(57)【要約】穀物収量を増加させるために有用な育種法が本明細書に開示される。本明細書において、現代のインディカ品種の穀物収量を増加させることが示され、改善された穀物の開発を補助するために用いられ得る新規な遺伝子であるSPIKEが開示される。また、本明細書において、現代のインディカ品種の穀物収量を増加させるための材料及び方法も開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
改善された穀物収量を有する後代イネを生産するための方法であって、
a）SPIKE遺伝子を含む第一のイネを提供するステップ、
b）第一のイネを第二のイネと交雑させて後代イネを生産するステップ、
c）SPIKE遺伝子について第二のイネを分析するステップ、
d）SPIKE遺伝子を含み、第二のイネに対して改善された穀物収量を有する後代イネを同定し選択するステップ、
を含む、上記方法。
【請求項２】
SPIKE遺伝子が、配列番号1、配列番号2、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、及び配列番号102からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
SPIKE遺伝子が、配列番号1、配列番号2、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、及び配列番号102からなる群より選択される配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一であるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
SPIKE遺伝子が、配列番号2と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一であるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
SPIKE遺伝子が、RM5503、RM3423、及びInd4からなる群より選択される第一の上流分子マーカー、並びにRM6909、AGT3、RM17487、RM17486、及びInd12からなる群より選択される第二の下流分子マーカーを検出することにより同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
SPIKE遺伝子が、RM3423、及びInd4からなる群より選択される第一の上流分子マーカー、並びにAGT3、RM17487、RM17486、及びInd12からなる群より選択される第二の下流分子マーカーを検出することにより同定され、第一の上流及び第二の下流分子マーカーが、表１に記載された対応するフォワード及びリバースプライマーを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
SPIKE遺伝子が、約105塩基対の第一の分子マーカーであるInd2、及び約252塩基対の第二の分子マーカーであるRM17487を検出することによって同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
SPIKE遺伝子が、約105塩基対の第一の分子マーカーであるInd2（フォワードプライマー：ACAAGAAGCCGGGAAACCTA（配列番号27）、リバースプライマー：CTCCTCCGGTCCTCCTTAAC（配列番号28））、及び約252塩基対の第二の分子マーカーであるRM17487（フォワードプライマー：CGGAGCATGTGGAGAGGAACTCG（配列番号55）、リバースプライマー：GGAGAGGGCAAGGGCTTCTTCG（配列番号56））を検出することによって同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
穀物収量が改善された純系のイネを生産する方法であって、
a）請求項１に記載の方法に従って、穀物収量が改善されたイネを生産するステップ、
b）ステップa）で生産されるイネを、それ自身と又は他のイネと交雑して後代イネ種子を得るステップ、
c）ステップb）の後代イネ種子を成長させて穀物収量が改善されたさらなるイネを得るステップ、並びに
d）交雑及び成長ステップを0〜7回反復して穀物収量が改善された純系のイネを作成するステップ、
を含む、上記方法。
【請求項１０】
ステップc）が、改善された穀物収量を示すイネを同定及び選択するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ホモ接合型の純系イネを選択するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
穀物収量が改善されたイネを生産するための方法であって、
a）SPIKE遺伝子を含む第一のイネを提供するステップ、
b）SPIKE遺伝子をコードする核酸を、第一のイネから第二のイネへ移行させるステップ、
c）SPIKE遺伝子について第二のイネを分析するステップ、
d）SPIKE遺伝子を含み、移行前の第二のイネと比べて改善された穀物収量を示す第二のイネを同定及び選択するステップ、
を含む、上記方法。
【請求項１３】
SPIKE遺伝子が、配列番号1、配列番号2、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、及び配列番号102からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
SPIKE遺伝子が、配列番号1、配列番号2、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、及び配列番号102からなる群より選択される配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一であるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
SPIKE遺伝子が、配列番号2と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一であるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
SPIKE遺伝子が、RM5503、RM3423、及びInd4からなる群より選択される第一の上流分子マーカー、並びにRM6909、AGT3、RM17487、RM17486、及びInd12からなる群より選択される第二の下流分子マーカーを検出することにより同定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
SPIKE遺伝子が、RM3423、及びInd4からなる群より選択される第一の上流分子マーカー、並びにAGT3、RM17487、RM17486、及びInd12からなる群より選択される第二の下流分子マーカーを検出することにより同定され、第一の上流及び第二の下流分子マーカーが、表１に記載された対応するフォワード及びリバースプライマーを用いて検出される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
SPIKE遺伝子が、約105塩基対の第一の分子マーカーであるInd2、及び約252塩基対の第二の分子マーカーであるRM17487を検出することによって同定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
SPIKE遺伝子が、約105塩基対の第一の分子マーカーであるInd2（フォワードプライマー：ACAAGAAGCCGGGAAACCTA（配列番号27）、リバースプライマー：CTCCTCCGGTCCTCCTTAAC（配列番号28））、及び約252塩基対の第二の分子マーカーであるRM17487（フォワードプライマー：CGGAGCATGTGGAGAGGAACTCG（配列番号55）、リバースプライマー：GGAGAGGGCAAGGGCTTCTTCG（配列番号56））を検出することによって同定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
第一のイネから第二のイネへの核酸の移行が、SPIKE遺伝子を含む子孫植物を生産するための第一のイネと第二のイネとの交雑によって行われ、ステップc）及びd）が、一以上の子孫植物に対して行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
第一のイネから第二のイネへの核酸の移行が、遺伝子組換え法によって、交雑によって、戻し交雑によって、原形質融合によって、倍化半数体技術によって、又は胚救出（embryo rescue）によって行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
戻し交雑が、SPIKE遺伝子の遺伝子移入、及び少なくとも85%、少なくとも87%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも94%、少なくとも96%、又は少なくとも98%の第二のイネのゲノムの回復をもたらす、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
第二のイネのゲノムの回復が、92%〜97%である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ステップd）が、第二のイネを、穀物収量を測定するためのバイオアッセイに供するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１２に記載の方法によって生産される穀物収量が改善されたイネ、又はその一部であって、SPIKE遺伝子を含み、SPIKE遺伝子がその天然の遺伝的背景に存在しない、上記イネ又はその一部。
【請求項２６】
第一のイネが、新植物タイプ（New Plant Type（NPT））品種YP9由来のイネの同質遺伝子系統から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２７】
第一のイネが、イネ（Oryza sativa）亜種の熱帯ジャポニカから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２８】
第一のイネがダリンガン（Daringan）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２９】
第二のイネが、イネ（Oryza sativa）亜種のインディカから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項３０】
第二のイネが、PSBRc18、チヘラン（Ciherang）、TDK1、BR11、及びスワルナ（Swarna）からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
a）少なくとも一つの植物プロモーター、及び
b）SPIKEタンパク質（配列番号3）の配列と少なくとも70%同一であるポリペプチド配列をコードする少なくとも一つのポリヌクレオチド、
を含む遺伝子組換え植物細胞であって、該プロモーター及びポリヌクレオチドが作動可能に連結されており、植物細胞の染色体DNAに組込まれている、上記遺伝子組換え植物細胞。
【請求項３２】
細胞のタイプが、イネ、コムギ、ソルガム、及びトウモロコシからなる群より選択される、請求項３１に記載の遺伝子組換え植物細胞。
【請求項３３】
植物細胞が、SPIKE遺伝子についてホモ接合型である、請求項３１に記載の遺伝子組換え植物細胞。
【請求項３４】
請求項３１に記載の複数の細胞を含む、遺伝子組換え植物。
【請求項３５】
a）少なくとも一つの植物プロモーター、及び
b）SPIKEの配列と少なくとも70%同一である少なくとも一つのポリヌクレオチド配列であって、該SPIKEのポリヌクレオチド配列が、配列番号1、配列番号2、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、及び配列番号102からなる群より選択される配列を含む、上記ポリヌクレオチド配列、
を含む遺伝子組換え植物であって、該プロモーター及びポリヌクレオチドが作動可能に連結されており、植物細胞の染色体DNAに組込まれている、上記遺伝子組換え植物。
【請求項３６】
植物が、イネ、コムギ、ソルガム、及びトウモロコシからなる群より選択される、請求項３５に記載の遺伝子組換え植物。
【請求項３７】
植物が、イネである、請求項３６に記載の遺伝子組換え植物。
【請求項３８】
ポリヌクレオチド配列が、SPIKEの配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一である、請求項３５に記載の遺伝子組換え植物。
