(57)【要約】リアソータントインフルエンザウイルスを生成するための改善された方法が提供される。一局面において、インフルエンザウイルスを調製する方法が提供され、上記方法は、ａ）インフルエンザウイルスゲノムのうちの少なくとも１種のセグメントを発現するためのコード配列を含む１種以上の発現構築物を調製する工程；ｂ）２９３Ｔではない細胞に、インフルエンザウイルスのウイルスセグメントをコードする１種以上の発現構築物を導入する工程であって、ここで少なくとも１種の発現構築物は、上記工程（ａ）で調製した発現構築物である、工程；およびｃ）上記工程（ｂ）で導入された発現構築物からリアソータントインフルエンザウイルスを生成するために、上記細胞を培養する工程；を包含し、ここで工程（ａ）〜（ｃ）は、１２４時間以下の期間で行われる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザウイルスを調製する方法であって、前記方法は、
ａ）インフルエンザウイルスゲノムのうちの少なくとも１種のセグメントを発現するためのコード配列を含む１種以上の発現構築物を調製する工程；
ｂ）２９３Ｔではない細胞に、インフルエンザウイルスのウイルスセグメントをコードする１種以上の発現構築物を導入する工程であって、ここで少なくとも１種の発現構築物は、前記工程（ａ）で調製した発現構築物である、工程；および
ｃ）前記工程（ｂ）で導入された発現構築物からリアソータントインフルエンザウイルスを生成するために、前記細胞を培養する工程；
を包含し、ここで工程（ａ）〜（ｃ）は、１２４時間以下の期間で行われる、方法。
【請求項２】
インフルエンザウイルスを調製する方法であって、前記方法は、
ａ）インフルエンザウイルスゲノムのうちの少なくとも１種のセグメントを発現するためのコード配列を含む１種以上の発現構築物を調製する工程；
ｂ）細胞に、インフルエンザウイルスのウイルスセグメントをコードする１種以上の発現構築物を導入する工程であって、ここで少なくとも１種の発現構築物は、前記工程（ａ）で調製した発現構築物である、工程；および
ｃ）前記工程（ｂ）で導入された発現構築物からリアソータントインフルエンザウイルスを生成するために、前記細胞を培養する工程；
を包含し、ここで工程（ａ）〜（ｃ）は、１００時間以下の期間で行われる、方法。
【請求項３】
前記細胞は、非ヒト細胞もしくはヒト非腎臓細胞である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
リアソータントインフルエンザウイルスを調製する方法であって、前記方法は、
ａ）インフルエンザウイルスゲノムのうちの少なくとも１種のセグメントを発現するためのコード配列を含む合成発現構築物を、（ｉ）前記合成発現構築物の複数の重複するフラグメントを合成する工程であって、ここで前記重複するフラグメントは、完全な前記合成発現構築物にまたがる、工程、および（ｉｉ）前記フラグメントを連結し、前記合成発現構築物を提供する工程、によって、提供する工程；
ｂ）２９３Ｔではない細胞に、インフルエンザウイルスを生成するために必要とされるウイルスセグメントをコードする１種以上の発現構築物を導入する工程であって、ここで少なくとも１種の発現構築物は、前記工程（ａ）で調製した合成発現構築物である、工程；ならびに
ｃ）前記工程（ｂ）で導入されたウイルスセグメントから、リアソータントインフルエンザウイルスを生成するために、前記細胞を培養する工程；
を包含し、ここで工程（ａ）〜（ｃ）は、１２４時間以下の期間で行われる、方法。
【請求項５】
前記細胞は、非ヒト細胞もしくはヒト非腎臓細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（ｄ）前記工程（ｃ）で使用される細胞と同じ細胞タイプの細胞と、前記工程（ｃ）で生成したウイルスとを接触させて、さらなるリアソータントインフルエンザウイルスを生成する工程をさらに包含する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
インフルエンザウイルスを調製する方法であって、前記方法は、
ａ）インフルエンザウイルスゲノムのうちの少なくとも１種のセグメントを発現するためのコード配列を含む合成発現構築物を、（ｉ）前記合成発現構築物の複数の重複するフラグメントを合成する工程であって、ここで前記重複するフラグメントは、完全な前記合成発現構築物にまたがる、工程、および（ｉｉ）前記フラグメントを連結し、前記合成発現構築物を提供する工程、によって提供する工程；
ｂ）細胞に、インフルエンザウイルスのウイルスセグメントをコードする１種以上の発現構築物を導入する工程であって、ここで少なくとも１種の発現構築物は、前記工程（ａ）で調製した合成発現構築物である、工程；
ｃ）前記工程（ｂ）で導入されたウイルスセグメントから、リアソータントインフルエンザウイルスを生成するために、前記細胞を培養する工程；ならびに
ｄ）前記工程（ｃ）で使用される細胞と同じ細胞タイプの細胞と、前記工程（ｃ）で生成したウイルスとを接触させて、さらなるリアソータントインフルエンザウイルスを生成する工程；
を包含し、ここで工程（ａ）〜（ｃ）は、１２４時間以下の期間で行われる、方法。
【請求項８】
前記工程（ｃ）および（ｄ）で使用される細胞は、２９３Ｔではない、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記工程（ｃ）および（ｄ）で使用される細胞は、非ヒト細胞もしくはヒト非腎臓細胞である、請求項７または請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記合成発現構築物は、ＨＡおよび／もしくはＮＡセグメントのコード配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記合成発現構築物は、直線状である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記フラグメントは、６１〜１００ヌクレオチドの間の長さを有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記フラグメントは、６１〜７４ヌクレオチドの間の長さを有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記フラグメントは、約４０ヌクレオチドの重複を有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記工程（ａ）で得た合成発現構築物の少なくとも一部は、増幅される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記合成発現構築物を提供する工程は、（ｉ）前記合成発現構築物の複数の重複するフラグメントを合成する工程であって、ここで前記重複するフラグメントは、完全な前記合成発現構築物にまたがる、工程、（ｉｉ）前記フラグメントを連結し、ＤＮＡ分子を提供する工程；（ｉｉｉ）前記ＤＮＡ分子を融解する工程；（ｉｖ）前記ＤＮＡを、前記ＤＮＡ分子からミスマッチヌクレオチドを切り出す薬剤の存在下で再アニールする工程；ならびに（ｖ）前記ＤＮＡを増幅して、前記合成発現構築物を生成する工程、を包含する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記リアソータントインフルエンザウイルスは、リアソータントインフルエンザＡウイルスである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記リアソータントインフルエンザＡウイルスは、配列番号９〜１４の配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の同一性を有する１種以上のバックボーンセグメントを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記リアソータントインフルエンザＡウイルスは、配列番号４２〜４７の配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の同一性を有する１種以上のバックボーンセグメントを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記リアソータントインフルエンザＡウイルスは、２種以上のインフルエンザＡ株に由来するバックボーンセグメントを含む、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記リアソータントインフルエンザＡウイルスは、配列番号４３のＰＢ１セグメント；配列番号４４のＰＢ２セグメント；配列番号９のＰＡセグメント；配列番号４５のＮＰセグメント；配列番号１３のＭセグメント；および配列番号１４のＮＳセグメントを含む、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記リアソータントインフルエンザＡウイルスは、配列番号１８のＰＢ１セグメント；配列番号１１のＰＢ２セグメント；配列番号９のＰＡセグメント；配列番号１２のＮＰセグメント；配列番号１３のＭセグメント；および配列番号１４のＮＳセグメントを含む、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記リアソータントインフルエンザウイルスは、リアソータントインフルエンザＢウイルスである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記リアソータントインフルエンザＢウイルスは、配列番号７１のＰＡセグメント、配列番号７２のＰＢ１セグメント、配列番号７３のＰＢ２セグメント、配列番号７４のＮＰセグメント、配列番号７６のＮＳセグメントおよび配列番号７５のＭセグメントを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記リアソータントインフルエンザＢウイルスは、配列番号７１のＰＡセグメント、配列番号７２のＰＢ１セグメント、配列番号７３のＰＢ２セグメント、配列番号７４のＮＰセグメント、配列番号７６のＮＳセグメントおよび配列番号８１のＭセグメントを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
インフルエンザワクチンを調製する方法であって、前記方法は、
ａ）細胞と請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法によって調製されるリアソータントインフルエンザウイルスとを接触させる工程；
ｂ）インフルエンザウイルスを生成するために、前記細胞を培養する工程；および
ｃ）前記工程（ｂ）において生成したインフルエンザウイルスからワクチンを調製する工程
を包含する、方法。
【請求項２７】
前記細胞は、ヒト非腎臓細胞もしくは非ヒト細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記工程（ａ）に使用した細胞は、前記リアソータントインフルエンザウイルスを調製するために使用した細胞と同じ細胞タイプである、請求項２６または請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記工程（ｃ）は、前記ウイルスを不活性化する工程を包含する、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ウイルスは、全ビリオンワクチンである、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ワクチンは、スプリットビリオンワクチンである、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ワクチンは、表面抗原ワクチンである、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ワクチンは、ビロソームワクチンである、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ワクチンは、１用量あたり、１０ｎｇ未満の残留宿主細胞ＤＮＡを含む、請求項２６〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
インフルエンザウイルスに由来するウイルスセグメントをコードする合成発現構築物を調製する方法であって、前記方法は、
ａ）インフルエンザウイルスに由来するＨＡもしくはＮＡセグメントのコード領域のうちの少なくとも一部の配列を提供する工程；
ｂ）前記コード領域が由来するインフルエンザウイルスのＨＡおよび／もしくはＮＡサブタイプを同定する工程；
ｃ）前記工程（ｂ）で同定されるサブタイプと同じＨＡもしくはＮＡサブタイプを有するインフルエンザウイルスに由来するＵＴＲ配列を提供する工程；ならびに
ｄ）前記コード配列および前記ＵＴＲを含むウイルスセグメントをコードする合成発現構築物を調製する工程、
を包含する、方法。
【請求項３６】
前記細胞は、哺乳動物細胞もしくはトリ細胞である、上述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞は、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞もしくはＰｅｒＣ６細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞は、細胞株ＭＤＣＫ  ３３０１６（ＤＳＭ  ＡＣＣ２２１９）である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞は、懸濁物中で増殖する、上述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞は、接着して増殖する、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
２種以上のインフルエンザバックボーンを含む、ライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、米国仮出願第６１／８４９，３２５号（２０１３年１月２３日出願）、ＵＳ１３／８４１，７５２（２０１３年３月１５日出願）およびＧＢ１３０４８２７．７（２０１３年３月１５日出願）（これらの完全な内容は、全ての目的のために参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
（政府支援の陳述）
本発明は、Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ  Ｐｒｅｐａｒｅｄｎｅｓｓ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙによって付与されたＢＡＲＤＡ契約番号ＨＨＳＯ１００２０１００００６１Ｃの下、政府の支援を受けて一部支持された。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
ＵＴＲ構築および合成遺伝子セグメントのライブラリーの生成のために使用されたインフルエンザウイルスのデータベースは、契約番号ＨＨＳＮ２７２２００９００００７Ｃの下、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓによって一部資金供与されたものである。
【０００４】
（技術分野）
本発明は、インフルエンザウイルス再集合の分野にある。さらに、本発明は、インフルエンザウイルスに対して防御するためのワクチンを製造することに関する。
【背景技術】
【０００５】
２００９年のＨ１Ｎ１インフルエンザ汎流行対応は、歴史上最も迅速な全世界的ワクチン開発の成果であった。汎流行の宣言の６ヶ月以内に、ワクチン会社は、許可されたパンデミックワクチン（ｐａｎｄｅｍｉｃ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）を開発し、製造し、数億用量を流通させた。不運なことには、その対応は、実質的なワクチン量が、第２の汎流行の波がピークに達した後にのみ入手可能であったので、十分に迅速ではなかった。この遅れは、ワクチン製造に使用され得る高収量インフルエンザ株の利用が遅れたことに少なくとも部分的に起因した。
【０００６】
高収量インフルエンザ株を得る１つの方法は、循環しているワクチン株を、より迅速に増殖する高収量ドナー株と再集合させる（ｒｅａｓｓｏｒｔ）ことである。これは、培養宿主に、上記循環しているインフルエンザ株（ワクチン株）および高収量ドナー株を共感染させ（ｃｏ−ｉｎｆｅｃｔ）、上記ワクチン株由来のヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）セグメント、ならびに上記ドナー株に由来する他のウイルスセグメント（すなわち、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１およびＮＳ２をコードするもの）を含むリアソータントウイルスを選択することによって達成され得る。別のアプローチは、上記インフルエンザウイルスを逆遺伝学によって再集合することである（例えば、参考文献１および２を参照のこと）。
【０００７】
２００９年の経験が示したように、インフルエンザウイルスを再集合させるための伝統的方法は、汎流行の間に十分量のインフルエンザワクチンを提供するには十分迅速でないと思われる。特に、高収量シードウイルスを調製するにあたって貴重な時間が失われてしまう。従って、インフルエンザ汎流行の出現とインフルエンザワクチンの提供との間にかかる時間をさらに短縮するために、高収量シードウイルスの迅速な生成を可能にする方法を提供することは、当該分野でなお必要である。先行技術は、ＨＡセグメントを合成して調製することによってこの問題を解決することを示唆した（例えば、参考文献３、４および５を参照のこと）。インフルエンザウイルスがこれら方法を使用して調製され得る、報告された最も迅速な時間枠は、９日間である。さらに、これら技術は、高トランスフェクション効力を有するが、ワクチン製造には承認されていない２９３Ｔ細胞の使用に依拠する。リアソータントインフルエンザウイルスを調製するためのさらに改善された方法を提供することは、当該分野で必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００７／００２００８号
【特許文献２】国際公開第２００７／１２４３２７号
【特許文献３】国際公開第２０１１／０１２９９９号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（好ましい実施形態の要旨）
いくつかの局面において、本発明は、インフルエンザウイルスのより迅速な調製を可能にする方法を提供する。例えば、本発明は、インフルエンザウイルスを調製するための方法を提供し、上記方法は、（ａ）インフルエンザウイルスゲノムのうちの少なくとも１種のセグメントを発現するためのコード配列を含む１種以上の発現構築物を調製する工程；（ｂ）２９３Ｔでない細胞に、上記インフルエンザウイルスのウイルスセグメントをコードする１種以上の発現構築物を導入する工程であって、ここで少なくとも１種の発現構築物は、上記工程（ａ）で調製した発現構築物である、工程；および（ｃ）上記工程（ｂ）で導入された発現構築物からリアソータントインフルエンザウイルスを生成するために、上記細胞を培養する工程；を包含し、ここで上記工程（ａ）〜（ｃ）は、１２４時間以下の期間で行われる。上記細胞は、好ましくは、非ヒト細胞もしくはヒト非腎臓細胞である。
【００１０】
同様に、インフルエンザウイルスを調製するための方法が提供され、上記方法は、（ａ）インフルエンザウイルスゲノムのうちの少なくとも１種のセグメントを発現するためのコード配列を含む１種以上の発現構築物を調製する工程；（ｂ）細胞に、上記インフルエンザウイルスのウイルスセグメントをコードする１種以上の発現構築物を導入する工程であって、ここで少なくとも１種の発現構築物は、上記工程（ａ）で調製した発現構築物である、工程；および（ｃ）上記工程（ｂ）で導入された発現構築物からリアソータントインフルエンザウイルスを生成するために、上記細胞を培養する工程；を包含し、ここで上記工程（ａ）〜（ｃ）は、１００時間以下の期間で行われる。
【００１１】
本発明はまた、インフルエンザウイルスを調製するための方法を提供し、上記方法は、（ａ）インフルエンザウイルスゲノムのうちの少なくとも１種のセグメントを発現するためのコード配列を含む合成発現構築物を、（ｉ）上記合成発現構築物の複数の重複するフラグメントを合成する工程であって、ここで上記重複するフラグメントは、完全な合成発現構築物にまたがる、工程および（ｉｉ）上記フラグメントを連結し、上記合成発現構築物を提供する工程、によって提供する工程；（ｂ）２９３Ｔでない細胞に、上記インフルエンザウイルスのウイルスセグメントをコードする１種以上の発現構築物を導入する工程であって、ここで少なくとも１種の発現構築物は、上記工程（ａ）で調製した合成発現構築物である、工程；ならびに（ｃ）上記工程（ｂ）で導入されたウイルスセグメントからリアソータントインフルエンザウイルスを生成するために、上記細胞を培養する工程；を包含し、ここで上記工程（ａ）〜（ｃ）は、１２４時間以下の期間で行われる。上記細胞は、好ましくは、非ヒト細胞もしくはヒト非腎臓細胞である。
【００１２】
上記方法は、（ｄ）上記工程（ｃ）で使用される細胞と同じ細胞タイプの細胞と、上記工程（ｂ）で生成したウイルスとを接触させて、さらなるリアソータントインフルエンザウイルスを生成する工程をさらに包含し得る。
【００１３】
本発明はまた、インフルエンザウイルスを調製するための方法を提供し、上記方法は、（ａ）インフルエンザウイルスゲノムのうちの少なくとも１種のセグメントを発現するためのコード配列を含む合成発現構築物を、（ｉ）上記合成発現構築物の複数の重複するフラグメントを合成する工程であって、ここで上記重複するフラグメントは、完全な合成発現構築物にまたがる、工程、および（ｉｉ）上記フラグメントを連結し、上記合成発現構築物を提供する工程、によって提供する工程；（ｂ）細胞に、インフルエンザウイルスのウイルスセグメントをコードする１種以上の発現構築物を導入する工程であって、ここで少なくとも１種の発現構築物は、上記工程（ａ）で調製した合成発現構築物である、工程；（ｃ）上記工程（ｂ）で導入されたウイルスセグメントからリアソータントインフルエンザウイルスを生成するために、上記細胞を培養する工程；ならびに（ｄ）上記工程（ｃ）で使用される細胞と同じ細胞タイプの細胞と、上記工程（ｃ）で生成したウイルスとを接触させて、さらなるリアソータントインフルエンザウイルスを生成する工程；を包含し、ここで工程（ａ）〜（ｃ）は、１２４時間以下の期間で行われる。上記使用される細胞は、好ましくは、２９３Ｔではない。
【００１４】
インフルエンザワクチンを調製するための方法がさらに提供され、上記方法は、（ａ）細胞と、本発明に従う方法によって調製されるリアソータントインフルエンザウイルスとを接触させる工程；（ｂ）インフルエンザウイルスを生成するために、上記細胞を培養する工程；および（ｃ）上記工程（ｂ）で生成したインフルエンザウイルスからワクチンを調製する工程を包含する。上記方法において使用される細胞は、好ましくは、ヒト非腎臓細胞もしくは非ヒト細胞である。代わりに、もしくはさらに、上記工程（ａ）で使用される細胞は、前段落で考察される方法においてインフルエンザウイルスをレスキューするために使用された細胞と同じ細胞タイプである。これは、規制上の承認を容易にし、相反する培養条件を回避し、２種の異なる細胞タイプを保持する必要性を回避するので、好ましい。上記使用される細胞は、好ましくは、２９３Ｔではない。なぜならこの細胞は、ヒトワクチン製造については承認されていないからである。
【００１５】
本発明はまた、インフルエンザウイルスに由来するウイルスセグメントをコードする合成発現構築物を調製するための方法を提供し、上記方法は、（ａ）インフルエンザウイルスに由来するＨＡもしくはＮＡセグメントにコード領域のうちの少なくとも一部の配列を提供する工程；（ｂ）上記コード領域が由来するインフルエンザウイルスのＨＡおよび／もしくはＮＡサブタイプを同定する工程；（ｃ）上記工程（ｂ）で同定されるサブタイプと同じＨＡもしくはＮＡサブタイプを有するインフルエンザウイルスに由来するＵＴＲ配列を提供する工程；ならびに（ｄ）上記コード配列および上記ＵＴＲを含むウイルスセグメントをコードする合成発現構築物を調製する工程を包含する。
【００１６】
（合成発現構築物）
上記合成発現構築物は、インフルエンザウイルスゲノムのうちの１種以上のウイルスＲＮＡセグメントを発現するためのコード配列を含むＤＮＡ分子である。上記コードされたセグメントは発現され得、次いで、ビリオンにパッケージされて、組換え発現されるウイルスを与え得るウイルスＲＮＡとして機能し得る。従って、上記合成発現構築物は、単独で、もしくは他の発現構築物と組み合わせてのいずれかで、逆遺伝学によってインフルエンザウイルスを生成するのに適している。
【００１７】
上記合成発現構築物は、（ｉ）上記合成発現構築物の複数の重複するフラグメントを合成する工程であって、ここで上記重複するフラグメントは、完全な合成発現構築物にまたがる、工程、および（ｉｉ）上記フラグメントを連結し、上記合成発現構築物を提供する工程によって生成され得る。
【００１８】
