(57)【要約】  サンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）（サンショウ（（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｐｅｐｐｅｒ）としても一般に知られている）の、成熟種子を含む種子は、顔面潮紅／紅潮などの更年期障害の改善の使用に有効な量のＮＭＳを提供するように、十分な濃度で存在するＮＭＳ前駆体のＮ−メチルセロトニン５−Ｏ−β−グルコシド（「ＮＭＳ−グルコシド」）を含み、かつ十分な効率で代謝される。サンショウの種子またはサンショウの種子の抽出物はまた、顔面潮紅を制御する機能性食品または栄養補助食品を提供するために、他のＮＭＳまたはＮＭＳ前駆体の他の供給源の強化用として使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
閉経に関連する顔面潮紅を予防または改善するのに有効な量の、ｎ−メチルセロトニングルコシド（「ＮＭＳ−グルコシド」）、またはＮＭＳ前駆体の使用。
【請求項２】
前記ＮＭＳ−グルコシドまたはＮＭＳ前駆体は植物源に含まれている請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記植物源は、サンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）の種子、またはサンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）の種子の抽出物である請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記サンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）種子は、成熟種子である請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記ＮＭＳ−グルコシドは、栄養補助食品または機能性食品に含まれている請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
ｎ−メチルセロトニングルコシド（「ＮＭＳ」）もまた使用される請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
更年期の顔面潮紅の頻度を低減、または更年期の顔面潮紅の重症度を低減する方法であって、有効量のＮＭＳ−グルコシドもしくはＮＭＳ前駆体、またはこれらの混合物を、それを必要としている女性に投与することを含む方法。
【請求項８】
前記ＮＭＳ−グルコシドは、植物源由来のものである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＮＭＳ−グルコシドは、サンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）の種子、またはサンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）の種子の抽出物に含まれている請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）の種子は、成熟種子である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＮＭＳ−グルコシドは、栄養補助食品または機能性食品に含まれている請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
ＮＭＳもまた投与される請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
閉経に関連する顔面潮紅の発症を軽減するよう、ＮＭＳ−グルコシドまたはＮＭＳの有効量を含むように標準化された、ＮＭＳ−グルコシドまたはＮＭＳを天然に含む植物抽出物。
【請求項１４】
ＮＭＳ−グルコシドを含む栄養補助食品または機能性食品。
【請求項１５】
ＮＭＳをさらに含む請求項１４に記載の栄養補助食品。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の簡単な説明］
本発明は、閉経に関連する顔面潮紅（顔面紅潮ともいう）の治療、予防または改善における、Ｎ−メチルセロトニングルコシド（「ＮＭＳ−グルコシド」）および／もしくはＮ−メチルセロトニン（ＮＭＳ）、または他のＮＭＳ前駆体の使用に関する。ＮＭＳ−グルコシドは、サンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）の種子または種子抽出物などの植物源から得ることができる。本発明はまた、Ｎ−メチルセロトニン（「ＮＭＳ］）、ＮＭＳ−グルコシド、サンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）の種子、ＮＭＳ−グルコシドを含有するサンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）の種子抽出物、他のＮＭＳ前駆体またはこれらの混合物の少なくとも１つで強化された、ブラック・コホッシュなどの各種植物抽出物の使用に関する。
