(57)【要約】  本開示は、免疫原性ポリペプチドに融合させたＮ末端シグナルペプチドを含む融合タンパク質を提供する。免疫原性ポリペプチドは、ウイルス、細菌、又は真菌に由来するものであってよい。本開示はまた、Ｎ末端シグナルペプチドを用いた、免疫原性ポリペプチドの発現増大も提供する。Ｎ末端シグナルペプチドは、タンパク質、特に、分泌又は膜貫通ペプチドのどちらでもないタンパク質の合成を増強する方法も提供する。融合タンパク質は、疾病を診断し、免疫応答を誘導するために用いることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（ａ）Ｎ末端シグナルペプチドであって、配列番号３からなるＮ末端シグナルペプチド；及び
（ｂ）免疫原性ポリペプチド
を含む融合タンパク質。
【請求項２】
前記免疫原性ポリペプチドが、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、及び真菌タンパク質からなる群から選択されるタンパク質を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記免疫原性ポリペプチドが、ウイルスタンパク質を含む、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記免疫原性ポリペプチドが、２、３、４、５又は６つのタンパク質を含むポリタンパク質である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ウイルスが、ピコルナウイルス（picornavirirus）、フラビウイルス（flavirus）、トガウイルス（togavirus）、及びヒトパピローマウイルス（human papilloma virus）からなる群から選択される、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記ウイルスタンパク質が、口蹄疫ウイルス（Foot-and-Mouth Disease Virus）（ＦＭＤＶ）タンパク質を含む、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記ポリタンパク質が、ＦＭＤＶ  ｖｐ１タンパク質、ＦＭＤＶ  ｖｐ２タンパク質、ＦＭＤＶ  ｖｐ３タンパク質、及びＦＭＤＶ  ｖｐ４タンパク質からなるタンパク質の群から選択される少なくとも２つのタンパク質を含む、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
エピトープタグをさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記エピトープタグが、ヘキサヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグからなる群から選択される、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記エピトープタグが、前記シグナルペプチドのＮ末端に位置する、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記エピトープタグが、前記免疫原性ペプチドのＣ末端に位置する、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記免疫原性ポリペプチドが、ＦＭＤＶプロテアーゼである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項１に記載の融合タンパク質をコード化するポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１５】
（ｉ）請求項１に記載の融合タンパク質、及び
（ｉｉ）アジュバント
を含む免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記アジュバントが、少重膜非リン脂質小胞（Paucilamellar nonphospholipid vesicle）、水酸化アルミニウム、ＧＭＣＳＰ、ＢＣＧ、ｔｈｕｒ−ＭＤＰ、ｎｏｒ−ＭＤＰ、ＭＴＰ−ＰＥ、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ＭＦ−５９、及びＲＩＢＩからなる群から選択される、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
薬学的に許容される担体又は希釈剤をさらに含む、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
免疫原性ポリペプチドの生産を増大させる方法であって、宿主細胞において前記免疫原性ポリペプチドを融合タンパク質として発現させるステップを含み、前記融合タンパク質が、以下：
（ａ）Ｎ末端シグナルペプチドであって、配列番号３からなるＮ末端シグナルペプチド；及び
（ｂ）免疫原性ポリペプチド
を含み、Ｎ末端シグナルペプチドを含まない宿主細胞における免疫原性ポリペプチドの発現と比較して生産が増大する、方法。
【請求項１９】
前記宿主細胞が、バキュロウイルス（baculovirus）細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
被験者において防御免疫応答を誘導する方法であって、請求項１５に記載の組成物を前記被験者に投与するステップを含む方法。
【請求項２１】
前記被験者がヒトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記防御免疫応答が、細胞性免疫応答及び抗体媒介性免疫応答の少なくとも１つを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体媒介性免疫応答が、中和抗体を含む、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１５日に提出された米国仮特許出願第６１／７９０，１１４号に対する優先権を請求する。この文献の内容は、あらゆる目的のために本明細書にその全体を組み込むものとする。
【０００２】
配列表の相互参照
本出願は、２０１３年３月１４日に作成された、「NOVV_52_SeqList.txt」と題する２４ｋｂ配列表の内容を参照により組み込む。
【背景技術】
【０００３】
背景
ヒト及び動物は、細菌、真菌、及びウイルスなどの病原体に起因する疾病及び障害を患う。病原体による感染に対する免疫を誘導するためのワクチンの使用は、当該技術分野において公知である。ワクチンは、歴史的に、死滅ウイルス及び生弱毒化ワクチンなどの様々な手法を用いて調製されてきた。死滅ウイルス及び生弱毒化ワクチンは、有害な作用を伴い得るが、死滅ウイルスは、場合によっては、有効でないか、あるいは、実際に疾病を悪化させる恐れがある。
【０００４】
ワクチン生産の効率もまた、商業的実現可能性に対する障壁となり得る。あるケースでは、ワクチンの生産前に必要な長いリード時間が、また他のケースでは、不活性化前の生ウイルスの調製が、疾病及び障害を引き起こし得る。例えば、口蹄疫ウイルス（Foot-and-mouth disease virus）（ＦＭＤＶ）は、ピコルナウイルス科（Picornaviridae）に属する原型アフトウイルス（aphthovirus）である。口蹄疫大流行による経済的損失は、あらゆる家畜の疾病の中で最も高いものに含まれ、普及したワクチン接種は、疾病対策のための最適な方法である。既存のワクチンは、死滅全ウイルスワクチンであり、これには、不活性化前の生ウイルスの増殖、一部の株の増殖不足、及び貯蔵時の免疫原性の低下に起因するものなどの制限が認識されている。Porta et al.,“Eficient production of foot-and-mouth disease virus empty capsids in insect cells following down regulation of 3C protease activity,”J Virol Methods. 2013 Feb;187(2):406-12)を参照されたい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
