(57)【要約】  本発明は、ヘモグロビン（Ｓ）のアロステリック修飾のための医薬組成物、並びにヘモグロビン（Ｓ）により媒介される疾患並びに組織及び／又は細胞の供給により利益を受けるであろう疾患の治療におけるそれらの使用方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
表１中の化合物からなる群から選択される化合物約１ｍｇ〜約１０ｇと、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤とを含む組成物。
【請求項２】
前記化合物が表１中の化合物１２である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
血液と、表１中の化合物からなる群から選択される１種以上の化合物とを含む血液組成物であって、
前記血液が赤血球と血漿とからなり、
前記血液中の前記１種以上の化合物の少なくとも２０％が生理的条件下で前記赤血球に結合している、組成物。
【請求項４】
前記１種以上の化合物の少なくとも３０％が前記赤血球に結合している、請求項３に記載の血液組成物。
【請求項５】
前記１種以上の化合物の少なくとも５０％が前記赤血球に結合している、請求項３に記載の血液組成物。
【請求項６】
前記１種以上の化合物の少なくとも８０％が前記赤血球に結合している、請求項３に記載の血液組成物。
【請求項７】
前記１種以上の化合物の少なくとも９０％が前記赤血球に結合している、請求項３に記載の血液組成物。
【請求項８】
前記組成物が表１中の化合物１２である、請求項３に記載の血液組成物。
【請求項９】
前記赤血球の少なくとも一部が鎌状化し、前記ヘモグロビンの少なくとも一部が前記化合物に結合している、請求項３に記載の血液組成物。
【請求項１０】
前記血液がヘモグロビンを含まない又は実質的に含まない、請求項３に記載の血液組成物。
【請求項１１】
血液と、表１中の化合物からなる群から選択される１種以上の化合物とから形成される付加物を含む血液組成物であって、
前記血液が赤血球と血漿とからなり、
前記付加物が定常状態条件下、ｉｎ  ｖｉｖｏで血管空間と血管外空間との間に分布し、
前記１種以上の化合物の少なくとも一部が前記血管空間内に前記付加物の一部として残存する、
血液組成物。
【請求項１２】
前記１種以上の化合物の少なくとも２０％が前記血管空間内に前記付加物の一部として残存する、請求項１１に記載の血液組成物。
【請求項１３】
前記１種以上の化合物の少なくとも４０％が前記血管空間内に前記付加物の一部として残存する、請求項１１に記載の血液組成物。
【請求項１４】
前記１種以上の化合物の少なくとも６０％が前記血管空間内に前記付加物の一部として残存する、請求項１１に記載の血液組成物。
【請求項１５】
前記１種以上の化合物の少なくとも８０％が前記血管空間内に前記付加物の一部として残存する、請求項１１に記載の血液組成物。
【請求項１６】
前記１種以上の化合物の少なくとも９５％が前記血管空間内に前記付加物の一部として残存する、請求項１１に記載の血液組成物。
【請求項１７】
前記組成物が表１中の化合物１２である、請求項１１に記載の血液組成物。
【請求項１８】
治療を必要とする対象を治療する方法であって、請求項１に記載の医薬組成物を有効量、前記対象に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘモグロビン（Ｓ）のアロステリック修飾のための医薬組成物、並びにヘモグロビン（Ｓ）により媒介される疾患並びに組織及び／又は細胞の酸素供給により利益を受けるであろう疾患の治療におけるそれらの使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
鎌状赤血球症は、特にアフリカ系及び地中海系の人々に見られる赤血球の疾患である。鎌状赤血球症の根本は鎌状ヘモグロビン（ＨｂＳ又はヘモグロビン（Ｓ））にあり、それはヘモグロビン（Ｈｂ）の優勢なペプチド配列に対して点突然変異を含む。
【０００３】
ヘモグロビン（Ｈｂ）は、肺から体中の種々の組織及び器官に酸素分子を運ぶ。ヘモグロビンは、配座変化により酸素と結合したり、酸素を放出したりする。鎌状ヘモグロビン（ＨｂＳ）は、グルタミン酸がバリンにより置換されている点突然変異を含み、ＨｂＳが重合を起こしやすく、その特徴的な鎌状の形状を有するＨｂＳを含む赤血球を与える。鎌状の細胞は、正常な赤血球より堅くもあり、柔軟性がないので血管の閉塞につながることがある。米国特許第７，１６０，９１０号明細書は、ヘモグロビンのアロステリック修飾剤である化合物を開示している。しかし、Ｈｂ又はＨｂＳなどの異常なＨｂにより媒介される疾患を治療できる追加の治療剤が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、全般的には、ヘモグロビン（Ｓ）のアロステリック修飾剤として好適な組成物に関する。いくつかの態様において、本発明は、ヘモグロビン（Ｓ）により媒介される疾患並びに組織及び／又は細胞の酸素供給により利益を受けるであろう疾患を治療する方法に関する。
【０００５】
他の態様では、本発明は、表１中の化合物からなる群から選択される化合物約１ｍｇ〜約１０ｇと、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤とを含む医薬組成物に関する。
【０００６】
