(57)【要約】  本発明の態様は、癌増殖阻止、癌細胞侵襲阻止および癌再発阻止の活性の一つ以上を有することにより特徴付けられる、フィビュリン３(ＥＧＦ含有フィビュリン様細胞外マトリックスタンパク質１(ＥＦＥＭＰ１)とも称する)ポリペプチド変異体およびそれをコードするヌクレオチド配列を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ. 配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一性を有するアミノ酸配列；および
ii. 癌細胞侵襲の阻止および癌増殖阻止からなる群から選択される少なくとも一つの活性を含み、
配列番号１の２１８位のアミノ酸残基がアスパラギン酸である、単離ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１に示すアミノ酸配列と１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】
癌が低悪性度神経膠腫、中悪性度神経膠腫、高悪性度神経膠腫、線維肉腫、結腸直腸癌、肺癌、結腸癌、肝臓癌、乳癌、前立腺癌および鼻咽頭癌からなる群から選択される、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
癌が神経膠腫である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６】
癌が多形神経膠芽腫である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項７】
活性が癌細胞侵襲の阻止であり、癌細胞が癌幹細胞および非幹様癌細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１の単離ポリペプチドをコードする配列を含む、単離核酸分子。
【請求項９】
核酸がデオキシリボース核酸である、請求項８に記載の単離核酸分子。
【請求項１０】
ｉ. 配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一性を有するアミノ酸配列；および
ii. 癌細胞侵襲の阻止および癌増殖阻止からなる群から選択される少なくとも一つの活性を含み、
配列番号２の２１０位のアミノ酸残基がアスパラギン酸である、単離ポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号２に示すアミノ酸配列と１００％同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１３】
癌が低悪性度神経膠腫、中悪性度神経膠腫、高悪性度神経膠腫、線維肉腫、結腸直腸癌、肺癌、結腸癌、肝臓癌、乳癌、前立腺癌および鼻咽頭癌からなる群から選択される、請求項１０に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１４】
癌が神経膠腫である、請求項１０に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１５】
癌が多形神経膠芽腫である、請求項１０に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１６】
活性が癌細胞侵襲の阻止であり、癌細胞が癌幹細胞および非幹様癌細胞からなる群から選択される、請求項１０に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１０の単離ポリペプチドをコードする配列を含む、単離核酸分子。
【請求項１８】
核酸がデオキシリボース核酸である、請求項１７に記載の単離核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年４月２日出願の米国特許仮出願番号６１／８０７４４５に基づく優先権を主張し、引用によりその全体を本明細書に包含させる。
【０００２】
発明の分野
本発明の態様は、癌増殖阻止、癌細胞侵襲阻止および癌再発阻止の活性の一つ以上を有することにより特徴付けられる、フィビュリン３(ＥＧＦ含有フィビュリン様細胞外マトリックスタンパク質１(ＥＦＥＭＰ１)とも称される)ポリペプチド変異体およびそれをコードするヌクレオチド配列に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
フィビュリン類は、反復上皮増殖因子様ドメインおよび独特なＣ末端構造を有することにより特徴付けられる、分泌型糖タンパク質の７個のメンバーのファミリーである。癌におけるフィビュリンタンパク質機能の研究は、いくつかのフィビュリンタンパク質が腫瘍抑制活性を有し、いくつかが発癌性活性を有することを示している。さらに、いくつかの個々のフィビュリンタンパク質(例えば、フィビュリン３／ＥＦＥＭＰ１)は、組織特異的態様で腫瘍抑制活性または発癌性活性を示す。
【０００４】
ＥＦＥＭＰ１腫瘍抑制機能は次の現象により示される。ＥＦＥＭＰ１は、内皮細胞出芽の抑制を介する抗血管形成機能を有する。ＥＦＥＭＰ１の過発現は、線維肉腫細胞の腫瘍形成能を阻害する。ＥＦＥＭＰ１発現の低下および／またはＥＦＥＭＰ１プロモーターのメチル化が、肺癌、肝癌、乳癌、結腸癌、前立腺癌および鼻咽頭癌で起こる。多形神経膠芽腫、肝細胞癌および鼻咽頭癌におけるＥＦＥＭＰ１発現は、良好な予後と相関する。ＥＦＥＭＰ１は、鼻咽頭癌および神経膠芽腫細胞株におけるＡＫＴシグナル伝達活性を抑制する。
