(57)【要約】Ｅ１２と名付けられたバレイショ栽培品種が、開示される。本発明は、バレイショ栽培品種Ｅ１２の塊茎、バレイショ栽培品種Ｅ１２の種子、バレイショ栽培品種Ｅ１２の植物及び植物部分、バレイショ栽培品種Ｅ１２から産生された食物製品、並びに、バレイショ栽培品種Ｅ１２をそれ自体又は別のバレイショ変種と交配することによってバレイショ植物を産生するための方法に関連する。本発明はまた、トランスジェニックバレイショ植物を産生するための方法、並びにこれらの方法によって産生されたトランスジェニックバレイショ植物及びその部分にも、関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
バレイショ栽培品種Ｅ１２のバレイショ塊茎又は塊茎の部分であって、前記塊茎の代表的サンプルは、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１２０３７２の下で寄託されている、バレイショ塊茎又は塊茎の部分。
【請求項２】
請求項１に記載の前記塊茎又は前記塊茎の部分を成長させることによって産生された、バレイショ植物またはその部分。
【請求項３】
請求項２に記載の前記植物の生理学的特徴及び形態学的特徴の全てを有する、バレイショ植物。
【請求項４】
請求項２に記載の前記植物から産生される細胞の組織培養物であって、前記組織培養物の前記細胞は、葉、花粉、胚、子葉、胚軸、分裂組織細胞、根、根冠、雌ずい、葯、花、幹及び塊茎から成る群より選択される植物部分から産生される、組織培養物。
【請求項５】
請求項４に記載の前記組織培養物から再生されたバレイショ植物であって、前記植物は、バレイショ栽培品種Ｅ１２の生理学的特徴及び形態学的特徴の全てを有する、バレイショ植物。
【請求項６】
請求項１に記載の前記バレイショ塊茎又は前記塊茎の部分を成長させることによって産生された、バレイショ種子。
【請求項７】
請求項６に記載の前記種子を成長させることによって産生された、バレイショ植物またはその部分。
【請求項８】
請求項７に記載の前記バレイショ植物の組織培養物から再生されたバレイショ植物であって、前記植物は、バレイショ栽培品種Ｅ１２の生理学的特徴及び形態学的特徴の全てを有する、バレイショ植物。
【請求項９】
バレイショ種子を産生するための方法であって、少なくとも１種のバレイショ植物が請求項２に記載の前記バレイショ植物である２種のバレイショ植物を交配すること、及び生じたバレイショ種子を収穫することを含む、方法。
【請求項１０】
バレイショ種子を産生するための方法であって、少なくとも１種のバレイショ植物が請求項７に記載のバレイショ植物である２種のバレイショ植物を交配すること、及び生じたバレイショ種子を収穫することを含む、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の前記方法によって産生された、バレイショ種子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の前記バレイショ種子を成長させることによって産生された、バレイショ植物またはその部分。
【請求項１３】
請求項１２に記載の前記植物から産生された、バレイショ種子。
【請求項１４】
前記バレイショ植物のうちの１種は、トランスジェニックであり、他方は、バレイショ栽培品種Ｅ１２である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記バレイショ植物のうちの１種は、トランスジェニックであり、他方は、バレイショ栽培品種Ｅ１２である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の前記方法によって産生された、バレイショ植物またはその部分。
【請求項１７】
バレイショ栽培品種Ｅ１２に所望の形質を導入する方法であって、前記方法は、
（ａ）塊茎の代表的サンプルがＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１２０３７２の下で寄託されているＥ１２植物を、所望の形質を含む別のバレイショ栽培品種と交配することにより、子孫植物を産生することであって、前記所望の形質は、雄性不稔、除草剤耐性、昆虫耐性、改変された脂肪酸代謝、改変された炭水化物代謝及び細菌性の病気、真菌性の病気又はウイルス性の病気に対する耐性からなる群より選択されること；
（ｂ）前記所望の形質を有する１種以上の子孫植物を選択すること；
（ｃ）選択された子孫植物を、Ｅ１２植物と戻し交配し、戻し交配子孫植物を産生すること；
（ｄ）前記所望の形質を有する戻し交配子孫植物を選択すること；並びに
（ｅ）工程（ｃ）及び（ｄ）を２回以上連続して繰り返し、前記所望の形質を含む選択された第３又はそれ以上の戻し交配子孫植物を産生すること、を含む方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の前記方法によって産生されたバレイショ植物であって、前記植物は、前記所望の形質を有し、バレイショ栽培品種Ｅ１２の生理学的特徴及び形態学的特徴の全てを有する、バレイショ植物。
【請求項１９】
前記所望の形質は、除草剤耐性であり、前記耐性は、イミダゾリノン、スルホニルウレア、グルホシネート、Ｌ−ホスフィノトリシン、トリアジン及びベンゾニトリルから成る群より選択される除草剤に対して付与される、請求項１８に記載のバレイショ植物。
【請求項２０】
前記所望の形質は、昆虫耐性であり、前記昆虫耐性は、バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）内毒素をコードする導入遺伝子によって付与される、請求項１８に記載のバレイショ植物。
【請求項２１】
前記所望の形質は、改変された脂肪酸代謝又は改変された炭水化物代謝であり、前記所望の形質は、フルクトシルトランスフェラーゼ、レバンスクラーゼ、α−アミラーゼ、インベルターゼ及びデンプン分枝酵素から成る群より選択されるタンパク質をコードする核酸、又はステアリル−ＡＣＰデサチュラーゼのアンチセンスをコードするＤＮＡによって付与される、請求項１８に記載のバレイショ植物。
【請求項２２】
商用植物製品を産生する方法であって、請求項２の前記植物又はその部分を得ること、及び、前記植物又はその植物部分から商用植物製品を産生することを含み、前記商用植物製品は、フライドポテト、ポテトチップス、脱水バレイショ材料、ポテトフレーク及びポテト顆粒から成る群より選択される、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の前記方法によって産生された、商用植物製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮特許出願第６１／８１８，７５２号（２０１３年５月２日出願）に対する優先権を主張し、その全体は、本書中で参考によって組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、Ｅ１２と名付けられた新規なバレイショ（ｐｏｔａｔｏ）栽培品種、並びに、そのバレイショ変種によって産生された塊茎、植物、植物部分、培養組織及び種子に関する。本発明は、さらに、バレイショ栽培品種Ｅ１２由来の食物製品、例えば、フライドポテト、ポテトフレーク及びポテト顆粒に関する。本出願において挙げられる全ての刊行物は、本書中で、参考によって組み込まれる。
【０００３】
バレイショは、世界で四番目に重要な食物収穫物であり、断然最も重要な野菜である。バレイショは、現在、米国のほぼ全ての州で、市販用に育てられている。年間のバレイショ生産量は、米国内で１．６×１０１０ｋｇ（１８００万トン）を超え、世界中で２．７２×１０１１ｋｇ（３億トン）を超える。バレイショの人気は、主に、その汎用性及び栄養的な価値に起因する。バレイショは、新鮮なまま、冷凍して又は乾燥させて使用されてもよく、又は、粉末、デンプン又はアルコールに加工されてもよい。これらは、炭水化物の複合体を含み、カルシウム、ナイアシン及びビタミンＣが豊富である。
【０００４】
食品産業においてバレイショの品質は、２つの重大な要因により、悪く作用する：（１）バレイショは、揚げる際又は焼く際に迅速に酸化されて発癌物質であるアクリルアミドを形成する非必須アミノ酸であるアスパラギンを大量に含む；及び（２）バレイショは、傷ついたバレイショの損傷プラスチドからポリフェノールオキシダーゼが漏れ出した際に起こる望まざる事象である酵素的褐色化及び変色を、非常に受け易い。細胞質において、酵素は、フェノールを酸化し、これは、迅速に重合体化して、暗色の色素を産生する。塊茎は、大量のリン酸化デンプンを含み、これらの幾らかは、保存の間に分解されて、グルコース及びフルクトースを産生する。これらの還元糖は、１２０℃を超える温度で加熱された場合に、アミノ酸と反応してアクリルアミドを含むメイラード産物を形成する。デンプンリン酸化に関与する２つの酵素は、水ジキナーゼＲ１及びホスホリラーゼ−Ｌ（Ｒ１及びＰｈＬ）である。褐色化はまた、デンプンのグルコース及びフルクトースへの部分的分解の結果として、非酵素的にも起こる。
【０００５】
現在、低アクリルアミド含量、黒斑傷耐性の上昇及び老化甘味増加の低減を有する塊茎を産生するバレイショ植物変種は、存在しない。従って、毒性化合物のレベルの低下を有するが、未知又は外来性の核酸の使用を伴わないバレイショ変種を開発する需要が、存在する。本発明は、この需要を満たす。
【０００６】
関連技術及びそれに関連する制限の上述の例は、例示を意図し、排除を意図しない。関連技術の他の限定は、本明細書を読んだ際に、乙業者に明らかになる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以下の実施形態及びその局面は、システム、ツール及び方法と組み合わせて記載され、これらは、例示を意味し、範囲の限定を意味しない。種々の実施形態において、上述の問題の１つ以上は、軽減されているか又は消滅しており、他方で、他の実施形態は、他の改善を指向する。
【０００８】
この目的のために、本発明は、バレイショ植物ゲノムに対してネイティブであり、外来性ＤＮＡ、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＤＮＡ、ウイルスマーカー又はベクター骨格配列を含まない核酸配列によって、形質転換された新規なバレイショ変種Ｅ１２を提供する。むしろ、バレイショ変種Ｅ１２のゲノム内に挿入されたＤＮＡは、バレイショに対してネイティブであるか、又はバレイショに生殖的に適合性な植物であるワイルドポテト（ｗｉｌｄ  ｐｏｔａｔｏ）に対してネイティブである非コードポリヌクレオチドであり、黒色斑傷の発現、アスパラギン蓄積及び老化甘味増加に関与する遺伝子をサイレンシングする。
【０００９】
従って、１つの実施形態において、本発明は、第１サイレンシングカセット及び第２サイレンシングカセットを含むｐＳＩＭ２７８と呼ばれる植物ベクターを提供し、第１サイレンシングカセットは、アンチセンス方向で、アスパラギンシンセターゼ−１遺伝子（ｆＡｓｎ１）の断片とポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の３’−非翻訳配列との２コピーのＤＮＡセグメントを有し、第２サイレンシングカセットは、アンチセンス方向で、バレイショホスホリラーゼ−Ｌ（ｐＰｈＬ）遺伝子の断片とバレイショＲ１遺伝子の断片との２コピーのＤＮＡを含む。ｐＳＩＭ１２７８ベクターは、植物形質転換の前の植物ＤＮＡの維持を支え且つ植物細胞の形質転換の際には植物細胞内に移動しない９，５１１ｂｐの骨格領域、及び形質転換の際に植物細胞のゲノム内に安定的に組み込まれるネイティブなＤＮＡを含む１０，１４７ｂｐのＤＮＡ挿入領域を含む。
【００１０】
異なる実施形態において、本発明は、本発明の植物ベクターによって形質転換した植物細胞を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、本発明の植物ベクターによって形質転換した１つ以上の細胞を含むバレイショ植物変種を提供する。本発明の１つの局面において、バレイショ植物変種は、ベクターの２つのサイレンシングカセットのうち少なくとも１つを発現し、サイレンシングカセットの発現は、遺伝子内植物の塊茎においてアスパラギンシンセターゼ−１遺伝子及びポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子の下方制御をもたらす。本発明の好ましい局面において、少なくとも１つのサイレンシングカセットを発現するバレイショ植物変種の塊茎は、同じ変種の非形質転換植物の塊茎に存在しない２以上の所望の形質を提示する。本発明の最も好ましい局面は、２以上の所望の形質が、低アスパラギン蓄積、黒斑傷の低下及び熱誘導性アクリルアミド形成の低下から成る群より選択される。
【００１１】
本発明の異なる局面において、バレイショ植物変種は、植物ＤＮＡベクターのサイレンシングカセットの両方を発現し、サイレンシングカセットの発現は、バレイショ植物変種の塊茎において、アスパラギンシンセターゼ−１遺伝子及びポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子、ホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子及びジキナーゼＲ１遺伝子の下方制御をもたらす。本発明の好ましい局面において、植物ＤＮＡベクターの２つのサイレンシングカセットを発現するバレイショ植物変種の塊茎は、同じ変種の非形質転換植物の塊茎に存在しない２以上の所望の形質を提示する。好ましい実施形態において、２以上の所望の形質が、低アスパラギン蓄積、黒斑傷の減少、保存の間の還元糖の蓄積の低下、及び熱誘導性アクリルアミド形成の低下から成る群より選択される。本発明の１つの局面において、植物ＤＮＡベクターの２つのサイレンシングカセットを発現するバレイショ植物変種は、Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ  Ｅ１２変種である。
【００１２】
従って、本発明に従い、Ｅ１２と名付けられたソラナム・ツベロサムＬ．（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  Ｌ．）の属及び種の新規なバレイショ栽培品種が、提供される。従って、本発明は、バレイショ栽培品種Ｅ１２、バレイショ栽培品種Ｅ１２の塊茎、バレイショ栽培品種Ｅ１２の植物、バレイショ栽培品種Ｅ１２の種子、バレイショ栽培品種Ｅ１２の食物製品、並びに、バレイショ栽培品種Ｅ１２を自家受粉するか、又はバレイショ栽培品種Ｅ１２を別のバレイショ栽培品種と交配すること、及びバレイショ栽培品種Ｅ１２の突然変異誘発若しくは形質転換によるバリアントの作製によってバレイショ栽培品種Ｅ１２を産生するための方法に関する。
【００１３】
従って、栽培品種Ｅ１２を用いるこのような任意の方法が、本発明の実施形態である：自家受粉、戻し交配、ハイブリッド産生、集団に対する交配など。少なくとも親の一方としてバレイショ栽培品種Ｅ１２を用いて産生される全ての植物が、本発明の範囲内である。好都合にも、このバレイショ栽培品種は、他の異なるバレイショ植物との交配のために使用されて、優れた特徴を有する第１世代（Ｆ１）バレイショハイブリッド塊茎、種子及び植物を産生してもよい。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、バレイショ栽培品種Ｅ１２の単一若しくは複数遺伝子変換植物を提供する。１つの実施形態において、移入された遺伝子は、優性対立遺伝子であっても、又は劣性対立遺伝子であってもよい。幾つかの実施形態において、移入された遺伝子は、除草剤耐性、昆虫耐性、細菌性、真菌性又はウイルス性の病気に対する耐性、雄性稔性、雄性不稔、栄養品質の増大、均一性、並びにデンプン及び他の炭水化物の濃度の増大、傷のでき易さの低下及びデンプンから糖への変換率の低下などの形質を付与する。この遺伝子は、天然に存在するバレイショ遺伝子であっても、遺伝子操作技術、戻し交配又は突然変異を通して導入された導入遺伝子であってもよい。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、バレイショ栽培品種Ｅ１２の組織培養物における使用のための、再生可能な細胞を提供する。１つの実施形態において、組織培養物は、上述のバレイショ植物の生理学的及び形態学的特徴の全てを有する植物を再生すること、並びに、上述のバレイショ植物と実質的に同じ遺伝子型を有する植物を再生することが、可能である。幾つかの実施形態において、このような組織培養物における再生可能細胞は、胚、プロトプラスト、分裂組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、雌ずい、子葉、胚軸、根、根冠、花、種子、葉柄、塊茎、芽又は幹である。なおさらに、本発明は、本発明の組織培養物から再生されたバレイショ植物を提供する。
【００１６】
さらなる実施形態において、本発明は、バレイショ植物変種Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ  Ｅ１２の塊茎から作製される食物製品を提供する。好ましくは、食物製品は、熱処理製品である。なおより好ましくは、食物製品は、フライドポテト、ポテトチップス、脱水バレイショ材料、ポテトフレーク又はポテト顆粒である。
【００１７】
上述の例示的局面及び実施形態に加え、さらなる局面及び実施形態が、以下の説明の研究によって、明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクターを図示する。左側のベクター骨格領域は、９，５１１ｂｐ長であり、９，９５７ｂｐの位置にて開始し、１９，４６８ｂｐの位置にて終わる。骨格ＤＮＡは、主に、植物形質転換の前のＤＮＡ挿入物の維持の指示を提供する細菌ＤＮＡから成る。ＤＮＡ挿入領域（右側）は、１０，１４７ｂｐ長（１９，４６９ｂｐ〜１９，６６０ｂｐ及び１ｂｐ〜９，９５６ｂｐ）である。ＤＮＡ挿入物は、ネイティブのＤＮＡのみから成り、形質転換の際にバレイショ遺伝子内に安定的に組み込まれた。
【図２】ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクター内に挿入されたＤＮＡ挿入物内のサイレンシングカセットの概略図を提供する。各サイレンシングカセットは、スペーサーによって隔てられた２つの遺伝子断片の２コピーを含む。４つの標的遺伝子、すなわちＡｓｎ−１、Ｐｐｏ−５、Ｐｈｌ及びＲ１の断片を含む２コピーのＤＮＡセグメントは、Ｐｒｏとして示される２つの収れん型プロモーターの間に逆方向反復として挿入され、これは、塊茎内で優性に活性である。生じたサイレンシングカセットを含む植物は、塊茎において多様でありポリアデニル化されていない一連のＲＮＡ分子を産生し、これらは、企図する標的遺伝子を劇的かつ激しくサイレンシングする。ＲＮＡ分子のサイズは、一般に、使用した２つのプロモーター間の距離よりも短い。何故なら、逆方向転写は、衝突転写をもたらすからである。
【図３】カテコールアッセイの結果を示す。Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ対照は左であり、変種Ｅ１２は右である。暗褐色は、黒色斑傷の減少が存在しないことを示す。図３に示されるように、Ｅ１２は、黒色斑傷減少についての形質を有し、他方で、対照は有さない。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下の説明及び表において、多くの用語が使用される。このような用語が与えられる範囲を含めて、本明細書及び特許請求の範囲の明らか且つ一定した理解を提供するために、以下の定義が提供される：