【請求項３９】
植物が、SPIKE遺伝子についてホモ接合型である、請求項３５に記載の遺伝子組換え植物。
【請求項４０】
請求項３５に記載の植物の種子。
【請求項４１】
請求項３５に記載の植物の、植物の一部。
【請求項４２】
前記植物が、対応する非遺伝子組換え植物に対して増加したm2あたり穀物収量、対応する非遺伝子組換え植物に対して増加した一穂あたり籾数、及び対応する非遺伝子組換え植物に対して増加した止葉幅からなる群より選択される表現型を示す、請求項３５に記載の遺伝子組換え植物。
【請求項４３】
遺伝子組換え植物を選択するための方法であって、
a）増加した穀物収量について集団をスクリーニングするステップであって、集団中の植物が、その染色体DNAに組込まれた組換えDNAを有する少なくとも一つの遺伝子組換え植物細胞を含み、前記組換えDNAが、SPIKEの配列と少なくとも70%同一であるポリヌクレオチド配列のオープンリーディングフレームに機能的に連結され植物細胞において機能的であるプロモーターを含み、少なくとも一つの遺伝子組換え植物細胞を含む前記集団の個々の植物が、少なくとも一つの遺伝子組換え植物細胞を含まない対照植物における穀物収量と同等以上の穀物収量を示す上記ステップ、及び
b）該集団から、少なくとも一つの遺伝子組換え植物細胞を含まない対照植物における穀物収量より高い穀物収量を示す一以上の植物を選択するステップ、
を含む、上記方法。
【請求項４４】
ステップb）で選択された一以上の植物から種子を回収するステップをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
a）前記組換えDNAが選択された植物に安定に組込まれることを確認するステップ、
b）SPIKEの配列と少なくとも70%同一であるポリヌクレオチド配列の発現を決定するために選択された植物の組織を分析するステップであって、該SPIKEのポリヌクレオチド配列が、配列番号1、配列番号2、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、及び配列番号102からなる群より選択される配列を含む上記ステップ、
をさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
ポリヌクレオチド配列が、SPIKEの配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
遺伝子組換え植物が、イネ、コムギ、ソルガム、及びトウモロコシからなる群より選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
遺伝子組換え植物が、イネである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
穀草において穀物収量を増加させる方法であって、
a）SPIKE遺伝子と対応するポリヌクレオチド配列を含む染色体DNAを含む穀草の第一の変種の植物を、SPIKE遺伝子と対応するポリヌクレオチド配列を含む染色体DNAを含まない穀草の第二の変種と交雑するステップであって、該SPIKE遺伝子と対応するポリヌクレオチド配列が、配列番号1、配列番号2、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、及び配列番号102からなる群より選択される配列を含む上記ステップ、
b）SPIKE遺伝子と対応するポリヌクレオチド配列を含む染色体DNAを有する一以上の後代植物を選択するステップ、
c）選択された後代植物を戻し交雑し、戻し交雑後代植物を生産するステップ、
d）SPIKE遺伝子と対応するポリヌクレオチド配列を含む染色体DNAを有する一以上の戻し交雑後代交配植物を選択するステップ、
e）ステップc）及びステップd）を一回以上反復し、SPIKE遺伝子と対応するポリヌクレオチド配列を含む染色体DNA、並びに穀草の第一の変種と交雑する前の穀草の第二の変種の生理学的及び形態学的特徴の全てを有する、第三の又はそれ以降の世代の戻し交雑後代植物を生産するステップ、
を含む、上記方法。
【請求項５０】
穀草が、イネ、コムギ、ソルガム、及びトウモロコシからなる群より選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
穀草が、イネである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
穀草の第一の変種が、新植物タイプ（New Plant Type（NPT））品種YP9由来のイネの同質遺伝子系統から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
穀草の第一の変種が、イネ（Oryza sativa）亜種の熱帯ジャポニカから選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
穀草の第一の変種が、ダリンガン（Daringan）である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
穀草の第二の変種が、イネ（Oryza sativa）亜種のインディカから選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
穀草の第二の変種が、PSBRc18、チヘラン（Ciherang）、TDK1、BR11、及びスワルナ（Swarna）からなる群より選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
SPIKEに対応するポリヌクレオチド配列の検出が、遺伝子マーカーを用いて行われる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５８】
SPIKE遺伝子に対応するポリヌクレオチド配列の検出が、RM5503、RM3423、及びInd4からなる群より選択される第一の上流分子マーカー、並びにRM6909、AGT3、RM17487、RM17486、及びInd12からなる群より選択される第二の下流分子マーカーを検出することを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
SPIKE遺伝子に対応するポリヌクレオチド配列の検出が、RM3423、及びInd4からなる群より選択される第一の上流分子マーカー、並びにAGT3、RM17487、RM17486、及びInd12からなる群より選択される第二の下流分子マーカーを検出することを含み、第一の上流及び第二の下流分子マーカーが、表１に記載された対応するフォワード及びリバースプライマーを用いて検出される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
SPIKE遺伝子に対応するポリヌクレオチド配列の検出が、約105塩基対の第一の分子マーカーであるInd2、及び約252塩基対の第二の分子マーカーであるRM17487を検出することを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
SPIKE遺伝子に対応するポリヌクレオチド配列の検出が、約105塩基対の第一の分子マーカーであるInd2（フォワードプライマー：ACAAGAAGCCGGGAAACCTA（配列番号27）、リバースプライマー：CTCCTCCGGTCCTCCTTAAC（配列番号28））、及び約252塩基対の第二の分子マーカーであるRM17487（フォワードプライマー：CGGAGCATGTGGAGAGGAACTCG（配列番号55）、リバースプライマー：GGAGAGGGCAAGGGCTTCTTCG（配列番号56））を検出することを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
請求項４０に記載の種子を栽培するステップを含む、穀草植物を栽培するための方法。
【請求項６３】
請求項４１に記載の植物の一部を栽培するステップを含む、穀草植物を栽培するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、2013年2月1日に出願された米国仮出願番号61/759,408に対して優先権を主張し、その全開示を、全ての目的のために参照により本明細書に明示的に組み込む。
【背景技術】
【０００２】
世界の人口は、2050年には90億を超えると予想されている。この増加の大部分は、アジア及びアフリカの発展途上国で起こると考えられる。2035年までに、増加する人口を養うために、コメの生産の26%の増加が不可欠であると予測されている。緑の革命は1960年代に穀物生産の増加をもたらしたが、それ以降、コメの潜在収量を増加させる大きな進展はない。
【０００３】
コメ（オリザ・サティバ（Oryza sativa）L.）は、主にアジアにおいて、30億以上の人々の主食である。インディカ品種は、中国南部、東南アジア、及び南アジアにおいて栽培され、世界のコメ生産地域の約70%を占めているのに対し、ジャポニカ品種は主に東アジアで生育されている。都市化及び工業化のために、インディカ品種の収量の増加は、東南アジア及び南アジアにおいて喫緊の課題である。さらに、高品質の穀物（市場価値に影響する）及び高い収量は、その地方における新品種の採用にとって不可欠である。
【０００４】
イネの穀物収量は、一穂あたり籾数、植物当たり穂数、千粒重、及び稔実率によって決定される。収量構成要素についての多くの量的形質遺伝子座が同定されているが、これまでに単離されている遺伝子は少数である。現在までに、イネ収量関連形質について、少なくとも9つの遺伝子又は遺伝子座が自然変種から同定されている：一穂籾数についてはGn1a 及びAPO1；穀物のサイズについてはGS3、GW2、及びqSW5；籾の着粒構造についてはDEP1及びWFP；強い茎についてはSCM2；並びに晩生及び一穂あたり籾数についてはGhd7、AP01、SCM2、DEP1は、圃場試験においてジャポニカを遺伝的背景とする系統のコメ収量を増加させた。しかしながら、インディカ品種において穀物収量を増加させる遺伝子を同定した報告はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
インディカ品種において穀物収量を増加させる遺伝子の同定により、より高い収量の品種を作成し、高まるコメの生産増加への需要を満たすことが可能になる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、改善された穀物収量を有する後代イネを生産するための方法であって、SPIKE遺伝子を含む第一のイネを提供するステップ、第一のイネを第二のイネと交雑させて後代イネを生産するステップ、SPIKE遺伝子について第二のイネを分析するステップ、SPIKE遺伝子を含み、第二のイネに対して改善された穀物収量を示す後代イネを同定し選択するステップ、を含む上記方法を提供されている。
【０００７】
SPIKE遺伝子が、配列番号1、配列番号2、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、及び配列番号102からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む方法も、同様に提供されている。
【０００８】
SPIKE遺伝子が、配列番号1、配列番号2、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、及び配列番号102からなる群より選択される配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一であるポリヌクレオチド配列を含む方法も、同様に提供されている。
【０００９】
SPIKE遺伝子が、配列番号2と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一であるポリヌクレオチド配列を含む方法も、同様に提供されている。
【００１０】
SPIKE遺伝子が、RM5503、RM3423、及びInd4からなる群より選択される第一の上流分子マーカー、並びにRM6909、AGT3、RM17487、RM17486、及びInd12からなる群より選択される第二の下流分子マーカーを検出することにより同定される方法も、同時に提供されている。
【００１１】
SPIKE遺伝子が、RM3423、及びInd4からなる群より選択される第一の上流分子マーカー、並びにAGT3、RM17487、RM17486、及びInd12からなる群より選択される第二の下流分子マーカーを検出することにより同定され、第一の上流及び第二の下流分子マーカーが、表１に記載された対応するフォワード及びリバースプライマーを用いて検出される方法も、同様に提供されている。
【００１２】
