(57)【要約】  免疫調節剤として使用される、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート化合物又はその薬学的な塩及び緩衝液を含む組成物が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)アミノアルキルグルコサミニドホスフェート又はその薬学的に許容される塩と、(ii)薬学的に許容されるpH範囲を提供するのに十分な有効量のHEPES緩衝液とを含む組成物。
【請求項２】
前記緩衝液が、薬学的に許容されるpH範囲内であるpHを有するHEPESからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記緩衝液が、約7〜約8の間のpHを有するHEPESである、請求項2に記載の組成物。
【請求項４】
約7.0のpHを有する、請求項2に記載の組成物。
【請求項５】
pH＝7.0を有する、請求項2に記載の組成物。
【請求項６】
前記アミノアルキルグルコサミニドホスフェートが、構造
【化１】
2016512226.tif 000012
(式中、
mは、0〜6であり、
nは、0〜4であり、
Xは、O又はSであり、
Yは、O又はNHであり、
Zは、O又はHであり、
R1、R2、R3はそれぞれ、C1〜20アシル及びC1〜20アルキルからなる群から独立して選択され、
R4は、H又はメチルであり、
R5は、-H、-OH、-(C1〜C4)アルコキシ、-PO3R8R9、-OPO3R8R9、-SO3R8、-OSO3R8、-NR8R9、-SR8、-CN、-NO2、-CHO、-CO2R8及び-CONR8R9からなる群から独立して選択され、ここで、R8及びR9は、それぞれ独立して、H及び(C1〜C4)アルキルから選択され、
R6及びR7はそれぞれ、独立してH又はPO3H2である)を有する、請求項1に記載の組成物。
【請求項７】
nが、両端含む0〜2の整数である、請求項6に記載の組成物。
【請求項８】
R1、R2、及びR3がそれぞれ独立して、約7〜約16個の炭素原子を含有する、請求項6に記載の組成物。
【請求項９】
R1、R2、及びR3がそれぞれ独立して、約9〜約14個の炭素原子を含有する、請求項6に記載の組成物。
【請求項１０】
nが0である、請求項6に記載の組成物。
【請求項１１】
R5がCO2Hである、請求項6に記載の組成物。
【請求項１２】
R6がPO3H2である、請求項6に記載の組成物。
【請求項１３】
R7がHである、請求項6に記載の組成物。
【請求項１４】
前記アミノアルキルグルコサミニドホスフェートが、構造
【化２】
2016512226.tif 000013
(式中、XはO又はSであり、YはO又はNHであり、ZはO又はHであり、R1、R2、及びR3はそれぞれ、C1〜20アシル及びC1〜20アルキルからなる群から独立して選択され、R4はH又はメチルである)を有する、請求項1に記載の組成物。
【請求項１５】
前記アミノアルキルグルコサミニドホスフェートが、構造
【化３】
2016512226.tif 000014
を有する、請求項1に記載の組成物。
【請求項１６】
前記アミノアルキルグルコサミニドホスフェートが、構造
【化４】
2016512226.tif 000015
を有する、請求項1に記載の組成物。
【請求項１７】
R6がリン酸基であり、対イオンがモノエタノールアミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンからなる群から選択される、請求項6に記載の組成物。
【請求項１８】
前記対イオンが、モノエタノールアミンである、請求項17に記載の組成物。
【請求項１９】
前記対イオンが、モノエタノールアミンである、請求項14に記載の組成物。
【請求項２０】
懸濁液の形態の、請求項1に記載の組成物。
【請求項２１】
溶液の形態の、請求項1に記載の組成物。
【請求項２２】
透明溶液の形態の、請求項20又は21に記載の組成物。
【請求項２３】
混合物、溶液及び透明溶液が、200mμ以下の粒子サイズを有するナノ粒子組成物である、請求項22に記載の組成物。
【請求項２４】
前記溶液が免疫調節剤として使用される、請求項23に記載の組成物。
【請求項２５】
摂氏40度にて14日間にわたり動的光散乱(DLS)によって測定して、200ナノメートル以下の滅菌濾過粒子サイズを有する、請求項1に記載の組成物。
【請求項２６】
逆相高性能液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)によって測定して、4.46%〜5.93%の、摂氏40度にて14日後のパーセント純度の減少を有する、請求項1に記載の組成物。
【請求項２７】
前記溶液が、免疫調節剤として使用される、請求項1に記載の組成物。
【請求項２８】
前記溶液が、ワクチンアジュバントとして使用される、請求項27に記載の組成物。
【請求項２９】
抗原をさらに含む、請求項28に記載の組成物。
【請求項３０】
粘膜投与に好適な、請求項27に記載の組成物。
【請求項３１】
鼻腔内投与に好適な、請求項30に記載の組成物。
【請求項３２】
外来性抗原のない状態で対象に投与される、請求項27に記載の組成物。
【請求項３３】
対象の免疫応答を増強するための方法であって、前記対象に、有効量の請求項1に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項３４】
前記対象が哺乳動物である、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
前記哺乳動物がヒトである、請求項36に記載の方法。
【請求項３６】
外来性抗原を前記対象に投与することをさらに含む、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
前記対象が哺乳動物である、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
前記哺乳動物がヒトである、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
対象における感染性疾患、自己免疫疾患又はアレルギー状態を緩和し、又は実質的に予防するための方法であって、前記対象に有効量の請求項1に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項４０】
前記対象が哺乳動物である、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
前記哺乳動物がヒトである、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
外来性抗原を前記対象に投与することをさらに含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
前記対象が哺乳動物である、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
水が無菌である、請求項1に記載の組成物。
【請求項４６】
(i)アミノアルキルグルコサミニドホスフェート又はその薬学的に許容される塩と、(ii)薬学的に許容されるpHを提供するのに十分な有効量のクエン酸又は酢酸緩衝液とを含む組成物。
【請求項４７】
pHが、6.5より大きくない、請求項46に記載の組成物。
【請求項４８】
pHが、約4.0〜約6.0の間である、請求項46に記載の組成物。
【請求項４９】
