(57)【要約】抗腫瘍反応性、抗ウイルス反応性、および抗細菌反応性を有する臨床的に妥当な量のポリクローナルγδ T細胞を増大させる方法が本明細書において提供される。ポリクローナルγδ T細胞は、固形腫瘍を含む種々の腫瘍、ならびにウイルス感染症および細菌感染症のような他の状態を標的とすることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも約109個の精製γδ T細胞を含み、該γδ T細胞が
(a) Vδ1、Vδ2、およびVδ1negVδ2neg TCRサブセットのものであり;
(b) 本質的に同一の遺伝物質を有し; かつ
(c) キメラ抗原受容体を含まない、
細胞組成物。
【請求項２】
NK細胞またはαβ T細胞を含まない、請求項1記載の細胞組成物。
【請求項３】
γδ T細胞がCD3を発現する、請求項1記載の細胞組成物。
【請求項４】
γδ T細胞がCD57もPD-1も発現しない、請求項1記載の細胞組成物。
【請求項５】
請求項1〜4のいずれか一項記載の細胞組成物および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項６】
(a) 第1のポリクローナルγδ T細胞集団を含む細胞のサンプルを得る段階; ならびに
(b) 第1のポリクローナルγδ T細胞集団をインターロイキン-2 (IL-2)およびインターロイキン-21 (IL-21)の存在下で人工の抗原提示細胞(aAPC)とともに培養する段階であって、それによって請求項1〜4のいずれか一項記載の細胞組成物を作製する、段階
を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の細胞組成物を作製する方法。
【請求項７】
CD56発現細胞およびTCRαβ発現細胞の細胞サンプルを枯渇させる段階をさらに含む、請求項6記載の方法。
【請求項８】
細胞サンプルが末梢血サンプル、臍帯血サンプル、または組織サンプルである、請求項6記載の方法。
【請求項９】
細胞サンプルが単一の対象から得たものである、請求項6記載の方法。
【請求項１０】
第1のポリクローナルγδ T細胞集団が約104〜約106個のγδ T細胞を含む、請求項6記載の方法。
【請求項１１】
aAPCがトランスジェニックK562細胞である、請求項6記載の方法。
【請求項１２】
aAPCがCD137Lを発現する、請求項6記載の方法。
【請求項１３】
aAPCがCD19、CD64、CD86、およびmIL15をさらに発現する、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
aAPCが少なくとも1種の抗CD3抗体クローンを発現する、請求項11記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも1種の抗CD3抗体クローンがOKT3および/またはUCHT1である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
aAPCがOKT3およびUCHT1を発現する、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
aAPCが不活性化されている、請求項6記載の方法。
【請求項１８】
aAPCが照射されている、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
aAPCが感染性物質について試験され、感染性物質がないことが確認されている、請求項6記載の方法。
【請求項２０】
第1のポリクローナルγδ T細胞集団をaAPCとともに培養する段階が、約10:1〜約1:10 (γδ T細胞 対 aAPC)の比率で細胞を培養することを含む、請求項6記載の方法。
【請求項２１】
培養物中のaAPCが毎週補充される、請求項6記載の方法。
【請求項２２】
第1のポリクローナルγδ T細胞集団をaAPCとともに培養する段階が、少なくとも2週間培養することを含む、請求項6記載の方法。
【請求項２３】
第1のポリクローナルγδ T細胞集団をaAPCとともに培養する段階が、ポリクローナルγδ T細胞数の少なくとも100倍の増加をもたらす、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
段階(b)が、培養物をアミノビスフォスフォネートで処理することをさらに含む、請求項6記載の方法。
【請求項２５】
γδ T細胞がヒトγδ T細胞である、請求項6記載の方法。
【請求項２６】
(a) 第1のポリクローナルγδ T細胞集団を含む細胞のサンプルを得る段階; ならびに
(b) 第1のポリクローナルγδ T細胞集団を少なくとも1種の抗CD3抗体クローンの存在下で、およびさらにインターロイキン-2 (IL-2)およびインターロイキン-21 (IL-21)の存在下で培養する段階であって、それによって請求項1〜4のいずれか一項記載の細胞組成物を作製する、段階
を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の細胞組成物を作製する方法。
【請求項２７】
CD56発現細胞およびTCRαβ発現細胞の細胞サンプルを枯渇させる段階をさらに含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも1種の抗CD3抗体クローンがOKT3またはUCHT1である、請求項26記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも1種の抗CD3抗体クローンがOKT3およびUCHT1である、請求項26記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも1種の抗CD3抗体クローンがaAPCの表面に発現される、請求項26記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも1種の抗CD3抗体クローンがマイクロビーズの表面に存在する、請求項26記載の方法。
【請求項３２】
第1のポリクローナルγδ T細胞集団を培養する段階が、少なくとも2週間培養することを含む、請求項26記載の方法。
【請求項３３】
請求項1〜4のいずれか一項記載の細胞組成物または請求項5記載の薬学的組成物の有効量を投与する段階を含む、患者において疾患を処置する方法。
【請求項３４】
疾患ががんである、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
がんがT細胞ALL、B-ALL、CML、結腸がん、卵巣がん、神経芽細胞腫、脳腫瘍、または膵臓がんである、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
疾患がウイルス感染症である、請求項33記載の方法。
【請求項３７】
ウイルス感染症がサイトメガロウイルス(CMV)、エプスタイン・バー・ウイルス(EBV)、またはヒト免疫不全ウイルス(HIV)である、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
疾患が細菌感染症である、請求項33記載の方法。
【請求項３９】
疾患が敗血症である、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
細胞組成物が患者にとって同種異系である、請求項33記載の方法。
【請求項４１】
細胞組成物が患者にとって自己由来である、請求項33記載の方法。
【請求項４２】
患者が事前の抗がん療法を受けている、請求項34記載の方法。
【請求項４３】
患者が寛解期にある、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
患者が、がんの症状はないがしかし検出可能ながん細胞を含む、請求項42記載の方法。
【請求項４５】
患者がヒト患者である、請求項33記載の方法。
【請求項４６】
(a) 請求項6〜25のいずれか一項記載の方法によって細胞組成物を作製する段階; および
(b) 該細胞組成物の有効量をそれを必要としている患者に投与する段階
を含む、患者において疾患を処置する方法。
【請求項４７】
患者における疾患の処置で用いるための、請求項1〜4のいずれか一項記載の細胞集団を含む組成物または請求項5記載の薬学的組成物。
【請求項４８】
疾患ががんである、請求項47記載の組成物。
【請求項４９】
がんがT細胞ALL、B-ALL、CML、結腸がん、卵巣がん、または膵臓がんである、請求項48記載の組成物。
【請求項５０】
疾患がウイルス感染症である、請求項47記載の組成物。
【請求項５１】
ウイルス感染症がサイトメガロウイルス(CMV)、エプスタイン・バー・ウイルス(EBV)、またはヒト免疫不全ウイルス(HIV)である、請求項50記載の組成物。
【請求項５２】
疾患が細菌感染症である、請求項47記載の組成物。
【請求項５３】
疾患が敗血症である、請求項52記載の組成物。
【請求項５４】
細胞組成物が患者にとって同種異系である、請求項47記載の組成物。
【請求項５５】
細胞組成物が患者にとって自己由来である、請求項47記載の組成物。
【請求項５６】
疾患の処置のための医薬の製造における、請求項1〜4のいずれか一項記載の細胞集団の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2013年10月25日付で出願された米国仮特許出願第61/895,626号の優先権の恩典を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、国防総省により授与された助成金番号10626252の下で政府支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
1. 発明の分野
本発明は広くは、医学および免疫学の分野に関する。ある特定の局面において、本発明の分野は免疫療法に関する。より詳しくは、本発明は、臨床用ポリクローナルγδT細胞の製造およびそのような細胞を用いた治療法に関する。
【背景技術】
【０００４】
2. 関連技術の記述
ヒトγδT細胞は先天性および適応性の両方の性質を有し、細胞接触時の細胞溶解を含むある範囲のエフェクタ機能を示す(Bonneville et al., 2010)。腫瘍標的細胞の認識とその後の死滅化は、γおよびδ T細胞受容体(TCR)鎖のヘテロ二量体によって達成される。ヒトTCR可変(V)領域は、14種の固有のVγ対立遺伝子、3種の固有のVδ対立遺伝子(Vδ1、Vδ2、およびVδ3)、ならびにVα対立遺伝子と共通の分類を共有する5種のVδ対立遺伝子(Vδ4/Vα14、Vδ5/Vα29、Vδ6/Vα23、Vδ7/Vα36、およびVδ8/Vα38-2)を規定する(Lefranc, 2001)。TCRα/TCRβヘテロ二量体を発現するT細胞は、およそ95%の末梢血(PB) T細胞を含み、主要組織適合複合体(MHC)分子との関連でペプチドを認識する(Turchinovich and Pennington, 2011)。対照的に、TCRγδリガンドはMHC認識とは無関係に認識されるが、しかしPB中では稀有(T細胞の1%〜5%)である(Bonneville et al., 2010; Kabelitz et al., 2007; Xu et al., 2011)。
【０００５】
ヒトγδ T細胞は、腫瘍細胞を溶解させる先天的な能力を示し、免疫療法に有望である。つまり、がん細胞には多くのTCRγδリガンドが存在しており、その結果、ポリクローナルなγδ TCRレパートリーを維持する増大手法はヒトでの適用にとって魅力的である可能性を高める。Vγ9Vδ2 T細胞の養子移植はがんの調査的処置で客観的臨床応答を生じたが、しかし非Vγ9Vδ2 T細胞の投与は未だ行われていない(Kondo et al., 2008; Lang et al., 2011; Nagamine et al., 2009; Nicol et al., 2011; Wilhelm et al., 2003)。ハプロタイプ一致のαβ T細胞を欠失させた造血幹細胞の移植(HSCT)レシピエント間での白血病の長期寛解は、ドナー由来Vδ1 T細胞の生着頻度の増加と相関性があった(Godder et al., 2007; Lamb et al., 1999; Lamb et al., 1996; Lamb et al., 2001)。Vδ1negVδ2neg T細胞の治療的影響について記述している報告はこれまでになく、このサブセットは、Vδ1およびVδ2 TCRを発現するT細胞と直接比較されていない。したがって、非Vγ9Vδ2系統に関する知識とヒトでの適用においては、かなりの隔たりがある。
【０００６】
アミノビスフォスフォネート、例えば、ゾレドロン酸(Zol)は、臨床用にγδ T細胞のVγ9Vδ2サブセットを増殖させるために用いられている(Stresing et al., 2007; Thompson et al., 2010)。他のγδ T細胞系統は、アミノビスフォスフォネートによって増殖されない。とは言っても、がん免疫療法としてVγ9Vδ2 γδ T細胞を用いた臨床試験は、何らかの客観的応答を示したが、単一療法として治癒的ではなかった(Nicol et al., 2011; Wilhelm et al., 2003)。プレートに結合された抗体およびサイトカイン・カクテルも、さらに多様なγδ T細胞のセットを増殖させるために用いられてきたが、しかし(i) それらは一貫したVδ1およびVδ1negVδ2neg頻度を達成しなかった、(ii) γδ T細胞の絶対数が臨床的に意義がなかった(細胞108個未満)、(iii) それらはVγ頻度を包括的に分析するものではなかった、ならびに(iv) それらは、これらの試薬が適正製造規範(GMP)品質で全て利用できるとは限らないので、臨床の場へ直接的に移行可能ではない(Dokouhaki et al., 2010; Kang et al., 2009; Lopez et al., 2000)。それゆえ、γδ T細胞をエクスビボで増やす臨床的に妥当な方法、およびそれによって作製された細胞が大いに必要とされる。
【発明の概要】
【０００７】
抗腫瘍反応性、抗ウイルス反応性、および抗細菌反応性を有する臨床的に妥当な量のポリクローナルγδ T細胞を増大させる方法が本明細書において提供される。γδ T細胞は、固形腫瘍ならびにウイルス感染症および細菌感染症のような他の状態を含む種々の腫瘍を標的化することができる。
【０００８】
1つの態様において、少なくとも約109個の精製γδ T細胞を含む細胞組成物が提供される。細胞組成物は少なくとも約109、1010、1011個またはそれ以上の精製γδ T細胞を含みうる。1つの局面において、精製γδ T細胞はVδ1、Vδ2、およびVδ1negVδ2neg TCRサブセットのものでありうる。1つの局面において、精製γδ T細胞はVδ1、Vδ2、Vδ3、Vδ5、Vδ7、またはVδ8 TCR鎖とVγ2、Vγ3、Vγ7、Vγ8、Vγ9、Vγ10、またはVγ11 TCR鎖との任意の組み合わせを発現しうる。1つの局面において、精製γδ T細胞は本質的に同一の遺伝物質を有しうる。1つの局面において、精製γδ T細胞はキメラ抗原受容体を含有しえない。
【０００９】
1つの局面において、細胞組成物はNK細胞またはαβ T細胞を含有しえない。1つの局面において、γδ T細胞はCD3を発現しうる。さらなる局面において、γδ T細胞はCD38、CD95、CD25、CD27、CD28、CD45、またはCCR7を発現または共発現しうる。1つの局面において、γδ T細胞はCXCR4も、CCR4も、CLAも、CD4も、CD8も、CD122も、CD127も、CD56も、CD57も、PD-1も発現しえない。
【００１０】
さまざまな局面において、本態様のγδ T細胞は治療的な可能性向上させるように遺伝的に編集されうる。そのような遺伝的編集は、例えば、人工ヌクレアーゼの使用によるような、当技術分野において公知の任意の手段によって行われうる。そのような遺伝的編集は、キメラ抗原受容体(CAR)またはT細胞受容体(TCR)の発現を通じてγδ T細胞の特異性をリダイレクトしうる。そのような遺伝的編集は、ホーミング、サイトカイン産生、再循環死滅化の改善、および/または生着の改善によってγδ T細胞の効力を改善しうる。
【００１１】
1つの態様において、本態様の細胞組成物および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物が提供される。
【００１２】
1つの態様において、本態様の細胞組成物を作製する方法が提供される。本方法は、第1のポリクローナルγδ T細胞集団を含む細胞のサンプルを得る段階; ならびに第1のポリクローナルγδ T細胞集団をインターロイキン-2 (IL-2)およびインターロイキン-21 (IL-21)の存在下で人工の抗原提示細胞(aAPC)とともに培養する段階を含みうる。いくつかの局面において、培養する段階は、T細胞集団を増大させるために限られた期間エクスビボで行われうる。1つの局面において、培養する段階は、アミノビスフォスフォネート(例えば、ゾレドロン酸)とともに培養することをさらに含みうる。
【００１３】
1つの局面において、細胞のサンプルは末梢血サンプルまたは臍帯血サンプルでありうる。別の局面において、細胞のサンプルは組織から得られうる。別の局面において、細胞のサンプルは単一の対象から得られうる。対象はドナーまたは患者でありうる。いくつかの局面において、単一のドナーから作製されたγδ T細胞は、1体または複数体の同種異系のレシピエントへ注入されうる。1つの局面において、γδ T細胞はヒトγδ T細胞でありうる。
【００１４】
いくつかの局面において、培養する段階の前のγδ T細胞の初期集団の精製は、常磁性ビーズ選択またはフローサイトメトリーを用いるような、単離/濃縮を含みうる。そのような選択は、CD56発現細胞およびTCRαβ発現細胞の細胞サンプルを枯渇させる段階を含みうる。γδ T細胞の純度は、1つまたは複数のγδ TCRに特異的なモノクローナル抗体で染まるTCRの存在に基づきうる。
【００１５】
1つの局面において、aAPCはトランスジェニックK562細胞でありうる。1つの局面において、aAPCはCD137Lを発現しうる。他の局面において、aAPCはCD19、CD64、CD86、またはmIL15をさらに発現しうる。ある特定の局面において、aAPCは、例えば、OKT3および/またはUCHT1のような、少なくとも1種の抗CD3抗体クローンを発現しうる。1つの局面において、aAPCは不活性化され(例えば、照射され)うる。1つの局面において、aAPCは感染性物質について試験され、感染性物質がないことが確認されうる。そのようなaAPCを産生するための方法は、当技術分野において公知である。
【００１６】