上記方法は、所望のＤＮＡ配列を、選択されたＤＮＡ合成法によって、例えば、ホスホルアミダイト化学によって調製され得るフラグメントへと概念的に分ける工程を包含し得る。参考文献６および７は、全体で１６，２９９塩基対のマウスミトコンドリアゲノムが、６００の重複する６０塩基オリゴヌクレオチドから合成され得たことを報告する。上記方法は、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ［ＮＥＢ］）、Ｔ５エキソヌクレアーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）およびＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を使用して、短時間の５０℃反応の間に複数のＤＮＡフラグメントを連結する（６）。本発明者らは、この方法が、インフルエンザウイルスゲノムの合成ＤＮＡコピーを生成するために使用され得ること、および得られる方法が、迅速かつ容易に自動化されることから特に有利であることを発見した。従って、上記の方法の工程（ｉｉ）においてフラグメントを連結することは、上記フラグメントとＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡリガーゼとを接触させる工程を包含し得る。上記方法は、ＤＮＡを増幅し得る任意のＤＮＡポリメラーゼ（ＰｈｕｓｉｏｎＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＴａｑ  ＤＮＡＴＭポリメラーゼが挙げられる）で実施され得る。好ましくは、上記方法は、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＰｈｕｓｉｏｎＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＦＵＴＭ、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅＴＭ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＭＰＬＩＴＡＱＴＭ  ＧＯＬＤ  ＤＮＡ  ｐｏｌ、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶＥＮＴＲＴＭ  ＤＮＡ  ｐｏｌ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌなど）を使用する。これは、得られるＤＮＡ分子の誤り率を減少させるので、好ましい。適切なＤＮＡリガーゼもまた、当業者に公知であり、ＴａｑＴＭ  ＤＮＡリガーゼ、ＡＭＰＬＩＧＡＳＥ熱安定性ＤＮＡリガーゼ、およびＴｆｉリガーゼが挙げられる。参考文献８はまた、使用され得る適切なリガーゼを考察する。
【００１９】
適切な緩衝液および反応条件は、参考文献６および７に記載され、当業者に公知でもある。上記方法は、４０℃〜６０℃の間の温度で、例えば、４５℃〜５５℃の間の温度で、もしくは約５０℃の温度で行われ得る。好ましくは、上記フラグメントは、上記ＤＮＡポリメラーゼおよび上記ＤＮＡリガーゼとともに１５〜６０分の間の期間にわたってインキュベートされる。
【００２０】
上記合成発現構築物は、約３０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、４０〜６０ヌクレオチドもしくは少なくとも６１ヌクレオチドのサイズを有するフラグメントからアセンブリされ得る。上記フラグメントはまた、４０ヌクレオチド未満、５０ヌクレオチド未満、６０ヌクレオチド未満、１００ヌクレオチド未満、２００ヌクレオチド未満、５００ヌクレオチド未満、１０００ヌクレオチド未満、５０００ヌクレオチド未満、もしくは１００００ヌクレオチド未満の長さを有し得る。好ましくは、上記合成発現構築物は、６１〜１００ヌクレオチドの間、例えば、６１〜７４ヌクレオチドの間のサイズを有するフラグメントからアセンブリされる。このようなフラグメントは、先行技術で使用されるフラグメントより長い。例えば、参考文献６および７は、６０ヌクレオチドの長さを有するフラグメントを使用した。より長いフラグメントを使用することによって、本発明者らは、合成発現構築物を得るための速度が増大することを見出した。これは、当業者は、より長いフラグメントが熱力学的に不利であり、重複部分が互いにアニールするのはより困難であると予測すると思われたので、予測外であった。
【００２１】
上記フラグメントは合成され、連結されて、上記合成発現構築物を与える。これは、１回より多くの連結（例えば、ライゲーション）工程を行うことによって達成され得る。例えば、上記ＤＮＡフラグメントのうちのいくつかは、より長いフラグメントを与えるために連結され得、次いで、これらより長いフラグメントは、完全な合成発現構築物が最終的に調製されるまで再び連結され得るなど。上記分子がこの様式で段階を追ってアセンブリされる場合、各段階での上記フラグメントは、ベクターの中で（例えば、プラスミドまたはＢＡＣもしくはＹＡＣベクターの中で）挿入物として維持され得る。
【００２２】
上記合成発現構築物はまた、１回の連結工程（例えば、１回のライゲーション工程）を使用してアセンブリされ得、これは、上記合成発現構築物のより迅速なアセンブリを可能にするので好ましい。これら実施形態において、合成発現構築物全体にまたがるフラグメントは、１回の反応で合成発現構築物全体をアセンブリする連結薬剤（例えば、ＤＮＡリガーゼ）で処理される。
【００２３】
上記フラグメントは、重複するように設計され得、それによって、正確な順序でのアセンブリを促進し、これは、上記合成発現構築物が１回の連結工程でアセンブリされる場合に好ましい。上記フラグメントが少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチドもしくは少なくとも６０ヌクレオチド重複することは、好ましい。これは、本発明者らが、この増大した重複部分が高精度で上記フラグメントの迅速な合成を可能にすることを発見したので、好ましい。従って、上記方法は、上記重複するフラグメントが完全な合成発現構築物にまたがるように、所望の合成発現構築物の複数の重複するフラグメントの合成を包含し得る。各フラグメントの両末端は、重複が全く必要とされない場合（しかし、環状分子が望ましい場合には、２つの末端フラグメントが重複し得る）の直線状分子の末端フラグメントを除いて、隣接する５’もしくは３’フラグメントと重複する。合成プロセスの間のフラグメントのアセンブリは、インビトロおよび／もしくはインビボでの組換えを包含し得る。インビトロでの方法に関しては、３’エキソヌクレアーゼでの消化が、フラグメントの末端で突出部を露出するために使用され得、次いで、重複するフラグメントにおける相補的な突出部がアニールされ得、続いて、連結修復される（「チューバックアセンブリ（ｃｈｅｗｂａｃｋ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）」）。インビボでの方法に関しては、重複するクローンは、例えば、参考文献９で開示されるＴＡＲクローニング法を使用してアセンブリされ得る。＜１００ｋｂｐのフラグメントに関しては（例えば、インフルエンザウイルスゲノムの全てのセグメントをコードするために十分容易に）、インビトロ組換え法に単に依拠することは、容易に可能である。
【００２４】
他の合成法も使用され得る。例えば、参考文献１０は、約５ｋｂｐのフラグメントが合成され、次いで、従来のクローニング法によってより長い配列へとアセンブリされる方法を開示する。未精製の４０塩基合成オリゴヌクレオチドは、自動化ＰＣＲベースの遺伝子合成によって、５００〜８００ｂｐシントンへと構築され、これらシントンは、少数のエンドヌクレアーゼおよび「選択によるライゲーション」を使用して、約５ｋｂｐセグメントのマルチシントンへと連結される。これら大きなセグメントは、その後、より長い配列へと、従来のクローニングによってアセンブリされ得る。この方法は、３２ｋｂｐ  ＤＮＡ分子を容易に提供し得、この分子は、完全なインフルエンザウイルスをコードするには容易に足りる。同様に、参考文献１１は、３２ｋｂ分子が完全な配列にわたる７つのＤＮＡフラグメントからアセンブリされた方法を開示する。上記７つのＤＮＡの末端は、特有の接合部で操作され、それによって、隣接するフラグメントのアセンブリのみを可能にする。各ＤＮＡの末端において相互接続する制限部位接合部は、アセンブリ後に体系的に除去される。
【００２５】
上記合成発現構築物のアセンブリ後に、上記合成発現構築物の全体もしくは一部を増幅することは可能である。ＤＮＡ増幅の方法は、当該分野で公知であり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる。上記合成発現構築物の一部しか増幅されない場合、１種以上のウイルスセグメントをコードする上記発現構築物の一部を増幅することは、好ましい。
【００２６】
参考文献６の方法の１つの欠点は、合成生成物のうちの３％しか正確な配列を有しないということである。先行技術において、この問題は、サブアセンブリをクローニングおよび配列決定することによって解決され、誤りのない配列のセットが、その後のアセンブリの回のために選択された。これは、得られるＤＮＡ分子における誤りの問題に対処しているものの、上記方法は時間を浪費するので、高速かつ高精度を要する方法における使用には適していない。従って、本発明者らは、誤りの訂正という問題を異なる方法で対処した。特に、彼らは、誤り率が代替の誤り訂正工程を含めることによって有意に減少され得ることを発見した。従って、本発明は、合成発現構築物を調製するための方法を提供し、上記方法は、（ｉ）上記合成発現構築物の複数の重複するフラグメントを合成する工程であって、ここで上記重複するフラグメントは、完全な合成発現構築物にまたがる、工程、（ｉｉ）上記フラグメントを連結し、ＤＮＡ分子を提供する工程；（ｉｉｉ）上記ＤＮＡ分子を融解する工程；（ｉｖ）上記ＤＮＡ分子からミスマッチヌクレオチドを切り出す薬剤の存在下で、上記ＤＮＡを再アニールする工程；ならびに（ｖ）上記ＤＮＡを増幅して、上記合成発現構築物を生成する工程を包含する。このさらなる工程を含めることによって、本発明者らは、８０〜１００％が正確な配列を有する全長配列を得ることができた。上記工程（ｖ）のＤＮＡは、当該分野で公知であり上記で記載されるように、ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅され得る。
【００２７】
ＤＮＡを融解し（すなわち、ＤＮＡ二重らせんを１本鎖に解離する）、再アニールするために適した条件は、当該分野で公知である。例えば、上記ＤＮＡは、少なくとも９０℃の温度へと加熱することによって融解され得る。同様に、上記ＤＮＡは、上記温度を低下させることによって再アニールされ得る。ミスマッチヌクレオチドを切り出すために使用される薬剤は、通常、例えば、Ｒｅｓ １酵素（これは、ＥｒｒＡＳＥＴＭ  ｅｒｒｏｒ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｎｏｖｉｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）において入手可能である）、Ｃｅｌ  Ｉ、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、Ｔ７エンドヌクレアーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏ．）Ｖ、緑豆エンドヌクレアーゼのような酵素である。
【００２８】
合成発現構築物は、１種以上の「ウォーターマーク（ｗａｔｅｒｍａｒｋ）」配列を含み得る。これらは、ＤＮＡの中の情報を同定するかもしくはコードするために使用され得る配列である。上記ウォーターマーク配列は、非コード配列もしくはコード配列のいずれかの中にあり得る。最も一般的には、それは、アミノ酸配列を変化させずに、コード配列内の情報をコードする。セグメント化ＲＮＡウイルスゲノムをコードするＤＮＡに関しては、任意のウォーターマーク配列は、同義のコドン変化がコードされるＲＮＡセグメントの実質的な生物学的効果を有し得るので、理想的には、遺伝子間部位に含まれる。
【００２９】
上記合成発現構築物は、直線状であっても（１４）環状であってもよい。環状の合成発現構築物は、直線状の構築物を環状にすることによって作製され得る。逆もまた同様である。このような環化のための方法は、参考文献１４に記載されている。環状分子を直線状にすることは、種々の容易な方法において、例えば、１種以上の制限酵素を利用することによって、もしくは核酸増幅技術（例えば、ＰＣＲによる）を使用してテンプレート（環状テンプレートを含む）から増幅することによって、達成され得る。
【００３０】
上記合成発現構築物が環状である場合、上記工程（ｉｉ）の後のＤＮＡと、直線状ＤＮＡを分解する薬剤（例えば、酵素）とを接触させることは、可能である。これは、直線状の合成発現構築物が選択的に除去され、従って、環状生成物を選択するという利点を有する。適切な薬剤は、当該分野で公知であり、例えば、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、およびエキソヌクレアーゼＩＩＩが挙げられる。
【００３１】
上記合成発現構築物は、ベクター（例えば、プラスミドもしくは他のエピソーム構築物）の中に、当該分野で公知の従来技術を使用して組みこまれ得る。上記合成発現構築物の３’および／もしくは５’末端フラグメントは、ベクターの突出部に相補的な突出部を含み得、このことは、上記合成発現構築物のクローニングを容易にする（その結果、例えば、上記合成発現構築物は、制限酵素によって作られる突出部にクローニングされ得る）。上記ベクターは、上記ＤＮＡ構築物からウイルスＲＮＡセグメントを発現するために必要な調節配列（例えば、ＲＮＡ  ｐｏｌ  Ｉプロモーター、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩプロモーター；ＲＮＡポリメラーゼＩ転写終結配列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写終結配列など）を提供し得る。これは、これら配列がその後上記合成発現構築物に含まれる必要はないので、有利であり得る。これら配列を提供するベクターに調節配列なしで合成発現構築物をクローニングし、その後、得られた合成発現構築物が、次いで、ウイルスセグメントを発現するために使用され得るように調節配列とともに元の合成発現構築物を含む直線状の合成発現構築物を増幅することも、可能である。
【００３２】
（発現構築物）
本発明は、逆遺伝学技術によってインフルエンザウイルスを生成する。これら技術において、上記ウイルスは、前節に記載されるように、インフルエンザウイルスゲノムのうちの少なくとも１種のセグメントを発現するためのコード配列を含む合成発現構築物を使用して、培養宿主において生成され得る。上記合成発現構築物は、その中にコードされるウイルスセグメントの真核生物細胞における発現を駆動し得る。上記発現されるウイルスセグメントＲＮＡは、ビリオンへと組みこまれ得るウイルスタンパク質へと翻訳され得る。
【００３３】
用語「合成発現構築物」とは、前節に記載されるように合成して調製されたか、またはこのようにして（例えば、ＤＮＡ増幅によって）調製される発現構築物から得られる発現構築物をいう。上記用語は、このような発現構築物を含むベクターをも包含する。用語「発現構築物」は、合成発現構築物、および合成により調製されなかった発現構築物の両方を包含する。
【００３４】
上記合成発現構築物は、インフルエンザウイルスを生成するために必要なウイルスセグメント全てをコードし得る。あるいは、それは、１種、２種、３種、４種、５種、６種、もしくは７種のウイルスセグメントをコードし得る。上記合成発現構築物が、インフルエンザウイルスを生成するために必要なウイルスセグメント全てをコードしない場合、残りのウイルスセグメントは、１種以上のさらなる発現構築物によって提供され得る。これら１種以上のさらなる発現構築物はまた、合成発現構築物であってもよいし、例えば、参考文献１２に記載される方法のような代替法を使用して生成された発現構築物であってもよい。
【００３５】
上記合成発現構築物が、インフルエンザウイルスを生成するために必要なウイルスセグメント全てをコードしない場合、上記合成発現構築物は、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）および／もしくはヘマグルチニン（ＨＡ）セグメントをコードし得、残りのｖＲＮＡコードセグメントは、上記ＨＡおよび／もしくはＮＡセグメントを除いて、異なる発現構築物に含められる。これは、新たなインフルエンザワクチン株が出現する（例えば、新たな汎流行性インフルエンザウイルスもしくは新たな流行期インフルエンザウイルス）場合に、上記ＨＡおよび／もしくはＮＡセグメントを含む上記発現構築物のみが、置換される必要があるという利点を有する。
【００３６】
上記発現構築物は、１方向性もしくは２方向性発現構築物であり得る。宿主細胞が、１種を超える導入遺伝子を（同じ発現構築物上であろうと異なる発現構築物上であろうと）発現する場合、１方向性および／もしくは２方向性の発現を使用することは可能である。
【００３７】
２方向性発現構築物は、同じ構築物から異なる方向（すなわち、５’→３’および３’→５’の両方）で発現を駆動する少なくとも２種のプロモーターを含む。上記２種のプロモーターは、同じ２本鎖ＤＮＡの異なる鎖に作動可能に連結され得る。好ましくは、上記プロモーターのうちの一方は、ｐｏｌ  Ｉプロモーターであり、他方のプロモーターのうちの少なくとも１種は、ｐｏｌ  ＩＩプロモーターである。これは、上記ｐｏｌ  Ｉプロモーターが、キャップされていないｖＲＮＡを発現するために使用され得る一方で、上記ｐｏｌ  ＩＩプロモーターが、後にタンパク質へと翻訳され得るｍＲＮＡを転写するために使用され得、従って、同じ構築物からのＲＮＡおよびタンパク質の同時発現を可能にするので、有用である。
【００３８】
上記発現構築物において使用されるｐｏｌ  Ｉおよびｐｏｌ  ＩＩプロモーターは、宿主細胞が由来する同じ分類学上の目に由来する生物にとって内因性であり得る。あるいは、上記プロモーターは、宿主細胞とは異なる分類学上の目における生物に由来し得る。用語「目」とは、従来の分類学上の順位付けをいい、目の例は、霊長目、齧歯目、食肉目、有袋目、クジラ目などである。ヒトおよびチンパンジーは、同じ分類学上の目（霊長目）の中にいるが、ヒトおよびイヌは、異なる目の中にいる（霊長目  対  食肉目）。例えば、ヒトｐｏｌ  Ｉプロモーターは、イヌ細胞（例えば、ＭＤＣＫ細胞）においてウイルスセグメントを発現するために使用され得る［１３］。１種より多くの発現構築物が、発現系内で使用される場合、上記プロモーターは、内因性および非内因性のプロモーターの混合物を含み得る。
【００３９】
上記発現構築物は、代表的には、ＲＮＡ転写終結配列を含む。上記終結配列は、内因性終結配列であってもよいし、上記宿主細胞にとって内因性でない終結配列であってもよい。適切な終結配列は、当業者に明らかであり、ＲＮＡポリメラーゼＩ転写終結配列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写終結配列、およびリボザイムが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、上記発現構築物は、ｍＲＮＡのために、特に、発現がｐｏｌ  ＩＩプロモーターによって制御される遺伝子の末端に、１以上のポリアデニル化シグナルを含み得る。
【００４０】
発現構築物は、ベクター（例えば、プラスミドもしくは他のエピソーム構築物）であり得る。このようなベクターは、代表的には、少なくとも１種の細菌性および／もしくは真核生物性の複製起点を含む。さらに、上記ベクターは、原核生物および／もしくは真核生物の細胞における選択を可能にする選択マーカーを含み得る。このような選択マーカーの例は、抗生物質（例えば、アンピシリンもしくはカナマイシン）に対する耐性を付与する遺伝子である。上記ベクターは、ＤＮＡ配列のクローニングを促進するために１以上のマルチクローニング部位をさらに含み得る。
【００４１】
代替として、発現構築物は、直線状の発現構築物であってもよい。このような直線状の発現構築物は、代表的には、いかなる増幅および／もしくは選択配列をも含まない。しかし、このような増幅および／もしくは選択配列を含む直線状の構築物もまた、本発明の範囲内にある。インフルエンザウイルスの発現のためにこのような直線状の発現構築物を使用する方法の一例は、参考文献１４に記載される。
【００４２】
上記発現構築物が直線状の発現構築物である場合、発現構築物を直線状にして、その後、単一の制限酵素部位を使用して、上記宿主細胞に導入することは、可能である。あるいは、上記発現構築物を、少なくとも２種の制限酵素部位を使用してベクターから切り出すことは可能である。さらに、直線状の発現構築物を、核酸増幅技術を使用して（例えば、ＰＣＲによって）それを増幅することによって得ることもまた、可能である。
【００４３】
上記発現構築物が合成発現構築物ではない場合、それは、当該分野で公知の方法を使用して生成され得る。このような方法は、例えば、参考文献１５に記載された。
【００４４】
本発明の発現構築物は、当業者に公知の任意の技術を使用して、宿主細胞へと導入され得る。例えば、本発明の発現構築物は、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム、マイクロインジェクション、もしくは微粒子銃を使用することによって、宿主細胞に導入され得る。いったんトランスフェクトされたら、上記宿主細胞は、上記構築物中の遺伝子エレメントを認識し、上記コードされたウイルスＲＮＡセグメントを発現し始める。
【００４５】
上記発現構築物は、上記インフルエンザウイルスの増殖のためにその後使用される同じ細胞タイプに導入され得る。あるいは、上記発現構築物が導入される細胞および上記インフルエンザウイルスの増殖のために使用される細胞は、異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、細胞は、参考文献１６に記載されるように、上記細胞への上記発現構築物の導入後に添加され得る。これは、上記ウイルスのレスキュー効率を増大させ、従ってさらには、ウイルスレスキューに必要とされる時間を短縮する助けにもなり得るので、特に好ましい。添加される細胞は、上記発現構築物が導入される細胞と同じもしくはそれとは異なる細胞タイプであってもよいが、同じ細胞タイプの細胞を使用することが好ましい。なぜならこのことは、規制上の承認を容易にし、相反する培養条件を回避するからである。
【００４６】
発現宿主がイヌ細胞（例えば、ＭＤＣＫ細胞株）である場合、タンパク質コード領域は、例えば、野生型イヌ遺伝子に由来するか、もしくはイヌウイルスに由来するプロモーターを使用して、そして／またはヒト細胞よりイヌ細胞により適したコドン使用法を有して、イヌでの発現のために最適化され得る。例えば、ヒト遺伝子は、ＰｈｅのコドンとしてＵＵＣが僅かに多い（５４％）のに対して、イヌ細胞では、その優先性はより強い（５９％）。同様に、ヒト細胞においてＩｌｅコドンの大きな優先性は存在しないのに対して、イヌのコドンのうちの５３％は、Ｉｌｅに関してＡＵＣを使用する。イヌウイルス（例えば、イヌパルボウイルス（ｓｓＤＮＡウイルス））はまた、コドン最適化のガイダンスを提供し得る。例えば、イヌパルボウイルス配列におけるＰｈｅコドンのうちの９５％は、ＵＵＵであり（対して、イヌゲノムにおいては４１％）、Ｉｌｅコドンのうちの６８％は、ＡＵＵであり（対して３２％）、Ｖａｌコドンのうちの４６％はＧＵＵであり（対して１４％）、Ｐｒｏコドンのうちの７２％は、ＣＣＡであり（対して２５％）、Ｔｙｒコドンのうちの８７％は、ＵＡＵであり（対して４０％）、Ｈｉｓコドンのうちの８７％は、ＣＡＵであり（対して３９％）、Ｇｌｎコドンのうちの９２％は、ＣＡＡであり（対して２５％）、Ｇｌｕコドンのうちの８１％は、ＧＡＡであり（対して４０％）、Ｃｙｓコドンのうちの９４％は、ＵＧＵであり（対して４２％）、Ｓｅｒコドンのうちの僅か１％が、ＵＣＵであり（対して２４％）、ＣＣＣは、Ｐｈｅについては決して使用されず、ＵＡＧは、終止コドンとしては決して使用されない。従って、タンパク質コード遺伝子は、イヌ細胞における発現のために既に性質が最適化され、それによって、発現を容易にする遺伝子により似せて作製され得る。
【００４７】
（逆遺伝学）
インフルエンザウイルスの逆遺伝学は、複製および転写を開始するために必要な４種のタンパク質（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡおよびＮＰ）、および全８つのウイルスゲノムセグメントを発現するために１２の発現構築物で実施され得る。しかし、発現構築物の数を減らすために、複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（ウイルスＲＮＡ合成のために）が、単一の発現構築物に含まれ得（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、もしくは全８種のインフルエンザｖＲＮＡセグメントをコードする配列）、そしてＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを有する複数のタンパク質コード領域が別の発現構築物上に含まれ得る（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種もしくは８種のインフルエンザｍＲＮＡ転写物をコードする配列）［１７］。１種以上のインフルエンザｖＲＮＡセグメントをｐｏｌ  Ｉプロモーターの制御下に、および１種以上のインフルエンザタンパク質コード領域を同じ発現構築物上の別のプロモーター（特に、ｐｏｌ  ＩＩプロモーター）の制御下に含めることもまた、考えられる。これは、好ましくは、２方向性発現構築物を使用することによって行われる。
【００４８】
公知の逆遺伝学システムは、ｐｏｌ  Ｉプロモーター、細菌ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターなどからウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）分子を発現する工程を含む。インフルエンザウイルスは、生活環を開始するためにはウイルスポリメラーゼの存在を要するので、システムはまた、これらタンパク質を提供し得る。例えば、上記システムは、ウイルスポリメラーゼタンパク質をコードする発現構築物をさらに含み得、その結果、両方のタイプのＤＮＡの発現が、完全な感染性ウイルスのアセンブリをもたらす。上記ウイルスポリメラーゼをタンパク質として供給することもまた、可能である。
【００４９】
逆遺伝学が、インフルエンザｖＲＮＡの発現のために使用される場合、配列エレメントについての互いに関して正確なスペーシングが、ポリメラーゼが複製を開始するために重要であることは、当業者にとって明らかである。従って、上記ウイルスＲＮＡをコードする配列が、ｐｏｌ  Ｉプロモーターと終結配列との間で正確に位置づけられるが、この位置づけが、逆遺伝学システムを扱うものの能力の十分範囲内であることは、重要である。
【００５０】
組換えウイルスを生成するために、細胞は、ビリオンをアセンブリするために必要なウイルスゲノムの全てのセグメントを発現しなければならない。上記発現構築物は、好ましくは、上記ウイルスＲＮＡおよびタンパク質の全てを提供するが、ヘルパーウイルスを使用して、上記ＲＮＡおよびタンパク質のうちのいくつかを提供することもまた可能である。しかし、ヘルパーウイルスを使用しない系が好ましい。
【００５１】
