまたはラット、より好ましくはマウスである。
【００２６】
とりわけ好ましい態様において、ｉＤＣは造血幹細胞のドナー（単数または複数）に由来する。
【００２７】
好ましくは、適当な前駆細胞は、表面上にＣＤ１４を発現する細胞を選択することによって、骨髄または血液（末梢または臍帯血）に由来する。
【００２８】
「操作」なる用語は、ＤＣ前駆細胞またはＤＣによって天然に発現されないか、またはそのレベルで天然に発現されない１つ以上のサイトカインおよび／または１つ以上の抗原の発現をもたらす処理を示すために使用される。好ましい態様において、細胞は、１つ以上のサイトカインおよび／または１つ以上の抗原をコードする核酸配列を含むベクターの導入により操作される。これらをコードする核酸配列は１つのベクターまたは別々のベクターに含まれること、例えば１つ以上のサイトカインをコードする核酸配列は１つのベクターに含まれ、１つ以上の抗原をコードする核酸配列は別のベクターに含まれることが可能である。別の好ましい態様において、ＤＣ前駆細胞またはＤＣは、ヒトゲノムにおいて天然にコードされるが、通常、これはＤＣ前駆細胞またはＤＣにおいて発現しないか、または発現が抑制されているサイトカインおよび／または抗原を発現するように操作される。これは、それぞれのサイトカインおよび／または抗原をコードする遺伝子の近接においてプロモーターおよび／またはエンハンサー配列の導入を含む当該分野で既知の方法によってなし遂げられ得る。プロモーターが導入されるとき、それらをそれぞれの遺伝子のコード領域の上流に、これらのプロモーターが内在性サイトカインおよび／または抗原の発現を指向する方法において導入することが好ましい。好ましくは、強い構成的プロモーターは、ウイルスプロモーター、例えばＣＭＶ前初期プロモーターまたはＳＶ４０プロモーターまたはハウスキーピング遺伝子のプロモーターのように導入される。別の態様において、必要に応じてサイトカインおよび／または抗原の発現および発現レベルの適応を可能にする調節性プロモーター系を使用する。かかる調節可能なプロモーター系は、例えばＴｅｔｏｎ、Ｔｅｔｏｆｆまたはｌａｃリプレッサー系を含む。再び、サイトカインおよび抗原に対して異なるプロモーター系、例えばサイトカインに対して調節可能なプロモーターおよび抗原に対して構成的プロモーターが、使用され得る。ベクターを使用するアプローチは、異種プロモーター／エンハンサーを導入するアプローチと組み合わせることができる、例えば細胞は、それぞれのサイトカイン遺伝子の近接への適当なプロモーター／エンハンサーの導入によってヒトゲノムにおいてコードされる１つ以上のサイトカインを発現するように操作され、１つ以上の抗原をコードする核酸配列を含むベクターでトランスフェクトされ得る。
【００２９】
抗原またはサイトカインの「内在性発現」なる用語は、樹状細胞自身および／またはその前駆細胞による当該分子の生産を示す。当該内在性発現は、上記で概説されているとおり、当該サイトカインまたは抗原をコードする細胞遺伝子の上方制御によって、またはサイトカインまたは抗原の組換え発現によって介在される。
【００３０】
細胞遺伝子の上方制御は、好ましくは、組織特異的、誘導的または構成的プロモーターのコントロール下で細胞遺伝子の転写活性化によってなし遂げられる。特定の遺伝子の転写を活性化することができる核酸、または、細胞中に発現されると、内在性サイトカイン遺伝子の転写を誘導する調節タンパク質、例えば転写因子をコードする核酸で細胞をトランスフェクトすることも好ましい。しかしながら、サイトカインまたは抗原の組換え発現を使用することが、一般的に容易であり、したがって好ましい。
【００３１】
「組換え発現」なる用語は、樹状細胞またはその前駆細胞における遺伝子の発現であって、当該遺伝子は細胞に導入される核酸分子に含まれる発現を示す。真核細胞に外来核酸分子を導入するための方法は当該分野でよく知られている。原則として、樹状細胞の発達または機能を損なうことなく、細胞によって少なくとも１つのサイトカインおよび少なくとも１つの抗原の所望の発現をもたらす限り、任意のこのような方法を使用することができる。
【００３２】
したがって、本願発明の好ましい態様において、ヒト樹状細胞（ＤＣ）前駆細胞のＤＣへの自律分化を誘導する少なくとも１つのサイトカインおよび少なくとも１つの抗原の発現を誘導するためのｉＤＣの操作は、ＤＣまたはその前駆細胞への当該タンパク質をコードするベクターの導入である。
【００３３】
ベクター
好ましくは、サイトカインおよび抗原をコードする遺伝子は、哺乳動物細胞における使用のための発現ベクターを使用して導入される。このようなベクターは、通常、複製起点（必要なとき、以下参照）、発現される遺伝子の前に位置するプロモーターを、所望によりトランスにおいてエンハンサー、任意の必要なリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列と共に含む。次に、かかる発現ベクターは、少なくとも１つの抗原および少なくとも１つのサイトカインの発現を介在するために使用され得る。
【００３４】
好ましい態様において、本願発明の発現ベクターは、プラスミド；ファージミド；ファージ；コスミド；人工染色体、特に人工哺乳動物染色体；ノックアウトまたはノックイン構築物；ウイルス、特にアデノウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒化したワクシニアウイルス、カナリアポックスウイルス、ヘルペスウイルス、特に単純ヘルペスウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ライノウイルス、フィロウイルス、および上記ウイルスの操作された型；ビロゾーム(virosome)；裸の(naked)ＤＮＡ、リポソーム；ウイルス様粒子；および核酸被覆粒子、特にゴールドスフィアを含み、本質的にそれらを構成するか、またはそれらからなる。レトロウイルスは、好ましくはレンチウイルスである。
【００３５】
組換えウイルスベクターの産生を可能にするプラスミドの例は、ｐＦａｓｔＢａｃ１（Invitrogen Corp., Carlsbad CA）、ｐＤＣＣＭＶ（Wiznerowicz et al., “Double-copy bicistronic retroviral vector platform for gene therapy and tissue engineering: application to melanoma vaccine development.” GeneTher. 1997 Oct；4(10):1061-8.）およびｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ（Q-biogene, Carlsbad, California）を含む。特に、レンチウイルスベクター（ＬＶ）、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターのようなウイルスベクターが好ましい。
【００３６】
ＬＶは、単球およびＤＣへの効率的な、長続きする、非毒性の、および非免疫原性の遺伝子送達を得ることができるアプローチを提供する。レンチウイルスは、細胞核輸送機構による認識することができる、レンチウイルスの組み込み前の複合体の核親和性の(karyophilic)特性によって、非増殖性細胞に感染することができる。ＬＶは、初代静止細胞、培養において増殖停止された細胞、ならびに最終分化した細胞に形質導入することができる。レンチウイルスのパッケージングシステムは、Ｎａｌｄｉｎｉらの次の三者(tripartite)一過性のトランスフェクション処理Ｎａｌｄｉｎｉ  Ｌら“In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector”. Science. Apr 12 1996;272(5259):263-267）により最初に開発され、ＨＩＶの４つのアクセサリー遺伝子（ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆ）をウイルス力価または形質導入効率に影響することなく当該ウイルスのパッケージングシステムから欠失させた「第２世代」ＬＶに後に発展された（Dull Tら. “A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system”. J Virol. 1998;72(11):8463-8471）。したがって、このシステムにおける残る唯一の補助遺伝子は、Ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）と共に、その同種結合配列として、ウイルス生産中の核からベクターおよびパッケージング構築ＲＮＡの効率的な輸送のために必要とされるｒｅｖである。したがって、毒性ならびに組換えの可能性の両方が、「第２世代」ＬＶにおいて低下される。当該パッケージングシステムにおける改良と並行して、３’長い末端反復（ＬＴＲ）において４００ヌクレオチド欠失を一般的に含む自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＶ設計が開発された（Zufferey Rら “Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery”. J Virol. Dec 1998;72(12):9873-9880）。野生型ウイルスでのベクター動員(mobilization)および複製コンピテントＬＶの後の生産のリスクは、ＳＩＮベクターに対して大幅に減少させる。ｔａｔ−独立プロモーターを有する自己不活性化ベクターは、「第３世代」ＬＶと称されている。ほとんどの場合、ＬＶは、ユビキタス細胞表面リン脂質に結合し、それにより広い宿主範囲を達成すると報告されているラブドウイルスエンベロープタンパク質である、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）で偽型化される(pseudotyped)（すなわち、異種エンベロープタンパク質でコーティングされる）。
【００３７】
したがって、本願発明の好ましい態様において、レンチウイルスベクターは、第１世代ＬＶ、第２世代ＬＶまたは第３世代ＬＶである。とりわけ好ましい態様において、ＬＶは、優れた安全性プロフィールを有するため、第３世代、すなわち自己不活性化ＬＶである。ＬＶは、好ましくは、他のウイルスが起源である天然エンベロープで偽型化されるか、または特定の細胞の感染を標的とするように分子を含む操作されたエンベロープで偽型化される。特定の細胞の感染を標的とするベクターの使用は、オフ標的(off-target)細胞（非ＤＣまたは非ＤＣ前駆体）の感染を回避する安全性を増加させ、したがって、とりわけ好ましい。
【００３８】
とりわけ好ましいインテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクターは、配列番号：１により定義される核酸配列を有する変異インテグラーゼを有する。
【００３９】
インテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクターの使用は、組込事象が評価することが困難であるという結果を伴う挿入突然変異を引き起こし得るため、ｉＤＣの安全性を増加させる。驚くべきことに、本願発明の基本となる試験において、インテグラーゼ欠損型ベクターは細胞分裂中に消え、自身で複製できないけれども、なお、分化したＤＣにおいて抗原およびサイトカインの安定なおよび永続的な発現を可能にすることを見出した。
【００４０】
アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳コントロール複合体、例えば、後期プロモーターおよび三者リーダー配列に結合され(ligate)得る。興味ある遺伝子は、インビトロまたはインビボ組換えによってアデノウイルスのゲノム中に挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅｌ、Ｅ３またはＥ４）における挿入は、感染された細胞において生存可能であり、それぞれのハイパーサイトカイン(hypercytokine)を発現することができる組換えウイルスをもたらす。使用されるウイルスベクターは複製能力のないように修飾されることが好ましい。
【００４１】
導入遺伝子の安定な発現を可能にするために、発現ベクターは、細胞のゲノムから独立して複製を可能にする複製起点が提供されるべきであるか、または第１および／または第２の細胞のゲノムに組み込まれるべきであり、またはそれは複製しない細胞の核においてエピソームとして安定に維持され得る。第１の場合、発現ベクターはエピソーム的に維持される。適当な複製起点は、ＳＶ４０または他のウイルス（例えば、ポリオーマ、Ａｄｅｎｏ、ＣＭＶ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）供給源に由来し得る。第２の場合、発現ベクターがゲノム、例えば染色体に組み込まれるとき、複製起点を提供することを必要としない。後者の場合、エピソームは、レトロウイルス、レンチウイルスまたはさらに具体的にはＨＩＶの二本鎖ＤＮＡコピーを含む組み込み前の複合体に対応する。したがって、本願発明の基本となる試験において、エピソーム的に複製せず、ｉＤＣのゲノムに組み込まれないインテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクターが、ｉＤＣの自律分化を誘導し、生存能力を数週間維持するために、およびＨＳＣの移植後の免疫不全宿主において免疫系の再生をサポートするために適当であることを驚くべきことに見出した。したがって、宿主細胞のゲノムに組み込まれない複製能力のないベクターがとりわけ好ましい。
【００４２】
少なくとも１つのサイトカインおよび少なくとも１つの抗原の発現を指向するために、それらをコードする遺伝子は、細胞の転写機構によって認識される内部プロモーターおよび／またはエンハンサー作動的に連結される。適当なプロモーターは、哺乳動物細胞のゲノム（例えば、ＭＨＣＩＩプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター）または哺乳動物ウイルス（例えば、サイトメガロウイルスプロモーター、脾臓フォーカス形成ウイルスＳＦＦＶプロモーター）に由来し得る。樹状細胞、またはその前駆細胞における上記遺伝子の発現を可能にするプロモーターがとりわけ好ましい。
【００４３】
原則として、抗原提示細胞において転写的に活性であるすべてのプロモーターが、ｉＤＣまたはその前駆細胞における抗原およびサイトカインの発現を可能にするレンチウイルスベクターの構築のために使用することができる。したがって、プロモーターは、好ましくは、共刺激リガンド（Ｂ７．１／ＣＤ８０、Ｂ７．２／ＣＤ８６、ＣＤ７０）、ＤＣ成熟マーカー（ＣＤ８３）およびＤＣマーカー（ＣＤ１ｃ／ＢＤＣＡ−１、ＣＤ１４１／ＢＤＣＡ−３、ＣＤ２０９、ＣＤ４０）からなる群から選択される。
【００４４】
構成的早期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターにより、または抗原提示細胞限定主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）プロモーターにより駆動されるＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を発現するＬＶで形質導入されるマウス骨髄前駆細胞は、インビトロおよびインビボでＤＣ自律分化を効果的に誘導した(Pinchaら, 2011) (Pincha Mら. Lentiviral vectors for induction of self-differentiation and conditional ablation of dendritic cells. Gene Ther. 2011,Aug;18(8):750-764.)。したがって、これらの２つのプロモーターがとりわけ好ましい。さらに、他の一般的に使用される構成的プロモーター（ＳＶ４０、ＵＢＣ、ＥＦ１α、ＰＧＫおよびＣＡＧＧ）の使用は、ヒトｉＤＣの生産用のＬＶ設計のために好ましい。例えばドキシサイクリンまたはタモキシフェンで、誘導することができるプロモーターもまた使用することができる。
【００４５】
ＳＶ４０ウイルスの早期および後期プロモーターは、両方ともＳＶ４０ウイルス複製起点も含むフラグメントとしてウイルスから容易に得られるため、特に有用である。ウイルス複製起点に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩＩ部位にわたる約２５０ｂｐ配列を含む限り、小型または大型ＳＶ４０フラグメントも使用され得る。
【００４６】
本明細書において使用される「作動可能に連結」は、発現コントロール配列が興味あるコード配列の発現を効果的にコントロールできるように遺伝的構築物に組み込まれることを意味する。
【００４７】
特定の開始シグナルもまた、コード配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳調節シグナルが、さらに、提供される必要があり得る。当業者は容易にこれを決定し、必要なシグナルを提供することができる。開始コドンは、挿入物全体の翻訳を保証するために所望のコード配列のリーディングフレームでインフレーム（またはインフェーズ）でなければならないことが知られている。これらの外因性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、種々の起源の、天然および合成の両方のものであってよい。
【００４８】
哺乳動物細胞によって単一の多シストロン性(multicistronic)ＲＮＡにおいていくつかのサイトカインおよび抗原の共発現を可能にするために、「２Ａ」エレメントを含むベクター設計が使用され得る。２Ａ様配列は、高度に保存されている天然ウイルスエレメントであり、コンセンサスモチーフ（２Ａ、Ａｓｐ−Ｖａｌ／Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ；２Ｂ、Ｐｒｏ）を含む短いポリペプチド配列（約２０アミノ酸長）であり、２Ａグリシンおよび２Ｂプロリン間の開裂を引き起こす。当該開裂は、２Ａエレメントがグリシンおよびプロリン残基間のペプチド結合形成をスキップするようにリボソーム活性を修飾し、個々の複数のタンパク質産物の放出を引き起こすリボソーム「スキッピング」メカニズムによって起こると考えられる（Donnelly MLら. “Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein ’cleavage’ mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal ’skip’.” J Gen Virol. May 2001;82(Pt 5):1013-1025）。最近の試験は、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）転写産物から個々のタンパク質として多数の遺伝子の同時の共発現のための多シストロン性ベクターを作るために２Ａ様ｃｉｓ−作用性ヒドロラーゼエレメント（ＣＨＹＳＥＬ）を利用している（Chinnasamy Dら. “Multicistronic lentiviral vectors containing the FMDV 2A cleavage factor demonstrate robust expression of encoded genes at limiting MOI”. Virol J. 2006;3:14; Szymczak AL, Vignali DA. “Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors”. Expert Opin Biol Ther. May 2005;5(5):627-638）。多シストロン性ベクターの構築における２Ａシステムの特定の利点は、単一のプロモーターのみの使用の実現可能性である。これらの小さいサイズによって、単一のベクター構築物は、複数のタンパク質の発現のためにいくつかの２Ａエレメントを利用することができる。２Ａ様エレメントは、等モル比で開裂の高い効率で複数のタンパク質産物の発現を可能にする（de Felipe Pら. “E unum pluribus: multiple proteins from a self-processing polyprotein”. Trends Biotechnol. Feb 2006;24(2):68-75）。ベクターにおける異種２Ａエレメントは、相同組換えを回避し、レンチウイルスベクターの安定性を維持する。ベクターにおいて使用することができる様々な型の２Ａ−エレメントは、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）、トーセア・アシグナ(Thosea asigna)ウイルス（Ｔ２Ａ）およびブタテシオウイルス(teschovirus)−１（Ｐ２Ａ）を含む。
【００４９】
あるいは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が使用され得る。通常、真核生物において、翻訳は、５’−キャップ認識が翻訳開始複合体の集合のために必要とされるため、ｍＲＮＡ分子の５’末端のみで開始することができる。ＩＲＥＳは、内部翻訳開始と呼ばれるプロセスによってメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列の中央で翻訳開始を可能にするヌクレオチド配列である。ウイルスＩＲＥＳは、例えば、ピコルナウイルス、肝炎ウイルスまたはポリオウイルスにおいて見られる。細胞ＩＲＥＳは、例えば線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、インシュリン様増殖因子２（ＩＧＦ−ＩＩ）、Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃ、Ｐｉｍ−１、タンパク質キナーゼ、ｐ５８ＰＩＴＳＬＲＥまたはｐ５３をコードするｍＲＮＡにおいて見られる。２Ａエレメントと同様に、異種ＩＲＥＳは、いくつかのタンパク質産物への１つのｍＲＮＡ翻訳のためにベクターにおいて組み合わせることができる。
【００５０】
したがって、２つ以上のポリペプチド、例えば抗原およびサイトカインをコードするベクターにおいて、当該ポリペプチドをコードする核酸配列は、好ましくは２ＡエレメントまたはＩＲＥＳによって分離される。本願発明における使用のためのとりわけ好ましい２Ａエレメントは、配列番号：５および６により定義される。
【００５１】
発現の効率は、適当な転写エンハンサーエレメントおよび転写ターミネーターの包含によって増強され得る。真核性発現において、元のクローン化セグメント内に含まれなかったとき、転写ユニットに適当なポリアデニル化部位（例えば、５’−ＡＡＴＡＡＡ−３’）も組み込むことを一般的に望む。一般的に、ポリＡ付加部位は、転写終結の前の位置でタンパク質の終結部位の約３０から２０００ヌクレオチド「下流」に置かれる。
【００５２】
プロドラッグ、例えばガンシクロビルの投与時にインビボでｉＤＣの薬理学的除去を可能にするベクターにおいて自殺遺伝子、例えばＨＳＶ−ＴＫの包含（Pincha Mら Lentiviral vectors for induction of self-differentiation and conditional ablation of dendritic cells. Gene Ther. 2011,Aug;18(8):750-764）、またはあるいは、小分子医薬を使用して条件付き二量化を可能にするヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）に融合される修飾されたヒトカスパーゼ９の使用（Strathoofら, An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy, Blood. 2005 June 1; 105(11): 4247-4254）は、インビボで操作されたｉＤＣの安全性を増加させるために使用することができる。したがって、好ましい態様において、ベクターは、さらに自殺遺伝子をコードする。当該遺伝子は、好ましくは、ＨＳＶ−ＴＫまたはヒトＦＫ５０６結合タンパク質に融合される修飾されたヒトカスパーゼ９である。
【００５３】
抗原
好ましくは、ｉＤＣによって発現される抗原は、異種反応性、同種反応性、新反応性または自己免疫からなる群から選択される細胞傷害性または体液性免疫応答を誘導することができる抗原である。
【００５４】
「異種反応性」なる用語は、別の生物種、好ましくは病原体によって発現されるタンパク質に対する免疫応答の誘発を示す。
【００５５】
「同種反応性」なる用語は、同じ種由来のドナーから移植された細胞または組織によって発現されるタンパク質に対する免疫応答の誘発を示す。
【００５６】
「新反応性」なる用語は、ｉＤＣを受ける対象の変異タンパク質に対する免疫応答の誘発を示す。好ましくは、新反応性は癌抗原に向けられる。
【００５７】
「自己免疫」なる用語は、免疫細胞介在免疫応答を生じる生物体において発現されるタンパク質に対する免疫応答の誘発を示す。一般的には、自己免疫は、免疫寛容のメカニズムの除外によって引き起こされる。好ましくは、自己免疫は、変異されることなく癌細胞によって異常に過剰発現されるタンパク質に向けられる。
【００５８】
異種反応性を誘導するとりわけ好ましい抗原は、ｐｐ６５（ヒトサイトメガロウイルスに由来する）、ＮＳ３（Ｃ型肝炎ウイルスに由来する）およびｇａｇおよびｅｎｖ（ヒト免疫不全ウイルスに由来する）からなる群から選択される。
【００５９】
とりわけ好ましい癌抗原、すなわち新反応性または自己免疫を誘発する抗原は、ＴＲＰ２、ＭＡＲＴ１、ＷＴ１およびチロシナーゼ（全て黒色腫に由来する）およびＷＴ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕおよびＢＲＣＡ１／２（全て乳癌に由来する）からなる群から選択される。
【００６０】
配列番号：２によって示される核酸によってコードされるｐｐ６５の使用がとりわけ好ましい。異なるトリプレットが同じアミノをコードすることができるように遺伝子コードは縮重していることが理解されるべきである。したがって、本願発明はまた、配列番号：２と同じアミノ酸配列をコードする全ての核酸配列に関する。同じアミノ酸をコードする異なるトリプレットが異なる種において異なる効率で翻訳されるため、コドン最適化による核酸配列の最適化が本願によって考えられる。
【００６１】
全長タンパク質または免疫原性ペプチド性エピトープとしてのＯＶＡとしても知られている実験的抗原ニワトリ卵オボアルブミンの使用がとりわけ好ましい。
【００６２】
さらに、ベクターによって含まれる核酸配列によってコードされる少なくとも１つの抗原は、免疫学的に同一である前記抗原の１つの変異体であり得る。
【００６３】
抗原に対して「変異体」なる用語は、抗原から少なくとも１、２、３、４、５、８、１０、１５または２０個のアミノ酸の欠失および／または置換によって得られるタンパク質を示す。好ましくは、変異体は、抗原と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％、９９．８％または９９．９％配列同一性を有する。少なくとも１、２、３、４、５、８、１０、１５または２０個のアミノ酸のＣ−末端および／またはＮ−末端欠失によって得られる変異体がとりわけ好ましい。
【００６４】
さらに、「変異体」なる用語は、完全長抗原の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０個のアミノ酸を保持する上記抗原のフラグメントを示す。
【００６５】
抗原の全ての変異体またはフラグメントが抗原と免疫学的に同一であることが好ましい。２つ以上の抗原が同じ抗体、Ｔ細胞またはＢ細胞により認識されるとき、「免疫学的に同一」である。同じ抗体、Ｔ細胞またはＢ細胞による２つ以上の免疫原性ポリペプチドの認識は、当該抗体、Ｔ細胞またはＢ細胞の「交差反応性」としても知られている。好ましくは、同じ抗体、Ｔ細胞またはＢ細胞による２つ以上の免疫学的に同一のポリペプチドの認識は、全てのポリペプチドにおいて同一の、または類似のエピトープの存在による。。類似のエピトープは、同じ抗体またはＢ細胞受容体のＦａｂ領域によって、または同じＴ細胞受容体のＶ領域によって結合されるために十分な構造および／または電荷特性を共有する。抗体、Ｔ細胞受容体またはＢ細胞受容体の結合特性は、好ましくは、問題になっているエピトープへの受容体の結合親和性により定義される。２つの免疫原性ポリペプチドは、低いアフィニティー定数を有するポリペプチドのアフィニティー定数が、高いアフィニティー定数を有するポリペプチドのアフィニティー定数の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％であるとき、本願により理解されるとき「免疫学的に同一」である。受容体へのポリペプチドの結合親和性を決定するための方法、例えば、平衡透析または酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）は当該分野でよく知られている。好ましくは、２つ以上の「免疫学的に同一の」ポリペプチドは、少なくとも１つの同一のエピトープを含む。
【００６６】
サイトカイン
ｉＤＣによって発現されるサイトカインは、それ自体または１つ以上のさらなるサイトカインと組み合わせて、樹状細胞への前駆細胞の分化を誘導する、および／またはＴまたはＢ細胞を刺激して、発達させる、生存能力を維持する、または適応免疫応答を備える(mount)ことができる任意のサイトカインである。さらに、少なくとも１つのサイトカインおよび少なくとも１つの抗原を発現するｉＤＣは、本願においてさらに以下で示される方法および使用に対して適当であることが必要である。特に、ＤＣは、幹細胞移植後に免疫不全宿主において機能的免疫系の再生を支持する全てのサイトカインを発現させなければなならい。
【００６７】
好ましくは、ｉＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１５、ＴＧＦ−Ｂ、ＴＮＦ−α、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ−３およびＣＤ４０Ｌからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインを発現する。
【００６８】
さらに好ましくは、ｉＤＣは、（ｉ）ＦＬＴ３ＬおよびＩＬ−３；（ｉｉ）ＦＬＴ３ＬおよびＣＤ４０Ｌ；（ｉｉｉ）ＦＬＴ３ＬおよびＩＦＮα；（ｉｖ）ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−αおよびＩＬ−１５；（ｖ）ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−αおよびＴＮＦ−α；および（ｖｉ）ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−αおよびＴＧＦ−Ｂからなる組合せの群から選択されるサイトカインの組合せを発現する。
【００６９】
より好ましくは、ｉＤＣは、（ｉ）ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−α；（ｉｉ）ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４；および（ｉｉｉ）ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１５からなる組合せの群から選択されるサイトカインの組合せを発現する。
【００７０】
核酸配列ＧＭ−ＣＳＦは配列番号：３に挙げられ、ＩＦＮαをコードする核酸は配列番号：４に挙げられる。遺伝子コードは、異なるトリプレットが同じアミノをコードすることができるように縮重していることが理解されるべきである。したがって、本願発明はまた、配列番号：３および４によってコードされるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードする全ての核酸配列に関する。同じアミノ酸をコードする異なるトリプレットが異なる種において異なる効率で翻訳されるため、コドン最適化による核酸配列の最適化が本願により構想される。
【００７１】
ｉＤＣの産生
さらに、本願発明は、以下の工程
ａ）適当なドナーに由来するサンプルから前駆細胞を単離すること；
ｂ）ヒトＤＣ前駆細胞のＤＣへの自律分化を誘導する少なくとも１つのサイトカインおよび少なくとも１つの抗原の発現をなし遂げるように、細胞を操作すること
を含む、ｉＤＣを産生するための方法に関する。
【００７２】
好ましくは、上記方法は、以下の工程
ａ）適当なドナーに由来するサンプルから前駆細胞を単離すること；
ｂ）遺伝子導入方法を増強する、および／または前駆細胞の樹状細胞への発達を刺激するサイトカインの存在下で適当な培地中で前駆細胞をインキュベートすること、
ｃ）当該細胞を、ヒトＤＣ前駆細胞のＤＣへの自律分化を誘導する少なくとも１つのサイトカインおよび少なくとも１つの抗原の発現のために適当である少なくとも１つのベクターでトランスフェクトすること、または形質導入すること
を含む。
【００７３】
上記全ての定義はまた、この態様に適用する。
【００７４】
遺伝子導入方法を増強するサイトカインは、トランスフェクション前または中に増殖培地加えられると、外来核酸の摂取の効率を増加させるサイトカインである。この目的のために、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４またはそれらの組合せが好ましい。
【００７５】
この方法によって産生されるｉＤＣは、適当な培地におけるさらなる使用までに培養され得る。しかしながら、当該ｉＤＣはまた、患者に投与されるまで、冷凍貯蔵され得る。生存細胞の冷凍保存のための方法は当業者に知られている。
【００７６】
本願発明の好ましい態様において、前駆細胞はヒトドナーに由来するＣＤ１４を発現する末梢血単球であり、方法の工程ａ）における培地はＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を、またはＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮαを補われている。この態様は、好ましくは、前記サイトカインの発現のためのインテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクターの使用を含み、少なくとも１つの抗原は工程ｃ）において使用される。好ましくは、抗原はｐｐ６５である。この態様は、実施例の部においてより詳細に記載されている。
【００７７】
本願発明のｉＤＣの治療的使用
さらに、本願発明は、医薬としての使用のための上記ｉＤＣに関する。
【００７８】
さらに、本願発明は、造血幹細胞（ＨＳＣ）の移植後の免疫不全対象の免疫系の再生における使用のための上記ｉＤＣに関する。
【００７９】
好ましくは、対象は、霊長類、齧歯動物、ネコ、イヌ、ブタ、ウシおよびヒツジからなる群から選択される生物体である。霊長類は、好ましくは、ヒト、チンパンジーまたはマカクザル、より好ましくはヒトである。齧歯動物は、好ましくは、マウスまたはラット、より好ましくはマウスである。
【００８０】
マウスは、好ましくは、ＮＯＤ−Ｒａｇ１ｎｕｌｌＩＬ２Ｒｙｎｕｌｌ−ＮＲＧ、ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒｙｎｕｌｌ−ＮＳＧおよびＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒｙｎｕｌｌ−ＮＯＧからなる群から選択される血統に属する。Ｂａｌｂ／ｃ−Ｒａｇ１ｎｕｌｌＩＬ２Ｒｙｎｕｌ；ＮＯＤ−ＳＣＩＤ、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ  β２ｍｎｕｌｌのようなヒト化マウスの産生のために使用された高齢マウス血統がまた好ましい。加えて、マウスにおいてヒトＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩまたはヒト細胞の発達に重要であるヒトサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−１５）を発現する新しいトランスジェニックまたはノックインマウス血統もまた使用することができる。
