(57)【要約】  本発明は、Fcの連結によって得られる長い血漿中半減期を有する成長ホルモン化合物に関する。増加した半減期は、治療薬を低頻度又は低用量で投与できるようにする利点である。本発明は更に、異種発現のための発現ベクターを含む、かかる化合物を生成する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体Fcドメインに連結された成長ホルモン変異体(GH変異体-Fc)を含む、成長ホルモン化合物。
【請求項２】
成長ホルモン変異体が、ヒト成長ホルモン受容体(hGHR)への低下した親和性を有する、請求項1に記載の成長ホルモン化合物。
【請求項３】
5000〜0.5nmol、例えば、4000〜1.0nmol、2500〜10nmol、1000〜25nmol、500〜50nmol、又は例えば、250〜75nmolの親和性(KD)で、部位1を介してhGHRに結合する、請求項1又は2に記載の成長ホルモン化合物。
【請求項４】
同等のhGH-Fc化合物と比較して増加したin vivo半減期を有する、請求項1から3のいずれか一項に記載の成長ホルモン化合物。
【請求項５】
同等のhGH-Fc化合物と比較して増加したMRTを有する、請求項1から4のいずれか一項に記載の成長ホルモン化合物。
【請求項６】
延長したIGF-1応答を誘導することができる、請求項1から5のいずれか一項に記載の成長ホルモン化合物。
【請求項７】
延長したIGF-1応答の誘導し、この応答が、24時間超、例えば48時間超、例えば96時間超又は144時間超も続く、請求項1から6のいずれか一項に記載の成長ホルモン化合物。
【請求項８】
脳下垂体摘出ラットにおいて体重増加を誘導する、請求項1から7のいずれか一項に記載の成長ホルモン化合物。
【請求項９】
成長ホルモン変異体が、ヒト成長ホルモン(配列番号1)のK41、R64及び/又はK172に対応する位置に少なくとも1つの点変異を有する、請求項1から8のいずれか一項に記載の成長ホルモン化合物。
【請求項１０】
1つのFcドメインと1つのGH変異体ポリペプチド(一価)とを含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の成長ホルモン化合物。
【請求項１１】
少なくとも1種のFcポリペプチドとGH変異体(GH変異体-Fcポリペプチド)の融合タンパク質を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の成長ホルモン化合物。
【請求項１２】
少なくとも1種のGH変異体とFcポリペプチド(GH変異体-Fcポリペプチド)の融合タンパク質を含み、GH変異体とFcポリペプチドがGSリンカー等のリンカーペプチドによって連結されている、請求項1から11のいずれか一項に記載の成長ホルモン化合物。
【請求項１３】
Fcポリペプチドが、1つ又は複数のシステインを含むヒンジ領域を含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の成長ホルモン化合物。
【請求項１４】
GHD、AGHD、IBD及び/又はCDを治療する方法で使用するための、請求項1から13のいずれか一項に記載の成長ホルモン化合物。
【請求項１５】
請求項12に規定のGH変異体とFcポリペプチドの融合体をコードする、発現ベクター。
【請求項１６】
請求項12に規定のGH変異体とFcポリペプチドの融合体を発現する、宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、主に組換え方法により調製される成長ホルモン化合物である。野生型成長ホルモンとして、そのような化合物は、成長ホルモン活性を有する化合物の血漿濃度の増加が患者に有益である疾患又は障害の治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
成長ホルモン(GH)は、哺乳動物の下垂体前葉によって分泌されるポリペプチドホルモンである。種に応じて、GHは、およそ22kDaの分子量に相当するおよそ190個のアミノ酸残基から構成されるタンパク質である。GHは、細胞表面受容体のGH受容体(GHR)に結合し、それを介してシグナルを送る。GHは、成長を促進すること、正常な身体組成、同化作用及び脂質代謝を維持することに主要な役割を果たす。グルコース取り込みの減少、脂肪分解の増加、アミノ酸取り込みの増加及びタンパク質合成等の、中間体代謝に直接的な効果も有する。ホルモンは、脂肪組織、肝臓、腸、腎臓、骨格、結合組織及び筋肉を含む他の組織に対しても効果を発揮する。組換えhGH(ソマトロピン)は、例えば、Genotropin(商標)(Pfizer)、Nutropin(商標)及びProtropin(商標)(Genentech)、Humatrope(商標)(Eli Lilly)、Serostim(商標)(Serono)、Norditropin(Novo Nordisk)、Omnitrope(Sandoz)、Nutropin Depot(Genentech and Alkermes)として市販されている。加えて、N末端に追加のメチオニン残基を有する類縁体も、例えば、Somatonorm(商標)(Pharmacia Upjohn/Pfizer)として市販されている。
【０００３】
GHは、GHタンパク質ファミリーの他のメンバー、プロラクチン(PRL)及び胎盤性ラクトゲン(PL)と共通のトポロジーを共有する。GHは、2つの保存されたジスルフィド連結を有する「アップ-アップ-ダウン-ダウン」("up-up-down-down")トポロジーを示す4ヘリックスバンドルと分類される。特に、成熟野生型ヒトGH(配列番号1により同定されるhGH)は、191個のアミノ酸残基から構成され、53、165、182及び189位に4つのシステイン残基を有し、これらは、C53とC165及びC182とC189をそれぞれ接続する2つの細胞内ジスルフィド結合を形成することにより、タンパク質の三次元構造を安定化させる。hGHの構造は、遊離形態(Chantalet L. et al (1995) Protein and Peptide Letters 3、333〜340頁)及び結合タンパク質との複合体(ヒトGHR(hGHR)の細胞外ドメイン)(deVos、A. M. et al (1992) Science 255、306〜312頁)におけるX線結晶学により実験的に決定されている。これらの構造は、Protein Data Bank(PDB)に寄託されており、公的に入手可能である(それぞれ、PDB受託コード1HGU及び1HWG)。このように、公開されているhGH構造から、hGHRに結合するhGHにとって重要な残基を同定することができる。研究は、様々な変異体が成長ホルモン受容体に対して低い親和性を有することを実証している(Cunningham BC、Proc Natl Acad Sci U S A. 1991年4月15日;88(8):3407〜11頁及びCunningham BC、Wells JA、Science. 1989年6月2日;244(4908):1081〜5頁)。更に、hGHの動力学的特性は、核磁気共鳴(NMOLR)分光法(Kasimova M.R. et al. J. Mol. Biol.(2002) 318、679〜695頁)により研究されてきた。成熟ヒトGHRは、シグナルペプチドの除去によってもたらされたGHR遺伝子によりコードされたタンパク質のAA19-638を含む配列番号2により、本明細書において同定されている。細胞外の部分は、AA19-256を構成する成長ホルモン結合タンパク質とも呼ばれる。
【０００４】
hGHは、米国特許出願第2003/0162949号、国際公開第02/055532号及び国際公開第2006048777号に記載されているように、広範囲の変異誘発を受けており、成長ホルモンのシステイン変異体、プロテアーゼ安定化変異体及びペグ化型を含む変更された化学的及び生物学的特性を有するhGH類縁体及びコンジュゲートを産生する試みにおいて、修飾されてきた。
【０００５】
機能性の増加した成長ホルモン化合物の探求において、半減期が増加した化合物が、必要とされる化合物の量及び治療薬の投与の頻度を低減するために望ましい。
【０００６】
抗体治療の大きな成功に触発され、延長器(protractor)としての抗体免疫グロブリンFc領域の使用についての集中的な研究は、国際公開第2012/008779号及び国際公開第2006/107124号、Fc領域が非ペプチジルポリマー(PEG)を介して成長ホルモンに共有的に連結している場合は国際公開第2005047334/35/36/37号に記載された化合物等の半減期が増加した成長ホルモン化合物、並びに国際公開第01/03737号、国際公開第200814743号、米国特許第7404956号、国際公開第04101739号及び国際公開第2005001025号に記載されているFc融合体等の成長ホルモン融合体を提供している。米国特許出願第2012/0116056号は、望ましくないFc媒介副作用を低減する目的で、ヒト成長ホルモン(hGH)と選択された特定のヒトIgG  Fc変異体とのFc融合タンパク質を記載する。
【０００７】
そのような方法は、hGHの半減期を増加することに適しているが、成長ホルモンの半減期及び安定性を更に増加したいという願いは、都合良い治療薬を患者に提供することを可能にするために依然として最優先である。
【０００８】
配列の一覧:
配列番号1:成熟hGH1-191(ソマトトロピン)(略してhGHと呼ばれる)
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
配列番号2:ヒトGHRの成熟ヒトGHR19-638
FSGSEATAAILSRAPWSLQSVNPGLKTNSSKEPKFTKCRSPERETFSCHWTDEVHHGTKNLGPIQLFYTRRNTQEWTQEWKECPDYVSAGENSCYFNSSFTSIWIPYCIKLTSNGGTVDEKCFSVDEIVQPDPPIALNWTLLNVSLTGIHADIQVRWEAPRNADIQKGWMVLEYELQYKEVNETKWKMMDPILTTSVPVYSLKVDKEYEVRVRSKQRNSGNYGEFSEVLYVTLPQMSQFTCEEDFYFPWLLIIIFGIFGLTVMLFVFLFSKQQRIKMLILPPVPVPKIKGIDPDLLKEGKLEEVNTILAIHDSYKPEFHSDDSWVEFIELDIDEPDEKTEESDTDRLLSSDHEKSHSNLGVKDGDSGRTSCCEPDILETDFNANDIHEGTSEVAQPQRLKGEADLLCLDQKNQNNSPYHDACPATQQPSVIQAEKNKPQPLPTEGAESTHQAAHIQLSNPSSLSNIDFYAQVSDITPAGSVVLSPGQKNKAGMSQCDMHPEMVSLCQENFLMDNAYFCEADAKKCIPVAPHIKVESHIQPSLNQEDIYITTESLTTAAGRPGTGEHVPGSEMPVPDYTSIHIVQSPQGLILNATALPLPDKEFLSSCGYVSTDQLNKIMP
配列番号3:ヒトFc IgG1
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
-  下線を引いた配列は、ヒンジ領域を指し、太字AAは、完全長重鎖配列におけるL234、L235、G237、A330及びP331に対応するアミノ酸残基である。
配列番号4:ラットFc IgG2a
VPRECNPCGCTGSEVSSVFIFPPKTKDVLTITLTPKVTCVVVDISQNDPEVRFSWFIDDVEVHTAQTHAPEKQSNSTLRSVSELPIVHRDWLNGKTFKCKVNSGAFPAPIEKSISKPEGTPRGPQVYTMAPPKEEMTQSQVSITCMVKGFYPPDIYTEWKMNGQPQENYKNTPPTMDTDGSYFLYSKLNVKKETWQQGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
-  下線を引いた配列は、ヒンジ領域を指す。
配列番号5:GSリンカー(S(GGGGS)6)
SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願第2003/0162949号
【特許文献２】国際公開第02/055532号
【特許文献３】国際公開第2006048777号
【特許文献４】国際公開第2012/008779号
【特許文献５】国際公開第2006/107124号
【特許文献６】国際公開第2005047334号
【特許文献７】国際公開第2005047335号
【特許文献８】国際公開第2005047336号
【特許文献９】国際公開第2005047337号
【特許文献１０】国際公開第01/03737号
【特許文献１１】国際公開第200814743号
【特許文献１２】米国特許第7404956号
【特許文献１３】国際公開第04101739号
【特許文献１４】国際公開第2005001025号
【特許文献１５】米国特許出願第2012/0116056号
【特許文献１６】国際公開第2011/089250号
【特許文献１７】国際公開第08009545号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】(Chantalet L. et al (1995) Protein and Peptide Letters 3、333〜340頁
【非特許文献２】deVos、A. M. et al (1992) Science 255、306〜312頁
【非特許文献３】Cunningham BC、Proc Natl Acad Sci U S A. 1991年4月15日;88(8):3407〜11頁
【非特許文献４】Cunningham BC、Wells JA、Science. 1989年6月2日;244(4908):1081〜5頁
【非特許文献５】Kasimova M.R. et al. J. Mol. Biol.(2002) 318、679〜695頁
【非特許文献６】Sambrook et al.、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、New York、1989
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の主な態様は、免疫グロブリンFc領域との融合によって本明細書で実証される通りに延長した半減期を有する成長ホルモン化合物に関する。該化合物は、ヒト成長ホルモンと比較して1つ又は複数のアミノ酸残基が変化した改変アミノ酸配列によって更に特徴付けられる。かかる変異体の普通と異なる特性は、ヒト成長ホルモンと比較して機能性を部分的に改変することを目標としている。
【００１２】
遅延性の成長ホルモン化合物という趣旨でのかかる成長ホルモン変異体は、ヒト成長ホルモンの生物学的活性を保持しながら、半減期を更に一層長期化させる。よって、かかる化合物は、低頻度及び低用量で投与することができる治療用成長ホルモン化合物を提供して、血中の成長ホルモン活性を増大させることができる好都合な製品を患者に提供するという問題の解決を支援することができる。一実施形態では、本発明は抗体Fcドメインに連結された成長ホルモン変異体(GH変異体-Fc)を含む成長ホルモン化合物に関する。かかる一実施形態では、該化合物は2つのポリペプチドから成り、1つはGH変異体-Fcポリペプチド融合体(GH-variant-Fc polypeptide fusion)であり、FcポリペプチドがGH-変異体-Fcポリペプチド融合体のFc配列に連結される。一実施形態では、成長ホルモン化合物はGH変異体の配列中に1〜5つの点変異を含み、それによって成長ホルモン受容体への親和性が低下する。本発明による成長ホルモン化合物は延長した半減期(T 1/2)の延長をin vivoで示すだけでなく、延長したIGF-応答を誘導する能力も示す。
【００１３】
本発明の更なる態様は、かかる化合物を生成するための方法及び手段に関し、特に、GH変異体-Fc融合ポリペプチドをコードするDNA配列及びベクター、並びにGH変異体-Fc融合ポリペプチドをコードするかかるベクターを、Fcポリペプチドをコードするベクターと任意選択で組み合わせて含む宿主細胞に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】4つの成長ホルモン変異体Fc融合化合物の薬物動態プロファイルを示す。各成長ホルモンFc融合化合物は、同じ一般構造:hGH-リンカー-Fc(IgG1)/Fc(IgG1)を有する。成長ホルモン配列における変異は、各分子において数字の説明により示されている。
【図２】Sprague Dawleyラットへの単回用量の静脈内投与後の、成長ホルモン変異体のFc融合化合物のIGF-1血漿濃度-時間プロファイルを示す。図2Aは、IGF-1の総濃度を示し、一方、図2Bは、ベースライン修正IGF-1血漿濃度を示す。成長ホルモン配列における変異は、各分子において数字の説明により示されている。
【図３】15nmolalの単回用量の静脈内投与後の、下垂体切除Sprague Dawleyラットの体重に対する成長ホルモン変異体のFc融合化合物の効果を示す。成長ホルモン配列における変異は、各分子において数字の説明により示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義
