(57)【要約】  本発明は、病理学的プリオンタンパク質(PrPsc)によって汚染されている可能性が高い試料又は材料において、病理学的プリオンタンパク質を不活化するための方法に関し、この方法は、病理学的プリオンタンパク質によって汚染されている可能性が高い試料又は材料を少なくとも1つのメチオニンスルホキシド還元酵素と接触させることを伴う。【特許請求の範囲】
【請求項１】
病理学的プリオンタンパク質(PrPsc)によって汚染されている可能性がある試料又は材料において、病理学的プリオンタンパク質を不活化するための方法であって、病理学的プリオンタンパク質によって汚染されている可能性がある試料又は材料を、少なくとも1つのメチオニンスルホキシド還元酵素(MSR)と接触させる方法。
【請求項２】
メチオニンスルホキシド還元酵素がヒトMSRである、請求項1に記載の不活化方法。
【請求項３】
メチオニンスルホキシド還元酵素がメチオニンスルホキシド還元酵素A(MSRA)である、請求項1又は2に記載の不活化方法。
【請求項４】
メチオニンスルホキシド還元酵素がメチオニンスルホキシド還元酵素B(MSRB)である、請求項1又は2に記載の不活化方法。
【請求項５】
メチオニンスルホキシド還元酵素が天然由来のものである、請求項1から4のいずれか一項に記載の不活化方法。
【請求項６】
メチオニンスルホキシド還元酵素が合成由来のものである、請求項1から4のいずれか一項に記載の不活化方法。
【請求項７】
メチオニンスルホキシド還元酵素が遺伝子組換えによって生産された、請求項1から4のいずれか一項に記載の不活化方法。
【請求項８】
病理学的プリオンタンパク質によって汚染されている可能性がある試料が、生物学的製剤、特に血液製剤、例えば血漿又は血漿製剤である、請求項1から7のいずれか一項に記載の不活化方法。
【請求項９】
MSRで病理学的プリオンタンパク質を不活化する工程が60℃未満の温度で行われる、請求項1から8のいずれか一項に記載の不活化方法。
【請求項１０】
MSRで病理学的プリオンタンパク質を不活化する工程の前又は後に、60℃を超える温度で、病理学的プリオンタンパク質によって汚染されている可能性がある試料又は材料を熱処理する工程を更に含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の不活化方法。
【請求項１１】
NADH又はNADPHを、病理学的プリオンタンパク質によって汚染されている可能性がある試料又は材料に添加することを含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の不活化方法。
【請求項１２】
MSRが、優先的には共有結合によって、固体支持体上に、より優先的には単純な架橋によって固定化される、請求項1から11のいずれか一項に記載の不活化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病理学的プリオンタンパク質によって汚染されている可能性がある生物学的製剤又は材料において、病理学的プリオンタンパク質を不活化するための方法に関する。より詳細には、本発明は、メチオニンスルホキシド還元酵素(MSR)を用いる生物学的不活化のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プリオン病とも呼ばれる伝染性海綿状脳症(TSE)は、ヒト(例えば、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)及びクールー)及び動物(特に、羊スクレイピー及びウシ海綿状脳症)の両方に影響する中枢神経系(CNS)の変性疾患である。
【０００３】
これらの疾患の病原体は、「非従来型伝染性物質(Unconventional Transmissible Agents)」(UTA)のカテゴリーに分類される。PrPscと呼ばれる、その病理学的形態にあるプリオンのタンパク質は、プリオン病のマーカーである。このタンパク質は、現在、UTA感染の全ての事例において、特に脳において見られる感染力を担う要素として考えられている。PrPscは、健康な個体において、脳内接種によってTSEの症候を生じさせ得る。実際、PrPscの複製又は増殖の原因となる作用物質は病理学的プリオンタンパク質自体であり、なぜなら、これは、健全なプリオンタンパク質を病理学的プリオンタンパク質に変形させることによって、指数関数的に増殖又は増大し得るためである。PrPのいわゆる「病理学的」形態は、したがって、その立体構造がヒト又は非ヒト感染動物におけるTSEの発生に関連するタンパク質形態である。
【０００４】
PrPcの3次元構造と比較して修飾された、PrPscの3次元構造によって、通常の消毒及び滅菌手段(熱、化学物質、酵素等)に対する優れた耐性によって表される、非定型の物理化学的特性がもたらされる。
【０００５】
