(57)【要約】  本発明は、従属栄養条件下で培養された微細藻類のタンパク質強化方法であって、前記微細藻類はクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属であり、従属栄養培養が、発酵培地における無窒素栄養源の欠損により前記微細藻類の増殖を制限することを目的としたステップを含むことを特徴とする方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
従属栄養的に増殖させた微細藻類のタンパク質強化方法であって、前記微細藻類はクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属であり、従属栄養培養が、発酵培地における無窒素栄養源の欠損により前記微細藻類の増殖を制限し、それにより、バイオマスのタンパク質含有量が５０重量％を超えることを可能にすることを目的としたステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記欠損させた無窒素栄養源がグルコースおよびリン酸塩からなる群から選択される栄養物質であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記栄養源の制限がない場合の増殖速度よりも１０％〜６０％低い増殖速度が得られるように前記栄養源を欠損させることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類が、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）およびクロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
０．０６ｈ−１〜０．０９ｈ−１の増殖速度が得られるように前記栄養物質が供給されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
欠損させた培養期が、少なくとも１時間、好ましくは少なくとも１０時間、より好ましくは少なくとも２０時間、特に３０時間〜６０時間継続されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）種の微細藻類の従属栄養培養が、
ａ．前記微細藻類が増殖される第１のステップであって、大量のバイオマスが急速に得られるように、グルコース供給速度が前記微細藻類の消費能力に調整されるステップと、
ｂ．前記微細藻類がタンパク質を生産する第２のステップであって、貯蔵物質のさらなる蓄積を防止するか、またはその消費を促進するように、前記グルコース供給速度が前記微細藻類のグルコース消費能力よりも明らかに低い値に設定されるステップと
を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）種の微細藻類の従属栄養培養が、増殖速度を制限して前記タンパク質含有量の増加をもたらす、リン酸塩欠損で培養するステップを含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細藻類バイオマスのタンパク質強化方法であって、前記微細藻類が、より具体的にはクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属であり、さらにより具体的にはクロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）種またはクロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）種である方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
藻類（大型藻類および微細藻類）は、特定の、しかし、ほとんど明らかにされていない豊かさを有する。食品、化学薬品およびバイオエネルギーの製造におけるその使用は、依然として非常に稀である。しかしながら、藻類は大きな価値を有する成分を秘めており、その豊かさおよび存在量は、これらを餌にする海洋動物のみが真に認識することができる。
【０００３】
微細藻類は、実際に、ビタミン、脂質、タンパク質、糖、色素および抗酸化剤の源である。
【０００４】
従って、藻類および微細藻類は、栄養補助食品、機能性食品、化粧品もしくは医薬品を製造するために、または水産養殖のためにこれらを使用する産業にとって興味深いものである。
【０００５】
微細藻類は、特に、光にさらされる全てのバイオトープにコロニーを形成する光合成微生物である。
【０００６】
工業規模では、微細藻類のモノクローナル培養は、光バイオリアクタ（独立栄養条件：光およびＣＯ２の存在下）において、または場合により発酵槽（従属栄養条件：暗所で炭素源の存在下）において行われる。
【０００７】
少数の微細藻類種は、実際に、光がなくても増殖することができる：クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）、シクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）、クリプテコジニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）である。