SPIKE遺伝子が、約105塩基対の第一の分子マーカーであるInd2（フォワードプライマー：ACAAGAAGCCGGGAAACCTA（配列番号27）、リバースプライマー：CTCCTCCGGTCCTCCTTAAC（配列番号28））、及び約252塩基対の第二の分子マーカーであるRM17487（フォワードプライマー：CGGAGCATGTGGAGAGGAACTCG（配列番号55）、リバースプライマー：GGAGAGGGCAAGGGCTTCTTCG（配列番号56））を検出することによって同定される方法も、同様に提供されている。
【００１３】
本発明は、穀物収量が改善された純系のイネを生産する方法であって、本明細書で提供される方法に従って、穀物収量が改善されたイネを生産するステップ、生産される該イネを、それ自身と又は他のイネと交雑して後代イネ種子を得るステップ、該後代イネ種子を成長させて穀物収量が改善されたさらなるイネを得るステップ、並びに交雑及び成長ステップを0〜7回反復して穀物収量が改善された純系のイネを作成するステップ、を含む上記方法もまた提供する。
【００１４】
SPIKE遺伝子について第二のイネを分析するステップが、改善された穀物収量を示すイネを同定及び選択するステップをさらに含む、かかる方法もまた提供される。
【００１５】
ホモ接合型の純系イネを選択するステップをさらに含む、かかる方法もまた提供される。
【００１６】
本発明は、穀物収量が改善されたイネを生産するための方法であって、SPIKE遺伝子を含む第一のイネを提供するステップ、SPIKE遺伝子をコードする核酸を、第一のイネから第二のイネへ移行させるステップ、SPIKE遺伝子について第二のイネを分析するステップ、SPIKE遺伝子を含み、移行前の第二のイネと比べて改善された穀物収量を示す第二のイネを同定及び選択するステップ、を含む上記方法もまた提供する。
【００１７】
第一のイネから第二のイネへの核酸の移行が、SPIKE遺伝子を含む子孫植物を生産するための第一のイネと第二のイネとの交雑によって行われ、SPIKE遺伝子について第二のイネを分析するステップ、及びSPIKE遺伝子を含み、移行前の第二のイネと比べて改善された穀物収量を示す第二のイネを同定及び選択するステップが、一以上の子孫植物に対して行われる、かかる方法もまた提供される。
【００１８】
第一のイネから第二のイネへの核酸の移行が、遺伝子組換え法によって、交雑によって、戻し交雑によって、原形質融合によって、倍化半数体技術によって、又は胚救出（embryo rescue）によって行われる、かかる方法もまた提供される。
【００１９】
戻し交雑が、SPIKE遺伝子の遺伝子移入、及び少なくとも85%、少なくとも87%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも94%、少なくとも96%、又は少なくとも98%の第二のイネのゲノムの回復をもたらす、かかる方法もまた提供される。
第二のイネのゲノムの回復が、92%〜97%である、かかる方法もまた提供される。
【００２０】
SPIKE遺伝子を含み、移行前の第二のイネと比べて改善された穀物収量を示す第二のイネを同定及び選択するステップが、第二のイネを、穀物収量を測定するためのバイオアッセイに供するステップをさらに含む、かかる方法もまた提供される。
【００２１】
本発明は、本明細書の方法によって生産される穀物収量が改善されたイネ、又はその一部であって、SPIKE遺伝子を含み、SPIKE遺伝子がその天然の遺伝的背景に存在しない、上記イネ又はその一部もまた提供する。
【００２２】
第一のイネが、新植物タイプ（New Plant Type（NPT））品種YP9由来のイネの同質遺伝子系統から選択される、かかる方法もまた提供される。
【００２３】
第一のイネが、イネ（Oryza sativa）亜種の熱帯ジャポニカから選択される、かかる方法もまた提供される。
【００２４】
第一のイネがダリンガン（Daringan）である、かかる方法もまた提供される。
第二のイネが、イネ（Oryza sativa）亜種のインディカから選択される、かかる方法もまた提供される。
【００２５】
第二のイネが、PSBRc18、チヘラン（Ciherang）、TDK1、BR11、及びスワルナ（Swarna）からなる群より選択される、かかる方法もまた提供される。
【００２６】
本発明は、少なくとも一つの植物プロモーター、及びSPIKEタンパク質（配列番号3）の配列と少なくとも70%同一であるポリペプチド配列をコードする少なくとも一つのポリヌクレオチド、を含む遺伝子組換え植物細胞であって、該プロモーター及びポリヌクレオチドが作動可能に連結されており、植物細胞の染色体DNAに組込まれている、上記遺伝子組換え植物細胞もまた提供する。
【００２７】
細胞のタイプが、イネ、コムギ、ソルガム、及びトウモロコシからなる群より選択される、かかる方法もまた提供される。
植物細胞が、SPIKE遺伝子についてホモ接合型である、かかる方法もまた提供される。
【００２８】
本発明は、本明細書の植物の複数の細胞を含む、遺伝子組換え植物もまた提供する。
本発明は、少なくとも一つの植物プロモーター、及びSPIKEの配列と少なくとも70%同一である少なくとも一つのポリヌクレオチド配列を含む遺伝子組換え植物であって、該プロモーター及びポリヌクレオチドが作動可能に連結されており、植物細胞の染色体DNAに組込まれている、上記遺伝子組換え植物もまた提供する。
【００２９】
本発明は、植物が、イネ、コムギ、ソルガム、及びトウモロコシからなる群より選択される、植物もまた提供する。
植物が、イネである、かかる植物もまた提供される。
【００３０】
ポリヌクレオチド配列が、SPIKEの配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一である、かかる植物もまた提供される。
植物が、SPIKE遺伝子についてホモ接合型である、かかる植物もまた提供される。
【００３１】
本発明は、本明細書の植物の種子もまた提供する。
本発明は、本明細書の植物の、植物の一部もまた提供する。
【００３２】
本発明は、本明細書の植物であって、対応する非遺伝子組換え植物に対して増加したm2あたり穀物収量、対応する非遺伝子組換え植物に対して増加した一穂あたり籾数、及び対応する非遺伝子組換え植物に対して増加した止葉幅からなる群より選択される表現型を示す、前記植物もまた提供する。
【００３３】
本発明は、遺伝子組換え植物を選択するための方法であって、増加した穀物収量について集団をスクリーニングするステップであって、集団中の植物が、その染色体DNAに組込まれた組換えDNAを有する少なくとも一つの遺伝子組換え植物細胞を含み、前記組換えDNAが、SPIKEの配列と少なくとも70%同一であるポリヌクレオチド配列のオープンリーディングフレームに機能的に連結され植物細胞において機能的であるプロモーターを含み、少なくとも一つの遺伝子組換え植物細胞を含む前記集団の個々の植物が、少なくとも一つの遺伝子組換え植物細胞を含まない対照植物における穀物収量と同等以上の穀物収量を示す上記ステップ、及び該集団から、少なくとも一つの遺伝子組換え植物細胞を含まない対照植物における穀物収量より高い穀物収量を示す一以上の植物を選択するステップ、を含む上記方法もまた提供する。
【００３４】
該集団から、少なくとも一つの遺伝子組換え植物細胞を含まない対照植物における穀物収量より高い穀物収量を示す一以上の植物を選択するステップ中で選択された一以上の植物から種子を回収するステップをさらに含む、かかる方法もまた提供される。
【００３５】
前記組換えDNAが選択された植物に安定に組込まれることを確認するステップ、及びSPIKEの配列と少なくとも70%同一であるポリヌクレオチド配列の発現を決定するために選択された植物の組織を分析するステップをさらに含む、かかる方法もまた提供される。
【００３６】
本発明は、穀草において穀物収量を増加させる方法であって、SPIKE遺伝子と対応するポリヌクレオチド配列を含む染色体DNAを含む穀草の第一の変種の植物を、SPIKE遺伝子と対応するポリヌクレオチド配列を含む染色体DNAを含まない穀草の第二の変種と交雑するステップ、SPIKE遺伝子と対応するポリヌクレオチド配列を含む染色体DNAを有する一以上の後代植物を選択するステップ、選択された後代植物を戻し交雑し、戻し交雑後代植物を生産するステップ、SPIKE遺伝子と対応するポリヌクレオチド配列を含む染色体DNAを有する一以上の戻し交雑後代植物を選択するステップ、選択された後代植物を戻し交雑し戻し交雑後代植物を生産するステップ及びSPIKE遺伝子と対応するポリヌクレオチド配列を含む染色体DNAを有する一以上の戻し交雑後代植物を選択するステップを一回以上反復し、SPIKE遺伝子と対応するポリヌクレオチド配列を含む染色体DNA、並びに穀草の第一の変種と交雑する前の穀草の第二の変種の生理学的及び形態学的特徴の全てを有する、第三の又はそれ以降の世代の戻し交雑後代植物を生産するステップ、を含む上記方法もまた提供する。
【００３７】
穀草が、イネ、コムギ、ソルガム、及びトウモロコシからなる群より選択される、かかる方法もまた提供される。
穀草が、イネである、かかる方法もまた提供される。
【００３８】
穀草の第一の変種が、新植物タイプ（New Plant Type（NPT））品種YP9由来のイネの同質遺伝子系統から選択される、かかる方法もまた提供される。
【００３９】
穀草の第一の変種が、イネ（Oryza sativa）亜種の熱帯ジャポニカから選択される、かかる方法もまた提供される。
穀草の第一の変種が、ダリンガン（Daringan）である、かかる方法もまた提供される。
【００４０】
穀草の第二の変種が、イネ（Oryza sativa）亜種のインディカから選択される、かかる方法もまた提供される。
【００４１】
穀草の第二の変種が、PSBRc18、チヘラン（Ciherang）、TDK1、BR11、及びスワルナ（Swarna）からなる群より選択される、かかる方法もまた提供される。
【００４２】
本発明は、本明細書の種子を栽培するステップを含む、穀草植物を栽培するための方法もまた提供する。
【００４３】
本発明は、本明細書の植物の一部を栽培するステップを含む、穀草植物を栽培するための方法もまた提供する。
【００４４】
本特許又は出願ファイルは、少なくとも一つのカラーで作られた図を含む。カラー図面を含むこの特許又は特許出願公開のコピーは、要求及び必要な手数料の支払いにより、事務局により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１−１】SPIKEについて準同質遺伝子系統（NIL）の収量関連形質の特徴づけ。Ａ：IR64及びNIL-SPIKEの植物形態を示す写真。スケールバー：20 cm。Ｂ：IR64及びNIL-SPIKEの穂の構造を示す写真。スケールバー：10 cm。
【図１−２】SPIKEについて準同質遺伝子系統（NIL）の収量関連形質の特徴づけ。Ｃ：IR64（左側の葉）及びNIL-SPIKE（右側の葉）の止葉を示す写真。スケールバー：5 cm。Ｄ：IR64及びNIL-SPIKEの穂首（panicle neck）の断面図の写真。スケールバー：500 μm。
【図１−３】SPIKEについて準同質遺伝子系統（NIL）の収量関連形質の特徴づけ。IR64及びNIL-SPIKEの一穂あたり籾数（n＝８）（Ｅ）、止葉幅（n＝９）（Ｆ）、成熟した根の乾燥重量（n＝１０）（Ｇ）。***は0.1%で有意、**は1%、*は5%で、n.sは有意でない。
【図１−４】SPIKEについて準同質遺伝子系統（NIL）の収量関連形質の特徴づけ。玄米における白未熟粒の割合（Ｈ）、穂首における維管束の数（n＝２０）（Ｉ）、及び二回の乾期（DS）及び雨期（WS）間のm2あたり穀粒重量（Ｊ）、を示す棒グラフ。Ｊにおけるバーの上の割合は、IR64と比べたNILの収量増加である。値は平均であり、箱ヒゲは標準偏差（Ｊでは平均値の標準誤差）を示す。***は0.1%で有意、**は1%、*は5%で、n.sは有意でない。
【図２−１】マップに基づくSPIKE遺伝子のクローニング及び発現分析。高解像度のマップをもとに、SPIKEの遺伝子座をInd4及びInd12の間の18.0kbpの領域に狭めた。候補遺伝子は赤で示される。四角は、遺伝子予測モデルに基づいた候補遺伝子の存在を示す。マップの下の数は、組換えの数を示す。
【図２−２】マップに基づくSPIKEのクローニング及び発現分析。（Ｂ）IR64及びNIL-SPIKE（NIL）の茎、葉、葉鞘、及び根におけるSPIKEの半定量発現分析。（Ｃ）冠根及び側根の断面図（スケールバー：50μm）における、NIL-SPIKEプロモーターによって駆動されるGUSの生産を示す写真。
【図２−３】マップに基づくSPIKEのクローニング及び発現分析。（Ｄ）幼穂の断面図（スケールバー：2mm）における、NIL-SPIKEプロモーターによって駆動されるGUSの生産を示す写真。（Ｅ）IR64及びNIL-SPIKEの幼穂の3-5-、6-10-、11-20-、及び21-50-mm期のSPIKEの定量発現分析を示す棒グラフ。発現を、IR64の3-5-mmの幼穂期に対して定性する。値は3反復の平均であり、箱ヒゲは平均値の標準誤差を示す。*は5%で有意、n.sは有意でない。