pHが、約5.0である、請求項48に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート化合物(AGP)を含む組成物及びワクチンアジュバントにおける、若しくはワクチンアジュバントとしての、又は予防的若しくは治療的処置における、該組成物の使用に関する。該組成物を使用するための方法も開示される。
【０００２】
連邦支援研究に関する言及
本発明の態様は、NIH Contract番号HHSN272200900008Cに従った米国政府支援により実施され、米国政府は、本発明において特定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
アミノアルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)は、Toll様受容体4(TLR4)の合成リガンドである。AGPと、TLR4を介したそれらの免疫調節効果は、WO2006/016997、WO2001/090129、及び/又は米国特許第6,113,918号などの特許刊行物に開示されており、文献においても報告されてきた。さらなるAGP誘導体が、米国特許第7,129,219号、米国特許第第6,525,028号及び米国特許第6,911,434号に開示されている。TLR4のアゴニストとして働くAGPもあれば、TLR4アンタゴニストとして認識されるAGPもある。AGPは、ワクチンアジュバントとしても、サイトカイン産出を刺激し、マクロファージを活性化し、先天性免疫応答を促進し、免疫化された動物における抗体産生を増加させるための免疫調節剤としても有用であると知られている。これまで、アジュバント及び/又は免疫調節剤としてのAGPが、滅菌水及びグリセロール(およそ2%)を典型的に使用する水中油エマルジョンの形態で主に利用されてきた。医薬組成物及び/又はアジュバント組成物中でこれらのAGPと共に使用することができる緩衝液を同定することが依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】WO2006/016997
【特許文献２】WO2001/090129
【特許文献３】米国特許第6,113,918号
【特許文献４】米国特許第7,129,219号
【特許文献５】米国特許第第6,525,028号
【特許文献６】米国特許第6,911,434号
【発明の概要】
【０００５】
したがって、本発明は、1つ以上のAGP及び緩衝液を含む医薬組成物を提供する。本明細書で本発明において開示される医薬組成物は、以下の利点:他のAGP水性製剤に対して、緩衝化溶液中のAGPの最大若しくは増加された若しくは改善された安定性、及び/又は緩衝化溶液中のAGPの最大若しくは増加された若しくは改善された効力のうちの1つ以上をもたらし得る。
【０００６】
約pH7にて、又は生理学的に通常のpHにて、又は薬学的に許容されるpHにて、改善された安定性及び/又は効力を有する緩衝化AGP組成物もまた提供される。
【０００７】
対象(又はヒト若しくは他の哺乳動物などの患者)を本発明の組成物で治療する方法も提供される。
【０００８】
本発明によれば、(i)アミノアルキルグルコサミニドホスフェート又はその薬学的に許容される塩、及び(ii)緩衝液を含む組成物が提供される。緩衝化溶液とAGP化合物を組み合わせて、免疫調節剤としての有用性を有する組成物が形成される。
【０００９】
さらに、対象、好ましくはヒトの免疫応答を調節するための方法であって、前記対象に有効量の医薬組成物を投与することを含む方法が提供される。
【００１０】
また、対象、好ましくはヒトにおける、感染性疾患、自己免疫疾患、神経学的疾患又はアレルギー若しくは炎症状態を緩和し、又は実質的に予防するための方法であって、前記対象に有効量の医薬組成物を投与することを含む方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例からのCRX-601及びCRX-601分解物の構造を示す図である。
【図２】中性又は生理学的pH近くでの、CRX-601と製剤化した緩衝液に対する分解の加速された速度を示すグラフである。
【図３】各緩衝液に対して、最適pH近くで、CRX-601と製剤化した3つの緩衝液に対する分解の加速された速度を示すグラフである。
【図４】実施例からのCRX-527及びCRX-527分解物の構造を示す図である。
【図５】それぞれCRX-527及びCRX-601中の、リン酸塩(phosphate)及びHEPES緩衝液を用いた分解の加速された速度を示すグラフである。
【図６】3つの緩衝液中と製剤化したCRX-601の長期安定性を示すグラフである。
【図７】各緩衝液に対して、最適pH近くで、CRX-601と製剤化した緩衝液(クエン酸(citrate))の間の相対効力を示すグラフである。
【図８】各緩衝液に対して、最適pH近くで、CRX-601と製剤化した緩衝液(酢酸(acetate))の間の相対効力を示すグラフである。
【図９】各緩衝液に対して、最適pH近くで、CRX-601と製剤化した緩衝液(HEPES)の間の相対効力を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
アミノアルキルグルコサミニドホスフェート化合物
AGPは、Toll様受容体4(TLR4)調節因子である。Toll様受容体4は、細菌LPS(リポ多糖)を認識し、活性化されると先天性免疫応答を開始する。AGPは、細菌LPSの脂質Aタンパク質の単糖模倣体であり、該化合物の「アシル鎖」上で、エーテル及びエステル結合で開発されてきた。これらの化合物を作製するための方法は公知であり、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている、WO2006/016997、米国特許第7,288,640号、同第6,113,918号、及びWO01/90129号に開示されている。他のAGP及び関連する方法は、米国特許第7,129,219号、米国特許第6,525,028号、及び米国特許第6,911,434号に開示されている。本発明の組成物中で使用されるアシル鎖上にエーテル結合を有するAGPは、公知であり、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、WO2006/016997に開示されている。特に興味深いのは、WO2006/016997中、段落[0019]〜[0021]にて、式(III)によって示され、記載されるアミノアルキルグルコサミニドホスフェート化合物である。
【００１３】
本発明で使用したアミノアルキルグルコサミニドホスフェート化合物は、以下の式1にて示される構造を有する。
【００１４】
【化１】
2016512226.tif 000002
式中、
mは、0〜6であり、
nは、0〜4であり、
Xは、O又はS、好ましくはOであり、
Yは、O又はNHであり、
Zは、O又はHであり、
R1、R2、R3はそれぞれ、C1〜20アシル及びC1〜20アルキルからなる群から独立して選択され、
R4は、H又はMeであり、
R5は、-H、-OH、-(C1〜C4)アルコキシ、-PO3R8R9、-OPO3R8R9、-SO3R8、-OSO3R8、-NR8R9、-SR8、-CN、-NO2、-CHO、-CO2R8及び-CONR8R9からなる群から独立して選択され、ここで、R8及びR9はそれぞれ独立して、H及び(C1〜C4)アルキルから選択され、
R6及びR7はそれぞれ、独立してH又はPO3H2である。
【００１５】
