(57)【要約】【課題】本発明の癌病変標識用組成物は、癌の病変に結合して、癌病変の位置、サイズなどをリアルタイムで検出することができ、癌病変の外科的手術医成功率を向上させるだけでなく、正常組織の過多の損失を防止することができるので、効果的な抗癌治療に広く活用できる。【解決手段】大凝集アルブミン（ＭＡＡ）に、生体組織染色用色素、放射性同位元素またはこれらの組み合わせが結合された複合体を含む癌病変標識用組成物、前記癌病変標識用組成物を用いて、癌病変の位置に対する情報を提供する方法、前記癌病変標識用組成物を含む癌病変標識用キット及び前記癌病変標識用組成物に含まれた大凝集アルブミンに、生体組織染色用色素が結合された複合体を提供する。【選択図】図１４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
大凝集アルブミン（ＭＡＡ）に、生体組織染色用色素、放射性同位元素またはこれらの組み合わせが結合された複合体を含む癌病変標識用組成物。
【請求項２】
前記生体組織染色用色素は、肉眼で確認可能な色素または蛍光色素であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記肉眼で確認可能な色素は、中性赤、ナイルブルー、ビスマルクブラウン、リチウムカルミン、トリパンブルー、ヤーヌスグリーン、メチルバイオレット、オーラミン、マラカイトグリーン、サフラニン、エオシン、コンゴレッド、エリスロシン、ニグロシン、アルシアンブルーヘマトキシリン、アニリンブルー、ライトグリーン及びこれらの組み合わせよりなる群から選択されることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記蛍光色素は、近赤外線蛍光色素であることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記近赤外線蛍光色素は、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）であることを特徴とする請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記放射線同位元素は、Ｈ−３、Ｃ−１４、Ｐ−３２、Ｓ−３５、Ｃｌ−３６、Ｃｒ−５１、Ｃｏ−５７、Ｃｏ−５８、Ｃｕ−６４、Ｆｅ−５９、Ｙ−９０、Ｉ−１２４、Ｉ−１２５、Ｒｅ−１８６、Ｉ−１３１、Ｔｃ−９９ｍ、Ｍｏ−９９、Ｐ−３２、ＣＲ−５１、Ｃａ−４５、Ｃａ−６８及びこれらの組み合わせよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
大凝集アルブミンに、フィブリンがさらに結合されたことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記複合体が、ゼラチンまたはゼラチンスポンジの内部に捕集された形態で存在することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ゼラチンスポンジは、ゼラチンに存在するリシンの側鎖アミン基と、グルタメートまたはアスパラテートの側鎖カルボキシル基と間にイソペプチド結合が生成された形態の構造物であることを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記癌は、固形癌であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記固形癌は、前立腺癌、乳癌、子宮癌、皮膚癌、子宮頸癌、肺癌、脳腫瘍、胃腸管腫瘍、肝癌、軟組織肉腫、リンパ腫及びこれらの組み合わせよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物は、癌除去手術中に、リアルタイムで癌病変組織のサイズ及び位置確認のために使用されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
大凝集アルブミンに、（ａ）生体組織染色用色素、放射性同位元素またはこれらの組み合わせ、及び（ｂ）フィブリンが結合された複合体を含む癌病変標識用組成物であって、前記複合体は、ゼラチンスポンジの内部に捕集された組成物。
【請求項１４】
（ａ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物を個体から発生された癌の病変に投与するステップと、
（ｂ）前記個体から色合い、近赤外線蛍光、放射線及びこれらの組み合わせよりなる群から選択される信号を確認するステップと、
を含む癌病変の位置に対する情報を提供する方法。
【請求項１５】
求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物を含む癌病変標識用キット。
【請求項１６】
前記キットは、癌除去手術中に、リアルタイムで癌病変組織のサイズ及び位置の確認のために使用されることを特徴とする請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
大凝集アルブミンに、生体組織染色用色素が結合された複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な癌病変標識用組成物に関する。より詳しくは、本発明は、大凝集アルブミン（ＭＡＡ：ｍａｃｒｏａｇｇｒｅｇａｔｅｄ  ａｌｂｕｍｉｎ）に、生体組織染色用色素、放射性同位元素またはこれらの組み合わせが結合された複合体を含む癌病変標識用組成物、前記癌病変標識用組成物を用いて癌病変の位置に対する情報を提供する方法、前記癌病変標識用組成物を含む癌病変標識用キット及び前記癌病変標識用組成物に含まれた大凝集アルブミンに生体組織染色用色素が結合された複合体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