1つの局面において、第1のポリクローナルγδ T細胞集団は、約104〜約106個のγδ T細胞を含みうる。1つの局面において、第1のポリクローナルγδ T細胞集団をaAPCとともに培養する段階は、約10:1〜約1:10; 約3:1〜約1:5; 約1:1〜約1:3 (γδ T細胞 対 aAPC); またはその中で導出できる任意の範囲の比率で細胞を培養することを含みうる。例えば、T細胞およびaAPCの共培養物は、約1:1、約1:2または約1:3の比率であることができる。
【００１７】
1つの局面において、培養物中のaAPCは毎週、補充されうる。1つの局面において、第1のポリクローナルγδ T細胞集団をaAPCとともに培養する段階は、少なくとも2週間培養することを含みうる。1つの局面において、第1のポリクローナルγδ T細胞集団をaAPCとともに培養する段階は、ポリクローナルγδ T細胞数の少なくとも100倍の増加をもたらしうる。
【００１８】
1つの態様において、本態様の細胞組成物を作製する方法が提供される。本方法は、第1のポリクローナルγδ T細胞集団を含む細胞のサンプルを得る段階; ならびに第1のポリクローナルγδ T細胞集団を、例えば、OKT3および/またはUCHT1のような、少なくとも1種の抗CD3抗体クローンの存在下で、さらに、インターロイキン-2 (IL-2)およびインターロイキン-21 (IL-21)の存在下で培養する段階を含みうる。いくつかの局面において、抗CD3抗体クローンはaAPCの表面に発現されうる。他の局面において、抗CD3抗体クローンはマイクロビーズの表面に存在しうる。
【００１９】
いくつかの局面において、培養する段階は、T細胞集団を増大させるために限られた期間エクスビボで行われうる。1つの局面において、培養する段階は、アミノビスフォスフォネート(例えば、ゾレドロン酸)とともに培養することをさらに含みうる。
【００２０】
1つの局面において、細胞のサンプルは末梢血サンプルまたは臍帯血サンプルでありうる。別の局面において、細胞のサンプルは単一の対象から得られうる。対象はドナーまたは患者でありうる。1つの局面において、γδ T細胞はヒトγδ T細胞でありうる。いくつかの局面において、γδ T細胞は胚性幹細胞、造血幹細胞、または人工多能性幹細胞のような、幹細胞に由来しうる。
【００２１】
いくつかの局面において、培養する段階の前のγδ T細胞の初期集団の精製は、常磁性ビーズ選択またはフローサイトメトリーを含みうる。そのような選択は、CD56発現細胞およびTCRαβ発現細胞の細胞サンプルを枯渇させる段階を含みうる。γδ T細胞の純度は、γδ TCRに特異的なモノクローナル抗体で染まるTCRの存在およびαβ TCRの染色の非存在に基づきうる。
【００２２】
1つの局面において、第1のポリクローナルγδ T細胞集団をaAPCとともに培養する段階は、少なくとも2週間培養することを含みうる。1つの局面において、第1のポリクローナルγδ T細胞集団を培養する段階は、ポリクローナルγδ T細胞数の少なくとも100倍の増加をもたらしうる。
【００２３】
1つの態様において、本態様の細胞組成物または薬学的組成物の有効量を投与する段階を含む、患者において疾患を処置する方法が提供される。1つの局面において、患者はヒト患者でありうる。
【００２４】
1つの局面において、疾患はがんでありうる。ある特定の局面において、がんはT細胞ALL、B-ALL、CML、結腸がん、卵巣がん、神経芽細胞腫、脳腫瘍、または膵臓がんのような、血液がんまたは固形がんでありうる。いくつかの局面において、患者は事前の抗がん療法を受けていてもよい。1つの局面において、疾患は寛解期にありうる。別の局面において、患者は、がんの症状はないが、しかし検出可能ながん細胞を含む可能性がある。
【００２５】
別の局面において、疾患はウイルス感染症(例えばサイトメガロウイルス(CMV)、エプスタイン・バー・ウイルス(EBV)、またはヒト免疫不全ウイルス(HIV))でありうる。別の局面において、疾患は細菌感染症でありうる。1つの局面において、疾患は敗血症でありうる。
【００２６】
1つの局面において、細胞組成物は患者にとって同種異系でありうる。さまざまな局面において、同種異系の細胞組成物は患者とHLAを共有しうるか、または共有しえない。別の局面において、細胞組成物は患者にとって自己由来でありうる。
【００２７】
1つの態様において、本態様の方法による細胞組成物を作製する段階および該細胞組成物の有効量をそれを必要としている患者に投与する段階を含む、患者において疾患を処置する方法が提供される。
【００２８】
いくつかの局面において、本明細書において記述される細胞集団由来の細胞の有効量をいくつかの局面において2回以上、例えば少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14日間、またはそれ以上間隔を空けて提供する段階を含む、医学的状態を有する個体を処置するための方法が提供される。
【００２９】
1つの態様において、本態様の、細胞集団を含む組成物または薬学的組成物が、患者における疾患の処置で用いるために提供される。疾患はがん(例えば、T細胞ALL、B-ALL、AML、結腸がん、卵巣がん、膵臓がんなど)、ウイルス感染症(例えばサイトメガロウイルス(CMV)、エプスタイン・バー・ウイルス(EBV)、もしくはヒト免疫不全ウイルス(HIV))、または細菌感染症(例えば、敗血症)でありうる。1つの局面において、細胞組成物は患者にとって同種異系でありうる。別の局面において、細胞組成物は患者にとって自己由来でありうる。別の態様において、疾患の処置のための医薬の製造における本態様の細胞集団の使用が提供される。
【００３０】
本発明の方法および/または組成物との関連で論じられる態様は、本明細書において記述されるいずれの他の方法または組成物に対しても利用されうる。したがって、1つの方法または組成物に関する態様は、本発明の他の方法および組成物に同様に適用されうる。
【００３１】
本明細書において用いられる場合、「1つの(a)」または「1つの(an)」は、1つまたは複数を意味しうる。本明細書において特許請求の範囲において用いられる場合、「含む(comprising)」という単語と併用されると、「1つの(a)」または「1つの(an)」という単語は1つまたは2つ以上を意味しうる。
【００３２】
たとえ本開示が選択肢のみならびに「および/または」に言及する定義を支持するとしても、特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、選択肢のみに言及しているまたはそれらの選択肢が相互に排他的であることが明示されている場合を除き、「および/または」を意味するように用いられる。本明細書において用いられる場合、「別の」は、少なくとも第2のまたはそれ以上を意味しうる。
【００３３】
本出願の全体を通じて、「約」という用語は、ある値が、その値を決定するために利用されている装置、方法に内在する誤差の変動、または研究対象に存在する変動を含むことを示すために用いられる。
【００３４】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい態様を示しているが、この詳細な説明から本発明の趣旨および範囲のなかでさまざまな修正および変更が当業者に明らかになるので、例示にすぎないことが理解されるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の局面をさらに説明するために含まれる。本発明は、本明細書において提示される具体的態様の詳細な説明とともに、これらの図面の1つまたは複数を参照することによってさらによく理解されうる。
【００３６】
【図１】図1A〜G  バルク(ポリクローナル)集団としてのIL-2およびIL-21の存在下でのγ線照射aAPCに対するPB由来γδ T細胞の持続的増殖。(A) aAPCおよびサイトカインに対する共培養前(0日目)および共培養後(22日目)のγδ T細胞の頻度。4回の独立した実験から、7人の代表的ドナーのうちの1人を示す。(B) 共培養22日目のCD3、CD56、TCRαβ、およびTCRγδの発現。4回の独立した実験から、7人の代表的ドナーのうちの1人を示す。(C) ポリクローナルγδ T細胞の推定される細胞計数、ここで3本の矢印はaAPCの添加を表す。黒線は2回の独立した実験からプールされた平均±SD (n = 4)であり、灰色の各線は個々のドナーである。(D) 膜結合IL-15 (mIL15)、CD86、および/またはCD137Lを発現しているaAPCと併せてIL-2およびIL-21と共培養されたγδ T細胞の9日にわたる増加倍率（fold increase）。データは2回の独立した実験からプールされた平均±SD (n = 3)であり、各記号(shape)は個々のドナーを表す。統計分析にはボンフェローニの事後検定とともに二元ANOVAを用いた。＊p < 0.05; ＊＊p < 0.01。(E) 可溶性組み換えIL-2および/またはIL-21の存在下でaAPC (クローン番号4)と共培養されたγδ T細胞の9日にわたる増加倍率。データは2回の独立した実験からプールされた平均±SD (n = 3)であり、ここで各記号は個々のドナーを表す。統計分析にはボンフェローニの事後検定とともに二元ANOVAを用いた。＊p < 0.05。(F) aAPCクローン番号4およびサイトカインに対して22日間数値的に増大されたγδ T細胞上のTCRδ1およびTCRδ2鎖の代表的発現。2回の独立した実験から、4人の代表的ドナーのうちの1人を示す。(G) aAPC (クローン番号4)およびサイトカインに対して22日間増殖されたポリクローナルγδ T細胞上のTCRδ1+TCRδ2neg、TCRδ1negTCRδ2+、およびTCRδ1negTCRδ2neg鎖の細胞表面発現の頻度。データは2回の独立した実験からプールされた平均±SD (n = 4)であり、各記号は個々のドナーを表す。
【図２】導入された共刺激分子の影響を明らかにするためにγδ T細胞との共培養に向けて開発されたaAPC。K562細胞に、Sleeping Beauty (SB)トランスポザーゼと、IL-15サイトカイン/ペプチドがIL-15受容体-αに融合されている膜結合IL-15 (mIL15)の変種を発現するSBトランスポゾンとをエレクトロポレーションした。遺伝子操作された細胞をFACSにより単細胞選別して、aAPCクローンA6を作製した。aAPCクローンA6はaAPCクローン番号4とは異なるmIL15の変種を用いることに留意されたい。クローンA6にその後、SBトランスポザーゼと、CD86またはCD137Lのいずれかを含むSBトランスポゾンとをエレクトロポレーションし、遺伝子操作された細胞をFACSにより単細胞選別して、aAPCクローンA3およびD4を作製した。aAPCの細胞表面免疫表現型を示すが、ここで前方散乱をx軸に示し、mIL15、CD86、およびCD137Lを、それぞれ、y軸の上部、中央部、および下部に示す。
【図３】図3A〜D  aAPCに対するUCB由来γδ T細胞の増大。γδ T細胞をCD3およびTCRγδでの染色に基づきFACSによって選別し、可溶性組み換えIL-2およびIL-21の存在下でaAPCクローン番号4により毎週刺激した。(A) 共培養物からの推定される全細胞数であり、ここで黒線は4回の独立した実験からプールされた平均±SD (n = 5)を表し、灰色の線は個々のドナーである。矢印はγ線照射aAPCの添加を表す。IL-2およびIL-21と併せたaAPCに対する5週間の増大後の、フローサイトメトリーによる代表的ドナー(4回の独立した実験からの5人のうちの1人)の(B) CD3 (y軸)およびTCRδγ (x軸)、(C) TCRαβ (y軸)およびTCRγδ (x軸)、ならびに(D) CD3 (y軸)およびCD56 (x軸)の発現。右上隅には象限頻度を示す。
【図４】図4A〜D  aAPCに対して増殖かつ活性化されたγδ T細胞におけるVδおよびVγ mRNAの存在量。aAPC/IL-2/IL-21に対する共培養22日目の、DTEAによる、PBMC由来γδ T細胞における(A) Vδおよび(B) Vγ対立遺伝子をコードするmRNA種の定量化。PBMCについて記述されたようにaAPC/IL-2/IL-21に対する共培養34〜35日目の、DTEAによる、UCB由来γδ T細胞における(C) Vδおよび(D) Vγ対立遺伝子をコードするmRNA種の定量化。箱ヒゲ図は25%および75%パーセンタイルを示し、ここで直線は上から下へ最大値、平均値および最小値を表す(n=4)。グラフ下部の実線は、DTEA陰性対照の平均±2×SDから算出された検出限界(LOD)を表す。スチューデントの対応のある片側t検定を対立遺伝子ごとにサンプルLODに対して行った。＊p < 0.05、および＊＊p < 0.01
【図５】UCBに由来しaAPCに対して増殖されたγδ T細胞上のTCRδ1およびTCRδ2鎖の表面発現。IL-2およびIL-21の存在下においてaAPCクローン番号4に対する共培養35日後の、UCB由来γδ T細胞でのTCRδ2 (y軸)およびTCRδ1 (x軸)の、フローサイトメトリーによる発現。右上隅には象限頻度(割合)を示す。T細胞は4回の独立した実験で増殖された。
【図６】図6A〜F  IL-2およびIL-21の存在下でのγ線照射aAPCに対して分離された集団としてのPB由来Vδ T細胞サブセットの持続的増殖。aAPC (クローン番号4)およびサイトカインによる2回の7日間刺激後に、γδ T細胞のバルク集団を、それぞれTCRδ1+TCRδ2neg、TCRδ1negTCRδ2+、およびTCRδ1negTCRδ2negとして定義されたT細胞の染色に基づいてFACSによりVδ1、Vδ2、およびVδ1negVδ2negサブセットに分けた。(A) 単離された群としての、aAPCおよびサイトカインに対する15日の数値的増大後の、γδ T細胞のVδ1、Vδ2、およびVδ1negVδ2negサブセット(左から右へ)でのTCRδ1およびTCRδ2鎖の発現。4人の代表的ドナーのうちの1人を、2回の独立した実験からプールして示す。流れプロット内の象限頻度(割合)を右上隅に示す。(B) 単離された群としての、aAPCおよびサイトカインに対する15日の数値的増大後の、γδ T細胞のサブセットでのTCRδ1+TCRδ2neg (白色棒)、TCRδ1negTCRδ2+ (黒色棒)、およびTCRδ1negTCRδ2neg (灰色棒)細胞表面タンパク質発現の頻度。データは2回の独立した実験からプールされた平均±SD (n = 4)である。(C) サイトカインの存在下においてaAPCクローン番号4で2回刺激(矢印)された各単離Vδサブセットの増殖および全細胞計数を示す。データは2回の独立した実験からプールされた平均±SD (n = 4)である。(D〜F) 分離されたサブセットとしての、aAPCおよびサイトカインに対する15日の増殖後の、γδ T細胞亜集団での(D) Vδ1＊01、(E) Vδ2＊02、および(F) Vδ3＊01をコードするmRNA種の存在量を特定かつ測定するために、直接的TCR発現アレイ(DTEA)を用いた。箱ヒゲ図は25%および75%パーセンタイルを示し、ここで直線は上から下へ最大値、平均値および最小値を表す(n=4)。スチューデントの対応のある両側t検定を統計分析のために行った。＊＊p < 0.01および＊＊＊p < 0.001
【図７】図7A〜E  aAPC、IL-2、およびIL-21に対して分離かつ増大されたγδ T細胞において共有されるVα/Vδ対立遺伝子のmRNA発現。IL-2およびIL-21の存在下でのaAPCクローン番号4に対するVδ1、Vδ2、およびVδ1negVδ2neg集団の15日の共培養後の、DTEAによる、共有されるVδおよびVα対立遺伝子の発現。分離された各サブセットにおける(A) Vδ4 (Vα14)、(B) Vδ5 (Vα29)、(C) Vδ6 (Vα23)、(D) Vδ7 (Vα36)、および(E) Vδ8 (Vα38-2)の検出。箱ヒゲ図は25%および75%パーセンタイルを示し、ここで直線は上から下へ最大値、平均値および最小値を表す(n=4)。スチューデントの対応のある両側t検定を集団間の統計分析のために行った。
【図８】図8A〜O  γδ T細胞サブセットでのVγ鎖をコードするmRNA種の存在量。PB由来のポリクローナルγδ T細胞をIL-2およびIL-21の存在下においてaAPCクローン番号4で2回刺激し、その後、TCRδ1+TCRδ2neg、TCRδ1negTCRδ2+、およびTCRδ1negTCRδ2neg亜集団へFACS分離した。これらを次に、IL-2およびIL-21の存在下においてaAPCクローン番号4でさらに2回、単離されたサブセットとして刺激した。DTEAを用いて、(A) Vγ1＊01、(B) Vγ2＊02、(C) Vγ3＊01、(D) Vγ5＊01、(E) Vγ6＊01、(F) Vγ7＊01、(G) Vγ8＊01M、(H) Vγ8＊01X、(I) Vγ9＊01、(J) Vγ9＊02、(K) Vγ10＊01、(L) Vγ11＊01、(M) Vγ11＊02、(N) VγA＊01、および(O) VγB＊01をコードするmRNAを特定かつ定量化した。箱ヒゲ図は25%および75%パーセンタイルを示し、ここで直線は上から下へ最大値、平均値および最小値を表す(n=4)。スチューデントの対応のある両側t検定を、Vδ選別集団の間で対立遺伝子ごとに行った。＊p < 0.05、および＊＊p < 0.01
【図９】図9A〜B  IL-2およびIL-21と併せたaAPCに対して増殖されたポリクローナルγδ T細胞の免疫表現型。(A) ゲーティング(4人のドナーを代表する1人を2回の独立した実験から示す)および(B) 培養22日目のPBMC由来ポリクローナルγδ T細胞のフローサイトメトリーによる表面マーカーの頻度。直線は2回の独立した実験からプールされた平均±SD (n = 4)を示し、ここで各記号は個々のドナーを表す。