式1において、正常脂肪アシル（normal fatty acyl）残基(すなわち二級アシルオキシ又はアルコキシ残基、例えばR1O、R2O及びR3O)が結合する3'立体中心の配置は、R又はSであり、好ましくは(カーン・インゴルド・プレローグ順位則によって指定されるように)Rである。R4及びR5が結合するアグリコン立体中心の配置はR又はSであり得る。全ての立体異性体、エナンチオマーとジアステレオマーの両方、及びそれらの混合物が、本発明の範囲内にあると考慮される。
【００１６】
ヘテロ原子Xとアグリコン窒素原子の間の炭素原子の数は、変数「n」によって決定され、これは、0〜4の整数、好ましくは0〜2の整数であり得る。
【００１７】
正常脂肪酸（normal fatty acid）R1、R2、及びR3の鎖長は、約6〜約16個の炭素、好ましくは約9〜14個の炭素であり得る。鎖長は、同一であっても異なってもよい。いくつかの好ましい実施形態には、R1、R2及びR3が、6又は10又は12又は14である鎖長が含まれる。
【００１８】
式1は、L/D-セリル、-スレオニル、-システイニルエーテル及びエステル脂質AGP、アゴニストとアンタゴニストの両方及びそれらの相同体(n=1〜4)、並びに種々のカルボン酸生物学的等価物（bioisostere）(すなわち、R5は塩形成可能な酸性基であり、リン酸は、グルコサミン単位の4又は6位のいずれかであり得るが、好ましくは4位である)を包含する。
【００１９】
式1のAGP化合物を使用する本発明の好ましい実施形態において、nは0であり、R5はCO2Hであり、R6はPO3H2であり、R7はHである。この好ましいAGP化合物は、以下のような式1a中の構造として示される。
【００２０】
【化２】
2016512226.tif 000003
式中、XはO又はSであり、YはO又はNHであり、ZはO又はHであり、R1、R2、R3はそれぞれ、C1〜20アシル及びC1〜20アルキルからなる群から独立して選択され、R4はH又はメチルである。
【００２１】
式1aにおいて、正常脂肪アシル残基が結合する3'立体中心の配置(すなわち、二級アシルオキシ又はアルコキシ残基、例えば、R1O、R2O及びR3O)がR又はSであり、好ましくは(カーン・インゴルド・プレローグ順位則によって指定されるよう)Rである。R4及びCO2Hが結合するアグリコン立体中心の配置は、R又はSであり得る。全ての立体異性体、エナンチオマーとジアステレオマーの両方、及びそれらの混合物が、本発明の範囲内にあると考慮される。
【００２２】
式1aは、L/D-セリル、-スレオニル、-システイニルエーテル又はエステル脂質AGP、アゴニストとアンタゴニストの両方を包含する。
【００２３】
式1と式1a両方において、Zは、二重結合又はそれぞれが一重結合によって結合する2つの水素原子によって結合したOである。すなわち、化合物は、Z=Y=Oの場合、エステル結合し、Z=O及びY=NHの場合、アミド結合し、Z=H/H及びY=Oの場合、エーテル結合する。
【００２４】
式1の特に好ましい化合物は、CRX-601及びCRX-527と呼ばれる。これらの構造は以下のように示される。
【００２５】
【化３】
2016512226.tif 000004
2016512226.tif 000005
【００２６】
さらに、別の好ましい実施形態は、示される構造を有するCRX547を使用する。
【００２７】
【化４】
2016512226.tif 000006
【００２８】
さらに他の実施形態には、より短い二級アシル又はアルキル鎖を有するAGPに対して安定性の増加を提供しているCRX602又はCRX526などのAGPが含まれる。
【００２９】
【化５】
2016512226.tif 000007
2016512226.tif 000008
【００３０】
緩衝液
本発明の一実施形態において、AGPを含む組成物は、両性イオン性緩衝液を用いて緩衝する。好適には、両性イオン性緩衝液は、アミノアルカンスルホン酸又は好適な塩である。アミノアルカンスルホン酸緩衝液の例としては、HEPES、HEPPS/EPPS、MOPS、MOBS及びPIPESが挙げられるが、これらに限定はされない。好ましくは、緩衝液は、例えば、市販の注射産物中で使用するための、ヒトにおける使用に適した薬学的に許容される緩衝液である。最も好ましくは、緩衝液はHEPESである。
【００３１】
本発明の好適な実施形態において、AGPは、
i)約7のpHを有するHEPES、
ii)約5のpHを有するクエン酸(citrate)(例えばクエン酸ナトリウム)、及び
iii)約5のpHを有する酢酸(acetate)(例えば酢酸アンモニウム)
からなる群から選択される緩衝液を用いて緩衝する。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態において、AGP、CRX-601、CRX-527及びCRX-547は、約7のpHを有するHEPESを用いて緩衝する。緩衝液は、所望の等張性を達成するために、適切な量の生理食塩水又は他の賦形剤と共に使用してもよい。好ましい一実施形態において、0.9%生理食塩水が使用される。
【００３３】
HEPES:CAS登録番号:7365-45-9 C8H18N2O4S
1-ピペラジンエタンスルホン酸、4-(2-ヒドロキシエチル)
HEPESは、約6〜約8の生理学的pH範囲(例えば6.15〜8.35)、さらに特定すると約6.8〜約8.2のより有用な範囲、本発明の場合は、約7〜約8の間又は7と8の間、好ましくは約7と8未満の間で緩衝するように設計された両性イオン性緩衝液である。HEPESは典型的には、白色結晶質粉末であり、以下の構造の分子式:C8H18N2O4Sを有する。
【００３４】
【化６】
2016512226.tif 000009
HEPESは周知であり、市販されている(例えば、Goodら、Biochemistry 1996を参照のこと)。
【００３５】
本発明の組成物中の緩衝液として用いる場合、クエン酸緩衝液(例えばクエン酸ナトリウム)と酢酸は両方とも、約5のpHを有する。一実施形態において、緩衝液の濃度は、約10mMであるが、いくつかの実施形態において、高い緩衝液濃度が必要であり得る。クエン酸及び酢酸緩衝液を、酸性又は弱酸性pHを必要とするAGPと共に、本発明の組成物中で使用してもよい。酢酸緩衝液は、ミョウバン（alum）の存在下のような、クエン酸緩衝液を使用できない環境又は組成物中でよく働く。クエン酸及び酢酸緩衝液は市販されている。
【００３６】
ナノ粒子混合物/溶液
形成された時に、本発明の組成物は、分散液又は溶液であって良い。好適に、組成物は、200nm以下の粒子サイズを有するナノ粒子溶液である。好適な一実施形態において、組成物は、ミセル又はリポソーム特性を示している、200nm以下の粒子サイズを有するナノ粒子溶液である。一実施形態において、溶液又は分散液は、免疫調節剤として薬学的使用のために好適である。溶液中の粒子サイズは、溶液又は分散液中の組成物が、音波処理にかけられる時間の長さによってある程度決定される。
【００３７】
治療及び投与方法
本発明は、対象の免疫応答を増強するための方法であって、対象に有効量の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００３８】
本発明の組成物は、全身又は粘膜経路を介して投与する手段によって、哺乳動物を保護又は治療するために使用してもよい。これらの投与には、筋肉内、腹腔内、皮内又は皮下経路を介した、又は口腔/食道、気道、尿生殖路への粘膜投与を介した注射が含まれてもよい。本発明の組成物は、単一用量又は複数用量として投与してもよい。さらに、本発明の組成物は、プライミング及びブースティングに対する異なる経路、例えばIMプライミング用量及びブースター用量のためのINで投与してもよい。
