(57)【要約】  本発明は、カルバＮＡＤＨベースの第１蛍光団の酸化型および４４５〜５４０ｎｍの波長で励起可能であり、５６０ｎｍより大きい発光極大を有する第２蛍光団を含む、分子内蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に有用である化合物、ならびにそれに関連する方法、キットおよび組成物に関する。【選択図】  図２
2016528175.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）カルバＮＡＤＨベースの第１蛍光団の酸化型、および、
（２）４４５〜５４０ｎｍの波長を有する光で励起可能であり、５６０ｎｍより大きい発光極大を有する第２蛍光団、
を含む化合物であって、該カルバＮＡＤＨベースの第１蛍光団および該第２蛍光団が共有結合的に連結されている化合物。
【請求項２】
（１）カルバＮＡＤＨベースの第１蛍光団の還元型、および、
（２）４４５〜５４０ｎｍの波長を有する光で励起可能であり、５６０ｎｍより大きい発光極大を有する第２蛍光団、
を含む化合物であって、該カルバＮＡＤＨベースの第１蛍光団および該第２蛍光団が共有結合的に連結されている化合物。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物であって、
（ａ）該第１および第２蛍光団の間の距離が１．５〜５ｎｍであり、
および／または、
（ｂ）該化合物が以下：
（ｉ）カルバＮＡＤＨベースの第１蛍光団の酸化型、および、
（ｉｉ）４４５〜５４０ｎｍの波長を有する光で励起可能であり、５６０ｎｍより大きい発光極大を有する第２蛍光団、および、
（ｉｉｉ）２５原子以下の長さを有するリンカー分子、
からなり、および／または、
（ｃ）該第１蛍光団の酸化型がカルバＮＡＤであり、
および／または、
（ｄ）該カルバＮＡＤＨベースの第１蛍光団の酸化型が式ＩＩのカルバＮＡＤＨベースの第１蛍光団であり：
【化１】
2016528175.tif 000006
式中、
ＱはＮＲ１Ｒ２であり、ここでＲ１およびＲ２は独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル基およびＣ１〜Ｃ１２アルキニル基から選択され、場合によりここで該アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基の１個以上の炭素原子はＯ、ＮまたはＳにより置換されており、および／または、
場合によりここで前記のＣ１〜Ｃ１２アルキル、アルケニルもしくはアルキニル基は＝Ｏ、−ＯＨ、−ＳＨ、＝ＳもしくはＣ１〜Ｃ４アルキルにより置換されており、ここで場合により該アルキル基の１個以上の炭素原子はＯ、ＮもしくはＳにより置換されており、そして、
ＪはＨ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル基およびＣ１〜Ｃ１２アルキニル基から選択され、場合によりここで該アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基の１個以上の炭素原子はＯ、ＮもしくはＳにより置換されており、および／または場合によりここで前記のＣ１〜Ｃ１２アルキル、アルケニルもしくはアルキニル基は＝Ｏ、−ＯＨ、−ＳＨ、＝ＳもしくはＣ１〜Ｃ４アルキルにより置換されており、ここで場合により該アルキル基の１個以上の炭素原子はＯ、ＮもしくはＳにより置換されており、特にここでＪおよびＱの一方は２５原子以下の長さを有するリンカー分子を介して該第２蛍光団に連結されており、そして、
Ｔは水素原子またはホスフェート基であり、
特にここでＱはＮ−（６−“ｃｙ３”アミノヘキシル）カルバモイルメチルにより置換されている、
前記化合物。
【請求項４】
請求項２に記載の化合物であって、
（ａ）該第１および該第２蛍光団の間の距離が１．５〜５ｎｍであり、
および／または、
（ｂ）該化合物が以下：
（ｉ）カルバＮＡＤＨベースの第１蛍光団の還元型、および、
（ｉｉ）４４５〜５４０ｎｍの波長を有する光で励起可能であり、５６０ｎｍより大きい発光極大を有する第２蛍光団、および、
（ｉｉｉ）２５原子以下の長さを有するリンカー分子、
からなり、および／または、
（ｃ）該第１蛍光団の還元型がカルバＮＡＤＨであり、
（ｄ）該カルバＮＡＤＨベースの第１蛍光団の還元型が式ＩＩＩのカルバＮＡＤＨベースの第１蛍光団であり：
【化２】
2016528175.tif 000007
式中、
ＱはＮＲ１Ｒ２であり、ここでＲ１およびＲ２は独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル基およびＣ１〜Ｃ１２アルキニル基から選択され、場合によりここで該アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基の１個以上の炭素原子はＯ、ＮもしくはＳにより置換されており、および／または、
場合によりここで前記のＣ１〜Ｃ１２アルキル、アルケニルもしくはアルキニル基は＝Ｏ、−ＯＨ、−ＳＨ、＝ＳもしくはＣ１〜Ｃ４アルキルにより置換されており、ここで場合により該アルキル基の１個以上の炭素原子はＯ、ＮもしくはＳにより置換されており、そして、
ＪはＨ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル基およびＣ１〜Ｃ１２アルキニル基から選択され、場合によりここで該アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基の１個以上の炭素原子はＯ、ＮもしくはＳにより置換されており、および／または場合によりここで前記のＣ１〜Ｃ１２アルキル、アルケニルもしくはアルキニル基は＝Ｏ、−ＯＨ、−ＳＨ、＝ＳもしくはＣ１〜Ｃ４アルキルにより置換されており、場合によりここで該アルキル基の１個以上の炭素原子はＯ、ＮもしくはＳにより置換されており、特にここでＪおよびＱの一方は２５原子以下の長さを有するリンカー分子により該第２蛍光団に連結されており、そして、
Ｔは水素原子またはホスフェート基であり、
特にここでＱはＮ−（６−“ｃｙ３”アミノヘキシル）カルバモイルメチルで置換されている、
前記化合物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物であって、該第２蛍光団がコアとして２−［３−（１，３−ジヒドロ−１，３，３−トリメチル−２Ｈ−インドール−２−イリデン）−１−プロペン−１−イル］−１，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウム−発色団部分、５，６−ジクロロ−２−［３−（５，６−ジクロロ−１，３−ジヒドロ−１，３−ジメチル−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イリデン）−１−プロペン−１−イル］−１，３−ジメチル−１Ｈ−ベンズイミダゾリウム発色団部分、１−メチル−４−［３−（１−メチル−４（１Ｈ）−キノリニリデン）−１−プロペン−１−イル］−キノリニウム発色団部分、および２−（４−（ジエチルアミノ）−２−ヒドロキシフェニル）−４−（４−（ジエチルイミニオ）−２−ヒドロキシシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−３−オキソシクロブタ−１−エノレート発色団部分からなる群から選択される発色団を含む、前記化合物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物であって、該第２蛍光団が“Ｃｙ３”（＝２−［３−（１，３−ジヒドロ−１，３，３−トリメチル−２Ｈ−インドール−２−イリデン）−１−プロペン−１−イル］−１，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウム）部分を含む、前記化合物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物であって、以下：
（ｉ）Ｎ６−［Ｎ−（６−“Ｃｙ３”アミノヘキシル）カルバモイルメチル］カルバＮＡＤＨ、または、
（ｉｉ）Ｎ６−［Ｎ−（６−“Ｃｙ３”アミノヘキシル）カルバモイルメチル］カルバＮＡＤ、または、