【図１０】図10A〜H  aAPC、IL-2、およびIL-21に対して増殖されたVδ T細胞サブセットの免疫表現型。Vδ1、Vδ2、およびVδ1negVδ2negサブセットを、分離された集団として増殖15日後に分析した。(A) Vδ1、Vδ2、およびVδ1negVδ2negサブセット(左から右へ)でのCD3 (x軸)およびTCRγδ (y軸)発現のフローサイトメトリープロット。(B) Vδ1 (赤色)、Vδ2 (黒色)、およびVδ1negVδ2neg (青色) T細胞サブセットにおけるTCRγδ染色の平均蛍光強度(MFI)であり、ここで各記号は異なるドナーを表し、データは2回の独立した実験からプールされた平均±SD (n = 4)である。(C) Vδ1、Vδ2、およびVδ1negVδ2negサブセット(左から右へ)でのCD4 (x軸)およびCD8 (y軸)発現の代表的なフローサイトメトリープロットならびに(D) Vδ1 (赤色)、Vδ2 (黒色)、およびVδ1negVδ2neg (青色) T細胞の頻度の概略であり、ここでデータは2回の独立した実験からプールされた平均±SD (n = 3)であり、各記号は異なるドナーを表す。Vδ1、Vδ2、およびVδ1negVδ2negサブセット(左から右へ)での(E) CCR7 (x軸)およびCD62L (y軸)、(F) CD28 (x軸)およびCD27 (y軸)、ならびに(G) CD45RA (x軸)およびCD27 (y軸)発現のフローサイトメトリープロット。(H) (G)部において示されるように、CD27およびCD45RAの発現に基づく分化状態へのγδ T細胞の割り当て。各記号は異なるドナーを表し、データは2回の独立した実験からプールされた平均±SD (n = 3)である。全ての流れプロットは、2回の独立した実験からの4人の正常ドナーを代表する。流れプロットの象限頻度(割合)を右上隅に示す。
【図１１】図11A〜D  ポリクローナルγδ T細胞により分泌されるサイトカインおよびケモカイン。IL-2およびIL-21と併せたγ線照射aAPCクローン番号4に対する共培養22日目に、T細胞を37℃で6時間、CM (モック)または白血球活性化カクテル(LAC; PMA/イオノマイシン)とともにインキュベートした。27-Plex Luminexアッセイ法を用いて組織培養上清を調べ、(A) TH2サイトカイン、(B) TH17サイトカイン、(C) TH1サイトカイン、および(D) ケモカインの存在を検出した。データは2回の独立した実験で4人のドナーからプールされた平均±SDであり、ここで各ドナーには多重分析の前にプールされた三つ組の実験ウェルがあった。スチューデントのt検定を各サイトカインまたはケモカインについてモックおよびLAC群の間での統計分析のために行った。＊p < 0.05、＊＊p < 0.01、および＊＊＊p < 0.001
【図１２】図12A〜F  腫瘍細胞に応答したIFNγ分泌に関するTCRγδへの依存。ポリクローナルγδ T細胞を、6時間の腫瘍細胞共培養の前におよびその間に、NMS (陰性対照)または中和TCRγδ抗体(αTCRγδ; クローンIM)とともに1時間インキュベートした。細胞をTCRδ1、TCRδ2、CD3、およびIFNγについて染色し、T細胞サブセットをゲーティングし、IFNγ産生を評価した。ゲーティング戦略は、(A) 活性化T細胞ゲートでの前方および側方散乱(それぞれFSCおよびSSC)の分離、(B) T細胞ゲートでの混入腫瘍細胞からのCD3+ T細胞の単離、ならびに(C) それぞれ、TCRδ1+TCRδ2neg、TCRδ1negTCRδ2+、およびTCRδ1negTCRδ2negに基づくVδ1、Vδ2、およびVδ1negVδ2negサブセットへの分離であった。(D) CAOV3卵巣がん細胞と共培養され、NMS (白抜き)またはαTCRγδ (影付き)で処理されたVδ1、Vδ2、およびVδ1negVδ2negゲート(左から右へ)を詳述するヒストグラムの比較。ヒストグラムに隣接する数値はMFIである。流れプロットは、2つの独立した実験でCAOV3細胞と共培養された3人のPBドナーのうちの1人を代表する。(E) CAOV3および(F) OC314細胞に応答したIFNγ分泌の阻害率を、次の方程式: 阻害(%) = 100 - 100×[(MFI腫瘍 + T細胞 - MFIT細胞のみ)αTCRγδ/(MFI腫瘍 + T細胞 - MFIT細胞のみ)NMS]に基づき各Vδ T細胞サブセットについて算出した。データは2回の独立した実験からプールされた平均±SD (n = 3)である。
【図１３】図13A〜G  ポリクローナルγδ T細胞による腫瘍細胞株パネルの特異的溶解。標準的な4時間CRAを、エフェクタ(ポリクローナルγδ T細胞) 対 標的(E:T)比を増加させながら、(A) 同種異系ドナー(4人の代表的ドナーのうちの1人)由来のB細胞、(B) B-ALL細胞株: RCH-ACV、(C) T-ALL細胞株: Jurkat、(D) CML細胞株: K562、(E) 膵臓がん細胞株: BxPc-3、(F) 結腸がん細胞株: HCT-116、ならびに(G) 卵巣がん細胞株: OC314およびCAOV3に対して行った。各線はエフェクタポリクローナルγδ T細胞の個々のPBドナーを表し、ここでデータは、2回の独立した実験からの平均±SD (n = 3ウェル/アッセイ)である。
【図１４】図14A〜G  ポリクローナルγδ T細胞による腫瘍細胞株パネルのインビトロ溶解。標準的な4時間CRAを、エフェクタ(ポリクローナルγδ T細胞) 対 標的(E:T)比をを増加させながら、(A) 自己B細胞、(B) 同種異系B細胞(4人のドナーのうちの1人)、(C) B-ALL細胞株: cALL-2、(D) 未分化白血球細胞株: Kasumi-3、(E) K562由来aAPCクローン番号4、(F) 膵臓がん細胞株: CaPan-2、MiaPaCa-2、およびSu8686、ならびに(G) 卵巣がん細胞株: A2780、EFO21、EFO27、Hey、IGROV1、OAW42、OVCAR3、およびUPN251に対して行った。各線は個々のγδ T細胞集団(PBドナーに由来する)を表し、溶解データは、2回の独立した実験からプールされた平均±SD (n = 3ウェル/アッセイ)として提示されている。
【図１５】図15A〜D  Vδ T細胞サブセットによる血液学的腫瘍細胞および固形腫瘍細胞の特異的溶解。(A) Jurkat、(B) K562、(C) OC314、および(D) CAOV3がん細胞株を標的とするVδ1 (円形)、Vδ2 (四角形)、およびVδ1negVδ2neg (三角形) γδ T細胞サブセットエフェクタを用いた標準的な4時間CRA。データは、2回の独立した実験からプールされたものであり、CRAでの三つ組の測定値からのドナー平均の平均±SD (n = 4)である。
【図１６】図16A〜B  γδ T細胞サブセットによる長期の死滅化能。(A) CAOV3および(B) UPN251卵巣腫瘍細胞を6ウェルプレートに播種し、終夜インキュベートして、接着を確立した。Vδ1、Vδ2、またはVδ1negVδ2negサブセット由来のT細胞を次いで、2日間、腫瘍細胞と共培養した。残存する接着細胞を酵素によってウェルからはがし、生存細胞を数えた。T細胞なしの腫瘍細胞を陽性対照として利用し、腫瘍細胞なしのT細胞を陰性対照として利用した。死滅化(%) = (生存細胞)共培養 / (生存細胞)腫瘍のみ×100。データは、3回の独立した実験からプールされた平均±SD (n = 3)である。
【図１７】図17A〜C  ポリクローナルγδ T細胞による腫瘍溶解の阻害。(A) IL-2およびIL-21の存在下におけるaAPCクローン番号4に対する22日の増殖後のPB由来ポリクローナルγδ T細胞上のCD3、DNAM1、およびNKG2Dの代表的発現。2回の独立した実験からの4人のドナーのうちの1人を示す。各プロットの右上隅には流れプロットの象限頻度を示す。累積度数(割合)が平均±SD (n = 4)として示されており、ここで各記号は異なるドナーを表す。(B) NKG2D、DNAM1、TCRγδ (クローンB1)、およびTCRγδ (クローンIM)に対する中和抗体を用い、標準的な4時間CRAにおいて、12:1のE:T比でJurkat (左)またはOC314 (右)腫瘍標的の死滅化をブロックした。抗体をT細胞とともに1時間およびCRAの間3 μg/mLでプレインキュベートした。NMSを抗体添加の対照として利用し、抗体なしのウェルを正規化の目的で用いた。特異的溶解を抗体なしのウェルに対して正規化して、以下により定義される相対的な細胞溶解を得た: 相対的な細胞溶解(%) = (特異的溶解)抗体あり / (特異的溶解)抗体なし × 100。データは、2回の独立した実験からプールされた三つ組の正規化CRA測定値の平均 ± SD (n = 4ドナー)である。統計分析にはボンフェローニの事後検定とともに二元ANOVAを用いた。＊p < 0.05, ＊＊p < 0.01、および＊＊＊p < 0.001。(C) 0.3、1、および3 μg/mLの抗体を用いた、ポリクローナルγδ T細胞によるJurkat (左)およびOC314 (右)細胞の細胞溶解の、NMS (円形)、TCRγδ IM抗体(四角形)、またはプールされた(三角形)抗体(DNAM1、NKG2D、TCRγδ (B1)、およびTCRγδ (IM)に特異的)による用量依存的阻害。データは、2回の独立した実験からプールかつ正規化された三つ組の平均 ± SD (n = 4ドナー)である。
【図１８】図18A〜C  IL-2およびIL-21と併せたaAPCに対して増殖/活性化されたポリクローナルγδ T細胞およびγδ T細胞サブセットの養子免疫伝達による卵巣がんのインビボ除去。CAOV3-effLuc-mKate腫瘍細胞(3×106個/マウス)を-8日目にNSGマウスへ腹腔内注射し、PBS (ビヒクル/モック)またはγδ T細胞のどちらかで処置を始める際の0日目まで生着させた。それぞれ、0、7、14、および21日目に3×106、6×106、10×106、および15×106個の細胞により、4通りのT細胞用量を腹腔内投与した。(A)ビヒクル、Vδ1、Vδ2、Vδ1negVδ2neg、およびポリクローナルγδ T細胞処置群における0日目(上パネル)または72日目(下パネル)時点のBLI画像。画像は2回の独立した実験からの6〜14匹のマウスを代表する。(B) 0日目(黒色)および72日目(青色)時点のマウスのBLI測定結果であり、ここで各記号は個々のマウスを表し、直線は平均(n = 6〜14)であり、データは2回の独立した実験からプールされている。スチューデントの対応のある両側t検定を統計分析のために用いており、p値を示してある。(C) ビヒクル(白四角形)またはポリクローナルγδ T細胞(黒四角形)で処置されたマウスの全生存。ゲーハン・ブレスロウ・ウィルコキソン検定を用いて、p値を算出した。H = ハザード比。
【図１９】増強ホタルルシフェラーゼ(effLuc)およびmKateを共発現させるために用いられたDNAプラスミドpLVU3G-effLuc-T2A-mKateS158Aの概略図。注釈  LTR: 長鎖末端反復配列; HIV cPPT: HIVセントラルポリプリン配列（HIV central polyprine tract）; B1: Gatewayドナー部位B1; effLuc: 増強ホタルルシフェラーゼ; T2A: T2Aリボソームスリップ部位; mKate S158A: 増強mKate赤色蛍光タンパク質; B2: Gatewayドナー部位B2; HBV PRE: B型肝炎翻訳後調節要素; HIV SIN LTR: HIV自己不活性化長鎖末端反復配列; ampR: アンピシリン耐性(β-ラクタマーゼ)。
【図２０】γδ T細胞の単離および増殖のための代替的プロトコル。初めに、まずマイクロビーズを用いてCD56+ NK細胞およびTCRαβ+ αβ T細胞を抜き取る。残存する細胞をaAPCの存在下においてインキュベートし、γδ T細胞集団の増殖(propagation)および増大を選択的に促進する。
【図２１】γδ T細胞の増大。新鮮なドナーPBMC由来のCD3+ T細胞が示されており(左パネル)、代替的単離プロトコルを用いた増大後の細胞と比較されている(右パネル)。
【図２２】γδおよびαβ T細胞による膵臓がん細胞株10.05の特異的溶解。標準的な4時間CRAを、エフェクタ(ポリクローナルγδ T細胞) 対 標的(E:T)比を増加させながら、膵臓がん細胞株に対して行った。データは、2回の独立した実験からの平均±SD (n = 3ウェル/アッセイ)である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
例示的態様の説明
ヒトγδ T細胞は天然の抗腫瘍免疫を有するが、しかし臨床におけるその有用性は、他のγδ T細胞系統が腫瘍を認識かつ死滅化しうるにもかかわらず、1つの系統(Vγ9Vδ2)に限られている。γδ T細胞による免疫療法に対するポリクローナルによるアプローチは、腫瘍表面の複数のリガンドを標的化し、治療的効力を最大化し得る。しかしながら、ポリクローナルγδ T細胞の臨床的に適切な増大は、未だ達成されていない。腫瘍表面の複数リガンドの認識は、δおよびγ TCR鎖のヘテロ二量体から構成される、γδ T細胞表面に発現されたT細胞受容体(TCR)によって媒介される。さらに、γδ T細胞TCRは主要組織適合複合体(MHC)拘束外で抗原を認識し、これはMHCとの関連でその抗原を認識するαβ T細胞とは対照的である。それゆえ、MHC非適合性のγδ T細胞を無関係の患者に与え、腫瘍反応性T細胞の万能供給源として機能させることが可能であり得る。したがって、1人のドナーから作製されたγδ T細胞を、ドナーとHLAを共有しうるまたは共有しえない1人または複数人の同種異系のレシピエントへ注入することが可能である。これは、γδ T細胞を事前に調製でき、要求に応じて注入することもできる、「即納の」治療法を提供する。
【００３８】
γおよびδ鎖のヘテロ二量体から構成されるT細胞受容体(TCR)を発現しているT細胞は、悪性細胞を死滅化する能力を示すが、しかしVδ1およびVδ3アイソタイプを発現しているまたはポリクローナルレパートリーを利用している細胞の直接的使用は、未だ達成されていない。本発明者らは、人工の抗原提示細胞(aAPC)をK562腫瘍細胞株から作製し、規定のγδ TCRを発現するヒトT細胞を臨床的に魅力ある数まで増大させた。増殖されたγδ T細胞は、Vδ1、Vδ2、Vδ3、Vδ5、Vδ7、およびVδ8とVγ2、Vγ3、Vγ7、Vγ8、Vγ9、Vγ10、およびVγ11 TCR鎖とを発現していたことから、ポリクローナルであった。ナイーブ、中枢記憶、およびエフェクタ記憶T細胞の集団は、それぞれ、Vδ1、Vδ1negVδ2neg、およびVδ2 TCR鎖の発現によって優位を占められた。腫瘍細胞を溶解させるT細胞の効率は、分化の順(Vδ2>Vδ1negVδ2neg>Vδ1)に従っていた。卵巣がん異種移植片は、Vδサブセットおよびポリクローナルγδ T細胞により有意に除去され、これは処置されたマウスの全生存を有意に増加させた。
【００３９】
本明細書において提供される方法は、(i) ポリクローナルγδ T細胞を作製し、(ii) 頻度および細胞生存性の両方において他の技法よりも大幅に優れている方法でVδ1サブセットの増大をもたらし、(iii) 有毒成分を有するアミノビスフォスフォネートを用いる方法と比べて優れた生存性でVδ2細胞を作製し、ならびに(iv) Vδ1negVδ2negサブセットを成功裏に増殖させる。本方法において用いられるaAPCは、臨床利用に即座に利用可能であり、それゆえ、この技術の臨床移転を円滑化する。Vδ1細胞はヒトに直接注入されたことはない。Vδ1negVδ2negサブセットは、今回、ヒトにおいて初めて試験されうる抗腫瘍免疫を有する。
【００４０】
本開示のaAPC増大技術は、限定的な出発量から、外見的には制限のない数のポリクローナルγδ T細胞を増殖させ、(i)循環血中γδ T細胞の限定的な出発量、(ii) 固定されたクローン型へのγδ T細胞初期集団の極性化、および(iii) 他のT細胞型、すなわち、αβ T細胞に用いられる増大プロトコルではγδ T細胞増殖を維持できないという問題を回避することができる。本開示の技術は、(i) 現在、臨床GMP施設内にあるaAPCを用いること、(ii) aAPCが、少量の末梢血中に存在する出発量から臨床的に適切な数(109超個の細胞)までポリクローナルγδ T細胞を数値的に増大させることができること、および(iii) 腫瘍細胞表面の複数分子を標的化し、同時に、腫瘍が治療法から逃れる機会を最小化しかつ治療的効力を最大化しうる2つ以上の系統のγδ T細胞を用いることという競争優位性を有する。これらのポリクローナルγδ T細胞は、試験されたあらゆる腫瘍型(ALL、CML、結腸がん、卵巣がん、膵臓がん)を死滅化することができるが、しかし無関係の個体由来の正常組織(B細胞)には反応しなかった。かくして、固定されたまたは所望のレパートリーを有する大きなポリクローナルγδ T細胞バンクを作製することができ、例えば、がんの処置のために安全に無関係の患者に投与することが可能であり得る。
【００４１】
本発明は、適応性T細胞療法のための細胞療法製品をもたらし、少なくとも4つの潜在的使用を有する。第1に、ポリクローナルγδ T細胞は、無関係の個体に投与できる腫瘍反応性T細胞の万能供給源として用いることができる。これには商業化の魅力がある。というのは、T細胞の万能供給源は、処置される患者ごとに自己T細胞を作製することに関連した費用を減らすことができるからである。第2に、ポリクローナルγδ T細胞をさらに操作して、その腫瘍反応性を、例えば、特異的腫瘍抗原を標的とするキメラ抗原受容体(CAR)の導入を通じて、高めることができる。第3に、ポリクローナルγδ T細胞はまた、抗ウイルス活性(サイトメガロウイルス(CMV)、エプスタイン・バー・ウイルス(EBV)、およびヒト免疫不全ウイルス(HIV))を有し、免疫不全患者、例えば、造血幹細胞の移植(HSCT)を受けているがん患者においてウイルス感染症の直接的免疫療法および/または日和見感染の防御として用いることができる。第4に、ポリクローナルγδ T細胞の万能セットの移植は細菌感染症および敗血症の制御において用いられうる。
【００４２】
I. 免疫系および免疫療法
いくつかの態様において、医学的障害は、免疫応答を誘発するポリクローナルγδ T細胞集団の移入によって処置される。本発明のある特定の態様において、がんまたは感染は、免疫応答を誘発するポリクローナルγδ T細胞集団の移入によって処置される。したがって、免疫応答の基本的理解が必要である。
【００４３】
適応免疫系の細胞は、リンパ球と呼ばれる、白血球の一種である。B細胞およびT細胞がリンパ球の主要型である。B細胞およびT細胞は同じ多能性造血幹細胞に由来し、それらが活性化されるまでは互いに区別ができない。B細胞は体液性免疫応答において大きな役割を果たすが、T細胞は細胞性媒介免疫応答に密接に関与する。それらは、T細胞受容体(TCR)と呼ばれる特別な受容体が、その細胞表面上に存在することによって、B細胞およびNK細胞のような、他のリンパ球型と区別することができる。ほぼ全ての他の脊椎動物において、B細胞およびT細胞は骨髄中の幹細胞によって産生される。T細胞は胸腺に移動し、胸腺中で発達するものであり、その名称は胸腺に由来している。ヒトでは、リンパ球プールのおよそ1%〜2%が一時間おきに再循環して、抗原特異的リンパ球が第二リンパ組織内でそれらの特異的抗原を見つける可能性を最適化する。
【００４４】
