(57)【要約】  本発明は、エプスタインバーウイルス(EBV)のLMP2Aタンパク質に由来するHLA-A2制限CLGGLLTMVペプチドに結合するＴ細胞レセプター(TCR)に関する。本発明のTCRは、TCRα鎖可変ドメイン及び/又はTCRβ鎖可変ドメインを含んでなる。特定の好適なTCRはまた、ペプチド-HLA-A2複合体として提示される天然ペプチド変異型SLGGLLTMV及びCLGGLITMVにも結合する。本発明のTCRは、当該LMP2Aエピトープに関する優れた特異性プロフィールを証明しており、当該複合体に関する結合親和性を有し、このことにより、図３に示す天然型EBV LMP2A TCRα鎖の細胞外配列(配列番号４)及び図４に示す天然型EBV LMP2A TCRβ鎖の細胞外配列(配列番号５)を有する可溶性参照TCRと比較して該複合体を認識する能力が増強している。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
CLGGLLTMV(配列番号１)-HLA-A2複合体に対する結合特性を有し、TCRα鎖可変ドメイン及び/又はTCRβ鎖可変ドメインを含んでなり、
α鎖可変ドメインは、配列番号２のアミノ酸残基１〜113の配列に対して少なくとも80％同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、及び/又は
β鎖可変ドメインは、配列番号３のアミノ酸残基１〜112の配列に対して少なくとも80％同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、
ここで、α鎖可変ドメインは以下の変異：
【表１】
2016528244.tif 000007
の少なくとも１つを有し、及び/又はβ鎖可変ドメインは以下の変異：
【表２】
2016528244.tif 000008
の少なくとも１つを有する、Ｔ細胞レセプター(TCR)。
【請求項２】
(i)α鎖可変ドメインが配列番号６のQ1〜P113；配列番号７のQ1〜P113、配列番号８のQ1〜P113、配列番号９のQ1〜P113、配列番号10のQ1〜P113、配列番号11のQ1〜P113又は配列番号12のQ1〜P113を含んでなり、(ii)β鎖が配列番号13のE1〜T112を含んでなる、請求項１に記載のTCR。
【請求項３】
α鎖TRAC定常ドメイン配列及び/又はβ鎖TRBC1若しくはTRBC2定常ドメイン配列を有するα-βヘテロ二量体である、請求項１又は２に記載のTCR。
【請求項４】
α鎖及びβ鎖定常ドメイン配列が、TRACのエキソン２のCys4とTRBC1又はTRBC2のエキソン２のCys2との間の天然型ジスルフィド結合を欠失するように短縮又は置換により改変されている、請求項３に記載のTCR。
【請求項５】
α鎖及び/又はβ鎖定常ドメイン配列が、TRACのThr48から及びTRBC1又はTRBC2のSer57からシステイン残基への置換により改変されており、該システイン同士が該TCRのα定常ドメインとβ定常ドメインとの間のジスルフィド結合を形成している、請求項３又は４に記載のTCR。
【請求項６】
Vα-L-Vβ型、Vβ-L-Vα型、Vα-Cα-L-Vβ型、Vα-L-Vβ-Cβ型(式中、Vα及びVβはそれぞれTCRα及びβ可変領域であり、Cα及びCβはそれぞれTCRα及びβ定常領域であり、Lはリンカー配列である)の単鎖形式である、請求項１又は２に記載のTCR。
【請求項７】
検出可能な標識、治療剤又はPK調節成分と結合した、請求項１〜６のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項８】
当該TCRのα鎖又はβ鎖のＣ末端又はＮ末端に共有結合した抗CD3抗体を含んでなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載のTCR。
【請求項９】
配列番号６、７、８、９、10、11又は12のα鎖及び抗CD3抗体に融合した配列番号13のβ鎖を有する、請求項８に記載のTCR。
【請求項１０】
β鎖が抗CD3抗体配列にリンカー配列を介して結合している、請求項９に記載のTCR。
【請求項１１】
リンカー配列がGGGGS(配列番号23)、GGGSG(配列番号24)、GGSGG(配列番号25)、GSGGG(配列番号26)、GSGGGP(配列番号27)、GGEPS(配列番号28)、GGEGGGP(配列番号29)及びGGEGGGSEGGGS(配列番号30)からなる群より選択される、請求項１０に記載のTCR。
【請求項１２】
(ａ)α鎖アミノ酸配列及び(ｂ)β鎖-抗CD3アミノ酸配列を含んでなり、α鎖配列が以下：
(i)アミノ酸１〜113が配列番号９の配列のアミノ酸１〜113で置換されている、配列番号２又は配列番号４のTCRα鎖配列；
(ii)アミノ酸１〜113が配列番号９の配列のアミノ酸１〜113で置換されており、１位のアミノ酸がＡで置換されている、配列番号２又は配列番号４のTCRα鎖配列；
(iii)アミノ酸１〜113が配列番号９の配列のアミノ酸１〜113で置換されており、１位のアミノ酸がＧで置換されている、配列番号２又は配列番号４のTCRα鎖配列；
(iv)アミノ酸１〜113が配列番号９の配列のアミノ酸１〜113で置換されており、α鎖のＣ末端が配列番号４の番号付けに基いてF200からS207まで(両端を含む)の８アミノ酸を欠いている、配列番号２又は配列番号４のTCRα鎖配列；
(v)アミノ酸１〜113が配列番号９の配列のアミノ酸１〜113で置換されており、１位のアミノ酸がＡで置換されており、α鎖のＣ末端が配列番号４の番号付けに基いてF200からS207まで(両端を含む)の８アミノ酸を欠いている、配列番号２又は配列番号４のTCRα鎖配列；
(vi)アミノ酸１〜113が配列番号９の配列のアミノ酸１〜113で置換されており、１位のアミノ酸がＧで置換されており、α鎖のＣ末端が配列番号４の番号付けに基いてF200からS207まで(両端を含む)の８アミノ酸を欠いている、配列番号２又は配列番号４のTCRα鎖配列；
からなる群より選択され、及び/又はβ鎖-抗CD3アミノ酸配列が以下：
(vii)１位及び２位のアミノ酸がそれぞれＤ及びＩである、配列番号16のTCRβ鎖-抗CD3配列；
(viii)１位及び２位のアミノ酸がそれぞれＡ及びＩである、配列番号16のTCRβ鎖-抗CD3配列；
(ix)１位及び２位のアミノ酸がそれぞれＡ及びＱである、配列番号16のTCRβ鎖-抗CD3配列；
(x)１位及び２位のアミノ酸がそれぞれＤ及びＩであり、108位〜131位のアミノ酸がRTSGPGDGGKGGPGKGPGGEGTKGTGPGG(配列番号31)で置換され、254位〜258位のアミノ酸がGGEGGGSEGGGS(配列番号30)で置換されている、配列番号16のTCRβ鎖-抗CD3配列；
(xi)１位及び２位のアミノ酸がそれぞれＤ及びＩであり、257位のアミノ酸がＳであり、258位のアミノ酸がＧである、配列番号16のTCRβ鎖-抗CD3配列；
(xii)１位及び２位のアミノ酸がそれぞれＤ及びＩであり、256位のアミノ酸がＳであり、258位のアミノ酸がＧである、配列番号16のTCRβ鎖-抗CD3配列；
(xiii)１位及び２位のアミノ酸がそれぞれＤ及びＩであり、255位のアミノ酸がＳであり、258位のアミノ酸がＧである、配列番号16のTCRβ鎖-抗CD3配列；
(xiv)１位及び２位のアミノ酸がＡ及びＱであり、257位のアミノ酸がＳであり、258位のアミノ酸がＧである、配列番号16の配列を有するTCRβ鎖-抗CD3；
(xv)１位及び２位のアミノ酸がＡ及びＱであり、256位のアミノ酸がＳであり、258位のアミノ酸がＧである、配列番号16の配列を有するTCRβ鎖-抗CD3；
(xvi)１位及び２位のアミノ酸がＡ及びＱであり、255位のアミノ酸がＳであり、258位のアミノ酸がＧである、配列番号16の配列を有するTCRβ鎖-抗CD3；
(xvii)１位及び２位のアミノ酸がそれぞれＡ及びＩであり、257位のアミノ酸がＳであり、258位のアミノ酸がＧである、配列番号16の配列を有するTCRβ鎖-抗CD3；
(xviii)１位及び２位のアミノ酸がそれぞれＡ及びＩであり、256位のアミノ酸がＳであり、258位のアミノ酸がＧである、配列番号16の配列を有するTCRβ鎖-抗CD3；
(xix)１位及び２位のアミノ酸がそれぞれＡ及びＩであり、255位のアミノ酸がＳであり、258位のアミノ酸がＧである、配列番号16の配列を有するTCRβ鎖-抗CD3
からなる群より選択される、請求項８に記載のTCR。
【請求項１３】
α鎖配列及びβ鎖-抗CD3配列の組合せが以下：
α鎖アミノ酸配列が(i)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(vii)である；
α鎖アミノ酸配列が(i)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(x)である；
α鎖アミノ酸配列が(vi)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(ix)である；
α鎖アミノ酸配列が(v)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(viii)である；
α鎖アミノ酸配列が(vi)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(vii)である；
α鎖アミノ酸配列が(i)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xi)である；
α鎖アミノ酸配列が(i)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xii)である；
α鎖アミノ酸配列が(i)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xiii)である；
α鎖アミノ酸配列が(vi)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xiv)である；
α鎖アミノ酸配列が(vi)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xv)である；
α鎖アミノ酸配列が(vi)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xvi)である；
α鎖アミノ酸配列が(v)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xvii)である；
α鎖アミノ酸配列が(v)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xviii)である；
α鎖アミノ酸配列が(v)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xix)である；
α鎖アミノ酸配列が(vi)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xi)である；
α鎖アミノ酸配列が(vi)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xii)である；
α鎖アミノ酸配列が(vi)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xiii)である.
