(57)【要約】本発明は、ＮＲＰ−２９４５、ＮＲＰ−２９８３およびＮＮＺ−４９２１を含む神経再生ペプチド（ＮＲＰ）、ならびにこれらのＮＲＰと相互作用するものとして新規に同定されている受容体、例えばＣＣＲ３と協働するＣＸＣＲ４に関する。本発明はまた、これらのＮＲＰおよびその各々のケモカイン受容体、ならびにかかる成分を含む組成物を使用する方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内でＣＸＣＲ４発現を下方制御する方法であって、
前記細胞を、外因性ＮＲＰ２９４５（配列番号ｌ）、ＮＮＺ−４９２１（配列番号２）、ＮＲＰ２９８３（配列番号９）またはその機能的類似体と接触させ、それによりＣＸＣＲ４発現を下方制御するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記細胞が、がん細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、腺がん型のがん細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、前立腺がん細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、神経細胞、神経幹細胞または神経前駆体細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
がん細胞の移動を阻害する方法であって、
前記がん細胞を、外因性ＮＲＰ２９４５（配列番号ｌ）、ＮＮＺ−４９２１（配列番号２）、ＮＲＰ２９８３（配列番号９）またはその機能的類似体と接触させ、それにより前記移動を阻害するステップを含む、方法。
【請求項７】
前記がん細胞が、腺がん細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記がん細胞が、前立腺がん細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
がん細胞による組織の浸潤を阻害する方法であって、
前記がん細胞を、外因性ＮＲＰ２９４５（配列番号ｌ）、ＮＮＺ−４９２１（配列番号２）、ＮＲＰ２９８３（配列番号９）またはその機能的類似体と接触させ、それにより前記浸潤を阻害するステップを含む、方法。
【請求項１０】
前記がん細胞が、腺がん細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記がん細胞が、前立腺がん細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
腫瘍転移を阻害する方法であって、前記腫瘍を、外因性ＮＲＰ２９４５（配列番号ｌ）、ＮＮＺ−４９２１（配列番号２）、ＮＲＰ２９８３（配列番号９）またはその機能的類似体と接触させ、それにより腫瘍転移を阻害するステップを含む、方法。
【請求項１３】
前記腫瘍が、腺がん型腫瘍である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記腫瘍が、前立腺腫瘍である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
患者におけるがんを治療するかまたは寛解させる方法であって、
ＮＲＰ２９４５（配列番号ｌ）、ＮＮＺ−４９２１（配列番号２）、ＮＲＰ２９８３（配列番号９）またはその機能的類似体を前記患者に投与し、それにより前記がんを治療するかまたは寛解させるステップを含む、方法。
【請求項１６】
前記がんが、腺がん型のがんである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記がんが、前立腺がんである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
患者における腫瘍転移を予防または阻害する方法であって、
ＮＲＰ２９４５（配列番号ｌ）、ＮＮＺ−４９２１（配列番号２）、ＮＲＰ２９８３（配列番号９）またはその機能的類似体を前記患者に投与し、それにより腫瘍転移を予防または阻害するステップを含む、方法。
【請求項１９】
前記腫瘍が、腺がん型腫瘍である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記腫瘍が、前立腺腫瘍である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
損傷によるニューロンにおけるアポトーシスを阻害する方法であって、
前記ニューロンを、外因性ＮＲＰ２９４５（配列番号ｌ）、ＮＮＺ−４９２１（配列番号２）、ＮＲＰ２９８３（配列番号９）またはその機能的類似体と接触させ、それによりアポトーシスを阻害するステップを含む、方法。
【請求項２２】
前記損傷が、機械的損傷、酸化的損傷、酸素およびグルコース欠乏による損傷、または毒素による損傷である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
患者におけるＣＮＳ損傷によるニューロンのアポトーシスを予防または阻害する方法であって、
ＮＲＰ２９４５（配列番号ｌ）、ＮＮＺ−４９２１（配列番号２）、ＮＲＰ２９８３（配列番号９）またはその機能的類似体を前記患者に投与し、それによりアポトーシスを阻害するステップを含む、方法。
【請求項２４】
前記ＣＮＳ損傷が、虚血傷害、外傷による損傷、または神経性疾患による損傷である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＣＸＣＲ４／ＣＣＲ３ヘテロ二量体形成を促進する方法であって、
前記細胞を、外因性ＮＲＰ２９４５（配列番号ｌ）、ＮＮＺ−４９２１（配列番号２）、ＮＲＰ２９８３（配列番号９）またはその機能的類似体と接触させ、それによりＣＸＣＲ４／ＣＣＲ３ヘテロ二量体形成を促進するステップを含む、方法。
【請求項２６】
前記細胞が、がん細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞が、腺がん型のがん細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
細胞内のＣＸＣＲ４受容体を活性化させる方法であって、
前記細胞を、外因性ＮＲＰ２９４５（配列番号ｌ）、ＮＮＺ−４９２１（配列番号２）、ＮＲＰ２９８３（配列番号９）またはその機能的類似体と接触させ、それにより前記ＣＸＣＲ４受容体を活性化させるステップを含む、方法。
【請求項２９】
前記細胞が、ＣＮＳ細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が、ニューロンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
配列番号９の神経再生ペプチド。
【請求項３２】
配列番号９の神経再生ペプチドを含む組成物。
【請求項３３】
動物における神経細胞の欠損によって特徴づけられる神経障害を治療する方法であって
、
前記動物に、ある量の配列番号９または請求項３２に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項３４】
前記神経障害が、筋萎縮性側索硬化症、神経毒性損傷、酸化的損傷、多発性硬化症、末梢神経障害、低酸素／虚血、外傷性脳損傷、視神経障害または糖尿病性末梢神経障害である、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＲＰ２９４５、ＮＲＰ２９８３およびＮＮＺ−４９２１を含む神経再生ペプチド（ＮＲＰ：ｎｅｕｒａｌ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、ならびにこれらのＮＲＰと相互作用するものとして新規に同定されている受容体、例えばＣＣＲ３と協働するＣＸＣＲ４に関する。本発明はまた、これらのＮＲＰおよびその各々のケモカイン受容体、ならびにかかる成分を含む組成物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＲＰ
本明細書に開示されたペプチドは、神経再生ペプチド（ＮＲＰ）と命名された、新規に発見されたペプチドファミリーに属する。それらは、神経再生にとって重要な一連の生物学的機能を発揮する小ペプチドであり、ニューロンの生存、増殖、移動および分化の促進に関与する（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００３】
ＮＲＰは、ニューロンの移動を誘発する新規な因子をスクリーニングするための生体外ラット脳切片培養モデルを用いて発見された。ラットの新皮質および背側視床（脳の器官）の培養された器官型切片中で、高度に精製されたペプチド（後に「神経再生ペプチド」またはＮＲＰと命名された）が、ニューロンの増殖および移動ならびにニューロン由来の視床皮質細胞間橋（ｂｒｉｄｇｅｓ）の形成を刺激した一方、酸化的および機械的ストレスから脳組織を保護する場合に驚くべき活性を示した（非特許文献３）。
【０００４】
魚類、両生類、鳥類、ならびにマウス、ラット、イヌおよびヒトのゲノムを含む脊椎動物ゲノム内部には、様々なＮＲＰ遺伝子ファミリーメンバがコードされている。完全長の注釈付きでかつＥＳＴ由来のＮｒｐ遺伝子配列は、わずかに３５〜４０％の配列類似性を示す。にもかかわらず、これらの遺伝子産物に由来する生物活性のあるＮＲＰ配列（１１〜２５アミノ酸長）は、様々なゲノムの中で比較すると、５５〜９０％の配列類似性を示す。
【０００５】
ＮＲＰ２９４５は、安定性および薬物動態について最適化されている合成１１−ｍｅｒペプチド模倣薬である。ＮＲＰ２９４５配列Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｉｂ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ（配列番号ｌ）は、様々なＮＲＰ関連配列に対して、８０〜９０％の配列類似性を示す。ＮＲＰ２９４５は、配列Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ（配列番号２）を有するＮＮＺ−４９２１と非常に密接に関連する。ＮＮＺ−４９２１は、アミノ酸４０〜５０位を含む分泌アイソフォーム２（ＣＡＰＳ−２）におけるカルシウム依存性活性化タンパク質のＮ末端配列内に天然に見出される配列を示している。ＣＡＰＳ−２中のアスパラギン酸が存在する４３位については１つの違いが存在するが、これはＮＮＺ−４９２１中でアラニンに変化している。ＣＡＰＳ−２は、ＣＡＰＳの３つのアイソフォームのうちの１つを表し、それは分泌小胞のカルシウム調節エキソサイトーシス（ｃａｌｃｉｕｍ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ）にとって必要とされる（非特許文献４）。
【０００６】
ＮＲＰ２９８３は、合成１１−ｍｅｒペプチド模倣薬ＧＲＲＡＡＰＧＲ−β−Ａｌａ−ＧＧ（配列番号９）であり、ＮＲＰ２９４５およびＮＲＰ４９２１に密接に関連する。
ヒトＣＡＰＳ−２は、シナプス前終末の小胞内で発現される。ＣＡＰＳ−２が豊富に存在する小胞はまた、ＮＴ３およびＢＤＮＦを有し、それ故、ＣＡＰＳ−２が神経保護に関与しうるであろうと考えられる（非特許文献５）。胚性および出生後組織に対して実施さ
れた試験によると、ＮＲＰ２９４５が、生存、増殖、移動、および分化に関与することが示されている。特に、このペプチドは、酸化的および興奮毒性ストレスの間に細胞生存を促進することに関与する化学誘引物質として作用すると考えられる（非特許文献１）。
【０００７】
ＣＣＲ３およびＣＸＣＲ４
ＣＣケモカイン受容体（βケモカイン受容体とも称される）は、ＣＣケモカインファミリーのサイトカインに特異的に結合しかつ応答する膜内在性タンパク質である。それらは、Ｇタンパク質共役受容体のより大きなファミリーに属する、ケモカイン受容体の１つのサブファミリーを示す。ＣＣＲ３は、エオタキシン（ＣＣＬ１１）、エオタキシン−３（ＣＣＬ２６）、ＭＣＰ−３（ＣＣＬ７）、ＭＣＰ−４（ＣＣＬ１３）、およびＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）を含む、複数の炎症性／誘導性ケモカインに対する受容体である（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。
【０００８】
ＣＣＲ３は、好酸球および好塩基球の双方において高度に発現され、さらにＴｈ１およびＴｈ２細胞ならびに気道上皮細胞において発現される。ＣＣＲ３は、アレルギー反応に関与する好酸球および他の炎症性細胞の蓄積および活性化に寄与すると考えられ、また寄生虫感染部位に見いだされる場合がある。さらに、それは、ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ−１の侵入に対する共受容体であることが知られている（非特許文献１３）。
【０００９】
ＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）は、Ｇタンパク質共役ケモカイン受容体（ＧＰＣＲ：Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）である。それは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および単球などの白血球、ならびに様々なＣＮＳ領域（例えば、後頭、側頭皮質および脊髄−非特許文献１４）およびＰＮＳ組織（例えば、後根神経節−非特許文献１５）や、初期胎盤形成事象の間、肺、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、精巣および子宮組織のような様々な個体発生的に発生する器官において、広く発現される（非特許文献１６）。ＣＸＣＲ４の遺伝子操作によって創出された「ノックアウト」マウス変異体が、胚発生の過程で致死性を示すことから、このケモカイン受容体は全体的な細胞生存および細胞分化にとって重要であることが明示される。
【００１０】
ＣＸＣＲ４受容体系の遺伝子発現については、正常酸素圧条件下でＣＸＣＲ４遺伝子発現を下方制御する顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）またはインターロイキン２１（ＩＬ−２１）のような作用物質が、細胞生存および再生に対して有益な効果を有するという逆説が存在する（非特許文献１７；非特許文献１８）。毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ：ｃｉｌｉａｒ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）によるＣＸＣＲ４メッセージの一時的な上方制御は、神経前駆体細胞のニューロン分化の開始の間で生じ（非特許文献１９）、次いでその後の発現が急激に低下する。さらに、長期的に上方制御されるＣＸＣＲ４遺伝子の発現は、有害であり、過形成（非特許文献２０）およびがん細胞において認めることができる。
【００１１】
本発明者らの試験に先行して、ＣＸＣＲ４受容体に対する唯一既知の天然リガンドは、ストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）と命名された。生理的条件下で、ＳＤＦ−１は、前駆体Ｂ細胞の増殖および発生において骨髄間質細胞により分泌される。高濃度のＳＤＦ−１が炎症性部位に存在することから、ＣＸＣＲ４を発現する幹細胞のＳＤＦ−１勾配への移動により、様々な損傷組織の修復が促進される。さらに、ＣＮＳの内部では、リガンドＳＤＦ−１は、アストロサイトおよびニューロンにより分泌され、それにより介在ニューロンの生存、移動、および最終分化の発生的側面が影響を受ける。
【００１２】
様々なタイプのがん細胞の中で、ＣＸＣＲ４の過剰発現および器官特異的な転移を含む、ＣＸＣＲ４に関連したがんの病理については、多数の報告がなされている。転移の間、
二次損傷において発現されるＳＤＦ−１は、ＣＸＣＲ４を発現する悪性細胞の移動を方向づける化学誘引物質として機能する。すべてのがんの約７５％が、調節不全のＣＸＣＲ４遺伝子およびタンパク質発現の兆候を示し、それによりＣＸＣＲ４はがんにおける重要な治療標的として認定されている。
【００１３】
ＣＸＣＲ４は、心不全を有する患者において上方制御される数種のケモカイン受容体のうちの１つである（非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３）。さらに、ＣＸＣＲ４は、Ｔ細胞株の熱帯性ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）の標的宿主細胞への侵入を促進する主要な共受容体として同定されている。ＳＤＦ−１のＨＩＶ感染に対する阻害効果は、ＣＸＣＲ４に対する競合的結合ならびにＣＸＣＲ４の下方制御によるものと考えられる。ＣＸＣＲ４は、有望な抗転移薬および抗ＨＩＶ薬における有望な分子標的であり、それ故、数種のＣＸＣＲ４リガンド（拮抗剤）が開発されている。
【００１４】
生理学的な（正常酸素圧での）出生後のヒト脳の発生過程では、ＣＸＣＲ４は、海馬および小脳において最も顕著に発現される（非特許文献２４）。しかし、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ：Ｍｉｄ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｒｔｅｒｙ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）の技術の使用によって脳を操作する間、ニューロンおよび反応性アストロサイトのＣＸＣＲ４遺伝子発現は、同側内部、特に帯状回皮質のＶＩ層内部の正常酸素圧下の制御レベルより２〜６倍上方制御される（非特許文献２５）。他方で、ＣＸＣＲ４に特異的なリガンドＳＤＦ−１は、数時間にわたって同時に下方制御される（非特許文献２５）。ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１受容体リガンド系のこの対抗した発現レベルの場合、脱感作は、ＭＣＡＯで損傷した脳のプレナンブラ（ｐｒｅｎｕｍｂｒａ）近傍でのその後の再生を可能にする受容体のレベルで阻止される。
【００１５】
ＣＸＣＲ４受容体タンパク質の下方制御は、その細胞質側末端のリン酸化により開始され、その後、リン酸化セリン残基およびＣＸＣＲ４関連Ｃ末端でのジロイシンモチーフが重要な役割を有する、β−アレスチンの結合が生じる。この複合体は、分解経路または回収エンドソームに対する後期エンドソーム／リソソームに選別される。ＣＸＣＲ４の下方制御は、他のＧＰＣＲの刺激を通じても生じうるであろう。ＳＤＦ−１によるＣＸＣＲ４の活性化過程については、十分に文書化されている。ＣＸＣＲ４は、そのリガンドの結合後、二量体化を生じ、Ｇタンパク質Ｇｉを活性化する。しかし、ＣＸＣＲ４を介した下流活性化は、他のＧタンパク質および非Ｇタンパク質を介しても生じうるであろう。
【００１６】
ＳＤＦ−１との結合時、ＣＸＣＲ４は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質の解離を介した下流シグナル伝達、次いで細胞内サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ：ｃｙｃｌｉｃ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）濃度の低下、細胞内Ｃａ２＋放出の上方制御、および細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ−ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ）１／２リン酸化の増加を誘起する。ＣＸＣＲ４関連のシグナル伝達における別の制御機構は、原形質膜上のＣＸＣＲ４受容体の密度によって媒介される。ＣＸＣＲ４タンパク質の実際の量は、細胞内プロテアソーム経路を含む受容体のユビキチン化／脱ユビキチン化事象によって調節される（非特許文献２６）。
【００１７】
ＣＸＣＲ４がホモ二量体を形成することに加えて、ＣＸＣＲ４がヘテロ二量体を形成する証拠があり、それからＧｉ以外の別のＧタンパク質共役が生じうる。非特許文献２７は、Ｔ細胞の免疫シナプス（ＩＳ：ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｙｎａｐｓｅｓ）へのＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５の動員、およびその後の受容体の会合が、ケモカイン誘導性のＴ細胞の同時刺激を促進することを示唆する証拠を提供している。興味深いことに、ＣＸＣＲ４／ＣＣＲ５ヘテロ二量体は、Ｇｑおよび／またはＧ１１に共役し、Ｔ細胞活性化を増強しうる刺激性シグナルを生成し、それによりＴ細胞挙動を調節するための機構を提供することが示された（非特許文献２７）。
【００１８】
骨髄幹細胞ホーミングへの関与および様々な免疫細胞型に対する効果とは別に、ＳＤＦ−１α／ＣＸＣＲ４シグナル伝達は、膵島起源の重要な成分であることが示されている（例えば、非特許文献２８を参照）。ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１系は、胚性脳の発生過程でのニューロンの化学誘引に関与することも示されており、脳組織の酸化的／興奮毒性ストレス後でのニューロン生存の促進にとっても重要である。
【００１９】
ＣＮＳにおいては、ＣＸＣＲ４リガンドＳＤＦ−１は、ニューロンおよびグリアの増殖、移動、および生存を増強するなどの種々の生物学的活性を示す。ＳＤＦ−１生物活性の有望な機構は、細胞内カルシウム濃度の増加を誘起することによる、細胞外制御キナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）経路の下流活性化を含む（非特許文献２９）。さらに、ＣＸＣＲ４の活性化により、リン酸化β−カテニンの核への移行が促進され、神経前駆体細胞内でニューロン生存および増殖を促進する遺伝子を支持する遺伝子発現パターンが惹起される（非特許文献３０）。
【００２０】
特に、ＳＤＦ−１は、ホモ二量体構造のＣＸＣＲ４受容体に結合するが、ケモカイン受容体の刺激において低い効力を示す。ナノモルでの低域範囲内の濃度が必要とされ、９ｎＭのＳＤＦ−１は、神経幹細胞を化学誘引するのに必要とされる最低濃度である（非特許文献３１）。しかし、この最低必要濃度のＳＤＦ−１は、脳発生の感受期中に分析される場合、インビボで存在する可能性は低い。
【００２１】
さらに、ＳＤＦ−１が、細胞表面上にＣＸＣＲ４受容体を有する免疫細胞を誘引することは望ましくない。この活性は、ＳＤＦ−１が脳損傷後に各々の損傷部位に投与される場合、問題でありうる。これらの検討結果から、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１神経再生領域における薬剤開発の努力（例えば、（非特許文献３２）を参照）は、より強力でかつ免疫細胞に対してより少ない負の効果を有する受容体作動薬の発見から多いに恩恵を受けることになるであろう。
【００２２】
ここで本発明は、例としてのみ図を参照しながら説明される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】ゴルバ（Ｇｏｒｂａ），Ｔら著、２００６年、「神経再生タンパク質は新規な化学誘引および生存促進ペプチドである（Ｎｅｕｒａｌ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｒｅ  ｎｏｖｅｌ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」、エクスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第３１２巻、ｐ．３０６０〜３０７４
【非特許文献２】シエグ（Ｓｉｅｇ），Ｆおよびアントニック（Ａｎｉｏｎｉｃ），Ａ著、２００７年、「神経再生および神経発生における別の戦略（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）」、リサーチ・サインポスト・エディション（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｓｉｇｎｐｏｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ）（章、ｐ．２７〜５８）、バレリア・ソゴス（Ｖａｌｅｒｉａ  Ｓｏｇｏｓ）およびアンドレア・ダイアナ（Ａｎｄｒｅａ  Ｄｉａｎａ）編
【非特許文献３】ランドグラフ（Ｌａｎｄｇｒａｆ）ら、２００５年
【非特許文献４】スパイデル（Ｓｐｅｉｄｅｌ），Ｄら著、２００３年、「分泌性のＣａ２＋依存性活性化タンパク質のファミリー：構造、発現、局在化、および機能の比較分析（Ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｃａ２＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ：ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ）、第２７８巻（５２）、ｐ．５２８０２〜５２８０９
【非特許文献５】サダカタ（Ｓａｄａｋａｔａ）ら、２００４年