近年、サブユニットワクチンを生産するための組み換え技術の使用が、特に関心を集めている。しかし、組み換えの手法は、生ウイルス生産の課題を解決し、迅速合成の可能性をもたらすものの、好適な量の免疫原の生産は、様々な理由のために困難となり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本開示は、ポリペプチドに融合させたＮ末端シグナルペプチドを含む融合タンパク質を提供する。本開示はまた、特に、分泌又は膜貫通タンパク質のどちらでもないタンパク質について、Ｎ末端シグナルペプチドを用いることにより、ポリペプチドの生産を増強する方法も提供する。融合タンパク質は、疾病を診断し、免疫応答を誘導するために用いることができる。いくつかの態様では、ポリペプチドは、免疫原性である。免疫原性ポリペプチドは、ウイルス、細菌、又は真菌に由来するものであってよい。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、ｖｐ０−ｖｐ３−ｖｐ１を順に有する非切断前駆体ポリタンパク質である、ＦＭＤＶ  Ｐ１タンパク質（「ｖｐ１〜４」として示す）を含むＢＶ１１６８（配列番号４をコード化する）及びＢＶ１１６９（配列番号１をコード化する）のプラスミドマップを示す。ｖｐ０は、ｖｐ４及びｖｐ２を含有する。配列は、ＢＶ１１６９が、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５インフルエンザウイルス由来のヘマグルチニンシグナルペプチドを含有する以外は、同一である。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、シグナルペプチドの非存在下で発現される同じポリペプチドと比較して、ＨＡシグナルペプチドを用いたとき得られる発現増強を示す。プラスミドは、図１に表すように調製した。ＢＶ１１６８は、ヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６）を有するＦＭＤＶ  Ｐ１タンパク質を含有した。ＢＶ１１６９は、ヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６）を有するＦＭＤＶ  Ｐ１タンパク質と、さらには、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５ＨＡ（配列番号３）由来のＮ末端シグナルペプチドも含有する。プラスミドをＳｆ９細胞において発現させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにより分析した。レーンは、次の通りである：Ｍ−マーカ。レーン１〜３は、ＢＶ１１６８から発現されたヘキサヒスチジンタグを有し、シグナルペプチドは含まないＦＭＤＶ  Ｐ１タンパク質を示す。レーン４〜６は、ＢＶ１１６９から発現されたヘキサヒスチジンタグ及びシグナルペプチドを有するＦＭＤＶ  Ｐ１タンパク質を示す。レーン７は、ＢＶ２６６対照を示し、レーン８は、ＢＶ１０６４  Ｓ３００Ｆｘｎを示す。図２Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、全タンパク質株によるレーン４〜６での発現増強を示す。図２Ｂ〜Ｄは、抗ヒスチジン抗体（図２Ｂ；「抗ＨＩＳ  Ｍａｂ」）、抗ＦＭＤＶ  ｖｐ２抗体（図２Ｃ；「Ｆ１４１２ＳＡ  Ｍａｂ」）、及び抗ＦＭＤＶ  ｖｐ１抗体（図２Ｄ；「１２ＦＥ９．２．１Ａ  Ｍａｂ」）により検出された、レーン４〜６での発現増強を示す。
【図３】図３は、シグナルペプチドを用いて発現することによる、個別の非分泌タンパク質の発現増強を示す。Ｓｆ９細胞を、シグナルペプチドを含む、及び含まない組み換えタンパク質を発現するバキュロウイルス（Baculovirus）に感染させた。感染から７０時間後に細胞を回収した。回収した粗材料（すなわち、細胞及び培地）を、組み換えタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットにより分析した。パネル（ａ）、すなわち、左側パネルは、ＦＭＤＶ  ｖｐ０の発現を示す。パネル（ｂ）、すなわち、右側パネルは、ＦＭＤＶ  ｖｐ１タンパク質の発現を示す。「＋」組み換えタンパク質は、シグナルペプチドを含み、「−」組み換えタンパク質は、シグナルペプチドを含まない。
【図４Ａ】図４Ａ−４Ｄは、本明細書に開示する配列を示す。図４Ａは、ＢＶ１１６９プラスミドによりコード化されるヌクレオチド配列を示す。発現されるタンパク質は、ＦＭＤＶ  Ｐ１前駆体ポリタンパク質であり、これは、Ｎ末端のＨＡシグナルペプチド及びＣ末端のＨｉｓ６−タグと一緒に、ｖｐ１〜ｖｐ４（すなわち、ｖｐ０−ｖｐ３−ｖｐ１；ｖｐ０は、ｖｐ２及びｖｐ４の両方を含む）を含む。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＢＶ１１６９により発現されたペプチド配列を示す。発現されたタンパク質は、ＦＭＤＶ  Ｐ１タンパク質であり、Ｎ末端のＨＡシグナルペプチド及びＣ末端のＨｉｓ６−タグと一緒に、タンパク質ｖｐ１〜ｖｐ４を含む。シグナルペプチド（ＭＥＫＩＶＬＬＬＡＩＶＳＬＶＫ；配列番号３）は、Ｉｎｄｏ  Ｈ５Ｎ１  ＨＡに由来する。
【図４Ｃ】図４Ｃ及び４Ｄは、それぞれ、ＢＶ１１６８プラスミドによりコード化されたヌクレオチド及びペプチド配列を示す。コード化された配列は、ＢＶ１１６８が、ＨＡシグナルペプチドを含まない以外は、ＢＶ１１６９と同じである。
【図４Ｄ】図４Ｃ及び４Ｄは、それぞれ、ＢＶ１１６８プラスミドによりコード化されたヌクレオチド及びペプチド配列を示す。コード化された配列は、ＢＶ１１６８が、ＨＡシグナルペプチドを含まない以外は、ＢＶ１１６９と同じである。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｃは、単一タンパク質及びタンデムでのタンパク質の発現を示す。Ｓｆ９細胞を、シグナルペプチドを含む（＋）又は含まない（−）タンパク質１、２、３、及び／若しくは４を発現する組み換えバキュロウイルス（baculovirus）（ＢＶ）に感染させ、感染から約６５時間後に回収した。粗サンプル（すなわち、細胞及び培地）を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにより分析した。発現された組み換えタンパク質を点で示す。ＢＶ１は、ＦＭＤＶ  ｖｐ１を発現する。ＢＶ２は、ＦＭＤＶ  ｖｐ０及びｖｐ３を発現する。ＢＶ３は、ＦＭＤＶ  ｖｐ１、ｖｐ０及びｖｐ３を発現する。ＢＶ４は、ＦＭＤＶ  Ｐ１ポリタンパク質（すなわち、ｖｐ０−ｖｐ３−ｖｐ１）を発現する。図５Ａは、全タンパク質株を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂ及び５Ｃは、それぞれ、ｖｐ１及びｖｐ２抗体の結合を示す。ｖｐ０タンパク質が、ｖｐ２タンパク質及びｖｐ４タンパク質を含むことに留意されたい。ＢＶ２とｖｐ１抗体との反応は、ｖｐ０との交差反応によるものである。また、ＦＭＤＶプロテアーゼ３Ｃによる発現増強も得られた（データは示していない）。「＋」組み換えタンパク質は、シグナルペプチドを含み、「−」組み換えタンパク質は、シグナルペプチドを含まない。
【図５Ｃ】図５Ｂ及び５Ｃは、それぞれ、ｖｐ１及びｖｐ２抗体の結合を示す。ｖｐ０タンパク質が、ｖｐ２タンパク質及びｖｐ４タンパク質を含むことに留意されたい。ＢＶ２とｖｐ１抗体との反応は、ｖｐ０との交差反応によるものである。また、ＦＭＤＶプロテアーゼ３Ｃによる発現増強も得られた（データは示していない）。「＋」組み換えタンパク質は、シグナルペプチドを含み、「−」組み換えタンパク質は、シグナルペプチドを含まない。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
定義
本明細書で用いる場合、「バキュロウイルス（baculvirus）」（バキュロウイルス科（Baculoviridae）としても知られる）は、節足動物のエンペロープＤＮＡウイルスの科を指し、そのメンバーは、挿入細胞培養物において組み換えタンパク質を生成するための発現ベクターとして用いることができる。ビリオンは、環状のスーパーコイル二本鎖ＤＮＡの分子（Ｍｗ  ５４×１０６〜１５４×１０６）を含有する１つ又は複数の桿状ヌクレオキャプシドを含む。ベクターとして用いられるウイルスは、一般に、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角病ウイルス（ＮＶＰ）である。導入された遺伝子の発現は、典型的に、感染した細胞にウイルスを埋め込んだ大型の核封入体のポリヘドロンタンパク質成分の発現を通常調節する強力なプロモータの制御下で起こる。
