(57)【要約】  本発明は、Ｌ−イソロイシン生産能が向上した微生物及びこれを用いたＬ−イソロイシンの製造方法に関し、より詳しくは、Ｌ−イソロイシン及びＬ−スレオニンの誘導体に対して耐性を有するＬ−イソロイシン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）変異株及びこれを用いたＬ−イソロイシン製造方法に関する。
2016514474.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−イソロイシン生産用コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）変異株ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ。
【請求項２】
前記変異株が、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−スレオニン、及びその誘導体に対して耐性を有する、請求項１に記載の変異株ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ。
【請求項３】
前記Ｌ−イソロイシン誘導体が、４−チアイソロイシン（４−ｔｈｉａｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ，ｔｈｉａｉｌｅ）またはイソロイシン−ヒドロキサメート（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ−ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ，ｉｌｅＨｘ）であり、Ｌ−スレオニン誘導体が、α−アミノ−β−ヒドロキシノルバリン（α−ａｍｉｎｏ−β−ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｒｖａｌｉｎｅ，ＡＨＶ）である、請求項２に記載の変異株ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異株ＫＣＣＭ１１２４８Ｐを培養する工程を含むＬ−イソロイシン製造方法。
【請求項５】
前記変異株ＫＣＣＭ１１２４８Ｐの培養液からＬ−イソロイシンを回収する工程を含む、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
培養温度が、２０〜４５℃、好気の条件下で１０〜１６０時間培養される、請求項４に記載の製造方法。
【請求項７】
コリネバクテリウムグルタミカム中から、Ｌ−イソロイシン誘導体及びＬ−スレオニン誘導体に耐性を有する変異株を選別する工程を含む、Ｌ−イソロイシン生産用コリネバクテリウムグルタミカム変異株製造方法。
【請求項８】
前記変異株選別は、突然変異方法による請求項７に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−イソロイシン生産能が向上した微生物及びこれを用いたＬ−イソロイシンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アミノ酸はタンパク質の基本単位であり、機能性食品の添加剤、動物の栄養普及及び製薬産業に広く用いられている。全２０種類のアミノ酸のうち、分岐鎖アミノ酸（ｂｒａｎｃｈｅｄ−ｃｈａｉｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）は、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンの３種を指すものであり、産業的にその価値が次第に高まっている。分岐鎖アミノ酸は、人体内における骨格間を維持して形成するのに重要な機能を果たし、インシュリン調節及び筋肉の維持と増量に機能性があると報告されている（非特許文献１）。特に、Ｌ−イソロイシンは筋肉で代謝されてエネルギーを生成し、ヘモグロビンの生成に関与して疲労の軽減と成長促進機能を果たす。これにより、輸液製剤及び栄養剤として多様に用いられ、スポーツ栄養食品への利用が増加している。
【０００３】
Ｌ−イソロイシンを産業的に生産するためには、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）が代表的な微生物として用いられている。この微生物は、ピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）と２−ケト酪酸（２−ｋｅｔｏｂｕｔｙｒａｔｅ）を前駆体として用いて３つの中間代謝物質を経てＬ−イソロイシンを合成する（図１参照）。前記２つの前駆体から２−アセト−２−ヒドロキシ酪酸（２−ａｃｅｔｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）を合成し、２，３−ジヒドロキシ−３−メチル吉草酸（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｙｌｖａｌｅｒａｔｅ）と２−ケト−３−メチル吉草酸（２−ｋｅｔｏ−３−ｍｅｔｈｙｌｖａｌｅｒａｔｅ）を経て最終的にＬ−イソロイシンを生産する。それぞれの中間代謝物質を合成するためには、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙ  ａｃｉｄ  ｉｓｏｍｅｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｃｉｄ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）、そしてアミノトランスフェラーゼ（ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）という酵素が用いられる（非特許文献２）。