対立遺伝子。対立遺伝子は、１つの形質又は特徴に関する遺伝子の１つ以上の代替形態のいずれかである。二倍体細胞又は生物において、所定の遺伝子の２つの対立遺伝子は、一対の相同染色体上の対応する遺伝子座を占める。
【００２０】
アミノ酸配。列本書中で使用される場合、植物から単離されたか、植物にネイティブであるか、若しくは植物において天然に存在する、又は、合成的に作製された、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質及びそれらの断片を含むが、内在性対応物の核酸配列を含まない。
【００２１】
人為的に操作された。本書中で使用される場合、「人為的に操作された」は、手で、又は機械的手段によって、又は遺伝子操作技術などの組換え的手段によって、植物又は植物細胞を移動するか、配置するか、手術するか、又は制御することにより、操作されない天然に存在する対応物とは異なる生物学的、生化学的、形態学的、又は生理学的な表現型及び／又は遺伝子型を有する植物又は植物細胞を産生することを意味する。
【００２２】
無性繁殖。葉の切断物、幹の切断物、根の切断物、塊茎の芽、走根、単一植物細胞プロトプラスト、カルスなどから感染な植物を作製することによる子孫の産生であり、配偶子の融合を含まない。
【００２３】
骨格。移入することを企図するＤＮＡ挿入配列を除外した、二値ベクトルの核酸配列。
【００２４】
戻し交配。戻し交配は、増殖型が、ハイブリッド子孫を親の一方に戻して繰り返し交配するプロセス、例えば、第１世代ハイブリッドＦ１をＦ１ハイブリッドの親遺伝子型の１つと交配するプロセスをいう。
【００２５】
細菌輪腐病。細菌輪腐病は、細菌クラビバクター・ミシガネンシス（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ）亜種によって生じる病気である。細菌輪腐病は、塊茎内の導管輪の特徴的崩壊にその名を由来する。この輪は、しばしば、クリームイエローから明褐色の、チーズ様の腐敗として現れる。バレイショの外側表面において、重度に侵された塊茎は、わずかに萎び、乾燥し、割れた領域を示す。感染塊茎の導管組織における細菌輪腐病の兆候は、上述よりも明らかでなく、崩壊した散発的に表れる暗色の線としてのみ、又は連続的な黄変色として現れる場合がある。
【００２６】
黒色斑傷。損傷した塊茎において見出される黒色斑は、細胞の損傷の後に産生され組織を茶色、灰色又は黒色の外観にする、メラニンと呼ばれる色素の結果である。メラニンは、細胞損傷の結果として、フェノール基質及び適切な酵素が互いに接触した際に形成される。この損傷は、細胞を壊すことを必要としない。しかし、この基質と酵素との混合は、通常、組織が衝突した際に必ず起こる。暗色斑は、まず、導管輪のすぐ下の辺縁組織において生じるが、皮層組織の部分を含むには十分な大きさであり得る。
【００２７】
境界様配列。「境界様」配列は、改変するために選択された植物種、又は改変するために生殖適合性である植物種から単離され、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の境界配列と同様に機能する。すなわち、本発明の境界様配列は、それが連結するポリヌクレオチドの組み込みを促進し且つ容易にする。境界様配列は、５〜１００ｂｐ長、１０〜８０ｂｐ長、１５〜７５ｂｐ長、１５〜６０ｂｐ長、１５〜５０ｂｐ長、１５〜４０ｂｐ長、１５〜３０ｂｐ長、１６〜３０ｂｐ長、２０〜３０ｂｐ長、２１〜３０ｂｐ長、２２〜３０ｂｐ長、２３〜３０ｂｐ長、２４〜３０ｂｐ長、２５〜３０ｂｐ長又は２６〜３０ｂｐ長の間である。左境界配列及び右境界配列は、改変される植物のゲノムから単離され、及び／又はこれに対してネイティブである。境界様配列は、任意の公知のアグロバクテリウム由来のＴ−ＤＮＡ境界配列に対して、ヌクレオチド配列において同一ではない。従って、境界様配列は、アグロバクテリウム、例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）又はアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）に由来するＴ−ＤＮＡ境界配列とは異なる、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上のヌクレオチドを有し得る。すなわち、本発明の境界配列又は境界様配列は、アグロバクテリウム種、例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンス又はアグロバクテリウム・リゾゲネス由来のＴ−ＤＮＡ境界配列と少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％又は少なくとも５０％の配列同一性を有するが、１００％の配列同一性は有さない。境界様配列は、植物ゲノムから単離され得、改変されるか又は突然変異誘発されて、別のヌクレオチド配列内にヌクレオチド配列を組み込むことができる効率性を変えてもよい。他のポリヌクレオチド配列が、本発明の境界様配列に付加されるか、又はこれの内に組み込まれてもよい。従って、左境界又は右境界は、５’−及び３’−マルチクローニング部位又はさらなる制限部位を有するように、改変されてもよい。境界配列は、同伴するベクターからの骨格ＤＮＡが植物ゲノム内に組み込まれない確度を高めるために改変されてもよい。
【００２８】
本質的に成る。特定の要素から「本質的に成る」組成物は、これらの要素、並びに、本発明の組成物の基本的及び新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない要素を含むことに限定される。従って、組成物が、本発明の基本的及び新規な特徴に影響を及ぼさない、すなわち、選択された植物種又は選択された植物種と生殖適合性である植物由来でない外来性ＤＮＡを含まない限り、この組成物は、本発明の組成物の構成要素であると考えられてもよく、すなわち、「本質的に成る」の語によって特徴づけられる。
【００２９】
子葉。子葉は、種子の葉の種類である。子葉は、種子の食物保存組織を含む。
【００３０】
縮重プライマー。「縮重プライマー」は、類似であるが同一ではない相同性の配列にハイブリダイズする際に塩基不適合を受け入れ得る、十分なオリゴヌクレオチド変動を含むオリゴヌクレオチドである。
【００３１】
双子葉植物（ｄｉｃｏｔ）。胚が２枚の葉又は子葉を有する、顕花植物。ｄｉｃｏｔの例としては、タバコ、トマト、バレイショ、カンショ、キャッサバ、アルファルファ及びダイズを含むマメ科植物、ニンジン、イチゴ、レタス、オーク、カエデ、クルミ、バラ、ハッカ、カボチャ、ヒナギク及びサボテンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
ＤＮＡ挿入物。本発明に従い、植物のゲノム内に挿入されるＤＮＡ挿入物は、この植物にネイティブであるポリヌクレオチド配列を含むか、又はこの植物に対しネイティブな遺伝子エレメントを有する。１つの例において、例えば、本発明のバレイショ変種Ｅ１２のＤＮＡ挿入物は、バレイショ又はバレイショ生殖適合性植物であるワイルドポテトにネイティブである１０，１４７ｂｐの非コードポリヌクレオチドであり、形質転換の際に植物細胞のゲノム内に安定的に組み込まれて、黒色斑傷の発現、アスパラギン蓄積及び老化甘味増加に関与する遺伝子をサイレンシングする。ＤＮＡ挿入物は、好ましくは、２つの発現カセットを含み、ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクターと呼ばれる形質転換ベクター内に挿入される。第１カセットは、アスパラギンシンセターゼ−１遺伝子（Ａｓｎ１）及びポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子（Ｐｐｏ５）の両方の断片を、ＡＤＰグルコースホスホリラーゼ遺伝子（Ａｇｐ）のＡｇｐプロモーターと顆粒結合シンターゼ遺伝子（Ｇｂｓｓ）のＧｂｓｓプロモーターとの間に逆方向反復として配置して含む。これらのプロモーターは、塊茎内で優性に活性である。第２のカセットの機能は、デンプン関連遺伝子ジキナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）及びホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子（ＰｈＬ）のプロモーターをサイレンシングすることである。このカセットは、第１カセットと同じＡｇｐプロモーター及びＧｂｓｓプロモーターと作動可能に連結した、デンプン関連遺伝子ジキナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）及びホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子（ＰｈＬ）のプロモーターの断片から成る。これらの発現カセットは、外来性遺伝子を含まず、選択された植物種又は選択された植物種と生殖適合性である植物のいずれかからのＤＮＡのみから成る。
【００３３】
胚。胚は、成熟種子内に含まれる未熟な植物である。
【００３４】
外来性。「外来性」は、核酸に関して、非植物生物に由来する核酸であるか、若しくは形質転換される植物と同一でない植物に由来する核酸であるか、又は形質転換される植物と交配可能でない植物に由来せず、標的植物に属さないことを意味する。本発明に従い、外来性ＤＮＡ又はＲＮＡは、真菌、細菌、ウイルス、哺乳類、魚類又は鳥類の遺伝的性質において天然に存在するが、形質転換される植物において天然に存在しない核酸を表す。従って、外来性核酸は、例えば、形質転換植物によって天然に産生されないポリペプチドをコードするものである。外来性核酸は、タンパク質産物をコードする必要はない。本発明に従い、所望の遺伝子内植物は、そのゲノム内に何ら外来性核酸を含まないものである。
【００３５】
遺伝子。本書中で使用される場合、「遺伝子」は、コード領域をいい、この領域の５’−又は３’−であるヌクレオチド配列を含まない。機能的遺伝子は、プロモーター又はターミネーターに作動可能に連結したコード領域である。遺伝子は、形質転換又は種々の繁殖方法を用いて、異なる種又は同じ種のいずれかの種のゲノム内に導入され得る。
【００３６】
遺伝子変換された。（変換）遺伝子変換された（変換）植物は、戻し交配と呼ばれる植物繁殖技術によって開発された植物をいい、ここで、変種の所望の形態学的及び生理学的特徴の本質的に全てが、この変種内に戻し交配技術を介して、遺伝子操作を介して、又は突然変異を介して移入された１つ以上の遺伝子に加えて、回収されている。１つ以上の遺伝子座もまた、移入される。
【００３７】
遺伝的再編成。遺伝物質の新規な構成を導入する、インビボで並びにインビトロで自発的に起こり得る、遺伝子エレメントの再集合をいう。例えば、異なる遺伝子座にポリヌクレオチドを一緒にスプライシングすることは、植物発生及び生殖組換えの両方の間に、自発的にインビボで起こり得る。従って、非天然の遺伝子改変技術によるインビトロでの遺伝子エレメントの組換えは、インビボで生殖組換えを通して起こり得る組換え事象に近似する。ＤＮＡ挿入物の植物ゲノム内への挿入は、例えば、遺伝子再編成又はゲノム再編成の例である。
【００３８】
ジャガイモシストセンチュウ（Ｇｏｌｄｅｎ  ｎｅｍａｔｏｄｅ）。ジャガイモシストセンチュウとして一般に公知であるグロボデラ・ロストキエンシス（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）は、バレイショ植物の根及び塊茎に罹患する植物寄生性線虫である。兆候としては、貧弱な植物成長、しおれ、水ストレス及び栄養不足が挙げられる。
【００３９】
胚軸。胚軸は、子葉と根との間の、胚又は苗の部分である。従って、これは、苗条と根との間の遷移区域と考えられ得る。
【００４０】
枠内。ヌクレオチドトリプレット（コドン）は、植物細胞において、所望の組換えタンパク質の近接のアミノ酸配列に翻訳される。具体的には、本発明は、第２の核酸に読み取り枠内で連結した第１核酸を企図し、ここで、第１のヌクレオチド配列は、遺伝子であり、第２のヌクレオチド配列は、プロモーター又は類似の調節エレメントである。
【００４１】
組み込み。選択された植物種又は選択された植物種と生殖適合性である植物に由来する核酸配列の、選択された植物種の細胞のゲノム内への挿入をいう。「組み込み」は、ネイティブの遺伝子エレメントの食ヴつ細胞ゲノム内への組み込みをいう。ネイティブの遺伝子エレメントを、例えば相同組換えによって組み込むために、本発明は、このようなプロセスにおける工程として、非ネイティブのＤＮＡを「使用」し得る。従って、本発明は、特定のＤＮＡ分子の「使用」と特定のＤＮＡ分子の植物細胞ゲノム内への「組み込み」との間を区別する。
【００４２】
導入。本書中で使用される場合、感染、トランスフェクション、形質転換又は形質移入を含む方法による、細胞への核酸配列の挿入をいう。
【００４３】
単離された。「単離された」は、その通常のネイティブな環境から物理的に分離されている核酸又は化合物をいう。単離された物質は、例えば、溶媒、緩衝液、イオンまたは他の構成要素を含む好適な溶液中で維持されてもよく、純粋な形態であっても、純粋な形態でなくてもよい。
【００４４】
リーダー。遺伝子に先行する（すなわち５’側である）、転写されるが翻訳されない配列。
【００４５】
遺伝子座。遺伝子座は、１つ以上の形質、例えば、雄性不稔、除草剤耐性、昆虫耐性、病気耐性、ワキシーデンプン、改変された脂肪酸代謝、改変されたフィチン酸代謝、改変された炭水化物代謝及び改変されたタンパク質代謝を付与する。この形質は、例えば、戻し交配、天然若しくは誘発された突然変異によりこの変種のゲノム内に導入された天然に存在する遺伝子、又は遺伝子形質転換技術を通して導入されたトランスジーンによって確認され得る。遺伝子座は、１つの染色体位置に組み込まれた１つ以上の対立遺伝子を含み得る。
【００４６】
市場用収量。市場用収量は、直径５〜１０ｃｍ（２〜４インチ）の間で収穫された全ての塊茎の重量をいう。市場用収量は、ｃｗｔ＝４５ｋｇ（１００ポンド）のｃｗｔ（百重量）で測定される。
【００４７】
単子葉（ｍｏｎｏｃｏｔ）。胚が１枚の葉又は子葉を有する、顕花植物。ｍｏｎｏｃｏｔの例としては、ターフグラス、トウモロコシ、コメ、カラスムギ、コムギ、オオムギ、ソルガム、ラン、アイリス、ユリ、タマネギ及びヤシが挙げられる。
【００４８】
ネイティブな。「ネイティブな」遺伝子エレメントは、形質転換される植物のゲノム内に天然に存在するか、これに由来するか、又はこれに属する、核酸をいう。従って、形質転換される植物又は植物種のゲノムから単離されたか、又は形質転換される植物種と生殖適合性であるすなわち交配可能である植物又は植物種から探知された任意の核酸、遺伝子、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの分子は、この植物種に「ネイティブ」である、すなわち、固有である。言い換えると、ネイティブな遺伝子エレメントは、古典的植物繁殖を通した植物の改良のために、植物増殖型にアクセス可能である全ての遺伝子物質を表す。ネイティブな核酸の任意のバリアントはまた、本発明に従って、「ネイティブである」と考えられる。この観点で、「ネイティブな」核酸はまた、植物又はその生殖適合性である種から単離されてもよく、又は、得られたバリアントが植物から単離された未改変且つネイティブな核酸に対して、ヌクレオチド配列において９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％若しくは６０％以上類似であるように、改変されるか若しくは突然変異されてもよい。ネイティブな核酸バリアントはまた、ヌクレオチド配列において、約６０％未満、約５５％、又は約５０％未満類似していてもよい。植物から単離された「ネイティブな」核酸はまた、この核酸から転写され、翻訳された、天然に生じたタンパク質産物のバリアントをコードしてもよい。従って、「ネイティブな」核酸はまた、核酸が単離された植物において発現される未改変且つネイティブなタンパク質のアミノ酸配列に対して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％若しくは６０％以上類似であるタンパク質をコードし得る。
【００４９】
ネイティブな遺伝子エレメント。「ネイティブな遺伝子エレメント」は、本発明に従う選択された植物種ゲノム内に組み入れられて、組み込まれ得る。ネイティブな遺伝子エレメントは、選択された植物種に属する植物又は選択された植物種と生殖適合性である植物から単離される。例えば、栽培されたバレイショ（ソラナム・ツベロサム）内に組み込まれたネイティブなＤＮＡは、Ｓ．ツベロサムの任意の遺伝子型に由来しても、又はＳ．ツベロサムと生殖適合性であるワイルドポテト種（例えば、Ｓ．デミッスム（Ｓ．ｄｅｍｉｓｓｕｍ））の任意の遺伝子型に由来してもよい。
【００５０】
天然に存在する核酸。天然に存在する核酸は、選択された植物種のゲノム内で見出され、ＤＮＡ分子であっても、又はＲＮＡ分子であってもよい。通常植物種のゲノム内に存在する制限部位の配列は、制限部位がゲノムから物理的に単離されなかったとしても、外因性ＤＮＡ分子、例えばベクター又はオリゴヌクレオチド内で遺伝子操作され得る。従って、本発明は、ヌクレオチド配列、例えば制限酵素認識部位の合成的作製を、その配列が、形質転換される選択された植物種又は選択された植物種と生殖適合性である植物におけるゲノム内に天然で存在する限り、許容する。
【００５１】
作動可能に連結した。２以上の分子を、これらが植物細胞内で組み合わせて適切に機能する様式で組み合わせること。例えば、プロモーターは、このプロモーターが構造遺伝子の転写を制御する場合、構造遺伝子に作動可能に連結されている。
【００５２】
植物本書中で使用される場合、用語「植物」は、被子植物類及び裸子植物類、例えば、バレイショ、トマト、タバコ、アルファルファ、レタス、ニンジン、イチゴ、テンサイ、キャッサバ、カンショ、ダイズ、トウモロコシ、ターフグラス、コムギ、コメ、オオムギ、ソルガム、カラスムギ、オーク、ユーカリ、クルミ及びヤシが挙げられるが、これらに限定されない。従って、植物は、ｍｏｎｏｃｏｔであってもｄｉｃｏｔであってもよい。語「植物」は、本書中で使用される場合、生殖によって産生されたか非生殖的に産生されたかに拘わらず、植物細胞、種子、植物子孫、繁殖体、並びにこれらのいずれかの発生物、例えば切断物若しくは種子をも、含む。植物細胞としては、浮遊培養物、カルス、胚、成長点領域、カルス組織、葉、根、苗条、配偶体、芽胞体、花粉、種子及び小胞子が挙げられる。植物は、種々の成熟段階であり得、ポット内、温室若しくは野外で、液体若しくは固体培養において成長させられても、又は土壌において若しくは好適な培地中で、成長させられてもよい。導入されたリーダー、トレイラー又は遺伝子配列の植物における発現は、一時的であっても、恒久的であってもよい。「選択された植物種」は、これらの「植物」のいずれか１つの種であり得るが、これらに限定されない。
【００５３】
植物部分。本書中で使用される場合、用語「植物部分」（又はバレイショ植物若しくはその部分）としては、プロトプラスト、葉、幹、根冠、葯、雌ずい、種子、胚、花粉、胚珠、子葉、胚軸、花、塊茎、芽、組織、葉柄、細胞、分裂組織細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
