(57)【要約】本発明は、線維性疾患及びガンを処置するための化合物１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オンの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝線維症ではない線維性疾患を治療若しくは予防するため、又はチロシンキナーゼ関連ガンを治療若しくは予防するための方法に使用するための、化合物１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン。
【請求項２】
線維性疾患が、肺、心臓、筋肉、皮膚、軟組織、骨髄、腸及び関節の線維症である、請求項１に記載の使用のための化合物。
【請求項３】
線維性疾患が、肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症、腎性全身性線維症、クローン病、ケロイド、陳旧性心筋梗塞、強皮症／全身性硬化症、関節線維症又は癒着性関節包炎である、請求項１に記載の使用のための化合物。
【請求項４】
チロシンキナーゼ関連ガンが、ＰＤＧＦＲ関連ガン、ＶＥＧＦＲ関連ガン又はＫＩＴ関連ガンである、請求項１に記載の使用のための化合物。
【請求項５】
ガンが、腎細胞ガン腫；消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）；胃ガン；神経線維腫症を伴う髄膜腫；膵臓神経内分泌腫瘍；膵臓外分泌腫瘍；白血病；骨髄増殖性疾患／骨髄異形成疾患；肥満細胞症；皮膚線維肉腫；乳ガン、肺ガン、甲状腺ガン若しくは結腸直腸ガン又は前立腺ガンを含む固形腫瘍である、請求項１又は４に記載の使用のための化合物。
【請求項６】
肝臓ガンを根治治療するための方法に使用するための、化合物１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン。
【請求項７】
肝臓ガンが肝細胞ガン腫である、請求項６に記載の使用のための化合物。
【請求項８】
コラーゲン線維の産生に関与し、及び／又は細胞外マトリックスの産生に関与する細胞の増殖及び／又は活性化を阻害するのに使用するための、化合物１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン。
【請求項９】
コラーゲン線維の産生に関与し、及び／又は細胞外マトリックスの産生に関与する細胞のアポトーシスを促進するのに使用するための、化合物１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線維性疾患及びガンを処置するための化合物１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オンの使用に関する。
【０００２】
背景
チロシンキナーゼはシグナル伝達カスケードの重要なメディエーターであり、外部刺激及び内部刺激に応答して成長、分化、代謝及びアポトーシスのような多様な生物学的プロセスにおける重要な役割を決定する。最近の進歩により、線維症又はガンの病理生理学におけるチロシンキナーゼの役割が示唆されている。
【０００３】
線維症に関しては、疾患進行の決定因子及び抗線維化治療のターゲット候補として、様々なチロシンキナーゼが同定されている。これは、レセプターチロシンキナーゼ（例えば、ＰＤＧＦレセプター、ＶＥＧＦレセプター、ＥＧＦレセプター及びＪＡＫキナーゼ）及び非レセプターチロシンキナーゼ（例えば、ｃ−Ａｂｌ、ｃ−Ｋｉｔ及びＳｒｃキナーゼ）の両方を含む［１］。全ての線維性疾患において、星細胞を含む線維芽細胞が増殖し、筋線維芽細胞に活性化される。筋線維芽細胞は、過剰増殖を受ける主要なコラーゲン産生細胞型である［２］。ＰＤＧＦは、間葉由来の細胞の主要なマイトジェンである。ＰＤＧＦの過剰活性は、臓器線維症及び腫瘍形成を含むいくつかのヒト障害に関連している［３］。肺線維症、肝線維症［２］、強皮症［４〜６］、腎線維増殖性疾患［７、８］、骨髄増殖性疾患、例えば特発性骨髄線維症［９、１０］、白血病、特に、骨髄線維症が現れる急性巨核芽球性白血病［１１］及び慢性骨髄性白血病［１２〜１４］の進行中の骨髄の白血病細胞では、ＰＤＧＦレベル又は活性の上昇が特に報告されている。
【０００４】
おそらくは、線維症を処置するための最も有望な薬物は、ＰＤＧＦレセプターチロシンキナーゼ阻害剤である。ＰＤＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の投与は、金属誘発性肺傷害ラットモデルにおける肺線維症を軽減し［１５］、ラットにおける慢性同種移植腎症を改善することが示されている［１６］。慢性骨髄性白血病を有する患者では、非選択的ＰＤＧＦＲ阻害剤イマチニブ（グリベック）は、骨髄線維症の退行を誘導することが示されている［１７］。統合すると、これらの動物研究及び予備臨床研究は、ＰＤＧＦレセプターチロシンキナーゼの阻害が、様々な組織における線維性疾患の実行可能な治療戦略を提供し得ることを示している。
【０００５】
ＰＤＧＦＲ経路の活性を遮断する薬剤に加えて、様々な線維性疾患（例えば、特発性肺線維症、腎線維症、肝線維症及び皮膚線維症）の前臨床モデルにおいて、他のチロシンキナーゼの異常活性を遮断するモノクローナル抗体及び小分子阻害剤の両方が試験された。これらの研究の結果は有望であり、線維性疾患における様々な化合物を用いた臨床試験が促された。これまでのところ、特発性肺線維症におけるインテダニブを用いた研究、並びに特発性肺線維症及び全身性硬化症におけるイマチニブを用いた研究の結果が報告されている。これらの研究では、肯定的な主要転帰は報告されなかったが、抗線維化効果の有望な傾向は、新たなクラスの有効な抗線維化ターゲット療法の希望を喚起している［１］。
【０００６】
