(57)【要約】生物由来のトランスクリプトームからペアエンドリードの少なくとも１ペアを得るステップと、ペアの第１のリードと、有向非巡回データ構造におけるノードとの間の最適スコアを有するアライメントを見出すステップと（データ構造は、エクソンまたは転写物など、ＲＮＡ配列を表すノードと、ノードのペアを接続するエッジとを有する）、ペアエンドリードのペアの挿入長さと実質的に同様の長さを有するパスによって下流ノードに接続されたノードを含む候補パスを同定するステップと、ペアエンドリードを候補パスにアラインして、最適スコアリングアライメントを決定するステップとを伴う、トランスクリプトームを解析する方法。
2016539443.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスクリプトームを解析する方法であって、
トランスクリプトームからペアエンドリードのペアを得るステップと；
前記ペアの第１のリードと、有向非巡回データ構造におけるノードとの間の最適スコアを有するアライメントを見出すステップであって、前記データ構造が、ＲＮＡ配列を表すノードおよび前記ノードのペアを接続するエッジを含むステップと；
ペアエンドリードの前記ペアの挿入長さと実質的に同様の長さを有するパスによって下流ノードに接続されたノードを含む候補パスを同定するステップと；
前記ペアエンドリードを前記候補パスにアラインして、最適スコアリングアライメントを決定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記トランスクリプトームから複数のペアエンドリードを得るステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ペアエンドリードの前記複数のペアのそれぞれについて最適スコアリングアライメントを決定するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記複数のペアエンドリードが、前記トランスクリプトーム由来のｃＤＮＡ断片から得られる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
決定された前記最適スコアリングアライメントに基づきアイソフォームを同定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
同定された前記アイソフォームが、新規アイソフォームである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記新規アイソフォームを表すように前記有向非巡回データ構造をアップデートするステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記新規アイソフォームを表すように前記有向非巡回データ構造をアップデートするステップが、少なくとも１つの新たなノードを加えることを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ノードおよび前記下流ノードが、ペアエンドリードの前記ペアが得られたエクソンのペアを表す、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ペアエンドリードの前記ペアに関与する任意のアライメント計算から、候補パスではないいかなるパスも除外するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ペアエンドリードの複数のペアを前記有向非巡回データ構造にアラインするステップと；
ペアエンドリードの前記複数のペアのアラインされた前記ペア間の距離およびアラインされた前記ペア間の前記距離の頻度を決定するステップと；
前記構造を通るアイソフォームパスをアイソフォーム頻度で表すことが、アラインされた前記ペア間の前記距離の前記頻度で前記アイソフォームパスに含まれる特徴のペアをもたらすように、前記アイソフォームパスおよび前記アイソフォーム頻度のセットを決定するステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記特徴が、エクソンを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
アイソフォームパスの決定された前記セットの各パスが、前記生物に存在する転写物アイソフォームを表す、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
アラインされた前記ペア間の前記距離が、各ペアの第１のアラインされたメンバーの上流端から、このペアの第２のアラインされたメンバーの下流端までのパス長さを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
トランスクリプトミクスのためのシステムであって、前記システムは、
有向非巡回データ構造をその中に保存した非一過性メモリに連結されたプロセッサーを含むコンピュータシステムを含み、前記データ構造が、ＲＮＡ配列を表すノードおよび前記ノードのペアを接続するエッジを含み、前記システムは、
ｃＤＮＡ断片からペアエンドリードのペアを得て、
前記ペアの第１のリードと、前記データ構造におけるノードとの間の最適スコアを有するアライメントを見出し、
前記ペアエンドリードの挿入長さと実質的に同様の長さを有するパスによって下流ノードに接続されたノードを含む候補パスを同定し、
前記ペアエンドリードを前記候補パスにアラインして、最適スコアリングアライメントを決定する
ように操作可能である、システム。
【請求項１６】
ｃＤＮＡ断片から複数のペアエンドリードを得るようにさらに操作可能である、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
決定された前記最適スコアリングアライメントに基づき新規アイソフォームを同定するようにさらに操作可能である、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
前記新規アイソフォームを表すよう前記有向非巡回データ構造をアップデートするようにさらに操作可能である、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
前記新規アイソフォームを表すように前記有向非巡回データ構造をアップデートするステップが、少なくとも１つの新たなノードを加えることを含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
ペアエンドリードの前記ペアに関与する任意のアライメント計算から、候補パスではないいかなるパスも除外するようにさらに操作可能である、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２１】
トランスクリプトームにおけるアイソフォーム頻度を推測する方法であって、
ｃＤＮＡ由来のペアエンドリードの複数のペアを、それぞれノードとして表されるゲノム由来の複数の特徴を含む参照データ構造にアラインするステップであり、前記複数の特徴のペアが、それらの近位端においてエッジによって接続されるステップと；
前記ペアエンドリードのアラインされた前記ペア間の距離およびアラインされた前記ペア間の前記距離の頻度を決定するステップと；
前記構造を通るアイソフォームパスをアイソフォーム頻度で表すことが、前記アラインされたペア間の前記距離の前記頻度で前記アイソフォームパスに含まれている特徴のペアをもたらすように、前記アイソフォームパスおよび前記アイソフォーム頻度のセットを決定するステップと
を含む方法。
【請求項２２】
前記ｃＤＮＡが、生物の実質的にトランスクリプトーム全体を表し、前記特徴が、エクソンを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
アイソフォームパスの決定された前記セットの各パスが、前記生物に存在する転写物アイソフォームを表す、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
アイソフォームパスの前記セットを決定するステップが、新規アイソフォームパスを発見することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記新規アイソフォームパスを含むように前記参照データ構造をアップデートするステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
アラインされた前記ペア間の前記距離が、各ペアの第１のアラインされたメンバーの上流端から、このペアの第２のアラインされたメンバーの下流端までのパス長さを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
アイソフォームパスの前記セットを決定するステップが、一次方程式のセットを解くことを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
アイソフォームパスの前記セットを決定するステップが、一次方程式の前記セットを解く前に、生物学的データから前記アイソフォーム頻度のうち１つを得ることを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
アイソフォームパスおよびアイソフォーム頻度のセットを決定する前に、アラインされた前記ペア間の前記距離の前記頻度を正規化するステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記データ構造が、遺伝的特徴データベースにおける各アノテートされた特徴を表すノードを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
トランスクリプトームにおけるアイソフォーム頻度を推測するシステムであって、前記システムは、
それぞれノードとして表されるゲノム由来の複数の特徴を含む参照データ構造をその中に保存した非一過性メモリに連結されたプロセッサーを含むコンピュータシステムを含み、前記複数の特徴のペアは、それらの近位端においてエッジによって接続されており、前記システムが、
ｃＤＮＡ由来のペアエンドリードの複数のペア間の距離および前記ペア間の前記距離の頻度を決定し、
前記構造を通るアイソフォームパスをアイソフォーム頻度で表すことが、前記アラインされたペア間の前記距離の前記頻度で前記アイソフォームパスに含まれている特徴のペアをもたらすように、前記アイソフォームパスおよび前記アイソフォーム頻度のセットを決定する
ように操作可能である、システム。
【請求項３２】
前記ｃＤＮＡが、生物の実質的にトランスクリプトーム全体を表し、前記特徴が、エクソンを含み、前記システムが、ｃＤＮＡ由来のペアエンドリードの複数のペアを前記参照データ構造にアラインするようにさらに操作可能である、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
アイソフォームパスの決定された前記セットの各パスが、前記生物に存在する転写物アイソフォームを表す、請求項３２に記載のシステム。
【請求項３４】
アイソフォームパスの前記セットを決定するステップが、新規アイソフォームパスを発見することを含む、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３５】
前記新規アイソフォームパスを含むよう前記参照データ構造をアップデートするようにさらに操作可能である、請求項３４に記載のシステム。
【請求項３６】
アラインされた前記ペア間の前記距離が、各ペアの第１のアラインされたメンバーの上流端から、このペアの第２のアラインされたメンバーの下流端までのパス長さを含む、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３７】
アイソフォームパスの前記セットを決定するステップが、一次方程式のセットを解くことを含む、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３８】
アイソフォームパスの前記セットを決定するステップが、一次方程式の前記セットを解く前に、生物学的データから前記アイソフォーム頻度のうち１つを得ることを含む、請求項３７に記載のシステム。
【請求項３９】
アイソフォームパスおよびアイソフォーム頻度の前記セットを決定する前に、アラインされた前記ペア間の前記距離の前記頻度を正規化するようにさらに操作可能である、請求項３１に記載のシステム。
【請求項４０】
前記データ構造が、離れた遺伝的特徴データベースにおける各アノテートされた特徴を表すノードを含む、請求項３１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、２０１４年１月１７日に出願された米国特許出願第１４／１５７，９７９号に対する優先権の利益を主張し、この出願は、２０１３年１０月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／８９３，４６７号に対する優先権の利益を主張し、これらの内容は参考として援用される。
【０００２】
配列表
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１４年１０月１４日に作成されたＡＳＣＩＩフォーマットの配列表は、ＳＢＧ−００９−０１ＷＯ−２−Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ＿ＳＴ２５と命名され、１，２１７バイトのサイズである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、全般的には、バイオインフォマティクスに関し、特に、有向非巡回（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｃｙｃｌｉｃ）データ構造を使用した解析に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
トランスクリプトームは、特定の発達段階または生理的状態についての細胞中の転写物の完全セットおよびその含量である。トランスクリプトームは、生物の機能、発達および疾患の中核をなす。生物の性質そのものおよび活力は、全転写物（ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡおよび低分子ＲＮＡを含む）、その発現レベル、遺伝子スプライシングパターンおよび転写後修飾から生じる。実際には、予想されたよりもはるかに大きな割合のヒトゲノムが転写されることが、現在公知である。Ｂｅｒｔｏｎｅら、２００４年、Ｇｌｏｂａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｗｉｔｈ  ｇｅｎｏｍｅ  ｔｉｌｉｎｇ  ａｒｒａｙｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０６巻：２２４２〜２２４６頁を参照されたい。
