(57)【要約】  本発明は、示差的な、特異的な蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いた、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および他の細胞型の同定、およびさらに分離の分野の発明である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の集団における間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を同定する方法であって、
蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて、その表面上に検出可能なレベルのＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を提示し検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４およびＣＤ４５を提示しない、前記集団における細胞を同時に同定するステップ、および、
それにより、細胞の集団における間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を同定するステップ、
を含む、
方法。
【請求項２】
細胞の集団における特定の細胞型を同定する方法であって、
ＦＡＣＳを用いて、前記集団における細胞の表面上の、前記の特定の細胞型を示す７またはそれより多い細胞表面マーカーの存在または不存在を、同時に同定するステップを含む、
方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、
前記方法は、前記集団における細胞の表面上の、前記の特定の細胞型を示す１０またはそれより多い細胞表面マーカーの存在または不存在を、同定するステップを含む、
方法。
【請求項４】
請求項２または３に記載の方法であって、
前記の特定の細胞型は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）であり、
前記方法は、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４およびＣＤ４５の存在または不存在を同時に同定するステップを含み、
ここで、細胞表面上の、検出可能なレベルのＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の存在、および、検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４およびＣＤ４５の不存在は、それがＭＳＣであることを示す、
方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、
前記方法は、検出可能なレベルのＣＤ１８１およびＣＤ１８４の存在または不存在を同定するステップをさらに含み、
ここで、細胞表面上の、検出可能なレベルのＣＤ１８１およびＣ１８４の存在は、それが特定のサブタイプのＭＳＣであることを示す、
方法。
【請求項６】
請求項２または３に記載の方法であって、
前記の特定の細胞型は、中胚葉系列の前駆細胞であり、
前記方法は、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２７１、ＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５の存在または不存在を同定するステップを含み、
ここで、細胞表面上の、検出可能なレベルのＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ２７１の存在、および、検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５の不存在は、それが中胚葉系列の前駆細胞であることを示す、
方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、
前記方法は、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ１（ＣＸＣＲ１）、ＣＸＣＲ２またはＣＸＣＲ４の存在または不存在を同定するステップをさらに含み、
ここで、細胞表面上の、検出可能なレベルのＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２またはＣＸＣＲ４の存在は、患者において、特定の損傷した組織へ移行することが可能であることを示す、
方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、
細胞表面上の、検出可能なレベルのＣＸＣＲ４の存在は、患者において、損傷した心臓組織、網膜組織または骨組織へ移行することが可能であることを示す、
方法。
【請求項９】
請求項２または３に記載の方法であって、
前記の特定の細胞型は線維芽細胞であり、
前記方法は、とりわけ、ＣＤ１０、ＣＤ２９およびＣＤ１０６の存在または不存在を同定するステップを含み、
ここで、細胞表面上の、検出可能なレベルのＣＤ１０、ＣＤ２９およびＣＤ１０６の存在は、それが線維芽細胞であることを示す、
方法。
【請求項１０】
請求項２または３に記載の方法であって、
前記の特定の細胞型は、非常に微小な胚／外肺葉様の幹細胞（ｖｅｒｙ  ｓｍａｌｌ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ／ｅｐｉｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）（ＶＳＥＬ）であり、
前記方法は、検出可能なレベルのＳｃａ−１、ＣＤ４５Ｒ、Ｇｒ−１、ＴＣＲａｌｐｈａｂｅｔａ、ＴＣＲｇａｍｍａｄｅｌｔａ、ＣＤ１１ｂ、Ｔｅｒ１１９およびＯｃｔ−４の存在または不存在を同定するステップを含み、
ここで細胞表面上の、検出可能なレベルのＳｃａ−１、ＣＤ４５Ｒ、Ｇｒ−１、ＴＣＲａｌｐｈａｂｅｔａ、ＴＣＲｇａｍｍａｄｅｌｔａ、ＣＤ１１ｂ、Ｔｅｒ１１９およびＯｃｔ−４の存在は、それがＶＥＳＬであることを示す、
方法。
【請求項１１】
請求項２または３に記載の方法であって、
前記の特定の細胞型は造血幹細胞（ＨＳＣ）であり、
前記方法は、とりわけ、検出可能なレベルのＣＤ１３３の存在または不存在を同定するステップを含み、
ここで、細胞表面上の、検出可能なレベルのＣＤ１３３の存在は、それがＨＳＣであることを示す、
方法。
【請求項１２】
請求項２または３に記載の方法であって、
前記の特定の細胞型は内皮前駆細胞（ＥＰＣ）であり、
前記方法は、とりわけ、検出可能なレベルのＫＤＲ、ＶＥ−カドヘリンおよびＣＤ３１の存在または不存在を同定するステップを含み、
ここで、細胞表面上の、検出可能なレベルのＫＤＲ、ＶＥ−カドヘリンおよびＣＤ３１の存在は、それがＥＰＣであることを示す、
方法。
【請求項１３】
請求項２または３に記載の方法であって、
前記の特定の細胞型は組織系幹細胞（ｔｉｓｓｕｅ−ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）であり、
前記方法は、とりわけ、検出可能なレベルのＣＤ１１７＋、ＣＤ１８４、ｃ−ｍｅｔおよびＡＣ１３３の存在または不存在を同定するステップを含み、
ここで、細胞表面上の、検出可能なレベルのＣＤ１１７＋、ＣＤ１８４、ｃ−ｍｅｔおよびＡＣ１３３の存在は、それが組織系幹細胞であることを示す、
方法。
【請求項１４】
細胞集団における間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を同定するためのキットであって、
７またはそれより多い蛍光標識抗体を含み、
前記キット中の少なくとも１つの抗体は、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４およびＣＤ４５のそれぞれに特異的に結合する、
キット。
【請求項１５】
細胞の集団における特定の細胞型を同定するためのキットであって、
７またはそれより多い蛍光標識抗体を含み、
前記キット中の少なくとも１つの抗体は、前記の特定の細胞型を示す７またはそれより多い細胞表面マーカーの１つに特異的に結合する、
キット。
【請求項１６】
請求項１５に記載のキットであって、
前記キットは、１０またはそれより多い蛍光標識抗体を含み、
前記キット中の少なくとも１つの抗体は、前記の特定の細胞型を示す１０またはそれより多い細胞表面マーカーの１つに特異的に結合する、
キット。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載のキットであって、
前記キット中の少なくとも１つの抗体は、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４およびＣＤ４５のそれぞれに特異的に結合する、
キット。
【請求項１８】
請求項１７に記載のキットであって、
前記キット中の少なくとも１つの抗体は、ＣＤ１８１およびＣＤ１８４のそれぞれに特異的に結合する、
キット。
【請求項１９】
請求項１５または１６に記載のキットであって、
前記キット中の少なくとも１つの抗体は、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２７１、ＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５のそれぞれに特異的に結合する、
キット。
【請求項２０】
請求項１９に記載のキットであって、
前記キット中の前記の少なくとも１つの抗体は、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体タイプ１（ＣＸＣＲ１）、ＣＸＣＲ２およびＣＸＣＲ４のそれぞれに特異的に結合する、
キット。
【請求項２１】
請求項１５または１６に記載のキットであって、
前記キット中の少なくとも１つの抗体は、ＣＤ１０、ＣＤ２９およびＣＤ１０６のそれぞれに特異的に結合する、
キット。
【請求項２２】
請求項１５または１６に記載のキットであって、
前記キット中の少なくとも１つの抗体は、Ｓｃａ−１、ＣＤ４５Ｒ、Ｇｒ−１、ＴＣＲａｌｐｈａｂｅｔａ、ＴＣＲｇａｍｍａｄｅｌｔａ、ＣＤ１１ｂ、Ｔｅｒ１１９およびＯｃｔ−４のそれぞれに特異的に結合する、
キット。
【請求項２３】
請求項１５または１６に記載のキットであって、
前記キット中の少なくとも１つの抗体は、ＣＤ１３３に特異的に結合する、
キット。
【請求項２４】
請求項１５または１６に記載のキットであって、
前記キット中の少なくとも１つの抗体は、ＫＤＲ、ＶＥ−カドヘリンおよびＣＤ３１のそれぞれに特異的に結合する、
キット。
【請求項２５】
請求項１５または１６に記載のキットであって、
前記キット中の少なくとも１つの抗体は、ＣＤ１１７＋、ＣＤ１８４、ｃ−ｍｅｔおよびＡＣ１３３のそれぞれに特異的に結合する、
キット。
【請求項２６】
ＦＡＣ試薬の活性成分の相対的な特定の濃度に基づいて、細胞集団における間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を同定するための、試薬または物質組成であって、
蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて、その表面上に検出可能なレベルのＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を提示し検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４およびＣＤ４５を提示しない、前記集団における細胞を、同時に同定するステップ、および、
それにより、細胞集団における間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を同定するステップ、
を含む、
試薬または物質組成。
【請求項２７】
ＦＡＣ試薬の活性成分の相対的な特定の濃度に基づいて、細胞の集団における特定の細胞型を同定するための、試薬または物質組成であって、
ＦＡＣＳを用いて、前記集団における細胞の表面上の、前記の特定の細胞型を示す７またはそれより多い細胞表面マーカーの存在または不存在を、同時に同定するステップを含む、
試薬または物質組成。
【請求項２８】
ＦＡＣＳ分析を用いて、７またはそれより多い細胞表面マーカーの存在または不存在を同時に同定するための、蛍光標識抗体のパネルを製造する方法であって、
前記方法は、
（ａ）前記の７またはそれより多い細胞表面マーカーを選択するステップ；
（ｂ）異なるレーザー上に陽性マーカーを広げるステップ；
（ｃ）７またはそれより多い蛍光標識抗体を選択するステップ；
（ｄ）前記の７またはそれより多いマーカー（陽性および陰性の両方）の公知の発現を有する細胞において最適な濃度および最小のスペクトルオーバーラップが達成されることを確実にするために、抗体を滴定するステップ；
（ｅ）陽性の細胞表面マーカーに対して前記抗体を試験するステップ；
（ｆ）前記抗体のコアパネルを試験するステップ；
（ｇ）プレースホルダーのマーカーを発現するために、細胞を誘導または刺激するステップ；
