(57)【要約】  本発明は、3次元コラーゲンゲル環境で培養された癌細胞株でリジル-tRNA合成酵素（lysyl-tRNA synthetase;KRS）の作用を分析して、癌転移抑制剤のスクリーニングおよび癌細胞の癌細胞塊からの離脱、上皮-中胚葉細胞転移（epithelial- mesenchymal transition）、移動、浸潤、および転移のモニターリング方法に関するもので、詳細にはHCT116細胞株を含む、多様な大腸癌細胞を用いてKRSを発現するか、または発現しないように調節された細胞株や回転楕円体（spheroid）塊細胞株を作製し、2次元的な環境で培養する場合、KRSの発現を抑制する細胞株で不完全な上皮-中間葉細胞転移表現型（incomplete epithelial-to-mesenchymal transition phenotype;incomplete ECM phenotype）が誘導され、これはKRSの発現抑制が細胞-細胞外基質（extracellular matrix;ECM）付着および細胞-ECM信号伝達活性を抑制することを確認した。また、前記作製された回転楕円体細胞株を水溶性環境または3次元コラーゲンゲル培養環境で培養した場合、KRSの発現抑制は、中間葉細胞に細胞を誘導するが、これは細胞-細胞付着の瓦解につながらず、細胞-ECM付着およびそれに関連した信号活性を抑制することにより、3次元コラーゲンゲル培養環境で培養した回転楕円体細胞から離脱の抑制をもたらし、細胞の微細環境内に存在するTGFβ1による細胞の離脱を誘導しないことを確認することにより、癌転移抑制剤のスクリーニングおよび癌細胞の移動、浸潤、および転移のモニターリング方法に用いることができ、これは薬物開発に必要な前臨床実験時の低コスト高効率の付加価値を創出し得るスクリーニング方法の一つとして有用に用いられる。
2016519318.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
1）3次元あるいは細胞外基質に囲まれた細胞培養環境でリジル-tRNA合成酵素（lysyl-tRNA synthetase;KRS）を発現または発現しないように調節された癌細胞株または癌細胞塊を培養する工程;
2）前記工程1）の癌細胞株または癌細胞塊に被検物質を処理する工程;
3）前記工程2）の癌細胞株または癌細胞塊でKRSの作用を分析する工程;と
4）前記工程3）のKRS作用を阻害する被検物質を選別する工程を含む、癌転移抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記工程1）の3次元環境が、水溶性環境またはコラーゲンに囲まれていることを特徴とする請求項１に記載の癌転移阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記工程1）の癌細胞株または癌細胞塊が、転移性癌または転移性誘発可能な癌であることを特徴とする請求項１に記載の癌転移阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記転移性癌が、大腸癌、乳癌、肝臓癌、胃癌、骨腫瘍、肺癌、膵臓癌、頭部または頸部癌、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、食道癌、小腸癌、肛門部癌、結腸癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、陰門癌、ホジキンリンパ腫、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌および中枢神経系腫瘍からなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の癌転移抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記工程2）の被検物質が、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、抗体、抗体の部分、活性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などからなる群から選択されたいずれか一つであることを特徴とする請求項１に記載の癌転移抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記工程3）のKRSの作用が、癌細胞の細胞-細胞間付着、細胞-細胞外基質（extracellular matrix;ECM）付着、細胞の分散（scattering）、細胞の創傷治癒（wound -healing）、細胞付着の信号伝達因子の活性変化、c-Junのパキシリンプロモーターへの結合、および回転楕円体（spheroid）細胞塊からの離脱（dissemination）からなる群から選択されるいずれか一つ以上を分析することを特徴とする請求項１に記載の癌転移抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記細胞-細胞間の付着が、ZO-1、オクルディン、CK14、β-カテニン（β-catenin）、またはE-カドヘリン（E-cadherin）からなる群から選択されたいずれか一つ以上の上皮マーカーの発現または発現位置の変化、またはフィブロネクチン、ツイスト（Twist）、ビメンチン、α-SMA（smooth muscle actin）、スナイル１（snail1）、スラグ（Slug）、またはN-カドヘリン（N- cadherin）からなる群から選択されたいずれか一つ以上の中間葉マーカーの発現または発現位置の変化、または細胞の分散であることを特徴とする請求項６に記載の癌転移阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記細胞-細胞外基質付着が、細胞が細胞外基質に付着した程度と細胞の広がり（spreading）程度、焦点接着（focal adhesion）の生成と瓦解、アクチンの再構成、リン酸化されたFAK 、c-Src、ERKs、またはパキシリンの発現、または発現位置の変化であることを特徴とする請求項６に記載の癌転移阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記細胞付着の信号伝達活性が、FAK、c-Src、ERKs、c-Jun、およびパキシリンの発現またはリン酸化の変化または減少、またはインテグリンα6との結合の変化であることを特徴とする請求項６に記載の癌転移阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記工程3）のKRSの作用の分析が、ウェスタンブロット、リアルタイムPCR（real time PCR）、免疫沈降法（co-immunoprecipitation）、ChIP（chromatin immunoprecipitation）、FRET分析、免疫蛍光染色（immunofluorescence ）、および免疫組織化学（immunohistochemistry）からなる群から選択されたいずれか一つで測定することを特徴とする請求項１に記載の癌転移阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
1）3次元あるいは細胞外基質に囲まれた環境でリジル-tRNA合成酵素（lysyl-tRNA synthetase;KRS）を発現または発現しないように調節された癌細胞株または癌細胞塊を培養する工程;
2）前記工程1）の癌細胞株または癌細胞塊でKRSの作用を分析する工程;と
3）前記工程2）のKRSの作用レベルを用いて前記癌細胞株または癌細胞塊の転移レベルを分析する工程を含む、癌細胞の癌細胞株または癌細胞塊からの離脱（dissemination）、上皮-中胚葉細胞転移または分化（epithelial-mesenchymal transition）、移動、浸潤、転移レベルまたはそれらに関連した信号伝達因子の発現および活性のモニタリング方法。
【請求項１２】
前記工程1）の3次元環境が、水溶性環境またはコラーゲンに囲まれていることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程1）の癌細胞株または癌細胞塊が、転移性癌または転移性誘発可能な癌であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記工程2）のKRSの作用が、癌細胞の細胞-細胞間付着、細胞-細胞外基質（ECM）付着、細胞の分散、細胞の創傷治癒、細胞付着の信号伝達因子の活性の変化、c-Junのパキシリンプロモーターへの結合、および回転楕円体細胞塊からの離脱からなる群から選択されるいずれか一つ以上を分析することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞-細胞間の付着が、ZO-1、オクルディン、CK14、β-カテニン、またはE-カドヘリンからなる群から選択されたいずれか一つ以上の上皮マーカーの発現または発現位置の変化、またはフィブロネクチン、ツイスト、ビメンチン、α-SMA（smooth muscle actin）、スナイル１、スラグ、またはN-カドヘリンからなる群から選択されたいずれか一つ以上の中間葉マーカーの発現または発現位置の変化、または細胞の分散であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞-細胞外基質付着が、細胞が細胞外基質に付着した程度と細胞の広がり程度、焦点接着の生成と瓦解、アクチンの再構成、リン酸化されたFAK 、c-Src、ERKs、またはパキシリンの発現または発現位置の変化であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞付着の信号伝達活性が、FAK、c-Src、ERKs、c-Jun、またはパキシリンの発現またはリン酸化の変化または減少、またはインテグリンα6との結合の変化であることをを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リジル-tRNA合成酵素（lysyl-tRNA synthetase）を発現するか、または発現しないように調節された細胞、あるいは回転楕円体（spheroid）の塊になった細胞株（塊状細胞株）を3Dコラーゲンゲル環境で培養し、癌細胞の細胞-細胞間付着、細胞-細胞外基質（extracellular matrix;ECM）の付着、細胞付着の信号伝達活性と細胞離脱（dissemination）の変化測定を用いた癌転移抑制剤のスクリーニング方法および癌細胞の移動、浸潤、転移性のモニターリング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌による死亡の90％は、転移によるものと言われている。転移は、血流とその他の因子によって癌細胞が特定の器官に伝達されたことを始めとして、その新しい場所で癌細胞の相互作用を通じて再び成長することである。ほとんどの癌は、器官（organ）の壁を構成する上皮細胞で発生する。上皮細胞は、細胞の付着および移動に関与するタンパク質であるFAK、Src、パキシリン（paxillin）、ERKsなどを発現するようになり、それらの活性と発現が調節されることにより、細胞-細胞付着、細胞-細胞外基質（extracellular matrix;ECM）付着、移動および浸潤などの多様な機能が調節される（Petrie and Yamada,2012年;WehrleHaller,2012年）。前記タンパク質は、上皮細胞の細胞-細胞間の付着が瓦解されることにより、移動性が強い中間葉細胞（mesenchymal cells）への転換に関連して上皮-中間葉細胞転移（epithelial-to-mesenchymal transition;EMT）を誘導する（Bolos ら.,2010年）。これらのEMT現象は、胚の発達に重要な役割を果たすだけでなく、組織を毀損して病気を引き起こし得るが、代表的な疾患としては、組織の線維化症（fibrosis）と癌の形成および発達がある。組織線維化症は、通常の機能を担当する実質細胞の減少とコラーゲンの蓄積を起こし、組織の機能を失わせる。この過程で、変形された細胞の形態、骨格構造、コラーゲンの生成機能と移動性などが組織線維化症の原因であることが知られている（Kalluri and Neilson,2003年）。このようなEMT現象が癌でも起こる。癌の塊を構成する細胞からEMTを経て、移動性が強い癌細胞が離れ出て血流やリンパ系に入り、新しい場所に移動して、腫瘍を新たに形成するようになる。つまり、分極化された上皮細胞（polarized epithelial cell）が運動性細胞（motile cell）に転換されるEMTは、癌腫（carcinoma）が分化され、さらに悪質な状態に進行するのに重要な役割を果たしている（Meng and Wu,2012年）。一方、循環腫瘍細胞（circulating tumor cell;CTC）、すなわち、転移性細胞の異質性（heterogeneity）が最近報告され、転移のためには上皮タイプ（epithelial type）の性向をある程度維持する不完全EMT表現型（incomplete EMT phenotype ）の細胞が末端の転移場所（distal metastatic site）で再びコロニー化（colonization）への利点を持ち得ることが確認された（Thiery and Lim,2013年;Yuら,2013年）。
【０００３】
様々な組織の細胞は、それぞれ特異的な微細環境（microenvironment）によって細胞の特性が維持される。したがって、このような微細環境が細胞を適切に調節し得ない場合、細胞としての性質を失ってしまったり（degeneration）、非正常的な分化、統制されていない増殖などの非正常的な細胞機能を誘発し、癌のような疾病が発生する（Sansone and Bromberg,2011年）。実際に患者ごとに、癌の転移傾向と治療効果が異なる理由は、癌細胞自体の違いもあるだろうが、周辺の腫瘍微小環境にも大きな影響を受けることによって、互いに異なる治療結果をもたらし得る。
【０００４】
細胞の移動および浸潤を含む転移性癌細胞の多様な機能は、細胞が転移中の細胞周囲の微細環境に大きな影響を受ける。前記の微細環境で多様な種類の成長因子やTGFβ1およびTNFαのようなサイトカイン（cytokine）が分泌され、腫瘍細胞が育ちやすく、移動および浸潤しやすい環境を提供する。このように、腫瘍微細環境が細胞の増殖、生存、移動、浸潤等を含む多様な機能維持および分化を調節するため、微細環境に対する十分な理解なしに細胞に対する研究や臨床治療に応用することは限界がある（Friedlら,2012年）。現在、抗癌剤は、癌細胞自体の増殖または細胞の信号伝達の変化に集中して薬が開発されてきたため、腫瘍周辺の微細環境の変化による癌の発生と進行を調節できず、根本的な癌の発生および転移を制御することができなかった。したがって、癌細胞と周囲の細胞環境の有機的なネットワーキングを究明および分析する研究を行なって、細胞の機能、特に、付着（adhension）、EMT、移動、および浸潤に対する分子的機序を究明することにより、新たな抗癌戦略を癌転位抑制の次元で提示する可能性を有している（Friedlら,2012年）。
【０００５】
試験管内2次元的環境での細胞培養は、従来のプラスチックフラスコ（plastic flask）または皿（ディッシュ）の表面に細胞を培養するもので、平らな形状の細胞を観察することになる。そのため最近では、生体内環境を模倣するために人為的な細胞形態を有する2次元の短所を補完した3次元細胞培養の研究が台頭している（Nygaら,2011年）。生体内の環境では、試験管内2次元的環境とは異なって細長い細胞の形態を有することもある。したがって、試験管内3次元細胞培養が実際の細胞形態および機能の研究、そしてさらに微細環境との相互作用の研究において、良い代案になり得る（Arefら,2013年）。したがって、細胞および3次元細胞周辺の微細環境との相互作用を通じて付着、EMT、移動、および浸潤などの癌細胞の転移に関連した細胞機能がどのように調節されるかを分子的レベルで究明することが必要であり、これは癌転移阻害剤の開発に用いることができる。
【０００６】
アミノアシル-tRNA合成酵素（aminoacyl-tRNA synthetase）は、細胞内で、該当アミノ酸とtRNAを結合させ、そのように形成されたアミノアシル-tRNAは、伸長因子（elongation factor）、リボソーム（ribosome）に移されて、タンパク質の合成に用いられる。したがって、アミノ酸およびtRNAに対するアミノアシル-tRNA合成酵素の結合特異性は、タンパク質合成過程の精度を維持するために重要な決定因子である。このようなアミノアシル-tRNA合成酵素の構成原のひとつであるリジル-tRNA合成酵素（lysyl-tRNA synthetase;KRS）はいくつかの哺乳類でアミノアシル-tRNA合成酵素を構成するタンパク質の多様な機能を調節するために分子貯蔵所（molecular reservior）として作用する巨大分子複合体を形成し、ヒトのリジル-tRNA合成酵素は、RNAとその他のタンパク質との間の相互作用に関与する固有のN-末端（N-terminal）延長部位を含有しており、また、大腸癌細胞の転移機能を向上させ、癌転移に重要な役割をすることが知られている（非特許文献１）。
【０００７】
そこで、本発明者らは、3D環境で培養された癌細胞でリジル-tRNA合成酵素（lysyl-tRNA synthetase;KRS）の作用を分析して、癌転移抑制剤のスクリーニング方法を開発するために努力中、大腸癌細胞であるHCT116細胞株を用いて、KRSを発現するかまたは発現しないように調節された回転楕円体の塊状細胞株を準備して、細胞外基質がコーティングされた2次元的環境や、水溶性の3次元あるいは細胞外基質に囲まれた3次元的細胞培養環境で培養観察した時、KRSの発現を抑制する細胞株で不完全な上皮-中間葉細胞転移表現型（incomplete epithelial-to-mesenchymal transition phenotype;incomplete ECM phenotype）が誘導され、これは、細胞-細胞外基質（extracellular matrix;ECM）付着および細胞-ECM信号伝達活性が抑制されることを確認した。また、前記作製された回転楕円体の塊状細胞株を3D培養環境で培養した場合、KRSの発現抑制は、細胞離脱を抑制し、中間葉（mesenchymal）細胞に細胞を誘導するが、これは細胞-細胞付着の瓦解を招来することができず、細胞-ECM付着およびそれに関連したERKsの活性化、パキシリンの発現およびリン酸化（活性化）などの信号活性を阻害することにより、細胞微細環境内離脱を抑制することを確認し、このようなKRS-依存的な癌細胞の離脱が大腸癌患者の癌組織の染色でKRSおよびERKs /パキシリンが、癌が浸潤する端での目立った現状とつながっていることを確認することにより、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Kimら, FASEB J. 2012年, 第26（10）巻,P.4142-59