抗癌治療の場合、様々な抗癌剤を使用する方法が開発されているが、未だに、外科手術的な方法で癌細胞を除去する方法が最も多く行われている。しかし、外科手術的な方法を使用する場合、手術後における患者の健康及び福祉のために、手術中に手術範囲を最小化する技術が必須である。特に、乳癌の場合、乳房が小さな国内女性の手術時、切除する病変が他の国に比べて少なくしなければ、乳房保存的治療法の目標を達成することができなくなる。手術範囲は病変と病変周囲のエッジ余分部位に決定される。執刀医が、病変部位と範囲を正確に知らなければ、病変周囲のエッジ余分を大きくして置く必要がある。なぜなら、むやみに手術範囲を縮めていては腫瘍が切除面に残ってしまうことがあるからである。しかし、実際臨床手術では、手術執刀医が手術中に病変を正確にリアルタイムで確認するための方法が多くない。非常に精密な診断方法が開発されたにもかかわらず、このような診断方法は、手術中には使用できなく、実際手術中には、主に執刀医の触感や視覚に依存することになり、この場合、病変が明確に区別される場合はまれである。特に、病変が小さい場合は、さらに区別ができなくなる。微細浸潤手術及び保存的手術の目的を達成するために、執刀医に、病変を手術中にリアルタイムで知らせる技術が必要とされる。
【０００３】
従来の腫瘍除去手術、特に、乳癌手術時には、患者の微細病変の位置を手術前に超音波、マンモグラフィー、または磁気共鳴映像で確認し、確認された病変の位置を標識した後、標識された部位の組織を除去しており、確認された病変の位置を標識する方法としては、皮膚表面に絵を描く方法、ワイヤーを利用する方法、チャーコール（ｃｈａｒｃｏａｌ）のような黒い色素を注射する方法などが使われていた。しかし、病変の位置を標識するために、皮膚上にペンを用いて絵を描く方法は、非常に柔軟な乳房組織の特性上、診断するときと違って、手術室で乳房の形状が多く変化するという点、乳房深部の病変の場合には、皮膚表面に標識したことだけでは、標識が不充分であるという点などの問題があり、容易に使用できるが正確度が低い短所がある。次に、ワイヤーを用いて乳房病変に刺す方法は、本来ワイヤーを皮膚表面に垂直に挿入しなければならないが、超音波プローブに影響を与えることがあるので、仕方なく斜線に挿入しなければならないという点、ワイヤーの位置が乳房の動きに応じて移動してしまうという点などのため、予想より低い正確度を示し、挿入されたワイヤーは、手術に邪魔となり、ワイヤーの挿入部位を切除する手術が追加的に行わなければならないという短所がある。最後に、チャーコールのような色素を注射する方法は、注射された色素が病変に結合して、病変の位置を正確に標識できるという長所がある反面、乳房深部の病変の場合は、外部では黒色の色素を確認することができなく、色素により手術部位が汚染されることがあるという短所がある。また、このような短所は、乳癌以外の癌組織を除去するための外科的手術の際にも同様の問題となる。
【０００４】
このように、現在までに開発された技術では外科的に癌病変を除去するための手術範囲を精密に決定することは難しいため、今のところは、外科的に癌病変を除去する場合、切除範囲が必要以上に拡大されるしかなく、手術後にも病変が正常に除去されたのかを確認するための検査が同伴されなければならない。
【０００５】
そこで、本発明者らは、癌病変を外科的に除去するとき、生体組織染色用色素が結合された大凝集アルブミンを含む標識子が癌の病変に效果的に吸着され、病変の位置を正確に標識でき、前記色素をリアルタイムで追跡し、除去しようとする病変の範囲を正確に確認することを確認して、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、大凝集アルブミン（ＭＡＡ）に、生体組織染色用色素、放射性同位元素またはこれらの組み合わせが結合された複合体を含む癌病変標識用組成物を提供することである。
【０００７】
発明の別の目的は、前記癌病変標識用組成物を用いて癌病変の位置に対する情報を提供する方法を提供することである。
【０００８】
本発明のさらに別の目的は、前記癌病変標識用組成物を含む癌病変標識用キットを提供することである。
【０００９】
本発明のさらに別の目的は、前記癌病変標識用組成物に含まれた大凝集アルブミンに生体組織染色用色素が結合された複合体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明は、大凝集アルブミン（ＭＡＡ）に生体組織染色用色素、放射性同位元素またはこれらの組み合わせが結合された複合体を含む癌病変標識用組成物を提供する。このとき、前記組成物により標識される癌は、前記ＭＡＡが浸透して固定され得る組織を内包する癌であれば特に制限されないが、組織内に前記ＭＡＡが浸透して固定され得る固形癌であることが好ましい。その例には、前立腺癌、乳癌、子宮癌、皮膚癌、子宮頸癌、肺癌、脳腫瘍、胃腸管腫瘍、肝癌、軟組織肉腫、リンパ腫などが挙げられる。
【００１１】
本明細書において、用語「大凝集アルブミン（ＭＡＡ）」とは、ヒトの血清アルブミンを加熱して凝固させて製造された直径１０〜５０μｍのタンパク質性粒子を意味し、前記直径が１０ｎｍ未満のヒト血清アルブミンと比較して、その構造及び物理的特性が異なる。前記ＭＡＡは、静脈注射する場合、約８μｍの肺毛細血管に滞留し、微小塞栓を引き起こす特性を示すので、前記特性を利用して、放射性同位元素で標識されたＭＡＡは、肺チンチグラム（肺塞栓、肺血栓、高安病、肺炎、肺癌などの肺血流異常や左・右シャントや肺静脈圧亢進の診断）や静脈スキャン（その部位で中枢の静脈血診断）や静脈スキャン（ファザ病（Ｆａｚａ  ｄｉｓｅａｓｅ）等末梢動脈血流異常の診断）などに使われてきた。本発明のＭＡＡは、癌病変組織に注入し、癌病変組織に標識物質を結合させるための媒介体として使用される。本発明のＭＡＡは、組換えＨＳＡを用いて合成でき、自己由来でないＨＳＡを用いて合成することができる。また、商業的に利用可能なものを購入してもよい。本発明のＭＡＡは、癌病変組織に注入し、癌病変組織に標識物質を結合させるための媒介体として使用されている。前記媒介体は、標識物質を吸着させ、前記標識物質が癌病変組織に拡散されることを防止する役割を果たす。
【００１２】
本明細書において、用語「生体組織染色用色素」とは、生体組織に結合して結合された位置を標識することで、標識された位置を肉眼でまたは検出用道具を使用して確認することができるようにする物質を意味する。本発明の目的上、前記生体組織染色用色素は、癌組織に結合され、癌発生部位を標識する用途として使用可能な標識物質となり得る。好ましくは、肉眼で確認可能な色素、結合部位で蛍光を発生させ、蛍光カメラなどの装備を使用して検出できる蛍光色素などを単独または組み合わせて使用してもよいが、特に、これに制限されない。
【００１３】