【０００５】
ＥＦＥＭＰ１発癌性機能は次の現象により示される。ＥＦＥＭＰ１発現の増加は、子宮頚癌の予後不良と関係付けられている。臨床試験結果は、ＥＦＥＭＰ１過発現が、乳癌の予後不良と相関することを証明した。膵臓腺癌細胞において、ＥＦＥＭＰ１過発現は異組織(xenograft)の形成を促進する。ＥＦＥＭＰ１は、膵臓癌細胞株におけるＡＫＴシグナル伝達活性を促進する。ある神経膠腫細胞において、ＥＦＥＭＰ１は、インビトロ基質特異的細胞接着を増強し、細胞運動性および分散を促進することが示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
まだ有効な処置が何もない致命的形態の脳腫瘍である多形神経膠芽腫(ＧＢＭ)は、異なる増殖および侵襲特性を有することで特徴付けられる、多様な亜集団の細胞からなる。手術、放射線および化学療法のような処置後のＧＢＭ再発の根底にある機序は決定的には解明されていない。再発は、 神経幹細胞特性を有し、放射線および化学療法に耐性であって、神経幹細胞特性を有するＧＢＭ細胞の侵襲性亜集団(いわゆる腫瘍幹細胞)が原因であろうと推定されている。ＧＢＭ増殖は、血管新生腫瘍微小環境に大きく依存するように見え、抗血管形成治療剤がＧＢＭ腫瘍増殖を一時的に抑制することが示されている。しかし、抗血管形成治療剤はＧＢＭ患者の全体的生存を改善せず、侵襲パターンが増加した腫瘍再発に終わる。これまでは、神経膠腫細胞侵襲を標的とした治療は存在しない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
過去３０年間、手術後の放射線療法にテモゾロミド処置の併用が追加されたにもかかわらず、ＧＢＭ癌患者について生存期間中央値の２.５ヶ月のわずかな延長しか達成されていない。本発明の目的は、ＧＢＭのような癌における癌細胞増殖、侵襲および／または再発の阻止を提供できる、癌治療剤を提供することである。従って、本発明の態様は、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ、タンパク質チロシンキナーゼ２(ＰＴＫ２)およびＮＯＴＣＨを含むタンパク質の活性および／または発現レベルを、癌細胞において調節することにより特徴付けられる、野生型ＥＦＥＭＰ１タンパク質のアミノ酸配列変異体を提供する。癌は、ＧＢＭのような低〜中悪性度神経膠腫、高悪性度神経膠腫、線維肉腫、結腸直腸癌、肺癌、結腸癌、肝臓癌、乳癌、前立腺癌または鼻咽頭癌であり得る。そして、癌細胞は癌幹細胞および非幹様癌細胞であり得る。
【０００８】
本発明のある態様は、(ｉ)配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９９％または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む；および(ii)癌細胞侵襲の阻止、腫瘍増殖の阻止および癌再発の阻止からなる群から選択される少なくとも一つの活性を有する、ポリペプチドを提供する。本発明のある態様は、このようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
【０００９】
本発明のある態様は、(ｉ)配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９９％または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む；および(ii)ＥＧＦＲ発現の阻止、ＥＧＦＲ活性の阻害、ＡＫＴ発現の阻止、ＡＫＴ活性の阻害、ＰＫＴ２発現の阻止、ＰＫＴ２活性の阻害、ＮＯＴＣＨ発現の阻止およびＮＯＴＣＨ活性の阻害からなる群から選択される少なくとも一つの活性を有する、ポリペプチドを提供する。本発明のある態様は、このようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】フィビュリンタンパク質ＥＦＥＭＰ１、ＥＦＥＭＰ２およびフィビュリン５(ＦＢＬＮ５)のCLUSTAL Wアミノ酸配列アライメントである。
【図１Ｂ】ヒト、マウスおよびラットＥＦＥＭＰ１タンパク質、ヒトＥＧＦＲタンパク質の４種のアイソフォームおよびＥＧＦＲの欠失変異体におけるＥＧＦＲ相同領域(ＥＨＲ)のCLUSTAL Wアミノ酸配列アライメントである。
【００１１】
【図２】ＦＬＡＧ標識された野生型ＥＦＥＭＰ１タンパク質構築物Ｅ１および一連のＦＬＡＧ標識されたＥＦＥＭＰ１タンパク質変異体構築物Ｅ２〜Ｅ１１、Ｅ１３〜Ｅ１５およびＥ１８のモジュラー構造の模式図である。
【００１２】
【図３Ａ】図２および実施例１に記載するＥ１〜Ｅ３、Ｅ６〜Ｅ７、Ｅ１０〜Ｅ１１、Ｅ１３およびＥ１５  ｐｃＤＮＡ  ３.１＋構築物ならびにベクターｐｃＤＮＡ  ３.１＋(Ｐ)で安定にトランスフェクトしたＵ２５１細胞株の親培養から開始する、実施例４に記載するＳ.Ｃ.異種移植片アッセイからの腫瘍重量のプロットである。
【図３Ｂ】図２および実施例１に記載するＥ１、Ｅ２、Ｅ５、Ｅ１１、Ｅ１３、Ｅ１５およびＥ１８  ｐＴＲＩＰＺレンチウイルス構築物ならびにベクターｐＴＲＩＰＺ(Ｖｅｃ)を感染させたＵ２５１細胞の親培養から開始する、実施例４に記載するＳ.Ｃ.異種移植片アッセイからの腫瘍重量のプロットである。
【００１３】