【非特許文献６】ドーハーティ（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ）ら著、「ヒト好酸球エオタキシン受容体のクローニング、発現、および特徴づけ（Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｅｏｔａｘｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）、第１８３巻（５）、ｐ．２３４９〜５４、１９９６年
【非特許文献７】ポナス（Ｐｏｎａｔｈ）ら著、「好酸球上に選択的に発現されるヒトエオタキシン受容体の分子クローニングおよび特徴づけ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｅｏｔａｘｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｏｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ）」、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）、第１８３巻、ｐ．２４３７〜４８、１９９６年
【非特許文献８】ヨウン（Ｙｏｕｎ）ら著、「ロイコタクチン−１の分子クローニング：新規なヒトβ−ケモカイン、好中球、単球、およびリンパ球における化学誘引物質、およびＣＣケモカイン受容体１および３における強力なアゴニスト（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｌｅｕｋｏｔａｃｔｉｎ−１：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ，ａ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ，ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ，ａｎｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ａｎｄ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｇｏｎｉｓｔ  ａｔ  ＣＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  １  ａｎｄ  ３）」、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．）、第１５９巻、ｐ．５２０１〜５２０５、１９９７年
【非特許文献９】キタウラ（Ｋｉｔａｕｒａ）ら著、「ヒトエオタキシン、好酸球選択的ＣＣケモカインの分子クローニング、および特異的な好酸球エオタキシン受容体、ＣＣケモカイン受容体３の同定（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｏｔａｘｉｎ，ａｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＣＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ，ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｅｏｔａｘｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３）」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２７１巻、ｐ．７７２５〜７７３０、１９９６年
【非特許文献１０】キタウラ（Ｋｉｔａｕｒａ）ら著、「ＣＣケモカイン受容体３の機能的リガンドである新規なヒトＣＣケモカイン（エオタキシン−３）の分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ＣＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｅｏｔａｘｉｎ−３）ｔｈａｔ  ｉｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｌｉｇａｎｄ  ｏｆ  ＣＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３）」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２７４巻、ｐ．２７９７５〜２７９８０、１９９９年
【非特許文献１１】パン（Ｐａｎ）ら著、「粘膜組織内の上皮細胞によって発現されるＣＣＲ１０およびＣＣＲ３に対する新規なケモカインリガンド（Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ＣＣＲ１０  ａｎｄ  ＣＣＲ３  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ）」、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第１６５巻、ｐ．２９４３〜２９４９、２０００年
【非特許文献１２】ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）ら著、「ＣＣＲ３受容体に結合し、ヒト好酸球を活性化する新規なヒトＣＣケモカインのクローニングおよび機能的特徴づけ（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ＣＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＣＣＲ３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ）」、ジャーナル・オブ・ルーコサイト・バイオロジー（Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．）、第６２巻、ｐ．６６７〜６７５、１９９７年
【非特許文献１３】ネデレック（Ｎｅｄｅｌｌｅｃ），Ｒら著、２００９年、「代替の共受容体ＣＣＲ３およびＦＰＲＬ１を介したウイルス侵入はヒト免疫不全ウイルス１型サブタイプが異なる（Ｖｉｒｕｓ  ｅｎｔｒｙ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ＣＣＲ３  ａｎｄ  ＦＰＲＬ１  ｄｉｆｆｅｒｓ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｓｕｂｔｙｐｅ）」、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ）、第８３巻（１７）、ｐ．８３５３〜８３６３
【非特許文献１４】セーガル（Ｓｅｈｇａｌ），Ａら著、１９９８年、「ＣＸＣＲ−４の分子キャラクタリゼーション：脳腫瘍関連遺伝子候補（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＸＣＲ−４：ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ）」、ジャーナル・オブ・サージカル・オンコロジー（Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ）、第６９巻（４）、ｐ．２３９〜２４８
【非特許文献１５】オー（Ｏｈ），ＳＢら著、２００１年、「ケモカインおよび糖タンパク質１２０は一次侵害受容ニューロンを直接興奮させることによって痛覚過敏をもたらす（Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  １２０  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｐａｉｎ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｅｘｃｉｔｉｎｇ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ）」、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ）、第２１巻（１４）、ｐ．５０２７〜５０３５
【非特許文献１６】シン（Ｓｉｎｇｈ），ＡＴら著、２０１０年、「新規な神経再生ペプチド（ＮＲＰ）による栄養膜の移動および生存の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｂｙ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｎｅｕｒａｌ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＮＲＰ））」、生殖生体医学オンライン（Ｒｅｐｒｏｄ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｏｎｌｉｎｅ）、第２１巻（２）、ｐ．２３７〜２４４
【非特許文献１７】グプタ（Ｇｕｐｔａ），ＳＫら著、１９９９年、「ヒト単球およびマクロファージの分化過程でのＣＸＣＲ４発現およびＳＤＦ−１α機能活性の調節（Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＸＣＲ４  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ＳＤＦ−１  ａｌｐｈａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）」、ジャーナル・オブ・ロイコサイト・バイオロジー（Ｊ  Ｌｅｕｃｏ  Ｂｉｏｌ）、第６６巻（１）、ｐ．１３５〜１４３
【非特許文献１８】ヨシダ（Ｙｏｓｈｉｄａ），Ｎら著、２０１１年、「活性化Ｂ細胞上でのＣＸＣＲ４発現はＣＤ６３およびＩＬ−２１によって下方制御される（ＣＸＣＲ４  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＣＤ６３  ａｎｄ  ＩＬ−２１）」、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）、第１８６巻（５）、ｐ．２８００〜２８０８
【非特許文献１９】ヤング（Ｙａｎｇ），Ｊら著、２０１２年、「ブタ神経前駆細胞における分化誘導過程での遺伝子転写における定量的変化（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）」、モレキュラー・ビジョン（Ｍｏｌ  Ｖｉｓ）、第１８巻、ｐ．１４８４〜１５０４
【非特許文献２０】ダラシュ−ヤハナ（Ｄａｒａｓｈ−Ｙａｈａｎａ），Ｍら著、２００４年、「腫瘍成長、血管新生、および転移における高い発現レベルのＣＸＣＲ４の役割（Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ＣＸＣＲ４  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ，ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）」、ファセブ・ジャーナル（ＦＡＳＥＢ  Ｊ）、第１８巻（１１）、ｐ．１２４０〜１２４２
【非特許文献２１】アウクルスト（Ａｕｋｒｕｓｔ）ら著、「うっ血性心不全を有する患者におけるＣ−Ｃケモカインの循環レベルの上昇（Ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  Ｃ−Ｃ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）」、サーキュレーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）、１９９８年、第９７巻（１２）、ｐ．１１３６〜４３
【非特許文献２２】ダマス（Ｄａｍａｓ）ら著、「ヒト末期心不全におけるＣＣ−およびＣＸＣ−ケモカインおよびそれらの受容体の心筋での発現（Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＣ−  ａｎｄ  ＣＸＣ−ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）」、カルジオバスキュラー・リサーチ（Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．）、２０００年、第４７巻（４）、ｐ．７７８〜８７
【非特許文献２３】ダマス（Ｄａｍａｓ）ら著、「静脈内免疫グロブリンの慢性心不全に対する調節性効果における単核血球中でのケモカインおよびその対応する受容体の促進された遺伝子発現（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ−ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）」、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・カレッジ・オブ・カーディオロジー（Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．）、２００１年、第３８巻（１）、ｐ．１８７〜９３
【非特許文献２４】ファン・デル・ミアー（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒ），Ｐら著、２００１年、「発生するヒト脳におけるＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、およびＣＣＲ３ケモカイン受容体の発現パターン（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  ＣＸＣＲ３，ＣＸＣＲ４，ａｎｄ  ＣＣＲ３  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ）」、ジャーナル・オブ・ニューロパソロジー・アンド・エクスペリメンタル・ニューロロジー（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ）、第６０巻（１）、ｐ．２５〜３２
【非特許文献２５】スタム（Ｓｔｕｍｍ），ＲＫら著、２００２年、「成体脳におけるＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体系における２つの役割：ＳＤＦ−１発現のアイソフォームの選択的調節は、局所虚血後のＣＸＣＲ４依存性の神経可塑性および脳の白血球の動員を調節する（Ａ  ｄｕａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｂｒａｉｎ：ｉｓｏｆｏｒｍ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＤＦ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ＣＸＣＲ４−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ａｆｔｅｒ  ｆｏｃａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）」、米国神経科学会雑誌（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ）、第２２巻（１４）、ｐ．５８６５〜５８７８
【非特許文献２６】マインズ（Ｍｉｎｅｓ），ＭＡら著、２００９年、「ＵＳＰ１４によるＣＸＣＲ４の脱ユビキチン化は、ＥＲＫ活性化と異なり、ＣＸＣＬ１２誘発性のＣＸＣＲ４分解および化学走性の双方にとって重大である（Ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＸＣＲ４  ｂｙ  ＵＳＰ１４  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｂｏｔｈ  ＣＸＣＬ１２−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＣＸＣＲ４  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ＥＲＫ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ）、第２８４巻（９）、ｐ．５７４２〜５７５２
【非特許文献２７】コンテント（Ｃｏｎｔｅｎｔｏ），ＲＬら著、２００８年、「ＣＸＣＲ４−ＣＣＲ５：Ｔ細胞機能を調節する対（ＣＸＣＲ４−ＣＣＲ５：ａ  ｃｏｕｐｌｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）」、プロナス（ＰＮＡＳ）、第１０５巻（２９）、ｐ．１０１０１〜１０１０６
【非特許文献２８】アイシェ（Ａｙｓｅ）ら、２０１２年
【非特許文献２９】ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）ＬＬら著、２００１年、「単核球細胞内でのＣＤ４０媒介性シグナル伝達：腫瘍壊死因子受容体関連因子ｍＲＮＡの上方制御およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼシグナル伝達経路の活性化（ＣＤ４０−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ：ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｍＲＮＡｓ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ）」、インターナショナル・イムノロジー（Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）、第１３巻（３）、ｐ．２７３〜２８３
【非特許文献３０】ルオ（Ｌｕｏ），Ｙら著、２００６年、「ＳＤＦ１α／ＣＸＣＲ４シグナル伝達はラット神経前駆細胞内のβ−カテニン転写活性を刺激する（ＳＤＦ１ａｌｐｈａ／ＣＸＣＲ４  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｒａｔ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）」、ニューロサイエンス・レターズ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ）、第３９８巻（３）、ｐ．２９１〜２９５
【非特許文献３１】シュー（Ｘｕ），Ｈおよびヘイルショーン（Ｈｅｉｌｓｈｏｒｎ），ＳＣ著、２０１２年、「ＣＸＣＬ１２勾配におけるＢＤＮＦに増強される神経幹細胞の化学走性に関する微少流体研究（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＢＤＮＦ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｉｎ  ＣＸＣＬ１２  Ｇｒａｄｉｅｎｔｓ）」、スモール（Ｓｍａｌｌ）、第９巻（４）、ｐ．５８５〜５９５
【非特許文献３２】ラタイチャク（Ｒａｔａｊｃｚａｋ），ＭＺおよびキム（Ｋｉｍ），Ｃ著、２０１２年、「幹細胞動員におけるケモカイン受容体アゴニストの使用（Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｉｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」、エキスパート・オピニオン・オン・バイオロジカル・セラピー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ）、第１２巻（３）、ｐ．２８７〜２９７
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Ｈ２Ｏ２により誘発された細胞死に対するＮＲＰ２９４５の効果。記号＊、＊＊、＃＃は、実施例１８に記載のように、統計学的に有意なｐ値を示す。
【図２】酸素グルコース欠乏（ＯＧＤ：ｏｘｙｇｅｎ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ）により誘発された細胞死に対するＮＲＰ２９４５の効果。記号＊、＊＊、＃＃は、実施例１８に記載のように、統計学的に有意なｐ値を示す。
【図３】Ｈ２Ｏ２により誘発された細胞死に対するＮＲＰ２９４５の時間依存的効果。記号＊、＊＊、＃＃は、実施例１８に記載のように、統計学的に有意なｐ値を示す。
【図４】ＯＧＤにより誘発された細胞死に対するＮＲＰ２９４５の時間依存的効果。記号＊、＊＊、＃＃は、実施例１８に記載のように、統計学的に有意なｐ値を示す。
【図５】酸素グルコース欠乏（ＯＧＤ）により誘発された細胞死に対するＮＲＰ２９４５の効果は、ＣＸＣＲ４阻害剤ＡＭＤ３１００の同時投与によって消滅される。記号＃＃は、実施例１８に記載のように、統計学的に有意なｐ値を示す。
【図６】ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ３アセンブリならびにその後のＮＮＺ−４９２１による同時活性化への小脳顆粒細胞の生存の依存性。
【図７】ＮＲＰ２９４５との接触後のヒト分化ＥＳＣ中でのＣＸＣＲ４遺伝子発現における、未処理のｈＥＳＣ対照およびヒト組織ｃＤＮＡライブラリーの場合と比較した倍率変化。
【図８】酸化ストレス後、かつＮＲＰ２９４５の存在下でのＮＲＰ１３ｑｌ３．２の遺伝子発現特性。
【図９】ＮＲＰ２９４５によって促進された、ＤＵ−１４５前立腺がん細胞の化学反発。
【図１０】ヒト染色体１３ｑ１３．２ＮＲＰコーディング配列。フォワードプライマー（配列番号１０）は、太字／下線で示される。リバースプライマー（配列番号ｌ１）は、逆相補方向（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）であり、太字／イタリック体／下線で示される。
【図１１】ペプチド模倣薬ＮＲＰ２９８３（配列番号９）は、ＮＲＰ２９４５に匹敵する生存促進活性を示した。１ｆＭのＮＲＰ２９８３を酸化ストレス下の小脳微小外植片（ｍｉｃｒｏｅｘｐｌａｎｔｓ）に添加した結果、培養された小脳細胞の生存が７０％促進された。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
神経再生ペプチド（ＮＲＰ）は、哺乳類における神経機能を促進するのに望ましい特性を呈することが示されているペプチドのクラスである。これらの機能は、神経生存、神経増殖、ニューロン突出伸長（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）、神経移動、およびニューロン分化を含む。いくつかのＮＲＰについては前述のとおりであり、米国特許出願第１０／２２５，８３８号明細書および米国特許出願第１０／９７６，６９９号明細書、米国特許第７５６３８６２号明細書、米国特許第７７６７７８６号明細書、米国特許第８１３８３０４号明細書、および米国特許第８３０９６８４号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ０２／０２６７８２号、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３６２０３号、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１７５３４号、ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２６９９４号、およびＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１１９５１号で開示されているものを含む。上記特許および特許出願の各々は、あたかも個別に援用されるように、参照により全体が本明細書中に明示的に援用される。
【００２６】
典型的なＮＲＰは、以下を含む。
ＧＲＲＡＡＰＧＲ−Ａｉｂ−ＧＧ（ＮＲＰ２９４５；配列番号ｌ）
ＧＲＲＡＡＰＧＲＡＧＧ（ＮＮＺ−４９２１；配列番号２）
ＧＲＲＡ−Ａｉｂ−ＰＧＲＡＧＧ（配列番号５）
ＧＲＲＡＡＰＧＲＡＮＧ（配列番号６）
ＧＲＤＲＡＡＰＧＲＡＧＧ（配列番号７）
ＲＥＧＲＲＤＡＰＧＲＡＧＧ（配列番号８）
ＧＲＲＡＡＰＧＲ−β−Ａｌａ−ＧＧ（ＮＲＰ２９８３）（配列番号９）
前述のとおり、ＣＸＣＲ４受容体は、炎症中の白血球の輸送、酵素分泌およびＴ細胞活性化に関与するＧＰＣＲ型のケモカイン受容体である。過去１０年間に、ＣＸＣＲ４がＣＮＳにおいて広く発現されることが見出されている。さらに、ＣＸＣＲ４が、新皮質における介在ニューロンの移動を促進するために極めて重要であることが見出されている（スタム（Ｓｔｕｍｍ）ら、２００７年）。上述のとおり、ＣＸＣＲ４はまた、がん、過形成、および転移に関与している。さらに、ＣＸＣＲ４は、ＨＩＶ−１の標的宿主細胞への侵入における主要な共受容体として同定されている。
【００２７】
