(57)【要約】  膀胱癌を検出する組成物及び方法が提供される。いくつかの実施形態では、低悪性度の膀胱癌を検出する方法が提供される。いくつかの実施形態では、膀胱癌の再発をモニタリングする方法が提供される。上記方法は、アンドロゲンアクセプター（ＡＲ）及び／又はウロプラキン１Ｂ（ＵＰＫ１Ｂ）を検出することを含む。また、ＡＲ及び／又はＵＰＫ１Ｂの発現を判定することによるアンドロゲンアクセプターアンタゴニストを用いた治療法をモニタリングする方法が提供される。いくつかの実施形態では、上記発現は尿試料において判定される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において膀胱癌の存在を検出する方法であって、被験体に由来する試料中の一組の膀胱癌マーカーの各マーカーのレベルを検出することを含み、前記一組の膀胱癌マーカーがウロプラキン１Ｂ（ＵＰＫ１Ｂ）若しくはアンドロゲンアクセプター（ＡＲ）、又はＵＰＫ１Ｂ及びＡＲの両方を含み、ＵＰＫ１Ｂ及びＡＲから選択される少なくとも１つのマーカーのレベルの上昇の検出が前記被験体における膀胱癌の存在を示す、被験体において膀胱癌の存在を検出する方法。
【請求項２】
膀胱癌を伴う被験体における抗アンドロゲン療法をモニタリングする方法であって、第１の時間点において前記被験体に由来する試料中の一組の膀胱癌マーカーの各マーカーのレベルを検出することを含み、前記一組の膀胱癌マーカーがウロプラキン１Ｂ（ＵＰＫ１Ｂ）若しくはアンドロゲンアクセプター（ＡＲ）、又はＵＰＫ１Ｂ及びＡＲの両方を含み、第２の時間点に比較して第１の時間点における前記少なくとも１つのマーカーのレベルの減少が、前記被験体が抗アンドロゲン療法に反応していることを示す、膀胱癌を伴う被験体における抗アンドロゲン療法をモニタリングする方法。
【請求項３】
第２の時間点における前記少なくとも１つのマーカーのレベルと、第１の時間点における前記少なくとも１つのマーカーのレベルとを比較することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記被験体が第１の時間点において抗アンドロゲン療法を受けている、請求項２又は請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第２の時間点が、被験体が抗アンドロゲン療法を開始する前である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記被験体が第２の時間点において抗アンドロゲン療法を受けている、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記一組の膀胱癌マーカーが、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）、ケラチン２０（ＫＲＴ２０）、及びアネキシン１０（ＡＮＸＡ１０）から選択される少なくとも１つのマーカーを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記一組の膀胱癌マーカーが、
ａ）ＡＲ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、及びＡＮＸＡ１０、
ｂ）ＡＲ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、及びＫＲＴ２０、
ｃ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、及びＡＮＸＡ１０、
ｄ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、及びＫＲＴ２０、
ｅ）ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、及びＡＮＸＡ１０、
ｆ）ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、及びＫＲＴ２０、
ｇ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、及びＡＮＸＡ１０、又は、
ｈ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＫＲＴ２０、及びＡＮＸＡ１０、
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
内在性コントロールを検出することを更に含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記内在性コントロールが、ＡＢＬ、ＧＵＳＢ、ＧＡＰＤＨ、ＴＵＢＢ、及びＵＰＫ１ａから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
外在性コントロールを検出することを更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記外在性コントロールがＲＮＡである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出がＲＴ−ＰＣＲを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
定量的ＲＴ−ＰＣＲを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｃｔ値又はΔＣｔ値と、閾値Ｃｔ値又は閾値ΔＣｔ値とを比較することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ΔＣｔが、内在性コントロールに対するＣｔ値から前記マーカーに対するＣｔ値を引いたものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＲＴ−ＰＣＲ反応が、初期変性工程から最終伸長工程を通して２時間未満である、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が、前記試料に由来するＲＮＡと一組の膀胱癌マーカープライマー対とを接触させることを含み、前記一組の膀胱癌マーカープライマー対が、ＡＲを検出する第１のプライマー対、若しくはＵＰＫ１Ｂを検出する第１のプライマー対、又はＡＲを検出する第１のプライマー対及びＵＰＫ１Ｂを検出する第２のプライマー対を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記一組の膀胱癌マーカープライマー対が、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、及びＡＮＸＡ１０から選択されるマーカーを検出する第３のプライマー対を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記一組の膀胱癌マーカープライマー対が、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、及びＡＮＸＡ１０から選択されるマーカーを検出する第４のプライマー対を含み、第３のプライマー対と第４のプライマー対とが異なるマーカーを検出する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記一組の膀胱癌マーカープライマー対が、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、及びＡＮＸＡ１０から選択されるマーカーを検出する第５のプライマー対を含み、第３のプライマー対と第４のプライマー対と第５のプライマー対とが異なるマーカーを検出する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記一組の膀胱癌マーカープライマー対が、
ａ）ＡＲを検出する第１のプライマー対、ＣＲＨを検出する第２のプライマー対、ＩＧＦ２を検出する第３のプライマー対、ＫＲＴ２０を検出する第４のプライマー対、及びＡＮＸＡ１０を検出する第５のプライマー対、
ｂ）ＡＲを検出する第１のプライマー対、ＣＲＨを検出する第２のプライマー対、ＩＧＦ２を検出する第３のプライマー対、及びＫＲＴ２０を検出する第４のプライマー対、
ｃ）ＵＰＫ１Ｂを検出する第１のプライマー対、ＣＲＨを検出する第２のプライマー対、ＩＧＦ２を検出する第３のプライマー対、ＫＲＴ２０を検出する第４のプライマー対、及びＡＮＸＡ１０を検出する第５のプライマー対、
ｄ）ＵＰＫ１Ｂを検出する第１のプライマー対、ＣＲＨを検出する第２のプライマー対、ＩＧＦ２を検出する第３のプライマー対、及びＫＲＴ２０を検出する第４のプライマー対、
ｅ）ＡＲを検出する第１のプライマー対、ＵＰＫ１Ｂを検出する第２のプライマー対、ＣＲＨを検出する第３のプライマー対、ＩＧＦ２を検出する第４のプライマー対、ＫＲＴ２０を検出する第５のプライマー対、及びＡＮＸＡ１０を検出する第６のプライマー対、
ｆ）ＡＲを検出する第１のプライマー対、ＵＰＫ１Ｂを検出する第２のプライマー対、ＣＲＨを検出する第３のプライマー対、ＩＧＦ２を検出する第４のプライマー対、及びＫＲＴ２０を検出する第５のプライマー対、
ｇ）ＵＰＫ１Ｂを検出する第１のプライマー対、ＣＲＨを検出する第２のプライマー対、ＩＧＦ２を検出する第３のプライマー対、及びＡＮＸＡ１０を検出する第４のプライマー対、又は、
ｈ）ＵＰＫ１Ｂを検出する第１のプライマー対、ＣＲＨを検出する第２のプライマー対、ＫＲＴ２０を検出する第３のプライマー対、及びＡＮＸＡ１０を検出する第４のプライマー対、
を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
各膀胱癌マーカープライマー対が、５０〜５００ヌクレオチド長、５０〜４００ヌクレオチド長、５０〜３００ヌクレオチド長、５０〜２００ヌクレオチド長、又は５０〜１５０ヌクレオチド長のアンプリコンを産生する、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの膀胱癌マーカープライマー対がゲノム配列中のイントロンに及ぶ、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
各膀胱癌マーカープライマー対がゲノム配列中のイントロンに及ぶ、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＡＲを検出するプライマー対が、配列番号５４の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第１のプライマー、及び配列番号５５の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第２のプライマーを含み、各プライマーが５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＵＰＫ１Ｂを検出するプライマー対が、配列番号５１の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第１のプライマー、及び配列番号５２の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第２のプライマーを含み、各プライマーが５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である、請求項１８〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記試料に由来するＲＮＡと内在性コントロールプライマー対とを接触させることを更に含む、請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記内在性コントロールプライマー対がＡＢＬを検出するためのものである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料に由来するＲＮＡと外在性コントロールプライマー対とを接触させることを更に含む、請求項１８〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記外在性コントロールプライマー対が外在性ＲＮＡを検出するためのものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記方法が、ＡＲアンプリコン、若しくはＵＰＫ１Ｂアンプリコン、又はＡＲアンプリコン及びＵＰＫ１Ｂアンプリコンの両方を含む一組の膀胱癌マーカーアンプリコンを形成すること、及び前記膀胱癌マーカーアンプリコンと、前記ＡＲアンプリコンを検出する第１のプローブ、若しくは前記ＵＰＫ１Ｂアンプリコンを検出する第１のプローブ、又は前記ＡＲアンプリコンを検出する第１のプローブ及び前記ＵＰＫ１Ｂアンプリコンを検出する第２のプローブを含む一組の膀胱癌マーカープローブとを接触させることを更に含む、請求項１８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記一組の膀胱癌マーカーアンプリコンが、ＣＲＨアンプリコン、ＩＧＦ２アンプリコン、ＫＲＴ２０アンプリコン及びＡＮＸＡ１０アンプリコンから選択される第３のアンプリコンを含み、前記一組の膀胱癌マーカープローブが前記第３のアンプリコンを検出する第３のプローブを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記一組の膀胱癌マーカーアンプリコンが、ＣＲＨアンプリコン、ＩＧＦ２アンプリコン、ＫＲＴ２０アンプリコン及びＡＮＸＡ１０アンプリコンから選択される第４のアンプリコンを含み、前記一組の膀胱癌マーカープローブが第４のアンプリコンを検出する第４のプローブを含み、第３のアンプリコンと第４のアンプリコンとが異なる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記一組の膀胱癌マーカーアンプリコンが、ＣＲＨアンプリコン、ＩＧＦ２アンプリコン、ＫＲＴ２０アンプリコン、及びＡＮＸＡ１０アンプリコンから選択される第５のアンプリコンを含み、前記一組の膀胱癌マーカープローブが第５のアンプリコンを検出する第５のプローブを含み、第３のアンプリコンと第４のアンプリコンと第５のアンプリコンとが異なる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記一組の膀胱癌アンプリコン及び前記一組の膀胱癌マーカープローブが、
ａ）ＡＲアンプリコン、ＣＲＨアンプリコン、ＩＧＦ２アンプリコン、ＫＲＴ２０アンプリコン、及びＡＮＸＡ１０アンプリコン、並びにＡＲアンプリコンを検出する第１のプローブ、ＣＲＨアンプリコンを検出する第２のプローブ、ＩＧＦ２アンプリコンを検出する第３のプローブ、ＫＲＴ２０アンプリコンを検出する第４のプローブ、及びＡＮＸＡ１０アンプリコンを検出する第５のプローブを含む一組の膀胱癌マーカープローブ、
ｂ）ＡＲアンプリコン、ＣＲＨアンプリコン、ＩＧＦ２アンプリコン、及びＫＲＴ２０アンプリコン、並びにＡＲアンプリコンを検出する第１のプローブ、ＣＲＨアンプリコンを検出する第２のプローブ、ＩＧＦ２アンプリコンを検出する第３のプローブ、及びＫＲＴ２０アンプリコンを検出する第４のプローブを含む一組の膀胱癌マーカープローブ、
ｃ）ＵＰＫ１Ｂアンプリコン、ＣＲＨアンプリコン、ＩＧＦ２アンプリコン、ＫＲＴ２０アンプリコン、及びＡＮＸＡ１０アンプリコン、並びにＵＰＫ１Ｂアンプリコンを検出する第１のプローブ、ＣＲＨアンプリコンを検出する第２のプローブ、ＩＧＦ２アンプリコンを検出する第３のプローブ、ＫＲＴ２０アンプリコンを検出する第４のプローブ、及びＡＮＸＡ１０アンプリコンを検出する第５のプローブを含む一組の膀胱癌マーカープローブ、
ｄ）ＵＰＫ１Ｂアンプリコン、ＣＲＨアンプリコン、ＩＧＦ２アンプリコン、及びＫＲＴ２０アンプリコン、並びにＵＰＫ１Ｂアンプリコンを検出する第１のプローブ、ＣＲＨアンプリコンを検出する第２のプローブ、ＩＧＦ２アンプリコンを検出する第３のプローブ、及びＫＲＴ２０アンプリコンを検出する第４のプローブを含む一組の膀胱癌マーカープローブ、
ｅ）ＡＲアンプリコン、ＵＰＫ１Ｂアンプリコン、ＣＲＨアンプリコン、ＩＧＦ２アンプリコン、ＫＲＴ２０アンプリコン、及びＡＮＸＡ１０アンプリコン、並びにＡＲアンプリコンを検出する第１のプローブ、ＵＰＫ１Ｂアンプリコンを検出する第２のプローブ、ＣＲＨアンプリコンを検出する第３のプローブ、ＩＧＦ２アンプリコンを検出する第４のプローブ、ＫＲＴ２０アンプリコンを検出する第５のプローブ、及びＡＮＸＡ１０アンプリコンを検出する第６のプローブを含む一組の膀胱癌マーカープローブ、
ｆ）ＡＲアンプリコン、ＵＰＫ１Ｂアンプリコン、ＣＲＨアンプリコン、ＩＧＦ２アンプリコン、及びＫＲＴ２０アンプリコン、並びにＡＲアンプリコンを検出する第１のプローブ、ＵＰＫ１Ｂアンプリコンを検出する第２のプローブ、ＣＲＨアンプリコンを検出する第３のプローブ、ＩＧＦ２アンプリコンを検出する第４のプローブ、及びＫＲＴ２０アンプリコンを検出する第５のプローブを含む一組の膀胱癌マーカープローブ、
ｇ）ＵＰＫ１Ｂアンプリコン、ＣＲＨアンプリコン、ＩＧＦ２アンプリコン、及びＡＮＸＡ１０アンプリコン、並びにＵＰＫ１Ｂアンプリコンを検出する第１のプローブ、ＣＲＨアンプリコンを検出する第２のプローブ、ＩＧＦ２アンプリコンを検出する第３のプローブ、及びＡＮＸＡ１０アンプリコンを検出する第４のプローブを含む一組の膀胱癌マーカープローブ、又は、
ｈ）ＵＰＫ１Ｂアンプリコン、ＣＲＨアンプリコン、ＫＲＴ２０アンプリコン、及びＡＮＸＡ１０アンプリコン、並びにＵＰＫ１Ｂアンプリコンを検出する第１のプローブ、ＣＲＨアンプリコンを検出する第２のプローブ、ＫＲＴ２０アンプリコンを検出する第３のプローブ、及びＡＮＸＡ１０アンプリコンを検出する第４のプローブを含む一組の膀胱癌マーカープローブ、
を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＡＲを検出するプローブが、配列番号５６の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含み、前記プローブが５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＵＰＫ１Ｂを検出するプローブが、配列番号５３の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含み、前記プローブが５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
各膀胱癌マーカープローブが色素を含み、各色素が他の３つの色素と検出可能に異なる、請求項３２〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
各プローブが蛍光色素及びクエンチャー分子を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
内在性コントロールアンプリコンを形成すること、及び前記内在性コントロールアンプリコンと内在性コントロールプローブとを接触させることを更に含む、請求項３２〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記内在性コントロールプローブが、前記膀胱癌マーカープローブの色素と検出可能に異なる色素を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
外在性コントロールアンプリコンを形成すること、及び前記外在性コントロールアンプリコンと外在性コントロールプローブとを接触させることを更に含む、請求項３２〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記外在性コントロールプローブが、前記膀胱癌マーカープローブ及び前記内在性コントロールプローブの色素と検出可能に異なる色素を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記一組の膀胱癌マーカーが単一の多重反応において検出される、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記試料が尿路上皮細胞を含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記試料が尿試料及び膀胱洗浄試料から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記被験体が少なくとも１つの膀胱癌の症状を有する、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記少なくとも１つの症状が、腹痛、尿中の血液、排尿時痛、頻尿、尿意切迫感、及び失禁から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記被験体が膀胱癌の病歴を有する、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記被験体が膀胱癌の再発についてモニターされている、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記患者が過去３ヶ月間にカルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）で治療されたことがある、請求項５０又は５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記膀胱癌が低悪性度の膀胱癌である、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
２以上の膀胱癌マーカーレベルを複合スコアに統合するため線形判別分析（ＬＤＡ）を使用することを含む、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
全ての膀胱癌マーカーレベルを統合して複合スコアとするためＬＤＡを使用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
一組の膀胱癌マーカープライマー対を含む組成物であって、前記一組の膀胱癌マーカープライマー対がＡＲを検出する第１のプライマー対若しくはＵＰＫ１Ｂを検出する第１のプライマー対、又はＡＲを検出する第１のプライマー対及びＵＰＫ１Ｂを検出する第２のプライマー対を含む、一組の膀胱癌マーカープライマー対を含む組成物。
【請求項５７】
前記一組の膀胱癌マーカープライマー対がＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、及びＡＮＸＡ１０から選択されるマーカーを検出する第３のプライマー対を含む、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
前記一組の膀胱癌マーカープライマー対が、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、及びＡＮＸＡ１０から選択されるマーカーを検出する第４のプライマー対を含み、第３のプライマー対と第４のプライマー対とが異なるマーカーを検出する、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
前記一組の膀胱癌マーカープライマー対が、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、及びＡＮＸＡ１０から選択されるマーカーを検出する第５のプライマー対を含み、第３のプライマー対と第４のプライマー対と第５のプライマー対とが異なるマーカーを検出する、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
前記一組の膀胱癌マーカープライマー対が、
ａ）ＡＲを検出する第１のプライマー対、ＣＲＨを検出する第２のプライマー対、ＩＧＦ２を検出する第３のプライマー対、ＫＲＴ２０を検出する第４のプライマー対、及びＡＮＸＡ１０を検出する第５のプライマー対、
ｂ）ＡＲを検出する第１のプライマー対、ＣＲＨを検出する第２のプライマー対、ＩＧＦ２を検出する第３のプライマー対、及びＫＲＴ２０を検出する第４のプライマー対、
ｃ）ＵＰＫ１Ｂを検出する第１のプライマー対、ＣＲＨを検出する第２のプライマー対、ＩＧＦ２を検出する第３のプライマー対、ＫＲＴ２０を検出する第４のプライマー対、及びＡＮＸＡ１０を検出する第５のプライマー対、
ｄ）ＵＰＫ１Ｂを検出する第１のプライマー対、ＣＲＨを検出する第２のプライマー対、ＩＧＦ２を検出する第３のプライマー対、及びＫＲＴ２０を検出する第４のプライマー対、
ｅ）ＡＲを検出する第１のプライマー対、ＵＰＫ１Ｂを検出する第２のプライマー対、ＣＲＨを検出する第３のプライマー対、ＩＧＦ２を検出する第４のプライマー対、ＫＲＴ２０を検出する第５のプライマー対、及びＡＮＸＡ１０を検出する第６のプライマー対、
ｆ）ＡＲを検出する第１のプライマー対、ＵＰＫ１Ｂを検出する第２のプライマー対、ＣＲＨを検出する第３のプライマー対、ＩＧＦ２を検出する第４のプライマー対、及びＫＲＴ２０を検出する第５のプライマー対、
ｇ）ＵＰＫ１Ｂを検出する第１のプライマー対、ＣＲＨを検出する第２のプライマー対、ＩＧＦ２を検出する第３のプライマー対、及びＡＮＸＡ１０を検出する第４のプライマー対、又は、
ｈ）ＵＰＫ１Ｂを検出する第１のプライマー対、ＣＲＨを検出する第２のプライマー対、ＫＲＴ２０を検出する第３のプライマー対、及びＡＮＸＡ１０を検出する第４のプライマー対、
を含む、請求項５６に記載の組成物。
【請求項６１】
各膀胱癌マーカープライマー対が、５０〜５００ヌクレオチド長、５０〜４００ヌクレオチド長、５０〜３００ヌクレオチド長、５０〜２００ヌクレオチド長、又は５０〜１５０ヌクレオチド長のアンプリコンを産生する、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの膀胱癌マーカープライマー対がゲノム配列中のイントロンに及ぶ、請求項５６〜６１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６３】
各膀胱癌マーカープライマー対がゲノム配列中のイントロンに及ぶ、請求項５６〜６２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６４】
前記ＡＲを検出するプライマー対が、配列番号５４の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第１のプライマー、及び配列番号５５の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第２のプライマーを含み、各プライマーが５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である、請求項５６〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６５】
前記ＵＰＫ１Ｂを検出するプライマー対が、配列番号５１の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第１のプライマー、及び配列番号５２の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第２のプライマーを含み、各プライマーが５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である、請求項５６〜６４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６６】
前記組成物が一組の膀胱癌マーカープローブを更に含み、前記一組の膀胱癌マーカープローブが、ＡＲアンプリコンを検出する第１のプローブ、若しくはＵＰＫ１Ｂアンプリコンを検出する第１のプローブ、又はＡＲアンプリコンを検出する第１のプローブ及びＵＰＫ１Ｂアンプリコンを検出する第２のプローブを含む、請求項５６〜６５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６７】
前記一組の膀胱癌マーカープローブが、ＣＲＨアンプリコン、ＩＧＦ２アンプリコン、ＫＲＴ２０アンプリコン、及びＡＮＸＡ１０アンプリコンから選択される第３のアンプリコンを検出する第３のプローブを含む、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
前記一組の膀胱癌マーカープローブが、ＣＲＨアンプリコン、ＩＧＦ２アンプリコン、ＫＲＴ２０アンプリコン、及びＡＮＸＡ１０アンプリコンから選択される第４のアンプリコンを検出する第４のプローブを含み、第３のアンプリコンと第４のアンプリコンとが異なる、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６９】
前記一組の膀胱癌マーカープローブが、ＣＲＨアンプリコン、ＩＧＦ２アンプリコン、ＫＲＴ２０アンプリコン、及びＡＮＸＡ１０アンプリコンから選択される第５のアンプリコンを検出する第４のプローブを含み、第３のアンプリコンと第４のアンプリコンと第５のアンプリコンとが異なる、請求項６６に記載の組成物。
【請求項７０】
前記一組の膀胱癌マーカープローブが、
ａ）ＡＲアンプリコンを検出する第１のプローブ、ＣＲＨアンプリコンを検出する第２のプローブ、ＩＧＦ２アンプリコンを検出する第３のプローブ、ＫＲＴ２０アンプリコンを検出する第４のプローブ、及びＡＮＸＡ１０アンプリコンを検出する第５のプローブ、
ｂ）ＡＲアンプリコンを検出する第１のプローブ、ＣＲＨアンプリコンを検出する第２のプローブ、ＩＧＦ２アンプリコンを検出する第３のプローブ、及びＫＲＴ２０アンプリコンを検出する第４のプローブ、
ｃ）ＵＰＫ１Ｂアンプリコンを検出する第１のプローブ、ＣＲＨアンプリコンを検出する第２のプローブ、ＩＧＦ２アンプリコンを検出する第３のプローブ、ＫＲＴ２０アンプリコンを検出する第４のプローブ、及びＡＮＸＡ１０アンプリコンを検出する第５のプローブ、
ｄ）ＵＰＫ１Ｂアンプリコンを検出する第１のプローブ、ＣＲＨアンプリコンを検出する第２のプローブ、ＩＧＦ２アンプリコンを検出する第３のプローブ、及びＫＲＴ２０アンプリコンを検出する第４のプローブ、
ｅ）ＡＲアンプリコンを検出する第１のプローブ、ＵＰＫ１Ｂアンプリコンを検出する第２のプローブ、ＣＲＨアンプリコンを検出する第３のプローブ、ＩＧＦ２アンプリコンを検出する第４のプローブ、及びＫＲＴ２０アンプリコンを検出する第５のプローブ、及びＡＮＸＡ１０アンプリコンを検出する第６のプローブ、
ｆ）ＡＲアンプリコンを検出する第１のプローブ、ＵＰＫ１Ｂアンプリコンを検出する第２のプローブ、ＣＲＨアンプリコンを検出する第３のプローブ、ＩＧＦ２アンプリコンを検出する第４のプローブ、及びＫＲＴ２０アンプリコンを検出する第５のプローブ、
ｇ）ＵＰＫ１Ｂアンプリコンを検出する第１のプローブ、ＣＲＨアンプリコンを検出する第２のプローブ、ＩＧＦ２アンプリコンを検出する第３のプローブ、及びＡＮＸＡ１０アンプリコンを検出する第４のプローブ、又は、
ｈ）ＵＰＫ１Ｂアンプリコンを検出する第１のプローブ、ＣＲＨアンプリコンを検出する第２のプローブ、ＫＲＴ２０アンプリコンを検出する第３のプローブ、及びＡＮＸＡ１０アンプリコンを検出する第４のプローブ、
を含む、請求項６６に記載の組成物。
【請求項７１】
前記ＡＲを検出するプローブが、配列番号５６の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含み、前記プローブが５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である、請求項６６〜７０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７２】
前記ＵＰＫ１Ｂを検出するプローブが、配列番号５３の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含み、前記プローブが５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である、請求項６６〜７１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７３】
内在性コントロールプライマー対を更に含む、請求項５６〜７２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７４】
内在性コントロールアンプリコンを検出する内在性コントロールプローブを更に含む、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７５】