【０００５】
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技術に基づくトランスクリプトーム解析のための方法が報告されている。例えば、Ｗａｎｇら、２００９年、ＲＮＡ−Ｓｅｑ：  ａ  ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １０巻（１号）：５７〜６３頁、２００９年を参照されたい。ＲＮＡ−Ｓｅｑ（ＲＮＡシーケンシング）方法は、大容量のトランスクリプトームデータを迅速に作成することを約束する。
【０００６】
しかし、ＲＮＡ−Ｓｅｑは、リードを有効に活用するために克服しなければならない、大量のデータの保存および解析などのインフォマティクス上の課題に直面する。ＲＮＡ−Ｓｅｑリードのアラインおよび解析は、関与する情報の性質のみならず、容量における問題も提示する。大型のデータセットによるリードマッピングは、計算的に困難であり、差次的発現のための分析方法は、登場し始めたばかりである。Ｇａｒｂｅｒら、２０１１年、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ  ８巻（６号）：４６９〜４７７頁を参照されたい。ＲＮＡ−Ｓｅｑからの多数のリードをマッピングする計算的要求は、利用できるようになってきた大量の参照データによって大幅に増えている。
例えば、ＧＥＮＣＯＤＥコンソーシアムは、報告されたヒトゲノムにおけるあらゆる遺伝子特徴を同定しようと努める。Ｈａｒｒｏｗら、２０１２年、ＧＥＮＣＯＤＥ：  Ｔｈｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｈｅ  ＥＮＣＯＤＥ  Ｐｒｏｊｅｃｔ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２２巻：１７６０〜１７７４頁。ＧＥＮＣＯＤＥプロジェクトによって包含される材料の容量は、恐るべき大きさである。新たなタンパク質コード遺伝子座が追加され続けるのみならず、アノテートされる選択的スプライシング転写物の数も着実に増加する。ＧＥＮＣＯＤＥ７発表は、２０，０００種を超えるタンパク質コードＲＮＡ遺伝子座およびほぼ１０，０００種の長い非コードＲＮＡ遺伝子座（ｌｎｃＲＮＡ）ならびに他の供給源において提示されていない３３，０００種を超えるコード転写物を含む。ＧＥＮＣＯＤＥは、非翻訳領域（ＵＴＲ）、長い遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）遺伝子、短い非コードＲＮＡおよび選択的スプライシングパターンなど、他の特徴も含む。ＲＮＡ−Ｓｅｑ研究はごく限定された量の新たなデータから開始されたとしても、ＧＥＮＣＯＤＥなどの供給源からの潜在的な参照データの容量が非常に大きいため、新たなデータの意味づけは、計算的に困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｅｒｔｏｎｅら、２００４年、Ｇｌｏｂａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｗｉｔｈ  ｇｅｎｏｍｅ  ｔｉｌｉｎｇ  ａｒｒａｙｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０６巻：２２４２〜２２４６頁
【非特許文献２】Ｗａｎｇら、２００９年、ＲＮＡ−Ｓｅｑ：  ａ  ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １０巻（１号）：５７〜６３頁、２００９年
【非特許文献３】Ｇａｒｂｅｒら、２０１１年、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ  ８巻（６号）：４６９〜４７７頁
【非特許文献４】Ｈａｒｒｏｗら、２０１２年、ＧＥＮＣＯＤＥ：  Ｔｈｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｈｅ  ＥＮＣＯＤＥ  Ｐｒｏｊｅｃｔ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２２巻：１７６０〜１７７４頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
要旨
本発明は、全般的に、有向非巡回グラフ（ＤＡＧ）または同様のデータ構造として組織化された参照を使用した、ペアエンド（ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ）リードの解析のためのシステムおよび方法を提供する。エクソンおよびイントロンなど、参照における特徴は、ＤＡＧにおけるノードを提供し、これらの特徴は、エッジによりその標準的なゲノム上の順序で互いにリンクされる。ＤＡＧは、いかなるサイズにも縮尺調整することができ、実際に、外的アノテート参照からインポートされた配列を、第１の事例において投入することができる。新たなデータが、ペアエンドリードを含む場合、ペアの各リードは、長さＬのゲノムに沿ったいずれかの場所に潜在的にアラインすることができ、複雑なＤＡＧにおいて、はるかに多くの場所が存在し得る（すなわち、ＤＡＧが、平均的に、いずれかの遺伝子座にわたりｎプレックス（ｎ−ｐｌｅｘ）である場合、ペアエンドリードのペアのアラインは、（ｎＬ）＾２の選択肢からの選択に達する）。しかし、挿入長さ情報は、ＤＡＧ内の潜在的アライメントを制約するためのツール（パス内の距離の遠さのみならず、パスを除外し、Ｌに関して線形となるように選択肢の数を限定することにもよる）を提供する。ペアエンドリードは、他の情報も提供することができる。例えば、ペアエンドリードは、ＤＡＧを改変するための基礎を提供することができ、アイソフォーム頻度の推測などに使用することができる。実際に、挿入長さ情報を有するペアエンドリードのセットは、ＤＡＧに基づくアライメントに焦点を合わせることおよびＤＡＧをアップデートすることによく適している情報品質を保有して、それ以外では発見または気付かれない可能性がある実際に発生する天然アイソフォームを表す。よって、ペアエンドリードは、ＲＮＡ−Ｓｅｑプロジェクトに特によく適しており、非常に大きなセットのＲＮＡ−Ｓｅｑデータが、非常に大きな参照セットに対して解析されることを可能にする。ペアエンドＲＮＡ−Ｓｅｑリードを使用して、トランスクリプトームのあらゆるアイソフォームを発見することは、計算的に解決が困難という訳ではなく、トランスクリプトミクスは、以前には不可能なペースおよびスループットで稼働することができる。１種またはいずれかの数のトランスクリプトームを、１種またはいずれかの数の生物から試験して、生物の機能、発達および疾患の理解を増加させることができる。
【０００９】
本発明の態様は、ゲノム上の順序で近位エッジによって接続された参照の特徴（例えば、エクソン、イントロンなど）を含むＤＡＧの創出に関する。このＤＡＧデータ構造は、例えば、アイソフォームの同定を含む、トランスクリプトミクスにおける適用を有する。かかるＤＡＧ参照は、ペアリードを含むＲＮＡ−Ｓｅｑデータに関与するトランスクリプトミクスにおいて使用される。ＲＮＡ−Ｓｅｑデータは、特徴（例えば、アノテートされた供給源ゲノムまたはトランスクリプトームから創出される）をノードとして含むＤＡＧ参照を使用して解析することができる。本発明のシステムおよび方法は、ペアエンドリードを使用する改善されたアライメント、ペアエンドリード情報を使用するＤＡＧの構築、アイソフォーム確率もしくは頻度の推測、またはこれらの組合せを提供する。
【００１０】
ある特定の態様において、本発明は、トランスクリプトームを解析する方法であって、生物由来のトランスクリプトームからペアエンドリードの少なくとも１ペアを得るステップと、ペアの第１のリードと、有向非巡回データ構造におけるノードとの間の最適スコアを有するアライメントを見出すステップと（データ構造は、エクソンまたは転写物など、ＲＮＡ配列を表すノードと、ノードのペアを接続するエッジとを有する）、ペアエンドリードのペアの挿入長さと実質的に同様の長さを有するパスによって下流ノードに接続されたノードを含む候補パスを同定するステップと、ペアエンドリードを候補パスにアラインして、最適スコアリングアライメントを決定するステップとに関与する方法を提供する。本方法は、ペアエンドリードのペアに関与する任意のアライメント計算から、候補パスではないいかなるパスも除外するステップを含むことができる。
【００１１】
本方法は、任意の数のペアエンドリードに適する。ノードおよび下流ノードは、ペアエンドリードのペアが得られたエクソンのペアを表すことができる。本方法は、決定された最適スコアリングアライメントに基づきアイソフォームを同定するステップを含むことができる。一部の実施形態において、同定されたアイソフォームは、新規アイソフォームである。有向非巡回データ構造は、新規アイソフォームを表すようにアップデートすることができる（例えば、少なくとも１つの新たなノードまたはエッジを加えることにより）。
【００１２】
本発明の関連する態様は、トランスクリプトミクスのためのコンピュータシステムを提供する。本システムは、非一過性メモリに連結されたプロセッサーを有し、ＲＮＡ配列を表すノードおよびノードのペアを接続するエッジを有する有向非巡回データ構造を保存するために使用される。本システムは、トランスクリプトームからペアエンドリードのペアを得て、ペアの第１のリードと、本データ構造におけるノードとの間の最適スコアを有するアライメントを見出し、ペアエンドリードのペアの挿入長さと実質的に同様の長さを有するパスによって下流ノードに接続されたノードを含む候補パスを同定し、ペアエンドリードを候補パスにアラインして、最適スコアリングアライメントを決定するように操作可能である。好ましくは、本システムは、その後のアライメントの試みからあらゆる非候補パスを除外する。ある特定の実施形態において、本システムは、ｃＤＮＡ断片から複数のペアエンドリードを得るようにさらに操作可能である。好ましくは、本システムは、ペアエンドリードの複数のペアのそれぞれに対し最適スコアリングアライメントを決定するように操作可能である。ｃＤＮＡ断片は、単一のトランスクリプトームを表し得る。本システムは、決定された最適スコアリングアライメントに基づき、新規アイソフォームなど、アイソフォームを同定することができる。本システムは、新規アイソフォームを表すように有向非巡回データ構造をアップデートするように操作可能であり得る。一部の実施形態において、新規アイソフォームを表すように有向非巡回データ構造をアップデートするステップは、少なくとも１つの新たなノードを加えることを含む。ノードおよび下流ノードは、ペアエンドリードのペアが得られたエクソンのペアを表すことができる。本システムは、ペアエンドリードのペアに関与する任意のアライメント計算から、候補パスではないいかなるパスも除外するように操作可能であり得る。
【００１３】
本発明の他の態様は、例えば、アイソフォーム頻度の推測に有用なシステムおよび方法による発現解析を提供する。
【００１４】
ある特定の態様において、本発明は、トランスクリプトームにおけるアイソフォーム頻度を推測する方法を提供する。本方法は、生物のトランスクリプトームからペアエンドリードの複数のペアを得るステップと、任意選択で、これらのリードを参照データ構造にアラインするステップとを含む。本データ構造は、それぞれノードとして表されるゲノム由来の複数の特徴を含む。ノードまたは特徴のペアは、それらの近位端においてエッジによって接続される（すなわち、ペア内で、２つのペアメンバーは、エッジによりゲノム上のそれらの近位端において互いに接続される；いかなるペアメンバーも、他のペアのメンバーであり得るため、特徴のいずれか一端または両端は、１つまたはいずれかの数のエッジにより他の特徴に接続され得る）。ペアエンドリードのアラインされたペア間の距離およびアラインされたペア間の距離の頻度が決定される。アイソフォームパスおよびアイソフォーム頻度のセットは、構造を通るアイソフォームパスをアイソフォーム頻度で表すことが、アラインされたペアの距離の頻度で、アイソフォームパスに含まれている特徴のペアをもたらすように決定される。アイソフォームパスの決定されたセットの各パスは、生物に存在する転写物アイソフォームを表すことができる。アラインされたペア間の距離は、各ペアの第１のアラインされたメンバーの上流端から、このペアの第２のアラインされたメンバーの下流端までのパス長さであり得る。ある特定の実施形態において、アイソフォームパスのセットを決定するステップは、新規アイソフォームパスを発見することを含む。参照データ構造は、新規アイソフォームパスを含むようにアップデートすることができる。
【００１５】
アイソフォームパスのセットを決定するステップは、代数的に、例えば、一次方程式のセットを解くことにより行うことができる。一部の実施形態において、アイソフォーム頻度のうち１つは、一次方程式のセットを解く前に生物学的データから得られる（例えば、これにより、一次方程式における残る変数を決定することができる）。それに加えてまたはそれに代えて、アラインされたペア間の距離の頻度は、アイソフォームパスおよびアイソフォーム頻度のセットを決定する前に正規化されていてもよい。
【００１６】
データ構造は、既存の遺伝的特徴データベースから構築することができる。例えば、各ノードは、かかるデータベース由来の特徴を表すことができる。
【００１７】
