(57)【要約】多数のサブユニットを含有する合成高分子であって、前記サブユニットのうちの１つ以上が、リン酸基または修飾リン酸基と連結されるアミノ酸側鎖を含有し、ホスホジエステル結合または修飾ホスホジエステル結合により隣接サブユニットに結合される合成高分子。本発明は、類似体ポリペプチドの分野に、ならびにこのような類似体を製造するのに有用である合成化学化合物に関する。【選択図】図１
2016519055.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多数の単量体サブユニットを含む合成高分子であって、前記単量体サブユイットのうちの少なくとも１つがリン酸基または修飾リン酸基と連結されるアミノ酸側鎖を含有し、前記単量体サブユニットのリン酸基または修飾リン酸基がホスホジエステル結合または修飾ホスホジエステル結合により隣接単量体サブユニットと連結される合成高分子。
【請求項２】
リン酸基または修飾リン酸基と連結されるアミノ酸側鎖を含有する前記単量体サブユニットが、アミノ酸側鎖とリン酸基または修飾リン酸基との間に糖部分を含有する、請求項１に記載の合成高分子。
【請求項３】
前記糖部分が五炭糖部分である、請求項２に記載の合成高分子。
【請求項４】
前記五炭糖部分がデオキシリボースまたはリボース糖部分である、請求項２に記載の合成高分子。
【請求項５】
リン酸基または修飾リン酸基と連結されるアミノ酸側鎖を含有する前記単量体サブユニットが、ホスホジエステル結合により隣接単量体と連結される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の合成高分子。
【請求項６】
リン酸基または修飾リン酸基と連結されるアミノ酸側鎖を含有する前記単量体が、修飾ホスホジエステル結合により隣接単量体と連結される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の合成高分子。
【請求項７】
前記修飾ホスホジエステル結合が、ホスホロチオレート、ジホスホロチオレート、アルキルホスホネート、アルコキシホスホネートおよびホスホルアミデート結合からなる群から選択される、請求項６に記載の合成高分子。
【請求項８】
リン酸基または修飾リン酸基と連結されるアミノ酸側鎖を含有する前記単量体サブユニットが、次式：
【化１】
2016519055.tif 000015
を有し、
式中、Ａ＝Ｈ、ＯＨ、アルキル基、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシ基、ビオチン、染料、逆結合、アミノ酸、ポリペプチドもしくは類似体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、固体支持体、固体支持体との連結、または隣接単量体サブユニット、
Ｂ＝Ｈ、ＯＨ、アルキル基、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシ基、ビオチン、染料、逆結合、アミノ酸、ポリペプチドもしくは類似体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、固体支持体、固体支持体との連結、または隣接単量体サブユニット、
Ｌ＝Ｒと共有結合されるリンカー、
Ｙ＝ＬおよびＦ間のスペーサー、
Ｆ＝ホスホジエステル基または修飾ホスホジエステル基、ならびに
Ｒ＝アミノ酸側鎖
である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の合成高分子。
【請求項９】
前記分子の前記単量体サブユニットの各々がリン酸基または修飾リン酸基と連結されるアミノ酸側鎖を含有し、前記単量体サブユニットの前記リン酸基または修飾リン酸基がホスホジエステル結合または修飾ホスホジエステル結合により隣接単量体サブユニットと連結される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の合成高分子。
【請求項１０】
前記分子の単量体サブユニットのうちの１つ以上が、リン酸基または修飾リン酸基と連結されるアミノ酸側鎖を含有するサブユニット以外であり、前記単量体サブユニットの前記リン酸基または修飾リン酸基がホスホジエステル結合または修飾ホスホジエステル結合により隣接単量体サブユニットと連結される、請求項１〜８のいずれかに記載の合成高分子。
【請求項１１】
前記単量体サブユニットのうちの１つ以上が、１つ以上の保護基の存在により保護される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の合成高分子。
【請求項１２】
リン酸基または修飾リン酸基と連結されるグリシンの側鎖以外のアミノ酸側鎖を含む単量体分子。
【請求項１３】
アミノ酸側鎖とリン酸基または修飾リン酸基との間に糖部分を含む、請求項１２に記載の単量体分子。
【請求項１４】
前記糖部分が五炭糖部分である、請求項１３に記載の単量体分子。
【請求項１５】
前記五炭糖部分がデオキシリボースまたはリボース糖部分である、請求項１４に記載の単量体分子。
【請求項１６】
前記アミノ酸側鎖がリン酸基と連結される、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の単量体分子。
【請求項１７】
前記アミノ酸側鎖が修飾リン酸基と連結される、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の単量体分子。
【請求項１８】
前記修飾リン酸基が、ホスホルアミデート、ホスホルアミダイト、ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオレート、ジホスホロチオレート、アルキルホスホネート、アルコキシホスホネートおよびアルコキシ基からなる群から選択される、請求項１７に記載の単量体分子。
【請求項１９】
１つ以上の保護基の存在により保護される、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の単量体分子。
【請求項２０】
次式：
【化２】
2016519055.tif 000016
を有し、
式中、Ａ＝Ｈ、ＯＨ、アルキル基、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシ基、ビオチン、染料、逆結合、アミノ酸、ポリペプチドもしくは類似体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、固体支持体、または固体支持体との連結、
Ｂ＝Ｈ、ＯＨ、アルキル基、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシ基、ビオチン、染料、逆結合、アミノ酸、ポリペプチドもしくは類似体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、固体支持体、または固体支持体との連結、
Ｌ＝Ｒと共有結合されるリンカー、
Ｙ＝ＬおよびＦ間のスペーサー、
Ｆ＝ホスホジエステル基または修飾ホスホジエステル基、ならびに
Ｒ＝アミノ酸側鎖
である、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の単量体分子。
【請求項２１】
合成高分子を伸長するための方法であって、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の単量体分子を獲得すること、ならびにホスホジエステル結合または修飾ホスホジエステル結合により前記単量体分子を前記合成高分子の単量体サブユニットに連結することを包含する合成高分子の伸長方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドの類似体の分野に、ならびにこのような類似体を製造するのに有用である合成化学化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリペプチドは、α−アミノ酸の重合体である。アミノ酸の一般式は、式Ａで以下のように示される。
【化１】
2016519055.tif 000003
【０００３】
式Ａで示されるように、アミノ酸は、アミノ基(ＮＨ２)、カルボキシル基(ＣＯＯＨ)および側鎖(Ｒ)を含有し、その各々は中心アルファ炭素に結合される。それらのそれぞれの側鎖(Ｒ)とともに以下の表１に列挙された遺伝暗号によりコードされる２０のアミノ酸(イミノ酸プロリンを含む)が存在する。
【表１】
2016519055.tif 000004
【０００４】
天然アミノ酸のほかに、遺伝暗号によりコードされない２つの他のアミノ酸が、タンパク質中に見出されている。セレノシステインはいくつかの酵素中に存在し、例えばそのいくつかはヒトに存在する。ピロリシンは、いくつかのメタン生成性古細菌において、それらがメタンを生成するために用いる酵素中に存在する。ＤＮＡコード化されない付加的アミノ酸としては、カルニチンおよびＧＡＢＡ(ガンマ−アミノ酪酸)、セレノメチオニン、ならびにヒドロキシプロリンが挙げられる。
【０００５】
アミノ酸は、あるアミノ酸からのカルボキシ部分からのヒドロキシル基、および第二のアミノ酸のヒドロキシ部分からのアミノ基からの水素のうちの１つが水として放出され、図Ｂに示されるようにペプチド結合(ＣＯ−ＮＨ)が形成される脱水または縮合反応により、第二のアミノ酸と連結されて、アミドである分子の生成を引き起こす。
【化２】
2016519055.tif 000005
【０００６】
ペプチド結合による２つのアミノ酸の連結は、ジペプチドとして言及される。２つ以上のアミノ酸の鎖は、ポリペプチドとして言及される。ポリペプチドの場合、各アミノ酸は、２つの末端アミノ酸を除いて、ポリペプチド結合により２つの隣接アミノ酸と連結される。本特許出願において、「ポリペプチド」という用語は、少なくとも２つのアミノ酸を有する鎖を指す。ポリペプチドが完全生物学的形態であり、安定立体配座である場合、ポリペプチドは「タンパク質」として本明細書中で言及され得る。「タンパク質」という用語は、本明細書中で用いる場合、安定三次元構造を有することも有さないこともあり、生物学的または化学的活性を有することも有さないこともある２〜５０のアミノ酸の短いアミノ酸オリゴマーを指す。
【０００７】
タンパク質は、動物または植物の身体内部で、および環境中で、種々の機能を有する。生体系において、タンパク質、例えばコラーゲン、ケラチンおよび植物タンパク質は剛性を提供し、構造を形成する。その他のタンパク質は、細胞シグナル伝達およびシグナル変換の過程に関与する。他のタンパク質は、生体系および環境の両方において、酵素として機能して、化学反応を触媒する。