前記内在性コントロールがＡＢＬである、請求項７３又は７４に記載の組成物。
【請求項７６】
凍結乾燥した組成物である、請求項５６〜７５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７７】
溶液である、請求項５６〜７５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７８】
尿路上皮細胞を更に含む、請求項７７に記載の組成物。
【請求項７９】
前記尿路上皮細胞が尿試料に由来する、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８０】
溶解した尿路上皮細胞を更に含む、請求項７７に記載の組成物。
【請求項８１】
前記尿路上皮細胞が尿試料に由来する、請求項８０に記載の組成物。
【請求項８２】
ヒト試料に由来するＲＮＡを更に含む、請求項７７に記載の組成物。
【請求項８３】
前記ＲＮＡが尿試料の細胞に由来する、請求項８０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の分野
膀胱癌を検出する組成物及び方法が提供される。特に、膀胱癌の検出に有用な膀胱癌マーカー及びマーカーのパネルが提供される。
【背景技術】
【０００２】
２．背景
アメリカ合衆国の１年あたり７０５００人を含め、世界中で毎年３８６０００人が膀胱癌と診断されている。膀胱癌の発生率は女性よりも男性において３倍高い。最も高い発生率及び有病率は欧州連合、北アメリカ、北アフリカ、及び中東に見られる。
【０００３】
喫煙は膀胱癌の最も大きな危険因子である。更なる危険因子として、化学物質への曝露、化学療法（シトキサン等）、放射線治療、及び慢性膀胱感染症が挙げられる。
【０００４】
膀胱腫瘍は、狭い指状の突起を成長させる尿路上皮癌である乳頭状腫瘍、及びあまり一般的ではないが浸潤性となる危険性の高い上皮内癌等の非乳頭状（固着性）腫瘍を含む。
【０００５】
膀胱癌の症状は、腹痛、尿中の血液、骨痛又は圧痛、疲労、排尿時痛、頻尿、尿意切迫、失禁、及び体重減少を含む場合がある。診断は、一般的には画像化、検尿、及び／又は生検に基づく。
【０００６】
膀胱癌に関する予後は、診断時の癌のステージに依存する。初期腫瘍の予後は良好であるが、進行した腫瘍の予後は悪い。膀胱癌の最大７０％に生じる癌の再発を検出するため、長期間の経過観察が推奨される。最初の２年間は３ヶ月毎〜４ヶ月毎、その後の数年間、しばしばその患者の生涯に亘ってより長い間隔での膀胱鏡検査及び尿細胞診が推奨される。これらの方法は侵襲的であり高価なため、膀胱癌は診断から死亡までの間治療するのに最も費用がかかる癌の１つとされている。
【０００７】
既存の非侵襲的な診断検査として、ＩｍｍｕｎｏＣｙｔ（商標）（ニュージャージー州デンヴィルのScimedx）及びＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）（イリノイ州アボットパークのAbbott Molecular）が挙げられる。ＩｍｍｕｎｏＣｙｔ（商標）は、尿試料から単離された剥離細胞における膀胱癌のいくつかの細胞マーカーを検出するための蛍光マーカーで標識された３種のモノクローナル抗体のカクテルを使用する細胞学アッセイである。ＩｍｍｕｎｏＣｙｔ（商標）は、腫瘍細胞の検出において細胞学の感度を改善するため標準的な尿細胞学と併せて使用される。ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）もまた細胞学に基づくアッセイであり、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によりいくつかの染色体における異数性を検出する。これらの結果の判定は、尿中の細胞核の顕微鏡検査によりシグナルを数えることによって行われる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
膀胱癌の早期検出のため改善された方法が必要とされている。特に、細胞学に頼らない正確な尿に基づく診断検査は、高価で侵襲的な膀胱鏡検査、及び多大な労力を必要とし、潜在的に主観的な細胞学アッセイに対する必要性を減少し得る。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
３．要約
膀胱癌を検出する組成物及び方法が提供される。特に、膀胱癌の検出に有用な膀胱癌マーカー及びマーカーのパネルが提供される。いくつかの実施の形態では、アンドロゲンアクセプター（ＡＲ）及び／又はウロプラキン１Ｂ（ＵＰＫ１Ｂ）のｍＲＮＡ、また任意に、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡから選択される少なくとも１つのｍＲＮＡのレベルを、例えば、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定し、その結果を使用して被験体が膀胱癌を有するか否かを判定する。いくつかの実施の形態では、ＡＲ及び／又はＵＰＫ１ＢのｍＲＮＡ、また任意に、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択される少なくとも１つのｍＲＮＡのレベルを内在性コントロールに対して正規化する。いくつかの実施の形態では、内在性コントロールはＡＢＬ  ｍＲＮＡである。いくつかの実施の形態では、膀胱癌を伴う又は伴わない被験体に由来する膀胱尿路上皮細胞において同様のレベルで発現されることが予想される内在性コントロールが選択される。いくつかの実施の形態では、試料は尿試料である。いくつかの実施の形態では、本発明の方法を腫瘍再発について膀胱癌の病歴を有する被験体をモニターするため使用する。いくつかの実施の形態では、被験体は過去３ヶ月以内にカルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）で治療されたことがある。いくつかの実施の形態では、本発明の方法を膀胱癌の病歴のない被験体における膀胱癌の検出に使用する。かかる実施の形態では、上記被験体は膀胱癌の症状を有する。膀胱癌の非限定的な症状の例として、腹痛、尿中の血液、骨痛又は圧痛、疲労、排尿時痛、頻尿、尿意切迫、失禁及び体重減少が挙げられる。いくつかの実施の形態では、膀胱癌は低悪性度の膀胱癌である。
【００１０】
いくつかの実施の形態では、被験体において膀胱癌の存在を検出する方法が提供される。いくつかの実施の形態では、方法は、被験体に由来する試料中の一組の膀胱癌マーカーの各マーカーのレベルを検出することを含み、前記一組の膀胱癌マーカーが、アンドロゲンアクセプター（ＡＲ）若しくはウロプラキン１Ｂ（ＵＰＫ１Ｂ）、又はＡＲ及びＵＰＫ１Ｂの両方を含む。いくつかの実施の形態では、ＡＲ及び／又はＵＰＫ１Ｂのレベルの上昇の検出が前記被験体における膀胱癌の存在を示す。
【００１１】
いくつかの実施の形態では、膀胱癌を伴う被験体における抗アンドロゲン療法をモニタリングする方法が提供される。いくつかの実施の形態では、方法は、第１の時間点において前記被験体に由来する試料中の一組の膀胱癌マーカーの各マーカーのレベルを検出することを含み、前記一組の膀胱癌マーカーが、アンドロゲンアクセプター（ＡＲ）若しくはウロプラキン１Ｂ（ＵＰＫ１Ｂ）、又はＡＲ及びＵＰＫ１Ｂの両方を含む。いくつかの実施の形態では、第２の時間点に比較して第１の時間点における前記少なくとも１つのマーカーのレベルの減少が、前記被験体が抗アンドロゲン療法に反応していることを示す。いくつかの実施の形態では、前記方法が、第２の時間点における前記少なくとも１つのマーカーのレベルと、第１の時間点における前記少なくとも１つのマーカーのレベルとを比較することを含む。いくつかの実施の形態では、前記被験体が第１の時間点において抗アンドロゲン療法を受けている。いくつかの実施の形態では、第２の時間点が、被験体が抗アンドロゲン療法を開始する前である。いくつかの実施の形態では、前記被験体が第２の時間点において抗アンドロゲン療法を受けている。
【００１２】
いくつかの実施の形態では、前記一組の膀胱癌マーカーが、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）、ケラチン２０（ＫＲＴ２０）、及びアネキシン１０（ＡＮＸＡ１０）から選択される少なくとも１つのマーカーを更に含む。いくつかの実施の形態では、前記一組の膀胱癌マーカーが、ａ）ＡＲ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、及びＡＮＸＡ１０、ｂ）ＡＲ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、及びＫＲＴ２０、ｃ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、及びＡＮＸＡ１０、ｄ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、及びＫＲＴ２０、ｅ）ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、及びＡＮＸＡ１０、ｆ）ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、及びＫＲＴ２０、ｇ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、及びＡＮＸＡ１０、又はｈ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＫＲＴ２０、及びＡＮＸＡ１０を含む。
【００１３】
いくつかの実施の形態では、方法は、内在性コントロールを検出することを更に含む。いくつかの実施の形態では、前記内在性コントロールが、ＡＢＬ、ＧＵＳＢ、ＧＡＰＤＨ、ＴＵＢＢ、及びＵＰＫ１ａから選択される。いくつかの実施の形態では、前記内在性コントロールがＡＢＬである。いくつかの実施の形態では、方法は、外在性コントロールを検出することを含む。いくつかの実施の形態では、前記外在性コントロールがＲＮＡである。いくつかの実施の形態では、前記外在性コントロールがＡｒｍｏｒｅｄ  ＲＮＡ（商標）である。いくつかの実施の形態では、上記方法は単一の多重反応において、ａ）ＡＲ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、内在性コントロール、及び外在性コントロール、ｂ）ＡＲ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、内在性コントロール、及び外在性コントロール、ｃ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、内在性コントロール、及び外在性コントロール、ｄ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、内在性コントロール、及び外在性コントロール、ｅ）ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、及びＡＮＸＡ１０、ｆ）ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、内在性コントロール、及び外在性コントロール、ｇ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＡＮＸＡ１０、内在性コントロール、及び外在性コントロール、又はｈ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、内在性コントロール、及び外在性コントロールを検出することを含む。いくつかの実施の形態では、上記方法は単一の多重反応において、ａ）ＡＲ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＡＢＬ、及び外在性コントロール、ｂ）ＡＲ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＢＬ、及び外在性コントロール、ｃ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＡＢＬ、及び外在性コントロール、ｄ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＢＬ、及び外在性コントロール、ｅ）ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、及びＡＮＸＡ１０、ｆ）ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＢＬ、及び外在性コントロール、ｇ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＡＮＸＡ１０、ＡＢＬ、及び外在性コントロール、又はｈ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＡＢＬ、及び外在性コントロールを検出することを含む。
【００１４】
いくつかの実施の形態では、検出はＲＴ−ＰＣＲを含む。いくつかの実施の形態では、検出は、定量的ＲＴ−ＰＣＲを含む。いくつかの実施の形態では、方法は、Ｃｔ値又はΔＣｔ値と閾値Ｃｔ値又は閾値ΔＣｔ値とを比較することを含む。いくつかの実施の形態では、ΔＣｔが、内在性コントロールに対するＣｔ値から前記マーカーに対するＣｔ値を引いたものである。いくつかの実施の形態では、前記ＲＴ−ＰＣＲ反応が、初期変性工程から最終伸長工程を通して３時間未満又は２時間未満かかる。
【００１５】
いくつかの実施の形態では、方法は、前記試料に由来するＲＮＡと一組の膀胱癌マーカープライマー対とを接触させることを含み、前記一組の膀胱癌マーカープライマー対がＡＲを検出する第１のプライマー対、若しくはＵＰＫ１Ｂを検出する第１のプライマー対、又はＡＲを検出する第１のプライマー対及びＵＰＫ１Ｂを検出する第２のプライマー対を含む。いくつかの実施の形態では、前記一組の膀胱癌マーカープライマー対が、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択されるマーカーを検出する第３のプライマー対を含む。いくつかの実施の形態では、前記一組の膀胱癌マーカープライマー対が、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択されるマーカーを検出する第４のプライマー対を含み、第３のプライマー対と第４のプライマー対とが異なるマーカーを検出する。いくつかの実施の形態では、前記一組の膀胱癌マーカープライマー対が、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択されるマーカーを検出する第５のプライマー対を含み、第３のプライマー対と第４のプライマー対と第５のプライマー対とが異なるマーカーを検出する。いくつかの実施の形態では、上記一組の膀胱癌マーカープライマー対は、ａ）ＡＲ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、及びＡＮＸＡ１０、ｂ）ＡＲ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、及びＫＲＴ２０、ｃ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、及びＡＮＸＡ１０、ｄ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、及びＫＲＴ２０、ｅ）ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、及びＡＮＸＡ１０、ｆ）ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、及びＫＲＴ２０、ｇ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、及びＡＮＸＡ１０、又はｈ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＫＲＴ２０、及びＡＮＸＡ１０から選択される一組のマーカーにおける各マーカーを検出する別々のプライマー対を含む。いくつかの実施の形態では、上記一組の膀胱癌マーカープライマー対は、ａ）ＡＲ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、内在性コントロール、及び外在性コントロール、ｂ）ＡＲ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、内在性コントロール、及び外在性コントロール、ｃ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、内在性コントロール、及び外在性コントロール、ｄ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、内在性コントロール、及び外在性コントロール、ｅ）ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、及びＡＮＸＡ１０、ｆ）ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、内在性コントロール、及び外在性コントロール、ｇ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＡＮＸＡ１０、内在性コントロール、及び外在性コントロール、又はｈ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、内在性コントロール、及び外在性コントロールから選択される１セットにおいて各マーカー及びコントロールを検出する別々のプライマー対を含む。いくつかの実施の形態では、上記一組の膀胱癌マーカープライマー対は、ａ）ＡＲ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＡＢＬ、及び外在性コントロール、ｂ）ＡＲ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＢＬ、及び外在性コントロール、ｃ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＡＢＬ、及び外在性コントロール、ｄ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＢＬ、及び外在性コントロール、ｅ）ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、及びＡＮＸＡ１０、ｆ）ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＢＬ、及び外在性コントロール、ｇ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＡＮＸＡ１０、ＡＢＬ、及び外在性コントロール、又はｈ）ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＡＢＬ、及び外在性コントロールから選択される１セットにおいて各マーカー及びコントロールを検出する別々のプライマー対を含む。
【００１６】
いくつかの実施の形態では、各膀胱癌マーカープライマー対が、５０〜５００ヌクレオチド長、５０〜４００ヌクレオチド長、５０〜３００ヌクレオチド長、５０〜２００ヌクレオチド長、又は５０〜１５０ヌクレオチド長のアンプリコンを産生する。いくつかの実施の形態では、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの膀胱癌マーカープライマー対がゲノム配列中のイントロンに及ぶ。いくつかの実施の形態では、各膀胱癌マーカープライマー対がゲノム配列中のイントロンに及ぶ。
【００１７】
いくつかの実施の形態では、前記ＡＲを検出するプライマー対が、配列番号５４の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第１のプライマー、及び配列番号５５の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第２のプライマーを含み、各プライマーが５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である。いくつかの実施の形態では、前記ＵＰＫ１Ｂを検出するプライマー対が、配列番号５１の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第１のプライマー、及び配列番号５２の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第２のプライマーを含み、各プライマーが５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である。
【００１８】
いくつかの実施の形態では、方法は、前記試料に由来するＲＮＡと内在性コントロールプライマー対とを接触させることを更に含む。いくつかのかかる実施の形態では、内在性コントロールを検出する内在性コントロールプライマー対は、ＡＢＬ、ＧＵＳＢ、ＧＡＰＤＨ、ＴＵＢＢ、及びＵＰＫ１ａから選択される。いくつかの実施の形態では、上記内在性コントロールプライマー対はＡＢＬを検出するためのものである。いくつかの実施の形態では、上記内在性コントロールプライマー対は、配列番号８を含む第１のプライマー及び配列番号９を含む第２のプライマーを含み、各プライマーは５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である。いくつかの実施の形態では、上記内在性コントロールプライマー対は、配列番号４１を含む第１のプライマー及び配列番号４２を含む第２のプライマーを含み、各プライマーは５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である。いくつかの実施の形態では、上記内在性コントロールプライマー対は、配列番号８の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第１のプライマー、及び配列番号９の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第２のプライマーを含み、各プライマーは５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である。いくつかの実施の形態では、上記内在性コントロールプライマー対は、配列番号４１の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第１のプライマー、及び配列番号４２の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第２のプライマーを含み、各プライマーは５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である。
【００１９】
いくつかの実施の形態では、方法は、前記試料に由来するＲＮＡと外在性コントロールプライマー対とを接触させることを含む。いくつかのかかる実施の形態では、前記外在性コントロールプライマー対が外在性ＲＮＡを検出するためである。いくつかの実施の形態では、上記外在性コントロールプライマー対は、配列番号２３を含む第１のプライマー及び配列番号２４を含む第２のプライマーを含み、各プライマーは５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である。いくつかの実施の形態では、上記外在性コントロールプライマー対は、配列番号４４を含む第１のプライマー及び配列番号４５を含む第２のプライマーを含み、各プライマーは５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である。いくつかの実施の形態では、上記外在性コントロールプライマー対は、配列番号２３の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第１のプライマー、及び配列番号２４の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第２のプライマーを含み、各プライマーは５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である。いくつかの実施の形態では、上記外在性コントロールプライマー対は、配列番号４４の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第１のプライマー、及び配列番号４５の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第２のプライマーを含み、各プライマーは５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である。
【００２０】
いくつかの実施の形態では、方法は、ＡＲアンプリコン若しくはＵＰＫ１Ｂアンプリコン、又はＡＲアンプリコン及びＵＰＫ１Ｂアンプリコンの両方を含む一組の膀胱癌マーカーアンプリコンを形成すること、及び前記膀胱癌マーカーアンプリコンと、前記ＡＲアンプリコンを検出する第１のプローブ若しくは前記ＵＰＫ１Ｂアンプリコンを検出する第１のプローブ、又は前記ＡＲアンプリコンを検出する第１のプローブ及び前記ＵＰＫ１Ｂアンプリコンを検出する第２のプローブを含む一組の膀胱癌マーカープローブとを接触させることを含む。いくつかの実施の形態では、前記一組の膀胱癌マーカーアンプリコンが、ＣＲＨアンプリコン、ＩＧＦ２アンプリコン、ＫＲＴ２０アンプリコン、ＡＮＸＡ１０アンプリコン、ＵＰＫ２アンプリコン、ＭＧＥＡ５アンプリコン、及びＰＩＫ３Ａアンプリコンから選択される第３のアンプリコンを含み、前記一組の膀胱癌マーカープローブが前記第３のアンプリコンを検出する第３のプローブを含む。いくつかの実施の形態では、前記一組の膀胱癌マーカーアンプリコンが、ＣＲＨアンプリコン、ＩＧＦ２アンプリコン、ＫＲＴ２０アンプリコン、ＡＮＸＡ１０アンプリコン、ＵＰＫ２アンプリコン、ＭＧＥＡ５アンプリコン、及びＰＩＫ３Ａアンプリコンから選択される第４のアンプリコンを含み、前記一組の膀胱癌マーカープローブが第４のアンプリコンを検出する第４のプローブを含み、第３のアンプリコンと第４のアンプリコンとが異なる。いくつかの実施の形態では、前記一組の膀胱癌マーカーアンプリコンが、ＣＲＨアンプリコン、ＩＧＦ２アンプリコン、ＫＲＴ２０アンプリコン、ＡＮＸＡ１０アンプリコン、ＵＰＫ２アンプリコン、ＭＧＥＡ５アンプリコン、及びＰＩＫ３Ａアンプリコンから選択される第５のアンプリコンを含み、前記一組の膀胱癌マーカープローブが第５のアンプリコンを検出する第５のプローブを含み、第３のアンプリコンと第４のアンプリコンと第５のアンプリコンとが異なる。
【００２１】
いくつかの実施の形態では、前記ＡＲを検出するプローブが、配列番号５６の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含み、前記プローブが５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である。いくつかの実施の形態では、前記ＵＰＫ１Ｂを検出するプローブが、配列番号５３の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含み、前記プローブが５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である。いくつかの実施の形態では、各膀胱癌マーカープローブが色素を含み、各色素が他の３つの色素と検出可能に異なる。いくつかの実施の形態では、各膀胱癌マーカープローブが蛍光色素及びクエンチャー分子を含む。
【００２２】
いくつかの実施の形態では、方法は、内在性コントロールアンプリコンを形成すること、及び前記内在性コントロールアンプリコンと内在性コントロールプローブとを接触させることを含む。いくつかの実施の形態では、上記内在性コントロールプローブは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号４３の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含み、上記内在性コントロールプローブは５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である。前記内在性コントロールプローブが、前記膀胱癌マーカープローブの色素と検出可能に異なる色素を含む。
【００２３】
いくつかの実施の形態では、方法は、外在性コントロールアンプリコンを形成すること、及び前記外在性コントロールアンプリコンと外在性コントロールプローブとを接触させることを含む。いくつかの実施の形態では、上記外在性コントロールプローブは、配列番号２５又は配列番号４６の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含み、上記外在性コントロールプローブは５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である。いくつかの実施の形態では、前記外在性コントロールプローブが、前記膀胱癌マーカープローブ及び前記内在性コントロールプローブの色素と検出可能に異なる色素を含む。
【００２４】
いくつかの実施の形態では、前記一組の膀胱癌マーカーが単一の多重反応において検出される。いくつかの実施の形態では、上記方法は、２以上の膀胱癌マーカーレベルを複合スコアに統合するため線形判別分析（ＬＤＡ）を使用することを含む。いくつかの実施の形態では、ＬＤＡを全ての膀胱癌マーカーレベルを複合スコアに統合するため使用する。
【００２５】
いくつかの実施の形態では、前記試料が尿路上皮細胞を含む。いくつかの実施の形態では、前記試料が尿試料及び膀胱洗浄試料から選択される。いくつかの実施の形態では、前記被験体が膀胱癌の病歴を有する。いくつかの実施の形態では、前記被験体が膀胱癌の再発についてモニターされている。
【００２６】
いくつかの実施の形態では、組成物が提供される。いくつかの実施の形態では、組成物は、一組の膀胱癌マーカープライマー対を含み、前記一組の膀胱癌マーカープライマー対が、ＡＲを検出する第１のプライマー対若しくはＵＰＫ１Ｂを検出する第１のプライマー対、又はＡＲを検出する第１のプライマー対及びＵＰＫ１Ｂを検出する第２のプライマー対を含む。いくつかの実施の形態では、前記一組の膀胱癌マーカープライマー対がＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択されるマーカーを検出する第３のプライマー対を含む。いくつかの実施の形態では、前記一組の膀胱癌マーカープライマー対が、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択されるマーカーを検出する第４のプライマー対を含み、第３のプライマー対と第４のプライマー対とが異なるマーカーを検出する。いくつかの実施の形態では、前記一組の膀胱癌マーカープライマー対が、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択されるマーカーを検出する第５のプライマー対を含み、第３のプライマー対と第４のプライマー対と第５のプライマー対とが異なるマーカーを検出する。
【００２７】
いくつかの実施の形態では、各膀胱癌マーカープライマー対が、５０〜５００ヌクレオチド長、５０〜４００ヌクレオチド長、５０〜３００ヌクレオチド長、５０〜２００ヌクレオチド長、又は５０〜１５０ヌクレオチド長のアンプリコンを産生する。いくつかの実施の形態では、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの膀胱癌マーカープライマー対がゲノム配列中のイントロンに及ぶ。いくつかの実施の形態では、各膀胱癌マーカープライマー対がゲノム配列中のイントロンに及ぶ。
【００２８】
