(57)【要約】  本発明は、式Ｉの化合物またはその水和物を提供する。【化１】2016539099.tif 000036 【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式の化合物：
【化１】
2016539099.tif 000035
またはその水和物。
【請求項２】
水和物である、請求項１に記載の化合物の結晶形。
【請求項３】
以下の少なくとも１つによって特徴付けられる、請求項２に記載の化合物：
ａ．７．８°、８．０°および１０．７°（それぞれ±０．２°）からなる群から選択される１つ以上の強いピークと組み合わせて、５．２°の回折角２θにて強いピークを有する、ＣｕＫα放射線を使用した粉末Ｘ線回折パターン、ならびに
ｂ．アダマンタンの高磁場共鳴（δ＝２９．５ｐｐｍ）を基準として、１８１．８、１６１．２、１６０．０、１４７．６および１３７．４ｐｐｍ（それぞれ±０．２ｐｐｍ）におけるピークを含む１３Ｃ固体状態ＮＭＲスペクトル。
【請求項４】
室温での含水量が約９重量％〜約１２重量％の範囲である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
患者における糖尿病を治療する方法であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物の有効量を、そのような治療を必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項６】
患者における１型糖尿病を治療する方法であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物の有効量を、そのような治療を必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項７】
患者における２型糖尿病を治療する方法であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物の有効量を、そのような治療を必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項８】
療法に使用するための請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
糖尿病の治療に使用するための請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
前記糖尿病が１型糖尿病である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
前記糖尿病が２型糖尿病である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物と、１種以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本発明は、ピラゾール化合物の酢酸塩である新規ＳＧＬＴ１阻害剤、該化合物を含む医薬組成物、生理的傷害を治療するために該化合物を使用する方法、ならびに該化合物の合成に有用な中間体およびプロセスに関する。
【０００２】
本発明は、糖尿病ならびに高血糖に関連する他の疾患および傷害の治療の分野である。糖尿病は高血糖値によって特徴付けられる疾患のグループである。それは米国において約２５００万人の人々に影響を与え、また、２０１１  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｆａｃｔ  Ｓｈｅｅｔ（アメリカ合衆国保健福祉省、疾病管理予防センター）によれば、米国において７番目の主な死亡原因である。
【０００３】
ナトリウム結合グルコース共輸送体（ＳＧＬＴ）は、グルコースなどの炭水化物の吸収に関与していることが知られている輸送体の１つである。より具体的には、ＳＧＬＴ１は小腸の刷子縁膜を横切るグルコースの輸送に関与している。ＳＧＬＴ１の阻害は、小腸におけるグルコースの吸収の低下をもたらす場合があり、それにより糖尿病を治療するための有用な手法を提供する。
【０００４】
米国特許第７，６５５，６３２号明細書は、糖尿病などの高血糖に関連する疾患の予防または治療に有用としてさらに開示されているヒトＳＧＬＴ１阻害活性を有する特定のピラゾール誘導体を開示している。さらに、国際公開第２０１１／０３９３３８号は、骨粗鬆症などの骨疾患の治療に有用であるとさらに開示されているＳＧＬＴ１／ＳＧＬＴ２阻害剤活性を有する特定のピラゾール誘導体を開示している。
【０００５】
糖尿病のための代替の薬物および治療に対する必要性が存在している。本発明は、ＳＧＬＴ１阻害剤であるピラゾール化合物の酢酸塩を提供し、それ自体が糖尿病などの特定の傷害の治療に適切であり得る。
【０００６】
したがって、本発明は、式Ｉの化合物：
【化１】
2016539099.tif 000002
またはその水和物を提供する。
【０００７】
本発明はまた、水和物である式Ｉの化合物の結晶形を提供する。
【０００８】
さらに、本発明は、以下のうちの少なくとも１つによって特徴付けられる、水和物である式Ｉの化合物の結晶形を提供する：
ａ．７．８°、８．０°および１０．７°（それぞれ±０．２°）からなる群から選択される１つ以上の強いピークと組み合わせて、５．２°の回折角２θにて強いピークを有する、ＣｕＫα放射線を使用した粉末Ｘ線回折パターン、ならびに
ｂ．アダマンタンの高磁場共鳴（δ＝２９．５ｐｐｍ）を基準として、１８１．８、１６１．２、１６０．０、１４７．６および１３７．４ｐｐｍ（それぞれ±０．２ｐｐｍ）における強いピークを含む１３Ｃ固体状態ＮＭＲスペクトル。
【０００９】
本発明は、水和物であり、室温での含水量が約９重量％〜約１２重量％の範囲である、式Ｉの結晶形をさらに提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、患者における糖尿病を治療する方法であって、式Ｉの化合物またはその水和物の有効量を、そのような治療を必要とする患者に投与することを含む、方法を提供する。本発明は、患者における１型糖尿病を治療する方法であって、式Ｉの化合物またはその水和物の有効量を、そのような治療を必要とする患者に投与することを含む、方法をさらに提供する。さらに、本発明は、患者における２型糖尿病を治療する方法であって、式Ｉの化合物またはその水和物の有効量を、そのような治療を必要とする患者に投与することを含む、方法を提供する。本発明はまた、式Ｉの化合物またはその水和物の有効量を、そのような治療を必要とする患者に投与することを含む、患者における耐糖能異常（ＩＧＴ）、空腹時血糖の異常（ＩＦＧ）またはメタボリックシンドロームを治療する方法を提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、療法、特に糖尿病の治療に使用するための式Ｉの化合物またはその水和物を提供する。さらに、本発明は、１型糖尿病の治療に使用するための式Ｉの化合物またはその水和物を提供する。さらに、本発明は、２型糖尿病の治療に使用するための式Ｉの化合物またはその水和物を提供する。本発明は、ＩＧＴ、ＩＦＧまたはメタボリックシンドロームの治療に使用するための式Ｉの化合物またはその水和物をさらに提供する。本発明はまた、糖尿病を治療するための医薬を製造するための式Ｉの化合物またはその水和物の使用を提供する。さらに、本発明は、１型糖尿病を治療するための医薬を製造するための式Ｉの化合物またはその水和物の使用を提供する。本発明はまた、２型糖尿病を治療するための医薬を製造するための式Ｉの化合物またはその水和物の使用を提供する。本発明はまた、ＩＧＴ、ＩＦＧまたはメタボリックシンドロームを治療するための医薬を製造するための式Ｉの化合物またはその水和物の使用を提供する。
【００１２】
本発明は、式Ｉの化合物またはその水和物と、１種以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物をさらに提供する。特定の実施形態において、組成物は１種以上の他の治療剤をさらに含む。本発明はまた、式Ｉの化合物またはその水和物を合成するための新規中間体およびプロセスを包含する。
【００１３】
さらに、本発明は、４−｛４−［（１Ｅ）−４−（２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカ−２−イル）ブト−１−エン−１−イル］−２−メチルベンジル｝−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルベータ−Ｄ−グルコピラノシドを、湿潤酢酸エチルと混合するステップを含む、結晶性ＳＧＬＴ１阻害剤を調製するためのプロセスを提供する。本発明は、４−｛４−［（１Ｅ）−４−（２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカ−２−イル）ブト−１−エン−１−イル］−２−メチルベンジル｝−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルベータ−Ｄ−グルコピラノシドを、湿潤酢酸エチルと混合するステップ、次いで得られた固体を収集するステップを含む、結晶性ＳＧＬＴ阻害剤を調製するためのプロセスをさらに提供する。
【００１４】
非晶質固体である４−｛４−［（１Ｅ）−４−（２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカ−２−イル）ブト−１−エン−１−イル］−２−メチルベンジル｝−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルベータ−Ｄ−グルコピラノシド（遊離塩基）の単離および精製は、資源集約的であり得るクロマトグラフィーの使用を必要とする。式Ｉの化合物は、クロマトグラフィーの除去により単離および精製の改善を可能にし、医薬製剤、特に医薬組成物の商業的生産および貯蔵のために改善された形態安定性および取扱特性を有する結晶形を提供する。
【００１５】
本明細書で使用する場合、「強いピーク」という用語は、関連スペクトルまたは粉末パターンにおける最も強いピークの少なくとも５％である強度を有するピークを意味する。
【００１６】
本明細書で使用する場合、「治療する」または「治療するため」という用語は、既存の症状または傷害の進行または重症度を抑制、遅延、停止または反転させることを含む。
【００１７】
本明細書で使用する場合、「患者」という用語は、マウス、モルモット、ラット、イヌまたはヒトなどの哺乳動物を指す。好ましい患者はヒトであることが理解される。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、患者への単回または複数回用量の投与により、診断または治療下の患者において所望の効果を提供する、本発明の化合物の量または用量を指す。
