(57)【要約】本発明は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４が、本明細書に定義された式（Ｉ）の放射標識された化合物に関する。
2016513083.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化２７】
2016513083.tif 000030
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、Ｃ１−７アルキル、Ｃ１−７ハロアルキルから独立して選択され、Ｒ１及びＲ２は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、ヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ３は、Ｃ１−７アルキルであり；
Ｒ４は、水素、Ｃ１−７アルコキシ、又はＣ１−７ハロアルコキシであり；
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、又はＲ４のいずれかは、３Ｈ、１１Ｃ、及び１８Ｆから選択される放射性核種で標識されている］
の放射標識された化合物。
【請求項２】
Ｒ１が、Ｃ１−７アルキルであり、
Ｒ２が、Ｃ１−７フルオロアルキルであり；
Ｒ３が、メチルであり；
Ｒ４が、水素であり；
ここで、Ｒ２が、１８Ｆ又は３Ｈで標識されているか、或いはＲ３が、１１Ｃで標識されている、請求項１の放射標識された化合物。
【請求項３】
Ｒ１及びＲ２が、それらが結合する窒素原子と一緒になって、ヘテロシクロアルキル、好ましくはモルホリニルを形成し；
Ｒ３が、メチルであり；
Ｒ４が、Ｃ１−７フルオロアルキルオキシであり；
ここで、Ｒ４が、１８Ｆで標識されている、請求項１の放射標識された化合物。
【請求項４】
Ｒ１及びＲ２が、それらが結合する窒素原子と一緒になって、ヘテロシクロアルキル、好ましくはモルホリニルを形成し；
Ｒ３が、メチルであり；
Ｒ４が、Ｃ１−７アルキルオキシであり；
ここで、Ｒ４が、３Ｈ、又は１１Ｃのいずれかで標識されている、請求項１の放射標識された化合物。
【請求項５】
下記：
【化２８】
2016513083.tif 000031
からなる群から選択される、請求項１〜４の放射標識された化合物。
【請求項６】
ＰＤＥ１０Ａ  ＰＥＴトレーサーとして使用するための、請求項１〜５の放射標識された化合物。
【請求項７】
ＰＤＥ１０Ａ結合研究において使用するための、請求項１〜５の化合物。
【請求項８】
ＰＥＴトレーサー、又はオートラジオグラフィー放射性リガンドとして使用するための、請求項１〜５の化合物。
【請求項９】
被験体の脳におけるＰＤＥ１０Ａの画像診断において使用するための、請求項１〜５の化合物。
【請求項１０】
被験体の組織におけるＰＤＥ１０Ａのポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）イメージングのための方法であって、
ａ）有効量の請求項１〜５の化合物を被験体に投与し；
ｂ）化合物を被験体の組織に浸透させ；そして
ｃ）被験体のＣＮＳ又は脳組織のＰＥＴ像を採取する；
ことを含む方法。
【請求項１１】
被験体の組織におけるＰＤＥ１０Ａ機能性の検出のための方法であって、
ａ）有効量の請求項１〜５の化合物を被験体に投与し；
ｂ）化合物を被験体の組織に浸透させ；そして
ｃ）被験体のＣＮＳ又は脳組織のＰＥＴ像を採取する；
ことを含む方法。
【請求項１２】
被験体の脳におけるＰＤＥ１０Ａの画像診断のための組成物の製造のための、請求項１〜５のいずれか一項に定義の化合物の使用。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか一項記載の化合物、及び薬学的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１４】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、式Ｉ：
【化１】
2016513083.tif 000003
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、Ｃ１−７アルキル、Ｃ１−７ハロアルキルから独立して選択され、Ｒ１及びＲ２は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、ヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ３は、Ｃ１−７アルキルであり；
Ｒ４は、水素、Ｃ１−７アルコキシ、又はＣ１−７ハロアルコキシであり；
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、又はＲ４のいずれかは、３Ｈ、１１Ｃ、及び１８Ｆから選択される放射性核種で標識されている］
の放射標識された化合物に関する。本発明の化合物は、ＰＤＥ１０Ａ機能性の標識及び画像診断に有用である。
【０００２】
放射標識された式Ｉの化合物が、ＰＤＥ１０Ａ機能性の標識及び分子イメージング診断のためのＰＥＴ（ポジトロン放出断層撮影）及び／又はオートラジオグラフィーの放射性トレーサーとして使用しうることが認められている。分子イメージングは、分子プローブ（例えば放射性トレーサー）と、ＰＥＴ、核磁気共鳴、近赤外、又は他の方法を介して視覚化される生物学的標的（例えば、分子プローブに結合又は保持することができる受容体、酵素、イオンチャンネル、又は他の任意の細胞若しくは細胞外成分）との選択的及び特異的相互作用に基づく。ＰＥＴ、核医学イメージングモダリティは、所与の器官における生物学的標的の分布、このような器官又は細胞の代謝活性、或いは薬物がこのような器官に入り、生物学的標的に結合し、及び／又は生物学的過程を改変する能力に関する重要な情報を提供する三次元画像をもたらすのに理想的に適している。ＰＥＴは、非侵襲的映像技術であるので、ヒト及び動物における疾患の病態生理学並びに所与の分子標的又は細胞過程に対する薬物の作用を研究することに用いることができる。所与の分子標的に特異的であるＰＥＴ放射性トレーサーが入手可能であることにより、薬物の開発、及び薬物の作用のメカニズムの理解が促されうる。更には、ＰＥＴ放射性トレーサーは、疾患の結果として現れる病態生理学的変化を証明することにより、疾患の診断を促進しうる。ＰＤＥ１０Ａは、異なる３群の研究グループによって１９９９年に報告されているように、単一の遺伝子にコードされる二重基質ＰＤＥである（Fujishige K., et al., Eur J Biochem (1999) 266(3):1118-1127、Soderling S.H., et al., ProcNatl Acad Sci USA (1999) 96(12):7071-7076、Loughney K., et al., Gene (1999) 234(1):109-117）。ＰＤＥ１０Ａは、アミノ酸配列（７７９ａａ）、組織特異的発現パターン、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰに対する親和性、並びに特異的及び一般的阻害物質によるＰＤＥ活性に対する効果に関して、多重遺伝子族の他のメンバーとは似ていない。
【０００３】
ＰＤＥ１０Ａは、脳、特に側坐核及び尾状核被殻において主として発現するＰＤＥファミリーの最も制限された分布の一つを有する。更に、視床、嗅球、海馬、及び前頭皮質は、中程度のＰＤＥ１０Ａの発現を示す。これらの脳領域の全ては、統合失調症及び精神病の病態生理に関与することが示唆されており、この荒廃的な精神疾患におけるＰＤＥ１０Ａの中心的役割が示唆されている。中枢神経系外においても、ＰＤＥ１０Ａの転写発現は、甲状腺、脳下垂体、インスリン分泌膵細胞、及び精巣などの末梢組織においても観察される（Fujishige, K. et al., J. Biol. Chem. 1999, 274, 18438-18445、Sweet, L. (2005) 国際公開公報第2005/012485号）。一方、ＰＤＥ１０Ａタンパク質の発現は、腸神経節、精巣、及び精巣上体精子においてのみ観察されている（Coskran T. M., et al., J. Histochem. Cytochem. 2006, 54 (11), 1205-1213）。
【０００４】