（ｈ）前記プレースホルダーの抗体を試験および滴定するステップ；
（ｉ）前記プレースホルダーの条件を最適化するステップ；および、
（ｊ）他の細胞型の不存在下で、および混合された集団において、細胞に全パネルを試験するステップ、
を含む、
方法。
【請求項２９】
蛍光標識抗体のパネルであって、
ＦＡＣＳ分析を用いて、７またはそれより多い細胞表面マーカーの存在または不存在を同時に同定するための蛍光標識抗体のパネルであり、
請求項２８の方法を用いて製造される、
蛍光標識抗体のパネル。
【請求項３０】
細胞の集団における新規の細胞型を同定する方法であって、
ＦＡＣＳを用いて、前記集団における前記細胞の表面上の、７またはそれより多い細胞表面マーカーの存在または不存在を同時に同定するステップを含み、
前記の７またはそれより多いマーカーの少なくとも一部は、特定の細胞型を示し、
前記の７またはそれより多いマーカーの少なくとも１つは、前記の特定の細胞型によって検出可能に発現されない、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、示差的な、特異的な蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いた、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および他の細胞型の同定、およびさらに分離の分野の発明である。すなわち、本発明は、様々な相対的な特定の濃度での試薬または物質組成であり、それは、驚くべきことに、試薬中の様々な特定の濃度の標識細胞マーカーに起因して、標識細胞に対する治療的（または生理学的）効果を提供する。本発明は、特定の相対的な試薬濃度の効果に基づく、細胞の選択的分離のための試薬および方法である。本発明者らは、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて、７またはそれより多い細胞表面マーカーの存在または不存在下で、物質組成が細胞上でそれらの同時の同定を可能にする薬剤として区別して作用することができる、驚くべき方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
序論
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、再生医療の分野におけるそれらの可能性に多くの注目を受けていて、多くの障害に関する臨床試験において使用されている。ＭＳＣは、急性心筋梗塞［１，２］、脳卒中［３］、多系統萎縮症（ＭＳＡ）［４］、移植片対宿主病［５］、および脊髄損傷［６］の患者において、治療利益の可能性が示されている。
【０００３】
国際細胞治療学会（ＩＳＣＴ）は、ＭＳＣを同定するのに用いられる最小基準のセットを開発した［７］。これらは：ｉ）プラスチックへの付着、ｉｉ）脂肪細胞、軟骨細胞、および骨細胞への分化、および、ｉｉｉ）細胞表面分子の特定の発現パターンである。最初の２つの基準は、異なる条件下での細胞培養で評価され、一方で最後のものはマルチカラーフローサイトメトリー（ＭＦＣ）を用いて評価することができる。ＭＳＣとして同定されるためには、細胞集団の９５％よりも多くが、ＣＤ７３（エクト５’−ヌクレオチダーゼ）、ＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）およびＣＤ１０５（エンドグリン）を発現しなければならず、そして、ＣＤ１１ｂまたはＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１９またはＣＤ７９α、およびＨＬＡ−ＤＲに関して陰性（≦２％の陽性細胞）でなければならない［７］。
【０００４】
ＭＳＣの表面マーカーのパターンは、パラレルチューブのアプローチ：チューブごとに異なるフルオロフォアにそれぞれコンジュゲートされた２〜４つの抗体の組み合わせを有する多数のサンプルチューブを用いて、伝統的に分析がされている。これは、実際的な制限を含む。例えば、パラレルチューブによる結果は、細胞集団が均質であるかのように分析され、表面マーカーの発現（％）が報告される。
【０００５】
ＭＳＣに関するマルチカラーパネルの公表された例は、現在までのところ、推奨される表面マーカーのＩＳＣＴ基準を無視し（Ｍａｒｔｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、シングルチューブのアプローチではなくパラレルチューブを使用し（Ｔｕｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｂｕｎｎｅｌｌ，  ２０１１）、または、慣習のコンジュゲートおよび最も一般的な蛍光色素を利用する（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋｅ，２０１１）、のいずれかであり、個々の研究の要求に適応できない、柔軟性のないツールを生じる。ある場合には、研究者らは、フローサイトメトリーによりＭＳＣとして同定される細胞が、他の２つの最小基準：プラスチックへの付着および３系統分化の能力も観察されることを確認していない（Ｍａｒｔｉｎｓら、２００９）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、驚くべきことに、脂肪細胞、軟骨細胞および骨細胞へ分化することが証明された、プラスチック付着細胞上の、ＩＳＣＴにより推奨される間葉系幹細胞ＭＳＣマーカーを含む、マルチカラーフローサイトメトリー（ＭＦＣ）パネルを開発した。本発明者らは、コアパネル（３つの最も一般に利用可能な蛍光色素コンジュゲート、蛍光色素ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＰＥ（フィコエリトリン）およびＡＰＣ（アロフィコシアニン）にコンジュゲートされた試薬を用いなかった）を設計し、これらの３つの位置を交換可能なプレースホルダーとして用いることを可能にし、および、目的とする他の抗原と組み合わせてパネルの使用を可能にした。本発明者らは、２つの一般に用いられる組織源（臍帯マトリックスおよびＢＭ吸引液）由来のＭＳＣを用いて、パネルを評価した。また、本発明者らは、異種集団内のＭＳＣを同定するためにパネルを用いることが可能であることも確認した。
【０００７】
マルチカラーフローサイトメトリー（ＭＦＣ）は、シングルカラーフローサイトメトリーとは異なり、分析の開発に、より高度の技術的困難性を導入する。様々な表面マーカーを同時に分析するためには、各表面マーカーは、検出のための特異的な抗体を必要とする。フローサイトメトリーでは、検出のための一次抗体およびシグナル増幅のための二次抗体の代わりに、蛍光色素に直接コンジュゲートされた抗体を用いることが最も良い。したがって、多数の抗体を同時に使用する場合、それらのコンジュゲートされた蛍光色素は、それらの放出波長内でそれらが重ならないように賢明に選択しなければならない。簡単に言えば、色スペクトルができるだけ遠く離れた蛍光色素を選択すべきである。成功は、主に３つの因子：最適に滴定された抗体、正確な補正（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）および抗原−蛍光色素バランスに依存する。どのようにこれが達成されるのか、以下により詳細に述べる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の方法は、パラレルチューブのアプローチに勝る様々な利点を有する。第一に、単一の細胞レベルでの細胞の表現型を同定するための高い精度は、臨床状況において、患者サンプルまたは治療細胞の産物中の特定の細胞型の正確な定量化に極めて重要である。またそれは、高い検出感度も提供し、最新の分析ストラテジーを用いて、混合された細胞サンプルにおいてＭＳＣを同定することも可能にする。これは、異種であり得る臨床サンプルを研究する場合に、特に利点となる。第二に、シングルチューブのフローサイトメトリーは、小サンプル（生検または小児検体など）から最大限の情報が得られることを可能にし、それはまた、研究対象あたり１つのチューブのみ必要とするので、より大きな研究プロジェクトも促進する。最後に、マルチカラーアプローチは、異なる型のＭＳＣの検出を容易にし、表現型および機能、例えば、サイトカイン産生、アポトーシス、および細胞周期分析の、同時の分析を可能にする（Ｄｅ  Ｒｏｓａら、２００３）。
【０００９】
本発明は、新規の細胞型を同定および分離／捕捉するハイスループットの細胞薬剤の発見技術、および、ハイスループットの細胞ソーティング／自動化細胞スクリーニングと組み合わせたアルゴリズムを提供する。本発明は、候補細胞を同定するための（例えば、７つの典型的なＭＳＣマーカーを有するが、例えばＣＤ６２に関して＋ｖｅでもある、新規の細胞を同定するための）アルゴリズムを用いることにより、１０００のマーカー、色、および、マーカーと色の組み合わせの自動化およびコンピューターによる分析が、新規の細胞型を同定することを可能にする。以下のアルゴリズムを用いることにより、ＦＡＣＳ実験を規定し、存在するならば候補細胞を同定／捕捉するためのマーカー、抗体および色の組み合わせを試験することが可能である。このプロセスは、細胞医薬に初めて適用される「合理的な」薬剤設計アプローチを可能にし−研究者らが新規の細胞型の設計および実証的試験をすることを可能にする。したがって、実践する研究者らが、（ｉ）理論的に最適な細胞、例えば、７つの典型的なＭＳＣマーカーおよびＣＸＣＲ４およびＣＤ６２を発現するものを構築すること、（ｉｉ）（存在するならば）この細胞を分離することを試験するために、潜在的なＦＡＣＳパネルを計算すること、それから、（ｉｉｉ）自動化ソーティングと組み合わせて、１０００の組織サンプルからこの細胞を分離／捕捉すること、および、（ｉｖ）その特有のＦＡＣＳマーカープロファイルを通して候補細胞の新規性を決定的に試験および証明することを、可能にする。本発明なしでは、このプロセス（ｉ〜ｉｖ）は、１００の実験室内実験を含む何ヶ月もの「試行錯誤」の研究を要する。本発明の組成物およびアルゴリズムの組み合わせの使用は、研究者らが、細胞薬剤の発見を自動化および合理化すること、および、より速い、より正確な、および、より効率的かつ効果的な、新規の細胞の同定および捕捉を計算する、コンピューターによるアプローチ（スーパーを含む）を利用することを可能にする。
【００１０】
本発明に対する様々な態様が存在する。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）免疫蛍光ラベリング試薬は、ＣＤ７３（エクト５’−ヌクレオチダーゼ）、ＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）およびＣＤ１０５（エンドグリン）を発現するＭＳＣに対するモノクローナル抗体のコンジュゲートを含み、ＣＤ１１ｂまたはＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１９またはＣＤ７９α、およびＨＬＡ−ＤＲに関して陰性（≦２％の陽性細胞）であり［７］、それは、特定の細胞型の改善された同定およびサンプル回収さえも可能にする特定の表現型を示す医療効果を生じる、相対的な特定の濃度に関して、実験的に選択されている。本発明の一態様は、検出アッセイにおける対象細胞の表現型の発現を変えるための試薬の医薬（薬剤）として、すなわち、様々な分析における免疫蛍光抗体ラベルの各々の濃度を選択的に変化させることによって前記細胞をより良く特徴付けるための、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の免疫蛍光ラベリングの両方のための試薬として、であり、そして、抗体を含む実験試薬は、制限されないが、以下の細胞型を目的とするものを含む：線維芽細胞（ＣＤ１０、ＣＤ２９、ＣＤ１０６）；ＶＳＥＬＳ（Ｓｃａ−１、ＣＤ４５Ｒ、Ｇｒ−１、ＴＣＲ  ａｌｐｈａ−ｂｅｔａ、ＴＣＲ  ｇａｍｍａ−ｄｅｌｔａ、ＣＤ１１ｂ、Ｔｅｒ１１９、Ｏｃｔ−４；ＨＳＣ：ＣＤ１３３）；ＥＰＣ（ＫＤＲ、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３１）；ＭＳＣサブタイプ（ＣＤ１８１、ＣＤ１８４）；および組織系幹細胞（ＣＤ１１７＋、ＣＤ１８４、ｃ−ｍｅｔ、ＡＣ１３３）。加えて、これらの手順を行なうためのキットは別の態様である。
【００１１】
