(57)【要約】  本発明は、エストロゲン受容体βサブタイプ（ＥＲβ）アゴニストを使用する中皮腫、特に悪性胸膜中皮腫の処置であって、患者にＥＲβアゴニストを投与すること、次いで最大で２４時間のある時間ｔの後に、患者に白金含有抗がん薬を投与することを含む、処置を提供する。本発明は、患者における中皮腫の処置で使用するためのＥＲβアゴニストおよび白金含有抗がん薬であって、前記処置が、患者にＥＲβアゴニストを投与すること、次いで最大で２４時間のある時間ｔの後に、患者に白金含有抗がん薬を投与することを含む、ＥＲβアゴニストおよび白金含有抗がん薬；ならびに白金含有抗がん薬およびＥＲβアゴニストを含むキットも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における中皮腫の処置で使用するためのＥＲβアゴニストであって、前記処置が、
ａ）患者にＥＲβアゴニストを投与すること、次いで最大で２４時間のある時間ｔの後に、
ｂ）患者に白金含有抗がん薬を投与すること
を含む、ＥＲβアゴニスト。
【請求項２】
白金含有抗がん薬がシスプラチンである、請求項１に記載の使用のためのＥＲβアゴニスト。
【請求項３】
ＥＲβアゴニストが、式（III）の化合物またはその塩もしくはエステルであり、
【化１】
2016539954.tif 000004
（式中、Ｒ１は、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ＯＲＡ、Ｎ（ＲＢ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、−ＳＯ２Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、ハロＣ１〜６アルキル、ジハロＣ１〜６アルキル、トリハロＣ１〜６アルキル、ハロＣ２〜６アルケニル、ジハロＣ２〜６アルケニル、トリハロＣ２〜６アルケニル、シアノＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜４アルコキシＣ１〜６アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ３〜８シクロアルキルＣ１〜６アルキル、フェニル、ベンジル、および５〜１０員のヘテロシクリルからなる群から選択され、前記フェニル、ベンジルまたはヘテロシクリル基は、非置換であるか、１〜３個の置換基で置換することができ、それぞれの置換基は、ＯＲＡ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、ハロＣ１〜６アルキル、ジハロＣ１〜６アルキル、およびトリハロＣ１〜６アルキルからなる群から選択され；
Ｒ２は、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ＯＲＡ、Ｎ（ＲＢ）２、Ｎ（ＯＨ）２、１〜３個のハロゲンで任意選択で置換された−Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、−ＳＯ２Ｃ１〜４アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＯＨ、−Ｃ（ＮＨ２）＝Ｎ−ＯＨ、−Ｃ（ＣＯ２Ｈ）＝Ｎ−ＯＨ、−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−Ｃ（ＮＨ  Ｃ１〜４アルキル）＝ＮＨ、−Ｃ（Ｏ−Ｃ１〜４アルキル）＝ＮＨ、−Ｃ（ＮＨ２）＝Ｎ−ＮＨ２、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｎ＝Ｃ（−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−）、−Ｓ−ＣＮ、−Ｓ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−Ｓ−Ｃ（ＮＨ２）＝Ｎ−ＯＨ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＣＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＣＨ２ＳＯ３Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、ハロＣ１〜６アルキル、ジハロＣ１〜６アルキル、トリハロＣ１〜６アルキル、シアノＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜４アルコキシＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ３〜８シクロアルキルＣ１〜６アルキル、フェニル、ベンジル、および５〜１０員のヘテロシクリルからなる群から選択され、前記フェニル、ベンジルまたはヘテロシクリル基は、非置換であるか、１〜３個の置換基で置換することができ、それぞれの置換基は、ＯＲＡ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、ハロＣ１〜６アルキル、ジハロＣ１〜６アルキル、およびトリハロＣ１〜６アルキルからなる群から選択され、ただし、Ｒ１およびＲ２のうちの一方がハロゲンを表す場合、他方はハロゲン以外の基を表さなければならず、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６のそれぞれは独立して、水素、ＯＲＡ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、ハロＣ１〜６アルキル、ジハロＣ１〜６アルキル、およびトリハロＣ１〜６アルキルからなる群から選択され、
各ＲＡは独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ３〜８シクロアルキルＣ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、およびＣ６〜１０アリールＣ１〜６アルキルからなる群から選択され、それぞれは１〜３個のハロゲン原子で任意選択で置換されており、
各ＲＢは独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ３〜８シクロアルキルＣ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、およびＣ６−１０アリールＣ１〜６アルキルからなる群から選択され、それぞれは１〜３個のハロゲン原子で任意選択で置換されている）
ただし、式（III）の化合物は、
４−［３−（４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−（３，５−ジメチル−イソオキサゾール−４−イル）−インドール−１−イル］−フェノール；
１−（４−ヒドロキシ−フェニル）−２−（４−メチル−イミダゾール−１−イル）−１Ｈ−インドール−３−カルボニトリル；
１−（４−ヒドロキシ−フェニル）−２−（１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−１Ｈ−インドール−３−カルボニトリル；
１−（３−クロロ−４−ヒドロキシ−フェニル）−２−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インドール−３−カルボニトリル；
１−（４−ヒドロキシ−フェニル）−２−プロパ−１−イニル−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸アミド；または
１−（４−ヒドロキシ−フェニル）−２−チアゾール−２−イル−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸
でない、請求項１または請求項２に記載の使用のためのＥＲβアゴニスト。
【請求項４】
ＥＲβアゴニストが、式：
【化２】
2016539954.tif 000005
を有する化合物、またはその塩もしくはエステルである、請求項３に記載の使用のためのＥＲβアゴニスト。
【請求項５】
中皮腫が悪性胸膜中皮腫である、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のためのＥＲβアゴニスト。
【請求項６】
さらなる化学療法薬を投与することをさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用のためのＥＲβアゴニスト。
【請求項７】
さらなる化学療法薬がペメトレキセドである、請求項６に記載の使用のためのＥＲβアゴニスト。
【請求項８】
ペメトレキセドが、ＥＲβアゴニストを投与した後であって、任意選択で白金含有抗がん薬を投与する前に投与される、請求項７に記載の使用のためのＥＲβアゴニスト。
【請求項９】
ｔが、最大で約８時間、例えば、最大で４時間である、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用のためのＥＲβアゴニスト。
【請求項１０】
ＥＲβアゴニストが、エストロゲン受容体α−サブタイプよりも、エストロゲン受容体β−サブタイプに対して２００倍超選択的である、請求項９に記載の使用のためのＥＲβアゴニスト。
【請求項１１】
患者における中皮腫の処置で使用のためのＥＲβアゴニストおよび白金含有抗がん薬であって、前記処置が、
ａ）患者にＥＲβアゴニストを投与すること、次いで最大で２４時間のある時間ｔの後に、
ｂ）患者に白金含有抗がん薬を投与すること
を含む、ＥＲβアゴニストおよび白金含有抗がん薬。
【請求項１２】
ＥＲβアゴニストが、請求項３に規定した化合物またはその塩もしくはエステルである、請求項１１に記載の使用のためのＥＲβアゴニスト。
【請求項１３】
ＥＲβアゴニストが、式：
【化３】
2016539954.tif 000006
を有する化合物、またはその塩もしくはエステルである、請求項１２に記載の使用のためのＥＲβアゴニスト。
【請求項１４】
患者における中皮腫の処置をするための方法であって、
ａ）患者にＥＲβアゴニストを投与すること、次いで最大で２４時間のある時間ｔの後に、
ｂ）患者に白金含有抗がん薬を投与すること
を含む、方法。
【請求項１５】
患者における中皮腫を処置する薬剤を製造するためのＥＲβアゴニストであって、前記処置が、
ａ）患者にＥＲβアゴニストを投与すること、次いで最大で２４時間のある時間ｔの後に、
ｂ）患者に白金含有抗がん薬を投与すること
を含む、ＥＲβアゴニスト。
【請求項１６】
白金含有抗がん薬およびＥＲβアゴニスト、例えば、請求項３に規定した化合物、またはその塩もしくはエステル、およびシスプラチンまたはカルボプラチンを含むキット。
【請求項１７】
請求項１６に記載の白金含有抗がん薬およびＥＲβアゴニストを含むキットであって、前記ＥＲβアゴニストが、式：
【化４】
2016539954.tif 000007
を有する化合物、またはその塩もしくはエステルであり、白金含有抗がん薬がシスプラチンである、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エストロゲン受容体βサブタイプアゴニスト（ＥＲβアゴニスト）および白金含有抗がん薬を使用する中皮腫、特に悪性胸膜中皮腫の処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
中皮腫は、肺および／または腹部の中皮細胞のがんである。悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）は、中皮腫の最も一般的な形態であり、これは、アスベストへの曝露に関連している。現在、ＭＰＭの割合は、上昇しており、推定では、ＭＰＭの発病率が西欧諸国では次の１０〜１５年以内にピークとなることが示されている一方、日本では、ピークは、現在から４０年まで起こらないと予測されている（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＢＭ．、Ａｎｎ  Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ、２０１２；１（４）：４９１〜６ページ；Ｐｒａｚａｋｏｖａ  Ｓ、Ｔｈｏｍａｓ  ＰＳ、Ｓａｎｄｒｉｎｉ  Ａ、Ｙａｔｅｓ  ＤＨ．、Ｃｌｉｎ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ、２０１３；８（１）：１〜１０ページ）。アスベストの使用は、世界中の多くの国で禁止されているが、アスベストの生産およびアスベストへの曝露は依然として存在し、局地的に高い中皮腫の発病率を伴っている（Ｓｔａｙｎｅｒ  Ｌ、Ｗｅｌｃｈ  ＬＳ、Ｌｅｍｅｎ  Ｒ．、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ、２０１３；３４：２０５〜１６ページ）。カーボンナノチューブも、中皮腫を引き起こすことについて潜在的な懸念事項となっており、その理由は、これらが中皮腫を誘発する潜在性を有する「アスベスト様」病原性を示すことが報告されているためである（Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ  Ｋ、Ｐｏｌａｎｄ  ＣＡ、Ｍｕｒｐｈｙ  ＦＡ、Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ  Ｍ、Ｃｈｅｒｎｏｖａ  Ｔ、Ｓｃｈｉｎｗａｌｄ  Ａ．、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、２０１３；６５（１５）：２０７８〜８６ページ；Ｄｕｍｏｒｔｉｅｒ  Ｈ．、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．、２０１３；６５（１５）：２１２０〜２６ページ）。
【０００３】
ＭＰＭは、処置するのが極めて困難な疾患であり、中央値全生存時間は、病期にかかわらず９〜１７カ月の範囲である（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＮＰ、Ｋｉｎｄｌｅｒ  ＨＬ．、Ｓｅｍｉｎ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ、２０１１；３２：１０２〜１０ページ；Ｍｏｓｓｍａｎ  ＢＴら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、２０１３；１８２（４）：１０６５〜７７ページ）。シスプラチンおよびペメトレキセドの組合せが現在の標準的治療（ＳＯＣ）として確立されている。しかし、処置された患者の４０％しかこの療法に応答を示さず、全体的な生存期間中央値は、１２．１カ月である。（Ｖｏｇｅｌｚａｎｇ  ＮＪら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２００３；２１：２６３６〜４４ページ）。さまざまな化学療法剤が、単剤療法として、または多剤療法の一部として、ＭＰＭの処置の第二選択薬として使用されてきたが、首尾よく検証されたものはない。
【０００４】
Ｐｉｎｔｏｎ，Ｇ．ら、Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｂｏｏｋ  ｏｆ  ｔｈｅ  １１ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  Ｇｒｏｕｐ、２０１２年９月、１０４〜１０５ページでは、ＥＲβアゴニストのＫＢ９５２０は、Ｇ１で細胞周期を遮断することによって、培養時にヒトＥＲβ陽性ＲＥＮ中皮腫細胞株の増殖を阻害すると言われている。その要約書が関係するポスターにおいて、Ｐｉｎｔｏｎらは、ＥＲβアゴニストがｉｎ  ｖｉｔｒｏで、かつマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでヒト中皮腫ＲＥＮ細胞に対してシスプラチンおよびペメトレキセドの抗増殖作用を強力にした証拠を提示した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