【０００８】
細胞シグナル伝達およびシグナル変換タンパク質、例えば受容体、受容体リガンド、抗体および酵素は、ポリペプチド鎖の精確なフォールディングを基礎にした特定の立体配座を有する。ポリペプチドのアミノ酸は、互いに相互作用して、天然状態として既知の、折りたたまれたタンパク質である明確な三次元構造を生成する。それは、その結果生じる三次元構造を決定するポリペプチド中のアミノ酸の配列である。
【０００９】
ポリペプチドの場合、多数の三次元立体配座が考えられる。しかしながら、熱力学的に最も安定である立体配座が、優位に採用される。ペプチド結合は、堅くかつ平坦である。ペプチド結合と隣接する２つのアミノ酸の中心炭素、ならびにペプチド結合それ自体のＣＯおよびＮＨは、単一平面にある。しかしながら、アミノ酸側鎖(Ｒ)は、それらの中心炭素周囲を自由に回転する。その結果は、一連の剛性平面で作られるポリペプチド主鎖であり、隣接平面は、隣接平面間で共有される中心四面体炭素での回転の共通点を共有する。ポリペプチド鎖の中心炭素でのねじれ自由度は、原子間の立体障害により妨げられない限り、ポリペプチド鎖の種々のアミノ酸側鎖に互いと自由に相互作用させ、最も熱力学的に安定な立体配座を採用させる。
【００１０】
相対的に長さが短い、５０アミノ酸未満、特に３０アミノ酸未満のポリペプチド鎖では、ポリペプチドは、典型的には、二次構造をほとんど有さず、フォールディングをほとんど伴わない。しかしながら、５０アミノ酸より長いポリペプチド鎖では、主にアミノ酸の配列によって、特にそれらの側鎖によって決まるたたまれた立体配座をポリペプチドが採用するので、二次構造はより大きい意義を有する。
【００１１】
例えば医学的または環境的適用のために、それらの細胞シグナル伝達、シグナル変換または酵素的特性に関して、ならびにそれらの構造的特性に関してはより低い程度に、ポリペプチドを用いるという発想は、長い間、望ましいと考えられてきた。しかしながら、ポリペプチドのこのような使用を相容れない追求目標にする多数の問題が存在する。
【００１２】
ポリペプチドの化学合成は、成長中のペプチド結合連結アミノ酸鎖に化学的に保護されたアミノ酸を１つずつ段階的に付加することを包含する。近年まで、各付加的アミノ酸添加ステップでの収率が低すぎるため、このような化学合成は実用的でなかった。段階的添加工程の合成における誤りは、各付加的アミノ酸に関して９０％の収率を提供する剛性方法に関しては、１０個だけのアミノ酸のポリペプチドに関する最終収率は３４％に過ぎず、２０個のアミノ酸のポリペプチドに関する最終収率は１２％に過ぎない。しかしながら、近年、合成工程は、９９％より高い各新規添加アミノ酸に関する収率を提供して、従来得られていたよりも有意に高い収率を提供することが報告されている。
【００１３】
治療目的のためのポリペプチドの使用に伴うさらに扱いにくい問題は、その活性部位へのポリペプチドの送達、ならびに生物学的環境におけるポリペプチドの不安定性に関する。ポリペプチドは唾液および胃液酵素により迅速に分解されるため、ポリペプチドの経口投与は実用的でない。しかしながら、このような投与経路が、例えば静脈内投与により、迂回される場合でさえ、血流中に、または身体全体に見出されるペプチダーゼ酵素により、ポリペプチドは不活性断片に迅速に分解される。したがって、ポリペプチドが治療的に用いられた場合、非常に短期間であっても、何らかの活性ポリペプチドの利用可能性を保証するために、ポリペプチドの迅速な分解および排除は、超薬理学的用量の投与を要する。さらに重要なことは、このような超薬理学的用量のポリペプチドの投与が、その後の臨床的毒性と関連すると思われる点である。それは主に、治療薬としてのポリペプチドの使用が広範に利用されていないというこれらの理由のためである。
【００１４】
分解および送達についての同様の問題は、環境的目的のためのポリペプチドの使用に伴って生じる。環境ペプチダーゼ、例えば細菌および真菌のような顕微鏡的生物体におけるものは、迅速にポリペプチドを分解し、それらの意図した目的のためにポリペプチドを役に立たなくさせる。
【００１５】
環境的な、および臨床的に投与されるポリペプチドの不安定性の問題を克服するために、多くの試みがなされてきた。上記のように、一方法は、超薬理学的用量でポリペプチドを投与するかまたは適用することである。しかしながら、このような超薬理学的用量投与は、極端に高い経費と、ならびに考え得る毒性と関連する。したがって、ほとんどの状況において、この選択肢は実行可能でない。
【００１６】
身体的および環境的ペプチダーゼに対して耐性である機能的タンパク質様分子を獲得するための試みにおいて、ポリペプチドの種々の類似体が生成されている。Ｈｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ,ＰＮＡＳ，７２(２)：５６３−５６６(１９７５)は、ペプチド結合のＣＯおよびＮが入れ替えられるペプチド類似体であるレトロ−Ｄ類似体を試験した。Ｈｅｃｔｈｅｒに開示されるように、このようなペプチド類似体は、経口投与される場合、活性を保持すると予測される。しかしながら、Ｈｅｃｔｈｅｒにさらに開示されるように、レトロ−Ｄ類似体は機能的活性を欠く。
【００１７】
Ｇｏｐｉ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５３５：１７５−１７８(２００３)は、ペプチド鎖中のベータ−アミノ酸の組み入れがタンパク質分解性分解に対するペプチドの耐性を提供する、と開示している。天然アミノ酸は、アミノ基およびカルボキシル基が同一中心炭素原子に結合されるアルファ−アミノ酸である。グリシン以外の天然アミノ酸の各々は、ベータ−アミノ酸として作られ得る。グリシンは、単一炭素だけを有し、したがってアミノおよびカルボキシル基はグリシン側鎖の異なる炭素と結合され得ないため、ベータ−アミノ酸に作られ得ない。Ｇｏｐｉは、単一ベータ−アミノ酸のペプチドへの添加がプロテアーゼによる分解からペプチドを保護する、と開示した。しかしながら、Ｇｏｐｉは、ベータ−アミノ酸の存在が、さらにまた、ペプチドの機能性をかなり低減する、とさらに開示した。
【００１８】
Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ（米国特許第５，７７０，７３２号）は、活性ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸サブユニット、アミノ酸のピロリノンサブユニット類似体による取り替えを開示する。要するに、ポリペプチドのアミド主鎖は、５員ピロリノン環系で中心アミド基を取り替えるために再整列される。Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ特許の発明人等は、会社Ｐｒｏｖｉｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．(Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ)を設立して、これらのピロリノン模擬足場を含有するペプチド類似体を開発し、商業化した。
【００１９】
本出願人の知るところでは、従来技術のペプチド類似体のうち、ペプチドの代用物として広範囲の用途を見出したものはない。したがって、プロテアーゼ分解に耐性であり、類似体が基礎とする天然ペプチドの機能性を保持するペプチド類似体を開発するための目標は依然としてわかりにくい。
【００２０】
核酸は、ポリペプチドとは異なる生体高分子の一クラスである。ポリペプチドとは違って、核酸の単量体単位は、ペプチド結合というよりむしろホスホジエステル結合の主鎖により、一緒に結び付けられる。さらにまた、ポリペプチドとは違って、天然核酸は、リボ核酸(ＲＮＡ)の場合にはリボース、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)の場合にはデオキシリボースの糖の反復単位を含有する。
【００２１】
核酸とポリペプチドの間の別の差異は、側鎖にある。ポリペプチドが中心炭素と連結されるアミノ酸側鎖を含有する一方、天然核酸は４つの側鎖を含有する。ＲＮＡの場合、側鎖は、プリン  アデニンおよびグアニン、ならびにピリミジン  シトシンおよびウラシルである。ＤＮＡの場合、側鎖は、プリン  アデニンおよびグアニン、ならびにピリミジン  シトシンおよびチミンである。
【００２２】
これらの差異は別にして、核酸およびポリペプチドは、共同のいくつかの特徴を共有する。ポリペプチドと同様に、一本鎖核酸は、側鎖の高自由度の動きを有する平坦な主鎖、この場合はプリンまたはピリミジンを本質的に有する。ポリペプチドと同様に、核酸は、身体内の、ならびに環境中の酵素による分解に付される。
【００２３】
ペプチド核酸(ＰＮＡ)は、ペプチド結合により連結されるＮ−(２−アミノセチル)−グリシン単位を反復する主鎖を有するキメラ高分子化合物である。種々のプリンおよびピリミジン塩基は、メチレンカルボニル結合により主鎖と連結される。ＰＮＡはプロテアーゼまたはヌクレオシダーゼにより分解されず、ＤＮＡの作用を抑制するためにＤＮＡと結合することは有用である。
【００２４】
ＰＮＡ分子は、合成核酸類似体である。今日まで、ホスホジエステルまたは修飾ホスホジエステル主鎖を基礎にした合成ポリペプチド分子を、本発明人は承知していない。以下でさらに詳細に記載されるように、このような分子は、ヒトおよび動物医療における治療的および診断的指標のために有用であり、ポリペプチドが有用である状況での環境的適用において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】糖部分を含有するアラニンホスホルアミダイト単量体の合成を示す。
【図２】糖部分を含有するフェニルアラニンホスホルアミダイト単量体の合成を示す。
【図３】糖部分を含有するシステインホスホルアミダイト単量体の合成を示す。
【図４】糖部分を含有するリシンホスホルアミダイト単量体の合成を示す。
【図５】糖部分を含有するチロシンホスホルアミダイト単量体の合成を示す。
【図６】糖部分を欠くアラニンホスホルアミダイト単量体の合成を示す。
【図７】糖部分を欠くフェニルアラニンホスホルアミダイト単量体の合成を示す。
【図８】糖部分を欠くリシンホスホルアミダイト単量体の合成を示す。
【図９】糖部分を欠くチロシンホスホルアミダイト単量体の合成を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