本明細書において、用語「肉眼で確認可能な色素」とは、生体組織に結合した標識物質が可視光線領域の色を示し、標識された部位を肉眼で確認することができるようにする色素の一種を意味する。本発明の目的上、前記肉眼で確認可能な色素は、癌が発生された部位に注射し、外科手術的な方法で癌を除去する場合、切除する癌病変を明確に確認することができるようにし、癌手術の成功率を向上させる役割を果たすことができる。前記肉眼で確認可能な標識物質は、好ましくは、中性赤、ナイルブルー、ビスマルクブラウン、リチウムカルミン、トリパンブルー、ヤーヌスグリーン、メチルバイオレット、オーラミン、マラカイトグリーン、サフラニン、エオシン、コンゴレッド、エリスロシン、ニグロシン、アルシアンブルーヘマトキシリン、アニリンブルー、ライトグリーンなどを単独または混合して使用してもよいが、癌病変組織を確認することができるようにする目的を達成できる限り、特に、これらに制限されない。
【００１４】
本明細書において、「蛍光色素」とは、一定波長の光を吸収して、励起状態を形成した後、光の浸透距離が最大になり、水分によるエラー信号を最小化できる蛍光を発生する有機化合物を意味する。好ましくは、７００ｎｍ〜３０００ｎｍ、より好ましくは、７５０ｎｍ〜９００ｎｍの近赤外線波長の蛍光を発生する有機化合物である近赤外線蛍光色素であってもよい。前記近赤外線蛍光色素から発生する近赤外線波長の蛍光は、蛍光カメラ、蛍光センシングプローブ（ＰＣＴ／ＫＲ２０１１／００９２７１）などの装備を利用し、写真形態に撮影したり、リアルタイムモニターリングしたりすることができる。本発明の近赤外線波長の蛍光は、生体内における吸収が異なる波長帯に比べて、相対的に少なく、比較的生体内の深い部位から発生する近赤外線も生体外部で検出が可能である。本発明の目的上、前記近赤外線領域蛍光色素は、癌が発生された部位に注射し、外科手術的な方法で癌を除去する場合、切開する前に、癌の病変部位を正確に確認することができるようにし、癌手術の成功率を向上させる役割を果たすことができる。特に、前記肉眼で確認可能な色素とは違って、切開して直接的な病変を確認する前に、体外でも病変の位置を検出できるので、迅速、且つ正確な癌手術を行うことができる。前記近赤外線蛍光色素としては、好ましくは、インドシアニングリーンなど挙げられるが、人体に使用可能な近赤外線蛍光色素である以上、本発明の範囲に含まれていてもよい。
【００１５】
前記近赤外線蛍光色素がＭＡＡに結合された複合体は、腫瘍に蓄積されるものとして知らされた他の物質に近赤外線蛍光色素が結合された複合体に比べて、検出される蛍光信号の安定性及び正確性に優れているという長所を有するので、微細病変を見出すことができる割合が高く、病変切除正確度を向上させることができる。
【００１６】
本明細書において、用語「インドシアニングリーン（ＩＣＧ：ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  ｇｒｅｅｎ）」とは、生物学または医学分野で広く使われる近赤外線領域の蛍光映像用染料を意味する。人体に注入された後、１時間程度過ぎれば分解されてなくなるか、大小便として排出される特性があり、人体に使用可能な蛍光染料として臨床的適用に有利である。実際に、インドシアニングリーンを用いて、人体に適用した事例は多種論文に報告されている。例えば、乳癌患者１８名から安全に臨床的に使用したことが報告された（Ｔ．Ｋｉｔａｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ，１２：２１１−２１５，２００５）。さらに、前記近赤外線蛍光色素を吸着結合させることは、本発明のＭＡＡに近赤外線蛍光色素を混合させるステップを介して達成できる。
【００１７】
本発明の一実施例によれば、ＭＡＡにＩＣＧが結合された複合体（ＩＣＧ−ＭＡＡ）の製造時、高い水準の近赤外線蛍光信号を示す複合体の製造に適した混合比率は、０．２３ｍｇ／ｍＬのＭＡＡに対しては、３．９μＭのＩＣＧ、２．３ｍｇ／ｍＬのＭＡＡに対しては、６．５μＭのＩＣＧ及び１１．５ｍｇ／ｍＬのＭＡＡに対しては、６．５μＭのＩＣＧであることが確認されており（表１及び図４）、生体内に注入する場合には、生体内における拡散などにより、濃度が変わるので、注射時点に正確な濃度を定めることができないが、実験的に１０倍濃度の６５μＭで最も蛍光が高い値を示していることが確認された。また、このように作製された複合体、がインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）及びインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）条件で安定性を示すのかを確認した結果、インビトロ及びインビボ条件からで全て相対的に高い水準の近赤外線蛍光信号の強度と安定性を示していることが分かった（図５及び図６）。
【００１８】
本明細書において、「放射性同位元素」とは、原子番号は同じであるが、原子量が相違し、放射能を発散しうる元素を意味する。ガンマ線や他の亜原子粒子を放出し、放射性減衰をする特性を利用して、一般に疾患を診断するのに重要な標識子として使われることもある。本発明の目的上、前記放射性同位元素は、近赤外線蛍光色素から発生される蛍光が検出されない程度の深部組織に癌が発生された部位に注射し、外科手術的な方法で癌を除去する場合、切開する前に、癌の病変部位を正確に確認することができるようにし、癌手術の成功率を向上させる役割を果たすことができる。前記放射性同位元素は、癌の病変に結合できるＭＡＡに標識できる特性を示すものであれば、特に制限されなく、好ましくは、Ｈ−３、Ｃ−１４、Ｐ−３２、Ｓ−３５、Ｃｌ−３６、Ｃｒ−５１、Ｃｏ−５７、Ｃｏ−５８、Ｃｕ−６４、Ｆｅ−５９、Ｙ−９０、Ｉ−１２４、Ｉ−１２５、Ｒｅ−１８６、Ｉ−１３１、Ｔｃ−９９ｍ、Ｍｏ−９９、Ｐ−３２、ＣＲ−５１、Ｃａ−４５、Ｃａ−６８などが挙げられ、より好ましくは、医学的に使われるＩ−１２４、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｃｕ−６４、Ｔｃ−９９ｍ、Ｍｏ−９９、ＣＲ−５１、Ｃａ−４５、Ｃａ−６８などが挙げられ、最も好ましくはＴｃ−９９ｍが挙げられる。このとき、癌は、特にこれらに制限されないが、外科的な切除術で除去できる特性を示すものであれば、特に、これらに制限されないが、前立腺癌、乳癌、子宮癌、皮膚癌、子宮頸癌、肺癌、脳腫瘍、胃腸管腫瘍、肝癌、軟組織肉腫、リンパ腫など大部分の固形癌であってもよい。
【００１９】