【図４Ａ】図２および実施例１に記載するＥ１〜Ｅ３、Ｅ５、Ｅ６〜Ｅ７、Ｅ９〜Ｅ１０、Ｅ１１およびＥ１３〜Ｅ１５  ｐｃＤＮＡ  ３.１＋構築物でおよびベクターｐｃＤＮＡ  ３.１＋(Ｖｅｃ)で安定にトランスフェクトしたＵ２５１細胞の親培養株ならびにＵ２５１親対照細胞(Ｐ)で開始した、実施例５に記載するマトリゲル細胞侵襲アッセイからのtranswellインサートの底面の写真である。
【図４Ｂ】図２および実施例１に記載するＥ１、Ｅ２、Ｅ５、１３、Ｅ１５およびＥ１８  ｐＴＲＩＰＺレンチウイルス構築物ならびにベクターｐＴＲＩＰＺ(Ｖｅｃ)を感染させたＵ２５１神経球細胞培養から開始する、実施例５に記載するマトリゲル侵襲アッセイからの細胞侵襲のプロットである。
【図４Ｃ】図４Ｂに示すマトリゲル侵襲アッセイの細胞で行った、実施例６に記載する酵素電気泳動のゲルの写真である。
【００１４】
【図５】図２および実施例１に記載するＥ１、Ｅ２、Ｅ５およびＥ１０  ｐＴＲＩＰＺレンチウイルス構築物を感染させた親培養Ｕ２５１細胞で実施した、実施例７に記載する免疫ブロットの写真である。
【００１５】
【図６】図２および実施例１に記載するＥ１、Ｅ２およびＥ５  ｐＴＲＩＰＺレンチウイルス構築物を感染させたＵ２５１神経球細胞培養から開始する、実施例８に記載するＩ.Ｃ.異種移植片アッセイからのマウスの生存プロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な記載
本発明により達成される目的は、神経膠腫(例えば、多形神経膠芽腫)のような癌について、癌増殖阻止、癌細胞侵襲阻止および癌再発阻止の活性の少なくとも一つを有する、ＥＦＥＭＰ１ポリペプチド変異体のアミノ酸配列を提供することである。ある態様において、野生型ＥＦＥＭＰ１タンパク質のアミノ酸配列変異体(ＥＦＥＭＰ１由来腫瘍抑制タンパク質(ＥＴＳＰ)と称することもある)は、高速増殖性および侵襲性神経膠腫腫瘍細胞亜集団の増殖および侵襲活性を、同所性腫瘍フォーマティングで個々に、また同時に抑制する。このようなＥＴＳＰは、少なくとも一部、野生型ＥＦＥＭＰ１のアミノ酸配列相同性試験および変異体ＥＦＥＭＰ１ポリペプチドの実験により発見された。
【００１７】
図１Ａは、野生型ＥＦＥＭＰ１、ＥＦＥＭＰ２およびフィビュリン５(ＦＢＬＮ５)のアミノ酸配列のCLUSTAL W(１.８３)アライメントであり、これは、ＥＦＥＭＰ１がＥＦＥＭＰ２およびＦＢＬＮ５より長いタンパク質であるが、高度の配列類似性がこれらのタンパク質で存在することを示す。図１Ａはまた、野生型ＥＦＥＭＰ１およびＦＢＬＮ５それぞれにおける、弱い(ＲＧＥ)および強い(ＲＧＤ)インテグリン結合部位の位置も示す。図１Ｂは、ＥＦＥＭＰ１における３８アミノ酸ＥＧＦＲ相同領域(ＥＨＲ)のCLUSTAL W(１.８３)アライメントである。整列させたＥＨＲアミノ酸配列は、ヒト、マウスおよびラットＥＦＥＭＰ１；ヒトＥＧＦＲの４種のアイソフォーム(ＥＧＦＲｖ１、ＥＧＦＲｖ２、ＥＧＦＲｖ３、ＥＧＦＲｖ４)；およびヒト癌において同定されたＥＧＦＲの欠失変異体(ＥＧＦＲｖIII)である。
【００１８】
図２は、構築物Ｅ１〜Ｅ１１、Ｅ１３〜Ｅ１５およびＥ１８によりコードされる一連のＦＬＡＧ標識されたＥＦＥＭＰ１タンパク質のモジュラードメインの模式図である。構築物Ｅ１は、シグナルペプチド、ＤＳＬモチーフ、挿入を有するＥＧＦ様モジュール、１〜５と番号付けされた５個のＥＧＦ様モジュールおよびフィビュリン型モジュールを含む、野生型(ｗｔ)アミノ酸配列を有する完全長ＥＦＥＭＰ１タンパク質をコードする。
【００１９】
構築物Ｅ２は、アミノ酸８１〜１７２が欠失しており、ＥＦＥＭＰ１特異的な、ｗｔ  ＥＦＥＭＰ１の挿入を有するＥＧＦ様モジュールが大部分除去されている、ＥＦＥＭＰ１変異体をコードする。
【００２０】
構築物Ｅ３は、アミノ酸３７９〜４９３が欠失しており、ｗｔ  ＥＦＥＭＰ１のフィビュリン型モジュールを大部分除去されている、ＥＦＥＭＰ１変異体をコードする。
【００２１】
構築物Ｅ４は、アミノ酸１８６がアラニンからグリシンに変えられ、ｗｔ  ＥＦＥＭＰ１の弱いインテグリン結合部位が強いインテグリン結合部位に変えられている、ＥＦＥＭＰ１変異体をコードする。
【００２２】
構築物Ｅ５は、アミノ酸３７９〜４９３が欠失しており、ｗｔ  ＥＦＥＭＰ１のフィビュリン型モジュールが大部分除去され、アミノ酸２１０がグルタミン酸からアスパラギン酸に変えられ、ｗｔ  ＥＦＥＭＰ１の弱いインテグリン結合部位が強いインテグリン結合部位に変えられている、ＥＦＥＭＰ１変異体をコードする。
【００２３】
構築物Ｅ６は、アミノ酸１７３〜２１３および３７９〜４９３が欠失しており、ｗｔ  ＥＦＥＭＰ１のＥＧＦ様モジュールおよびフィビュリン型モジュールが大部分除去されている、ＥＦＥＭＰ１変異体をコードする。
【００２４】
構築物Ｅ７は、アミノ酸１７３〜２１３が欠失しており、ｗｔ  ＥＦＥＭＰ１のＥＧＦ様モジュールが大部分除去されている、ＥＦＥＭＰ１変異体をコードする。
【００２５】
構築物Ｅ８は、アミノ酸３７９〜４９３が欠失しており、ｗｔ  ＥＦＥＭＰ１のフィビュリン型モジュールが大部分除去され、アミノ酸１８６がアラニンからグリシンに変えられ、ｗｔ  ＥＦＥＭＰ１の弱いインテグリン結合部位が強いインテグリン結合部位に変えされている、ＥＦＥＭＰ１変異体をコードする。
【００２６】
構築物Ｅ９は、アミノ酸１８６がアラニンからグリシンに変えられ、アミノ酸２１０がグルタミン酸からアスパラギン酸に変えられ、ｗｔ  ＥＦＥＭＰ１の２カ所の弱いインテグリン結合部位が２カ所の強いインテグリン結合部位に変えられている、ＥＦＥＭＰ１変異体をコードする。
【００２７】