ＧＰＣＲは、ＣＸＣＲ４の他に、その乱雑な（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）性質が知られている。しかし、本発明者らは、ＣＸＣＲ４もまた乱雑であることを見出している。本明細書中に示されるように、ＣＸＣＲ４の他の高親和性リガンドとして、ＳＤＦ−１に加え、神経再生ペプチドＮＲＰ２９４５、ＮＲＰ２９８３およびＮＮＺ−４９２１が挙げられる。特に、ＳＤＦ−１がナノモルの低域範囲内での化学誘引におけるＥＣ５０値を有する一方、予備実験によると、ＮＲＰ２９４５は、フェムトモルの低域範囲内でのＥＣ５０値を有することが示される。したがって、ＮＲＰ２９４５のニューロンの化学誘引（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔｉｖｅ）の効力は、ＳＤＦ−１の場合より百万倍高い可能性がある。
【００２８】
ＮＲＰにおける様々な作用機序は、先行的に、また本明細書で詳述されるように、本発明者らの試験によって判明している。本明細書中に提供される本発明者らのデータによると、ＮＲＰ２９４５およびＮＮＺ−４９２１などのＮＲＰが、ＣＸＣＲ４受容体の刺激作用（または活性化）に関与することが示される。本発明者らは、ＮＲＰ２９４５およびＮＮＺ−４９２１のようなＮＲＰリガンドによるＣＸＣＲ４の活性化が、酸化ストレス条件下での神経細胞死を阻止する際に重要な役割を果たすことを見出している。さらに、本発明者らの現在の知見によると、ニューロン移動および最終のニューロン分化の促進（例えば、ゴルバ（Ｇｏｒｂａ）ら、２００６年を参照）が、ＮＲＰとそれらの受容体ＣＸＣＲ４との相互作用によって影響されうることが示唆される。
【００２９】
本発明者らは、先行的に、リガンドＮＲＰ２９４５がヒトＮＲＰ遺伝子発現を自己分泌様式で促進することを判定している。既報のとおり、ヒト染色体のクロマチンバンド１５ｑｌ２および１３ｑｌ３．２は、ＮＲＰ遺伝子配列を有する。ヒト胚性Ｗ９幹細胞およびヒトがん由来の細胞株ＮＴＥＲＡ−２は、各々、１００ｆＭおよび１００ｐＭのＮＲＰ２９４５を投与した後の５〜１０分以内に、刺激された内因性ＮＲＰ遺伝子の発現を示す。
【００３０】
本発明者らはまた、ＮＲＰが、ＥＲＫ１／２リン酸化の活性化およびＡｋｔ−１リン酸化を介したホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路の活性化により、それらの下流シグナル伝達を行うことができることを公表している（ゴルバ（Ｇｏｒｂａ）ら、２００６年）。さらに、本発明者らは、本明細書中に、ＮＲＰとＣＸＣＲ４との間の相互作用が特異的な拮抗剤ＡＭＤ３１００の投与によって遮断されうることを示している。高度に特異的な拮抗剤として、ＡＭＤ３１００はまた、ＣＸＣＲ４との会合時、ＳＤＦ−１の結合ポケットを遮断する（リアン（Ｌｉａｎｇ）ら、２０１２年）。
【００３１】
しかし、ＳＤＦ−１相互作用ではホモ二量体立体配置のＣＸＣＲ４受容体が必要とされるのに対して、ＮＲＰ２９４５およびＮＮＺ−４９２１は、ホモ二量体ＣＸＣＲ４受容体に結合しない。これは、競合におけるＣＸＣＲ４ホモ二量体受容体と非標識ＮＮＺ−４９２１およびＮＲＰ２９４５とを使用する放射性１２５Ｉ−ＳＤＦ−１置換試験によって判定された。ＮＲＰ分子は、ホモ二量体ＣＸＣＲ４受容体複合体から、放射性標識されたＳＤＦ−１分子を置換することができない（１２５Ｉ−ＳＤＦ−１結合試験では、競合的リガンドとしてＮＮＺ−４９２１が使用され、それは組換えホモ二量体ＣＸＣＲ４を発現するＨＥＫ２９３細胞内で使用された。ＮＮＺ−４９２１は放射性リガンドＳＤＦ−１を置換することができなかった  −  セレップ（ＣＥＲＥＰ）、フランスにより実施）。
【００３２】
さらに、本発明者らは、本明細書中に、ＮＲＰ２９４５およびＮＮＺ−４９２１が、ヘテロ二量体立体配置のＣＸＣＲ４およびＣＣＲ３という名称の別のケモカイン受容体と相互作用することを示す。このことは、ＮＮＺ−４９２１の存在下で、ＣＣＲ３受容体のリガンド（エオタキシン−３またはＣＣＬ−２６）を、酸化ストレスを受けた小脳微小外植片に添加することにより、解明された（本明細書中の図６を参照）。ＮＮＺ−４９２１の生存を促進する活性は、部分アゴニストのエオタキシン−３によって完全に遮断された。ＮＮＺ−４９２１の添加を伴わずにエオタキシン−３が小脳微小外植片に投与されると、これにより、正常酸素圧または酸化ストレス条件下のいずれにしてもニューロン生存率全体に対する効果は全くなかった（本明細書中の図６を参照）。
【００３３】
新規に発見されたＣＸＣＲ４／ＣＣＲ３ヘテロ二量体複合体は、ＣＸＣＲ４媒介性の下流の細胞内シグナル伝達に対して調節効果を有すると考えられる。特に、ＣＸＣＲ４／ＣＣＲ３複合体の刺激（ａｇｏｎｉｚａｔｉｏｎ）により、ＣＸＣＲ４遺伝子発現の速やかな下方制御や、おそらくはＧタンパク質サブユニットのＣＸＣＲ４受容体への共役がもたらされる。さらに、両ケモカイン受容体（ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ３）を発現する細胞型は、生存、移動および最終細胞分化に関与する遺伝子の下流遺伝子発現の活性化により、
ＮＲＰ２９４５およびＮＮＺ−４９２１媒介性のリガンド結合に応答する。
【００３４】
要するに、本明細書で詳述される試験によると、ＮＲＰ２９４５およびＮＮＺ−４９２１が、ニューロンにおけるＨ２Ｏ２誘発性の細胞死および酸素グルコース欠乏に誘発される細胞死のレベルを有意に低下させることが示される。この神経保護活性は、ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ３との相互作用に依存している。したがって、ＮＲＰ２９４５およびＮＮＺ−４９２１は、受容体アゴニストとして作用しており、ヘテロ二量体ＣＸＣＲ４／ＣＣＲ３複合体を原形質膜に動員すると考えられる。さらに、ＮＲＰ２９４５の結合活性化により、ＣＸＣＲ４遺伝子発現の即時型下方制御がもたらされる。それと同時に、ＮＲＰ２９４５は、ＣＸＣＲ４／ＣＣＲ３を発現するがん細胞に対して抗浸潤および抗移動効果を示す。
【００３５】
したがって、ＮＲＰ２９４５およびＮＮＺ−４９２１などのＮＲＰを使用することで、細胞内でのＣＸＣＲ４の立体配置およびレベルの双方の調節が可能である。このことから、ＮＲＰおよび受容体ＣＸＣＲ４／ＣＣＲ３は、ＣＮＳ障害、心不全および他の心血管状態、糖尿病、特に膵臓β細胞がＣＸＣＲ４およびＣＣＲ３を同時発現する１型糖尿病、および様々な増殖性障害の予防および治療、ならびに特にがん細胞の移動および転移の予防を含む、広範囲の医学的用途において有用性を有する。さらに、ＮＲＰは、ＮＲＰに基づく治療を監視する方法および新しい薬剤候補を同定する方法を含む、種々のアッセイにおいて有用性を有する。
【００３６】
発明の概要
一態様では、本発明は、細胞内でＣＸＣＲ４発現を下方制御する方法であって、細胞を、外因性ＮＲＰ２９４５（配列番号ｌ）、ＮＮＺ−４９２１（配列番号２）、ＮＲＰ２９８３（配列番号９）またはその機能的類似体と接触させ、それによりＣＸＣＲ４発現を下方制御するステップを含む、方法を包含する。
【００３７】
他の一態様では、本発明は、がん細胞の移動を阻害する方法であって、がん細胞を、外因性ＮＲＰ２９４５（配列番号ｌ）、ＮＮＺ−４９２１（配列番号２）、ＮＲＰ２９８３（配列番号９）またはその機能的類似体と接触させ、それにより移動を阻害するステップを含む、方法を包含する。
【００３８】
さらに他の一態様では、本発明は、がん細胞による組織の浸潤を阻害する方法であって、がん細胞を、外因性ＮＲＰ２９４５（配列番号ｌ）、ＮＮＺ−４９２１（配列番号２）、ＮＲＰ２９８３（配列番号９）またはその機能的類似体と接触させ、それにより浸潤を阻害するステップを含む、方法を包含する。
【００３９】
さらに他の一態様では、本発明は、腫瘍転移を阻害する方法であって、腫瘍を、外因性ＮＲＰ２９４５（配列番号ｌ）、ＮＮＺ−４９２１（配列番号２）、ＮＲＰ２９８３（配列番号９）またはその機能的類似体と接触させ、それにより腫瘍転移を阻害するステップを含む、方法を包含する。
【００４０】
特定の態様では、本方法におけるがん細胞は、前立腺由来の腺がん細胞である。別の特定の態様では、がん細胞は、前立腺がん細胞である。
別の態様では、本発明は、患者におけるがんを治療するかまたは寛解させる方法であって、ＮＲＰ２９４５（配列番号ｌ）、ＮＮＺ−４９２１（配列番号２）、ＮＲＰ２９８３（配列番号９）またはその機能的類似体を患者に投与し、それによりがんを治療するかまたは寛解させるステップを含む、方法を包含する。
【００４１】
さらに別の態様では、本発明は、患者における腫瘍転移を予防または阻害する方法であ
って、ＮＲＰ２９４５（配列番号ｌ）、ＮＮＺ−４９２１（配列番号２）、ＮＲＰ２９８３（配列番号９）またはその機能的類似体を患者に投与し、それにより腫瘍転移を予防または阻害するステップを含む、方法を包含する。
【００４２】
さらに別の態様では、本発明は、損傷によるニューロンにおけるアポトーシスを阻害する方法であって、ニューロンを、外因性ＮＲＰ２９４５（配列番号ｌ）、ＮＮＺ−４９２１（配列番号２）、ＮＲＰ２９８３（配列番号９）またはその機能的類似体と接触させ、それによりアポトーシスを阻害するステップを含む、方法を包含する。
【００４３】
さらなる態様では、本発明は、患者におけるＣＮＳ損傷によるニューロンのアポトーシスを予防または阻害する方法であって、ＮＲＰ２９４５（配列番号ｌ）、ＮＮＺ−４９２１（配列番号２）、ＮＲＰ２９８３（配列番号９）またはその機能的類似体を患者に投与し、それによりアポトーシスを阻害するステップを含む、方法を包含する。
【００４４】
さらなる態様では、本発明は、ＣＸＣＲ４／ＣＣＲ３ヘテロ二量体形成を促進する方法であって、細胞を、外因性ＮＲＰ２９４５（配列番号ｌ）、ＮＮＺ−４９２１（配列番号２）、ＮＲＰ２９８３（配列番号９）またはその機能的類似体と接触させ、それによりＣＸＣＲ４／ＣＣＲ３ヘテロ二量体形成を促進するステップを含む、方法を包含する。
【００４５】
さらなる態様では、本発明は、細胞内のＣＸＣＲ４受容体を活性化させる方法であって、細胞を、外因性ＮＲＰ２９４５（配列番号ｌ）、ＮＮＺ−４９２１（配列番号２）、ＮＲＰ２９８３（配列番号９）またはその機能的類似体と接触させ、それによりＣＸＣＲ４受容体を活性化させるステップを含む、方法を包含する。
【００４６】
さらなる態様では、本発明は、配列番号９の神経再生ペプチドを提供する。
別の態様では、本発明は、配列番号９の神経再生ペプチドを含む組成物をさらに提供する。
【００４７】
別の態様では、動物における神経細胞の欠損によって特徴づけられる神経障害を治療する方法であって、前記動物にある量の配列番号９または上で定義された組成物を投与するステップを含む、方法が提供される。神経障害は、筋萎縮性側索硬化症、神経毒性損傷、酸化的損傷、多発性硬化症、末梢神経障害、低酸素／虚血、外傷性脳損傷、視神経損傷または糖尿病性末梢神経障害から選択される。
【００４８】
本発明のさらなる態様および実施形態は、以下の説明から明らかになるであろう。
定義
本明細書中の各事例において、本発明の説明、実施形態、および実施例において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などは、限定することなく、拡大解釈されるべきである。したがって、文脈的に明確に他を必要としない限り、本明細書および特許請求の範囲の全体を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などは、排他的意味ではなく包含的意味で、すなわち、「含むが限定されない」の意味で解釈されるべきである。
【００４９】
便宜上、本説明における「ＮＲＰ」に対する一般的な参照は、任意の供給源、例えば、単離された天然ＮＲＰ、組換えＮＲＰ、および合成ＮＲＰから得られるペプチドを含み、かつ、天然ペプチド配列を有するＮＲＰおよび修飾ペプチド配列を有するＮＲＰを含むものと解釈される。特に注目すべきなのは、ＮＲＰの機能的類似体、すなわち開始ペプチド配列の活性のうちの１つ以上を保持する類似体である。かかる活性は、以下にさらに説明される。
【００５０】
「外因性」は、本明細書で使用される場合、参照される分子または参照される活性が宿主細胞または宿主生物に導入されることを意味するように意図される。「外因性」ＮＲＰは、人工的な、すなわち非天然の手段によって得られるペプチドを示す。これは、限定はされないが、合成化学、組換え技術、精製プロトコルなどを含む。天然、組換え、または合成供給源から単離されたペプチドが含まれる。また、細胞または無細胞翻訳系に導入可能なプラスミド、ベクター、または他の発現構築物によって生成されたペプチドも含まれる。「外因性」ＮＲＰは、ヒトの介入なしに細胞によって作られる内因性の天然ペプチドとは明確に区別される。
【００５１】
また、用語「ＮＲＰ」、「ＮＲＰ化合物」、「ＮＲＰ類似体」、「配列番号」、および他のかかる用語は、簡素化のため、本明細書に記載の分子を同定するために使用され、それらの完全な特徴づけを提供するために使用されないことも理解されるべきである。したがって、「ＮＲＰの類似体」は、本明細書中で特定のアミノ酸配列、特定の二次元表現の構造を有するものとして特徴づけられる場合があるが、主張される実際の分子が、三次元構造、特定の結合についての移動性および分子の全体としての他の特性を含む、他の特徴を有することは理解される。分子自体およびそれらの全体としての特性は、本開示によって包含される。
【００５２】
特定の実施形態では、ＮＲＰの「類似体」は、少なくとも一部には、酵素分解の低下によって安定性が増大していてもよい。ＮＲＰ類似体は、アミノ酸置換基または修飾アミノ酸を有してもよい。ＮＲＰ類似体は、アミノ酸を置換する非アミノ酸置換基を有してもよい。ＮＲＰの類似体は、いずれかのアミド化されたＣ末端を含んでもよく、またはＣ末端のヒドロキシル残基（ＯＨ）を有してもよい。他の有用な類似体は、本明細書中に詳述される。
【００５３】
本明細書で使用される「ＮＲＰ」、「ＮＲＰ化合物」、「ＮＲＰ類似体」および類似用語は、機能的配列、例えば、以下の活性、すなわち、ＣＸＣＲ４および／またはＣＣＲ３結合活性、ＣＸＣＲ４活性化の活性、細胞保護活性（例えば神経保護活性）、アポトーシスを予防または阻害する（例えば、ニューロンにおけるアポトーシスを予防する）活性、ＣＸＣＲ４発現を下方制御する活性、ＣＸＣＲ４／ＣＣＲ３ヘテロ二量体形成を促進する活性、およびがん細胞の移動、浸潤、および／または転移を阻害する活性のうちの１つ以上を有する配列を示す。
【００５４】
したがって、ペプチドが「ＮＲＰ」と命名されたことは、それが単に神経効果を有することを意味していない。むしろ、用語ＮＲＰは、本明細書に記載される類似の構成成分を有するペプチドを含むことが意図されているが、他の細胞型、組織、および／または器官に対する効果を有してもよい。
【００５５】
ＮＲＰ類似体
ＮＲＰの類似体は、天然アミノ酸の配列および立体構造を有するように作製してもよい。あるいは、ＮＲＰ類似体は、以下のタイプの修飾、すなわち（１）βターンの安定化、（２）グリシン残基の置換、（３）Ｎ末端グリシン残基の置換、および／または（４）環化、のうちの１つ以上を含んでもよい。
【００５６】
チョウ（Ｃｈｏｕ）およびファスマン（Ｆａｓｍａｎ）のβターン予測によると、様々なＮＲＰにおいてβターンが示されている。これらは、アミノ酸ドメインＡＰＧＲ（配列番号３）およびＲＡＧＧ（配列番号４）中に見出される。βターンの安定化のため、アルキル化アミノ酸などの立体的制約を導入することは可能である。容易に入手可能なアルキル化アミノ酸として、α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）が挙げられ、それは、ＮＲＰにおけるアラニンおよびグリシン残基の片方または双方と置換させて使用してもよい。
【００５７】
１つの他の有用な修飾は、アラニンのβ−アラニンとの置換である。例えば、ペプチド配列Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  β−Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ（配列番号９）を作製することは可能である。
【００５８】
アミノ酸ドメインＡＰＧＲ（配列番号３）の修飾においては、アラニンまたはグリシンは、α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）と置換してもよい。アミノ酸ドメインＲＡＧＧ（配列番号４）の修飾においては、アラニンは、アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）と置換してもよい。
【００５９】
ＮＲＰにおいては、アスパラギン（Ｎ）による内部グリシン残基の置換が、グリシンよりも高いβターンの傾向を有するアスパラギンに起因して、βターンを誘発しうることは留意すべきである。したがって、内部グリシン残基のアスパラギンとの置換の代わりに、グリシンをアスパラギンとアミノ酸１０位で置換することは可能である（例えば、ＧＲＲＡＡＰＧＲＡＮＧ（配列番号６））。
【００６０】
ＮＲＰのＮ末端でのＧ１の切断は、生物学的活性の欠損をもたらす可能性がある。特定の環境下では、Ｇ１は、アセチル基と置換してもよい。Ｌ−アミノ酸のＤ−アミノ酸との置換については、これによりペプチドの二次構造が影響を受ける場合がある。ＮＲＰにおいては、Ｎ末端から３番目のアミノ酸Ｌ−ＡｒｇがＤ−Ａｒｇと置換される環境があってもよい。
【００６１】
ＮＲＰの環状ペプチド模倣物を作製することが望ましい場合がある。環化の一方法は、システイン残基を配列の各末端に付加し、次いで得られた生成物を酸化し、環状ジスルフィドを生成することを含む。ＮおよびＣ末端双方のグリシン残基がシステイン残基と置換され、次いで酸化される状況があってもよい。Ｃ末端残基のＮ末端残基への直接環化は、アミド結合を作ることによって生じさせることができる。
【００６２】
円二色性の使用は二次構造を指し示す可能性があり、また小ペプチドのモデリング用のコンピュータシミュレーションソフトウェアの使用は、従来の方法を用いて行ってもよい。これらの技術の双方は、ＮＲＰ類似体の構造的特徴を決定するために使用してもよい。
【００６３】
ＮＲＰ類似体の合成
ペプチド合成のための出発物質および試薬は、アルドリッチケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）、バケム（Ｂａｃｈｅｍ）（トランス、カリフォルニア州）、およびシグマ（Ｓｉｇｍａ）（セントルイス、ミズーリ州）などの供給業者から得てもよい。あるいは、試薬は、当業者に周知の方法により調製してもよい。
【００６４】
典型的な手順は、「有機合成のためのフィーザーおよびフィーザーの試薬（Ｆｉｅｓｅｒ  Ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第１〜１７巻、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク、ニューヨーク州、１９９１年；「ロッドの炭素化合物の化学（Ｒｏｄｄ’ｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）」、第１〜５巻および付録、エルゼビア・サイエンス・パブリッシャーズ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、１９８９年；「オーガニック・リアクションズ（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）」、第１〜４０巻、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク、ニューヨーク州、１９９１年；マーチ（Ｍａｒｃｈ）Ｊ著、「アドバンスド・オーガニック・ケミストリー（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第４版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ
）、ニューヨーク、ニューヨーク州、１９９２年；およびラロック（Ｌａｒｏｃｋ）著、「コンプリヘンシブ・オーガニック・トランスフォーメーションズ（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ）」、ブイシーエイチ・パブリッシャーズ（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、１９８９年、などの参考文献中に記載されている。
【００６５】
ほとんどの場合、アミノ酸、そのエステルまたはアミド、および保護アミノ酸は、供給業者から入手してもよい。また、修飾アミノ酸およびそのアミドまたはエステルの調製は、化学および生化学の文献に幅広い記載がある。かかる手順は、当業者に周知であると考えられる。例えば、Ｎ−ピロリジン酢酸は、デガ−スザフラン（Ｄｅｇａ−Ｓｚａｆｒａｎ）Ｚ．およびプリズビラク（Ｐｒｙｚｂｙｌａｋ）Ｒ著、ジャーナル・オブ・モレキュラー・ストラクチャー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．）、第４３６巻−７、ｐ．１０７〜１２１、１９９７年に記載されており、またＮ−ピペリジン酢酸は、マツダ（Ｍａｔｓｕｄａ）Ｏ、イトウ．（Ｉｔｏ）Ｓ、およびセキヤ（Ｓｅｋｉｙａ）Ｍ著、ケミカル・アンド・ファーマシューティカル・ブレティン（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．）、第２３巻（１）、ｐ．２１９〜２２１、１９７５年に記載されている。
【００６６】
合成生産は、グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）Ｍ編、「ペプチドおよびペプチドミメティックの合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」、「有機化学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」（ハウベン−ウェイル（Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ））（ワークベンチ・エディション（Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）、２００４年；ゲオルグ・チーメ出版（Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ）、スタットガート、ニューヨーク）に記載の固相合成方法を用いて行ってもよい。この技術は、十分に理解されており、ペプチドの調製における一般的な方法である。
【００６７】
本方法の一般概念は、鎖の最初のアミノ酸の固体ポリマーへの共有結合による付着によって決まる。次いで、保護アミノ酸が、一つずつ（段階的戦略）、または数ブロック単位で（セグメント戦略）、所望される配列が構築されるまで添加される。最終的に、保護ペプチドは固体樹脂支持体から除去され、保護基は切断される。この手順により、試薬および副産物は濾過によって除去され、それ故に中間体を精製する必要性がなくなる。
【００６８】
アミノ酸は、樹脂のような任意の適切なポリマーに付着させてもよい。アミドポリマー樹脂は、特に本発明に適している。同樹脂であれば、最初の保護アミノ酸が共有結合によって強く結合できる官能基を含む必要がある。様々なポリマー、例えばセルロース、ポリビニルアルコール、ポリメタクリル酸メチル、およびポリスチレンは、この目的に適している。適切な樹脂は、市販されており、当業者にとって周知である。
【００６９】
かかる合成において使用可能な適切な保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、ｔ−アミロキシカルボニル（Ａｏｃ）、トシル（Ｔｏｓ）、ｏ−ブロモ−フェニルメトキシカルボニル（ＢｒＺ）、２，６−ジクロロベンジル（ＢｚｌＣｌ２）、およびフェニルメトキシカルボニル（ＺまたはＣＢＺ）を含む。さらなる保護基が、グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）（上記）、ならびにマクオミエ（ＭｃＯｍｉｅ）ＪＦＷ著：「有機化学における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ
Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、プレナム出版社（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９７３年において同定されている。
【００７０】
ペプチドを調製するための一般的手順は、最初にカルボキシル末端の保護アミノ酸を樹脂に付着させることを含む。付着後、樹脂は、濾過され、洗浄され、カルボキシル末端アミノ酸のα−アミノ基上の保護基が除去される。この保護基の除去は、当然ながら、アミ
ノ酸と樹脂の間の結合を破壊することなくなされる必要がある。次のアミノ、また必要に応じて側鎖の保護アミノ酸は、次いで樹脂上のアミノ酸の遊離アミノ基に共役される。この共役は、２番目のアミノ酸の遊離カルボキシル基と樹脂に付着された最初のアミノ酸のアミノ基の間でのアミド結合の形成によって生じる。
【００７１】
上記の一連の事象は、連続するアミノ酸と、すべてのアミノ酸が樹脂に付着するまで繰り返される。最終的に、保護ペプチドは樹脂から切断され、保護基は除去され、所望されるペプチドが得られる。ペプチドを樹脂から分離しかつ保護基を除去するのに用いられる切断技術は、樹脂および保護基の選択に左右され、ペプチド合成技術の熟練者にとって既知である。
【００７２】