用語「結合親和性」は、2つの分子、例えば受容体とリガンドの非共有相互作用の強度の測度として本明細書において使用される。用語「結合親和性」は、一価相互作用(固有活性)を記載するために使用される。
【００１６】
用語「ヌクレオチド配列」は、ポリペプチドをコードするDNA(又はRNA配列)を定義するために使用される。
【００１７】
用語「アミノ酸」には、遺伝子コードによりコードされた一群のアミノ酸が含まれ、これらは本明細書において標準アミノ酸と呼ばれる。遺伝子コードによりコードされなかった天然アミノ酸、また合成アミノ酸が更に含まれる。
【００１８】
用語「ポリペプチド」及び「ペプチド」は、本明細書で使用されるとき、ペプチド結合により接続されている少なくとも2つのアミノ酸から構成される化合物を意味する。
【００１９】
用語「タンパク質」は、本明細書で使用されるとき、1つ以上のポリペプチドからなる生化学化合物を意味する。
【００２０】
用語「薬物」、「治療薬」、「医薬」又は「薬」は、本明細書で使用されるとき、治療に使用することができる医薬組成物に使用される活性成分を指す。
【００２１】
用語「成長ホルモン変異体」は、配列番号1により同定される成熟ヒト成長ホルモンの配列と異なるアミノ酸配列を有する、成長ホルモンタンパク質の類縁体を記載するために本明細書において使用される。
【００２２】
用語「Fcドメイン」は、2つのFcポリペプチドの複合体を記載するために本明細書において使用される。
【００２３】
用語「複合体」は、コード化ヌクレオチド配列の翻訳の際に確立されたペプチド結合により連結していない、少なくとも2つのポリペプチドの会合を記載するために本明細書において使用される。会合は、共有的又は非共有的でありうる。
【００２４】
用語「延長部分」は、タンパク質のin vivo半減期を延ばす能力を有する単位を定義するために本明細書において使用される。したがって用語には、Fcドメイン、PEG分子、血清アルブミン、アルブミン結合剤、成長ホルモン結合タンパク質、AAポリマー(XTEN technology(Amunix、Mountain View、CA)及びPASylation(登録商標)(XL-protein GMBH、Freising、Germany)に使用されている)、並びにヒドロキシエチルデンプン及びヘパロサン(heparosan)等の炭水化物群等の、周知の実体が含まれる。
【００２５】
説明
本発明は、抗体Fcドメインに連結された成長ホルモン変異体を含む成長ホルモン化合物に関し、かかる化合物は、略して「GH変異体-Fc」と呼ばれてもよい。
【００２６】
成長ホルモン化合物
成熟したヒト成長ホルモンタンパク質は、3つのループ(ループ1〜3又はL1〜3)によって接続された4本のへリックス(へリックス1〜4又はH1〜4)とC末端セグメントとから構成される。ヒト成長ホルモンでは、へリックス1はAA残基6〜35によって規定され、へリックス2はAA残基71〜98によって規定され、へリックス3はAA残基107〜127によって規定され、へリックス4はAA残基155〜184として規定される。成長ホルモン受容体との相互作用によって、成長ホルモンは生物学的活性を媒介する。
【００２７】
本明細書で後述するように、本発明による成長ホルモン化合物は、成長ホルモン部分と遅延化部分(protracting part)とから構成され、成長ホルモン部分は化合物の生物学的機能性に関与すると考えられており、一方、遅延化部分は成長ホルモン化合物の半減期の延長に少なくとも部分的に関与している。
【００２８】
よって、成長ホルモン化合物は通常、成長ホルモンポリペプチド、例えば、配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンと高レベルの同一性を有するアミノ酸鎖を含むこととなる。本明細書で後述するように、本発明による成長ホルモン化合物は、ヒト成長ホルモンの配列とは異なるタンパク質配列によって規定される、成長ホルモン変異体を含む。
【００２９】
本発明による成長ホルモン化合物は、成長ホルモン融合体と成長ホルモンコンジュゲートの両方を包含する。成長ホルモン融合体という文言から明らかなように、化合物は少なくとも1つのペプチド結合によって第2のタンパク質配列に連結された成長ホルモン配列を含み、一方、成長ホルモンコンジュゲートは、化学修飾による成長ホルモン部分と遅延化部分の共有結合的な連結を指す。融合タンパク質の作成は当技術分野で周知であり、通常、前記成長ホルモン配列をコードするDNA配列と、リンカー配列を任意選択で含む前記第2のタンパク質をコードする第2のDNA配列とを連結する組換え発現ベクターを使用して、融合タンパク質を発現させることによって得られる。成長ホルモン融合体には、これらに限定されないが、抗体Fcドメインを含む融合体が含まれる。
【００３０】
同様に、成長ホルモン部分と遅延化部分とのコンジュゲーションは、Fcドメインを成長ホルモン変異体に共有結合的に付着させる、当技術分野で公知の方法によって得ることができる。付着は、成長ホルモン変異体のN末端又はC末端アミノ酸残基に対するものであっても、鎖中のアミノ酸残基に対するものであってもよい。点変異を成長ホルモンに導入して、遅延化部分のかかる付着を促進してもよい。
【００３１】
一実施形態では、本発明は抗体Fcドメインに連結された成長ホルモン変異体を含む成長ホルモン化合物に関し、この化合物はGH変異体-Fcと記載されることもある。
【００３２】
成長ホルモン変異体
本発明による成長ホルモン変異体は、配列番号1によって特定される成熟したヒト成長ホルモンの配列とは異なる配列を有する。
【００３３】
少なくとも1つのアミノ酸残基の付加及び/又は欠失及び/又は置換によって、天然に存在するヒト成長ホルモン配列と比較して相違が生じ得る。該用語は、成長ホルモン配列の1つ若しくは複数のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換された、並びに/又は1つ若しくは複数のアミノ酸残基が成長ホルモンから欠失した、並びに/又は1つ若しくは複数のアミノ酸残基が成長ホルモンに付加された及び/若しくは挿入された、変異による成長ホルモンタンパク質に使用される。
【００３４】
一実施形態では、本発明による成長ホルモン変異体は、ヒト成長ホルモンに対して8つ未満の修飾(置換、欠失及び/又は付加)を含む。一実施形態では、成長ホルモン変異体は、ヒト成長ホルモンに対して7つ未満の修飾(置換、欠失及び/又は付加)を含む。一実施形態では、成長ホルモン変異体は、ヒト成長ホルモンに対して6つ未満の修飾(置換、欠失及び/又は付加)を含む。一実施形態では、成長ホルモン変異体は、ヒト成長ホルモンに対して5つ未満の修飾(置換、欠失及び/又は付加)を含む。一実施形態では、成長ホルモン変異体は、ヒト成長ホルモンに対して4つ未満の修飾(置換、欠失及び/又は付加)を含む。一実施形態では、成長ホルモン変異体は、ヒト成長ホルモンに対して3つ未満の修飾(置換、欠失及び/又は付加)を含む。一実施形態では、成長ホルモン変異体は、ヒト成長ホルモンに対して2つ未満の修飾(置換、欠失及び/又は付加)を含む。一連の実施形態では、成長ホルモンの成長ホルモン変異体は、配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンと少なくとも95、96、97、98又は99%同一である。
【００３５】
一実施形態では、成長ホルモン変異体は正確に7つのアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、成長ホルモン変異体は正確に6つのアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、成長ホルモン変異体は正確に5つのアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、成長ホルモン変異体は正確に4つのアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、成長ホルモン変異体は正確に3つのアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、成長ホルモン変異体は正確に2つのアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、成長ホルモン変異体は正確に1つのアミノ酸修飾を含む。
【００３６】
上述のように、成長ホルモンの全体構造は周知であり、二次元及び三次元構造によって、異なる機能性に少なくとも部分的に割り当てられている可能性がある種々の領域が特定されている。二次元構造によって、ヘリックス1〜4及び間にあるループ1〜3が規定されている。成長ホルモン受容体結合は、部位1及び部位2と呼ばれる、それぞれが複数の不連続のアミノ酸ストレッチに及ぶ三次元の部位に割り当てられている。本明細書で記載する通りに、GH化合物/GH変異体は、部位1又は部位2の点変異又はAA欠失によって、hGH又は配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンを含むGH化合物と比較して、部位1又は部位2を介するhGHRへの低い結合親和性を有することが好ましい。
【００３７】
一実施形態では、成長ホルモン変異体は、部位1(ヘリックス1(9〜35)及びループ1(36〜71)及びヘリックス4(155〜184))に、例えば、ヘリックス1における、Met14、His18、His21、Gln22及びPhe25に対応する位置に、少なくとも1つの点変異を有する。
【００３８】
一実施形態では、成長ホルモン変異体は、ループ1に、例えば、Lys41、Tyr42、Leu45、Gln46、Asn47、Pro48、Gln49、Ser51、Leu52、Pro59、Pro61、Ser62、Asn63、Arg64、Glu65、Thr67及びGln68に対応する位置に、又は例えば、Lys41、Leu45、Pro59、Pro61、Arg64及びGlu65に対応する位置に、少なくとも1つの点変異を有する。
【００３９】
一実施形態では、成長ホルモン変異体は、ヘリックス4に、例えば、Tyr164、Arg167、Lys168、Asp171、Lys172、Glu174、Thr175、Phe176、Arg178、Ile179、Cys182、Cys189及びGly190に対応する位置に、又は例えば、Lys172、Glu174、Thr175、Phe176及びArg178に対応する位置に、少なくとも1つの点変異を有する。
【００４０】
一実施形態では、成長ホルモン変異体は、部位2 (N-末端及びヘリックス1(1〜35)及び/又はループ2/ヘリックス3(99〜127))に、少なくとも1つの点変異を有する。
【００４１】
一実施形態では、成長ホルモン変異体は、N-末端及びヘリックス1に、例えば、Phe1、Pro2、Ile4、Pro5、Leu6、Arg8、Leu9、Asn12、Ala13、Leu15、Arg16及びArg19に対応する位置に、少なくとも1つの点変異を有する。
【００４２】
一実施形態では、成長ホルモン変異体は、ループ2/ヘリックス3に、例えば、Val102、Tyr103、Asn109、Asp116、Leu117、Glu119、Gly120及びThr123に対応する位置に、少なくとも1つの点変異を有する。
【００４３】
一実施形態では、成長ホルモン変異体は、ヘリックス3(AA107〜127)に、例えば、Asn109、Asp116、Leu117、Glu119、Gly120及びThr123に対応する位置に、少なくとも1つの点変異を有する。
【００４４】
一実施形態では、成長ホルモン変異体は、G120に対応する位置に点変異を有する。
【００４５】
一実施形態では、成長ホルモン変異体は、Lys41、Arg64、Lys172及び/又はGly120に対応する位置に、少なくとも1つの点変異を有する。
【００４６】
一実施形態では、成長ホルモン変異体は、Lys41、Arg64、Lys172及び/又はGly120に対応する位置に、少なくとも2つの点変異を有する。
【００４７】
一実施形態では、成長ホルモン変異体は、Lys41、Arg64、Lys172及び/又はGly120に対応する位置に、少なくとも3つの点変異を有する。
【００４８】
一実施形態では、成長ホルモン変異体は、Lys41、Arg64及び/又はLys172に対応する位置に、少なくとも1つの点変異を有する。
【００４９】
一実施形態では、成長ホルモン変異体は、Lys41、Arg64及び/又はLys172に対応する位置に、少なくとも2つの点変異を有する。
【００５０】
一実施形態では、成長ホルモン変異体は、正確に1つ、2つ又は3つの点変異を有する。一実施形態では、成長ホルモン変異体は、Lys41、Arg64又はLys172に対応する位置に単一変異を有する。
【００５１】
一実施形態では、成長ホルモン変異体は、K41A、R64A及びK172Aの群から選択される1つの点変異を有する。一実施形態では、成長ホルモン変異体は、K41A、R64A及びK172Aの群から選択される2つの点変異を有する。一実施形態では、成長ホルモン変異体は、点変異K41Aを有する。一実施形態では、成長ホルモン変異体は、点変異R64Aを有する。一実施形態では、成長ホルモン変異体は、点変異K172Aを有する。
【００５２】
一実施形態では、成長ホルモン変異体は、点変異K41A及びR64Aを有する。一実施形態では、成長ホルモン変異体は、点変異R64A及びK172Aを有する。一実施形態では、成長ホルモン変異体は、点変異K41A及びK172Aを有する。一実施形態では、成長ホルモン変異体は、3つの点変異K41A、R64A及びK172Aを有する。
【００５３】
更なる実施形態では、成長ホルモン変異体は、上述の領域の1つ又は複数のアミノ酸残基の1つ又は複数の欠失、例えば、部位1又は部位2における少なくとも1つのアミノ酸残基の欠失を有する。かかる一実施形態では、成長ホルモン変異体は、Lys41、Arg64、Lys172及び/又はGly120に対応する位置に少なくとも1つ、2つ、又は3つのアミノ酸残基の欠失を有する。
【００５４】
点変異は、上述の通りの1つ又は複数のアミノ酸残基の、アラニン(A)残基による置換であってもよい。
【００５５】
かかる実施形態では、Lys41、Arg64及びLys72の1つ又は複数は、アラニン(A)残基によって置換されていてもよく、一方、Gly120はアルギニン(R)によって置換されていてもよい。
【００５６】
安定性
代替の成長ホルモン化合物の開発に関する一般的な懸念事項は、かかる化合物の安定性である。安定性は、製造中、保管中、使用中及び患者の体内等の種々の状況に関係し得る。新規化合物の評価に当たって、ある種のプロテアーゼに耐性がある化合物又はin-vivoでの半減期が延長した化合物を選択すると有用であり得る。増大した安定性は、免疫グロブリンのFc領域に連結された成長ホルモン変異体を含む化合物だけでなく、単独の成長ホルモン変異体にも、両方に有利であると考えられる。
【００５７】
一実施形態では、成長ホルモン化合物は、タンパク質分解に対して安定化された成長ホルモン変異体を含む。(特定の変異によって)タンパク質分解に対して安定化された成長ホルモンタンパク質の非限定的な例は、WO2011/089250に見出すことができる。
【００５８】
プロテアーゼに対して安定化された成長ホルモン変異体には、追加的なジスルフィド結合が導入された変異体が含まれる。追加的なジスルフィド架橋により、好ましくはL3がヘリックス2に接続される。よって、本発明による成長ホルモン変異体は、好ましくは、配列番号1におけるL73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C又はF92C/T148Cに対応する変異の対を含んでもよい。更なる実施形態では、成長ホルモン変異体は、配列番号1におけるL81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C又はF92C/T148Cに対応する変異の対を含む。好ましい実施形態において2つの追加のシステイン残基を導入すると、配列番号1のH2におけるAA84又はAA85及びL3におけるAA143又はAA144に対応する位置の野生型のアミノ酸残基が置換される。
【００５９】
本発明による成長ホルモン変異体は、更なる実施形態において、上述の安定化の変異と受容体相互作用の変異の両方を含んでもよい。好ましい実施形態では、ジスルフィドの安定化は、部位1、例えばLys41、Arg64及び/又はLys172における変異の組合せに含まれる。かかる変異体の例は、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C及びS85C/S144Cから選択される変異対を有し、Lys41、Arg64及び/又はLys172に対応する位置に1つ又は複数の変異を追加的に含み、上述の後者のものが好ましくはAla残基によって置換されている変異体である。
【００６０】
成長ホルモン「活性」