いくつかの実施形態において、発現構築物もまた含まれ、この発現構築物は、宿主細胞におけるアクセサリータンパク質の発現をもたらす。例えば、逆遺伝学システムの一部として非ウイルスセリンプロテアーゼ（例えば、トリプシン）を発現することは、有利であり得る。
【００５２】
（ウイルスセグメント）
上記合成発現構築物は、１種以上のウイルスセグメントをコードする。インフルエンザ汎流行の最初の数日の間に、完全なコード領域のみならず、不完全な非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む利用可能な循環する株の配列を有することは、通常のことではない。ウイルスの生成を開始する前に完全なセグメント配列（上記コード領域およびＵＴＲを含む）を待つことは、時間がかかり、ワクチンの提供を遅らせる。本発明者らは、ウイルスセグメントをコードする合成発現構築物を調製するための改善された方法を提供した。この方法は、上記ウイルスセグメントを得るために必要な時間を短縮する。上記方法は、以下の工程を包含する：（ａ）インフルエンザウイルスに由来するＨＡもしくはＮＡセグメントのコード領域のうちの少なくとも一部の配列を提供する工程；（ｂ）上記コード領域が由来するウイルスのＨＡおよび／もしくはＮＡサブタイプを同定する工程；（ｃ）上記工程（ｂ）で同定されるサブタイプと同じＨＡもしくはＮＡサブタイプを有するインフルエンザウイルスに由来するＵＴＲ配列を提供する工程；ならびに（ｄ）上記コード配列および上記ＵＴＲを含むウイルスセグメントをコードする合成発現構築物を調製する工程。
【００５３】
上記ウイルスセグメントのコード領域の配列は、循環する株を配列決定することによって提供され得る。上記配列はまた、他の供給源（例えば、ヘルスケア当局）から得られ得る。好ましくは、全コード領域が上記方法において使用される。なぜなら、これは、上記コード領域が由来するウイルスのＨＡもしくはＮＡサブタイプの決定を容易にするからである。上記コード領域のうちの少なくとも一部を使用することもまた、可能であるが、ただし、上記コード領域は、ＨＡもしくはＮＡサブタイプの決定を可能にするために十分完全である。これは、一般に、全長コード領域のうちの少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％を網羅するフラグメントが利用可能である場合である。この分析において使用されるウイルスセグメントは、好ましくは、ＨＡもしくはＮＡセグメントである。
【００５４】
上記コード配列が由来するウイルスのＨＡおよび／もしくはＮＡサブタイプは、当該分野で標準的な方法を使用して決定され得る。例えば、上記コード領域の配列は、既知のＨＡおよび／もしくはＮＡサブタイプを有するウイルスに由来するコード領域の配列に対して整列させられ得る。整列される上記コード配列は、当然のことながら、同じウイルスセグメント（例えば、上記ＨＡもしくはＮＡセグメント）のコード領域である必要がある。同じＨＡおよび／もしくはＮＡサブタイプを有するウイルスに由来するインフルエンザウイルスセグメントは、配列間で最高の配列同一性を示す。上記分析を行うために適したプログラムは、当該分野で公知であり、ＢＬＡＳＴＴＭが挙げられる。
【００５５】
上記ウイルスセグメントに適したＵＴＲを提供するために、工程（ａ）において最高の配列同一性を示したウイルス株のＵＴＲが使用され得る。あるいは、上記ＵＴＲは、同じＨＡもしくはＮＡサブタイプを有するウイルス株に由来するＵＴＲのコンセンサス配列を決定することによって同定され得る。これは、同じＨＡもしくはＮＡサブタイプを有する２種以上のインフルエンザ株を整列させ、上記ＵＴＲにおける保存された残基を決定することによって、達成され得る。例えば、上記コンセンサス配列は、同じＨＡもしくはＮＡサブタイプを有する２種、５種、１０種、１５種、２０種、３０種以上のインフルエンザ株に由来するＵＴＲを整列させることによって、決定され得る。上記コンセンサスＵＴＲ配列は、次いで、完全なＤＮＡ分子を調製するために使用され得る。複数の配列を整列させるために適したプログラムは、当該分野で公知であり、ＣｌｕｓｔａｌＷ２ＴＭが挙げられる。
【００５６】
上記ＤＮＡ分子が、コンセンサスＵＴＲ配列を使用して調製される場合、このコンセンサス配列を毎回決定する必要は必ずしもない。代わりに、上記分析は、種々のＨＡおよびＮＡサブタイプを有するインフルエンザウイルス株について行われ得、各ＨＡおよびＮＡサブタイプについて得られるＵＴＲは、データーベース中に保持され得る。循環する株のＨＡもしくはＮＡサブタイプがいったん決定されたら、同じＨＡもしくはＮＡサブタイプを有するインフルエンザ株のＵＴＲを上記データベースから選択することのみが必要である。
【００５７】
上記コード配列および上記同定されたＵＴＲを含むＤＮＡ分子は、本明細書で記載される方法のうちのいずれかによって調製され得る。
【００５８】
（培養宿主）
上記インフルエンザウイルスは、代表的には、細胞株を使用して生成されるが、初代細胞が代替として使用され得る。上記細胞は、代表的には、哺乳動物のものであるが、トリもしくは昆虫細胞もまた、使用され得る。適切な哺乳動物細胞としては、ヒト、ハムスター、ウシ、霊長類およびイヌの細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ヒト非腎臓細胞もしくは非ヒト細胞である。種々の細胞が使用され得る（例えば、腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞など）。適切なハムスター細胞の例は、名称ＢＨＫ２１もしくはＨＫＣＣを有する細胞株である。適切なサルの細胞は、例えば、アフリカミドリザル細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞株のような腎臓細胞［１８〜２０］である。適切なイヌの細胞は、例えば、ＣＬＤＫおよびＭＤＣＫ細胞株のような腎臓細胞である。適切なトリ細胞としては、ニワトリ胚性幹細胞に由来するＥＢｘ細胞株、ＥＢ４５、ＥＢ１４、およびＥＢ１４−０７４［２１］が挙げられる。
【００５９】
さらに適切な細胞としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＨＯ；ＭＲＣ  ５；ＰＥＲ．Ｃ６［２２］；ＦＲｈＬ２；ＷＩ−３８など。適切な細胞は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ［２３］から、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［２４］から、もしくはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から、広く入手可能である。例えば、上記ＡＴＣＣは、種々の異なるＶｅｒｏ細胞をカタログ番号ＣＣＬ  ８１、ＣＣＬ  ８１．２、ＣＲＬ  １５８６およびＣＲＬ−１５８７の下で供給しており、ＭＤＣＫ細胞をカタログ番号ＣＣＬ  ３４の下で供給している。ＰＥＲ．Ｃ６は、ＥＣＡＣＣから寄託番号９６０２２９４０の下で入手可能である。
【００６０】
本発明における使用に好ましい細胞は、Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞［２５〜２７］である。元のＭＤＣＫ細胞は、ＡＴＣＣからＣＣＬ  ３４として入手可能である。これらの派生物または他のＭＤＣＫ細胞が使用されることは好ましい。このような派生物は、例えば、参考文献２５において記載されており、この参考文献は、懸濁培養における増殖に適合したＭＤＣＫ細胞（「ＭＤＣＫ  ３３０１６」もしくはＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９として寄託された「３３０１６−ＰＦ」）を開示している。さらに、参考文献２８は、無血清培養において懸濁物中で増殖するＭＤＣＫ由来の細胞（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４４９として寄託された「Ｂ−７０２」）を開示している。いくつかの実施形態において、使用されるＭＤＣＫ細胞株は、腫瘍形成性であり得るが、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞を使用することもまた、想定される。例えば、参考文献２９は、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞（「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０２）および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０３）が挙げられる）を開示する。参考文献３０は、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １２０４２）を含む、非常に感染しやすいＭＤＣＫ細胞を開示している。
【００６１】
本発明の方法において１種より多くの細胞タイプの混合物を使用することも考えられるが、１つの細胞タイプを使用すること、例えば、モノクローナル細胞を使用することが、好ましい。細胞の混合物が使用される場合、上記混合物は２９３Ｔ細胞を含まないことは好ましい。なぜなら、これら細胞はワクチン製造について承認されていないからである。
【００６２】
本発明の方法において使用される細胞は、好ましくは、ヒトへの投与に使用され得るインフルエンザワクチンを生成するために適した細胞である。このような細胞は、ワクチン製造について承認され、国の管理当局によって登録された細胞バンクシステムから得られなければならず、ワクチン生成について許可された最大継代数内でなければならない（概要については参考文献３１を参照のこと）。ワクチン製造について承認された適切な細胞の例としては、ＭＤＣＫ細胞（ＭＤＣＫ  ３３０１６のような；参考文献２５を参照のこと）、ＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、およびＰＥＲ．Ｃ６細胞が挙げられる。本発明の方法は、好ましくは、２９３Ｔ細胞を使用しない。なぜなら、これら細胞は、ワクチン製造について承認されていないからである。
【００６３】
好ましくは、上記ウイルスを生成するため、および上記ワクチンを調製するために使用される細胞は、同じ細胞タイプである。例えば、上記細胞は、両方ともＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞もしくはＰｅｒＣ６細胞であり得る。これは、承認を１つの細胞株について得る必要しかないので、規制当局の承認を容易にすることから好ましい。それは、競合する培養選択圧もしくは異なる細胞培養条件が回避され得るというさらなる利点を有する。本発明の方法はまた、同じ細胞株をずっと、例えば、ＭＤＣＫ  ３３０１６を使用し得る。
【００６４】
本発明の方法に従って調製されるインフルエンザウイルスは、その後、卵の中で増殖させられ得る。ワクチン用のインフルエンザウイルス増殖のための現在の標準的方法は、ＳＰＦ孵化鶏卵を使用し、ウイルスは、その卵の内容物（尿膜腔液）から精製される。ウイルスを卵によって継代し、その後、上記ウイルスを、細胞培養物中で増殖させることもまた可能であり、その逆もまた同様である。
【００６５】
好ましくは、上記細胞は、一般的な汚染物質源を回避するために、血清の非存在下で培養される。真核生物細胞培養のための種々の無血清培地が、当業者に公知である（例えば、イスコフ培地、ウルトラＣＨＯ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、ＥＸ−ＣＥＬＬ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））。さらに、無タンパク質培地が使用され得る（例えば、ＰＦ−ＣＨＯ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））。さもなければ、複製のための細胞はまた、特注の血清含有培地（例えば、０．５％〜１０％のウシ胎仔血清を有する、ＭＥＭもしくはＤＭＥＭ培地）中で培養され得る。
【００６６】
上記細胞は、接着培養物もしくは懸濁物中にあり得る。
【００６７】
（リアソータントウイルス）
本発明の方法によって生成されるリアソータントインフルエンザ株は、ワクチン株および１種以上のドナー株に由来するウイルスセグメントを含む。上記ワクチン株は、上記リアソータントインフルエンザ株のＨＡセグメントを提供するインフルエンザ株である。上記ワクチン株は、任意の株であり得、流行期間で変動し得る。
【００６８】
ドナー株は、上記インフルエンザ株のバックボーンセグメント（すなわち、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１およびＮＳ２をコードするもの）のうちの１種以上を提供するインフルエンザ株である。上記ＮＡセグメントはまた、ドナー株によって提供され得るか、または上記ワクチン株によって提供され得る。本発明のリアソータントインフルエンザ株はまた、上記ワクチン株に由来するバックボーンセグメントのうちの１種以上である（しかし全てではない）を含み得る。上記リアソータントインフルエンザウイルスは、合計８種のセグメントを含むので、上記リアソータントインフルエンザウイルスは、従って、上記ワクチン株に由来するｘ種（ここでｘは、１〜７である）のウイルスセグメントおよび上記１種以上のドナー株に由来する８−ｘ種のウイルスセグメントを含む。
【００６９】
上記リアソータントインフルエンザウイルス株は、野生型ワクチン株と比較して、同じ時間で（例えば、１２時間、２４時間、４８時間もしくは７２時間）および同じ増殖条件下で細胞培養物および／もしくは卵の中でより高いかまたは類似のウイルス力価まで増殖し得る。特に、それらは、野生型ワクチン株と比較して、同じ時間でおよび同じ増殖条件下でＭＤＣＫ細胞（例えば、ＭＤＣＫ  ３３０１６）においてより高いもしくは類似のウイルス力価まで増殖し得る。上記ウイルス力価は、当業者に公知の標準的方法によって決定され得る。有用なことには、本発明のリアソータントウイルスは、同じ時間枠でおよび同じ条件下で、野生型ワクチン株のウイルスル力価より少なくとも５％高い、少なくとも１０％高い、少なくとも２０％高い、少なくとも５０％高い、少なくとも１００％高い、少なくとも２００％高い、もしくは少なくとも５００％高いウイルス力価を達成し得る。上記リアソータントインフルエンザウイルスはまた、野生型ワクチン株と比較して、同じ時間でおよび同じ増殖条件下で、類似のウイルス力価まで増殖し得る。この状況において類似の力価とは、上記リアソータントインフルエンザウイルスが、同じ時間でおよび同じ増殖条件下で、野生型ワクチン株で達成されるウイルス力価の３％以内である力価（すなわち、野生型力価±３％）まで増殖することを意味する。
【００７０】
本発明のリアソータントウイルスは、２種以上のドナー株に由来するバックボーンセグメント、または本明細書で記載されるとおりのドナー株に由来する少なくとも１種の（すなわち、１種、２種、３種、４種、５種もしくは６種）バックボーンウイルスセグメントを含み得る。上記バックボーンウイルスセグメントは、ＨＡもＮＡもコードしないものである。従って、バックボーンセグメントは、代表的には、上記インフルエンザウイルスのＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１およびＮＳ２ポリペプチドをコードする。
【００７１】
本発明のリアソータントウイルスが、１つのドナー株に由来するバックボーンセグメントを含むリアソータントである場合、上記リアソータントウイルスは、一般に、１：７、２：６、３：５、４：４、５：３、６：２もしくは７：１の比で、上記ドナー株および上記ワクチン株に由来するセグメントを含む。上記ドナー株に由来するセグメントの大部分を有するもの、特に、６：２の比が代表的である。上記リアソータントウイルスが、２種のドナー株に由来するバックボーンセグメントを含む場合、上記リアソータントウイルスは、一般には、１：１：６、１：２：５、１：３：４、１：４：３、１：５：２、１：６：１、２：１：５、２：２：４、２：３：３、２：４：２、２：５：１、３：１：２、３：２：１、４：１：３、４：２：２、４：３：１、５：１：２、５：２：１もしくは６：１：１の比で、第１のドナー株、第２のドナー株、および上記ワクチン株に由来するセグメントを含む。上記リアソータントインフルエンザウイルスはまた、２種より多くの、例えば、３種、４種、５種もしくは６種のドナー株に由来するウイルスセグメントを含み得る。
【００７２】
上記リアソータントインフルエンザウイルスが、２種または３種のドナー株に由来するバックボーンセグメントを含む場合、各ドナー株は、上記リアソータントインフルエンザウイルスのバックボーンセグメントのうちの１種より多くを提供し得るが、上記ドナー株のうちの１種もしくは２種はまた、単一のバックボーンセグメントのみを提供し得る。
【００７３】
上記リアソータントインフルエンザウイルスが、２種、３種、４種もしくは５種のドナー株に由来するバックボーンセグメントを含む場合、上記ドナー株のうちの１種もしくは２種は、上記リアソータントインフルエンザウイルスのバックボーンセグメントのうちの１種より多くを提供し得る。一般に、上記リアソータントインフルエンザウイルスが、６種より多くのバックボーンセグメントを含むことはできない。よって、例えば、上記ドナー株のうちの１種が上記ウイルスセグメントのうちの５種を提供する場合、上記リアソータントインフルエンザウイルスは、合計２種の異なるドナー株に由来するバックボーンセグメントしか含むことができない。
【００７４】
一般に、リアソータントインフルエンザウイルスは、各バックボーンセグメントのうちの１種のみを含む。例えば、上記インフルエンザウイルスが、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８に由来するＮＰセグメントを含む場合、別のインフルエンザ株に由来するＮＰセグメントを同時に含むことはできない。
【００７５】
ワクチン株として使用され得る株は、抗ウイルス治療に耐性（例えば、オセルタミビル［３２］および／もしくはザナミビルに耐性）である株（耐性汎流行性株［３３］を含む）を含む。
【００７６】
本発明の方法によって生成されるリアソータントインフルエンザ株は、汎流行性間期の（流行期）インフルエンザワクチン株であるワクチン株に由来するセグメントを含み得る。それはまた、汎流行性の株もしくは潜在的に汎流行性の株であるワクチン株に由来するセグメントを含み得る。汎流行性アウトブレイクを引き起こす可能性を与えるインフルエンザ株の特徴は、以下である：（ａ）現在循環しているヒト株におけるヘマグルチニンと比較して、新たなヘマグルチニンを含む（すなわち、１０年を超えてヒト集団において顕性でなかったもの（例えば、Ｈ２）、または上記ヒト集団において以前に全く認められなかったもの（例えば、一般に、トリ集団においてのみ見いだされてきたＨ５、Ｈ６もしくはＨ９）。その結果、上記ヒト集団は、上記株のヘマグルチニンに対して免疫学的にナイーブである；（ｂ）上記ヒト集団において水平伝播し得る；および（ｃ）ヒトに対して病原性である。Ｈ５ヘマグルチニンタイプを有するワクチン株は、好ましい。ここで上記リアソータントウイルスは、汎流行性インフルエンザ（例えば、Ｈ５Ｎ１株）に対して免疫化するためのワクチンにおいて使用される。他の考えられる株としては、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１およびＨ７Ｎ７、ならびに任意の他の潜在的に出現する汎流行性株が挙げられる。本発明は、非ヒト動物集団からヒトへと拡がり得るかもしくは拡がってしまった潜在的汎流行性ウイルス株（例えば、ブタ起源のＨ１Ｎ１インフルエンザ株）に対して防御するためのワクチンにおける使用のために、リアソータントウイルスを生成するのに特に適している。
【００７７】
本発明の方法は、リアソータントインフルエンザＡ株およびリアソータントインフルエンザＢ株を調製するために使用され得る。
【００７８】
（リアソータントインフルエンザＡウイルス）
上記方法が、リアソータントインフルエンザＡ株を調製するために使用される場合、上記株は、インフルエンザＡウイルスＨＡサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６もしくはＨ１７を含み得る。それらは、インフルエンザＡウイルスＮＡサブタイプＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８もしくはＮ９を含み得る。上記ワクチン株が、流行期インフルエンザ株である場合、それは、Ｈ１もしくはＨ３サブタイプを有し得る。本発明の一局面において、上記ワクチン株は、Ｈ１Ｎ１もしくはＨ３Ｎ２株である。
【００７９】
上記リアソータントインフルエンザＡウイルスは、好ましくは、ドナー株ＰＲ８−Ｘに由来する少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントを含む。従って、本発明のインフルエンザウイルスは、以下から選択される１種以上のゲノムセグメントを含み得る：配列番号９の配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の同一性を有するＰＡセグメント、配列番号１０の配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の同一性を有するＰＢ１セグメント、配列番号１１の配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の同一性を有するＰＢ２セグメント、配列番号１３の配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の同一性を有するＭセグメント、配列番号１２の配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の同一性を有するＮＰセグメント、および／または配列番号１４の配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の同一性を有するＮＳセグメント。上記リアソータントインフルエンザＡウイルスは、これらバックボーンセグメントのうちの全てを含み得る。
【００８０】
代わりに、もしくはさらに、上記リアソータントインフルエンザＡウイルスは、１０５ｐ３０株に由来する１種以上のバックボーンウイルスセグメントを含み得る。従って、上記リアソータントインフルエンザＡウイルスが、１０５ｐ３０株に由来する１種以上のゲノムセグメントを含む場合、上記ウイルスセグメントは、以下から選択される配列を有し得る：配列番号４２の配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の同一性を有するＰＡセグメント、配列番号４３の配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の同一性を有するＰＢ１セグメント、配列番号４４の配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の同一性を有するＰＢ２セグメント、配列番号４６の配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の同一性を有するＭセグメント、配列番号４５の配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の同一性を有するＮＰセグメント、および／または配列番号４７の配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の同一性を有するＮＳセグメント。上記リアソータントインフルエンザＡウイルスは、これらバックボーンセグメントのうちの全てを含み得る。
【００８１】
上記リアソータントインフルエンザウイルスは、２種以上のインフルエンザドナー株に由来するバックボーンセグメントを含み得る。本発明者らは、このようなリアソータントインフルエンザＡウイルスが、培養宿主中で特によく増殖することを見出した。例えば、本発明者らは、１０５ｐ３０に由来するＮＰ、ＰＢ１およびＰＢ２セグメント、ならびにＰＲ８−Ｘに由来するＭ、ＮＳおよびＰＡセグメントを含むリアソータントインフルエンザＡウイルスが、ＰＲ８−Ｘに由来する全バックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザＡウイルスと比較して、より高いレスキュー効率を提供しかつより迅速に増殖することを見出した。同様に、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／４／０９に由来するＰＢ１セグメントおよびＰＲ８−Ｘに由来する他のバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザＡ株は、しばしば、ＰＲ８−Ｘに由来する全バックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザＡウイルスより高いレスキュー効率およびＨＡ収量を有した。このようなリアソータントインフルエンザＡウイルスは、本発明の方法における使用に特に適している。なぜなら、その増大したレスキュー効率は、ワクチン製造のためのシードウイルスが得られ得る速度をさらに増大させるからである。
【００８２】
２種以上のインフルエンザドナー株に由来するバックボーンセグメントを有するリアソータントインフルエンザＡウイルスは、種々のインフルエンザＡ株に由来するＨＡセグメントおよびＰＢ１セグメントを含み得る。これらリアソータントインフルエンザウイルスにおいて、上記ＰＢ１セグメントは、上記ワクチン株と同じインフルエンザウイルスＨＡサブタイプを有するドナーウイルスに由来し得る。例えば、上記ＰＢ１セグメントおよび上記ＨＡセグメントは、両方とも、Ｈ１サブタイプを有するインフルエンザウイルスに由来し得る。上記リアソータントインフルエンザＡウイルスはまた、異なるインフルエンザウイルスＨＡサブタイプを有する異なるインフルエンザＡ株に由来するＨＡセグメントおよびＰＢ１セグメントを含み得、ここで上記ＰＢ１セグメントは、Ｈ３  ＨＡサブタイプを有するインフルエンザウイルスに由来せず、そして／または上記ＨＡセグメントは、Ｈ１もしくはＨ５  ＨＡサブタイプを有するインフルエンザウイルスに由来しない。例えば、上記ＰＢ１セグメントは、Ｈ１ウイルスに由来し得、そして／または上記ＨＡセグメントは、Ｈ３インフルエンザウイルスに由来し得る。上記リアソータントが１種より多くのインフルエンザドナー株に由来するウイルスセグメントを含む場合、そのさらなるドナー株は、任意のドナー株であり得る。例えば、上記ウイルスセグメントのうちのいくつかは、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４もしくはＡ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０のインフルエンザ株に由来し得る。Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／６／６０株に由来するウイルスセグメントを含むリアソータントは、有利であり得、例えば、その場合、上記リアソータントウイルスは、弱毒化生インフルエンザワクチンにおいて使用される。