一実施形態において、本発明は、ポリペプチドおよび核酸の両方の要素を含有する合成高分子分子である。高分子分子は、核酸または主鎖修飾核酸中に存在するような、ホスホジエステルまたは修飾ホスホジエステル主鎖により鎖中で連結される一連の単量体サブユニットを含有する。合成高分子は、天然ポリペプチドまたはオリゴヌクレオチドと比較して、酸、ヌクレアーゼおよび／またはプロテアーゼ増大を示す。分子の単量体は、さらにまた、核酸中に存在する塩基の代わりにアミノ酸側鎖を含有する。
【００２７】
本出願の単量体は、高収率で長い重合体の合成を可能にするが、それは、このような重合体の合成が標準オリゴヌクレオチド合成方法により成し遂げられ得るためである。したがって、本発明の適用の利点は、自動ポリペプチド合成方法と比較して、改良された単位長当たり収率である。
【００２８】
本明細書中では、「単量体サブユニット」という用語は、高分子中のサブユニットの鎖内に存在する単量体を指し、「反応性単量体」という用語は、高分子の一部ではない、そして１つ以上の他の反応性単量体と組み合わされて、高分子を形成し得る分子を指し、ならびに「単量体」という用語は、本明細書中で用いる場合、単量体サブユニットおよび／または反応性単量体のいずれかまたは両方を指す。
【００２９】
好ましい一実施形態では、合成高分子は、さらに、糖部分、例えば五炭糖、例えばリボースまたはデオキシリボースを含有する。糖部分は、ホスホジエステルまたは修飾ホスホジエステル主鎖のアミノ酸側鎖およびホスフェートまたは修飾ホスフェートと連結され、独立してつながる。
【００３０】
好ましい一実施形態では、糖はデオキシリボースであり、主鎖はホスホジエステルである。したがって、この実施形態における高分子は、ＤＮＡのヌクレオシドの窒素塩基がアミノ酸側鎖により取って代わられるデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)類似体であると考えられ得る。この実施形態の高分子は、ポリペプチド主鎖がホスホジエステル主鎖により取って代わられたポリペプチド類似体であるとも考えられ得る。少なくとも３つの類似体単量体サブユニットの鎖を有するこの実施形態のＤＮＡ／ポリペプチド類似体は、式Ｃで示される。
【化３】
2016519055.tif 000006
【００３１】
式Ｃで示されるように、デオキシリボース糖部分の５つの炭素は、１〜５の番号を付けられる。式ＣのＲ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、アミノ酸側鎖であり、これらは、遺伝暗号によりコードされるアミノ酸または遺伝暗号によりコードされないアミノ酸を有し得る。隣接糖部分は、天然ＤＮＡと同様に、ホスホジエステル結合により連結される。式ＣのＡおよびＢは、本発明のこの実施形態に対する物質ではなく、例えば、本発明の単量体であり得るし、そうでないこともある隣接単量体サブユニットであり得る。適切なＡおよびＢ基の他の例としては、Ｈ、ＯＨ、アルキル基、例えばメチル、エチル、ブチル、プロピルまたはイソプロピル基、アルコキシ基、例えばメトキシ、エトキシ、ブトキシ、プロポキシまたはイソプロポキシ基、アミノ基、カルボキシ基、ビオチン、染料、逆連結、アミノ酸、ポリペプチドまたは類似体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、固体支持体、例えば一般的支持体、および固体支持体との連結、例えば長鎖スクシニミジルエステル結合が挙げられる。
【００３２】
好ましくは、式Ｃのアミノ酸側鎖Ｒは、位置１で糖と連結される。あまり好ましくはないが、Ｒは、位置１以外の糖の環上の一、例えば五炭糖の位置２で、あるいはヘキソースまたはヘプトース糖の位置２または３で連結される。
【００３３】
式Ｃの高分子の反応性基は、保護または非保護状態であり得る。例えば、ホスホジエステル結合のホスフェートの潜在的反応性Ｏ基およびＯＨ基、ならびにアミノ酸側鎖上の任意の反応性基は、保護され得る。例えばアラニン、グリシン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンの側鎖はアルキル基からなり、一般的に、化学合成中の副反応を防止するために基を保護する必要がない。同様に、フェニルアラニンの側鎖は、反応性官能基を含有せず、一般的に基を保護する必要がない。しかしながら、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、リシン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファンおよびチロシンの側鎖は反応性官能基を含有し、化学合成中のこれらの官能基の反応を防止するために基を保護することは必要でない。
【００３４】
利用され得る保護基の例としては、アルコール保護基、例えばアセチル、ベンゾイル、ベンジル、ベータ−メトキシエトキシメチルエーテル、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）、メトキシトリチル（ＭＭＴ）、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＰＭＢ）、メチルチメチルエーテル、ピバロイル、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、トリチル（Ｔｒ）、シリルエーテル、例えばＴＭＳ、ＴＢＤＭＳ、ＴＯＭおよびＴＩＰＳ、メチルエーテルおよびエトキシエチルエーテル、アミン保護基、例えばカルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルボニル（ＭｏｚまたはＭｅＯＺ）、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、９−フルオロエニルメチルオキシカルボニル（ＦＯＭＣ）、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル、ベンジル、カルバメート、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、ｐ−メトキシフェニル、トシルおよびスルホンアミド基、例えばノシルおよびＮｐｓ基、カルボニル保護基、例えばアセタルおよびケタール、アシラールおよびジチアン、カルボン酸保護基、例えばメチルエステル、ベンジルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、２，６−二置換フェノールのエステル、シリルエステル、オルトエステルおよびオキサゾリン、末端アルキン保護基、例えばプロパルギルアルコールおよびシリル基、ならびにホスフェート保護基、例えば２−シアノエチルおよびメチルが挙げられる。
【００３５】
別の好ましい実施形態では、式Ｃの単量体サブユニットのうちの１つ以上のデオキシリボース糖部分は、式Ｄで示されるように、リボース糖部分に取って代わられる。所望により、リボース部分の遊離ヒドロキシル基は保護され得る。
【化４】
2016519055.tif 000007
【００３６】
別の実施形態では、合成高分子の単量体サブユニットの糖部分は、デオキシリボースまたはリボース以外である。例えば糖部分は、２’Ｏ−メチルリボース、三炭糖、四炭糖、五炭糖、六炭糖または七炭糖部分であり得るし、アルドースまたはケトース糖であり得る。適切な糖の例としては、四炭糖、例えばエリトロース、トレオースおよびエリスルロース；五炭糖、例えばアラビノース、リキソース、キシロース、リブロースおよびキシルロース；六炭糖、例えばアロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボースおよびタガトース；ならびに七炭糖、例えばセドヘプツロース、マンノヘプツロースおよびマンノケトヘプトースが挙げられる。糖は、１つ以上の位置で脱酸素化され、したがってデオキシ糖部分であり得る。
【００３７】
合成高分子の糖部分は、所望により修飾され得る。例えば糖の任意の位置、例えば２位置は、例えばフッ素または塩素を用いてハロゲン化され得る。その他の修飾としては、例えば２位置での、糖中のＯ−メトキシまたはエトキシメトキシが挙げられる。別の修飾は、例えば式Ｃに示されたような位置２での、デオキシであり得る。
【００３８】
別の実施形態では、合成高分子の糖部分は、糖以外の環化構造により取って代わられる。例えば、合成高分子は、非糖、例えばシクロアルキル環部分、例えばシクロペンタンまたはシクロヘキサンを含有し得る。これらの環化構造としては、モルホリノ、ピペリジノ、ピロリジノ、または機器ベースのオリゴヌクレオチド合成において既知であるようなその他の環構造が挙げられ得る。環化構造部分は、糖に関して上記したように修飾されるかまたは置換され得る。
【００３９】
別の実施形態では、合成高分子の単量体サブユニットのうちの１つ以上は、アミノ酸側鎖とホスホジエステル基または修飾ホスホジエステル基との間に糖部分を含まない。代わりに、層部分は、式Ｅで以下に示されるようにリンカーにより取って代わられる。
【化５】
2016519055.tif 000008
【００４０】
式Ｆにおいて、Ａ、ＢおよびＲ基は、式Ｃ、ＤおよびＥにおけると同様である。しかしながら、式Ｆでは、糖部分は存在しない。代わりに、合成高分子は、Ｒ基を高分子のホスホジエステル主鎖と連結するリンカー(Ｌ)、ならびに高分子のホスホジエステル主鎖の隣接ホスフェート基を共有的に結合するスペーサー(Ｙ)を含有する。
【００４１】
リンカーＬは、Ｒと共有結合する。リンカーＬは、１〜１０原子長であり、生物学的系で生じる任意の原子で構成され得るし、多重共有結合を形成し得る。したがって、Ｌの原子の例としては、Ｃ、Ｎ、ＯまたはＳが挙げられる。あまり好ましくないが、リンカーは、Ｃａ、Ｍｎ、Ｍｇ、ＦｅおよびＳｅのような原子を含有することがある。Ｌから生じる側鎖は重要でなく、Ｌの長さを決定する場合、考慮されない、ということに留意されたい。側鎖がＬ上に存在する場合、側鎖のサイズは、分子のアミノ酸側鎖Ｒが他の化合物との相互作用のために、例えば結合のために利用可能であるようなものである。
【００４２】
好ましい一実施形態では、Ｌは、架橋剤を用いて活性化アミノ酸側鎖ＲをＹスペーサーと繋ぐ化学的架橋反応に起因する共有的化学的結合である。このような架橋試薬の例としては、ホモ二官能性およびヘテロ二官能性架橋試薬、例えばＮＨＳエステル、マレイミド、カルボジイミド、イソチオネート、イミドエステル、ピリジルジチオール、ハロセチル、アリール、アジドおよびヒドラジドが挙げられる。その他の適切な架橋剤は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃａｔａｌｏｇに開示されており、これは、ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍでアクセスし得る。
