(57)【要約】  本発明のペプチドは、天然のＩＬ−３の機能と同一または類似した機能を行うだけではなく、小さなサイズによって皮膚透過度に非常に優れている。また、本発明のペプチドは、ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル経路抑制を通じてＮＦ−κＢの活性化及び核移行を抑制するだけではなく、ＲＡＮＫＬまたは炎症性サイトカイン−誘導されたＴＲＡＰ、カテプシンＫまたはタイプ１またはタイプ２ＴＮＦ受容体の発現を抑制することによって、破骨細胞の分化を処理濃度−依存的に抑制する。また、本発明のペプチドは、ＯＣＮ、ＯＰＮ、ＢＳＰ、またはＯＰＮのような造骨細胞分化マーカーの発現を促進することによって、造骨細胞の分化に寄与することができる。したがって、本発明のペプチドの優れた活性及び安定性は、医薬品、医薬部外品、または化粧品に非常に有用に適用可能である。【選択図】図３ａ
2016525539.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号：１または配列表の配列番号：２のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドは、ヒトＩＬ−３タンパク質から由来したことを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドは、ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル経路を抑制することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドは、ＲＡＮＫＬまたは炎症性サイトカイン−誘導された破骨細胞分化能を抑制することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドは、ＲＡＮＫＬまたは炎症性サイトカイン−誘導されたＴＲＡＰ、カテプシンＫまたはタイプ１またはタイプ２ＴＮＦ受容体の発現を抑制することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
前記炎症性サイトカインは、ＴＮＦ−α、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、またはＩＬ−７を含むことを特徴とする請求項４から５のいずれかに記載のペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドは、造骨細胞の分化を促進することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドのＮまたはＣ末端は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で構成された群から選択される保護基が結合されていることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む骨疾患改善または治療用薬剤学的組成物。
【請求項１０】
前記骨疾患は、骨多孔症、少年期骨多孔症、骨形成不全症、骨軟化症、骨壊死症、くる病、骨髄炎、歯槽骨消失、骨ページェット病、高カルシウム血症、原発性副甲状線機能亢進症、転移性骨疾患、骨髄腫、リウマチ性関節炎での骨消失、癌による骨消失、線維性骨異形成症、無形性骨疾患、代謝性骨疾患、または年齢による骨質量の消失を含むことを特徴とする請求項９に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１１】
請求項１から８のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む骨分化促進用組成物。
【請求項１２】
前記組成物は、オステオカルシン（ＯＣＮ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＮ）、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、またはオステオポンチン（ＯＰＮ）の発現を促進することを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１から８のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む組成物を対象に投与する段階を含む骨疾患改善または治療方法。
【請求項１４】
前記骨疾患は、骨多孔症、少年期骨多孔症、骨形成不全症、骨軟化症、骨壊死症、くる病、骨髄炎、歯槽骨消失、骨ページェット病、高カルシウム血症、原発性副甲状線機能亢進症、転移性骨疾患、骨髄腫、リウマチ性関節炎での骨消失、癌による骨消失、線維性骨異形成症、無形性骨疾患、代謝性骨疾患、または年齢による骨質量の消失を含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１から８のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む組成物を細胞に接触させる段階を含む骨分化促進方法。
【請求項１６】
前記組成物は、オステオカルシン（ＯＣＮ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＮ）、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、またはオステオポンチン（ＯＰＮ）の発現を促進することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１３年７月２３日付で大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１３−００８６９３９号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は、本明細書に参照として挿入される。
【０００２】
本発明は、破骨細胞分化抑制用ペプチド及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
骨の恒常性と骨格の構造的形状は、骨を吸収する破骨細胞と骨を形成する造骨細胞との間の組織化された活性によって保持される。多核細胞である破骨細胞は、造血幹細胞から分化され［非特許文献１］、破骨細胞への分化は、造骨細胞と活性化されたＴリンパ球から分泌されるＲＡＮＫリガンドによって調節される［非特許文献２］。
【０００４】
ＲＡＮＫＬ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ  ｋａｐｐａ−Ｂ  Ｌｉｇａｎｄ）は、破骨細胞前駆体に存在する受容体であるＲＡＮＫと結合し、Ｍ−ＣＳＦ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｃｏｌｏｎｙ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ）が存在する時、破骨細胞の分化が誘導される。ＲＡＮＫＬは、破骨細胞形成と骨吸収を調節する信号伝逹経路を活性化させる［非特許文献３］。ＲＡＮＫは、チロシンキナーゼ活性（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有さず、ＴＲＡＦｓ（ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ）と知られたアダプタータンパク質（ａｄａｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を通じて信号伝逹を誘導する［非特許文献４］。細胞内の分子一部であるＴＲＡＦ６は、破骨細胞生成の重要な役割を行い、多様な下位信号を活性化させる［非特許文献５］。ＴＲＡＦ６は、ＲＡＮＫの細胞質のドメインと結合した後、ＮＦ−κＢとＡＰ−１（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−１）を活性化させる［非特許文献６］。
