(57)【要約】RAを有する患者における抗TNFを用いた治療に対する応答を予測する際のマーカーとしての、SNP rs3794271および/またはそれと完全に連鎖不平衡の状態にあるSNPの使用に関する。また、rs3794271および/またはそれと完全に連鎖不平衡の状態にあるSNPについての遺伝子型の決定に基づき、抗TNFを用いた治療に対する応答を予測するための方法、ならびにRAを有する患者に対する治療を判断または推奨するための方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から得られたサンプルから、一塩基多型（SNP）rs3794271、および/またはSNP rs3794271と連鎖不平衡の状態にある少なくとも1種のSNPについての遺伝子型を決定する工程を含む、インフリキシマブまたはエタネルセプトの中より選択される腫瘍壊死因子α阻害剤（抗TNFα剤）を用いた治療に対する、関節リウマチ（RA）を有する患者の応答の予測のためのインビトロ方法であって、
i. SNP rs3794271における少なくとも1つの対立遺伝子Gの存在が、治療に対する不良な応答の指標であり、一方でSNP rs3794271におけるG以外の2つの対立遺伝子の存在が、療法に対する良好な応答の指標であり；かつ/または
ii. 該連鎖不平衡の状態にあるSNPに関して、SNP rs3794271における対立遺伝子Gと相関する少なくとも1つの対立遺伝子の存在が、治療に対する不良な応答の指標であり、一方で該連鎖不平衡の状態にあるSNPに関して、SNP rs3794271における対立遺伝子Gと相関しない2つの対立遺伝子の存在が、治療に対する良好な応答の指標である、
インビトロ方法。
【請求項２】
SNP rs3794271における2つの対立遺伝子Gの存在が、治療に対する不良な応答の傾向を表す、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
遺伝子型をSNP rs3794271について決定する、請求項1〜2のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
得られたサンプルが、血漿、血液、血清、および唾液を含む群より選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
遺伝子型の決定が、シーケンシング、ハイブリダイゼーション、制限酵素断片長多型（RFLP）、多型DNAのランダム増幅（RAPD）、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、または増幅断片長多型（AFLPD）、およびそれらの組み合わせを含む群より選択されるDNA解析技法を用いて実施される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
請求項1〜5のいずれか一項に従った、SNP rs3794271遺伝子型、および/またはrs3794271と連鎖不平衡の状態にあるSNPの決定を含む、RAを有する患者に対する治療を判断または推奨する方法であって、該患者が治療に対する不良な応答の傾向を有する場合に、インフリキシマブおよびエタネルセプトを除外する療法が推奨される、方法。
【請求項７】
請求項1〜5のいずれか一項に従った、SNP rs3794271遺伝子型、および/またはrs3794271と連鎖不平衡の状態にあるSNPの決定を含む、RAを有する患者に対する治療を判断または推奨する方法であって、該患者が治療に対する良好な応答の傾向を有する場合に、インフリキシマブまたはエタネルセプトを含む療法が推奨される、方法。
【請求項８】
SNP rs3794271についての遺伝子型を、請求項3〜5のいずれか一項に従って決定し、かつ患者が少なくとも1つの対立遺伝子Gを提示する場合に、インフリキシマブまたはエタネルセプトを除外する療法が推奨される、請求項6に記載の方法。
【請求項９】
SNP rs3794271についての遺伝子型を、請求項3〜5のいずれか一項に従って決定し、かつ患者がG以外の2つの対立遺伝子を提示する場合に、インフリキシマブまたはエタネルセプトを含む療法が推奨される、請求項6に記載の方法。
【請求項１０】