構築物Ｅ１０は、アミノ酸１３０がメチオニンからバリンに変更され、ＥＧＦＲと配列類似性を共有する挿入を有するＥＧＦ様モジュールにおける２０アミノ酸配列に位置するヒトｗｔ  ＥＦＥＭＰ１におけるそのアミノ酸残基が、対応するマウスおよびラットＥＦＥＭＰ１残基に変えられている、ＥＦＥＭＰ１変異体をコードする。
【００２８】
構築物Ｅ１１は、アミノ酸４４〜１７２および３７９〜４９３が欠失しており、ｗｔ  ＥＦＥＭＰ１のＤＳＬモチーフが一部除去され、ｗｔ  ＥＦＥＭＰ１の挿入を有するＥＧＦ様モジュールおよびフィビュリン型モジュールが大部分除去されている、ＥＦＥＭＰ１変異体をコードする。
【００２９】
構築物Ｅ１３は、アミノ酸２１４〜４９３が欠失しており、ｗｔ  ＥＦＥＭＰ１のＥＧＦ様モジュール２〜５およびフィビュリン型モジュールが大部分除去されている、ＥＦＥＭＰ１変異体をコードする。
【００３０】
構築物Ｅ１４は、アミノ酸２１４〜４９３が欠失しており、ｗｔ  ＥＦＥＭＰ１のＥＧＦ様モジュール２〜５およびフィビュリン型モジュールが大部分除去され、アミノ酸１８６がアラニンからグリシンに変えられ、ｗｔ  ＥＦＥＭＰ１の弱いインテグリン結合部位が強い結合部位に変えられている、ＥＦＥＭＰ１変異体をコードする。
【００３１】
構築物Ｅ１５は、アミノ酸２１４〜４９３が欠失しており、ｗｔ  ＥＦＥＭＰ１のＥＧＦ様モジュール２〜５およびフィビュリン型モジュールの大部分が除去され、アミノ酸２１０がグルタミン酸からアスパラギン酸に変えられ、ｗｔ  ＥＦＥＭＰ１の弱いインテグリン結合部位が強い結合部位に変えられている、ＥＦＥＭＰ１変異体をコードする。
【００３２】
構築物Ｅ１８は、アミノ酸１７３〜４９３が欠失しており、ｗｔ  ＥＦＥＭＰ１のＥＧＦ様モジュール１〜５およびフィビュリン型モジュールが大部分除去されている、ＥＦＥＭＰ１変異体をコードする。
【００３３】
Ｕ２５１は、ヒト多形神経膠芽腫に由来する高腫瘍形成能悪性神経膠腫細胞株である。Ｕ２５１を培養するための種々のプロトコールが存在する。Ｕ２５１の親培養は血清含有および粘着性である。Ｕ２５１の神経球(ＮＳ)培養は無血清および非粘着性またはフィブロネクチン固着粘着性であり、正常神経幹細胞の培養のために使用するサプリメントを用いる。Ｕ２５１は異なる細胞亜集団からなる。親培養において、細胞亜集団の大部分は染色体７の２個の正常コピーと１個の染色体７の７ｑ欠失コピーを担持する。ＮＳ培養において、細胞亜集団の大部分は染色体７の１個の正常コピーと染色体７の１個の７ｑ欠失コピーを担持する。
【００３４】
染色体７の２個の正常コピーと染色体７の１個の７ｑ欠失コピーを担持するＵ２５１細胞は、実施例４に記載するＳ.Ｃ.異種移植片アッセイで速い増殖を示す。これらはまた実施例８に記載するＩ.Ｃ.異種移植片アッセイにおいて、侵襲性を欠くが、腫瘍塊の大部分を形成する。
【００３５】
染色体７の１個の正常コピーと染色体７の１個の７ｑ欠失コピーを担持するＵ２５１−ＮＳ細胞は、実施例５および６に記載するマトリゲル侵襲および酵素電気泳動アッセイにおいて、高レベルの侵襲性を示す。これらはまた、腫瘍幹様細胞特性を有し、実施例４に記載するＳ.Ｃ.異種移植片アッセイにおいて腫瘍形成能を欠く。血管内皮細胞増殖因子を過発現するようにトランスフェクトされたＵ２５１−ＮＳ細胞は、実施例４に記載する皮下(Ｓ.Ｃ.)異種移植片アッセイにおいて、腫瘍を形成する。Ｕ２５１−ＮＳ細胞は、実施例８に記載する頭蓋内(Ｉ.Ｃ.)異種移植片アッセイにおいて、侵襲性の腫瘍を形成する。そして、これらは、実施例８に記載するＩ.Ｃ.異種移植片アッセイにおいて、染色体７の２個の正常コピーと染色体７の１個の７ｑ欠失コピーを担持するＵ２５１細胞よりも侵襲性である。
【００３６】
表１は、３タイプのＵ２５１細胞培養で得られたｑＲＴ−ＰＣＲ結果を記載する。第一のタイプは、図２および実施例１に記載するＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１３、Ｅ１４、Ｅ１５およびＥ１８  ｐｃＤＮＡ  ３.１＋構築物ならびにプラスミドベクターｐｃＤＮＡ  ３.１＋(Ｖｅｃ)で安定にトランスフェクトしたＵ２５１細胞株の親培養であった。第二のタイプは、図２および実施例２に記載するＥ１、Ｅ２、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ１１、Ｅ１３、Ｅ１５およびＥ１８  ｐＴＲＩＰＺレンチウイルス構築物ならびにプラスミドベクターｐＴＲＩＰＺ(Ｖｅｃ)を感染させたＵ２５１細胞の親培養であった。第三のタイプは、図２および実施例２に記載するＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ５、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１３、Ｅ１５およびＥ１８  ｐＴＲＩＰＺレンチウイルス構築物ならびにプラスミドベクターｐＴＲＩＰＺ(Ｖｅｃ)を感染させた、Ｕ２５１神経球細胞(Ｕ２５１−ＮＳ)培養であった。ＰＣＲプライマー対の順方向プライマーをＦＬＡＧタグとアニールし、逆方向プライマーをＥＦＥＭＰ１のエクソン４とアニールした。
【００３７】