【０００５】
ＴＮＦ（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ）−αは、ＴＮＦリガンド系のタンパク質であって、これは、単核細胞／大食細胞または破骨細胞を含んだ多種の細胞から分泌され、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２（ＴＮＦＲ  ｐ５５とＴＮＦＲ  ｐ７５と知られた）という２つの細胞膜受容体を通じてさまざまな生物学的反応を誘導し、ＴＮＦＲ１とＴＮＦＲ２いずれもＮＦ−κＢの細胞質内抑制剤であるＩκＢのタンパク質加水分解を促進することができる細胞内シグナルを誘導する［非特許文献７］。
【０００６】
ＴＮＦ−αは、炎症反応、免疫調節、細胞増殖及び分化、細胞自殺のような多様な範囲の反応を調節する［非特許文献８］。また、ＴＮＦ−αは、インビトロ及びインビボで骨吸収を促進し［非特許文献９］、造骨細胞でＲＡＮＫＬの分泌を誘導することができる［非特許文献１０］。また、ＴＮＦ−αは、リウマチ性関節炎から発生する骨と関節破壊の原因に重要な役割を果たすだけではなく、歯周炎、整形外科の移植後の解離、慢性炎症性骨吸収の多様な形態で、その原因として機能するものと明らかになった。ＴＮＦ−αは、リポポリサッカライド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）によって刺激された破骨細胞によって媒介される［非特許文献１１］。ＴＮＦ−αは、閉経後に表われる骨多孔症でエストロゲン欠乏によって表われる骨消失に重要な役割を果たす［非特許文献１２］。
【０００７】
活性化されたＴリンパ球によって主に分泌されるサイトカインであるＩＬ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）−３は、免疫と造血幹細胞システムとの間の連結環として使われる［非特許文献１３］。ＩＬ−３は、マウス破骨細胞前駆体に直接に作用するだけではなく、大食細胞側に細胞分化を促進することによって、ＲＡＮＫＬによって誘導された破骨細胞の分化を抑制する［非特許文献１４］。破骨細胞前駆体で、ＩＬ−３は、ＩκＢのリン酸化と分解とを抑制することによって、ＲＡＮＫＬによって誘導されたＮＦ−κＢの核移行を妨害する。また、ＲＡＮＫＬに誘導されたＪＮＫ（ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｉｎａｓｅ）の活性を抑制し、ｃ−Ｆｏｓ、ＮＦＡＴｃ１転写因子の発現を下向き調節する。ＩＬ−３は、転写後の段階でＲＡＮＫの発現を抑制し、前記過程は、マウスを用いたインビボ実験を通じて再び戻すことができないということが確認された。
【０００８】
本明細書の全般に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、それを全体として本明細書に参照して挿入されて、本発明が属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｔ．Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｏ．Ｏｈｎｅｄａ，Ｆ．Ａｒａｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９８（２００１）２５４４−２５５４
【非特許文献２】Ｙ．Ｙ．Ｋｏｎｇ，Ｕ．Ｆｅｉｇｅ，Ｉ．Ｓａｒｏｓｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０２（１９９９）３０４−３０９
【非特許文献３】Ｊ．Ｌｉ，Ｉ．Ｓａｒｏｓｉ，Ｘ．Ｑ．Ｙａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７（２０００）１５６６−１５７１．
【非特許文献４】Ｌ．Ｇａｌｉｂｅｒｔ，Ｍ．Ｅ．Ｔｏｍｅｔｓｋｏ，Ｄ．Ｍ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（１９９８）３４１２０−３４１２７
【非特許文献５】Ｍ．Ａ．Ｌｏｍａｇａ，Ｗ．Ｃ．Ｙｅｈ，Ｉ．Ｓａｒｏｓｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３（１９９９）１０１５−１０２４
【非特許文献６】Ｓ．Ｌ．Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１４（２００４）４６３−４６５
【非特許文献７】Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．，Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｊ．Ｋ．，Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｅ．Ｍ．，Ｖａｎ  Ａｎｔｗｅｒｐ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｓ．（１９９５）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．９，２７２３−２７３５
【非特許文献８】Ｌｅｄｇｅｒｗｏｏｄ，Ｅ．Ｃ．，Ｐｏｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｊ．Ｒ．（１９９９）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７９，１０４１−１０５０
【非特許文献９】Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ，Ｄ．Ｒ．，Ｎｅｄｗｉｎ，Ｇ．Ｅ．，Ｂｒｉｎｇｍａｎ，Ｔ．Ｓ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｍｕｎｄｙ，Ｇ．Ｒ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３１９，５１６−５１８
【非特許文献１０】Ｈｏｆｂａｕｅｒ，Ｌ．Ｃ．，Ｌａｃｅｙ，Ｄ．Ｌ．，Ｄｕｎｓｔａｎ，Ｃ．Ｒ．，Ｓｐｅｌｓｂｅｒｇ，Ｔ．Ｃ．，Ｒｉｇｇｓ，Ｂ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｋｈｏｓｌａ，Ｓ．（１９９９）Ｂｏｎｅ  ２５，２５５−２５９
【非特許文献１１】Ａｂｕ−Ａｍｅｒ，Ｙ．，Ｒｏｓｓ，Ｆ．Ｐ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ，Ｓ．Ｌ．（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００，１５５７−１５６５
【非特許文献１２】Ｃｅｎｃｉ，Ｓ．，Ｗｅｉｔｚｍａｎｎ，Ｍ．Ｎ．，Ｒｏｇｇｉａ，Ｃ．，Ｎａｍｂａ，Ｎ．，Ｎｏｖａｃｋ，Ｄ．，Ｗｏｏｄｒｉｎｇ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｐａｃｉｆｉｃｉ，Ｒ．（２０００）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６，１２２９−１２３７
【非特許文献１３】Ｊ．Ｗ．Ｓｃｈｒａｄｅｒ，Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３，ｉｎ：Ａ．Ｗ．Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｍ．Ｔ．Ｌｏｔｚｅ（Ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，２００３，ｐｐ．２０１−２２５