【０００４】
コリネバクテリウムグルタミカム菌株において、Ｌ−イソロイシンの生合成工程で重要なアセトヒドロキシ酸シンターゼは、ｉｌｖＢＮ遺伝子によりコードされ、最終産物であるＬ−イソロイシンにより遺伝子の発現及び酵素の活性が阻害されるフィードバック抑制作用を受ける。また、２−ケト酪酸を生成するスレオニンジヒドラターゼ（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）もＬ−イソロイシンによりフィードバック抑制を受けており、Ｌ−イソロイシン生合成に関連した遺伝子の発現調節及び酵素の活性を調節することが高収率のＬ−イソロイシン生産菌株を作るのに重要な要素として知られている（非特許文献３）。これと併せて、図１で見られるように、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシンは同一の生合成経路を通じて生成されるため、Ｌ−イソロイシンを大量生産するためには２−ケト酪酸の前駆体として用いられるＬ−スレオニンの円滑な供給がなされてこそ他の分岐鎖アミノ酸の生産を減少させ、持続的なＬ−イソロイシン合成が可能である。このような問題を解決するために、Ｌ−スレオニン誘導体であるα−アミノ−β−ヒドロキシノルバリン（α−ａｍｉｎｏ−β−ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｒｖａｌｉｎｅ）を用いてＬ−スレオニンの生産能を高めた文献があり（非特許文献４）、Ｌ−スレオニン生成能を有する微生物にＬ−イソロイシン生産能を付与する方法（特許文献１）、Ｌ−スレオニン及びＬ−イソロイシンを同時生産する微生物（特許文献２）等の先行特許がある。そしてイソロイシン誘導体である４−チアイソロイシン（４−ｔｈｉａｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）を用いてスレオニンジヒドラターゼのフィードバック抑制を確認した文献（非特許文献５）とイソロイシン−ヒドロキサメート（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ−ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ）に耐性を有する変異株を得てＬ−イソロイシン生成能を向上させたという報告があり（非特許文献６）、Ｌ−イソロイシン生産菌株に変異を与えてＬ−バリンの生成よりはＬ−イソロイシン生成効率を高めたＡＨＡＳ開発方法（特許文献３）、Ｌ−イソロイシンの生産方法を改善するために酸素の供給、または発酵時にｐＨのような物理的条件の変化によって収率を向上させた研究が発表されている（非特許文献７）。
【０００５】
しかし、これまで研究開発されたＬ−イソロイシン生産微生物の場合、Ｌ−イソロイシン生合成経路の一部物質に対してそれぞれ分離された耐性を有しており、Ｌ−イソロイシン生合成のフィードバックの調節に関係する様々な物質に耐性を有するＬ−イソロイシン生産微生物の開発の必要性が依然として残っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国公開特許第２０１１−００５８７３１号公報
【特許文献２】韓国公開特許第２００２−００１３７７７号公報
【特許文献３】韓国公開特許第２０１１−００６１７８０号公報
【特許文献４】韓国公開特許第２０００−０００２４０７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｎｄｒｅａ  ｔｏｍ  ｅｔ  ａｌ，（２００６）Ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，１３６，３２４ｓ−３３０ｓ
【非特許文献２】Ｊｉｎ  ｈｗａｎ  ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ，Ａｐｐｌ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，（２０１０）８５：４９１−５０６
【非特許文献３】Ｊｉｎ  ｈｗａｎ  ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｊｏｕｒｎａｌ，（２０１０）５６０−５７７
【非特許文献４】Ｃａｙｏ  ｒａｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ，（１９９２）１６７７−１６８２