植物種。少なくとも何らかの生殖適合性を示す、種々の公的に命名された植物種に属する植物の群。
【００５５】
植物形質転換及び細胞培。養広範には、植物細胞が遺伝的に改変され、維持、さらなる成長、及び／又はさらなる発生のために、適切な植物培養培地に移されるプロセスをいう。
【００５６】
的確繁殖。核酸、例えば選択された植物種から又は選択された植物と同じ種の別の植物から又は選択された植物種と生殖適合性である種から単離された、ネイティブな遺伝子及び調節エレメントの、個々の植物細胞への安定的導入、並びにその後のこれらの遺伝的に改変された植物細胞の植物全体への再生による、植物の改善をいう。未知の又は外来性の核酸が恒久的に植物ゲノム内に組み込まれないので、本発明の技術は、従来的植物繁殖を通しても利用可能である、同じ遺伝物質を用いる。
【００５７】
子孫。本書中で使用される場合、少なくとも一方の植物がバレイショ栽培品種Ｅ１２を含む２種のバレイショ植物の交配から産生されたＦ１バレイショ植物を含み、子孫はさらに、回帰した親系統との世代間交配であるその後のＦ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９及びＦ１０を含むが、これらに限定されない。
【００５８】
定量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）。定量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）は、通常は連続的に分布している、ある程度数値的に表すことが可能である形質を、制御する遺伝子座をいう。
【００５９】
組換え。本書中で使用される場合、遺伝子がクローニングされ得、ＤＮＡが配列決定され得、タンパク質産物が産生され得る、種々の技術を広範に記載する。本書中で使用される場合、この用語はまた、遺伝子の植物宿主系の細胞への移入後に産生されているタンパク質もまた、記載する。
【００６０】
再生。再生は、組織培養物からの植物の発生をいう。
【００６１】
調節配列。植物系において目的の遺伝子の転写又は生じたＲＮＡの翻訳を増大し及び／又は最大化するために、発現ベクター内に含まれ得る、標準的且つ当業者に公知である配列をいう。これらとしては、プロモーター、ペプチド輸送シグナル配列、イントロン、ポリアデニル化、及び転写終結部位が挙げられるが、これらに限定されない。核酸構築物を植物における発現レベルを上げるように改変する方法もまた、当該分野で公知である（例えば、Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２６０  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７３１〜３８，１９８５；Ｃｏｒｎｅｊｏ  ｅｔ  ａｌ．，２３  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６７：８１，１９９３を参照されたい）。タンパク質の転写の速度に影響を及ぼすための植物系の操作において、種々の因子が当該分野で公知であり、これらとしては、正又は負に作用する配列であるエンハンサー及びサイレンサーなどの調節配列が挙げられ、並びに、染色体構造が、影響を有し得る。本発明は、これらの因子の少なくとも１つが、目的のタンパク質を発現するように植物を操作する際に利用され得ることを提示する。本発明の調節配列は、ネイティブな遺伝子エレメントであり、すなわち、改変されるために選択された植物種から単離される。
【００６２】
選択可能マーカー。「選択可能マーカー」は、代表的に、抗生物質、除草剤又は毒性化合物に対しある種の耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子であり、形質転換事象を同定するために使用される。選択可能マーカーの例としては、ストレプトマイシン耐性をコードするストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｓｐｔ）遺伝子、マンノース−６−ホスフェートをフルクトース−６ホスフェートに変換するホスホマンノースイソメラーゼ（ｐｍｉ）遺伝子、カナマイシン及びゲネチシンの耐性をコードするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子、ヒグロマイシンに対する耐性をコードするヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ又はａｐｈｉｖ）遺伝子、スルホニルウレア型除草剤に対する耐性をコードするアセトラクテートシンターゼ（ａｌｓ）遺伝子、グルタミンシンターゼの作用を阻害するように作用する除草剤に対する耐性をコードする遺伝子、例えばホスフィノトリシンすなわちｂａｓｔａ（例えば、ｂａｒ遺伝子）又は、当該分野で公知の他の類似の遺伝子が挙げられる。
【００６３】
センス抑制。トランスジェニック植物における遺伝子の全て又は部分の、１つ以上のさらなるコピーの発現による内因性遺伝子の発現の低下。
【００６４】
比重。本書中で使用される場合、「比重」は、密度の表現であり、バレイショ品質の測定値である。塊茎の比重及びデンプン含量と乾燥物質の百分率又は全固体との間の高い相関性が、存在する。高い比重は、加工製品のより高い割合及びより良い品質に寄与する。
【００６５】
Ｔ−ＤＮＡ様。「Ｔ−ＤＮＡ様」配列は、選択された植物種から、又は選択された植物種と生殖適合性である植物から単離された核酸であり、アグロバクテリウム種Ｔ−ＤＮＡに対し少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％の配列同一性を共有するが、１００％は共有しない。Ｔ−ＤＮＡ様配列は、各々がヌクレオチド配列を別のポリヌクレオチド内に組み込むことできる、１つ以上の境界配列若しくは境界様配列を含み得る。
【００６６】
総収量。総収量は、全ての収穫塊茎の総重量をいう。
【００６７】
トレイラー。遺伝子の後に従う（すなわち３’側である）、転写されるが翻訳されない配列。
【００６８】
転写ＤＮＡ。遺伝子並びにその遺伝子に伴う非翻訳リーダー及びトレイラーの両方を含むＤＮＡであり、これは、先行するプロモーターの作用によって、単一のｍＲＮＡとして転写される。
【００６９】
植物細胞の形質転換。ＤＮＡが植物細胞のゲノム内に安定的に組み込まれるプロセス。「安定的」は、細胞ゲノム内への細胞ゲノムによる、ポリヌクレオチドの恒久的な、若しくは非一時的な、保持及び／又は発現をいう。従って、安定的に組み込まれたポリヌクレオチドは、形質転換した細胞ゲノム内の固定剤であり、複製され得、細胞又は生じた形質転換植物の継続的な子孫を通して増殖し得る。形質転換は、天然の条件又は当該分野で周知の種々の方法を用いて、人為的条件下で生じ得る。形質転換は、原核生物宿主細胞又は真核生物宿主細胞への核酸配列の挿入のための、任意の公知の方法に依存し得、アグロバクテリウム媒介型形質転換プロトコール、ウイルス感染、ウィスカー法、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、ポリエチレングリコール処理、マイクロインジェクション及び微粒子銃が挙げられる。
【００７０】
トランスジーン。タンパク質コード領域を含む宿主ゲノム内に挿入された遺伝子。本発明の文脈において、トランスジーンを含むエレメントは、宿主ゲノムから単離される。
【００７１】
トランスジェニック植物。少なくとも１つのトランスジーンを含む遺伝的に改変された植物。
【００７２】
バリアント。本書中で使用される場合、「バリアント」は、特定の遺伝子又はタンパク質の、標準的又は所定のヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列から逸脱する、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を意味すると理解される。用語「アイソフォーム」、「イソ型」及び「アナログ」もまた、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の「バリアント」形態をいう。１以上のアミノ酸の付加、除去若しくは置換、又はヌクレオチド配列の変更により改変されているアミノ酸配列は、「バリアント」配列と考えられ得る。バリアントは、置換されたアミノ酸が類似の構造的又は化学的特性を有する「保存的」変更、例えば、ロイシンのイソロイシンによる置き換えを有し得る。バリアントは、「非保存的」変更、例えば、グリシンのトリプトファンによる置き換えを有し得る。同様な僅かな変動はまた、アミノ酸欠失若しくは挿入、又は両方を含み得る。アミノ酸残基が置換され得るか、挿入され得るか、又は欠失され得る決定における手引きは、当該分野で周知のコンピュータープログラム、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ（ＩｎｆｏｒＭａｘ，ＭＤ）ソフトウェアを用いて見出され得る。
【００７３】
つる熟成。つる熟成は、炭水化物を利用すること及び光合成することを続ける植物の能力をいう。つる熟成は、１〜５の段階において評点し、ここで、１＝死んだつる、及び５＝つるは緑色、未だ開花している。
【００７４】
所望の形質のバレイショ植物のゲノム内への挿入は、特に困難を示す。何故なら、バレイショは、四倍体であり、高度に異種接合であり、且つ近交弱勢に感受性であるからである。従って、従来の繁殖を用いる加工の間に、より少ないアクリルアミドを産生し、有害なメイラード反応産物がより少ない、トランスジェニックバレイショ植物を効率的に開発することは、非常に困難である。有害なメイラード反応産物としては、以下が挙げられる：Ｎ−ニトロソ−Ｎ−（３−ケト−１，２−ブタンジオール）−３’−ニトロチラミン（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ７０：１０〜５，１９９５）、５−ヒドロキシメチル−２−フルフラニル（Ｊａｎｚｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ３８：８０１〜９，２０００）、及び突然変異誘発特性による他のメイラード反応産物（Ｓｈｉｂａｍｏｔｏ，Ｐｒｏｇ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  ３０４：３５９〜７６，１９８９）。
【００７５】
加工の変更、デキストロースの低減、並びにアスパラギナーゼ、シトレート及び競合アミノ酸などの添加物を通してアクリルアミドを低減するために、幾つかの方法が試験されており、研究が進行中である。バレイショ産業を通した加工変更を実施するための所要の主要な支出は、何百万ドルにも及ぶ。支出に加え、これらの加工変更は、添加物、例えばアスパラギナーゼ若しくはシトレートに伴う潜在的に負である風味を含む、重要な欠点を有する。代表的には、揚げ物製造は、フライドポテトの加工の間に、所望の金褐色を発色させるためにデキストロースを加えるが、デキストロースはまた、メイラード反応を通してアクリルアミドの形成を増大する。アクリルアミドにおける有意な低減は、主に、加工からデキストロースを省くことによってもたらされるが、金褐色のサインは、何らかの他の方法で（例えば、アナトーなどの色素の添加を通して）発色させなければならない。代替の色素の使用は、これらの褐色化反応を通して発する代表的な風味の非存在をもたらす。アスパラギンなどの反応物を低減するための、添加物の使用によるさらなる挑戦は、凍結保存の間に起こる水分移動であり、これは、表面へのアスパラギンの復活及びアクリルアミドの増大をもたらす。最後に、バレイショが傷ついたのちに起こる黒色化は、品質並びにフライドポテト及びポテトチップスの加工の際の回収に影響を及ぼす。損傷し傷ついたバレイショは、処理の前に削り取るか、又は取り除かれなければならず、品質の挑戦又は経済的損失をもたらす。
【００７６】
本発明の「ネイティブ技術」戦略は、黒色斑傷を担うポリフェノールオキシダーゼ−５（ＰＰＯ−５）の発現、アクリルアミド形成の前駆体であるアスパラギンの蓄積を担うアスパラギンシンセターゼ−１（Ａｓｎ−１）の発現、及び／又は、通常はアスパラギンなどのアミノ酸と反応してアクリルアミドを含む毒性のメイラード産物を形成する還元糖の蓄積に関連する酵素であるホスホリラーゼ−Ｌ及びキナーゼ−Ｒ１の発現を低減することによる、バレイショの農業特徴及び栄養的価値を改善するための、バレイショ産業の需要を指向する。塊茎におけるこれらの遺伝子の部分的又は完全なサイレンシングは、アクリルアミドを産生する可能性を低下させる。本発明のネイティブな技術の使用は、バレイショ植物から又はバレイショ植物と生殖適合性である植物から得た遺伝物質である、非コード調節領域のみを含む「ネイティブな」遺伝物質のみによる、何ら外来性の遺伝物質を植物ゲノム内に組み込むことなくバレイショの形質転換により、市場で価値のあるバレイショ植物変種のゲノム内への所望の形質の組み込みを可能にする。所望の形質は、衝撃誘導型の黒色斑傷に対する高度な耐性、アクリルアミド前駆体であるアスパラギンの形成の低減及び還元糖の蓄積の低減、及びその結果としてのアクリルアミドを含むメイラード産物の蓄積の低減、改善された品質並びに食品色調節を含む。既存のバレイショ変種へのこれらの所望の形質の組み込みは、従来型繁殖を通して達成することは不可能である。何故なら、バレイショは、四倍体であり、高度に異種接合であり、且つ近交弱勢に感受性であるからである。
【００７７】
本発明において使用される非コードバレイショ植物ＤＮＡ挿入配列は、バレイショ植物ゲノムに対してネイティブであり、何らアグロバクテリウムＤＮＡを含まない。ＤＮＡ挿入物は、好ましくは、２つの発現カセットを含み、ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクターと呼ばれる形質転換ベクター内に挿入される。第１カセットは、アスパラギンシンセターゼ−１遺伝子（Ａｓｎ１）及びポリフェノールオキシダーゼ−５遺伝子（Ｐｐｏ５）の両方の断片を、ＡＤＰグルコースホスホリラーゼ遺伝子（Ａｇｐ）のＡｇｐプロモーターと顆粒結合シンターゼ遺伝子（Ｇｂｓｓ）のＧｂｓｓプロモーターとの間に逆方向反復として配置して含む。これらのプロモーターは、塊茎内で優性に活性である。第２のカセットの機能は、デンプン関連遺伝子ジキナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）及びホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子（ＰｈＬ）のプロモーターをサイレンシングすることである。このカセットは、第１カセットと同じＡｇｐプロモーター及びＧｂｓｓプロモーターと作動可能に連結した、デンプン関連遺伝子ジキナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）及びホスホリラーゼ−Ｌ遺伝子（ＰｈＬ）のプロモーターの断片から成る。これらの発現カセットは、外来性遺伝子を含まず、選択された植物種又は選択された植物種と生殖適合性である植物のいずれかからのＤＮＡのみから成る。
【００７８】
本発明において使用される市場的に価値のあるバレイショ植物変種は、Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋである。Ｌｕｔｈｅｒ  Ｂｕｒｂａｎｋは、この品種を、１８７０年代初頭に開発した。植物は、育ちがよく、不確定な型の成長を有する。幹は太く、突角を成し、細かな斑を有する。葉は、長い〜中程度の幅であり、明るい〜中程度の緑色である。花は僅かで、白色であり、不稔である。栽培品種は、痩果病に耐性であるが、フザリウム属及びバーティシリウム属の萎ちょう病、葉巻病及び網状壊死、並びにウイルス類に感受性である。植物は、コブ、尖頭及びアレイ状突起を有さない塊茎を産生するために、高く且つ均一な土壌水分及び制御された窒素稔性の条件を必要とする。植物がストレスに曝された際、ゼリー末端及び糖末端を発生させる。産生された塊茎は、大きな褐色の皮及び白色の中身を有し、良好な長期保存特徴を示し、優れたベーキング及び加工品質についての標準を表す。Ｒｕｓｓｅｔｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ変種は、黒色斑傷を発生し易さが高く、高い遊離のアスパラギン含量及び高い老化甘味増加能力を有する（Ａｍ．Ｊ．Ｐｏｔａｔｏ  Ｒｅｓ（１９６６）４３：３０５〜３１４）。この変種は、稔性であり、特にフライドポテトの産生のために、北西部及び中西部において広く育てられている。
【００７９】
本発明は、マーカーよりもむしろポリメラーゼ連鎖反応を用いて同定された形質転換ベクターｐＳＩＭ１２７８によって形質転換され、首尾よく増殖されている、顕著な市場価値を有するバレイショ変種、すなわちＲｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋを、提供する。また、本発明のバレイショ植物変種Ｅ１２の塊茎の、製造された食物製品が、提供される。バレイショ栽培品種Ｅ１２は、経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）により、以下の独特の植物変種識別子を有する：ＳＰＳ−φφＥ１２−８。
【００８０】
ネイティブＤＮＡによる標的化遺伝子サイレンシングは、バレイショ植物変種Ｅ１２の塊茎における標的化遺伝子のＲＮＡ転写物のレベルを低下させる。Ａｓｎ１及びＰｐｏ５遺伝子サイレンシングは、デンプン関連遺伝子キナーゼ−Ｒ１（Ｒ１）及びホスホリラーゼ−Ｌ（ＰｈＬ）のさらなる阻害なしに、２〜４分の１にアクリルアミド形成を顕著に低下させるために充分である。従って、本発明の遺伝子内バレイショ植物変種Ｅ１２の塊茎は、揚げるか又は焼く際のアクリルアミド形成の低下に関連する、遊離のアミノ酸アスパラギンとグルタミンとの比の低下を含む、非常に望ましい形質を組み込む。具体的には、本発明のバレイショ品種Ｅ１２は、アスパラギン含量の２〜４分の１を下回る低下及び黒色斑傷に関連する変色の低減によって特徴づけられる。さらに、本発明のバレイショ品種Ｅ１２は、保存の間の、デンプンの還元糖であるグルコース及びフルクトースへの分解の遅延を示す。デンプンから糖への変換の不全は、老化甘味増加及びアクリルアミド形成をさらに低下させ、熱誘導型褐色化を制限する。
【００８１】
本発明のバレイショ変種Ｅ１２は、従って、その塊茎が加熱処理の際に有意に少ないアクリルアミドしか産生せず、潜在的有害性を有する外来性遺伝子を何ら有さないので、バレイショ産業及び食物市場において非常に価値が高い。
【実施例】
【００８２】
本発明は、ネイティブな非コードＤＮＡを選択されたバレイショ植物変種のゲノム内に組み込み、新規な遺伝子内バレイショ植物変種を開発するために、ネイティブ技術を使用する。本方法は、形質同定、ベクターの設計、ベクターのアグロバクテリウム内への組み込み、レシピエントバレイショ変種の選択、植物形質転換、オープン読み取り枠の非存在の照明、及びネイティブなＤＮＡのみを含む新規なバレイショ品種の確認を含む。本発明のバレイショ栽培品種Ｅ１２は、非形質転換対応物よりも、アクリルアミドを形成する可能性がより低く、スクロースの量が低く、黒色斑傷に対してより耐性である。
【００８３】
実施例１．ｐＳＩＭ１２７８形質転換ベクター