【０００２】
［発明の背景］
ブラック・コホッシュ（アクタエア・ラケモサ（Ａｃｔａｅａ  ｒａｃｅｍｏｓａ）およびシミシフガ・ラケモサ（Ｃｉｍｉｃｉｆｕｇａ  ｒａｍｃｅｍｏｓａ）の両方の名でも知られている）の抽出物は、完全には解明されていない多くの栄養素を含有している。それにもかかわらず、ヒトは、ブラック・コホッシュが閉経関連の顔面潮紅を軽減し、気分を改善するという逸話のようであり、かつ限られた臨床的証拠を根拠に、何世紀もの間それを使用してきた。ブラック・コホッシュの栄養素の一つであるＮ−メチルセロトニン（ＮＭＳ）は、この成分に関して存在するデータが、ある種のブラック・コホッシュ抽出物が顔面潮紅の改善に有用であり得るという主張に一定の支持を与えている点で興味深い。例えば、Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ  ２００８  Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５６：１１７１８を参照されたい。
【０００３】
セロトニン（５−ＨＴ）受容体は、体温調節と関係しており（特に、５−ＨＴ７イソ型；図１Ａ）、ヒトの臨床試験で、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）が顔面潮紅症状の治療に有効なことが示されている）。これらの発見は、セロトニンシグナル伝達が体温調節において一定の重要性を有することを示すものである。興味深いことに、ＮＭＳは他の５−ＨＴ受容体よりも優先的に５−ＨＴ７受容体に結合し、セロトニン自体のそれと同等の親和性（ＥＣ５０＝２２ｎＭ；図１Ｂ；）で５−ＨＴ７受容体を活性化させる。しかしながら、ブラック・コホッシュの１回分の用量に含まれそうなＮＭＳの濃度（ブラック・コホッシュ抽出物８０ｍｇに約３０ｐｐｍ）では、僅かに２．４μｇのＮＭＳを与えることができるに過ぎない。この用量は、概略、６０ｋｇの女性で０．１８ｎＭの最大濃度に対応すると解釈される。このＮＭＳ濃度は、５−ＨＴ７と結合するには十分な高さであるが、５−ＨＴ７（図１Ｂ）または５−ＨＴトランスポータ（ＳＥＲＴ；図１Ｃ）のいずれでも単独で機能的効果を発現するには不十分であり得る。ブラック・コホッシュの抽出効率は、製造ロット間で変動し得るため、この用量問題は、臨床研究においてブラック・コホッシュで観察された混合結果について一定の説明を与えることになり得る。さらに、ブラック・コホッシュ抽出物は、ＮＭＳではなく、アクテイン含有量について標準化されている。
【０００４】
更年期障害を軽減するのに必要なＮＭＳの用量は、ブラック・コホッシュにより与えられ得る量より多いであろう。したがって、この技術分野において、顔面潮紅などの更年期障害の改善に使用することができる天然のＮＭＳ源が求められている。
【０００５】
［本発明の詳細な説明］
本発明によれば、サンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）（サンショウ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｐｅｐｐｅｒ）としても一般に知られている）の、成熟種子を含む種子が、顔面潮紅／紅潮などの更年期障害の改善の使用に有効な量のＮＭＳを提供するように、十分な濃度で存在するＮＭＳ前駆体のＮ−メチルセロトニン５−Ｏ−β−グルコシド（「ＮＭＳ−グルコシド」）を含み、かつ十分な効率で代謝されることがわかった。したがって、本発明の一態様は、ＮＭＳ−グルコシドを含むサンショウの種子またはサンショウの種子抽出物の、更年期障害の制御に使用するための栄養補助食品または機能性食品中における使用である。
【０００６】
したがって；
ａ）ＮＭＳもしくはＮＭＳ−グルコシド、またはこれらの混合物を含有するサンショウの種子またはサンショウの種子の抽出物、あるいは
ｂ）ＮＭＳ−グルコシド
ｃ）ＮＭＳもしくはＮＭＳ−グルコシド、またはこれらの混合物を含有する他の植物源
ｄ）ＮＭＳに代謝され得る、起源を問わない他のＮＭＳ前駆体
は、顔面潮紅などの更年期障害を軽減するのに有効な量で、単独または混合物で使用することができ、あるいは、顔面潮紅の改善に有効な量とするためにＮＭＳと併用して使用することができる。
【０００７】
本発明で使用し得るＮＭＳは、抽出物などの植物調製物の一部であってもよい。ブラック・コホッシュが可能性のある植物源であるが、ＮＭＳ前駆体の濃度がより高いことが知られているサンショウが好ましい植物源である。あるいは、原料を問わない合成ＮＭＳを使用してもよい。
【０００８】
したがって、本発明はまた、
ａ）最小有効用量のＮＭＳ、ＮＭＳ前駆体またはこれらの混合物を含有する、種を問わない植物抽出物；
ｂ）ＮＭＳが植物抽出物由来であるか否かにかかわりなく、最小有効用量のＮＭＳまたはＮＭＳ前駆体を含む組成物の使用；
ｃ）有効用量に満たない量のＮＭＳまたはＮＭＳ前駆体を天然に含有する植物抽出物であって、ＮＭＳまたは前駆体の総量を有効な量にするために、追加のＮＭＳまたは前駆体が加えられた植物抽出物の使用；
ｄ）上記の組み合わせ；
ｅ）閉経期、周閉経期および／または閉経後の障害の制御に有用な他の成分と組み合わせた、上記ａ〜ｄのいずれかの使用を提供する。