【００８１】
本願発明の１つのとりわけ好ましい態様において、マウスは、
（ｉ）Ｐｒｋｄｃ遺伝子の両方の対立遺伝子における突然変異；
（ｉｉ）ＩＬ２−受容体ガンマ鎖をコードする遺伝子の両方の対立遺伝子における突然変異；および
（ｉｉｉ）ＫＩＴｔ受容体をコードする遺伝子における突然変異
により特徴付けられる。
【００８２】
突然変異（ｉ）および（ｉｉ）は、好ましくは機能喪失の突然変異、すなわち遺伝子産物の生産を防止するか、または非機能性遺伝子産物の生産を引き起こす突然変異である。突然変異（ｉｉｉ）は、好ましくは、限定された機能のＫＩＴ−受容体をもたらすか、または定義された条件下で遺伝子産物の形成を阻害する条件付きｎｕｌｌ−突然変異である。条件付きｎｕｌｌ−突然変異の産生のための方法は当業者によく知られている。
【００８３】
好ましくは、マウスはＮＯＤマウスである。さらに好ましくは、それはＮＯＤ  Ｓｉｒｐａ対立遺伝子を有する。
【００８４】
このマウスは、ＮＳＧマウスとしても称され、ＤＥ  １０  ２０１２  ２０７  ４５３に記載されている。これは、当該マウスおよびその産生に関する限り、出典明示により包含させる。
【００８５】
免疫不全
「免疫不全」なる用語は、年齢、性別および一般的な生活環境、例えば栄養状態に対して対象にマッチする同じ種の平均的個体と比較して、免疫応答障害により特徴付けられる対象の免疫系の任意の状態を示す。当該免疫不全は、好ましくは、細菌、ウイルス、真菌または他の単細胞の真核生物によって引き起こされる感染症に対する対象の感受性の増加、または悪性腫瘍に対する感受性の増加を引き起こす、以下に定義される免疫細胞の少なくとも１つのグループの数の減少または機能障害により引き起こされる。
【００８６】
当該分野において、「免疫抑制」および「免疫不全」患者間で区別され、後者は前者よりも弱い免疫応答を示す。しかしながら、本願において使用されるとき「免疫不全」なる用語は、軽感染の頻度の増加から、例えばＸ−連鎖重症複合免疫不全において観察することができる免疫系の全部門のほとんど完全な欠失までの、免疫系のあらゆる種類の起こり得る障害を包含する。
【００８７】
免疫系は、２つの主な部門、適応免疫系および先天性免疫系を含む。
【００８８】
病原体に対する先天性免疫系の応答は、所定の病原体に特異的ではない。先天性免疫系は、むしろ、多くの病原体に共通の分子構造に特異的なパターン認識受容体に頼る。自然免疫応答を介在する細胞は、肥満細胞、食細胞（樹状細胞、マクロファージおよび好中球）およびナチュラルキラー細胞である。
【００８９】
適応免疫系の応答は、所定の抗原に特異的であり、したがって、当該抗原に限定される。適応免疫系の細胞は、成熟中に乱雑にそれぞれの細胞において個々に形成される抗原受容体を有する。したがって、適応免疫系は、多数の異なる受容体を有する様々な細胞を含む。対象が病原体に遭遇すると、病原体の抗原に特異的な受容体を有する細胞の亜集団の増殖が誘導される。あとで、病原体が身体から除去されると、いくつかのこれらの細胞は記憶細胞の集団を形成し、当該病原体に再び遭遇するとき、免疫応答のより迅速な増加を可能にする。
【００９０】
適応免疫応答はＴ−リンパ球およびＢ−リンパ球によって介在される。
【００９１】
Ｔ−リンパ球には２つの主要なグループがある：（ｉ）表面上のＣＤ４−受容体の発現により特徴付けられるＴ−ヘルパー細胞は、受容体に適当な抗原が結合すると、種々のサイトカインを生産する。当該サイトカインは免疫系の他の細胞を活性化する。特に、マクロファージの殺菌機能およびＢ−リンパ球による抗体の分泌を刺激する。（ｉｉ）表面上のＣＤ８−受容体の発現により特徴付けられる細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、ウイルスまたは他の病原体によって感染されている細胞を認識して殺す、および腫瘍細胞を認識して殺す。主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣＩ）によって提示される抗原に対するＣＴＬ活性化は、Ｔヘルパー細胞によって促進される。
【００９２】
Ｂ−リンパ球は、受容体により認識される抗原に特異的な抗体を分泌する。
【００９３】
その原因に依存して、免疫不全は永続性または一過性であり得る。先天的な遺伝子異常による原発性免疫不全は一般的に永続性である。免疫不全が電離放射線または細胞毒性薬によって引き起こされるとき、その期間は医薬または放射線の量に依存する。当該量が対象における全ての造血幹細胞を殺すために十分に高いとき、免疫不全は永続性である。造血幹細胞の一部だけが殺されるとき、残りの造血幹細胞が異なる造血系に再び存在することができると、免疫不全は解決する。
【００９４】
好ましくは、対象の免疫不全は、電離放射線によって引き起こされる免疫不全、少なくとも１つの細胞毒性薬の投与によって引き起こされる免疫不全、原発性免疫不全および病原体によって引き起こされる免疫不全からなる群から選択される免疫不全によって引き起こされる。２つ以上の前記免疫不全が対象に存在し得ることも予期される。
【００９５】
電離放射線によって引き起こされる免疫不全は、当該放射線に対する予想外の、または意図的な暴露によって引き起こされ得る。一般的に、電離放射線に対する意図的な暴露は、癌の処置として行われる。電離放射線は、主に、迅速に分裂する細胞を殺す。したがって、癌細胞は、多くの場合、迅速な増殖により特徴付けられるため、種々の癌の治療に適している。しかしながら、造血幹細胞を含む免疫系の細胞もまた、電離放射線に対して高度に感受性である。したがって、当該細胞は癌の放射線治療の過程で損傷し得る。当該損傷は、固形癌の臓器または組織特異的照射の望ましくない副作用であり得る。しかしながら、とりわけ免疫系の幹細胞の変性から生じる白血病の場合、全ての造血幹細胞の完全な根絶が、しばしば最後の手段である。この場合、照射後の同種異系の造血幹細胞の移植は、患者の生存のために必要である。
【００９６】
癌の放射線療法において使用される電離放射線の典型的なタイプは、Ｘ線、電子ビーム（エネルギー範囲４から２０ＭｅＶ）、粒子放射線（プロトン、ニュートロン、イオン原子核）およびコバルト−６０、ラジウム−２２６、セシウム−１３７またはイリジウム−１９２のような供給源由来のガンマ放射線である。
【００９７】
原発性免疫不全は、対象における少なくとも１つのタイプの免疫細胞の発達を損なうか、または完全に阻害する遺伝子異常によって引き起こされる。
【００９８】
好ましくは、原発性免疫不全は、Ｘ−連鎖重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、アデノシンデアミナーゼ欠損症およびＩＬ−７Ｒα−鎖欠損症からなる群から選択される。好ましくは、Ｘ−連鎖ＳＣＩＤは、ＩＬ−２ＲＧの突然変異によって引き起こされる。
【００９９】
造血幹細胞の移植によって処置される免疫不全はまた、電離放射線および／または少なくとも１つの細胞毒性薬の投与によって悪化する原発性免疫不全であり得ることが理解されるべきである。
【０１００】
少なくとも１つの細胞毒性薬の投与によって引き起こされる免疫不全はまた、癌治療の典型的な効果である。癌治療において使用される細胞毒性薬は、頻繁に、癌細胞に加えて免疫細胞（造血幹細胞を含む）を殺す。通常使用される細胞毒性薬の用量で、患者における全ての造血幹細胞が殺されるとは限らないため、当該免疫不全は一般的に一過性である。それにもかかわらず、造血幹細胞移植がこの状態のケアとして考えられるとき、本願発明の方法は有用である。
【０１０１】
他のタイプの処置にもはや応答しない特定の癌（例えばホジキンリンパ腫）の重症例では、「高用量化学療法」と呼ばれる化学療法の一種が使用される。他の化学療法レジメンにおける細胞毒性薬の用量は、結果として生じる免疫不全を最小限にするように選択されるが、対象の免疫系の完全な破壊は高用量化学療法の計画的な効果である。この理由のため、対象は、高用量化学療法の完了後に、自家または同種異系の造血幹細胞移植を受ける。
【０１０２】
典型的な細胞毒性薬は、トポイソメラーゼＩまたはＩＩの任意の阻害剤、例えば、カンプトテシン（トポＩ）またはエトポシド（トポＩＩ）；ＤＮＡをインターカレート(interchelate)任意の化合物、例えば、ドキソルビシンを含む。アルキル化物質、抗代謝産物、抗生物質、エポチロン、核受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、白金化合物、インターフェロンおよび細胞周期依存性タンパク質キナーゼ（ＣＤＫ）の阻害剤、シクロオキシゲナーゼおよび／またはリポキシゲナーゼの阻害剤、白金配位錯体、エチレンイミン、メチルメラミン(methylmelamine)、トラジン(trazine)、ビンカアルカロイド、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、スルホン酸アルキル、葉酸アナログ、アントラセンジオン、置換ウレア、メチルヒドラジン誘導体、特にアセジアスルホン(acediasulfone)、アクラルビシン、アンバゾン、アミノグルテチミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ホリナートカルシウム、カルボプラチン、カペシタビン(carpecitabine)、カルムスチン、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダプソーン、ダウノルビシン、ジブロムプロパミジン、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エンジイン、エピルビシン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、リン酸エストラムスチン、エトポシド、フラボピリドール、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ホスフェストロール、フラゾリドン、ゲムシタビン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシカルバミド、ヒドロキシメチルニトロフラントイン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イドクスウリジン、イホスファミド、イリノテカン、リュープロリド、ロムスチン、ルルトテカン、マフェニドスルフェートオラミド(mafenide sulfate olamide)、メクロレタミン、メゲストロールアセテート(megastrolacetate)、メルファラン、メパクリン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトロニダゾール、マイトマイシンＣ、ミトポドジド、ミトタン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、ナリジクス酸、ニフラテル、ニフロキサジド、ニフララジン(nifuralazine)、ニフルチモックス、ニムスチン、ニモラゾール(ninorazole)、ニトロフラントイン、ナイトロジェンマスタード、オレオムシン（oleomucin）、オキソリン酸、ペンタミジン、ペントスタチン、フェナゾピリジン、フタリルスルファチアゾール、ピポブロマン、プレドニムスチン、プロイシン、プロカルバジン、ピリメタミン、ラルチトレキセド、ラパマイシン、ロフェコキシブ、ロシグリタゾン、サラゾスルファピリジン、スクリフラビニウムクロライド(scriflavinium chloride)、セムスチン、ストレプトゾシン、スルファカルバミド、スルファセタミド、スルファクロロピリダジン、スルファジアジン、スルファジクラミド(sulfadicramide)、スルファジメトキシン、スルファチアゾール(sulfaethidole)、スルファフラゾール、スルファグアニジン、スルファグアノール、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、コトリモキサゾール、スルファメトキシジアジン、スルファメトキシピリダジン、スルファモキソール、���ルファニルアミド、スルファペリン、スルファフェナゾール、スルファチアゾール、スルフイソミジン、スタウロスポリン、タモキシフェン、タキソール、テニポシド、ターチポシド(tertiposide)、チオグアニン、チオテパ、チニダゾール、トポテカン、トリアジクオン、トレオスルファン、トリメトプリム、トロホスファミド、ＵＣＮ−０１、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、およびゾルビシン、またはそれらのそれぞれの誘導体またはそれらの類似体が特に好ましい。
【０１０３】
病原体によって引き起こされる免疫不全は、対象のウイルスまたは細菌での感染によって引き起こされる。当該病原体は、例えば宿主細胞としてそれらを使用することによって、免疫系の細胞と直接的に相互作用するとき、または間接的な手段によって、免疫不全を引き起こす。間接的な手段は、免疫細胞の活性または前駆細胞からの成熟免疫細胞の産生を調節する物質の分泌を含む。さらに、病原体は、宿主生物の細胞によるこのような化合物の分泌を誘導し得る。本願で言及されるとき、病原体によって引き起こされる免疫不全は、好ましくはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）での感染によって引き起こされる。
【０１０４】
免疫系の再生
「免疫不全対象の免疫系の再生」なる用語は、免疫不全対象の免疫系の全体的な機能の改良に関する。
【０１０５】
好ましくは、少なくとも１つのタイプの免疫細胞の数および／または活性が増加される。さらに好ましくは、適応または先天性免疫系の活性が増加される。また好ましくは、Ｂ−リンパ球またはＴ−リンパ球の活性および／または数が増加される。
【０１０６】
よりさらに好ましくは、免疫系の両方の部門における免疫細胞の数および／または免疫系の両方の部門の活性が増加される。
【０１０７】
より好ましくは、免疫系の再生の結果として、年齢、性別および栄養状態にマッチする健常個体および免疫系がＨＳＣの移植および本願発明のｉＤＣの投与によって再生されている対象の免疫系の機能間に有意な差異はない。したがって、より好ましくは、免疫系の再生は免疫不全を完全にケアする。
【０１０８】
しかしながら、移植されるＨＳＣのレシピエントは、宿主の免疫系の残りによる移植されるＨＳＣの拒絶反応を抑制するために、または移植片対宿主病に対抗するために、免疫抑制療法を必要とし得ると予期される。かかる免疫抑制療法の必要性は、本願において理解されるこの用語は、移植されるＨＳＣから生じる免疫系の起こり得る機能を示すのみであるため、免疫系の再生をあまり完全に与えない。
【０１０９】
ＨＳＣの移植
「造血幹細胞の移植」なる用語は、ある対象（「ドナー」）からの造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む材料を得ること、およびＨＳＣを含む調製物を同じか、または異なる対象（「レシピエント」）に投与することのプロセスを示す。
【０１１０】
最も簡単な場合には、ドナーから生産されるＨＳＣを含む材料は、さらなる処置工程なしにレシピエントに投与される。末梢血、臍帯血および骨髄に由来するＨＳＣ調製物は、その中に含まれる細胞型の濃縮または枯渇なしに、直接的に対象に投与され得る。これらの場合、ＨＳＣを含む調製物は、ドナーから得られる材料と同一である。
【０１１１】
しかしながら、ドナーに由来する材料からのＴ−リンパ球を枯渇させることによってレシピエントに投与される調製物を生産することが好ましい。これは、ドナーから生産される材料からＣＤ８−陽性および／またはＣＤ３−陽性である細胞を取り出すことによりなし遂げることができる。ＣＤ３４−陽性である細胞が対象に投与されるＨＳＣの調製を強化する(enrich)ことも好ましい。ＨＳＣが末梢血に由来するとき、対象への投与の前に、ＣＤ３４−陽性である細胞を強化することが好ましい。特定の表面抗原を有する細胞の枯渇または濃縮のための手段および方法は、当該分野で慣用であり、例えば実施例の部に記載されている。
【０１１２】
対象に移植されるＨＳＣは、当該分野で知られているあらゆる方法により生産され得る。一般的には、ドナーの骨髄は移植のためのＨＳＣの供給源である。この方法において、ＨＳＣはドナーの大骨から取り出される。
【０１１３】
しかしながら、アフェレーシスによる末梢血からの幹細胞の生産は、最も一般的な方法となっている。ＨＳＣが生産される前に、ドナーは顆粒球コロニー刺激因子を受け、末梢血におけるＨＳＣの量を増加させる。アフェレーシスは、全血から白血球（ＨＳＣを含む）を分離するために使用される。白血球は移植における使用のために貯蔵されるが、血漿および赤血球はドナー循環に戻される。
【０１１４】
ＨＳＣのさらなる供給源は臍帯血である。臍帯血は胎盤および出生後の臍帯から生産される。臍帯血は、成体末梢血において通常見られるよりも高い濃度のＨＳＣを有する。
【０１１５】
本願発明の文脈において、幹細胞は前記３つの供給源の１つに由来することが好ましい。
【０１１６】
ＨＳＣの移植は自家または同種異系である。
【０１１７】
自家幹細胞移植において、ＨＳＣのドナーおよびレシピエントは同一である、すなわち、対象に投与される調製物により含まれるＨＳＣは、同じ対象に由来する。対象の免疫不全が高用量化学療法によって引き起こされるとき、ＨＳＣの自家移植が好ましい。この場合、ＨＳＣを含む材料は高用量化学療法の開始前に対象から生産することができ、ＨＳＣを含む調製物を高用量化学療法の完了後に対象に投与することができる。
【０１１８】
ＨＳＣの同種異系の移植は、１つ以上の対象からのＨＳＣ含む材料の生産および異なる対象への第１の対象のＨＳＣを含む調製物の投与を含む。したがって、ドナーおよびレシピエントは同一ではない。ＨＳＣの同種異系の移植の特別な場合はＨＳＣの異種の移植である。この場合、ＨＳＣのドナーおよびレシピエントは異なる種に属する。ＨＳＣの同種異系の移植は、例えば、ヒト化マウスにおいてヒト免疫系のモデルを作るために、実験的に行われる。
【０１１９】
ＨＳＣの異種移植は一般的に、対象が白血病、骨髄腫、重症複合免疫不全、再生不良性貧血または先天性好中球減少症に苦しむときに、行われる。これらの場合、ドナーは、できる限りレシピエントとの多数の免疫学的特性を共有するものから選択される。とりわけ重要なことは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子で一致することである。したがって、本願発明の１つの好ましい態様において、ＨＳＣの移植は、ドナーおよびレシピエントがヒトである同種異系の移植である。
【０１２０】
造血幹細胞の移植と関連する１つの重大なリスクは移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である。当該状態は、レシピエントの組織に対する移植された免疫細胞の応答により特徴付けられる。ＧＶＨＤ、急性および慢性ＧＶＨＤの２つのサブタイプが存在する。
【０１２１】
急性ＧＶＨＤは移植後の最初の３月中に起こり、慢性ＧＶＨＤはもっと後の発症を有する。両方の型は、関与する免疫細胞のタイプによって、およびサイトカインパターンによって異なる。一般的に、急性ＧＶＨＤは、慢性ＧＶＤＨよりもより重度である。急性ＧＶＨＤは、免疫系を抑制する強力な薬物を必要とし得る。結果として、急性ＧＶＨＤに罹患し、それに対して処置される多数の患者は、生命に関わる感染を患う。
【０１２２】
ＧＶＨＤは、いくつかの組織および臓器：皮膚、粘膜、胃腸管、肝臓および肺に影響を及ぼす。慢性ＧＶＨＤはさらに、外分泌腺および結合組織に損傷を与え得る。ＧＶＨＤは、臓器病変の数および程度に依存して、軽度（グレード１）、中程度（グレード２）または重度（グレード３および４）であり得る。グレード１のＧＶＨＤを有する患者は通常、処置を必要とせず、他のグレードは薬理学的免疫抑制を必要とする。
【０１２３】
ＧＶＨＤのリスクは、ドナーおよびレシピエント間のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）のミスマッチの数で増加する。この理由のため、ＨＳＣ移植のドナーおよびレシピエントのＨＬＡタイプは、注意深くマッチさせるべきである。残念ながら、ヒトＨＬＡ分子の高い可変性および良いマッチのための必要性は、所定のレシピエントに対する適当なドナーのためのサーチをとても難しくさせる。いくつかの場合において、ＨＳＣ移植によって処置される疾患が治療できることを超えて進行する前に、適当なドナーを見つけることができない。
【０１２４】
最も良いドナーは、レシピエントと同じヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ、−Ｂ、−Ｃおよび−ＤＲＢ１を有する個体である。しかしながら、前記遺伝子座の１つでのミスマッチは、とりわけ低リスクの疾患を有していない患者において、許容できる。低リスクの疾患は、好ましくは、第１の慢性期における慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群サブタイプ難治性貧血または第１寛解期における急性白血病である。さらなるＨＬＡ遺伝子座を分析したとき、ＨＬＡ−ＤＱ、−ＤＰ、−ＤＲＢ３、−ＤＲＢ４または−ＤＲＢ５の単一のミスマッチは許容されるが、これらの第２次遺伝子座での複数のミスマッチは生存率を減少させる（Spellmanら, 2012, “A perspective on the selection of unrelated donors and cord blood units for transplantation”, Blood 120: 259-265）。
【０１２５】
驚くべきことに、本願発明の基本となる試験において使用されたマウスは、巨視的または臨床的観察（体重、活性、毛の質）による臨床兆候なく、組織学的実験時にＧＶＨＤの軽度（グレード１）の兆候のみを示した。これらの結果は、ＨＳＣの移植は異種であった、すなわちドナー（ヒト）およびレシピエント（マウス）間でＨＬＡ分子のミスマッチは膨大であったが（実施例４参照）、重度のＧＶＨＤは観察されなかったことを示した。明らかに、本願発明のｉＤＣの存在は、レシピエントの組織に対する移植された免疫細胞の耐容性を増加させる。
【０１２６】
したがって、本願発明の別の好ましい態様において、ドナーおよびレシピエントがヒトであり、当該分野で知られているＨＳＣ移植の方法によって必要とされるものよりも低いＨＬＡマッチを有する、ＨＳＣの移植は同種異系である。
【０１２７】
特に、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＣおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１からなる群から選択される遺伝子座の少なくとも２または３つのミスマッチは許容される。この群はまた、ＨＬＡ遺伝子座の「第１次群」と称される。さらに好ましくは、前記群内の２または３つのミスマッチは許容される。より好ましくは、前記ＨＬＡ遺伝子座の２つのミスマッチは許容される。
【０１２８】
ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４およびＨＬＡ−ＤＲＢ５からなる群に関して、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４または少なくとも４つのミスマッチが好ましくは許容される。当該群は、ＨＬＡ遺伝子座の「第２次群」と称される。さらに好ましくは、２または３つのミスマッチは許容される。より好ましくは、２つのミスマッチは許容される。
【０１２９】
本願発明のとりわけ好ましい態様において、第１次群から選択される遺伝子座の少なくとも２つのミスマッチおよび第２次群から選択される遺伝子座の少なくとも２つのミスマッチは許容される。
【０１３０】
本願発明のさらに別のとりわけ好ましい態様において、第１次群から選択される遺伝子座の少なくとも２つのミスマッチおよび第２次群から選択される遺伝子座の少なくとも３つのミスマッチは許容される。
【０１３１】
本願発明のさらに別のとりわけ好ましい態様において、第１次群から選択される遺伝子座の少なくとも２つのミスマッチおよび第２次群から選択される遺伝子座の少なくとも４つのミスマッチは許容される。
【０１３２】
本願発明の別のとりわけ好ましい態様において、第１次群から選択される遺伝子座の少なくとも３つのミスマッチおよび第２次群から選択される遺伝子座の少なくとも２つのミスマッチは許容される。
【０１３３】
本願発明のさらに別のとりわけ好ましい態様において、第１次群から選択される遺伝子座の少なくとも３つのミスマッチおよび第２次群から選択される遺伝子座の少なくとも３つのミスマッチは許容される。
【０１３４】
本願発明のさらに別のとりわけ好ましい態様において、第１次群から選択される遺伝子座の少なくとも３つのミスマッチおよび第２次群から選択される遺伝子座の少なくとも４つのミスマッチは許容される。
【０１３５】
別の好ましい態様において、ＨＳＣの移植は、ドナーがヒトであり、レシピエントが齧歯動物、好ましくは原発性免疫不全、より好ましくは重症複合型免疫不全ＳＣＩＤ、例えば、Ｘ−連鎖ＳＣＩＤ（ＩＬ−２ＲＧにおいて突然変異を有する）または組換え活性化遺伝子（ＲＡＧ−１およびＲＡＧ−２）に由来する酵素における重症複合型免疫不全ＳＣＩＤを有するマウスである異種である。
【０１３６】
異種のＨＳＣ移植の好ましい態様において、レシピエントは本願において上記されているＮＲＧマウスであり、ＨＳＣのドナーは霊長類、さらに好ましくはヒトである。
【０１３７】
さらに、本願発明は、幹細胞移植後に制御性Ｔ細胞の内因性再生（Ｔｒｅｇｓ）を可能にするための上記ｉＤＣに関する。サプレッサーＴ細胞として以前は知られていたＴｒｅｇｓは、免疫系を調節し、自己抗原に対する耐容性を維持し、自己免疫疾患を破棄するＴ細胞の亜集団である。マウスモデルは、Ｔｒｅｇｓの調節が自己免疫疾患を処置し、臓器移植を容易にすることができることを示唆した。マウス試験は、実験的自己免疫の阻害において産生および操作された寛容原性ＤＣのインビトロでの治療的ワクチン接種の効率を示した。ドナー由来ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（＋）ＦＯＸＰ３（＋）制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の適合移植は、ミスマッチ骨髄移植モデルにおいてマウスを移植片対宿主病から保護した。同様の戦略を研究するヒトにおける第１の臨床試験からの結果は、いくつかの群によって実証されており、同種異系の幹細胞移植後の重度の合併症、例えば移植片対宿主病の防止のためのＴｒｅｇｓの有効性を確認するように見える。ヒトにおいて、Ｔｒｅｇｓは、ＣＤ４＋／ＣＤ１２７−ＣＤ２５ｈｉまたはＣＤ４＋／ＣＤ１２７−ＣＤ２５ｈｉＦＯＸＰ３＋細胞として免疫表現型的に定義することができる。したがって、本願発明のｉＤＣは、ＨＳＣ移植のレシピエントが経験する移植片対宿主病を処置するために使用され得る。
【０１３８】
さらに、本願発明は、リンパ系に広がる癌またはリンパ向性病原体により引き起こされる疾患の処置のための医薬としての使用のための上記ｉＤＣに関する。
【０１３９】
本願発明のｉＤＣは、リンパ管を通ってリンパ節に優先的に移動する。この理由のため、とりわけリンパ節に関与する疾患の処置のために適している。
【０１４０】
癌の１つの特徴は、転移形成を引き起こす身体中に全身的に広がる能力である。転移が存在するとき、原発性腫瘍の外科的切除または照射は、疾患をケアする十分ではない。転移が少ないとき、外科手術および／または放射線治療が当該転移を除去するために使用され得る。しかしながら、ほとんどの場合、転移の数は、あまりに播種性であり、前記手段による除去ができない。癌疾患の時点で、全身療法、例えば化学療法は、ケアの機会を維持する残された処置の唯一の手段である。しかしながら、多くの場合、化学療法は全ての癌細胞を殺すことができないか、または癌が薬物に対する耐性を獲得する。したがって、癌細胞の全身的拡がりを防止することが極めて重要である。
【０１４１】
２つの主な経路、すなわち循環系およびリンパ系が癌の全身性拡散のために存在する。後者の場合、腫瘍細胞はリンパ管排出(draining)領域に移動し、そこで腫瘍が発生する。次に、当該細胞は所属リンパ節へ移動する。これらのリンパ節は「センチネルリンパ節」としても知られている。リンパ節排出の特定の領域の分析は腫瘍の外科的切除の日常的な一環であり、センチネルリンパ節における癌細胞の存在または非存在は、疾患の病期および適当な処置の選択のための重要なパラメーターである。センチネルリンパ節における癌細胞の存在は予後不良と関連する。
【０１４２】
本願発明のｉＤＣは、リンパ節に存在する癌細胞の死を介在する可能性を有し、したがって疾患のさらなるリンパ拡散をブロックする。当該ｉＤＣのこの使用のために、それらは問題になっている癌細胞によって提示される抗原を発現することが好ましい。
【０１４３】
本願発明によって処置される好ましい癌は、黒色腫および乳癌、血液学的悪性腫瘍（白血病、リンパ腫）、神経学的悪性腫瘍（神経膠腫、グリア芽腫）、前立腺癌、肺癌、大腸癌および肝臓癌からなる群から選択される。黒色腫および乳癌の処置がとりわけ好ましい。
【０１４４】
好ましくは、リンパ系に広がる癌の処置のためのｉＤＣは、ＴＲＰ２、ＭＡＲＴ１、ＷＴ１およびチロシナーゼ（全て黒色腫に由来する）およびＷＴ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕおよびＢＲＣＡ１／２（全て乳癌に由来する）からなる群から選択される少なくとも１つの抗原を発現する。
【０１４５】
リンパ系において主にまたは排他的に見られる病原体が存在する。かかる疾患の治療において使用するために、ｉＤＣは、好ましくは、それぞれの病原体によって発現もされる少なくとも１つの抗原を発現する。
【０１４６】
病原体は、好ましくは、ウイルス、細菌、真菌および単細胞の真核生物からなる群から選択される。さらに好ましくは、それはウイルス、より好ましくはＨＩＶである。好ましくは、ＨＩＶの処置における使用のためのｉＤＣは、抗原ｇａｇおよびｅｎｖを発現する。
【０１４７】
免疫系を再生するための方法
さらに、本願発明は、以下の工程
ａ）造血幹細胞を対象に移植すること；および
ｂ）少なくとも１つの抗原およびヒトＤＣ前駆細胞のＤＣへの自律分化を誘導する少なくとも１つのサイトカインを発現するように操作されたｉＤＣを対象に投与すること
を含む、免疫不全対象における免疫系を再生するための方法に関する。
【０１４８】
ｉＤＣおよびその治療的使用のための上記全ての定義はまたこの態様に適用される。
【０１４９】
上記方法は、好ましくは、ヒト化免疫系を有するマウスを産生するために使用される。したがって、対象は、好ましくはマウスである。さらに好ましくは、当該マウスは、ＮＯＤ−Ｒａｇ１ｎｕｌｌＩＬ２Ｒｙｎｕｌｌ−ＮＲＧ、ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒｙｎｕｌｌ−ＮＳＧおよびＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒｙｎｕｌｌ−ＮＯＧからなる群から選択される血統に属する。
【０１５０】
好ましくは、ＨＳＣはヒトに由来し、抗原はｐｐ６５である。さらに、ｉＤＣは抗原ｐｐ６５およびサイトカイン（ｉ）ＧＭ−ＣＳＦおよび（ｉｉ）インターフェロン−αまたはインターロイキン−４またはインターロイキン−１５を発現することが好ましい。さらに好ましくは、この発現はベクターによって介在され、より好ましくは、インテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクターによって介在される。
【０１５１】
この態様によって産生されるマウスは、ＨＳＣの移植前または後に本願発明のｉＤＣを受けなかったマウスと比較して改善された機能を有するヒト化免疫系を有する。
【０１５２】
このタイプの異種のＨＳＣ移植は、齧歯動物、好ましくはマウスにおいてヒト免疫系を創造する。かかるヒト免疫系を有する動物は、研究のための重要なツールであり、倫理的なまたはロジスティック(logistic)な理由のためにヒトにおいて行うことができない特定の実験のために使用され得る。残念ながら、この動物モデルはいくつかの欠乏症を有する。ヒトＨＳＣの移植後に、リンパ組織はほんのわずかに発生する。驚くべきことに、ヒトＨＳＣの移植後に本願発明のヒトｉＤＣのマウスへの投与は、当該処置されたマウスにおいてヒトＴ細胞およびＤＣを含むリンパ節の改善された再構成をもたらし、したがって、これらのマウスはヒト免疫系のより良いモデルとなる。
【０１５３】
ヒト化免疫系（ＨＩＳ）に基づく現在利用できるマウスモデルは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を介して抗原エピトープを提示する標的細胞を認識し、溶解することができる機能性Ｔ細胞、特に機能性細胞傷害性Ｔ細胞の乏しい発生を示す。これと対照的に、本願発明によって産生されるヒト免疫系を有するマウスは、発生頻度の増加および改善されたＴ−リンパ球活性を示す。加えて、本願発明によって産生されるヒト免疫系を有するマウスは、ヒト免疫グロブリン（例えばＩｇＭ、ＩｇＧ）および抗原特異的ヒト抗体の生産と相関している成熟Ｂ細胞の発生頻度の増加を示した。加えて、本願発明によって産生されるヒト免疫系を有するマウスは、胸腺におけるヒトＴ細胞の増強された発生およびＴｒｅｇの通常発生を示した。
【０１５４】
したがって、本願発明の別の好ましい態様は、上記方法によって産生されるヒト化免疫系を有するマウス、およびヒト免疫系の試験のための、またはヒトにおけるその使用のための薬物、インプラントまたはデバイスの試験のための当該マウスの使用に関する。好ましい使用は、当該マウスモデルでのヒト適応免疫系の試験である。
【０１５５】
インプラントが人体において炎症を引き起こすことが望ましくないため、本願発明のヒト化マウスモデルにおけるインプラントの試験がとりわけ好ましい使用である。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５産生および特性化。（ａ）ＧＣＳＦ動員健常ドナー由来のＣＤ１４＋単球を、磁気選別によって単離し、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５に対してＬＶ−ＧＭ−ＩＦＮαおよびＬＶ−ｐｐ６５または慣用のＤＣ（Ｃｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５）産生に対してＬＶ−ｐｐ６５単独で同時形質導入した。Ｃｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５  ＤＣは、組換えサイトカイン、すなわち、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−αの存在下で培養中維持された。（ｂ）回復の平均パーセントによって示される細胞生存能力を、異なる時点（７、１４および２１日）で培養されたＳｍｙｌｅ／ｐｐ６５またはＣｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５において評価した。（ｃ）ＣＭＶ−ｐｐ６５の発現、および（ｄ）樹状細胞表現型の安定性を、最大３週間培養されたＳｍｙｌｅ／ｐｐ６５およびＣｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５においてフローサイトメトリーにより分析した。データはそれぞれの時点に対して少なくとも３つの異なるドナーの平均を示す。＊ｐ＜０．０５
【０１５７】
【図２】Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５（組換えサイトカインを補っていない）およびＣｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５（組換えＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−αを補った）細胞培養上清において蓄積されたサイトカイン。（ａ）７日後のサイトカインパターン。（ｂ）１４日後のサイトカインパターン。（ｃ）２１日後のサイトカインパターン。