（ｉｉｉ）Ｎ６−［Ｎ−（６−“Ｃｙ３”アミノヘキシル）カルバモイルメチル］カルバＮＡＤＨおよびＮ６−［Ｎ−（６−“Ｃｙ３”アミノヘキシル）カルバモイルメチル］カルバＮＡＤの混合物、
からなる群から選択される、前記化合物。
【請求項８】
以下：
（ａ）請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物、および、
（ｂ）ＮＡＤ（Ｈ）依存性オキシドレダクターゼ、
を含むキット。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物、または請求項８に記載のキットの使用であって、
（ａ）試料中の分析物の量または濃度を決定するための、および／または、
（ｂ）ＦＲＥＴ試薬としての、
前記使用。
【請求項１０】
ＮＡＤ（Ｈ）依存性オキシドレダクターゼおよび発蛍光性補酵素の酸化型を用いて試料中の分析物を決定するための方法であって、該方法が以下の工程：
（ａ）ＮＡＤ（Ｈ）依存性オキシドレダクターゼおよび発蛍光性補酵素の酸化型を該試料と混合する工程、それにより、
（ｂ）該分析物をＮＡＤ（Ｈ）依存性オキシドレダクターゼおよび発蛍光性補酵素の酸化型を含む試薬系と反応させる工程、
（ｃ）該還元された補酵素の蛍光放射を測定する工程、
を含み、前記の発蛍光性補酵素が以下：
（１）ＮＡＤＨベースの第１蛍光団、および、
（２）４４５〜５４０ｎｍの波長を有する光により励起可能であり、５６０ｎｍより大きい発光極大を有する第２蛍光団、
を含む化合物である、
前記方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、
（ａ）該発蛍光性補酵素の酸化型における変化が請求項１０の工程（ｂ）において生成され、特に、
（ｉ）該発蛍光性補酵素の酸化型における前記の変化が還元であり、および／または、
（ｉｉ）該補酵素における前記の変化が該分析物の量および／または濃度と相関しており、
および／または、
（ｂ）請求項１０の方法の後に、該発蛍光性補酵素の蛍光放射に基づいて該分析物の量および／または濃度を決定し、
および／または、
（ｃ）該発蛍光性補酵素が請求項１、３および５〜７のいずれか１項に記載の化合物またはＮＡＤＨである、
前記方法。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の方法であって、
（ａ）該分析物がグルコース、グルコース−６−リン酸、コレステロール、グリセロール、グリセロールリン酸、ラクテート、３−ヒドロキシ酪酸などのケトン類、グルタメートなどのＬ−アミノ酸、マレエート、エタノール、ホルムアルデヒドおよびソルビトールからなる群から選択され、より好ましくはグルコースであり、および／または、
（ｂ）第３蛍光体が内部蛍光標準として用いられ、かつ前記の第３蛍光体の発光波長が該第２蛍光団の発光波長から最低でも１００ｎｍ、好ましくは１４０ｎｍより大きく隔てられており、より好ましくは前記の第３蛍光体の発光波長が６６０〜９００ｎｍである方法。
【請求項１３】
以下：
（ａ）請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物、または請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の発蛍光性補酵素、および、
（ｂ）場合によりＮＡＤ（Ｈ）依存性オキシドレダクターゼ、および、
（ｃ）場合によりさらなる試薬、
を含むキット。
【請求項１４】
さらに第３蛍光体を含む請求項８または１３に記載のキットであって、前記の第３蛍光体の発光波長が該第２蛍光団の発光波長から最低でも１００ｎｍ、好ましくは１４０ｎｍより大きく隔てられている、前記キット。
【請求項１５】
請求項１４に記載のキットであって、該第３蛍光体の発光波長が６６０〜９００ｎｍである、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルバＮＡＤＨ（ｃａｒｂａＮＡＤＨ）ベースの第１蛍光団の酸化型および約４４５〜約５４０ｎｍの波長で励起可能であり約５６０ｎｍより大きい発光極大を有する第２蛍光団を含む、分子内蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に有用である化合物、ならびにそれに関連する方法、キットおよび組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの生体分析法は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）の酸化状態に基づいている。ＮＡＤは、多数の環状構造を有し、それはそのニコチンアミド環内で酸化還元反応を起こす。密接に関連するＮＡＤＰ分子は、アデノシンのリボース環の２’位においてリン酸化されている。
【０００３】
ＮＡＤおよびＮＡＤＰは、水素化物イオンの形式的付加（ｆｏｒｍａｌ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）により可逆的に還元されることができ、両方の分子は可逆反応において補酵素として作用する。従って、ＮＡＤおよびＮＡＤＨに基づく酵素反応は蛍光分析を受け入れられる。
【０００４】
多くのオキシドレダクターゼ酵素は、これらの補因子を用いて分子間で水素基を移すことができる。これらの分子の還元型はそれらの光を吸収する能力においてそれらの酸化型と異なるため、反応は３４０ｎｍにおける光吸収に基づいて、または４４５ｎｍにおける光の蛍光放射により定量化されてきた。
【０００５】
酵素的デヒドロゲナーゼ反応は、ＮＡＤおよびＮＡＤＰの還元型は３４０ｎｍの波長における光を吸収するが酸化型は吸収しない特性を利用することができる。同様に、還元型は３４０ｎｍで励起された際に４４５ｎｍにおいて蛍光放射することができるが、酸化型はできない。これらの特性は、これらの補因子の酸化状態の変化を直接含む反応の定量化を可能にする。例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼは、アデノシン三リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐａｔｅ）（ＡＴＰ）の存在下でのＮＡＤのＮＡＤＨからの形成を触媒するために用いられ、アデノシン三リン酸の濃度は蛍光強度における減少として測定され得る（米国特許第４，４４６，２３１号および第４，７３５，８９７号）。
【０００６】
オキシドレダクターゼは血糖値の定量的測定においても極めて一般的であり、例えば欧州特許第０  ２９３  ７３２Ａ２号、米国特許出願公開第２００５／０２１４８９１  Ａ１号、および米国特許出願公開第２００６／０００３３９７号を参照。これらの刊行物の全てが、グルコースの測定のための類似の試験プロトコルを記載しており、ここで酵素−補酵素対であるグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧｌｕｃＤＨ）／ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を含有する試薬系が用いられている。ＧｌｕｃＤＨの作用の際に、水素化物イオンが、グルコースからＮＡＤに、ＮＡＤＨが形成されるように移される。結果として生じるＮＡＤＨの量は、グルコースの濃度に直接相関している。ＮＡＤＨは強い蛍光体であり、その濃度は蛍光強度の測定により決定され得る。試料中の分析物濃度は、典型的には測定された蛍光強度を既知の分析物濃度を用いて得られた較正曲線に対して関連付けることにより決定される。
【０００７】
明らかに、生化学分析のための酵素に基づく測定系は、臨床的に関連する分析法の重要な構成要素である。これは主に、酵素の助けにより直接または間接的に決定される分析物、例えば代謝産物または基質の測定に関する。分析物は、酵素−補酵素複合体の助けにより変換され、続いて定量化される。このプロセスにおいて、決定されるべき分析物は適切な酵素および補酵素と接触させられ、ここで酵素は通常は触媒量で用いられる。補酵素は、酵素反応により変化し、例えば酸化または還元される。このプロセスは、例えば光度測定的に決定され得る。較正は、測定された値および決定されるべき分析物の濃度の間の直接相関を提供する。
