(57)【要約】本開示のいくつかの実施形態は、ナノ細孔を横断する分子の遷移を制御するためのシステム、方法、およびデバイスを対象にする。いくつかの実施形態は、第１のコンパートメント、第２のコンパートメント、第１のコンパートメント内に提供される第１の電極および第２のコンパートメント内に提供される第２の電極を備える、第１の対の電極と、第１のコンパートメントを第２のコンパートメントから分離する仕切りと、仕切り内に提供されるオリフィスと、オリフィスに近接して配列される、第２の対の電極であって、分子と官能化される、第２の対の電極と、第２の対の電極間の間隔を備える、トンネル間隙とを備える、デバイスを対象にする。
2016512605.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ細孔を横断する分子の遷移を制御するためのデバイスであって、
第１のコンパートメントと、
第２のコンパートメントと、
前記第１のコンパートメント内に提供される第１の電極および前記第２のコンパートメント内に提供される第２の電極を備える、第１の対の電極と、
前記第１のコンパートメントを前記第２のコンパートメントから分離する仕切りと、
前記仕切り内に提供されるオリフィスと、
前記オリフィスに近接して配列される、第２の対の電極であって、分子と官能化される、第２の対の電極と、
前記第２の対の電極間の間隔を備える、トンネル間隙と、
を備える、デバイス。
【請求項２】
分子輸送のための第１の方向における電気浸透流動が発生されるように、電圧バイアスを前記第２の対の電極間に印加するように構成される、電圧バイアスをさらに備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
少なくともＡＣ電圧バイアスをさらに備え、前記ＡＣ電圧バイアスは、少なくとも１ｋＨｚの周波数のＡＣ電圧バイアスを前記第２の対の電極間に印加するように構成される、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記トンネル間隙内の分子の存在に応じて、検出され得るように、前記ＡＣ電圧バイアスのＡＣ電流信号を非線形モードで処理するように構成される、処理手段をさらに備える、請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
前記第１の電極と前記第２の対の電極との間および前記第２の電極と前記第２の対の電極との間のうちの少なくとも１つに印加するように構成される、電圧バイアスと、第２の電極対と通信する回路とをさらに備え、前記回路は、前記第２の電極対によって発生される信号によって、前記電圧バイアスを制御するように構成される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
ＡＣおよびＤＣ成分の両方を用いて、電圧バイアスを第２の電極対間に印加するように構成される、電圧源をさらに備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項７】
分子の収集および検出のうちの少なくとも１つを制御するためのデバイスであって、
第１のコンパートメントと、
第２のコンパートメントと、
前記第１のコンパートメント内に提供される第１の電極および前記第２のコンパートメント内に提供される第２の電極を備える、第１の対の電極と、
前記第１のコンパートメントを前記第２のコンパートメントから分離する仕切りと、
前記仕切り内に提供されるオリフィスと、
前記オリフィスに近接して配列される、少なくとも１つのオリフィス電極と、
を備える、デバイス。
【請求項８】
ナノ細孔内の検体分子の濃度を制御するためのデバイスであって、
検体分子を含有するリザーバと、
電圧源と、
前記リザーバの片側に配列される、ナノ細孔と、
電解質と、
１つまたはそれを上回る電極と、
を備え、
前記ナノ細孔は、前記電極と連接され、前記電圧源からの電圧バイアスを介して、電解質の電気浸透流動を前記細孔内に発生させるように構成され、
前記電気浸透流動は、前記リザーバから前記ナノ細孔の中への流体流動を介して、前記リザーバからの検体分子を捕捉することおよび集中させることのうちの少なくとも１つを行うように構成される、デバイス。
【請求項９】
ナノ細孔を横断する分子の遷移を制御するためのデバイスであって、
第１のコンパートメントと、
第２のコンパートメントと、
前記第１のコンパートメント内に提供される第１の電極および前記第２のコンパートメント内に提供される第２の電極を備える、第１の対の電極と、
前記第１のコンパートメントを前記第２のコンパートメントから分離する仕切りと、
前記仕切り内に提供されるナノ細孔と、
前記オリフィスに近接して配列される、第２の対の電極であって、分子と官能化される、第２の対の電極と、
前記第２の対の電極間の間隔を備える、トンネル間隙と、
を備え、
前記第１の対の電極は、前記ナノ細孔の中への分子の流動に対抗するようにバイアスされ、
前記第２の対の電極は、電気浸透流動を前記ナノ細孔の中に発生させるようにバイアスがかけられる、デバイス。
【請求項１０】
非帯電分子の転位を制御するためのナノ細孔デバイスであって、
第１のコンパートメントと、
第２のコンパートメントと、
前記第１のコンパートメント内に提供される第１の電極および前記第２のコンパートメント内に提供される第２の電極を備える、第１の対の電極と、
前記第１のコンパートメントを前記第２のコンパートメントから分離する仕切りと、
前記仕切り内に提供されるナノ細孔と、
前記オリフィスに近接して配列される、第２の対の電極であって、分子と官能化される、第２の対の電極と、
前記第２の対の電極間の間隔を備える、トンネル間隙と、
を備え、
前記第２の対の電極は、ストークス流を前記ナノ細孔の中に発生させるようにバイアスがかけられる、デバイス。
【請求項１１】
ナノ細孔を横断する分子の遷移を制御するための方法であって、
ナノ細孔を横断する分子の遷移を制御するためのデバイスを提供するステップであって、前記デバイスは、
第１のコンパートメントと、
第２のコンパートメントと、
前記第１のコンパートメント内に提供される第１の電極および前記第２のコンパートメント内に提供される第２の電極を備える、第１の対の電極と、
前記第１のコンパートメントを前記第２のコンパートメントから分離する仕切りと、
前記仕切り内に提供されるオリフィスと、
前記オリフィスに近接して配列される、第２の対の電極であって、分子と官能化される、第２の対の電極と、
前記第２の対の電極間の間隔を備える、トンネル間隙と、
を備える、ステップと、
電圧バイアスを前記第２の対の電極間に印加するステップであって、前記電圧バイアスは、分子輸送のために第１の方向に電気浸透流動を発生させるように構成される、ステップと、
を含む、方法。
【請求項１２】
少なくとも１ｋＨｚの周波数のＡＣ電圧を前記第２の対の電極間に印加するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＡＣ電流信号の非線形処理を介して、前記トンネル間隙内の分子の存在を検出するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
電圧バイアスを前記第１の電極と前記第２の対の電極との間および前記第２の電極と前記第２の対の電極との間のうちの少なくとも１つに印加するステップをさらに含み、前記電圧バイアスは、第２の電極対によって発生される信号によってフィードされる回路によって制御される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記電圧バイアスは、ＡＣおよびＤＣ成分の両方を備える、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
ナノ細孔内の検体分子の濃度を制御するための方法であって、
ナノ細孔内の検体分子の濃度を制御すたるためのデバイスを提供するステップであって、前記デバイスは、
検体分子を含有するリザーバと、
電圧源と、
前記リザーバの片側に配列される、ナノ細孔と、
電解質と、
１つまたはそれを上回る電極と、
を備え、
前記ナノ細孔は、前記電極と連接され、前記電圧源からの電圧バイアスを介して、電解質の電気浸透流動を前記細孔内に発生させるように構成される、ステップと、
前記電圧源を介して、前記細孔内の電解質の電気浸透流動を発生させるステップであって、前記電気浸透流動は、前記リザーバから前記ナノ細孔の中への流体流動を介して、前記リザーバからの検体分子を捕捉することおよび集中させることのうちの少なくとも１つを行うように構成される、ステップと、
を含む、方法。