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、癌転移抑制剤のスクリーニング方法を提供することである。
【００１０】
本発明のまた他の目的は、癌細胞の癌塊からの離脱（dissemination）、上皮-中胚葉細胞転移あるいは分化（epithelial-mesenchymal transition）、移動、浸潤、転移およびそれらに関連する信号伝達因子の発現および活性のモニターリング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成するために、本発明は下記の工程を含む、癌転移抑制剤のスクリーニング方法を提供する：
1）3次元あるいは細胞外基質に囲まれた環境で、リジル-tRNA合成酵素（lysyl-tRNA synthetase;KRS）を発現または発現しないように調節された癌細胞株もしくは癌細胞塊を培養する工程;
2）前記工程1）の癌細胞株または癌細胞塊に被検物質を処理する工程;
3）前記工程2）の癌細胞株または癌細胞塊でKRSの作用を分析する工程;および
4）前記工程3）のKRS作用を阻害する被検物質を選別する工程。
【００１２】
また、本発明は下記の工程を含む、癌細胞の癌細胞株または癌細胞塊からの離脱、上皮-中胚葉細胞転移または分化（epithelial-mesenchymal transition）、移動、浸潤、転移レベルまたはそれらに関連した信号伝達因子の発現および活性のモニタリング方法を提供する：
1）3次元あるいは細胞外基質で囲まれた環境で、リジル-tRNA合成酵素（lysyl-tRNA synthetase;KRS）を発現または発現しないように調節された癌細胞株または癌細胞塊を培養する工程;
2）前記工程1）の癌細胞株または癌細胞塊でKRSの作用を分析する工程;及び
3）前記工程2）のKRSの作用レベルを用いて前記癌細胞株または癌細胞塊の転移レベルを分析する工程。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、3次元あるいは細胞外基質に囲まれた環境で培養された癌細胞株で、リジル-tRNA合成酵素（lysyl-tRNA synthetase;KRS）に依存的な細胞-細胞間付着、細胞-細胞外基質（extracellular matrix;ECM）付着、細胞付着の信号伝達活性および細胞離脱を分析することにより、究極的には、それを通じて、癌転移抑制剤のスクリーニング方法および癌細胞の癌塊からの離脱、上皮-中胚葉細胞転移あるいは分化（epithelial- mesenchymal transition）、移動、浸潤、転移およびそれらに関連する信号伝達因子の発現および活性のモニタリング方法に用いることができ、これは薬物開発に必要な前臨床実験時の低コスト高効率の付加価値を創出し得るスクリーニング方法の一つとして有用に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図1のAは、懸滴培養（hanging drop culture）の方法で得られた回転楕円体の塊状細胞を3D環境で培養する細胞培養模式図を示す図である。  図1のBは、2次元環境で培養した細胞および懸滴培養の方法で得られた回転楕円体の塊状細胞の培養の様子を比較した図である。  図1のCは、懸滴培養方法で培養した回転楕円体の塊状細胞で時間が経過するにつれて、E-カドヘリン（E-cadherin）の発現が増加することを示す図である。  図1のDは、3Dコラーゲンゲル環境で培養した回転楕円体の塊状細胞の様子を光学顕微鏡で観察した図である。  図1のEは、リジル-tRNA合成酵素（lysyl-tRNA synthetase;KRS）を抑制するshRNAをトランスフェクション（transfection）させた細胞株を懸滴培養方法で培養して得られた回転楕円体の塊状細胞株でKRSの発現を確認した図である。  Mock：対照群、および  0-3、2-1、2-2、5-3：KRSの発現が抑制された細胞株クローン。  図1のFは、懸滴培養方法で培養した回転楕円体の塊状細胞で上皮-中胚葉細胞転移（epithelial-to-mesenchymal transition;EMT）関連マーカーのmRNA発現を確認した図である。  P：HCT116親細胞株である対照群、  2-1、2-2、2-3、5-4：KRSの発現が抑制された細胞株クローン、および  KRS WT：KRS過発現細胞株。  図1のGは、懸滴培養方法で培養した回転楕円体の塊状細胞でEMT関連マーカーのタンパク質発現を確認した図である。  Mock：対照群、および  shKRS：KRSの発現が抑制された細胞株クローン。
【図２】図2のAは、血清（serum）を含む正常な2次元的（2D）細胞培養でKRSに依存的なEMTマーカータンパク質の発現の変化を確認した図である。  P：対照群、  2-1、2-2、2-3、5-4：KRSの発現が抑制された細胞株クローン、および  WT：KRS過発現細胞株。  図2のBは、正常的に血清10％を含む2次元環境で培養した細胞に何も処理しないか、TNFαまたはTGFβ1を処理した時、EMT関連マーカーのタンパク質発現の変化を示す図である。  Parental：対照群、  shKRS 2-1：KRSの発現が抑制された細胞株2-1クローン、および  KRS WT：KRS過発現細胞株。  図2のCは、正常的に血清10％を含む2次元環境で培養した細胞でKRSの発現を調節した場合、E-カドヘリン（E-cadherin）とβ-カテニン（β-catenin）の発現が抑制されることを示す図である。  Parental：対照群、  shKRS：KRSの発現が抑制された細胞株クローン、および  KRS WT：KRS過発現細胞株。  図2のDは、正常的に血清10％を含む2次元的（2D）環境で細胞培養時、プレートに付いてコロニー（colony）を形成して育つ細胞の様子を位相差顕微鏡で観察した図である。  KRS-neg：KRSの発現が抑制された細胞株、および  KRS-pos：HCT116親細胞株またはKRS過発現細胞株。
【図３】図3は、細胞を正常的な場合よりも血清の濃度を2％に下げ、血清中の成長因子の効果を最小限にして、細胞をラミニン（laminin）が事前にコーティングされたディッシュやカバーガラス上に2次元的に培養し分析した図であり、
【図３ａ】図3のAは、KRSの発現が抑制された細胞株（shKRS2-1、shKRS5-4）で細胞付着によるSrc、ERKs、パキシリンのリン酸化が顕著に減少する一方、FAKのリン酸化レベルには差がないことを示す図であり、
【図３ｂ】図3のBは、KRSを発現する親細胞株（parental cells）および過発現細胞株は、ERKsのリン酸化レベルが高い一方、KRSの発現が抑制された細胞株において顕著に低くなっていることを示す図であり、
【図３ｃ】図3のCは、KRSを発現する細胞株および過発現細胞株は、パキシリンのリン酸化レベルが高い反面、KRSの発現が抑制された細胞株において顕著に低くなっていることを示す図であり、
【図３ｄ】図3のDは、HCT116細胞にKRSのsuppressionによる細胞の形や広がりの程度に大きな差のないことを示す図であり、
【図３ｅ】図3のEは、KRSを発現する親細胞株（parental cells）および過発現細胞株は、ERKsのリン酸化（活性化）のレベルが高い反面、KRSの阻害剤であるYH16899（Kim DG ら,Nat Chem Biol.2014年Jan;第10（1）巻,P.29-34）を処理した場合、そのERKsのリン酸化が著しく低くなっていることを免疫蛍光染色（immunofluorescence）で確認した図であり、
【図３ｆ】図3のFは、KRSを発現する親細胞株および過発現細胞株は、パキシリンのTyr118リン酸化（活性化）のレベルが高いのに対し、KRSの阻害剤であるYH16899（Kim DG ら,Nat Chem Biol.2014 年Jan;第10（1）巻,P.29-34）を処理した場合、そのERKsのリン酸化が著しく低くなっていることを免疫蛍光染色で確認した図であり、
【図３ｇ】図3のGは、KRSを発現する親細胞株および過発現細胞株は、FAK Tyr397のリン酸化と関連した細胞の形や広がりの程度がYH16899の処理によって大差がないことを示す図である。
【図４】図4のAは、正常的に血清10％を含む2次元環境で培養した細胞でKRSの発現を調節した場合、FAKおよびERKsのリン酸化が抑制されることを示す図である。  P：対照群、  2-1、5-4：KRSの発現が抑制された細胞株クローン、および  myc-KRS WT：myc-KRS過発現細胞株。  図4のBは、正常的に血清10％を含む2次元環境で培養した細胞でKRSの発現を調節した場合、c-Srcおよびパキシリンのリン酸化が抑制されることを示す図である。  P：対照群、および  2-1、5-4：KRSの発現が抑制された細胞株クローン。  図4のCは、KRS発現を調節した細胞株を懸濁液（suspension）状態または2次元的環境でフィブロネクチン（fibronectin）が事前にコーティングされた培養皿に再び移し、2時間培養した後、FAKおよびERKsのリン酸化を確認した図である。  S：懸濁液、  FN：フィブロネクチンがあらかじめコーティングされた培養皿に細胞を培養した条件、  P：対照群、  2-1、5-4：KRSの発現が抑制された細胞株クローン、および  myc-KRS WT：KRS過発現細胞株。  図4のDは、KRSの発現を抑制した細胞株を2次元環境でフィブロネクチンがあらかじめコーティングされた2次元環境の培養皿に再び移し、2時間培養した後、チロシン（tyrosine）397がリン酸化されたFAKを確認することにより、焦点接着（focal adhesion）の発達が抑制されることを示す図である。  P：対照群、  2-1、5-4：KRSの発現が抑制された細胞株クローン、および  myc-KRS WT：myc-KRS過発現細胞株。
【図５】図5は、コラーゲンで囲まれた3次元コラーゲンゲル環境で培養した回転楕円体の塊状細胞株を3時間または24時間培養した時、KRSが発現したり発現しないように調節した場合、細胞-細胞外基質（extracellular matrix;ECM）付着関連信号伝達の活性の変化を示す図である。  Parental：対照群、  2-1、2-2、2-3、5-4：KRSの発現が抑制された細胞株クローン、および  KRS WT：KRS過発現細胞株。
【図６】図6のAは、3次元コラーゲンゲル内で培養した正常なKRSを発現するHCT116細胞、KRS発現を阻害した細胞株（shKRS2-1、shKRS5-4）の回転楕円体の塊状細胞株を、p-ERKs免疫染色（immunostaining）後、共焦点顕微鏡で観察したp-ERKsの免疫染色、ERKsのリン酸化レベルを示す図である。  図6のBは、3次元コラーゲンゲル内で正常的なKRSを発現するHCT116細胞、KRS発現を阻害した細胞株（shKRS2-1）の回転楕円体の塊状細胞株のパキシリン免疫染色後、共焦点顕微鏡で観察したパキシリンを示す図である。  図6のCは、3次元コラーゲンゲル内で正常的なKRSを発現するHCT116細胞の回転楕円体の塊状細胞株に、対照群としてDMSO（Dimethyl sulfoxide）を処理したり、KRSを阻害するYH16899を処理した後、p- ERKs免疫染色して共焦点顕微鏡で観察してERKsのリン酸化レベルを示す図である。  図6のDは、3Dコラーゲンゲル内で正常的なKRSを発現するHCT116細胞の回転楕円体の塊状細胞株に、対照群としてDMSOを処理したり、MEK/ERKリン酸化酵素を阻害する選択的阻害剤（selective inhibitor ）であるU0126を処理あるいはKRSを阻害するYH16899を処理した後、パキシリンを免疫染色して共焦点顕微鏡で観察してパキシリンの発現レベルを示す図である。
【図７】図7のAは、3Dコラーゲンゲル環境で培養した回転楕円体の塊状HCT116親細胞株でERKs阻害剤を処理した時、細胞-ECM付着関連信号伝達の活性の変化を示す図である。  U0126：ERKs阻害剤。  図7のBは、3Dコラーゲンゲル環境で培養した回転楕円体の塊状HCT116親細胞株でERKs阻害剤を処理した時、細胞-細胞付着関連遺伝子のmRNA発現の変化を示す図である。  U0126：ERKs阻害剤。
【図８】図8のAは、3Dコラーゲンゲル環境で培養した回転楕円体の塊状細胞でEMT関連タンパク質の変化を示す図である。  P：対照群、  2-1、2-2：KRSの発現が抑制された細胞株クローン、および  KRS WT：KRS過発現細胞株。  図8のBは、3Dコラーゲンゲル環境で培養した回転楕円体の塊状細胞を5日間培養した時、スナイル1の発現の変化を示す図である。  Parental：対照群、および  shKRS2-1、shKRS2-2：KRSの発現が抑制された細胞株クローン。  図8のCは、3Dコラーゲンゲル環境で培養した回転楕円体の塊状細胞を3日間培養した時、E-カドヘリンの発現が抑制されることを示す図である。  Parental：対照群、  shKRS：KRSの発現が抑制された細胞株クローン、および  KRS WT：KRS過発現細胞株。
【図９】図9のAは、3次元コラーゲンゲル内でKRSが発現する親細胞株もしくは過剰発現する細胞株からは上皮マーカー（epithelial marker）であるサイトケラチン14（cytokeratin 14：CK14）の発現が全体的に高く、回転楕円体の端から離脱する細胞からは発現がいいが、（白い矢印の頭）、KRSが発現抑制された細胞では、CK14の発現が全体的に低く、回転楕円体から離脱する細胞で発現されないことを示す図である。  図9のBは、3次元コラーゲンゲル内でKRSが発現する親細胞株もしくは過剰発現する細胞株からは上皮マーカーであるサイトケラチン14（CK14）の発現が全体的に高く、回転楕円体の端から離脱する細胞から発現がよいが、（白い矢印の頭）、KRSが発現されてもMEK/ERK阻害剤U1026またはKRS阻害剤YH16899が処理された状況では、上皮マーカーであるCK14の発現が全体的に低く、回転楕円体から離脱する細胞で発現されないことを示す図である。
【図１０】図10のAは、3Dコラーゲンゲル環境で培養した回転楕円体の塊状細胞の様子でKRSの発現を抑制した場合に細胞の離脱（dissemination）が表れないことを確認した図である。  Parental：対照群、  2-1、2-2、2-3、5-4：KRSの発現が抑制された細胞株クローン、および  KRSWT：KRS過発現細胞株。  図10のBは、3Dコラーゲンゲル環境で培養した回転楕円体の塊状細胞でTGFβ1タンパク質の発現レベルを確認した図である。  Parental：対照群、  2-1、2-2、2-3、5-4：KRSの発現が抑制された細胞株クローン、および  KRSWT：KRS過発現細胞株。
【図１１】図11のAは、3Dコラーゲンゲル環境で培養した回転楕円体の塊状細胞の様子で、TNFαを処理した時の細胞の離脱を確認した図である。  Parental：対照群、  shKRS：KRSの発現が抑制された細胞株、および  KRS WT：KRS過発現細胞株。  図11のBは、3Dコラーゲンゲル環境で培養した回転楕円体の塊状細胞の様子で、TGFβ1を処理した時の細胞の離脱を確認した図である。  Parental：対照群、  shKRS：KRSの発現が抑制された細胞株、および  KRS WT：KRS過発現細胞株。
【図１２】図12は、3Dコラーゲンゲル環境で培養した回転楕円体の塊状細胞の様子で、TGFβとERKs阻害剤を処理した時に細胞の離脱が抑制されることを示す図である。  U0126：ERKs阻害剤。
【図１３】図13のAは、HCT116親細胞、KRS発現が阻害された細胞株およびKRS過発現細胞株にEKAR（Fluorescence Resonance Energy Transfer（FRET）-based ERKs activity indicators,Harveyら.,2008年 PNAS 第105巻,P.19264-19269）をトランスフェクションしてFRET技法を用いて、ERKs活性を測定した図である。ERKsリン酸化が高い信号は赤色、リン酸化が低い信号は青色で示す。  図13のBは、HCT116親細胞（parental,P）、KRS発現が阻害された細胞株[shKRS2-1およびshKRS5-4]、そしてKRS過発現細胞株（KRS WT）にEKARをトランスフェクションしてFRET技法を用いて、ERK活性を測定した結果を統計的に示した図である。
【図１４】図14は、HCT116親細胞（parental,P）、KRS発現が阻害された細胞株[shKRS2-1およびshKRS5-4]そしてKRS過発現細胞株（KRS WT）に各々pCMV-Mock（M）、pCMV-パキシリン （Px）、pCMV-ERK1/2（Ek）を一時的にトランスフェクションした場合、パキシリンの発現とTyr118のリン酸化を示す図である。
【図１５】図15のAは、myc-KRSが過剰発現されたHCT116細胞株を用いて、10％血清が存在する正常な2D条件で共免疫沈降法（coimmunoprecipitation）を行なった時、インテグリンα6、インテグリンβ1、KRSとp67LR（p67 laminin receptor）が結合するかどうかと、YH16899（YH）が処理された場合の変化を示す図である。  図15のBは、myc-KRSが過剰発現されたHCT116細胞株を用いて、ラミニン（10mg/ml）があらかじめコーティングされて2％血清（serum）が含まれている2次元条件で共免疫沈降法（coimmunoprecipitation）を行なった時、インテグリン（integrin）α6、インテグリンβ1、KRS及びp67LR（p67 laminin receptor）が結合するかどうかと、YH16899（YH）が処理された場合の変化を示す図である。
