(57)【要約】本開示の実施形態は、たとえば癌の治療のための、腫瘍溶解性ウイルス、たとえばワクシニアウイルスに関し、ウイルスは、Ｔ細胞上の細胞分子、たとえばＣＤ３を認識する活性化ドメイン及び腫瘍抗原、たとえばＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２、ＧＤ２又はＧｌｙｐｉｃａｎ−３を認識する抗原認識ドメインを有するエンゲージャー分子をコードする。いくつかの実施形態において、エンゲージャー分子は、たとえばサイトカイン又は副刺激ドメインをさらに含む。１つ又は複数の組成物を使用した癌の治療方法は本開示に包含される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面分子に特異的な単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）と、腫瘍抗原に特異的なｓｃＦｖとを含む二部分分子（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）をコードする、腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２】
前記細胞表面分子がエフェクター細胞上にある、請求項１記載のウイルス。
【請求項３】
前記エフェクター細胞がＴリンパ球である、請求項２記載のウイルス。
【請求項４】
前記腫瘍抗原が、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２、及びＧＤ２からなる群から選択される、請求項１記載のウイルス。
【請求項５】
前記細胞表面分子が、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される、請求項１記載のウイルス。
【請求項６】
前記細胞表面分子がＣＤ３である、請求項１記載のウイルス。
【請求項７】
前記腫瘍溶解性ウイルスが、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）、粘液腫ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、麻疹ウイルス（ＭＶ）、又はニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）である、請求項１記載のウイルス。
【請求項８】
治療有効量の請求項１記載のウイルスを個体に送達する工程を含む、癌のための個体の治療方法。
【請求項９】
前記ウイルスの量が、１０５〜１０１３ｐｆｕのウイルスを含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
追加の癌治療を前記個体に送達する工程をさらに含む、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記追加の癌治療が、手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、又はそれらの組合せである、請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１３年３月５日に出願された米国仮特許出願番号第６１／７７２，８０３号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示の分野は、少なくとも免疫学、ウイルス学、細胞生物学、分子生物学、及び癌医学を含む医学を含む。
【背景技術】
【０００３】
いくつかの悪性腫瘍の治癒率は有意に改善した一方で、進行固形腫瘍に罹患した患者の予後は、過去数十年間にわたりまったく変わらず、新規治療法の必要性を強調している。腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、その安全性に加えて、腫瘍細胞に感染し、そこで複製し、それを溶解させるその能力ゆえに、現在の固形腫瘍治療の選択肢に加えられる有用な選択肢である。臨床研究によれば、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの腫瘍内又は静脈内注射が安全であり、腫瘍溶解を誘導しうることが示されたとはいえ、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの抗腫瘍効果は最適には及ばず、ほとんどの腫瘍が発生し、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス療法のさらなる改善の必要性を強調している。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、個体の免疫療法のための方法及び／又は組成物に関する。特定の実施形態において、個体は癌を有する哺乳動物であり、癌治療を必要とする。癌は、肺癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、肝臓癌、結腸癌、胃癌、脾臓癌、皮膚癌、脳腫瘍、血液癌、腎臓癌、甲状腺癌等を含む、任意の種類であってよい。癌は、固形腫瘍であってもよい。特定の場合には、癌は、腫瘍抗原を含む１つ又は複数の腫瘍マーカーを有する。本開示の特定の態様において、１つ又は複数の腫瘍抗原が、少なくともいくつかの癌細胞に存在する可能性があり、１つ又は複数の腫瘍抗原が、免疫療法の標的になる可能性がある。
【０００５】
本開示の特定の実施形態において、免疫療法における使用に好適な組換え腫瘍溶解性ウイルスベクター、たとえばＴ細胞エンゲージャー強化腫瘍溶解性ウイルス（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ−ａｒｍｅｄ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｕｓｅｓ）（ＴＥＡ−ＯＶ）に関する方法及び組成物が、本明細書において提供される。本明細書において提供されるＴＥＡ−ＯＶは、組換え腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍細胞を直接殺傷することに加えて、同時に腫瘍細胞を殺傷するためにウイルスを感染させた腫瘍の近傍内でＴ細胞を刺激する点において、単独の腫瘍溶解性ウイルス及び単独のＴ細胞を超える利点を提供する。特定の実施形態において、ベクターは、腫瘍内注射されるか、又は静脈内注射されるが、他の送達手段も本開示に包含される。いくつかの実施形態において、ベクターは、二重特異性活性を含み、特定の実施形態において、それは活性化ドメイン及び抗原認識ドメインの存在に関する。特定の態様において、腫瘍溶解性ウイルスベクターは、ＴＥＡ−ＶＶと呼ばれるＴ細胞エンゲージャー強化ワクシニアウイルスである。
【０００６】
第１の態様において、組換え腫瘍溶解性ウイルス、たとえば腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、たとえば二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチド、たとえばＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２、ＧＤ２又はＧｌｙｐｉｃａｎ−３を標的にするエンゲージャーをコードする核酸の発現を導くプロモーターを有する発現領域を含むよう組み換えられたものが本明細書において提供される。特定の実施形態において、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーポリペプチドは、活性化ドメイン及び抗原認識ドメインを含む。いくつかの実施形態において、活性化ドメインは、Ｔ細胞受容体ポリペプチドの受容体又はリガンド、たとえばＴ細胞を活性化させるためにＣＤ３に結合するポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原認識ドメインは、標的細胞、たとえば癌細胞上の細胞表面タンパク質の受容体又はリガンドである。より具体的な実施形態において、活性化ドメイン及び／又は抗原認識ドメインの一方又は両方が、抗体、たとえば単鎖抗体、たとえば単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。特定の実施形態において、抗原認識ドメインは標的細胞上に存在する分子に結合し、活性化ドメインは最終的には受容標的細胞に対して毒性を有するプロセスを誘発する細胞受容体に結合する。特定の実施形態において、二重特異性は、２つの抗体フラグメント若しくは抗原結合フラグメント又はそれらの誘導体、たとえば単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）に関する。いくつかの実施形態において、１つのｓｃＦｖがＣＤ３特異的であるとはいえ、代替的実施形態において、ｓｃＦｖはＴＣＲ複合体の別の構成要素に特異的である。当業者は、ＴＣＲ複合体が、３つの二量体シグナリングモジュールＣＤ３δ／ε、ＣＤ３γ／ε及びＣＤ３ζ／ζ又はζ／ηを有する可変ＴＣＲα及びβ鎖の八量体複合体であることを認める。いくつかの場合において、本明細書に開示の組成物は、ｓｃＦＶを有するＣＤ３εを標的にするとはいえ、特異的ｓｃＦｖを有する他のＣＤ３分子、とりわけＣＤ３ζ、又はＴＣＲα及びβ鎖を標的にすることは、本開示に包含される。特定の実施形態において、ＴＣＲ複合体の一部ではない標的分子（ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ２７８）が、本開示に包含される。特定の実施形態において、一方のｓｃＦｖが、Ｔリンパ球上のＣＤ３分子に特異的であり、他方のｓｃＦｖは、選択される特定の腫瘍抗原に特異的である。
【０００７】
いくつかの実施形態において、理論に縛られるわけではないが、Ｔ細胞エンゲージャー強化腫瘍溶解性ウイルス、たとえばＴ細胞エンゲージャー強化腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍におけるＴ細胞浸潤を促進し、ウイルス発現性Ｔ細胞エンゲージャーを通じて、ウイルスを感染させていない腫瘍細胞のバイスタンダー殺傷を誘導し、抗腫瘍効果の増強をもたらす。
【０００８】
腫瘍抗原のための特定のｓｃＦｖは、特定の腫瘍抗原を含む、たとえばそれを細胞表面上に提示する対応する癌細胞を認識するように選択されるか又は適合させてもよい。特定の実施形態において、腫瘍抗原は、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、Ｇｌｙｐｉｃａｎ−３、５Ｔ４、８Ｈ９、αｖβ６インテグリン、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＦＡＰ、ＦＡＲ、ＦＢＰ、胎児ＡｃｈＲ、葉酸受容体α、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＩＬ１１Ｒａ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＫＤＲ、Ｌａｍｂｄａ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＣ１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、スルビビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、ＶＥＧＲＲ２、癌胎児性抗原、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＶＥＧＦ受容体であり、他の例示的な抗原は、腫瘍の細胞外マトリックス内に存在する抗原、たとえばフィブロネクチン、テネイシンの癌胎児性変異体、又は腫瘍の壊死領域である。
【０００９】
特定の一実施形態において、ＥｐｈＡ２を標的にし、ＥｐｈＡ２発現腫瘍の溶解を未改変ワクシニアウイルスよりも効率的に誘導する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子をコードするポリヌクレオチドを含む、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが本明細書において提供される。特定の実施形態において、ウイルスベクターは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子をコードし、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３４Ｌ（ＯＸ４０Ｌ）、及びＣＤ１３７Ｌ（４１ＢＢＬ）を含む副刺激分子を発現させる１つ又は複数のポリヌクレオチドもまたコードする。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、少なくとも１つの二量化ドメイン又は少なくとも１つの三量化ドメインをコードする。ある構成において、二量化又は三量化ドメインは、ウイルスベクター上に配置されていてもよい。特定の実施形態において、二量化又は三量化ドメインをコードする核酸配列は、活性化ドメイン及び抗原認識ドメインをコードする核酸の間に配置される。本開示の特定の例示的な組成物には、たとえば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７の配列が含まれる。
【００１０】
いくつかの実施形態において、ワクシニアウイルスは、Ｗｙｅｔｈ、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ．Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ）、Ｌｉｓｔｅｒ、又はＷｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ）株であってもよい。プロモーターは、ワクシニアウイルスプロモーター、合成プロモーター、少なくとも感染初期中に転写を導くプロモーター、又は少なくとも感染後期中に転写を導くプロモーターであってもよい。
【００１１】
本開示の例示的なＴＥＡ−ＶＶは、機能的二重特異性エンゲージャー分子をインビトロ及びインビボで発現し、未改変ワクシニアウイルスと比較して類似のウイルス／複製／腫瘍溶解効果を示し、未改変ワクシニアウイルスと比較してヒトＴ細胞の存在下で腫瘍殺傷をより効果的に誘導し、且つ／又はウイルスに感染していない細胞のバイスタンダー殺傷を効果的に誘導し、その組成物はまた、腫瘍進行をインビボで阻害する。単に実証的な例として、Ａ５４９ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞が、本開示の方法で殺傷される。
【００１２】
別の一実施形態において、癌治療のための二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子を発現させるために、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス以外の任意のタイプの好適な腫瘍溶解性ウイルスベクターが用いられてもよい。特定の実施形態において、ベクターは、腫瘍溶解性アデノウイルスベクター（ＡｄＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レオウイルス、粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）、ポリオウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、麻疹ウイルス（ＭＶ）、及びニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）等である。いくつかの実施形態において、ウイルスポリヌクレオチドは、活性化ドメイン及び抗原認識ドメインを含む融合分子をコードし、特定の実施形態において、各ドメインはｓｃＦｖである。活性化ドメインは、抗原認識ドメインに対してポリペプチドのＮ末端の方に配置されてもよく、又は活性化ドメインは、抗原認識ドメインに対してポリペプチドのＣ末端の方に配置されてもよい。
【００１３】
組換え腫瘍溶解性ウイルスは、当技術分野における任意の好適な遺伝子組換え法により生成されてもよい。
【００１４】
別の一態様において、個体に治療有効量のＴＥＡ−ＯＶを投与する工程を含む、癌を有する個体の治療方法が本明細書において提供され、前記ＴＥＡ−ＯＶは、前記癌により提示されるＴＡＡ又はＴＳＡに結合する抗原認識ドメインを含むＴ細胞エンゲージャーを発現させる。特定の実施形態において、個体に、組換えＴ細胞エンゲージャー強化ワクシニアウイルス（ＴＥＡ−ＶＶ）が投与される。特定の実施形態において、ＴＥＡ−ＶＶは、腫瘍内、血管内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、髄腔内、鼻腔内投与される。
【００１５】
いくつかの実施形態において、癌のための個体の治療方法であって、細胞表面分子に特異的なｓｃＦｖと、腫瘍抗原に特異的なｓｃＦｖとを含む二重特異性分子をコードする腫瘍溶解性ウイルスなどの本開示のウイルスの治療有効量を個体に送達する工程を含む、治療方法が本明細書において提供される。特定の実施形態において、個体に投与されるウイルスの量、たとえば治療有効量は、１０５〜１０１３ｐｆｕのウイルスを含む。本開示の方法は、追加の癌治療、たとえば手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、又はそれらの組合せを個体に送達する工程を含んでいてもよい。本開示の方法は、個体が癌治療を必要とすることを同定する工程を含んでいてもよい。
【００１６】