ペプチドは、２つのシステイン残基間でのジスルフィド結合の形成によって環化させてもよい。かかる結合を形成するための方法は、周知であり、Ｇ．Ａ．グラント（Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ）編、「合成ペプチド：ユーザーガイド（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ）」、第２版、オックスフォード大学出版局（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、２００２年、Ｗ．Ｃ．チャン（Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ）およびＰ．Ｄ．ホワイト（Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ）編、「Ｆｍｏｃ固相合成：実践的アプローチ（Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、オックスフォード大学出版局（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、２０００年およびそれらの中の参考文献に記載のような方法を含む。
【００７３】
ペプチド合成における代替技術は、ボダンスズキー（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）ら著、「ペプチド合成（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第２版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク、１９７６年（参照により全体が本明細書中に明示的に援用される）中に記載されている。例えば、ＮＲＰはまた、アミド結合形成の化学的または酵素的方法を用いたアミノ酸またはペプチド断片の段階的またはブロック共役を含む、標準の溶液ペプチド合成法を用いて合成してもよい。これらの溶液合成法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｈ．Ｄ．ジャクブケ（Ｈ．Ｄ．Ｊａｋｕｂｋｅ）著、「ペプチド、分析、合成、生物学（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８７年、ｐ．１０３〜１６５；Ｊ．Ｄ．グラス（Ｊ．Ｄ．Ｇｌａｓｓ）著、同書、ｐ．１６７〜１８４；および欧州特許出願公開第０３２４６５９Ａ２号明細書（酵素的ペプチド合成法について記述）を参照。
【００７４】
市販のペプチドシンセサイザー、例えばアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製モデル４３０Ａ（Ｍｏｄｅｌ  ４３０Ａ）もまた、使用してもよい。ＮＲＰ類似体の化学合成は、ペプチドの入手、特にペプチドの大規模生成ための最も便利な手段を示しうる一方、組換えペプチドの作製および内因性ペプチドの単離を含む他の方法もまた、当業者にとって使用可能であることは理解されるであろう。したがって、ＮＲＰの供給源は、決して本発明に限定するものではない。
【００７５】
ＮＲＰを使用するアッセイ
本明細書中に示されるように、ＮＲＰ２９４５およびＮＮＺ−４９２１は、ＣＸＣＲ４アゴニストとして作用する。ＮＲＰ２９４５およびＮＮＺ−４９２１は、ＣＸＣＲ４／ＣＣＲ３のヘテロ二量体複合体を原形質膜に能動的に動員するものと考えられる。さらに、ＮＲＰの結合活性化により、ＣＸＣＲ４遺伝子発現の即時型下方制御がもたらされる。これに基づき、ＮＲＰ２９４５、ＮＮＺ−４９２１、およびその機能的類似体などのＮＲＰは、細胞内でのＣＸＣＲ４の立体配置およびレベルの双方を調節するために使用してもよ
い。これは、治療的有用性、ならびに当業者によって利用可能な様々なアッセイにおける有用性を有する。
【００７６】
ＮＲＰを可視化する、例えばＮＲＰの結合またはレベルを評価するためのアッセイにおいては、ペプチドは、検出可能な物質を含む１つ以上の標識を含むように修飾してもよい。適切な検出可能な物質として、酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例として、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。適切な補欠分子族複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる。適切な蛍光材料の例として、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅ）フルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられる。発光材料の例として、ルミノールが挙げられる。適切な放射性物質の例として、１４Ｃ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３ＩＩ、９９ｍＴｃ、３５Ｓ、および３Ｈが挙げられる。
【００７７】
ＮＲＰは、ＮＲＰ中の修飾基または１つ以上のアミノ酸構造への１４Ｃの取り込みにより、１４Ｃで放射性標識してもよい。標識ＮＲＰは、化合物のインビボでの薬物動態を評価するため、ならびに用量または投与計画の適合性を評価するため、また用量の増加または低下が必要であるか否かを予測するため、使用してもよい。ＣＸＣＲ４受容体の組織分布は、インビボまたは被験体から得られたインビトロ試料中のいずれかで、標識ＮＲＰを用いて検出してもよい。
【００７８】
ＮＲＰは、インビボでの使用においては、放射性テクネチウムまたはヨウ素で標識してもよい。標識用のキレート化基が導入可能な部位を提供する修飾基、例えば遊離アミノ基を有するコール酸のＡｉｃ誘導体は、選択してもよい。放射性ヨードの様々な同位体のいずれかは、導入してもよい。１２３Ｉ（半減期＝１３．２時間）は全身シンチグラフィ用に使用可能であり、１２４Ｉ（半減期＝４日）はポジトロンＣＴ（ＰＥＴ）用に使用可能であり、１２５Ｉ（半減期＝６０日）は代謝回転試験用に使用可能であり、また１３ＩＩ（半減期＝８日）は全身計測および遅延低分解能造影試験用に使用可能である。
【００７９】
１つ以上の検出可能な標識をＮＲＰに付加するため、クリックケミストリーを用いることも可能である。クリックケミストリーは、モジュラー構成要素、例えば、炭素−ヘテロ原子結合形成を含む。しかし、天然のモジュラー反応（例えば、ペプチド／タンパク質合成）と異なり、クリックケミストリー反応は不可逆性である。同反応は、エネルギーの高い試薬または反応物に左右される（コルブ（Ｋｏｌｂ）ら著、ドラッグ・ディスカバリー・トゥデイ（Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ）、第８巻、ｐ．１１２８、２００３年）。クリックケミストリー反応の例として、環化付加反応、例えば１，３−双極子ファミリー、およびヘテロディールス・アルダー反応（カール・アンカー（Ｋａｒｌ  Ａｎｋｅｒ）著、アンゲバンテ・ケミーエ（Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．）、第３９巻、ｐ．３５５８、２０００年）；求核開環反応（例えば、エポキシド、アジリジン、環状硫酸エステル（ｃｙｃｌｉｃ  ｓｕｌｆａｔｅｓ）など；コルブ（Ｋｏｌｂ）ら著、アンゲバンテ・ケミエ・インターナショナル・エディション（Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ．）、第４０巻、ｐ．２００４、２００１年）；ならびに、カルボニル化学、例えばオキシムエーテル、ヒドラゾン、および芳香族複素環の形成、が挙げられる。他の反応として、炭素−炭素多重結合、例えばエポキシ化（アドルフソン（Ａｄｏｌｆｓｓｏｎ）ら著、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．）、第４０巻、ｐ．３９９１、１９９９年）およびジヒドロキシル化（コルブ（Ｋｏｌｂ）ら著、ケミカル・レビューズ（Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．）第９４巻、ｐ．２４８３、１９９４年）およびアジド−ホスフィン共役（シュタウディンガー・ライゲーション（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ  ｌｉｇａｔｉ
ｏｎ）；シュタウディンガー（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ）ら著、ヘルベティカ・キミカ・アクタ（Ｈｅｌｖ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ．）、第２巻、ｐ．６３５、１９１９年；ゴロロボフ（Ｇｏｌｏｌｏｂｏｖ）ら著、４面体（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）、第３７巻、ｐ．４３７、１９８１年）、が挙げられる。
【００８０】
クリックケミストリーは、特にアミノ酸配列の標識にとって有用である。例えば、ワン（Ｗａｎｇ）ら著、米国化学会誌（Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．）、第１２５巻、ｐ．３１９２、２００３年；リンク（Ｌｉｎｋ）およびティレル（Ｔｉｒｒｅｌｌ）著、米国化学会誌（Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．）、第１２５巻、ｐ．１１１６４、２００３年、ディーターズ（Ｄｉｅｔｅｒｓ）ら著、米国化学会誌（Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．）、第１２５巻、ｐ．１１７８２、２００３年を参照。ペプチドは、リジンまたはシステイン残基のいずれかをアジドまたはアルキンで修飾し、その後フルオレセインを有する補助基と反応させることにより、フルオレセインで標識してもよい。同様に、ペプチドは、アジドまたはアセチレンに基づく合成アミノ酸を用いて合成してもよい。特に、アルキンまたはアジドを有するペプチドは、対応物の非天然アミノ酸と反応させてもよい。また、アジド−アルキン［３＋２］環化付加反応において、アジドまたはアルキンを有するペプチドをアジドまたはアルキンを有する色素と反応させることにより、有機分子をペプチドに挿入することも可能である。本発明においては、ＮＲＰ２９４５およびＮＮＺ−４９２１などのＮＲＰは、内部アルデヒド基を活性化させることによって修飾してもよく、それにより、ＣＸＣＲ４および／またはＣＣＲ３受容体の結合時に蛍光が発せられるようになる（サリック（Ｓａｌｉｃ）およびミッチソン（Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ）著、プロナス（ＰＮＡＳ）、第１０５巻（７）、ｐｐ．２４１５〜２４２０、２００８年）。
【００８１】
他の実施形態では、ＮＲＰは、有望な薬剤候補のスクリーニングにおいて使用される。かかるスクリーニング法は、ＣＸＣＲ４受容体への結合時に検出可能なシグナルを有する標識ＮＲＰを提供することによって実施してもよい。ＣＸＣＲ４受容体は、少なくとも１つの試験分子と既知の濃度で接触することで、試験試料が形成される。次いで、試験試料は、ＮＲＰと接触される。それとは別に、ＮＲＰは、任意の試験分子を含まない試料に添加され、対照試料が形成される。試験試料から得られるシグナルは、対照試料から得られるシグナルと比較される。
【００８２】
ＮＲＰと受容体の結合によって誘発されるシグナルは、蛍光シグナルであってもよい。一例として、シグナルは、第２のアクセサリー分子の添加時に誘発してもよく、例えば蛍光分子は、標識ＮＲＰに結合する分子に結合させてもよい。１つの特定例として、ＮＲＰは、ビオチンで標識してもよく、またアクセサリー分子は、蛍光標識されたストレプトアビジン分子であってもよい。かかる実験においては、ＣＸＣＲ４受容体は、細胞株中で発現させてもよい。プロセスは、用量反応曲線として実施してもよい。試験化合物は、異なる濃度で受容体とともにインキュベートしてもよく、標識ＮＲＰの結合後に誘発されるシグナルは、測定され、対照と、さらには相互に比較される。
【００８３】
別のアプローチとして、試験化合物は、ＣＸＣＲ４を遮断するモノクローナル抗体を用いて、受容体結合についてアッセイしてもよい（フォン・チャーナー（ｖｏｎ  Ｔｓｃｈａｒｎｅｒ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３２４巻、ｐ．３６９〜３７２、１９８６年；米国特許第８１３８３０４号明細書も参照）。試験化合物とＮＲＰの競合は、上記のように行ってもよい。他の競合実験は、ＣＸＣＲ４受容体の代わりにまたはそれに加えて、ＣＣＲ３受容体を用いて行ってもよい。
【００８４】
ＮＲＰの治療用途
ＣＮＳ損傷および障害
本明細書に示される実験結果に基づき、ＮＲＰ２９４５、ＮＮＺ−４９２１、およびそ
の機能的類似体などのＮＲＰは、中枢神経系（ＣＮＳ：ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ
ｓｙｓｔｅｍ）におけるアポトーシスを介した細胞死を予防するために使用してもよい。特に、ＮＲＰは、作製し、ＣＮＳ損傷または疾患を発症した患者に投与してもよい。
【００８５】
ニューロンのアポトーシスは、急性ＣＮＳ損傷、例えば、虚血性または外傷性障害に続く細胞欠損、ならびに慢性神経変性に関与する。ＣＮＳ損傷は、ニューロン、星状細胞、乏突起膠細胞、ならびに好中球、ミクログリア、およびマクロファージなどの炎症細胞においてアポトーシス死をもたらしうる。アポトーシスを介したニューロン死はまた、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病、脳卒中、進行性ＭＳおよび筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ：ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）を含む神経障害に関与する。かかる障害では、アポトーシスは、酸化ストレス、ならびにミトコンドリアおよびＥＲ機能障害を生じるカルシウム恒常性の撹乱を含む。
【００８６】
ＮＲＰの保護活性は、予防的治療において、例えば、ＣＮＳにおける細胞死を遮断または低減するため、利用してもよい。したがって、ＮＲＰは、脳卒中、虚血性脳卒中、低酸素／虚血、虚血性梗塞、アテローム硬化性血栓症（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）、ラクナ（ｌａｃｕｎｅｓ）、塞栓症、高血圧性出血、破裂動脈瘤、血管奇形、一過性脳虚血発作、頭蓋内出血、自然発症くも膜下出血、低酸素性虚血性脳症、高血圧性脳症、脳動脈の炎症性疾患、例えば心不全（おそらくは冠動脈バイパス術に起因する）によって誘発される灌流低下、および脳血管疾患の他の形態、を含む脳血管障害の効果からＣＮＳ細胞を保護しうる。
【００８７】
ＮＲＰはまた、頭蓋底骨折、脳神経損傷、びまん性軸索損傷、窒息、周産期低酸素虚血性損傷、頸動脈海綿洞瘻、気頭症、気瘤および鼻漏、脳挫傷、外傷性脳損傷、外傷性脳内出血、外傷性脳損傷、穿通性外傷性脳損傷および小児における急性脳腫脹を含む、脊髄または頭蓋脳損傷に引き続くアポトーシスからＣＮＳ細胞を保護するために使用してもよい。
【００８８】
ＮＲＰは、さらに、視神経脊髄炎、急性散在性脳脊髄炎、急性および亜急性壊死性出血性脳炎、末梢神経障害に併発するシルダー汎発性脳硬化症および多発性硬化症、ならびに進行性認知症、びまん性脳萎縮、非アルツハイマー型のびまん性皮質萎縮、レビー小体病、ピック病、前頭側頭型認知症、視床変性症、深部虚血性および出血性視床脳卒中（ｄｅｅｐ  ｉｓｃｈａｅｍｉｃ  ａｎｄ  ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｔｈａｌａｍｉｃ  ｓｔｒｏｋｅｓ）、非ハンチントン型舞踏病および認知症、皮質脊髄変性（ヤコブ病）、認知症−パーキンソン病−筋萎縮性側索硬化症合併症（グアマニナ（Ｇｕａｍａｎｉｎａ）およびその他）および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のうちの１つ以上を含む神経系の変性疾患を含む脱髄性疾患に起因するアポトーシスからＣＮＳ細胞を保護するために使用してもよい。
【００８９】
さらに、ＮＲＰは、末梢神経障害に起因するアポトーシスからＣＮＳ細胞を保護するために使用してもよい。末梢神経障害には１００を超えるタイプがあり、各々、症状、発生のパターン、および予後からなる一連のその固有の特徴を有する。末梢神経障害は、遺伝性または後天性のいずれかでありうる。遺伝型の末梢神経障害は、遺伝子突然変異または潜在的な遺伝子発現の乱れをもたらす後成的に関連のあるゲノムの領域内での有意な遺伝的変異によって誘発されうる。
【００９０】
後天性末梢神経障害は、例えば、神経に至る肉体的損傷（外傷）、腫瘍、毒素（化学療法を含む）、自己免疫応答、栄養障害、アルコール依存、血管および代謝障害（例えば、糖尿病性神経障害）に起因しうる。ＨＩＶ関連末梢神経障害は、ＨＩＶウイルスの逆転写酵素を標的にする薬剤の一般的な副作用である。末梢神経障害の症状は、一過性のしびれ
、刺痛、およびチクチクする感覚、触覚または筋力低下に対する感受性から、灼熱痛、筋消耗、麻痺、器官または腺の機能障害などのより極端な症状まで様々でありうる。
【００９１】
さらに、ＮＲＰは、錯乱、昏迷または昏睡−虚血−低酸素症、低血糖症、高血糖症、高炭酸ガス血症、肝不全およびライ症候群のうちの１つ以上を含む症候群を呈する代謝疾患、進行性錐体外路症候群を呈する代謝疾患、小脳性運動失調、高熱症、セリアック・スプルー病を呈する代謝疾患、クッシング病およびステロイド脳症、甲状腺性精神病および甲状腺機能低下症および膵性脳症を含む精神病または認知症を引き起こす代謝疾患、を含む神経系の後天性代謝障害に起因するアポトーシスからＣＮＳ細胞を保護するために使用してもよい。神経障害を生じうる代謝障害の例として、ビタミンＢ６（ピリドキシン）の過剰な消費が挙げられる。これは、一日推奨摂取量の１００倍上回る量が数週間摂取される場合によって発症しうる。
【００９２】
さらなる態様では、ＮＲＰは、栄養障害、薬剤、アルコール、およびアルコール依存による神経系の疾患に起因するアポトーシスからＣＮＳ細胞を保護するために使用してもよい。薬剤および他の化学薬品による神経系の障害は、オピエートおよび合成鎮痛薬、鎮静・催眠薬、刺激薬、向精神薬、細菌性毒素、植物毒、有毒生物咬傷および刺傷、重金属、工業毒、抗新生物薬および免疫抑制薬、サリドマイド、アミノグリコシド抗生物質（聴器毒性）およびペニシリン誘導体（発作）、および心保護薬（β遮断薬、ジギタリス誘導体およびアミオダロン）を含む。
【００９３】
本発明の組成物および方法は、限定はされないが、ＣＮＳ毒素への暴露、および中枢神経系の感染、例えば細菌、真菌、スピロヘータ、寄生虫、およびサルコイド感染、例えば発熱性感染症、細菌性髄膜炎、および軟膜炎を含む、急性脳損傷によるＣＮＳにおける細胞死の予防においても用途が見出される。
【００９４】
上記の疾患または損傷のうちの１つ以上を患う患者であれば、ＣＮＳにおけるアポトーシスを遮断または低減可能な予防的治療の恩恵を受けることになる。
増殖性状態
本明細書に示されるように、ＮＲＰ２９４５は、様々な増殖性状態、特に過形成、がん、および転移に関与している、ＣＸＣＲ４の発現を下方制御する。ＮＲＰ２９４５はまた、ＣＸＣＲ４／ＣＣＲ３を発現するがん細胞に対して抗浸潤性および抗移動性効果を有することが本明細書中に示されている。したがって、ＮＲＰは、ある範囲の増殖性状態に対する予防薬および／または治療薬において使用してもよい。ＮＲＰ、特にＮＲＰ２９４５、ＮＮＺ−４９２１、およびその機能的類似体は、がん細胞の移動、浸潤、および／または転移を阻害するために使用してもよい。
【００９５】
様々な態様において、ＮＲＰは、増殖性状態、例えば過形成およびがんを予防または治療するか、あるいは転移性疾患を予防または阻害するための作用物質として使用してもよい。したがって、ＮＲＰは、口腔がん、咽喉がん、口唇がん、舌がん、歯肉がん、鼻咽頭がん、食道がん、胃がん、小腸がん、結腸直腸がんを含む大腸がん、肝臓がん、胆嚢がん、膵がん、鼻腔がん、肺がん、骨がん、軟部組織がん、皮膚がん、メラノーマ、乳がん、子宮がん、卵巣がん、前立腺がん、睾丸がん、陰茎がん、膀胱がん、腎臓がん、脳がん、特に、多形神経膠芽腫および神経芽細胞腫、甲状腺がん、リンパ腫、白血病などの寛解、予防、および／または治療にとって有用でありうる。
【００９６】
ＮＲＰは、特に、前立腺がんの治療または寛解、および／または前立腺がんの転移の予防または阻害に適する場合がある。また、腺がん、特に悪性の腺がんは注目すべきである。典型的な腺がんは、前立腺のもの、ならびに結腸、直腸、肺、子宮頸部、前立腺、尿膜管、腟、乳房、食道、膵臓、胃、および咽頭の腺がんを含む。
【００９７】
ＮＲＰは、特に、悪性増殖性または腫瘍性疾患、例えば、腫瘍、例えば乳腺腫瘍；循環系腫瘍（例えば、心臓、縦隔、胸膜、および他の胸腔内臓器腫瘍、血管腫瘍、および腫瘍関連血管組織）；排泄系腫瘍（例えば、腎臓、腎盂、尿管、膀胱、他の不特定の泌尿器腫瘍）；胃腸管腫瘍（例えば、食道、胃、小腸、結腸、結腸直腸、直腸Ｓ状部、直腸、肛門および肛門管腫瘍）、肝臓および肝内胆管、胆嚢、胆道の他の不特定の部分、膵臓、他の消化器の腫瘍を含む腫瘍）；頭頸部；口腔腫瘍（例えば、唇、舌、歯肉、口腔底、口蓋、および口の他の部分、耳下腺、および唾液腺の他の部分、扁桃腺、中咽頭、鼻咽頭、梨状陥凹、下咽頭、および唇における他の部位、口腔および咽頭の腫瘍）、の予防または治療において有用であると考えられる。
【００９８】
また、生殖器系腫瘍（例えば、外陰部、腟、子宮頸部、子宮体、子宮、卵巣、および女性生殖器に関連する他の部位、胎盤、陰茎、前立腺、精巣、および男性生殖器に関連する他の部位）；気道腫瘍（例えば、鼻腔および中耳、副洞、喉頭、気管、気管支、および肺の腫瘍、例えば、小細胞肺がんまたは非小細胞肺がん）；骨格系腫瘍（例えば、肢の骨および関節軟骨、骨・関節軟骨および他の部位）；皮膚腫瘍（例えば、皮膚の悪性メラノーマ、非メラノーマ皮膚がん、皮膚の基底細胞がん、皮膚の扁平上皮がん、中皮腫、カポジ肉腫）；ならびに脳および他の中枢神経系腫瘍（例えば、髄膜、脳、脊髄、脳神経および中枢神経系の他の部分の腫瘍、例えば、神経膠芽腫または髄質芽細胞腫）；ならびに頭部および／または頸部がん、も含まれる。
【００９９】
さらに、末梢神経および自律神経系、結合および軟部組織、後腹膜および腹膜、眼および付属器、甲状腺、副腎および他の内分泌腺および関連の構造体を含む他の組織に関与する腫瘍、リンパ節の二次および不特定の悪性新生物、呼吸器系および消化器系の二次悪性新生物および他の部位の二次悪性新生物、血液およびリンパ系の腫瘍（例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、エイズ関連リンパ腫、悪性免疫増殖性疾患、多発性骨髄腫および悪性形質細胞新生物（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌ  ｎｅｏｐｌａｓｍｓ）、リンパ性白血病、急性または慢性骨髄性白血病、急性または慢性リンパ性白血病、単球性白血病、特定細胞型の他の白血病、不特定細胞型の白血病、リンパ系、造血および関連組織の他の不特定の悪性新生物、例えばびまん性大細胞型リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫または皮膚Ｔ細胞リンパ腫）、も含まれる。脊髄がんとして、例えば急性または慢性骨髄性白血病が挙げられる。
【０１００】
腫瘍、腫瘍性疾患、がん（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、またはがん（ｃａｎｃｅｒ）が言及される場合、これはまた、元の器官または組織における転移、および／または、元の部位に代わってまたはそれに加えた任意の他の部位における転移を含み、この任意の他の部位は、腫瘍および／または転移のいずれの１もしくは複数の部位でもありうる。ＮＲＰは、それを必要とする被験者において、腫瘍侵襲性またはかかる腫瘍成長に関連した症状を治療するか、腫瘍の転移拡散を予防するか、あるいは微小転移の成長を予防または阻害する、特に腫瘍の転移拡散を治療または予防する場合に適用される。
【０１０１】
一実施形態では、ＮＲＰは、ＣＸＣＲ４受容体系の脱感作およびそれに続く機能不全をもたらす、ＣＸＣＲ４および／またはＳＤＦ−１の過剰発現によって媒介される転移、腫瘍侵襲性、および／または腫瘍成長を予防または治療する場合に適用される。さらなる実施形態では、ＮＲＰは、それを必要とする被験者に、腫瘍に関連した調節解除された血管新生、例えばＣＸＣＲ４および／またはＳＤＦ−１によって媒介される血管新生を阻害または制御する場合に適用される。
【０１０２】
抗がん剤としてのＮＲＰの使用は、特に、他の抗がん薬、例えば、化学療法薬、免疫療法薬、または細胞成長因子およびそれらの受容体の活性を阻害する薬剤と同時に行っても
よい。したがって、ＮＲＰは、単一の調製形態で使用される場合、有益な治療活性を示しうるが、同活性は、１つ以上の併用薬と併用される場合、さらに増強されうる。同時投与においては、典型的な化学療法薬は、アルキル化薬、代謝拮抗薬、抗生物質および植物由来の抗がん薬を含む。