さらに他の態様では、本発明は、血液と、表１中の化合物からなる群から選択される１種以上の化合物とを含む血液組成物に関し、前記血液は赤血球と血漿とからなり、血液中の前記１種以上の化合物の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％が、生理的条件下でヘモグロビン（Ｓ）を含有する赤血球に結合する。
【０００７】
本発明の他の態様では、表１中の化合物と血液とを含む血液組成物を提供し、前記血液はヘモグロビンを含む赤血球を含み、ヘモグロビンの少なくとも一部はヘモグロビン（Ｓ）であり、前記ヘモグロビン（Ｓ）の少なくとも一部は前記化合物との付加物として存在する。
【０００８】
本発明の別の態様では、ヘモグロビン（Ｓ）と、表１中の化合物からなる群から選択される化合物との付加物が本明細書で提供される。
【０００９】
好ましい実施形態では、赤血球及びＨｂ−Ｓとの付加物中に存在する、表１からなる群から選択される化合物は、定常状態条件下で、化合物の少なくとも一部が血管空間内に前記付加物の一部として残存するような、血管空間と血管外空間との分布容積を有する。一
態様では、前記化合物の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％が血管空間内に前記付加物の一部として残存する。
【００１０】
図１は、高い経口バイオアベイラビリティ、持続的暴露、及び、ＧＢＴ４４０を単回投与した後の劇的なＲＢＣ分配をグラフで示す。関連する特定の薬物動態学的パラメーターを下記の表に示す。
【００１１】
【表１】
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【００１２】
別の態様では、本発明は、治療を必要とする対象を治療する方法であって、対象に本発明の医薬組成物を有効量投与することを含む方法に関する。本明細書で使用する場合、対象は哺乳動物、例えば霊長類、好ましくはヒトを指す。
【００１３】
本発明の前述の態様及び他の態様について以下に詳述する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】高いｉｎ  ｖｉｖｏ経口バイオアベイラビリティ、持続的暴露、及びＧＢＴ４４０を単回投与した後の高いＲＢＣ分配を示すグラフである。
【図１Ｂ】高いｉｎ  ｖｉｖｏ経口バイオアベイラビリティ、持続的暴露、及びＧＢＴ４４０を単回投与した後の高いＲＢＣ分配を示すグラフである。
【図１Ｃ】高いｉｎ  ｖｉｖｏ経口バイオアベイラビリティ、持続的暴露、及びＧＢＴ４４０を単回投与した後の高いＲＢＣ分配を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義
本明細書及び添付される特許請求の範囲では、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、及び「ｔｈｅ（その）」が複数の指示対象を含むことに留意されたい。そのため、例えば、「１種の溶媒」への言及は、複数のそのような溶媒を含む。
【００１６】
本明細書では、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、その組成物及び方法が列挙された要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味するものとする。組成物及び方法の定義に使用される「〜から本質的になる」は、述べられた目的のための組み合わせにとって本質的な重要性のある他の要素を除外することを意味するものとする。そのため、本明細書に定義される要素から本質的になる組
成物又はプロセスならば、特許請求される発明の基本的で新規な特性に実質的に影響しない他の材料又は工程を除外しないであろう。「〜からなる」は、微量元素を超える他の成分及び実質的な方法工程を除外することを意味するものとする。これらの移行語のそれぞれにより定義される実施形態は、本発明の範囲内にある。
【００１７】
特記されない限り、明細書及び特許請求の範囲中で使用される成分、反応条件などの量を表す全数字は、全ての場合で用語「約」により修飾されていると理解すべきである。したがって、そうでないと示されない限り、以下の明細書及び添付される特許請求の範囲に述べられる数値パラメーターは近似値である。各数値パラメーターは、報告される有効桁数に照らして、通常の丸め技術を適用して、少なくとも解釈されるべきである。数値の名称、例えば、範囲を含む、温度、時間、量、及び濃度の前に使用される用語「約」は、（＋）又は（−）１０％、５％、又は１％変動し得る近似値を示す。
【００１８】
用語「薬学的に許容できる」は、インビボの、好ましくはヒトの投与に安全で非毒性であることを指す。
【００１９】
用語「薬学的に許容できる塩」は、薬学的に許容できる塩を指す。
【００２０】
用語「塩」は、酸と塩基の間に形成されるイオン性化合物を指す。本明細書に提供される化合物が酸性官能基を含む場合、そのような塩には、非限定的に、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、及びアンモニウム塩がある。本明細書では、アンモニウム塩には、プロトン化された窒素塩基及びアルキル化窒素塩基を含む塩がある。薬学的に許容できる塩に有用な例示的で非限定的なカチオンには、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、ＮＨ４、Ｃａ、Ｂａ、イミダゾリウム、及び天然アミノ酸に基づくアンモニウムカチオンがある。本明細書に利用される化合物が塩基性官能基を含む場合、そのような塩には、非限定的に、カルボン酸及びスルホン酸などの有機酸の塩、並びにハロゲン化水素、硫酸、リン酸などの鉱酸の塩がある。薬学的に許容できる塩に有用な例示的で非限定的なアニオンには、オキサラート、マレアート、アセタート、プロピオナート、スクシナート、タルトラート、クロリド、スルファート、バイスルファート、一塩基性、二塩基性、及び三塩基性ホスファート、メシラート、トシラートなどがある。