【０１５８】
【図３】Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５免疫化は、ＨＩＳ−ＮＲＧマウスの末梢血におけるヒトＣＤ３＋Ｔ細胞の発生頻度を有意に増強する。（ａ）ＨＩＳ−ＮＲＧマウスを、ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）の移入によって産生した。マウスに、ＨＳＣ−再構成後の１０および１１週目に右脇腹にＳｍｙｌｅ／ｐｐ６５またはＣｏｎ／ｐｐ６５を皮下に注入した。（ｂ）ＨＳＣＴ後の１０、１３および２０週目の、コントロール、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５またはＣｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５−免疫化  ＨＩＳ−マウスの末梢血におけるＣＤ４５＋／ＣＤ３＋ヒトＴ細胞の発生頻度。
【０１５９】
【図４】Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５免疫化は、ＨＩＳ−ＮＲＧマウスにおけるヒトＣＤ３＋Ｔ細胞の発生頻度およびエフェクター記憶細胞傷害性Ｔ細胞を有意に増強する。（ａ）ＨＩＳ−ＮＲＧマウス脾臓から得られる単核細胞におけるヒトＣＤ４５＋およびＣＤ３＋細胞の発生頻度。（ｂ）ＨＳＣＴ後の２０週目のＨＩＳ−マウスからの脾臓における、ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球サブセットの相対発生頻度およびＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブ(naive)およびエフェクター記憶ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ−サブセットの対応する発生頻度。＊ｐ＜０．０５
【０１６０】
【図５】Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５でのＨＩＳ−ＮＲＧの免疫化後のリンパ節の巨視的検出。（ａ）Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５細胞で免疫化されたマウスにおける末梢リンパ節（ＬＮ）の巨視的検出。（ｂ）身体の異なる部分において検出可能なＬＮを示すマウスの頻度。
【０１６１】
【図６】野生型Ｃ５７ＢＬ／６  ａｎｄ  Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５で免疫化されたＨＩＳ−マウスから得られるＬＮの免疫蛍光分析。ヒトＴ細胞およびＤＣは、ＨＩＳ−ＮＲＧマウス免疫化マウスにおいてＬＮ  Ａｎｌａｇｅを満たす。
【０１６２】
【図７】ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５で以前に免疫化されたＨＩＳ−ＮＲＧマウスへのｓ．ｃ．投与されたＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５−ｆｌＵＣの移動をモニタリングするための光学的画像分析。（ａ）実験スキーム。（ｂ）ＨＩＳ−ＮＲＧマウスにおける生物発光シグナルの検出。（ｃ）ＳｍｙｌｅｄＣ／ｐｐ６５−ｆＬＵＣが注射されたのと同じ側  対  反対側にて検出された定量化生物発光シグナル。
【０１６３】
【図８】ＨＩＳ−ＮＲＧ免疫化後のＣＭＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答の特性化。（ａ）Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５で免疫化されたＨＩＳ−ＮＲＧから回収されたＬＮにおけるヒトＣＤ４５＋、ＣＤ３＋およびＣＤ１９＋細胞の発生頻度。（ｂ）ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブ、エフェクター記憶（ＥＭ）ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ−、セントラルメモリー（ＣＭ）ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ６２Ｌ−ターミナルエフェクター（ＴＥ）の相対発生頻度。（ｃ）Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５−免疫化されたマウスから単離されたＬＮから細胞を得て、自家Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５またはＳｍｙｌｅ（抗原なし）と７日間共培養した。再刺激をＣＭＶ−ｐｐ６５重複ペプチドと一晩インキュベーションによって行い、ＩＦＮγスポットをカウントした。（ｄ）ｈＩＬ−７およびｈＩＬ−１５の存在下でヒト抗−ＣＤ２、ＣＤ３およびＣＤ２８抗体で７２時間活性化された、コントロール、Ｃｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５およびＳｍｙｌｅ／ｐｐ６５−免疫化ＨＩＳ−ＮＲＧから得られる脾細胞から取り出されたヒトＣＤ３＋細胞。
【０１６４】
【図９】ＨＩＳ−ＮＲＧマウスにおけるＢ細胞応答。末梢血（Ａ）および脾臓（Ｂ）におけるヒトＢ細胞の発生頻度、およびＨＩＳ−ＮＲＧの血清におけるヒト免疫グロブリンＧおよびＭの検出。
【０１６５】
【図１０】（Ａ）Ｇ−ＣＳＦ動員ＣＤ３４＋幹細胞ドナーから得られる単球からのＣｏｎｖＤＣおよびＳｍｙｌｅＤＣの生産スキーム。この試験において、両方のタイプのＤＣが、ｐｐ６５抗原の発現のためにレンチウイルスベクターで同時形質導入される。（Ｂ）ＮＲＧマウスへのヒト造血幹細胞移植、免疫化および分析のスケジュール。（Ｃ）免疫化ＮＲＧマウスにおいて産生されたｐｐ６５に対するヒトＴ細胞応答の分析のための処理。
【０１６６】
【図１１】ＧＣＳＦ−動員ドナーからのヒト慣用（ＣｏｎｖＤＣ）およびＳｍｙｌｅＤＣの産生および分析。（Ａ）ＣＭＶ−ｐｐ６５タンパク質ＬＶ−ＣＭＶ−ｐｐ６５単独をコードする単シストロン性のインテグラーゼ欠損型ＬＶを使用して、ＣｏｎｖＤＣを産生し、ＬＶ−ＣＭＶ−ｐｐ６５およびヒトＧＭ−ＣＳＦおよびヒトＩＦＮ−αをコードする二シストロン性ＬＶベクターを使用して、単球に同時形質導入し、ＳｍｙｌｅＤＣを産生した。（Ｂ）ヒトＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−α生産を、最大２１日間の培養中に維持されるＳｍｙｌｅＤＣからの上清において週に１回測定した。（Ｃ）最大２１日間の週に１回回収された生存細胞のパーセントによって示されるＣｏｎｖＤＣおよびＳｍｙｌｅＤＣの細胞生存能力。（Ｄ）ＣＭＶ−ｐｐ６５、（Ｅ）ＣＤ１４の発現および（Ｆ）（ＣＤ１１ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ８３およびＣＤ８０の発現により測定される）ＤＣ培養におけるＤＣ分化の安定性を、フローサイトメトリーによって週に１回評価した。（Ｇ）ＣｏｎｖＤＣおよびＳｍｙｌｅＤＣから週に１回得られる細胞上清を、ＤＣ１、ＤＣ２およびケモカインのサイトカインビーズアレイにより分析した。データは、少なくとも３つの異なるドナーからの少なくとも３つの独立した実験の平均を示す。＊ｐ＜０．０５
【０１６７】
【図１２】ホタルルシフェラーゼを発現するレンチウイルスベクターでさらなる同時形質導入で生産されたＳｍｙｌｅＤＣを、ＮＲＧマウスに皮下に形質導入した次の日に、注射した。マウス（ｎ＝６）にルシフェリンを腹腔内に投与し、光学的画像分析を、生物発光シグナルの局所化のために行った。興味ある領域において検出される生物発光を、ＳｍｙｌｅＤＣ／ルシフェラーゼ投与後１４、３０および４５日間測定し、それぞれのマウスについてプロットした。
【０１６８】
【図１３】ＳｍｙｌｅＤＣ免疫化は、血漿におけるヒトサイトカインの検出およびヒトＴ細胞の拡張を増強させる。（Ａ）ヒトサイトカインを、コントロール、ＣｏｎｖＤＣまたはＳｍｙｌｅＤＣ−免疫化ＨＩＳ−マウス（ＨＣＴ後の２０週目）からの血漿中で検出した。バーはサイトカイン濃度（ｐｇ／ｍＬ）の平均を示し、エラーバーはＳＥＭを示す。（Ｂ）プライム・ブース免疫化の前（１０週）、免疫化後２週目（１３週）および免疫化後８週目（２０週）に、コントロール、ＣｏｎｖＤＣまたはＳｍｙｌｅＤＣ−免疫化ＨＩＳ−マウスの末梢血における（Ｃ）ＣＤ３＋、（Ｄ）ＣＤ１９＋、（Ｅ）ＣＤ４＋および（Ｆ）ＣＤ８＋細胞の発現と比較しての、ヒトＣＤ４５＋、造血細胞およびサブ画分の生着の分析。データは、コントロール（ｎ＝１０）、ＣｏｎｖＤＣ（ｎ＝７）およびＳｍｙｌｅＤＣ（ｎ＝２２）免疫化マウスの分布を示す。
【０１６９】
【図１４】再生されたＬＮに存在するヒト細胞のＳｍｙｌｅＤＣ免疫化および特性化後の、ＨＩＳ−ＮＲＧにおける流入領域リンパ節およびリンパ流量の再生。（Ａ）最後のＳｍｙｌｅＤＣ免疫化後８週目の鼠径部および腋窩ＬＮの巨視的検出。イメージは、Ａｘｉｏｃａｍ蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）にて１０ｘ倍率で入手し、Ａｘｉｏｗｅｒｔソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を使用して分析した。（Ｂ）局所性および全身性リンパ再生の両方を証明する、ＳｍｙｌｅＤＣ注射部位と同じ側（ＩＳ、黒色バー）または反対側部位（ＣＬ、空のバー）で再生されたＬＮを有するマウスの頻度。（Ｃ）ＳｍｙｌｅＤＣ−免疫化マウスから回収されたＬＮ（ｎ＝４）におけるヒトＣＤ４５＋、ＣＤ３＋およびＣＤ１９＋細胞および（Ｄ）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の平均頻度。（Ｅ、Ｆ）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＬＮ  Ｔ細胞（ｎ＝４）それぞれにおけるＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブ、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋セントラルメモリーおよびＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ−エフェクター記憶亜集団の特性化。（Ｇ）ＣＤ３における（ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ｈｉＰＤ−１＋ＩＣＯＳ＋を発現する）濾胞性(follicular)Ｔヘルパー細胞の発生頻度を、ＳｍｙｌｅＤＣ−注入ＨＩＳマウスから得られたプールされたＬＮ（ｎ＝８）において分析し、マウスにおけるヒトＴ細胞の内在性産生を確認した。ヒト扁桃腺細胞をポジティブコントロールとして使用した。（Ｈ）マウスにおけるヒトＢ細胞の内在性産生を示す、プールされたヒト化ＬＮおよびヒト扁桃腺細胞からのＣＤ１９＋細胞におけるＣＤ２４ｈｉＣＤ３８ｈｉ移行(transitional)、ＩｇＤ＋ＣＤ２４ｉｎｔＣＤ３８ｉｎｔ成熟およびＣＤ２７ｈｉＣＤ３８ｈｉ形質芽細胞の相対発生頻度。
【０１７０】
【図１５】隣接側および反対側リンパ節へのＳｍｙｌｅＤＣ／ルシフェラーゼの移動。ヒトＣＤ３４＋細胞を移植され、ＳｍｙｌｅＤＣ（１０、１１週目）で免疫化されたＮＲＧマウスに、次に（２０週目）ＳｍｙｌｅＤＣ／ルシフェラーゼを投与した。（外部イメージによって、または外植されたＬＮの分析によって検出可能である）あらかじめ形成された再生されたＬＮに広がる生物発光シグナルが、ＳｍｙｌｅＤＣの遊走能およびＬＮにおいて細胞の高い生存能力（最大２１日間）を証明した。
【０１７１】
【図１６】マウスの脾臓においてヒトＤＣの検出。脾臓をヒトＣＤ３４＋細胞を移植され、ＳｍｙｌｅＤＣまたはＣｏｎｖＤＣ（１０、１１週目）で免疫化されたＮＲＧマウス、または非免疫化コントロールから回収し、２０週目に殺した。骨髄性ＤＣ（Ｌｉｎ−、ＨＬＡ−ＤＲ＋  ＣＤ１１ｃ＋）および形質細胞様ＤＣ（Ｌｉｎ−、ＨＬＡ−ＤＲ＋  ＣＤ１２３＋）の存在について、脾細胞を免疫染色およびフローサイトメトリーにより分析した。当該データは、マウスにおけるヒト樹状細胞の内在性産生を示す。
【０１７２】
【図１７】脾臓またはＨＩＳ−ＮＲＧマウスＳｍｙｌｅＤＣにおけるヒト細胞集団の絶対数の拡張。（Ａ）ＨＣＴ後の２０週目に、コントロール、ＣｏｎｖＤＣおよびＳｍｙｌｅＤＣ−免疫化されたマウスからの脾臓あたりのヒトＣＤ４５＋、ＣＤ３＋およびＣＤ１９＋細胞の全細胞数を示す散布図。（Ｂ）ＣＤ４＋およびＣ）ＣＤ８＋Ｔ細胞における全、ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブおよびＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ−エフェクター記憶亜集団からの脾臓あたりの細胞数。（Ｄ）ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ｈｉＰＤ−１＋ＩＣＯＳ＋濾胞性Ｔヘルパー細胞の全細胞数、および（Ｅ）コントロール、ＣｏｎｖＤＣおよびＳｍｙｌｅＤＣ−免疫化マウスからの脾臓あたりのＣＤ１９＋ＣＤ２４ｈｉＣＤ３８ｈｉ移行、ＣＤ１９＋ＩｇＤ＋ＣＤ２４ｉｎｔＣＤ３８ｉｎｔ成熟およびＣＤ１９＋ＣＤ２７ｈｉＣＤ３８ｈｉ形質芽細胞の全細胞数。バーおよびエラーバーはそれぞれ平均およびＳＥＭを示す。＊はｐ＜０．０５を示す。データは、ＳｍｙｌｅＤＣが、ＨＩＳ−ＮＲＧマウスにおける成熟ヒトＴおよびＢ細胞のプールを定量的におよび潜在的に定性的に（広範なＴ細胞受容体およびＢ細胞受容体レパートリー）拡張することを証明する。
【０１７３】
【図１８】ＳｍｙｌｅＤＣ免疫化後のｐｐ６５  ＨＩＳ−ＮＲＧに対するヒトＴ細胞および体液性応答。（Ａ）ヒトＣＤ３＋細胞を、免疫化後の８週目に、コントロール（ｎ＝４）、ＣｏｎｖＤＣおよび（ｎ＝４）ＳｍｙｌｅＤＣ−免疫化（ｎ＝６）ＨＩＳ−マウスからの脾細胞から取り出した。ＳｍｙｌｅＤＣでの１０日間のＥｘ−ｖｉｖｏ拡張後に、ＣＭＶ−ｐｐ６５重複プールペプチド(overlapping pooled-peptide)の存在（ｐｐ６５ｐｐ）または非存在（ＮｏＡｇ）下での再刺激を抗−ＩＦＮ−γ−被覆プレート上で一晩で行った。バーは２ｘ１０４細胞に対するＩＦＮ−γ陽性スポットの平均を示す。（Ｂ）同様の処理を、ＳｍｙｌｅＤＣ−免疫化ＨＩＳ−ＮＲＧ（ｎ＝４  マウス）から得られたＬＮから回収されたエフェクター細胞で行った。これは、ＣＭＶ血清反応陽性ヒトドナーから得られるＰＢＭＮＣと並行してアッセイされた。データは２ｘ１０４細胞における平均されたＩＦＮ−γ陽性スポットを示す。（Ｃ）ヒトＣＤ１９＋細胞内でＣＤ２７＋ＣＤ３８＋ＩｇＧ＋を発現する細胞頻度。コントロールおよび免疫化後の８週目にＤＣ−免疫化されたマウスからの血漿中の、（Ｄ）総免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ、および（Ｅ）ＩｇＭの定量化。免疫化後の８週目にコントロール、ＣｏｎｖＤＣおよびＳｍｙｌｅＤＣ−注入されたマウスからの血漿中の（Ｆ）ｐｐ６５−特異的ＩｇＧおよび（Ｇ）ｐｐ６５−特異的ＩｇＭの定量化。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者からの血漿サンプルを、ｐｐ６５−特異的ＩｇＧおよびＩｇＭの両方に対するポジティブコントロールとして使用した。バーおよびエラーバーはそれぞれ平均およびＳＥＭを示す。「ｎｄ」は検出されないを表す。＊はｐ＜０．０５を示す。データは、マウスにおいて機能的なヒト適応抗原特異的ＴおよびＢ細胞応答を証明する。
【０１７４】
【図１９】体重および組織学的分析による移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のモニタリング。（Ａ）ヒトＣＤ３４＋細胞を移植され、ＳｍｙｌｅＤＣまたはＣｏｎｖＤＣ（１０、１１週目）で免疫化された４週齢ＮＲＧマウスまたは非免疫化コントロールを、体重増加について時間とともにモニタリングした。有意な差異を観察しなかった。殺した後、皮膚および大腸試料を回収し、ＧＶＨＤの兆候について分析した。（Ｂ）皮膚および大腸の組織学的分析（４００ｘ  Ｈ＆Ｅ  染色）はそれぞれ、ＳｍｙｌｅＤＣで免疫化された４つのうち２つおよび４つのうち３つにおいて軽度グレード１ＧＶＨＤを示した。いくつかのアポトーシス性破片が検出可能であったが、リンパ球の限局性および散在性(sparse)浸潤物は炎症を示さなかった。このデータは、マウスにおいて完全な適応ヒト異種移植片免疫系の再生にもかかわらず、重度または中程度の移植片対宿主病は観察されなかったということを証明する。
【０１７５】
【図２０】抗原を欠いている（ＩＤＬＶ−ＧＭＣＳＦ−２Ａ−ＩＦＮａ）二シストロン性ベクターでの単球の形質導入によって産生されるＳｍｙｌｅＤＣについて、またはｐｐ６５抗原を共発現する（ＩＤＬＶ−ＧＭＣＳＦ−２Ａ−ＩＦＮａ−２Ａ−ｐｐ６５）三シストロン性(tricistronic)ベクターでの単球の形質導入によって産生されるＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５についての実験的スキーム。（Ａ）ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５生産のスキーム。（Ｂ）免疫化および分析のスケジュール。（Ｃ）免疫化マウスにおいて産生されたヒトＴ細胞応答の分析。
【０１７６】
【図２１】ＳｍｙｌｅＤＣおよびＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５の産生。ａ）二シストロン性および三シストロン性レンチウイルスベクターの略図。ｂ）生存細胞の回復：０日目に形質導入された単球の流入と比較してのパーセンテージとしての７、１４および２１日目に回復した総生存ＳｍｙｌｅＤＣ（グレー色）およびＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５（黒色）。ｃ）７、１４および２１日目にＣＤ８６＋／ＨＬＡ−ＤＲ＋細胞のＦＡＣＳ分析によるＤＣ表面抗原の発現の安定性。ｄ）７、１４および２１日目にＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５の細胞内染色により分析したｐｐ６５発現の持続性。ｅ）７日目にパーセンテージとしての関連ＤＣ免疫表現型マーカー（ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ１２３）の発現。ｆ）サイトカインビーズアレイを使用して、７日目にＳｍｙｌｅＤＣおよびＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５上清において検出可能な分泌されるサイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮ−γ、ＭＣＰ−１、ＴＮＦ−α）およびトランスジェニックサイトカイン（ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−α）。全ての分析を、３つの異なるドナーから得られた単球での独立したトリプリケートとして行った。当該データは、完全ｐｐ６５抗原の共発現がｉＤＣの特性を変化させなかったということを証明する。
【０１７７】
【図２２】臍帯血から得られた単球でのＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５の産生および免疫表現型分析。（ａ）７日目にＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５で行われたフローサイトメトリー分析の典型的な例。（ｂ）免疫表現型マーカー陽性細胞（ｎ＝４）の頻度。当該データは、幹細胞移植のために使用されるヒト臍帯血材料からのＳｍｙｌｅＤＣの生産が実行可能であり、再現性があるということを証明する。
【０１７８】
【図２３】インテグラーゼコンピテント（ＩＣ）およびインテグラーゼ欠損型（ＩＤ）レンチウイルスベクターの統合分析。ａ）１０、２０および３０日目に回収された、ＩＣ−ＬＶまたはＩＤ−ＬＶで産生されたＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５に対する１細胞あたりの組み込まれたＬＶコピーの数、およびｑＰＣＲにより分析されたＤＮＡ。ｂ）ＬＡＭ−ＰＣＲを使用して、遺伝子から＋／−１０ｋｂに分布される組み込み部位の頻度を分析した。ＩＣ−ＬＶ（灰色）およびＩＤ−ＬＶ（黒色）。ｃ）転写開始部位（ＴＳＳ）、遺伝子リーディングフレームにおける上流のいずれかと比較しての組み込み部位の頻度。ｄ）遺伝子座において検出可能な１０個のドミナント組み込み部位（灰色ボックスは分析間または分析内の再現性のある(recurrent)遺伝子を示す）およびそれぞれの遺伝子における挿入の相対発生頻度を描写する動力学的分析。データは、レンチウイルスの組み込みがＩＤ−ＬＶについてわずかに観察されること、および組み込みパターンが腫瘍形成発達に対するホットスポットを示さないことを証明する。
【０１７９】
【図２４】ＨＣＭＶでのレンチウイルスベクターＤＣの感染。ａ）０−１０ｄ．ｐ．ｉのＧＦＰ発現によるＨＣＭＶ感染（ＭＯＩ＝１）の動力学を示すフローサイトメトリー分析。ヒト繊維芽細胞（ＨＦ）はポジティブコントロールであり、比較はＧＭＣＳＦ／ＩＬ４を発現するｉＤＣ（ＳｍａｒｔＤＣ）、ＧＭＣＳＦ／ＩＦＮａを発現するｉＤＣ（ＳｍｙｌｅＤＣ）またはＧＭＣＳＦ／ＩＦＮａ／ｐｐ６５を発現するｉＤＣ（ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５）を含んだ。ｂ）ＨＣＭＶ感染後のいくつかのｄ．ｐ．ｉ．でのＣＤ８０発現における変化を示すフローサイトメトリー分析。パーセンテージは、非感染細胞（模擬(mock)、左グラフ）およびＨＣＭＶ感染細胞（右グラフ）を比較するＣＤ８０＋細胞の分析を示す。ｃ）細胞上清に放出されたＨＣＭＶビリオンの検出。それぞれの感染細胞培養からの上清を０、２、４、６、８および１０日目に回収し、ＨＦ細胞に感染させるために使用した。新たに生産されたウイルスをプラーク形成アッセイによって決定した。プラークの数をそれぞれの時点で決定し、ｐｆｕ／ｍｌとして示した。データは、ＳｍｙｌｅＤＣが細胞におけるＩＦＮ−ａの発現によってＨＣＭＶを拡げないことを証明する。
【０１８０】
【図２５】ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５でのＴ細胞インビトロ刺激。ａ）ＨＣＭＶ  血清反応陽性ドナー（ｎ＝３）から得られるＣＤ３＋Ｔ細胞を、刺激しなかった、または、ｐｐ６５ペプチドまたはＳｍｙｌｅＤＣまたはＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５で１６時間インビトロで刺激した。ＩＦＮ−γ＋を生産するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の平均頻度。（ｎ＝３）、＊ｐ＜０．０５および１つのドナーからの典型的なドットブロット分析を示す。ｂ）微小培養(microculture)におけるＣＤ８＋Ｔ細胞拡張。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５サイトカインおよび照射された支持細胞の存在下で２サイクル、１０：１の比率でインビトロでＡＰＣ（ＳｍｙｌｅＤＣまたはＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５）で刺激した。ＡＰＣなしのＴ細胞をコントロールとして使用した。左の棒グラフ：それぞれのグループにおいて拡張されたＴ細胞の絶対数をトリパンブルー排除によって決定した。右の棒グラフ：拡張されたＴ細胞をｐｐ６５エピトープに対して反応性のペンタマーで染色した（Ａ＊０２０１−ＮＬＶＰＭＶＡＴＡ：白色／Ｂ＊０７−ＴＰＲＶＴＧＧＧＡＭ：黒色）、＊ｐ＜０．０５。ｃ）細胞傷害性アッセイ。ＳｍｙｌｅＤＣまたはＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５で拡張されたＣＤ８＋Ｔ細胞を標的細胞（ＨＬＡ＊Ａ２またはＨＬＡ＊Ｂ７＋／−ｐｐ６５を発現するＫ５６２）と異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比率で播種し、４時間共培養した。細胞上清を、共役酵素アッセイを測定することによってＬＤＨ放出について評価した。データは、インビトロでｐｐ６５に対して反応性である記憶Ｔ細胞を拡張するＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５の機能性を確認する。
【０１８１】
【図２６】ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５におけるｐｐ６５共発現の効果を評価するために、Ｇ−ＣＳＦドナーからのＣＤ３４＋ＨＳＣを移植されたＮＲＧマウスの免疫化。ａ）実験的スキーム。Ｇ−ＣＳＦ動員(mobilized)幹細胞を移植された照射された４週齢ＮＲＧマウスを、移植後１０および１１週目にＳｍｙｌｅＤＣまたはＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５のいずれかで免疫化した。血液、血漿、脾臓および骨髄を２０週目に回収した。ｂ）末梢血におけるヒトリンパ球拡張の動力学。血液中のヒトＴヘルパー（ＣＤ４５＋／ＣＤ４＋）およびＣＴＬ（ＣＤ４５＋／ＣＤ８＋）の頻度を、ＤＣ免疫化の前、およびＤＣ免疫化の後１０、１３および２０週目に決定した。ｃ）末梢血におけるヒトＢ細胞拡張の動力学。ヒトＢ細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ１９＋）細胞の頻度を、ＦＡＣＳ分析によって免疫化ＮＲＧマウスの血液において決定した。ｄ）左の棒グラフ：ＦＡＣＳによって決定された脾臓中のＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＣＤ１９＋細胞の絶対数；右の棒グラフ：ＳｍｙｌｅＤＣ（ｎ＝５）およびＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５（ｎ＝２）で免疫化されたマウスから回収されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団において決定されたＴ細胞サブセット：ナイーブ（Ｎ、白色）、Ｔセントラルメモリー（ＴＣＭ、灰色）およびＴエフェクター記憶（ＴＥＭ、黒色）。データは、成熟ヘルパーおよび細胞傷害性Ｔ細胞の内在性再生を産生するＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５の能力を示す。
【０１８２】
【図２７】成体ＣＤ３４＋細胞を移植され、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５で免疫化されたＮＲＧマウスの機能的効果。ａ）成体ＨＳＣを移植され、ＳｍｙｌｅＤＣまたはＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５で免疫化されたＮＲＧマウスの血漿中の検出可能なヒトサイトカイン（ｐｇ／ｍｌ）。ｂ）成体ＨＳＣを移植され、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５で免疫化されたマウス（ｎ＝３）から得られたプールされ、分類されたＣＤ４＋またはＣＤ８＋脾細胞を、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５でインビトロで拡張し、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴプレートアッセイ上で不適切なペプチドプール（ＴＲＰ２）またはｐｐ６５ペプチドプールで適用した(pulsed)。ｃ）ヒトドナー（ｎ＝３）から得られる血漿と比較した、成体ＨＳＣを移植され、ＳｍｙｌｅＤＣ（ｎ＝５）またはＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５（ｎ＝５）で免疫化されたＮＲＧマウスの血漿中の検出可能なヒト免疫グロブリン（ｎｇ／ｍｌ）：ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＭ。ｅ）ＥＬＩＳＡにより測定されるｐｐ６５に対するＳｍｙｌｅＤＣ（ｎ＝３）またはＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５（ｎ＝３）で免疫化されたマウスから得られるマウス血漿ＩｇＭおよびＩｇＧの反応性。データは、機能的なヒト免疫応答（サイトカインおよび免疫グロブリン）および抗原特異的応答（Ｔヘルパー、ＣＴＬ、ＩｇＧ）を再生するｐｐ６５の必要条件を証明する。
【０１８３】
【図２８】ＵＣＢ  ＣＤ３４＋  ＨＳＣを移植されたＮＲＧマウスの免疫化。ａ）実験的スキーム。ＵＣＢ幹細胞コントロール（ｎ＝７）を移植された、移植後のＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５で１０および１１週目に２回（ｎ＝８）または６、７、１０および１１週目に４回（ｎ＝４）免疫化された４週齢の照射されたＮＲＧマウス。非免疫化されたマウスをコントロールとして使用した。血液、血漿、脾臓および胸腺を１６週目に回収した。ｂ）末梢血におけるヒトリンパ球再構成の動力学。ヒトＴヘルパー（ＣＤ４５＋／ＣＤ４＋）、ＣＴＬ（ＣＤ４５＋／ＣＤ８＋）およびＢ細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ１９＋）の頻度を、ＦＡＣＳ分析によって免疫化されたマウスの血液において決定した。ｃ）ヒトＴヘルパー細胞またはＣＴＬ：ナイーブ（Ｎ）、Ｔセントラルメモリー（ＴＣＭ）およびＴエフェクター記憶（ＴＥＭ）について絶対数として決定された脾臓におけるＴ細胞サブセットの発達の動力学。ｄ）胸腺における発達の異なるステージでのＴ細胞の分析。ＤＰ：ＣＤ４５＋／ＣＤ４＋／ＣＤ８＋、ＣＤ４ＳＰ：ＣＤ４５＋／ＣＤ４＋／ＣＤ８−、ＣＤ８ＳＰ：ＣＤ４５＋／ＣＤ４−／ＣＤ８＋ ＣＤ３ｌｏ：ＣＤ４５＋／ＴＣＲαβ−／ＴＣＲγδ− ＣＤ３αβｈｉ：ＣＤ４５＋／ＴＣＲαβ＋、ＣＤ３γδｈｉ：ＣＤ４５＋／ＴＣＲγδ＋。ｆ）ＣＤ４＋／ＣＤ１２７−ＣＤ２５ｈｉまたはＣＤ４＋／ＣＤ１２７−ＣＤ２５ｈｉＦＯＸＰ３＋として血液中の決定されたＴｒｅｇｓの頻度。データは、ＳｍｙｌｅＤＣ免疫化がまた臍帯血新生児幹細胞起源である免疫系の再生も刺激することを証明する。この効果は、胸腺におけるＴ細胞の初期発達を含み、γδＴ細胞およびＴｒｅｇｓのような耐性(tolerizing)細胞の頻度に影響しない。
【０１８４】
【図２９】臍帯血ＣＤ３４＋細胞を移植され、異なる用量のＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５で免疫化されたＮＲＧマウスの機能的効果。臍帯血ＨＳＣを移植され、非免疫化の（コントロール）マウス（ｎ＝２）、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５で２回（２×）免疫化された、またはＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５で４回（４×）免疫化されたマウスから得られる分類されたＣＤ３＋脾細胞を、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５でインビトロで拡張し、不適切なペプチドプール（ＴＲＰ２）またはｐｐ６５ペプチドプールで刺激または適用しなかった。ａ）ＣＤ４＋／ＩＦＮ−γ＋の細胞内分析およびｂ）ＣＤ８＋／ＩＦＮ−γ＋の細胞内分析を行い、反応性Ｔ細胞の頻度を決定した。ｃ）ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５で４回免疫化された移植されたマウス（ｎ＝５）と比較しての、臍帯血ＨＳＣを移植されたコントロールのＮＲＧマウス（ｎ＝５）の血漿において検出可能なヒト免疫グロブリン（ｎｇ／ｍｌ）：ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＭ。ｄ）コントロールマウスまたはＥＬＩＳＡにより測定されるｐｐ６５に対するＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５（ｎ＝３）で４回免疫化されたマウスから得られるマウス血漿ＩｇＧの反応性。ヒト血漿はポジティブコントロールとして含まれた。抗原に対するＴ細胞およびＢ細胞応答の両方が産生され得るため、データは臍帯血の幹細胞に由来する機能性ヒト免疫系の内在性再生を証明する。
【発明を実施するための形態】
【０１８５】
第１の局面において、本願発明は、医薬としての使用のための、
ａ）ヒト樹状細胞（ＤＣ）前駆細胞のＤＣへの自律分化を誘導する少なくとも１つのサイトカイン；および
ｂ）少なくとも１つの抗原；
を発現するように操作された誘導された樹状細胞（ｉＤＣ）に関する。
【０１８６】
第２の局面において、本願発明は、造血幹細胞（ＨＳＣ）の移植後の免疫不全対象の免疫系の再生における使用のための、
ａ）ヒト樹状細胞（ＤＣ）前駆細胞のＤＣへの自律分化を誘導する少なくとも１つのサイトカイン；および
ｂ）少なくとも１つの抗原；
を発現するように操作されたｉＤＣに関する。
【０１８７】
第３の局面において、本願発明は、ベクターがレンチウイルスベクターである、局面２のｉＤＣに関する。
【０１８８】
第４の局面において、本願発明は、レンチウイルスベクターがインテグラーゼ欠損型である、局面３のｉＤＣに関する。
【０１８９】
第５の局面において、本願発明は、少なくとも１つの抗原を発現するｉＤＣがヒト樹状細胞（ＤＣ）前駆細胞のＤＣへの自律分化を誘導する少なくとも１つのサイトカインを発現する、局面２から４のいずれかのｉＤＣに関する。
【０１９０】
第６の局面において、本願発明は、サイトカインがＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１５、ＴＧＦ−Ｂ、ＴＮＦ−α、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ−３およびＣＤ４０Ｌからなる群から選択される、局面５の方法に関する。
【０１９１】
第７の局面において、本願発明は、ｉＤＣが（ｉ）ＦＬＴ３ＬおよびＩＬ−３；（ｉｉ）ＦＬＴ３ＬおよびＣＤ４０Ｌ；（ｉｉｉ）ＦＬＴ３ＬおよびＩＦＮα；（ｉｖ）ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−αおよびＩＬ−１５；（ｖ）  ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−αおよびＴＮＦ−α；および、（ｖｉ）ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−αおよびＴＧＦ−Ｂからなる群から選択されるサイトカインの組合せを発現する、局面６のｉＤＣに関する。
【０１９２】
第８の局面において、本願発明は、ｉＤＣによって発現される１つの抗原が、異種反応性、同種反応性、新反応性または自己免疫からなる群から選択される細胞傷害性または体液性免疫応答を誘導することができる抗原である、局面２から７のいずれかのｉＤＣに関する。
【０１９３】
第９の局面において、本願発明は、対象の免疫不全が、電離放射線によって引き起こされる免疫不全、少なくとも１つの細胞毒性薬の投与によって引き起こされる免疫不全、原発性免疫不全および病原体によって引き起こされる免疫不全からなる群から選択される免疫不全である、局面２から８のいずれかのｉＤＣに関する。
【０１９４】
第１０の局面において、本願発明は、造血幹細胞移植が自家である、局面２から９のいずれかのｉＤＣに関する。
【０１９５】
第１１の局面において、本願発明は、幹細胞移植が異種である、局面２から９のいずれかのｉＤＣに関する。
【０１９６】
第１２の局面において、本願発明は、対象がヒトである、局面２から１１のいずれかのｉＤＣに関する。
【０１９７】
第１３の局面において、本願発明は、リンパ系に広がる癌またはリンパ向性病原体により引き起こされる疾患の処置のための医薬としての使用のための、