ガンに関しては、成長因子の過剰発現とそれに続く特定のレセプターチロシンキナーゼ（例えば、ＰＤＧＦＲβ、ＶＥＧＦＲ）の活性化により、Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫマイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼシグナル伝達経路の過剰活性化が引き起こされ得る［１８、１９］。Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫマイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼシグナル伝達経路の活性化は、細胞の増殖及び生存を直接的に増加させることが公知であり、ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦの産生を増加させることによって血管新生を間接的に刺激し得る［１８］。これらのプロセスは腫瘍成長に必要であるので、Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路の分子成分は、ガン（特に、肝細胞ガン腫（ＨＣＣ））を処置するための治療ターゲット候補である［２０］。
【０００７】
抗ガン薬ソラフェニブは、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＰＤＧＦＲβ及びｋｉｔ並びにＲａｆセリン／トレオニンキナーゼアイソフォーム（例えば、Ｒａｆ−１及びＢ−Ｒａｆ）を含む血管新生に重要な上流のレセプターチロシンキナーゼを阻害する。したがって、ソラフェニブは腫瘍細胞死を誘導し、血管新生を阻害し得る。機序は十分に解明されていないが、ソラフェニブは、いくつかの腫瘍細胞株においてアポトーシスを誘導することも示されている［２０、２１］。ソラフェニブは、外科的切除又は肝臓移植による治癒が不能な進行性ＨＣＣ患者のための最初のＦＤＡ承認全身治療薬である。
【０００８】
要するに、これは、線維性疾患又はガンの処置のための、チロシンキナーゼに作用する新たな治療薬を同定することの利益を示している。
【０００９】
発明の概要
本発明は、線維性疾患及びガンを処置するための医薬組成物の調製における１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オンの新規使用を提供する。１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オンは、レセプターチロシンキナーゼ及び非レセプターチロシンキナーゼの阻害、並びに／又は線維芽細胞における細胞内シグナル伝達経路の阻害を介した抗線維化特性及び抗ガン特性を有する。
【００１０】
図面及び表の説明
図面、表及び本明細書で使用される略語：
−  Ｃｏｌ１ａ１  ＝  コラーゲン、Ｉ型、アルファ１
−  Ｃｏｌ４ａ１  ＝  コラーゲン、４型、アルファ１
−  Ｃｐｍ  ＝  カウント毎分
−  Ｃｔｒｌ  ＝  コントロール又はビヒクル
−  ＥＧＦＲ  ＝  上皮成長因子レセプター
−  ＥＲＫ  ＝  細胞外シグナル調節キナーゼ
−  ＦＢＳ  ＝  ウシ胎児血清
−  ＦＣＳ  ＝  ウシ胎仔血清
−  ＦＤＡ  ＝  食品医薬品局
−  ＦＧＦＲ  ＝  線維芽細胞成長因子レセプター
−  ＧＩＳＴ  ＝  消化管間質腫瘍
−  ＨＣＣ  ＝  肝細胞ガン
−  ＨＧＦＲ  ＝  肝細胞成長因子レセプター
−  ｈＨＳＣ  ＝  ヒト初代肝星細胞
−  ＪＡＫ  ＝  ヤヌスキナーゼ
−  ＭＡＰ  ＝  マイトジェン活性化タンパク質
−  ＭＥＫ  ＝  マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ
−  ＰＤＧＦＲ  ＝  血小板由来成長因子レセプター
−  ＲＣＣ  ＝  腎細胞ガン腫
−  ＲＴ−ＰＣＲ  ＝  逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
−  ＴＧＦβＲ  ＝  トランスフォーミング成長因子ベータレセプター
−  ＶＥＧＦＲ  ＝  血管内皮成長因子レセプター
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】式（Ｉ）の化合物は、ＰＤＧＦ−ＢＢによって誘導されたｈＨＳＣ細胞の増殖を妨げる。間葉系細胞の主要なマイトジェンであるＰＤＧＦ−ＢＢ（１０ng/mL）によって、ヒト初代肝星細胞（ｈＨＳＣ）の増殖をin vitroで刺激した。強力なＰＤＧＦＲ阻害剤であるクレノラニブをポジティブコントロールとして使用した。無血清培地中、ＰＤＧＦ−ＢＢによる刺激の１時間前に、クレノラニブ及び式（Ｉ）の化合物を細胞培養液に追加した。インキュベーションの２４時間後に、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みを測定することによって、細胞増殖を評価した。実験結果を平均±標準偏差（ＳＤ）として表し、棒グラフとしてプロットした。Sigma Plot 11.0ソフトウェアを使用して、一元ＡＮＯＶＡ、次いでボンフェローニ事後検定を使用して、統計分析を実施した。［＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１（ＰＤＧＦ−ＢＢ １０ng/mL群との比較）］
【図２】式（Ｉ）の化合物は、血清によって誘導されたｈＨＳＣ細胞の増殖を妨げる。ウシ胎児血清ＦＢＳ（０．５％）によって、ヒト初代肝星細胞（ｈＨＳＣ）の増殖をin vitroで刺激した。強力なＰＤＧＦＲ阻害剤であるクレノラニブをポジティブコントロールとして使用した。ＦＢＳによる刺激の１時間前に、クレノラニブ及び式（Ｉ）の化合物を細胞培養液に追加した。インキュベーションの４８時間後に、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みを測定することによって、細胞増殖を評価した。実験結果を平均±標準偏差（ＳＤ）として表し、棒グラフとしてプロットした。Sigma Plot 11.0ソフトウェアを使用して、一元ＡＮＯＶＡ、次いでボンフェローニ事後検定を使用して、統計分析を実施した。［＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１（ＦＢＳ ０．５％群との比較）］