【非特許文献５】Ｊｏｈｎ  Ｊ．ｗａｓｍｕｔｈ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，（１９７３）５６２−５７０
【非特許文献６】Ｍ．ｋｉｓｕｍｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（１９７１）６９  ２９１−２９７
【非特許文献７】Ｚｈｉｈｉａｎ  ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  ｂｉｏｓｙｓｔ  ｅｎｇ，（２０１０）３３：３３９−３４５
【非特許文献８】Ｊａｍｅｓ  Ｍ．Ｌｅｅ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎｓ，（１９９１）ｐｐ１３８−１７６
【非特許文献９】Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１（１９９１）ｐｐ１３８−１７６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、従来の菌株より収率に優れたＬ−イソロイシン生産微生物を開発するために鋭意努力した結果、Ｌ−スレオニン誘導体であるα−アミノ−β−ヒドロキシノルバリン及びＬ−イソロイシン誘導体である４−チアイソロイシン、イソロイシン−ヒドロキサメートに対して共通耐性を付与した結果、これから得られた変異株が高い収率でＬ−イソロイシンを生産することを見出し本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、高収率のＬ−イソロイシン生産用コリネバクテリウムグルタミカム変異株を提供することである。
本発明の他の目的は、前記変異株を用いてＬ−イソロイシンを製造する方法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、コリネバクテリウムグルタミカム中から高収率のＬ−イソロイシン生産用変異株を製造する方法を提供することである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のコリネバクテリウムグルタミカム変異株は、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−スレオニン及びこの誘導体に対する共通耐性を有することにより、Ｌ−イソロイシンに対するフィードバック阻害を受けず、前駆体であるＬ−スレオニンの十分な供給がなされ、Ｌ−イソロイシンの生産能が向上している。従って、前記微生物を用いる本発明のＬ−イソロイシン製造方法によると、Ｌ−イソロイシンを高効率及び高収率で製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の最終産物であるＬ−イソロイシンの生合成過程とともに同じ分岐鎖アミノ酸の生合成経路を示す。図１に示されるように分岐鎖アミノ酸は同一の酵素による生合成過程を経て生成されている。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の一実施態様として、Ｌ−イソロイシン生産用コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）変異株ＫＣＣＭ１１２４８Ｐを提供する。
【００１４】
本発明における用語「Ｌ−イソロイシン」とは、必須アミノ酸の１つとして構造的にＬ−バリン、Ｌ−ロイシンとともに分岐鎖アミノ酸に該当する化学式ＨＯ２ＣＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３であるＬ−アミノ酸を意味する。
【００１５】
一方、微生物において、Ｌ−イソロイシンの生合成は図１に示されたように、ピルビン酸と２−ケト酪酸を前駆体として４工程の生合成過程を経て合成される。しかし、前記生合成工程は、残りの分岐鎖アミノ酸、即ち、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシンの生合成にも共通に用いられ、Ｌ−イソロイシンの生合成に必要な前駆体であるＬ−スレオニンの十分な供給もなされなければならないため、発酵によりＬ−イソロイシンを大量製造するのに問題があった。本発明の変異株は、最終産物であるＬ−イソロイシンまたはその誘導体に対する耐性を有してフィードバック阻害が解除され、また、Ｌ−スレオニン誘導体に対する耐性を有してフィードバック阻害が解除されるので、十分な前駆体の供給がなされることによりＬ−イソロイシン生産能が向上した新規の微生物である。
【００１６】
本発明の前記変異株は、好ましくは、Ｌ−イソロイシンまたはその誘導体、Ｌ−スレオニンまたはその誘導体に耐性を有することができ、最も好ましくは、Ｌ−イソロイシンの誘導体及びＬ−スレオニン誘導体に耐性を有することができる。
【００１７】