更に、TSEにおける血液感染力の存在の検出を目的とした多くの研究が、近年、行われている(Brown、P.、Vox Sanguinis(2005)89、63〜70頁を参照されたい)。この研究全体は、非常に低い血液感染力(10〜30感染単位/ml)が特定のプリオン病において実験的に実証され得ることを示す。
【０００６】
血液誘導体、例えば凝固から得られる血漿タンパク質の、製薬産業における使用は、何年にもわたって連続的に成長してきている。そして、このような製品の使用に関連する予防原則は、これらの製品内の考えられる病理学的プリオンタンパク質の除去及び/又は不活化を最も保証するために手順が体系的に設けられることを含意する。
【０００７】
プリオンタンパク質を除去するための既知の方法は、保持及び/又は濾過手段を用いることが最も多く、この手段は、目的の血漿タンパク質の同時の除去及び多かれ少なかれ顕著な除去をもたらし得ることがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】EP0264166
【特許文献２】WO2005022148
【特許文献３】WO2006117483
【特許文献４】WO2009/125139
【特許文献５】WO2010/026346
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Brown、P.、Vox Sanguinis(2005) 89、63〜70頁
【非特許文献２】Canelloら、Biochemistry 2008、47、8866〜8873頁
【非特許文献３】Tarragoら、The journal of biological chemistry Vol. 284、No. 28、18963〜18971頁、2009年7月10日
【非特許文献４】Schmidt N.J.、Emmous R.W.、Diagnostic Procedures for viral, ricketsial and chlaveydial Infection、1989、第6版
【非特許文献５】Ryuichiro Atarashiら、Prion Volume 5 Issue 3、150〜153頁、2011年7月/8月/9月
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、病理学的プリオンタンパク質に関して生物学的製剤、特に血液製剤又は血液誘導体の汚染除去を可能にし、前記生物学的製剤を劣化させない方法が実に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この状況において、本発明者らは、生物学的製剤を処理するため及び潜在的に存在する病理学的プリオンタンパク質を不活化するための、特定の酵素、すなわち、メチオニンスルホキシド還元酵素(MSR)の使用を提唱する。本発明によるMSRはまた、設備の一部分、例えば外科的機器、不活性表面、又は他の表面を処理するためにも用いられ得る。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、病理学的プリオンタンパク質(PrPsc)に汚染している可能性がある試料又は材料において病理学的プリオンタンパク質を不活化するための方法であって、病理学的プリオンタンパク質に汚染している可能性がある試料又は材料を、少なくとも1つのメチオニンスルホキシド還元酵素(MSR)と接触させる方法である。
【００１３】
特定の実施形態において、MSRは、優先的には共有結合で、固体支持体上に、より優先的には単純な架橋によって固定化される。
【００１４】
本発明によると、不活化プロセスは、生体試料、特に血液製剤又は血液誘導体を処理するために用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】メチオニンの酸化/還元反応の略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
定義
本発明の状況内において、「病理学的プリオンタンパク質」は、プリオンタンパク質(PrP)の異常な形態を意味する。プリオンタンパク質PrPは、通常、細胞内に天然の状態で存在し且つそれらの正常な働きに関与するホスファチジル糖脂質(GPI)を介して原形質膜に固定された、シアロ糖タンパク質である。タンパク質の正常な、すなわち非病理学的な形態は、通常、PrPcと呼ばれる。PrPscと呼ばれる、PrPの「病理学的」形態は、非病理学的タンパク質のアイソフォームにある(その中間体又は核形態を含む)。
【００１７】