本発明では、新規のＦＡＣＳ試薬は、特定のマーカーを発現する細胞を同定するために用いられるだけでなく、予想外に、細胞表現型に影響を及ぼす物質組成を提供し、活性成分（制限されないが、ＭＳＣに対するモノクローナル抗体のコンジュゲート）の各々の濃度を変化させることにより、細胞集団における間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の即時の同定および分離さえも可能にする。これによって、試薬の活性成分は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて、様々なＭＳＣの、濃度の範囲にわたる同時の同定を可能にする。これによって、試薬（単数または複数）は、表面上に検出可能なレベルのＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を提示し検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４およびＣＤ４５を提示しない、集団におけるＭＳＣの示差的検出を可能にし、その表面マーカーパターンを有する細胞を分離する。また、本発明は、試薬も提供し（その反応成分の測定された相対的濃度に基づいて、細胞の集団における特定の細胞型を同定および分離する）、ＦＡＣＳを用いて、集団における細胞の表面上の、特定の細胞型を示す７またはそれより多い細胞表面マーカーの存在または不存在を、同時に同定すること、および、指標の細胞表面マーカーを有する細胞を分離することを含む。ここで、前記試薬は、インビボ、インビトロおよびエクスビボで使用して、ヒトまたは動物において作用する、および、幹細胞および非−幹細胞に作用することができ、制限されないが、培地、賦形剤、不活性の添加剤、血液、組織、および、他の体液と組み合わせて用いられることを含み；制限されないが、フローサイトメトリーと組み合わせた使用を含み、一方で、その使用は、制限されないが、分離、検出、および、組織、血液、溶液および固体（凍結サンプルを含む）由来の細胞および病理検体の回収の補助を含むことができる。
【００１２】
本明細書において本発明者らは、ユーザーが、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて、７またはそれより多い細胞表面マーカーの存在または不存在を同時に同定することを可能にさせる薬剤として、物質組成が細胞に作用することができる、驚くべき方法を提供する。
【００１３】
表現型に対するパネルおよびアルゴリズム（すなわち、制限されないが、末梢血、骨髄、脂肪、生検サンプルにおける他の細胞から、または、任意の他の組織から分離され、または改変され、または分化転換を用いてＩＰＳから生じた細胞から、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、同定、分離、および、区別するための手段）が、本明細書により提案される。我々は、ＭＳＣ表現型をより良く予測するためのフルオロフォアＩＳＣＴコアパネルおよびアルゴリズムの手段により、ＭＳＣの表現型の改善された予測を提供する。ＭＳＣは、再生医療の治療の分野での使用の可能性を有し、多様な障害に関する臨床試験において用いられている。それにより、国際細胞治療学会（ＩＳＣＴ）は、マルチカラーフローサイトメトリー（ＭＦＣ）により測定される細胞表面分子の発現の特定のパターンを含む、ＭＳＣを同定するために用いられる最小基準のセットを開発している。ＭＳＣの表面マーカー発現に関するＭＦＣの方法論は、伝統的に、マルチプルのパラレルの（ｐａｒａｌｌｅｌ）サンプルを用いている。ＭＳＣのシングル−サンプルのマルチカラー分析を行なうことが可能であることは、多くの利点がある。この研究において、我々は、ＭＳＣの同定のための７−フルオロフォアＩＳＣＴコアパネル、および、ＭＳＣの異なるサブタイプを同定するための試薬に用いることのできる３つのプレースホルダー位置からなる、１０−フルオロフォアパネルの開発を報告する。このパネルは、骨髄および臍帯マトリックスのＭＳＣを表現型する（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）ために用いることができ、線維芽細胞および末梢血単核細胞の混合された集団における、ＭＳＣのレアイベントを区別する。このツールは、血液および骨髄中のＭＳＣを同定および定量化するための有益な方法を提供し、また、消化された組織からの単一の細胞懸濁液にも用いることができた。
【００１４】
本発明者らは、驚くべきことに、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて、７またはそれより多い細胞表面マーカーの存在または不存在を、同時に同定することが可能であることを示した。
【００１５】
本発明は、細胞集団におけるＭＳＣを同定する、および場合により分離する方法を提供し、それは、ＦＡＣＳを用いて、その表面上に検出可能なレベルのＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を提示し検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４およびＣＤ４５を提示しない、集団における細胞を、同時に同定するステップ、および、それにより、細胞集団における間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を同定する、および場合により分離するステップを含む。７つのマーカーの存在または不存在は、ＦＡＣＳを用いて、同時に同定される。７つのマーカーの存在または不存在は、同じ時に同定される。本発明の方法は、集団の１サンプルを用いる。それは、パラレルチューブのアプローチを伴わない。
【００１６】
また、本発明は、細胞の集団における特定の細胞型を同定する、および場合により分離する方法も提供し、それは、ＦＡＣＳを用いて、集団における細胞の表面上の、特定の細胞型を示す７またはそれより多い細胞表面マーカーの存在または不存在を同時に同定するステップを含む。
【００１７】
本発明は、細胞集団における間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を同定する、および場合により分離するためのキットを提供し、それは、７またはそれより多い蛍光標識抗体を含み、キット中の少なくとも１つの抗体は、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４およびＣＤ４５のそれぞれに特異的に結合する。
【００１８】
また、本発明は、細胞の集団における特定の細胞型を同定する、および場合により分離するためのキットも提供し、それは、７またはそれより多い蛍光標識抗体を含み、キット中の少なくとも１つの抗体は、特定の細胞型を示す７またはそれより多い細胞表面マーカーの１つ（ｏｎ  ｏｆ）に特異的に結合する。
【００１９】
本発明は、細胞集団におけるＭＳＣを同定する、および場合により分離するための試薬およびキットを提供し、それは、ＦＡＣＳを用いて、その表面上に検出可能なレベルのＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を提示し検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４およびＣＤ４５を提示しない、集団における細胞を、同時に同定するステップ、および、それにより、細胞集団における間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を同定するステップを含む。７つのマーカーの存在または不存在は、ＦＡＣＳを用いて、同時に同定される。
【００２０】
また、本発明は、細胞の集団における特定の細胞型を同定する、および場合により分離するための試薬も提供し、それは、ＦＡＣＳを用いて、集団における細胞の表面上の、特定の細胞型を示す７またはそれより多い細胞表面マーカーの存在または不存在を、同時に同定するステップを含む。
【００２１】
また、本発明は、ＦＡＣＳ分析を用いて、７またはそれより多い細胞表面マーカーの存在または不存在を同時に同定するための蛍光標識抗体のパネルを製造する方法も提供し、当該方法は、（ａ）７またはそれより多い細胞表面マーカーを選択するステップ；（ｂ）異なるレーザー上に陽性マーカーを広げるステップ；（ｃ）７またはそれより多い蛍光標識抗体を選択するステップ；（ｄ）７またはそれより多いマーカー（陽性および陰性の両方）の公知の発現を有する細胞において最適な濃度および最小のスペクトルオーバーラップが達成されることを確実にするために、抗体を滴定するステップ；（ｅ）陽性の細胞表面マーカーに対して抗体を試験するステップ；（ｆ）抗体のコアパネルを試験するステップ；（ｇ）プレースホルダーのマーカーを発現するために細胞を誘導または刺激するステップ；（ｈ）プレースホルダーの抗体を試験および滴定するステップ；（ｉ）プレースホルダーの条件を最適化するステップ；および（ｊ）他の細胞型の不存在下で、および混合された集団において、細胞に全パネルを試験するステップ、を含む。
【００２２】
また、本発明は、ＦＡＣＳ分析を用いて７またはそれより多い細胞表面マーカーの存在または不存在を同時に同定するための、本発明の方法を用いて生産される、蛍光標識抗体のパネルも提供する。
【００２３】
また、本発明は、細胞の集団における新規の細胞型を同定する、および場合により分離する方法も提供し、それは、ＦＡＣＳを用いて、集団における細胞の表面上の、７またはそれより多い細胞表面マーカーの存在または不存在を同時に同定するステップを含み、ここで、７またはそれより多いマーカーの少なくとも一部は特定の細胞型を示し、７またはそれより多いマーカーの少なくとも１つは特定の細胞型によって検出可能に発現されない。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】１０色パネルで染色されたＵＣＭ  ＭＳＣを示す。Ａ）＜１％のＣＤ１４＋イベントが存在するようにゲートを設定するために用いたＣＤ１４−ＦＭＯ。Ｂ）＜１％のＣＤ１９＋イベントが存在するようにＣＤ１９＋閾値を設定するために用いたＣＤ１９−ＦＭＯを用いて修正したＡでのゲート。Ｃ）表現型分析のために全パネルで染色したサンプルに適用したゲート。
【図２】６ステップのゲーティングストラテジーを示し、上に概略バージョンを示し、および、ＵＣＭ  ＭＳＣのサンプルとともに例示する。１）ＦＳＣ  ｖｓ．ＳＳＣプロット上の、全１０抗体で染色したチューブからの、全ての非ゲートの記録されたイベント。ゲートを引いてデブリおよびダブレットを除外した。２）ＣＤ１４−／ＣＤ１９−イベント上でゲーティングするＣＤ１４  ｖｓ．ＣＤ１９プロット。３）ＣＤ３４−／ＣＤ４５−イベント上でゲーティングするＣＤ３４  ｖｓ．ＣＤ４５プロット。４）ＣＤ７３＋／ＣＤ９０＋イベント上でゲーティングするＣＤ７３  ｖｓ．ＣＤ９０プロット。５）ＣＤ１０５−強度を示すＣＤ１０５  ｖｓ．ＳＳＣプロット。６）非染色および染色細胞のオーバーレイは、ＣＤ１０５−強度のクリアなシフトを示し、最後の陽性ＩＳＣＴ−マーカーを確認する。黒＝非染色、赤＝染色。
【図３】明るい、または暗い、プレースホルダーの存在下での、コア表面マーカー発現を示す。ＵＣＭ（ｎ＝６）およびＢＭ  ＭＳＣ（ｎ＝６）を、以前に説明したゲーティングストラテジーを用いてゲートした。ＵＣＭ  ＭＳＣは、ＢＭ  ＭＳＣよりも均質な前および横の散乱プロファイルを示す。外傷患者から得られたＢＭ吸引液から分離されたＢＭ  ＭＳＣは、市販のＢＭ吸引液（＃４）およびＢＭ  ＭＳＣ（＃１）およびＵＣＭ  ＭＳＣと比較して、小さなＣＤ３４ｄｉｍ集団（サンプル＃２、＃３、＃５、＃６）を示す。非染色のコントロール（オーバーレイヒストグラム）と比較すると、全てのサンプルはＣＤ１０５を発現する。
【図４】ＢＭおよびＵＣＭ  ＭＳＣの間の、プレースホルダーパネル発現の違いを示す。サンプルを、明るい（ＵＣＭ  ＭＳＣ、ｎ＝３；ＢＭ  ＭＳＣ、ｎ＝３）または暗い１０色パネル（ＵＣＭ  ＭＳＣ、ｎ＝６；ＢＭ  ＭＳＣ、ｎ＝４）のいずれかで染色した。明るいパネルで用いたプレースホルダーの抗体は、ＣＤ２９−ＦＩＴＣ、ＣＤ１６４−ＰＥおよびＣＤ４４−ＡＰＣであり、暗いパネルでのものは、ＣＤ４９ｄ−ＦＩＴＣ、ＣＤ２９−ＰＥおよびＣＤ１８２−ＡＰＣであった。暗いプレースホルダーパネルを構成するマーカー（ＣＤ２９−ＰＥ、ＣＤ４９ｄ−ＦＩＴＣ、ＣＤ１８２−ＡＰＣ）の間では、ＵＣＭ  ＭＳＣにおいてより高く発現されるＣＤ４９ｄの観点から、ＢＭおよびＵＣＭ  ＭＳＣの間の発現に違いがあるだけである（ｐ＝０．００６）。
【図５】線維芽細胞が主の混合物におけるＭＳＣの同定を示す。ＵＣＭ−ＭＳＣ（２％）をＨＳＦと混合した。Ａ１）１０色パネルで染色されたＵＣＭ  ＭＳＣのチューブからの、全ての非ゲートの記録されたイベント。細胞ゲートを引いてデブリおよびダブレットを除外した。Ｂ１）ＨＳＦのチューブからの、全ての非ゲートの記録されたイベント。細胞ゲートはＨＳＦを含んだ。Ｃ１）２％のＭＳＣを加えたＨＳＦ。６０，０００の記録された細胞のイベントでは、ＭＳＣは、前および横の散乱に基づいて、ＨＳＦから区別することができない。Ｃ２〜Ｃ６）図２に示すＭＳＣゲーティングストラテジーであり、２．０％の同定されたＭＳＣをもたらす（５９，５５０の細胞のイベントのうち、１，１６４のＭＳＣ）。
【図６】ＰＢＭＣが主の混合物におけるＭＳＣの同定を示す。ＵＣＭ−ＭＳＣ（１％）をＰＢＭＣと混合した。Ａ１）１０色パネルで染色されたＵＣＭ  ＭＳＣのチューブからの、全ての非ゲートの記録されたイベント。細胞ゲートを引いてデブリおよびダブレットを除外した。Ｂ１）ＰＢＭＣのチューブからの、全ての非ゲートの記録されたイベント。細胞ゲートはＰＢＭＣを含んだ。Ｃ１）１％のＭＳＣを加えたＰＢＭＣ。１００，０００の記録された細胞イベントでは、ＭＳＣは、前および横の散乱に基づいて、ＰＢＭＣから区別することができない。Ｃ２〜Ｃ６）図２に示すＭＳＣゲーティングストラテジーであり、０．６３％の同定されたＭＳＣをもたらす。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