【００１９】
有効量は、公知の技術の使用によって、および類似の状況下で得られた結果を観察することによって、当業者としての担当診断医によって容易に決定され得る。患者に対する有効量を決定する際に、限定されないが、哺乳動物の種、その大きさ、年齢および全体的な健康、関与する特定の疾患または傷害、疾患または傷害の関与または重症度の程度、個々の患者の反応、投与される特定の化合物、投与様式、投与される製剤の生物学的利用能特性、選択される用法、併用薬の使用、および他の関連状況を含む、複数の要因が担当診断医によって考慮される。
【００２０】
式Ｉの化合物は、通常、広範な投薬範囲にわたって効果的である。例えば、通常、１日当たりの投薬量は約０．０１〜約３０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内である。一部の場合、上述の範囲の下限値以下の投薬レベルが十分であってもよく、他の場合、さらに多くの用量があらゆる有害な副作用を引き起こさずに利用されてもよく、したがって上記の投薬範囲は本発明の範囲を決して限定するものではない。
【００２１】
本発明の化合物は、好ましくは、化合物を生物学的に利用可能にする任意の経路によって投与される医薬組成物として製剤化される。最も好ましくは、そのような組成物は経口投与用である。そのような医薬組成物およびそれを調製するためのプロセスは当該分野において周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｄ．Ｂ．Ｔｒｏｙ、編集、第２１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００６を参照のこと）。
【００２２】
本発明のさらなる態様において、本発明の化合物は、抗糖尿病薬などの１種以上の治療剤と組み合わせて投与されてもよい。併用投与は同時または連続投与を含む。さらに、組み合せの同時投与は各治療剤の単一の組み合わせ用量または別個の用量としてであってもよい。抗糖尿病薬の例としては、メトホルミン；シタグリプチンまたはリナグリプチンなどのＤＰＰＩＶ阻害剤；グリメピリドなどのスルホニル尿素；ピオグリタゾンなどのチアゾリジンジオン；グラルギンなどの基礎インスリン；ＨＵＭＡＬＯＧまたはＮＯＶＯＬＯＧなどの即効型インスリン；エクセナチドまたはリラグルチドなどのＧＬＰ−１アゴニスト；ダパグリフロジンまたはエンパグリフロジンなどのＳＧＬＴ２阻害剤；ＬＹ２４０９０２１などのグルカゴン受容体アンタゴニストなどが挙げられる。
【００２３】
式Ｉの化合物は、以下に記載される調製例、実施例およびスキームに例示されるように調製され得る。試薬および出発物質は当業者に容易に利用可能である。他に指定しない限り、全ての置換基は以前に定義される通りである。これらのスキーム、調製例および実施例は、決して本発明の範囲に対する限定ではないことは理解される。
【００２４】
分割の例としては、選択的結晶化技術またはキラルクロマトグラフィーが挙げられる（例えば、Ｊ．Ｊａｃｑｕｅｓら、「Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ，ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９８１、ならびにＥ．Ｌ．ＥｌｉｅｌおよびＳ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ、「Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９９４を参照のこと）。個々のジアステレオマーまたは幾何異性体のクロマトグラフィー、キラルクロマトグラフィーまたは選択的結晶化による分離および単離は、合成における任意の都合の良い時点で行うことができることは当業者にとってさらに明確であるはずである。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「δ」はテトラメチルシランから低磁場へのｐｐｍを指し、「ｍｉｎ」は分を指し、「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを指し、「ＭｅＯＨ」はメタノールまたはメチルアルコールを指し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを指す。
【００２６】
「Ａｃ」という用語は、以下の構造：
【化２】
2016539099.tif 000003
のアセチル置換基を指す。
【００２７】
「Ｂｚ」という用語は、以下の構造：
【化３】
2016539099.tif 000004
のベンゾイル置換基を指す。
【００２８】
「ＢＯＣ」という用語は、ｔ−ブチルオキシカルボニル保護基を指す。
【００２９】
【化４】
2016539099.tif 000005
【実施例】
【００３０】
調製例１
（４−ブロモ−２−メチル−フェニル）メタノール
【化５】
2016539099.tif 000006
スキーム１、工程Ａ：ボラン−テトラヒドロフラン錯体（０．２ｍｏｌ、２００ｍＬ、１．０Ｍ溶液）を、テトラヒドロフラン（２００ｍＬ）中の４−ブロモ−２−メチル安息香酸（３９ｇ、０．１８ｍｏｌ）の溶液に加える。室温にて１８時間後、減圧下で溶媒を除去して固体を得る。フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、白色固体（３２．９ｇ、０．１６ｍｏｌ）として標題化合物を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１．５５（ｓ，１Ｈ），２．２８（ｓ，３Ｈ），４．６１（ｓ，２Ｈ），７．１８−７．２９（ｍ，３Ｈ）。
【００３１】
（４−ブロモ−２−メチル−フェニル）メタノールの代替合成
ボラン−ジメチルスルフィド錯体（ＴＨＦ中に２Ｍ、１１６ｍＬ、０．２３２ｍｏｌ）を、３℃にて無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、１４６ｍＬ）中の４−ブロモ−２−メチル安息香酸（２４．３ｇ、０．１１３ｍｏｌ）の溶液にゆっくり加える。撹拌後、１０分間冷却し、冷却浴を取り除き、反応を室温にゆっくり加温させる。１時間後、溶液を５℃に冷却し、水（１００ｍＬ）をゆっくり加える。酢酸エチル（１００ｍＬ）を加え、相を分離する。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させる。濾過および減圧下での濃縮により、残渣を得、それを、１５％の酢酸エチル／イソ−ヘキサンで溶出するシリカのショートパッドを通す濾過によって精製して、標題化合物（２０．７ｇ、９１．２％収率）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１８３／１８５（Ｍ＋１−１８）。
【００３２】
調製例２
４−ブロモ−１−クロロメチル−２−メチル−ベンゼン
【化６】
2016539099.tif 000007
スキーム１、工程Ｂ：塩化チオニル（１４．３１ｍＬ、０．２ｍｏｌ）を、０℃にてジクロロメタン（２００ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（０．０２５ｍｏｌ、２．０ｍＬ）中の（４−ブロモ−２−メチル−フェニル）メタノール（３２．９ｇ、０．１６ｍｏｌ）の溶液に加える。室温にて１時間後、混合物を氷水（１００ｇ）内に注ぎ、ジクロロメタン（３００ｍＬ）で抽出し、抽出物を５％炭酸水素ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）およびブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮して、白色固体として粗標題化合物（３５．０ｇ、０．１６ｍｏｌ）を得る。この物質をさらに精製せずに反応の次の工程に使用する。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ２．３８（ｓ，３Ｈ），４．５２（ｓ，２Ｈ），７．１３−７．３５（ｍ，３Ｈ）。
【００３３】
４−ブロモ−１−クロロメチル−２−メチル−ベンゼンの代替合成
メタンスルホニルクロリド（６．８３ｍＬ、８８．３ｍｍｏｌ）を、氷／水中で冷却したジクロロメタン（８０．７ｍＬ）中の（４−ブロモ−２−メチル−フェニル）メタノール（１６．１４ｇ、８０．２７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１６．７８ｍＬ、１２０．４ｍｍｏｌ）の溶液にゆっくり加える。混合物を室温にゆっくり加温させ、１６時間撹拌する。さらにメタンスルホニルクロリド（１．２４ｍＬ、１６．１ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温にて２時間撹拌する。水（８０ｍＬ）を加え、相を分離する。有機層を塩酸（１Ｎ、８０ｍＬ）、次いで飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（８０ｍＬ）、次いで水（８０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させる。濾過し、減圧下で濃縮して、残渣を得、それを、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサンで溶出する）により精製して、標題化合物（１４．２ｇ、８０．５％収率）を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（３００．１１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．３６−７．３０（ｍ，２Ｈ），７．１８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），４．５５（ｓ，２Ｈ），２．４１（ｓ，３Ｈ）。
【００３４】
調製例３
４−［（４−ブロモ−２−メチル−フェニル）メチル］−５−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾール−３−オール
【化７】
2016539099.tif 000008