関連する態様において、本発明は、トランスクリプトームにおけるアイソフォーム頻度を推測するコンピュータシステムを提供する。本システムは、非一過性メモリに連結されたプロセッサーを含み、それぞれノードとして表されるゲノム由来の複数の特徴を含む参照データ構造を保存し、ここで、複数の特徴のペアは、それらの近位端においてエッジによって接続されている。本システムを使用して、トランスクリプトーム由来のペアエンドリードの複数のペア間の距離およびペア間の距離の頻度を得るまたは決定することができる。続いて、アイソフォームパスおよびアイソフォーム頻度のセットは、構造を通るアイソフォームパスをアイソフォーム頻度で表すことが、アラインされたペアの距離の頻度で、アイソフォームパスに含まれている特徴のペアをもたらすように決定することができる。特徴は、エクソンを含むことができ、システムは、ペアエンドリードの複数のペアを参照データ構造にアラインするようにさらに操作可能である。アイソフォームパスの決定されたセットの各パスは、生物に存在する転写物アイソフォームを表すことができる。アイソフォームパスのセットを決定するステップは、新規アイソフォームパスを発見することを含むことができる。本システムは、新規アイソフォームパスを含むように参照データ構造をアップデートすることができる。アラインされたペア間の距離は、各ペアの第１のアラインされたメンバーの上流端から、このペアの第２のアラインされたメンバーの下流端までのパス長さを含むことができる。一部の実施形態において、アイソフォームパスのセットを決定するステップは、一次方程式のセットを解くことを含む。ある特定の実施形態において、アイソフォームパスのセットを決定するステップは、一次方程式のセットを解く前に、生物学的データからアイソフォーム頻度のうち１つを得ることを含む。本システムは、アイソフォームパスおよびアイソフォーム頻度のセットを決定する前に、アラインされたペア間の距離の頻度を正規化するように操作可能であり得る。本データ構造は、離れた遺伝的特徴データベースにおける各アノテートされた特徴を表すノードを含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＤＡＧと比較されるリードの図解表現を示す。
【図２】図２は、比較に対応する実際の行列を示す。
【図３】図３は、本発明の方法の略図を提示する。
【図４】図４は、仮説上のＤＡＧおよびペアエンドリードのペアを略図で示す。
【図５】図５は、仮説上のＤＡＧを通る候補パスを示す。
【図６】図６は、仮説上のＤＡＧ由来の候補パスを示す。
【図７】図７は、配列に関与する３種の代替ヒストリーを示す。
【図８】図８は、本発明に従うアライメントを描写する。
【図９】図９は、アイソフォーム頻度分布を示す。
【図１０】図１０は、本発明の方法を実行するためのシステムを図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
遺伝子は、一般に、単一の特異的なタンパク質をコードしないことが理解されている。その代わりに、所定の遺伝子のエクソンの異なるサブセットが、異なる割合で、異なる時点に転写される。これらの異なる転写物によって創出される異なるタンパク質は、アイソフォームと呼ばれ、その延長線で、異なる転写物それ自体もアイソフォームと呼ばれる。上述の通り、現代のバイオインフォマティクスは、潜在的に参照として有用な、少なくとも部分的にアノテートされたトランスクリプトームをもたらした。例えば、Ｇｅｎｃｏｄｅプロジェクトは、ヒトゲノムにおいて遺伝子のみならず、エクソン（他の領域と共に）もカタログ作成した。
【００２０】
本明細書に記載されているシステムおよび方法を使用して、これらのアノテートされたトランスクリプトームにおける情報を効率的に活用する。実際に、本発明は、アノテートされたトランスクリプトームとペアエンドリードとの比較が、理想的には、配列データがＤＡＧに基づくデータ構造として保存される分析的アプローチに適するという洞察を含む。
【００２１】
本発明の実施形態は、アノテートされたトランスクリプトームにおけるデータにより有向非巡回データ構造を創出する方法を提供する。かかるデータ構造において、アノテートされたトランスクリプトーム由来の特徴（例えば、エクソンおよびイントロン）は、エッジによって接続されるノードとして表される。よって、現実世界のトランスクリプトーム由来のアイソフォームは、ＤＡＧに基づくデータ構造を通る対応するパスによって表される。
【００２２】
本発明の態様は、１種または複数の公知の参照由来のイントロンおよびエクソンなど、特徴を含むＤＡＧの創出に関する。ＤＡＧは、グラフとして提示することができるデータと、データを提示するグラフを指すものと本技術分野において理解されている。本発明は、バイオインフォマティクス処理またはグラフとしての提示のためのコンピュータシステムにより読み取ることができるデータとしてＤＡＧを保存するための方法を提供する。ＤＡＧは、例えば、グラフのための構文で構築された言語、グラフを目的とした汎用マークアップ言語などにおいて、ノードおよびエッジのリスト、行列もしくは行列を表す表、アレイのアレイまたは行列を表す同様の可変構造を含むいずれか適したフォーマットでセーブすることができる。
【００２３】
一部の実施形態において、ＤＡＧは、ノードおよびエッジのリストとして保存される。かかる方法の１つは、全ノードを含むテキストファイルを作成することであり、各ノードにＩＤを割り当て、全エッジはそれぞれが、開始および終了ノードのノードＩＤを有する。よって、例えば、ＤＡＧが、２つの文（「Ｓｅｅ  Ｊａｎｅ  ｒｕｎ」および「Ｒｕｎ，  Ｊａｎｅ  ｒｕｎ」）について作成される場合、大文字と小文字を区別しない（ｃａｓｅ−ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）テキストファイルを作成することができる。いずれかの適したフォーマットを使用することができる。例えば、テキストファイルは、カンマ区切り値を含むことができる。このフォーマットにおいて将来の参照のためにこのＤＡＧを「Ｊａｎｅ」と命名すると、ＤＡＧ「Ｊａｎｅ」は、次の通りに読み取ることができる：１  ｓｅｅ，２  ｒｕｎ，３  ｊａｎｅ，４  ｒｕｎ，１−３，２−３，３−４。当業者であれば、この構造が、図７および図８ならびに下の付随する記述において表されるイントロンおよびエクソンに適用できることを認められる。
【００２４】
ある特定の実施形態において、ＤＡＧは、Ｎ×Ｎ行列における（ｉ，ｊ）エントリが、ノードｉおよびノードｊが接続されていることを表示する行列（またはアレイのアレイまたは行列を表す同様の可変構造）を表す表として保存される（Ｎは、ゲノム上の順序でノードを含有するベクトルである）。ＤＡＧが非巡回となるには、あらゆる非ゼロエントリが、対角を上回ることを単純に必要とする（ノードが、ゲノム上の順序で表されていると仮定）。バイナリーの場合、０エントリは、ノードｉからノードｊへのエッジが存在しないことを表し、１エントリは、ｉからｊへのエッジを表す。当業者であれば、行列構造が、０〜１以外の値をエッジに関連付けることが可能であることを認める。例えば、任意のエントリは、世界中の観察されたデータの何らかの天然の品質を反映する重みまたは使用された回数を示す数値であり得る。行列は、表または線形の一連の行（例えば、まず行１、続いてセパレーターなど）としてテキストファイルに書き込むことができ、それによって、単純な直列化構造を提供する。
【００２５】
行列ＤＡＧを直列化する有用な方法の１つは、ノードの定義後に、エントリにカンマ区切り値を使用することである。このフォーマットを使用して、ＤＡＧ「Ｊａｎｅ」は、上述と同じノード定義と、続く行列エントリを含む。このフォーマットは、次の通りに読み取ることができる：
１  ｓｅｅ，２  ｒｕｎ，３  ｊａｎｅ，４  ｒｕｎ
，，１，＼，，１，＼，，，１＼，，，
ゼロ（０）のエントリは単純に省略されており、「＼」は改行文字である。
【００２６】
本発明の実施形態は、グラフのための構文で構築された言語におけるＤＡＧの保存を含む。例えば、Ｇｒａｐｈｖｉｚとして公知のグラフ視覚化ソフトウェアパッケージを備えたＤＯＴ言語は、補助的情報を有するＤＡＧの保存に使用することができ、Ｇｒａｐｈｖｉｚウェブサイトから入手できる多数のツールを使用してグラフィックファイルフォーマットに変換することができるデータ構造を提供する。Ｇｒａｐｈｖｉｚは、オープンソースのグラフ視覚化ソフトウェアである。グラフ視覚化は、アブストラクトグラフおよびネットワークの略図として構造情報を表す方法である。これは、ネットワーク、バイオインフォマティクス、ソフトウェアエンジニアリング、データベースおよびウェブデザイン、機械学習ならびに他の技術領域のための視覚インターフェースにおける用途を有する。Ｇｒａｐｈｖｉｚレイアウトプログラムは、単純なテキスト言語におけるグラフの記述を採用し、ウェブページのための画像およびＳＶＧ；他の文書における包含のためのＰＤＦもしくはＰｏｓｔｓｃｒｉｐｔ；または対話型グラフブラウザにおけるディスプレイなど、有用なフォーマットで略図を作成する。
【００２７】
関連する実施形態において、ＤＡＧは、グラフその他を目的とする汎用マークアップ言語で保存される。上述の線形テキストファイルまたはカンマ区切り行列の記述に従って、当業者であれば、ＸＭＬなどの言語を使用（拡張）して、ノードおよびそのヘッダーまたはＩＤ、エッジ、重みなどを定義する標識（マークアップ）を作成することができることを認識する。しかし、ＤＡＧは、構造化および保存され、本発明の実施形態は、エクソンおよびイントロンなどの特徴を表すためのノードの使用に関与する。これは、ＲＮＡ−Ｓｅｑリードを解析し、アイソフォームを発見、同定および表すための有用なツールを提供する。
【００２８】
ノードが、特徴または特徴の断片を表す場合、これらの断片を通るパスによってアイソフォームを表すことができる。「スキップされた」エクソンは、ある前のエクソンをある後のエクソンに接続するエッジによって表される。遺伝子の選択的スプライシングまたはアイソフォームを表すためのＤＡＧを構築するための技法が本明細書に提示されている。選択的スプライシングは、そのそれぞれの内容が参照により本明細書に組み込まれる、ＬｅｅおよびＷａｎｇ、２００５年、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ、Ｂｒｉｅｆ  Ｂｉｏｉｎｆ  ６巻（１号）：２３〜３３頁；Ｈｅｂｅｒら、２００２年、Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｇｒａｐｈｓ  ａｎｄ  ＥＳＴ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １８巻追補１：ｓ１８１〜１８８頁；Ｌｅｉｐｚｉｇら、２００４年、Ｔｈｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｇａｌｌｅｒｙ  （ＡＳＧ）：  Ｂｒｉｄｇｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇａｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ、Ｎｕｃｌ  Ａｃ  Ｒｅｓ  ２３巻（１３号）：３９７７〜２９８３頁；およびＬｅＧａｕｌｔおよびＤｅｗｅｙ、２０１３年、Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｄａｔａ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  ｓｐｌｉｃｅ  ｇｒａｐｈｓ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２９巻（１８号）：２３００〜２３１０頁に記述されている。追加的な記述は、そのそれぞれの内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｌｏｒｅａら、２００５年、Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＡＩＲ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５巻：５４〜６６頁；Ｋｉｍら、２００５年、ＥＣｇｅｎｅ：  Ｇｅｎｏｍｅ−ｂａｓｅｄ  ＥＳＴ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｆｏｒ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５巻：５６６〜５７６頁；およびＸｉｎｇら、２００６年、Ａｎ  ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ−ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｆｒｏｍ  ｓｐｌｉｃｅ  ｇｒａｐｈｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３４巻、３１５０〜３１６０頁に見出すことができる。
１．ペアエンドリードの使用
【００２９】
本発明は、ペアリードを含むＲＮＡ−Ｓｅｑデータに関与するトランスクリプトミクスに関する。本発明のシステムおよび方法は、ペアエンドリードを使用した改善されたアライメントを提供する。ある特定の実施形態において、ペアエンドリードは、アライメントを制約するために使用されて、これにより、ＲＮＡ−Ｓｅｑプロジェクトの計算的コストを大幅に改善する。
【００３０】
多くのシーケンシングデータは、ペアエンドデータである。かかるデータの特徴をアライメントで表す方法が存在する：アライメントにおいてペアエンドメートが割り当てられる場所間の距離は、シーケンシングランによって与えられる挿入サイズにおよそ対応するはずである。一般に、挿入サイズによって与えられる情報は、アライメントアルゴリズムが明らかにすることを試みる情報に関係する。
【００３１】
ペア核酸リードを生成するためのいくつかの方法が、本技術分野において公知である。典型的には、この方法は、既知のサイズ分布の配列をもたらす核酸試料の選択的断片化のある形態に関与する。断片化試料の末端は、典型的には、官能基または自己環化により保護され、ここで、残る核酸試料材料は除去される。次に、末端は、増幅されシーケンシングされ、互いにある距離を生じたことが既知の核酸リードの集団をもたらす。
【００３２】
メートペア試料調製キットは、例えば、Ｎｅｘｔｅｒａ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から市販されている。かかるプラットフォームにおけるシーケンシングのためのペア核酸を調製するために、核酸試料は、２〜５ｋｂの間の長さのセグメントへと断片化される。次に、断片末端がビオチン化されて、アフィニティーカラム分離を使用した後の回収を容易にする。ビオチン化末端を連結して、環状ＤＮＡセグメントを創出する。この時点で、試料からの環状化されていない核酸を消化し、その後除去する。次に、残る環状化ＤＮＡを再断片化して、クラスタリングおよびシーケンシングに適した断片を得る。ビオチン化された本来の末端は、アフィニティーカラムまたはストレプトアビジンコーティングビーズにより、環状化ＤＮＡの残る断片から取り出すことができる。次に、回収された末端は、末端修復され、ポリＡテイル付加され、増幅およびシーケンシングに先立ちシーケンシングアダプターが付加される。
【００３３】
２．アライメント