【００４３】
上記のようなＬは、アミノ酸側鎖がＹ基と連結される実施例において以下に開示される単量体の合成方法の結果として生じ得る。しかしながら、本出願の単量体が作られる多数の方法が存在し、そのいくつかは、ＲおよびＹを連結するための架橋剤の使用を包含しない。このような方法に起因する単量体はＬを有さないことがあり、あるいはＬは、化学的架橋反応に起因する共有的化学的結合以外であり得る。
【００４４】
例えば、式ＣおよびＤに上記で示された高分子合成分子において、Ｒ基は、糖により主鎖と連結される。環中のＯおよび位置１および２での炭素を含む糖の部分はＬに対応するために考え出され、位置３、４および５での炭素はＹに対応するために考え出され得る。この状況では、Ｌは、化学的架橋反応に起因する共有的化学的結合ではない。したがって、ＬはＲと単量体の主鎖基との間の繋がりであるので、Ｌの実際の同一性は本出願の単量体に欠かせないというわけではない。所望により、リンカーＬは省かれ得るし、アミノ酸側鎖Ｒは直接Ｙと連結され得る。
【００４５】
スペーサーＹは、一般的に１〜１５、好ましくは３〜１２原子長である。Ｙの原子は逐次的に共有結合され、好ましくはＣ、Ｎ、ＯまたはＳである。Ｙの原子と結合される他の原子は、分子を利用する場合に立体障害を引き起こさない限り、一般的に必須というわけではない。Ｌに関する場合と同様に、側鎖が存在する場合、またはＹが環構造、例えば式Ｃ、ＤおよびＥの環構造の一部である場合、Ｙの長さは、ホスホジエステル主鎖の隣接ホスフェート基間に続いて起こる原子の数であるとみなされる。
【００４６】
好ましい一実施形態では、合成高分子は、一部がリンカーＬであり、一部がスペーサーＹである環構造を含む。このような環構造を有する本出願の合成高分子は、式Ｃ、ＤおよびＥで示され、式中、環構造は糖である。代替的には、環構造は糖部分以外であり得る。合成高分子中に含まれ得る、そしてリンカーＬおよびスペーサーＹの両方を構成する糖意外である適切な環構造部分の例は、モルホリノ、シクロアルキル、例えばシクロブチル、シクロペンチルまたはシクロヘキシル、アリール、例えばフェニルまたはナフチル、およびヘテロアリール、例えばイオウ含有環、例えばチオフェン、窒素含有環、例えばピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピロリン、ピロリジン、ピリジン、ピリミジン、プリン、キノリン、イソキノリンまたはカルバゾール、もしくは酸素含有環、例えばフラン、あるいはオキサゾールまたはチアゾールのような組合せである。環構造へ、糖部分であっても非糖部分であっても、置換され得る。したがって、環構造は、基、例えばあるいる基、アミノ基、メルカプト器またはハロゲン基、例えば塩素またはフッ素を含み得る。
【００４７】
本明細書中のこの時点まで、高分子の上記実施形態の全てが、ホスホジエステル主鎖に関して開示されている。核酸適用において、種々の理由のために、例えば合成を促進するために、または分解に対して主鎖をより耐性にさせるために、ホスホジエステル主鎖における種々の変化が導入されている。ホスホジエステル主鎖におけるこのような変化は、本出願の高分子に利用され得る。
【００４８】
核酸主鎖化学の分野で既知であるホスホジエステル主鎖の任意の修飾が、本発明の適用の単量体のために利用され得る。例えば、ホスホジエステル結合の代わりに、主鎖は、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート結合を含有し得るが、この場合、非架橋酸素(Ｏ)のいずれかまたは両方がイオウ(Ｓ)に取って代わられる。主鎖は、ホスホロチオレートまたはジホスホロチオエート結合を含有し得るが、この場合、架橋Ｏ基のいずれかまたは両方がＳに取って代わられる。主鎖は、アルキルホスホネート、例えばメチルホスホネートまたはエチルホスホネートを含み得るが、この場合、非架橋Ｏ基のいずれかまたは両方が、アルキル基、例えばメチルまたはエチルに取って代わられる。主鎖は、アルコキシホスホネート結合、例えばメトキシホスホネートまたはエトキシホスホネートを含有し得るが、この場合、非架橋Ｏ基のいずれかまたは両方が、アルコキシ基、例えばメトキシまたはエトキシに取って代わられる。主鎖は、ホスホルアミダイト結合を含有し得るが、この場合、架橋および／または非架橋Ｏ基のうちの１つ以上がアミノ基に取って代わられる。上記は、利用され得るホスホジエステル主鎖の修飾の単なる例である。
【００４９】
したがって、上記のように、合成高分子は、式Ｇとして以下に示される一般式を有する。
【化６】
2016519055.tif 000009
【００５０】
式Ｇにおいて、変数Ａ、Ｂ、Ｒ、ＬおよびＹは、式Ｃ〜Ｆの場合と同じである。Ｆは、ホスホジエステルまたは修飾ホスホジエステル主鎖基であり、ｎ＝少なくとも２である。式Ｇにおける破線は、式Ｇの高分子が少なくとも２つのサブユニットを含有すること、さらにサブユニットが任意であることを示す。
【００５１】
合成高分子は多重サブユニットを含有し、そのうちの少なくとも１つは式Ｈで表されるが、この場合、Ａ、Ｂ、Ｙ、Ｌ、ＦおよびＲは式Ｃ〜Ｇで上記したものと同じである。
【化７】
2016519055.tif 000010
【００５２】
好ましい一実施形態では、本出願の高分子は、式Ｈで示されているようなサブユニットを含有し、合成高分子の各サブユニットは、Ｈで示されているものと同じである。しかしながら、以下でさらに詳細に考察されるように、本出願の高分子は、式Ｈで示されるもの以外のサブユニットを含有し得る。
【００５３】
例えば、高分子は、式Ｈで示されるような１つ以上のサブユニット、ならびに例えばＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチドである１つ以上のサブユニットを含有し得る。ヌクレオチドの主鎖基は、ホスホジエステル主鎖基または修飾ホスホジエステル主鎖基であり得る。したがって、一実施形態では、高分子は、ホスホジエステルまたは修飾ホスホジエステル主鎖基と連結されるヌクレオシドである１つ以上のサブユニットを含有する。
【００５４】
式Ｈで示される単量体サブユニットに関する場合と同様に、式Ｈのもの以外であるサブユニットは、保護基の存在により保護され得る。このような保護基は、当該技術分野で既知である。
【００５５】
好ましい一実施形態では、本出願の単量体は、アミノ酸側鎖Ｒ、リンカーＬ、スペーサーＹおよびホスホジエステル基または修飾ホスホジエステル基を含有する。好ましい一実施形態では、本出願の単量体は、式Ｉで示されるものと同じである。
【化８】
2016519055.tif 000011
【００５６】
式Ｉにおいて、スペーサーＹ、ならびにリンカーＬの一部分はデオキシリボース内にあり、Ｒはアミノ酸側鎖であり、ＡおよびＢは独立して隣接単量体サブユニットであり得るが、これは本発明の単量体であり得るし、そうでないこともある。適切なＡおよびＢ基の他の例としては、Ｈ、ＯＨ、アルキル基、例えばメチル、エチル、ブチル、プロピルまたはイソプロピル基、アルコキシ基、例えばメトキシ、エトキシ、ブトキシ、プロポキシまたはイソプロポキシ基、アミノ基、カルボキシ基、ビオチン、染料、逆結合、アミノ酸、ポリペプチドまたは類似体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、固体支持体、例えば一般的支持体、および固体支持体との連結、例えば長鎖スクシニミジルエステル結合が挙げられる。
【００５７】
別の好ましい実施形態では、単量体は、式Ｉで示されるデオキシリボース部分の代わりに、式Ｊで示されるようなリボース部分を含有する。
【００５８】
別の好ましい実施形態では、式ＩまたはＪのリボースまたはデオキシリボース部分は、式Ｋで示されるように、デオキシリボースまたはリボース以外の糖部分に取って代わられる。例えば糖部分は、２’Ｏ−メチルリボース、三炭糖、四炭糖、五炭糖、六炭糖または七炭糖部分であり得るし、アルドースまたはケトース糖であり得る。適切な糖の例としては、四炭糖、例えばエリトロース、トレオースおよびエリスルロース；五炭糖、例えばアラビノース、リキソース、キシロース、リブロースおよびキシルロース；六炭糖、例えばアロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グルコース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボースおよびタガトース；ならびに七炭糖、例えばセドヘプツロース、マンノヘプツロースおよびマンノケトヘプトースが挙げられる。糖は、１つ以上の位置で脱酸素化され、したがってデオキシ糖部分であり得る。
【化９】
2016519055.tif 000012
【００５９】
単量体の糖部分は、単量体サブユニットとしてであっても、反応性単量体としてであっても、所望により修飾され得る。例えば糖の任意の位置、例えば２位置は、例えばフッ素または塩素を用いてハロゲン化され得る。その他の修飾としては、例えば２位置での、糖中のＯ−メトキシまたはエトキシメトキシが挙げられる。別の修飾は、例えば式Ｉに示されたような位置２での、デオキシであり得る。
【００６０】
別の実施形態では、単量体の糖部分は、式Ｌで示されるような糖以外の環化構造により取って代わられる。例えば、単量体は、非糖、例えばシクロアルキル環部分、例えばシクロペンタンまたはシクロヘキサンを含有し得る。環化構造部分は、糖に関して上記したように修飾されるかまたは置換され得る。
【００６１】
別の実施形態では、糖部分または環化構造は単量体中に存在せず、その代わりに、単量体はリンカーＬおよびスペーサーＹを含有するが、この場合、Ｌはアミノ酸側鎖をスペーサーと繋ぎ合わせ、スペーサーは、ＡおよびＦを繋ぎ合わせて、Ｌと結合する一連の原資である。この実施形態は、式Ｌで示される。
【化１０】
2016519055.tif 000013
【００６２】
式Ｌにおいて、リンカーＬは、Ｒと共有結合する。リンカーＬは、１〜１０原子長であり、生物学的系で生じる任意の原子で構成され得るし、多重共有結合を形成し得る。したがって、Ｌの原子の例としては、Ｃ、Ｎ、ＯまたはＳが挙げられる。あまり好ましくないが、リンカーは、Ｃａ、Ｍｎ、Ｍｇ、ＦｅおよびＳｅのような原子を含有することがある。Ｌから生じる側鎖は重要でなく、Ｌの長さを決定する場合、考慮されない、ということに留意されたい。側鎖がＬ上に存在する場合、側鎖のサイズは、分子のアミノ酸側鎖Ｒが他の化合物との相互作用のために、例えば結合のために利用可能であるようなものである。