【００３９】
本発明の組成物は、単独で、又は好適な薬学的担体と共に投与してもよく、錠剤、カプセル、粉末、溶液、懸濁液又はエマルジョンなどの固体又は液体形態の製造において使用できる。本組成物は、「ワクチン」内に製剤化、遊離溶液中で投与、又はアジュバント若しくは賦形剤と共に製剤化してもよい。ワクチン調製は一般に、Vaccine Design (「The subunit and adjuvant approach」(Powell M. F. & Newman M.J.編) (1995) Plenum Press New York)で記述される。リポソーム内への封入は、Fullerton、米国特許第4,235,877号に記述される。ワクチンは、溶液中で保存してもよく、又は凍結乾燥してもよい。
【００４０】
対象の治療のために、本発明の組成物を組み込む治療剤の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、投与された他の医薬品、他の医学的合併症に関する患者の生理的状態を含む多くの様々な因子によっても、治療が予防的であるか治療的であるかどうかによっても変わる。治療投与量は、安全性及び有効性を最適化するために、用量設定される必要がある。本明細書で記述される対象用量は典型的に、適用に依存して、毎日、毎週又は毎月、及びその間の他の任意の時間間隔で与えられ得る投与当たり約0.1μg〜50mgの範囲である。より典型的には、粘膜又は局所用量は、投与当たり約10μg〜10mg、任意選択で約100μg〜1mgの範囲であり、2〜4回の投与は、数日又は数週間間が空く。より典型的には、免疫刺激物の用量は、毎日又は毎週投与にて、投与当たり1μg〜10mg、最も典型的には、10μg〜1mgの範囲である。非経口送達のため、例えば先天性免疫応答を誘導するため、又は専用送達ビヒクル中での、本明細書で本発明を組み込んでいる用量は典型的に、適用に依存して、毎日、毎週又は毎月、及びその間の他の任意の時間間隔で与えられ得る投与当たり約0.1μg〜10mgの範囲である。より典型的には、これらの目的のための非経口用量は、投与当たり約10μg〜5mg、最も典型的には、約100μg〜1mgの範囲であり、2〜4回の投与は、数日又は数週間間が空く。しかしながら、いくつかの実施形態において、これらの目的のための非経口用量は、以上で記述した典型的な用量よりも、5〜10,000倍高い範囲内で使用することもできる。
【００４１】
対象における感染性疾患、自己免疫疾患、神経学的障害又はアレルギー若しくは炎症状態を緩和し、又は実質的に予防するための方法であって、対象に有効量の医薬組成物を投与することを含む方法も提供される。いくつかの例において、外来性抗原を、医薬組成物と共に、対象に投与してもよい。免疫応答を引き起こすか又は増強するための組成物において、本発明の組成物を、ヒト又は他の哺乳動物などの温血動物へ、タンパク質又はポリペプチド抗原、又はタンパク質若しくはポリペプチド抗原を発現するポリヌクレオチドなどの抗原と共に投与する。所望の応答を引き起こすために投与した抗原の量は、当業者によって簡単に決定でき、投与した抗原の型、投与経路及び免疫化スケジュールと共に変化する。本発明の組成物はまた、非特異的耐性効果を介した即時保護を引き起こすために、外来性抗原なしに投与できる。非特異的耐性を刺激する、及び/又はアジュバント効果を引き起こす能力を有する組成物を、迅速に作用するワクチン製剤中で使用できる。
【００４２】
用語/定義
本明細書で議論したように、用語「脂肪族」はそれ自身、又は別の置換基の一部として、他に言及しない限り、指定された炭素原子数を有する、完全飽和、モノ又はポリ不飽和であってもよく、二価及び多価基を含んでもよい、直鎖又は分岐鎖、又は環状炭化水素基、又はその組合せを意味する(すなわち、C1〜C10又はC1〜10は、1〜10個の炭素を意味する)。飽和炭化水素基の例としては、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、シクロヘキシル、(シクロヘキシル)メチル、シクロプロピルメチル、例えばn-ペンチル、n-ヘキシル、n-ヘプチル、n-オクチルの相同体及び異性体などの基が挙げられる。不飽和脂肪族基は、1つ以上の二重結合又は三重結合を有するものである。不飽和脂肪族基の例としては、ビニル、2-プロペニル、クロチル、2-イソペンテニル、2-(ブタジエニル)、2，4-ペンタジエニル、3-(1，4-ペンタジエニル)、エチニル、1-及び3-プロピニル、3-ブチニル、並びにより高次の相同体及び異性体が挙げられる。典型的には、脂肪族基は、1〜24個の炭素原子を有する。「低級脂肪族」基は、一般に8個以下の炭素原子を有する、より短い鎖脂肪族基である。
【００４３】
用語「アシル」は、ヒドロキシ基の除去によって有機酸から誘導される基を指す。アシル基の例としては、アセチル、プロピオニル、ドデカノイル、テトラデカノイル、イソブチリルなどが挙げられる。したがって、本明細書で使用する場合、用語「アシル」は、他に-C(O)-脂肪族として定義される基を含むことを意味し、脂肪族基は好ましくは、飽和脂肪族基である。
【００４４】
用語「薬学的に許容される塩」は、本明細書に記述した化合物上で見られる特定の置換基に依存して、相対的に非毒性の酸又は塩基で調製される活性化合物の塩を含むことを意味する。本発明の化合物が、比較的酸性の官能性を含有する場合、塩基付加塩は、ニート又は好適な不活性溶媒中いずれかで、そのような化合物の中性形態を十分量の所望の塩基と接触させることによって得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩の例としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ又はマグネシウム塩又は同様の塩が挙げられる。一実施形態において、塩は、モノエタノールアミン(MEA)又はトリエタノールアミン(TEA)などのエタノールアミン塩である。本発明の組成物中で使用した化合物が、比較的塩基性の官能性を含有する場合、酸付加塩は、ニート又は好適な不活性溶媒中いずれかで、そのような化合物の中性形態を、十分量の所望の酸と接触させることによって得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一炭酸水素酸、リン酸、一リン酸水素酸、二リン酸水素酸、硫酸、一硫酸水素酸、ヨウ化水素酸又は亜リン酸などの無機酸から由来するもの、並びに酢酸、プロピオン酸、イソブチル酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、p-トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などの比較的非毒性の有機酸から由来する塩が挙げられる。アルギン酸などのアミノ酸の塩、及びグルクロン酸又はガラクツロン酸などの有機酸の塩も含まれる(例えば、Berge, S.M.ら、「Pharmaceutical Salts」、Journal of Pharmaceutical Science、66、1〜19、1977を参照のこと)。本発明の組成物中で使用されるある特定の化合物は、化合物が塩基又は酸付加塩のいずれかに変換されるのを許容する、塩基性と酸性の官能性の両方を含有する。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、活性成分の免疫調節活性を干渉せず、投与される患者に対して毒性ではない媒体を意味する。
【００４６】