本発明は、配列リードを、アノテートされた参照を表す有向非巡回データ構造にアラインするための方法およびシステムを提供する。本発明のアライメントアルゴリズムを使用して、ＲＮＡ−Ｓｅｑ結果および実質的に包括的な参照に関連する厖大な数にもかかわらず、リードを迅速にマップすることができる。他の状況においても同様に、ＤＡＧは、ラインするのに理想的な対象である。アノテートされたトランスクリプトームから構築されたＤＡＧに対するアライメントの実行は、その後のワークフローおけるアノテートされたトランスクリプトームの使用よりもはるかに有効である。
【００３４】
多数の利益は、参照としてＤＡＧを使用することにより得られる。例えば、ＤＡＧに対するアラインは、１つの参照に対してアラインし、続いてアノテートされたトランスクリプトームを踏まえてその結果を調整する試みよりも正確である。これは、主に、後者のアプローチが、初期アライメントにおいて使用した配列と、トランスクリプトームにおいて表される他の配列との間の不自然な非対称を強制するためである。あらゆる関連する物理的可能性を潜在的に表す対象に対するアラインは、物理的可能性ごとに線形配列に対しアラインする試みよりもはるかに計算的に効率的である（かかる可能性の数は、一般に、接合部の数において指数関数的である）。
【００３５】
本発明の実施形態は、参照データ構造に対する１つまたは複数のリードのアラインを含む。アライメントは、リードを最もよく表すデータ構造のエッジおよびノードを見出すＤＡＧに基づくアライメントを含むことができる。アライメントは、ペアワイズ様式でのＤＡＧのノード由来のエクソンに対するリードのアラインの事例を含むこともできる。
【００３６】
ペアワイズアライメントは、一般に、標的の一部に沿ってある一配列を配置し、アルゴリズムに従ってギャップを導入し、この２配列がどの程度マッチするかスコアリングし、好ましくは、参照に沿った様々な位置に対し反復することに関与する。最良のスコアリングマッチは、アライメントであると思われ、配列データが表すものに関する推測を表す。一部の実施形態において、核酸配列のペアのアライメントのスコアリングは、置換およびインデルの確率の値の設定に関与する。個々の塩基がアラインされると、マッチまたはミスマッチが、置換確率によりアライメントスコアに寄与し、これは、例えば、マッチに対し１およびミスマッチに対し−０．３３であり得る。インデルは、アライメントスコアからギャップペナルティを差し引き、これは、例えば、−１であり得る。ギャップペナルティおよび置換確率は、配列が進化する仕方に関する経験的知識または演繹的仮説に基づくことができる。これらの値は、得られるアライメントに影響を与える。特に、ギャップペナルティと置換確率との間の関係性は、置換またはインデルが、得られるアライメントにおいて好まれるかどうかに影響する。
【００３７】
式に表明される通り、アライメントは、２つの配列ｘとｙの間の推測される関係性を表す。例えば、一部の実施形態において、配列ｘおよびｙのアライメントＡは、（ｉ）｜ｘ’｜＝｜ｙ’｜となる；（ｉｉ）ｘ’およびｙ’からスペースを除去すると、ｘおよびｙにそれぞれ戻るべきである；ならびに（ｉｉｉ）任意のｉについて、ｘ’［ｉ］およびｙ’［ｉ］は、両者共にスペースとなることができないように、スペースを含有し得る別の２つの文字列ｘ’およびｙ’に、ｘおよびｙをそれぞれマップする。
【００３８】
ギャップは、ｘ’またはｙ’のいずれかにおける連続スペースの最大の部分文字列である。アライメントＡは、次の３種類の領域を含むことができる：（ｉ）マッチしたペア（例えば、ｘ’［ｉ］＝ｙ’［ｉ］；（ｉｉ）ミスマッチしたペア（例えば、ｘ’［ｉ］≠ｙ’［ｉ］かつ両者共にスペースではない）；または（ｉｉｉ）ギャップ（例えば、ｘ’［ｉ．．ｊ］またはｙ’［ｉ．．ｊ］のいずれかがギャップである）。ある特定の実施形態において、マッチしたペアのみが、高い正のスコアａを有する。一部の実施形態において、ミスマッチしたペアは、一般に、負のスコアｂを有し、長さｒのギャップも、負のスコアｇ＋ｒｓ（式中、ｇ、ｓ＜０）を有する。ＤＮＡに関して、一般的なスコアリングスキームの１種は（例えば、ＢＬＡＳＴによって使用される）、スコアａ＝１、スコアｂ＝−３、ｇ＝−５およびｓ＝−２を作成する。アライメントＡのスコアは、あらゆるマッチしたペア、ミスマッチしたペアおよびギャップのスコアの和である。ｘおよびｙのアライメントスコアは、ｘおよびｙのあらゆる可能なアライメントの中の最大スコアとして定義することができる。
【００３９】
一部の実施形態において、任意のペアは、置換確率の４×４行列Ｂによって定義されるスコアａを有する。例えば、Ｂ（ｉ，ｉ）＝１および０＜Ｂ（ｉ，ｊ）ｉ＜＞ｊ＜１は、１つの可能なスコアリングシステムである。例えば、転移（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）が、トランスバージョンよりも生物学的にあり得ると考えられる場合、行列Ｂは、Ｂ（Ｃ，Ｔ）＝．７およびＢ（Ａ，Ｔ）＝．３または本技術分野において公知の方法によって望まれるもしくは決定される他のいずれかのセットの値を含むことができる。
【００４０】
本発明の一部の実施形態に従ったアライメントは、ペアワイズアライメントを含む。ペアワイズアライメントは、一般に、ｍ個の文字を有する配列Ｑ（クエリー）およびｎ文字の参照ゲノムＴ（標的）に関して、ＱとＴとの間で可能なローカルアライメントを見出し評価することに関与する。任意の１≦ｉ≦ｎおよび１≦ｊ≦ｍに関して、Ｔ［ｈ．．ｉ］およびＱ［ｋ．．ｊ］（式中、ｈ≦ｉおよびｋ≦ｊ）の最大の可能なアライメントスコアが算出される（すなわち、位置ｉで終了するＴの任意の部分文字列および位置ｊで終了するＱの任意の部分文字列の最良のアライメントスコア）。これは、ｃｍ個の文字を有するあらゆる部分文字列の検査を含むことができ、ここでｃは類似性モデルに依存した定数であり、各部分文字列をＱと別々にアラインする。各アライメントはスコア化され、好まれるスコアを有するアライメントがアライメントとして受容される。当業者は、配列アライメントのための正確なアルゴリズムおよび近似的なアルゴリズムが存在することを十分に理解する。正確なアルゴリズムは、最高スコアのアライメントを見出す予想されるが、計算が高価でありうる。２つの周知の正確なアルゴリズムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、４８巻（３号）：４４３〜４５３頁、１９７０年）およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１４７巻（１号）：１９５〜１９７頁、１９８１年；Ａｄｖ．  ｉｎ  Ｍａｔｈ．、２０巻（３号）：３６７〜３８７頁、１９７６年）である。Ｇｏｔｏｈ（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１６２巻（３号）：７０５〜７０８頁、１９８２年）による、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎに対するさらなる改善は、計算時間を、Ｏ（ｍ２ｎ）からＯ（ｍｎ）［ここで、ｍおよびｎは、比較される配列サイズであり、並列処理により適する］へと短縮する。バイオインフォマティクスの分野では、Ｇｏｔｏｈの改変アルゴリズムが、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムと称されることが多い。並列計算リソースが、より広くかつ廉価に利用可能となりつつあるので、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ法は、より多くの配列セットをより多くの基準配列に対してアラインするのに使用されている。例えば、Ａｍａｚｏｎのクラウドコンピューティングリソースを参照されたい。本明細書において参照される上記の雑誌論文の全ては、参照によりそれらの全体において組み込まれる。
【００４１】
Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（ＳＷ）アルゴリズムでは、配列内の塩基間の重複に対して報酬を与え、配列間のギャップに対してペナルティペナルティを課すことにより、直鎖状の配列をアラインする。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎはまた、ＳＷは、短い配列が、長い配列を記載する文字の文字列にわたることを必要としないという点でも、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈと異なる。すなわち、ＳＷは、１つの配列が、他の配列の全体についてのリードであることを仮定しない。さらに、ＳＷは、文字列の全長にわたり伸長するアライメントを見出さなくてもよいため、局所的アライメントは、２つの配列内のどこでも開始および終結させることが可能である。
【００４２】
一部の実施形態において、ペアワイズアライメントは、ドットマトリクス方法、ダイナミックプログラミング方法またはワード（ｗｏｒｄ）方法に従って進む。ダイナミックプログラミング方法は、一般に、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（ＳＷ）アルゴリズムまたはＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ（ＮＷ）アルゴリズムを実行する。ＮＷアルゴリズムに従ったアライメントは、一般に、線形ギャップペナルティｄによる相似行列Ｓ（ａ，ｂ）（例えば、上述の行列Ｂなど）に従ってアラインされた文字をスコア化する。行列Ｓ（ａ，ｂ）は、一般に、置換確率を与える。ＳＷアルゴリズムは、ＮＷアルゴリズムと同様であるが、いずれの負のスコアリング行列セルも、ゼロに設定される。ＳＷおよびＮＷアルゴリズムならびにそれらの実行は、両者共に参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７０１，２５６号および米国特許出願公開第２００９／０１１９３１３号により詳細に記載されている。
【００４３】
Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムのバージョンを実行するアライメントプログラムは、Ｇｅｅｋｎｅｔ（Ｆａｉｒｆａｘ、ＶＡ）によって維持されるＳｏｕｒｃｅＦｏｒｇｅウェブサイトから入手できるＭＵＭｍｅｒである。ＭＵＭｍｅｒは、ゲノムスケールの配列を迅速にアラインするためのシステムである（Ｋｕｒｔｚ，  Ｓ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、５巻：Ｒ１２頁（２００４年）；Ｄｅｌｃｈｅｒ，  Ａ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２７巻：１１頁（１９９９年））。例えば、ＭＵＭｍｅｒ  ３．０は、１３．７秒間で、７８ＭＢのメモリを使用して、２．４ＧＨｚのＬｉｎｕｘ（登録商標）デスクトップコンピュータにおいて、５メガベースゲノムのペア間のあらゆる２０塩基対またはそれより長い正確なマッチを見出すことができる。ＭＵＭｍｅｒは、ショットガンシーケンシングプロジェクト由来の１００個または１０００個のコンティグを取り扱うことができ、システムにより含まれるＮＵＣｍｅｒプログラムを使用して、これらを別のセットのコンティグまたは参照にアラインする。種が、ＤＮＡ配列アライメントにとって多岐にわたり過ぎて類似性を検出できない場合、ＰＲＯｍｅｒプログラムは、両方のインプット配列の６フレーム翻訳に基づきアライメントを作成することができる。
【００４４】
他の例示的なアライメントプログラムは、次のものを含む：ヌクレオチドデータベースの効率的大規模アライメント（ＥＬＡＮＤ：Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｄａｔａｂａｓｅｓ）または配列およびバリエーションのコンセンサス評価（ＣＡＳＡＶＡ：Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）ソフトウェア（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のＥＬＡＮＤｖ２コンポーネント；Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）製のＲＴＧ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ；Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ（Ｓｅｌａｎｇｏｒ、Ｍａｌａｙｓｉａ）製のＮｏｖｏａｌｉｇｎ；Ｅｘｏｎｅｒａｔｅ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｈｉｎｘｔｏｎ、ＵＫ）（Ｓｌａｔｅｒ，  Ｇ．およびＢｉｒｎｅｙ，  Ｅ．、ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ６巻：３１頁（２００５年））、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｄｕｂｌｉｎ（Ｄｕｂｌｉｎ、Ｉｒｅｌａｎｄ）製のＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（Ｓｉｅｖｅｒｓ  Ｆ．ら、Ｍｏｌ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ  ７巻、ａｒｔｉｃｌｅ  ５３９（２０１１年））；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｄｕｂｌｉｎ（Ｄｕｂｌｉｎ、Ｉｒｅｌａｎｄ）製のＣｌｕｓｔａｌＷまたはＣｌｕｓｔａｌＸ（Ｌａｒｋｉｎ  Ｍ．Ａ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２３巻、２９４７〜２９４８頁（２００７年））；ならびにＦＡＳＴＡ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｈｉｎｘｔｏｎ、ＵＫ）（Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｗ．Ｒ．ら、ＰＮＡＳ  ８５巻（８号）：２４４４〜８頁（１９８８年）；Ｌｉｐｍａｎ，  Ｄ．Ｊ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７巻（４６９３号）：１４３５〜４１頁（１９８５年））。
【００４５】
上述の通り、ＲＮＡ−Ｓｅｑリードを有向非巡回アノテートされた参照ゲノムにアラインする際に、ＳＷアライメントアルゴリズムまたはその修正バージョン（さらに詳細に後述する）を実行することが好ましくまたは望ましくあり得る。
【００４６】
下記の等式（１）：
【数１】
2016539443.tif 000003
との関連で、ＳＷアルゴリズムは、長さｎおよびｍの２つの文字列を表示する、ｎ×ｍ行列Ｈで容易に表示される。