【０１０３】
アルキル化薬として、ナイトロジェンマスタード、ナイトロジェンマスタード−Ｎ−オキシド塩酸塩、クロラムブチル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｔｙｌ）、シクロホスファミド、イホスファミド、チオテパ、カルボコン、インプロスルファントシラート、ブスルファン、ニムスチン塩酸塩、ミトブロニトール、メルファラン、ダカルバジン、ラニムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、トリエチレンメラミン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ピポブロマン、エトグルシド、アルトレタミン、アンバムスチン、ジブロスピジウム塩酸塩（ｄｉｂｒｏｓｐｉｄｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ホテムスチン、プレドニムスチン、プミテパ（ｐｕｍｉｔｅｐａ）、リボムスチン（ｒｉｂｏｍｕｓｔｉｎ）、テモゾロミド、トレオスルファン、トロホスファミド、ジノスタチンスチマラマー、カルボコン、アドゼレチン（Ａｄｚｅｌｅｃｉｎ）、システムスチン（ｓｙｓｔｅｍｓｔｉｎ）、ビセレシン、白金錯体（カルボプラチン、シスプラチン、ミボプラチン（ｍｉｂｏｐｌａｔｉｎ）、ネダプラチン、オキサリプラチンなど）、が挙げられる。
【０１０４】
代謝拮抗薬は、例えば、メルカプトプリン、６−メルカプトプリンリボシド、チオイノシン、メトトレキサート、エノシタビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、アンシタビン塩酸塩、５−ＦＵ剤（例えば、フルオロウラシル、テガフール、ＵＦＴ、ドキシフルリジン、カルモフール、ガロシタビン（ｇａｌｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、エミテフール（ｅｍｉｔｅｆｕｒ）など）、アミノプテリン、ロイコボリンカルシウム、タブロイド（ｔａｂｌｏｉｄ）、ブトシン（ｂｕｔｏｃｉｎ）、カルシウムホリエート（ｃａｌｃｉｕｍ  ｆｏｌｉａｔｅ）、レボホリナートカルシウム、クラドリビン、エミテフール、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、ペントスタチン、ピリトレキシム、イドクスウリジン、ミトグザオン（ｍｉｔｏｇｕｚａｏｎ）、チアゾフリン（ｔｈｉａｚｏｆｕｒｉｎ）、アンバムスチン（ａｍｂａｍｕｓｔｉｎ）およびゲムシタビン、を含んでもよい。
【０１０５】
抗がん抗生物質は、例えば、アントラサイクリン抗がん剤（ドキソルビシン塩酸塩、ダウノルビシン塩酸塩、アクラルビシン塩酸塩、ピラルビシン塩酸塩（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、エピルビシン塩酸塩など）、アクチノマイシンＤ、アクチノマイシンＣ、マイトマイシンＣ、クロモマイシンＡ３、ブレオマイシン塩酸塩、ブレオマイシン硫酸塩、フレオマイシン硫酸塩（ｐｈｌｅｏｍｙｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、ネオカルチノスタチン、ミスラマイシン、サルコマイシン（ｓａｒｋｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、ミトタン、ゾルビシン塩酸塩（ｚｏｒｂｉｃｉｎ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ミトキサントロン塩酸塩およびイダルビシン塩酸塩、を含んでもよい。
【０１０６】
植物由来の抗がん剤は、例えば、ビンカアルカロイド抗がん剤（ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、ビンデシン硫酸塩（ｖｉｎｄｅｓｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）、ビノレルビンなど）、タキサン抗がん剤（イチイ属／イチイの植物由来、タキソール型の薬剤）、（パクリタキセル、ドセタキセルなど）、エトポシド、エトポシドリン酸塩、テニポシド、およびビノレルビン、を含んでもよい。
【０１０７】
細胞成長因子およびそれらの受容体の活性を阻害する前記薬剤における細胞成長因子は、ＥＧＦ（上皮成長因子：ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）またはＥＧＦと実質的に同じ活性を有する材料（例えば、ＥＧＦ、ＨＥＲ２リガンドなど）、イン
スリンまたはインスリンと実質的に同じ活性を有する材料（例えば、インスリン、ＩＧＦ（インスリン様成長因子：ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）−１、ＩＧＦ−２など）、ＦＧＦ（線維芽細胞成長因子：ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦと実質的に同じ活性を有する材料（例えば、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、ＫＧＦ（ケラチノサイト成長因子：ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ−１０など）、または他の細胞成長因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子：ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｇｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、ＥＰＯ（エリスロポエチン：ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ＩＬ−２（インターロイキン２：ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２）、ＮＧＦ（神経成長因子：ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子：ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＴＧＦ−β（トランスフォーミング成長因子：ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＨＧＦ（肝細胞成長因子：ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子：ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）など）、を含んでもよい。
【０１０８】
細胞成長因子の受容体は、上記の細胞成長因子に結合する能力を有する任意の受容体であってもよい。詳細には、それらは、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、インスリン受容体、ＩＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体１またはＦＧＦ受容体２、ＨＧＦ受容体（ｃ−ｍｅｔ）、ＶＥＧ受容体、ＳＣＦ受容体（ｃ−ｋｉｔ）、インスリン受容体およびソニックヘッジホッグ（ＥＰＯに対する標的）を含む。細胞成長因子の活性を阻害する薬剤は、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（ＨＥＲ２抗体）、グリベック（ＧＬＥＥＶＥＣ）（ｃ−ｍｅｔ、ｃ−ｋｉｔ、Ａｂｌ阻害剤）、イレッサ（Ｉｒｅｓｓａ）（ＥＧＦ受容体阻害剤）などを含んでもよい。上記薬剤に加えて、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカンなど）、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、ソブゾキサンなど）、血管新生阻害剤などもまた、使用してもよい。
【０１０９】
心血管疾患
ＣＸＣＲ４は、心不全を有する患者において過剰発現され、本明細書中に示されるように、ＮＲＰ２９４５は、ＣＸＣＲ４の発現を下方制御する。したがって、ＮＲＰ２９４５、ＮＮＺ−４９２１、およびその機能的類似体などのＮＲＰは、心不全および他の心血管疾患のための予防薬および／または治療薬において使用してもよい。
【０１１０】
心不全（うっ血性心不全（ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）またはうっ血性心不全（ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆａｉｌｕｒｅ）と称されることが多い）は、心臓が十分なポンプ作用を提供し、血流を分布させ、身体の需要を満たすことができない場合に生じる。心不全は、例えば、心筋梗塞や、様々な形態の虚血性心疾患、高血圧、心臓弁疾患、および／または心筋症と関連する場合がある。例えば、マクマレー（ＭｃＭｕｒｒａｙ）およびプフェッファー（Ｐｆｅｆｆｅｒ）、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）著、第３６５巻（９４７４）、ｐ．１８７７〜８９、２００５年を参照。
【０１１１】
心不全はまた、酸素および栄養分に対する身体の必要量が増加し、需要が心臓の能力を超える場合に生じうる。これは、重症貧血、グラム陰性敗血症、脚気（ビタミンＢ１／チアミン欠乏）、甲状腺中毒症、パジェット病、動静脈瘻、または動静脈奇形と合併して生じうる。
【０１１２】
診断の間、心不全は、慢性（例えば、喫煙、肥満、または糖尿病に関連）、または急性として特徴づけられる場合がある。急性非代償性心不全は、増悪するものか、あるいは、患者が緊急の治療または入院を必要とする症状を有するというエピソードを示す非代償性心不全である。例えば、ジェサップ（Ｊｅｓｓｕｐ）ら著、サーキュレーション（Ｃｉｒ
ｃｕｌａｔｉｏｎ）、第１１９巻（１４）、ｐ．１９７７〜２０１６、２００９年を参照。
【０１１３】
心不全は、心臓の片側に対する疾患（すなわち、左心不全と右心不全）、または両側に対する疾患（すなわち、混合症状）を含んでもよい。それは、収縮不全または拡張機能障害に関連しうる。同疾患は、静脈背圧（前負荷）の一次的な増加、または十分な動脈灌流（後負荷）を供給できないことに起因しうる。この疾患は、高い全身血管抵抗を伴う低い心拍出量または低い血管抵抗を伴う高い心拍出量（すなわち、低拍出性心不全と高拍出性心不全）に起因しうる。心不全のあらゆる形態および原因は、本明細書に包含される。
【０１１４】
予防または治療可能な他の心血管疾患は、冠動脈心疾患（虚血性心疾患または冠動脈疾患とも称される）、心筋症（心筋の疾患）、高血圧性心疾患（高血圧に続発する心臓の疾患）、不整脈（心拍リズムの異常）、炎症性心疾患、例えば心内膜炎（心臓の内層の炎症）、炎症性心肥大、心筋炎（心臓の筋肉部分の炎症）、心臓弁疾患、脳血管疾患（脳卒中など、脳に供給する血管の疾患）、末梢動脈疾患（手足に供給する血管の疾患）、先天性心疾患（出生時に存在する心奇形）、およびリウマチ性心疾患（リウマチ熱による心臓障害）、を含む。
【０１１５】
心血管作動薬としてのＮＲＰの使用は、他の心血管治療薬と同時に行ってもよい。例えば、１つ以上のＮＲＰは、１つ以上のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬、ジゴキシン、β遮断薬、利尿薬、またはアルドステロン拮抗薬とともに投与してもよい。
【０１１６】
非限定的な例証が、以下のように提供される。ＡＣＥ阻害剤は、エナラプリル（例えば、バソテック（Ｖａｓｏｔｅｃ）（登録商標））、リシノプリル（例えば、プリニビル（Ｐｒｉｎｉｖｉｌ）（登録商標）、ゼストリル（Ｚｅｓｔｒｉｌ）（登録商標））、およびカプトプリル（例えば、カポテン（Ｃａｐｏｔｅｎ）（登録商標））を含む。アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬は、ロサルタン（例えば、コザール（Ｃｏｚａａｒ）（登録商標））およびバルサルタン（例えば、ディオバン（Ｄｉｏｖａｎ）（登録商標））を含む。ジゴキシン（例えば、ラノキシン（Ｌａｎｏｘｉｎ）（登録商標））はまた、ジギタリスと称される。β遮断薬は、カルベジロール（例えば、コレグ（Ｃｏｒｅｇ）（登録商標））、メトプロロール（例えば、ロプレッサー（Ｌｏｐｒｅｓｓｏｒ）（登録商標））、およびビソプロロール（例えば、ゼベタ（Ｚｅｂｅｔａ）（登録商標））を含む。利尿薬は、ブメタニド（例えば、ブメックス（Ｂｕｍｅｘ）（登録商標））およびフロセミド（例えば、ラシックス（Ｌａｓｉｘ）（登録商標））を含む。アルドステロン拮抗薬は、スピロノラクトン（例えば、アルダクトン（Ａｌｄａｃｔｏｎｅ）（登録商標））およびエプレレノン（例えば、インスプラ（Ｉｎｓｐｒａ）（登録商標））を含む。
【０１１７】
糖尿病状態
ＣＸＣＲ４シグナル伝達は、膵島細胞の発生にとって必要である。本明細書に示されるように、ＮＲＰ２９４５およびＮＮＺ−４９２１などのＮＲＰは、ＣＸＣＲ４アゴニストであり、ＣＸＣＲ４／ＣＣＲ３のヘテロ二量体に結合する。したがって、ＮＲＰ２９４５、ＮＮＺ−４９２１、およびその機能的類似体などのＮＲＰは、糖尿病、特に膵β細胞がＣＸＣＲ４およびＣＣＲ３を同時発現させる１型糖尿病のための予防薬および／または治療薬において使用してもよい。
【０１１８】
１型糖尿病（１型糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ  ｔｙｐｅ  １）とも称され、かつてはインスリン依存性糖尿病または若年性糖尿病と称された）は、インスリンを産生する膵臓のβ細胞の自己免疫性破壊に起因する糖尿病の一形態である。続発するインスリン欠乏は、血中および尿中グルコースの増加をもたらす。１型糖尿病は、脱水、
体重減少、糖尿病性ケトアシドーシスに関連しており、最終的に神経（糖尿病性神経障害）および眼の小血管（糖尿病性網膜症）、腎臓（糖尿病性腎症）、および心臓に損傷をもたらし、また心臓発作および脳卒中を誘発しうる大動脈のアテローム動脈硬化症に人を罹患させる可能性がある。ＮＲＰは、これらの糖尿病状態の発症を停止または遅延させるのに有用でありうる。
【０１１９】
ＮＲＰは、糖尿病用の他の薬剤または治療と同時に使用してもよい。例えば、１つ以上のＮＲＰは、インスリン治療（例えば、皮下インスリン注射またはインスリンポンプ）とともに投与してもよく、または膵移植、膵島細胞移植、または幹細胞エデュケーター療法（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｅｄｕｃａｔｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ）と併用してもよい。特定の態様では、ＮＲＰは、免疫抑制薬と同時に使用してもよい。適切な薬剤として、例えば、シクロスポリンＡ、抗ＣＤ３抗体、例えばテプリズマブおよびオテリキシズマブ、抗ＣＤ２０抗体、例えばリツキシマブ、抗ＣＤ４抗体、および抗ＣＤ８抗体、が挙げられる。
【０１２０】
ＮＲＰの投与
ＮＲＰ２９４５、ＮＮＺ−４９２１、およびその機能的類似体などのＮＲＰは、患者への直接投与を介して使用してもよい。特に、１つ以上のＮＲＰは、治療薬として調製し、使用してもよい。ペプチドは、薬物または薬剤の一部として投与してもよい。これは、ＮＲＰに、任意の薬学的に適切な担体、アジュバント、または賦形剤を結合させることを含んでもよい。さらに、ＮＲＰは、他の非ＮＲＰ神経保護剤または他の治療薬とともに使用してもよい。担体、アジュバント、または賦形剤の選択は、利用される投与経路に左右されうる。
【０１２１】
投与経路は、特定の条件に適するように幅広く変更してもよい。ＮＲＰは、様々な方法で、すなわち腹腔内に、静脈内に、局所的に（例えば点眼剤）または脳室内に投与してもよい。末梢投与は、中枢神経系との直接的干渉を回避するため、使用してもよい。任意の既知の末梢投与経路は、使用してもよい。
【０１２２】
これは、非経口投与、例えば、末梢循環の中への注射、皮下投与、眼窩内投与、点眼、脊髄内投与、大槽内投与、局所投与、注入による投与（例えば、浸透圧ポンプまたは皮膚パッチなどの持続放出デバイスまたはミニポンプを使用）、植込錠による投与、エアロゾル投与、吸入による投与、乱刺投与（ｓｃａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、腹腔内投与、関節内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、経口投与、頬側投与、経肺投与、直腸投与または腟内投与を含む。
組成物は、上記のＣＮＳ細胞保護のため、治療有効量（例えば予防をもたらす量）でのヒトまたは他の哺乳類への非経口投与を意図して製剤化してもよい。特定の投与経路は、皮下注射（例えば、０．９％塩化ナトリウム中に溶解）および経口投与（例えば、カプセル剤中）を含む。
【０１２３】
ＮＲＰを患者のＣＮＳに直接的に投与することが望ましい場合がある。これは、任意の適切な投与経路により、行ってもよい。例として、側脳室内注射によるかまたは外科的に挿入されたシャントを通じた、患者の脳の側脳室へ、髄液中へまたは直接的に患者の脳の発症部位への投与が挙げられる。
【０１２４】
増殖性障害においては、注射は、腫瘍の内部または近位部位あるいは病変に直接的に、静脈内、筋肉内、皮下、臓器内、鼻腔内、皮内、眼内（例えば点眼剤）、脳内、直腸内、腟内、または腹腔内投与により、投与してもよい。
【０１２５】
上記の様々な治療法においては、１つ以上のＮＲＰは、患者にとっての利点を高めるため、１つ以上の併用薬とともに投与してもよい（例えば、１つ以上のＮＲＰとメチルプレ
ドニソン（ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）の併用療法）。この投与時間は限定されない。ＮＲＰおよび併用薬は、同時にまたは様々な時刻に被験体に投与してもよい。併用薬の用量は、臨床的に採用される通常用量に従ってもよく、また投与対象、投与経路、疾患状態、組み合わせなどに応じて適切に決定してもよい。
【０１２６】
ＮＲＰおよび併用薬の投与方法は、特に限定されることなく、ＮＲＰまたはその塩および投与時に結合させるべき併用薬にとって許容可能なものであってもよい。かかる投与方法は、例えば、ＮＲＰおよび併用薬の同時組み合わせによって製剤化された単一の調製物の投与であってもよい。あるいは、同時投与は、２つの異なる薬剤（一方はＮＲＰを用いて製剤化された薬剤であり、もう一方は併用薬である）の同一投与経路によるものであってもよい。
【０１２７】
別の実施形態として、同一経路による投与は、様々な時刻に、２つの異なる薬剤（一方はＮＲＰを用いて製剤化された薬剤であり、もう一方は併用薬である）を用いて行ってもよい。さらに別の実施形態として、同時投与は、２つの異なる薬剤（一方はＮＲＰを用いて製剤化された薬剤であり、もう一方は併用薬である）を用いた、異なる経路によるものであってもよい。さらに別の実施形態として、投与は、２つの異なる薬剤（一方はＮＲＰを用いて製剤化された薬剤であり、もう一方は併用薬（例えば、ＮＲＰの投与とその後の併用薬の投与、またはその逆）などである）を用いた、様々な時刻での異なる経路によるものであってもよい。
【０１２８】
いずれの併用薬であっても低毒性を有する必要がある。したがって、かかる薬剤は、当該技術分野で既知の方法に従い、ＮＲＰおよび／または上記の併用薬を薬理学的に許容できる担体と混合することによって調製された医薬組成物の形態で、安全に経口的または非経口的に（例えば、局所、直腸、静脈などにより）投与してもよい。かかる医薬組成物として、限定はされないが、錠剤（糖衣錠およびフィルムコート錠を含む）、散剤、顆粒剤、カプセル剤（ソフトカプセルを含む）、溶液、注射、坐剤、徐放性製剤などが挙げられる。
【０１２９】
ＮＲＰの治療量
投与されるべきＮＲＰ、例えば、ＮＲＰ２９４５、ＮＮＺ−４９２１、またはその機能的類似体の有効量の決定は、当業者の技能の範囲内であり、かつ当業者にとって一般的なものである。特定の実施形態では、使用されるべきＮＲＰの量は、本明細書に記載のアッセイ系を用いたインビトロ試験によって評価してもよい。投与されるべきＮＲＰの最終量は、投与経路、使用されるＮＲＰや治療されるべき障害または状態の性質に左右されることになる。
【０１３０】
薬物中への封入については、ＮＲＰは、本明細書に記載のような従来の方法により、直接的に合成してもよい。ＮＲＰ化合物を含有する組成物は、本明細書に記載の経路を含む１つ以上の経路により投与してもよい。例として、静脈内、腹腔内、脳内、脳室内、吸入、洗浄、直腸、腟内、経皮、または皮下投与は、使用してもよい。
【０１３１】
適切な用量範囲は、例えば、約０．１μｇ〜約１５μｇ／ｋｇ体重、または他の実施形態では、約２０μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇ体重／日であってもよい。他の用量としては、約０．１μｇ／ｋｇ体重〜約１００μｇ／ｋｇ体重の範囲であってもよい。他の実施形態では、１μｇ／ｋｇ体重〜約１０μｇ／ｋｇ体重の用量は、有用でありうる。さらなる実施形態では、ＮＲＰの用量は、約０．１μｇ／ｋｇ体重〜約０．１ｍｇ／ｋｇの範囲内であってもよい。記載された用量が限定を意図していないことは理解されるであろう。記載された範囲外の他の用量については、当業者によって決定してもよい。
【０１３２】
ＮＲＰが別の薬剤と組み合わせて投与される場合、併用薬の含量は、使用される薬物製剤形態に応じて変わることになる。それは、全製剤中、約０．１〜１００重量％、または約０．１〜５０重量％、または約０．５〜２０重量％であってもよい。併用薬中の担体などの添加剤の含量もまた、使用される薬物製剤形態に応じて変わってもよい。それは、全製剤中、約１〜９９．９重量％、または約１０〜９０重量％であってもよい。
【０１３３】
一般的提案として、非経口投与されるＮＲＰの１用量あたりの全薬学的有効量は、用量応答曲線によって測定可能な範囲内となる。例えば、血中のＮＲＰは、治療されるべき哺乳動物の体液中で測定し、投薬量を決定してもよい。あるいは、漸増量のＮＲＰ化合物を患者に投与し、同ペプチドに対する患者の血清レベルを検査してもよい。使用すべきＮＲＰの量は、ＮＲＰのこれらの血清レベルに基づき、モル基準で計算してもよい。
【０１３４】
化合物の適切な投薬量を決定するための一方法は、体液または血液などの生体液中のＮＲＰレベルを測定することを必要とする。かかるレベルの測定は、例えば、１３Ｃ−１５Ｎで標識されたＮＲＰ２９４５またはＮＮＺ−４９２１を使用し、ＲＩＡ  ＥＬＩＳＡおよびＨＰＬＣに基づく方法を含む任意の手段により、行ってもよい。ＮＲＰレベルを測定後、生体液は、単一または複数用量を用いて同化合物と接触される。この接触ステップ後、ＮＲＰレベルは、生体液中で再測定される。生体液中のＮＲＰレベルが、同分子が投与されるべきである場合の所望される有効性をもたらすのに十分な量低下している場合、同分子の用量は、最大有効性をもたらすように調整してもよい。
【０１３５】
この方法は、インビトロまたはインビボで行ってもよい。例えば、生体液が哺乳動物から抽出され、ＮＲＰレベルが測定された後、本明細書中の化合物は、単一または複数用量を用いて哺乳動物に投与してもよく（すなわち、接触ステップは、哺乳動物への投与によってなされる）、次いでＮＲＰレベルは、哺乳動物から抽出された生体液から再測定される。
【０１３６】
ＮＲＰは、徐放系により適切に投与してもよい。徐放性組成物の例として、成型物の形態での半透性ポリマーマトリックス、例えばフィルム、またはマイクロカプセルが挙げられる。徐放性マトリックスは、ポリ乳酸（米国特許第３７７３９１９号明細書、欧州特許第５８４８１号明細書）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）ら、１９８１年）、酢酸エチレンビニル（ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）ら、上記）、またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３９８８号明細書）を含む。徐放性組成物はまた、リポソーム結合（ｌｉｐｏｓｏｍａｌｌｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）化合物を含む。
【０１３７】
化合物を含有するリポソームは、独国特許第３２１８１２１号明細書；フワン（Ｈｗａｎｇ）ら、１９８０年；欧州特許第５２３２２号明細書；欧州特許第３６６７６号明細書；欧州特許第８８０４６号明細書；欧州特許第１４３９４９号明細書；欧州特許第１４２６４１号明細書；日本国特許出願公開第８３−１１８００８号明細書、米国特許第４４８５０４５号明細書および米国特許第４５４４５４５号明細書ならびに欧州特許第１０２３２４号明細書によって例示される、当業者に既知の方法により調製される。リポソームは、脂質含量が約３０モルパーセントコレステロール（この選択された比率は最も有効な治療用に調節されている）より多い、小型単層型（約２００〜８００オングストローム）であってもよい。非ＰＥＧ化ペプチドよりも長寿命を有するＰＥＧ化ペプチドもまた、例えば国際公開第９５／３２００３号パンフレット中に記載の複合技術（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に基づいて使用してもよい。