【００８３】
上記リアソータントインフルエンザＡウイルスはまた、２種以上のインフルエンザドナー株に由来するバックボーンセグメントを含み得、ここで上記ＰＢ１セグメントは、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９インフルエンザ株に由来する。このセグメントは、配列番号２４の配列と少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性もしくは１００％の同一性を有し得る。上記リアソータントインフルエンザＡウイルスは、Ｈ１  ＨＡサブタイプを有し得る。本発明のこの局面に従うリアソータントインフルエンザウイルスが、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９に由来するＨＡおよび／もしくはＮＡセグメントを含まないことは、理解される。
【００８４】
上記リアソータントインフルエンザ株は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／４／０９株に由来するＨＡセグメントおよび／もしくはＮＡセグメントを含み得る。従って、例えば、上記ＨＡ遺伝子セグメントは、配列番号５０に対してより配列番号７０に対して密接に関連している（すなわち、同じアルゴリズムおよびパラメーターを使用して、配列番号５０に対するより配列番号７０と比較してより高い程度の配列同一性を有する）Ｈ１ヘマグルチニンをコードし得る。配列番号７０および５０は、８０％同一である。同様に、上記ＮＡ遺伝子は、配列番号５１に対してより配列番号９９に対して密接に関連しているＮ１ノイラミニダーゼをコードし得る。配列番号９９および５１は、８２％同一である。
【００８５】
上記リアソータントインフルエンザＡウイルスはまた、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９インフルエンザ株に由来する少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントを含み得る。上記少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントがＰＡセグメントである場合、それは、配列番号２３の配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を有し得る。上記少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントがＰＢ１セグメントである場合、それは、配列番号２４の配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を有し得る。上記少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントがＰＢ２セグメントである場合、それは、配列番号２５の配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を有し得る。上記少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントがＮＰセグメントである場合、それは、配列番号２６の配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を有し得る。上記少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントがＭセグメントである場合、それは、配列番号２７の配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を有し得る。上記少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントがＮＳセグメントである場合、それは、配列番号２８の配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を有し得る。
【００８６】
リアソータントインフルエンザＡウイルスが、Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７に由来するＰＢ１セグメントを含む場合、それは、好ましくは、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４に由来するＰＡ、ＮＰもしくはＭセグメントを含まない。リアソータントインフルエンザＡウイルスがＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４に由来するＰＡ、ＮＰもしくはＭセグメントを含む場合、それは、好ましくは、Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７に由来するＰＢ１セグメントを含まない。いくつかの実施形態において、本発明は、Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７に由来するＰＢ１セグメント、ならびにＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４に由来するＰＡ、ＮＰおよびＭセグメントを有するリアソータントインフルエンザＡウイルスを含まない。Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７に由来するＰＢ１タンパク質は、配列番号２９の配列を有し得、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４に由来するＰＡ、ＮＰもしくはＭタンパク質は、それぞれ、配列番号３０、３１もしくは３２の配列を有し得る。
【００８７】
上記バックボーンウイルスセグメントは、特定の培養宿主中での培養のために最適化され得る。例えば、上記リアソータントインフルエンザウイルスは、哺乳動物細胞中で培養される場合、培養宿主中での最適な増殖のために、上記ウイルスセグメントのうちの少なくとも１種を適合させることは、有利である。例えば、発現宿主がイヌ細胞（例えば、ＭＤＣＫ細胞株）である場合、上記ウイルスセグメントは、上記細胞中でのウイルス増殖を最適化する配列を有し得る。従って、本発明のリアソータントインフルエンザウイルスは、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して、配列番号３に整列させた場合、配列番号３のアミノ酸３８９に対応する位置においてリジンを、および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して、配列番号３に整列させた場合、配列番号３のアミノ酸５５９に対応する位置においてアスパラギンを有するＰＢ２ゲノムセグメントを含み得る。上記ＰＡゲノムセグメントが、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して、配列番号１に整列させた場合、配列番号１のアミノ酸３２７に対応する位置においてリジンを、および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して、配列番号１に整列させた場合、配列番号１のアミノ酸４４４に対応する位置においてアスパラギン酸を、および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して、配列番号１に整列させた場合、配列番号１のアミノ酸６７５に対応する位置においてアスパラギン酸を有する、本発明に従うリアソータントインフルエンザウイルスもまた提供される。本発明のリアソータントインフルエンザ株はまた、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して、配列番号４に整列させた場合、配列番号４のアミノ酸２７に対応する位置においてスレオニンを、および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して、配列番号４に整列させた場合、配列番号４のアミノ酸３７５に対応する位置においてアスパラギンを有するＮＰゲノムセグメントを有し得る。改変体インフルエンザ株はまた、これら変異のうちの２種以上を含み得る。上記改変体インフルエンザウイルスが、上記で同定されるアミノ酸変化のうちの両方を有する改変体ＰＢ２セグメント、および／または上記で同定されるアミノ酸変化のうちの３種全てを含むＰＡ、および／または上記で同定されるアミノ酸変化のうちの両方を含むＮＰセグメントを含むことは、好ましい。上記インフルエンザＡウイルスは、Ｈ１株であり得る。
【００８８】
代わりに、もしくはさらに、上記リアソータントインフルエンザＡウイルスは、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して、配列番号２に整列させた場合、配列番号２のアミノ酸２００に対応する位置においてイソロイシンを、および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して、配列番号２に整列させた場合、配列番号２のアミノ酸３３８に対応する位置においてアスパラギンを、および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して、配列番号２に整列させた場合、配列番号２のアミノ酸５２９に対応する位置においてイソロイシンを、および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して、配列番号２に整列させた場合、配列番号２のアミノ酸５９１に対応する位置においてイソロイシンを、および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して、配列番号２に整列させた場合、配列番号２のアミノ酸６８７に対応する位置においてヒスチジンを、および／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して、配列番号２に整列させた場合、配列番号２のアミノ酸７５４に対応する位置においてリジンを有するＰＢ１セグメントを含み得る。
【００８９】
好ましいペアワイズアラインメントアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを使用する（例えば、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリクスを使用して、ギャップオープンペナルティー＝１０．０、およびギャップ伸長ペナルティー＝０．５で）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズム［３４］である。このアルゴリズムは、便利なことには、ＥＭＢＯＳＳパッケージにおけるニードルツールで実施される［３５］。
【００９０】
本発明の方法における使用のためのドナー株の選択は、再集合される予定のワクチン株に依存し得る。進化的に遠い株の間のリアソータントは、細胞培養において十分に複製しないと思われるので、上記ドナー株および上記ワクチン株が、同じＨＡおよび／もしくはＮＡサブタイプを有することは、考えられる。しかし、他の実施形態において、上記ワクチン株および上記ドナー株は、異なるＨＡおよび／もしくはＮＡサブタイプを有し得、この取り合わせは、上記ワクチン株に由来するＨＡおよび／もしくはＮＡセグメントを含むリアソータントウイルスの選択を容易にし得る。従って、上記１０５ｐ３０およびＰＲ８−Ｘ株は、Ｈ１インフルエンザサブタイプを含むとはいえ、これらドナー株は、Ｈ１インフルエンザサブタイプを含まないワクチン株のために使用され得る。
【００９１】
上記ＨＡおよび／もしくはＮＡセグメントを別のサブタイプに変化させたドナー株のリアソータントもまた、使用され得る。１０５ｐ３０もしくはＰＲ８−Ｘ株のＨ１インフルエンザサブタイプは、例えば、Ｈ３もしくはＨ５サブタイプに変化させられ得る。
【００９２】
従って、インフルエンザＡウイルスは、１０５ｐ３０もしくはＰＲ８−Ｘ株に由来する１種、２種、３種、４種、５種、６種もしくは７種のウイルスセグメント、およびＨ１サブタイプのものではないＨＡセグメントを含み得る。上記リアソータントドナー株は、Ｎ１サブタイプのものではないＮＡセグメントをさらに含み得る。
【００９３】
上記リアソータントドナー株は、本発明の１０５ｐ３０もしくはＰＲ８−Ｘ株に由来する少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種もしくは少なくとも７種のウイルスセグメント、ならびに異なるインフルエンザ株に由来するＨ１  ＨＡセグメントを含み得る。
【００９４】
本発明の方法において使用される「第２のインフルエンザ株」は、上記使用されるドナー株とは異なる。
【００９５】
（リアソータントインフルエンザＢウイルス）
本発明はまた、リアソータントインフルエンザＢ株を調製するために使用され得る。
【００９６】
例えば、上記方法は、第１のインフルエンザＢウイルスに由来するＨＡセグメント、ならびにＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株である第２のインフルエンザＢウイルスに由来するＮＰおよび／もしくはＰＢ２セグメントを含むリアソータントインフルエンザＢウイルスを生成するために使用され得る。上記Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株は、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８であり得る。
【００９７】
上記方法はまた、第１のインフルエンザＢウイルスに由来するＨＡセグメント、およびＢ／Ｌｅｅ／４０でもＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／６６でもＢ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０でもない第２のインフルエンザＢウイルスに由来するＮＰセグメントを含むリアソータントインフルエンザＢウイルスを生成するために使用され得る。例えば、上記リアソータントインフルエンザＢウイルスは、配列番号８０、１００、１０３もしくは１０４の配列を有しないＮＰセグメントを有し得る。上記リアソータントインフルエンザＢウイルスはまた、配列番号１９、２３、４４もしくは４５のタンパク質をコードしないＮＰセグメントを有し得る。上記リアソータントインフルエンザＢウイルスは、上記第２のインフルエンザＢウイルスに由来するＮＰおよびＰＢ２セグメントの両方を含み得る。上記第２のインフルエンザＢウイルスは、好ましくは、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株である。上記Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株は、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８であり得る。
【００９８】
本発明はまた、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株に由来するＨＡセグメントおよびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株に由来する少なくとも１種のバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザＢウイルスを生成するために使用され得る。上記リアソータントインフルエンザＢウイルスは、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株に由来する２種、３種、４種、５種もしくは６種のバックボーンセグメントを含み得る。好ましい実施形態において、上記リアソータントインフルエンザＢウイルスは、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株に由来する全バックボーンセグメントを含む。上記Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株は、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８であり得る。
【００９９】
上記方法はまた、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株およびＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株に由来するウイルスセグメントを含むリアソータントインフルエンザＢウイルスを生成するために適しており、ここで上記Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株および上記Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株に由来するセグメントの比は、１：７、２：６、４：４、５：３、６：２もしくは７：１である。７：１、６：２、４：４、３：４もしくは１：７の比、特に、４：４の比は、このようなリアソータントインフルエンザＢウイルスが培養宿主中で特に良く増殖するので好ましい。上記Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株は、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８であり得る。上記Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株は、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０であり得る。これら実施形態において、上記リアソータントインフルエンザＢウイルスは、通常、同じインフルエンザＢドナー株に由来する全バックボーンセグメントを含まない。
【０１００】
上記方法はまた、リアソータントインフルエンザＢウイルスを生成するために使用され得、上記ウイルスは、以下を含む：
ａ）配列番号７１のＰＡセグメント、配列番号７２のＰＢ１セグメント、配列番号７３のＰＢ２セグメント、配列番号７４のＮＰセグメント、配列番号７６のＮＳセグメントおよび配列番号７５のＭセグメント；または
ｂ）配列番号７１のＰＡセグメント、配列番号７８のＰＢ１セグメント、配列番号７３のＰＢ２セグメント、配列番号７４のＮＰセグメント、配列番号８２のＮＳセグメントおよび配列番号８１のＭセグメント；または
ｃ）配列番号７１のＰＡセグメント、配列番号７８のＰＢ１セグメント、配列番号７９のＰＢ２セグメント、配列番号７４のＮＰセグメント、配列番号７６のＮＳセグメント、および配列番号７５のＭセグメント；または
ｄ）配列番号３０のＰＡセグメント、配列番号７２のＰＢ１セグメント、配列番号７３のＰＢ２セグメント、配列番号７４のＮＰセグメント、配列番号７６のＮＳセグメントおよび配列番号７５のＭセグメント、または
ｅ）配列番号７１のＰＡセグメント、配列番号７２のＰＢ１セグメント、配列番号７３のＰＢ２セグメント、配列番号７４のＮＰセグメント、配列番号８２のＮＳセグメントおよび配列番号８１のＭセグメント。
【０１０１】
インフルエンザＢウイルスは、現在、異なるＨＡサブタイプを示さないが、インフルエンザＢウイルス株は、２種の異なる系統に分かれる。これら系統は、１９８０年代後期に明らかになり、互いから抗原的におよび／もしくは遺伝的に区別され得るＨＡを有する［３６］。現在のインフルエンザＢウイルス株は、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様かもしくはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様かのいずれかである。これら株は、通常、抗原的に区別されるが、アミノ酸配列における差異はまた、上記２つの系統を区別するために記載されてきた。例えば、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株は、しばしば（常ではないものの）、アミノ酸残基１６４（「Ｌｅｅ４０」ＨＡ配列に対して番号付けられる）において欠失を有するＨＡタンパク質を有する［３７］。いくつかの実施形態において、本発明のリアソータントインフルエンザＢウイルスは、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株に由来するウイルスセグメントを含み得る。それらは、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株に由来するウイルスセグメントを含み得る。あるいは、それらは、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株およびＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株に由来するウイルスセグメントを含み得る。
【０１０２】
上記リアソータントインフルエンザＢウイルスが、２種以上のインフルエンザＢウイルス株に由来するウイルスセグメントを含む場合、これらウイルスセグメントは、関連したノイラミニダーゼを有するインフルエンザ株に由来し得る。例えば、上記ウイルスセグメントを提供するインフルエンザ株は、両方がＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様ノイラミニダーゼ［３８］を有し得るか、または両方がＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様ノイラミニダーゼを有し得る。例えば、２種のＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様ノイラミニダーゼは、両方が以下の配列特徴のうちの１種以上を有し得る：（１）残基２７においてセリンではなく、好ましくは、ロイシン；（２）残基４４においてグルタミン酸ではなく、好ましくは、リジン；（３）残基４６においてはスレオニンではなく、好ましくは、イソロイシン；（４）残基５１ではプロリンではなく、好ましくは、セリン；（５）残基６５ではアルギニンではなく、好ましくは、ヒスチジン；（６）残基７０ではグリシンではなく、好ましくは、グルタミン酸；（７）残基７３ではロイシンではなく、好ましくは、フェニルアラニン；および／または（８）残基８８ではプロリンではなく、好ましくは、グルタミン。同様に、いくつかの実施形態において、上記ノイラミニダーゼは、残基４３で欠失を有し得るか、またはそれは、スレオニン；ＮＡ遺伝子におけるトリヌクレオチド欠失を生じる残基４３で欠失を有し得、これはＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株の特徴として報告されているが、最近の株は、Ｔｈｒ−４３を再獲得した［３７］。逆に、当然のことながら、反対の特徴を、２種のＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様ノイラミニダーゼが共有し得る（例えば、Ｓ２７、Ｅ４４、Ｔ４６、Ｐ５１、Ｒ６５、Ｇ７０、Ｌ７３、および／もしくはＰ８８）。これらアミノ酸は、「Ｌｅｅ４０」ノイラミニダーゼ配列に対して番号づけられている［３９］。上記リアソータントインフルエンザＢウイルスは、上記特徴を有するＮＡセグメントを含み得る。かわりに、もしくはさらに、上記リアソータントインフルエンザＢウイルスは、上記の特徴を有するＮＡセグメントを有するインフルエンザ株に由来するウイルスセグメント（ＮＡ以外）を含み得る。
【０１０３】
Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株であるインフルエンザＢウイルスのバックボーンウイルスセグメントは、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８の対応するウイルスセグメントに対してより、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７に由来する対応するウイルスセグメントに対してより高いレベルの同一性を有し得、その逆もまた同様である。例えば、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０（これは、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株である）のＮＰセグメントは、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８のＮＰセグメントに対して９９％の同一性を、およびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７のＮＰセグメントに対してほんの９６％の同一性を有する