Tリンパ球は骨髄内の造血幹細胞から生じ、典型的には、胸腺に移動して成熟する。αβ T細胞はその膜上に特有の抗原結合受容体(T細胞受容体)を発現し、これは他の細胞の表面上の主要組織適合複合体(MHC)分子と会合した抗原のみを認識可能である。γδ T細胞は、αβ T細胞と異なる循環血中Tリンパ球の小集団である。γδ T細胞は、外来微生物、またはウイルス感染症もしくはがんのようなストレスによって誘導される内因性細胞生産物のどちらかに由来しうるペプチドおよび非ペプチド両方の抗原を認識することができる。αβ T細胞とは異なり、γδ T細胞はMHC拘束されない。
【００４５】
γδ T細胞はαβ T細胞が有する細かな特異性という特徴を欠くので、それらは、感染および腫瘍に対する最前線の監視機能を提供する、より原始的な免疫機構に相当すると提唱されている(Boismenu et al., 1997)。いくつかの研究によって、さまざまなウイルス、細菌および寄生虫に対するγδ T細胞の応答(Bukowski et al., 1994; Wallace et al., 1995; Lang et al., 1995; Elloso et al., 1996)ならびにさまざまな起源の腫瘍細胞の溶解を媒介するその能力(Zocchi et al., 1990; Kitayama et al., 1993; Choudhary et al., 1995)が実証されている。これらの結果から、γδ T細胞はがんおよび感染病の処置において治療的な可能性を持ちうることが示唆される。
【００４６】
II. 態様に関連した方法および組成物
ある特定の局面において、本発明は、ポリクローナルγδ T細胞を作製および/または増大させる方法を含み、この方法には、細胞を人工の抗原提示細胞とともに培養する段階が含まれる。ある特定の局面において、γδ T細胞は、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)、G-CSFでの刺激後に回収されたPBMC、骨髄、または臍帯血に由来するγδ T細胞のような、初代ヒトγδ T細胞である。細胞はaAPCとの共培養でのバルク集団としてエクスビボで数日間、数週間または数ヶ月間、増殖されうる。共培養は103、104、105、106、107もしくは108個のγδ T細胞、またはその中で導出できる任意の数の細胞、および103、104、105、106、107、108もしくは109個のaAPC、またはその中で導出できる任意の数のaAPCで開始されうる。共培養は1対2であるγδ T細胞対aAPCの比率で開始されることが好ましい。
【００４７】
γδ T細胞はIL-2、または共通のγ鎖に結合する他のサイトカイン(例えば、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21など)での刺激によって増大されうる。γδ T細胞の増大は10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100 U/mLのIL-2で刺激されうる; 好ましくは増大は50 U/mLのIL-2で刺激される。γδ T細胞の増大は10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100 ng/mLのIL-21で刺激されうる; 好ましくは増大は30 ng/mLのIL-21で刺激される。刺激は1週間に1、2、3、4、5、6、または7回、好ましくは1週間に3回行われうる。さらなる局面において、増大されたγδ T細胞は凍結保存されうる。
【００４８】
本発明のある特定の態様において、γδ T細胞はそれを必要としている個体、例えばがんまたは感染症を有しうる個体などに送達される。細胞はその後、個体の免疫系を増強して、それぞれのがん、病原性細胞、または病原体感染細胞を攻撃する。場合によっては、個体にγδ T細胞の1回または複数回の投薬を供与する。個体にγδ T細胞の2回またはそれ以上の投薬を供与する場合、投与間の期間は、個体での増殖のための時間を可能とするのに十分とすべきであり、具体的な態様において投薬間の期間は1、2、3、4、5、6、7日またはそれ以上である。γδ T細胞は患者に対して同種異系または自己由来でありうる。
【００４９】
本発明の処置法が有用である腫瘍には、固形腫瘍または血液腫瘍に見出されるものなどの、任意の悪性細胞型が含まれる。例示的な固形腫瘍は、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、頭部、頸部、卵巣、腎臓、喉頭、肉腫、肺、膀胱、黒色腫、前立腺、および乳房からなる群より選択される器官の腫瘍を含むことができるが、これらに限定されることはない。例示的な血液腫瘍には、骨髄の腫瘍、T細胞またはB細胞の悪性疾患、白血病、リンパ腫、芽細胞腫、骨髄腫などが含まれる。本明細書において提供される方法を用いて処置されうるがんのさらなる例としては、肺がん(小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、および肺扁平上皮がんを含む)、腹膜がん、胃がん(消化管がんおよび消化管間質がんを含む)、膵臓がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんまたは子宮がん、唾液腺がん、腎臓がんまたは腎がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、さまざまなタイプの頭頸部がん、および黒色腫が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００５０】
がんは、具体的には、以下の組織型のものでありうるが、これらに限定されることはない: 新生物、悪性; がん腫; がん腫、未分化; 巨細胞紡錘形細胞がん; 小細胞がん; 乳頭状がん; 扁平上皮がん; リンパ上皮がん; 基底細胞がん; 毛質性上皮がん; 移行上皮がん; 乳頭状移行上皮がん; 腺がん; ガストリノーマ、悪性; 胆管がん; 肝細胞がん; 混合型肝細胞がんおよび胆管がん; 索状腺がん; 腺様のう胞がん; 腺腫性ポリープ内腺がん; 腺がん、家族性結腸ポリポーシス; 固形がん; カルチノイド腫瘍、悪性; 細気管支肺腺がん; 乳頭状腺がん; 嫌色素細胞がん; 好酸性細胞がん; 好酸性腺がん; 好塩基性細胞がん; 透明細胞腺がん; 顆粒細胞がん; 濾胞状腺がん; 乳頭状および濾胞状腺がん; 非被包性硬化がん; 副腎皮質細胞がん; 類内膜がん; 皮膚付属器がん; アポクリン腺がん; 皮脂腺がん; 耳垢腺がん; 粘液性類表皮がん; 嚢胞腺がん; 乳頭状嚢胞腺がん; 乳頭状漿液性嚢胞腺がん; 粘液嚢胞腺がん; 粘液性腺がん; 印環細胞がん; 浸潤性腺管がん; 髄様がん; 小葉がん; 炎症性乳がん; パジェット病、乳房; 細葉細胞がん; 腺扁平上皮がん; 扁平上皮化生を伴う腺がん; 胸腺腫、悪性; 卵巣間質性腫瘍、悪性; 莢膜細胞腫、悪性; 顆粒膜細胞腫、悪性; 男性ホルモン産生細胞腫、悪性; セルトーリ細胞がん; ライディヒ細胞腫、悪性; 脂質細胞腫瘍、悪性; パラガングリオーマ、悪性; 乳房外パラガングリオーマ、悪性; 褐色細胞腫; 悪性グロームス腫瘍; 悪性黒色腫; メラニン欠乏性黒色腫; 表在拡大型黒色腫; 悪性黒子黒色腫; 末端性黒子性黒色腫; 結節型黒色腫; 巨大色素性母斑における悪性黒色腫; 類上皮細胞黒色腫; 青色母斑、悪性; 肉腫; 線維肉腫; 線維性組織球腫、悪性; 粘液肉腫; 脂肪肉腫; 平滑筋肉腫; 横紋筋肉腫; 胎児性横紋筋肉腫; 胞巣型横紋筋肉腫; 間質性肉腫; 混合腫瘍、悪性; ミュラー管混合腫瘍; 腎芽細胞腫; 肝芽細胞腫; がん肉腫; 間葉腫、悪性; ブレンナー腫瘍、悪性; 葉状腫瘍、悪性; 滑膜肉腫; 中皮腫、悪性; 未分化胚細胞腫; 胎生期がん; 奇形腫、悪性; 卵巣甲状腺腫、悪性; 絨毛がん; 中腎腫、悪性; 血管肉腫; 血管内皮腫、悪性; カポジ肉腫; 血管周囲細胞腫、悪性; リンパ管肉腫; 骨肉腫; 傍骨性骨肉腫; 軟骨肉腫; 軟骨芽細胞腫、悪性; 間葉性軟骨肉腫; 骨の巨細胞腫瘍; ユーイング肉腫; 歯原性腫瘍、悪性; エナメル上皮歯牙腫; エナメル上皮種、悪性; エナメル上皮線維肉腫; 松果体腫、悪性; 脊索腫; 神経膠腫、悪性; 脳室上衣腫; 星状細胞腫; 原形質性星状細胞腫; 線維性星状細胞腫; 星状芽細胞腫; 神経膠芽細胞腫; 乏突起膠腫; 希突起膠芽細胞腫; 原始神経外胚葉性腫瘍; 小脳肉腫; 神経節芽細胞腫; 神経芽細胞腫; 網膜芽細胞腫; 嗅神経原性腫瘍; 髄膜腫、悪性; 神経線維肉腫; 神経鞘腫、悪性; 顆粒細胞腫瘍、悪性; 悪性リンパ腫; ホジキン病; ホジキン傍肉芽腫; 悪性リンパ腫、小リンパ球性; 悪性リンパ腫、大細胞、びまん性; 悪性リンパ腫、濾胞性; 菌状息肉腫; 他の特定非ホジキンリンパ種; B細胞リンパ腫; 低悪性度/濾胞性非ホジキンリンパ腫(NHL); 小リンパ球性(SL) NHL; 中悪性度/濾胞性NHL; 中悪性度びまん性NHL; 高悪性度免疫芽球性NHL; 高悪性度リンパ芽球性NHL; 高悪性度小型非開裂細胞性NHL; 巨大病変NHL; マントル細胞リンパ腫; AIDS関連リンパ腫; ヴァルデンストレームマクログロブリン血症; 悪性組織球増殖症; 多発性骨髄腫; 肥満細胞肉腫; 免疫増��性小腸疾患; 白血病; リンパ性白血病; 形質細胞性白血病; 赤白血病; リンパ肉腫細胞白血病; 骨髄性白血病; 好塩基球性白血病; 好酸球性白血病; 単球性白血病; 肥満細胞性白血病; 骨髄巨核芽球性白血病; 骨髄肉腫; 毛様細胞性白血病; 慢性リンパ球性白血病(CLL); 急性リンパ性白血病(ALL); 急性骨髄性白血病(AML); ならびに慢性骨髄芽球性白血病。
【００５１】
いくつかの局面において、γδ T細胞は、例えば臍帯血、末梢血、ヒト胚性幹細胞、または人工多能性幹細胞のバンクから得たものである。治療効果に適した用量は、例えば、好ましくは一連の投薬サイクルにおいて、1用量あたり少なくとも105個または約105〜約1010個の細胞であろう。例示的な投薬計画は、0日目に少なくとも約105個の細胞で始めて、例えば患者内用量漸増スキームを始めて数週間以内に約1010個の細胞である目標用量まで漸増させる、4回の用量漸増1週間投薬サイクルからなる。適当な投与様式には、静脈内、皮下、腔内(例えば貯蔵アクセス装置(reservoir-access device)による)、腹腔内、および腫瘍塊中への直接注入が含まれる。
【００５２】
本発明の薬学的組成物は、単独でまたはがんもしくは感染病を処置するのに有用な十分に確立された他の薬剤との組み合わせで用いることができる。単独で送達されようと、他の薬剤との組み合わせで送達されようと、本発明の薬学的組成物はさまざまな経路を介しておよび哺乳類、特にヒトの体内のさまざまな部位に送達されて、特定の効果を達成することができる。当業者は、投与のために2つ以上の経路を使用できるものの、特定の経路が別の経路よりも即時的かつ効果的な反応をもたらしうることを認識するであろう。局所送達または全身送達は、体腔内への処方物の適用もしくは点滴注入を含む投与によって、または筋肉内投与、静脈内投与、門脈内投与、肝内投与、腹腔投与、皮下投与もしくは皮内投与を含む非経口的な導入によって達成することができる。
【００５３】
本発明の組成物は、各投与単位、例えば注射液が所定量の組成物を含有する単位投与形態で、単独でまたは他の活性薬剤との適切な組み合わせで提供することができる。本明細書において用いられる単位投与形態という用語は、ヒトおよび動物対象にとり単回投与量として適した物理的に個別の単位をいい、各単位は所望の効果を生じさせるのに十分な量として算出された所定量の本発明の組成物を、単独でまたは他の活性薬剤との組み合わせで、適切な場合には、薬学的に許容される希釈剤、担体、またはビヒクルとともに含有する。本発明の新規な単位投与形態の仕様は、特定の対象における薬学的組成物に関連した特定の薬力学に依る。
【００５４】
望ましくは、長期にわたる特異的な抗腫瘍応答が確立されて、そのような処置がなければ生じるものと思われるよりも腫瘍のサイズを低減するか、または腫瘍増殖もしくは再増殖を取り除くような、有効な量または十分な数の単離されたポリクローナルγδ T細胞が組成物中に存在し、対象へ導入される。望ましくは、対象へ導入されるポリクローナルγδ T細胞の量は、ポリクローナルγδ T細胞が存在しない、それ以外は同じである条件と比較した場合に腫瘍サイズの10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、または100%の減少を引き起こす。
【００５５】
したがって、投与されるポリクローナルγδ T細胞の量は、投与の経路を考慮すべきであり、所望の治療応答を達成するように十分な数のポリクローナルγδ T細胞が導入されるようなものとすべきである。さらに、本明細書において記述される組成物中に含まれる各活性薬剤の量(例えば、接触される各細胞あたりの量または一定の体重あたりの量)は、用途によって異なりうる。一般に、ポリクローナルγδ T細胞の濃度は、望ましくは、処置されている対象において少なくとも約1×106個〜約1×109個のポリクローナルγδ T細胞、さらにより望ましくは、約1×107個〜約5×108個のポリクローナルγδ T細胞をもたらすのに十分とすべきであるが、それを上回る、例えば、細胞5×108個超の、またはそれを下回る、例えば、細胞1×107個未満の任意の適当な量が利用されてもよい。投薬スケジュールは十分に確立された細胞に基づく治療法に基づくことができ(例えば、Topalian and Rosenberg, 1987; 米国特許第4,690,915号を参照のこと)、または代替の持続注入戦略を利用することもできる。
【００５６】
これらの値は、本発明の実践のために本発明の方法を最適化した後に、実践者により利用されるポリクローナルγδ T細胞の範囲の一般的なガイダンスを与えるものである。本明細書におけるそのような範囲の記述は、特定の適用において正当化されるかもしれないが、より多いまたはより少ない量の成分の使用を決して除外するものではない。例えば、実際の投与量および投与スケジュールは、組成物が他の薬学的組成物と組み合わせて投与されるかどうかに依って、または個人間の薬物動態、薬物消長、および代謝の差異に依って変わりうる。当業者は、特定の状況の要件にしたがっていくらかの必要な調整を容易に行うことができる。
【００５７】
III. 人工の抗原提示細胞
ある場合には、aAPCは態様の治療用組成物および細胞療法製品を調製する際に有用である。抗原提示システムの調製および使用に関する一般的なガイダンスについては、例えば、米国特許第6,225,042号、同第6,355,479号、同第6,362,001号、および同第6,790,662号; 米国特許出願公開第2009/0017000号および同第2009/0004142号; ならびに国際公開番号WO2007/103009を参照されたい。
【００５８】
aAPCシステムは少なくとも1つの外因性補助分子を含みうる。任意の適当な数および組み合わせの補助分子が利用されうる。補助分子は、共刺激分子および接着分子のような補助分子から選択されうる。例示的な共刺激分子としては、CD86およびB7.1 (B7.1は以前はB7として公知であり、CD80としても公知である)が挙げられ、特にT細胞表面上のCD28および/またはCTLA-4分子に結合し、それによって、例えば、T細胞の増大、Th1分化、T細胞短期間生存、およびインターロイキン(IL)-2のようなサイトカインの分泌に影響を与える(Kim et al., 2004参照)。接着分子には、セレクチンなどの炭水化物結合糖タンパク質、インテグリンなどの膜貫通型結合糖タンパク質、カドヘリンなどのカルシウム依存性タンパク質、および細胞間接着分子(ICAM)などの単回膜貫通型免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリータンパク質を含めることができ、これらは、例えば、細胞・細胞間または細胞・マトリックス間の接触を促進する。例示的な接着分子としては、LFA-3およびICAM-1のようなICAMが挙げられる。共刺激分子および接着分子を含む、提示的な補助分子の選択、クローニング、調製、および発現に有用な技法、方法、および試薬は、例えば、米国特許第6,225,042号、同第6,355,479号、および同第6,362,001号に例示されている。
【００５９】
他の好ましい態様において、aAPCを(例えば、化学的処理または照射により)不活性化してもよく、これにより、不活性化後、細胞増殖または複製が本質的に起こらなくなる。したがって、不活性化は、aAPCの重要なAPC機能を維持し、同時に、aAPCを用いて開発された細胞療法生成物の安全性に関する懸念を軽減するのに役立つ。架橋およびaAPCに関連する方法については、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2009/0017000号を参照されたい。その後、不活性化されたaAPC培養物は、ポリクローナルγδ T細胞の治療的に有効な集団を活性化かつ濃縮するのに適正なだけ長い時間維持される。
【００６０】
IV. キメラ抗原受容体
本明細書において用いられる「キメラ抗原受容体(CAR)」という用語は、例えば、人工T細胞受容体Tボディ、一本鎖免疫受容体、キメラT細胞受容体、またはキメラ免疫受容体をいい、特定の免疫エフェクタ細胞へ人為的な特異性を移植する操作された受容体を包含しうる。CARを利用して、T細胞へモノクローナル抗体の特異性を与え、それによって、例えば、養子細胞療法で用いるための、多数の特異的T細胞を作製することを可能にする。具体的な態様において、CARは、例えば、腫瘍関連抗原に対する細胞の特異性を方向付ける。いくつかの態様において、CARは、細胞内活性化ドメイン、膜貫通ドメイン、および長さが異なりかつ腫瘍関連抗原結合領域を含みうる細胞外ドメインを含む。特定の局面において、CARは、CD3-ζ膜貫通ドメインおよびエンドドメインに融合された、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片(scFv)の融合体を含む。他のCARデザインの特異性は、受容体のリガンド(例えば、ペプチド)に由来し、またはデクチンのような、パターン認識受容体に由来しうる。ある場合には、抗原認識ドメインの間隔を改変して、活性化誘発性の細胞死を低減することができる。ある場合には、CARは、CD3-ζ、FcR、CD27、CD28、CD137、DAP10、および/またはOX40のような、さらなる共刺激シグナル伝達のためのドメインを含む。場合によっては、複数の分子をCARとともに発現させることができ、これには、共刺激分子、画像化のための(例えば、陽電子放出断層撮影のための)レポーター遺伝子、プロドラッグの添加時にT細胞を条件的に除去する遺伝子産物、ホーミング受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、およびサイトカイン受容体が含まれる。