表１の結果は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１３、Ｅ１４、Ｅ１５およびＥ１８構築物が、Ｕ２５１トランスフェクタント細胞の親培養で発現されることを示す。表１の結果はまた、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ１１、Ｅ１３、Ｅ１５およびＥ１８構築物が、ドキシサイクリン誘導性で、Ｕ２５１レンチウイルスインフェクタント細胞の親培養で発現されることも示す。Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ５、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１３、Ｅ１５およびＥ１８構築物は、ドキシサイクリンを含む、Ｕ２５１の神経球(Ｕ２５１−ＮＳ)培養レンチウイルスインフェクタント細胞でも発現される。
【表１】
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【００３８】
表２は、図２および実施例１に記載するＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１３、Ｅ１４およびＥ１５  ｐｃＤＮＡ  ３.１＋構築物ならびにプラスミドベクターｐｃＤＮＡ  ３.１＋(Ｖｅｃ)で安定にトランスフェクトしたＵ２５１細胞の親培養株で開始する、実施例３に記載する足場非依存性増殖および細胞増殖軟寒天コロニー形成アッセイにより得られた結果を記載する。表２はまた、図２および実施例２に記載するＥ１、Ｅ２、Ｅ５、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１３、Ｅ１５およびＥ１８  ｐＴＲＩＰＺレンチウイルス構築物ならびにプラスミドベクターｐＴＲＩＰＺ(Ｖｅｃ)を感染させたＵ２５１神経球細胞(Ｕ２５１−ＮＳ)培養で開始した、実施例３に記載する足場非依存性増殖および細胞増殖軟寒天コロニー形成アッセイにより得られた結果を記載する。レンチウイルスインフェクタントを、導入遺伝子を発現させるためにドキシサイクリン含有培地で培養し、蛍光顕微鏡でＲＦＰ発現をアッセイすることにより発現を確認した。表２の結果は、構築物Ｅ２、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ１１、Ｅ１３、Ｅ１４およびＥ１５から発現されたＥＦＥＭＰ１タンパク質変異体がＵ２５１および／またはＵ２５１−ＮＳ細胞増殖を抑制することを示す。ＥＦＥＭＰ１タンパク質変異体Ｅ３が、Ｕ２５１軟寒天アッセイにおいて細胞増殖を増加させることも示す。
【表２】
2016504422.tif 000004
【００３９】
図３Ａは、図２および実施例１に記載するＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１３およびＥ１５  ｐｃＤＮＡ  ３.１＋構築物で安定にトランスフェクトしたＵ２５１細胞の親培養株およびＵ２５１親対照細胞(Ｐ)で開始した、実施例４に記載するＳ.Ｃ.異種移植片アッセイからの腫瘍重量のプロットである。この結果は、構築物Ｅ２、Ｅ３、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ１１およびＥ１５から発現されたＥＦＥＭＰ１タンパク質変異体が、Ｓ.Ｃ.異種移植片アッセイにおいてＵ２５１細胞形成腫瘍を抑制することを示す。
【００４０】
図３Ｂは、図２および実施例２に記載するＥ１、Ｅ２、Ｅ５、Ｅ１１、Ｅ１３、Ｅ１５およびＥ１８  ｐＴＲＩＰＺレンチウイルス構築物ならびにプラスミドベクターｐＴＲＩＰＺ(Ｖｅｃ)を感染させたＵ２５１細胞の親培養で開始した、実施例４に記載したＳ.Ｃ.異種移植片アッセイからの腫瘍重量のプロットである。マウスにドキシサイクリン含有水を１日目から実験の間中与えた。ＲＦＰ発現は得られた腫瘍で示された。この結果は、構築物Ｅ２、Ｅ５、Ｅ１５およびＥ１８から発現されたＥＦＥＭＰ１タンパク質変異体が、Ｓ.Ｃ.異種移植片アッセイにおいてＵ２５１細胞形成腫瘍を抑制することを示す。
【００４１】
図４Ａは、図２および実施例１に記載するＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１３、Ｅ１４およびＥ１５  ｐｃＤＮＡ  ３.１＋構築物およびプラスミドベクターｐｃＤＮＡ  ３.１＋(Ｖｅｃ)で安定にトランスフェクトしたＵ２５１細胞の親培養株ならびにＵ２５１親対照細胞(Ｐ)で開始する、実施例５に記載するマトリゲル細胞侵襲アッセイからの細胞プレートの写真である。この結果は、構築物Ｅ３、Ｅ１１およびＥ１５から発現されたＥＦＥＭＰ１タンパク質変異体は、マトリゲルアッセイにおけるＵ２５１細胞の侵襲性を抑制することを示す。
【００４２】
図４Ｂは、図２および実施例２に記載するＥ１、Ｅ２、Ｅ５、Ｅ１３、Ｅ１５およびＥ１８  ｐＴＲＩＰＺレンチウイルス構築物をおよびプラスミドベクターｐＴＲＩＰＺ(Ｖｅｃ)を感染させたＵ２５１神経球細胞(Ｕ２５１−ＮＳ)培養で開始する、実施例５に記載するマトリゲル侵襲アッセイにおける細胞侵襲のプロットである。レンチウイルスインフェクタントを、導入遺伝子を発現させるためにドキシサイクリン含有培地で培養し、蛍光顕微鏡でＲＦＰ発現をアッセイすることにより発現を確認した。この結果は、構築物Ｅ５から発現されたＥＦＥＭＰ１タンパク質変異体はＵ２５１−ＮＳ細胞侵襲を有意に抑制し、一方、野生型ＥＦＥＭＰ１ならびに構築物Ｅ１、Ｅ１５およびＥ１８から発現されたＥＦＥＭＰ１タンパク質変異体はＵ２５１−ＮＳ細胞侵襲を有意に促進することを示す。
【００４３】
