(57)【要約】ポリヌクレオチド分析物中のヌクレオチド塩基の配列を決定する方法が開示される。これはａ．その少なくともいくつかが（１）単一ヌクレオチド塩基および（２）プラズモン共鳴を発生させることができるコロイド金属粒子の両方を含む液滴のストリームを生成するステップならびにｂ．各液滴に電磁放射線を照射し、（１）その中に含まれる金属粒子にプラズモン共鳴を発生させ、（２）その中に同様に含まれるヌクレオチド塩基にそのタイプに特徴的な１つ以上の波長でラマン散乱光を発生させるステップにより特徴づけられる。適切には、液滴ストリーム中の単一ヌクレオチド塩基の順序は分析物中のヌクレオチド塩基の配列に対応する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチド分析物中のヌクレオチド塩基の配列を決定する方法であって、
ａ．その少なくともいくつかが（１）単一ヌクレオチド塩基および（２）プラズモン共鳴を発生させることができるコロイド金属粒子の両方を含む液滴のストリームを生成するステップ、ならびに、
ｂ．各液滴に電磁放射線を照射し、（１）その中に含まれる金属粒子にプラズモン共鳴を発生させ、（２）その中に同様に含まれるヌクレオチド塩基にそのタイプに特徴的な１つ以上の波長でラマン散乱光を発生させるステップ
により特徴づけられる、方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）において用いられる液滴のストリームが、金属粒子の水性コロイドを含む空の液滴のストリーム中に単一ヌクレオチド塩基を挿入することにより生成されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）において用いられる液滴のストリームが、金属粒子の水性コロイドを含む空の液滴のストリームに単一ヌクレオチド塩基を含有する水性液滴の対応するストリームを合体させることにより生成されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ａ）において、液滴ストリーム中の単一ヌクレオチド塩基の順序が、分析物中のヌクレオチド塩基の配列に対応することを特徴とする、前請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
単一ヌクレオチド塩基が、ポリヌクレオチド分析物から、エキソヌクレアーゼの作用、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性、または加ピロリン酸分解のいずれかにより調製されることを特徴とする、前請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記金属が、銅、銀または金から選択されることを特徴とする、前請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記金属粒子が、５〜１００ｎｍの範囲内の平均最大寸法を有することを特徴とする、前請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記金属粒子が、１０〜５０ｎｍの範囲内の平均最大寸法を有することを特徴とする、前請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記金属粒子の表面が、前記ヌクレオチド塩基に結合するように化学修飾されることを特徴とする、前請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ポリヌクレオチド分析物が、ＲＮＡまたはＤＮＡであり、各単一ヌクレオチド塩基が、チミン、グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルからなる群から選択されることを特徴とする、前請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）において用いられる電磁放射線が、レーザー光であることを特徴とする、前請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ラマン散乱光が、ストークスシフト光であることを特徴とする、前請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ラマン散乱光が、第２電磁放射線源による前記ヌクレオチド塩基の励起を用いて生成されるアンチストークスシフト光であることを特徴とする、前請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記単一ヌクレオチドが、少なくとも１つの金属粒子の表面に化学的または物理的に結合されることを特徴とする、前請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記液滴が、それらが閉じ込められる場所まで追跡され、その場所でラマン散乱光の検出が行われることを特徴とする、前請求項のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、自然発生のＲＮＡまたはＤＮＡに由来する、ポリヌクレオチド中のヌクレオチド塩基の配列を決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝物質の次世代配列決定は、ますます高速化する配列決定装置の市場参入に伴って配列決定の単価が下落しているように、すでに一般に生物科学、とくに医学に顕著な影響を与えている。