【請求項１７】
ナノ細孔を横断する分子の遷移を制御するための方法であって、
ナノ細孔を横断する分子の遷移を制御するためのデバイスを提供するステップであって、前記デバイスは、
第１のコンパートメントと、
第２のコンパートメントと、
前記第１のコンパートメント内に提供される第１の電極および前記第２のコンパートメント内に提供される第２の電極を備える、第１の対の電極と、
前記第１のコンパートメントを前記第２のコンパートメントから分離する仕切りと、
前記仕切り内に提供されるナノ細孔と、
前記オリフィスに近接して配列される、第２の対の電極であって、分子と官能化される、第２の対の電極と、
前記第２の対の電極間の間隔を備える、トンネル間隙と、
を備える、ステップと、
前記第１の対の電極にバイアスをかけ、前記ナノ細孔の中への分子の流動に対抗するステップと、
前記第２の対の電極にバイアスをかけ、電気浸透流動を前記ナノ細孔の中に発生させるステップと、
を含む、方法。
【請求項１８】
非帯電分子の転位を制御するための方法であって、
非帯電分子の転位を制御するためのナノ細孔デバイスを提供するステップであって、前記デバイスは、
第１のコンパートメントと、
第２のコンパートメントと、
前記第１のコンパートメント内に提供される第１の電極および前記第２のコンパートメント内に提供される第２の電極を備える、第１の対の電極と、
前記第１のコンパートメントを前記第２のコンパートメントから分離する仕切りと、
前記仕切り内に提供されるナノ細孔と、
前記オリフィスに近接して配列される、第２の対の電極であって、分子と官能化される、第２の対の電極と、
前記第２の対の電極間の間隔を備える、トンネル間隙と、
を備え、
前記第２の対の電極は、ストークス流を前記ナノ細孔の中に発生させるように、バイアスがかけられる、ステップと、
前記第２の対の電極にバイアスをかけ、ストークス流を前記ナノ細孔の中に発生させるステップと、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府によって支援された研究および開発に関するステートメント）
本開示の実施形態は、国立衛生研究所によって付与されたＮＩＨ  Ｇｒａｎｔ第Ｒ０１  ＨＧ００６３２３号のもとでの政府支援によってなされた。米国政府は、本明細書中に開示されている発明において一定の権利を有する。
【０００２】
（関連出願）
本願は、２０１３年３月１３日に出願され、“ＳＹＳＴＥＭＳ，ＤＥＶＩＣＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＴＲＡＮＳＬＯＴＡＴＩＯＮ  ＣＯＮＴＲＯＬ”と題された、米国仮特許出願第６１／７８０，４７７号の３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）のもとでの利益を主張するものであり、該米国仮特許出願の全開示は、参照により本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００３】
ナノ細孔内のポリマーの同定および配列決定の主要な課題は、電気泳動によって細孔を通して駆動される高帯電分子の高速性であることが広く認識されている１。熱変動を克服するために十分な大きさの電圧２（すなわち、２５ｍＶの数倍である、数倍の熱エネルギーまたは電圧）では、転位速度は、二本鎖ＤＮＡの場合、ＤＮＡ塩基あたり約数マイクロ秒（またはそれ未満）である。現在、転位を減速させるための方式が、提案されている。第１のものでは、ＤＮＡを処理する、分子モータが、ナノ細孔の中に引き込まれるにつれて、ＤＮＡ分子をトラップするために使用される（図１）。重合をブロッキングする修飾鎖４で終端される、ＤＮＡ３が、鎖４のためそれを処理することができない、ＤＮＡポリメラーゼ２によって捕捉される。非ハイブリダイズ領域５が、ポリメラーゼから垂下し、電気泳動によって、ナノ細孔１の中に引き込まれる。適正な電気駆動力を用いて、ブロッキング鎖４は、ナノ細孔の中に引っ張られるにつれて、ＤＮＡから剥離される。いったんブロッキング鎖が除去されると、相補鎖の合成が、ヌクレオチドの存在下で開始する。これは、細孔を通したオーバーハング鎖５の比較的に低速の引き戻しをもたらし、配列が読み取られることを可能にする３。本方式は、ＤＮＡ配列決定に制限される。
【０００４】
第２のアプローチでは、ＤＮＡトランジスタと呼ばれる、固体転位デバイスが、提供される４，５（図２）。ＤＮＡ分子（または、他の帯電ポリマー）１３は、固体ナノ細孔１０の中に引き込まれ、そこで、一式の３つの埋込電極（誘電体１２によって分離される）が、反対電場を印加する。電場が、十分に大きい場合、ＤＮＡの動きは、完全に停止されることができる。
【０００５】
検体の結合に依拠する、多くの分析技法に一般的なさらに別の問題が存在する。結合の確率は、解離定数Ｋｄによって判定される。高選択性結合剤の場合、Ｋｄは、１０−９Ｍ程度と小さくあり得る。しかしながら、多くの代謝物およびタンパク質は、これよりはるかに低い濃度で生体細胞内に存在する。これは、ポリメラーゼ連鎖反応が、検体の濃度を増加させるために使用され得る場合、ＤＮＡ配列決定において問題ではないが、他の検体（例えば、タンパク質、アミノ酸代謝物）の濃度を増加させる同等方法は、存在しない。したがって、検体を集中およびトラップし、検出器におけるその効果的濃度を上昇させる、デバイスの必要性がある６。
【０００６】
加えて、また、実装が単純であって、かつ化学組成物の読取のための方式と互換性がある、任意の帯電ポリマーと併用され得る、転位制御方式を開発することが望ましいであろう。これらおよび他の利点は、本発明の転位制御方式において得られる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
故に、前述の難点のうちの少なくともいくつかに対処するために、本開示は、本明細書に開示される実施形態のうちの少なくともいくつかに関して、以下の概要を提示する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、ナノ細孔を横断する分子の遷移を制御するためのデバイスが、提供され、第１のコンパートメントと、第２のコンパートメントと、第１のコンパートメント内に提供される第１の電極および第２のコンパートメント内に提供される第２の電極を備える、第１の対の電極と、第１のコンパートメントを第２のコンパートメントから分離する仕切りと、仕切り内に提供されるオリフィスと、オリフィスに近接して配列される、第２の対の電極であって、分子と官能化される、第２の対の電極と、第２の対の電極間の間隔を備える、トンネル間隙とを含む。
【０００９】
いくつかのそのような実施形態では、電圧バイアスが、第２の対の電極間に印加されてもよく、分子輸送のために第１の方向に電気浸透流動を発生させるように構成されてもよい。
【００１０】
いくつかのそのような実施形態では、少なくとも１ｋＨｚの周波数のＡＣ電圧が、第２の対の電極間に印加されてもよい。さらに、トンネル間隙内の分子の存在は、ＡＣ電流信号の非線形処理を用いて検出されてもよい。
【００１１】
いくつかのそのような実施形態では、電圧バイアスが、第１の電極と第２の対の電極との間および第２の電極と第２の対の電極との間のうちの少なくとも１つに印加されてもよく、電圧バイアスは、第２の電極対によって発生される信号によってフィードされる回路によって制御される。
【００１２】
いくつかのそのような実施形態では、印加される電圧バイアスは、ＡＣおよびＤＣ成分の両方を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、分子の収集および／または検出を制御するためのデバイスが、提供され、第１のコンパートメントと、第２のコンパートメントと、第１のコンパートメント内に提供される第１の電極および第２のコンパートメント内に提供される第２の電極を備える、第１の対の電極と、第１のコンパートメントを第２のコンパートメントから分離する仕切りと、仕切り内に提供されるオリフィスと、オリフィスに近接して配列される、少なくとも１つのオリフィス電極とを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ナノ細孔内の検体分子の濃度を制御するためのデバイスが、提供され、電圧バイアス手段によって細孔内に電解質の電気浸透流動を発生させるように構成される電極と連接される、ナノ細孔を含み、電気浸透流動は、ナノ細孔の少なくとも片側に提供されるバルクリザーバからの検体分子を、バルクリザーバからナノ細孔の中への結果として生じる流体流動を介して、捕捉することおよび集中させることのうちの少なくとも１つを行うように構成される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ナノ細孔を横断する分子の遷移を制御するためのデバイスが、提供され、第１のコンパートメントと、第２のコンパートメントと、第１のコンパートメント内に提供される第１の電極および第２のコンパートメント内に提供される第２の電極を備える、第１の対の電極と、第１のコンパートメントを第２のコンパートメントから分離する仕切りと、仕切り内に提供されるナノ細孔と、オリフィスに近接して配列される、第２の対の電極であって、分子と官能化される、第２の対の電極と、第２の対の電極間の間隔を備える、トンネル間隙とを含む。そのような実施形態では、第１の対の電極は、ナノ細孔の中への分子の流動に対抗するようにバイアスがかけられてもよく、第２の対の電極は、電気浸透流動をナノ細孔の中に発生させるようにバイアスがかけられてもよい。