【０００９】
本発明はまた、閉経期、周閉経期および／または閉経後の障害の重症度または発症を予防、治療、改善および／または低減する方法であって、
ＮＭＳ−グルコシド、ＮＭＳ、サンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）の種子、サンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）の種子抽出物（ＮＭＳ−グルコシド、ＮＭＳシュウ酸塩、ＮＭＳ塩酸塩、ＮＭＳニ塩酸塩を含む）、およびこれらの混合物からなる群から選択される成分の有効量を、
前記障害を発現している女性、または閉経期、周閉経期もしくは閉経後の女性に投与することを含む方法を提供する。
【００１０】
本発明はまた、ＮＭＳ、ＮＭＳ前駆体またはこれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１種の活性成分の有効量を全体として含む、植物抽出物の混合物、好ましくはブラック・コホッシュおよびサンショウの抽出混合物に関する。
【００１１】
本発明の他の態様は、更年期障害に対して唯一有効な活性成分が、ＮＭＳ、ＮＭＳ前駆体またはこれらの混合物である、栄養補助食品または機能性食品である。
【００１２】
ブラック・コホッシュと比較して５０倍より多くＮＭＳを含有する（ＮＭＳ−グルコシドなどの前駆体の形態で）サンショウ、すなわちサンショウ（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）もまた、本発明の一部として使用し得る。したがって、サンショウ属（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ）が、利用可能なＮＭＳの代替源になり得るであろう。
【００１３】
本発明の他の態様は、顔面潮紅を対象とする唯一の成分としての、ＮＭＳ、ＮＭＳ−グルコシドまたは他のＮＭＳ前駆体の（単独で、または混合物での）、栄養補助または医薬組成物中における使用である。
【００１４】
サンショウ属（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ）抽出物と、クズおよびダイズ抽出物、またはゲニステインとの併用も考えられる。
【００１５】
［定義］
本明細書では以下の定義が適用される。
【００１６】
「ＮＭＳ前駆体」は、摂取後、ＮＭＳに変換される化合物である。この定義に含まれる具体的な化合物は、ＮＭＳシュウ酸塩、ＮＭＳ塩酸塩、ＮＭＳニ塩酸塩およびＮＭＳグルコシドである。「他のＮＭＳ前駆体」とは、ＮＭＳ−グルコシド以外のＮＭＳ前駆体をいう。
【００１７】
「予防」とは、可能性がある全ての顔面潮紅が決して起こらないことの保証を意味するものではない。それは、むしろ、顔面潮紅が発現する危険性が低下すること、発症率が低下すること、重症度が軽減されること、および／または、一般にそれに伴う不快感が改善されることを示すために使用される。それは、また、顔面潮紅が発現する間隔が伸びることを示すために使用され得る。
【００１８】
「周閉経期」、すなわち閉経期（少なくとも１２ヶ月の月経期の停止）の前の期間であり、月経周期が維持されているにもかかわらず生じる、エストロゲン濃度の不規則な上昇／低下、無排卵の月経周期、顔面潮紅、睡眠障害、気分変調、骨量の減少または膣の乾燥などの更年期障害の発現のうちの１つ以上により特徴づけられる期間。これは一般に４０歳代の女性に生じる。
【００１９】
「閉経期」は女性に月経期が無くなった時である。卵巣は排卵およびそれらのエストロゲンの大部分の産生を停止している。それは、女性が１２ヶ月間連続して月経期が無かったときに診断される。
【００２０】
「閉経後」―閉経期後の期間。丸一年月経期がない女性は閉経後であるとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】Ｎ−メチルセロトニン（ＮＭＳ）は５−ＨＴ７受容体によって顔面潮紅を軽減でき、またセロトニンの取り込みを阻害することにより気分を改善することができた。Ａ）５−ＨＴ７受容体は野生型（ＷＴ）動物において活性化された場合には体温を低下させたが、５−ＨＴ７アゴニストは、５−ＨＴ７ノックアウト（ＫＯ）動物では体温を低下させなかった（Ｈｅｄｌｕｎｄら，２００４）。Ｂ）ＮＭＳによる５−ＨＴ７受容体の最大活性化は５０〜１００ｎＭで生じ、ＥＣ５０は約２２ｎＭであった。Ｃ）セロトニン再取り込みトランスポーターのＮＭＳによる最大阻害は、１〜１０Ｍで生じ、ＩＣ５０は約５００ｎＭ（プロザック（Ｐｒｏｚａｃ）の１００分の１の親和性；Ｐｏｗｅｌｌら，２００８）であった。
【図２】閉経期の動物モデルの顔面潮紅および気分関連行動に対する、食餌由来のＮＭＳの効果を評価するための研究計画。動物に、外科的に閉経を引き起こし（卵巣摘出；ＯＶＸ）、異なる量のＮＭＳを含有する食餌を与えた。その後、動物の、オープン・フィールドでの自発運動、高架式十字迷路による不安様行動、および水泳試験による抑うつ様行動を試験した。その後、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）の静脈注射（ｉ．ｖ．）により顔面潮紅を引き起こし、皮膚温度を監視した。ＣＧＲＰ投与の２時間後、組織を採取した。略語：Ｓ．Ｃ．、皮下の；ｓｔ．、直線的体重換算；ＢＳＡ、体表面積換算；ＢＣ５４０、ブラック・コホッシュ市販用量；ｃＡＭＰ、環状アデノシン一リン酸；Ｖｍａｘ、酵素反応の最大速度；ＳＥＲＴ、セロトニントランスポーター；ＩＣ５０、５０％阻害濃度；Ｉｍａｘ、最大阻害濃度。