薬学的に許容される担体としては、水中油又は油中水エマルジョン、多重エマルジョン(例えば水中油中水)、ミクロエマルジョン、リポソーム、マイクロビーズ、ミクロスフィア、ミクロソームなどが挙げられる。例えば、担体は、本発明の化合物が、スフィア若しくは粒子のマトリックス内にある、又はスフィア若しくは粒子の表面に吸着している、ミクロスフィア又は好ましくはナノスフィアであっても、マイクロ粒子又は好ましくはナノ粒子であってもよい。担体はまた、トリエチルアミン、トリエタノールアミン若しくは製剤に性質としてアルカリ性を与える他の薬剤を含有する水溶液又はミセル分散液、又は水酸化アルミニウム、水酸化カルシウム、リン酸カルシウム又はチロシン吸着質を含有する懸濁液であってもよい。担体としてはまた、全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸着遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが挙げられる。薬学的に活性な物質に対するそのような媒体及び薬剤の使用が、当技術分野で周知である。任意の従来の媒体又は薬剤が、活性成分と不適合である場合を除いて、治療用組成物中でのその使用が企図される。
【００４７】
特定の実施形態において、リポソーム、ナノカプセル、マイクロ粒子、脂質粒子、ベシクルなどが、好適な宿主細胞/生物への、本発明の組成物の導入のために使用される。特に、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、ベシクル、ナノスフィア又はナノ粒子など中に封入される送達のために製剤化されてもよい。
【００４８】
可能性のある薬物担体としてのリポソーム及びリポソーム様調製物の形成及び使用は一般に、当業者に公知である(例えば、Lasic、Trends Biotechnol 1998 Jul;16(7):307〜21; Takakura、Nippon Rinsho 1998 Mar;56(3):691〜5; Chandranら、Indian J Exp Biol. 1997 Aug;35(8):801〜9; Margalit、Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1995; 12(2〜3):233〜61、米国特許第5,567,434号、米国特許第5,552,157号、米国特許第5,565,213号、米国特許第5,738,868号及び米国特許第5,795,587号を参照のこと)。
【００４９】
リポソームは、T細胞懸濁液、初代肝細胞培養物及びPC12細胞を含む、他の手順によってトランスフェクトするのが通常困難ないくつもの細胞型で使用することに成功している(Renneisenら、J Biol Chem. 1990 Sep 25;265(27):16337〜42; Mullerら、DNA Cell Biol. 1990 Apr;9(3):221〜9)。加えて、リポソームは、ウイルスに基づく送達システムに典型的であるDNA長さ制限がない。リポソームは、遺伝子、種々の薬物、放射線治療剤、酵素、ウイルス、転写因子、アロステリックエフェクターなどを、種々の培養細胞株及び動物に、効果的に導入するために使用されてきた。さらに、リポソームの使用は、全身送達後、自己免疫応答又は許容できない毒性に関連するとは考えられていない。
【００５０】
特定の実施形態において、リポソームは、水性媒体中に分散し、(多重膜ベシクル(MLV)とも呼ばれる)自発的に多重膜同心二層ベシクルを形成するリン脂質から形成される。
【００５１】
あるいは、他の実施形態において、本発明は、本発明の組成物の薬学的に許容されるナノカプセル製剤を提供する。ナノカプセルは一般に、安定で再生可能な方法で、化合物を封入することができる(例えば、Quintanar-Guerreroら、Drug Dev Ind Pharm. 1998 Dec;24(12):1113〜28を参照のこと)。細胞内重合性オーバーローディングによる副作用を避けるために、そのような超微粒子(約0.1μmの大きさ)が、インビボで分解可能なポリマーを用いて設計されてもよい。そのような粒子は、例えば、Couvreurら、Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1988;5(1):1〜20; zur Muhlenら、Eur J Pharm Biopharm. 1998 Mar;45(2):149〜55; Zambauxら、J Controlled Release. 1998 Jan 2;50(1〜3):31〜40及び米国特許第5,145,684号によって記述されたように作製できる。
【００５２】
本明細書で使用する場合、用語「免疫調節剤」は、対象の免疫応答を増大させる、減少させる、変化させる又は影響を与えることによってなど、対象における免疫応答を変更する物質を意味する。
【００５３】
投与経路
非経口に、すなわち、腹腔内、皮下又は筋肉内に投与できる本発明の組成物には、以下の好ましい担体が含まれる。皮下使用のための好適な担体の例には、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液、又は注射用USP Water中の0.9%塩化ナトリウム及び注射用USP Water中の0.01〜0.1%トリエタノールアミンが挙げられるが、これらに限定はされない。筋肉内注射のための好適な担体としては、10%USPエタノール、40%プロピレングリコール及び残部5%デキストロースなどの許容される等張溶液、又は注射用USP Water中の0.9%塩化ナトリウムが挙げられるが、これらに限定はされない。静脈内使用のため好適な担体の例としては、10%USPエタノール、40%USPプロピレングリコール及び残部が注射用UPS Water又は注射用UPS Water中の0.9%塩化ナトリウムが挙げられるが、これらに限定はされない。一実施形態において、担体には、10%USPエタノール及び注射用USP Waterが含まれ、また別の実施形態に対して、許容される担体は、注射用USP Water中の0.01〜0.1%トリエタノールアミンである。薬学的に許容される非経口溶媒は、活性成分を除去せずに、5ミクロンフィルタ、又は好ましくは0.2ミクロンフィルタを通して濾過してもよい溶液又は分散液を提供するためのようなものである。
【００５４】
本発明の組成物の別の投与経路は、粘膜投与、特に鼻腔内投与又はいくつかの場合、吸入による投与(肺投与)である。肺薬物送達は、液体ネブライザー、エアロゾルに基づく定量吸入器(MDI)及び乾燥粉末分散機器を含む、種々の異なるアプローチによって達成できる。この型の投与における使用のための組成物は、典型的に乾燥粉末又はエアロゾルである。
【００５５】
乾燥粉末は、本発明の組成物に加えて、担体、吸収増強剤、及び任意選択で他の成分を含有する。担体は、例えば、単糖、二糖又は多糖、糖アルコール又は別のポリオールである。好適な担体には、ラクトース、グルコース、ラフィノース、メレジトース、ラクチトール、マルチトール、トレハロース、スクロース、マンニトール及びデンプンが含まれる。ラクトースが特に好ましく、とりわけその一水和物の形態である。ポリペプチド、界面活性剤、アルキルグリコシド、脂肪酸又はリン脂質のアミン塩のような吸収増強剤も含まれる。製剤の成分は典型的に、微細に分割された形態でなければならず、すなわちそれらの容量中位径は一般に、レーザー回析器具又はコールターカウンターによって測定されたように、約30〜約200ミクロンであるべきである。所望の粒子サイズは、当技術分野で公知の方法、例えば、製粉、微粒子化又は直接沈殿を用いて産出されて良い。