【００６１】
本明細書において用いられる「T細胞受容体(TCR)」という用語は、ガンマおよびデルタ(γ/δ)鎖のヘテロ二量体から構成されるT細胞上のタンパク質受容体をいう。本発明の態様において、TCRは、例えばヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、記憶T細胞、調節性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、およびγδ T細胞を含む、TCRを含む任意の細胞において、改変されうる。
【００６２】
本明細書において用いられる場合、「抗原」という用語は、抗体またはT細胞受容体によって結合されうる分子である。抗原は、体液性免疫応答および/または細胞性免疫応答をさらに誘導することができ、Bおよび/またはTリンパ球の産生をもたらす。
【００６３】
本発明の態様は、抗原特異的なキメラ抗原受容体(CAR)ポリペプチドをコードする核酸を包含する核酸を含み、免疫原性を低減させるためにヒト化されたCAR (hCAR)を含み、これは細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、および1つまたは複数のシグナル伝達モチーフを含む細胞外ドメインを含む。ある特定の態様において、CARは、1つまたは複数の抗原間の共用空間から構成されるエピトープを認識しうる。デクチン-1のような、パターン認識受容体は、糖鎖抗原に対する特異性を導出するように用いられうる。ある特定の態様において、結合領域はモノクローナル抗体の相補性決定領域、モノクローナル抗体の可変領域、および/またはその抗原結合断片を含むことができる。別の態様において、その特異性は、受容体に結合するペプチド(例えば、サイトカイン)に由来する。相補性決定領域(CDR)は、抗原を補完し、それゆえ受容体にその特定の抗原に対するその特異性を提供する抗原受容体(例えば、免疫グロブリンおよびT細胞受容体)タンパク質の可変ドメインに見出される短いアミノ酸配列である。抗原受容体の各ポリペプチド鎖は、3つのCDR (CDR1、CDR2、およびCDR3)を含む。抗原受容体は典型的には、2つのポリペプチド鎖から構成されるので、抗原と接触しうる各抗原受容体には6つのCDRが存在する -各重鎖および軽鎖が3つのCDRを含む。免疫グロブリンおよびT細胞受容体に関連した大部分の配列変異は、CDRにおいて見出されるので、これらの領域は超可変ドメインといわれることもある。これらのなかで、CDR3は、これがVJ (重鎖およびTCR αβ鎖の場合にはVDJ)領域の組み合わせによりコードされるので、最大の変異性を示す。
【００６４】
ヒトCAR核酸はヒト患者に向けた細胞免疫療法を増強するためのヒト遺伝子であるものと企図される。具体的な態様において、本発明は完全長CAR cDNAまたはコード領域を含む。抗原結合領域またはドメインは、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,109,304号に記述されているものなどの、特定のヒトモノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片(scFv)のVHおよびVL鎖の断片を含むことができる。断片は、ヒト抗原特異的抗体の任意の数の異なる抗原結合ドメインであることもできる。より具体的な態様において、断片は、ヒト細胞での発現に向けてヒトコドン利用の最適化が行われている配列によってコードされる抗原特異的scFvである。
【００６５】
配置は、例えばダイアボディまたは多量体など、多量体でありうる。多量体は、ダイアボディといわれていたものへの軽鎖および重鎖の可変部分の交差対形成によって形成される可能性が最も高い。構築体のヒンジ部分は、完全に欠失されている状態から、最初のシステインが維持されている状態まで、セリンではなくプロリンの置換まで、最初のシステインまでが切断されている状態までと、多数の選択肢を有することができる。Fc部分は欠失されうる。安定であり、かつ/または二量体化する任意のタンパク質がこの目的に役立ちうる。ただ1つのFcドメイン、例えば、ヒト免疫グロブリン由来のCH2またはCH3ドメインのどちらかを用いることができる。二量体化を改善するように改変されたヒト免疫グロブリンのヒンジ、CH2およびCH3領域を用いることもできる。免疫グロブリンのヒンジ部分だけを用いることもできる。CD8αの部分を用いることもできる。
【００６６】
本発明のキメラ受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、キメラ受容体が配置された免疫細胞の通常のエフェクタ機能の少なくとも1つの活性化に関与する。「エフェクタ機能」という用語は、分化した細胞の特殊化した機能をいう。例えば、T細胞のエフェクタ機能は、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性でありうる。ナイーブ、幹細胞様、記憶、または記憶型T細胞におけるエフェクタ機能は、抗原依存性の増殖を含む。したがって「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクタ機能のシグナルを伝達し、かつ特殊化した機能を果たすように細胞に指令するタンパク質の部分をいう。通常は細胞内シグナル伝達ドメイン全体が利用されるが、多くの場合には細胞内ポリペプチド全体を用いる必要はないであろう。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分がエフェクタ機能のシグナルをなお伝達する限り、細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分に用途がある範囲内で、無傷鎖の代わりにそのような切断部分が用いられうる。したがって細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクタ機能のシグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインのいかなる切断部分も含むよう意図される。例としては、T細胞受容体のゼータ鎖またはその相同体のいずれか(例えば、イータ、デルタ、ガンマまたはイプシロン)、MB1鎖、B29、Fc RIII、Fc RI、およびシグナル伝達分子の組み合わせ、例えばCD3ζおよびCD28、CD27、4-1BB、DAP-10、OX40、ならびにそれらの組み合わせのほかに、他の類似の分子および断片ならびにITAMの修飾などのシグナル伝達部分に対する変異が挙げられる。活性化タンパク質ファミリーの他の成員の細胞内シグナル伝達部分、例えばFcγRIIIおよびFcεRIを用いることができる。
【００６７】
抗原特異的な細胞外ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトIgG4FcヒンジおよびFc領域のような、膜貫通ドメインによって連結されうる。代替物には、ヒトCD4膜貫通ドメイン、ヒトCD28膜貫通ドメイン、膜貫通ヒトCD3ζドメイン、または1つもしくは複数のシステイン変異ヒトCD3ζドメイン、またはCD16およびCD8ならびにエリスロポエチン受容体のような、他のヒト膜貫通シグナル伝達タンパク質由来の他の膜貫通ドメインが含まれる。
【００６８】
いくつかの態様において、CAR核酸は、膜貫通ドメインおよび修飾されたCD28細胞内シグナル伝達ドメインのような、他の共刺激受容体をコードする配列を含む。他の共刺激受容体には、CD28、CD27、OX-40 (CD134)、DAP10、および4-1BB (CD137)の1つまたは複数が含まれるが、これらに限定されることはない。CD3 ζによって開始される一次シグナルに加えて、ヒトCARに挿入されたヒト共刺激受容体により提供されるさらなるシグナルは、T細胞の完全活性化に重要であり、インビボ残留性および養子免疫療法の治療的成功を改善するのに役立ちうる。
【００６９】
特定の態様において、本発明は、単離された核酸セグメントおよびCARをコードするDNA配列を組み入れている発現カセットに関する。本発明のベクターは主に、調節された真核生物プロモーター、例えば、MNDU3プロモーター、CMVプロモーター、EF1αプロモーター、またはユビキチンプロモーターの制御下で所望の遺伝子を免疫細胞、好ましくはT細胞に送達するようにデザインされる。また、ベクターは、他の理由がなければ、インビトロでのその操作を容易とするために、選択可能なマーカーを含んでもよい。他の態様において、CARは、DNA鋳型からインビトロで転写されたmRNAから発現されうる。
【００７０】
キメラ抗原受容体分子は、組み換え体であり、抗原に結合する、かつその細胞質尾部に存在する1つまたは複数の免疫受容体活性化モチーフ(ITAM's)を介して活性化シグナルを伝達するその両方の能力によって区別される。抗原結合部分(例えば、一本鎖抗体から作製された(scFv))を利用する受容体構築体は、それらがHLA非依存的に標的細胞表面上の天然抗原に結合するという点で「万能」であるというさらなる利点を与える。例えば、いくつかの研究室が、CD3複合体のゼータ鎖(ζ)、Fc受容体γ鎖、およびskyチロシンキナーゼの細胞内部分をコードする配列に融合されたscFv構築体に関して報告している。CTLによる腫瘍認識および溶解を含む再指令されたT細胞エフェクタ機構が、いくつかのマウスおよびヒト抗原-scFv: ζシステムにおいて立証されている。
【００７１】
今日まで、非ヒト抗原結合領域は、典型的には、キメラ抗原受容体の構築に用いられている。マウスモノクローナル抗体のような、非ヒト抗原結合領域を用いることに関する潜在的な問題は、ヒトエフェクタ機能性がないことおよび腫瘍塊に侵入することができないことである。言い換えれば、そのような抗体は補体依存性の溶解を媒介することも、抗体依存性の細胞毒性またはFc受容体媒介性の食作用を通じヒト標的細胞を溶解して、CARを発現する細胞を破壊することもできない可能性がある。さらに、非ヒトモノクローナル抗体は外来タンパク質としてヒト宿主により認識されうるので、そのような外来抗体の反復注射は、有害な過敏性反応につながる免疫応答の誘導につながりうる。マウスに基づくモノクローナル抗体の場合、これはヒト抗マウス抗体(HAMA)応答といわれることが多い。それゆえ、ヒト抗体の使用は、それらがマウス抗体と同じくらい強いHAMA応答を引き起こすことはないので、より好ましい。同様に、CARにおけるヒト配列の使用は、免疫を介した認識、それゆえ、レシピエントに存在し、かつHLAとの関連でプロセッシングされた抗原を認識する内因性T細胞による除去を回避することができる。
【００７２】
いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、(a) 細胞内シグナル伝達ドメイン、(b) 膜貫通ドメイン、および(c) 抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。
【００７３】
具体的な態様において、CARにおける細胞内受容体シグナル伝達ドメインは、例えば、T細胞抗原受容体複合体のもの、例えばCD3のζ鎖、同様にFcγRIII共刺激シグナル伝達ドメインであるCD28、CD27、DAP10、CD137、OX40、CD2などを単独でまたはCD3ζとの系列で含む。具体的な態様において、細胞内ドメイン(これは細胞質ドメインといわれることもある)は、TCRζ鎖、CD28、CD27、OX40/CD134、4-1BB/CD137、FcεRIγ、ICOS/CD278、IL-2Rβ/CD122、IL-2Rα/CD132、DAP10、DAP12、およびCD40のうちの1つまたは複数の一部または全部を含む。いくつかの態様において、細胞内ドメインにおいて内因性T細胞受容体複合体の任意の部分を利用する。いわゆる第三世代のCARは、例えば相加効果または相乗効果のため、ともに融合された少なくとも2つまたは3つのシグナル伝達ドメインを有するので、1つまたは複数の細胞質ドメインが利用されうる。
【００７４】
キメラ抗原受容体のある特定の態様において、受容体の抗原特異的部分(これは抗原結合領域を含む細胞外ドメインといわれることもある)は、デクチン-1のようなパターン認識受容体によって認識される糖鎖抗原を含む腫瘍関連抗原または病原体特異的抗原結合ドメインを含む。腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の細胞表面に発現される限り、いかなる種類のものであってよい。腫瘍関連抗原の例示的な態様としては、CD19、CD20、がん胎児性抗原、αフェトプロテイン、チロシン-プロテインキナーゼ膜貫通受容体(ROR)1、CA-125、MUC-1、CD56、EGFR、c-Met、AKT、Her2、Her3、上皮腫瘍抗原、黒色腫関連抗原、変異p53、変異rasなどが挙げられる。ある特定の態様において、腫瘍関連抗原の量が少ない場合には持続性を改善するために、CARを膜結合サイトカインと共発現させることができる。例えば、CARを膜結合IL-15と共発現させることができる。
【００７５】
ある特定の態様において、HA-1、サバイビン、WT1、およびp53のような、細胞内腫瘍関連抗原が標的化されうる。これは、HLAとの関連で細胞内腫瘍関連抗原から表現されるプロセッシングされたペプチドを認識する万能T細胞上に発現されたCARによって達成されうる。さらに、万能T細胞を遺伝子操作して、HLAとの関連で細胞内プロセッシング腫瘍関連抗原を認識するT細胞受容体のペアリングを発現させてもよい。
【００７６】
病原体はいかなる種類のものであってよいが、しかし具体的な態様において、病原体は、例えば真菌、細菌、またはウイルスである。例示的なウイルス病原体としては、アデノウイルス科(Adenoviridae)のファミリーのもの、エプスタイン・バー・ウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、JCウイルス、BKウイルス、HSV、HHVファミリーのウイルス、ピコルナウイルス科(Picornaviridae)、ヘルペスウイルス科(Herpesviridae)、ヘパドナウイルス科(Hepadnaviridae)、フラビウイルス科(Flaviviridae)、レトロウイルス科(Retroviridae)、オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)、パポバウイルス科(Papovaviridae)、ポリオーマウイルス(Polyomavirus)、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)、およびトガウイルス科(Togaviridae)が挙げられる。例示的な病原性ウイルスは天然痘、インフルエンザ、おたふく風邪、はしか、水痘、エボラおよび風疹を引き起こす。例示的な病原性真菌としては、カンジダ菌(Candida)、アスペルギルス菌(Aspergillus)、クリプトコッカス菌(Cryptococcus)、ヒストプラスマ菌(Histoplasma)、ニューモシスティス菌(Pneumocystis)、およびスタキボトリス菌(Stachybotrys)が挙げられる。例示的な病原性細菌としては、連鎖球菌(Streptococcus)、シュードモナス菌(Pseudomonas)、赤痢菌(Shigella)、カンピロバクター菌(Campylobacter)、ブドウ球菌(Staphylococcus)、ヘリコバクター菌(Helicobacter)、大腸菌(E. coli)、リケッチア菌(Rickettsia)、バシラス菌(Bacillus)、ボルデテラ菌(Bordetella)、クラミジア菌(Chlamydia)、スピロヘータ菌(Spirochetes)、およびサルモネラ菌(Salmonella)が挙げられる。1つの態様において、病原体受容体デクチン-1を用いて、真菌の細胞壁上の糖鎖構造を認識するCARを作製することができる。デクチン-1の特異性に基づいてCARを発現するように遺伝子操作されたT細胞は、アスペルギルス菌を認識し、菌糸成長を標的化しうる。別の態様において、ウイルス決定基(例えば、CMVおよびエボラ由来の糖タンパク質)を認識してウイルス感染症および病態を妨げる抗体に基づいて、CARを作製することができる。
【００７７】
いくつかの態様において、病原性抗原は、CARにおける細胞外ドメインが例えばデクチン-1を介して真菌細胞壁の糖質のパターンを認識する、アスペルギルス菌糖質抗原である。
【００７８】
本発明によるキメラ免疫受容体は、当技術分野において公知の任意の手段によって産生されうるが、組み換えDNA技法を用いて産生されることが好ましい。キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸配列は、標準的な分子クローニング技法(ゲノムライブラリスクリーニング、PCR、プライマー支援ライゲーション、酵母および細菌由来のscFvライブラリ、部位特異的突然変異誘発法など)により調製され、完全なコード配列へアセンブルされうる。得られたコード領域は発現ベクターへ挿入され、適当な発現宿主の同種異系T細胞株を形質転換させるために用いられうる。
【００７９】
本明細書において用いられる場合、核酸構築体もしくは核酸配列またはポリヌクレオチドは、T細胞へ形質転換または導入され、転写かつ翻訳されて、産物(例えば、キメラ抗原受容体)を産生しうるDNA分子を意味するように意図される。
【００８０】
本発明において利用される例示的な核酸構築体(ポリヌクレオチド)において、プロモーターは、本発明のキメラ受容体をコードする核酸配列と機能的に連結され、すなわち、それらは、キメラ受容体をコードするDNAからのメッセンジャーRNAの転写を促進するように配置される。プロモーターはゲノム由来のものであってよく、または合成により作製されてもよい。T細胞で用いるための種々のプロモーターは、当技術分野において周知である(例えば、CD4プロモーター)。プロモーターは構成的または誘導的であってよく、ここで誘導は、例えば特定の細胞型または特定のレベルの成熟に関連している。あるいは、いくつかの周知のウイルスプロモーターも適している。関心対象のプロモーターには、β-アクチンプロモーター、SV40初期および後期プロモーター、免疫グロブリンプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーター、ならびに脾フォーカス形成ウイルスプロモーターが含まれる。プロモーターはエンハンサーに関連付けられていても、関連付けられていなくてもよく、ここでエンハンサーは、特定のプロモーターに天然に関連付けられていてもよく、または異なるプロモーターに関連付けられていてもよい。