前記連鎖不平衡の状態にあるSNPが、SEQ ID NO: 1によって規定される、治療に対する不良な応答の傾向についての遺伝子座に位置する、請求項1、2、4、5、6、および7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記連鎖不平衡の状態にあるSNPが、rs10841585、rs10841586、rs4451779、rs10743388、rs10770689、rs6487129、rs10770691、rs11045376、rs11045378、rs10770695、rs12301364、rs10841593、rs151131008、rs11045385、rs10770701、rs954866、rs3809209、rs7305718、rs74406912、rs11045390、rs11045392、rs2203493、rs137927950、rs2417861、rs3751218、rs959346、rs10770702、rs10743389、rs10770704、rs71939085、rs10743390、rs11392906、rs201855778、rs10770705、rs10770706、rs78690605、rs10505868、rs1473993、rs3838816、およびrs10770707からなる群より選択される、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記連鎖不平衡の状態にあるSNPが、rs10770707、rs1473993、rs10770704、rs10770702、rs959346、rs3751218、rs11045392、rs11045390、rs74406912、rs10770701、およびrs954866からなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
RAを有する患者における、インフリキシマブおよびエタネルセプトの中より選択される抗TNFα剤を用いた治療に対する応答の傾向のマーカーとしての、SNP rs3794271、および/またはSNP rs3794271と連鎖不平衡の状態にあるSNPの使用。
【請求項１４】
前記連鎖不平衡の状態にあるSNPが、SEQ ID NO: 1によって規定される、治療に対する不良な応答の傾向を与える遺伝子座に位置する、請求項13に記載の使用。
【請求項１５】
前記連鎖不平衡の状態にあるSNPが、rs10841585、rs10841586、rs4451779、rs10743388、rs10770689、rs6487129、rs10770691、rs11045376、rs11045378、rs10770695、rs12301364、rs10841593、rs151131008、rs11045385、rs10770701、rs954866、rs3809209、rs7305718、rs74406912、rs11045390、rs11045392、rs2203493、rs137927950、rs2417861、rs3751218、rs959346、rs10770702、rs10743389、rs10770704、rs71939085、rs10743390、rs11392906、rs201855778、rs10770705、rs10770706、rs78690605、rs10505868、rs1473993、rs3838816、およびrs10770707からなる群より選択される、請求項14に記載の使用。
【請求項１６】
前記連鎖不平衡の状態にあるSNPが、rs10770707、rs1473993、rs10770704、rs10770702、rs959346、rs3751218、rs11045392、rs11045390、rs74406912、rs10770701、およびrs954866からなる群より選択される、請求項15に記載の使用。
【請求項１７】
マーカーがSNP rs3794271である、請求項13に記載の使用。
【請求項１８】
SNP rs3794271、および/またはSNP rs3794271と連鎖不平衡の状態にある少なくとも1種のSNPの遺伝子型を決定するための手段、ならびに該決定を実施するための指示および結果の解釈のための指示を含む、関節リウマチを有する患者における、インフリキシマブまたはエタネルセプトの中より選択される抗TNFα剤を用いた治療に対する応答を予測するためのキットであって、SNP rs3794271における少なくとも1つの対立遺伝子Gの存在、および/または該連鎖不平衡の状態にあるSNPに関してSNP rs3794271における対立遺伝子Gと相関する対立遺伝子の存在が、治療に対する不良な応答の指標であり、一方でSNP rs3794271におけるG以外の2つの対立遺伝子の存在、および/または該連鎖不平衡の状態にあるSNPに関してSNP rs3794271における対立遺伝子Gと相関しない2つの対立遺伝子の存在が、治療に対する良好な応答の指標であることを、結果の解釈のための該指示が示している、キット。
【請求項１９】
前記連鎖不平衡の状態にあるSNPが、SEQ ID NO: 1によって規定される、治療に対する不良な応答の傾向を与える遺伝子座に位置する、請求項18に記載のキット。
【請求項２０】