本発明のリアソータントインフルエンザＢウイルスがＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株に由来するバックボーンウイルスセグメントを含む場合、上記ウイルスセグメントは、以下の配列を有するタンパク質をコードし得る。上記ＰＡタンパク質は、配列番号８３の配列と少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性もしくは１００％の同一性を有し得る。上記ＰＢ１タンパク質は、配列番号８４の配列と少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性もしくは１００％の同一性を有し得る。上記ＰＢ２タンパク質は、配列番号８５の配列と少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の同一性を有し得る。上記ＮＰタンパク質は、配列番号８６の配列と少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性もしくは１００％の同一性を有し得る。上記Ｍ１タンパク質は、配列番号８７の配列と少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性もしくは１００％の同一性を有し得る。上記Ｍ２タンパク質は、配列番号８８の配列と少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性もしくは１００％の同一性を有し得る。上記ＮＳ１タンパク質は、配列番号８９の配列と少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性もしくは１００％の同一性を有し得る。上記ＮＳ２タンパク質は、配列番号９０の配列と少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性もしくは１００％の同一性を有し得る。いくつかの実施形態において、上記リアソータントインフルエンザＢウイルスはまた、これらバックボーンセグメントの全てを含み得る。
【０１０４】
本発明のリアソータントインフルエンザＢウイルスがＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株に由来するバックボーンウイルスセグメントを含む場合、上記ウイルスセグメントは、以下の配列を有するタンパク質をコードし得る。上記ＰＡタンパク質は、配列番号９１の配列と少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性もしくは１００％の同一性を有し得る。上記ＰＢ１タンパク質は、配列番号９２の配列と少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性もしくは１００％の同一性を有し得る。上記ＰＢ２タンパク質は、配列番号９３の配列と少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の同一性を有し得る。上記ＮＰタンパク質は、配列番号９４の配列と少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性もしくは１００％の同一性を有し得る。上記Ｍ１タンパク質は、配列番号９５の配列と少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性もしくは１００％の同一性を有し得る。上記Ｍ２タンパク質は、配列番号９６の配列と少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性もしくは１００％の同一性を有し得る。上記ＮＳ１タンパク質は、配列番号９７の配列と少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性もしくは１００％の同一性を有し得る。上記ＮＳ２タンパク質は、配列番号９８の配列と少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性もしくは１００％の同一性を有し得る。
【０１０５】
本発明は、配列番号７１〜７６もしくは７７〜８２の配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％もしくは少なくとも約９９％もしくは１００％の同一性を有するウイルスセグメントを有するドナー株で実施され得る。遺伝コードの縮重に起因して、異なる配列を有するいくつかの核酸によってコードされる同じポリペプチを有することがあり得る。例えば、配列番号３３および３４の核酸配列は、それらが同じウイルスタンパク質をコードするとしても、７３％の同一性を有するに過ぎない。従って、本発明は、配列番号７１〜７６もしくは７７〜８２の配列と同じポリペプチドをコードするウイルスセグメントで実施され得る。
【０１０６】
機能的ＮＳタンパク質をコードしないＮＳセグメントを含むリアソータントウイルスはまた、本発明の範囲内にある。ＮＳ１ノックアウト変異体は、参考文献４０に記載される。これらＮＳ１変異体ウイルス株は、弱毒化生インフルエンザワクチンを調製するために特に適している。
【０１０７】
本発明の方法において使用される「第２のインフルエンザ株」は、上記使用されるドナー株とは異なる。
【０１０８】
（バックボーンライブラリー）
汎流行の間にインフルエンザワクチンを迅速に供給するために、上記リアソータントインフルエンザウイルスは、短い時間枠で高ウイルス力価まで増殖し得ることは、重要である。本発明者らは、それが、最速で増殖するリアソータントを同定するために、種々のバックボーンと組み合わせて上記ワクチン株のＨＡおよびＮＡセグメントを含む多くのリアソータントインフルエンザウイルスを試験するために有用であり得ることを発見した。本発明は、従って、２種以上のインフルエンザバックボーンを含むライブラリーを提供する。例えば、上記ライブラリーは、５種、１０種、１５種、２０種、３０種、４０種、５０種、１００種もしくは２００種の異なるインフルエンザバックボーンを含み得る。上記バックボーンは、上記ライブラリーにおいて発現構築物に含まれ得る。いくつかの実施形態において、上記ライブラリーは、インフルエンザウイルスのＨＡおよび／もしくはＮＡセグメントをコードする発現構築物を含まなくてもよい。なぜならこれらセグメントは、循環するインフルエンザ株に由来するからである。上記ライブラリーは、前節に記載されるとおりの少なくとも１種のインフルエンザバックボーンを含み得る。
【０１０９】
上記ライブラリー中の各発現構築物は、インフルエンザウイルスのバックボーンセグメントの全てをコードし得る。バックボーンセグメント全てをコードしない発現構築物を含めることもまた、考えられる。例えば、上記ライブラリーは、１種、２種、３種、４種、５種、６種もしくは７種のウイルスバックボーンセグメントをコードする発現構築物を含み得る。
【０１１０】
新たな循環する株が同定される場合、その株のＨＡおよびＮＡセグメントは、発現構築物（これは、合成発現構築物であり得る）中に含まれ得る。この発現構築物および上記ライブラリー中の発現構築物は、宿主細胞（これは、好ましくは、同じ細胞株もしくは同じ細胞タイプの全てである）に共トランスフェクトされ得る。インフルエンザウイルスの全ウイルスセグメントをコードする発現構築物を受容する細胞は、これら発現構築物からリアソータントインフルエンザウイルスを生成する。このようにして、全てが同じＨＡおよびＮＡセグメントを含むが、異なるバックボーンセグメントを有する多くの種々のリアソータントインフルエンザウイルスを生成することは、可能である。これらリアソータントインフルエンザウイルスの増殖速度は、当該分野で標準的な方法を使用して決定され得、最速で増殖するリアソータントは、ワクチン生成のために選択され得る。
【０１１１】
（ウイルス調製）
一実施形態において、本発明は、インフルエンザウイルスを生成するための方法を提供し、上記方法は、（ａ）培養宿主に本発明のリアソータントウイルスを感染させる工程；（ｂ）上記工程（ａ）の宿主を培養して、上記ウイルスを生成する工程；および必要に応じて、（ｃ）上記工程（ｂ）で生成したウイルスを精製する工程を包含する。
【０１１２】
上記されるように、培養宿主は、細胞または孵化鶏卵であり得る。細胞が、本発明のこの局面において培養宿主として使用される場合、細胞培養条件（例えば、温度、細胞密度、ｐＨ値など）が、使用される上記細胞株および上記ウイルスに依存する広い範囲にわたって変動性であり、本願の要件に適合され得ることは公知である。従って、以下の情報は、ガイドラインを表すに過ぎない。
【０１１３】
上述したように、細胞は、好ましくは、無血清培地もしくは無タンパク質培地中で培養される。
【０１１４】
上記細胞の増殖は、当業者に公知の方法に従って行われ得る。例えば、上記細胞は、遠心分離もしくは濾過のような通常の補助的方法を使用する灌流システムにおいて培養され得る。さらに、上記細胞は、感染前に、流加システム（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｓｙｓｔｅｍ）で、本発明に従って増殖させられ得る。本発明の状況において、培養システムは、上記細胞が最初にバッチシステムで培養され、培地中の栄養分（もしくは栄養分の一部）の枯渇が、濃縮された栄養分の制御された供給によって補償される流加システムに関して言及される。感染前の細胞の増殖の間に上記培地のｐＨ値を、ｐＨ６．６〜ｐＨ７．８の値に、および特に、ｐＨ７．２〜ｐＨ７．３の間の値に調節することは、有利であり得る。細胞の培養は、好ましくは、３０℃〜４０℃の間の温度で行われる。感染細胞を培養する場合（工程ｂ）、上記細胞は、好ましくは、３０℃〜３６℃の間の温度もしくは３２℃〜３４℃の間の温度、または３３℃で培養される。これは、特に好ましい。なぜなら、この温度範囲での感染細胞のインキュベーションが、ワクチンへと処方される場合に改善された効率を生じるウイルスの生成を生じることが示されたからである［４１］。
【０１１５】
酸素分圧は、感染前の培養の間に、好ましくは、２５％〜９５％の間の値において、および特には、３５％〜６０％の間の値において調節され得る。本発明の状況において示される酸素分圧の値は、空気の飽和に基づく。細胞の感染は、バッチシステムにおいては、好ましくは、約８〜２５×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で、もしくは灌流システムにおいては、好ましくは、約５〜２０×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で行われる。上記細胞は、１０−８〜１０の間、好ましくは、０．０００１〜０．５の間のウイルス用量（ＭＯＩ値（「感染多重度」；感染時の細胞あたりのウイルス単位の数に対応する）で感染させられ得る。
【０１１６】
ウイルスは、接着培養もしくは懸濁物中で、細胞において増殖させられ得る。マイクロキャリア培養が使用され得る。したがって、一部の実施形態において、上記細胞は、懸濁物中での増殖に適合され得る。
【０１１７】
本発明に従う方法は、ウイルスの採取および単離、またはウイルスによって生成されるタンパク質の採取および単離も含む。ウイルスもしくはタンパク質の単離の間に、上記細胞は、分離、濾過もしくは限外濾過のような標準的な方法によって培養培地から分離される。次いで、上記ウイルスもしくは上記タンパク質は、勾配遠心分離、濾過、沈殿、クロマトグラフィーなどの当業者に十分公知の方法に従って濃縮され、次いで、精製される。上記ウイルスが精製の間もしくは精製後に不活性化されることも本発明にしたがって好ましい。ウイルス不活性化は、上記精製プロセス内のいずれかの時点で、例えば、β−プロピオラクトンもしくはホルムアルデヒドによって行われ得る。
【０１１８】
上記培養宿主は、卵であり得る。ワクチン用のインフルエンザウイルス増殖のための現在の標準的方法は、ＳＰＦ孵化鶏卵を使用し、ウイルスは、その卵の内容物（尿膜腔液）から精製される。ウイルスを卵によって継代し、その後、上記ウイルスを、細胞培養物中で増殖させることもまた可能であり、その逆もまた同様である。
【０１１９】
（ワクチン）
本発明は、上記方法に従って生成されるウイルスを利用して、ワクチンを生成する。
【０１２０】
ワクチン（特に、インフルエンザワクチン）は、一般に、生のウイルスもしくは不活性化ウイルスのいずれかに基づく。不活性化ワクチンは、全ビリオン、「スプリット」ビリオン、もしくは精製表面抗原に基づき得る。抗原はまた、ビロソームの形態で提示され得る。本発明は、これらタイプのワクチンのうちのいずれかを製造するために使用され得る。
【０１２１】
不活性化ウイルスが使用される場合、上記ワクチンは、全ビリオン、スプリットビリオン、もしくは精製表面抗原（インフルエンザについては、ヘマグルチニンを含み、通常はまた、ノイラミニダーゼを含む）を含み得る。ウイルスを不活性化するための化学的手段としては、以下の薬剤のうちの１つ以上の有効量での処理が挙げられる：洗剤、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、バイナリーエチルアミン、アセチルエチレンイミン、もしくはこれらの組み合わせ。ウイルス不活性化の非化学的方法は、当該分野で公知である（例えば、ＵＶ光もしくはγ線照射）。
【０１２２】
ビリオンは、ウイルス含有流体（例えば、尿膜腔液もしくは細胞培養上清）から、種々の方法によって採取され得る。例えば、精製プロセスは、上記ビリオンを破壊するために洗剤を含む線形スクロース勾配溶液を使用するゾーン遠心分離を含み得る。次いで、抗原は、ダイアフィルトレーションによって、必要に応じた希釈の後に精製され得る。
【０１２３】
スプリットビリオンは、精製されたビリオンを洗剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート  ８０、デオキシコレート、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ９など）で処理して、サブビリオン調製物を生成する（「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」スプリットプロセスを含む）ことによって得られる。インフルエンザウイルスをスプリットするための方法は、例えば、当該分野で周知である（例えば、参考文献４２〜４７などを参照のこと）。上記ウイルスのスプリットは、代表的には、感染性であろうと非感染性であろうと、破壊濃度のスプリット薬剤で全ウイルスを破壊するかもしくはフラグメント化することによって行われる。上記破壊は、上記ウイルスタンパク質の完全なもしくは部分的な可溶化を生じ、上記ウイルスの完全性を変化させる。好ましいスプリット薬剤は、非イオン性界面活性剤およびイオン性（例えば、カチオン性）界面活性剤（例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、ＮＰ９、４級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｃｅｔａｖｌｏｎ、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびＤＯＴ−ＭＡ）、オクチル−もしくはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００もしくはＴｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１））、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステル（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｌｅｎｅ  ｅｓｔｅｒ）などである。１つの有用なスプリット手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの連続的効果を使用し、スプリットは、最初のビリオン精製の間に起こり得る（例えば、スクロース密度勾配溶液において）。よって、スプリットプロセスは、上記ビリオン含有材料の清澄化（非ビリオン材料を除去するために）、上記採取したビリオンの濃縮（例えば、吸着法（例えば、ＣａＨＰＯ４吸着）を使用して）、非ビリオン材料からの全ビリオンの分離、密度勾配遠心分離工程においてスプリット薬剤を使用する（例えば、デオキシコール酸ナトリウムのようなスプリット薬剤を含むスクロース勾配を使用する）ビリオンのスプリット、次いで、望ましくない物質を除去するための濾過（例えば、限外濾過）を含み得る。スプリットビリオンは、有用には、リン酸ナトリウム緩衝化等張性塩化ナトリウム溶液中で再懸濁され得る。スプリットインフルエンザワクチンの例は、ＢＥＧＲＩＶＡＣＴＭ、ＦＬＵＡＲＩＸＴＭ、ＦＬＵＺＯＮＥＴＭおよびＦＬＵＳＨＩＥＬＤＴＭ製品である。
【０１２４】
精製されたインフルエンザウイルス表面抗原ワクチンは、表面抗原であるヘマグルチニン、および代表的には、同様にノイラミニダーゼを含む。精製形態でこれらタンパク質を調製するためのプロセスは、当該分野で周知である。上記ＦＬＵＶＩＲＩＮＴＭ、ＡＧＲＩＰＰＡＬＴＭおよびＩＮＦＬＵＶＡＣＴＭ製品は、インフルエンザサブユニットワクチンである。
【０１２５】
別の形態の不活性化抗原は、ビロソーム［４８］（核酸を含まないウイルス様リポソーム粒子）である。ビロソームは、洗剤でのウイルスの可溶化、続いて、ヌクレオキャプシドの除去およびウイルス糖タンパク質を含む膜の再構成によって、調製され得る。ビロソームを調製するための代替法は、ウイルス膜糖タンパク質を過剰量のリン脂質に添加して、それらの膜中においてリポソームにウイルスタンパク質を与えることを含む。
【０１２６】
本発明の方法はまた、生ワクチンを精製するために使用され得る。このようなワクチンは、通常、ビリオン含有流体からビリオンを精製することによって調製される。例えば、上記流体は、遠心分離によって清澄化され得、緩衝液（例えば、スクロース、リン酸カリウム、およびグルタミン酸一ナトリウムを含む）で安定化され得る。インフルエンザウイルスワクチンの種々の形態が、現在利用可能である（例えば、参考文献４９の第１７章および第１８章を参照のこと）。生ウイルスワクチンとしては、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅのＦＬＵＭＩＳＴＴＭ製品（三価生ウイルスワクチン）が挙げられる。
【０１２７】
上記ウイルスは、弱毒化され得る。上記ウイルスは、温度感受性であり得る。上記ウイルスは、低温適合（ｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄ）され得る。これら３つの特徴は、生のウイルスを抗原として使用する場合に特に有用である。
【０１２８】
ＨＡは、現在の不活性化インフルエンザワクチンにおける主要な免疫原であり、ワクチン用量は、ＨＡレベルを参照することによって標準化されている（代表的には、ＳＲＩＤによって測定される）。既存のワクチンは、代表的には、１株あたり約１５μｇのＨＡを含むが、より低い用量が、使用され得る（例えば、小児に関して、もしくは汎流行的状況において、またはアジュバントを使用する場合）。分割量（例えば、１／２（すなわち、７．５μｇ  ＨＡ／株）、１／４および１／８）が使用されてきたことと同様に、より高い用量も使用されてきた（例えば、３×もしくは９×用量［５０、５１］）。従って、ワクチンは、０．１〜１５０μｇの間のＨＡ／インフルエンザ株、好ましくは、０．１〜５０μｇの間（例えば、０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇなど）を含み得る。特定の用量としては、１株あたり、例えば、約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約３．７５、約１．９、約１．５などが挙げられる。
【０１２９】
生ワクチンに関して、投与は、ＨＡ含有量よりむしろ、５０％組織培養感染量（ｍｅｄｉａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｏｓｅ）（ＴＣＩＤ５０）によって測定され、１株あたり１０６〜１０８の間の（好ましくは、１０６．５〜１０７．５の間の）ＴＣＩＤ５０が、代表的である。
【０１３０】
本発明で使用されるインフルエンザ株は、野生型ウイルスにおいて見いだされる天然のＨＡ、もしくは改変ＨＡを有し得る。例えば、ＨＡを改変して、ウイルスをトリ種において非常に病原性にさせる決定基（例えば、ＨＡ１／ＨＡ２切断部位の周りの非常に塩基性の領域）を除去することは、公知である。逆遺伝学の使用は、このような改変を促進する。
【０１３１】
汎流行性間期の株に対して免疫化するために適しているのに加えて、本発明の組成物は、汎流行性もしくは潜在的に汎流行性の株に対して免疫化するために特に有用である。本発明は、ヒトおよび非ヒト動物にワクチン接種するのに適している。
【０１３２】
抗原が上記組成物中に有用に含まれ得る他の株は、抗ウイルス治療に抵抗性である（例えば、オセルタミビル［５２］および／もしくはザナミビルに抵抗性である）株である（耐性汎流行性株を含む［５３］）。
【０１３３】
本発明の組成物は、１つ以上の（例えば、１つ、２つ、３つ、４つもしくはそれより多い）インフルエンザウイルス株（インフルエンザＡ型ウイルスおよび／もしくはインフルエンザＢ型ウイルスを含む）に由来する抗原を含み得るが、ただし、少なくとも１つのインフルエンザ株が、本発明のリアソータントインフルエンザ株であることを条件とする。抗原のうち少なくとも２つ、少なくとも３つ、または全てが本発明のリアソータントインフルエンザ株に由来する組成物もまた想定される。ワクチンが１より多くのインフルエンザ株を含む場合、異なる株は、代表的には、別個に増殖させられ、上記ウイルスが採取された後に混合され、抗原が調製されてきた。従って、本発明のプロセスは、１より多くのインフルエンザ株に由来する抗原を混合する工程を包含し得る。三価ワクチンは、代表的である（２つのインフルエンザＡ型ウイルス株および１つのインフルエンザＢ型ウイルス株に由来する抗原を含む）。四価ワクチンもまた有用である［５４］（２つのインフルエンザＡ型ウイルス株および２つのインフルエンザＢ型ウイルス株に由来する抗原を含むか、または３つのインフルエンザＡ型ウイルス株および１つのインフルエンザＢ型ウイルス株に由来する抗原を含む）。
【０１３４】
（薬学的組成物）
本発明に従って製造されるワクチン組成物は、薬学的に受容可能である。それらは、通常、上記抗原に加えて、成分を含む。例えば、それらは、代表的には、１種以上の薬学的キャリアおよび／もしくは賦形剤を含む。以下に記載されるように、アジュバントもまた含まれ得る。このような成分の詳細な議論は、参考文献５５で入手される。
【０１３５】
ワクチン組成物は、一般に、水性形態にある。しかし、いくつかのワクチンは、乾燥形態、例えば、注射可能な固体、またはパッチ上の、乾燥したかもしくは重合した調製物の形態にあり得る。
【０１３６】
ワクチン組成物は、チオメルサールもしくは２−フェノキシエタノールのような保存剤を含み得る。しかし、上記ワクチンは、実質的に水銀物質を実質的に含まないべきである（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満）ことが好ましい（例えば、チオメルサールを含まない［４６、５６］）。水銀を含まないワクチンは、より好ましい。α−トコフェロールスクシネートは、水銀化合物の代替として含まれ得る［４６］。保存剤非含有ワクチンは、特に好ましい。
【０１３７】
張度を制御するために、組成物は、生理学的塩（例えば、ナトリウム塩）を含み得ることは好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、塩化ナトリウムは、１〜２０ｍｇ／ｍｌの間で存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、無水リン酸二ナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
【０１３８】
ワクチン組成物は、一般に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間（好ましくは、２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間）の質量オスモル濃度を有し、より好ましくは、２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内に入る。ワクチン接種によって引き起こされる疼痛に対して影響を有さない質量オスモル濃度が以前に報告されている［５７］が、この範囲において質量オスモル濃度を維持することは好ましい。
【０１３９】
ワクチン組成物は、１種以上の緩衝剤を含み得る。代表的な緩衝剤としては、以下が挙げられる：リン酸塩緩衝剤；Ｔｒｉｓ緩衝剤；ホウ酸塩緩衝剤；コハク酸塩緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤（特に、水酸化アルミニウムアジュバントで）；またはクエン酸塩緩衝剤。緩衝剤は、代表的には、５〜２０ｍＭ範囲で含まれる。
【０１４０】
ワクチン組成物のｐＨは、一般に、５．０〜８．１の間、より代表的には、６．０〜８．０の間（例えば、６．５〜７．５の間、または７．０〜７．８の間）である。本発明のプロセスは、従って、バルクワクチンのｐＨを、パッケージ前に調節する工程を包含し得る。
【０１４１】
上記ワクチン組成物は、好ましくは、無菌である。上記ワクチン組成物は、好ましくは、非発熱性である（例えば、１用量あたり＜１  ＥＵ（エンドトキシン単位、標準的な尺度）、好ましくは、＜０．１  ＥＵ／用量を含む）。上記ワクチン組成物は、好ましくは、グルテン非含有である。
【０１４２】
本発明のワクチン組成物は、洗剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎ」として公知）、オクトキシノール（例えば、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）もしくはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（「ＣＴＡＢ」）、またはデオキシコール酸ナトリウム（特に、スプリットワクチンもしくは表面抗原ワクチンのために））を含み得る。上記洗剤は、微量においてのみ存在し得る。従って、上記ワクチンは、オクトキシノール−１０およびポリソルベート８０の各々について１ｍｇ／ｍｌ未満で含み得る。他の残りの微量の成分は、抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。
【０１４３】
ワクチン組成物は、１回の免疫化のための物質を含んでいてもよいし、複数回の免疫化のための物質を含んでいてもよい（すなわち、「複数用量」キット）。保存剤を含めることは、複数用量の構成（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）において好ましい。複数用量組成物中に保存剤を含める代替として（もしくはそれに加えて）、上記組成物は、物質の取り出しのための無菌アダプタを有する容器中に含まれ得る。
【０１４４】
インフルエンザワクチンは、代表的には、約０．５ｍｌの投与体積で投与されるが、半用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）が、小児に投与され得る。
【０１４５】