【非特許文献１４】Ｓ．Ｍ．Ｋｈａｐｌｉ，Ｌ．Ｓ．Ｍａｎｇａｓｈｅｔｔｉ，Ｓ．Ｄ．Ｙｏｇｅｓｈａ，Ｍ．Ｒ．Ｗａｎｉ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１（２００３）１４２−１５１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、ＩＬ−３（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ３）と同じ機能または類似した機能を保持しながらも、天然のＩＬ−３タンパク質よりも活性及び安定性に優れた物質を開発するために努力してきた。その結果、本発明者らは、多くのペプチド候補物質のうちから優れた生理活性（例えば、破骨細胞分化抑制能、骨分化促進能など）を有するＩＬ−３−由来のペプチドを選別することによって、本発明を完成した。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、配列表の配列番号：１または配列表の配列番号：２のアミノ酸配列からなるペプチドを提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、骨疾患改善または治療用薬剤学的組成物を提供することである。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、骨分化促進用組成物を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、骨疾患改善または治療方法を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、骨分化促進方法を提供することである。
【００１６】
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の一態様によれば、本発明は、配列表の配列番号：１または配列表の配列番号：２のアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
【００１８】
本発明者らは、ＩＬ−３と同じ機能または類似した機能を保持しながらも、天然のＩＬ−３タンパク質よりも活性及び安定性に優れた物質を開発するために努力してきた。その結果、本発明者らは、多くのペプチド候補物質のうちから優れた生理活性（例えば、破骨細胞分化抑制能、骨分化促進能など）を有するＩＬ−３−由来のペプチドを選別した。
【００１９】
本発明者らは、ヒトＩＬ−３の機能と関連のある部位を基にして前述した特性を示す多数のＩＬ−３−由来のペプチドを合成した。より詳細には、ＩＬ−３タンパク質の多様な部位を任意的に部分合成して、受容体タンパク質に対する結合可能部位を１次探索した後、この予測された部位のアミノ酸配列を最適化して、本発明のペプチドを選別的に製造し、これら候補ペプチドのうちから最も活性に優れたペプチドをスクリーニングすることによって、本発明の配列表の配列番号：１及び配列表の配列番号：２のペプチドを製造した。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ｉ）本発明のペプチドは、天然のＩＬ−３の機能と同一または類似した機能を行うだけではなく、小さなサイズによって皮膚透過度に非常に優れている。
（ｉｉ）本発明のペプチドは、ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル経路抑制を通じてＮＦ−κＢの活性化及び核移行を抑制するだけではなく、ＲＡＮＫＬまたは炎症性サイトカイン−誘導されたＴＲＡＰ、カテプシンＫまたはタイプ１またはタイプ２ＴＮＦ受容体の発現を抑制することによって、破骨細胞の分化を処理濃度−依存的に抑制する。
（ｉｉｉ）また、本発明のペプチドは、オステオカルシン（ＯＣＮ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＮ）、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、またはオステオポンチン（ＯＰＮ）のような造骨細胞分化マーカーの発現を促進することによって、造骨細胞の分化に寄与することができる。
（ｉｖ）したがって、本発明のペプチドの優れた活性及び安定性は、医薬品、医薬部外品、または化粧品に非常に有用に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１ａ】本発明の合成例１によって製造された配列表の配列番号：１のペプチドの高性能液体クロマトグラフィー分析結果を示すグラフである。
【図１ｂ】本発明の合成例１によって製造された配列表の配列番号：２のペプチドの高性能液体クロマトグラフィー分析結果を示すグラフである。
【図２ａ】本発明の合成例１によって製造された配列表の配列番号：１のペプチド安定性テスト結果を純度で示すグラフである。
【図２ｂ】本発明の合成例１によって製造された配列表の配列番号：２のペプチド安定性テスト結果を純度で示すグラフである。
【図３ａ】本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号：１のペプチドで処理した破骨細胞の分化抑制効果を示した結果である。
【図３ｂ】本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号：２のペプチドで処理した破骨細胞の分化抑制効果を示した結果である。
【図４ａ】本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号：１のペプチドで処理した時、破骨細胞の分化促進酵素の抑制効果を示したグラフである。
【図４ｂ】本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号：２のペプチドで処理した時、破骨細胞の分化促進酵素の抑制効果を示したグラフである。
【図５ａ】本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号：１のペプチドで処理した時、破骨細胞分化マーカーであるＴＲＡＰ及びカテプシンＫのｍＲＮＡ抑制効果を示した結果である。
【図５ｂ】本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号：２のペプチドで処理した時、破骨細胞分化マーカーであるＴＲＡＰ及びカテプシンＫのｍＲＮＡ抑制効果を示した結果である。
【図６ａ】本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号：１のペプチドで処理した時、タイプ１及びタイプ２ＴＮＦ受容体のｍＲＮＡ抑制効果を示した結果である。
【図６ｂ】本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号：２のペプチドで処理した時、タイプ１及びタイプ２ＴＮＦ受容体のｍＲＮＡ抑制効果を示した結果である。
【図７ａ】本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号：１のペプチドで処理した時、ＲＡＮＫＬシグナル抑制効果を示した結果である。
【図７ｂ】本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号：２のペプチドで処理した時、ＲＡＮＫＬシグナル抑制効果を示した結果である。
【図８ａ】本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号：１のペプチドで処理した時、造骨細胞の分化促進を示した結果である。
【図８ｂ】本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号：２のペプチドで処理した時、造骨細胞の分化促進を示した結果である。
【図９ａ】本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号：１で処理した時、造骨細胞でＢＭＰ２シグナルであるｐ−Ｓｍａｄ１／５／８の発現を増加させるということを示した結果である。