細胞型の検出
本発明の方法を用いて、様々な特定の細胞型を、それらの細胞表面マーカーパターンを用いて、同定および場合により分離することができる。これらは、限定されないが、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、中胚葉系列の前駆細胞、線維芽細胞、非常に微小な胚／外肺葉様の幹細胞（ｖｅｒｙ  ｓｍａｌｌ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ／ｅｐｉｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）（ＶＳＥＬ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）および組織系幹細胞を含む。これらの細胞に関する細胞表面マーカーパターンは、特許請求の範囲に示される。
【００２６】
当該方法は、ＦＡＣＳを用いて、７またはそれより多い細胞表面マーカーの存在または不存在を同時に同定することに関する。任意の数のマーカーを同時に同定することができる。例えば、本発明は、ＦＡＣＳを用いて、８またはそれより多い、９またはそれより多い、１０またはそれより多い、１２またはそれより多い、１５またはそれより多い、２０またはそれより多い、２５またはそれより多い、３０またはそれより多い、３５またはそれより多い、４０またはそれより多い、４５またはそれより多い、５０またはそれより多い、５５またはそれより多い、６０またはそれより多い、６５またはそれより多い、７０またはそれより多い、７５またはそれより多い、８０またはそれより多い、８５またはそれより多い、９０またはそれより多い、９５またはそれより多い、１００または細胞、１５０またはそれより多い、２００またはそれより多い、２５０またはそれより多い、３００またはそれより多い、３５０またはそれより多い、４００またはそれより多い、５００またはそれより多い、６００またはそれより多い、７００またはそれより多い、８００またはそれより多い、９００またはそれより多い、１０００またはそれより多い、１５００またはそれより多い、２０００またはそれより多い、２５００またはそれより多い、または、５０００またはそれより多い、表面マーカーの存在または不存在を同定することに関してよい。これは、以下により詳細に述べるように行なうことができる。
【００２７】
７またはそれより多い細胞表面マーカーの存在または不存在は、同時に、すなわち同じ時に、判定される。本発明を用いて、ＦＡＣＳ分析は、細胞の集団に対して一度行なってよく、そこから、７またはそれより多いマーカーが存在または不存在であるか否かを判定することができる。一度よりも多く、または多数のサンプルを用いて、ＦＡＣＳ分析を行なう必要はない。本発明は、パラレルチューブのアプローチの使用を避ける。
【００２８】
様々な細胞表面マーカーに特異的に結合することが可能な抗体は、当技術分野で知られている。抗体は、それが、選択的または高い親和力でそのマーカーに結合するが、他の細胞表面マーカーまたは他のタンパク質には実質的に結合せず、結合せず、または低い親和力でのみ結合する場合に、細胞表面マーカー配列に「特異的に結合する」。例えば、抗体は、それが、選択的または高い親和力でＣＤ７３に結合するが、他の細胞表面マーカーまたはタンパク質、例えば、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４およびＣＤ４５には実質的に結合せず、結合せず、または低い親和力でのみ結合する場合に、ＣＤ７３に「特異的に結合する」。
【００２９】
抗体は、それが、１×１０−７Ｍまたはそれ未満、より好ましくは５×１０−８Ｍまたはそれ未満、より好ましくは１×１０−８Ｍまたはそれ未満、または、より好ましくは５×１０−９Ｍまたはそれ未満のＫｄで結合する場合に、選択的または高い親和力で結合する。一部分は、それが、１×１０−６Ｍまたはそれより高い、より好ましくは１×１０−５Ｍまたはそれより高い、より好ましくは１×１０−４Ｍまたはそれより高い、より好ましくは１×１０−３Ｍまたはそれより高い、さらにより好ましくは１×１０−２Ｍまたはそれより高いＫｄで結合する場合に、低い親和力で結合する。化合物（例えば抗体または抗体構築物およびオリゴヌクレオチド）の特異的な結合能力を判定するための競合結合または免疫放射定量測定法に関する様々なプロトコルは、当技術分野でよく知られている（例えば、Ｍａｄｄｏｘ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８，１２１１−１２２６，１９９３を参照）。
【００３０】
抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ−移植抗体、またはヒト化抗体であってよい。抗体は、無傷の免疫グロブリン分子またはそのフラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖフラグメントであってよい。
【００３１】
本発明の方法での使用に適切な蛍光ラベルを、本発明のキットに関して以下に述べる。
【００３２】
ＭＳＣは、その表面上に、検出可能なレベルのＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を提示し、検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４およびＣＤ４５を提示しない。この発現パターンは、本発明の方法を用いて検出することができる。それ故に、ＭＳＣを同定することができ、場合により分離することができる。
【００３３】
中胚葉系列の前駆細胞は、検出可能なレベルのＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ２７１を発現し、および、（ｂ）検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しない。これらの細胞は、好ましくは、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２またはＣＸＣＲ４も発現する。それらは、より好ましくは、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２およびＣＸＣＲ４の全てを発現する。それらは、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５１６００（ＷＯ２０１３／００５０５３として公表）に開示される。この発現パターンは、本発明の方法を用いて検出することができる。それ故に、ＰＭＬを同定することができ、場合により分離することができる。
【００３４】
特定の細胞型は、好ましくは間質細胞である。本発明の方法を用いて同定することのできる他の特定の間質細胞の型、および、それらおよびそれらの表面マーカーの発現を以下に示す。＋は、細胞が、検出可能なレベルのマーカーを提示することを意味する。−は、細胞が、検出可能なレベルのマーカーを提示しないことを意味する。マウスおよびヒトにより共有されるマーカーは、マウス（ｍ）またはヒト（ｈ）に特有のものと同様に、マーカーの後に（ｍ／ｈ）を示す。これは、Ｊｏｈａｎｎａ  Ａ．Ｊｏｙｃｅ＆Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｗ．Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ９，２３９−２５２（２００９年４月）から得られる。
【００３５】
腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）：ＣＤ１１ｂ＋  ＣＤ１４＋  ＣＤ３１−  ＣＤ３４−  ＣＤ４５＋  ＣＤ６８＋  ＣＤ１１７−  ＣＤ１３３−  ＣＤ１４６−  ＣＤ２０４＋  ＣＤ２０６＋  ＣＣＲ２＋  ＣＳＦ１Ｒ＋  ＭＨＣ  ＩＩ＋  ＶＥＧＦＲ１＋  ＶＥＧＦＲ２−（ｍ／ｈ）Ｆ４／８０＋（ｍ）ＣＤ２３＋  ＣＤ１６３＋  ＣＸＣＲ４＋。
【００３６】
骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）：ＣＤ１１ｂ＋  ＣＤ１４＋／−  ＭＨＣ  Ｉ＋  ＭＨＣ  ＩＩ  ｌｏｗ（ｍ／ｈ）ＧＲ１＋  ＣＤ１１ｂ＋、および、ＬＹ６Ｇ＋  ＬＹ６Ｃｌｏｗ  ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋／−ＣＤ３３＋ＣＤ３４＋ＣＤ８６−にさらに細分化することができる。
【００３７】
アンジオポエチン受容体ＴＩＥ２を発現する単球（ＴＥＭ）：ＣＤ１１ｂ＋  ＣＤ１４＋  ＣＤ３１  ｌｏｗ  ＣＤ３４−  ＣＤ４５＋  ＣＤ１１７−  ＣＤ１３３−  ＴＩＥ２＋  ＶＥＧＦＲ２−  （ｍ／ｈ）  Ｆ４／８０＋  ＧＲ１  ｌｏｗ  ＳＣＡ１−  （ｍ）  ＣＤ１１ｃ＋  ＣＤ１３＋  ＣＤ１６＋  ＣＤ３３＋  ＣＤ６２Ｌ−  ＣＤ１４６−  ＣＣＲ２−  ＣＣＲ５＋  ＣＳＦ１Ｒ＋  （ｈ）
【００３８】
好中球：ＣＤ１１ｂ＋  ＣＤ１４  ｌｏｗ  ＣＤ３１＋  ＣＤ６６Ｂ＋  ＣＸＣＲ２＋  （ｍ／ｈ）  ＧＲ１＋  ＶＥＧＦＲ１＋  ＣＸＣＲ１−  （ｍ）  ＣＤ１５＋  ＣＸＣＲ１＋  （ｈ）
【００３９】
マスト細胞：ＣＤ４３＋  ＣＤ１１７＋  ＣＤ１２３＋  ＣＤ１５３＋  （ｍ／ｈ）  ＣＤ１１ｂ＋  ＣＤ１６＋  ＣＤ３４＋  ＳＣＡ１＋  （ｍ）  ＣＣＲ１＋  ＣＣＲ３＋  ＣＣＲ４＋  ＣＣＲ５＋  ＣＸＣＲ１＋  ＣＸＣＲ２＋  ＣＸＣＲ４＋  （ｈ）
【００４０】
内皮細胞：ＣＤ３１＋  ＣＤ３４＋  ＣＤ１０５＋  ＣＤ１０６＋  ＣＤ１４４＋（ｍ／ｈ）
【００４１】
周皮細胞：デスミン＋／−  ＮＧ２＋／−  ＳＭＡ＋／−  ＰＤＧＦＲ＋／−
【００４２】
線維芽細胞：ビメンチン＋  デスミン＋  ＳＭＡ＋／−  ＦＳＰ１＋  ＦＡＰ＋（ｍ／ｈ）
【００４３】
血小板：ＣＤ４１＋  ＣＤ４２ａ−ｄ  ＣＤ５１＋  ＣＤ１１０＋（ｍ／ｈ）
【００４４】
ＣＤ４＋Ｔ細胞  ＣＤ３＋  ＣＤ４＋  ＣＤ４５＋（ｍ／ｈ）
【００４５】
ＣＤ８＋Ｔ細胞  ＣＤ３＋  ＣＤ８＋  ＣＤ４５＋（ｍ／ｈ）
【００４６】
Ｂ細胞：ＣＤ３−  ＣＤ１９＋  ＣＤ２０＋  ＣＤ４５＋  （ｍ／ｈ）  ＣＤ４５ＲＡ＋  Ｂ２２０＋  （ｍ）
【００４７】
ＮＫ細胞：ＣＤ１１ｂ＋  ＣＤ２７＋  ＣＤ３−  ＣＤ１６＋／−  ＣＤ５６＋  ＣＤ３−  ＣＤ３３５＋  ＮＫｐ４６＋  （ｍ／ｈ）
【００４８】
また、本発明は、新規の細胞型を同定する、および場合により分離する方法も提供する。当該方法は、ＦＡＣＳを用いて、集団における細胞の表面上の、７またはそれより多い細胞表面マーカーの、存在または不存在を同時に同定するステップを含み、ここで、７またはそれより多いマーカーの少なくとも一部は特定の細胞型を示し、７またはそれより多いマーカーの少なくとも１つは特定の細胞型によって検出可能に発現されない。特定の細胞型は、上述のもののいずれかであってよい。特定の細胞型は、好ましくはＭＳＣである。当該方法は、ＦＡＣＳを用いて、集団における細胞の表面上の、８またはそれより多い細胞表面マーカーの、存在または不存在を同時に同定するステップに関してよく、ここで、８またはそれより多いマーカーは、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４およびＣＤ４５を含み、８またはそれより多いマーカーの少なくとも１つはＭＳＣによって発現されない。ＭＳＣ上の細胞表面マーカーは、よく特徴付けられていて、ＭＳＣによって発現されない少なくとも１つの細胞表面マーカーを同定することは日常的である。当業者は、以下のアルゴリズムを用いてマーカーのパネルおよび対応する抗体を設計して、ハイスループットの様式で新規の細胞型を同定することができる。
【００４９】
ＦＡＣＳ分析はよく知られた技術である。この技術を行なう１つの方法を実施例に開示する。ＦＡＣＳは単一の細胞を分離することができる。本発明の方法は、特定の型の単一の細胞（例えば、単一のＭＳＣまたは単一の中胚葉系列の前駆細胞）または上述の新規の細胞型を同定するため、および場合により分離するためであってよい。あるいは、本発明の方法は、特定の型の２またはそれより多い細胞（例えば、２またはそれより多いＭＳＣ、または、２またはそれより多い中胚葉系列の前駆細胞）を同定する、および場合により分離するためであってよい。
【００５０】