【００８１】
キメラ受容体をコードする読み取り枠の配列は、ゲノムDNA源、cDNA源から得られてもよく、もしくは合成されてもよく(例えば、PCRによって)、またはその組み合わせであってもよい。ゲノムDNAのサイズおよびイントロンの数に依って、cDNAまたはその組み合わせを用いることが望ましいことがある。というのは、イントロンはmRNAを安定化させ、またはT細胞特異的な発現を提供することが分かっているからである。また、mRNAを安定化させるために、内因性または外因性の非コード領域を用いることもさらに有利でありうる。
【００８２】
本発明のキメラ抗原受容体の発現のため、キメラ受容体のN末端構成要素をコードする核酸配列の天然のまたは内因性の転写開始領域を用いて、標的宿主においてキメラ受容体を作製することができる。あるいは、構成的または誘導的発現を可能にする外因性転写開始領域が用いられてもよく、ここで標的宿主、所望の発現のレベル、標的宿主の性質などに依って、発現を制御することができる。
【００８３】
同様に、キメラ受容体を表面膜に方向付けるシグナル配列は、キメラ受容体のN末端構成要素の内因性シグナル配列であることができる。任意で、場合によっては、この配列を異なるシグナル配列と交換することが望ましいこともある。しかしながら、選択されるシグナル配列は、キメラ受容体がT細胞の表面に提示されるように、T細胞の分泌経路に適合すべきである。
【００８４】
同様に、キメラ受容体のC末端構成要素をコードする核酸配列の天然のまたは内因性の転写終結領域によって、終結領域が提供されうる。あるいは、終結領域は異なる供給源から得られてもよい。ほとんどの場合に、終結領域の供給源は、通常、組み換えタンパク質の発現に重要であるとは考えられず、発現に悪影響を与えることなく広範囲の終結領域を利用することができる。
【００８５】
当業者によって理解されるように、場合によっては、CARにおける抗原結合ドメインの末端の数個のアミノ酸を、例えば、通常は10個以下、さらに通常は5個以下の残基を、欠失させることができる。同様に、境界に少数のアミノ酸、通常は10個以下、さらに通常は5個以下の残基を導入することが望ましい場合もある。アミノ酸の欠失または挿入は構築における必要性の結果としてであり得、好都合な制限部位、操作の簡易性、発現レベルの改善などをもたらす。さらに、同様の理由で、1つまたは複数のアミノ酸の、異なるアミノ酸での置換を行うことができ、通常は任意の1つのドメインにおいて約5個超のアミノ酸を置換することはない。
【００８６】
本発明によるキメラ受容体をコードするキメラ構築体は、従来の方法で調製することができる。ほとんどの場合に、天然の配列が利用されうるので、適宜、さまざまな構成要素の適切な結合を可能とするために、天然の遺伝子が単離され、操作されうる。したがって、遺伝子の望ましくない部分の欠失をもたらす適切なプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を利用することによって、キメラ受容体のN末端およびC末端タンパク質をコードする核酸配列を単離することができる。あるいは、クローニングされた遺伝子の制限消化物を用いて、キメラ構築体を作製することができる。どちらの場合も、平滑末端化されている、または相補的な重複部分を有する制限部位を提供するように、配列を選択することができる。
【００８７】
キメラ構築体を調製するためのさまざまな操作をインビトロで実行することができ、特定の態様において、キメラ構築体は標準的な形質転換または形質移入の方法を用い、適切な宿主におけるクローニングおよび発現のためのベクターに導入される。したがって、各操作の後に、DNA配列の結合から得られる構築体をクローニングし、ベクターを単離し、望ましいキメラ受容体を配列がコードすることを確実とするように配列をスクリーニングする。制限分析、配列決定などによって、配列をスクリーニングすることができる。
【００８８】
本発明のキメラ構築体は、がんを有する対象においてまたはがんを有するのではないかと疑われる対象において、腫瘍のサイズを低減することにより、または腫瘍の増殖もしくは再増殖を抑止することにより、これらの対象において用途が見出される。したがって、本発明はさらに、本発明のキメラ構築体を対象の単離されたT細胞に導入し、かつ形質転換されたT細胞を対象に再導入し、それによって抗腫瘍応答をもたらして対象において腫瘍を低減または除去することにより、対象において増殖を低減するためのまたは腫瘍形成を抑止するための方法にさらに関する。使用できる適当なT細胞には、細胞傷害性リンパ球(CTL)または破壊を必要としているT細胞受容体を有する任意の細胞が含まれる。当業者には周知であるように、対象からこれらの細胞を単離するためにさまざまな方法が容易に利用可能である。例えば、細胞表面マーカー発現の使用または市販のキット(例えば、Pierce, Rockford, I11.のISOCELL(商標))の使用が挙げられる。
【００８９】
キメラ構築体を裸のDNAとして対象自身のT細胞にまたは適当なベクターに導入できることが企図される。裸のDNAを用いてエレクトロポレーションによりT細胞を安定的に形質移入する方法は、当技術分野において公知である。例えば、米国特許第6,410,319号を参照されたい。裸のDNAは一般に、発現に適した方向でプラスミド発現ベクターに含まれる、本発明のキメラ受容体をコードするDNAをいう。好都合なことに、裸のDNAを用いることで、本発明のキメラ受容体を発現するT細胞を産生させるのに必要な時間が低減される。
【００９０】
あるいは、ウイルスベクター(例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクター)を用いて、キメラ構築体をT細胞に導入することができる。あるいは、運搬に関与するDNAおよびmRNA種のような、非ウイルスベクターを用いることができ、これにはSleeping Beautyシステムが含まれる。他のプラスミドには、エピソームプラスミドとして存在するDNA種が含まれる。本発明の方法によって用いるのに適したベクターは、対象のT細胞において非複製的である。ウイルスに基づく多数のベクターが公知であり、ここで細胞内で保持されるウイルスのコピー数は、細胞の生存能を維持するのに十分なほど少ない。例示的なベクターとしては、本明細書において開示されるpFB-neoベクター(STRATAGENE(登録商標))およびHIV、SV40、EBV、HSV、またはBPVに基づくベクターが挙げられる。
【００９１】
形質移入または形質導入されたT細胞が所望の調節によっておよび所望のレベルで表面膜タンパク質としてキメラ受容体を発現できることが確立されたら、キメラ受容体が宿主細胞において機能して所望のシグナル誘導を提供するかどうか判定することができる。その後、形質導入されたT細胞を対象に再導入または投与して、対象での抗腫瘍応答を活性化する。投与を容易にするため、本発明によって形質導入されたT細胞は薬学的組成物にされてもよく、またはさらに薬学的に許容されうる適切な担体もしくは希釈剤とともに、インビボでの投与に適したインプラントにされてもよい。そのような組成物またはインプラントを作製する手段は、当技術分野において記述されている(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mack, ed. (1980)を参照のこと)。適切な場合には、形質導入されたT細胞を、個別の投与経路のための通常の方法で、カプセル、溶液、注射液、吸入剤、またはエアロゾルのような、半固体または液体形態の製剤に処方することができる。当技術分野において公知の手段を利用して、組成物が標的組織もしくは臓器に達するまで組成物の放出および吸収を抑止もしくは最小化することができ、または組成物の持続放出を確実にすることができる。しかしながら、望ましくは、キメラ受容体を発現する細胞を無効にしない薬学的に許容される形態が利用される。したがって、望ましくは、形質導入されたT細胞を平衡塩類溶液、好ましくはハンクス平衡塩類溶液、または通常の生理食塩水を含有する薬学的組成物にすることができる。
【００９２】
V. 本発明のキット
本明細書において記述される組成物のいずれも、キット中に含まれうる。いくつかの態様において、同種異系の、ポリクローナルγδ T細胞がキット中で提供され、このキットは、培地、aAPC、増殖因子、および/またはサイトカインのような、細胞を増大させるのに適した試薬を含むこともできる。
【００９３】
キットは、本発明の1つもしくは複数の適切に分注された組成物または本発明の組成物を作製するための試薬を含んでもよい。キットの構成要素は、水媒体に入れてまたは凍結乾燥された形態でパッケージングされうる。キットの容器手段には、その中に構成要素が配され、好ましくは適切に分注されうる、少なくとも1つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器手段が含まれうる。キット内に2つ以上の構成要素が存在する場合、キットは一般に、さらなる構成要素を個別に入れられる第2の、第3の、または他のさらなる容器も含む。しかしながら、構成要素のさまざまな組み合わせがバイアル内に含まれうる。本発明のキットはまた、典型的には、ポリクローナルγδ T細胞を含有するための手段、および商業的販売のため厳重に密封された任意の他の試薬容器を含む。そのような容器は、例えば、所望のバイアルが保持される、射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器を含みうる。
【実施例】
【００９４】
VI. 実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含まれる。以下の実施例において開示される技法は、本発明の実践において良好に機能するように本発明者らによって発見された技法を表し、かくして、その実践にとって好ましい様式を構成すると考えられうることが当業者によって認識されるはずである。しかし、当業者は、本開示に照らして、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなしに多くの変化を、開示される具体的態様においてなすことができ、それでもなお、同様または類似の結果を得ることができると認識するはずである。
【００９５】
実施例1 - がん免疫療法のためのγδ T細胞のサブセット
γδ T細胞は、例えばK562細胞に対してなど、内因性の抗がん活性を有する(D'Asaro et al., 2010; Lamb et al., 1999)ことを考慮して、本発明者らは、腫瘍細胞が細胞基質を供給して、ポリクローナルγδ T細胞を増殖させうるかどうか試験した。K562細胞は、人工の抗原提示細胞(aAPC)として機能してαβ T細胞およびNK細胞をエクスビボで活性化させかつ数値的に増大させるように遺伝子操作されている(Denman et al., 2012; Maus et al., 2002; Numbenjapon et al., 2006; Singh et al., 2013; Suhoski et al., 2007)。本発明者らは、サイトカインとの組み合わせで、γ線照射されたK562由来aAPC (クローン番号4と命名、CD19、CD64、CD86、CD137L、およびIL-15の膜結合型突然変異タンパク質; mIL15を共発現するように遺伝子操作されている)が、Vδ1、Vδ2、Vδ3、Vδ5、Vδ7、およびVδ8をVγ2、Vγ3、Vγ7、Vγ8、Vγ9、Vγ10、およびVγ11 TCRとともに発現するポリクローナルT細胞の増殖を維持しうることを明らかにした。本発明者らは、これらのサブセットが分化状態(ナイーブ、中枢記憶、およびエフェクタ記憶)に関して異なり、かつ腫瘍細胞を死滅化させるその能力が異なることを実証する。これらの比較は養子免疫療法、がん生物学、および免疫学に対して意味を持つ。
【００９６】
aAPCに対するポリクローナルγδ T細胞のエクスビボでの数値的増大は、共刺激およびサイトカインに依る
γδ T細胞の養子免疫伝達には、末梢血単核細胞(PBMC)の出発数が限定的である(リンパ球プールに対してゲーティング: 3.2%±1.2%; 平均±標準偏差(SD); n = 4)ことから、エクスビボでの増殖を要する。PBMCから単離されたγδ T細胞を、可溶性組み換えIL-2およびIL-21の存在下で共刺激分子を発現するように操作されたγ線照射K562由来aAPC (クローン番号4)に対して22日間共培養し、これによって、CD3およびTCR γδを均一的に共発現するT細胞集団の増殖(97.9%±0.6%; 平均±SD; n = 4; 図1A)が引き起こされた。NK細胞(CD3negCD56+)およびαβ T細胞(TCR αβ+)は、これらの培養物に存在していなかった(図1B)。この増殖に対するアプローチにより3週間のうちに106個未満の全始原細胞から109個超のγδ T細胞が得られ(図1C)、これは4.9×103±1.7×103 (平均±SD; n = 4)倍の増加に相当していた。TCRδ1+TCRδ2neg、TCRδ1negTCRδ2+、およびTCRδ1negTCRδ2negの集団が共培養後に検出されたことから、aAPCがポリクローナルγδ T細胞増殖を支持することが示唆された(図1Fおよび1G)。このように、aAPCおよび組み換えヒトサイトカインは、PBMCに由来するわずかな出発数のγδ T細胞からのポリクローナルγδ T細胞の大幅な数値的増大を支持した。
【００９７】
aAPCに対する外因性サイトカインの添加および共刺激分子(mIL15、CD86、およびCD137L)の存在を、γδ T細胞の増殖を支持するその能力について評価した。親K562細胞を遺伝子操作して個々の共刺激分子を発現させ、クローニングを行って均質発現を達成し(図2)、γδ T細胞の増殖に及ぼす導入分子の影響を評価した。外因性IL-2およびIL-21との共培養をγδ T細胞および5セットのγ線照射K562: (i) 親、(ii) mIL15+、(iii) mIL15+CD86+、(iv) mIL15+CD137L+、および(v) mIL15+CD86+CD137L+ (クローン番号4)で開始した。γδ T細胞をサイトカインありかつAPCなしと並行して培養したことで、可溶性IL-2およびIL-21がγδ T細胞のごく限られた数値的増大を支持することが実証された(図1D)。親K562細胞を加えた場合に増殖が高まったことから、これらの細胞の内因性分子が増殖のためにγδ T細胞を活性化しうることが示唆された。CD86ありまたはなしでのmIL15の発現は、親K562と比べてγδ T細胞の増殖能をさらに改善させるように思われなかった。対照的に、mIL15+CD137L+およびmIL15+CD86+CD137L+ aAPCの共培養でγδ T細胞の有意に高い増殖率が観察された。かくして、サイトカインの存在下においてK562細胞に対するγδ T細胞の増殖を維持するにはCD137Lが重要であるものと思われる。IL-2およびIL-21がクローン番号4に対する共培養から除去された場合、γδ T細胞の増殖は停止し、合わせて、これらのサイトカインはγδ T細胞増殖率に対する相加的利点を示した(図1E)。これにより、aAPCクローン番号4をIL-2およびIL-21の両方と組み合わせて、エクスビボでγδ T細胞の増殖を推進させる手法が確証された。
【００９８】
aAPCに対する新生児γδ T細胞のエクスビボでの数値的増大
同種異系の臍帯血(UCB)を用いて、造血幹細胞の移植(HSCT)を受けている患者での造血を回復させる。造血を回復させるために回収されたUCB単位内の単核細胞の存在量が限られていることで、養子免疫伝達に直接利用可能な新生児γδ T細胞の数が抑制される。したがって、本発明者らは、低減された出発数のγδ T細胞からの増殖をaAPCが持続させるかどうか評価した。蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いて、104個(典型的UCB単位の約0.01%)のUCB由来γδ T細胞を単離し、これをIL-2およびIL-21とともにaAPCクローン番号4に対して共培養した。35日後に、平均1011個のUCB由来γδ T細胞(範囲: 6×109〜3×1011; n = 5)が104個の開始γδ T細胞から増殖されたので、細胞数の107倍の増加が認められた(図3A)。さらに2回の刺激をPBMCと比べてUCBに由来するγδ T細胞に対し行って、臨床的に妥当な数までのその増殖能を浮き彫りにした。γδ T細胞集団はCD3およびTCRγδの均一な共発現を示し(図3B)、TCRαβ+ T細胞(図3C)およびCD3negCD56+ NK細胞(図3D)を欠いていた。まとめると、これらのデータから、IL-2およびIL-21とともに用いられた場合のaAPCクローン番号4は小さな出発集団からのUCB由来γδ T細胞のエクスビボ増殖を持続させうることが実証される。
【００９９】
γδ T細胞は、aAPCに対する増殖後にポリクローナルなかつ規定されたTCRγδレパートリーを発現する
γδ T細胞がaAPCに対して数値的に増大することができたことの立証に基づき、本発明者らは、増殖された細胞のTCRレパートリーの判定を試みた。γδ T細胞におけるTCR発現の多様性を定量化する「直接的TCR発現アレイ」(DTEA)と名付けられた非酵素的デジタル多重アレイをここで利用して、aAPCにより増大されたγδ T細胞がポリクローナルTCRレパートリーを示したかどうか評価した(Zhang et al., 2012)。8種中4種のVδ対立遺伝子(Vδ1、Vδ2、Vδ3、およびVδ8) (図4A)が、PBMC由来γδ T細胞において検出され、これらはVγ2、Vγ7、Vγ8 (2つの対立遺伝子)、Vγ9、Vγ10、およびVγ11と共発現された(図4B)。同様に、Vδ2細胞の存在量は低減し、Vγ2細胞は増え、ならびにPBMC由来ではVγ3、Vδ5、およびVδ7細胞の存在は認められなかったが、UCBから増大されたγδ T細胞においてVδおよびVγ鎖のポリクローナルTCRレパートリーが観察された(図4Cおよび4D)。このように、aAPCは、PBMCおよびUCBの両方からのポリクローナルTCRレパートリーを維持しているγδ T細胞を増大させた。
【０１００】