組成物およびキットは、好ましくは、２℃〜８℃の間で貯蔵される。それらは、凍結されるべきではない。それらは、理想的には、遮光して保持されるべきである。
【０１４６】
（宿主細胞ＤＮＡ）
ウイルスが単離され、そして／または細胞株上で増殖させられた場合、最終ワクチン中に残っている細胞株ＤＮＡのいかなる潜在的な腫瘍形成活性をも最小限にするために、上記ＤＮＡの量を最小限にすることは、標準的な実施である。
【０１４７】
従って、本発明に従って調製されるワクチン組成物は、好ましくは、１用量あたり１０ｎｇ（好ましくは、１ｎｇ未満、より好ましくは、１００ｐｇ未満）の残留宿主細胞ＤＮＡを含むが、微量の宿主細胞ＤＮＡが存在し得る。
【０１４８】
あらゆる残留宿主細胞ＤＮＡの平均長が５００ｂｐ未満（例えば、４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満など）であることは、好ましい。
【０１４９】
夾雑するＤＮＡは、標準的精製手順（例えば、クロマトグラフィーなど）を使用するワクチン調製の間に除去され得る。残留宿主細胞ＤＮＡの除去は、ヌクレアーゼ処理によって（例えば、ＤＮａｓｅを使用することによって）増強され得る。宿主細胞ＤＮＡ夾雑物を減らすための便利な方法は、２工程処理（第１は、ＤＮａｓｅ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（これは、ウイルス増殖の間に使用され得る）を、次いで、カチオン性洗剤（例えば、ＣＴＡＢ）（これは、ビリオン破壊の間に使用され得る）使用する）を含む参考文献５８および５９において開示される。アルキル化剤（例えば、β−プロピオラクトン）での処理はまた、宿主細胞ＤＮＡを除去するために使用され得、有利なことには、ビリオンを不活性化するためにも使用され得る［６０］。
【０１５０】
（アジュバント）
本発明の組成物は、有利には、アジュバントを含み得る。これは、上記組成物を受ける被験体において誘発される免疫応答（液性および／もしくは細胞性）を高めるように機能し得る。好ましいアジュバントは、水中油型エマルジョンを含む。種々のこのようなアジュバントは公知であり、それらは、代表的には、少なくとも１種の油および少なくとも１種の界面活性剤を含み、上記油および界面活性剤は、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。上記エマルジョン中の油滴は、一般に、直径５μｍ未満であり、理想的には、サブミクロンの直径を有し、これら小さなサイズは、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ）で達成されて、安定なエマルジョンを提供する。２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴は、濾過滅菌に供され得るので、好ましい。
【０１５１】
前記エマルジョンは、動物（例えば魚類）供給源または植物供給源からのものなどの油を含むことができる。植物油の供給源としては、堅果、種子および穀粒が挙げられる。ラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油およびオリーブ油が、最も一般的に利用できる堅果油の例である。例えばホホバ豆から得られる、ホホバ油を使用することができる。種子油としては、紅花油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油およびこれらに類するものが挙げられる。穀粒の群の中で、トウモロコシ油が最も容易に入手できるが、他の穀類の穀粒、例えばコムギ、オートムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギおよびこれらに類するものの油も使用することができる。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油中に天然に存在しないが、堅果油および種子油から出発して適切な材料の加水分解、分離およびエステル化によって調製することができる。哺乳動物の乳からの脂肪および油は代謝性であり、従って、本発明の実施の際に使用することができる。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、鹸化および他の手段についての手順は、当該技術分野において周知である。殆どの魚類は、容易に回収できる代謝性の油を含有する。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨油、例えば鯨ろうが、ここで使用することができる魚油のいくつかの例である。多数の分岐鎖油が５炭素イソプレン単位で生化学的に合成されており、一般にテルペノイドと呼ばれる。サメ肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサン、として公知の、分岐した不飽和テルペノイドを含有し、これは、ここで特に好ましい。スクワラン、スクアレンの飽和類似体、も好ましい油である。スクアレンおよびスクワランを含む、魚油は、商業的供給源から容易に入手することができ、または当該技術分野において公知の方法によって得ることができる。別の好ましい油は、α―トコフェロール（下記参照）である。
【０１５２】
油の混合物を使用することができる。
【０１５３】
界面活性剤をそれらの「ＨＬＢ」（親水親油バランス）によって分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、およびさらに好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；商品名ＤＯＷＦＡＸＴＭで販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば、線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が様々であり得るオクトキシノール、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、すなわちｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質、例えばホスファチジルコリン（レシチン）；ノニルフェノールエトキシレート、例えばＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭＮＰシリーズ；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールから誘導されたポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）、例えばトリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０）；ならびにソルビタンエステル（一般にＳＰＡＮとして公知）、例えばソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ  ８５）およびソルビタンモノラウレートを含む（しかしこれらに限定されない）界面活性剤と共に用いることができる。非イオン性界面活性剤が好ましい。前記エマルジョンに含めるために好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ  ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【０１５４】
界面活性剤の混合物、例えばＴｗｅｅｎ  ８０／Ｓｐａｎ  ８５混合物、を使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ  ８０）、およびオクトキシノール、例えばｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、の組み合わせも適する。別の有用な組み合わせは、ラウレス９とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。
【０１５５】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０）０．０１％から１％、特に約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の洗剤）０．００１％から０．１％、特に０．００５％から０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９）０．１％から２０％、好ましくは０．１％から１０％および特に０．１％から１％または約０．５％である。
【０１５６】
上記ワクチンがスプリットウイルスを含む場合、上記ワクチンは、水相中に遊離界面活性剤を含むことが好ましい。これは、上記遊離界面活性剤が、上記抗原に対して「スプリット効果」を発揮し得、それによって、他の状態で存在し得る任意の非スプリットビリオンおよび／もしくはビリオン凝集物を破壊するので、有利である。これは、スプリットウイルスワクチンの安全性を改善し得る［６１］。
【０１５７】
好ましいエマルジョンは、＜１μｍの平均液滴サイズ（例えば、≦７５０ｎｍ、≦５００ｎｍ、≦４００ｎｍ、≦３００ｎｍ、≦２５０ｎｍ、≦２２０ｎｍ、≦２００ｎｍ、もしくはこれより小さい）を有し得る。これら液滴サイズは、便利なことには、微小流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓａｔｉｏｎ）のような技術によって達成され得る。
【０１５８】
本発明で有用な特定の水中油型エマルジョンアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５９】
・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ  ８０、およびＳｐａｎ８５のサブミクロンエマルジョン。上記エマルジョンの体積での組成は、約５％  スクアレン、約０．５％  ポリソルベート８０および約０．５％  Ｓｐａｎ  ８５であり得る。重量では、これらの比は、４．３％  スクアレン、０．５％  ポリソルベート８０および０．４８％  Ｓｐａｎ  ８５になる。このアジュバントは、引用文献６５の第１０章および引用文献６６の第１２章により詳細に記載されるように、「ＭＦ５９」として公知である［６２〜６４］。上記ＭＦ５９エマルジョンは、有利なことには、クエン酸イオン（例えば、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝液）を含む。
【０１６０】
・スクアレン、α−トコフェロール、およびポリソルベート８０を含むエマルジョン。このエマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水を含み得る。これらエマルジョンは、体積で２〜１０％  スクアレン、２〜１０％  トコフェロールおよび０．３〜３％  ポリソルベート８０を有し得、スクアレン：トコフェロールの重量比は、好ましくは、＜１（例えば、０．９０）である。なぜなら、これは、より安定なエマルジョンを提供し得るからである。スクアレンおよびポリソルベート８０は、約５：２の体積比もしくは約１１：５の重量比で存在し得る。それゆえ、これら３種の成分（スクアレン、トコフェロール、ポリソルベート８０）は、１０６８：１１８６：４８５またはおおよそ５５：６１：２５の重量比で存在し得る。１種のこのようなエマルジョン（「ＡＳ０３」）は、Ｔｗｅｅｎ  ８０をＰＢＳ中に溶解して、２％溶液を与え、次いで、この溶液９０ｍｌと、（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌ  スクアレン）の混合物とを混合し、次いで、上記混合物を微小流動化する（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅ）ことによって、作製され得る。得られたエマルジョンは、例えば、１００〜２５０ｎｍの間、好ましくは、約１８０ｎｍの平均直径を有するサブミクロン油滴を有し得る。上記エマルジョンはまた、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３−ｄｅ−Ｏ−ａｃｙｌａｔｅｄ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）（３ｄ−ＭＰＬ）を含み得る。このタイプの別の有用なエマルジョンは、ヒトの用量あたり、例えば、上記で検討した比で０．５〜１０ｍｇ  スクアレン、０．５〜１１ｍｇ  トコフェロール、および０．１〜４ｍｇ  ポリソルベート８０を含み得る［６７］。
【０１６１】
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）のエマルジョン。上記エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬ（下記を参照のこと）を含み得る。上記エマルジョンは、リン酸緩衝液を含み得る。
【０１６２】
・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）およびトコフェロール（例えば、α−トコフェロールスクシネート）を含むエマルジョン。上記エマルジョンは、約７５：１１：１０（例えば、７５０μｇ／ｍｌ  ポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１００μｇ／ｍｌ  α−トコフェロールスクシネート）の質量比でこれら３種の成分を含み得、これら濃度は、抗原由来のこれら成分の何らかの寄与を含むはずである。上記エマルジョンはまた、スクアレンを含み得る。上記エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬ（下記を参照のこと）を含み得る。その水相は、リン酸緩衝液を含み得る。
【０１６３】
・スクアラン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭ  Ｌ１２１」）のエマルジョン。上記エマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中に処方され得る。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドの有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバント中でトレオニル−ＭＤＰとともに使用されてきた［６８］（０．０５〜１％  Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％  スクアラン、２．５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％  ポリソルベート８０）。このエマルジョンはまた、「ＡＦ」アジュバントでのように［６９］（５％  スクアラン、１．２５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％  ポリソルベート８０）、上記Ｔｈｒ−ＭＤＰなしでも使用され得る。微小流動化が好ましい。
【０１６４】
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルもしくはマンニドエステル（ｍａｎｎｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）（例えば、ソルビタンモノオレエート（ｍｏｎｏｌｅａｔｅ）もしくは「Ｓｐａｎ  ８０」））を含むエマルジョン。上記エマルジョンは、好ましくは、熱可逆性であり、そして／または上記油滴のうちの少なくとも９０％（体積で）が、２００ｎｍ未満のサイズを有する［７０］。上記エマルジョンはまた、アルジトール；凍結保護剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）（例えば、糖（例えば、ドデシルマルトシドおよび／もしくはスクロース））；および／またはアルキルポリグリコシドのうちの１種以上を含み得る。上記エマルジョンは、ＴＬＲ４アゴニストを含み得る［７１］。このようなエマルジョンは、凍結乾燥され得る。
【０１６５】
・スクアレン、ポロキサマー１０５およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅのエマルジョン［７２］。アジュバント添加ワクチン中のこれら成分の最終濃度（重量）は、５％  スクアレン、４％  ポロキサマー１０５（プルロニックポリオール）および２％  Ａｂｉｌ−Ｃａｒｅ  ８５（ビス−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６  ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ジメチコン；カプリル／カプリントリグリセリド）である。
【０１６６】
・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献７３に記載されるように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロン液滴サイズが有利である。
【０１６７】
・非代謝性の油（例えば、軽油（ｌｉｇｈｔ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｏｉｌ））および少なくとも１種の界面活性剤（例えば、レシチン、Ｔｗｅｅｎ  ８０もしくはＳｐａｎ  ８０）のサブミクロン水中油型エマルジョン。添加剤が含まれ得る（例えば、ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−親油性結合体（例えば、参考文献７４に記載され、グルクロン酸のカルボキシル基を介して、脂肪族アミンを、デスアシルサポニン（ｄｅｓａｃｙｌｓａｐｏｎｉｎ）に添加することにより生成されるＧＰＩ−０１００）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）および／もしくはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミン）。
【０１６８】
・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡもしくはＱＳ２１）およびステロール（例えば、コレステロール）が螺旋状ミセルとして会合されるエマルジョン［７５］。
【０１６９】
・鉱油、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／もしくはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［７６］。
【０１７０】
・鉱油、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／もしくはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［７６］。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、エマルジョンは、送達時に抗原と即座に混合され得、従って、上記アジュバントおよび抗原は、パッケージされたもしくは配布されたワクチン（使用時に最終処方物の準備ができている）では別個に保持され得る。他の実施形態において、エマルジョンは、製造の間に抗原と混合され、従って、上記組成物は、液体アジュバント添加形態（ｌｉｑｕｉｄ  ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ｆｏｒｍ）においてパッケージされる。
【０１７２】
上記抗原は、一般に、水性形態にあり、その結果、上記ワクチンは、２種の液体を混合することによって最終的に調製される。混合するための上記２種の液体の体積比は、変動し得る（例えば、５：１〜１：５の間）が、一般に、約１：１であり、そしてこれが最も好ましい。成分濃度が、上記の特定のエマルジョンの説明において与えられる場合、これら濃度は、代表的には、非希釈組成物に関するものであり、したがって抗原溶液と混合した後の濃度は低下する（例えば、抗原およびアジュバントが１：１の比で混合される場合、半分の濃度になる）。
【０１７３】
（ワクチン組成物のパッケージング）
本発明の組成物（もしくはキット成分）に適した容器としては、バイアル、シリンジ（例えば、使い捨てシリンジ）、鼻スプレーなどが挙げられる。これら容器は、滅菌であるべきである。
【０１７４】
組成物／成分がバイアル中に配置される場合、上記バイアルは、好ましくは、ガラス材料もしくはプラスチック材料から作製され得る。上記バイアルは、好ましくは、上記組成物が上記バイアルに添加される前に、滅菌される。ラテックス感受性患者に伴う問題を回避するために、バイアルは、好ましくは、ラテックス非含有ストッパーでシールされ、全てのパッケージング材料中にラテックスが存在しないことが好ましい。上記バイアルは、ワクチンの単一用量を含んでいてもよいし、１用量より多い用量（「複数用量」バイアル）、例えば、１０用量を含んでいてもよい。好ましいバイアルは、無色ガラスから作製される。
【０１７５】
バイアルは、あらかじめ充填されたシリンジがキャップに挿入され得るように適合されたキャップ（例えば、ルアーロック）を有し得、上記シリンジの内容物は、上記バイアルへと排出され得（例えば、その中の凍結乾燥物質を再構成するために）、上記バイアルの内容物は、取り出されて上記シリンジへと戻され得る。上記バイアルから上記シリンジを取り出した後、次いで、ニードルが取り付けられ得、上記組成物が、患者へと投与され得る。上記キャップは、好ましくは、シールもしくはカバーの内部に配置され得る。その結果、上記シールもしくはカバーは、上記キャップに到達し得る前に除去されなければならない。バイアルは、特に、複数用量バイアルについては、その内容物の無菌的取り出しを可能にするキャップを有し得る。
【０１７６】
成分がシリンジにパッケージされる場合、上記シリンジは、これに取り付けられるニードルを有し得る。ニードルが取り付けられていない場合、別個のニードルが、組み立ておよび使用のために、上記シリンジと共に供給され得る。このようなニードルは、鞘に入れられ得る。安全ニードル（ｓａｆｅｔｙ  ｎｅｅｄｌｅ）が好ましい。１インチ  ２３ゲージ、１インチ  ２５ゲージおよび５／８インチ  ２５ゲージのニードルが代表的である。シリンジは、記録保持を容易にするために、ロット番号、インフルエンザ流行期、および内容物の使用期限がプリントされ得るピールオフラベルとともに提供され得る。上記シリンジにおけるプランジャーは、好ましくは、上記プランジャーが吸引の間に偶発的に除去されてしまわないように、ストッパーを有し得る。上記シリンジは、ラテックスゴムキャップおよび／もしくはプランジャーを有し得る。使い捨てシリンジは、単一用量のワクチンを含む。上記シリンジは、一般に、ニードルの取り付け前に、先端をシールするために先端キャップを有し、上記先端キャップは、好ましくは、ブチルゴムから作製され得る。上記シリンジおよびニードルが別個にパッケージされる場合、上記ニードルは、好ましくは、ブチルゴムシールドと適合させられる。好ましいシリンジは、商品名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」ＴＭの下で市販されるものである。
【０１７７】
容器は、例えば、小児への送達を容易にするために、半用量の体積を示すために印が付けられ得る。例えば、０．５ｍｌ用量を含むシリンジは、０．２５ｍｌ体積を示す印を有し得る。
【０１７８】
ガラス容器（例えば、シリンジもしくはバイアル）が使用される場合、ソーダ石灰ガラスよりむしろホウケイ酸ガラスから作製された容器を使用することが好ましい。
【０１７９】
キットもしくは組成物は、（例えば、同じボックスの中に）上記ワクチンの詳細（例えば、投与の説明書、上記ワクチン内の抗原の詳細など）を含むリーフレットとともにパッケージされ得る。上記説明書はまた、警告（例えば、ワクチン接種後のアナフィラキシー反応の場合に容易に利用可能なアドレナリン溶液を保持することなど）を含み得る。
【０１８０】
（処置方法、および上記ワクチンの投与）
本発明は、本発明に従って製造されるワクチンを提供する。これらワクチン組成物は、ヒト被験体もしくはヒト以外の動物被験体（例えば、ブタまたはトリ）への投与に適しており、本発明は、上記被験体に本発明の組成物を投与する工程を包含する、被験体における免疫応答を惹起するための方法を提供する。本発明はまた、医薬として使用するための本発明の組成物を提供し、被験体における免疫応答を惹起するための医薬の製造のための、本発明の組成物の使用を提供する。
【０１８１】
これら方法および使用によって惹起される免疫応答は、一般に、抗体応答（好ましくは、防御的抗体応答）を含む。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能力および防御を評価するための方法は、当該分野で周知である。ヒトでの研究から、ヒトインフルエンザウイルスのヘマグルチニンに対する抗体力価が、防御と相関する（約３０〜４０の血清サンプル赤血球凝集阻害力価が、同種のウイルスによる感染から約５０％防御を与える）ことが示された［７７］。抗体応答は、代表的には、赤血球凝集阻害によって、マイクロ中和によって、単一放射免疫拡散（ｓｉｎｇｌｅ  ｒａｄｉａｌ  ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）（ＳＲＩＤ）によって、および／もしくは単一放射溶血（ＳＲＨ）によって、測定される。これらアッセイ技術は、当該分野で周知である。
【０１８２】
本発明の組成物は、種々の方法において投与され得る。最も好ましい免疫化経路は、筋肉内注射（例えば、腕もしくは脚への）によるが、他の利用可能な経路としては、皮下注射、鼻内［７８〜８０］、経口［８１］、皮内［８２、８３］、経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［８４］などが挙げられる。
【０１８３】