【図１６】図16のAは、3Dコラーゲンゲルで培養した細胞の回転楕円体を用いて、KRSに依存的に活性化されたERKsが、その下位因子（downstream）としてよく知られている転写因子Elk-1よりc-Junのリン酸化と連携性があることを示す図である。  図16のBは、パキシリンのプロモーター部位に存在するc-JunおよびElk-1の結合可能部位と対照のための非結合部位を示す図である。  図16のCは、3次元コラーゲンゲルで回転楕円体で培養したHCT116親細胞株にDMSOを処理した対照群とYH16899を処理した試料、およびKRS発現が阻害された細胞株shKRS2-1からの試料にc-Jun抗体を用いてChIP（chromatin immmunoprecipitation）分析を行なった結果、対照群でc-Junの結合部位を示す図である。  図16のDは、3次元コラーゲンゲルで回転楕円体で培養したHCT116 parental細胞株にDMSOを処理した対照群とU1026またはYH16899を処理した試料、およびKRS発現が阻害された細胞株shKRS2-1からの試料にElk-1抗体を用いてChIP分析を行なった結果を示す図である。
【図１７】図17のAは、異なる大腸癌細胞株SW620にKRSの発現を抑制した場合、3次元コラーゲンゲル内の回転楕円体から離脱（dissemination）が抑制されることを示す図である。  図17のBは、異なる大腸癌細胞株SW620にKRS阻害剤であるYH16899を処理した場合、ERKsのリン酸化が減少してパキシリンの発現およびリン酸化が減少することを示す図である。
【図１８】図18のAは、3次元コラーゲンゲルでHCT116細胞株のERKインヒビターであるU0126を処理した時、パキシリンのような焦点接着（focal adhesion）関連分子の発現およびリン酸化レベルが低くなって上皮マーカーの発現が低くなることを示す図である。  図18のBは、3次元コラーゲンゲルでHCT116細胞株のKRSインヒビターであるYH16899を処理した時、ERKsのリン酸化およびパキシリンような焦点接着関連分子の発現およびリン酸化レベルが低くなって上皮マーカーの発現が低くなることを示す図である。
【図１９ａ】図19Aは、インテグリンα6の機能抑制抗体をあらかじめ処理した場合に、細胞をラミニン（laminin）が事前にコーティングされた2次元環境に2時間培養してから信号の活性を確認した場合、FAKのリン酸化は変わらず、ERKsの活性が低くなることによって、FAKとERKs間の信号活性が連携されないことを示す図である。
【図１９ｂ】図19Bは、HCT116 parental親細胞にAd-HA対象群アデノウイルスまたはAd-HA-R454 FAKリン酸化酵素活性が死んだ形態（dead form）のアデノウイルスを感染させたり、KRS発現を低下させた細胞株にAd-HA対照群ウイルス、Ad-HAΔN（1-100）FAK、あるいはAd-HA-FAK WTウイルスを感染させた後、FAKのリン酸化とERKsの活性の変化を確認して、FAKとERKsの活性が互いに連携されないことを示す図である。
【図１９ｃ】図19Cは、HCT116 parental親細胞にAd-HA対照群ウイルスもしくはAd-HA-R454 FAKリン酸化酵素活性が死んだ形態（dead form）のアデノウイルスを感染させたり、KRS発現を低下させた細胞株（shKRS2-1）にAd-HA対照群ウイルス、Ad-HAΔN（1-100）FAK、あるいはAd-HA-FAK WTウイルスを感染させた後、細胞株の回転楕円体を3次元コラーゲンゲルで持続撮影（time-lapse）顕微鏡で細胞の離脱を観察した結果、KRSの発現が抑制された細胞株にFAKを過剰発現させても離脱が誘導されないことを示す図である。
【図１９ｄ】図19Dは、HCT116 parental親細胞にAd-HA対照群ウイルスもしくはAd-HA-R454 FAKリン酸化酵素活性が死んだ形態のアデノウイルスを感染させたり、KRS発現を低下させた細胞株（shKRS5-4）にAd-HA対照群ウイルス、Ad-HAΔN（1-100）FAK、あるいはAd-HA-FAK WTウイルスを感染させた後、細胞株の回転楕円体を3次元コラーゲンゲルで持続撮影（time-lapse）顕微鏡で細胞の離脱を観察した結果、KRSの発現が抑制された細胞株にFAKを過剰発現させても離脱が誘導されないことを示す図である。
【図１９ｅ】図19Eは、アクティブな突然変異L37A FAKを発現させた細胞株でもFAKの活性によるERKsの活性が連携されないことを示す図である。
【図２０】図20のAは、KRS発現を低下させた細胞株にそれぞれpCMV-Mock、pCMV-パキシリン、pCMV-ERK1/2をトランスフェクションして安定細胞株（stable cell line）を構築した後、関連する因子の発現を示す図である。  図20のBは、KRS発現を低下させた細胞株にそれぞれpCMV-Mock、pCMV-パキシリン、pCMV-ERK1/2をトランスフェクションして安定細胞株（stable cell line）を構築した後、回転楕円体を形成して、3次元コラーゲンゲル内で回転楕円体の離脱の有無を持続撮影顕微鏡を通じて28時間観察した結果を示す図である。
【図２１】図21のAは、大腸癌で確定診断された臨床的組織を含むヒト結腸癌組織（human colon tumor tissue）の抽出液からパキシリン、p-ERKs、E-カドヘリン、およびKRSのウェスタンブロットを通じて発現量の関連性を示した図である。  図21のBは、Grade IIおよびIIIに確定診断された臨床的組織を含むヒト大結腸癌組織から入手した組織からパキシリン、p-ERKsとKRSの免疫組織化学（immunohistochemistry）染色を通じて前記タンパク質の関連性を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明は、下記の工程を含む、癌転移抑制剤のスクリーニング方法を提供する：
1）3次元あるいは細胞外基質で囲まれた環境でリジル-tRNA合成酵素（lysyl-tRNA synthetase;KRS）を発現するかまたは発現しないように調節された癌細胞株または癌細胞塊を培養する工程;
2）前記工程1）の癌細胞株または癌細胞塊に被検物質を処理する工程;
3）前記工程2）の癌細胞株または癌細胞塊でKRSの作用を分析する工程;と
4）前記工程3）のKRSの作用を阻害する被検物質を選別する工程。
【００１７】
前記の工程1）の3次元環境は、水溶性環境またはコラーゲン（collagen）に囲まれた環境であり得るが、これに限定されず、当業界の当業者によく知られている第1型コラーゲン、ラミニン（laminin）、フィブロネクチン（fibronectin）、マトリゲルまたはヒアルロン酸（hyaluronic acid）のような天然物質のハイドロゲル（hydrogel）はすべて使用可能であり、また、調合的に、多様な濃度の比率で混合して使用することも可能である。また、前記コラーゲンの濃度は、1〜5mg/mlであることが好ましく、2〜4mg/mlであることがより好ましく、2〜2.5mg/mlであることが最も好ましい。また、前記コラーゲンは中性で作製することが好ましいが、これに限定されない。また、前記3次元環境で培養された癌細胞株は、水溶液内回転楕円体培養または懸滴培養（hanging drop culture）して細胞外基質に囲まれたまま回転楕円体の塊を形成した細胞株であることが好ましいが、これに限定されない。
【００１８】
前記の工程1）の癌は、転移性癌または転移性誘発可能な癌であることが好ましく、それは、乳癌、肝臓癌、胃癌、大腸癌、骨腫瘍、肺癌、膵臓癌、頭部または頸部癌、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、食道癌、小腸癌、肛門部癌、結腸癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、陰門癌、ホジキンリンパ腫、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌および中枢神経系腫瘍からなる群から選択されることがより好ましく、本発明の好ましい実施例によれば、大腸癌であることが最も好ましいが、これに限定されない。
【００１９】
前記の工程2）の被検物質は、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体の部分、非ペプチド性化合物、活性化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液および血漿からなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００２０】
前記の工程3）のKRSの作用は、癌細胞の細胞-細胞間付着、細胞-細胞外基質（extracellular matrix;ECM）付着、細胞の分散（scattering）、細胞の創傷治癒（wound-healing）、細胞付着の信号伝達因子の活性の変化、c-Junのパキシリンプロモーターへの結合、および回転楕円体細胞塊からの離脱からなる群から選択されるいずれか一つ以上であることが好ましいが、これに限定されない。また、前記の細胞-細胞間の付着は、上皮マーカー等のZO-1、オクルディン、CK14、β-カテニン（β-catenin）、E-カドヘリン（E-cadherin）、または中間葉マーカー等のフィブロネクチン、ツイスト（Twist）、ビメンチン、α-SMA（smooth muscle actin）、スナイル１（snail1）、スラグ（Slug）、またはN-カドヘリン（N-cadherin）の発現または発現の位置が変化することが好ましく、前記細胞-細胞外基質付着は、細胞が細胞外基質に付着した程度と細胞の広がり（spreading）程度、焦点接着（focal adhesion）の生成と瓦解、アクチンの再構築、リン酸化されたFAK、c-Src、ERKs 、あるいはパキシリンの発現、または発現の位置が変わりものであり得、細胞付着の信号伝達活性はFAK、c-Src、ERKs、c-Jun、またはパキシリンの発現やリン酸化が変化または減少するか、インテグリンα6との結合が変化することであり得るが、これに限定されない。
【００２１】
また、前記の工程3）のKRS作用の分析は、本発明の実施例によればウエスタンブロット、リアルタイムPCR（real time PCR）、免疫沈降法（co-immunoprecipitation）、ChIP（chromatin immunoprecipitation）、FRET分析、免疫蛍光染色（immunofluorescence）、および免疫組織化学（immunohistochemistry）からなる群から選択され得るが、これに限定されず、当業界の当業者によく知られている方法であれば、すべて使用可能である。
【００２２】
また、本発明は下記の工程を含む、癌細胞の癌細胞株または癌細胞塊からの離脱、上皮-中胚葉細胞転移または分化（epithelial-mesenchymal transition）、移動、浸潤、転移レベルまたはそれらに関連した信号伝達因子の発現または活性をモニターリングする方法を提供する：
1）3次元あるいは細胞外基質に囲まれた環境でリジル-tRNA合成酵素（lysyl-tRNA synthetase;KRS）を発現するかまたは発現しないように調節された癌細胞株または癌細胞塊を培養する工程;
2）前記工程1）の癌細胞株または癌細胞塊でKRSの作用を分析する工程;および
3）前記工程2）のKRSの作用のレベルを用いて前記癌細胞株または癌細胞塊の転移レベルを分析する工程。
【００２３】
前記の工程1）の3次元環境は、水溶性環境またはコラーゲンに囲まれた環境であり得るが、これに限定されず、当業界の当業者によく知られている第1型コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲルまたはヒアルロン酸のような天然物質のハイドロゲルはすべて使用可能であり、また、調合的に、多様な濃度の割合で混合して使用することも可能である。また、前記コラーゲンの濃度は、1〜5mg/mlであることが好ましく、2〜4mg/mlであることがより好ましく、2〜2.5mg/mlであることが最も好ましい。また、前記コラーゲンは中性で作製することが好ましいが、これに限定されない。また、前記3次元環境で培養された癌細胞株は、水溶液内回転楕円体培養または懸滴培養して、細胞外基質に囲まれたまま回転楕円体の塊を形成した細胞株であることが好ましいが、これに限定されない。
【００２４】
前記の工程1）の癌は、転移性癌または転移性誘発可能な癌であることが好ましく、それは、乳癌、肝臓癌、胃癌、大腸癌、骨腫瘍、肺癌、膵臓癌、頭部または頸部癌、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、食道癌、小腸癌、肛門部癌、結腸癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、陰門癌、ホジキンリンパ腫、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌および中枢神経系腫瘍からなる群から選択されることがより好ましく、本発明の好ましい実施例によれば、大腸癌であることが最も好ましいが、これに限定されない。
【００２５】
前記の工程2）のKRSの作用は、癌細胞の細胞-細胞間付着、細胞-細胞外基質（ECM）付着、細胞の分散、細胞の創傷治癒、細胞付着の信号伝達因子の活性の変化、c-Junのパキシリンプロモーターへの結合、および回転楕円体細胞塊からの離脱からなる群から選択されるいずれか一つ以上であることが好ましいが、これに限定されない。また、前記の細胞-細胞間の付着は、上皮マーカー等のZO-1、オクルディン、CK14、β-カテニン、E-カドヘリン、または中間葉マーカー等のフィブロネクチン、ツイスト（Twist）、ビメンチン、α-SMA（smooth muscle actin）、スナイル１（snail1）、スラグ（Slug）、またはN-カドヘリンの発現または発現の位置が変化することが好ましく、前記細胞-細胞外基質付着は、細胞が細胞外基質に付着した程度と細胞の広がり（spreading）程度、焦点接着の生成と瓦解、アクチンの再構築、リン酸化されたFAK、c-Src、ERKs 、あるいはパキシリンの発現、または発現の位置が変わるものであり得、細胞付着の信号伝達活性はFAK、c-Src、ERKs、c-Jun、またはパキシリンの発現やリン酸化が変化または減少するか、インテグリンα6との結合が変化することであり得るが、これに限定されない。
【００２６】
また、前記の工程2）のKRSの作用分析は、本発明の実施例によればウエスタンブロット、リアルタイムPCR、免疫沈降法、ChIP（chromatin immunoprecipitation）、FRET分析、免疫蛍光染色、および免疫組織化学からなる群から選択され得るが、これに限定されず、当業界の当業者によく知られている方法であれば、すべて使用可能である。
【００２７】
本発明の具体的な実施例では、本発明者らは、2次元環境で培養した回転楕円体の塊状細胞（図1B参照）からE-カドヘリンの発現が培養時間依存的に増加することを確認して（図1C参照）、リジル-tRNA合成酵素（lysyl-tRNA synthetase;KRS）による影響を確認するためにKRSノックアウトまたは過剰発現細胞株を作製し、これを確認した（図1E参照）。前記作製されたKRSノックアウト細胞株で上皮-中間葉細胞転移（epithelial-to-mesenchymal transition;ETM）関連マーカー遺伝子のmRNA発現レベルを3次元的培養環境でも培養した後に確認した結果、上皮マーカーであるE-カドヘリンの発現が減少したものの、中間葉細胞マーカーであるビメンチン（Vimentin）、N-カドヘリン（N-cadherin）とツイスト（Twist）mRNAのレベルは、有意に増加することを確認した（図1E参照）。
【００２８】
また、血清10％を含む正常な2次元的（2D）環境で培養したHCT116（parental cell）親細胞とKRS過発現細胞株（WT）で上皮マーカー（epithelial marker）の発現が中間葉細胞マーカー（mesenchymal marker）より増加している一方、KRS発現が阻害された細胞株（2-1、2-1、2-3、5-4）においては、上皮マーカーの発現が中間葉細胞マーカーより減少していることを確認した。（図2A参照）。
【００２９】
また、KRSの発現が抑制された細胞株で周辺微細環境因子の影響を確認するために、TNFαまたはTGFβ1を処理した結果、TGFβ1を処理した時の上皮マーカータンパク質であるオクルディン（occludin）の発現量が増加して、中間葉細胞マーカーであるフィブロネクチンの発現量が減少することを確認した（図2B参照）。
【００３０】
また、KRSの発現が抑制された細胞株でE-カドヘリンとβ-カテニンの発現が抑制されたが（図2C参照）、細胞-細胞間の付着には顕著な変化がないことを確認した（図2D参照）。したがって、KRSが発現されないように調整すると、上皮細胞マーカーの発現が抑制され、中間葉細胞マーカーの発現が増加するが、相変わらず細胞がコロニーを形成して育ち、散らばらないので（図2Cおよび2D参照）、部分的な上皮-中胚葉細胞転移あるいは分化（epithelial-mesenchymal transitin,EMT）現象が誘導されることが分かる。
【００３１】
また、HCT116（parental）親細胞、KRS過発現（Myc-KRS-WT）、KRS発現が阻害された細胞株（shKRS2-1、shKRS5-4）細胞を、ラミニンがプレコートされた培養皿とカバーガラスにリプレーティング（replating）してから何も処理をしないか（図3A、3B、3C、および3Dを参照）または、YH16899処理する（図3A、3E、3F、および3Gを参照）検定を実行して、KRSの発現がFAKのリン酸化とは異なり、pERKsおよびパキシリンの発現およびリン酸化と連携性があって（図3A参照）、pERKs（図3Bおよび3Eを参照）およびTyr118がリン酸化されたパキシリンが位置する焦点接着に関連して影響を与えるが（図3Cおよび3Fを参照）、FAK Tyr397のリン酸化および細胞形態（図3Dおよび図3G）は、大きな差がないという事実を確認した。