ａ）ヒト樹状細胞（ＤＣ）前駆細胞のＤＣへの自律分化を誘導する少なくとも１つのサイトカイン；および
ｂ）少なくとも１つの抗原
を発現するように操作されたｉＤＣに関する。
【０１９８】
第１４の局面において、本願発明は、少なくとも１つのインテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクターを含むｉＤＣであって、当該ベクターが、
ａ）ヒト樹状細胞（ＤＣ）前駆細胞のＤＣへの自律分化を誘導する少なくとも１つのサイトカイン；および
ｂ）少なくとも１つの抗原
の発現を介在するｉＤＣに関する。
【０１９９】
第１５の局面において、本願発明は、以下の工程
ａ）造血幹細胞を対象に移植すること；および
ｂ）少なくとも１つの抗原およびヒト樹状細胞（ＤＣ）前駆細胞のＤＣへの自律分化を誘導する少なくとも１つのサイトカインを発現するように操作された誘導された樹状細胞（ｉＤＣ）を対象に投与すること
を含む、免疫不全対象における免疫系を再生するための方法に関する。
【０２００】
第１６の局面において、本願発明は、対象がマウスであり、ＨＳＣがヒトに由来する、局面１５の方法に関する。
【０２０１】
第１７の局面において、本願発明は、マウスが樹状細胞の内在性Ｔ細胞および内在性前駆細胞の存在により特徴付けられる、局面１６の方法に関する。
【０２０２】
第１８の局面において、マウス血統が（ＴおよびＢ細胞を含む）適応免疫系の機能不全または欠損に至る原発性免疫不全を有する、局面１６または１７の方法。
【０２０３】
第１９の局面において、本願発明は、マウスが、ＮＯＤ−Ｒａｇ１ｎｕｌｌＩＬ２Ｒｙｎｕｌｌ−ＮＲＧ、ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒｙｎｕｌｌ−ＮＳＧおよびＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒｙｎｕｌｌ−ＮＯＧからなる血統の群から選択される、局面１６から１８のいずれかの方法に関する。
【０２０４】
第２０の局面において、本願発明は、ベクターが抗原ｐｐ６５およびサイトカイン（ｉ）ＧＭ−ＣＳＦおよび（ｉｉ）インターフェロン−αおよび／またはインターロイキン−４の発現を介在する、局面１５から１９のいずれかの方法に関する。
【０２０５】
第２１の局面において、本願発明は、局面１６から２０のいずれかの方法により生産される再生された免疫系を有するマウスに関する。
【０２０６】
第２２の局面において、本願発明は、ヒト免疫系の試験のための、またはヒトにおける使用のための薬物、インプラントまたはデバイスの試験のための、局面２１のマウスの使用に関する。
【０２０７】
以下の実施例は単に、本願発明を説明することを意図する。実施例は、決して特許請求の範囲を限定しない。
【実施例１】
【０２０８】
材料および方法
レンチウイルスベクターの構築およびインテグラーゼ欠損レンチウイルスの作製
自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスバックボーンベクターおよびＣＭＶ−ｐｐ６５とホタルルシフェラーゼＬＶ−ｆＬＵＣを発現する単シストロン性ベクターは以前に記載されている（Salguero, G. et al., 2011, "Preconditioning therapy with lentiviral vector-programmed dendritic cells accelerates the homeostatic expansion of antigen-reactive human T cells in NOD.Rag1-/-.IL-2rgammac-/- mice." Hum Gene Ther 22: 1209-1224）。ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を発現する二シストロン性レンチウイルスベクターおよびＰ２Ａエレメントを間に入れたヒトインターフェロンアルファ（ＬＶ−Ｇ２α）（ＲＲＬ−ｃＰＰＴ−ＣＭＶ−ｈＧＭＣＳＦ−Ｐ２Ａ−ｈＩＬ４）の構築は、以前に記載されているように、構成され広範に特徴付けられている（Daenthanasanmak, A. et al., 2012, "Integrase-defective lentiviral vectors encoding cytokines induce differentiation of human dendritic cells and stimulate multivalent immune responses in vitro and in vivo." Vaccine 30: 5118-5131）。すべての構築物の構造的完全性は、制限消化およびプロモーターおよび導入遺伝子のシーケンシング分析によって再確認した。レンチウイルスの大規模作製は、以前に記載されているように、ヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞の一過性同時トランスフェクションによって行った（Stripecke, R., 2009, "Lentiviral vector-mediated genetic programming of mouse and human dendritic cells." Methods Mol Biol 506: 139-158.）。インテグラーゼ欠損レンチウイルスを生成するために、同時トランスフェクションにおいて４つのパッケージングプラスミド：サイトカインを発現するレンチウイルスベクターを含有するプラスミド、インテグラーゼ遺伝子にＤ６４Ｖ点突然変異を含有するｇａｇ／ＰＯＬを発現するプラスミド（ｐｃＤＮＡ３ｇ／ｐＤ６４Ｖ．４ｘＣＴＥ）、ｒｅｖを発現するプラスミド（ｐＲＳＶ−ＲＥＶ）、およびＶＳＶ−Ｇエンベロープをコードするプラスミド（ｐＭＤ．Ｇ）を使用した。ウイルス上清を回収し、超遠心分離によって濃縮し、力価を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）を使用してｐ２４抗原濃度を見積もることによって評価した。Ｐ２４相当物／ｍｌの１μｇは、約１×１０７の感染性ウイルス粒子／ｍｌに相当する。
【０２０９】
ヒトＣＤ３４陽性末梢血の幹細胞の単離
Ｇ−ＣＳＦ（Ｇｒａｎｏｃｙｔｅ、Ｃｈｕｇａｉ  Ｐｈａｒｍａ）での造血幹細胞動員レジメンに付した造血成体幹細胞移植成体ドナーの白血球アフェレーシスから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得た。全ての試験を、ハノーヴァー医科大学の倫理審査委員会によって承認されたプロトコールに従って行った。ＣＤ３４磁気細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ−Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＭＡＣＳによってＣＤ３４＋細胞を陽性選択した。２回の磁気での陽性選択の後にフローサイトメトリーによる評価で得られた細胞の純度は９７％超であり、ＣＤ３＋Ｔ細胞の混入は０．２％未満であった。
【０２１０】
従来のヒトＩＦＮαおよびＳｍｙｌｅＤＣの生成
自家ＣＤ３４陰性ＰＢＭＣ画分を使用して、ＣＤ１４単離ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いるＣＤ１４＋単球のさらなる陽性選択を行った。レンチウイルス遺伝子導入のために、単球を、形質導入前に８時間、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４（それぞれ５０ｎｇ／ｍｌ、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の存在下の無血清Ｃｅｌｌｇｒｏ培地での培養液中に維持した。ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５の生成のために、５×１０６のＣＤ１４＋単球を、５μｇ／ｍｌ硫酸プロタミン（Ｖａｌｅａｎｔ、Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の存在下、両方のＩＤ−ＬＶ−Ｇ２αの５（２．５μｇ／ｍＬ  ｐ２４相当物に対応する）の感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ）で１６時間形質導入した。形質導入後、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５  ＤＣをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、さらに、無血清Ｃｅｌｌｇｒｏ培地での培養液中に維持した。従来のＩＦＮ−α−ＤＣの産生のために、上記のように、単球をＩＤ−ＬＶ−ｐｐ６５と共にインキュベートした。１６時間の形質導入後、ＬＶを除去し、細胞を、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−α（１，０００Ｕ／ｍｌ、ＰＢＬ  ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｏｕｒｃｅ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）の存在下で、培養液中に維持した。ＳｍｙｌｅＤＣを培地中でサイトカインなしでインキュベートしながら、Ｃｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５のためのサイトカインを３日毎に補充した。ｉＤＣを培養の７、１４および２１日後に採取した。マウスの免疫化のために、形質導入後、１日目にＳｍｙｌｅ／ｐｐ６５または７日目にＣｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５  ＤＣを、ＰＢＳに再懸濁し、皮下注射に使用した。生菌数の数は、トリパンブルー排除によって決定した。
【０２１１】
ヒトＨＳＣのマウス移植
ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｒａｇ１ｔｍ１ＭｏｍＩｌ２ｒｇｔｍｌＷｊｌ（ＮＯＤ；Ｒａｇ１−／−；ＩＬ−２ｒγ−／−、ＮＲＧ）マウスを飼育し、ＩＶＣシステム（ＢｉｏＺｏｎｅ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）での病原体を含まない条件下で維持した。マウスが関与するすべての手順は、ニーダーザクセン州によって審査および承認され、ハノーヴァー医科大学の動物施設のガイドラインに従った。ＨＳＣ移植については、４週齢のマウスを、１３７Ｃｓカラム照射器（ｇａｍｍａｃｅｌｌ、会社、国）を使用して亜致死照射した（４５０ｃＧｙ）。マウスレシピエントの尾静脈に５×１０５のヒトＣＤ３４＋末梢血ＨＳＣを静脈内注射した。ヒト造血細胞の生着をモニタリングするために、マウスをヒトＨＳＣ移植後の異なる時点（６、１０および１３）で採血し、最終分析のために２０週目で屠殺した。ＤＣ免疫化のために、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５またはＣｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５  ＤＣを培養プレートから収集し、ＰＢＳの１００μＬ中に５×１０５細胞の濃度で再懸濁した。ＨＳＣ再構成マウスに、２７ゲージの針を使用して、マウスの右後肢に皮下注射することによりＤＣ懸濁液を、ＨＳＣ移植後１０および１１週目に注射した。
【０２１２】
フローサイトメトリー分析
ヒトＨＳＣ再構成マウスにおけるヒト造血細胞の生着を、以下のマウス抗ヒト抗体：ＰｅｒＣＰ抗ＣＤ４５、Ａｌｅｘａ７００抗ＣＤ１９、Ｐａｃｉｆｉｃ  ｂｌｕｅ抗ＣＤ４、ＡＰＣ抗ＣＤ３、ＰＥ−Ｃｙ７抗ＣＤ８、ＦＩＴＣ抗ＣＤ４５ＲＡ、ＰＥ抗ＣＤ６２Ｌ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ抗ＣＤ１４、ＦＩＴＣ抗Ｌｉｎｅａｇｅ陽性、ＡＰＣ抗ＣＤ１１ｃ、ＰＥ抗ＣＤ１２３（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて末梢血および脾臓で評価した。末梢血分析のために、血液を室温で５分間、赤血球溶解バッファー（０．８３％塩化アンモニウム／２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２）との２回のインキュベーションにより溶解し、続いて冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で安定化し、３００ｇで５分間の遠心分離を行った。細胞を４℃で３０分間抗体と共にインキュベートした。採取した脾臓細胞を、赤血球溶解バッファー（０．８３％塩化アンモニウム／２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２）で５分間処理し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、氷上で３０分間抗体と共にインキュベートした。洗浄工程後、細胞をＰＢＳに再懸濁し、ＬＳＲフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で取得した。ＤＣ表現型の特徴付けのために、以下の抗ヒト抗体：ＰＥ抗ＣＤ８０、ＰｅｒＣＰ抗ＨＬＡ−ＤＲ、ＡＰＣ抗ＣＤ８６、ＡＰＣ抗ＣＤ８３（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用した。ＤＣ染色のために、細胞を収集し、ＰＢＳで１回洗浄し、氷上でマウスＩｇＧ（５０μｇ／ｍＬ）と共に１５分間インキュベートし、続いて抗体と共にインキュベートした。細胞を洗浄し、細胞固定液（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に再懸濁し、さらにＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒサイトメーターを用いて分析した。分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。
【０２１３】
ヒトＴ細胞生着の組織学および免疫組織化学的分析
ヒトＨＳＣ再構成ＮＲＧまたはＣ５７Ｂｌ６野生型マウスからのＬＮを採取し、凍結保存のための最適切削化合物(optimal cutting temperature compound)（Ｏ．Ｃ．Ｔ．Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）に包埋した。凍結切片（５μｍ）をアセトンで固定し、モノクローナル抗マウスまたはヒトＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、抗マウスまたはヒトＣＤ１１ｃ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗マウスＬＹＶＥ−１（Ｄａｋｏ）、抗ＣＤ３１マウス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。免疫蛍光分析をＡＸＩＯＣＡＭ蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で行った。
【０２１４】
インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）生物発光イメージング分析
マウスをケタミン（腹腔内に１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（腹腔内に１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、ｄ−ルシフェリンの水溶液（腹腔内に１５０ｍｇ／ｋｇ）をイメージングの５分前に注射した。マウスを電荷結合素子カメラ（ＩＶＩＳ  ２００、Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ｃｒａｎｂｕｒｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）の暗いチャンバーに入れ、弱い照明下でグレースケール体表面基準画像（デジタル写真）を撮影した。光源のスイッチを切った後、動物の体内のルシフェラーゼ発現細胞から放出され、組織を透過した光子を、Ｉｇｏｒ（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ、ＵＳＡ）上のオーバーレイとしてソフトウェアプログラムＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用して、５分間までの規定時間にわたって定量した。解剖学的な局在化について、光強度（青、最小強度；赤、最大強度）を表す疑似カラーイメージをＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅで生成し、グレースケール基準画像上に重ねた。定量した発光は、動物の表面上に平均化光子放射輝度で構成され、光子／ｓｅｃ／ｃｍ２／ｓｒ（ｓｒ＝ステラジアン）として表わされる。
【０２１５】
マウスＬＮおよび脾臓から回収されたｐｐ６５−ＣＴＬの機能分析
ＣＭＶ−ｐｐ６５に対する免疫応答を評価するために、各群からの脾細胞を採取しプールし、ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ３で染色し、ＸＤＰセルソーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて選別した。ヒトＣＤ３＋細胞を、抗ヒトＩＦＮ−γでコーティングした９６ウェルＥＬＩＳＰＯＴプレートにウェル当たり１０．０００細胞の密度で播種し、ｐｐ６５重複ペプチドプール（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）の１０μｇ／ｍＬの存在下で一晩インキュベートした。ＣＭＶ、エプスタイン−バールウイルスおよびインフルエンザウイルスエピトープ（ＰＡＮＡ  Ｔｅｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ、ドイツ）の混合物に対応するＣＥＦリコールペプチドプールをポジティブコントロールとして使用した。翌日、細胞を洗浄し、プレートをさらに、ビオチンコンジュゲート抗ヒトＩＦＮ−γ抗体、続いてアルカリホスファターゼコンジュゲートストレプトアビジンと共にインキュベートした。プレートをＮＢＴ／ＢＣＩＰ液体基質を使用して発色させ、ＡＥＬＶＩＳ  ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（ＡＥＬＶＩＳ  ＧｍｂＨ、ハノーヴァー、ドイツ）で分析した。ＬＮから得られたリンパ球の分析のために、細胞をＳｍｙｌｅＤＣまたはＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５の存在下で７日間エキソビボで増殖させ、ＥＬＩＳＰＴプレート上のｐｐ６５重複ペプチドプールに曝露し、ＩＦＮ−γスポットをカウントした。
【０２１６】
ＨＳＣ−ＮＲＧマウスでの免疫グロブリン産生
再構成２０週間後（第２のＳｍｙｌｅまたはＩＦＮ−ｃｏｎＤＣの８週間後）にＨＳＣ−ＮＲＧマウスから血漿を採取し、別のところで記載したように（Becker, P. D. et al., 2010, "Generation of human antigen-specific monoclonal IgM antibodies using vaccinated "human immune system" mice" PLoS One 5）、全ヒトＩｇＭおよび全ヒトＩｇＧの存在についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。全ＩｇＭおよびＩｇＧの決定を、９６ウェルプレートをＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＭ（Ｆｃ５μ特異的、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）またはＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγフラグメント特異的、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）のいずれかでコーティングすることによって行った。既知のＩｇＭ（０．８ｍｇ／ｍｌ）およびＩｇＧ（１０．４ｍｇ／ｍｌ）濃度を有する対照ヒト血清タンパク質キャリブレータ（Ｄａｋｏ）を、試料と比較する標準として使用した。コーティング後、プレートをＥＬＩＳＡ洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で洗浄し、４％ミルクでブロックし、さらにマウス血漿の連続希釈物（１：５の希釈で開始）と共にインキュベートした。酵素コンジュゲート検出抗体を、ＨＲＰコンジュゲート抗ＩｇＧについては１：２５００の希釈で添加し、ＨＲＰコンジュゲート抗ＩｇＭについては１：５０００の希釈で添加した（両方ともＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから）。ＴＭＢ基質／停止溶液（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を、ＥＬＩＳＡアッセイの発色のために使用した。
【０２１７】
統計分析
パラメトリック（ｔ検定）とノンパラメトリック（Ｋｒｕｓｋａｌｌ−Ｗａｌｌｉｓ）統計分析を行って、ＨＩＳ−ＮＲＧマウスにおける造血系統の生着についての群間の差を比較した。Ｇｒａｐｈ  ｐｒｉｓｍバージョン５ソフトウェアで分析を行った。すべての検定は両側であり、Ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【０２１８】
結果
ＬＶ−誘導Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５生成および特徴付け
本発明者らは最近、ヒト単球におけるヒトＧＭ−ＣＳＦとＩＦＮαの構成的発現を促進するために使用されるインテグラーゼ欠損（ＩＤ）−ＬＶが、インビボで高活性の状態、高い生存力および生着特性を持つ非常に成長したＩＦＮα−ＤＣを誘導したことを示した（Daenthanasanmak, A. et al., 2012, "Integrase-defective lentiviral vectors encoding cytokines induce differentiation of human dendritic cells and stimulate multivalent immune responses in vitro and in vivo" Vaccine 30: 5118-5131）。「Ｓｍｙｌｅ」（自己分化した、骨髄由来の、レンチウイルスによって誘発される）ＤＣと名付けられたこれらのＬＶ誘導ＤＣは、ＣＭＶ外皮ウイルスタンパク質ｐｐ６５の発現のためにＩＤ−ＬＶと共に追加的に同時形質導入することができる。Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５はインビトロおよびインビボで抗ＣＭＶ特異的ＣＴＬ応答を強力に促進した。ここでは本発明者らは、ＧＣＳＦ動員造血幹細胞ドナーから得られた白血球アフェレーシスを用いて、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５  ＤＣ生成の実現可能性をテストすることを目的とした（図１Ａ）。簡単に言えば、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５生成のために、ＧＣＳＦ動員ＨＳＣＴのドナーの白血球アフェレーシスから得たＰＢＭＣの磁気選択によりＣＤ１４＋細胞を単離し、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で前処理し、続いて、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−αを発現する二シストロン性ＬＶと、ＣＭＶ−ｐｐ６５を発現するＬＶと共に一晩ＬＶ同時形質導入した。ＬＶを除去した後、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５は、サイトカインの補充なしに培養液中に維持した。ｐｐ６５を発現する従来のＩＦＮα＿ＤＣ（Ｃｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５）は、同様にＬＶ−ｐｐ６５で形質導入し、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦとＩＦＮαで三日おきに補充される培養液中で維持された単球細胞で生産された。細胞は、それらの分化状態、生存力および表現型の安定性を決定するために、３週間まで細胞を培養した。本発明者らは、培養７日目でＣｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５とＳｍｙｌｅ／ｐｐ６５  ＤＣの同等のレベル（４５％対３５．６％、Ｐ＞０．０５）を回収することができた（図１Ｂ）。重要なことは、培養１４日目ですでにＣｏｎ−ＩＦＮよりも３倍高い回収レベル（３５．４％対１４．２％、Ｐ＝０．０２１）をＳｍｙｌｅ／ｐｐ６５が示した。ＤＣ培養３週間後に、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５とＣｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５の両方が有意に生存能力を失ったが、まだＳｍｙｌｅ／ｐｐ６５は、Ｃｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５と比較してより高いレベルを示した（１７％対５％、Ｐ＜０．０５）。本発明者らはまた、培養期間を通じてＳｍｙｌｅ／ｐｐ６５とＣｏｎ−ＩＦＮ／５ｐｐ６５の分化状態を評価した。ｐｐ６５の同時発現を細胞内染色およびフローサイトメトリー分析によって確認した。ＣＭＶ−ｐｐ６５の発現レベルは、Ｃｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５  ＤＣにおけるよりもＳｍｙｌｅ／ｐｐ６５においてより高く維持された（５５％対２１．２％、Ｐ＝０．０１４）（図１Ｃ）。培養７日目には、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５とＣｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５の両方が、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８６およびＭＨＣ−ＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）の高発現レベルによって特徴付けられる典型的なＤＣ分化表現型を表示した（図１Ｄ）。ＣＤ８０およびＣＤ８３の発現によって示されるように、両方のタイプの細胞は、同等の成熟状態を示した。Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５は、１４日および２１日のより長い培養期間で免疫表現マーカーの安定的な発現を維持した。組換えサイトカインの存在下での培養にもかかわらず、Ｃｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５  ＤＣは脱分化し、分化および成熟マーカーの発現を失った。
【０２１９】
培養液中に維持されたＳｍｙｌｅ／ｐｐ６５およびＣｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５の両方は、いくつかの内因性の上方制御されたサイトカインを分泌した。これらのサイトカインは培養上清中に蓄積し、サイトカインアレイ分析によって検出できた。即ち、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１およびＴＮＦ−αが、Ｃｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５の全体の増強した活性化を示した（図２）。ＩＬ−１β、４、６、８、１２の蓄積レベルは、Ｃｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５培養物についてより高く、このことは、これらの細胞は継続的にいくつかのサイトカインの高レベルに曝露されてはいるものの、関連免疫表現マーカーの発現を維持することに関してそれらの機能は減少したことを意味している。
【０２２０】
Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５はヒトＨＳＣ移植後のリンパ球コンパートメントの回復をサポートする。
ＨＳＣ移植設定で免疫再構成を誘導するＳｍｙｌｅ／ｐｐ６５の可能性を評価するために、本発明者らは最初に４週齢の亜致死的放射線照射ＮＯＤ．Ｒａｇｌ−／−．ＩＬ２ｒγ−／−（ＮＧＲ）マウスにヒトＣＤ３４＋細胞を導入することによって（ＨＩＳ）のヒト化免疫系モデルを樹立した。ＨＳＣＴ後６週目ですでに末梢血中のＣＤ３＋ヒトＴ細胞を検出し（０．３５％）、それはＣＤ３４＋ＨＳＣ導入後２０週間で８．６％の平均頻度に到達した（データは示さず）。ヒトＣＤ１９＋Ｂ細胞が、８４％（６週目）から７７％（２０週目）までのレベルで、検出可能なヒトＣＤ４５＋細胞内で優勢であった（データは示さず）。ＨＩＳ−ＮＲＧのＨＳＣ再構成の２０週間後に、ヒトＣＤ４５＋細胞は全脾臓細胞の３．９％に対応し、ＣＤ１９＋Ｂ細胞がヒト細胞含量の過半数（８４％）に相当した。ヒトＣＤ３＋Ｔリンパ球はヒトＣＤ４５発現細胞の７．８％に対応し、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋を１：１の比で含有していた（データは示さず）。
【０２２１】
次に本発明者らは、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５での免疫がＨＩＳ−ＮＲＧマウスにおける免疫再構成を改善するかどうかを評価した。本発明者らは、ＨＳＣＴ後１０週後のＤＣの１回の注射、続いて１週間後のブースト注射で構成されるプライム／ブースト免疫スキームに従った。ＬＶ形質導入直後に採取したＳｍｙｌｅ／ｐｐ６５または７日間培養したＣｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５の皮下注射によって免疫化を行った。以前に記載されているように（Salguero, G. et al., 2011, "Preconditioning therapy with lentiviral vector-programmed dendritic cells accelerates the homeostatic expansion of antigen-reactive human T cells in NOD.Rag1-/-.IL-2rgammac-/- mice" Hum Gene Ther 22: 1209-1224）、ＤＣ細胞懸濁液（５×１０５）を右側腹部に注射した。非免疫化マウスを対照に供した（図３Ａ）。まず、本発明者らは末梢血中のヒトＣＤ４５＋細胞の再構成に対するＤＣ注射の効果を評価した。１０週目の免疫前ではヒトＣＤ４５＋の頻度はすべての群で同等であった。プライム／ブースト免疫１週間後、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５で免疫したマウスは、非免疫対照と比較して、ヒトＣＤ４５＋細胞の有意に上昇したレベルを示した（１．７％対０．６４％、ｐ＝０．０１）。ＣＤ４５＋細胞の頻度はＣｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５免疫マウスでは有意により高くはなかった（対照と比較して１．６％、Ｐ＝０．０９）。重要なことには、ＣＤ４５＋の有意に上昇したレベルは、対照マウスと比較してＳｍｙｌｅ／ｐｐ６５免疫後８週間維持された（１．９％対０．２％、Ｐ＝０．０３）。Ｃｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５でワクチン接種したマウスもまた、血中ＣＤ４５＋細胞のより高いが有意ではないレベルを示した（１．３％対０．２％、Ｐ＝０．０８）。次に本発明者らは、ＤＣ免疫後のＴ細胞コンパートメントを分析した。Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５免疫は、対照マウスと比較して末梢血中のＣＤ３＋頻度の初期の有意な増加につながり（０．１６％対０．０３％、Ｐ＜０．０４）、ＨＳＣＴ後２０週目で対照と比較してヒトＴ細胞の長期生着をサポートした（１．８％対０．０３％、Ｐ＝０．０４）（図３Ｂ）。顕著なことには、Ｃｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５免疫はＨＩＳ−ＮＲＧマウスにおけるヒトＣＤ３＋Ｔ細胞のレベルの初期の増加も長期的な増加も誘導しなかった（対照と比較して、０．１５％、Ｐ＝０．２６  ＤＣ注射後＋１週；０．３７％、Ｐ＝０．３１  ＤＣ注射後＋８週）。ＤＣ免疫後８週目でのＣＤ４５＋細胞のうちのヒトＴリンパ球の相対頻度の分析により、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５免疫化マウスでのＣＤ３＋コンパートメントの有意な上昇頻度が、対照と比較して（５９．７％対８．６％、Ｐ＝０．０００１）およびＣｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５と比較して（５９．７％対２１．７％、Ｐ＝０．００１）、示され、そして、ヒトＣＤ４５＋細胞の長期の生着がこれらのマウスにおけるヒトＴ細胞コンパートメントの拡大により決定されることが確認された。
【０２２２】
本発明者らはさらに、ＨＳＣ再構成２０週間後のワクチン接種および対照マウスからの脾臓の細胞含量を分析した（図４）。Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５で免疫したマウスは、ヒトＣＤ４５＋の有意により高い生着レベルを、非免疫化マウスに比較して（１９．１％対３．１％、Ｐ＝０．００７）およびＣｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５免疫化マウスに比較して（１９．１％対５．９％、Ｐ＝０．０１）、示した。したがって、対照マウスと比較して、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５免疫化マウスでヒトＣＤ３＋細胞のより高い頻度が観察され（１０．１％対０．３１％、ｐ＝０．００７）、全ヒトＣＤ４５＋細胞の４０．８％に相当した（図４Ａ）。Ｃｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５免疫はＣＤ３＋細胞の頻度を上昇させず（対照に対して０．１７％、Ｐ＝０．５）、脾臓におけるＣＤ４５＋細胞の僅か３．９％に相当した。ＣＤ３＋Ｔ細胞中のリンパ球サブセットの分布をさらに再構成ＮＲＧマウスの脾臓で分析した（図４Ｂ）。本発明者らは三つの群ＣＤ３＋／ＣＤ８＋細胞間に有意差を観察しなかったが（対照、５１％；Ｃｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５  ４０．９％；Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５  ４４．２％、Ｐ＞０．０５）、非免疫化コントロールと比較して、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５免疫化脾臓細胞におけるＣＤ８＋／ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブ細胞の有意に減小したレベルを観察した（１２．３％対３７．４９％、Ｐ＝０．０３）。これに反して、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５におけるＣＤ８＋／ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ−エフェクターメモリーＴ細胞の頻度は、対照ＮＲＧマウスよりも有意に高かった（３８．５％対１９．５％、ｐ＝０．０４）。ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの同様ではあるが有意ではない分布が、ナイーブ集団（１４．５％）とエフェクターメモリー（２４．７％）集団についてＣｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５  ＤＣで注射したマウスで見出された。ＣＤ３＋／ＣＤ４＋頻度の分析では、全ＣＤ４＋Ｔ細胞についてマウス群の間で統計学的な差は認められなかった（対照、４４．７％；Ｃｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５  ３４．７％；Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５  ５０％、Ｐ＞０．０５）。それにもかかわらず、Ｃｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５とＳｍｙｌｅ／ｐｐ６５の免疫による、対照と比較したナイーブ細胞の減少とエフェクターメモリーＴ細胞の増加がまた見られたが有意ではなかった。これらのデータを一緒に考慮すると、ＨＳＣＴ後のヒトＳｍｙｌｅ／ｐｐ６５免疫が、Ｔ細胞コンパートメントの迅速かつ持続的な再構成を推進し、主にエフェクターメモリー表現型でより少ない程度のＣＤ４＋で、ＣＤ８＋Ｔ−の増殖を著しくサポートした。