【００５６】
鼻腔内投与経路は、本発明の化合物に対する多くの他の投与形態に対して、多数の利点を提供する。例えば、鼻腔内投与の1つの利点は、簡便性である。注射用システムは、皮下注射器の滅菌を必要とし、施設環境において、汚染されたニードルによって偶然に指されることによる、疾患罹患のリスクについて、医療従事者の間での懸念をもたらす。使用したニードル及び注射器の安全廃棄に対する厳しい要件がまた、施設環境において、強要されなければならない。反対に、鼻腔内投与は、患者及び付き添っている医療従事者側でわずかな時間しか必要なく、注射剤よりも施設における重荷が遙かに少ない。
【００５７】
鼻腔内投与の第二の重要な利点は、薬物送達システムの患者の許容性である。鼻腔内投与は、非侵襲性であると理解され、痛みを伴わず、大した後遺症をなく、症状を示している患者に迅速な軽減の満足をもたらす。患者が小児である時に、これは特に有利である。別の重要な考慮は、患者が、所定の投与量の鼻腔スプレーを自分で投与可能であり得ることである。
【００５８】
鼻腔内投与のために、本発明の組成物を、液体として、又は固体として製剤化してもよい。そのような製剤には、1つ以上の追加アジュバント、鼻膜を通しての浸潤による、活性成分の吸収を増強するための薬剤、及び(液体組成物に対して)追加の水性緩衝液、又は他の薬学的に許容される担体を含有してもよい。組成物は、1つ以上の多価アルコール及び1つ以上の保存剤を任意選択でさらに含んでもよい。好適な保存剤は、例えば、ゲンタマイシン、バシトラシン(0.005%)又はクレゾールを含む。組成物は、アトマイザー、ネブライザー、スプレイヤー、ドロッパー又は溶液の、鼻粘膜との接触を保証する他の機器を用いることによって、スプレーの形態で鼻腔に投与してもよい。機器は、患者によって使用されてもよい単純な経鼻スプレイヤーのような単純なものであってもよく、又は医師のオフィス又は医療機関で使用されてもよい、組成物をより正確に分配するためのより複雑な器具であってもよい。
【００５９】
経鼻粉末組成物は、本発明の組成物を凍結乾燥すること、又は好適な経鼻粉末(例えばラクトース)上に組成物を吸着させ、必要に応じて、所望の粒子サイズに製粉することによって作製できる。あるいは、組成物とシクロデキストリン賦形剤の溶液を作製し、沈殿、濾過及び粉砕と続けることができる。凍結乾燥によって溶媒を除去し、続いて薬学的文献から公知の従来の技術を用いることによって、所望の粒子サイズに、粉末を粉砕することも可能である。最終段階は、例えば、好ましくは直径30〜200ミクロンの間の粒子を得るための、ふるいにかけることによるサイズ分類である。粉末を、経鼻送気器を用いて投与することができ、又はこれらは、吸入又は送気機器中のカプセルセット内に配置してもよい。ニードルをカプセルを通して侵入させ、カプセルの上部及び底部において孔を作製し、粉末粒子を吹き出すために空気を送る。粉末製剤はまた、不活性気体のジェットスプレー中で投与する又は液体有機流体中に懸濁することができる。
【００６０】
本発明の組成物は、個体の免疫応答に影響を与えるか、増強するために、有効量又は薬学的に有効量で、個体に投与する。本明細書で使用する場合、「有効量」又は「薬学的に有効量」は、ビヒクル又は陰性対照以上の応答を示す量である。「アジュバント-有効量」は、抗原と共に投与した時に、抗原のみによって産出されたもの以上の応答を示す当該化合物の量である。患者に投与されるべき本発明の組成物の正確な投与量は、使用する特定の化合物、投与経路、医薬組成物及び患者に依存する。
【００６１】
MM6効力アッセイ
MonoMac6効力アッセイを使用して、生物学的産物の2つの異なるロット間の相対効力を定量的に測定する。試験及び参照化合物の用量範囲を、MonoMac6細胞、ヒト単球細胞株と共インキュベートし、細胞上清をさらなる試験のために回収する。ネステッドELISAによって細胞上清から測定したケモカインマーカー(MIP-1β)は、リードアウトとして役目を果たす。効力解析鋳型を構築し、そこに未加工光学密度を貼り付け、解析を自動で実施する。試験曲線と参照応答曲線の間の傾きと平行度に基づき、定義された測定基準内の設定基準が、効力決定の成功が起こり得るかどうかを決定する。これらの基準が適合するのに成功した場合、解析により、参照産物に対する試験産物の相対効力値が得られる。
【００６２】
本発明は、単に例示目的で示すにすぎない以下の非限定実施例及び試験実施例によってさらに記述される。本明細書で引用した全ての参考文献が、その全体が参照によって組み込まれる。
【実施例】
【００６３】
[実施例1]
pH=7.0でのHEPESの製剤化
HEPESの分子量は238.3g/molである。したがって、6.044gのHEPESを秤量し、200mLの滅菌水を添加し、混合液を磁気撹拌子を用いて撹拌した。溶液のpHは、5.2であると測定された。次いで、5N NaOHを滴下添加し、7.0の最終pHを達成した。溶液の容量を、250mLまでにして、pH=7.0での100mM HEPES緩衝液を得た。この緩衝液を今後の使用のために滅菌濾過した。10mM HEPES緩衝液を調製するために、10mLの100mM HEPES緩衝液を、90mLの滅菌水中に希釈した(総容量＝100mL)。得られたpH=7.0での10mM HEPES緩衝液を、GSK Vaccines Hamilton、Montanaから得たCRX-601と使用するために、さらに滅菌濾過した。
【００６４】
[実施例2]
(比較):pH=8.0でのHEPESの製剤化
HEPESの分子量は238.3g/molである。したがって、6.044gのHEPESを秤量し、200mLの滅菌水を添加し、混合液を磁気撹拌子を用いて撹拌した。溶液のpHは、5.2であると測定された。次いで、5N NaOHを滴下添加し、8.0の最終pHを達成した。溶液の容量を、250mLまでにして、pH=8.0での100mM HEPES緩衝液を得た。この緩衝液を今後の使用のために滅菌濾過した。10mM HEPES緩衝液を調製するために、10mLの100mM HEPES緩衝液を、90mLの滅菌水中に希釈した(総容量＝100mL)。得られたpH=8.0での10mM HEPES緩衝液を、CRX-601と使用するために、さらに滅菌濾過した。
【００６５】
[実施例3]
pH=7.0でのAGP及びHEPESの製剤化
CRX-601を、3.99mgのCRX-601を秤量し、1.877mLの10mM HEPESを添加し、続いて水浴ソニケータ中の超音波処理によって、2mg/mL標的濃度にて、pH=7.0にて緩衝化した10mM HEPES中に製剤化した。25分後、溶液は視覚的に透明であったが、本明細書で用いた他の緩衝液での他のCRX-601製剤がまだ同様の外観を達成していなかったので、音波処理を続けた。目的が、同一の量の処理エネルギーに、各CRX-601緩衝製剤をかけることであったことから、これを行った。
【００６６】
[実施例4]
(比較):pH=8でのAGP及びHEPESの製剤化
CRX-601を、3.99mgのCRX-601を秤量し、1.877mLの10mM HEPESを添加し、続いて水浴ソニケータ中の超音波処理によって、2mg/mL標的濃度にて、pH=8.0にて緩衝化した10mM HEPES中に製剤化した。25分後、溶液は視覚的に透明であったが、本明細書で用いた他の緩衝液での他のCRX-601製剤がまだ同様の外観を達成していなかったので、音波処理を続けた。目的が、同一の量の処理エネルギーに、各CRX-601緩衝製剤をかけることであったことから、これを行った。
【００６７】
非HEPES緩衝液を製剤化すること