本明細書で記載する通りに、驚くべきことに、成長ホルモン変異体と免疫グロブリンFc領域とを含む成長ホルモン化合物が予想外に長期化した半減期を有すること、更にかかる化合物が予想外に有利な機能性を有し得ることが見出された。本発明の化合物の成長ホルモン変異体は、1つ又は複数のアミノ酸残基の変異/欠失/付加により、野生型ヒト成長ホルモンと比較して変異体の機能性が少なくとも部分的に改変されるので、特性が普通とは異なっている。改変された機能性は、化合物レベルで、例えば、GH変異体-Fc分子とhGH-Fc分子を比較することによって測定することもできる。
【００６１】
ヒト成長ホルモン及びその変異体の機能性は複数のレベルで測定することができ、例えば、表面プラズモン共鳴(surface plasma resonance)結合(SPR)アッセイで結合親和性を測定することによって、成長ホルモン受容体(GHR)と相互作用するタンパク質の能力を測定することができる。受容体成分は、全長のヒトGHRであってもよいし、1つ又は複数の受容体領域、特にhGH相互作用に関与する細胞外ドメインを含む部分的な受容体であってもよい。本明細書の方法Bに記載する通りに、細胞外ドメイン又はhGHBPは頻繁に使用される。
【００６２】
一実施形態では、成長ホルモン変異体又は本発明による成長ホルモン化合物は、hGH又はhGH配列(配列番号1)を含む同等な化合物と比較して減少した、GHRへの親和性を有する。
【００６３】
更なる実施形態では、本発明は、成長ホルモン変異体が低下した受容体親和性を有する、成長ホルモン化合物に関する。かかる一実施形態では、成長ホルモン変異体は、配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンと比較して、hGHRへの低い結合親和性を有する。一実施形態では、成長ホルモン変異体は、配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンと比較して、部位1を介するhGHRへの低い結合親和性を有する。hGHRへの結合親和性は、当技術分野で公知の任意の適切なアッセイ、例えばSPRアッセイによって、任意選択でビアコア(biacore)システムを使用して測定してもよい。
【００６４】
2つの分子間の一価相互作用による結合親和性は、平衡解離定数(KD)を決定することによって定量化し得る。そして、KDは、複合体の形成及び解離の反応速度の測定によって、例えばSPR法によって決定することができる。一価複合体の会合及び解離に対応する速度定数は、それぞれ会合速度定数ka(又はkon)及び解離速度定数kd(又はkoff)と呼ばれる。KDは、等式KD=kd/kaを通して、ka及びkdと関連付けられる。上の定義に従って、所与の受容体についての様々なリガンドとの結合親和性の比較等、様々な分子相互作用に関連する結合親和性を個々の複合体のKD値の比較によって比較することができる。
【００６５】
平衡解離定数の値は、周知の方法によって直接的に決定することもできる。リガンドの結合能を評価するための標準的なアッセイは当技術分野で公知であり、それには、例えば、ELISA、ウエスタンブロット、RIA、及びフローサイトメトリー分析が含まれる。結合反応速度及び結合親和性は、SPRアッセイ等の当技術分野で公知の標準的なアッセイによって評価することができる。よって、GH変異体の親和性は、平衡解離定数KD、例えば、平衡時の遊離試薬及び複合体の濃度の比率(KD=[A]*[B]/[AB])を算出することによって測定し得る。KDが低ければ結合が強いことを示し、ナノモルの範囲内のKDは一般に高親和性であるとみなされる。hGHのhGHRへのKDは約0.9nmolである。
【００６６】
一実施形態では、GH変異体のhGHRへの親和性(KD)は0.9nmol未満であり、例えば1.5nmolである。
【００６７】
一実施形態では、GH変異体のhGHRへのKDは、1.0nmol超、例えば5nmol超、例えば50nmol超、例えば100nmol超、例えば200nmol超、例えば500nmol超である。
【００６８】
一実施形態では、成長ホルモン変異体は、配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンと比較して、部位1を介するhGHRへの低い結合親和性を有し、ここでは、部位1を介するhGHRへの前記結合親和性がSPR(ビアコア)によって測定され、GH変異体に対するhGHのSPR KDの比率が1未満であり、例えば0.5未満であり、例えば0.05、例えば0.005又は例えば0.0005である。
【００６９】
本発明による成長ホルモン化合物の親和性は、野生型のhGH配列を含む同等の化合物の親和性より低くてもよい。
【００７０】
一実施形態では、成長ホルモン化合物は、配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンに抗体Fcドメイン(hGH-Fc)が連結された化合物と比較して、部位1を介するhGHRへの低い結合親和性を有する。
【００７１】
一実施形態では、成長ホルモン化合物は、配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンに抗体Fcドメイン(hGH-Fc)が連結された化合物と比較して、hGHの部位1を介するhGHRへの低い結合親和性を有し、ここでは、hGHの部位1を介するhGHRへの前記結合親和性が、SPRアッセイで測定され、任意選択でビアコアシステムを使用して測定される。
【００７２】
hGH-Fc(IgG)化合物は、約0.43nmolのKDを有する。一実施形態では、本発明による成長ホルモン化合物は、0.5nmolを上回る、例えば1.0nmol超、例えば5nmol超、例えば50nmol超、例えば100nmol超、例えば200nmol超、例えば500nmol超の親和性(KD)で、部位1を介してhGHRに結合する。
【００７３】
一実施形態では、本発明による成長ホルモン化合物は、5000nmol未満、例えば4000nmol未満、例えば2500nmol未満、例えば1000nmol未満、例えば750nmol未満、例えば500nmol未満の親和性(KD)で、部位1を介してhGHRに結合する。
【００７４】
一実施形態では、本発明による成長ホルモン化合物は、5000〜0.5nmol、例えば4000〜1.0nmol、2500〜10nmol、1000〜25nmol、500〜50nmol、250〜75nmolの親和性(KD)で、部位1を介してhGHRに結合する。
【００７５】
一実施形態では、成長ホルモン化合物は、配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンに前記抗体Fcドメイン(wt GH-Fc)が連結された化合物と比較して、部位1を介するhGHRへの低い結合親和性を有し、ここでは、部位1を介するhGHRへの前記結合親和性がSPR(ビアコア)によって測定され、GH変異体-Fcに対するhGH-FcのSPR KDの比率が1未満であり、例えば0.5未満であり、例えば0.05、例えば0.005又は例えば0.0005である。
【００７６】
本明細書で上述した通りに、本発明は、野生型の配列と異なる機能性を有する変異体にFcドメインを組み合わせると有利な特性を有することができるという発見に関する。通常、変異は特定の機能性を増大させるために導入されるが、本発明は、hGHでの変異が受容体への親和性及び/又は受容体を介するシグナル伝達を減少させるという逆の状況に関する。
【００７７】
受容体への結合は極めて重要であるが、代替の尺度はin vitro活性である。成長ホルモン変異体又はGH変異体-Fc化合物が結合してGHR受容体を介するシグナル伝達を刺激することを、in vitroでの細胞に基づくアッセイ、例えばBAFアッセイ(本明細書における方法C)で測定することができる。
【００７８】
一実施形態では、hGH変異体又はGH変異体-Fc化合物のin vitro活性は、hGH又はhGH配列(配列番号1)を含む同等なFc化合物と比較して低い。
【００７９】
一実施形態では、成長ホルモン変異体は、配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンと比較して、低いin vitro活性を有する。一実施形態では、成長ホルモン化合物は、hGH(配列番号1)に抗体Fcドメインが連結された化合物と比較して、低いin vitro活性を有する。かかる一実施形態では、in vitro活性は、BAFアッセイで測定される。一実施形態では、成長ホルモン変異体は、配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンと比較して、BAFアッセイで低いin vitro活性を有する。一実施形態では、成長ホルモン変異体は、配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンと比較して、BAFアッセイで低いin vitro活性を有し、ここでは、hGHに対するGH変異体の比率が1超、例えば2超、例えば5超である。
【００８０】
一実施形態では、成長ホルモン変異体は、配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンと比較して、BAFアッセイで低いin vitro活性を有し、ここでは、wt hGHに対するGH変異体の比率が1〜200であり、例えば1〜100、例えば1〜50、例えば1〜25、例えば1〜15、例えば1〜10である。
【００８１】
一実施形態では、成長ホルモン変異体は、配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンと比較して、BAFアッセイで低いin vitro活性を有し、ここでは、wt hGHに対するGH変異体の比率が2〜25であり、例えば2〜15、例えば2〜10である。
【００８２】
一実施形態では、成長ホルモン化合物は、配列番号1によって特定されるhGHに抗体Fcドメインが連結された化合物と比較して、BAFアッセイで低いin vitro活性を有する。
【００８３】
一実施形態では、成長ホルモン化合物は、配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンに抗体Fcドメイン(hGH-Fc)が連結された化合物と比較して、BAFアッセイで低いin vitro活性を有し、ここでは、前記hGH-Fcに対するGH変異体-FcのBAFの比率が1超、例えば2超、例えば5超、例えば10超、例えば25超、例えば50超である。
【００８４】
一実施形態では、成長ホルモン化合物は、hGH(配列番号1)に抗体Fcドメイン(hGH-Fc)が連結された化合物と比較して、BAFアッセイで低いin vitro活性を有し、ここでは、前記hGH-Fcに対するGH変異体-FcのBAFの比率が1〜200、例えば1〜100、例えば1〜50、例えば1〜25、例えば1〜15、例えば1〜10である。
【００８５】
一実施形態では、成長ホルモン化合物は、hGH(配列番号1)に前記抗体Fcドメイン(wt GH-Fc)が連結された化合物と比較して、BAFアッセイで低いin vitro活性を有し、ここでは、wt GH-Fcに対する前記GH変異体-FcのBAFの比率が2〜25、例えば2〜15、例えば2〜10である。
【００８６】
新規成長ホルモン化合物を作る目的が、より高レベルの循環成長ホルモンから利益を受ける患者のための治療の選択肢に置き換わる及び好ましくはそれを向上させる可能性のある新規治療用化合物を特定することを目指すのであれば、所与の化合物にGH受容体のシグナル伝達を刺激する能力があることを確認することが有意に関係する。
【００８７】
半減期(T1/2)
成長ホルモン変異体又は化合物の半減期(T1/2)は、その量が半減するのに必要な時間である。
【００８８】
成長ホルモン変異体又は化合物は、好ましくは、野生型ヒト成長ホルモン又はhGH配列を含む同等な化合物と比較して増加したT1/2を有し、それは、当業者に公知の種々の手段、例えばタンパク質を分解に対して安定化させる点変異によって得ることができる。成長ホルモン化合物の循環時間は、血清タンパク質との共有結合的又は非共有結合的な連結によっても増加し得る。血清アルブミンは、成長ホルモン若しくはその変異体とのコンジュゲーション(任意選択でリンカーを含む)又はタンパク質融合によって使用されてもよい。或いは、アルブミンへの化学的連結も、抗体Fc領域との融合又は連結と同様に考えてもよい。アルブミンへの非共有結合的付着は、アルブミン結合物質、例えば成長ホルモンに共有結合したアシル基(アルブミン結合物質)を使用することによって得てもよい。代替の遅延性部分が、当技術分野で公知の通りに使用されてもよい。
【００８９】
ラットモデルは成長ホルモン変異体及び化合物の生物学的効果を試験するためによく使用される。試験は、正常なラット及び/又は脳下垂体摘出ラットで行ってもよい。スプラーグドーリーラットが使用されることが多く、試験方法は、方法D及びEに記載される。かかる試験によって、所与の化合物の受容者の血中での総曝露量及び存在時間の決定に関係する幾つかの薬物動態パラメーター、例えばAUC、T1/2及びMRT(平均滞留時間)の情報を得ることができる。更に、IGF-1応答の誘導、hGHの生物学的効果についての特性を測定することができる。
【００９０】
一実施形態では、成長ホルモン変異体は、hGH(配列番号1)と比較して増加した半減期を有する。
【００９１】
一実施形態では、本発明による成長ホルモン化合物は、hGH(配列番号1)と比較して増加したin vivo T1/2を有する。
【００９２】
記載のアッセイ(本明細書の方法D)において、ヒト成長ホルモン(hGH)はおよそ12〜14分のT1/2を有することが留意される。ヒトでの半減期と同等ではないが、ラットでの増加したin vivo T1/2は、治療環境での延長したin vivo存在時間となることが企図される。
【００９３】
一実施形態では、成長ホルモン化合物は、30分を上回る、又は60分を上回る、又は90分を上回る、又は120分を上回るT1/2を有する。更なる実施形態では、T1/2は60分すなわち1時間を上回り、例えば2時間を上回り、又は好ましくは4時間を上回る。
【００９４】
上述の通りに、成長ホルモン化合物又は個々の成長ホルモン変異体の別を問わず、in vivo半減期を考慮することも関係し得る。
【００９５】
一実施形態では、成長ホルモン変異体は増加したT1/2を有し、例えば、30分を上回る、又は60分を上回る、又は90分を上回る、又は120分を上回るT1/2を有する。更なる実施形態では、成長ホルモン変異体のT1/2は60分すなわち1時間を上回り、例えば2時間を上回り、又は好ましくは4時間を上回る。
【００９６】
一実施形態では、延長したT1/2は、実施例で記載する通りに、ラットへの静脈内(iv.)又は皮下(sc.)投与後に測定される。当業者であれば、成長ホルモン変異体又は成長ホルモン化合物を検出可能な手段に応じて、どのようにかかるアッセイを変更できるかがわかるであろう。
【００９７】
一実施形態では、成長ホルモン化合物は、同等なhGH-Fc化合物と比較して増加した半減期を有する。一実施形態では、成長ホルモン化合物は、8時間超、例えば12時間超、例えば24時間超の半減期(T1/2)を有する。一実施形態では、成長ホルモン化合物は、正常なラットへの15nmolの単回iv.投与(single iv. dose)後に測定したとき、8時間超、例えば12時間超、例えば24時間超の半減期(T1/2)を有する。
【００９８】
一実施形態では、成長ホルモン化合物は、脳下垂体摘出ラットへの15nmolの単回iv.投与後に測定したとき(本明細書の方法E参照)、8時間超、例えば12時間超、例えば24時間超の半減期(T1/2)を有する。
【００９９】
一実施形態では、成長ホルモン化合物は、脳下垂体摘出ラットへの15nmolの単回iv.投与後に測定したとき、48時間超、例えば60時間超、例えば72時間超の半減期(T1/2)を有する。
【０１００】
一実施形態では、成長ホルモン変異体は、hGH(配列番号1)と比較して増加したMRTを有する。
【０１０１】
一実施形態では、成長ホルモン化合物は、同等なhGH-Fc化合物と比較して増加したMRTを有する。
【０１０２】
一実施形態では、成長ホルモン化合物は、12時間超、例えば18時間超、例えば24時間超のMRTを有する。一実施形態では、成長ホルモン化合物は、正常なラットへの単回投与の15nmolのiv.投与後に測定したとき、12時間超、例えば18時間超、例えば24時間超のMRTを有する。
【０１０３】
一実施形態では、成長ホルモン化合物は、脳下垂体摘出ラットへの単回投与の15nmolのiv.投与後に測定したとき、12時間超、例えば18時間超、例えば24時間超、例えば36時間超、例えば48時間超のMRTを有する。
【０１０４】
IGF-1応答を、例えば本明細書の方法Fに記載する通りに、成長ホルモン化合物の投薬後に測定することができるが、当業者であれば、同様の代替方法が適用されることがわかるであろう。成長ホルモンの単回投与後のラット中のIGF-1の血漿中濃度は、成長ホルモン化合物の血漿中濃度が増大した期間に合わせて、好ましくは増加するべきである。
【０１０５】
一実施形態では、本発明による成長ホルモン変異体又は成長ホルモン化合物は、IGF-1応答を誘導することができる。
【０１０６】