【図３−１】過剰発現及び遺伝子サイレンシングを介するSPIKEの遺伝子組換え分析（Ａ）IL64植物及びユビキチンプロモーターによってSPIKEが過剰発現しているUbi:SPIKEの形態を示す写真。スケールバー：20cm。（Ｂ）IL64植物及びUbi:SPIKEの穂構造を示す写真。スケールバー：5 cm。
【図３−２】過剰発現及び遺伝子サイレンシングを介するSPIKEの遺伝子組換え分析。IR64（n＝１７）並びに単一コピー（n＝２０）及び5コピー（n＝１３）を有するUbi:SPIKE植物の一穂あたり籾数（Ｃ）及び止葉幅（Ｄ）を示す棒グラフ。5%レベルでの多重比較のテューキー＝クレイマー（Tukey-Kramer）試験の結果を、C及びDで示す。
【図３−３】過剰発現及び遺伝子サイレンシングを介するSPIKEの遺伝子組換え分析。（Ｅ）NIL-SPIKE植物及びamiRNAによってSPIKEが発現抑制されている遺伝子組換え植物の形態を示す写真。スケールバー：20cm。（Ｆ）NIL-SPIKE及び遺伝子組換え植物の穂構造を示す写真。スケールバー：5 cm。
【図３−４】過剰発現及び遺伝子サイレンシングを介するSPIKEの遺伝子組換え植物を用いた分析。NIL-SPIKE（n＝５）及びamiRNA1（n＝４）及びamiRNA遺伝子組換え植物（n＝３）の一穂あたり籾数（Ｇ）及び止葉幅（Ｈ）を示す棒グラフ。値は平均であり、箱ヒゲは標準偏差を示す。*は5%で有意、n.sは有意でない。5%レベルでの多重比較のテューキー＝クレイマー（Tukey-Kramer）試験の結果を、G及びHで示す。
【図４−１】SPIKEは、インディカ遺伝背景において穀物収量を増加させる。遺伝子の位置（青色の楕円）、及び新植物タイプ（New Plant Type（NPT））品種YP4の形態を示す写真。スケールバー：20cm。
【図４−２】SPIKEは、インディカ遺伝背景において穀物収量を増加させる。遺伝子の位置（青色の楕円）、並びにIRRI146及びIRRI146-SPIKEの形態を示す写真。スケールバー：20cm。
【図４−３】過剰発現及び遺伝子サイレンシングを介するSPIKEの遺伝子組換え分析。m2あたりの穀粒重量（Ｃ）、一穂あたり籾数（Ｄ）、止葉幅（Ｅ）（n＝０）のIRRI146及びIRRI146-SPIKE間の比較を示す棒グラフ。値は平均であり、箱ヒゲは標準誤差を示す。***は0.1%で有意、**は1%、*は5%。
【図４−４】フィリンピンのIRRIの圃場で特徴づけられた、SPIKEを有する又は有さないインディカ品種、PSBRc18（フィリピン由来、n＝１０）、TDK1（ラオス由来、n＝１０）チヘラン（Ciherang）（インドネシア由来、n＝１３）、スワルナ（Swarna）（インド由来、n＝１７）、及びBR11（バングラデシュ由来、n＝２７）間の一穂あたり籾数の比較を示す棒グラフ（図４Ｆ）。値は平均であり、箱ヒゲは標準誤差を示す。***は0.1%で有意、**は1%、*は5%。
【図５】一穂あたり籾数（NIL-SPIKE；右側）についてのQTLの準同質遺伝子系統の開発のための育種計画、及びSPIKEでの集団の分離を示す図。高い小穂数を有し、熱帯ジャポニカのダリンガン（Daringan）由来の導入遺伝子を有するYTH326。YTH326を、遺伝子分析のために、BC3後代から選択した。NIL-SPIKEを、DNAマーカーを用いた前景調査及び背景調査によって選抜した。ゲル写真は、隣接マーカーであるRM17483及びRM17486によるSPIKE領域の遺伝子型を示す。
【図６−１】2011年の雨期（2011WS）及び2012年の乾期（2012DS）におけるIR64（青色）及びNIL-SPIKE（橙色）の形態学的形質を示す棒グラフ：登熟粒の割合（n＝２０）（Ａ）、植物あたり穂数（n＝２０）（Ｂ）。値は平均であり、箱ヒゲは標準偏差を示す。**は1%レベルで有意、*は5%レベルで有意、n.s.は有意でない。
【図６−２】2011年の雨期（2011WS）及び2012年の乾期（2012DS）におけるIR64（青色）及びNIL-SPIKE（橙色）の形態学的形質を示す棒グラフ： 1000粒重（n＝２０）（Ｃ）到穂日数（n＝１２）（Ｄ）。値は平均であり、箱ヒゲは標準偏差を示す。**は1%レベルで有意、*は5%レベルで有意、n.s.は有意でない。
【図７】一穂あたり籾数、二次枝梗数、及び葉幅の高解像マッピング。Ind4及びInd12間の組換えを有する植物の遺伝子型は、IR64については白で、YP9区分については灰色で示す。陰影を付けた箱は、組換えを有する領域を示す。括弧内の数は、分子マーカー間に組換えを有していた植物の数を示す。値は平均であり、箱ヒゲは標準偏差を示す。**は1%レベルで有意、*は5%レベルで有意。
【図８】IR64及びNIL-SPIKEにおけるSPIKE候補領域中の三つの予測された遺伝子のRT-PCR。プライマーを、予測された遺伝子であるOs04g52479、Os04g52500、及びOs04g52504について設計した。分子マーカーであるEx6.2、Ex7.2及びEx8.1を、Os04g52479、Os04g52500及びOs04g52504について、それぞれ設計した。UBQ5は、対照としてのユビキチンを増幅するためのプライマー対。
【図９Ａ】作物種間のSPIKEタンパク質配列の比較。SPIKEの系統樹を示す図。
【図９Ｂ−１】作物種間のSPIKEタンパク質配列の比較。イネ（IR64は配列番号6であり、NIL-SPIKEは配列番号7である）、ヤマカモジグサ（ミナトカモジグサ）（Brachypodium）（配列番号90）、コムギ（配列番号91）、ソルガム（配列番号92）及びトウモロコシ（配列番号93）間の比較を示すアライメント。灰色の領域は、トリプシン様セリン及びシステインプロテアーゼドメインを示す。赤い棒は、IR64及びYP9間の置換を示す。アスタリスクは完全な相同性を示し、セミコロンはアミノ酸の置換を示し、スペースは相動性の完全な欠失を示す。右側の数字は、各タンパク質におけるアミノ酸残基の累積数を示す。
【図９Ｂ−２】図９Ｂ−１の続き。
【図９Ｂ−３】図９Ｂ−２の続き。
【図９Ｂ−４】図９Ｂ−３の続き。
【図９Ｂ−５】図９Ｂ−４の続き。
【図９Ｂ−６】図９Ｂ−５の続き。
【図１０−１】NIL-SPIKEプロモーターによって駆動されるGUSの発現。発芽種子（スケールバー：2mm）（Ａ）、茎及び穂首における維管束（スケールバー：500μm）（Ｂ）を示す写真。
【図１０−２】NIL-SPIKEプロモーターによって駆動されるGUSの発現。若葉（スケールバー：2mm）（Ｃ）を示す写真。
【図１１−１】T0植物のSPIKEの発現の比較と特徴づけ（Ubi::SPIKE）。Ubi::SPIKE過剰発現植物におけるSPIKEの発現（Ａ）。UBQ5及びOsActin1は、対象としてのユビキチン及びアクチンを増幅するためのプライマーセット。amiRNA遺伝子発現抑制植物におけるSPIKEの発現（Ｂ）。
【図１１−２】T0植物のSPIKEの発現の比較と特徴づけ（Ubi::SPIKE）。0〜7のコピー数を有するT0過剰発現植物間の一穂あたり籾数を示すドット図（Ｃ）。0〜7のコピー数を有するT0過剰発現植物間の止葉幅を示すドット図（Ｄ）。
【図１１−３】T0植物のSPIKEの発現の比較と特徴づけ（Ubi::SPIKE）。BamH1によって消化されたDNAのサザンハイブリダイゼーションによるコピー数。青の四角はUbi::SPIKE（単一）植物を示し、一方赤の四角はUbi::SPIKE（複数）植物を示す。
【図１２−１】野生型（T65）（緑色）、nal1変異体（Fn188）（赤色）、IR64（青色）、及びNIL-SPIKE（橙色）間の農業形質の比較：穂長（Ａ）、止葉長（Ｂ）の比較を示す棒グラフ。箱ヒゲは標準偏差を示し、n=15である。異なる文字は、多重比較のためのテューキー＝クレイマー（Tukey-Kramer）試験による1%レベルでの有意な差を示す。T65、Fn188、IR64、及びNIL-SPIKEを、日本の沖縄県石垣島の、国際農林水産業研究センター（Japan International Research Center for Agricultural Sciences）の日本国沖縄県石垣島の熱帯・島嶼研究拠点（Tropical Agricultural Research Front）の圃場で、2011年の8月から11月まで栽培した。各区画において、播種後15日の苗を、20cm及び30cmの条間で圃場に移植した。28 kg ha-1のP、28 kg ha-1のK、28 kg ha-1のNを基肥として用い、同量を分げつ期に施肥した。
【図１２−２】野生型（T65）（緑色）、nal1変異体（Fn188）（赤色）、IR64（青色）、及びNIL-SPIKE（橙色）間の農業形質の比較：止葉幅（Ｃ）、一穂あたり籾数（Ｄ）の比較を示す棒グラフ。箱ヒゲは標準偏差を示し、n=15である。異なる文字は、多重比較のためのテューキー＝クレイマー（Tukey-Kramer）試験による1%レベルでの有意な差を示す。T65、Fn188、IR64、及びNIL-SPIKEを、日本の沖縄県石垣島の、国際農林水産業研究センター（Japan International Research Center for Agricultural Sciences）の日本国沖縄県石垣島の熱帯・島嶼研究拠点（Tropical Agricultural Research Front）の圃場で、2011年の8月から11月まで成長させた。各区画において、播種後15日の苗を、20cm及び30cmの条間で圃場に移植した。28 kg ha-1のP、28 kg ha-1のK、28 kg ha-1のNを基肥として用い、同量を分げつ期に施肥した。
【図１３−１】IR64及びNIL-SPIKEにおける子葉鞘におけるIAA輸送。寒天ブロックにおけるIR64及びNIL-SPIKEの0〜3mm子葉鞘におけるIAA生合成の比較を示す棒グラフ（n=6）（Ａ）。寒天ブロックにおけるIR64（青色）及びNIL-SPIKE（橙色）の1.5〜3mm子葉鞘におけるIAA生合成の比較を示す棒グラフ（n=6）（Ｂ）。
【図１３−２】IR64及びNIL-SPIKEにおける子葉鞘におけるIAA輸送。子葉鞘区分（1.5〜3.0mm）（n＝３）を用いるIAAの極性輸送を調査するための方法を示す図（Ｃ）。
【図１３−３】IR64及びNIL-SPIKEにおける子葉鞘におけるIAA輸送。IR64（青色）及びNIL-SPIKE（橙色）の子葉鞘における極性のIAA輸送の比較を示す棒グラフ（Ｄ）。箱ヒゲは標準偏差を示す。表面を殺菌した種子を27℃で、2日間赤色の光及びその後の1日の暗闇下で発芽させた。IAA生合成アッセイについては、6つの子葉鞘区分を、カミソリの刃で切り取り、1.2%寒天ブロック上（3 mm × 15 mm × 2 mm）に置き、示した時間インキュベートした。IAA輸送アッセイについては、3つの子葉鞘区分（1.5〜3.0 mm）を寒天ブロックに30分置き、IAAを枯渇させ、その後10mMリン酸バッファー（pH 6.8）中に3μMのIAAを含む濾紙に置き、尖端の又は底面の切断表面に10分接触させた。その後、子葉鞘を新しい寒天ブロックにおいた。ある時間の後、寒天を液体窒素で凍結させた。IAAをGC-SIM-MSによって決定した。
【図１４】Nal1配列の比較。
【図１５−１】Nal1配列の比較。予測された遺伝子である06（PG06：予測ナローリーフ（narrow leaf）1）、07（PG07：予測レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ）、及び08（PG08：推定タンパク質）のCLUSTALW多重配列アライメントを示す図。上から下までのアライメント：イネcDNA；EST；Predgeneset；AutoPredgeneset；Genscan_arabi；Genscan_maize；fgenesh_mono；RiceHMM；blastx_nr；mzef；AutoPredLTR；RepeatMasker；tRNAscan；tRNA  scan；RepeatMasker；AutoPredLTR；mzef；blastx_nr；RiceHMM；fgenesh_mono；Genscan_maize；Genscan_arabi；AutoPredneneset；Predgeneset；EST；及びイネcDNA。
【図１５−２】図１５−１の続き。