本発明における用語「誘導体」とは、本発明の最終産物であるＬ−イソロイシンまたは前駆体であるＬ−スレオニンの生合成に関連してフィードバック阻害を誘発し、微生物からＬ−イソロイシンまたはＬ−スレオニンの生産能を阻害させることがでる公知となった化合物を意味することができ、その例としてＬ−イソロイシン誘導体は、４−チアイソロイシン（ｔｈｉａｉｌｅ）またはイソロイシン−ヒドロキサメート（ｉｌｅＨｘ）であり、Ｌ−スレオニン誘導体は、α−アミノ−β−ヒドロキシノルバリン（ＡＨＶ）などを挙げることができるが、これに限定されない。好ましくは、前記変異株は、４−チアイソロイシン、イソロイシン−ヒドロキサメート及びα−アミノ−β−ヒドロキシノルバリンからなる群から選択された１個以上の物質に耐性を有することができ、最も好ましくは、４−チアイソロイシン、イソロイシン−ヒドロキサメート及びα−アミノ−β−ヒドロキシノルバリンにいずれも耐性を有することができる。
【００１８】
一般に、細胞内で一定濃度以上のＬ−イソロイシンが蓄積されれば、Ｌ−イソロイシン生合成が阻害されると知られている。従って、前記誘導体に対して耐性を有する菌株はＬ−イソロイシンによる阻害が解除され、高濃度のＬ−イソロイシンを含む条件でもＬ−イソロイシンを生成できる能力を有する菌株であるため、本発明の一実施例によると、本発明者らは、前記誘導体を用いて高濃度のＬ−イソロイシン生産株を選別した。また、Ｌ−スレオニンは、Ｌ−イソロイシンを大量生産するための２−ケト酪酸の前駆体として用いられるので、Ｌ−スレオニンに対して耐性を有する菌株はＬ−スレオニンによる阻害が解除され、前駆体であるＬ−スレオニンの十分な供給がなされるため、Ｌ−スレオニン誘導体も高濃度のＬ−イソロイシン生産株を選別するのに用いた。
【００１９】
本発明によると、Ｌ−イソロイシンの生産能が向上した微生物変異株は、母菌株を突然変異させて所の変異株を選択する。この時、微生物の突然変異の誘発は、該当分野において広く知られている様々な手段により行われ得、物理的あるいは化学的突然変異の発生のいずれか１つの方法を用いることができる。例えば、本発明に適合した化学的突然変異誘発要因としてＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、ジエポキシブタン、エチルメタンスルホネート、マスタード化合物、ヒドラジン及び亜硝酸を含むが、このような化合物に限定されるものではない。また、物理的突然変異誘発要因は、紫外線及びガンマ放射線を含むことができるが、これに限定されるものではない。
【００２０】
突然変異誘発時に、母菌株は、特定大きさの生存個体群を残す程度の濃度で突然変異誘発因子により影響を受ける。前記大きさは、突然変異誘発因子の種類に応じて変化し、突然変異因子が一定の殺生率で生存個体群内に誘発する突然変異の量に依存する。例えば、ＮＴＧの場合、好ましい殺生率は、出発個体群の１０％〜５０％を概ね残さなければならない。亜硝酸による突然変異の発生は、出発個体群の０．０１％〜０．１％を概ね残さなければならず、紫外線による突然変異の発生は、略１．０％を残さなければならない。本発明の一実施例によると、Ｌ−イソロイシン生産能が向上した微生物変異株を製作するために、母菌株の突然変異を誘発するための方法としてＮＴＧを用いた。
【００２１】
本発明の一実施例では、Ｌ−イソロイシンの生産能が向上した変異株を製作するためにグルタミン酸を生産するコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１１０４０（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＫＦＣＣ１１０４０、特許文献４）を母菌株として用いた。前記母菌株に無作為突然変異を行った後、Ｌ−イソロイシン導体である４−チアイソロイシン（ｔｈｉａｉｌｅ）、イソロイシン−ヒドロキサメート（ｉｌｅＨｘ）とＬ−スレオニン誘導体であるα−アミノ−β−ヒドロキシノルバリン（ＡＨＶ）がともに添加された最小培地に塗抹し、それぞれに対して１ｍＭ、１ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌの濃度に耐性を有する共通耐性変異株を選別し、ＫＣＪＩ−３８と命名した。また、前記共通耐性変異株は、母菌株に比べてＬ−イソロイシン生産量が１３倍以上増加したことを確認した（表１参照）。前記コリネバクテリウムグルタミカム変異株（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ，ＫＣＪＩ−３８）を２０１２年１月９日付で大韓民国ソウル特別市西大門区弘濟１洞３６１−２２１番地のユリムビルに所在する国際寄託機関である韓国微生物保存センターに寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１１２４８Ｐの付与を受けた。
【００２２】
本発明の他の一実施態様として、前記変異株を培養する工程を含むＬ−イソロイシン製造方法を提供する。
好ましくは、Ｌ−イソロイシン製造方法は、前記変異株を培養した培養液からＬ−イソロイシンを回収する工程をさらに含むことができる。
【００２３】