前記連鎖不平衡の状態にあるSNPが、rs10841585、rs10841586、rs4451779、rs10743388、rs10770689、rs6487129、rs10770691、rs11045376、rs11045378、rs10770695、rs12301364、rs10841593、rs151131008、rs11045385、rs10770701、rs954866、rs3809209、rs7305718、rs74406912、rs11045390、rs11045392、rs2203493、rs137927950、rs2417861、rs3751218、rs959346、rs10770702、rs10743389、rs10770704、rs71939085、rs10743390、rs11392906、rs201855778、rs10770705、rs10770706、rs78690605、rs10505868、rs1473993、rs3838816、およびrs10770707からなる群より選択される、請求項19に記載のキット。
【請求項２１】
前記連鎖不平衡の状態にあるSNPが、rs10770707、rs1473993、rs10770704、rs10770702、rs959346、rs3751218、rs11045392、rs11045390、rs74406912、rs10770701、およびrs954866からなる群より選択される、請求項20に記載のキット。
【請求項２２】
前記手段がSNP rs3794271についての遺伝子型を決定するために用いられ、かつ前記指示が、SNP rs3794271における少なくとも1つの対立遺伝子Gの存在が、治療に対する不良な応答の指標であり、一方でSNP rs3794271におけるG以外の2つの対立遺伝子の存在が、治療に対する良好な応答の指標であることを示している、請求項18に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リウマチ学分野、より具体的には、関節リウマチを有する患者における腫瘍壊死因子α阻害剤に対する応答に関する。
【背景技術】
【０００２】
最先端技術
関節リウマチ（本明細書においてRAと称される）は、主に関節における慢性炎症の存在を特徴とする全身性自己免疫疾患である。この慢性炎症は関節の進行性破壊に関与し、種々の程度の変形および/または機能障害につながる。ある特定の患者において、該疾患は、関節外の作用も有し得、眼、肺、胸膜、心臓および心膜、皮膚、または血管のような種々の臓器またはシステムに影響を及ぼす。RAはまだ知られていない原因を有するものの、自己免疫が、該疾患の慢性化および進行において中心的役割を担うことが知られている。RAは、非常に痛みを伴い、生活に支障をきたす疾患であり得る。
【０００３】
世界人口のおよそ1％はRAを有し、女性では男性よりも最大3倍の高い頻度である。RAはどの年齢でも出現し得るが、40歳代〜50歳代により多く見られる。
【０００４】
エタネルセプト、アダリムマブ、およびインフリキシマブなどの腫瘍壊死因子α阻害剤（本明細書において抗TNFα剤と称される）は、RAを有する患者の治療において非常に成功することが判明している。これらの薬物は、該疾患を長期化させる炎症過程の進行を減速させ得、したがってそれらは、疾患活動性を低下させ得、患者の生活の質を有意に改善させ得る。
【０００５】
RA治療におけるこの改善にもかかわらず、RA患者のおよそ20％〜40％は抗TNFα剤に有意に応答しない、またはこれらの治療に対する初期陽性応答を維持することができない。したがって、抗TNFα療法に応答しない患者の群は、トシリズマブ、アバタセプト、またはリツキシマブのような、抗TNFαとは異なる作用のメカニズムを有する代替的薬物からの恩恵を受け得る。疾患の早期段階における集中的治療が、RAを有する患者の良い進展に不可欠であり得ることは現在十分に確立されている。この理由により、この治療に応答しないであろうそうした患者を予測し得ることは高い臨床的価値があると考えられる。抗TNFα剤応答の早期予想は、該治療を放棄するのに役立ちかつ代替的療法を用いることを可能にすると考えられ、これは、治療応答陽性の可能性が増加し、かつ抗TNFα剤に関連した副作用が回避されるであろうため、患者にとって非常に有益であると考えられる。また、経済的観点から、およびRA治療の高い費用を考慮すると、臨床的意思決定および治療選択の最適化は、関連した医療支出の相当な低下に関連付けられるであろう。
【０００６】