【図９ｂ】本発明の合成例によって製造された配列表の配列番号：２のペプチドで処理した時、造骨細胞でＢＭＰ２シグナルであるｐ−Ｓｍａｄ１／５／８の発現を増加させるということを示した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の一具現例によれば、本発明の配列表の配列番号：１及び配列表の配列番号：２のペプチドは、ヒトＩＬ−３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ，ＡＡＨ６６２７５．１；配列表の配列番号：３）から由来し、これは、表１に例示されている。本発明の配列表の配列番号：１及び配列表の配列番号：２のペプチドは、天然ＩＬ−３と類似した作用を行って、その受容器と結合して、成長因子のような活性を有するペプチドである。
【００２３】
本発明のペプチドは、処理濃度−依存的に強力な破骨細胞分化抑制能を有するだけではなく、造骨細胞の分化を顕著に促進した（参考：図３ないし図８）。
【００２４】
本発明の一具現例によれば、本発明のペプチドは、ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル経路を抑制する。
【００２５】
本発明のペプチドは、ＲＡＮＫＬ−媒介されたＮＦ−κＢの活性化及び核移行を鮮明に抑制した（参考：図７ａ及び図７ｂ）。
【００２６】
本発明の一具現例によれば、本発明のペプチドは、ＲＡＮＫＬまたは炎症性サイトカイン−誘導された破骨細胞分化能を抑制し、ＲＡＮＫＬまたは炎症性サイトカイン−誘導されたＴＲＡＰ（Ｔａｒｔｒａｔｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、カテプシン（ｃａｔｈｅｐｓｉｎ）Ｋまたはタイプ１またはタイプ２ＴＮＦ受容体の発現を抑制する。
【００２７】
本発明の一具現例によれば、前述した炎症性サイトカインは、ＴＮＦ−α、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＩＬ−７を含み、より具体的には、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６を含み、さらに具体的には、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βを含み、最も具体的には、ＴＮＦ−αである。
【００２８】
本発明のペプチドは、造骨細胞の分化を促進することができる。
【００２９】
本発明の一具現例によれば、本発明のペプチドは、ＯＣＮ（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）、ＯＰＮ（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）、ＢＳＰ（ｂｏｎｅ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ）、及びＯＰＮ（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）のような造骨細胞分化マーカーの発現を促進する。
【００３０】
本明細書で、用語“ペプチド”は、ペプチド結合によってアミノ酸残基が互いに結合されて形成された線形の分子を意味する。本発明のペプチドは、当業者に公知の化学的合成方法、例えば、固相合成技術（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−５４（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ．ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．：Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１１１（１９８４））または液相合成技術（ＵＳ登録特許第５，５１６，８９１号）によって製造可能である。
【００３１】
本発明のペプチドは、それ自体として天然のＩＬ−３タンパク質よりも安定性に優れているが、アミノ酸の変形によって安定性がさらに向上する（参考：図２ａ及び図２ｂ）。
【００３２】
本発明によれば、本発明のペプチドは、天然のＩＬ−３タンパク質に比べて非常に優れた熱安定性を有する。天然ＩＬ−３タンパク質は、製造の難点及び高い生産コストだけではなく、温度及び長期保管時に低い安定性を有する。しかし、本発明のペプチドは、非常に安価に大量合成が可能であり、高温などで物理化学的に安定するために、生理活性の低下を最大限に防止し、体内外での残存期間を増加させることによって、さらに向上した治療効果を有する。したがって、本発明のペプチドは、医薬品、医薬部外品、及び化粧品のような長期間保存が要求される製品に有利に適用可能である。
【００３３】
本発明の一具現例によれば、前記ペプチドのＮまたはＣ末端は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で構成された群から選択される保護基が結合されうる。
【００３４】
前述したアミノ酸の変形は、本発明のペプチドの安定性を大きく改善する作用を行う。本明細書で言及される用語“安定性”は、“インビボ”安定性だけではなく、保存安定性（例えば、常温保存安定性）も意味する。前述した保護基は、生体内のタンパク質切断酵素の攻撃から本発明のペプチドを保護する作用を行う。
【００３５】
本発明の他の態様によれば、本発明は、前述したペプチドを有効成分として含む骨疾患改善または治療用薬剤学的組成物を提供する。
【００３６】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前述したペプチドを有効成分として含む骨分化促進用組成物を提供する。
【００３７】
本発明の組成物は、前述した本発明のＩＬ−３−関連ペプチドを有効成分として含むために、この２つの間に共通した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【００３８】
本明細書で使われる用語“骨疾患”は、ＲＡＮＫＬ−媒介されたシグナルと関連した疾患、疾病または状態であって、骨形成及び再吸収の調節と関連した疾患、疾病または状態を含むだけではなく、骨量減少、骨多孔症及び骨溶解を含めた骨量減少性障害も含む。
【００３９】
本発明の一具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物によって改善または治療される骨疾患は、骨多孔症、少年期骨多孔症、骨形成不全症、骨軟化症、骨壊死症、くる病、骨髄炎、歯槽骨消失、骨ページェット病（Ｐａｇｅｔ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、高カルシウム血症、原発性副甲状線機能亢進症、転移性（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ）骨疾患、骨髄腫、リウマチ性関節炎での骨消失、癌による骨消失、線維性骨異形成症、無形性骨疾患、代謝性骨疾患、及び年齢による骨質量の消失を含むが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
本発明の組成物は、（ａ）前述した本発明のＩＬ−３タンパク質の活性を示すペプチドの薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物として用いられうる。
【００４１】
本明細書で使われる用語“薬剤学的有効量”は、前述したＩＬ−３関連ペプチドの効能または活性を果たすのに十分な量を意味する。
【００４２】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微小結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含みうる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳しく記載されている。
【００４３】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口で投与し、非経口投与である場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、局所投与、経皮投与などで投与することができる。
【００４４】
本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様であり、通常の熟練された医師ならば、所望の治療または予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明の望ましい具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は、０．０００５〜１，０００ｍｇ／ｋｇである。
【００４５】
また、本発明の薬剤学的組成物は、当業者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を用いて製剤化することによって、単位用量の形態で製造されるか、または多用量容器内に内入させて製造可能である。この際、剤型は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳液の形態であるか、エクストラクト剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤またはゲル（例えば、ヒドロゲル）の形態でもあり得るが、分散剤または安定化剤をさらに含みうる。
【００４６】
また、本発明の組成物は、（ａ）前述した本発明のＩＬ−３−由来のペプチドの化粧品学的有効量（ｃｏｓｍｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）；及び（ｂ）化粧品学的に許容される担体を含む化粧品組成物として用いられうる。本明細書で使われる用語“化粧品学的有効量”は、前述した本発明の組成物の効能を果たすのに十分な量を意味する。
【００４７】
本発明の化粧品組成物は、当業者に通常製造される如何なる剤型にも製造可能であり、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション、及びスプレーなどに剤型化されうるが、これらに限定されるものではない。より詳細には、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレーまたはパウダーの剤型に製造可能である。
【００４８】
本発明の剤型が、ペースト、クリームまたはゲルである場合には、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などが用いられうる。
【００４９】
本発明の剤型が、パウダーまたはスプレーである場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムまたはポリアミドパウダーが用いられ、特に、スプレーである場合には、さらにクロロフルオロハイドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような噴霧剤を含みうる。
【００５０】
本発明の剤型が、溶液または乳濁液である場合には、担体成分として、溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルがある。
【００５１】
本発明の剤型が、懸濁液である場合には、担体成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天またはトラガントなどが用いられうる。
【００５２】
本発明の剤型が、界面活性剤含有クレンジングである場合には、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホスクシン酸モノエステル、イセチオン酸、イミダゾリウム誘導体、メチルタウリン、サルコシン酸、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが用いられうる。
【００５３】
本発明の化粧品組成物に含まれる成分は、有効成分としてのペプチド類と担体成分の以外に、化粧品組成物に通用される成分を含み、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料、及び香料のような通常の補助剤を含みうる。
【００５４】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前述したペプチドを有効成分として含む組成物を対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含む骨疾患改善または治療方法を提供する。
【００５５】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前述したペプチドを有効成分として含む組成物を細胞に接触させる段階を含む骨分化促進方法を提供する。
【００５６】
本発明の方法は、前述した組成物を用いるために、これらの間の共通した内容は、本明細書の過度な複雑性を回避するために、その記載を省略する。
【００５７】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者にとって自明である。
【実施例】
【００５８】
合成例１：Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ（配列表の配列番号：１）の合成
クロロトリチルクロライドレジン（Ｃｈｌｏｒｏ  ｔｒｉｔｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｒｅｓｉｎ；ＣＴＬ  ｒｅｓｉｎ、Ｎｏｖａ  ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔ  Ｎｏ．０１−６４−００２１）７００ｍｇを反応容器に入れ、メチレンクロライド（ＭＣ）１０ｍｌを加えて３分間撹拌した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍｌを入れて３分間撹拌した後、再び溶媒を除去した。反応器に１０ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液を入れ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）４００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かし、１時間撹拌しながら反応させた。反応後、洗浄し、メタノールとＤＩＥＡ（２：１）とをＤＣＭに溶かして１０分間反応させ、過量のＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）で洗浄した。溶液を除去し、ＤＭＦを１０ｍｌ入れて３分間撹拌した後、再び溶媒を除去した。脱保護溶液（２０％のピペリジン（Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）／ＤＭＦ）１０ｍｌを反応容器に入れ、１０分間常温で撹拌した後、溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れ、再び１０分間反応を保持した後、溶液を除去し、それぞれ３分ずつＤＭＦで２回、ＭＣで１回、ＤＭＦで１回洗浄して、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＣＴＬレジンを製造した。新たな反応器に１０ｍｌのＤＭＦ溶液を入れ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ、ＨｏＢｔ  ２００ｍｍｏｌｅ及びＢｏｐ  ２００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かした。反応器に４００ｍｍｏｌｅのＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）を分画で２回に亙って入れた後、あらゆる固体が溶けるまで少なくとも５分間撹拌した。溶かしたアミノ酸混合溶液を脱保護されたレジンがある反応容器に入れ、１時間常温で撹拌しながら反応させた。反応液を除去し、ＤＭＦ溶液で３回５分ずつ撹拌した後、除去した。反応レジンを少量取ってカイザーテスト（Ｎｉｈｙｄｒｉｎ  ｔｅｓｔ）を用いて反応程度を点検した。脱保護溶液で、前記のように同様に２回脱保護反応させて、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＣＴＬレジンを製造した。ＤＭＦとＭＣとで十分に洗浄し、もう一度カイザーテストを行った後、前記と同様に、下記のアミノ酸付着実験を行った。選定されたアミノ酸配列に基づいて、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、及びＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）順に連鎖反応させた。Ｆｍｏｃ−保護基を脱保護溶液で１０分ずつ２回反応させた後、よく洗浄して除去した。無水酢酸とＤＩＥＡ、ＨｏＢｔ（Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）を入れて１時間アセチル化を行った後、製造されたペプチジルレジンをＤＭＦ、ＭＣ及びメタノールでそれぞれ３回を洗浄し、窒素空気を徐々に流して乾燥した後、五酸化リン（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ  ｐｅｎｔｏｘｉｄｅ、Ｐ２Ｏ５）下で真空に減圧して完全に乾燥した後、脱漏溶液［ＴＦＡ（Ｔｒｉｆｌｕｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）９５％、蒸留水２．５％、チオアニソール（Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ）２．５％］３０ｍｌを入れた後、常温で時々振りながら２時間反応を保持した。フィルタリングを行ってレジンを濾過し、レジンを少量の溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を用いて全体ボリュームが半分程度残るように蒸留し、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、２回さらに冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去し、窒素下で十分に乾燥して、精製前、ＮＨ２−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−ＯＨペプチド１を０．５ｇ合成した（収率：８９．９％）。分子量測定器を用いて測定時に、分子量１３７５．４Ｄａ（理論値：１３７７．６Ｄａ）が得られた（図１ａ）。前記のような方法で配列表の配列番号：２のペプチド（ＮＨ２−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−ＯＨ）も合成した（収率：９２．１％）。分子量測定器を用いて測定時に、分子量１５６８．５Ｄａ（理論値：１５６７．９Ｄａ）の値が得られた（図１ｂ）。
【００５９】
【表１】
2016525539.tif 000003
【００６０】
試験例１：製造されたペプチドの熱安定性
合成例１から合成された配列表の配列番号：１または配列表の配列番号：２のペプチドとＮＩＢＳＣ（ＵＫ）で購入した標準品成長因子（ＩＬ−３）とを０．１ｍｇ／ｍｌの濃度のリン酸緩衝溶液で製造した。準備された溶液を１ｍｌずつガラスバイアルに入れた後、３７℃で静置した。３７℃に静置された溶液を０、１、３、５、１０、２０、そして、４０日目にサンプリングして、日付別に遠心分離して、変性されたペプチドやタンパク質を除去し、上澄み液を取ってＨＰＬＣを用いて定量を行った（それぞれ、図２ａ及び図２ｂ）。
【００６１】
試験例２：合成ペプチドを用いた破骨細胞の分化抑制効果の確認
合成例１から合成された配列表の配列番号：１及び配列表の配列番号：２のペプチドのインターロイキン（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ、ＩＬ）−３の類似効能及び抑制効能を分析するために、酒石酸塩−抵抗酸性リン酸分解酵素（Ｔａｒｔｒａｔｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）染色などの方法（Ｒｉｚｚｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：４２６６（１９８８））を参照して、破骨細胞に分化が可能なＲａｗ２６４．７細胞株を用いたＴＲＡＰ（Ｔａｒｔｒａｔｅ−ｒｅｓ）比色法を用いて測定した。
【００６２】
Ｒａｗ２６４．７細胞株（ＡＴＣＣ）をそれぞれ２５０ｍｌ容量の組織培養用フラスコを用いて１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ、Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ、Ｇｉｂｃｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）で培養した。該培養された細胞株をピペッティング（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）で気をつけて培養容器の底から取り外した後、遠心分離して細胞沈殿物のみを集めた。前記細胞沈殿物を１０％ＦＢＳが含有されたＤＭＥＭ培養液に再懸濁させた後、４６ウェル組織培養用平板に、各ウェル当たり１×１０４細胞になるように入れ、空試料とＲＡＷ２６４．７細胞の分化を誘導するために、ＲＡＮＫＬを１０ｎｇ／ｍｌ、ＴＮＦ−α  ５０ｎｇ／ｍｌの濃度と合成されたペプチドを１０％蒸留水に滅菌状態で溶かした後、１μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌの濃度で共に処理して、７２時間３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。７２時間後、同じ培養液で培地を交換した後、空試料とＲＡＮＫＬを１０ｎｇ／ｍｌ、ＴＮＦ−α  ５０ｎｇ／ｍｌの濃度と合成ペプチドを再び１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの濃度で４８時間前記した条件と同様に培養した。総５日間培養の進行が完了した後、培養上澄み液を除去し、細胞を固定するために、クエン酸溶液（ｃｉｔｒａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）２５ｍｌ、アセトン６５ｍｌ及び３７％ホルムアルデヒド８ｍｌを含む固定緩衝液（ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）を製造して、それを用いて３０秒間固定化させた後、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ）で３回洗浄した。洗浄溶液を除去した後、白血球アルカリホスファターゼキット（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｋｉｔ；Ｓｉｇｍａ，米国）を用いて染色した。
【００６３】