【０１３８】
一部の実施形態では、ＮＲＰは、一般に、単位用量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、または乳濁液）での所望される純度の各々を、薬学的または非経口的に許容できる担体と
混合することにより、製剤化してもよい。許容できる担体とはすなわち、用いられる用量および濃度でレシピエントに対して無毒でありかつ製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の他の成分と適合できるものである。例えば、製剤は、好ましくは、ペプチドに対して有害であることが知られている酸化剤および他の化合物を含まない。
【０１３９】
一部の実施形態では、製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、化合物を、液体担体、または微粉化した固体担体、またはその両方と、均一かつ緊密に接触させることにより、調製してもよい。次いで、必要に応じて、生成物は、所望される製剤に形成してもよい。一部の実施形態では、担体は、非経口担体、あるいはレシピエントの血液と等張な溶液である。かかる担体媒体の例として、水、生理食塩水、リンガー液、緩衝溶液、およびデキストロース溶液が挙げられる。固定油およびオレイン酸エチルなどの非水性媒体もまた、本明細書において有用である。
【０１４０】
担体は、等張性および化学的安定性を高める物質などの添加剤を適度に少量含有する。かかる材料は、望ましくは、使用される用量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、またあくまで例として、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸、および他の有機酸またはそれらの塩などの緩衝液；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、例えばポリアルギニンまたはトリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン；グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、またはアルギニンなどのアミノ酸、を含む。
【０１４１】
他の添加剤は、単糖、二糖、および他の炭水化物、例えば、セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、トレハロース、またはデキストリン；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの対イオン；ポリソルベート、ポロクサマー、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤；および／または中性塩、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２など、を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、０．５Ｍスクロースまたは０．５Ｍトレハロースを用いて安定化させてもよい。かかる糖類を使用することにより、ペプチドの長期貯蔵が可能になる。
【０１４２】
ＮＲＰは、望ましくは、約６．５〜約８のｐＨでかかる媒体中で製剤化してもよい。他のｐＨレベル、例えば約４．５〜約８もまた、有用でありうる。特定の前述の賦形剤、担体、または安定剤を使用する結果、化合物の塩が形成されることは理解されるであろう。最終調製物は、安定な液体または凍結乾燥固体であってもよい。
【０１４３】
他の実施形態では、アジュバントは、使用してもよい。錠剤、カプセル剤などに組み込み可能な典型的なアジュバントは、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチンなどの結合剤；結晶セルロースなどの賦形剤；コーンスターチまたはアルギン酸のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；スクロースまたはラクトースなどの甘味料；ペパーミント、ウィンターグリーン、またはサクランボなどの香味料である。剤形がカプセル剤の場合、それはまた、上記材料に加えて、脂肪油などの液体担体を含有してもよい。様々なタイプの他の材料は、コーティング剤としてかまたは投薬単位の物理的形態の修飾因子として使用してもよい。シロップまたはエリキシル剤は、活性化合物、スクロースなどの甘味料、プロピルパラベンのような保存剤、着色料、およびサクランボなどの香味料を含有してもよい。
【０１４４】
注射用の無菌組成物は、従来からの薬務に従って製剤化してもよい。例えば、水、あるいはゴマ、ピーナッツ、または綿実油のような天然植物油、あるいはオレイン酸エチルのような合成脂肪媒体などの媒体中への活性化合物の溶解または懸濁は、所望される場合が
ある。緩衝液、保存剤、抗酸化剤などは、承認された薬務に従って、組み込んでもよい。
【０１４５】
望ましくは、治療的投与のために使用されるべきＮＲＰ組成物は、無菌であってもよい。無菌性は、無菌濾過膜（例えば、約０．２ミクロンの孔径を有する膜）を通す濾過により、容易に得ることができる。治療組成物は、一般に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルの中に入れてもよい。
【０１４６】
他の実施形態では、ＮＲＰは、単位または複数用量用の容器、例えば、水溶液としてかまたは再構成のための凍結乾燥製剤として、密封アンプルまたはバイアルの中に貯蔵してもよい。凍結乾燥製剤の例として、１０ｍｌのバイアルを、５ｍｌの無菌濾過された、化合物の０．０１％（ｗ／ｖ）水溶液で満たし、得られた混合物を凍結乾燥する。注入溶液は、静菌水または他の適切な溶媒を用いて凍結乾燥化合物を再構成することによって調製してもよい。
【０１４７】
さらなる実施形態では、キットは、所定量の凍結乾燥ＮＲＰ化合物、剤形の調製のための生理学的に適合性の溶液、混合バイアル、混合デバイス、および使用説明書を含んでもよい。かかるキットは、業界での通常業務に従って、作製し、保存してもよい。
【０１４８】
（実施例）
本明細書に記載の実施例は、本発明の特定の実施形態を例示する目的のために提供され、決して本発明を限定することを意図していない。当業者は、本明細書中の開示および教示内容を利用し、過度の実験を行うことなく、他の実施形態および変形形態を作成することができる。すべてのかかる実施形態および変形形態は、本発明の一部であると考えられる。
【０１４９】
実施例１：ヒトＥＳ細胞培養液
ヒトＥＳ細胞（ｈＥＳＣ：ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）を用いる実験は、ＮＨＭＲＣの指針および規制に従い、またオースティン・ヘルス・ヒューマン・リサーチ・エシックス・コミッティ（Ａｕｓｔｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｈｕｍａｎ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（承認番号Ｈ２００８／０３１９４）、およびメルボルン大学ヒューマン・リサーチ・エシックス・コミッティ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（承認番号０６０５０１７）の承認の下で行った。Ｈ９（ＷＡ−０９、ワイセル（ＷｉＣｅｌｌ））細胞株は、前述のように成長させた（ドットリ（Ｄｏｔｔｏｒｉ）およびペラ（Ｐｅｒａ）、２００７年）。
【０１５０】
簡潔に述べると、ｈＥＳＣは、１％のインスリン／トランスフェリン／セレン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ：ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）、２ｍＭのグルタミン、２５Ｕ／ｍｌのペニシリン、２５μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（全部がインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製）および２０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ：ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ））を添加した、ピルビン酸ナトリウムを含まない、高グルコースのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）からなるｈＥＳＣ培地中のマイトマイシンＣで処理されたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ：ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）において培養した。
【０１５１】
あるいは、ｈＥＳＣは、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、２ｍＭのグルタミン、２５Ｕ／ｍｌのペニシリン、２５μｇ／ｍｌのスト
レプトマイシンおよび２０％のノックアウト血清代替物（全部がインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製）を添加した、ＤＭＥＭ／栄養素混合物Ｆ−１２からなるＫＳＲ培地中のマイトマイシンＣで処理されたヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ；アメリカ培養細胞系統保存機関、ＣＲＬ−２０９７）において培養した。
【０１５２】
全細胞は、１００％湿度下、３７℃、５％ＣＯ２中で培養した。コロニーは、７日ごとに機械的に切断し（継代培養または継代し）、新しく調製したＭＥＦまたはＨＦＦに移した。培地は、２日ごとに変更した。
【０１５３】
実施例２：ニューロンの分化および成長
ニューロン分化は、ヒトニューロスフェアについてドットリ（Ｄｏｔｔｏｒｉ）によって適応された、マウスニューロスフェアについて記載されたノギン誘導方法を用いて行った（ドットリ（Ｄｏｔｔｏｒｉ）およびペラ（Ｐｅｒａ）、２００７年）。コロニーは、５００ｎｇ／ｍｌのノギンを添加したｈＥＳＣ培地中、５％ＣＯ２下、３７℃で１４日間維持する一方、ノギンを一日おきに交換した。
【０１５４】
この時点で、細胞は、ＰＢＳで洗浄し、コロニーは、再び機械的に分離したが、この時、コロニーの中心の（分化した）部分は、さらに２６ゲージ針を使用してより小さい切片に切断した。同切片は、１Ｘ  Ｂ−２７（登録商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））および１Ｘ  Ｎ−２（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、２０ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＥＧＦおよび２０ｎｇ／ｍｌのヒト組換えｂＦＧＦ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を添加したニューロベーサル（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ）（登録商標）Ａ（ＮＢＭ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を含有する低接着性９６ウェルプレート内の個々のウェルに移した。培地は、２〜３日ごとに変更し、２週間にわたってニューロスフェアを形成させておいた。
【０１５５】
ニューロン分化を促進するため、ニューロスフェアは、解剖顕微鏡下でより小さい切片に再び分離し、３〜４つの切片を９６ウェルプレートの各ウェルに移した。この移動の前に、プレートは、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＢＳ中、１０μｇ／ｍｌ）でプレコーティングし、ＰＢＳで洗浄し、マウスラミニン（ＰＢＳ中、５μｇ／ｍｌ）で再コーティングし、再洗浄した。次いで、細胞は、損傷の誘発および低体温の評価の前に、成長因子が欠如したＮＢＭ中で１１日間成長させた（培地は２日おきに変更した）。
【０１５６】
実施例３：損傷および低体温の誘発
実験の当日、培地を、通常の抗酸化剤が欠如したＢ２７調製物（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；１０８８９−０３８）を含有するＮＢＭ＋Ｎ２に変更し、その交絡効果を排除した（ＮＢＭ−ＡＯ）。
【０１５７】
実施例４：酸素およびグルコース欠乏（ＯＤＧ：Ｏｘｙｇｅｎ  ａｎｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ）
等張圧条件を維持するため、２５ｍＭの２−デオキシ−Ｄ−グルコースを、上記のように、ＮＢＭ−ＡＯ培地に添加し、最初の培地変更前に室温で３０分間平衡化した。１ｆＭ〜１００ｐＭの範囲で増加する濃度のＮＲＰ２９４５を、損傷誘発時に細胞に添加した（グリコシン（ＧｌｙｃｏＳｙｎ）、ローワーハット、ニュージーランド）。培養上清を、この４時間が経過後に除去し、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性について分析するまで、４℃で貯蔵した。
【０１５８】
培地を新しいＮＢＭ−ＡＯと交換し、ＬＤＨを再び測定するまで、薬物を含有させてさらに細胞を２０時間インキュベートした。実験の開始時、５０μΜの新しいＨ２Ｏ２（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｈ１００９）を成長因子が陰性のＮＢＭに添加することによって酸
化ストレスを誘発するとともに、培養を４時間継続してＬＤＨを測定し、Ｈ２Ｏ２を含まないＮＢＭ−ＡＯを培養液に戻し、それを、ＬＤＨを再測定するまでさらに２０時間維持した。濃度が１ｆＭ〜１００ｐＭの範囲のＮＲＰ２９４５を、酸化ストレス誘発時に細胞に添加した。
【０１５９】
損傷の誘発後の時間経過とともにＮＲＰ２９４５の効果を評価するため、最も活性のある２つの濃度でのＮＲＰ２９４５とのインキュベーションを、損傷の誘発の直後、１時間後、３時間後、および６時間後に開始し、モデルの各々において２４時間後まで維持し、上記のように、転帰を４時間後および２４時間後に評価した。乳酸脱水素酵素活性（全細胞死のマーカー）およびＴＵＮＥＬ染色（アポトーシス死のマーカー）の測定は、キットの製造業者の使用説明書に従って実施した（ロシェ（Ｒｏｃｈｅ）、各々、１１６４４７９００１および１１６８４７９５９１０）。
【０１６０】
実施例５：小脳微小外植片のための基材の調製
カバーガラスは、ニュージーランド・バイオラブ（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）から入手した（サイズ１８ｍｍ×１８ｍｍ）。カバースリップは、１５０ｍｍのペトリ皿内に１皿あたり８カバースリップで置いた。カバーガラスの両側は、無水エタノールに浸漬し、洗浄した。エタノールを廃棄し、オートクレーブしたミリＱ（ＭｉｌｌｉＱ）（登録商標）を添加し、カバーガラスの両側をリンスした。次いで、水を廃棄し、カバーガラスを層流下で風乾した。
【０１６１】
ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）は、シグマ（Ｓｉｇｍａ）から入手した（Ｐ７２８０、凍結乾燥散剤、γ照射、平均モル重量３０，０００〜７０，０００、試験対象の細胞培養液）。これをオートクレーブしたＰＢＳで希釈し、１ｍｇ／ｍｌの保存液を作製した。保存液は、５００μｌ／チューブのアリコートに分割し、−２０℃で貯蔵した。
【０１６２】
実験においては、ＰＤＬの保存液をＰＢＳで１：１０に希釈し、最終濃度が１００μｇ／ｍｌである希釈標準溶液を作製した。約１００μｌのＰＤＬ希釈標準溶液をカバーガラスに添加し、これを２時間（最低）から一晩、３４℃でインキュベートした。
【０１６３】
次いで、１０ｍｌより多いオートクレーブしたミリＱ（ＭｉｌｌｉＱ）（登録商標）を各ペトリ皿に添加し、ＰＤＬでコーティングしたカバーガラスをリンスした。次いで、カバーガラスを、６ウェルの培養プレートに移した。風乾後、プレートをホイルでラップし、使用するまで４℃で貯蔵した。貯蔵は、最大で２週間可能であった。
【０１６４】
実施例６：培養するための小脳微小外植片の調製
子ラットとして、Ｐ３／４またはＰ７／８のいずれかをこの実験用に使用した（ウィスターラット）。
【０１６５】
Ｐ３／４小脳皮質の抽出においては、０．５ｍｌの氷冷ＰＢＳ／０．６５％Ｄ（＋）−グルコース緩衝液をペトリ皿に入れ、組織をこの溶液に入れた。Ｐ７／８小脳皮質の抽出においては、１．０ｍｌの氷冷ＰＢＳ／０．６５％Ｄ（＋）−グルコース緩衝液をペトリ皿に入れ、組織をこの溶液に入れた。
【０１６６】
積層小脳皮質を外科的に除去し、氷冷ＰＢＳ／０．６５％Ｄ（＋）−グルコース緩衝液に上記の量を用いて直ちに貯蔵した。次いで、皮質をペトリ皿に移し、髄膜を小脳から除去した。組織をハサミによりスライスし、１ｃｃのシリンジに取り付けた２３ゲージサイズの針を１回（Ｐ３／Ｐ４子）または２回（Ｐ７／Ｐ８子）通し、均一なサイズの微小外植片を得た。これをペトリ皿内に蓄えた。
【０１６７】
次いで、組織を１５ｍｌのファルコンチューブに移し、４℃、３５０ｒｐｍで２分間遠心分離した。ＰＢＳ／Ｇｌｕ（＋）緩衝液は、ピペットを使用して慎重に廃棄した。ペレットは、１ｍｌ／子で、低温のニューロベーサル（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ）（登録商標）培地（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に再懸濁した。これを、４℃、３５０ｒｐｍ（６０ＸＧ）で２分間遠心分離した。
【０１６８】
培地は廃棄し、ペレットは、Ｐ３／４子につき０．５ｍｌおよびＰ７／８子につき１．５ｍｌの温かいニューロベーサル（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ）（登録商標）培地に再懸濁した。次いでこれを、６ウェルプレート内のＰＤＬでコーティングしたカバースリップ上に１カバーガラスあたり４０〜４５μｌの量で播種した。
【０１６９】
カバーガラスは、１００％の湿度下、５％ＣＯ２中、３４℃で、４５分〜１．５時間インキュベートし、付着を可能にした。次いで、ニューロベーサル（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ）（登録商標）培地を１ウェルあたり１ｍｌ添加し、微小外植片を顕微鏡下で付着性について検査した。
【０１７０】
実施例７：毒素、ＡＭＤ３１００、エオタキシン−３、およびＮＮＺ−４９２１の投与
毒素の３−ニトロプロピオン酸およびグルタミン酸塩は、１００倍の濃度で調製した。５０ｍＭの３−ニトロプロピオン酸（シグマ（Ｓｉｇｍａ））について、ＮａＯＨで７〜７．２のｐＨ値に保存液を滴定した。５０ｍＭのＬ−グルタミン酸塩については、これを加熱（熱水）下で溶解した。
【０１７１】
負の対照として、１０μｌの３−ニトロプロピオン酸および１０μｌのグルタミン酸塩を投与した（４ウェル）。正の対照として、２０μｌのＰＢＳを、毒素を全く含まない正常酸素圧下の微小外植片に投与した（４ウェル）。
【０１７２】
ＡＭＤ３１００（シグマ（Ｓｉｇｍａ）製の特異的なＣＸＣＲ４拮抗剤）を、３００ｎＭの濃度で同時投与する一方、ヒト組換えエオタキシン−３（ファルマコ（Ｐｈａｒｍａｃｏ））を、１０および１００ｎＭの最終濃度で各々同時に適用した。１ｆＭの最終濃度から始まり１００ｎＭの最終濃度までの希釈系列で、ＮＮＺ−４９２１（ＧＲＲＡＡＰＧＲＡＧＧ；配列番号２）を投与した（各希釈につき４ウェル）。
【０１７３】
実施例８：小脳微小外植片中の細胞の固定および計数
４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ：ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）溶液は、４ｇのＰＦＡ／１００ｍｌのＰＢＳおよび１００μｌの１Ｎ  ＮａＯＨ（最終が１ｍＭ  ＮａＯＨ）を用いて調製した。
【０１７４】
細胞培養の終了時、細胞培地をピペットにより除去し、１ウェルあたり１ｍｌのＰＦＡ溶液を添加した。固定は、室温で１０分間または４℃で一晩行った。固定後、ＰＦＡ溶液を除去し、１ウェルあたり１ｍｌのＰＢＳ溶液を添加した。
【０１７５】
完全な成長領域（付着したニューロン）について、スクリーニングした。１ウェルあたり最も高密度に集合した領域のうちの最高の４つを、双眼顕微鏡を使用して、２０倍の倍率下で観察した。各々の微小外植片の外側縁から移動した全細胞について計数した。
【０１７６】
実施例９：ヒトＤＵ−１４５前立腺がん細胞の運動性の分析
ヒト上皮ＤＵ−１４５細胞は、アメリカ培養細胞系統保存機関から得た（ＨＴＢ−８１）。ＤＵ−１４５細胞株は、脳内で形成された転移性の前立腺由来のがんから元は単離された。同細胞は、接着性があり、神経芽細胞およびニューロンに類似したＣＸＣＲ４およびＣＣＲ３受容体を同時発現する。この実験においては、ＤＵ−１４５細胞を、５％ＣＯ
２中で１０％ＦＢＳを有するアメリカ培養細胞系統保存機関で調合されたイーグル最小必須培地中、３７℃で培養した。次いで、同細胞を、次のように継代培養した。
【０１７７】
培地を除去し、廃棄した。細胞層は、０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシンおよび０．５ｍＭ  ＥＤＴＡで短時間リンスし、すべての残存するトリプシンインヒビターを血清から除去した。各フラスコに、２〜３ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ溶液を添加した。これを、室温でインキュベートした。
【０１７８】
細胞は、除去するまで倒立顕微鏡下で観察した（１０〜１５分間）。細胞の凝集を阻止するため、振盪は避けた。除去することが困難だった細胞については、フラスコを３７℃に短時間置いた。フラスコに６〜８ｍｌの完全成長培地を添加し、細胞をピペットにより緩やかに吸引した。１：４〜１：６の継代培養容量比が得られた。
【０１７９】
実施例１０：ＤＵ−１４５細胞アッセイ用のボイデンチャンバー（Ｂｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒ）の調製
ボイデンチャンバーインサート（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ））は、１００μｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製培養グレード）で、３７℃で２時間コーティングした。インサートは、ＰＢＳで１回リンスした。底板は、０．００１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中、１００ｐｇ／ｍｌのＮＲＰ２９４５で一晩コーティングした。次いで、底板はＰＢＳで１回リンスした。その後、コーティングしたボイデンチャンバーは、細胞播種のため、冷却し、貯蔵し、準備することができた。
【０１８０】
実施例１１：ボイデンチャンバーバイオアッセイにおけるＤＵ−１４５細胞の播種、培養および分析
細胞は、上記のようにトリプシン処理した。トリプシン処理は、余分な完全成長培地の添加によって停止させた。その後、細胞を遠心分離（４℃、１５００ｒｐｍで５分間）により採取し、約５００万個の細胞／ｍｌの目標濃度にて新しい培地中で再構成した。典型的な実験では、１２ウェルプレートあたり約０．３ｍｌの細胞懸濁液が必要であった。
【０１８１】
細胞を計数し、５０，０００個の細胞を、１２ウェルのボイデンチャンバーの１つのインサートに播種した。約５０μ１の細胞懸濁液は、ピペット操作により各ウェルに播種した。細胞は、５％ＣＯ２中、３７℃でインキュベートした。２４時間後、インサート（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）製で８μｍの孔径）を、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中に固定した。細胞の上層は、Ｑチップ（Ｑ−ｔｉｐ）（登録商標）の使用により除去した。
【０１８２】
インサート膜の下層に付着させたＤＵ−１４５細胞は、ヘマトキシクリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｃｌｉｎ）染色を使用する標準の細胞可視化法を用いて、可視化し、計数した。細胞数計測は、インサートの下層部分に移動している全細胞を計数することによって行った。
【０１８３】
実施例１２：作用試験の機構
ＮＲＰ２９４５がＣＸＣＲ４受容体の活性化を通じて作用するか否かを評価するため、２つの追加的な実験を実施した。
【０１８４】