【図３】式（Ｉ）の化合物は、ＰＤＧＦ−ＢＢによって誘導されたＰＤＧＦＲβリン酸化を妨げる。無血清条件下、ＰＤＧＦ−ＢＢによって、ＰＤＧＦＲβリン酸化をｈＨＳＣにおいて誘導した。最初に、クレノラニブ（ＰＤＧＦＲ阻害剤）又は式（Ｉ）の化合物のいずれかでＨＳＣを６０分間処理し、次いで、ＰＤＧＦ−ＢＢ（３０ng/mL）と共に１０分間インキュベーションした。次いで、培養ウェルに固定したら、Human Phospho-PDGFRβ (Y751) Cell-Based ELISA kit (R&D Systems)を使用することによって、チロシン７５１のＰＤＧＦＲβリン酸化の程度を決定した。実験結果を平均±標準偏差（ＳＤ）として表し、棒グラフとしてプロットした。Sigma Plot 11.0ソフトウェアを使用して、一元ＡＮＯＶＡ、次いでボンフェローニ事後検定を使用して、統計分析を実施した。［＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１（ＰＤＧＦ−ＢＢ ３０ng/mL群との比較）］
【図４】式（Ｉ）の化合物による処置は、炎症性腸疾患モデルにおける結腸線維症の誘導を予防した。ＴＮＢＳ誘導大腸炎におけるα−ＳＭＡ（これは、線維化反応の認められているバイオマーカーである）の発現は、式（Ｉ）の化合物の投与によって部分的に抑制された。実験結果を平均±標準偏差（ＳＤ）として表し、棒グラフとしてプロットした。ｔ検定を使用して、統計分析を実施した。［＊：ｐ＜０．０５］
【図５】式（Ｉ）の化合物による処置は、活性化ｈＨＳＣにおいてある程度のアポトーシス促進応答を誘導し、スタウロスポリンのアポトーシス促進効果を有意に増強した。式（Ｉ）の化合物の単独での又はスタウロスポリン（これは、広域タンパク質キナーゼである）と組み合わせたアポトーシス促進特性を、ｈＨＳＣにおいて評価した。最初に、ＨＳＣを血清枯渇に１６時間曝し、続いて式（Ｉ）の化合物単独又は式（Ｉ）の化合物及びスタウロスポリンの組み合わせのいずれかで処置した。Caspase-Glo（登録商標）3/7 activity assay kitを使用することによって、これらの処置のアポトーシス促進効果を評価した。実験結果を平均±標準偏差（ＳＤ）として表し、棒グラフとしてプロットした。Sigma Plot 11.0ソフトウェアを使用して、対応のない二元ＡＮＯＶＡ、次いでボンフェローニ事後検定を使用して、統計分析を実施した。［＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１（「スタウロスポリン０．３μM」群との比較）；‡：ｐ＜０．０５；‡‡：ｐ＜０．０１；‡‡‡：ｐ＜０．００１（「スタウロスポリンなし」群との比較）］
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、線維症及びガンを処置するための化合物１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オンの使用に関するものであり、このような化合物は、星細胞（これは、細胞外マトリックスの形成及び線維症に関与する主な細胞型である）を含むヒト線維芽細胞の増殖及び活性化を予想外に低減することができる。
【００１３】
本発明にしたがって使用すべき化合物１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オンは、以下の式（Ｉ）：
【化１】
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を有する。
【００１４】
先行技術は、抗線維化効果又は抗ガン効果が、レセプターチロシンキナーゼの直接的及び／又は間接的な阻害による１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オンに関連することを教示していない。
【００１５】
したがって、本発明は、肝線維症ではない線維性疾患を治療若しくは予防するため、又はチロシンキナーゼ関連ガンを治療若しくは予防するための方法に使用するための、化合物１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オンに関する。
【００１６】
さらなる態様では、本発明は、コラーゲン線維の産生に関与し、及び／又は細胞外マトリックスの産生に関与する細胞の増殖及び／又は活性化を阻害するのに使用するための式（Ｉ）の化合物に関する。
【００１７】
本発明はさらに、コラーゲン線維の産生に関与し、及び／又は細胞外マトリックスの産生に関与する細胞のアポトーシスを促進するのに使用するための式（Ｉ）の化合物に関する。
【００１８】
本発明によれば、「線維症」という用語は、特に、肺、心臓、筋肉、皮膚、軟組織（例えば、縦隔又は後腹膜）、骨髄、腸及び関節（例えば、膝、肩又は他の関節）の線維症を含む。特に、「線維症」という用語は、肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症（炭坑作業員塵肺症の合併症）、腎性全身性線維症、クローン病、ケロイド、陳旧性心筋梗塞、強皮症／全身性硬化症、関節線維症、又は癒着性関節包炎のいくつかの形態を含む。「線維症」という用語は、本発明との関連では肝線維症を含まない。
【００１９】
レセプターチロシンキナーゼは広く豊富に存在し、ガンでは調節不全であり、数十年間にわたって、小分子又は抗体を使用するターゲット療法の注目の的である［２２〜２４］。
【００２０】