各緩衝液のpHは、それぞれの緩衝液に対する緩衝能力内であった。各緩衝液に対する調製レシピを以下に記述する。
【００６８】
[実施例5]
pH=5.0での酢酸緩衝液
酢酸アンモニウムの分子量は77.08g/molである。したがって、1.927gの酢酸アンモニウムを秤量し、200mLの滅菌水を添加し、混合液を磁気撹拌子を用いて撹拌した。溶液のpHは、6.6であると測定された。次いで、酢酸を滴下添加し、5.0の最終pHを達成した。溶液の容量を、250mLまでにして、pH=5.0での100mM酢酸緩衝液を得た。この緩衝液を今後の使用のために滅菌濾過した。10mM酢酸緩衝液を調製するために、10mLの100mM酢酸緩衝液を、90mLの滅菌水中に希釈した(総容量＝100mL)。得られたpH=5.0での10mM酢酸緩衝液を、CRX-601と使用するために、さらに滅菌濾過した。
【００６９】
[実施例6]
(比較)pH=5.5での酢酸緩衝液
酢酸アンモニウムの分子量は77.08g/molである。したがって、1.927gの酢酸アンモニウムを秤量し、200mLの滅菌水を添加し、混合液を磁気撹拌子を用いて撹拌した。溶液のpHは、6.6であると測定された。次いで、酢酸を滴下添加し、5.5の最終pHを達成した。溶液の容量を、250mLまでにして、pH=5.5での100mM酢酸緩衝液を得た。この緩衝液を今後の使用のために滅菌濾過した。10mM酢酸緩衝液を調製するために、10mLの100mM酢酸緩衝液を、90mLの滅菌水中に希釈した(総容量＝100mL)。得られたpH=5.5での10mM酢酸緩衝液を、CRX-601と使用するために、さらに滅菌濾過した。
【００７０】
[実施例7]
pH=5.0でのクエン酸緩衝液
クエン酸三ナトリウム(脱水)の分子量は294.1g/molであり、クエン酸(一水和物)の分子量は210.14g/molである。したがって、3.670gのクエン酸三ナトリウムと2.627gのクエン酸を秤量し、200mLの滅菌水を添加し、混合液を磁気撹拌子を用いて撹拌した。溶液のpHは、4.1であると測定された。次いで、5N NaOHを滴下添加し、5.0の最終pHを達成した。溶液の容量を、250mLまでにして、pH=5.0での100mMクエン酸緩衝液を得た。この緩衝液を今後の使用のために滅菌濾過した。10mMクエン酸緩衝液を調製するために、10mLの100mMクエン酸緩衝液を、90mLの滅菌水中に希釈した(総容量＝100mL)。得られたpH=5.0での10mMクエン酸緩衝液を、CRX-601と使用するために、さらに滅菌濾過した。
【００７１】
[実施例8]
(比較):pH=6.0でのクエン酸緩衝液
クエン酸三ナトリウム(脱水)の分子量は294.1g/molであり、クエン酸(一水和物)の分子量は210.14g/molである。したがって、3.670gのクエン酸三ナトリウムと2.627gのクエン酸を秤量し、200mLの滅菌水を添加し、混合液を磁気撹拌子を用いて撹拌した。溶液のpHは、4.1であると測定された。次いで、5N NaOHを滴下添加し、6.0の最終pHを達成した。溶液の容量を、250mLまでにして、pH=6.0での100mMクエン酸緩衝液を得た。この緩衝液を今後の使用のために滅菌濾過した。10mMクエン酸緩衝液を調製するために、10mLの100mMクエン酸緩衝液を、90mLの滅菌水中に希釈した(総容量＝100mL)。得られたpH=6.0での10mMクエン酸緩衝液を、CRX-601と使用するために、さらに滅菌濾過した。
【００７２】
[実施例9]
(比較):pH=6.1でのクエン酸緩衝液
クエン酸三ナトリウム(脱水)の分子量は294.1g/molであり、クエン酸(一水和物)の分子量は210.14g/molである。したがって、3.670gのクエン酸三ナトリウムと2.627gのクエン酸を秤量し、200mLの滅菌水を添加し、混合液を磁気撹拌子を用いて撹拌した。溶液のpHは、4.1であると測定された。次いで、5N NaOHを滴下添加し、6.1の最終pHを達成した。溶液の容量を、250mLまでにして、pH=6.1での100mMクエン酸緩衝液を得た。この緩衝液を今後の使用のために滅菌濾過した。10mMクエン酸緩衝液を調製するために、10mLの100mMクエン酸緩衝液を、90mLの滅菌水中に希釈した(総容量＝100mL)。得られたpH=6.1での10mMクエン酸緩衝液を、CRX-601と使用するために、さらに滅菌濾過した。
【００７３】
[実施例10]
(比較):pH=7.0でのクエン酸緩衝液
クエン酸三ナトリウム(脱水)の分子量は294.1g/molであり、クエン酸(一水和物)の分子量は210.14g/molである。したがって、3.670gのクエン酸三ナトリウムと2.627gのクエン酸を秤量し、200mLの滅菌水を添加し、混合液を磁気撹拌子を用いて撹拌した。溶液のpHは、4.1であると測定された。次いで、5N NaOHを滴下添加し、7.0の最終pHを達成した。溶液の容量を、250mLまでにして、pH=7.0での100mMクエン酸緩衝液を得た。この緩衝液を今後の使用のために滅菌濾過した。10mMクエン酸緩衝液を調製するために、10mLの100mMクエン酸緩衝液を、90mLの滅菌水中に希釈した(総容量＝100mL)。得られたpH=7.0での10mMクエン酸緩衝液を、CRX-601と使用するために、さらに滅菌濾過した。
【００７４】
[実施例11]
(比較):pH=7.0でのTRIS緩衝液
TRISの分子量は121.14g/molである。したがって、3.029gのTRISを秤量し、200mLの滅菌水を添加し、混合液を磁気撹拌子を用いて撹拌した。溶液のpHは、10.5であると測定された。次いで、6N HClを滴下添加し、7.0の最終pHを達成した。溶液の容量を、250mLまでにして、pH=7.0での100mM TRIS緩衝液を得た。この緩衝液を今後の使用のために滅菌濾過した。10mM TRIS緩衝液を調製するために、10mLの100mMクエン酸緩衝液を、90mLの滅菌水中に希釈した(総容量＝100mL)。得られたpH=7.0での10mM TRIS緩衝液を、CRX-601と使用するために、さらに滅菌濾過した。
【００７５】
[実施例12]
(比較):pH=7.0でのコハク酸緩衝液
コハク酸無水物の分子量は100.07g/molである。したがって、2.502gのコハク酸無水物を秤量し、200mLの滅菌水を添加し、混合液を磁気撹拌子を用いて撹拌した。溶液のpHは、2.5であると測定された。次いで、5N NaOHを滴下添加し、7.0の最終pHを達成した。溶液の容量を、250mLまでにして、pH=7.0での100mMコハク酸緩衝液を得た。この緩衝液を今後の使用のために滅菌濾過した。10mMコハク酸緩衝液を調製するために、10mLの100mMコハク酸緩衝液を、90mLの滅菌水中に希釈した(総容量＝100mL)。得られたpH=7.0での10mMコハク酸緩衝液を、CRX-601と使用するために、さらに滅菌濾過した。
【００７６】
[実施例13]
(比較):pH=7.0でのリン酸緩衝液
リン酸ナトリウム(一塩基性)の分子量は137.99g/molであり、リン酸ナトリウム(二塩基性)は、141.96g/molである。したがって、0.059gのリン酸ナトリウム(一塩基性)と0.082gのリン酸ナトリウム(二塩基性)を秤量し、80mLの滅菌水を添加し、混合液を磁気撹拌子を用いて撹拌した。溶液のpHは、7.0であると測定された。溶液の容量を、100mLまでにして、pH=7.0での10mMリン酸緩衝液を得た。この緩衝液を、CRX-601との今後の使用ために滅菌濾過した。
【００７７】
[実施例14]
(比較):pH=6.1でのリン酸ナトリウム緩衝液