ヒトの脳は、数百万もの相互通信するニューロンからなる複雑な器官である。疾患と関連する異常を理解することは、有効な診断及び新規な治療法の今後の開発への必須の手段である。ヒトにおける生化学的異常の研究は、薬物の発見及び開発の過程の必須かつ不可欠な構成要素に急速になりつつある。伝統的には、新薬の発見及び開発は、有望なリード候補物質を選択するインビトロ技術（その後、生きている動物で試験してからヒトへ投与する）に重点を置いて行われてきた。インビトロ系は生体系の複雑さの一部しか反映しておらず、またヒトの疾患のインビボ動物モデルは、ヒトの病態に近似したものにすぎないことが多いため、この過程の早期の段階において生きているヒトにおける薬物−受容体相互作用を着実に理解することが、新規治療法の有効かつタイムリーな発見及び開発をより促す際の大きな原動力になるであろう。近年、病態、疾患の過程、及び薬物の作用を評価するために、ヒトの医用画像がますます多く使用されている。これらのイメージングモダリティーには、ＰＥＴ、ＭＲＩ、ＣＴ、超音波、ＥＥＧ、ＳＰＥＣＴなどが含まれる（British Medical Bulletin, 2003, 65, 169-177）。したがって、非侵襲的なイメージングモダリティー、例えばＰＥＴの使用は、将来の薬物の開発にとっては、非常に貴重なツールである。非侵襲的な核イメージング技術は、生きている各種の被験体の生理学及び生化学についての基礎的及び診断情報を得るのに用いることができる。これらの技術は、このように生きている被験体に投与された放射性トレーサーから放射される放射線を検出することができる高機能のイメージング装置の使用に依存している。得られた情報を再構築して、時間の関数としての放射性トレーサーの分布を示す平面および断層の画像を提供することができる。放射性トレーサーを用いることで、被験体の構造、機能、そして最も重要なことには生理学及び生化学に関する情報を含む画像が得られる。この情報の多くは、他の手段では得ることができない。これらの研究で用いられている放射性トレーサーは、インビボの挙動を定義するためにデザインされており、被験体の生理学又は生化学に関する特定の情報の決定を可能とする。最近は、アルツハイマー病における心機能、心筋血流量、肺血流、肝機能、脳血流、局所的脳グルコース及び酸素代謝、幾つかの脳受容体及び酵素の機能、並びにアミロイドベータプラークの沈着の可視化に関する有用な情報を得るのに利用することができる（PET Molecular Imaging and Its Biological Applications, Eds. Michael E. Phelps, Springer, New York, 2004、Ametamy S. et al., Chem. Rev., 2008, 108, 1501-1516、Nordberg A. et al. Nat. Rev. Neurol., 2010, 6, 78-87）。
【０００５】
更に、
−  ＰＥＴイメージングにより、医薬の開発の早期段階で、ヒトにおける正常及び異常な神経化学の非侵襲的かつ定量的アッセイが提供されて、治療法の効率的かつ有効な発見が促される。
−  トレーサー量の標識された化合物は、新薬の早期評価（生体分布研究；薬物−用量レジームを最適化し、薬物の作用の下方応答を特徴付けるための受容体占有研究）を可能にする。
−  非侵襲的技術を用いてヒトにおける疾患のメカニズムを理解することは、疾患及び新規治療法の診断及び管理における将来の発達と密接に結びついている。
【０００６】
ＰＥＴに通常用いられる放射性核種には、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、又は１８Ｆが含まれる。原則としては、親化合物の原子の一つをＰＥＴ核種と置き換えることで、全ての薬物を標識することが可能であるが、数種についてしか、ヒトにおいてインビボのイメージング剤として適用可能であることが確認されていない。１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、及び１８Ｆの放射活性半減期は、それぞれ２０、１０、２、及び１１０分である。このように短い半減期のため、ＰＥＴを用いてインビボの生物学的過程を探索するためにトレーサーとして使用することには、多くの利点がある。同日中に同じ被験体での繰り返し研究が可能である。ＰＥＴは、詳細に明らかにされた化合物における薬物−用量−酵素／受容体占有相関を決定するためのツールとしてますます使用されている。標識受容体又は酵素と特異的に結合するＰＥＴ放射性トレーサーの使用により、下記：
−  薬物が脳に入り、標的部位に結合する能力、
−  所与の用量の薬物によってもたらされる標的部位占有の程度、
−  占有の時間的経過、及び
−  問題になっている薬物の相対的血漿中及び組織中動態、
に関する情報が提供されうる。
【０００７】
占有に関する研究は、通常は研究中の薬物候補物質と同一ではないＰＥＴ放射性トレーサーを用いて行われる（British Medical Bulletin, 2003, 65, 169-177）。
【０００８】
トリチウム標識化合物は、特に有用であり、高解像度オートラジオグラフィーを含む研究で広く使用されている。トリチウムの物理的（核）特性、放射線の最大ベータエネルギーの低さ（１８keV）、及び最大特異的活性の高さ（２９Ci／mg水素原子）のため、トリチウムは、例えば生物学的標本中の化合物、薬物及びホルモンの正確な所在を決定するための理想的なアイソトープである。
【０００９】
本発明は、式Ｉ：
【化２】
2016513083.tif 000004
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、Ｃ１−７アルキル、Ｃ１−７ハロアルキルから独立して選択され、Ｒ１及びＲ２は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、ヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ３は、Ｃ１−７アルキルであり；
Ｒ４は、水素、Ｃ１−７アルコキシ、又はＣ１−７ハロアルコキシであり；
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、又はＲ４のいずれかは、３Ｈ、１１Ｃ、及び１８Ｆから選択される放射性核種で標識されている］
の放射標識された化合物に関する。
【００１０】
詳細な態様では、本発明は、
Ｒ１が、Ｃ１−７アルキルであり、
Ｒ２が、Ｃ１−７フルオロアルキルであり；
Ｒ３が、メチルであり；
Ｒ４が、水素であり；
ここで、Ｒ２が、１８Ｆ又は３Ｈで標識されているか、或いはＲ３が、１１Ｃで標識されている、式Ｉの放射標識された化合物に関する。
【００１１】
詳細な態様では、本発明は、
Ｒ１及びＲ２が、それらが結合する窒素原子と一緒になって、ヘテロシクロアルキル、好ましくはモルホリニルを形成し；
Ｒ３が、メチルであり；
Ｒ４が、Ｃ１−７フルオロアルキルオキシであり；
ここで、Ｒ４が、１８Ｆで標識されている、式Ｉの放射標識された化合物に関する。
【００１２】
詳細な態様では、本発明は、
Ｒ１及びＲ２が、それらが結合する窒素原子と一緒になって、ヘテロシクロアルキル、好ましくはモルホリニルを形成し；
Ｒ３が、メチルであり；
Ｒ４が、Ｃ１−７アルキルオキシであり；
ここで、Ｒ４が、３Ｈ、又は１１Ｃのいずれかで標識されている、式Ｉの放射標識された化合物に関する。
【００１３】
詳細な態様では、本発明は、下記：
【化３】
2016513083.tif 000005
からなる群から選択される式Ｉの放射標識された化合物に関する。
【００１４】
詳細な態様では、本発明は、ＰＤＥ１０Ａ  ＰＥＴトレーサー、及び／又はオートラジオグラフィートレーサーとして使用するための式Ｉの放射標識された化合物に関する。
【００１５】
詳細な態様では、本発明は、ＰＤＥ１０Ａ結合研究において使用するための式Ｉの放射標識された化合物に関する。
【００１６】
詳細な態様では、本発明は、被験体の脳におけるＰＤＥ１０Ａの画像診断において使用するための式Ｉの放射標識された化合物に関する。
【００１７】
詳細な態様では、本発明は、被験体の組織におけるＰＤＥ１０Ａのポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）イメージングのための方法であって、
有効量の本発明の化合物を被験体に投与し；
化合物を被験体の組織に浸透させ；そして
被験体のＣＮＳ又は脳組織のＰＥＴ像を採取する；
ことを含む方法に関する。
【００１８】
詳細な態様では、本発明は、被験体の組織におけるＰＤＥ１０Ａ機能性の検出のための方法であって、
有効量の本発明の化合物を被験体に投与し；
化合物を被験体の組織に浸透させ；そして
被験体のＣＮＳ又は脳組織のＰＥＴ像を採取する；
ことを含む方法に関する。
【００１９】
詳細な態様では、本発明は、被験体の脳におけるＰＤＥ１０Ａの画像診断のための組成物の製造のための式Ｉの放射標識された化合物の使用に関する。
【００２０】
詳細な態様では、本発明は、本発明の化合物、及び薬学的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】ＰＤＥ１０Ａに結合するオートラジオグラフィー放射性リガンド［３Ｈ］−４の特異性：参照ＰＤＥ１０Ａ遮断剤（ＭＰ−１０）１０μMの非存在下（図１Ａ）及び存在下（図１Ｂ）で、ラット脳の矢状切片（sagittal rat brain section）を放射性リガンド（０．１nM）とインキュベートした。
【図１Ｂ】ＰＤＥ１０Ａに結合するオートラジオグラフィー放射性リガンド［３Ｈ］−４の特異性：参照ＰＤＥ１０Ａ遮断剤（ＭＰ−１０）１０μMの非存在下（図１Ａ）及び存在下（図１Ｂ）で、ラット脳の矢状切片（sagittal rat brain section）を放射性リガンド（０．１nM）とインキュベートした。
【図２Ａ】ＰＤＥ１０Ａに結合するオートラジオグラフィー放射性リガンド［３Ｈ］−２１の特異性：参照ＰＤＥ１０Ａ遮断剤（ＭＰ−１０）１０μMの非存在下（図２Ａ）及び存在下（図２Ｂ）で、ラット脳の矢状切片（sagittal rat brain section）を放射性リガンド（０．１nM）とインキュベートした。
【図２Ｂ】ＰＤＥ１０Ａに結合するオートラジオグラフィー放射性リガンド［３Ｈ］−２１の特異性：参照ＰＤＥ１０Ａ遮断剤（ＭＰ−１０）１０μMの非存在下（図２Ａ）及び存在下（図２Ｂ）で、ラット脳の矢状切片（sagittal rat brain section）を放射性リガンド（０．１nM）とインキュベートした。
【図３Ａ】ＰＥＴトレーサー［１８Ｆ］−２０の６０〜９０分ｐ．ｉ．から合計したマカク脳における冠状（図３Ａ）、矢状（図３Ｂ）、及び横断（図３Ｃ）ＰＥＴイメージ。切片は、冠状及び横断方向の線条体のレベルで、左から右へ表示されている。
【図３Ｂ】ＰＥＴトレーサー［１８Ｆ］−２０の６０〜９０分ｐ．ｉ．から合計したマカク脳における冠状（図３Ａ）、矢状（図３Ｂ）、及び横断（図３Ｃ）ＰＥＴイメージ。切片は、冠状及び横断方向の線条体のレベルで、左から右へ表示されている。