から選択される、請求項１２に記載のTCR。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のTCRをコードする核酸。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のTCRを提示する、天然に存在しない及び/又は精製された及び/又は遺伝子操作された細胞、特にＴ細胞。
【請求項１６】
(ａ)単一のオープンリーディングフレーム又はそれぞれα鎖及びβ鎖をコードする２つの別個のオープンリーディングフレームに請求項１４に記載の核酸を含んでなるTCR発現ベクター；又は
(ｂ)請求項１〜１３のいずれか１項に記載のTCRのα鎖をコードする核酸を含んでなる第１の発現ベクター、及び請求項１〜１３のいずれか１項に記載のTCRのβ鎖をコードする核酸を含んでなる第２の発現ベクター
を有する細胞。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のTCR又は請求項１５若しくは１６に記載の細胞を、１又はそれより多い医薬的に許容され得る担体又は賦形剤と共に含んでなる医薬組成物。
【請求項１８】
医薬における使用のための、ペプチド-HLA-A2複合体として提示されたCLGGLLTMVペプチド(EBV LMP2Aタンパク質に由来)に結合するTCR、又は該TCRを発現及び/若しくは提示する細胞。
【請求項１９】
EBV感染の治療法における使用のための、請求項１８に記載のTCR又は細胞。
【請求項２０】
TCRが請求項１〜１３のいずれか１項に記載のものであり、及び/又は細胞が請求項１５若しくは１６に記載のものである、請求項１８又は１９に記載のTCR又は細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エプスタインバーウイルス(EBV)のLMP2Aタンパク質に由来するHLA-A2制限CLGGLLTMVペプチドに結合するＴ細胞レセプター(TCR)に関する；本TCRは、天然型LMP2A TCRα及び/又はβ可変ドメインに対して変異したα及び/又はβ可変ドメインを含んでなる。特定の好適なTCRはまた、ペプチド-HLA-A2複合体として提示される天然ペプチド変異型SLGGLLTMV及びCLGGLITMVにも結合する。本発明のTCRは、当該LMP2Aエピトープに関する優れた特異性プロフィールを証明しており、当該複合体に関する結合親和性を有し、このことにより、下記の参照EBV LMP2A TCRと比較して該複合体を認識する能力が増強している。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
エプスタインバーウイルス(EBV)は、世界中で最も一般的なヒトウイルスの１つであり、ほとんどの人々が一生のうちのいつかEBVに感染する。米国では、35〜40歳の成人の95％もが感染している。思春期又は青年期には、EBVは、症例の35％〜50％において、発熱、咽頭痛及びリンパ節腫脹を含む症状を有する感染性単核球症を引き起こす。これら症状は通常１、２ヶ月以内に消失するが、EBVは、その人の残りの人生の間、喉及び血液の数個の細胞内で休眠又は潜伏したままである。このウイルスは周期的に再活性化することが可能であるが、通常は疾患の症状を伴わない。EBVはまた、身体の免疫系の幾らかの細胞で生涯にわたる休眠感染を確立する。多くの健常な人々が、一生涯に断続的にこのウイルスを保有し、伝染させ得る。通常、これらの人々がヒト間伝染の一次保有者である。
【０００３】
EBV感染は、単核球症、バーキットリンパ腫、鼻咽腔ガン(NPC)及びホジキンリンパ腫(HL)を含む、幾つかの悪性及び非悪性疾患に関連付けられている(Kutok, J. L.ら，Annu Rev Pathol 2006 1:375‐404)。EBV関連自己免疫の証拠もまた存在する。
LMP2Aは、全てのタイプII及びタイプIII疾患/悪性腫瘍において発現する数個のEBV遺伝子の１つである。LMP2Aは、Ｂ細胞レセプター信号伝達のネガティブモジュレーターとして作用し、チロシンキナーゼの隔絶を介して細胞生存を促進する膜貫通タンパク質である。HLA-A2制限ペプチドCLGGLLTMV(配列番号１)は、非顕在性疾患において最も免疫優勢なLMPエピトープであり、60〜75％の個体でエピトープ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球がエキソビボで検出可能である。CLGGLLTMVペプチドは、長い間、NPC及びHL治療に関して見込みのある標的であるとみられてきた。なぜならば、このエピトープが、NPC患者及びHL患者から採取した生検において保存されており、他のEBV潜在エピトープ同様に免疫学的に弱いからである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
したがって、HLA-A2制限CLGGLLTMVペプチド(天然変異型SLGGLLTMV(配列番号17)及びCLGGLITMV(配列番号18)を含む)は、本発明のEBV TCRが標的可能である適切な疾患マーカーを提供する。本発明のTCRは、養子療法として知られる治療プロセスにおける患者への投与のためにＴ細胞に形質転換され得る(これにより、Ｔ細胞は、当該HLA複合体を提示するEBV感染細胞を破壊できるようになる)。この目的のためには、TCRは、ペプチド-HLA複合体に関して、該複合体に特異的な天然型TCRより高い親和性及び/又は遅い解離速度(off-rate)を有することが望ましい。親和性の劇的増加は、TCR遺伝子改変CD8+Ｔ細胞における抗原特異性の喪失に関連付けられており、この喪失は、これらTCRトランスフェクトCD8+細胞の非特異的活性化をもたらす。よって、ペプチド-HLA複合体に関して、該複合体に特異的な天然型TCRより幾らか高いが、劇的には高くない親和性及び/又は遅いが、劇的には遅くない解離速度を有するTCRが、養子療法には好ましい(Zhaoら(2007) J Immunol. 179:5845-54；Robbinsら(2008) J Immunol. 180:6116-31；及びWO 2008/038002を参照)。本発明の幾つかのTCRは、細胞傷害性又は免疫エフェクター因子をEBV感染細胞に送達する目的に有用であり得る。この使用のためには、TCRは、ペプチド-HLA複合体に関して、該複合体に特異的な天然型TCRより相当に高い親和性及び/又は遅い解離速度を有することが望ましい。例えば、結合親和性は、下記の参照EBV LMP2A TCRのものの少なくとも二倍であり得る。
【０００５】
TCRは、国際免疫遺伝学(International Immunogenetics；IMGT)のTCR命名法を使用して説明され、IMGTのTCR配列についての公開データーベースに関連する。天然型α-βへテロ二量体TCRはα鎖及びβ鎖を有する。広義には、各鎖は、可変領域、連結領域及び定常領域を含んでなり、β鎖は、通常、可変領域と連結領域との間に短い多様性領域をも含有するが、この多様性領域は連結領域の一部と見なされることが多い。各可変領域は、フレームワーク配列中に埋め込まれた３つのCDR(相補性決定領域)を含んでなり、その１つはCDR3と名付けられた超可変領域である。フレームワーク配列、CDR1配列及びCDR2配列並びに部分的に規定されるCDR3配列により区別される幾つかのタイプのα鎖可変(Vα)領域及び幾つかのタイプのβ鎖可変(Vβ)領域が存在する。VαタイプはIMGT命名法では独特なTRAV番号で指称される。よって、「TRAV21」は、独特なフレームワーク配列及びCDR1配列及びCDR2配列、並びにCDR3配列(TCR間で保存されるアミノ酸配列により部分的に規定されるが、TCR間で変化するアミノ酸配列も含む)を有するTCRVα領域を規定する。同様に、「TRBV5-1」は、独特なフレームワーク配列及びCDR1及びCDR2配列を、部分的にのみ規定されるCDR3配列と共に有するTCRVβ領域を規定する。
【０００６】
TCRの連結領域は、同様に、独特なIMGT TRAJ及びTRBJ命名法により規定され、定常領域もIMGT TRAC及びTRBC命名法により規定される。
β鎖多様性領域は、IMGT命名法では略号TRBDで指称され、上記のとおり、TRBD/TRBJ連鎖領域は合わせて連結領域と見なされることが多い。
αβTCRのα鎖及びβ鎖は、一般に、各々が２つの「ドメイン」、すなわち可変ドメイン及び定常ドメインを有すると考えられている。可変ドメインは可変領域及び連結領域の連鎖からなる。したがって、本明細書及び特許請求の範囲において、用語「TCRα可変ドメイン」とはTRAV及びTRAJ領域の連鎖をいい、用語 TCRα定常ドメインとは細胞外TRAC領域又はＣ末端短縮型TRAC配列をいう。同様に、用語「TCRβ可変ドメイン」とは、TRBV及びTRBD/TRBJ領域の連鎖をいい、用語 TCRβ定常ドメインとは、細胞外TRBC領域又はＣ末端短縮型TRBC配列をいう。
【０００７】
IMGT命名法により規定される独特な配列は、広く知られており、TCR分野の当業者に利用可能である。例えば、それらはIMGTの公開データベースに見出すことができる。「T cell Receptor Factsbook」(2001) LeFranc and LeFranc, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8もまた、IMGT命名法により規定される配列を開示しているが、公開日及びその後のタイムラグのため、その情報は、時に、IMGTデータベースを参照して確認する必要がある。
本発明者らは天然型EBV LMP2A TCRを得た(クローンSB34；John Miles[Queensland Institute of Medical Research, Brisbane, Australia]から)。このTCRのDNA及び対応するアミノ酸配列は、ウェブサイト(http://www.tcells.org/scientific/johnmiles/)からダウンロード可能であり、以下のα鎖及びβ鎖を有する：
α鎖：TRAV12-3*01/TRAJ41*01/TRAC(天然型EBV LMP2A TCRα鎖の細胞外配列を図１に示す；配列番号２)。CDRは、配列番号２のアミノ酸27〜32(CDR1)、50〜54(CDR2)及び90〜102(CDR3)により規定される。
β鎖：TRBV11-2*01/TRBD1/TRBJ2-7*01/TRBC2(天然型EBV LMP2A TCRα鎖の細胞外配列を図２に示す；配列番号３)。CDRは、配列番号３のアミノ酸27〜31(CDR1)、49〜54(CDR2)及び94〜102(CDR3)により規定される。
(注記：用語「*01」は、この配列(IMGT命名法により指名されるような配列)について１より多い対立遺伝子変異型(バリアント)が存在し、それが上記TCRクローンに存在する*01変異型であることを示す。また、限定詞「*」なしは、該当配列に関しては唯１つの対立遺伝子のみが既知であることを意味する。)
【０００８】
用語「野生型TCR」、「天然型TCR」、「野生型EBV LMP2A TCR」及び「天然型EBV LMP2A TCR」は、本明細書中で同義に使用され、それぞれ配列番号２及び３の細胞外α鎖及びβ鎖を有する天然に存在するTCRをいう。