本明細書において、「Ｔｃ−９９ｍ」とは、テクネチウム（Ｔｃ：ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍ）の放射性同位元素として、６時間の短い半減期で、ガンマ線を発生させ、映像用として使われ、被爆量が非常に少なく、組織透過度に優れ、一部色素に現れるアレルギー反応も引き起こさないことから、医学研究に広く使われている。
【００２０】
本発明の一実施例によれば、ＭＡＡに放射線同位元素である［Ｔｃ−９９ｍ］ＴｃＯ４−を反応させる場合、９９％以上の収率で放射性同位元素がＭＡＡに結合された複合体を作製でき、これらの複合体を生体内に注入すれば、２０時間が経過した後にも、注入された位置を確認することができた（図３）、前記ＭＡＡに放射性同位元素である［Ｔｃ−９９ｍ］ＴｃＯ４−と近赤外線蛍光色素であるＩＣＧを順に反応させれば、放射性同位元素と近赤外線蛍光色素が結合された複合体（［Ｔｃ−９９ｍ］Ｔｃ−ＩＣＧ−ＭＡＡ）を作製でき（図１０）、前記作製された複合体は、生体内に注入し、２０時間が経過した後にも注入された位置を確認することができた（図１１）。
【００２１】
一方、本発明の生体組織染色用色素が大凝集アルブミンに結合された複合体の生体内標識子としての活用性を極大化するために、フィブリンを用いて複合体の物性を強化することができる。即ち、本発明の複合体は、生体内の病変部位に注入され、病変を標識することによって、手術時に病変部位を明確に認識できるようにする役割を果たしており、このような複合体が前述した標識子としての目的を円滑に行うためには、注入された病変部位で拡散を最大限防止しなければならない。このような目的を達成するための一つの手段として、フィブリンを使用することができる（図１）。図１は、ＭＡＡ及びＩＣＧを含む複合体にフィブリンを付加する場合、前記付加されたフィブリンによって複合体の生体内組織残留性が向上されていることを示す概略図である。図１に示されるように、前記フィブリンは、生体内に注入された複合体を相互連結させる役割を果たし、生体に注入された複合体が拡散されることを最大限防止することができる。従って、本発明の複合体は、フィブリンを、さらに含んでいてもよい。
【００２２】
本発明の一実施例によれば、前記作製したＭＡＡにＩＣＧが結合された複合体（ＩＣＧ−ＭＡＡ）に、トロンビン及びアプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）を含む混合物１とフィブリノーゲン及びＣａＣｌ２を含む混合物２を混合し、反応し、血液凝固繊維素（フィブリン）が結合されたＩＣＧ−ＭＡＡ−フィブリン複合体を作製した。このように作製されたＩＣＧ−ＭＡＡ−フィブリン複合体が、インビトロ及びインビボ条件で安定性を示すかを確認した結果、インビトロ及びインビボ条件で全ての相対的に高い水準の近赤外線蛍光信号の強度と安定性を示していたことが分かり（図５及び図６）、インビトロ及びインビボ条件で、ＭＡＡにＩＣＧが結合された複合体（ＩＣＧ−ＭＡＡ）よりは、ＩＣＧ−ＭＡＡ−フィブリン複合体が経時による拡散程度が低い水準を示して、癌病変標識子として有利な特性を示していることを確認した（図７、図８及び図９）。
【００２３】
また、前述ように、前記複合体が生体内で拡散されることを防止するための目的を達成するための他の手段として、ゼラチンスポンジを使用することができる。即ち、生体適合性に優れ、しかも室温で容易にゲルを形成することができるゼラチンを利用すれば、前記複合体が凝集された形態でゼラチンの内部に捕集された構造体を形成することができる。前記形成された構造体を生体に注入すれば、ゼラチンによって注入された部位で前記複合体の拡散を最大限抑制することができる。しかし、前記ゼラチンは、生体内の環境では容易に溶解され、前記構造体が崩壊されてしまう恐れのある短所があるので、このような短所を解決するために、ゼラチンの代りにゼラチンスポンジを使用して前記短所を克服することができる。
【００２４】
ゼラチンスポンジは、ゼラチン溶液を高温に加熱し、ゼラチンに存在するリシンの側鎖アミン基と、グルタメートまたはアスパラテートの側鎖カルボキシル基と間にイソペプチド結合が生成された形態の構造物である。前記ゼラチンスポンジは、ゼラチンと同じ生体適合性を示し、しかも水に対する溶解度が相対的に低く、生体内で容易に溶解されない特性を示すので、前記ゼラチンスポンジを用いて、本発明の複合体が凝集された形態で捕集された構造体を形成し、前記構造体を生体に注入すれば、生体内でゼラチンスポンジが溶解されなく、注入された構造体が崩壊されないので、注入された部位で前記複合体の拡散をさらに效果的に抑制することができる。
【００２５】
本発明の一実施例によれば、ゼラチン溶液を１６０℃で３時間加熱し、交差構造を含むゼラチンスポンジを製造し、ゼラチンとゼラチンスポンジをそれぞれ蒸留水に浸漬し、２４時間放置した結果、ゼラチンは蒸留水に完全に溶解された反面、ゼラチンスポンジは水に溶解されることなく、高い安定性を示していることを確認した（図１２）。
【００２６】
前述したゼラチンスポンジを使用する場合、近赤外線蛍光色素と放射性同位元素を同時に含むように構成され得る。即ち、ゼラチンスポンジ内に、ＭＡＡに近赤外線蛍光色素のＩＣＧが結合された形態の複合体（ＩＣＧ−ＭＡＡ）またはＭＡＡに放射性同位元素リン［Ｔｃ−９９ｍ］Ｔｃと近赤外線蛍光色素のＩＣＧが結合された形態の複合体（［Ｔｃ−９９ｍ］Ｔｃ−ＩＣＧＭＡＡ）を含むように構造体を作製することができる。また、前記ゼラチンスポンジ内に、ＭＡＡに近赤外線蛍光色素のＩＣＧが結合された形態の複合体（ＩＣＧ−ＭＡＡ）と放射性同位元素を、それぞれ個別的に含むように構造体を作製することもできるので、このように複合体と放射性同位元素を個別的に含む場合には、放射性同位元素を前記ゼラチンスポンジ内でさらに効果的に固定化させるための手段を、さらに含んでいてもよい。前記固定化手段には、放射性同位元素が結合された金箔コイルが挙げられるが、放射性同位元素を固定化させる目的を達成できる限り、前記固定化手段は、特にこれに制限されない（図２）。図２は、ＭＡＡ及びＩＣＧを含む複合体に放射性同位元素が結合された金箔コイルとゼラチンを付加して、作製された固形標識子の構造及び注入方法を示す概略図である。図２に示されるように、まず、放射性同位元素が結合されない複合体（ＩＣＧ−ＭＡＡ）を使用し、必要に応じて、放射性同位元素を追加する方式で標識子を作製できるので、前記ゼラチンスポンジを使用すれば、前記ＭＡＡ基盤標識子の活用性を拡張させることができる。
【００２７】