リン酸ナトリウム(二塩基性)の分子量は141.96g/molであり、塩化ナトリウムの分子量は58.5g/molである。したがって、7.098gのリン酸ナトリウム(二塩基性)と、5.844gの塩化ナトリウムを秤量し、900mLの滅菌水を添加し、混合液を、磁気撹拌子を用いて撹拌した。溶液のpHは、9.0であると測定された。次いで、6N HClを滴下添加し、6.1の最終pHを達成した。溶液の容量を、1000mLまでにして、pH=6.1での100mM NaClと50mMリン酸ナトリウム(二塩基性)緩衝液を得た。この緩衝液を、CRX-601との今後の使用のために滅菌濾過した。
【００７８】
[実施例15]
AGP及び緩衝液の製剤化
表1は、製剤分野で有用であるとして考えられた7つの共通緩衝液を列記している。CRX-601を、2mg/mLの標的濃度にて、表1で要約したそれぞれの緩衝液中に製剤化した。緩衝液を、表1で示した、それらの報告された最適なpHにて、又はその付近で製剤化した。
【００７９】
全ての試料を、処理するのにより長くかかった酢酸緩衝液中のCRX-601を除いて、処理によってではなく、特定の緩衝液のために引き起こされたCRX-601の分解を定量するために、同一の条件下で処理した。
【００８０】
【表１】
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【００８１】
緩衝液溶液のそれぞれを次いで、音波処理して、粒子サイズを減少させ、滅菌濾過を可能にした。表2は、CRX-601緩衝製剤のそれぞれに対する音波処理によって、部分的に透明な溶液を達成する(すなわちおよそ200nmの粒子サイズを達成する)ための処理時間を示している。
【００８２】
【表２】
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【００８３】
分解
表1の緩衝液1〜7を、加速安定性試験を用いて、表に示した濃度での安定性に関してスクリーニングした。緩衝液組成物を、14日間40℃で維持した。各組成物中のCRX-601の安定性を、共通CRX-601分解物(図1にて示した構造)に関して、組成物中のCRX-601の割合を測定することによって決定した。図2中のプロットは、CRX-601でスクリーニングした緩衝液の第一組からのデータを示している。各データシリーズに適合した傾向線の傾きが、CRX-601の分解速度の測定値である。興味深いことに、HEPES(pH=7.00)、酢酸(pH=5.50)及びクエン酸(pH=6.10)が、40℃にて14日後、溶液中で、CRX-601の最小の分解を引き起こしたことがわかった。リン酸ナトリウム(pH=7.15)、コハク酸(pH=7.00)、TRIS(pH=7.10)及びリン酸ナトリウム(pH=6.10)が、安定性の減少、驚くべきことに、HEPES(pH=7)と比較して安定性の減少を示した。pHにおける有意な変化は、本試験の間に観察されなかった。全ての製剤の粒子サイズは、凝集を示した、リポソーム水和緩衝液(LHB)と酢酸緩衝液中のCRX-601を除いて、安定したままであった。
【００８４】
[実施例16]
安定性/純度
緩衝液を、CRX-601の分解速度におけるpHの効果を同定するために評価し、とりわけ、pH=5.0での酢酸、pH=7.0、8.0でのHEPES、並びに5.0、6.0及び7.0でのクエン酸中に製剤化したCRX-601の安定性を試験した。この目的を達成するために、以下の緩衝液、pH7.0、8.0でのHEPES、pH5.0、6.0、7.0でのクエン酸及びpH=5.0での酢酸を、実施例1、2、5、7、8及び10に従って調製し、CRX-601を、それぞれにおいて製剤化して、40℃にて14日間の強制分解にかけた。
【００８５】
各緩衝化溶液に対する純度を、共通CRX-601分解物に対する組成物中のCRX-601の割合を測定することによって決定した。純度データを、図3にてプロットし、pH=7.0でのHEPESが、最小分解をもたらし、一方で異なるpH(pH=5)で、クエン酸と酢酸の両方が、CRX-601の最小分解をもたらすことを示す。
【００８６】
粒子サイズの増加を示した、pH=5.0でのクエン酸緩衝液中のCRX-601を除いて、粒子サイズにおいて有意な変化は、観察されなかった。本試験において、いずれの製剤に対しても、pHの有意な変化は観察されなかった。
【００８７】
[実施例17]
別のAGPで緩衝液を試験すること
(GSK Vaccines、Hamilton、Montanaより入手した)別のAGP CRX-527を、pH=7.0にて、リン酸及びHEPES緩衝液で、40℃にて14日間、加速安定性試験にてスクリーニングした。各組成物中のCRX-527の安定性を、共通CRX-527分解物(図4にて示した構造)に対する組成物中のCRX-527の割合を測定することによって決定した。同様に、緩衝化溶液に対する純度を、以上で説明したように、共通CRX-601分解物に関して組成物中の、CRX-601の割合を測定することによって決定した。図5におけるプロットは、CRX-601と共に2つの緩衝液中のCRX-527の分解プロファイルを示す。HEPESは、同一pH(pH=7.0)でのリン酸緩衝液と比較すると、AGPに対する安定性の増強を提供した。
【００８８】
[実施例18]
CRX-601長期安定性/純度
緩衝液を、CRX-610の長期安定性におけるpHの効果を同定するために評価し、とりわけ、pH=5.0での酢酸、pH=7.0でのHEPES、及びpH5.0でのクエン酸中に製剤化したCRX-601の安定性を試験した。この目的を達成するために、以下の緩衝液、pH7.0でのHEPES、pH5.0でのクエン酸及びpH=5.0での酢酸を、実施例1、5及び7に従って調製し、CRX-601を、それぞれにおいて製剤化して、2〜8℃にて、1年間を超えて保存した。各緩衝化溶液に対する純度を、共通CRX-601分解物に対する組成物中のCRX-601の割合を測定することによって決定した。純度データを図6にてプロットし、これは、約1年の期間にわたり試験したいずれの緩衝液においても、有意な分解がないことを示す。したがって、HEPES緩衝液は、酢酸及びクエン酸緩衝液でよりも明確に異なるpH値において、AGP化合物の所望の安定性を提供する。
【００８９】
[実施例19]
CRX-601効力試験
MonoMac6細胞効力アッセイを使用して、最適pHでの異なる緩衝液中のCRX527の相対効力と、最適pHにて異なる緩衝液中のCRX601の相対効力を測定した。HEPES中のCRX-527とCRX-527 INの効力を比較している初期実験は、効力における有意な差がないことを示した(データは示していない)。しかしながら、効力における明確な差が、pH=7.0でのHEPES、pH=5.0でのクエン酸及びpH=5.0での酢酸中のCRX-601を、CRX-601 IN(2%水性グリセロール)参照製剤に対するMM6細胞効力アッセイ中でスクリーニングした時には観察された。図7〜9で得た効力結果は、CRX-601酢酸とCRX-601クエン酸が、CRX-601 INと比較して、50%未満の効力を有したことを示している。有意な細胞死は、トリパンブルーによる染色時に、酢酸又はクエン酸緩衝化製剤にて観察されなかった。比較において、CRX-601 HEPESは、CRX-601 INと比較して、CRX-601効力において2倍の増加を有した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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