本発明のTCRの結合プロフィールと比較し得る参照TCRを提供する目的には、図３に示す天然型EBV LMP2A TCRα鎖の細胞外配列(配列番号４)及び図４に示す天然型EBV LMP2A TCRβ鎖の細胞外配列(配列番号５)を有する可溶性TCRを用いることが好都合である。このTCRを本明細書では「参照TCR」又は「参照EBV LMP2A TCR」と呼ぶ。配列番号４は、C161がT161(すなわちTRACのT48)から置換されていることを除き、天然型α鎖細胞外配列(配列番号２)と同一であることに留意すべきである。同様に、配列番号５は、C169がS169(すなわちTRBC2のS57)から、A187がC187から、そしてD201がN201から置換されていることを除き、天然型β鎖細胞外配列(配列番号３)と同一である。天然型α鎖及びβ鎖細胞外配列に対するこれらシステイン置換により、リフォールドした可溶性TCR(すなわち、細胞外α鎖及びβ鎖のリフォールディングにより形成されたTCR)を安定化する鎖間ジスルフィド結合の形成が可能となる。安定なジスルフィド連結可溶性TCRを参照TCRとして使用することにより、結合親和性及び結合半減期のより簡便な評価が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１(配列番号２)は、TRAV12-3*01/TRAJ41*01/TRAC遺伝子を用いる野生型EBV LMP2A特異的TCRのα鎖の細胞外部分のアミノ酸配列を示す。
【図２】図２(配列番号３)は、TRBV11-2*01/TRBD1/TRBJ2-7*01/TRBC2遺伝子を用いる野生型EBV LMP2A特異的TCRのβ鎖の細胞外部分のアミノ酸配列を示す。
【図３】図３(配列番号４)は、(本明細書で「参照TCR」と呼ばれる)可溶性TCRのα鎖のアミノ酸配列を示す。この配列は、システイン(太字及び下線)が配列番号２のT161(すなわち、TRAC定常領域のT48)から置換されていることを除き、図１のものと同じである。
【図４】図４(配列番号５)は、(本明細書で「参照TCR」と呼ばれる)可溶性TCRのβ鎖のアミノ酸配列を示す。この配列は、システイン(太字及び下線)が配列番号３のS169(すなわち、TRBC2定常領域のS57)から、A187がC187から、そしてD201がN201から置換されていることを除き、図２のものと同じである。
【図５】図５(配列番号６〜12)は、本発明のTCRに存在し得るα鎖のアミノ酸配列を示す。CDR領域又はCDR領域の実質的部分を形成するサブ配列に下線を付す。天然型α鎖(配列番号２)に対して変異した残基に影を付す。図３の配列との関係で導入されたシステインを太字及び下線で示す。
【図６】図６(配列番号13)は、本発明のTCRに存在し得るβ鎖のアミノ酸配列を示す。CDR領域又はCDR領域の実質的部分を形成するサブ配列に下線を付す。天然型α鎖(配列番号２)に対して変異した残基に影を付す。(図４の配列との関係で)導入されたシステインを太字及び下線で示す。また、図２の野生型配列に関して、C187がA187に変異されており、D201がN201から置換されており、これらβ鎖を有するいずれのα-β TCRにおいても不対システインが除去されている。
【図７】図７(配列番号14及び配列番号15)は、図３及び４にそれぞれ示すTCRα鎖及びβ鎖をコードするDNA配列を示す(導入されたシステインを太字で示す)。
【図８】図８(配列番号16)は、EBV LMP2A TCRβ鎖のＮ末端に、リンカー(すなわち、GGGGS[下線])を介して融合した抗CD3 scFv抗体フラグメント(太字)のアミノ酸配列を示す。EBV LMP2A TCRβ鎖は図６のもの(配列番号13)である。
【図９−１】図９は、実施例５に従って作製したTCR-scFv抗体融合体についての、実施例６に記載したアッセイの結果を示す。
【図９−２】図９−２の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明の第１の観点によれば、CLGGLLTMV(配列番号１)-HLA-A2複合体に対する結合性を有し、TCRα鎖可変ドメイン及び/又はTCRβ鎖可変ドメインを含んでなるＴ細胞レセプター(TCR)であって、
α鎖可変ドメインは、配列番号２のアミノ酸残基１〜113の配列に対して少なくとも80％同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、及び/又は
β鎖可変ドメインは、配列番号３のアミノ酸残基１〜112の配列に対して少なくとも80％同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、
α鎖可変ドメインは以下の変異：
【表１】
2016528244.tif 000002
の少なくとも１つを有し、及び/又はβ鎖可変ドメインは以下の変異：
【表２】
2016528244.tif 000003
の少なくとも１つを有するTCRが提供される。
【００１１】
本発明のTCRは、天然に存在しないものであってもよいし、及び/又は精製されていてもよいし、及び/又は遺伝子操作されていてもよい。本発明のTCRは、α鎖可変ドメイン及び/又はβ鎖可変ドメインに存在する１より多い変異を有していてもよい。特定の実施形態において、一方又は両方の可変ドメインに２〜20、３〜15、４〜12又は４〜10の変異が存在する。一方又は両方の可変ドメインには２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21又は22の変異が存在してもよい。幾つかの実施形態において、本発明のTCRのα鎖可変ドメインは、上記変異の少なくとも１つを有するという条件で、配列番号２のアミノ酸残基１〜113の配列に対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなってもよい。幾つかの実施形態において、本発明のTCRのβ鎖可変ドメインは、上記変異の少なくとも１つを有するという条件で、配列番号３のアミノ酸残基１〜112の配列に対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％又は少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなってもよい。
【００１２】
本明細書に開示する任意のTCRの表現型上サイレントな変異型もまた、本発明の範囲に含まれる。用語「表現型上サイレントな変異型」とは、本明細書で使用する場合、CLGGLLTMV(配列番号１)-HLA-A2複合体に関して、下記の範囲内のKD及び/又は結合半減期を有するTCRをいうと理解される。例えば、当業者に公知であるように、CLGGLLTMV(配列番号１)-HLA-A2複合体との相互作用に関する親和性を変更することなく、定常ドメイン及び/又は可変ドメインに、上記のものからの変化が組み込まれているTCRを製造することは可能であり得る。このような軽微な変異型も本発明の範囲に含まれる。１又はそれより多い保存的置換がなされているTCRもまた本発明の一部を構成する。
変異は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)をベースにするもの、制限酵素ベースのクローニング又はライゲーション非依存性クローニング(LIC)手順を含むがこれらに限定されない任意の適切な方法を用いて実施することができる。これら方法は、分子生物学の標準的教科書の多くに詳述されている。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)及び制限酵素-ベースのクローニングに関しての更なる詳細については、Sambrook & Russell(2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual(第３版) CSHL Pressを参照。ライゲーション非依存性クローニング(LIC)手順についての更なる情報は、Rashtchian(1995) Curr Opin Biotechnol 6(1): 30-6に見出すことができる。
【００１３】
本発明のTCRは、CLGGLLTMV(配列番号１)-HLA-A2複合体、又は天然変異型SLGGLLTMV(配列番号17)及びCLGGLITMV(配列番号18)に結合する特性を有する。本発明の或る特定のTCRは、これらエピトープに関し、他の無関係なエピトープに比して高度に特異的であることが見出されており、よって、これらエピトープをディスプレイする細胞及び組織への治療剤又は検出可能な標識の送達用ターゲティングベクターとして特に適切である。本発明のTCRに関して、特異性は、EBV LMP2A抗原陽性HLA-A2陽性標的細胞を認識できる一方で、EBV LMP2A陰性標的細胞(特に、非ガン性ヒト細胞)を認識する能力が極めて小さいことに関する。特異性は、例えば、細胞アッセイ(例えば、実施例６に記載のもの)で、測定することができる。本発明の或る特定のTCRは、養子療法における使用に高度に適切であることが見出されている。このようなTCRは、複合体に関して、23μM未満のKD(例えば、約0.1μM〜約22μM)及び/又は約３秒から約12分までの範囲の結合半減期(T1/2)を有していてもよい。幾つかの実施形態において、本発明のTCRは、複合体に関して、約0.5μM〜約15μM、約１μM〜約10μM又は約２μM〜約５μMのKDを有していてもよい。本発明のTCRは、複合体に関して約３μMのKDを有していてもよい。本発明の或る特定のTCRは、検出可能な標識又は治療剤に結合されているとき、治療薬及び/又は診断薬としての使用に高度に適切であることが見出されている。このようなTCRは、複合体に関して、約10pM〜約200nMの範囲のKD及び約10分〜約60時間のT1/2を有していてもよい。幾つかの実施形態において、本発明のTCRは、複合体に関して、約12pM〜約100nM、約15pM〜約１nM、約20pM〜約0.5nM、約30pM〜約0.1nM又は約40pM〜約50pMのKDを有していてもよい。
【００１４】
抗原提示細胞への治療剤の送達用ターゲティング剤としての使用のためには、TCRは可溶形態(すなわち、膜貫通ドメインも細胞質ドメインも有しない形態)であってもよい。安定性のために、本発明のTCR(好ましくは、可溶性αβヘテロ二量体TCR)は、例えばWO 03/020763に記載されるように、それぞれの定常ドメインの残基同士間に導入されたジスルフィド結合を有していてもよい。本発明のαβヘテロ二量体に存在する定常ドメインの一方又は両方は、Ｃ末端で、例えば最大15アミノ酸又は最大10アミノ酸又は最大８アミノ酸又はそれより少ない数のアミノ酸が欠失されていてもよい。養子療法における使用のためには、αβヘテロ二量体TCRは、例えば、細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインの両方を有する全長鎖としてトランスフェクトされていてもよい。
本発明のTCRはαβヘテロ二量体であってもよいし、単鎖形式であってもよい。単鎖形式は、Vα-L-Vβ型、Vβ-L-Vα型、Vα-Cα-L-Vβ型、Vα-L-Vβ-Cβ型(ここで、Vα及びVβはそれぞれTCRα及びβ可変領域であり、Cα及びCβはそれぞれTCRα及びβ定常領域であり、Ｌはリンカー配列である)のαβTCRポリペプチドを含む。或る特定の実施形態において、本発明の単鎖TCRは、WO 2004/033685に記載されているように、それぞれの定常ドメインの残基同士間の導入されたジスルフィド結合を有していてもよい。
【００１５】
幾つかの実施形態において、α鎖可変ドメインは、配列番号６又は配列番号７又は配列番号８又は配列番号９又は配列番号10又は配列番号11又は配列番号12のQ1〜P113のアミノ酸配列に対して少なくとも96、97、98若しくは99％配列同一性、又は100％配列同一性を有していてもよい。図５において下線を付したアミノ酸は不変であり得る。