本発明の一実施例によれば、放射性同位元素が結合された金箔コイル、ＩＣＧ、ＭＡＡ及びゼラチンスポンジを含む固形標識子を作製し、インビトロ及びインビボ条件でＩＣＧとゼラチンスポンジだけを含む対照群の固形標識子と安定性を比較した結果、インビトロ条件で８及び２４時間が経過した後、対照群の固形標識子ではＩＣＧが拡散され、蒸留水自体から近赤外線蛍光信号が検出される反面、本発明の固形標識子ではＩＣＧの拡散率が相対的に低い水準であることを確認しており（図１３）、インビボ条件で３週間が経過した後、対照群の固形標識子では、それ以上の近赤外線蛍光信号が検出されない反面、本発明の固形標識子では近赤外線蛍光信号が依然として検出されていることが確認された（図１４）。
【００２８】
本発明の他の様態によれば、本発明は（ａ）前記癌病変標識用組成物を個体で発生された癌の病変に投与するステップと、（ｂ）前記個体から色合い、近赤外線蛍光、放射線及びこれらの組み合わせよりなる群から選択される信号が発生される位置を確認するステップと、を含む癌病変の位置に対する情報を提供する方法を提供する。
【００２９】
本明細書において、「個体」とは、癌が発病して病変を示すことができ、本発明の癌病変標識用複合体または組成物が投与できる、生きている有機体を意味する。
【００３０】
本発明で提供する癌病変標識用組成物を生体内の癌病変組織に投与する場合、投与癌病変に結合され、病変の位置を色合い、近赤外線蛍光、放射能またはこれらの組み合わせにより標識することができ、前記標識を検出することによって、癌病変の位置、サイズなどを手術中にリアルタイムで検出することができるので、外科的な癌病変の除去時、正確性を向上させることができ、正常組織の過多の損失を防止することができる。
【００３１】
さらに、本発明の組成物に含まれた複合体は、他の物質に生体組織染色用色素を結合させた複合体に比べて、生体内の癌病変で長期間残留できるので、癌病変の外科的な切除時だけでなく、外科的な手術による癌病変切除の正確度を容易に確認することができる。例えば、超音波などを介して手術前に、微細病変の位置を確認した後、本発明の複合体を病変部位に注入し、数時間後、手術中にも安定、且つ正確に病変部位を確認することができる。
【００３２】
本発明のさらに別の様態として、本発明は、前記組成物を含む癌病変標識用キット及び前記組成物に含まれた大凝集アルブミンに生体組織染色用色素が結合された複合体を提供する。前記キットまたは複合体は、癌除去手術中に、リアルタイムで癌病変組織のサイズ及び位置の確認のために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＭＡＡ及びＩＣＧを含む複合体にフィブリンを付加する場合、前記付加されたフィブリンによって、複合体の生体内組織残留性が向上されたことを示す概略図である。
【図２】ＭＡＡ及びＩＣＧを含む複合体に、放射性同位元素が結合された金箔コイルとゼラチンを付加し、作製された固形標識子の構造及び注入方法を示す概略図である。
【図３】［Ｔｃ−９９ｍ］Ｔｃ−ＭＡＡが注射されたヌードマウスで、経時による［Ｔｃ−９９ｍ］Ｔｃ−ＭＡＡの変化を示すガンマ映像写真である。
【図４】ＩＣＧとＭＡＡの濃度変化によるＩＣＧ−ＭＡＡ複合体の近赤外線蛍光信号強度変化を示すグラフである。
【図５】インビトロ条件で、ＩＣＧ−ＨＳＡ、ＩＣＧ−ＭＡＡ、ＩＣＧ−ＭＡＡ−フィブリン及びＩＣＧ−グリコールキトサン複合体の経時による近赤外線蛍光信号の強度の変化を示すグラフである。
【図６】ヌードマウスに注射されたＩＣＧ−ＨＳＡ、ＩＣＧ−ＭＡＡ、ＩＣＧ−ＭＡＡ−フィブリン及びＩＣＧグリコールキトサン複合体の経時による近赤外線蛍光信号の強度の変化を示す写真である。
【図７】ＩＣＧ−ＭＡＡ−フィブリン複合体またはＩＣＧ−ＭＡＡ複合体が注入された鶏の胸肉または豚の三枚肉から観察される各複合体の形態を示す写真である。
【図８】筋肉組織に注入されたＩＣＧ−ＭＡＡ−フィブリン複合体とＩＣＧ−ＭＡＡ複合体の経時による拡散水準を示す蛍光写真である。
【図９】ヌードマウスに注入されたＩＣＧ−ＭＡＡ−フィブリン複合体とＩＣＧ−ＭＡＡ複合体の経時による拡散水準を示す蛍光写真である。
【図１０】ＭＡＡにＴｃ−９９ｍが結合された複合体の標識率を示すグラフである。
【図１１】それぞれの癌病変標識子の［Ｔｃ−９９ｍ］Ｔｃ−ＩＣＧ−ＭＡＡと［Ｔｃ−９９ｍ］Ｔｃ−ＩＣＧ−ＨＳＡが投与されたマウスにおいて、経時による各標識子の蛍光信号変化を示す写真である。
【図１２】経時によるゼラチンとゼラチンスポンジの溶解水準を比較した結果を示す写真である。
【図１３】放射性同位元素が結合された金箔コイル、ＩＣＧ、ＭＡＡ及びゼラチンスポンジを含む固形標識子と対照群であるＩＣＧ−Ｓｐｏｎｇｏｓｔａｎの経時による近赤外線蛍光信号の強度変化を示す写真である。
【図１４】ヌードマウスに注入された固形標識子、ＩＣＧ−Ｓｐｏｎｇｏｓｔａｎ及びＩＣＧ−ゼラチンの経時による近赤外線蛍光信号の強度を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるのではない。
【実施例】
【００３５】
［実施例１：大凝集アルブミン（ＭＡＡ）の作製］
０．１Ｍアセテート緩衝液（ｐＨ５．４）に希釈された２％ヒト血清アルブミン（１０ｍＬ）を塩化スズ（５０ｍｇ）と混合し、１０分間、室温で強く撹拌した後、７０℃で２０分間、さらに撹拌して反応した。前記反応が終了された後、反応物を冷却し、２０％のヒト血清アルブミン（０．３５ｍＬ）を加えた後、再び１０分間撹拌した。前記反応物をＭＡＡ基準２ｍｇずつガラス製のバイアルに分注し、凍結乾燥して、チオールＭＡＡを作製した。
【００３６】
［実施例２：放射線同位元素が結合されたＭＡＡ複合体及びその有用性の確認］
前記実施例１で作製されたチオールＭＡＡに、放射線同位元素の［Ｔｃ−９９ｍ］ＴｃＯ４−（１０ｍＣｉ／ｍＬ）を２ｍＬ加えて、１０分間、室温で反応して、放射線同位元素が結合されたＭＡＡ複合体（［Ｔｃ−９９ｍ］Ｔｃ−ＭＡＡ）を作製した。前記放射線同位元素がＭＡＡに正常に結合されたかを確認するために、前記複合体をＩＴＬＣ（Ｉｎｓｔａｎｔ  ｔｈｉｎ  ｌａｙｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）に適用し、アセトンを溶媒として用いて展開した結果、９９％以上のチオールＭＡＡが放射線同位元素と結合して、複合体を形成していることを確認した。
【００３７】