【００４７】
上記の等式では、ｓ（ａｉ，ｂｊ）は、マッチボーナス（ａｉ＝ｂｊである場合）またはミスマッチペナルティ（ａｉ≠ｂｊである場合）を表し、挿入および欠失には、それぞれ、ペナルティＷｉｎおよびＷｄｅｌが課される。大半の場合、結果として得られる行列は、ゼロである多くの成分を有する。この表示は、行列内の上行〜下行、右列〜左列のバックトレースを容易とし、これにより、アライメントの同定を容易とする。
【００４８】
行列にスコアを完全に追加したら、ＳＷアルゴリズムにより、バックトラックを実施して、アライメントを決定する。アルゴリズムは、行列内の最大値から始めて、各セルの最終的な最大値を計算するのに３つの値（Ｈｉ−１，ｊ−１、Ｈｉ−１，ｊ、またはＨｉ，ｊ−１）のうちのいずれを使用したのかに基づき、バックトラックする。バックトラッキングは、ゼロに達すると停止する。最適スコアリングアライメントは、挿入および欠失の最小可能な数を超えて含有することができるが、置換の最大可能な数よりもはるかに少なく含有する。
【００４９】
ＳＷまたはＳＷ−Ｇｏｔｏｈとして適用する場合、技法では、動的計画法アルゴリズムを使用して、それぞれ、サイズをｍおよびｎとする、２つの文字列ＳおよびＡの局所的配列アライメントを実施する。この動的計画法では、表または行列を援用して、マッチスコアを保存し、一連のセルについての再計算を回避する。文字列の各成分は、配列の文字に関するインデックスが付されていてもよく、すなわち、Ｓが文字列ＡＴＣＧＡＡであれば、Ｓ［１］＝Ａである。最適のアライメントをＨｉ，ｊ（上記）と表す代わりに、最適のアライメントは、下記の等式（２）：
【数２】
2016539443.tif 000004
のＢ［ｊ，ｋ］と表すことができる。
【００５０】
最大値関数であるＢ［ｊ，ｋ］の引数を、下記の等式（３）〜（５）［ここで、ＭＩＳＭＡＴＣＨ＿ＰＥＮＡＬＴＹ、ＭＡＴＣＨ＿ＢＯＮＵＳ、ＩＮＳＥＲＴＩＯＮ＿ＰＥＮＡＬＴＹ、ＤＥＬＥＴＩＯＮ＿ＰＥＮＡＬＴＹ、およびＯＰＥＮＩＮＧ＿ＰＥＮＡＬＴＹは、全て定数であり、ＭＡＴＣＨ＿ＢＯＮＵＳを除き、全て負である］に概括する。マッチの引数であるｐ［ｊ，ｋ］は、下記の等式（３）：
【数３】
2016539443.tif 000005
で与えられ、挿入の引数であるｉ［ｊ，ｋ］は、下記の等式（４）：
【数４】
2016539443.tif 000006
で与えられ、欠失の引数であるｄ［ｊ，ｋ］は、下記の等式（５）：
【数５】
2016539443.tif 000007
で与えられる。
【００５１】
３つの引数全てについて、［０，０］成分は、ゼロと置いて、バックトラックの完了を確認する、すなわち、ｐ［０，０］＝ｉ［０，０］＝ｄ［０，０］＝０とする。
【００５２】
スコア付けパラメータは、ある程度任意のものであり、計算の挙動を達成するように調整することができる。ＤＮＡのためのスコア付けパラメータ設定の一例（Ｈｕａｎｇ、３章：Ｂｉｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｃｏｍｐ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌシリーズ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．：  Ｔｈｅ  ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ、２００２年）であれば、
ＭＡＴＣＨ＿ＢＯＮＵＳ：１０
ＭＩＳＭＡＴＣＨ＿ＰＥＮＡＬＴＹ：−２０
ＩＮＳＥＲＴＩＯＮ＿ＰＥＮＡＬＴＹ：−４０
ＯＰＥＮＩＮＧ＿ＰＥＮＡＬＴＹ：−１０
ＤＥＬＥＴＩＯＮ＿ＰＥＮＡＬＴＹ：−５
である。
【００５３】
上記のギャップペナルティ（ＩＮＳＥＲＴＩＯＮ＿ＰＥＮＡＬＴＹ、ＯＰＥＮＩＮＧ＿ＰＥＮＡＬＴＹ）の間の関係は、ギャップ挿入ペナルティを、ギャップオープニングコストより大きく設定することにより、ギャップオープニングの数を制限する助けとなる、すなわち、ギャップをまとめてグループ化することを支援する。当然ながら、ＭＩＳＭＡＴＣＨ＿ＰＥＮＡＬＴＹ、ＭＡＴＣＨ＿ＢＯＮＵＳ、ＩＮＳＥＲＴＩＯＮ＿ＰＥＮＡＬＴＹ、ＯＰＥＮＩＮＧ＿ＰＥＮＡＬＴＹ、およびＤＥＬＥＴＩＯＮ＿ＰＥＮＡＬＴＹの間の代替的な関係も可能である。
【００５４】
一部の実施形態において、本発明の方法およびシステムは、多次元アライメントアルゴリズムを組み入れる。本発明の多次元アルゴリズムは、配列情報の「遡及（ｌｏｏｋ−ｂａｃｋ）」型解析を提供し（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎと同様に）、この遡及は、複数の経路および複数のノードを含む多次元空間により行われる。多次元アルゴリズムを使用して、ＤＡＧ型参照に対してＲＮＡ−Ｓｅｑリードをアラインすることができる。「背景技術（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）」で表されたアルゴリズムと異なり、アライメントアルゴリズムでは、ＤＡＧ（例えば、基準配列構築物）上の位置において含有される各配列に対する最大スコアを同定することにより、Ｃｉｊの最大値を同定する。実際、先行する位置を「後ろ向きに（ｂａｃｋｗａｒｄｓ）」見ることにより、複数の可能な経路にわたり最適のアライメントを同定することが可能である。
【００５５】
本発明のアルゴリズムは、上記で論じた通り、リード（別名「文字）および有向非巡回グラフ（ＤＡＧ）上で実行される。アルゴリズムを規定する目的で、Ｓを、アラインされる文字列とし、Ｄを、Ｓがアラインされる有向非巡回グラフとする。文字列Ｓの成分において、１で始まるインデックスがカッコ内に示される。したがって、Ｓが文字列ＡＴＣＧＡＡであれば、Ｓ［１］＝Ａ、Ｓ［４］＝Ｇなどである。
【００５６】
ＤＡＧについてのある特定の実施形態では、ノードの配列の各文字は、別個の成分であるｄとして表示される。ｄの先行成分（ｐｒｅｄｅｃｅｓｓｏｒ）は、以下のように定義される。
（ｉ）ｄが、そのノードの配列の第１の文字でなければ、そのノード内のｄに先行する文字が、その（唯一の）先行成分であり、
（ｉｉ）ｄが、そのノードの配列の第１の文字であれば、任意のノードの配列（例えば、ゲノムにおける全てのエクソンの上流）の最後の文字であって、ｄのノードの親である文字が、ｄの先行成分である。
【００５７】
全ての先行成分のセットは、Ｐ［ｄ］として表示する。
「最良の」アライメントを見出すために、アルゴリズムでは、Ｓの最初のｊ個の成分の、ｄに先行する（およびｄを含む）ＤＡＧの部分による最適のアライメントについてのスコアである、Ｍ［ｊ，ｄ］の値を求める。このステップは、上記の等式１内のＨｉｊを見出すステップと同様である。具体的に、Ｍ［ｊ，ｄ］を決定するステップは、下記：
【数６】
2016539443.tif 000008
で規定される通り、ａ、ｉ、ｅ、および０のうちの最大値を見出すことを伴う。
【００５８】
上記で記載した通り、ｅとは、Ｓの最初のｊ個の文字の、ＤＡＧの部分であって、ｄまでであるが、ｄを含まない部分によるアライメントのうちの最高のアライメントに、追加のＤＥＬＥＴＥ＿ＰＥＮＡＬＴＹを加えた値である。したがって、ｄが、ノードの配列の第１の文字でなければ、唯一の先行成分ｐが存在し、Ｓの最初のｊ個の文字の、ＤＡＧ（ｐまでであり、ｐを含む）によるアライメントスコアは、Ｍ［ｊ，ｐ］＋ＤＥＬＥＴＥ＿ＰＥＮＡＬＴＹと等しい。ｄが、そのノードの配列の第１の文字である場合、複数の可能な先行成分が存在することが可能であり、ＤＥＬＥＴＥ＿ＰＥＮＡＬＴＹは定数であるため、［Ｍ［ｊ，ｐ＊］＋ＤＥＬＥＴＥ＿ＰＥＮＡＬＴＹ］を最大化することは、先行成分を、Ｓの最初のｊ個の文字による最高のアライメントスコアと共に選択することと同じである。
【００５９】
等式（６）では、ｉとは、文字列Ｓの最初のｊ−１個の文字の、ｄまでであり、ｄを含むＤＡＧによるアライメントに、ＳＷにおける挿入引数の定義（等式１を参照されたい）と同様のＩＮＳＥＲＴ＿ＰＥＮＡＬＴＹを加えた値である。
【００６０】
加えて、ａとは、Ｓの最初のｊ個の文字の、ＤＡＧの部分であって、ｄまでであるが、ｄを含まない部分によるアライメントのうちの最高のアライメントに、ＭＡＴＣＨ＿ＳＣＯＲＥ（Ｓのｊ番目の文字が、文字ｄと同じである場合）またはＭＩＳＭＡＴＣＨ＿ＰＥＮＡＬＴＹ（Ｓのｊ番目の文字が、文字ｄと同じでない場合）を加えた値である。ｅと同様に、これは、ｄが、そのノードの配列の第１の文字でなければ、唯一の先行成分、すなわち、ｐが存在することを意味する。これは、ａが、Ｓの最初のｊ−１個の文字の、ＤＡＧ（ｐまでであり、ｐを含む）によるアライメントスコア、すなわち、ｄとＳのｊ番目の文字とがマッチするのかどうかに応じて、ＭＩＳＭＡＴＣＨ＿ＰＥＮＡＬＴＹまたはＭＡＴＣＨ＿ＳＣＯＲＥを加えたＭ［ｊ−１，ｐ］であることを意味する。ｄが、そのノードの配列の第１の文字である場合、複数の可能な先行成分が存在しうる。この場合、｛Ｍ［ｊ，ｐ＊］＋ＭＩＳＭＡＴＣＨ＿ＰＥＮＡＬＴＹまたはＭＡＴＣＨ＿ＳＣＯＲＥ｝を最大化することは、先行成分を、Ｓの最初のｊ−１個の文字による最高のアライメントスコア（すなわち、Ｍ［ｊ−１，ｐ＊］の候補引数の最高値）と共に選択し、ｄとＳのｊ番目の文字とがマッチするのかどうかに応じて、ＭＩＳＭＡＴＣＨ＿ＰＥＮＡＬＴＹまたはＭＡＴＣＨ＿ＳＣＯＲＥを加えることと同じである。
【００６１】
ここでもまた、ＳＷアルゴリズムの場合と同様に、ペナルティ、例えば、ＤＥＬＥＴＥ＿ＰＥＮＡＬＴＹ、ＩＮＳＥＲＴ＿ＰＥＮＡＬＴＹ、ＭＡＴＣＨ＿ＳＣＯＲＥ、およびＭＩＳＭＡＴＣＨ＿ＰＥＮＡＬＴＹは、少数のギャップを伴うアライメントを促すなどのように調整することができる。
【００６２】
上記の等式で記載されている通り、アルゴリズムでは、各リードについて、その成分についての挿入スコア、欠失スコア、およびマッチスコアを計算するだけでなく、ＤＡＧ上の任意の先行ノードを後ろ向きに見て（ＤＡＧの方向と反対方向に）、最適の（すなわち、最大の）スコアを見出すことにより、最大値を見出す。こうして、アルゴリズムは、ＤＡＧを通る異なる経路であって、公知の変異を含有する経路を横断することが可能である。グラフは、有向性であるため、グラフの方向と反対に移動するバックトラックは、グラフの起点に向けて好まれるアイソフォームに従い、最適アライメントスコアは、高度な確実性の最も可能性の高いアライメントを同定する。
【００６３】
図１は、ＤＡＧと比較されているリードの図解表現を示す。図１の上部分は、配列リード「ＡＴＣＧＡＡ」と共に参照配列ＴＴＧＧＡＴＡＴＧＧＧ（配列番号１）および既知の挿入イベント
【化１】
2016539443.tif 000009
（配列番号２）を示し、挿入には下線が引かれている。図１の中央は、関係性の視覚化に役立つように各配列を線形に保ちつつ、リード、配列番号１および配列番号２の間の関係性を示す。図１の下部分は、ＤＡＧを使用して構築されたアライメントを示す。描写されているＤＡＧにおいて、異なるパスに沿っているにもかかわらず、ＤＡＧの５’末端からＤＡＧの３’末端へと読み取ることにより、配列番号１および２は両者共に読み取ることができる。描写されている通り、上のパスとアラインするものとして配列リードを示す。
【００６４】
図２は、比較に対応する実際の行列を示す。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ技法と同様に、本発明の図示されているアルゴリズムは、最高スコアを同定し、バックトラックを実行して、リードの適切な場所を同定する。図１および図２は、本発明が、構築物に対する文字列の実際のマッチを産生することも強調する。配列リードが、ＤＡＧに含まれていない変異体を含む事例において、アラインされた配列は、ギャップ、挿入などとともに報告される。
【００６５】
アノテートされた参照のＤＡＧにＲＮＡ−Ｓｅｑリードをアラインすることにより、トランスクリプトームにおけるアイソフォームを発見することが可能になる。加えて、異なる型の選択的スプライシングが生じた可能性（例えば、関連するエクソンの１つにおいて１つのコドンがスキップされた可能性）は、「自由（ｆｒｅｅ）に」予測することができる。
【００６６】
エクソンは、２つのノードへと自動的に分離することができ、そのうち１つは第１のコドンに対応し、１つはエクソンの残りに対応する。これにより、未だ観察されたことがなかったとしても、両方の種類のスプライシングをＤＡＧにおいて表すことが可能となる。アライメントに対する１つのコドンの差異の価値が、多くの場合、代替を探させるよう誘導するほど十分に候補アライメントを罰しないであろうことを考慮すると、これらの状況の予測は有用であり得る（最大のかかるペナルティは、３つの挿入または３つの欠失についてのものであり、多くの場合ペナルティは、見込みのため、より小さくなる）。
【００６７】
トランスクリプトームをＤＡＧとして表すと、ＤＡＧを通るパスとしてアイソフォームの自然な解釈が可能になる。数学的構造において物理的な項目を表す場合に一般的な通り、利益は非常に多い。例えば、本発明のシステムおよび方法は、直感的な方法で配列を視覚化することを可能にする。配列は、例えば、ＤＡＧを通る２つのパスを示すことにより比較することができる。
【００６８】
加えて、本発明の方法は、グラフ定理およびアルゴリズムの活用の助けになる。ＤＡＧを通るパスの解析は、現代数学およびコンピュータ科学における活気のある研究分野である。トランスクリプトームの研究を改善するためにこの研究を活用する能力は、したがって有用である。例えば、エッジが、リードが接合部をまたぐ確率に対応する所定の重みである場合、パスの総重みは、異なるアイソフォームが実現される演繹的可能性に関する情報を保有することができる。ＤＡＧを通るパスの重みの最大化（または最小化）は公知であり、最短パスアルゴリズムを使用して、これらの最短パスを迅速に見出すことができる。
【００６９】
図３は、本発明の方法の略図を提示する。上述の通り、標準的な順序で接続されたエクソンを有するＤＡＧが構築されると、ペアエンドリードが得られる。次に、ペアエンドリードは、ＤＡＧにアラインされ、リードと、ＲＮＡ配列を表すノードおよびノードのペアを接続するエッジを含むＤＡＧとの間にアライメントが見出される（所定の判断基準を満たすアライメントスコアを有する）。所定の判断基準は、例えば、最高スコアリングアライメントであり得る。アライメントは、上述の改変Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムによって進むことができる。アライメントは、ペアエンドリードのペアに対して、アライメントを含む有向非巡回データ構造を通るパスに基づいてトランスクリプトームにおける転写物を同定することを含むことができる。アライメントは、アライメントにおける制約として挿入サイズを使用することにより効率的に行うことができる。ペアエンドリードを使用して、ＤＡＧを構築することができる（例えば、エッジを加える）。