よって、血漿中IGF-1の濃度が高くなることによって、IGF-1応答はwt化合物に観察される応答より強くなり得る。血漿中IGF-1の濃度を、72時間以内、例えば48時間以内、例えば36時間以内、例えば24時間以内に検出してもよい。様々な化合物の効果を比較するために、様々な時点で、例えば、投与後、6、12、24、36、48、72、96、144、192、240、288、336時間までのいずれかの値を測定し、個々の時点での値を比較してもよい。
【０１０７】
一実施形態では、成長ホルモン変異体又は成長ホルモン化合物は、増大したIGF-1応答を誘導する。一実施形態では、成長ホルモン変異体/化合物はIGF-1応答を誘導し、ここでは、IGF-1応答が、前記成長ホルモン変異体又は化合物の単回投与後96時間までに、又は例えば6、12、24、36、48、72時間までに増大した血漿中IGF-1濃度として検出される。一実施形態では、成長ホルモン変異体又は成長ホルモン化合物は、延長したIGF-1応答を誘導する。IGF-1の血漿中濃度が、wt化合物と比較して長い時間にわたり高いままであれば、成長ホルモン変異体/化合物は延長したIGF-1応答を誘導している。一実施形態では、成長ホルモン変異体又は成長ホルモン化合物は、wt hGH又はwt hGHを含む同等な化合物のIGF応答と比較して、延長したIGF-1応答を誘導する。一実施形態では、IGF応答は、24時間超、例えば48時間超、例えば96時間超、又は144時間超も続く。
【０１０８】
延長したIGF-1応答は、一定期間、例えば投与後336時間まで、例えば6、12、24、36、48、72、96、144、192、240、288又は336時間までの期間にわたる血漿中IGF-1濃度の曲線下の面積(AUC)として検出することができる。
【０１０９】
一実施形態では、成長ホルモン化合物はIGF-1応答を誘導し、ここでは、IGF-1応答が単回投与後に検出される。一実施形態では、成長ホルモン変異体/化合物はIGF-1応答を誘導し、ここでは、IGF-1応答が15nmolの単回i.v.投与後に検出される。
【０１１０】
一実施形態では、成長ホルモン化合物はIGF-1応答を誘導し、ここでは、IGF-1応答が単回投与の15nmolのi.v.投与後のAUCとして検出される。
【０１１１】
一実施形態では、成長ホルモン化合物はIGF-1応答を誘導し、ここでは、IGF-1応答が、15nmolの単回i.v.投与後336時間まで、例えば6、12、24、36、48、72、96、144、192、240、288又は336時間までの血漿中IGF-1のAUCとして検出される。
【０１１２】
一実施形態では、成長ホルモン化合物はIGF-1応答を誘導することができ、ここでは、前記応答がラットで測定される。
【０１１３】
一実施形態では、成長ホルモン化合物は、正常なラットでIGF-1応答を誘導することができる。一実施形態では、成長ホルモン化合物は、脳下垂体摘出ラットでIGF-1応答を誘導することができる。
【０１１４】
本発明によれば、IGF-1応答は、IGF-1濃度プロファイルに基づいて又はベースラインが補正されたIGF-1濃度プロファイルに基づいて検出することができる。血液又は血漿試料中のIGF-1の濃度を成長ホルモン化合物投与後に経時的に測定し、ベースラインを上回る増大が誘導されたIGF-1応答を表す。
【０１１５】
IGF-1応答は、単回i.v.投与に応答するIGF-1の曲線下の面積(AUC)として記載されてもよい。
【０１１６】
脳下垂体摘出ラットで体重増加を誘導する化合物の能力を測定することができる。一実施形態では、成長ホルモン化合物は体重増加を誘導する。一実施形態では、成長ホルモン化合物は、脳下垂体摘出ラットで体重増加を誘導する。
【０１１７】
一実施形態では、成長ホルモン化合物は、脳下垂体摘出ラットで体重増加を誘導する。
【０１１８】
Fcドメイン
抗体の結晶性断片領域(Fc領域又はFcドメイン)は、抗体の尾部である。IgG、IgA及びIgD抗体の場合、Fc領域は2つの同一のタンパク質断片を含有し、これらは両方とも第2及び第3の定常ドメイン(CH2及びCH3)を含む。IgM及びIgE抗体のFc領域は、各ポリペプチド鎖に3つの重鎖定常ドメイン(CHドメイン2〜4)を含有する。Fcドメインのタンパク質は本明細書ではFcポリペプチドと呼ばれ、通常、少なくともCH2及びCH3ドメインを含む。
【０１１９】
Fcドメインは、Fc受容体と呼ばれる細胞表面受容体、並びに補体系の幾つかのタンパク質との相互作用を媒介する。Fc領域は、抗体が免疫系と相互作用することを可能にする。抗体Fc領域は、抗体分子の長い半減期に少なくとも部分的に関与しており、それはIgGの場合、ヒトにおいておよそ720時間である。よって、Fcドメインは、潜在的な治療的化合物の半減期を延長するための魅力的な遅延化物質(protractor)である。
【０１２０】
本発明によれば、Fcドメインを成長ホルモン変異体の遅延化物質として使用すると、魅力的な機能性を有する成長ホルモン化合物となることが見出された。
【０１２１】
一実施形態では、成長ホルモン化合物は、抗体Fcドメインに連結された成長ホルモン変異体(GH変異体-Fc)を含み、ここでは、FcドメインのアイソタイプがIgGであり、例えばサブタイプIgG1であり、例えばIgG2であり、例えばIgG4である。
【０１２２】
一実施形態では、成長ホルモン化合物は、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインを含む。一実施形態では、成長ホルモン化合物は、配列番号3(11〜227)によってそれぞれ規定される2つのFcポリペプチドを含む。
【０１２３】
ヒンジ領域は、抗体の定常領域のCH1とCH2の間にあるタンパク質セグメントである。一実施形態では、Fc-ポリペプチドは、1つ又は複数のシステインを含むヒンジ領域を含む。一実施形態では、Fcドメインのポリペプチドは、配列番号3によって規定される配列をそれぞれ含む。一実施形態では、ヒンジ領域は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が改変されるように、例えば増加又は減少されるように修飾される。
【０１２４】
一実施形態では、定常領域は分子を安定化させるように改変されてもよく、例えば、IgG4定常領域において残基S228(EUインデックスによる残基の番号付け)をプロリン(P)に変異させてもよい。一実施形態では、Fcポリペプチドは、IgG4中のS228の位置又はS228に対応する位置にプロリン残基を含む。
【０１２５】
よって、Fcポリペプチドは、共有結合的に連結されていても、或いは非共有結合的に連結されていてもよい。
【０１２６】
一実施形態では、Fc領域は、Fc領域内に修飾を含むように、典型的には、とりわけ、血清中半減期、補体結合、Fc-受容体結合、タンパク質の安定性及び/若しくは抗原依存性の細胞障害活性、又はそれらの欠如等の、その機能的性質の1つ又は複数を改変するように工学的に操作されてもよい。
【０１２７】
更に、本発明のFcドメインは、そのグリコシル化を改変するように、更に抗体の1つ又は複数の機能的性質を改変するように、化学的に修飾されてもよい(例えば、Fc部分に1つ又は複数の化学的部分を付着させることができる)。
【０１２８】
IgG1 Fcドメインは、ある種のFc受容体への親和性の減少(L234A、L235E、及びG237A)及びC1q媒介性補体結合の低下(A330S及びP331S)(EUインデックスによる残基の番号付け)をそれぞれ生じる変異の1つ又は複数、及び恐らく全てを含んでもよい。
【０１２９】
FcRnへの結合親和性を向上させるために、Fc中の変異、例えば、IgG1アイソタイプのFcドメイン中の変異M428L及び/又はN434Sが含まれてもよい。
【０１３０】
連結
Fcドメインへの成長ホルモン変異体の連結は、当該技術において既知の複数の経路により得ることができる。一実施形態において、成長ホルモン化合物は、本明細書上記に記載されたように、抗体Fcドメインに共有的に連結された成長ホルモン変異体から構成される。
【０１３１】
伝統的には、融合タンパク質を作り出すには、タンパク質ドメインを組み合わせることを使用してきた。成長ホルモン変異体のコード化領域をFcポリペプチドと融合させることによって、成長ホルモン変異体Fc融合タンパク質を得ることができ、ここで成長ホルモン変異体は、少なくとも1つのポリペプチド結合を介して両方のFcポリペプチドに結合しており、2つのFcポリペプチドが結合してFcドメインを形成するので、GH成分に関して二価である成長ホルモン化合物をもたらす。
【０１３２】
一実施形態において、成長ホルモン変異体とFcポリペプチドは、少なくとも1つのペプチド結合により連結している。一実施形態において、融合体は、GSリンカー等のペプチドリンカーを介したものである。
【０１３３】
一実施形態において、成長ホルモン化合物は、二価融合タンパク質化合物である。
【０１３４】
一実施形態において、成長ホルモン化合物は、少なくとも1つのGH変異体及びFcポリペプチド(GH変異体-Fcポリペプチド)融合タンパク質を含み、ここでGH変異体及びFCポリペプチドは、GSリンカー等のリンカーペプチドにより連結している。
【０１３５】
代替的な実施形態において、2つのFcポリペプチドの一方のみが成長ホルモン変異体と融合しており、GH成分に関して一価である化合物をもたらす。
【０１３６】
一実施形態において、成長ホルモン化合物は、1つのGH変異体及び1つのFcドメインのみを含む。成長ホルモン化合物は、1つのGH変異体ポリペプチド及び2つのFcポリペプチドを含むことができる。したがって成長ホルモン化合物は、1つのGH変異体ポリペプチド及び1つのFcドメインを含むことができる。
【０１３７】
一実施形態において、1つのGH変異体は、前記GH変異体のN末端又はC末端を介してFcドメインに連結している。
【０１３８】
更なる一実施形態において、成長ホルモン化合物は、1つのFcポリペプチドのN末端又はC末端のFcドメインに連結している1つのGH変異体のみを含む。
【０１３９】
一実施形態において、GH変異体のC末端は、FcポリペプチドのN末端に連結している。
【０１４０】
一実施形態において、FcポリペプチドのC末端は、GH変異体のN末端に連結している。
【０１４１】
融合タンパク質の生成に対する代替案として、成長ホルモン変異体とFcドメインの共有連結をコンジュゲーションにより得ることができる。そのようなプロセスの方法は、当該技術において知られており、非ペプチド結合を伴い、コンジュゲーションの例は、背景技術のセクションに提示されている参考文献において見出すことができる。
【０１４２】
本明細書の開示によって明白であるように、本発明は、態様において、本明細書上記に定義されている成長ホルモン変異体を含めることを含む、増加した血漿半減期を有する成長ホルモン化合物を調製する方法に関する。ヒト成長ホルモン配列(配列番号1)それ自体の使用と比較したそのような変異体の使用は、所定の化合物の任意の延長部分に非依存的にin vivo半減期の増加を提供する。その特定の実施形態において、成長ホルモン変異体は、Fcドメインと組み合わせて使用される。
【０１４３】
調製方法
成長ホルモン化合物の生成は、当該技術において既知の様々な方法により実施することができる。標準的な方法は、タンパク質成分のクローニング、続く適切な宿主における発現を伴う。
【０１４４】
成長ホルモン変異体は、組換え核酸技術によって産生することができる。一般に、クローンした野生型成長ホルモン核酸配列を修飾して、所望の変異体をコードする。次に、この修飾された配列を発現ベクターに挿入し、次にこれを宿主細胞にトランスフォーム又はトランスフェクトする。
【０１４５】
成長ホルモンをコードする核酸構築物は、適切にはゲノム、cDNA又は合成由来でありうる。アアミノ酸配列の変更は、クイックチェンジ部位特異的変異誘発キット(quick change site-directed mutagenesis kit)の使用等の周知の技術によるコード領域の修飾によって達成される。一実施形態は、本発明の成長ホルモン変異体をコードするヌクレオチド配列又は構築物に関する。
【０１４６】
一実施形態において、本発明は、本発明のGH変異体及びFcポリペプチド融合体をコードする単離ヌクレオチド配列又は構築物に関する。
【０１４７】
成長ホルモン変異体をコードするDNA配列は、通常、任意のベクターでありうる組換えベクターに挿入され、これを組換えDNA手順に都合良く付すことができ、ベクターの選択は、多くの場合、導入される宿主細胞によって左右される。したがって、ベクターは、自己複製ベクター、すなわち染色体外実体として存在するベクターであってもよく、その複製は染色体複製に非依存的であり、例えばプラスミドである。或いは、ベクターは、宿主に導入されたときに宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それは組み込まれた染色体と一緒に複製される。
【０１４８】
ベクターは、好ましくは発現ベクターであり、そこでは成長ホルモン変異体をコードするDNA配列が、DNAの転写に必要な追加のセグメントに作動可能に連結している。用語「作動可能に連結する」は、セグメントが、意図される目的のために協調して機能するように配置されていることを示し、例えば、転写はプロモーターから始まり、ポリペプチドをコードするDNA配列を介して進行し、ターミネーター内で終止する。
【０１４９】
したがって、成長ホルモン変異体を発現するのに使用される発現ベクターは、クローンされた遺伝子又はcDNAの転写を開始し、方向付けることができるプロモーターを含む。プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示し、かつ宿主細胞と相同性又は異種性のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から誘導されうる、任意のDNA配列でありうる。
【０１５０】
加えて、成長ホルモン変異体を発現するのに使用される発現ベクターは、転写を終止することが宿主細胞に認識されている配列であるターミネーター配列も含む。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の3'末端に作動可能に連結している。選択された宿主細胞において機能性がある任意のターミネーターを、本発明に使用することができる。
【０１５１】
成長ホルモン変異体の発現は、宿主細胞のサイトゾルにおける細胞内発現を目的とすること又は増殖培地に細胞外発現の分泌経路を向けることができる。
【０１５２】
細胞内発現は、デフォルト経路であり、プロモーター、その後に成長ホルモン変異体ポリペプチドをコードするDNA配列、その後にターミネーターを含むDNA配列を有する発現ベクターを必要とする。
【０１５３】
成長ホルモン変異体を宿主細胞の分泌経路に向けるため、分泌シグナル配列(シグナルペプチド又はプレ配列としても知られている)が、成長ホルモン変異体のN末端伸長として必要である。シグナルペプチドをコードするDNA配列は、正確なリーディングフレーム内の成長ホルモン変異体をコードするDNA配列の5'末端と結合する。シグナルペプチドは、通常はタンパク質と関連しうるものでありうる又は別の分泌タンパク質をコードする遺伝子からのものでありうる。成長ホルモン変異体では、切断可能なN末端タグを頻繁に使用して、成熟ヒト成長ホルモンと同一のN末端が得られることを確実にする。変異体をコードするDNA配列は、更なるプロセシングの際に切断されるMEAE等の小ペプチドをコードするコドンと、インフレームで連結する。幾つかの目的において、シグナルMet開始コドンを付加して、翻訳を開始させることが可能である。タグは、タンパク質の更なるプロセシングにおける精製タグとして、追加的な機能を果たすことができる。本発明の成長ホルモン化合物を発現する方法は、実施例(方法A)に記載されており、当業者は、代替的な化合物を得るために方法をどのように改変するかを理解する。
【０１５４】
成長ホルモン変異体とFcドメインとの連結がペプチド結合を使用して得られる実施形態において、そのような化合物を得る最も都合良い経路は、インフレームの成長ホルモン変異体及びFcポリペプチドをコードする単一のヌクレオチド配列を作り出すことである。配列は、連結ペプチドを更にコードすることができる。順番は、2つの可能性のいずれかであり、例えば、GH変異体は、Fcポリペプチドに対してN末端でありうる又はGH変異体は、Fcポリペプチドに対してC末端でありうる。
【０１５５】
GH変異体、Fcポリペプチド、連結ペプチド、プロモーター、ターミネーター、精製タグ及び/又は分泌シグナル配列をそれぞれコードするDNA配列をライゲーションするため、並びに複製に必要な情報を含有する適切なベクターにこれらを挿入するために使用される手順は、当業者に良く知られている(例えば、Sambrook et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、New York、1989を参照すること)。
【０１５６】
一実施形態において、本発明は、GH変異体又は連結ペプチドを任意選択で含むGH変異体及びFcポリペプチド融合体をコードする発現ベクターに関する。
【０１５７】