スキーム１、工程Ｃ：水素化ナトリウム（８．２９ｇ、０．２１ｍｏｌ、油中の６０％分散系）を、０℃にてテトラヒドロフラン中のメチル４−メチル−３−オキソバレレート（２７．１ｍＬ、０．１９ｍｏｌ）の溶液に加える。室温にて３０分後、テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中の４−ブロモ−１−クロロメチル−２−メチル−ベンゼン（３５．０ｇ、０．１６ｍｏｌ）の溶液を加える。得られた混合物を７０℃にて一晩（１８時間）加熱する。１．０ＭのＨＣｌ（２０ｍＬ）を加えて反応をクエンチする。酢酸エチル（２００ｍＬ）で抽出し、抽出物を水（２００ｍＬ）およびブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。得られた残渣をトルエン（２００ｍＬ）に溶解し、ヒドラジン一水和物（２３．３ｍＬ、０．４８ｍｏｌ）を加える。ディーンスターク装置を用いて混合物を１２０℃にて２時間加熱して水を除去する。冷却し、溶媒を減圧下で取り除き、残渣をジクロロメタン（５０ｍＬ）およびメタノール（５０ｍＬ）で溶解する。この溶液を、水（２５０ｍＬ）を含むビーカーにゆっくり注ぐ。真空濾過により得られた沈殿生成物を回収する。４０℃にて一晩、オーブン内の真空中で乾燥させて、固体として標題化合物（４８．０ｇ、０．１６ｍｏｌ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３１１．０（Ｍ＋１）、３０９．０（Ｍ−１）。
【００３５】
４−［（４−ブロモ−２−メチル−フェニル）メチル］−５−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾール−３−オールの代替合成
アセトニトリル（６５．８ｍＬ）中の４−ブロモ−１−クロロメチル−２−メチル−ベンゼン（１３．１６ｇ、５９．９５ｍｍｏｌｅ）の溶液を調製する。炭酸カリウム（２４．８６ｇ、１７９．９ｍｍｏｌ）、ヨウ化カリウム（１１．９４ｇ、７１．９４ｍｍｏｌ）およびメチル４−メチル−３−オキソバレレート（８．９６ｍＬ、６２．９５ｍｍｏｌ）を加える。得られた混合物を周囲温度にて２０時間撹拌する。塩酸（２Ｎ）を加えてｐＨ３にする。溶液を酢酸エチル（１００ｍｌ）で抽出し、有機相をブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させる。混合物を濾過し、減圧下で濃縮する。残渣をトルエン（６５．８ｍＬ）に溶解し、ヒドラジン一水和物（１３．７ｍＬ、０．１８０ｍｏｌ）を加える。得られた混合物を加熱還流し、ディーンスターク装置を使用して水を除去する。３時間後、混合物を９０℃に冷却し、さらなるヒドラジン一水和物（１３．７ｍＬ、０．１８０ｍｏｌ）を加え、混合物を１時間加熱還流する。混合物を冷却し、減圧下で濃縮する。得られた固体を水（２００ｍＬ）で粉砕し、濾過し、６０℃にてＰ２Ｏ５上で真空オーブン中で乾燥させる。固体をイソ−ヘキサン（２００ｍＬ）中で粉砕し、濾過して標題化合物（１４．３ｇ、７７．１％収率）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３０９／３１１（Ｍ＋１）。
【００３６】
調製例４
４−（４−ブロモ−２−メチルベンジル）−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド
【化８】
2016539099.tif 000009
スキーム１、工程Ｄ：１Ｌのフラスコに、４−［（４−ブロモ−２−メチル−フェニル）メチル］−５−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾール−３−オール（２０ｇ、６４．７ｍｍｏｌ）、アルファ−Ｄ−グルコピラノシルブロミドテトラベンゾエート（５０ｇ、７６ｍｍｏｌ）、ベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（６ｇ、１９．４ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（５００ｍＬ）、炭酸カリウム（４４．７ｇ、３２３ｍｍｏｌ）および水（１００ｍＬ）を加える。反応混合物を室温にて一晩撹拌する。ジクロロメタン（５００ｍＬ）で抽出する。抽出物を水（３００ｍＬ）およびブライン（５００ｍＬ）で洗浄する。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して標題化合物（３７ｇ、６４ｍｍｏｌ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：８８９．２（Ｍ＋１），８８７．２（Ｍ−１）。
【００３７】
調製例５
４−｛４−［（１Ｅ）−４−ヒドロキシブト−１−エン−１−イル］−２−メチルベンジル｝−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド
【化９】
2016539099.tif 000010
スキーム１、工程Ｅ：３−ブテン−１−オール（０．５８ｍＬ、６．８ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（３０ｍＬ）およびトリエチルアミン（２０ｍＬ）中の４−（４−ブロモ−２−メチルベンジル）−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド（３ｇ、３．４ｍｍｏｌ）の溶液に加える。溶液を窒素で１０分にわたって脱気する。トリ−ｏ−トリルホスフィン（２０５ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）および酢酸パラジウム（７６ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を加える。９０℃にて２時間還流する。室温に冷却し、濃縮して、減圧下で溶媒を除去する。残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、標題化合物（２．１ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：８７８．４（Ｍ＋１）。
【００３８】
調製例６
４−｛４−［（１Ｅ）−４−オキシブト−１−エン−１−イル］−２−メチルベンジル｝−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド
【化１０】
2016539099.tif 000011
スキーム１、工程Ｆ：３，３，３−トリアセトキシ−３−ヨードフタリド（１３４ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）を、０℃にてジクロロメタン（２０ｍＬ）中の４−｛４−［（１Ｅ）−４−ヒドロキシブト−１−エン−１−イル］−２−メチルベンジル｝−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド（２８０ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）および炭酸水素ナトリウム（１３３．８ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）の溶液に加える。室温にて１５分後、反応物を飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）でクエンチする。ジクロロメタン（３０ｍＬ）で抽出する。抽出物を水（３０ｍＬ）およびブライン（４０ｍＬ）で洗浄する。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して標題化合物（２７０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：８７６．５（Ｍ＋１），８７４．５（Ｍ−１）。
【００３９】
調製例７
ｔｅｒｔ−ブチル２−｛（３Ｅ）−４−［３−メチル−４−（｛５−（プロパン−２−イル）−３−［（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］−１Ｈ−ピラゾール−４−イル｝メチル）フェニル］ブト−３−エン−１−イル｝−２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカン−９−カルボキシレート
【化１１】
2016539099.tif 000012
スキーム１、工程Ｇ：ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（９８ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を、１，２−ジクロロメタン（５ｍＬ）中の４−｛４−［（１Ｅ）−４−オキシブト−１−エン−１−イル］−２−メチルベンジル｝−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド（２７０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチル２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカン−９−カルボキシレート塩酸塩（１７９ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）の溶液に加える。室温にて３０分後、反応物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）でクエンチする。ジクロロメタン（３０ｍＬ）で抽出する。抽出物を水（３０ｍＬ）およびブライン（４０ｍＬ）で洗浄し、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して標題化合物（２７５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１１１５．６（Ｍ＋１）。
【００４０】
調製例８
４−｛４−［（１Ｅ）−４−（２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカ−２−イル）ブト−１−エン−１−イル］−２−メチルベンジル｝−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド二塩酸塩
【化１２】
2016539099.tif 000013
スキーム１、工程Ｈ：塩化水素（１，４−ジオキサン中の４．０Ｍ溶液、０．６ｍＬ、２．４ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（５ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル２−｛（３Ｅ）−４−［３−メチル−４−（｛５−（プロパン−２−イル）−３−［（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］−１Ｈ−ピラゾール−４−イル｝メチル）フェニル］ブト−３−エン−１−イル｝−２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカン−９−カルボキシレート（２７５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の溶液に加える。室温にて一晩（１８時間）後、濃縮して、減圧下で溶媒を除去して固体（２５８ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）として標題化合物を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１０１５．６（Ｍ＋１）。