【０２２３】
Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５免疫は末梢リンパ節の再構成を誘導する。
次に本発明者らは、ＨＳＣ再構成２０週間後のリンパ節（ＬＮ）の存在について、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５またはＣｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５  ＤＣで注射したマウスを分析した。本発明者らは、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５で注射したマウスで高い頻度のＬＮ形成を検出したが（６５％）、他方、対照マウスまたはＣｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５で注射したマウスはＬＮ構造の低い発生を示した（それぞれ１１％および２８％）（図５Ａ）。動物体の異なる領域におけるＬＮの頻度の定量により、ＤＣの注射部位と対応する流入領域におけるＬＮの形成との間の強い相関関係が明らかになった（図５Ｂ）。鼠径（５７％）、腸骨（３５％）および腋窩（５６％）のＬＮが、同じサイドでの対照マウスにおけるＬＮの完全な不存在に比較して、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５で免疫化したマウスで観察された。重要なことには、Ｃｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５注射によっては、腸骨ＬＮの形成は誘導されず、マウスにおいて鼠径および腋窩ＬＮの形成のみをそれぞれ１４％および２８％で誘導した。
【０２２４】
次いで本発明者らは、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５で免疫化したＮＲＧのマウスから得られたＬＮの免疫組織学的分析を行った。再構成されたＮＲＧからのＬＮにおけるＬＮ構造は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６から得られた正常な野生型ＬＮに比べて、Ｂ細胞濾胞性の欠如を示した（図６）。ヒト化ＬＮは、主にヒトＣＤ３＋Ｔ細胞によって満たされ、本発明者らはまたヒトＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋）の存在を観察した。ＬＮは、マウスリンパ血管細胞（ＬＹＶＥ−１）およびマウス内皮血管ＣＤ３１マーカーに陽性の細胞の層によってカプセル化された。重要なことには、本発明者らはまた、形成ＬＮ内の基本的な血管組織のプロセスを示唆する、マウスＣＤ３１に陽性の高内皮細静脈（ＨＥＶ）に似た構造の存在を観察した。
【０２２５】
次いで本発明者らは、注射されたＳｍｙｌｅ／ｐｐ６５  ＤＣがＨＩＳ−ＮＲＧマウスで形成された再構成ＬＮに移行することができるかどうかを評価した。Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５を、ホタルルシフェラーゼ（ＬＶ−ｆＬＵＣ）を発現するＬＶと共に、それらがルシフェリンへの曝露の際に生物発光を作り出すことができるように、同時形質導入した。免疫６週間後にＨＳＣ−ＮＲＧマウスの後肢の、ＬＮがより頻繁に見出される右側（図７）に、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５−ｆＬＵＣを注射した。ＤＣ移行のための対照として、本発明者らは反対側の脇腹にｆＬＵＣ−Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５を注射した。ｆＬＵＣ−Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５の生着および移行を、インビボ生物発光イメージングによって毎週追跡した。本発明者らは、反対側の脇腹の同じ場所に比べて、ＤＣ注射後２１日目の注射側のＬＮ位置に生物発光シグナルの蓄積を見出した。さらに、マウスを安楽死させ、ＬＮが露出したところ、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５の発光は、形成された鼠径ＬＮに位置しており、同側腋窩ＬＮだが、腸間膜などの腹腔内ＬＮではなかった（図７）。このデータは、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５  ＤＣは、特定領域排出ＬＮ原基が位置する部位に移行することができ、ＬＮ形成をトリガーできることを示している。
【０２２６】
Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５はＨＩＳ−ＮＲＧマウスにおける特異的免疫応答を誘導する。
Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５が末梢血リンパ球（ＰＢＬ）マウスモデルで抗ｐｐ５６特異的応答を促進することを本発明者は以前に証明している（Daenthanasanmak, A. et al., 2012, "Integrase-defective lentiviral vectors encoding cytokines induce differentiation of human dendritic cells and stimulate multivalent immune responses in vitro and in vivo." Vaccine 30: 5118-5131）。ここでは本発明者らは、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５免疫再構成ＮＲＧマウスがＣＭＶ−ｐｐ６５に対する特異的Ｔ細胞応答を促進できるかどうかを評価した。本発明者らは、ＬＮ形成におけるＳｍｙｌｅ／ｐｐ６５の有意な効果を観察しているので、まずこれらの知見は、局所的ＬＮでのＣＭＶ−ｐｐ６５に対する増強した抗原特異的反応性と相関するかどうかをテストすることを望んだ。本発明者らは最初に、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５免疫後に再構成されたＬＮの細胞含量をフローサイトメトリーにより評価した。ＬＮ細胞の大部分はヒトＣＤ４５＋（７７％）で、その７３％がＣＤ３＋Ｔリンパ球に対応し、３．８％がＣＤ１９＋Ｂ細胞に対応していた（図８Ａ）。ヒトＣＤ３＋細胞の中で、４２％がＣＤ４＋で５６％がＣＤ８＋で、両方のＴ細胞サブセットについてエフェクターメモリー表現型の優位性を有している（それぞれ８０％および７６％）（図８Ｂ）ことが見出された。ＣＭＶ−ｐｐ６５特異的応答を測定するために、ＬＮ細胞を、免疫後８週目で単離し、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５  ＤＣの存在下でエキソビボで７日間拡大させた。ＣＭＶ−ｐｐ６５抗原を発現しないＳｍｙｌｅＤＣを対照として供した（図８Ｃ）。ＤＣ同時培養後、細胞を回収し、ＩＦＮ−γでコーティングしたプレートに播種し、ＣＭＶ−ｐｐ６５重複プールペプチドで再刺激し、ＩＦＮ−γ産生についてＥＬＩＳＰＯＴにより分析した。ＣＭＶ反応性の健康なドナーからのＰＢＭＮＣをＩＦＮ−γ産生のためのポジティブコントロールとして使用した。顕著なことには、抗原なしのＳｍｙｌｅＤＣの存在下のＬＮ細胞と比較して、ＬＮ細胞はエキソビボ拡大後にＣＭＶ−ｐｐ６５に対して有意な反応性を示した（５３対１８．７スポット、Ｐ＜０．０２１、ｎ＝５マウスドナー）（図８Ｃ）。さらに本発明者らは、対照、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５およびＣｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５免疫化ＮＲＧマウスの脾臓からヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を回収することにより、ＣＭＶに対する全身特異的免疫応答を評価した（図８Ｄ）。ヒト組換えＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下でのヒト抗ＣＤ２、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ビーズとの４８時間インキュベート、続いてＩＬ７／ＩＬ１５の存在下での追加的７日間のＳｍｙｌｅ／ｐｐ６５  ＤＣとの同時培養により、本発明者らは最初にＴ細胞の増殖を促進した。ＣＭＶ−ｐｐ６５の発現を欠くＳｍｙｌｅＤＣと同時培養した細胞を対照に供した。Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５で免疫しさらにＳｍｙｌｅ／ｐｐ６５で拡大したＨＳＣ−ＮＲＧマウスの脾臓から回収したＴ細胞は、対照と比較して、平均化した陽性スポットの有意な増加を示した（３３．６スポット対０．５スポット、Ｐ＜０．０５）（図８Ｄ）。それとは反対に、Ｃｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５で注射したマウスの脾臓から回収したＴ細胞は減少したＣＭＶ−ｐｐ６５を有していた（１５．５平均スポット、ｐ＞０．０５対Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５）。
【０２２７】
ＨＳＣ−ＮＧＲマウスにおける免疫グロブリンの産生
本発明者らは、免疫後に再構成されたＮＲＧマウスＤＣにおけるＢリンパ球コンパートメントを特徴付けした。ＣＤ１９＋Ｂリンパ球（これは比較的初期のＢ細胞集団である）の頻度は、すべての事前免疫群間で有意差はなかった（対照、Ｃｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５およびＳｍｙｌｅ／ｐｐ６５について、それぞれ１．６％、４．５％および２％）（図９Ａ）。第２のＤＣ免疫後１週目のＣＤ１９＋Ｂ細胞の全体的レベルは減少したが、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５で注射したＮＲＧマウスは、対照およびＣｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５注射マウスに比較して、Ｂ細胞のより高い頻度を示した（１．１％対それぞれ０．４％および０．９％、ｐ＝０．０２）。免疫後８週間によって、Ｂ細胞の全体的頻度はすべての群で１未満であった（対照０．１８％；Ｃｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５  ０．１％；Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５  ０．３７％）。本発明者らはまた、免疫後８週目の脾臓でＢ細胞を回収することができ、対照マウス（２．５％）、Ｃｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５免疫ＮＲＧマウス（５．１％）およびＳｍｙｌｅ／ｐｐ６５免疫ＮＲＧマウス（７．８％）で、ヒトＣＤ１９＋細胞の有意差は観察できなかった。再構成マウスにおけるヒトＢ細胞の機能性を評価するために、本発明者らはさらに、ＤＣ免疫８週間後のＮＲＧマウスからの血漿中の免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ濃度およびＭ濃度を測定した。顕著なことには、対照マウス（０．７８μｇ／ｍＬ）およびＣｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５免疫マウス（０．０４７μｇ／ｍＬ）でのほとんど検出不可能なレベルに比較して、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５注射マウスでの有意なより高いＩｇＧレベル（５９．６μｇ／ｍＬ）を見出した。同様に、ＩｇＭ濃度は、対照マウスおよびＣｏｎ−ＩＦＮ／ｐｐ６５マウス（それぞれ０．１５μｇ／ｍＬおよび０．０１μｇ／ｍＬ）に比較して、Ｓｍｙｌｅ／ｐｐ６５注射マウスからの血漿ではより高かった（２６．６％）。
【０２２８】
考察
ＤＣは、適応ＴおよびＢ細胞免疫応答を刺激するための最も効果的な部位であるＬＮの展開を組織化するための中枢である。上記したｉＤＣ（ＩＤＬＶ−ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５）の様相を用いて、本発明者らはヒトＨＳＣを移植した免疫不全マウス系統におけるＤＣワクチン接種の効果を評価した。移植されたヒト造血幹細胞前駆体／幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞など）を用いたリンパ球減少性マウスモデルが、マウスでのヒト免疫システムを再構成するために世界中で開発されている（Lepus CM et al. "Comparison of Human Fetal Liver, Umbilical Cord Blood, and Adult Blood Hematopoietic Stem Cell Engraftment in NOD-scid/γc-/-, Balb/c-Rag1-/-γc-/-, and C.B-17-scid/bg Immunodeficient Mice". Human immunology. Oct 2009;70(10):790-802）。これらのモデルは、探求されてきており、いくつかの系統での骨髄ニッチでのＨＳＣ生着、動員、自己再生、分化などの血液学的再構成のいくつかのステップに従っている。ＨＳＣＴ後のこれらのマウスの長期間（１６〜２０週間）のフォローアップにより、一般的にＣＤ８＋Ｔ細胞の維持が損なわれることが示されている（Andre MC et al. "Long-term human CD34+ stem cell-engrafted nonobese diabetic/SCID/IL-2R gamma(null) mice show impaired CD8+ T cell maintenance and a functional arrest of immature NK cells". J Immunol. Sep 1 2010;185(5):2710-2720.）。ヒトＨＳＣ移植マウスは、生存性で機能的なＴ細胞を含む再生されたＬＮを展開しなかった。リンパ節は特殊化した組織であり、そこでは排出されたリンパが病原条件（感染症、がんなど）の免疫モニタリングのために濾過される。その特殊化した構造により、リンパ節は、適応免疫応答のプライミングおよび増幅のためにＴ細胞への抗原提示の最適化を可能にする。ヒト化マウスでＬＮから生成された抗原特異的ＣＴＬ応答の証明は、適応免疫応答に重要なヒトサイトカイン（例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＧＭＣＳＦ）のトランスジェニック発現の探索などのすでに利用可能なアプローチを使用して、あるいは単一のヒトＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子のトランスジェニックアプローチによっては、これまで記載されていない。一方、ここで記載したｉＤＣの免疫アプローチは、免疫欠損宿主に一緒に、いくつかのヒトサイトカインと高度に免疫原性の抗原（いくつかの異なるＭＨＣ拘束免疫応答を刺激することが知られている）との組合せを発現するヒト幹細胞移植によって、発現されるすべてのＭＨＣ分子に完全にマッチした高度に生存性のヒトプロフェッショナル抗原提示細胞をもたらす。かくして、これらの特性に基づいて、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５免疫は、末梢血中を循環するヒトＴ細胞の絶対的頻度の劇的な増加、ｐｐ６５ＣＭＶウイルス抗原に対するＣＴＬ応答、およびマウスにおける適応性ヒト免疫応答が再生されていたことを証明する血漿中のヒトＩｇＧの高レベルをもたらす。
【０２２９】
さらに、ヒトＨＳＣで再構成された免疫不全マウスにおける適応性ＴおよびＢ細胞免疫応答の刺激と同時にリンパ節の再生を促進するｉＤＣの能力は、移植されたヒトＨＳＣからの機能的免疫系の一般的な再生をサポートする特性をｉＤＣが有していることを示す。このように、ｉＤＣは、完全に機能的な免疫系の展開を促進し、したがって感染症またはＨＳＣ移植後の悪性疾患の再発に対するに感受性を低下させるために、ＨＳＣを移植したヒト患者において使用することができる。
【実施例２】
【０２３０】
（実施例１に基づく、しかし、付加的なデータおよび結果の部分的に拡大させた分析を含む）
材料および方法
レンチウイルスベクターの構築およびインテグラーゼ欠損レンチウイルスの作製
自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスバックボーンベクターおよびＣＭＶ−ｐｐ６５を発現する単シストロン性ベクターは、以前に記載されている（Sato, Caux et al. 1993；Salguero, Sundarasetty et al. 2011）。ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｈｕＧＭ−ＣＳＦ）を発現する二シストロン性レンチウイルスベクターおよびＰ２Ａエレメントを間に入れたヒトインターフェロンアルファ（ｈｕＩＦＮ−α）（ＬＶ−Ｇ２α）（ＲＲＬ−ｃＰＰＴ−ＣＭＶ−ｈＧＭＣＳＦ−Ｐ２Ａ−ｈＩＬ４）の構築は、以前に記載されたように、構築され広範に特徴付けられている（Daenthanasanmak, Salguero et al. 2012）。全ての構築物の構造的完全性は、制限消化およびプロモーターおよび導入遺伝子のシーケンシング分析によって再確認した。レンチウイルスの大規模作製を、以前に記載されているように、ヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞の一過性同時トランスフェクションによって行った（Stripecke 2009）。インテグラーゼ欠損レンチウイルスを生成するために、同時トランスフェクションにおいて以下の４つのパッケージングプラスミド：サイトカインを発現するレンチウイルスベクターを含有するプラスミド、インテグラーゼ遺伝子にＤ６４Ｖ点変異を含有するｇａｇ／ｐｏｌを発現するプラスミド（ｐｃＤＮＡ３ｇ／ｐＤ６４Ｖ．４ｘＣＴＥ）、ｒｅｖを発現するプラスミド（ｐＲＳＶ−ＲＥＶ）、およびＶＳＶ−Ｇエンベロープをコードするプラスミド（ｐＭＤ．Ｇ）を使用した。ウイルス上清を回収し、超遠心分離によって濃縮し、力価を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）を使用してｐ２４抗原濃度を見積もることによって評価した。１μｇのｐ２４相当物／ｍｌは、約１×１０７の感染性ウイルス粒子／ｍｌに相当する。
【０２３１】
ヒトＣＤ３４陽性末梢血幹細胞の単離
Ｇ−ＣＳＦ（Ｇｒａｎｏｃｙｔｅ、Ｃｈｕｇａｉ  Ｐｈａｒｍａ）での造血幹細胞動員レジメンに付した造血性成体幹細胞移植成体ドナーの白血球アフェレーシスから末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得た。全ての試験を、ハノーヴァー医科大学の倫理審査委員会によって承認されたプロトコールに従って行った。造血性幹細胞（ＨＳＣ）ＣＤ３４磁気細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ−Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＭＡＣＳによってＣＤ３４＋細胞を陽性選択した。２回の磁気での陽性選択の後にフローサイトメトリーによる評価で得られた細胞の純度は９９％超であり、ＣＤ３＋Ｔ細胞の混入は０．２％未満であった。
【０２３２】
ヒト従来およびＳｍｙｌｅＤＣの生成
自家ＣＤ３４陰性ＰＢＭＣ画分を使用して、ＣＤ１４単離ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いるＣＤ１４＋単球のさらなる陽性選択を行った。レンチウイルス遺伝子導入のために、単球を、導入前に８時間、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４（それぞれ５０ｎｇ／ｍｌ、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の存在下の無血清Ｃｅｌｌｇｒｏ培地での培養液中に維持した。ＳｍｙｌｅＤＣの生成のために、５×１０６のＣＤ１４＋単球を、５μｇ／ｍｌ硫酸プロタミン（Ｖａｌｅａｎｔ、Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の存在下、ＩＤ−ＬＶ−Ｇ２αおよびＩＤ−ＬＶ−ｐｐ６５両方の２．５μｇ／ｍＬ  ｐ２４相当物（５の感染多重度Ｍ．Ｏ．Ｉ．）を用いて形質導入した。１６時間の導入後、ＳｍｙｌｅＤＣを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、さらに無血清Ｃｅｌｌｇｒｏ培地での培養液中に維持した。従来の（Ｃｏｎｖ）ＤＣの産生のために、上記のように、単球をＩＤ−ＬＶ−ｐｐ６５と共にインキュベートした。１６時間の導入後、ＬＶを除去し、細胞を、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮ−α（１０００Ｕ／ｍｌ、ＰＢＬ  ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｏｕｒｃｅ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）の存在下で、７日間培養液中にさらに維持した。サイトカインを３日ごとに補給した。マウス免疫化のために、ＳｍｙｌｅＤＣを導入後直接的にまたはＣｏｎｖＤＣを培養の７日目に、ＰＢＳに再懸濁し、マウス注射に使用した。生存度、ＤＣ免疫表現型およびサイトカイン放出を、培養の７、１４および２１日後に、ＳｍｙｌｅまたはＣｏｎｖＤＣにおいて見積もった。生菌数の数を、トリパンブルー排除によって決定した。
【０２３３】
ヒトＨＳＣを用いたマウス移植
ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｒａｇ１ｔｍ１Ｍｏｍ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ（ＮＯＤ；Ｒａｇ１−／−；ＩＬ−２ｒγ−／−、ＮＲＧ）マウスを飼育し、ＩＶＣシステム（ＢｉｏＺｏｎｅ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）での病原菌を含まない条件下で維持した。マウスが関与する全ての手順は、ニーダーザクセン州によって審査および承認され、ハノーヴァー医科大学の動物施設によって提供されるガイドラインに従った。ＨＳＣ移植については、４週齡のマウスを、１３７Ｃｓカラム照射器（Ｇａｍｍａｃｅｌｌ  ３０００  Ｅｌａｎ、Ｃａｎａｄａ）を使用して亜致死照射した（４５０ｃＧｙ）。マウスレシピエントの尾静脈に５×１０５のヒトＣＤ３４＋細胞を静脈内注射した。ヒト造血細胞の生着をモニタリングするために、マウスをヒトＨＳＣ移植後の異なる時点（６、１０および１３）で採血し、最終分析のため２０週目で屠殺した。ＤＣ注射を、ＨＳＣ移植後１０週で行い、続いて１１週目に追加免疫した。簡単に述べると、ＳｍｙｌｅまたはＣｏｎｖＤＣを、培養プレートから収集し、１００μＬのＰＢＳ中に５×１０５細胞の濃度で再懸濁し、２７ゲージ針を用いてマウスの右後肢に皮下注射した。
【０２３４】
フローサイトメトリー分析
ヒトＨＳＣ再構成マウスにおけるヒト造血性細胞の生着を、以下のマウス抗ヒト抗体：ＰｅｒＣＰ抗ＣＤ４５、Ａｌｅｘａ７００抗ＣＤ１９、Ｐａｃｉｆｉｃ  ｂｌｕｅ（ＰＢ）抗ＣＤ４、ＡＰＣ抗ＣＤ３、ＰＥ−Ｃｙ７抗ＣＤ８、ＦＩＴＣ抗ＣＤ４５ＲＡ、ＰＥ抗ＣＤ６２Ｌ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ抗ＣＤ１４、ＦＩＴＣ抗Ｌｉｎｅａｇｅ陽性、ＡＰＣ抗ＣＤ１１ｃ、ＰＥ抗ＣＤ１２３（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて末梢血、脾臓およびＬＮで評価した。ヒトＢ細胞亜集団の特徴付けについて、次の蛍光色素コンジュゲート抗体：ＰＢ抗ＣＤ４５、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ６０５抗ＣＤ１９、ＰＥ抗ＣＤ２７、ＰＥ−Ｃｙ７抗ＣＤ３８、ＦＩＴＣ抗ＩｇＤ、Ａｌｅｘａ７００抗ＩｇＧ、ＡＰＣ抗ＩｇＭ、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５抗ＣＤ２４およびＡＰＣ−Ｃ７抗ＣＤ３を使用した。濾胞性Ｔヘルパー細胞を、ＰＢ抗ＣＤ４５、Ａｌｅｘａ７００抗ＣＤ１４／ＣＤ１９、ＦＩＴＣ抗ＣＤ３、ＡＰＣ−Ｃ７抗ＣＤ４、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５抗ＣＸＣＲ５、ＡＰＣ抗ＰＤ１およびＰＥ−Ｃｙ７抗ＩＣＯＳを用いた染色によって特徴付けした。末梢血分析のために、血液を室温で５分間、赤血球溶解バッファー（０．８３％塩化アンモニウム／２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２）との２回のインキュベーションにより溶解し、続いて冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて安定化し、３００ｇで５分間の遠心分離を行った。細胞を４℃で３０分間抗体と共にインキュベートした。採取した脾臓細胞を、赤血球溶解バッファー（０．８３％塩化アンモニウム／２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２）で５分間処理し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、氷上で３０分間抗体と共にインキュベートした。洗浄工程後、細胞をＰＢＳに再懸濁し、ＬＳＲ−ＩＩまたはＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で取得した。ＤＣ表現型の特徴付けのために、以下の抗ヒト抗体：ＡＰＣ抗ＣＤ１１ｃ、ＰＥ抗ＣＤ１４、ＡＰＣ抗ＣＤ３、ＰＥ抗ＣＤ８０、ＰｅｒＣＰ抗ＨＬＡ−ＤＲ、ＡＰＣ抗ＣＤ８６、ＡＰＣ抗ＣＤ８３（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびＦＩＴＣ抗ＣＭＶｐｐ６５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用した。ＤＣの染色のために、細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄し、氷上でマウスＩｇＧ（５０μｇ／ｍＬ）と共に１５分間インキュベートし、続いて抗体と共にインキュベートした。細胞を洗浄し、細胞固定液（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に再懸濁し、さらにＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒサイトメーターを用いて分析した。全ての分析は、ＦｌｏＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）ソフトウェアを用いて行った。
【０２３５】
リンパ節ドレナージ分析
後肢リンパドレナージの評価を、以前に記載された方法論（Harrell, Iritani et al. 2008）に適合させた。簡単に述べると、マウスに、２０〜３０μＬの５％エバンスブルーを右後肢に皮下注射した。注射後、色素を、リンパ管に３０分間取り込ませた。マウスを、安楽死させ、解剖して、鼠径部および腋窩部の流出ＬＮおよびリンパ管の位置を捜し当てた。
【０２３６】
マウスＬＮおよび脾臓から回収されたｐｐ６５−ＣＴＬの機能分析
ＣＭＶ−ｐｐ６５に対するＴ細胞免疫応答を評価するために、脾細胞を採取し、ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ３で染色し、ＸＤＰセルソーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて選別した。ヒトＣＤ３＋細胞を、ヒト抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８コンジュゲート磁気ビーズ（Ｍｙｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によりビーズ対細胞比１：２において活性化し、２００ｎｇ／ｍＬのヒト（ＩＬ）−２、５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−７および５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５の存在下においてＸ−Ｖｉｖｏ培地において培養した。Ｔ細胞を、ＳｍｙｌｅＤＣをＤＣ−Ｔ細胞比を１：１０でさらなる７日間での同時培養によってさらに増殖させた。ＬＮ細胞も、上記のように、採取し、ＳｍｙｌｅＤＣと直接インキュベートした。ＣＭＶ特異的なＩＦＮ−γ産生について、増殖したＴ細胞（脾臓から単離された）、ＬＮまたはＰＢＭＣ（ＣＭＶ反応性健常ドナー由来）（２０．０００細胞）を、抗ヒトＩＦＮ−γでコーティングした９６ウェルＥＬＩＳＰＯＴプレートに播種し、１０μｇ／ｍＬのｐｐ６５重複ペプチドプール（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）またはペプチドなしの存在下で一晩インキュベートした。翌日、細胞を洗浄し、プレートをさらに、ビオチンコンジュゲート抗ヒトＩＦＮ−γ抗体、続いてアルカリホスファターゼコンジュゲートストレプトアビジンと共にインキュベートした。プレートを、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ液体基質を使用して発色させ、ＡＥＬＶＩＳ  ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（ＡＥＬＶＩＳ  ＧｍｂＨ、Ｈａｎｎｏｖｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で分析した。
【０２３７】
ヒト造血性細胞生着の組織学および免疫組織化学的分析
ヒトＨＳＣ再構成ＮＲＧまたはＣ５７ＢＬ／６野生型マウスからのＬＮを採取し、凍結保存のための最適切削化合物（８．Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）に包埋した。凍結切片（５μｍ）をアセトンで固定し、モノクローナル抗ヒトＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、抗ヒトＰｅ−Ｔｅｘａｓ  ＲｅｄコンジュゲートＣＤ８、抗ヒトＣＤ１１ｃ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ１９（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗マウスＬＹＶＥ−１（Ｄａｋｏ）、抗マウスＣＤ３１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。免疫蛍光分析をＡｘｉｏｃａｍ蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で行い、画像をＡｘｉｏｗｅｒｔソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を用いて作成した。
【０２３８】
ＨＳＣ−ＮＲＧマウスにおける免疫グロブリン産生
再構成２０週間後、ＨＳＣ−ＮＲＧマウスから血漿を採取し、別のところで記載されたように（Becker, Legrand et al. 2010）、全ヒトＩｇＭおよび全ヒトＩｇＧの存在についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。全ＩｇＭおよびＩｇＧの決定を、９６ウェルプレートをＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＭ（Ｆｃ５μ特異的、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）またはＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγフラグメント特異的；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）のいずれでコーティングすることによって行った。既知のＩｇＭ（０．８ｍｇ／ｍｌ）およびＩｇＧ（１０．４ｍｇ／ｍｌ）濃度を有する対照ヒト血清タンパク質キャリブレータ（Ｄａｋｏ）を、試料と比較する標準として使用した。コーティング後、プレートをＥＬＩＳＡ洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で洗浄し、４％のミルクでブロックし、さらにマウス血漿の連続希釈物（１：５の希釈で開始）と共にインキュベートした。酵素コンジュゲート検出抗体を、ＨＲＰコンジュゲート抗ＩｇＧについては１：２５００の希釈で添加し、ＨＲＰコンジュゲート抗ＩｇＭについては１：５０００の希釈で添加した（両方ともＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから）。ＴＭＢ基質／停止溶液（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を、ＥＬＩＳＡアッセイの発色のために使用した。
【０２３９】
ヒトサイトカインの分析：
ＤＣ培養上清およびマウス血漿におけるヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインの検出を、蛍光ビーズに基づく１４−ｐｌｅｘ  Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイを製造者のプロトコール（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に従い行った。１４−ｐｌｅｘアッセイにより、サイトカインＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１０、ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−７、ＩＬ−２およびＩＬ−１２（ｐ７０）が測定された。ＤＣ上清およびマウス血漿におけるＩＦＮ−αの検出を、市販されているＥＬＩＳＡキット（Ｍａｂｔｅｃｈ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）によって行った。