【図３Ｃ】ＰＥＴトレーサー［１８Ｆ］−２０の６０〜９０分ｐ．ｉ．から合計したマカク脳における冠状（図３Ａ）、矢状（図３Ｂ）、及び横断（図３Ｃ）ＰＥＴイメージ。切片は、冠状及び横断方向の線条体のレベルで、左から右へ表示されている。
【図４Ａ】ＰＥＴトレーサー［１８Ｆ］−４の６０〜９０分ｐ．ｉ．から合計したマカク脳における冠状（図４Ａ）、矢状（図４Ｂ）、及び横断（図４Ｃ）ＰＥＴイメージ。切片は、冠状及び横断方向の線条体のレベルで、左から右へ表示されている。
【図４Ｂ】ＰＥＴトレーサー［１８Ｆ］−４の６０〜９０分ｐ．ｉ．から合計したマカク脳における冠状（図４Ａ）、矢状（図４Ｂ）、及び横断（図４Ｃ）ＰＥＴイメージ。切片は、冠状及び横断方向の線条体のレベルで、左から右へ表示されている。
【図４Ｃ】ＰＥＴトレーサー［１８Ｆ］−４の６０〜９０分ｐ．ｉ．から合計したマカク脳における冠状（図４Ａ）、矢状（図４Ｂ）、及び横断（図４Ｃ）ＰＥＴイメージ。切片は、冠状及び横断方向の線条体のレベルで、左から右へ表示されている。
【図５】１０〜９０分ｐ．ｉ．から合計したヒヒ脳におけるＰＥＴトレーサー［１１Ｃ］−２１の横断ＰＥＴイメージ。
【図６】１０〜９０分ｐ．ｉ．から合計したヒヒ脳におけるＰＥＴトレーサー［１１Ｃ］−４の横断ＰＥＴイメージ。
【００２２】
定義
語「アルコキシ」は、式−Ｏ−Ｒ’（式中、Ｒ’は、アルキル基である）の基を意味する。アルコキシ部分の例には、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシ、及びtert−ブトキシが含まれる。
【００２３】
語「ハロアルコキシ」は、アルコキシ基の少なくとも１の水素原子が同一又は異なるハロゲン原子、特にフッ素原子で置き換えられているアルコキシ基を意味する。ハロアルコキシの例には、モノフルオロ−、ジフルオロ−、若しくはトリフルオロ−メトキシ、−エトキシ、又は−プロポキシ、例えば３，３，３−トリフルオロプロポキシ、２−フルオロエトキシ、２，２，２−トリフルオロエトキシ、フルオロメトキシ、又はトリフルオロメトキシが含まれる。語「ペルハロアルコキシ」は、アルコキシ基の全ての水素原子が同一又は異なるハロゲン原子で置き換えられているアルコキシ基を意味する。
【００２４】
語「ハロアルキル」は、アルキル基の少なくとも１の水素原子が同一又は異なるハロゲン原子、特にフッ素原子で置き換えられているアルキル基を意味する。ハロアルキルの例には、モノフルオロ−、ジフルオロ−、若しくはトリフルオロ−メチル、−エチル、又は−プロピル、例えば３，３，３−トリフルオロプロピル、２−フルオロエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、フルオロメチル、又はトリフルオロメチルが含まれる。語「ペルハロアルキル」は、アルキル基の全ての水素原子が同一又は異なるハロゲン原子で置き換えられているアルキル基を意味する。
【００２５】
語「アルキル」は、１〜１２の炭素原子の一価の直鎖若しくは分岐鎖状の飽和炭化水素基を意味する。詳細な態様では、アルキルは、１〜７の炭素原子、より詳細な態様では、１〜４の炭素原子を有する。アルキルの例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、又はtert−ブチルが含まれる。
【００２６】
語「ヘテロシクロアルキル」は、３〜９の環原子の一価の飽和又は部分不飽和の一若しくは二環式の環系であって、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２若しくは３の環ヘテロ原子を含み、残りの環原子は炭素である環系を意味する。詳細な態様では、ヘテロシクロアルキルは、４〜７の環原子の一価の飽和単環式環系であって、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２若しくは３の環ヘテロ原子を含み、残りの環原子は炭素である環系である。単環式飽和ヘテロシクロアルキルの例は、アジリジニル、オキシラニル、アゼチジニル、オキセタニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリジニル、ピペリジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル、アゼパニル、ジアゼパニル、ホモピペラジニル、又はオキサゼパニルである。二環式飽和ヘテロシクロアルキルの例は、８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクチル、キヌクリジニル、８−オキサ−３−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクチル、９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニル、３−オキサ−９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニル、又は３−チア−９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニルである。部分不飽和ヘテロシクロアルキルの例は、ジヒドロフリル、イミダゾリニル、ジヒドロオキサゾリル、テトラヒドロピリジニル、又はジヒドロピラニルである。
【００２７】
語「半最大阻害濃度」（ＩＣ５０）は、インビトロでの生物学的過程の５０％阻害を得るために必要とされる特定化合物の濃度を意味する。ＩＣ５０値は、ｐＩＣ５０値に対数的に変換することができ（−ｌｏｇ ＩＣ５０）、ここで、より高い値は、指数関数的により高い力価を示す。ＩＣ５０値は、絶対値ではなく、実験条件、例えば、用いた濃度によって左右される。ＩＣ５０値は、Cheng-Prusoff式を使用して絶対阻害定数（Ｋｉ）に変換することができる（Biochem. Pharmacol. (1973) 22:3099）。
【００２８】
語「被験体」は、脊椎動物を意味する。ある態様では、脊椎動物は、哺乳動物である。哺乳動物には、ヒト、チンパンジー及びその他の類人猿及びサル種などの非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、及びブタなどの家畜動物、ウサギ、イヌ、及びネコなどの飼育動物、ラット、マウス及びモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物が含まれる。ある態様では、哺乳動物はヒトである。語「被験体」は、特定の年齢又は性別を意味しない。
【００２９】
語「薬学的に許容しうる塩」は、生物学的にもその他の点でも望ましくないものではない塩を意味する。薬学的に許容しうる塩には、酸及び塩基付加塩の両方が含まれる。
【００３０】
語「薬学的に許容しうる賦形剤」及び「治療的に不活性な賦形剤」は、区別しないで用いることができ、治療活性を有さず、投与された被験体に無毒である、薬学的製品の処方に用いられる崩壊剤、結合剤、充填剤、溶媒、緩衝剤、等張化剤、安定剤、抗酸化剤、界面活性剤、担体、希釈剤、又は滑沢剤などの、医薬組成物中の任意の薬学的に許容しうる成分を意味する。
【００３１】
医薬組成物
別の態様では、本発明の化合物及び治療的に不活性な担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物、更には本発明の化合物を用いてこのような組成物及び医薬を調製する方法が提供される。一つの例では、式［Ｉ］の化合物は、生理学的に許容される担体、すなわち、ガレヌス投与形態に用いられる投与量及び濃度で受容者に対して非毒性である担体と、適切なｐＨで、かつ所望の程度の純度で、周囲温度で混合することにより製剤化し得る。製剤のｐＨは、主に化合物の特定の用途及び濃度に依拠するが、好ましくは、約３〜約８の範囲のいずれかである。一例において、式［Ｉ］の化合物は、ｐＨ５の酢酸緩衝液中で製剤化される。別の態様において、式［Ｉ］の化合物は、無菌である。化合物は、例えば、固体又は非晶質組成物として、凍結乾燥製剤として、又は水溶液として保存され得る。
【００３２】
代表的な製剤は、本発明の化合物と、担体または賦形剤を混合することにより調製される。適当な担体および賦形剤は、当業者に周知であり、例えばAnsel, Howard C., et al., Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2004；Gennaro, Alfonso R., et al. Remington: The Science and Practice of Pharmacy. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2000；及びRowe, Raymond C. Handbook of Pharmaceutical Excipients. Chicago, Pharmaceutical Press, 2005に詳細に記載されている。製剤にはまた、１以上の緩衝剤、安定化剤、界面活性剤、湿潤剤、滑沢剤、乳化剤、懸濁剤、保存料、抗酸化剤、不透明化剤（opaquing agents）、滑剤、加工助剤、着色料、甘味料、芳香剤、風味剤、希釈剤、およびその他の公知の添加剤を含有させて、美しい体裁（elegant presentation）の薬（すなわち、本発明の化合物またはその医薬組成物）を提供するか、または医薬製品（すなわち医薬）の製造の助けにすることができる。
【００３３】
実施例
非放射性の参照化合物（４、２０、２１）は、国際公開公報第2012076430号に記載されているように調製した。