図４Ｃは、図４Ｂに示すマトリゲル侵襲アッセイの細胞で行った、実施例６に記載する酵素電気泳動の２個のゲルの写真である。この結果は、Ｕ２５１−ＮＳ神経膠腫細胞が、酵素電気泳動アッセイで検出して、活性ＭＭＰ２(〜６７kD)を分泌することを示す。ＭＭＰ２は神経膠腫細胞で高度に発現されるプロテアーゼであり、細胞侵襲を担う。また、構築物Ｅ５から発現されるＥＦＥＭＰ１タンパク質変異体は、Ｕ２５１−ＮＳ神経膠腫細胞の活性化ＭＭＰ２産生を有意に阻害し、一方、野生型ＥＦＥＭＰ１ならびに構築物Ｅ１、Ｅ１５およびＥ１８から発現されたＥＦＥＭＰ１タンパク質変異体は、Ｕ２５１−ＮＳ神経膠腫細胞の活性化ＭＭＰ２産生を有意に促進することも示される。
【００４４】
図５は、図２および実施例１に記載するＥ１、Ｅ２、Ｅ５およびＥ１０  ｐＴＲＩＰＺレンチウイルス構築物を感染させた親培養Ｕ２５１細胞で行った、実施例７に記載する免疫ブロットの写真である。レンチウイルスインフェクタントを、導入遺伝子を発現させるためにドキシサイクリン含有培地で３日間培養し、蛍光顕微鏡でＲＦＰ発現をアッセイすることにより発現を確認した。神経膠腫の約４０％がＥＧＦＲを過発現し、ＥＧＦＲ活性化は、細胞生存および増殖増強と機能的に相関する。ＮＯＴＣＨ１発現の増加によるＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化は、癌幹細胞の共通特性である。この結果は、Ｅ５構築物から発現されたＥＦＥＭＰ１タンパク質変異体がＵ２５１細胞においてタンパク質レベルでＥＧＦＲおよびＮＯＣＴＨ１発現を減少させることを示す。ＡＣＴＢ発現レベルを、等タンパク質負荷を示すために使用した。
【００４５】
図６は、図２および実施例１に記載したＥ１、Ｅ２およびＥ５  ｐＴＲＩＰＺレンチウイルス構築物を感染させたＵ２５１神経球細胞(Ｕ２５１−ＮＳ)培養で開始した、実施例８に記載する頭蓋内異種移植片アッセイからのマウスで実施したカプランマイヤー生存プロットである。マウスにドキシサイクリン含有水を１日目から実験の間中与えた。ＲＦＰ発現は得られた腫瘍で示された。この結果は、Ｅ５構築物から発現されたＥＦＥＭＰ１タンパク質変異体が、生存が有意に伸びたことにより測定して、Ｕ２５１−ＮＳ細胞の腫瘍形成能を阻止することが示され、生存期間中央値は２倍を超える。
【００４６】
まとめると、上記データおよび結果は、Ｅ５  ＥＦＥＭＰ１タンパク質変異体が強力なＥＴＳＰであることを示す。ＦＬＡＧ標識Ｅ５  ＥＦＥＭＰ１タンパク質変異体のアミノ酸配列を配列番号１１示す。非ＦＬＡＧ標識Ｅ５  ＥＦＥＭＰ１タンパク質変異体のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【実施例】
【００４７】
実施例１
ＥＦＥＭＰ１欠失／変異構築物。図２に示し、上に記載したＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１３、Ｅ１５およびＥ１８野生型および変異体ＥＦＥＭＰ１タンパク質をコードする発現構築物を、ＥＦＥＭＰ１の２個の別々のｃＤＮＡフラグメントのクローニングおよび／またはライゲーションのための制限部位を作るために設計したプライマーを用いて、ＰＣＲにより製造した。ＰＣＲ産物をＴＡ−クローニングベクターｐＣＲ４.０にクローン化し、配列を確認し、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３.１＋(Life Technologies)およびレンチウイルスベクターｐＴＲＩＰＺにサブクローニングした。シャトルベクターは、赤色蛍光タンパク質(ＲＦＰ)のための同じプロモーター下、ｐＴＲＩＰＺ(Thermo Scientific)におけるＥＦＥＭＰ１野生型および変異体タンパク質の発現のための配列内リボソーム進入部位を導入するために製造されている。
【００４８】
実施例２
Ｕ２５１レンチウイルスインフェクタント。Ｕ２５１(親および神経球培養)レンチウイルスインフェクタントを、ＨＥＫ２９３とプラスミドＤＮＡ構築物(レンチウイルスベクターｐＴＲＩＰＺ空ベクターまたはｐＴＲＩＰＺ−ＥＦＥＭＰ１構築物Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１３、Ｅ１５およびＥ１８を、それの生成された構築物であるｐｓＡＸ２およびｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇと共に)の同時導入によりレンチウイルスで産生した。Ｕ２５１レンチウイルスインフェクタントは、選択抗生物質(１.２５μg／mlピューロマイシン)の存在下１〜２週間培養し、ドキシサイクリン(１μg／ml)を添加して、倒立蛍光顕微鏡検査を用いる生存細胞におけるＲＦＰ発現を介した感染の成功をモニターすることによる非感染細胞の除去後に確立した。
【００４９】
Ｕ２５１安定トランスフェクタント。Ｕ２５１安定トランスフェクタントを、プラスミドＤＮＡ構築物(ｐｃＤＮＡ３.１ベクターまたはｐｃＤＮＡ−Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１３およびＥ１５)でトランスフェクトし、コロニーを形成させるために選択抗生物質(４００μg／mlネオマイシン)下で培養して、確立した。個々のコロニーをピペットチップで採り、６ウェルプレートに移して、コロニーを拡張させた。
【００５０】
実施例３