【００３２】
また、KRSの発現が抑制された細胞株で細胞-細胞外基質（ECM）付着関連信号伝達の活性を確認した結果、FAK、ERKs、c-Srcおよびパキシリンの活性が顕著に減少して（図4Aおよび4Bを参照）、これに伴う焦点接着の形成が抑制されることを確認した（図4D参照）。
【００３３】
また、3次元コラーゲンゲル環境で回転楕円体の塊で培養された細胞株（図1Dを参照）でKRSの発現を抑制した場合、ERKおよびパキシリンの発現および活性が抑制されることを確認し（図5を参照）、3次元コラーゲンゲル内で一日中培養したHCT116 parental親細胞、発現を阻害した細胞株（shKRS2-1、shKRS5-4）そしてU0126とYH16899を処理したHCT116 parental親細胞でERKsのリン酸化とパキシリンの発現を免疫染色を行なった結果、親細胞と比較してKRS発現を阻害した細胞株または阻害剤を処理した試料で、明らかにERKsのリン酸化（図6A、6C）とパキシリンの発現（図6B、6D）が減少していることを確認した。
【００３４】
KRSを発現するHCT116親細胞にERKs阻害剤を処理した時、FAK、パキシリン、E-カドヘリンの発現および活性が顕著に減少することを確認した（図7A参照）。また、前記の条件で信号活性因子のmRNAレベルを確認した結果、ERKs阻害剤によってE-カドヘリンの発現が有意に減少することを確認した（図7B参照）。
【００３５】
また、3次元コラーゲンゲル環境で回転楕円体の塊で培養されたKRS発現細胞株で回転楕円体細胞で上皮細胞のマーカータンパク質は減少して、中間葉細胞マーカータンパク質は増加するが（図8AおよびB参照）、細胞間の付着が散らばらない結果を確認し（図8C参照）、3次元コラーゲンゲル内で一日中培養したHCT116 parental親細胞、発現を阻害した細胞株（shKRS2-1）、myc-KRS WTを過剰発現する細胞株、そしてU0126とYH16899を処理した細胞での上皮細胞株のマーカーであるサイトケラチン14（CK14）の発現を測定するために、免疫染色を行なった結果、KRSを発現する回転楕円体の中で、外に離脱して動く細胞では、CK14の発現が目立って高く（矢印表示）、親細胞やmyc-KRS WT発現細胞株と比較してKRS発現を阻害した細胞株または阻害剤を処理した試料で、明らかにCK14の発現が低下していることを確認した（図9）。同一条件で培養された細胞株でKRSが発現する場合、時間依存的に細胞塊から離脱して、細胞が別の空間に移動及び浸潤することを確認した（図10A参照）。
【００３６】
また、3次元コラーゲンゲル環境で回転楕円体の塊で培養されたKRS発現細胞株でTFGβ1の発現が時間依存的に増加して（図10B参照）、前記の条件で培養された細胞株にTNFαを処理する場合にKRSの発現の有無にかかわらず、細胞の移動および浸潤突起形成が観察された（図11A参照）。しかし、TGFβ1を処理する場合には、KRSが発現される細胞では、細胞塊から離脱現象が観察されたが、KRSの発現が抑制された細胞株の場合、離脱現象が観察されなかった（図11B参照）。また、3次元コラーゲンゲル環境で回転楕円体の塊で培養されたKRS発現細胞株でERKs阻害剤を処理した場合、細胞の移動および離脱現象が観察されなかった（図12参照）。
【００３７】
また、HCT116細胞内でERKバイオセンサー（biosensor）をトランスフェクションして細胞内のERKs活性をFRET分析を通じて測定した結果、KRSの発現が阻害された細胞株で見られるERKsのリン酸化が親細胞よりも減少している一方、過発現された細胞株は、親細胞のERKsリン酸化よりも高いレベルを有することを確認した（図13A、13B）。
【００３８】
また、HCT116 KRS発現を低下させた（shKRS2-1とshKRS5-4）細胞株にそれぞれpCMV-Mock（M）、pCMV-パキシリン（Px）、pCMV-ERK1/2（Ek）を48時間一時的にトランスフェクションして、ウェスタンブロットした時、KRS発現が阻害された細胞株でERK1/2を人為的に発現させことにより、パキシリンの発現とTyr118のリン酸化が増加することを確認した。つまり、KRSが発現抑制された細胞でのパキシリンの低下した発現とリン酸化は、やはり低下したERKs活性に起因することを確認した（図14）。
【００３９】
また、myc-KRSが過剰発現されたHCT116細胞株を用いて、10％血清が存在する正常な2D条件（図15A）またはラミニン（10mg/ml）があらかじめコーティングされて2％血清が含まれた条件で（図15B）、共免疫沈降法を行なった時、インテグリンα6、インテグリンβ1およびp67LRが互いに結合していることを確認した、一方、インテグリンα6とインテグリンβ1は細胞が付着した条件でのみ結合し、付着と共にYH16899（YH）が処理された場合には、その結合が減少し、KRSとp67LRの結合は、細胞付着信号（adhesion signal）が存在していない懸濁液状況も確認されており、YH16899処理によって低下した。
【００４０】
また、3次元コラーゲンゲルで培養した細胞の回転楕円体を用いて、ChIP（Chromatin Immunoprecipitation）を行なった結果、JNKsやp38よりKRSに依存的に活性化されたERKsが、その下位因子としてよく知られた転写因子c-Junを通じてパキシリンの転写を調節することを確認した（図16A、16B、16C、16D）。
【００４１】
また、多様な大腸癌細胞株にKRSの発現を抑制したり（図17A）、KRS阻害剤であるYH16899を処理した時（図17B）、HCT116細胞株で見られる現象、すなわち3次元コラーゲンゲル内の回転楕円体から離脱が抑制され（図17A）、ERKのリン酸化が減少し、パキシリンの発現とリン酸化の減少（図17B）が再現されることを確認した。
【００４２】
また、HCT116細胞株でERK阻害剤であるU0126とKRSインヒビターであるYH16899を処理した時、焦点接着関連分子と上皮マーカーであるE-カドヘリン、β-カテニンの発現が減少することを確認すると共に、ERKsのリン酸化とパキシリンの発現およびリン酸化に抑制的効果を確認した（図18A、18B）。
【００４３】
また、3次元コラーゲンゲルでKRSが発現する親細胞の回転楕円体から離脱するのは、FAKの活性およびFAKのTyr925のリン酸化を通じたERKsの活性化機序に誘導されるのではないことが確認された（図19A、19B、19C、19D、19E）。
【００４４】
また、HCT116 KRS発現を低下させた細胞株にそれぞれpCMV-Mock、pCMV-パキシリン、pCMV-ERK1/2をトランスフェクションして安定細胞株を構築した後、ウェスタンブロットで前記した分子等に対する発現およびリン酸化の程度を確認した（図20A）。その後、細胞株の回転楕円体を確保して、3次元コラーゲンゲルに分注した後、持続撮影（time-lapse）顕微鏡で観察した結果、3次元コラーゲンゲルでKRS発現を低下させたHCT116細胞株がパキシリンとERK1/2の活性とパキシリンを得ることにより離脱に重要な信号活性が回復されたように、離脱する現象を観察することができた（図20B）。
【００４５】
また、Grade IIおよびIIIで確定診断された臨床的組織を含むヒト結腸癌組織の抽出液あるいは組織からパキシリン、p-ERKsとKRSのウェスタンブロット（図21A）または免疫組織化学染色（図21B）を通じて、それらが侵襲性癌細胞の辺縁（margin）で肯定的な関連性を確認した。
【００４６】
したがって、本発明者らは、3次元あるいは細胞外基質に囲まれた環境で培養された大腸癌細胞株でKRSが発現するかどうかによって、細胞-細胞間付着、細胞-細胞外基質（extracellular matrix;ECM）付着、細胞付着の信号伝達活性および細胞離脱と関連した活性因子の発現および活性の変化を分析することにより、癌転移抑制剤のスクリーニング方法および癌細胞の移動、浸潤、および転移のモニターリング方法に有用に用いることができることを確認した。
【００４７】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
【００４８】
ただし、下記の実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるものではない。
【００４９】
<実施例1>回転楕円体細胞でE-カドヘリン（E-cadherin）の発現増加を確認
<1-1>回転楕円体細胞の培養
ヒト大腸癌細胞株であるHT116細胞（American Type Culture Collection,米国）を37℃の細胞培養器の中で二日間培養した後、トリプシン/EDTAを処理して細胞を剥がした。前記切り離した細胞を遠心分離器を用いて沈降させた後、FBSを添加したRPMI-1640培養液10mlを添加して血球計算器（hematocytometer）を用いて、細胞の数を測定した。FBSが添加されたRPMI-1640培養液を皿に10ml入れて、前記細胞が3×105個になるように入れた。そして、それを37℃の細胞培養器でPerfecta3D Hanging Drop Plates（3D Biomatrix,米国）を用いて懸滴培養の方法で回転楕円体の塊の細胞を得た。
【００５０】
その結果、図1Bに示すように、2次元的環境で培養した細胞は、床についた平らな形状をしていたが、懸滴培養した場合は、回転楕円体の塊を形成することを確認した（図1B）。
【００５１】
<1-2>回転楕円体細胞塊でE-カドヘリンの発現増加を確認
前記実施例<1-1>の方法で得られた回転楕円体細胞塊でE-カドヘリンの発現量を確認するためにウエスタンブロットを実施した。
【００５２】
具体的には、回転楕円体の塊状細胞株を1000rpmでスピンダウン（spin down）させて取りまとめた後、100μl溶解緩衝液（溶解バッファー）[50mM Tris-HCl、pH7.4、1％NP-40 、0.25％デオキシコール酸ナトリウム（sodium deoxycholate）、150mM NaCl、1mM EDTA]に1％SDS、Na3O4V、プロテアーゼインヒビターカクテル（protease inhibitor cocktails,GenDepot,米国）を入れて4℃で1時間以上処理した。前記細胞を集めた後、4℃、13000rpmで30分間遠心分離して、新しい遠心分離チューブ（microcentrifuge tube）に上澄み液を移して、それをBCA試薬（BCA reagent,Thermo Scientifics,米国）を用いて、タンパク質を定量した。前記定量した試料に4×サンプル緩衝液（試料バッファー）[100％グリセロール4ml、Tris-HCl、pH6.8、2.4ml、SDS0.8g、ブロモフェノールブルー（bromophenol blue）4mg、β-モルカプトメタノール（β-mercaptoethanol）0.4ml、H2O 3.1ml（合計10ml基準）]を添加し、5分間、100℃で沸騰させた。前記試料を12％SDS-PAGE電気泳動を行なった後、Nitrocellulose Membranes ProtranTMニトロセルロース膜（Whatman）に移動させた後、5％スキムミルクで1時間前処理し、前処理した後、PBS（130mM NaCl、13mM Na2HPO4、3.5mM NaH2PO4、pH7.4）で2回洗浄し、E-カドヘリン（Santa Cruz Biotech,米国）およびα-チューブリン1次抗体（Sigma,米国）を用いて4℃で15時間反応させた後、翌日2次抗体を反応させて、ECL（Pierce,米国）を用いて、Ｘ線フィルムに現像した。
【００５３】
その結果、図1Cに示すように、回転楕円体の塊状細胞株で培養時間が経過するにつれて、E-カドヘリンの発現が増大することを確認した（図1C）。
【００５４】
<実施例2>リジル-tRNA合成酵素（lysyl-tRNA  synthetase;KRS）の発現が抑制された回転楕円体の塊細胞株で上皮-中間葉細胞転移（epithelial-to-mesenchymal transition;EMT）現象を確認
<2-1>KRSが発現抑制および過発現した回転楕円体の塊細胞株の樹立
前記実施例<1-1>の方法で得られた回転楕円体の塊状細胞を用いて、KRSが過発現または発現抑制された細胞株を樹立した。
【００５５】
具体的には、KRSの発現が抑制された細胞株は、lysyl-tRNA synthetaseMISSION(R)shRNA plasmid  DNA（Sigma,米国）を形質感染（トランスフェクション）して作製し、ここで、KRSはホモサピエンス（homo  sapiens）リジル-tRNA合成酵素、転写体異形（variant）1、mRNA配列（NM_001130089.1）を基準として用いた。前記KRSは、総1219bp長のエクソン（exon）1〜15を含んでいる。前記購入したKRS shRNAプラスミドDNAのうち、shKRS-0（配列番号1）は、KRSの1581-1604bp（エクソン12）、shKRS-1（配列番号2）は437-459bp（エクソン3〜4）、 shKRS-2（配列番号3）は、911-933bp（エクソン7）とshKRS-5（配列番号4）は、1071-1092bp（エクソン8）をそれぞれ標的とし、用いたshRNAの配列は下記の表1に示した。発現ベクターは、TRC1.5-pLK0.1-puroを用い、ピューロマイシン（puromycin）で選別して安定化された細胞株を確立した。ここで、KRSの発現を抑制する効果を示すshKRS-0、shKRS-2およびshKRS-5は、KRS第2型の中心ドメイン（class II core domain）を標的とするが、前記KRS第2型の中心ドメインは、二量体（dimer）を形成して適切なtRNAリボース（ribose）の3'OH基にリジン（lysine）をつなぐ役割によって、タンパク質の合成が円滑に進むように手助けする。
【００５６】
【表１】
2016519318.tif 000003
【００５７】
また、KRS過発現細胞株は、mycで標識されたKRS配列をクローニング（cloning）し（Kim ら,FASEB J. 2012年, Oct;第26（10）巻,P.4142-59）、前記クローニングされたpcDNA-Myc-KRS発現ベクターを細胞に注入し、250μg/ml G418を処理してmycで標識されたKRS過剰発現細胞株を樹立した。
【００５８】
その結果、KRSの発現が抑制される細胞株としては、shKRS-2およびshKRS-5 shRNAを用いて確立した細胞株で、shKRS-2によって得られた3つのクローンをそれぞれ2-1、2-2、2-3と命名し、shKRS-5によって得られたクローンを5-4と命名した。
【００５９】
<2-2>樹立された回転楕円体の塊細胞株でKRSの発現抑制を確認
前記実施例<2-1>の方法で作製されたKRSが発現抑制された細胞株の回転楕円体の塊でKRSの発現が抑制されるかどうかを確認するためにウエスタンブロットを実行し、具体的には、ウェスタンブロットは、前記実施例<1-2>の方法で実行し、KRS（Abcam,英国）およびα-チューブリン1次抗体（Sigma,米国）を用いて実施した。
【００６０】
その結果、図1Eに示すように、shKRSを処理した回転楕円体の塊細胞株でKRSの発現が抑制されることを確認した。
【００６１】
<2-3>KRSが発現抑制された回転楕円体の塊細胞株で上皮-中間葉細胞転移（epithelial-to-mesenchymal transition;EMT）関連マーカー遺伝子のmRNA発現レベルを確認
前記実施例<2-2>の方法で確認されたKRS発現抑制された細胞株でEMT関連マーカー遺伝子のmRNA発現レベルを確認するために、逆転写PCR（reverse transcription PCR）を行なった。
【００６２】
具体的には、前記実施例<2-1>の方法で樹立された細胞株をTRIzol（invitrogen,米国）溶液を用いてmRNAを抽出した後、ナノドロップ（nano drop,Thermo Scientific,米国）を用いて定量した。前記定量したmRNAは、Amfirivert cDNA Synthesis Master Mix（GenDePot,米国）を用いてcDNAに合成し、ThermoScientific DreamTaq Green PCR Master Mix（Thermo Scientific,米国）、およびβ-アクチンをプライマーとして用いてPCRを行なった。それぞれのサンプルの定量は、β-アクチンで確認した後、下記表2に示されたプライマーを用いて、EMTマーカーのmRNA量を確認した。
【００６３】
【表２】
2016519318.tif 000004
【００６４】
その結果、図1Fに示すように、KRS発現が抑制された細胞株の場合、上皮マーカーであるE-カドヘリンmRNAレベルが正常なHCT116細胞株およびKRS過発現細胞株よりも顕著に減少し、一方で中間葉（mesenchymal）マーカーであるビメンチン（Vimentin）、N-カドヘリン（N-cadherin）とツイスト（Twist）mRNAのレベルは、有意に増加することを確認した（図1E）。
【００６５】
<2-4>KRSが発現抑制された回転楕円体の塊細胞株で上皮-中間葉細胞転移（epithelial-to-mesenchymal transition;EMT）関連マーカー遺伝子のタンパク質発現レベルを確認
前記実施例<2-2>の方法で確認されたKRS発現が抑制された細胞株でEMT関連マーカー遺伝子のタンパク質発現レベルを確認するために、前記実施例<1-2>の方法でウエスタンブロットを行なった。ここで、E-カドヘリン（Santa Cruz Biotech,米国）、ビメンチン（Sigma,米国）、KRS（Abcam,英国）およびα-チューブリン1次抗体（Sigma,米国）を用いた。
【００６６】
その結果、図1Gに示すように、KRSの発現が抑制された細胞株の場合、E-カドヘリンの発現量が顕著に減少し、ビメンチンの発現が増加することを確認した（図1G）。したがって、KRSの発現が抑制された場合、EMT現象が一部誘導され、細胞-細胞間の付着性が減少し、これは細胞の移動および浸潤に影響を与えることが予想された。
【００６７】
<実施例3>2次元的培養環境でKRSの発現を抑制した場合、不完全なEMT表現型（incomplate EMT phenotype）現象を誘導