略語のリスト：Ａ＝非減衰補正活性；ＤＣＭ＝ジクロロメタン；ＤＩ−ＰＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン；ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド；ＥＯＢ＝照射の終了；ＥＯＳ＝合成の終了；ＥｔＯＡｃ＝酢酸エチル；ＥｔＯＨ＝エタノール；ＨＡＴＵ＝（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスファート）；Ｈｅｐｔ＝ヘプタン；ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー；ＬＣ−ＭＳ＝液体クロマトグラフィー／質量分析；ＭｅＣＮ＝アセトニトリル；Ｋ２．２．２＝４，７，１３，１６，２１，２４−ヘキサオキサ−１，１０−ジアザビシクロ［８．８．８］−ヘキサコサン；ＮＭＰ＝Ｎ−メチルピロリドン；ＱＭＡ＝第四級メチル化アンモニウム；Ｒ１＝リアクター１；Ｒ２＝リアクター２；ＲＢＦ＝丸底フラスコ；Ｒｆ＝移動距離比（frontal ratio）；ＲＣＰ＝放射化学的純度；Ｒｔ＝保持時間；ＲＴ＝室温；ＳＡ＝特異的放射活性；ＳＰＥ＝固相抽出；ＴＥＡ：トリエチルアミン；ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸；ＴＨＦ：テトラヒドロフラン；ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー；Ｔｏｌ＝トルエン。
【００３４】
実施例１
［１８Ｆ］−２−メチル−２Ｈ−ピラゾール−３，４−ジカルボン酸４−［（２−フルオロ−エチル）−メチル−アミド］３−［（２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イル）−アミド］（［１８Ｆ］−４）
【００３５】
［１８Ｆ］放射フッ素化についての一般的考察
水を必要とする全ての操作においては、ＨＰＬＣ品質の水を使用した。溶媒及び試薬は、それぞれＨＰＬＣ及び高純度グレードのものをSigma Aldrich Singaporeから購入した。すべての放射化学的操作においては、Synthra RN plus合成モジュール（Synthra GmbH）を用いた。［１８Ｏ］高度含有水（enriched [18O]-water）（９８％、２．５mL）中の［１８Ｆ］−フルオリド溶液は、GE HealthcareのPETtrace サイクロトロンにより製造した。ＱＭＡカートリッジ（Waters）に活性を負荷した後、水（０．３mL）にＭｅＣＮ（０．７mL）、Ｋ２．２．２（１２〜１５mg）、及びＫ２ＣＯ３（４mg）を含む溶液でカートリッジを洗浄することによって、フッ素−１８を５mLガラス状炭素リアクター１（Ｒ１）に移した。ＳＰＥ処方については、Emporeカートリッジ標準密度（Empore cartridge standard density）（６mL）を用いた。活性化のため、カートリッジをＥｔＯＨ（５mL）及び水（１０mL）で連続して洗浄した。粗生成物の精製前に、セミ分取ＨＰＬＣカラムを、所与の溶離液（総容量２００mL）で平衡化した。
【００３６】
フロー−ＲＡＭ１”ＮａＩ／ＰＭＴラジオデテクター（LabLogic）に合わせて、Perkin Elmer HPLCシリーズ200又はAgilent 1260シリーズを用いて品質管理を行った。各バッチの放射ＨＰＬＣ品質管理のために、セキュリティ対策カートリッジに合わせたPhenomenex column Luna C18(2) 3μm １００Å １５０×４．６mmを用いた。放射ＴＬＣは、アルゴン／メタンガス（９０／１０）を装備したBioscan AR-2000により行った。
【００３７】
実施例１．１
【化４】
2016513083.tif 000006
【００３８】
３−メチル−［１，２，３］オキサチアゾリジン  ２，２−ジオキシド（２）
［１，２，３］オキサチアゾリジン  ２，２−ジオキシド（１，６０mg、４８７μM、１．０当量；CAS Nr. 19044-42-9；European Journal of Medicinal Chemistry 2007, 42, 1176-1183）を、Ｔｏｌ（１．２ml）及びＭｅＯＨ（０．６ml）と合わせて、無色の溶液を与えた。０℃に冷却後、（ジアゾメチル）トリメチルシラン（ヘキサン中２M 溶液、６０９μl、１．２２mmol、２．５当量）を滴下により加え、黄色の反応混合物を０℃で３０分間撹拌した。次いでＲＴで一夜撹拌を続けた。溶媒を蒸発させ、Ｈ２Ｏを加え、生成物をＥｔＯＡｃで抽出した。粗生成物を黄色の油状物として得（５３mg、６４％）、次の工程でそのまま使用した。MS: m/z = 138.1 ([M+H]+)。
【００３９】
実施例１．２
【化５】
2016513083.tif 000007
【００４０】
［１８Ｆ］−２−メチル−２Ｈ−ピラゾール−３，４−ジカルボン酸４−［（２−フルオロ−エチル）−メチル−アミド］３−［（２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イル）−アミド］（［１８Ｆ］−４）
真空下、共沸蒸留により、［１８Ｆ］−ＫＦ／Ｋ２．２．２複合体（５２．７GBq）を乾燥した。ＭｅＣＮ（１mL）により２回目の蒸留を行って、［１８Ｆ］−ＫＦ／Ｋ２．２．２複合体の完全乾燥を確実に行った。次いで、無水ＭｅＣＮ（１mL）中に３−メチル−［１，２，３］オキサチアゾリジン  ２，２−ジオキシド（２）（４．２mg、３０．６μmol）を含む溶液を、反応性［１８Ｆ］フルオリドに加えた。得られた溶液を１１０℃で１０分間加熱し、次いで６０℃まで冷却した。真空下、窒素流下、ＭｅＣＮを６０℃で４分間、次いで９８℃で３分間、最大真空値が達成されるまで蒸発させた（窒素流なしで５mBar、Ａ＝４０．２GBq、収率ＥＯＢ＝９５％）。Ｒ１へＴＦＡ（５００μL）を加えた後、得られた溶液を１１０℃で１０分間加熱した。溶媒を真空下、窒素流下、最大真空値が得られるまで１００℃で蒸発させた（窒素流なしで５mBar、１０分間）。２５℃に冷却後、ＴＨＦ（１mL）にＤＩＰＥＡ（０．２mL）を含む溶液をＲ１に加え（密閉）、得られた溶液を２５℃で３分間撹拌し、あらかじめ１−メチル−５−（２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イルカルバモイル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニルクロリド（５）（CAS Nr. 1380331-83-8；国際公開公報第2012076430号）（３．２mg、８．３mol）を前負荷しておいたＲ２に移した（Ａ＝１２．７GBq、収率ＥＯＢ＝３８％）。溶液を８７℃で１０分間加熱し、次いで６０℃まで冷却した後に、窒素流下でフラッシュした。粗混合物を真空下で５分間濃縮し、ＨＰＬＣ溶離液で希釈した（１．８mL；溶離液Ａ：ＭｅＣＮ／ＡＭＦ緩衝液、１００mM、ｐＨ＝４．０、７０／３０；溶離液Ｂ：ＭｅＣＮ／ＡＭＦ緩衝液、１００mM、ｐＨ＝４．０、３０／７０）。得られた溶液をＲＴで３分間撹拌した（Ａ＝５．７GBq、収率ＥＯＢ＝２２％）。粗混合物を、セミ分取カラムに充填し、グラジエント溶離により精製した（６．５mL／分：０〜１２分  Ａ／Ｂ  ２５／７５、次いで１２〜２５分  Ａ／Ｂ  ３０／７０；カラム：Phenomex Luna C18(2) １００Å  ５μm  ２５０×１０mm；注入量：２mL；ＵＶ−検出波長＝２５４nm）。放射活性ピークを、水（４５mL）を含む丸底フラスコに回収した（Ｒｔ＝１４．５８分、ｖ＝４．３mL）。放射活性化合物を、固相抽出により２mL／分で抽出した。水（１０mL）で洗浄後、ＥｔＯＨ（０．５mL）及び食塩水（３mL）を連続して用いて、生成物をカートリッジから洗い落とした。これらの画分を、食塩水（２mL）を含む滅菌バイアル中で合わせた（Ａ＝５６０MBq、収率ＥＯＢ＝３．４％、ＳＡ  ＥＯＳ＝３２７MBq／μg、合成時間＝１８３分）。放射ＴＬＣ（radio-TLC）（Ｒｆ＝０．４５  Ｈｅｐｔ／ＥｔＯＡｃ  ３／２３、１００％）及び分析用放射ＨＰＬＣ（analytical radio-HPLC）（Ｒｔ＝１１．１５分、ＲＣＰ＝１００％；ＨＰＬＣシステム：Agilent 1260 シリーズ；溶離剤Ａ：ＭｅＣＮ／水  ７０／３０  ＰＩＣ（登録商標）Ｂ７；溶離剤Ｂ：ＭｅＣＮ／水  ３０／７０  ＰＩＣ（登録商標）Ｂ７；溶離方法：０．６３mL／分  Ａ／Ｂ  ３０／７０でアイソクラチック；カラム：Phenomex Luna C18(2)  １００Å  ３μｍ  １５０×４．６mm；注入量：２０μL；ＵＶ−検出波長＝２５４nm）により放射活性量を品質管理した。トレーサーの同一性は、参��化合物としての非放射性２−メチル−２Ｈ−ピラゾール−３，４−ジカルボン酸４−［（２−フルオロ−エチル）−メチル−アミド］３−［（２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イル）−アミド］（４）でスパイクすることにより確認した（ＵＶ−トレース：Ｒｔ＝１１．１２分、［１８Ｆ］−トレース：Ｒｔ＝１１．１５分）。
【００４１】
【化６】
2016513083.tif 000008
【００４２】
実施例２
［１１Ｃ］−２−メチル−２Ｈ−ピラゾール−３，４−ジカルボン酸４−［（２−フルオロ−エチル）−メチル−アミド］３−［（２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イル）−アミド］
【００４３】
中間体８の調製
【化７】
2016513083.tif 000009
【００４４】
２−［１−ジメチルアミノ−メタ−（Ｚ）−イリデン］−３−オキソ−コハク酸ジエチルエステル（８）