中皮腫の臨床管理について、改善された、または代替となる処置の必要性が存続している。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、患者における中皮腫の処置で使用するためのＥＲβアゴニストであって、前記処置が、
ａ）患者にＥＲβアゴニストを投与すること、次いで最大で２４時間のある時間ｔの後に、
ｂ）患者に白金含有抗がん薬を投与すること
を含む、ＥＲβアゴニストを提供する。
【０００７】
本発明者らは、ＥＲβアゴニストは、ＥＲβアゴニストが白金含有抗がん薬を投与する前の最大で２４時間のある時間ｔにおいて投与されるとき、悪性中皮腫を処置するのに白金含有抗がん薬と組み合わせて特に有効であることを意外にも見出した。この意外な相乗効果は、ＥＲβアゴニストが最初に投与されるときのみ存在し、この効果は、白金含有抗がん薬がＥＲβアゴニストの前に投与されるとき存在しない。
【０００８】
本発明は、患者における中皮腫の処置をするための方法であって、
ａ）患者にＥＲβアゴニストを投与すること、次いで最大で２４時間のある時間ｔの後に、
ｂ）患者に白金含有抗がん薬を投与すること
を含む、方法も提供する。
【０００９】
本発明はさらに、患者における中皮腫を処置するための薬剤を製造するためのＥＲβアゴニストであって、前記処置が、
ａ）患者にＥＲβアゴニストを投与すること、次いで最大で２４時間のある時間ｔの後に、
ｂ）患者に白金含有抗がん薬を投与すること
を含む、ＥＲβアゴニストを提供する。
【００１０】
本発明はさらに、患者における中皮腫の処置で使用するためのＥＲβアゴニストおよび白金含有抗がん薬であって、前記処置が、
ａ）患者にＥＲβアゴニストを投与すること、次いで最大で２４時間のある時間ｔの後に、
ｂ）患者に白金含有抗がん薬を投与すること
を含む、ＥＲβアゴニストおよび白金含有抗がん薬を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、白金含有抗がん薬およびＥＲβアゴニストを含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】未処置の細胞に対する、さまざまな用量の化合物（Ｉ）（１〜１００ｎＭの範囲）で２４時間処置した後の悪性胸膜中皮腫由来ＲＥＮ細胞の増殖阻害の百分率を示す図である。各バーは、平均＋／−標準偏差（ｓ．ｄ）を表す；＊ｐ≦０．０５。
【図１Ｂ】中皮由来細胞（ＭＥＴ５Ａ）における、ならびに内因性ＥＲβのさまざまな発現レベル（ＲＥＮ、ＭＭＢ、Ｈ２５９６、およびＭＳＴＯ−２１１Ｈ）を有するＭＰＭ由来細胞およびＥＲβ発現ベクターをトランスフェクトしたＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ／ＥＲβ）における、化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）で２４および４８時間処置した後の増殖阻害の百分率を示す図である。ＥＲβがＥＲβ特異的ｓｉＲＮＡでノックダウンされたＲＥＮおよびＭＭＢ細胞（ＲＥＮ／ｓｉＲＮＡ  ＥＲβおよびＭＭＢ／ｓｉＲＮＡ  ＥＲβ）も示されている。棒グラフの下のウエスタンブロットは、各細胞株およびローディング対照のチューブリンのＥＲβタンパク質発現を示す。各バーは、平均＋／−ｓ．ｄを表す；＊ｐ≦０．０５。
【図２Ａ】未処置の細胞に対する、単独で、またはシスプラチン（１００μＭ）およびペメトレキセド（２２μＭ）と組み合わせて化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）に２４時間曝露した後のＲＥＮ細胞生存度を示す図である。各バーは、平均＋／−ｓ．ｄを表す；＊ｐ≦０．０５。
【図２Ｂ】ｉｎ  ｖｉｖｏ実験の処置スケジュールを示す図である。
【図２Ｃ−２Ｄ】処置の２１日目に評価したｉｎ  ｖｉｖｏ平均腫瘍増殖（図２Ｃ）および平均腫瘍増殖阻害（図２Ｄ）を示す４つの異なる処置群のボックスプロットを示す図である。濃いセグメントは、中央値を表し、一方、各長方形の上および下の境界は、四分位数を表す。バーは、各群についての最小値および最大値を示し、異常値は、小円によって識別されている。
【図３Ａ】化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）で１、２、４、８、１６、または２４時間前処置し、その後ウォッシュオフし、さらに２４時間にわたって通常培地中で増殖を継続した後のＲＥＮ細胞における増殖阻害の百分率を示す図である。各バーは、平均＋／−ｓ．ｄを表す；＊ｐ≦０．０５。
【図３Ｂ】通常培地（対照）または化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）に２時間にわたって前曝露し、その後ウォッシュオフし、さらに２４、４８、または７２時間にわたって通常培地中で増殖を継続した後のＲＥＮ細胞生存度を示す図である。
【図４Ａ】化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）で処置を開始して２、４、８、または１２時間後にシスプラチン（１００μＭ）を添加することのＲＥＮ細胞生存度に対する効果を示す図である。各バーは、平均＋／−ｓ．ｄを表す；＊ｐ≦０．０５。
【図４Ｂ】化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）で２時間前処置し、その後ウォッシュオフし、さらに２４時間にわたってさまざまな濃度のシスプラチン（２０〜１００μＭ）を補充した通常培地中で増殖を継続した後のＲＥＮ細胞生存度を示す図である。各バーは、平均＋／−ｓ．ｄを表す；＊ｐ≦０．０５。
【図４Ｃ】シスプラチン処置（１００μＭ）を開始してから２、４、８、または１２時間後に化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）を添加することのＲＥＮ細胞生存度に対する効果を示す図である。各バーは、平均＋／−ｓ．ｄを表す。
【図４Ｄ】化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）で２時間前処置し、その後ウォッシュオフし、さらに２４時間にわたってさまざまな濃度のペメトレキセド（５〜２２μＭ）を補充した通常培地中で増殖を継続した後のＲＥＮ細胞生存度を示す図である。各バーは、平均＋／−ｓ．ｄを表す。
【図４Ｅ】化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）で２時間前処置し、その後ウォッシュオフし、さらに２４時間にわたって、通常培地、またはシスプラチン（１００μＭ）、ペメトレキセド（２２μＭ）、もしくはシスプラチン（１００μＭ）／ペメトレキセド（２２μＭ）の組合せを含有する培地中で増殖を継続した後のＲＥＮ細胞生存度を示す図である。各バーは、平均＋／−ｓ．ｄを表す；＊ｐ≦０．０５。
【図４Ｆ】図４Ｂに示した結果のアイソボログラム分析の結果を示す図である。
【図５Ａ】シスプラチン（１００μＭ）で２４時間処置した、または化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）で２時間前処置し、その後ウォッシュオフし、さらに２４時間にわたって通常培地±シスプラチン（１００μＭ）中で増殖を継続したＲＥＮ細胞の細胞周期の結果を示す図である。
【図５Ｂ】シスプラチン（２５、５０、および１００μＭ）で２４時間処置した、または化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）で２時間前処置し、その後ウォッシュオフし、さらに２４時間にわたって通常培地±シスプラチン（２５、５０、および１００μＭ）中で増殖を継続したＲＥＮ細胞におけるＰＡＲＰ１切断およびＡＫＴリン酸化のウエスタンブロット分析および相対濃度測定を示す図である。総ＡＫＴおよびチューブリン染色を正規化のために使用した。
【図６Ａ】シスプラチン（２５、５０、および１００μＭ）で２４時間処置した後、または化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）で２時間前処置し、その後ウォッシュオフし、さらに２４時間にわたって通常培地±さまざまな濃度のシスプラチン（２５、５０、および１００μＭ）中で増殖を継続した後のＭＥＴ５Ａ細胞生存度に対する効果を示す図である。各バーは、平均＋／−ｓ．ｄを表す；＊ｐ≦０．０５。
【図６Ｂ】シスプラチン（２５、５０、および１００μＭ）で２４時間処置した、または化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）で２時間前処置し、その後ウォッシュオフし、さらに２４時間にわたって通常培地±さまざまな濃度のシスプラチン（２５、５０、および１００μＭ）中で増殖を継続したＭＥＴ５Ａ細胞におけるＰＡＲＰ１切断およびＡＫＴリン酸化のウエスタンブロット分析および相対濃度測定を示す図である。総ＡＫＴおよびチューブリン染色を正規化のために使用した。
【図７Ａ】シスプラチン（５０μＭ）で２４時間処置した後の、または化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）で２時間前処置し、その後ウォッシュオフし、さらに２４時間にわたって通常培地±シスプラチン（５０μＭ）中で増殖を継続したＭＭＰ細胞生存度を示す図である。各バーは、平均＋／−ｓ．ｄを表す。
【図７Ｂ】シスプラチン（５０μＭ）で２４時間処置した、または化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）で２時間前処置し、その後ウォッシュオフし、さらに２４時間にわたって通常培地±シスプラチン（５０μＭ）中で増殖を継続したＭＭＰ細胞におけるＰＡＲＰ１切断およびＡＫＴリン酸化のウエスタンブロット分析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、患者における中皮腫の処置で使用するためのＥＲβアゴニストであって、前記処置が、
ａ）患者にＥＲβアゴニストを投与すること、次いで最大で２４時間のある時間ｔの後に、
ｂ）患者に白金含有抗がん薬を投与すること
を含む、ＥＲβアゴニストを提供する。
【００１４】
化合物（Ｉ）、選択的ＥＲβアゴニストは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＭＰＭ細胞株において抗増殖作用を有することが本発明者らによって見出された。化合物（Ｉ）の抗増殖作用は、ＥＲβに対するその効果と関連し、その有効性は、内因的に発現されるＥＲβのレベルに関係したことが判明した。化合物（Ｉ）は、ＥＲβ陽性中皮由来ＭＥＴ５Ａ細胞に対して抗増殖作用を有さない。
【００１５】
本発明者らは、さらに、選択的ＥＲβアゴニストの化合物（Ｉ）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、およびマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで、ＲＥＮ細胞におけるシスプラチン／ペメトレキセドの増殖阻害作用の増強をもたらすことを今や見出した。
【００１６】
本発明者らは、ＥＲβアゴニストおよびシスプラチン（またはシスプラチン／ペメトレキセドの組合せ）の投与の順序が、処置の有効性の改善に重要であることを意外にも見出した。シスプラチンの前にＥＲβアゴニストにＲＥＮ細胞を曝露すると、悪性中皮腫細胞の増殖および生存の相乗的阻害がもたらされ、一方、逆順序の薬物曝露は、この増強をもたらさなかった。
【００１７】
さらに、ＥＲβアゴニストでプレコンディショニングされたＭＰＭ細胞は、低用量シスプラチンの細胞傷害性に対してより感受性であった。ＥＲβアゴニストがシスプラチンの前に投与される場合、これは意外にも、化学増感剤として作用し、シスプラチンの細胞傷害性を増大させる。したがって本発明は、抗腫瘍有効性を失うことなく、患者におけるより穏やかなＳＯＣ（シスプラチン）レジメンを可能にし得る。シスプラチンは、重篤な毒性と関連するので、かつＭＰＭと診断される患者の大部分は、６５歳より老齢であるので、彼らの健康状態は、シスプラチン／ペメトレキセドの標準的な化学療法の投薬レジメンを許容しない場合がある。したがって、本知見は、標準的なシスプラチン／ペメトレキセド用量レジメンに耐容性を示すことができない患者において特定の有用性を見出し得る。
【００１８】
本発明者らは、悪性および非悪性細胞が、シスプラチンおよびＥＲβアゴニストに対して著しく異なる応答を有することをさらに見出した。化合物（Ｉ）に対する応答は、非悪性中皮由来細胞において中立であったが、この化合物はＭＰＭ細胞の増殖および腫瘍増殖を阻害した。
【００１９】
さらに、化合物（Ｉ）で前処置し、その後シスプラチンで処置すると、ＭＰＭ細胞におけるシスプラチンに対する細胞感受性が有意に増大した一方、非悪性中皮由来細胞では、それは、シスプラチン細胞傷害性を相殺した。したがって、ＥＲβアゴニストは、患者の正常細胞における白金含有抗がん薬の毒性を低減し、それにより白金含有抗がん薬の有害作用から正常細胞を保護するのに使用することができる。
【００２０】
したがって、ＥＲβアゴニストは、患者における白金含有抗がん薬の毒性の低減に有用性を有する。したがって本発明は、患者の非がん性細胞における白金含有抗がん薬の毒性の低減に使用するためのＥＲβアゴニストであって、前記処置が、
ａ）患者にＥＲβアゴニストを投与すること、次いで最大で２４時間のある時間ｔの後に、
ｂ）患者に白金含有抗がん薬を投与すること
を含む、ＥＲβアゴニストを提供する。
【００２１】
本発明は、白金含有抗がん薬の副作用を低減する方法であって、白金含有抗がん薬を投与する直前にＥＲβアゴニストを投与するステップを含む、方法も提供する。例えば、ＥＲβアゴニストは、白金含有抗がん薬の最大で２４時間前、例えば、１〜４時間前、例えば、２時間前に与えられる。
【００２２】
要約すると、本発明者らは意外にも、ＥＲβアゴニストが化学増感剤として作用し、シスプラチンと組み合わせた薬物投与の順序がｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察される相乗的な有効性にとって本質的であることを示した。
【００２３】
さらに、本発明者らは意外にも、化合物（Ｉ）は、ＥＲβ発現非悪性中皮ＭＥＴ５Ａ細胞において細胞傷害効果を有さず、さらに、化合物（Ｉ）は、これらの細胞におけるシスプラチンの細胞傷害性を減少させることを見出した。したがって、著しいさらに毒性を加えることなく、ＭＰＭの現在のシスプラチン処置にＥＲβアゴニストを追加する可能性がある。
【００２４】
［ＥＲβアゴニスト］