軟寒天コロニー形成アッセイ。８００〜１０００細胞を、５％ウシ血清または実施例１０に記載するＮＳ培養のためのマイトジェンサプリメントを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２中、１mlの０.３％軟寒天と混合し、同培地中の固化した０.５％軟寒天上に広げた(６ウェルプレートの４個の角のウェルにおいて１ウェルあたり１ml)。同培地の１mlを２週間後および３週間後に添加し、コロニー数を４倍レンズの顕微鏡下に４週間後計数した。細胞は、Ｕ２５１対照細胞および構築物Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１３、Ｅ１４、Ｅ１５またはｐｃＤＮＡ空ベクター(Ｖｅｃ)で安定にトランスフェクトしたＵ２５１細胞であった。細胞を、ドキシサイクリン含有培地で培養して、導入遺伝子発現を発現させた。各ウェルのコロニーの総数を４倍レンズの顕微鏡下で計数し、Ｖｅｃ対照(纏めて設定)からの平均コロニー数に対して正規化した。平均(Ａｖｅ)および標準偏差(ＳＤ)は、４個の独立したウェル上に形成されたコロニーに基づいた。５〜１０個の代表的コロニーを測定し、コロニーの直径により等級付けした。１＋(〜１０μm)、２＋(〜２０μm)、３＋(３０〜４０μm)、４＋(４０〜６０μm)、５＋(５０〜１００μm)、６＋(１００〜２００μm)。
【００５１】
実施例４
皮下(Ｓ.Ｃ.)異種移植片アッセイ。Ｕ２５１ＨＦレンチウイルスインフェクタント細胞株ｐＴＲＩＰＺ−ｖｅｃおよびｐＴＲＩＰＺ−Ｅ１、Ｅ２、Ｅ５、Ｅ１１、Ｅ１３、Ｅ１５およびＥ１８の親培養を１μg／mlドキシサイクリンを含む培地で培養した。１４倍希釈マトリゲル(元の濃度９〜１２mg／ml)を含む５０μl  ＤＭＥＭ／Ｆ１２中の２.５×１０６  Ｕ２５１ＨＦレンチウイルスインフェクタント細胞を、４〜６週齢の雌ヌードマウス(系統ＮＣｒＮｕ−Ｍ、Taconic, Hudson, NY)の左右の大腿の両側の前部に皮下注射した。注射したマウスに、注射の日から１μg／mlドキシサイクリンを含む水を与えた。腫瘍を注射２５日後に摘出し、秤量し、ｔ検定(対応、両側)により解析した。
【００５２】
実施例５
マトリゲル侵襲アッセイ。９〜１２mg／mlマトリゲルを氷上または４℃で融解した。１０ml氷冷無血清培地を融解マトリゲルに添加した。融解マトリゲルを氷冷ＳＦ−ＤＭＥＭ／Ｆ１２で希釈し、transwell(１２ウェル；８μm)に２００μl添加し、室温で＞１時間インキュベートすることにより、プレートを調節した。細胞播種前に、非結合物質を穏やかに吸引して除いた。マトリゲルコーティングは無色であり、不可視である。１００mm皿で８０〜９０％コンフルエンシーまで増殖させた細胞を、１０ml  ＰＢＳで洗浄することにより剥離し、２ml  ０.０５％トリプシン−ＥＤＴＡで３０秒消化させ、トリプシンを除去し、ボトルを軽打することにより細胞を剥離し、１０ml培養培地を添加し、ピペット中を上下させ、細胞を１５mlチューブに移すことにより、細胞を調製した。次いで細胞を遠沈させ、１０〜１５ml  ＳＦ培地に再懸濁し、１０μlを取って、血球計数器で細胞を計数した。次いで、５×１０６細胞を遠沈し、５ml  ＳＦ培地に１×１０６／mlで再懸濁した。５×１０５細胞を被覆transwellに添加し、１ml  ０.０５％ＣＳ培地を底ウェルに添加した。ＣＯ２インキュベーター中で播種し、そこでプレートを２４時間培養した。
【００５３】
マトリゲルを透過した細胞を、次のとおりHEMA3 CMSで染色した。０.５mlの定着性染料をプレートのウェルに添加し、０.２mlをtranswellに添加した。２０分後染料を除いた。次いで、０.５mlの赤色染料をプレートのウェルに添加し、０.２mlをtranswellに添加した。２０分後染料を除いた。次いで、０.５mlの暗青色染料をプレートのウェルに添加し、０.２mlをtranswellに添加した。２０分後染料を除いた。水に浸したＱチップをマトリゲル膜の除去に使用し、これを空気乾燥した。乾燥した膜をスライドに載せ、封入剤を添加した。次いで、カバースライドを上に乗せ、２０倍レンズを使用する顕微鏡を用いて、各フィルターで１０枚の写真を撮った。次いで、撮影した写真に基づき細胞を計数し、１に設定した対照(Ｖｅｃ)と比較し、ｔ検定(対応、両側)により解析した。
【００５４】
実施例６
ゼラチン酵素電気泳動アッセイ。構築物ｐＴＲＩＰＺ−Ｅ１、Ｅ２、Ｅ５、Ｅ１３、Ｅ１５またはＥ１８細胞からの野生型ＥＦＥＭＰ１および変異体ＥＦＥＭＰ１タンパク質を発現するＮＳ培養したＵ２５Ｆレンチウイルスインフェクタント細胞ならびにＮＳ培養Ｕ２５１ＨＦ対照、ｐＴＲＩＰＺ−ｖｅｃ細胞の条件培地を、１μg／mlドキシサイクリン含有無血清ＤＭＦＭ／Ｆ１２培地で４８時間増殖し、次のとおり回収した。細胞を遠沈し、０.３ml上清を１.５mlチューブに移した。タンパク質を１.２ml冷アセトンの添加により上清から沈殿させた。沈殿を、４Ｋ  ＲＰＭで５分、４℃で直ぐに回転させた。条件培地タンパク質(ＣＭ−Ｐ)を１００μl  １×ＲＩＰＡ＋１×プロテアーゼ阻止剤カクテルに再懸濁した。２μlのＣＭ−Ｐを採り、ＢＩＯ−ＲＡＤタンパク質アッセイでタンパク質濃度を決定した。再懸濁したＣＭ−Ｐを８０℃で保存した。
【００５５】