また、ＦＡＣＳは、特定のマーカーを発現する細胞も分離し得る。それ故に、本発明は、細胞集団における間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を同定および分離する方法も提供し、それは、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて、その表面上に検出可能なレベルのＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を発現し検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４およびＣＤ４５を発現しない、集団における細胞を、同時に同定するステップ、および、その表面マーカーパターンを有する細胞を分離するステップを含む。また、本発明は、細胞の集団における特定の細胞型を同定および分離する方法も提供し、それは、ＦＡＣＳを用いて、集団における細胞の表面上の、特定の細胞型を示す７またはそれより多い細胞表面マーカーの存在または不存在を、同時に同定するステップ、および、指標の細胞表面マーカーを有する細胞を分離するステップを含む。
【００５１】
ＦＡＣＳの方法で用いられる抗体は、典型的に、以下に述べる方法での使用のために滴定される。
【００５２】
細胞集団は典型的に、サンプル中に存在する。サンプルは、好ましくは液体サンプルである。サンプルは典型的に、患者の体液を含む。サンプルは、尿、リンパ液、唾液、粘液、乳または羊水であってよいが、好ましくは、血液、血漿または血清である。サンプルは、骨髄由来であってよい。典型的に、サンプルは起源がヒトであるが、その代わりに、別の哺乳類動物由来、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタのような商業的に飼育された動物由来であってよく、またはその代わりに、ネコまたはイヌのようなペットであってよい。
【００５３】
サンプルは典型的に、例えば、不要な分子または細胞（赤血球など）をフィルター除去する膜の通過により、または、遠心分離により、分析する前に処理される。サンプルは、得てすぐに測定してよい。また、サンプルは典型的に、分析前に、好ましくは−７０℃未満で保管してもよい。
【００５４】
キットおよび試薬
また、本発明は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または特定の細胞型を同定する、および場合により分離するためのキットも提供する。本発明のキットは、特定の型の単一の細胞（例えば、単一のＭＳＣまたは単一の中胚葉系列の前駆細胞）または新規の細胞型を同定する、および場合により分離するためであってよい。あるいは、本発明のキットは、特定の型の２またはそれより多い細胞、例えば、２またはそれより多いＭＳＣ、または、２またはそれより多い中胚葉系列の前駆細胞、または、１つのＭＳＣおよび１つの中胚葉系列の前駆細胞を、同定する、および場合により分離するためであってよい。
【００５５】
キットは、７またはそれより多い蛍光標識抗体を含む。キット中の少なくとも１つの抗体は、ＭＳＣまたは特定の細胞型を同定する、および場合により分離するために用いられている細胞表面マーカーのそれぞれに、特異的に結合する。例えば、一実施態様では、キットは、７またはそれより多い蛍光標識抗体を含み、キット中の少なくとも１つの抗体は、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４およびＣＤ４５のそれぞれに特異的に結合する。他の特異的なキットは、特許請求の範囲に記載する。
【００５６】
特異的な結合は上述される。
【００５７】
ＦＡＣＳを用いて、細胞の集団におけるＭＳＣまたは特定の細胞型を同定する、および場合により分離するために、本発明のキットを本発明の方法において用いてよい。当該キットは、上述の任意の細胞型を同定するためであってよく、および場合により分離するためであってよい。
【００５８】
様々なマーカーに対する抗体は、市販される。表１は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９およびＣＤ７９αに対する抗体の市販元を要約する。
【００５９】
キット中の各抗体は典型的に、異なる蛍光ラベルで標識される。７またはそれより多い蛍光ラベルは、典型的に、ＦＡＣＳを用いてそれらが同定され得るように選択される。７またはそれより多い蛍光ラベルは、好ましくは、ＢＶ６０５、Ｋ−Ｏｒａｎｇｅ、ｅＦ４５０、ＰＥ−Ｃｙ７、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＰＥ、ＦＩＴＣ／ＡＦ４８８、ＡＰＣ−ｅＦ７８０、ＡＦ７００およびＡＰＣから選択される。７またはそれより多い蛍光ラベルは、好ましくは、ＢＶ６０５、Ｋ−Ｏｒａｎｇｅ、ｅＦ４５０、ＰＥ−Ｃｙ７、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＡＰＣ−ｅＦ７８０およびＡＦ７００から選択される。これらのラベルの任意の組み合わせを用いてよい。これらのラベルとともに使用するための適切なＦＡＣＳ構成を以下に示す。
【００６０】
７またはそれより多い蛍光標識抗体は、好ましくは、抗−ＣＤ１４−ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ７８０（クローン６１Ｄ３，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈａｔｆｉｅｌｄ，Ｉｒｅｌａｎｄ，ＵＫ）、抗−ＣＤ１９−ＰＥ−Ｃｙ７（クローンＪ３−１１９，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）、抗−ＣＤ３４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（クローン５８１，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳ）、抗−ＣＤ４５−Ｋｒｏｍｅ  Ｏｒａｎｇｅ（クローンＪ．３３，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、抗−ＣＤ７３−ｅＦｌｕｏｒ４５０（クローンＡＤ２，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗−ＣＤ９０−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００（クローン５Ｅ１０，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗−ＣＤ１０５−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ６０５（クローン２６６，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）を含む。全ての抗体は、マウスアイソタイプＩｇＧ１，κであった。
【００６１】
７またはそれより多い蛍光標識抗体のそれぞれは、典型的に、本発明のＦＡＣＳの方法における使用に適切な濃度に滴定される。各抗体は典型的に、１：１０〜１：１００００００、例えば、１：５０、１：１００、１：５００、１：１０００、１：１０、０００、１：５０、０００、１：１００、０００で滴定される。滴定は、以下に詳細に述べるように、本発明の方法において重要である。
【００６２】
本発明のキットは、上述の任意の実施態様の実施を可能にする、１つまたは複数の他の試薬または器具をさらに含んでよい。そのような試薬または器具は、以下の１つまたは複数を含む：適切なバッファー（単数または複数）（水溶液）、対象からサンプルを得る手段（例えばベッセル、またはニードルを含む器具）、および／または、ＦＡＣＳ分析に必要な他の試薬。試薬は、液体サンプルが試薬を再懸濁するように、乾燥状態でキット中に存在してよい。キットはまた、場合により、キットを本発明の方法において使用することを可能にする説明書、または、どの患者に当該方法を用いてよいのかに関する詳細も含んでよい。
【００６３】
アルゴリズム
本発明は、７またはそれより多い細胞表面マーカーの存在または不存在が同時に同定されることを可能にする。これを行なうためには、以下のアルゴリズムを用いて様々な因子を考慮しなければならない。
【００６４】
本発明の目的は、（ｉ）プラスチック付着細胞上に、ＩＳＣＴにより推奨される陽性および陰性の表面マーカーを含む、マルチカラーフローサイトメトリーパネルを開発すること；（ｉｉ）３つの最も一般的な蛍光色素ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＰＥ（フィコエリトリン）またはＡＰＣ（アロフィコシアニン）にコンジュゲートされた試薬を使用しないパネルを設計し、研究者らが目的とする他の抗原と組み合わせてパネルを使用することを可能にする交換可能なプレースホルダーとして、これらの３つの位置が用いられることを可能にすること；および、（ｉｉｉ）細胞（例えば、臍帯マトリックスおよび骨髄穿刺液由来のＭＳＣ）を用いてパネルを評価することである。
【００６５】
方法の成功は、（ｉ）同定することが選択されたマーカーの数；（ｉｉ）ＦＡＣＳ機器における蛍光チャネル／デタクターの数；（ｉｉｉ）ＦＡＣＳ機器の各チャネル／デテクター上のレーザーの数；（ｉｖ）各マーカーに関して利用可能な抗体の数；（ｖ）抗体の感度（スペクトルの領域内でシグナルがどれくらい明るいか）；（ｖｉ）抗体コンジュゲートの性能（蛍光色素がどれくらい明るいか、および、マーカーの発現レベル）；および（ｖｉｉ）同一細胞上の他の抗体の存在に依存する。蛍光標識抗体の適切なパネルを設計する場合は、これら全てを考慮する必要がある。
【００６６】
本発明は、ＦＡＣＳ分析を用いて７またはそれより多い細胞表面マーカーの存在または不存在を同時に同定するための、蛍光標識抗体のパネルを製造する方法を提供し、当該方法は、（ａ）７またはそれより多い細胞表面マーカーを選択するステップ；（ｂ）異なるレーザー上に陽性マーカーを広げるステップ；（ｃ）７またはそれより多い蛍光標識抗体を選択するステップ；（ｄ）７またはそれより多いマーカー（陽性および陰性の両方）の公知の発現を有する細胞において最適な濃度および最小のスペクトルオーバーラップが達成されることを確実にするために、抗体を滴定するステップ；（ｅ）陽性の細胞表面マーカーに対して抗体を試験するステップ；（ｆ）抗体のコアパネルを試験するステップ；（ｇ）プレースホルダーのマーカーを発現するために、細胞を誘導または刺激するステップ；（ｈ）プレースホルダーの抗体を試験および滴定するステップ；（ｉ）プレースホルダーの条件を最適化するステップ；および（ｊ）他の細胞型の不存在下で、および混合された集団において、細胞に全パネルを試験するステップ、を含む。
【００６７】
ステップ（ｂ）は、最小のスペクトルオーバーラップおよび他のマーカーとの干渉を確実にする。異なるレーザーがＦＡＣＳ機器内にある。（ｃ）における７またはそれより多い蛍光標識抗体は、７またはそれより多いマーカーに特異的に結合する。典型的に、７またはそれより多いマーカーのそれぞれに特異的に結合する１つの抗体が存在する。しかしながら、パネルは、７またはそれより多いマーカーの１つまたは複数に特異的に結合する１よりも多い抗体を含んでよい。適切な抗体および蛍光ラベルは上述される。
【００６８】
滴定ステップ（ｄ）は、常法を用いて行なうことができる。本発明での使用に適切な抗体濃度は上述される。７またはそれより多い抗体の濃度を、ＦＡＣＳ分析を用いて試験し、最小のスペクトルオーバーラップおよび他のマーカーに特異的に結合する他の抗体との干渉を確実にする。
【００６９】
ステップ（ｅ）、（ｆ）、（ｈ）、（ｉ）および（ｊ）は、典型的に、ＦＡＣＳ分析を用いて行われる。これは、抗体が試験および滴定されることを可能にし、および、状態が最適化されることを可能にする。
【００７０】
（ｆ）における抗体のコアパネルは、目的とする特定の細胞型に関する細胞表面マーカーのコアパネル、例えば上述の任意のコアパネルに、特異的に結合する。ＭＳＣに関しては、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４およびＣＤ４５に特異的に結合する７つの抗体のコアパネルは、市販されるＭＳＣおよびその混合集団（すなわち非ＭＳＣおよびＭＳＣ）の細胞株上で試験してよい。上記および実施例に記載の１０色パネルもまた、これらの両方の条件下で試験してよい。これは、実施例で行なわれたことである。蛍光標識抗体のコアパネルは、典型的に、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＰＥ（フィコエリトリン）およびＡＰＣ（アロフィコシアニン）を含まない。
【００７１】
（ｇ）におけるプレースホルダーの抗体は、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＰＥ（フィコエリトリン）およびＡＰＣ（アロフィコシアニン）を含んでよい。交換可能なプレースホルダーの抗体は、コアパネルが、目的とする他の細胞表面マーカーと組み合わせて試験されることを可能にする。例えばＭＳＣに関しては、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４およびＣＤ４５に特異的に結合する７つの抗体のコアパネルを、ＣＤ６２のような他の細胞表面マーカーと組み合わせて試験してよい。これは、新規の細胞型が上記のように同定されるのを可能にする。