【０００９】
本明細書で用いる場合、「〜に由来する」という用語は、タンパク質、核酸若しくは他の分子の起源又は供給源を指す。タンパク質、核酸、及び他の分子は、本明細書に記載する供給源から改変してもよい。一部の態様では、改変は、完全長配列の残基又はヌクレオチドの欠失を含む。他の態様では、改変は、野生型配列の保存的突然変異を含む。
【００１０】
本明細書で用いる場合、「ワクチン」という用語は、免疫原に対する免疫応答を誘導して、防御免疫応答（すなわち、病原体による疾病又は障害の重症度を軽減する免疫応答）をもたらすために用いられる免疫原を含有する調製物を指す。防御免疫応答は、抗体の形成及び／又は細胞性応答を含み得る。好ましくは、ワクチンは、中和抗体の生成を誘導する。文脈によっては、用語「ワクチン」はまた、防御免疫を生み出すために、被験者に投与される免疫原の懸濁液又は溶液も指す。
【００１１】
本明細書で用いる場合、「ＶＬＰ」という用語は、ウイルス様粒子を指す。
【００１２】
本明細書で用いる場合、「約」という用語は、表示された値のプラスマイナス１０％を意味する。
【００１３】
本明細書で用いる場合、「アジュバント」という用語は、免疫原と組み合わせて用いられるとき、アジュバントなしで投与される免疫原に対する免疫応答に比べ、免疫原に対して誘導される免疫応答を改変する化合物を指す。
【００１４】
本明細書で用いる場合、「有効用量」という用語は、投与される用量が、細菌感染の治療又は管理に治療的利益をもたらすように、細菌毒素により誘発される疾病又は障害の少なくとも１つの症状を軽減する免疫応答を誘導するのに十分な免疫原の量を指す。有効な用量は、例えば、中和分泌及び／又は血清抗体の量を測定する、例えば、プラーク中和、補体固定、酵素結合イムノソルベント（ＥＬＩＳＡ）、又はマイクロ中和検定によって決定することができる。
【００１５】
本明細書で用いる場合、「実質的に防御的な抗体応答」という用語は、抗体、例えば、細菌毒素が細胞に侵入するのを阻止する中和抗体の生成を含む免疫応答を指す。
【００１６】
本明細書で用いる場合、「免疫原」又は「抗原」という用語は、免疫応答を誘導することができるタンパク質、及びペプチドなどの物質を指す。例えば、一部の態様では、免疫原は、免疫原性ポリペプチドである。
【００１７】
本明細書で用いる場合、「単離された」という用語は、被験者にあるのではない核酸、タンパク質、ＶＬＰなどの物質を指す。
【００１８】
本明細書で用いる場合、「被験者」又は「患者」という用語は、脊索動物亜門（subphylum cordata）の任意のメンバーを指し、限定するものではないが、ヒト及び他の霊長類、例えば、チンパンジー及び他の類人猿及びサル種などの非ヒト霊長類を含む。一部の態様では、被験者は、哺乳動物である。好適な哺乳動物としては、家畜、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマ、並びに飼育哺乳動物、例えば、イヌ及びネコが挙げられる。別の態様では、被験者は、マウス、ラット及びモルモットなどの実験用げっ歯類である。別の被験者は、鳥類である。鳥類は、家禽、野生及び競技用鳥類であってよい。例えば、ニワトリ、シチメンチョウ及び他のキジ目鳥類、アヒル、ガチョウなど。この用語は、成体及び新生個体を包含する。
【００１９】
本明細書で用いる場合、「トリインフルエンザウイルス」という用語は、主として鳥類にみいだされるが、ヒト又は他の動物にも感染し得るインフルエンザウイルスを指す。場合によっては、トリインフルエンザウイルスは、ヒトからヒトへ感染し、蔓延する恐れがある。ヒトに感染するトリインフルエンザウイルスは、インフルエンザ・パンデミック、すなわち、ヒトの罹患及び／又は死亡を引き起こす可能性を有する。パンデミックは、新型株のインフルエンザウイルス（ヒトが自然免疫を持たないウイルス）が出現し、個々の地域を越えて、場合によっては世界中に蔓延し、多数のヒトに一度に感染する場合に起こる。
【００２０】
本明細書で用いる場合、「季節性インフルエンザウイルス」という用語は、世界中の国立インフルエンザセンター（National Influenza Center）によって実施された疫病調査に基づいて所与のインフルエンザ流行シーズンの間、ヒトの集団内に発生することが判明しているインフルエンザウイルス株を指す。これらの会議によって、次の秋及び冬用のインフルエンザワクチンに含有させる３つのウイルス（Ａ型インフルエンザの２つのサブタイプ及びＢ型インフルエンザウイルスの１つのサブタイプ）の選択がなされる。この選択は、北半球では２月に、そして南半球では９月に行われる。通常、ワクチン中の３つのウイルス株のうち１つ又は２つが毎年変わる。Ａ型インフルエンザウイルスは、ウイルスの表面の２つのタンパク質：血球凝集素（Ｈ）及びノイラミニダーゼ（Ｎ）に基づいて、サブタイプに区分される。１７の異なる血球凝集素サブタイプと１０の異なるノイラミニダーゼサブタイプがある。Ａ型インフルエンザウイルスは、様々な株にさらに細分することができる。Ｂ型インフルエンザウイルスは、サブタイプに区分されないが、様々な株に細分することができる。“A revision of the system of nomenclature for influenza viruses: a WHO memorandum,”(1980) Buletin of the World Health Organization, 58(4):585-591を参照されたい。
【００２１】
本明細書で用いる場合、「免疫原性ポリペプチド」という用語は、被験者に投与したとき、免疫応答を誘導する病原体由来のタンパク質の一部又は全部を指す。好適な病原体としては、ウイルス、真菌、及び細菌が挙げられる。
【００２２】
宿主細胞におけるタンパク質の発現増強
宿主細胞におけるタンパク質の組み換え生産は、低い発現レベルによって妨げられる。本開示は、発現を増大させるためにシグナルペプチドを用いることによって、既存の技術より効率的に、ポリペプチドを生産する方法を提供する。シグナルペプチド（シグナル配列、リーダ配列又はリーダペプチドと呼ばれることもある）は、分泌経路に向かう運命にある、新しく合成されたタンパク質の大部分のＮ末端に存在する短いペプチドである。シグナルペプチドのコアは、単一αへリックスを形成する傾向にある疎水性アミノ酸の長い区間を有する。シグナルペプチドの終点には、典型的に、シグナルペプチダーゼ酵素により認識されて、切断されるアミノ酸の区間がある。
【００２３】
タンパク質の発現増大は、シグナルペプチドなしでタンパク質を発現させるのと比較して、シグナルペプチドを用いることにより達成される。発現用のポリペプチドは、好ましくは、非分泌性であるタンパク質及び非膜貫通性であるタンパク質から得られる。
【００２４】
特定の態様では、本開示は、病原体に対する免疫応答を誘導するための融合タンパク質、及び融合タンパク質を含む組成物を提供する。また、融合タンパク質をコードする核酸、核酸を含むベクター、及びベクターを含む宿主細胞も提供される。Ｎ末端シグナルペプチドを用いることによって、商業的に実現可能な量のポリペプチドを提供するのに十分な生産が達成されるように、要望されるポリペプチドの発現増大がもたらされる。
【００２５】
特定の態様では、ポリペプチドは、防御免疫応答を誘導するために用いることができる１つ又は複数の病原体に由来する免疫原性ポリペプチドである。病原体由来のポリペプチドは、例えば、ＦＭＤＶ感染の診断において、診断試薬としての用途も有する。Grubman and Baxt,“Foot-and-mouth disease,”Clin Microbiol Rev. 2004 Apr;17(2):465-93。
【００２６】
Ｎ末端シグナルペプチドを含む融合タンパク質
ポリペプチドは、典型的に、融合タンパク質として発現される。本明細書で用いる場合、「融合タンパク質」という用語は、アミド結合でつながれた少なくとも２つの異なるタンパク質に由来するポリペプチド配列を含む単一のポリペプチドとして解釈されるタンパク質を指す。融合タンパク質は、典型的に、少なくとも２つの異なるタンパク質の部分を含む融合タンパク質を調製し、発現させるのに用いられる典型的な分子生物学的手法を用いて調製する。特定の態様では、融合タンパク質は、Ｎ末端シグナル配列及びＣ末端免疫原性ポリペプチドを含む。
【００２７】