一実施形態において、免疫細胞上の標的に結合する活性化ドメイン及び標的細胞によりもたらされる又は標的細胞上に存在する１つ又は複数の分子に結合する抗原認識ドメインを含む分子をコードする核酸配列を含む、遺伝子組換え腫瘍溶解性ウイルスがある。特定の実施形態において、前記活性化ドメイン及び前記抗原認識ドメインは、リンカーにより連結される。いくつかの実施形態において、ウイルスは、１つ又は複数の副刺激分子をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、ウイルスは、二量化ドメインをコードする核酸をさらに含む。特定の実施形態において、ウイルスは、三量化ドメインをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、活性化ドメインは、抗体、リガンド、受容体、又はペプチドを含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞はＴ細胞であり、活性化ドメインはＣＤ３を認識する抗体であり、いくつかの実施形態において、免疫細胞はＮＫ細胞であり、活性化ドメインはＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、又はＮＫｐ３０を認識する抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は単鎖フラグメント可変（ｓｃＦｖ）抗体である。いくつかの実施形態において、抗原認識ドメインは、標的細胞によりもたらされる抗原を認識する抗体である。特定の場合には、抗体はｓｃＦｖ抗体である。いくつかの実施形態において、抗原認識ドメインは、リガンド、ペプチド、又は可溶性ＴＣＲである。特定の実施形態において、ウイルスは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、又は配列番号７の配列を含むポリペプチドをコードする。実施形態はまた、ウイルスであって、その抗原が、たとえばＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、Ｇｌｙｐｉｃａｎ−３、５Ｔ４、８Ｈ９、αｖβ６インテグリン、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＦＡＰ、ＦＡＲ、ＦＢＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ３、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＩＬ１１Ｒα、ＩＬ１３Ｒα２、Ｋａｐｐａ、ＫＤＲ、Ｌａｍｂｄａ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、スルビビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、及びＶＥＧＲＲ２からなる群から選択されるものなどの腫瘍抗原であるウイルスを含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞上の標的は、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、及び不変ＴＣＲからなる群から選択される。免疫細胞上の標的は、ＣＤ３であってもよい。いくつかの場合において、腫瘍溶解性ウイルスはワクシニアウイルスであるが、いくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）、粘液腫ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、麻疹ウイルス（ＭＶ）、又はニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）である。特定の実施形態において、��つ又は複数の副刺激分子は、４−１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、及びＯＸ４０Ｌからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、二量化ドメインは、ＩｇＧ１  ＣＨ２ＣＨ３ドメイン、ロイシンジッパー、ヘリックス−ループ−ヘリックス、アンキリン、又はＰＡＳドメインである。特定の実施形態において、三量化ドメインは、ヒトコラーゲンＸＶ型ＮＣＩ、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＩ型、コラーゲンＩＩＩ型、コラーゲンＩＶ型、コラーゲンＶ型、コラーゲンＸＩ型、Ｔ４フィブリチンのＣ末端ドメイン、又はＮｅｍｏ三量化ドメインに由来する。
【００１７】
本開示の一実施形態において、提供されるのは、治療有効量の本開示のウイルスを個体に送達する工程を含む、癌のための個体の治療方法である。いくつかの実施形態において、ウイルスの量は、１０５〜１０１３ｐｆｕのウイルスを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、追加の癌治療、たとえば手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、又はそれらの組合せを個体に送達する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法は、個体が癌治療を必要とすることを同定する工程をさらに含む。
【００１８】
上記において、以下の本発明の詳細な説明がよりよく理解されうるように、本発明の特徴及び技術的利点をかなり広く概括した。本発明の追加の特徴及び利点は、本明細書において以下に説明され、これが本発明の請求項の主題を形成する。本開示の発想及び特定の実施形態は、本発明と同じ目的を実施するための他の構造を修正又は設計するための基礎として容易に利用されうることが、当業者により認められものとする。またかかる等価な構造が、添付の特許請求の範囲に記載の本発明の趣旨及び範囲から逸脱しないことも当業者により認められるものとする。本発明を特徴付けると考えられる新規の特徴は、その構成及び操作方法の両方に関して、さらなる目的及び利点とともに添付の図面と併せて検討されたとき、以下の説明によってよりよく理解される。しかしながら、各図面は単に例示及び説明の目的のために提供されたにすぎず、本発明の限定の定義として意図されないことが明示的に理解されるものとする。
【００１９】
ここで、本発明をより十分に理解するために、添付の図面と併せて包含される以下の説明を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＴＥＡ−ＶＶについての例示的な原理を示す図である。
【００２１】
【図２】ＥｐｈＡ２−ｓｃＦｖ−ＣＤ３−ｓｃＦｖ（ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ）又はＧＦＰ（ＧＦＰ−ＶＶ）をコードする発現カセットの例示的な模式図を提供する図である。
【００２２】
【図３】Ｆ１７Ｒ後期プロモーターの転写制御下でのＧＦＰ発現のためにウイルス複製が必要であることを示す図である。
【００２３】
【図４】ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶが、ヒトＴ細胞及び腫瘍抗原ＥｐｈＡ２の両方に結合する能力を有する、分泌性二重特異性ＥｐｈＡ２−ｓｃＦｖ−ＣＤ３−ｓｃＦｖを発現させたことを示す図である。Ａ５４９腫瘍細胞（６ウェルプレート中１×１０６／２ｍｌ／ウェル）に、ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ又はＧＦＰ−ＶＶをＭＯＩ  ５で感染させた。培養培地を２４時間のインキュベーション後に回収し、１×１０６未刺激ＰＢＭＣに添加し、続いてＥｐｈＡ２−ＦＩＴＣ、ＣＤ８−ＰＥ及びＣＤ４−ＡＰＣで染色した。挿入された数値は、ゲーティングしたＣＤ８＋又はＣＤ４＋細胞からのＥｐｈＡ２陽性細胞集団のパーセンテージである。
【００２４】
【図５Ａ−５Ｂ】ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶが、親ＶＶと比較して、ＣＶ−１細胞及び正常ヒト細胞において類似のウイルス複製能を示したことを示す図である。ＣＶ−１（Ａ）及び正常ヒト線維芽細胞（Ｂ）におけるＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ、ＧＦＰ−ＶＶ、及びｖＳＣ２０の複製が提示される。細胞は０．１のＭＯＩで感染させ、１、２、又は３日後、ＣＶ−１細胞におけるプラークアッセイによりウイルス価を決定した。
【００２５】
【図６】ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶが、ＧＦＰ−ＶＶと比較して、ヒトＴ細胞の非存在下で、類似のＥｐｈＡ２＋Ａ５４９腫瘍細胞に対する腫瘍溶解能を示したことを示す図である。Ａ５４９腫瘍細胞に、ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ（ＥｐｈＡ２−ＶＶ）、又はＧＦＰ−ＶＶを、用量を増加させながら（ＭＯＩ  ０．０１、０．１、１、又は５）感染させた。感染後４８時間での細胞生存率を、ＭＴＳアッセイにより決定した。結果は、ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ又はＧＦＰ−ＶＶが、ヒトＴ細胞の非存在下で、類似のＡ５４９腫瘍細胞に対する腫瘍溶解活性を示したことを示した。
【００２６】
【図７】ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶが、ＧＦＰ−ＶＶと比較して、ヒトＴ細胞の存在下で、増強したＥｐｈＡ２＋Ａ５４９腫瘍細胞に対する腫瘍溶解能を示したことを示す図である。Ａ５４９腫瘍細胞に、ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ又はＧＦＰ−ＶＶをＭＯＩ  ０．１で感染させた。ある実験で、ヒトＴ細胞をＡ５４９細胞と共培養した（Ｔ：Ａ５４９＝５：１）。感染後様々な時点での細胞生存率を、ＭＴＳアッセイにより決定した。
【００２７】
【図８Ａ−８Ｂ】ヒトＴ細胞の存在下での腫瘍溶解性ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶのＥｐｈＡ２＋Ａ５４９腫瘍細胞に対する腫瘍溶解能が、ウイルス用量依存性であることを示す図である。Ａ５４９腫瘍細胞に、ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶを用量を増加させながら（ＭＯＩ  ０．００１、０．０１、０．１、又は１）感染させた。いくつかの実験において、ヒトＴ細胞をＡ５４９細胞と共培養した（Ｔ：Ａ５４９＝５：１）。感染後２４又は４８時間での細胞生存率を、ＭＴＳアッセイにより決定した。
【００２８】
【図９Ａ−９Ｄ】ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶがヒトＴ細胞を活性化させたことを示す図である。Ａ５４９細胞に、ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ又はＧＦＰ−ＶＶをＭＯＩ  ０．１又は１で感染させた。感染させたＡ５４９細胞いずれかを、ヒトＴ細胞の存在下で培養した（Ｔ細胞：Ａ５４９比＝５：１）。２４、４８、又は７２時間後、上清を回収し、ＩＦＮ−γ（Ａ及びＢ）及びＩＬ−２（Ｃ及びＤ）産生をＥＬＩＳＡにより決定した。
【００２９】
【図１０】ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶが腫瘍細胞のバイスタンダー殺傷を誘導したことを示す図である。Ａ５４９に、ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ又はＧＦＰ−ＶＶを様々なＭＯＩで感染させ、２４時間後に、上清を回収し、ＰＢＭＣ及びＡ５４９細胞の共培養アッセイに使用した（ＰＢＭＣ：腫瘍細胞＝５：１）。４８時間後、腫瘍細胞殺傷をＭＴＳアッセイにより測定した。
【００３０】
【図１１】ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶが、Ａ５４９皮下腫瘍モデルにおいて抗腫瘍応答の増強をもたらしたことを示す図である。２×１０６個のＡ５４９細胞を、１×１０７個の未刺激ＰＢＭＣと混合し、第０日のＳＣＩＤマウスの右側腹部に皮下接種し、直後に１×１０８ＰＦＵのＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ又はＧＦＰ−ＶＶを腹腔内注射した。腫瘍サイズを、キャリパーで測定した。
【００３１】
【図１２】ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶが、Ａ５４９皮下腫瘍モデルにおいて生存率の改善をもたらしたことを示す図である。マウスに腫瘍を接種し、続いて図１０に記載のとおりＶＶを注射した。マウス生存率をモニタリングした（ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ  ｎ＝８、ＧＦＰ−ＶＶ  ｎ＝７）。
【００３２】
【図１３Ａ−１３Ｂ】ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶが、Ａ５４９静脈内肺癌モデルにおいて抗腫瘍応答の増強をもたらすことを示す図である。２×１０６個のＡ５４９．ｅＧＦＰ．ＦＦＬｕｃ細胞を、第０日のＳＣＩＤマウスに静脈内注射し、第７日に、混合された１×１０７個の未刺激ＰＢＭＣ及び１×１０８ＰＦＵのＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ又はＧＦＰ−ＶＶの単回注射で処置した。腫瘍進行を、インビボ生物発光画像法で追跡した。Ａ．代表動物の画像を示す。Ｂ．実線は、各マウス群を表す。
【００３３】
【図１４Ａ−１４Ｃ】ＨＥＲ２−ＴＥが、ＨＥＲ２＋Ａ５４９腫瘍細胞の殺傷を効果的に誘導したことを示す図である。Ａ．レンチウイルスベクターにおけるＨＥＲ２−ｓｃＦｖ−ＣＤ３−ｓｃＦｖ（ＨＥＲ２−ＴＥ）又はＧＦＰ（ＧＦＰ）をコードするレンチウイルス発現カセットの模式図。Ｂ．非感染Ａ５４９（ＧＦＰ−、０．４×１０６個／ウェル）と混合されたレンチウイルス感染Ａ５４９（ＧＦＰ＋、０．６×１０６個／ウェル）を、未刺激ＰＢＭＣ（１×１０６個／ウェル）と、２４ウェルプレートにおいて２日間共培養した。細胞を回収し、抗ＣＤ３抗体で染色し、続いてフロー解析にかけた。Ｃ．細胞集団のパーセンテージを示した。Ｄ．ＧＦＰ発現を顕微鏡下で検査した。
【００３４】
【図１５Ａ−１５Ｂ】ＨＥＲ２−ＴＥの直列バイｓｃＦｖ（ｂｉ−ｓｃＦｖ）及びダイアボディの、ＨＥＲ２＋Ａ５４９（ＧＦＰ＋）腫瘍細胞の殺傷を誘導する能力を比較する図である。Ａ．レンチウイルスベクターにおける直列バイｓｃＦｖＨＥＲ２−ＴＥ又はダイアボディＨＥＲ２−ＴＥをコードする発現カセットの模式図。Ｂ．レンチウイルス感染ＨＥＲ２＋Ａ５４９腫瘍細胞（１×１０６個／ウェル）を、未刺激ＰＢＭＣ（１×１０６個／ウェル）と、２４ウェルプレートにおいて共培養した。ＧＦＰ発現を２４時間後に顕微鏡下で検査した。
【００３５】
【図１６Ａ−１６Ｃ】ＨＥＲ２−ＴＥが、ＧＤ２＋ＪＦ及びＬＡＮ１腫瘍細胞の殺傷を効果的に誘導したことを示す図である。Ａ．レンチウイルスベクターにおけるＧＤ２−ｓｃＦｖ−ＣＤ３−ｓｃＦｖ（ＧＤ２−ＴＥ）又はＧＦＰ（ＧＦＰ）をコードする発現カセットの模式図。レンチウイルス感染ＪＦ（ＧＦＰ＋）（Ｂ）又はＬＡＮ１（ＧＦＰ＋）（Ｃ）腫瘍細胞（１×１０６個／ウェル）を、未刺激ＰＢＭＣ（１×１０６個／ウェル）と、２４ウェルプレートにおいて共培養した。ＧＦＰ発現を顕微鏡下で検査した。
【００３６】
【図１７】肝細胞癌（ＨＣＣ）のためのＨＮ３−ＴＥ及びＧＣ３３−ＴＥの構築及び機能を示す図である。Ａ．レトロウイルスベクターにおけるＨＮ３−ｓｃＦｖ−ＣＤ３−ｓｃＦｖ（ＨＮ３−ＴＥ）又はＧＣ３３−ｓｃＦｖ−ＣＤ３−ｓｃＦｖ（ＧＣ３３−ＴＥ）をコードする発現カセットの模式図。Ｂ．ＨｕＨ７又はＨｅｐＧ２腫瘍細胞（５×１０３／ウェル）を、レトロウイルス感染ヒトＰＢＭＣと、Ｔ細胞の腫瘍細胞に対する様々な比で共培養し、腫瘍溶解を標準的なＣｒ放出ＣＴＬアッセイにより決定した。
【００３７】
【図１８】どのようにして三量体又は二量体形態の４−１ＢＢＬ強化Ｔ細胞エンゲージャーが構築されたのかを示す図である。
【００３８】
【図１９】４−１ＢＢＬ強化ＴＥＡ−ＶＶの抗腫瘍効果の増強を示す図である。
【００３９】
【図２０】副刺激シグナリング４−１ＢＢＬが、腫瘍殺傷効果をさらに増強し、Ｔ細胞活性化を誘導したことを示す図である。レトロウイルス（ＧＦＰ、ＨＥＲ２−ＴＥ、二量体−４１ＢＢＬ−ＨＥＲ２−ＴＥ、又は三量体−４１ＢＢＬ−ＴＥ）感染Ａ５４９腫瘍細胞（ＧＦＰ＋、１×１０６／ウェル）を、未刺激ＰＢＭＣと共培養し、４８時間後に、ＧＦＰ発現を顕微鏡下で検査した。
【００４０】
【図２１】ＩＦＮγ及びＩＬ２を使用したサイトカインＥＬＩＳＡを示す図である。レトロウイルス（ＧＦＰ、ＨＥＲ２−ＴＥ、二量体−４１ＢＢＬ−ＨＥＲ２−ＴＥ、又は三量体−４１ＢＢＬ−ＴＥ）感染Ａ５４９腫瘍細胞（ＧＦＰ＋、１×１０６／ウェル）を、未刺激ＰＢＭＣと共培養し、４８時間後に、培養培地を回収し、ＩＦＮγ及びＩＬ２のサイトカイン発現をＥＬＩＳＡにより検査した。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
長年にわたる特許法の慣習に沿って、請求項を含め本明細書において、「ａ」及び「ａｎ」という用語は、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）という用語とともに使用される場合、「１つ又は複数」を意味する。本発明のいくつかの実施形態は、１つ又は複数の本発明の要素、方法工程、及び／又は方法からなっていてもよく、又はそれらから本質的になっていてもよい。本明細書に記載の任意の方法又は組成物は、本明細書に記載の任意の他の方法又は組成物に関して実施できることが考慮されている。