【００１６】
いくつかの実施形態では、非帯電分子の転位を制御するためのナノ細孔デバイスが、提供され、第１のコンパートメントと、第２のコンパートメントと、第１のコンパートメント内に提供される第１の電極および第２のコンパートメント内に提供される第２の電極を備える、第１の対の電極と、第１のコンパートメントを第２のコンパートメントから分離する仕切りと、仕切り内に提供されるナノ細孔と、オリフィスに近接して配列される、第２の対の電極であって、分子と官能化される、第２の対の電極と、第２の対の電極間の間隔を備える、トンネル間隙とを含む。そのような実施形態では、第２の対の電極は、ストークス流をナノ細孔の中に発生させるようにバイアスがかけられてもよい。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ナノ細孔を横断する分子の遷移を制御するための方法が、提供され、開示されるシステム／デバイス実施形態のうちの１つまたは別のものによる、システムまたはデバイスを提供するステップと、分子輸送のために第１の方向に電気浸透流動を発生させるように構成される、電圧バイアスを第２の対の電極間に印加するステップとを含む。いくつかのそのような実施形態では、付加的ステップとして、
−少なくとも１ｋＨｚの周波数のＡＣ電圧を第２の対の電極間に印加するステップと、
−ＡＣ電流信号の非線形処理を介して、トンネル間隙内の分子の存在を検出するステップと、
−電圧バイアスを第１の電極と第２の対の電極との間および第２の電極と第２の対の電極との間のうちの少なくとも１つに印加するステップであって、電圧バイアスは、第２の電極対によって発生される信号によってフィードされる回路によって制御される、ステップと、
を含んでもよく、
−電圧バイアスは、ＡＣおよびＤＣ成分の両方を備える。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ナノ細孔内の検体分子の濃度を制御するための方法が、提供され、開示されるシステム／デバイス実施形態のうちの１つまたは別のものによる、システムまたはデバイスを提供するステップと、電圧バイアス手段によって細孔内に電解質の電気浸透流動を発生させるステップとを含み、電気浸透流動は、ナノ細孔の少なくとも片側に提供されるバルクリザーバからの検体分子を、バルクリザーバからナノ細孔の中への結果として生じる流体流動を介して、捕捉することおよび集中させることのうちの少なくとも１つを行うように構成される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ナノ細孔を横断する分子の遷移を制御するための方法が、提供され、開示されるシステム／デバイス実施形態のうちの１つおよび／または別のものによる、システムまたはデバイスを提供するステップと、ナノ細孔の中への分子の流動に対抗するように、第１の対の電極にバイアスをかけるステップと、電気浸透流動をナノ細孔の中に発生させるように、第２の対の電極にバイアスをかけるステップとを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、非帯電分子の転位を制御するための方法が、提供され、開示されるシステム／デバイス実施形態のうちの１つまたは別のものによる、システムまたはデバイスを提供するステップと、ストークス流をナノ細孔の中に発生させるように、第２の対の電極にバイアスをかけるステップとを含む。
【００２１】
本開示によって教示される多くの他の実施形態のこれらおよびいくつかは、本願とともに含まれる図面（簡単な説明が、以下に提供される）およびそれに続く発明を実施するための形態を参照して、さらにより明白となるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、分子モータを使用した転位制御の例証である。
【図２】図２は、本開示のいくつかの実施形態による、固体ナノ細孔内に埋込電極を伴う、転位制御の例証である。
【図３Ａ】図３Ａは、ナノ細孔に及ぶ電極にテザーされる認識分子による、ＤＮＡ塩基のトラップの実施例を図示する。
【図３Ｂ】図３Ｂは、６３塩基一本鎖ＤＮＡが認識分子で官能化された１０ｎｍ厚のＰｄ電極によって囲繞されるナノ細孔を転位させるにつれた転位時間（秒）の分布を図示する（バイアス＝７０ｍＶ）。認識分子を伴わない同一ナノ細孔および電極の場合の分布時間は、黒色バーによって示される。
【図４】図４は、本開示のいくつかの実施形態による、トンネル電極が同一平面において相互に対向される形態における、転位制御および読取方式のためのシステムを図示する。
【図５】図５は、本開示のいくつかの実施形態による、平面トンネル接合構成を図示する。
【図６】図６は、本開示のいくつかの実施形態による、積層トンネル接合構成を図示する。
【図７−１】図７は、本開示のいくつかの実施形態による、下側トンネル電極０Ｖおよび上側トンネル電極−０．５Ｖ（Ａ）、＋０．５Ｖ（Ｂ）、および０Ｖ（Ｃ）（±０．１Ｖが上側および下側基準電極に印加される）の場合の積層トンネル接合構成におけるナノ細孔の周囲の電場の分布を図示する（デバイスの断面が示され、完全デバイスは、本モデルをＸ−Ｘの周囲で回転させることによって説明される）。本分布は、他の電極が示されるようにバイアスがかけられた状態で、−０．５Ｖのバイアスがかけられる第２のトンネル電極の場合のものである。電場方向は、矢印によって示され、等電位線の密度は、電場強度を表す。
【図７−２】図７は、本開示のいくつかの実施形態による、下側トンネル電極０Ｖおよび上側トンネル電極−０．５Ｖ（Ａ）、＋０．５Ｖ（Ｂ）、および０Ｖ（Ｃ）（±０．１Ｖが上側および下側基準電極に印加される）の場合の積層トンネル接合構成におけるナノ細孔の周囲の電場の分布を図示する（デバイスの断面が示され、完全デバイスは、本モデルをＸ−Ｘの周囲で回転させることによって説明される）。本分布は、他の電極が示されるようにバイアスがかけられた状態で、−０．５Ｖのバイアスがかけられる第２のトンネル電極の場合のものである。電場方向は、矢印によって示され、等電位線の密度は、電場強度を表す。
【図８】図８は、いくつかの実施形態による、ナノ細孔の周囲の体積電荷の等高線を図示する（デバイスの断面が、示され、完全デバイスは、本モデルを水平軸上の０において垂直線の周囲を回転させることによって説明される）。本分布は、上部トンネル電極４７が０．４Ｖのバイアスがかけられ、下側トンネル電極４６が０Ｖ、下側基準電極が−０．０５Ｖ、および上側基準電極が＋０．０５Ｖの場合のものである。等高線は、正電荷の場合のみに示され、ナノ細孔の中心軸近傍の「孔」は、負電荷の蓄積の領域に対応する（但し、平均は、全体的に正である）。
【図９Ａ】図９Ａは、いくつかの実施形態による、ナノ細孔の異なるドメイン（左に番号）を図示する。
【図９Ｂ】図９Ｂは、流体の各体積に関する体積電荷、電場、および力を列挙する、表（表１）である。電気浸透流動が電気泳動力を克服する、トンネル電極（領域５）間の力の非常に大きな逆転に留意されたい。
【図１０】図１０は、いくつかの実施形態による、トンネル電極を横断して印加される電圧Ｖ３の関数としてのナノ細孔を通る粒子速度を図示する。
【図１１】図１１は、電気浸透力および電気泳動力が相互に対抗する、本開示の実施形態を図示する。基準電極は、「逆方向」にバイアスがかけられ得るが、ナノ細孔を通した流動は、依然として、生じる。
【図１２】図１２は、本開示のいくつかの実施形態による、裸ＳｉＮナノ細孔（正方形）、それを囲繞する裸Ｐｄ電極を伴う同一細孔（黒丸）、および４（５）−（２−メルカプトエチル）−ｌＨイミダゾール−２−カルボキサミドリーダ分子で官能化された電極を伴う同一細孔に関する、バイスの関数としてＤＮＡ分子の捕捉を示す、測定された計数率を図示する。