本発明における用語「培養」とは、微生物を適当に人工的に調節した環境条件で生育させることを意味する。本発明においてＬ−イソロイシンを生産するためにコリネバクテリウムグルタミカム変異株を培養する方法は、当業界において広く知られているコリネバクテリウムグルタミカムの培養方法を用いて行うことができる。具体的には、前記培養方法の例としては、回分式培養（ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続式培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ）及び流加式培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）が含まれるが、これに限定されるものではない。このような多様な方法は、例えば、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」（非特許文献８）などに開示されている。
【００２４】
培養に用いられる培地は適切な方式で特定菌株の要件を満たさなければならない。コリネバクテリア菌株に対する培養培地は公知となっている（例えば、非特許文献９）。用いられる糖源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、澱粉、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油等のようなオイル及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これら物質は個別にまたは混合物として用いられる。用いられる窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆、小麦及び尿素、または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが含まれてもよい。窒素源も個別にまたは混合物として用いることができる。用いられるリン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウム含有塩が含まれる。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有しなければならない。それ以外に、前記物質に加えてアミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が含まれてもよい。また、培養培地に適切な前駆体が用いられてもよい。前記原料は、培養過程で培養物に適切な方式により回分式でまたは連続式で添加することができる。
【００２５】
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような基礎化合物、もしくはリン酸または硫酸のような酸化合物を用いて、適切な方式で培養物のｐＨを調節することができる。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。好気状態を維持するために培養物内に酸素または酸素含有気体（例、空気）を注入する。培養物の温度は、普通、２０℃〜４５℃である。培養は、所のＬ−イソロイシンの生成量が最大に得られるまで続ける。このような目的で普通１０〜１６０の時間で達成される。Ｌ−イソロイシンは、培養培地の中に排出されたり、細胞の中に含まれていてもよい。
【００２６】
本発明のＬ−イソロイシン製造方法は、細胞または培養物からＬ−イソロイシンを回収する工程を含む。細胞または培養物からＬ−イソロイシンを回収する方法は、当業界において知られた方法、例えば、遠心分離、濾過、アニオン交換クロマトグラフィ、結晶化及びＨＰＬＣなどが用いられるが、これら例に限定されるものではない。本発明の一実施例によると、培養物を低速遠心分離してバイオマスを除去し、得られた上澄液を液体高速クロマトグラフィを通じて分離した。
【００２７】
本発明の他の一実施態様として、コリネバクテリウムグルタミカム中から、Ｌ−イソロイシン誘導体及びＬ−スレオニン誘導体に耐性を有する変異株を選別する工程を含む、Ｌ−イソロイシン生産用コリネバクテリウムグルタミカム変異株製造方法を提供する。
【００２８】
前記母菌株であるコリネバクテリウムグルタミカムは、天然型または突然変異菌株であってもよい。
好ましくは、前記変異株は突然変異方法を行ってなされる。
【００２９】
Ｌ−イソロイシン誘導体、Ｌ−スレオニン誘導体及び突然変異の方法は、前記で説明した通りである。
本発明の変異株の製造方法は、Ｌ−イソロイシン誘導体及びＬ−スレオニン誘導体が同時に耐性を有する変異株を選別し、既存の菌株より高収率のコリネバクテリウムグルタミカム変異株を選別することができる。
【００３０】
本発明の他の一実施態様として、コリネバクテリウムグルタミカム変異株ＫＣＣＭ１１２４８ＰのＬ−イソルシンの生産用途を提供する。
［発明を実施するための形態］
以下、本発明を下記実施例により詳しく説明する。ただし、下記実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の内容が下記実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
実施例１：人工変異法による変異株選別