【００４２】
Ｉ．特定の実施形態
本開示は、進行固形腫瘍を含む癌の治療のための新規腫瘍溶解性ウイルス方略、Ｔ細胞エンゲージャー強化腫瘍溶解性ウイルス（ＴＥＡ−ＯＶ）を提供する。腫瘍溶解性ウイルス療法は、前臨床モデル及び臨床研究において、新規癌治療法として有望であることが示されてきた。しかしながら、抗腫瘍効果は最適以下であり、ほとんどの腫瘍が再発し、さらなる改善の必要性を強調する。腫瘍溶解性ウイルスの主要な作用機序は、腫瘍細胞の破壊であり、次にそれが腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導し、そのことによりウイルスの局所注射後であったとしても転移性疾患を標的とする。現在のところ、ウイルスは腫瘍を通じて拡散し、抗原特異的Ｔ細胞応答の誘導は限定的であり、観察される最適以下の腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍活性を説明する。本開示の実施形態において、腫瘍環境内の常在Ｔ細胞を活性化することは、これらの限界を克服する。なぜなら、抗原特異的Ｔ細胞が、ワクシニアウイルスに感染していない腫瘍細胞を殺傷できる（バイスタンダー殺傷）からであり、活性化の際にそれらが放出するサイトカインは、内因性腫瘍特異的Ｔ細胞応答の誘導を促進する炎症促進性微小環境を生み出す。
【００４３】
腫瘍内のＴ細胞を活性化させるため、本明細書に記載されているのは、活性化ドメイン及び抗原認識ドメインを含む二重特異性分子であるＴ細胞エンゲージャーをコードする、Ｔ細胞エンゲージャー強化腫瘍溶解性ウイルス（ＴＥＡ−ＯＶ）である。特定の場合には、エンゲージャーは、ＣＤ３単鎖可変フラグメント（ＣＤ３−ｓｃＦｖ）を含む。腫瘍溶解性ワクシニアウイルスをプラットフォームとして使用した例示的な研究において、ＣＤ３−ｓｃＦｖは、ＣＤ３及び例示的な腫瘍細胞表面抗原ＥｐｈＡ２の両方と結合する分泌性二重特異性ｓｃＦｖ（ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ）として発現した。ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶは、対照ＶＶと比較して、ＶＶに感染していない腫瘍細胞のバイスタンダー殺傷を誘導することにより有意に増強された腫瘍溶解活性を示した。したがって、ＣＤ３及び腫瘍細胞表面抗原の両方と結合する二重特異性ｓｃＦｖをコードするＴ細胞エンゲージャー強化腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（ＴＥＡ−ＶＶ）は、Ｔ細胞の存在下で有意に増強された腫瘍溶解活性を示し、癌治療のためにＴ細胞と接合する独自の能力を有する新規及び増強腫瘍溶解性ウイルス方略を代表する。
【００４４】
本開示の実施形態は、腫瘍溶解性ＶＶをＴ細胞エンゲージャー（たとえば少なくともＣＤ３−ｓｃＦｖを含むもの）で強化することが、増強された抗腫瘍効果をもたらし、そのことにより、効果的な腫瘍溶解性ウイルス療法の開発及び使用のための新たな道を開くことを示す。ＴＥＡ−ＯＶは、現在の治療方略では多くの場合不治である進行固形腫瘍を含む癌の治療に有用である。
【００４５】
ＩＩ．エンゲージャー分子及びその適用
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される腫瘍溶解性ウイルスベクターは、エンゲージャー分子をコードするポリヌクレオチド、たとえばエンゲージャーポリペプチドを含むよう遺伝子組換えされる。かかるエンゲージャーポリペプチドは、一般に、抗原認識ドメイン及び活性化ドメインを含む。エンゲージャー分子の抗原認識ドメインは、標的細胞上に存在する１つ又は複数の分子と結合するよう設計されていてもよく、一方でエンゲージャー分子の活性化ドメインは、エフェクター細胞、たとえばＴリンパ球上に存在する分子に結合する。エンゲージャー分子の活性化ドメインがエフェクター細胞に結合すると、活性化ドメインはエフェクター細胞を活性化できる。いくつかの実施形態において、エンゲージャーの活性化ドメインが免疫細胞上の活性化分子に結合し、抗原認識ドメインが標的細胞抗原に結合するとき、免疫細胞は標的細胞を殺傷する。
【００４６】
エンゲージャーは、二部分（たとえば、任意選択でリンカーにより結合されうる活性化ドメインと抗原認識ドメインとを含む）であってもよく、三部分又は多部分（たとえば、１つ又は複数の活性化ドメイン及び／又は抗原認識ドメイン、又は他のドメイン、たとえば１つ又は複数の副刺激ドメイン及び／又は１つ又は複数の二量化若しくは三量化ドメインを含む）であってもよい。
【００４７】
いくつかの実施形態において、エンゲージャーはタンパク質、たとえば改変タンパク質である。特定の実施形態において、エンゲージャーの活性化ドメインは、抗体若しくは抗原結合性フラグメント又はそれらの部分、たとえば単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であるか、又はそれを含む。他の特定の実施形態において、抗原認識ドメインは、抗体若しくは抗体フラグメント若しくは抗原結合性フラグメント又はそれらの部分、たとえばモノクローナル抗体、Ｆｖ、若しくはｓｃＦｖであるか、又はそれを含み、又はそれは、リガンド、ペプチド、可溶性Ｔ細胞受容体、又はそれらの組合せを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、活性化ドメイン及び抗原認識ドメインは、リンカー、たとえばペプチドリンカーにより連結される。
【００４８】
エンゲージャー分子の活性化ドメインは、免疫細胞に活性化を提供できる。当業者は、免疫細胞が、異なる活性化受容体を有することを認める。たとえば、ＣＤ３はＴ細胞上の活性化受容体であり、一方でＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、又はＮＫｐ３０はＮＫ細胞上の活性化受容体であり、ＣＤ３又は不変ＴＣＲはＮＫＴ細胞上の活性化受容体である。したがって、Ｔ細胞を活性化させるエンゲージャー分子は、ＮＫ細胞を活性化させるエンゲージャー分子とは異なる活性化ドメインを有しうる。特定の実施形態において、たとえば、免疫細胞はＴ細胞であり、活性化分子は、ＣＤ３、たとえばＣＤ３γ、ＣＤ３δ若しくはＣＤ３ε、又はＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ２７８のうちの１つ又は複数である。他の特定の実施形態において、たとえば免疫細胞がＮＫ細胞である場合、活性化分子は、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、若しくはＮＫｐ３０であり、又は免疫細胞がＮＫＴ細胞である場合、活性化分子は、ＣＤ３若しくは不変ＴＣＲである。
【００４９】
いくつかの他の実施形態において、エンゲージャーは、１つ又は複数の他のドメイン、たとえば、１つ又は複数のサイトカイン、副刺激ドメイン、Ｔ細胞活性化の負の調節分子を阻害するドメイン、又はそれらの組合せを追加で含む。特定の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、及び／又はＩＬ−７である。他の特定の実施形態において、副刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、又はＣＤ１３７である。他の特定の実施形態において、Ｔ細胞活性化の負の調節分子を阻害するドメインは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、又はＢ７−Ｈ４である。
【００５０】
具体的なエンゲージャー分子の例。以下に、エンゲージャー分子の具体的な例を示す。一般に、ｓｃＦｖは、リンカーペプチドにより接続されたＶＨ及びＶＬドメインを含有する。たとえば、配列番号１は、下式を含むＥｐｈＡ２−ＣＤ３  Ｔ細胞エンゲージャーである。
【００５１】
ＥｐｈＡ２−ＣＤ３  Ｔ細胞エンゲージャー
リーダー−ＶＨ４Ｈ５−（Ｇ４Ｓ１）３−ＶＬ４Ｈ５−ＳＧ４Ｓ−ＶＨＯＫＴ３−（Ｇ４Ｓ１）３−ＶＬＯＫＴ３
【００５２】
配列番号１は以下のとおりであり、第１の下線部はリーダーであり、以降の下線部は、上式に記載のそれぞれのｓｃＦｖの間のリンカー配列である。
【００５３】
ＭＤＷＩＷＲＩＬＦＬＶＧＡＡＴＧＡＨＳＱＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＴＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＡＬＥＷＭＧＴＩＳＳＧＧＴＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＡＩＦＴＹＷＧＲＧＴＬＶＴＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＮＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＲＡＮＲＬＶＤＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＹＧＴＤＦＴＬＴＩＮＮＩＥＳＥＤＡＡＹＹＦＣＬＫＹＤＶＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＳＧＧＧＧＳＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＳ
【００５４】
ＨＥＲ２−ＣＤ３  Ｔ細胞エンゲージャー
リーダー−ＶＨＦＲＰ５−（Ｇ４Ｓ１）３−ＶＬＦＲＰ５−Ｇ４Ｓ−ＶＨＯＫＴ３−（Ｇ４Ｓ１）３−ＶＬＯＫＴ３
【００５５】
配列番号２は以下のとおりであり、第１の下線部はリーダーであり、以降の下線部は、上式に記載のそれぞれのｓｃＦｖの間のリンカー配列である。
【００５６】
ＭＤＷＩＷＲＩＬＦＬＶＧＡＡＴＧＡＨＳＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＫＫＰＧＥＴＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＰＦＴＮＹＧＭＮＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＫＷＭＧＷＩＮＴＳＴＧＥＳＴＦＡＤＤＦＫＧＲＦＤＦＳＬＥＴＳＡＮＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＳＥＤＭＡＴＹＦＣＡＲＷＥＶＹＨＧＹＶＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＬＴＱＳＨＫＦＬＳＴＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＫＡＳＱＤＶＹＮＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＳＡＳＳＲＹＴＧＶＰＳＲＦＴＧＳＧＳＧＰＤＦＴＦＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＦＣＱＱＨＦＲＴＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＡＬＧＧＧＧＳＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＳ
【００５７】
ＧＤ２−ＣＤ３  Ｔ細胞エンゲージャー
リーダー−ＶＨ１４ｇ２ａ−（ＳＧ４ＳＧ２）−ＶＬ１４ｇ２ａ−Ｇ４Ｓ−ＶＨＯＫＴ３−（Ｇ４Ｓ１）３−ＶＬＯＫＴ３
【００５８】
配列番号３は以下のとおりであり、第１の下線部はリーダーであり、以降の下線部は、上式に記載のそれぞれのｓｃＦｖの間のリンカー配列である。
【００５９】
ＭＥＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣＳＲＤＩＬＬＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＲＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＨＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＧＳＧＧＧＧＳＧＧＥＶＫＬＱＱＳＧＰＳＬＶＥＰＧＡＳＶＭＩＳＣＫＡＳＧＳＳＦＴＧＹＮＭＮＷＶＲＱＮＩＧＫＳＬＥＷＩＧＡＩＤＰＹＹＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＨＬＫＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＶＳＧＭＥＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＳ
【００６０】
ＨＮ３−ＣＤ３  Ｔ細胞エンゲージャー
リーダー−ＶＨＨＮ３−Ｇ４Ｓ−ＶＨＯＫＴ３−（Ｇ４Ｓ１）３−ＶＬＯＫＴ３
【００６１】
配列番号４は以下のとおりであり、第１の下線部はリーダーであり、以降の下線部は、上式に記載のＶＨとｓｃＦｖとの間のリンカー配列である。
【００６２】
ＭＤＷＩＷＲＩＬＦＬＶＧＡＡＴＧＡＨＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＹＦＤＦＤＳＹＥＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＳＩＹＨＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＴＬＲＡＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲＶＮＭＤＲＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＳＧＧＧＧＳＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＳ
【００６３】
ＧＣ３３−ＣＤ３  Ｔ細胞エンゲージャー
リーダー−ＶＨＧＣ３３−（Ｇ４Ｓ１）３−ＶＬＧＣ３３−Ｇ４Ｓ−ＶＨＯＫＴ３−（Ｇ４Ｓ１）３−ＶＬＯＫＴ３
【００６４】
配列番号５は以下のとおりであり、第１の下線部はリーダーであり、以降の下線部は、上式に記載のそれぞれのｓｃＦｖの間のリンカー配列である。
【００６５】
ＭＤＷＩＷＲＩＬＦＬＶＧＡＡＴＧＡＨＳＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＥＭＨＷＶＫＱＴＰＶＨＧＬＫＷＩＧＡＬＤＰＫＴＧＤＴＡＹＳＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＴＲＦＹＳＹＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＮＴＨＶＰＰＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＳＧＧＧＧＳＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＳ
【００６６】
二量化４１ＢＢＬ−ＨＥＲ２−ＣＤ３  Ｔ細胞エンゲージャー
リーダー−ＶＨＧＣ３３−（Ｇ４Ｓ１）３−ＶＬＧＣ３３−ＣＨ２ＣＨ３−（Ｇ４Ｓ１）−４１ＢＢＬ−（Ｇ４Ｓ１）−ＶＨＯＫＴ３−（Ｇ４Ｓ１）３−ＶＬＯＫＴ３
【００６７】
配列番号６は以下のとおりであり、第１の下線部はリーダーであり、以降の下線部は、上式に記載のそれぞれのｓｃＦｖ又はＣＨ２ＣＨ３ドメイン又は４−１ＢＢＬの間のリンカー配列である。
【００６８】
ＭＤＷＩＷＲＩＬＦＬＶＧＡＡＴＧＡＨＳＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＫＫＰＧＥＴＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＰＦＴＮＹＧＭＮＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＫＷＭＧＷＩＮＴＳＴＧＥＳＴＦＡＤＤＦＫＧＲＦＤＦＳＬＥＴＳＡＮＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＳＥＤＭＡＴＹＦＣＡＲＷＥＶＹＨＧＹＶＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＬＴＱＳＨＫＦＬＳＴＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＫＡＳＱＤＶＹＮＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＳＡＳＳＲＹＴＧＶＰＳＲＦＴＧＳＧＳＧＰＤＦＴＦＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＦＣＱＱＨＦＲＴＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＡＬＦＥＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＡＳＡＣＰＷＡＶＳＧＡＲＡＳＰＧＳＡＡＳＰＲＬＲＥＧＰＥＬＳＰＤＤＰＡＧＬＬＤＬＲＱＧＭＦＡＱＬＶＡＱＮＶＬＬＩＤＧＰＬＳＷＹＳＤＰＧＬＡＧＶＳＬＴＧＧＬＳＹＫＥＤＴＫＥＬＶＶＡＫＡＧＶＹＹＶＦＦＱＬＥＬＲＲＶＶＡＧＥＧＳＧＳＶＳＬＡＬＨＬＱＰＬＲＳＡＡＧＡＡＡＬＡＬＴＶＤＬＰＰＡＳＳＥＡＲＮＳＡＦＧＦＱＧＲＬＬＨＬＳＡＧＱＲＬＧＶＨＬＨＴＥＡＲＡＲＨＡＷＱＬＴＱＧＡＴＶＬＧＬＦＲＶＴＰＥＩＰＡＧＬＰＳＰＲＳＥＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＤＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＳ
【００６９】
三量化４１ＢＢＬ−ＨＥＲ２−ＣＤ３  Ｔ細胞エンゲージャー
リーダー−ＶＨＧＣ３３−（Ｇ４Ｓ１）３−ＶＬＧＣ３３−リンカー−Ｃｏｌ−リンカー−４１ＢＢＬ−（Ｇ４Ｓ１）−ＶＨＯＫＴ３−（Ｇ４Ｓ１）３−ＶＬＯＫＴ３
【００７０】
配列番号７は以下のとおりであり、第１の下線部はリーダーであり、以降の下線部は、上式に記載のそれぞれのｓｃＦｖ又はＣｏｌドメイン又は４−１ＢＢＬの間のリンカー配列である。
【００７１】
ＭＤＷＩＷＲＩＬＦＬＶＧＡＡＴＧＡＨＳＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＫＫＰＧＥＴＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＰＦＴＮＹＧＭＮＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＫＷＭＧＷＩＮＴＳＴＧＥＳＴＦＡＤＤＦＫＧＲＦＤＦＳＬＥＴＳＡＮＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＳＥＤＭＡＴＹＦＣＡＲＷＥＶＹＨＧＹＶＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＬＴＱＳＨＫＦＬＳＴＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＫＡＳＱＤＶＹＮＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＳＡＳＳＲＹＴＧＶＰＳＲＦＴＧＳＧＳＧＰＤＦＴＦＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＦＣＱＱＨＦＲＴＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＡＬＦＥＧＡＧＧＳＧＧＳＳＧＳＤＧＡＳＧＳＲＶＴＡＦＳＮＭＤＤＭＬＱＫＡＨＬＶＩＥＧＴＦＩＹＬＲＤＳＴＥＦＦＩＲＶＲＤＧＷＫＫＬＱＬＧＥＬＩＰＩＰＡＤＳＰＰＰＰＡＬＳＳＮＰＧＡＧＧＳＧＧＳＳＧＳＤＧＡＳＧＳＲＡＳＡＣＰＷＡＶＳＧＡＲＡＳＰＧＳＡＡＳＰＲＬＲＥＧＰＥＬＳＰＤＤＰＡＧＬＬＤＬＲＱＧＭＦＡＱＬＶＡＱＮＶＬＬＩＤＧＰＬＳＷＹＳＤＰＧＬＡＧＶＳＬＴＧＧＬＳＹＫＥＤＴＫＥＬＶＶＡＫＡＧＶＹＹＶＦＦＱＬＥＬＲＲＶＶＡＧＥＧＳＧＳＶＳＬＡＬＨＬＱＰＬＲＳＡＡＧＡＡＡＬＡＬＴＶＤＬＰＰＡＳＳＥＡＲＮＳＡＦＧＦＱＧＲＬＬＨＬＳＡＧＱＲＬＧＶＨＬＨＴＥＡＲＡＲＨＡＷＱＬＴＱＧＡＴＶＬＧＬＦＲＶＴＰＥＩＰＡＧＬＰＳＰＲＳＥＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＤＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＳ
【００７２】
本明細書に記載の任意のエンゲージャーについて、それぞれのドメインは、Ｎ末端からＣ末端までどのような順序であってもよく、たとえば、活性化ドメインを抗原認識ドメインのＮ末端側に有すること、活性化ドメインを抗原認識ドメインのＣ末端側に有すること等を含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、抗原認識ドメインを活性化ドメインのＮ末端側に有するエンゲージャー分子を分泌するよう改変される。特定の実施形態において、エンゲージャー分子の２つ以上のドメインがリンカーにより分けられる。リンカーは、任意の好適な長さのものであってよく、かかるパラメータは当技術分野において常法で最適化される。たとえば、リンカーは、第１及び第２のドメインのそれぞれが、互いに独立に、それらの異なる結合特異性を保持できることを確保するのに十分な長さ及び配列のものであってもよい。
【００７３】
いくつかの実施形態において、抗原認識ドメインにより結合される抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は腫瘍特異性抗原（ＴＳＡ）である。いくつかの実施形態において、エンゲージャーの抗原認識ドメインは、ＴＡＡ又はＴＳＡに特異的なｓｃＦｖである。特定の一実施形態において、ＴＡＡ又はＴＳＡは、癌細胞上に発現する。一実施形態において、ＴＡＡ又はＴＳＡは、血液癌細胞上に発現する。別の一実施形態において、ＴＡＡ又はＴＳＡは、固形腫瘍の細胞上に発現する。より具体的な実施形態において、固形腫瘍は、グリア芽腫、非小細胞肺癌、非小細胞肺癌以外の肺癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、肝臓癌、結腸癌、胃癌、脾臓癌、皮膚癌、神経グリア芽腫以外の脳腫瘍、腎臓癌、甲状腺癌等である。より具体的な実施形態において、ＴＡＡ又はＴＳＡは、個体において腫瘍細胞により発現させられる。特定の実施形態において、ＴＡＡ又はＴＳＡは、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、Ｇｌｙｐｉｃａｎ−３、５Ｔ４、８Ｈ９、αｖβ６インテグリン、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＦＡＰ、ＦＡＲ、ＦＢＰ、胎児ＡｃｈＲ、葉酸受容体α、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＩＬ１１Ｒａ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＫＤＲ、Ｌａｍｂｄａ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＣ１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、スルビビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、ＶＥＧＲＲ２、癌胎児性抗原、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＶＥＧＦ受容体のうちの１つ又は複数のものであり、たとえば、エンゲージャー上のｓｃＦｖはこれらのうちの１つ又は複数に特異的であり、他の例示的な抗原は、腫瘍の細胞外マトリックス内に存在する抗原、たとえばフィブロネクチン、テネイシンの癌胎児性変異体、又は腫瘍の壊死領域である。
【００７４】
本開示の実施形態において、方法及び組成物は、二重特異性単鎖抗体コンストラクトを含む組成物に関する。二重特異性単鎖抗体コンストラクトは、少なくとも２つのドメインを含んでいてもよく、又はそれらからなっていてもよく、又はそれらから本質的になっていてもよく、前記少なくとも２つのドメインの１つは、腫瘍抗原、たとえばＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２、ＧＤ２又はＧｌｙｐｉｃａｎ−３に特異的に結合し、第２のドメインは、Ｔ細胞タンパク質、たとえばＣＤ３抗原に結合する。
【００７５】
ＥｐｈＡ２は、ＥＰＨ受容体Ａ２（エフリンＡ型受容体２、ＥＰＨＡ２、ＡＲＣＣ２、ＣＴＰＡ、ＣＴＰＰ１、又はＥＣＫ）と呼ばれうるのであり、これは、ヒトにおいてタンパク質チロシンキナーゼファミリーのエフリン受容体サブファミリーにおけるＥＰＨＡ２遺伝子によりコードされるタンパク質である。このサブファミリーにおける受容体は、一般に、単一のキナーゼドメイン及びＣｙｓリッチドメイン及び２つのフィブロネクチンＩＩＩ型リピートを含む細胞外領域を含み、本開示の抗体の実施形態は、任意のこれらのドメインを標的としてもよい。エフリン受容体は、それらのそれぞれの細胞外ドメイン配列の類似性並びにエフリン−Ａ及びエフリン−Ｂリガンドとの結合へのそれらの親和性の結果として２つの群に分けられ、ＥｐｈＡ２は、エフリン−Ａリガンドと結合するタンパク質をコードする。例示的なヒトＥｐｈＡ２核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００４４３１にあり、例示的なヒトＥｐｈＡ２ポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＰ＿００４４２２にあり、これら配列の両方の全体が本明細書に組み込まれる。
【００７６】
ＨＥＲ２は、ヒト上皮成長因子受容体２（Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２、ＣＤ３４０、又はｐ１８５）と呼ばれうるのであり、これは、ヒトにおいて上皮成長因子受容体（ＥＦＲ／ＥｒｂＢ）ファミリーのＥＲＢＢ２遺伝子によりコードされるタンパク質である。ＨＥＲ２は、多数のシグナリング分子と相互作用できる細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含有する。本開示の抗体の実施形態は、細胞外リガンド結合ドメインを標的にしてもよい。
【００７７】
例示的なヒトＥｐｈＡ２核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００４４４８．２にあり、例示的なヒトＥｐｈＡ２ポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＰ＿００４４３９にあり、これら配列の両方の全体が本明細書に組み込まれる。
【００７８】
ＧＤ２は、神経外胚葉起源の腫瘍、たとえばヒト神経芽腫上及び黒色腫に発現するジシアロガングリオシドであり、正常組織上では非常に限定的に発現し、主にヒトの小脳及び末梢神経に発現する。Ｇｄ２は、細胞表面上に存在し集中し、セラミド成分の２つの炭化水素鎖が細胞膜に埋め込まれており、オリゴ糖が細胞外表面上に位置し、それらは細胞外分子又は隣接する細胞の表面のための認識点を提示する。本開示の抗体の実施形態は、細胞外ドメインを標的にしてもよい。
【００７９】
「二重特異性単鎖抗体コンストラクト」という用語は、２つの抗体に由来する結合ドメインを含むコンストラクトに関する。特定の実施形態において、二重特異性単鎖抗体コンストラクトは、直列バイｓｃＦｖ又はダイアボディであってもよい。結合ドメインのうちの１つは、たとえばＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２、ＧＤ２又はＧｌｙｐｉｃａｎ−３と特異的に結合／相互作用可能な、抗体、抗体フラグメント又はそれらの誘導体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の両方の可変領域（又はそれらの一部）を含んでいてもよい。第２の結合ドメインは、たとえばヒトＣＤ３抗原と特異的に結合／相互作用可能な、抗体、抗体フラグメント又はそれらの誘導体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の両方の可変領域（又はそれらの一部）を含んでいてもよい。特定の実施形態において、可変領域の一部は、少なくとも１つのＣＤＲ（「相補性決定領域」）、たとえば少なくともＣＤＲ３領域であってもよい。
【００８０】
特定の実施形態において、本開示の組成物において用いられる「二重特異性単鎖抗体コンストラクト」は、二重特異性単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは一般に、リンカーペプチドにより接続されたＶＨ及びＶＬドメインを含有する。分泌可能エンゲージャーは、細胞からのシグナルペプチド（分泌を可能にする）から構成され、リンカーペプチド（Ｌｘ、Ｌｙ、Ｌｚ）により接続された２つのｓｃＦｖが続く。リンカーは、第１及び第２のドメインのそれぞれが、互いに独立に、それらの異なる結合特異性を保持できることを確保するのに十分な長さ及び配列のものであってもよい。二重特異性単鎖分子は、当技術分野において知られており、ＷＯ９９／５４４４０；Ｍａｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７年）、１５８、３９６５〜３９７０頁；Ｍａｃｋ、ＰＮＡＳ、（１９９５年）、９２、７０２１〜７０２５頁；Ｋｕｆｅｒ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、（１９９７年）、４５、１９３〜１９７頁；Ｌｏｆｆｌｅｒ、Ｂｌｏｏｄ、（２０００年）、９５、６、２０９８〜２１０３頁；及びＢｒｕｈｌ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（２００１年）、１６６、２４２０〜２４２６頁に記載されている。
【００８１】
本開示の特定の実施形態において、本開示の例示的な分子フォーマットが、シグナルペプチドとそれに続く２つの抗体由来領域を含むポリペプチドをコードする腫瘍溶解性ウイルスポリヌクレオチドコンストラクトを提供する。各抗体由来領域（ｓｃＦｖ）は、１つのＶＨ及び１つのＶＬ領域を含む。特定の実施形態において、二重特異性ｓｃＦｖは、直列バイｓｃＦｖ又はダイアボディであってもよい。二重特異性ＳｃＦｖは、以下の様々なフォーマットに配置されうる。すなわち、ＶＨα−Ｌｘ−ＶＬα−Ｌｙ−ＶＨβ−Ｌｚ−ＶＬβ、ＶＬα−Ｌｘ−ＶＨα−Ｌｙ−ＶＨβ−Ｌｚ−ＶＬβ、ＶＬα−Ｌｘ−ＶＨα−Ｌｙ−ＶＬβ−Ｌｚ−ＶＨβ、ＶＨα−Ｌｘ−ＶＬα−Ｌｙ−ＶＬβ−Ｌｚ−ＶＨβ、ＶＨα−Ｌｘ−ＶＬβ−Ｌｙ−ＶＨβ−Ｌｚ−ＶＬα、ＶＬα−Ｌｘ−ＶＬβ−Ｌｙ−ＶＨβ−Ｌｚ−ＶＨα、ＶＨα−Ｌｘ−ＶＨβ−Ｌｙ−ＶＬβ−Ｌｚ−ＶＬα、ＶＬα−Ｌｘ−ＶＨβ−Ｌｙ−ＶＬβ−Ｌｚ−ＶＨα、ＶＨβ−Ｌｘ−ＶＬα−Ｌｙ−ＶＨα−Ｌｚ−ＶＬβ、ＶＬβ−Ｌｘ−ＶＬα−Ｌｙ−ＶＨα−Ｌｚ−ＶＨβ、ＶＨβ−Ｌｘ−ＶＨα−Ｌｙ−ＶＬα−Ｌｚ−ＶＬβ、ＶＬβ−Ｌｘ−ＶＨα−Ｌｙ−ＶＬα−Ｌｚ−ＶＨβ。したがって、上の可能な配置を有する二重特異性ｓｃＦｖは、二重特異性単鎖コンストラクトの特定の実施形態である。
【００８２】
本開示の特定の実施形態において、抗体コンストラクトはまた、たとえば組換えで製造されたコンストラクトの単離及び／又は調製のための、追加のドメインを含んでいてもよい。加えて、抗原結合ドメインは、複数の抗原を標的にすることを可能にする複数の抗原認識結合ドメインを含有していてもよい一方で、活性化ドメインは、細胞を活性化する複数のドメインを含有していてもよい。
【００８３】
本開示により使用される「単鎖」という用語は、二重特異性単鎖コンストラクトの前記第１及び第２のドメインが、好ましくは単一の核酸分子によりコード可能な共直線アミノ酸配列の形態で、共有結合で結合されることを意味する。
【００８４】
本開示の文脈において使用される「と結合／相互作用する」という用語は、少なくとも２つの「抗原相互作用部位」の互いとの結合／相互作用を定義する。「抗原相互作用部位」という用語は、本開示によれば、特異的抗原又は特異的抗原の群との特異的相互作用の能力を示すポリペプチドのモチーフを定義する。結合／相互作用はまた、「特異的認識」を定義するものと理解される。「特異的に認識する」という用語は、本発明によれば、抗体分子が、本明細書に定義される標的分子のそれぞれの少なくとも２つのアミノ酸と特異的に相互作用及び／又は結合可能であることを意味する。この用語は、抗体分子の特異性、すなわち本明細書に定義されるヒト標的分子の特異的領域間を識別するその能力に関する。抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用は、たとえば抗原のコンフォメーションの変化の誘導、抗原のオリゴマー化等による、シグナルの開始をもたらしてもよい。さらに、この結合は、「鍵と鍵穴の原理」の特異性により例示できる。したがって、いくつかの実施形態において、抗原相互作用部位及び抗原のアミノ酸配列における特異的モチーフが、それらの一次、二次又は三次構造の結果として、並びに前記構造の二次改変の結果として、互いに結合する。抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用は、この部位の抗原との単純な結合ももたらしうる。
【００８５】
本開示により使用される「特異的相互作用」という用語は、二重特異性単鎖コンストラクトが類似の構造の（ポリ）ペプチドと交差反応しないか、又は本質的に交差反応しないことを意味する。研究対象の一群の二重特異性単鎖コンストラクトの交差反応性は、たとえば、その二重特異性単鎖コンストラクトの群の、目的の（ポリ）ペプチド並びに数多くの多かれ少なかれ（構造的及び／又は機能的に）密接に関連する（ポリ）ペプチドに対する結合を、従来の条件下（たとえば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８年並びにＵｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９年を参照のこと）で評価することにより試験されうる。目的の（ポリ）ペプチド／タンパク質と結合するが、任意の他の（ポリ）ペプチドとは結合しないか、又はそれらとは本質的に結合しない抗体のみが、目的の（ポリ）ペプチド／タンパク質に特異的であると考えられる。抗原相互作用部位と特異的抗原との特異的相互作用の例には、リガンドのその受容体への特異性が含まれる。この定義は、リガンドの相互作用を特に含み、リガンドはその特異的受容体との結合の際にシグナルを誘導する。対応するリガンドの例には、サイトカインが含まれ、サイトカインはその特異的サイトカイン受容体と相互作用／結合する。前記相互作用の別の一例は、抗原決定基（エピトープ）と抗体の抗原結合部位との相互作用である。
【００８６】
「と結合／相互作用する」という用語はまた、ヒト標的分子又はそれらの一部の２つの領域からなる、立体構造エピトープ、構造エピトープ又は不連続エピトープに関する。本開示の文脈において、立体構造エピトープは、一次配列においては分かれているが、ポリペプチドが折り畳まれて天然タンパク質になるときに分子の表面上で一体となる、２つ以上の別個のアミノ酸配列により定義される（Ｓｅｌａ、（１９６９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６６、１３６５頁及びＬａｙｅｒ、（１９９０年）Ｃｅｌｌ  ６１、５５３〜６頁）。