本発明において使用される形質転換ベクターｐＳＩＭ１２７８は、ｐＳＩＭ１０６に由来し、これを、０．４−ｋｂバレイショ植物ＤＮＡ断片（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ５６６５５５として寄託される）を、プラスミドｐＶＳ１及びｐＢＲ３２２由来の細菌の複製起点並びにカナマイシンに対する細菌耐性のためのｎｐｔＩＩＩ遺伝子を有するｐＣＡＭＢＩＡ１３０１（ＣＡＭＢＩＡ，Ｃａｎｂｅｒｒａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の５．９−ｋｂ  ＳａｃＩＩ−ＳｐｈＩ断片に連結することによって作製した。アグロバクテリウムｉｐｔ遺伝子、並びにそれに先行するＵｂｉ−３プロモーター（Ｇａｒｂａｒｉｎｏ  ａｎｄ  Ｂｅｌｋｎａｐ，１９９４）及び後に従うＵｂｉ−３ターミネーターを含む発現カセットを、ベクター骨格内に、２．６−ｋｂ  ＳａｃＩＩ断片として導入した（Ｒｏｍｍｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。２つのサイレンシングカセットを有するネイティブな１０−ｋｂ  ＤＮＡセグメントのｐＳＩＭ１０６のＤＮＡ挿入物への挿入は、ｐＳＩＭ１２７８を生じた。このベクターを、全ての形質転換に用いた。ｐＳＩＭ１２７８ベクターマップを、図１に示す。ベクター骨格領域は、９，５１１ｂｐであり、９，９５７ｂｐの位置にて開始し、１９，４６８ｂｐの位置にて終わる。骨格ＤＮＡは、主に、細菌ＤＮＡから成り、植物形質転換の前のＤＮＡ挿入物の維持の指示を提供する。骨格部分は、植物細胞内に形質移入されない。骨格の種々のエレメントを、表１に記載する。
【００８４】
【表１】
2016519928.tif 000003
【００８５】
実施例２．植物ＤＮＡ挿入物及びしにオープン読み取り枠（ＯＲＦ）
ｐＳＩＭ１２７８において使用したＤＮＡ挿入領域は、１０，１４７ｂｐ長（１９，４６９ｂｐ〜１９，６６０ｂｐ及び１ｂｐ〜９，９５６ｂｐ）である。ＤＮＡ挿入物は、ネイティブのＤＮＡのみから成り、バレイショ遺伝子内に安定的に組み込まれる。ＤＮＡ挿入物及びその機能的部分は、ベクターｐＳＩＭ１２７８の遺伝物質のみであり、本発明のバレイショ植物変種内に組み込まれる。ＤＮＡ挿入物は、図２及び以下の表２に記載される。
【００８６】
【表２】
2016519928.tif 000004
【００８７】
本発明のバレイショ系統Ｅ１２を作製するために使用される表２に記載のＤＮＡ挿入物は、隣接する遺伝子を活性化せず、バレイショ植物変種Ｅ１２の表現型に悪い影響を及ぼさない。加えて、本発明のバレイショ植物変種Ｅ１２は、ＤＮＡ挿入物によってコードされるオープン読み取り枠に伴う新規なタンパク質を産生しない。
【００８８】
実施例３．アグロバクテリウム株及びトランスフェクション
Ｃ５８由来のアグロバクテリウム株ＡＧＬ１を、強毒性プラスミドｐＴｉＢｏ５４２（Ｌａｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）．の運搬ＤＮＡの正確な結失によって開発した。一般的組換え遺伝子（ｒｅｃＡ）におけるトランスポゾン挿入は、ｐＳＩＭ１２７８のような組換えプラスミドベクターを安定化する（図１）。ＡＧＬ１は、カルベニシリン及びリファンピシンに対する耐性を示し、チメンチンを用いて形質転換したバレイショ組織から除去される。
【００８９】
Ｒｕｓｓｅｔｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ変種のストック植物を、４０ｍｌの３％スクロース及び２ｇ／ｌ  ｇｅｌｒｉｔｅ含有半分強度Ｍ５１６培地（増殖培地）を入れたマゼンタの箱内で維持した。４〜６ｍｍのバレイショ節間セグメントを、４週齢の植物から切断し、ｐＳＩＭ１２７８を保有するアグロバクテリウムＡＧＬ１株によって感染させて、３％スクロース及び６ｇ／ｌアガー含有組織培養培地（同時栽培培地）に移した。感染外植片を、２週間後に３％スクロース、６ｇ／ｌアガー及び１５０ｍｇ／ｌチメンチン含有のＭ４０４培地に移し、アグロバクテリウムを除去した（ホルモン非含有培地）。本方法の詳細は、Ｒｉｃｈａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）に記載される。
【００９０】
１か月後、感染外植片を、何ら合成ホルモンを含有しない新鮮な培地に移し、Ｐｅｒｃｉｖａｌ成長チャンバー内で１６時間の光周期下で２４℃にてインキュベートした。ここで、これらは、苗条を形成し始めた。多くの苗条は、ｉｐｔ遺伝子を発現し、サイトキニン過剰発現表現型を示した；これらの苗条は、さらなる分析のために考慮しなかった。ＰＣＲゲノタイピングは、残りの苗条の約０．３〜１．５％が、Ｐ−ＤＮＡの少なくとも一部分を含む一方で、ｉｐｔ遺伝子を欠くことを実証した。従って、形質転換植物を選択するために、マーカーを使用しなかった。ｉｐｔベースのマーカー不使用植物形質は、Ｒｉｃｈａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）によって公開されている。
【００９１】
アグロバクテリウムを除去するプロセスを、外植片感染の２日後に開始した。この目的のために、組織を、生きたアグロバクテリウムがいないことを証明するまで、抗生物質チメンチン（１５０ｍｇ／Ｌ）に曝露した。証明を、形質転換事象の幹断片を栄養ブロス−酵母抽出物（ＮＢＹ培地）上で２週間にわたり２８℃にてインキュベートすることによって得た（２回繰り返した）。９７ＣＦＲパート３４０に従い、形質転換植物を、生きたアグロバクテリウムがいない場合にのみ、輸送し、野外に植えた。
【００９２】
バレイショ植物変種Ｅ１２を、ＤＮＡゲルブロットによって分析し、組み込まれたＤＮＡ挿入配列の構造及びコピー数を決定し、ベクター骨格配列の非存在を確認した。加えて、分子性質決定を使用し、ＤＮＡ挿入物に隣接する結合部の配列を決定して、挿入ＤＮＡの安定性を示した。結合部の配列決定情報は、遺伝子内バレイショ植物変種Ｅ１２についての特異的ＰＣＲ試験を開発するための基礎を提供した。バレイショ栽培品種Ｅ１２は、種々のＤＮＡ消化物がＡＧＰ、ＡＳＮ、ＰＨＬ及びＧＢＳ分子プローブにハイブリダイズしたハイブリダイゼーション結果から導き出し、ＤＮＡ挿入物の１つの完全なコピーを含むことを見出した。
【００９３】
実施例４．ベクター骨格ＤＮＡの非存在についての証拠
多くの市販のトランスジェニック作物と違い、本発明のバレイショ栽培品種Ｅ１２は、ベクター骨格ＤＮＡなどの形質転換のために使用したアグロバクテリウム由来配列を非含有であることを、３つの異なる方法によって確認した：１）第１に、ベクター骨格内のネガティブ選択可能イソペンテニルイソメラーゼ（ｉｐｔ）マーカー遺伝子の存在又は非存在を、ｉｐｔ遺伝子発現及びその結果であるサイトキニン型ホルモンイソペンテニルアデノシンの形成を引き起こす、アグロバクテリウム由来のｉｐｔ遺伝子発現カセットを含む骨格ＤＮＡの植物細胞への偶発性輸送として決定した、２）次いで、サザンブロットハイブリダイゼーションが形質転換バレイショ植物に対して使用され、骨格ＤＮＡの非存在を確認するための第１スクリーニング方法に回され、並びに３）次いで、境界領域と隣接する骨格ＤＮＡとの結合部又はＤＮＡ挿入物に隣接する骨格ＤＮＡ内の領域を示す断片を増幅するためのＰＣＲを設計した。本方法の有効性を、ｐＳＩＭ１２７８  ＤＮＡを陽性対照として使用して確認した。本発明のバレイショ栽培品種Ｅ１２は、ベクター骨格ＤＮＡの存在の指標であるＰＣＲバンドを生成しなかった。
【００９４】
実施例５．挿入ＤＮＡの安定性
ＤＮＡ挿入物の安定性を、元の形質転換体において、並びに増殖させた植物材料において再び、どちらもＤＮＡゲルブロットハイブリダイゼーション及び形質評価を用いて評価した。これらの研究を、遺伝子内事象が、信頼のできる様式で一定して組み込まれた形質を発現することを確認するために行った。不安定性は、稀な組換え事象によって起こり得るか、又は、メチル化によっても起こり得る。バレイショは、通常、クローン的に増殖されるので、生殖増殖作物についての標準的評価は、直接適用可能ではなく、種子よりもむしろ塊茎を、その後の世代を決定するために使用した。ＤＮＡブロットハイブリダイゼーションの結果は、一定のバンドが多くの世代において存在したことを示し、従って、安定的であることを示した。安定性についてのさらなる証拠を、１及び２の塊茎種子の世代において形質有効性を確認することによって得た。
【００９５】
ＤＮＡ挿入物安定性を、元の形質転換材料（Ｇ０）において、インビトロで増殖させ土壌に植えていない植物の葉からＤＮＡを抽出し評価することによって実証した。第１世代（Ｇ１）分析のために、各遺伝子内変種由来の２つの増殖植物及び各対照由来の１つの植物を、温室内に植えた；各植物から収穫した塊茎の１つを、Ｇ１植物の葉を得るために植え、これを、ＤＮＡを単離してＧ１世代を評価するために使用した。この世代由来の塊茎を、再び植え、得られたＧ２植物の葉により、この世代の性質決定をした。
【００９６】
全てのレーンにおいて、本発明のＲｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋバレイショ栽培品種Ｅ１２から単離されたＤＮＡの、ＧＢＳプローブによるハイブリダイゼーションは、２つの共通のバンド（７．２及び８．０−ｋｂ）を明らかにし、ＡＧＰプローブによるハイブリダイゼーションは、３つのバンド（１．４、４．２及び４．９−ｋｂ）を明らかにした。これらのバンドは、非改変ゲノムのＤＮＡ断片の指標である。全ての遺伝子内材料から単離されたＤＮＡにおける２つのさらなるバンドの存在（２．２−ｋｂのバンドは、内部ＤＮＡ挿入断片の指標であり、他方（Ｅ１２及びＧＢＳについての４．４−ｋｂ、Ｅ１２及びＡＧＰについての２．１５−ｋｂ）はＤＮＡ挿入結合部断片を表す）は、元の形質転換体（Ｇ０）の挿入物が、第１及び第２無性世代Ｇ１及びＧ２において安定的に維持されていることを示す。
【００９７】
Ｐｐｏ活性についてのカテコールアッセイは、Ｅ１２変種におけるＤＮＡ挿入物安定性についてのさらなる証拠を提供した。全てのＥ１２塊茎は、変色しないままであり（図３）、他方で、非形質転換材料は、染色された。このことは、変種Ｅ１２が、２年間の野外試験後に、Ｇ２塊茎においてＰｐｏ５遺伝子をサイレンシングする能力を有していることを実証した。野外試験材料の調製は、挿入した遺伝物質の安定性に影響を及ぼすことなく、組織培養及び無性生殖の繰り返しを含んだ。
【００９８】
実施例６．結合部分析及び変種特異的検出
少なくとも１つのＤＮＡ挿入物／隣接ＤＮＡ結合部を、アダプター連結媒介型ＰＣＲ又は熱非対称インターレースＰＣＲのいずれかを用いて配列決定した。連結部配列を、バレイショ栽培品種Ｅ１２についてのプライマーを設計するために用い、これらのプライマーを、変種特異的ＰＣＲベース検出方法のために適用した。開発したこの方法を、野外及び貯蔵において植物及び塊茎をモニタリングするために使用し、塊茎又は加工食品中の遺伝子内材料の非存在を確認し、有機種子の純度を保証した。
【００９９】
実施例７．遺伝子サイレンシングの有効性及び組織特異性
遺伝子サイレンシング方法を使用し、Ａｓｎ１、Ｐｐｏ５、ＰｈＬ及びＲ１のネイティブなタンパク質の活性を低下させ、タンパク質量よりもむしろ転写物レベルを評価し、新規な表現型形質と分子レベルでの変化とを結びつけた。
【０１００】
葉及び幹におけるＡＳＮ（アスパラギン）形成に関与するＡｓｎ１遺伝子の強力なサイレンシングは、成長に悪い影響を与え得るので、塊茎及び走根に特異的であり光合成活性組織及び根においてじっと活性が低いプロモーターであるＡｇｐプロモーター及びＧｂｓｓプロモーターを、塊茎及び走根における遺伝子サイレンシングを駆動するために使用した。植物変種Ｅ１２及び非形質転換対照物の種々の組織における４つの標的遺伝子の転写物レベルを、ノーザンブロット分析によって決定した。
【０１０１】
非形質転換対照の塊茎において、転写物レベルは、Ａｓｎ１、ＰｈＬ及びＲ１遺伝子について「高い」（ノーザンブロットハイブリダイゼーションによって容易に検出可能である）。Ｐｐｏ５遺伝子については「低い」。ノーザンブロットの比較は、Ａｓｎ１、Ｐｐｏ５及びＰｈＬは、温室及び野外において、塊茎内で同様に発現されることを示した。対照的に、Ｒ１遺伝子は、温室成長対照塊茎において、野外からの塊茎よりも、僅かにより効果的にサイレンシングされた。
【０１０２】
変種Ｅ１２の塊茎において、Ａｓｎ１及びＰｐｏ５遺伝子についての強く低減した転写物レベルは、低アクリルアミド潜在性及び黒色斑傷に関連する変色の低減に関連した。
【０１０３】
ＰｈＬ遺伝子についての転写物レバルは、Ｅ１２系統の塊茎において、部分的に低下した。この変化は、グルコース及びフルクトースの量の低減と結びついた。Ｒ１転写物は、Ｅ１２の塊茎において部分的に低減され（「ささやいた」）、デンプンの糖への分解を制限することを補助した。
【０１０４】
Ａｓｎ１、Ｐｐｏ５及びＲ１遺伝子は、非形質転換植物の走根において、低レベルで発現した。対照的に、対照における高い転写物レベルが、ＰｈＬ遺伝子に伴った。
【０１０５】
Ａｓｎ１及びＰｐｏ５遺伝子の転写物レベルは、温室で育てたＲｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ  Ｅ１２植物において、対照走根よりもなお低かった。この改変は、予測されており、何ら望まぬ又は異常な新規な表現型と結びつかなかった。ＰｈＬ遺伝子の発現もまた、遺伝子内変種Ｅ１２の走根において下方制御された。
【０１０６】
Ｒ１遺伝子についての転写物の量は、変種Ｅ１２の走根において、僅かに低減した（「ささやいた」）。この分子変化は、デンプンの糖への限定的な分解に寄与した。
【０１０７】
葉の組織において、Ａｓｎ１遺伝子についての転写物レベルは、Ｅ１２系統と非形質転換対応物とは類似であった。Ｐｐｏ５遺伝子発現についての転写物レベルは、全ての場合において検出不能であり、他方、ＰｈＬ遺伝子についてのレベルは、元のＲｕｓｓｅｔｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ変種及び形質転換誘導体Ｅ１２の間で、一貫して高かった。Ｒ１遺伝子についての転写物レベルは、その対象と比較した際、変種Ｅ１２において変わらなかった。
【０１０８】
幹組織において、Ａｓｎ１遺伝子転写物レベルは、事象Ｅ１２及びその対象について、類似であった。Ｐｐｏ５遺伝子についての転写物レベルは、本発明の変種Ｅ１２において低減した。ＰｈＬ遺伝子発現は、Ｅ１２系統及びその対照と非常に類似であり、Ｒ１遺伝子発現は、低減しなかった。
【０１０９】
根組織において、Ａｓｎ１及びＰｐｏ５遺伝子両方についての転写物レベルは、変種Ｅ１２において低減した。これらの結果は、サイレンシングを駆動するために使用されたプロモーターが、地下組織において部分的に機能的であることを示した。
【０１１０】
花組織において、Ａｓｎ１遺伝子転写物レベルは、本発明の変種Ｅ１２において、元の変種Ｒｕｓｓｅｔｔ  Ｂｕｒｂａｎｋよりも低かった。転写物は、Ｐｐｏ５遺伝子については検出可能ではなく、ＰｈＬ及びＲ１遺伝子の発現レベルは、対照と類似していた。
【０１１１】
これらの結果は、Ａｓｎ１及びＰｐｏ５遺伝子の発現レベルが、バレイショ変種Ｅ１２における塊茎及び走根において下方制御されていること、並びに、Ｒ１及びＰｈＬ遺伝子は、変種Ｅ１２における塊茎及び走根において部分的にサイレンシングされることを実証した。サイレンシングは、塊茎及び走根において、最も効果的であった。
【０１１２】
選択されたバレイショ変種Ｅ１２は、Ａｓｎ１及びＰｐｏ５遺伝子の発現レベルにおいて、Ｒ１及びＰｈＬ遺伝子の発現レベルより、強力に影響した。これらの結果は、発明者の目的である（１）Ｐｐｏタンパク質及び遊離のＡＳＮの形成を、可能な限り協力に防止すること、及び（２）デンプンのグルコース及びフルクトースへの変換は、部分的にのみブロックすることと、一致した。
【０１１３】
塊茎及び走根以外の組織における転写物レベルにおける時による変化は、塊茎／走根プロモーターの何らかの漏出を実証した。また、サイレンシングカセットの発現を通して塊茎において産生される小ＲＮＡが、他の組織、特に根及び幹に移動し得る（Ｍｏｌｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。塊茎および走根以外の組織における発現レベルの変化の殆どの場合、この相違は、僅かであった。バレイショ栽培品種Ｅ１２の特定の組織における下方制御された転写物レベルのまとめを、表３に示す。表３において、Ａ＝Ａｓｎ１、Ｐ＝Ｐｐｏ５、Ｌ＝ＰｈＬ及びＲ＝Ｒ１である。表３において下線を引いた文字は、強力に（２分の１を下回って）下方制御された遺伝子発現レベルを示し、さもなければ、発現レベルは、２分の１を下回らないで下方制御される。
【０１１４】
【表３】
2016519928.tif 000005
【０１１５】
実施例８．野外性能及び塊茎評価
２００９、２０１０及び２０１１年の試験を、収穫を容易にするために機械的に植え、遺伝子内バレイショが、非改変材料と離れていることを確実にした。２００９年評価のために、各事象及び対照変種由来の「核種子」小塊茎を、一列に４〜５プロット植えるために使用し（プロットあたり２０個の小塊茎）、プロットを、野外を横切るブロック内で無作為に置いた。この無作為完全ブロック設計（ＲＣＢ）は、代表的には、新規なバレイショ変種及び事象の評価のためのものであった。２０１０及び２０１１年に取られたアプローチは、１カ所あたり１つの事象及び対照あたり２つの無作為プロットを使用し、また、ブロックの数と同数又は同反復回数（１事象あたりのプロット数）で、ＲＣＢ設計をも使用した。２０１０年における各プロットは、２００９年にＲｕｓｓｅｔ  ＢｕｒｂａｎｋについてＣｈｅｒｒｙ  Ｃｏｕｎｔｙ，ＮＥで産生された第１世代（Ｇ１）塊茎からの各２０種子片の３行から成る。２０１１年試験のためのＲｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ種子は、２０１０年にＣｈｅｒｒｙ  Ｃｏｕｎｔｙ，ＮＥで産生された第２世代（Ｇ２）であった。全ての試験において、遺伝子内系統の種子を、その非改変対照と同様に操作した。野外で生育した塊茎は、種子として小塊茎よりも望ましい。何故なら、これらは、より生育がよく、より高い収量及び品質の塊茎を産生する均一な植物を産生するからである。
【０１１６】
各プロットを、幾つかの場合においては、人為的に誘導してはいないが生育季節の間に自発的に起こる昆虫、病気及び環境ストレスに対する差次的応答についての正規化モニタリングスケールを用いて、定性的に評価した。季節中期のモニタリングを、初期列閉鎖及び開花（４月に評価したＦｌｏｒｉｄａ試験を除く殆どの試験においては６月〜７月）の直前又は間に、２００９年、２０１０年及び２０１１年に行い、植物の勢力、葉の色、葉の大きさ、葉の巻き方、病気の症候（存在／非存在）及び昆虫関連植物損傷を評価した。２０１１年において、生育領域に共通の特定の昆虫、病気及び非生物ストレス因子を、評価した。病気及び昆虫圧力は、一般に、季節の中期及び後期に最も高いが、病原体及び昆虫によって起こる症候について、７月〜９月に植物をモニタリングした（Ｆｌｏｒｉｄａ試験については３月〜５月）。つる成熟及び病気の後期モニタリングを、塊茎成熟及び後期皮形成を確実にすることを意図して、つる殺傷の前に１度実施した。つる殺傷は、つるの刈り取り又は打ち付けのいずれかによってなされるか、又はＲｅｇｌｏｎｅなどの認可された除草剤を製造業者の推奨（ＪＲ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒｏｓｅｖｉｌｌｅ，ＭＮ）に従って使用することによってなされる。この時点で、植物を、病気の症候及び昆虫の損傷についても評価した。病気の症候が同定された幾つかの場合において、新芽試験をも行い、治験を確認した。
