(57)【要約】  患者におけるCMV感染の存在を認識する方法であって、-患者から得られる全血試料におけるCD28neg/CD27neg CD4 Ｔ細胞のレベルを測定すること；-CMVに感染していない対照群のレベルとCD28neg/CD27neg CD4 Ｔ細胞のレベルを比較すること；および-患者におけるCD28neg/CD27neg CD4 Ｔ細胞のレベルが対照群のCD28neg/CD27neg CD4 Ｔ細胞のレベルよりも著しく高い場合にCMV感染の存在を特徴づけることによる前記方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者におけるCMV感染の存在を認識する方法であって、
-患者から得られる全血試料におけるCD28neg/CD27neg CD4 Ｔ細胞のレベルを測定すること；
-CMVに感染していない対照群のレベルとCD28neg/CD27neg CD4 Ｔ細胞のレベルを比較すること；および
-患者におけるCD28neg/CD27neg CD4 Ｔ細胞のレベルが対照群のCD28neg/CD27neg CD4 Ｔ細胞のレベルよりも著しく高い場合にCMV感染の存在を特徴づけること
による前記方法。
【請求項２】
CD28neg/CD27neg CD4 Ｔ細胞のPD-1発現を測定し、この発現が経時的に増加するかどうかをウイルス血症の指標とする、非活動性CMV感染と活動性CMV感染とを区別するための、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫不全患者、移植レシピエントまたは新生児においてCMV感染によって引き起こされる合併症のリスク評価のための、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
抗ウイルス薬でのCMVの治療の進行をモニターするための、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
CD28neg/CD27neg CD4 Ｔ細胞のレベルがフローサイトメトリーによって測定される、請求項１〜４の少なくとも１つに記載の方法。
【請求項６】
CD28neg/CD27neg CD4 Ｔ細胞のレベルが、それぞれ別々に標識したCD4、CD27、CD28、およびPD-1に対する抗体を用いる複数色分析によって測定される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
CD28、CDs27、CD4およびPD-1に対する抗体と混合し、次いで周囲温度でインキュベートし、溶解液を添加し、次いでインキュベートし、細胞を分離し、フローサイトメトリーを行うことによって血液試料が処理される、請求項１〜６の少なくとも１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、CMV感染の存在を認識する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトメガロウイルス(CMV)は、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)またはヒトヘルペスウイルス5型(HHV5)とも呼ばれ、多くの感染症を引き起こす。詳しくは、http://en.wikipedia.org/wiki/Human_cytomegalovirusを参照されたい。
【０００３】
このウイルスは、ヒトの感染個体の細胞内に終世存続する。この疾患が終了した後であっても、そのヒトの終生、このウイルスが体液を介して無症状で断続的に排出される場合がある。HCMVの初感染では、多くの場合重篤な症状がほとんど見られないため、その感染個体は、その個体が感染していることを自覚さえしない。このウイルスは、まれに、長期の発熱および頸部アデノパシーを含む単核球症様症候群に関連する場合がある。さらに、免疫適格個体において、まれに関節痛および関節炎、大腸炎、肺炎、肝炎または心筋炎に付随して初感染が生じる場合がある。健常集団の60%までが、リンパ組織に終世存続するHCMVを有している。
【０００４】
対照的に、周産期および免疫不全個体においてはCMV感染は顕著である。これらの個体には、臓器移植患者、幹細胞移植患者、細胞増殖抑制剤で治療した患者または、エイズを患っておりCD4+レベルが低い個体が含まれる。長期の免疫抑制によってウイルス複製が制御されず重篤な疾患が生じる恐れのある、臓器移植または幹細胞移植後の免疫不全患者においては、CMV関連疾患症状ははるかに一般的である。このリスクは、免疫抑制剤のレベルに加えて、主としてドナーおよびレシピエントのCMV感染状態によって決定される。CMV関連合併症のリスクは、陰性移植片のCMV陰性レシピエントにおいて最も低い。レシピエントがCMV陽性である場合、このリスクは中程度に高いが、CMV陰性患者がCMV陽性ドナーから移植片を受容する場合にこのリスクは最も高い。これらの環境下では、CMV感染は、ほとんどの器官において、核または細胞質における巨細胞を示すリンパ球または形質細胞の間質性感染をもたらす。しばしば肺炎、網膜炎、大腸炎および肝炎が生じる。細菌によるさらなる重感染が引き起こされる場合があり、これは致死性の合併症をもたらす恐れがある。