【００８７】
本開示のコンストラクトはまた、本明細書で下に開示のとおり、本明細書に記載のヒトＣＤ３複合体の２つの領域又はそれらの一部から構成される且つ／又はそれらを含む、立体構造／構造エピトープと特異的に結合／相互作用するよう想定される。
【００８８】
したがって、特異性は、当技術分野において知られている方法並びに本明細書に開示及び記載の方法により、実験的に決定できる。かかる方法は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＣＬ、ＩＲＭＡ、ＥＩＡ試験及びペプチドスキャンを含むが、これに限定されるものではない。
【００８９】
「抗体フラグメント又はその誘導体」という用語は、単鎖抗体又はそのフラグメント、合成抗体、抗体フラグメント、たとえばＣａｍｅｌ  Ｉｇ、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ２）’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）等、又はこれらの任意のものの化学修飾誘導体に関する。本開示により用いられる抗体又はそれらの対応する免疫グロブリン鎖を、当技術分野において知られている常法を使用して、たとえばアミノ酸欠失、挿入、置換、付加及び／又は組換え、及び／又は当技術分野において知られている任意の他の修飾（たとえば翻訳後及び化学修飾、たとえばグリコシル化及びリン酸化）を、単独で又は組み合わせて使用することにより、さらに修飾できる。免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の基礎となるＤＮＡ配列におけるかかる修飾を導入する方法は、当業者によく知られており、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）を参照のこと。
【００９０】
「抗体フラグメント又はその誘導体」という用語は、特に、少なくとも１つのＣＤＲを含む（ポリ）ペプチドコンストラクトに関する。
【００９１】
記載した抗体分子のフラグメント又は誘導体は、上の抗体分子の一部であり、且つ／又は化学的／生化学的若しくは分子生物学的方法により修飾された（ポリ）ペプチドを定義する。対応する方法は、当技術分野において知られ、とりわけ実験マニュアルに記載されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版  １９８９年及び第３版  ２００１年；Ｇｅｒｈａｒｄｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、１９９４年；Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ：Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７年；Ｇｏｌｅｍｉｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００２年を参照のこと）。
【００９２】
本明細書に記載の二重特異性単鎖コンストラクトに含まれる可変ドメインは、追加のリンカー配列により接続されていてもよい。「ペプチドリンカー」という用語は、本開示によれば、定義されたコンストラクトの第１のドメイン及び第２のドメインのアミノ酸配列が互いに結合されているアミノ酸配列を定義する。かかるペプチドリンカーの本質的な技術的特徴は、前記ペプチドリンカーが重合活性を一切含まないことである。二次構造の促進を含まないペプチドリンカーの特徴は、当技術分野において知られており、たとえば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８年）３７、９２６６〜９２７３頁）、Ｃｈｅａｄｌｅら（Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２年）２９、２１〜３０頁）並びにＲａａｇ及びＷｈｉｔｌｏｗ（ＦＡＳＥＢ（１９９５年）９（１）、７３〜８０頁）に記載されている。５個未満のアミノ酸を有する想定されるペプチドリンカーは、４個、３個、２個又は１個のアミノ酸を含みうる。「ペプチドリンカー」の文脈において特に好ましい「単一」アミノ酸は、Ｇｌｙである。したがって、ペプチドリンカーは、単一のアミノ酸Ｇｌｙからなっていてもよい。さらにまた、二次構造を一切促進しないペプチドリンカーが好ましい。ドメインの互いとの連結は、たとえば、遺伝子工学により提供されうる。融合及び作動可能に連結された二重特異性単鎖コンストラクトを調製し、それらを哺乳類細胞又は細菌において発現させるための方法は、当技術分野においてよく知られている（たとえば、ＷＯ９９／５４４４０、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．１９８９年及び１９９４年又はＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１年）。
【００９３】
本明細書で上及び下に記載の二重特異性単鎖抗体コンストラクトは、ヒト化又は脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）抗体コンストラクトであってもよい。（ポリ）ペプチド及び、特に、抗体コンストラクトのヒト化及び／又は脱免疫化のための方法は、当業者に知られている。
【００９４】
本開示の医薬組成物の一実施形態において、ヒトＣＤ３特異的ドメインのＶＨ及びＶＬ領域は、Ｘ３５−３、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ−Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１−４０９、ＣＬＢ−Ｔ３．４．２、ＴＲ−６６、ＷＴ３２、ＳＰｖ−Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ−１４１、ＸＩＩＩ−４６、ＸＩＩＩ−８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２−８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２−４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ−Ｔ３０１、ＳＭＣ２、ＷＴ３１及びＦ１０１．０１からなる群から選択されるＣＤ３特異的抗体に由来する。これらのＣＤ３特異的抗体は当技術分野において知られており、とりわけ、Ｔｕｎｎａｃｌｉｆｆｅ（１９８９）、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１、５４６〜５５０頁に記載されている。特定の実施形態において、ＶＨ及びＶＬ領域は、ヒトＣＤ３−ε鎖又はヒトＣＤ３−ζ鎖を特異的に認識することが可能な抗体／抗体誘導体等に由来する。
【００９５】
本開示はまた、上に定義した二重特異性単鎖抗体コンストラクトをコードする腫瘍溶解性ウイルス核酸配列を含む組成物及びこの核酸配列を有する細胞を包含する。腫瘍溶解性ウイルス核酸分子は、組換え核酸分子であり、特定の態様において合成であってもよい。
【００９６】
別の一態様において、エンゲージャー分子、たとえば任意の本明細書に記載のエンゲージャー分子をコードするウイルスポリヌクレオチドが本明細書において提供される。特定の一実施形態において、ウイルスポリヌクレオチドは、ウイルスを含有する細胞におけるエンゲージャー分子の誘導性発現を可能にする。本明細書において提供される任意の実施形態において、ウイルスは、好ましくは細胞により分泌可能な形態のエンゲージャーをコードする。上記ポリヌクレオチドは、活性化ドメイン及び抗原認識ドメインを含む融合分子をコードし、特定の実施形態において、各ドメインはｓｃＦｖである。活性化ドメインは、抗原認識ドメインに対してポリペプチドのＮ末端の方に配置されてもよく、又は活性化ドメインは、抗原認識ドメインに対してポリペプチドのＣ末端の方に配置されてもよい。
【００９７】
調節配列を本開示の組成物に含まれる腫瘍溶解性ウイルス核酸分子に追加してもよいことは当業者にとって明らかである。たとえば、プロモーター、転写エンハンサー、及び／又は本開示のポリヌクレオチドの誘導された発現を可能にする配列が用いられてもよい。好適な誘導系は、たとえばＧｏｓｓｅｎ及びＢｕｊａｒｄ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９（１９９２年）、５５４７〜５５５１頁）並びにＧｏｓｓｅｎら（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２（１９９４年）、５８〜６２頁）により記述されているテトラサイクリン調節遺伝子発現、又はたとえばＣｒｏｏｋ（１９８９年）ＥＭＢＯ  Ｊ．８、５１３〜５１９頁により記述されているデキサメタゾン誘導性遺伝子発現系である。
【００９８】
さらに、腫瘍溶解性ウイルス核酸分子が、たとえばチオエステル結合及び／又はヌクレオチド類似体を含有していてもよいことが、さらなる目的のために想定される。細胞におけるエンド−及び／又はエキソヌクレアーゼに対する核酸分子の安定化のために、修飾が有用でありうる。核酸分子は、細胞における核酸分子の転写を可能にするキメラ遺伝子を含む適切な腫瘍溶解性ベクターにより転写されてもよい。この点に関して、かかるポリヌクレオチドを、「遺伝子ターゲティング」又は「遺伝子治療」アプローチのために使用できることもまた理解されるべきである。別の一実施形態において、核酸分子は標識化される。核酸の検出のための方法は、当技術分野においてよく知られており、たとえば、サザン及びノーザンブロッティング、ＰＣＲ又はプライマー伸長である。この実施形態は、たとえば遺伝子治療アプローチ中に、上述の核酸分子の導入の成功を検証するためのスクリーニング方法のために有用でありうる。
【００９９】
腫瘍溶解性ウイルス核酸分子は、任意の前述の核酸分子を単独で又は組み合わせて含む、組換えにより製造されたキメラ核酸分子であってもよい。特定の態様において、核酸分子はベクターの一部である。
【０１００】
したがって、本開示はまた、本開示に記載の核酸分子を含む腫瘍溶解性ウイルスベクターを含む組成物に関する。
【０１０１】
特定の実施形態において、本明細書に定義される二重特異性単鎖抗体コンストラクトをコードする核酸配列に作動可能に連結されている調節配列である核酸配列を含む腫瘍溶解性ウイルスベクターがある。かかる調節配列（制御要素）は、当業者に知られており、プロモーター、スプライシングカセット、翻訳開始コドン、インサートをベクターに導入するための翻訳及び挿入部位を含んでいてもよい。特定の実施形態において、核酸分子は、真核又は原核細胞における発現を可能にする前記発現制御配列に作動可能に連結される。
【０１０２】
腫瘍溶解性ウイルスベクターが、本明細書に定義される二重特異性単鎖抗体コンストラクトをコードする核酸分子を含む発現ベクターであることが想定される。特定の態様において、腫瘍溶解性ウイルスベクターは、ワクシニアウイルスベクターである。ワクシニアウイルスは、Ｗｙｅｔｈ又はＷｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ）株であってもよい。ワクシニアウイルスは、そのゲノムに欠失又は１つ若しくは複数の遺伝子に変異を有していてもよい。ワクシニアウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子は、欠失していてもよい。ワクシニアウイルスは、ワクシニアウイルス成長因子をコードする遺伝子に変異を有していてもよい。特定の態様において、腫瘍溶解性ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは市販されており、たとえば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）又はＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ社（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）製のものを含む。
【０１０３】
「調節配列」という用語は、それらが連結されるコーディング配列の発現を実現するのに必要なＤＮＡ配列を指す。かかる制御配列の性質は、宿主生物により異なる。原核生物では、制御配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位及びターミネーターを含む。真核生物では、制御配列は一般に、プロモーター、ターミネーター及び、いくつかの例において、エンハンサー、トランス活性化因子又は転写因子を含む。「制御配列」という用語は、最低でも、その存在が発現に必要な全構成要素を含むことが意図されており、追加の有利な構成要素もまた含んでいてもよい。
【０１０４】
「作動可能に連結される」という用語は並置を指し、そのように記載される構成要素は、それらが意図される仕方で機能することを可能にする関係にある。コーディング配列に「作動可能に連結される」制御配列は、コーディング配列の発現が、制御配列に適合する条件下で達成されるように連結される。制御配列がプロモーターである場合、二本鎖核酸が好ましくは使用されることは、当業者にとって明らかである。
【０１０５】
したがって、いくつかの実施形態において、記載のベクターは、腫瘍溶解性ウイルス発現ベクターである。「発現ベクター」は、選択された宿主を形質転換するために使用でき、選択された宿主におけるコーディング配列の発現を提供するコンストラクトである。発現ベクターは、たとえばクローニングベクター、バイナリーベクター又は組込みベクターでありうる。発現は、好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの核酸分子の転写を含む。真核生物における発現を確保する調節要素は、当業者によく知られている。真核細胞の場合には、それらは、転写の開始を確保するプロモーター並びに、任意選択で転写の終結及び転写物の安定化を確保するポリＡシグナルを通常は含む。真核生物宿主細胞における発現を可能にする調節要素の例は、酵母菌のＡＯＸ１若しくはＧＡＬ１プロモーター、又は哺乳類若しくは他の動物細胞のＣＭＶ−、ＳＶ４０−、ＲＳＶ−プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶ−エンハンサー、ＳＶ−４０エンハンサー若しくはグロビンイントロンがある。
【０１０６】
転写の開始の原因となる要素に加えて、かかる調節要素はまた、ポリヌクレオチドの下流に、転写終結シグナル、たとえばＳＶ４０−ポリＡ部位又はｔｋ−ポリＡ部位を含んでいてもよい。さらに、使用される発現系によって、ポリペプチドを細胞内コンパートメントに導くこと又はそれを培地中に分泌することが可能なリーダー配列を、記載の核酸配列のコーディング配列に追加してもよく、これは当技術分野においてよく知られている。リーダー配列は、翻訳、開始及び終結配列と適切な段階で組み合わされ、好ましくは、リーダー配列は、翻訳されたタンパク質又はその一部を細胞膜周辺腔又は細胞外培地へ分泌するよう導くことが可能である。任意選択で、異種配列が、所望の特性、たとえば発現した組換え産物の安定化又は簡易精製を付与するＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードしうる。上記を参照のこと。この文脈において、好適な発現ベクターが当技術分野において知られており、たとえばＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ  ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＦ−Ｎｅｏ、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ及びｐＥＦ−ＡＤＡ（Ｒａｕｍら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（２００１年）５０（３）、１４１〜１５０頁）又はｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）がある。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換又は形質移入することが可能なベクターにおける真核生物プロモーター系であるが、原核生物宿主の制御配列もまた使用できる。ベクターが適切な宿主に組み込まれると、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベル発現に好適な条件下で維持され、所望の場合には、本開示のポリペプチドの回収及び精製を続けてもよい。
【０１０８】