【０２４０】
インビボ生物発光イメージング分析
マウスをケタミン（腹腔内に１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（腹腔内に１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、ｄ−ルシフェリンの水溶液（腹腔内に１５０ｍｇ／ｋｇ）をイメージングのに５分前に注射した。マウスを電荷結合素子カメラ（ＩＶＩＳ  ２００、Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ｃｒａｎｂｕｒｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）の暗いチャンバーに入れ、弱い照明下でグレースケール体表面基準画像（デジタル写真）を撮像した。光源のスイッチを切った後、動物の体内のルシフェラーゼ発現細胞から放出され、組織を透過した光子を、Ｉｇｏｒ（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ、ＵＳＡ）上のオーバーレイとしてソフトウェアプログラムＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用して、５分間までの規定時間にわたって定量した。解剖学的な局在化について、光強度（青色、最小強度；赤色、最大強度）を表す疑似カラーイメージを、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅで生成し、グレースケール参照基準上に重ねた。定量した発光は、動物の表面上に平均化光子放射輝度で構成され、光子／ｓｅｃ／ｃｍ２／ｓｒ（ｓｒ＝ステラジアン）として表わされる。
【０２４１】
組織中のレンチウイルスコピーの分析に関するリアルタイムＰＣＲ
全ゲノムのＤＮＡを、脾臓およびリンパ節（左および右の脇腹）から、ＱｉａＡｍｐ  ＤＮＡ血液ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、製造業者の指示に従って抽出した。ベクター由来のコピー数を、以前に記載（Maetzig T et al., 2010およびRothe M, et al., 2012）されたように、定量的なリアルタイムＰＣＲによって決定した。上記工程から調製された１００ｎｇ／２μＬのゲノムＤＮＡを、ｗＰＲＥ（マーモット肝炎ウイルスポスト転写性調節エレメント；ｗＰＲＥフォワード：５’−ＧＡＧＧＡＧＴＴＧＴＧＧＣＣＣＧＴＴＧＴ（配列番号９）、ｗＰＲＥリバース：５’−ＴＧＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＡＡＴＧＣＣ（配列番号１０）またはＰＴＢＰ２（ポリピリミジントラクト結合タンパク質２）；ＰＴＢＰ２フォワード：５’−ＴＣＴＣＣＡＴＴＣＣＣＴＡＴＧＴＴＣＡＴＧＣ（配列番号１１）、ＰＴＢＰ２リバース：５−ＧＴＴＣＣＣＧＣＡＧＡＡＴＧＧＴＧＡＧＧＴＧ（配列番号１２）に関する、１μＬのプライマー混合物と混合された７．５μＬのＳＹＢＲＴａｑを含有し、容量を１３μＬにＰＣＲグレードのヌクレアーゼフリー水を用いて調整している１３μＬのＲＱ−ＰＣＲ混合物に添加した。これらの２つの単位複製配列を含有しているプラスミドベクター（ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ、ハノーヴァー医科大学の実験血液学部門のＭｉｃｈａｅｌ  Ｒｏｔｈｅの好意により提供された）を、４ログにわたる既知の希釈を用いた標準曲線に使用した。全ての試料を、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析した。サイクリング条件は、９５℃で１０分間、４０サイクルの９５℃で１５ｓ、５６℃で２０ｓおよび６５℃で３０ｓであった。結果を、プライマーペア特異的なリアルタイムＰＣＲ効率を利用することによっておよび試料ＣＴ値をプラスミドベクター（ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ）を用いて作成された標準曲線と比較することによって定量した。データを、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって分析した。
【０２４２】
ＧＶＨＤの組織学的分析
皮膚および腸から代表的な試料を、採取し、常法通りホルマリン固定し、パラフィン包埋した。２μｍ切片を、ブロックから切断し、ＨＥに対して染色した。経験を積んだ血液病理学者が、動物の処置群をブラインドにしたスライドを再検討した。半定量的スコア（Lerner KG et al. Transplant Proc 1974 6:367-371に従って改変）を使用して、組織学的な変化のスコアをつけた。ＧＶＨＤグレード１は、構造的な変化を伴わない単一または複数のアポトーシス性形態（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｆｉｇｕｒｅ）によって規定される。グレード２は、複数のポトーシス性形態およびクリプトまたは皮膚付属物の脱落を示す。グレード３は、付加的な表面ネクローシスおよびクリプトまたは皮膚付属物の重篤な欠損を示す。
【０２４３】
統計分析
パラメトリック（ｔ検定）およびノンパラメトリック（Ｋｒｕｓｋａｌｌ−Ｗａｌｌｉｓ）統計分析を行って、ＮＲＧマウスにおけるヒト造血系統の生着について群間の差を比較した。Ｇｒａｐｈ  ｐｒｉｓｍバージョン５ソフトウェアで分析を行った。すべての検定は両側であり、ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【０２４４】
結果
ＳｍｙｌｅＤＣの生成およびインビトロでの特徴付け
ＩＤ−ＬＶを用いる、ｈｕＧＭ−ＣＳＦ、ｈｕＩＦＮ−αおよびＣＭＶ−ｐｐ６５ウイルス性抗原のヒト単球への遺伝子導入により、インビトロおよびインビボで持続性ＳｍｙｌｅＤＣ（Lerner KG et al. Transplant Proc 1974 6:367-371）が生成された。本発明者らは、これらの条件下、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を量的遺伝子レポーターとして用いて、１０〜５０％の間の伝達効率を観察した。本発明者らは、本発明者らのプロトコールを適合させて、Ｇ−ＣＳＦ−動員ＨＳＣドナーから得られたＰＢＭＣからのＣＤ３４−フラクションからＤＣを生成させた（図１０）。対照ＣｏｎｖＤＣを、単球にｐｐ６５を発現するＩＤ−ＬＶベクター（図１１Ａ）を導入することによって生産し、組換え型ｈｕＧＭ−ＣＳＦ／ｈｕＩＦＮ−αの存在下での培養で維持した。ＳｍｙｌｅＤＣの生成について、単球は、加えて、ｈｕＧＭ−ＣＳＦ／ｈｕＩＦＮ−α導入遺伝子を発現するバイシストロニックＩＤ−ＬＶを同時形質導入され（図１１Ａ）、サイトカインの非存在下で維持された。蓄積されたヒトＩＦＮ−α（２．０ｎｇ／ｍＬ）およびＧＭ−ＣＳＦ（０．３ｎｇ／ｍＬ）のレベルを、２１日までの連続培養において検出した（図１１Ｂ）。ＣｏｎｖＤＣと比較して、ＳｍｙｌｅＤＣ培養は、有意に高い細胞生存度（７日目、４５対３６％、ｐ＞０．０５；１４日目、３５対１４％、ｐ＝０．０２１；２１日目、１７対５％、ｐ＜０．０５、図１１Ｃ）および細胞内ｐｐ６５発現（１４日目にピーク、５５対２１％、ｐ＝０．０１４、図１１Ｄ）を提示した。本発明者らはＤＣにおいてｐｐ６５を量的遺伝子レポーターとして検証していないが、このデータはＧＦＰをマーキング遺伝子として用いる本発明者らの経験と相関する。培養の２１日後、両方のＤＣタイプは単球マーカーＣＤ１４＋の発現を喪失し（図１１Ｅ）、他方で、ＤＣ表面マーカーＣＤ１１ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ８３およびＣＤ８０はＳｍｙｌｅＤＣにおいて持続性に発現した（図１１Ｆ）。ＣｏｎｖＤＣおよびＳｍｙｌｅＤＣによって分泌されるサイトカインの分析により、化学誘引性タンパク質ＭＣＰ−１およびＩＬ−８のｎｇ／ｍｌレベルでの高い安定的な産生が明らかにされた（図１１Ｇ）。ＣｏｎｖＤＣは、高レベルのＤＣ２−タイプインターロイキンＩＬ−６およびＩＬ−４も分泌した。いくつかの他のサイトカインが両方の培養についてより低いｐｇ／ｍｌ濃度（ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−５およびＩＦＮ−γ）で検出可能であったことは、混合性のＤＣ１−およびＤＣ２−タイプのサイトカインパターンを示している。
【０２４５】
ＳｍｙｌｅＤＣ／ｆＬｕｃを用いて免疫され、光学的なイメージングによって分析されたＮＲＧマウスはインビボで高い生存度を示す
２日目に、ホタルルシフェラーゼを発現するレンチウイルスベクターを用いて標識されたＳｍｙｌｅＤＣをｓ．ｃ．でＮＲＧマウス（ｎ＝７）に注射（ｉｎｊｅｃｔｒｅｄ）し、生物発光シグナルを注射後１４、３０および４５日に非観血的に測定した。全てのマウスは、４５日までに注射部位において検出可能な生物発光シグナルを示した（図１２）。
【０２４６】
ヒトＣＤ３４＋細胞のＮＲＧへの移植に続くＳｍｙｌｅＤＣ免疫化により、Ｔ細胞増殖の増加がもたらされた。
本発明者らは、２回陽性選択し、高度に純粋（＞９９％）な成体ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣを亜致死的に放射線照射した４週齡ＮＲＧマウスに移した。ＣＤ３４＋細胞移植後１０週、ヒト造血再構成は、プラトーに達し、安定になった（ヒトＣＤ４５＋細胞に相当する２〜５％のＰＢＭＣ）。本発明者らは、ＤＣ免疫化前、異なる試験群におけるＰＢＬにおいてヒトＣＤ４５＋頻度に統計的に有意な差を観察しなかった（データ示さず）。したがって、マウスは、ＨＣＴ後に、異なる免疫化群にランダムに割り当てられ、同じＨＣＴドナーの単球（５×１０５細胞）を用いて生産されたＤＣのプライム−ブースター免疫を右後部脇腹へのｓ．ｃ．注射によって受け取った（図１０Ｂ）。本発明者らは、非免疫化マウス対同じＣＤ３４＋ドナーからの単球を用いて生産されたＣｏｎｖＤＣおよびＳｍｙｌｅＤＣを用いて免疫化したマウスの長期（２０週）の造血性および免疫再構成を比較した。ＳｍｙｌｅＤＣ免疫化後１０週、＞１０ｐｇ／ｍｌレベルのヒトＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−５、ＭＣＰ−１およびＩＦＮ−γならびにより低いレベルのいくつかの他のヒト因子（ＩＬ−１２、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−４、ＩＬ−１３）が血漿中に検出可能であったことから、ＳｍｙｌｅＤＣ免疫化の持続的効果が示された（図１３Ａ）。この時点で、ＣｏｎｖＤＣおよび対照を用いて免疫化したマウスの血漿中のヒトサイトカインのレベルは、劇的により低いものであった。２０週の終了時点で、本発明者らは、対照およびＣｏｎｖＤＣ群の間でヒトＣＤ４５＋、Ｂ（ＣＤ１９＋）およびＴ細胞（ＣＤ３＋）の頻度において有意な差を観察しなかった（図１３Ｂ）。しかしながら、ヒトＣＤ４５＋細胞の頻度は、ＳｍｙｌｅＤＣ免疫化マウスに関して有意に高かった。注目すべきことに、ヒトＣＤ４５＋細胞の量を分析したところ、ヒトＴ細胞の相対的な頻度はＳｍｙｌｅＤＣワクチン接種の際に有意に上昇（５０％まで）していたが、他方で、ヒトＢ細胞（ＣＤ１９＋として規定される）の相対的な頻度は有意に減少していた（ＳｍｙｌｅＤＣにおいて３０％まで）（図１３Ｃ−Ｄ、表１）。実際、ＳｍｙｌｅＤＣプライム−ブースター免疫（ＨＣＴ後１３週）の１週後でさえ、Ｔ細胞増殖における上昇は既に有意であった。ＨＣＴ後２０週に、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、ＳｍｙｌｅＤＣを用いて免疫したマウスの最も頻繁なＴ細胞集団（平均３０％）を代表し、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は明らかに検出可能であった（ＰＢＬにおけるヒトＴ細胞の平均２０％）（図１３Ｅ−Ｆ、表１）。
【０２４７】
ＳｍｙｌｅＤＣ免疫後のリンパ節およびリンパ流の再生
屠殺後分析の際の最も著しい所見の１つは、ＳｍｙｌｅＤＣを用いて免疫したマウスにおける末梢リンパ節の検査からきており：ＬＮは鼠径部および腋窩部領域で明らかに可視であった（図１４Ａ）。共通のサイトカイン受容体γ鎖の発現を欠いているＮＲＧマウスが欠陥性リンパ発生および不活性のＬＮ小節を提示すること（Cao, Shores et al. 1995）およびヒトＨＣＴの後でさえ、末梢性ＬＮの再生がレスキューされず、ＬＮは剖検においてたいていが小さいかまたは同定可能ではないことが長く知られている。ＳｍｙｌｅＤＣを用いて免疫したマウスは、それぞれ、コホートの９０％および７０％まで目立って活性な腋窩部および鼠径部ＬＮを示した。ＣｏｎｖＤＣ免疫により、より低い頻度において腋窩部（６６％）および鼠径部（３３％）ＬＮがもたらされた（図１４Ｂ）。著しくは、右側でのＳｍｙｌｅＤＣ免疫化と対応するリンパ性流出軸の同側でのＬＮの形成の間に強い相関性があった。ＨＣＴ後２０週で、体幹下部（鼠径部ＬＮ）から体幹上部（遠位の腋窩部流出ＬＮ）の機能的なリンパ性ドレナージを確認するために、本発明者らは、ＳｍｙｌｅＤＣ免疫部位に近いＮＲＧマウスの皮下に５％エバンスブルーを注射した。インクにより注射部位に隣接する流出鼠径部ＬＮが染色され、青色のシグナルがリンパ管から遠位の腋窩部ＬＮに移動した。正常なリンパ系を有する免疫コンピテント（Ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）なＣ５７ＢＬ／６マウスは類似するインクのドレナージパターンを示し、他方で、非免疫マウスまたはＣｏｎｖＤＣを用いて免疫したマウスは障害性のドレナージを示した（データ示さず）。
【０２４８】
再生されたリンパ節は、ヒトＴ細胞およびＢ細胞を分化の異なる段階で含有する。
ＳｍｙｌｅＤＣ−免疫化マウスから外植されたＬＮの免疫組織学的分析は、リンパ球の大量の浸潤を明らかにしたが、ほんの僅かの領域が野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスから得られた正常に発生したＬＮにおいて観察された胚中心の解剖学的構造に似ている（データ示さず）。免疫蛍光分析は、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を用いて優勢な再増殖を示した（データ示さず）。ヒトＣＤ１１ｃ＋ＤＣは、皮質において検出されたまたはマウスリンパ性内皮細胞（ＬＹＶＥ−１）と共局在していた。本発明者らは、マウス内皮ＣＤ３１マーカー（内皮性の細静脈の可能性が最も高い）に陽性の管構造も検出した。ＬＮのフローサイトメトリー分析により、ヒトＣＤ４５＋細胞（７７％）、ＣＤ３＋Ｔリンパ球（７３％）および僅か３．８％のＣＤ１９＋Ｂ細胞（図１４Ｃ）が明らかにされた。ヒトＣＤ３＋細胞内では、５６％がＣＤ４＋であり、４２％がＣＤ８＋であった（図１４Ｄ）。著しくは、両方のＴ細胞サブセットについて、本発明者らは、約８０％のＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ−エフェクターメモリー細胞、１０〜２０％の中心的なメモリー細胞、および５％未満のナイーブＴ細胞（図１４Ｅ−Ｆ）を観察した。濾胞性Ｔヘルパー細胞（Ｔｆｈ）を同定するために、ＳｍｙｌｅＤＣ−免疫化マウスから外植されたＬＮをプールし、４．２％のＣＤ３＋集団に相当する、ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ｈｉＰＤ−１＋ＩＣＯＳ＋細胞に関して分析した（図１４Ｇ）。ヒト扁桃が、約８％のＴｆｈ細胞頻度を示した（図１４Ｇ）。本発明者らは、プールしたＬＮにおけるＢ細胞亜集団も検査し、それをヒト扁桃と比較した（データ示さず）。ＣＤ２４ｈｉＣＤ３８ｈｉ移行性Ｂ細胞は、ヒト化ＬＮ（０．４％）および扁桃（２．４％）において全ＣＤ１９＋細胞のマイナー集団に相当する（図１４Ｈ）。ナイーブＢ細胞（ＩｇＤ＋ＣＤ２４ｉｎｔＣＤ３８ｉｎｔ）は、ヒト化ＬＮにおいて、扁桃におけるよりも頻度が低かった（５．９％対４３．９％）。驚いたことに、本発明者らは、ヒト化ＬＮにおいて、扁桃と比較して、ＣＤ２７ｈｉＣＤ３８ｈｉ最終分化型プラズマ芽球の頻度が劇的に高いことを見出した（４９．１％対０．７％）（図１４Ｈ）。
【０２４９】
ＳｍｙｌｅＤＣは、隣接性（ａｄｊａｓｃｅｎｔ）および遠位性ＬＮに移動した。
ＳｍｙｌｅＤＣ−免疫化マウスに引き続いてルシフェラーゼ遺伝子を用いてマークしたＳｍｙｌｅＤＣを注射した注射部位の非侵襲性の光学的イメージング分析により、生物発光放出細胞の隣接する鼠径部ＬＮの領域への移動が明らかにされた（図１５）。注射部位におけるおよびＬＮ領域における生物発光シグナルは、注射後７〜２１日に増加した。ＳｍｙｌｅＤＣ／ＬＵＣ注射後２１日外植した局所性および遠位性ＬＮは、生物発光シグナルを示した。そのデータは、ＳｍｙｌｅＤＣが免疫再生されたＨＩＳ−ＮＲＧマウスにおいて局所性および遠位性ＬＮに移動できることを実証する。これらの結果を強めることとして、ヒト骨髄球性およびプラズマ細胞様ＤＣは、ＳｍｙｌｅＤＣを用いて免疫したマウスにおいて、ＣｏｎｖＤＣおよび対照におけるよりも、高い絶対数で検出可能であった（図１６）。これは潜在的に、内因性に再生されたＤＣ前駆体がＬＮにおいてＤＣに分化することを刺激する、ＬＮにおけるＳｍｙｌｅＤＣのパラ分泌効果を示している。加えて、ＳｍｙｌｅＤＣ注射部位に隣接性のＬＮの高感度リアルタイムＰＣＲ分析により、レンチウイルスベクターの検出可能なコピー（１細胞ごとに０．７８＋／−０．４３コピー）が示された。ＬＶコピーも、免疫側と反対側のＬＮにおいて（０．０５＋／−０．０４コピー／細胞）および脾臓（０．５８＋／−０．４９コピー／細胞）において、検出可能であり、ＳｍｙｌｅＤＣのリンパ性器官への全身性移動が確認された。
【０２５０】
ヒト成熟ＴおよびＢ細胞の絶対数の増加は、ＳｍｙｌｅＤＣ免疫化マウスの脾臓において検出することができる。
ＨＣＴ後２０週、ＳｍｙｌｅＤＣ−免疫化マウスは、非免疫化マウス（ｐ＝０．００２８）と比べて、脾臓におけるヒトＣＤ３＋Ｔ細胞の絶対数（８５８，４８７）において１００倍を超える増加を示した（図１７Ａ）。ＣｏｎｖＤＣを用いて免疫したマウス（６，３９４細胞／脾臓、１３２倍低い、ｐ＝０．０２対ＳｍｙｌｅＤＣ）および対照マウス（４，４５９細胞／脾臓、１９２倍低い、ｐ＝０．０００７対ＳｍｙｌｅＤＣ）は、脾臓へのＣＤ３＋細胞の高レベルの増殖／ホーミングを支持できなかった（表１）。末梢血において以前に見積もられたより低い相対的な頻度と対照的に、脾臓における絶対的なＣＤ１９＋Ｂリンパ球量は、ＳｍｙｌｅＤＣ−免疫化マウス（４０６，６７２細胞／脾臓）において、ＣｏｎｖＤＣ−免疫化（８２，０６５細胞／脾臓、５倍より低い、ｐ＝０．３７）および対照マウス（１５，６３９細胞／脾臓、２６倍より低い、ｐ＝０．００３４）におけるよりも有意に高かった。組織学的には、ヒトＴおよびＢ細胞が、小節に似ているクラスター内で相互作用することが見出された（データ示さず）。Ｔリンパ球サブセットの組成を、さらに分析した。ＳｍｙｌｅＤＣマウスの脾臓におけるＴｈおよびＣＴＬ細胞の平均数は、それぞれ３７０，０８６および８１，６４９細胞／脾臓であった（図１７Ｂ−Ｃ）。これは、ＣｏｎｖＤＣ免疫化（それぞれ、１３，９７６および７，９３７細胞／脾臓、ｐ＝０．００４６および０．０３８対ＳｍｙｌｅＤＣ）の後にまたは非免疫対照（ＣＤ４＋に関して１，９４３、ｐ＝０．００３５およびＣＤ８＋に関して５２、ｐ＝０．０２１対ＳｍｙｌｅＤＣ）に見出された数よりも有意に高かった。ナイーブおよびエフェクターＴヘルパーおよびＣＴＬの両方が、絶対的な細胞数の点で増加した（図１７Ｂ−Ｃ）。ＨＩＳ−ＮＲＧマウスの脾臓において稀に観察される濾胞性Ｔ細胞は、ＳｍｙｌｅＤＣ免疫化後（対照群において、僅か１２細胞／脾臓と比較して、（ｐ＝０．００２３）、平均で９，４２５のＴｆｈ細胞／脾臓で検出可能であり、ＣｏｎｖＤＣ群においては検出可能なＴｆｈ集団はなかった（図１７Ｄ）。脾臓におけるＢ細胞亜集団の詳細な分析により、移行性Ｂ細胞（対照６，７３２、ＣｏｎｖＤＣ  ２９，０２８およびＳｍｙｌｅＤＣ  ７７，４５４細胞／脾臓）の数において有意な差は明らかにされなかった（図１７Ｅ）。しかしながら、ＳｍｙｌｅＤＣ−免疫化は、他の群と比較して、成熟Ｂ細胞（８３，４５４細胞／脾臓）およびプラズマ芽球／プラズマ細胞（９１，５２２細胞／脾臓）の有意な目立った増殖を導いた。
【０２５１】
ＳｍｙｌｅＤＣ免疫は、抗−ｐｐ６５Ｔ細胞免疫応答を誘導する
本発明者らは、養子性ｈｕＰＢＬ／Ｔ細胞導入前のＳｍｙｌｅＤＣを用いたＮＲＧマウスの免疫化が、インビボで抗−ｐｐ６５特異的なＴ応答を増強することを以前示した（Daenthanasanmak, Salguero et al. 2012）。ここで、本発明者らは、ＳｍｙｌｅＤＣが、ＨＣＴ後ｐｐ６５に対して反応性の内因性に発生するヒトＴ細胞を刺激できるかどうかを評価した。ヒトＣＤ３＋細胞を、ＨＣＴ後２０週脾臓またはＬＮからＦＡＣＳソートした。免疫アッセイを実行するため十分なＴ細胞数を得るため、脾臓からのＴ細胞を、抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８コンジュゲートビーズの存在下において３日増殖させ、ＳｍｙｌｅＤＣ  プラス  サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５）を用いて７日間さらに同時培養した（図１０Ｃ）。Ｔ細胞を、抗原性刺激（ＮｏＡｇ）の非存在下においてまたはｐｐ６５オーバーラップペプチドプール（ｐｐ６５ｐｐ）を用いてＩＦＮ−γ−被覆プレートに一晩播種し、ＩＦＮ−γ−ＥＬＩＳＰＯＴによって分析した。ＳｍｙｌｅＤＣ−免疫化マウスからの脾細胞は、ｐｐ６５−反応性Ｔ細胞の、ＣｏｎｖＤＣ−免疫化マウス（３３．６スポット対１５．５スポット、３連の平均、ｐ＝０．２５）または対照マウス（１スポット未満、ｐ＜０．０５）よりも、高い頻度を示した（図１８Ａ）。ＳｍｙｌｅＤＣ−免疫化マウス（ｎ＝４）からの個々のＬＮから単離され、ＳｍｙｌｅＤＣ  プラス  サイトカインを用いて７日間培養されたＴ細胞も、ｐｐ６５ペプチドに対して反応した（ｐｐ６５：５３スポット対抗原なし：１８．７スポット、ｐ＝０．０２１）。ＣＭＶ−反応性ドナーからのＰＢＭＣを、アッセイのためのポジティブコントロールとして使用した（図１８Ｂ）。
【０２５２】
ＳｍｙｌｅＤＣ免疫化は、免疫グロブリンおよびｐｐ６５−特異的な体液性応答を誘導する
本発明者らは、脾臓におけるＩｇＧメモリーＢ細胞の頻度における有意な増加、同様に、免疫グロブリンレベルが検出の限界に近かった対照群と比べて、ＳｍｙｌｅＤＣ免疫化の際に血漿ＩｇＭおよびＩｇＧの生成を観察した（図１８Ｃ−Ｅ）。ｐｐ６５に対して特異的なＩｇ反応性を、組織内開発したＥＬＩＳＡシステムに関して、ＣＭＶ血清陽性の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者から得られた血漿をポジティブコントロールとして用いて見積った。ＣｏｎｖＤＣ−免疫化または対照マウスからの血漿中に検出可能なシグナルはなかったが、抗−ｐｐ６５  ＩｇＧおよびＩｇＭは、それぞれ、４／２２および１１／２２マウスの血漿において見出された（図１８Ｆ−Ｇ）。著しくは、これらの機能的な抗原特異性のヒトＴおよびＢ細胞応答にもかかわらず、本発明者らは、これらのマウスにおいて、ＨＣＴ後６から２０週の重量モニタリングによって評価される、ＧＶＨＤの如何なる徴候も検出しなかった（図１９Ａ）。１０匹のＳｍｙｌｅＤＣを用いて免疫したマウスのコホートはＨＣＴ後４０週維持され、本発明者らは遅発性ＧＶＨＤの臨床徴候も疾患の如何なる巨視的な臨床徴候も観察しなかった。このような状況ではあるが、本発明者らは、一般に影響される組織（すなわち、皮膚および腸）におけるＧＶＨＤの徴候について、Ｈ＆Ｅ染色および光学顕微鏡によって、いくつかのマウス（ｎ＝４）を組織病理学的に分析した。本発明者らは、アポトーシス小体の検出に対応する、４匹のマウスのうち２匹については皮膚においておよび４匹のマウスのうち３匹の腸において、穏やかなグレード１のＧＶＨＤのみを観察した（図１９Ｂ−Ｃ）。
【０２５３】
ＰＣＲによるマウスの組織におけるＳｍｙｌｅＤＣの検出。
レンチウイルスベクターにおけるＷＰＲＥエレメントの検出のため定量的なリアルタイムＰＣＲ法を使用し、標準対照として、組み込まれたＬＶ配列の３コピーを含有している２９３Ｔ細胞系統を用いた。ＳｍｙｌｅＤＣの分析により、１細胞ごとに７．５コピーのベクターがもたらされた。ヒトＣＤ３４＋細胞を移植し、ＳｍｙｌｅＤＣを用いて免疫したＮＲＧマウス（ｎ＝４）から収集された脾臓の分析は、１細胞ごとに０．５８＋／−０．４９コピーを示した。ヒトＣＤ３４＋細胞を移植し、ＳｍｙｌｅＤＣを用いて免疫したＮＲＧマウス（ｎ＝４）から収集されたＬＮの分析は、隣接性ＬＮについて１細胞ごとに０．７８＋／−０．４３コピーおよび反対側ＬＮについて１細胞ごとに０．０５２＋／−０．０４１コピーを示した。そのデータにより、皮膚に注射したＳｍｙｌｅＤＣの局所性および遠位性ＬＮおよび脾臓への移動能力が確認された（表２）。
【０２５４】
考察
このＨＩＳ−ＮＲＧモデルを用いるヒトＨＣＴ設定におけるＳｍｙｌｅＤＣの有効性を実証するための前臨床検証研究は、末梢リンパ節の発生を含むＴおよびＢ細胞最終適応免疫再構成効果の完全な範囲が観察されたことから、我々の予想を超えていた。ＣｏｎｖＤＣおよびＳｍｙｌｅＤＣの両方は、Ｇ−ＣＳＦ動員ＨＣＴドナーから単離された単球を用いて生産できた。ＳｍｙｌｅＤＣは、ＣｏｎｖＤＣよりも、インビトロでより高い生存度および関連性のある免疫性細胞表面マーカーおよびサイトカインの発現について持続性の自己分泌活性化を示した。ＨＣＴ後１０週のＳｍｙｌｅＤＣの皮下投与および別の１０週後の血漿分析は、ＣｏｎｖＤＣ−免疫化または対照マウスにおけるよりも、実質的に高いレベルのいくつかのヒトサイトカイン（ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−５、ＭＣＰ−１、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α、ＩＬ−８、ＩＬ−４）を明らかにした。これは、有意に高い頻度のヒトＴ細胞、高い絶対数のエフェクターメモリーＴ細胞ならびに血液、脾臓およびＬＮにおける最終分化型の血漿Ｂ細胞の検出に関連づけられた。ＨＣＴ後２０週の免疫モニタリングにより、これらの細胞効果がｐｐ６５−特異的なＴ細胞および抗体応答を伴うことが示された。データを総合すると、ｐｐ６５を発現するＣｏｎｖＤＣを用いた免疫化は、非免疫マウスと比べて、免疫モジュレーションをある程度示したが、ＳｍｙｌｅＤＣの効果は明らかにより著明であった。これらの差は、頑強な抗原提示のため、効率的にシグナルする、サイトカインおよびケモカインを産生する、移動する、誘引するおよび他の細胞の免疫系と相互作用するために、投与後に十分に長く持続する、有糸分裂後および非複製性の抗原提示細胞が関与する細胞療法の必要性を強調する。
【０２５５】
ＮＲＧマウスにおける、これらの新しいインビボ所見によっても、機能的な免疫系を有するヒト化マウスの生成を改善する、新規の進歩が導かれ得る。免疫不全マウスにおいて免疫再構成を誘導するための、いくつかのトランスジェニックおよびワクチン接種アプローチが過去１０年間評価されてきたにもかかわらず、最終的におよび機能的に分化したＴおよびＢ細胞へのヒト造血系発生に取り組むための適切なインビボ実験モデルを欠いている。インビボでのＨＣＴ後のヒト免疫再構成を実験的に再現するために、Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｉｓｈｉｋａｗａおよび同僚は、ＣＤ３４＋ＨＳＣを、共通のインターロイキン−２受容体ガンマ鎖（ＩＬ２Ｒγ）（ＮＯＤ／Ｒａｇ１ｎｕｌｌ／ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ−ＮＲＧ、ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ／ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ−ＮＳＧ、またはＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ−ＮＯＧ）を欠いている異なるタイプの免疫不全マウス系統に移植して、ＣＤ３４＋細胞導入後８から１０週ヒト造血系統の再構成をもたらす先駆けとなった（Ishikawa, Yasukawa et al. 2005；Shultz, Brehm et al. 2012）。しかしながら、ＨＳＣの供給源および細胞移植のための方法とは関係なく、ヒト化マウスは、最適以下のレベルのリンパ球再構成、抗原特異的な細胞性および体液性応答の欠乏または低いレベルならびに全体性アネルギーを掲示した（Lepus, Gibson et al. 2009；Andre, Erbacher et al. 2010）。ＨＩＳマウスの非効率的なリンパの発生においてインパクトを与える因子には、ヒト組織適合性分子の非存在および乏しいヒト化サイトカイン環境が含まれる。この欠乏を克服するため、組換え型サイトカインのデリバリー（Chen, Khoury et al. 2009；O'Connell, Balazs et al. 2010）、ＨＰＣに沿った胎性リンパ組織の移植（Biswas, Chang et al.2011;Hu and Yang 2012）または主要組織適合性分子（ＭＨＣ）クラスＩ（Shultz, Saito et al.2010）およびＩＩ（Danner, Chaudhari et al. 2011）もしくは極めて重要な造血性サイトカイン（Willinger, Rongvaux et al. 2011）を構成的に発現するトランスジェニック系統の使用を含むアプローチが最近記載された。一部は改善されるが、これらの戦略では、ヒトウイルスチャレンジに対するＢおよびＴ細胞応答における限定的な改善を許容するものであった。Ｇ−ＣＳＦ−動員成体造血性幹細胞を用いたＨＣＴ移植に関する以前の報告と一貫して、本発明者らは、非免疫対照マウスにおけるＴリンパ球の低い相対頻度（すなわち、２０％未満）を観察し、これはＣｏｎｖＤＣ−免疫化を用いて得られた結果でも反映されていた。反対に、既報告のように、循環ヒトＢ細胞（ここではＣＤ１９＋細胞として規定される）の相対頻度は、対照マウスにおいて８０％よりも一般に高かった。ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５免疫化はＰＢＬにおける相対的なＢ細胞頻度の減少をもたらしたが、脾臓およびリンパ節においては絶対的なＢ細胞量の増加に関連していた。注目すべきことに、これらの組織におけるＴおよびＢ細胞の高い再増殖割合は、免疫活性化と関連する成熟型の表現型と相関する。重要なことに、ＨＳＣ移植マウスにおける再構成されたリンパ構造の存在を記載している報告はわずかである（Sun, Denton et al. 2007；Marodon, Desjardins et al. 2009；Singh, Singh et al. 2012）。
【０２５６】
ヒト臍帯血または胎性の肝臓を用いて、それにより、我々の研究（Ｇ−ＣＳＦ−動員成体血液を用いる）におけるよりも、高い割合のヒト細胞移植（＞６０％）に達することによって、ヒトＣＤ３４＋ＨＣＴを改善できるにもかかわらず、既報告のＬＮ構造は未公開（ａｎｅｃｄｏｔａｌ）であるかまたは観察に非常に長い期間を必要とする（Lang, Kelly et al. 2013）。これらのデータは、機能的なおよび持続性のＤＣが、ヒト化マウスにおける完全な免疫機能に向けて、リンパ球を活性化する、動員する、および最終的に成熟させるために、ＨＣＴ後に末梢リンパ節およびリンパ流の再生に関して必要とされえることを含意する。したがって、ヒト化マウスモデルにおけるＬＮおよびリンパの発生に付随する機能的なＤＣの存在を増進させることは、適応免疫の予測的な研究に関してこれらのモデルを用いるための「必須的制約（ｃｏｎｄｉｔｉｏ  ｓｉｎｅ  ｑｕａ  ｎｏｎ）」でありえる。早期のＴ細胞発生が我々の有効性研究の焦点ではなかったが、我々は、脾臓において見出された高い絶対的なナイーブおよびメモリー／エフェクターＴ細胞数が、これらのヒト化マウスにおける真正の高い胸腺形成（ｔｈｙｍｏｐｏｉｅｓｉｓ）を反映することを予測する。究極的には、この「ヒト内因性再生全身性リンパ節（ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｌｙ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ）」（「ＨＥＲＳ−ＬＮ」）の新規様式により、ヒト免疫系、抗原提示、ＴおよびＢ細胞最終活性化の発生のならびにＨＣＴプロトコール、ワクチンおよび免疫調節性分子の前臨床試験の有用な解釈の、より詳細な機構的なインビボ研究が将来において許容される。
【０２５７】
がん免疫療法のための単一のトリシストロニックレンチウイルスベクターを用いて生成されるレンチウイルス−誘導型ＤＣの安全性評価、アップスケール（ｕｐ−ｓｃａｌｌｉｎｇ）および臨床開発は、我々のグループの進行中の作業である（Pincha, Sundarasetty et al. 2012; Sundarasetty, Singh et al. 2013）。単一のトリシストロニックレンチウイルスベクターを用いてｐｐ６５を同時発現するＳｍｙｌｅＤＣの生産は、ＣＭＶ−血清陰性ドナーまたは臍帯血からの幹細胞移植物を受ける移植患者を免疫する臨床治験へのトランスレーションのために進行中である（Daenthasanmak, Salguero et al, in "Example 3"）。加えて、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５は、神経膠腫および乳癌に対する自己細胞免疫療法製品として、将来においても探索されるだろう、というのも、ＨＣＭＶは、これらのタイプのがんのウイルス性の標的として最近関係付けられているからである。
【実施例３】
【０２５８】
実験の目的
最近のこの研究において、本発明者らは、２種の完全にヒト化されたマウスＨＣＴモデルを使用し、臨床前の単一３シストロンインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターを用いてインビボで生じさせたＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５を評価した。本発明者らは、いくつかの有効性および安全パラメータを試験し、ヒトＣＤ３４＋幹細胞を移植された照射ＮＲＧマウスで、効力の証明を確立した（新生仔ＵＣＢとの比較における、Ｇ−ＣＳＦ動員成体ＨＳＣ）。本発明者らは、これらのヒト化ＨＣＴマウス予測モデルで、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５による、内因的に発生した細胞傷害性Ｔ細胞の増殖およびＨＣＭＶ  ｐｐ６５抗原に対する液性免疫の応答性を増進する適応免疫効果を実証した。
【０２５９】
結果
樹状細胞の回復、生存能力およびアイデンティティに及ぼす３シストロンベクターの影響