一部の態様では、シグナルペプチドは、インフルエンザ株Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５のＨＡタンパク質由来のものである。例えば、シグナルペプチドは、ＭＥＫＩＶＬＬＬＡＩＶＳＬＶＫ（配列番号３）から成るものでよい。別の態様では、シグナルペプチドは、ＭＥＫＩＶＬＬＬＡＩＶＳＬＶＫを含む。ＨＡタンパク質（配列番号６）におけるＫ残基のＣ末端の別のアミノ酸を用いてもよい。一部の態様では、シグナルペプチドは、ＨＡタンパク質の別の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０個のアミノ酸を含む。
【化１】
2016512680.tif 000003
【００２８】
一部の態様では、免疫原性ポリペプチドは、複数のタンパク質が、連続したオープンリーディングフレームを形成するように、タンデムでアラインメントされる２つ以上のタンパク質を含む。特定の態様では、タンデムタンパク質は、「ポリタンパク質」と呼ばれ、通常の感染の際のその生成を表す。一部の態様では、タンデムポリペプチドのタンパク質は、単一のポリペプチドとして宿主から調製される。別の態様では、タンデムポリペプチドは、例えば、内在性プロテアーゼにより、合成中に切断される。
【００２９】
一部の態様では、融合タンパク質は、１つの病原体由来の免疫原性ポリペプチドを含む。別の態様では、免疫原性ポリペプチドは、２つ、３つ、４つ、５つ若しくは６つの病原性タンパク質の一部又は全部を含むポリタンパク質であってよい。一部の態様では、ポリタンパク質は、２つ以上の病原体由来のタンパク質を含んでもよい。従って、例えば、融合タンパク質は、２つの病原体、３つの病原体、４つの病原体、又は５つの病原体を含んでよい。病原体は、同じ種又は異なる種に由来するものであってよく；例えば、融合タンパク質は、ウイルス、細菌、及び真菌に由来するタンパク質を含有してよい。特定の態様では、病原体は、同じ病原体種の異なる株であり；例えば、融合タンパク質は、異なるＨＩＶ株由来の同じタンパク質の部分を含んでもよく、従って、ワクチンとして投与したとき、複数の株に対する免疫を提供する。
【００３０】
免疫原性ポリペプチドは、完全長タンパク質の断片を含んでもよい。多様なサイズの完全長タンパク質の断片が許容可能である。断片は、完全長タンパク質の少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも２５個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも７５個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、少なくとも１２５個のアミノ酸、少なくとも１５０個のアミノ酸、少なくとも２００個のアミノ酸、少なくとも２５０個のアミノ酸、少なくとも２７５個のアミノ酸、少なくとも３００個のアミノ酸、少なくとも３５０個のアミノ酸、少なくとも３７５個のアミノ酸、又は少なくとも４００個のアミノ酸を有し得る。
【００３１】
別の態様では、免疫原性ポリペプチドは、ネイティブポリペプチドとの同一性を有する。同一性は、以下のパラメータ：スコアマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ；オープニングギャップペナルティー：１０；伸長ギャップペナルティー：１０；終了ギャップペナルティー：０．０５；セパレーションギャップペナルティー：０．０５を用いたClustalW (Version 2; ch.embnet.org/software/ClustalW.html)によって測定することができる。ネイティブタンパク質配列と比較して、免疫原性ポリペプチドは、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有し得るが、ここで、同一性は、ポリペプチドの長さに対して測定される。
【００３２】
特定の態様では、免疫原性ポリペプチドは、ウイルスに由来する。好適なウイルスとしては、ピコルナウイルス科（picornaviridae）（例えば、ポリオ、ＨＦＭＤ、コクサッキーウイルス（Coxsackievirus）、エンテロウイルス（enterovirus））、フラビウイルス（Flavivirus）（例えば、Ｃ型肝炎（hepatitis C）、ウェストナイル（West Nile）、及びデング熱（Dengue fever））並びにトガウイルス（Togavirus）（例えば、αウイルス（alphavirus及び風疹（rubella））が挙げられる。ヒトパピローマウイルス（papilloma virus）由来のタンパク質も、本明細書に開示する融合タンパク質を用いて、より高いレベルで発現させることができる。
【００３３】
特定の態様では、ウイルスは、ピコルナウイルス（picornavirus）である。ピコルナウイルス（Picornavirus）複製は、単一のオープニングリーディングフレームの翻訳から開始して、単一のポリタンパク質を生成するが、これは、複数の位置で、ウイルスコード化及び宿主細胞プロテアーゼにより切断されて、約１２の構造及び非構造タンパク質をもたらす。単一Ｐ１ペプチドとして発現される構造タンパク質（ｖｐ１、ｖｐ３、ｖｐ０）は、ｖｐ０、ｖｐ３及びｖｐ１に切断され、ウイルスゲノムを組み込んだ無エンベロープ正十二面体キャプシドに自己集合する。
【００３４】
一部の態様では、ピコルナウイルス（picornavirus）ウイルスは、口蹄疫ウイルス（foot-and-mouth disease virus）（ＦＭＤＶ）であってよい。細胞におけるＦＭＤＶ構造タンパク質の生産は、ウエスタンブロットによって検出可能な低い発現レベルしかないため、困難であった。（Oem et al.,“Characterrization of recombinant foot-and-mouth disease virus pentamer-like structures expressed by baculovirus and their use as diagnostic antigens in a blocking ELISA,”Vaccine. 2007 May 16;25(20):4112-21；Porta et al.,“Efficient production of foot-and-mouth disease virus empty capsids in insect cells following down regulation of 3C protease activity,”J Virol Methods. 2013 Feb;187(2):406-12）。
【００３５】
Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５ＨＡタンパク質由来のシグナルペプチド配列を、ＦＭＤＶ  Ｐ１構造タンパク質前駆体遺伝子のＮ末端に付加することにより、バキュロウイルス（baculovirus）−昆虫細胞発現系でのＰ１ポリペプチド発現レベルが有意に増強された。図２Ａ〜２Ｄで、ペプチドを含まないレーン１〜３を、ペプチドを発現するレーン４〜６と比較する。シグナルペプチドは、分泌及び膜貫通タンパク質にのみ存在し、ＦＭＤＶタンパク質は、分泌又は膜貫通タンパク質のどちらでもないことから、発現レベルの増大は、極めて意外であった。このように、本明細書に開示するシグナルペプチド手法は、非分泌タンパク質及び非膜貫通タンパク質の発現を増大させるのに特に好適である。
【００３６】
一部の態様では、タンパク質の一部を、タンパク質の精製中に取り出してもよい。一部の態様では、切断は、プロテアーゼによって行う。プロテアーゼは、宿主細胞内で発現させてもよいし、また、内在性プロテアーゼ若しくは過剰発現プロテアーゼであってもよい。別の態様では、融合タンパク質は、宿主細胞からの単離後に切断する。
【００３７】
特定の態様では、ＨＡシグナルペプチドを取り出してもよい。また別の態様では、ポリタンパク質として発現した融合タンパク質を、被験者に投与する前に、２つ以上の個別のタンパク質に切断してもよい。ＦＭＤＶポリタンパク質Ｐ１に関する例示的な実施例として、投与するタンパク質は、ヘキサヒスチジンタグを除去し、かつＨＡシグナルペプチド（配列番号３）を除去した配列番号４であってよい。他の態様では、ポリタンパク質Ｐ１は、被験者に投与する前に、個別のタンパク質ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３、及びｖｐ４に切断する。