追加の調節要素には、転写エンハンサーが翻訳エンハンサーとともに含まれる。有利には、上述の本開示のベクターは、選択可能及び／又はスコアリング可能マーカーを含む。形質転換された細胞の選択に有用な選択可能マーカー遺伝子は当業者によく知られており、たとえば、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｒｅｉｓｓ、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  Ａｄｖ．）１３（１９９４年）、１４３〜１４９頁）、アミノグリコシドであるネオマイシン、カナマイシン及びパロマイシンに対する耐性を付与するｎｐｔ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ、ＥＭＢＯ  Ｊ．２（１９８３年）、９８７〜９９５頁）、並びにハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｍａｒｓｈ、Ｇｅｎｅ  ３２（１９８４年）、４８１〜４８５頁）の選択の根拠としての代謝拮抗物質耐性を含む。追加の選択可能遺伝子が記述されてきたのであり、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（１９８８年）、８０４７頁）、細胞がマンノースを利用することを可能にするマンノース−６−ホスフェートイソメラーゼ（ＷＯ９４／２０６２７）及びオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ、１９８７年：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ編収録）又はブラストシジンＳに対する耐性を付与するアスペルギルス・テルレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）由来のデアミナーゼ（Ｔａｍｕｒａ、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９（１９９５年）、２３３６〜２３３８）である。
【０１０９】
有用なスコアリング可能なマーカーもまた、当業者に知られており、市販されている。有利には、前記マーカーは、ルシフェラーゼ（Ｇｉａｃｏｍｉｎ、Ｐｌ．Ｓｃｉ．１１６（１９９６年）、５９〜７２頁；Ｓｃｉｋａｎｔｈａ、Ｊ．Ｂａｃｔ．１７８（１９９６年）、１２１頁）、緑色蛍光タンパク質（Ｇｅｒｄｅｓ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３８９（１９９６年）、４４〜４７頁）又はβ−グルクロニダーゼ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、ＥＭＢＯ  Ｊ．６（１９８７年）、３９０１〜３９０７頁）をコードする遺伝子である。この実施形態は、記載のベクターを含有する細胞、組織及び生物の簡便で迅速なスクリーニングのために特に有用である。
【０１１０】
上述のとおり、記載の腫瘍溶解性ウイルスベクター核酸分子は、癌治療のために単独で使用できる。上述の二重特異性単鎖抗体コンストラクトのうちの任意の１つをコードするＤＮＡ配列を含有するベクターは、対象に送達され、ひいては目的のポリペプチドをもたらす。
【０１１１】
上記によれば、本開示は、本明細書に定義される二重特異性単鎖抗体コンストラクトのポリペプチド配列をコードする核酸分子を含む、遺伝子工学において従来使用されている腫瘍溶解性ウイルスベクターを得る方法に関する。好ましくは、腫瘍溶解性ベクターは、発現ベクター及び／又は遺伝子導入若しくはターゲティングベクターである。組換えベクターを構築するために、当業者によく知られている方法を使用できる。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記引用）、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９８９年、上記引用）又は他の標準的教科書に記載の技術を参照のこと。本開示の核酸分子を含有する腫瘍溶解性ウイルスベクターは、細胞宿主のタイプにより変わるよく知られている方法により、宿主細胞内に導入できる。たとえば、リン酸カルシウム処置又は電気穿孔法が、細胞宿主について使用できる。上記Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと。
【０１１２】
本開示の医薬組成物は、本明細書で上に定義される腫瘍溶解性ウイルスベクターで形質転換又は形質移入された宿主を含むことがさらに想定される。宿主は、上述のベクターのうちの少なくとも１つ又は上述の核酸分子のうちの少なくとも１つを宿主内に導入することにより製造できる。宿主における少なくとも１つのベクター又は少なくとも１つの核酸分子の存在は、上述の特異的単鎖抗体コンストラクトをコードする遺伝子の発現を媒介することができる。
【０１１３】
宿主内に導入された記載の核酸分子又はベクターは、宿主のゲノムに統合されてもよく、又はそれは染色体外に維持されてもよい。
【０１１４】
宿主は、任意の真核細胞又は原核細胞でありうる。記載の宿主は、哺乳類細胞であってもよいことが特に想定される。特に好ましい宿主細胞には、ＣＶ−１、ＢＳ−Ｃ−１、ＨｕＴＫ−１４３Ｂ、ＢＨＫ−２１、ＣＥＦ、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ミエローマ細胞株、たとえばＳＰ２／０又はＮＳ／０細胞が含まれる。
【０１１５】
本開示の医薬組成物はまた、細胞増殖又は細胞刺激のために有用な免疫エフェクター細胞のための活性化シグナルを提供することが可能な、タンパク質様化合物を含んでいてもよい。タンパク質様化合物は、上に定義した二重特異性単鎖抗体コンストラクトの追加のドメインとしてではなく、本開示の医薬組成物の少なくとも１つの追加構成要素として理解される。
【０１１６】
本開示に照らし、免疫エフェクター細胞のための活性化シグナルを提供する「タンパク質様化合物」は、たとえば、Ｔ細胞のためのさらなる活性化シグナル（たとえばさらなる副刺激分子、すなわちＢ７−ファミリーの分子、Ｏｘ４０  Ｌ、４．１  ＢＢＬ）、又はさらなるサイトカイン、すなわちインターロイキン（たとえばＩＬ−２）、又はＮＫＧ−２Ｄ接合化合物であってもよい。タンパク質様化合物の好ましいフォーマットには、追加の二重特異性抗体及びフラグメント又はそれらの誘導体、たとえば二重特異性ｓｃＦｖが含まれる。タンパク質様化合物には、Ｔ細胞受容体又はスーパー抗原に特異的なｓｃＦｖフラグメントが含まれうるが、これに限定されるものではない。スーパー抗原は、ＭＨＣから独立した仕方でＴ細胞受容体可変領域のいくつかのサブファミリーに直接結合し、そのことにより一次Ｔ細胞活性化シグナルを媒介する。タンパク質様化合物はまた、非Ｔ細胞である免疫エフェクター細胞のための活性化シグナルを提供してもよい。非Ｔ細胞である免疫エフェクター細胞の例には、とりわけ、ＮＫ細胞が含まれる。
【０１１７】
本開示の一実施形態は、本開示の組成物の製造のための方法に関し、この方法は、本明細書に定義される宿主を、コンストラクトの発現を可能にする条件下で培養する工程、及び製造された二重特異性単鎖抗体コンストラクトを培養物から回収する工程を含む。
【０１１８】
本開示の一実施形態は、上に定義した方法により製造され且つ／又は上に定義した二重特異性単鎖抗体コンストラクト、上に定義した核酸配列、上に定義したベクター、上に定義した宿主の、癌性疾患、たとえば腫瘍性疾患の予防、治療又は寛解のための医薬組成物の調製のための使用に関する。特に、本開示の医薬組成物は、たとえば固形腫瘍を有する癌を含む癌の予防、寛解及び／又は治療において特に有用でありうる。
【０１１９】
上に定義した細胞、二重特異性単鎖抗体コンストラクト、核酸分子及びベクターが、単独又は任意の組合せで、標準的なベクター及び／又は遺伝子送達系を使用して、少なくともいくつかの場合において、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とともに投与されることが本開示により想定される。投与に続いて、前記核酸分子又はベクターは、対象のゲノムに安定的に統合されうる。
【０１２０】
特定の実施形態において、いくつかの細胞又は組織に特異的で、前記細胞内に持続するウイルスベクターを使用できる。好適な医薬担体及び賦形剤は、当技術分野においてよく知られている。本開示により調製される組成物は、上に同定される疾患の予防又は治療又は遅延のために使用できる。
【０１２１】
さらに本開示は、上に定義した方法により製造され且つ／又は上に定義した二重特異性単鎖抗体コンストラクト、上に定義した核酸配列、上に定義したベクターを有する有効量の細胞を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、腫瘍性疾患の予防、治療又は寛解のための方法に関する。
【０１２２】
本開示の実施形態は、上に定義した二重特異性単鎖抗体コンストラクト、上に定義した核酸配列、上に定義したベクター及び／又は上に定義した宿主を含むキットに関する。本開示のキットが、医学的治療又は介入を必要とする個体に投与される本明細書で上に記載の医薬組成物を、単独で又はさらなる薬剤と組み合わせて含むこともまた想定される。
【０１２３】
ＩＩＩ．腫瘍溶解性ウイルスの治療的使用
例示のため、癌患者又は癌に罹患しやすい患者又は癌に罹患していることが疑われる患者を、本明細書に記載のとおり治療できる。本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスが、個体に投与され、長期間保持されてもよい。個体は、ウイルスの１回又は複数の投与を受けてもよい。いくつかの実施形態において、ウイルスは、免疫認識を抑制するためにカプセル化され、腫瘍の部位に置かれる。本開示の実施形態は、本開示の組成物の製造のための方法、癌の予防、治療又は寛解のための方法、及び腫瘍溶解性ウイルスの癌の予防、治療又は寛解における使用をさらに包含する。
【０１２４】
様々な実施形態において、発現コンストラクト、核酸配列、宿主細胞及び／又はそれらを含む医薬組成物が、癌性疾患、たとえば腫瘍性疾患の予防、治療又は寛解のために使用される。特定の実施形態において、本開示の医薬組成物は、たとえば固形腫瘍を有する癌を含む癌の予防、寛解及び／又は治療において特に有用でありうる。
【０１２５】
本開示の組成物の投与のための可能な適応症は、癌性疾患、たとえば腫瘍性疾患、たとえば乳癌、前立腺癌、肺癌、及び結腸癌又は上皮癌／細胞癌、たとえば乳癌、結腸癌、前立腺癌、頭頸部癌、皮膚癌、泌尿生殖器の癌、たとえば卵巣癌、子宮体癌、子宮頚癌及び腎臓癌、肺癌、胃癌、小腸癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、胆管癌、食道癌、唾液腺癌、及び甲状腺癌である。特定の実施形態において、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、及び骨髄異形成症候群を含むが、これに限られない血液悪性腫瘍は、本開示の方法及び組成物で治療される。特定の実施形態において、癌は、たとえばＥｐｈＡ２−、ＨＥＲ２−、ＧＤ２−又はＧｌｙｐｉｃａｎ−３−陽性である。他の特定の実施形態において、癌は、たとえば、その細胞表面上の提示される、本明細書に列挙された任意の腫瘍関連抗原又は腫瘍特異性抗原について陽性である。本開示の組成物の投与は、微小残存病変、初期固形腫瘍、進行固形腫瘍及び／又は転移性固形腫瘍を含む、あらゆるステージ及びタイプの癌について有用である。
【０１２６】
本明細書において使用される「治療」又は「治療する」は、疾患又は病態の症状又は病理に対する任意の有益又は所望の効果を含み、治療されている疾患又は病態、たとえば癌の１つ又は複数の測定可能なマーカーにおける極小の減少をも含みうる。治療は、疾患若しくは病態の症状の減少若しくは寛解、又は疾患若しくは病態の進行の遅延を、任意選択で伴いうる。「治療」は、疾患若しくは病態、又はそれらの関連症状の完全な根絶又は治癒を必ずしも指さない。
【０１２７】
本明細書において使用される「予防する」、及び類似する用語、たとえば「予防される」、「予防すること」等は、疾患又は病態、たとえば癌の発生又は再発の可能性を予防、阻害、又は低減するためのアプローチを指す。それはまた、疾患若しくは病態の発症若しくは再発を遅延させること、又は疾患若しくは病態の症状の発生若しくは再発を遅延させることを指す。本明細書において使用される「予防する」及び類似する用語はまた、疾患又は病態の発症又は再発前の疾患又は病態の強度、影響、症状及び／又は負担を減少させること含む。
【０１２８】
特定の実施形態において、本発明は、部分的に、単独又は別の治療との任意の組合せで、少なくともいくつかの態様において、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とともに投与できるウイルス、発現コンストラクト、核酸分子及び／又はベクターを考慮する。いくつかの実施形態において、ウイルスの投与前に、それらは当技術分野においてよく知られている好適な医薬担体及び賦形剤と組み合わされてもよい。本開示により調製される組成物は、癌の発生又は悪化の予防又は治療又は遅延のために使用できる。
【０１２９】
さらに、本開示は、有効量の本開示の腫瘍溶解性ウイルスをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、癌性（腫瘍性を含む）疾患の予防、治療又は寛解のための方法に関し、ウイルスは、免疫細胞上の標的に結合する活性化ドメイン及び標的細胞によりもたらされる又は標的細胞上に存在する１つ又は複数の分子に結合する抗原認識ドメインを含む分子を発現させる。本開示は、本明細書において考慮される且つ／又は本明細書において考慮される方法によりもたらされる、エンゲージャーをコードする核酸配列、エンゲージャーをコードするベクターを含む。
【０１３０】
本開示は、他の癌治療、たとえば二重特異性抗体コンストラクト、標的化毒素又は他の化合物、たとえば免疫細胞を介して作用するもの、たとえばＴ細胞療法との併用投与プロトコルをさらに包含する。本発明の組成物の併用投与のための臨床的投与計画は、他の構成要素の投与と同時、その前及び／又は後の併用投与を包含しうる。特定の併用療法には、化学療法、放射線、手術、ホルモン療法、及び／又は他のタイプの免疫療法が含まれる。
【０１３１】
実施形態は、本明細書に記載の１つ又は複数の腫瘍溶解性ウイルス、本明細書に記載の核酸配列、本明細書に記載のベクター及び／又は本明細書に記載の宿主を含むキットに関する。本開示のキットが、医学的治療又は介入を必要とする個体に投与される本明細書で上に記載の医薬組成物を、単独で又はさらなる薬剤と組み合わせて含むこともまた考慮される。
【０１３２】
ウイルスは、宿主生物、たとえば哺乳動物に、多様な仕方で導入されうる。特定の実施形態において、ウイルスは腫瘍の部位に導入されてもよく、代替的実施形態において、ウイルスは癌にホーミングする（ｈｏｎｅ）か、又は癌にホーミングするよう改変される。用いられるウイルスの数は、多くの状況、導入の目的、細胞寿命、使用されるプロトコル、たとえば投与の回数、ウイルスの安定性等に依存する。ウイルスは、分散液で適用されてもよく、目的の部位に、又はその近傍に注射されてもよい。ウイルスは、生理的に許容される媒体中にあってもよい。
【０１３３】
腫瘍溶解性ウイルスは、静脈内又は動脈内投与されてもよい。腫瘍溶解性ウイルスは、注射のための薬学的に許容可能な配合物中に分散されてもよい。個体に、約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３ｐｆｕの間のウイルスが投与されてもよい。個体は、腫瘍溶解性ウイルスを、１回、２回、３回、４回、５回、６回又はそれを超える回数を含む複数回、投与されてもよい。
【０１３４】
系は変数の影響を受けることが認められるべきである。したがって、各個の患者について、集団全体に投与されうるウイルスが存在したとしても、各患者は、個体にとって適切な投与量についてモニタリングされるだろうことが予測され、患者をモニタリングするかかるプラクティスは、当技術分野において常法である。
【０１３５】
ＩＶ．医薬組成物
本開示によれば、「医薬組成物」という用語は、個体への投与のための組成物に関する。好ましい一実施形態において、医薬組成物は、非経口、経皮、腔内、動脈内、髄腔内又は静脈内投与のための、又は癌への直接注射のための組成物を含む。前記医薬組成物が、注入又は注射を介して個体に投与されることが特に想定される。好適な組成物の投与は、様々な方法により、たとえば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、局所又は皮内投与により実施できる。本開示の医薬組成物はさらに、薬学的に許容可能な担体を含んでいてもよい。好適な医薬担体の例は、当技術分野においてよく知られており、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルション、たとえば油／水エマルション、様々なタイプの湿潤剤、無菌液等を含む。かかる担体を含む組成物は、よく知られている従来の方法により配合できる。これらの医薬組成物を、対象に好適な用量で投与できる。投与計画は、主治医及び臨床因子により決定されると考えられる。医療技術分野においてよく知られているとおり、任意の一患者についての投与量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、全般的健康状態、並びに同時に投与される他の薬物を含めた、多数の要因に依存する。本開示の組成物は、局所的又は系統的に投与されてもよい。投与は一般に非経口、たとえば静脈内であると考えられる。ＤＮＡもまた標的部位に、たとえばバイオリスティック送達により内部若しくは外部標的部位へと、又はカテーテルにより動脈内部位へと、直接投与できる。好ましい一実施形態において、医薬組成物は皮下投与され、より一層好ましい一実施形態において、静脈内投与である。非経口投与のための調製物は、無菌水性溶液又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルションを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、たとえばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル、たとえばオレイン酸エチルである。水性担体には、水、アルコール／水性溶液、エマルション又は懸濁液、たとえば生理食塩水及び緩衝媒体が含まれる。非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、又は固定油が含まれる。静脈内媒体には、流体及び栄養補充液、電解質補充液（たとえばリンゲルデキストロースベースのもの）等が含まれる。保存剤及び他の添加剤、たとえば抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、及び不活性ガス等もまた存在してよい。加えて、本開示の医薬組成物は、タンパク質担体、たとえば好ましくはヒト由来の血清アルブミン又は免疫グロブリン等を含んでいてもよい。本開示の医薬組成物は、医薬組成物の意図される用途に応じて、タンパク質様二重特異性単鎖抗体コンストラクト又はこれをコードする核酸分子又はベクター（本開示に記載のとおり）に加えて、さらなる生物活性剤を含んでいてもよいことが想定される。