【表１】
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表１：レセプターチロシンキナーゼをターゲティングするガン治療の選択例
【００２１】
本発明によれば、「チロシンキナーゼ関連ガン」という表現は、単一又は一群のチロシンキナーゼレセプターの無秩序な活性又は発現に依拠する任意の形態のガンを意味する。本発明の特定の実施態様では、チロシンキナーゼは、レセプターチロシンキナーゼ、より具体的にはＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｋｉｔ若しくはＪＡＫキナーゼ、又は非レセプターチロシンキナーゼ、より具体的にはｃ−Ａｂｌ若しくはＳｒｃキナーゼである。特定の実施態様によれば、ガンという用語は、肝細胞ガン腫；腎細胞ガン腫；消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）；胃ガン；神経線維腫症を伴う髄膜腫（menigioma）；膵臓神経内分泌腫瘍；膵臓外分泌腫瘍；白血病；骨髄増殖性疾患／骨髄異形成疾患；肥満細胞症；皮膚線維肉腫；乳ガン、肺ガン、甲状腺ガン及び結腸直腸ガン、前立腺ガンを含む固形腫瘍を含む。
【００２２】
特定の態様では、本発明は、肝臓ガン、特に肝細胞ガン腫の根治治療に関する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、肝臓ガンと異なるガンの治療又は予防に関する。特に、そのガンは、腎細胞ガン腫；消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）；神経線維腫症を伴う髄膜腫（menigioma）；膵臓神経内分泌腫瘍；膵臓外分泌腫瘍；白血病；骨髄増殖性疾患／骨髄異形成疾患；肥満細胞症；皮膚線維肉腫；乳ガン、肺ガン、甲状腺ガン及び結腸直腸ガン、前立腺ガンを含む固形腫瘍から選択され得る。特定の態様では、予防又は治療されるガンは、線維性ガンである。
【００２４】
治療又は予防は、前記化合物又はこれを含有する医薬組成物を、宣告された障害を有する患者に投与して、進行を治癒し、遅延させ、若しくは遅らせることにより、該患者の症状を改善することを含むか、又は健康な被験体、特に線維性疾患を発症するリスクを有する被験体に投与することを含む。
【００２５】
本発明にしたがって処置すべき被験体は、線維性疾患又はガンに関連するいくつかの基準、例えば以前の薬物治療、関連病状、遺伝子型、リスク因子への曝露、ウイルス感染、並びにイメージング方法及び免疫学的方法、生化学的方法、酵素的方法、化学的方法又は核酸検出方法によって評価され得る任意の他の関連バイオマーカーに基づいて選択され得る。
【００２６】
１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オンは、異なる安定異性体を有し得る。
【００２７】
化合物１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オンの合成は、例えば、国際公開第２００４／００５２３３号で化合物２９について記載されているように行われ得る。
【００２８】
式（Ｉ）の化合物は、薬学的に許容し得る塩として製剤化され得るが、これは、式（Ｉ）の化合物の有機塩基若しくは無機塩基又は有機酸若しくは無機酸から得られるやや毒性の塩又は無毒の塩である。これらの塩は、化合物の最終精製工程において、又は予め精製された化合物に塩を組み込むことによって得られ得る。
【００２９】
線維性疾患又はガンを処置するための式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物は、薬学的な枠組みの中で許容し得る１つ又は複数の賦形剤又はビヒクル（例えば、医薬用途に適合する当業者に周知の生理食塩水、生理溶液、等張液など）を含み得る。これらの組成物は、分散剤、可溶化剤、安定化剤、保存剤などの中から選択される１つ又は複数の薬剤又はビヒクルを含み得る。これらの製剤（液体及び／又は注射用及び／又は固体）に有用な薬剤又はビヒクルは、特に、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリソルベート８０、マンニトール、ゼラチン、ラクトース、植物油、アカシア、リポソームなどである。これらの組成物は、最終的には、持続放出及び／又は徐放を保証するガレヌス形態又はデバイスによって、注射用懸濁液、ゲル、油、丸薬、坐薬、粉末、ゲルキャップ、カプセル、エアロゾルなどの形態で製剤化され得る。この種の製剤の場合、セルロース、炭酸塩又はデンプンなどの薬剤が有利に使用され得る。
【００３０】
式（Ｉ）の化合物は、上で定義した医薬組成物を使用することによって有効量で投与され得る。本発明との関連では、「有効量」という用語は、所望の治療結果をもたらすのに十分な化合物の量を指す。
【００３１】
式（Ｉ）の化合物は、様々な方法で、及び様々な形態で投与され得る。したがって、例えば、それは、全身的に、経口的に、非経口的に、吸入によって、又は注射、例えば静脈内注射によって、筋肉内経路によって、皮下経路によって、経皮経路によって、動脈内経路によって投与され得る。経口投与は、式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物の好ましい投与経路である。
【００３２】
当業者であれば、患者、病状、投与形態などに応じて、投与に関する回数及び／又は用量を適合させ得る。典型的には、線維性疾患又はガンの処置の場合、式（Ｉ）の化合物は、投与１回当たり０．０１mg〜１ｇ、好ましくは投与１回当たり１mg〜１００mgで変化する用量で投与され得る。投与は、必要な場合には、毎日又は１日当たり数回実施され得る。
【００３３】