このPrPの病理学的形態は、特に、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)に罹患した対象において見られる。特徴的には、臨床的兆候、特に組織学的病変の発生の前に長期の臨床的に無症状の潜伏期があり、その間に、プリオンタンパク質の病理学的形態PrPscが中枢神経系に蓄積する。罹患した対象において、PrPをコードする遺伝子の発現のいかなる修飾も、その翻訳のいかなる改変も実証されていない。CJDの2つの形態が、今日までに同定されている。sCJD形態は、高齢者対象(通常、およそ65歳)において自然に生じる自然発生的形態に対応する。これは、いかなる感染性の原因も同定されておらず、加齢疾患に類似している。形態vCJDは、ESBに汚染された牛を摂取したことに起因する、ヒトにおける狂牛病の発現に対応する。これは、比較的若い対象(20〜30歳)である、非常に少数の対象(世界中で228の記載例)に感染している。プリオンのこの形態は、血液を介して伝染すると考えられている。
【００１８】
「不活化」は、プリオンタンパク質が非変性プリオンタンパク質の立体構造の変化を誘発するその能力、及び/又は神経変性疾患を誘発するその能力を失うことを意味する。不活化は、ペプチド構造の分解をそれ自体が意味する、タンパク質の分解を必ずしも伴うわけではない。PrPscの不活化は、特に、プリオンタンパク質の非病理学的非変性形態に戻すことにあり得る。
【００１９】
試料又は材料の「汚染除去」は、前記試料又は材料内/上に存在し得る病理学的プリオンタンパク質が不活化することを意味する。優先的には、試料又は材料は、前記試料又は材料内のプリオンタンパク質PrPscに関連するいかなる感染力も測定することがもはや不可能である場合に、汚染除去されていると考えられる。
【００２０】
「試料」は、病理学的プリオンタンパク質で汚染されている可能性がある、及び病理学的プリオンタンパク質を含有することによって汚染されている可能性がある、任意の材料源を意味する。このような材料源は、例えば、生体試料、化粧品又は医薬品、遺伝子操作によって得られる製品、食品、飲料であり得るが、この列挙は限定的なものではない。好ましくは、これは、生体試料、例えば、生体液又は組織又は組織抽出物、例えば脊柱組織、特に脊髄である。試料はまた、ヒト又は動物源に由来する組成物、例えば、成長ホルモン又は細胞抽出物、例えば下垂体抽出物であり得る。このような組成物は、実際、病理学的プリオンタンパク質によって汚染されている可能性がある。生体液の場合では、前記組成物は血液又は誘導体、血漿、リンパ、尿、乳等であり得るが、この列挙は限定的なものではない。優先的には、試料は、血液製剤又は血液誘導体、例えば、血漿誘導体、又は血漿タンパク質の濃縮物である。
【００２１】
メチオニンスルホキシド還元酵素
MSRは、メチオニンスルホキシド(MetSO)残基を有するタンパク質の再生に関与する、多くの真核生物及び原核生物の両方に存在する酵素タンパク質である。より具体的には、MSRは、MetSOをメチオニンに還元するための反応を触媒することを可能にする。特に反応性酸素誘導体(ROS)の作用化での、タンパク質内でのメチオニンの酸化は、前記タンパク質の機能性の喪失を伴うことが多い。その病理学的形態にあるプリオンタンパク質が大量のMetSOを含有することが実証されている(Canelloら、Biochemistry 2008、47、8866〜8873頁)。
【００２２】
本発明は、前記病理学的プリオンタンパク質を不活化するための、病理学的プリオンタンパク質によって汚染されている可能性がある試料又は材料の処理におけるMSRの使用を提唱する。
【００２３】
本発明によると、用いられるMSRは、天然由来、特に植物、細菌、若しくは動物由来、又は合成若しくは半合成のものであり得る。
【００２４】
特にヒトにおいて、MSRの2つの主な形態、すなわち、メチオニン-S-スルホキシド及びメチオニン-R-スルホキシドの還元にそれぞれ関与するMSRA及びMSRBが存在する(図1を参照されたい)。より具体的には、同一の遺伝子msra(染色体8p23.1上に位置する)は、ミトコンドリア、サイトゾル、及び/又は細胞核内に存在する4つのアイソフォームMSRA1(RefSeq RNA NM_012331)、MSRA2(RefSeq RNA NM_001135670)、MSRA3(RefSeq RNA NM_001135671)、及びMSRA4(RefSeq RNA NM_001199729)をコードする。また、ヒトにおいては、ミトコンドリア、小胞体、サイトゾル、及び/又は細胞核内に存在するアイソフォームMSRB1(Ref. Seq RNA NM_016332)、MSRB2(Ref. Seq RNA NM_012228)、MSRB3.A(Ref. Seq RNA NM_198080)、及びMSRB3.B(3つの異なる変異体:Ref. Seq RNA NM_001031679、Ref. Seq RNA NM_001193460、RefSeq RNA NM_001193461によってコードされる)をそれぞれコードする3つの遺伝子msrb、すなわち、msrb1(染色体16p13.3上)、msrb2(染色体10p12上)、及びmsrb3(染色体12q14.3上)が存在する。