ＤＣＭ（５０ml）にエチル  クロロ−オキソ−酢酸エチルエステル（６）（１０．０  ｇ、７３．３mmol）を含む溶液に、０℃で、ＤＣＭ（６０ml）に３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）アクリル酸エチル（７）（１０．４ｇ、７３．３mmol）及びピリジンを含む溶液を滴下により加えた。反応混合物を２５℃で２０時間撹拌した。混合物を、ＤＣＭ（２００ml）で希釈し、水で洗浄した（２×２００ml）。水層をＤＣＭ（２×２００ml）で再抽出した。合わせた有機層をブライン（７５ml）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、真空中で溶媒を蒸発させて、２−［１−ジメチルアミノ−メタ−（Ｚ）−イリデン］−３−オキソ−コハク酸ジエチルエステル（８）（１５．０ｇ；粗生成物、８４％）を黄色の固体として与えた。LC-MS: 244.2 ([M+H]+)。
【００４５】
中間体９の調製
【化８】
2016513083.tif 000010
【００４６】
２−ベンジル−２Ｈ−ピラゾール−３，４−ジカルボン酸ジエチルエステル（９）
ＥｔＯＨ（５０ml）に２−［１−ジメチルアミノ−メタ−（Ｚ）−イリデン］−３−オキソ−コハク酸ジエチルエステル（８）（５．００ｇ；２０．６mmol；粗生成物）を含む溶液に、２５℃で、フェニルヒドラジン塩酸塩（６．０２ｇ、３０．９mmol）、次いで触媒量のＨＣｌ水溶液（０．２ml）を加え、２５℃で１２時間撹拌を続けた。溶媒を真空中で除去した。得られた粗残渣を水（５０ml）に溶解し、水層をＥｔＯＡｃ（２×５０ml）で抽出した。合わせた有機層をブライン（５０ml）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、真空中で濃縮した。このようにして得られた粗物質を、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（３０％ＥｔＯＡＣ／ヘキサン）で精製して、２−ベンジル−２Ｈ−ピラゾール−３，４−ジカルボン酸ジエチルエステル（９）（３．５ｇ、５２％）を黄色がかった液体として与えた。LC-MS: 303.1 ([M+H]+)。
【００４７】
中間体１０の調製
【化９】
2016513083.tif 000011
【００４８】
２−ベンジル−２Ｈ−ピラゾール−３，４−ジカルボン酸４−エチルエステル（１０）
ＴＨＦ（１５ｍｌ）、ＭｅＯＨ（７ｍｌ）、及び水（７ｍｌ）の混合物に２−ベンジル−２Ｈ−ピラゾール−３，４−ジカルボン酸ジエチルエステル（９）（１．５０ｇ、５．００mmol）を含む溶液に、水酸化リチウム一水和物（２０８mg、５．００mmol）を０℃で加えた。反応混合物を２５℃で１時間撹拌した。溶媒を真空中で除去した。得られた粗物質を水（１５ml）で希釈した。水層をＥｔＯＡｃ（２×１０ml）で洗浄し、０℃に冷却し、１N ＨＣｌ水溶液で酸性化した（ｐＨ５）。得られた沈澱固体をろ過し、真空下で乾燥して、２−ベンジル−２Ｈ−ピラゾール−３，４−ジカルボン酸４−エチルエステル（１０）を白色固体（０．７ｇ、５１％）として与えた。LC-MS: 275.1 ([M+H]+)。
【００４９】
【化１０】
2016513083.tif 000012
【００５０】
実施例２．１
【化１１】
2016513083.tif 000013
【００５１】
１−ベンジル−５−（２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イルカルバモイル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸エチルエステル（１２）
塩化オキサリル（１０ml）に２−ベンジル−２Ｈ−ピラゾール−３，４−ジカルボン酸４−エチルエステル（中間体１０）（０．５０ｇ、１．８０mmol）を含む溶液を、５０℃で２時間加熱した。真空中で揮発分を慎重に除去した。次いで、粗製の酸塩化物にピリジン（１５ml）を０℃で滴下により加え、次いで２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イルアミン（１１、CAS Nr. 1380331-14-5、国際公開公報第2012076430号）（４５０mg、１．８０mmol）を加えた。得られた反応混合物を２５℃で１０分間撹拌した。混合物を氷冷水に注いだ。このようにして得られた固体をろ過し、水及びヘキサンで連続して洗浄し、最後にＴｏｌと共沸することにより乾燥して、１−ベンジル−５−（２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イルカルバモイル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸エチルエステル（１２）（０．４５ｇ、５３％）を灰白色の固体として生成した。LC-MS: 467.0 ([M+H]+)。
【００５２】
実施例２．２
【化１２】
2016513083.tif 000014
【００５３】
１−ベンジル−５−（２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イルカルバモイル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸（１３）
ＴＨＦ（２５ml）に１−ベンジル−５−（２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イルカルバモイル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸  エチルエステル（１２）（０．５０ｇ、１．０７mmol）を含む溶液に、０℃で、水酸化リチウム一水和物の水溶液（１M；１．３４mｌ、１．３４mmol）を加えた。次いで反応混合物を２５℃で２時間撹拌した。混合物を、１N ＨＣｌ水溶液で酸性化した。得られた沈澱をろ過し、水、次いでヘキサンで洗浄し、最後にＴｏｌと共沸することにより乾燥して、１−ベンジル−５−（２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イルカルバモイル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸（１３）（０．２５ｇ、５３％）を灰白色の固体として与えた。LC-MS: 439.1 ([M+H]+)。
【００５４】
実施例２．３
【化１３】
2016513083.tif 000015
【００５５】
２−ベンジル−２Ｈ−ピラゾール−３，４−ジカルボン酸４−［（２−フルオロ−エチル）−メチル−アミド］３−［（２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イル）−アミド］（１４）
ＤＭＦ（５ml）に１−ベンジル−５−（２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イルカルバモイル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボン酸（１３）（０．３０ｇ、０．６８４mmol）を含む溶液に、ＨＡＴＵ（０．５４ｇ、１．４４mmol）、（２−フルオロ−エチル）−メチル−アミン塩酸塩（０．３０９ｇ、２．７４mmol）及びＤＩＰＥＡ（０．４８ml、２．７４mmol）を０℃で加えた。得られた反応混合物を２５℃で１６時間撹拌した。混合物を水（１０ml）で希釈し、１５分間撹拌した。得られた沈澱固体をろ過し、水で完全に洗浄し、Ｔｏｌと共沸することにより乾燥し、次いで真空下で更に乾燥することにより２−ベンジル−２Ｈ−ピラゾール−３，４−ジカルボン酸４−［（２−フルオロ−エチル）−メチル−アミド］３−［（２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イル）−アミド］（１４）（２００mg、６９％）を灰白色の固体として生成した。LC-MS: 498.0 ([M+H]+)。
【００５６】
実施例２．４
【化１４】
2016513083.tif 000016
【００５７】
２Ｈ−ピラゾール−３，４−ジカルボン酸４−［（２−フルオロ−エチル）−メチル−アミド］３−［（２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イル）−アミド］（１５）
無水ＤＣＭ（１００ml）に２−ベンジル−２Ｈ−ピラゾール−３，４−ジカルボン酸４−［（２−フルオロ−エチル）−メチル−アミド］３−［（２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イル）−アミド］（１４）（１．６ｇ、３．２mmol）を含む溶液に、窒素下、三臭化ホウ素（ＤＣＭ中１M 溶液、６．４ml、６．４mmol）を０℃で加えた。混合物を０℃で０．５時間、撹拌した。反応混合物を、１N ＮａＯＨ水溶液で中和した。真空下、溶媒を除去した。このようにして得られた粗物質を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、２Ｈ−ピラゾール−３，４−ジカルボン酸４−［（２−フルオロ−エチル）−メチル−アミド］３−［（２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イル）−アミド］（１５）（５００mg、３８％）を灰白色の固体として与えた。LC-MS: 408.1 ([M+H]+)。
【００５８】
実施例２．５
【化１５】
2016513083.tif 000017
【００５９】