【００３８】
一部の態様では、開示した融合タンパク質の精製は、エピトープタグにより促進され得る。当該技術分野で公知の好適なタグとしては、ＦＬＡＧタグ、６ヒスチジンタグ（ヘキサヒスチジン若しくは６Ｈｉｓとしても知られる）、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグが挙げられる。本明細書に開示する、エピトープタグを含むあらゆる配列は、タグなしで開示されるともみなすべきである。エピトープタグは、精製に必要なあらゆる場所に配置してよい。例えば、エピトープタグは、Ｎ末端又はＣ末端にあってよい。一部の態様では、エピトープタグは、融合タンパク質内に含有させてもよい。このような状況は、例えば、Ｎ又はＣ末端の一部が、融合タンパク質の生産中に除去される場合に起こり得る。特定の態様では、エピトープタグは、タンパク質合成中、又は合成後に除去してもよい。
【００３９】
一部の態様では、融合タンパク質は、免疫原性ポリペプチドのＣ末端に付加された膜貫通Ｃ末端（ＴＭ／ＣＴ）ドメインを有してもよい。好適なＣ末端ドメインは、２０１０年７月２２日に公開された米国特許出願公開第２０１０−０１８４１９２号に記載されている。一部の態様では、ＴＭ／ＣＴドメインは、インフルエンザＨＡに由来するものであってもよい。例えば、好適なＴＭ／ＣＴドメインは、鳥類、パンデミック及び／又は季節性インフルエンザウイルスに由来するものであってよい。ＴＭ／ＣＴドメインは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５及びＨ１６からなる群におけるＨＡタンパク質に由来するものであってよい。
【００４０】
免疫原（例えば、融合タンパク質）は、様々な製剤で投与してよい。例えば、融合タンパク質は、ミセルで、精製タンパク質、又はウイルス様粒子（ＶＬＰ）として投与してもよい。ミセル、医薬及びワクチン製剤も、本開示の様々な態様の範囲に含まれる。
【００４１】
核酸のクローニング及び操作
本開示の態様は、タンパク質をコードする核酸に関する。タンパク質をコードする核酸を調製する方法は、当該技術分野では公知である。例えば、特定のタンパク質をコードする遺伝子を、細胞から抽出したポリアデニル化ｍＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲにより単離することができる。一部の態様では、得られる産物遺伝子は、ベクター中に核酸挿入片としてクローニングすることができる。「ベクター」という用語は、核酸を増殖させ、及び／又は生物、細胞、若しくは細胞成分の間で輸送することができる手段を指す。ベクターとしては、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポソン、人工染色体が挙げられる。一部の態様では、ベクターは、自律的に複製し得る。ベクターはまた、宿主細胞の染色体に組み込んでもよい。別の態様では、ベクターは、自律的に複製しない、ネイキッドＲＮＡポリヌクレオチド、ネイキッドＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖内でＤＮＡ及びＲＮＡの両方から構成されるポリヌクレオチド、ポリ−リシン結合ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ペプチド結合ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、リポソーム結合ＤＮＡなどであってよい。全部ではないが、多くの一般的実施形態において、本開示のベクターは、プラスミド又はバクミド（bacmid）である。
【００４２】
本開示に適用可能な分子生物学的技術（例えば、クローニング、突然変異、細胞培養など）を記載する一般的文書としては、以下のものが挙げられる：Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger)；Sambrook et al., Molecular Cloning--A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000 (“Sambrook”)及びCurrent Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al.,編, Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc.及びJohn Wiley & Sons, Inc.,の合弁会社(“Ausbel”)。
【００４３】
一部の態様では、タンパク質（キメラ分子を含む）をコード化するヌクレオチドを発現ベクターにクローニングしてもよい。「発現ベクター」は、そこに組み込まれた核酸の発現、並びにその複製を促進することができるベクター、多くの場合、プラスミドである。典型的に、発現させようとする核酸は、プロモータ及び／又はエンハンサーに「作動可能に連結され」、プロモータ及び／又はエンハンサーによる転写調節制御を受ける。別の実施形態では、ベクターは、別のタンパク質をコード化するヌクレオチドをさらに含んでもよい。
【００４４】
ベクターに好適なプロモータとしては、ＡｃＭＮＰＶ多面体プロモータ（又は他のバキュロウイルス（baculovirus））、ファージλＰＬプロモータ、大腸菌（E. coli）ｌａｃ、ｐｈｏＡ及びｔａｃプロモータ、ＳＶ４０早期及び後期プロモータ、並びにレトロウイルスＬＴＲのプロモータが挙げられる。他の好適なプロモータは、当該技術分野において公知である。ベクターは、転写開始、終結のための部位、及び転写領域では、リボソーム結合部位をさらに含んでもよい。構築物によって発現された転写物のコード部分は、翻訳すべきポリペプチドの開始点に翻訳開始時コドンを、終了点に適切に位置する終止コドンを含んでもよい。
【００４５】
ベクターは、１つ又は複数の選択マーカを含んでもよい。このようなマーカとしては、真核細胞培養の場合には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８若しくはネオマイシン耐性、並びに大腸菌（E. coli）又は他の細菌での培養の場合には、テトラサイクリン、カナマイシン若しくはアンピシリン耐性遺伝子がある。ベクターの例としては、ウイルスベクター、例えば、バキュロウイルス（baculovirus）、ポックスウイルス（poxvirus）（例えば、ワクシニア（vaccinia）ウイルス、アビポックス（avipox）ウイルス、カナリアポックス（canarypox）ウイルス、鶏痘（fowlpox）ウイルス、アライグマ痘（raccoonpox）ウイルス、ブタ痘（swinepox）ウイルスなど）、アデノウイルス（adenovirus）（例えば、イヌアデノウイルス（canine adenovirus））、ヘルペスウイルス（herpesvirus）、及びレトロウイルス（retrovirus）が挙げられる。用いることができる他のベクターとしては、細菌ベクター、例えば、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０及びｐＱＥ−９、ｐＢｌｕｅｒｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、及びｐＲＩＴ５などが挙げられる。好ましい真核ベクターとしては、ｐＦａｓｔＢｃｌ、ｐＷＩＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐ００４４、ｐＸＴＩ、ｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬが挙げられる。他の好適なベクターは、当業者には容易に明らかであろう。
【００４６】
様々なタイプの突然変異誘発を用いて、ヌクレオチド配列又はアミノ酸を改変することができる。こうした突然変異誘発として、限定はしないが、部位特異的、ランダム点突然変異誘発、相同性組み換え（ＤＮＡシャッフリング）、鋳型を含むウラシルを用いた突然変異誘発、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップドデュプレックスＤＮＡ（gapped duplex DNA）などが挙げられる。別の方法としては、点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を用いた突然変異誘発、制限−選択及び制限−精製、欠失突然変異誘発、全遺伝子合成による突然変異誘発、二本鎖切断修復などが挙げられる。一実施形態では、突然変異誘発は、天然に存在する分子又は改変若しくは突然変異した天然の分子、例えば、配列、配列比較、物理的性質、結晶構造などの既知情報によって誘導することができる。