先行調査により、いくつかのマーカーと抗TNFα療法に対する応答との関連性が解析されている。これらの一部には、TNFαサイトカインをコードする遺伝子のプロモーター領域における多型、ならびにHLA-DR（主要組織適合複合体、クラスII、DR）遺伝子、FCGR3（Fc受容体γIII）遺伝子、およびIL1RN（インターロイキン1受容体アンタゴニスト）遺伝子における多型が含まれる。しかしながら、これらの調査から得られた結果は、これまでのところ矛盾している。より最近では、一部のゲノムワイド関連調査（GWAS）により、抗TNFαに対する応答と関連した特定の多型が見出された（Liu C, et al,「Genome-wide association scan identifies candidate polymorphisms associated with differential response to anti-TNF treatment in rheumatoid arthritis」, Mol Med, 2008, vol. 14, pp. 575-81（非特許文献1）；Plant D et al,「Genome-wide association study of genetic predictors of anti-tumor necrosis factor treatment efficacy in rheumatoid arthritis identifies associations with polymorphisms at seven loci」, Arthritis Rheum, 2011, vol. 63, pp. 645-53（非特許文献2）；Krintel SB, et al, 「Investigation of single nucleotide polymorphisms and biological pathways associated with response to TNF alpha inhibitors in patients with rheumatoid arthritis」, Pharmacogenet Genomics, vol. 22, pp. 577-89（非特許文献3））。しかしながら、これらの多型のいずれも、十分に信頼性のある予測能力を実証していない。結局のところ、臨床的実践において用いられるのに十分な信頼性または堅牢性を有するマーカーはまだ存在しない。
【０００７】
これらすべての理由により、臨床的実践において用いられ得、かつ抗TNFα療法に対して陰性応答を有するそうした患者を確実に同定することを可能にし得る、抗TNFα剤に対する応答の予測のためのマーカーを同定する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Liu C, et al,「Genome-wide association scan identifies candidate polymorphisms associated with differential response to anti-TNF treatment in rheumatoid arthritis」, Mol Med, 2008, vol. 14, pp. 575-81
【非特許文献２】Plant D et al,「Genome-wide association study of genetic predictors of anti-tumor necrosis factor treatment efficacy in rheumatoid arthritis identifies associations with polymorphisms at seven loci」, Arthritis Rheum, 2011, vol. 63, pp. 645-53
【非特許文献３】Krintel SB, et al, 「Investigation of single nucleotide polymorphisms and biological pathways associated with response to TNF alpha inhibitors in patients with rheumatoid arthritis」, Pharmacogenet Genomics, vol. 22, pp. 577-89
【発明の概要】
【０００９】
発明の説明
本発明者らは、一塩基多型（本明細書においてSNPと称される）rs3794271が、RAを有する患者における抗TNFα療法に対する応答を予測し得る高い能力を有することを見出した。驚くべきことに、本発明者らによって実施された研究により、該SNPと抗TNFα療法に対する応答との関連性は、ゲノム規模レベルで有意であることが実証されている。これらすべての実験は、本明細書の実験の節に示されている。これらの結果に基づき、SNP rs3794271は、この群の薬物に対するRA患者の応答を予測する非常に強力なマーカーであると結論付けることができる。
【００１０】