【図１３】図１３は、本開示のいくつかの実施形態による、ナノ細孔への入口に分子を集中させるための捕捉方式を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本開示の実施形態のいくつかの基本は、認識トンネルとして知られる、トンネル電極にテザーされる認識試薬による標的分子のトラップである。７一連の前述の開示第ＷＯ２００９／１１７５２２Ａ２号、第ＷＯ２０１０／０４２５１４Ａ１号、第ＷＯ２００９／１１７５１７号、第ＷＯ２００８／１２４７０６Ａ２号、および第ＷＯ２０１１／０９１４１号（それぞれ、参照することによって本明細書に組み込まれる）では、核酸塩基が、ヌクレオ塩基がアダプタ分子で官能化されたトンネル間隙を通して通過するにつれて発生される電子トンネル電流信号を使用して読み取られ得る、システムが、開示された。ポリマー内に埋め込まれた個々の塩基を読み取るための本システムの能力の実証は、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．８によって与えられている。Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．８による論文では、動的分子間力分光法が、どのように一対の認識分子によってトラップされた標的分子の解離速度を測定し得るかが示されている。本トラップは、ＤＮＡ１７中のＣ塩基の具体的実施例を使用して、図３Ａに図示される。認識分子４（５）−（２−メルカプトエチル）−ｌＨイミダゾール−２−カルボキサミド１６は、２〜３ｎｍ分離される、電極１４に共有結合的にテザーされる。認識分子１６は、ＤＮＡが電極間の空間に及ぶナノ細孔１５を通して通過するにつれて、塩基１７と水素結合錯体を形成する９。
【００２４】
認識トンネルは、配列の読取を可能にするだけではなく、ある場合には、また、検体分子をトンネル間隙内にトラップすることができる。注意深く選択された温度、溶液粘性、およびバイアスを用いても、固体ナノ細孔内で達成される最低速転位時間（約４ｎｍ径細孔）は、塩基（二本鎖ＤＮＡの場合）あたり約０．３μｓであって１０、あまりに高速で、配列が電子的に読み取られることができない。
【００２５】
転位が、どのように官能化されたナノ細孔内で減速されるかの例示的例証、すなわち、認識分子への検体の結合速度論が、考慮される。結合された錯体の解離速度（図９）ｋｏｆｆ、は、以下に従って、印加された力に依存する。
【００２６】
【数１】
2016512605.tif 000003
式中、ｋｏｆｆ０は、ゼロ力における解離速度であって、Ｆは、トラップ結合を破壊する、印加される力であって、ｘＴＳは、結合破壊に対する障壁（結合破壊のための遷移状態に対する距離）を説明するパラメータであって、ｋＢは、ボルツマンの定数であって、Ｔは、絶対温度である。ナノメートルスケールの間隙内のｋｏｆｆ０の直接測定（動的分子間力分光法８を使用する）は、約０．３ｓ−１であることを示す。したがって、外部力が印加されない状態で、ＤＮＡ塩基は、約３秒間、認識トンネル間隙内に留まるであろう。本時間周期は、錯体の閉じ込めの結果である１１，１２。
【００２７】
同一の一式の動的分子間力分光法測定８は、ｘＴＳ＝０．７８ｎｍをもたらす。ＤＮＡ分子にかかる力は、概して、Ｆ＝０．２４ｐＮ／ｍＶに従って１３、ナノ細孔を横断して印加される電圧に依存するため、任意の外部から印加されるバイアスにおける解離速度が、計算されることができる。例えば、塩基あたり１０ｍｓの滞留時間が、配列を正確に読み取るために望ましい場合、ｋｏｆｆは、
【００２８】
【化１】
2016512605.tif 000004
であるように、ｋｏｆｆ０の約１００ｓ−１または３３３倍の増加となるはずである。３００Ｋでは、ｋＢＴ＝４．２ｐＮ．ｎｍであって、したがって、ＦｘＴＳは、約２４．４ｐＮ．ｎｍとなるはずである。ｘＴＳ＝０．７８ｎｍでは、１３０ｍＶの電圧によって与えられる力Ｆ＝３１．２ｐＮである。故に、転位は、類似バイアスにおける非官能化細孔内の塩基あたり０．３μｓと比較して、化学結合によって、３０，０００倍の低速である、塩基あたり１０ｍｓの滞留時間まで減速される１０。
【００２９】
実験データは、電極の官能化が、裸金属電極を越えての転位と比較して、転位を減速させる見解を支持する（図３Ｂ）。加えて、転位時間は、印加される電圧に伴って指数関数的にではなく、線形に変化し、摩擦が、能動的化結合および結合解除を支配することを示す。４（５）−（２−メルカプトエチル）−ｌＨイミダゾール−２−カルボキサミドで官能化されたＰｄ電極によって囲繞されるナノ細孔を用いて行われる電流遮断時間の分布は、図３Ｂにおける白抜きバー１８によって示される。データは、７０ｍＶのバイアスが印加される６３ヌクレオチド一本鎖ＤＮＡの場合のものである。適合（実線）は、塩基あたり約０．２ｍｓ滞留時間に対応する、ピーク１０±１ｍｓを伴う対数正規分布に対して行われる（但し、多くの事象は、これより長い）。
【００３０】
対照的に、非官能化電極に対する遮断時間の中央値（図３Ｂにおける黒色バー１９）は、同一ＤＮＡが同様に７０ｍＶバイアスがかけられた同一細孔の場合、約０．５ｍｓである。これは、塩基あたり約８μｓに対応する。これは、依然として、非金属化細孔（および、二本鎖ＤＮＡ）の場合に報告される最低速時間より＞２０倍低速であって、これは、金属電極への一本鎖ＤＮＡの結合に起因すると考えられる。１４したがって、４（５）−（２−メルカプトエチル）−ｌＨイミダゾール−２−カルボキサミドで官能化され、ナノ細孔に近接近して配置された金属電極を用いると、ＤＮＡ転位は、金属電極および官能化を伴わない固体ナノ細孔を通した転位と比較して、約１０００倍減速され得る。認識トンネル幾何学形状は、限定されたバイアス（例えば、１０〜１００ｍＶ範囲）が細孔を横断して印加され得ることを前提として、配列読取のために、転位を適正に減速させる役割を果たす。しかしながら、いくつかの実施形態では、トンネル電極を横断してバイアスを印加する必要性は、ナノ細孔を横断する任意の転位バイアスの印加を複雑にし得る。これは、以下に記載のように対処されることができる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、認識トンネルによる信号の発生は、前述に開示される転位バイアス値を上回る、約０．１〜約０．５Ｖのトンネル間隙を横断する電圧を含む１５。図４を参照すると、いくつかの実施形態では、全体的転位バイアスは、細孔の両側の電解質溶液中に浸漬される、一対の基準電極Ｒ１、２７およびＲ２、２８を横断して印加される。２つの基準電極間に印加される総バイアスは、Ｖ１＋Ｖ２（図上のＶ１、２９、Ｖ２、３０）である。ナノ細孔自体が、トンネル電極（Ｔ１、２５およびＴ２、２６）を含有するため、いくつかの実施形態では、これらの電極の電位は、基準電極に対して定義される（いくつかの実施形態では、これが行われない場合、イオンおよび帯電分子は、転位に対抗するようその電位を改変するように、金属表面上に吸収され得る）。いくつかの実施形態では、２つのトンネル電極が同一電位（Ｖ３、３１、＝０）であることに応じて、理想的には、Ｖ１は、ナノ細孔電極２５および２６の電位が２つの基準電極２７と２８との間の中間にあるように、Ｖ２（Ｖ２＜０）の大きさとほぼ等しく設定される。
【００３２】
いくつかの実施形態によると、転位されるべき分子が、下側リザーバ内に設置される場合、ＤＮＡ（負に帯電）の場合、Ｖ１をより負にすることは、分子のより高速の捕捉をもたらす一方、Ｖ２の増加は、Ｔ１  ２５およびＴ２  ２６（付着された認識分子、Ｒ、３２、３３とともに）によって形成される接合からの分子のより高速な引き離しをもたらす。しかしながら、バイアスが、Ｖ１＋Ｖ２の大きさを上回る、トンネル接合を横断して印加される場合、一方または他のトンネル電極は、典型的トンネル電圧が、転位電位（例えば、Ｖ１＋Ｖ２＝５０ｍＶの大きさ）を上回るため（５００ｍＶ）、Ｒ１またはＲ２のいずれかより電位がより高い（または、低い）。Ｔ１またはＴ２のいずれかの電位が、Ｒ１を下回る場合、ＤＮＡ分子は、ナノ細孔から跳ね返される（静電力のみが考慮される場合）。Ｔ１またはＴ２がＲ２を上回る場合、ＤＮＡ分子は、再び、静電力のみが考慮される限定において、間隙から迅速に引き反されないであろう。
【００３３】