【００２５】
MSRは、野生型若しくは非変性のMSR、又は、非変性MSRにほぼ相同な配列を有する、組換えの、誘導された、若しくは突然変異MSRであり得る。「ほぼ相同な配列」という表現は、1つ又は複数の置換、付加、及び/又は欠失、好ましくは保存的操作にかけられた任意の配列を含む。「保存的な置換、付加、及び/又は欠失」という表現は、MSRの全体的な立体構造及び/又は生物学的活性の(MetSOからメチオニンへの還元の)いかなる大きな改変も伴わない、アミノ酸残基の、別のアミノ酸残基での任意の置き換え、付加、又は抑制を表す。保存的置換には、限定はしないが、類似の特性(例えば、形態、極性、水素結合力、酸性度、塩基性度、疎水性、及び他の特性等)を有するアミノ酸での置き換えが含まれる。類似の特性を有するアミノ酸は、当技術分野において周知である。
【００２６】
用いられるMSRは、野生型形態の活性と比較して同等の又は優れた生物学的活性を有する、野生型MSRの変異体であり得、これらの変異体には特に、天然の対立遺伝子変異に由来する変異体、及び/又は同一種の個体において天然に見られるMSRのアイソフォームに由来する変異体、及び任意の形態又は程度のグリコシル化又は任意の他の翻訳後修飾が含まれる。野生型の活性と比較して同一若しくは優れた生物学的活性を有する、及び/又は少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、更に好ましくは少なくとも90%の配列同一性を有する、MSRのホモログ又は誘導体もまた含まれる。
【００２７】
好ましい実施形態において、用いられるMSRは、ヒトMSRである。特に、MSRは、上記のヒトMSRA又はMSRBのいずれでもよい。別の典型的な実施形態において、用いられるMSRは、細菌MSRである。
【００２８】
必要に応じて由来が異なり得る、いくつかのMSRを同時に用いることも可能である。
【００２９】
本発明によるMSRは、全ての標準的な精製技術によって、ペプチド合成によって、特に、化学合成によって、化学的操作によって、又は他の技術によって調製され得る。
【００３０】
MSRが組換えMSRである場合において、MSRは、ベクターによってコードされる組換えタンパク質の発現を可能にする条件下での、宿主細胞へのベクターの移入、及びこのようにして生産されたタンパク質の回収を含む、組換えタンパク質を生産するための標準的方法を用いて得られ得る。ベクターは、当業者によって現在用いられている方法に従って調製され得、それから得られたクローンは、標準的な方法、例えばリポフェクション、エレクトロポレーション、又は熱ショックを用いて、宿主細胞内に導入され得る。宿主細胞は、特に、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、又は哺乳動物細胞であり得る。
【００３１】
MSRをトランスジェニック生物において、例えば、植物において、又はヤギ、ウサギ、若しくはブタ等の非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳において生産することも可能である。トランスジェニック哺乳動物の乳内へのMSRの分泌を可能にする、乳腺を介するMSRの分泌は、組織依存的な方法でMSRの発現を制御することを伴う。このような制御方法は、当業者に周知である。発現の制御は、タンパク質を動物の特定の組織に向かって発現させることを可能にする配列によって行われる。これらは特に、WAP、ベータカゼイン、ベータラクトグロブリンのプロモーター配列、及びペプチドシグナル配列である。トランスジェニック動物の乳から目的のタンパク質を抽出するための方法は、特許EP0264166において記載されている。
【００３２】
遺伝子の選択的スプライシングに特に起因する任意の既存のMSRアイソフォームが用いられ得る。また、MSRとして、非変性MSRの生物学的に活性な部分を用いることも可能である。「生物学的に活性な部分」は、用いられるMSRが、非変性タンパク質の活性に少なくとも同等の生物学的活性(MetSOからメチオニンへの還元)を有することを意味する。
【００３３】
本発明によると、例えば、
-  配列番号1のヌクレオチド配列から合成され得る、MSRA1をコードする配列番号2の配列、
-  配列番号3のヌクレオチド配列から合成され得る、MSRA2をコードする配列番号4の配列
-  配列番号5のヌクレオチド配列から合成され得る、MSRA3をコードする配列番号6の配列
-  配列番号7のヌクレオチド配列から合成され得る、MSRA4をコードする配列番号8の配列
等の配列を例えば含む、ヒト由来のMSRAを用いることが可能である。
【００３４】
別の例において、