いくつかの実施の形態では、前記ＡＲを検出するプライマー対が、配列番号５４の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第１のプライマー、及び配列番号５５の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第２のプライマーを含み、各プライマーが５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である。いくつかの実施の形態では、前記ＵＰＫ１Ｂを検出するプライマー対が、配列番号５１の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第１のプライマー、及び配列番号５２の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第２のプライマーを含み、各プライマーが５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である。
【００２９】
いくつかの実施の形態では、組成物は、一組の膀胱癌マーカープローブを更に含み、前記一組の膀胱癌マーカープローブが、ＡＲアンプリコンを検出する第１のプローブ若しくはＵＰＫ１Ｂアンプリコンを検出する第１のプローブ、又はＡＲアンプリコンを検出する第１のプローブ及びＵＰＫ１Ｂアンプリコンを検出する第２のプローブを含む。いくつかの実施の形態では、前記一組の膀胱癌マーカープローブが、ＣＲＨアンプリコン、ＩＧＦ２アンプリコン、ＫＲＴ２０アンプリコン、ＡＮＸＡ１０アンプリコン、ＵＰＫ２アンプリコン、ＭＧＥＡ５アンプリコン、及びＰＩＫ３Ａアンプリコンから選択される第３のアンプリコンを検出する第３のプローブを含む。いくつかの実施の形態では、前記一組の膀胱癌マーカープローブが、ＣＲＨアンプリコン、ＩＧＦ２アンプリコン、ＫＲＴ２０アンプリコン、ＡＮＸＡ１０アンプリコン、ＵＰＫ２アンプリコン、ＭＧＥＡ５アンプリコン、及びＰＩＫ３Ａアンプリコンから選択される第４のアンプリコンを検出する第４のプローブを含み、第３のアンプリコンと第４のアンプリコンとが異なる。いくつかの実施の形態では、前記一組の膀胱癌マーカープローブが、ＣＲＨアンプリコン、ＩＧＦ２アンプリコン、ＫＲＴ２０アンプリコン、ＡＮＸＡ１０アンプリコン、ＵＰＫ２アンプリコン、ＭＧＥＡ５アンプリコン、及びＰＩＫ３Ａアンプリコンから選択される第５のアンプリコンを検出する第４のプローブを含み、第３のアンプリコンと第４のアンプリコンと第５のアンプリコンとが異なる。
【００３０】
いくつかの実施の形態では、前記ＡＲを検出するプローブが、配列番号５６の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含み、前記プローブが５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である。いくつかの実施の形態では、前記ＵＰＫ１Ｂを検出するプローブが、配列番号５３の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含み、前記プローブが５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である。いくつかの実施の形態では、各膀胱癌マーカープローブは色素を含み、各色素は他の３つの標識と検出可能に異なる。いくつかの実施の形態では、各膀胱癌マーカープローブは蛍光色素及びクエンチャー分子を含む。
【００３１】
いくつかの実施の形態では、組成物は内在性コントロールを検出する内在性コントロールプライマー対を更に含む。いくつかの実施の形態では、上記内在性コントロールはＡＢＬ、ＧＵＳＢ、ＧＡＰＤＨ、ＴＵＢＢ、及びＵＰＫ１ａから選択される。いくつかの実施の形態では、上記内在性コントロールプライマー対はＡＢＬである。いくつかの実施の形態では、上記内在性コントロールプライマー対は、配列番号８を含む第１のプライマー及び配列番号９を含む第２のプライマーを含み、各プライマーは５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である。いくつかの実施の形態では、上記内在性コントロールプライマー対は、配列番号４１を含む第１のプライマーと配列番号４２を含む第２のプライマーとを含み、各プライマーは５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である。いくつかの実施の形態では、上記内在性コントロールプライマー対は、配列番号８の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第１のプライマー、及び配列番号９の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第２のプライマーを含み、各プライマーは５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である。いくつかの実施の形態では、上記内在性コントロールプライマー対は、配列番号４１の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第１のプライマー、及び配列番号４２の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含む第２のプライマーを含み、各プライマーは５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である。
【００３２】
いくつかの実施の形態では、組成物は、内在性コントロールアンプリコンを検出する内在性コントロールプローブを更に含む。いくつかの実施の形態では、上記内在性コントロールは、ＡＢＬ、ＧＵＳＢ、ＧＡＰＤＨ、ＴＵＢＢ、及びＵＰＫ１ａから選択される。いくつかの実施の形態では、内在性コントロールはＡＢＬである。いくつかの実施の形態では、内在性コントロールプローブは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号４３の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は少なくとも１８のヌクレオチドを含み、上記内在性コントロールプローブは５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、又は３０未満のヌクレオチド長である。いくつかの実施の形態では、上記内在性コントロールプローブは、上記膀胱癌マーカープローブの色素と検出可能に異なる色素を含む。
【００３３】
いくつかの実施の形態では、組成物は凍結乾燥した組成物である。いくつかの実施の形態では、前記組成物が溶液である。いくつかの実施の形態では、前記組成物が尿路上皮細胞を更に含む。いくつかの実施の形態では、前記尿路上皮細胞が尿試料に由来する。
【００３４】
本発明の更なる実施形態及び詳細が以下に記載される。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
４．発明の詳細な説明
４．１．定義
本発明の理解を容易にするため、いくつかの用語及び表現を以下に定義する。
【００３６】
本明細書で使用される「検出する」、「検出すること」、又は「検出」の用語は、検出可能に標識された組成物を発見する、又は識別する、又はその特異的な観察の全般的な行為のいずれかを説明する場合がある。
【００３７】
本明細書で使用される「検出可能に異なる」の用語は、同時に検出され識別され得る一組の標識（色素等）を指す。
【００３８】
本明細書で使用される「患者」及び「被験体」の用語は、ヒトを指すため同じ意味で使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、非ヒト動物に由来する試料に対して使用されてもよい。
【００３９】
本明細書で使用される「膀胱癌」は、膀胱内壁から生じる移行上皮癌等の腫瘍であり、低悪性度及び高悪性度の膀胱癌、並びに転移性膀胱癌を含む。「低悪性度の膀胱癌」は、膀胱腔の内側へと突出する表在性腫瘍を指す。低悪性度の膀胱癌は高い再発率を有する。「高悪性度の膀胱癌」は、膀胱壁に侵入する成長が早く及び／又は浸潤性の腫瘍を指す。高悪性度の膀胱癌は、身体の他の領域へと広がる（すなわち、転移する）可能性がある。「転移性膀胱癌」は、膀胱の範囲を越えて体内の１又は複数の場所へと広がった浸潤性膀胱癌を指す。
【００４０】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」等の用語は、限定されないが、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む核酸含有分子を指す。該用語は、限定されないが、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチル-アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、及び２，６−ジアミノプリンを含む、ＤＮＡ及びＲＮＡの既知の塩基類縁体のいずれかを含む配列を包含する。
【００４１】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」の用語は、５００より少ないヌクレオチドを有する１本鎖ポリヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、８〜２００、８〜１００、１２〜２００、１２〜１００、１２〜７５、又は１２〜５０のヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、それらの長さで呼ばれる場合があり、例えば、２４残基のオリゴヌクレオチオは「２４−ｍｅｒ」と呼ばれることがある。
【００４２】
本明細書で使用される、標的ＲＮＡ（又はその標的領域）に対して「相補的」の用語、及び標的ＲＮＡ配列の相補性に対するプローブ配列の「相補性」の割合は、標的ＲＮＡの配列、又は標的ＲＮＡの逆相補配列に対する「同一性」の割合である。本明細書に記載される組成物で使用されるプローブ（又はその領域）と、本明細書に開示されるもののような標的ＲＮＡとの間の「相補性」の程度を判定するにあたり、「相補性」の程度は、プローブ（又はその領域）の配列と、標的ＲＮＡ又はそれと最もよく整列する標的ＲＮＡの逆相補配列との間のパーセント同一性として表される。上記割合は、その２つの配列間で同一の整列された塩基の数を数えて、プローブ中の連続するヌクレオチオドの総数で除して１００を乗じることにより算出される。「相補性」の用語を使用する場合、別段の指示がない限り、対象オリゴヌクレオチドは標的分子に対して少なくとも９０％相補的である。いくつかの実施形態では、対象のオリゴヌクレオチドは、標的分子に対して少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％相補的である。
【００４３】
本明細書で使用される「プライマー」又は「プローブ」は、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡから逆転写されたＤＮＡ等の標的核酸分子の少なくとも８つの連続するヌクレオチドの配列に相補的な領域を含むオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、プライマー又はプローブは、標的分子の少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、又は少なくとも３０の連続するヌクレオチドの配列に対して相補的な領域を含む。プライマー又はプローブが、「標的分子の少なくともｘの連続するヌクレオチドに相補的」な領域を含む場合、そのプライマー又はプローブはその標的分子の少なくともｘの連続するヌクレオチドに対して少なくとも９５％相補的である。いくつかの実施形態では、プライマー又はプローブは、上記標的分子に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％相補的である。
【００４４】
本明細書で使用される「試料」として、尿試料（尿試料に由来する試料を含む）、及び他の種類のヒト試料が挙げられる。本明細書で使用される尿試料として、限定されないが、全尿、尿試料に由来する細胞を含む試料、尿試料の遠心分離によって単離された細胞ペレットを含む試料、尿試料の濾過によって単離された細胞を含む試料等が挙げられる。いくつかの実施形態では、尿試料は、防腐剤、例えば、赤血球及び／又は白血球の溶解等の損傷を引き起こす防腐剤を含む。いくつかの実施形態では、試料は、組織試料（膀胱組織及び／又は膀胱腫瘍試料を含む）、血液試料（全血、血清、血漿等を含む）等の尿試料以外のヒト試料である。いくつかの実施形態では、試料は膀胱洗浄試料である。
【００４５】
本明細書で使用される「副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン」、すなわち「ＣＲＨ」は、ＣＲＨ、また同様にＣＲＨタンパク質をコードするｍＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、ＣＲＨはヒトＣＲＨである。ヒトＣＲＨ  ｍＲＮＡ配列の非限定的な例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００７５６、及び配列番号１に見出される。
【００４６】
本明細書で使用される「インスリン様成長因子２」、すなわち「ＩＧＦ２」は、ＩＧＦ２、また同様にＩＧＦ２タンパク質をコードするｍＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ２はヒトＩＧＦ２である。ヒトＩＧＦ２  ｍＲＮＡ配列の非限定的な例は、配列番号２〜配列番号４に示される。
【００４７】
本明細書で使用される「ケラチン２０」、すなわち「ＫＲＴ２０」は、ＫＲＴ２０、また同様にＫＲＴ２０タンパク質をコードするｍＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、ＫＲＴ２０はヒトＫＲＴ２０である。ヒトＫＲＴ２０  ｍＲＮＡ配列の非限定的な例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１９０１０、及び配列番号５に見出される。
【００４８】
本明細書で使用される「アネキシンＡ１０」、すなわち「ＡＮＸＡ１０」は、ＡＮＸＡ１０、また同様にＡＮＸＡ１０タンパク質をコードするｍＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、ＡＮＸＡ１０はヒトＡＮＸＡ１０である。ヒトＡＮＸＡ１０  ｍＲＮＡ配列の非限定的な例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００７１９３、及び配列番号６に見出される。
【００４９】
本明細書で使用される「アンドロゲンアクセプター」、すなわち「ＡＲ」は、ＡＲ、また同様にＡＲタンパク質をコードするｍＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、ＡＲはヒトＡＲである。ヒトＡＲ  ｍＲＮＡ配列の非限定的な例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００００４４及びＮＭ＿００１０１１６４５、並びに配列番号４９及び配列番号５７に見出される。
【００５０】
本明細書で使用される「ウロプラキン１Ｂ」、すなわち「ＵＰＫ１Ｂ」は、ＵＰＫ１Ｂ、また同様にＵＰＫ１Ｂタンパク質をコードするｍＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、ＵＰＫ１ＢはヒトＵＰＫ１Ｂである。ヒトＵＰＫ１Ｂ  ｍＲＮＡ配列の非限定的な例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００６９５２、及び配列番号５０に見出される。
【００５１】
本明細書で使用される「ウロプラキン２」、すなわち「ＵＰＫ２」は、ＵＰＫ２、また同様にＵＰＫ２タンパク質をコードするｍＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、ＵＰＫ２はヒトＵＰＫ２である。ヒトＵＰＫ２  ｍＲＮＡ配列の非限定的な例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００６７６０．３、及び配列番号５８に見出される。
【００５２】
本明細書で使用される「髄膜腫発現抗原５」、すなわち「ＭＧＥＡ５」は、ＭＧＥＡ５、また同様にＭＧＥＡ５タンパク質をコードするｍＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、ＭＧＥＡ５はヒトＭＧＥＡ５である。ヒトＭＧＥＡ５  ｍＲＮＡ配列の非限定的な例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１４２４３４．１及びＮＭ＿０１２２１５．３、並びに配列番号５９及び配列番号６０に見出される。
【００５３】
本明細書で使用される「ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート３−キナーゼ、触媒サブユニットアルファ」、すなわち「ＰＩＫ３ＣＡ」は、ＰＩＫ３ＣＡ、また同様にＰＩＫ３ＣＡタンパク質をコードするｍＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、ＰＩＫ３ＡはヒトＰＩＫ３ＣＡである。ヒトＰＩＫＣ３Ａ  ｍＲＮＡ配列の非限定的な例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００６２１８．２、及び配列番号６１に見出される。
【００５４】
本明細書で使用される「内在性コントロール」は、検出に使用される試料中に本来存在する部分を指し、本明細書に記載される膀胱癌マーカー（限定されないが、ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、及びＡＮＸＡ１０を含む）のレベルを正規化するために使用され得る。そのため、内在性コントロールは、典型的には、細胞毎に同様のレベルで、また膀胱癌を伴う被験体に由来する細胞と膀胱癌を伴わない被験体に由来する細胞において同様のレベルで存在する部分である。いくつかの実施形態では、内在性コントロールはＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ等）である。内在性コントロールの非限定的な例として、ＡＢＬ  ｍＲＮＡ、ＧＵＳＢ  ｍＲＮＡ、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ、ＴＵＢＢ  ｍＲＮＡ、及びＵＰＫ１ａ  ｍＲＮＡが挙げられる。ヒトＡＢＬ  ｍＲＮＡ配列の非限定的な例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００７３１３、及び配列番号７に見出される。いくつかの実施形態では上記膀胱癌マーカーが検出されるのと同じ手法で、またいくつかの実施形態では上記膀胱癌マーカーと同時に検出され得る、内在性コントロールが選択される。いくつかの実施形態では、試料の十分性の内在性コントロール指標（すなわち、膀胱癌マーカーの検出レベルに対して試料中の細胞の十分な数の指標）であることに加えて、内在性コントロールは、それ自体が膀胱癌の指標である可能性がある、試料中の尿路上皮細胞レベルの上昇を示す場合もある。
【００５５】
本明細書で使用される「外在性コントロール」は、検出に使用される試料に添加される部分を指す。典型的には、検出に使用される試料中に存在すると予測されないもの、又は試料中に本来存在する部分の量が検出不可能であるか、若しくは外在性コントロールとして試料に添加される量よりもはるかに低いレベルで検出可能であるように、試料中に非常に低いレベルで存在する外在性コントロールを選択する。いくつかの実施形態では、外在性コントロールは、上記膀胱癌マーカーの検出に使用される種類の試料に存在すると予測されないヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、外在性コントロールは、その試料が採取された種に存在することが知られていないヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、外在性コントロールは、その試料が採取された被験体とは異なる種に由来するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、外在性コントロールは、いかなる種にも存在していることが知られていないヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では上記膀胱癌マーカーが検出されるのと同じ手法で、またいくつかの実施形態では上記膀胱癌マーカーと同時に検出され得る外在性コントロールを選択する。いくつかの実施形態では、外在性コントロールはＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、バクテリオファージ保護コートにパッケージされたＲＮＡを含むＡｒｍｏｒｅｄ  ＲＮＡ（商標）である。例えば、WalkerPeach et al., Clin. Chem. 45:12:2079-2085 (1999)を参照されたい。
【００５６】
本明細書において上記配列では、両方の文字がその位置におけるウラシル又はチミンを示すように、「Ｕ」と「Ｔ」とは同じ意味で使用される。当業者は、ウラシル又はチミンが意図される、及び／又はその配列中のその位置において使用されるべきかどうかを文脈及び／又は意図される用途から理解する。例えば、当業者は、天然のＲＮＡ分子が典型的にはウラシルを含むのに対し、天然のＤＮＡ分子は典型的にはチミンを含むことを理解するであろう。そのため、ＲＮＡ配列が「Ｔ」を含む場合、当業者は、天然のＲＮＡにおけるその位置はおそらくウラシルであると理解し得る。
【００５７】
本開示では、「から選択される配列」は、「から選択される１つの配列」及び「から選択される１又は複数の配列」の両方を包含する。そのため、「から選択される配列」が使用される場合、列挙される配列の１つ、又は２つ以上が選択され得ることが理解される。
【００５８】
本開示では、「からなる一組の膀胱癌マーカー」を検出することを含む方法は、任意の更なる膀胱癌マーカーではなく、そのセットの膀胱癌マーカーのみの検出を含む。しかしながら、上記方法は、内在性及び／又は外在性のコントロールを検出するといった追加の構成要素又は工程を含んでもよい。同様に、「一組の膀胱癌マーカープライマー対」及び／又は「一組の膀胱癌マーカープローブ」を含む方法又は組成物は、他のいかなる膀胱癌マーカーに対してではなく、そのセットの膀胱癌マーカーのみに対するプライマー対及び／又はプローブを含み得る。しかしながら、上記方法又は組成物は、１若しくは複数の内在性コントロールプライマー対、及び／又は１若しくは複数の外在性コントロールプライマー対等の追加の構成要素を含んでもよい。
【００５９】
４．２．膀胱癌の検出
本発明者らは、アンドロゲンアクセプター（ＡＲ）及び／又はウロプラキン１Ｂ（ＵＰＫ１Ｂ）、また任意に、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択される少なくとも１つのマーカーを検出することを含む、膀胱癌を検出するアッセイを開発した。ここに記載されるアッセイは、既存の及び以前に記載された膀胱癌の診断に対していくつかの利点を有する。例えば、本発明のアッセイは、高価になる可能性があり、結果の正確な解釈に熟練した細胞学者を必要とする細胞学に依拠しない。その代わり、本発明のアッセイはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に依拠し、例えば、ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）システム（カリフォルニア州サニーベールのCepheid）を使用する実質的に自動化された手法で実施され得る。自動化システム、例えば、ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）システムを使用して、本発明のアッセイを３時間未満、いくつかの実施形態では２時間未満で完了することができる。既存の検査は、検査室が完了して結果を送付するまで数日を要する場合がある。さらに、はるかに少ない容量（いくつかの実施形態では、５ｍｌ以下）の尿に対して本発明のアッセイを実施することができる。そのため、細胞学ではなくＰＣＲに依拠する本発明のアッセイは、膀胱癌の診断のための迅速なワンポット反応を可能とし、多くの例において、ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）等の自動化システムを使用する看護拠点において実施され得る。
【００６０】
４．２．１．一般的な方法
膀胱癌を検出する組成物及び方法が提供される。いくつかの実施形態では、低悪性度の膀胱癌を検出する組成物及び方法が提供される。いくつかの実施形態では、高悪性度の膀胱癌を検出する組成物及び方法が提供される。いくつかの実施形態では、膀胱癌の再発をモニタリングする組成物及び方法が提供される。
【００６１】
いくつかの実施形態では、膀胱癌を検出する方法は、試料中のＡＲのレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、膀胱癌を検出する方法は、試料中のＵＰＫ１Ｂのレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、膀胱癌を検出する方法は、試料中のＡＲ及びＵＰＫ１Ｂのレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、膀胱癌を検出する方法は、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択される少なくとも１つの追加のマーカーのレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、膀胱癌を検出する方法は、ＡＲ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０及びＡＮＸＡ１０、又はＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０及びＡＮＸＡ１０、又はＡＲ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２及びＫＲＴ２０、又はＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２及びＫＲＴ２０、又はＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２及びＡＮＸＡ１０を含む、又はそれらからなる一組の膀胱癌マーカーのレベルを検出することを含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、膀胱癌を検出する方法は、少なくとも１つの内在性コントロールのレベルを検出することを更に含む。いくつかの実施形態では、膀胱癌を検出する方法は、少なくとも１つの外在性コントロールのレベルを検出することを更に含む。いくつかの実施形態では、膀胱癌を検出する方法は、少なくとも１つの内在性コントロール及び少なくとも１つの外在性コントロールのレベルを検出することを更に含む。
【００６３】
いくつかの実施形態では、膀胱癌を検出する方法は、試料中のＡＲ  ｍＲＮＡのレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、膀胱癌を検出する方法は、試料中のＵＰＫ１Ｂ  ｍＲＮＡのレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、膀胱癌を検出する方法は、試料中のＡＲ  ｍＲＮＡ及びＵＰＫ１Ｂ  ｍＲＮＡのレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、膀胱癌を検出する方法は、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、及びＡＮＸＡ１０のｍＲＮＡから選択される少なくとも１つの追加のマーカーのレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、膀胱癌を検出する方法は、ＡＲ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０及びＡＮＸＡ１０のｍＲＮＡ、又はＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０及びＡＮＸＡ１０のｍＲＮＡ、又はＡＲ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２及びＫＲＴ２０のｍＲＮＡ、又はＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２及びＫＲＴ２０のｍＲＮＡ、又はＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２及びＡＮＸＡ１０のｍＲＮＡを含む、又はそれらからなる一組の膀胱癌マーカーのレベルを検出することを含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、膀胱癌を検出する方法は、少なくとも１つの内在性コントロールＲＮＡのレベルを検出することを更に含む。いくつかの実施形態では、膀胱癌を検出する方法は、少なくとも１つの外在性コントロールＲＮＡのレベルを検出することを更に含む。いくつかの実施形態では、膀胱癌を検出する方法は、少なくとも１つの内在性コントロールＲＮＡ及び少なくとも１つの外在性コントロールＲＮＡのレベルを検出することを更に含む。
【００６５】
本開示では、「標的ＲＮＡ」の用語は、便宜的上、ＡＲ及びＵＰＫ１Ｂ、またＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡ等の他の標的ＲＮＡ、並びに外在性コントロール及び／又は内在性コントロールのＲＮＡを指すため使用される。そのため、標的ＲＮＡに関して議論が提示される場合、その議論は、具体的にはＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡ、及び／又は他の標的ＲＮＡを包含することが意図されると理解される。
【００６６】
いくつかの実施形態では、１又は複数の標的ＲＮＡのレベルは、尿試料において検出される。いくつかの実施形態では、１又は複数の標的ＲＮＡのレベルは、赤血球及び／又は白血球に対して溶解等の損傷をもたらす方式で保存された尿試料において決定される。いくつかの実施形態では、１又は複数の標的ＲＮＡのレベルは、防腐処理を伴う又はそれを伴わないいずれかの尿試料から単離された尿路上皮細胞において検出される。いくつかの実施形態では、尿路上皮細胞は濾過により単離される。
【００６７】
いくつかの実施形態では、被験体に由来する試料中のＡＲ  ｍＲＮＡレベルの上昇の検出は、その被験体における膀胱癌の存在を示す。いくつかの実施形態では、被験体に由来する試料中のＵＰＫ１Ｂレベルの上昇の検出は、その被験体における膀胱癌の存在を示す。いくつかの実施形態では、被験体に由来する試料中のＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択される１又は複数の標的ｍＲＮＡレベルの上昇の検出は、その被験体における膀胱癌の存在を示す。いくつかの実施形態では、検出は定量的に行われる。他の実施形態では、検出は定性的に行われる。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡを検出することは、標的ＲＮＡ、標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコン、及び標的ＲＮＡの相補鎖から選択されるポリヌクレオチド及び核酸を含む複合体を形成することを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡを検出することはＲＴ−ＰＣＲを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡを検出することは、定量的ＲＴ−ＰＣＴを含む。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡのレベルを、標的ＲＮＡの正常レベル又はコントロールレベルと比較する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡ等の標的ＲＮＡのレベルは、その患者における膀胱癌の状況又は進行をモニターするため患者から１回又は複数回採取された試料において測定され得る。いくつかの実施形態では、低悪性度の膀胱癌の病歴、又は高悪性度の膀胱癌の病歴等の膀胱癌の病歴を有する患者を、定期的に又は半定期的な間隔でＡＲ及び／又はＵＰＫ１ＢのｍＲＮＡ、また任意に、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択される少なくとも１つのｍＲＮＡのレベルを検出することによりモニターする。いくつかのかかる実施形態では、少なくとも１ヶ月毎に１回、少なくとも２ヶ月毎に１回、少なくとも３ヶ月毎に１回、少なくとも４ヶ月毎に１回、少なくとも５ヶ月毎に１回、少なくとも６ヶ月毎に１回、少なくとも９ヶ月毎に１回、少なくとも１年毎に１回、又は少なくとも２年毎に１回標的ＲＮＡのレベルを検出することにより患者をモニターする。