２〜４μgのＣＭ−Ｐを１×ＲＩＰＡおよび２×サンプル緩衝液(１００μl  １０％ＢＢ、１０ml  グリセロール、１ｇ  ＳＤＳ、７.５ml  １Ｍ  Ｔｒｉｓ.ＨＣｌ  ｐＨ６.８、無菌ｄｄＨ２Ｏを５０mlまで添加)と混合し、短く回転させ、１×Ｔｒｉｓ−グリシン−ＳＤＳランニング緩衝液中の酵素電気泳動ゲルに充填した。ゲルを、室温で９０Ｖで２時間流した。ゲルを２.５％Triton X-100で１〜２時間、ＲＴで穏やかに振盪させながら数回線上した。次いで、ゲルを一夜、３７℃でプロテアーゼ反応緩衝液(５０mM  Ｔｒｉｓ  (ｐＨ＝７.５)、１０mM  ＣａＣｌ２、１５０mM  ＮａＣｌ)中インキュベートした。次いで、ゲルを３０分、Coomassie Blue R-250(ｄｄＨ２Ｏ中０.１％クーマシーブルー、１０％酢酸、１０％イソプロパノール)で、穏やかに振盪しながら染色した。次いで、ゲルを１０％酢酸、３０％メタノール溶液で３回、２０分染色し、２枚のセロハン紙の間で一夜乾燥させた。
【００５６】
実施例７
免疫ブロット法。全細胞ライセートの３０〜４０μgタンパク質を、１×Ｔｒｉｓ−グリシン−ＳＤＳランニング緩衝液中の８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに充填した。ゲルを、室温で、９０Ｖで２時間流し、ニトロセルラー膜に移した。５％脱脂乳で１時間ブロットを遮断し、次いで、ＥＧＦＲ(１：１０００希釈)またはＮＯＴＣＨ１(１：１０００希釈)に対するウサギ一次抗体を含む１％ＢＳＡ中で、一夜インキュベートした。次いで、１×ＴＢＳＴで１時間洗浄し、抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰ結合二次抗体(１：１０,０００希釈)と１時間インキュベートした。ＥＣＬ検出キットを使用して、免疫ブロットのシグナルを展開させた。
【００５７】
実施例８
頭蓋内(Ｉ.Ｃ.)異種移植片アッセイ。神経膠腫細胞(１×１０５／３μl  ＤＭＥＭ／Ｆ１２)を、ＩＡＣＵＣ承認手術法に従い、４〜６週齢、雌ヌードマウス(系統ＮＣｒＮｕ−Ｍ、Taconic, Hudson, NY)の前頭葉に注射した。Ｉ.Ｃ.植え込み後、瀕死の徴候(せむし様姿勢、著しい体重減少および歩行障害)についてマウスを連日モニターし、定期的に体重測定した。脳損傷症状(運動失調、半身麻痺など)および／または２０％体重減少を発症したとき、マウスを屠殺し、翌日を生存分析のための生存日として記録した。
【００５８】
実施例９
Ｕ２５１の親培養。Ｕ２５１細胞を、通常の組織培養処理皿で、５％ウシ血清および１×ペニシリン−ストレプトマイシン添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、３７℃、５％ＣＯ２で、湿潤チャンバーで培養した。
【００５９】
実施例１０
Ｕ２５１のＮＳ培養。Ｕ２５１細胞を、寒天(１％)被覆皿で、２０ng／ml  ＥＧＦ、２０ng／ml  ｂＦＧＦ、０.３％Ｂ２７および１×ペニシリン−ストレプトマイシン添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、３７℃、５％ＣＯ２で、湿潤チャンバーで培養した。
【００６０】
次の刊行物は、その全体を引用により本明細書に包含させる。
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Lissemore JL, Starmer WT. Phylogenetic analysis of vertebrate and invertebrate Delta/Serrate/LAG-2 (DSL) proteins. Mol Phylogenet Evol. 1999 Mar;11(2):308-19.
Stone EM, Lotery AJ, Munier FL, Heon E, Piguet B, Guymer RH, Vandenburgh K, Cousin P, Nishimura D, Swiderski RE, Silvestri G, Mackey DA, Hageman GS, Bird AC, Sheffield VC, Schorderet DF. A single EFEMP1 mutation associated with both Malattia Leventinese and Doyne honeycomb retinal dystrophy. Nat Genet. 1999 Jun;22(2):199-202.
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Thermo Scientific Open Biosystems Expression Arrest TRIPZ Lentiviral shRNAmir; Technical Manual.
【００６１】
本開示は、ある態様および実施例の状況で提供されているが、本開示は具体的に記載されたポリペプチドおよび核酸配列の態様を超えて拡張されることは当業者には理解される。従って、本開示は例示的であり、ここでの態様の具体的開示に限定することを意図しない。
【図１Ａ】
2016504422.tif 000005
【図１Ｂ】
2016504422.tif 000006
【図２】
2016504422.tif 000007
【図３Ａ】
2016504422.tif 000008
【図３Ｂ】
2016504422.tif 000009
【図４Ａ】
2016504422.tif 000010
【図４Ｂ】
2016504422.tif 000011
【図４Ｃ】
2016504422.tif 000012
【図５】
2016504422.tif 000013
【図６】
2016504422.tif 000014
【配列表】
2016504422000001.app
【国際調査報告】
2016504422.tif 000015
2016504422.tif 000016