【０００８】
さらに、当業者にとって、従属栄養条件は、
−  細菌および酵母用に使用されるものと同一であり、かつ培養パラメータの全てが制御可能である発酵槽の使用と、
−  光に基づく培養によって得られるものよりもはるかに大量のバイオマスの製造と
を可能にするための、従属栄養条件下の培養コストは光栄養条件下の培養コストの１／１０であると推定される。
【０００９】
微細藻類の有利な使用は、一般に、
−  その優れた抗酸化特性と、食品に自然の色を提供する需要が高まっている色素（クロロフィルａ、ｂおよびｃ、β−カロテン、アスタキサンチン、ルテイン、フィコシアニン、キサントフィル、フィコエリトリンなど）、
−  タンパク質（その栄養価を最適化するため）、または
−  脂質（その脂肪酸含有量を最適化（その乾燥物質の６０重量％まで、さらに８０重量％まで）するため）
などの、対象の成分を蓄積するように発酵条件の制御を必要とし、脂質の蓄積は、特に、
・  バイオ燃料用途のためだけでなく、
・  選択された微細藻類がいわゆる「必須」（すなわち、ヒトまたは動物によって天然に産生されないため、食餌で提供される）多価不飽和脂肪酸、すなわちＰＵＦＡを産生する場合には、ヒトまたは動物の食品用途のためでもある。
【００１０】
従って、この結果に到達するために、タンパク質または脂質の最大収量および生産が得られるように、まず高細胞密度（ＨＣＤ）発酵方法が徹底的に調査された。
【００１１】
これらのＨＣＤ培養の目的は、最短時間内に可能な限り高い濃度で所望の生成物を得ることであった。
【００１２】
この指針は、例えば、クロレラ・ゾフィンギエンシス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）によるアスタキサンチンの生合成について検証されており、微細藻類の増殖はこの化合物の生産と直接相関することが証明された（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｐｅｎｇ，２００８，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２４（９），１９１５−１９２２）。
【００１３】
しかしながら、最大速度（μ、単位ｈ−１）で増殖を維持するという事実が、必ずしも所望の生成物の高い生産量と相関するわけではない。
【００１４】
実際、微細藻類の大量の脂質貯蔵をもたらすために、例えば、微細藻類をその増殖を制限する栄養的ストレスにさらす必要があることは、この分野の専門家によってすぐに明らかになった。
【００１５】
現在、増殖と生産とは、発酵方法において切り離されている。
【００１６】
例えば、多価不飽和脂肪酸（ここでは、ドコサヘキサエン酸、すなわちＤＨＥＡ）の蓄積を促進するために、特許出願の国際公開第０１／５４５１０号パンフレットでは、細胞の増殖と多価不飽和脂肪酸の生産とを分離することが助言されている。
【００１７】
従って、微細藻類シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種株ＡＴＣＣ２０８８８において、酸素の制限のない第１の増殖期では、高細胞密度（１００ｇ／ｌ超）の産生を促進するように行われ、次に第２のステップでは、微細藻類にストレスをかけてその増殖を遅くし、対象の脂肪酸の生産を開始するように、酸素の供給を徐々に減少している。
【００１８】
微細藻類クリプテコディニウム・コーニー（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ）では、低グルコース濃度（約５ｇ／ｌ）およびこれによる低増殖速度を用いて、高いドコサヘキサエン酸（ＤＨＥＡ、多価不飽和脂肪酸）含有量が得られる（Ｊｉａｎｇ
ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，２０００，Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３５（１０），１２０５−１２０９）。
【００１９】
これらの結果は、産物形成の反応速度が微細藻類の増殖と正または負に、さらにはその２つの組み合わせで関連することを明確に示している。
【００２０】
その結果、産物形成が高細胞増殖と相関しない場合には、細胞増殖速度を制御することが賢明である。
【００２１】
一般に、当業者は、発酵条件（Ｔｐ、ｐＨなど）の制御、または発酵培地への栄養成分
の供給の制御（半連続的な、いわゆる「流加培養」条件）によって、微細藻類の増殖を制御することを選択する。
【００２２】
当業者が炭素源の供給によって従属栄養条件下の微細藻類の増殖を制御することを選択する場合、通常、生産される代謝産物（例えば、ＤＨＥＡタイプの多価不飽和脂肪酸）に応じて、炭素源（純粋なグルコース、アセテート、エタノールなど）を微細藻類（Ｃ．コーニー（Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ）、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）など）へ適応させることが選択される。