【０００８】
補酵素は、酵素に共有結合的または非共有結合的に結合しており、分析物の変換により変化する有機分子である。補酵素の有名な例は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）であり、それからＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨがそれぞれ還元により形成される。
【０００９】
先行技術から既知の多くのオキシドレダクターゼベースの測定系は、限られた貯蔵寿命を有し、十分な保管寿命を達成するための冷却または乾燥保管のような注意深い取り扱いを必要とする。従って、不正確な気付かれない不完全な保管により引き起こされる間違った結果が起こり得る。特に、一次包装の開封および長期の使用期間による乾燥剤の消耗は、結果として測定誤差をもたらし得る。
【００１０】
そのような酵素に基づく測定系の必須の構成要素、すなわち酵素および補酵素は、両方ともそのような限られた安定性に独立して寄与し得る。例えば、ＮＡＤおよびＮＡＤＰのような補酵素は、かなり不安定であることが知られている。
【００１１】
ＮＡＤおよびＮＡＤＰは両方とも塩基不安定性分子であり、その分解経路は文献に記載されている（例えば、N.J.Oppenheimer in The Pyridine Nucleotide Coenzymes Academic Press, ニューヨーク、ロンドン1982, J. Everese, B. Anderson, K. Yon, 編者, 第３章、56-65ページ参照）。本質的に、ＡＤＰ−リボースは、ＮＡＤまたはＮＡＤＰの分解の間にリボースおよびピリジン単位の間のグリコシル結合の開裂により形成される。還元型であるＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨは酸不安定性であり；例えばエピマー化が既知の分解経路である。
【００１２】
ＮＡＤ／ＮＡＤＰの、およびＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨの不安定性は、リボースおよびピリジン単位間のグリコシル結合の易変性によるものである。しかし、水溶液中のように強烈ではない条件下でさえも、補酵素ＮＡＤおよびＮＡＤＰは周囲の湿気のみにより既に加水分解されている可能性がある。
【００１３】
カルバＮＡＤはＮＡＤに対する類似体であり、ここでリボースがカルバ環状糖単位により置換されている。カルバＮＡＤ（またはカルバ−ＮＡＤ）は、以下の構造（Ｉ）を有する。
【００１４】
【化１】
2016528175.tif 000003
【００１５】
しかし、より安定な補酵素であるカルバＮＡＤを用いた場合でさえも、以下の問題を含む数々の極めて根本的な問題が蛍光強度の測定に関連する：
蛍光強度測定に基づく測定に関する誤差の１つの重要な原因は、自然環境から検出器へと到達して非特異的なシグナルを引き起こし得る非特異的な光に由来する。
【００１６】
測定される蛍光の強度は、蛍光体の量の関数であるだけではない。むしろ、それは試料中のその分子環境によっても著しく影響を受ける。蛍光という用語の下に要約される特定のプロセスにおいて、消光は測定における誤差に寄与する。
【００１７】
分子の励起および光量子の放出の間で統計平均においておよそ数ナノ秒の時間が経過するため、分子の位置および配向が吸収および発光の間で変化し得る。干渉は、それからの結果に蛍光強度、特に温度依存性に関して影響を及ぼす。
【００１８】
蛍光は、一般に紫外光により励起される。電子的に励起された状態の光化学反応は、蛍光体の退色を引き起こし得る。これはさらなる誤差の原因である。
【００１９】
これに基づいて、特に記載された安定性の問題、測定誤差および干渉に関する向上した測定を可能にする方法を提案することが本発明の目的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】米国特許第４，４４６，２３１号
【特許文献２】米国特許第４，７３５，８９７号
【特許文献３】欧州特許第０  ２９３  ７３２Ａ２号
【特許文献４】米国特許出願公開第２００５／０２１４８９１  Ａ１号
【特許文献５】米国特許出願公開第２００６／０００３３９７号
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】N.J.Oppenheimer in The Pyridine Nucleotide Coenzymes Academic Press, ニューヨーク、ロンドン1982, J. Everese, B. Anderson, K. Yon, 編者、第３章、56-65ページ
【発明の概要】
【００２２】
本発明は、以下：
（１）カルバＮＡＤＨベースの第１蛍光団の酸化型および、
（２）４４５〜５４０ｎｍの波長を有する光で励起可能であり、５６０ｎｍより大きい発光極大を有する第２蛍光団、
を含む化合物であって、特にカルバＮＡＤＨベースの第１蛍光団および第２蛍光団が共有結合的に連結されている化合物に関する。
【００２３】
別の態様において、本発明は、試料中の分析物の濃度または量を決定するための蛍光ベースの方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、Ｎ６−［Ｎ−（６−“Ｃｙ３”−アミノヘキシル）カルバモイルメチル］カルバＮＡＤのＮ６−［Ｎ−（６−“Ｃｙ３”アミノヘキシル）カルバモイルメチル］カルバＮＡＤＨへの酵素的還元の反応混合物の、反応開始前（実線）および反応の完了（点線）の蛍光放射スペクトルを示す。スペクトルは、３６０ｎｍの励起波長を用いて、３７０ｎｍ〜７００ｎｍで記録された。
【図２】図２は、当該技術で既知であるようなＣｙ３の化学構造を示す。名称Ｃｙ３は、（示されているような）メチンの数に関し、側鎖は指定されなかった。従って、様々な構造が文献においてＣｙ３と呼ばれている。Ｒ基は同一でなくてもよい。一般的に用いられるような色素において、それらは短い脂肪族鎖であり、その一方または両方が高度に反応性の部分、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドまたはマレイミドで終わっている。
【図３】図３は、オキサカルボシアニン（Ｃ３）色素の構造（図３Ａ）ならびに消衰スペクトル（図３Ｂ）および発光スペクトル（図３Ｃ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、以下：
（１）カルバＮＡＤＨベースの第１蛍光団の酸化型および、
（２）４４５〜５４０ｎｍの波長を有する光で励起可能であり、５６０ｎｍより大きい発光極大を有する第２蛍光団、
を含む化合物であって、特にカルバＮＡＤＨベースの第１蛍光団および第２蛍光団が共有結合的に連結されている化合物に関する。
【００２６】
本発明の化合物は、例えば本記載において詳述されるような分子内蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法において特に有用である。
【００２７】
好ましい態様において、第２蛍光団の発光極大は５６０〜７５０ｎｍである。
【００２８】
別の好ましい態様において、第２蛍光団は４４５〜４７５ｎｍの波長を有する光により励起可能である。
【００２９】
好ましくは、カルバＮＡＤＨベースの第１蛍光団は、３００〜４００ｎｍ、好ましくは３６０〜３８０ｎｍ、より好ましくは３６５〜３８５ｎｍ、最も好ましくは３７０〜３８０ｎｍの波長を有する光により励起可能である。
【００３０】
カルバＮＡＤＨは、３６０ｎｍの波長を有する光により最大限に励起可能である。
【００３１】
カルバＮＡＤＨの発光極大は４６５ｎｍである。
【００３２】