【００６３】
好ましい一実施形態では、Ｌは、架橋剤を用いて活性化アミノ酸側鎖ＲをＹスペーサーと繋ぐ化学的架橋反応に起因する共有的化学的結合である。式Ｌにおいて、Ｙスペーサーは非糖スペーサーである。Ｌに示されているように、Ｙは三炭素スペーサーである。したがって、Ｙという文字は式Ｌにおいて上記で明白に示されていない。このような架橋試薬の例としては、ホモ二官能性およびヘテロ二官能性架橋試薬、例えばＮＨＳエステル、マレイミド、カルボジイミド、イソチオネート、イミドエステル、ピリジルジチオール、ハロセチル、アリール、アジドおよびヒドラジドが挙げられる。その他の適切な架橋剤は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃａｔａｌｏｇに開示されており、これは、ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍでアクセスし得る。
【００６４】
上記のようなＬは、一般的に、アミノ酸側鎖がＹ基と連結される実施例において以下に開示される単量体の合成方法の結果として生じ得る。しかしながら、本出願の単量体が作られる多数の方法が存在し、そのいくつかは、ＲおよびＹを連結するための架橋剤の使用を包含しない。このような方法に起因する単量体はＬを有さないことがあり、あるいはＬは、化学的架橋反応に起因する共有的化学的結合以外であり得る。
【００６５】
例えば、式ＣおよびＤに上記で示された高分子合成分子において、Ｒ基は、糖により主鎖と連結される。環中のＯおよび位置１および２での炭素を含む糖の部分はＬに対応するために考え出され、位置３、４および５での炭素はＹに対応するために考え出され得る。この状況では、Ｌは、化学的架橋反応に起因する共有的化学的結合ではない。したがって、ＬはＲと単量体の主鎖基との間の繋がりであるので、Ｌの実際の同一性は本出願の単量体に欠かせないというわけではない。所望により、リンカーＬは省かれ得るし、アミノ酸側鎖ＲおよびＹは互いに直接連結され得る。
【００６６】
単量体についての上記の実施形態において、単量体は、ホスホジエステル基を含有する。核酸適用において、種々の理由のために、例えば合成を促進するために、または分解に対して主鎖をより耐性にさせるために、ホスホジエステル主鎖における種々の変化が導入されている。ホスホジエステル主鎖におけるこのような変化は、本出願の高分子に利用され得る。
【００６７】
核酸主鎖化学の分野で既知であるホスホジエステル主鎖の任意の修飾が、本発明の適用の単量体のために利用され得る。例えば、反応性単量体に関しては、式Ｈ〜ＬのいずれかにおけるＦは、ホスホルアミデート、ホスホルアミダイト、例えばｐ−エトキシ、またはホスホネート基であり得る。例えば、単量体サブユニットに関しては、Ｆはホスホジエステル基、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート基、アルキルホスホネート、例えばメチルホスホネートまたはエチルホスホネート基、アルコキシホスホネート、例えばメトキシホスホネートまたはエトキシホスホネート基、アルコキシ、例えばメトキシまたはエトキシ基、ホスホルアミデート基、または核酸化学で用いられるようなホスホジエステル基のその他の修飾であり得る。
【００６８】
単量体の上記の実施形態において、任意のアミノ酸側鎖が含まれ得る。しかしながら、アミノ酸グリシンの側鎖は単に水素(Ｈ)であるため、Ｒとしてグリシン側鎖を含有する反応性単量体は、本出願の範囲から除外される。しかしながら、グリシン側鎖を含有する単量体サブユニットは、本出願の範囲から除外されない。
【００６９】
単量体の反応性基は、反応性単量体としてであっても、単量体サブユニットとしてであっても、保護化または非保護化状態であり得る。このような反応性基としては、例えばイミン基、アミン基、ヒドロキシル基、チオールおよびカルボキシル基が挙げられ得る。アラニン、グリシン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンの側鎖はアルキル基で構成され、一般的に、化学合成中の副反応を防止するために保護基を必要としない。同様に、フェニルアラニンの側鎖は反応性官能基を含有せず、一般的に、保護基を必要としない。しかしながら、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、リシン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファンおよびチロシンの側鎖は反応性官能基を含有し、化学合成中のこれらの官能基の、例えば分枝のような反応を防止するために、保護基が必要とされる。
【００７０】
本出願の単量体に利用され得る保護基の例としては、アルコール保護基、例えばアセチル、ベンゾイル、ベンジル、ベータ−メトキシエトキシメチルエーテル、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）、メトキシトリチル（ＭＭＴ）、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＰＭＢ）、メチルチメチルエーテル、ピバロイル、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、トリチル（Ｔｒ）、シリルエーテル、例えばＴＭＳ、ＴＢＤＭＳ、ＴＯＭおよびＴＩＰＳ、メチルエーテルおよびエトキシエチルエーテル、アミン保護基、例えばカルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルボニル（ＭｏｚまたはＭｅＯＺ）、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、９−フルオロエニルメチルオキシカルボニル（ＦＯＭＣ）、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル、ベンジル、カルバメート、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、ｐ−メトキシフェニル、トシル、およびスルホンアミド基、例えばノシルおよびＮｐｓ基、カルボニル保護基、例えばアセタルおよびケタール、アシラールおよびジチアン、カルボン酸保護基、例えばメチルエステル、ベンジルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、２，６−二置換フェノールのエステル、シリルエステル、オルトエステルおよびオキサゾリン、末端アルキン保護基、例えばプロパルギルアルコールおよびシリル基、ならびにホスフェート保護基、例えば２−シアノエチルおよびメチルが挙げられる。
【００７１】
本出願の合成高分子は、好ましくは、ＤＮＡおよびＲＮＡのような核酸を合成するために用いられる固体状態ホスホルアミダイト合成方法により製造される。このような方法において、最初の単量体は、固体状態支持体、例えば制御細孔ガラスビーズ(ＣＰＧ)に固定される。ホスホルアミダイト合成スキームにおけるように、単量体は、好ましくは、単量体の各反応性基を被覆する保護基を有する。
【００７２】
伸長の第一ステップでは、存在する末端単量体が非ブロック化され、これがＤＭＴのようなブロッキング基を鎖伸長の部位から除去し、その位置に反応性基を残す。活性剤溶液が新規の単量体に添加される。次に、鎖に添加されるべき新規の単量体は、結合非ブロック化単量体または鎖と組み合わされ、それにより鎖を伸長する。１つの単量体により鎖を伸長するための反応を可能にした後、次のステップは、非反応化試薬が不活性にされるキャッピングステップであり、それにより内部欠失を有する鎖の伸長を防止する。次に、酸化ステップが起こり、これによってＯまたはＳがホスフェート基に添加されて、ホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはその他の修飾リン結合を生じる。所望の高分子が構築されるまで、付加的単量体単位に関して当該サイクルが反復される。すべての単量体添加の完了後、分子は支持体から切り離され、脱保護化される。
【００７３】
単量体の製造のための一般スキームは、実施例１における米国特許第４，４１５，７３２号（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）に記載された方法と類似するが、但し、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ実施例におけるＢは本発明の適用とは異なる。
【００７４】
本発明の単量体は、以下のように製造され得る。アミノ酸の側鎖に対応する保護化化学基を得る。側鎖がアミノ、ヒドロキシ、カルボキシまたはチオール反応性基を含有する場合、反応性基は、好ましくはＤＮＡホスホルアミダイト化学的性質と適合性である化学的保護基で保護される。このような化学的性質により重合体中に単量体を組み入れさせるため、ＤＮＡホスホルアミダイト化学的性質との適合性が選択される。しかしながら、単量体が、重合体中に組み入れられることなく、単独で用いられるべきものである場合、あるいは単量体がＤＮＡホスホルアミダイト化学的性質以外により重合体中に組み入れられるべきものである場合、ＤＮＡホスホルアミダイト化学的性質と適合性でない化学的保護基が用いられ得る。ホスフェートまたは修飾ホスフェート基と組み合わされて、単量体を提供する中間体を得るために、保護化アミノ酸側鎖を上記のような糖またはその他のＬ基と反応させる。ブロッキング基、例えばＤＭＴは、糖またはその他のＬ基における望ましくない副反応を防止するために用いられる。ブロック化中間体は、ヘテロ−またはホモ−二官能性架橋剤、例えばＥＤＣ、ＮＨＳエステル、またはその他の作用物質、例えばＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃａｔａｌｏｇで言及されたものと反応させられる。次に、ブロック化中間体は、リン酸化剤、例えばクロロ−Ｎ  Ｎ−ジメチルアミノメトキシホスフィン［ＣＨ３Ｏ−Ｐ（Ｃｌ）−Ｎ（ＣＨ３）２］と組み合わされて、単量体を生成する。
【００７５】