【図３】実験的に引き起こされた顔面潮紅期間中の皮膚温度についての、代表的な、生データとベースライン補正データを示す。食餌治療を受けなかった動物（０μｇ／ｋｇ／日のＮＭＳ）は、最も高いベース温度を有し、かつ計算されたベースラインに対して最も高いＣＧＲＰ応答を示した。食餌療法期間を通して０．４８または１８．５μｇ／ｋｇ／日のＮＭＳを受けた動物は、未処理の対照と比べてより低いベース温度およびより低いＣＧＲＰ応答を示した。エストラジオールの皮下投与を受け、食餌によるＮＭＳを与えられなかった動物（陽性対照）は、最も低いベース温度、および最も低いＣＧＲＰ応答を示した。
【図４】食餌由来のＮＭＳは、ベースライン皮膚温度を低下させ、ＣＧＲＰ誘起顔面潮紅応答を低減した。１８．５μｇ／ｋｇ／日のＮＭＳを受けた群は、未処理の対照と比べてベースの皮膚温度が低かった。ベースライン補正データを、反復測定分散分析で分析すると、また曲線から下の面積を一元配置分散分析で分析すると、ＮＭＳの顔面潮紅応答に対する類似の効果が認められた。日内対照のない治療群は分析から除外した。統計パラメータはグラフに示されている。エラーバーは平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。共通の文字を共有しない治療は、テューキーのポストホックテストで有意差があった（ｐ＜０．０５）。
【図５】Ｎ−メチルセロトニン（ＮＭＳ）は、卵巣を摘出したメスのラットの循環（血漿）エストラジオール値を上昇させたが、これはＮＭＳが１７β−エストラジオールの非卵巣合成および／または分泌を調節したことを示唆している。Ａ）ＮＭＳの食餌による補充が、用量に依存して血漿エストラジオールを増加させた。エストラジオールを補充された動物は、最大濃度の血漿エストラジオールを有した。Ｂ）日内対照のデータ。各グラフ内には、エストラジオールを補充された群（上側）および補充されなかった群（下側）の分散分析パラメータが挿入されている。共通の文字を有さない治療は、テューキーのポストホックテストで有意差があった（ｐ＜０．０５）。エラーバーはＳＥＭを表す。
【図６】卵巣を摘出したメスのラットでは、食餌由来のＮＭＳは体重を変化させず、子宮肥大はなかった。Ａ）平均体重はＮＭＳ補充群と対照食餌群の間で違いはなく、エストラジオール投与動物は、実験期間を通して、他の全ての群と比較して体重が顕著に低かった。ＢおよびＣ）初期重量に対する百分率で表した重量変化は、研究期間を通して、または研究終了時点で、エストラジオール投与動物を除いて、食餌治療群の間に違いはなかった。Ｄ）８０日間の補充後も、ＮＭＳは子宮重量を変化させず、エストラジオール投与動物は、卵巣を摘出された対照、および全ＮＭＳ補充群と比べて、子宮重量が顕著に増加した。反復測定分散分析または一元配置分散分析によりグループ間の有意差（ｐ＜０．０５）を求め、その後、必要に応じてテューキーのポストホックテストを行った（＊＊＊、ｐ＜０．００１）。有意な主効果が認められた場合、各グラフ内に分散分析のパラメータが挿入されている。エラーバーはＳＥＭを表す。
【図７】食餌由来のＮＭＳは、卵巣摘出したメスのラットの、気分の行動指標を変化させなかった。Ａ）強制水泳試験（ＦＳＴ、全試験時間６００秒）の第２セッションの間、エストラジオール投与動物の無動時間は比較的少なかった（抗抑うつ様行動）。Ｂ）ＦＳＴの第２セッションの間、壁よじ登り行動に費やした時間は、グループ間で有意差はなかった。Ｃ）オープン・フィールド（不安様行動および歩行試験）で、３０分間の試験中に試験場を動いた総距離は、グループ間で差がなかった。Ｄ）高架式十字迷路における全体的探索行動（不安様行動の試験）は、全ての群で低調であり、開放走行路で費やした時間（不安様行動）にグループ間で差がなかった。グループ間の有意差（ｐ＜０．０５）を一元配置分散分析により、またその後のテューキーのポストホックテスト（＊、ｐ＜０．０５）により求めた。有意な主効果が認められた場合、各グラフ内に分散分析のパラメータが挿入されている。エラーバーはＳＥＭを表す。
【図８】閉経期の動物モデルにおける顔面潮紅および気分関連行動に対する、食餌由来の、粉砕したサンショウ属（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ）の種子からのＮＭＳ−グルコシドの効果を評価するための追跡研究計画。第１の研究（図２）と同様に、動物に外科的に閉経を引き起こした（卵巣摘出；ＯＶＸ）。この第２の研究では、何匹かの動物に、２用量のＮＭＳを繰り返す食事を与え、他の動物には、粉砕したサンショウ属（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ）の種子を給餌して、等価用量のＮＭＳ−グルコシドを与えた。その後、動物の、オープン・フィールドでの自発運動、高架式十字迷路による不安様行動、および水泳試験による抑うつ様行動を試験した。その後、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）の静脈注射（ｉ．ｖ．）により顔面潮紅を引き起こし、皮膚温度を監視した。ＣＧＲＰ投与の２時間後、組織を採取した。