【００４１】
【化１３】
2016539099.tif 000014
【００４２】
調製例９
４−（４−ブロモ−２−メチルベンジル）−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド
【化１４】
2016539099.tif 000015
スキーム２、工程Ａ：１Ｌのフラスコに、４−［（４−ブロモ−２−メチル−フェニル）メチル］−５−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾール−３−オール（２４ｇ、７７．６ｍｍｏｌ）、２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−アルファ−Ｄ−グルコピラノシルブロミド（５０．４ｇ、１１６ｍｍｏｌ）、ベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（５ｇ、１５．５ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（２５０ｍＬ）、炭酸カリウム（３２ｇ、３２３ｍｍｏｌ）および水（１２０ｍＬ）を加える。反応混合物を室温にて一晩撹拌する。ジクロロメタン（４５０ｍＬ）で抽出する。抽出物を水（３００ｍＬ）およびブライン（５００ｍＬ）で洗浄する。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して標題化合物（３６．５ｇ、５７ｍｍｏｌ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：６３８．５（Ｍ＋１），６３６．５（Ｍ−１）。
【００４３】
４−（４−ブロモ−２−メチルベンジル）−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシドの代替合成
試薬４−［（４−ブロモ−２−メチル−フェニル）メチル］−５−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾール−３−オール（２４．０ｇ、７７．６ｍｍｏｌ）、２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−アルファ−Ｄ−グルコピラノシルブロミド（５０．４ｇ、１１６ｍｍｏｌ）、ベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（４．９４ｇ、１５．５２ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（３２．１８ｇ、２３２．９ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（２５０ｍＬ）および水（１２０ｍＬ）を合わせ、混合物を室温にて１８時間撹拌する。混合物をジクロロメタン（２５０ｍＬ）と水（２５０ｍＬ）との間で分配する。有機相をブライン（２５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。得られた残渣を、フラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン中の１０％酢酸エチルからジクロロメタン中の７０％酢酸エチルで溶出する）により精製して標題化合物（３６．５ｇ、７４％収率）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：６３９／６４１（Ｍ＋１）。
【００４４】
調製例１０
４−｛４−［（１Ｅ）−４−ヒドロキシブト−１−エン−１−イル］−２−メチルベンジル｝−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル２，３，４−テトラ−Ｏ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド
【化１５】
2016539099.tif 000016
スキーム２、工程Ｂ：３−ブテン−１−オール（６．１ｍＬ、７０ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（２００ｍＬ）およびトリエチルアミン（５０ｍＬ）中の４−（４−ブロモ−２−メチルベンジル）−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド（１５ｇ、２３．５ｍｍｏｌ）の溶液に加える。溶液を１０分にわたって窒素で脱気する。トリ−ｏ−トリルホスフィン（１．４３ｇ、４．７ｍｍｏｌ）および酢酸パラジウム（５２６ｍｇ、２．３５ｍｍｏｌ）を加える。９０℃にて２時間還流した後、冷却し、濃縮して、減圧下で溶媒を除去する。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、標題化合物（７．５ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：６３１．２（Ｍ＋１），６２９．２（Ｍ−１）。
【００４５】
調製例１１
４−｛４−［（１Ｅ）−４−オキシブト−１−エン−１−イル］−２−メチルベンジル｝−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド
【化１６】
2016539099.tif 000017
スキーム２、工程Ｃ：３，３，３−トリアセトキシ−３−ヨードフタリド（２．１ｇ、４．７６ｍｍｏｌ）を、０℃にてジクロロメタン（５０ｍＬ）中の４−｛４−［（１Ｅ）−４−ヒドロキシブト−１−エン−１−イル］−２−メチルベンジル｝−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド（１．５ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）および炭酸水素ナトリウム（２ｇ、２３．８ｍｍｏｌ）の溶液に加える。室温にて１５分後、反応を飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）でクエンチする。ジクロロメタン（３０ｍＬ）で抽出し、抽出物を水（３０ｍＬ）およびブライン（４０ｍＬ）で洗浄する。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して標題化合物（０．９５ｇ、１．５１ｍｍｏｌ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：６２８．８（Ｍ＋１），６２６．８（Ｍ−１）。
【００４６】
調製例１２ａ
ｔｅｒｔ−ブチル２−｛（３Ｅ）−４−［３−メチル−４−（｛５−（プロパン−２−イル）−３−［（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］−１Ｈ−ピラゾール−４−イル｝メチル）フェニル］ブト−３−エン−１−イル｝−２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカン−９−カルボキシレート
【化１７】
2016539099.tif 000018
スキーム２、工程Ｄ：ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（３０３ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）を、１，２−ジクロロエタン（３０ｍＬ）中の４−｛４−［（１Ｅ）−４−オキシブト−１−エン−１−イル］−２−メチルベンジル｝−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド（６００ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチル２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカン−９−カルボキシレート塩酸塩（３３３ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）の溶液に加える。室温にて３０分後、反応を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１５ｍＬ）でクエンチする。ジクロロメタン（６０ｍＬ）で抽出する。抽出物を水（３０ｍＬ）およびブライン（６０ｍＬ）で洗浄する。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して標題化合物（５００ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：８６６．８，８６７．８（Ｍ＋１），８６４．８，８６５．８（Ｍ−１）。
【００４７】
調製例１３
４−｛４−［（１Ｅ）−４−（２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカ−２−イル）ブト−１−エン−１−イル］−２−メチルベンジル｝−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド二塩酸塩
【化１８】
2016539099.tif 000019
スキーム２、工程Ｅ：塩化水素（１，４−ジオキサン中の４．０Ｍ溶液、１．５ｍＬ、５．８ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（２０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル２−｛（３Ｅ）−４−［３−メチル−４−（｛５−（プロパン−２−イル）−３−［（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］−１Ｈ−ピラゾール−４−イル｝メチル）フェニル］ブト−３−エン−１−イル｝−２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカン−９−カルボキシレート（５００ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）の溶液に加える。室温にて２時間後、濃縮して、減圧下で溶媒を除去して、固体として標題化合物（４８０ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：７６７．４（Ｍ＋１）。