本出願の合成高分子を用いて、ポリペプチドの作用を模倣するかまたは調整し得る。本明細書中で用いる場合、「模倣する」という用語は、活性の大きさまたは時間経過に関係なく、そうでなければポリペプチドを用いることにより得られる応答を得るために、合成高分子を利用することを意味する。多くの場合、合成高分子は、ポリペプチドのアミノ酸配列に対応するアミノ酸側鎖を伴う単量体の配列を有する。本明細書中で用いる場合、「調整する」という用語は、ポリペプチドの活性を抑制することまたは刺激すること、あるいはそうでなければ修飾することを意味する。例えば、合成高分子は、直接的触媒作用により、あるいは酵素重合の崩壊、フォールディング、補因子との結合、または基質との結合により、ポリペプチドの作用を増大するかまたは減少し得る。
【００７６】
本出願の合成高分子化合物により模倣され得るポリペプチドの一例は、十二指腸の壁を通して栄養物を輸送するのを手助けするポリペプチドであるコレシストキニンである。コレシストキニンのアミノ酸配列にじゅんじ的に対応するアミノ酸側鎖を含有する一連の単量体を有する合成高分子は、経口投与され得る。合成高分子は消化管中のタンパク質分解酵素による分解に耐性であるため、それは胃を通過した後、十二指腸に到達し、腸壁に結合して、十二指腸における栄養物の取り込みを増大する。
【００７７】
模倣され得るポリペプチドの別の例は、ＡＣＴＨ(副腎皮質刺激ホルモン)である。ＡＣＴＨのアミノ酸配列に対応するアミノ酸側鎖を伴う本発明の適用の単量体の配列を含有する合成高分子の注射、あるいは合成高分子への培養中の副腎細胞の曝露は、副腎細胞によるコルチゾールの分泌を増大させる。
【００７８】
本出願に従って模倣され得るポリペプチドの第三の例は、昆虫捕食に対して防衛するために植物により分泌されるホルモンであるシステミンである。システミンのアミノ酸配列に対応するアミノ酸側鎖を伴う単量体配列を有する合成高分子を植物に適用することは、昆虫の侵襲に対する植物の耐性を増大する。
【００７９】
本出願に従って模倣され得るポリペプチドの第四の例は、フィトスルホカイン(ＰＳＫ)である。ＰＳＫは、アスパラガスおよびニンジンにおける細胞分化を促進する５−ｍｅｒポリペプチドである。
【００８０】
調製され得るポリペプチドの一例は、ヒスタミンである。ヒスタミンのアミノ酸配列に対応するアミノ酸側鎖を有する単量体の配列を含有する合成高分子の投与は、ヒスタミン受容体の競合的結合のため、減少を生じる。
【００８１】
合成高分子は、当該技術分野で既知の任意の手段、例えば限定されないが、錠剤、カプセル、カプレット、懸濁液、粉末、凍結乾燥形態およびエアゾールにより処方され得るし、緩衝剤、結合剤、安定化剤、酸化防止剤、および当該技術分野で既知のその他の作用物質と混合され、処方され得る。合成高分子を含有する製剤は、当該技術分野で既知の任意の手段により、例えば、限定されないが、静脈内注射、皮下注射、粘膜を通した投与、経口投与、皮膚投与、皮膚パッチおよびエアゾールにより、個体に投与され得る。合成高分子を含有する製剤は、当該技術分野で既知の任意の手段により、例えば噴霧、塗布、ダビング、および顆粒の形態で適用することにより、環境に、例えば植物に適用され得る。
【００８２】
一実施形態では、本発明は、合成高分子および製薬上許容可能な担体を含む薬学的組成物である。合成高分子は、本出願の少なくとも１つの合成高分子を、所望により、１つ以上の製薬上許容可能な担体、例えば賦形剤、例えば希釈剤、担体等、ならびに添加物、例えば安定化剤、防腐剤、可溶化剤、緩衝剤等を一緒に含む薬学的組成物に処方されるかまたは調合され得る。製剤賦形剤としては、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ヒドロキシセルロース、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、マンニトール、塩化ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムが挙げられ得る。注射またはその他の液体投与用製剤に関しては、少なくとも１つ以上の緩衝構成成分を含有する水が適切であり、安定化剤、防腐剤および可溶化剤も用いられ得る。固形投与製剤に関しては、種々の増粘剤、充填剤、嵩高剤および担体添加物のうちのいずれか、例えばデンプン、糖、脂肪酸等が用いられ得る。局所投与製剤に関しては、種々のクリーム、軟膏、ゲル、ローション等のうちのいずれかが用いられ得る。ほとんどの薬学的製剤に関して、非活性成分は、調製物の、重量または容量での、より大きい部分を構成する。薬学的製剤に関しては、種々の計量放出性、徐放性または時効性製剤および添加物のうちのいずれかが用いられるということも意図され、したがって、一定時間に亘る本出願のペプチド模倣性化合物の有効な送達のために投与量が処方され得る。
【００８３】
本出願の合成高分子および薬学的組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内である注射により、あるいは当該技術分野で既知の任意の他の手段により、投与され得る。概して、合成高分子が身体内に導入され得る任意の投与経路としては、粘膜を通した投与、頬投与、経口投与、皮膚投与、吸入投与、経鼻投与等が挙げられ得る。処置のための投薬量は、前記の手段のいずれか、または当該技術分野で既知の任意の他の手段による、所望の治療効果をもたらすのに十分な量の投与である。
【００８４】
本出願の単量体は、いくつかの用途を有する。主に、単量体は、ペプチドまたはタンパク質模倣物または調整物質として有用である本発明の重合体を製造するための基本要素として有用である。付加的には、単量体は、核酸分子上のタグまたは情報提供基として有用である。
【００８５】
本出願の単量体は、タグまたは情報提供基として用いられる場合、いくつかの有益な特徴を提供する。それらは、核酸を合成するために用いられるような標準ホスホルアミダイト化学により合成核酸中に挿入され得るため、それらは核酸の任意の位置に挿入され得る。さらに、単量体の多重コピー、または種々のアミノ酸側鎖を有する異なる単量体が利用されて、独自の標識を提供し得る。さらに、単量体は、他のオリゴヌクレオチド標識、例えば蛍光または金属ラベリングと組み合わせて用いられ得る。
【００８６】
以下の非限定的実施例で、本発明をさらに例証する。
【実施例】
【００８７】
実施例１  −  単量体の調製
表２に示すように、アミノ酸側鎖の複雑性により、アミノ酸を群分けする。
【表２】
2016519055.tif 000014
【００８８】
簡単なアミノ酸側鎖は、反応性基、例えば−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＳＨを欠き、例としてはアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、セリン、トレオニン、バリンおよびグリシンの側鎖が挙げられる。複雑なアミノ酸側鎖としては、反応性基を各フェニルアラニンの側鎖、ならびにアスパラギン、システイン、グルタミン、リシン、メチオニン、チロシンおよびヒスチジンのアミノ酸側鎖が挙げられる。非常に複雑なアミノ酸側鎖は、多重反応性基を含有し、例としてはアルギニン、プロリンおよびトリプトファンのものが挙げられる。
【００８９】
実施例１ａ  −  簡単なアミノ酸側鎖を用いるデオキシリボホスホルアミダイト単量体の調製
実施例１ａ．１  −  アラニン
主鎖スペーサーと共有結合されるアミノ酸アラニンの側鎖を用いて、ホスホルアミダイト単量体を調製する。この実施例では、図１に示すように、化合物１(Ｉ)は主鎖スペーサー、５’ジメトキシトリチル、１’アミン修飾環状デオキシリボース（Ｉ）である。化合物２（ＩＩ）は、メトキシアミン（ＣＡＳ＃７４−８９−５、化合物ＩＤ  ６３２９）である。化合物ＩおよびＩＩは、メーカーが示唆するように、二官能性架橋剤（ＩＩＩ）、例えばＤＭＡ（ジメチルアジピミデート、ＣＡＳ  ＃１４６２０−７２−５）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｐａｒｔ＃２０６６０）を用いて架橋される。架橋中間体（ＩＶ）、１ｍｍｏｌｅを、乾燥窒素で予め洗い流しておいた１０ｍｌ反応容器中の３ｍｌの乾燥無酸ＣＨＣｌ３およびジイソプロピルエチルアミン、４ｍｍｏｌｅ中に溶解する。ホスフィチル化試薬（ｎ−ジメチルアミノメトキシ−ホスフィン、２ｍｍｏｌｅ）を、乾燥窒素下に保持しながら、反応容器に滴下する。Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ（米国特許第４，４１５，７３２号）により記載されたようなこのホスフィチル化プロトコールは、乾燥窒素下での少なくとも１５分間の反応時間後、溶液を３５ｍｌの酢酸エチルとともに１２５ｍｌの分離漏斗に移す、ということを必要とする。次に、溶液を８０ｍｌの飽和ＮａＣｌで４回抽出する。次いで、有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、減圧下で蒸発させて発泡体とする。次に、発泡体を、１０ｍｌのトルエンまたは１０ｍｌの酢酸エチルで溶解する。次いで、溶液を激しく撹拌しながら５０ｍｌの冷却（−７８℃）ヘキサンに滴下して、粉末を生成する。懸濁液を濾過し、粉末をさらなる７５ｍｌの冷却ヘキサンで洗浄する。次に、その結果生じた粉末を減圧および乾燥窒素下で乾燥し、乾燥生成物を乾燥窒素下で保存する。
【００９０】
実施例１ａ．２  −  アスパラギン酸
単量体を実施例１ａ．１に従って調製するが、但し、出発物質ＩＩはアスパラギン酸の側鎖、３−アミノプロパン酸ＣＩＤ＃２３９である。
【００９１】
実施例１ａ．３  −  グルタミン酸
単量体を実施例１ａ．１に従って調製するが、但し、出発物質ＩＩはグルタミン酸の側鎖、アミノブタン酸ＣＩＤ＃１１９である。
【００９２】
実施例１ａ．４  −  イソロイシン
単量体を実施例１ａ．１に従って調製するが、但し、出発物質ＩＩはイソロイシンの側鎖、２−アミノブタンＣＩＤ＃２７２４５３７である。
【００９３】
実施例１ａ．５  −  ロイシン
単量体を実施例１ａ．１に従って調製するが、但し、出発物質ＩＩはロイシンの側鎖、イソ−ブチルアミンＣＩＤ＃６５５８である。
【００９４】
実施例１ａ．６  −  セリン
単量体を実施例１ａ．１に従って調製するが、但し、出発物質Ｉはセリンの側鎖、エタノールアミンＣＩＤ＃７００である。
【００９５】
実施例１ａ．７  −  トレオニン
単量体を実施例１ａ．１に従って調製するが、但し、出発物質ＩＩはトレオニンの側鎖、３−アミノ−２−プロパノール、ＣＩＤ＃４６３１４１５である。
【００９６】
実施例１ａ．８  −  バリン
単量体を実施例１ａ．１に従って調製するが、但し、出発物質ＩＩはバリンの側鎖、２−プロピルアミンＣＩＤ＃６３６３である。
【００９７】
実施例１ａ．９  −  グリシン