間を空けた異種２Ａエレメント（豚テシオウイルス由来のＰ２Ａおよび口蹄疫ウイルス由来のＦ２Ａ）を用いた３シストロン自己不活性化レンチウイルスベクターＩＤ−ＬＶ−Ｇ２αｐｐ６５（図２１Ａ）を設計した。水疱性口内炎−Ｇタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）でシュードタイピングした第三世代インテグラーゼ欠損レンチウイルスの大規模バッチを記載（Daenthanasanmak et al.,2012）の通りに生成した。ｐ２４キャプシドタンパク質の濃度を測定することによってウイルス力価を決定したところ、正常範囲（３シストロン：７μｇ／ｍｌ、ｎ＝１０；２シストロン：９．４μｇ／ｍｌ、ｎ＝１０）の力価を得た。形質導入された２９３Ｔ細胞における、導入遺伝子ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α、およびｐｐ６５すべての発現を、ウエスタンブロットおよび免疫検出による溶解物および細胞上清の分析によって確認した。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−αタンパク質は、主に分泌され、細胞上清中に検出可能であった。ウエスタンブロット解析は、専らｐｐ６５タンパク質のみの細胞内発現を示し、これは、細胞内染色およびフローサイトメトリー分析によって確認された。健常ドナーから得られた単球を感染多重度（ＭＯＩ）５のＩＤ−ＬＶ−Ｇ２αｐｐ６５ベクターに一晩曝露し、続いて７日間、組み換えサイトカインなしでエキソビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）培養したところ、平均して、形質導入に使用された単球の２０％が回復した（これと比較して、対照の２シストロンベクターでは３２％であった）。本発明者らが、細胞回復に及ぼすＭＯＩの用量効果を観察したところ、ＭＯＩ＝５が最も一貫した細胞の回復（データは示されていない）をもたらした。２シストロンベクターによる形質導入と３シストロンベクターによる形質導入では、更なる培養によって生細胞数が同程度減少した（インプットに対して１４日目には８％、２１日目には５％）。これは、１つのベクター内で分化サイトカインとシスで与えた場合、ｐｐ６５には毒性作用または形質導入作用がないことを実証するものである（図２１ｂ）。免疫表現型マーカー（ＨＬＡ−ＤＲ＋／ＣＤ８６＋）の安定性およびＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５における細胞内ｐｐ６５発現の検出可能レベルを、最長２１日間のエキソビボ培養期間の間分析したが、細胞は、約１カ月間の培養の後、最終的に老化し、死滅した（図２１ｃ、ｄ）。ＤＣ培養の７日目に、活性化された単球に由来するＤＣで典型的な免疫表現型ＤＣマーカー（ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＨＬＡ−ＡＢＣ＋、ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ８０＋、ＣＤ８６＋の頻度が高い）のパネルについて、さらなる詳細な分析を行ったところ、免疫学的に重要なマーカーの発現への、ｐｐ６５抗原による有害な影響は示されなかった。推定上の単球（＜１０％ＣＤ１４＋）、形質細胞様ＤＣ（＜４０％ＣＤ１２３＋）および最終分化したＤＣ（＜１０％ＣＤ８３＋）マーカーを発現している細胞が低頻度で察された（図２１ｅ）。ｐｐ６５の同時発現は、内因的に上方制御されているいくつかのサイトカイン（１０ｐｇ／ｍｌまでの低レベルから中程度レベル：ＩＬ−５、ＩＬ−１２ｐ、ＩＬ−１０、ＩＬ−７、ＩＬ−６、ＩＬ−４、およびＴＮＦ−α；１〜１０ｎｇ／ｍｌの高レベル：ＩＬ−８およびＭＣＰ−１）またはベクター内で同時発現さ��るトランスジェニックＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−αサイトカイン（それぞれ平均約１．０ｎｇ／ｍｌおよび４．６ｎｇ／ｍｌで検出可能（ｎ＝３））の分泌にも影響を及ぼさなかった（図２１ｆ）。結論として、本発明者らの観察では、ベクター内においてシスで同時発現されるｐｐ６５による、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５の生存能力または分化への有害作用は見られなかった。
【０２６０】
臍帯血単球からのＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５の産生
インフォームドコンセントの下、ハノーヴァー医科大学（Ｈａｎｎｏｖｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ）のＯｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  Ｃｌｉｎｉｃで出産する産婦によって提供されたヒト臍帯血由来の試料で、臍帯血バンクを構築した。単核細胞は、フィコール分離によって単離し、凍結保存するか、ＣＤ３４＋造血幹細胞濃縮を行った。ＣＤ３４陽性および陰性画分の両方をドナー試料ごとに凍結保存した。ＣＤ１４＋単球は、ＣＤ３４陰性画分からＭＡＣＳによって濃縮した。それらの単球は、本発明者らが以前に記述したプロトコールを使用して、ヒトＧＭ−ＣＳＦ−ＩＦＮａ−ｐｐ６５をコードしているウイルスで形質導入され、同じドナーからのＣＤ３４＋細胞が移植されているマウスに投与された。ＤＣ分化免疫表現型およびｐｐ６５抗原発現を分析するために、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５細胞の一部を培養で７日間維持した。
【０２６１】
ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５におけるＩＤ−ＬＶ−Ｇ２αｐｐ６５の組み込みパターン
ＩＤ−ＬＶ配列の組み込みパターンは、ベクター注入されたマウスの肝細胞で以前に示されており（Matrai et al.,2011）、ＩＤ−ＬＶは、マウスＤＣおよびヒトＤＣのインビトロ形質導入にも試みられている（Negri et al.,2012）が、ＩＤ−ＬＶの組み込みパターンは、形質導入された単球またはＤＣについてはこれまで特徴付けられていなかった。ＤＣは、有糸分裂後の複製しない細胞であるが、潜在的に発癌性の遺伝子座に組み込みが偏ると、遺伝毒性作用の素因となりうる。バックボーンＬＶ−Ｇ２αｐｐ６５ベクターの組み込みパターンを評価するために、インテグラーゼコンピテント（ＩＣ−ＬＶ）またはインテグラーゼ欠損（ＩＤ−ＬＶ）ベクターを用いて作製したＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５を１０、２０、および３０日間培養し、組み込まれたベクターのコピー数を比較した。１０日目、ＩＣ−ＬＶで作製したＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５の１細胞当たりの組み込まれたコピー数は、ＩＤ−ＬＶで作製したＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５（１細胞当たり０．３コピー）より４倍多かった（１細胞当たり１．２コピー）。両方の培養とも、組み込まれたコピー数／細胞は、更なる培養（２０日目）によって、そして細胞が老化に達した際に、連続的に低減した（約３０日；ＩＣ−ＬＶ：１細胞当たり０．３コピー；ＩＤ−ＬＶ：１細胞当たり０．１コピー）（図２２ａ）。遺伝的に改変された単球のクローン貢献を、レンチウイルス形質導入の１０、２０、および３０日後の時点に、高スループットの組み込み部位（ＩＳ）分析（Schmidt et al.,2007）でモニターした。線形増幅媒介（ＬＡＭ）ＰＣＲおよび次世代シーケンシングによって、ＩＣ−ＬＶで形質導入された単球では、３．０００箇所のユニークな染色体位置にマップされた＞４０．０００のＩＳ配列が検出され、ＩＤ−ＬＶで形質導入された単球では、＞１．５００のユニークな染色体位置にマップされた＞１４．０００のＩＳ配列が検出された。染色体当たりの組み込み部位の分布は偏っていなかった。すなわち、組み込みの数は、どちらのベクタータイプでも、全体的に、染色体の大きさと相関していた。すなわち、比較的大きな１番染色体では１０箇所を超える組み込みが検出され、２１番染色体ではほぼ１箇所の組み込みが検出された。遺伝子内または遺伝子から距離＋／−１０ｋｂ以内におけるウイルス組み込みの数に関する分布は、両方のベクタータイプで同様であり、大部分の組み込みは遺伝子の外側（図２２ｂ）、特に、転写開始部位の上流５ｋｂまで（図２２ｃ）であった。形質導入の全時点におけるＩＳの過半数は、５％よりかなり低く、場合により、少数が、回収した配列読み取りの最高５％にまで達した。挿入を最も高頻度で示した１０箇所の遺伝子座は、時点ごとにかなり多様であった（図２２ｄ）。とりわけ、ＩＤ−ＬＶで形質導入された単球は、ゴルジン（ｇｏｌｇｉｎ）抗原７（ＧＯＬＧＡ７）をコードする遺伝子の遺伝子座への再発性の挿入を示した。ＧＯＬＧＡ７を含む遺伝子座は、すべての時点のＩＤ−ＬＶにおいて、最も高頻度のＩＳであったが、この頻度は経時的に低下した。両方のタイプのベクターで挿入が起こった共通の遺伝子座の他のものには、ＷＤＲ７４（マウスにおける胚盤胞形成に必要とされるタンパク質）、ジンクフ���ンガータンパク質３７Ａ（ＺＮＦ３７Ａ）およびテンシン相同膜貫通ホスファターゼ（ＴＰＴＥ）がある。これらすべてのタンパク質のＲＮＡ発現は、通常は遍在的であり、ヒトにおける未知の発癌機能を有する白血球で検出できる。
【０２６２】
ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５のＨＣＭＶ感染症はインビトロにおけるウイルス複製を妨げる
単球由来ＤＣは、ＨＣＭＶ感染を受けやすいことが知られており、それらが活性化されたＤＣに分化する際に、ウイルス複製が観察された（Riegler et al.,2000）。したがって、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５の安全に関する１つの重要な側面は、この細胞産物が、例えばＨＣＭＶ血清陽性ドナーから作製された場合、ＨＣＭＶの伝染をなお許容するかどうかであった。この点について検討するため、異なるタイプのレンチウイルスベクターを導入したＤＣ、すなわち、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−αを発現するＳｍｙｌｅＤＣならびにＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を同時発現するＳｍａｒｔＤＣを比較した（Daenthanasanmak et al.,2012）。樹状細胞を、ＭＯＩ  ２で、ＧＦＰを発現している遺伝子組み替えウイルス株ＨＣＭＶ−ＴＢ４０／Ｅに感染させた。以前に記述されている通り（Sinzger et al.,2008）、感染したヒト線維芽細胞（ＨＦ）をポジティブコントロールとして使用した。染色されていない細胞を蛍光顕微鏡検査を使用して観察した。緑色蛍光シグナルは細胞の感染を示す。この実験では、蛍光シグナルは、ＩＦＮ−αを発現していないＳｍａｒｔＤＣで１０日目に観察されるのみであった（図２４ａ）。これらの結果をＦＡＣＳ分析で確認した。感染の７日後には、ＨＦ細胞の約５０％が感染していた。これは、フローサイトメトリー分析によってＧＦＰ＋細胞として示された。ＳｍａｒｔＤＣ培養における細胞の約０．５％はＨＣＭＶ感染を示したが、ＳｍｙｌｅＤＣおよびＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５細胞は、ほぼベースラインのＧＦＰ＋細胞（＜０．０６％）を示した。ウイルス持ち越しによる人為現象の可能性を排除するために、ＭＯＩ  １でこの実験を繰り返し、ウイルス感染の後に、細胞をしっかりと洗浄した（５回）。ＧＦＰ発現の動態分析は、感染後２日目から１０日目までＨＣＭＶ感染したＨＦの量が増大したことを示した（図２４ａ）。ＳｍａｒｔＤＣでは、ＧＦＰ＋細胞の頻度は、最初２％であり、４日目には０．２％に減少しており、その後１０日目には０．６％まで増加した。ＳｍｙｌｅＤＣおよびＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５でも、最初の感染が約２％であったが、培養におけるその後の時点でさえ、ＧＦＰ＋細胞の頻度は０．０６％未満であった。これらの分析は、ＣＤ８０をモニターすることによって補われた。ＣＤ８０は、活性化されたＤＣで上方制御されるが、ＨＣＭＶ感染後に調整されることが示されている（Moutaftsi et al.,2002）重要な同時刺激マーカーである。偽感染した細胞では、上記３つのタイプのＤＣで、ＣＤ８０の発現が同程度であった（細胞の５０％で検出可能）。一方、ＨＣＭＶ感染において、ＳｍａｒｔＤＣではＣＤ８０発現が下方制御された（１０日目に細胞の２０％で検出可能）が、ＳｍｙｌｅＤＣ、とりわけＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５では、ウイルス感染後に増大した（１０日目に細胞の８０％で検出可能）（図２４ｂ）。細胞が新しいビリオンを放出できたかどうか評価するために、各時点から収集した上清をプラークアッセイによって分析した（図２４ｃ）。感染したＨＦは、４日目に多量のウイルス放出を示し（１．４×１０６ｐｆｕ／ｍｌ）、１０日目（１．３５×１０６ｐｆｕ／ｍｌ）まで徐々に減少し、培養細胞の大部分が溶解した。ＤＣ培養の０日目には、残存量の���イルスが検出できたのみであった（１２０〜３００ｐｆｕ／ｍｌ、ＤＣ表面に付着し、その後放出された、残っていた持ち越しウイルスを反映している可能性がある）（図２４ｃ）。培養の４日目まで、すべてのＤＣ群で、放出ウイルスが検出不能であった。ＳｍａｒｔＤＣでは、６日目にウイルスの放出が始まり（５ｐｆｕ／ｍｌ）、これは１０日目（３５ｐｆｕ／ｍｌ）まで徐々に増大した。対照的に、ＳｍｙｌｅＤＣまたはＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５細胞上清では、その後のウイルス放出が観察されなかった。したがって、たとえＤＣが最初に感染していたとしても、ＳｍｙｌｅＤＣおよびＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５によるＩＦＮ−α発現は、ＩＬ−４を発現するＳｍａｒｔＤＣよりも、ＨＣＭＶの感染および放出をより強くコントロールしているようであった。
【０２６３】
自家ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５によるＣＴＬのインビトロ刺激および増殖
ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋ＣＴＬは両方とも、初期ＨＣＭＶ感染（Gamadia et al.,2003）およびＨＣＴ後におけるＨＣＭＶの再活性化（Einsele et al.,2002）におけるウイルス複製の制御において、個体を保護するのに必要である。ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５が、ＨＣＭＶ血清応答陽性ＨＤから得られた両方のタイプのＴ細胞（形質導入後の７日目に採取した）を活性化することができたかどうかを、フローサイトメトリー分析に基づく１６ｈ  ＩＦＮ−γキャッチアッセイを使用して評価した（ｎ＝３）（図２５ａ）。対照群として、本発明者らは、無刺激、ｐｐ６５ペプチドプールによる刺激（このアッセイの標準的なポジティブコントロール）、およびｐｐ６５抗原を提示していないＳｍｙｌｅＤＣを含めた。これらの健常ドナーおよび短いアッセイ条件では、本発明者らは、ｐｐ６５ペプチドで刺激した際に、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞の頻度の増加を観察しなかった。ｐｐ６５ペプチドによる刺激とは対照的に、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５で刺激されたＣＤ３＋Ｔ細胞では、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ４＋Ｔ細胞（１８倍、ｐ＜０．０５）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（５倍、ｐ＜０．０５）の頻度の有意な増大が生じた。ｐｐ６５抗原を提示していないＳｍｙｌｅＤＣは、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞に対する、より弱いが、一貫した刺激を示した。これは、放出されたＩＦＮ−αが、Ｔ細胞を活性化して、ＩＦＮ−γを産生させる直接的な刺激作用（Hervas-Stubbs et al.,2011）による可能性が高い。
【０２６４】
抗原特異的なＣＤ８＋エフェクター細胞の活性化に及ぼすｐｐ６５発現の作用をさらに明らかにするため、本発明者らは、ＣＴＬを増殖させて以降の機能アッセイ用に十分な数になるように、Ａ＊０２；Ｂ＊０７ドナー（ｎ＝３、ＨＣＭＶ血清応答陽性）から得られたＤＣおよびＴ細胞の２つの連続したミクロ培養を行った（図２５ｂ）。精製された自家ＣＤ８＋Ｔ細胞と同時培養されたＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５は、刺激となる組み換え体サイトカイン（ＩＬ−２、−７および−１５）の存在下におけるＴ細胞の維持と比較して、７倍高いＴ細胞増殖をもたらした。注目すべきことに、ＳｍｙｌｅＤＣとＣＴＬの同時培養も、より高いＴ細胞増殖（１２倍）をもたらした。これは、刺激が部分的に恒常性作用により、抗原に依存しないことを示す。ミクロ培養系における同様の増殖は、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５とＣＤ３＋Ｔ細胞との同時培養の後でも観察された。それでも、唯一ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５の存在下で増殖したＣＴＬは、高頻度のｐｐ６５特異的なＴ細胞を示し、これをペンタマー染色によって分析した（Ａ＊０２拘束性エピトープｐｐ６５  ａ．ａ．４９５〜５０３：平均＝７．７％、Ｐ値＜０．０５；Ｂ＊０７拘束性エピトープｐｐ６５  ａ．ａ．４１７〜４２６：平均６．４％、Ｐ値＜０．１）（図２５ｂ）。ＳｍｙｌｅＤＣまたはＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５で刺激され、インビトロ増殖したＣＴＬを、その後、細胞傷害性機能について評価された。Ａ＊０２（ＫＡ＊０２）またはＢ＊０７（ＫＢ＊０７）を構成的に発現するように遺伝的に改変され、高レベルのｐｐ６５抗原を発現するようにレンチウイルスで形質導入されたＫ５６２細胞を標的として使用した（図２５ｃ）。ＣＴＬを、異なったエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で４時間同時インキュベートし、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出について細胞上清を評価した。ＳｍｙｌｅＤＣと共に増殖したＣＴＬは、ＫＡ＊０２またはＫＢ＊０７標的との同時インキュベーションの際に、標的においてｐｐ６５抗原が発現したかしないかに関わらず、類似した細胞傷害性の作用を示した。対照的に、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５で刺激されたＣＴＬは、ｐｐ６５を発現するＫ５６２標的細胞を用量依存的により効果的に溶解させた（図２５ｃ）。このデータは、ｐｐ６５特異的なＴ細胞刺激を生み出すようにベクターを導入したＤＣにおけるｐｐ６５同時発現のインビトロ作用を確認した。
【０２６５】
ヒト成体ＣＤ３４＋細胞を移植され、ＳｍｙｌｅＤＣ対ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５で免疫処置されたＮＲＧマウスの造血再構成
ＣＤ８＋増殖に及ぼすＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５のインビボ作用を実証し、Ｂ細胞および液性応答に及ぼす可能性のある適応作用を評価するために、４週齢の放射線照射されたＮＲＧマウスに、磁気ビーズを用いた２ラウンドの選択の後にＧ−ＣＳＦ動員幹細胞ドナーから得られたＣＤ３４＋細胞を移植した（図２６ａ）。ＨＣＴの１０週後に、末梢血の分析によって、ヒト造血細胞の生着がすべてのマウスで同等のレベルであることが確認された。この時点における、マウス細胞と比較したヒトＣＤ４５＋細胞の平均頻度は約２．５％であった。このＨＣＴヒト化マウスモデルについて本発明者らが以前に観察した通り（実施例３参照）、過半数のヒト細胞（８０〜９０％）はＢ細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ１９＋細胞と定義する）であった。ヒトＴ細胞の頻度は、それよりかなり低く、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４５＋／ＣＤ４＋細胞と定義される；１〜６％）が明らかに優性であったが、ＣＴＬは極めて低い頻度（ＣＤ４５＋／ＣＤ４＋細胞と定義される；最大３％まで）であった。したがって、適応造血再構成、すなわちＴ細胞およびＢ細胞の増殖に及ぼす作用を評価するために、同じＨＳＣドナー材料から精製されるＣＤ１４＋単球を「自家」ＳｍｙｌｅＤＣまたはＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５を製造するのに使用した。ＨＣＴ後の１０週目および１１週目に単回の初回刺激／追加刺激としてＤＣワクチン接種を行った。ＨＣＴ後の１３週目に中間ＰＢＬ分析を行った後、巨視的病理検査および組織収集を行うために、２０週目にマウスを屠殺した。最初に、本発明者らは、血中で検出可能なヒトＴ細胞およびＢ細胞の動態分析を行った。ＳｍｙｌｅＤＣまたはＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５で免疫処置されたマウスは、１３〜２０週目に、ヒトヘルパーＴ細胞（平均５０％）およびＣＴＬ細胞（３０％）両方の頻度の顕著な増大を示した（図２６ｂ）。このモデルを使用した本発明者らのグループの以前の結果は、免疫処置されていないＨＣＴ対照が、２０週目において、１０週目と同様に、ヒトヘルパーＴ細胞とＣＴＬを同様のレベルで示したことを示した（「実施例２」参照）。付随して、最後の免疫処置（１３週目）の２週間後とは対照的に、ＤＣ初回刺激／追加刺激（２０週目）の９週間後に観察された作用は劇的であった。この点で、最も高頻度のヒト細胞はＴ細胞であり、これは、両方のワクチン群でＣＤ４＋Ｔ細胞が約４０％を占めていた。一方、本発明者らは、ＳｍｙｌｅＤＣ免疫処置では平均的１７％のＣＤ８＋Ｔ細胞を観察し、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５免疫処置では平均３０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を観察した（ｐ＞０．５）（図２６ｂ）。ＣＤ４／ＣＤ８比（ＳｍｙｌｅＤＣでは２．６、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５では１．５、ｐ＝０．０７）を低下させるＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５のより顕著な作用を示すこれらの結果は、本発明者らのインビトロＴ細胞刺激アッセイと結果と一致しており、ＣＴＬ増殖に及ぼすｐｐ６５発現の作用を実証するものである。同時に、分析の２０週目に、両方の免疫処置群におけるＢ細胞の頻度が、１０週目における初期の９０％と比較して、約１０％まで有意に低下した（図２６ｃ）。したがって、これらの結果は、免疫処置の際に、ベクターを導入されたＤＣが、ＨＳＣの発生の優先順位をなんらかの方法でＢ細胞からＴ細胞に切り替えることができたことを示した。本発明者らは、脾臓におけるヒトＴ細胞（３７％Ｔｈ、１８％ＣＴＬ、および３３％Ｂ細胞）の優性な再増殖を観察した。脾臓内の細胞の約３３％がヒトＣＤ４５＋リンパ球であった。これは、ＰＢＬに比べて３倍高い頻度である。骨髄でも同様に高頻度のヒトＴリンパ球が検出された（約１７％がヒト細胞；このうち、３５％がＴｈ、２６％がＣＴＬ、２９％がＢ細胞）。脾細胞における表現型Ｔ細胞マーカーの分析は、マウス部分集団（ＳｍｙｌｅＤＣではｎ＝５およびＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５ではｎ＝２）でのみ可能であった。ナイーブ、セントラルメモリー、およびエフェクターメモリーの頻度がさらに均衡していたＳｍｙｌｅＤＣ免疫処置とは大きく異なり、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５で免疫処置されたマウスから分析されたＴｈ細胞は、より優性なエフェクターメモリー表現型を示し、ナイーブ細胞は残存レベルしか示さなかった（図２６ｄ）。同時に、エフェクターメモリーＣＴＬの頻度は、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５免疫処置後よりもわずかに高かった。したがって、Ｂ／Ｔ細胞コンパートメントだけが免疫処置後に変わったのではなく、Ｔ細胞活性化のレベルも変わったのである。本発明者らは、マウスの移植片対宿主病のいずれの徴候もモニターした。Ｔ細胞の頻度および活性化の劇的な上昇にもかかわらず、ＧＶＨＤが観察されたのは、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５で免疫処置された１６匹のマウスのうちのわずか１匹であった。ＰＢＬ分析は、ＰＢＬ、脾臓、および骨髄でエフェクターメモリーＴｈおよびＣＴＬ細胞の頻度が高いことを示した。
【０２６６】
ＨＣＴ後におけるＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５の機能性および恒常性ヒトＴ細胞およびＢ細胞作用
様々な造血系列の再構成に及ぼす作用に加えて、本発明者らは、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５で免疫処置されたＨＩＳマウスの機能的免疫応答に関するいくつかの特性を特徴付けた。ＰＢＬ−ＣＤ３４＋ＨＳＣを移植され、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５で免疫処置されたマウスは、マウス血漿で検出可能だったいくつかのヒトサイトカインのレベルの劇的な増加を示した（図２７ａ）。これらのサイトカインは、偏りの無いＴｈ１／Ｔｈ２パターンを反映したものであり、ＩＬ−５（好酸球活性化に関連）およびＭＣＰ１（単球およびマクロファージの移動および浸潤を調節するケモカイン）に加えて、Ｔｈ１型のサイトカイン（１０ｐｇ／ｍｌまで：ＩＬ−５（ＩＬ−β）；１０ｐｇ／ｍｌ超：ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α）も、Ｔｈ２型のサイトカイン（１０ｐｇ／ｍｌまで：ＩＬ−１２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ−８；１０ｐｇ／ｍｌ超：ＩＦＮ−γ）も検出された。注目すべきことに、ＭＣＰ１を例外として、これらのサイトカインは、ＳｍｙｌｅＤＣ免疫処置後のマウス血漿では検出可能でなかった。これは、Ｔ細胞およびＢ細胞との免疫シナプスを安定化させ、広範なヒトサイトカインおよびケモカインの産生を促進する、ＤＣによる内因性ｐｐ６５抗原提示の重要な役割を示す。
【０２６７】
抗ｐｐ６５特異的なＴ細胞応答を評価するため、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５で免疫処置されたマウスの脾細胞をプールし、選別されたヒトＴｈ細胞およびＣＴＬをＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで非特異的に活性化し、更なる分析を可能にするためにＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５と共にさらにインビトロ増殖させた。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して、１週間の刺激の後における抗ｐｐ６５応答を評価した。Ｔ細胞にｐｐ６５をパルス添加した後、本発明者らは、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞の両方の応答性（定量化されたＩＦＮ−γ陽性スポットとして測定される）を観察したが、ｐｐ６５ペプチドをパルス添加されなかったＣＤ４＋も活性化されたので、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答性のみがｐｐ６５に特異的であることが示された（図２７ｂ）。
【０２６８】
もう１つの重要な免疫モニタリングパラメータは、ＨＣＴおよび免疫処置の後のマウスの血清転換であった。とりわけ、幾つかのタイプのヒト免疫グロブリンがＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５免疫処置後に検出可能であった（ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、およびＩｇＧＭ）（図２７ｃ）。ＳｍｙｌｅＤＣワクチン中に抗原がない場合には、本発明者らは、ＩｇＭ産生しか観察することができなかった。したがって、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５の抗原提示は、Ｂ細胞発生中に、Ｉｇ−スイッチを促進した。ｐｐ６５に対して特異的な血漿免疫グロブリン応答性の分析は、検出可能なレベルのＩｇＭを示した（図２７ｄ）。
【０２６９】
ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞を移植され、様々な用量のＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５で免疫処置されたＮＲＧマウスの造血再構成
ＵＣＢは、極めて未熟な分化段階にあるＨＳＣおよび前駆細胞の豊かな供給源である。それ故、レンチウイルスベクターを導入したＤＣの、インビボ造血再構成における作用について検討するより厳格なモデルとして、本発明者らは、ＵＣＢから単離されたＣＤ３４＋細胞をＨＳＣの供給源として用いた。ＵＣＢ単球からのＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５の生成は、本発明者らの標準的なプロトコールを使用して可能だった。ＮＲＧマウスへのＣＤ３４＋ＵＣＢＴの導入は、１用量１．５×１０５個の細胞を放射線照射された４週齢のマウスにｉ．ｖ．注射することで、再現性をもって確立することができた（図２８ａ）。本発明者らは、ＰＢＬ−ＣＤ３４＋モデルについて行ったように、すなわち、ＨＣＴ後の１０週目および１１週目に、免疫処置されていないマウスをＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５で免疫処置されるマウスと比較した。加えて、ＨＳＣがより未熟な状態にあり、かつ潜在的によりアネルギー性の環境にあることを考慮に入れて、本発明者らは、さらに初期、ＨＣＴ後の６週目および７週目にも、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５免疫処置を投与した（図２８ｂ）。免疫処置されていない対照マウスは、ＨＣＴの１０週間後に、循環リンパ球の６０〜８０％がヒト起源であり、そのうち＞９０％をＢ細胞が占め、約１０％をＴ細胞が占めることを示した（図２８ｂ）。ＨＣＴ後の１０週目から１６週目まで、本発明者らは、血中におけるＴｈ細胞およびＣＴＬの頻度が連続的かつ漸進的に増加し、Ｔｈのピークが２０％となり、ＣＴＬのピークが１０％となることを観察した。ＣＤ４／ＣＤ８比は、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５による１回の初回刺激／追加刺激ワクチン接種では変わらなかった（対照の３．１に対して、ワクチン接種されたマウスの１６週目では２．６、ｐ＝０．４５）が、２回の初回刺激／追加刺激ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５ワクチン接種の後には、最後の１６週目の時点で、ＣＤ４／ＣＤ８比の低下が観察された（１．６、ｐ＝０．０９）。Ｂ細胞の頻度は、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５免疫処置の後、影響されなかった（すべての群で、ワクチン接種の前の約９０％から１６週目の約５０％までの範囲にあった）。これらのことが見出されたのに加えて、より強力なＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５免疫処置によって、ＨＣＴ後の１０週目から１６週目までの時点における、より高頻度のエフェクターメモリーＣＴＬ（それぞれ９％と２９．５、ｐ＝０．１、図２８ｃ）に関する量的作用も示した。脾臓では、強力な４×ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５免疫処置の後に、全ＣＴＬ（対照マウス１．１×１０６に対して２．７×１０６、ｐ＝０．１８）、ナイーブＣＴＬ（対照マウス０．３×１０６に対して０．８×１０６、ｐ＝０．４６）、およびＥＭ  ＣＴＬ（対照マウス０．３×１０６に対して１×１０６、ｐ＝０．１８）の絶対細胞数が増加した（図２８ｃ）。
【０２７０】
ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５免疫処置は胸腺Ｔ細胞発生を強化する
本発明者らは、臍帯血幹細胞再構成に由来する成熟Ｔ細胞の増殖が末梢胸腺外事象であるのか、または胸腺内でＴ細胞の発生を強化するＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５免疫処置の結果でもありえたのかを評価した。本発明者らは、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５（２×）で免疫処置されたマウスの胸腺において、有意に高い頻度の二重陽性ＣＤ４＋／ＣＤ８＋およびＣＤ３＋ｌｏ；ＴＣＲαβ−Ｔ細胞前駆体を観察した（図２８ｄ）。これは、胸腺Ｔ細胞発生の回転率が高くなっており、その結果、ＣＴＬの数が多くなりうることを示す。そのようなＣＴＬは、次いで、末梢における（ＬＮおよび脾臓で）後続の抗原刺激および成熟Ｔ細胞への進行のためにナイーブＴ細胞として血中に動員される可能性がある。
【０２７１】
ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５免疫処置は胸腺Ｔ細胞発生を強化する
耐容性と関連づけられているＴ細胞系列におけるＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５の影響を評価するため、本発明者らは、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の頻度を調べた。ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５免疫処置は、成熟して機能的なヒトＣＴＬの再構成およびＵＣＢＴ後の液性応答を改善したが、調節性ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−Ｔ細胞の中程度ではあるが、注目すべき程度の増殖も観察された。とりわけ、４×ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５免疫処置は、血中におけるその頻度を増大させた（６．７％；４×ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５対対照、ｐ＝０．０６、図２８ｅ）。エフェクターおよび免疫寛容誘導性細胞の均衡のとれた再生は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症に対抗する免疫寛容誘導性能力を与えている可能性がありうる。注目すべきことに、ＵＣＢ由来のＨＳＣを移植され、１６週間まで継続的に観察されたマウスは、ＧＶＨＤを発病しなかった。
【０２７２】
機能的なヒト免疫系で再構成されたＮＲＧマウスにおける無徴候または軽度のグレード１  ＧＶＨＤ
造血幹細胞の異種移植の後、完全に機能するヒト免疫系をマウスで再構成する場合、マウスの移植片対宿主病が懸念される。結局、レシピエントのＨＬＡ分子は、ドナーのＨＬＡ分子とはまったく適合しない。この理由から、上述の実施例で使用された動物をＧＶＨＤの徴候および症状について評価した。評価は、腸の炎症および／または調節性免疫細胞の頻度などの解剖的な特徴に基づくものであった。解剖的な評価は、熟練した病理学者が行った。評価の結果を表３にまとめる。