患者の臨床症状を呈するCMV疾患と、診断検査（CMV-PCRまたはpp65抗原による血液中のCMVの検出）後にのみ認識することができるCMV感染とは区別される。残念ながら、これらの診断テストは最適ではない。例えばCMV-PCRは25%の偽陽性結果を示す。
【０００５】
Sesterらは、Transplantation 2001 (Sester M, Sester U, Gartner B, Heine G, Girndt M, et al. (2001) Levels of virus-specific CD4 T cells correlate with cytomegalovirus control and predict virus-induced disease after renal transplantation. Transplantation 71: 1287-1294)およびAJT 2005 (Sester U, Gartner BC, Wilkens H, Schwaab B, Wossner R, et al. (2005) Differences in CMV-specific T-cell levels and long-term susceptibility to CMV infection after kidney, heart and lung transplantation. Am J Transplant 5: 1483-1489.)において、改善された検出法に関して報告している。しかしながら、この方法は、それが長時間行われ（結果が得られるまで約8時間）、さらに、Ｔ細胞は機能的に無傷でなければならず、そのため例えば試料を永続して約4℃(2℃〜6℃)に冷却して分析する骨の折れる処置と試料採取後24時間以内に測定を行うことを必要とするため好ましくない。
【０００６】
Jesser et al. 2006 (Jesser RD, Li S, Weinberg A (2006) Regulatory T cells generated during cytomegalovirus in vitro stimulation of mononuclear cells from HIV-infected individuals on HAART correlate with decreased lymphocyte proliferation. Virology 352: 408-417.)およびTovar-Salazar et al 2010 (Tovar-Salazar A, Patterson-Bartlett J, Jesser R, Weinberg A (2010) Regulatory function of cytomegalovirus-specific CD4+CD27-CD28- T cells. Virology 398: 158-167)は、CMV特異的Ｔ細胞(CD27neg CD28neg CD4 Ｔ細胞と定義される)の頻度が、PBMNCのin vitro CMV特異的増殖と相互相関し(Jesser 2006)、これらが多量のPD1を発現すること(Tovar-Salazar et al 2010)を示した。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の目的の1つは、先行技術の欠点を避ける方法を提供することである。
本目的は、患者におけるCMV感染の存在を認識する方法であって、
-患者から得られる全血試料におけるCD28neg/CD27neg CD4 Ｔ細胞のレベルを測定すること；
-CMVに感染していない対照群のレベルとCD28neg/CD27neg CD4 Ｔ細胞のレベルを比較すること；および
-患者におけるCD28neg/CD27neg CD4 Ｔ細胞のレベルが対照群のCD28neg/CD27neg CD4 Ｔ細胞のレベルよりも著しく高い場合にCMV感染が存在すると同定すること
による前記方法によって達成される。
【０００８】
本発明の方法は、顕著な量のCD28neg/CD27neg/CD4 Ｔ細胞がCMVに特異的であるという驚くべき発見に基づく。従って、CD28neg/CD27neg/CD4 Ｔ細胞は、Sesterらによって記載されたアッセイにおける代替物として用いることができる。
本発明の方法は、非活動性CMV感染と活動性CMV感染とを区別するために用いることができる。移植の場合、CD28neg/CD27neg CD4 Ｔ細胞のPD-1またはLA-4発現を測定し、この発現が経時的に増加するかどうかをウイルス血症の指標とすることによって活動性(一次)CMV感染を検出することができる。驚くべきことに、CD28neg/CD27neg CD4 Ｔ細胞において、PD-1発現を測定するだけで、この発現が経時的に増加するかどうかがウイルス血症の指標となる場合、CTLA-4発現を測定しなくてもCMVの再活性化を同定することができる。
本発明の方法は、移植レシピエントにおけるCMV感染によって引き起こされる合併症のリスク評価に用いることができる。
【０００９】