-  配列番号9のヌクレオチド配列から合成され得る、MSRB1をコードする配列番号10の配列
-  配列番号11のヌクレオチド配列から合成され得る、MSRB2をコードする配列番号12の配列
-  配列番号13のヌクレオチド配列から合成され得る、MSRB3Aをコードする配列番号14の配列
-  配列番号15、配列番号17、又は配列番号19のヌクレオチド配列からそれぞれ合成され得る、MSRB3の3つの変異体に対応する配列番号16、配列番号18、又は配列番号20の配列
等の配列を例えば含む、ヒト由来のMSRBが用いられる。
【００３５】
典型的な特定の適用において、用いられるMSRは、配列番号2、配列番号4、配列番号6、及び配列番号8のペプチド配列から選択されるヒトMSRAのアイソフォームの1つの、少なくとも1つの生物学的に活性な部分を含む。
【００３６】
別の典型的な特定の適用において、用いられるMSRは、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、及び配列番号20のペプチド配列から選択されるヒトMSRBのアイソフォームの1つの、少なくとも1つの生物学的に活性な部分を含む。
【００３７】
特定の例において、MSRは組換え酵素である。
【００３８】
別の例において、それぞれが上記のヌクレオチド配列の1つから合成された、及び/又はそれぞれが上記のペプチド配列の1つの少なくとも1つの生物学的に活性な部分を有する、少なくとも2つのMSRの組み合わせが用いられる。実際、特定の条件下で、MSRA及びMSRBの相乗的活性は、それらを同時に用いる場合に観察される。この場合において、MSRは、例えば処理対象の試料の性質に応じて、同一の又は異なる量で添加され得る。
【００３９】
試料又は材料の処理
本発明によると、処理対象の試料又は材料を、潜在的に存在する病理学的プリオンタンパク質の不活化を可能にするために十分な時間にわたり、少なくとも1つのMSRと接触させる。優先的には、試料を、10分と120分との間に含まれる時間にわたり、より優先的には15分と60分との間に含まれる時間にわたり、MSRと接触させる。
【００４０】
優先的には、接触は、感染量(infectious load)が、当業者に周知の技術、例えばウェスタンブロット又は感染力試験で測定可能な力価より低く低減するまで維持される。
【００４１】
有利には、処理対象の試料又は材料とMSRとの接触は、アルカリ性pHで、優先的には8を超えるpHで、より優先的には9を超えるpHで行われる。
【００４２】
典型的な実施形態において、MSRは、処理対象の試料に直接添加され得る、固体又は液体組成物の形態である。外科的機器等の設備の一部分の場合では、前記設備の一部分は、MSRを含む溶液内に浸され得る。
【００４３】
処理対象の試料が液体試料である場合、試料をMSRと接触させる工程は、PrPscの不活化を最適化するために、撹拌、例えば機械的撹拌を用いて行われ得る。
【００４４】
優先的には、本発明による方法は、100℃未満の温度、より優先的には80℃未満、より優先的には60℃未満の温度で行われる。
【００４５】
特定の場合において、特に非生体試料の処理では、MSRでPrPscを不活化する工程から上流及び/又は下流で、特に60℃を超える温度、優先的には80℃を超える温度、より優先的には100℃を超える温度での熱処理工程を提供することが可能である。
【００４６】
特定の場合では、MSRの使用は、タンパク質を変性させ得る化学的化合物、例えば洗剤、特にドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、又はカオトロピック塩、特に尿素及びグアニジン塩の、同時又は同時ではない使用と組み合わせられ得る。
【００４７】
場合によって、本発明の不活化方法は、NADH又はNADPHの存在下で適用される。この特定の実施形態において、本発明の方法は、したがって、NADH又はNADPHの、好ましくは病理学的プリオンタンパク質で汚染されている可能性がある試料、例えば血漿又は血漿製剤への添加を更に含む。
【００４８】
NADH又はNADPH(水素化されたジヌクレオチドアデニンニコチンアミド又は水素化されたジヌクレオチドアデニンニコチンアミドリン酸)は、細胞内経路内に存在する補酵素であり、細胞内での生合成反応において用いられる電子の主な源である。これはまた、酸化ストレス及び反応性酸素種に対する保護のためのメカニズムにおいて用いられる。
【００４９】
1つの実施形態において、不活化を増幅させるために、酸化還元酵素、より詳細にはチオレドキシン(Trx)を試料に添加することによって、MSRを再生させることが可能である(Tarragoら、The journal of biological chemistry Vol. 284、No. 28、18963〜18971頁、2009年7月10日)。優先的には、Trxの添加は、NADPHを同時に又は連続的に添加することによって行われる。酸化還元酵素は、処理対象の試料に、MSRと同時に、又は試料内でのMSRの反応時間の後に、又は特定の場合ではMSRを添加する前に、添加され得る。