本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。インフルエンザワクチンは、６ヶ月齢からの小児および成人での免疫化における使用に関して現在推奨されている。従って、ヒト被験体は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、もしくは少なくとも５５歳であってもよい。上記ワクチンを受けるのに好ましい被験体は、高齢（例えば、≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは、≧６５歳）、若年齢（例えば、≦５歳）、入院している被験体、ヘルスケアワーカー、軍隊および軍職員、妊婦、慢性疾患の、免疫不全の被験体、上記ワクチンを受ける７日前までに抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよびザナミビル化合物；以下を参照のこと）を摂取している被験体、卵アレルギーがある人々、および外国に旅行する人々である。上記ワクチンは、これらの群に適しているのみではないが、一般に、集団においてより多く使用され得る。汎流行性株については、すべての年齢群への投与が好ましい。
【０１８４】
好ましい本発明の組成物は、効力についてＣＰＭＰ基準のうちの１つ、２つもしくは３つを満たす。成人（１８〜６０歳）において、これら基準は、以下である：（１）≧７０％血清保有率（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）；（２）≧４０％セロコンバージョン；および／もしくは（３）ＧＭＴ増加≧２．５倍。高齢者（＞６０歳）において、これら基準は、以下である：（１）≧６０％血清保有率；（２）≧３０％セロコンバージョン；および／もしくは（３）ＧＭＴ増加≧２倍。これら基準は、少なくとも５０名の患者でのオープンラベル研究に基づく。
【０１８５】
処置は、単一用量スケジュールもしくは複数用量スケジュールによってであり得る。複数用量は、初回免疫化スケジュールおよび／もしくは追加免疫化スケジュールにおいて使用され得る。複数用量スケジュールにおいて上記種々の用量は、同じ経路もしくは異なる経路によって与えられ得る（例えば、非経口の初回免疫（ｐｒｉｍｅ）および粘膜の追加免疫（ｂｏｏｓｔ）、粘膜の初回免疫および非経口の追加免疫など）。１より多くの用量の投与（代表的には、２用量）は、免疫学的に経験したことがない患者（例えば、これまでインフルエンザワクチンを受けたことのない人に関して）において、または新たなＨＡサブタイプ（汎流行性アウトブレイクにおけるような）に対するワクチン接種のために、特に有用である。複数用量は、代表的には、少なくとも１週間空けて（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）投与される。
【０１８６】
本発明によって生成されるワクチンは、他のワクチン（例えば、麻疹ワクチン、ムンプス・ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合体化Ｂ型インフルエンザワクチン、不活性化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合型ワクチン（例えば、四価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチン）、ＲＳウイルスワクチン、肺炎球菌結合型ワクチンなど）と実質的に同時（例えば、同じ医療相談の間に、またはヘルスケア専門家およびワクチン接種施設への訪問の間に）に患者に投与され得る。肺炎球菌ワクチンおよび／もしくは髄膜炎菌ワクチンと実施的に同時の投与は、高齢の患者において特に有用である。
【０１８７】
同様に、本発明のワクチンは、抗ウイルス化合物、および特に、インフルエンザウイルスに対して活性な抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよび／もしくはザナミビル）と実質的に同時（例えば、同じ医療相談の間に、またはヘルスケア専門家への訪問の間に）に、患者に投与され得る。これら抗ウイルス剤としては、ノイラミニダーゼインヒビター（例えば、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸もしくは５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−２−エノン酸（ｅｎｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（そのエステル（例えば、そのエチルエステル）およびその塩（例えば、そのリン酸塩）を含む）が挙げられる。好ましい抗ウイルス剤は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸、エチルエステル、ホスフェート（１：１）（オセルタミビルホスフェート（ＴＡＭＩＦＬＵＴＭ）としても公知）である。
【０１８８】
（他の生物学的薬剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ））
本発明は、インフルエンザウイルスおよびインフルエンザワクチンを参照して記載されてきたが、本発明はまた、逆遺伝学によって生成され得る他のウイルス、および他のウイルスワクチンの生成のために使用され得る。例えば、本発明の方法は、デングウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、コロナウイルスのようなウイルスを生成するために特に適している。
【０１８９】
組換え生成され得る他の生物学的薬剤はまた、本発明の方法によって生成され得る。適切な例としては、抗体、増殖因子、サイトカイン、リンホカイン、レセプター、ホルモン、診断用抗原などが挙げられる。
【０１９０】
本明細書で記載される方法の工程は、これらウイルス、ワクチンもしくは生物学的薬剤に必要な変更を加えて適用される。
【０１９１】
（一般）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を含み、例えば、Ｘを「含む」組成物は、もっぱらＸからなってもよいし、さらなる何かを含んでいてもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【０１９２】
語句「実質的に」は、「完全に」を排除しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、完全にＹを含まなくてもよい。必要であれば、語句「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
【０１９３】
数値ｘに関する用語「約」とは、任意であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１９４】
別段示されなければ、２種以上の成分を混合する工程を包含するプロセスは、いかなる特定の混合する順序も必要としない。従って、成分は、任意の順序で混合され得る。３つの成分が存在する場合、２つの成分が、互いに合わされ得、次いで、その組み合わせが、第３の成分と合わせられ得るなど。
【０１９５】
上記方法の種々の工程は、同時もしくは種々の時点で、同じもしくは異なる地理上の位置（例えば、国）で、そして同じもしくは異なる人々もしくは実体によって行われ得る。
【０１９６】
動物（および特にウシ）の物質が、細胞培養において使用される場合、それら物質は、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない、特に、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から得られるべきである。全体として、動物由来物質が完全に存在しない状態で細胞を培養することが好ましい。
【０１９７】
化合物が、組成物の一部として身体に投与される場合、その化合物は、代わりに、適切なプロドラッグによって置換され得る。
【０１９８】
２つのアミノ酸配列の間のパーセンテージ配列同一性への言及は、整列された場合、アミノ酸のパーセンテージが、上記２つの配列を比較することにおいて同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性もしくは配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム（例えば、参考文献８５の第７．７．１８節において記載されるもの）を使用して決定され得る。好ましいアラインメントは、アフィンギャップ検索と、キャップオープンペナルティー１２およびギャップ伸長ペナルティー２、ＢＬＯＳＵＭマトリクス６２を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。上記Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献８６に教示される。
【０１９９】
２つの核酸配列の間のパーセンテージ配列同一性への言及は、整列された場合、塩基のパーセンテージが、上記２つの配列を比較することにおいて同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性もしくは配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム（例えば、参考文献８５の第７．７．１８節において記載されるもの）を使用して決定され得る。好ましいアラインメントプログラムは、好ましくは、デフォルトパラメーター（これは、以下のとおりである：オープンギャップ＝３；伸長ギャップ＝１）を使用する、ＧＣＧ  Ｇａｐ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｓｕｉｔｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．１）である。
【図面の簡単な説明】
【０２００】
【図１−１】図１  合成遺伝子セグメントアセンブリおよび誤りの訂正の方法。（Ａ）プロセスフロー。各工程を行うための時間は、右側に示される。（Ｂ）プロセスの模式図。「Ｘ」は、オリゴヌクレオチド合成誤りの部位を示す。環状ＤＮＡおよび最終のアセンブリされた遺伝子図解（下の２つ）において、ｐＫＳ１０配列は白であり、インフルエンザコード配列は、黒である。（Ｃ）ウイルスレスキューのために使用された調節エレメントを含む、直線状の合成ＨＡおよびＮＡ遺伝子のエチジウムブロミド染色したアガロースゲル。ＭＷ−分子量マーカー。
【図１−２】図１  合成遺伝子セグメントアセンブリおよび誤りの訂正の方法。（Ａ）プロセスフロー。各工程を行うための時間は、右側に示される。（Ｂ）プロセスの模式図。「Ｘ」は、オリゴヌクレオチド合成誤りの部位を示す。環状ＤＮＡおよび最終のアセンブリされた遺伝子図解（下の２つ）において、ｐＫＳ１０配列は白であり、インフルエンザコード配列は、黒である。（Ｃ）ウイルスレスキューのために使用された調節エレメントを含む、直線状の合成ＨＡおよびＮＡ遺伝子のエチジウムブロミド染色したアガロースゲル。ＭＷ−分子量マーカー。
【図２】図２  オリゴヌクレオチド配列情報の伝達から回収されたウイルスの確認までの合成Ｈ７Ｎ９インフルエンザウイルスレスキューのタイムライン。
【図３−１】図３  シミュレートされた汎流行対応に由来する合成Ｈ７Ｎ９リアソータントウイルスの性能。（Ａ）示されたバックボーンプラスミドならびに合成ＨＡおよびＮＡ遺伝子構築物で共トランスフェクトして４８時間後（点付きの柱）および７２時間後（白い柱）にＭＤＣＫ補充２９３Ｔ細胞から回収した培養流体中のインフルエンザウイルスの力価。ウイルス力価を、ＭＤＣＫ細胞単層を使用して病巣形成アッセイによって決定した。（Ｂ）ＭＤＣＫ  ３３０１６ＰＦ懸濁培養物中の合成Ｈ７Ｎ９リアソータントウイルスの複製動力学。（Ｃ）スクロース密度勾配でウイルスを精製した後のＲＰ−ＨＰＬＣによって決定されたＭＤＣＫ懸濁培養物中の合成Ｈ７Ｎ９ウイルスからのＨＡ収量。図３（Ａ）および３（Ｂ）のｙ軸は、感染単位（ｌｏｇ１０  ＩＵ／ｍＬ）を示す。図３（Ｃ）のｙ軸は、ＨＡ収量（μｇ／ｍＬ単位）を示す。
【図３−２】図３  シミュレートされた汎流行対応に由来する合成Ｈ７Ｎ９リアソータントウイルスの性能。（Ａ）示されたバックボーンプラスミドならびに合成ＨＡおよびＮＡ遺伝子構築物で共トランスフェクトして４８時間後（点付きの柱）および７２時間後（白い柱）にＭＤＣＫ補充２９３Ｔ細胞から回収した培養流体中のインフルエンザウイルスの力価。ウイルス力価を、ＭＤＣＫ細胞単層を使用して病巣形成アッセイによって決定した。（Ｂ）ＭＤＣＫ  ３３０１６ＰＦ懸濁培養物中の合成Ｈ７Ｎ９リアソータントウイルスの複製動力学。（Ｃ）スクロース密度勾配でウイルスを精製した後のＲＰ−ＨＰＬＣによって決定されたＭＤＣＫ懸濁培養物中の合成Ｈ７Ｎ９ウイルスからのＨＡ収量。図３（Ａ）および３（Ｂ）のｙ軸は、感染単位（ｌｏｇ１０  ＩＵ／ｍＬ）を示す。図３（Ｃ）のｙ軸は、ＨＡ収量（μｇ／ｍＬ単位）を示す。
【図４】図４  レスキュー効率に対するＭＤＣＫ細胞のトランスフェクション２４時間後のＭＤＣＫフィーダー細胞添加の効果。ＰＲ８ｘバックボーンと、（Ａ）Ａ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）もしくは（Ｂ）Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９のいずれかに由来するＨＡおよびＮＡセグメントとを含む組換えウイルスの力価を、病巣形成アッセイによって、トランスフェクションの７２時間後に測定した。点付きの柱は、さらなる細胞での結果を示す一方で、白い柱は、さらなる細胞なしの結果を示す。ｙ軸は、感染単位（ｌｏｇ１０  ＩＵ／ｍＬ）を示す。
【図５−１】図５  合成インフルエンザウイルスレスキュー効率。ＭＤＣＫ細胞のトランスフェクトされた培養物からのウイルスレスキュー効率に対する最適化されたバックボーンの効果を示す代表的データ。示されたバックボーンプラスミドならびに合成ＨＡおよびＮＡ構築物でトランスフェクトした後の種々の時点でまたは新たなＭＤＣＫ細胞単層（継代１）での培養流体のうちの５００μｌを使用する盲検的な継代（ｂｌｉｎｄ  ｐａｓｓａｇｅ）の２４〜４８時間後に回収した培養流体中のインフルエンザウイルスの検出。ウイルス力価を、（Ａ）Ｈ１Ｎ１株、（Ｂ）Ｈ３Ｎ２株、（Ｃ）弱毒化Ｈ５Ｎ１株、（Ｄ）ブタ由来Ｈ３Ｎ２ｖ株、（Ｅ）Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ系統株、および（Ｆ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統株について、病巣形成アッセイを使用して決定した。ｙ軸は、感染単位（ｌｏｇ１０  ＩＵ／ｍＬ）を示す。
【図５−２】図５  合成インフルエンザウイルスレスキュー効率。ＭＤＣＫ細胞のトランスフェクトされた培養物からのウイルスレスキュー効率に対する最適化されたバックボーンの効果を示す代表的データ。示されたバックボーンプラスミドならびに合成ＨＡおよびＮＡ構築物でトランスフェクトした後の種々の時点でまたは新たなＭＤＣＫ細胞単層（継代１）での培養流体のうちの５００μｌを使用する盲検的な継代（ｂｌｉｎｄ  ｐａｓｓａｇｅ）の２４〜４８時間後に回収した培養流体中のインフルエンザウイルスの検出。ウイルス力価を、（Ａ）Ｈ１Ｎ１株、（Ｂ）Ｈ３Ｎ２株、（Ｃ）弱毒化Ｈ５Ｎ１株、（Ｄ）ブタ由来Ｈ３Ｎ２ｖ株、（Ｅ）Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ系統株、および（Ｆ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統株について、病巣形成アッセイを使用して決定した。ｙ軸は、感染単位（ｌｏｇ１０  ＩＵ／ｍＬ）を示す。
【図５−３】図５  合成インフルエンザウイルスレスキュー効率。ＭＤＣＫ細胞のトランスフェクトされた培養物からのウイルスレスキュー効率に対する最適化されたバックボーンの効果を示す代表的データ。示されたバックボーンプラスミドならびに合成ＨＡおよびＮＡ構築物でトランスフェクトした後の種々の時点でまたは新たなＭＤＣＫ細胞単層（継代１）での培養流体のうちの５００μｌを使用する盲検的な継代（ｂｌｉｎｄ  ｐａｓｓａｇｅ）の２４〜４８時間後に回収した培養流体中のインフルエンザウイルスの検出。ウイルス力価を、（Ａ）Ｈ１Ｎ１株、（Ｂ）Ｈ３Ｎ２株、（Ｃ）弱毒化Ｈ５Ｎ１株、（Ｄ）ブタ由来Ｈ３Ｎ２ｖ株、（Ｅ）Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ系統株、および（Ｆ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統株について、病巣形成アッセイを使用して決定した。ｙ軸は、感染単位（ｌｏｇ１０  ＩＵ／ｍＬ）を示す。
【図６】図６  ＭＤＣＫ補充２９３Ｔ細胞もしくはＭＤＣＫ細胞のみのいずれかからの合成Ｈ７Ｎ９ａウイルスのレスキュー。＃１９バックボーンプラスミドならびに合成Ｈ７およびＮ９構築物でトランスフェクションして４８時間後（点付きの柱）および７２時間後（白い柱）に回収した培養流体中のインフルエンザウイルスの検出。ウイルス力価を、病巣形成アッセイを使用してＭＤＣＫ細胞単層上で決定した。ｙ軸は、感染単位（ｌｏｇ１０  ＩＵ／ｍＬ）を示す。
【図７】図７  ＭＤＣＫ  ３３０１６ＰＦ懸濁培養物中での代替のＮＡ  ＵＴＲを有する合成Ｈ７Ｎ９リアソータントウイルスの複製動力学。ＭＤＣＫ懸濁培養物中の代替のＮＡ  ＵＴＲおよび異なるバックボーン、（Ａ）ＰＲ８ｘ、（Ｂ）＃１９、および（Ｃ）＃２１を有する合成Ｈ７Ｎ９ウイルスの複製動力学。開始ｍ．ｏ．ｉ．は、０．００１であった。ｘ軸は、感染後の時間を示す。ｙ軸は、感染単位（ｌｏｇ１０  ＩＵ／ｍＬ）を示す。
【図８】図８  代替のＮＡ  ＵＴＲを有する合成Ｈ７Ｎ９ウイルスによるシチメンチョウＲＢＣ凝集によるＨＡ収量。ｙ軸は、ＨＡ単位を示す。
【図９】図９は、ＰＲ８−Ｘもしくは＃２１バックボーンのいずれかと、（Ａ）汎流行性様Ｈ１株（株１）もしくは（Ｂ）第２の汎流行性様株（株２）に由来するＨＡおよびＮＡセグメントとを含む逆遺伝学由来６：２リアソータントに感染させたＭＤＣＫ細胞培養物の感染後６０時間で回収したスクロース勾配精製ウイルスのＨＡ含有量（レクチン捕捉ＥＬＩＳＡによって決定される）を比較する。図９Ａおよび図９Ｂにおいて、黒色の棒は、コントロールとしての参照ワクチン株（ＷＨＯ−Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｒｅ供給株に由来）を表し、灰色の棒は、ＰＲ８−Ｘバックボーンを含むリアソータントウイルスを表し、白色の棒は、＃２１バックボーンを含むリアソータントウイルスを表す。ｙ軸は、ＨＡ収量（μｇ／ｍｌ単位）を示す。
【図１０】図１０は、ＰＲ８−Ｘもしくは＃２１バックボーンのいずれかと、（Ａ）プレパンデミック（ｐｒｅ−ｐａｎｄｅｍｉｃ）Ｈ１株（株１）および（Ｂ）第２のプレパンデミックＨ１株（株２）に由来するＨＡおよびＮＡセグメントとを含む逆遺伝学由来６：２リアソータントに感染させたＭＤＣＫ細胞培養物から、感染後６０時間で回収した未精製ウイルスのＨＡ含有量（レクチン捕捉ＥＬＩＳＡによって決定される）を比較する。図１０Ａおよび図１０Ｂにおいて、黒色の棒は、コントロールとしての参照ワクチン株（ＷＨＯ−Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｒｅ供給株に由来）を表し、灰色の棒は、ＰＲ８−Ｘバックボーンを含むリアソータントウイルスを表し、白色の棒は、＃２１バックボーンを含むリアソータントウイルスを表す。ｙ軸は、ＨＡ収量（μｇ／ｍｌ単位）を示す。
【図１１】図１１は、ＰＲ８−Ｘもしくは＃２１バックボーンのいずれかと、Ｈ３株（株１）に由来するＨＡおよびＮＡセグメントとを含む逆遺伝学由来６：２リアソータントに感染させたＭＤＣＫ細胞培養物から、感染後６０時間で回収したスクロース精製ウイルスのＨＡ収量（ＨＰＬＣによって決定される）を比較する。黒色の棒は、コントロールとしての参照ワクチン株（ＷＨＯ−Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｒｅ供給株に由来）を表し、灰色の棒は、ＰＲ８−Ｘバックボーンを含むリアソータントウイルスを表し、白色の棒は、＃２１バックボーンを含むリアソータントウイルスを表す。ｙ軸は、ＨＡ収量（μｇ／ｍｌ単位）を示す。
【図１２】図１２は、参照ワクチン株、またはＰＲ８−Ｘもしくは＃２１バックボーンのいずれかならびに汎流行性様Ｈ１株（株２）に由来するＨＡおよびＮＡセグメントで作製した逆遺伝学由来６：２リアソータントウイルスへの感染後６０時間で孵化鶏卵から回収したウイルスのウイルス力価（病巣形成アッセイ（ｆｏｃｕｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）（ＦＦＡ）によって決定される；図１２Ａ）ならびにＨＡ力価（レクチン捕捉ＥＬＩＳＡによって決定される；図１２Ｂ）を比較する。図１２Ａにおいて、個々の点は、１個の卵のデータを示す。線は、個々のデータ点の平均を表す。ｙ軸は、感染単位／ｍｌを示す。図１２Ｂにおいて、黒色の棒は、参照ワクチン株（ＷＨＯ−Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｒｅ供給株に由来）を表し、灰色の棒は、ＰＲ８−Ｘバックボーンを含むリアソータントウイルスを表し、白色の棒は、＃２１バックボーンを含むリアソータントウイルスを表す。ｙ軸は、プールした卵サンプルのＨＡ収量（μｇ／ｍｌ単位）を示す。
【図１３】図１３は、野生型（ＷＴ）もしくは逆遺伝学由来（ＲＧ）Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８株に対して、ＭＤＣＫ細胞における種々のリアソータントインフルエンザＢ株のＨＡ収量を比較する。上記試験したインフルエンザＢウイルスのウイルスセグメントを、表１に示す。ｙ軸は、ＨＡ収量（μｇ／ｍＬ単位）を示す。
【図１４】図１４は、野生型（ＷＴ）もしくは逆遺伝学由来（ＲＧ）Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０株に対して、ＭＤＣＫ細胞における種々のリアソータントインフルエンザＢ株のＨＡ収量を比較する。上記試験したインフルエンザＢウイルスのウイルスセグメントを、表１に示す。ｙ軸は、ＨＡ収量（μｇ／ｍＬ単位）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０２０１】
（発明を実施するための態様）
（酵素によるアセンブリおよびインビトロでの誤りの訂正を介する増大された遺伝子合成速度および精度）
遺伝子アセンブリの純粋に酵素による１工程の、等温性アセンブリ方法（以前は、１６，２９９塩基対のマウスミトコンドリアゲノム全体を、６００の重複する６０塩基オリゴヌクレオチドから合成するために使用された（６））を、インフルエンザウイルスゲノムセグメントの合成ＤＮＡコピーの生成のために適合させた。上記方法は、５’  Ｔ５エキソヌクレアーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ［ＮＥＢ］）およびＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を使用して、短時間の５０℃反応の間に複数のＤＮＡフラグメントを連結する（７）。上記方法を、合成ワクチンシードのための遺伝子をアセンブリするために選択した。なぜばら、それは、迅速でかつ容易に自動化されるからである。得られた合成遺伝子の全塩基は、化学合成されたオリゴヌクレオチドにそれらの起源を有する。現在の技術を使用しても、ＤＮＡオリゴヌクレオチド合成は、代表的には、化学的カップリングの失敗から塩基を失うことに起因して、３２５塩基ごとに約１塩基の誤り率を有し、この誤り率は、合成されるオリゴヌクレオチドの長さとともに増大する（６）。１．７ｋｂ  ＨＡおよび１．５ｋｂ  ＮＡ  ウイルスＲＮＡゲノムセグメントのＤＮＡコピーが、約６０塩基の長さとともに、反対鎖のオリゴヌクレオチドとの間の３０塩基の重複があるオリゴヌクレオチドを使用して、この技術によって合成される場合、合成生成物のうちのわずか３％が、正確な配列を有するに過ぎない。マウスミトコンドリアゲノム合成の間に、サブアセンブリされたものをクローニングし、配列決定し、誤りのない配列のセットを、その後のアセンブリの回のために選択した（６）。迅速なインフルエンザワクチンシードウイルス生成の目的で、この誤りの訂正の方法は、受け入れられない遅れをもたらす。
【０２０２】
精度および速度の両方をもってＨＡおよびＮＡゲノムセグメントのＤＮＡコピーを合成するという問題は、（ｉ）オリゴヌクレオチド間の重複を増大させる、（ｉｉ）酵素による誤りの訂正工程を導入する、および（ｉｉｉ）一度にアセンブリされるオリゴヌクレオチドの数を増大させ、サブアセンブリを介した段階的アセンブリの必要性を排除する（図１ａおよびｂ）ことによって解決された。具体的には、オリゴヌクレオチドの長さを、６０〜７４塩基へと増大させ、全長遺伝子（５’および３’非翻訳領域を含む）を、ライゲーションの前に完全な２本鎖遺伝子がアニールされ得るように、２本鎖ＤＮＡ分子の全ての残基を含んで少しずつ場所をずらして配置したオリゴヌクレオチドのセットからアセンブリした。実際に、ソフトウェアアルゴリズムは、これら基準を満たすオリゴヌクレオチド（ＨＡ、ＮＡ対あたり最大９６オリゴヌクレオチド）のために配列のセットを生成する。上記オリゴヌクレオチドの化学合成、酵素による等温アセンブリ、およびＰＣＲ増幅の後に、融解し再アニールしたＤＮＡをもう１回のＰＣＲ増幅の前に２本鎖ＤＮＡ分子中の塩基ミスマッチの領域を切り出す市販のＥｒｒＡＳＥ誤り訂正キット（Ｎｏｖｉｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で処理することによって、誤りを含むＤＮＡを酵素的に除去する。
【０２０３】
生成物のサイズをアガロースゲルで検証した後に、ウイルスレスキュー用のＲＮＡゲノムセグメントおよびｍＲＮＡを生成するために必要とされる制御配列（Ｐｏｌ  ＩおよびＰｏｌ  ＩＩプロモーターおよびそれらのターミネーター、ならびにポリアデニル化シグナルを含む）を、上記合成ＤＮＡと、これら調節配列を含む直線状にしたプラスミド（ｐＫＳ１０）とを等温でカップリングすることによって付加する（８７）。直線状にしたプラスミドの末端と、遺伝子合成のために使用した５’および３’プライマーの末端との間のヌクレオチド同一性は、このアセンブリをガイドする。アセンブリした分子は、転写制御領域の外側のプライマーを使用する高忠実度ＰＣＲ増幅の回の基質である。
【０２０４】