【００７０】
この方法は、ＲＮＡ−Ｓｅｑによって得られるリードの解析に適する。ある特定の実施形態において、有向非巡回データ構造は、少なくとも１本の染色体について実質的にあらゆる公知の特徴を表す。アライメントを見出す前に、有向非巡回データ構造を創出および保存することができる。一部の実施形態において、アライメントは、有向非巡回データ構造を通る可能なパスの少なくとも大部分と各配列リードとを比較することにより見出される。この方法は、見出されたアライメントに基づき、複数の配列リードをコンティグへとアセンブルするステップを含むことができる。
３．アライメントにおける制約としての挿入サイズの使用
【００７１】
挿入サイズ情報をＤＡＧと組み合わせることができる方法の１つは、アライメントにおける制約として挿入サイズを使用することである。この方法の使用から、スピードおよび正確さの両方における可能な増加が得られる。この方法は、アライメントに関連する重要な情報を廃棄させないようにするため、別々のペアエンドメートのアラインよりも正確であり得る。２つのペアエンドメートのアラインが、おおよそ、ゲノムにおけるＬ個の可能な場所（ゲノムが、長さＬを有する場合）の中から２個の場所を選ぶことに独立して達することに留意されたい。よって、アラインは、およそＬ＾２の可能性の中から選ぶことを伴う。しかし、第１のアライメントは、第１のアライメントの周辺の一定のサイズｋのある領域に他のアライメントを強く制約するために使用されると、およそｋＬの可能性しかない−−Ｌの桁内であり、Ｌ＾２ではない。これははるかにより速い。
【００７２】
図４〜図６は、アライメントを制約するための挿入サイズ情報の使用を図示する。
【００７３】
図４は、挿入サイズｋを定義する任意の構造の仮説上のＤＡＧおよびペアエンドリードの仮説上のペアを図示する。描かれているＤＡＧにおいて、ノードは四角であり、エッジは線である。描写されている実施形態において、挿入サイズｋは、平均ｋｂｐを有するおよその正規分布から導かれる。ペアの第１のメンバーは、ＤＡＧにアラインされる（例えば、上述のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎまたは改変Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎを使用して）。一般に、ペアエンドシーケンシングは、各末端にアダプターを有する断片に関与し、断片−アダプター境界から互いに向けて内向きに拡張するペアエンドリードを有する。ペアエンドリード間にギャップが存在し得る。挿入長さは、断片の長さを表すように採用することができる−すなわち、一方の断片−アダプター境界から他方の断片−アダプター境界への距離。例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれるＬｉｎｄｇｒｅｅｎ、２０１２年、ＡｄａｐｔｅｒＲｅｍｏｖａｌ：  ｅａｓｙ  ｃｌｅａｎｉｎｇ  ｏｆ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅａｄ、ＢＭＣ  Ｒｅｓ  Ｎｏｔｅｓ  ５巻：３３７頁（例えば、Ｌｉｎｄｇｒｅｅｎ、図１、パネルＣ）を参照されたい。
【００７４】
図５において、最も左にある黒い四角は、ペアの第１のメンバーがアラインするエクソンを表す。距離のセットは、予想される挿入サイズ値の大部分（例えば、９９．９５％）を占めると決定される。例えば、挿入サイズが正規分布する場合、距離のセットは、ｋの３標準偏差内の距離であり得る。距離の決定されたセットは、下流ノードおよびしたがって候補パスの選択に使用される。選択された下流ノードは、ペアエンドリードのペアの第２のメンバーの潜在的なアライメント部位を表す。図５において、下流ノードのセットも黒く塗りつぶされた四角である。上流ノードで始まり下流ノードのうちの１つで終わるパスは、ペアエンドリードのペアをアラインするための候補パスである。
【００７５】
図６は、図４のＤＡＧの候補パスを図示する。図６はＤＡＧも示し、これは図４のＤＡＧ内に含有されるＤＡＧを示すことに留意されたい。全候補パスおよび候補パスのみを図６に図示する。挿入サイズｋ（図４から）を定義するペアエンドリードの仮説上のペアは、計算的節約のため、図６に示すこのＤＡＧにアラインすることができる。アライメントにおけるこの制約を認識することなく、ペアの各リードは、長さＬのゲノムに沿ったいずれかの場所に潜在的にアラインすることができ、複雑なＤＡＧ（例えば、図４におけるＤＡＧは、その長さにわたりおよそ４プレックスである）において、はるかに多くの場所が存在し得る（すなわち、ＤＡＧが、いずれかの遺伝子座にわたり平均的にｎプレックスである場合、ペアエンドリードのペアのアラインは、（ｎＬ）＾２の選択肢から選ぶことに達する）。図示されている方法に従ったＤＡＧによるアライメントの実行は、非常に大規模のプロジェクトを、計算的にはるかにコストを低くし、ＲＮＡ−Ｓｅｑプロジェクトからの大容量のペアエンドリードデータによって、遥かにより優れたスループットをもたらすことができる。
【００７６】
４．多様な選択的スプライシングに対する感度
現在の技法は、リードがエクソンの接合部をまたぐ場合、数種類の状況の間を識別することが困難または不可能である。かかる状況の１つは、変異が発生した場合である。別のかかる状況は、変異の非存在下であっても、コドンの一部が含まれたまたはスキップされた選択的スプライシングの型が発生したため、リードが、接合部のいずれの側においてもマッチするように思われない場合に生じる。また、シーケンシングエラーは、別のかかる状況を示す。
【００７７】
一例として、次の配列を考える：
【化２】
2016539443.tif 000010
配列中、平坦なテキスト領域は、エクソンを表し、第１の下線を引かれた部分は、イントロンを表し、第２の下線を引かれた部分は、選択的スプライシングにより、第２のエクソンに含まれ得るまたは含まれない領域である。よって、成熟ＲＮＡは、２つの型
【化３】
2016539443.tif 000011
のうちいずれかを採ることができる。
そこで、次のリードを得ると仮定する：ＴＧＧＡＴＡＧＡＴＧＡＡ（配列番号６）。かかるリードは、重要な方法で異なる数種類の因果関係ヒストリーを有し得る。
【００７８】
図７は、これらの配列に関与する３種の代替ヒストリーを示す。図７の上から３分の１にわたって描写される第１の状況において、リードは、配列番号４から採取され、変異またはシーケンシングエラーは発生していない。第２の状況において、リードは、配列番号５から採取され、シーケンシングエラーが発生している。第３の状況において、リードは、転写物、配列番号５から採取され、リードは、変異を正確に反映している。
【００７９】
線形参照配列が、平坦なテキスト領域（図７における破線の下線）のみからなる場合、アライメントスコアが非常に高くなる（多くのマッチによってブーストされ、１のミスマッチペナルティのみを被る）ため、使用中のアルゴリズムがアライメントに恐らく誤りとフラグを立て（ｆｌａｇ）ない可能性が非常に高い。スプライシング情報に関してその他の何らかのファイルまたはデータベースを検査するのではなく、これは、変異または単一のシーケンシングエラーを単純に仮定する。ＤＡＧ参照に対するアラインがより良い成果を出す。
【００８０】
図８は、ＤＡＧ参照に対する配列番号３のアライメントを描写する（図８においては、イントロンがなくなったため、配列番号４として現れる）。ここでは、正確なアライメントは、このＤＡＧとのいずれか可能なアライメントの最高スコアを有するため、直ちに回復させせられる。ＤＡＧの性質によって、図８は、次のものも描写する：
ＡＵＧＣＡＵＵＵＣＣＧＵＧＧＡＵＡＧＡＵＧＣＡＵＣＡＧＡＡＡＵＡＧ（配列番号５）
【００８１】
これは、非常に一般的な現象であり、エクソンの小部分が、どの程度頻繁に選択的スプライシングによる包含または排除に付されるかを考慮すると、頻繁に発生する。線形参照に関与するシステムは、通常、これらの状況が生じる場合、誤った特徴付けを検出できず、これらの誤りを防ぐ唯一の方法は、このプロセスを極めて高くつく（時間と金の両方で）ものにするほど非常に多くの線形参照に対しアラインすることである。
【００８２】
５．ペアエンドデータの適切な使用：ＤＡＧの改変
本発明は、挿入サイズと正しいアライメントとの間の関係性の追加的な活用を提供する。所定のアライメントまたはアライメントのペアにおける制約として挿入サイズを取り扱うものと現在のパラダイムを見ることができる。これは、状況に関する不完全な記述である。アライメントおよび転写物の組合せにおける制約として挿入サイズを見ることがより正確であり得る。
【００８３】
本発明の方法は、アライメントのみならず転写物における品質管理としての挿入サイズの使用に関与する。２つのペアエンドメートのそれぞれが、転写物ＤＡＧにおいて高スコアリングアライメントを有する場合、また、アライメントのこのペアが、著しく信じ難い挿入サイズに対応する場合、転写物に関する考えを調整する（例えば、グラフにエッジを加えることにより）ことが、多くの場合、アライメントのそれぞれの正確さに関する考えを調整することよりも合理的ある。
【００８４】
これは、２つのペアエンドメートがＤＡＧにアラインするときは常に、挿入サイズまたはアライメントによって暗示されるサイズの計算によって実行することができる（リードはいくつかの特徴と一貫し得るため、２つ以上のサイズが関与し得る）。最小のかかる挿入サイズおよび挿入サイズの予想値の商（ｑｕｏｔｉｅｎｔ）が、ある定数（恐らくは２）を超える場合、ＤＡＧを検査して、接続されると、アイソフォームに暗示される挿入サイズおよび挿入サイズの予想値の商が０．５〜１．５の間になるアイソフォームの存在を必然的に伴う、接続されていないノードのペアを見出す。かかるノードのペアが存在する場合、これらをエッジで接続する。複数のかかるペアが存在する場合、１に最も近い比を生じるペアを選び、これを接続する。
【００８５】
ある特定の態様において、本発明は、トランスクリプトームからペアエンドリードの少なくとも１ペアを得るステップと、ペアの第１のリードと、有向非巡回データ構造におけるノードの間で最適スコアを有するアライメントを見出すステップと（データ構造は、エクソンまたは転写物など、ＲＮＡ配列を表すノードと、ノードの各ペアを接続するエッジとを有する）、ペアエンドリードのペアの挿入長さと実質的に同様の長さを有するパスによって下流ノードに接続されたノードを含む候補パスを同定するステップと、ペアエンドリードを候補パスにアラインして、最適スコアリングアライメントを決定するステップと、ペアエンドリードのペアによって示される候補パスの創出に必要または好まれる場合、新たなエッジを含むようにＤＡＧを改変するステップとに関与する、トランスクリプトームを解析する方法を提供する。当業者であれば、ペアエンドリードのペアの挿入長さと実質的に同様の長さを有するパスを、いずれか適した判断基準によって定義できることを認識する。例えば、実質的に同様は、同数のヌクレオチドを意味することができる、あるいは好ましくは、±１０または±１００ヌクレオチドを意味することができる。ある特定の実施形態において、実質的に同様は、使用者によって、互いの１０％以内、または好ましくは、２５％以内または５０％以内または１００％以内の長さを意味するものと定義することができる。好まれる実施形態において、実質的に同様の長さは、他方の長さの２倍以下であることを意味する。本方法は、ｃＤＮＡ断片由来など、多数のペアエンドリードに適する（例えば、単一のトランスクリプトームを表すｃＤＮＡ断片）。ノードおよび下流ノードは、ペアエンドリードのペアが得られたエクソンのペアを表すことができる。本方法は、決定された最適スコアリングアライメントに基づきアイソフォームを同定するステップを含むことができる。一部の実施形態において、同定されたアイソフォームは、新規アイソフォームである。有向非巡回データ構造は、新規アイソフォームを表すようにアップデートすることができる（例えば、新たなエッジを加えることにより）。本方法は、ペアエンドリードのペアに関与する任意のアライメント計算から、候補パスではないいかなるパスも除外するステップを含むことができる。本発明の他の態様は、例えば、アイソフォーム頻度の推測に有用なシステムおよび方法による発現解析を提供する。
【００８６】
６．ペアエンドデータの使用：アイソフォーム頻度の推測
強力な技法は、適切にアラインするためのペアエンド構造の使用からではなく、アライメントから挿入サイズを推測する中間ステップにより、アイソフォーム頻度を推測するためのアライメントの使用から生じる。エクソンのペアが試料に現れる頻度が既知である場合（例えば、Ｈａｒｒｏｗ、２０１２年、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２巻：１７６０頁を参照）、このような頻度を使用して、アイソフォームが試料に現れる頻度を構築することができる。さらに、エクソンの異なるペアは、通常、異なる距離だけ離れている。よって、ペアエンドメート間で観察される距離を使用（僅かに間接的に）して、エクソン頻度の経過を追うことができる。
【００８７】
説明のための例を次に示す。ペアエンドメートのペアごとに、ペアをまず任意選択でＤＡＧ参照にアラインすることができる。各ペアメンバーにおける参照ポイント（例えば、最も左にある位置）間の距離に留意し追跡する。アイソフォーム頻度を推測する方法は、ＤＡＧへのペアのアラインを必要としない場合があることが認められるが、これは、ＤＡＧとのアライメントから得ることができる。
【００８８】
アラインされたペアごとの参照ポイント間の距離の留意および追跡に適した１つの方法は、ハッシュ表の使用によるものである。距離ハッシュにおいて、キーは、１〜１０００の間のあらゆる距離であり得、各キーの値は、ゼロに初期化される。次に、距離に対応するキーの値を調べ、この値をインクリメントすることにより、インクリメントを行うことができる。この種のハッシュ表操作は、極めて速く、実際に一定の時間で行うことができることに留意されたい。加えて、ハッシュ表は、ＢｉｏＰｅｒｌなど、既存のバイオインフォマティクスパッケージによって十分に支持されていることが認められる。次に、エクソンの各ペアは、エクソン間の真の距離に最も近い距離に対応する値の和に関連付けられる（すなわち：これらエクソン間の距離に近い距離に観察されるあらゆる「ヒット」を合計する。この数およびペアの総数の商は、試料におけるエクソンの全ペアと比べて、エクソンのこのペアが発生する頻度に非常に近い）。
【００８９】