特定の実施態様では、本発明は、線維症疾患又はガンを処置するための、少なくとも１つの他の治療活性剤と組み合わせた式（Ｉ）の化合物の使用に関する。他の活性剤は、特に、他の抗線維化剤又は他の抗ガン剤、例えばソラフェニブから選択され得る。本発明者らは、式（Ｉ）の化合物が、アポトーシス促進化合物のアポトーシス促進活性を増強することができることを示した。したがって、本発明はまた、アポトーシス促進薬と組み合わせた式（Ｉ）の化合物の使用に関する。特に、式（Ｉ）の化合物は、線維芽細胞に対してアポトーシス促進効果を有するキナーゼ阻害剤、例えばスタウロスポリンと組み合わせて使用され得る。
【００３４】
さらなる態様では、本発明は、線維性疾患又はガンを処置する方法であって、式（Ｉ）の化合物を、特にこの化合物を含有する医薬組成物の形態で投与することを含む方法を提供する。
【００３５】
以下の非限定的な実施例を参照して本発明をさらに説明する。
【００３６】
実施例
材料及び方法
化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Fluka cat# 41640）に溶解した。
【００３７】
ｈＨＳＣの培養及び処理条件
２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ScienCell cat# 0010）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ScienCell cat# 0503）及び星細胞成長サプリメント（SteCGS; ScienCell cat# 5352）を補充したＳＴｅＣＭ培地（ScienCell cat# 5301）中で、ヒト初代肝星細胞（ｈＨＳＣ）（ScienCell）を培養した。ポリ−Ｌリジン（Sigma cat# P4707）で培養プラスチックをコーティングした。細胞１．２×１０４個／ウェルの密度でｈＨＳＣを９６ウェルプレートにプレートし、３７℃及び５％ＣＯ２で一晩培養し、続いて、ＰＢＳ（Invitrogen cat# 14190）で細胞を洗浄し、さらに２４時間にわたって成長培地を無血清無ＳｔｅＣＧＳ培地と交換した。
【００３８】
ＰＤＧＦ誘導増殖アッセイの場合、全ての化合物で細胞を１時間前処理してから、ＰＤＧＦ−ＢＢ（１０ng/mL；R&D Systems cat# 520-BB）を追加した。次いで、処理をさらに２０時間継続した。血清誘導増殖アッセイの場合、化合物で細胞を１時間前処理してから、ＦＢＳ（０．５％）（ScienCell cat# 0010）を無ＳｔｅＣＧＳ培地に２０時間適用した。
【００３９】
ＰＤＧＦ誘導増殖の決定
ＢｒｄＵ標識検出キット(Roche cat# 11647229001)を使用してブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込みによって、細胞増殖を測定した。ＢｒｄＵ標識溶液を細胞に追加し、続いてさらに４時間インキュベーションしてから固定し、ヌクレアーゼを追加し、抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ及びペルオキシダーゼ基質を追加した。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Tecan）を使用して、４０５nmの吸光度（基準波長６９０nm）を測定した。
【００４０】
ＰＤＧＦ誘導ＰＤＧＦＲβリン酸化アッセイ
製造業者の説明書にしたがってcell based ELISA kit (R&D Systems cat# KCB1767)を使用して、ｈＨＳＣにおけるＰＤＧＦＲβリン酸化を測定した。簡潔に言えば、ＰＤＧＦで刺激した後に細胞を固定し、ウェル中で透過処理した。次いで、二重免疫酵素標識法を使用することによって、ＰＤＧＦＲβリン酸化を測定した。細胞を２つの一次抗体（チロシン７５１におけるＰＤＧＦＲβリン酸化を検出するリン酸化特異的抗体、及びリン酸化型ＰＤＧＦＲβ及び非リン酸化型ＰＤＧＦＲβの両方を認識するコントロール抗体）と共に同時にインキュベーションした。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はアルカリホスファターゼ（ＡＰ）のいずれかで標識された２つの二次抗体、及びＨＲＰ又はＡＰのいずれかに対する２つのスペクトル的に異なる蛍光基質を検出に使用した。リン酸化ＰＤＧＦＲβの蛍光をパンタンパク質の蛍光に対して正規化した。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Tecan）を使用して、蛍光を測定した。
【００４１】
ＴＧＦ−β１によるＨＳＣ活性化
上記のように、標準的な条件下で、ヒト初代肝星細胞（ｈＨＳＣ）（ScienCell）を培養した。遺伝子発現パターンを決定するための実験の場合、細胞１．４×１０５個／ウェルの密度でｈＨＳＣを１２ウェルプレートにプレートし、一晩培養した。翌日、培養培地を除去し、ＰＢＳ（Invitrogen cat# 14190）で細胞を洗浄し、さらに１６時間にわたって無血清無ＳｔｅＣＧＳ培地を追加した。無血清無ＳｔｅＣＧＳ培地中、化合物とそれに加えてＴＧＦβ１（１ng/mL）で細胞を２４時間処理した。
【００４２】
遺伝子発現
製造業者の説明書にしたがってRNeasy（登録商標）Mini Kit (Qiagen)を使用して、全ＲＮＡを単離した。ＲＴ緩衝液１×（Invitrogen）、１mM ＤＴＴ（Invitrogen）、０．１８mM ｄＮＴＰ（Promega）、ｐｄＮ６（Amersham）２００ng及びＲＮａｓｅ阻害剤（Promega）３０Ｕの存在下で、Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴ（モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素）（Invitrogen cat# 28025）を使用して、全ＲＮＡ ２５０ngをｃＤＮＡに逆転写した。