【００７２】
ステップ（ｄ）および／または（ｈ）のように、フローサイトメトリーに関する抗体を滴定する理由は、不必要に抗体を消費せずに、陽性および陰性のシグナルの間の最適な分離を可能にするためであり、したがって、バックグラウンドノイズおよび方法の全体的費用を低減させる。染色ボリュームにおける高すぎる抗体濃度もまた、非特異的の抗体結合をもたらし得る。したがって、分析の特異性を増大させるためでなく、試薬の消費およびコストを低減させるためにも、滴定は良好なプラクティスである（ＩＣＳＨ／ＩＣＣＳ，２０１３）。滴定の終点は、最も高い染色指標をもたらす抗体濃度を同定することである。これは当分野において日常的である。
【００７３】
本発明による蛍光標識抗体のパネルを製造する方法は、自動化することができる。自動化された方法は、手作業／人の処理の制約を取り除き、自動化されたスクリーニングおよび計算能力を可能にし、合理的な（ｒａｔｉｏｎａｌｅ）ハイスループットの細胞薬剤の発見を可能にする。これは、ＦＡＣＳ分析を用いて１０００またはそれより多い細胞表面マーカーの存在または不存在を同時に同定するための蛍光標識抗体のパネルが、製造されるのを可能にする。
【００７４】
また、本発明は、本発明の方法を用いて生産される、ＦＡＣＳ分析を用いて７またはそれより多い細胞表面マーカーの存在または不存在を同時に同定するための、蛍光標識抗体のパネルも提供する。
【００７５】
また、本発明は、細胞集団における間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を同定する方法も提供し、それは、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の存在およびＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４およびＣＤ４５の不存在を、上記の（ｂ）〜（ｊ）を用いて同時に同定するための、および、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて、その表面上に検出可能なレベルのＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を提示し検出可能なレベルのＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４およびＣＤ４５を提示しない、集団における細胞を、蛍光標識抗体のパネルを用いて同定し、それにより、細胞集団における間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を同定するための、蛍光標識抗体のパネルを製造するステップを含む。
【００７６】
また、本発明は、細胞の集団における特定の細胞型を同定する方法も提供し、それは、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて、特定の細胞型における７またはそれより多い細胞表面マーカーの存在を、上記の（ａ）〜（ｊ）を用いて同時に同定するための、および、ＦＡＣＳを用いて、集団における細胞の表面上の、特定の細胞型を示す７またはそれより多い細胞表面マーカーの存在または不存在を、蛍光標識抗体のパネルを用いて同時に同定するための、蛍光標識抗体のパネルを製造するステップを含む。
【００７７】
当該方法は、ＭＳＣまたは特定の細胞型を示す１０またはそれより多い細胞表面マーカーの存在または不存在を同定するための、蛍光標識抗体のパネルを製造するステップも含んでよい。上述の任意の実施態様は、本実施態様に同等に適用される。
【００７８】
本発明の特定の一実施態様は、アルゴリズム、および、（ｉ）脂肪細胞、軟骨細胞および骨細胞へ分化することが証明されたプラスチック付着細胞上に、ＩＳＣＴにより推奨されるＭＳＣマーカーを含む、ＭＦＣパネルを開発する方法；（ｉｉ）コアパネル（３つの最も一般に利用可能な蛍光色素コンジュゲート−ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＰＥ（フィコエリトリン）またはＡＰＣ（アロフィコシアニン）にコンジュゲートされた試薬を用いなかった）を設計する方法（研究者らが目的とする他の抗原と組み合わせてパネルを使用することを可能にする交換可能なプレースホルダーとして、これらの３つの位置が用いられることを可能にする）；（ｉｉｉ）２つの一般に用いられる組織源：臍帯マトリックスおよび骨髄穿刺液由来のＭＳＣを用いてパネルを評価する方法；（ｉｖ）異種集団中のＭＳＣを同定するためにパネルを用いることができることを確実にする方法、を目的とする。
【００７９】
別の特定の実施態様は、サンプルデータのアイテムを含むＭＦＣパネルからのデータを、統合分類（ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、および、統計集団またはコミティーメソッド（ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｍｅｔｈｏｄ）（例えば、ブートストラップ、バギング、またはアーキングアルゴリズム）を用いて形成された回帰ツリーモデルを用いて処理するための、より良い手段の開発を目的とする。さらなる実施態様では、統合分類および回帰ツリーモデルは、事前処理によりトレーニングされる（ｔｒａｉｎｅｄ）。
【００８０】
ｉ）ＭＳＣ含有量（％）について以前に記録したサンプルの実際のサンプルデータを含む病歴データ、および、
ｉｉ）好適なＭＳＣ分析後の結果をどのように予測するかを知るための、これらのサンプルに関する対応する好適なＭＳＣ分析後の結果。特定の一実施態様では、事前処理は、病歴サンプルデータおよび対応するサンプルの好適なＭＳＣ分析後の結果の量を低減する（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）ステップ；分類および回帰ツリーを用いて、病歴サンプルデータおよび対応するサンプルの好適なＭＳＣ分析後の結果に含まれる変数の数を低減するステップ；病歴サンプルデータおよび対応するサンプルの好適なＭＳＣ分析後の結果の値を変換するステップ；ブースティングアルゴリズム（ｂｏｏｓｔｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を抽出された特性に適用するステップ；および、ブーストされ抽出された特性から、好適な結果（高収率のＭＳＣ）を予測するための、分類および回帰ツリーモデルを作成するステップを含む。さらなる一実施態様では、モデルは、無作為に選択された９０％のトレーニングサンプルにおけるモデルの繰り返しトレーニングにより交差検定され、残りの１０％のホールドアウトテストセット（ｈｏｌｄ−ｏｕｔ  ｔｅｓｔ  ｓｅｔ）での予測が続けられ、好適なＭＳＣ分析後の結果においてスクリーニング関連の改善の推定を生み出す。
【００８１】
さらに別の実施態様では、好適な結果（良好な利益（ｙｉｅｌｄ））の予測は、統合分類、および、回帰ツリーモデル（多くの明確なツリーの組み合わせを含むブートストラップアルゴリズムを用いて形成され、各モデルは、元のサンプルから引かれた一連のブートストラップサンプルにおいて推定される）を用いて、データのアイテムを処理するステップを含み、ここで、サンプルに関して予測するためにＭＳＣ細胞の表現型を計算するために用いられるスクリーニングの判定は、その結果、平均的な予測される好適な交差したストラップツリーの組み合わせ、および、ブートストラップツリーの大部分が、所定の閾値レベルよりも上を好適と予測するかどうかを含む多数決基準に基づく。
【００８２】
特定の一実施態様では、統合分類、および、統計集団またはコミティーメソッド（例えば、ブートストラップ、バギング、またはアーキングアルゴリズム）を用いて形成された回帰ツリーモデルを用いて、サンプル情報のアイテムを処理するための、より良い手段の開発。さらなる実施態様では、統合分類および回帰ツリーモデルは、事前処理によりトレーニングされる。
【００８３】
ｉ）ＭＳＣ含有量（％）について以前に記録されたサンプルの実際のサンプル情報を含む、病歴データ、および
ｉｉ）好適なＭＳＣ分析後の結果をどのように予測するかを知るための、これらのサンプルに関する対応する好適なＭＳＣ分析後の結果。特定の一実施態様では、事前処理は、病歴サンプルデータおよび対応するサンプルの好適なＭＳＣ分析後の結果の量を低減するステップ；分類および回帰ツリーを用いて、病歴サンプルデータおよび対応するサンプルの好適なＭＳＣ分析後の結果に含まれる変数の数を低減するステップ；病歴サンプルデータおよび対応するサンプルの好適なＭＳＣ分析後の結果の値を変換するステップ；ブースティングアルゴリズムを、抽出された特性に適用するステップ；および、ブーストされ抽出された特性から、好適な結果（高収率のＭＳＣ）を予測するための、分類および回帰ツリーモデルを作成するステップを含む。さらなる一実施態様では、モデルは、無作為に選択された９０％のトレーニングサンプル中のモデルの繰り返しトレーニングにより交差検定され、残りの１０％のホールドアウトテストセットでの予測が続けられ、好適なＭＳＣ分析後の結果においてスクリーニング関連の改善の推定を生み出す。
【００８４】
別の実施態様では、好適な結果の予測は、統合分類、および、回帰ツリーモデル（多くの明確なツリーの組み合わせを含むブートストラップアルゴリズムを用いて形成され、各モデルは、元のサンプルから引かれた一連のブートストラップサンプルにおいて推定される）を用いて、データのアイテムを処理するステップを含み、ここで、サンプルに関して予測するためにＭＳＣ細胞の数を計算するために用いられるスクリーニングの判定は、その結果、平均的な予測される好適な交差したストラップツリーの組み合わせ、および、ブートストラップツリーの大部分が、所定の閾値レベルよりも上を好適と予測するかどうかを含む多数決基準に基づく。
【実施例】
【００８５】
材料および方法
ヒト臍帯マトリックスサンプルの収集
ヒト臍帯および胎盤を、選択的帝王切開の出産後に正期産から収集し、処理するまで、出産から９０分未満の輸送の間、室温で無菌的に保管した。臍帯を胎盤から分離し、胎盤に近位の１０ｃｍ切片を取り出して、滅菌容器内に置いた。臍帯を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）でリンスして、血液を洗い流し、抗生物質−抗真菌（両方ともＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で補充されたＨａｎｋｓ緩衝食塩水（ＨＢＳＳ）中で、４℃にて２時間インキュベートした。この研究は現地の研究倫理委員会により承認され、全ての母親は同意書を提供した。臍帯マトリックスＭＳＣは、公表された方法［１３，１４］を一部改変して調製した。それから、細胞を採取し、計数し、そして、１０％ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）で補充された培養培地中で、−８０℃まで３代継代で凍結保存し、後の使用のために液体窒素中で保管した。
【００８６】
ヒト骨髄穿刺液サンプルの収集
整形外科の外傷に関する外科的処置中に骨髄穿刺液を収集した。１〜８ｍｌのサンプルを、腸骨稜からヘパリン化シリンジ内に収集し、処理されるまで１時間未満の輸送の間、室温で保管した。ＨＢＳＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて骨髄を１：２希釈し、遠心分離による骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）の分離のために、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ  １．０７７（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の上に重ねた。この研究は現地の研究倫理委員会により承認され、患者は同意書を提供した。Ｔ２５フラスコ（ＣｅｌｌＳＴＡＲ，Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｓｔｏｎｅｈｏｕｓｅ，ＵＫ）中の、５ｍｌの細胞培養培地、αＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、期限切れのアフェレーシス血小板から調製された１０％の血小板溶解物、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５Ｕ／ｍｌのヘパリン（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ，Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に、ＢＭＭＣを１×１０５細胞／ｃｍ２で蒔き、そして、３７℃、空気中５％のＣＯ２でインキュベートした。８日目に、培養表面をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で覆ってフラスコを５分間３７℃でインキュベートすることにより使用済み培地の除去後、細胞を採取し、細胞を分離した。遠心分離により細胞を収集し、完全培地に再懸濁し、そして上記のように計数した；それから、９５％コンフルエントまで、５００細胞／ｃｍ２で細胞を培養した。細胞を採取し、計数し、そして、上述のように、培養培地／１０％ＤＭＳＯ中に、２代継代で凍結保存した。若い健常者（２２才男性）からの１つの追加の骨髄サンプル、および、２代継代で凍結保存された、分離されたＭＳＣ（２２才女性）を、処理および細胞分離プロトコルの内部コントロールとして、Ｌｏｎｚａ（Ｌｏｎｚａ，Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）から購入した。