【００４７】
一部の態様では、ヌクレオチド配列は、例えば、特定の宿主についてのコドン発現を最適化する（ヒトｍＲＮＡ内のコドンをＳｆ９細胞などの昆虫細胞により選択されるものに変更する）ために、サイレント突然変異を含んでもよい。例えば、米国特許出願公開第２００５／０１１８１９１号を参照されたい。
【００４８】
真核宿主細胞としては、酵母、昆虫、トリ、植物、Ｃ．エレガンス（C. elegans）（又は線虫）及び哺乳動物宿主細胞がある。昆虫細胞の好適な例は、ツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）（Ｓｆ）細胞、例えば、ＳＤ、Ｓｆ２１、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）細胞、例えば、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞、及びショウジョウバエ（Drosophilla）Ｓ２細胞が挙げられる。真菌（酵母を含む）宿主細胞の例としては、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）、クルイベロミセス・ラクチス・ラクチス（Kluyveromyces lactis lactis）、Ｃ．アルビカンス（C. albicans）及びＣ．グラブラタ（C. gkabrata）などのカンジダ（Candida）の種、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）（S. pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、及びヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）などがある。哺乳動物細胞の例としては、ＣＯＳ細胞、ベビーハムスター腎細胞、マウスＬ細胞、ＬＮＣａＰ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞、及びアフリカミドリザル（African green monkey）細胞、ＣＶ１細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ及びＨｅｐ−２細胞がある。また、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）卵母細胞、又は両生類由来の他の細胞を用いてもよい。原核宿主細胞の例としては、例えば、大腸菌（E. coli）、枯草菌（B. subtilis）、腸チフス菌（Salmonella typhi）、及びマイコバクテリア（mycobacteria）などの細菌細胞が挙げられる。
【００４９】
ウイルス様粒子
当該技術分野では様々なＶＬＰが知られている。一部の態様では、本開示の融合タンパク質をＶＬＰに組み込む。他の態様では、ＶＬＰに組織化するタンパク質の発現を増強するために、本開示の融合タンパク質を用いることにより、ＶＬＰ生産を増強することができる。一部の態様では、ＶＬＰは、インフルエンザＶＬＰであってよい。インフルエンザＶＬＰは、Robinsonによる米国特許第７，７６３，４５０号、Smithによる同第８，０８０，２５５号、Galarzaによる米国特許第７，５５６，９４０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０１２９４０１号に記載されているように調製することができる。インフルエンザＭ１単独の発現は、ＶＬＰを組織化するのに十分である。従って、本明細書に開示する１つ又は複数の融合タンパク質以外に、インフルエンザＶＬＰは、インフルエンザＭ１タンパク質のみを含んでもよい。他の態様では、１つ又は複数の別のインフルエンザタンパク質を含んでもよい。例えば、別のタンパク質としては、Ｍ２、ＨＡ又はＮＡなどの他のインフルエンザタンパク質が挙げられる。
【００５０】
ＨＡ及びＮＡタンパク質は、様々なサブタイプ及び／又は様々な株に由来するものであってよい。例えば、ＨＡは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５及びＨ１６からなる群から選択してよい。ＮＡは、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８及びＮ９からなる群から選択してよい。ＨＡは、血球凝集素活性を呈示し得る。ＮＡは、ノイラミニダーゼ活性を呈示し得る。
【００５１】
インフルエンザタンパク質（例えば、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、又はＮＡ）は、様々な供給源に由来するものであってよい。例えば、インフルエンザタンパク質は、以下：ヒト及び他の霊長類、例えば、チンパンジーや他の類人猿及びサル種などの非ヒト霊長類；家畜、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマ；飼育哺乳動物、例えば、イヌ及びネコ；実験用動物、例えば、マウス、ラット及びモルモットなどのげっ歯類；鳥類、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウなどの家禽、野生及び競技用鳥類に由来するものであってよい。特定の態様では、インフルエンザは、トリインフルエンザ；例えば、Ｈ９Ｎ２サブタイプ（例えば、株Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９）又はＨ５Ｎ２サブタイプ（例えば、株Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５）である。他の特定の態様では、インフルエンザは、Ｈ１Ｎ１サブタイプ又はＨ３Ｎ２サブタイプである。
【００５２】
医薬又はワクチン製剤及び投与
本明細書に開示する方法により生産されるタンパク質は、当該技術分野では公知の手法に従い、被験者に投与するための医薬組成物として製剤化することができる。
【００５３】
医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含有してよい。本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される」という用語は、哺乳動物、特にヒトへの使用について、連邦又は州政府の取締り機関により承認されているか、又は米国薬局方、欧州薬局方若しくは他の一般に認定されている薬局方に記載されていることを意味する。これらの組成物は、脊椎動物において、防御免疫応答を誘導するためのワクチン及び／又は抗原組成物として有用となり得る。
【００５４】
一部の態様では、製剤は、薬学的に許容される担体又は賦形剤を含んでよい。薬学的に許容される担体として、限定はしないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、滅菌等浸透圧水性緩衝液、及びこれらの組み合わせが挙げられる。薬学的に許容される担体、希釈剤、及び他の賦形剤の網羅的論考は、Remington’s Pharmaceutical Sciences（Mack Pub. Co. N.J. 現行版）に記載されている。製剤は、投与方法に合わせて改変してもよい。例示的実施形態では、製剤は、ヒトへの投与に適しており、無菌、非粒子状及び／又は非発熱性である。
【００５５】
組成物はまた、湿潤剤、若しくは乳化剤、若しくはｐＨ緩衝剤、又はこれらの混合物を含んでもよい。組成物は、再構成（例えば、水若しくは食塩水を用いて）に好適な凍結乾燥粉末のような固体の形態、液体の溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤、又は粉末であってよい。経口製剤は、標準的担体、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含んでよい。
【００５６】