【００６９】
いくつかの実施形態では、抗アンドロゲン療法に対する反応をモニターするため患者から１回又は複数回採取した試料において、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡ等の標的ＲＮＡのレベルを測定することができる。抗アンドロゲン剤の非限定的な例として、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ（商標））、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ（商標））、及びニルタミド（Ｎｉｌａｎｄｒｏｎ（商標））が挙げられる。いくつかの実施形態では、膀胱癌に対して抗アンドロゲン療法を受けている患者を、定期的又は半定期的な間隔で、ＡＲ及び／又はＵＰＫ１ＢのｍＲＮＡ、また任意に、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択される少なくとも１つのｍＲＮＡのレベルを検出することによってモニターする。いくつかのかかる実施形態では、少なくとも１ヶ月毎に１回、少なくとも２ヶ月毎に１回、少なくとも３ヶ月毎に１回、少なくとも４ヶ月毎に１回、少なくとも５ヶ月毎に１回、少なくとも６ヶ月毎に１回、少なくとも９ヶ月毎に１回、少なくとも１年毎に１回、又は少なくとも２年毎に１回標的ＲＮＡのレベルを検出することにより患者をモニターする。いくつかの実施形態では、治療中のＡＲ及び／又はＵＰＫ１Ｂのレベルの減少は、膀胱癌が抗アンドロゲン療法に反応していることを示す。
【００７０】
いくつかの実施形態では、試験される試料は尿試料（排泄された尿試料等）であるか、又は尿試料に由来する。いくつかの実施形態では、例えば、尿試料中に存在する赤血球及び／又は白血球を損傷（例えば、溶解）するため尿試料に防腐剤を添加する。尿路上皮細胞の単離前に赤血球及び／又は白血球を損傷又は溶解することにより、赤血球及び／又は白血球による汚染を減少することができる。いくつかの実施形態では、尿試料を遠心分離して尿路上皮細胞を濃縮する。いくつかの実施形態では、尿試料を濾過して他の尿又は防腐剤の材料から尿路上皮細胞を単離する。いくつかのかかる実施形態では、濾過はＧｅｎｅＸｐｅｒｔカートリッジ（カリフォルニア州サニーベールのCepheid）の一部である。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本発明の方法において５ｍｌ未満、４ｍｌ未満、３ｍｌ未満、又は２ｍｌ未満の尿を使用する。いくつかの実施形態では、尿試料は遠心分離工程を伴わずに分析される。そのため、いくつかの実施形態では、本発明の方法は遠心分離をせずに行われる。いくつかの実施形態では、大量の尿を使用してもよく、いくつかのかかる実施形態では、分析前に尿路上皮細胞を濃縮するため遠心分離工程を使用してもよい。
【００７２】
いくつかの実施形態では、試験される試料は、血液、痰、粘液、唾液、精液等の別の体液である。いくつかの実施形態では、試験される試料は血液試料である。いくつかの実施形態では、血液試料は全血である。いくつかの実施形態では、血液試料は血液細胞の試料である。いくつかの実施形態では、血液試料は血漿である。いくつかの実施形態では、血液試料は血清である。
【００７３】
試験される臨床試料は、いくつかの実施形態では、新鮮（すなわち、凍結されたことがない）である。他の実施形態では、上記試料は凍結標本である。いくつかの実施形態では、上記試料はホルマリン固定パラフィン包埋試料等の組織試料である。いくつかの実施形態では、上記試料は液体の細胞学的試料である。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、排泄尿から得られるもの等の尿路上皮細胞の試料における膀胱癌の早期検出に使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、排泄尿から得られるもの等の尿道上皮細胞の試料を使用する膀胱癌の再発に関するモニタリングに使用される。
【００７５】
いくつかの実施形態では、１又は複数の以下の危険因子、すなわち、喫煙歴、血尿、膀胱癌又は他の癌の病歴、及びベンゼン等の既知の発癌性物質への曝露を有する個体から試験される試料を得る。いくつかの実施形態では、尿中の血液、頻尿、尿意切迫、失禁、排尿困難、腹痛、原因不明の体重減少及び／又は食欲不振等の膀胱癌と関連し得る診断兆候又は臨床症状を有する個体から上記試料を得る。いくつかの実施形態では、以前に低悪性度又は高悪性度の膀胱癌と診断された個体から試験される試料を得る。いくつかのかかる実施形態では、上記個体は膀胱癌の再発についてモニターされる。
【００７６】
膀胱癌は、原発腫瘍の成長パターンを示すステージに分けることができる。表Ａは、米国癌合同委員会（ＡＪＣＣ）による膀胱癌のステージを示す。示されるステージは、「ＴＮＭ」システムの「Ｔ」部分のみを含む。「Ｔ」部分は原発腫瘍を指すのに対し、「Ｎ」はリンパ節への癌の広がりを指し、「Ｍ」はその癌が遠位部位へと転移したかどうかを指す。
【００７７】
【表１】
2016513961.tif 000002
【００７８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、危険因子を有しない健康な個体の定期的なスクリーニングに使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、１又は複数の上述の危険因子を有する無症候性の個体をスクリーンするために使用される。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、低悪性度の膀胱癌を検出するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、高悪性度の膀胱癌を検出するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、少なくとも１５％、少なくとも１７％、少なくとも２０％、少なくとも２２％、少なくとも２５％、少なくとも２７％、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、又は少なくとも３５％の低悪性度の膀胱癌を検出する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の高悪性度の膀胱癌を検出する。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、患者における膀胱癌の治療の有効性を査定するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ＡＲ及び／又はＵＰＫ１ＢのｍＲＮＡ、また任意に、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択される少なくとも１つのｍＲＮＡ等の標的ＲＮＡレベルを治療中の様々な時に特定し、治療開始前に患者から採取した保存試料に由来する標的ＲＮＡレベルと比較する。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡレベルを患者から採取した保管用正常試料に由来する標的ＲＮＡレベルと比較する。理想的には、正常試料中の標的ＲＮＡレベルは、標的ＲＮＡレベルの異常な変化がないことの証拠となる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ＡＲ及び／又はＵＰＫ１ＢのｍＲＮＡ、また任意に、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択される少なくとも１つのｍＲＮＡのレベルの使用は、膀胱癌の再発をモニタリングするために提供される。いくつかの実施形態では、１以上、２以上、３以上、若しくは４以上、５以上、又は６つ全てのｍＲＮＡレベルの上昇は、その患者において膀胱癌が再発したことを示す。
【００８２】
本明細書に記載されるいずれかの実施形態では、ＲＮＡレベルは、同じ又は別々のアッセイ反応において一斉に又は同時に検出されてもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡレベルは、異なる時間、例えば、順次のアッセイ反応において検出される。
【００８３】
いくつかの実施形態では、方法は、被験体に由来する試料中のＡＲ及び／又はＵＰＫ１ＢのｍＲＮＡ、また任意に、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択される少なくとも１つのｍＲＮＡのレベルを検出することを含み、ＲＮＡの正常レベルよりも高いいずれか１つのｍＲＮＡのレベルの検出がその被験体における膀胱癌の存在を示す。いくつかの実施形態では、２、３、４、５、又は６の膀胱癌マーカーｍＲＮＡレベルの上昇の検出は、その被験体における膀胱癌の存在を示す。いくつかの実施形態では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５の膀胱癌マーカーｍＲＮＡレベルの上昇の検出は、高悪性度の膀胱癌のより大きなリスクを示す。
【００８４】
いくつかの実施形態では、被験体における膀胱癌の診断を容易にする方法が提供される。かかる方法は、被験体に由来する試料中のＡＲ及び／又はＵＰＫ１ＢのｍＲＮＡ、また任意に、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択される少なくとも１つのｍＲＮＡのレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、被験体に由来する試料中のＡＲ及び／又はＵＰＫ１ＢのｍＲＮＡ、また任意に、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択される少なくとも１つのｍＲＮＡのレベルに関する情報は、医師に連絡される。本明細書で使用される「医師」は、病院、クリニック、内科医院、内科医、看護師、又は上述のいずれかの団体及び個人の代理人等の患者を診断及び／又は治療する個人又は団体を指す。いくつかの実施形態では、ＡＲ及び／又はＵＰＫ１ＢのｍＲＮＡ、また任意に、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択される少なくとも１つのｍＲＮＡのレベルを検出することは、医師又は医師の代理人から被験体の試料を受け取った検査室において行われる。検査室は、本明細書に記載されるものを含む任意の方法によって検出を行い、その後、結果を医師に連絡する。本明細書で使用されるように、任意の手段により医師に提供する場合、結果を「連絡する」。いくつかの実施形態では、かかる連絡は個人的に口頭若しくは文書でもよく、又は電話でもよく、ｅ−メール、郵便又は他のクーリエであってもよく、又は例えば、その医師によって管理されていないデータベースを含む、その医師によってアクセス可能なデータベースに直接的に情報を預けることによって行われてもよい。いくつかの実施形態では、上記情報は電子フォームで維持される。いくつかの実施形態では、上記情報は、メモリ又はＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリ、コンピューターチップ、デジタルビデオディスク（ＤＶＤ）、コンパクトディスク（ＣＤ）、ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）、磁気テープ等の他のコンピューター可読媒体に保存され得る。
【００８５】
いくつかの実施形態では、膀胱癌の存在を検出する方法が提供される。いくつかの実施形態では、膀胱癌を診断する方法が提供される。いくつかの実施形態では、上記方法は、試料中のＡＲ及び／又はＵＰＫ１ＢのｍＲＮＡ、また任意に、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、及びＡＮＸＡ１０から選択される少なくとも１つのｍＲＮＡのレベルの検出のため、被験体から試料を得ること、及びその試料を検査室に提供することを含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、試料中のＡＲ及び／又はＵＰＫ１ＢのｍＲＮＡ、また任意に、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択される少なくとも１つのｍＲＮＡのレベルを示す検査室からの連絡を受けることを更に含む。いくつかの実施形態では、上記４つのｍＲＮＡのいずれか１つのレベルが、ｍＲＮＡの正常レベル又はコントロールレベルよりも高い場合に膀胱癌が存在する。本明細書で使用される「検査室」は、本明細書で記載される方法を含む任意の方法で試料中の標的ＲＮＡのレベルを検出し、医師にそのレベルを連絡する任意の施設である。いくつかの実施形態では、検査室はその医師の管理下にある。いくつかの実施形態では、検査室はその医師の管理下にない。
【００８６】
検査室が医師に標的ＲＮＡのレベルを連絡する場合、いくつかの実施形態では、検査室は、正常レベルの数値を提供すると共に又はそれを提供せずに、試料中のＲＮＡのレベルを表す数値を連絡する。いくつかの実施形態では、検査室は、「高」、「低」、「上昇」、「減少」、「陽性」（「ＡＲ陽性」又は「ＡＲ及びＣＲＨ陽性」等）等の定性的値を提供することによりＲＮＡのレベルを連絡する。いくつかの実施形態では、検査室は、「膀胱癌陽性」若しくは「癌について陽性」等、又は単純に「癌陽性」若しくは「癌陰性」等の示唆される診断結果を連絡する。
【００８７】
本明細書で使用されるように、方法が膀胱癌を検出すること、膀胱癌の存在を判定すること、膀胱癌についてモニタリングすること、及び／又は膀胱癌を診断することに関する場合、その方法は、上記方法の工程が実施されるが、結果が膀胱癌の存在について陰性である活動を含む。すなわち、膀胱癌を検出すること、判定すること、モニタリングすること、及び診断することは、その結果が陽性結果か又は陰性結果のいずれかである方法を実施する例を含む。
【００８８】
いくつかの実施形態では、２以上のＲＮＡを単一の反応において同時に検出する。いくつかの実施形態では、ＡＲ  ｍＲＮＡと、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択される少なくとも１つのｍＲＮＡとを単一の反応において同時に検出する。いくつかの実施形態では、ＵＰＫ１Ｂ  ｍＲＮＡと、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択される少なくとも１つのｍＲＮＡとを単一の反応において同時に検出する。いくつかの実施形態では、ＡＲ及びＵＰＫ１ＢのｍＲＮＡと、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択される少なくとも１つのｍＲＮＡとを単一の反応において同時に検出する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの内在性コントロール及び／又は少なくとも１つの外在性コントロールを単一の反応において膀胱癌マーカーにより同時に検出する。
【００８９】
４．２．２．コントロールの例
いくつかの実施形態では、ＡＲ及び／又はＵＰＫ１ＢのｍＲＮＡ、また任意に、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択される少なくとも１つのｍＲＮＡ等の標的ＲＮＡの正常レベル（「コントロール」）を、試料において測定されるレベルを比較することができる、正常な尿路上皮細胞又は他の参照物質の特徴である平均レベル又は範囲として決定することができる。正常な被験体において決定された標的ＲＮＡの平均又は範囲を、膀胱癌の指標である標的ＲＮＡの上記正常レベルを検出するためのベンチマークとして使用することができる。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの正常レベルは、健康な個体の尿から単離された正常尿路上皮細胞等の１又は複数の個体に由来する個別の又はプールされたＲＮＡ含有試料を使用して決定され得る。
【００９０】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの正常レベルの決定は、標的ＲＮＡ、標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコン、及び標的ＲＮＡの相補鎖から選択される核酸にハイブリダイズした検出用ポリヌクレオチドを含む複合体を検出することを含む。すなわち、いくつかの実施形態では、正常レベルは、標的ＲＮＡ自体ではなく標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコン、又は標的ＲＮＡの相補鎖を検出することにより決定され得る。いくつかの実施形態では、かかる複合体の正常レベルを決定し、コントロールとして使用する。上記複合体の正常レベルは、いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの正常レベルと相関する。そのため、標的の正常レベルを本明細書で述べる場合、そのレベルは、いくつかの実施形態では、かかる複合体を検出することによって決定され得る。
【００９１】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの正常レベルは、患者試料に由来する標的ＲＮＡのレベルとして同じ方法によって決定されるか、又は決定されている。かかる実施形態では、上記方法はＲＴ−ＰＣＲ（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ等）である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、コントロールは、単一の個体の細胞、例えば、健康な個体の尿から単離された正常な尿路上皮細胞に由来するＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、コントロールは、単一の個体の全血又は血清等の血液に由来するＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、コントロールは複数の個体からの細胞プールに由来するＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、コントロールは複数の個体からの尿プールに由来するＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、コントロールは市販のヒトＲＮＡ（例えば、Ambionを参照されたい）を含む。いくつかの実施形態では、正常レベル又は正常範囲は、レベルの上昇について試料を試験する前に既に予め決定されていてもよい。
【００９３】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの正常レベルは、１又は複数の継続的な細胞株、典型的には、正常な尿路上皮細胞におけるレベルに近似するレベルのＲＮＡを有することが以前に示されている細胞株より決定され得る。
【００９４】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡレベルの定量は、試料調製の間の１細胞当たりの全ＲＮＡ及び試料喪失の程度に関して仮定する必要がある。異なる試料間又は異なる条件下で調製された試料間の相違を補正するため、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの内在性コントロール及び／又は少なくとも１つの外在性コントロールのレベルに対して標的ＲＮＡの量を正規化する。
【００９５】
いくつかの実施形態では、コントロールＲＮＡは内在性コントロールＲＮＡである。内在性コントロールＲＮＡは、目的に適した任意のＲＮＡ、例えば、膀胱癌及び非膀胱癌の患者に由来する細胞毎に及び尿路上皮細胞においておおよそ一定のレベルで存在するＲＮＡであってもよい。内在性コントロールＲＮＡの非限定的な例として、ＡＢＬ、ＧＵＳＢ、ＧＡＰＤＨ、ＴＵＢＢ、及びＵＰＫ１ａが挙げられる。いくつかの実施形態では、１つの内在性コントロールを正規化に使用する。いくつかの実施形態では、２以上の内在性コントロールを正規化に使用する。また、いくつかの実施形態では、内在性コントロールは、膀胱癌の指標となり得る、試料中の尿路上皮細胞のレベルの上昇を示してもよい。そのため、いくつかの実施形態では、内在性コントロールは、試料の十分性を示すのみならず、それ自体が膀胱癌の指標である、尿試料中の細胞数の上昇も示し得る。
【００９６】
いくつかの実施形態では、コントロールＲＮＡは外在性コントロールＲＮＡである。いくつかのかかる実施形態では、外在性コントロールＲＮＡは、バクテリオファージコートによって保護されているＡｒｍｏｒｅｄ  ＲＮＡ（商標）である。外在性コントロールＲＮＡは、いくつかの実施形態では、検出アッセイ反応が失敗したかどうかを判定するため使用される場合があり、したがって、その結果は無意味である。例えば、外在性コントロールＲＮＡがアッセイ反応において増幅されない場合には、標的ＲＮＡに関する陰性結果は、そのレベルが、標的ＲＮＡレベルが低いということよりもむしろ反応の失敗を反映することから無意味な可能性がある。反応の失敗は、限定されないが、試料中の反応阻害物質の存在（「阻害試料」）、支障のある試薬、ＲＮアーゼの存在等を含むいくつもの理由で起こり得る。外在性ＲＮＡコントロールを試料採取及び分析の任意の段階で添加してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、外在性コントロールＲＮＡを、防腐剤を添加する際に試料に添加するか、診断検査室によって受け取られる際に試料に添加するか、分析の直前に試料に添加するか、又は分析中の試料に添加する（非限定的な例として、尿路上皮細胞の溶解中又は溶解後であるが、増幅試薬の添加前）。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、又はＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡ等の標的ＲＮＡのレベルを例えば、確認された膀胱癌に由来する参照レベルと比較する。かかる実施形態では、参照試料と比較した類似レベルの標的ＲＮＡが膀胱癌を示す。
【００９８】
いくつかの実施形態では、各標的ＲＮＡの正常レベルよりも少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％大きい、ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、又はＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡ等の標的ＲＮＡのレベルは、膀胱癌の存在を示す。いくつかの実施形態では、各標的ＲＮＡの正常レベルよりも少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、又は少なくとも約１０倍大きいＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、又はＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡ等の標的ＲＮＡのレベルが膀胱癌の存在を示す。
【００９９】
いくつかの実施形態では、ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、又はＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡ等の標的ＲＮＡのコントロールレベルは、試料中の標的ＲＮＡのレベルとして、同じアッセイ又は同じアッセイのバッチ等において同時期に決定される。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡのコントロールレベルは、試料中の標的ＲＮＡのレベルとして同時期には決定されない。いくつかのかかる実施形態では、上記コントロールレベルは予め決定されている。
【０１００】
いくつかの実施形態では、内在性コントロール及び／又は外在性コントロールのレベルは、試料中の標的ＲＮＡのレベルとして、同じアッセイ又は同じアッセイのバッチ等において同時期に決定される。いくつかの実施形態では、アッセイは、同じアッセイ反応において同時に、ＡＲ及び／又はＵＰＫ１ＢのｍＲＮＡ、また任意に、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択される少なくとも１つのｍＲＮＡ、並びに内在性コントロールのレベルを決定する試薬を含む。いくつかの実施形態では、アッセイは、同じアッセイ反応において同時に、ＡＲ及び／又はＵＰＫ１ＢのｍＲＮＡ、また任意に、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択される少なくとも１つのｍＲＮＡ、並びに外在性コントロールのレベルを決定する試薬を含む。いくつかの実施形態では、アッセイは、同じアッセイ反応において同時に、ＡＲ及び／又はＵＰＫ１ＢのｍＲＮＡ、また任意に、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択される少なくとも１つのｍＲＮＡ、内在性コントロール、並びに外在性コントロールのレベルを決定する試薬を含む。いくつかのかかる実施形態では、例えば、アッセイ反応物は、ＡＲ及び／又はＵＰＫ１Ｂ、また任意に、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択される少なくとも１つのｍＲＮＡを増幅するプライマー対、内在性コントロールを増幅するプライマー対及び／又は外在性コントロールを増幅するプライマー対、並びに増幅産物を検出する検出可能に異なって標識されたプローブ（例えば、検出される各異なるアンプリコンに対する検出可能に異なる色素を有するＴａｑＭａｎ（商標）プローブ等）を含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、例えば、正常細胞において、標的ＲＮＡが非常に低いレベルで存在するか、又は全く存在しないことが知られている場合、標的ＲＮＡのレベルはコントロールレベルと比較されない。かかる実施形態では、試料中の高レベルの標的ＲＮＡの検出は、膀胱癌の指標である。
【０１０２】
４．２．３．試料調製の例
４．２．３．１．尿防腐剤の例
いくつかの実施形態では、尿試料に防腐剤を添加する。いくつかの実施形態では、尿試料を採取して（例えば、排泄されて）１時間以内、２時間以内、３時間以内、又は６時間以内の時間に防腐剤を添加する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法により試料を分析する前の１時間以内、２時間以内、３時間以内、又は６時間以内に尿試料に防腐剤を添加する。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、防腐剤は、赤血球及び／又は白血球の溶解等の損傷をもたらすが、尿路上皮細胞は損傷しない。赤血球及び／又は白血球は、腫瘍及び／又は感染症の結果尿中に存在する場合がある。いくつかの実施形態では、防腐剤の添加により、例えば濾過によって、尿路上皮細胞の改善された富化を可能とする。いくつかの実施形態では、防腐剤は尿試料のｐＨを低下させ、尿塩の可溶性を改善する。いくつかのかかる実施形態では、防腐剤は濾過工程における塩のフィルターの通過を容易にする。フィルターを通過する保存尿の望ましいｐＨは、約２．５〜４である。いくつかの実施形態では、保存尿の望ましいｐＨは約２．７〜３．７である。いくつかの実施形態では、保存尿の望ましいｐＨは約３〜３．５である。いくつかの実施形態では、保存尿の望ましいｐＨは約３．２である。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、尿／保存試料が０．８７５Ｍ〜２．６２５Ｍの塩酸グアニジン、０．２５％〜０．７５％のＮ−アセチル−Ｌ−システイン、６．２５ｍＭ〜１８．７５ｍＭのクエン酸ナトリウム、及び０．６２５％〜１．８７５％のＴｗｅｅｎ−２０を含み、３〜３．５のｐＨを有するように、防腐剤を添加する。いくつかの実施形態では、尿／保存試料が約１．７５Ｍの塩酸グアニジン、約０．５％のＮ−アセチル−Ｌ−システイン、約１２．５ｍＭのクエン酸ナトリウム、及び約１．２５％のＴｗｅｅｎ−２０を含み、約３．２のｐＨを有するように防腐剤を添加する。
【０１０５】
市販の防腐剤の非限定的な例は、ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（マサチューセッツ州ベッドフォードのHologic）である。
【０１０６】
４．２．３．２．細胞富化の例
いくつかの実施形態では、尿路上皮細胞を遠心分離によって富化する。いくつかのかかる実施形態では、細胞ペレットを上清及び／又は防腐剤に再懸濁する。細胞ペレットの再懸濁物を溶液中の細胞の濃度を調整するため使用することができる。再懸濁した細胞ペレットを本明細書に記載される方法に（例えば、溶解を伴って）使用してもよく、又は濾過等の更なる富化に供してもよい。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、尿路上皮細胞は遠心分離によって富化される。尿路上皮細胞の捕捉に適し得るフィルター孔サイズの非限定的な例として、０．８μｍ、２μｍ、８μｍ、及び１０μｍが挙げられる。いくつかの実施形態では、フィルター孔サイズを、大半の尿路上皮細胞を保持しながら赤血球及び／又は白血球が通過できるものを選択する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される膀胱癌診断アッセイを実施するため設計されたＧｅｎｅＸｐｅｒｔカートリッジ内にフィルターを配置する。
【０１０８】
４．２．３．３．ｍＲＮＡ調製の例
標的ＲＮＡを任意の適切な方法によって調製することができる。全ＲＮＡを、限定されないが、Wilkinson, M. (1988) Nucl. Acids Res. 16(22):10,933、及びWilkinson, M. (1988) Nucl. Acids Res. 16(22): 10934に記述されるプロトコルを含む任意の方法により、又はＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬（Invitrogen）、トータルＲＮＡ抽出キット（iNtRON Biotechnology）、トータルＲＮＡ精製キット（Norgen Biotek Corp.）、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（商標）（Ambion）、ＭａｇＭＡＸ（商標）（Ambion）、ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）（Ambion）、ＲＮｅａｓｙ（Qiagen）等の市販のキット又は試薬を使用することにより、単離することができる。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡが細胞から最初に精製されていない試料においてＲＮＡレベルを測定する。いくつかのかかる実施形態では、細胞を溶解工程に供してＲＮＡを遊離する。溶解方法の非限定的な例として、超音波処理（例えば、２秒〜１５秒、３６ｋＨｚで８μｍ〜１８μｍ）、化学的溶解、例えば、界面活性剤を使用する化学的溶解、及び様々な市販の溶解試薬（QiagenのＲｎｅａｓｙリシスバッファー等）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡが単離された試料においてＲＮＡレベルを測定する。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、又はＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡ等の標的ＲＮＡを検出する前にＲＮＡを修飾する。いくつかの実施形態では、試料中の全てのＲＮＡが修飾される。いくつかの実施形態では、分析される特定の標的ＲＮＡのみが、例えば、配列特異的な方式で修飾される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは逆転写される。かかる実施形態では、ＲＮＡはＭＭＬＶ逆転写酵素を使用して逆転写される。ＭＭＬＶ逆転写酵素を使用してＲＮＡを逆転写する条件の非限定的な例として、４０℃〜５０℃での５分〜２０分のインキュベーションが挙げられる。