【００４３】
次いで、MyiQ Single-Color Real-Time PCR Detection又はiCycler iQ Multiplex Real-Time PCR Detection System（システムは両方ともBiorad製）を使用して、定量ＰＣＲを行った。簡潔に言えば、iQ SYBR Green Supermix kitを使用して、９６ウェルプレート中、５倍希薄した逆転写ミックス５μLによってＰＣＲ反応を実施した。実験条件は、体積反応２５μL、３mM ＭｇＣｌ２並びにリバースプライマー及びフォワードプライマー（１０pMol）各０．５μLであった。
【００４４】
【表２】
2016506913.tif 000004
【００４５】
基準として３６Ｂ４遺伝子の発現を使用して、発現レベルを正規化した。
【００４６】
ＰＣＲ反応効率を１００％に近づけ、相関係数を１に近づけるために、最良のポイント（少なくとも３点）を選択することによって、各遺伝子について標準曲線を作成した。ハウスキーピング遺伝子及びターゲット遺伝子の両方の標準曲線方程式を使用して（各ターゲット遺伝子の特異的ＰＣＲ効率を考慮）、発現レベルを決定した。
【００４７】
ＴＧＦβ１に対するインダクション係数を以下のように決定した：
【数１】
2016506913.tif 000005
Ａ＝試験群における研究遺伝子の発現レベル
Ｂ＝ＴＧＦβ１ １ng/mL群における研究遺伝子の発現レベル
【００４８】
したがって、インダクション係数が低いほど、関心対象の化合物は、ｈＨＳＣのＴＧＦβ１活性化をより阻害する。実験結果をインダクション係数の平均±標準偏差（ＳＤ）として表した。
【００４９】
カスパーゼ３／７活性化の測定によるアポトーシスの評価
上記のように、標準的な条件下で、ヒト初代肝星細胞（ｈＨＳＣ）（ScienCell）を培養した。アポトーシスアッセイの場合、細胞１．２×１０４個／ウェルの密度でｈＨＳＣをブラック９６ウェルプレートにプレートし、３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間培養し、続いて、ＰＢＳ（Invitrogen cat# 14190）で細胞を洗浄し、さらに１６時間にわたって成長培地を無血清無ＳｔｅＣＧＳ培地と交換した。無血清無ＳｔｅＣＧＳ培地中、式１の化合物単独で、又は式１の化合物をスタウロスポリンと組み合わせて細胞を２４時間処理した。
【００５０】
製造業者の説明書にしたがってPromega製のアッセイ(Promega cat# G8093)を使用することによって、カスパーゼ−３活性及びカスパーゼ−７活性を決定した。インキュベーション期間の終了時において、ブランク、ネガティブコントロール細胞又は処理細胞の培養培地１００μLを含有する各ウェルに、Caspase-Glo（登録商標）３／７試薬１００μLを追加した。細胞溶解後、Tecan製の古典的なプレートリーダーにおいて発光シグナルを測定することによって、活性化カスパーゼ３及び７による（ＤＥＶＤ配列を含有する）基質の切断を決定した。発光は、処理細胞中に存在するカスパーゼ活性の量に比例した。
【００５１】
ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ及びｃ−Ｋｉｔタンパク質キナーゼ活性阻害の測定
以下の表に示されているように、１０個の選択したキナーゼについて、式（Ｉ）の化合物によるキナーゼ阻害を１０μMの濃度で試験した。放射タンパク質キナーゼアッセイ（３３PanQinase（登録商標）活性アッセイ）をキナーゼ活性の測定に使用した。全てのタンパク質キナーゼのアッセイは、７０mM ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ７．５、３mM ＭｇＣｌ２、３mM ＭｎＣｌ２、３μM Ｎａ−オルトバナダート、１．２mM ＤＴＴ、ＡＴＰ（不定量、各キナーゼの見掛けのＡＴＰ−Ｋｍに相当、表１を参照のこと）、［γ−３３Ｐ］−ＡＴＰ（約８×１０５cpm／ウェル）、タンパク質キナーゼ（不定量、表１を参照のこと）及び基質（不定量、以下の表を参照のこと）を含有していた。
【００５２】
試験したタンパク質キナーゼのアッセイパラメータ
【表３】
2016506913.tif 000006
【００５３】
反応カクテルを３０℃で６０分間インキュベーションした。２％（v/v）Ｈ３ＰＯ４５０μlによって反応を停止させ、プレートを吸引し、０．９％（w/v）ＮａＣｌ ２００μLで２回洗浄した。マイクロプレートシンチレーションカウンター（Microbeta, Wallac）を用いて、３３Ｐの取り込みを決定した。
【００５４】
各キナーゼについて、完全な反応カクテルを含むがキナーゼを含まない３つのウェルのcpmの中央値を「低コントロール」と定義した。この値は、タンパク質キナーゼの非存在下、しかし基質の存在下におけるプレートに対する放射活性の非特異的結合を反映している。加えて、各キナーゼについて、完全な反応カクテルを含むがいかなる化合物も含まない３つの他のウェルのcpmの中央値を「高コントロール」（すなわち、阻害剤の非存在下における完全活性）とした。高コントロールと低コントロールとの差を各キナーゼの１００％活性とした。
【００５５】
データ評価の一環として、各キナーゼの低コントロールの値を、高コントロールの値及びそれらの対応する「化合物の値」から差し引いた。以下の式：
残存活性（％）＝１００×［（化合物のcpm−低コントロール）／（高コントロール−低コントロール）］
を使用することによって、各化合物のウェルの残存活性（％単位）を計算した。
【００５６】
ヒト腫瘍細胞株増殖の阻害の評価