【００２１】
「全血」という用語は、その全ての天然構成要素、成分、若しくは要素、又はかなりの量の天然構成要素、成分、若しくは要素を含有する血液を指す。例えば、対象に血液を投与する前に、精製プロセスにより一部の成分を除去することも考えられる。
【００２２】
用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本明細書では、疾病若しくは病態又はその１つ以上の症状を軽減、減少、又は改善すること、追加の症状を予防すること、症状の根源的な代謝的な原因を改善又は予防すること、疾病若しくは病態を阻害すること、例えば、疾病若しくは病態の進展を停止又は抑制すること、疾病若しくは病態を緩和すること、疾病若しくは病態の後退を起こすこと、疾病若しくは病態により起こった状態を緩和すること、又は疾病若しくは病態の症状を抑制することを含み、予防を含むものとする。その用語は、疾病又は病態を緩和すること、例えば、臨床症状の後退を起こすことも含む。その用語は、治療効果及び／又は予防効果を達成することも含む。治療効果とは、治療される根源的な疾患の根絶又は改善を意味する。また、治療効果は、個人が根源的な疾患にまだ悩んでいるにもかかわらず改善が個人に観察されるように、根源的な疾患に関連する１つ以上の生理学的症状の根絶又は改善により達成される。予防効果のためには、組成物は、特定の疾病を起こす危険性のある個人に、又は疾病の１つ以上の生理学的症状を報告している個人に、この疾病の診断がまだなされていないとしても投与される。
【００２３】
用語「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」又は「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、疾病又は疾患を得る危険性の低減を指す（すなわち、疾病に曝されるか、又は罹りやすい可能性があるが、その疾病の症状を経験していないか、又は示していない対象に、疾病の臨床的症状の少なくとも１つが起こらないようにする）。その用語は、例えば、そのような疾病又は疾患を患う危険性がある対象に、臨床症状が起こらないようにし、それにより実質的に疾病又は疾患の発症を回避することをさらに含む。
【００２４】
用語「有効量」は、本明細書に記載される化合物又は組成物の鼻腔内投与による、病態又は疾患の治療のために有効な量を指す。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物又は剤形のいずれかの有効量は、ヘモグロビンにより媒介される疾患又は組織及び／若しくは細胞の酸素供給により利益を受けるであろう疾患を治療するために利用される、その必要のある対象への本明細書に記載される組成物又は剤形のいずれかの量である。
【００２５】
本明細書の用語「担体」は、細胞、例えば、赤血球又は組織への化合物の組み込みを促進する比較的非毒性の化学化合物又は作用物質を指す。
【００２６】
化合物
本明細書で使用される化合物は、下記の表１又はそのＮ−オキシド、又はそのそれぞれの薬学的に許容される塩から選択される。後述の化合物のＮ−オキシドは新規であると考えられ、Ｎ−オキシド化合物及びそれらの塩はそれぞれ本発明の別の実施形態を形成する。
【００２７】
表１中の化合物は、以下に限定されるものではないが、赤血球と血漿との間の分配、分布容積、酸素平衡曲線、酸素親和性及び重合活性などの１つ以上の生物学的パラメーターに基づいて測定される１つ以上の生物学的活性基準を満たすことができる化合物である。
【００２８】
【表２】
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【００２９】
【表３】
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【００３０】
【表４】
2016512821.tif 000006
【００３１】
【表５】
2016512821.tif 000007
【００３２】
【表６】
2016512821.tif 000008
【００３３】
【表７】
2016512821.tif 000009
【００３４】
【表８】
2016512821.tif 000010
【００３５】
【表９】
2016512821.tif 000011
【００３６】
【表１０】
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【００３７】
【表１１】
2016512821.tif 000013
【００３８】
【表１２】
2016512821.tif 000014
【００３９】
【表１３】
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【００４０】
【表１４】
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【００４１】
好ましい実施形態では、化合物は化合物１２である。
【００４２】
医薬組成物
本発明のさらなる態様において、本明細書に記載される化合物のいずれか及び少なくとも１種の薬学的に許容できる賦形剤を含む組成物が提供され、表１の化合物は、１ｍｇ〜１０ｇの量で組成物中に存在する。