一部の態様では、製剤の１つ又は複数の成分を充填した１つ又は複数の容器を含む医薬用パック又はキットが提供される。特定の態様では、キットは、２つの容器を含んでよく、第１の容器は、毒素受容体結合タンパク質融合タンパク質、毒素受容体結合タンパク質融合タンパク質を含むミセル、又は毒素受容体結合タンパク質融合タンパク質を含むＶＬＰを含有し、第２の容器は、アジュバントを含有する。このような容器には、医薬又は生物学的製剤の製造、使用又は販売を取り締まる政府機関により規定された形態の通知が付属しており、この通知は、ヒトへの投与についての、当該機関による製造、使用又は販売の承認を表す。製剤はまた、組成物の量を表示するアンプル又はサシェットなどの密封容器内に包装してもよい。
【００５７】
投与及び用量決定
投与は、任意の好適な経路であってよい。好適な経路としては、非経口投与（例えば、皮内、筋内、静脈内及び皮下）、硬膜外、及び粘膜（例えば、鼻内及び経口又は肺経路又は座薬による）、経皮若しくは皮内が挙げられる。投与は、注入又はボーラス注射、上皮若しくは皮膚粘膜（mucocutaneous linings）（例えば、口腔粘膜、結腸、結膜、鼻咽頭、中咽頭、腟、尿道、膀胱及び腸管粘膜など）を介した吸収によっても投与することができ、他の生物学的に活性の薬剤と一緒に投与することができる。一部の態様では、鼻内又は他の粘膜投与経路によって、他の投与経路より実質的に高い抗体若しくはその他の免疫応答が誘導され得る。投与は、全身又は局所的のいずれでもよい。
【００５８】
一部の態様では、投与は、注射器を用いた注射により、無針注射器により実施してよい。他の態様では、投与は、点滴、大粒子エーロゾル（約１０ミクロン超）、又は上気道への噴霧によって行われる。
【００５９】
一部の態様では、投与をターゲティングしてもよい。例えば、免疫付与部位に免疫応答を誘導する目的で、粘膜組織をターゲティングするように、免疫原を投与してよい。腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）などの粘膜組織は、特定の粘膜ターゲティング特性を有するアジュバントを含有する組成物の経口投与を用いることにより、免疫のためにターゲティングすることができる。鼻咽喉リンパ組織（ＮＡＬＴ）及び気管関連リンパ組織（ＢＡＬＴ）などの別の粘膜組織をターゲティングしてもよい。
【００６０】
一部の態様では、複数の免疫原を投与してもよい。２つ以上の免疫原を投与する場合、例えば、複数の免疫原を含有する容器から物質を注射することにより、被験者の同じ位置に同時に共投与してよい。他の態様では、２つ以上の免疫原を共投与する場合、短い時間間隔内に、異なる部位に順次共投与してよい；例えば、１回目の投与を大腿に、２回目の投与を腕に実施してよく、その際、２回目の投与は、短い時間（例えば、最大３０分）内に行う。
【００６１】
投与は、例えば、投薬スケジュール、例えば、組成物の初回投与と、後のブースタ投与で実施してよい。特定の実施形態では、組成物の２回目用量は、初回投与から２週間から１年後、好ましくは、約１、約２、約３、約４、約５、又は約６ヵ月後に投与する。さらに、２回目用量後で、かつ初回投与から約３ヵ月から約２年後、又はそれ以上の期間後、好ましくは、約４、約５、若しくは約６ヶ月、又は約７ヵ月後、あるいは約１年後に、３回目用量を投与してもよい。３回目用量は、２回目用量後に被験者の血清及び／若しくは尿又は粘膜分泌物中に特定の免疫グロブリンが全く検出されないか、又は検出されても低レベルである場合に、任意選択で投与してよい。好ましい実施形態では、２回目用量は、初回投与から約１ヵ月後、３回目用量は、初回投与から約６ヵ月後に投与する。別の実施形態では、２回目用量は、初回投与から約６ヵ月後に投与する。別の実施形態では、本開示の組成物は、併用治療の一環として投与することができる。例えば、他の免疫原性組成物、抗ウイルス剤及び／又は抗生物質と一緒に組成物を製剤化してもよい。
【００６２】
医薬組成物投与計画は、例えば、最初に、予防又は治療免疫応答を誘発するのに有効な量を明らかにすることによって、当業者が容易に決定することができ、これは、例えば、ウイルス特異的免疫グロブリンの血清力価を測定することにより、又は血清サンプル、若しくは尿サンプル、若しくは粘膜分泌物中の抗体の阻害率を測定することにより行う。投与計画は、動物試験から決定することができる。ワクチンの有効性を試験するのに用いられる動物の非制限的リストには、モルモット、ハムスター、フェレット、チンチラ、マウス及びコットンラットが含まれる。
【００６３】
ほとんどの動物は、感染因子に対する天然の宿主ではないが、それでも、様々な態様の疾病の研究において役立ち得る。例えば、上記の動物のいずれかに、ワクチン候補を投与して、誘導された免疫応答を部分的に特性決定する、及び／又は任意の中和抗体が生成されたかどうかを決定することができる。例えば、マウスはサイズが小さく、しかも低コストであるため、研究者がより大きな規模で試験を実施することができるので、多くの試験がマウスモデルで実施されている。
【００６４】
さらに、当業者により、ヒトへの好ましい有効な用量を決定するために、ヒト臨床試験を実施することもできる。このような臨床試験はルーティンであり、当該技術分野では公知である。使用すべき正確な用量はまた、投与経路に応じて変動し得る。有効な用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又は動物試験系から得られた用量−応答曲線から補外することができる。用量は、例えば、年齢、健康状態、体重、性別、食事、投与時間、及びその他の臨床学的因子に基づいて調節してよい。
【００６５】
単一用量による免疫の刺激は可能であるが、要望される効果を達成するために、同じ、又は異なる経路により、追加用量を投与してもよい。例えば、新生児及び乳児の場合、十分なレベルの免疫を誘発するために、複数回の投与が必要となり得る。投与は、感染に対する十分なレベルの防御を維持する上で必要に応じて、幼児期全体を通じ、間隔をおいて継続することができる。同様に、感染の再発又は重篤な感染症に特に罹患しやすい成人、例えば、医療従事者、デイケア従事者、幼児の家族メンバー、高齢者、及び心肺機能が損なわれた個人は、防御免疫応答を定着させる、及び／又は維持するために、複数回の免疫を必要とし得る。誘導された免疫のレベルは、例えば、中和分泌及び血清抗体の量を測定することによりモニターすることができ、要望されるレベルの防御を誘発して維持する上で必要に応じて、用量を調節したり、ワクチン接種を繰り返したりする。
【００６６】
一部の態様では、組成物は、液体として供給してもよい。組成物の液体形態は、少なくとも約５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも約１００μｇ／ｍｌ、少なくとも約２００μｇ／ｍｌ、少なくとも約５００μｇ／ｍｌ、又は少なくとも約１ｍｇ／ｍｌで、密封された容器に入れて供給してよい。
【００６７】
アジュバント
アジュバントとして知られる免疫応答の非特異的刺激物質を用いて、特定の組成物の免疫原性を増強することも可能である。抗原に対する全身の免疫増大を促進するために、アジュバントが実験により用いられている（例えば、米国特許第４，８７７，６１１号を参照）。免疫プロトコルでは、何年もの間、応答を刺激するためにアジュバントを使用しており、このように、アジュバントは、当業者には周知である。一部のアジュバントは、抗原が提示される方法に影響を与える。例えば、タンパク質抗原をミョウバンにより沈降させると、免疫応答は増大する。また、抗原の乳化も、抗原提示の持続時間を長続きさせる。Vogel et al.,“A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2nd Edition),”（あらゆる目的のためにその全体を参照により本明細書に組み込む）に記載されている任意のアジュバントの含有は、本開示の範囲内で考慮される。
【００６８】
例示的アジュバントとしては、フロイントアジュバント（死滅結核菌（Mycobacterium tuberculosis）を含む免疫応答の非特異的刺激物質）、不完全フロイントアジュバント及び水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。他のアジュバントとしては、ＧＭＣＳＰ、ＢＣＧ、ｔｈｕｒ−ＭＤＰ及びｎｏｒ−ＭＤＰなどのＭＤＰ化合物、ＣＧＰ（ＭＴＰ−ＰＥ）、脂質Ａ、及びモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ＭＦ−５９、ＲＩＢＩ（細菌から抽出した３つの成分を含有する）、ＭＰＬ、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）及び２％スクアレン／Tween（登録商標）８０エマルジョン中の細胞壁骨格（ＣＷＳ）がある。