【図９】食餌由来の、粉砕したサンショウ属（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ）の種子からのＮＭＳ−グルコシドは、エストラジオールおよびＮＭＳと同様の方法で、ＣＧＲＰ誘起顔面潮紅応答を低減した。Ａ）サンショウ属（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ）の種子を与えられた動物が顔面潮紅応答を低下させ、そしてこの顔面潮紅応答は、未処理の対照とは有意差があったが、エストラジオールまたは化学的に合成されたＮＭＳシュウ酸塩を等価用量与えられた動物のそれとは等価であることが、反復測定分散分析により認められた。Ｂ）曲線の下の面積を一元配置分散分析により分析すると、顔面潮紅応答に対する類似の効果が認められた。統計パラメータはグラフに示されている。エラーバーは平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。共通の文字を共有しない治療は、テューキーのポストホックテストで有意差があった（ｐ＜０．０５）。
【図１０】第１の研究と同様に、追跡調査によって、サンショウ属（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ）の種子およびＮＭＳが気分の行動指標を変化させないことが実証されたことを示す。Ａ）オープン・フィールド（不安様行動および歩行運動の試験）、Ｂ）高架式十字迷路（不安様行動の試験）またはＣ）強制水泳試験（抑うつ様行動のため）において、治療の有意な効果は認められなかった。エラーバーはＳＥＭを表す。
【図１１】卵巣を摘出したメスのラットでは、食餌由来のサンショウ属（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ）の種子からのＮＭＳ−グルコシドに子宮肥大作用は認められなかったが、体重を変化させ得た。Ａ）第１の研究と同様に、サンショウ属（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ）の種子およびＮＭＳは子宮重量を変化させなかったが、エストラジオールを与えられた動物は、卵巣摘出対照および他の全ての群と比べて、予想通り顕著に高い子宮重量であった。Ｂ）初期重量に対する割合で表した重量変化は、時間とともに、対照とサンショウ補充群との間、または対照とＮＭＳ補充群の間で異なった。エストラジオール投与動物は、他の全ての群と比べ、実験期間を通して、体重が顕著に低かった。Ｃ）しかしながら、第１の研究と同様に、初期体重に対する割合で表した最終的な体重変化は、試験の終了時点では、エストラジオール投与動物を除いて、食餌治療群の間で差はなかった。反復測定分散分析、または必要に応じて一元配置分散分析により、グループ間の有意差（ｐ＜０．０５）を求めた。共通の文字を共有しない治療は、テューキーのポストホックテストで有意差があった（ｐ＜０．０５）。簡潔にするために、（Ｂ）および（Ｃ）では分散分析のパラメータを除いた。エラーバーはＳＥＭを表す。
【００２２】
本明細書で報告している研究は、食餌由来のＮＭＳおよびＮＭＳ−グルコシドの、閉経期の動物モデルにおける顔面潮紅応答および気分関連行動に対する効果に焦点を当てている。図２および図８の研究計画が示すように、動物に外科的に閉経を引き起こし、異なる量のＮＭＳまたはＮＭＳ−グルコシドを含有する食餌を与えた。本発明者らは、補充食を与えた動物の、オープン・フィールドにおける自発運動、高架式十字迷路における不安様行動、および水泳試験における抑うつ様行動を試験した。その後、本発明者らは顔面潮紅応答を実験的に引き起こし、動物の皮膚温度の変化を監視した。本研究の全体的な目的は、閉経期の女性、または周閉経期もしくは閉経後段階にある女性であって、更年期障害に罹患している女性、またはそのような障害に罹患する危険性を低減したいと望んでいる女性に使用するための、栄養補助食品としてのＮＭＳまたはＮＭＳ−グルコシドを支持するデータを提供することであった。
【００２３】
［ＮＭＳ、ＮＭＳ−グルコシドまたは他のＮＭＳ前駆体の植物源］
ＮＭＳ、ＮＭＳ−グルコシドおよび／または他のＮＭＳ前駆体の供給源として使用し得る植物としては：サンショウ（Ｚ．ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）、トウサンショウ（Ｚ．ｓｉｍｕｌａｎｓ）、カホクサンショウ（Ｚ．ｂｕｎｇｅａｎｕｍ）、イヌサンショウ（Ｚ．ｓｃｈｉｎｉｆｏｌｉｕｍ）、テリハサンショウ（Ｚ．ｎｉｔｉｄｕｍ）、ザントキシルム・レトサ（Ｚ．ｒｈｅｔｓａ）、フユサンショウ（Ｚ．ａｌａｔｕｍ）、ヒマラヤサンショウ（Ｚ．ａｃａｎｔｈｏｐｏｄｉｕｍ）および／またはアメリカサンショウ（Ｚ．ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）などのサンショウ属（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ）の種が挙げられる。好ましい植物源はサンショウ（Ｚ．ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）である。