【０１１７】
平均値、標準偏差及び９０％信頼区間を、ＪＭＰ  ９．０．２を用いて計算した。従来の変種範囲を、全ての従来型変種の最小及び最大の平均値（年＊場所＊エントリー）を得、実験に含めることによって、作成した。Ｒｕｓｓｅｔｔ  ｖａｒｉｅｔｉｅｓについての全ての特徴を、ＪＭＰ  ９．０．２において、複数年及び複数の場所からのデータを合わせることによって、分析した。
【０１１８】
実施例９．バレイショ栽培品種Ｅ１２性質決定のまとめ
バレイショ栽培品種Ｅ１２は、黒色斑傷を担う酵素の発現を低減させること、及び反応物、すなわちアスパラギン及び還元糖の濃度を低下させることを通してアクリルアミドを低減することによる、品質の改善を指向する。バレイショ栽培品種Ｅ１２を、バレイショ植物ゲノムに対してネイティブであり外来性ＤＮＡ、アグロバクテリウムＤＮＡ、ウイルスマーカー又はベクター骨格配列を含まない核酸配列によって形質転換した。加えて、農業研究を行い、本形質に伴う特徴を除いて従来対照と同じく育った事象を得た。
【０１１９】
農業特徴
２００９、２０１０及び２０１１年に生育したバレイショ栽培品種Ｅ１２事象及び対照の農業特徴の評価を、表４〜７に示す。結果を、可能な場合、統計学的方法によって分析した。データ全体は、Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ対照とＥ１２  Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ事象との間に主要な相違はなかった。
【０１２０】
表４は、変種Ｅ１２について試験した各特徴についての部位年の数を示す。Ｅ１２及びＢｕｒｂａｎｋ対照についての農業的特徴を、表５に示す。７つの農業特徴について、統計学的に有意な相違は、Ｅ１２と対照との間に検出されなかった。つる成熟評点データは、統計学的に比較することができず、Ｅ１２の値は、合わせた従来型の変種の範囲の外であった（それぞれ、３．６５対３．００〜３．５０）。植物勢力について、統計学的に有意な相違を、Ｅ１２と対照との間に検出した（３．３８対３．０８）が、Ｅ１２の値は、従来型変種範囲内であった。表５において、植物あたりの幹のデータは、２０１１年からのみである；従来型の変種（ＣｏｎＶ）は、従来型のＲａｎｇｅｒ、Ｂｕｒｂａｎｋ及びＡｔｌａｎｔｉｃ変種の平均値の範囲に等しかった；ＮＡは、統計学的比較が不可能であったことを示す。
【０１２１】
Ｅ１２及びＢｕｒｂａｎｋ対照の収量及び等級を、表６に示す。総収量、比重、高糖又は糖末端について、統計学的に有意な相違は検出されなかった。内部欠陥全体について、統計学的分析は不可能であったが、Ｅ１２についての値は、従来型の変種範囲内であった。Ｅ１２と対照との間で、４つの相違が検出された：４〜６ｏｚ．カテゴリー（２５．３対２１．５）、６〜１０ｏｚ．カテゴリー（３３．１対３０．３）、１０〜１４ｏｚ．カテゴリー（１２．６対１６．２）、及び１４ｏｚ．を超えるカテゴリー（８．９対１３．１）。これらの相違についてのＥ１２についての全ての値は、従来の変種の範囲内であった。表６において、比重のデータは、２０１１年からのみである；従来型の変種（ＣｏｎＶ）は、従来型のＲａｎｇｅｒ及びＢｕｒｂａｎｋ変種の平均値の範囲に等しかった；ＮＡは、統計学的比較が不可能であったことを示す。
【０１２２】
Ｅ１２及びＢｕｒｂａｎｋ対照の花の色を、表７に示す。紫色／混合色の花及び白色の花の両方を、各エントリーにつき、異なるプロットにおいて観察した。
【０１２３】
【表４】
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【０１２４】
【表５】
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【０１２５】
【表６】
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【０１２６】
【表７】
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【０１２７】
バレイショ栽培品種Ｅ１２についての表４〜７に提示されたデータに基づき、非形質転換Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ変種とバレイショ栽培品種Ｅ１２との間に、農業特徴、花の色、収量及び等級、並びに経済学的相互作用において、主要な相違はないと結論した。従って、複数年データに基づき、Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔ変種Ｅ１２は、雑草性又は病虫害の可能性の結果として、環境における存続性の有意な危険はないことを提起した。
【０１２８】
黒色斑傷耐性
黒色斑傷は、損傷した塊茎の有する変色であり、バレイショ産業における最も重要な品質問題の１つを表す。この条件は、損傷したプラスチドから細胞質へのポリフェノールオキシダーゼ（Ｐｐｏ）の漏出の結果である。次いで、細胞質において、酵素オキシダーゼは、暗色の沈殿物を形成する。ｐＳＩＭ１２７８  ＤＮＡ挿入物の２つのサイレンシングカセットのうちの１つは、ソラナム・ベルコサム由来の２コピーのＰｐｏ５遺伝子の断片を、調節エレメントの間に逆向き反復として含む。この逆向き反復の発現は、バレイショＰｐｏ５遺伝子のサイレンシングを引き起こし、黒色斑傷の出現を有意に低減する。
【０１２９】
バレイショ栽培品種Ｅ１２及び黒色斑傷に感受性である対照Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ変種の野外で生育した塊茎を、黒色斑傷耐性について、２つの方法でアッセイした。
【０１３０】
塊茎変色は、カテコールを含むフェノール類を酸化し、迅速に重合体化して色素を生じる化合物を産生する、ポリフェノールオキシダーゼの活性によって起こる。黒色斑傷耐性について試験する間接的な方法は、１ｍｌのカテコール（２５ｍＭ、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ中、ｐＨ６．５）を塊茎の切断表面上にピペットで置き、暗褐色沈殿物のＰｐｏ依存型発生をモニタリングすることである。暗褐色沈殿物のＰｐｏ依存型発生を、２０分間後に評価した。Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ対照及び変種Ｅ１２の塊茎を、Ｃａｎｙｏｎ  Ｃｏｕｎｔｙ，ＩＤにおいて２００９年に生育した３つの異なる植物から収穫した。バレイショ栽培品種Ｅ１２についてのカテコールアッセイの結果を、図３に示す。図３に示されるように、Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ対照は、暗褐色に変色して黒色斑傷を示した。他方で、バレイショ栽培品種Ｅ１２は、暗褐色に変色せず、このことは、Ｅ１２が、非形質転換Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ対照よりも黒色斑傷に対し耐性であることを示す。
【０１３１】
傷耐性についてアッセイする第２の方法は、２００９年にＣａｎｙｏｎ  Ｃｏｕｎｔｙ，ＩＤから収穫された、各々対照及びバレイショ栽培品種Ｅ１２の９つの塊茎を、傷バレル（回転ドラム）内で１０回転まで回し、室温にて３日間にわたりインキュベートし、その後、機械的に皮むきして、黒色斑傷及び線割れ（割れ傷）斑の両方の数を計数した。表８は、３回の実験の毛化の平均値で表した結果を示し、エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。有意性を、スチューデント両側ｔ検定を用いて決定した（ｐ＜．０５）。
【０１３２】
【表８】
2016519928.tif 000010
【０１３３】
表８に示されるように、バレル傷試験は、本発明のバレイショＥ１２における検出不能な黒色斑傷レベルを示した。これらの結果は、変種Ｅ１２の塊茎が、非形質転換対照Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ変種の塊茎よりも黒色斑傷に耐性であること、並びに、ｐＳＩＭ１２７８のＤＮＡ挿入物は、黒色斑傷を伴う衝撃誘導型変色をもたらすことを示す。
【０１３４】
アスパラギン及びアクリルアミドレベル
アスパラギンシンセターゼ遺伝子のサイレンシングは、バレイショ栽培品種Ｅ１２における遊離のアスパラギンの７４％の平均低下をもたらした。メイラード反応において還元糖と合わさってアクリルアミドを形成するアスパラギンのより低いレベルは、揚げ物におけるアクリルアミドの６７％の低減をもたらす。Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ対照とバレイショＥ１２との間のアスパラギン及びアクリルアミドにおける相違を、表９に示す。アクリルアミドについて試験する前に、対照及びＥ１２を、フライドポテトにした。全ての結果を、収穫に近い時期に分析した塊茎からのものであった。
【０１３５】
【表９】
2016519928.tif 000011
【０１３６】
バレイショ栽培品種Ｅ１２は、黒色斑傷を担う酵素の発現を低減し、アクリルアミドレベルの低下を有する、品質を改善したＲｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ変種である。
【０１３７】
本発明のさらなる実施形態
上述の有利な特徴を組み合わせるバレイショ変種をもたらす研究は、主に経験的である。この研究は、大きな調査時間、労力及び費用を必要とする。バレイショ栽培品種の開発は、しばしば、温室から商用利用までに、８年以上もの時間を費やす。繁殖は、最も重要な特徴を子孫に組み込むための、優れた親の注意深い選択によって始まる。全ての所望の形質は、通常、１つの交配によって現れることはないので、繁殖は、必ず累積的になる。
【０１３８】
この繁殖技術は、親クローンの制御された受粉によって続く。代表的には、雌親を受粉する際に花粉を後に使用するため、ゼラチンカプセル内に集める。ハイブリッド種子を、温室内に撒き、何千もの個々の苗から塊茎を収穫し、保持する。翌年、各々得られた苗からの１〜４個の塊茎を、野外に撒き、ここでは、ウイルス及び病気を撒き散らさないよう、細心の注意を払う。この第１年苗収穫物から、選択プロセスを生き抜いた各ハイブリッド固体からの幾つかの「種」塊茎を、翌年の植え付けのために保持する。第２年の後に、密度測定及び揚げ物試験のためにサンプルを採取し、商用利用のための塊茎の好適性を決定する。この時点までの選択プロセスを生き延びた植物を、次いで、より包括的な一連の揚げ物試験及び密度決定のために、第３年により大きな容量で植える。開発段階第４年に、選択を生き延びたものを幾つかの条件で野外試験に供し、異なる生育条件に対するその適合性を決定する。やがては、優れた品質を有する変種を、他の農場に移し、市場規模に種子を増大する。一般に、この時点までに、８年以上の作付、収穫及び試験を調査し、新規且つ改善されたバレイショ栽培品種を開発することを企図する。
【０１３９】
特定のタンパク質生成物をコードする遺伝子の単離及び性質決定を可能にした分子生物学技術の出現により、植物生物学分野における科学者らは、植物のゲノムを外来性遺伝子を含んで発現するように、又は、ネイティブもしくは内因性の遺伝子のさらなる型若しくは改変型（恐らくは、異なるプロモーターによって駆動される）を含んで発現するように操作することに、強い関心を抱いてきた。このような外来性のさらなる遺伝子は、本書中で、集合的に、「トランスジーン」と呼ばれる。ここ１５〜２０年にわたり、トランスジェニック植物を産生するための幾つかの方法が開発されてきており、本発明もまた、詳細な実施形態において、特許請求した変種又は系統の形質転換変種に関する。
【０１４０】
植物形質転換は、植物細胞において機能する発現ベクターの構築を含む。このようなベクターは、調節配列（例えば、プロモーター）の制御下の、又は調節配列に作動可能に連結した遺伝子を含むＤＮＡを含む。発現ベクターは、１つ以上のこのような作動可能に連結した遺伝子／調節エレメント組み合わせを含み得る。（単数又は複数の）ベクターは、プラスミドの形態であってもよく、単独で用いられても、又は他のプラスミドと組み合わせて用いられてもよく、以下に記載されるような、トランスジーンをバレイショ植物の遺伝物質内に組み込む形質転換方法を用いて、形質転換バレイショ植物を提供する。
【０１４１】
従来型植物繁殖は、代表的に、新規且つ改善された特徴を有する変種を作製するための、植物染色体の無作為組換えに依存する。標準的周知技術に従い、遺伝子及び調節エレメントを含む遺伝子「発現カセット」を、アグロバクテリウム単離された運搬ＤＮＡ（「Ｔ−ＤＮＡ」）の境界内に挿入し、植物ゲノム内に組み込む。Ｔ−ＤＮＡ材料のアグロバクテリウム媒介型移入は、代表的に、以下の標準的手順を含む：（１）少なくとも１つが外来性起源である遺伝子エレメントのインビトロ組換えにより、形質転換の選択のための発現カセットを産生すること、（２）この発現カセットを、しばしば、外来性ＤＮＡを含む少なくとも１つの他の発現カセット共に、Ｔ−ＤＮＡ境界配列によって隣接されるアグロバクテリウムＤＮＡの通常数百塩基対から成る二値ベクトルのＴ−ＤＮＡ領域内に挿入すること、（３）Ｔ−ＤＮＡ境界の間に位置する配列を、しばしば、アグロバクテリウム由来のさらなる二値ベクター配列の幾つか又は全てと一緒に、植物細胞内に組み込むこと、並びに（４）所望の形質を示す、安定的に形質転換した植物細胞を選択すること。この形質は、例えば、収量の増加、改善された勢力、病気及び昆虫に対する増大された耐性、又はストレス下で生存する能力の上昇である。
【０１４２】
従って、遺伝子操作方法は、外来性の、非常在性の、プロモーター及びターミネーターなどの調節エレメント、並びに新規な形質の発現に関与するか又は形質転換体のウイルス、細菌及び植物からの同定及び選択のためのマーカーとしての機能に関与する遺伝子を含む、核酸に依存する。マーカー遺伝子は、代表的に、細菌供給源に由来し、抗生物質耐性又は除草剤耐性を付与する。古典的繁殖方法は、骨が折れ、時間がかかり、新しい変種は、代表的に、１つの比較的穏やかな改善しか示さない。
【０１４３】
「アンチセンス」技術において、ネイティブの遺伝子の配列は、逆向きにされて、トランスジェニック植物における遺伝子の発現をサイレンシングする。しかし、逆向きＤＮＡは、通常、プロモーターとターミネーターとの間に挿入された新規且つ性質決定されていないオープン読み取り枠を含み、これは、外来性アミノ酸配列をコードし、植物成長に干渉するか、及び／又は栄養的価値を減じるので、所望されない場合がある。
【０１４４】
バレイショ形質転換のための発現ベクター：マーカー遺伝子
発現ベクターは、調節エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結した少なくとも１つの遺伝子マーカーを含み、これは、ネガティブ選択、すなわち、選択的マーカー遺伝子を含まない細胞の成長の阻害によって又はポジティブ選択、すなわち、遺伝子マーカーによってコードされる産物についてのスクリーニングによってのいずれかで、回収される。多くの、植物形質転換のために一般的に使用される選択可能マーカー遺伝子は、形質転換分野において周知であり、例えば、選択的化学薬剤、例えば抗生物質又は除草剤を代謝的に解毒する酵素をコードする遺伝子、又は阻害剤に非感受性である改変された標的をコードする遺伝子である。幾つかのポジティブ選択方法もまた、当該分野で公知である。
【０１４５】
植物形質転換のための、１つの一般に使用される選択可能マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子であり、これは、植物調節シグナルの制御下にある場合、カナマイシンに対する耐性を付与する。Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：４８０３（１９８３）．別の一般に使用される選択可能マーカー遺伝子は、抗生物質ヒグロマイシンに対する耐性を付与する、ヒグロマイシントランスフェラーゼ遺伝子である。Ｖａｎｄｅｎ  Ｅｌｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５：２９９（１９８５）。
【０１４６】
さらなる選択可能マーカー遺伝子は、抗生物質に対する耐性を付与する細菌起源の遺伝子であり、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ及びブレオマイシン耐性決定因子であるアミノグリコシド−３’−アデニルトランスフェラーゼが挙げられる。Ｈａｙｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８６：１２１６（１９８８），Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１０：８６（１９８７），Ｓｖａｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４：１９７（１９９０）Ｈｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：１７１（１９８６）．他の選択可能マーカー遺伝子は、グリホシネート、グルホシネート又はブロモキシニルなどの除草剤に対する耐性を付与する。Ｃｏｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１７：７４１〜７４４（１９８５），Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：６０３〜６１８（１９９０）及びＳｔａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４１９〜４２３（１９８８）。
【０１４７】
細菌起源でない植物形質転換のための選択可能マーカー遺伝子としては、例えば、マウスジヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、植物５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ及び植物アセトラクテートシンターゼが挙げられる。Ｅｉｃｈｈｏｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１３：６７（１９８７），Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：４７８（１９８６），Ｃｈａｒｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．８：６４３（１９９０）。
【０１４８】