［１１Ｃ］−２−メチル−２Ｈ−ピラゾール−３，４−ジカルボン酸４−［（２−フルオロ−エチル）−メチル−アミド］３−［（２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イル）−アミド］（［１１Ｃ］−４）
１mLのＶ−バイアルに２Ｈ−ピラゾール−３，４−ジカルボン酸４−［（２−フルオロ−エチル）−メチル−アミド］３−［（２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イル）−アミド］（１５）（４mg）を加えた。前駆体を、ジメチルホルムアミド０．１mLに溶解した。別の１mLのバイアルで、１，４，７，１０，１３，１６−ヘキサオキサシクロオクタデカン（０．５６mg）をジメチルホルムアミド０．１mLに溶解し、その後、テトラヒドロフラン中の１M カリウムtert−ブトキシド ９．５μLを加えた。２つのバイアルの内容物を完全に混合し、最終バイアルに隔壁シールのキャップをしてから、［１１Ｃ］ヨウ化メチルを加えた。［１１Ｃ］二酸化炭素から製造され、ヘリウム流に担持された［１１Ｃ］ヨウ化メチルを、上記の溶液に捕捉した。放射活性がプラトーになったのち、反応バイアルを室温で２分間置き、次いで３０％アセトニトリル／７０％水性緩衝液（ｏ−リン酸によりｐＨ３．２に調整された５７mM ＴＥＡ）からなる分取ＨＰＬＣ移動相０．２mLでクエンチした。粗反応生成物を、逆相ＨＰＬＣ（Waters XBridge C18 １０×１５０mm、１０μ）により、２５４nmで１５mL／分、精製した。前駆体（Ｒｔ＝２．２分）から分離した放射生成物（Ｒｔ＝７．７分）を、水５０mLのリザーバーに、間接的に回収した。水のリザーバー中の生成物画分を、C18 Sep-Pakに充填した。次いで、C18 Sep-Pakを、０．９％塩化ナトリウム注射用液 １０mLで洗い流した。最終生成物を、滅菌され、発熱物質を含まないバイアル中、滅菌０．２２μフィルターを介して、エタノール １mL、次いで０．９％塩化ナトリウム注射用液 １４mLで、C18 Sep-Pakから溶離した。
【００６０】
［１１Ｃ］−２−メチル−２Ｈ−ピラゾール−３，４−ジカルボン酸４−［（２−フルオロ−エチル）−メチル−アミド］３−［（２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イル）−アミド］（［１１Ｃ］−４）についての平均非減衰補正放射化学的収率は、約１０％であった。一定部分（０．１mL）について放射活性を評価し、分析用ＨＰＬＣ（３５％アセトニトリル／６５％水性緩衝液（ｏ−リン酸によりｐＨ３．２に調整された５７mM ＴＥＡ）；Waters XBridge C18 １０×１５０mm、１０μ）により、２５４nmで２mL／分、チェックした。２−メチル−２Ｈ−ピラゾール−３，４−ジカルボン酸４−［（２−フルオロ−エチル）−メチル−アミド］３−［（２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イル）−アミド（４）に対応する単一の放射活性ピーク（Ｒｔ＝４．５分）が観察された。放射活性を、担体のＵＶ吸収ピークと関連する質量と関連させることにより決定した合成終了時における特異的放射活性は、合成終了時で９０００mCi／μmole以上であった。
【００６１】
【化１６】
2016513083.tif 000018
【００６２】
実施例３
［３Ｈ］−２−メチル−２Ｈ−ピラゾール−３，４−ジカルボン酸４−［（２−フルオロ−エチル）−メチル−アミド］３−［（２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イル）−アミド］
【００６３】
実施例３．１
【化１７】
2016513083.tif 000019
【００６４】
［３Ｈ］−２−メチル−２Ｈ−ピラゾール−３，４−ジカルボン酸４−［（２−ヒドロキシ−エチル）−メチル−アミド］３−［（２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イル）−アミド（［３Ｈ］−１７）
ＴＨＦ １mlに｛メチル−［１−メチル−５−（２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イルカルバモイル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニル］−アミノ｝−酢酸メチルエステル（１６）（CAS Nr. 1380330-71-1；国際公開公報第2012076430号）（２２mg、４９μmol）を含む溶液を、ＴＨＦ／ヘプタン（２：１）１５０μlにリチウムボロトリチド ５０μmolを含む溶液へ０℃で加える。室温で３時間撹拌後、反応混合物をアセトン ０．２mlでクエンチしてから、ＴＨＦ ０．４mlにＴＦＡ ２０μlを含む溶液を加える。減圧下で溶媒を除去し、得られる残渣を、ＴＨＦ １０mlに溶解し、溶液に、短いシリカSep-Pakカートリッジを通過させる。溶媒の蒸発後、得られる粗生成物を、ＨＰＬＣ（Nuleodur C18 Gravity、アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ／水中０．１％ＴＦＡ  １０：９０〜４６：５４で９分間、次いで９５％アセトニトリルで３分間溶離）で精製する。生成物の画分を回収し、次いで重炭酸水溶液を加えて中和する。純粋な化合物を、固相抽出により単離する（StrataX）。カートリッジを水で洗浄後、生成物をエタノールで溶離して、［３Ｈ］−２−メチル−２Ｈ−ピラゾール−３，４−ジカルボン酸４−［（２−ヒドロキシ−エチル）−メチル−アミド］３−［（２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イル）−アミド］ ３２５mCiを放射活性純度９７％で生成する。
【００６５】
実施例３．２
【化１８】
2016513083.tif 000020
【００６６】
［３Ｈ］−２−メチル−２Ｈ−ピラゾール−３，４−ジカルボン酸４−［（２−フルオロ−エチル）−メチル−アミド］３−［（２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イル）−アミド（［３Ｈ］−４）
ＤＭＦ １００μlに［３Ｈ］−２−メチル−２Ｈ−ピラゾール−３，４−ジカルボン酸４−［（２−ヒドロキシ−エチル）−メチル−アミド］３−［（２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イル）−アミド］（［３Ｈ］−１７）９８mCiを含む溶液に、ヒューニッヒ塩基 １６μl（９２μmol）、トリエチルアミントリヒドロフルオリド ５μl（３１μmol）、及びペルフルオロブタンスルホニルフルオリド ８．４μl（２７μmol）を加える。反応混合物を室温で６７時間撹拌する。水 ２．５mlで希釈後、粗生成物を、固相抽出（StrataX、エタノール）により予備精製する。ＨＰＬＣ（Nuleodur C18 Gravity、アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ／水中０．１％ＴＦＡ  ４０：６０〜４９：５１、６分）による最終精製後、生成物の画分を回収し、次いで重炭酸水溶液を加えることによって中和する。純粋な化合物を、固相抽出（StrataX）により単離する。カートリッジを水で洗浄後、生成物をエタノールで溶離して、［３Ｈ］−２−メチル−２Ｈ−ピラゾール−３，４−ジカルボン酸４−［（２−フルオロ−エチル）−メチル−アミド］３−［（２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イル）−アミド］（［３Ｈ］−４）２１mCiを、放射化学的純度＞９７％、特異的活性４７Ci／mmolで与える。
【００６７】
【化１９】
2016513083.tif 000021
【００６８】
実施例４
［１８Ｆ］−２−メチル−４−（モルホリン−４−カルボニル）−２Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸｛２−［３−（２−フルオロ−エトキシ）−フェニル］−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イル｝−アミド（［１８Ｆ］−２０）
【００６９】
実施例４．１
【化２０】
2016513083.tif 000022
【００７０】
トルエン−４−スルホン酸２−［３−（７−｛［２−メチル−４−（モルホリン−４−カルボニル）−２Ｈ−ピラゾール−３−カルボニル］−アミノ｝−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−２−イル）−フェノキシ］−エチルエステル（１９）
出発物質である２−メチル−４−（モルホリン−４−カルボニル）−２Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸［２−（３−ヒドロキシ−フェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イル］−アミド（１８）（CAS Nr. 1380330-59-5；国際公開公報第2012076430号）（１００mg、２２３μmol）をＮＭＰ（２．０ml）と合わせて、淡黄色の溶液を与えた。エタン−１，２−ジイル  ビス（４−メチルベンゼンスルホナート）（１６６mg、４４７μmol）及び炭酸セシウム（７３mg、２２３μmol）を加え、反応混合物を６０℃で一夜撹拌した。ＥｔＯＡｃ及びＨ２Ｏを加えた。有機層を回収し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。ろ過、及び溶媒の蒸発の後、粗化合物を、フラッシュクロマトグラフィー（１０ｇ  ＳｉＯ２  カートリッジ、ＣＨ２Ｃｌ２〜ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ３水溶液  ３００：１０：１）で精製した。ＨＰＬＣによる最終精製により、表題化合物（３８mg、２６％）を灰白色の泡状物として生成した。LC-MS: 646.2 ([M+H]+)。