ゆえに、本発明の一局面は、RAを有する患者における抗TNFα治療に対する応答の予測マーカーとしてのSNP rs3794271の使用に言及する。
【００１１】
下記の実施例は、抗TNFα剤がインフリキシマブまたはエタネルセプトである場合に、SNP rs3794271が治療に対する応答をより正確に予測することを示している。したがって、具体的な態様において、本発明は、RAを有する患者におけるインフリキシマブまたはエタネルセプトを用いた治療に対する応答の予測における、マーカーとしてのSNP rs3794271の使用に言及する。
【００１２】
最先端技術において記載されている先行マーカーと比較して、rs3794271は、臨床的実践における意思決定のためのツールとして用いられるのに十分に高い予測能力を有することを示しており、それによって、各RA患者に対する薬理学的治療の最適化のための非常に有益な情報を与える。
【００１３】
「一塩基多型」という用語は、ゲノムの配列の単一塩基（アデニン（A）、チミン（T）、シトシン（C）、またはグアニン（G））に影響を及ぼす、DNA配列における変動を指す。しかしながら、現在の最先端技術における一部の例において、少数のヌクレオチドの変化、ならびにわずかな挿入および欠失（インデル）もSNPと見なされ得る。SNPが一般集団において1％より高い頻度を有する場合、それは一般的変種と見なされ、一方で集団における頻度が1％より低い場合、それは稀な変種と見なされる。本発明において、「SNP」および「一塩基多型」という用語は区別なく用いられ、一塩基多型および数個のヌクレオチドの変化を含む変動と、わずかな欠失または挿入との両方を含む。
【００１４】
SNP rs3794271は、ヒト染色体領域12p12.2（第12染色体のNCBI参照配列：NC_000012.11、公表日：2012年8月31日）におけるSLCO1C1遺伝子の第4イントロンに見出され、該染色体の位置20,860,093における遺伝的変種を規定する（2009年2月、GRCh37/hg19ヒトゲノムアセンブリに従って）。
【００１５】
人間が2倍体である（つまり、各細胞内に2セットの常染色体を有する）ことを考慮すると、母系および父系の両染色体に任意の多型が存在していると考えられる。各SNPは、「対立遺伝子」と称される2種の単一塩基配列を有する。SNP rs3794271に関して、このことは、個体が、両染色体に対立遺伝子Gを有し得ることを意味する（すなわち、このSNPについてGホモ接合性個体、つまりはGG個体）。あるいは、個体は、該SNP位置において両染色体に代替の形態Aを有し得る、つまりこのSNPについて2つの対立遺伝子Aを有し得（すなわち、Aホモ接合性個体、つまりはAA個体）、または個体は、各タイプの1つの対立遺伝子も有し得る（すなわち、ヘテロ接合性個体、GAまたはAG）。
【００１６】
本発明者らは、RAを有する患者において、SNP rs3794271位置における対立遺伝子Gの存在が、インフリキシマブまたはエタネルセプトのいずれかを用いた治療に対する不良な応答を表すことを見出した。本発明者らの結果に従うと、このSNPに関してヘテロ接合性の個体（すなわち、1つの対立遺伝子G）は、インフリキシマブまたはエタネルセプトに対して応答なしの可能性が高い。このSNPに関してGGホモ接合性の患者の場合には、この応答なしの可能性はさらにより大きい。したがって、SNP rs3794271のジェノタイピングにより、これらの薬物を用いた治療に対するRAを有する患者の応答についての高精度の予測が可能となる。
【００１７】
ゆえに、本発明の別の局面は、RAを有する患者における抗TNFα治療に対する応答の予測のためのインビトロ方法に言及する。この方法は、患者から得られたサンプルからのSNP rs3794271遺伝子型についての決定を含み、（SNP rs3794271の位置における）少なくとも1つの対立遺伝子Gの存在は、治療に対する不良な応答の指標である。この同じ局面は、患者から得られたサンプルからSNP rs3794271についての遺伝子型を決定する工程を含む、抗TNFα治療に対するRA患者における応答を予測するインビトロ方法として示され得、SNP rs3794271の位置におけるG以外の2つの対立遺伝子の存在は、治療に対する良好な応答の指標である。言い換えれば、両対立遺伝子における代替形態Aの存在、つまりSNP rs3794271の位置における2つの対立遺伝子Aの存在は、治療に対する良好な応答の高い可能性を表す。
【００１８】
具体的な態様において、本発明のインビトロ方法は、インフリキシマブまたはエタネルセプトの中より選択する抗TNFα治療に対する応答を判定するように設計される。
【００１９】