ＦＲＥＴに関してそのような化合物を用いることは、蛍光ベースの方法におけるＮＡＤ由来の化合物の上記の欠陥を克服する。実施例において記載されるように、化合物Ｎ６−［Ｎ−（６−“Ｃｙ３”アミノヘキシル）カルバモイルメチル］カルバＮＡＤＨは、ＦＲＥＴ法に有用であることが証明されている。“Ｃｙ３”は、図２において示されているような化合物のクラスを定めており、２−［３−［１−（ヘキサン−５−オイル）−１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−５−スルホ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］−１−プロペン−１−イル］−３，３−ジメチル−５−スルホ−１−（３−スルホフェニル）−３Ｈ−インドリウム構成要素（ｅｎｔｉｔｙ）とも呼ばれ、ここでヘキサノイル基のカルボニル基はアミノヘキシル基のアミノ基と連結されている。
【００３３】
用語“カルバＮＡＤＨベースの第１蛍光団”は、４００〜５７０ｎｍで蛍光を発するカルバＮＡＤ／カルバＮＡＤＨ酸化還元系に基づく化合物の還元型のみを示すために用いられる。酵素の基質は、通常は（カルバＮＡＤＨベースの第１蛍光団の酸化型とも呼ばれる）その酸化（カルバＮＡＤ）型の本発明に従う化合物または発蛍光性補酵素である。
【００３４】
本発明に従う化合物は、カルバＮＡＤ部分を含み、従ってニコチンアミド構成要素およびアデノシン構成要素をそれぞれ含む。ニコチンアミド構成要素は還元されて１，４−ジヒドロニコチンアミド構成要素になることができ、それは蛍光団として作用する。ニコチンアミド構成要素は常に未置換である。アデノシン構成要素の残りの原子は置換されていてよい。当業者には明らかであるように、そのような置換は対象の酵素反応と適合性でなければならない。そのような置換はThe pyridine nucleotide coenzymes. ニューヨーク州ニューヨーク: Academic Press Inc.; 1982. 第4章: B. M. Anderson Analogs of Pyridine Nucleotide Coenzmes pp. 91-134において列挙されている。好ましい置換基は、アデノシン構成要素の２’ＯＨ基上のホスフェート基であり、それは結果としてカルバＮＡＤＰ部分をもたらす。好ましくは、置換基はアデニン核酸塩基上にある（The pyridine nucleotide coenzymes. ニューヨーク州ニューヨーク: Academic Press Inc.; 1982. 第4章: B. M. Anderson Analogs of Pyridine Nucleotide Coenzmes pp. 103-104 表I 項目II A）。置換に関する最も好ましい位置は、アデニン核酸塩基のＮ６およびＣ８である。Ｎ６およびＣ８における適切な置換基は、独立してＣ１〜Ｃ１２アルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり、それは場合により１個以上のＯ、Ｎおよび／またはＳ原子により遮られており、ここで前記のＣ１〜Ｃ１２アルキル、アルケニルまたはアルキニル基は場合により＝Ｏ、−ＯＨ、−ＳＨ、＝Ｓ、またはＣ１〜Ｃ４アルキルで置換されており、そのアルキルは場合により１個以上のＯ、ＮまたはＳ原子により置換されているかまたは遮られており、ここで好ましくはＮ６またはＣ８の一方は２５原子以下の長さを有するリンカー分子を介して第２蛍光団に連結されている。カルバＮＡＤベースの部分はカルバＮＡＤ部分として理解されており、それは場合により上記で定義されたように置換されている。
【００３５】
カルバＮＡＤＨの酸化型、すなわちカルバＮＡＤは、上記の式（Ｉ）の構造を有する。
【００３６】
好ましい態様において、カルバＮＡＤＨベースの第１蛍光団の酸化型は、式ＩＩのカルバＮＡＤＨベースの第１蛍光団であり：
【００３７】
【化２】
2016528175.tif 000004
【００３８】
式中、
ＱはＮＲ１Ｒ２であり、ここでＲ１およびＲ２は独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル基およびＣ１〜Ｃ１２アルキニル基から選択され、場合によりここでアルキル基、アルケニル基およびアルキニル基の１個以上の炭素原子はＯ、ＮもしくはＳにより置換されており、および／または、
場合によりここで前記のＣ１〜Ｃ１２アルキル、アルケニルもしくはアルキニル基は＝Ｏ、−ＯＨ、−ＳＨ、＝ＳもしくはＣ１〜Ｃ４アルキルにより置換されており、ここで場合によりそのアルキル基の１個以上の炭素原子はＯ、ＮもしくはＳにより置換されており、そして、
ＪはＨ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル基およびＣ１〜Ｃ１２アルキニル基から選択され、場合によりここでそのアルキル基、アルケニル基およびアルキニル基の１個以上の炭素原子はＯ、ＮもしくはＳにより置換されており、および／または場合によりここで前記のＣ１〜Ｃ１２アルキル、アルケニルもしくはアルキニル基は＝Ｏ、−ＯＨ、−ＳＨ、＝ＳもしくはＣ１〜Ｃ４アルキルにより置換されており、ここで場合によりそのアルキル基の１個以上の炭素原子はＯ、ＮもしくはＳにより置換されており、特にここでＪおよびＱの一方は２５原子以下の長さを有するリンカー分子を介して第２蛍光団に連結されており、そして、
Ｔは水素原子またはホスフェート基であり、特にここでＱはＮ−（６−“ｃｙ３”アミノヘキシル）カルバモイルメチルにより置換されている。
【００３９】
さらなる好ましい態様において、カルバＮＡＤＨベースの第１蛍光団および第２蛍光団は、例えばＮ６−［Ｎ−（６−“Ｃｙ３”アミノヘキシル）カルバモイルメチル］カルバＮＡＤＨに関するように、共有結合的に連結されている。
【００４０】
さらなる好ましい態様において、第１および第２蛍光団の間の距離は、１．５〜５ｎｍである。
【００４１】
さらなる好ましい態様において、化合物は、以下：
（ｉ）カルバＮＡＤＨベースの第１蛍光団の酸化型、および、
（ｉｉ）４４５〜５４０ｎｍの波長を有する光で励起可能であり、５６０ｎｍより大きい発光極大を有する第２蛍光団、および、
（ｉｉｉ）２５原子以下の長さを有するリンカー分子；
からなる。
【００４２】
Ｎ６−［Ｎ−（６−“Ｃｙ３”アミノヘキシル）カルバモイルメチル］カルバＮＡＤＨの場合、リンカーは構造−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）５−を有する。このリンカーは１６原子の長さを有する。
【００４３】
“Ｘ原子の長さを有するリンカー分子”は、２つの他の部分（ｉ）および（ｉｉ）を連結する直鎖中にＸ個の原子を有するリンカーとして理解される。
【００４４】
好ましいリンカーは、アルキレン、アルケニレン、またはアルキニレン構成要素であり、それは場合により１個以上のＯ、Ｎおよび／またはＳ原子により遮られており、ここで前記のアルキレン、アルケニレン、またはアルキニレン構成要素は場合により＝Ｏ、−ＯＨ、−ＳＨ、＝Ｓ、またはＣ１〜Ｃ４アルキル基で置換されており、そのアルキル基は場合により１個以上のＯ、ＮまたはＳ原子により置換されているかまたは遮られている。特に、リンカーは−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−部分、アミド基および／またはエーテル基を含んでいてよい。
【００４５】
好ましくは、リンカーは下記で定義されるカルバＮＡＤＨベースの第１蛍光団またはＮＡＤＨベースの第１蛍光団のアデニン部分のＮ６またはＣ８原子に連結されている。
【００４６】
さらに別の好ましい態様において、第１蛍光団はカルバＮＡＤＨである。従って、別の好ましい態様において、第１蛍光団の酸化型はカルバＮＡＤである。
【００４７】
“第１蛍光団はカルバＮＡＤＨである”は、本発明の化合物が第１蛍光団としてカルバＮＡＤＨ部分を有することとして理解される。
【００４８】
本発明に従う“蛍光団”は、室温においておよび水溶液中で蛍光を発することができる部分である。
【００４９】
さらに別の好ましい態様において、第２蛍光団は３６０ｎｍの波長において前記の第２蛍光団に関する最大吸収の５％未満の吸収を有する。より好ましい態様において、第２蛍光団は３６０ｎｍの波長において前記の第２蛍光団に関する最大吸収の３％未満の吸収を有する。
【００５０】
これは、第１蛍光団が励起される際に、第２蛍光団の不必要な直接励起が得られないか無視できる程度しか得られないことを確実にする。
【００５１】