このデータから、アイソフォーム頻度を代数的に決定することができる。好まれる形式の方程式は、関連するアイソフォームの構造に依存し得るが、一般的技法が次の通りに確立している：
【００９０】
３種のアイソフォームが存在することを仮定し、そのうち１種は、エクソンＡ、ＢおよびＣを含有し、そのうち別の１種は、エクソンＡ、ＢおよびＤを含有し、そのうち３番目は、エクソンＢ、ＣおよびＤを含有する。エクソンペアの頻度（［ＡＢ］は、全アラインされたリードの中のエクソンペアＡＢの頻度である）は、アラインされたリードから得られる（すなわち、エクソンｉが、アライメントにおけるエクソンｊに接続される度に、対応する頻度は１をインクリメントされる）。
次に、３種のアイソフォームの頻度が、（順番に）［Ａ］＝ｆ、［Ｂ］＝ｇおよび［Ｃ］＝ｈである場合、エクソンペアの頻度は、次の通りになるはずである：
［ＡＢ］＝ｆ＋ｇ
［ＢＣ］＝ｆ＋ｈ
［ＢＤ］＝ｇ＋ｈ
【００９１】
左側の値は、アライメントから既知であるため、アイソフォーム頻度を解くことができる。一般に、本発明の方法は、エクソンペア頻度対アイソフォーム頻度に関する方程式を書き込むステップを含み、前者を使用して後者を得る。当業者であれば、描写されている方程式を解くための代数方法を認識する。説明のための例を挙げるために、上述のものを代数操作することで次式が生じることが認められる：
ｆ＝［ＡＢ］−ｇ
かつ：
ｈ＝［ＢＤ］−ｇ
よって：
［ＢＣ］＝ｆ＋［ＢＤ］−ｇ
および：
［ＢＣ］＝［ＡＢ］−ｇ＋［ＢＤ］−ｇ
再配列により次式がもたらされる：
［ＢＣ］／２（［ＡＢ］＋［ＢＤ］）＝ｇ
［ＢＣ］、［ＡＢ］および［ＢＤ］は全て、アライメントから既知であるため、これによりｇが計算される。ｆおよびｈについて解くことは自明である。
【００９２】
ある状況下では、解くべき変数の数が、インプット変数の数以上であるという点において、「自由度」問題が存在するように思われる場合がある。この明らかな問題に取り組むためのいずれか適した技法を用いることができ、これは特定の状況に依存し得る。適した技法は、変数を正規化するステップ；１セットより多くのアイソフォーム頻度を解き、１つの事後（ａｆｔｅｒ−ｔｈｅ−ｆａｃｔ）を選ぶステップ；少なくとも１つのインプット値を付帯的に得るステップ（例えば、生物学的試料から）、またはインプット情報を提供するステップ（例えば、文献または仮説から）を含むことが判明し得る。
【００９３】
要となるステップのグラフ的な解釈に留意することが重要である：ｘ軸に距離およびｙ軸に頻度を有するグラフが作成されることを仮定する。次に、エクソンペアは、このグラフにおけるピークとして現れ、多くの場合、これらのピークのいくつかは、同様にアイソフォーム頻度として容易に解釈可能である。
【００９４】
よって、本発明は、トランスクリプトームからペアエンドリードの複数のペアを得て、任意選択で、これらのリードを参照データ構造にアラインすることにより、トランスクリプトームにおけるアイソフォーム頻度を推測する方法を提供する。データ構造は、それぞれノードとして表される、ゲノム由来の複数のエクソンを含む。ノードまたはエクソンのペアは、それらの近位端においてエッジによって接続される。ペアエンドリードのアラインされたペア間の距離およびアラインされたペア間の距離の頻度が決定される。アイソフォームパスおよびアイソフォーム頻度のセットは、構造を通るアイソフォームパスをアイソフォーム頻度で表すことが、エクソンのペアが、アラインされたペアの距離の頻度でアイソフォームパスに含まれることをもたらすように決定される。アイソフォームパスの決定されたセットの各パスは、生物に存在する転写物アイソフォームを表すことができる。アラインされたペア間の距離は、各ペアの第１のアラインされたメンバーの上流端から、このペアの第２のアラインされたメンバーの下流端までのパス長さであり得る。ある特定の実施形態において、アイソフォームパスのセットを決定するステップは、新規アイソフォームパスを発見することを含む。参照データ構造は、新規アイソフォームパスを含むようにアップデートすることができる。
【００９５】
アイソフォームパスのセットを決定するステップは、代数的に、例えば、一次方程式のセットを解くことにより行うことができる。一部の実施形態において、アイソフォーム頻度のうち１つは、一次方程式のセットを解く前に、生物学的データから得られる（例えば、そこで、一次方程式における残る変数を決定することができる）。それに加えてまたはそれに代えて、アラインされたペア間の距離の頻度は、アイソフォームパスおよびアイソフォーム頻度のセットを決定する前に正規化されていてもよい。
【００９６】
７．演繹的エクソンおよびアイソフォームカウント分布の組み入れ
一部の実施形態において、本発明は、アイソフォームカウントの相対頻度のための演繹的データが存在する状況を活用する。転写物のアイソフォーム分布は、タンパク質アイソフォームの分布に相関すると推測することができる。所定の遺伝子のエクソンおよびアイソフォームカウントの分布ならびにこれらの分布が配列に関する他の事実（例えば、コード配列であるか非コード配列であるか）に対し感受性となる方法に関する問題を、不完全であるとしても徹底的に試験した。
【００９７】
アイソフォーム頻度は、文献から、または解析を行うことにより得ることができる。例えば、アイソフォーム頻度は、上のセクション６「ペアエンドデータの使用：アイソフォーム頻度の推測」に記載されている通り、ペアエンドリードＲＮＡ−Ｓｅｑリードから推測することができる。一部の実施形態において、下のセクション８「挿入サイズをより有効に使用して、アイソフォーム確率を推測する」に記載されている通り、ペアエンドリードデータからの挿入サイズを使用して、アイソフォーム頻度を推測した。ある特定の実施形態において、アイソフォーム頻度は、データベースまたは文献などの供給源から得られる。
【００９８】
図９は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアミノ酸配列の試験によって得られるタンパク質アイソフォーム分布を表し、これは、Ｎａｋａｏら、２００５年、Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ：  ｐａｔｔｅｒｎ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌｓ、Ｎｕｃｌ  Ａｃ  Ｒｅｓ  ３３巻（８号）：２３５５〜２３６３頁の３番目の図の再現である。加えて、Ｃｈａｎｇらは、様々な選択的スプライシング型の定量的分布を演繹するためのプログラミング方法を使用した。Ｃｈａｎｇら、２００５年、Ｔｈｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｇｒａｐｈｓ  ｉｎ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｆｏｒｍ  ｆｒｏｍ  ＥＳＴ  ｄａｔａｂａｓｅ、Ｉｎｔ  Ｊ．  Ｃｏｍｐ．  Ａｐｐｌ．  Ｔｅｃｈ  ２２巻（１号）：１４頁。
【００９９】
図９に示す情報は、ＤＡＧへのリードのマッピングに役立つように使用することができるアイソフォームカウント分布を表す。同様に、エクソンカウント分布情報を得ることができる。
【０１００】
例えば、転写物当たりのエクソン数の実証された分布が存在する。例えば、Ｈａｒｒｏｗら（２０１２年）ＧＥＮＣＯＤＥ：  Ｔｈｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｈｅ  ＥＮＣＯＤＥ  Ｐｒｏｊｅｃｔ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２２巻：１７６０〜１７７４頁を参照されたい。タンパク質コード遺伝子座における転写物は、転写物当たり４つのエクソンにおけるピークを実証するが、ｌｎｃＲＮＡは、２つのエクソンにおける別個のピークを示す（Ｈａｒｒｏｗら、２０１２年の図２を参照）。Ｈａｒｒｏｗらのエクソンカウント分布またはＮａｋａｏらのアイソフォーム分布は、確率的に解釈することができ、ｙ軸が、絶対頻度の代わりに相対頻度を示す。かかる情報を使用して、候補アライメントが、実際のヌクレオチド配列に対応する見込みに関する判定を通知することができる。先行技術技法は、アライメントのスコアに主に頼る。本発明は、アイソフォーム数の演繹的知識を含む方法を提供する。
【０１０１】
例えば、大型のリードのセットについて、７５％は、８つのアイソフォームのセット｛Ｉ１、Ｉ２、…、Ｉ８｝における領域に明確にマップすることができるが、その残りの２５％は、Ｉ５またはさらなるアイソフォームＩ９に対応するエクソンの何らかの他の組合せのいずれかへのマッピングとして解釈することができる。この状況において、様々な種類の事実が、リードの最後の２５％をどのようにアラインするかに関する決断に関連する。かかる関連する事実として、（ｉ）Ｉ５へのアライメントおよびＩ９へのアライメントのスコア；（ｉｉ）調節機序に関して我々が有し得る任意のさらなる知識；および（ｉｉｉ）演繹的に、８または９ついずれのアイソフォームが存在する可能性が高いかということが挙げられる。
【０１０２】
本発明は、ＤＡＧ参照にリードをマッピングする場合、アイソフォーム分布情報を組み入れる。アイソフォーム頻度分布情報は、いくつか異なる方法で使用することができる。リードのマッピングに演繹的アイソフォーム数を含む第１の例示的な方法は、（１）ゲノムの関連する領域のためにＤＡＧを構築するステップ（このＤＡＧのエッジは、重みを加えられても重みを加えられなくてもよい）と、（２）ＤＡＧの各エッジに、エッジの使用を示す値を関連付けるステップとを含む。そのエッジをまたぐ方法でアラインされるリードの数が、ある変数Ｕよりも少ない場合、この使用を「オフ」に設定する。この変数は、エッジが「使用」されているかどうかを直感的に反映している。これを見積もる方法の１つは、これを、（試料におけるリードの数）＊（エクソンの長さの合理的な見積りおよび平均リード長さの商）＊（．００５）に等しく設定することによるものであり得る。
【０１０３】
さらに、本方法は、（３）ゲノムの関連する領域に、使用の閾値Ｔに対応する変数を関連付けるステップを含み、恐らく、グラフにおいて使用されるエッジの数の予想値＋グラフにおいて使用されるエッジの数の標準偏差に等しくＴを設定する。これらの数は、問題となっている遺伝子について予想される経験的エクソン頻度、アイソフォーム頻度またはその両方に対応するノードの数および最大パスを有するＤＡＧにおけるエッジの数を見積もることにより計算することができる。経験的頻度は、例えば、エクソンカウント分布に関してはＨａｒｒｏｗら、２０１２年から、またはアイソフォーム分布に関してはＮａｋａｏら、２００５年から得ることができる。
【０１０４】
本方法は、（４）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎまたは他のアルゴリズムにおいて使用されるスコアリングスキームを修飾するステップ、「使用」されたエッジ（すなわち、Ｂｏｏｌｅａｎ使用の値が「オン」または「真」であるエッジ）の総数Ｎが、Ｔを超える場合、あるペナルティによって未使用のエッジの横断を罰するステップを含む。このペナルティは、Ｎが増加するにつれて増加するように設計することができる。ペナルティのための合理的な式は、ｍａｘ（０，（Ｎ−Ｔ）＊（挿入ペナルティ）＊２）であり得る。ゼロの項は、負のペナルティを回避すると思われるが（すなわち、新たなエッジを使用するためのボーナスを回避する）、かかるボーナスは、ある文脈において適切であり得、この場合において、ゼロおよび後者の発現の値のうちの最大を採る必要がない。
【０１０５】
リードが処理される順序に対し感受性であるアライメントの形式における歓迎されないパス依存性を回避するために、アライメントを数回反復し、結果を比較することができる。これは、アルゴリズムの漸近的稼働時間に影響を与えない。
【０１０６】
リードのマッピングにおいて演繹的アイソフォーム数を含む代替的な例示的方法は、
（ｉ）ＤＡＧに対し各リードをアラインするステップ；
（ｉｉ）アイソフォームの観察される数を、アイソフォームの予想される数（例えば、遺伝子に関するバックグラウンド情報を考慮して、アイソフォームの数の演繹的確率分布から得られる）と比較するステップ；および
（ｉｉｉ）観察される数と予想される数との間の差が、ある閾値を超える場合、最も稀な候補アイソフォームに割り当てられたリードを再アラインするステップを含む。再アライメントにおいて、稀な候補アイソフォームへのいずれかのアライメントは、差の規模に応じた重みによりペナルティを科される。ペナルティは、ｍａｘ（０，（Ｎ−Ｔ）＊（挿入ペナルティ）＊２）（式中、Ｎは、「使用」されたエッジ（すなわち、Ｂｏｏｌｅａｎ使用の値が「オン」または「真」であるエッジ）の総数であり、Ｔは、使用の閾値である）であり得る。一部の実施形態において、Ｔは、グラフにおいて使用されるエッジの数の予想される値＋グラフにおいて使用されるエッジの数の標準偏差である。
【０１０７】
アイソフォームの数の演繹的確率分布を使用する方法の適用により、ＤＡＧにマップされているリードがプッシュされて、演繹的分布に近づく分布がもたらされる。
【０１０８】
８．挿入サイズをより有効に使用して、アイソフォーム確率を推測する
２つのエクソンＥ１およびＥ２が、異なるアイソフォームにおいて発生し、これらは、これら２つのアイソフォームにおいて距離Ｌ１およびＬ２だけ離れていると仮定する。一方のメートがＥ１にマップし、他方がＥ２にマップするペアエンドリードのペアが得られることが起こる場合もある。次に、いずれのアイソフォームがこのペアに起因するかに関する選択は、Ｌ１またはＬ２（あるいはエクソンのエッジからのメートのオフセットを考慮して適切な量だけシフトさせられたこれらの距離のうちの一つ）のいずれが、リード間の真の距離であるかを推測する問題に帰着させることができる。
【０１０９】
我々は通常、ペアエンドシーケンシングランにおける挿入サイズの分布に関する優れたバックグラウンド情報を有するため、アイソフォーム割り当ての問題を挿入サイズに関する疑問に置き換えることは、有用である。通常、リードが、一方のアイソフォームまたは他方から得られた可能性がより高いと考える他の理由がないことを考慮して、我々は、単純Ｂａｙｅｓｉａｎ計算を行って、分布における挿入サイズＬ１およびＬ２の確率の比に従って、２つのアイソフォームにリードを確率的に割り当てることができる。
【０１１０】
これは、一般に、この場合、リードが、この２つのアイソフォームについて等しい証拠的重みを保有するものとみなす、現在の技法に対する顕著な改善である。記載されている方法で挿入サイズを組み入れることは、したがって、関連する証拠を無視することのない方法である。
【０１１１】
よって、我々は、このような漠然とした事例において次の通りに、アイソフォームをカウントすることができる：