植物形質転換のための別のクラスのマーカー遺伝子は、抗生物質などの毒性物質に対する耐性についての形質転換細胞の直接的な遺伝子選択よりもむしろ、推定形質転換植物細胞のスクリーニングを必要とする。これらの遺伝子は、特定の組織における遺伝子の発現を定量するか、又は空間的パターンを可視化する際に特に有用であり、レポーター遺伝子と呼ばれる。何故なら、これらは、遺伝子発現の調査のために、遺伝子又は遺伝子調節配列に融合し得るからである。推定形質転換細胞をスクリーニングするための、一般的に使用される遺伝子としては、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが挙げられる。Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：３８７（１９８７），Ｔｅｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．８：３４３（１９８９），Ｋｏｎｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：１３１（１９８７），ＤｅＢｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６８１（１９８４）．。
【０１４９】
植物組織の破壊を必要としない、ＧＵＳ活性を可視化するためのインビボ方法が、利用可能である。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ２９０８，ＩＭＡＧＥＮＥ  ＧＲＥＥＮ，ｐ．１〜４（１９９３）及びＮａｌｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１５：１５１ａ（１９９１）。しかし、ＧＵＳ活性を可視化するためのこれらのインビボ方法は、低い感受性、高い蛍光バックグラウンド、及び選択可能マーカーとしてのルシフェラーゼの使用に関連する制限ゆえに、形質転換細胞を回収するために有用であることが証明されていない。
【０１５０】
より近年、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子が、原核細胞及び真核細胞における遺伝子発現のマーカーとして、利用されている。Ｃｈａｌｆｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：８０２（１９９４）．ＧＦＰ及びＧＦＰの突然変異タイは、スクリーニング可能マーカーであり得る。
【０１５１】
バレイショ形質転換のための発現ベクター：プロモーター
発現ベクター内含まれ得る遺伝子は、調節エレメント、例えばプロモーターを含むヌクレオチド配列によって駆動されなければならない。幾つかの種類のプロモーターが、単独で又はプロモーターと組み合わせて使用され得る他の調節エレメントと同じく、形質転換分野で周知である。
【０１５２】
本書中で使用される場合、「プロモーター」は、転写の開始から上流のＤＮＡ領域であって、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写を開始する他のタンパク質の認識及び結合に関与する領域に対する言及を含む。「植物プロモーター」は、植物細胞における転写を開始可能であるプロモーターである。発生制御下のプロモーターの例としては、特定の組織、例えば、葉、根、種子、繊維、木質導管、仮導管又は厚壁において優先的に転写を開始するプロモーターが挙げられる。このようなプロモーターは、「組織好適」と呼ばれる。特定の組織においてのみ転写を開始するプロモーターは、「組織特異的」と呼ばれる。「細胞型」特異的プロモーターは、主に、１つ以上の器官の特定の細胞型、例えば、根又は葉における脈管細胞において、発現を駆動する。「誘導型」プロモーターは、環境制御下にあるプロモーターである。誘導型プロモーターによる転写に作用し得る環境条件の例としては、嫌気条件又は光の存在である。組織特異的、組織好適、細胞型特異的及び誘導型のプロモーターは、「非構成的」プロモーターのクラスを構成する。「構成的」プロモーターは、殆どの環境条件下で活性であるプロモーターである。
【０１５３】
Ａ．誘導型プロモーター
誘導型プロモーターは、バレイショにおける発現のために、遺伝子に作動可能に連結される。場合により、誘導型プロモーターは、バレイショにおける発現のための遺伝子に作動可能に連結されるシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に、作動可能に連結される。誘導型プロモーターにより、転写の速度が、誘導剤に応答して上昇する。
【０１５４】
任意の誘導型プロモーターが、本発明において使用され得る。Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：３６１〜３６６（１９９３）を参照されたい。誘導型プロモーターの例としては、Ｅｘｅｍｐｌａｒｙ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｉｎｃｌｕｄｅ，ｂｕｔ  ａｒｅ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ，ｔｈａｔ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ銅に応答するＡＣＥＩ系由来のもの（Ｍｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９０：４５６７〜４５７１（１９９３））；ベンゼンスルホンアミド除草剤毒性軽減剤に応答するトウモロコシ由来のＩｎ２遺伝子（Ｈｅｒｓｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２２７：２２９〜２３７（１９９１）及びＧａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２４３：３２〜３８（１９９４））、又はＴｎ１０由来のＴｅｔリプレッサー（Ｇａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２２７：２２９〜２３７（１９９１））が挙げられる。特に好ましい誘導型プロモーターは、通常は植物が応答しない誘導剤に応答するプロモーターである。例示的な誘導型プロモーターは、ステロイドホルモン遺伝子からの誘導型プロモーターであり、その転写活性は、グルココルチコステロイドホルモンによって誘導される。Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：０４２１（１９９１）。
【０１５５】
Ｂ．構成的プロモーター
構成的プロモーターは、バレイショにおける発現のための遺伝子に作動可能に連結されるか、又は構成的プロモーターは、バレイショにおける発現のための遺伝子に作動可能に連結されるシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に、作動可能に連結される。
【０１５６】
多くの異なる構成的プロモーターが、本発明において利用され得る。例示的な構成的プロモーターとしては、植物ウイルス由来のプロモーター、例えば、ＣａＭＶ由来の３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０〜８１２（１９８５））及びコメアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１６３〜１７１（１９９０））；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９〜６３２（１９８９）及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５〜６８９（１９９２））；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１〜５８８（１９９１））；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７２３〜２７３０（１９８４））及びトウモロコシＨ３ヒストン（Ｌｅｐｅｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２３１：２７６〜２８５（１９９２）及びＡｔａｎａｓｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２（３）：２９１〜３００（１９９２））である遺伝子に由来するプロモーターである。
【０１５７】
ＡＬＳ３構造遺伝子に対し５’側であるＡＬＳプロモーター、Ｘｂａ１／Ｎｃｏｌ断片（又はこのＸｂａ１／Ｎｃｏｌ断片に類似したヌクレオチド配列）は、特に有用な構成的プロモーターを表す。ＰＣＴ出願ＷＯ  ９６／３０５３０を参照されたい。
【０１５８】
Ｃ．組織特異的又は組織好適プロモーター
組織特異的プロモーターは、バレイショにおける発現のために、遺伝子に作動可能に連結される。場合により、組織特異的プロモーターは、バレイショにおける発現のための遺伝子に作動可能に連結されるシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に、作動可能に連結される。組織特異的プロモーターに作動可能に連結した目的の遺伝子によって形質転換された植物は、特異的組織において、トランスジーンのタンパク質産物を、独占的に又は優先的に産生する。
【０１５９】
組織特異的又は組織好適プロモーターのいずれかは、本発明において利用され得る。例示的な組織特異的又は組織好適プロモーターとしては、ファゼオリン遺伝子由来のものなどの根好適プロモーター（Ｍｕｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３：４７６〜４８２（１９８３）及びＳｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３３２０〜３３２４（１９８５））；ｃａｂ又はｒｕｂｉｓｃｏに由来するものなどの葉特異的及び光誘導型プロモーター（Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．４（１１）：２７２３〜２７２９（１９８５）及びＴｉｍｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５７９〜５８２（１９８５））；ＬＡＴ５２の由来するものなどの葯特異的プロモーター−（Ｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１７：２４０〜２４５（１９８９））；Ｚｍ１３に由来するものなどの花粉特異的プロモーター（Ｇｕｅｒｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２４４：１６１〜１６８（１９９３））又はａｐｇに由来するものなどの小胞子好適プロモーター（Ｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｘ．Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｐｒｏｄ．６：２１７〜２２４（１９９３））が挙げられる。
【０１６０】
タンパク質を細胞内区画に標的化するためのシグナル配列
トランスジーンによって産生されたタンパク質の葉緑体、液胞、ペルオキシソーム、グリオキシソーム、細胞壁若しくはミトコンドリアなどの細胞内区画への輸送、又はアポプラストへの分泌のための輸送は、目的のタンパク質をコードする遺伝子の５’及び／又は３’領域への、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列の作動可能な連結によって達成される。構造遺伝子の５’及び／又は３’末端における配列の標的化は、タンパク質合成及びプロセシングの間に、コードされたタンパク質が最終的に区画化される場所を決定し得る。
【０１６１】
シグナル配列の存在は、ポリペプチドを、細胞内小器官若しくは細胞内区画、又はアポプラストへの分泌について、方向づける。多くのシグナル配列が、当該分野で公知である。例えば、Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：４９（１９９２）；Ｃｌｏｓｅ，Ｐ．Ｓ．，Ｍａｓｔｅｒ’ｓ  Ｔｈｅｓｉｓ，Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９３）；Ｋｎｏｘ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９：３〜１７（１９８７）；Ｌｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：１２４〜１２９（１９８９）；Ｆｒｏｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：４８３〜４９６（１９９１）；Ｍａｔｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：８３４（１９９１）；Ｇｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０８：１６５７（１９８９）；Ｃｒｅｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２：１２９（１９９１）；Ｋａｌｄｅｒｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３９：４９９〜５０９（１９８４）；Ｓｔｅｉｆｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：７８５〜７９３（１９９０）を参照されたい。
【０１６２】
外来性タンパク質遺伝子及び農業用遺伝子
本発明に従うトランスジェニック植物により、外来性タンパク質が、商用品質で産生され得る。従って、形質転換植物の選択及び増殖のための、当該分野で周知の技術は、複数のトランスジェニック植物を生じ、これは、従来様式で収穫され、次いで、外来性タンパク質が、目的の組織又は全体のバイオマスから抽出される。植物バイオマスからのタンパク質抽出は、例えば、以下によって議論される公知の方法によって達成され得る：Ｈｅｎｅｙ  ａｎｄ  Ｏｒｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１４：９２〜６（１９８１）。
【０１６３】
好ましい実施形態に従い、外来性タンパク質の市場用製品として産生されたトランスジェニック植物は、バレイショ植物である。別の好ましい実施形態において、目的のバイオマスは、種子又は塊茎である。高レベルの発現を示す比較的少数のトランスジェニック植物について、遺伝子マップが、まずは従来のＲＦＬＰ、ＰＣＲ及びＳＳＲ分析を介して作成され得る。俺らの分析は、組み込まれたＤＮＡ分子のおよその染色体位置を同定する。この点に関する例示的方法論についてはＧｌｉｃｋ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ２６９：２８４（１９９３）を参照されたい。染色体位置に関するマップ情報は、本トランスジェニック植物の特許保護のために有用である。認可されない増殖が行われ、他の生殖質との交配が作製された場合には、組み込み領域のマップは、疑わしい植物についての類似のマップと比較され得、後者が本植物と共有する百分率を有するか否かを決定する。マップ比較は、ハイブリダイゼーション、ＲＦＬＰ、ＰＣＲ、ＳＳＲ及び配列決定を含み得、これらは従来技術である。
【０１６４】
同様に、本発明を用いて、農業遺伝子が、形質転換植物において発現され得る。より詳細には、植物は、農業目的の種々の表現型を発現するように遺伝子操作され得る。この点に関係する例示的な遺伝子としては、いかに示すカテゴリーのものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６５】
１．有害生物及び病気に対する耐性を付与する遺伝子及びこれらは、以下をコードする：
Ａ．植物の病気に耐性の遺伝子植物防御は、多くの場合、病気耐性遺伝子の産物（Ｒ）と病原体における対応する非病原性（Ａｖｒ）遺伝子の産物との間の特異的相互作用によって活性化される。植物変種は、クローニングされた耐性遺伝子によって形質転換されて、特定の病原体株に対して抵抗性であるように植物を操作し得る。例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７８９（１９９４）（ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｏｍａｔｏ  Ｃｆ−９  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）；Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４３２（１９９３）（ｔｏｍａｔｏ  Ｐｔｏ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）；Ｍｉｎｄｒｉｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ７８：１０８９（１９９４）（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＲＳＰ２  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）を参照されたい。
Ｂ．有害生物、例えばダイズシストセンチュウに対する抵抗性を付与する遺伝子例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ  ９６／３０５１７；ＰＣＴ出願ＷＯ  ９３／１９１８１を参照されたい。
Ｃ．バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）タンパク質、その誘導体又はその上にモデリングした合成ポリヌクレオチド例えば、Ｂｔ  δ−内毒素遺伝子のクローニング及びヌクレオチド配列を開示するＧｅｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ４８：１０９（１９８６）を参照されたい。さらに、δ−内毒素遺伝子をコードするＤＮＡ分子が、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから、例えば、ＡＴＣＣ登録番号４００９８、６７１３６、３１９９５及び３１９９８の下で購入可能である。
Ｄ．レシチン例えば、Ｖａｎ  Ｄａｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２４：２５（１９９４）を参照されたい。これは、幾つかのクリビア・ミニアータ（Ｃｌｉｖｉａ  ｍｉｎｉａｔａ）マンノース結合レシチン遺伝子のヌクレオチド配列を開示する。
Ｅ．アビジンなどのビタミン結合タンパク質ＰＣＴ出願ＵＳ  ９３／０６４８７を参照されたい。これは、昆虫有害生物に対する殺幼虫剤としての、アビジン及びアビジンホモログの使用を教示する。
Ｆ．酵素インヒビター、例えば、プロテアーゼインヒビター若しくはプロテイナーゼインヒビター又はアミラーゼインヒビター。例えば、Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１６７９３（１９８７）（コメシステインプロテイナーゼインヒビターのヌクレオチド配列）、Ｈｕｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：９８５（１９９３）（タバコプロテイナーゼインヒビターＩをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列）、Ｓｕｍｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：１２４３（１９９３）（ストレプトマイセス・ニトロスポレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｉｔｒｏｓｐｏｒｅｕｓ）α−アミラーゼインヒビターのヌクレオチド配列）及び米国特許５，４９４，８１３（Ｈｅｐｈｅｒ  ａｎｄ  Ａｔｋｉｎｓｏｎ，ｉｓｓｕｅｄ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２７，１９９６）を参照されたい。