【００２３】
温度も重要なパラメータである：
−  例えば、クロレラ・ミヌティッシマ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ）によるＥＰＡなど、特定の微細藻類種による多価不飽和脂肪酸の合成は、前記微細藻類の最適な増殖に必要とされる温度よりも低い温度で促進されることが報告されており、
−  反対に、従属栄養的に増殖するクロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ
ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）によるルテインの収量は、生産温度を２４℃から３５℃へ上昇させると高くなる。
【００２４】
クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）は、最良の産油微細藻類の１つとして正当に認識されている。
【００２５】
従属栄養条件下では、それは、炭水化物をトリグリセリドに急速に変換する（その乾燥物質の５０％超）。
【００２６】
このトリグリセリドの生産を最適化するために、当業者は、発酵培地の栄養環境に作用することによって、油の生産に対して炭素フラックスを最適化するように導く。
【００２７】
従って、十分な量の炭素が供給されるが、窒素欠損条件下である場合に油が蓄積することが分かる。
【００２８】
このように、Ｃ／Ｎ比はここでは決定的であり、グルコース含有量が制限されていないときに窒素含有量に直接作用することにより最良の結果が得られることが認められている。
【００２９】
驚くことではないが、この窒素欠損は細胞増殖に影響を与え、その結果、増殖速度は通常の微細藻類の増殖速度よりも３０％低くなる（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１０，１５４，ｐｐ．１００１−１０１１）。
【００３０】
この結果を説明するために、上記論文においてＸｉｏｎｇらは、実際に、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）バイオマスをその５つの主成分、すなわち、炭水化物、脂質、タンパク質、ＤＮＡおよびＲＮＡ（その乾燥物質の８５％に相当）に分類する場合、Ｃ／Ｎ比が、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび炭水化物含有量に影響を与えない場合には、タンパク質および脂質含有量にとって重要になることを示している。
【００３１】
すなわち、低Ｃ／Ｎ比によるクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）細胞の増殖は２５．８％のタンパク質および２５．２３％の脂質を含有するが、高Ｃ／Ｎ比によって、５３．８％の脂質および１０．５％のタンパク質の合成が可能になるということである。
【００３２】
従って、油の生産を最適化するために、当業者は、タンパク質の生産を犠牲にして炭素フラックスを油の生産に転換させることにより制御することが不可欠であり、微細藻類が窒素欠損培地に入れられる場合、炭素フラックスは再分配され、脂質貯蔵物質に蓄積され
る。
【００３３】
従って、この教示を得て、タンパク質が豊富なバイオマスを製造するために、当業者はこの代謝制御とは反対のことを実行する、すなわち、代わりに低Ｃ／Ｎ比を促進する発酵条件を適用し、それによって、
−  発酵培地に、タンパク質に変換される炭素源の負荷を一定に保持しながら大量の窒素源を供給し、
−  微細藻類の増殖を刺激する
ように導かれる。
【００３４】
貯蔵脂質の生産を犠牲にして、タンパク質（およびそれによりバイオマス）の生産に向けて炭素フラックスを変更することが問題である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３５】
本発明に関連して、本出願人の企業は、従来当業者によって構想されるものの代替となる解決法を開示することによって、新規の経路を模索することを選択した。
【００３６】
すなわち、本発明は、従属栄養的に増殖した微細藻類のタンパク質強化方法であって、前記微細藻類がクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属であり、より具体的にはクロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）またはクロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）であり、前記従属栄養培養方法が、発酵培地における無窒素栄養源の欠損により前記微細藻類の増殖を制限することを目的とするステップを含む、方法に関する。
【００３７】