いくつかの実施形態では、解決策の１つは、交流（ＡＣ）バイアスを用いてトンネル間隙を操作することである。具体的には、ＡＣバイアスの周波数が、ＤＮＡの誘電応答周波数（典型的には、数ｋＨｚ１６−１９）を上回る場合、転位に及ぼすＡＣバイアスＶ３  ３１の影響は、小さくなり得る。以下に示されるように、いくつかの実施形態は、ＤＣ電圧とＡＣ信号の組み合わせが課されるようなＶ３を提供する。いくつかのそのような実施形態では、トンネル電流は、当技術分野において公知のように、ピーク振幅検出器またはロックインを用いて検出される。これは、電流信号の時間平均が、ＡＣバイアスが印加された状態で、ゼロであるためである。参照番号３４は、いくつかの実施形態によると、Ｔ１とＴ２との間の接合を横断して流動するトンネル電流に比例して電圧信号を発生させる、電流／電圧コンバータ（トランスインピーダンス増幅器）である。いくつかの実施形態では、本コンバータの応答は、デバイスを通して流動する電流１ｎＡに対して１Ｖの出力である。故に、ＡＣ電圧出力は、ロックイン検出器３５の信号入力にフィードされ、ＤＣ成分は、キャパシタ３７によってブロックキングされる。ＡＣ駆動電圧は、ロックインのための基準信号として使用される。本バイアスの例示的値は、約ｌ００ｍＶ〜約ｌ０００ｍＶのピークトゥーピーク範囲内であって、５００ｍＶのピークトゥーピークが好ましい。例示的周波数は、約１ｋＨｚ〜約１００ｋＨｚの範囲内にあってもよく、約２０ｋＨｚが、いくつかの実施形態によると、好ましい周波数である。いくつかの実施形態による、得られたＤＣ信号に対する信号平均時間は、約５ｍｓ〜５０約マイクロ秒の範囲内であって、約５００マイクロ秒が、いくつかの実施形態によると、好ましい。これらの時間は、出力電圧３６を発生させるために、ロックイン３５内に設定され、それによって、間隙内の化学種の同定を可能にするために不可欠なトンネル信号の動的特徴を留保しながら、（いくつかの実施形態では）ＡＣ変調信号の数サイクルにわたって平均化を可能にしてもよい。２０ロックインは、信号平均時間定数を設定するために使用されるレジスタを伴う、単純ピーク検出回路（ダイオードおよびキャパシタ）と置換されてもよいことは、当業者に認識されるであろう。
【００３４】
図５および６は、本開示の実施形態による、ナノ細孔内のトンネル接合のための２つの例示的配列を図示する。図５は、いくつかの実施形態による、平面構成を示し、約１０〜約１００ｎｍの幅のワイヤが、膜４２内のナノ細孔４１に及ぶ、一対の電極４３を形成するように切断される。いくつかの実施形態では、膜は、典型的には、約１０〜約１００ｎｍの厚さであって、窒化ケイ素またはシリコンの酸化物から作製される。電極間の間隙は、約２ｎｍ〜約３ｎｍであって、ナノ細孔は、類似直径を含んでもよい。図６は、米国特許出願第６１／７１１，９８１号（参照することによって本明細書に組み込まれる）に前述される、いくつかの実施形態による、平面「積層」構成を示す。図６では、２つの電極４５および４７は、約２ｎｍ〜約３ｎｍの厚さの誘電層４６によって分離され、Ａｌ２Ｏ３は、好ましい材料であって、原子層堆積によって堆積される（いくつかの実施形態によると）。電極（４５および４７）は、薄い（０．５ｎｍ）Ｔｉ接着層上に堆積される、約４ｎｍ〜約１０ｎｍの厚さのＰｄ金属であってもよい。狭着物は、ＳｉＮ基板４２上に着座し、典型的には、約１０〜約１００ｎｍの厚さである。ナノ細孔４１（または、他の間隙）は、アセンブリ全体を通して穿孔され、電極４５および４７の縁を暴露させる。いくつかの実施形態では、電極は、デバイス全体を認識分子４４のエタノール溶液中に一晩浸漬させることによって、官能化されてもよい。本平面構成は、大トンネルバイアスの使用の問題の解決策につながる、予想外の特性を含み、それらを広範囲の距離から収集することによって、中性分子でさえ間隙中にトラップする能力を与える。
【００３５】
ナノ細孔中のＤＮＡまたは任意の他の帯電ポリマーの動きは、ＤＮＡにかかる実際の力が、正に分極された電極へのＤＮＡの電気泳動誘引に加え、寄与を有するため、複雑である。具体的には、ＤＮＡにかかる力として、以下が挙げられ得る。
（ａ）分子のサイズおよび速度に依存する、抗力。
（ｂ）第一次近似に対して、細孔に沿った電圧にのみ依存する、ＤＮＡ電荷に比例する、電気泳動力（ＤＮＡ電荷は、長さに伴って増加するが、細孔内の電場は、所与の電圧の場合、細孔長に伴って減少する）。
（ｃ）ＡＣ電場の大きさの勾配、その周波数、そのサイズ、ならびに電解質環境に対するＤＮＡの誘電および伝導性特性に依存する、誘電泳動力。
（ｄ）無作為熱力。
【００３６】
これらの寄与は全て、図７−９に示される、いくつかの実施形態による、積層電極デバイス内のＤＮＡ転位の有限要素分析において考慮されている。図７では、細孔幾何学形状の垂直断面の半分が、構成の円筒形方位対称に起因して示される。３次元構造は、モデルをＸ−Ｘとマークされた軸線の周囲で回転させることによって発生される。ナノ細孔４１の半分が、図７Ａ−Ｃおよび８の左に示される。窒化ケイ素基板は、４２である。ここではＶ＝０と仮定される、下側Ｐｄ電極は、４５である。誘電Ａｌ２Ｏ３層は、４６である。上部Ｐｄ電極は、４７である。下側チャンバ５０内の塩類液は、下側基準電極２７と接触する。同様に、上側チャンバ５１内の塩類液は、上側基準電極２８と接触する。１Ｍ  ＫＣｌ内の電場は、図上の矢印によって示される。一連の図（図７Ａ−Ｃ）は、上部基準電極が＋０．１Ｖのバイアスがかけられ、底部基準電極が−０．１Ｖのバイアスがかけられた状態で、上部電極４７が、−０．５Ｖ、０Ｖおよび＋０．５Ｖのバイアスがかけられるにつれて、電場分布がどのように変化するかを示す。６０塩基またはより長いＤＮＡは、いくつかの実施形態によると、電気泳動に対抗する強電場が電極４７と４５との間にあるとき（すなわち、Ｖ３＝−０．５Ｖの場合）でも、細孔を通して転座する。これは、本領域内の電場が、ＤＮＡを押し出すように作用する間、電気浸透流動（本領域内でのみ）が、反対方向に作用するためである。
【００３７】
故に、ＤＮＡは、電極４５の近傍における誘引電気泳動力によって細孔の中に引き込まれ、次いで、電極４７と４５との間の逆電場によって提示される障壁によってトラップされる（または、いくつかの実施形態では、再び押し戻されさえする）。変動が、それを電場逆転の次の領域（電極４７の上方）の中に駆動するとすぐ、次いで、上部電極２８によって上方に掃引されることができる。いくつかの実施形態では、類似パターンが、より小さいＶ３を用いて生じるが、ここでは、ＤＮＡは、より少ない時間の間、電極４５と４７との間の逆転電場の領域内にトラップされる。挙動は、Ｖ３＝０Ｖ（図７Ｃ）であるときと異なり得、ここでは、電場は、２つの電極４５と４７との間の領域内に存在しない。その結果、ＤＮＡは、多くの場合、トラップされ、時として、電気浸透流動によって、細孔から下側リザーバ５０の中に逆放出される。いくつかの実施形態では、本効果は、サイズに依存する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、Ｖ３＞０（図１１）である、逆状況でも、転位は、依然として、生じる。この場合、電極４５と４７との間の間隙内の転位を補助する、強電場が、存在する。しかしながら、ＤＮＡは、最も正の電極４７に付着し得るが、ナノ細孔から急速に拡散し、電極４７の上部表面にわたって拡散し得る。
【００３９】
本反直感的挙動につながる物理的機構は、図８−１０に詳細に論じられる。ＳｉＮナノ細孔の上部における金属電極（溶媒に面する負に帯電された表面を有する）および上側Ｐｄ電極４７の表面はまた、負電位時、著しく負に帯電され、これらの表面電荷は両方とも、正体積電荷をナノ細孔内に誘発させる。体積電荷の分布は、軸の周囲の負体積電荷の領域（細孔内の白色領域）の出現状態でさえ、均一ではない（図８）。これらの電荷に作用する体積力は、電場にもまた比例し、正電荷の場合、電場のように指向される。電場は、細孔内のその方向を変化させるため（図７Ａ）、溶媒に作用する、２つの対抗力が、存在する。水の非圧縮性および連続性に起因して、液体全体は、より強い力の方向に移動するであろう。細孔は、いくつかのドメインに分割され（図９）、表Ｉに、Ｖ３＝−０．４Ｖ（Ｖ２−Ｖ１＝１００ｍＶ）の場合のドメイン毎の総体積電荷、電場の平均縦方向成分、および総体積力が示される。上向き、すなわち、負から正電極のドメイン体積力が、優勢であって、溶媒の流動をその方向に生じさせる。
【００４０】
図１０は、いくつかの実施形態による、図６に示される、「積層」トンネル接合幾何学形状の場合のトンネル電極Ｖ３を横断するバイアスの関数としての転位速度を示す。本配列は、ＤＮＡの単一粒子モデルに対するものであるため、伸長鎖から生じる付加的摩擦またはナノ細孔の外側の鎖の一部にかかる力を表さない。また、ＤＮＡに結合する認識分子（図４における３２、３３）から生じる摩擦力も含まない。
【００４１】
ナノ細孔を通る水中のＤＮＡの転位速度は、ピコ秒スケールにおいて、電場および移動度の変化に対して反応する。瞬間速度
【００４２】