このように、１つのこうした装置では、二本鎖ＤＮＡ分析物はまず複数のより小さなポリヌクレオチド断片に分解され、そのそれぞれの一本鎖の両端は一本鎖第１オリゴヌクレオチドを不対アデニン塩基へのハイブリダイゼーションによりその相補的な両端に結合することができるようにまずアデニル化される。こうして得られる処理断片は次にサイズ選択され、それ自体が第１の相補配列である結合一本鎖第２オリゴヌクレオチドで覆われた表面上で捕捉され、実際にはさらなるハイブリダイゼーションにより表面結合二本鎖断片のライブラリを形成することができる。その後のクラスタリングステップでは、これらのライブラリ構成要素は次に、未使用の第２オリゴヌクレオチドを用いる伸長および等温架橋反応を用いて表面上で何百万回もクローン的に増幅される。これは、実際には、その鎖の１つによって表面に結合したポリヌクレオチド断片の密集体をもたらす。各断片の非結合相補鎖は次に配列決定用の結合一本鎖断片を残して除去される。配列決定段階では、これらの一本鎖断片のそれぞれはプライムされ、ポリメラーゼ連鎖反応およびジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）形態のＤＮＡの４つの特徴的なヌクレオチド塩基の混合物を用いる伸長によりその相補鎖が再形成される。各ｄｄＮＴＰタイプは異なる波長で蛍光する異なるフルオロフォアで標識される部分で末端ブロックされる。伸長反応はここで３ステップのサイクルの形態をとる；第１に、適切なｄｄＮＴＰが伸長鎖に結合され；第２に、これが含有するヌクレオチド塩基が試料を照射し、蛍光の波長を検出することにより同定され；最後に、末端ブロックおよびその関連フルオロフォアが除去され、次の伸長事象の発生を可能にする。この手段により、相補鎖の配列を塩基ごとに形成することができる。この方法は高度に自動化することができ、高精度の配列リードを生成することができるが、その処理速度は伸長サイクルの速度により制限されることが理解されるだろう。このように、実際には、この技術の使用は比較的短いポリヌクレオチド断片の並列処理およびそれから得られるさまざまなリードからの全配列のアセンブリを含む傾向がある。これは本質的にコンピュータ処理の複雑さおよび潜在的なエラーの発生につながり得る。
【０００３】
より最近では、直接配列決定方法の開発の努力がなされている。例えば、我々の係属中出願、国際公開第２００９／０３０９５３号は、とくに一本または二本鎖ポリヌクレオチド試料（例えば自然発生ＲＮＡまたはＤＮＡ）中のヌクレオチド塩基または塩基対の配列がこれをナノポアの開口部内にまたはこれに隣接して並置されたプラズモンナノ構造を備えるナノ多孔質基板を通して転位させることにより読まれる、新規高速配列決定装置について開示する。この装置では、プラズモンナノ構造は、その中で（任意で標識された）各ヌクレオチド塩基が順に光子を入射光との相互作用により特徴的に蛍光またはラマン散乱させるように誘導される、検出窓（本質的には電磁場）を画定する。こうして生成された光子はその後遠隔検出され、多重化され、その情報内容がポリヌクレオチドに関連するヌクレオチド塩基配列に特徴的であるデータストリームに変換される。この配列はその後、それと一体化したマイクロプロセッサまたはそれに付属した補助計算装置中にプログラムされた対応するソフトウェアにおいて具現化された計算アルゴリズムを用い、データストリームから回収することができる。プラズモンナノ構造およびそれらの関連共鳴特性の使用についてのさらなる背景は、例えばＡｄｖ．Ｍａｔ．２００４，１６（１９）ｐｐ．１６８５−１７０６を参照することができる。
【０００４】
ポリヌクレオチドの高速配列決定の別の装置は、例えば米国特許第６６２７０６７号、第６２６７８７２号および第６７４６５９４号に記載される。そのもっとも単純な形態では、この装置はプラズモンナノ構造の代わりに電極を用い、基板上またはナノポアの開口部中もしくは周辺の検出窓を画定する。次に電極に異なる電位が印加され、その間を流動するイオン性媒体の電気特性の変化が、ナノポアを通るポリヌクレオチドおよび関連電解質の電気泳動的転位の結果として、時間の関数で測定される。この装置では、さまざまな個別のヌクレオチド塩基が検出窓を通過する際、それらはこれを連続的に閉塞および開放する「閉塞事象」を引き起こし、電流または抵抗の特徴的な変動をもたらす。これらの変動はその後上述したような分析に適したデータストリームを生成するのに用いられる。
【０００５】