一方、前記作製された複合体が生体内標識子として使用され得るかを確認するために、次の実験を行った：前記作製された［Ｔｃ−９９ｍ］Ｔｃ−ＭＡＡ１ｍＣｉ／５０μＬをヌードマウスの左尻に注射し、注射した直後（０ｈ）及び２０時間が経過した時点（２０ｈ）で、動物ＳＰＥＣＴ装置（ＮａｎｏＳＰＥＣＴ，Ｂｉｏｓｃａｎ）を利用し、ヌードマウスのガンマ映像を撮影した（図３）。図３は、［Ｔｃ−９９ｍ］Ｔｃ−ＭＡＡが注射されたヌードマウスで経時による［Ｔｃ−９９ｍ］Ｔｃ−ＭＡＡの変化可否を示すガンマ映像写真である。図３に示されるように、注射した直後（０ｈ）及び２０時間が経過した後にも（２０ｈ）、［Ｔｃ−９９ｍ］Ｔｃ−ＭＡＡは継続的に注射された病変に持続的に残留していることが確認された。
【００３８】
［実施例３：インドシアニングリーン（ＩＣＧ）が結合されたＭＡＡ基盤標識子の製造及びその有用性の確認］
近赤外線蛍光信号を発生しうるインドシアニングリーン（ＩＣＧ）がＭＡＡと結合された複合体は、生体内で安定的に作用する標識子として使用できることが予想されたので、前記複合体を作製し、その生体内標識子としての有用性を確認した。
【００３９】
（実施例３−１：ＩＣＧとＭＡＡの混合比率決定）
近赤外線蛍光を示すＭＡＡ基盤標識子を製造するために、前記作製されたＭＡＡに近赤外線蛍光を示すインドシアニングリーン（ＩＣＧ）が結合された複合体（ＩＣＧ−ＭＡＡ）を作製した。
【００４０】
このとき、最も強い近赤外線蛍光を示せるＩＣＧとＭＡＡの混合比を決定するために、１．３〜１０３２μＭのＩＣＧと０〜１１．５ｍｇ／ｍＬのＭＡＡを様々な割合で反応し、それぞれのＩＣＧ−ＭＡＡ複合体を作製し、前記作製された各ＩＣＧ−ＭＡＡ複合体で示される近赤外線蛍光の信号強度を測定した（表１及び図４）。図４は、ＩＣＧとＭＡＡの濃度変化によるＩＣＧ−ＭＡＡ複合体の近赤外線蛍光信号強度変化を示すグラフである。
【００４１】
ＩＣＧとＭＡＡの濃度変化によるＩＣＧ−ＭＡＡ複合体の近赤外線蛍光信号強度
【表１】
2016511745.tif 000003
【００４２】
前記表１及び図４から分かるように、ＭＡＡを処理しない場合には、２５．８μＭのＩＣＧが最も高い値の近赤外線蛍光信号強度を示し、０．２３ｍｇ／ｍＬのＭＡＡを処理した場合には、３．９μＭのＩＣＧが最も高い値の近赤外線蛍光信号強度を示し、２．３ｍｇ／ｍＬのＭＡＡを処理した場合には、６．５μＭのＩＣＧが最も高い値の近赤外線蛍光信号強度を示し、１１．５ｍｇ／ｍＬのＭＡＡを処理した場合にも、６．５μＭのＩＣＧが最も高い値の近赤外線蛍光信号強度を示した。
【００４３】
一方、生体に注射する場合は、生体内における拡散などにより濃度が変わるので、注射時点に正確な濃度を決めることができないが、実験的に１０倍濃度である６５μＭで最も蛍光が高い値を示していることを確認した。
【００４４】
（実施例３−２：ＩＣＧが結合された複合体の作製）
前記実施例から得られた結果を利用してＩＣＧが結合された様々な複合体を作製した。
【００４５】
まず、６５μＭ  ＩＣＧをヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、グリコールキトサンまたはＭＡＡに加え、反応することによって、それぞれの複合体（ＩＣＧ−ＨＳＡ、ＩＣＧ−ＭＡＡ及びＩＣＧ−グリコールキトサン）を作製した。
【００４６】
また、前記作製したＩＣＧ−ＭＡＡとトロンビン及びアプロチニンを含む混合物１と、フィブリノーゲン及びＣａＣｌ２を含む混合物２を混合し、反応して、血液凝固繊維素（フィブリン）が結合されたＩＣＧ−ＭＡＡ−フィブリン複合体を作製した。このとき、フィブリノーゲン、アプロチニン、トロンビン及びＣａＣｌ２の混合比は、それぞれ２５ｍｇ／ｍＬ、５００ＫＩＵ／ｍＬ、２５０ＩＵ／ｍＬ及び４ｍｇ／ｍＬであった。
【００４７】
（実施例３−３：ＩＣＧが結合された複合体の近赤外線蛍光能安定性の確認）
組織標識用組成物は、その使用特性上、生体組織に注射され、注射部位が標識されたとき、蛍光を放出する期間が永いほど、手術室での使用が有利であるので、前記作製された４種の複合体の近赤外線蛍光能安定性をインビトロまたはインビボで確認した。
【００４８】
＜実施例３−３−１：インビトロ安定性の確認＞
前記実施例３−２で作製した４種の複合体をインビトロ条件で、８００時間放出する近赤外線蛍光信号の強度を測定した（図５）。図５は、インビトロ条件でＩＣＧ−ＨＳＡ、ＩＣＧ−ＭＡＡ、ＩＣＧ−ＭＡＡ−フィブリン及びＩＣＧ−グリコールキトサン複合体の経時による近赤外線蛍光信号の強度の変化を示すグラフである。図５に示されるように、ＩＣＧ−ＭＡＡが含まれた複合体が相対的に高い水準の近赤外線蛍光信号の強度と安定性を示していることを確認しており、ＩＣＧ−ＭＡＡよりはＩＣＧ−ＭＡＡ−フィブリンが相対的に高い水準の近赤外線蛍光信号の強度と安定性を示していることが分かった。
【００４９】
＜実施例３−３−２：インビボ安定性の確認＞
前記実施例３−２で作製した４種の複合体を各ヌードマウスの太腿に５０μＬずつ注射し、３週間、各ヌードマウスで発生する近赤外線蛍光信号の変化をＸｅｎｏｇｅｎ  Ｌｕｍｉｎａ装置を利用して測定した（図６）。図６は、ヌードマウスに注射されたＩＣＧ−ＨＳＡ、ＩＣＧ−ＭＡＡ、ＩＣＧ−ＭＡＡ−フィブリン及びＩＣＧ−グリコールキトサン複合体の経時による近赤外線蛍光信号の強度の変化を示す写真である。図６に示されるように、注射直後には、４種の複合体で全て高い水準の近赤外線蛍光信号が示されたが、１週間が経過した時点からＩＣＧ−ＨＳＡ及びＩＣＧ−グリコールキトサン複合体で示される近赤外線蛍光信号が急激に減少し、３週間が経過した時点ではＩＣＧ−ＨＳＡ及びＩＣＧ−グリコールキトサン複合体で示される近赤外線蛍光信号は、ほとんど検出されなかった。これに対して、ＩＣＧ−ＭＡＡ及びＩＣＧ−ＭＡＡ−フィブリン複合体で示される近赤外線蛍光信号は３週間が経過した時点でも一定水準で示されていることが確認した。
【００５０】
前記実施例の結果から、ＩＣＧ−ＭＡＡが含まれた複合体は、インビトロ及びインビボから相対的に高い水準の近赤外線蛍光信号の強度と安定性を示していることが分かった。また、同じ近赤外線蛍光色素を用いたが、このように異なった結果が導出された理由は、ＩＣＧ−ＭＡＡを含まない複合体は相対的に短時間内に体内で分解及び吸収されたためと予想された。特に、ＩＣＧ−ＭＡＡ−フィブリンの場合、大凝集アルブミンに血液凝固繊維まで加えられ、高い形態維持安定性を示して、癌病変標識子として非常に有利な特性を示していることを確認することができた。
【００５１】
（実施例３−４：ＩＣＧ−ＭＡＡ−フィブリン複合体とＩＣＧ−ＭＡＡ複合体の有用性の比較）