【０１１１】
標的ＲＮＡが逆転写される際に標的ＲＮＡのＤＮＡ相補鎖が形成される。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ自体（又は標的ＲＮＡ自体のＤＮＡコピー）ではなく標的ＲＮＡの相補鎖が検出される。そのため、本明細書で述べられる方法が標的ＲＮＡを検出する、又は標的ＲＮＡのレベルを決定することを示す場合、かかる検出又は決定は、標的ＲＮＡ自体に代えて、又はそれに加えて標的ＲＮＡの相補鎖に対して行われてもよい。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡではなく標的ＲＮＡの相補鎖が検出される場合、標的ＲＮＡの相補鎖に相補的な検出用のポリヌクレオチドを使用する。いくつかのかかる実施形態では、検出用ポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡに対して配列が同一である部分を少なくとも含むが、ウリジンに代えてチミジンを含有する、及び／又は他の修飾ヌクレオチドを含有する場合がある。
【０１１２】
４．２．４．分析方法の例
上述のように、方法は膀胱癌の検出用に提示される。上記方法は、ＡＲ及び／又はＵＰＫ１Ｂ、また任意に、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択される少なくとも１つのマーカーを含む膀胱癌マーカーのパネルを検出することを含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、少なくとも１つの内在性コントロール及び／又は少なくとも１つの外在性コントロールを検出することを更に含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は６つの膀胱癌マーカーのレベルの上昇の検出は、膀胱癌の存在を示す。いくつかの実施形態では、膀胱癌は低悪性度の膀胱癌である。いくつかの実施形態では、膀胱癌は高悪性度の膀胱癌である。いくつかの実施形態では、膀胱癌は、膀胱癌の病歴を有する患者における膀胱癌の再発である。
【０１１３】
本明細書に提示される方法では、ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡ等の標的ＲＮＡの特異的かつ定量可能な（又は半定量可能な）検出を可能とし得る任意の分析手法が使用され得る。かかる分析手法として、限定されないが、ＲＴ−ＰＣＲ法、及び当業者に既知の他の方法が挙げられる。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、又はＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡ等の標的ＲＮＡを検出する方法は、標的ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを増幅することを含む。かかる増幅は任意の方法によって達成することができる。方法の例として、限定されないが、リアルタイムＰＣＲ、エンドポイントＰＣＲ、及びドイツのImplenにおいて利用可能なＳｅｎｓｅＡｍｐ  Ｐｌｕｓ（商標）キットによって提供されるようなｃＤＮＡにアニールしたＴ７プロモーターに由来するＴ７ポリメラーゼを使用する増幅が挙げられる。
【０１１５】
標的ＲＮＡ又は標的ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを増幅する場合、いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコンが形成される。ＤＮＡアンプリコンは１本鎖であってもよく、２本鎖であってもよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡアンプリコンが１本鎖である場合、ＤＮＡアンプリコンの配列はセンス又はアンチセンスの方向のいずれかで標的ＲＮＡに関連する。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ自体ではなく、標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコンが検出される。そのため、本明細書で述べられる方法が標的ＲＮＡを検出する、又は標的ＲＮＡのレベルを決定することを示す場合、かかる検出又は決定は、標的ＲＮＡ自体に代えて、又はそれに加えて標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコンに対して行われ得る。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡではなく標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコンが検出される場合、標的ＲＮＡの相補鎖に相補的な検出用ポリヌクレオチドを使用する。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡではなく標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコンが検出される場合、標的ＲＮＡに相補的な検出用ポリヌクレオチドを使用する。さらに、いくつかの実施形態では、複数の検出用ポリヌクレオチドを使用してもよく、いくつかのポリヌクレオチドは標的ＲＮＡに相補的であってもよく、またいくつかのポリヌクレオチドは標的ＲＮＡの相補鎖に相補的であってもよい。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、ＡＲ及び／又はＵＰＫ１ＢのｍＲＮＡ、また任意に、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、又はＰＩＫ３Ａから選択される少なくとも１つのｍＲＮＡ等の１又は複数の標的ＲＮＡを検出する方法は、以下に記載されるＲＴ−ＰＣＲを含む。いくつかの実施形態では、１又は複数の標的ＲＮＡの検出は、任意の方法で成され得るＲＴ−ＰＣＲ反応のリアルタイムのモニタリングを含む。かかる方法として、限定されないが、ＴａｑＭａｎ（商標）、分子ビーコン、又はＳｃｏｒｐｉｏｎプローブ（すなわち、ＦＲＥＴプローブ等のエネルギー移動（ＥＴ）プローブ）の使用、及びＳＹＢＲグリーン、ＥｖａＧｒｅｅｎ、チアゾールオレンジ、ＹＯ−ＰＲＯ、ＴＯ−ＰＲＯ等のインターカレーター色素の使用が挙げられる。
【０１１７】
標的ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを増幅する条件の非限定的な例は以下の通りである。サイクルの例は、９０℃〜１００℃で２分〜１５分の初期変性の後、９０℃〜１００℃で１秒〜１０秒の変性、６０℃〜７０℃で１０秒〜３０秒のアニーリング、及び６０℃〜７５℃で１０秒〜４０秒の伸長を含むサイクリングを含む。いくつかの実施形態では、初期変性工程の後の第１サイクルのため、サイクル変性工程を省略する。いくつかの実施形態では、Ｔａｑポリメラーゼを増幅に使用する。いくつかの実施形態では、上記サイクルを、少なくとも１０回、少なくとも１５回、少なくとも２０回、少なくとも２５回、少なくとも３０回、少なくとも３５回、又は少なくとも４５回行う。いくつかのかかる実施形態では、Ｔａｑをホットスタート機能により使用する。いくつかの実施形態では、増幅反応はＧｅｎｅＸｐｅｒｔカートリッジにおいて起こり、４つの膀胱癌マーカー標的ＲＮＡの増幅は同じ反応において起こる。いくつかの実施形態では、ＡＲ及び／又はＵＰＫ１ＢのｍＲＮＡ、また任意に、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択される少なくとも１つのｍＲＮＡの検出は、初期変性から最後の伸長まで３時間未満、２．５時間未満、又は２時間未満に起こる。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡの検出は、標的ＲＮＡ又はその相補鎖に相補的なポリヌクレオチド、及び標的ＲＮＡ、標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコン、及び標的ＲＮＡの相補鎖から選択される核酸を含む複合体を形成することを含む。そのため、いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは標的ＲＮＡと複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ等の標的ＲＮＡの相補鎖と複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコンと複合体を形成する。２本鎖ＤＮＡアンプリコンが複合体の一部である場合、本明細書で使用されるように、その複合体はＤＮＡアンプリコンの一方の鎖又は両方の鎖を含んでもよい。そのため、いくつかの実施形態では、複合体はＤＮＡアンプリコンの一方の鎖のみを含む。いくつかの実施形態では、複合体は三本鎖であり、ポリヌクレオチド及びＤＮＡアンプリコンの両方の鎖を含む。いくつかの実施形態では、複合体は、ポリヌクレオチドと標的ＲＮＡ、標的ＲＮＡの相補鎖、又は標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコンとの間のハイブリダイゼーションによって形成される。ポリヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、プライマー又はプローブである。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、方法は複合体を検出することを含む。いくつかの実施形態では、複合体は検出時に会合していなくてもよい。すなわち、いくつかの実施形態では、複合体が形成され、その後、その複合体は何らかの方法で解離又は破壊され、その複合体に由来する成分が検出される。かかるシステムの例はＴａｑＭａｎ（商標）アッセイである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドがプライマーである場合、上記複合体の検出は、標的ＲＮＡ、標的ＲＮＡの相補鎖、又は標的ＲＮＡのＤＮＡアンプリコンの増幅を含んでもよい。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、本明細書で述べられる方法において少なくとも１つの標的ＲＮＡを検出するため使用される分析方法は、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡを検出するため使用される分析方法は、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブの使用を含む。上記アッセイは、合成されたＰＣＲ産物を検出し、定量化するため、蛍光共鳴エネルギー移動（「ＦＲＥＴ」）等のエネルギー移動（「ＥＴ」）を使用する。典型的には、色素とクエンチャーとが近接してクエンチャーがＦＲＥＴによる色素の蛍光シグナルを抑制することを可能とするように、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは５’末端に連結された蛍光色素分子と、３’末端に連結されたクエンチャー分子とを含む。ポリメラーゼがＴａｑＭａｎ（商標）プローブが結合されるキメラアンプリコンテンプレートを複製する場合、ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼはプローブを切断し、色素シグナル（蛍光等）が検出されるように色素とクエンチャーとを脱共役する。各ＲＴ−ＰＣＲサイクルと共に、切断されるプローブの量に比例してシグナル（蛍光等）は増加する。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果の定量は、既知濃度の核酸による標準曲線を構築した後、未知の濃度の標的ＲＮＡの定量情報を外挿することによって行われる。いくつかの実施形態では、標準曲線を作成するため使用される核酸は、ＲＮＡ（例えば、内在性コントロール、又は外在性コントロール）である。いくつかの実施形態では、標準曲線を作成するため使用される核酸は、精製した２本鎖プラスミドＤＮＡ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製された１本鎖ＤＮＡである。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、標的核酸と内在性参照との増幅効率がおおよそ等しい場合、比較Ｃｔ（サイクル閾値、例えば、蛍光シグナルがバックグラウンドを上回るために必要なＰＣＲサイクル数）法によって定量が成される。Ｃｔ値は、試料中の核酸標的の量に反比例する。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡのＣｔ値を、外在性コントロールＲＮＡ等のコントロール又は標準物質と比較することができる。いくつかの実施形態では、外在性コントロール及び標的ＲＮＡのＣｔ値を適切な内在性コントロールに対して正規化する。内在性コントロールの非限定的な例は本明細書に述べられる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、それを下回る場合に膀胱癌が示される、標的ＲＮＡに対する閾値Ｃｔ（又は「カットオフＣｔ」）値が予め決定されている。かかる実施形態では、コントロール試料は試験試料と共にアッセイされなくてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書で述べたように、それを上回る場合に膀胱癌が示されるΔＣｔ閾値が予め決定されている。
【０１２４】
ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイに加えて、本明細書に提示される方法におけるＰＣＲ産物の検出及び定量に有用な他のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ化学物質として、限定されないが、以下に述べられる、分子ビーコン、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブ、及びＳＹＢＲグリーン、ＥｖａＧｒｅｅｎ、チアゾールオレンジ、ＹＯ−ＰＲＯ、ＴＯ−ＰＲＯ等のインターカレーター色素が挙げられる。
【０１２５】
様々な実施形態において、単一の多重反応において、本明細書に記載されるパネルの４つの膀胱癌マーカー、また任意に、少なくとも１つの内在性コントロール及び／又は少なくとも１つの外在性コントロールを検出するため、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出が利用される。様々な実施形態において、単一の多重反応において、本明細書に記載されるパネルの５つの膀胱癌マーカー、また任意に、少なくとも１つの内在性コントロール及び／又は少なくとも１つの外在性コントロールを検出するため、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出が利用される。いくつかの多岐にわたる実施形態では、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ等の異なるＲＮＡ標的に対して各々特異的な複数のプローブを使用する。いくつかの実施形態では、各標的ＲＮＡ特異的プローブは、同じ多重反応に使用される他のプローブとスペクトル的に識別可能である。７色の多重システムの非限定的な例は、例えば、Lee et al., BioTechniques, 27: 342-349に記載される。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ産物の定量は、ＳＹＢＲグリーン、ＥｖａＧｒｅｅｎ、チアゾールオレンジ、ＹＯ−ＰＲＯ、ＴＯ−ＰＲＯ等の２本鎖ＤＮＡ産物に結合する色素を使用して成される。いくつかの実施形態では、上記アッセイは、QiagenによるＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲアッセイである。このアッセイでは、全ＲＮＡを最初に試料から単離する。その後、全ＲＮＡを、３’末端でポリアデニル化し、５’末端にポリｄＴを有するユニバーサルプライマーを使用して逆転写する。いくつかの実施形態では、単一の逆転写反応が複数の標的ＲＮＡをアッセイするのに十分である。その後、標的ＲＮＡ特異的プライマー、及び５’末端にポリｄＴ配列を含むｍｉＳｃｒｉｐｔユニバーサルプライマーを使用してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行う。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ色素は２本鎖ＤＮＡに非特異的に結合し、励起により発光する。いくつかの実施形態では、ＰＣＲテンプレート（例えば、QiagenによるＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキットにおいて利用可能）へのプライマーの高特異的なアニーリングを促進する緩衝条件を使用し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎに結合して定量に悪影響を及ぼす、非特異的なＤＮＡ２本鎖及びプライマー二量体の形成を回避することができる。そのようにして、ＰＣＲ産物が蓄積するにつれて、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎからのシグナルは増加し、特異的産物の定量を可能とする。
【０１２７】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、当該技術分野で利用可能な任意のＲＴ−ＰＣＲ機器を使用して実施する。典型的には、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲデータ採取及び分析に使用される機器は、サーマルサイクラー、蛍光の励起及び発光の採取のための光学系、並びに任意に、コンピューター、並びにデータ取得及び分析のソフトウェアを備える。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法で使用される分析方法はＤＡＳＬ（商標）（cDNA-mediated Annealing, Selection, Extension, and Ligation）アッセイである。いくつかの実施形態では、全ＲＮＡを試料から単離して任意の方法によって分析する。その後、全ＲＮＡをポリアデニル化する（１８超のＡ残基を反応混合物中のＲＮＡの３’末端に付加する）。５’末端から３’末端にかけてＰＣＲプライマー部位、及び試料ＲＮＡのポリｄＡテイルに結合するポリｄＴ領域を含む配列を含むビオチン標識ＤＮＡプライマーを使用してＲＮＡを逆転写する。その後、得られたビオチン化ｃＤＮＡ転写産物をビオチン−ストレプトアビジン相互作用を介して固体の支持体にハイブリダイズし、１又は複数の標的ＲＮＡ特異的ポリヌクレオチドと接触させる。標的ＲＮＡ特異的ポリヌクレオチドは、５’末端から３’末端にかけて、ＰＣＲプライマー部位を含む領域、アドレス配列を含む領域、及び標的ＲＮＡ特異的配列を含む。
【０１２９】
いくつかのＤＡＳＬ（商標）の実施形態では、標的ＲＮＡ特異的配列は、膀胱癌マーカー標的ＲＮＡ、内在性コントロールＲＮＡ、又は外在性コントロールＲＮＡの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９の連続するヌクレオチドに同一か、又は相補的な配列を有する、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９の連続するヌクレオチドを含む。
【０１３０】
ハイブリダイゼーションの後、標的ＲＮＡ特異的ポリヌクレオチドを伸長し、その後、固定化ｃＤＮＡアレイから伸長生成物を溶離する。蛍光標識したユニバーサルプライマーを使用する第２のＰＣＲ反応は、標的ＲＮＡ特異的配列を含む蛍光標識ＤＮＡを作製する。その後、検出及び定量のため、標識したＰＣＲ産物をマイクロビーズアレイにハイブリダイズする。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法において少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルを検出及び定量するため使用される分析方法は、ビーズに基づくフローサイトメトリックアッセイである。その全体が引用することにより本明細書の一部をなす、Lu J. et al. (2005) Nature 435:834-838を参照されたい。ビーズに基づくフローサイトメトリックアッセイの例は、Luminex, Inc.のｘＭＡＰ（商標）技術である（http://www.luminexcorp.com/technology/index.htmlを参照されたい）。いくつかの実施形態では、全ＲＮＡを試料から単離した後、ビオチンで標識する。その後、各々異なる蛍光強度を有する２種の色素によって標識されているマイクロビーズに共有結合された標的ＲＮＡ特異的捕捉プローブ（例えば、www.luminexcorp.com/products/assays/index.htmlにおいてLuminex, Inc.により販売されるＦｌｅｘｍｉＲ（商標）製品）に標識ＲＮＡをハイブリダイズする。ストレプトアビジン結合レポーター分子（例えば、「ＳＡＰＥ」としても知られているストレプトアビジン−フィコエリトリン）を捕捉した標的ＲＮＡに付着し、フローサイトメトリーを使用して各ビーズ特有のシグナルを読み取る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料を最初にポリアデニル化し、その後、試料ＲＮＡのポリｄＡテイルの３’末端、及びビオチン化デンドリマーに付着したポリヌクレオチドの５’末端に相補的な架橋ポリヌクレオチドを使用して、ビオチン化３ＤＮＡ（商標）デンドリマー（すなわち、多数のビオチン分子が付着した複数アームのＤＮＡ）で標識する。その後、ストレプトアビジン結合レポーター分子を、フローサイトメトリーによる分析の前にビオチン化デンドリマーに付着する。いくつかの実施形態では、ビオチン標識ＲＮＡを最初にＳＡＰＥに曝露し、その後、ＲＮＡ／ＳＡＰＥ複合体を、９００ものビオチン分子に結合することができるＤＮＡデンドリマーに付着した抗フィコエリトリン抗体に曝露する。これは、複数のＳＡＰＥ分子がビオチン−ストレプトアビジン相互作用によりビオチン化デンドリマーに結合することを可能とし、それによって上記アッセイからのシグナルを増加する。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法における少なくとも１つの標的ＲＮＡのレベルを検出及び定量するため使用される分析方法は、ノーザンブロッティング等のゲル電気泳動及び標識プローブ（例えば、放射性標識又は化学発光標識で標識されたプローブ）を用いる検出による。いくつかの実施形態では、全ＲＮＡを試料から単離した後、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によってサイズ分離する。その後、分離したＲＮＡを、メンブレン上にブロットし、放射性標識した相補性プローブにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、プローブの例は、デオキシリボース又はリボースの糖に代えて二環式の糖部分を含有するロックド核酸（「ＬＮＡ」）類縁体等の以下に述べられる１又は複数の親和性増強ヌクレオチド類縁体を含有する。例えば、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす、Varallyay, E. et al. (2008) Nature Protocols 3(2):190-196を参照されたい。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、１又は複数の標的ＲＮＡの検出及び定量は、微小流体デバイス及び単一分子検出を使用して成される。いくつかの実施形態では、単離された全ＲＮＡ試料中の標的ＲＮＡは２つのプローブにハイブリダイズし、そのうちの１つは標的ＲＮＡの５’末端の核酸に相補的であり、２つ目は標的ＲＮＡの３’末端に相補的である。各プローブは、いくつかの実施形態では、ＬＮＡヌクレオチド類縁体等の１又は複数の親和性増強ヌクレオチド類縁体を含み、各々が異なる蛍光発光スペクトルを有する異なる蛍光色素（すなわち、検出可能に異なる色素）で標識される。その後、特有の同時光子破裂（coincident burst of photons）が特定の標的ＲＮＡを同定し、特定の特有の同時光子破裂の数が計数されて試料中の標的ＲＮＡの量を定量することができるように、上記試料を複数のレーザーが蛍光プローブを励起する微小流体キャピラリに流す。いくつかの代替的な実施形態では、標的ＲＮＡ特異的プローブは、例えば、フルオロフォア、電子スピン標識等から選択される３以上の異なる標識で標識された後、ＲＮＡ試料にハイブリダイズされてもよい。
【０１３４】
ハイブリダイゼーションの前に試料ＲＮＡを修飾してもよい。その後、標的ＲＮＡ／プローブの２本鎖を、３つの標識の特有のシグナルを記録する検出器を備える微小流体デバイスのチャネルに通す。この方法では、個々の分子をそれらの特有のシグナルによって検出し、計数する。各々がその全体が引用することにより本明細書の一部をなす、Fuchs et al., U.S. Genomics, Inc.に対する米国特許第７，４０２，４２２号及び同第７，３５１，５３８号を参照されたい。
【０１３５】
４．２．５．自動化及びシステムの例
いくつかの実施形態では、遺伝子発現は自動化された試料操作及び／又は分析のプラットフォームを使用して検出される。いくつかの実施形態では、市販の自動化分析プラットフォームを利用する。例えば、いくつかの実施形態では、ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）システム（カリフォルニア州サニーベールのCepheid）を利用する。
【０１３６】
ＧｅｎｅＸｐｅｒｔシステムを用いる使用について本発明を解説する。試料調製及び分析の方法の例を以下に記載する。しかしながら、本発明は特定の検出方法又は分析プラットフォームに限定されない。当業者は、いくつものプラットフォーム及び方法を利用することができることを認識する。
【０１３７】
ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）は自己内蔵型の使い捨てカートリッジを利用する。試料抽出、増幅、及び検出は全て、この内蔵型の「カートリッジ内検査室」において行われ得る（例えば、各々がその全体が引用することにより本明細書の一部をなす、米国特許第５，９５８，３４９号、同第６，４０３，０３７号、同第６，４４０，７２５号、同第６，７８３，７３６号、同第６，８１８，１８５号を参照されたい）。
【０１３８】
上記カートリッジの部材として、限定されないが、試薬を含む加工チャンバー、フィルター、並びに標的核酸の抽出、精製及び増幅に有用な捕捉技術を備える。バルブはチャンバーからチャンバーへの流体の移動を可能とし、核酸溶解部材及び濾過部材を備える。光学窓はリアルタイムの光学検出を可能とする。反応チューブは非常に迅速な熱サイクルを可能とする。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、ＧｅｎＸｐｅｒｔ（商標）システムは、拡張可能性に対する複数のモジュールを備える。各モジュールは、試料操作部材及び分析部材と共に、複数のカートリッジを備える。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）試料調製方法は、尿から細胞を捕捉し、濃縮するため濾過を利用する。いくつかの実施形態では、０．８μｍのフィルター孔サイズを利用する。このサイズは、尿中の全ての細胞の捕捉を容易にする。他の実施形態では、０．５μｍ〜１０μｍ、０．５μｍ〜５μｍ、０．８μｍ〜１０μｍ、０．８μｍ〜５μｍ、０．８μｍ〜２μｍ、２μｍ〜５μｍ、２μｍ〜１０μｍ、２μｍ〜８μｍ、５μｍ〜８μｍ、又は５μｍ〜１０μｍの孔サイズを利用する。いくつかのフィルター（５μｍ、８μｍ、及び１０μｍ等）は、アッセイの標的細胞であるより大きな尿路上皮細胞を捕捉しながら、試料から大半の赤血球及び白血球の除去を可能とする。いくつかの実施形態では、この試料調製方法は、感染又は炎症により存在し得る白血球を除去することによりアッセイの特異性を改善する。いくつかの例では、全尿の遠心分離の後の尿ペレットからのＲＮＡ単離等の試料調製方法は、白血球の除去を可能としない。いくつかの実施形態では、フィルターによる細胞捕捉の効率は遠心分離と比べて高く、より一貫性のある結果を提供し得る。
【０１４１】
上記尿から細胞をフィルター上に捕捉した後、いくつかの実施形態では、細胞を洗浄し、その後、超音波処理（２秒〜１５秒、３６ｋＨｚで８μｍ〜１６μｍ）を使用して溶解する。その後、細胞溶解物を採取し、それを使用して、凍結乾燥粒子としてカートリッジに存在するＲＴ−ＰＣＲ試薬を再構成する。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、膀胱癌マーカーを増幅し膀胱癌マーカーの存在又は発現レベルを分析する。いくつかの実施形態では、逆転写はＭＭＬＶ  ＲＴ酵素、及び４０℃〜５０℃で５分〜２０分のインキュベーションを使用する。いくつかの実施形態では、ＰＣＲは、ＡｐｔａＴａｑ（Roche）等のホットスタート機能を有するＴａｑポリメラーゼを使用する。いくつかの実施形態では、初期変性は９０℃〜１００℃で２分〜５分であり、サイクル変性温度は９０℃〜１００℃で１秒〜１０秒であり、サイクルアニール温度は６０℃〜７０℃で１０秒〜３０秒であり、またサイクル伸長温度は６０℃〜７５℃で１０秒〜４０秒であり、最大５０サイクルを行う。
【０１４３】
本発明は、特定のプライマー及び／又はプローブの配列に限定されない。増幅プライマー及び検出プローブの例は実施例に記載される。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、オフライン（off-line）遠心分離を使用して細胞含有量の低い試料によるアッセイ結果を改善する。防腐剤が添加された又は添加されていない試料を遠心分離に供し、上清を除去する。その後、ペレットをより小容量の上清又は防腐剤のいずれかに再懸濁する。その後、再懸濁したペレットを先に記載されるＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）カートリッジに添加する。
【０１４５】
４．２．６．データ分析の例