【００６９】
一部の態様では、アジュバントは、少重膜脂質小胞（paucilamellar lipid vesicle）であってもよく、これは、実質的に球状のシェルの形態で配置される２〜１０の二層を有し、これらの二層は、脂質二層を含まない大きな無定形の中心腔を囲む水性層によって隔てられている。少重膜脂質小胞は、非特異的刺激物質として、抗原の担体として、別のアジュバントの担体として、並びにこれらの組み合わせとして、いくつかの方法で免疫応答を刺激するように作用し得る。例えば、抗原が小胞に対して細胞外のままであるように、抗原を、事前形成小胞と混合することによりワクチンを調製した場合、少重膜脂質小胞は、非特異的免疫刺激物質として作用する。小胞の中心腔内に抗原を包膜することにより、小胞は、免疫刺激物質及び抗原の担体の両方として作用する。別の実施形態では、小胞は、主として非リン脂質小胞から成る。他の実施形態では、小胞は、Novasomes（登録商標）である。Novasomes（登録商標）は、約１００ｎｍ〜約５００ｎｍの少重膜非リン脂質小胞（paucilamellar nonphospholipid vesicle）である。これらは、Ｂｒｉｊ  ７２、コレステロール、オレイン酸及びスクアレンを含む。Novasomesは、インフルエンザ抗原の有効なアジュバントであることが立証されている（米国特許第５，６２９，０２１号、同第６，３８７，３７３号、及び同第４，９１１，９２８号を参照）。
【００７０】
本開示の組成物は、「免疫刺激物質」と一緒に製剤化してもよい。これらは、免疫系の応答を増大させるための身体自身の化学的メッセンジャー（サイトカイン）である。免疫刺激物質として、限定はしないが、免疫刺激、免疫増強、及び炎症誘発活性を有する各種サイトカイン、リンホカイン及びケモカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３）；増殖因子（例えば、顆粒球−マクロファージ（ＧＭ）−コロニー刺激因子（ＣＭ）；並びに他の免疫刺激分子、例えば、マクロファージ炎症因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１；Ｂ７．２などが挙げられる。免疫刺激分子は、本開示の組成物と同じ製剤中で投与してもよいし、又は個別に投与してもよい。免疫刺激作用を生み出すように、タンパク質又はタンパク質をコード化する発現ベクターのいずれかを投与してもよい。従って、一実施形態では、本開示は、アジュバント及び／又は免疫刺激物質を含む抗原性及びワクチン製剤を含む。本開示は、毒素生成成分による感染の結果、又は毒素を身体に導入する事象の結果として、ヒト若しくは他の動物に導入された毒素により誘導される続発の疾病に対する実質的な免疫を付与するように、細菌毒素でヒト若しくは他の動物にワクチン接種することを考慮する。
【００７１】
本開示の態様を以下の実施例によりさらに詳しく説明するが、これらを限定的と解釈すべきではない。本出願全体を通して引用される全ての参照文献、アクセッション番号、配列、特許及び公開特許出願、並びにその中の図面及び配列表の内容は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込むものとする。
【実施例】
【００７２】
実施例１
ＦＭＤＶポリタンパク質の調製及び発現
ＦＭＤＶポリタンパク質を２つのベクター、ＢＶ１１６８及びＢＶ１１６９にクローニングした（図１）。ベクターは、ＢＶ１１６９が、Ｎ末端にＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５シグナルペプチド配列（配列番号３：ＭＥＫＩＶＬＬＬＡＩＶＳＬＶＫ）を含む以外は、同一である。いずれの場合も、Ｐ１ポリタンパク質は、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグを含んだ。ＢＶ１１６８によりコード化されるタンパク質及びヌクレオチド配列を図４Ｃ及び４Ｄにそれぞれ示す。ＢＶ１１６８によりコード化されるタンパク質及びヌクレオチド配列を図４Ａ及び４Ｂにそれぞれ示す。
【００７３】
Ｓｆ９細胞を、ＢＶ１１６８及びＢＶ１１６９の３つのクローンに、０．５ｆｆｕ／細胞のＭＯＩで感染させ、２７℃、１５０ｒｐｍで約７０時間インキュベートした。図２に示すように、粗回収物（細胞及び培地）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにより分析した。レーンは次の通りである：Ｍ−マーカ。レーン１〜３は、ＢＶ１１６８から発現されるヘキサヒスチジンタグを有し、シグナルペプチドを含まないＦＭＤＶ  Ｐ１タンパク質を示す。レーン４〜６は、ＢＶ１１６９から発現される、ヘキサヒスチジンタグ及びシグナルペプチドを含むＦＭＤＶ  Ｐ１タンパク質を示す。レーン７は、ＢＶ２６６対照を示し、レーン８は、ＢＶ１０６４  Ｓ３００  Ｆｘｎを示す。図２Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、全タンパク質株によるレーン４〜６における発現の増強を示す。図２Ｂ〜Ｄは、抗ヒスチジン抗体（図２Ｂ；「抗ＨＩＳ  Ｍａｂ」）、抗ＦＭＤＶ  ｖｐ２抗体（図２Ｃ；「Ｆ１４１２ＳＡ  Ｍａｂ」）により、及び抗ＦＭＤＶ  ｖｐｌ抗体（図２Ｄ；「１２ＦＦ９．２．１Ａ  Ｍａｂ」）により検出されたレーン４〜６における発現の増強を示す。
【００７４】
データから、Ｎ末端シグナルペプチドを含む融合タンパク質として過剰発現させると、ＦＭＤＶポリタンパク質Ｐ１発現は実質的に増大することが明らかにされた。Ｐ１タンパク質は、非切断形態で生成され、抗ＦＭＤＶモノクローナル抗体により検出可能である。
【００７５】
実施例２
単一ＦＭＤＶポリペプチドの発現増強
シグナルペプチドと融合させると、個別の非分泌タンパク質の発現が増強される。Ｓｆ９細胞を、各々シグナルペプチドを含む、又は含まないＦＭＤＶ  ｖｐ０又はＦＭＤＶ  ｖｐ１タンパク質を発現するバキュロウイルス（Baculovirus）に感染させた。感染から７０時間後に細胞を回収した。回収した粗材料（すなわち、細胞及び培地）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び組み換えタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットにより分析した。図３のパネル（ａ）（左側パネル）は、ＦＭＤＶ  ｖｐ０の発現を示す。図３のパネル（ｂ）（右側パネル）は、ＦＭＤＶ  ｖｐ１タンパク質の発現を示す。いずれの場合も、「＋」組み換えタンパク質は、シグナルペプチドを含み、「−」組み換えタンパク質は、シグナルペプチドを含まない。矢印は、発現されたｖｐ１タンパク質を示す。
【００７６】
実施例３
単一及び複数のタンパク質を含むＦＭＤＶポリペプチドの発現
シグナルペプチドは、単一のタンパク質及びタンデムでのタンパク質の発現の発現を増大させる。図５は、様々な異なる構築物による発現の増大を示す。Ｓｆ９細胞を、シグナルペプチドを含む（＋）又は含まない（−）タンパク質１、２、３、及び／又は４を発現する組み換えバキュロウイルス（baculovirus）（ＢＶ）に感染させ、感染から約６５時間後に回収した。粗サンプル（すなわち、細胞及び培地）を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにより分析した。発現された組み換えタンパク質を点で示す。ＢＶ１は、ＦＭＤＶ  ｖｐ１を発現する。ＢＶ２は、ＦＭＤＶ  ｖｐ０  ｖｐ３を発現する。ＢＶ３は、ＦＭＤＶ  ｖｐ１、ｖｐ０及びｖｐ３を発現する。ＢＶ４は、ＦＭＤＶ  Ｐ１ポリタンパク質（すなわち、ｖｐ０−ｖｐ３−ｖｐ１）を発現する。図５Ａは、全タンパク質株を示す。図５Ｂ及び５Ｃは、それぞれ、ｖｐ１及びｖｐ２抗体の結合を示す。ｖｐ０タンパク質が、ｖｐ２タンパク質を含むことに留意されたい。いずれの場合も、タンパク質の発現増大が得られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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