【図１６】IR64、NIL-SPIKE、及びNIL- qTSN4.6間のTSN（一穂あたり籾数）及びFLW（止葉幅）の比較。IR64、NIL（YP9由来のNIL-SPIKE）、FVW29（日本晴由来のNIL-qTSN4.6）、FVW 32（日本晴由来のNIL-qTSN4.6）、及びFVW34（日本晴由来のNIL-qTSN4.6）間の止葉幅（Ａ）、及び一穂あたり籾数（Ｂ）を比較する棒グラフ。NIL- qTSN4.6のFLWは、NIL-SPIKEと同じで、NIL- qTSN4.6のTSNは、IR64とNIL-SPIKEの間の中間の表現型である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本開示を通して、様々な出版物、特許及び公開特許明細書が言及される。これらの出版物、特許及び公開特許明細書の開示を、本発明が関する分野の状況をより詳細に説明するために、本開示に参照により組み込む。
【００４７】
単数系の用語は、文脈が明確にそうでないと示さない限り、複数の対象を含む。同様に、用語「又は」は、文脈が明確にそうでないと示さない限り、「及び」を含むと意図される。核酸又はポリペプチドについて与えられる全ての塩基サイズ又はアミノ酸サイズ、及び全ての分子量又は分子量値は、おおよそであり、説明のために提供されることが、さらに理解される。本明細書に記載されるものと同等又は等価な方法及び材料が本開示の実施又は試験において用いられ得るが、好適な方法及び材料が以下に記載される。用語「含む（comprise）」は「含む（include）」を意味する。略語「e.g.（例えば）」は、ラテン語のexempli gratia（例えば）に由来し、本明細書において、非限定例を示すために用いられる。したがって、略語の「e.g.」は、用語「for example（例えば）」の同意語である。
【００４８】
定義
「収量」は、植物、植物の群、又は作物により生産される穀物の量を説明する。収量は、限定されるものではないが、m2あたりの穀物収量、t ha-1、及び植物あたりの平均穀物収量を含む幾つかの方法で測定され得る。
【００４９】
本明細書で用いられる「表現型」は、観察可能な特徴の個々の変異であり、例えば植物の穀物収量は、植物によって遺伝し得るか、又はトランスフェクション等の方法によって植物に人工的に組み込まれ得る。
【００５０】
本明細書で用いられる「導入遺伝子(introgression)」は、一以上の遺伝子、又は遺伝子群の、戻し交雑の結果としての、一つの植物変種から他の変種の遺伝子複合体への移動を意味する。
【００５１】
本明細書で用いられる「遺伝子組換え植物細胞」は、アグロバクテリウム媒介の形質転換によって、又は組換えDNAによってコートされた微粒子を用いる衝突若しくは他の手段によって、安定的に組み込まれた、非天然の、組換えDNAで形質転換された植物細胞を意味する。本発明の遺伝子組換え植物細胞は、微生物として存在する最初に形質転換された植物細胞、又は分化した組織、例えば安定的に組み込まれた、非天然の組換えDNAを有する遺伝子組換え植物に再生される後代植物細胞、又は後代遺伝子組換え植物由来の種子又は花粉であり得る。
【００５２】
本明細書で使用される「遺伝子組換え植物」は、組換えDNAの安定的な組込みによってそのゲノムが変更された植物を意味する。遺伝子組換え植物は、最初に形質転換された植物細胞から再生された植物、及びより後の世代由来の後代遺伝子組換え植物、又は形質転換植物の交雑種を含む。
【００５３】
本明細書で用いられる「組換えDNA」は、天然のDNA又はcDNA又は合成DNAを含むDNAを含む、遺伝的に変更され、細胞の外側で構築されたDNAを意味する。
【００５４】
「百分率同一性」は、DNA又はタンパク質区分の配列、例えばヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が、アライメント配列のウィンドウを介して不変であるDNAの配列の程度を説明する。百分率同一性は、アライメントされた長さにわたって、好ましくはBLASTp等の局所アライメントアルゴリズムを用いて計算される。本明細書で用いられる場合、BLASTpによって作られるアライメントが最小のe-valueを有する場合、配列は「アライメント」されている。
【００５５】
本明細書で用いられる「プロモーター」は、転写を開始するための制御DNAを意味する。「植物細胞において機能的であるプロモーター」は、その起源が植物細胞であるか否かを問わず、植物細胞において転写を開始することができるプロモーターであり、例えば、アグロバクテリウムのプロモーターが植物細胞において機能的であることが周知である。したがって、植物プロモーターは、植物、植物ウイルス並びにアグロバクテリウム及びブラディリゾビウム細菌等の細菌から得られるプロモーターDNAを含む。
【００５６】
本明細書で用いられる「作動可能に連結される」は、組換えDNA構築物における二つ以上のDNAフラグメントの結合によって、一方、例えばタンパク質コードDNAの機能が、他方、例えばプロモーターによって制御されることを意味する。
【００５７】
本明細書で用いられる「発現される」は、生産されること、例えばその同族DNAがタンパク質に翻訳されるmRNAに転写される時に、タンパク質が植物細胞において発現されることを意味する。
【００５８】
本明細書で用いられる「対照植物」は、高められた穀物収量を付与する組換えDNAを含まない植物を意味する。対照植物は、高められた穀物収量を有する遺伝子組換え植物を同定及び選択するために用いられる。好適な対象植物は、遺伝子組換え植物を作るために用いられた親系統の、すなわち組換えDNAを欠く非遺伝子組換え植物であり得る。好適な対象植物は、幾つかの場合、陰性分離個体として知られる組換えDNAを含まないヘミ接合性の遺伝子組換え植物系統の後代植物であり得る。
【００５９】
用語「量的形質遺伝子座」又は「QTL」は、連続的に分布する表現形質の示差的発現を反映する、少なくとも二つの対立遺伝子を有する多型性の遺伝子座を指す。
【００６０】
本開示の文脈における「関連する」又は「関連」との用語は、例えば、連鎖不均衡にある、すなわち核酸及び表現型が独立的に分離していた場合よりも、核酸及び性質が後代植物においてより頻繁に共に見つかる核酸及び表現形質を指す。
【００６１】
用語「マーカー」又は「分子マーカー」又は「遺伝子マーカー」は、遺伝子又は量的形質遺伝子座（QTL）等の遺伝的に関連した遺伝子座を同定する場合に、参照の点として用いられる遺伝子座（「マーカーフォーカス」）を指す。該用語は、ゲノム配列に相補的な核酸配列、例えばプローブ又はプライマーとして用いられる核酸もまた指し得る。プライマーは、マーカー配列の上流又は下流の配列に対して相補的であり得る。該用語は、マーカーと関連する増幅産物もまた指す。該用語は、マーカーと関連する対立遺伝子もまた指す。表現型と関連する対立遺伝子変異は、配列に基づいて生殖質を区別するためのマーカーの使用も可能にする。
【００６２】
本開示の文脈における用語「交雑される」又は「交雑」は、後代（すなわち、細胞、種子又は植物）を生産するための受粉による配偶子の融合を意味する。該用語は、性的交雑（一方の植物の他方による受粉）及び自家受粉（selfing）（自家受粉（self-pollinating）、すなわち、花粉及び胚珠が同一の植物に由来するか、又は遺伝的に同一な植物に由来する場合）の両方を包含する。
【００６３】
遺伝子組換え法による穀物収量が改善されたイネの生産
一つの特定の実施形態によれば、新規な遺伝子SPIKE、又はその収量改善部分を含む核酸（好ましくはDNA）配列が、穀物収量が改善されたイネの生産のために用いられ得る。この態様では、本実施形態は、穀物収量が改善されたイネを生産するためのSPIKE、又はその収量改善部分の使用を提供し、SPIKEを含む核酸配列のインディカイネ品種における導入を含む。核酸配列は、任意の好適なドナーイネに由来し得る。SPIKE、又はその収量改善部分を含む核酸配列を提供可能な好適なドナーイネは、熱帯ジャポニカ在来種のダリンガン（Daringan）、インディカ品種であるShennung 89-366とダリンガン（Daringan）の交雑種に由来するNPT品種YP9（IR68522-10-2-2）、熱帯ジャポニカBali Ontjer、（Bali Ontjer由来の）NPT IR65564-22-2-3とIRRI146の交雑種の後代である。相対的に高い穀物収量を示し、SPIKEを含む他の関連イネも、ドナー植物として利用され得る。
【００６４】
好適なドナーイネにおいて同定されたら、SPIKE、又はその収量改善部分を含む核酸配列は、利用可能な任意の方法によって好適なレシピエント植物に移行させられ得る。例えば、前記核酸配列は、ドナーイネを感受性のレシピエントイネと交雑することによって（すなわち、遺伝子導入によって）、形質転換によって、原形質融合によって、倍化半数体技術によって又は胚救済（embryo rescue）によって、又は任意の他の核酸移行系によって、任意にその後SPIKEを含み改善された穀物収量を示す子孫植物の選択によって、移行され得る。移行の遺伝子組換え法については、SPIKE、又はその収量改善部分を含む核酸配列は、本分野で知られる方法を用いることによってドナー植物から単離され得、単離された核酸配列は、遺伝子組換え法、例えばベクターの手段によって、配偶子において、又は任意の他の好適な移行要素において、例えば前記核酸配列でコートした弾道粒子（ballistic particle）等によってレシピエント植物に移行され得る。
【００６５】
植物の形質転換は、一般に植物細胞において機能するであろう発現ベクターの構築を含む。幾つかの実施形態では、かかるベクターはSPIKE、又はその収量改善部分を含む核酸配列を含み、プロモーター等の制御エレメントの制御下であるか制御配列に作動可能に連結されている。発現ベクターは、該組み合わせに含まれる少なくとも一つの遺伝子がSPIKEである限り、一以上のかかる作動可能に連結された遺伝子／調節エレメントの組み合わせを含み得る。ベクターはプラスミドの形態であり得、改善された穀物収量を有する遺伝子組換え植物を提供するために、アグロバクテリウム形質転換系等の本分野で知られる形質転換法を用いて、単独で、又は他のプラスミドと共に用いられ得る。
【００６６】
発現ベクターは、マーカーを含む形質転換された細胞がネガティブセレクションによって（選択可能なマーカー遺伝子を含まない細胞の増殖の阻害によって）、又はポジティブセレクションによって（マーカー遺伝子によってコードされる産物のスクリーニングによって）回収されることを可能にする、（プロモーター等の）制御エレメントに作動可能に連結された少なくとも一つのマーカー遺伝子を含み得る。植物形質転換のため広く一般に用いられている選択可能なマーカー遺伝子は本分野で知られており、例えば、抗生物質又は除草剤であり得る選択的な化学薬剤を代謝的に解毒する酵素をコードする遺伝子、又は阻害剤に非感受性である変更されたターゲットをコードする遺伝子が挙げられる。マンノース選択等の幾つかのポジティブ選択法は本分野において知られている。あるいは、マーカーのない形質転換は、記載したマーカー遺伝子を含まない植物を得るために用いられ得、そのための技術は本分野で知られている。
【００６７】
植物に発現ベクターを導入するための一つの方法は、アグロバクテリウムの自然形質転換系に基づく（例えば、Horsch et al., 1985を参照されたい）。発現ベクターを植物組織に導入する方法として、直接感染又は植物細胞とアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）との共培養が挙げられる。アグロバクテリウムベクター系及びアグロバクテリウム媒介遺伝子移行のための方法の説明は、Grube及びCrosby, 1993並びにMoloney et al., 1989によって提供されている。U.S. Pat. No: 5,591,616もまた参照されたい。植物発現ベクター及びレポーター遺伝子並びに形質転換プロトコルの一般的な説明、並びにアグロバクテリウムベクター系及びアグロバクテリウム媒介遺伝子移行のための方法の記載は、Gruber及びCrosby, 1993に見出すことができる。植物組織の一般的な培養方法は、例えばMiki et al., 1993によって、及びPhillips, et al., 1988によって提供される。分子クローニング技術及び好適な発現ベクターのための適切な参照ハンドブックは、Sambrook及びRussell（2001）である。
【００６８】
遺伝子組換え法に有用な組換えDNA構築物は、周知の方法を用いて構築され、典型的にDNAに作動可能に連結されたプロモーターを含み、その発現が高められた農学的な性質を提供する。他の構築物の成分は、追加の制御エレメント、例えば転写を高めるための5'リーダー及びイントロン、3'非翻訳領域（例えばポリアデニル化シグナル及び部位）、移行のためのDNA、又はシグナルペプチドを含み得る。
【００６９】