【００７１】
実施例４．２
【化２１】
2016513083.tif 000023
【００７２】
［１８Ｆ］−２−メチル−４−（モルホリン−４−カルボニル）−２Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸｛２−［３−（２−フルオロ−エトキシ）−フェニル］−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イル｝−アミド（［１８Ｆ］−２０）
［１８Ｆ］−ＫＦ／Ｋ２．２．２複合体（２６．０GBq）を、真空下、共沸蒸留により乾燥した。ＭｅＣＮ（１mL）により２回目の蒸留を行って、［１８Ｆ］−ＫＦ／Ｋ２．２．２複合体の完全乾燥を確実に行った。次いで、無水ＤＭＳＯ（０．８ml）にトルエン−４−スルホン酸２−［３−（７−｛［２−メチル−４−（モルホリン−４−カルボニル）−２Ｈ−ピラゾール−３−カルボニル］−アミノ｝−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−２−イル）−フェノキシ］−エチルエステル（１９）（５．８mg、８．９８μmol）を含む溶液を、反応性［１８Ｆ］−フルオリドに加えた。得られた溶液を１２０℃で３０分間加熱し、次いで４０℃に冷却した。粗混合物をＨＰＬＣ溶離液（４mL；溶離液Ａ：ＴＦＡ０．０２％を含むＨ２Ｏ；溶離液Ｂ：ＴＦＡ０．０２％を含むＭｅＣＮ）で希釈し、ＲＴで３分間撹拌した。粗混合物を、精製用セミ分取ＨＰＬＣカラムに充填した（５mL／分でグラジエント溶離：０〜２０分  Ａ／Ｂ  ４０／６０、次いでＡ／Ｂ  ７０／３０；カラム：Nucleodur C18 Pyramid １１０Å  ７μm  ２５０×１０mm；注入量：５mL；ＵＶ検出波長＝２５４nm）。放射活性ピーク（Ｒｔ＝１８．３５分、ｖ＝１１mL）を、水（５０mL）を含む丸底フラスコに回収した。放射活性化合物を、５mL／分で固相抽出により抽出した。水（１０mL）で洗浄後、ＥｔＯＨ（１mL）及び食塩水（７mL）を連続して用いて、カートリッジから生成物を溶離させた。これらの画分を、食塩水（３mL）を含む滅菌バイアルに合わせた（Ａ＝２．３２GBq、収率ＥＯＢ＝１８％、ＳＡ  ＥＯＳ＝１０１MBq／μg、合成時間＝１０７分）。放射ＴＬＣ（radio-TLC）（Ｒｆ＝０．２５  Ｈｅｐｔ／ＥｔＯＡｃ  １５／８５）及び分析用放射ＴＬＣ（analytical radio-HPLC）（Ｒｔ＝４．１８分、ＲＣＰ＝９９．８％；ＨＰＬＣシステム：Perkin Elmer HPLC series 200；溶離剤Ａ：ＴＦＡ０．０２％を含むＨ２Ｏ；溶離剤Ｂ：ＴＦＡ０．０２％を含むＭｅＣＮ；溶離方法：１．５mL／分  Ａ／Ｂ  ４０／６０でアイソクラチック；カラム：Thermo Scientific Hypersil Gold C18 １７５Å  ３μm  １５０×４．６mm；注入量：２０μL；ＵＶ−検出波長＝２５４nm）により放射活性量を品質管理した。トレーサーの同一性は、参照化合物としての非放射性２−メチル−４−（モルホリン−４−カルボニル）−２Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸｛２−［３−（２−フルオロ−エトキシ）−フェニル］−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イル｝−アミドでスパイクすることにより確認した（ＵＶ−トレース：Ｒｔ＝４．０３分、［１８Ｆ］−トレース：Ｒｔ＝４．１４分）。
【００７３】
【化２２】
2016513083.tif 000024
【００７４】
実施例５
【化２３】
2016513083.tif 000025
【００７５】
［１１Ｃ］−２−メチル−４−（モルホリン−４−カルボニル）−２Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸［２−（３−メトキシ−フェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イル］−アミド（［１１Ｃ］−２１）
１mlのＶ−バイアルに、前駆体である２−メチル−４−（モルホリン−４−カルボニル）−２Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸［２−（３−ヒドロキシ−フェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イル］−アミド（１８）（CAS Nr. 1380330-59-5；国際公開公報第2012076430号）を加えた。前駆体をジメチルスルホキシド ０．２mLに溶解した。５N 水酸化ナトリウム ３μlを加え、バイアルに、隔壁シールのキャップをしてから、［１１Ｃ］ヨウ化メチルを加えた。［１１Ｃ］二酸化炭素から製造され、ヘリウム流に担持された［１１Ｃ］ヨウ化メチルを、上記の溶液に捕捉した。放射活性がプラトーになった後、反応バイアルを８０℃の水浴中、３分間加熱し、次いで３０％アセトニトリル／７０％水性緩衝液（ｏ−リン酸によりｐＨ３．２に調整された５７mM ＴＥＡ）からなる分取ＨＰＬＣ移動相０．２mLでクエンチした。粗反応生成物を、逆相ＨＰＬＣ（Waters XBridge C18 １０×１５０mm、１０μ）により、１０mL／分、２５４nmで精製した。前駆体（Ｒｔ＝３．２分）から分離した放射生成物（Ｒｔ＝９．５分）を、水５０mLのリザーバーに、間接的に回収した。水のリザーバー中の生成物画分を、C18 Sep-Pakに充填した。次いで、C18 Sep-Pakを、０．９％塩化ナトリウム注射用液 １０mLで洗い流した。生成物［１１Ｃ］−２１を、滅菌され、発熱物質を含まないバイアル中、滅菌０．２２μフィルターを介して、エタノール１mL、次いで０．９％塩化ナトリウム注射用液 １４mLで、C18 Sep-Pakから溶離した。
【００７６】
［１１Ｃ］−２１についての平均非減衰補正放射化学的収率は、約２５％であった。一定部分（０．１mL）について放射活性を評価し、分析用ＨＰＬＣ（４０％アセトニトリル／６０％水性緩衝液（ｏ−リン酸によりｐＨ３．２に調整された５７mM ＴＥＡ；Waters XBridge C18 １０×１５０mm、１０μ）により、２５４nmで２mL／分、チェックした。［１１Ｃ］−２−メチル−４−（モルホリン−４−カルボニル）−２Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸［２−（３−メトキシ−フェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イル］−アミド（［１１Ｃ］−２１）に対応する単一の放射活性ピーク（Ｒｔ＝２．３分）が観察された。放射活性を、担体のＵＶ吸収ピークと関連する質量と関連させることにより決定した合成終了時における特異的放射活性は、合成終了時で７５００mCi／μmole以上であった。
【００７７】
【化２４】
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【００７８】
実施例６
【化２５】
2016513083.tif 000027
【００７９】
［３Ｈ］−２−メチル−４−（モルホリン−４−カルボニル）−２Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸［２−（３−メトキシ−フェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−７−イル］−アミド（［３Ｈ］−２１）
ＤＭＦ ３００μlにフェノール前駆体（１８）０．６７mg（１．５μmol）を含む溶液を、ＤＭＦ ２００μlに［３Ｈ］−ノシル酸メチル（４−ニトロベンゼンスルホン酸メチル−［メチル−３Ｈ］） ５０mCi（０．６９μmol）を含む溶液に加え、次いで炭酸セシウム ０．７mg（３．６μmol）を加える。室温で３時間撹拌後、反応混合物を塩化アンモニウム水溶液で希釈し、tert−ブチルメチルエーテルで抽出する。有機層分離及び蒸発後、得られた粗生成物を、ＨＰＬＣ（XBridge C18、アセトニトリル／水  ２０：８０〜７０：３０、１５分間）で精製する。生成物画分を回収し、次に純粋な化合物を、固相抽出（Sep-Pak C18）により単離する。エタノールで溶離後、［３Ｈ］−２−メチル−４−（モルホリン−４−カルボニル）−２Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸［２−（３−メトキシ−フェニル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリジン−7−イル］−アミド（［３Ｈ］−２１） ５mCiを、放射化学的純度＞９９．４％、特異的活性７６Ci／mmolで得る。
【００８０】
【化２６】
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【００８１】
薬理学的試験
本発明の化合物の活性を決定するために、以下の試験を行った。本発明の化合物のＰＤＥ１０Ａ活性は、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）に基づく、先に記載された方法（Fawcett, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97(7), 3702-3707）に類似する方法を用いて決定した。