<3-1>2次元的培養環境でKRSの発現を抑制した場合、細胞-細胞付着性あるいはEMT関連タンパク質の発現減少を確認
正常に血清10％を含む2次元的（2D）環境で細胞を培養する際に、細胞-細胞付着や上皮-中胚葉細胞転移あるいは分化（EMT）関連タンパク質の発現量を確認するために、100mm細胞培養ディッシュで培養したHCT116細胞の細胞-細胞付着関連タンパク質の発現に対してウエスタンブロットを行なった。
【００６８】
具体的には、血清10％を含む2次元的環境で培養した細胞株をPBSで2回洗浄し、200μlの溶解緩衝液[50mM Tris-HCl、pH7.4、1％NP- 40、0.25％デオキシコール酸ナトリウム（sodium deoxycholate）、150mM NaCl、1mM EDTA]にSDS、Na3O4V、プロテアーゼインヒビターカクテル（protease inhibitor cocktails,GenDepot,米国）を入れて4℃で15分間処理した。前記細胞を集めた後、4℃、13000xgで30分間遠心分離して、新しい遠心分離チューブ（microcentrifuge tube）に上澄み液を移して、それをBCA試薬（BCA reagent,Thermo Scientifics,米国）を用いて、タンパク質を定量した。前記定量した試料に4×サンプル緩衝液（試料バッファー）[100％グリセロール4ml、Tris-HCl、pH6.8、2.4ml、SDS0.8g、ブロモフェノールブルー（bromophenol blue）4mg、β-モルカプトメタノール（β-mercaptoethanol）0.4ml、H2O 3.1ml（合計10ml基準）]を添加し、5分間、100℃で沸騰させてサンプルを準備して、ZO-1（Zymed,米国）、β-カテニン（Santa Cruz,米国）およびE-カドヘリンの1次抗体を用いた後の過程は、前記実施例<1-2>の方法で行なった。
【００６９】
その結果、細胞-細胞間の付着傾向を知ることができる上皮マーカータンパク質のZO-1（Zymed）、β-カテニン（Santa Cruz）、E-カドヘリン（Santa Cruz）発現量が、正常なHCT116細胞とKRSを過発現させた細胞株に比べて、KRS発現が抑制された細胞株で減少することを確認した。逆にKRS発現が阻害された細胞株で、中間葉細胞マーカー（mesenchymal marker）タンパク質のビメンチン（sigma）、N-カドヘリン（BD Scieneces）、ツイスト1（Abcam）、スナイル1（Cell signaling）、フィブロネクチン（DAKO）の発現が増加していることを確認した。インテグリンα6（Chemicon）、インテグリンβ1（Santa Cruz）、インテグリンβ4（Santa Cruz）、p67ラミニン受容体（Abcam）、ラミニン（Abcam）のタンパク質発現量は、KRSの発現の有無とは関係なく、同一に発現していることを確認した（図2A）。
【００７０】
<3-2>2次元的培養環境でKRSの発現を抑制した場合、周囲の微細環境因子の影響を確認
2次元的培養環境で培養した場合、時間の経過に伴う細胞周辺の微細環境因子の影響を確認するために、TNFαおよびTGFβ1のようなサイトカインを10％FBSを含む培養液に追加処理して、細胞-細胞間の付着性を確認することができる上皮マーカータンパク質の発現を、前記実施例<3-1>の方法で確認した。
【００７１】
その結果、図2Bに示すように、通常のHCT116細胞株およびKRS過発現細胞株の場合、TNFαを処理した時にタンパク質発現に差を示さなかったが、TGFβ1を処理した時に細胞-細胞間の付着性に関連したオクルディンまたはZO-1がそれぞれ減少し、フィブロネクチンのような中間葉マーカータンパク質の発現が増加することを確認した。一方、KRSの発現が抑制された細胞株の場合、TGFβ1を処理した時にオクルディンのような上皮マーカータンパク質の発現量が増加して、フィブロネクチンの発現量が減少することを確認した（図2B）。
【００７２】
したがって、KRS発現の有無が、細胞のEMT現象に関連していることを確認し、TGFβ1のような細胞微細環境因子の影響でKRSが細胞の移動および浸潤に重要な役割を肯定的に行なうことが確認された。
【００７３】
<3-3>2次元的培養環境でKRSの発現を抑制した場合、E-カドヘリンの発現抑制と細胞-細胞付着性の維持確認
前記実施例<3-1>と同様に、KRSの発現を抑制した場合、E-カドヘリンの発現が抑制されることを免疫蛍光染色法で確認した。
【００７４】
具体的には、二日間37℃のCO2細胞培養器の中で培養したHCT116細胞をトリプシン/EDTA処理して細胞を数えた後、血球計算器（hematocytometer）を用いて、細胞の数を測定し、それを6ウェルプレートに1×106個になるように入れた。一日中37℃のCO2細胞培養器の中で培養した後、4％ホルムアルデヒドで30分間固定し、30mMグリシンを10分間処理した。0.5％トリトン（triton）X-100を用いて、5分間透過化（permeabilization）させて、2％BSA溶液で1時間前処理した後、FITCで標識されたE-カドヘリン1次抗体（Bio Legend,米国）を16乃至18時間、4℃で処理した。最後に、核染色のためのDAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole,青色）溶液を処理してDAPI染色を行なった。そして、染色を終えた細胞が付いているカバーガラスをスライドガラス（slide glass）に載せてマウント（mounting）した後、染色された細胞を蛍光顕微鏡（Olympus,日本）を用いて観察した。
【００７５】
その結果、図2Cに示すように、通常のHCT116細胞およびKRSを過発現させた細胞株の場合、細胞間の付着部位でE-カドヘリンの発現が正常に観察されるのに対し、KRSの発現を抑制した場合、E-カドヘリン発現が抑制され、細胞間の付着部位でE-カドヘリンの発現が減少したけれど、細胞間の結合あるいは付着性は変化がないことを確認した。また、これは、細胞-細胞間の付着傾向を確認することができるまた別のマーカーであるβ-カテニンの場合にも、同じ結果を示すことを確認した（図2C）。また、図2Dに示すように、KRS発現が阻害された細胞株（shKRS2-1、shKRS5-4）はKRSを発現するHCT116親細胞（parental）とKRSを過発現する細胞株（Myc-KRS-WT）と比較して見るとき、EMT（上皮-中胚葉細胞転移、epithelial-mesenchymal Transition）マーカータンパク質の発現で見られる現象とは異なり、shKRS2-1とshKRS5-4で細胞-細胞間の接触が変わらずに円満に集団的なコロニーをなすことを確認した（図2D）。2D状況でEMTマーカータンパク質の発現が差があるにもかかわらず、プレート上で成長した細胞の様子や形態には差がないことからして、KRSの発現が完全EMTを誘発するのではなく、部分的なEMT（incomplete EMT）を誘発することを知ることができる。
【００７６】
<実施例4>ラミニン（10μg/ml）が事前にコーティングされた2次元的培養環境でKRSを発現または発現していない細胞株の細胞付着に関する信号伝達因子の確認
KRS発現と細胞-ECM付着との関係について調べるために、KRSが細胞質から原形質膜に移動した後、ラミニンに依存的に細胞移動に関連して信号伝達活性に影響を与えることが既に報告されているので、（Kim DGら,FASEB J. 2012年10月,第26（10）巻,P.4142-59）、懸濁液状態で1時間混合した後、ラミニンをコーティングした培養皿に再分注することにより、ラミニンという特殊なECMへの付着がされる場合、KRSの発現に伴う細胞付着関連信号伝達の様相を焦点接着に関連したFAK、Src、パキシリン、ERKsのようなタンパク質の発現およびリン酸化程度の測定を通じて確認した。
【００７７】
具体的には、準備されたHCT116親細胞、KRS発現阻害された細胞株、KRS過発現細胞株を培養皿から取り外した後、遠心分離して細胞と溶液を分離した。ここから培地は、血清free RPMI1640培地に1％BSAと（細胞がヘルシーでありながら血清の影響を最小限に抑えるため）2％FBSが含まれているリプレーティング（replating）バッファーを用いた。血球計数器を用いて細胞数を測定した後、リプレーティングバッファーを追加して、細胞が、それぞれ0.2×106cells、2×106cellsになるように細胞をe-チューブに入れ、総体積が1mlになるようにリプレーティングバッファーを満たした。HCT116親細胞にYH16899処理した試料は、リプレーティングバッファーに10μMになるように処理して準備した。37°Cで1時間懸濁液の状態でローリング（60rpm）させる。その間に前日の夜にラミニン（10μg/ml）をあらかじめコーティングしておいた培養皿とカバーガラスをPBSで2回洗浄した後、リプレーティングバッファーを入れて37°Cで置いておく。1時間混合した細胞を免疫蛍光染色するために、準備しておいたラミニンコーティングされたカバーガラスが含まれている6-wellに0.2×106細胞を分注して、ウエスタンブロットをするために準備しておいラミニンコーティングされた60mmディッシュに、2×106cellsになるように細胞を分注し、2時間37°Cの細胞培養器で培養した。免疫蛍光染色するための試料は、PBSで2回洗浄した後、4％ホルムアルデヒドで15分間固定し、30mMグリシンを10分処理した後、0.5％トリトンX-100を用いて、5分間透過化（permeabilization）して、3％BSA溶液で1時間遮断した。標識がされていないp-ERKs（Cell signaling）、p-Tyr118-パキシリン（Santa Cruz Biotech．Inc.）、あるいはp-Tyr397-FAK（Abcam）抗体を16〜18時間以上4℃で処理後、2次抗体を室温で2時間処理して、ファロイジン（phalloidin）処理を通じたアクチン（actin）染色した後、最後に核染色のためのDAPI（4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;ブルー）溶液を処理した。そして、ウェスタンブロットをするための試料は、PBSで2回洗浄した後、溶解バッファー（50mM Tris-HCl、pH7.4、1％NP-40、0.25％デオキシコール酸ナトリウム、150mM NaCl、1mM EDTA）を処理して、タンパク質を抽出して定量し、作製された試料でウェスタンブロットを行なった。
【００７８】
その結果、KRSを発現する親細胞株（Parental）および過発現細胞株（Myc-KRS-WT）と比較して見たとき、KRSの発現が抑制された細胞株（shKRS2-1、shKRS5-4）で細胞付着に伴うSrc、ERKs、パキシリンのリン酸化が顕著に減少することを確認した。しかし、FAKのリン酸化レベルには差がないことを確認した（図3A）。KRSに依存的に見られるERKs、パキシリンのリン酸化レベルは、FAKを通じないKRSの信号伝達活性によってなされることを示す。焦点接着に関連したタンパク質であるp-ERKsとp-パキシリンで免疫染色を行なった結果、ウェスタンブロットと同様にKRSを発現する親細胞株および過発現細胞株は、ERKsとパキシリンのリン酸化レベルが高いのに対し、KRSの発現が抑制された細胞株において顕著に低くなっていることを確認することができた（図3Bと3C）。KRSとラミニン受容体との結合を阻害する阻害剤YH16899（Kim DGら,Nat Chem Biol．2014年1月,第10（1）巻,P.29-34。）を10μMで処理すると、KRSを発現する親細胞株および過発現細胞株に処理した試料で処理していない対照群と比較して見たとき、Src、ERKs、パキシリンのリン酸化が減少することを確認し（図3A）、同様の結果を、p-ERKsおよびパキシリン染色した免疫蛍光染色で見ることができた（図3E及び図3F）。このような結果は、KRSが細胞-ECM付着に関連した信号伝達因子の活性に重要な作用をし得ることを示す。しかし、HCT116細胞にKRSの抑制やYH16899の処理は、Tyr397のリン酸化の程度に大きな違いがなかったように（図3A）、細胞の形状や広がりの程度に大差ないこと（図3Dおよび図3G）が確認された。
【００７９】
<実施例5>2次元的培養環境でKRSの発現を抑制した場合、細胞-細胞外基質（extracellular matrix;ECM）付着関連信号伝達活性の阻害を確認
2次元的培養環境で、前記実施例<2-1>の方法で樹立された細胞株の細胞およびECMとの間の付着及び前記付着に関連した信号伝達活性を確認するためにウエスタンブロットを行なった。また、細胞-ECM付着関連信号伝達活性を確認するために、細胞株は、特定のECMがあらかじめコーティングされた培養容器に血清がない状態で再分注した後、2時間以内に細胞付着に伴う信号伝達因子の信号活性を確認し、前記信号活性の確認方法は、公知の方法で行なった（Julianoら,2001年）。
【００８０】
具体的には、KRSを発現するHCT116親細胞株、KRS発現抑制細胞株であるshKRS2-1とshKRS5-4、およびKRS過発現細胞株をラミニン10μg/mlがあらかじめコーティングされた培養容器に1％BSAを含む無血清培養培地に再分注後、2時間後に細胞抽出液を確保して、前記実施例<1-2>の方法でウエスタンブロットを行なった。ここで、pY397FAK（Abcam,英国）、pY577FAK（Santa Cruz,米国）、pY861FAK（Santa Cruz,米国）、pY925FAK（Santa Cruz,米国）、FAK（Santa Cruz,米国）、p-ERKs（cell signaling,米国） 、ERKs（cell signaling,米国）、KRS（Abcam,英国）、pY416c-Src（cell signaling,米国）、c-Src（Santa Cruz,米国）、pY118パキシリン（pY118paxillin,santa Cruz,米国）、パキシリン（paxillin,BD Transduction Laboratories,米国）およびα-チューブリン（Sigma,米国）の1次抗体を用いた。
【００８１】
また、前記KRSを発現するHCT116親細胞株、KRS発現抑制細胞株であるshKRS2-1とshKRS5-4、およびKRS過発現細胞株をフィブロネクチン10μg/mlをあらかじめコーティングした培養容器に1％BSAを含む無血清培養培地に再分注した後、2時間後に細胞抽出液を確保して、前記実施例<1-2>の方法でウエスタンブロットを行なった。
【００８２】
その結果、図4Aに示すように、KRSを発現するHCT116親細胞株およびKRSを過発現する細胞株では、FAKおよびEKRsのリン酸化が起こることを確認したが、KRSの発現が抑制された細胞株では、FAKおよびERKsのリン酸化が著しく減少することを確認した（図4A）。また、図4Bに示すように、HCT116親細胞株と比較してKRSの発現が抑制された細胞株の場合、c-Srcおよびパキシリンのリン酸化が有意に抑制され、特にパキシリンの発現が顕著に減少することを確認した（図4B）。また、図4Cに示すように、KRSを発現する親細胞株および過発現細胞株と比較してKRSの発現が抑制された細胞株においてFAKのリン酸化は、微弱に減少したが、ERKsのリン酸化が顕著に減少することを確認した（図4C）。これは、KRSが細胞-ECM付着に関する信号伝達因子の活性に重要な作用をし得ることを示す。
【００８３】
<実施例6>2次元的培養環境でKRSの発現を抑制した場合、焦点接着形成の阻害を確認
細胞-ECM付着による焦点接着の形成がKRS発現に依存的であるかどうかを確認するために、免疫蛍光染色法を行なった。
【００８４】
具体的には、KRSを発現するHCT116親細胞株、KRS発現抑制細胞株であるshKRS2-1とshKRS5-4、およびKRS過発現細胞株をラミニンもしくはフィブロネクチン10μg/mlがあらかじめコーティングされたカバーガラスに1％BSAが含まれている無血清培養培地に再分注後、2時間後に前記実施例<3-3>の方法で免疫蛍光染色法を行なった。ここで、Tyr397がリン酸化されたFAK 1次抗体（pY397FAK）および核を示すためにDAPIを用いた。
【００８５】
その結果、図3Dに示したようフィブロネクチンがコーティングされた2次元環境でHCT116親細胞株およびKRSを過発現する細胞株では、pY397FAKが豊富な焦点接着がよく発達したが、KRSの発現が抑制された細胞株では、pY397FAKがスポット（spots）の形態で染色されず、焦点接着の発達が有意に抑制されることを確認した（図4D）。前記の結果は、KRSが細胞-ECM付着にも重要な役割を果たしていることを示す。しかし、KRSの機能に必要なラミニンがあらかじめコーティングされた2次元環境では、KRSの発現が抑制されるか、またはKRS阻害剤を処理した場合に、pERKsおよびp-Tyr118パキシリンのスポットが細胞内に減少したが、Tyr397がリン酸化されたFAKの位置およびその関連細胞の形態は、KRSを発現するか、KRS阻害剤を処理していない場合と差がなかった。したがって、KRSの発現は、ERKsとパキシリンなどを含む細胞-細胞外基質（ECM）付着信号伝達の過程に重要であることを示す。
【００８６】
<実施例7>3次元コラーゲンゲル環境で回転楕円体の塊で培養された細胞でKRSの発現を抑制した場合、ERKおよびパキシリンの発現および活性抑制を確認
<7-1>3次元コラーゲンゲル環境でHCT116細胞の培養