【化２】
2016512605.tif 000005
は、したがって、電場
【００４３】
【化３】
2016512605.tif 000006
電気泳動移動度μｅｐ、および電気浸透速度
【００４４】
【化４】
2016512605.tif 000007
の瞬間値の観点で以下の形態に表され得る。
【００４５】
【数２】
2016512605.tif 000008
転位時間の大きさを推定するために、以下のように近似化される。
【００４６】
【数３】
2016512605.tif 000009
Ｅａｒｌｅ  Ｓｔｅｌｌｗａｇｅｎ，  Ｙｏｎｇｊｕｎ  Ｌｕ，  ａｎｄ  Ｎａｎｃｙ  Ｃ．  Ｓｔｅｌｌｗａｇｅｎ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２００５年）；３３（１４）：４４２５−４４３２；Ｎａｎｃｙ  Ｃ．  Ｓｔｅｌｌｗａｇｅｎ  ａｎｄ  Ｅａｒｌｅ  Ｓｔｅｌｌｗａｇｅｎ，  Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ（２００９年３月６日）；１２１６（１０）：１９１７−１９２９，  Ｐｈｙｓ  Ｒｅｖ  Ｅ  Ｓｔａｔ  Ｎｏｎｌｉｎ  Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ  Ｐｈｙｓ．（２００８年８月）；７８（２Ｐｔ１）：０２１９１２を参照されたい。
【００４７】
【化５】
2016512605.tif 000010
は、ＤＮＡの電解質の粘度、電解質濃度、および有効（スクリーニングされた）電荷、ＤＮＡ長、ナノ細孔の長さおよびその半径に若干依存するが、例証目的のために、一定であると仮定される。
【００４８】
下から上へのｚ−軸垂直線を伴う、図９および図１０とともに表１を参照すると、図９における細孔の種々のドメイン内の電気泳動速度νｅｐのｚ−成分は（Ｖ３＝−０．４Ｖであるとき）、６．４５ｃｍ／ｓ〜−０．５ｍ／ｓの値をとる一方、電気浸透速度ｕの平均ｚ−成分は、水非圧縮性に起因して、全ドメインに対して
【００４９】
【化６】
2016512605.tif 000011
の同一値を有する。これは、塩基に対する、約３１ｎｓ、６．８ｎｓ、８ｎｓ、および２０ｎｓの種々のドメイン（３、４、５、６）を通した平均転位時間の推定につながり、合計Ｔ＞６６ｎｓをもたらす。ｕ＝０であるときの図１０における場合（Ｖ３＝−０．１Ｖまたは＋０．２２Ｖであるとき）、電気泳動速度のみ、転位時間を決定し、この場合、Ｔ＞１／塩基で決定される。Ｖ３の値を−０．１Ｖ〜０．２２Ｖに選定することによって、電気浸透速度は、負となり、電気泳動に対抗し、転位時間は、ほぼ任意の長さにされることができる。
【００５０】
電気浸透ストークス流の法則のため、ナノ細孔の中への液体の流動は、液体の非圧縮性に起因して、分子を広範囲の距離から細孔の中にもたらす一方、電気泳動力は、細孔近傍にのみ作用することから、基準電極Ｒ１およびＲ２は、「逆方向」にバイアスがかけられ得、分子は、依然として、捕捉および転位され得る。これは、図１１に示される例示的実施形態に図示され、積層トンネル接合構成が、使用され、電極は、図６におけるように標識化され、電圧Ｖ１、Ｖ２、およびＶ３は、図４におけるように定義される。例えば、負に帯電されたＤＮＡ分子が、Ｒ１と仕切り４２との間の下側リザーバ内に設置され、Ｖ１が、Ｒ１がＴ１  ４５に対して正であるように配列される場合、電気泳動力１００２は、ＤＮＡ分子をナノ細孔から遠ざけるように作用する。しかしながら、Ｔ２  ４７がＴ１  ４５に対して負にされるときに生じる、電気浸透力は、ここでは、電気浸透力が電気泳動力を超えることを前提として、分子を細孔の中に引っ張る。したがって、これらの条件では、転位は、実質的に、任意に減速されることができる。さらに、大Ｖ１を「逆」方向に印加することによって、実質的Ｖ３が、印加され、大トンネル信号を発生させることができる。長距離のストークス流１００３のため、ナノ細孔への進入に対抗する電気泳動力が、ナノ細孔のすぐ近傍においてのみ作用するため、分子は、依然として、効率的に捕捉されることができる。
【００５１】
これらの挙動は、いくつかの実施形態では、印加されるバイアスＶ３がＡＣ正弦波であるとき、再現される。ＤＮＡは、細孔に進入するとき、Ｖ３の値に従って転位する。これは、転位時間が、これらのシミュレーションでは、ＡＣ波形の周期よりはるかに短いため、そのような実施形態に該当する。
【００５２】
故に、いくつかの実施形態では、閾値周波数を上回る（いくつかの実施形態では、約１０ｋＨｚを上回る）ＡＣバイアスを用いて実施されるトンネル検出では、ＤＮＡは、バイアスが最適値に到達すると、転位する。いくつかの実施形態の場合に要求される周波数を推定するために、より現実的測定転位時間が、官能化されたトンネル接合に考慮される（図３Ｂ）。いくつかの実施形態では、配列を読み取るために、塩基あたり多くのサイクルが、必要とされる。故に、図３Ｂに示される分布のピークは、０．１６ｍｓ／塩基に対応する。各塩基を１０回サンプリングするために、いくつかの実施形態によると、約６３ｋＨｚのＡＣ周波数を要求する。
【００５３】
前述の実施形態のいくつかでは、電気泳動力だけで、認識分子を伴わない場合、転位時間は、認識分子によって課される化学抗力がモデル内に含まれなかったため、６０塩基ＤＮＡの場合、数マイクロ秒である。例えば、周波数が各塩基が間隙内に留まる時間の間のサイクル数に対応する、Ｖ３に対するＡＣ電圧の影響をシミュレートするために、ＡＣ信号の周波数は、約１００ＭＨｚに設定される。これは、ＤＣ電圧のみ、Ｖ１、Ｖ２、およびＶ３のＤＣ成分によって制御されるとき、転位確率を変化させない信号をもたらす。したがって、いくつかの実施形態によると、Ｖ３の小ＤＣ値は、転位率を制御するために使用されることができる一方、はるかに大きい重畳ＡＣ電圧は、配列の読取のために要求される大きさのトンネル信号を発生させる。
【００５４】
いくつかの実施形態によると、Ｖ１およびＶ２は、コンピュータプログラムが、トンネル信号を転位電圧値を制御するために使用される入力としてフィードし、これらの電位の能動的制御を可能にすることによって、外部から制御されることができる。転位電位の能動的制御が、以前に提案されているが（Ｋｅｙｓｅｒ２１およびその中の参考文献参照）、そのような提案は、ナノ細孔を横断して印加される電位を制御するために使用される信号として、イオン電流遮断を測定する文脈においてのみであった。その目的のために、いくつかの実施形態による、本明細書に説明される手段によってトンネル信号を測定する能力は、転位制御のための新たな道を切り開く。例えば、いくつかの実施形態によると、Ｖ１は、トンネル事象が検出器出力３６によって信号伝達されるまで、より大きくされ得る（０．１〜０．５ボルト）。その時点において、Ｖ１は、次いで、さらなる捕捉を防止するために低減されてもよい一方、Ｖ２は、次いで、所望の転位率を与えるために調節されてもよい。
【００５５】
いくつかの実施形態では、Ｖ３  ３１（図４）は、約−０．１Ｖ〜約−０．５Ｖの電圧に設定されてもよい。Ｖ１  ２９は、約−０．０１〜約−０．１Ｖの値に設定されてもよく、Ｖ２  ３０は、約＋０．０１〜約＋０．１Ｖの値に設定されてもよい。故に、トンネル信号が、分子が間隙内に存在することを示すと、Ｖ２は、−０．５Ｖまで降下され、電極４７に印加されるバイアスに一致し、認識トンネル信号が最初にトラップされた塩基から記録されるまで、分子を間隙内に止めてもよい。Ｖ２は、次いで、約＋０．０１〜約＋０．１Ｖの値にすぐに戻され、次いで、再び降下され、配列内の次の塩基の読取を可能にする等と続いてもよい。
【００５６】
いくつかの実施形態では、Ｖ３は、約＞１０ｋＨｚの周波数のＡＣ電圧であって、約０．１〜約１Ｖのピークツーピーク振幅であってもよい。Ｖ１  ２９は、約−０．０１〜約−０．１Ｖの値に設定されてもよく、Ｖ２  ３０は、約＋０．０１〜約＋０．１Ｖの値に設定されてもよい。いったん捕捉事象が、トンネル信号によって検出されると、Ｖ１は、次いで、さらなる捕捉を防止するために低減されてもよく、Ｖ２は、所望の転位率を得るように低減されてもよい。
【００５７】
いくつかの実施形態では、Ｖ１の記号は、いったん分子が捕捉されると、Ｒ１およびＲ２の両方が、分子の末端を引き寄せるよう動作するように、完全に変更され得る。故に、分子を引き寄せる等力および反力を用いて、分子は、細孔内で完全に停止され得る。そのような実施形態における利点は、大（延伸）力が、分子にかけられ、ナノ細孔への正面および背面入口を横断する電位差が、エネルギー中の熱変動よりはるかに大きいであろうため、分子の位置における熱変動を抑制しながら、実質的にｋＴ未満の（すなわち、Ｖ１およびＶ２が反対方向に作用するＶ１−Ｖ２の場合、２５ｍＶをはるかに下回る）バイアス差さえ、分子を転位させるために使用され得るように、熱変動を実質的に低減させ得ることである。したがって、転位が能動的に制御され得る電位の範囲は、大きく向上される。