最初の実験では、ヒトニューロンを、上記のように酸素グルコース欠乏（ＯＧＤ）損傷に暴露した。２つの濃度のＮＲＰ２９４５を、この実験用に、３００ｎＭのＡＭＤ３１００（ＣＸＣＲ４受容体に対する既知の拮抗剤）の存在下または不在下いずれかにおいて使用した。ＡＭＤ３１００の濃度は、ラットの海馬および小脳細胞に対して実施した先行試験から選択した。細胞は上記実験と同じ方法で成長させ、分析はＬＤＨアッセイを用いて
行った。
【０１８５】
第２の実験は、ＮＲＰ２９４５の、その標的受容体サブユニットＣＸＣＲ４の遺伝子発現を調節する能力を評価するため、実施した。この目的のため、Ｗ９−ｈＥＳＣを、正常酸素圧条件下で、１０分、３０分または６０分、１０ｐＭまたは１００ｐＭいずれかのＮＲＰ２９４５に暴露するか、あるいは、４時間のＯＧＤ損傷を組み合わせて、１０ｐＭまたは１００ｐＭいずれかの濃度のＲＰ２９４５で暴露した。４時間の終了時、ｍＲＮＡを全細胞試料から抽出し、ｃＤＮＡ合成は、スーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｒｉｐｔ）（登録商標）ｃＤＮＡキット（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））とそれに続くリアルタイムＰＣＲを用いて実施した。リアルタイムＰＣＲの有効性は、ＣＸＣＲ４産物増幅のために以下のプライマーを使用する場合で９９％であった。
フォワード：ＡＧＣＴＧＴＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＧＧＴＧＧＴＣＴＡＴＧ（２７−ｍｅｒ）（配列番号１５）（刊行物：ナガセ（Ｎａｇａｓｅ）、ミヤマス（Ｍｉｙａｍａｓｕ）ら著（２０００年）−  ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）、第１６４巻、ｐ．５９３５−５９４３による）
リバース：ＧＣＧＣＴＴＣＴＧＧＴＧＧＣＣＣＴＴＧＧＡＧＴＧＴＧ（２６−ｍｅｒ）（配列番号１６）
実施例１３：統計学的分析
マルチウェルプレート内の周辺ウェルからの示差的蒸発（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）のため導入される系統的バイアスの潜在的な影響を最小にするため、これらのウェルは、培養には使用しないが内部試験用ウェルと同じ容量の培地で満たした。時間および資源の制約のため、インキュベーターの使用を各々の温度条件ごとに無作為化することはできなかった。トンネル（Ｔｕｎｎｅｌ）陽性細胞の計測前、ウェルは画像化し、画像は定量前に別々に再符号化した。機械で読み込むＬＤＨアッセイプロセスにおいて、追加的な結合は全く行わなかった。
【０１８６】
実験の中で、各比較は、少なくとも３通りに実施し、これらの値の平均値は、フォワードにとり、群比較を行った。二元配置ＡＮＯＶＡを実施し、次いでＳＰＳＳ（スタティスティクス２０（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ２０））を使用して、ｐ＜０．０５での有意水準（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｓｅｔ）で、ダネットの事後多重比較検定（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔ）を行った。この検定では、３つの群間変数；処理、プレート内の位置および実験番号と、１つの群内変数；評価時間とを用いた。すべての値は、平均値±ＳＥＭとして提示した。
【０１８７】
実施例１４：ＮＫＰ１３．ｑｌ３．２遺伝子配列
ヒト染色体１３ｑｌ３．２は、大発作てんかん、双極性障害および自閉症の形態における既知の感受性遺伝子座である。ＮＲＰ領域内の唯一知られたＥＳＴは、ヒト子宮ＥＳＴ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）：ＤＢ２７６４８１；イントロンを含む）である。米国特許第７７６７７８６号明細書は、特定のＮＲＰ１３ｑｌ３．２スプライスバリアントについて報じている。ＵＳＢ２における先に公表されたスプライスバリアントと比較すると、エクソン１は、異なる同一性を有する。全コーディング配列は、３つのエクソンに短縮される。完全コーディング配列は、１１５のアミノ酸長のタンパク質をコードする３４５の核酸長を有する。完全長ＮＲＰ配列は、非古典的な分泌経路を介して分泌されると考えられる。
【０１８８】
ヒト染色体１３ｑｌ３．２ＮＲＰ  ｃｄｓ（３エクソン）を図１０に示す。完全長ヌクレオチド配列は配列番号１２に対応する一方、完全長アミノ酸配列は配列番号１３に対応する。アミノ酸配列はまた、下記に示す。下記に示されるように、エクソン１は、太字／大文字で示す。エクソン２は、太字／イタリックで示す。エクソン３は、太字／小文字で示す。下線の配列（配列番号１４）は、再生活性における最短の生理活性配列である。
【０１８９】
【化１】
2016514954.tif 000003
実施例１５：ｃＤＮＡ合成および半定量ＲＴ−ＰＣＲ
ｍＲＮＡを、標準的手順に従って抽出した（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製トリアゾール（ＴＲＩｚｏｌｅ）（登録商標）またはキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）製ＲＮイージーミニ（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ））。ＤＮアーゼＩ（ＤＮＡｓｅＩ）インキュベーション混合物を用い、ｍＲＮＡ画分を、ＤＮアーゼＩ（ＤＮＡｓｅＩ）処理に供した。この処理においては、１０μｌのＤＮアーゼＩ（ＤＮＡｓｅＩ）ストック＋７０μｌの緩衝液をｍＲＮＡ調製物に添加し、室温で５分間インキュベートした。次いで、ｃＤＮＡ合成を、標準的手順に従って行った（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製スーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）（登録商標）ＩＩＩ逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ））。
【０１９０】
最適化されたＲＴ−ＰＣＲ法では、高いＧＣ含量およびＴＭ（７８℃）の場合でのイントロン介在性（ｉｎｔｒｏｎ−ｓｐａｎｎｉｎｇ）フォワードプライマーと、より低いＴＭ（６０℃）の場合でのリバースプライマーとを使用した。これらのプライマーは、図１０に示すとともに、さらに以下に示す。ｍＲＮＡは、ｃＤＮＡの合成開始前にＤＮアーゼＩ（ＤＮａｓｅＩ）で処理したが、イントロン介在性プライマーが９つの核酸のイントロンのみに架橋した。これにより、事前のＤＮアーゼＩ（ＤＮａｓｅＩ）処理から、フォワードプライマーのヘアピン構造の形成がもたらされ、偽陽性のＰＣＲ産物のゲノム増殖が生じた可能性があることが仮定された。
【０１９１】
予想されたＲＴ−ＰＣＲ産物は、２２１ｂｐ長であった。ＰＣＲ条件は、５８℃でのアニーリングおよび３６の全サイクルを含んだ。ジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）（登録商標）サイクラーの操作開始時、試料は、９４℃で５分間インキュベートした。３６サイクルは、９４℃で３０秒間；５８℃で３０秒間；７２℃で３０秒間；続いてＰＣＲの終了時に１５℃に冷却、といったシークエンスを含んだ。
フォワードプライマー：ｈｕｍＣｈｒｌ３ＮＲＰ−Ｆ２Ａフォワード（２５−ｍｅｒ）
５’−ＧＣＣＴＡＣＡＴＣＣＣＴＧＴＣＴＡＧＣＡＧＣＡＴＣ−３’（配列番号１０）
リバースプライマー：ｈｕｍＣｈｒｌ３ＮＲＰ−Ｒ２リバース（２２−ｍｅｒ）
５’−ＣＡＴＴＣＴＡＡＡＡＣＡＡＧＧＡＴＣＣＡＡＧ−３’（配列番号１１）
ＰＣＲ反応は、２５．００μｌの全容量を得るように、１０倍緩衝液（２．５０μｌ）、５０ｍＭのＭｇＣｌ２（０．７５μｌ）、１０ｍＭのｄＮＴＰｓ（０．５０μｌ）、プライマー１（０．５０μｌ）、プライマー２（０．５０μｌ）、タック・ポリメラーゼ（Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（０．１０μｌ）、ｃＤＮＡ（１．００μｌ）、Ｈ２Ｏ（１９．１５μｌ）を含んだ。タックＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）は、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から供給された（プラチナム（Ｐｌａｔｉｎｕｍ）（登録商標）タック・ポリメラーゼ（Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ））。
【０１９２】
実施例１６：ＮＴＥＲＡ−２細胞株の培養、分化、および分析
ＮＴＥＲＡ−２（アメリカ培養細胞系統保存機関番号ＣＲＬ−１９７３）は、染色体１、１０、１１および１３の唯一のコピーを有するヒトがん由来の多能性細胞株である。これは、ＮＲＰ発現の検出を意図して３６サイクルのＰＣＲを用いるための起動力であった
。
【０１９３】
未分化のＮＴＥＲＡ−２細胞を入手した。凍結ストックは、最大２継代数で調製した。ＮＲＰ発現は、最大４〜５継代数を有する細胞内で評価することができた。細胞培地は、アメリカ培養細胞系統保存機関で調合されたＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを含んだ。培地は、２〜３日ごとに交換した。継代のため、細胞を擦過により除去し、次いで７５ｃｍ２のフラスコに移した。初期播種は、フラスコ１本あたり１２〜１５ｍｌの細胞培地中に５００万個の細胞を含んだ。
【０１９４】
継代培養は、遺伝子発現試験のために実施した。継代培養のため、細胞は、擦過により除去し、次いで４℃、１５００ｒｐｍで７分間の遠心分離により収集した。培地を廃棄し、細胞を、１６ｍｌの新しいＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳに再懸濁した。予想される収量は、フラスコ内で１２００万〜１５００万個の細胞であった。したがって、再懸濁された細胞は、１ｍｌあたり約１００万個の細胞の濃度であった。１ｍｌの細胞懸濁液を１２ウェル組織培養プレートの各ウェルに添加したことにより、１ウェルあたり約１００万個の細胞のプレーティング密度が得られた。
【０１９５】
継代数３においては、残存する４ｍｌの細胞懸濁液＋８ｍｌの培地を、新しいＴ７５培養フラスコに移した。
実施例１７：遺伝子発現アッセイにおけるｍＲＮＡの採取
処理条件は、以下のとおりであった。１）正常酸素圧条件下での未処理対照；２）酸化ストレス下の未処理対照（ｐＨ：６．８〜７．０に滴定された５０ｍＭのストック（シグマ（Ｓｉｇｍａ））から得た０．５ｍＭの３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰ））；３）正常酸素圧条件下での１ｐＭのＮＲＰ２９４５；および４）酸化ストレス下での１ｐＭのＮＲＰ２９４５（０．５ｍＭの３−ＮＰ）。すべての条件は、１５分間、３０分間、および６０分間適用した。
【０１９６】
次いで、ｍＲＮＡを採取した。細胞は、処理終了時に１回洗浄し、次いで細胞を擦過した。細胞は、２５ゲージ針により１５ｍｌのファルコンチューブに通した。ファルコンチューブの細胞含有物を吸引し、ＤＭＥＭで１回洗浄し、その後トリプシン処理した。これを、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳを添加することによって停止させた。遠心分離は、４℃、１５００ｒｐｍで７分間行った。その後、ペレットは、ＲＮＡ抽出まで、−８０℃または液体窒素中のいずれかで貯蔵しておいた。
【０１９７】
ＲＮＡ抽出においては、解凍した細胞ペレットを、製造業者の使用説明書に従って調製した（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）製ＲＮイージーミニ（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ））。ＲＮＡ濃度は、ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）（商標）により測定した。これに続き、ｃＤＮＡ合成を行った。十分な量のｃＤＮＡを合成するため、細胞試料中のＲＮＡ濃度が１０〜２０ｎｇ／μｌであることを確認した。これにより、全収量が１つの条件あたり数μｇに近づいた。
【０１９８】
実施例１８：実験結果
ニューロンの損傷および死滅
酸素グルコース欠乏および酸化ストレスの双方により、４時間後、約３７％の細胞死がもたらされた（図１参照）。５０μΜのＨ２Ｏ２により、損傷の４時間後、３．７倍の酸化ストレスの増大が誘発された（図１Ａ参照）。Ｈ２Ｏ２の除去により、最初の４時間以内の９％／時から、その後の２０時間の約０．６１％／時間に、細胞死の速度が低下した（図１参照）。
【０１９９】
本発明者らのデータによると、両損傷モデルでのヒトＷ９−ｈＥＳＣにおいて、ＮＲＰ
２９４５が、用量依存的な神経保護を提供することが示される。細胞死の有意な低下が１ｆＭの濃度で見られ、そこでは細胞死は２３．２％低下した（ｐ≦０．０３７  ９５％ＣＩ  １．０４〜４５．３）（図１Ａ）。１０ｆＭの濃度では、細胞死は４０％低下した（ｐ≦０．０００１  ９５％ＣＩ  １７．９−６２．２）（図１Ａ）。１００ｆＭでは、細胞死は４４％低下した（ｐ≦０．０００１  ９５％ＣＩ  ２１．５〜６５．８）（図１Ａ）。１ｐＭでは、細胞死は３５％低下した（ｐ≦０．０００４  ９５％ＣＩ  １３．５０〜０５７．７）（図１Ａ）。ここでは、対照における基本的損傷（ｂａｓａｌ  ｉｎｊｕｒｙ）に対する補正が考慮される。
【０２００】
４時間後のＨ２Ｏ２の除去および２４時間後の実験終了後、ＮＲＰ２９４５は、神経保護効果を示し続ける。１０ｆＭおよび１００ｆＭの濃度では、各々、ＬＤＨで検出された細胞死の７０％（ｐ≦０．０１  ９５％ＣＩ  １３．３０〜０１２６．４）および５７％（ｐ≦０．０４８  ９５％ＣＩ  ０．３７〜１１３．４）の低下があった（図１Ｂ）。
【０２０１】
２４時間後の正味効果は、以下のとおりである。１ｆＭではＬＤＨ放出が２７％低下し（ｐ≦０．０５  ９５％ＣＩ  ０．０３〜５３．７）、１０ｆＭではＬＤＨ放出が４８％低下し（ｐ≦０．０００１  ９５％ＣＩ  ２０．８〜７４．５）、１００ｆＭではＬＤＨ放出が４７％低下し（ｐ≦０．０００１  ９５％ＣＩ  ２０．１〜７４．０）、１ｐＭではＬＤＨ放出が２６％低下した（ｐ≦０．００１  ９５％ＣＩ  １３．４〜６７．１）（図１Ｃ）。
【０２０２】
２４時間後のアポトーシス細胞死に対するＴＵＮＥＬ染色によると、細胞死の１９％が正常酸素圧条件下で発生し、かつＨ２Ｏ２媒介性酸化ストレスが約３５％のアポトーシス細胞を誘発することが示唆された。１００ｆＭのＮＲＰ２９４５の投与の場合、細胞の５６．２％（ｐ≦０．００２  ９５％ＣＩ  １７．７〜８６．２）が、酸化ストレス条件下でアポトーシスを免れた（図１Ｄ）。
【０２０３】
酸素欠乏単独では、ＬＤＨで検出された細胞死が、４時間後に約２．９倍増加した（図２参照）。培養液を通常の空気／５％ＣＯ２インキュベーターに戻し、４時間後に再び培地を交換することにより、酸素欠乏に誘発される細胞損傷は、緩徐化したが、完全には停止しなかった（各々、６％／時間と０．２９％／時間；図２参照）。酸素およびグルコース欠乏の組み合わせにより、はるかにより有意な損傷が引き起こされ、ＬＤＨで検出された細胞死が４時間後に４．２倍増加した（図２参照）。この細胞死は、正常な培養条件に戻した際、より遅い速度で継続した（各々、９．８％／時間と０．６５％／時間；図２参照）。
【０２０４】
ＮＲＰ２９４５は、ＯＧＤ後、ＬＤＨで検出された細胞死の用量依存的低下を示したが、Ｈ２Ｏ２媒介性損傷の間に必要な濃度よりはるかに高い濃度が必要とされた。ＬＤＨで検出された細胞死の有意な低下が、１ｐＭの濃度で始まるように見られ、細胞死における２３％の低下をもたらした（ｐ≦０．００５  ９５％ＣＩ  ５．３〜４０．７）（図２Ａ）。１０ｐＭでは、細胞死は３７％低下した（ｐ≦０．０００１  ９５％ＣＩ  １９．４〜５４．８）（図２Ａ）。１００ｐＭでは、細胞死は４３％低下した（ｐ≦０．０００１
９５％ＣＩ  ２５．９〜６１．３）（図２Ａ）。
【０２０５】
４時間後のＯＧＤの除去と２４時間後の実験終了との間に生じる損傷の緩徐化については、１０ｐＭおよび１００ｐＭで各々、６７％（ｐ≦０．００１  ９５％ＣＩ  ２４．３〜１１０．０）および７９％（ｐ≦０．０００１  ９５％ＣＩ  ３６．０〜１２１．８）の大幅な低下があった（図２Ｂ）。
【０２０６】
２４時間後の正味効果は、以下のようなＬＤＨ放出の有意な低下であった。１００ｆＭ
では１７％の低下がもたらされ（ｐ≦０．０３２  ９５％ＣＩ  １．１３〜３４．７）、１ｐＭでは２８％の低下がもたらされ（ｐ≦０．００００１  ９５％ＣＩ  １１．５〜４５．１）、１０ｐＭでは４４％の低下がもたらされ（ｐ≦０．０００１  ９５％ＣＩ  ２７．８〜６１．４）、また１００ｐＭでは５２％の低下がもたらされた（ｐ≦０．０００１  ９５％ＣＩ  ３５．６〜６９．２）（図２Ｃ）。
【０２０７】
２４時間後のアポトーシス細胞死に対するＴＵＮＥＬ染色によると、細胞死の２０％がこの機序によって生じることと、１００ｐＭではＷ９−ｈＥＳＣの２３％（ｐ≦０．０３６  ９５％ＣＩ  １．２〜４５．０）がアポトーシス細胞死から保護されることが示唆された（図２Ｄ）。
【０２０８】
これらの観察結果を確認するため、Ｈ２Ｏ２媒介性の損傷およびＯＧＤ実験は、最高の神経保護効果を示すＮＲＰ２９４５の濃度（Ｈ２Ｏ２損傷については１０ｆＭおよび１００ｆＭ、ＯＧＤについては１０ｐＭおよび１００ｐＭ）を用いて、以前と同様に繰り返した。損傷暴露の時間は４時間である一方、ＮＲＰ２９４５の投与は、１時間、３時間、および６時間遅らせた（図３）。したがって、６時間経過時は、損傷時間の終了の２時間後であった。
【０２０９】
以前と同様、Ｈ２Ｏ２損傷の最初の４時間以内に、１０ｆＭおよび１００ｆＭの双方のＮＲＰ２９４５では、細胞死における４０％（ｐ≦０．０００１  ９５％ＣＩ  １６．２〜６５．３）および３７％（ｐ≦０．００１  ９５％ＣＩ  １２．７〜６１．８）の低下がもたらされた。１０ｆＭおよび１００ｆＭの双方のＲＰ２９４５では、Ｈ２Ｏ２損傷誘発の１時間後に投与した時（３時間暴露）、細胞死は各々、３５％（ｐ≦０．００２  ９５％ＣＩ  １０．８〜５９．９）および３３％（ｐ≦０．００３  ９５％ＣＩ  ９．２〜５８．３）、有意に低下した（図３Ａ）。ＮＲＰ２９４５をＨ２Ｏ２損傷誘発の３時間後に添加した時（１時間暴露）、有益な効果は全く有意でなかった。
【０２１０】
２４時間後の正味効果は、１０ｆＭのＮＲＰ２９４５を投与した場合で、ＬＤＨ放出の４８％（ｐ≦０．０００１  ９５％ＣＩ  ２１．４〜７４．９）、３５％（ｐ≦０．００４  ９５％ＣＩ  ８．６〜６２．１）、および２３％（ｐ≦０．１２４  ９５％ＣＩ  −
３．８〜４９．６）の低下、また１００ｆＭのＮＲＰ２９４５を投与した場合で、４１％（ｐ≦０．０００１  ９５％ＣＩ  １５．１〜６８．５）、３９％（ｐ≦０．００１  ９５％ＣＩ  １２．５〜６６．０）および２７％（ｐ≦０．０４  ９５％ＣＩ  ０．８２〜５４．３）の低下であった（各々、Ｈ２Ｏ２誘発の０時間後、１時間後、および３時間後に添加）（図３Ｂ）。３時間後の１００ｆＭのＮＲＰ２９４５添加によるＬＤＨ放出における正味の低下は、統計学的に有意である。
【０２１１】
ＬＤＨ誘発性の細胞死における同様の低下が、ＯＧＤ損傷後に認められた。ＬＤＨで検出された細胞死における有意な低下が、１０ｐＭおよび１００ｐＭの濃度のＮＲＰ２９４５を損傷誘発期間に投与した時に認められ（１０ｐＭでは４１％低下（ｐ≦０．０００１
９５％ＣＩ  １８．６〜６３．６）および１００ｐＭでは４７％低下（ｐ≦０．０００１  ９５％ＣＩ  ２５．２〜７０．２））、また損傷誘発の１時間後に認められた（１０ｐＭでは３１％低下（ｐ≦０．００３  ９５％ＣＩ  ９．１〜５４．１）および１００ｐＭでは３４％低下（ｐ≦０．００１  ９５％ＣＩ  １１．２〜５６．２））（図４Ａ）。
【０２１２】
ＯＧＤ損傷の２４時間後の正味効果は、１０ｐＭのＮＲＰ２９４５を投与した場合で、ＬＤＨ放出の４８％（ｐ≦０．０００１  ９５％ＣＩ  ２１．２〜７４．２）、３６％（ｐ≦０．００４  ９５％ＣＩ  ８．５２〜６１．５）、および２２％（ｐ≦０．０４５  ９５％ＣＩ  ０．９５〜５３．５）の低下、また１００ｐＭのＮＲＰ２９４５を投与した場合で、ＬＤＨ放出の５４％（ｐ≦０．０００１  ９５％ＣＩ  １４．９〜６７．９）、
３５％（ｐ≦０．００１  ９５％ＣＩ  １２．４〜６５．４）および２２％（ｐ≦０．０４  ９５％ＣＩ  ０．８〜５３．７）の低下であった（各々、０時間後、１時間後、および３時間後の添加時）（図４Ｂ）。３時間後の１０ｐＭおよび１００ｐＭのＮＲＰ２９４５添加によるＬＤＨ放出における正味の低下は、統計学的に有意である。
【０２１３】
ＣＸＣＲ４受容体
ＮＲＰ２９４５がヒト神経細胞調製物中でＣＸＣＲ４受容体を介してその細胞保護的効果を発揮するか否かを評価するため、本発明者らは、細胞を、ＣＸＣＲ４受容体の既知の合成拮抗剤である３００ｎＭのＡＭＤ３１００に暴露した。本発明者らは、２つの異なる濃度のＮＲＰ２９４５を使用した。本発明者らは、ａ）ＯＧＤの間に神経保護効果を示さなかった１００ｆＭ、およびｂ）ＯＧＤ損傷の間に神経保護を確かに示した１００ｐＭといった濃度を選択した。
【０２１４】
細胞は、先行実験と同じ方法でＯＧＤ損傷に暴露した。３００ｎＭのＡＭＤ３１００がＷ９−ｈＥＳＣに対して全く毒性作用を有しないことを確認するため、ＡＭＤ３１００は、正常酸素圧およびＯＧＤ条件下で試験した。それは、これらの試験条件下で全く毒性を示さなかった（図５Ａ）。
【０２１５】
ＯＧＤ損傷の４時間後、１００ｐＭのＮＲＰ２９４５の投与の場合に認められるＬＤＨで検出された細胞死において有意な低下があった（４４％の低下（ｐ≦０．０００１  ９５％ＣＩ  ２２．８〜６５．６））が、この低下は、阻害剤の投与後に消失した（図５Ａ）。
【０２１６】
同様の結果が、ＯＧＤ誘発の２４時間後に認められた。２４時間後の正味効果は、１００ｐＭのＮＲＰ２９４５を投与した場合でのＬＤＨ放出の有意な低下であったが（５５％の低下（ｐ≦０．０００１  ９５％ＣＩ  ２６．１〜７６．５））、この低下はＡＭＤ３１００によって遮断された（図５Ｂ）。結果によると、ＮＲＰ２９４５が、ＣＸＣＲ４受容体を介して原形質膜でその作用を確かに発揮していることが示される。
【０２１７】
ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ３受容体
次いで、小脳顆粒細胞の生存を、実施例７に記載のように評価した。小脳微小外植片の成分を表す小脳顆粒細胞を、グルタミン酸塩および３−ＮＰの毒性によって同時負荷した一方、ＮＮＺ−４９２１、エオタキシン−３およびＡＭＤ３１００を同時投与した。細胞生存分析は、４８時間後に実施した。特に、エオタキシン−３は、単独では、正常酸素圧下の細胞または酸化／興奮毒性ストレス下で維持された細胞に対して全く毒性作用を有しなかった（図６）。
【０２１８】
両濃度のエオタキシン−３により、ＮＮＺ−４９２１によって発揮される神経保護効果の抑止がもたらされた（図６）。さらに、同結果によると、エオタキシン−３およびＡＭＤ３１００の同時投与が、ＮＮＺ−４９２１の神経保護活性の完全な阻害に対して相乗効果をもたらすことが示された。上記のように、エオタキシン−３をＡＭＤ３１００と組み合わせることで、１０ｆＭまたは１００ｆＭのＮＮＺ−４９２１の細胞死の低下における活性が完全に遮断された（図６）。これから、ＣＸＣＲ４が、ＮＲＰに促進されるニューロン生存にとって決定的なＣＣＲ３とのヘテロ二量体を形成すると解釈することができる。
【０２１９】
特に、ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ３受容体の各々の両拮抗剤（ＡＭＤ３１００およびエオタキシン−３）は、ＮＮＺ−４９２１のニューロン生存を促進する活性を完全に遮断する能力を有する。ＡＭＤ３１００およびエオタキシン−３の併用については相乗効果が全くなく、それから、ＮＲＰ分子における結合ポケットが両受容体サブユニット（ＣＸＣＲ４
およびＣＣＲ３）によって構成されなければならず、それによりこのヘテロ二量体複合体のアゴニズムを促進するという結論が導かれる。
【０２２０】
ＣＸＣＲ４およびＮＲＰの発現
以下の実験セットは、ＮＲＰ２９４５を使用することで、Ｗ９−ｈＥＳＣとの接触後、ＣＸＣＲ４遺伝子発現を調節可能か否かを評価するために実施した。成長因子がその各々の標的ケモカイン受容体の遺伝子発現状態を調節可能であることは既知である。ＳＤＦ−１およびＣＸＣＲ４の発現レベルを評価する、幹細胞および神経前駆体細胞に関するいくつかの試験が実施されている。さらに、Ｇ−ＣＳＦが、培養されたＮＰＣｓの細胞培地へ添加されると、インキュベーションの２４時間以内にＣＸＣＲ４の上方制御を誘発することが示されている（キム（Ｋｉｍ）ら、２００６年）。にもかかわらず、短い時間枠、すなわち数分以内でのＣＸＣＲ４遺伝子発現の調節を示すデータは存在しない。
【０２２１】