【００４３】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される化合物のいずれか及び薬学的に許容できる賦形剤を含む組成物を提供する。
【００４４】
そのような組成物は、様々な投与経路用に製剤できる。経口送達に好適な組成物が恐らく最も頻繁に使用されるであろうが、利用可能な他の経路には、経皮、静脈内、動脈内、肺、直腸、鼻腔内、膣内、舌、筋肉内、腹腔内、皮内、頭蓋内、及び皮下経路がある。本明細書に記載される化合物のいずれかの投与に好適な剤形には、錠剤、カプセル、丸剤、散剤、エアゾール剤、坐剤、非経口薬品、並びに懸濁剤、液剤、及び乳剤を含む経口液剤がある。持続放出剤形も、例えば、経皮パッチ形態で使用できる。剤形は全て、当技術分野において標準的である方法を利用して調製できる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄ．，Ａ．Ｏｓｌｏ  ｅｄｉｔｏｒ，Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．１９８０を参照されたい）。
【００４５】
薬学的に許容できる賦形剤は、非毒性であり、投与を助け、本発明の化合物の治療効果に悪影響を与えない。そのような賦形剤は、どのような固体、液体、半固体でもよく、エアゾール組成物の場合、一般的に当業者に利用可能である気体の賦形剤でもよい。本発明による医薬組成物は、当技術分野に公知である方法を利用して従来の手段により調製される。
【００４６】
本明細書に開示される組成物は、医薬調製物に通常利用されるビヒクル及び賦形剤、例えば、タルク、アラビアゴム、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、ココアバター、水性又は非水性溶媒、油類、パラフィン誘導体、グリコールなどのいずれとも一緒に利用できる。着色剤及び着香剤を、調製物に、特に経口投与用の調製物に加えることもできる。液剤は、水、又はエタノール、１，２−プロピレングリコール、ポリグリコール、ジメチルスルホキシド、脂肪族アルコール、トリグリセリド、グリセリンの部分エステルなどの生理学的に適合する有機溶媒を使用して調製できる。
【００４７】
固体の医薬賦形剤には、スターチ、セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアラート、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルクなどがある。液体及び半固体の賦形剤は、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール、及び、石油系、動物系、植物系、又は合成の油を含む種々の油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などから選択できる。特定の実施形態において、本明細書に提供される組成物は、α−トコフェロール、アラビアゴム、及び／又はヒドロキシプロピルセルロースの１つ以上を含む。
【００４８】
一実施形態において、本発明は、有効量の本明細書に提供される化合物を含む、薬物デポ（ｄｒｕｇ  ｄｅｐｏｔｓ）又はパッチなどの持続放出製剤を提供する。別の実施形態において、パッチは、α−トコフェロールが存在する状態で、アラビアゴム又はヒドロキシプロピルセルロースを別々に、又は組み合わせてさらに含む。好ましくは、ヒドロキシプロピルセルロースは、１０，０００から１００，０００の平均ＭＷを有する。より好ましい実施形態において、ヒドロキシプロピルセルロースは、５，０００から５０，０００の平均ＭＷを有する。
【００４９】
本発明の化合物及び医薬組成物は、単独でも、他の化合物との組み合わせでも使用できる。他の薬剤と共に投与される場合、共投与は、両方の薬理学的効果が同時に患者において明らかであるようなどのような方法でもよい。そのため、共投与は、単一の医薬組成物、同じ剤形、又は同じ投与経路ですら、本発明の化合物と他の薬剤の両方の投与に利用されることを必要とせず、２つの薬剤が正確に同時に投与されることも必要でない。しかし、共投与は、最も簡便には、同じ剤形及び同じ投与経路により、実質的に同時に達成されるであろう。明らかに、そのような投与は、本発明による新規な医薬組成物において両有効成分を同時に送達することにより、最も好都合に進行する。
【００５０】
本発明の他の態様では、表１から選択される化合物がヘモグロビンＳに結合している１種以上の付加物が考えられる。一実施形態では、付加物は、化合物１２とヘモグロビンＳとから生成する。
【００５１】
治療方法
本発明は、赤血球の酸素運搬能を向上させる方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、赤血球又は全血をｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ又はｅｘ
ｖｉｖｏで、本発明の１種以上の化合物又は医薬組成物を用いて処理する方法であって、前記１種以上の化合物又は医薬組成物を投与すること、又はそれらを血液、とりわけヘモグロビン（Ｓ）を含有する血液と接触させることによる方法に関する。
【００５２】