いくつかの実施形態では、ＡＲ及び／又はＵＰＫ１ＢのｍＲＮＡ、また任意に、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡの少なくとも１つ等の標的ＲＮＡのレベルは、内在性コントロールＲＮＡに対して正規化される。正規化は、例えば、内在性コントロールＲＮＡのレベルに対する標的ＲＮＡのレベルの差の決定を含んでもよい。いくつかのかかる実施形態では、ＲＮＡのレベルは定量的ＰＣＲから得られるＣｔ値によって表される。いくつかのかかる実施形態では、上記差はΔＣｔとして表される。ΔＣｔは、Ｃｔ［標的ＲＮＡ］−Ｃｔ［内在性コントロール］又はＣｔ［内在性コントロール］−Ｃｔ［標的ＲＮＡ］として算出され得る。いくつかの実施形態では、ΔＣｔ＝Ｃｔ［内在性コントロール］−Ｃｔ［マーカー］である。いくつかの実施形態では、閾値ΔＣｔ値を、膀胱癌が示される値を上回って又は下回って設定する。いくつかのかかる実施形態では、ΔＣｔ閾値を９５％の正常試料が正しく特性評価される値を下回るΔＣｔ値として設定する。いくつかのかかる実施形態では、閾値ΔＣｔ値よりも高いΔＣｔ値は膀胱癌の指標である。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、例えば、２以上のマーカーを単一の複合スコアに統合するため、線形判別分析（ＬＤＡ）を使用する。いくつかのかかる実施形態では、ＬＤＡに含まれるマーカーに対して単一の閾値を使用する。いくつかの実施形態では、各マーカーのＣｔ又はΔＣｔをＬＤＡ方程式において重み付けする。いくつかの実施形態では、上記方程式において少なくとも２つのマーカーに異なる重み係数が与えられる。いくつかの実施形態では、上記方程式において各マーカーに異なる重み係数が与えられる。いくつかの実施形態では、ＬＤＡ方程式が例えば、試料データセットに対してＲＯＣ曲線に沿った、選択された感受性及び／又は特異性をもたらすように重み係数を決定する。いくつかの実施形態では、標準化されたＬＤＡ方程式を使用する。いくつかのかかる実施形態では、線形判別分析を使用することにより、誤分類（偽陰性及び偽陽性等）を減少する及び／又は最小化する。標準化されたＬＤＡ方程式の非限定的な例は以下の形式を有してもよい。
ＬＤＡ＝β０＋β１ｘ１＋β２ｘ２＋β３ｘ３＋β４ｘ４＋β５ｘ５
（式中、ｘ１＝（内在性コントロールＣｔ−ｐ）／Ｐ、ｘ２＝（マーカー１ΔＣｔ−ｑ）／Ｑ、ｘ３＝（マーカー２ΔＣｔ−ｒ）／Ｒ、ｘ４＝（マーカー３ΔＣｔ−ｓ）／Ｓ、ｘ５＝（マーカー４ΔＣｔ−ｔ）／Ｔ
（式中、ΔＣｔ＝内在性コントロールＣｔ−マーカーＣｔ）、式中、β１、β２、β３、β４、及びβ１は重み係数であり、β０は切片であり、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、及びｔはそれぞれ、試料データセットに由来する内在性コントロール、マーカー１、マーカー２、マーカー３、及びマーカー４に対する平均Ｃｔ又はΔＣｔ値であり、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、及びＴはそれぞれ、試料データセットに由来する内在性コントロール、マーカー１、マーカー２、マーカー３、及びマーカー４に対するＣｔ又はΔＣｔの標準偏差である）。いくつかの実施形態では、β２は回帰により条件的にβ１等を構成する。いくつかの実施形態では、ＬＤＡがそのカットオフ未満又はそれに等しい場合に試料を陽性とするようにＬＤＡカットオフを設定する。いくつかの実施形態では、ＬＤＡがそのカットオフ未満である場合に試料を陽性とするようにＬＤＡカットオフを設定する。いくつかの実施形態では、ＬＤＡがそのカットオフよりも大きいか、又はそれに等しい場合に試料を陽性とするようにＬＤＡカットを設定する。いくつかの実施形態では、ＬＤＡがそのカットオフよりも大きい場合に試料を陽性とするようにＬＤＡカットオフを設定する。
【０１４７】
ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＣＲＨ、及びＩＧＦ２の４つのマーカーの組合せに対するＬＤＡ方程式の非限定的な例は以下の通りである。
ＬＤＡ＝−２．９４＋１．６０×ｘ１−１．０５×ｘ２−０．３８×ｘ３−０．７１×ｘ４−１．７４×ｘ５
（式中、ｘ１＝（ＡＢＬ  Ｃｔ−３１．７）／２．６、ｘ２＝（ＡＮＸＡ１０  ΔＣｔ−（−７．８））／５．２、ｘ３＝（ＫＲＴ２０  ΔＣｔ−（−３．２））／４．６、ｘ４＝（ＣＲＨ  ΔＣｔ−（−９．４））／５．３、及びｘ５＝（ＩＧＦ２  ΔＣｔ−（−６．２））／６．３）。上記方程式について、いくつかの実施形態では、ＬＤＡが−２以下の場合に試料を陽性と分類する。このカットオフを用いて、いくつかの実施形態では、９０％〜９５％の対応する特異性が７４％〜８５％の感受性をもたらす。
【０１４８】
ＵＰＫ１Ｂ、ＡＮＸＡ１０、ＣＲＨ、及びＩＧＦ２の４つのマーカーの組み合せに対するＬＤＡ方程式の非限定的な例は以下の通りである。
ＬＤＡ＝−２．３９＋６．７９×ｘ１−３．３１×ｘ２−１．８７×ｘ３−３．９０×ｘ４−４．６５×ｘ５
（式中、ｘ１＝（ＡＢＬ  Ｃｔ−３１．７）／２．６、ｘ２＝（ＡＮＸＡ１０  ΔＣｔ−（−９．１４））／４．９、ｘ３＝（ＵＰＫ１Ｂ  ΔＣｔ−（−１０．１））／４．６、ｘ４＝（ＣＲＨ  ΔＣｔ−（−１０．１））／４．７、及びｘ５＝（ＩＧＦ２  ΔＣｔ−（−８．２））／６．０）。上記方程式について、いくつかの実施形態では、ＬＤＡが＋２以下の場合に試料を陽性と分類する。このカットオフを用いて、いくつかの実施形態では、９０％〜９５％の対応する特異性が８９％と高い感受性をもたらす。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、コンピューターに基づく分析プログラムを使用して、臨床医に対して、検出アッセイによって作成された生データ（例えば、本明細書に記載される膀胱癌マーカーの発現レベル）を予測値のデータへと置き換える。臨床医は、任意の好適な手段を使用して予測値にアクセスすることができる。そのため、いくつかの実施形態では、本発明は、おそらく遺伝学又は分子生物学に長けていない臨床医が生データを理解する必要がない更なる利益を提供する。上記データは、その最も有用な形式で臨床医に直接提示される。その後、臨床医は被験体の治療を最適化するため上記情報をすぐに利用することができる。
【０１５０】
本発明は、上記アッセイを行っている検査室、情報の供給元、医療従事者、及び被験体へとまたそこから情報を受け取る、加工する、及び送ることができる任意の方法を検討する。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、試料（例えば、生検又は血清又は尿試料）を被験体から取得して、世界中のどこか（例えば、被験体が居住する国とは異なる国の、又はその情報が最終的に使用される所）のプロファイリングサービス（例えば、医療施設の臨床検査室、ゲノムプロファイリング企業等）に提出して生データを作成する。上記試料が組織又は他の生体試料を含む場合、被験体が医療センターを訪れて得られた試料を取得し、プロファイリングセンターへと送ってもよく、又は被験体が彼ら自身の試料（例えば、尿試料）を採取してそれを直接プロファイリングセンターへと送ってもよい。上記試料が以前に特定された生物学的情報を含む場合、被験体によってその情報を直接プロファリングサービスへと送ってもよい（例えば、上記情報を含むインフォメーションカードをコンピューターによってスキャンし、電子通信システムを使用してそのデータをプロファイリングセンターのコンピューターへと送ってもよい）。プロファイリングサービスによって受け取られると、上記試料を加工し、被験体に望ましい診断又は予後の情報について詳細なプロファイル（すなわち、発現データ）を作成する。
【０１５１】
その後、プロファイルデータを治療している臨床医による解釈に適したフォーマットに用意する。例えば、生の発現データを提供するよりも、用意されたフォーマットは、特定の治療の選択肢の推奨と共に、被験体に対して診断又はリスク評価（例えば、本明細書に記載される膀胱癌マーカーの発現レベル、又は膀胱癌の診断）を表す場合がある。上記データは、任意の好適な方法によって臨床医に表示されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、上記プロファイリングサービスは、（例えば、治療時において）臨床医に対して印刷され得る、又は臨床医に対してコンピューターのモニター上に表示され得る報告書を作成する。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、上記情報を看護拠点又は地域の施設において最初に分析する。その後、生データを更なる分析のため及び／又は生データを臨床医若しくは患者に有用な情報へと変換するため中央処理施設へと送る。中央処理施設は、データ分析のプライバシー（全てのデータを均一なセキュリティプロトコルにより中央施設に保存する）、スピード、及び均一性の利点を提供する。その後、中央処理施設はその被験体の治療をフォローするデータの結末を管理する。例えば、電子通信システムを使用して、中央処理施設は臨床医、被験体、又は研究者にデータを提供することができる。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、被験体は電子通信システムを使用して上記データに直接アクセスすることができる。被験体は、その結果に基づいて更なる介入又はカウンセリングを選択してもよい。いくつかの実施形態では、上記データを研究用途に使用する。例えば、疾患の特定の状態若しくはステージの有用な指標として、又は治療方針計画を決定するための診断の手引きとしてマーカーの組み入れ又は除外を更に最適化するため上記データを使用してもよい。
【０１５４】
４．２．７．ポリヌクレオチドの例
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、合成ポリヌクレオチドが提供される。本明細書で使用される合成ポリヌクレオチドは、化学的又は酵素的のいずれかでｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されたポリヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドの化学合成として、限定されないが、ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ（GE Healthcare）、ＡＢＩ  ３９００  ＤＮＡ合成装置（Applied Biosystems）等のポリヌクレオチド合成装置を使用する合成が挙げられる。酵素的合成として、限定されないが、酵素的増幅、例えばＰＣＲによってポリヌクレオチドを産生することが挙げられる。ポリヌクレオチドは、本明細書に述べられる１又は複数のヌクレオチド類縁体（すなわち、修飾ヌクレオチド）を含んでもよい。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡから選択される配列の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、又は少なくとも３０の連続するヌクレオチドに同一か、又は相補的な領域を含むポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０のｍＲＮＡ、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択される配列の６〜１００、８〜１００、８〜７５、８〜５０、８〜４０、又は８〜３０の長さ（span）の連続するヌクレオチドに同一か、又は相補的な領域を含むポリヌクレオチドが提供される。ポリヌクレオチドの非限定的な例を表１及び表６に示す。
【０１５６】
様々な実施形態において、ポリヌクレオチドは、５００より少ない、３００より少ない、２００より少ない、１５０より少ない、１００より少ない、７５より少ない、５０より少ない、４０より少ない、又は３０より少ないヌクレオチドを含む。様々な実施形態において、ポリヌクレオチドは６〜２００、８〜２００、８〜１５０、８〜１００、８〜７５、８〜５０、８〜４０、又は８〜３０のヌクレオチド長である。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはプライマーである。いくつかの実施形態では、プライマーは検出可能な部分で標識される。いくつかの実施形態では、プライマーは標識されない。本明細書で使用されるプライマーは、標的ＲＮＡ若しくはその標的ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、又は標的ＲＮＡ若しくはｃＤＮＡから増幅されたアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド（総括して「テンプレート」と呼ぶ）であり、テンプレート、ポリメラーゼ、並びに好適なバッファー及び試薬の存在下で伸長されてプライマー伸長産物を形成することができる。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはプローブである。いくつかの実施形態では、プローブは検出可能な部分で標識される。本明細書で使用される検出可能な部分として、蛍光色素等の直接的に検出可能な部分と、結合対のメンバー等の間接的に検出可能な部分の両方が挙げられる。検出可能な部分が結合対のメンバーである場合、いくつかの実施形態では、上記プローブは、そのプローブと結合対の第２のメンバーに結合した検出可能な標識とをインキュベートすることにより検出可能である。いくつかの実施形態では、プローブは、例えばプローブが、例えばマイクロアレイ又はビーズ上の捕捉プローブである場合は標識されない。いくつかの実施形態では、プローブは、例えばポリメラーゼによって伸長可能ではない。他の実施形態では、プローブは伸長可能である。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、蛍光色素（ドナー）で５’末端が標識され、またその基が近接する（すなわち、同じプローブに付着する）場合に色素からの蛍光発光を吸収（すなわち、抑制）する化学基であるクエンチャー（アクセプター）で３’末端が標識されているＦＲＥＴプローブである。他の実施形態では色素及びクエンチャーはＦＲＥＴプローブの末端にない。そのため、いくつかの実施形態では、色素の発光スペクトルは、クエンチャーの吸収スペクトルとかなり重複するはずである。
【０１６０】
４．２．７．１．ポリヌクレオチド修飾の例
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される少なくとも１つの標的ＲＮＡを検出する方法は、１又は複数の親和性増強ヌクレオチド類縁体を含むポリヌクレオチド等の１又は複数の修飾されたポリヌクレオチドを採用する。本明細書に記載される方法において有用な修飾ポリヌクレオチドとして、逆転写用プライマー、ＰＣＲ増幅プライマー、及びプローブが挙げられる。いくつかの実施形態では、親和性増強ヌクレオチドの組込みは、デオキシリボヌクレオチドのみを含有するポリヌクレオチドと比較してその標的核酸に対するポリヌクレオチドの結合の親和性及び特異性を増加し、より短いポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドと標的核酸との間の相補性のより短い領域の使用を可能とする。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、親和性増強ヌクレオチド類縁体としては、１又は複数の塩基修飾、糖修飾及び／又は骨格修飾を含むヌクレオチドが挙げられる。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、親和性増強ヌクレオチド類縁体に使用される修飾塩基としては、５−メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、２−クロロ−６−アミノプリン、キサンチン及びヒポキサンチンが挙げられる。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、親和性増強ヌクレオチド類縁体としては、２’置換糖、例えば、２’−Ｏ−アルキルリボース糖、２’−アミノ−デオキシリボース糖、２’−フルオロ−デオキシリボース糖、２’−フルオロ−アラビノース糖、及び２’−Ｏ−メトキシエチルリボース（２’ＭＯＥ）糖等の修飾糖を有するヌクレオチドが挙げられる。いくつかの実施形態では、修飾糖は、アラビノース糖、又はｄ−アラビノヘキシトール糖である。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、親和性増強ヌクレオチド類縁体は、骨格修飾、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ；例えばアミノ酸骨格により互いに連結された核酸塩基を含むオリゴマー）の使用を含む。他の骨格修飾としては、ホスホロチオエート結合、ホスホジエステル修飾核酸、ホスホジエステルとホスホロチオエート核酸との組合せ、メチルホスホネート、アルキルホスホネート、ホスフェートエステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、カルバメート、カーボネート、ホスフェートトリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ｐ−エトキシ、並びにそれらの組合せが挙げられる。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、修飾塩基を有する少なくとも１つの親和性増強ヌクレオチド類縁体、修飾糖を有する少なくとも１つのヌクレオチド（同じヌクレオチドであってもよい）、及び／又は少なくとも１つの非天然のヌクレオチド間結合を含む。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、親和性増強ヌクレオチド類縁体は、二環式の糖であるロックド核酸（「ＬＮＡ」）糖を含有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法における使用のためのポリヌクレオチドは、ＬＮＡ糖を有する１又は複数のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＬＮＡ糖を有するヌクレオチドからなる１又は複数の領域を含有する。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドが点在するＬＮＡ糖を有するヌクレオチドを含有する。例えば、Frieden, M. et al. (2008) Curr. Pharm. Des. 14(11):1138-1142を参照されたい。
【０１６７】
４．２．７．２．プライマーの例
いくつかの実施形態では、プライマーが提供される。いくつかの実施形態では、プライマーは、ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡから選択される配列の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、又は少なくとも３０の連続するヌクレオチドに同一か、又は相補的である。いくつかの実施形態では、ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡから選択される配列の６〜１００、８〜１００、８〜７５、８〜５０、８〜４０、又は８〜３０の連続するヌクレオチドの長さに同一又はそれに相補的な領域を含むプライマーが提供される。プライマーの非限定的な例を表１及び表６に示す。また、いくつかの実施形態では、プライマーは標的ＲＮＡと同一ではない又はそれに相補的ではない部分又は領域を含んでもよい。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡに対して同一ではない又はそれに相補的ではないプライマーの任意の領域が同一又は相補的な領域を妨げないように、標的ＲＮＡと同一又はそれに相補的なプライマーの領域は連続的である。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、プライマーは、標的ＲＮＡに全く同じように存在する部分を含む。いくつかのかかる実施形態では、標的ＲＮＡ中に全く同じように存在する領域を含むプライマーは、ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、又は標的ＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの増幅によって産生されたアンプリコンに選択的にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、上記プライマーは、使用される特定のアッセイの条件下でｃＤＮＡ又はアンプリコンに選択的にハイブリダイズするように、ｃＤＮＡ又はアンプリコンの十分な部分に相補的である。
【０１６９】
本明細書で使用される「選択的にハイブリダイズする」は、プライマー又はプローブ等のポリヌクレオチドが、ハイブリダイズする領域に異なるヌクレオチド配列を有する同じ試料に存在する別の核酸にハイブリダイズするよりも少なくとも５倍大きな親和性で試料中の特定の核酸にハイブリダイズすることを意味する。ハイブリダイゼーション条件の例、例えば、逆転写反応又はＰＣＲ増幅反応に関しては、本明細書で述べられる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはハイブリダイズする領域に異なるヌクレオチド配列を有する同じ試料に存在する別の核酸にハイブリダイズするよりも少なくとも１０倍大きな親和性で試料中の特定の核酸にハイブリダイズする。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本明細書で述べられるように、例えば、標的ＲＮＡを逆転写するためプライマーを使用する。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡ又はそれから逆転写されたｃＤＮＡを増幅するためプライマーを使用する。かかる増幅は、いくつかの実施形態では、本明細書で述べられるように、例えば定量的ＰＣＲである。いくつかの実施形態では、プライマーは検出可能な部分を含む。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、プライマー対が提供される。かかるプライマー対は、ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、若しくはＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡ、又は内在性コントロールＲＮＡ、若しくは外在性コントロールＲＮＡ等の標的ｍＲＮＡの部分を増幅するように設計される。いくつかの実施形態では、プライマー対は、５０〜１５００ヌクレオチド長、５０〜１０００ヌクレオチド長、５０〜７５０ヌクレオチド長、５０〜５００ヌクレオチド長、５０〜４００ヌクレオチド長、５０〜３００ヌクレオチド長、５０〜２００ヌクレオチド長、５０〜１５０ヌクレオチド長、又は５０〜１００ヌクレオチド長のアンプリコンを産生するように設計される。プライマー対の非限定的な例を表１及び表６に示す。いくつかの実施形態では、イントロンを含まずにｍＲＮＡがゲノム配列よりも好ましく増幅されるように、ゲノム配列中のイントロンに及ぶプライマー対を設計する。「イントロンに及ぶ」は、上記プライマー対の一方のプライマーがゲノム配列中のイントロンに対して少なくとも部分的に５’に位置するｍＲＮＡ又はそのｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ中の配列に相補的であり、上記プライマー対の一方がゲノム配列中の同じイントロンに対して少なくとも部分的に３’に位置するｍＲＮＡ又はそのｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ中の配列に相補的であることを意味する。いくつかの実施形態では、上記プライマー対の一方のプライマーがゲノム配列中のイントロンに対して５’に位置するｍＲＮＡ又はそのｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ中の配列に相補的であり、上記プライマー対の一方のプライマーがゲノム配列中の同じイントロンに対して３’に位置するｍＲＮＡ又はそのｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ中の配列に相補的である。いくつかの実施形態では、上記プライマー対の一方のプライマーが、連続する相補配列がゲノム配列中に見出されないようにイントロンが除去された場合に共にスプライスされるｍＲＮＡ又はそのｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ中の配列に対して相補的であってもよい。かかるプライマーを含むプライマー対は、なおもイントロンに及ぶと考えらえる。
【０１７２】
４．２．７．３．プローブの例
様々な実施形態において、膀胱癌の存在を検出する方法は、試料の核酸とプローブとをハイブリダイズすることを含む。いくつかの実施形態では、上記プローブは、ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、又はＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡ等の標的ＲＮＡに相補的な部分を含む。いくつかの実施形態では、上記プローブは、標的ＲＮＡに全く同じように存在する部分を含む。いくつかのかかる実施形態では、標的ＲＮＡに相補的なプローブは、使用される特定のアッセイの条件下で標的ＲＮＡに選択的にハイブリダイズするように、標的ＲＮＡの十分な部分に相補的である。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡに相補的なプローブは、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、又はＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡ等の標的ＲＮＡの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、又は少なくとも３０の連続するヌクレオチドに対して相補的な領域を含む。プローブの非限定的な例を表１及び表６に示す。また、標的ＲＮＡに相補的なプローブは、標的ＲＮＡに相補的でない部分又は領域を含んでもよい。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡに相補的でないプローブの任意の領域が相補的な領域を妨げないように、標的ＲＮＡに相補的なプローブの領域は連続的である。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、上記プローブは、ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、又はＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡ等の標的ＲＮＡに全く同じように存在する部分を含む。かかる実施形態では、標的ＲＮＡに全く同じように存在する領域を含むプローブは、そのＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、又は標的ＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの増幅により産生されたアンプリコンに選択的にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、上記プローブは、使用される特定のアッセイの条件下でｃＤＮＡ又はアンプリコンに選択的にハイブリダイズするように、ｃＤＮＡ又はアンプリコンの十分な部分に相補的である。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ又はアンプリコンに相補的なプローブは、ｃＤＮＡ又はアンプリコンの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、又は少なくとも３０の連続するヌクレオチドに相補的な領域を含む。また、ｃＤＮＡ又はアンプリコンに相補的なプローブは、ｃＤＮＡ又はアンプリコンに相補的でない部分又は領域を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ又はアンプリコンに相補的でないプローブの任意の領域が相補的な領域を妨げないように、ｃＤＮＡ又はアンプリコンに相補的なプローブの領域は連続的である。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、１又は複数の標的ＲＮＡを検出可能に定量する方法は、（ａ）標的ＲＮＡを逆転写して標的ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを産生すること、（ｂ）（ａ）からのｃＤＮＡを増幅すること、及び（ｃ）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ及び検出プローブを使用して標的ＲＮＡの量を検出すること（増幅工程（ｂ）と同時であってもよい）を含む。
【０１７５】
上述のように、いくつかの実施形態では、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出は、限定されないが、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、分子ビーコンプローブ、及びＳｃｏｒｐｉｏｎプローブを含むＦＲＥＴプローブを使用して行われてもよい。いくつかの実施形態では、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出及び定量は、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、すなわち、典型的にはＤＮＡの一方の末端に共有結合した蛍光色素とＤＮＡの他方の末端等の他の場所に共有結合したクエンチャー分子とを有する線状プローブを用いて行われる。ＦＲＥＴプローブは、ＦＲＥＴプローブがｃＤＮＡにハイブリダイズされる場合に色素蛍光が消光され、ＦＲＥＴプローブがｃＤＮＡの増幅の間に消化される場合に色素がＦＲＥＴプローブから遊離して蛍光シグナルを生じるように、ｃＤＮＡの領域に相補的な配列を含む。かかる実施形態では、試料中の標的ＲＮＡの量は、ｃＤＮＡ増幅中に測定される蛍光の量に比例する。
【０１７６】
ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、上記プローブが特異的にハイブリダイズしてＰＣＲアンプリコンを生じるように、典型的には、標的ＲＮＡの領域、又は標的ＲＮＡテンプレートから逆転写されたその相補的なｃＤＮＡ（すなわち、プローブ領域の配列は、検出される標的ＲＮＡに相補的であるか、又はそこに全く同じように存在する）に相補的な配列を有する連続するヌクレオチドの領域を含む。いくつかの実施形態では、上記プローブは、検出される標的ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡの領域に相補的であるか、又はそこに全く同じように存在する配列を有する、例えば、少なくとも８個の連続するヌクレオチド、少なくとも１０個の連続するヌクレオチド、少なくとも１２個の連続するヌクレオチド、少なくとも１４個の連続するヌクレオチド、又は少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含む、標的ＲＮＡテンプレートから逆転写されたｃＤＮＡの領域に完全に相補的であるか、又はそこに全く同じように存在する配列を有する少なくとも６個の連続するヌクレオチドの領域を含む。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ配列に相補的な配列を有するｃＤＮＡの領域は、ｃＤＮＡ分子の中心にあるか、又はその付近にある。いくつかの実施形態では、相補性の領域の５’末端及び３’末端において少なくとも２個のヌクレオチド、例えば少なくとも３個のヌクレオチド、例えば少なくとも４個のヌクレオチド、例えば少なくとも５個のヌクレオチドのｃＤＮＡが独立して存在する。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、分子ビーコンを使用してＰＣＲ産物を検出及び定量することができる。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブと同様に、分子ビーコンは、そのプローブの末端に付着した蛍光色素及びクエンチャーを有するプローブを介してＰＣＲ産物を検出及び定量するためＦＲＥＴを使用する。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブと異なり、分子ビーコンはＰＣＲサイクルの間無傷のままである。分子ビーコンプローブは、溶液中で遊離している場合にステムループ構造を形成し、それにより、色素とクエンチャーとが蛍光消光を生じるのに十分近接することを可能とする。分子ビーコンが標的にハイブリダイズする場合、色素とクエンチャーとが空間的に分離されて色素が蛍光発光するように、ステムループ構造を消滅する。分子ビーコンは、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｌｉｎｋ（商標）（http://www.genelink.com/newsite/products/mbintro.aspを参照されたい）から入手可能である。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブを配列特異的プライマー、またＰＣＲ産物の検出及び定量用の両方として使用することができる。分子ビーコンのように、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブは標的核酸にハイブリダイズしていない場合にステムループ構造を形成する。しかしながら、分子ビーコンと異なり、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブは、配列特異的プライミング及びＰＣＲ産物検出の両方を達成する。蛍光色素分子をＳｃｏｒｐｉｏｎプローブの５’末端に付着させ、クエンチャーを他の場所、例えば３’末端に付着する。上記プローブの３’部分はＰＣＲプライマーの伸長産物に相補的であり、この相補的部分は非増幅部分によって上記プローブの５’末端に連結される。Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーが伸長された後、上記プローブの標的特異的配列は、伸長されたアンプリコン内のその相補鎖に結合し、それによってステムループ構造を開いて５’末端の色素が蛍光発光してシグナルを発生することを可能とする。Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブは、例えば、Premier Biosoft Internationalから入手可能である（http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/Scorpion.htmlを参照されたい）。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴプローブに対して使用することができる標識として、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素等の比色分析及び蛍光の色素、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ等のＢＯＤＩＰＹ色素；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ；クマリン、並びに７−アミノ−４−メチルクマリン、アミノクマリン、及びヒドロキシクマリン等のその誘導体；Ｃｙ３及びＣｙ５等のシアニン色素；エオシン及びエリスロシン；フルオレセイン、及びフルオロセインイソチオシアネート等のその誘導体；Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｙｅ（商標）等のランタニドイオンの大環状キレート；Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ；Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ；ローダミンレッド、テトラメチルローダミン、及びローダミン６Ｇ等のローダミン色素；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ；チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロ二量体等の蛍光エネルギー移動色素；並びにＴＯＴＡＢが挙げられる。
【０１８１】
色素の具体例としては、上記及び下記に特定されるもの：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０；アミン反応性ＢＯＤＩＰＹ色素、例えば、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６５５、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、及びＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ；Ｃｙ３、Ｃｙ５、６−ＦＡＭ、フルオレセインイソチオシアネート、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、Ｒｅｎｏｇｒａｐｈｉｎ、ＲＯＸ、ＳＹＰＲＯ、ＴＡＭＲＡ、２’、４’，５’，７’−テトラブロモスルホンフルオレセイン、及びＴＥＴが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８２】
色素／クエンチャーの対（すなわち、ドナー／アクセプターの対）の例としては、フルオレセイン／テトラメチルローダミン；ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン；ＥＤＡＮＳ／ダブシル；フルオレセイン／フルオレセイン；ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ；フルオレセイン／ＱＳＹ  ７又はＱＳＹ  ９色素が挙げられるが、これらに限定されない。ドナーとアクセプターとが同じ場合、いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴは蛍光偏光解消により検出することができる。色素／クエンチャーの対（すなわち、ドナー／アクセプターの対）のいくつかの具体例としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０／ＱＳＹ  ３５；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０／ダブシル；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８／ＱＳＹ  ３５；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８／ダブシル；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８／ＱＳＹ  ７又はＱＳＹ  ９；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５／ＱＳＹ  ７又はＱＳＹ  ９；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８／ＱＳＹ  ７又はＱＳＹ  ９；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８／ＱＳＹ  ２１；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４／ＱＳＹ  ２１；及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７／ＱＳＹ  ２１が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合では、同じクエンチャー、例えば高スペクトルクエンチャー、例えばＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（商標）クエンチャー（アイオワ州コーラルヴィルのIntegrated DNA Technologies）又はＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）（ＢＨＱ（商標）；ミズーリ州セントルイスのSigma-Aldrich）を複数の色素に用いてもよい。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、例えば、２以上の部分（アンプリコン等）が同時に検出される多重反応において、各プローブは、同じ反応において同時に検出される場合に色素が識別され得るように検出可能に異なる色素を含む。当業者は多重反応における使用のため一組の検出可能に異なる色素を選択することができる。
【０１８４】
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において使用されるＲＴ−ＰＣＲプローブの調製に有用な蛍光標識リボヌクレオチドの具体例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Invitrogen）から入手することができ、これらとしては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−５−ＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−１４−ＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６−１４−ＵＴＰ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−５−ＵＴＰ、及びＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−１４−ＵＴＰが挙げられる。Ｃｙ３−ＵＴＰ及びＣｙ５−ＵＴＰ等の他の蛍光リボヌクレオチドは、Amersham Biosciences（GE Healthcare）から入手可能である。
【０１８５】
本明細書に記載される方法に使用されるＲＴ−ＰＣＲプローブの調製に有用な蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの例としては、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）−１’−ｄＵＴＰ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ−７−ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−５−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８−５−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ−１４−ｄＵＴＰ、ローダミングリーン−５−ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２−５−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−１４−ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６−１４−ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８−５−ｄＵＴＰ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−１２−ｄＵＴＰ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−５−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−１４−ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４−５−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０−１４−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５−１４−ｄＵＴＰ；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−７−ＯＢＥＡ−ｄＣＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６−１６−ＯＢＥＡ−ｄＣＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４−７−ＯＢＥＡ−ｄＣＴＰ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７−１２−ＯＢＥＡ−ｄＣＴＰが挙げられる。蛍光標識ヌクレオチドは市販されており、例えば、Invitrogenから購入することができる。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドを介して、色素とクエンチャー等の他の部分とが本明細書に記載される方法で使用されるポリヌクレオチド、例えばＦＲＥＴプローブ中に導入される。「修飾ヌクレオチド」は、化学的に修飾されたが、なおもヌクレオチドとしての機能を有するヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、共有結合的に付着した色素又はクエンチャー等の化学部分を有し、例えば、ポリヌクレオチドの固相合成によりポリヌクレオチド中へと導入され得る。他の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、核酸への修飾ヌクレオチドの組み込みの前、その間、又はその後に色素又はクエンチャーと反応し得る１又は複数の反応性基を含む。具体的な実施形態では、修飾ヌクレオチドはアミン修飾ヌクレオチド、すなわち、反応性のアミン基を有するように修飾されたヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ウリジン、アデノシン、グアノシン、及び／又はシトシン等の修飾塩基性部分を含む。具体的な実施形態では、アミン修飾ヌクレオチドは、５−（３−アミノアリル）−ＵＴＰ；８−［（４−アミノ）ブチル］−アミノ−ＡＴＰ及び８−［（６−アミノ）ブチル］−アミノ−ＡＴＰ；Ｎ６−（４−アミノ）ブチル−ＡＴＰ、Ｎ６−（６−アミノ）ブチル−ＡＴＰ、Ｎ４−［２，２−オキシ−ビス−（エチルアミン）］−ＣＴＰ；Ｎ６−（６−アミノ）へキシル−ＡＴＰ；８−［（６−アミノ）へキシル］−アミノ−ＡＴＰ；５−プロパギルアミノ−ＣＴＰ、５−プロパギルアミノ−ＵＴＰから選択される。いくつかの実施形態では、種々の核酸塩基部分を有するヌクレオチド、例えば、５−（３−アミノアリル）−ＵＴＰに代えて５−（３−アミノアリル）−ＧＴＰが同様に修飾される。多くのアミン修飾ヌクレオチドが、例えば、Applied Biosystems、Sigma、Jena Bioscience、及びTriLinkから市販されている。
【０１８７】
また、検出可能部分の例として、限定されないが、結合対のメンバーが挙げられる。いくつかのかかる実施形態では、結合対の第１のメンバーは、ポリヌクレオチドに連結される。結合対の第２のメンバーは、蛍光標識等の検出可能な標識に連結される。結合対の第１のメンバーに連結されたポリヌクレオチドが検出可能な標識に連結された結合対の第２のメンバーとインキュベートされる場合、結合対の第１のメンバーと第２のメンバーとが会合し、ポリヌクレオチドを検出することができる。結合対の例として、限定されないが、ビオチンとストレプトアビジン、抗体と抗原等が挙げられる。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、複数の標的ＲＮＡを単一の多重反応において検出する。いくつかのかかる実施形態では、特有のｃＤＮＡに対して標的化された各プローブが、そのプローブから遊離された場合にスペクトル的に識別可能である。そのため、各標的ＲＮＡは特有の蛍光シグナルによって検出される。
【０１８９】
当業者は、選択されたアッセイ、例えば、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイに適した検出方法を選択することができる。選択された検出方法は、上記の方法である必要はなく、任意の方法であってもよい。
【０１９０】
４．３．組成物及びキットの例
別の態様では、組成物が提供される。いくつかの実施形態では、組成物は本明細書に記載される方法における使用のため提供される。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡ特異的プライマーを含む組成物が提供される。「標的ＲＮＡ特異的プライマー」の用語は、（ｉ）ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、若しくはＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡ等の標的ＲＮＡ中に全く同じように存在するか、又は（ｉｉ）ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、若しくはＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡ等の標的ＲＮＡ中に見出される連続するヌクレオチドの領域のヌクレオチドの配列に相補的な配列を有する連続するヌクレオチドの領域を有するプライマーを包含する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の標的ＲＮＡ特異的プライマーを含む組成物が提供される。「標的ＲＮＡ特異的プライマー対」の用語は、ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、若しくはＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡ等の標的ＲＮＡの規定の領域を増幅するのに適したプライマー対を包含する。標的ＲＮＡ特異的プライマー対は、典型的には、標的ＲＮＡ（典型的には、プライマーはＲＮＡよりもＤＮＡ又は修飾ヌクレオシドを含むが）の領域の配列に同一の配列を含む第１のプライマーと、標的ＲＮＡの領域に相補的な配列を含む第２のプライマーとを含む。プライマー対は通例、５０〜１５００ヌクレオチド長、５０〜１０００ヌクレオチド長、５０〜７５０ヌクレオチド長、５０〜５００ヌクレオチド長、５０〜４００ヌクレオチド長、５０〜３００ヌクレオチド長、５０〜２００ヌクレオチド長、５０〜１５０ヌクレオチド長、又は５０〜１００ヌクレオチド長の標的ｍＲＮＡの領域を増幅するのに適している。非限定的なプライマー及びプライマー対の例を表１及び表６に示す。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１対、少なくとも２対、少なくとも３対、少なくとも４対、少なくとも５対、又は少なくとも６対の標的ＲＮＡ特異的プライマー、各ＡＲ及び／又はＵＰＫ１ＢのｍＲＮＡ、並びにＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択される少なくとも１つのｍＲＮＡを増幅する１対のプライマーを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、内在性コントロールＲＮＡを増幅する標的ＲＮＡ特異的プライマー対、及び／又は外在性コントロールＲＮＡを増幅する標的ＲＮＡ特異的プライマー対を更に含む。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、組成物は少なくとも１つの標的ＲＮＡ特異的プローブを含む。「標的ＲＮＡ特異的プローブ」の用語は、（ｉ）ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、若しくはＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡ等の標的ＲＮＡ中に全く同じように存在するか、又は（ｉｉ）ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、若しくはＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡ等の標的ＲＮＡ中に見出される連続するヌクレオチドの領域の配列に相補的な配列を有する連続するヌクレオチドの領域を有するプローブを包含する。標的特異的プローブの非限定的な例を表１及び表６に示す。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、組成物（１対又は複数対の標的ＲＮＡ特異的プライマーを含む上述の組成物を含む）は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又は少なくとも６のプローブ、各ＡＲ及び／又はＵＰＫ１Ｂ、並びにＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３Ａから選択される少なくとも１つのｍＲＮＡを検出する１つのプローブを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、内在性コントロールＲＮＡを検出するプローブ、及び／又は外在性コントロールＲＮＡを検出するプローブを更に含む。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、組成物は水性組成物である。いくつかの実施形態では、水性組成物は、リン酸塩、ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ等の緩衝成分、及び／又は以下に述べられる追加の成分を含む。いくつかの実施形態では、組成物は乾燥、例えば、凍結乾燥されており、流体の添加による再構成に適している。乾燥組成物は、１若しくは複数の緩衝成分、及び／又は追加の成分を含んでもよい。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、組成物は１又は複数の追加の成分を更に含む。追加の成分として、限定されないが、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、及びＭｇＣｌ２等の塩；Ｔａｑ等の熱安定性ポリメラーゼを含むポリメラーゼ；ｄＮＴＰ；ＭＭＬＶ逆転写酵素等の逆転写酵素；ＲＮアーゼ阻害剤；ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等；β−メルカプトエタノール等の還元剤；ＥＤＴＡ等が挙げられる。当業者は、上記組成物の意図される用途に応じて好適な組成物成分を選択することができる。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的ＲＮＡを検出する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、逆転写酵素反応用プライマーとして使用される。いくつかの実施形態では、上記ポリヌクレオチドは増幅用プライマーとして使用される。いくつかの実施形態では、上記ポリヌクレオチドはＲＴ−ＰＣＲ用プライマーとして使用される。いくつかの実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの標的ＲＮＡを検出するプローブとして使用される。いくつかの実施形態では、上記ポリヌクレオチドは検出可能に標識される。いくつかの実施形態では、上記ポリヌクレオチドはＦＲＥＴプローブである。いくつかの実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、分子ビーコン、又はＳｃｏｒｐｉｏｎプローブである。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、組成物は、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、又はＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡの領域に全く同じように存在するか、又はそれに相補的な配列を有する少なくとも１つのＦＲＥＴプローブを含む。いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴプローブは、ＰＣＲ反応中にＦＲＥＴプローブが消化される場合に特異的な標的ＲＮＡと関連する特有の蛍光発光を生じるように、ドナー／アクセプター対で標識される。いくつかの実施形態では、組成物が複数のＦＲＥＴプローブを含む場合、各プローブは、ＰＣＲ反応中にＦＲＥＴプローブが消化される場合に、各々が特異的なプローブ配列及び／又は標的ＲＮＡと関連する特有の蛍光発光を生じるように異なるドナー／アクセプター対で標識される。いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴプローブの配列は、標的ＲＮＡの標的領域に相補的である。他の実施形態では、ＦＲＥＴプローブは、標的ＲＮＡの最もよく整列された標的領域の配列と比較した場合に１又は複数のミスマッチ塩基を含む配列を有する。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、又は少なくとも２５のヌクレオチドからなるＦＲＥＴプローブを含み、上記配列の少なくとも一部はＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、又はＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡの領域に全く同じように存在するか、又はそれに相補的である。いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴプローブの少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、又は少なくとも２５のヌクレオチドは、ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、又はＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡの領域中に全く同じように存在するか、又はそれに相補的である。いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴプローブは、ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、又はＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡの配列又は相補鎖と比較した場合、１個、２個、又は３個のミスマッチ塩基を含む配列を有する。
【０２００】
いくつかの実施形態では、キットは上述のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、キットは、上述の少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブを含む。いくつかの実施形態では、キットは、熱安定性ポリメラーゼ等の少なくとも１つのポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、キットはｄＮＴＰを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で記載されるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法における使用のためのキットは、１又は複数の標的ＲＮＡ特異的ＦＲＥＴプローブ、及び／又は標的ＲＮＡの逆転写のための１又は複数のプライマー、及び／又は標的ＲＮＡ若しくは標的ＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡの増幅のための１若しくは複数のプライマーを含む。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、１又は複数のプライマー及び／又はプローブは「線状」である。「線状」のプライマーは、単一鎖の分子であるポリヌクレオチドを指し、典型的には、例えば、そのプライマーが内部二本鎖を形成するように、同じポリヌクレオチド内の別の領域に相補的な、少なくとも３、４、又は５の連続するヌクレオチドの短い領域を含まない。いくつかの実施形態では、逆転写における使用のためのプライマーは、標的ＲＮＡの５’末端において少なくとも４、例えば少なくとも５、例えば少なくとも６、例えば少なくとも７以上の連続するヌクレオチドに相補的な配列を有する、３’末端において少なくとも４、例えば少なくとも５、例えば少なくとも６、例えば少なくとも７以上の連続するヌクレオチドの領域を含む。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、キットは、ＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、又はＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡ等の標的ＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡの増幅のため、１対又は複数対の線状プライマー（「フォワードプライマー」及び「リバースプライマー」）を含む。したがって、いくつかの実施形態では、第１のプライマーは、ｍＲＮＡ中の第１の場所の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、又は少なくとも２５の連続するヌクレオチドの領域の配列と同一の配列を有する、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、又は少なくとも２５の連続するヌクレオチドの領域を含む。さらに、いくつかの実施形態では、第２のプライマーは、２つのプライマーを使用するＰＣＲ反応がｍＲＮＡの第１の場所からｍＲＮＡの第２の場所へと延びるアンプリコンをもたらすように、ｍＲＮＡにおける第２の場所の少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、又は少なくとも２５の連続するヌクレオチドの領域の配列に相補的な配列を有する、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、又は少なくとも２５の連続するヌクレオチドの領域を含む。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも２組、少なくとも３組、又は少なくとも４組のプライマーを含み、その各々はＡＲ、ＵＰＫ１Ｂ、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＵＰＫ２、ＭＧＥＡ５、及びＰＩＫ３ＡのｍＲＮＡを含む、種々の標的ＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡの増幅用である。いくつかの実施形態では、キットは、内在性コントロール及び／又は外在性コントロール等のコントロールＲＮＡを増幅するため少なくとも１組のプライマーを更に含む。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物における使用のためのプローブ及び／又はプライマーは、デオキシリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物における使用のためのプローブ及び／又はプライマーは、デオキシリボヌクレオチド、及びＬＮＡ類縁体又は他の上述の二本鎖安定化ヌクレオチド類縁体等の１又は複数のヌクレオチド類縁体を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物における使用のためのプローブ及び／又はプライマーは、全てのヌクレオチド類縁体を含む。いくつかの実施形態では、プローブ及び／又はプライマーは、相補性の領域にＬＮＡ類縁体等の１又は複数の二本鎖安定化ヌクレオチド類縁体を含む。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法における使用のためのキットは、逆転写及び増幅反応における使用のための試薬を更に含む。いくつかの実施形態では、上記キットは、逆転写酵素等の酵素、及びＴａｑポリメラーゼ等の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、上記キットは、逆転写及び増幅における使用のためのデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を更に含む。更なる実施形態では、上記キットは、プローブ及びプライマーの特異的ハイブリダイゼーションに対して最適化されたバッファーを含む。