幾つかの実施形態において、β鎖可変ドメインは、配列番号13のE1〜T112のアミノ酸配列に対して少なくとも96、97、98若しくは99％配列同一性、又は100％配列同一性を有していてもよい。図６において下線を付したアミノ酸は不変であり得る。
本発明のTCRの１つのサブクラスにおいて、α鎖可変ドメインは、配列番号６又は配列番号７又は配列番号８又は配列番号９又は配列番号10又は配列番号11又は配列番号12のQ1〜P113を含んでなってもよく；及び/又は、β鎖は配列番号13のE1〜T112を含んでなってもよい。本発明のTCRは、配列番号９のQ1〜P113を含んでなるα鎖可変ドメイン及び配列番号13のE1〜T112を含んでなるβ鎖を含んでなってもよい。本発明のTCRは、配列番号７のQ1〜P113を含んでなるα鎖可変ドメイン及び配列番号13のE1〜T112を含んでなるβ鎖を含んでなってもよい。
当業者に自明なように、配列は、TCRの結合特性に実質的に影響を及ぼすことなく、そのＣ末端及び/又はＮ末端で１、２、３、４、５又はそれより多くの残基を切り取ることも可能であり得る。このような軽微な変異型の全てが本発明に包含される。
【００１６】
本発明のα-βヘテロ二量体TCRは、通常、α鎖TRAC定常ドメイン配列及び/又はβ鎖TRBC1若しくはTRBC2定常ドメイン配列を含んでなる。α鎖及びβ鎖定常ドメイン配列は、TRACのエキソン２のCys4とTRBC1若しくはTRBC2のエキソン２のCys2との間の天然型ジスルフィド結合を欠失するように短縮化又は置換により改変されていてもよい。α鎖及び/又はβ鎖定常ドメイン配列も、TRACのThr48及びTRBC1若しくはTRBC2のSer57からシステイン残基への置換により改変され、当該システインがTCRのα定常ドメインとβ定常ドメインとの間のジスルフィド結合を形成していてもよい。
本発明の或る特定のTCRは、CLGGLLTMV-HLA-A2複合体に関して、参照EBV LMP2A TCRのものより実質的に高い結合親和性及び/又は結合半減期を有する。天然型TCRの結合親和性を増大させると、ペプチド-MHCリガンドに関するTCRの選択性は低減することが多い。このことはZhao Yangbingら(The Journal of Immunology, The American Association of Immunologists, US, vol. 179, No. 9、1 November 2007, 5845-5854)で証明されている。しかし、本発明のTCRは、CLGGLLTMV-HLA-A2複合体に関する選択性を保持する(幾つかの実施形態においては、親の天然型TCRより実質的に高い結合親和性を有するにもかかわらず)。
結合親和性(平衡定数KDに反比例する)及び結合半減期(T1/2と表される)は、任意の適切な方法により測定することができる。TCRの親和性が２倍になればKDは1/2になることが理解されている。T1/2はln2/解離速度(koff)として算出される。よって、T1/2が２倍になればkoffは1/2になる。TCRのKD値及びkoff値は、通常、可溶形態のTCR、すなわち細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインの残基を除去するように短縮された形態のTCRについて測定する。したがって、所与のTCRは、その可溶形態がCLGGLLTMV-HLA-A2複合体に関して結合親和性及び/又は結合半減期を有する場合には、該特性を有すると理解されるべきである。好ましくは、所与のTCRの結合親和性又は結合半減期は、同じアッセイプロトコルを用いて数回(例えば３回又はそれより多い回数)測定して、結果の平均をとる。１つの好適な実施形態において、この測定は、本明細書の実施例３の表面プラズモン共鳴(BIAcore)法を用いてなされる。参照CLGGLLTMV-HLA-A2 TCRは、この方法で測定したときに約23μMのKDを有し、約３秒のT1/2を有する。
【００１７】
１つの更なる観点において、本発明は本発明のTCRをコードする核酸を提供する。幾つかの実施形態において、核酸はcDNAである。幾つかの実施形態において、本発明は、本発明のTCRのα鎖可変ドメインをコードする配列を含んでなる核酸を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、本発明のTCRのβ鎖可変ドメインをコードする配列を含んでなる核酸を提供する。核酸は、天然に存在しないものであってもよいし、及び/又は精製されていてもよいし、及び/又は遺伝子操作されていてもよい。
別の１つの観点において、本発明は、本発明の核酸を含んでなるベクターを提供する。好ましくは、ベクターはTCR発現ベクターである。
本発明はまた、本発明のベクター(好ましくはTCR発現ベクター)を有する細胞を提供する。ベクターは、単一のオープンリーディングフレーム内にα鎖及びβ鎖をコードするか又は２つの別個のオープンリーディングフレーム内にα鎖及びβ鎖をそれぞれコードする本発明の核酸を含んでなってもよい。別の１つの観点は、本発明のTCRのα鎖をコードする核酸を含んでなる第１の発現ベクター及び本発明のTCRのβ鎖をコードする核酸を含んでなる第２の発現ベクターを有する細胞を提供する。このような細胞は養子療法に特に有用である。本発明の細胞は、単離されていてもよいし、及び/又は組換であってもよいし、及び/又は天然に存在しないものであってもよいし、及び/又は遺伝子操作されていてもよい。
【００１８】
本発明のTCRは養子療法に有用であるので、本発明は、本発明のTCRを提示する、天然に存在しない及び/又は精製された及び/又は遺伝子操作された細胞、特にＴ細胞を包含する。本発明のTCRをコードする核酸(例えばDNA、cDNA又はRNA)でのＴ細胞のトランスフェクションに適切な方法が存在する(例えば、Robbinsら(2008) J. Immunol. 180:6116-6131を参照)。本発明のTCRを発現するＴ細胞は、EBV感染の養子療法ベースの治療における使用に適切である。当業者に公知であるように、養子療法を行なうことができる適切な方法が存在する(例えば、Rosenbergら(2008) Nat Rev Cancer 8(4):299-308を参照)。
本発明の幾つかの可溶性TCRは、検出可能な標識又は治療剤の抗原提示細胞及び抗原提示細胞を含有する組織への送達に有用である。したがって、本発明の可溶性TCRは、検出可能な標識(TCRを使用してCLGGLLTMV-HLA-A2複合体を提示する細胞の存在を検出する診断目的のため)；治療剤；又は(例えば、PEG化による)PK調節成分と(共有結合的又はその他の様式で)結合されていてもよい。
診断目的用の検出可能な標識としては、例えば、蛍光標識、放射性標識、酵素、核酸プローブ及び造影剤が挙げられる。
本発明のTCRと結合され得る治療剤としては、免疫調整剤、放射性化合物、酵素(例えばパーフォリン)又は化学療法剤(例えばシスプラチン)が挙げられる。所望の位置で毒性効果が発揮されることを確実にするため、毒性物質は、緩慢に放出されるように、TCRに連結したリポソームの内部に存在させることができる。これにより、身体内での輸送の間の損傷効果が予防され、毒性物質は、TCRが問題の抗原提示細胞に結合した後、最大効果を発揮することが確実になる。
【００１９】
他の適切な治療剤として、以下のものが挙げられる：
・小分子細胞傷害性物質、すなわち、哺乳動物細胞を殺傷する能力を有する分子量700ダルトン未満の化合物。このような化合物はまた、細胞傷害性効果を有することができる毒性金属を含有し得る。更に、これら小分子細胞傷害性物質にはまた、プロドラッグ、すなわち、生理学的条件下で崩壊又は変換して細胞傷害性物質を放出する化合物が含まれると理解される。このような物質の例として、シスプラチン、メイタンシン(maytansine)誘導体、ラケルマイシン(rachelmycin)、カリケアマイシン(calicheamicin)、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルフィマーソディウムホトフィリンII(sorfimer sodiumphotofrin II)、テモゾロマイド(temozolmide)、トポテカン、トリメトレキサート(trimetreate)、グルクロナート、オーリスタチンＥ(auristatin E)、ビンクリスチン及びドキソルビシンが挙げられる；
・ペプチド細胞毒素、すなわち、哺乳動物細胞を殺傷する能力を有するタンパク質又はそのフラグメント。例えば、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素Ａ、DNAアーゼ及びRNAアーゼ；
・放射性核種、すなわち、１以上のα粒子若しくはβ粒子又はγ線の同時放射を伴って崩壊する元素の不安定同位体。例えば、ヨウ素131、レニウム186、インジウム111、イットリウム90、ビスマス210及び213、アクチニウム225及びアスタチン213；高親和性TCR又はその多量体へのこれら放射性核種の結合を容易にするために、キレート化剤が使用されてもよい；
・免疫刺激物質、すなわち、免疫応答を刺激する免疫エフェクター分子。例えば、サイトカイン(例えばIL-2及びIFN-γ)、
・スーパー抗原及びその変異体；
・TCR-HLA融合体；
・ケモカイン、例えばIL-8、血小板第４因子、メラノーマ増殖刺激タンパク質など；
・抗体又はそのフラグメント。抗-Ｔ細胞又はNK細胞決定基抗体(例えば、抗-CD3、抗-CD28又は抗-CD16)が挙げられる；
・抗体様結合特性を有するオルターナティブタンパク質足場
・補体活性化物質；
・異種タンパク質ドメイン、同種タンパク質ドメイン、ウイルス性/細菌性タンパク質ドメイン、ウイルス性/細菌性ペプチド。
【００２０】
１つの好適な実施形態は、抗CD3抗体、その機能的フラグメント又は変異型と(通常、α鎖又はβ鎖のＮ末端又はＣ末端への融合により)結合した本発明のTCRにより提供される。用語「抗体」は、本明細書で使用する場合、フラグメント及び変異型(バリアント)を包含する。抗CD3抗体の例としては、OKT3、UCHT-1、BMA-031及び12F6が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の組成物及び方法における使用に適切である抗体フラグメント及び変異型/アナログとしては、数例挙げるとすれば、ミニボディ、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、dsFv及びscFvフラグメント、ナノボディTM([Ablynx(Belgium)から販売されている]これら構築物はラクダ科動物(例えば、ラクダ又はラマ)抗体に由来する合成の単鎖免疫グロブリン可変重鎖ドメインを含んでなる)及びドメイン抗体(Domantis(Belgium)；親和性成熟単鎖免疫グロブリン可変重鎖ドメイン又は免疫グロブリン可変軽鎖ドメインを含んでなる)又は抗体様結合特性を示すオルターナティブタンパク質足場(例えば、アフィボディ[Affibody(Sweden)]；工学的に操作されたプロテインＡ足場を含んでなる)又はアンチカリン(Anticalins)(Pieris(Germany))；工学的に操作されたアンチカリンを含んでなる)が挙げられる。
【００２１】