本発明者らは、ＮＲＰ２９４５が、暴露からわずか１０分の時間枠内に、自己分泌の様式で、ヒトＮＴＥＲＡ−２細胞内の内因性ＮＲＰ遺伝子発現（１３ｑｌ３．２上に位置づけられるＮＲＰ遺伝子）を上方制御可能であることを先行的に見出している（シエグ（Ｓｉｅｇ）およびミヤスマス（Ｍｉｙａｓｍａｓｕ）、結果は未公表）。したがって、ＮＲＰ２９４５がまた、ＣＸＣＲ４遺伝子発現に対して即時型効果を有しうることが仮定された。
【０２２２】
データは、正常酸素圧条件についてはＣＸＣＲ４遺伝子の任意の発現単位として示し、βアクチン発現（ハウスキーピング遺伝子）に正規化した（図７）。リアルタイムＰＣＲによると、ＣＸＣＲ４遺伝子の発現が、正常酸素圧条件下でＮＲＰ２９４５の暴露量を増加させると、わずか１０分後に有意に低下することが示された。ＯＧＤの存在下で、ＣＸＣＲ４遺伝子発現は、５０％増加し、ＮＲＰ２９４５の添加により変化しなかった（図７）。ＣＸＣＲ４遺伝子の下方制御は、３０分後にピークに達し、それは少なくとも１時間維持された（図７参照）。したがって、３０分以内に、ＮＲＰ２９４５は、ＣＸＣＲ４発現を、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリー中に見られる構成的に発現されるレベルまで下方制御することができた。
【０２２３】
この発現パターンを、ヒト染色体１３上でのＮＲＰ発現と比較した。正常酸素圧条件下で各々のＮＲＰ遺伝子発現を示すように３６のＰＣＲサイクルを用いる必要があったため、酸素正常状態の間、ＮＲＰは、低い構成的レベルで発現された（図８）。酸化ストレスの開始後、ＮＲＰ遺伝子発現は、完全に遮断されたが、３０分後に回復した（図８）。遺伝子発現は、酸化ストレスの開始から６０分後、さらに増加した。ＮＲＰ２９４５を正常酸素圧下のＮＴＥＲＡ−２細胞と接触させた時、ＮＲＰ１３ｑｌ３．２の遺伝子発現は、わずか１５分後に非常に増加した。これは、ペプチドとの接触の３０分後にピークに達した（図８）。酸化ストレスとＮＲＰ２９４５の同時投与の間、ＮＲＰ１３ｑｌ３．２遺伝子発現は、１５分後に上方制御され、分析期間中、高値のままである（図８）。
【０２２４】
がん細胞阻害
追加的な試験では、ＤＵ−１４５細胞（ヒト前立腺がん細胞）の運動性を、実施例９〜１１に記載のように評価した。本発明者らは、ＮＲＰ２９４５が、化学反発性に、ヒト前立腺がん由来のＤＵ−１４５細胞の運動性／浸潤性を低下させる能力を有することを見出した。０．１ｎｇ／ｍｌのＲＰ２９４５のボイデンチャンバー底板への付着およびその後のＤＵ−１４５細胞の播種は、インキュベーションの２４時間後、移動細胞の３６％の低下をまねいた（図９）。ＣＸＣＲ４のみを発現するがん細胞は、ＮＲＰとの接触後、運動性に関して全く効果を示さない。
【０２２５】
したがって、０．１ｎｇ／ｍｌのＲＰ２９４５の投与は、ヒトＤＵ−１４５細胞の運動
性における有意な低下をまねいた。これは、神経幹細胞または初代神経細胞を用いかつＮＲＰ２９４５と同じコーティング濃度を適用する、先行的な走触性移動アッセイと好対照をなす。これらの先行実験によると、ニューロン移動における有意な増加が示された。例えば、米国特許第７５６３８６２号明細書を参照。特に、神経細胞の化学誘引を誘発する同一濃度のＮＲＰ２９４５は、ヒトＤＵ−１４５細胞において示されるように、ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ３受容体を同時発現するがん細胞に対して抑制的な遊走活性をもたらす。
【０２２６】
実施例１９：結論
実験データから、本発明者らは、次のように結論づけた。ＮＲＰ結合活性化（例えば、ＮＲＰ２９４５またはＮＮＺ−４９２１による）は、ＣＸＣＲ４／ＣＣＲ３ヘテロ二量体の形成を誘発し、ＣＸＣＲ４遺伝子発現の即時型下方制御をもたらす。特に、最終の細胞分化が、ＮＲＰが分化前の（ｐｒｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）神経幹細胞と接触してから開始されることから、ＣＸＣＲ４下方制御は好ましい生物活性である。したがって、ＮＲＰ２９４５およびＮＮＺ−４９２１などのＮＲＰは、ヘテロ二量体ＣＸＣＲ４／ＣＣＲ３複合体を原形質膜に動員する能力があると考えられる受容体アゴニストとして作用している。それと同時に、ＮＲＰ２９４５およびＮＮＺ−４９２１を含むＮＲＰは、ＣＸＣＲ４／ＣＣＲ３を発現するがん細胞に対するそれらの抗浸潤および抗移動効果において有用である。
【０２２７】
本発明は例として記載されているが、変形形態および修正形態が本発明の範囲から逸脱することなくなされる場合があることは理解されるべきである。さらに、既知の均等物が特定の特徴に対して存在する場合、かかる均等物は、あたかも本明細書中で特別に参照されるように援用される。
【０２２８】
参考文献
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ｅｄｉｔｉｏｎ）（章、ｐ．２７〜５８）、バレリア・ソゴス（Ｖａｌｅｒｉａ  Ｓｏｇｏｓ）およびアンドレア・ダイアナ（Ａｎｄｒｅａ  Ｄｉａｎａ）編
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ネデレック（Ｎｅｄｅｌｌｅｃ），Ｒら著、２００９年、「代替の共受容体ＣＣＲ３およびＦＰＲＬ１を介したウイルス侵入はヒト免疫不全ウイルス１型サブタイプが異なる（Ｖｉｒｕｓ  ｅｎｔｒｙ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ＣＣＲ３  ａｎｄ  ＦＰＲＬ１  ｄｉｆｆｅｒｓ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｓｕｂｔｙｐｅ）」、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ）、第８３巻（１７）、ｐ．８３５３〜８３６３
セーガル（Ｓｅｈｇａｌ），Ａら著、１９９８年、「ＣＸＣＲ−４の分子キャラクタリゼーション：脳腫瘍関連遺伝子候補（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＸＣＲ−４：ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ）」、ジャーナル・オブ・サージカル・オンコロジー（Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ）、第６９巻（４）、ｐ．２３９〜２４８
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シン（Ｓｉｎｇｈ），ＡＴら著、２０１０年、「新規な神経再生ペプチド（ＮＲＰ）による栄養膜の移動および生存の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｂｙ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｎｅｕｒａｌ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＮＲＰ））」、生殖生体医学オンライン（Ｒｅｐｒｏｄ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｏｎｌｉｎｅ）、第２１巻（２）、ｐ．２３７〜２４４
グプタ（Ｇｕｐｔａ），ＳＫら著、１９９９年、「ヒト単球およびマクロファージの分化過程でのＣＸＣＲ４発現およびＳＤＦ−１α機能活性の調節（Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＸＣＲ４  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ＳＤＦ−１  ａｌｐｈａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）」、ジャーナル・オブ・ロイコサイト・バイオロジー（Ｊ  Ｌｅｕｃｏ  Ｂｉｏｌ）、第６６巻（１）、ｐ．１３５〜１４３
ヤング（Ｙａｎｇ），Ｊら著、２０１２年、「ブタ神経前駆細胞における分化誘導過程での遺伝子転写における定量的変化（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ
ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）」、モレキュラー・ビジョン（Ｍｏｌ  Ｖｉｓ）、第１８巻、ｐ．１４８４〜１５０４
ヨシダ（Ｙｏｓｈｉｄａ），Ｎら著、２０１１年、「活性化Ｂ細胞上でのＣＸＣＲ４発現はＣＤ６３およびＩＬ−２１によって下方制御される（ＣＸＣＲ４  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ
ｂｙ  ＣＤ６３  ａｎｄ  ＩＬ−２１）」、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）、第１８６巻（５）、ｐ．２８００〜２８０８
ダラシュ−ヤハナ（Ｄａｒａｓｈ−Ｙａｈａｎａ），Ｍら著、２００４年、「腫瘍成長、血管新生、および転移における高い発現レベルのＣＸＣＲ４の役割（Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ＣＸＣＲ４  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ
ｇｒｏｗｔｈ，ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）」、ファセブ・ジャーナル（ＦＡＳＥＢ  Ｊ）、第１８巻（１１）、ｐ．１２４０〜１２４２
ファン・デル・ミアー（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒ），Ｐら著、２００１年、「発生するヒト脳におけるＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、およびＣＣＲ３ケモカイン受容体の発現パターン（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  ＣＸＣＲ３，ＣＸＣＲ４，ａｎｄ
ＣＣＲ３  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ）」、ジャーナル・オブ・ニューロパソロジー・アンド・エクスペリメンタル・ニューロロジー（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ）、第６０巻（１）、ｐ．２５〜３２
スタム（Ｓｔｕｍｍ），ＲＫら著、２００２年、「成体脳におけるＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体系における２つの役割：ＳＤＦ−１発現のアイソフォームの選択的
調節は、局所虚血後のＣＸＣＲ４依存性の神経可塑性および脳の白血球の動員を調節する（Ａ  ｄｕａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｂｒａｉｎ：ｉｓｏｆｏｒｍ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＤＦ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ＣＸＣＲ４−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ａｆｔｅｒ  ｆｏｃａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）」、米国神経科学会雑誌（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ）、第２２巻（１４）、ｐ．５８６５〜５８７８
マインズ（Ｍｉｎｅｓ），ＭＡら著、２００９年、「ＵＳＰ１４によるＣＸＣＲ４の脱ユビキチン化は、ＥＲＫ活性化と異なり、ＣＸＣＬ１２誘発性のＣＸＣＲ４分解および化学走性の双方にとって重大である（Ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＸＣＲ４  ｂｙ  ＵＳＰ１４  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｂｏｔｈ  ＣＸＣＬ１２−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＣＸＣＲ４  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ＥＲＫ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ）、第２８４巻（９）、ｐ．５７４２〜５７５２
コンテント（Ｃｏｎｔｅｎｔｏ），ＲＬら著、２００８年、「ＣＸＣＲ４−ＣＣＲ５：Ｔ細胞機能を調節する対（ＣＸＣＲ４−ＣＣＲ５：ａ  ｃｏｕｐｌｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）」、プロナス（ＰＮＡＳ）、第１０５巻（２９）、ｐ．１０１０１〜１０１０６
ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）ＬＬら著、２００１年、「単核球細胞内でのＣＤ４０媒介性シグナル伝達：腫瘍壊死因子受容体関連因子ｍＲＮＡの上方制御およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼシグナル伝達経路の活性化（ＣＤ４０−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ：ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｍＲＮＡｓ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ）」、インターナショナル・イムノロジー（Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）、第１３巻（３）、ｐ．２７３〜２８３
ルオ（Ｌｕｏ），Ｙら著、２００６年、「ＳＤＦ１α／ＣＸＣＲ４シグナル伝達はラット神経前駆細胞内のβ−カテニン転写活性を刺激する（ＳＤＦ１ａｌｐｈａ／ＣＸＣＲ４
ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｒａｔ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）」、ニューロサイエンス・レターズ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ）、第３９８巻（３）、ｐ．２９１〜２９５
シュー（Ｘｕ），Ｈおよびヘイルショーン（Ｈｅｉｌｓｈｏｒｎ），ＳＣ著、２０１２年、「ＣＸＣＬ１２勾配におけるＢＤＮＦに増強される神経幹細胞の化学走性に関する微少流体研究（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＢＤＮＦ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｉｎ
ＣＸＣＬ１２  Ｇｒａｄｉｅｎｔｓ）」、スモール（Ｓｍａｌｌ）、第９巻（４）、ｐ．５８５〜５９５
ラタイチャク（Ｒａｔａｊｃｚａｋ），ＭＺおよびキム（Ｋｉｍ），Ｃ著、２０１２年、「幹細胞動員におけるケモカイン受容体アゴニストの使用（Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｉｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」、エキスパート・オピニオン・オン・バイオロジカル・セラピー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ）、第１２巻（３）、ｐ．２８７〜２９７
ドットリ（Ｄｏｔｔｏｒｉ），Ｍおよびペラ（Ｐｅｒａ），Ｍ著、２００８年、「神経幹細胞、分子生物学における方法（Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、シュプリンガーリンク（Ｓｐｒｉ
ｎｇｅｒＬｉｎｋ）、第４３８巻、文献中の章：「ヒトＥＳ細胞の神経分化（Ｎｅｕｒａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）」、ｐ．１９〜３０、レスリー  Ｐ．ワイナー（Ｌｅｓｌｉｅ  Ｐ．Ｗｅｉｎｅｒ）編
ポナス（Ｐｏｎａｔｈ）ら著、「好酸球上に選択的に発現されるヒトエオタキシン受容体の分子クローニングおよび特徴づけ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｅｏｔａｘｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｏｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ）」、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）、第１８３巻、ｐ．２４３７〜４８、１９９６年
アウクルスト（Ａｕｋｒｕｓｔ）ら著、「うっ血性心不全を有する患者におけるＣ−Ｃケモカインの循環レベルの上昇（Ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  Ｃ−Ｃ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）」、サーキュレーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）、１９９８年、第９７巻（１２）、ｐ．１１３６〜４３
ダマス（Ｄａｍａｓ）ら著、「ヒト末期心不全におけるＣＣ−およびＣＸＣ−ケモカインおよびそれらの受容体の心筋での発現（Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ  ＣＣ−  ａｎｄ  ＣＸＣ−ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）」、カルジオバスキュラー・リサーチ（Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．）、２０００年、第４７巻（４）、ｐ．７７８〜８７
ダマス（Ｄａｍａｓ）ら著、「静脈内免疫グロブリンの慢性心不全に対する調節性効果における単核血球中でのケモカインおよびその対応する受容体の促進された遺伝子発現（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ−ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）」、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・カレッジ・オブ・カーディオロジー（Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．）、２００１年、第３８巻（１）、ｐ．１８７〜９３
カヤリ（Ｋａｙａｌｉ）ら著、２０１２年、「ＳＤＦ−ｌα／ＣＸＣＲ４軸はヒト胎児膵臓内分泌前駆細胞の増殖および成熟に必要である（Ｔｈｅ  ＳＤＦ−ｌα／ＣＸＣＲ４
Ａｘｉｓ  ｉｓ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｅｔａｌ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ）」、プロス・ワン（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ）、第７巻（６）、ｅ３８７２１
ドーハーティ（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ）ら著、「ヒト好酸球エオタキシン受容体のクローニング、発現、および特徴づけ（Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｅｏｔａｘｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）、第１８３巻（５）、ｐ．２３４９〜５４、１９９６年
ヨウン（Ｙｏｕｎ）ら著、「ロイコタクチン−１の分子クローニング：新規なヒトβ−ケモカイン、好中球、単球、およびリンパ球における化学誘引物質、およびＣＣケモカイン受容体１および３における強力なアゴニスト（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｌｅｕｋｏｔａｃｔｉｎ−１：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ，ａ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ，ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ，ａｎｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ａｎｄ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｇｏｎｉｓｔ  ａｔ  ＣＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  １  ａｎｄ  ３）」、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．）、第１５９巻、ｐ．５２０１〜５２０５、１９９７年
キタウラ（Ｋｉｔａｕｒａ）ら著、「ヒトエオタキシン、好酸球選択的ＣＣケモカインの分子クローニング、および特異的な好酸球エオタキシン受容体、ＣＣケモカイン受容体３の同定（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｏｔａｘｉｎ，ａｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＣＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ，ａｎｄ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ
ｅｏｔａｘｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３）」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２７１巻、ｐ．７７２５〜７７３０、１９９６年
キタウラ（Ｋｉｔａｕｒａ）ら著、「ＣＣケモカイン受容体３の機能的リガンドである新規なヒトＣＣケモカイン（エオタキシン−３）の分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ＣＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｅｏｔａｘｉｎ−３）ｔｈａｔ  ｉｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｌｉｇａｎｄ  ｏｆ
ＣＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３）」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２７４巻、ｐ．２７９７５〜２７９８０、１９９９年
パン（Ｐａｎ）ら著、「粘膜組織内の上皮細胞によって発現されるＣＣＲ１０およびＣＣＲ３に対する新規なケモカインリガンド（Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ＣＣＲ１０  ａｎｄ  ＣＣＲ３  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ）」、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第１６５巻、ｐ．２９４３〜２９４９、２０００年
ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）ら著、「ＣＣＲ３受容体に結合し、ヒト好酸球を活性化する新規なヒトＣＣケモカインのクローニングおよび機能的特徴づけ（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ
ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ＣＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＣＣＲ３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ）」、ジャーナル・オブ・ルーコサイト・バイオロジー（Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．）、第６２巻、ｐ．６６７〜６７５、１９９７年
本明細書中に記載されたすべての公表された書籍、論文、特許、および特許出願を含む各刊行物は、明確かつ完全に参照により本明細書中に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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