【０２７３】
結果は、再構成されたヒト免疫系が、たとえそれが他の点で機能的であっても、マウスにおいてＧＶＨＤの中等度または重度の徴候を引き起こさなかったことを示している。したがって，造血幹細胞移植後のレシピエントにおける機能的な免疫系の再構成を補助するための本発明のｉＤＣの使用は、レシピエントの組織に対する、移植された免疫系の耐容性を誘導する可能性を有する。したがって、マウスとヒトの間の白血球抗原の違いは様々なヒトのＨＬＡ分子の違いよりも大きいという事実を考えると、本発明のｉＤＣの使用は、移植後のＧＶＤＨを最小にするために現在適用されている適合性判断基準を満たさないドナーを使用する同種間のＨＳＣ移植を可能にする可能性を有する。ｉＤＣのこの使用は、所与の患者のための潜在的ドナーの範囲をかなり広げ、それ故、ＨＬＡ分子の希少な組合せを有するレシピエントのドナーを見つける可能性を有する。
【０２７４】
考察
同種異系ＨＳＣの移植は、高リスク血液系悪性腫瘍の患者の有効な治療オプションであるが、ＨＣＭＶ感染は、生存をかなりの危険に曝す。本発明者らの結果は、初期ＣＭＶプロモーターの制御下に、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、およびＨＣＭＶ  ｐｐ６５抗原をコードしている３シストロンＩＤ−ＬＶが、Ｇ−ＣＳＦ動員されたドナーの末梢血および臍帯血に由来するヒトＣＤ１４＋単球を高効率で再プログラムできることを示す。単球をＩＤ−ＬＶベクターに１終夜曝露すると、それらは、高い生存能力、免疫学的特性（ＭＨＣ  ＩＩ、同時刺激分子、および炎症性サイトカインの発現）、ならびにＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、およびｐｐ６５の構成的発現を有する、７日間自律的に維持されるＤＣに自己分化する。ｐｐ６５の異所性発現がＩＦＮシグナリングを阻害する可能性があると以前に報告されている（Browne and Shenk, 2003）が、本発明者らの観察では、この３シストロンベクターにおいてシスに発現されたｐｐ６５の有害作用がみられなかった。これは、ＤＣの再プログラムのために、２つのベクターを使用してｐｐ６５をトランスで同時発現させた本発明者らの以前の研究を支持する（Daenthanasanmak et al.,2012;Salguero et al.,2011）。
【０２７５】
ＭＯＩ  ５のＩＤ−ＬＶを用いた単球の形質導入の結果、１細胞当たり０．３コピー未満のベクターとなり、組み込みパターンの分析は、高いポリクローナル性があり、以前に記載されているがん原遺伝子クラスターへの偏りがないことを示した。ＧＯＬＧＡ７クラスター領域へのＩＤ−ＬＶの組み込みが最も高頻度の「ホットスポット」のようであった。これは、活性化樹状細胞に分化する過程にある活性化単球の活性転写領域を反映している可能性がある。ＧＯＬＧＡ７は、偏在的に発現されるタンパク質であり、ゴルジから原形質膜までタンパク質を輸送するパルミトイル化酵素として機能する（Ohta et al.,2003）。ＧＯＬＧＡ７遺伝子発現は、活性化されたＤＣで増大する（Cuiffo and Ren, 2010;Li et al.,2000）。ＤＣおよびＢ細胞活性化の間、ＭＨＣＩＩは、内部小胞から原形質膜へと能動的に外面化され、ＧＯＬＧＡ７は、ゴルジ装置を通したタンパク質輸送で重要な役割を有している可能性がある。ＧＯＬＧＡ７は、８番染色体における、骨髄単球性白血病におけるトリソミーモザイク現象と関連している領域に位置している（Ripperger et al.,2011）が、原がん遺伝子であると知られているわけではない。しかし、組み込み部位についてＩＣ−ＬＶが何故同じ選好性を示さなかったかは、未だ機構的に解明されてはいない。これは、活性化された単球のゲノムにおけるＩＤ−ＬＶの組み換えおよび最終的な組み込みは、ＩＣ−ＬＶよりも、転写活性の高い「開いた」ゲノム領域に偏っているかもしれないことを示している。それでも、レンチウイルスベクターを導入したＤＣのどちらのタイプも、造血幹細胞を遺伝的に改変するのに使用したレンチウイルスベクターの前臨床研究で特徴付けられた最も知られているホットスポット（ＫＤＭ２Ａ、ＰＡＣＳ１およびＴＮＲＣ６Ｃ）（Aiuti et al.,2013）への組み込みを示さなかった。これは、細胞型および活性化刺激によって異なるであろう活発に転写されているクロマチン領域に組み込まれるＨＩＶ−１の挙動を反映している。
【０２７６】
ＣＤ３４＋およびＣＤ１４＋前駆細胞からインビトロ誘導された樹状細胞は、ＨＣＭＶに極めて感染しやすく、ＨＣＭＶの完全な複製サイクルを妨げないことが報告されていた（Hertel et al.,2003;Riegler et al.,2000）ので、本発明者らは、安全性に関する潜在的な懸念として、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５がＨＣＭＶを伝染させうるかどうか調べた。内皮向性株ＴＢ４０／Ｅ−ＧＦＰを用いた本発明者らのインビトロ感染研究は、ＩＬ−４を発現するＳｍａｒｔＤＣが、ＨＣＭＶに、より感染しやすく、ＨＣＭＶの伝染を引き起こすことから、ＳｍｙｌｅＤＣによるＩＦＮ−γの強い発現がウイルス複製を阻害しうることを示した。とりわけ、ＳｍｙｌｅＤＣおよびＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５をＨＣＭＶにインビトロ曝露すると、Ｔ細胞を同時活性化するのに極めて重要な同時刺激分子であるＣＤ８０の上方制御が起きた。これは、構成的なＩＦＮ−γも、これらのＤＣに及ぼすＨＣＭＶの潜在的な免疫抑制作用を妨げたことを示唆する。
【０２７７】
臨床的に、ｐｐ６５特異的なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＨＣＭＶクリアランスで極めて重要な役割を果たすことが実証された。本発明者らの結果から、本発明者らは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を刺激する、ベクターが導入されたＤＣにおいて内因的に発現されたｐｐ６５の明らかな作用をインビトロで観察した。これは、ＩＦＮ−γ細胞内染色の上方制御およびｐｐ６５免疫優性エピトープに対する応答性ＴＣＲを有するＴ細胞の増殖によって検出された。さらに、増殖したｐｐ６５特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞は、ｐｐ６５抗原を発現している標的細胞に対して、優れた細胞溶解活性を示した。
【０２７８】
強力なインビトロ抗原性刺激に加えて、ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５は、ＨＣＴおよびＵＣＢＴヒト化マウスモデルにおける造血再構成を加速させた。本発明者らのインビトロ結果と同様に、免疫処置に使用されたＤＣによるｐｐ６５抗原の発現は、血中および脾臓内のヒトエフェクターＣＴＬの頻度を量的および／または質的に高めた。ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５免疫処置の後、胸腺内で新規に発生した、いくつかの組織に生体分布したＴ細胞は、主にメモリーＴ細胞となったが、抗原（ＨＣＴ後のＳｍｙｌｅＤＣ免疫処置）がない場合、本発明者らは、血中におけるナイーブＣＴＬ部分集団の増殖を主に観察した。ＳｍｙｌｅＤＣでワクチン接種されたマウスの脾臓および骨髄で観察されたエフェクターメモリーＣＴＬ集団の分化を何が推進したかは明らかでない。それらは、ＰＢＬ−ＨＣＴ後の免疫処置されていないマウスでも観察されたように、マウス異種抗原に応答性のＴ細胞を代表しているのかもしれない（実施例２参照）。
【０２７９】
ＨＣＴ後におけるヒト化モデルの免疫再構成の限界の１つは、成熟したＢ細胞の再構成が不十分であることと、Ｉｇクラススイッチの欠如である。注目すべきことに、ＩｇＭ、ＩｇＧ、およびＩｇＡは、ＨＣＴ後にＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５で免疫処置されたマウスにおいて高レベルで検出された（しかし、ＳｍｙｌｅＤＣでは検出されなかった）。これは、ｐｐ６５抗原は、Ｉｇクラススイッチについて、Ｂ細胞の成熟に影響を与えているかもしれないという考えを支持している。ヒト化マウスでの研究は、Ｂ細胞成熟がエフェクターＴ細胞の発生と相関していることを実証した（Lang et al.,2013）。したがって，ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５群によって推進されたｐｐ６５特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖は、Ｂ細胞成熟、Ｉｇクラススイッチ、および抗原特異的な特異抗体の分泌に必要なＣＤ４０Ｌなどの極めて重要な成熟因子を提供している可能性がある。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４などの組み換え体サイトカインの送達（Chen et al.,2012）またはＨＬＡクラスＩもしくはＩＩのトランスジェニック発現（Jaiswal et al.,2012;Suzuki et al.,2012）など、ＨＩＳマウスにおける適応免疫応答を改善する努力がいくつかなされている。ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５は、移植されたＨＳＣと完全にＨＬＡ適合し、広範なサイトカインを発現して、強力な抗原性シグナルを提供するので、これらの必要条件のいくつかを満たし得る。
【０２８０】
若年のヒト患者では、リンパ球枯渇後のＴ細胞免疫再構成が活発な胸腺リンパ球新生を介して起こりうるが、年配の成人では、主に末梢増殖したクローンの恒常性維持増殖を介して起こる（Williams et al.,2007）。恒常性維持増殖は、末梢Ｔ細胞プールの迅速かつ顕著な増殖をもたらし、恒常性維持サイトカインおよびリンパ球減少後の期間における抗原誘発応答に依存している（Williams et al.,2007）。ＨＣＭＶに対するいくつかのワクチン候補が現在臨床試験で評価されているが、生存力が高く、潜在的に大規模産生が可能であり、抗原性免疫再構成および恒常性維持免疫再構成の両方を提供する個別化されたベクター導入樹状細胞ワクチンは、ＨＣＴ後およびＵＣＢＴ後の死亡率および罹患率を下げる有望な臨床技術革新である。
【０２８１】
ＨＣＭＶが神経膠腫および乳がんなどの悪性疾患の病原ウイルスでありうることを示した病理学的および臨床的証拠が増加している（Soderberg-Naucler et al.,2013;Taher et al.,2013）。ＨＣＭＶによる悪性造血細胞の感染は報告されていないが、ＨＣＴレシピエントまたはドナーのＨＣＭＶ陽性血清状態は、急性白血病患者（特に急性リンパ性白血病）の生存に負の影響を与える（Schmidt-Hieber et al.,2013b）。さらに、ＨＣＴ後早期にＨＣＭＶ再活性化があった急性骨髄性白血病患者は、再発のリスクの低下を示した。これは、推定上の「ウイルス対白血病」作用（Elmaagacli, 2013;Green et al.,2013）またはＨＣＭＶが、白血病再発を増加させる病原ウイルスでありうることを示唆している。したがって，移植片対白血病を改善し、白血病再発率を低下させるという根拠で、ＨＣＴの後のＨＣＭＶを制御する免疫処置も探究される可能性がある。それ故、高リスクの急性白血病に対する将来の免疫治療臨床試験のために、ウイルス生産の規模を大きくし、医薬品の製造および品質管理に関する基準（ＧＭＰ）に従ったＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５生産の検証が開発中である。
【０２８２】
材料と方法
プラスミド構築およびインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤ−ＬＶ）の生成
レンチウイルスバックボーンベクターＲＲＬは、Ｌｕｉｇｉ  Ｎａｌｄｉｎｉ教授（ミラノ大学（Ｕｎｉｖ．  Ｍｉｌａｎ））より贈与された。ベクターＲＲＬ−ｃＰＰＴ−ＣＭＶｐ−ＧＭ−ＣＳＦ−Ｐ２Ａ−ＩＦＮ−α（ＬＶ−Ｇ２α）およびＲＲＬ−ｃＰＰＴ−ＣＭＶｐ−ｐｐ６５（６５ｋＤａ）の構築は、以前に記載されている（Daenthanasanmak et al.,2012）。ＬＶ−ＧＭ−ＣＳＦ−Ｐ２Ａ−ＩＦＮ−α−Ｆ２Ａ−ｐｐ６５（ＬＶ−Ｇ２α−ｐｐ６５）を作製するために、口蹄疫ウイルスの２Ａエレメント（Ｆ２Ａ）が間に入った鋳型として、ヒトＧＭ−ＣＳＦ−ＩＦＮ−αおよびｐｐ６５のｃＤＮＡを使用してオーバーラップＰＣＲを行った。Ｆ２Ａエレメントを用いたＬＶ構築の戦略は、以前に記載されている（Szymczak and Vignali, 2005）。ＩＦＮ−αとｐｐ６５の間に入るＦ２Ａエレメントを作製するのに使用したプライマーは、Ｆ２Ａ／ｐｐ６５  Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＣＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＡＣＴＴＴＧＡＡＴＴＴＴＧＡＣＣＴＴＣＴＣＡＡＧＴＴＧＧＣＧＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＴＧＧＡＧＴＣＧＣＧＣＧＧＴＣＧＣＣＧＴＴＧ−３’（配列番号７）およびＦ２Ａ／ＩＦＮ−α  Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＧＧＧＴＴＧＧＡＣＴＣＣＡＣＧＴＣＴＣＣＣＧＣＣＡＡＣＴＴＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＴＴＣＡＡＡＧＴＣＴＧＴＴＴＣＡＣＣＧＧＴＴＣＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＡＡＡＣＴＴＴＣＴＴＧＣＡ−３’（配列番号８）であった。ＰＣＲ産物を制限酵素ＸｂａＩおよびＣｌａＩで消化し、ＲＲＬ−ｃＰＰＴ−ＣＭＶｐ−ＭＣＳベクターの多重クローニング部位に挿入した。すべての構築物の構造完全性を制限消化およびシーケンシング分析によって確認した。大規模レンチウイルス生産は、以前に記載されているように、ヒト胎児由来腎臓２９３Ｔ細胞の一過性同時形質移入によって行った（Stripecke, 2009）。ＩＤ−ＬＶの生成は、バックボーンベクターと下記のパッケージングプラスミドの組合せを同時形質移入で使用して行った。Ｄ６４Ｖ点変異を含むｇａｇ／ｐｏｌを発現するプラスミド（ハノーヴァー医科大学のＡｘｅｌ  Ｓｃｈａｍｂａｃｈ教授より贈与）、およびｒｅｖを発現するプラスミド、およびＶＳＶ−Ｇエンベロープをコードするプラスミド。
【０２８３】
ＩＤ−ＬＶでレンチウイルスベクターを導入したＤＣの作製
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ＨＬＡ−Ａ＊０２．０１／ＨＬＡ−Ｂ＊０７．０２陽性ＨＣＭＶ応答性の成人健常ボランティアから、白血球アフェレーシスはＧ−ＣＳＦ動員ドナーから、臍帯血は、ハノーヴァー医科大学の倫理審査委員会の承認を得た研究プロトコールに従って得た。ＣＤ１４＋単球からレンチウイルスで誘導されたＤＣの作製は、以前に記載されている（Daenthanasanmak et al.,2012）。簡潔には、ＣＤ１４単離ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ−Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＰＢＭＣからＣＤ１４＋を単離した。形質導入前の８時間、組み換え体ヒトＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４（各５０ｎｇ／ｍｌ、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で単球をあらかじめ調整した。２．５μｇ／ｍＬ  ｐ２４相当のＩＤ−ＬＶ−Ｇ２α／ｐｐ６５を使用して、５μｇ／ｍｌの硫酸プロタミン（Ｖａｌｅａｎｔ、Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の存在下、感染多重度（ＭＯＩ）５で１６時間、５×１０６個の単球への形質導入を行った。形質導入後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、無血清Ｘ−ｖｉｖｏ培地（Ｌｏｎｚａ）による培養でさらに維持するか、マウスの免疫処置に直接使用した。
【０２８４】
サイトカインおよび導入遺伝子発現の分析
２９３Ｔ細胞溶解物中および上清中のＨＣＭＶ  ｐｐ６５タンパク質の検出は、ウエスタンブロット解析（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定された。ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５における細胞内ｐｐ６５の発現については、以前に記載されているように（Daenthanasanmak et al.,2012）、細胞内染色およびフローサイトメトリーによって行った。最初に、ＳｍｙｌｅＤＣをＤＣ表面抗原について抗ヒトＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ１１ｃ、およびＣＤ１２３モノクローナル抗体の組合せで染色し、次いでＢＤ  ｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で固定および透過化処理し、ＨＣＭＶ−ｐｐ６５に対するＦＩＴＣコンジュゲートマウスモノクローナル抗体（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＵＳＡ）と共にインキュベートした。分析は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用したＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行った。ＳｍｙｌｅＤＣ培養物の細胞上清中のサイトカインの検出は、製造業者の指示に従って使用した多重ｌｕｍｉｎｅｘビーズキット（Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＵＳＡ）によって行った。
【０２８５】
組み込み分析
１０、２０および３０日間培養で維持されたＩＣ−ＬＶおよびＩＤ−ＬＶから生じたＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５を、以前に記載されているように（Schmidt et al.,2007）、ＬＡＭ−ＰＣＲ方法によってウイルスコピー数および組み込み部位分析で評価した。組み込まれたＬＶのコピー数をｑＰＣＲによって定量化した。
【０２８６】
ＨＣＭＶ−ＴＢ４０／Ｅ  ＧＦＰの感染およびプラークアッセイ
ＨＣＭＶ  ＴＢ４０／Ｅ  ＧＦＰ株を、以前に記載されているように（Sinzger et al.,2008）増殖させたところ、ウイルス力価は１．７５×１０７ｐｆｕ／ｍｌであった。各タイプの標的ＤＣを、各時点（感染の０、２、４、６、８、および１０日後（ｄ．ｐ．ｉ））に５×１０５細胞ウェルで６ウェルに播種した。ヒト線維芽細胞（ＨＦ）をポジティブコントロールとして使用した。ＤＣおよびＨＦ細胞を２４時間ＨＣＭＶ（ＭＯＩ  ２および１で）に感染させた。感染後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％ＦＢＳならびに１％のペニシリンおよびストレプトマイシンを補ったＤＭＥＭによる培養で維持した。感染した細胞を各時点にＧＦＰ分析用に採取し、ＤＣの表面染色のためにＰＥコンジュゲート抗ヒトＣＤ８０を使用した。洗浄後、細胞を１％のパラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリーによって分析した。プラーク形成アッセイのために、各時点に細胞上清を収集し、１００μｌの無希釈のＤＣ上清または希釈したＤＣ上清（１０倍の連続希釈で２０μｌ）を、４８ウェルプレートに播種された単層のＨＦ細胞に添加した。各上清および各時点につき２つの２連ウェルを用意した。２時間のインキュベーションの後、感染が細胞と細胞の間でのみ可能であることが確実となるように、５００μｌのカルボキシメチルセルロースを添加した。感染の４〜１０日後にプラーク数を分析した。プラーク数を確認するため、１０日目にギムザ染色を使用してプラークを染色した。力価（ｐｆｕ／ｍｌ）は、２連ウェルで計数したプラーク数の平均値×希釈率／希釈液の体積（０．１ｍｌ）から計算した。
【０２８７】
インビトロ刺激されたｐｐ６５応答性Ｔ細胞の分析
ＰＢＭＣから自家ＣＤ３＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、製造業者のプロトコール（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に従ってＭＡＣＳシステムを使用して単離した。１０μｇ／ｍｌのＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ  ＣＭＶ−ｐｐ６５オーバーラップペプチドプール（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）またはＤＣで１６時間刺激されたＴ細胞のＩＦＮ−γ細胞内染色分析のために、Ｔ細胞を採取し、ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ３、ＰＢコンジュゲート抗ヒトＣＤ４、およびＰＣｙ７コンジュゲート抗ヒトＣＤ８抗体で染色した。Ｃｙｏｆｉｘ／ｐｅｒｍ（ＢＤ）で４℃、２０分間、固定／透過化処理し、洗浄した後、染色のため、抗ヒトＩＦＮγ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を３０分間使用した。ＬＳＲＩＩ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用したフローサイトメトリーによって細胞を捕捉し、分析した。ミクロ培養増殖系には、ＳｍｙｌｅＤＣまたはＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５（７日目）を単離された自家ＣＤ８＋Ｔ細胞と共に、５％ヒトＡＢ血清を補ったＸ−ｖｉｖｏ培地中、１：１０（ＡＰＣ：Ｔ細胞）の比率で９６ウェルプレートにて同時培養した。１ミクロ培養当たり、ガンマ線照射された自家ＣＤ８−フィーダー細胞（２×１０５）を添加した。３日間の後、ＩＬ−２（２０  ＩＵ／ｍｌ）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＩＬ−７およびＩＬ−１５（各５ｎｇ／ｍｌ、Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ、Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を１日おきに細胞に補充した。７日後の再刺激のために、凍結保存されたＤＣを解凍し、Ｔ細胞に１：１０の比率で添加した。再刺激されたＴ細胞を採取し、計数し、四量体染色によってｐｐ６５−応答性について分析した。ＰＥコンジュゲート四量体（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ、ｐｐ６５アミノ酸（ａ．ａ．）４９５〜５０３；ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２−ＴＰＲＶＴＧＧＧＡＭ、ｐｐ６５  ａ．ａ．４１７〜４２６；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ３、ＰＢコンジュゲート抗ヒトＣＤ４、およびＰＣｙ７コンジュゲート抗ヒトＣＤ８を使用した。
【０２８８】
免疫不全ＮＲＧマウスへの造血幹細胞移植
ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｒａｇ１ｔｍｌＭｏｍ  Ｉｌ２ｒｇｔｍｌＷｊｌ（Ｎｏｄ．Ｒａｇ１−／−．ＩＬ２ｒγ−／−、ＮＲＧ）マウスの繁殖対を、ＩＶＣシステム（ＢｉｏＺｏｎｅ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）における病原体のない条件下で繁殖させ、飼育した。マウスが関与するすべての手順は、ニーダーザクセン州によって審査および承認され、ハノーヴァー医科大学の動物施設により提供されたガイドラインに従って行った。ＭＡＣＳシステムでＧ−ＣＳＦ動員ドナーから単離された５×１０５個のヒトＣＤ３４＋幹細胞または臍帯血から単離された１．５×１０５個のＣＤ３４＋細胞を、４週齢の放射線照射されたＮＲＧマウスの尾静脈に移植した。移植後の６／７週目および１０／１１週目に、初回刺激／追加刺激として５×１０５個の自家ＳｍｙｌｅＤＣまたはＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５を、後側腹部における皮下注射によってマウスにワクチン接種した。免疫処置前、１０週目に、ベースラインフローサイトメトリー分析のために、各マウスから末梢血を収集した。血、血漿、脾臓、および骨髄を収集するために、２０週目にマウスを屠殺した。ＰＢＬ試料を赤血球溶解バッファー（０．８３％塩化アンモニウム／２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２）中で、５分間２回処置し、ＰＢＳで洗浄し、ヒト抗体ＰＢコンジュゲート抗ＣＤ４５、ＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ３、Ａｌｅｘａ７００コンジュゲート抗ＣＤ１９、ＡＰＨＣｙ７コンジュゲート抗ＣＤ４、ＰＣｙ７コンジュゲート抗ＣＤ８、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ４５ＲＡ、ＰＣｙ５コンジュゲート抗ＣＤ６２Ｌで染色した。ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋陽性の細胞であるナイーブ細胞（Ｎ）、Ｔセントラルメモリー（ＴＣＭ、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ−）、およびＴエフェクターメモリー（ＴＥＭ、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋）によって、Ｔ細胞の部分集団を定義した。分析は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを使用したＦＡＣＳ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行った。Ｔ細胞エフェクター機能アッセイには、ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をＭｏｆｌｏ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で脾細胞から選別し、マウス（ｎ＝３）から得られた、選別されたＣＤ４＋またはＣＤ８＋脾細胞をプールし、ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｔ細胞活性化キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）でＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５による７日間のインビトロ刺激の前に４８時間刺激した。１ウェル当たり５０，０００個のＴ細胞を採取し、ＩＦＮ−γ抗体コーティングされたＥＬＩＳＰＯＴプレートに接種し、ｐｐ６５ペプチドプールを終夜パルス添加した。プレートを製造業者（Ｍａｂｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）による記載の通りに発色させた。ペプチドをパルス添加されていない細胞を対照として使用した。マウス血漿中のサイトカインおよび免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）のレベルを、製造業者のプロトコール（Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ  Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＵＳＡ）に従ってビーズアレイで定量化した。Ｔｒｅｇ頻度の分析には、単核細胞を、最初に、ＰＢコンジュゲート抗ＣＤ４５、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ３、Ａｌ���ｘａ７００コンジュゲート抗ＣＤ４、ＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ１２７、ＰＣｙ７コンジュゲート抗ＣＤ２５で表面マーカーについて染色した。Ｆｏｘｐ３  ｆｉｘ／ｐｅｒｍバッファー（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で４℃、３０分間、固定／透過化処理し、その後洗浄した後、ＰＥコンジュゲート抗Ｆｏｘｐ３を使用して３０分間染色し、その後洗浄し、さらに細胞捕捉へと進行した。
【０２８９】
胸腺の分析
胸腺を採取し、続いて単細胞懸濁液をＰＢコンジュゲート抗ＣＤ４５、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ３、Ａ７００コンジュゲート抗ＣＤ４、ＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ３、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＴＣＲαβ、およびＦＩＴＣコンジュゲート抗ＴＣＲγδで染色し、その後洗浄し、ＬＳＲＩＩフローサイトメトリーによって分析した。胸腺の様々な発生段階におけるＴ細胞の分析。ＤＰ：ＣＤ４５＋／ＣＤ４＋／ＣＤ８＋、ＣＤ４ＳＰ：ＣＤ４５＋／ＣＤ４＋／ＣＤ８−、ＣＤ８ＳＰ：ＣＤ４５＋／ＣＤ４−／ＣＤ８＋、ＣＤ３ｌｏ：ＣＤ４５＋／ＴＣＲαβ−／ＴＣＲγδ−、ＣＤ３αβｈｉ：ＣＤ４５＋／ＴＣＲαβ＋、ＣＤ３γδｈｉ：ＣＤ４５＋／ＴＣＲγδ＋。分析は、ＦｌｏＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）ソフトウェアを使用して行った。
【０２９０】
統計分析
統計的有意性を決定するのに、ノンパラメトリックマン・ホイットニーＴ検定統計分析を使用した。すべての検定は片側であり、Ｐ＜０．０５を有意とみなした。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェア（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）で分析した。
【０２９１】
参考
【０２９２】
【表１】
2016513953.tif 000002
【表２】
2016513953.tif 000003
【表３】
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【表４】
2016513953.tif 000005
【０２９３】
表１：ＣｏｎｖＤＣで免疫処置された対照または免疫処置されていない対照との比較における、ＳｍｙｌｅＤＣで免疫処置されたマウスの血中および脾臓内のヒトＴ細胞頻度の有意な増大
【表５】
2016513953.tif 000006
【０２９４】
【表６】
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【０２９５】
【表７】
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【表８】
2016513953.tif 000009
【０２９６】
併せて、以上に示したデータは以下のことを実証した。
【０２９７】
１．従来のヒトＤＣワクチン（インビトロまたはインビボにおける生存力が低く、免疫学的に安定でない）と本発明者らのｉＤＣ（インビトロおよびインビボで数週間にわたって生存し効力をもつ）との根本的な相違。
【０２９８】
２．いったん皮下に注射されたｉＤＣの、ＬＮ−「原基」にトラフィキングし、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞（特に、エフェクターメモリー細胞およびセントラルメモリー細胞に代表される）、瀘胞ヘルパーＴ細胞ならびに成熟Ｂ細胞のリクルートメントをもたらす能力。
【０２９９】
３．ｉＤＣ投与が、ＣＭＶで発現されるタンパク質（ｐｐ６５）に対する抗原特異的な応答として測定可能な適応ＣＴＬ応答をもたらすこと。
【０３００】
４．マウスで高レベルのヒトＩｇＧ産生およびｐｐ６５に対する応答性を刺激する（ＮＲＧにおけるヒトＢ細胞の発生中に免疫グロブリンクラススイッチが起こったことを実証する）ｉＤＣ免疫処置の作用。
【０３０１】
５．ｉＤＣリプログラミングにおける安全性の強化された（これは、挿入変異のリスクを低下させることによって遺伝的プログラミングの安全性を強化する）インテグラーゼ欠損レンチウイルスの適用性。
【０３０２】
６．ｉＤＣの臨床開発および使用に向けた現実的な展望（１．レンチウイルスベクターは、臨床遺伝子治療プロトコールにおいてエキソビボ遺伝子導入用にすでに使用されており、２．本発明者らが用いたＨＳＣ供給源は、臨床ＨＳＣＴ用に日常的に使用されており、３．用いられたｐｐ６５  ＣＭＶ抗原は、ＨＳＣＴ後のリンパ球減少性宿主における強力な抗ＣＭＶ応答を刺激するのに臨床的に重要であるので）。
【０３０３】
７．ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−αのみを発現するＳｍｙｌｅＤＣと、ＨＣＭＶのｐｐ６５抗原をさらに発現するＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５  ｉＤＣとの間の比較は、後者のタイプのｉＤＣが、レシピエントにおけるより高いレベルのヒトサイトカインおよび様々なタイプのヒト免疫グロブリンの存在と有意に相関しており、Ｂ細胞およびＴ細胞のより迅速な増殖を引き起こすことを示す。
【０３０４】
８．血中および脾臓内で成熟Ｔ細胞の増殖が観察されたことに加えて、ＵＣＢＴ後のＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５免疫処置によって、胸腺におけるＴ細胞前駆体の頻度が高くなっていることを示した。これは、胸腺細胞増殖を強化する恒常性および／または抗原性シグナルを与えるＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５の能力を反映している。ＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５免疫処置が、末梢へのナイーブＴ細胞の移動を強化し、胸腺におけるＴ細胞前駆体のより定常的な産生を可能にしている可能性もある。
【０３０５】
９．機能的な適応ヒト免疫系がマウスで効果的に再構成されたのにもかわらず、同様に異種のヒト幹細胞を移植され、ｐｐ６５免疫原を提示するドナー由来のＳｍｙｌｅＤＣで免疫処置された５８匹のマウスのうち１匹のマウスでしか重度の移植片対宿主病が観察されなかった。残りのマウスでは臨床上のＧＶＨＤ徴候は観察されなかった。熟練した病理学者によって病理組織学的に分析された４匹のマウスのコホートでは、部分集団のマウスが軽度のグレード１  ＧＶＨＤを示したのみであった。４回のＳｍｙｌｅＤＣ／ｐｐ６５投与による免疫処置は、Ｔｒｅｇｓの頻度を中程度に増大させた。したがって，ｉＤＣの使用は、現行の臨床プロトコールが必要とするようにレシピエントと完全に適合していないドナーを使用した造血幹細胞移植における転帰を潜在的に改善しうる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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