【００５０】
産業的適用に適した1つの実施形態において、MSRは、当業者に知られている様々な固定化技術に従って固定化される。次いで、MSRを処理対象の試料と接触させることができる。これらの様々な固定化技術は、製品におけるMSRの移動を予防し、特定の精製工程を省く可能性をもたらす。これらの異なる技術を用いて、MSRはまた再利用され得、適用された方法の費用有効性を提供し得る。
【００５１】
典型的には、MSRは、MSR上で利用可能な第一級アミンとアミド結合を生成するために事前に活性化された固体支持体上に共有結合によって固定化される。臭化シアンによって誘発されるアミド化では、セルロース、アガロース、及びセファロース等の多糖型の支持体、並びにシリカゲル又は多孔性ガラスの形態の支持体が優先的に用いられる。カルボジイミドでの活性化によるアミド化では、酸性支持体、特に機能化されたシリカ又はプラスチックが優先的に用いられる。クロロギ酸エチルでの活性化によるアミド化では、ジオール支持体、特に多糖、シリカゲル、又は多孔性のガラスが優先的に用いられる。
【００５２】
特に、MSRは、架橋剤、特にグルタルアルデヒドによる単純な架橋によって固定化される。
【００５３】
適用
本発明による方法は、病理学的プリオンタンパク質を含有し得る固体又は液体の任意の種類の試料又は材料を処理するために用いられ得る。
【００５４】
特に、本発明による方法は、任意の液体、食品、又は生物学的製剤、設備の一部分、装置、機器等に適用され得る。
【００５５】
例えば、本発明によるMSRは、医療設備、例えば外科的機器を滅菌するための方法において用いられ得る。また、MSRは、表面、特に、PrPscによって汚染されている可能性がある製品が処理される特定の工場/製造所の実験台又は床を消毒するために用いられ得る。
【００５６】
MSRはまた、医薬品組成物又は化粧品組成物、特に血液由来製品を含む組成物の調製の間に用いられ得る。
【００５７】
また、MSRは、食品、特に、肉製品又は乳等の動物から得られる製品を含む食品を調製及び/又は調整するための方法において用いられ得る。
【００５８】
感染力の滴定による不活化方法の検証
本発明による方法による、試料又は材料における病理学的プリオンタンパク質の不活化の効率は、そのマーカーがまさに前記病理学的立体構造タンパク質である感染力の滴定によって確認され得る。
【００５９】
試料、特に生体試料の場合では、滴定前の前記試料のいくつかの希釈、最も具体的には連続希釈又は逐次希釈を進めることが可能である。これらの希釈によって、感染力の定量の精度を上げることが可能になる。例えば、処理対象の試料は等比級数に従ってロード緩衝液内に希釈され、これは「希釈工程」とも呼ばれる。希釈工程は、好ましくは3つである。各希釈点を、次いで、病理学的プリオンタンパク質の検出のための試験にかける。比較の目的で、同一の滴定を非処理対象試料に平行して行うことが可能である。
【００６０】
滴定は、当業者に知られている任意の滴定方法によって行われ得る。特に、滴定は、文献WO2005022148及びWO2006117483(特に、参照例A及び参照例B)において記載されている「TCIA」と呼ばれる方法のモデル、又は「TCIA」と出願WO2009/125139において記載されている「PMCA」とを組み合わせる方法のモデルで行われ得る。
【００６１】
本発明の1つの実施形態において、力価を計算するための方法は、Spearman - Karber(Schmidt N.J.、Emmous R.W.、Diagnostic Procedures for viral, ricketsial and chlaveydial Infection、1989、第6版)の方法である。この方法は、試験対象試料の希釈が等比級数に従うこと、すなわち逐次希釈間に定数比があること、及び、各希釈の一定容積(通常、0.150ml)が少なくとも5つのウェルに播種されることを前提とする。最近用いられている希釈係数は10進法係数である。この方法は、特許出願WO2010/026346において詳述されている。
【００６２】
本発明の方法は、以下の、本発明の範囲を限定しないさらなる記載によってより良く理解されよう。
【実施例】
【００６３】
(実施例1)
MSRA又はMSRB2による病原性プリオンの不活化の試験
様々なMSR濃度を、PrPc/PrPscの混合物を含有するミンチした脳の試料内でインキュベートし、MSRの影響を、ウェスタンブロットで分析されたプロテイナーゼKに対する耐性の半定量的用量によって測定する。より詳細には、補酵素の役割を有するNADH又はNADPHの量を、インキュベーション培地に添加し得る。