第１蛍光団から第２蛍光団への効率的なエネルギー移動は、第１蛍光団の発光スペクトルおよび第２蛍光団の励起スペクトルのスペクトル重複がある場合に起こる。
【００５２】
本発明の化合物における、または本発明に従う方法における使用のための発蛍光性補酵素における適切な第２蛍光団に関する例は、コアとして以下の発色団からなる群から選択される発色団を含む蛍光団である：（“Ｃｙ３”中にあるような）２−［３−（１，３−ジヒドロ−１，３，３−トリメチル−２Ｈ−インドール−２−イリデン）−１−プロペン−１−イル］−１，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウム−発色団部分、５，６−ジクロロ−２−［３−（５，６−ジクロロ−１，３−ジヒドロ−１，３−ジメチル−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イリデン）−１−プロペン−１−イル］−１，３−ジメチル−１Ｈ−ベンズイミダゾリウム発色団部分、（ピナシアノール（ｐｙｎａｃｙｎｏｌ）中にあるような）１−メチル−４−［３−（１−メチル−４（１Ｈ）−キノリニリデン）−１−プロペン−１−イル］−キノリニウム発色団部分、および２−（４−（ジエチルアミノ）−２−ヒドロキシフェニル）−４−（４−（ジエチルイミニオ）−２−ヒドロキシシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−３−オキソシクロブタ−１−エノレート発色団部分（スクアリリウム色素）。これらの発色団は、それらは追加で１個以上の置換基を含むことができるため、コアと呼ばれ、ここでその置換基は、未置換の発色団と比較した場合に、置換された発色団の基本的な構造を変化させない。詳細には、その１個以上の置換基は、未置換の発色団に存在する１個以上の水素残基と置き換わる。典型的な置換基は、短いアルキル残基、例えばメチル、エチルもしくはプロピル、またはアルコキシ残基、例えばメトキシ、エトキシもしくはプロポキシを含むが、それらに限定されない。適切な発色団は、図２および３にも示されている。
【００５３】
当業者は、所与の色素の励起および発光スペクトルを記録することにより、さらなる適切な色素を選択することができる。
【００５４】
好ましい蛍光団は、（“Ｃｙ３”中にあるような）２−［３−（１，３−ジヒドロ−１，３，３−トリメチル−２Ｈ−インドール−２−イリデン）−１−プロペン−１−イル］−１，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウム−発色団部分または図２において示されているようなコアをコアとして含む。
【００５５】
Ｎ６−［Ｎ−（６−“Ｃｙ３”アミノヘキシル）カルバモイルメチル］カルバＮＡＤおよびその還元型は、実施例により示されるように、本発明の特に好ましい化合物である。
【００５６】
ＮＡＤＨ依存性オキシドレダクターゼを用いて、化合物の還元型を酸化型へと再生させることができる。従って、本発明は、さらなる観点において、本発明の化合物の還元型ならびに酸化型および還元型の混合物にも関する。
【００５７】
好ましい態様において、カルバＮＡＤＨベースの第１蛍光団の還元型は、式ＩＩＩのカルバＮＡＤＨベースの第１蛍光団であり：
【００５８】
【化３】
2016528175.tif 000005
【００５９】
式中、
ＱはＮＲ１Ｒ２であり、ここでＲ１およびＲ２は独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル基およびＣ１〜Ｃ１２アルキニル基から選択され、場合によりここでそのアルキル基、アルケニル基およびアルキニル基の１個以上の炭素原子はＯ、ＮもしくはＳにより置換されており、および／または、
場合によりここで前記のＣ１〜Ｃ１２アルキル、アルケニルもしくはアルキニル基は＝Ｏ、−ＯＨ、−ＳＨ、＝ＳもしくはＣ１〜Ｃ４アルキルにより置換されており、ここで場合によりそのアルキル基の１個以上の炭素原子はＯ、ＮもしくはＳにより置換されており、そして、
ＪはＨ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル基およびＣ１〜Ｃ１２アルキニル基から選択され、場合によりここでそのアルキル基、アルケニル基およびアルキニル基の１個以上の炭素原子はＯ、ＮもしくはＳにより置換されており、および／または場合によりここで前記のＣ１〜Ｃ１２アルキル、アルケニルもしくはアルキニル基は＝Ｏ、−ＯＨ、−ＳＨ、＝ＳもしくはＣ１〜Ｃ４アルキルにより置換されており、場合によりここでそのアルキル基の１個以上の炭素原子はＯ、ＮもしくはＳにより置換されており、特にここでＪおよびＱの一方は２５原子以下の長さを有するリンカー分子により第２蛍光団に連結されており、そして、
Ｔは水素原子またはホスフェート基であり、
特にここでＱはＮ−（６−“ｃｙ３”アミノヘキシル）カルバモイルメチルで置換されている。
【００６０】
好ましい態様において、本発明は、Ｎ６−［Ｎ−（６−“Ｃｙ３”アミノヘキシル）カルバモイルメチル］カルバＮＡＤＨ、Ｎ６−［Ｎ−（６−“Ｃｙ３”アミノヘキシル）カルバモイルメチル］カルバＮＡＤ、またはＮ６−［Ｎ−（６−“Ｃｙ３”アミノヘキシル）カルバモイルメチル］カルバＮＡＤおよびＮ６−［Ｎ−（６−“Ｃｙ３”アミノヘキシル）カルバモイルメチル］カルバＮＡＤＨの混合物にも関する。
【００６１】
さらに別の態様において、本発明は、以下：
（ａ）本発明のＦＲＥＴに有用な化合物、および、
（ｂ）ＮＡＤ（Ｈ）依存性オキシドレダクターゼ；
を含む試薬系（キットとも呼ばれる）に関する。
【００６２】
そのような試薬系またはキットは、試料中の分析物を決定するための方法において用いることができる。
【００６３】
本発明はさらに、本発明の化合物の、または本発明の試薬系の、または本発明のキットの、試料中の分析物の量および／または濃度を決定するための使用に関する。
【００６４】
本発明はさらに、本発明のＦＲＥＴに有用な化合物の、または本発明の試薬系の、または本発明のキットの、ＦＲＥＴ試薬としての使用に関する。
【００６５】
本発明はさらに、以下：
（ａ）本発明の化合物または本発明の方法の文脈において定義されるような発蛍光性補酵素、および、
（ｂ）場合によりＮＡＤ（Ｈ）依存性オキシドレダクターゼ、および、
（ｃ）場合によりさらなる試薬、
を含むキットに関する。
【００６６】
さらなる態様において、本発明は、ＮＡＤ（Ｈ）依存性オキシドレダクターゼおよび発蛍光性補酵素の酸化型を用いて試料中の分析物を決定するための方法に関し、その方法は以下の工程を含む：
（ａ）ＮＡＤ（Ｈ）依存性オキシドレダクターゼおよび発蛍光性補酵素の酸化型を試料と混合する工程、それにより、
（ｂ）分析物をＮＡＤ（Ｈ）依存性オキシドレダクターゼおよび発蛍光性補酵素の酸化型を含む試薬系と反応させる工程、
（ｃ）還元された補酵素の蛍光放射を測定する工程；
ここでその発蛍光性補酵素は、以下を含む化合物である：
（１）ＮＡＤＨベースの第１蛍光団、および、
（２）４４５〜５４０ｎｍの波長を有する光により励起可能であり、５６０ｎｍより大きい発光極大を有する第２蛍光団。
【００６７】
別の好ましい態様において、第２蛍光団は４４５〜４７５ｎｍの波長を有する光により励起可能である。
【００６８】
“ＮＡＤＨベースの蛍光団”は、ＮＡＤＨベースの部分、またはカルバＮＡＤＨベースの部分をそれぞれ含む蛍光団として理解される。
【００６９】
本発明の方法における使用のためのＮＡＤＨベースの部分の酸化型は、ＮＡＤ部分を含み、それは場合により置換されている。対応する還元されたＮＡＤＨベースの部分は、ＮＡＤＨの１，４−ジヒドロニコチンアミド部分を含み、それは蛍光団として作用し、その１，４−ジヒドロニコチンアミド部分は常に未置換である。ＮＡＤＨ部分の残りの原子は置換されていてよい。当業者には明らかであるように、そのような置換は対象の酵素反応と適合性でなければならない。好ましい置換基は、アデノシン構成要素の２’ＯＨ基上のホスフェート基であり、それは結果としてカルバＮＡＤＰ部分をもたらす。置換に関する好ましい他の位置は、アデニン核酸塩基のＮ６およびＣ８である。Ｎ６およびＣ８における適切な置換基は、独立してＣ１〜Ｃ１２アルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり、それは場合により１個以上のＯ、Ｎおよび／またはＳ原子により遮られており、ここで前記のＣ１〜Ｃ１２アルキル、アルケニルまたはアルキニル基は場合により＝Ｏ、−ＯＨ、−ＳＨ、＝Ｓ、またはＣ１〜Ｃ４アルキルで置換されており、そのアルキルは場合により１個以上のＯ、ＮまたはＳ原子により置換されているかまたは遮られている。より好ましくは、アデニン核酸塩基のＮ６またはＣ８の一方は、２５原子以下の長さを有するリンカー分子を介して第２蛍光団に連結されている。