本発明者らは、TCRδ特異的抗体でポリクローナル集団を選別することにより、および単離された培養物に対してDTEAを繰り返すことにより、これらのmRNAデータの検証を試みた。市販されているTCRδ特異的mAbは2つしかなく、それらにより、PBMC (図1Fおよび1G)ならびにUCB (図5)からaAPCにより増大されたγδ T細胞内にVδ1>Vδ1negVδ2neg>Vδ2に従うTCRδ頻度で3つの個別のVδ集団(Vδ1: TCRδ1+TCRδ2neg、Vδ2: TCRδ1negTCRδ2+、およびVδ1negVδ2neg: TCRδ1negTCRδ2neg)が特定されたが、これはDTEAを裏付けるものであった。PBMC由来γδ T細胞プールからFACSにより単離されたサブセットを、個別の集団としてクローン番号4により増殖させたが、それらはTCRδアイソタイプの発現によって評価した場合にその同一性を維持しており(図6Aおよび6B)、選別されたサブセットの間でaAPCに対する増殖率の差異は認められなかった(図6C)。DTEAによって、これらの単離されたVδ1、Vδ2、およびVδ1negVδ2neg集団が、それぞれ、Vδ1＊01 (図6D)、Vδ2＊02 (図6E)、およびVδ3＊01 (図6F) mRNAを主に発現することが実証された。他のVδ2対立遺伝子(Vδ1＊01_07およびVδ1＊01_75)の発現は、ポリクローナルγδ T細胞(図4A)および選別されたサブセットの各々にはなかった。Vδ発現について選別された3つのT細胞サブセットにおいては、少量のVδ4 (図7A)、Vδ5 (図7B)、Vδ6 (図7C)、およびVδ7 (FIG. 7D) mRNA種が検出された。Vδ8 mRNAは選別されたVδ1negVδ2neg細胞にもっぱら存在しており(図7E)、これらのT細胞はPBMC由来のバルクγδ T細胞におけるVδ8の主な寄与体である可能性が高い(図4A)。まとめて、これらの結果から、(i) 単離されたVδ1およびVδ2サブセットがVδ mRNA発現に関して純粋であったことが示され、(ii) PBMC由来のTCRδ1negTCRδ2negγδ T細胞がVδ3およびVδ8 mRNAを主に発現したことが実証され、かつ(iii) Vδ1、Vδ2、およびVδ1negVδ2neg T細胞サブセットがaAPCに対して別々に増殖されうることが立証される。
【０１０１】
次にDTEAを用いてVγ TCR用法(Vγ TCR usage)を評価し、単離された3つのVδサブセットの各々のなかでの対立遺伝子のペアリングおよびVγレパートリーについての洞察を得た。全体として、Vδ1およびVδ1negVδ2negサブセットは、Vγ鎖とのその対形成において違いがなかった(p = 0.419; 二元ANOVA)が、Vγ発現はVδ1 T細胞(p < 0.0001)およびVδ1negVδ2neg T細胞(p < 0.0001)の両方と比べてVδ2 T細胞において有意に違っていた。このことは、各Vγ対立遺伝子の傾向においても認められ、ここでVδ1およびVδ1negVδ2neg T細胞は、Vδ2 T細胞と異なっていた(図8)。実際に、Vγ2＊02 (図8B)、Vγ8＊01M (図8G)、Vγ＊01X (図8H)、Vγ9＊01 (図8I)、およびVγ9＊02 (図8J) mRNA種の存在量に関しVδサブセット間で有意差が検出された。かくして、各Vδサブセット内での多様なVγ mRNA用法はIL-2およびIL-21とともにaAPCに対する増殖時に達成されるポリクローナルレパートリーを増強する。本発明者らの知る限り、これは今日までに、Vδ1、Vδ2、およびVδ1negVδ2negサブセットを発現するT細胞間のVγ用法の最も詳細な評価である。
【０１０２】
増殖されたγδ T細胞サブセットは、その治療的な可能性を予測する異なるマーカーを発現する
記憶、ホーミング、および細胞溶解などのT細胞機能は、その表面表現型によって予測することができる。本発明者らはマーカーのパネルを探索して、ポリクローナルγδ T細胞を特徴付けた(図9)。aAPCに対する22日の共培養後、全部ではないが、大部分のγδ T細胞がCD4negCD8negであった。これらのT細胞は、CD38およびCD95の発現によって測定された場合に活性化されたが、しかしCD57およびプログラム死-1 (PD-1)の発現がないことによって証明されたように使い尽くされなかった。大部分の細胞がCD27およびCD28共刺激リガンドを発現し、ナイーブ(CD45RA)マーカーと比較して、抗原を経験した(CD45RO)マーカーへの選好性を有していた。皮膚、リンパ節、および骨髄へのそのホーミングの可能性が、それぞれ、CCR4、CCR7/CD62L、およびCXCR4/CLAの発現によって実証された。これらのデータは、活性化し抗原を経験し、記憶形成および組織へのホーミングの可能性を持ったγδ T細胞を増殖させるaAPCの能力と一致している。
【０１０３】
本発明者らの増殖に対するアプローチにより、本発明者らはVδ1、Vδ2、およびVδ1negVδ2neg 系統を識別することが可能となり、かくして、本発明者らは、γδ T細胞の亜集団が、その治療的な可能性を予測するマーカーの発現の明白な差異を持ちうるかどうか調べた。本発明者らは、TCRγδに対するmAb染色の強度により、異なるMFIを有する集団が特定されることに注目した(図1A)。Vδ2 T細胞はTCRγδ低の分類(43 ± 9; 平均 ± SD; n = 4)に対応し、Vδ1negVδ2neg T細胞はTCRγδ中間の分類(168 ± 40)に対応し、Vδ1 T細胞はTCRγδ高の分類(236 ± 56)に対応していた(図10Aおよび10B)。CD4およびCD8はγδ T細胞には通常発現されないが、しかし分離されたサブセットにおけるCD4およびCD8の発現にはバラツキが検出された(図10Cおよび10D)。Vδ2細胞とは異なるものとしてVδ1およびVδ1negVδ2neg集団を示したCCR7/CD62L (図10E)およびCD27/CD28 (図10F)を含めて、αβ T細胞の間で記憶細胞を類型化するために用いられる規定マーカーの発現において差異が認められた。しかし、ヒトγδ T細胞記憶がCD27およびCD45RAの発現に基づいて報告されており(図10G)、ここでCD27+CD45RA+、CD27+CD45RAneg、CD27negCD45RAneg、およびCD27negCD45RA+はそれぞれ、TN、TCM、TEM、およびTEMRAに対応する(Caccamo et al., 2011; Pang et al., 2012)。大部分のTN細胞がVδ1であり、大部分のTCMがVδ1negVδ2negであり、大部分のTEM細胞がVδ2であり、全てのVδサブセットが少なくともいくらかのTN、TCM、およびTEM集団を有していた。対照的に、Vδサブセットのいずれにおいても実質的にTEMRAは検出されなかった(図10Gおよび10H)。これらの異なる免疫表現型を考慮して、本発明者らは、異なる機能的属性が3つのγδ T細胞サブセットに起因しうるものと提唱する。
【０１０４】
γδ T細胞サブセットは腫瘍に応じて産生されるインターフェロン-γを予測する
γδ T細胞は活性化に応じてサイトカインを産生することができる。それゆえ、サイトカインおよびケモカインの多重分析を行って、aAPCにより増殖されたγδ T細胞が治療の間に炎症環境を育てるかどうか判定した。ホルボールミリスチン酸アセテート(PMA)およびイオノマイシンを白血球活性化カクテル(LAC)として用い、TCR活性化を模倣した。培地でモック活性化された細胞を陰性対照として利用した。LACにより処理されたγδ T細胞からはTH2サイトカインIL-4、IL-5およびIL-13の有意な産生は認められなかったが、しかしベースラインからのIL-10産生には微増が認められた(図11A)。対照的に、IL-lRA、IL-6、およびIL-17は、TH17炎症応答と一致してLACにより処理されたγδ T細胞によって有意に分泌された(図11B)。さらに、炎症性TH1サイトカインIL-2、IL-12 (p70)、インターフェロン-γ (IFNγ)、および腫瘍壊死因子-α(TNFα)は、モック処理対照と比べてLACへの曝露によりγδ T細胞によって有意に産生された(図11C)。ケモカインCCL3 (マクロファージ炎症タンパク質-1α; MIP1α)、CCL4 (MIP1β)、およびCCL5 (活性化調節性正常T細胞発現分泌タンパク質; regulated on activation, normal T cell expressed and secreted (RANTES)が大量に検出された(図11D)。CCR5はこれらのケモカインの3つ全てに結合する(Rostene et al., 2007)が、しかしγδ T細胞の6% ± 2% (平均 ± SD; n = 4)しか、この受容体を発現していなかった。全体として、γδ T細胞の非特異的活性化は細胞に基づく免疫療法の場合に望まれるように、主として炎症性応答につながった。
【０１０５】
IFNγは、評価された全てのサイトカインのうちで最も応答性であり(図11C)、腫瘍に対するγδ T細胞応答のマーカーとして選択された。細胞内サイトカイン発現を用いて、フローサイトメトリーによりVδ T細胞サブセットを分離し、腫瘍に対するその応答を評価した(図12A〜C)。aAPCにより増殖/活性化されたポリクローナルγδ T細胞と卵巣がん細胞との共培養は、それぞれ、855 ± 475、242 ± 178、および194 ± 182 (mean ± SD; n = 4)のIFNγ MFIによって示されるように、Vδ2 > Vδ1 > Vδ1negVδ2negに従うIFNγ産生の階層をもたらした(図12D)。IFNγの産生はTCRγδ中和抗体でブロックされたことから、腫瘍に対するこのサイトカイン応答はγδ T細胞サブセットの各々でTCRγδを通じて媒介されることが示唆された(図12D〜F)。これらのデータは、サイトカイン応答が、TCRγδによって特定されるγδ T細胞サブタイプに依存していたという前提を支持している。
【０１０６】
ポリクローナルγδ T細胞およびVδ T細胞サブセットは広範囲の腫瘍細胞を溶解する
aAPCにより増殖/活性化されたγδ T細胞が活性化されて、前炎症性メディエータを産生しうることを立証した後で、本発明者らは、広範囲の腫瘍細胞株を溶解するその能力について調べた(図13および14)。ポリクローナルγδ T細胞は、自己由来または同種異系の正常B細胞に対して細胞溶解を実質的に示さなかったが、しかし同種異系のB細胞急性リンパ性白血病(ALL)細胞株であるRCH-ACVおよびcALL-2を死滅化することが可能であった。T細胞ALL細胞株Jurkatも細胞溶解に感受性であったことから、γδ T細胞を用いて、B細胞悪性腫瘍およびT細胞悪性腫瘍の両方を標的化できることが示唆された。Kasumi-3は、γδ T細胞によって死滅化されたCD33+CD34+未分化型白血球細胞株であり、これはγδ T細胞での最未分化型腫瘍の標的化を支持するものである。慢性骨髄性白血病(CML)細胞株K562およびK562に由来するクローン番号4のaAPCは、ポリクローナルγδ T細胞によって死滅化された。膵臓がん細胞株BxPc-3、CaPan-2、MiaPaCa-2、およびSu8686は、結腸がん細胞株HCT-116と同様に、γδ T細胞によって溶解された。10種の卵巣細胞株は、以下の順序の感度減少でポリクローナルγδ T細胞により死滅化された: CAOV3 > EFO21 > UPN251 > IGROV1 > OC314 > Hey > A2780 > OVCAR3 > OAW42 > EFO27。これらの細胞溶解データは、広範囲の腫瘍をインビトロで特異的に死滅化する同種異系のポリクローナルγδ T細胞の能力を際立たせている。
【０１０７】
本発明者らは次に、分離された3つのγδ T細胞集団の死滅化能を測定した。血液学的(Jurkat)腫瘍細胞株ならびにK562腫瘍細胞株ならびに固形(OC314およびCAOV3)腫瘍細胞株は、全3つのVδ系統によって溶解された(図15)。全ての標的に対してはっきりとした溶解順が認められ、4時間アッセイ法において死滅化能を規定する順位はVδ2>>Vδ1negVδ2neg>Vδ1であった(図15)。これはT細胞分化免疫表現型と一致していた。というのは、TEM細胞の頻度がVδ2>Vδ1negVδ2neg>Vδ1に従っており(図10H)、TEM細胞は低分化型T細胞と比べてさらに高いエフェクタ能を保有することが報告されている(June, 2007)からである。長期アッセイ法を行って、Vδサブセットおよび腫瘍細胞間の48時間の共培養後の死滅化を評価した(図16)。2日以内に3つ全てのサブセットによって95%超のCAOV3およびUPN251腫瘍細胞が除去された。まとめて、これらのデータは、aAPCに対して増殖された各Vδ系統が、異なる効率であるとはいえ、腫瘍を溶解することが可能であって、Vδ1negVδ2neg亜集団の抗腫瘍活性が初めて観察されたことを立証するものであった。
【０１０８】
腫瘍溶解の効率はTCRγδ、NKG2D、およびDNAM1に影響される
本発明者らは、T細胞による細胞溶解が、受容体を抗体でブロックすることによりTCRγδに直接依存しているかどうかの判定を試みた。実験手法では、γδ T細胞が、死滅化のためにT細胞およびNK細胞の両方を活性化しうる、DNAM1およびNKG2Dを共発現すること(図17A)を考慮に入れた(Bauer et al., 1999; Gilfillan et al., 2008)。NKG2D、DNAM1、およびTCRγδに特異的な抗体(クローンB1)は、JurkatおよびOC314細胞の溶解の低減に対してわずかな影響しか及ぼさなかった。対照的に、TCRγδをブロックする抗体(クローンIM)は、Jurkat細胞およびOC314細胞の両方の死滅化を低減させた(図17B)。抗体(NKG2D、DNAM1、TCRγδを結合する)プールは、用量依存的に、Jurkat (65% ± 8%の低減)細胞およびOC314 (71% ± 10%の低減)細胞の、γδ T細胞を介した細胞溶解のさらなる低減をもたらした(図17Bおよび17C)。全体として、これらの結果から、死滅化のためのaAPC増殖/活性化γδ T細胞の活性化は多因子性であるが、しかしTCRγδに依存することが実証された。
【０１０９】
定着卵巣がん異種移植片はγδ T細胞の養子免疫伝達によって除去される
aAPCにより増殖/活性化されたポリクローナルγδ T細胞の養子免疫伝達が、ヒトがんの免疫療法として提唱されている。これをモデル化するため、NSGマウスにCAOV3-effLuc-mKate卵巣がん細胞の腹腔内(i.p.)注射を与え、次いで処置群に無作為に分けた。8日の生着後、ビヒクル、Vδ1、Vδ2、Vδ1negVδ2neg、またはポリクローナルγδ T細胞をマウスにi.p.投与(漸増用量)した(図18)。実験中、非侵襲的生物発光画像法(BLI)で腫瘍量を連続的にモニタリングした。定着腫瘍(図18A上パネルおよび18B)は、ビヒクル(モック)処置マウスにおいて成長し続けたが、しかしVδ1 (p = 0.001)、Vδ2 (p < 0.001)、Vδ1negVδ2neg (p < 0.001)、およびポリクローナル(p < 0.001) γδ T細胞で処置されたマウスにおいては有意に低減された(図18A下パネルおよび18B)。ポリクローナルγδ T細胞による処置は、モック処置マウスと比べて全生存(p = 0.0001)を改善させたが、ここで90%のマウスが卵巣がん異種移植片を切り抜けて生き残り、処置なしのマウスのハザード比は20.4であった(図18C)。3つのVδサブセットがインビボで腫瘍を標的化するその能力について比較されたのはこれが初めてであり、インビボ抗腫瘍活性に関するVδ1negVδ2neg T細胞の、これが初めての評価である。要するに、γδ T細胞は、インビボでがんを処置するのに有効であり、したがって、細胞に基づくがん処置への魅力的なアプローチとなる。
【０１１０】
実施例2 - 材料および方法
細胞株および細胞培養
HCT-116 (カタログ番号CCL-247)、Kasumi-3 (カタログ番号CRL-2725)、およびK562 (カタログ番号CCL-243)細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC; Manassas, VA)から得た。Jurkat (カタログ番号ACC 282)細胞株は、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Germany)から受け取った。K562細胞は、既述(Manuri et al., 2010; Singh et al., 2011)のようにaAPC (クローン番号4)として機能するように遺伝子操作した。B細胞急性リンパ性白血病(B-ALL)細胞株であるcALL-2およびRCH-ACV細胞株は、Jeff Tyner博士(OHSU)から贈与され、膵臓がん細胞株(BxPC-3、CaPan-2、MiaPaCa-2、およびSu8686)はViji Ramachandran博士(MDACC)から寄贈され、卵巣がん細胞株(A2780、CAOV3、EFO21、EFO27、Hey、IGROV1、OAW42、OC314、OVCAR3、およびUPN251)はRobert C. Bast, Jr.博士(MDACC)から提供された。細胞培養物は、(i) RPMI (Gibco, Grand Island NY): K562親細胞、aAPCクローン番号4、aAPCクローンA6、aAPCクローンA3、aAPCクローンD4、Jurkat、cALL-2、RCH-ACV、Kasumi-3、A2780、EFO21、EFO27、Hey、IGROV1、OC314、OVCAR3、およびUPN251、(ii) DMEM (Sigma, St. Louis, MO): 293-METR、CAOV3、BxPC-3、CaPan-2、MiaPaCa-2、OAW42、およびSu8686、または(iii) McCoy's 5A (Sigma): HCT-116中で維持された。各培地に10%熱不活化ウシ胎仔血清(Hyclone, Logan, UT)および1% GLUTAMAX(登録商標)-100 (Gibco)を補充した。UPN251およびOAW42細胞にインスリン-トランスフェリン-セレン溶液(Gibco)を補充した。細胞は、37℃で5% CO2を含む加湿条件の下で培養した。
【０１１１】
γδ T細胞の増殖