TCRと抗CD3抗体との連結は、直接であってもよいし、リンカー配列を介する間接的であってもよい。リンカー配列は、通常、可撓性を制限するおそれが大きい嵩高い側鎖を有しないアミノ酸(例えば、グリシン、アラニン及びセリン)から主に作られているという点で可撓性である。使用に適した又は最適なリンカー配列の長さは容易に決定される。リンカー配列は約12アミノ酸長未満、例えば、10アミノ酸長未満、又は５〜10アミノ酸長であることが多い。本発明のTCRにおいて使用し得る適切なリンカーとしては、(WO2010/133828に記載されるような)GGGGS(配列番号23)、GGGSG(配列番号24)、GGSGG(配列番号25)、GSGGG(配列番号26)、GSGGGP(配列番号27)、GGEPS(配列番号28)、GGEGGGP(配列番号29)及びGGEGGGSEGGGS(配列番号30)が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の抗CD3-TCR融合構築物の具体的実施形態としては、配列番号６又は配列番号７又は配列番号８又は配列番号９又は配列番号10又は配列番号11又は配列番号12から選択されるα鎖可変ドメイン及び抗CD3に相当するアミノ酸配列に融合した配列番号13のTCRβ鎖を有するものが挙げられる。α鎖配列の１位のアミノ酸は、Ａ及びＧから選択される代替のアミノ酸で置換されていてもよい。
【００２２】
より具体的には、本発明のTCR-抗CD3融合体としては、以下：
(i)アミノ酸１〜113が配列番号９の配列のアミノ酸１〜113で置換されている、配列番号２又は配列番号４のTCRα鎖配列；
(ii)アミノ酸１〜113が配列番号９の配列のアミノ酸１〜113で置換されており、１位のアミノ酸がＡで置換されている、配列番号２又は配列番号４のTCRα鎖配列；
(iii)アミノ酸１〜113が配列番号９の配列のアミノ酸１〜113で置換されており、１位のアミノ酸がＧで置換されている、配列番号２又は配列番号４のTCRα鎖配列；
(iv)アミノ酸１〜113が配列番号９の配列のアミノ酸１〜113で置換されており、α鎖のＣ末端が配列番号４の番号付けに基いてF200からS207まで(両端を含む)の８アミノ酸を欠いている、配列番号２又は配列番号４のTCRα鎖配列；
(v)アミノ酸１〜113が配列番号９の配列のアミノ酸１〜113で置換されており、１位のアミノ酸がＡで置換されており、α鎖のＣ末端が配列番号４の番号付けに基いてF200からS207まで(両端を含む)の８アミノ酸を欠いている、配列番号２又は配列番号４のTCRα鎖配列；
(vi)アミノ酸１〜113が配列番号９の配列のアミノ酸１〜113で置換されており、１位のアミノ酸がＧで置換されており、α鎖のＣ末端が配列番号４の番号付けに基いてF200からS207まで(両端を含む)の８アミノ酸を欠いている、配列番号２又は配列番号４のTCRα鎖配列
からなる群より選択されるTCRα鎖アミノ酸配列、及び/又は以下：
(vii)１位及び２位のアミノ酸がそれぞれＤ及びＩである、配列番号16のTCRβ鎖-抗CD3配列；
(viii)１位及び２位のアミノ酸がそれぞれＡ及びＩである、配列番号16のTCRβ鎖-抗CD3配列；
(ix)１位及び２位のアミノ酸がそれぞれＡ及びＱである、配列番号16のTCRβ鎖-抗CD3配列；
(x)１位及び２位のアミノ酸がそれぞれＤ及びＩであり、108位〜131位のアミノ酸がRTSGPGDGGKGGPGKGPGGEGTKGTGPGG(配列番号31)で置換されており、254位〜258位のアミノ酸がGGEGGGSEGGGS(配列番号30)で置換されている、配列番号16のTCRβ鎖-抗CD3配列；
(xi)１位及び２位のアミノ酸がそれぞれＤ及びＩであり、257位のアミノ酸がＳであり、258位のアミノ酸がＧである、配列番号16のTCRβ鎖-抗CD3配列；
(xii)１位及び２位のアミノ酸がそれぞれＤ及びＩであり、256位のアミノ酸がＳであり、258位のアミノ酸がＧである、配列番号16のTCRβ鎖-抗CD3配列；
(xiii)１位及び２位のアミノ酸がそれぞれＤ及びＩであり、255位のアミノ酸がＳであり、258位のアミノ酸がＧである、配列番号16のTCRβ鎖-抗CD3配列；
(xiv)１位及び２位のアミノ酸がＡ及びＱであり、257位のアミノ酸がＳであり、258位のアミノ酸がＧである、配列番号16の配列を有するTCRβ鎖-抗CD3；
(xv)１位及び２位のアミノ酸がＡ及びＱであり、256位のアミノ酸がＳであり、258位のアミノ酸がＧである、配列番号16の配列を有するTCRβ鎖-抗CD3；
(xvi)１位及び２位のアミノ酸がＡ及びＱであり、255位のアミノ酸がＳであり、258位のアミノ酸がＧである、配列番号16の配列を有するTCRβ鎖-抗CD3；
(xvii)１位及び２位のアミノ酸がそれぞれＡ及びＩであり、257位のアミノ酸がＳであり、258位のアミノ酸がＧである、配列番号16の配列を有するTCRβ鎖-抗CD3；
(xviii)１位及び２位のアミノ酸がそれぞれＡ及びＩであり、256位のアミノ酸がＳであり、258位のアミノ酸がＧである、配列番号16の配列を有するTCRβ鎖-抗CD3；
(xix)１位及び２位のアミノ酸がそれぞれＡ及びＩであり、255位のアミノ酸がＳであり、258位のアミノ酸がＧである、配列番号16の配列を有するTCRβ鎖-抗CD3
からなる群より選択されるTCRβ鎖-抗CD3アミノ酸配列を挙げてもよい。
【００２３】
上記を参照すると、TCR-抗CD3融合体の例は、以下のとおりである：
α鎖アミノ酸配列が(i)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(vii)であるTCR-抗CD3融合体；
α鎖アミノ酸配列が(i)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(x)であるTCR-抗CD3融合体；
α鎖アミノ酸配列が(vi)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(ix)であるTCR-抗CD3融合体；
α鎖アミノ酸配列が(v)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(viii)であるTCR-抗CD3融合体；
α鎖アミノ酸配列が(vi)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(vii)であるTCR-抗CD3融合体；
α鎖アミノ酸配列が(i)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xi)であるTCR-抗CD3融合体；
α鎖アミノ酸配列が(i)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xii)であるTCR-抗CD3融合体；
α鎖アミノ酸配列が(i)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xiii)であるTCR-抗CD3融合体；
α鎖アミノ酸配列が(vi)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xiv)であるTCR-抗CD3融合体；
α鎖アミノ酸配列が(vi)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xv)であるTCR-抗CD3融合体；
α鎖アミノ酸配列が(vi)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xvi)であるTCR-抗CD3融合体；
α鎖アミノ酸配列が(v)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xvii)であるTCR-抗CD3融合体；
α鎖アミノ酸配列が(v)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xviii)であるTCR-抗CD3融合体；
α鎖アミノ酸配列が(v)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xix)であるTCR-抗CD3融合体；
α鎖アミノ酸配列が(vi)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xi)であるTCR-抗CD3融合体；
α鎖アミノ酸配列が(vi)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xii)であるTCR-抗CD3融合体；及び
α鎖アミノ酸配列が(vi)であり、β鎖-抗CD3アミノ酸配列が(xiii)であるTCR-抗CD3融合体。
【００２４】
幾つかの目的のために、本発明のTCRは、幾つかのTCRを含んでなる複合体に凝集して、多価TCR複合体を形成していてもよい。多価TCR複合体の製造に使用し得る多量体化ドメインを含むヒトタンパク質が存在する。例えば、p53の四量体化ドメインは、単量体scFvフラグメントと比較して増大した血清残留性及び顕著に低減した解離速度を示す四量体のscFv抗体フラグメントを作製するために利用されている(Willudaら(2001) J. Biol. Chem. 276 (17) 14385-14392)。ヘモグロビンもまた、この種の適用に使用することができる四量体化ドメインを有する。本発明の多価TCR複合体は、非多量体野生型又は本発明のＴ細胞レセプターヘテロ二量体と比較して、CLGGLLTMV-HLA-A2複合体に関する結合能力が増強されていてもよい。よって、本発明のTCRの多価複合体もまた本発明に含まれる。本発明に従うこのような多価TCR複合体は、インビトロ又はインビボにおける、特定の抗原を提示する細胞の追跡又は標的化に特に有用であり、また、そのような用途を有する更なる多価TCR複合体の製造用の中間体としても有用である。
当該分野において周知であるように、TCRは翻訳後修飾に付されていてもよい。グリコシル化はそのような修飾の１つであり、TCR鎖中の規定されたアミノ酸へのオリゴ糖部分の共有結合的付加を含む。例えば、アスパラギン残基又はセリン/スレオニン残基は、周知のオリゴ糖付加位置である。特定のタンパク質のグリコシル化状況は、タンパク質配列、タンパク質コンホメーション及び特定の酵素の利用可能性を含む幾つかの因子に依存する。更に、グリコシル化状況(すなわち、オリゴ糖タイプ、共有結合及び付加の総数)は、タンパク質の機能に影響することがある。したがって、組換えタンパク質を製造するときには、グリコシル化の制御が望ましい場合が多い。制御されたグリコシル化は、抗体ベースの治療薬を改善するために使用されている(Jefferis R., Nat Rev Drug Discov. 2009 Mar；8(3):226-34)。
【００２５】
本発明の可溶性TCRのためには、グリコシル化は、例えば特定の細胞株を用いることにより、インビボで制御されてもよいし、化学的修飾により、インビトロで制御されてもよい。このような修飾は望ましい。なぜならば、グリコシル化は、薬物動態を改善し、免疫原性を低減し、及び天然型ヒトタンパク質をより厳密に模擬することができるからである(Sinclair AM and Elliott S., Pharm Sci. 2005 Aug；94(8):1626-35)。
患者への投与のために、本発明のTCR(好ましくは、検出可能な標識若しくは治療剤と結合しているか、又はトランスフェクトされたＴ細胞で発現されているTCR)又は本発明の細胞は、医薬組成物中で、医薬的に許容され得る１又はそれより多い担体又は賦形剤と共に提供されてもよい。本発明に従う治療用又は造影用TCR又は細胞は、通常、医薬的に許容され得る担体を通常含む滅菌医薬組成物の一部として供給される。この医薬組成物は、(患者への望ましい投与方法に依存して)任意の適切な形態であり得る。医薬組成物は、単位剤形で提供されてもよく、一般には密封された容器中で提供され、キットの一部として提供されてもよい。このようなキットは、(必須ではないが)通常、使用指示書を含む。キットは複数の単位剤形を含んでいてもよい。