幾つかの実施形態では、本発明の化合物及び医薬組成物をｅｘ  ｖｉｖｏで貯蔵する及び／又は使用する方法が考えられ、本方法では、以下に限定されるものではないが、自己血輸血又は非自己血輸血、冠動脈バイパス手術、及び、対象に血液を灌流及び／又は再灌流することを含む任意の体外処置などの処置に使用される全血と、化合物及び／又は医薬組成物を混合する。特定の実施形態では、化合物及び／又は医薬組成物は、貯蔵するために全血と混合することができる。
【００５３】
本方法の別の態様では、本発明は、本発明の医薬組成物を有効量、対象に投与することにより、治療を必要とする対象（例えば、鎌状赤血球貧血）を治療する方法に関する。好ましい一態様では、医薬組成物は、表１の１種又は複数種の化合物を１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇ、より好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日含む。
【００５４】
本発明の複数の態様では、対象の体内のヘモグロビンＳの酸素親和性を増加させる方法を提供し、本方法は、治療を必要とする対象に本発明の医薬組成物、又は表１の１種以上の化合物を含む血液組成物を治療有効量投与することを含む。好ましい実施形態では、血液組成物はヘモグロビン（Ｓ）を含まない。
【００５５】
本発明の複数の態様では、酸素欠乏症に伴う症状を治療する方法を提供し、本方法は、治療を必要とする対象に前述の医薬組成物又は血液組成物を治療有効量投与することを含む。
【００５６】
本発明の他の態様では、鎌状赤血球貧血に関連する酸素欠乏症を治療する方法を提供し、本方法は、治療を必要とする対象に前述の医薬組成物又は血液組成物を治療有効量投与することを含む。
【００５７】
さらに、本発明の化合物及び医薬組成物を全血又は濃厚赤血球（ｐａｃｋｅｄ  ｃｅｌｌｓ）に、好ましくは、貯蔵時に又は輸血時に添加することができる。幾つかの実施形態では、化合物及び医薬組成物を全血又は赤血球画分に、適切なリザーバを使用して閉鎖系で添加することができ、その中に貯蔵前に化合物又は医薬組成物が入れられるか、又はそれは採血バッグ内の抗凝固溶液中に存在する。
【００５８】
合成方法
表１の化合物の合成は、米国特許出願第６１／６６１，３２０号明細書及び米国特許出願第６１／５８１，０５３号明細書に記載されており、これらはそれぞれ、これらの化合物の合成を説明するためだけに、参照によりその内容全体が本明細書に援用される。
【実施例】
【００５９】
本発明の様々な実施形態を説明するために、以下の実施例を記載する。それらは決して本発明を限定するものではない。本発明は、目的を遂行し、前述の目標を達成し、利点を得るのによく適合し、さらに本明細書に固有の目的を遂行し、目標を達成し、利点を得るのにもよく適合していることが当業者には分かるであろう。本実施例（並びに本明細書に記載の方法）は、好ましい実施形態を現在代表するものである。それらは例示的であって、本発明の範囲を限定するものではない。変更及び他の使用は特許請求の範囲によって定義される本発明の精神に包含され、当業者はそれらを想到するであろう。
【００６０】
実施例１
本発明で提供される化合物は、ヘモグロビンのアロステリック修飾剤である。このようなものとして、これらの化合物は赤血球を単独で修飾するものではない。代わりに、表１
の化合物が存在すると、ヘモグロビンの濃度に対する赤血球の反応が増加する。表１の化合物はヘモグロビンの機能を向上させることができるため、赤血球に対して効果があると予想される。
【００６１】
化合物の薬物動態学的（ＰＫ）特性を評価するために、この実験を確立し、使用した。
【００６２】
試料採取及びデータ解析：ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、雄性、８〜１２週齢）に、化合物１２、化合物２２又は化合物２３に対応する３類の化合物の１つを投与した。ラットに経口（１０ｍｇ／ｋｇ）用量又は静脈内（１ｍｇ／ｋｇ）用量の化合物を投与した。実験前にラットを終夜絶食させ、２時間のサンプリング時点の後に食餌を与えた。
【００６３】
様々な時点で血液試料を回収した。血液を３．２％ＴＳＣ（クエン酸三ナトリウム）で抗凝固処理し、一部を遠心分離及び血球の除去により血漿画分に分離した。血漿及び溶解した血液試料の薬物濃度をＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して分析した。ＰＫパラメーターは、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して濃度−時間特性の非コンパートメント解析により算出した。見掛けの消失半減期（ｔ１／２）値は、ｌｎ（２）／ｋとして算出した。血中濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ）値は線形台形法を用いて推定した。ＡＵＣｌａｓｔ値は、投与時間から測定可能な最終濃度まで算出した。ＡＵＣｉｎｆ値は、対応するＡＵＣｌａｓｔの合計及びｋで除した検出可能な最終濃度の比として算出される。血漿クリアランス（Ｃｌ）は用量／ＡＵＣｉｎｆから算出される。定常状態における分布容積（Ｖｓｓ）は、平均滞留時間ｉｎｆ×Ｃｌｓｓから算出される。最高濃度（Ｃｍａｘ）及びＣｍａｘ到達時間（Ｔｍａｘ）を観測値として記録した。各実験時点の血液／血漿分配比を算出した。
【００６４】
結果：表２は、後述の化合物の選択されたＰＫパラメーターを要約する。
【００６５】
【表１５】
2016512821.tif 000017
【００６６】