【００２４】
さらに、柑橘類植物もまたＮＭＳ前駆体を含有していることが知られていることから、シトラス・ベルガミア（Ｃｉｔｒｕｓ  ｂｅｒｇａｍｉａ）（ベルガモット）、レモン、オレンジ、ミカン、キノット、シトロンも使用し得る。柑橘類植物中のそれらの化合物は、葉、果皮、内果皮および種子に見出し得る。
【００２５】
コレマ・クリスタツム（Ｃ．ｃｒｉｓｔａｔｕｍ）、ガリンイワノリ（Ｃ．ｃａｌｌｏｐｉｓｍｕｍ）、コレマ・フラッキドゥム（Ｃ．ｆｌａｃｃｉｄｕｍ）およびコレマ・フスコビレンス（Ｃ．ｆｕｓｃｏｖｉｒｅｎｓ）などのイワノリ属（Ｃｏｌｌｅｍａ）の地衣類もまた使用し得る。
【００２６】
種子は、単に圧潰、ミリングまたは粉化によって使用のために調製し得る。抽出物は、当該技術分野でよく知られている方法、例えば（ａｎ）メタノール、エタノール、エチルアセテート、ジエチルエーテル、ｎ−ヘキサン、メチレンクロリドのような溶媒による抽出、または二酸化炭素（純粋なもの、またはアルコールなどの他の溶媒との混合物）もしくは一酸化二窒素のような超臨界流体を用いた抽出、（ｂ）エッセンシャルオイルを得るための水蒸気蒸留、または（ｃ）窒素のような高温ガスによる抽出／蒸留により調製し得る。
【００２７】
本発明では食物を伴わないＮＭＳ−グルコシドの使用を考えているため、本発明による種子の摂取は、多くのアジア料理またはアジア風料理で使用されているように、香辛料または香味料として単に種子を摂取することとは区別されるべきである。したがって、具体的には、本発明は、スパイスの効いた食事またはスナックなどの食物に混合された、ＮＭＳ−グルコシドまたはＮＭＳ−グルコシド前駆体の摂取を除外する。
【００２８】
［用量］
大人の１日の投与量中に含まれることが必要なＮＭＳの「有効用量」は、少なくとも５マイクログラム〜２２５ミリグラム、好ましくは５０マイクログラム〜１００ミリグラム、より好ましくは１００マイクログラム〜７５ミリグラムである。あるいは、有効用量は１日当たり少なくとも、５、１０、２５、５０、１００、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００または４５００マイクログラムである。あるいは、その量は１日当たり少なくとも５００ミリグラムであり、それより多いことが好ましい。
【００２９】
サンショウの種子では、「有効用量」は１日当たり５０〜２００００ｍｇの種子、好ましくは１日当たり約８０〜２５００ｍｇ以上の種子である。
【００３０】
ＮＭＳ−グルコシドでは、大人の１日の投与量中に含まれるべき「有効用量」は、少なくとも５マイクログラム〜２２５ミリグラム、好ましくは５０マイクログラム〜１００ミリグラム、より好ましくは１００マイクログラム〜７５ミリグラムである。あるいは、有効用量は１日当たり少なくとも、５、１０、２５、５０、１００、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００または５５００マイクログラムである。あるいは、その量は１日当たり少なくとも６００マイクログラムであり、それより多いことが好ましい。
【００３１】
他のＮＭＳ前駆体では、その有効量は、ＮＭＳの有効量（上記を参照）を得るのに必要な前駆体の量として計算されるであろう。
【００３２】
ＮＭＳおよびＮＭＳ−グルコシドの含有量は、質量分析検出器を備えた液体クロマトグラフィーを用いて確認することができる。抽出方法は、Ｙａｎａｓｅら（２０１０）と同様の方法で行うことができる。
【００３３】
上述した有効成分の１日の用量は、単回投与の用量として服用しても、あるいは１日を通してより少ない用量を複数回にわけて、例えば、１日に２回、１日に３回、または別の都合の良い投与計画で服用してもよい。規則正しい服用、すなわち、少なくとも１週間、好ましくは少なくとも１ヶ月間、より好ましくは「長期」とみなし得る期間、すなわち１ヶ月を超える持続期間の規則正しい服用が推奨される。
【００３４】
［製剤］
本発明の栄養補助食品および機能性食品組成物は、ヒトへの投与に適した任意のガレノス製剤形態、特に従来の経口投与用の任意の形態、例えば、錠剤、丸薬、顆粒剤、糖衣錠、カプセルおよび発泡性製剤（例えば、粉末および錠剤など）などの固体形態、または、例えば飲料、ペーストおよび油性懸濁液としての、溶液、乳液または懸濁液などの液体形態であってよい。ペーストは、例えば、（魚、豚、家禽、牛の）ゼラチン、植物性タンパク質またはリグニンスルホン酸塩のマトリックスであることを特徴とするハードまたはソフトシェルカプセルでカプセル化してもよい。他の適用形態の例としては、経皮、非経口または注射投与用の形態がある。栄養補助食品および機能性食品組成物は、放出制御（遅延）製剤の形態であってもよい。
【００３５】
本発明の栄養補助および機能性食品組成物は、さらに保護親水コロイド（ガム、タンパク質、加工デンプンなど）、バインダー、膜形成剤、カプセル化剤／材料、壁／シェル材料、マトリックス化合物、コーティング、乳化剤、界面活性剤、可溶化剤（オイル、脂肪、ワックス、レシチンなど）、吸着剤、担体、フィラー、共化合物、分散剤、湿潤剤、加工助剤（溶剤）、流動化剤、矯味剤、増量剤、ゼリー化剤、ゲル形成剤、抗酸化剤および抗菌剤を含有し得る。