前記実施例３−３の結果からＩＣＧ−ＭＡＡを含むＩＣＧ−ＭＡＡ−フィブリン複合体とＩＣＧ−ＭＡＡ複合体が癌病変標識子として非常に有利な特性を示していることが確認されたので、前記各複合体の癌病変標識子としての効果を比較した。
【００５２】
＜実施例３−４−１：組織内で注入された形態の比較＞
前記各複合体を筋肉組織の一種の鶏の胸肉または脂肪組織の一種の豚の三枚肉にそれぞれ注入し、前記注入された各組織を１−２ｍｍ厚さに切断した後、切断された各組織で観察される各複合体の形態を比較した（図７）。図７は、ＩＣＧ−ＭＡＡ−フィブリン複合体またはＩＣＧ−ＭＡＡ複合体が注入された鶏の胸肉または豚の三枚肉で観察される各複合体の形態を示す写真である。図７で見るように、ＩＣＧ−ＭＡＡ−フィブリン複合体を注入すれば、組織内で直ぐ凝固され、楕円体形状を維持する反面、ＩＣＧＭＡＡ複合体を注入すれば、筋肉組織で筋繊維のきめに沿って拡散され、脂肪組織では注射針の跡に沿って拡散される現象が発生していることを確認した。
【００５３】
従って、血液凝固繊維素で凝固させるＩＣＧ−ＭＡＡ−フィブリンを生体組織内に注入したとき、ＩＣＧ−ＭＡＡに比べて、稠密した結合組織まで拡散されていないことで、より繊細に病変を標識することができることを確認した。
【００５４】
＜実施例３−４−２：組織内で経時による拡散水準の比較＞
生体組織に注入された各複合体が組織内で拡散されれば、近赤外線蛍光信号を示す部位が増大し、繊細な病変部位標識役割を制限できるものと予想された。
【００５５】
これを確認するために、ＩＣＧ−ＭＡＡ−フィブリン複合体とＩＣＧ−ＭＡＡ複合体を鶏の胸肉に注入し、注入当時及び注入後２日が経過した時点で、各複合体から示される近赤外線蛍光信号の拡散水準を比較した（図８）。図８は、筋肉組織に注入されたＩＣＧ−ＭＡＡ−フィブリン複合体とＩＣＧ−ＭＡＡ複合体の経時による拡散水準を示す蛍光写真である。図８に示されるように、ＩＣＧ−ＭＡＡ−フィブリン複合体は注入後、凝集が生じ、ＩＣＧ−ＭＡＡがフィブリンに閉じ込められるようになり、時間が経過した後にも拡散による近赤外線蛍光信号を示す部位のサイズが増大しない反面、ＩＣＧ−ＭＡＡ複合体は、経時によって近赤外線蛍光信号を示す部位のサイズが増大していることが分かった。
【００５６】
＜実施例３−４−３：マウスで経時による拡散水準の比較＞
前記実施例の結果が生体内でも適用できるかを確認するために、ヌードマウスの皮下に、ＩＣＧ−ＭＡＡ−フィブリン複合体またはＩＣＧ−ＭＡＡ複合体を注入し、注入当時及び注入後、２日が経過した時点で、各複合体から示される近赤外線蛍光信号の拡散水準をＸｅｎｏｇｅｎ  Ｌｕｍｉｎａ装置を利用して測定した（図９）。図９は、ヌードマウスに注入されたＩＣＧ−ＭＡＡ−フィブリン複合体とＩＣＧ−ＭＡＡ複合体の経時による拡散水準を示す蛍光写真である。図９に示されるように、図８の結果と同様に、ＩＣＧ−ＭＡＡ−フィブリン複合体は、注入後、凝集が生じ、ＩＣＧ−ＭＡＡがフィブリンに閉じ込められるようになり、時間が経過した後にも拡散による近赤外線蛍光信号を示す部位のサイズが増大しない反面、ＩＣＧ−ＭＡＡ複合体は経時によって近赤外線蛍光信号を示す部位のサイズが増大していることが分かった。
【００５７】
従って、ＩＣＧ−ＭＡＡ−フィブリン複合体が最も優れた蛍光能及び体内安定性を示すだでなく、経時による拡散程度が低い水準を示し、癌病変標識子として有利な特性を示していることを確認した。
【００５８】
［実施例４：［Ｔｃ−９９ｍ］Ｔｃ−ＩＣＧ−ＭＡＡの製造及び効果の確認］
（実施例４−１：［Ｔｃ−９９ｍ］Ｔｃ−ＩＣＧ−ＭＡＡの製造）
前記実施例１で作製されたＭＡＡに、［Ｔｃ−９９ｍ］ＴｃＯ４−２０ｍＣｉ／２ｍＬを加え、１０分間、室温で反応した。反応が終了した後、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）４２μｇ／μＬを加え、１０分間、室温で、さらに反応して、ＭＡＡに、近赤外線蛍光色素のＩＣＧと放射性同位元素のＴｃ−９９ｍが標識された複合体を製造した。
【００５９】
前記製造された複合体にＴｃ−９９ｍが正常に標識されたかを確認するために、前記複合体をＩＴＬＣ（Ｉｎｓｔａｎｔ  ｔｈｉｎ  ｌａｙｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）に適用し、アセトンを溶媒として用いて展開した（図１０）。図１０は、ＭＡＡに、Ｔｃ−９９ｍが結合された複合体の標識率を示すグラフである。図１０に示されるように、標識率は９９％以上林であることを確認することができた。さらに、ＩＣＧ近赤外線蛍光信号をＳａｆｉｒｅ  ＩＩ蛍光装置を利用して測定した（ＲＦＵ７，６１２）。
【００６０】
これにより、ＭＡＡを利用して、［Ｔｃ−９９ｍ］Ｔｃ−ＩＣＧ−ＭＡＡ複合体を製造できることを確認した。
【００６１】
（実施例４−２：［Ｔｃ−９９ｍ］Ｔｃ−ＩＣＧ−ＭＡＡの効果の確認）
生体内組織において経時による希釈水準の側面から、本発明の複合体を従来の癌病変標識子と比較し、本発明の複合体が癌病変標識子として活用できるかを確認しようとした。
【００６２】
具体的に、従来の癌病変標識子としてヒト血清アルブミンに近赤外線蛍光色素のＩＣＧと放射性同位元素のＴｃ−９９ｍが標識された複合体（［Ｔｃ−９９ｍ］Ｔｃ−ＩＣＧ−ＨＳＡ）を製造した。
【００６３】
ヌードマウスの右尻に、前記製造された複合体（［Ｔｃ−９９ｍ］Ｔｃ−ＩＣＧ−ＨＳＡ）を１ｍＣｉ／５０μＬで注射し、前記ヌードマウスの左尻に前記実施例４−１で製造された複合体（［Ｔｃ−９９ｍ］Ｔｃ−ＩＣＧ−ＭＡＡ）を１ｍＣｉ／５０μＬで注射した後、注射した直後（０ｈ）及び２０時間が経過した時点（２０ｈ）で、ヌードマウスのガンマ映像を、動物ＳＰＥＣＴ装置（ＮａｎｏＳＰＥＣＴ，  Ｂｉｏｓｃａｎ）を利用して撮影した（図１１）。図１１は、それぞれの癌病変標識子の［Ｔｃ−９９ｍ］Ｔｃ−ＩＣＧ−ＭＡＡと［Ｔｃ−９９ｍ］Ｔｃ−ＩＣＧ−ＨＳＡが投与マウスで経時による各標識子の蛍光信号変化を示す写真である。図１１に示されるように、注射した直後（０ｈ）には、２種の複合体が全て注射された病変のみに残留したが、２０時間が経過した後には（２０ｈ）、［Ｔｃ−９９ｍ］Ｔｃ−ＩＣＧ−ＨＳＡは、周辺組織へと分散され、蛍光信号が弱まった反面、［Ｔｃ−９９ｍ］Ｔｃ−ＩＣＧ−ＭＡＡは、継続的に注射された病変で持続的に残留していることを確認した。
【００６４】