図３は、ＲＡＮＫＬとＴＮＦ−αによって分化が誘導されるＲａｗ２６４．７細胞の、ＩＬ−３−１（図３ａ）及びＩＬ−３−２（図３ｂ）による分化の抑制結果である。図３ａ及び図３ｂで示すように、本発明のペプチドは、ＲＡＮＫＬとＴＮＦ−αにより誘導されるＲａｗ２６４．７細胞の破骨細胞への分化を抑制することができる。
【００６４】
試験例３：合成ペプチドを用いた破骨細胞の分化抑制効果の確認
Ｒａｗ２６４．７細胞にＲＡＮＫＬ  １０ｎｇ／ｍｌまたはＴＮＦ−α  ５０ｎｇ／ｍｌと合成例１で合成したペプチドを１または１０μｇ／ｍｌとで共に処理し、５日間分化誘導後、破骨細胞分化マーカーであるＴＲＡＰ活性の抑制程度を確認する実験を実施した。培養後、培養液を除去した後、溶解緩衝液（２０ｍＭ  ｔｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ、３％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）１００μｌを添加して、細胞壁を破壊した。クエン酸溶液（１８ｍＭ  ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ、９ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ、１２ｍＭ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ；ｐＨ３．５）５００μｌ、酒石酸溶液（ｔａｒｔｒａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）５０μｌ、２０ｍＭ  ホスフェート基質５００μｌを入れて反応溶液を作った後、前記溶解物（ｌｙｓａｔｅ）１００μｌと反応溶液１００μｌを同量で入れた後、３７℃で３０分間反応させた。分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて吸光度４０５ｎｍで発色を測定した。本発明の配列表の配列番号：１または配列表の配列番号：２のペプチドをＲＡＮＫＬ及びＴＮＦ−αと共に処理した場合、前記ペプチドが、破骨細胞分化マーカーであるＴＲＡＰ活性を濃度−依存的に抑制することを確認した（図４ａ及び図４ｂ）。
【００６５】
試験例４：合成ペプチドを用いた破骨細胞分化マーカーのｍＲＮＡ抑制効果の確認
Ｒａｗ２６４．７細胞をＲＡＮＫＬ  １０ｎｇ／ｍｌまたはＴＮＦ−α  ５０ｎｇ／ｍｌと合成例１で合成したペプチドを１または１０μｇ／ｍｌとで共に処理し、５日間分化を誘導した後、カテプシンＫのｍＲＮＡ発現の抑制程度を確認する実験を実施した。図５ａ及び図５ｂは、それぞれ本発明のペプチドを処理した時、カテプシンＫのｍＲＮＡレベルが減少することを示す。また、図６ａ及び図６ｂは、ＲＡＮＫＬまたはＴＮＦ−αを処理した時、増加するタイプ１またはタイプ２のＴＮＦ受容体が、本発明のペプチドを処理した時、これらのｍＲＮＡ発現がいずれも減少することを確認させてくれた。ＰＣＲに用いられたターゲット−特異的プライマー配列は、次の通りである：ＴＲＡＰ  フォワードプライマー配列、５’−ＡＡＡＴＣＡＣＴＣＴＴＴＡＡＧＡＡＣＡＧ−３’及びＴＲＡＰ  リバースプライマー、５’−ＴＴＡＴＴＧＡＡＴＡＧＣＡＧＴＧＡＣＡＧ−３’（アニーリング温度、４５℃）；カテプシンＫ  フォワードプライマー配列、５’−ＣＣＴＣＴＣＴＴＧＧＴＧＴＣＣＡＴＡＣＡ−３’及びカテプシンＫ  リバースプライマー、５’−ＡＴＣＴＣＴＣＴＧＴＡＣＣＣＴＣＴＧＣＡ−３’（アニーリング温度、５３℃）；ＧＡＰＤＨ  フォワードプライマー配列、５’−ＧＧＴＧＴＧＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＣＣＧＴＡＴＴＧ−３’及びＧＡＰＤＨ  リバースプライマー、５’−ＣＣＧＴＴＧＡＡＴＴＴＧＣＣＧＴＧＡＧＴＧＧＡＧＴ−３’（アニーリング温度、５５℃）；タイプ１ＴＮＦ受容体  フォワードプライマー配列、５’−ａｃｃｔｔｔａｃｇｇｃｔｔｃｃｃａｇａａ−３’及びタイプ１ＴＮＦ受容体  リバースプライマー、５’−ｔｃｃｔｔａｃａｇｃｃａｃａｃａｃｃｇｔ−３’（アニーリング温度、５５℃）；タイプ２ＴＮＦ受容体  フォワードプライマー配列、５’−ａｇｇｃｔｇｇａａａｇｃｃｃｃｔａａｃｔ−３’及びタイプ２ＴＮＦ受容体  リバースプライマー、５’−ａｔｇｇｇｇｇｔａｃｔｇｇａｇａｃａｇｇ−３’（アニーリング温度、５５℃）；及びアクチン  フォワードプライマー配列、５’−ＣＧＴＧＧＧＣＣＧＣＣＣＴＡＧＧＣＡ−３’及びアクチン  リバースプライマー、５’−ＴＴＧＧＣＴＴＡＧＧＧＴＴＣＡＧＧＧＧＧ−３’（アニーリング温度、５５℃）。
【００６６】
したがって、本発明のペプチドは、ＲＡＮＫＬとＴＮＦ−αによって増加するＴＲＡＰ、カテプシンＫ、そして、タイプ１及びタイプ２ＴＮＦ受容体をいずれも抑制することができる（図５ａ〜図５ｂ及び図６ａ〜図６ｂ）。
【００６７】
試験例５：合成ペプチドによるＲＡＮＫＬのシグナル抑制確認実験
Ｒａｗ２６４．７細胞に合成例１で合成したペプチドを処理し、３０分経過後、ＲＡＮＫＬタンパク質の代表的なシグナルであるＮＦ−κＢの核移行を確認した。各ペプチドの効果は、ＮＦ−κＢの多重クローン抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ  ｓｃ−３７２，サンタクルーズ，米国）を用いてウェスタンブロッティングを通じて確認した。本発明のペプチドを処理した場合、ＮＦ−κＢ活性化及び核移行が確認された（図７ａ及び図７ｂ）。その他のＲＡＮＫＬタンパク質の代表的なシグナル中にｃ−Ｊｕｎのリン酸化とリン酸化されたｃ−Ｊｕｎの核移行を確認した。各ペプチドの効果は、ホスホ−ｃ−Ｊｕｎの多重クローン抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ  ｓｃ−１６９４，サンタクルーズ，米国）を用いてウェスタンブロッティングを通じて確認した（図７ａ及び図７ｂ）。
【００６８】
試験例１ないし試験例５の実験結果を総合すれば、本発明のペプチドは、ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナルの活性化抑制を通じて破骨細胞の分化を非常に効果的に抑制する。
【００６９】
試験例６：合成ペプチドによる骨分化マーカー遺伝子促進効果の確認
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に合成例１で合成したペプチドを１０または５０μｇ／ｍｌで処理し、２日間分化を誘導させた後、ＯＣＮ（オステオカルシン）、ＯＰＮ（オステオプロテゲリン）、ＢＳＰ（骨シアロタンパク質）、及びＯＰＮ（オステオポンチン）のような造骨細胞分化マーカーのｍＲＮＡ発現確認実験を進行した。図８は、本発明のペプチドを処理した時、造骨細胞分化マーカーであるＰＣＲに用いられたターゲット−特異的プライマー配列は、次の通りである：ＯＣＮ  フォワードプライマー配列、５’−ｇｃｇｃｔｃｔｇｔｃｔｃｔｃｔｇａｃｃｔ−３’及びＯＣＮ  リバースプライマー、５’−ｔｔｔｇｔａｇｇｃｇｇｔｃｔｔｃａａｇｃ−３’（アニーリング温度、６０℃）；ＯＰＧ  フォワードプライマー配列、５’−ｃｔｇｃｃｔｇｇｇａａｇａａｇａｔｃａｇ−３’及びＯＰＧ  リバースプライマー、５’−ｔｔｇｔｇａａｇｃｔｇｔｇｃａｇｇａａｃ−３’（アニーリング温度、６０℃）；ＢＳＰ  フォワードプライマー配列、５’−ａａａｇｔｇａａｇｇａａａｇｃｇａｃｇａ−３’及びＢＳＰ  リバースプライマー、５’−ｇｔｔｃｃｔｔｃｔｇｃａｃｃｔｇｃｔｔｃ−３’（アニーリング温度、６０℃）；ＯＰＮ  フォワードプライマー配列、５’−ＧＡＴＧＡＡＴＣＴＧＡＣＧＡＡＴＣＴＣＡＣ−３’及びＯＰＮ  リバースプライマー、５’−ＣＴＧＣＴＴＡＡＴＣＣＴＣＡＣＴＡＡＣＡＣ−３’（アニーリング温度、５０℃）。前記遺伝子のｍＲＮＡレベルが配列表の配列番号：１または配列表の配列番号：２のペプチドによって増加することを示す。したがって、本発明のペプチドは、造骨細胞分化マーカーであるＯＣＮ、ＯＰＮ、ＢＳＰ、及びＯＰＮの遺伝子発現を増加させることによって、造骨細胞の分化を促進することができる。