【００５８】
いくつかの実施形態では、基準電極は、ナノ細孔の中への輸送に対抗するようにバイアスがかけられるが、トンネルバイアスは、本反力を克服し、分子を細孔の中に、但し、反力のため、はるかに遅い速度において、牽引し得る、電気浸透流動を発生させるように構成される。電気浸透流動は、塩類液中の短距離の局所電場と比較して、はるかに長い範囲のストークス流のため、分子の効率的捕捉をもたらす。
【００５９】
本開示は、ＤＮＡ分子を伴うシステムおよびその動作を図示するが、正味正または負電荷を担持する、あるいは電荷を全く担持しない、任意の帯電または中性ポリマーとも作用するであろうことが認識されるであろう。特に、前述のようなストークス流によって支配されるシステムでは、中性分子が、ナノ細孔の中に収集および牽引されるであろう。
【００６０】
故に、図７から明白であるように、細孔の入口および出口から数細孔径分延在し得る、電場（比較的に実質的、すなわち、有意であり得る）が存在する。本領域に進入する粒子は、ナノ細孔の中に掃引され得、そこで、Ｖ２およびＶ３の値に応じて、転位する、またはトラップされるであろう。いくつかの実施形態では、いったん検体がトンネル接合内に入ると、結合パートナーの有効濃度が非常に高いため、認識試薬による結合が生じる可能性が高い。これを図示するために、８×１０−２７ｍ３または８×１０−２４リットルである、体積（２ｎｍ）３のトンネル接合を検討する。本体積内の分子の１つは、約１０２３分子／リットルまたは約０．１Ｍに対応する。Ｋｏｎに関する拡散限界値は、１０９Ｍ−１ｓ−１であって、結合が困難である、システム内の実験的に判定された下限は、１０６Ｍ−１ｓ−１である。したがって、本下限においてさえ、結合は、実験的に判定された限界と一貫して、非常に高速である（ｌ／［ＫｏｎＣ］、式中、Ｃは、濃度であって、１０μｓの時間をもたらす）２０。したがって、細孔近傍の具体的電場の領域に到達する全ての分子が、検出され得る。細孔から離れると、電場は、著しく小さい。
【００６１】
これを図示するために、約０．１Ｖ／１０ｎｍまたは１０７Ｖ／ｍである、細孔内の電場を検討する。細孔から離間される（いくつかの実施形態では、１つまたは２つの細孔径分、１０ｎｍ）ことによって、電流密度（および、故に電場）は、その比率（ｒ／Ｒ）２が降下するであろう（ｒは、ナノ細孔の半径であって、Ｒは、細孔につながるチャネルの半径である）。故に、Ｒが約１μｍであって、ｒが約１ｎｍである場合、細孔から離間される（例えば、１つまたは２つの細孔径分、１０ｎｍ）リザーバ内の電場は、約１ボルト／メートル未満である。小分子（移動度１０−８ｍ２／Ｖｓを伴う）のドリフト速度は、したがって、約１０ｎｍ／秒となり得る。したがって、ストークス流が不在の場合、細孔から離れたリザーバ内の分子の運動は、電気泳動ドリフト速度が、ナノ細孔幾何学形状によって決定される電流のこれらの値において十分に小さいため、拡散によって支配される。時間ｔにおける分子が拡散する距離Ｌ２は、
【００６２】
【化７】
2016512605.tif 000012
によって与えられ、Ｄは、拡散定数である。小分子の場合、Ｄは、約１０−１０ｍ２／ｓである。したがって、細孔に向かって指向される速度ベクトル成分を伴う分子は、体積約（Ｌ２）にわたってトラップされるであろう。３そのような実施形態では、これは、捕捉率を限定し得る。図１２は、いくつかの実施形態による、裸ＳｉＮ細孔、Ｐｄ電極が組み込まれた細孔、および認識分子で官能化されたＰｄ電極を伴う細孔の場合の測定された捕捉率を示す。Ｒ１とＲ２との間の小値のバイアス（Ｖ１＋Ｖ２）では、計数率は、１００ｎＭ濃度（例えば）でも、比較的に小さい（いくつかの実施形態では、数計数／分）。
【００６３】
電気泳動のための小捕捉体積は、図１２に図示される。本図では、Ｌ１は、半球の半径を表し、細孔近傍の電場は、大きい（約１０６Ｖ／ｍ）。本半球の中に拡散する分子は、ナノ細孔の中に通過するであろう。集団分画ｆは、本高電場領域に向かって進む速度ベクトルを有し、ｆ＜０．５であって、リザーバおよび細孔の幾何学形状の詳細に応じて、可能性として考えられる値は、約０．１である。したがって、ｔ秒以内にナノ細孔内に捕捉される分子の数Ｎは、およそ以下となる。
【００６４】
【数４】
2016512605.tif 000013
式中、Ｃは、標的検体の濃度である。Ｎ≧１を有する場合、
【００６５】
【化８】
2016512605.tif 000014
分子／ｍ３、またはモル／リットルの単位において、以下となる。
【００６６】
【数５】
2016512605.tif 000015
ｔ＝１ｓ、Ｄ＝１０−１０ｍ２／ｓ、およびｆ＝０．１の場合、Ｃ≧１６ｐＭである。したがって、わずか１秒の取得時間内でも、本開示のいくつかの実施形態の濃度下限は、多くの抗体ベースの検出システムに優る改良となる６（および、抗体ベースのシステムは、検体の先験的知識を要求する）。本下限Ｃｍｉｎは、
【００６７】
【化９】
2016512605.tif 000016
としてスケーリングされ、したがって、１００ｓまでの取得時間の増加は、Ｃｍｉｎを１６ｆＭまで低下させる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本下限は、リザーバ内の電場がナノ細孔を通る電流によって発生される小電場を上回って増加されると、さらに低下され得る（所与の時間内に）。故に、これは、付加的電極６２が、ナノ細孔の下側表面上に設置され、（いくつかの実施形態では）ナノ細孔に近接する面積（例えば、数ミクロン以内）に制限されることによって遂行され得る。バイアスＶｅ  ６３を用いて、下側基準電極Ｒ１  ６０と電極６２との間に大バイアス（０．０５Ｖまたはより大きい）を印加することによって、帯電分子は、電極６２上に蓄積するように駆動され得る。リザーバ壁６１は、Ｖｅによって発生される電場が幾何学形状に起因してより小さい、死点を回避するように最適に成形される。いったん分子が下側表面電極６２上に集中すると、下側基準電極６０および上側基準電極６５のバイアスは、転位のための最適な値に戻され得る。
【００６９】
いくつかの実施形態では、電気浸透流動が、輸送を支配するとき（拡散より；図９Ｂ−表１における条件参照）、以下の考慮点が適用される。例えば、半径Ｒおよび長さＬの細孔のシス側における電位は、以下となる２２。
【００７０】
【数６】
2016512605.tif 000017
式中、
【００７１】
【化１０】
2016512605.tif 000018
は、細孔を横断するバイアス電圧である。「半径方向」電場は、以下となり、
【００７２】
【数７】
2016512605.tif 000019
ＤＮＡの電気泳動速度は、以下となる。
【００７３】
【数８】
2016512605.tif 000020
電気泳動は、
【００７４】
【化１１】
2016512605.tif 000021
（式中、Ｄ／２ｒは、ｒの方向における平均１次元拡散速度である）のとき、細孔への捕捉における拡散を支配する。臨界半径は、したがって、以下となる。
【００７５】
【数９】
2016512605.tif 000022
式中、
【００７６】
【化１２】
2016512605.tif 000023
は、細孔内側の平均電場である。
【００７７】
代替として、いくつかの実施形態では、細孔内の電気浸透移動度に伴って、
【００７８】
【化１３】
2016512605.tif 000024
であることに応じて、溶媒の連続性および非圧縮性は、いくつかの実施形態による、距離ｒにおけるシス側の溶媒流動は、およそ以下となることを要求する。
【００７９】
【数１０】
2016512605.tif 000025
本仮定は、数値計算によって（近似的に）確認され得る。水流動は、
【００８０】
【化１４】
2016512605.tif 000026
であって、電気浸透臨界半径
【００８１】
【化１５】
2016512605.tif 000027
をもたらす場合、捕捉における拡散を支配し得る。最後に、電気浸透捕捉は、いくつかの実施形態では、
【００８２】
【化１６】
2016512605.tif 000028
である場合、すなわち、細孔内のＤＮＡの電気泳動移動度が電気泳動のものを上回る
【００８３】
【化１７】
2016512605.tif 000029
である場合、電気泳動のものを支配し得る。細孔を通して転位するＤＮＡの速度は、