【０１３６】
Ｖ．腫瘍溶解性ウイルス
腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍細胞に感染し、そこで複製し、それを溶解し、以降の複製ラウンドにおいて他の腫瘍細胞へと拡散するそれらの能力ゆえに、有望な抗癌剤である。腫瘍溶解性ワクシニアウイルス療法は、前臨床モデル及び臨床研究において、有望であることが示されてきた。しかしながら、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの抗腫瘍効果は最適以下である。これは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの腫瘍を通じた限定的なウイルス拡散及び腫瘍内での抗腫瘍Ｔ細胞応答の限定的な活性化ゆえである可能性がもっとも高い。したがって、本開示は、１）Ｔ細胞腫瘍浸潤及び活性化を促進し、２）ワクシニアウイルスに感染していない腫瘍細胞を効果的に溶解する（バイスタンダー殺傷）、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを提供する。これらの態様は、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの現在の限界を克服する。
【０１３７】
腫瘍溶解性ウイルスは、ＤＮＡ又はＲＮＡをそれらの遺伝物質として利用できる。腫瘍溶解性ＤＮＡウイルスは、正２０面体又は複雑なカプシド対称性を有していてもよい。正２０面体腫瘍溶解性ＤＮＡウイルスは、裸であってもよく、又はエンベロープを含んでいてもよい。腫瘍溶解性ＤＮＡウイルスのファミリーには、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（たとえば、３６〜３８ｋｂのゲノムサイズを有するアデノウイルス）、ヘルペスウイルス目（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）（たとえば、１２０〜２００ｋｂのゲノムサイズを有するＨＳＶ１）及びポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）（たとえば、１３０〜２８０ｋｂのゲノムサイズを有するワクシニアウイルス及び粘液腫ウイルス）が含まれる。腫瘍溶解性ＲＮＡウイルスには、正２０面体又はらせんカプシド対称性を有するものが含まれる。正２０面体腫瘍溶解性ウイルスはエンベロープがなく裸であり、レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）（たとえば、２２〜２７ｋｂのゲノムを有するレオウイルス）及びピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）（たとえば、７．２〜８．４ｋｂのゲノムサイズを有するポリオウイルス）を含む。らせん腫瘍溶解性ＲＮＡウイルスは、エンベロープで包まれ、ラプドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（たとえば、１３〜１６ｋｂのゲノムサイズを有するＶＳＶ）及びパラミクソウイルス科（たとえば１６〜２０ｋｂのゲノムサイズを有するＭＶ及びＮＤＶ）を含む。
【０１３８】
任意のこれらのタイプの腫瘍溶解性ウイルスが、本開示において用いられうる。特定の実施形態において、ワクシニアウイルスが用いられる。
【０１３９】
ＶＩ．キット
本明細書に記載の任意の組成物が、キットに含まれてもよい。非限定的な一例において、１つ又は複数のウイルス及び／又はウイルスを生成又は操作するための試薬が、キットに含まれてもよい。キットの構成要素は、好適な容器手段中に提供される。
【０１４０】
キットのいくつかの構成要素は、水性媒体中又は凍結乾燥形態で包装できる。キットの容器手段は、一般に、構成要素を入れることができ、好ましくは好適に等分できる、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジ、又は他の容器手段を含むと考えられる。キットに２つ以上の構成要素が存在する場合、キットはまた、一般に、追加の構成要素を別個に入れることができる第２、第３、又は他の追加容器を含有すると考えられる。しかしながら、構成要素の様々な組合せが１つのバイアル内に含まれうる。キットはまた、典型的には、構成要素を含有するための手段を市販用に厳重に密閉されて含むと考えられる。かかる容器には、内部に所望のバイアルが保持された射出成形又はブロー成形プラスチック容器が含まれうる。
【０１４１】
キットの構成要素が１つ及び／又は複数の液体溶液中に提供されるとき、液体溶液は水性溶液であり、無菌水性溶液が特に有用である。いくつかの場合において、容器手段は、それ自体シリンジ、ピペット、及び／又は他のかかる器具であってもよく、そこから配合物を身体の感染領域に適用し、動物に注射し、且つ／又はキットの他の構成要素に適用し且つ／又はそれと混合することさえできる。
【０１４２】
しかしながら、キットの構成要素は、乾燥粉末として提供できる。試薬及び／又は構成要素が乾燥粉末として提供されるとき、粉末は好適な溶媒の添加により液状に戻しうる。溶媒はまた、別の容器手段内に提供されうることが想定される。キットはまた、無菌で薬学的に許容可能な緩衝液及び／又は他の希釈液を含有するための第２の容器手段を含んでいてもよい。
【０１４３】
特定の実施形態において、治療において使用するためのウイルスは、キットにおいて提供され、いくつかの場合において、ウイルスは本質的にキットの唯一の構成要素である。キットは、所望のウイルスを改変するための試薬及び材料を含んでいてもよい。特定の実施形態において、試薬及び材料は、発現コンストラクト、所望の配列を増幅するためのプライマー、制限酵素、ウイルスを含むための１つ又は複数のＤＮＡ、ヌクレオチド、好適な緩衝液又は緩衝試薬、塩等を含み、いくつかの場合において、試薬は、本明細書に記載のエンゲージャー分子をコードするベクター及び／若しくはＤＮＡ並びに／又はそれらのための調節要素を含む。
【０１４４】
特定の実施形態において、キットにおいて、個体から１つ又は複数の試料を抽出するために好適な１つ又は複数の器具がある。器具は、シリンジ、メス等であってもよい。
【０１４５】
いくつかの場合において、キットはまた、ウイルス実施形態に加えて、第２の癌治療、たとえば化学療法、ホルモン療法、及び／又は免疫療法を含む。キットは、個体のために特定の癌に合わせて製造されてもよく、個体のためのそれぞれの第２の癌治療を含んでいてもよい。
【実施例】
【０１４６】
以下の実施例は、本開示の好ましい実施形態をより完全に示すために提示される。しかしながら、それらは決して本開示の広い範囲を限定するものとして解釈されないものとする。
【０１４７】
実施例１
新規癌治療としてのＴ細胞エンゲージャー強化腫瘍溶解性ウイルス（ＴＥＡ−ＯＶ）
本開示の少なくともいくつかの実施形態の意義は、ワクシニアウイルスに感染していない腫瘍細胞のバイスタンダー殺傷を誘導する独自の能力を有する改善した腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの開発が、増強された抗腫瘍効果をもたらすことである。本明細書において確立されたのは、新規腫瘍溶解性ワクシニアウイルス療法として、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスをＴ細胞エンゲージャーで強化する原理であり、そのことにより効果的な腫瘍溶解性ウイルス療法の開発のための新たな道を開く。本開示の実施形態の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Ｔ細胞エンゲージャーを組み込むことにより腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを増強する第１の実施例を代表する。この新しい方略は、様々な形態の腫瘍溶解性ウイルス、たとえば腫瘍溶解性アデノウイルス（ＡｄＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レオウイルス、粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）、ポリオウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、麻疹ウイルス（ＭＶ）、及びニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の効果の改善に適用可能である。
【０１４８】
重要なことに、本開示の実施形態は、進行固形腫瘍の治療のために有用な治療組成物を提供する。以下の実施例は、ヒト腫瘍異種移植モデルにおける新規腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの効果を評価する。ＴＥＡ−ＶＶ実施形態は、たとえば、少なくとも現在の治療方略では多くの場合不治であるものを含む進行固形腫瘍の治療に有用である。
【０１４９】
特定の態様において、ＴＥＡ−ＯＶ技術は、高度に革新的である。なぜならそれは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスをＴ細胞エンゲージャーＣＤ３−ｓｃＦｖで強化することが、増強された抗腫瘍効果をもたらすかどうかを試験したからである。特定の実施形態において、ＴＥＡ−ＯＶは、１つ又は２つの機構を通じてその抗腫瘍活性を及ぼす。すなわちｉ）二重特異性ｓｃＦｖにより、Ｔ細胞が、ワクシニアウイルスに感染していない腫瘍細胞を認識及び殺傷するように導き（バイスタンダー殺傷）、増強された腫瘍溶解をもたらし、ｉｉ）ＣＤ３−ｓｃＦｖが腫瘍内のＴ細胞を活性化し、それらが活性化の際に放出するサイトカインが、炎症促進性微小環境を生み出し、腫瘍成長を阻害する。
【０１５０】
実施例２
進行固形腫瘍のためのＴ細胞エンゲージャー強化腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（ＴＥＡ−ＶＶ）の開発
Ｔ細胞が、疾患の初期及び後期の両方において、癌患者における腫瘍成長及び生存率を制御可能であるという証拠が増加している。たとえば、Ｔ細胞の養子移入が、ホジキンリンパ腫、上咽頭癌、神経芽腫及び黒色腫を含む播種性腫瘍を効果的に治療することが示された。しかしながら、腫瘍特異的Ｔ細胞応答を、癌患者において開始させて維持することは困難であり、それは、イムノエディティング中に選択される、腫瘍細胞の数多くの免疫回避機序により限定的であった。したがって、腫瘍の免疫回避機序を克服する能力をもってＴ細胞を癌治療に関与させるための代替的方略を開発することが所望されると考えられる。本開示は、かかる方略を提供する。
【０１５１】
腫瘍溶解性ワクシニアウイルスをＴ細胞エンゲージャーＣＤ３−ｓｃＦｖで強化することは、Ｔ細胞を癌治療に関与させる有用な手段である。ＣＤ３−ｓｃＦｖは、ＣＤ３−ｓｃＦｖ及び腫瘍表面抗原に特異的なｓｃＦｖからなる二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）において使用されてきた。臨床研究は、ＢｉＴＥ療法が、非ホジキンリンパ腫及びＢ前駆細胞急性リンパ芽球性白血病に罹患した患者において、かなり効果的な腫瘍細胞の殺傷をもたらすことを示してきた。本開示においては、Ｔ細胞エンゲージャーＣＤ３−ｓｃＦｖ強化腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（ＴＥＡ−ＶＶ）がある。ＴＥＡ−ＶＶは、Ｔ細胞がワクシニアウイルスに感染していない腫瘍細胞を認識及び殺傷する（バイスタンダー殺傷）よう導く二重特異性ｓｃＦｖをコードし、増強された腫瘍溶解をもたらす。加えて、ＣＤ３−ｓｃＦｖは、腫瘍内へのＴ細胞浸潤及びそれらの活性化を促進すると考えられ、それらが活性化の際に放出するサイトカインは、炎症促進性微小環境を作り出すと考えられ、腫瘍成長を阻害する。重要なことに、ＣＤ３−ｓｃＦｖは、患者における膨大な数の存在するＴ細胞クローンを、腫瘍細胞にリダイレクトすることが可能であり、したがって、腫瘍の多くの免疫回避機序を克服する。加えて、腫瘍溶解性ウイルスは、Ｔ細胞エンゲージャーの局所産生を誘導し、これは標的でのより高い濃度を可能にしうる一方で、全身性副作用を減少させる。したがって、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを二重特異性ｓｃＦｖで強化することは、Ｔ細胞を癌治療に関与させる代替的アプローチを提供し、バイスタンダー殺傷を誘導することにより、現在のワクシニアウイルス療法の抗腫瘍活性の所望の増加をもたらす（図１）。
【０１５２】
ＣＤ３−ｓｃＦｖ強化ワクシニアウイルスが、進行固形腫瘍のための効果的なウイルス療法アプローチとして開発される。本開示の特定の実施形態において、二重特異性ｓｃＦｖを発現させる腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＣＤ３及び腫瘍細胞抗原の両方に結合し、腫瘍内へのＴ細胞浸潤及びワクシニアウイルスに感染していない腫瘍細胞のバイスタンダー殺傷を促進し、増強された抗腫瘍活性をもたらす。本研究において、ＣＤ３及び腫瘍細胞抗原ＥｐｈＡ２と結合する、分泌性二重特異性ｓｃＦｖとして発現したヒトＣＤ３−ｓｃＦｖを製造した（ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ）（図２）。ヒト肺癌細胞株Ａ５４９に発現する分泌性ＥｐｈＡ２−ＣＤ３−ｓｃＦｖは、ウイルスに感染していないＥｐｈＡ２陽性Ａ５４９の殺傷を誘導し、バイスタンダー腫瘍殺傷の誘導を示唆する（図１０）。例示的な一実施形態（図２）において、ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶは、二重特異性ＥｐｈＡ２−ｓｃＦｖ−ＣＤ３−ｓｃＦｖを調節するＦ１７Ｒプロモーター及び標識、たとえばＤｓＲｅｄを調節するＰｓｅｌプロモーターを含む１つの分子を含む。構成要素の代替的構成もまた好適でありうる。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、本開示は、進行固形腫瘍の治療のための効果的な腫瘍溶解性ＶＶを提供する。本開示は、新規腫瘍溶解性ＶＶ療法として、腫瘍溶解性ＶＶをＴ細胞エンゲージャーで強化する原理を確立したのであり、そのことにより改善した腫瘍溶解性ウイルス療法の開発及び使用のための新たな道を開いた。この方略は、様々な形態の腫瘍溶解性ウイルスに適用可能である。
【０１５４】
実施例３
ＥＰＨＡ２−ＴＥＡ−ＶＶの構築
Ｔ細胞エンゲージャーをＷＲワクシニアウイルスのｖＳＣ２０株のＴＫ遺伝子内に含有するｐＳＥＬシャトルプラスミドの１バージョンの組換えにより、分泌性ＥｐｈＡ２−ｓｃＦｖ−ＣＤ３−ｓｃＦｖ（ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ）又はＧＦＰ（ＧＦＰ−ＶＶ）を発現するワクシニアウイルス（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ株）を生成した。最初に、シャトルベクターｐＳＥＬを構築し、ＥｐｈＡ２−ｓｃＦｖ−ＣＤ３−ｓｃＦｖ、又はＧＦＰを含有させた（図２）。挿入されたＴ細胞エンゲージャーを、Ｆ１７Ｒ後期プロモーターの転写制御下で発現させ、Ｔ細胞活性化前の十分なウイルス複製を可能にした。ＶＶはまた、感染性のモニタリングを可能にするためにＤｓＲｅｄ２を発現させる（図３）。ＴＥをコードする組換えウイルスを構築するために、シャトルベクターｐＳＥＬをヒト１４３ＴＫ細胞内に形質移入した。次に、細胞をウイルスＶＳＣ２０に０．１の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。３ラウンドのプラーク選択及び増幅とＴＥＡの発現の確認後、クローンのうちの１つを増幅及び精製のために選択した。
【０１５５】
実施例４
ＥＰＨＡ２−ＴＥＡ−ＶＶは分泌性機能的二重特異性ＥＰＨＡ２−ＳＣＦＶ−ＣＤ３−ＳＣＦＶを発現させた
ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ感染腫瘍細胞が分泌性二重特異性ＥｐｈＡ２−ｓｃＦｖ−ＣＤ３−ｓｃＦｖを発現するかどうかを研究した。このために、肺癌細胞株Ａ５４９に、ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ又はＧＦＰ−ＶＶをＭＯＩ  ５で形質導入し、インキュベーション２４時間後に、細胞培養培地を回収した。次に、新鮮なヒトＰＢＭＣを、ＶＶ感染Ａ５４９培養物から回収された培地とともにインキュベートし、続いてＥｐｈＡ２−ＦＩＴＣ（ＦＩＴＣで標識されたＥｐｈＡ２タンパク質）、ＣＤ８−ＰＥ、及びＣＤ４−ＡＰＣで染色した。フロー解析は、ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ感染Ａ５４９が、ヒトＴ細胞及びＥｐｈＡ２の両方に結合する機能を有する、分泌性二重特異性ＥｐｈＡ２−ｓｃＦｖ−ＣＤ３−ｓｃＦｖを発現させたことを示した（図３）。この結果は、ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ感染腫瘍細胞が、ヒトＴ細胞及び腫瘍抗原ＥｐｈＡ２の両方に結合する能力を有する、分泌性二重特異性ＥｐｈＡ２−ｓｃＦｖ−ＣＤ３−ｓｃＦｖを発現させたことを示す。