このステップは、微細藻類の増殖を可能にするために不十分な量の無窒素栄養因子が培地に供給される従属栄養培養ステップである。「不十分な量」は、この栄養因子が供給されないことを意味しないことに留意すべきである。この栄養欠損期の結果は、細胞代謝を、完全に阻害することなく遅くする（制限する）ことである。
【００３８】
本発明の意味において、「強化」は、バイオマスのタンパク質含有量が５０重量％を超えるように、バイオマスのタンパク質含有量を、少なくとも１５重量％、好ましくは少なくとも２０重量％増加させることを指す。
【００３９】
本発明は、より具体的には、発酵培地における無窒素栄養源の欠損によって前記微細藻類の増殖を制限することを目指すステップを含む、前記微細藻類の従属栄養培養方法を包含する。
【００４０】
従って、本発明は、従属栄養的に増殖された微細藻類のタンパク質強化方法であって、前記微細藻類がクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属であり、より具体的にはクロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）またはクロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）であり、発酵培地における無窒素栄養源の欠損により前記微細藻類の増殖を制限し、それによってバイオマスのタンパク質含有量が５０重量％を超えることを可能にすることを目的とするステップを含む従属栄養培養を含む、方法に関する。
【００４１】
「発酵培地における無窒素栄養源の欠損」とは、微細藻類に、その増殖に不十分な量の無窒素栄養因子の少なくとも１つが供給される培養を意味する。
【００４２】
特に、栄養源は、前記栄養源の制限がない場合の増殖速度よりも１０％〜６０％低い増
殖速度が得られるように欠損している。特に、グルコースの制限がない場合の増殖速度と比較して１０％〜６０％、特に、グルコースの制限がない場合の増殖速度と比較して１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％または５５％、増殖速度を低下させることが開示される。好ましくは、増殖速度は１５％〜５５％低下する。
【００４３】
栄養因子（特に、グルコース）の欠損を含む培養期の継続時間は、少なくとも１時間、好ましくは少なくとも１０時間、より好ましくは少なくとも２０時間であり、特に、３０時間〜６０時間である。
【００４４】
その結果、培地中に残留する無窒素栄養因子はなく、微細藻類は、この栄養因子が供給されると急速にそれを消費する。しかしながら、培地中に残留する無窒素栄養因子の欠如は、微細藻類にその栄養因子を完全に与えない状態とは区別される。
【００４５】
従って、本発明の文脈において、本質的な基準は、発酵培地における無窒素栄養物質の欠損により引き起こされるストレス、すなわち細胞ストレスによって誘導される細胞増殖の制限である。
【００４６】
従って、この戦略は、バイオマスのタンパク質含有量を増加させるためにバイオマスを増加させ、それにより細胞増殖を増加させることが必然的に必要であるという技術的な先入観とは全く反対である。
【００４７】
「無窒素栄養源」とは、例えば、グルコースおよびリン酸塩からなる群から選択される栄養物質を意味する。
【００４８】
以下に例示されるように、
−  発酵培地におけるグルコースの欠損により、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）、
−  発酵培地におけるリン酸塩の欠損により、クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）
の増殖を制限することが有利に選択され得る。
【００４９】
特に、これらの株については、栄養物質は、０．０６ｈ−１〜０．０９ｈ−１の増殖速度が得られるように供給される。
【００５０】
非常に特殊な実施形態では、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）株は、株ＵＴＥＸ１６６３（米国オースティンにあるテキサス大学のＴｈｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ）である。非常に特殊な実施形態では、クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）株は、株ＣＣＡＰ２１１／８Ｄ（英国スコットランドのＴｈｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）である。
【００５１】
必要に応じて、前記微細藻類の増殖は、硫酸塩などの細胞増殖を阻害する物質を培地に添加することによって制限することができる。
【００５２】
さらに、任意の理論に拘束されることなく、本出願人の企業は、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）属の微細藻類におけるグルコースフラックスが、通常、非常に正確な優先順位決定：
１．基礎代謝、
２．増殖、すなわちタンパク質に富んだバイオマスの形成、