【００６４】
材料
ミンチした脳は感染性形態のプリオンを含有し、用いられるMSRA又はMSRB2は、36U/mg(1ユニットは、30℃でpH7.4で1μmolのNADPHの酸化をもたらし、すなわち2×3.6IUである)の比活性度を有する1mg/mlで95%まで精製された2×100μgのMSRA又はMSRB2(Abcam社)から調製されたクライオチューブの形態である。チューブは0.5IU当たりのアリコートを提供し、したがって、総数14である。
【００６５】
プロテイナーゼKでの試験
プロテイナーゼKでの試験を用い、その後、ウェスタンブロットで発現させてPrPscを検出した。実際、PrPscは、プロテアーゼに基づく処理に対してより耐性である。したがって、プロテイナーゼによる消化は、ウェスタンブロットの予備工程であり、主にPrPcを消化する。その後の検出工程は、したがって、非病理学的形態のタンパク質がプロテアーゼによって消化されているため、非病理学的形態のタンパク質をもはや検出しない。
【００６６】
方法
i)ミンチされた脳試料を、プロテイナーゼKに対する感度試験のために、リン酸ナトリウム緩衝液(二ナトリウムリン酸塩)50mM、pH=7.5、50mMのNaCl(希釈緩衝液)内で、2つの分析可能最低濃度まで希釈し、
ii)1mlの各濃度内の50μlの希釈緩衝液でクライオチューブをすすぐことによって、0.5IU又は1IU(1つのクライオチューブ又は2つのクライオチューブ)を、すなわち、プリオン濃度当たり2つの酵素濃度を添加する。各試料は、独立して、且つ2組ずつ作製する(全体で8つの試料)。60μlの希釈緩衝液を添加した、同一希釈のいかなる酵素も有さない1mlの対照もまた作製し(2つの試料)、
iii)10個のチューブを、1時間、37℃でインキュベートし、
iv)プロテイナーゼKに対する感度試験を、各試料について行う。
【００６７】
(実施例2)
MSRA又はMSRB2による病原性プリオンの不活化の試験
この実施例において、様々なMSRA及び/又はMSRB2濃度を、PrPc/PrPscの混合物を含有するミンチされたヒト脳の試料内でインキュベートし、MSRの影響を、RT-QuiC(「real-time quaking induced conversion」)技術(Ryuichiro Atarashiら、Prion Volume 5 Issue 3、150〜153頁、2011年7月/8月/9月)によってPrPscの増幅の遅延を測定することによって分析する。補酵素の役割を有する一定量のNADH又はNADPHを、特定の場合では、インキュベーション培地内に添加する。
【００６８】
材料及び方法
ミクロソーム画分の調製
Institut du Cerveau et de la Moelle Epiniere(ICM - Hopital Pitie Salpetriere、パリ、フランス)で入手可能な、散発性クロイツフェルト・ヤコブ病(sCJD)又は変異型クロイツフェルト・ヤコブ病(vCJD)で死亡した患者のヒト脳の試料を用いた。
【００６９】
試料を粉砕し、PBS内に入れ、次いで、1回目の遠心分離(室温、すなわち約25℃で、350×gで5分)によって澄明化した。
【００７０】
上清を回収し、次いで、2回目の遠心分離(室温で、10,000×gで10分)にかけた。
【００７１】
この2回目の遠心分離の最後に上清を回収し、超遠心分離(4℃で、100,000×gで1時間)にかけた。
【００７２】
ペレットを100μlのPBS(vCJD試料)又は200μlのPBS(sCJD試料)内に入れた。
【００７３】
陽性対照
各実験は、関連するミクロソーム画分の処理条件と同一の処理条件下(緩衝液、環境、温度、MSR-A濃度)で作製された陽性対照を用いて完了した。陽性対照は酸化型タンパク質(MS01、Oxford Biomedical Research社)を含有しており、そのメチオニンスルホキシドレベルについて、スルホキシドメチオニンの高度に特異的なウサギポリクローナル抗体によるウェスタンブロットによってモニタリングした。
【００７４】
酵素
pH7.4で30℃で1μモルのNADPHの酸化をもたらす単位である、36U/mg((1ユニットは、30℃でpH7.4で1μmolのNADPHの酸化をもたらす)の比活性度を有する、1mg/mlで95%まで精製された活性な組換えヒトMSRA(ab82728、Abcam(登録商標))を、1/10及び1/100まで希釈した。
【００７５】
1nmolの酵素が37℃で1分の間に3nmolのメチオニンスルホキシド結合の還元を可能にするような非活性度を有する、1mg/mlで90%まで精製された活性な組換えヒトMSRB2(ab95916、Abcam(登録商標))を、1/10及び1/100まで希釈した。
【００７６】