【００８２】
ヒトＰＤＥ１０Ａ全長アッセイは、９６ウエルのマイクロタイタープレート中で行った。反応混合物５０μlには、２０mMＨＥＰＥＳ  ｐＨ＝７．５／１０mM ＭｇＣｌ２／０．０５mg／ml ＢＳＡ（Sigma cat. # A-7906）、５０nM ｃＧＭＰ（Sigma, cat. # G6129）、５０nM ［３Ｈ］−ｃＧＭＰ（GE Healthcare, cat. # TRK392 S.A. １３．２Ci/mmol）、及び３．７５ng／ウエル  ＰＤＥ１０Ａ酵素（Enzo Life Science, Lausen, Switzerland cat # SE-534）を含有させ、特定の試験化合物を含有させ、又は含有させなかった。効果の５０％の阻害をもたらす阻害物質の濃度（例えば、ＰＤＥ１０Ａ活性を５０％阻害する競合物質の濃度であるＩＣ５０）を算出するためのデータを得るために、さまざまな濃度の阻害候補物質を用いた。非特異的活性は、酵素を使用しないで試験した。反応は、基質溶液（ｃＧＭＰ及び［３Ｈ］−ｃＧＭＰ）を加えることによって開始させ、室温で２０分間進行させた。１８mM 硫酸亜鉛溶液（停止試薬）中のＹＳｉ−ＳＰＡシンチレーションビーズ（GE Healthcare, cat. # RPNQ0150）２５μlを加えることによって、反応を停止させた。振とう下、１時間後にプレートを１７０ｇで１分間遠心分離して、ビーズを静止させた。その後、Perkin Elmer TopCount Scintillation プレートリーダー上で、放射活性数を測定した。
【００８３】
式（Ｉ）の化合物は、１０μM未満、より具体的には５μM未満、更により具体的には１μM未満のＩＣ５０値を有する。以下の表には、トレーサーについてのデータを示す。
【００８４】
【表１】
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【００８５】
インビトロオートラジオグラフィー（図１及び２）
１）インビトロオートラジオグラフィー
トリチウム標識された放射性リガンドの結合部位の分布、更にはＰＤＥ１０Ａに対する結合特異性を、オスSprague-Dawley系ラットを用いて、インビトロオートラジオグラフィーにより検討した。動物を屠殺し、速やかに脳を取り出し、ドライアイス粉末中で凍結した。Cryostatミクロトーム中で、１０μmの厚さの矢状切片を切り出し、粘着スライドガラス上に解凍して載せた（thaw-mounted）。脳切片を最初に、ＲＴで、Ringer緩衝液（１２０mM ＮａＣｌ、５mM ＫＣｌ、２mM ＣａＣｌ２、１mM ＭｇＣｌ２、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４）中で１０分間、次に放射性リガンドを含むRinger緩衝液中で６０分間インキュベートした。放射性トレーサーの非特異的結合（ＮＳＢ）の評価のために、追加のシリーズの切片を、放射性トレーサー、及び参照高親和性ＰＤＥ１０Ａ阻害物質（ＭＰ−１０）を含むRinger緩衝液とインキュベートした。
【００８６】
インキュベーションの終了時に、切片を、氷冷Ringer緩衝液中３×５分すすぎ、次いで４℃で、蒸留水に速やかに１回浸漬した。スライドに載せた脳切片を冷空気流下で３時間乾燥し、［３Ｈ］−ミクロスケールと共に、Fujiイメージングプレートに５日間曝した。次いでイメージングプレートを、高解像度Fuji BAS リーダー中でスキャンした。対象の脳領域に結合した放射性トレーサーの総量（ＴＢ）を、ＭＣＩＤイメージ解析プログラムを用いて測定し、結合した放射性トレーサー／mg・タンパク質のfmolとして表した。ＰＤＥ１０Ａに特異的に結合した放射性リガンドの量（％ＳＢ）を、式：％ＳＢ＝１００−（ＮＳＢ／ＴＢ＊１００）により算出した。得られた結果は、特異的結合が、９５％を超えていることを示した（図１及び２を参照）。
【００８７】
カニクイザルにおけるＰＥＴイメージング実験（図３及び４）
フッ素１８により標識された放射性トレーサーの全用量を、イソフルラン麻酔下、最大１分間かけてi.v.注入する；投与後、カニューレを食塩水 ５mlで洗い流す。放射性トレーサーは、ＥｔＯＨ最大１０％を含む滅菌食塩水中で配合する。
【００８８】
動物として、平均体重７〜８kgのオスのカニクイザル（モーリシャス原産のMacaca fascicularis）を一夜、又はスキャニング前最低６時間絶食させる。動物の準備は、麻酔なしで行う。動物を座らせ、腕／脚を拘束する。放射性トレーサーの注射のため、そして液体の点滴のアクセスポイントとして、右及び左の橈側皮静脈に静脈カテーテルを挿入する。スキャニングの前に、動物にプロポフォル（３〜６mg／kg）により麻酔をかけ、ＰＥＴカメラベッドへ移し、そこで、ガス状の麻酔の投与のために気管内チューブを挿入する。サルを、スキャナー用カウチ上のＰＥＴ互換性の小児科用拘束具内に、仰向けに寝かせ、イソフルラン麻酔下（１〜２％）におく。呼吸速度及び呼吸終期の二酸化炭素濃度をモニターするために、気管内チューブをカプノグラフに接続する。動脈血酸素飽和パーセントを、パルスオキシメトリを介して連続的に観測する。無菌条件下で動脈血の採取のために、大腿動脈にカニューレを挿入する。動物を、ＣＴスカウトスキャンを用いたＰＥＴ用スキャナーの内腔に置く。正確な位置が確認されたら、透過スキャンを得る。
【００８９】
次いで動物に、放射性トレーサーを投与する。General Electric Discovery VCT全身用スキャナーを用いて、動的３次元（３Ｄ）ＰＥＴスキャンを行う；３５の同時スライス（simultaneous slice）の軸方向視野１５．７cm。動的放射データ（emission data）を、頭を視野の中央に配置した床位置（bed position）で１８０分間取得する。正確なスキャン時間を、放射性トレーサーの投与時間、及び血液採取時点と共に記録する。
【００９０】
各取得の間、全血及び血漿の投与関数（input function）の決定のために、大腿動脈から動脈血試料を採取する。１８Ｆを測定するために較正し、基準化した専用のＰＥＴガンマカウンター（Wizard2, Perkin Elmer）を用いて、全血及び血漿中の放射活性濃度を、放射性トレーサーの投与１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、６０秒、９０秒、２分、５分、１０分、２０分、４０分、６０分、９０分、１２０分、及び１８０分後に測定する。全血試料を秤量し、計数する。血漿試料を同様に処理する。
【００９１】
標準放射性トレーサーに対応する血漿中放射活性の画分を、投与２、５、１０、２０、４０、６０、９０、及び１２０分後に採取した動脈血漿試料の放射−ＨＰＬＣにより決定する。
【００９２】
ヒヒにおけるインビボＰＥＴイメージング（図５及び６）
オスのヒヒ（papio anubis）において、ＰＥＴ実験を行った。ＰＥＴ試験前の１２時間、動物を絶食させた。最初にヒヒを、抑制用量５〜７mg／kgの塩酸ケタミンの筋肉内投与により鎮静させて、表面レベル（superficial level）の麻酔を達成し、次いで、プロポフォール（DIPRIVAN（登録商標）Injectable Emulsion）の連続的静脈内注入を０．３〜０．４mg／kg／時間で維持した。等張食塩水の注入により、循環血液量を維持した。血液の採取のために、大腿動脈カテーテルを挿入した。心拍数、ＥＣＧ、血圧、及び酸素飽和度を含む生理学的バイタルサインを、試験をとおして連続的に監視した。動物を、ECAT HRRT（登録商標）脳ＰＥＴスキャナー（High Resolution Research Tomograph、CPS Innovations, Inc., Knoxville, TN）に配置した。固定を再現できるように頭部ホルダーに取り付けられた熱可塑性マスクに、動物の頭部を合わせた。減衰補正のため、Ｃｓ−１３７点源１mCiによる６分間の透過スキャンを最初に行った。［１１Ｃ］−放射性トレーサー（約２０mCi、又は１．５μg）を、１分間のボラス注射として静脈内投与した。放射性トレーサーの投与開始時に、ＰＥＴスキャニング及び動脈血採取を開始し、放射性トレーサーの投与後０〜１２０分、ＰＥＴ像を取得した。減衰、散乱、及び不動作時間を修正する反復性サブセット化による期待値最大化法（iterative ordered-subset expectation-maximization）（ＯＳＥＭ）アルゴリズムを用いて、放射ＰＥＴスキャン（emission PET scan）を再構築した。標準的ＶＯＩテンプレートを、各動物の基底ＰＥＴに移した。ＰＥＴイメージング試験の結果、放射性トレーサーは、速やかにヒヒ脳に浸透し、尾状核被殻などのＰＤＥ１０Ａ発現脳領域に特異的に蓄積することが示された。
【図１Ａ】
2016513083.tif 000032
【図１Ｂ】
2016513083.tif 000033
【図２Ａ】
2016513083.tif 000034
【図２Ｂ】
2016513083.tif 000035
【図３Ａ−３Ｃ】
2016513083.tif 000036
【図４Ａ−４Ｃ】
2016513083.tif 000037
【図５】
2016513083.tif 000038
【図６】
2016513083.tif 000039
【国際調査報告】
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2016513083.tif 000041
2016513083.tif 000042
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