安定な液滴ストリーム、とくに微小液滴ストリームの生成は、分子生物学においてすでに用途を有するもう１つの技術開発分野である。例えば、米国特許第７７０８９４９号は安定な油中水滴を生成する新規マイクロ流体方法を開示し、例えば米国特許出願公開第２０１１／０２５０５９７号は１つの核酸テンプレート（一般的にはポリヌクレオチドＤＮＡまたはＲＮＡ断片）およびポリメラーゼ連鎖反応を用いてテンプレートを増幅させることができる複数のプライマー対を含有する微小液滴を生成するためのこの技術の利用について記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2004−290977号公報
【特許文献２】特開2004−351417号公報
【特許文献３】米国特許出願公開第2012／0122714号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第2011／0000560号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第2010／01376163号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第2010／0022414号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第2008／0003142号明細書
【発明の概要】
【０００７】
我々はここで、上述したものとは異なる、ポリヌクレオチド分析物中のヌクレオチド塩基の配列を決定する新規方法を開発した。この方法の１つの実施形態では、ともに分析される場合その順序が分析物のそれに適切に対応する液滴ストリームを含む個別の単一ヌクレオチド塩基含有液滴は、ラマン分光分析により特徴分析される。本方法の特徴は、各液滴が、単一ヌクレオチド塩基だけでなく、正しい波長の電磁放射線により刺激されるとプラズモン共鳴を発生させることができる金属粒子のコロイドも含むということである。このプラズモン共鳴は、粒子周辺および液滴中に強い電磁場を生成し、その中に含まれる特定のヌクレオチド塩基による入射光のラマン散乱を増強させるように機能する。
【０００８】
よって、本発明によると、ポリヌクレオチド分析物中のヌクレオチド塩基の配列を決定する方法であって、
ａ．その少なくともいくつかが（１）単一ヌクレオチド塩基および（２）プラズモン共鳴を発生させることができるコロイド金属粒子の両方を含む液滴のストリームを生成するステップ、ならびに
ｂ．各液滴に電磁放射線を照射し、（１）その中に含まれる金属粒子にプラズモン共鳴を発生させ、（２）その中に同様に含まれるヌクレオチド塩基にそのタイプに特徴的な１つ以上の波長でラマン散乱光を発生させるステップ
により特徴づけられる、方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【０００９】
本発明の方法のステップ（ａ）では、その少なくともいくつかが単一ヌクレオチド塩基およびプラズモン共鳴を発生させることができる金属粒子のコロイドの両方を含む液滴のストリームが生成される。好適には、液滴ストリーム中の単一ヌクレオチド塩基の順序は、分析物中の配列に対応する。一般的には、液滴は水性であり、液滴ストリームは炭化水素またはシリコーン油のような非混和性担体溶媒中に維持される。所定の液滴が２つ以上の単一ヌクレオチド塩基を含有するというリスクを回避するため、ヌクレオチド塩基は、各充填液滴が１〜２０、好適には２〜１０個の空の液滴で離されるような割合で組み込むことが好ましい。その後充填液滴および溶媒のストリームは、流路、適切にはマイクロ流体流路に沿って、液滴が離散状態に維持され、互いに合体する機会を持たないような割合および方法で流動させる。適切には、用いられる液滴は、１００ミクロン未満、好適には５０ミクロン未満、より好適には２０ミクロン未満、さらにより好適には１５ミクロン未満の直径を有する。すべてのそれらの直径のうち、２〜２０ミクロンの範囲内がもっとも好適である。任意で、液滴は、望ましくないエマルジョンの形成を防止し、表面張力を向上させる追加成分を含有してもよい。一般的には、単一ヌクレオチド塩基は、自然発生ポリヌクレオチド分析物、好適には自然発生のＲＮＡまたはＤＮＡに由来するものであるが、他の天然または合成類似体中で通常見られない成分を用いることもできる。
【００１０】
ステップ（ａ）の１つの実施形態では、整列した液滴ストリームは、単一ヌクレオチド塩基のストリームを金属粒子の水性コロイドおよびいずれかの任意の添加物のみからなる対応する「空」液滴のストリーム中に導入することにより形成される。この導入は、例えば、単一ヌクレオチド塩基を含有する第２整列液滴ストリームを形成し、２つのストリーム中の対応する液滴を両方の成分を含有するより大きな液滴の単一ストリームに順次合体させることにより行うことができる。あるいは、単一ヌクレオチド塩基は、捕捉して、コロイドを含む連続液滴中に塩基ごとに注入することができる。
【００１１】