化合物１２の分布容積は０．１４Ｌ／ｋｇであり、これは、ラットでは化合物１２が血管外空間にあまり分布していない（対照正常（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｎｏｒｍａｌ）Ｖｚ＝０．１Ｌ／ｋｇ）ことを示す。２種類の関連化合物では比較的高いＶｓｓ（化合物２２及び化合物２３、それぞれ３．１及び３．１５）が認められ、これらの化合物は化合物１２よりも血管外空間及びその他のコンパートメントに分布し易いことを示す。
【００６７】
しかし、赤血球コンパートメントを考慮すると、化合物１２は意外にも化合物２２又は化合物２３よりもはるかに多く血液中に分配される。化合物を経口投与する場合、ピーク
濃度（Ｃｍａｘ）における血液中の相対比（血漿と比較した場合）は、化合物１２（２１倍）の方が化合物２２（５倍）又は化合物２３（３倍）よりずっと高かった。ピーク濃度で赤血球／血漿比を測定した場合、化合物１２は赤血球中に７０対１の比で分配され、薬物標的のヘモグロビンを含有するコンパートメントへの優先的な分配が証明された。化合物１２のヘモグロビン及びヒト血清アルブミンへの結合を測定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ系で、裏付けとなるデータが報告された。この機能アッセイで、両方のタンパク質がそれらの各生理学的比で存在する場合、化合物１２はヘモグロビンに優先的に結合することを示した。
【００６８】
化合物１２を経口投与した動物で全暴露を追跡すると、別の驚くべき意外な知見が見出された。化合物１２は、化合物２２（５倍）又は化合物２３（１倍）の血液／血漿比と比較して、血液中の化合物のレベルの方が血漿中の化合物のレベルより５５倍高かった。
【００６９】
化合物１２は赤血球中に優先的に分配することができるが、これは静脈内治療されたマウスでも確認された。マウスで血液／血漿の比が１５．４（ｉｎ  ｖｉｖｏピーク濃度で）及び３０（全暴露で）であることが認められた。ラットにおける測定と同様に、マウスでも分布容積（Ｖｓｓ）は低かった（０．１０）。従って、化合物１２はマウスでは血管外空間に広く分布しないと予想される。
【００７０】
結論として、表２に示す結果から、化合物１２は血管外組織に分布せず（低Ｖｓｓ）、標的コンパートメント（赤血球）に選択的に分配されるため、化合物１２は低毒性の可能性があることが分かる。
【００７１】
従って、表１から選択される１種以上の化合物と血液とを含む血液組成物が本明細書で提供され、血液中で１種又は複数種の化合物の少なくとも３０％は、血液中に存在する赤血球の結合している。
【００７２】
実施例２
実施例１の化合物のその他の薬物動態学的（ＰＫ）特性を評価するために、別の一連のアッセイを行った。
【００７３】
逆Ｈｅｍｏｘアッセイ
様々な濃度の化合物１２、２２及び２３で処理する前及び処置した後の全血の酸素平衡曲線（ＯＥＣ）は、ＨＥＭＯＸ分析装置（ＴＣＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｎｅｗ  Ｈｏｐｅ，ＰＡ）を使用して次のように行った。ホモ接合鎌状赤血球患者からの血液試料は、Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｏｐａｔｈｙ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｏａｋｌａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＨＯＲＩ）を通して、治験審査委員会の承認を得て入手した。自己血漿を用いてヘマトクリットを２０％に調整し、血液試料を化合物の非存在下又は存在下、３７℃で１時間インキュベートした。これらの試料１００μｌをＨｅｍｏｘ緩衝液（３０ｍＭ  ＴＥＳ、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ＝７．４）５ｍＬに３７℃で添加した後、Ｈｅｍｏｘ試料室に移した。圧縮空気を１０分間フラッシュすることにより、試料に酸素を飽和させた。次いで、試料に純粋な窒素をフラッシュし、溶液ｐＯ２による酸素化Ｈｂ及び還元Ｈｂの各吸光度を記録する。次いで、酸素平衡データをＨｉｌｌモデルにフィッティングさせてｐ５０の値を得る。ＴＣＳソフトウェアを用いて、全血単独（対照）の脱酸素化曲線と化合物の存在下での全血の脱酸素化曲線の両方を収集した。
【００７４】
結果：下記の表３はΔｐ５０％値を記載し、「＋」はΔｐ５０％が０〜２９であることを示し、「＋＋」はΔｐ５０％が３０〜５０であることを示し、「＋＋＋」はΔｐ５０％が５０以上であることを示す。正のΔｐ５０値は対照と比較して、曲線が左側にシフトし
、ｐ５０値が低くなることに対応し、化合物がＨｂ（Ｓ）を修飾して酸素に対するその親和性を増加させる作用をすることを示す。
【００７５】
Ｒ／Ｔアッセイ
弛緩状態から緊張状態への移行アッセイ（“Ｒ／Ｔアッセイ”）を使用して、脱酸素化条件下でヘモグロビンの高酸素親和性弛緩（Ｒ）状態を維持する化合物１２、２２及び２３の能力を調べた。この能力は、「ΔＲ」値（即ち、化合物で処理しない場合の時間と比較した、ヘモグロビンを化合物で処理した後のＲ状態の時間の変化）として表すことができる。ΔＲは、化合物処理後の％Ｒを処理しない場合の％Ｒと比較したものである（例えば、処理しない場合のＲ％が８％であり、３０μＭの標的化合物で処理した場合が４８％Ｒのとき、その化合物の％Ｒは４０％である。
【００７６】