【０２０６】
以下の実施例は解説目的にすぎず、何らの限定も意味しない。
【実施例】
【０２０７】
５．実施例
５．１．実施例１：高悪性度及低悪性度の膀胱癌の検出
膀胱癌の検出のための最も正確なパネルを決定するため膀胱組織及び尿試料の両方において３０を超えるｍＲＮＡのマーカー及び２０を超えるマイクロＲＮＡのマーカーを評価した。８つのマーカー及びＧｅｎｅＸｐｅｒｔシステム（カリフォルニア州サニーベールのCepheid）を使用した２００を超える尿試料からの結果に基づき、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、及びＡＮＸＡ１０のｍＲＮＡマーカーからなるパネル（少なくとも１つの内在性コントロール及び／又は少なくとも１つの外在性コントロールを含む又は含まない）を選択した。
【０２０８】
ＣＲＨ、ＩＧＦ２、ＫＲＴ２０、及びＡＮＸＡ１０のｍＲＮＡの様々な組合せを検出するためのＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）システムにおける使用に対し、様々な反応組成物を設計した。表１は、様々な反応組成物において定量的ＲＴ−ＰＣＲによって各々の標的ＲＮＡを検出するため使用したプライマー及びプローブの配列を示す。
【０２０９】
【表２】
2016513961.tif 000003
【０２１０】
Ｆ１〜Ｆ６は、多重反応において同時に検出され識別され得る検出可能に異なる色素であり、Ｑ１〜Ｑ６はクエンチャーである（本実施例では、上記配列中に示されるように、Ｑ２、Ｑ４、Ｑ５、及びＱ６は同じクエンチャーであり、Ｑ１はダブシルである）。
【０２１１】
３種の異なる反応組成物の最終のプライマー及びプローブの組成を表２に示す。
【０２１２】
【表３】
2016513961.tif 000004
【０２１３】
各反応物は、５０ｍＭ〜９０ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭ〜５ｍＭのＭｇＣｌ２、４００μＭ〜８２５μＭのｄＮＴＰ、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５、０．０１％のアジ化ナトリウム、及び０．９単位／μｌのＲＮアーゼ阻害剤を含有した。ＭＭＬＶ逆転写酵素（０．３７５単位／μｌ）及びＡｐｔａＴａｑ（０．２５単位／μｌ；Roche）を逆転写及び増幅にそれぞれ使用した。ＴＳＲ  ＣＬ１は、Ａｒｍｏｒｅｄ  ＲＮＡ（商標）外在性コントロール（配列番号４７；テキサス州オースチンのAsuragen）を含んだ。
【０２１４】
試験される各試料について、５ｍＬの排泄尿を、好ましくは試料採取の１時間以内に、５ｍＬの防腐剤（３．５ＭのグアニジンＨＣｌ、１％のＮ−アセチル−Ｌ−システイン、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム、及び２．５％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ３．２）に添加した。保存試料を氷上へと移し、４℃で保存した。各試料の臨床情報は採取地より提供された。１ミリリットル当たりの赤血球数を、顕微鏡を用いた評価によって決定した。
【０２１５】
使用前に、保存した尿を３回転倒して混合した。１．２ｍＬの保存した尿を分析のためＧｅｎｅＸｐｅｒｔカートリッジに充填した。そのカートリッジは、尿路上皮細胞を捕捉するための０．８μｍフィルターを備えていた。捕捉した細胞を洗浄し、カートリッジ内で超音波処理（２秒〜１５秒、３６ｋＨｚで８μｍ〜１６μｍ）を使用して溶解した。その後、溶解物を使用してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（先に記載される）に使用する試薬を再構成した。使用した反応サイクルは、ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）システムにおいてＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）カートリッジを使用して、４５℃で１０分間の後、９５℃で２分間、その後９５℃で５秒間、６０℃で２０秒、及び７２℃で２０秒を４５サイクルであった。デルタＣｔ（ΔＣｔ）をＣｔ（ＡＢＬ）−Ｃｔ（マーカー）として算出した。膀胱癌を有すると予測されない患者に由来する試料との少なくとも９５％特異性を与えるΔＣｔとしてΔＣｔカットオフを設定した（データは示されていない）。上記マーカーのうちいずれか１つについてのΔＣｔカットオフを越えるΔＣｔを陽性結果、すなわち、膀胱癌の存在の指標とした。
【０２１６】
また、いくつかの試料をＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）（イリノイ州アボットパークのAbbott Laboratories）を使用して試験した。その実験の結果を表３（高悪性度の膀胱癌）及び表４（低悪性度の膀胱癌）に示す。陽性の結果を示す閾値を超えるΔＣｔが強調される。３つのＴＳＲロットの各々、すなわち、ＣＬ３、ＣＬ４、及びＣＬ１は、ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）と同じく、１００％の高悪性度の膀胱癌試料を検出した。
【０２１７】
低悪性度の膀胱癌については、検出率は、ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）のわずか１６％（３／１９）と比較して３７％（７／１９）であった。
【０２１８】
【表４】
2016513961.tif 000005
【０２１９】
【表５】
2016513961.tif 000006
【０２２０】
表３及び表４において試験された個々のマーカーの各々に関して、高悪性度の膀胱癌及び低悪性度の膀胱癌に対する感受性の要約、並びに低リスクの膀胱癌を伴う患者における特異性を表５に示す。
【０２２１】
【表６】
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【０２２２】
上記４つのマーカー、すなわち、ＫＲＴ２０、ＩＧＦ２、ＣＲＨ、及びＡＮＸＡ１０を検出するための代替的なプライマー及びプローブの例を表６に示す。また、表６は、外在性コントロールと、内在性コントロールであるＡＢＬとを検出する一組のプライマー及びプローブの例を示す。表６に示される色素及びクエンチャーは一般的なものであり、２以上のクエンチャーＱ１〜Ｑ６は同じでもよい（Ｑ１は上記配列中に示されるダブシルである）。当業者は、多重アッセイにおける使用に適したセット、例えば、一組の検出可能に異なる色素を選択できるであろう。また、各一組のプライマーについて予測されるアンプリコンの長さ、また同じく、標的のゲノムコピー上のプライマー部位の間に介在する任意のイントロン（複数の場合がある）の長さが示される。
【０２２３】
【表７】
2016513961.tif 000008
【０２２４】
５．２．実施例２：より大きなコホートにおけるＫＲＴ２０、ＩＧＦ２、ＣＲＨ、及びＡＮＸＡ１０のマーカーパネルを使用する膀胱癌の検出に対するアッセイ感受性
７つの異なる場所で被験体から尿試料を採取した。研究への組み入れに関する適格基準は、以下を含んだ。
１８歳以上、
審査ＩＲＢ又はＨＲＥＣにより必要とされる文書化されたインフォームドコンセント、及び署名されたカリフォルニアにおける患者に対する実験被験体の権利章典、
少なくとも以下の基準のうち１つ、
膀胱癌の病歴又は再発、
顕微血尿又は肉眼血尿による膀胱鏡評価に関する紹介、
泌尿器科評価に関する紹介があるが、以前の膀胱癌の病歴又は膀胱癌の臨床証拠がない、
標準的なケアに必要なものに加えて、少なくとも１５ｍｌの排泄尿を提供するための同意、
膀胱鏡検査手順の間に採取された任意の生検標本に関する病理学的結果及び報告される他の医療記録を許可するための同意。
除外基準は、年齢１８歳未満及び初尿のみを含んだ。現在又は以前にカルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）で治療された患者、及び現在若しくは以前に膀胱内療法、又は経尿道的電気切除術、又は膀胱癌に対する放射線療法で治療された患者を本研究に適格とした。さらに、上記研究の間の繰り返し登録も許可した。
【０２２５】
採取地のうち二カ所は、尿試料に対するＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）の分析結果を提供した。試験される各試料について、１５ｍＬの排泄尿を、好ましくは試料採取の１時間以内に、１５ｍＬの防腐剤（３．５ＭのグアニジンＨＣｌ、１％のＮ−アセチル−Ｌ−システイン、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム、及び２．５％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ３．２）に添加した。保存試料を氷上に移し、４℃で保存した。各試料の臨床情報は採取地より提供された。
【０２２６】
使用前に、保存した尿を３回転倒して混合した。４ｍＬの保存した尿を分析のためＧｅｎｅＸｐｅｒｔカートリッジに充填した。そのカートリッジは、尿路上皮細胞を捕捉するための０．８μｍフィルターを備えていた。捕捉した細胞を洗浄し、カートリッジ内で超音波処理（２秒〜１５秒、３６ｋＨｚで８μｍ〜１６μｍ）を使用して溶解した。その後、溶解物を使用してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（先に記載される）に使用する試薬を再構成した。使用した反応サイクルは、ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）システムにおいてＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）カートリッジを使用して、４５℃で１０分間の後、９５℃で２分間、その後、９５℃で５秒間、６０℃で２０秒、及び７２℃で２０秒を４５サイクルであった。ＡＮＸＡ１０、ＫＲＴ２０、及びＩＧＦ２について、デルタＣｔ（ΔＣｔ）をＣｔ（ＡＢＬ）−Ｃｔ（マーカー）として算出した。膀胱癌を有すると予測されない患者に由来する試料との高い特異性（９０％超）を与えるΔＣｔとしてΔＣｔカットオフを設定した（データは示されていない）。マーカーのうちいずれか１つについてのΔＣｔカットオフを越えるΔＣｔを陽性結果、すなわち、膀胱癌の存在の指標とした。ＣＲＨについて、ＣＲＨマーカーに関する陽性を判定するためΔＣｔに代えてＣｔ値を使用した。４５未満のＣＲＨ  Ｃｔ値を陽性結果、すなわち、膀胱癌の存在の指標とした。４つの膀胱癌マーカー（ＫＲＴ２０、ＩＧＦ２、ＣＲＨ、及びＡＮＸＡ１０）に加えて、ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）膀胱癌アッセイは２つのコントロール、すなわち、試料中のＡＢＬ  ｍＲＮＡを検出するプライマー及びプローブ、並びにＡｒｍｏｒｅｄ  ＲＮＡ（商標）外在性コントロールＲＮＡを検出するプライマー及びプローブを含んだ。
【０２２７】
最初の分析では、膀胱癌について陽性の膀胱鏡検査結果を有した患者から採取した１３２の試料をＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）膀胱癌アッセイにより試験した。また、それらの試料のうち６０はＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）を使用して試験した。表７は、それら１３２試料に関する結果を示す。
【０２２８】
【表８】
2016513961.tif 000009
【０２２９】
これらの試料について表７に示されるように、ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）膀胱癌アッセイは、低悪性度の膀胱癌に対して５４．１％の感受性、及び高悪性度の膀胱癌に対して８９．７％の感受性を有した。対照的に、ＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）は、低悪性度の膀胱癌に対してわずか２４％の感受性、及び高悪性度の膀胱癌に対して７６．６％の感受性を有した。さらに、ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）膀胱癌アッセイは、全ての悪性度及びステージの膀胱癌を検出することができた。
【０２３０】
その後、３つの患者群に従って同じデータセットを、（Ａ）現在、膀胱癌の再発についてモニタリングされている膀胱癌の病歴を有する患者、（Ｂ）試料採取前３ヶ月以内にカルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）で治療されたことのある患者、及び（Ｃ）膀胱癌に対して症候性であり、以前に膀胱癌の病歴を有しない患者に分けた。それらの患者群の結果を表８に示す。
【０２３１】
【表９】
2016513961.tif 000010
【０２３２】
表８に示されるように、ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）膀胱癌アッセイは、患者群全体における場合と同様に、膀胱癌についてモニターされている患者、及び膀胱癌に症候性の患者において、低悪性度及び高悪性度の膀胱癌に対して同様の感受性を有した（表７を参照されたい）。直近三ヶ月以内にＢＣＧで治療されたことのある患者では、ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）膀胱癌アッセイは６６．７％の感受性を有したが、試料サイズが小さすぎて（６試料）、その結果から結論を導くことができなかった。
【０２３３】
ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）膀胱癌アッセイとＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）とを直接比較するため、両方のアッセイで試験された試料のみを含むデータセットを選択した。表９は、２つの群、すなわち（Ａ及びＢ）試料採取の前３ヶ月以内にカルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）で治療されたことのある患者と統合した、膀胱癌の再発について現在モニターされている膀胱癌の病歴を有する患者（ＢＣＧ治療患者に由来する試料１つのみを両方のアッセイで試験したことから、これらの群を統合した）、及び（Ｃ）膀胱癌に症候性であり、以前に膀胱癌の病歴を有しない患者に分けた患者によるそのデータセットに対する結果を示す。
【０２３４】
【表１０】
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【０２３５】
表９に示されるように、ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）膀胱癌アッセイとＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）の両方で試験したそれらの試料について、両方の患者群において低悪性度及び高悪性度の膀胱癌の検出に対してＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）膀胱癌アッセイはＵｒｏＶｙｓｉｏｎ（商標）よりも高い感受性を示した。
【０２３６】
次に、採取後１週間よりも長く試験したことを意味する保存試料（採取後８日〜９ヶ月の範囲の試料）、及び採取の１週間以内に試験したことを意味する新鮮な試料に上記データセットを分けた。その分析結果を表１０に示す。
【０２３７】
【表１１】
2016513961.tif 000012
【０２３８】
表１０に示されるように、ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）膀胱癌アッセイは、新鮮試料及び保存試料において低悪性度及び高悪性度の膀胱癌の検出に対して同様の感受性を有した。
【０２３９】
５．３．実施例３：より大きなコホートにおけるＫＲＴ２０、ＩＧＦ２、ＣＲＨ、及びＡＮＸＡ１０のマーカーパネルを使用する膀胱癌の検出に対するアッセイ特異性
膀胱癌に対する陽性の膀胱鏡検査結果を有する患者に由来する試料に加えて、膀胱癌に対して陰性の膀胱鏡検査結果を有するが、膀胱癌の再発についてモニターされ、試料採取の前３ヶ月以内にＢＣＧを受けた患者、及び膀胱癌に症候性であることがわかったが、以前に膀胱癌の病歴を有しない患者から７カ所で尿試料を採取した。さらに、腎臓結石等の他の疑いのある状態に関する泌尿器の紹介を有する患者から尿試料を採取した。最後に、健康な個体から尿試料を採取した。尿試料を保存し、実施例２に記載されるようにＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）膀胱癌アッセイを使用して分析した。
【０２４０】
膀胱癌について陰性の膀胱鏡結果を有する患者に由来する試料について、３つの患者群、すなわち（Ａ）膀胱癌の再発について現在モニターされている膀胱癌の病歴を有する患者、（Ｂ）試料採取の前３ヶ月以内にカルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）で治療されたことのある患者、及び（Ｃ）膀胱癌に症候性であり、以前に膀胱癌の病歴を有しない患者に従って上記アッセイ結果を分けた。それらの患者群に対する結果を表１１に示す。
【０２４１】
【表１２】
2016513961.tif 000013
【０２４２】
表１１に示されるように、ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）膀胱癌アッセイは、患者群（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）に対して、それぞれ７３．９％、８５．７％、及び８４．３％の特異性を有した。
【０２４３】
次に、膀胱癌ではない他の泌尿器系の状態を有する疑いのある患者における、ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）膀胱癌アッセイの特異性を判定した。７０の患者試料をこのカテゴリーで採取した。ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）膀胱癌アッセイによる結果は、１４の陽性結果、５０の陰性結果、及び６の無効結果であった。したがって、この患者集団に対するＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）膀胱癌アッセイの特異性は、７８．１％であった。
【０２４４】
最後に、健康な個体におけるＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）膀胱癌アッセイの特異性を判定した。５５の試料をこのカテゴリーで採取した。結果は、４の陽性及び５１の陰性であり、この被験体カテゴリーに関して９２．７％の特異性を示した。
【０２４５】
５．４．実施例４：ＫＲＴ２０、ＩＧＦ２、ＣＲＨ、及びＡＮＸＡ１０のマーカーパネルを使用する弱陽性又は偽陰性であった試料における膀胱癌の検出
上記コホートに由来する弱陽性又は偽陰性であった多くの試料を含む試料収集物を、更なる２つのマーカー、アンドロゲンアクセプター（ＡＲ）及びウロプラキン１Ｂ（ＵＰＫ１Ｂ）を使用して分析した。
【０２４６】
２ミリリットルの保存した尿をＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）カートリッジに充填し、尿をフィルターに通した。３Ｍのグアニジウムチオシアネート及び０．１％のサルコシルを使用してフィルターに捕捉された細胞を除去し、その細胞に由来するＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Qiagen）を使用して精製した。その後、ＲＮＡ試料をＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ（商標）（カリフォルニア州サニーベールのCepheid）上で分析した。各反応物は、５μｌの精製ＲＮＡ、４００ｎＭのＡＢＬに対するフォワードプライマー、４００ｎＭの各標的ＲＮＡに対するフォワードプライマー（ＡＲ及び／又はＵＰＫ１Ｂ）、４００ｎＭのＡＢＬに対するリバースプライマー、４００ｎＭの各標的ＲＮＡに対するリバースプライマー、２００ｎＭのＡＢＬプローブ、及び３００ｎＭの各標的ＲＮＡに対するプローブ、５０ｍＭ〜９０ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭ〜５ｍＭのＭｇＣｌ２、４００μＭ〜８２５μＭのｄＮＴＰ、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５、０．０１％のアジ化ナトリウム、及び０．１２５単位／μｌのＲＮアーゼ阻害剤を含有した。ＭＭＬＶ逆転写酵素（０．３７５単位／μｌ）及びＡｐｔａＴａｑ（０．２５単位／μｌ；Roche）を、それぞれ逆転写及び増幅に使用した。使用したサイクルは、４５℃で６００秒、９５℃で１２０秒、並びに９５℃で５秒、６０℃で２０秒、及び７２℃で２０秒を４５サイクルであった。ＡＲ及びＵＰＫ１Ｂを検出するプライマー及びプローブの配列を表１２に示す。
【０２４７】
【表１３】
2016513961.tif 000014
【０２４８】
ＡＢＬ  Ｃｔが３９よりも大きかった場合、その試料を分析から除外した。デルタＣｔ（ΔＣｔ）をＣｔ（ＡＢＬ）−Ｃｔ（マーカー）として算出した。ＡＲに対するΔＣｔカットオフを−４．５に設定し、ＵＰＫ１Ｂに対するΔＣｔカットオフを１．５に設定した。いずれか１つのマーカーについてΔＣｔカットオフを上回るΔＣｔを陽性結果、すなわち、膀胱癌の存在の指標とした。試料中に標的が検出されなかった場合、Ｃｔを０に設定し、ΔＣｔを−２０に設定した。上記実験の結果を表１３に示す。
【０２４９】
【表１４】
2016513961.tif 000015
【０２５０】
2016513961.tif 000016
【０２５１】
膀胱癌マーカーとしてのＡＲ又はＵＰＫ１Ｂのいずれかを使用して、上述の４つのマーカーパネルを使用して偽陰性と以前に同定された少なくとも６つの試料を膀胱癌に関して陽性と同定した。
【０２５２】
ＡＲ又はＵＰＫ１Ｂを使用する膀胱癌の検出に関する感受性及び特異性を表１４に示す。
【０２５３】
【表１５】
2016513961.tif 000017
【０２５４】
２３の高悪性度及び低悪性度膀胱癌試料をＡＲとＵＰＫ１Ｂとの両方で試験した。試験試料に対するＡＲ及びＵＰＫ１Ｂの組合せの感受性（シングルポジティブとダブルポジティブとの両方を陽性結果とする）は８７％である。
【０２５５】
上記試料の一部はより低いＡＢＬレベルを有し、試料中の細胞数が少ない可能性を示す。表１５に示されるように、３６未満のＡＢＬ  Ｃｔを有する試料において、両方のマーカーの感受性は増加する。
【０２５６】
【表１６】
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【０２５７】
５．５．実施例５：追加のマーカーを使用する膀胱癌の検出
合理的に９５％に近い正常試料との特異性を保持しながら、膀胱癌に対して最良の感受性を与え得るマーカーの組合せを決定するため、追加のマーカーの発現レベルを評価するためＸｐｅｒｔ膀胱アッセイを適合した。各尿試料を２つのアッセイの各々において試験でき、合計１０のマーカーに関する発現の情報を採取するように、ＡＲ、ＡＢＬ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＵＰＫ１Ｂ、ＵＰＫ２、及びＭＧＥＡ５に対するプライマー及びプローブを含有する新たな試薬ビーズを製剤化し、カートリッジを組み立てた。
【０２５８】
プライマー及びプローブの配列を表１６に示す。
【０２５９】
【表１７】
2016513961.tif 000019
【０２６０】
Ｆ１〜Ｆ６は、多重反応において同時に検出され識別され得る検出可能に異なる色素であり、Ｑ１〜Ｑ６はクエンチャーである（本実施例では、Ｑ３及びＱ４が同じクエンチャーであり、Ｑ４及びＱ５が同じクエンチャーである）。
【０２６１】
各反応は、５０ｍＭ〜９０ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭ〜５ｍＭのＭｇＣｌ２、４００μＭ〜８２５μＭのｄＮＴＰ、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５、０．０１％のアジ化ナトリウム、及び０．９単位／μｌのＲＮアーゼ阻害剤を含有した。ＭＭＬＶ逆転写酵素（０．３７５単位／μｌ）及びＡｐｔａＴａｑ（０．２５単位／μｌ；Roche）を、逆転写及び増幅にそれぞれ使用した。
【０２６２】
試験される各試料について、４．５ｍＬの排泄尿を、好ましくは試料採取の１時間以内に、４．５ｍＬの防腐剤（３．５ＭのグアニジンＨＣｌ、１％のＮ−アセチル−Ｌ−システイン、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム、及び２．５％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ３．２）に添加した。容器を３回転倒して混合した。保存試料を氷上に移し、２℃〜８℃で保存した。各試料に関する臨床情報は採取地より提供された。
【０２６３】
試験した試料の要約を表１７に示す。
【０２６４】
【表１８】
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【０２６５】
使用前に、保存した尿を３回転倒して混合した。分析のため４ｍＬの保存した尿をＧｅｎｅＸｐｅｒｔカートリッジに充填した。そのカートリッジは、尿路上皮細胞を捕捉するための０．８μｍフィルターを備えていた。捕捉した細胞を洗浄し、カートリッジ内で超音波処理（２秒〜１５秒、３６ｋＨｚで８μｍ〜１６μｍ）を使用して溶解した。その後、溶解物を使用してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（先に記載される）に使用する試薬を再構成した。使用した反応サイクルは、ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）システムにおいてＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）カートリッジを使用して、４５℃で１０分間の後、９５℃で２分間、その後、９５℃で５秒間、６０℃で２０秒、及び７２℃で２０秒を４５サイクルであった。デルタＣｔ（ΔＣｔ）をＣｔ（ＡＢＬ）−Ｃｔ（マーカー）として算出した。膀胱癌を有すると予測されない患者に由来する試料との少なくとも９５％特異性を与えるΔＣｔとしてΔＣｔカットオフを設定した。マーカーのうちいずれか１つについてのΔＣｔカットオフを上回るΔＣｔを陽性結果、すなわち、膀胱癌の存在の指標とした。
【０２６６】
表２０に示される４マーカーアッセイにおける３６超のＡＢＬ  Ｃｔを上記研究から排除した。表２１に示される５マーカーアッセイ及び表２２に示される４マーカーアッセイにおける３７超のＡＢＬ  Ｃｔを上記研究から排除した。陽性に対するカットオフ値を正常試料との約９５％特異性を可能とするように選択した。ＭＧＥＡ５について、このマーカーが膀胱癌を伴う患者に由来する尿標本において下方制御されることが見出されたことから、陽性コール（positive call）は上記カットオフ未満の標的デルタＣｔ値である。
【０２６７】
ＵＰＫ２はＡＢＬと類似の発現パターンを有することがわかり、ＡＢＬに代えて内在性コントロールとして使用できることを示した（データは示されていない）。ＵＰＫ２が主に尿路上皮細胞特異的であることから、わずかな尿路上皮細胞を含むか又はそれを全く含まない試料は低レベルのＵＰＫ２  ＲＮＡを有するはずであり、したがって、有用な試料の妥当性コントロールとなるであろう。
【０２６８】
表１８は、９つのマーカーの各々に関する感受性及び特異性を要約し、表１９は１つのマーカーのみでいくつの試料が陽性であったかを示す。
【０２６９】
【表１９】
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【０２７０】
【表２０】
2016513961.tif 000022
【０２７１】
表２０は、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＣＲＨ、及びＩＧＦ２を使用する４マーカー組合せアッセイに対する感受性及び特異性を要約する。表２１は、ＫＲＴ２０、ＡＮＸＡ１０、ＣＲＨ、ＩＧＦ２、及びＵＰＫ１Ｂを使用する５マーカー組合せアッセイに対する感受性及び特異性を要約する。表２２は、ＵＰＫ１Ｂ、ＡＮＸＡ１０、ＣＲＨ、及びＩＧＦ２を使用する４マーカー組合せアッセイに対する感受性及び特異性を要約する。
【０２７２】
【表２１】
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【０２７３】
【表２２】
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【０２７４】
【表２３】
2016513961.tif 000025
【０２７５】
ＵＰＫ１Ｂの追加、又はＫＲＴ２０をＵＰＫ１Ｂに代えることは、低悪性度及びＣＩＳに対してアッセイ感受性を改善した。また、ＫＲＴ２０をＵＰＫ１Ｂに代えることにより、ＫＲＴ２０を含む４マーカー組合せアッセイと比較して、陰性の膀胱鏡検査を有する患者による特異性を６７％から６９％に改善した。
【０２７６】
本出願において引用される全ての出版物、特許、特許出願及び他の文書は、各個別の出版物、特許、特許出願又は他の文書が全ての目的のため引用されることにより本明細書の一部をなすように個別に示されるのと同じ程度に全ての目的のためその全体が引用されることにより本明細書の一部をなす。
【０２７７】
様々な具体的実施形態が解説され記載されているが、本発明（複数の場合がある）の趣旨及び範囲から解離することなく変更することができることが理解されるであろう。
【０２７８】
【表２４】
2016513961.tif 000026
【０２７９】
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【０２８０】
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【０２８１】
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【０２８２】
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【０２８３】
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【０２８４】
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【０２８５】
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【０２８６】
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【０２８７】
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【０２８８】
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【０２８９】
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【０２９０】
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【０２９１】
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【０２９２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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