末梢血単核細胞(PBMC)および臍帯血(UCB)は、インフォームドコンセントの承諾が得られた後に、Ficoll-Hypaque (GE Healthcare)によって健常ボランティアから単離された(Singh et al., 2008)。108個の融解されたPBMCをCD56マイクロビーズ(カタログ番号130-050-401, Miltenyi Biotec, Auburn, CA)で最初に処理し、LSカラム(カタログ番号130-042-401, Miltenyi Biotec)にて分離し、培養物からNK細胞を枯渇させた。CD56枯渇選別からの非標識細胞を次に、TCRγ/δ+ T細胞単離キット(カタログ番号130-092-892, Miltenyi Biotec)で標識し、LSカラムに配して、非標識画分中のγδ T細胞を、マグネットに付着された他の細胞から分離した。γδ T細胞を完全培地(CM; RPMI, 10% FBS, 1% GLUTAMAX(登録商標))中、外因性IL-2 (Aldeleukin; Novartis, Switzerland; 50 U/mL, aAPC添加日の初めに1週間に3回添加した)およびIL-21 (カタログ番号AF20021; Peprotech, Rocky Hill, NJ; 30 ng/mL, aAPC添加日の初めに1週間に3回添加した)の存在下において1個のT細胞と2個のγ線照射(100 Gy) aAPC (クローン番号4)との比率で刺激した。細胞を可溶性サイトカインの存在下において2〜5週間、7日ごとにaAPCの添加により連続的に再刺激した。aAPCクローン番号4上のCD19、CD64、CD86、CD137L、およびeGFP (IgG4 Fc stalkにインフレームで融合され、かつeGFPと共発現されるIL-15ペプチド)の共発現の検証を、T細胞培養物への添加の前に行った(Singh et al., 2011)。蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いて、Vδ1 (Vδ1+Vδ2neg)、Vδ2 (Vδ1negVδ2+)、およびVδ1negVδ2neg (Vδ1negVδ2neg)集団を単離し、これらを上記のようにaAPCクローン番号4で2回刺激し、表現型決定し、機能的アッセイ法に用いた。UCB由来γδ T細胞を、抗TCRγδおよび抗CD3 mAbを用いて、融解された単核細胞からFACSによって単離し、PBMCのようにaAPC/サイトカインにて5週間刺激した。
【０１１２】
aAPCに対するγδ T細胞の共培養
増殖についてサイトカインに対するγδ T細胞の依存性を評価するため、共培養物を105個のγδ T細胞および2×105個のaAPC (クローン番号4)から始め、次いで等量の(i) CM、(ii) CMおよび100 U/mL IL-2、(iii) CMおよび60 ng/mL IL-21、または(iv) CM、100 U/mL IL-2、および60 ng/mL IL-21に加えた。共培養を始めてから9日後にCELLOMETER(登録商標) Auto T4細胞計数器(Nexcelom, Lawrence, MA)を用いT細胞を数えて、収率を判定した。K562細胞を1つまたは複数の共刺激分子により遺伝子操作して、3種の新たなaAPCを作製した(図2)。IL-15Rαにインフレームで融合されたIL-15ペプチドを発現するSleeping Beauty (SB)トランスポゾンおよびSB11トランスポザーゼを、NUCLEOFECTOR(登録商標) II (Lonza, Basel, Switzerland)およびKit V (cat# VCA-1003, Lonza)でヌクレオフェクションにより親K562細胞(CD86negおよびCD137Lneg)へ同時に電気的に導入した。FACSを用いてmIL15+細胞を単離し、クローン(クローンA6と命名; mIL15+CD86negCD137Lneg)を樹立し、これに次いで、SB11およびCD86またはCD137Lを発現するSBトランスポゾンをエレクトロポレーションした。細胞を再度FACS選別して、クローンA3 (mIL15+CD86+CD137Lneg)およびD4 (mIL15+CD86negCD137L+)を得た。共培養を、100 U/mL IL-2および60 ng/mL IL-21を補充したCM中で105個のγδ T細胞から始め、これを、2×105個のγ線照射された(i) 親K562細胞、(ii) クローンA6、(iii) クローンA3、(iv) クローンD4、(v) クローン番号4 aAPC、または(vi) aAPCなし、に加えた。サイトカイン実験について上述したように開始から9日後にT細胞を数えた。
【０１１３】
フローサイトメトリー
細胞を、表1に詳述されている抗体で表現型決定した。アイソタイプ対照を用いて、ゲーティングを検証した。染色をFACS緩衝液(リン酸緩衝生理食塩水, 2%ウシ胎仔血清, 0.1%アジ化ナトリウム)中にて4℃で20〜30分間行い、染色の前におよび染色の間にFACS緩衝液による2回の洗浄を行った。細胞内染色を固定化および透過処理の後に、BD CYTOFIX/CYTOPERM(商標) (BD Biosciences, San Diego, CA)により4℃で20分間行った。細胞内染色を4℃で30分間、Perm/Wash緩衝液, 10%ヒトAB血清中で行った。FITC、PE、PerCP/Cy5.5、およびAPC抗体をそれぞれ、1：20、1：40、1：33、および1：40の希釈で用いた。サンプルをFACSCalibur(商標) (BD Biosciences, San Jose, CA)にて取得し、FlowJoソフトウェア(バージョン7.6.3)で分析した。
【０１１４】
DTEAによるmRNA分子の存在量および同一性
aAPCに対する共培養後の指定された時点で、T細胞を細胞106個あたりRLT Buffer (Qiagen) 160 μLの比率で溶解し、-80℃で凍結した。RNA溶解物を解凍し、関心対象のmRNAを検出するために多重化された標的特異的な色分けレポーターおよびビオチン化された捕捉プローブを用いた65℃で最低限12時間のハイブリダイゼーションの後にNCOUNTER(登録商標) Analysis System (NanoString Technologies, Seattle, WA)を用いてすぐに分析した。2つのCodeSetを、選択されたmRNA転写産物のRefSeqアクセッション番号から作製し、デザイナTCR発現アッセイ(DTEA)のための特異的なレポーターおよび捕捉プローブ対を作製するために用いた。(i) 非標的分子に対するレポーター・捕捉プローブ対の交差ハイブリダイゼーションによるオフターゲット効果を最小化し、(ii) 特定の遺伝子に対する全部ではないが、大部分の転写産物変種を標的化し、かつ(iii) 効率的にハイブリダイズするレポーター・捕捉NCOUNTER(登録商標)プローブ対を特定した。DTEAデータをスパイク陽性対照RNAとハウスキーピング遺伝子(ACTB、G6PD、OAZ1、POLR1B、POLR2A、RPL27、Rps13、およびTBP)の両方に対して正規化した。スパイクされた陽性対照正規化因子を、個々のサンプルの計数の合計で割った全サンプルの合計の平均から算出した。スパイクされた陽性対照正規化因子を、個々のサンプルの計数の幾何平均で割った全サンプルの幾何平均の平均から算出した。正規化された計数を報告した。
【０１１５】
サイトカイン分泌
サイトカインの発現を細胞内染色によって評価し、組織培養上清へのサイトカインの分泌をLUMINEX(登録商標)多重分析によって評価した。前者について、γδ T細胞を正常マウス血清(NMS; Jackson ImmunoResearch)またはTCRγδブロッキング抗体(クローンIMMU510 (IM); Thermo Fisher, Pittsburg, PA)のいずれかとともに0.6、2.0、および6.0 μg/mLの濃度で1時間37℃でインキュベートした。T細胞を次に、等しい量および数の標的細胞(CAOV3またはOC314)に加えて、0.3、1.0、および3.0 μg/mLの抗体終濃度を得た。共培養物をブレフェルジンA (GolgiPlug; BD Biosciences)の存在下において37℃で6時間インキュベートして、サイトカインのエキソサイトーシスおよび分泌をブロックした。共培養物を次に、表面マーカー、例えば、(i) CD3、TCRδ1、およびTCRδ2について染色し、(ii) BD CYTOFIX/CYTOPERM(商標) (カタログ番号555028, BD Biosciences)で固定化かつ透過処理し、(iii) 細胞内IFNγについて染色し、ならびに(iv) フローサイトメトリーによって分析した。サイトカイン分泌を評価するための共培養物をCM (モック処理)または白血球活性化カクテル(LAC; 5 ng/mL PMAおよび500 ng/mLイオノマイシン)中で24時間インキュベートし、三つ組のウェルからの上清をプールして、LUMINEX(登録商標) 100 (xMap Technologies, Austin, TX)を用いBIO-PLEX(登録商標) Human Cytokine Group I 27-plex Assay (カタログ番号L50-0KCAF0Y, BioRad Technologies, Hercules, CA)によって分析した。
【０１１６】
クロム放出アッセイ法
既述(Singh et al., 2011)のように、標準的な4時間CRAを用いてインビトロでの特異的溶解を評価した。健常ドナー由来のB細胞をCD19マイクロビーズ(カタログ番号130-050-301, Miltenyi Biotec)で各アッセイ日に単離し、標的細胞として用いた。NKG2Dに特異的な抗体(クローン1D11; BD Biosciences)、DNAM1に特異的な抗体(クローンDX11; BD Biosciences)、TCRγδに特異的な抗体(クローンB1; BD Biosciences)、およびTCRγδに特異的な抗体(クローンIM)を12:1のE:T比にてCRA中0.3、1.0、および3.0 μg/mLで中和実験に用いた。NMSを同じ濃度で陰性対照として用い、抗体なしのウェルをデータ正規化の目的に用いた。
【０１１７】
長期死滅化アッセイ法
接着腫瘍細胞(CAOV3またはUPN251)を細胞4×104個/ウェルの密度で12ウェルプレート中に播種した。翌日、5×105個のγδ T細胞を各ウェルに加え、かつ同数を腫瘍細胞なしのウェル(培地のみ)に加えた。腫瘍細胞のうちの1ウェルには、増殖用の陽性対照として加えられた等量のCMが含まれた。2日後に、上清を集め、ウェルをPBSで洗浄し、残存している腫瘍細胞をトリプシン-EDTAにより集め、数えた。残存している腫瘍細胞の存在量を、モック処理した腫瘍細胞に対して正規化した。
【０１１８】
レンチウイルスパッケージングおよびCAOV3細胞の形質導入
レンチウイルス粒子を他(Turkman et al., 2011)で記述されているプロトコルの修正版にしたがってパッケージングし、BLI (Rabinovich et al., 2008)による非侵襲的画像化のために腫瘍細胞へ増強ホタルルシフェラーゼ(effLuc)を導入した。手短に言えば、パッケージング細胞(293-METR)をT125フラスコに配し、翌日、製造元の使用説明書(Invitrogen)にしたがいLipofectamine 2000トランスフェクション試薬とともにpCMV R8.2、VSV-GおよびpLVU3G-effLuc-T2A-mKateS158A (図19)プラスミドでトランスフェクションした。ウイルス粒子をトランスフェクションから48時間および72時間後に集め、100 kDa NMWLフィルタ(カタログ番号UFC810096, MilliPore, Billerica, MA)を通して濃縮した。CAOV3細胞を6ウェルプレートにプレーティングし、翌日、effLuc-mKateをコードするウイルスを8 μg/mLのポリブレンとともに加えた。プレートを1.5時間1,800 rpmで回転させ、6時間後に、ウイルス馴化上清をDMEM完全培地と交換し、これを翌日に変えた。親細胞株と同じ形態を呈した形質導入CAOV3の単個細胞クローンを限界希釈法により得、クローン1C2を選んだ。というのは、クローン1C2は高い(106超のシグナル対ノイズ比) effLuc活性で均一のmKate蛍光を有していたからである。
【０１１９】
マウス実験
インビボでの抗腫瘍効力をNSGマウス(NOD.Cg-PrkdcscidI12rγtm1Wjl/SzJ; Jackson Laboratories)において評価した。CAOV3-effLuc-mkate (クローン1C2; 細胞3×106個/マウス)腫瘍を腹腔内(i.p.)注射によって樹立し、マウスを複数の処置群へ無作為に分配した。8日後(0日目に指定した)に、γδ T細胞を腹腔内投与し、陰性対照としてPBSを腹腔内投与し、用量漸増投与計画を始めた。T細胞用量は0、7、14、および21日目に、それぞれ、3×106、6×106、107、および1.5×107個であった。非侵襲的BLIを実験期間中に行い、IVIS(登録商標)-100 Imager (Caliper)で検出した場合の、D-ルシフェリン(カタログ番号122796, Caliper, Hopkinton, MA)皮下投与後のCAOV3-effLuc-mKateの腫瘍量を連続的に測定した。LIVING IMAGE(登録商標)ソフトウェア(バージョン2.50, Xenogen, Caliper)を用いてBLIを分析した。
【０１２０】
（表１）用いた抗体
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【０１２１】
実施例3 - 考察
本研究では、血液悪性腫瘍および固形腫瘍に対して幅広い反応性を保持する複数のγδ T細胞集団の持続的増殖のための細胞プラットフォームとしてaAPCクローン番号4を樹立する。ある特定のVδ TCR用法を発現するT細胞が、がんに対する臨床応答に関連付けられている。例えば、Vδ1 T細胞は治療法のために直接的には注入が行われていない。本発明者らのデータは、これらの細胞が抗腫瘍免疫を媒介し、がん治療法に向けてVδ1 T細胞の養子免疫伝達を支持しうることを立証する。本発明者らの増殖された/活性化されたVδ2 T細胞は、最も高い、腫瘍細胞の死滅化およびサイトカイン産生を示した。腫瘍の標的化におけるVδ1negVδ2neg-T細胞の役割は、これまで知られていなかった; しかしながら、本発明者らの結果は、Vδ1negVδ2neg細胞が抗腫瘍活性を示し、このサブセットが免疫不全患者にとって有益でもありうることを直接的に示す。全体として、本明細書におけるデータは、腫瘍および日和見ウイルス感染症の処置として全てのVδ TCR型の発現を維持するγδ T細胞の養子免疫伝達を促進するものである。
【０１２２】
操作されたaAPCを用いて、ポリクローナルTCRレパートリーを維持しかつ腫瘍を死滅化させるが正常細胞は死滅化させない能力を有した多数のγδ T細胞を作製することができる。ポリクローナルγδ T細胞を注入するアプローチは、炎症性サイトカインの産生ならびにインビトロおよびインビボで腫瘍に対し直接の細胞毒性を及ぼすことを含むある範囲のエフェクタ機能を示すTN、TCM、およびTEM γδ T細胞を作製するというaAPCの能力によってさらに支持される。クローン番号4は、現行の適正製造規範(cGMP)を順守しマスター細胞バンクとして産生されており、ヒトに応用するための臨床用γδ T細胞を作製することへの明瞭な道となる。臨床試験ではこれから、初めて、感染を処置する可能性を持った、固形腫瘍および血液学的腫瘍の両方に対するTCRγδ治療法のポリクローナルレパートリーを維持するT細胞養子免疫伝達の効力について試験することができる。
【０１２３】
実施例4 - γδ T細胞の単離および増殖のための代替プロトコル
代替的γδ T細胞単離手順
患者バフィーコート由来の末梢血単核細胞(PBMC)は、常磁性マイクロビーズとともにインキュベートし、磁場の存在下において強磁性球(Miltenyi)で構成される連続カラムに通すことによって、CD56+ナチュラルキラー(NK)細胞およびαβ T細胞が枯渇された。さらに多数のリンパ球集団の中でも、γδ T細胞を含有する残りの細胞を、IL-2およびIL-21の存在下において改変K562活性化かつ増殖化細胞(aAPC)に対して培養し、γδ T細胞の選択的増大をもたらす(図20参照)。
【０１２４】
この単離の方法は、CD56ビーズおよびTCRαβビーズの両方が臨床用試薬として利用可能であるので、有利である。提唱される増大プロトコル(IL-2およびIL-21の存在下においてaAPCを用いる)は、同じものである。
【０１２５】
新鮮ドナーPBMC由来のCD3+ T細胞を、改変された単離プロトコルを用いて増大後の細胞と比較した。当初、γδ T細胞は末梢血中で少数集団である。aAPCに対する増殖に先立ってNK細胞およびαβ T細胞を枯渇させることにより、γδ T細胞の増大が可能となった(図21)。
【０１２６】
CD56+およびTCRαβ+細胞の連続的枯渇後にPBMCから増大されたγδ T細胞による膵臓がん細胞株の特異的溶解を図22に示す。γδ T細胞は膵臓がん細胞株に対する固有の活性を示したが、αβ T細胞はそうでなかった。
【０１２７】
実施例5 - γδ T細胞の増殖のためのさらなる代替プロトコル
γδ T細胞は、違った帰結に至る異なった抗CD3抗体クローンを用いて誘発される(Dopfer et al., 2014)。例えば、クローンOKT3を用いて、γδ T細胞からサイトカイン産生を誘導することができ、クローンUCHT1を用いて、標的細胞に対するさらに高い細胞毒性を誘導することができる。
【０１２８】
γδ T細胞はまた、IL-2およびIL-21の存在下においてOKT3、UCHT1、もしくは両抗体を負荷したaAPCに対して; またはIL-2およびIL-21の存在下においてOKT3、UCHT1、もしくは両抗体を負荷したマイクロビーズに対して増殖される。
【０１２９】
インビトロおよびインビボでさまざまながん細胞株および原発がんに対抗する際のγδ T細胞の有効性は、さまざまな増大機構にしたがって試験されるであろう。
【０１３０】
本明細書において開示され主張される方法は全て、本開示に照らして過度の実験を行うことなく作製および実行されうる。本発明の組成物および方法を好ましい態様に関して記述してきたが、本明細書において記述される方法に対して、および方法の段階においてまたは段階の順序において、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく変形が適用されうることが当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連するある特定の薬剤を、本明細書において記述される薬剤の代わりに用いてもよく、それでも同じまたは類似の結果が達成されることは明らかであろう。当業者には明らかなそのような類似の置換および修正は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲および概念の範囲内にあると考えられる。
【０１３１】
参考文献
以下の参考文献は、それらが、本明細書において記載されるものの補足となる例示的な手順のまたはその他の詳細を提供する限りにおいて、参照により本明細書に明確に組み入れられる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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