「ＥＲβアゴニスト」は、エストロゲン受容体β−サブタイプにおいてＥＣ５００．１〜１０，０００ｎＭの範囲内の効力を呈する化合物である。本発明で使用するのに好適なＥＲβアゴニスト化合物は、そのＥＣ５０範囲内のより低い濃度でのエストロゲン受容体β−サブタイプにおける効力、例えば、ＥＣ５００．１〜１００ｎＭの範囲内の効力を示す。本発明の好適なＥＲβアゴニスト化合物は、エストロゲン受容体α−サブタイプよりも、エストロゲン受容体β−サブタイプに対して選択的なものである。選択的ＥＲβアゴニストは、エストロゲン受容体α−サブタイプと比較して２０倍以上、またはより好ましくは、エストロゲン受容体α−サブタイプと比べて５０倍以上のエストロゲン受容体β−サブタイプに対する選択性を示す化合物である。ある特定の好適な実施形態では、本発明で使用するためのＥＲβアゴニスト化合物は、エストロゲン受容体α−サブタイプよりも、エストロゲン受容体β−サブタイプに対して１００倍超選択的、２００倍超選択的；３００倍超選択的；または５００倍超選択的である（ＥＣ５０効力値に基づいて計算した場合）。
【００２５】
ＥＲβアゴニストは、当技術分野で公知である。例えば、本発明で使用するためのＥＲβアゴニストは、ＷＯ２００２／０７２５６１、ＷＯ０３／０４４００６、ＷＯ２００４／０９４４０１、ＷＯ２００６／０８８７１、ＷＯ２００６／０１９８３１、ＷＯ２００６／０４４１７６、ＷＯ２００６／０６２８７６、ＷＯ２００７／０６２８７６、ＥＰ２１４３４３２、ＷＯ２００８／０３３８９４、ＷＯ２００８／０４３５６７、ＷＯ２００９／０１２１９１、ＷＯ２００９／０１２９５４、ＷＯ２００９／０５５７３４、ＷＯ２００９／１２４９６８、ＷＯ２００９／１２７６８６、ＷＯ２０１０／０３１８５２、ＷＯ２０１１／０４２４７３、ＷＯ２０１１／０４２４７４、ＷＯ２０１１／０４２４７５、ＷＯ２０１１／０４２４７７、およびＷＯ２０１３／０１７６１９のいずれか１つにおいてＥＲβアゴニストとして記載された化合物であり得る。これらの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれている。
【００２６】
好ましくは、ＥＲβアゴニストは、ＷＯ２００９／１２７６８６またはＷＯ２００６／０６２８７６においてＥＲβアゴニストとして記載された化合物である。例えば、これは、式（III）の化合物、またはその薬学的に許容されるエステル、アミド、もしくはカルバメートの塩、およびその薬学的に許容されるエステル、アミド、カルバメート、もしくは塩の溶媒和物を含めた、その薬学的に許容されるエステル、アミド、カルバメート、溶媒和物、もしくは塩でもよく、
【００２７】
【化１】
2016539954.tif 000002
（式中、Ｒ１は、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ＯＲＡ、Ｎ（ＲＢ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、−ＳＯ２Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、ハロＣ１〜６アルキル、ジハロＣ１〜６アルキル、トリハロＣ１〜６アルキル、ハロＣ２〜６アルケニル、ジハロＣ２〜６アルケニル、トリハロＣ２〜６アルケニル、シアノＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜４アルコキシＣ１〜６アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ３〜８シクロアルキルＣ１〜６アルキル、フェニル、ベンジル、および５〜１０員のヘテロシクリルからなる群から選択され、前記フェニル、ベンジルまたはヘテロシクリル基は、非置換であるか、１〜３個の置換基で置換することができ、それぞれの置換基は、ＯＲＡ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、ハロＣ１〜６アルキル、ジハロＣ１〜６アルキル、およびトリハロＣ１〜６アルキルからなる群から選択され；
Ｒ２は、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ＯＲＡ、Ｎ（ＲＢ）２、Ｎ（ＯＨ）２、１〜３個のハロゲンで任意選択で置換された−Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、−ＳＯ２Ｃ１〜４アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＯＨ、−Ｃ（ＮＨ２）＝Ｎ−ＯＨ、−Ｃ（ＣＯ２Ｈ）＝Ｎ−ＯＨ、−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−Ｃ（ＮＨ  Ｃ１〜４アルキル）＝ＮＨ、−Ｃ（Ｏ−Ｃ１〜４アルキル）＝ＮＨ、−Ｃ（ＮＨ２）＝Ｎ−ＮＨ２、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｎ＝Ｃ（−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−）、−Ｓ−ＣＮ、−Ｓ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−Ｓ−Ｃ（ＮＨ２）＝Ｎ−ＯＨ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＣＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＣＨ２ＳＯ３Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、ハロＣ１〜６アルキル、ジハロＣ１〜６アルキル、トリハロＣ１〜６アルキル、シアノＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜４アルコキシＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ３〜８シクロアルキルＣ１〜６アルキル、フェニル、ベンジル、および５〜１０員のヘテロシクリルからなる群から選択され、前記フェニル、ベンジルまたはヘテロシクリル基は、非置換であるか、１〜３個の置換基で置換することができ、それぞれの置換基は、ＯＲＡ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、ハロＣ１〜６アルキル、ジハロＣ１〜６アルキル、およびトリハロＣ１〜６アルキルからなる群から選択され、ただし、Ｒ１およびＲ２のうちの一方がハロゲンを表す場合、他方はハロゲン以外の基を表さなければならず、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６のそれぞれは独立して、水素、ＯＲＡ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、ハロＣ１〜６アルキル、ジハロＣ１〜６アルキル、およびトリハロＣ１〜６アルキルからなる群から選択され、
各ＲＡは独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ３〜８シクロアルキルＣ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、およびＣ６〜１０アリールＣ１〜６アルキルからなる群から選択され、それぞれは１〜３個のハロゲン原子で任意選択で置換されており、
各ＲＢは独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ３〜８シクロアルキルＣ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリール、およびＣ６〜１０アリールＣ１〜６アルキルからなる群から選択され、それぞれは１〜３個のハロゲン原子で任意選択で置換されている）
ただし、式（III）の化合物は、
４−［３−（４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−（３，５−ジメチル−イソオキサゾール−４−イル）−インドール−１−イル］−フェノール；
１−（４−ヒドロキシ−フェニル）−２−（４−メチル−イミダゾール−１−イル）−１Ｈ−インドール−３−カルボニトリル；
１−（４−ヒドロキシ−フェニル）−２−（１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−１Ｈ−インドール−３−カルボニトリル；
１−（３−クロロ−４−ヒドロキシ−フェニル）−２−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−インドール−３−カルボニトリル；
１−（４−ヒドロキシ−フェニル）−２−プロパ−１−イニル−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸アミド；または
１−（４−ヒドロキシ−フェニル）−２−チアゾール−２−イル−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸
でない。
【００２８】
好ましくは式（III）の化合物において、Ｒ１は、ＯＲＡ、Ｎ（ＲＢ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、ハロＣ１〜４アルキル、ジハロＣ１〜４アルキル、トリハロＣ１〜４アルキル、ハロＣ２〜４アルケニル、ジハロＣ２〜４アルケニル、トリハロＣ２〜４アルケニル、フェニル、および５〜６員のヘテロシクリルからなる群から選択され、前記フェニルまたはヘテロシクリル基は、非置換であるか、ＯＲＡ、ハロゲン、シアノ、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ２〜４アルケニル、Ｃ２〜４アルキニル、ハロＣ１〜４アルキル、ジハロＣ１〜４アルキル、およびトリハロＣ１〜４アルキルからなる群から選択される１〜３個の置換基によって上記のように置換されている場合があり、
Ｒ２は、ハロゲン、ＯＲＡ、Ｎ（ＲＢ）２、１〜３個のハロゲンで任意選択で置換される−Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、−Ｃ（ＮＨ２）＝Ｎ−ＯＨ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、ハロＣ１〜４アルキル、ジハロＣ１〜４アルキル、トリハロＣ１〜４アルキル、ハロＣ１〜４アルケニル、ジハロＣ１〜４アルケニル、トリハロＣ１〜４アルケニル、フェニル、および５〜６員のヘテロシクリルからなる群から選択され、前記フェニルまたはヘテロシクリル基は、非置換であるか、ＯＲＡ、ハロゲン、シアノ、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ２〜４アルケニル、Ｃ２〜４アルキニル、ハロＣ１〜４アルキル、ジハロＣ１〜４アルキル、およびトリハロＣ１〜４アルキルからなる群から選択される１〜３個の置換基によって置換することができ、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６のそれぞれは独立して、水素、ＯＲＡ、ハロゲン、シアノ、Ｃ１〜４アルキル、ハロＣ１〜４アルキル、ジハロＣ１〜４アルキル、およびトリハロＣ１〜４アルキルからなる群から選択され、
各ＲＡは独立して、水素、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ２〜４アルケニル、Ｃ２〜４アルキニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、フェニル、およびベンジルからなる群から選択され、ならびに
各ＲＢは独立して、水素およびＣ１〜４アルキルからなる群から選択される。
【００２９】
より好ましくは、式（III）の化合物において、Ｒ１は、ＯＲＡ、Ｎ（ＲＢ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ２〜４アルケニル、Ｃ２〜４アルキニル、フェニル、および５〜６員のヘテロシクリルからなる群から選択され、前記フェニルまたはヘテロシクリル基は、非置換であるか、ハロゲン、シアノ、Ｃ１〜４アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、およびＯＲＡから選択される１〜３個の置換基によって置換することができ、
各ＲＡは独立して、水素またはＣ１〜４アルキルを表し、ならびに
各ＲＢは独立して、水素およびＣ１〜４アルキルからなる群から選択される。このような実施形態では、好ましくは、Ｒ２は、１〜３個のハロゲンで任意選択で置換された−Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、−Ｃ（ＮＨ２）＝Ｎ−ＯＨ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ２〜４アルケニル、Ｃ２〜４アルキニル、および５〜６員のヘテロシクリルからなる群から選択され、前記ヘテロシクリル基は、非置換であるか、ハロゲン、シアノ、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ２〜４アルケニル、Ｃ２〜４アルキニル、ハロＣ１〜４アルキル、ジハロＣ１〜４アルキル、およびトリハロＣ１〜４アルキル、ならびにＯＲＡ（式中、ＲＡは、水素またはＣ１〜４アルキルを表す）からなる群から選択される１〜３個の置換基によって置換することができる。より好ましくは、Ｒ２は、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（ＮＨ２）＝Ｎ−ＯＨ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ２〜４アルケニル、Ｃ２〜４アルキニル、および５〜６員のヘテロシクリルからなる群から選択され、前記ヘテロシクリル基は、非置換であるか、ハロゲン、シアノ、Ｃ１〜４アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、およびＯＲＡ（式中、ＲＡは、水素またはＣ１〜４アルキルを表す）から選択される１〜３個の置換基によって置換することができる。
【００３０】
別の好適な実施形態では、式（III）の化合物において、Ｒ１は、５〜６員のヘテロシクリル基であり、前記ヘテロシクリル基は、ハロゲン、シアノ、およびＣ１〜４アルキルから選択される１〜３個の置換基で置換されており、
Ｒ２は、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（ＮＨ２）＝Ｎ−ＯＨ、−ＣＯ２Ｈ、および−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈからなる群から選択され、ならびに
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６のそれぞれは独立して、水素およびハロゲンからなる群から選択される。
【００３１】
別の好適な実施形態では、式（III）の化合物において、Ｒ１は、５員のヘテロシクリル基であり、前記ヘテロシクリル基は、メチルおよびエチルから独立して選択される２個の置換基で置換されており、
Ｒ２は、−Ｃ（ＮＨ２）＝Ｎ−ＯＨであり、ならびに
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６のそれぞれは独立して、水素およびハロゲンからなる群から選択される。
【００３２】
より好ましくは、本発明で使用するためのＥＲβアゴニストは、式：
【００３３】
【化２】
2016539954.tif 000003
を有する化合物、またはその塩もしくはエステルである。最も好ましくは、ＥＲβアゴニストは、式（Ｉ）の化合物（「化合物（Ｉ）」）、またはその塩もしくはエステルである。
【００３４】
本発明で使用するためのＥＲβアゴニストは、塩の形態であり得る。薬中に使用するのに適している化合物の塩は、対イオンが薬学的に許容されるものである。
【００３５】