アンプリコンの精製および濃縮の後に、約１０μｇの、制御配列に隣接したインフルエンザ遺伝子を含むアセンブリした直線状ＤＮＡカセットを得る。これは、インフルエンザウイルスレスキューのためのＭＤＣＫ  ３３０１６ＰＦ細胞株へのトランスフェクションの準備ができている（図１ｃ）。オリゴヌクレオチドの受領からトランスフェクションの準備ができた精製ＨＡもしくはＮＡコードＤＮＡカセットまでの時間は、約１０時間である。ウイルスレスキューが、酵素によりアセンブリされ、誤りを訂正し、増幅したＤＮＡを使用して進行中である間に、並行したクローニングおよび配列決定から、アセンブリされた遺伝子の配列が検証される。代表的には、得られた全長配列のうちの８０〜１００％が、正確である。
【０２０５】
（ワクチン製造細胞株での合成ＤＮＡからのインフルエンザウイルスの最適化されたレスキュー）
合成シードウイルス生成のレスキュープロトコルを、各発現プラスミドが、メッセンジャーＲＮＡの転写を駆動するためにＰｏｌ  ＩＩプロモーターが５’末端で、およびマイナス鎖インフルエンザＲＮＡゲノムセグメントの転写を駆動するためにヒトＰｏｌ  Ｉプロモーターによって３’末端で接したウイルス遺伝子セグメントのｃＤＮＡコピーを有する、以前に記載された８プラスミドアンビセンス（ａｍｂｉｓｅｎｓｅ）系から適合させる（８８）。製造に適したＭＤＣＫ  ３３０１６ＰＦ細胞株は、２９３Ｔ細胞（これは、ワクチン生成に適していない）より、逆遺伝学によってトランスフェクションおよびインフルエンザウイルスレスキューの効率の低い培養基である。インフルエンザウイルス逆遺伝学レスキューは、Ｖｅｒｏ細胞（そのうちのいくつかのバンクは、ワクチン生成に適している）を使用して記載されてきた（８９，９０）。しかし、ワクチンウイルスレスキューのための１つの細胞株および抗原生成のための異なる細胞株を使用することは、偶発的因子のリスクならびに管理および製造の複雑さを付加する。従って、本発明者らは、単一の細胞株がシード生成およびワクチン抗原生成のために使用され得るように、ＭＤＣＫ  ３３０１６ＰＦ細胞における逆遺伝学ＤＮＡレスキューの効率を増大させるように決めた。Ｐｏｌ  Ｉプロモーターは、一般に種特異的であるが、ヒトＰｏｌ  Ｉは、イヌ起源のＭＤＣＫ  ３３０１６ＰＦ細胞における転写を効率的に駆動する。
【０２０６】
ＨＡもしくはＮＡをコードする各直線状合成カセット１μｇを、ＭＤＣＫ  ３３０１６ＰＦ細胞へと、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＳ、もしくはＭをコードする各アンビセンスプラスミド１μｇおよびプロテアーゼＴＭＰＲＳＳ２をコードするヘルパープラスミドと一緒に共トランスフェクトする（９１）。レスキュー効率を増大させるために、本発明者らは、トランスフェクション後に、新鮮な（トランスフェクトされていない）ＭＤＣＫ  ３３０１６ＰＦ細胞の培養物を添加する。このことは、ウイルス回収の確率を、おそらく、レスキューされたウイルスが中でさらに増幅し得る細胞のより健康な集団を提供することによって増大させる（図４）。ウイルスを、トランスフェクション後７２時間以内に（Ｖｅｒｏ細胞もしくは２９３Ｔ細胞のトランスフェクション後より約２４時間後）、細胞培養培地中で、病巣形成アッセイ（ここでトランスフェクトされた培養物の培地が新鮮なＭＤＣＫ細胞単層に添加され、発現されるＮＰについて免疫染色することによって感染性ウイルスが検出される）を使用して検出する。
【０２０７】
（合成ウイルスレスキューのための改善されたバックボーン）
レスキュー効率における有意な増大を、改善されたインフルエンザバックボーン（ＨＡおよびＮＡ以外のインフルエンザウイルスタンパク質をコードするゲノムセグメントのセット）を使用することによって提供した。最初のバックボーン改善は、ＭＤＣＫ  ３３０１６ＰＦ細胞における増殖に５継代にわたって適合させたＰＲ８改変体（ＰＲ８ｘと称される）に由来する遺伝子を使用することから生じた。さらなる改善は、複数の株のバックボーンゲノムセグメントを組み合わせることから生じた。ＭＤＣＫ  ３３０１６ＰＦ細胞を使用するインフルエンザワクチンの試験製造の間に、数種のヒトインフルエンザウイルス（例えば、株１０５ｐ３０（ＭＤＣＫ  ３３０１６ＰＦ細胞において３０回継代したＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）様株）を、株ＰＲ８ｘほど効率的ではないものの、培養細胞中で効率的に増殖するように適合させた。歴史上のＨ３Ｎ２株に由来するＨＡおよびＮＡ遺伝子、ならびに株１０５ｐ３０に由来するＮＰ、ＰＢ１、およびＰＢ２ゲノムセグメントと株ＰＲ８ｘに由来するＭ、ＮＳ、およびＰＡゲノムセグメントとから構成されるバックボーン（＃１９と称される）を有する合成されたウイルスは、しばしば、逆遺伝学レスキュー効率およびＨＡの収量においてＰＲ８ｘバックボーン全体を有する等価なウイルスより優れている（表１および図５）。同様に、Ｈ１Ｎ１株に由来するＨＡおよびＮＡ遺伝子、ならびにＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９のＰＢ１ゲノムセグメントおよび株ＰＲ８ｘに由来する他のゲノムセグメントを有するバックボーン（＃２１と称される）を有する合成されたウイルスはしばしば、ＰＲ８ｘバックボーン全体を有する等価なウイルスより高いレスキュー効率およびＨＡ収量を有した（表１および図５）。この知見は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＰＢ１ゲノムセグメントが、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９およびＰＲ８バックボーンを有するドナー株での鶏卵の共感染のリアソータント子孫において優先的に見出されるという報告と一致する（１８）。
【０２０８】
【表１】
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【０２０９】
歴史的に、大部分のインフルエンザＢ型ワクチンシードは、野生型ウイルス（リアソータントではない）であった。なぜなら野生型インフルエンザＢウイルスは、一般に、十分な収量を提供するからである。インフルエンザＢウイルスのための合成手順をより容易に使用するために、合成インフルエンザＢウイルスの一貫したレスキューを提供する２種の最適化したＢ型バックボーンを開発した（表１および図５）。第１のもの（Ｂｒｉｓｂａｎｅと称される）において、全バックボーンゲノムセグメントは、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８に由来する；第２のもの（＃Ｂ３４と称される）において、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、およびＮＰをコードするゲノムセグメントは、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８に由来し、ＭおよびＮＳをコードするものは、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／１９９０に由来する。
【０２１０】
全体的に、Ａ株に関して最適化したバックボーンの使用によって、レスキュー効率が最大１０００倍まで増大し（トランスフェクション後に得られた感染力価によって測定される場合。図５）、ＨＡ検出のために使用される株およびアッセイに依存して、ＭＤＣＫ  ３３０１６ＰＦ細胞における研究スケール感染においてＨＡ収量が３０％から１５倍増大した（表１）。一般に、これらウイルスに由来するＨＡの収量はまた、上記ウイルスが孵化鶏卵中で増殖される場合に、ＰＲ８バックボーンを有するウイルスに由来するものと比較して増大する（表２）。このような株特異的差異を利用するために、最適な合成シード生成ストラテジーは、目的の循環する株に由来するＨＡおよびＮＡと代替のバックボーンの一団とを組み合わせて、高収量ワクチンウイルスを単離する機会を最大にする。
【０２１１】
【表２】
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【０２１２】
（シミュレートした汎流行対応における合成ワクチンウイルス生成の速度）
上記合成系の最初の反復における適時の概念実証試験において、ウイルス合成群は、合成に直接関与しなかった共同研究者によって未同定のＨＡおよびＮＡゲノムセグメント配列とともに提供された（１７）。上記配列は、汎流行の初めの数日においておそらく利用可能である情報を模倣する、不完全な非翻訳領域（ＵＴＲ）を除いて、完全コード領域を含んだ。ＨＡゲノムセグメントの配列分析は、それが低病原性の北米トリＨ７Ｎ３ウイルス（Ａ／Ｃａｎａｄａ  ｇｏｏｓｅ／ＢＣ／３７５２／２００７）と非常に密接に関連していること（ＧｅｎＢａｎｋに対してＢｌａｓｔによって９６％  ヌクレオチド配列同一性）、およびＮＡゲノムセグメントが低病原性の北米トリＨ１０Ｎ９ウイルス（Ａ／ｋｉｎｇ  ｅｉｄｅｒ／Ａｌａｓｋａ／４４３９７−８５８／２００８）と非常に密接に関連している（ＧｅｎＢａｎｋに対してＢｌａｓｔによって９６％ヌクレオチド配列同一性）を示した。本発明者らのソフトウェアは、レスキューに使用されたオリゴヌクレオチドの配列を生成するが、利用可能な配列データに多義性がある場合には、ユーザー介入が必要とされる。この場合、未知の末端ＵＴＲ配列を、制限された数の関連する全長Ｈ７配列との配列アラインメントに基づいて、およびＧｅｎＢａｎｋにおける高品質配列データから作ったＨ７およびＮ９ゲノムセグメントに関するコンセンサスＵＴＲとの比較によって、生成した。この分析から、Ｈ７Ｎ９株のＮＡ遺伝子の非コード領域における不均一性（プラスセンス配向において１４３４でのＵ／Ｃ）が明らかになった。よって、５’  ＮＡオリゴヌクレオチドの代替のセットを使用して、ＮＡカセットの２種の改変体を構築した。
【０２１３】
オリゴヌクレオチド合成は、２０１１年８月２９日月曜日の午前８：００（ＥＤＴ）に開始した（図２）。９月４日金曜日の正午までに、第２の培養物の免疫染色から、ウイルスがレスキューされたことを確認した。合成開始からレスキューされたウイルスの検出までの４日と４時間は、カリフォルニアにあるオリゴヌクレオチド合成および遺伝子アセンブリ実験室からマサチューセッツにあるウイルスレスキュー実験室までＤＮＡを輸送するのにかかった時間を含んだ。全ての機能が１箇所に統合される場合、輸送に起因する遅れおよび災難の可能性は低減される。本来の概念実証レスキューを、２９３Ｔ細胞を使用して行った；ＭＤＣＫ細胞を使用する上記株のレスキューは、実際の汎流行対応の間に行われるように、約２４時間、レスキューされたウイルスの検出を遅らせる（図６）。上記概念実証訓練からの合成Ｈ７Ｎ９リアソータントウイルスのＨＡおよびＮＡゲノムセグメントの配列を、ＭＤＣＫ  ３３０１６ＰＦ細胞における２回のウイルス増幅の後に決定したところ、オリゴヌクレオチド合成をプログラムするために使用されるものと同一であった。２方向赤血球凝集阻害（ＨＩ）試験（合成および天然の株に由来する抗原、ならびに合成および天然のウイルス感染後に採取したフェレット血清を使用する相互ＨＩアッセイ）（１９、２０）は、Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｎｅｂｒａｓｋａ／１７０９７−４／２０１１（Ｈ７Ｎ９）に対する合成ウイルスの抗原的同一性を実証した。これはその後、ウイルス合成群に電気的に伝播した配列が得られた野生型ウイルスとして明らかになった（表１）。
【０２１４】
上記Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｎｅｂｒａｓｋａ／１７０９７−４／２０１１  ＨＡおよびＮＡ遺伝子を、ＰＲ８ｘ、＃１９、および＃２１のバックボーンとともにレスキューした。ウイルスレスキューは、トランスフェクションの４８時間後および７２時間後に回収したウイルスの力価に基づいて、ＰＲ８ｘバックボーンより、＃１９および＃２１のバックボーンを使用した方が効率的であった（図３ａ）。増殖特徴を試験するために、合成ウイルスを、ＭＤＣＫ  ３３０１６  ＰＦ単層中で一度増幅し、次いで、感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）０．００１で懸濁ＭＤＣＫ  ３３０１６ＰＦ培養物に感染させるために使用した。ウイルス回収の効率における差異にも拘わらず、ウイルスは、バックボーンとは無関係に、類似の増殖特徴を示した（図３ｂ）。ウイルスのＨ７Ｎ９ａセット（Ｃ１４３４プラスセンスＮＡ）は、それらのＨ７Ｎ９ｂ対応物（Ｕ１４３４プラスセンスＮＡ；図７）より約１０倍高い感染力価を達成した。最高の感染収量を有するウイルスはまた、感染したＭＤＣＫ懸濁培養物の容積あたり最も多いＨＡを生成した（図３ｃ）。従って、ゲノムＲＮＡの５’  ＮＡ非コード領域における一ヌクレオチド置換は、感染力価およびＨＡ収量の両方に強く影響を及ぼした（図８）。＃１９バックボーンを有するＨ７Ｎ９ａウイルスは、標準的なＰＲ８ｘバックボーンの状況において同じＨＡおよびＮＡを有するウイルスより１．５倍多くのＨＡを生成した（図３ｃ）。これの証拠は、ワクチンシード生成プロセスにおいて早く高収量ワクチンウイルス株を同定する確率を増大させるために、複数のバックボーンを有する複数のＨＡもしくはＮＡ改変体をレスキューする重要性を確認した。複数の改変体の同時のレスキューが、標準的なプラスミド変異誘発アプローチよりも合成アプローチを使用してより迅速かつより容易に達成される。この例はまた、、汎流行対応のために、遺伝子データベース内に可能な限り完全なゲノムセグメント配列を含めること、およびウイルスゲノムセグメントに由来する末端配列を配列決定プライマーに由来するものから明確に線引きすることの重要性を示す。
【０２１５】
（ワクチンウイルス生成への合成アプローチの強固さ）
遺伝子合成、酵素による誤り訂正、最適化されたレスキュープロトコル、および最適化されたバックボーンを組み合わせることによって、合成アプローチは、インフルエンザワクチンウイルスを得るための強固なツールを提供する。これまで、チームは、合成でレスキューできないいかなるインフルエンザウイルス株にも遭遇しなかった。合成プロセスを、広く種々のインフルエンザ株（Ｈ１Ｎ１（２００９年以前のおよび２００９年以降の改変体）、流行期Ｈ３Ｎ２、ブタ起源Ｈ３Ｎ２ｖ、Ｂ（ＹａｍａｇａｔａおよびＶｉｃｔｏｒｉａ系統）、弱毒化Ｈ５Ｎ１、およびＨ７Ｎ９株を含む）を生成するために使用した（表３）。ＭＤＣＫ細胞での合成インフルエンザウイルス回収の強固さは、卵を使用する従来のワクチンウイルス単離の、特に、近年のＨ３Ｎ２株に関する信頼性の低さとは著しく対照的である（２１）。
【０２１６】
【表３】
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【０２１７】
（グローバル株変化および汎流行対応システムの関わり合い）
より高収量のインフルエンザワクチンシードが合成技術を使用して生成され得る速度、容易さおよび精度は、より迅速な将来的な汎流行対応およびより良好に適合した流行期および汎流行性インフルエンザワクチンのより信頼性の高い供給を約束する。元のインフルエンザウイルス単離に使用されるヒト鼻分泌物からの偶発的因子の増殖の可能性は、このような物質が配列情報を生成するためにのみ使用され、ワクチン生成バイオリアクターもしくは卵に接種するために使用されるウイルスへの増殖には使用されない場合に排除される。合成およびウイルスレスキューの技術的工程の速度は、実際には、合成技術に基づくシード生成の潜在的な加速の比較的主要でない構成要素である。合成ワクチンウイルスの性能が十分である場合、より大きな時間の節約が、上記合成技術が、実験室間でウイルスおよび臨床標本を輸送し、高収量ワクチン株を生成する古典的な再集合アプローチを使用する必要性を緩和する能力から生じる。
【０２１８】
今日、インフルエンザサーベイランスを行う１２０を超えるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｃｅｎｔｅｒｓ（ＮＩＣ）が、ＭＤＣＫ細胞において野生型ウイルスを増殖させようとの試みを行っているＷＨＯ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒへと臨床標本を定期的に輸送している。合成ワクチンウイルスを用いて、上記システムは増大した効率を実現し得る。ＮＩＣにおいて臨床標本中のＨＡおよびＮＡゲノムＲＮＡを直接配列決定することによって得られる配列データは、公衆にアクセス可能なウェブサイトに投稿され得、ここでそれらは、製造業者、公衆衛生機関、および世界中の他の研究者によって直ちにダウンロードされ得る。配列データのストリームを配列のデータベースおよび現在開発中のアルゴリズムによるＨＩデータに対して連続比較することから、現在のワクチン株からの有意な抗原性の差異を有する可能性が最も高い顕現性ウイルスが同定され得る。高増殖バックボーンの一団での効率的な一次合成レスキューが、抗原性試験に必要とされるウイルス、およびあるウイルスが抗原的に異なりかつ疫学的に重要であると見出される場合に使用される予定である最良のワクチンシード候補を同時に生成する。
【０２１９】
今日、ワクチンウイルスは、ＷＨＯ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒもしくはリアソータント生成実験室から、それらが十分に試験された後に製造業者へと輸送されるに過ぎず、試験はしばしば、ワクチン株の生成より長い時間がかかる。これら合成技術によって可能になったシード生成の分業化は、製造業者が、ＮＩＣが配列を投稿した直後に彼らが生成し得る株の危険性がある規模拡大およびプロセス開発に着手することを可能にし得る。シード試験と同時にこれら製造活動を実施すると、汎流行対応時間からさらに数週間が短縮される。合成インフルエンザ遺伝子のライブラリーは、ライブラリーで予め合成された遺伝子が将来的な汎流行性株に適合する場合、汎流行対応をさらに加速し得る。
【０２２０】
（ＰＲ８−Ｘもしくはイヌ適合ＰＲ８−Ｘバックボーンを含むリアソータントウイルスの増殖特徴）
高増殖ドナー株を提供するために、本発明者らは、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９のＰＢ１セグメントおよびＰＲ８−Ｘに由来する他の全バックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスが、ＰＲ８−Ｘに由来する全バックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスと比較して、改善された増殖特徴を示すことを見出した。このインフルエンザバックボーンは、＃２１といわれる。
【０２２１】
ウイルス再集合のためのドナー株として＃２１株が適切であることを試験するために、リアソータントインフルエンザウイルスを、逆遺伝学によって生成する（このウイルスは、種々のインフルエンザ株（人畜共通感染株、流行期株、および汎流行性様株を含む）に由来するＨＡおよびＮＡタンパク質、ならびにＰＲ８−Ｘもしくは＃２１バックボーンのいずれかに由来する他のウイルスセグメントを含む）。これらリアソータントウイルスのＨＡ含有量、ＨＡ収量およびウイルス力価を決定する。コントロールとして、ＰＲ８−ＸもしくはＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９に由来するあらゆるバックボーンセグメントを含まない参照ワクチン株を使用する。これらウイルスを、孵化鶏卵もしくはＭＤＣＫ細胞のいずれかにおいて培養する。
【０２２２】
その結果は、＃２１バックボーンを含むリアソータントウイルスが、卵および細胞培養物の両方においてコントロールウイルスおよびＰＲ８−Ｘに由来する全バックボーンセグメントを含むウイルスと比較して、より高いウイルス力価およびＨＡ収量を一貫して与えることを示す。この差異は、＃２１リアソータントとＰＲ８−Ｘリアソータントとの間の差異のみであるので、ＰＢ１セグメントに起因する（図８〜１１を参照のこと）。
【０２２３】
ＰＲ８−Ｘの増殖特徴に対するイヌ適合変異の効果を試験するために、本発明者らは、ＰＲ８−ＸのＰＡセグメント（Ｅ３２７Ｋ、Ｎ４４４Ｄ、およびＮ６７５Ｄ）、またはＮＰセグメント（Ａ２７Ｔ、Ｅ３７５Ｎ）に変異を導入する。これらバックボーンは、それぞれ、ＰＲ８−Ｘ（ｃＰＡ）およびＰＲ８−Ｘ（ｃＮＰ）といわれる。ＰＲ８−Ｘ（ｃＰＡ）およびＰＲ８−Ｘ（ｃＮＰ）バックボーン、ならびに汎流行性様Ｈ１インフルエンザ株（株１）またはＨ３インフルエンザ株（株２）のＨＡおよびＮＡセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスを生成する。コントロールとして、ＰＲ８−Ｘに由来するあらゆるバックボーンセグメントも含まない参照ワクチン株を使用する。上記リアソータントインフルエンザウイルスを、ＭＤＣＫ細胞で培養する。
【０２２４】
その結果は、イヌ適合バックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスが、未改変ＰＲ８−Ｘバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスと比較して、より高いウイルス力価まで一貫して増殖することを示す（図８および図９を参照のこと）。
【０２２５】
（ＰＲ８−Ｘ、＃２１もしくは＃２１Ｃバックボーンを含むリアソータントウイルスの増殖特徴）
バックボーンセグメントにおけるイヌ適合変異が、＃２１バックボーンの増殖特徴を改善するか否かを試験するために、本発明者らは、ＰＲ８−Ｘ  ＰＢ２セグメントの中に変異（Ｒ３８９Ｋ、Ｔ５５９Ｎ）を導入することによって、＃２１バックボーンを改変する。このバックボーンは、＃２１Ｃといわれる。２種の異なる汎流行性様Ｈ１株（株１および株２）に由来するＨＡおよびＮＡタンパク質、ならびにＰＲ８−Ｘ、＃２１バックボーンもしくは＃２１Ｃバックボーンのいずれかに由来する他のウイルスセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスを、逆遺伝学によって生成する。コントロールとして、ＰＲ８−ＸもしくはＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９に由来するあらゆるバックボーンセグメントも含まない参照ワクチン株を使用する。これらウイルスを、ＭＤＣＫ細胞で培養する。これらリアソータントウイルスのウイルス収量を決定する。汎流行性様Ｈ１株（株１）に由来するＨＡおよびＮＡセグメントならびにＰＲ８−Ｘもしくは＃２１Ｃバックボーンを含むリアソータントインフルエンザウイルスに関しては、ＨＡ力価もまた、決定する。
【０２２６】
その結果は、＃２１Ｃバックボーンを含むリアソータントインフルエンザウイルスは、ＰＲ８−Ｘバックボーンセグメントもしくは＃２１バックボーンのみを含むリアソータントインフルエンザウイルスと比較して、より高いウイルス力価まで一貫して増殖することを示す（図５、図６および図７を参照のこと）。＃２１Ｃバックボーンを含むリアソータントインフルエンザウイルスはまた、ＰＲ８−Ｘリアソータントと比較してより高いＨＡ力価を示す。
【０２２７】
（リアソータントインフルエンザＢウイルスの増殖特徴）
種々のインフルエンザ株に由来するＨＡおよびＮＡタンパク質、ならびにＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８および／もしくはＢ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０に由来する他のウイルスセグメントを含むリアソータントインフルエンザＢウイルスを、逆遺伝学によって生成する。コントロールとして、その対応する野生型インフルエンザＢ株を使用する。これらウイルスを、孵化鶏卵もしくはＭＤＣＫ細胞のいずれかにおいて培養する。以下のインフルエンザＢ株を使用する：
【０２２８】
【表４】
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【０２２９】
結果は、リアソータントウイルス＃２、＃９、＃３０、＃３１、＃３２、＃３３、＃３４および＃３５が、その対応する野生型株より、培養宿主において等しく良好にもしくはさらに良好に増殖することを示す（図１３および図１４を参照のこと）。これら株の大部分は、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８に由来するＮＰセグメントを含み、いくつか（特に、最良に増殖したもの）は、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／０８に由来するＰＢ２セグメントをさらに含む。これらウイルスのうちの全てがまた、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株およびＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株に由来するウイルスセグメントを７：１、６：２、４：４、３：４もしくは１：７の比で含む。
【０２３０】
本発明は、例示によってのみ記載されており、本発明の範囲および趣旨内に留まりつつ改変が行われ得ることが理解される。
【０２３１】
【化１】
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【０２３２】
【化２】
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【０２３３】
【化３】
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【図３−２】
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【図７（Ａ）】
2016506724.tif 000010
【図７（Ｂ）】
2016506724.tif 000011
【図７（Ｃ）】
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【図８】
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【図９（Ａ）】
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【図９（Ｂ）】
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【図１０（Ａ）】
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【図１０（Ｂ）】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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