成長ホルモン変異体をコードするDNA配列が導入される宿主細胞は、細胞内又は細胞外のいずれかにおいて成長ホルモン変異体を発現することができる任意の細胞でありうる。翻訳後修飾が必要な場合、適切な宿主細胞には、酵母菌、真菌、昆虫及び本明細書の方法Aに記載されているHEC細胞を含む哺乳類細胞等の高等真核細胞が含まれる。GH変異体又はGH変異体-Fcポリペプチド融合体を発現する宿主細胞は、本発明の更なる実施形態である。
【０１５８】
本明細書に上記に記載されたように、本発明の成長ホルモン化合物は、成長ホルモン変異体に関して一価又は二価のいずれかでありうる。二価成長ホルモン変異体-Fc分子の発現は、両方のタンパク質をコードする単一のヌクレオチド配列の発現により得ることができる。一価成長ホルモン変異体-Fc分子の発現は、別個のFcポリペプチドが発現されなければならず、成長ホルモン変異体-Fcポリペプチドと第2のFcポリペプチドの異種複合体を得なければならないので、更なる考慮が必要になる。
【０１５９】
Fcポリペプチドの配列に応じて、複合体は、共有的又は非共有的に形成されうる。Fcポリペプチドは、ジスルフィド結合を形成することができるシステイン残基を含むことができ、これは免疫グロブリン分子のヒンジ領域に通常存在し、したがってFcポリペプチドに含まれうる。
【０１６０】
GH変異体-Fcポリペプチドと第2のFcポリペプチドとの複合体形成は、同じ細胞内の両方のコード化フレームを発現すること又は個別の宿主細胞培養物に発現する場合、後にポリペプチドを混合することにより、得ることができる。第1の方法が好ましく、成長ホルモン化合物、例えばGH変異体-Fcを構成するタンパク質複合体の精製が後に続くことがある。
【０１６１】
ポリペプチド又はタンパク質複合体の精製は、当該技術において既知の標準的な手順を使用して実施することができる。
【０１６２】
本発明は、本発明の成長ホルモン化合物を調製する方法であって、
a)成長ホルモン変異体ポリペプチドを発現する宿主細胞を得るステップと、
b)2つのFcポリペプチドの会合によりFcドメインを形成することができるFcポリペプチドを発現する宿主細胞を得るステップと、
c)前記成長ホルモン変異体ポリペプチド及び前記宿主細胞からの2つのFcポリペプチドにより形成される前記Fcドメインを、発現及び精製するステップと、
d)成長ホルモン変異体ポリペプチドをFcドメインと連結させるステップと、
e)前記成長ホルモン化合物を得るステップと
を含む方法に更に関する。
【０１６３】
本発明は、GH変異体Fcポリペプチド融合体を含む、本発明の成長ホルモン化合物を調製する方法であって、
a)GH変異体-Fcポリペプチド融合体を発現する宿主細胞(1)を得るステップと、
b)Fcポリペプチドを発現する宿主細胞(2)を任意選択で得るステップであって、前記宿主細胞(2)がa)の宿主細胞(1)と同一であってもよい、ステップと、
c)前記宿主細胞からの前記ポリペプチドを発現及び精製するステップと、
d)成長ホルモン化合物を得るステップであって、前記化合物がGH変異体-Fcポリペプチド融合体を含む、ステップと
を含む方法に更に関する。
【０１６４】
更なる実施形態において、化合物は、GH変異体-Fcドメインである。更なる実施形態において、宿主細胞(1)及び(2)は、同一である。
【０１６５】
医薬組成物
したがって、本発明の1つの目的は、そのような成長ホルモン化合物を治療活性量で含む医薬製剤を提供することである。上記に記載されたように、濃度は、液剤では0.25mg/ml〜250mg/ml又は固体剤形では2.5mg/g〜250mg/gに変わりうる。前記製剤は、2.0〜10.0のpHを有することが好ましい。製剤は、緩衝剤系、防腐剤、等張剤、キレート剤、安定剤及び/又は界面活性剤、並びに様々なこれらの組合せを更に含むことができる。医薬組成物における防腐剤、等張剤、キレート剤、安定剤及び界面活性剤の使用は、当業者に良く知られている。製剤は、当該技術に既知の標準的な方法を使用して調製することができる。Remington:The Science and Practice of Pharmacy、19版、1995を参照することができる。一実施態様において、本発明の医薬組成物は液剤である。
【０１６６】
治療方法
本発明の態様は、治療の方法における成長ホルモン化合物及びその組成物の使用に関する。一実施形態において、成長ホルモン化合物及びその組成物は、治療の方法に使用されるためのものである。
【０１６７】
一実施形態において、成長ホルモン化合物及びその組成物は、医薬の調製に使用されるためのものである。
【０１６８】
そのような実施形態において、本発明の成長ホルモン化合物又は医薬組成物は、小児及び成人の成長ホルモン欠乏症の治療又は予防のためのものである。循環成長ホルモンの濃度の増加が助けになりうる他の疾患又は障害を、本発明の成長ホルモン化合物又は医薬組成物の使用により治療又は予防することもできる。一実施形態において、本発明の成長ホルモン化合物又は医薬組成物は、循環成長ホルモンの量の増加による利益が観察される疾患又は状態を治療するためのものである。そのような疾患又は状態には、成長ホルモン欠乏症(GHD);ターナー症候群;プラダーウィリー症候群(PWS);ヌーナン症候群;ダウン症候群;慢性腎疾患;若年性関節リウマチ;嚢胞性線維症;HAART治療を受けている小児におけるHIV感染(HIV/HALS小児);妊娠期間不足(SGA)で生まれた低身長児;SGAではなく極低出生体重(VLBW)で生まれた小児の低身長;骨格形成異常;軟骨低形成症;軟骨発育不全症;特発性低身長(ISS);成人におけるGHD;脛骨、腓骨、大腿骨、上腕骨、橈骨、尺骨、鎖骨、中手骨(matatarsea)、中足骨(matatarsea)及び指等の長骨の骨折;頭蓋骨(scull)、手底部(base of hand)及び足底部(base of food)等の海綿様骨の骨折;例えば手、膝又は肩における腱又は靭帯の手術後の患者;仮骨延長法(distraction oteogenesis)を有する又は受けている患者;膝、臀部、肩、肘、手首又は顎等における股関節若しくは円板置換、半月板修復、脊髄固定又は装具固定後の患者;釘、ねじ釘及び板等の骨接合材料が固定された患者;骨折の骨癒合不全又は変形治癒を有する患者;例えば脛骨又第1趾からの骨切り術(osteatomia)後の患者;移植片の移植後の患者;外傷又は関節炎により引き起こされた膝の関節軟骨変性;ターナー症候群の患者における骨粗鬆症;男性における骨粗鬆症;慢性透析を受ける成人患者(APCD);APCDにおける栄養失調関連心血管疾患;APCDにおけるカヘキシーの逆転;APCDにおけるがん;APCDにおける慢性閉塞性肺疾患(chronic abstractive pulmonal disease);APCDにおけるHIV;APCDにおける高齢者;APCDにおける慢性肝臓疾患、APCDにおける疲労症候群;クローン病;肝臓機能障害;HIV感染を有する男性;短腸症候群;中心性肥満;HIV関連脂肪異栄養症症候群(HALS);男性不妊症;待機的大手術、アルコール/薬物解毒又は神経性外傷後の患者;加齢;虚弱高齢者;骨関節炎;外傷的に損傷を受けた軟骨;勃起不全;線維筋痛症;記憶障害;うつ病;外傷性脳傷害;くも膜下出血;極低出生体重;代謝症候群;グルココルチコイドミオパシー;或いは小児におけるグルココルチコイド治療に起因する低身長が含まれる。成長ホルモンは、筋肉組織、神経組織若しくは創傷の治癒の加速;損傷組織の血流の加速若しくは改善;又は損傷組織の感染率の減少のためにも使用されてきた。
【０１６９】
一実施形態において、成長ホルモン化合物及びその組成物は、小児のGHD、成人のGHD(AGHD)、ターナー症候群(TS)、ヌーナン症候群、特発性低身長(ISS)、妊娠期間に比べて小さい(SGA)、プラダーウィリー症候群(PWS)、慢性腎不全(CRI)、骨格形成異常、SHOX欠損症、AIDS消耗症、HIV関連脂肪異栄養症症候群(HARS)、任意選択でステロイド依存性疾患、嚢胞性線維症及び線維筋痛症を含む短腸症候群の治療のためのものである。
【０１７０】
一実施形態において、本発明は、上記に記述された疾患又は状態を治療する方法に関し、ここで成長ホルモン化合物の活性は、前記疾患又は状態の治療に有用である。そのような化合物の投与は、患者における循環成長ホルモン化合物の量の増加に関連する治療利益をもたらす。ある実施形態において、前記方法は、成長ホルモン化合物の医薬組成物の有効量を患者に投与し、それによって前記患者の症状を寛解させることを含む。
【０１７１】
一実施形態において、本発明は、成長ホルモン化合物を含む本発明の医薬組成物の治療有効量の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む方法に関する。したがって本発明は、これらの疾患又は状態を治療する方法であって、本発明の医薬組成物中の成長ホルモン化合物の治療有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。
【０１７２】
本発明の化合物の「治療有効量」は、本明細書で使用されるとき、所定の疾患及びその合併症の臨床症状を治癒する、緩和する又は部分的に阻止するのに十分な量を意味する。このことを達成するのに適切な量は、「治療有効量」と定義される。それぞれの目的における有効な量は、例えば、疾患及び傷害の重篤度、並びに対象の体重、性別、年齢及び一般的状態によって左右される。適切な投与量を決定することは、日常的な実験を使用して達成することができ、このことは、熟練の医師又は獣医にとって全て通常の技能の範囲内であることが理解される。
【０１７３】
一実施形態において、本発明は、上記に記述された疾患又は状態の治療に使用される医薬の製造における、成長ホルモン化合物又はそのコンジュゲートの使用を提供する。
【０１７４】
本発明は、更なる態様において、本明細書上記に記載された医薬組成物を伴う方法に関する。本発明は以下の非限定的実施形態によって更に記載される。
【０１７５】
実施形態
1.  抗体Fcドメインに連結された成長ホルモン変異体(GH変異体-Fc)を含む、成長ホルモン化合物。
【０１７６】
2.  成長ホルモン変異体が、hGH(配列番号1)と比較して、1つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び/又は付加を有する、実施形態1に記載の成長ホルモン化合物。
【０１７７】
3.  成長ホルモン変異体が、hGH(配列番号1)と比較して、最大5つのアミノ酸の置換、欠失及び/又は付加を有する、実施形態1〜2に記載の成長ホルモン化合物。
【０１７８】
4.  成長ホルモン変異体が向上した安定性を有する、実施形態1から3のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０１７９】
5.  成長ホルモン変異体が、配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンと比較して向上した安定性を有する、実施形態1から4のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０１８０】
6.  成長ホルモン変異体が、配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンと比較して向上したプロテアーゼ耐性を有する、実施形態1から5のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０１８１】
7.  成長ホルモン変異体が低下した受容体親和性を有する、実施形態1から6のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０１８２】
8.  成長ホルモン変異体が、配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンと比較してGHRへの低い結合親和性を有する、実施形態1から7のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０１８３】
9.  成長ホルモン変異体が、配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンと比較して、部位1を介するhGHRへの低い結合親和性を有する、実施形態1から8のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０１８４】
10.  成長ホルモン変異体が、配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンと比較して、部位1を介するhGHRへの低い結合親和性を有する実施形態1から9のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物であって、部位1を介するhGHRへの前記結合親和性がSPR(ビアコア)によって測定される、成長ホルモン化合物。
【０１８５】
11.  成長ホルモン変異体が、5000〜0.5nmol、例えば、4000〜1.0nmol、2500〜10nmol、1000〜25nmol、500〜50nmol、250〜75nmolの親和性(KD)で部位1を介してhGHRに結合する、実施形態1から10のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０１８６】
12.  配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンに前記抗体Fcドメイン(wt GH-Fc)が連結された化合物と比較して、hGHRへの低い結合親和性を有する、実施形態1から11のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０１８７】
13.  配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンに前記抗体Fcドメイン(wt GH-Fc)が連結された化合物と比較して、部位1を介するhGHRへの低い結合親和性を有する、実施形態1から12のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０１８８】
14.  配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンに前記抗体Fcドメイン(wt GH-Fc)が連結された化合物と比較して、部位1を介するhGHRへの低い結合親和性を有する、実施形態1から13のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物であって、部位1を介するhGHRへの前記結合親和性がSPR(ビアコア)によって測定される、成長ホルモン化合物。
【０１８９】
15.  5000〜0.5nmol、例えば、4000〜1.0nmol、2500〜10nmol、1000〜25nmol、500〜50nmol、250〜75nmolの親和性(KD)で、部位1を介してhGHRに結合する、実施形態1から14のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０１９０】
16.  成長ホルモン変異体が、配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンと比較して、低いin vitro活性を有する、実施形態1から15のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０１９１】
17.  配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンに前記抗体Fcドメインが連結された化合物と比較して、低いin vitro活性を有する、実施形態1から16のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０１９２】
18.  in vitro活性がBAFアッセイで測定される、実施形態16及び17のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０１９３】
19.  成長ホルモン変異体が、配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンと比較して、BAFアッセイで低いin vitro活性を有する、実施形態1から18のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０１９４】
20.  成長ホルモン変異体が、配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンと比較して、BAFアッセイで低いin vitro活性を有する、実施形態1から19のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物であって、wt GHに対するGH変異体の比率が、1超、例えば2超、例えば5超である、成長ホルモン化合物。
【０１９５】
21.  成長ホルモン変異体が、配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンと比較して、BAFアッセイで低いin vitro活性を有する、実施形態1から20のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物であって、wt hGHに対するGH変異体の比率が1〜200、例えば1〜100、例えば1〜50、例えば1〜25、例えば1〜15、例えば1〜10である、成長ホルモン化合物。