適当な塩としては、有機または無機の酸または塩基で形成されるものがある。特に、本発明による酸で形成される適当な塩としては、鉱酸、強有機カルボン酸、例えば、非置換であるか、例えば、ハロゲンによって置換されている１〜４個の炭素原子のアルカンカルボン酸など、例えば、飽和もしくは不飽和ジカルボン酸など、例えば、アミノ酸などのヒドロキシカルボン酸などで、または有機スルホン酸、例えば、非置換であるか、例えば、ハロゲンによって置換されている（Ｃ１〜Ｃ４）−アルキル−もしくはアリール−スルホン酸などで形成されるものがある。薬学的に許容される酸付加塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、クエン酸、酒石酸、酢酸、リン酸、乳酸、ピルビン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、コハク酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、オキサロ酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸、イセチオン酸、アスコルビン酸、リンゴ酸、フタル酸、アスパラギン酸、およびグルタミン酸、リシン、およびアルギニンから形成されるものがある。
【００３６】
薬学的に許容される塩基性塩としては、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えば、カリウムおよびナトリウムのもの、アルカリ土類金属塩、例えば、カルシウムおよびマグネシウムのもの、ならびに有機塩基、例えば、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルコミン（ｇｌｕｃｏｍｉｎｅ）、モルホリン、チオモルホリン、ピペリジン、ピロリジン、モノ−、ジ−、もしくはトリ−低級アルキルアミン、例えば、エチル−、ｔｅｒｔ−ブチル−、ジエチル−、ジイソプロピル−、トリエチル−、トリブチル−、もしくはジメチル−プロピルアミン、またはモノ−、ジ−、もしくはトリヒドロキシ低級アルキルアミン、例えば、モノ−、ジ−、もしくはトリエタノールアミンとの塩がある。対応する内部塩がさらに形成されてもよい。
【００３７】
有機化学／薬化学の当業者は、多くの有機化合物が、溶媒との複合体であって、溶媒中でこれらが反応し、または溶媒からこれらが析出もしくは結晶化される、複合体を形成することができることを察知するであろう。これらの複合体は、「溶媒和物」として公知である。例えば、水との複合体は、「水和物」として公知である。水和物などの溶媒和物は、薬物物質が化学量論量または非化学量論量で結晶格子中に水などの溶媒を組み込む場合、存在する。薬物物質は、水和物の存在についてルーチン的にスクリーニングされ、理由は、これらが、薬物製造プロセスの任意の段階で、または薬物物質もしくは剤形を貯蔵すると遭遇し得るためである。溶媒和物は、Ｓ．Ｂｙｒｎら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２（７）、１９９５、９５４〜９５４ページ、およびＷａｔｅｒ−Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  Ｄｒｕｇ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ、２版、Ｒ．Ｌｉｕ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、５５３ページに記載されている。これらは、参照により本明細書に組み込まれている。したがって、本発明で使用するためのＥＲβアゴニストおよびその塩は、溶媒和物の形態で存在し得ることが当業者によって理解されるであろう。薬中に使用するのに適している本発明のＥＲβアゴニストの化合物の溶媒和物は、付随する溶媒が薬学的に許容されるものである。例えば、水和物は、薬学的に許容される溶媒和物の一例である。
【００３８】
有機化学／薬化学の当業者は、ＥＲβアゴニストは、プロドラッグの形態で提供されてもよいことも察知するであろう。プロドラッグは、レシピエントに投与すると、例えば、血液中での加水分解によって体内で、医学的効果を有するその活性型に変換され得る化合物として定義することができる。薬学的に許容されるプロドラッグは、Ｔ．ＨｉｇｕｃｈｉおよびＶ．Ｓｔｅｌｌａ、Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ、１４巻（１９７６）；「Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ」、Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８５；ならびにＥｄｗａｒｄ  Ｂ．Ｒｏｃｈｅ編、Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７に記載されている。これらは、参照により本明細書に組み込まれている。
【００３９】
本発明における活性剤（ＥＲβアゴニストおよび白金含有抗がん薬（その上に任意のさらなる治療剤））は、同じ、または異なる投与経路によって投与され得る。
【００４０】
治療効果を実現するのに要求されるＥＲβアゴニストの量は、特定の化合物、投与経路、タイプ、種、年齢、体重、性別を含めた処置下の対象、ならびに対象の医学的状態、ならびに対象の腎機能および肝機能、ならびに処置されている特定の障害または疾患、およびその重症度によって変動することになる。通常の熟練した医師は、状態の進行を防止し、それに対抗し、またはそれを停止するのに要求される薬物の有効量を容易に判定および処方することができる。
【００４１】
本発明のＥＲβアゴニストの経口投与量は、示された効果について使用される場合、成人について１日当たり体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ（ｍｇ／ｋｇ／日）〜約５ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．３〜３ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは０．５〜２．０ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは０．７５〜１．５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲となる。したがって、経口１日投与量は、成人について５ｍｇ〜約３５０ｍｇ、好ましくは２０ｍｇ〜２００ｍｇ、より好ましくは３５ｍｇ〜１５０ｍｇ、最も好ましくは５０ｍｇ〜約１００ｍｇの範囲であり、例えば、７５ｍｇである。有利なことに、本発明で使用するためのＥＲβアゴニストは、単回の一日用量で投与してもよく、または総１日投与量を、１日２、３、または４回の分割用量で投与してもよい。経口投与について、組成物は、好ましくは、約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分、好ましくは約１ｍｇ〜約１００ｍｇの活性成分、例えば、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、または５００ミリグラムの活性成分を含有する別々の単位で提供される錠剤の形態または提供の他の形態で提供される。
【００４２】
静脈内投薬が使用される場合、好適な投薬速度は、定速注入の間、約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／分となる。典型的な注入時間は、５〜９０分である。
【００４３】
本発明で使用するためのＥＲβアゴニストの医薬製剤は、経口、非経口（皮下、皮内、筋肉内、静脈内［ボーラスまたは注入］、および関節内を含む）、吸入（さまざまなタイプの計量用量加圧エアロゾル、噴霧器、または注入器によって生成され得る微粒子ダストまたはミストを含む）、直腸、腹腔内、ならびに局部（経皮、頬側、舌下、および眼内を含む）投与に適したものがある。
【００４４】
ＥＲβアゴニストの製剤は、好都合なことには単位剤形で提供することができ、薬学の技術分野で周知の方法のいずれかによって調製することができる。
【００４５】
経口投与に適したＥＲβアゴニストの製剤は、それぞれが所定量の活性成分を含有するカプセル剤、カシェ剤、丸剤、もしくは錠剤などの別々の単位として；粉末もしくは顆粒として；水性液体もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、例えば、エリキシル剤、チンキ剤、懸濁液、もしくはシロップ剤として；または水中油型液体エマルジョンもしくは油中水型液体エマルジョンとして提供されてもよい。活性成分は、ボーラス、舐剤、またはペーストとして提供されてもよい。
【００４６】
非経口投与用製剤は、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、および製剤を意図されたレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有し得る水性および非水性滅菌注射液、ならびに懸濁剤および増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液がある。製剤は、単位用量または複数回用量容器、例えば、密封されたアンプルおよびバイアルで提供されてもよく、使用直前に滅菌液体担体、例えば、生理食塩水または注射用水の添加のみを必要とする凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓｅｄ））条件で貯蔵されてもよい。即席の注射液および懸濁液は、以前に記載した種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。非経口投与のための例示的な組成物としては、例えば、適当な無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒、例えば、マンニトール、１，３−ブタンジオール、水、リンガー液、等張性塩化ナトリウム溶液など、あるいは合成のモノ−もしくはジグリセリド、およびオレイン酸を含めた脂肪酸、またはクレマフォール（Ｃｒｅｍａｐｈｏｒ）を含めた他の適当な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を含有することができる注射用溶液または懸濁液がある。
【００４７】
経鼻、エアロゾル、または吸入投与のための例示的な組成物としては、生理食塩水中の溶液があり、これは、例えば、ベンジルアルコールもしくは他の適当な防腐剤、生物学的利用能を増強するための吸収促進剤、および／または当技術分野で公知のものなどの他の可溶化剤もしくは分散剤を含有することができる。
【００４８】
直腸投与用製剤は、通常の担体、例えば、カカオバター、合成グリセリドエステル、またはポリエチレングリコールなどを含む坐剤として提供され得る。このような担体は、典型的には通常の温度で固体であるが、直腸腔内で液化および／または溶解して薬物を放出する。
【００４９】
口内、例えば、頬側または舌下の局部投与用製剤としては、風味基剤、例えば、スクロースおよびアカシアまたはトラガカントなどの中に活性成分を含むロゼンジ、ならびにゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアなどの基剤中に活性成分を含む香錠がある。局部投与のための例示的な組成物は、プラスチベース（ポリエチレンでゲル化した鉱油）などの局部用担体を含む。
【００５０】
ＥＲβアゴニストの好適な単位投与製剤は、上文に列挙した有効用量、またはその適切な画分のＥＲβアゴニストを含有するものである。
【００５１】
特に上述した成分に加えて、本発明で使用するための製剤は、問題の剤形を考慮した、当技術分野で慣例的な他の作用物質を含み得る、例えば、経口投与に適したものは、香味剤を含み得ることが理解されるべきである。
【００５２】
［白金含有抗がん薬］
白金含有抗がん薬は、白金を含有するがんを処置するための化学療法剤である。これらは、一付加物としてのＤＮＡの架橋、ストランド間架橋、ストランド内架橋、またはＤＮＡタンパク質架橋を引き起こすと考えられている。これらとしては、それだけに限らないが、シスプラチン、カルボプラチン、オキサプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン、ネダプラチン、トリプラチン、オルマプラチン、テトラプラチン、リポプラチン、およびホスファプラチン、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン、ネダプラチン、またはトリプラチン、オルマプラチン、テトラプラチン、およびホスファプラチンがある。これらの化合物は、当技術分野で公知の方法によって調製することができる。
【００５３】
本発明で使用するための白金含有抗がん薬は、シスプラチン、カルボプラチン、オキサプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン、ネダプラチン、トリプラチン、オルマプラチン、テトラプラチン、リポプラチン、およびホスファプラチンからなる群、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン、ネダプラチン、またはトリプラチン、オルマプラチン、テトラプラチン、およびホスファプラチンから選択され得る。好ましくは、白金含有抗がん薬はシスプラチンまたはカルボプラチンからなる群から選択される。最も好ましくは、これはシスプラチンである。
【００５４】
本発明で使用するための白金含有抗がん薬の医薬製剤は、例えば、静脈内投与（特にシスプラチン、カルボプラチン、およびオキサリプラチンの場合）、または経口投与（特にサトラプラチンの場合）のための製剤である。
【００５５】
白金含有抗がん薬の最適な用量は、投薬スケジュール、選択した特定の薬物の効力、患者の年齢、サイズ、性別、および状態、疾患の特質および重症度、ならびに他の関連した医学的および身体的要因に依存する。したがって、薬学的有効量は、介護者または臨床医が容易に判定することができる。一般に、白金含有抗がん薬の適切な量は、化学療法の効果を得るように選択される。本発明における白金含有抗がん薬の静脈内用量は、典型的には約１０ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分、好ましくは約５０ｍｇ〜約２５０ｍｇの活性成分を含有することになる。
【００５６】
シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金含有抗がん薬は、通常、静脈内に（IV）投与される。このような場合では、これらは、約１０〜約４２０分、例えば、約３０〜約３００分、例えば、約３０〜約１８０分、例えば、約１２０分の期間にわたって投与される。白金含有抗がん薬がシスプラチンである場合、これは典型的には、約１２０分にわたって投与される。例えば、約１２０分にわたって静脈内に７５ｍｇ／ｍ２注入される。典型的な注入速度は、約０．００５〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ／分の範囲内である。白金含有抗がん薬の有効な静脈内用量は、典型的には、約０．１〜約５０ｍｇ／体重１ｋｇ、好ましくは約１〜約５ｍｇ／体重１ｋｇである。
【００５７】