【００３６】
本発明をより良く説明するために以下の実施例を示すが、本発明はこれらに限定されない。
【００３７】
［実施例］
［方法］
動物は、約６０日齢で到着し、研究期間（約１６０日齢まで）を通して特定の規定食が与えられた。規定食は、Ｄｙｅｔｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）により調合され、供給されたが、これは修正ＡＩＮ−９３Ｇ規定食をベースとしたものである。これらの規定食を自由に食べさせた。到着後２週目、約８０日齢で、動物は卵巣を摘出され、３週間の回復期間を与えられ、その後、所定の規定食が与えられた。第１の研究では、これらの規定食は、０、０．０８、０．４８、３．２、１８．５、１８５または３７００μｇ／ｋｇ／日のＮＭＳ二塩酸塩を含有した（図２）。第２の追跡研究では、規定食は、ＮＭＳを含まないもの（対照）、ＮＭＳシュウ酸塩（１８．５または５５．５μｇ／ｋｇ／日）を含むもの、または、等価用量（１８．５または５５．５μｇ／ｋｇ／日；図８）のＮＭＳ−グルコシドを供給できる量のサンショウ属（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ）種子粉砕物を含むものであった。質量分析検出器を備えた液体クロマトグラフィーを用いてＮＭＳおよびＮＭＳ−グルコシドの含有量を確認した。抽出方法は、Ｙａｎａｓｅら（２０１０）と同様の方法とした。
【００３８】
最初の行動評価（オープン・フィールド）の２週前から全ての規定食を与えた。陽性対照動物には、結晶性１７β−エストラジオールおよびコレステロールの混合物を詰めた５．０ｍｍの皮下用シラスティック・カプセル・インプラント（２５％、内径０．０５８インチ、外径０．０７７インチ；Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ＃５０８−００６）を投与した。その後、動物の自発運動（オープン・フィールド）を調べ、また２種の行動分析（高架式十字迷路および水泳試験）により、それぞれの分析の間に２週を置いて気分を評価した。最後の行動試験（水泳試験）を終えた２週後、動物に麻酔をかけ、実験的に引き起こした顔面潮紅に対するそれらの生理学的応答を試験した。温度監視の終了後、動物の麻酔が効いている間に組織を摘出した。
【００３９】
卵巣摘出。到着後２週目、イソフルラン吸入により各動物に麻酔をかけ、背側の腰部中央部分の毛を剃り、手術用消毒剤のヨードとアルコールを綿棒で塗布した。その後、滅菌布／パッドで覆った温かい温熱パッドの上に、尾を施術者の方に向けて腹臥位に動物を置いた。胸郭の後端と尾の基部の間の中間部に、２〜３ｃｍの背側正中線の皮膚切開を行った。脊髄と腹側正中線間の距離の約１／３にわたって左右両側へ、筋層内部に達する５．５〜１０ｍｍ長さの一本の横断切開を行った。筋層を通して卵巣と卵管を体外に取り出した。卵管と子宮の間の位置で、子宮脈管構造の周りを止血鉗子でクランプし、子宮脈管構造を溶解性縫合糸で結紮した。卵巣近くの卵管を介して、各卵巣と卵管の一部をシングルカットし、取り出した。止血鉗子を外し、残りの組織を腹腔内に戻した。他方の卵巣も同様にして取り出した。筋肉の切開は縫合しない。皮膚切開を閉じるために、滅菌創傷リップを使用した。動物の感染または病的状態の兆候を日々観察した。
【００４０】
動物の扱い。行動分析の前の４日間、毎日手でラットを扱った。これには、動物をケージから優しく取り出し、実験者の膝の上のタオルに拘束せずに乗せ、動物に探索させることが含まれた。これにより、動物は実験者に扱われることに順応した。全ての行動試験はコロニー室の隣の部屋で行われ、試験前の終夜をかけて動物を試験室に慣れさせた。
【００４１】
オープン・フィールド試験。オープン・フィールドで動物を試験し、全体的な自発運動およびベースとなる不安状態を測定した。オープン・フィールド試験では、各ラットは１００×１００×４０ｃｍの試験場からなる新しい環境に置かれる。ラットを室の中央に置き、デジタルカメラでオープン・フィールドでの行動を３０分間記録し、ソフトウェア（ＡｎｙＭａｚｅ、Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）によりその行動を測定した。次のパラメータ、ａ）総歩行距離、ｂ）中央にいる時間、ｃ）中央への移動、ｄ）糞便排泄回数、を解析した。
【００４２】
高架式十字迷路試験。高架式十字迷路で動物を試験し、不安関連行動を測定した。高架式迷路は床から約８５ｃｍの高さであり、同じ大きさ（５０×１０ｃｍ）の２つの開放走行路および２つの閉鎖走行路からなった。閉鎖走行路は４０ｃｍ高さの壁によって囲まれており、走行路は黒色のアクリル板で作製されており、中央のプラットフォーム（１０×１０ｃｍ）から放射状に張り出してプラス記号を形成していた（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＩＮ）。各ラットを、中央プラットフォーム上に、開放走行路の１つの方に向けて置き、５分の試験の間、動画取り込みソフトウェア（ＡｎｙＭａｚｅ）で行動を記録した。開放および閉鎖走行路上で過ごした時間、ならびに開放および閉鎖走行路に入った回数を動画分析（ＡｎｙＭａｚｅ）により評価した。さらに、動物が、２本足直立や毛繕いに費やす時間、ならびに首を伸ばしながらも前に踏み出さない姿勢をとる回数および開放走行路の端部から下を見下ろす回数を、実験者がその場で採点した。