【００４８】
【化１９】
2016539099.tif 000020
【００４９】
調製例１４
ｔｅｒｔ−ブチル４−ブト−３−イニル−４，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカン−９−カルボキシレート
【化２０】
2016539099.tif 000021
スキーム３、工程Ａ：炭酸セシウム（４６．６６ｇ、１４３．２１ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（１６７ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカン−９−カルボキシレート塩酸塩（１６．６６ｇ、５７．２８ｍｍｏｌｅ）の懸濁液に加える。混合物を室温にて１０分間撹拌し、次いで４−ブロモブチン（６．４５ｍＬ、６８．７４ｍｍｏｌ）を加える。反応を加熱還流し、１８時間撹拌する。混合物を冷却し、減圧下で濃縮する。残渣を水（２００ｍＬ）と酢酸エチル（１５０ｍＬ）との間で分配する。相を分離し、水層を酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出する。合わせた有機層を水（２００ｍＬ）、次いでブライン（１５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して標題化合物（１７．２ｇ、９８％収率）を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（３００．１１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ３．４３−３．３１（ｍ，４Ｈ），２．５３−２．４８（ｍ，２Ｈ），２．３７−２．２９（ｍ，４Ｈ），２．２０（ｓ，２Ｈ），１．９４（ｔ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ），１．４４（ｓ，１７Ｈ）。
【００５０】
調製例１５
ｔｅｒｔ−ブチル４−［（Ｅ）−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ブト−３−エニル］−４，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカン−９−カルボキシレート
【化２１】
2016539099.tif 000022
スキーム３、工程Ｂ：トリエチルアミン（５．６２ｍｍｏｌｅ、０．７８３ｍＬ）、４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン（８．５６ｍＬ、５９．０ｍｍｏｌ）およびジルコノセンクロリド（１．４５ｇ、５．６２ｍｍｏｌｅ）を、ｔｅｒｔ−ブチル４−ブト−３−イニル−４，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカン−９−カルボキシレート（１７．２１ｇ、５６．１６ｍｍｏｌｅ）に加える。得られた混合物を６５℃で３．５時間加熱する。混合物を冷却し、ジクロロメタン（１５０ｍＬ）に溶解する。得られた溶液を、ジクロロメタン（２×２００ｍＬ）で溶出する約４ｃｍ厚のシリカゲルのパッドに通す。濾液を減圧下で濃縮して、標題化合物（２１．２ｇ、８７％収率）を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（３００．１１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ６．６５−６．５５（ｍ，１Ｈ），５．４９−５．４３（ｍ，１Ｈ），３．４２−３．２９（ｍ，４Ｈ），２．４０−２．２７（ｍ，６Ｈ），２．２５−２．０８（ｍ，２Ｈ），１．７０−１．１３（ｍ，２９Ｈ）。
【００５１】
調製例１６
ｔｅｒｔ−ブチル２−｛（３Ｅ）−４−［３−メチル−４−（｛５−（プロパン−２−イル）−３−ベータ−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］−１Ｈ−ピラゾール−４−イル｝メチル）フェニル］ブト−３−エン−１−イル｝−２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカン−９−カルボキシレート
【化２２】
2016539099.tif 000023
スキーム３、工程Ｃ：テトラヒドロフラン（２００ｍＬ）および水（４０ｍＬ）中の４−（４−ブロモ−２−メチルベンジル）−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド（２０ｇ、３１．３ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル４−［（Ｅ）−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ブト−３−エニル］−４，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカン−９−カルボキシレート（１６．３ｇ、３７．５ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（１２．９７ｇ、９３．８２ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素ガスを通して泡立てることによって１５分間脱気する。Ｐｄ（ＯＡｃ）２（１４０ｍｇ、６２５μｍｏｌ）および２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’，４’，６’−トリ−イ−プロピル（ｔｒｉ−ｉ−ｐｒｏｐｙｌ）−１，１’−ビフェニル（０．５９６ｇ、１．２５ｍｍｏｌ）を加え、反応を１６時間加熱還流する。溶液を室温に冷却し、メタノール（２００ｍＬ）を加える。３０分後、溶媒を減圧下で除去する。混合物を酢酸エチル（５００ｍＬ）とブライン（５００ｍＬ）との間で分配して、相分離を補助するためにＭｇＳＯ４水溶液（１Ｍ、５００ｍｌ）を加える。層を分離し、有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、酢酸エチル（約１．５Ｌ）で溶出する１０ｃｍのシリカゲルのパッドで濾過する。濾液を捨て、シリカパッドをＴＨＦ（２Ｌ）中の５％ＭｅＯＨでフラッシュする。メタノール濾液を減圧下で濃縮して、標題化合物（２０．１ｇ、９２％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：６９９（Ｍ＋１）。
【００５２】
【化２３】
2016539099.tif 000024
【００５３】
調製例１７
ｔｅｒｔ−ブチル４−［（Ｅ）−４−［４−［（３−ヒドロキシ−５−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチル］−３−メチル−フェニル］ブト−３−エニル］−４，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカン−９−カルボキシレート
【化２４】
2016539099.tif 000025
スキーム４、工程Ａ：メタノール（１３０Ｌ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−［（Ｅ）−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ブト−３−エニル］−４，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカン−９−カルボキシレート（３５．８ｋｇ、８２．４ｍｏｌ）を、室温にてメタノール（４４０Ｌ）中の（４−［（４−ブロモ−２−メチル−フェニル）メチル］−５−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾール−３−オール（２３．９ｋｇ、７７．３ｍｏｌ）の溶液に加える。水（５９０Ｌ）およびリン酸三カリウム（１００ｋｇ、４７１．７ｍｏｌ）を加え、反応を窒素雰囲気下に置く。撹拌溶液に、メタノール（１５Ｌ）中のトリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（１．４２ｋｇ、１．５５ｍｏｌ）およびジ−ｔｅｒｔ−ブチルメチルホスホニウムテトラフルオロボレート（７７５ｇ、３．１２ｍｏｌ）の懸濁液を加える。得られた混合物を７５℃にて２時間加熱する。混合物を冷却し、珪藻土で濾過する。濾過ケーキをメタノール（６０Ｌ）ですすぎ、濾液を減圧下で濃縮する。酢酸エチル（３００Ｌ）を加え、層を分離し、有機層を１５％ブライン（３×１２０Ｌ）で洗浄する。有機層を減圧下で濃縮し、酢酸エチル（３００Ｌ）を加え、混合物を１８〜２０時間撹拌する。ヘプタン（３００Ｌ）を加え、混合物を１０℃に冷やし、混合物をさらに１８〜２０時間撹拌する。得られた固体を濾過により回収し、酢酸エチル／ヘプタン（２：３、２×９０Ｌ）でケーキをそそぎ、４０℃にて真空下で乾燥させて、白色固体として標題化合物（２９．３ｋｇ、７０．６％収率）を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ７．１４（ｓ，１Ｈ），７．０７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．３９（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），６．２５−６．１２（ｍ，１Ｈ），３．６３（ｓ，２Ｈ），３．４５−３．３８（ｂｓ，３Ｈ），３．３４（ｓ，３Ｈ），３．３３（ｓ，３Ｈ），２．８５−２．７５（ｍ，１Ｈ），２．４９−２．４０（ｍ，５Ｈ），２．３３（ｓ，３Ｈ），１．６８−１．６２（ｍ，２Ｈ），１．６０−１．３６（ｍ，１５Ｈ），１．１１（ｓ，３Ｈ），１．１０（ｓ，３Ｈ）。
【００５４】
調製例１２ｂ
ｔｅｒｔ−ブチル２−｛（３Ｅ）−４−［３−メチル−４−（｛５−（プロパン−２−イル）−３−［（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］−１Ｈ−ピラゾール−４−イル｝メチル）フェニル］ブト−３−エン−１−イル｝−２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカン−９−カルボキシレートの代替調製
【化２５】
2016539099.tif 000026