グリシンベースの単量体に関しては、自動オリゴヌクレオチド合成のために利用される既存の単量体、例えばＤ−スペーサー（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃａｔａｌｏｇ  ＃１０−１９１４、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  ＶＡ）が利用され得る。
【００９８】
実施例１ｂ  −  複雑なアミノ酸側鎖を用いるデオキシリボホスホルアミダイト単量体の調製
実施例１ｂ．１  −  フェニルアラニン
単量体を実施例１ａ．１に従って調製するが、但し、出発物質ＩＩは、図２に示すように、フェニルアラニンの側鎖、ベンジルアミンＣＩＤ＃７５０４である。
【００９９】
実施例１ｂ．２  −  アスパラギン
単量体を実施例１ｂ．２に従って調製するが、但し、出発物質ＩＩは、Ｌ−アスパラギン、ＣＩＤ＃６２６７である。アスパラギンアミノ酸は、Ｌ−アルギニンに関して記載したように(実施例１ｃ．１)、第一級アミン上のアセチル基で保護される。
【０１００】
実施例１ｂ．３  −  システイン
図３に示すように、単量体を実施例１ｂ．２に従って調製するが、但し、出発物質は、システインの側鎖、２−アミノエタンチオールＣＩＤ＃６０５８である（１−メルカプトヘキサンＣＩＤ＃８１０６が、システインのチオールのための保護基として用いられる）。
【０１０１】
実施例１ｂ．４  −  グルタミン
単量体を実施例１ｂ．２に従って調製するが、但し、出発物質ＩＩは、Ｌ−グルタミンＣＩＤ＃５９６１である。Ｌ−グルタミンアミノ酸は、Ｌ−アルギニンに関して記載したように(実施例１ｃ．１)、第一級アミン上のアセチル基で保護される。
【０１０２】
実施例１ｂ．５  −  リシン
図４に示すように、単量体を実施例１ｂ．２に従って調製するが、但し、出発物質ＩＩは、リシンの側鎖、４−アミノブタン酸ＣＩＤ＃１１９を有する。４−アミノブタン酸のアミノ基は、Ｌ−アルギニンに関して記載したように(実施例１ｃ．１)、第一級アミン上のアセチル基で保護される。
【０１０３】
実施例１ｂ．６  −  メチオニン
単量体を実施例１ｂ．２に従って調製するが、但し、出発物質ＩＩは、メチオニンの側鎖、３−メチルチオプロピルアミンＣＩＤ＃７７７４３を有する。
【０１０４】
実施例１ｂ．７  −  チロシン
単量体を実施例１ｂ．２に従って調製するが、但し、出発物質ＩＩは、図５に示すように、チロシンの側鎖、４−ヒドロキシベンジルアミンＣＩＤ＃９７４７２を有する。
【０１０５】
実施例１ｃ  −  非常に複雑なアミノ酸側鎖を用いるデオキシリボホスホルアミダイト単量体の調製
実施例１ｃ．１  −  アルギニン
Ｌ−アルギニンＣＩＤ＃６３２２（メタノール中１０ｍｇ／ｍｍｌ）を、試料中の第一級アミンに対して４倍モル過剰量の無水酢酸で無水アセチルと反応させる。連続的に混合しながら、フュームフード中で室温で２４時間、反応を継続する。
【０１０６】
実施例１ｃ．２  −  ヒスチジン
単量体を実施例１ｃ．１に従って調製するが、但し、出発物質ＩＩは、Ｌ−ヒスチジンＣＩＤ＃６２７４である。Ｌ−ヒスチジンアミノ酸は、Ｌ−アルギニンに関して記載したように(実施例１ｃ．１)、第一級アミン上のアセチル基で保護される。
【０１０７】
実施例１ｃ．３  −  プロリン
主鎖スペーサーと共有結合されるアミノ酸プロリンの側鎖を用いて、ホスホルアミダイト単量体を調製した。この実施例では、化合物１は主鎖スペーサー、５’ジメトキシトリチル、１’アミン修飾環状デオキシリボース（Ｉ）である。化合物２（ＩＩ）は、プロリン（ＣＡＳ＃７００５−２０−１、化合物ＩＤ  １４５７４２）である。化合物ＩおよびＩＩは、メーカーが示唆するような条件を用いて、二官能性架橋剤（ＩＩＩ）、例えばＥＤＣまたはＤＣＣ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｐａｒｔ番号それぞれ２２９８０および２０３２０）を用いて架橋される。
【０１０８】
実施例１ｃ．４  −  トリプトファン
単量体を実施例１ｃ．１に従って調製するが、但し、出発物質ＩＩは、アセチル−Ｌ−トリプトファン、ＣＩＤ＃７００６５３である。
【０１０９】
実施例２  −  リボホスホルアミダイト単量体の調製
実施例１ａ．１〜１ｃ．４に記述した各アミノ酸側鎖に関して、実施例１の方法を反復するが、但し、デオキシリボース糖部分の代わりにリボース糖部分を用いる。
【０１１０】
実施例３  −  ２’−Ｏ−メチルリボホスホルアミダイトの調製
実施例１ａ．１〜１ｃ．４に記述した各アミノ酸側鎖に関して、実施例１の方法を反復するが、但し、２’−デオキシリボースベースの糖の代わりに２’−Ｏ−メチルリボース糖ベースの部分を用いる。両方の場合に、５’ヒドロキシル基はＤＭＴ基(ジメトキシトリチル)でブロックされる。
【０１１１】
実施例４  −  糖部分を欠くホスホルアミデート単量体の調製
実施例１ａ．１〜１ｃ．４に記述した各アミノ酸側鎖に関して、実施例１の方法を反復するが、但し、アミノ酸側鎖をＬ基を介してＹスペーサーと連結し(化合物Ｉ、実施例４ａ)、スペーサーが糖意外である場合はベータシアノエチルホスホルアミダイト器およびＤＭＴ保護化酸素を分離する。
【０１１２】
実施例４ａ．  −  アラニン、図６に示す
【０１１３】
実施例４ｂ．  −  フェニルアラニン、図７に示す
【０１１４】
実施例４ｃ．  −  リシン、図８に示す
【０１１５】
実施例４ｄ．  −  チロシン、図９に示す
【０１１６】
実施例５  −  最終単量体がＬ基を各単量体の製造のための代替方法
出発物質は、メチルプロパンジオールＣＩＤ＃７５０３である。メチルプロパンジオール（１０ｍｍｏｌ）を、トリエチルアミン(２５ｍｍｏｌ)の存在下で塩化ジメトキシトリチル（１２ｍｍｏｌ）と反応させ、Ｚｅｋｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｚｅｋｒｉ，Ａｌａｍｄａｒｉ，ａｎｄ  Ｋｈａｌａｆｉ−Ｎｅｚｈａｄ．２０１０．Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｅｔｈｉｏｐ．２４（２）：２９９−３０４）に従って反応させる。冷却反応混合物を１００ｍｌのクロロホルム中に溶解し、６０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ３で洗浄する。有機層を分離し、水（２×５０ｍｌ）で抽出する。その結果生じた有機層を、次に乾燥し、逆相クロマトグラフィーによりＤＭＴ−Ｏ−メチルプロパン−３−オールを単離する。実施例１．ａ１に記載したように、化合物Ｉをホスホルアミダイトに転化する。
【０１１７】
実施例６  −  主鎖における変更
実施例１〜５の各々の方法を反復するが、但し、実施例７ステップ４の酸化剤を、イオン酸化剤、例えばビューケージ試薬（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．４０−４０３６−ＸＸ）（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）に置換し、その結果、ホスホロチオエート結合を生じる。
【０１１８】
実施例７  −  本発明の単量体を組み入れる重合体の合成
本出願の単量体を、自動オリゴヌクレオチド合成のために一般に用いられる化学工程を介して、重合体中に組み入れる。この合成方法は、初期脱ブロック化ステップ前に初期合成単量体と共有的に結合されることもされないこともある固体支持体を利用する。合成サイクルは、４つのステップからなる：脱ブロック化（脱トリチル化）、カップリング、キャッピング（ＡおよびＢ相）および酸化である。重合体に関する合成条件は、ＡＢＩ  Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ＤＮＡ合成機（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適合する条件で実施される。サイクルおよびプログラム時間はすべて、メーカーにより示唆されたとおりである。ＤＮＡ合成機は、キメラ重合体の合成に必要とされる本発明の単量体およびその他の修飾因子の全てに関する十分な試薬スロットを一般的に有さないため、部分的配列を異なる合成機に挿入し得るが、最終脱ブロック化ステップは無能力化される。重合体の各セクションを完了したら、カラム（依然として固体支持体に結合された伸長重合体を含有する）を、合成の次のセクションに関してプログラムされた合成機に移す。
【０１１９】
以下で列挙する各ステップ後、成長中の支持体結合重合体を無水アセトニトリルで洗浄して、非反応化学物質および化学副産物を除去する。
【０１２０】
ステップ１：脱ブロック化
脱ブロック化は、酸性条件下で重合体の伸長中の末端からＤＭＴ基を除去する。不活性溶媒ＤＣＭ(ジクロロメタン)中の３％ジクロロ酢酸(ＤＣＡ)溶液を、脱ブロック化のために用いる。橙色反応産物の生成により、脱ブロック効率をモニタリングする。脱ブロック化の結果は、重合体延長の先端での遊離ヒドロキシル基である。
【０１２１】
ステップ２：カップリング
乾燥窒素フラッシュ化単量体を、０．０２〜０．２Ｍの濃度で無水アセトニトリル中に懸濁する。懸濁化単量体を合成機に付着させて、合成前に、乾燥窒素またはアルゴンでフラッシュし、再び手短にフラッシュする（１〜２分）。０．２〜０．７Ｍの１Ｈ−テトラゾールまたは２−エチルチオテトラゾール（または類似の相溶性化合物）により、単量体を活性化する。固体支持体を含有する反応カラムに構成成分を送達しながら、単量体および活性化剤を手短に混合して、オリゴヌクレオチド合成機の流体ラインを生じさせる。活性化ホスホルアミダイトを、支持体結合物質より１．５〜２０倍過剰量で供給し、５’−ヒドロキシ基と反応させて、ホスファイトトリエステル結合を形成する。本発明の単量体のプログラムされた反応時間を、カップリング反応のために５〜１５分とする。各カップリングステップの完了時に、反応カラムを洗浄して、未反応物質を除去する。
【０１２２】
ステップ３：キャッピング
カップリングステップ中に単量体が添加されなかった場合の重合体の延長を防止するために、合成サイクルの第三ステップがキャッピングである。キャッピング試薬としては、無水酢酸および１メチルアミジゾール(ａｍｉｄｉｚｏｌｅ)、またはいくつかの場合には、ＤＭＡＰが挙げられる。これらの試薬はヒドロキシル基と反応して、さらなる伸長を防止する。その他の反応部位が重合体上に存在する場合、キャッピングは分枝を防止し得る。
【０１２３】
ステップ４：酸化