【００７０】
さらなる好ましい態様において、発蛍光性補酵素は以下：
（ｉ）ＮＡＤＨベースの第１蛍光団、および、
（ｉｉ）４４５〜５４０ｎｍの波長を有する光で励起可能であり、５６０ｎｍより大きい発光極大を有する第２蛍光団、および、
（ｉｉｉ）２５原子以下の長さを有するリンカー分子、
からなる。
【００７１】
好ましくは、ＮＡＤＨベースの第１蛍光団は、３００〜４００ｎｍ、好ましくは３６０〜３８０ｎｍ、より好ましくは３６５〜３８５ｎｍ、最も好ましくは３７０〜３８０ｎｍの波長を有する光により励起可能である。
【００７２】
ＮＡＤＨは、３４０ｎｍの波長を有する光により励起可能である。
【００７３】
カルバＮＡＤＨは、３６０ｎｍの波長を有する光により最大限に励起可能である。
【００７４】
ＮＡＤＨおよびカルバＮＡＤＨの発光極大は、両方とも４６５ｎｍである。
【００７５】
ＮＡＤＨおよびカルバＮＡＤＨは、両方とも本発明に従う適切な第１蛍光団である。
【００７６】
従って、好ましい態様において、ＮＡＤＨベースの第１蛍光団は、ＮＡＤＨおよびカルバＮＡＤＨからなる群から選択される。より好ましい態様において、ＮＡＤＨベースの蛍光団は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、カルバＮＡＤＨおよびカルバＮＡＤＰＨから、さらにもっと好ましくはＮＡＤＨおよびカルバＮＡＤＰＨから選択され、最も好ましくはカルバＮＡＤＨである。
【００７７】
さらにもっと好ましい態様において、ＮＡＤＨベースの蛍光団の酸化型は、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、カルバＮＡＤおよびカルバＮＡＤＰから、さらにもっと好ましくはＮＡＤおよびカルバＮＡＤから選択され、最も好ましくはカルバＮＡＤである。そのような第１蛍光団の酸化型は、本発明の方法における使用のための発蛍光性酵素の酸化型中に存在する。
【００７８】
好ましい態様において、本発明に従う方法における使用のための発蛍光性補酵素およびその酸化型は、上記で記載された本発明の化合物である。
【００７９】
分子内蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を実施するために有用なそのような化合物は、以下：
（１）カルバＮＡＤＨベースの第１蛍光団の酸化型および、
（２）４４５〜５４０ｎｍの波長を有する光で励起可能であり、５６０ｎｍより大きい発光極大を有する第２蛍光団、
を含む。
【００８０】
上記でＮＡＤＨベースの部分またはカルバＮＡＤＨベースの部分を含む蛍光団に関してそれぞれ記載された好ましい態様は、本発明の方法にも適用される。
【００８１】
好ましくは、本発明の方法の後に、発蛍光性補酵素の蛍光放射に基づいて分析物の量および／または濃度を決定する。
【００８２】
方法の好ましい態様において、発蛍光性補酵素の酸化型における変化は、工程（ｂ）において生じる。
【００８３】
特に好ましい態様において、発蛍光性補酵素の酸化型における前記の変化は、発蛍光性補酵素の還元である。
【００８４】
さらなる特に好ましい態様において、補酵素における前記の変化は、分析物の量および／または濃度と相関している。
【００８５】
分析物は、例えば、酵素としてのＮＡＤ（Ｈ）依存性オキシドレダクターゼの助けにより直接または間接的に決定され得る代謝産物または基質であることができる。分析物は、酵素−補酵素複合体の存在下で反応し、次いで定量化されることができる。これに関して、決定されるべき分析物は、適切な酵素および補酵素と接触させられ、ここで補酵素は酵素反応により還元される。較正は、測定された値および決定されるべき分析物の濃度の直接的な関係を提供する。
【００８６】
分析物は、血液、血清、血漿もしくは尿のような体液中に、または廃水もしくは食物中に存在し得る。分析物として、あらゆる生物学的または化学的化合物が決定されてよく、それはＮＡＤ（Ｈ）依存性オキシドレダクターゼに媒介される酸化還元反応により分析されることができる（例えばＮＡＤ（Ｈ）依存性オキシドレダクターゼの基質である化合物）。適切な分析物は、トリグリセリド、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、グルコース、グルコース−６−リン酸、コレステロール、グリセロール、グリセロールリン酸、ラクテート、３−ヒドロキシ酪酸などのケトン類、グルタメートやシステインなどのＬ−アミノ酸、グルタチオン、ペプチド類、尿素、アンモニウム、サリチレート、ピルベート、ＣＯ２、マレエート、エタノール、ホルムアルデヒドおよびソルビトールである。
【００８７】
さらに別の好ましい態様において、分析物は、グルコース、グルコース−６−リン酸、コレステロール、グリセロール、グリセロールリン酸、ラクテート、３−ヒドロキシ酪酸などのケトン類、グルタメートなどのＬ−アミノ酸、マレエート、エタノール、ホルムアルデヒドおよびソルビトールからなる群から選択され、より好ましくはグルコースである。
【００８８】
当業者には完全に明らかであるように、本発明の方法は、分析物を試薬系と反応させる工程が補酵素において蛍光を誘導することができる光源を用いることにより実施されることを含む。そのような光の存在下では、補酵素の酸化還元状態における変化を反映し、対象の分析物の濃度と相関する蛍光シグナルが生成され、測定され得る。
【００８９】
従って、本発明は、以下の工程を含む、試料中の分析物の濃度および／または量を決定するための方法にも関し：
（ａ）ＮＡＤ（Ｈ）依存性オキシドレダクターゼおよび発蛍光性補酵素の酸化型を試料と混合する工程、それにより、
（ｂ）分析物をＮＡＤ（Ｈ）依存性オキシドレダクターゼおよび発蛍光性補酵素の酸化型を含む試薬系と反応させる工程、
（ｃ）還元された補酵素の蛍光放射を測定する工程、
（ｄ）発蛍光性補酵素の蛍光放射に基づいて分析物の量および／または濃度を決定する工程；
ここで前記の発蛍光性補酵素は本発明の化合物である。
【００９０】
別の態様において、そのキットおよび／または試薬系は、内部蛍光標準として用いられる第３蛍光体を含むが、スペクトルの相互干渉を避けるため、この第３蛍光体は、第２蛍光団から最低でも約１００ｎｍ、好ましくは約１４０ｎｍより大きく隔てられたより高い発光波長を有する。ＬＥＤ励起源と適合性であるため、第３蛍光体の発光波長は約６６０〜約９００ｎｍであることが好ましい。
【００９１】
さらなる好ましい態様において、第３蛍光体は、特に内部蛍光標準として本発明の方法において用いられる。
【００９２】
対象の分析物を決定するために用いられるＮＡＤ（Ｈ）依存性オキシドレダクターゼは、通常は溶液中で提供され、それは好ましくは緩衝されており、または乾燥物質として提供される。好ましくは、酵素は特定の範囲の緩衝条件において最高に用いられる。従って、本発明の試薬系またはキットは、通常はＮＡＤ（Ｈ）依存性オキシドレダクターゼ、本発明の化合物およびオキシドレダクターゼの対象の分析物との酵素反応を可能にする緩衝系を含むであろう。当業者は、そのような緩衝条件を選択することに、それらは当該技術において広く知られているため、全く問題を有しないであろう。
【００９３】
試薬系またはキットは、使用準備済の形態で提供されて分析されるべき試料と混合されることができ、またはそれは個々の試薬、特にＮＡＤ（Ｈ）依存性オキシドレダクターゼおよび本発明の化合物、ならびに場合により必要である場合は緩衝剤および／または試薬および／または第３蛍光体を試料とあらゆる望まれる順序で混合することにより生成されることができる。
【００９４】