【０１９６】
22.  成長ホルモン変異体が、配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンと比較して、BAFアッセイで低いin vitro活性を有する、実施形態1から21のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物であって、wt hGHに対するGH変異体の比率が2〜25、例えば2〜15、例えば2〜10である、成長ホルモン化合物。
【０１９７】
23.  配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンに前記抗体Fcドメインが連結された化合物と比較して、BAFアッセイで低いin vitro活性を有する、実施形態1から22のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０１９８】
24.  配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンに前記抗体Fcドメイン(wt GH-Fc)が連結された化合物と比較して、BAFアッセイで低いin vitro活性を有する、実施形態1から23のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物であって、前記wt GH-Fcに対するGH変異体-FcのBAFの比率が1超、例えば2超、例えば5超である、成長ホルモン化合物。
【０１９９】
25.  配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンに前記抗体Fcドメイン(wt GH-Fc)が連結された化合物と比較して、BAFアッセイで低いin vitro活性を有する、実施形態1から24のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物であって、前記wt GH-Fcに対するGH変異体-FcのBAFの比率が1〜200、例えば1〜100、例えば1〜50、例えば1〜25、例えば1〜15、例えば1〜10である、成長ホルモン化合物。
【０２００】
26.  配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンに前記抗体Fcドメイン(wt GH-Fc)が連結された化合物と比較して、BAFアッセイで低いin vitro活性を有する、実施形態1から25のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物であって、前記wt GH-Fcに対するGH変異体-FcのBAFの比率が2〜25、例えば2〜15、例えば2〜10である、成長ホルモン化合物。
【０２０１】
27.  増加したin vivo半減期(T1/2)を有する、実施形態1から26のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２０２】
28.  同等のhGH-Fc化合物と比較して増加したin vivo半減期を有する、実施形態1から27のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２０３】
29.  8時間超、例えば12時間超、例えば24時間超のin vivo半減期を有する、実施形態1から28のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２０４】
30.  正常な又は脳下垂体摘出ラットへの単回iv投与後に測定したとき、8時間超、例えば12時間超、例えば24時間超のin vivo半減期を有する、実施形態1から29のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２０５】
31.  正常な又は脳下垂体摘出ラットへの15nmolの単回iv投与後に測定したとき、8時間超、例えば12時間超、例えば24時間超のin vivo半減期を有する、実施形態1から30のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２０６】
32.  増加したMRTを有する、実施形態1から31のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２０７】
33.  同等のhGH-Fc化合物と比較して増加したMRTを有する、実施形態1から32のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２０８】
34.  正常な又は脳下垂体摘出ラットへの単回iv投与後に測定したとき、同等のhGH-Fc化合物と比較して増加したMRTを有する、実施形態1から33のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２０９】
35.  12時間超、例えば18時間超、例えば24時間超のMRTを有する、実施形態1から34のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２１０】
36.  正常なラットへの単回投与の15nmolのiv投与後に測定したとき、12時間超、例えば18時間超、例えば24時間超のMRTをin vivoで有する、実施形態1から35のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２１１】
37.  脳下垂体摘出ラットへの単回投与の15nmolのiv投与後に測定したとき、12時間超、例えば18時間超、例えば24時間超、例えば36時間超、例えば48時間超のMRTをin vivoで有する、実施形態1から36のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２１２】
38.  IGF-1応答を誘導することができる、実施形態1から37のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２１３】
39.  増大したIGF-1応答を誘導する、実施形態1から38のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２１４】
40.  延長したIGF-1応答を誘導する、実施形態1から39のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２１５】
41.  IGF-1応答を誘導する、実施形態1から40のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物であって、IGF-1応答が単回iv投与後に検出可能である、成長ホルモン化合物。
【０２１６】
42.  IGF-1応答を誘導する、実施形態1から41のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物であって、IGF-1応答が単回iv投与後の血漿中IGF-1濃度のAUCとして検出される、成長ホルモン化合物。
【０２１７】
43.  IGF-1応答を誘導する、実施形態1から42のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物であって、IGF-1応答が単回投与のiv投与後96時間までの増加した血漿中IGF-1濃度として検出される、成長ホルモン化合物。
【０２１８】
44.  IGF-1応答を誘導する、実施形態1から43のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物であって、IGF-1応答が、単回投与の15nmolのiv投与後336時間までの血漿中IGF-1濃度のAUCとして検出される、成長ホルモン化合物。
【０２１９】
45.  延長したIGF-1反応を誘導し、この応答が、24時間超、例えば48時間超、例えば96時間超又は144時間超も続く、実施形態1から44のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２２０】
46.  IGF-1応答を誘導する、実施形態1から45のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物であって、IGF-1応答が、IGF-1濃度プロファイルに基づいて又はベースラインが補正されたIGF-1濃度プロファイルに基づいて検出される、成長ホルモン化合物。
【０２２１】
47.  IGF-1応答を誘導する、実施形態1から46のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物であって、前記応答がラットで検出される、成長ホルモン化合物。
【０２２２】
48.  正常なラットでIGF-1応答を誘導する、実施形態1から47のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２２３】
49.  脳下垂体摘出ラットでIGF-1応答を誘導する、実施形態1から48のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２２４】
50.  体重増加を誘導する、実施形態1から49のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２２５】
51.  脳下垂体摘出ラットで体重増加を誘導する、実施形態1から50のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２２６】
52.  成長ホルモン変異体が、配列番号1によって特定されるヒト成長ホルモンと比較して、少なくとも1つの変異を有する、実施形態1から51のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２２７】
53.  成長ホルモン変異体が、部位1(ヘリックス1[9〜35]及びループ1[36〜71]及びヘリックス4[155〜184])に少なくとも1つの点変異を有する、実施形態1から52のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２２８】
54.  成長ホルモン変異体が、ヘリックス1に少なくとも1つの点変異を有する、例えば、Met14、His18、His21、Gln22及びPhe25に対応する位置に変異を有する、実施形態1から53のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２２９】
55.  成長ホルモン変異体が、ループ1に少なくとも1つの点変異を有する、例えば、Lys41、Tyr42、Leu45、Gln46、Asn47、Pro48、Gln49、Ser51、Leu52、Pro59、Pro61、Ser62、Asn63、Arg64、Thr67、Glu65及びGln68に対応する位置に変異を有する、実施形態1から54のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２３０】
56.  成長ホルモン変異体が、ループ1に少なくとも1つの点変異を有する、例えば、Lys41、Leu45、Pro59、Pro61、Arg64及びGlu65に対応する位置に変異を有する、実施形態1から55のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２３１】
57.  成長ホルモン変異体が、ヘリックス4に少なくとも1つの点変異を有する、例えば、Tyr164、Arg167、Lys168、Asp171、Lys172、Glu174、Thr175、Phe176、Arg178、Ile179、Cys182、Cys189及びGly190に対応する位置に変異を有する、実施形態1から56のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２３２】
58.  成長ホルモン変異体が、ヘリックス4に少なくとも1つの点変異を有する、例えば、Lys172、Glu174、Thr175、Phe176、及びArg178に対応する位置に変異を有する、実施形態1から57のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２３３】
59.  成長ホルモン変異体が、部位2(N-末端及びヘリックス1[1〜35]及びループ2/ヘリックス3[99〜127])に少なくとも1つの点変異を有する、実施形態1から58のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２３４】
60.  成長ホルモン変異体が、N-末端及びヘリックス1に少なくとも1つの点変異を有する、例えば、Phe1、Pro2、Ile4、Pro5、Leu6、Arg8、Leu9、Asn12、Ala13、Leu15、Arg16及びArg19に対応する位置に変異を有する、実施形態1から59のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２３５】
61.  成長ホルモン変異体が、ループ2/ヘリックス3に少なくとも1つの点変異を有する、例えば、Val102、Tyr103、Asn109、Asp116、Leu117、Glu119、Gly120及びThr123に対応する位置に変異を有する、実施形態1から60のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２３６】
62.  成長ホルモン変異体が、ヘリックス3(AA107〜127)に少なくとも1つの点変異を有する、実施形態1から61のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２３７】
63.  成長ホルモン変異体が、ヘリックス3に少なくとも1つの点変異を有する、例えば、Asn109、Asp116、Leu117、Glu119、Gly120及びThr123に対応する位置に変異を有する、実施形態1から62のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２３８】
64.  成長ホルモン変異体が、Gly120の位置に少なくとも1つの点変異を有する、実施形態1から63のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２３９】
65.  成長ホルモン変異体が、Lys41、Arg64、Lys172及び/又はGly120に対応する位置に少なくとも1つの点変異を有する、実施形態1から64のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２４０】
66.  成長ホルモン変異体が、Lys41、Arg64及び/又はLys172に対応する位置に少なくとも1つの点変異を有する、実施形態1から65のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２４１】
67.  成長ホルモン変異体が、部位1又は部位2に少なくとも1つのアミノ酸残基の欠失を有する、実施形態1から66のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２４２】
68.  Fcドメインが成長ホルモン変異体に共有結合的に連結している、実施形態1から67のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２４３】
69.  ペプチド結合によって連結している、実施形態1から68のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２４４】
70.  GH変異体とFcポリペプチドの融合タンパク質を含む、実施形態1から69のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２４５】
71.  GH変異体とFcポリペプチドの融合タンパク質を含む、実施形態1から70のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物であって、前記融合タンパク質がGS-リンカー等のリンカーペプチドを含む、成長ホルモン化合物。
【０２４６】
72.  唯一のGH変異体ポリペプチドと2つのFcポリペプチド(一価)を含む、実施形態1から71のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２４７】
73.  2つのGH変異体ポリペプチドと2つのFcポリペプチド(二価)を含む、実施形態1から72のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２４８】
74.  GH変異体ポリペプチドが、GHのN末端又はC末端を介してFcドメインに連結されている、実施形態1から73のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２４９】