カップリングステップ中のホスホルアミダイト単量体の添加は、ホスファイトトリエステル結合の形成を生じる。成長中の重合体を弱塩基、例えばピリジンまたはウリジン中のヨウ素で処理すると、(酸化剤)結合は四配位化リン酸トリエステルになり、これは重合体の最終脱保護時にホスホジエステル結合になる。
【０１２４】
最終単量体間結合がホスホロチオエートである場合、ステップ３としてのキャッピングステップ前に硫酸化ステップがより効率的に実施され、その場合、キャッピングステップがステップ４となる。
【０１２５】
最終脱ブロック、固体支持体からの切断、および脱保護化
合成の終わりに、重合体を最終回の脱ブロックをして、末端ＤＭＴ基を除去する。次に、重合体を塩基性条件、最も一般的にはアンモニア下で固体支持体から切り離す。アンモニア処理は、重合体側鎖上の保護基も除去する（アミノ酸側鎖またはヌクレオチド塩基）。
【０１２６】
実施例７．１  −  ＤＮＡ分子中への単量体サブユニットの組み入れ
実施例７の方法に従って、実施例１〜６の各々に従って調製された単量体サブユニットを、以下の配列ＡＧＴＴＧＣＡＣＧＴを有するＤＮＡ分子中に組み入れて、式ＡＧＴＴＧＣＡＣＧＴＭ（式中、Ｍは単量体サブユニットを表す）を有する合成高分子を得る。
【０１２７】
実施例７．２  −  ＤＮＡ分子中への単量体サブユニットの組み入れ
実施例７の方法に従って、実施例１〜６の各々に従って調製された単量体サブユニットを、以下の配列ＡＧＴＴＧＣＡＣＧＴを有するＤＮＡ分子中に組み入れて、式ＡＧＴＴＧＣＡＣＧＴＭ（式中、Ｍは単量体サブユニットを表す）を有する合成高分子を得て、次に、付加的ヌクレオチドを順次添加して、式ＡＧＴＴＧＣＡＣＧＴＭＣＧＡＴを有する合成分子を得る。
【０１２８】
実施例７．３  −  ＲＮＡ分子中への単量体サブユニットの組み入れ
実施例７の方法に従って、実施例１〜６の各々に従って調製された単量体サブユニットを、以下の配列ＡＧＵＵＧＣＡＣＧＵを有するＲＮＡ分子中に組み入れて、式ＡＧＵＵＧＣＡＣＧＵＭ（式中、Ｍは単量体サブユニットを表す）を有する合成高分子を得る。
【０１２９】
実施例７．４  −  ＲＮＡ分子中への単量体サブユニットの組み入れ
実施例７の方法に従って、実施例１〜６の各々に従って調製された単量体サブユニットを、以下の配列ＡＧＵＵＧＣＡＣＧＵを有するＲＮＡ分子中に組み入れて、式ＡＧＵＵＧＣＡＣＧＵＭ（式中、Ｍは単量体サブユニットを表す）を有する合成高分子を得て、次に、付加的ヌクレオチドを順次添加して、式ＡＧＵＵＧＣＡＣＧＵＭＣＧＡＵを有する合成分子を得る。
【０１３０】
実施例７．５  −  ホモ重合体
実施例７の方法に従って、各々、ヒスチジンの側鎖を有する実施例１〜５の１０連続単量体を含有する合成高分子を調製する。
【０１３１】
実施例７．６  −  ヘテロ重合体
実施例７の方法に従って、単量体のアミノ酸側鎖が変更される実施例１〜５の３０個の単量体を含有する合成高分子を調製する。
【０１３２】
実施例７．７  −  非均一主鎖を有するヘテロ重合体
実施例７の方法に従って、単量体のアミノ酸側鎖が変更される、ならびに主鎖基が変更される実施例１〜５の３０個の単量体を含有する合成高分子を調製する。
【０１３３】
実施例７．８  −  非均一主鎖および非均一リンカー基を有するヘテロ重合体
実施例７の方法に従って、単量体のアミノ酸側鎖、主鎖基およびリンカー(Ｌ)が変更される実施例１〜５の２０個の単量体を含有する合成高分子を調製する。
【０１３４】
実施例８  −  単量体の使用
Ｈ−タグを生成するために単量体を用いる実施例。    最終配列が５’ＨＨＨ  ＨＨＨ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴ３’であるように、実施例１  ｃ２に記載したような６個のＨｉｓ側鎖単量体（Ｈ）を、オリゴヌクレオチド合成中に２０ｍｅｒポリｄＴの５’位置に添加する。Ｈを、合成のためにアセトニトリル中に０．１Ｍの濃度で用いる。ＡＢＩ  Ｅｘｐｅｄｉｔｅ合成機に関するメーカーの推奨に従って、キメラ重合体を合成する。脱保護後、Ｈ−タグ化ポリｄＴを、ヒスチジン特異的抗体（ポリクローナルＩｇＧ  ａｂ６４４２、ＡＢＣＡＭから）とともにインキュベートした。２０−ｍｅｒポリｄＴの対照試料も、ヒスチジン特異的抗体とともにインキュベートした。天然１２％ポリアクリルアミド（２０：１  アクリルアミド：ビス）を、４つの試料：２０−ｍｅｒポリｄＴ、２０−ｍｅｒポリｄＴ＋ヒスチジン特異的抗体、Ｈｉｓ−タグ化２０−ｍｅｒポリｄＴ、Ｈｉｓ−タグ化２０−ｍｅｒポリｄＴ＋ヒスチジン特異的抗体（ＦＩＣＯＬＬ(登録商標)（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ゲル上に負荷する前にすべての試料に添加）とともに負荷した。ヒスチジン特異的抗体の添加は、対照と比較した場合、Ｈｉｓ−タグ化２０−ｍｅｒポリｄＴオリゴヌクレオチドに関してゲルシフトを生じた。
【０１３５】
実施例９  −  単量体の使用
単量体が一旦オリゴヌクレオチド中に組み入れられ、脱保護化されると、システイン側鎖は、２つの個々のオリゴヌクレオチド一本鎖を共有的に連結し得るジスルフィド結合を形成し得る。配列５’ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ−Ｃ−ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ３’（ここで、Ｃは、システイン側鎖を伴う本発明の単量体を表す）を、合成のために０．１Ｍの濃度で用いる。ＡＢＩ  Ｅｘｐｅｄｉｔｅ合成機に関するメーカーの推奨に従って、キメラ分子を合成する。
【０１３６】
本実施例のキメラ重合体の５０ｎＭ規模合成を、２０マイクロリットルの滅菌水中に懸濁する。１マイクロリットルの１０ｍＭ  ＤＴＴを１０マイクロリットルの懸濁重合体に添加し、次いで、室温で１０分間保持する。セファデックスＧ−１０カラム中での短時間遠心分離により、またはプッシュカラムの使用により、ＤＴＴを除去する。その結果生じた溶液を、窒素下で蒸発、乾燥させる。乾燥試料を１０マイクロリットルの水に再懸濁する。天然１２％ポリアクリルアミド（２０：１  アクリルアミド：ビス）を、以下のレーンで負荷した：非処理キメラ重合体、ＤＴＴ処理重合体、および２０−ｍｅｒポリｄＴオリゴヌクレオチド（ゲル上に載せる前にすべての試料にフィコールを添加）。その結果生じた帯域は、二量体化されるキメラ試料に関してゲル中でのより高い見掛けの分子量へのシフトを示す。
【０１３７】
実施例１０  −  合成高分子の使用
アルギニンバソプレッシンの作用の模倣
本出願によるアルギニンバソプレッシン合成重合体を、ＣＹＳ−ＴＹＲ−ＰＨＥ−ＧＬＮ−ＡＳＮ−ＣＹＳ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−ＧＬＹのアミノ酸側鎖の配列を用いて製造する。本出願の単量体、ならびにＡＢＩ  Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ＤＮＡ合成機のための標準ＤＮＡ合成条件を用いて、配列を複製する。
【０１３８】
成体アカゲザルの左前下行回旋動脈および右冠動脈からの単一ＶＭＣを単離し、新規分散培養として、および初代培養としてともに試験する。短期初代培養化細胞(継代されていない)は、供給源組織の特質、例えば収縮、弛緩、受容体および膜電気的特性を２〜３週間保持する。Ｎａ＋、Ｃａ２＋またはＣｌ−による負荷を防止し、高比率の生育可能な収縮細胞を生じるグルタミン酸カリウム溶液(ＫＧ)中のコラゲナーゼおよびプロテアーゼ酵素で、ＶＭＣを解離する（Ｍｉｙａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７２：Ｈ２６４５−２６５４，１９９７；Ｈｅｒｍｓｍｅｙｅｒ  ｅｔ，Ａｒｔ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ，２４：９５５−９６１，２００４）。培養のために調製された細胞を、カバーガラス上の哺乳動物第五世代のための心臓血管培養溶液（ＣＶ５Ｍ）中で、低密度で播種して、個々の細胞の選択を助長する。カバーガラスへの付着の７〜１４日後に、ＶＭＣを実験のために用いる。
【０１３９】
カバーガラス上の新規分散または初代培養ＶＭＣを、Ａｘｉｏｖｅｒｔ倒立蛍光顕微鏡上の層流設計の小室中に入れて、ツァイスＰｌａｎ  Ｎｅｏｆｌｕａｒ  ２５Ｘ／０．８０水浸対物レンズで観察する。蛍光強度を高感度較正ビデオセンサーで測定し、コンピューター取得および管理プログラムによりデジタルで記録する。哺乳動物用イオン溶液バージョン２（ＩＳＭ２）を、小室を通して継続的にポンプ輸送して（１ｍｌ／分で）、連続的平衡および試薬の洗い落としを提供する。１５分の平衡期間後、ＶＭＣに、室温で１５分間、３μＭのｆｌｕｏ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）をＣａ２＋探知のために負荷する。個々の細胞全体に亘って、本出願のアルギニンバソプレッシンまたはアルギニンバソプレッシン類似体を添加することにより、個々のＶＭＣを刺激する。無流動条件下で１５秒後、ＩＳＭ２の連続流動を復活させて、約３００μｌの小室容積を保持する。光強度がカルシウムシグナル(蛍光)および細胞収縮性と一致してから１分、ならびにその後の時点で、蛍光画像を得る。本発明の重合体は、天然アルギニンバソプレッシンの場合と同様にＶＭＣにおけるカルシウムシグナルおよび細胞収縮性に影響を及ぼす、ということが判明した。
【０１４０】
上記の本発明の種々の修正は、当業者には明らかである。このような修正は以下の特許請求の範囲内に含まれるよう意図される。
【図１】
2016519055.tif 000017
【図２】
2016519055.tif 000018
【図３】
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【図４】
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【図５】
2016519055.tif 000021
【図６】
2016519055.tif 000022
【図７】
2016519055.tif 000023
【図８】
2016519055.tif 000024
【図９】
2016519055.tif 000025
【配列表】
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【国際調査報告】
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2016519055.tif 000027
2016519055.tif 000028