本実験により、in vitroにおけるガン細胞増殖に対する式（Ｉ）の化合物の直接的な阻害効果が実証された。３７℃及び５％ＣＯ２のインキュベータ内において、１０％ＦＢＳを含有する完全培地（ATCC製）中で、２２種のヒト腫瘍細胞株を培養した。対数期の細胞を増殖アッセイに使用した。細胞を採取し、計数し、次いで適切な密度で９６ウェルプレートに播種し、１６〜２４時間インキュベーションした。次いで、様々な濃度の式（Ｉ）の化合物を追加した（１００μMから３倍希釈ずつ減少する８種の濃度）。７２時間の増殖アッセイの間、処理培地を２４時間ごとに換えた。CellTiter-Glo（登録商標）kit (Promega)を使用して、薬物処理細胞及びコントロール細胞を分析した。簡潔に言えば、CellTiter-Glo（登録商標）試薬を各試験ウェルに追加し、オービタルシェーカー上で２分間混合した。プレートを９０ｇで少し遠心分離し、室温でさらに１０分間インキュベーションして、発光シグナルを安定化した。PHERAstar Plus上で、発光シグナルを検出した。
【００５７】
大腸炎モデルにおける結腸壁線維症の発症の評価
２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）による結腸炎誘導の５日前から安楽死まで、式（Ｉ）の化合物をSprague Dawleyラットに３０mg/kg／日で経口投与した。
【００５８】
大腸炎を誘導するために、ペントバルビタールの腹腔内注射を使用して、Sprague Dawleyラットを２時間麻酔した。ＴＮＢＳ（４０％エタノール中、８０mg/kg）を肛門から８cmの箇所に直腸内注射することによって、大腸炎を誘導した。ＴＮＢＳ投与の４日後に動物を屠殺し、遺伝子発現アッセイを使用して、式（Ｉ）の化合物の予防効果を評価した。
【００５９】
結腸サンプルにおけるα−ＳＭＡ遺伝子発現の研究
製造業者の説明書にしたがってRNeasy（登録商標）Mini Kit (Qiagen)を使用して、全ＲＮＡを単離した。ＲＴ緩衝液１×（Invitrogen）、１mM ＤＴＴ（Invitrogen）、０．１８mM ｄＮＴＰ（Promega）、ｐｄＮ６（Amersham）２００ng及びＲＮａｓｅ阻害剤（Promega）３０Ｕの存在下で、Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴ（モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素）（Invitrogen cat# 28025）を使用して、全ＲＮＡ １μgをｃＤＮＡに逆転写した。次いで、CFX96 Touch（商標）Real-Time PCR Detection System (Biorad)を使用して、定量ＰＣＲを行った。簡潔に言えば、iQ SYBR Green Supermix kitを使用して、９６ウェルプレート中、５倍希薄した逆転写ミックス５μLによってＰＣＲ反応を実施した。実験条件は、体積反応２５μL、３mM ＭｇＣｌ２並びにリバースプライマー及びフォワードプライマー（１０pMol）各０．５μLであった。
【００６０】
【表４】
2016506913.tif 000007
【００６１】
基準として36B4遺伝子の発現を使用して、発現レベルを正規化した。
【００６２】
【表５】
2016506913.tif 000008
【００６３】
ＰＣＲ反応効率を１００％に近づけ、相関係数を１に近づけるために、最良のポイント（少なくとも３点）を選択することによって、各遺伝子について標準曲線を作成した。ハウスキーピング遺伝子及びターゲット遺伝子の両方の標準曲線方程式を使用して（各ターゲット遺伝子の特異的ＰＣＲ効率を考慮）、発現レベルを決定した。
【００６４】
ＴＮＢＳ処理ラットに対するインダクション係数を以下のように決定した：
【数２】
2016506913.tif 000009
Ａ＝ＴＮＢＳ＋式（Ｉ）の化合物（３０mg/kg/日）群における研究遺伝子の発現レベル
Ｂ＝ＴＮＢＳ群における研究遺伝子の発現レベル
【００６５】
したがって、インダクション係数が低いほど、関心対象の化合物は、結腸壁のＴＮＢＳ誘導線維症をより阻害する。実験結果をインダクション係数の平均±標準偏差（ＳＤ）として表した。
【００６６】
結果及び結論：
ＰＤＧＦの過剰活性は、臓器線維症及び腫瘍形成を含むいくつかのヒト障害に関連している。ＰＤＧＦは、それらの増殖、遊走及び生存を刺激することによって、筋線維芽細胞の増殖において重要な役割を果たしている。
【００６７】
予想外のことに、本発明者らの実験データにより、式（Ｉ）の化合物は、ＰＤＧＦによる処理（図１）又は血清による処理（図２）のいずれかによって誘導されたｈＨＳＣの増殖を用量依存的に阻害することが示された。図１及び２で実証されているように、式（Ｉ）の化合物の有効性は、選択的ＰＤＧＦＲ阻害剤クレノラニブのものと同程度である。式（Ｉ）の化合物は抗増殖特性を有し、ＰＤＧＦＲシグナル伝達経路の機能的活性化を妨げる。
【００６８】
リガンドによってレセプターのホモ二量体化又はヘテロ二量体化が誘導されると、ＰＤＧＦＲの細胞質ドメイン内の特定のチロシン残基が自己リン酸化し、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、Ｒａｓ−ＭＡＰＫ、Ｓｒｃファミリーキナーゼ及びホスホリパーゼＣγ（ＰＬＣγ）を含むいくつかのシグナル伝達経路が活性化する。この結果、細胞の増殖及び生存が刺激される。
【００６９】
予想外のことに、本発明者らの実験データにより、式（Ｉ）の化合物は、ｈＨＳＣにおいてＰＤＧＦ−ＢＢによって誘導されたＰＤＧＦＲβのチロシン７５１のリン酸化を阻害することが示された。式（Ｉ）の化合物による阻害は用量依存的であり、選択的ＰＤＧＦＲ阻害剤クレノラニブを用いて得られた阻害と同程度に有効である（図３）。
【００７０】