スキーム４、工程Ｂ：室温にて、ｔｅｒｔ−ブチル４−［（Ｅ）−４−［４−［（３−ヒドロキシ−５−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチル］−３−メチル−フェニル］ブト−３−エニル］−４，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカン−９−カルボキシレート（１７．８３ｋｇ、３３．２ｍｏｌｅ）、アセトニトリル（１８０Ｌ）およびベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（１．５２ｋｇ、４．８７ｍｏｌｅ）を合わせる。炭酸カリウム（２７．６ｋｇ、１９９．７ｍｏｌｅ）をゆっくり加え、混合物を２時間撹拌する。２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−アルファ−Ｄ−グルコピラノシルブロミド（２４．９ｋｇ、６０．５５ｍｏｌ）を加え、反応混合物を３０℃に加温し、１８時間撹拌する。混合物を減圧下で濃縮し、酢酸エチル（１８０Ｌ）、続いて水（９０Ｌ）を加える。層を分離し、有機相を１５％ブライン（３×９０Ｌ）で洗浄し、混合物を濃縮し、シリカゲル（６３ｋｇ、溶出液（１：２→１：０）として酢酸エチル／ヘプタン）上でカラムクロマトグラフィーを使用して精製して、黄色の泡状物として標題化合物（１９．８ｋｇ、９４％純度、６８．８％収率）を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．１３（ｓ，１Ｈ），７．０３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．７８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３６（ｄ，Ｊ＝１６．０，１Ｈ），６．２５−６．１３（ｍ，１Ｈ），５．６４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），５．４５−５．２５（ｍ，２Ｈ），５．１３−４．９５（ｍ，２Ｈ），４．８４−４．７６（ｍ，１Ｈ），４．２５−４．１３（ｍ，２Ｈ），４．１０−４．００（ｍ，２Ｈ），３．９０−３．８６（ｍ，１Ｈ），３．５８−３．５０（ｍ，２Ｈ），３．４０−３．２２（ｍ，４Ｈ），２．８９−２．７９（ｍ，１Ｈ），２．１０−１．９０（ｍ，１８Ｈ），１．８２（ｓ，３Ｈ），１．６２−０．８２（ｍ，２２Ｈ）。
【００５５】
調製例１８
２−｛（３Ｅ）−４−［３−メチル−４−（｛５−（プロパン−２−イル）−３−［（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］−１Ｈ−ピラゾール−４−イル｝メチル）フェニル］ブト−３−エン−１−イル｝−２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカン
【化２６】
2016539099.tif 000027
スキーム４、工程Ｃ：ｔｅｒｔ−ブチル２−｛（３Ｅ）−４−［３−メチル−４−（｛５−（プロパン−２−イル）−３−［（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］−１Ｈ−ピラゾール−４−イル｝メチル）フェニル］ブト−３−エン−１−イル｝−２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカン−９−カルボキシレート（１９．６ｋｇ、２２．６ｍｏｌｅ）をジクロロメタン（１２０Ｌ）と合わせ、０℃に冷却する。トリフルオロ酢酸（３４．６Ｌ、５１．６ｋｇ、４５２ｍｏｌｅ）をゆっくり加え、９時間撹拌する。反応を氷水（８０Ｌ）でクエンチし、水酸化アンモニウム（８５〜９０Ｌ）を加えて反応混合物をｐＨ（８〜９）に調整する。ジクロロメタン（１２０Ｌ）を加え、反応混合物を室温に加温し、層を分離する。有機層を水（７５Ｌ）、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、黄色の固体として標題化合物（１６．２ｋｇ、９５．０％純度、９３％収率）を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．０８（ｓ，１Ｈ），６．９９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．７６（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．３８（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），６．００−５．８３（ｍ，１Ｈ），５．３１（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），５．２５−５．１３（ｍ，４Ｈ），４．３２（ｄｄ，Ｊ＝１２．８，９．２Ｈｚ，１Ｈ），４．１４（ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，１Ｈ），３．９０（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ），３．７５−３．５０（ｍ，３Ｈ），３．３０−３．００（ｍ，５Ｈ），２．８５−２．７５（ｍ，１Ｈ），２．７０−２．４８（ｍ，３Ｈ），２．２５（ｓ，１Ｈ），２．１３−１．６３（ｍ，１９Ｈ），１．３２−１．２１（ｍ，１Ｈ），１．１４（ｓ，３Ｈ），１．１３（ｓ，３Ｈ），１．１２（ｓ，３Ｈ），１．１０（ｓ，３Ｈ）。
【００５６】
実施例１
水和した結晶性４−｛４−［（１Ｅ）−４−（２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカ−２−イル）ブト−１−エン−１−イル］−２−メチルベンジル｝−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルベータ−Ｄ−グルコピラノシドアセテート
４−｛４−［（１Ｅ）−４−（２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカ−２−イル）ブト−１−エン−１−イル］−２−メチルベンジル｝−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルベータ−Ｄ−グルコピラノシド（遊離塩基）の第１の代替調製
【化２７】
2016539099.tif 000028
スキーム１、工程Ｉ：水酸化ナトリウム（０．５ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ、１．０Ｍ溶液）を、メタノール（２ｍＬ）中の４−｛４−［（１Ｅ）−４−（２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカ−２−イル）ブト−１−エン−１−イル］−２−メチルベンジル｝−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド二塩酸塩（２５８ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）の溶液に加える。４０℃にて２時間後、濃縮して減圧下で溶媒を除去して残渣を得、それを分取ＨＰＬＣ法：高ｐＨ、３０×７５ｍｍ、５μｍのＣ１８ＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＤＢカラムを使用して８５ｍＬ／分にて４分間２５％Ｂ、４分間２５〜４０Ｂ％、ｐＨ１０にて溶媒Ａ−ＮＨ４ＨＣＯ３を含むＨ２Ｏ、溶媒Ｂ−ＭｅＣＮによって精製して固体（４６ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）として標題化合物（遊離塩基）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：５９８．８（Ｍ＋１），５９６．８（Ｍ−１）。
【００５７】
４−｛４−［（１Ｅ）−４−（２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカ−２−イル）ブト−１−エン−１−イル］−２−メチルベンジル｝−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルベータ−Ｄ−グルコピラノシド（遊離塩基）の第２の代替調製
【化２８】
2016539099.tif 000029
スキーム２、工程Ｆ：メタノール（５ｍＬ）、トリエチルアミン（３ｍＬ）および水（３ｍＬ）を、４−｛４−［（１Ｅ）−４−（２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカ−２−イル）ブト−１−エン−１−イル］−２−メチルベンジル｝−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド二塩酸塩（４８０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）に加える。室温にて１８時間（一晩）後、減圧下で濃縮乾固する。得られた残渣を分取ＨＰＬＣ法：高ｐＨ、３０×７５ｍｍ、５μｍのＣ１８ＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＤＢカラムを使用して８５ｍＬ／分にて４分間２５％Ｂ、４分間２５〜４０Ｂ％、溶媒Ａ−ｐＨ１０にてＮＨ４ＨＣＯ３を含むＨ２Ｏ、溶媒Ｂ−ＭｅＣＮによって精製して、固体（５０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）として標題化合物（遊離塩基）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：５９８．８（Ｍ＋１），５９６．８（Ｍ−１）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００．３１ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ７．１１（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，１Ｈ），７．０４（ｄｄ，Ｊ＝１．３，８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３６（ｄ，Ｊ＝１５．８Ｈｚ，１Ｈ），６．１６（ｄｔ，Ｊ＝１５．８，６．３Ｈｚ，１Ｈ），５．０２（ｍ，１Ｈ），３．８１（ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，１Ｈ），３．７２（ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１Ｈ），３．６８（ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１Ｈ），３．６４（ｍ，１Ｈ），３．３７−３．２９（ｍ，４Ｈ），２．７９（ｍ，１Ｈ），２．７２（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，４Ｈ），２．４４−２．３３（ｍ，６Ｈ），２．３０（ｓ，３Ｈ），２．２６（ｂｒｏａｄｓ，２Ｈ），１．５９（ｍ，２Ｈ），１．５０（ｍ，２Ｈ），１．４３（ｍ，２Ｈ），１．３６（ｍ，２Ｈ），１．１１（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），１．１０（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）。