単一ヌクレオチド塩基のストリームそのものについて、これは適切には、各ヌクレオチド塩基を解放され次第連続的に除去する流動水性媒体中で、例えば、それに対するエキソヌクレアーゼの作用により、ポリヌクレオチド分析物から生成してもよい。あるいは、単一ヌクレオチド塩基は、解放されたヌクレオチド塩基が反応ゾーンから連続的に除去され、従来のポリメラーゼ連鎖反応の逆反応の構築を回避する条件下、高濃度のピロリン酸アニオンの存在下での加ピロリン酸分解により、ポリヌクレオチド分析物から生成することができる。この加ピロリン酸分解反応は、好適には、酵素を含む水性反応媒体の存在下、２０〜９０℃、好適には５０〜７５℃の範囲内の温度で行われる。好適には、単一ヌクレオチド塩基が反応ゾーンから連続的に除去されるように、非平衡流の条件下で行われる。もっとも好適には、反応は、酵素を含有する水性緩衝媒体に分析物が結合した表面上を連続的に流動させることにより行われる。
【００１２】
この第２実施形態において用いられる酵素は、適切には分析物の漸進的な３’−５’ピロリン酸分解を引き起こし、高い選択性および適度な反応速度でデオキシリボヌクレオチド三リン酸をもたらすことができるものである。適切には、この分解反応は、できるだけ迅速に、例えば毎秒１〜５０個以上のヌクレオチドの範囲内の速度で行われる。ポリヌクレオチドに適用されるような加ピロリン酸分解反応についてのさらなる情報は、例えばＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４（１９６９）ｐｐ．３０１９−３０２８を参照することができ、その関連主題は、本明細書に参照により組み入れる。酵素は、適切には、反応条件下で本質的にエキソヌクレアーゼ活性もエンドヌクレアーゼ活性も示さないポリメラーゼからなる群から選択される。有利に用いることができるポリメラーゼの例としては、これらに限定されないが、大腸菌（例えばクレノウ断片ポリメラーゼ）、テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（例えばＴａｑ  Ｐｏｌ）ならびにバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・カルドベロックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ）およびバチルス・カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）のような細菌から得られる原核生物ｐｏｌ１型酵素または酵素誘導体が挙げられる。適切には、ピロリン酸分解は、ピロリン酸アニオンおよびマグネシウムカチオンを好適にはミリモル濃度でさらに含む媒体の存在下で行われる。
【００１３】
好適には、コロイドを含む金属粒子は、銅、銀、金またはこれらの金属の相互または他の金属との適切な錯体からなる。これらの粒子は、いずれの形状を有してもよく、適切には、２５００ｎｍ未満、好適には１５０ｎｍ未満、例えば５〜１００ｎｍ、もっとも好適には１０〜５０ｎｍの範囲内の平均最大寸法を有する。適切には、水性液滴中の金属粒子の濃度は、（１）コロイドがその使用条件下で安定なままであり、（２）金属粒子のプラズモン共鳴特性が悪影響を受けないことを前提として可能な限り高い。好適な実施形態では、ほぼ球状の金粒子のコロイドが用いられ、これは塩化金酸のような金塩の例えばクエン酸塩、ヒドロキノンまたはグルコースのような糖での還元により便利に生成することができる。この反応を行う方法は、当技術分野において周知であり、実際にこの方法で生成される金コロイドは、商業的に容易に入手可能である。一般的には、金属粒子の表面は、金属粒子のように反発し、凝集を防止するイオンシースで覆われている。例えば、粒子が金塩のクエン酸ナトリウム還元により生成される場合、関連表面電荷は、（吸着したクエン酸アニオンから）マイナスとなり、周りの水相中には電荷のバランスをとるナトリウムカチオンが存在する。この表面電荷は、ヌクレオチド塩基を粒子に結合させるのを補助するのに用いることができるが、表面は、所望に応じてヌクレオチド塩基の特異的かつより強力な結合部位をもたらすため、さらに化学修飾することもできると考えられる。
【００１４】
プロセスのステップ（ｂ）では、ステップ（ａ）において生成された各液滴に電磁放射線が照射され、金属粒子にプラズモン共鳴を発生させる。適切には、電磁放射線源は、レーザーにより生成されるもののような高強度単色光源である。この目的は、ラマン散乱信号を増強させることである。１つの実施形態では、この照射は、油中液滴のマイクロ流体ストリームを各液滴が順に比較的短い時間放射線に露出する「検出窓」に通すことにより、動的に行われ得る。あるいは、好適には、ステップ（ａ）からの液滴は、適切にはそれらをほぼ無期限に保持することができる捕捉場所まで、例えばチャンバーまたはチャネル中での物理的閉じ込めにより追跡される。この方法の利点は、液滴を潜在的により長期間照射することができ、使用者が所定の液滴が実際にヌクレオチド塩基を含有することに満足できることである。この方法は、液滴流量が例えば毎秒５０〜３０００、好適には１００〜２０００液滴の範囲内と高い場合、とくに有用である。