多数のオキシドレダクターゼまたはデヒドロゲナーゼ酵素がＮＡＤ（Ｐ）を補酵素として用いている。全てのこれらの酵素は、本発明の意味において“ＮＡＤ（Ｈ）依存性オキシドレダクターゼ”である。
【００９５】
“ＮＡＤ（Ｐ）”は、ＮＡＤおよびＮＡＤＰを含むことを意味している。
【００９６】
酵素は、国際生化学・分子生物学連合（ＩＵＢＭＢ）の命名法委員会により推奨される酵素委員会（ＥＣ）命名法に基づいて分類され得る（例えば、www.expasy.ch/sprot/enzyme.-htmlを参照）。
【００９７】
オキシドレダクターゼ酵素は、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを補因子として利用する。例えば、オキシドレダクターゼは、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを受容体として用いて供与体のＣＨ−ＯＨ基に作用するオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１．１）；ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを受容体として用いて供与体のアルデヒドまたはオキソ基に作用するオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．２．１）；ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを受容体として用いて供与体のＣＨ−ＣＨ基に作用するオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．３．１）；ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを受容体として用いて供与体のＣＨ−ＮＨ２基に作用するオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．４．１）；ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを受容体として用いて供与体のＣＨ−ＮＨ基に作用するオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．５．１）；ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに作用するオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．６）；およびＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを受容体として用いてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに作用するオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．６．１）として分類される。
【００９８】
追加のオキシドレダクターゼは、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを受容体として用いて供与体の硫黄基に作用するオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．８．１）；ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを受容体として用いて供与体としてのジフェノール類および関連する物質に作用するオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１０．１）；ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを受容体として用いて供与体としての水素に作用するオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１２．１）；対になった供与体に作用して分子酸素を組み込むオキシドレダクターゼであって、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを一方の供与体として用いて２個の原子を組み込むオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１４．１２）ならびにＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを一方の供与体として用いて１個の原子を組み込むオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１４．１３）；ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを受容体として用いて金属イオンを酸化するオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１６．１）；ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを受容体として用いて−ＣＨ２基に作用するオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１７．１）；ならびにＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを受容体として用いて供与体としての還元型フェレドキシンに作用するオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１８．１）を含む。
【００９９】
本発明に従う方法における試薬系の一部としての使用のための典型的なオキシドレダクターゼは、アデノシルホモシステインヒドロラーゼ、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、アルドースレダクターゼ（ＡＲ）、カタラーゼ、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＤＯＸＰＲ）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（ＤＨＰＲ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＩＰＭＤＨ）、エノイルＡＣＰレダクターゼ（ＥＡＣＰＲ）、ギ酸デヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、Ｄ２−ヒドロキシイソカプロン酸デヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼ（ＨＭＧ  ＣｏＡＲ）、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＭＰＤＨ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、Ｐ４５０レダクターゼ、Ｄ３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、テトラヒドロ葉酸レダクターゼ、トリパノチオンレダクターゼ、ステロイドデヒドロゲナーゼ、コレステリンデヒドロゲナーゼ、およびジヒドロステロールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１４５）を含む。
【０１００】
一態様において、本発明に従う方法における試薬系の一部として用いられるオキシドレダクターゼは、好ましくはグルコースデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．４７）、乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２７、１．１．１．２８）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３７）、グリセリンデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．６）、アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．ｌ．ｌ．ｌ．ｌ）、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、例えばＬ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．４．１．５）、コレステリンデヒドロゲナーゼ、およびジヒドロステロールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１４５）を含む群から選択される。