両MSRの酵素活性を、参照タンパク質(MSo1B、Oxford Biomedical Research社)をNADPHの存在下で前記酵素と接触させることからなる活性試験によって検証した。分析は、メチオニンスルホキシドの高度に特異的なウサギポリクローナル抗体によるウェスタンブロットによって行った。メチオニンスルホキシドの顕著な還元を、MSRのいずれか一方で処理された試料において、対照試料と比較して確認した。
【００７７】
NADPH(N9660、Sigma Aldrich社)を用いる実験の全てにおいて、0.01NのNaOH内に懸濁したNADPHを、500μg/ml(すなわち、600nmol/ml)となるように用いた。使用の前に、NADPHを、60nmol/mlとなるようにPBS内に希釈した。
【００７８】
試料の調製
実験は、酵素濃度(1/10及び1/100までの希釈)のそれぞれについて、2つの異なる濃度のミクロソーム画分vCDJ及びsCDJ(dil -5(10-5)及びdil -2(10-2))を用いて行い、5μlのNADPHの存在又は不存在下(+NADPH/-NADPH)で、基質/酵素比率に従って作用するようにした。
【００７９】
MSRA又はMSRB2で1時間処理した後、試料を、マトリクスの影響を最も排除しながらも分析工程のために滴定され得るプリオン濃度を維持するように、調製物dil -5(10-5)では1/100まで、調製物dil -2(10-2)では1/1000まで、再び希釈した。
【００８０】
2つの陰性対照(5μlのMSRA 1/10+5μlのPBS+5μlのNADPH、5μlのMSRB2 1/10+5μlのPBS+5μlのNADPH)もまた分析した。
【００８１】
各実験を3回ずつ行った。
【００８２】
RT-Quic技術
分析を、Atarashiら、2011において示されるような「RT-Quic」方法を用いて行った。要約すると、この方法は、試料内での正常なプリオンタンパク質(PrPc)から異常なプリオンタンパク質(PrPsc)への変換の増幅に基づく。試料内でのチオフラビンT(ThT)の存在に関連する蛍光発光を次いで測定する。ThTを、PrPcからPrPscへの変換の間に、試料内の新たに形成されたアミロイド線維に組み込んだ。この方法によって、異常なPrPの全形態の検出が可能になり、情報がリアルタイムで提供される。
【００８３】
MSRで処理した試料において、未処理対照で観察される増幅時間に関して、増幅の遅延が観察されることが予想される。結果を分析するために、TT(閾値時間)の概念を、増幅曲線の値が、陰性対照で観察された値を超える値である60,000FU(蛍光単位)に任意で設定された閾値を超える時間であると定義した。各条件で(プリオンのタイプ、ミクロソーム画分の希釈、及び分析前の希釈)、TTを陽性対照で観察された結果から定義し、参照として用いた。参照間隔のTTの最大値より大きい、処理対象試料についてのTT値は、対照試料内に存在するPrPscの量よりも顕著に少ない量のPrPscに対応する。この差は、したがって、MSRの活性の結果である、PrPscの増幅の遅延を実証する。
【００８４】
結果
分析対象試料についての増幅の遅延の結果を、以下の表にまとめる。
【００８５】
【表１】
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【００８６】
【表２】
2016528169.tif 000003
【００８７】
したがって、体系的な遅延が、MSRで処理したvCDJ試料において観察される。NADPHの存在下での実質的により顕著な影響が、「スチューデント検定」によって統計的に検証された。
【００８８】
【表３】
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【００８９】
体系的な遅延が、MSRAで処理したsCDJ試料においても観察される(いかなる分析希釈も有さない試料における対照で21〜34.5に対して35〜46、分析希釈1/1000の対照で5〜21に対して22〜68、以下のTable 4(表4)を参照されたい)。
【００９０】
【表４】
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【００９１】
NADPHの存在下での実質的により顕著な影響もまた観察された(表では報告していない)。
【００９２】
異常なプリオンタンパク質を増幅させるための活性の低減は、外因性MSRで処理した試料において実際に観察される。更に、影響は、NADPHの存在下で向上する。更に、MSRA及びMSRBの相乗的影響が、これら2つの酵素で処理した試料において得られると予想される。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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