【００８４】
【化１８】
2016512605.tif 000030
となり得、移動度は、図９に示されるように、種々のドメイン内の電場の方向および溶媒電気浸透流動の方向を定義する記号を含有する。
【００８５】
最後に、電気泳動および電気浸透の場合の捕捉率、すなわち、細孔オリフィスを通る粒子流束は、いくつかの実施形態では、それぞれ、以下となり、
【００８６】
【数１１】
2016512605.tif 000031
これは、半径の標的
【００８７】
【化１９】
2016512605.tif 000032
における拡散流束に関するスモルコフスキーの式に対応する。再び、Ｎ１と仮定すると、以下となり、
【００８８】
【数１２】
2016512605.tif 000033
いくつかの実施形態では、以下をもたらす。
【００８９】
【数１３】
2016512605.tif 000034
式中、移動度は、１０−８ＳＩ単位と仮定された。本条件は、拡散仮定からのものと同一の大きさであるが、捕捉は、中性分子のために作用し得る。１００ｓまでの時間の延長は、本限界をｆＭ濃度に近接して低減させる。再び、電気浸透捕捉機構が、いくつかの実施形態では、電気泳動ではなく、流体流動を用いるため、中性分子が捕捉され得ることに留意されたい。
【００９０】
開示される実施形態の種々の実装、特に、論じられるプロセスの少なくともいくつかは、デジタル電子回路、集積回路、特殊設計ＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路）、コンピュータハードウェア、ファームウェア、ソフトウェア、および／またはそれらの組み合わせにおいて実現されてもよい。これらの種々の実装は、記憶システムからデータおよび命令を受信し、そこにデータおよび命令を伝送するように連結された、特殊または汎用であり得る、少なくとも１つのプログラマブルプロセッサと、少なくとも１つの入力デバイスと、少なくとも１つの出力デバイスとを含む、プログラマブルシステム上で実行可能および／または解釈可能である、１つまたはそれを上回るコンピュータプログラム内の実装を含んでもよい。
【００９１】
そのようなコンピュータプログラム（また、プログラム、ソフトウェア、ソフトウェアアプリケーション、またはコードとしても知られる）は、例えば、プログラマブルプロセッサのための機械命令を含み、高レベル手続きおよび／またはオブジェクト指向プログラミング言語および／またはアセンブリ／機械言語において実装されてもよい。本明細書で使用されるように、用語「機械可読媒体」は、機械命令を機械可読信号として受信する機械可読媒体を含む、機械命令および／またはデータをプログラマブルプロセッサに提供するために使用される、任意のコンピュータプログラム製品、装置、および／またはデバイス（例えば、磁気ディスク、光ディスク、メモリ、プログラマブル論理デバイス（ＰＬＤ））を指す。用語「機械可読信号」は、機械命令および／またはデータをプログラマブルプロセッサに提供するために使用される、任意の信号を指す。
【００９２】
ユーザとの相互作用を提供するために、本明細書に説明される主題は、情報をユーザに表示するためのディスプレイデバイス（例えば、ＣＲＴ（ブラウン管）またはＬＣＤ（液晶ディスプレイ）モニタおよび同等物）と、それによってユーザが入力をコンピュータに提供し得る、キーボードおよび／またはポインティングデバイス（例えば、マウスまたはトラックボール）とを有する、コンピュータ上に実装されてもよい。例えば、本プログラムは、分注ユニット、遠隔制御、ＰＣ、ラップトップ、スマートフォン、メディアプレーヤ、または携帯端末（「ＰＤＡ」）によって記憶、実行、および動作されることができる。ユーザとの相互作用を提供する、他の種類のデバイスも、使用されてもよい。例えば、ユーザに提供されるフィードバックは、感覚フィードバック（例えば、視覚的フィードバック、聴覚的フィードバック、または触知的フィードバック）の任意の形態であってもよく、ユーザからの入力は、音響、音声、または触知入力を含む、任意の形態で受信されてもよい。
【００９３】
本明細書に説明される主題のある実施形態は、バックエンド構成要素（例えば、データサーバとして）を含む、またはミドルウェア構成要素（例えば、アプリケーションサーバ）を含む、またはフロントエンド構成要素（例えば、それを通してユーザが本明細書に説明される主題の実装と相互作用し得る、グラフィカルユーザインターフェースまたはウェブブラウザを有する、クライアントコンピュータ）を含む、またはそのようなバックエンド、ミドルウェア、またはフロントエンド構成要素の任意の組み合わせである、コンピューティングシステムおよび／またはデバイス内に実装されてもよい。システムの構成要素は、デジタルデータ通信（例えば、通信ネットワーク）の任意の形態または媒体によって相互接続されてもよい。通信ネットワークの実施例として、ローカルエリアネットワーク（「ＬＡＮ」）、広域ネットワーク（「ＷＡＮ」）、およびインターネットが挙げられる。
【００９４】
前述のいくつかのそのような実施形態による、コンピューティングシステムは、クライアントおよびサーバを含んでもよい。クライアントおよびサーバは、概して、相互から遠隔にあって、典型的には、通信ネットワークを通して相互作用する。クライアントおよびサーバの関係は、個別のコンピュータ上で起動し、クライアント−サーバ関係を相互に対して有する、コンピュータプログラムによって生じる。
【００９５】
本願のいずれかに提示される、限定ではないが、特許、特許出願、記事、ウェブページ、書籍等を含む、刊行物または他の文書のあらゆる参考文献は、参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる。
【００９６】
デバイス、システム、および方法の例示的実施形態が、本明細書に説明された。いずれかに記載のように、これらの実施形態は、例証目的のためだけに説明されており、限定ではない。他の実施形態も、可能性として考えられ、本開示によって網羅され、これは、本明細書に含有される教示から明白であろう。したがって、本開示の範疇および範囲は、前述の実施形態のいずれかによって限定されるべきではなく、本開示によって支持される請求項およびその均等物に従ってのみ定義されるべきである。さらに、本開示の実施形態は、転位制御に対応するあらゆる要素を含む、任意の他の開示される方法、システム、およびデバイスからのあらゆる要素をさらに含み得る、方法、システム、およびデバイスを含んでもよい。言い換えると、１つまたは別の開示される実施形態からの要素は、他の開示される実施形態からの要素と相互に交換可能であってもよい。加えて、開示される実施形態の１つまたはそれを上回る特徴／要素は、除去されてもよく、依然として、特許可能主題をもたらす（したがって、本開示のさらなる実施形態をもたらす）。対応して、本開示のいくつかの実施形態は、１つまたはそれを上回る要素／特徴を具体的に欠いていることによって、１つおよび／または別の参考文献と特許可能に別個であり得る。言い換えると、ある実施形態に対する請求は、１つまたはそれを上回る要素／特徴を具体的に除外するための否定的限定を含有し、そのような特徴／要素を含む先行技術と特許可能に別個である実施形態をもたらし得る。
【００９７】
参考文献
【００９８】
【化２０−１】
2016512605.tif 000035
【００９９】
【化２０−２】
2016512605.tif 000036
【図１】
2016512605.tif 000037
【図２】
2016512605.tif 000038
【図３Ａ】
2016512605.tif 000039
【図３Ｂ】
2016512605.tif 000040
【図４】
2016512605.tif 000041
【図５】
2016512605.tif 000042
【図６】
2016512605.tif 000043
【図７Ａ】
2016512605.tif 000044
【図７Ｂ】
2016512605.tif 000045
【図７Ｃ】
2016512605.tif 000046
【図８】
2016512605.tif 000047
【図９Ａ】
2016512605.tif 000048
【図９Ｂ】
2016512605.tif 000049
【図１０】
2016512605.tif 000050
【図１１】
2016512605.tif 000051
【図１２】
2016512605.tif 000052
【図１３】
2016512605.tif 000053
【国際調査報告】
2016512605.tif 000054
2016512605.tif 000055
2016512605.tif 000056