本発明における白金含有抗がん薬の経口用量は、成人について１日当たり体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ（ｍｇ／ｋｇ／日）〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日の間、好ましくは１日当たり体重１ｋｇ当たり２ｍｇ（ｍｇ／ｋｇ／日）〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは３〜６ｍｇ／ｋｇ／日の範囲となる。
【００５８】
白金含有抗がん薬は、例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ）に示されている、または当業者によって別段に判定される量で使用され得る。例えば、成人についてのシスプラチンの典型的な静脈内投与量は、１日７０〜１００ｍｇ／ｍ２（１日約１２５〜１８５ｍｇの投与量に対応する）であり、これは、最大で３日間繰り返してもよい。例えば、悪性胸膜中皮腫を有する成人についてのシスプラチンの典型的な単回用量は、２時間にわたって注入される７５ｍｇ／ｍ２である。ＭＰＭについてのシスプラチンの標準的治療投与量は、２１日サイクルの１日目における２時間にわたって注入される７５ｍｇ／ｍ２のシスプラチンであり、その後２０日の休止が続き、その期間の間さらにシスプラチンは投与されない。サイクルは、ＭＰＭの段階に応じて１回または数回繰り返される場合がある。
【００５９】
一実施形態では、本発明の投与量計画は、患者における中皮腫を処置するのに使用するため、例えば、ＭＰＭを処置するためのＥＲβアゴニスト、例えば、化合物（Ｉ）、およびシスプラチンであって、ＥＲβアゴニストが、５ｍｇ〜約３５０ｍｇ、好ましくは２０ｍｇ〜２００ｍｇ、より好ましくは３５ｍｇ〜１５０ｍｇ、最も好ましくは５０ｍｇ〜１００ｍｇ、例えば、７５ｍｇの用量で投与され、次いで最大で２４時間のある時間ｔの後に、例えば、１５分、３０分、１時間、９０分、２時間、４時間、８時間、１６時間、または２４時間の後に、シスプラチンの７５ｍｇ／ｍ２の用量が２１日サイクルの１日目に２時間にわたって注入され、その後２０日の休止が続き、その期間の間さらにシスプラチンは投与されない、ＥＲβアゴニスト、例えば、化合物（Ｉ）、およびシスプラチンを提供する。任意選択で、ＥＲβアゴニストは、シスプラチンを投与した後の２１日サイクル中の１日または複数の日にも、例えば、２１日サイクルの２〜７日目にも、または２１日サイクルの２〜２１日目にも投与されてもよい。サイクルは、ＭＰＭの段階に応じて１回または数回繰り返される場合がある。
【００６０】
白金含有抗がん薬がカルボプラチンである場合、これは典型的には、約３０分にわたって投与される。カルボプラチンの典型的な用量は、約３０分にわたって静脈内に注入して２〜８の標的血漿濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）、より典型的には４〜６ＡＵＣである。カルボプラチンのＡＵＣの単位は、ｍｇのカルボプラチン／ｍＬ・分である。カルボプラチンの正確な用量は、Ｃａｌｖｅｒｔら（Ｃａｌｖｅｒｔ，Ａ．Ｈ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ（１９８９）、７：１７４８〜５６ページ）の方法を使用して計算され得る。その方法は、カルボプラチン用量（ミリグラムでの）＝ＡＵＣ×（球状濾過率（ｇｌｏｂｕｌａｒ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）＋２５）であり、すなわち、ＡＵＣ＝５である場合、カルボプラチン用量（ミリグラムでの）＝５×（球状濾過率＋２５）である。糸球体濾過率は、クレアチニンクリアランス、ＥＤＴＡクリアランス、あるいはＣｏｃｋｃｒｏｆｔ−Ｇａｕｌｔ式（Ｃｏｃｋｃｒｏｆｔ  Ｄ、Ｇａｕｌｔ  ＭＤ．Ｎｅｐｈｒｏｎ、１６：３１〜４１ページ、１９７６；Ｗｉｎｔｅｒ，Ｍ．Ａ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ（２０１２）、３２（７）：６０４／１２；Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．Ｌ．ら、Ａｎｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ（２０１３）、４７（７〜８）：１０３９〜４４ページに記載された；またはｈｔｔｐ：／／ｎｅｐｈｒｏｎ．ｃｏｍ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＣＧＳＩ．ｃｇｉ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｃｕｌａｔｏｒ．ｃｏｍ／ｅｎｇｌｉｓｈ／ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ／ｃｏｃｋｒｏｆｔ／ｃｃａ．ｈｔｍ；もしくはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｃｕｌａｔｏｒ．ｃｏｍ／ｅｎｇｌｉｓｈ／ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ／ｃｏｃｋｒｏｆｔ／ｃｃａ．ｈｔｍの計算ツールを参照）に基づく。
【００６１】
悪性胸膜中皮腫を有する成人についてのカルボプラチンの用量の一例は、２１日サイクルの１日目に３０分にわたって注入される４〜６ＡＵＣ（例えば、５ＡＵＣ）であり、その後２０日の休止が続き、その期間の間さらにカルボプラチンは投与されない（例えば、Ｓａｎｔｏｒｏ  Ａ．ら、Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｏｎｃｏｌ（２００８）、３：７５６〜６３ページ；Ｃｅｒｅｓｏｌｉ  Ｇ．Ｌ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ（２００６）、２４：１４４３ページ；およびｈｔｔｐ：／／ｃｈｅｍｏｒｅｇｉｍｅｎ．ｃｏｍ／Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ−ｃ−４７−５７．ｈｔｍｌを参照）。サイクルは、ＭＰＭの段階に応じて１回または数回繰り返される場合がある。
【００６２】
一実施形態では、本発明の投与量計画は、患者における中皮腫を処置するのに使用するため、例えば、ＭＰＭを処置するためのＥＲβアゴニスト、例えば、化合物（Ｉ）、およびカルボプラチンであって、ＥＲβアゴニストが、５ｍｇ〜約３５０ｍｇ、好ましくは２０ｍｇ〜２００ｍｇ、より好ましくは３５ｍｇ〜１５０ｍｇ、最も好ましくは５０ｍｇ〜１００ｍｇ、例えば、７５ｍｇの用量で投与され、次いで最大で２４時間のある時間ｔの後に、例えば、１５分、３０分、１時間、９０分、２時間、４時間、８時間、１６時間、または２４時間の後に、カルボプラチンのＡＵＣ  ５の用量が２１日サイクルの１日目に３０分にわたって注入され、その後２０日の休止が続き、その期間の間さらにカルボプラチンは投与されない、ＥＲβアゴニスト、例えば、化合物（Ｉ）、およびカルボプラチンを提供する。任意選択で、ＥＲβアゴニストは、カルボプラチンを投与した後の２１日サイクル中の１日または複数の日にも、例えば、２１日サイクルの２〜７日目にも、または２１日サイクルの２〜２１日目にも投与されてもよい。サイクルは、ＭＰＭの段階に応じて１回または数回繰り返される場合がある。
【００６３】
特に上述した成分に加えて、本発明の製剤は、目的の製剤のタイプを考慮する技術分野で慣例的な他の作用物質を含み得、例えば、経口投与に適したものは、香味剤を含み得ることが理解されるべきである。
【００６４】
［さらなる治療剤］
ＥＲβアゴニストおよび白金含有抗がん薬が、本発明の処置における活性剤としてそれだけ使用される場合があるが、１種または複数のさらなる治療剤をＥＲβアゴニストおよび白金含有抗がん薬と組み合わせて使用することも可能である。１種または複数のさらなる治療剤は、ＥＲβアゴニストおよび白金含有抗がん薬の一方または両方と同時に、逐次的に、または別個に使用され得る。このようなさらなる治療剤は、さらなるＥＲβアゴニストであっても、がんの防止もしくは処置で有用な異なる作用物質、例えば、化学療法剤であってもよい。
【００６５】
特に、本発明のＥＲβアゴニストおよび白金含有抗がん薬は、中皮腫の処置に有用な他の作用物質、例えば、ペメトレキセドと組み合わせて使用することができる。このような組合せの個々の成分は療法の過程中の異なる時間に別々に、または分割式もしくは単一式の併用形態で同時に投与することができる。
【００６６】
本発明のある特定の実施形態では、例えば、白金含有抗がん薬がシスプラチンである実施形態では、さらなる化学療法薬が投与される。好ましくはさらなる化学療法薬は、ペメトレキセドである。ペメトレキセドは、例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ）に示されている、または当業者によって別段に判定される量で投与され得る。例えば、５００ｍｇ／ｍ２のペメトレキセドが、シスプラチンとともに２１日サイクルの１日目に１０分にわたる静脈内注入剤として投与され、シスプラチンは、ペメトレキセド投与の最後からおよそ３０分後に開始して２時間にわたって７５ｍｇ／ｍ２の用量で注入される。この後に２０日の休止が続き、その期間の間、さらにペメトレキセドまたはシスプラチンは投与されない。サイクルは、ＭＰＭの段階に応じて１回または数回繰り返される場合がある。これは、悪性胸膜中皮腫の標準的治療である。
【００６７】
シスプラチンおよびペメトレキセドを使用する標準的治療は、Ｖｏｇｅｌｚａｎｇ，Ｎ．Ｊ．らＪ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ（２００３）２１：２６３６およびｈｔｔｐ：／／ｃｈｅｍｏｒｅｇｉｍｅｎ．ｃｏｍ／Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ−ｃ−４７−５７．ｈｔｍｌにさらに記載されている。さらなる治療剤ペメトレキセドの他に、ビタミンサプリメントを、ペメトレキセドの最初の投薬の１週間前から、ペメトレキセドの最後の投薬から２１日後まで投与してもよい（葉酸３５０〜１０００ｍｃｇ、ｐｏ  ｑｄ；ビタミンＢ１２  １０００ｍｃｇ、Ｉ．Ｍ．９週間毎）。デキサメタゾン（デカドロン）４ｍｇも、ペメトレキセドの前日、当日、および翌日に１日２回投与してもよい。
【００６８】
本発明のある特定の実施形態では、例えば、白金含有抗がん薬がカルボプラチンである実施形態では、さらなる化学療法薬が投与される。好ましくはさらなる化学療法薬は、ペメトレキセドである。例えば、５００ｍｇ／ｍ２のペメトレキセドが、カルボプラチンとともに２１日サイクルの１日目に１０分にわたって静脈内注入剤として投与され、カルボプラチンは、ペメトレキセド投与の最後からおよそ３０分後に開始して３０分にわたって注入されるＡＵＣ  ５の用量である。この後に２０日の休止が続き、その期間の間、さらにペメトレキセドまたはカルボプラチンは投与されない。サイクルは、ＭＰＭの段階に応じて１回または数回繰り返される場合がある。カルボプラチンおよびペメトレキセドを使用する中皮腫の処置は、Ｃｅｒｅｓｏｌｉ  Ｇ．Ｌ．，らＪ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ（２００６）；２４：１４４３ページおよびｈｔｔｐ：／／ｃｈｅｍｏｒｅｇｉｍｅｎ．ｃｏｍ／Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ−ｃ−４７−５７．ｈｔｍｌ．にさらに記載されている。さらなる治療剤ペメトレキセドの他に、ビタミンサプリメントを、ペメトレキセドの最初の投薬の１週間前からペメトレキセドの最後の投薬から２１日後まで投与してもよい（葉酸３５０〜１０００ｍｃｇ、ｐｏ  ｑｄ。ビタミンＢ１２  １０００ｍｃｇ  Ｉ．Ｍ．、９週間毎）。デキサメタゾン（デカドロン）４ｍｇも、ペメトレキセドの前日、当日、および翌日に１日２回投与してもよい。
【００６９】
一実施形態では、本発明の投与量計画は、患者における中皮腫の処置で使用するため、例えば、ＭＰＭを処置するためのＥＲβアゴニスト、例えば、化合物（Ｉ）、およびシスプラチンまたはカルボプラチン、およびペメトレキセドであって、ＥＲβアゴニストが、５ｍｇ〜約３５０ｍｇ、好ましくは２０ｍｇ〜２００ｍｇ、より好ましくは３５ｍｇ〜１５０ｍｇ、最も好ましくは５０ｍｇ〜１００ｍｇ、例えば、７５ｍｇの用量で投与され、次いで最大で２４時間のある時間ｔの後に、例えば、１５分、３０分、１時間、９０分、２時間、４時間、８時間、１６時間、または２４時間の後に、２１日サイクルの１日目に、１０分にわたって５００ｍｇ／ｍ２のペメトレキセドを静脈内注入剤として投与しておよそ３０分後に開始して、５０〜１００ｍｇ／ｍ２（例えば、７５ｍｇ／ｍ２）の用量のシスプラチンが２時間にわたって注入され、またはＡＵＣ  ４〜７．５（例えば、５もしくは６）のカルボプラチンが３０分にわたって注入される、ＥＲβアゴニスト、例えば、化合物（Ｉ）、およびシスプラチンまたはカルボプラチン、およびペメトレキセドを提供する。この後に２０日の休止が続き、その期間の間、さらにペメトレキセドまたはシスプラチン／カルボプラチンは投与されない。任意選択で、ＥＲβアゴニストは、シスプラチンまたはカルボプラチンを投与した後の２１日サイクル中の１日または複数の日にも、例えば、２１日サイクルの２〜７日目にも、または２１日サイクルの２〜２１日目にも投与されてもよい。サイクルは、ＭＰＭの段階に応じて１回または数回繰り返される場合がある。
【００７０】
一実施形態では、本発明の投与量計画は、患者における中皮腫の処置で使用するため、例えば、ＭＰＭを処置するためのＥＲβアゴニスト、例えば、化合物（Ｉ）、ならびにシスプラチンおよびペメトレキセドであって、ＥＲβアゴニストが、５ｍｇ〜約３５０ｍｇ、好ましくは２０ｍｇ〜２００ｍｇ、より好ましくは３５ｍｇ〜１５０ｍｇ、最も好ましくは５０ｍｇ〜１００ｍｇ、例えば、７５ｍｇの用量で投与され、次いで最大で２４時間のある時間ｔの時間後に、例えば、１５分、３０分、１時間、９０分、２時間、４時間、８時間、１６時間、または２４時間の後に、２１日サイクルの１日目に、１０分にわたる静脈内注入剤としての５００ｍｇ／ｍ２のペメトレキセドを投与しておよそ３０分後に開始して、７５ｍｇ／ｍ２の用量のシスプラチンが、２時間にわたって注入される、ＥＲβアゴニスト、例えば、化合物（Ｉ）、ならびにシスプラチンおよびペメトレキセドを提供する。この後に２０日の休止が続き、その期間の間、さらにペメトレキセドまたはシスプラチンは投与されない。任意選択で、ＥＲβアゴニストは、シスプラチンを投与した後の２１日サイクル中の１日または複数の日にも、例えば、２１日サイクルの２〜７日目にも、または２１日サイクルの２〜２１日目にも投与されてもよい。サイクルは、ＭＰＭの段階に応じて１回または数回繰り返される場合がある。
【００７１】
一実施形態では、本発明の投与量計画は、患者における中皮腫の処置で使用するため、例えば、ＭＰＭを処置するためのＥＲβアゴニスト、例えば、化合物（Ｉ）、ならびにカルボプラチンおよびペメトレキセドであって、ＥＲβアゴニストが、５ｍｇ〜約３５０ｍｇ、好ましくは２０ｍｇ〜２００ｍｇ、より好ましくは３５ｍｇ〜１５０ｍｇ、最も好ましくは５０ｍｇ〜１００ｍｇ、例えば、７５ｍｇの用量で投与され、次いで最大で２４時間のある時間ｔの時間後に、例えば、１５分、３０分、１時間、９０分、２時間、４時間、８時間、１６時間、または２４時間の後に、２１日サイクルの１日目に、１０分にわたる静脈内注入剤としての５００ｍｇ／ｍ２のペメトレキセドを投与しておよそ３０分後に開始して、５ＡＵＣの用量のカルボプラチンが、３０分にわたって注入される、ＥＲβアゴニスト、例えば、化合物（Ｉ）、ならびにカルボプラチンおよびペメトレキセドを提供する。この後に２０日の休止が続き、その期間の間、さらにペメトレキセドまたはカルボプラチンは投与されない。任意選択で、ＥＲβアゴニストは、カルボプラチンを投与した後の２１日サイクル中の１日または複数の日にも、例えば、２１日サイクルの２〜７日目にも、または２１日サイクルの２〜２１日目にも投与されてもよい。サイクルは、ＭＰＭの段階に応じて１回または数回繰り返される場合がある。