【００８７】
ヒト線維芽細胞の細胞株
混合された細胞集団におけるＭＳＣを同定するためにパネルを用いることが可能であるか否かを試験するために、陰性コントロールとして、ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＳＦ）の細胞株１１８４を用いた。細胞を、高グルコースＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０％のＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、８０〜９０％コンフルエントまで培養した。上記のようにＡｃｃｕｔａｓｅを用いてそれらを採取した。
【００８８】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）
現地の研究倫理委員会による承認付きの同意書が通知された後に、健常者由来の末梢血を、ヘパリン化バキュテナーチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）中に回収した。ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて血液サンプルを１：２希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ  １．０７３（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に重ねて、遠心分離によりＰＢＭＣを分離した。上記のように細胞を計数し、ＭＳＣと混合して、パネルが異種サンプル中のＭＳＣを同定することができるかどうか評価した。
【００８９】
ＭＳＣの調製
ＵＣＭおよびＢＭ  ＭＳＣを解凍して、上記のそれらのそれぞれの培養培地中に、空気中５％のＣＯ２で、３７℃にて、５，０００細胞／ｃｍ２で増殖させ、そして、Ａｃｃｕｔａｓｅを用いて採取した。ＵＣＭ  ＭＳＣおよびＢＭ  ＭＳＣは、５代継代で用いた。採取における細胞の生存能力は８２％未満となることは決してなかった。
【００９０】
表面マーカーの選択
陽性マーカー
ＩＳＣＴ基準によれば、ＭＳＣは、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を発現しなければならないので、これらをマルチカラーパネルに含めた。
【００９１】
陰性マーカー
ＩＳＣＴの陰性マーカーのうち、以下を含めた：ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、およびＣＤ４５。ＭＳＣによるＨＬＡ−ＤＲ発現が誘導され得るので、それは決定的な陰性マーカーとはみなされず、したがってパネルから除外した［７］。ＩＳＣＴにより推奨される２つの単球マーカー（ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１４）のうち、ＣＤ１４を選択した（この抗原を標的とする、より様々な利用可能な産物（特に、抗−ＣＤ１４抗体がコンジュゲートされる様々なフルオロフォア）のため）。同様の理由で、ＣＤ７９αよりもＢリンパ球マーカーＣＤ１９を選択した。１３の供給元が２０１２年７月にレビューされた−ＣＤ１１ｂ：７９の産物、ＣＤ１４：１００の産物、ＣＤ１９：１０８の産物、ＣＤ７９α：２６の産物、表１参照。
【００９２】
モノクローナル抗体の選択
７色コアパネル
上記の選択表面マーカーを標的とするモノクローナル抗体を同定するための基準は、ＦＩＴＣ、ＰＥおよびＡＰＣにコンジュゲートされるべきではない（これらの一般に使用される蛍光色素が、目的とする追加のマーカーを試験するために利用できるように）ということであった。同様に、紫レーザーに適切なフルオロフォアは、より一般に利用可能でないので、紫レーザーは、その最大の可能性（ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  Ｉに関する３×光電子増倍管が我々に利用可能）まで用いられることが要求された。さらに、スペクトルオーバーラップおよび他のマーカーとの干渉を最小限化するために、異なるレーザー上に陽性マーカーを広げることが決定された。これらの基準を考慮して、１３の供給元を、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５に対するそれらのフルオロフォア−コンジュゲートモノクローナル抗体に関してスクリーニングした。パネルの開発での使用に選択されたモノクローナル抗体は：抗−ＣＤ１４−ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ７８０（クローン  ６１Ｄ３，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈａｔｆｉｅｌｄ，Ｉｒｅｌａｎｄ，ＵＫ）、抗−ＣＤ１９−ＰＥ−Ｃｙ７（クローンＪ３−１１９，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）、抗−ＣＤ３４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（クローン５８１，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳ）、抗−ＣＤ４５−Ｋｒｏｍｅ  Ｏｒａｎｇｅ（クローンＪ．３３，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、抗−ＣＤ７３−ｅＦｌｕｏｒ４５０（クローンＡＤ２，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗−ＣＤ９０−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００（クローン５Ｅ１０，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗−ＣＤ１０５−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ６０５（クローン２６６，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）であった。全ての抗体は、マウスアイソタイプＩｇＧ１，κであった。
【００９３】
プレースホルダー
プレースホルダーのコンセプトを試験するために、以下の報告された陽性ＭＳＣ−マーカーを、コアパネルと組み合わせて用いた：抗−ＣＤ２９−ＦＩＴＣ（クローンＴＳ２／１６，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗−ＣＤ２９−ＰＥ（クローンＨＵＴＳ−２１，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）［１５］、抗−ＣＤ４４−ＡＰＣ（クローンＩＭ７，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）［１６］、抗−ＣＤ４９ｄ−ＦＩＴＣ（クローン４４Ｈ６，Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｋｉｄｌｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）［１７］、抗−ＣＤ１６４−ＰＥ（クローンＮ６Ｂ６，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）［１８］、および、抗−ＣＤ１８２−ＡＰＣ（クローン５Ｅ８／ＣＸＣＲ２，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）［１９］。全ての抗体は、ＣＤ４４−ＡＰＣ（ＩｇＧ２ｂ，κ）、ＣＤ２９−ＰＥおよびＣＤ１６４−ＰＥ（ＩｇＧ２α，κの両方）は別として、マウスアイソタイプＩｇＧ１，κであった。プレースホルダーを、予備データによるシグナル強度に基づいて２つのパネルに分けた。１つは明るいパネル、ＣＤ２９−ＦＩＴＣ、ＣＤ１６４−ＰＥおよびＣＤ４４−ＡＰＣ、および、１つは暗いパネル、ＣＤ４９ｄ−ＦＩＴＣ、ＣＤ２９−ＰＥ、およびＣＤ１８２−ＡＰＣであり、プレースホルダーの抗体の明度がコアパネルの性能に影響を及ぼさないことを確実にした。
【００９４】
抗体滴定
陰性ＭＳＣマーカー抗体（ＣＤ１４、ＣＤ１９、およびＣＤ４５）を、末梢血に対して滴定した。ＩＳＨＡＧＥ手順を用いて臍帯血液に対してＣＤ３４を滴定し、ＣＤ３４＋細胞を検出した［２０］。陽性ＭＳＣマーカー抗体（ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６４およびＣＤ１８２）を、ＵＣＭ  ＭＳＣに対して滴定した。
【００９５】
モノクローナル抗体染色ストラテジー
パネルを段階的に組み立てて、試薬を組み合わせて用いることができることを確実にした。はじめに、ＵＣＭ  ＭＳＣを、陽性マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５に対する抗体で単一染色し、３つの可能な全ての組み合わせで二重染色し、それから三重染色した。結果を分析して、全ての組み合わせに関するシグナルを比較した。それからサンプルを、明るい１０色パネル（ＵＣＭ  ＭＳＣ，ｎ＝３；ＢＭ  ＭＳＣ，ｎ＝３）または暗い１０色パネル（ＵＣＭ  ＭＳＣ，ｎ＝６；ＢＭ  ＭＳＣ，ｎ＝４）で染色した。抗体捕捉（ＡｂＣ）ビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、全ての試薬に関する補正コントロールを作成した。全ての１０の組み合わせ中の１つを除き全ての抗体で染色することにより、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｍｉｎｕｓ−ｏｎｅ（ＦＭＯ）コントロール［２１］を並行して作成し、ゲートをどこに設定するべきか特定した。ＵＣＭ  ＭＳＣサンプル（ｎ＝４）を、ＨＳＦ  １１８４またはＰＢＭＣと混合して、ＭＳＣが、混合された細胞集団においてレアイベントとして同定することができることを確認した。
【００９６】
モノクローナル抗体の染色条件
１００μｌのＦＡＣＳバッファー（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；０．２％のＢＳＡおよび０．０５％のアジ化ナトリウム、両方ともＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）中で、細胞（３×１０５）を３０分間、暗所の氷上で、以前の滴定実験により決定された適切な量の各抗体とともにインキュベートした。それから細胞を、４℃で７分間、５１５×ｇの遠心分離によりペレット化し、上清を捨てて、細胞を３ｍｌの同一バッファー中に再懸濁し、そして、遠心分離により再度ペレット化した。上清を迅速に捨てた後、チューブを穏やかにタッピングすることにより、チューブ内に残った少量のバッファー中に、細胞ペレットを再懸濁した。線維芽細胞およびＰＢＭＣを用いて、混合された集団サンプルを、染色前に最終的な細胞数が３×１０５となるように調製した。
【００９７】
フローサイトメトリーデータの取得
染色された細胞を、２時間以内に、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ  ６．１．３ソフトウェアでのＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  Ｉ  フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて分析した。用いたフィルター構成を表２に示す。レーザーのウォームアップを可能にするために、各運転前に少なくとも１時間、機器のスイッチを入れ、Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  Ｓｅｔｕｐ＆Ｔｒａｃｋｉｎｇ  Ｂｅａｄｓ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて機器の性能をチェックした。全てのサンプルは補正せずに記録した。最小限の１０，０００の細胞のイベントを、それぞれのモノクローナル抗体の組み合わせに関して記録した。混合された細胞集団のデータ取得の間、線維芽細胞に関して６０，０００細胞のイベント、および、ＰＢＭＣに関して１００，０００のイベントを記録した。電圧は非染色サンプルに設定した［２２］。