回転楕円体の塊である細胞を3次元コラーゲンゲル環境内で培養するために10×再形成緩衝液[2.2gの重炭酸ナトリウム、4.8g HEPES、100ml基準]、10×RPMI培養液、コラーゲン（collagen type I,BD Bioscience,米国）、2N NaOHおよび無血清RPMI-1640培養溶液をよく混合し、コラーゲンIの最終濃度が2.0〜2.5mg/mlとなるように溶液を準備した。すべての工程は、氷の上で進行してコラーゲンが固まるのを防止した。前記溶液を、直径10ｍｍの孔があるPDMS（polydimethylsiloxane）または共焦点顕微鏡の培養器システムに合った磁性の4-ウェルチャンバー（magnetic 4-well chamber,Live Cell instrument,韓国）に入れた。ここで、孔の底に細胞を含まないコラーゲン溶液を薄く敷いてコラーゲン底膜（bottom layer）を作った後、そこに細胞とコラーゲン溶液の混合液を添加し、37℃の細胞培養器の中で30分間固めた。二日間回転楕円体の塊で培養されたHCT116細胞を細胞ろ過器（cell strainer,SPL,韓国）を用いて回転楕円体の大きさが70μmを超える凝集（aggregation）された細胞を除去し、70μmの孔を通過した回転楕円体細胞塊だけを集めて、無血清RPMI-1640培養液で2回洗浄した。そして、細胞を遠心分離で沈殿させた後、培養液はすべて除去して残っている細胞に、前記コラーゲン溶液を添加してよく混合し、PDMS、顕微鏡観察時に使用する培養容器または48-ウェルプレートの各孔に80〜150μlずつ入れて37℃の細胞培養器で30分間固めた。十分に固まったことを確認した後、FBSが添加されたRPMI-1640培養溶液を添加した。
【００８７】
その結果、図1Dに示すように、回転楕円体形態の細胞株が、時間が経つにつれて徐々にサイズが大きくなって、光学顕微鏡下で暗く見えるように増殖し得ることを確認した（図1D）。
【００８８】
<7-2>3次元コラーゲンゲル環境でKRSの発現を抑制した場合、ERKsとパキシリンの発現および活性の抑制を確認
2次元的環境で培養されたHCT116細胞株で、細胞-細胞外基質付着においてKRSの重要性を確認し、そこで、FAK、ERKs、パキシリンおよびc-Srcのリン酸化、およびパキシリンの発現がKRSの発現抑制によって顕著に減少することを確認した。したがって、前記の結果が、3次元コラーゲンゲル環境で回転楕円体の塊で培養された細胞でも同一な影響を与えるかどうかを確認するためにウエスタンブロットを行なった。
【００８９】
具体的には、実施例<2-1>の方法で樹立された細胞株を用いて、KRSを発現するHCT116親細胞株、KRS発現抑制細胞株であるshKRS2-1、shKRS2-2、shKRS2-3とshKRS5-4、およびKRS過発現細胞株を、前記<7-1>の方法で培養し、ここで、前記細胞株を3次元コラーゲンゲル環境に入れて、3または24時間後の試料を得た。そのために、先端を切ったイエローチップ（yellow tip）を用いて、48ウェルプレート中に細胞が入っているコラーゲンゲルと培地を1.7ml遠心分離用チューブ（microcentrifuge-tube）に集めた。前記細胞を4℃、5,000xgで1分間遠心分離した後、上澄み液（培養液）を除去し、残ったペレット（pellet）は、冷たいPBSで2回洗浄し、同一の速度および時間で遠心分離した。前記ペレットに1％SDS、Na3O4V、タンパク質分解酵素阻害剤カクテル（protease inhibitor cocktail,GenDepot,米国）が入っている100μlの溶解緩衝液を添加して4℃で1時間以上処理した後、4℃、13,000xgで30分間遠心分離して、新しい遠心分離用チューブに上澄み液のみ入れた。前記上澄み液に4×サンプル緩衝液（試料バッファー）を入れた後、5分間、100℃で沸騰させてサンプルを準備し、以後の過程は、前記実施例<1-2>の方法で行なった。ここで、pY397FAK、pY577FAK、FAK、pY416c-Src、p-ERKs、ERKs、パキシリン、KRSとα-チューブリンの1次抗体を用いた。
【００９０】
その結果、図5に示すように、3次元コラーゲンゲル環境で培養されKRSの発現が抑制された細胞株でKRSが発現される細胞株と比較して、特異的にFAKのリン酸化が低く維持されるのではなく、3次元コラーゲン環境での培養時間によって増加することにより、3次元コラーゲンゲル環境でKRSの発現有無とFAKリン酸化の変化とは相関関係がないことが確認された。しかし、ERKsのリン酸化およびパキシリンの発現は、KRSの発現が抑制された細胞株で著しく低いことを3次元コラーゲンゲル環境でも確認できた。また、2次元環境でKRSを過発現した細胞株の場合、懸濁液状態でもERKsのリン酸化が著しく増加することにより、KRSの発現とERKsのリン酸化および活性化、そしてさらにパキシリンの発現が緊密な相関関係を有することを確認した。
【００９１】
<実施例8>コラーゲンゲルで囲まれた3次元（3D）環境でKRSの発現抑制、ETKの活性抑制あるいはKRSの機能抑制によるERKs活性およびパキシリンの発現および活性に対する否定的影響を確認
KRSに依存的な焦点接着と関連したタンパク質の発現変化が3次元コラーゲンゲル内での細胞培養でも起こるかどうかを確認するために、3次元コラーゲンゲル内で一日中培養した正常なHCT116細胞、発現を阻害した細胞株（shKRS2-1、shKRS5-4）およびMEK/ERKリン酸化酵素を阻害する選択的阻害剤（selective inhibitor）であるU0126とKRSを阻害するYH16899を処理した細胞でERKsのリン酸化とパキシリンの発現を免疫染色を行ない、共焦点顕微鏡で観察した。
【００９２】
具体的には、PDMSにコラーゲンI型を分注し、一日中何も処理しないか、または（図6Aおよび6B）U0126（50mM）またはYH16899（50mM）を処理してから（図6Cおよび6D）培養した細胞が入っているコラーゲンゲルを4％ホルムアルデヒドで30分間固定した後、30mMグリシンを30分処理した。0.5％トリトンX-100を用いて、30分間透過化して、3％BSA溶液で2時間遮断した。標識されていないp-ERKs（cell signaling）とパキシリン（BD bioscience）抗体を16〜18時間以上4℃で処理した後、2次抗体を4時間以上室温で処理して、最後に核染色のためのDAPI（4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;ブルー）溶液を処理した。染色された細胞を共焦点顕微鏡を用いて観察した。
【００９３】
その結果、通常のHCT116回転楕円体細胞では、p-ERKsの免疫染色また、核の中と核の周辺で見られることを確認し（図6Aおよび6C）、焦点接着により見られる部分にパキシリンが強く点（spot）で染色されたことを確認した（図6Bおよび6D）。しかし、KRS発現を阻害した細胞株およびU0126とYH16899を処理した細胞の回転楕円体でERKsのリン酸化レベルも非常に低くなっていること（図6Aおよび6C）を確認することができ、パキシリンの免疫染色が著しく減少していることを確認することができた（図6Bおよび6D）。これらの結果は、3次元コラーゲンゲル内でHCT116回転楕円体がKRSに依存的に見せる離脱現象が、ERKの活性とパキシリン発現と密接な関連があることを示す。
【００９４】
<実施例9>3次元コラーゲンゲル環境で回転楕円体の塊で培養された細胞でKRSが発現する場合、信号活性因子の発現変化を確認
<9-1>3次元コラーゲンゲル環境で回転楕円体の塊で培養された細胞でKRSが発現する場合、信号活性因子のタンパク質レベルの変化を確認
【００９５】
2次元的環境でHCT116親細胞の細胞-ECM付着においてKRSによるERKsリン酸化、およびパキシリンの発現および活性化が重要であることが確認されたので、3次元コラーゲンゲル環境内でもKRSを発現するHCT116親細胞で細胞-ECM付着においてERKs活性を確認するためにウエスタンブロットを行なった。
【００９６】
具体的には、3次元コラーゲンゲル環境で回転楕円体の塊で培養されたHCT116親細胞にERKs特異的阻害剤であるU0126を50または100μM処理して、24時間培養して、全体の細胞抽出物（whole cell extract）を集めて前記実施例<7-2>の方法でウエスタンブロットを行なった。ここで、pY397FAK、FAK、p-ERKs、ERKs、pY118パキシリン、パキシリン、E-カドヘリン、β-カテニン、KRS、α-チューブリン、pAkt1/2/3およびカスパーゼ3に対する1次抗体を用いた。
【００９７】
その結果、図7Aに示すように、3次元コラーゲンゲル環境で培養されたHCT116親細胞でERKsを阻害した場合、細胞-ECM付着関連信号伝達因子であるFAKおよびパキシリンのリン酸化が同時に減少し、特にパキシリンの発現も有意に減少することを確認した。また、E-カドヘリンの発現レベルも減少することを確認した（図7A）。前記の結果は、KRSの発現抑制で誘導される現象と一致し、HCT116親細胞のERKsリン酸化は、パキシリンの発現とリン酸化と密接な関係にあり、KRSによる細胞-ECM付着に重要な役割を果たすことを示す。
【００９８】
<9-2>3次元コラーゲンゲル環境で回転楕円体の塊で培養された細胞でKRSが発現する場合、信号活性因子のmRNAレベルの変化を確認
前記実施例<9-1>と同様に、3次元コラーゲンゲル環境で回転楕円体の塊で培養された細胞でKRSが発現する場合は、信号活性因子の一つであるE-カドヘリンのmRNAレベルを確認するために、リアルタイムPCRを行なった。
【００９９】
具体的には、3次元コラーゲンゲル環境で培養されたHCT116親細胞にERKs阻害剤であるU0126を処理していないか、または50および100μMで処理して24時間培養した後、前記実施例<2-3>の方法でリアルタイムPCRを行なった。ここで、プライマーは、前記表2のhEcad-5（配列番号5）とhEcad-3（配列番号6）を用いた。
【０１００】
その結果、図7Bに示すように、E-カドヘリンのmRNA発現レベルが、ERKs阻害剤を処理していない対照群と比較して有意に減少することを確認した（図7B）。
【０１０１】
したがって、3次元環境で培養されたHCT116親細胞の細胞-ECM付着および細胞-細胞付着において、KRSによるERKsおよびパキシリンのリン酸化および、パキシリンの発現との間に有意な相関関係があることを確認した。
【０１０２】
<実施例10>3次元コラーゲンゲル環境で回転楕円体の塊で培養された細胞でKRSが発現する場合、細胞-ECM付着形成抑制を確認
3次元コラーゲンゲル環境で回転楕円体の塊で培養された細胞からKRSを発現するHCT116親細胞を長期間培養することにより、前記HCT116親細胞から分泌されたサイトカインが細胞培養の微細環境に含まれ、前記培養された細胞の形態および浸潤に及ぼす影響を確認するために、免疫蛍光染色法を行なった。
【０１０３】
具体的には、PDMSにコラーゲンを添加し、一日中HCT116親細胞株には何も処理しないか、ERKs阻害剤であるU0126 50μMを処理、またはKRSの発現が抑制された細胞株を培養した場合、細胞が入っているコラーゲンゲルを4 ％パラホルムアルデヒドで室温で30分間固定し、30 mMグリシンを15分処理した。そして1％トリトンX-100を用いて、常温で30分間透過化させて、3％BSA溶液で2時間前処理した。FITCで標識されたE-カドヘリン抗体を16乃至18時間、4℃で処理して、最後に核染色のためにDAPI溶液を処理して、染色された細胞を共焦点顕微鏡を用いて観察した。
【０１０４】
その結果、図8Cに示すように、HCT116親細胞およびKRS過発現細胞株と比較して、KRSの発現が抑制された細胞株でE-カドヘリンの発現が有意に減少して細胞-細胞間の境界面にE-カドヘリンの発現が確認されなかった。しかし、HCT116およびKRS過発現細胞株で堅固な球形をなしていた回転楕円体細胞間の付着が変わらず、回転楕円体の塊である細胞の形態は散らばらず維持することを確認した（図8C）。前記の結果は、3次元コラーゲンゲル環境でもKRSの発現が細胞-細胞間の付着を調節して、たとえ部分的であったとしてもEMT現象に影響を及ぼし、上皮および上皮中間葉細胞の形態の二重的性向を調節することになることが分かった。
【０１０５】
<実施例11>コラーゲンゲルに囲まれた3次元（3D）環境でKRS発現する細胞の離脱と上皮マーカーであるサイトケラチン14（CK14）の関連性を確認。
3次元コラーゲンゲル内で細胞離脱がKRSの発現に依存的で、KRSの発現を抑制した細胞株は、細胞-細胞接触に関連した上皮マーカーの発現が低くなる。しかし、KRSの発現が抑制された細胞株は、2D培養環境で分散されず、3次元コラーゲンゲル環境で離脱しないので、3次元コラーゲンゲル内でKRSの発現が抑制された細胞株の細胞塊（回転楕円体）からの離脱は上皮マーカーの発現が必要なのかどうか調べるために、3次元コラーゲンゲル環境で24時間培養し、離脱が起きた場合にCK14に対して染色をして共焦点顕微鏡を用いて観察した。
【０１０６】
具体的には、PDMSにコラーゲンゲル内に細胞を分注して一日中何も処理しないか（図9A）U0126（50mM）、またはYH16899（50mM）を処理してから（図9B）培養した細胞が入っているコラーゲンゲルを4％ホルムアルデヒドで30分間固定した後、30mMグリシンを30分処理した。0.5％トリトンX-100を用いて、30分間透過化して、3％BSA溶液で2時間遮断した。標識されていないCK14（Abcam）抗体を16〜18時間以上4℃で処理した後、2次抗体を4時間以上室温で処理して、ファロイジン（phalloidin）染色を通じてF-アクチンと核染色のためのDAPI（4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;ブルー）溶液を処理した。染色された細胞を共焦点顕微鏡を用いて観察した。
【０１０７】
その結果、細胞の離脱が起きたKRSが発現する細胞の場合には、離脱する細胞からCK14の発現が目立った（図9A、9B）、離脱が起こらなかった条件、すなわちKRSが発現抑制されたか、KRSが発現されてもU1026もしくはYH16899が処理された状況では、CK14の発現が全体的に低く、回転楕円体から離脱する細胞で発現されないことを確認した（図9A、9B）。つまり、これにより、KRSが発現抑制された場合、上皮マーカーが発現低下したが、分散が起こらず、不完全EMT（epithelial-mesenchymal transition）が誘導されたものと把握され、これはKRSが発現抑制された細胞株において効果的な離脱の現象が起きていないという事実は、つまり、KRSに依存的な離脱は上皮マーカーなしには起こり得ないことを示唆している。
【０１０８】
<実施例12>3次元コラーゲンゲル環境で回転楕円体の塊で培養された細胞でKRSが発現される場合、細胞の形態変化、移動、および浸潤への影響を確認
3次元コラーゲンゲル環境で回転楕円体の塊で培養された細胞でKRSに依存的なEMT関連タンパク質の発現の変化が細胞の形態変化、移動、および浸潤に影響を与えるかどうかを確認するために、時間差顕微鏡（持続撮影（time- lapse）顕微鏡）を用いて観察した。
【０１０９】
具体的には、時間差顕微鏡の培養器システムを使用するために磁性の4-ウェルチャンバー（magnetic 4-well chamber,Live Cell Instrument,韓国）に細胞が入っているコラーゲン2.5mg/mlを添加し、37℃の細胞培養器で30分間固めた。前記コラーゲンが十分に固まったことを確認した後、10％FBSを含むRPMI-1640培養培地を入れた。そして、3次元コラーゲンゲルが入っている磁性のチャンバーと、それに合ったアダプターを時間差顕微鏡に装着して、複数の位置（multi-position）を指定した後、約36時間37℃、5％CO2培養器で観察した。コラーゲンゲルが乾かないように培養液を6時間ごとに添加し、ここで焦点に変動が生じないように注意した。
【０１１０】
その結果、図10Aに示すように、HCT116親細胞およびKRS過発現細胞株では、時間の経過につれて、一部の細胞が主要細胞塊（main cell mass）から離脱して周辺空間へ移動および浸潤の機能を示す一方、KRSの発現が抑制された細胞株の場合には、細胞の塊が増大していくだけで、細胞の離脱は確認されなかった。前記図10Aは、細胞の形態変化、移動、および浸潤の観察を6時間ごとに、24時間（1:00:00）および28時間目（1:04:00）を示している（図10A）。
【０１１１】
<実施例13>3次元コラーゲンゲル環境で回転楕円体の塊で培養された細胞でKRSが発現される場合、TGFβ1の発現増加を確認
前記<実施例12>の結果が細胞の微細環境に存在するサイトカインのオートクライン（autocrine）効果によるものであることを確認するために、代表的な多機能的なサイトカイン（multifunctional cytokine）でありながら、EMT誘発サイトカインであるTGFβ1（Katsunoら,Curr Opin Oncol,2013年,第25巻,p.76-84）の発現を確認するために、前記実施例<6-2>の方法でウエスタンブロットを行なった。
【０１１２】
その結果、図10Bに示すように、HCT116親細胞およびKRS過発現細胞株は、TGFβ1の発現レベルが時間が経つにつれて著しく増加するが、一方、KRSの発現を抑制させた細胞株は、初期からTGFβ1の発現レベルが高く、時間による増加傾向が少ないことを確認した（図10B）。
【０１１３】
したがって、KRSの発現が抑制される細胞株の場合、TGFβ1の効果が表れず、これは前記の結果と同様で、たとえ細胞が瓦解されない不完全な現象であってもKRSの抑制でEMT関連因子の発現調節次元で中間葉細胞の性質を有する細胞であるため、TGFβ1による追加的な細胞の離脱が誘導されないことがあり得ることを示す。
【０１１４】
<実施例14>3次元コラーゲンゲル環境で回転楕円体の塊で培養された細胞からの細胞の離脱がKRS発現依存的であることを確認
細胞を取り巻く微小環境が細胞の機能に影響を与えることが、2次元および3次元培養環境で培養された細胞株で確認された（図2および図10）、したがって、3次元コラーゲンゲル環境で回転楕円体の塊で培養された細胞にTNFαおよびTGFβ1のようなサイトカインを処理する場合、回転楕円体からの離脱がKRS発現に依存的かどうかを確認するために、TNFαおよびTGFβ1を処理して36時間時間差顕微鏡を用いて観察した。
【０１１５】
その結果、図11Aに示すように、TNFαを処理した時、HCT116親細胞、KRS過発現細胞株およびKRS発現が抑制された細胞株のすべてで浸潤性突起（invasive protrusion）の形成が増加し、回転楕円体の塊を成していた細胞がそれぞれ離れて移動することが確認された（図11A）。つまり、TNFαによる細胞の浸潤性突起の形成と離脱はKRSに非依存的であると確認した。しかし、TGFβ1サイトカインが細胞の離脱に重要な役割をするものと推定されて（図10B）TGFβ1を処理し、その結果、図11Bに示すように、HCT116親細胞およびKRS過発現細胞株にTGFβ1を処理したとき、浸潤性突起が形成されることが観察されなかったが、回転楕円体の塊から細胞が離脱して移動する現象を確認した。一方、KRSの発現が抑制された細胞株の場合、TGFβ1を処理しても細胞の移動が顕著に減少することを確認し、細胞の離脱現象が表れないことを確認した（図11B）。