【００７２】
さらなる化学療法薬がペメトレキセドである実施形態では、デキサメタゾンも、ペメトレキセド投与の前日、当日、および翌日に投与してもよい。毒性を低減するために、ペメトレキセドで処置される患者は、日常的に低用量の経口葉酸配合物または葉酸を含む総合ビタミン剤を摂取するように指導される場合もある。例えば、葉酸４００ｍｃｇ〜１０００ｍｃｇを、ペメトレキセドの最初の投薬の７日前に開始して、療法の全過程の間継続し、さらにペメトレキセドの最後の投薬から２１日の間１日１回経口投与してもよい。患者は、ペメトレキセドの最初の投薬の前の週の間、およびその後３サイクル毎にビタミンＢ１２の筋肉内注射を１回受けてもよい。後続のビタミンＢ１２注射は、ペメトレキセドと同じ日に与えられる場合がある。したがって、処置がさらなる化学療法薬ペメトレキセドの投与を含む本発明の実施形態では、処置は、デキサメタゾン；葉酸配合物；葉酸を含む総合ビタミン剤；およびビタミンＢ１２の１種または複数の投与をさらに含み得る。
【００７３】
上記他の治療剤は、例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ）に示されている、または当業者によって別段に判定される量で使用され得る。
【００７４】
中皮腫の他の処置、例えば、放射線療法を本発明と組み合わせて使用してもよい。本発明の処置は、例えば、腫瘍を除去するための胸膜切除術／剥皮術（Ｐ／Ｄ）もしくは胸膜肺全摘出術（ＥＰＰ）、または流体が胸部内もしくは腹部内に蓄積する場合、胸腔穿刺／穿開術もしくは胸膜癒着術に加えて使用され得る。
【００７５】
本発明でさらに作用物質として使用するためのさらなるＥＲβアゴニストは、ＷＯ２００２／０７２５６１、ＷＯ０３／０４４００６、ＷＯ２００４／０９４４０１、ＷＯ２００６／０８８７１、ＷＯ２００６／０１９８３１、ＷＯ２００６／０４４１７６、ＷＯ２００６／０６２８７６、ＷＯ２００７／０６２８７６、ＥＰ２１４３４３２、ＷＯ２００８／０３３８９４、ＷＯ２００８／０４３５６７、ＷＯ２００９／０１２１９１、ＷＯ２００９／０１２９５４、ＷＯ２００９／０５５７３４、ＷＯ２００９／１２４９６８、ＷＯ２００９／１２７６８６、ＷＯ２０１０／０３１８５２、ＷＯ２０１１／０４２４７３、ＷＯ２０１１／０４２４７４、ＷＯ２０１１／０４２４７５、ＷＯ２０１１／０４２４７７、およびＷＯ２０１３／０１７６１９のいずれか１つにおいてＥＲβアゴニストとして記載された化合物であり得る。
【００７６】
本発明で使用するためのさらなる化学療法剤は、さらなる白金含有抗がん薬（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン、ネダプラチンおよびトリプラチンからなる群から選択される）；アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード（エクロレタミン（ｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、シクロホスファミド、メルファラン、クロランブシル、イホスファミド、およびブスルファンを含む）、ニトロソ尿素（ｎ−ニトロソ−ｎ−メチル尿素（ＭＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、およびセムスチン（ＭｅＣＣＮＵ）、ホテムスチン、およびストレプトゾトシンを含むニトロソ尿素を含む）、テトラジン（ダカルバジン、ミトゾロミド、およびテモゾロミドを含む）、アジリジン（チオテパ、マイトマイシン、およびジアジクォン（ＡＺＱ）を含む）、ならびに非古典的なアルキル化剤（プロカルバジンおよびヘキサメチルメラミンを含む））；抗代謝産物（例えば、抗フォレート（ペメトレキセドおよびメトトレキセートを含む）、フルオロピリミジン（フルオロウラシルおよびカペシタビンを含む）、デオキシヌクレオシド類似体（シタラビン、ゲムシタビン、デシタビン、ビダーザ、フルダラビン、ネララビン、クラドリビン、クロファラビン、およびペントスタチンを含む）、ならびにチオプリン（チオグアニンおよびメルカプトプリンを含む））；抗微小管剤（例えば、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、およびビンフルニンを含む）、ならびにタキサン（パクリタキセル、エトポシド、およびテニポシドを含む））；トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ノボビオシン、メルバロン、およびアクラルビシン）；他の酵素阻害剤（例えば、ボルテゾミブ、イマチニブ、およびプロカルバジン）；ならびに細胞傷害性抗生物質（例えば、アントラサイクリン（オキソルビシン（ｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、アクラルビシン、およびミトキサントロンを含む）、ならびにアクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、およびマイトマイシン））からなる群から選択される場合がある。
【００７７】
［中皮腫］
用語「中皮腫」は、本明細書において、それだけに限らないが、類上皮、肉腫様、および混合（二相性）中皮腫を含む。中皮腫のタイプとしては、それだけに限らないが、胸膜、腹膜、心膜、および精巣鞘膜の悪性中皮腫がある。
【００７８】
本発明の処置は、中皮腫、例えば、類上皮、肉腫様（線維性）、および混合（二相性）中皮腫の処置に有用である。本発明の処置は、類上皮および混合中皮腫の処置に特に有用である。本発明の処置は、例えば、悪性胸膜、悪性腹膜、悪性心膜、または悪性精巣鞘膜中皮腫の処置に有用である。本発明の処置は、悪性胸膜中皮腫の処置に特に有用である。
【００７９】
本明細書において、「患者」は、中皮腫に感受性であり得る任意の哺乳動物（例えば、ヒト）を指す。本発明の使用のための化合物は、ヒト患者の処置について特定の使用を見出す。
【００８０】
［時間、ｔ］
本発明の処置では、ＥＲβアゴニストが最初に患者に投与され、次いで最大で２４時間のある時間ｔの後に、白金含有抗がん薬が投与される。
【００８１】
ある特定の好適な実施形態では、ｔは、最大で約１６時間；好ましくは最大で約８時間；より好ましくは最大で約４時間；最も好ましくは最大で約２時間である。
【００８２】
ある特定の好適な実施形態では、ｔは、約１５分〜約２４時間；約１５分〜約１６時間；好ましくは約３０分〜約８時間；より好ましくは約３０分〜約４時間；より好ましくは約１時間〜約２時間；最も好ましくは約２時間である。
【００８３】
ＥＲβアゴニスト、白金含有抗がん薬、およびペメトレキセドを投与することを含む実施形態では、好ましくは少なくとも白金含有抗がん薬は、ＥＲβアゴニストを投与してから最大で約２４時間までに投与される。より好適な実施形態では、少なくとも白金含有抗がん薬は、ＥＲβアゴニストを投与してから最大で約４時間まで、最も好ましくはＥＲβアゴニストを投与してから最大で約２時間までに投与される。このような実施形態では、白金含有抗がん薬の前、例えば、約１０〜約６０分前、より好ましくは約３０分前にペメトレキセドを投与することが好ましい。好ましくは白金含有抗がん薬は、シスプラチンまたはカルボプラチンである。
【００８４】
ＥＲβアゴニスト、ならびにシスプラチンおよびペメトレキセドの両方を投与することを含む実施形態では、好ましくは少なくともシスプラチンは、ＥＲβアゴニストを投与してから最大で約２４時間までに投与される。より好適な実施形態では、少なくともシスプラチンは、ＥＲβアゴニストを投与してから最大で約４時間まで、最も好ましくはＥＲβアゴニストを投与してから最大で約２時間までに投与される。このような実施形態では、シスプラチンの前、例えば、約１０〜約６０分前、より好ましくは約３０分前にペメトレキセドを投与することが好ましい。
【００８５】
ＥＲβアゴニスト、ならびにシスプラチンおよびペメトレキセドの両方を投与することを含む実施形態では、好ましくは少なくともシスプラチンは、ＥＲβアゴニストを投与して約１５分〜約２４時間後に投与される。より好適な実施形態では、少なくともシスプラチンは、ＥＲβアゴニストを投与して約３０分〜約４時間後、最も好ましくはＥＲβアゴニストを投与して約２時間後に投与される。
【００８６】
ＥＲβアゴニスト、ならびにカルボプラチンおよびペメトレキセドの両方を投与することを含む実施形態では、好ましくは少なくともカルボプラチンは、ＥＲβアゴニストを投与して最大で約２４時間後に投与される。より好適な実施形態では、少なくともカルボプラチンは、ＥＲβアゴニストを投与してから最大で約４時間まで、最も好ましくはＥＲβアゴニストを投与してから最大で約２時間までに投与される。このような実施形態では、カルボプラチンの前、例えば、約１０〜約６０分前、より好ましくは約３０分前にペメトレキセドを投与することが好ましい。
【００８７】
ＥＲβアゴニスト、ならびにカルボプラチンおよびペメトレキセドの両方を投与することを含む実施形態では、好ましくは少なくともカルボプラチンは、ＥＲβアゴニストを投与して約１５分〜約２４時間後に投与される。より好適な実施形態では、少なくともカルボプラチンは、ＥＲβアゴニストを投与して約３０分〜約４時間後、最も好ましくはＥＲβアゴニストを投与して約２時間後に投与される。
【００８８】
ある特定の好適な実施形態では、ＥＲβアゴニストは、化合物（Ｉ）であり、白金含有抗がん薬は、シスプラチンであり、ｔは、例えば、最大で８時間、最大で４時間、最大で２時間、または約２時間であり、任意選択でペメトレキセドも投与される。
【００８９】
別の実施形態では、ＥＲβアゴニストは、化合物（Ｉ）であり、白金含有抗がん薬は、カルボプラチンであり、ｔは、例えば、最大で８時間、最大で４時間、最大で２時間、または約２時間であり、任意選択でペメトレキセドも投与される。
【００９０】
ある特定の好適な実施形態では、ＥＲβアゴニストが最初に患者に投与され、次いで最大で２４時間、例えば、最大で約１６時間；最大で約８時間；最大で約４時間；または約２時間のある時間ｔの後に、白金含有抗がん薬が投与され、任意選択でペメトレキセドが投与され、この後、１回または複数回のさらなる用量のＥＲβアゴニストが、白金含有抗がん薬が投与された後に１日または複数の日に投与される。例えば、ＥＲβアゴニストは、白金含有抗がん薬の後に最大で２０日かつ２０日を含めた間、毎日投与されてもよい。
【００９１】
ある特定の好適な実施形態では、ＥＲβアゴニストが最初に患者に投与され、次いで１５分から２４時間の間、例えば、３０分から約１６時間の間；約３０分から８時間の間；約１時間から４時間の間；または約２時間のある時間ｔの後に、白金含有抗がん薬が投与され、任意選択でペメトレキセドが投与され、この後、１回または複数回のさらなる用量のＥＲβアゴニストが、白金含有抗がん薬が投与された後に１日または複数の日に投与される。例えば、ＥＲβアゴニストは、白金含有抗がん薬の後に最大で２０日かつ２０日を含めた間、毎日投与されてもよい。
【実施例】
【００９２】
以下の材料および方法は、以下の実施例の１つまたは複数に適用可能である。
【００９３】
［材料および方法］
［試薬および抗体］
α−チューブリンに特異的なモノクローナル抗体、ＰＡＲＰ１、およびＥＲβに特異的なポリクローナル抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。ホスホ−ＡＫＴ（ｐＳｅｒ４７３）は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）製、抗マウスおよび抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート抗体ならびに化学試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）製であった。ＥＣＬは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）製であった。ニトロセルロース膜およびタンパク質アッセイキットは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）製であった。培地、血清、抗生物質、およびＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥトランスフェクション試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）製であった。ＥＲβ選択的アゴニスト化合物（Ｉ）は、ＷＯ２００９／１２７６８６に記載されているように調製することができる。シスプラチンは、ＥＢＥＷＥ  Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ  Ｇｅｓ．ｍ．ｈ．Ｈ（Ｕｎｔｅｒａｃｈ、オーストリア）またはＥＢＥＷＥ  Ｉｔａｌｉａ  ＳＲＬ（Ｒｏｍａ、イタリア）製であった。ペメトレキセドは、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ（Ｈｏｕｔｅｎ、オランダ）製であった。
【００９４】
［細胞培養およびトランスフェクション］
類上皮ＭＰＭ由来ＲＥＮ細胞株は、Ａｌｂｅｌｄａ  Ｓ．Ｍ．博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ；ＰＡ、ＵＳＡ）によって単離され、特徴付けられ、提供された。二相性ＭＳＴＯ−２１１Ｈおよび中皮ＭＥＴ５Ａ細胞株は、Ｉｓｔｉｔｕｔｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｏ  Ｔｕｍｏｒｉ（ＩＳＴ）Ｃｅｌｌ−ｂａｎｋ、Ｇｅｎｏａ、イタリアから得；ＭＭＢおよびＭＭＰ細胞株は、ＭＰＭを有する患者の胸水から得、培養液中で安定化させ（Ｃａｃｃｉｏｔｔｉ  Ｐら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、２００１；９８：１２０３２〜７ページ；Ｐｉｎｔｏｎ  Ｇ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００９；６９：４５９８〜６０４）；Ｈ２５９６細胞株は、切除されたＭＰＭを有する患者に由来する外科標本からＨ．Ｉ．Ｐａｓｓ博士によって生成された（Ｐａｓｓ  Ｈ．Ｉ．ら、Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ、１９９５；５９（４）：８３５〜４４ページ）。細胞は、５％  ＣＯ２を含有する加湿環境中で３７℃にて、１０％  ＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、および１０μｇ／ｍｌ  ペニシリンを補充したＲＰＭＩ培地中で増殖させた。マイコプラズマ感染は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）製のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ＰｌｕｓＴＭ  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔキットを使用することによって除外した。ＭＳＴＯ−２１１Ｈ／ＥＲβ細胞については、組織培養皿中で８０％コンフルエンスまで増殖させた細胞に、製造者が記載したようにＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬を使用してヒト野生型ＥＲβを発現するｐＣＮＸ２プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）を一過性にトランスフェクトした。遺伝子サイレンシングは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）によるＥＲβ特異的ｓｈＲＮＡレンチウイルスプラスミド（ｐＬＫＯ．１−ｐｕｒｏ）、またはＱｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）による特異的ｓｉＲＮＡを使用して実現した。