【０１５６】
実施例５
ＥＰＨＡ２−ＴＥ発現はＶＶ複製能を損なわない
ＥｐｈＡ２−ＴＥがＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶの複製能を損なわないことを示すため、ＣＶ−１細胞及び正常ヒト線維芽細胞にＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ、ＧＦＰ−ＶＶ及び親ｖＳＣ２０  ＶＶを感染させた。ＣＶ−１のＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ、ＧＦＰ−ＶＶ、又はｖＳＣ２０への感染は、様々な時点で類似のウイルス量をもたらした（図５）。対照的に、すべての３つのウイルスについて、正常ヒト線維芽細胞において複製が乏しかった（図５）。したがって、ＥｐｈＡ２−ＴＥは、ＶＶ複製に干渉しない。
【０１５７】
実施例６
ＥＰＨＡ２−ＴＥ発現はＶＶの腫瘍細胞溶解誘導能を損なわない
ヒトＴ細胞の非存在下でのＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ又はＧＦＰ−ＶＶの腫瘍細胞溶解誘導能を比較した。Ａ５４９細胞に、ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ又はＧＦＰ−ＶＶをＭＯＩを増加させながら（０、０．０１、０．１、１、又は５）感染させ、ウイルス感染４８時間後、Ａ５４９生存率をＭＴＳアッセイにより決定した。Ａ５４９細胞は、使用されたＶＶと無関係にＭＯＩの増加とともに殺傷された（図６）。ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶとＧＦＰ−ＶＶとの間に差はなかったのであり、これはＥｐｈＡ２−ＴＥの発現がＶＶ腫瘍細胞溶解誘導能に干渉しないことを示す。
【０１５８】
実施例７
ＥＰＨＡ２−ＴＥＡ−ＶＶはヒトＴ細胞の存在下で有意に増強されたＡ５４９に対する腫瘍溶解活性を示した
次に、ヒトＴ細胞の存在下でＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶの腫瘍溶解活性が存在するかどうかを決定した。最初に、Ａ５４９細胞に、ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ又はＧＦＰ−ＶＶを０．１のＭＯＩで感染させた。上述のとおりヒトＴ細胞を添加し、ウイルス感染２４又は４８時間後、Ａ５４９生存率をＭＴＳアッセイにより決定した。ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶのみが、ヒトＴ細胞の存在下で増強された腫瘍溶解活性を２４時間（ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ対ＧＦＰ−ＶＶ、７５％対１００％）及び４８時間（ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ対ＧＦＰ−ＶＶ、３５％対８１％）で示した（図７）。
【０１５９】
ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶがヒトＴ細胞をＡ５４９細胞にリダイレクトするかどうかをさらに決定するため、細胞に、ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶをＭＯＩを増加させながら（ＭＯＩ  ０．００１、０．０１、０．１、又は１）感染させた。次に、ヒトＴ細胞、ＣＤ４／ＣＤ８マイクロビーズを有するＰＢＭＣから単離された未刺激Ｔ細胞をＡ５４９細胞に、５：１のＴ細胞対Ａ５４９の比で添加した。ウイルス感染２４、４８、７２又は９６時間後に、Ａ５４９生存率をＭＴＳアッセイにより決定した。ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶのみに感染したＡ５４９細胞を対照とした。ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶはそれ自体で、細胞殺傷を用量依存的な仕方で誘導した。しかしながら、試験されたもっとも高いＭＯＩでも、１５％の腫瘍細胞が依然として感染９６時間後に生存していた（図８Ｂ）。ヒトＴ細胞の培養物への添加は、抗腫瘍効果を有意に（ｐ＜０．０５）増加させ、すべての腫瘍細胞が感染９６時間以内に０．１及び１のＭＯＩで殺傷された（図８Ａ）。
【０１６０】
まとめると、データは、ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶがヒトＴ細胞をＡ５４９細胞にリダイレクトすることを示す。
【０１６１】
実施例８
ＥＰＨＡ２−ＴＥＡ−ＶＶはＴ細胞を活性化させる
ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶにより分泌されるＥｐｈＡ２−ＴＥがＴ細胞を腫瘍細胞にリダイレクトするだけでなく、ヒト細胞を活性化させるかどうかを決定するため、Ａ５４９細胞をＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ又はＧＦＰ−ＶＶに１又は０．１のＭＯＩで感染させた。上述のとおりヒトＴ細胞を添加し、ウイルス感染２４又は４８時間後、細胞培養培地を回収し、炎症促進性サイトカインの存在をＥＬＩＳＡにより決定した。ヒトＴ細胞は、ＧＦＰ−ＶＶ感染Ａ５４９及びヒトＴ細胞のものと比較した、ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ感染Ａ５４９及びヒトＴ細胞の細胞培養上清における炎症誘発性サイトカイン、たとえばＩＦＮ−ベータ及びＩＬ−２の産生（ｐ＜０．０５）により証明されるとおり、ＥｐｈＡ２−ＴＥにより活性化させられた。Ｔ細胞は、ＧＦＰ−ＶＶ感染Ａ５４９に応答して、ほとんど又はまったくＩＦＮ−ベータ及びＩＬ−２を産生しなかった（図９）。これらの結果は、Ｔ細胞活性化が腫瘍細胞によるＥｐｈＡ２−ＴＥの発現に依存することを示す。
【０１６２】
実施例９
ＴＥＡ−ＶＶは非感染腫瘍細胞のバイスタンダー殺傷を誘導した
ワクシニアウイルスに感染していない腫瘍細胞のバイスタンダー殺傷を誘導するＴＥＡ−ＶＶの能力を検討した。まず、ＥｐｈＡ２陽性肺癌細胞株Ａ５４９にＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ、ｍＴＥＡ−ＶＶ、又はＧＦＰ−ＶＶを様々なＭＯＩで形質導入した。細胞培養培地を４８時間培養後に回収した。次に、ＴＥＡ−ＶＶ感染Ａ５４９の培養物から回収された細胞培養培地の存在下で、非感染Ａ５４９を新鮮なＰＢＭＣと共培養した。４８時間後、腫瘍殺傷をＭＴＳアッセイを使用して測定した。結果は、Ａ５４９が、ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ感染Ａ５４９の細胞培養培地の存在下でのみ殺傷されたことを示し、腫瘍細胞のバイスタンダー殺傷を示す（図９）。
【０１６３】
実施例１０
ワクシニアウイルスにおけるＥＰＨＡ２Ｔ細胞エンゲージャーは増強された抗腫瘍効果を示す
例示的なＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶの効果を、インビボ腫瘍モデルを使用した、ヒトＴ細胞の存在下でのその抗腫瘍効果の増強において特徴付けた。
【０１６４】
インビボでのＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶの抗腫瘍効果を研究するため、本発明者らは、皮下Ａ５４９腫瘍モデルを最初に使用した。Ａ５４９腫瘍を確立するため、２×１０６個のＡ５４９細胞を、健常ドナーからの未刺激ＰＢＭＣと混合し、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウスの右側腹部に皮下接種し、続いて１×１０８ｖｐのＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ又はＧＦＰ−ＶＶを第０日に腹腔内注射した。ＰＢＳを受けたマウスを対照とした。ＧＦＰ−ＶＶは、対照マウスにおけるのと比較して、腫瘍成長を中程度に阻害した。対照的に、ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶを受けたマウスは、ＧＦＰ−ＶＶ又はＰＢＳを受けたマウスと比較して、腫瘍成長の有意な減少を示した（ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ対ＧＦＰ−ＶＶ  ｐ＜０．０００１）（図１１）。加えて、ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶはまた、ＧＦＰ−ＶＶ又はＰＢＳ群と比較して、マウス生存率を大きく増加させた（図１２）。
【０１６５】
ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶの抗腫瘍効果を研究するため、第０日にルシフェラーゼ発現Ａ５４９細胞（Ａ５４９．ｅＧＦＰ．ｆｆｌｕｃ）をＳＣＩＤ−Ｂｇマウスに静脈内注射した。第７日に、１０×１０６未処置ＰＢＭＣ及び１×１０８ｖｐのＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ又はＧＦＰ−ＶＶの混合物を静脈内投与した。ＰＢＭＣのみを受けたマウスを対照とした。生物発光画像法の定量は、ＧＦＰ−ＶＶプラスＰＢＭＣのみが、対照と比較して腫瘍成長を中程度に阻害したことを示した。対照的に、ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶプラスＰＢＭＣを受けたマウスは、ＧＦＰ−ＶＶプラスＰＢＭＣ又はＰＢＭＣのみを受けたマウスと比較して、腫瘍成長の有意な減少を示した（図１２、ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶ対ＧＦＰ−ＶＶ  ｐ＜０．０５）。したがって、両方の動物モデルにおいて、ＥｐｈＡ２−ＴＥＡ−ＶＶは、ＧＦＰ−ＶＶと比較して増強された抗腫瘍活性をもたらした。
【０１６６】
実施例１１
ＨＥＲ２−ＴＥの構築及び機能
分泌性二重特異性ＨＥＲ２−ＴＥのＨＥＲ２＋腫瘍細胞の殺傷を誘導する能力を特徴付けるため、分泌性二重特異性ＨＥＲ２−ＴＥ及びＧＦＰ（ＨＥＲ２−ＴＥ）、又はＧＦＰのみ（ＧＦＰ）をコードするレンチウイルスを構築した（図１４Ａ）。Ｌｖ−ＨＥＲ２−ＴＥ又はＬｖ−ＧＦＰ感染Ａ５４９を、非感染Ａ５４９（ＧＦＰ−）と混合し、続いて未刺激ＰＢＭＣと２日間共培養した。腫瘍細胞殺傷をフローサイトメトリーにより測定した。Ｌｖ−ＨＥＲ２−ＴＥは、ＧＦＰ＋及びＧＦＰ−Ａ５４９細胞の両方の殺傷を誘導した一方で、Ｌｖ−ＧＦＰはＡ５４９の殺傷を誘導しなかったのであり、これは、感染腫瘍細胞による分泌性二重特異性ＴＥの発現が、ウイルスに感染していない腫瘍細胞のバイスタンダー殺傷を誘導したことを示す（図１４Ｂ）。まとめると、これらの結果は、ＨＥＲ２−ＴＥが非感染Ａ５４９細胞のＣＤ３＋Ｔ細胞介在性殺傷を誘導したことを示した。
【０１６７】
実施例１２
バイＳＣＦＶ直列ＨＥＲ２−ＴＥ及びダイアボディＨＥＲ２−ＴＥの比較
二重特異性直列ＨＥＲ２−ＴＥ及びダイアボディＨＥＲ２−ＴＥのＧＤ２＋腫瘍細胞の殺傷を誘導する能力を比較するため、分泌性二重特異性直列ＨＥＲ２−ＴＥ（Ｂｉ−ｓｃＦｖ−ＨＥＲ２−ＴＥ）、ダイアボディＨＥＲ２−ＴＥ（ダイアボディ−ＨＥＲ２−ＴＥ）又はＧＦＰのみ（ＧＦＰ）をコードするレンチウイルスを構築した（図１５）。Ｌｖ−Ｂｉ−ｓｃＦｖ−ＨＥＲ２−ＴＥ、Ｌｖ−ダイアボディ−ＨＥＲ２−ＴＥ、又はＬｖ−ＧＦＰ感染ＨＥＲ２＋腫瘍細胞株Ａ５４９を、未刺激ＰＢＭＣと共培養した。腫瘍細胞殺傷を顕微鏡下で２４時間後にモニタリングした。Ｌｖ−Ｂｉ−ｓｃＦｖ−ＨＥＲ２−ＴＥ又はＬｖ−ダイアボディ−ＨＥＲ２−ＴＥの両方が、ＨＥＲ２＋Ａ５４９腫瘍細胞の殺傷を効果的に誘導した一方で、Ｌｖ−ＧＦＰは、それらの殺傷を誘導しなかった（図１６Ｂ）。これらの結果は、二重特異性直列ＨＥＲ２−ＴＥ及びダイアボディＨＥＲ２−ＴＥの両方が、ＨＥＲ２＋腫瘍細胞のＣＤ３＋Ｔ細胞介在性殺傷を効果的に誘導したことを示した。
【０１６８】
実施例１３
ＧＤ２−ＴＥの構築及び機能
二重特異性ＧＤ２−ＴＥのＧＤ２＋腫瘍細胞の殺傷を誘導する能力を特徴付けるため、分泌性二重特異性ＧＤ２−ＴＥ及びＧＦＰ（ＧＤ２−ＴＥ）、又はＧＦＰのみ（ＧＦＰ）をコードするレンチウイルスを構築した（図１６Ａ）。Ｌｖ−ＧＤ２−ＴＥ又はＬｖ−ＧＦＰ感染ＧＤ２＋腫瘍細胞株ＪＦ又はＬＡＮ２を、未刺激ＰＢＭＣと共培養した。腫瘍細胞殺傷を顕微鏡下でモニタリングした。Ｌｖ−ＧＤ２−ＴＥは、ＧＤ２＋腫瘍細胞株ＪＦ及びＬＡＮ１の両方の殺傷を誘導した一方で、Ｌｖ−ＧＦＰはそれらの殺傷を誘導しなかった（図１６Ｂ）。これらの結果は、ＧＤ２−ＴＥがＧＤ２＋腫瘍細胞のＣＤ３＋Ｔ細胞介在性殺傷を誘導したことを示した。
【０１６９】
ＴＥＡ−ＯＶ技術は、癌治療として増強された腫瘍溶解性ウイルスを生成するために開発された。この技術は、任意の既知の腫瘍溶解性ウイルス及び任意の既知の腫瘍抗原に適合できる。腫瘍溶解性ワクシニアウイルス及びＥｐｈＡ２腫瘍抗原をモデルとして使用して、Ｔ細胞エンゲージャーを発現する腫瘍溶解性ウイルスが、ｉ）ＥｐｈＡ２陽性腫瘍細胞を殺傷し、ｉｉ）ウイルスに感染していないＥｐｈＡ２陽性腫瘍細胞のバイスタンダー殺傷を誘導することが示された。この技術は、ウイルス癌治療の分野全体について広い適用範囲を有し、選択される任意の腫瘍溶解性ウイルス及び腫瘍抗原に適合できる。
【０１７０】
実施例１４
例示的な実施例
肝細胞癌（ＨＣＣ）のためのＨＮ３−ＴＥ及びＧＣ３３−ＴＥの構築及び機能（ＨＮ３及びＧＣ３３は、ＨＣＣ抗原Ｇｌｙｐｉｃａｎ−３に対する２つの抗体クローンである）。二重特異性ＥｐｈＡ２−ＴＥ、ＨＮ３−ＴＥ及びＧＣ３３−ＴＥのＨＣＣの殺傷を誘導する能力を特徴付けるため、分泌性二重特異性ＥｐｈＡ２−ＴＥ、ＨＮ３−ＴＥ、ＧＣ３３−ＴＥ、及びＧＤ２−ＴＥをコードするレトロウイルス（Ｒｖ）を構築した（図１７Ａ）。レトロウイルス感染ヒトＰＢＭＣをＨＣＣ株Ｈｕｈ７又はＨｅｐＧ２と共培養し、腫瘍細胞傷害性を６時間Ｃｒ放出ＣＴＬアッセイにより決定した。結果は、ＥｐｈＡ２−ＴＥ、ＨＮ３−ＴＥ、又はＧＣ３３−ＴＥが、ＨＣＣ  Ｈｕｈ７又はＨｅｐＧ２の溶解を効果的に誘導したことを示した。
【０１７１】
図１８は、三量体又は二量体形態の４−１ＢＢＬ強化Ｔ細胞エンゲージャーが構築されるのを示す。三量体−４１ＢＢＬ−ＨＥＲ２−Ｔ細胞エンゲージャーは、安定な三量体を形成するコラーゲンＸＶ  ＮＣ１ドメイン（ｃｏｌ）のＮ末端三量化領域をコードする。二量体−４１ＢＢＬ−ＨＥＲ２−Ｔ細胞エンゲージャーは、安定な二量体を形成するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ＣＨ３ドメインをコードする。４−１ＢＢＬは、ＴＮＦスーパーファミリーに属し、その二量体又は三量体形態は、有意な副刺激機能のために必要とされる。
【０１７２】
図１９は、４−１ＢＢＬ強化ＴＥＡ−ＶＶの増強された抗腫瘍効果を示す。４−１ＢＢＬ強化ＴＥＡ−ＶＶは、ＴＥＡ−ＶＶの抗腫瘍効果を３つの機序を通じて増強する。すなわち、１）Ｔ細胞エンゲージャーの三量化又は二量化がｓｃＦｖの標的に対する結合親和性を増加させる、２）４１ＢＢ−ＬがＴ細胞をさらに活性化させる、３）４１ＢＢ−Ｌ副刺激が、Ｔ細胞に調節性Ｔ細胞により媒介される免疫抑制を克服する能力を付与する。
【０１７３】
図２０は、副刺激シグナリング４−１ＢＢＬが、腫瘍殺傷効果をさらに増強し、Ｔ細胞活性化を誘導したことを示す。４１ＢＢＬ−ＨＥＲ２−Ｔ細胞エンゲージャー又は制御レンチウイルスベクターを発現するレンチウイルスを生成した（Ｌｖ−ＧＦＰ、Ｌｖ−ＨＥＲ２−ＴＥ、Ｌｖ−二量体−４１ＢＢＬ−ＨＥＲ２−ＴＥ、又は三量体−４１ＢＢＬ−ＨＥＲ２−ＴＥ）。ヒトＡ５９４−ＧＦＰ肺腫瘍細胞（ＨＥＲ２陽性）を、レンチウイルスに感染させ、未刺激ヒトＰＢＭＣと共培養した。４８時間後、４−１ＢＢＬの副刺激が、ＴＥＡ−ＶＶの溶解活性を有意に増強したことが観察された。加えて、細胞培養上清をサイトカインＥＬＩＳＡのために回収した。炎症誘発性サイトカイン、たとえばＩＦＮγ及びＩＬ２の産生により判断されるとおり、未刺激ヒトＰＢＭＣを４１ＢＢＬにより活性化させた（図２１）。
【０１７４】
本発明及びその利点が詳細に記載されたとはいえ、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく、様々な変更、置換及び改変が本明細書においてなされうることが理解されるべきである。さらに、本願の範囲は、本明細書に記載のプロセス、機械、製造、物の組成、手段、方法及び工程の特定の実施形態に限定されることが意図されてはいない。本発明の開示から当業者が容易に認めると考えられるように、現在存在しているか又は後になって開発され、本明細書に記載の対応する実施形態と実質的に同じ機能を果たすか、又は実質的に同じ結果を達成するプロセス、機械、製造、物の組成、手段、方法、又は工程は、本発明により利用できる。したがって、添付の特許請求の範囲はその範囲内に、かかるプロセス、機械、製造、物の組成、手段、方法、又は工程を含むことが意図されている。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２】
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【図３】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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