線維症に関しては、疾患進行の決定因子及び抗線維化治療のターゲット候補として、様々なレセプターチロシンキナーゼが既に同定されている。最近の前臨床結果は、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ及びＦＧＦＲ活性化経路の同時阻害が、より選択的にＰＤＧＦＲ経路を阻害する処置と比較して、肺線維症モデルにおける抗線維化活性の増強をもたらしたことを示している。表２に示されているように、本発明者らは、予想外のことに、式（Ｉ）の化合物が、線維症及びガンの発症の両方に関与する選択したキナーゼ（レセプターチロシンキナーゼＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＦＧＦＲを含む）のキナーゼ活性を阻害することができたことを見出した。
【００７１】
【表６】
2016506913.tif 000010
表２：生化学的キナーゼ活性アッセイで測定したところ、式（Ｉ）の化合物は、選択したレセプターチロシンキナーゼのキナーゼ活性を阻害する。報告した結果は、１０μモル／Ｌの濃度で得られた。
【００７２】
表３に示されているように、本発明者らは、予想外のことに、直接的なキナーゼ阻害特性に加えて、式（Ｉ）の化合物が、活性化ｈＨＳＣにおいて、ＴＧＦβ１処理により誘導される古典的な線維化促進遺伝子（例えば、αＳＭＡ、Ｃｏｌ１α１、Ｃｏｌ４α１、ＴＧＦβＲ１）の両方の発現、及びＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＦＧＦＲ１（これらは、以前に発表されたソース［６３］から判断すると、線維症の発症に関連するチロシンキナーゼレセプターである）の発現を阻害することができたことを見出した。表３に示されているように、式（Ｉ）の化合物の遺伝子阻害プロファイルは、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＲＡＦ及びＫＩＴをターゲティングするチロシンキナーゼ阻害剤ソラフェニブを用いて得られたものと非常に類似していた。以前に、ソラフェニブは、前臨床モデルにおいて重要な抗線維化活性を示し、肝細胞ガン腫（ＨＣＣ）及び腎細胞ガン腫（ＲＣＣ）などのガンの処置において臨床的有効性を示している［６４〜６６］。
【００７３】
無血清条件下、ＴＧＦβ１（１ng/mL）で処理することによって、線維化促進遺伝子及びガン関連遺伝子の両方の発現を初代ヒト肝星細胞（ｈＨＳＣ）において誘導した。ソラフェニブ（Nevaxar）（これは、抗線維化特性及び抗ガン特性の両方を発揮するマルチレセプターチロシンキナーゼ阻害剤である）を基準化合物として使用した。ＴＧＦβ１に曝露した２４時間後に定量ＲＴ−ＰＣＲ技術によって、処理ｈＨＳＣ及び未処理ｈＨＳＣの両方における関心対象の遺伝子の発現を決定した。
【００７４】
１０μモル／Ｌの濃度で得られたＥｍａｘ値（これは最大阻害を示す）として実験結果を表した。Sigma Plot 11.0ソフトウェアを使用して、一元ＡＮＯＶＡ、次いでボンフェローニ事後検定を使用して、統計分析を実施した。
［＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１（ＴＧＦβ１ １ng/mL群との比較）］
【００７５】
【表７】
2016506913.tif 000011
表３  式（Ｉ）の化合物及びソラフェニブは両方とも、ｈＨＳＣにおいてＴＧＦβ１による処理によって誘導された同じターゲット遺伝子の発現を妨げる。
【００７６】
腸線維症は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の病原的な特徴であり［６７］、この疾患の前臨床モデルに存在する。これまでのところ、ＩＢＤにおける線維症の発症を予防するための処置も、発生した線維症を治療するための処置も特定されていない。図４に示されているように、本発明者らは、予想外のことに、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）誘導ＩＢＤの前臨床モデルにおいて、大腸炎によって誘導される結腸の線維症マーカー（α−ＳＭＡ）発現の増加が、式（Ｉ）の化合物の投与によって部分的に抑制されたことを見出した。これは、式（Ｉ）の化合物が、様々な器官及び様々な障害における線維症の発症を予防及び／又は治療し得ることを示唆している。
【００７７】
【表８】
2016506913.tif 000012
表４：式（Ｉ）の化合物は、選択した種類のガン由来の実験細胞株の増殖を阻害する。材料及び方法に記載されているように、実験データのカーブフィッティングによって計算したＥＣ５０値（μモル／ｌ単位）として阻害率を表す。
【００７８】
抗ガン活性を有する治療化合物のほとんどは、ガン細胞の増殖を妨げる。表４に示されているように、本発明者らは、予想外のことに、式（Ｉ）の化合物が、様々な種類の腫瘍に対応する多様なガン細胞株の増殖を阻害したことを見出した。
【００７９】
活性化ｈＨＳＣのアポトーシスを誘導する能力は、線維性疾患の重要なターゲットである。本発明者らは、予想外のことに、式（Ｉ）の化合物が、図５に示されているようにある程度のアポトーシス促進特性を有するが、予想外のことに、広域スペクトルキナーゼ阻害剤スタウロスポリンのアポトーシス促進活性を用量依存的に増強したことを見出した。
【００８０】
【表９】
2016506913.tif 000013
2016506913.tif 000014
2016506913.tif 000015
【図１】
2016506913.tif 000016
【図２】
2016506913.tif 000017
【図３】
2016506913.tif 000018
【図４】
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【図５】
2016506913.tif 000020
【配列表】
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【国際調査報告】
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