（１）挿入サイズの確率分布を計算する（Ｐ（ｓ）により、挿入サイズｓを有するリードの確率を表す）。これは、１回のみ計算される必要があり、前処理ステップにおいて行うことができることに留意されたい。
（２）２つのペアエンドメートのそれぞれが、エクソンの内側にマップされる場合：
（２ａ）これらのエクソンを含む全アイソフォームのリストを作成する。
（２ｂ）各アイソフォームに、そのアイソフォームに由来するリードによって暗示される挿入サイズを関連付ける。
（２ｃ）（２ｂ）において計算された挿入サイズのそれぞれのＰ（ｓ）を計算する。
（２ｄ）各アイソフォームに、（２ｃ）において計算された全Ｐ（ｓ）値の和で割ったＰ（ｓ）の関連値を関連付ける。
【０１１２】
本明細書に記載されている技法が、「下流」のツール、すなわち、リードカウントをインプットとみなし、他の有用なアウトプットを与えるツールを使用する能力に影響を与えない方法で、アイソフォームのリードカウントを改善することが認められる。
【０１１３】
９．「最大ＤＡＧ」の構築
一部の実施形態において、ＤＡＧにおけるノードの全ペアが、「より初期」または「左側」のエクソンを表すノードから「より後期」または「右側」のエクソンへと向かうエッジにより接続されたＤＡＧを構築することが有益であり得る。
【０１１４】
Ｇｅｎｃｏｄｅまたは同様のアノテートされたトランスクリプトームを使用して、エクソンおよび他の特徴を表すためのノードが創出される。Ｇｅｎｃｏｄｅは、これらのノードに、ノードの配列、参照配列においてそれが占有する位置（およびしたがってその長さ）などの情報を関連付けるのに十分な情報を提供する。よって、非一過性メモリに連結されたプロセッサーを含むコンピュータシステムを使用して、ゲノム由来の複数の特徴のそれぞれが、ノードとして表される。複数の特徴のペアごとに、ペアの２つのメンバーをそれらの近位端によって接続するエッジが創出される。かかる動きの生物学的解釈は、ゲノムにおいて現れる順序を順守するエクソンの全組合せを表すアイソフォームの存在を推量することまたは少なくともその発見を容易にすることである。エクソンがゲノムに現れる順序を順守することが賢明であるという帰納的理由および生化学的理由の両方が存在する。
【０１１５】
例えば、報告は、多重エクソンプレｍＲＮＡにおけるエクソンの順序が常に維持されていることを示唆する。例えば、Ｂｌａｃｋ、２００５年、Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｓｗｅｒ  ｆｏｒ  ａ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｃｏｎｕｎｄｒｕｍ、ＰＮＡＳ  １０２巻：４９２７〜８頁を参照されたい。いかなる特定の機序にも制約されないが、スプライシング機構が、イントロンの開始および終了ならびに分岐点アデニンまたはスプライス接合部と近位の他の保存された配列を認識すると理論化され得る。スプライシング機構またはスプライソソームは、プレｍＲＮＡに沿って５’から３’へと移動し、イントロンを除去し、エクソンをスプライシングする。よって、ゲノムＤＮＡ鎖に沿って現れる５’から３’の順序で、あらゆるエクソンを接続することについて現象学的および文献の支持が存在するように思われる。Ｓｈａｏら、２００６年、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｅｘｏｎ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ，  ｅｘｏｎ  ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓ−ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２２巻：６９２〜６９８頁も参照されたい。ある特定の仮説について、本発明の方法は、ヒトプレｍＲＮＡが、ゲノム配列によって定義されるエクソンの順序を保持する線形分子にスプライスされるという仮説に従う。
【０１１６】
加えて、有向非巡回データ構造においてエクソンスクランブリングの事例を含むことが望ましい場合（例えば、Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９８５年、Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｏｃｃｕｒｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ、Ｎａｔｕｒｅ  ３１３巻：６４〜６７頁を参照）、「フィクション（ｆｉｃｔｉｏｎ）」として重複エクソンを含むことにより、エクソンがその本来の順序でスプライスされるという仮説を実質的に維持することができる（またはその代わりに、仮説を放棄することができる）。
【０１１７】
したがって、例えば、ゲノムが、次のエクソンを次の順序で含む場合：ＡＢＣＤＥＦＧＨＩ、
ダッシュ記号をエッジとして、文字をノードとして使用して、エッジの完全セットを次によって表すことができる：
Ａ−Ｃ；Ａ−Ｄ；Ａ−Ｅ；Ａ−Ｆ；Ａ−Ｇ；Ａ−Ｈ；Ａ−Ｉ；Ｂ−Ｃ；Ｂ−Ｄ；Ｂ−Ｅ；Ｂ−Ｆ；Ｂ−Ｇ；Ｂ−Ｈ；Ｂ−Ｉ；Ｃ−Ｄ；Ｃ−Ｅ；Ｃ−Ｆ；Ｃ−Ｇ；Ｃ−Ｈ；Ｃ−Ｉ；Ｄ−Ｅ；Ｄ−Ｆ；Ｄ−Ｇ；Ｄ−Ｈ；Ｄ−Ｉ；Ｅ−Ｆ；Ｅ−Ｇ；Ｅ−Ｈ；Ｅ−Ｉ；Ｆ−Ｇ；Ｆ−Ｈ；Ｆ−Ｉ；Ｇ−Ｈ；Ｇ−Ｉ
これが、１種を除く全アイソフォームの発見に適切であることを立証し、この１種のアイソフォームが、例としてＡＤＥＨＧである場合、
非巡回データ構造に、人為的またはフィクションのＧ（これをＧ’と呼ぶ）を「スパイク」することができる。そして、このアイソフォームは、Ａ−Ｄ−Ｅ−Ｈ−Ｇ’によって表すことができ、構造は、ＨからＧへのいかなるエッジも含む必要はない。しかし、エクソンスクランブリングが無視され、ゲノムエクソンの順序が、あらゆる含まれるエッジによって維持され得ることが判明し得る。
【０１１８】
本発明のＤＡＧは、まず、アノテートされたトランスクリプトーム由来のインプットデータを使用することにより調製することができる。このような場合、最初から、ＤＡＧは、あらゆる公知のアイソフォームを含む。最大ＤＡＧが作成される場合、ＤＡＧは、ゲノムエクソンの順序を維持するあらゆる可能なエッジを含み、よって、公知および新規アイソフォームの両方を表すノードおよびエッジを含む。ノードおよびエッジは、有向非巡回データ構造としてメモリに保存され、本方法は、エッジのサブセットによって接続された特徴のサブセットを含むパスにペアエンド配列リードをアラインし、これにより、パスに対応するアイソフォームを同定するステップを含む。
【０１１９】
新たなデータが、ＤＡＧにアラインされる場合（例えば、ペアエンドＲＮＡ−Ｓｅｑリード）、これらのデータは、アノテートされた参照において同定されたことがないエクソンを含むことができる。このエクソンは、この例では新規であるため、そのアイソフォームも新規である。新規アイソフォームを既存のＤＡＧにアラインすることは、ＤＡＧにおける新たなノードの創出を導いて、新規エクソンを表すこともできるため、参照としてのＤＡＧの使用は、この状況に理想的に適する。よって、同定されたアイソフォームが新規である場合、転写物配列のアラインは、有向非巡回データ構造における新たなノードの創出を伴うことができる。新たなノードは、例えば、１つのエクソンが、別のエクソンと単一のコドンだけ異なるスプライス変異体のために創出することもできる。
【０１２０】
好ましくは、最大ＤＡＧは、ペアエンドリードの解析に先立ち、それと無関係に、最初に建設される（全体または部分的に）。よって、本方法は、転写物をアラインする前に、複数の特徴のペアごとにエッジを創出するステップを含むことができる。有向非巡回データ構造の性質に関する理由のため、データ構造において表される参照は、任意の大きさ、例えば、数百または数千のエクソン、イントロンまたはその両方であり得る。
【０１２１】
１０．本発明のシステム
図１０は、本明細書に記載されている方法論の実行に有用なコンピュータシステム４０１を図示する。本発明のシステムは、図１０に示すコンポーネントのうちいずれか１つまたはいずれかの数を含むことができる。一般に、システム４０１は、ネットワーク４１５を介して互いに通信することができる、コンピュータ４３３およびサーバーコンピュータ４０９を含むことができる。加えて、データは、データベース４０５（例えば、ローカルのまたは離れた）から任意選択で得ることができる。一部の実施形態において、システムは、配列リードの初期処理のためのシーケンサーコンピュータ４５１に連結することができる、シーケンシングデータを得るための機器４５５を含む。
【０１２２】
一部の実施形態において、方法は、並列処理により行われ、サーバー４０９は、並列アーキテクチャを有する複数のプロセッサー、すなわち、複数の配列（例えば、ＲＮＡ−Ｓｅｑリード）を参照配列構築物（例えば、ＤＡＧ）と比較することができるプロセッサーおよびストレージの分布したネットワークを含む。本システムは、複数のリードと参照配列構築物の間の複数の比較を同時に実行する複数のプロセッサーを含む。ハイブリッドコンフィギュレーションも可能であるが、並列コンピュータ内のメインメモリは、単一のアドレス空間内の全ての処理エレメント間で共有されているか、または分散されている、すなわち、各処理エレメントが、それ固有のローカルアドレス空間を有することが典型的である。（分散型メモリとは、メモリが論理的に分散されているという事実を指すがまた、それが、物理的に分散されていることもしばしば示唆する）。処理エレメントが、それ固有のローカルメモリおよび非ローカルプロセッサー上のメモリへのアクセスを有する場合、分散共有メモリおよびメモリの視覚化は、２つの手法を組み合わせる。ローカルメモリへのアクセスは、非ローカルメモリへのアクセスより速いことが典型的である。
【０１２３】
メインメモリの各エレメントに、等しい待ち時間およびバンド幅でアクセスしうる、コンピュータアーキテクチャは、ユニフォームメモリアクセス（ＵＭＡ：Ｕｎｉｆｏｒｍ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ａｃｃｅｓｓ）システムとして公知である。ＵＭＡは、メモリが物理的に分散されていない、共有メモリシステムだけにより達成しうることが典型的である。この特性を有さないシステムは、非ユニフォームメモリアクセス（ＮＵＭＡ：Ｎｏｎ−Ｕｎｉｆｏｒｍ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ａｃｃｅｓｓ）アーキテクチャとして公知である。分散型メモリシステムは、非ユニフォームメモリアクセスを有する。
【０１２４】
プロセッサー間通信およびプロセッサー−メモリ間通信は、共有（マルチポート型またはマルチプレックス型）メモリ、クロスバースイッチ、共有バス、またはスター、リング、ツリー、ハイパーキューブ、ファットハイパーキューブ（ノードにおいて複数のプロセッサーを伴うハイパーキューブ）、またはｎ次元メッシュを含む無数のトポロジーを有する相互接続ネットワークを介する方式を含む、複数の方式で、ハードウェア内に実装することができる。
【０１２５】
相互接続されたネットワークに基づく並列コンピュータは、直接的に接続されていないノード間のメッセージの送受信を可能とする経路決定を組み込まなければならない。プロセッサー間の通信に使用される媒体は、大型のマルチプロセッサーマシン内で階層的である可能性が高い。このようなリソースは、市販されていて購入して専用で使用するか、または「クラウド」、例えば、アマゾンクラウドコンピューティングを介して、これらのリソースにアクセスすることができる。
【０１２６】
コンピュータは一般に、バスを介してメモリおよび入力−出力（Ｉ／Ｏ）機構へと連結されたプロセッサーを含む。メモリは、ＲＡＭまたはＲＯＭを含むことが可能であり、少なくとも１つの有形の非一時的媒体であって、システムが、本明細書で記載される機能を果たすようにさせる実行可能な命令を保存する媒体を含むことが好ましい。当業者であれば、本発明の方法の実施に必要であるかまたは最適であると認識する通り、本発明のシステムは、バスを介して互いに通信する、１または複数のプロセッサー（例えば、中央処理装置（ＣＰＵ）、グラフィックプロセッサユニット（ＧＰＵ）など）、コンピュータ読取り型記憶デバイス（例えば、メインメモリ、スタティックメモリなど）、またはこれらの組合せを含む。
【０１２７】
プロセッサーは、当技術分野で公知の、任意の適切なプロセッサーであって、Ｉｎｔｅｌ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）により、ＸＥＯＮ  Ｅ７という商標で販売されているプロセッサー、またはＡＭＤ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）により、ＯＰＴＥＲＯＮ  ６２００という商標で販売されているプロセッサーなどのプロセッサーでありうる。
【０１２８】
本発明に従う入力／出力デバイスは、ビデオディスプレイユニット（例えば、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）またはブラウン管（ＣＲＴ）モニター）、英数字入力デバイス（例えば、キーボード）、カーソル制御デバイス（例えば、マウスまたはトラックバッド）、ディスクドライブユニット、信号発生器（例えば、スピーカー）、タッチスクリーン、加速度計、マイクロフォン、セルラー式ラジオ波アンテナ、および、例えば、ネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ）、Ｗｉ−Ｆｉカード、またはセルラー式モデムでありうる、ネットワークインターフェースデバイスを含みうる。
参照による組込み
【０１２９】
本開示を通して特許、特許出願、特許公開、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツなど、他の文献に対する言及および引用を行ってきた。全てのこのような文献は、参照によりそれらの全体において全て目的で本明細書に組み込まれる。
同等物
【０１３０】
当業者には、本明細書で示され、記載される実施形態に加えて、本発明の多様な改変およびその多くのさらなる実施形態も、本明細書で引用される研究文献および特許文献への言及を含む、本明細書の全内容から明らかとなろう。本明細書における対象物は、その多様な実施形態における本発明およびその同等物の実施に適応させうる、重要な情報、例示、および指針を含有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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