75.  GH変異体ポリペプチドが、FcポリペプチドのN末端又はC末端に連結されている、実施形態1から74のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２５０】
76.  唯一のGH変異体ポリペプチドが、Fcドメインの1つのFcポリペプチドのN末端に連結されている、実施形態1から75のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２５１】
77.  唯一のGH変異体ポリペプチドが、Fcドメインの1つのFcポリペプチドのC末端に連結されている、実施形態1から76のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２５２】
78.  FcドメインのFcポリペプチドが共有結合的に連結されている、実施形態1から77のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２５３】
79.  FcドメインのFcポリペプチドが、少なくとも1つのジスルフィド結合を介して共有結合的に連結されている、実施形態1から78のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２５４】
80.  Fcポリペプチドが、ヒンジ領域中の少なくとも1つのジスルフィド結合を介して共有結合的に連結されている、実施形態1から79のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２５５】
81.  Fcポリペプチドが、2つ又は3つの定常ドメインを含む、実施形態1から80のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２５６】
82.  Fcポリペプチドが、アイソタイプIgG、IgA又はIgDのものである、実施形態1から81のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２５７】
83.  Fcポリペプチドが、サブタイプIgG1、IgG2又はIgG4を有するアイソタイプIgGのものであり、例えば、配列番号3(11〜227)によって規定されるIgG1のものである、実施形態1から82のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２５８】
84.  Fcポリペプチドがヒンジ領域を含み、前記ヒンジ領域が1つ又は複数のシステインを任意選択で含む、実施形態1から83のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２５９】
85.  Fcポリペプチドが、1つ又は複数の点変異を有する、実施形態1から84のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２６０】
86.  FcポリペプチドがIgG4タイプのものであり、S228の位置にプロリン残基を有する、実施形態1から85のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２６１】
87.  FcポリペプチドがIgG1タイプのものであり、L234A、L235E、及びG237Aの点変異の1つ又は複数を有する、実施形態1から86のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２６２】
88.  FcポリペプチドがIgG1タイプのものであり、A330S及びP331Sの点変異の1つ又は複数を有する、実施形態1から87のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２６３】
89.  Fcポリペプチドが、FcRnへの結合親和性を向上させるために1つ又は複数の変異を有する、実施形態1から88のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２６４】
90.  FcポリペプチドがIgG1タイプのものであり、M428L及びN434Sの点変異の1つ又は複数を有する、実施形態1から89のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２６５】
91.  実施形態1から90のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物を含む、医薬組成物。
【０２６６】
92.  治療する方法で使用するための、実施形態1から90のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２６７】
93.  GHD及び/又はAGHDを治療する方法で使用するための、実施形態1から90のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２６８】
94.  IBD又はCDを治療する方法で使用するための、実施形態1から90のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物。
【０２６９】
95.  治療有効量の成長ホルモン化合物を、必要とする個体に投与することを含む、GHD及び/又はAGHDを治療する方法であって、成長ホルモン化合物が、抗体Fcドメインに連結された成長ホルモン変異体である方法。
【０２７０】
96.  実施形態70から90のいずれか一つに規定のGH変異体とFcポリペプチドの融合体をコードする、単離されたヌクレオチド配列。
【０２７１】
97.  実施形態70から90のいずれか一つに規定のGH変異体とFcポリペプチドの融合体をコードする、発現ベクター。
【０２７２】
98.  実施形態70から90のいずれか一つに規定のGH変異体とFcポリペプチドの融合体を発現する、宿主細胞。
【０２７３】
99.  a)  成長ホルモン変異体ポリペプチドを発現する宿主細胞を得るステップ、
b)  2つのFc-ポリペプチドの会合によってFcドメインを形成することが可能なFcポリペプチドを発現する宿主細胞を得るステップ、
c)  前記宿主細胞から前記成長ホルモン変異体ポリペプチド及び2つのFcポリペプチドによって形成された前記Fcドメインを発現させ、精製するステップ、
d)  成長ホルモン変異体ポリペプチドとFcドメインを連結するステップ、並びに
e)  前記成長ホルモン化合物を得るステップ
を含む、実施形態1から98のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物を調製する方法。
【０２７４】
100.  a)  GH変異体とFcポリペプチドの融合体を発現する宿主細胞(1)を得るステップ、
b)  a)の宿主細胞(1)と同一であってもよい、Fcポリペプチドを発現する宿主細胞(2)を任意選択で得るステップ、
c)  前記宿主細胞から前記ポリペプチドを発現させ、精製するステップ、並びに
d)  GH変異体-Fcポリペプチド融合体を含む成長ホルモン化合物を得るステップ
を含む、GH変異体とFcポリペプチドの融合体を含む、実施形態68から88のいずれか一つに記載の成長ホルモン化合物を調製する方法。
【０２７５】
101.  実施形態1から100のいずれか一つに規定の成長ホルモン変異体を含む、増加した血漿中半減期を有する成長ホルモン化合物を調製する方法。 
【０２７６】
102.  ヒト成長ホルモン配列(配列番号1)を含む同等の化合物に対して増加した血漿中半減期が得られる、実施形態101に記載の方法。
【０２７７】
103.  成長ホルモン化合物が成長ホルモン変異体と遅延化実体(protracting entity)とを含む、実施形態101に記載の方法。
【０２７８】
104.  成長ホルモン化合物が、遅延化実体としての抗体Fcドメインに連結された成長ホルモン変異体を含む、実施形態103に記載の方法。
【実施例】
【０２７９】
A.GH-Fc化合物を調製する一般的方法
成長ホルモンポリペプチド(野生型及び変異体)、並びにそのFc融合体を、以下のように発現及び精製することができる。
【０２８０】
成長ホルモンポリペプチドをコードする遺伝子をプラスミドベクターに組換え的に挿入する。続いて適切な大腸菌(E.coli)株を、プラスミドベクターの使用によりトランスフォームする。hGH又はGH変異体を、N末端メチオニンにより又はMEAE融合体として発現させることができ、MEAE配列は後に切断される。
【０２８１】
部位特異的点変異を、PCR(Quik Change Lightening Site-Directed Mutagenesis Kit、Agilent Technologies Site-Directed Mutagenesis Kit、カタログ番号210519)の使用により導入した。組換え核酸技術を使用して、GH変異体を、2つの配列の間のS(G4S)6リンカーを用いてhIgG1 Fcと縮合した。hGH-リンカー-Fc(hIgG1)及びFc(hIgG1)をコードする遺伝子を、それぞれEcoRI及びBamHIの部位において、個別のpJSV002プラスミドに(別々に)クローンし(国際公開第08009545号)、繁殖させてプラスミドを調製するため、大腸菌Top 10にトランスフォームした。Fc変異体は、hIgG1 Fcをコードする配列に部位特異的点変異を導入して得ることができる。
【０２８２】
ヒト及びラットFcコードDNAセグメントを使用し、ヒト成長ホルモン又はその変異体の融合体を、GHコード配列のC末端又はN末端のいずれかにおいて生成した。ここで、ペプチドリンカーS(G4S)6をGH部分とFc部分の間に挿入した。同様に、Fcへの結合も、C末端又はN末端のいずれかに、例えば、ヒンジ領域のCH2及びCH3領域維持部分のN末端に実施した。Fc配列を、ジスルフィド結合によりFcドメインを安定化することができる2つのシステインを含む「DKTHTCPPCP」を維持しながら、「SEPKSC」の欠損により短縮した(配列番号3を参照すること)。
【０２８３】
細胞、並びにhGH及びhGH変異体ポリペプチドの発現
細胞貯蔵物を、25%グリセロールにより調製し、-80℃で保存した。グリセロール貯蔵株をLBプレートに接種し、続いて37℃で一晩インキュベートした。各プレートの内容物をLB培地で洗浄し、発現のために500mLのLB培地で希釈した。培養物を、OD600が0.6に達するまで、220rpmにより振とうしながら37℃でインキュベートした。続いて誘導は、16時間にわたって25℃で0.2mMのIPTGを使用して実施する。細胞を、最終的に遠心分離により採取する。
【０２８４】
続いて細胞を、0.05%のTween20、2.5mMのEDTA、4Mの尿素及び任意選択で10mMのシステアミンを含有する10mMのTris-HCl、pH=9.0に懸濁する。細胞を、30kPSIで細胞破砕機(cell disrupter)を使用して破砕する。上澄みを遠心分離により収集し、続いてクロマトグラフィー精製に付す。精製は、イオン交換クロマトグラフィー及び疎水性相互作用を使用し、続いて、CHO細胞に発現しているヒトジペプチジルペプチダーゼI(hDPPI)の使用によるペプチドタグの除去によって実施する。最終精製は、イソ沈殿(isoprecipitation)及びイオン交換クロマトグラフィーにより達成される。精製は、これらに限定されないが、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及び当業者に既知の膜に基づいた分離技術を使用して達成することもできる。
【０２８５】
細胞及び成長ホルモンFc融合体の発現
HEK293 6E細胞(Invitrogen)を、25μg/mlのGeneticin 418及び0.1%のpluronic F-68を含有する培地FreeStyleTM-293(Life Technologies)中に1×106細胞/mlで増殖させた。hGH-リンカー-Fc又はFcをコードする2つのプラスミド(pJSV002)を、Opti-MEM(登録商標)Reduced Serum Medium(Life Technologies)及び293fectin(Invitrogen)の使用によりトランスフェクトした。各トランスフェクションは、200mlのHEK293 6E細胞をトランスフェクトするために、それぞれ100ugのプラスミドを使用した。増殖の第1日目の後、等量の新たな培地を培養物に加え、培養上澄みを、培養の更に4〜5日後に採取した。
【０２８６】
培養物の上澄みを、MabSelectSureアフィニティーカラム(GE Healthcare)の装填する前に、0.22μmフィルターで濾過した。標的タンパク質を、20mMのギ酸、100mMのNaCl、pH3.5を含有する緩衝剤で溶出した。次に、収集したピーク画分(UV280でモニターした)を1MのTris-HCl、pH9.0によりpH8.5に調整し、30Qアニオン交換クロマトグラフィー(GE Healthcare)により更に精製し、これを、25mMのTris-HCl、pH8.5を含有する緩衝剤で予備平衡した。標的タンパク質を、25mMのTrisHCl、pH8.5中のNaClの0〜0.3Mの直線勾配を5ベッド体積で用いて溶出した。標的タンパク質を含有する画分を、SDS-PAGEにより同定し、G-25脱塩カラム(GE Healthcare)を使用するPBS、pH7.2への緩衝剤交換のためにプールした。タンパク質濃度は、280nmolでの吸光度を測定することにより決定した。
【０２８７】
成長ホルモンコンジュゲートの生成
延長部分を有する成長ホルモンポリペプチドのコンジュゲートは、当該技術に記載されている通りに実施することができる。当業者は、様々な技術を適用して、上記に記載されたように発現及び精製された成長ホルモンポリペプチドの異なるアミノ酸残基に、延長部分を付加することを知っている。そのような方法の例は、延長成長ホルモン化合物を生成する以前に記載された方法を参照する、背景技術のセクションに提示されている参考文献において見出すことができる。
【０２８８】
B.部位1を介したhGHRへのhGH及びGH化合物の受容体相互作用を試験する一般的方法(Biacore)
GH化合物の受容体相互作用は、表面プラズモン共鳴(SPR)分析を使用して分析する。方法は、GH化合物にとって一般的である。
部位1を介したhGH及びGH化合物とhGH受容体との相互作用は、Biacore T100 instrument(GE Healtcare,Sweden)を使用する表面プラズモン共鳴により研究した。抗hGH mAb(Fitzgerald Industries International、USA、#10G05B)を、製造会社の説明書に従って、典型的には5000RUのレベルでCM-5チップに固定した。hGH又はGH化合物を、処理緩衝剤(10mMのHEPES、0.15MのNaCl、30mMのEDTA、0.05%の  Surfactant P20、pH7.4)により10〜25μg/mlで捕捉し、250〜400RUの捕捉リガンドをもたらす。次に0〜800nmolの濃度のhGHRを30ml/分で表面に注入した。固定された抗hGH mAbを有するが、捕捉されたhGHを有さない表面を、基準として使用した。
【０２８９】
動的データを、1:1ラングミュア結合モデルを用いるBiacore(商標)Evaluation Software 2.0によって分析する。
【０２９０】
C.hGH及びhGH化合物の生物学的活性を試験する一般的方法(BAFアッセイ)
hGH化合物の生物学的活性は、細胞に基づいた受容体能力繁殖アッセイ、すなわちBAFアッセイにより測定される。BAF-3細胞(骨髄から誘導されたネズミプロ-Bリンパ球細胞系)は、増殖及び生存がIL-3依存性である。IL-3はJAK-2及びSTATを活性化し、これらは、刺激によりGHを活性化させる同じメディエーターである。BAF-3細胞を、hGH受容体を含有するプラスミドでトランスフェクトした。hGHによる刺激によって繁殖することができるクローンは、hGH依存性細胞系になり、本明細書以降、BAF3-GHRと呼ばれる。細胞系は、GHと用量関連増殖パターンで応答し、したがって、繁殖アッセイにおいて異なるhGH化合物の効果を評価するのに使用することができる。BAF-3 GHR細胞を、飢餓培地(GHなしの培養培地)において37℃、5%のCO2で24時間増殖させる。細胞を遠心分離し、培地を除去し、細胞を飢餓培地に2.22×105細胞/mlで再懸濁する。90μlの細胞上澄みの一部を、マイクロタイタープレート(96 well NUMC-cone)に接種する。異なる濃度の成長ホルモン化合物を細胞に加え、プレートを37℃、5%のCO2で72時間インキュベートする。
【０２９１】
AlamarBlueは、レドックス指示薬、AlamarBlue(商標)(BioSourceカタログ番号Dal 1025)であり、これは、細胞代謝に固有の反応によって低減され、したがって、生細胞数の間接的な測定を提供する。AlamarBlue(商標)を、6回希釈し(5μlのAlamarBlue(商標)+25μlの飢餓培地)、30μlの希釈されたAlamarBlue(商標)を、各ウエルに加える。次に細胞を更に4時間インキュベートする。最後に、細胞の代謝活性を、544nmolの励起フィルター及び590nmolの発光フィルターを使用する蛍光プレートリーダーにより測定する。所定の化合物の結果を、前記化合物のEC50と、並行して実施した野生型hGHのEC50との比として表す。