【０１１６】
これは、KRSの発現抑制で減少していた上皮細胞のマーカーを含むEMT関連タンパク質の発現量を確認した場合、TGFβ1処理によってZO1とオクルディン（occludin）のような細胞-細胞の連結地点（cell-cell junction）に存在する上皮細胞マーカーのタンパク質レベルが増加してフィブロネクチンの発現が再び減少するものとみて、2次元環境であったが、細胞の微細環境内のTGFβ1によってKRSの発現が低下した細胞では、EMT現象が抑制されることを示す。つまり、KRS発現が抑制されて中間葉細胞の形態に、一部がある程度変換されたので（図2および図8）EMT誘発サイトカインであるTGFβ1（Katsunoら,2013年,Curr Opin Oncol,第25巻,P.76-84）のような微細環境因子による効果は、それ以上細胞の離脱、移動、および浸潤に影響を及ぼさないことを示す。
【０１１７】
<実施例15>3次元コラーゲンゲル環境で回転楕円体の塊で培養された細胞でERKsを抑制した場合、細胞の離脱抑制を確認
前記<実施例14>の結果において、HCT116親細胞にTGFβ1を処理した時の回転楕円体の塊から細胞が離脱および移動する現象が確認され、KRSの発現が抑制された細胞は、TGFβ1を処理しても離脱せず、一方、KRSの発現が抑制された細胞は、KRSを発現する細胞と比較して、ERKsの活性が著しく低下したことが確認された（図5参照）。したがって、細胞外信号調節キナーゼ（extracellular signal-regulated kinase,ERKs）阻害剤であるU0126をHCT116親細胞株に処理した時、細胞の離脱および移動に否定的な影響を与えることが予想された。それを確認するためにERKs阻害剤である50μMのU0126を細胞株に処理して、回転楕円体の塊をリアルタイム映像化（live imaging）して細胞の離脱と移動現象を観察した。
【０１１８】
その結果、図12に示すように、ERKs阻害剤を処理した場合に細胞の離脱および移動現象は表われなかった（図12）。これは、HCT116の回転楕円体からの離脱は、ERKs活性化に依存的であることを示す。
【０１１９】
したがって、3次元コラーゲンゲル環境でHCT116親細胞の癌細胞離脱は、KRSによるERKsの活性およびパキシリンの発現および活性によって調節されることを確認した。
【０１２０】
<実施例16>FRET実験手法を用いたKRS-依存的ERK活性の測定
既存のERKの信号と活性を調べるために行なわれてきた方法は、ウェスタンブロットまたは免疫染色であり、これらの方法は、細胞のイベントの一時的な一部分をスナップ写真で観察するという欠点を有している。したがって、本実験では、ERK活性を測定することができるFRET-基礎センサーを通じて、生きている細胞内でのERK信号を観察するために、ERK活性センサーであるEKAR（extracellular signal-regulated kinase activity reporter）は、ERKのリン酸化によって立体構造変化を起こしてFRET信号が増加する原理で、細胞内EKARのCFP-YFPの比率を観察する（Harveyら,2008年,Proc Natl Acad Sci USA．2008年12月9日,第105（49）巻,P.19264-9）ことによってERK活性を測定した。
【０１２１】
具体的には、HCT116親細胞、KRS発現が阻害された細胞株およびKRS過発現細胞株にEKAR（the extracellular signal-regulated kinase activity reporter,Harveyら,2008年,Proc Natl Acad Sci USA．2008年12月9日,第105（49）巻,P.19264-9）を48時間トランスフェクションした。2D上で観察した場合、細胞を分注して、一般の培養ディッシュ上では24時間後に、ラミニン-コーティングディッシュ上に再分注（2％血清を含んだ状態で）し、2時間後にFRET（Fluorescence resonance energy transfer）顕微鏡でERK活性を測定した。FRETイメージは、Nikon Ti-E inverted microscope（equipped with PFS,CoolSNAP HQ camera（Roper Scientific,Trenton,NJ）、excitation and emission filter wheels）を使用してイメージ（4X4 binning mode,200-ms exposure）を得た。すべてのシステムは、MetaMorph softwareを通じて作業した。細胞内FRETプローブの二重放出比（dual-emission ratio,CFP/FRET）によって得られたイメージは、MetaMorph softwareで提供されるdisplay（IMD）modeを用いて、FRET/CFP比率を8段階に分けて擬似色（pseudo-color）イメージで示した。
【０１２２】
その結果、KRS依存的にERKのリン酸化の程度が変化していることを確認し、これをERKsリン酸化が高い信号を赤色に、リン酸化が低い信号を青色に擬似色（pseudo-color）を通じて比較分析した（図13A ）。分析した結果を統計処理した結果、KRS過発現細胞株で最も高いERKの活性を示し、その次に親細胞、そしてKRS発現が阻害された細胞株でERKの活性が低く表示されることを確認した（図13B）。このようなFRET信号強度の結果をもとにKRSの発現は、ERKの活性に密接に関与していることを示す。
【０１２３】
<実施例17>KRS発現抑制細胞株に対するERKsのトランスフェクションによるパキシリンの発現および信号活性変化を確認
KRSが発現される親細胞および過剰発現細胞株では、ERKsとパキシリンの活性化および3次元環境で細胞塊から離脱の現象が誘導されたが、KRSの発現が抑制された細胞では、ERKsとパキシリンの活性化と細胞の離脱が起きなかった。したがって、KRSの発現が抑制された細胞株に人為的にERKsあるいはパキシリンを過剰発現させた場合、3次元環境で細胞塊から離脱の現象が誘導されるかどうかを確認した。
【０１２４】
具体的には、KRS発現抑制細胞株に対するERKsあるいはパキシリンの遺伝子をリポフェクタミン2000（Life Technology,Grand Island,ニューヨーク,米国）を用いて、生産者のプロトコルに従ってトランスフェクションをして48時間後、その細胞を3次元コラーゲンゲルで一日培養した後、抽出液を確保して、ウェスタンブロットで確認した。
【０１２５】
その結果、KRSの発現が抑制された細胞株shKRS2-1およびshKRS5-4にERK（Ek）を発現させた場合、それぞれERKの活性化が起こり、パキシリンの発現およびTyr118のリン酸化が向上した。しかし、FAKの活性は変わらないことを確認した（図14）。
【０１２６】
<実施例18> KRSとp67ラミニン（laminin）受容体（p67LR）およびインテグリンα6β1の結合体形成確認
インテグリンα6β1は、細胞外に存在するECM分子であるラミニンと相互作用し、膜に存在するラミニン受容体とも結合するという事実が報告されたことがあり（Canfield,SM,and Khakoo,AY 1999年,J Immunol,第163巻,P.3430-3440）、インテグリンは、細胞内癒着信号（adhesion signal）に直接関与するタンパク質としてERKの活性を調節することがよく知られている（Lee,JW,and Juliano,R,2004年,Mol Cells 第17巻,P.188-202）。したがって、細胞内のERKの活性を誘導するKRS、インテグリンα6β1、p67LRの相互作用を調べるために、Mycで標識されたKRSを発現する細胞株を用いて、共免疫沈降法を行なった、特にラミニンの影響を調べるためにラミニン（laminin）コーティングされたディッシュにリプレーティングして培養された細胞から確保した細胞抽出液を用いて共免疫沈降法を行なった。
【０１２７】
具体的には、正常に10％血清を含む培地で育てた細胞から得られた総細胞抽出物と（細胞がヘルシーながら血清の影響を最小限に抑えるため）2％血清が存在する条件でラミニンコーティング（10μg/ml）をした培養皿に、再び再分注し、リプレーティング（replating）過程を2時間行なって得られた総細胞抽出物にそれぞれ抗-Myc抗体を入れて4℃で18時間以上反応させた。4°Cでチューブを取り出した後、プロテインAとG（体積比1：1）がコーティングされたセファロースビーズ（sepharose bead）を入れて4°Cで4時間反応させた。RIPAバッファーでビーズを洗浄した後、2×SDS-PAGE試料バッファーで5分煮る。このように準備された共免疫沈降法サンプルをウエスタンブロットを通じて表記された因子との結合を確認した。
【０１２８】
その結果、myc-KRSとインテグリンα6、インテグリンβ1およびp67LRが互いに結合していることを確認することができた。しかし、KRS阻害剤であるYH16899（Kim DGら,Nat Chem Biol．2014年1月,第10（1）巻,P.29-34．）を処理した時、その結合が阻害されることが分かった。このタンパク質間の相互作用でラミニンの影響を調べるために、ラミニン-コーティングディッシュに2％FBSのみ添加した培地を用いて再分注し、同一な共免疫沈降法を行なった時、同じようにmyc-KRSとインテグリンα6、インテグリンβ1およびp67LRが互いに結合していることを確認し、加えて付着信号（adhesion signal）が抑制された懸濁液状況でもKRSとp67LRの結合を確認することができた（図15A、15B）。しかし、インテグリンα6、インテグリンβ1とKRSの結合は、細胞が付着できなかった懸濁液の場合には起こらず、付着した場合にのみ結合が可能なことが確認された（図15A、15B）。結論的に、細胞付着信号に関与するインテグリンα6β1とKRSの結合が追加的にYH16899化合物の処理によって抑制され得ることを確認することにより、細胞内接着に関連した信号伝達活性にKRS/p67LR/インテグリンα6β1の結合体形成が重要であり、その結合体の形成にYH16899が影響を与え得ることを示す。
【０１２９】
<実施例19>3次元コラーゲンゲルで培養された細胞を用いたChIP（Chromatin Immunoprecipitation）分析を通じて、活性化されたERKsがパキシリンの発現を調節することができることを確認
前記<実施例17>で確認したように、KRS発現を低下させたshKRS2-1細胞株にそれぞれpCMV-Mock、pCMV-パキシリン、pCMV-ERK1/2を一時的トランスフェクションした時、KRS発現が阻害された細胞株にERK1/2を入れた時、パキシリンの発現が増加することを確認した。したがって、HCT116細胞株でERKsの活性によりパキシリンの発現が調節されるという予測のもと、ERKsの下位因子としてよく知られている転写因子ELK-1、c-Junを通じてパキシリンの発現を調節するかどうかを確認するために、ChIP（Chromatin Immunoprecipitation）を行なった。
【０１３０】
具体的には、3次元コラーゲンゲル内で培養されたKRSが発現調節された細胞で、JNKsやp38のリン酸化およびERKsの下位転写因子でElk-1またはc-Junのリン酸化（活性化）をウェスタンブロットで確認した場合、KRSによるERKsの活性化は、c-Junの活性化に連携することが確認された。3次元コラーゲンゲルで回転楕円体で培養したHCT116親細胞株にDMSOを処理した対照群、YH16899を処理した試料、およびKRS発現が阻害された細胞株shKRS2-1からの試料をChIP-IT Express Enzymatic（Active motif ）キット（BMS）を用いて、超音波分析（sonication）を通じてクロマチン細分化（Chromatin fragmentation）をした後、一部は入力に残し、残りのカットされたクロマチンは、c-Jun（cell signaling Technology）、あるいはElk-1（Santa Cruz Biotech．Inc.）抗体とキットで提供されるプロテインG磁気ビーズを入れて4℃で18時間以上反応させた。抗体と反応した後、磁気ビーズをキットに含まれているChIPバッファー1、2で洗浄した。クロマチンを溶出した後、逆クロスリンク（reverse cross-linking）反応を行なった。ここで、入力DNAをChIPバッファ2と5M NaClで処理した。その後、同時にChIPとinput DNA試料を95°Cで15分間反応させた。プロテイナーゼKで消化させた後、プロテイナーゼK反応停止液を用いて、消化反応を停止させた。このように得られたDNAは下記の<表3>に記述された該等プライマーを用いてPCR分析を行なった。
【０１３１】
【表３】
2016519318.tif 000005
【０１３２】
その結果、図16Aに示すように、KRSの発現とJNKsおよびp38の活性化は、連携されず、さらにERKsの下位転写因子であるElk-1やc-Jun中にKRS依存的なERKsの活性は、c-Junの活性および発現量と相関関係があることを確認した。したがって、KRS発現細胞株でERKsの活性化は、c-Junの活性につながり得ることを確認した。
【０１３３】
また、3次元コラーゲンゲルで回転楕円体で培養した細胞に、c-Jun抗体を用いてChIP分析を行なった時、対照群では、c-Junが非特異的な部位には結合しなかったが、特異的に結合可能な配列部位のパキシリンプロモーター（図16B）に結合するという事実を確認することができた。しかし、YH16899処理によってc-Junがパキシリンプロモーターに結合することが阻害されることを確認した（図16C）。これらの現象からERKsの下位因子であるリン酸化されたc-Junがパキシリンのプロモーターに結合することにより、パキシリンの転写に影響を及ぼしていることが分かる。そしてYH16899処理時には、c-Junがパキシリンプロモーターに結合できないようにするという事実を通じて、YH16899処理時パキシリンの発現が減少してパキシリンのリン酸化レベルが減少する原因であることを知ることができた。また、ERKsの下位因子としてよく知られているElk-1によってもパキシリンの転写工程を調節すると予想されたが、Elk-1抗体を用いてChIP分析をした結果、Elk-1抗体は、パキシリンプロモーターに結合していないことを確認した（図16D）。
【０１３４】
結局、3次元コラーゲンゲル内で回転楕円体の塊で培養されたHCT116細胞では、ERKsによって調節される転写因子c-Junを通じてパキシリンの転写を調節することを知ることができ、KRSとラミニン受容体との結合を阻害するYH16899を処理した時に表れる総パキシリン発現とリン酸化レベルの減少は、KRS/インテグリンα6β1/p67LRの結合が不可能でERKsの活性が成り立たないことにより、c-Junがパキシリンプロモーターに結合されず、発現が抑制されるためであることを確認した。そして、3次元コラーゲンゲル内で回転楕円体で培養されたHCT116細胞のERKsによるパキシリンの発現調節は、Elk-1ではなくc-Junが関与するという事実を示す。
【０１３５】
<実施例20>他の大腸癌細胞株でKRS発現に依存的な離脱およびYH16899化合物処理によるERKsのリン酸化とパキシリンの発現およびリン酸化の抑制的効果確認
HCT116細胞株でKRSの発現依存的に3次元コラーゲンゲル内の回転楕円体から離脱したり、またはYH16899を処理した時に見られるERKsリン酸化およびパキシリンタンパク質の発現とリン酸化の減少が、普遍的で他の大腸癌細胞株でも表れ得る現象なのかどうかを調べるために、多様な大腸癌細胞株（SW620、HCT15、SNU977、KM12SM、SNU-C5）にshKRSを安定化したトランスフェクション（stable transfection）してKRSを発現抑制（clone＃2と＃5）して離脱を持続撮影（time-lapse）顕微鏡で観察したり（図17A）、YH16899を処理して信号伝達活性（図17B）を確認した。
【０１３６】
具体的には、大腸癌細胞としてよく知られているSW620、HCT15、SNU977、KM12SM、SNU-C5（韓国細胞株銀行、ソウル大学癌研究所）を3次元コラーゲンゲル内に回転楕円体の塊で分注して、6時間後に持続撮影（time-lapse）でイメージングをしたり、あるいは通常の10％血清が含まれている2D培養条件で2日間培養した後、溶解バッファー（50mM Tris-HCl、pH7.4、1％NP-40、0.25％デオキシコール酸ナトリウム、150mM NaCl、1mM EDTA）にSDS、Na3O4V、プロテアーゼインヒビターカクテル（GenDepot）を入れて溶解過程を経て細胞溶解物（cell lysate）を得てタンパク質を定量した後、ウェスタンブロットを表記の因子に対して行なった。
【０１３７】
その結果、HCT116細胞株と同様に、他の大腸癌細胞株SW620の場合、親細胞は、3次元回転楕円体の塊から離脱現象が起きたが、KRSを発現抑制した細胞株（＃2、＃5）およびSW620親細胞にU016あるいはYH16899を処理した場合には、その離脱現象が生じなかった（図17A）。そればかりではなく、多様な大腸癌細胞株においてYH16899を処理した時、細胞死滅を誘導せずにFAK、ERKs、パキシリンのリン酸化の減少と共に、E-カドヘリンおよびパキシリンの発現量の減少が生じる結果を得ることができた（図17B）。したがって、大腸癌細胞株でYH16899の処理による抑制効果は、一部の細胞株でのみ表れる特殊な現象というよりは、複数の大腸癌細胞株において普遍的に表われる現象なので、YH16899が多くの大腸癌細胞株の阻害効果をもたらし得る普遍的な阻害剤であることを確認した。
【０１３８】
<実施例21>HCT116細胞株でYH16899化合物の処理によって、ERKsのリン酸化とパキシリンの発現およびリン酸化に対する抑制的効果確認