ＨｂＳ／Ａの混合物は、Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｏｐａｔｈｙ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｏａｋｌａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＨＯＲＩ）を通して、治験審査委員会の承認を得て鎌状赤血球患者から入手した血液から精製した。ＨｂＳ／Ａ（最終濃度３μＭ）を９６ウェルプレート内で、化合物の存在下又は非存在下、５０μＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ＝７．４及び３０μＭ
２，３ジホスホグリセリン酸（ＤＰＧ）中、最終容量１６０μｌで、３７℃で１時間インキュベートした。化合物を様々な濃度（最終濃度３μＭ〜１００μＭ）になるように添加した。このプレートをＭｙｌａｒフィルムで被覆した。インキュベート終了後、Ｍｙｌａｒカバーを除去し、プレートを３７℃で予熱したＳｐｅｃｔｒｏｓｔａｒ  Ｎａｎｏプレートリーダーに入れた。５分後、Ｎ２（流量＝２０Ｌ／分）を分光光度計に流通させた。分光学的測定（３００ｎｍ〜７００ｎｍ）を５分毎に２時間行った。データ解析は、全波長で取得したデータから直線回帰を用いて行った。
【００７７】
結果：下記の表３はΔＲ値を記載し、「＋」はΔＲが０〜３０であることを示し、「＋＋」はΔＲが３０〜５０であることを示し、「＋＋＋」はΔＲが５０以上であることを示す。
【００７８】
重合アッセイ
重合アッセイは、ｐＨ７．４の１．８Ｍリン酸カリウム緩衝液に交換した精製ＨｂＳを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う。僅かに変更した方法（Ａｎｔｏｎｉｎｉ及びＢｒｕｎｏｒｉ、１９７１）を使用し、ＨｂＳは、Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｏｐａｔｈｙ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｏａｋｌａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＨＯＲＩ）を通して、治験審査委員会の承認を得てホモ接合鎌状赤血球患者から入手した血液からＣＲＯ  ＶＩＲＵＳＹＳで精製する。化合物は１００％ＤＭＳＯで調製し、所望の量を５０μＭの精製ＨｂＳに、最終ＤＭＳＯ濃度が０．３％になるように添加する。２．５Ｍリン酸カリウム原液と水とのｐＨ７．４の混合物を用いて、最終リン酸カリウム濃度を１．８Ｍに調整する。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした後、窒素９９．５％及び酸素０．５％を含有するグローブボックス内で脱酸素化するために、２４ウェルプレートに移す。２４ウェルプレートを被覆せず、グローブボックス内のプレートクーラー上で４℃で１時間半インキュベートする。反応混合物５０μｌを９６ウェルプレートに移し、７００ｎｍでの吸光度をグローブボックス内にあるプレートリーダーで、３７℃で１分毎に１時間測定する。時間に対する吸光度のプロットを、Ｂｏｌｔｚｍａｎシグモイドフィッティングを用いてフィッティングさせ、遅延時間（０から半Ｖｍａｘの時間まで）を測定する。化合物を比較し、ランク付けするために遅延時間を遅延率（％ＤＴ）として表し、これはＨｂＳ／化合物の遅延時間とＨｂＳ単独の遅延時間の差に１００を乗じ、ＨｂＳ単独の遅延時間で除したものと定義される。
【００７９】
結果：下記の化合物を重合アッセイで試験した。活性範囲は表示するダガー（†）記号
の数で定義される。†は活性が≧４０％且つ≦８０％であることを示し；††は活性が＞８０％且つ≦１２０％であることを示し；†††は活性が＞１２０％且つ≦１４０％であることを示し；††††は活性が＞１６０％であることを示す。
【００８０】
【表１６】
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【００８１】
実施例３
ヘモグロビンの酸素親和性及び血液の流動学的特性に対する本発明の化合物の効果を調べるために、別の１組のアッセイを行った。
【００８２】
酸素解離アッセイ
９６ウェルフォーマット酸素解離アッセイ（ＯＤＡ）では、化合物５、９及び１２は全て、鎌状赤血球症患者の臨床試験で現在試験されている薬剤である５−ヒドロキシフルフラール（５−ＨＭＦ）よりもＨｂＳの酸素親和性の増加において強力であった。
【００８３】
結果：下記の表４は酸素親和性の変化（Δ酸素化状態）を記載する。２時間受動的脱酸素化を行った後、Ｈｂと等モル濃度の化合物１２により、Ｈｂ酸素親和性が６倍増加した。化合物１２が化学量論未満の濃度（化合物１２対Ｈｂの比が１：３）で存在した場合でも、Ｈｂの酸素親和性は２倍改善し、これは酸素化Ｈｂが１６％多く存在したということになる。
【００８４】
次いで、ＴＣＳ  Ｈｅｍｏｘ分析装置で２５μＭの精製Ｈｂを用いて、薬剤のアッセイを行った。化合物１２：Ｈｂの比が１：３のとき、Ｈｂ対照と比較して、酸素親和性は１５％改善されたが、化学量論濃度では酸素親和性の改善は７０％より大きかった。
【００８５】
逆Ｈｅｍｏｘアッセイ
洗浄された赤血球又は全血を用いて、上記実施例２に記載したもののと実質的に同様に、逆Ｈｅｍｏｘアッセイを行った。
【００８６】