医薬組成物は、任意の適切な経路(好ましくは、非経口経路[皮下、筋内、より好ましい静脈内経路を含む])による投与に適合されていてもよい。このような組成物は、薬学分野において公知の任意の方法により、例えば活性成分を担体又は賦形剤と滅菌条件下で混合することにより、製造されてもよい。
【００２６】
本発明の物質の投薬量は、治療すべき疾患又は異常、治療すべき個体の年齢及び状態などに依存して広範囲に変化し得る。抗CD3抗体に結合した本発明の可溶性TCRに適切な用量範囲は、25ng/kg〜50μg/kgであり得る。最終的には医師が使用すべき適切な投薬量を決定する。
本発明のTCR、医薬組成物、ベクター、核酸及び細胞は、実質的に純粋な形態、例えば、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％又は100％純粋で提供されてもよい。
【００２７】
本発明はまた、以下のものを提供する：
・医薬における使用のため、好ましくはEBV感染の治療法における使用のための、ペプチド-HLA-A2複合体として提示されたCLGGLLTMVペプチド(EBV LMP2Aタンパク質に由来)に結合するTCR。TCRは、天然に存在していなくてもよく、及び/又は精製されていてもよく、及び/又は工学的に操作されていてもよい；
・EBV感染治療用医薬の製造における、ペプチド-HLA-A2複合体として提示されたCLGGLLTMVペプチド(EBV LMP2Aタンパク質に由来)に結合するTCR又は当該TCRを発現及び/若しくは提示する細胞の使用；
・ペプチド-HLA-A2複合体として提示されたCLGGLLTMVペプチド(EBV LMP2Aタンパク質に由来)に結合するTCR又は当該TCRを発現及び/若しくは提示する細胞を患者に投与することを含んでなる、患者におけるEBV感染の治療法。
【００２８】
好ましくは、本発明のTCRは、ペプチド-HLA-A2複合体として提示されたCLGGLLTMVペプチド(EBV LMP2Aタンパク質に由来)に結合するTCRである。
本発明の各々の観点の好適な特徴は、他の観点の各々についてのとおりである(ただし、必要な変更は加える)。本明細書において言及した先行技術文献は、法が許容する最大範囲まで組み込まれる。
本発明を以下の実施例において更に説明する。
【実施例】
【００２９】
実施例
実施例１
pGMT7-ベースの発現プラスミドへの参照EBV LMP2A TCRα鎖及びβ鎖可変領域配列のクローニング
参照EBV LMP2A TCR可変αドメイン及びTCR可変βドメインを、EBV LMP2A Ｔ細胞クローン(John Miles及びScott Burrows[Queensland Institute of Medical Research, Brisbane, Australia]から提供されたクローンSB34)から単離したトータルcDNAからPCR増幅した。α鎖の場合、制限部位NdeIをコードするα鎖可変領域配列特異的オリゴヌクレオチドA1(gaattccatatgcaaaaagaagttgaacaagatcctggaccactc；配列番号19)と、制限部位SalIをコードするα鎖定常領域配列特異的オリゴヌクレオチドA2(ttgtcagtcgacttagagtctctcagctggtacacg；配列番号20)とを使用してα鎖可変ドメインを増幅する。β鎖の場合、制限部位NdeIをコードするβ鎖可変領域配列特異的オリゴヌクレオチドB1(gaattccatatggaagctggagttgctcaatctcccagatataag；配列番号21)と、制限部位AgeIをコードするβ鎖定常領域配列特異的オリゴヌクレオチドB2(tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggc；配列番号22)とを使用してβ鎖可変ドメインを増幅する。
Sambrook及びRussellによるMolecular Cloning a Laboratory Manual(第３版)に記載の標準的方法によって、α可変ドメイン及びβ可変ドメインを、Cα又はCβを含有するpGMT7-ベースの発現プラスミドにクローニングした。Applied Biosystems 3730xl DNA分析機を使用してプラスミドを配列決定した。
NdeI及びSalIで切断したTCRα鎖をコードするDNA配列を、NdeI及びXhoIで切断したpGMT7＋Cαベクターにライゲートした。NdeI及びAgeIで切断したTCRβ鎖をコードするDNA配列を、NdeI及びAgeIで切断した別のpGMT7＋Cβベクターにライゲートした。
【００３０】
ライゲーション
ライゲートしたプラスミドを、コンピテントなE. coli株XL1-blue細胞に形質転換し、100μg/mlアンピシリン含有LB/アガープレートに播種した。37℃にて一晩のインキュベーション後、単一コロニーを採取し、100μg/mlアンピシリンを含有する10mlのLB中で一晩37℃にて振盪しながら増殖させる。Miniprepキット(Qiagen)を使用してクローン化プラスミドを精製し、Applied Biosystems 3730xl DNA分析機を使用してプラスミドを配列決定した。
図３及び４はそれぞれ、図７(配列番号14)(配列番号15)のDNA配列からそれぞれ生じる参照EBV LMP2A TCRのα鎖及びβ鎖細胞外アミノ酸配列(それぞれ配列番号４及び５)を示す。リフォールディングしてへテロ二量体TCRを形成する際に、人工の鎖間ジスルフィド結合が提供されるように、天然型TCRに関して、α鎖及びβ鎖の定常領域においてシステインが置換導入されたことに留意すべきである。導入システインを太字及び下線で示す。図７のDNA配列において、制限酵素認識配列に下線を付す。
【００３１】
実施例２
可溶性参照EBV LMP2A TCRの発現、リフォールディング及び精製
実施例１で作製したように、TCRα鎖及びβ鎖をそれぞれ含有する発現プラスミドを、E.coli株BL21pLysSに別々に形質転換し、単一アンピシリン耐性コロニーを、0.6〜0.8程度のOD600までTYP(アンピシリン100μg/ml)培地で37℃にて増殖後、0.5mM IPTGでタンパク質発現を誘導した。誘導後３時間で、Beckman J-6Bでの4000rpmにて30分間の遠心分離により細胞を採取した。MgCl2及びDNaseIの存在下に25mlのBug Buster(NovaGen)を用いて細胞ペレットを溶解させた。Beckman J2-21遠心分離機での13000rpmにて30分間の遠心分離により封入体ペレットを回収した。その後、３回の界面活性剤洗浄を行って細胞残渣及び膜成分を除去した。各回、封入体ペレットをTriton緩衝液(50mM Tris-HCl pH8.0、0.5％ Triton-X100、200mM NaCl、10mM NaEDTA)中でホモジナイズした後、Beckman J2-21で13000rpmにて15分間の遠心分離によりペレット化した。次いで、以下の緩衝液：50mM Tris-HCl pH8.0、１mM NaEDTA中での同様な洗浄により界面活性剤及び塩を除去した。最後に、封入体を30mgのアリコートに分け、−70℃にて凍結させた。封入体タンパク質の収量を６Ｍグアニジン-HClで溶解することによって定量し、OD測定はHitachi U-2001分光光度計で行った。次いで、消光率を用いてタンパク質濃度を算出した。
【００３２】
約15mgのTCRβ鎖及び15mgのTCRα鎖の可溶化封入体を凍結ストックから解凍し、10mlのグアニジン溶液(６Ｍグアニジン-塩酸、50mM Tris HCl pH8.1、100mM NaCl、10mM EDTA、10mM DTT)中に希釈して、完全な鎖変性を確実にした。その後、十分に還元及び変性したTCR鎖を含有するグアニジン溶液を、0.5リットルの以下のリフォールディング緩衝液中に注入した：100mM Tris pH8.1、400mM L-アルギニン、２mM EDTA、５Ｍ尿素。酸化還元カップル(システアミン塩酸及びシスタミン二塩酸)をそれぞれ6.6mM及び3.7mMの最終濃度まで添加し、約５分後に変性TCR鎖を添加した。溶液を30分間程度放置した。リフォールドしたTCRを、Spectra/Por(登録商標)1メンブレン(Spectrum；Product No. 132670)において10ＬのH2Oに対して18〜20時間透析した。その後、透析緩衝液を新鮮な10mM Tris pH8.1(10Ｌ)に２回交換し、透析を５℃±３℃にて更に８時間程度継続した。
透析後のリフォールド産物をPOROS(登録商標) 50HQアニオン交換カラムにロードし、50カラム容量にわたる10mM Tris pH8.1中０〜500mM NaClのグラジエントで結合タンパク質を溶出させることにより、Akta(登録商標)精製装置(GE Healthcare)を用いて、変性産物及び不純物から可溶性TCRを分離した。ピーク画分をプールし、プロテアーゼインヒビターカクテル(Calbiochem)を加えた。次いで、プールした画分を４℃で保存し、クーマシー染色SDS-PAGEにより分析後、プールして濃縮した。最後に、PBS緩衝液(Sigma)中で予め平衡化したGE Healthcare Superdex(登録商標) 75HRゲル濾過カラムを使用して、可溶性TCRを精製し、特徴付けた。約50kDaの相対分子量で溶出するピークをプールし、濃縮後、BIAcore(登録商標)表面プラズモン共鳴分析により特徴決定した。
【００３３】
実施例３
結合特性決定
BIAcore分析
表面プラズモン共鳴バイオセンサ(BIAcore 3000(登録商標))を使用して、可溶性TCRのペプチド-MHCリガンドへの結合を分析することができる。これは、ストレプトアビジン被覆結合表面(センサチップ)に固定可能な可溶性ビオチン化ペプチド-HLA(「pHLA」)複合体の製造によって容易になる。センサチップは、４つの異なるpHLA複合体へのＴ細胞レセプター結合の同時測定を可能にする４つの個別フローセルを備える。pHLA複合体の手動注入により、固定化クラスＩ分子の正確なレベルを容易に操作することができる。
ビオチン化クラスＩ HLA-A*02分子を、構成成分たるサブユニットタンパク質及び合成ペプチドを含有する細菌発現封入体からインビトロでリフォールドさせ、続いて精製及びインビトロでの酵素的ビオチン化を行った(O'Callaghanら(1999) Anal. Biochem. 266: 9-15)。HLA-A*02-重鎖を、該タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインに代えてＣ末端ビオチン化タグと共に適切な構築物で発現させた。約75mg/リットル細菌培養物の封入体発現レベルが得られた。MHC軽鎖又はβ2-ミクログロブリンもまたE.coliで適切な構築物から封入体として約500mg/リットル細菌培養物のレベルで発現させた。
【００３４】
E. coli細胞を溶解し、封入体を約80％の純度まで精製した。封入体からのタンパク質を６Ｍグアニジン-HCl、50mM Tris pH8.1、100mM NaCl、10mM DTT、10mM EDTA中で変性させ、0.4Ｍ L-アルギニン、100mM Tris pH8.1、3.7mMシスタミン二塩酸、6.6mMシステアミン塩酸、４mg/Ｌの(HLA-A*02分子によるローディングに必要な)EBV LMP2Aペプチド中、＜５℃のリフォールディング緩衝液中への変性タンパク質の単発添加により、30mg/リットルの重鎖、30mg/リットルのβ2mの濃度でリフォールドさせた。少なくとも１時間４℃にて完全にリフォールドさせた。