Ｇ．エクジステロイド又は幼若ホルモンなどの昆虫特異的ホルモン、それらのバリアント、それらに基づく模倣物、又はそのアンタゴニスト若しくはアゴニスト例えば、Ｈａｍｍｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：４５８（１９９０）による、クローニングした幼若ホルモンエステラーゼ（幼若ホルモンの不活性化剤）のバキュロウイルス発現の開示を参照されたい。
Ｈ．発現の際に罹患した有害生物の生理学を破壊する、昆虫特異的ペプチド又はニューロペプチド例えば、Ｒｅｇａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９（１９９４）（発現クローニングが昆虫利尿ホルモンレセプターをコードするＤＮＡを生じる）、及びＰｒａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６３：１２４３（１９８９）（アロスタチンは、ジプロテラ・プンタータ（Ｄｉｐｌｏｐｔｅｒａ  ｐｕｎｔａｔａ）において同定される）の開示を参照されたい。また、Ｔｏｍａｌｓｋｉらに対する米国特許５，２６６，３１７も参照されたい。これは、昆虫特異的な麻痺性ニューロトキシンをコードする遺伝子を開示する。
Ｉ．天然において蛇、スズメバチなどによって産生される昆虫特異的毒。例えば、Ｐａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １１６：１６５（１９９２）を、サソリ殺昆虫性ペプチドをコードする遺伝子の植物における異種発現の開示について参照されたい。
Ｊ．モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体又は殺昆虫活性を有する別の非タンパク質分子の過剰蓄積に対する酵素応答。
Ｋ．生物学的活性分枝の翻訳後改変を含む改変に関与する酵素、例えば、解糖酵素、タンパク分解酵素、脂肪分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼ、エステラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼ及びグルカナーゼであり、天然又は合成のいずれかである。ＰＣＴ出願ＷＯ  ９３／０２１９７（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．）を参照されたい。これは、カラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を開示する。キチナーゼコード配列を含むＤＮＡ分子が、例えば、ＡＴＣＣから、登録番号３９６３７及び６７１５２の下で得られ得る。また、Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２３：６９１（１９９３）をも参照されたい。これはタバコイモムシキチナーゼをコードするヌクレオチド配列を教示する。並びに、Ｋａｗａｌｌｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：６７３（１９９３）も参照されたい。これは、パセリｕｂｉ４−２ポリユビキチン遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。
Ｌ．シグナル伝達を刺激する分子例えば、Ｂｏｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２４：７５７（１９９４）による、リョクトウカルモジリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列の開示、及びＧｒｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：１４６７（１９９４）（ダイズカルモジリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を提供する）を参照されたい。
Ｍ．疎水性モーメントペプチド以下を参照されたい：ＰＣＴ出願ＷＯ  ９５／１６７７６、これは、真菌植物病原体を阻害するタキプレシンのペプチド誘導体を開示する。並びに、ＰＣＴ出願ＷＯ  ９５／１８８５５は、病気耐性を付与する、合成抗微生物ペプチドを教示する。
Ｎ．Ａ膜パーミアーゼ、チャネルフォーマー又はチャネルブロッカー。例えば、Ｊａｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ８９：４３（１９９３）の、トランスジェニックタバコ植物にシュードモナス・ソラナセアラム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）に対する耐性を付与する、セクロピン−β溶解性ペプチドの異種発現の開示を参照されたい。
Ｏ．ウイルス侵襲性タンパク質又はそれに由来する複合毒素例えば、形質転換植物細胞におけるウイルスコートタンパク質の蓄積は、このコードタンパク質が由来するウイルス及び関連のウイルスの感染及び／又はウイルスによってかかる病気発症に対する耐性を付与する。Ｂｅａｃｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．２８：４５１（１９９０）を参照されたい。コートタンパク質媒介型耐性は、アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス及びタバコモザイクウイルスに対する形質転換植物に付与されている。
Ｐ．昆虫特異的抗体又はそれに由来するイムノトキシン従って、昆虫の腸における重要な代謝機能に対し標的化された抗体は、影響を受けた酵素を不活化させ、昆虫を殺傷する。Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ＃４９７，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｉｎｔ’ｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ（Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）（１９９４）（トランスジェニックタバコにおける一本鎖抗体断片の産生を介した酵素不活性化）を参照されたい。
Ｑ．ウイルス特異的抗体例えば、Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：４６９（１９９３）を参照されたい。これは、組換え抗体遺伝子を発現するトランスジェニック植物が、ウイルス攻撃から保護されることを示す。
Ｒ．病原体又は寄生生物により天然で産生される発生停止タンパク質従って、真菌エンド−α−１，４−Ｄ−ポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁可溶性ホモ−α−１，４−Ｄ−ガラクツロナーゼにより、真菌の定着及び植物栄養放出を容易にする。Ｌａｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４３６（１９９２）を参照されたい。マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質をコードする遺伝子のクローニング及び性質決定は、Ｔｏｕｂａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２：３６７（１９９２）によって記載される。
Ｓ．植物により天然で産生される発生停止タンパク質例えば、Ｌｏｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：３０５（１９９２）は、オオムギリボソーム不活性化遺伝子を発現するトランスジェニック植物が、真菌の病気に対し上昇した抵抗性を有することを示している。
Ｔ．全身獲得抵抗性（ＳＡＲ）応答に関与する遺伝子及び／又は病因関連遺伝子Ｂｒｉｇｇｓ，Ｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５（２）（１９９５）。
Ｕ．抗真菌遺伝子Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｍｅｌｃｈｅｒｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０１：７０９〜７１２（１９９３）；Ｐａｒｉｊｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ  １８３：２５８〜２６４（１９９１）及びＢｕｓｈｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ．Ｊ．ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈ．２０（２）：１３７〜１４９（１９９８）を参照されたい。
Ｖ．フィトフトラ・ブライト（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｂｌｉｇｈｔ）に対する耐性を付与する遺伝子、例えば、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及び他の耐性遺伝子Ｎａｅｓｓ，Ｓ．Ｋ．，ｅｔ．ａｌ．，（２０００）Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｌａｔｅ  ｂｌｉｇｈｔ  ｉｎ  Ｓｏｌａｎｕｍ  ｂｕｌｂｏｃａｓｔａｎｕｍ  ｉｓ  ｍａｐｐｅｄ  ｔｏ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ８．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０１：６９７〜７０４及びＬｉ，Ｘ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９９８）Ａｕｔｏｔｅｔｒａｐｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｍｍｏｎ  ＡＦＬＰ  ｍａｒｋｅｒｓ：ｔｈｅ  Ｒ２  ａｌｌｅｌｅ  ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ  ｍａｐｐｅｄ  ｏｎ  ｐｏｔａｔｏ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ４．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９６：１１２１〜１１２８を参照されたい。
【０１６６】
２．除草剤に対する耐性を扶養する遺伝子。例えば：
Ａ．成長点又は分裂組織を阻害する除草剤、例えば、イミダゾリノン又はスルホニルウレアこのカテゴリーにおける遺伝子の例は、例えば、それぞれ以下に記載されるように、突然変異体ＡＬＳ及びＡＨＡＳ酵素をコードする：Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．７：１２４１（１９８８）及びＭｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８０：４４９（１９９０）。
Ｂ．グリホセート（それぞれ突然変異体５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰ）及びａｒｏＡ遺伝子によって、耐性が損なわれる）、並びにグルホシネート（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）及びストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ＰＡＴバー遺伝子）及びピリジンオキシ又はフェノキシプロピオン酸及びシクロヘキサンなど（ＡＣＣアーゼインヒビターコード遺伝子）の他のホスホノ化合物例えば、グリホセート耐性を付与するＥＰＳＰの形態のヌクレオチド配列を開示する、Ｓｈａｈ，ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許４，９４０，８３５を参照されたい。ａｒｏＡ遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ登録番号３９２５６の下で得られ、突然変異体遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｃｏｍａｉに対する米国特許４，７６９，０６１に開示される。Ｋｕｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．に対する欧州特許出願０  ３３３  ０３３、及びＧｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許４，９７５，３７４は、Ｌ−ホスフィノトリシンなどの除草剤に対する耐性を付与するグルタミンシンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を開示する。ＰＡＴ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｌｅｅｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．に対する欧州出願０  ２４２  ２４６において提供される。ＤｅＧｒｅｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：６１（１９８９）は、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性についてコードするキメラバー遺伝子を発現する、トランスジェニック植物の産生を記載する。フェノキシプロピオン酸及びシクロヘキサン、例えばセトキシジム及びハロキシホップに対する耐性を付与する例示的な遺伝子は、以下に記載されるＡｃｃ１−Ｓ１、Ａｃｃ１−Ｓ２及びＡｃｃ２−Ｓ３遺伝子である：Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８３：４３５（１９９２）。
Ｃ．光合成を阻害する除草剤、例えばトリアジン（ｐｓｂＡ及びｇｓ＋遺伝子）又はベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）Ｐｒｚｉｂｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：１６９（１９９１）は、突然変異体ｐｓｂＡをコードするプラスミドによる、クラミドモナスの形質転換を記載する。ニトリラーゼ遺伝子についてのヌクレオチド配列は、Ｓｔａｌｋｅｒに対する米国特許４，８１０，６４８にいて開示され、これらの遺伝子を含むＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ登録番号５３４３５、６７４４１及び６７４４２の下で利用可能である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードするＤＮＡのクローニング及び発現は、以下に記載される：Ｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８５：１７３（１９９２）。
Ｄ．多数の型の除草剤に耐性である酵素を発現する植物を作製することが見出されているアセトヒドロキシ酸シンターゼが、種々の植物内に導入されている。Ｈａｔｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４６：４１９，１９９５を参照されたい。除草剤に対する耐性を付与する他の遺伝子としては、ラット染色体Ｐ４５０７Ａ１と酵母ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼとのキメラタンパク質をコードする遺伝子（Ｓｈｉｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０６：１７，１９９４）、グルタチオンレダクターゼ及びスーパーオキシドジスムターゼについての遺伝子（Ａｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３６：１６８７，１９９５）、並びに種々のホスホトランスフェラーゼについての遺伝子（Ｄａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：６１９，１９９２）が挙げられる。
Ｅ．プロトポルフィリノゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｘ）が、全ての植物の生存のために必要な葉緑素の産生のために必須であるｐｒｏｔｏｘ酵素は、種々の除草剤化合物についての標的として寄与する。これらの除草剤はまた、存在する全ての異なる種の植物の成長も阻害し、全体的破壊をもたらす。これらの除草剤に対して耐性である改変されたｐｒｏｔｏｘ活性を有する植物の開発は以下に記載される：米国特許６，２８８，３０６；６，２８２，８３７；５，７６７，３７３及び国際公開ＷＯ  ０１／１２８２５。
【０１６７】
３．付加価値形質を付与するか又はこれに寄与する遺伝子。例えば：
Ａ．改変された脂肪酸代謝。例えば、ステアリル−ＡＣＰデサチュラーゼのアンチセンス遺伝子による、植物のステアリン酸含量を増大するような植物の形質転換によるもの。Ｋｎｕｌｔｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２６２５（１９９２）を参照されたい。
Ｂ．低下したフィテート含量−１）フィターゼをコードする遺伝子の導入は、フィテートの分解を増大し、形質転換植物に、より多くの遊離のホスフェートを追加する。例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）フィターゼ遺伝子のヌクレオチド配列の開示については、Ｖａｎ  Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １２７：８７（１９９３）を参照されたい。２）遺伝子は、低下したフィターゼ含量を誘導されることもできた。トウモロコシにおいて、例えば、これは、低レベルのフィチン酸によって特徴づけられるトウモロコシ突然変異を担う１つの対立遺伝子に関連するＤＮＡをクローニングし、次いで再導入することによって、達成され得た。Ｒａｂｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｙｄｉｃａ  ３５：３８３（１９９０）を参照されたい。