植物細胞において活性な多くのプロモーターが、記載されている。これらとして、植物ゲノムに存在するプロモーター、並びに他の供給源由来のプロモーター、例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の腫瘍導入プラスミドに維持されるノパリンシンターゼ（NOS）プロモーター及びオクトピンシンターゼ（OCS）プロモーター、並びにカリフラワーモザイクウイルス由来のCaMV35Sプロモーターが挙げられる。植物細胞において機能するプロモーターは当業者に知られており、遺伝子組換え植物細胞中に所望の遺伝子の発現をもたらすための本発明の組換えポリヌクレオチドにおける使用のために利用可能である。
【００７０】
さらに、プロモーターは、遺伝子発現を高めるのを補助するために、複数の「エンハンサー配列」を含むように変更され得る。かかる構築物にエンハンサー配列を含めることによって、選択されたタンパク質の発現が高められ得る。これらのエンハンサーは、しばしば真核細胞において機能するプロモーターにおける転写開始の5'側に見出されるが、しばしばコード配列の上流（5'）又は下流（3'）に挿入され得る。幾つかの場合、これらの5'エンハンサー要素はイントロンである。エンハンサーとして特に有用なものは、イネアクチン1遺伝子及びイネアクチン2遺伝子の5'イントロン、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子イントロン、トウモロコシ熱ショックタンパク質70遺伝子イントロン並びにトウモロコシシュランケン（shrunken）1遺伝子である。
【００７１】
植物に発現ベクターを導入するための他の方法は、DNAが微粒子の表面に維持される微粒子媒介形質転換に基づく。発現ベクターは、微粒子を植物の細胞壁及び細胞膜を貫通するのに十分である300〜600 m/sの速度まで加速する、弾道装置（ballistic device）を用いて植物組織に導入される（Sanford et al., 1987, 1993；Sanford, 1988, 1990；Klein et al., 1988, 1992を参照されたい）。植物にDNAを導入するための他の方法は、標的細胞の超音波処理を介する（Zhang et al., 1991を参照されたい）。あるいは、リポソーム又はスフェロプラスト融合が、発現ベクターを植物に導入するために用いられる（例えば、Deshayes et al.,及びChristou et al., 1987を参照されたい）。CaCl2沈殿、ポリビニルアルコール又はポリ−L−オルニチンを用いるプロトプラストへのDNAの直接取り込みもまた報告されている（例えば、Hain et al. 1985及びDraper et al., 1982を参照されたい）。プロトプラスト及び全細胞及び組織のエレクトロポレーションもまた、記載されている（D'Halluin et al., 1992及びLaursen et al., 1994）。
【００７２】
イネ標的組織の形質転換の後に、上記選択可能なマーカー遺伝子の発現が、現在本分野において周知な再生及び選択法を用いて、形質転換された細胞、組織及び／又は植物の優先的な選択を可能とする。本明細書に記載されたマーカーは、その目的のためにも用いられ得る。
【００７３】
非遺伝子組換え法による、穀物収量が改善されたイネの生産
収量が改善されたイネを生産するための他の実施形態では、原形質融合が、ドナー植物からレシピエント植物への核酸の移行のために用いられ得る。原形質融合は、単一の二核又は多核細胞を生産する、誘導される又は自発的な結合、例えば二つ以上のプロトプラスト（細胞壁が酵素処理によって除去された細胞）間の体細胞ハイブリダイゼーションである。自然では交配し得ない植物種によってさえも得られ得る融合した細胞は、性質の所望の組み合わせを示すハイブリッド植物に組織培養される。より具体的には、第一のプロトプラストは、イネ又改善された穀物収量を示す他の植物系統から得られ得る。例えば、ダリンガン（Darigan）、YP9、又はBali Ontjer由来のプロトプラストが用いられ得る。第二のプロトプラストは、イネ又は他の植物変種、好ましくは一般的なインディカイネ品種から得られ得る。さらに、第二のプロトプラストは、商業的に望ましい特徴、例えば限定するものではないが、病害抵抗性、昆虫抵抗性、雑草抵抗性等を含むイネ変種に由来し得る。その後、プロトプラストは、本分野で知られる伝統的なプロトプラスト融合手順を用いて融合される。
【００７４】
あるいは、胚救出（embryo rescue）が、ドナー植物からレシピエント植物へのSPIKEを含む核酸の移行に用いられ得る。胚救出は、植物が生存可能な種子を生産できない交雑種から胚を単離するための手順として用いられ得る。この方法では、植物の受精子房又は未熟な種子が、組織培養されて新たな植物が作られる。
【００７５】
伝統的な育種技術もまた、より高い穀物収量が望ましい標的レシピエントイネ、好ましくはインディカイネ品種にSPIKEをコードする核酸配列を遺伝子導入するために用いられ得る。系統育種とも呼ばれる一つの方法では、SPIKEをコードする核酸配列を含むドナーイネは、より高い穀物収量が望ましいイネ、好ましくはインディカイネ品種と交雑される。得られる植物集団（F1ハイブリッドを表す）は、その後自家受粉し、種子をつくる（F2種子）。その後、F2種子から成長したF2植物は、改善された穀物収量をもとにスクリーニングされる。集団は、多くの異なる方法で改善された穀物収量についてスクリーニングされ得る。例えば、集団は幾つかの作期にわたる圃場評価によってスクリーニングされ得る。収量は、m2あたりの穀物収量（GYS）、ヘクタールあたりの穀粒重量（例えば、t ha-1、kg ha-1）、植物あたりの平均穀粒重量、又は本分野で知られる任意の他の手段によって決定され得る。
【００７６】
本明細書で記載される方法によって得られ得る改善された穀物収量を有するイネ、又はその一部もまた、本発明の実施形態である。
【００７７】
一つの特定の実施形態は、そのゲノム中にSPIKE又はその収量改善部分を含む、改善された穀物収量を有するイネ、若しくはその一部であって、SPIKE又はその収量改善部分が、その天然の遺伝的背景に存在しない上記イネ若しくはその一部に関する。本明細書で記載される改善された穀物収量を有するイネは、任意の遺伝子タイプ、例えば純系、ハイブリッド、一倍体、二ゲノム性半数体、単為結実、又は遺伝子組換えであり得る。さらに、本発明の植物は、改善された穀物収量の性質について、ヘテロ接合性又はホモ接合性、好ましくはホモ接合性であり得る。SPIKE及びその収量改善部分は、改善された穀物収量を有する植物を提供するために任意の植物に導入され得るが、本明細書に記載される方法及び植物は、好ましくは穀草ファミリー、より好ましくはイネに関する。
【００７８】
純系の改善された穀物収量を有するイネ系統は、循環選択及び戻し交雑、自家受粉及び／又は二ゲノム性半数体の技術、又は親系統を作成するために用いられる任意の他の技術を用いて開発され得る。選択及び戻し交雑の方法では、改善された穀物収量は、反復親と第一のドナー植物（反復親とは異なり、本明細書では、「非反復親」と呼ばれる）を交雑することによって、標的レシピエント植物（反復親と呼ばれる）に遺伝子導入され得る。反復親は、穀物収量の増加が望ましい植物、好ましくはインディカイネ品種である。任意に、反復親は、商業的に望ましい特徴、例えば、限定するものではないが、病害抵抗性、昆虫抵抗性、雑草抵抗性等を有する。非反復親は、SPIKEをコードする核酸配列を含む。非反復親は、反復親と交雑稔性であるいずれの植物変種又は純系系統でもあり得る。反復親と非反復親の交雑から生じる後代は、反復親と戻し交雑される。その後、得られる植物集団はスクリーニングされる。集団は、多くの異なる方法でスクリーニングされ得る。その後、改善された穀物収量を示し、必要なSPIKEをコードする核酸配列を含むF1ハイブリッドを選択し、イネを次第に純系とするために、多くの世代にわたって、自家受粉させ、選択する。この連続する自家受粉及び選択のプロセスは、0〜5以上の世代で行われ得る。かかる育種及び選択の結果は、改善された穀物収量に関連する遺伝子、並びに商業的に興味のある性質に関連する他の遺伝子について遺伝的に同種である系統の生産である。
【００７９】
バイオアッセイの表現型病理学スクリーニングを用いる代わりに、マーカー支援選抜（MAS）が、SPIKEをコードする核酸配列を含む後代を同定するために、一以上の本明細書に記載された分子マーカー、ハイブリダイゼーションプローブ、又はポリヌクレオチド用いて行われ得る。あるいは、MASは定量バイオアッセイから得られる結果を確認するために用いられ得る。適切な選択がなされたら、プロセスは反復される。反復親への戻し交雑及び改善された穀物収量の選択のプロセスは、約5世代以上反復される。このプロセスで生じる後代は、SPIKEについてヘテロ接合性である。その後、最後の戻し交雑世代を、改善された穀物収量についてのホモ接合性純系育種後代を提供するために、自家受粉させる。
【００８０】
本明細書に記載された改善された穀物収量を有するイネ系統は、改善された穀物収量を有するハイブリッド植物を作るためにさらなる交雑において用いられ得る。例えば、本明細書に記載の方法によって生産された、改善された穀物収量を有する第一の純系イネは、商業的に望ましい性質、例えば、限定するものではないが、病害抵抗性、昆虫抵抗性、雑草抵抗性等を有する第二の純系イネと交雑され得る。この第二の純系イネは、比較的改善された穀物収量を有していても有していなくてもよい。
【００８１】
マーカー支援選抜及び戻し交雑
SPIKEマーカー支援選抜（MAS）及びマーカー補助戻し交雑（MABC）が本明細書において記載される。
【００８２】
分子マーカーとしては、制限フラグメント長多型（RFLP）、ランダム増幅多型DNA（RAPD）、増幅されたフラグメント長多型（AFLP）、一塩基多型（SNP）又は単純配列反復（SSR）が挙げられる。作物種における分子マーカーの開発のための主要な動機は、マーカー支援選抜（MAS）及びマーカー支援戻し交雑（MABC）を介する植物育種における効率の増加の可能性である。遺伝子マーカーの対立遺伝子は、一以上の遺伝子座に所望の遺伝子型を含み、所望の表現型と共に所望の遺伝子型をその後代に移行させると予期される植物を同定するために用いられる。遺伝子マーカーの対立遺伝子は、一つの遺伝子座、又は複数の関連していない又は関連している遺伝子座（例えば、ハプロタイプ）に所望の遺伝子型を含み、所望の表現型と共に所望の遺伝子型をその後代に移行させると予期される植物を同定するために用いられ得る。
【００８３】
所望の表現型、例えば改善された穀物収量及び多型性の染色対遺伝子座が、共に分離されると決定させた後、所望の表現型に対応する対立遺伝子について選択するために、それらの多型の遺伝子座を用いること：マーカー支援選抜（MAS）と呼ばれるプロセスが可能である。手短には、マーカー核酸に対応する核酸が、選択される植物由来の生物学的サンプルにおいて検出される。この検出は、例えば、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、サザン分析、ノーザン分析、インサイチュー（in situ）ハイブリダイゼーション、プライマーのハイブリダイゼーション及びそれに続くマーカーの領域のPCR増幅等、プローブ核酸のマーカーへのハイブリダイゼーションの形態をとり得る。マーカーを検出するための様々な手順が本明細書に記載される。生物学的サンプルにおける特定のマーカー及び／又はマーカー対立遺伝子の存在（又は不在）を確認した後、植物は選択される、すなわち、選択的育種によって後代植物を作るために用いられる。
【００８４】
改善された穀物収量についての多数の植物のスクリーニングは、高価で、時間がかかり、信頼できないものとなり得る。本明細書に記載された遺伝的に関連した核酸の、改善された穀物収量のための遺伝子マーカーとしての使用は、育種計画における稔性回復が可能な植物の選択に効果的な方法である。例えば、改善された穀物収量の圃場評価に対するマーカー支援選抜の一つの利点は、成長の季節に関わらず、MASが一年のいずれの時間でもなされ得ることである。さらに、環境効果はMASには関係ない。
【００８５】
植物育種におけるMASの他の使用は、戻し交雑育種による反復親遺伝子型の回復を支援することである。戻し交雑育種は、後代をその親の一つと交雑するプロセスである。戻し交雑は、通常一つ又は幾つかの遺伝子座を、ドナー親から、別の反復親由来の所望の遺伝的背景に遺伝子導入する目的のためになされる。なされる戻し交雑のサイクルが多いほど、反復親の得られる変異への遺伝的貢献がより高くなる。これは、ドナー親植物がその他の点で望ましくないものであり得るため、しばしば不可欠である。対照的に、集中的な育種計画の結果である改変種は、改善された穀物収量等の一つの所望の性質においてのみ不十分であり得る。戻し交雑は、性質について、又は対して選択するためになされ得る。
【００８６】