【００７０】
試験例７：合成ペプチドによる骨分化のシグナル促進効果の確認
骨分化促進に関連したシグナルであるｐＳｍａｄ１／５／８を本ペプチドが活性化するか否かを確認するために、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を６ウェルプレートに２×１０５細胞に分注して、２４時間３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。２４時間後、血清が含まれない培地に交換して、２４時間スターベーション（ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）を進行させた後、ペプチドを１０μｇ／ｍｌの濃度で処理するか、または陽性対照群として使われたＢＭＰ２は、５０ｎｇ／ｍｌで３０分間処理し、前記細胞をＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝液を入れて溶解させて、タンパク質を収得してウェスタンブロッティングを実施した。
【００７１】
前述した結果と一致するにも、本発明の配列表の配列番号：１または配列表の配列番号：２のペプチドを処理した時、Ｓｍａｄ１／５／８のリン酸化が起こるということを確認し、これは、本発明のペプチド処理によって骨形成促進シグナルが伝達されて、造骨細胞分化（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）が保持されるということを意味する（それぞれ、図９ａ及び図９ｂ）。
【００７２】
剤型例１：柔軟化粧水
前記合成例１から製造されたペプチド１またはペプチド２を含むナノソームを含み、下記の組成からなる柔軟化粧水を一般的な化粧水製造方法によって製造した。
【表２】
2016525539.tif 000004
【００７３】
剤型例２：保湿クリーム
前記合成例１から製造されたペプチド１またはペプチド２を含むナノソームを含み、下記の組成からなる栄養クリームを一般的な保湿クリーム製造方法によって製造した。
【表３】
2016525539.tif 000005
【００７４】
剤型例３：保湿化粧水
前記合成例１から製造されたペプチド１またはペプチド２を含むナノソームを含み、下記の組成からなる栄養化粧水を一般的な化粧水製造方法によって製造した。
【表４】
2016525539.tif 000006
【００７５】
剤型例４：エッセンス
前記合成例１から製造されたペプチド１またはペプチド２を含むナノソームを含み、下記の組成からなるエッセンスを一般的なエッセンス製造方法によって製造した。
【表５】
2016525539.tif 000007
【００７６】
以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者において、このような具体的な技術は、単に一具現例であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物とによって定義される。
【図１ａ】
2016525539.tif 000008
【図１ｂ】
2016525539.tif 000009
【図２ａ】
2016525539.tif 000010
【図２ｂ】
2016525539.tif 000011
【図３ａ】
2016525539.tif 000012
【図３ｂ】
2016525539.tif 000013
【図４ａ】
2016525539.tif 000014
【図４ｂ】
2016525539.tif 000015
【図５ａ】
2016525539.tif 000016
【図５ｂ】
2016525539.tif 000017
【図６ａ】
2016525539.tif 000018
【図６ｂ】
2016525539.tif 000019
【図７ａ】
2016525539.tif 000020
【図７ｂ】
2016525539.tif 000021
【図８ａ】
2016525539.tif 000022
【図８ｂ】
2016525539.tif 000023
【図９ａ】
2016525539.tif 000024
【図９ｂ】
2016525539.tif 000025
【配列表】
2016525539000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年1月21日(2016.1.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号：１または配列表の配列番号：２のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドは、ヒトＩＬ−３タンパク質から由来したことを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドは、ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル経路を抑制することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドは、ＲＡＮＫＬまたは炎症性サイトカイン−誘導された破骨細胞分化能を抑制することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドは、ＲＡＮＫＬまたは炎症性サイトカイン−誘導されたＴＲＡＰ、カテプシンＫまたはタイプ１またはタイプ２ＴＮＦ受容体の発現を抑制することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
前記炎症性サイトカインは、ＴＮＦ−α、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、またはＩＬ−７を含むことを特徴とする請求項４から５のいずれかに記載のペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドは、造骨細胞の分化を促進することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドのＮまたはＣ末端は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で構成された群から選択される保護基が結合されていることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む骨疾患改善または治療用薬剤学的組成物。
【請求項１０】
前記骨疾患は、骨多孔症、少年期骨多孔症、骨形成不全症、骨軟化症、骨壊死症、くる病、骨髄炎、歯槽骨消失、骨ページェット病、高カルシウム血症、原発性副甲状線機能亢進症、転移性骨疾患、骨髄腫、リウマチ性関節炎での骨消失、癌による骨消失、線維性骨異形成症、無形性骨疾患、代謝性骨疾患、または年齢による骨質量の消失を含むことを特徴とする請求項９に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１１】
請求項１から８のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む骨分化促進用組成物。
【請求項１２】
前記組成物は、オステオカルシン（ＯＣＮ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、またはオステオポンチン（ＯＰＮ）の発現を促進することを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【国際調査報告】
2016525539.tif 000026
2016525539.tif 000027
2016525539.tif 000028
2016525539.tif 000029
2016525539.tif 000030
2016525539.tif 000031