【００５８】
４−｛４−［（１Ｅ）−４−（２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカ−２−イル）ブト−１−エン−１−イル］−２−メチルベンジル｝−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルベータ−Ｄ−グルコピラノシドの第３の代替調製
スキーム３、工程Ｄ：トリフルオロ酢酸（３２．２ｍＬ、０．４２６ｍｏｌ）を、氷水中で冷やしたジクロロメタン（１４９ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル２−｛（３Ｅ）−４−［３−メチル−４−（｛５−（プロパン−２−イル）−３−ベータ−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］−１Ｈ−ピラゾール−４−イル｝メチル）フェニル］ブト−３−エン−１−イル｝−２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカン−９−カルボキシレート（１４．８７ｇ、２１．２８ｍｍｏｌ）の溶液に加える。溶液を室温に加温する。３０分後、混合物を、必要に応じて一定温度を維持するために冷却を適用して、ＭｅＯＨ（２Ｍ、３００ｍＬ）中のアンモニアにゆっくり加える。溶液を室温にて１５分間撹拌する。混合物を減圧下で濃縮し、ＳＣＸ−２樹脂を使用して残渣を精製する。塩基性濾液を減圧下で濃縮し、残渣を酢酸エチル中で粉砕／超音波処理し、濾過し、乾燥させる。得られた固体をＭｅＯＨ（２００ｍＬ）に溶解し、真空中で濃縮する。これを数回繰り返して標題化合物（遊離塩基）（１２．２２ｇ、収率９６％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：５９９（Ｍ＋１）；［α］Ｄ２０＝−１２°（Ｃ＝０．２、ＭｅＯＨ）。
【００５９】
最終標題化合物、水和した結晶性４−｛４−［（１Ｅ）−４−（２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカ−２−イル）ブト−１−エン−１−イル］−２−メチルベンジル｝−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルベータ−Ｄ−グルコピラノシドアセテート
【化２９】
2016539099.tif 000030
４−｛４−［（１Ｅ）−４−（２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカ−２−イル）ブト−１−エン−１−イル］−２−メチルベンジル｝−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルベータ−Ｄ−グルコピラノシド（９０２ｍｇ）を丸底フラスコ（１００ｍＬ）に入れ、湿潤酢酸エチル（１８ｍＬ）で処理する。［注意−湿潤酢酸エチルは酢酸エチル（１００ｍＬ）および純水（１００ｍＬ）を混合することによって調製する。混合後、層を分離し、使用するために上部の湿潤酢酸エチル層を除去する。酢酸は酢酸エチルの加水分解生成物であり、湿潤酢酸エチル中に存在する。］湿潤酢酸エチルを加えると、化合物は完全ではないが、溶解する。数分後、白色沈殿物が形成する。さらなる量の湿潤酢酸エチル（２ｍＬ）を加えて、残りの化合物を溶解する。溶媒を室温にて一晩蓋をせずに撹拌し、その時間の間、溶媒は部分的に蒸発する。生成物スラリーからの残りの溶媒を真空下で除去し、得られた固体を窒素ストリーム下で乾燥させて、結晶性固体として最終標題化合物を得る。固体状態ＮＭＲによって少量の非晶質物質を生成物中で識別する。この結晶性最終標題化合物は、さらなる結晶性最終標題化合物を調製するために種晶として使用できる。
【００６０】
最終標題化合物、水和した結晶性４−｛４−［（１Ｅ）−４−（２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカ−２−イル）ブト−１−エン−１−イル］−２−メチルベンジル｝−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルベータ−Ｄ−グルコピラノシドアセテートの代替調製
窒素雰囲気下で、４−｛４−［（１Ｅ）−４−（２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカ−２−イル）ブト−１−エン−イル］−２−メチルベンジル｝−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド（２．１ｋｇ、２．７４ｍｏｌ）、メタノール（４．４Ｌ）、テトラヒドロフラン（４．２Ｌ）および水（２１０ｍＬ）を合わせる。炭酸カリウム（４６０ｇ、３．３３ｍｏｌｅ）を加え、４〜６時間撹拌し、次いで反応混合物を濾過して固体を除去する。濾液を減圧下で濃縮し、次いでエタノール（９．０Ｌ）、続いて酢酸（２３７ｍＬ、４．１３ｍｏｌ）を加え、室温にて１時間撹拌する。撹拌溶液に、湿潤酢酸エチル（１０Ｌ、約３ｗ／ｗ％の水を含有する）、続いて水（５００ｍＬ）を５時間にわたってゆっくり加える。懸濁液を２４時間撹拌し、湿潤酢酸エチル（４．９５Ｌ、約３ｗ／ｗ％の水を含有する）を８時間にわたって加える。懸濁液を２４時間撹拌し、さらなる湿潤酢酸エチル（１１．５Ｌ、約３ｗ／ｗ％の水を含有する）を１６時間にわたってゆっくり加える。懸濁液を２４時間撹拌し、濾過によって固体を回収し、固体を湿潤酢酸エチル（３．３Ｌ、約３ｗ／ｗ％の水を含有する）でそそぐ。３０℃未満の減圧下でオーブン中で乾燥させて、オフホワイトの結晶性固体（１．５５ｋｇ、２．３５ｍｏｌ、９６．７％純度、７２．４ｗ／ｗ％有効性、有効性に基づいて６８．０％収率）として標題化合物を得る。ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：５９９．３７９８（Ｍ＋１）。
【００６１】
粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）
結晶性固形物のＸＲＤパターンを、４０ｋＶおよび４０ｍＡで作動する、ＣｕＫα源（λ＝１．５４０６０Å）およびＬｉｎｘｅｙｅ検出器を備えたＢｒｕｋｅｒ  Ｄ８  Ａｄｖａｎｃｅ粉末Ｘ線回折装置上で得る。サンプルを、２θでの４〜４０°で、２θでのステップサイズ０．００８４°および走査速度０．５秒／ステップを用い、ならびに０．２ｍｍの発散スリットを用いて走査する。乾燥粉末を低バックグラウンドのシリカサンプルホルダに詰めて、滑面をスライドガラスを用いて得る。結晶形回折パターンを２２℃および４２％の相対湿度で得る。結晶学技術分野において周知なのは、任意の所与の結晶形に関して、回折ピークの相対強度が、結晶形態などの特定の因子から生じる優先配向に起因して異なる可能性があることである。優先配向の効果が存在する場所では、ピーク強度が変化するが、多形体の特徴的ピーク位置は変化しない。例えば、米国薬局方＃２３、国民医薬品集＃１８、１８４３〜１８４４頁、１９９５年を参照のこと。さらに、任意の所与の結晶形に関して、ピーク角度位置が若干変化する場合があるということも結晶学技術分野では周知である。例えば、サンプルを解析する温度もしくは湿度の変動、サンプル変位、または内部標準の存在もしくは非存在に起因して、ピーク位置はシフト可能である。本件では、２θでの±０．２のピーク位置変動は、示される結晶形の明白な同定を妨げることなく、これらの潜在的変動を考慮にいれることにする。結晶形の確認は、区別可能なピーク（°２θ単位での）、典型的にはより顕著なピークの任意の特有の組み合わせに基づいてなされ得る。室温および相対湿度で得られる結晶形回折パターンを、８．８５３および２６．７７４°２θでの国立標準局（ＮＢＳ）６７５標準ピークに基づいて調整する。
【００６２】
水和した結晶性４−｛４−［（１Ｅ）−４−（２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカ−２−イル）ブト−１−エン−１−イル］−２−メチルベンジル｝−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルベータ−Ｄ−グルコピラノシドアセテートの調製サンプルは、ＣｕＫα放射線を使用してＸＲＤパターンによって、以下の表１に記載される回折ピーク（２θ値）を有する、特に７．８°、８．０°および１０．７°（それぞれ±０．２°）からなる群から選択されるピークの１つ以上と組み合わせて５．２°においてピークを有すると特徴付けられる。
【００６３】
水和した結晶性４−｛４−［（１Ｅ）−４−（２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカ−２−イル）ブト−１−エン−１−イル］−２−メチルベンジル｝−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルベータ−Ｄ−グルコピラノシドアセテートの粉末Ｘ線回折ピーク
【００６４】
【表１】
2016539099.tif 000031
【００６５】
１３Ｃ固体状態（１３Ｃ  ｓｓＮＭＲ）
１００．６２２ＭＨｚの炭素周波数および４００．１３１ＭＨｚのプロトン周波数で作動し、Ｂｒｕｋｅｒ  ４ｍｍ二重共鳴プローブを備えたＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩ  ４００ＭＨｚ  ＮＭＲ分光計を使用して１３Ｃ交差分極／マジック角スピニングＮＭＲ（固体状態ＮＭＲまたはｓｓＮＭＲ）スペクトルを得た。ＴＯＳＳ側波帯抑圧を、ＳＰＩＮＡＬ６４デカップリングおよびＲＡＭＰ１００整形Ｈ核ＣＰパルスを利用する交差分極と共に使用する。獲得パラメーターは以下の通りである：２．６μｓの９０°プロトンｒ．ｆ．パルス幅、接触時間は２．０ｍｓであり、３ｓのパルス繰り返し時間、１０ｋＨｚのＭＡＳ周波数、３０ｋＨｚのスペクトル幅、獲得時間は３４ｍｓであり、走査数は１８，６６１であった。化学シフトは別の実験においてアダマンタン（δ＝２９．５ｐｐｍ）を参照基準とする。
【００６６】