【００１５】
ヌクレオチド塩基が発生させるラマン散乱光は、分析物を構成するさまざまなヌクレオチド塩基タイプに特徴的な１つ以上の波長で検出される。よって、分析物がＤＮＡである場合、１つの可能性としては４つの波長が選択され、そのそれぞれは構成要素のアデニン、チミン、グアニンおよびシトシン塩基の振動モードに特有の特徴を有する。追加の波長の検出も、修飾ヌクレオチド塩基の特徴分析、例えばメチル化を可能にするのに用いることができる。別の実施形態では、各ヌクレオチドは、信頼できる検出を確保するため複数の波長で検出してもよい。一般的には、この検出が行われる波長は、λd値を有し、
λd  = λe + λb  （ストークスシフト）
λd  = λe - λb （アンチストークスシフト）
であり、λｅは（一般的には可視または近紫外線で発生する）入射光の波長であり、λbは（一般的には赤外線で発生する）塩基の特徴的な振動モードを有する波長である。１つの実施形態では、検出は、ストークスシフト散乱光について行われる。一般的には、ラマン散乱光の量を検出および定量化するのに光検出器または光子計数器が用いられる。本発明の別の実施形態では、ステップ（ｂ）は、ヌクレオチド塩基が金属粒子の少なくとも１つに付着した場合行われ、ラマン散乱光はいわゆる表面増強ラマン分光分析効果（ＳＥＲＳ）により増幅される。あるいは、アンチストークスシフト散乱光を検出することが可能であるが、こうした方法では、単一ヌクレオチド塩基は、まず正しい波長の第２電磁放射線源により低位励起振動状態まで吸い上げる必要がある。上述したすべての実施形態において、液滴が所定の場所まで追跡される場合、さまざまな場所を連続的に調査して出力を得ることができ、これはコンピュータ処理により配列リストに変換することができる。
【００１６】
一般的には、ラマン散乱により検出されるヌクレオチド塩基の振動モードは、同位相環呼吸振動に関連するものである。これは、チミンでは４８５〜５０５ｃｍ−１、グアニンでは６７５〜６９０ｃｍ−１、シトシンでは７７５〜８００ｃｍ−１、アデニンでは７２４〜７３２ｃｍ−１の周波数シフトで起こる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本発明の液滴配列決定方法をここで装置を参照して例示する。
【図１】それぞれ単一ヌクレオチド塩基およびコロイド金を含有する水性液滴が形成および検出される配列決定装置を概略的に示す。
【００１８】
ヒトＤＮＡに由来する１００ヌクレオチド塩基ポリヌクレオチド分析物から得られる単一ヌクレオチド塩基を含有する水性ストリーム１は、直径１０ミクロンのマイクロ流体チューブを通って流動する。単一ヌクレオチド塩基そのものは、チューブの内面に付着した分析物をクレノウ断片エキソヌクレアーゼで消化することにより調製されるデオキシリボヌクレオチド一リン酸の形態である。ストリーム中の単一ヌクレオチド塩基の順序は、よって分析物中のそれらの配列に対応する。１は、液滴ヘッド２から第１チャンバー３に入り、ここで軽質シリコーン油４の１つ以上のストリームと接触する。これらのストリームの速度は、乱流混合を回避し、それぞれ約８ミクロンの直径を有する油中に懸濁した実質的に水性の球状液滴５をもたらすように選択される。５のストリームは、次に同じ直径の第２マイクロ流体チューブに沿って毎秒１０００液滴の割合で、５ミクロンの水性球状液滴７の第２ストリームも第２液滴ヘッド８を用いて供給される第２チャンバー６まで推進させる。液滴７は、球状金粒子（平均最大寸法１０ｎｍ、濃度５ｍｇ／ｍｌ）の水性コロイドを含み、５と順次合体させ、直径約９ミクロンの肥大した水性液滴９が形成される。液滴９は、次に容器１０まで送達され、ここでそれらの進行は一連の部位１１ａの１つに到達するまで追跡され、ここでそれらは分析されるまで保持される（１１ｂ）。一般的には、分析はすべての部位が充填された後、または分析物のすべてが消費された後に行われる。
【００１９】
次に、アレイ中の各液滴は、正しい順序で高強度レーザー光（例えばＮｄ：ＹＡＧレーザーからの５３２ｎｍ波長光）によって照射され、ラマン散乱ストークシフト光はＤＮＡの４つのヌクレオチド塩基タイプに特徴的な上記入射レーザー光からの波長シフトで作動する光検出器により検出される。受信した情報から、単一ヌクレオチド塩基は各液滴中で同定され、空の液滴からの無応答は除外される。次いで、結果は、分析物の元のヌクレオチド塩基配列を再形成するようプログラムされたコンピュータにより処理される。所望に応じ、照射および検出の複数のサイクルを液滴のアレイ全体にさまざまなインターバルで行うことができ、これを平均して信号対雑音比、したがって結果の信頼性を向上させることができる。
【図１】
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【国際調査報告】
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