集団のメンバー間の遺伝子多型に対応するマーカーは、本分野で十分に確立された多くの方法（制限フラグメント長多型（RFLP）、アイソザイムマーカー、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ASH）、増幅された植物ゲノムの可変配列、自家持続配列複製、単純配列反復（SSR）、単一ヌクレオチド多型（SNP）、又は増幅されたフラグメント長多型（AFLP））によって検出され得る。
【００８７】
遺伝子マーカーの大部分は、その検出のために、核酸の一以上の特徴に依存する。例えば、遺伝子マーカーを検出するためのいくつかの技術は、遺伝子マーカーに対応する核酸へのプローブ核酸のハイブリダイゼーションを利用する。ハイブリダイゼーションのフォーマットとして、限定するものではないが、液相、固相、混合相又はインサイチューハイブリダイゼーションアッセイが挙げられる。制限フラグメント長多型（RFLP）であるマーカーは、プローブ（典型的に、検出される核酸のサブフラグメントに対応するサブフラグメント又は合成オリゴヌクレオチドである）を、制限消化ゲノムDNAにハイブリダイズさせることによって検出される。制限酵素は、異なる個体において少なくとも二つの代替の（又は多型性の）長さの制限フラグメントを提供するように選択され、しばしば系統ごとに異なる。各交雑種について有益なフラグメントを生産する（一以上の）制限酵素の決定は、単純な手順であり、本分野で周知である。適切な基質（例えば、アガロース）において長さによって分離し、膜（例えば、ニトロセルロース、ナイロン）に移行させた後、標識したプローブをプローブの標的への平衡結合をもたらす条件下でハイブリダイズさせた後、洗浄により過剰なプローブを除去する。マーカー遺伝子座に対する核酸プローブは、クローニング及び／又は合成され得る。核酸プローブと共に用いるために好適な検出可能な標識は、分光学的、放射同位元素的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的又は化学的手段によって検出可能な任意の組成を含む。有用な標識として、標識されたストレプトアビジンコンジュゲートによる染色のためのビオチン、磁性ビーズ、蛍光色素、放射標識、酵素及び比色標識が挙げられる。他の標識として、フルオロフォア、化学発光剤及び酵素により標識された抗体に結合するリガンドが挙げられる。標識マーカーは、マーカー遺伝子座への標識されたPCRプライマーの使用等によって簡単に達成される。
【００８８】
その後、ハイブリダイズしたプローブは、最も典型的には、オートラジオグラフィー又は他の同様の検出技術（例えば、蛍光光度分析、液体シンチレーションカウンター等）を用いて検出される。特定のハイブリダイゼーションプロトコルの例は、本分野において広く利用可能である。
【００８９】
増幅可変配列は、同種のメンバー間で高い核酸残基の可変性を示す植物ゲノムの増幅された配列を指す。全ての生物は、可変ゲノム配列を有し、（クローンを除く）各生物は、異なるセットの可変配列を有する。同定されると、特定の可変配列の存在は、表現形質を予測するために用いられ得る。好ましくは、植物由来のDNAは、DNAの可変配列に隣接するプライマーによる増幅のための鋳型として働く。可変配列は増幅され、その後配列決定される。
【００９０】
In vitro増幅技術は、本分野で周知である。技術の例として、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ鎖反応（LCR）、O,β−レプリカーゼ増幅及び他のRNAポリメラーゼ媒介技術（例えば、NASBA）をはじめとするin vitro法が挙げられる。本質的に、任意のRNAが、逆転写酵素及びポリメラーゼを用いる制限消化、PCR伸長及び配列決定に好適な二本鎖DNAに変換され得る。
【００９１】
例えば、増幅反応におけるプライマーとしての使用のための、及び核酸配列プローブとしての使用のためのオリゴヌクレオチドは、典型的に固相ホスホラミダイトトリエステル法に従って化学的に合成されるか、又は単に商業的に注文され得る。
【００９２】
あるいは、自家持続配列複製が、遺伝子マーカーを同定するために用いられ得る。自家持続配列複製は、レトロウイルス複製に関わる三つの酵素活性：（１）逆転写酵素、（２）RNAseH及び（３）DNA依存性RNAポリメラーゼを用いることによる、実質的に等温条件下でin vitroで対数的に複製される標的核酸配列を用いる核酸増幅法を指す。cDNA中間体の手段によってRNA複製のレトロウイルス戦略を模倣することによって、この反応は元の標的のcDNA及びRNAコピーを蓄積する。
【００９３】
増幅されたフラグメント長多型（AFLP）、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ASH）、単一ヌクレオチド多型（SNP）、単純配列反復（SSR）及びアイソザイムマーカーを含む、多くの異なるタイプの分子マーカーが存在する。SSRデータは、プライマーをSSR配列に隣接する植物ゲノムの保存された領域にハイブリダイズすることによって作成される。その後、プライマー間の反復を増幅するためにPCRが用いられる。その後、増幅された配列は、電気泳動され、サイズ及びしたがってジ−、トリ及びテトラヌクレオチド反復を決定する。
【００９４】
好ましい表現型を示す植物のゲノムにおけるSPIKEの存在は、上記方法、例えばRFLP、AFLP、SSR等のいずれかによって決定される。植物由来の核酸が所望の遺伝子マーカーについて陽性である場合、植物は、同じ遺伝子型を有する純系の育種系統を作るために自家受粉され得るか、又は性的に交雑されたハイブリッド世代を作るために、同じマーカーを有するか他の所望の特徴を有する植物と交雑され得る。
【００９５】
本発明の材料及び方法は、イネ以外の穀草、例えばコムギ、ソルガム及びトウモロコシにおける改善された穀物収量を与えるために、同様に用いられ得る。
【実施例】
【００９６】
本明細書に記載された方法及び実施形態が、以下の実施例でさらに定義され、ここでは、他で記載しない限り、全ての部及び割合は重量により、度は摂氏度である。本発明の幾つかの実施形態が、本明細書の実施例で定義される。これらの実施例が、本発明の好ましい実施形態を示すと同時に、例証としてのみ与えられる点に留意されたい。本明細書の考察及びこれらの実施例から、当業者は、その精神及び範囲から離れることなく、本発明の本質的な特徴を確認することができ、様々な使用法及び状況にそれを適合させるために、本発明の様々な変更及び改変をなし得る。
【００９７】
結果
NIL-SPIKEの特徴
本明細書でSPIKE（SPIKELET NUMBER、籾数）と呼ぶ量的形質遺伝子座（QTL）qTSN4を、SPIKEのについてのNIL、NIL-SPIKEを用いて特徴づけた（図１−１Ａ）。NIL-SPIKEは、IR64よりも長い穂（図１−１Ｂ）、葉（図１−２Ｃ）、及び穂頸（図１−２Ｄ）を有していた。収量関連形質の中でも、それはより高いTSN（一穂あたり籾数）（図１−３Ｅ）、止葉幅（FLW；図１−３Ｆ）、根の乾燥重量（RDW；図１−３Ｇ）及び登熟粒の割合（図Ｓ２Ａ）を有していたが、より低い植物当たり穂数及び1000粒量（図２ＳＢ、Ｃ）を有していた。注目すべきことに、登熟粒の割合に加えて、おそらく維管束数（VBN；図１−４Ｉ）の増加によって、同化産物の穂への供給が強化され、玄米外観品質が改善されたと考えられる（図１−４Ｈ）。結果として、NILのm2あたりの穀物収量（GYS）は、四つの作期にわたって、一貫してIR64のそれよりも高く、この四つの作期のうち三つにおいて有意に高かった（図１−４Ｊ）。NILの平均GYSは、IR64の平均GYS（〜400 g/m2）よりも、乾期において28%高く、雨期において24%高かった。したがって、穀物の見かけの低下を伴わないNILにおけるGYSの増加は、シンクサイズ（高いTSN）、ソースサイズ（広いFLW及び高いRDW）、及び転流能（高いVBN）の増大を介して達成された。さらに、到穂日数は変化しなかった（図Ｓ２Ｄ）。したがって、SPIKEは出穂日などの地域適応性に関する形質を変えることなく収量を改善する非常に有用な遺伝子である。
【００９８】
高解像関連マッピング及びSPIKEの同定
SPIKEについて遺伝子を同定するために、高解像関連分析を、TSNについて7996 BC4F3植物を用いて評価した。候補領域は、Ind4及びInd12（18.0kbp）マーカーの間に存在し、その領域にはミシガン州立大学のイネゲノムアノテーションプロジェクト（Rice Genome Annotation Project）のデータベースが三つの遺伝子を予測している（図２−１Ａ）。TSNに加えて、示唆された遺伝子は、二次枝梗数及び葉幅の増加と関連していた（図７）。幼穂における発現分析は、Os04g52479（Nal1：ナローリーフ1）のみが発現されたことが明らかになった（図８）。したがって、これがSPIKEの最も見込みのある候補である。SPIKEの予測アミノ酸配列の分析は、IR64及びNIL-SPIKE間で三つのアミノ酸置換を明らかにし、その一つはトリプシン様セリン及びシステインプロテアーゼドメインに存在する（図９−１、９−２）。さらに、SPIKEタンパク質は、ヤマカモジグサ（Brachypodium）、コムギ、ソルガム、及びトウモロコシのタンパク質と＞84%の同一性を示し、トリプシン様セリン及びシステインプロテアーゼドメインにおいて高い類似性を示す。この類似性は、これらの種間のSPIKEタンパク質ファミリーの生物化学的機能の保存を示している。
【００９９】
SPIKEの発現分析
SPIKEは、幾つかの器官において一貫して発現されていた（図２−２Ｂ）。植物発育器官のSPIKEの組織的発現を分析するために、β‐グルクロニダーゼ（GUS）レポーター遺伝子を、遺伝子組換えIR64植物において、ネイティブなSPIKEプロモーターの制御下で発現させた。組織化学的分析は、子葉鞘、穂首及び茎の維管束、葉（図Ｓ６Ａ−Ｃ）、冠根、側根（図２−２Ｃ）、及び幼穂（図２−２Ｄ）におけるGUS活性を明らかにした。子葉鞘に加えて、GUS発現のパターンは、NIL-SPIKEにおいて増強された器官と一致していた。定量RT-PCRは、様々なステージにおける幼穂におけるSPIKEの発現が、NIL-SPIKEにおいてIR64におけるものより一貫して高く、21〜50 mm期ではIR64の発現の2倍であることを明らかにした（P=0.05；図２−３Ｅ）。この結果は、幼穂期でのSPIKE発現の増加が、一穂あたり籾数を増加させたことを示している。
【０１００】
遺伝子組換え植物体を用いた分析によるSPIKE遺伝子の効果の検証
SPIKEの発現解析データを裏付けるため及びSPIKEの機能への洞察を得るために、（恒常的プロモーターを用いる）過剰発現系統及び（人工のマイクロRNA：amiRNAを用いる）発現抑制系統を作成した。ユビキチンプロモーターと融合させたNIL-SPIKE由来のSPIKEのcDNAを含むDNAフラグメント（Ubi:SPIKE）を、形質転換によってIR64に導入した。過剰発現遺伝子組換え植物は、大きな穂及び広い止葉を含む、NIL-SPIKEと同様の表現型を示した（図３−１Ａ、Ｂ）。単一コピーを有する植物は、IR64より有意に高いTSN及びFLWを有していた（図３−２Ｃ、Ｄ）。複数コピーを有する植物は、単一コピーを有するものよりも有意に高いTSN及びFLWを有しており、これはTSN及びFLWの増加がSPIKEの発現と連動することを示唆している。複数コピーを有する事象において、有意に高い転写産物が観察された（図Ｓ７Ａ）。これは、SPIKE転写産物の、植物表現型に対する用量効果を示唆している。さらに、T0 Ubi:SPIKE植物のTSN及びFLWは、コピー数と共に増加した（図Ｓ７Ｃ−Ｅ）。対照的に、SPIKEを下方調節するための、SPIKEの第一（amiRNA1）及び第四（amiRNA4）のエクソンを標的とする二つのamiRNA前駆体のNIL-SPIKEへの形質転換は、NIL-SPIKEよりも有意に低いTSN及び狭い葉を有する遺伝子組換え植物を生産した（図３−４Ｇ、Ｈ）。
【０１０１】
nal1（機能欠失）変異体Fn188は、同様に、その野生型である台中（Taichung）65に対して低減されたTSN及びFLWを示した（図１２−１、１２−２）。これらの結果は、SPIKE（熱帯ジャポニカ由来のNal1の新規対立遺伝子）が発現に対応して穂及び止葉を増大させることを示している。Nal1はオーキシン極性輸送に関係することが報告されたが、IR64とNIL-SPIKE間で、インドール酢酸（IAA）生合成又は輸送に差は観察されなかった（図１３−１、１３−２）。遺伝子組換え分析は、SPIKEが、葉における葉脈パターン形成及び極性オーキシン輸送に影響を与えるNal1と同一であったことを明らかにした。自然変異から同定されたSPIKEは、熱帯ジャポニカ由来の新規対立遺伝子である一方、変異系統から同定されたnal1は、機能欠失変異である。nal1変異体は、野生株と比べてTSNが低減されており、一方熱帯ジャポニカ由来のNal1における新規対立遺伝子は、増加したTSNを示した。該データは、幼穂形成期でのオーキシン輸送の活性がTSNと関係していることを示している。TSNの増加によって、NIL-SPIKEの穀物収量は結果として増加した。