Ｌ−イソロイシンの生産能が向上した微生物変異株を得るために、下記の方法を用いて微生物の変異を誘導した。
【００３２】
具体的には、母菌株であるコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１１０４０（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＫＦＣＣ１１０４０、特許文献４）を活性化培地で１６時間培養し、活性化された菌株を１２１℃で１５分間滅菌した種培地に接種して１４時間培養し、その後培養液５ｍｌを回収した。回収した培養液を１００ｍｍのクエン酸緩衝溶液で洗浄した後、ＮＴＧ（Ｎ−ＭｅｔｈｙＬ−Ｎ’−ｎｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）を最終濃度２００ｍｇ／ｌになるように添加した後、２０分間処理し、１００ｍＭのリン酸緩衝溶液で洗浄した。ＮＴＧが処理された菌株を最小培地に塗抹して死滅率を求めたところ、死滅率は８５％であった。
【００３３】
４−チアイソロイシン（ｔｈｉａｉｌｅ）、イソロイシン−ヒドロキサメート（ｉｌｅＨｘ）及びα−アミノ−β−ヒドロキシノルバリン（ＡＨＶ）に対する共通耐性変異株を求めるために、前記ＮＴＧが処理された菌株をｔｈｉａｉｌｅ、ｉｌｅＨｘ、ＡＨＶの最終濃度がそれぞれ１ｍＭ、１ｍｇ／ｌ、２５ｍｇ／ｌとなるように添加された最小培地に塗抹し、３０℃で５日間培養し、ｔｈｉａｉｌｅ、ｉｌｅＨｘ及びＡＨＶの共通耐性変異株を得た。
【００３４】
前記方法で得られた変異株は、コリネバクテリウムグルタミカムＫＣＪＩ−３８（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ，ＫＣＪＩ−３８）と命名し、２０１２年１月９日付で韓国微生物保存センターに寄託して受託番号ＫＣＣＭ１１２４８Ｐの付与を受けた。
【００３５】
実施例１及び２で用いた培地の組成は、下記の通りである。
＜活性化培地＞
肉汁１％、ポリペプトン１％、ソディウムクロライド０．５％、酵母抽出物１％、寒天２％、ｐＨ７．２
＜種培地＞
ブドウ糖５％、バクトペプトン１％、ソディウムクロライド０．２５％、酵母抽出物１％、尿素０．４％、ｐＨ７．２
＜最小培地＞
ブドウ糖１．０％、硫酸アンモニウム０．４％、硫酸マグネシウム０．０４％、リン酸第１カリウム０．１％、尿素０．１％、サイアミン０．００１％、ビオチン２００μｇ／Ｌ、寒天２％、ｐＨ７．２
実施例２：Ｌ−イソロイシン生産用変異株のＬ−イソロイシンの生産性の調査
前記実施例１で得られた高濃度のｔｈｉａｉｌｅ、ｉｌｅＨｘ及びＡＨＶの共通耐性変異株であるコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＪＩ−３８（ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ）のＬ−イソロイシン生産性を確認するために、下記のような方法で培養した。
【００３６】
生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナー−バッフル付フラスコに母菌株及び前記変異株を接種した後、３０℃で６０時間２００ｒｐｍで振盪培養してＬ−イソロイシンを製造した。
【００３７】
本実施例２で用いた生産培地の組成は、下記の通りである。
＜生産培地＞
ブドウ糖１０％、酵母抽出物０．２％、硫酸アンモニウム１．６％、第１リン酸カリウム０．１％、０．１％、硫酸鉄７水塩１０ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン１水塩１０ｍｇ／ｌ、ビオチン２００μｇ／ｌ、ｐＨ７．２
培養終了後、液体高速クロマトグラフィを用いてＬ−イソロイシンの生産量を測定し、実験した各菌株に対する培養液中のＬ−イソロイシン濃度は下記表１に示した。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
その結果、前記表１に示されたように、母菌株であるコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１１０４０（特許文献４）は、０．１ｇ／ｌの濃度でＬ−イソロイシンを生産したが、本発明による変異株コリネバクテリウムグルタミカムＫＣＪＩ−３８（ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ）は、１．３ｇ／ｌの濃度でＬ−イソロイシンを生産し、母菌株に比べて約１３倍以上Ｌ−イソロイシン生産性が増加したことを確認した。
【００４０】
前記結果は、Ｌ−イソロイシン誘導体に関する耐性を有する変異株が結果的にフィードバックの阻害を受けず、Ｌ−スレオニン誘導体に対する耐性を有する変異株が前駆体の供給が円滑でＬ−イソロイシンを高効率及び高収率で生産することができることを意味する。
【図１】
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【国際調査報告】
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