【００９５】
［増殖アッセイ］
細胞を、６ウェルプレート中で、１０％  ＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、および１０μｇ／ｍｌ  ペニシリンを補充したＲＰＭＩ培地中で１０×１０４細胞／ウェルの密度で播種し、５％  ＣＯ２を含有する加湿環境中で３７℃にて一晩インキュベートして付着させた。処置の後、細胞をトリプシン処理し、トリパンブルーで染色した。生存可能と考えられる細胞（無染色細胞）の数を、染色後５分以内にＢｕｒｋｅｒ血球計算器で計数した。
【００９６】
［ウォッシュオフ実験］
細胞培養物を１〜１６時間（実験に応じて）にわたって化合物（Ｉ）で前処置し、その後ウォッシュオフし、次いで通常の増殖培地±シスプラチン、ペメトレキセド、またはシスプラチン／ペメトレキセドを補充した。総インキュベーション時間は、２４〜７２時間であった（実験に応じて）。対照培養物を、薬物を添加していない通常の増殖培地中で維持した。生存細胞の数は、増殖アッセイについて記載したように判定した。
【００９７】
［アドオン実験］
アドオン実験では、第２の薬物を、第１の薬物をウォッシュオフすることなく細胞培養培地に直接添加した。総インキュベーション時間は、２４時間であった。対照培養物は、薬物を添加していない通常の増殖培地中で維持した。生存細胞の数は、増殖アッセイについて記載したように判定した。
【００９８】
［細胞溶解および免疫ブロット］
細胞を、プロテアーゼ阻害剤（１０μｇ／ｍｌ  ロイペプチン、４μｇ／ｍｌ  ペプスタチン、および０．１ユニット／ｍｌ  アプロチニン）を新たに添加した１％  ＮＰ−４０溶解緩衝液（１％  ＮＰ−４０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．５  ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＮａＦ、１０ｍＭ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、０．４ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４）を用いて抽出した。組織からのタンパク質抽出については、各試料約１００ｍｇを、１％  ＮＰ−４０溶解緩衝液中でＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザーデバイスを使用してホモジナイズした。溶解産物を４℃にて１０分間１３，０００×ｇで遠心分離し、上清を収集し、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ法を用いてタンパク質濃度についてアッセイした。
【００９９】
タンパク質は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、タンパク質をニトロセルロースに移し、特異的抗体と反応させ、次いでペルオキシダーゼ−コンジュゲート二次抗体および化学発光ＥＣＬ試薬を用いて検出した。濃度測定分析は、ＧＳ２５０  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して実施した。
【０１００】
［細胞周期分析］
細胞周期／アポトーシス分析について、５×１０５個の細胞を組織培養プレート中に播種し、１００μＭ  シスプラチンで２４時間処置し、または１０ｎＭ  化合物（Ｉ）で２時間前処置し、その後ウォッシュオフし、５％  ＣＯ２雰囲気中で３７℃にてさらに２４時間にわたって通常培地±１００μＭ  シスプラチン中で増殖を継続した。インキュベーション後、剥離および懸濁した細胞を完全ＲＰＭＩ中に回収し、５００×ｇで１０分間遠心分離した。ペレットをＰＢＳで洗浄し、４℃の氷冷７５％エタノール中で固定し、１００ｍｇ／ｍＬ  ＲＮＡｓｅ  Ａで３７℃にて１時間処置し、２５μｇ／ｍｌ  ヨウ化プロピジウムで染色し、最後に、フローサイトメーターＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＭｏｄｆｉｔソフトウェア（Ｖｅｒｉｔｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｈｏｕｓｅ、Ｔｏｐｓｈａｍ、ＭＥ、ＵＳＡ）を使用することによって分析した。
【０１０１】
［ｉｎ  ｖｉｖｏ実験］
［動物］  ＣＤ１ヌードマウス（雄、生後６週；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｃａｌｃｏ、イタリア）に、ＲＰＭＩ培地０．５ｍＬ中の２×１０６個のルシフェラーゼ形質導入ＲＥＮ細胞を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。麻酔し、１５ｍｇ／ｍＬ  Ｄ−ルシフェリン０．３ｍＬをｉ．ｐ．注射した後、腫瘍寸法および発光細胞の局在化を、Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＶＩＳ（登録商標））システム１００シリーズ（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して監視した。目的の領域を腫瘍部位の周囲で同定し、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して総光子数として定量化した。腫瘍サイズの値は、それぞれの毎週の測定の発光シグナルを接種後１５日目（処置を開始した日）の処置群内のすべての動物の平均値で減算して得た。処置の毒性を評価するために、マウスを処置の開始時と終了時に秤量した。マウスを処置の２０日後に殺し、剖検した。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験は、Ｉｓｔｉｔｕｔｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｏ  Ｔｕｍｏｒｉ（Ｇｅｎｏａ、イタリア）倫理委員会によって承認され、関連した規制基準に準拠する。マウスは、無菌条件下で維持し、取り扱い、食物および水に自由にアクセスさせた。
【０１０２】
［薬物投与］  １５日の時間経過により、ＩＶＩＳ（登録商標）イメージングによる検出可能な腫瘍小結節を形成させた。次いでマウスを秤量し、１０匹の動物の処置群に層別化した。処置プロトコルを１５日目から３５日目に行い、マウスをＩＶＩＳ（登録商標）イメージングによって毎週分析して腫瘍増殖を評価した。一用量の化合物（Ｉ）を使用した（１０ｍｇ／ｋｇ／日）。化合物（Ｉ）は、ビヒクル（５％  ＤＭＳＯ／４０％  ＰＥＧ４００／５５％  水）中に溶解させ、皮下投与によって１日１回（１〜２１日目）投与した。５ｍｇ／ｋｇ  シスプラチン溶液（ＥＢＥＷＥ  Ｉｔａｌｉａ  ｓｒｌ、Ｒｏｍａ、イタリア）を、それぞれ４日目および１１日目に皮下に投与し、１５０ｍｇ／ｋｇ  ペメトレキセド（等張食塩水中に溶解した）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ、Ｈｏｕｔｅｎ、Ｎｅｄｅｒｌａｎｄ）を、それぞれ５〜９日目および１２〜１６日目に皮下に注射した。未処置の動物に空のビヒクルを投薬した。３５日目に、４つの群からのマウスを安楽死させ、剖検した。腹膜中に増殖している腫瘍を切除し、腫瘍組織の一部分を直ちに凍結させ、後の分析のために−８０℃で貯蔵した。
【０１０３】
［統計分析］
差分分析の統計的評価を一元配置ＡＮＯＶＡおよびスチューデントｔ−検定によって実施した。統計的有意性の閾値は、ｐ≦０．０５に設定した。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験の統計分析は、Ｒ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ．Ｒ：Ａ  ｌａｎｇｕａｇｅ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ、Ｖｉｅｎｎａ、オーストリア、２０１２、ＩＳＢＮ３−９０００５１−０７−０を使用することによって行った。異なる群を比較するために、ノンパラメトリッククラスカル−ワリス検定を使用した。差異が有意である（ｐ≦０．０５）と判明した場合、Ｗｉｌｋｏｘｏｎ順位和検定を引き続いて適用してペアワイズ比較を行った。
【実施例１】
【０１０４】
［ＭＰＭ細胞増殖に対する化合物（Ｉ）の効果］
（ａ）さまざまな用量の化合物（Ｉ）（１〜１００ｎＭの範囲）の増殖阻害作用を、上述した増殖アッセイを使用して、ＥＲβ陽性ＲＥＮ中皮腫細胞に対して試験した。結果を図１Ａに示す。化合物（Ｉ）は有意に（ｐ≦０．０５）用量依存的な様式で細胞増殖および生存度を低減し、最高の有効性は、１０ｎＭにおいてであった。
【０１０５】
（ｂ）２４および４８時間における単剤としての化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）の抗増殖活性を、非悪性中皮ＭＥＴ５Ａ細胞、悪性中皮腫細胞ＲＥＮ、ＭＭＢ、Ｈ２５９６、およびＭＳＴＯ−２１１Ｈ；ヒトＥＲβを発現するように一過性にトランスフェクトされたＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ／ＥＲβ）；ならびにＥＲβがＥＲβ特異的ｓｉＲＮＡでノックダウンされた悪性中皮腫細胞ＲＥＮおよびＭＭＢ（ＲＥＮ／ｓｉＲＮＡ  ＥＲβおよびＭＭＢ／ｓｉＲＮＡ  ＥＲβ）において評価した。結果を図１Ｂに示す。
【０１０６】
化合物（Ｉ）は、ＲＥＮおよびＭＭＢ細胞の増殖を有意に（ｐ≦０．０５）阻害し、一方、阻害作用は、ＥＲβの高い内因性レベルにもかかわらずＭＥＴ５Ａ細胞内で観察されなかった。これは、これらの非悪性の表現型に関係する場合がある。Ｈ２５９６細胞は、化合物（Ｉ）に対して弱い応答を有していた。理由は、Ｈ２５９６細胞が非常低いレベルのＥＲβを発現するためである。ＥＲβ陰性ＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞は、化合物（Ｉ）の処置に対して応答を示さなかった。しかし、ＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞にＥＲβ発現ベクターを一過性にトランスフェクトすると、化合物（Ｉ）に対してこれらの細胞が感作された。
【実施例２】
【０１０７】
［ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのシスプラチン／ペメトレキセドの有効性に対する化合物（Ｉ）の効果］
（ａ）シスプラチン／ペメトレキセド化学療法の組合せ（これらのそれぞれのＩＣ５０濃度での）に化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）を加えることの増殖阻害作用を、通常培地（対照）、化合物（Ｉ）のみ、およびシスプラチン／ペメトレキセドと比較してＲＥＮ細胞において試験した。生存細胞の数を、増殖アッセイについて記載したように判定した。２４時間後の細胞生存度を測定した。結果を図２Ａに示す。
【０１０８】
化合物（Ｉ）／シスプラチン／ペメトレキセド（それぞれ１０ｎＭ／１００μＭ／２２μＭ）の３重の組合せは、化合物（Ｉ）単独またはシスプラチン／ペメトレキセド処置単独より優れており、化合物（Ｉ）がシスプラチン／ペメトレキセド処置の効果を増強することを実証した。
【０１０９】
（ｂ）シスプラチン／ペメトレキセド組合せに対する化合物（Ｉ）の効果も、中皮腫ｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルで評価した。生後６週のＣＤ１ヌード雄マウスに２×１０６個のＲＥＮ細胞を腹膜内に接種した（４つの群、１群当たり１０匹の動物）。接種の前に、ＭＰＭ細胞を、ルシフェラーゼ遺伝子を担持するレンチウイルスベクターで形質導入して、生きたマウスにおけるイメージングを可能にした。ビヒクル、化合物（Ｉ）、シスプラチン／ペメトレキセド、または化合物（Ｉ）／シスプラチン／ペメトレキセドを用いた処置を、図２Ｂに示したように、１５日目（腹膜腔内の腫瘍発生率がすべての動物群において１００％であったとき）に開始し、２１日間継続した。化合物（Ｉ）を１０ｍｇ／ｋｇ／日で皮下注射によって投与した。未処置の動物は、空のビヒクルで皮下に投薬した。２つの群を、５ｍｇ／ｋｇ  シスプラチンで４日目および１１日目に処置し、その後１５０ｍｇ／ｋｇ  ペメトレキセド（５〜９日目および１２〜１６日目）を用いて、単独で、または化合物（Ｉ）と組み合わせて５日の処置をした。３５日目に、マウスを屠殺し、腫瘍を解剖し、直ちに凍結させた。結果を図２Ｃおよび２Ｄに示す。
【０１１０】
化合物（Ｉ）で処置したマウスは、１０日以内のビヒクル対照と比較してシスプラチン／ペメトレキセド処置群と腫瘍寸法の同様の減少を生じた（データを示さず）。処置して２０日後に、腫瘍増殖の統計的に有意な低減が、ビヒクル、化合物（Ｉ）、およびシスプラチン／ペメトレキセド群と比較して化合物（Ｉ）／シスプラチン／ペメトレキセドで処置された群において観察された。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏでのシスプラチン／ペメトレキセドと組み合わせた化合物（Ｉ）を用いた処置は、いずれの処置単独よりも大きい有効性を有し、処置期間の最後で、ビヒクル処置動物と比較して腫瘍負荷量を有意に低減させた。さらに、化合物（Ｉ）／シスプラチン／ペメトレキセドの３重の組合せは、処置の開始時の腫瘍体積未満にまで腫瘍体積を縮小させた。化合物（Ｉ）を用いた処置は、薬物投与中のマウスの体重の変化を監視することによって評価した場合、有毒とならなかった。したがって、実施例２（ａ）においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで示した増殖阻害作用は、マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍形成活性ということになった。
【実施例３】
【０１１１】
［ＲＥＮ細胞の増殖に対する化合物（Ｉ）の効果］
（ａ）化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）への短時間の曝露（１、２、４、８、１６、および２４時間）の増殖阻害作用を、ＲＥＮ細胞において試験した。細胞培養物を化合物（Ｉ）で１〜１６時間前処置し、その後ウォッシュオフし、次いで通常の増殖培地を補充した。総インキュベーション時間は、２４時間であった。２４時間の試験について、細胞を、２４時間のインキュベーション時間にわたって化合物（Ｉ）を含む培養液中で維持した。対照培養物は、通常の増殖培地中で維持した。生存細胞の数を、増殖アッセイについて記載したように判定した。結果を図３Ａに示す。