３．貯蔵物質（脂質、およびデンプンなどの炭水化物）
に応じて使用されることを見出した。
【００５３】
この原理は、窒素の一定の供給がにもかかわらず、微細藻類が増殖される際のタンパク質含有量の自然変位を説明する。
【００５４】
従って、本出願人の企業は、微細藻類バイオマスのタンパク質を強化するために、微細藻類の増殖を制限すること、および
−  グルコースの全消費をタンパク質産生経路に向けさせ、
−  脂質などの貯蔵物質の蓄積を避けるように、
その窒素以外の栄養源（例えば、グルコース）の消費を制御することが必要であることを見出した。
【００５５】
実際、窒素欠損の回避により、代謝フラックスが脂質の生産に向かうことの防止が可能になる。
【００５６】
必要に応じて、特定の阻害剤の使用によって貯蔵材料の任意の合成を完全に遮断まですることが有利である。
【００５７】
実際、脂質およびさらにはデンプン（緑色微細藻類の優れた貯蔵炭水化物）の合成経路のいくつかの阻害剤が知られている：
−  脂質については、脂肪酸合成の阻害剤としてのセルレニンと、リパーゼの阻害剤としてのストレプトミケス・トキシトリキニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｏｘｙｔｒｉｃｉｎｉ）により生産される天然物質のリプスタチンとが記載され、
−  デンプンについては、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼおよびＵＤＰ−Ｇａｌｐムターゼの強力な阻害剤として、イミノ糖（糖の環内酸素原子の窒素原子による単純な置換によって得られる）が歴史的に知られている。
【００５８】
従って、本方法は、従属栄養条件下での微細藻類バイオマスの発酵を含み、バイオマスを増殖させる第１のステップと、無窒素栄養源の発酵培地を取り除く第２のステップとを有する。
【００５９】
この第２のステップは、バイオマスのタンパク質を強化することを可能にする。特に、バイオマスのタンパク質含有量が５０重量％（乾燥物質の重量による）を超えることを可能にする。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本発明に従う第１の好ましい実施形態では、前記微細藻類、特にクロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）を従属栄養的に培養するための方法は、
○  微細藻類を増殖させる第１のステップであって、大量のバイオマスが急速に得られるように、グルコース供給速度が前記微細藻類の消費能力に調整されるステップと、
○  微細藻類がタンパク質を生産する第２のステップであって、貯蔵物質のさらなる蓄積を防止するか、またはその消費を促進するように、グルコース供給速度が前記微細藻類のグルコース消費能力よりも明らかに低い値に設定されるステップと
を含む。
【００６１】
以下に例示されるように、微細藻類が増殖される第１のステップは不連続または「バッ
チ」モードで実行され、最初のグルコース供給の全体が微細藻類によって消費されて、基礎となるバイオマスの生産をもたらす。
【００６２】
タンパク質が生産される第２のステップは、
−  最初のグルコース供給が消費された後、いわゆる「流加培養」系を用いて完全培地が半連続的に供給され、発酵の他の操作パラメータは変更されていない条件下で実行される。
【００６３】
グルコースは連続的に供給され、次に、培地中の残留グルコース含有量がゼロに維持されるように、供給速度が株の最大消費速度よりも低くされる。
【００６４】
従って、株の増殖は、グルコースの利用可能性によって制限される（グルコース制限条件）。
−  あるいは、連続ケモスタット操作が使用され、株の増殖速度（μ）がその最小値で維持され、株の増殖がグルコース供給によって制限される。
【００６５】
この操作方法により、グルコースの制限と、課せられた低増殖速度とにより、高タンパク質含有量を有するバイオマスを得ることが可能になり、全てが非常に良好な生産性を確保する。
【００６６】
本発明による第２の好ましい実施形態では、前記微細藻類、特にクロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）を従属栄養的に培養するための方法は、リン酸塩供給の制限が増殖速度を制限して、その結果、タンパク質含有量の増加をもたらす、微細藻類を増殖させるステップを含む。従って、クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）種の微細藻類の従属栄養培養は、増殖速度を減少させてタンパク質含量の増加をもたらす、リン酸塩の欠損による従属栄養培養のステップを含む。
【００６７】
本発明は、例示的かつ非限定的であることが意図される以下の実施例を用いてより良く理解されるであろう。
【実施例】
【００６８】
実施例１：栄養培地の供給を制限しない逐次バッチ発酵を用いた、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）の生産