【００４３】
水泳試験。各ラットの抑うつ様行動を、水泳試験により調べた。この試験は、逃れられないことが認知された状況に対する順応性応答を測定するものであるから、２日にわたり連続して行った。第１の試験では、逃れられない状況にあることを動物に知らしめ、第２の試験で、逃れられない状況で努力を継続する意思がないことに由来する動物の受動的対処の程度を測定する。典型的抗うつ剤は、受動的対処（無動）の量を制限し、能動的対処（泳ぎ／壁よじ登り行動）の量を増大させる。１日目（８時〜１３時）、３０ｃｍまで新鮮な水（２５℃）を入れたプレキシガラス製円筒容器（４５ｃｍ×２０ｃｍ）に１５分間動物を入れることにより試験に慣れさせ、その後、タオルで水をふき取って乾かし、元のケージに戻した。２日目（２４時間後）、全水泳時間５分の試験を行い、その後、タオルでラットの水をふき取って乾かし、元のケージに戻した。円筒容器の上方の天井に固定され、ラップトップに接続されたデジタルビデオカメラで両試験を記録した。泳ぎと無動に費やした全時間を、行動ソフトウェア（Ａｎｙｍａｚｅ、Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ  Ｃｏ．）により、実時間で測定し、また、取り込んだビデオを見ていない実験者が事後に採点した。泳ぎは、水の表面を大きく乱さない、前肢と後肢の動きと定義した。無動は、動物が頭を水面上に出すために必要な僅かな動き以外、どのような動きもないことと定義した。壁よじ登り行動は、水の表面を大きく乱す、前肢の速い動きと定義した。
【００４４】
顔面潮紅の研究。ウレタン（７５０ｍｇ／ｋｇ）およびα−クロラロース（６０ｍｇ／ｋｇ）の併用腹腔内注射により動物に麻酔をした。この麻酔は、イソフルラン、ペントバルビタールまたはケタミン／キシラジンで観察されるのと同程度の低体温を、通常、引き起こさないという点で好ましい。さらに、イソフルランはＣＧＲＰで誘起された顔面潮紅を阻害することが示されている。一方の後肢の足底に、サーミスタ・プローブ（ＡＤＩ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＣＯ）をテープで止めた。４０分後、麻酔が引き起こした低体温が安定してから、ベースの皮膚温度を記録した。その後、実験の残り時間を通して、５秒間隔で体温監視を行った。その後、生理食塩水に溶解したカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ；１０μｇ／ｋｇ、静脈内）を尾静脈から注射した。装置の処理能力の制約により、最大８匹の動物を同時に試験した。単独飼育のストレスおよび潜在的なストレスホルモンによる体温への影響を避けるため、ケージ仲間は常に一緒に試験した。したがって、１日のうちに試験できたのは、僅かに４グループであった。これにより、８匹の動物からなる１０の集団［１日に８匹からなる１セットを２週間（平日は１０日）］が得られ、処理群のいくつかに日内対照の欠損が生じた。いくつかの群に対する、この日内対照の欠損は、後で、顔面潮紅応答の最終の解析を妨げるので、これらの群は顔面潮紅解析から除外した。
【００４５】
［結果］
図１〜１１に詳細が示されているように、
Ａ）粉砕したサンショウ属（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ）の種子からのＮＭＳ−グルコシドは、エストロゲン（すなわち、エストラジオール）、および化学的に合成されたＮＭＳと同様に、顔面潮紅応答を低減した。
Ｂ）サンショウ属（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ）の種子は、最終的な体重増加、子宮肥大または気分関連行動に影響を与えなかった。これらの発見は、化学的に合成されたＮＭＳによるものと同様であった。
Ｃ）体温調節効果のためのＮＭＳのヒトに対する等価用量（ＨＥＤ）は、ＨＥＤ計算の体表面積（ＢＳＡ）法を使用すると、約１５０〜８４０μｇ／日である。このデータは、所与の製品中のＮＭＳ含有量を最適化すれば、子宮肥大の危険を伴わずに、更年期の顔面潮紅が軽減されることを示している。
Ｄ）追跡研究では、粉砕したサンショウの種子中のＮＭＳ−グルコシドは、化学的に合成されたＮＭＳと等価であり、ＢＳＡ計算法を用いると、ＨＥＤ＝１５０〜５４０μｇ／日（０．７〜３．２ｇ種子／日）であった。
Ｅ）ＮＭＳは非子宮性エストラジオール分泌を３倍にしたが、これはサンショウ属（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ）種子からのＮＭＳ−グルコシドの作用のいくつかを説明し得るものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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