【０１０２】
SPIKEによるインディカ品種における穀物収量の増強
異なる遺伝的背景において収量を増加させることについてのSPIKEの有効性を評価するために、該遺伝子を新規な高収量インディカ品種であるIRR1146（フィリピンでは、「NSIC Rc158」としてリリースされている）に遺伝子導入した。IRRI1146への反復戻し交雑及びマーカー補助選抜により、IRRI146-SPIKE NILを作成した（図４−１Ａ、４−２Ｂ）。IRRI146-SPIKEは、IRRI146に対し98%の遺伝的同一性を有していたので、IRRI146におけるSPIKEの多面的効果は、NIL-SPIKEにおけるものと同様であった。IRRI146-SPIKEのGYS、TSN、及びFLWは、IRRI146のものより優位に高かった（図４−３Ｃ−Ｅ）。YP9由来のSPIKEを、同様に、異なる遺伝的及び地理的背景を有する五つの一般的なインディカ品種に導入した。その効果を、一般的なインディカ品種である、フィリピン由来のPSBRc18（IR51672-62-2-1-1-2-3）、インドネシア由来のチヘラン（Ciherang）、ラオス由来のTDK1、バングラデシュ由来のBR11、インド由来のスワルナ（Swarna）の異なる遺伝的背景において確認した。SPIKEについてホモ接合性である植物は、反復親よりも優位に高いTSNを有していた（図４−４Ｆ）。
【０１０３】
材料及び方法
植物材料
戻し交雑育種によって、インディカ品種のIR64の遺伝的背景中に、NPT品種から遺伝した農業形質に変異を有する334 BC3由来のILを開発した。我々は、高いTSNを有するIL：インディカ品種のShennung 89-366と熱帯ジャポニカ在来種のダリンガン（Daringan）の交雑種に由来するNPT品種YP9（IR68522-10-2-2）に由来するYTH326（IR84640-11-110-6-4-2-2-4-2-2-3-B）を選択した（図５）。IR64とYTH326の交雑種に由来するBC4F2集団を用いて、高いTSNについて、染色体4の長腕のSSRマーカーであるRM3423及びRM17492の間にqTSN4を同定した。NIL-SPIKEを、BC4F2集団から選択された植物の自家受粉により開発し、農業形質の評価、形質転換、及び発現のために用いた。
【０１０４】
nal1を有する系統Fn188は、ナショナルバイオリソースプロジェクト（National Bioresource Project）の下で、九州大学により提供された。Fn188は、ドナー親としてのnal1変異体と、反復親としてのジャポニカ品種である台中（Taichung）65の間の交雑由来のBC3後代から開発された。nal1遺伝子座は、染色体4の長腕上のマーカーであるC1100とC600の間にマッピングされた。Nal1はSPIKEと同一であると考えられたので、Fn188を、SPIKEの効果と比較するための農業形質の特徴づけのために用いた。
【０１０５】
IRRI146-SPIKEの開発
高収量のインディカ品種であるIRRI146（IR77186-122-2-2-3）は、最近フィリピンにおいて「NSIC Rc158」としてリリースされた。熱帯ジャポニカのBali Ontjer由来のNPT IR65564-22-2-3とIRRI146の交雑種の後代を、IRRI146に三回戻し交雑した。各世代において、SPIKE隣接マーカーであるRM5503及びRM6909を用いてMASを行った。全ての染色体をカバーする116の多型性SSRマーカーを用いる96のBC3F1植物の全ゲノム調査を行った。一つのBC3F1植物を選択し、IRR1146の遺伝的背景中のSPIKEについてのNILを開発するために自家受粉させた。このIRRI146-SPIKEを、農学的形質及び穀物収量について、反復親と比較した。
【０１０６】
SPIKEを有するインディカ品種の開発
戻し交雑及びMASによって5つの一般的な品種：PSBRc18（IR51672-62-2-1-1-2-3）（フィリピン）、チヘラン（Ciherang）（インドネシア）、TDK1（ラオス）、BR11（バングラデシュ）、及びスワルナ（Swarna）（インド）にSPIKEを遺伝子導入した。YP9と各品種の交雑種の後代を、該一般的な品種に二回戻し交雑した。各世代において、SPIKE隣接マーカーであるInd2及びRM17487を用いてMASを行った。SPIKEについてホモ接合性である植物を、各BC2F2集団から選択し、圃場においてTSNについて評価した。
【０１０７】
SPIKEの表現型評価
全ての植物を、フィリピン、ラグナ、ロスバニョス（Los Banos）のIRRIにおいて圃場で成長させ、成熟期に1000粒重、PN、FLW、及びTSNについて評価した。穂軸を穂首の１cm下で切断し、VBNを立体顕微鏡下でカウントした。ポットで成長させた植物のRDWを、成熟期に測定した。
【０１０８】
穀物収量を評価するために、IR64、NIL-SPIKE、IRRI146、及びIRRI146-SPIKEを、系統ごとに四反復で無作為プロットで成長させた。各プロットの面積は少なくとも4.8 m2であり、播種後21日の苗を、1株当たり3苗、20cmと25cmの条間で移植した。基肥として各30 kg/haのN、P、及びKを移植の前日に施用し、30 kg/haのNを追肥として二回、移植の2週及び4週後に施用した。成熟期に、1.0 m2のイネ（各プロットにおいて20株）を収穫し、植物をオーブンにおいて70 °Cで5日間乾燥させた。GYSを、14%の水分含量ベースで計算した。白未熟粒を、系統ごとに四反復で、穀粒判別器（Cervitec 1625グレインインスペクター、FOSS Analytical、Hillerod、デンマーク）により評価した。
【０１０９】
高解像関連マップ
SPIKEについてヘテロ接合性であるBC4F2植物から作成した7996のBC4F3植物のゲノムDNAを、新鮮な葉から抽出した。隣接マーカーであるRM17450及びRM3836の間に組換えを有する1073のBC4F3植物のゲノムDNAを、セチルトリメチルアンモニウムブロミド法によって凍結乾燥した葉から個々に抽出した。RM3423とAGT3の間に組換えを示した41のBC4F3植物を選択し、AGT3を自家受粉して後代試験に用いるためのBC4F4系統を作成した。BC4F4系統の中で、各組換え体由来のホモ接合性植物を選択し、TSN及びFLWについて評価した。22のDNAマーカーを、マップの構築のために用いた（表1）。
【０１１０】
【表１】
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【０１１１】
SPIKEの形質転換
SPIKEのコード領域の全長を包含するフラグメントを、NIL-SPIKEの幼穂由来のcDNAから、8M17-c1のプライマー対を用いて、増幅した。フラグメントをバイナリ―ベクターであるpCAMBIA1300int-prUbi1-tNOSに、トウモロコシユビキチンプロモーターとノパリンシンターゼターミネーターの間にライゲーションし、過剰発現ベクターを作った。アグロバクテリウム媒介形質転換を用いて、ベクターをIR64に導入した。再生植物を、サザンブロット分析によって導入遺伝子のコピー数について評価した。SPIKEの遺伝子発現抑制には、amiRNAアプローチを用いた。二つの21bpのamiRNA配列−amiRNA1（SPIKEの第一のエクソンのための、TATAAGAAGTATGCTGCGCTA（配列番号4））、及びamiRNA4（SPIKEの第四のエクソンのための、TTAATATCAAGTTCCAGACGC（配列番号5））を、Web MicroRNA Designer 3ソフトウェアを用いて設計した。amiRNAの前駆体（表1）は、プラスミドpNW55を鋳型として用いる重複PCRを用いて、部位特異的突然変異により作製した。前駆体をバイナリーベクターであるpCAMBIA1300int-prUbi1-tNOSにライゲーションし、発現抑制ベクターを作った。アグロバクテリウム媒介形質転換を用いて、ベクターをNIL-SPIKEに導入した。遺伝子組換え植物（T0）をポットに移植し、T1植物を、20cm及び30cmの条間で、スクリーンハウス内に移植した。これらの植物を、TSN及びFLWについて評価した。
【０１１２】
promoter:GUSベクターを作るために、UP6-1プライマー対を用いたSPIKEのATGコドンの上流の1918bpのフラグメントを増幅した。増幅したフラグメントを、バイナリーベクターであるpCAMBIA0380（Cambia、Canberra、ACT、オーストラリア）において、GUSレポーター遺伝子の上流にライゲーションした。このベクターをアグロバクテリウム媒介形質転換によってIR64に導入した。再生した植物の器官を、GUS活性を分析するためにサンプリングした。
【０１１３】
発現分析及びIAA輸送
各器官の全RNAをRNeasy Plant Mini Kit（Qiagen、California、米国)を用いて抽出した。SPIKEの候補遺伝子を同定するために、1μgの全RNAを用いてRT-PCRを行った。各候補のための遺伝子特異的プライマー（表1）と1μLのcDNAを用いてPCRを行った。異なる器官における発現の比較のために、幼穂、茎、葉鞘、葉、及び根の全RNAを、穂の開始期に抽出した。seq8M17-56プライマー対及びReverTra Ace qPCR RTキット（東洋紡、大阪、日本）を用いて、500ngの全RNAを用いてRT-PCRを行った。seq8M17-56プライマー対とLightCycler 480 SYBR Green I Master Mixを用いて、LightCycler 480 System（Roche Applied Science）において、1/5 cDNA混合物を用いてqRT-PCR反応を行った。データをハウスホールド遺伝子であるユビキチン（Os01g22490）の発現に対して標準化した。
【０１１４】
IR64及びNIL-SPIKE子葉鞘におけるIAA生合成の割合を、切断した子葉鞘から寒天ブロックへ移行したIAAの量を、ガスクロマトグラフィー−選択的イオンモニタリング−質量分析（GC-SIM-MS）によって測定することによって調査した（図１３−１、１３−２）。IR64及びNIL-SPIKE子葉鞘における極性IAA輸送を調べるために、3μMのIAAを、子葉鞘断片（1.5〜3.0mm）の尖端に30分適用し、その後子葉鞘を寒天ブロック上で10分間インキュベートし、輸送されたIAAを上記GC-SIM-MSによって測定した。
【０１１５】
本明細書で言及した特許文献及び非特許文献を含む全ての刊行物を、参照により明示的に本明細書に組込む。本明細書に記載されたいずれの文書の引用も、前記のいずれかが関連先行技術であることの承認としては意図されていない。これらの文書の内容に関する日付又は表現に関する全ての記載は、出願人に利用可能な情報に基づくものであり、これらの文書の日付又は内容の正しさに関するいかなる承認も構成しない。
【０１１６】
様々な及び好ましい実施形態に言及して本発明を記載したが、本発明の本質的な範囲から離れることなく、それらの要素について様々な変更がなされ得、等価物に置換し得ることが当業者には理解されるであろう。さらに、本発明の本質的な範囲から離れることなく、本発明の教示に特定の条件又は材料を適合させるために、様々な改変がなされ得る。
【０１１７】
したがって、本発明が、本発明を実施するために熟慮された、本明細書に開示された特定の実施形態に限定されるものではないが、本発明が特許請求の範囲に属する全ての実施形態を含むことが意図される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ−１】
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【図９Ｂ−２】
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【図９Ｂ−３】
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【図９Ｂ−４】
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【図９Ｂ−５】
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【図９Ｂ−６】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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