10容量の10mM Tris pH8.1への透析により緩衝液を交換した。次いで、タンパク質溶液を1.5μm酢酸セルロースフィルターに通して濾過し、POROS(登録商標) 50HQアニオン交換カラム(８mlのベッド容積)にロードした。Akta(登録商標)精製装置(GE Healthcare)を使用して、10mM Tris pH8.1中０〜500mM NaCl線形グラジエントでタンパク質を溶出させた。HLA-A*02-ペプチド複合体は約250mM NaClで溶出した。ピーク画分を収集し、プロテアーゼインヒビターカクテル(Calbiochem)を加え、該画分を氷上で冷却した。
ビオチンタグ化pHLA分子を、10mM Tris pH8.1、５mM NaCl中に、同じ緩衝液中で平衡化させたGE Healthcare迅速脱塩カラムを用いて緩衝液交換した。溶出直後に、タンパク質含有画分を氷上で冷却し、プロテアーゼインヒビターカクテル(Calbiochem)を加えた。次いで、ビオチン化試薬を添加した：１mMビオチン、５mM ATP(pH８に緩衝化)、7.5mM MgCl2及び５μg/ml BirA酵素(O'Callaghanら(1999) Anal. Biochem. 266: 9-15に従って精製)。その後、混合物を室温にて一晩インキュベートした。
【００３５】
ゲル濾過クロマトグラフィーを用いてビオチン化pHLA-A*01分子を精製した。GE Healthcare Superdex(登録商標) 75 HR 10/30カラムを、濾過PBSで予め平衡化した。１mlのビオチン化反応混合物をロードし、Akta(登録商標)精製装置(GE Healthcare)を使用してカラムをPBSで0.5ml/分にて展開した。ビオチン化pHLA-A*02分子は、約15mlで単一ピークとして溶出した。タンパク質を含有する画分をプールし、氷上で冷却し、プロテアーゼインヒビターカクテルを加えた。タンパク質濃度はクーマシー結合アッセイ(PerBio)を用いて決定し、ビオチン化pHLA-A*02分子のアリコートを−20℃にて凍結保存した。
BIAcore(登録商標) 3000表面プラズモン共鳴(SPR)バイオセンサは、小さなフローセル内のセンサ表面近くでの、応答単位(RU)で表された屈折指数の変化(レセプターリガンド相互作用を検出し、親和性及び動力学的パラメータを分析するために使用することができる原理である)を測定する。BIAcore(登録商標)実験は、PBS緩衝液(Sigma, pH7.1〜7.5)をランニング緩衝液として及びタンパク質サンプルの希釈物の調製に使用して、温度25℃にて実施した。ストレプトアビジンは、標準アミンカップリング法によりフローセルに固定化した。pHLA複合体は、ビオチンタグを介して固定化した。次いで、可溶性TCRを、異なるフローセルの表面上を一定の流速で通過させ、その際のSPR応答を測定することによりアッセイを実施した。
【００３６】
平衡結合定数
上記BIAcore(登録商標)分析法を使用して、平衡結合定数を決定した。ジスルフィド連結可溶性へテロ二量体形態の参照EBV LMP2A TCRの系列希釈物を調製し、５μl/分の一定流速にて２つの異なるフローセル上に注入した；一方は1000RU程度の特異的HLA-A*02複合体が被覆され、他方は1000RU程度の非特異的HLA-A2-ペプチド複合体が被覆されていた。応答は、コントロールセルからの測定値を用いて、各濃度に関して規格化した。規格化した応答データをTCRサンプルの濃度に対してプロットし、平衡結合定数KDを算出するために、非線形曲線フィッティングモデルにフィットさせた(Price & Dwek, Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists (第２版) 1979, Clarendon Press, Oxford)。
動力学的パラメータ
上記BIAcore(登録商標)分析法を用いて、平衡結合定数及び解離速度も決定した。
高親和性TCR(下記実施例４参照)に関して、KDは、解離速度定数koff及び会合速度定数konを実験的に測定することにより決定した。平衡定数KDはkoff/konとして算出した。
一方は約1000RUの特異的EVDPIGHLY HLA-A*01複合体が被覆され、他方は約1000RUの非特異的HLA-A1-ペプチド複合体が被覆された２つの異なるセルに、TCRを注入した。流速は50μl/分に設定した。代表的には、250μlのTCRを約１μM濃度で注入した。その後、応答がベースラインに復帰するか又は２時間以上が経過するまで、緩衝液を流した。動力学的パラメータはBIAevaluation(登録商標)ソフトウエアを用いて算出した。解離相を一次指数関数減衰式にフィットさせた。これにより半減期の算出が可能になった。
【００３７】
実施例４
本発明のTCRの作製
本発明の下記のTCRについて、TCRα鎖及びβ鎖をそれぞれ含有する発現プラスミドを、実施例１のとおりに作製した：
【表３】
2016528244.tif 000004
【００３８】
プラスミドを、E.coli株BL21pLysSに別々に形質転換し、単一アンピシリン耐性コロニーを、0.6〜0.8程度のOD600までTYP(アンピシリン100μg/ml)培地で37℃にて増殖後、0.5mM IPTGでタンパク質発現を誘導した。誘導後３時間で、Beckman J-6Bでの4000rpmにて30分間の遠心分離により細胞を採取した。MgCl2及びDNaseIの存在下に25mlのBug Buster(Novagen)を用いて細胞ペレットを溶解させた。Beckman J2-21遠心分離機での13000rpmにて30分間の遠心分離により封入体ペレットを回収した。その後、３回の界面活性剤洗浄を行って細胞残渣及び膜成分を除去した。各回、封入体ペレットをTriton緩衝液(50mM Tris-HCl pH8.0、0.5％ Triton-X100、200mM NaCl、10mM NaEDTA)中でホモジナイズした後、Beckman J2-21で13000rpmにて15分間の遠心分離によりペレット化した。次いで、以下の緩衝液：50mM Tris-HCl pH8.0、１mM NaEDTA中での同様な洗浄により界面活性剤及び塩を除去した。最後に、封入体を30mgのアリコートに分け、−70℃にて凍結させた。封入体タンパク質の収量を６Ｍグアニジン-HClで溶解することによって定量し、OD測定はHitachi U-2001分光光度計で行った。次いで、消光率を用いてタンパク質濃度を算出した。
【００３９】
本発明の各TCRについて、約10mgのTCRβ鎖及び10mgのTCRα鎖の可溶化封入体を、10mlのグアニジン溶液(６Ｍグアニジン-塩酸、50mM Tris HCl pH8.1、100mM NaCl、10mM EDTA、10mM DTT)中に希釈して、完全な鎖変性を確実にした。その後、十分に還元及び変性したTCR鎖を含有するグアニジン溶液を、0.5リットルの以下のリフォールディング緩衝液中に注入した：100mM Tris pH8.1、400mM L-アルギニン、２mM EDTA、５Ｍ尿素。酸化還元カップル(システアミン塩酸及びシスタミン二塩酸)をそれぞれ6.6mM及び3.7mMの最終濃度まで添加し、約５分後に変性TCR鎖を添加した。溶液を約30分間放置した。リフォールドしたTCRを、Spectra/Por(登録商標)1メンブレン(Spectrum；Product No. 132670)において10ＬのH2Oに対して18〜20時間透析した。その後、透析緩衝液を新鮮な10mM Tris pH8.1(10Ｌ)に２回交換し、透析を５℃±３℃にて更に約８時間継続した。
透析後のリフォールド産物をPOROS(登録商標) 50HQアニオン交換カラムにロードし、15カラム容量にわたる10mM Tris pH8.1中０〜500mM NaClのグラジエントで結合タンパク質を溶出させることにより、Akta(登録商標)精製装置(GE Healthcare)を用いて、変性産物及び不純物から可溶性TCRを分離した。次いで、プールした画分を４℃にて保存し、クーマシー染色SDS-PAGEにより分析後、プールして濃縮した。最後に、PBS緩衝液(Sigma)中で予め平衡化したGE Healthcare Superdex(登録商標) 75HRゲル濾過カラムを使用して、可溶性TCRを精製し、特徴付けた。約50kDaの相対分子量で溶出するピークをプールし、濃縮後、BIAcore(登録商標)表面プラズモン共鳴分析により特徴決定した。
【００４０】
こうして作製したTCRのEBV LMP2Aエピトープに関する親和性プロフィールを、実施例３の方法を用いて評価し、参照TCRと比較した。結果を下記の表に示す。
【表４】
2016528244.tif 000005
【００４１】
実施例５
可溶性抗CD3 scFv-EBV LMP2A TCR融合体の発現、リフォールディング及び精製
α鎖及び抗CD3 scFv-TCRβ鎖融合体を含んでなるTCRを下記のとおりに作製した。
α鎖配列は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11又は配列番号12から選択した。β鎖配列は配列番号13であった。この配列を抗CD3 scFV 配列にリンカーを介して融合させた。リンカーは、GGGGS(配列番号23)、GGGSG(配列番号24)、GGSGG(配列番号25)、GSGGG(配列番号26)、GSGGGP(配列番号27)、GGEPS(配列番号28)、GGEGGGP(配列番号29)及びGGEGGGSEGGGS(配列番号30)からなる群より選択した。抗CD3 scFV配列(図８に示す)の１位のアミノ酸は、Ｄ又はＡのいずれかであり、２位のアミノ酸はＩ又はＱのいずれかであった。
この構築物は以下のとおり作製した：
【００４２】
ライゲーション
上記の(ａ)TCR Vα鎖及び(ｂ)TCR Vβ鎖融合配列をコードする合成遺伝子を、E.coli株BL21-DE3(pLysS)における高レベル発現のためのT7プロモーターを含有するpGMT7＋Cαベクター及びpGMT7ベースの発現プラスミドにそれぞれ別々にライゲートした(Panら，Biotechniques(2000) 29 (6)：1234-8)。
発現
この発現プラスミドをE.coli株BL21 (DE3) Rosetta pLysSに別々に形質転換し、アンピシリン耐性の単一コロニーを37℃にてTYP(アンピシリン100μg/ml)培地中で0.6〜0.8程度のOD600まで増殖させた後、0.5mM IPTGでタンパク質発現を誘導した。誘導の３時間後、Beckman J-6Bでの4000rpmにて30分間の遠心分離により細胞を採集した。MgCl2及びDNaseの存在下、25mlのBug Buster(登録商標)(NovaGen)で細胞ペレットを溶解させた。Beckman J2-21遠心分離器での13000rpmにて30分間の遠心分離により封入体ペレットを回収した。次いで、３回の界面活性剤による洗浄を行って細胞残渣及び膜成分を除去した。各回ごとに、封入体ペレットをTriton緩衝液(50mM Tris-HCl pH8.0、0.5％ Triton-X100、200mM NaCl、10mM NaEDTA)中でホモジナイズした後、Beckman J2-21での13000rpmにて15分間の遠心分離によりペレット化した。その後、下記緩衝液中での同様な洗浄により界面活性剤及び塩を除去した：50mM Tris-HCl pH8.0、１mM NaEDTA。最後に、封入体を30mgのアリコートに分け、−70℃で凍結させた。
【００４３】
リフォールディング