水和した結晶性４−｛４−［（１Ｅ）−４−（２，９−ジアザスピロ［５．５］ウンデカ−２−イル）ブト−１−エン−１−イル］−２−メチルベンジル｝−５−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルベータ−Ｄ−グルコピラノシドアセテートについての代表的な１３Ｃ  ｓｓＮＭＲ共鳴には、１８１．８、１６１．２、１６０．０、１４７．６、１３７．４、１３５．９、１３５．３、１３２．６、１３１．６、１２９．４、１２７．３、１２６．４、１２２．２、１０１．９、９９．７、９８．５、９７．９、７８．３、７７．７、７７．２、７６．３、７５．６、６９．１、６８．１、６４．２、６２．６、６０．１、５６．１、５４．２、４１．７、４０．５、３９．１、３４．７、３２．３、３１．５、３１．０、２９．２、２７．８、２６．４、２３．８、２０．８、１９．９、１８．４および１６．９ｐｐｍ（それぞれ±０．２ｐｐｍ）が含まれる。
【００６７】
ナトリウム依存性グルコース輸送体１（ＳＧＬＴ１）およびＳＧＬＴ２アッセイ
ヒトＳＧＬＴ１（ｓｌｃ５ａ１、ＮＭ＿０００３４３）、ヒトＳＧＬＴ２（ｓｌｃ５ａ２、ＮＭ＿００３０４１）およびマウスＳＧＬＴ１（ｓｌｃ５ａ１、ＮＭ＿０１９８１０．４）をコードするｃＤＮＡをそれぞれ、Ｏｐｅｎｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよびＯｐｅｎｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入する。ｃＤＮＡを哺乳動物発現のためにｐｃＤＮＡ３．１＋内にクローニングし、標準的な哺乳動物トランスフェクション手順を使用してチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）−Ｋ１細胞内に安定的にトランスフェクトする。各々の過剰発現細胞株のＳＧＬＴ発現サブクローンを、１４Ｃ−α−メチル−Ｄ−グルコピラノシド（１４Ｃ−ＡＭＧ）取り込みアッセイ（以下を参照のこと）においてネオマイシン（ジェネティシン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対する耐性および活性に基づいて選択する。安定なＳＧＬＴ発現細胞を、標準的な細胞培養技術を使用して維持する。
【００６８】
ＳＧＬＴ活性を、以下に記載される上記の細胞株内のナトリウム依存性１４Ｃ−ＡＭＧ取り込みとして測定する。３０，０００細胞を含有する１００μＬの培養培地を、９６ウェルＢｉｏＣｏａｔポリ−Ｄ−リシンプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ）の各ウェルに播種し、３７℃にて一晩培養する。培養培地を吸引し、細胞を、２００μＬの反応緩衝液（１４０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、および１４ｍＭのＮ−２−ヒドロエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（Ｈｅｐｅｓ）、ｐＨ７．５）で２回洗浄する。過剰な緩衝液をペーパータオルで拭き取る。３５μＬの反応緩衝液を各ウェルに加える。様々な濃度の試験化合物を含有するか、または対照として化合物を含有しない反応緩衝液中の５μＬの１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を各ウェル内に分注する。４μＭの最終濃度にするために反応緩衝液中の１０μＬの１４Ｃ−ＡＭＧを加えることによって反応を開始する。プレートを３７℃にて１２５分間インキュベートする。反応緩衝液を吸引することによって反応を停止させ、次いで２００μＬの氷冷反応緩衝液で３回洗浄する。手動吸引を適用して、反応緩衝液の完全な除去を確実にする。１０μＬの０．１ＮのＮａＯＨを各ウェルに加え、次いで１００μＬのＳｕｐｅｒｍｉｘシンチレーションカクテル（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を加える。混合後、プレート内のシンチレーションシグナルをＭｉｃｒｏＢｅｔａ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）でカウントする。１０点反応曲線を、ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ（ＩＤ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を使用して実験的４パラメーターモデルにフィットして、半最大阻害（ＩＣ５０）にて阻害剤濃度を決定する。実施例１の遊離塩基を本質的に上記のように試験する。
【００６９】
【表２】
2016539099.tif 000032
【００７０】
より具体的には、表２のデータは、実施例１の遊離塩基が、インビトロでヒトおよびマウスＳＧＬＴ１を阻害し、インビトロでヒトＳＧＬＴ２よりヒトおよびマウスＳＧＬＴ１において有効であることを実証している。
【００７１】
経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）におけるグルコース低下効果
１％ヒドロキシエチルセルロース、０．２５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０ｗ／消泡剤０．０５％のビヒクルを加えることによって試験化合物を製剤化し、試験化合物を予備秤量して１ｍｇ／ｍｌ溶液にする。混合物を約３０秒間、プローブ超音波処理する。得られた溶液をストック溶液として使用し、そこから低濃度の用量溶液をビヒクルで希釈することによって調製する。
【００７２】
単一収容したＣ５７Ｂｌ／６マウスを、試験日の前の夕方近くに食餌へのアクセスを取り除くことによって一晩絶食させる。翌朝、マウスの体重を計り、単一の空腹時血液サンプルを、尾を切断することによって採取して、グルコメーター（Ｒｏｃｈｅ  ＡｃｃｕＣｈｅｋ）によってグルコースを測定する。研究群（ｎ＝５）は空腹時血糖に基づいて決定し、好ましくは８０〜１００ｍｇ／ｄｌのグルコースの範囲の動物を含む。
【００７３】
分類後、最初のマウスに１０ｍｌ／ｋｇの試験化合物調製物を経口強制投与し、タイマーを開始する。各々、次の動物は１分半間隔をあけて投与する。最初の化合物処置の開始から３時間後、ベースライン血液サンプルを、グルコース（尾の切断を介して最初の動物由来）を測定するために採取する。次いで即座に動物に３ｇ／ｋｇにて５０％デキストロース（Ｈｏｓｐｉｒａ）の経口用量を与える。血液サンプルを、尾静脈により正確に１分半の間隔でグルコースのために採取し、血液を、デキストロース投与後、２０、４０、６０および１２０分にて各動物において収集する。
【００７４】
【表３】
2016539099.tif 000033
【００７５】
上記の表３に示されるように、実施例１の遊離塩基は、正常な血糖のＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて５０％デキストロース（Ｈｏｓｐｉｒａ（登録商標））の経口ボーラス投与後、グルコース変動幅の用量依存的な減少をもたらす。実施例１の遊離塩基はまた、ＯＧＴＴの間、ベースライン調整したグルコースの曲線下面積（ＡＵＣ）の用量依存的な減少を実証する。さらに、実施例１の遊離塩基は、ＯＧＴＴの間、血漿グルコースの平均最大濃度（Ｃｍａｘ）を用量依存的に減少させる。
【００７６】
ストレプトゾトシン誘発性糖尿病を有するオスのラットの混合金属耐性試験におけるグルコース値
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を投与されているラットは糖尿病を発症する。これらの動物におけるグルコースレベルを調節する薬剤は、ヒトにおける糖尿病の治療に有用であると考えられる。
【００７７】
１％ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、０．２５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０ｗ／消泡剤０．０５％のビヒクルを加えることによって試験化合物を製剤化し、試験化合物を予備秤量して２．５ｍｇ／ｍｌ溶液にする。混合物を約３０秒間、プローブ超音波処理する。得られた溶液をストック溶液として使用し、そこから低濃度の用量溶液をビヒクルで希釈することによって調製する。ＳＴＺ、４５ｍｇ／ｋｇを３ｍｌアリコートの０．１Ｍのクエン酸緩衝液に溶解することによって製剤化し、投与しない場合、氷上で暗所に保存する。脂肪カロリー（６０％）、炭水化物カロリー（２６％）およびタンパク質カロリー（１５％）を含む高脂肪含有量の混合食餌（Ｂｉｏ−Ｓｅｒｖ（登録商標）齧歯動物食餌Ｆ３２８２高脂肪）を利用する。単一収容したＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを３〜７日の期間、慣れさせる。
【００７８】
動物が直近に餌を与えられていないことを確実にするために、ＳＴＺを明サイクル（６ａｍに点灯し、６ｐｍに消灯する）の約６時間の午後に投与する。イソフルランで動物に麻酔をかけ、ＳＴＺを尾静脈注射により送達する。動物が意識を取り戻すと、それらを住居に戻し、７日間回復させる。
【００７９】
金属耐性試験（ＭＴＴ）の直前の２日前に、全てのラットに少量（２〜４ｇ）のＦ３２８２食餌を与えることにより、それらを実験の間、その食餌を与える前にその食餌に慣れさせる。実験の前の晩に、ラットを無菌のケージに移し、それらの食餌を取り除く。翌朝、動物の体重を計り、グルコース測定（Ａｂｂｏｔｔ  ＡｌｐｈａＴＲＡＫ（商標）グルコメーター：コード２９）のために血液サンプルを、尾の切断により採取する。絶食した体重およびグルコースに基づいて動物を分類する（ｎ＝６）。試験化合物を経口投与してから３０分後、２つのグルコース測定値を収集する。次いで５グラムペレットのＢｉｏ−Ｓｅｒｖ（登録商標）食餌３２８２を与える。２０分後、残りの食餌を取り去り、体重を計る。グルコース測定のために血液サンプルを２０、４０、６０および１２０分に採取する。
【００８０】
【表４】
2016539099.tif 000034
【００８１】
上記の表４に示されるように、実施例１の遊離塩基は、ビヒクル対照と比較してＭＴＴにおけるグルコースを有意におよび用量依存的に減少させる。陽性対照であるアカルボースは、あらゆる時点において対照と比較してグルコースを有意に減少させなかった。さらに、実施例１の遊離塩基処置に関連するグルコースベースライン調整したＡＵＣが用量依存的に減少する。アカルボースは、１０ｍｇ／ｋｇにて実施例１のものと同様のレベルまでグルコースＡＵＣを有意に減少させる。表４は、実施例１の遊離塩基がオスのラットにおいてグルコースレベルを調節することを実証する。
【国際調査報告】
2016539099.tif 000037
2016539099.tif 000038