結果：下記の表４は、各被検化合物に関するｐ５０の変化率（Δｐ５０％）を示す。洗浄した赤血球（ＲＢＣ）では、対照の赤血球と比較して（Δｐ５０＝３０ｍｍＨｇ）、５−ＨＭＦ、化合物５、及び化合物１２（１ｍＭ化合物）によりｐ５０がそれぞれ２０ｍｍＨｇ、９ｍｍＨｇ及び７ｍｍＨｇとなった。化合物活性に対する血漿タンパク質の影響を調べるために、鎌状赤血球症患者からの全血中のＯＥＣを測定した。対照の血液のｐ５０が３０ｍｍＨｇであったのに対して、５−ＨＭＦ、化合物５、化合物９、及び化合物１２によりｐ５０がそれぞれ２７ｍｍＨｇ、１８ｍｍＨｇ、１１ｍｍＨｇ及び６ｍｍＨｇとなった。
【００８７】
粘度アッセイ
鎌状赤血球症患者は、非変形性の鎌状赤血球赤血球（ｓｓＲＢＣ）によって起こる血液粘度の増加を循環系が補償する手段として貧血を発症する。低酸素状態にしたｓｓＲＢＣ
の粘度をこれらの化合物が低下させるかどうかを調べるために、鎌状赤血球症患者血液レオロジーに対する５−ＨＭＦ、化合物５、化合物９、又は化合物１２の効果を試験した。鎌状赤血球症患者からの血液を用いて、全血（ヘマトクリット３０％、約１．５ｍＭ  Ｈｂ）を５−ＨＭＦ、化合物５、化合物９、又は化合物１２と共に、２時間低酸素状態（２．４％Ｏ２）に曝しながらインキュベートした。円錐平板型粘度計を使用して、６０ｓ−１〜４１５ｓ−１の範囲の剪断速度で粘度を測定した。
【００８８】
結果：下記の表４は、各化合物に対するセンチポアズ（ΔｃＰ）値の変化を記載する。本発明の化合物は血液粘度を劇的に改善した。例えば、化合物１２は、６．３３ｃＰ（化合物１２なし）から４．３２ｃＰ（等モルの化合物１２）に粘度を改善した（低下させた）。酸素正常状態の（ｎｏｒｍｏｘｉｃ）鎌状赤血球症血液の平均粘度は、３．６９ｃＰである。このような血液粘度の改善により、低酸素組織中でのｓｓＲＢＣの滞留時間が減少する可能性があり、低酸素組織を通って運搬する時の個々の赤血球中での重合レベルの低下が可能となる。さらに、化合物１２は、鎌状赤血球症患者からの赤血球の重合及び鎌状化を遅延させることも示された。これらの特性は全て、化合物１２がＨｂＳ重合体濃度の劇的な低下を引き起こし、鎌状赤血球症患者における、血流閉塞を引き起こす硬い赤血球を形成する可能性を低下させ得ることを示す。
【００８９】
【表１７】
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【００９０】
実施例４
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ重合の遅延及び赤血球の鎌状化の予防における化合物１２及び５−ＨＭＦの有効性を調べるために、別の１組のアッセイを行った。
【００９１】
重合アッセイ
上記実施例２に記載したのと同様に、ＨｂＳ重合を遅延させる５−ＨＭＦ及び化合物１２の能力を評価した。精製ＨｂＳ（５０μＭ）を２５μＭ、５０μＭ、又は１００μＭの５−ＨＭＦ又は化合物１２と共に予備インキュベートした後、１．８Ｍリン酸カリウム中、４℃で受動的に脱酸素化した。４℃から３７℃への温度ジャンプにより重合を誘導した。持続的低酸素状態でのＨｂＳ溶液の濁度に基づいて重合を定量した。
【００９２】
結果：下記の表５は、各被検化合物に関する重合の遅延（分）を記載する。表６は、細胞内アッセイとｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの両方における、特性が十分明らかになっているＨｂＳ重合阻害剤である一酸化炭素（ＣＯ）配位ＨｂＡによる重合の遅延を記載する。ＤＴ：遅延時間。化合物１２はＨｂＳ重合を用量依存的に遅延させた。未処理ＨｂＳ対照
の重合遅延は、亜ジチオン酸塩又はレーザー処理を用いた能動的脱酸素化により認められた重合遅延より比較的長かった。しかし、化合物１２は、ＣＯ配位ＨｂＡと同程度までＨｂＳ重合遅延させた。
【００９３】
鎌状化アッセイ
鎌状化実験では、赤血球を化合物１２又は５−ＨＭＦと共に予備インキュベートした後、３７℃の加湿チャンバ内で０．５時間低酸素状態（ｐＯ２約３０ｍｍＨｇ）にし、その後、光学顕微鏡を使用して画像化した。各画像中の鎌状化した赤血球のパーセンテージをＣｅｌｌＶｉｇｅｎｅソフトウェアを用いて算出した。
【００９４】
結果：下記の表５は、鎌状化した赤血球のパーセントに対する各化合物の効果を記載する。ＨＣＴ：ヘマトクリット。化合物１２は、低酸素下でのＲＢＣの鎌状化を予防し、化合物１２が細胞内ＨｂＳ重合を予防する能力を有することを示唆した。この鎌状化アッセイでは、赤血球を、微小循環を通る典型的な赤血球運搬時間（１分未満）よりずっと長時間、低酸素状態に曝したため、生理的条件下で鎌状化を予防するのに必要な化合物の量はずっと少ない可能性がある。
【００９５】
【表１８】
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【００９６】
【表１９】
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【００９７】
上記のことから、本発明の具体的な実施形態が説明のために本明細書に記載されてきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱せずに種々の改良がなされ得ることを認識するであろう。
【００９８】
本発明の記載全体にわたって、種々の特許出願及び刊行物が参照されるが、そのそれぞれは引用により本明細書にその全体として組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【国際調査報告】
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