他の実施形態において、本発明の方法は、抗ウイルス薬でのCMVの治療の進行をモニターするために用いることができる。
本発明によれば、CD28neg/CD27neg CD4 Ｔ細胞のレベルは、特にフローサイトメトリーによって測定される。
本発明のさらなる実施形態において、CD28neg/CD27neg CD4 Ｔ細胞のレベルは、それぞれ別々に標識したCD4、CD27、CD28およびPD-1に対する抗体を用いる4色分析によって測定される。
本発明のさらに他の実施形態において、CD28、CDs27、CD4およびPD-1に対する抗体と混合し、次いで周囲温度でインキュベートし、溶解液を添加し、次いでインキュベートし、細胞を分離し、フローサイトメトリーを行うことによって血液試料が処理される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】CD28neg/CD27neg/CD4 Ｔ細胞のCMV血清反応陽性集団を示す図である。
【図２】CD28neg/CD27neg/CD4 Ｔ細胞の百分率≧0.44によって、CMV血清反応陽性とCMV血清陰性とが区別されることを示す図である。
【図３】CD28-CD27CD4 Ｔ細胞上のPD-1が一次CMV感染および再活性化の両方においてアップレギュレートされることを示す図である。
【図４】CD28-CD27CD4 Ｔ細胞上のCTLA-4が、一次CMV感染においてはアップレギュレートされるが、再活性化においてはアップレギュレートされないことを示す図である。
【図５】移植後のCD28-CD27-CD4 Ｔ細胞上のPD1 MFIの縦断的解析を示す図である。
【図６】CD28-CD27-CD4 Ｔ細胞上のPD1 MFIの、ウイルス血症に関連した縦断的解析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の方法は、全血から出発するアッセイ、すなわち、血清反応陽性患者と血清反応陰性患者を区別するためのカットオフ値の決定（例えば、感度88,89%および特異度100でのCD28neg CD27neg CD4 Ｔ細胞≧0,61%または感度=93.33%および特異度=97.06%でのCD28neg CD27neg CD4 Ｔ細胞≧0.44%（図1および2)）を提供する。対照は、例えばROC分析によって示される。45例のCMV血清反応陽性健常対照および34例のCMV血清反応陰性健常対照を用いた例を図2に示す。本例において、CMV血清反応陽性の正確な指標として、CD28-/CD27-CD4 Ｔ細胞の百分率≧0.44%が同定された(感度=93.33%、特異度=97.06%)。特異度100%、感度88,89%では、カットオフ値はCD28neg CD27neg CD4 Ｔ細胞≧0,61%である。
ウイルス血症は、PD-1発現の増加によって予測することができる(図3)。これによって、活動性CMV感染の初期症状が最初に出現する前に医師が抗ウイルス治療を具体的に開始することを可能にする。CD27neg CD4 Ｔ細胞のPD-1発現は、移植手術前の平均値(MFI:527)からウイルス血症発現直前のより高い値(MFI:722)へと増加するか、またはその値(MFI:722)からウイルス血症におけるさらに高い値(MFI:803)へと増加する。
【００１２】
図4は、CD28neg CD27neg CD4 Ｔ細胞において、CTLA-4をモニターすることによって得られた結果を示す。本例においては、CD28neg CD27neg CD4 Ｔ細胞におけるCTLA-4は一次CMV感染においてアップレギュレートされるが、再活性化においてはアップレギュレートされない。
図5の左部分のグラフは感染の経過を示す。図3の右部分は非ウイルス血症患者のグラフを示す。非ウイルス血症患者よりも急な左のグラフの傾きから、CMVによって引き起こされる感染が開始されたため治療を開始しなければならないことを医師は理解する。傾きが横ばい状態になる場合、医師はその治療が有効であることを知る。
【００１３】
本発明の方法は以下の利点を提供する：
・本方法はCMV関連細胞性免疫の刺激非依存的同定を可能にする；
・本方法は従来の試験の持続期間約8時間よりも迅速（<1.5時間）である；
・本方法はより簡単である（簡単な表面染色、わずか100μlの血液を必要とするのみ、インキュベーション時間なし）；
・より優れたロジスティックス、表面染色は、刺激依存的アッセイと比較してより長期間の試料の保存を可能にする。
【００１４】
本発明の方法は、以下のプロトコルによってさらに説明される。
全血100μlにCD27、CD28、CD4およびPD1(CTLA-4)に対する抗体を滴定量で加え、混合し、室温、暗所で20分間インキュベートした。続いて、赤血球を溶解し、これをリン酸緩衝化生理食塩水、5%濾過ウシ胎児血清、0,5%ウシ血清アルブミンおよび0.07%アジ化ナトリウムからなるFACS緩衝液で洗浄し、その後細胞上での抗原の発現を解析した。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【国際調査報告】
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