［実施例５：ゼラチンを用いたＭＡＡ基盤標識子の製造及びその有用性の確認］
近赤外線蛍光信号を発生しうるインドシアニングリーン（ＩＣＧ）が、ＭＡＡと結合された複合体の製造時、高い生体内適合性を示めすと共に、生体内で容易に溶解されない安定性を示すゼラチンスポンジを使用する場合、生体内でさらに安定的に作用する標識子を作製できることが予想されたので、前記ゼラチンスポンジを用いた複合体を作製し、その生体内標識子としての有用性を確認した。
【００６５】
（実施例５−１：放射性同位元素が結合された金箔コイルの作製）
ＣＴ（Ｘ−ｒａｙ）映像からよく分かる臨床適用中の金属材質コイル（例えば、ＵｌｔｒａＣｌｉｐ）に、０．４４Ｍ  ＨＡｕＣｌ４  １．８ｍＬ、ＣＴＡＢ３ｇ、ブタノール２．５ｇ及びオクタン１．０ｇを加え、表面をメッキして、金箔コイルを取得し、前記金箔コイルに、［Ｉ−１２５］ＮａＩ  １００ｕＣｉを加えた後、室温で５分間撹拌し、反応して、放射性同位元素が結合された金箔コイルを作製した。
【００６６】
（実施例５−２：ゼラチンスポンジの製造）
ゼラチン乾燥フレーク０．６ｇに１０ｍＬ蒸留水を加え、６０℃に加熱しながら完全に溶解させて、ゼラチン溶液を得た。前記ゼラチン溶液を４℃で、１時間放置して、ゼラチンを製造した。前記製造されたゼラチンを１６０℃で、３時間加熱して、交差構造を含むゼラチンスポンジを製造した。前記交差構造は、ゼラチンに存在するリシンの側鎖アミン基と、グルタメートまたはアスパラテートの側鎖カルボキシル基を高温で反応して、イソペプチド結合を生成することにより形成された。
【００６７】
前記製造されたゼラチンとゼラチンスポンジのいずれかが物質が体内で安定性を示すかを確認するために、前記ゼラチンとゼラチンスポンジを蒸留水に浸漬し、２４時間放置しながら、これらの溶解有無を確認した（図１２）。図１２は、経時によるゼラチンとゼラチンスポンジの溶解水準を比較した結果を示す写真である。図１２に示されるように、交差結合が形成されないゼラチンは、１日以内に水に完全に溶解された反面、交差結合が形成されたゼラチンスポンジは１日が経過した後にも水に溶解されないことが確認された。
【００６８】
これにより、ゼラチンよりはゼラチンスポンジの方が体内で安定性を示していることが分かった。
【００６９】
（実施例５−３：ゼラチンスポンジを用いたＭＡＡ基盤固形標識子の製造及びその有用性の検証）
前記実施例１で作製されたＭＡＡ、前記実施例５−１で作製された放射性同位元素が結合された金箔コイル、前記実施例５−２で作製されたゼラチンスポンジ及びＩＣＧを用いて固形標識子を作製し、それらから示される近赤外線蛍光信号の特性を検証した。
【００７０】
＜実施例５−３−１：固形標識子の作製＞
前記実施例１で作製したＭＡＡと６．５、６５または６５０μＭのＩＣＧを混合し、前記混合物に、前記実施例５−１で作製された放射性同位元素が結合された金箔コイルを添加して混合物を得た後、前記混合物に、ゼラチンを加え、１６０℃で３時間加熱して、放射性同位元素が結合された金箔コイル、ＩＣＧ、ＭＡＡ及びゼラチンスポンジを含む固形標識子（Ｒａｄｉｏｇｏｌｄｃｏｉｌ／ＥＢ―ＩＣＧ−ＭＡＡ−ゼラチンスポンジ）をそれぞれ作製した。
【００７１】
前記作製されたそれぞれの固形標識子を蒸留水に浸漬し、１日間放置しながら浸漬直後（０時間）、８時間が経過した時点及び２４時間が経過した時点において、近赤外線蛍光強度を測定し、対照群と比較した（図１３）。このとき、対照群としては商業的に入手可能なゼラチンスポンジの一つであるＳｐｏｎｇｏｓｔａｎを６．５、６５または６５０μＭのＩＣＧ溶液と混合して製造されたこと（ＩＣＧ−Ｓｐｏｎｇｏｓｔａｎ）を使用した。図１３は、放射性同位元素が結合された金箔コイル、ＩＣＧ、ＭＡＡ及びゼラチンスポンジを含む固形標識子と対照群のＩＣＧ−Ｓｐｏｎｇｏｓｔａｎにおける経時による近赤外線蛍光信号の強度変化を示す写真である。図１３に示されるように、同じＩＣＧ濃度では、前記固形標識子が対照群に比べて相対的に高い水準の近赤外線蛍光信号の強度を示し、８及び２４時間まで経過された時点では、対照群でＩＣＧが拡散され、蒸留水自体から近赤外線蛍光信号が検出された反面、前記固形標識子でのＩＣＧ拡散率は低い水準を示した。
【００７２】
また、それぞれ異なるＩＣＧ濃度を含む固形標識子では、６５０μＭのＩＣＧを含む固形標識子が最も高い水準の近赤外線蛍光信号強度を示していることを確認することができた。
【００７３】
＜実施例５−３−２：マウスにおける経時による近赤外線蛍光信号の強度及びＩＣＧ拡散水準の比較＞
異なる濃度（６．５、６５または６５０μＭ）のＩＣＧを用いて、前記実施例の方法で作製したそれぞれの固形標識子、ＩＣＧ−Ｓｐｏｎｇｏｓｔａｎ及びＩＣＧ−ゼラチンをヌードマウスの皮下に注入し、注入直後（０ｈ）、１日が経過した時点（１日）、１週間が経過した時点（１週）または３週間が経過した時点（３週）で、各ヌードマウスをＸｅｎｏｇｅｎ  Ｌｕｍｉｎａ装置に適用し、それぞれの注入位置に示される近赤外線蛍光信号の強度を測定した（図１４）。図１４は、ヌードマウスに注入された固形標識子、ＩＣＧ−Ｓｐｏｎｇｏｓｔａｎ及びＩＣＧ−ゼラチンの経時による近赤外線蛍光信号の強度を示す写真である。図１４に示されるように、本発明の固形標識子は３週間が経過した時点でも近赤外線蛍光信号が検出された反面、ＩＣＧ−Ｓｐｏｎｇｏｓｔａｎ及びＩＣＧ−ゼラチンは３週間が経過した時点で、ほとんど近赤外線蛍光信号が検出されなかった。また、本発明の固形標識子を注入した場合、前記固形標識子の製造時に使用されたＩＣＧの濃度が高い水準の場合に検出された近赤外線蛍光信号が高い水準を示していることが分かった。
【００７４】
前述記載を総合すれば、本発明の複合体は、注射された病変に長時間残留し、正確な微細病変を見出す割合が高く、信号強度が強く、病変切除の正確度に優れた標識子として有利な特性を有していることを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明の癌病変標識用組成物は、癌の病変に結合して癌病変の位置、サイズなどを手術中にリアルタイムで検出することができ、癌病変の外科的手術の成功率を向上させるだけでなく、正常組織の過多の損失を防止することができるので、効果的な抗癌治療に広く活用できるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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