Ｃ．改変された炭水化物組成。例えば、デンプンの分枝パターンを改変する酵素をコードする遺伝子で植物を形質転換することによる。Ｓｈｉｒｏｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：８１０（１９８８）（ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）突然変異フラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０：２２０（１９８５）（バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Ｐｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２９２（１９９２）（バチルス・リケニホニス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｎｎｉｓ）α−アミラーゼを発現するトランスジェニック植物の産生）、Ｅｌｌｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：５１５（１９９３）（トマトインベルターゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、Ｓｏｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２４８０（１９９３）（オオムギα−アミラーゼ遺伝子の部位特異的突然変異誘発）及びＦｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：１０４５（１９９３）（トウモロコシ胚乳デンプン分枝酵素ＩＩ）を参照されたい。
Ｄ．ＦＡＤ−２遺伝子改変を介したオレイン酸の上昇及び／又はＦＡＤ−３遺伝子改変を介したリノレン酸の上昇米国特許６，０６３，９４７；６，３２３，３９２；及び国際公開ＷＯ  ９３／１１２４５を参照されたい。
【０１６８】
４．雄性不稔を制御する遺伝子
Ａ．タペータム特異的プロモーターの制御下のデアセチラーゼ遺伝子の導入及び化学的Ｎ−Ａｃ−ＰＰＴの添加。国際公開ＷＯ  ０１／２９２３７を参照されたい。
Ｂ．種々の雄ずい特異的プロモーターの導入。国際公開ＷＯ  ９２／１３９５６及びＷＯ  ９２／１３９５７を参照されたい。
Ｃ．バルナーゼ及びバルスター遺伝子の導入Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：６１１〜６２２，１９９２を参照されたい。
【０１６９】
バレイショ形質転換の方法
植物形質転換のための多くの方法が開発されており、生物学的及び物理的植物形質転換プロトコールが挙げられる。例えば、Ｍｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ」ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．Ｅｄｓ．（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３）ｐａｇｅｓ  ６７〜８８を参照されたい。加えて、植物細胞についてのベクターの発現及びインビトロ培養方法又は組織形質転換及び植物の再生が、利用可能である。例えば、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ」ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．Ｅｄｓ．（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３）ｐａｇｅｓ  ８９〜１１９を参照されたい。
【０１７０】
Ａ．アグロバクテリウム媒介型形質転換−ベクターを植物内に導入するための１つの方法は、アグロバクテリウムの天然の形質転換システムに基づく。例えば、Ｈｏｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：１２２９（１９８５）を参照されたい。Ａ．ツメファシエンス及びＡ．リゾゲネスは、植物細胞を遺伝的に形質転換する、植物病原性土壌細菌である。Ａ．ツメファシエンス及びＡ．リゾゲネスのＴｉ及びＲｉプラスミドは、それぞれ、植物の遺伝的形質転換を担う遺伝子を有する。例えば、Ｋａｄｏ，Ｃ．Ｉ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１０：１（１９９１）を参照されたい。アグロバクテリウムベクター系及びアグロバクテリウム媒介型遺伝子移入のための方法の記載は、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ，Ｍｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ  ａｎｄ  Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ８：２３８（１９８９）によって提示される。また、１９９６年１０月８日に発行された米国特許５，５６３，０５５（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓ）も参照されたい。
【０１７１】
Ｂ．直接遺伝子移入−集合的に直接遺伝子移入と呼ばれる植物形質転換の幾つかの方法が、アグロバクテリウム媒介型形質転換の代替法として開発されている。植物表面の１〜４μｍの微小射出の遺伝的に適合性な方法。発現ベクターを、植物細壁及び細胞膜を貫くのに十分な３００〜６００ｍ／秒の速さに微小射出を加速する微粒子銃デバイスにより、植物組織内に導入する。Ｓａｎｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｒｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．５：２７（１９８７）；Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｊ．Ｃ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．６：２９９（１９８８）；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．６：５５９〜５６３（１９８８）；Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｊ．Ｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  ７：２０６（１９９０）；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２６８（１９９２）．１９９１年５月１４日に発行された米国特許５，０１５，５８０（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，ｅｔ  ａｌ．）、及び１９９４年６月２１日に発行された米国特許５，３２２，７８３（Ｔｏｍｅｓ，ｅｔ  ａｌ．）もまた、参照されたい。
【０１７２】
ＤＮＡの植物への物理的送達のための別の方法は、標的細胞の超音波処理である。Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９９６（１９９１）．あるいは、リポソーム及びスフェロプラスト融合が、発現ベクターを植物内に導入するために使用されている。Ｄｅｓｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：２７３１（１９８５）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３９６２（１９８７）。ＣａＣｌ２沈殿、ポリビニルアルコール又はポリ−Ｌ−オルニチンを用いるＤＮＡの原形質中への直接取り込みもまた、報告されている。Ｈａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１６１（１９８５）及びＤｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３：４５１（１９８２）。原形質及び全細胞並びに組織のエレクトロポレーションもまた、記載されている。Ｄｏｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ＶＩＩｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＩＡＰＴＣ，Ａ２−３８，ｐ  ５３（１９９０）；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：１４９５〜１５０５（１９９２）及びＳｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：５１〜６１（１９９４）。
【０１７３】
バレイショ標的組織の形質転換後、上述の選択可能マーカー遺伝子の発現は、当該分野で周知の再生及び選択方法を用いた形質転換細胞、組織及び／又は植物の優先的選択を可能にする。
【０１７４】
形質転換のための上述の方法が、代表的に、トランスジェニック変種を産生するために使用される。次いで、新規なトランスジェニック変種を産生するために、トランスジェニック変種を、別の（非形質転換又は形質転換）変種に交配させる。あるいは、特定のバレイショ系統に上述の形質転換技術を用いて遺伝子操作した遺伝的形質を、植物増殖分野で周知の従来型戻し交配技術を用いて、別の系統に移してもよい。例えば、戻し交雑アプローチを使用し、操作した形質を、公の、非エリート変種からエリート変種へと移動させてもよく、又は、そのゲノム内に外来性遺伝子を含む変種からこの遺伝子を含まない変種へと移動させてもよい。本書中で使用される場合、「交配する」は、単純にＸをＹによってかけ合わせることをいっても、又は文脈に依存して、戻し交配のプロセスをいってもよい。
【０１７５】
当業者は、用語バレイショ植物が、本発明の文脈で使用される場合、これはまた、Ｅ１２の本質的に識別可能な特徴を保持する派生変種、例えば、この変種の遺伝子変換植物又はそこに組み込まれた１つ以上の付加価値遺伝子（例えば、除草剤又は有害生物耐性）を有するトランスジェニック誘導体をも含むことを理解する。戻し交配方法は、特徴を改善するか、又は特徴を変種に導入するために、本発明と共に使用され得る。用語「戻し交配」は、本書中で使用される場合、ハイブリッド子孫を回帰した親に戻す１、２、３、４、５、６、７、８、９以上の回数の繰り返し交配をいう。１つ以上の所望の特徴のために遺伝子を供した親バレイショ植物を、非回帰親又はドナー親と呼ぶ。この用語は、非回帰親が、戻し交配プロトコールにおいて１回使用され、回帰しないという事実をいう。非回帰親からの遺伝子が移入されている親バレイショ植物は、回帰親として知られ、戻し交配プロトコールにおいて、何回も使用される。代表的な戻し交配プロトコールにおいて、目的の元の変種（回帰親）は、移入された目的の遺伝子を有する第２の変種（非回帰親）と交配される。この交配から得られた子孫を、次いで、再び回帰親にかけ合わせ、このプロセスを、変換した植物において、非回帰親から移入された１つ以上の遺伝子に加えて回帰親の所望の形態学的及び生理学的特徴を本質的に全て回収したバレイショ植物が得られるまで繰り返す。
【０１７６】
好適な回帰親の選択は、連続的戻し交配手順のために重要な工程である。戻し交配プロトコールの到達点は、元の変種における１以上の形質又は特徴を、改変することである。これを達成するために、回帰変種の１つ以上の遺伝子を、非回帰親由来の所望の遺伝子により、改変するか、置換するか、又は補充する一方で、所望の遺伝子の残りの全ては本質的に保持し、従って、元の変種の所望の生理学的及び形態学的構造を保持する。特定の非回帰親の選択は、戻し交配に依存する。幾つかの市場で望ましい、農業的に重要な形質を、植物に加える。正確な戻し交配プロトコールは、改変されるか又は加えられた特徴若しくは形質に依存して、適切な試験プロトコールを決定する。移入される特徴が優性対立遺伝子である場合は戻し交配方法は単純化されるが、劣勢対立遺伝子もまた、移入され得る。この場合、所望の特徴が首尾よく移入されたか否かを決定するために、子孫の試験を導入する必要がある。
【０１７７】
このように、トランスジーンは、種々の確立された、当業者に周知の組換え方法のいずれかを用いて、導入され得る。例えば、以下である：Ｇｒｅｓｓｅｌ，１９８５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ  Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｃｒｏｐｓ：Ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｔ  Ｒｅａｌｉｔｉｅｓ，Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｆｏｒｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ，Ｌ．ｖａｎ  Ｖｌｏｔｅｎ−Ｄｏｔｉｎｇ，（ｅｄ．），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈｕｔｔｎｅｒ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｒｅｖｉｓｉｎｇ  Ｏｖｅｒｓｉｇｈｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｋｌｅｅ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ：Ｐｌａｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ，Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ；Ｋｏｎｃｚ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｏｆ  ＴＬ−ＤＮＡ  Ｇｅｎｅ  ５  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｈｅ  Ｔｉｓｓｕｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｇｅｎｅｓ  Ｃａｒｒｉｅｄ  ｂｙ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｙｐｅ  ｏｆ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｂｉｎａｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ；Ｌａｗｓｏｎ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｍｉｘｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｃｕｌｔｉｖａｒ：Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｖｉｒｕｓ  Ｘ  ａｎｄ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｖｉｒｕｓ  Ｙ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｍｉｔｓｋｙ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｌａｎｔｓ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ＰＬＲＶ．米国特許５，５１０，２５３；Ｎｅｗｅｌｌ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  Ｌ．Ｃｖ．Ｒｕｓｓｅｔ  Ｂｕｒｂａｎｋ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ；Ｐｅｒｌａｋ，Ｆ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｐｏｔａｔｏｅｓ：Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｄａｍａｇｅ  ｂｙ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｂｅｅｔｌｅｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、これらの全ては、この目的のために、本書中に参考として組み込まれる。
【０１７８】
新規な変種の開発のためには通常選択されないが、戻し交配及び遺伝子操作技術によって改善され得る多くの形質が、同定されている。これらの形質は、トランスジェニックであってもなくてもよい；これらの形質の例としては、除草剤耐性；細菌性の病気、真菌性の病気又はウイルス性の病気に対する耐性；昆虫耐性；デンプン又は他の炭水化物の濃度における均一性若しくは増大；栄養品質の向上；塊茎が傷を負う傾向の低下；及びデンプンの糖への還元の割合の低下が挙げられるが、これらに限定されない。これらの遺伝子は、核を通して遺伝的に受け継がれる。これらの形質の幾つかは、以下に記載される：米国特許５，５００，３６５、米国特許５，３８７，７５６、米国特許５，７８９，６５７、米国特許５，５０３，９９９、米国特許５，５８９，６１２、米国特許５，５１０，２５３、米国特許５，３０４，７３０、米国特許５，３８２，４２９、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎ．５，５０３，９９９、米国特許５，６４８，２４９、米国特許５，３１２，９１２、米国特許５，４９８，５３３、米国特許５，２７６，２６８、米国特許４，９００，６７６、米国特許５，６３３，４３４及び米国特許４，９７０，１６８。
【０１７９】
寄託情報
Ｊ．Ｒ．Ｓｉｍｐｌｏｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ所有の、上で開示し添付の特許請求の範囲で挙げたバレイショ栽培品種Ｅ１２の塊茎寄託は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０によって行った。寄託日は、２０１３年５月２３日であった。マイクロチューブの２５のバイアルの寄託物を、Ｊ．Ｒ．Ｓｉｍｐｌｏｔ  Ｃｏｍｐａｎｙによって維持された同じ寄託物から、本出願の提出日の前に受け取った。全ての制限は、特許の付与の際に不可逆的に取り除かれ、この寄託は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§  １．８０１〜１．８０９の全ての要件を満たすことを意図する。ＡＴＣＣ登録番号は、ＰＴＡ−１２０３７２である。寄託物は、３０年間の期間にわたって、又は最後の要求から５年間にわたって、又は、より長い場合には特許の権利光子可能期間にわたって、寄託当局によって維持され、必要に応じて、その期間の間、取り換えられる。
【０１８０】
多くの例示的局面及び実施形態が上で議論されているが、当業者は、特定の改変、交換、追加及びその部分的組み合わせを、理解する。従って、以下の添付の特許請求の範囲は、以後、全てのこのような改変、交換、追加及び部分的組み合わせを、その真の精神及び範囲内であるように、含むと解釈されることが、意図される。
【図１】
2016519928.tif 000012
【図２】
2016519928.tif 000013
【図３】
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【国際調査報告】
2016519928.tif 000015