【０２９２】
D.成長ホルモン化合物の薬物動態パラメーターを評価する一般的方法(正常なラット)
実施例の化合物の薬物動態を、静脈内(i.v.)単回用量の投与後に、雄Sprague Dawleyラットにおいて調査する。
試験化合物を、20mg/mLのグリシン、2mg/mLのマンニトール、2.5mg/mLのNaHCO3、8.2に調整したpHを含有する希釈緩衝剤により最終濃度の11mg/mLに希釈する。
試験化合物を、およそ250gの体重を有する雄Sprague Dawleyラットにより研究する。試験化合物を、0.1mlの体積中15nmolal/ラット(濃度150nmolal/ml)又はおよそ60nmolal/kg体重等の所定の用量を27Gの針を使用して尾静脈にi.v.で単回注射として投与する。
【０２９３】
各試験化合物において、血液試料採取を以下のスケジュールに従って実施する。
【０２９４】
【表１】
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【０２９５】
各試料採取時間において、200μlの血液を、25Gの針の使用により尾静脈又は舌下神経叢から引き抜く。血液を、EDTA被覆試験管の中に試料採取し、1200×Gにより4℃で10分間遠心分離するまで、氷上に保存する。50μlの血漿をMicronic管に移し、分析するまで、-20℃で保存する。
【０２９６】
試験物質濃度は、均質ビーズに基づいたアッセイであるLuminescence Oxygen Channeling Immunoassay(LOCI)により決定される。LOCI試薬は、2つのラテックスビーズ試薬及びサンドイッチの一方の部分であるビオチン化GH結合タンパク質を含む。ビーズ試薬の一方は、一般的な試薬(ドナービーズ)であり、ストレプトアビジンで被覆されており、感光色素を含有する。第2のビーズ試薬(アクセプタービーズ)は抗体で被覆されおり、サンドイッチを作製する。アッセイの際に、3つの反応体は分析物と組み合わされて、ビーズ-凝集体-免疫複合体を形成する。複合体への照明は、ドナービーズから一重項酸素を放出させ、それをアクセプタービーズの中に向け、化学発光を誘発し、これをEnVisionプレートリーダーにより測定する。生成された光の量は、hGH誘導体の濃度と比例する。LOCI緩衝剤により40×に希釈した試料/標準物質/対照の2μLを、384ウエルLOCIプレートに適用する。ビオチン化GH結合タンパク質とmAb M94169抗(hGH)コンジュゲートアクセプタービーズの混合物の15μLを、各ウエルに加える(21〜22℃)。プレートを21〜22℃で1時間インキュベートする。30μLのストレプトアビジン被覆ドナービーズ(67μg/mL)を各ウエルに加え、全てを21〜22℃で30分間インキュベートする。プレートを、680nmolレーザーによる励起の後に520〜645nmolのバンド幅を有するフィルター用いて、Envisionプレートリーダーにより21〜22℃で読み取る、1ウエルあたりの合計測定時間は、70msの励起時間を含む210msである。成長ホルモン化合物の検出限界は、50pMである。ノンコンパートメント(non-compartmental)薬物動態分析を、WinNonlin Professional(Pharsight Inc.、Mountain View、CA、USA)の使用により各試験化合物の平均濃度-時間プロファイルに対して実施する。終末相半減期(t1/2)及び平均滞留時間(MRT)の薬物動態パラメーター推定値を計算する。
【０２９７】
E.成長ホルモン化合物のin vivo応答を評価する方法(下垂体切除Sprague Dawleyラット)
in vivo応答を下垂体切除雄Sprague Dawleyラットにより研究した。下垂体切除雄ラットは良く知られており、下垂体が外科的に除去された後に成長ホルモンの産生が生じない、成長ホルモン欠乏症の認められている動物モデルである。これは、ヒトにおける成長ホルモン欠乏症の別の重要な臨床的特徴である、インスリン様増殖因子-1(IGF-1)の低い循環レベルももたらす。
【０２９８】
下垂体切除は、90〜100gの体重を有する4週齢の雄ラットに対して通常実施される。手術の3〜4週間後に研究に参加した動物は、100〜110gの体重を有する。手術後3〜4週間の間に10%を超える体重増加を有する動物は、研究に参加することができない。
【０２９９】
下垂体切除の手順
麻酔及び術前鎮痛
ラットには、フェンタニル-フルアニソン(Hypnorm 1mlあたり0.315mgのフェンタニル及び10mgのフルアニソン)、並びにミダゾラム(Midazolam Accord 1mlあたり5mlのミダゾラム)により麻酔を掛けた。ラットには、滅菌水で希釈したフェンタニル-フルアニソンとミダゾラムの混合物の2ml/kgを腹腔内に投与する。得られた混合物は、1mlあたり0.07875mgのフェンタニル、2.5mgのフルアニソン及び1.25mgのミダゾラムを含有する。
【０３００】
外科的手順
ラットを無菌手術のために準備する。ラットを、下垂体切除の手順のために設計されたHoffman-Reiter定位装置に載せる。
ガラスシリンジに付けた18Gの針を、ラットの右耳の中に導入する。回転運動させながら、針を、鼓膜、中耳及び側頭骨に通す。この位置から下垂体を吸引する。
ラットを定位装置から降ろし、回復のために熱プレートに移す。ラットが回復すると、ケージに移す。
【０３０１】
術後鎮痛及び管理
回復する前、ラットを、滅菌水で希釈した、1mlあたり5mgのカプロフェンを含有する溶液を用いて、1ml/kg(Rimadyl 1mlあたり50mgのカプロフェン)のカプロフェンにより皮下処理する。術後鎮痛は、1mlあたり0.05mgのカプロフェンを5%デキストロース溶液に添加し、これを飲料水の代わりにラットに提供することによって、手術後の2日間にわたって維持する。術後の最初の2日間の後、ラットに飲料水として5%デキストロース溶液を、術後10〜14日間まで提供する。
【０３０２】
下垂体切除Sprague Dawleyラットを、各群に9匹の動物を有する異なる投与群に無作為に割り当てた。一群は、ビヒクルのみを受け、対照群として機能した。全ての試験群において、各動物は、単回i.v.用量の15nmolalの試験化合物を受けた。体重を、0、1、2、3、4、7、8、9、10、11及び14日目の8〜10amに測定した。
各試験化合物において、血液試料採取を以下のスケジュールに従って実施する。
【０３０３】
【表２】
2016511275.tif 000003
【０３０４】
各試料採取時間において、200μlの血液を、25Gの針の使用により尾静脈又は舌下神経叢から引き抜く。血液を、EDTA被覆試験管の中に試料採取し、1200×Gにより4℃で10分間遠心分離するまで、氷上に保存する。50μlの血漿をMicronic管に移し、分析するまで、-20℃で保存する。血漿濃度-時間プロファイルを、各化合物において生成する。ノンコンパートメント薬物動態分析を、WinNonlin Professional(Pharsight Inc.、Mountain View、CA、USA)の使用により各試験化合物の平均濃度-時間プロファイルに対して実施する。終末相半減期(t1/2)及び平均滞留時間(MRT)の薬物動態パラメーター推定値を計算する。
【０３０５】
F.ラットにおいてIGF応答を検出する方法
血漿IGF-1濃度は、市販のELISAアッセイ(Immunodiagnostic Systems Ltd. Octeia Rat/Mouse IGF-1、カタログ番号AC-18F1 IDS Ltd.、Englandからの市販のアッセイ)により決定する。アッセイは、捕獲剤(catcher)として高度にIGF-1特異的なポリクローナル抗体及び検出剤(detector)としてホースラディッシュペルオキシダーゼ標識高親和性モノクローナル抗体を使用するサンドイッチELISAである。アッセイの検出下限は、63ng/mlである。IGF-1血漿濃度-時間プロファイルを、ベースライン修正IGF-1血漿濃度-時間プロファイルと一緒に、各化合物において生成する。ベースライン修正プロファイルがゼロを超える時間及び程度を、化合物効力の測度として使用する。
【０３０６】
G.ミニブタにおいて成長ホルモン化合物の薬物動態パラメーターを評価する方法
実施例の化合物の薬物動態を、皮下(s.c.)単回用量の投与後に、雌Gottingenミニブタにおいて調査する。試験化合物を、20mg/mLのグリシン、2mg/mLのマンニトール、2.5mg/mLのNaHCO3、8.2に調整したpHを含有する希釈緩衝剤により15mg/mLの最終濃度に希釈する。試験化合物を、およそ10〜12kgの体重を有する雌Gottingenミニブタにより研究する。
【０３０７】
試験化合物を、首の右側の、耳からおよそ5〜7cm及び首の中間から7〜9cmに単回皮下注射により投与した。注射は、針の0.5cmが導入されうるように、21gの針にストッパーを付けて行った。各動物は、0.1mL/kgの投与体積で20nmolal/kgの用量を受けた。
【０３０８】
各試験化合物において、血液試料採取を、以下のスケジュールに従って各動物において実施した。投与前、投与の1、4、12、24、36、48、72、96、168、240、336、504、672、840及び1008時間後。2mlの血液試料を、頸静脈に挿入したVacutainerの使用により、麻酔を掛けていないミニブタから収集して、EDTA管に入れた。採血の直後に、管を、十分な混合を確実にするため、穏やかに反転させた。血液を、1500gにより4℃で10分間にわたって遠心分離する前に、氷上に最大10分間保持した。200μlの血漿を、化合物の濃度決定のために、Micronic管にピペットで移し、200μlの血漿を、IGF-1の決定のために、Micronic管にピペットで移した。血漿試料を、分析するまで、-20℃で保存した。
【０３０９】
試験物質濃度を、均質ビーズに基づいたアッセイであるLuminescence Oxygen Channeling Immunoassay(LOCI)により決定した。LOCI試薬は、2つのラテックスビーズ試薬及びサンドイッチの一方の部分であるビオチン化GH結合タンパク質を含む。ビーズ試薬の一方は、一般的な試薬(ドナービーズ)であり、ストレプトアビジンで被覆されており、感光色素を含有する。第2のビーズ試薬(アクセプタービーズ)は抗体で被覆されおり、サンドイッチを作製する。アッセイの際に、3つの反応体は分析物と組み合わされて、ビーズ-凝集体-免疫複合体を形成する。複合体への照明は、ドナービーズから一重項酸素を放出させ、それをアクセプタービーズの中に向け、化学発光を誘発し、これをEnVisionプレートリーダーにより測定する。生成された光の量は、hGH誘導体の濃度と比例する。LOCI緩衝剤により40×に希釈した試料/標準物質/対照の2μLを、384ウエルLOCIプレートに適用する。ビオチン化GH結合タンパク質とmAb M94169抗(hGH)コンジュゲートアクセプタービーズの混合物の15μLを、各ウエルに加える(21〜22℃)。プレートを21〜22℃で1時間インキュベートする。30μLのストレプトアビジン被覆ドナービーズ(67μg/mL)を各ウエルに加え、全てを21〜22℃で30分間インキュベートする。プレートを、680nmolレーザーによる励起の後に520〜645nmolのバンド幅を有するフィルター用いて、Envisionプレートリーダーにより21〜22℃で読み取る、1ウエルあたりの合計測定時間は、70msの励起時間を含む210msである。成長ホルモン化合物の検出限界は、50pMである。
【０３１０】
ノンコンパートメント薬物動態分析を、WinNonlin Professional(Pharsight Inc.、Mountain View、CA、USA)の使用により各試験化合物の平均濃度-時間プロファイルに対して実施した。終末相半減期(t1/2)及び平均滞留時間(MRT)の薬物動態パラメーター推定値を計算した。
【０３１１】
(実施例1)
一連の化合物を調製して(上記のCに記載されたように)、成長ホルモンタンパク質の、ラットFcに対するヒトの配列の機能性、並びに位置及び力価を比較した。化合物を、上記に記載されたように正常なラットにおいて評価し、下記のTable1(表3)に含まれる薬物動態データを提供した。
【０３１２】
【表３】
2016511275.tif 000004
【０３１３】
得られたデータは、ラットにおける半減期(T 1/2)及び平均滞留時間(MRT)の際立った増加が、連結及びFcに非依存的に全ての化合物から得られること、同時に、成長ホルモンに関して、一価が最高値を提供することを実証した。
【０３１４】
(実施例2)
更なる成長ホルモン融合体化合物を生成して、4つまでの点変異を含む成長ホルモン変異体を使用するあらゆる効果を評価した。使用した変異体は、以下の点変異のK41A、R64A、K172A及びG120Rの1つ以上を含む。
【０３１５】
薬物動態データを、上記に記載されたように得て、下記のTable2(表4)に含める。
【０３１６】
【表４】
2016511275.tif 000005
【０３１７】
得られたデータは、半減期(T 1/2)及び平均滞留時間(MRT)の際立った増加が、連結及びFcに非依存的に全ての化合物から得られること、同時に、成長ホルモンに4つ点変異を有する化合物が、特にC末端を介して一価が結合されるとき、最高値を有することを実証した。点変異の数をK41AとK172A又はK41AとR64Aのいずれかに低減しても、依然として高いT 1/2及びMRTを有する化合物をもたらした。
【０３１８】
(実施例3)
更なる成長ホルモン融合体化合物を生成して、安定化ジスルフィド結合及び4つまでの追加の点変異を含む成長ホルモン変異体を使用するあらゆる効果を評価した。安定化ジスルフィド結合は、成長ホルモン化合物の安定/プロテアーゼ抵抗性を増加することを以前に示しているQ84C及びY143C変異を導入することによって得られる。Q84C及びY143C変異を、上記の点変異のK41A、R64A、K172A及びG120Rの1つ以上と組み合わせた化合物の、薬物動態プロファイルへの効果を試験した。
【０３１９】
薬物動態データを、上記に記載されたように得て、下記のTable3(表5)及び図1に含める。
【０３２０】
【表５】
2016511275.tif 000006
【０３２１】
追加のジスルフィド結合及びK41A、R64A及びK172Aから選択される1つ以上の点変異を含む成長ホルモン変異体は、追加のジスルフィド結合を含まない変異体のように、増加した半減期(T 1/2)及び平均滞留時間を有する。
【０３２２】
(実施例4)
上記に記載された化合物の選択肢を、BAFアッセイにより試験し、GH融合化合物のin vitro生物学的活性を、野生型ヒト成長ホルモンと比べて評価した。
【０３２３】
【表６】
2016511275.tif 000007
【０３２４】
K41A、R64A及びK172A変異を含むGH融合化合物は、高いBAF比及び部位1を介するhGHRへの400nmolを超えるSPR KDを有し、変異が、受容体と相互作用する化合物の能力に影響を及ぼすことが確認される。変異を2つだけ含むGH融合変異体は、受容体とのより強い相互作用及び低いBAF比も有し、化合物が生物学的活性を有する可能性が更に高いことが更に注目される、
【０３２５】
(実施例5)
更なる実験において、GH融合体の機能性をSprague Dawleyラットにおいて試験した。
IGF-1血漿濃度を、方法Fに記載されたように測定した。結果(図2に示されている)は、融合化合物がIGF-1応答をラットに誘導できることを実証する。
【０３２６】
加えて、体重に対する効果も測定し、結果を図3に示す。動物の体重増加及び観察されたIGF-1応答によって明らかなように、GH融合化合物には生物学的活性が見出された。
【０３２７】
(実施例6)
選択された化合物の薬物動態パラメーターを、方法Gに記載されたようにミニブタを使用して推定した。上記のように、化合物を、FC配列のN末端とGH変異体のC末端とを示されているように連結している一価融合体として調製した。
【０３２８】
得られたデータをTable5(表7)に提示する。
【０３２９】
【表７】
2016511275.tif 000008
【０３３０】
本発明のある特定の特徴が本明細書において例示及び記載されてきたが、多くの改変、置換、変更及び等価物が、ここで、当業者によって生じる。したがって、添付の特許請求の範囲は、全てのそのような改変及び変更を、本発明の真の精神の範囲内である限り、網羅することを意図することが理解されるべきである。
【図１】
2016511275.tif 000009
【図２】
2016511275.tif 000010
【図３】
2016511275.tif 000011
【配列表】
2016511275000001.app
【国際調査報告】
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2016511275.tif 000013
2016511275.tif 000014
2016511275.tif 000015
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