【００９８】
フローサイトメトリーのデータ分析
ＦＣＳファイルは自動的に補正され、ＡｂＣビーズからのデータを用いてＫａｌｕｚａ  １．２（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）において解析し、補正ルールを作成した。試験全体を通じて、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を、ロジクル（ｌｏｇｉｃｌｅ）（二重の指数関数的（ｂｉ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ））軸上に示し、軸より下の陰性イベントの視覚化を可能にした［２３］。イベントの密度に関する情報を伝達するために、視覚化された異常値を有する等高線密度プロット（ｃｏｎｔｏｕｒ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｐｌｏｔ）を、標準的なプロットとして選択した［２４］。細胞集団全体から、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を得た。記述統計は、中央値、最低および最高値を含んだ。統計的有意性をスチューデントのｔ検定により評価した。
【００９９】
結果
ＭＳＣを同定するためのゲーティングストラテジー
全てのゲートは、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ（ＦＭＯ）コントロールを用いて設定し、正確なゲーティングを確実にした（図１）［２１］。実証するために、象限ゲートで、ＣＤ１４  ｖｓ．ＣＤ１９プロット上にＣＤ１４−ＦＭＯを表示した。右象限に分類されたイベントの＜１％まで、ＣＤ１４ゲートを調節した（Ａ）。それから、ＣＤ１９−ＦＭＯサンプルをサンプルプロット上に表示し、適宜、ＣＤ１９に関してゲートを調節した（Ｂ）。最後に、全ての抗体で染色されたサンプルを、設定したゲートを用いて視覚化した（Ｃ）。同一の手順を全てのＦＭＯに関して行なった。
【０１００】
ＦＭＯで設定したゲートを用いて、ＭＳＣを同定するためにマルチステップのゲーティングストラテジーを開発した（図２に図式的に概説されてＵＣＭ  ＭＳＣで例示される）。第一に、全ての記録されたイベントは、前散乱ｖｓ．横散乱のプロット上に視覚化され、細胞の周りにゲートを引いてデブリおよびダブレットを除外した（ステップ１）。対数軸上に横散乱を表示し、線形軸上に前散乱を表示した。ゲートした細胞をＣＤ１４  ｖｓ．ＣＤ１９プロット上に表示し、ダブル陰性（ＣＤ１４−／ＣＤ１９−）イベントを同定した（ステップ２）。ＣＤ１４−／ＣＤ１９−イベントをＣＤ３４  ｖｓ．ＣＤ４５プロット上に表示し、ＣＤ３４−／ＣＤ４５−イベントをゲートした（ステップ３）。これらをＣＤ７３  ｖｓ．ＣＤ９０プロット上に表示し、ダブル陽性（ＣＤ７３＋／ＣＤ９０＋）イベントをゲートした（ステップ４）。ダブル陽性イベントをＣＤ１０５  ｖｓ．横散乱プロット上に表示し、ＣＤ１０５強度を観察した（ステップ５）。陽性マーカーのうち、ＣＤ１０５強度が、サンプル間で最も変化することが分かった。ＣＤ７３およびＣＤ９０は一貫して明るかったので、ゲーティングストラテジーにおいて、これらをＣＤ１０５の前に用いた。非染色細胞に関するヒストグラムの上にＣＤ７３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ１０５＋細胞に関するヒストグラムを重ねることにより、集団全体がＣＤ１０５＋であることが確認された（ステップ６）。ＣＤ１０５  ＦＭＯとＣＤ１０５  ＭＦＩにおける非染色細胞との間に違いはなく、そのため、非染色コントロールを用いることができた。
【０１０１】
表現型分析
ゲーティングストラテジーを通して示されるコア表面マーカーパターンは、ＢＭおよびＵＣＭ  ＭＳＣに関して一貫し、プレースホルダーのシグナル強度により影響を受けなかった（図３）。ＵＣＭ  ＭＳＣは、より均質な前および横の散乱プロファイルを示した。サンプル＃２および＃３においてＢＭ  ＭＳＣ細胞ゲートの外側に見られる不均一性は、細胞のデブリである可能性が最も高く、それらのより低い生存能力（それぞれ８２％および８６％）を反映する。外傷患者由来のＢＭ吸引液から分離されたＢＭ  ＭＳＣは、市販のＢＭ吸引液（サンプル＃４）、市販のＢＭ  ＭＳＣ（＃１）、およびＵＣＭ  ＭＳＣと比較して、小さなＣＤ３４ｄｉｍ集団（サンプル＃２、＃３、＃５および＃６）を示す。
【０１０２】
骨髄ｖｓ．臍帯マトリックスのＭＳＣ上の、表面抗原の強度分析
陽性および陰性のＩＳＣＴマーカーに関するＭＦＩの観点から、ＢＭおよびＵＣＭ  ＭＳＣの間に統計的に有意な違いはなかった（データ示さず）。明るいパネルでは、ＣＤ１４およびＣＤ３４は、非染色コントロールよりも高いＭＦＩを有した（このことは、偽陽性を除外するためのゲートを設定するために、ＦＭＯを使用する重要性を示す）。ＣＤ４９ｄ  ＭＦＩはＢＭ  ＭＳＣよりもＵＣＭ  ＭＳＣが高かった（ｐ＝０．００６）（図４）。ＣＤ４４は、ＵＣＭ  ＭＳＣと比較して、ＢＭ  ＭＳＣにおいて、より広い範囲のシグナル強度を示した。暗いパネルおよび明るいパネルは、抗原（この場合、ＣＤ２９）の発現が、用いたクローンおよび／または蛍光色素に大いに依存することを明らかにし：同一サンプルを染色するために用いた場合、ＣＤ２９−ＦＩＴＣは、ＣＤ２９−ＰＥよりも高いＭＦＩを生じた。
【０１０３】
混合された細胞集団におけるＭＳＣの同定
ＭＳＣは、２％（２．０％、５９，５５０の細胞イベントのうち１，１６４のＭＳＣ）、５％（４．６％、５９，５８７の細胞イベントのうち２７３０のＭＳＣ）および１０％（１０．４％、５９，４７４の細胞イベントのうち６１９３のＭＳＣ）で線維芽細胞の集団と混合した場合に同定することができ（図５）、２度繰り返した。１％（０．６３％、９８，０７１の細胞イベントのうち６２０のＭＳＣ）、２％（１．９％、９７，７０５の細胞イベントのうち１８６０のＭＳＣ）、５％（３．７％、９７，３６０の細胞イベントのうち３６２７のＭＳＣ）および１０％（６．８％、９５，７７２の細胞イベントのうち６５３５のＭＳＣ）でＰＢＭＣに加えられたＭＳＣを同定することも可能であり（図６）、１度行った。しかしながら、ＰＢＭＣ調製は、陰性のＩＳＣＴ  ＭＳＣマーカー−ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、およびＣＤ４５を発現する細胞が多数を占める。したがって、ゲーティングストラテジーは、それらの発現に関して陽性のＭＮＣについて再計算されたこれらのマーカーに関して、ＦＭＯを用いて修正しなければならなかった。計算されたＭＳＣは、紫チャネルにおいて、主なＰＢＭＣよりも高い自己蛍光も有し、一部のＭＳＣを、ＣＤ４５に関して偽陽性に見えるようにさせ、それにより、それらはゲーティングステップ３において除外される。これは、同定率のわずかな低減をもたらした。
【０１０４】
結論
ＭＳＣは、インビボでレアな細胞集団であり、ＭＦＣはそれらの同定および研究を可能にする。これを実証するために、ＭＳＣを、低濃度（１〜１０％）で、ＨＳＦと、およびＰＢＭＣと、混合し、このパネルを用いてそれらを検出することが可能であった。線維芽細胞の表面マーカー発現は、ＭＳＣと同様であり［２５］、それらは多くの同様の組織中に存在する。線維芽細胞は、様々な組織における一般的な細胞型である。それらはＩＳＣＴ−マーカーを共有すること［２５］、および、脂肪細胞、軟骨細胞および骨細胞へ分化すること［２６］が示されている。したがって、臨床用途のためなど、一次組織由来のＭＳＣの純粋な出発原料を分離することが重要である場合には、これらの２つの細胞型を区別することが可能であることが望ましい。本研究では、用いたヒト皮膚線維芽細胞の細胞株はＣＤ９０−陰性であり、このマーカーに基づく細胞分離を可能にした。しかしながら、一次線維芽細胞はＣＤ９０＋であることが示されているので、これらの細胞の記載の陽性マーカー（例えば、ＣＤ１０、ＣＤ２９、およびＣＤ１０６［２５］）を用いて線維芽細胞をより良く区別するプレースホルダーを用いることができた。
【０１０５】
ＰＢＭＣは主にリンパ球および単球からなり、これらとＭＳＣの混合は、骨髄、血液、および他の複雑な組織サンプルにおいてＭＳＣを同定するステップに近いステップを取る。パネルを用いてこの異種サンプル中のＭＳＣを検出することができるので、様々な病態（３〜４色分析で行なわれた、および／または、ＩＳＣＴ−マーカーを含めなかった）において、循環するＭＳＣの研究を再評価するために用いることができた［２７〜３１］。定量化ビーズを用いた直接の単一のプラットフォームの方法により、または、パネルデータを、ＣＤ３４＋細胞の定量化に用いられる自動化された血液白血球カウント［２０］と組み合わせて、二重のプラットフォームの方法を間接的に用いて、パネルを用いてＭＳＣ／μｌサンプルを定量化することができた。したがって、このパネルを用いて、標準的な様式で、非骨髄ＭＳＣのソースを評価することができた。
【０１０６】
本研究における２つのＣＤ２９−コンジュゲートで見ることができたように（図４）、異なるクローンおよびコンジュゲートは、大いに異なる強度シグナルを生じることができる。目的とする研究のために最適な性能の抗体を同定することが重要である（性能は変化し得るので）［３２］。明るいパネルおよび暗いパネルは、７色コアパネルの性能に影響を及ぼさなかった。他の目的のためにパネルを改変する場合は、細胞は、別々に、７色コアパネル（追加のプレースホルダーの抗体のそれぞれ）で染色しなければならず、（または機能性染色（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ  ｓｔａｉｎ））、それから、組み合わせて、追加がコアパネルの結果に影響を及ぼさないことを確実にする。
【０１０７】
細胞からのシグナルを測定する能力における不正確さは、光子を計測する統計から生じるエラーに関連し、このエラーは、従来の方法により統計的に補正されるデータさえ、陽性に見え得る誤りのデータイベントを生じ得る、集団の拡張（ａ  ｓｐｒｅａｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）をもたらし得る［３３］。この「拡張エラー（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ  ｅｒｒｏｒ）」は、このパネルにおいてＣＤ１４を検出するために用いられるＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ７８０のような遠赤色素で最も著しい。したがって、このパネルを使用する場合は、拡張に合わせるために、および、ＣＤ１４−ＦＭＯを用いて閾値を設定するために、ロジクル軸を用いてデータを示すことが重要である。
【０１０８】
拡張エラーはまた、統合分類、および、回帰ツリーモデル（多くの明確なツリーの組み合わせを含むブートストラップアルゴリズムを用いて形成され、各モデルは、元のサンプルから引かれた一連のブートストラップサンプルにおいて推定される）を用いることにより補正することもでき、ここで、スクリーニングの判定は、平均的な予測される好適な交差したストラップツリーの組み合わせ、および、ブートストラップツリーの大部分が、所定の閾値レベルよりも上を好適と予測するかどうかを含む多数決基準に基づいて、ＭＳＣ細胞の表現型を計算するために用いられる。
【０１０９】
結論付けると、本出願において提案される革新的な１０色パネルおよびアルゴリズムは、統計的モデリングプログラムおよび７つのＩＳＣＴコア−パネルマーカーからなり、必要に応じて、追加すべき（ｔｏ  ｂｅ  ｐｏｐｕｌａｔｅ）３つまでのプレースホルダーの位置さえ含むことができ、それらは、骨髄および臍帯のＭＳＣを表現型するために用いることができる。それは、ＭＳＣ研究の任意の態様で、研究者らが、アポトーシス、細胞周期分析および増殖（細胞ごと（ｏｎ  ａ  ｃｅｌｌ−ｂｙ−ｃｅｌｌ  ｂａｓｉｓ））のようなイベントの視覚化のために、機能性細胞色素と組み合わせて、ＭＳＣおよびそれらのサブタイプを研究するための、柔軟なフローサイトメトリーツールを提供する。
［参考文献］
2016519938.tif 000002
2016519938.tif 000003
2016519938.tif 000004
2016519938.tif 000005
【０１１０】
表
【表１】
2016519938.tif 000006
【表２】
2016519938.tif 000007
【図１】
2016519938.tif 000008
【図２】
2016519938.tif 000009
【図３】
2016519938.tif 000010
【図４】
2016519938.tif 000011
【図５】
2016519938.tif 000012
【図６】
2016519938.tif 000013
【国際調査報告】
2016519938.tif 000014
2016519938.tif 000015
2016519938.tif 000016
2016519938.tif 000017
2016519938.tif 000018