約20mgのTCRα鎖及び約40mgのscFv-TCRβ鎖の可溶化封入体を凍結ストックから解凍し、20mlのグアニジン溶液(６Ｍグアニジン-塩酸、50mM Tris HCl pH8.1、100mM NaCl、10mM EDTA、10mM DTT)中に希釈し、完全な鎖変性を確実にするため、37℃の水浴で30分〜１時間インキュベートした。次いで、完全に還元し変性したTCR鎖を含有するグアニジン溶液を、１リットルの下記リフォールディング緩衝液に注入した：100mM Tris pH8.1、400mM L-アルギニン、２mM EDTA、５Ｍ尿素。レドックスカップル(システアミン塩酸塩及びシスタミン二塩酸塩(それぞれ10mM及び2.5mMの最終濃度まで))を添加して約５分後、変性TCRα鎖及びscFv-TCRβ鎖を添加した。この溶液を30分間程度放置した。リフォールディングしたscFv-TCRを、透析チューブセルロースメンブレン(Sigma-Aldrich；製品番号D9402)において10ＬのH2Oに対して18〜20時間透析した。この期間の後、透析緩衝液を新鮮な10mM Tris pH8.1(10Ｌ)に２回交換し、透析を５℃±３℃で更に８時間程度続けた。可溶性で正確にフォールディングしたscFv-TCRを、分解産物及び不純物から下記の３工程精製法により分離した。
【００４４】
第１精製工程
透析したリフォールディング体(10mM Tris pH8.1中)をPOROS(登録商標) 50HQアニオン交換カラムにロードし、Akta精製装置(GE Healthcare)を用いて６カラム容量にわたる０〜500mM NaClのグラジエントで結合タンパク質を溶出させた。ピーク画分(導電率20mS/cm程度で溶出)を４℃で保存した。ピーク画分を、Instant Blue(登録商標) Stain(Novexin)染色SDS-PAGEにより分析した後、プールした。
第２精製工程
プールしたアニオン交換画分を、scFv-TCR融合体のpIに依存して20mM MES pH６〜6.5での希釈により緩衝液交換した。希釈したプール画分(20mM MES pH６〜6.5中)をPOROS(商標登録) 50HSカチオン交換カラムにロードし、Akta(登録商標)精製装置(GE Healthcare)を用いて６カラム容量にわたる０〜500mM NaClのグラジエントで結合タンパク質を溶出させることにより、可溶性で正確にフォールディングしたscFv-TCRを、分解産物及び不純物から分離した。ピーク画分(導電率10mS/cm程度で溶出)を４℃で保存した。
最終精製工程
第２精製工程からのピーク画分をInstant Blue(登録商標) Stain(Novexin)染色SDS-PAGEにより分析した後にプールした。次いで、プール画分を最終精製工程用に濃縮し、PBS緩衝液(Sigma)中で予め平衡化したSuperdex(登録商標) S200ゲル濾過カラム(GE Healthcare)を用いて可溶性scFv-TCRを精製し、特徴付けた。約78kDaの相対分子量で溶出するピークを、Instant Blue(登録商標) Stain(Novexin)染色SDS-PAGEにより分析した後、プールした。
【００４５】
実施例６
抗CD3 scFv-EBV LMP2A高親和性TCR融合体によるＴ細胞の、ペプチドパルスされたT2細胞及び３つの細胞株IM9、HCT116及びcolo205に対する再指向化
５つの抗CD3 scFv-EBV LMP2A TCR融合体を実施例５に記載のとおりに作製した。α鎖及びβ鎖の配列は以下のとおりであった：
【表５】
2016528244.tif 000006
【００４６】
特異的ペプチド-MHC認識を介する抗CD3 scFv-EBV LMP2A TCR融合体による細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)の活性化を証明するために、下記のアッセイを行った。IFN-γ産生(ELISPOTアッセイにより測定)を、CTL活性化に関する読取値(read-out)として使用し、該融合タンパク質の抗CD3 scFv部分の効力を評価することを可能にした。
アッセイ培地：10％ FCS(熱不活化；Sera Laboratories lnternational, cat# EU-000-Fl)、88％ RPMI 1640(Invitrogen, cat# 42401018)、１％グルタミン(Invitrogen, cat# 25030024)及び１％ペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen, cat#15070063)。
洗浄緩衝液：0.05％ Tween-20を含有する１×PBSサシェ(Sigma, cat# P3813)(脱イオン水で作製)
PBS(Invitrogen, cat# 10010015)
希釈緩衝液：PBS及び10％ FCS(熱不活化)
ヒトIFNγ ELISPOT PVDF-Enzymatic kit(BD Biosciences, cat# 551849)は、必要な他の全ての試薬を含有する(捕捉及び検出抗体、ストレプトアビジン-HRP及び基質溶液並びにヒトIFN-γ PVDF ELISPOT 96ウェルプレート)。
【００４７】
方法
標的細胞の調製
標的細胞をEBV LMP2A抗原発現について、標準的手順及び当該抗原に特異的なプライマーを用いる定量的RT-PCRにより特徴付けた。本アッセイで使用したIM9標的細胞は、EBV LMP2Aを発現することが示された；colo205結腸直腸細胞株はEBV LMP2A-である。十分な標的細胞(本アッセイでは50 000細胞/ウェルが可能)を、Megafuge 1.0(Heraeus)での1200rpmにて５分間の３回の遠心分離により洗浄した。次いで、細胞をアッセイ培地に106細胞/mlで再懸濁した。
エフェクター細胞の調製
本方法で使用したエフェクター細胞(Ｔ細胞)は、末梢血単核細胞(PBMC)であった。PBMCは、Lymphoprep(Axis-Shields, cat# NYC-1114547)及びLeucosepチューブ(Greiner, cat# 227290)を用いて標準的手順により血液から単離した。エフェクター細胞を解凍し、アッセイ培地中に配置した後、Megafuge 1.0(Heraeus)での1300rpmにて10分間の遠心分離により洗浄した。次いで、細胞をアッセイ培地中に４×最終必要濃度で再懸濁した。
試薬/試験化合物の調製
アッセイ培地中に希釈して４×最終濃度を得ることにより、種々の濃度の抗CD3 scFv-EBV LMP2A TCR融合タンパク質(10nM〜0.1pM)を調製した。
【００４８】
ELISPOT
プレートを下記のように調製した：100μlの抗IFN-γ又は抗GrB捕捉抗体をプレートあたり10mlの滅菌PBS中に希釈した。次いで、100μlの希釈捕捉抗体を各ウェル中に小分けした。次いで、プレートを一晩４℃にてインキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄(プログラム１、プレートタイプ２、Ultrawash Plus 96ウェルプレートウォッシャー；Dynex)して捕捉抗体を除去した。次いで、200μlのアッセイ培地を各ウェルに添加し、プレートを室温にて２時間インキュベートすることにより、プレートをブロックした。次いで、アッセイ培地をプレートから洗い流し(プログラム１、プレートタイプ２、Ultrawash Plus 96ウェルプレートウォッシャー, Dynex)、ELISPOTプレートをペーパータオル上で軽く叩いたり、弾いたりすることにより、残った培地を除去した。
次いで、アッセイの構成要素をELISPOTプレートに下記の順序で添加した：
50μlの標的細胞  106細胞/ml(合計50,000標的細胞/ウェルを得る)
50μlの試薬(抗CD3 scFv-TCR融合体；種々の濃度)
50μlの培地(アッセイ培地)
50μlのエフェクター細胞(20,000 PBMC細胞/ウェル)。
【００４９】
次いで、プレートを一晩インキュベートした(37℃/５％CO2)。翌日、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し(プログラム１、プレートタイプ２、Ultrawash Plus 96ウェルプレートウォッシャー, Dynex)、ペーパータオル上で軽く叩いて乾燥させて過剰な洗浄緩衝液を除去した。次いで、100μlの一次検出抗体を各ウェルに添加した。製造業者の指示書で特定される希釈率で一次検出抗体を10mlの希釈緩衝液(単一プレートに必要な容量)中に希釈した。次いで、プレートを室温で少なくとも２時間インキュベートした後、洗浄緩衝液で３回洗浄した(プログラム１、プレートタイプ２、Ultrawash Plus 96ウェルプレートウォッシャー, Dynex)；プレートをペーパータオル上で軽く叩いて過剰の洗浄緩衝液を除去した。
【００５０】
二次検出は、100μlの希釈ストレプトアビジン-HRPを各ウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートすることにより実施した。ストレプトアビジン-HRPは、製造業者の指示書で特定される希釈率で10mlの希釈緩衝液(単一プレートに必要な容量)に希釈した。次いで、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し(プログラム１、プレートタイプ２, Ultrawash Plus 96ウェルプレートウォッシャー, Dynex)、ペーパータオル上で軽く叩いて過剰の洗浄緩衝液を除去した。次いで、200μlのPBSを各ウェルに添加してプレートを２回洗浄し、弾いたり、ペーパータオル上で軽く叩いたりして過剰の緩衝液を除去した。
使用のせいぜい15分前に、１滴(20μl)のAEC色素原を各１mlのAEC基質に加えて混合した。10mlのこの溶液を各プレートについて調製した；ウェルあたり100μlを加えた。次いで、ホイルを用いてプレートを遮光し、(通常５〜20分以内に起こる)スポット発色を定期的にモニターした。水道水でプレートを洗浄して発色反応を終了させ、振って乾燥させた後、プレートを３つの構成パーツに解体した。その後、プレートを室温にて少なくとも２時間乾燥させた後、Immunospotプレートリーダー(CTL；Cellular Technology Limited)を用いてスポットを計数した。
【００５１】
結果
抗CD3 scFv-EBV LMP2A TCR融合体をELISPOTアッセイ(上記)により試験した。Prism(Graph Pad)を使用して、各ウェル中で観察されたスポット数を、融合構築物の濃度に対してプロットした(図９参照)。これら用量-応答曲線から、EC50値を決定した(EC50は、最大応答の50％を導く抗CD3 scFv-EBV LMP2A TCR融合体の濃度で決定される)。
図９のグラフは、EBV LMP2A提示細胞株IM9の存在下における、異なる抗CD3 scFv-EBV LMP2A高親和性TCRによるＴ細胞の特異的活性化を証明する。このデータは、各ケースにおける少なくとも３つの別個のアッセイを代表するものである。
図９のデータから以下のEC50値が得られる；a29b1-抗CD3については1430pM、a32b1-抗CD3については681pM、a37b1-抗CD3については1980pM、a38b-抗CD3については66.7pM、a42b1-抗CD3については439pM。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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