使用した株は、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）（株ＵＴＥＸ１６６３  −  米国オースティンにあるテキサス大学のＴｈｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ）である。
【００６９】
前培養：
−  ２ｌの三角フラスコ中に６００ｍｌの培地
−  培地の組成（以下の表１）
【００７０】
【表１】
2016514471.tif 000002
【００７１】
８ＮのＮａＯＨを添加することにより、滅菌の前にｐＨ７に調整した。
【００７２】
培養は、以下の条件下で進行する：
−  時間：７２時間、
−  温度：２８℃、
−  振とう速度：１１０ｒｐｍ（Ｉｎｆｏｒｓ  Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎインキュベータ）。
【００７３】
前培養物を次に、３０ｌのサルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）発酵槽に移す。
【００７４】
バイオマス生産培養：
培地は前培養のものと同一であるが、尿素はＮＨ４Ｃｌに置き換えられる。
【００７５】
【表２】
2016514471.tif 000003
【００７６】
発酵槽の初期容積（Ｖｉ）は、接種後に１３．５ｌに調整される。
【００７７】
それを、１６〜２０ｌの最終容積まで増加させる。
【００７８】
発酵の操作パラメータは以下の通りである。
【００７９】
【表３】
2016514471.tif 000004
【００８０】
最初に供給されたグルコースが消費されたら、消泡剤を含まない最初の培地と同一の培地が、５００ｇ／ｌのグルコースと、他の要素（グルコースに対する割合は最初の培地と同じである）とを含有する濃縮溶液の形態で、発酵槽において２０ｇ／ｌのグルコース含有量が得られるように供給される。
【００８１】
残留グルコース濃度がゼロになる度に、他に２回の同一の添加が同様にして供給される。
【００８２】
Ｃｌｅｒｏｌ  ＦＢＡ  ３１０７消泡剤は、過剰の泡立ちを回避するために必要に応じて添加される。
【００８３】
結果：
４６時間の培養後、３６．２％のタンパク質含有量（Ｎ６．２５により評価）を有する３８ｇ／ｌのバイオマスが得られる。
【００８４】
実施例２：グルコースの制限供給による流加発酵を用いた、Ｃ．ソロキニアナ（Ｃ．ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）の生産
この実施例では、最初に供給されたグルコースが消費された後、完全培地（流加培養モード）の供給が開始される。発酵の他の操作パラメータは変更されていない。
【００８５】
グルコースは、５００ｇ／ｌの濃縮溶液を用いて連続的に供給される。培地中の残留グルコース含有量がゼロに維持されるように、すなわち、株の増殖がグルコースの供給量によって制限される（グルコース制限条件）ように、供給速度は株の最大消費速度よりも低い。
【００８６】
この速度は、時間と共に指数関数的に上昇する。添加流速を計算するために使用される式は、供給されたグルコースが全て消費されたときに株がとり得る増殖速度に対応する係数μによって特徴付けられる：
Ｓ＝Ｓ０  ｘ  ｅｘｐ（μ．ｔ）。
Ｓ＝グルコース供給流速（単位ｇ／ｈ）。
Ｓ０＝バッチの最後に存在するバイオマスに応じて決定される、初期グルコース供給流速。本発明者らの条件下では１２ｇ／ｈである。
μ＝流速加速係数。０．１１ｈ−１よりも低くなければならず、栄養制限の非存在下における株の増殖速度である。
ｔ＝流加培養操作の継続時間（単位：時間）。
【００８７】
塩は、可能であれば、単独で、あるいはグルコースと混合して、連続的に供給される。しかしながら、塩は数回に分けて順次供給されてもよい。
【００８８】
以下の表４は、１００ｇのグルコースに対する塩の必要量を示す。
【００８９】
【表４】
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【００９０】
グルコース以外の要素の濃度は、株の栄養要求量に対して過剰であるように決定した。
【００９１】
過剰の発泡を避けるために、必要に応じてＣｌｅｒｏｌ  ＦＢＡ  ３１０７消泡剤が添加される。
【００９２】
結果：流加培養操作中のグルコース供給速度の効果
流加培養モードにおいて種々のグルコース供給速度で試験を行った。これらは、適用されるμによって特徴付けられる。得られたバイオマスのタンパク質含有量は、Ｎ６．２５で表される全窒素を測定することによって評価される。
【００９３】
【表５】
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【００９４】
これらの結果は、グルコース制限がタンパク質含有量の増加を可能にすることを示す。
【００９５】
実際、０．０９の高いμを用いても、得られるタンパク質含有量は、実施例１のように制限がない場合に得られるよりも高いことが観察される（３９．３％対３６．２％）。
【００９６】
グルコースを用いた代謝の制限が厳しくなると、その結果、タンパク質含有量のさらなる増加が得られる。