HCT116細胞株で見られる離脱現象がERKsの活性、パキシリンの発現および活性が重要な要因として作用するので、3次元コラーゲンゲルでERKs阻害剤であるU0126と（図18A）KRS阻害剤であるYH16899を処理した時（図18B）の焦点接着関連分子と上皮マーカーの発現を確認してみた。
【０１３９】
具体的には、コラーゲンに囲まれた3次元ゲルで培養したHCT116親細胞にU0126を50、100μMもしくはYH16899を50、100μMで一日処理した後、溶解バッファーにSDS、Na3O4V、プロテアーゼインヒビターカクテル（GenDepot）を入れて4 ℃で1時間以上処理した。4℃、13000rpmで30分間遠心分離した後、新しいマイクロ遠心チューブに上澄み液（細胞抽出液）のみ移した。4×SDS-PAGE試料バッファーを入れた後、5分間、100℃で沸かした。この抽出液をα-チューブリン抗体（Sigma）を用いたウエスタンブロットを通じて定量し、他のタンパク質の発現量およびリン酸化の程度の変化をウェスタンブロットを通じて測定した。
【０１４０】
その結果、焦点接着関連分子であるFAK、ERKs、パキシリン、のリン酸化レベルが低くなり、上皮マーカーであるE-カドヘリン、β-カテニンの発現が減少することを確認した（図18A、18B）。したがって、U0126またはYH16899処理した場合、ERKsとパキシリン発現および活性抑制により3次元コラーゲン内でHCT116親細胞の離脱が妨害されることを確認した。
【０１４１】
<実施例22>KRS発現するHCT116親細胞において細胞付着に依存的なERKsの活性化にインテグリンα6の重要性確認
前記実施例では、HCT116親細胞のERKsの活性化は、KRS、p67LR、インテグリンα6β1の結合と連携して（図15）、ERKsの活性は、FAKと連携していない場合も確認された（図5）。それで、細胞が付着することによるFAKの活性化（Tyr397のリン酸化後、c-SrcによるTyr925のリン酸化を通じたERKs活性化：Lee JW and Juliano R. Molecules and Cells.2004年4月30日,第17（2）巻,P.188-202）がERKsの活性化に連結するかどうかを確認しようとした。つまり、インテグリンα6の細胞外基質との結合機能を抗体に予め結合させることによりERKの活性が抑制される場合、FAKのTyr397およびTyr925のリン酸化が連携されるかどうかを確認した。
【０１４２】
具体的には、HCT116親細胞を2％の血清が存在する場合に、懸濁液の状態で、あるいはラミニンがあらかじめコーティングされた培養皿にリプレーティングした。ここで、細胞をあらかじめ正常なIgG（Immunoglobulin,抗体対照群）やインテグリンα6抗体をあらかじめ1時間混ぜて反応させた後、リプレーティングした。リプレーティング2時間または24時間後、細胞抽出液をそれぞれ確保して前記タンパク質に対してウエスタンブロットを行なった。
【０１４３】
その結果、ラミニンがコーティングされた2D状態のHCT116細胞は、24時間程度経過した場合、ERKsの活性化およびパキシリンのリン酸化が細胞が付着した場合に誘導されたが、これらはインテグリンα6前処理によって抑制されることを確認した。しかし、FAKのリン酸化は、影響を受けずに維持されることを確認した（図19A）。これは、インテグリンα6は、KRSによるERKsの活性化に重要ではあるが、FAKのリン酸化を媒介としないことを示す。したがって、KRS発現依存的な細胞の3次元コラーゲンゲル内でのERKsの活性化、パキシリンの発現と活性化、さらに回転楕円体からの離脱は、FAKの活性化およびTyr925のリン酸化とは無関係であることを確認した。
【０１４４】
<実施例23>KRSが発現抑制された細胞株に活性化した形態のFAKやWT FAKを過発現させた場合、ERKs、パキシリンの発現と信号活性に連携されず、3次元コラーゲンゲルから離脱有無の確認
前記実施例を通じて分かるように、HCT116細胞株で見られる離脱現象は、ERKsの活性、そしてERKsの活性化によるパキシリンの発現および活性と密接な関連がある。それで、細胞が付着することによるFAKの活性化（Tyr397のリン酸化後、c-SrcによるTyr925のリン酸化を通じたERKs活性化：Lee JW and Juliano R. Molecules and Cells．2004年4月30日,第17（2）巻,P.188-202）がERKsの活性化につながってKRS発現に依存的な離脱を誘導するかどうかを確認しようとした。
【０１４５】
具体的には、HCT116 parental親細胞にAd-HA対照群ウイルスもしくはAd-HA-R454 FAKリン酸化酵素活性が死んだ形態（dead form）のアデノウイルスを感染させたり、KRSの発現を低下させた細胞株にAd-HA対照群ウイルス、Ad-HAΔN（1-100）FAK（活性化したFAK;Lim STら,Molecular Cell,2008年1月18日,第29（1）巻,P.9-22）、あるいはAd-HA-FAK WT（野生型）ウイルスを12時間感染させた後、ウェスタンブロットで前記された分子に対する発現およびリン酸化の程度を確認した（図19B）。その後、細胞株の回転楕円体を確保して、3次元コラーゲンゲルに分注した後、持続撮影顕微鏡で観察した。
【０１４６】
その結果、3次元コラーゲンゲルでKRSが発現する親細胞に非活性化（リン酸化酵素活性が死んだ）R454 FAK突然変異体が発現されても、対照群ウイルスを感染させた親細胞のように回転楕円体細胞の離脱が円滑に起きることを確認した。一方、KRS発現を低下させたHCT116細胞株に活性化形態のFAKや野生型FAKを過剰発現させてもKRSが発現抑制された細胞の離脱抑制現象を回復することができないことを確認した（図19Cおよび19D ）。活性化した突然変異体L37A FAK（Jungら,J Cell Sci.,2012年12月15日,第125（Pt24）巻,P.5960-73）を発現させたHCT116 shKRS細胞株でもFAKの活性によるERKsの活性が連携されなかったことが確認された（図19E）。
【０１４７】
<実施例24>KRSが発現抑制された細胞株にpCMV-Mock、pCMV-パキシリン、またはpCMV-ERK1/2、あるいはパキシリンとERKを共同で人為的に発現するようにトランスフェクションした場合、ERKS、パキシリンの発現と信号活性が部分的に向上し、3次元コラーゲンゲルから離脱することを確認
【０１４８】
前記実施例を通じて分かるように、HCT116細胞株で見られる離脱現象は、ERKsの活性、パキシリンの発現および活性と密接な関連がある。したがって、KRS発現が阻害された細胞株にERKsの活性とパキシリンの発現および活性を回復させれば、3次元コラーゲンゲル内で回転楕円体の離脱が起こるかどうかを確認するために、KRS発現が阻害された細胞株にパキシリン（Paxクローン）あるいはERKs（ERKクローン）を単独で、そしてパキシリンとERKsを一緒に入れた（PEEクローン）安定化した細胞株（stable cell lines）を作製し、その中でウェスタンブロットを通じてERKsおよびパキシリン活性が優れたクローンを選択した（図20A）。選択されたクローンは、回転楕円体に形成されるようにした後、分注して3次元コラーゲンゲル内で離脱が誘導されるかどうかを持続撮影顕微鏡を通じて28時間観察した。
【０１４９】
具体的には、KRS発現を低下させた細胞株にそれぞれpCMV-Mock、pCMV-パキシリン、pCMV-ERK1/2をトランスフェクションして安定化した細胞株の（stable cell lines）を構築した後、ウェスタンブロットで表記された因子に対して確認した（図20A）。その中で、それぞれの分子がトランスフェクションがよくて発現が良い細胞株を選択して回転楕円体を形成させた。作られた回転楕円体を分注して、3次元コラーゲンゲル内で回転楕円体の離脱の有無を持続撮影顕微鏡を通じて28時間観察した（図20B）。
【０１５０】
その結果、3次元コラーゲンゲルでHCT116 KRS発現を低下させた細胞株がパキシリンもしくはERK1/2の活性を得るか、または、両方のタンパク質の活性を得ることにより離脱する現象を観察することができた（図20B）。また、特異なことにKRS発現が阻害された細胞株にERK1/2を入れた時、パキシリンの発現が増加することを確認した（図20A）。それで、HCT116細胞株でERKsによってパキシリンの発現が調節されるという予想を確認することができた。したがって、KRS発現が阻害されることによって表われた離脱現象の抑制は、ERKsとパキシリンの活性阻害による現象であることを再確認した。
【０１５１】
<実施例25>ヒト結腸癌細胞でKRS、パキシリン、ERKs発現の比例的な相関関係を確認
韓国人の大腸癌患者の癌組織および対応する正常組織でKRS、パキシリン、ERKs発現の相関関係を確認するためにウェスタンブロットおよび免疫組織化学を行なった。
【０１５２】
具体的には、Grade IIおよびIIIに確定診断された臨床的組織を含むヒト結腸癌細胞から確保された組織の抽出液あるいは組織を用いて、パキシリン、p-ERKsとKRSのウェスタンブロット（図21A）または免疫組織化学染色（図21B）を通じて、それらが侵襲性癌細胞の辺縁（margin）で肯定的な関連性を確認した。免疫組織化学は、細胞や組織内の抗原を可視化する方法である。実際、癌組織内に多様な細胞の種類が存在するので、特定の細胞の種類や組織の部位に対して免疫組織化学を通じて様々な抗原の発現の部位および程度を相互的に検査することにより、同時に色々なタンパク質の発現の部位と程度の関連性に対して明らかにすることができる。
【０１５３】
その結果、ヒト結腸癌細胞でパキシリンとp-ERKs、KRSの発現をDAB stainingを通じて、各タンパク質の陽性部位と陽性反応の強さを観察した。その結果、grade IIまたはIIIの大腸癌患者のサンプルでKRSとパキシリンが同一な部位で高く発現することを観察し、また、p-ERKsの陽性反応の部位とKRS、パキシリンの陽性反応部位が一致することも確認できた（図21A、図21B）。したがって、臨床的結腸癌細胞（Clinical colon cancer tissues）でKRS、pERKsおよびパキシリンの発現部位が侵襲性癌細胞の辺縁（margin）で肯定的な関連性を示すので、KRSによって媒介される転移において、KRSによるERKsの活性調節そして再びパキシリンの発現および活性の調節が重要であり、癌の初期転移段階において、前記因子の抑制制御を通じた癌転位の抑制が可能であると思慮され、これらの3次元コラーゲンゲルで癌細胞離脱分析システムは、抗癌転位阻害剤の開発に役立つであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図３ｇ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図１９ｃ】
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【図１９ｄ】
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【図１９ｅ】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年1月5日(2016.1.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
1）3次元あるいは細胞外基質に囲まれた細胞培養環境でリジル-tRNA合成酵素（lysyl-tRNA synthetase;KRS）を発現または発現しないように調節された癌細胞株または癌細胞塊を培養する工程;
2）前記工程1）の癌細胞株または癌細胞塊に被検物質を処理する工程;
3）前記工程2）の癌細胞株または癌細胞塊でKRSの作用を分析する工程;と
4）前記工程3）のKRS作用を阻害する被検物質を選別する工程を含む、癌転移抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記工程1）の3次元環境が、水溶性環境またはコラーゲンに囲まれていることを特徴とする請求項１に記載の癌転移阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記工程1）の癌細胞株または癌細胞塊が、転移性癌または転移性誘発可能な癌であることを特徴とする請求項１に記載の癌転移阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記転移性癌が、大腸癌、乳癌、肝臓癌、胃癌、骨腫瘍、肺癌、膵臓癌、頭部または頸部癌、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、食道癌、小腸癌、肛門部癌、結腸癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、陰門癌、ホジキンリンパ腫、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌および中枢神経系腫瘍からなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の癌転移抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記工程3）のKRSの作用が、癌細胞の細胞-細胞間付着、細胞-細胞外基質（extracellular matrix;ECM）付着、細胞の分散（scattering）、細胞の創傷治癒（wound -healing）、細胞付着の信号伝達因子の活性変化、c-Junのパキシリンプロモーターへの結合、および回転楕円体（spheroid）細胞塊からの離脱（dissemination）からなる群から選択されるいずれか一つ以上を分析することを特徴とする請求項１に記載の癌転移抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記細胞-細胞間の付着が、ZO-1、オクルディン、CK14、β-カテニン（β-catenin）、またはE-カドヘリン（E-cadherin）からなる群から選択されたいずれか一つ以上の上皮マーカーの発現または発現位置の変化、またはフィブロネクチン、ツイスト（Twist）、ビメンチン、α-SMA（smooth muscle actin）、スナイル１（snail1）、スラグ（Slug）、またはN-カドヘリン（N- cadherin）からなる群から選択されたいずれか一つ以上の中間葉マーカーの発現または発現位置の変化、または細胞の分散であることを特徴とする請求項５に記載の癌転移阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記細胞-細胞外基質付着が、細胞が細胞外基質に付着した程度と細胞の広がり（spreading）程度、焦点接着（focal adhesion）の生成と瓦解、アクチンの再構成、リン酸化されたFAK 、c-Src、ERKs、またはパキシリンの発現、または発現位置の変化であることを特徴とする請求項５に記載の癌転移阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記細胞付着の信号伝達活性が、FAK、c-Src、ERKs、c-Jun、およびパキシリンの発現またはリン酸化の変化または減少、またはインテグリンα6との結合の変化であることを特徴とする請求項５に記載の癌転移阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
1）3次元あるいは細胞外基質に囲まれた環境でリジル-tRNA合成酵素（lysyl-tRNA synthetase;KRS）を発現または発現しないように調節された癌細胞株または癌細胞塊を培養する工程;
2）前記工程1）の癌細胞株または癌細胞塊でKRSの作用を分析する工程;と
3）前記工程2）のKRSの作用レベルを用いて前記癌細胞株または癌細胞塊の転移レベルを分析する工程を含む、癌細胞の癌細胞株または癌細胞塊からの離脱（dissemination）、上皮-中胚葉細胞転移または分化（epithelial-mesenchymal transition）、移動、浸潤、転移レベルまたはそれらに関連した信号伝達因子の発現および活性のモニタリング方法。
【請求項１０】
前記工程1）の3次元環境が、水溶性環境またはコラーゲンに囲まれていることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程1）の癌細胞株または癌細胞塊が、転移性癌または転移性誘発可能な癌であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程2）のKRSの作用が、癌細胞の細胞-細胞間付着、細胞-細胞外基質（ECM）付着、細胞の分散、細胞の創傷治癒、細胞付着の信号伝達因子の活性の変化、c-Junのパキシリンプロモーターへの結合、および回転楕円体細胞塊からの離脱からなる群から選択されるいずれか一つ以上を分析することを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞-細胞間の付着が、ZO-1、オクルディン、CK14、β-カテニン、またはE-カドヘリンからなる群から選択されたいずれか一つ以上の上皮マーカーの発現または発現位置の変化、またはフィブロネクチン、ツイスト、ビメンチン、α-SMA（smooth muscle actin）、スナイル１、スラグ、またはN-カドヘリンからなる群から選択されたいずれか一つ以上の中間葉マーカーの発現または発現位置の変化、または細胞の分散であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞-細胞外基質付着が、細胞が細胞外基質に付着した程度と細胞の広がり程度、焦点接着の生成と瓦解、アクチンの再構成、リン酸化されたFAK 、c-Src、ERKs、またはパキシリンの発現または発現位置の変化であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞付着の信号伝達活性が、FAK、c-Src、ERKs、c-Jun、またはパキシリンの発現またはリン酸化の変化または減少、またはインテグリンα6との結合の変化であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【国際調査報告】
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