【０１０１】
本発明は、以下の図および実施例によってより詳細に説明される予定である。
【０１０２】
波長の文脈における“約”は、＋／−１０ｎｍ、好ましくは＋／−５ｎｍの意味を有する。
【実施例】
【０１０３】
実施例１：Ｎ６−［Ｎ−（６−アミノヘキシル）カルバモイルメチル］カルバＮＡＤおよびＮ６−［Ｎ−（６−アミノヘキシル）カルバモイルメチル］カルバＮＡＤＨの合成
Ｎ６−［Ｎ−（６−アミノヘキシル）カルバモイルメチル］カルバＮＡＤＨの合成に関して、Lindberg, M.; Larsson, Per O.; Mosbach, K. European Journal of Biochemistry (1973), 40(1), 187-93において記載されている手順と類似の手順が用いられた：
１．１  Ｎ６カルボキシメチルカルバＮＡＤの合成
従って、国際公開第２０１１／０１２２７０号において記載されているように合成された２ｇ（３ｍｍｏｌ）のカルバＮＡＤおよび２ｇ（１０．７ｍｍｏｌ）のヨード酢酸（ｉｏｄａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）を、２５ｍｌの水中で溶解させ；ｐＨを約１３ｍｌの２Ｍ水酸化リチウムで６．５に調節した。その反応混合物を、室温で７日間保管した。ｐＨを毎日２Ｍ水酸化リチウムでｐＨ６．５に調節した。次いで、その水溶液のｐＨを０．５Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ１１．３に調節し、７５℃に１時間加熱した。ｐＨを１Ｍ  ＨＣｌでｐＨ７に調節した後、その混合物を氷冷アセトン（２５ｍｌの混合物に関して２５０ｍｌのアセトン）に加え、得られた懸濁液を４℃で一夜保管した。上清をデカンテーションにより除去した。残ったものを１５ｍｌの水中で溶解させ、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ２５カラム（ｄ＝１．６ｃｍ  ｈ＝２５ｃｍ）上でのＩＥＸクロマトグラフィーにより、溶離液Ａ（脱イオン水）から２Ｍ酢酸アンモニウムまでの勾配を４時間以内に適用して精製した。画分をＬＣ−ＭＳを用いることによりモニターし、正しい物質（７１９Ｄａ）を含有する画分を収集した。溶媒を除去し、残ったものを純水中で溶解させ、凍結乾燥させた。（Ｎ６カルボキシメチルカルバＮＡＤの収量：７５ｍｇ）。
【０１０４】
１．２  Ｎ６−［Ｎ−（６−アミノヘキシル）カルバモイルメチル］カルバＮＡＤの合成
７２ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）のＮ６カルボキシメチルカルバＮＡＤの５ｍｌの１Ｍ（５ｍｍｏｌ）ヘキサメチレンジアミン中における溶液に、３００ｍｇ（０．７ｍｍｏｌ）の１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）−カルボジイミン  メト  ｐ  トルエンスルホネートを、室温で一部ずつ添加した。３時間以内に、ｐＨを０．５Ｍ  ＨＣｌを用いてｐＨ４．７に調節し、その混合物を室温で２０時間撹拌した。その混合物を、ＲＰ１８  Ｈｙｐｅｒｓｉｌカラム（５μｍ、２１×２５０ｍｍ）クロマトグラフィーに直接適用し、勾配を適用した：１００％溶離液Ａ、６０分間で１００％溶離液Ｂへ、流速９ｍｌ／分、０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ７）である溶離液Ａおよび（０．２ｌのＡと０．８ｌのアセトニトリルの混合物である）溶離液Ｂを使用。画分をＬＣ−ＭＳを用いることによりモニターし、正しい物質（８１８Ｄａ）を含有する画分を収集した。
【０１０５】
１．３  Ｎ６−［Ｎ−（６−“Ｃｙ３”アミノヘキシル）カルバモイルメチル］カルバＮＡＤの合成
１．６ｍｇのＣｙ３  ＮＨＳエステル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅからの２−［３−（１，３−ジヒドロ−１，３，３−トリメチル−５−スルホ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）−１−プロペン−１−イル］−１−［６−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−６−オキソヘキシル］−３，３−ジメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドリウム分子内塩）の１００μｌのアセトニトリル中における溶液を、室温において３ｍｇのＮ６−［Ｎ−（６−アミノヘキシル）カルバモイルメチル］カルバＮＡＤの０．６ｍｌのホウ酸緩衝液ｐＨ８．５中における溶液に添加した。その混合物を一夜撹拌し、ロータリーエバポレーターを用いることにより真空下で蒸発させて乾燥させた。残ったものを１．２ｍｌの０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ７）中で溶解させ、Ｘ  Ｂｒｉｄｇｅ  Ｌ１８カラム（５μｍ、１０×２５０ｍｍ）を用いることにより精製した。溶離液Ａは０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ７）であり、溶離液Ｂはアセトニトリルであった。以下の勾配を適用した：５分間の５％Ｂおよび５分以内で５０％Ｂへ、流速４ｍｌ／分。画分をＬＣ−ＭＳを用いることによりモニターし、正しい物質（１４３３Ｄａ）を含有する画分を収集した。
【０１０６】
実施例２：Ｎ６−［Ｎ−（６−“Ｃｙ３”アミノヘキシル）カルバモイルメチル］カルバＮＡＤＨへの還元
Ｎ６−［Ｎ−（６−“Ｃｙ３”アミノヘキシル）カルバモイルメチル］カルバＮＡＤＨを、（国際公開第２０１０／０９４６３２号において記載されているように）Ｎ６−［Ｎ−（６−“Ｃｙ３”アミノヘキシル）カルバモイルメチル］カルバＮＡＤから、グルコースおよびグルコースデヒドロゲナーゼを用いた酵素反応によりその場で生成した。
【０１０７】
その反応を、閉じたバイアル中で、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０中で２５℃において、２００ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのグルコース、１ｍＭのＮ６−［Ｎ−（６−“Ｃｙ３”アミノヘキシル）カルバモイルメチル］カルバＮＡＤおよび４μＭのグルコースデヒドロゲナーゼを用いて実施した。３７０ｎｍ〜７００ｎｍの蛍光スペクトルを、３６０ｎｍの励起波長により、反応開始直前および反応の完了後に記録した（図１参照）。生成されたＮ６−［Ｎ−（６−Ｃｙ３アミノヘキシル）カルバモイルメチル］カルバＮＡＤＨは、約４６０ｎｍおよび５６５ｎｍにおける２個のピークの形成により検出され得る。約４６０ｎｍにおけるピークは、カルバＮＡＤＨ自体の蛍光を表しており（Ketteler et al., Fluorescence Properties of Carba Nicotinamide Adenine Dinucleotide for Glucose Sensing, ChemPhysChem (2012), 13(5), 1302-1306を参照）、一方で５６５ｎｍにおけるピークはＣｙ３に対するＦＲＥＴの結果を表している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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