【００９７】
これらの試験条件下では、５０％を超えるタンパク質含有量を得るために、株に０．０６ｈ−１未満のμを課することが必要である。
【００９８】
この条件に関連して生産性の低下が起こることに留意すべきである：試験３では１．３５ｇ／ｌ／ｈに対して０．５６ｇ／ｌ／ｈ。
【００９９】
実施例３：グルコースの制限供給による連続ケモスタット発酵を用いた、Ｃ．ソロキニアナ（Ｃ．ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）の生産
この実施例では、２ｌのザルトリウス・バイオスタット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｂｉｏｓｔａｔ）  Ｂ発酵槽が使用される。
【０１００】
発酵は実施例２と同様に行われるが、１／１０の大きさの容積を使用し、接種材料の容積は６０ｍｌであり、初期容積は１．３５ｌである。
【０１０１】
培地の連続供給は実施例２と同じ原理に従って開始され、この場合、塩は供給タンク内でグルコースと混合される。供給速度は、μ０．０６ｈ−１を適用することにより実施例２と同じ指数関数式に従って加速される。
【０１０２】
ケモスタット
１．６ｌの容積に達したときに（約５０ｇ／ｌのバイオマス濃度）、連続ケモスタット型の操作が始まる。
【０１０３】
１．発酵槽には、１００ｇ／ｌのグルコースを含有する、以下の組成の栄養培地溶液が９６ｍｌ／ｈの流速で連続的に供給される。
【０１０４】
【表６】
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【０１０５】
グルコース以外の要素の濃度は、株の栄養要求量に対して過剰であるように決定した。
【０１０６】
２．培養容積を１．６ｌに維持するように、培地は、ポンプに接続したサイフォン管によって発酵槽から連続的に除去される。
【０１０７】
このようにして、１時間につき、培地の０．０６／１画分（６％）が置換される。この置換速度は、希釈率（Ｄ）と呼ばれる。
【０１０８】
ケモスタット培養方法の原理に従って、株の増殖はグルコース供給によって制限されるため、株の増殖速度（μ）は同じ値で設定される。
Ｄ＝μ＝０．０６ｈ−１
【０１０９】
結果
ケモスタットモードで９７時間の操作の後、バイオマス濃度は４８ｇ／ｌ±２ｇ／ｌで安定し、タンパク質含有量は５３±２％である。
【０１１０】
この操作モードにより、グルコースの制限と、課せられる低増殖速度との結果、高タンパク質含有量を有するバイオマスを得ることが可能になり、全ては非常に良好な生産性を確保する（高濃度のバイオマスの結果、約２．９ｇ／ｌ／ｈ）。
【０１１１】
実施例４：リン酸塩供給の制限の有無にかかわらずバッチ発酵を用いた、クロレラ・プロ
トテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の生産
使用した株はクロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）（株ＣＣＡＰ２１  １／８Ｄ  −  英国スコットランドのＴｈｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ）である。
【０１１２】
前培養：
・  ５００ｍｌの三角フラスコ中に１５０ｍｌの培地
・  培地の組成：４０ｇ／ｌのグルコース＋１０ｇ／ｌの酵母抽出物
【０１１３】
培養は以下の条件下で進行する：継続時間：７２時間、温度：２８℃、振とう速度：１１０ｒｐｍ（Ｉｎｆｏｒｓ  Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎインキュベータ）。
【０１１４】
次に、前培養物を２ｌのザルトリウス・バイオスタット  Ｂ発酵槽へ移す。
【０１１５】
バイオマス生産培養：
培地の組成は、以下の通りである（ｇ／ｌ）。
【０１１６】
【表７】
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【０１１７】
リン酸塩供給は、試験１では制限するように、試験２では過剰であるように計算される。Ｃｌｅｒｏｌ  ＦＢＡ  ３１０７消泡剤は、過剰の泡立ちを避けるために必要に応じて添加される。発酵槽の初期容積（Ｖｉ）は、接種後に１ｌに調整される。
【０１１８】
発酵の操作パラメータは以下の通りである。
【０１１９】
【表８】
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【０１２０】
【表９】
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【０１２１】
これらの結果は、発酵の終了時に残留リン酸塩が存在しないことによって確認されるリン酸塩供給の制限が、増殖速度（累積μで測定）を制限し、先行する実施例におけるグルコースの制限と同様に、５０％よりも明らかに大きい値に達するタンパク質含有量の増加をもたらすことを示す。
【国際調査報告】
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