【０１１２】
２時間にわたる化合物（Ｉ）への曝露は、１時間の曝露および８時間より長い曝露と比べて有意に（ｐ≦０．０５）増大した増殖阻害活性を提示した。
【０１１３】
（ｂ）２時間にわたってさまざまな用量の化合物（Ｉ）（０．４、２、および１０ｎＭ）に短時間曝露した後の７２時間にわたる増殖阻害作用をＲＥＮ細胞において試験した。細胞培養物を、２時間にわたってさまざまな濃度の化合物（Ｉ）（０．４、２、および１０ｎＭ）で前処置し、その後ウォッシュオフし、次いでさらに２４、４８、または７２時間にわたって通常培地（化合物（Ｉ）を含まない）中で増殖を継続した。対照培養物を通常の増殖培地のみの中で維持した。生存細胞の数を、０、２４、４８、および７２時間において増殖アッセイについて記載したように判定した。結果を図３Ｂに示す。
【０１１４】
ＲＥＮ細胞増殖に対する阻害作用の継続時間は、２時間の前処置期間中に使用した化合物（Ｉ）の濃度に関係なく、少なくとも２４時間持続した。最大の抗増殖作用は、最高の化合物（Ｉ）濃度を使用したもので観察された。２４時間後、細胞は、増殖活性を徐々に回復し、化合物（Ｉ）で前処置して約４８時間後から、これらの増殖速度は、試験の開始から通常培地中で培養したＲＥＮ細胞のものと同様であった。
【実施例４】
【０１１５】
［ＲＥＮ細胞に対するシスプラチンおよび／またはペメトレキセドの効果についての化合物（Ｉ）を用いた前処置の効果］
（ａ）１００μＭ  シスプラチンを、１０ｎＭ  化合物（Ｉ）で２、４、８、および１２時間前処置したＲＥＮ細胞培養物に添加した（アドオン実験）。２４時間における生存細胞の数を、上記増殖アッセイについて記載したように判定した。対照培養物を、通常の増殖培地；増殖培地と化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）；および増殖培地とシスプラチン（１００μＭ）中で維持した。結果を図４Ａに示す。
【０１１６】
シスプラチンの抗増殖作用の増強は、時間に依存し、最大の阻害作用は、化合物（Ｉ）で前処置して２時間後にシスプラチンを添加するとき、得られた。
【０１１７】
（ｂ）さまざまな濃度のシスプラチン（２０、４０、６０、８０、および１００μＭ）を、化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）で２時間前処置したＲＥＮ細胞培養物に添加した。細胞を化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）で２時間前処置し、その後ウォッシュオフし、さらに２４時間にわたってさまざまな濃度のシスプラチン（２０、４０、６０、８０、および１００μＭ）を補充した通常培地中で増殖を継続した。さらに２４時間後の生存細胞の数を、上記増殖アッセイについて記載したように判定した。対照培養物を、通常の増殖培地で維持した；２時間の化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）、ウォッシュオフ、および次いでさらに２４時間の間通常培地中で増殖を継続した；ならびに増殖培地とシスプラチン（１００μＭ）。結果を図４Ｂに示す。
【０１１８】
最も効果的な抗増殖作用は、化合物（Ｉ）の前処置を最高濃度のシスプラチン（１００μＭ）と組み合わせたときに観察された。しかし、意外にも、２０μＭ  シスプラチンと組み合わせた化合物（Ｉ）での２時間の前処置は、１００μＭ  シスプラチン単独と同様に効果的であった。
【０１１９】
この実験の結果のアイソボログラム分析を実施した（Ｔａｌｌａｒｉｄａ  ＲＪ．、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２００１；２９８（３）：８６５〜７２ページ；Ｔａｌｌａｒｉｄａ  ＲＪ．、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２００６；３１９：１〜７ページ）。結果を図４Ｆに示す。図から分かるように、化合物（Ｉ）およびシスプラチンの組合せは、相乗効果を有する。
【０１２０】
（ｃ）化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）を、１００μＭのシスプラチンを用いて２、４、８、および１２時間にわたってシスプラチンで前処置したＲＥＮ細胞培養物に添加した（アドオン実験）。２４時間における生存細胞の数を、上記増殖アッセイについて記載したように判定した。対照培養物を、通常の増殖培地；増殖培地と化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）；および増殖培地とシスプラチン（１００μＭ）中で維持した。結果を図４Ｃに示す。
【０１２１】
シスプラチンおよび化合物（Ｉ）の両方で処置された細胞は、作用物質の一方のみで処置された細胞より大きい増殖阻害を示したが、化合物（Ｉ）を添加する前にシスプラチンで前処置すると、細胞増殖および生存度の相乗的阻害が生じなかった。これは、実施例４（ａ）に示したように、シスプラチンを添加する前に化合物（Ｉ）で前処置することと対照的である。したがって、化合物（Ｉ）およびシスプラチンによる悪性中皮腫細胞増殖および生存の相乗的阻害は、化合物（Ｉ）での前処置でのみ起こり、逆順序で起こらない。
【０１２２】
（ｄ）さまざまな用量のペメトレキセド（５、１１、１６．５、および２２μＭ）を、化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）で２時間前処置したＲＥＮ細胞培養物に添加した。細胞を、化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）で２時間前処置し、その後ウォッシュオフし、さらに２４時間にわたってさまざまな濃度のペメトレキセド（５、１１、１６．５、および２２μＭ）を補充した通常培地中で増殖を継続した。さらに２４時間後の生存細胞の数を、上記増殖アッセイについて記載したように判定した。対照培養物を、通常の増殖培地；２時間の化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）、ウォッシュオフ、および次いでさらに２４時間にわたる通常培地中での増殖の継続；ならびに増殖培地とペメトレキセド（２２μＭ）の中で維持した。結果を図４Ｄに示す。
【０１２３】
抗増殖作用の増強は、化合物（Ｉ）で前処置して２時間後にペメトレキセドを添加するとき、得られなかった。これは、実施例４ａに示したように、シスプラチンを添加する前に化合物（Ｉ）で前処置することと対照的である。したがって、化合物（Ｉ）を用いた前処置は、それがシスプラチンに対して呈するのと同じ有益な相乗効果をペメトレキセドに対して呈さない。
【０１２４】
（ｅ）シスプラチン（１００μＭ）、またはシスプラチン（１００μＭ）およびペメトレキセド（２２μＭ）を、化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）で２時間前処置したＲＥＮ細胞培養物に添加した。細胞を、化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）で２時間前処置し、その後ウォッシュオフし、さらに２４時間にわたってシスプラチン（１００μＭ）、またはシスプラチン（１００μＭ）およびペメトレキセド（２２μＭ）を補充した通常培地中で増殖を継続した。さらに２４時間後の生存細胞の数を、上記増殖アッセイについて記載したように判定した。対照培養物を、通常の増殖培地；増殖培地とシスプラチン（１００μＭ）；増殖培地とペメトレキセド（２２μＭ）；増殖培地とシスプラチン（１００μＭ）およびペメトレキセド（２２μＭ）；ならびに２時間の化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）での前処置、その後のウォッシュオフ、およびさらに２４時間にわたる通常培地中での増殖の継続の中で維持した。結果を図４Ｅに示す。
【０１２５】
シスプラチンまたはシスプラチン／ペメトレキセドを添加する前に化合物（Ｉ）でＲＥＮ細胞を前処置すると、細胞増殖および生存度に対する強い相乗的阻害作用が生じた。
【実施例５】
【０１２６】
［化合物（Ｉ）で処置した細胞の細胞周期分析］
ＲＥＮ細胞を、１００μＭ  シスプラチンで２４時間処置し、または１０ｎＭ  化合物（Ｉ）で２時間前処置し、その後ウォッシュオフし、さらに２４時間にわたって通常培地±１００μＭ  シスプラチン中で増殖を継続した。細胞周期分析を上述したように実施した。対照培養物を通常の増殖培地中で維持した。処置後、細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーによって細胞ＤＮＡ含有量について分析した。結果を図５Ａに示す。
【０１２７】
化合物（Ｉ）で２時間前処置し、その後２４時間シスプラチンで処置すると、任意の他の処置と比較してＧ０／Ｇ１相における細胞周期の有意かつ効率的な遮断および細胞が細胞周期のＳ期に入ることの阻害がもたらされた。さらに、有意なより高い百分率の死細胞が、試験した他の治療レジメンと比較して化合物（Ｉ）で前処置し、その後シスプラチンが続いたウェル中で見出された。
【０１２８】
化合物（Ｉ）／シスプラチンで処置された細胞において死細胞数が増加した１つのもっともと思われる説明は、アポトーシスの誘導であった。
【０１２９】
シスプラチン（２５、５０、および１００μＭ）で２４間処置した、または化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）で２時間前処置し、その後ウォッシュオフし、さらに２４時間にわたって通常培地±シスプラチン（２５、５０、および１００μＭ）中で増殖を継続したＲＥＮ細胞内のＰＡＲＰ１、切断されたＰＡＲＰ１、ＡＫＴ、およびリン酸化ＡＫＴのレベルも、ウエスタンブロット分析および相対濃度測定によって判定した。総ＡＫＴおよびチューブリン染色を正規化のために使用した。結果を図５Ｂに示す。ＰＡＲＰ１切断は、アポトーシス細胞死の指標であるので、これを分析した。ＡＫＴ活性の増大は、増殖、アポトーシス、およびシスプラチン耐性の制御に関係付けられているので（Ｐｉｎｔｏｎ  Ｇ．ら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ（２０１２）７：ｅ３６８５６）、異なる処置後のＡＫＴ活性化状態も分析した。
【０１３０】
細胞周期分析および死細胞の百分率から予期されるように、シスプラチンを添加する前の２時間の化合物（Ｉ）での処置は、切断されたＰＡＲＰ１の出現に対して最も大きい効果を有した（図５Ｂ）。興味深いことに、シスプラチン単独も化合物（Ｉ）単独も、有意なＰＡＲＰ１切断を生じなかった。化合物（Ｉ）での処置はまた、シスプラチンの非存在下および存在下の両方でＡＫＴリン酸化を有意に低減した（図５Ｂ）。
【実施例６】
【０１３１】
［ＭＥＴ５Ａ細胞におけるシスプラチン毒性に対する化合物（Ｉ）の効果］
シスプラチン毒性に対する化合物（Ｉ）の効果を、正常な中皮由来細胞株ＭＥＴ５Ａにおいて試験した。ＭＥＴ５Ａ細胞を、１０ｎＭ  化合物（Ｉ）で２時間処置し、その後ウォッシュオフし、さらに２４時間にわたって通常培地中で、またはさまざまな用量のシスプラチン（２５、５０、１００μＭ）の存在下で増殖を継続した。対照培養物を、正常な増殖培地；増殖培地とシスプラチン（１００μＭ）；ならびに２時間の化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）、ウォッシュオフ、および次いでさらに２４時間にわたる通常培地中での増殖の継続の中で維持した。結果を図６Ａに示す。
【０１３２】
ＭＥＴ５Ａ細胞は、ＲＥＮ細胞よりシスプラチン処置に対する高い感受性を示し、ＩＣ５０は、２５μＭであった。化合物（Ｉ）単独は、ＭＥＴ５Ａ細胞増殖または生存度に対して効果を有さなかった。保護効果が、化合物（Ｉ）での前処置を低用量のシスプラチンと組み合わせたときに観察された。
【０１３３】
したがって、化合物（Ｉ）がシスプラチンに対する細胞毒性を有意に増大させた悪性ＲＥＮ細胞における効果と対照的に（実施例４（ａ）、（ｂ）、および（ｅ）を参照）、化合物（Ｉ）は、非悪性中皮ＭＥＴ５Ａ細胞においてシスプラチンの毒性を減少させ、かつ／または相殺した。ＥＲβアゴニストは、加減抵抗器として作用し、疾患細胞またはストレスを受けた細胞内で恒常性を復旧するように試みると思われる。
【０１３４】
２４時間におけるＭＥＴ５Ａ細胞培養物中のＰＡＲＰ１、切断されたＰＡＲＰ１、ＡＫＴ、およびリン酸化ＡＫＴのレベルもまた、ウエスタンブロット分析および相対濃度測定によって判定した。
【０１３５】
化合物（Ｉ）で前処置すると、すべての濃度のシスプラチンに曝露された細胞内の切断されたＰＡＲＰ１の百分率が低減され（図６Ｂを参照）、細胞生存度について得たデータに一致した（図６Ａ）。化合物（Ｉ）は、ＭＥＴ５Ａ対照細胞内の基礎ｐＡＫＴレベルに対して効果を有さなかったが、これは、ｐＡＫＴのシスプラチン媒介阻害をアンタゴナイズした（図６Ｂにも示してある）。ＡＫＴ経路活性化は、抗アポトーシス効果および細胞生存に関連する。ＰＡＲＰ１切断の低減に対する化合物（Ｉ）の効果と一緒に、これは、非悪性ＭＥＴ５Ａ細胞におけるシスプラチン細胞傷害性の化合物（Ｉ）媒介減少を説明し得る。
【実施例７】
【０１３６】
［ＭＭＰ細胞に対する化合物（Ｉ）を用いた前処置およびシスプラチンの効果］
５０μＭ  シスプラチンを、１０ｎＭ  化合物（Ｉ）で２時間前処置したＭＭＰ細胞培養物に添加した（ウォッシュオフ実験）。２４時間における生存細胞の数を、上記増殖アッセイについて記載したように判定した。対照培養物を、通常の増殖培地；増殖培地と化合物（Ｉ）（１０ｎＭ）；および増殖培地とシスプラチン（５０μＭ）中で維持した。結果を図７Ａに示す。
【０１３７】
シスプラチンの抗増殖作用の増強が、細胞を化合物（Ｉ）で２時間前処置したときに観察された。
【０１３８】
２４時間におけるＭＭＰ細胞培養物中のＰＡＲＰ１、切断されたＰＡＲＰ１、ＡＫＴ、およびリン酸化ＡＫＴのレベルも、ウエスタンブロット分析によって判定した。
【０１３９】
結果を図７Ｂに示す。その図から分かるように、化合物（Ｉ）で２時間前処置し、その後ウォッシュオフし、５０μＭ  シスプラチンを補充した通常培地中で増殖を継続した細胞内で、切断されたＰＡＲＰ１のレベルの最も有意な増大があった。化合物（Ｉ）での処置は、シスプラチンの非存在下および存在下の両方でＡＫＴリン酸化を有意に低減したが、細胞が化合物（Ｉ）およびシスプラチンで処置されたとき最も有意に低減した。
【０１４０】
したがって、第２のヒト悪性中皮腫細胞株、ＭＭＰにおいて、シスプラチンと組み合わせた化合物（Ｉ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで化合物（Ｉ）単独またはシスプラチン単独と比較して相乗的な増殖阻害をもたらした。さらに、ＲＥＮ細胞における効果と同様に、ＭＭＰ細胞における化合物（Ｉ）およびシスプラチンの組合せは、リン酸化ＡＫＴのレベルを減少させ、切断されたＰＡＲＰ１のレベルを増大させた。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際調査報告】
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