別の特定の態様において、インフリキシマブまたはエタネルセプトに対する不良な応答の傾向は、（SNP rs3794271の位置における）2つの対立遺伝子Gの存在に関連付けられ、つまり不良な応答の傾向は、該SNP位置においてGGホモ接合性である個体に関連付けられる。
【００２０】
「不良な応答」とは、治療に応答しない患者を指す。「良好な応答」とは、治療に陽性に反応する患者を指す。治療応答は、EULAR応答（Fransen J et al,「The Disease Activity Score and the EULAR response criteria」, Clin Exp Rheumatol, 2005, vol. 23 (Supl. 39)）など、最先端技術における公知の方法を用いて判定され得る。EULAR応答は、RAの特定療法下にいる患者を、良好な応答者、中程度の応答者、または無応答者として分類する。臨床研究において、良好な応答または中程度の応答を有する患者は、機能的能力の有意な改善および関節損傷の進行の低下を有することを示しているが、一方で無応答患者は、疾患活動性の有意な低下を示さない。
【００２１】
EULAR応答基準は、応答カテゴリーを判定するためにDAS28を用いる。DAS28とは、28箇所の特定の関節における腫張および/または疼痛の存在をカウントし、この値と赤血球沈降速度（ESR）とを統合し、任意で、0〜100の範囲の視覚的尺度を用いた患者の全体的評価の後に得られるスコアである。0〜9.4に及ぶ連続的尺度において、DAS28に従った疾患の活動性のレベルは、低い（DAS28≦3.2）、中程度（3.2＜DAS28≦5.1）、または高い（DAS28＞5.1）と見なされる。EULAR応答は、基底点から終点までのDAS28変化の大きさ、ならびに終点における活動性レベルに基づいて患者を分類する。個々の患者についてのDAS28の1.2（測定誤差の2倍）という低下は、有意な変化と見なされる。このように、有意な変化（DAS28低下＞1.2）を有し、かつ低レベルの活動性（終点DAS28≦3.2）にも達する患者は、良好な応答者として分類される。いかなる終点DAS28であろうと、患者が0.6を上回ってDAS28を低下させない場合、それは療法に対して無応答者と見なされる。また、0.6〜1.2のDAS28低下を示すが、患者の終点DAS28が5.1よりも高い患者も、無応答患者と見なされる。残りの患者、すなわちEULARの良好な応答者のカテゴリーにもEULARの無応答者のカテゴリーにも入らない者は、中間の応答を有し、中程度の応答者としてカテゴリー化される。
【００２２】
それゆえ、EULAR基準に関して、不良な応答の傾向は、患者がEULAR無応答者であることを表し、一方で良好な臨床応答の傾向は、患者が良好なまたは中程度のEULAR応答者であることを表す。本発明の特定の態様において、良好な応答の傾向は、患者が良好なEULAR応答者であることを表す。
【００２３】
本発明における方法は、RAを有する患者に対してどれが最も適正な薬理学的治療であるかを判断するための非常に有用なツールを医療専門家に提供する。本発明における方法に従うと、専門家は、不良な応答の傾向があるとして分類された特定患者において、インフリキシマブおよびエタネルセプトを用いた治療を放棄することができ、かつ該患者において応答のより高い可能性を有するであろう代替的治療を推奨することができる。したがって、患者は効果のない治療法で治療されることを回避し、患者の回復にとって貴重な時間が節約され、かつインフリキシマブまたはエタネルセプトを用いた治療に関連した副作用が回避される。また、本発明の方法に従うと、良好な応答の傾向を有するそうした患者（すなわち、SNP rs3794271について、G以外の2つの異なる対立遺伝子を提示するそうした患者）は、インフリキシマブまたはエタネルセプトを用いた治療から恩恵を受けると考えられる。
【００２４】
本発明の局面は、SNP rs3794271についての決定を含む、RAを有する患者に対する治療を判断または推奨する方法に言及する。患者がSNP rs3794271位置に少なくとも1つの対立遺伝子Gのコピーを提示する場合、つまり患者が治療への不良な応答の傾向を有する場合、抗TNFα剤以外の療法が推奨される。特定の態様において、除外されるであろう抗TNFα剤はインフリキシマブおよびエタネルセプトである。特定の態様において、患者が両対立遺伝子においてG多型変種を有する場合、つまり患者がSNP rs3794271についてGGホモ接合性である場合、インフリキシマブおよびエタネルセプトを除外する療法が推奨される。別の態様において、患者がSNP rs3794271位置にGとは異なる2つの対立遺伝子（一般的には2つの対立遺伝子A）を提示する場合、つまり患者が治療に対する良好な応答の傾向を有する場合、インフリキシマブまたはエタネルセプトを含む療法が含まれる。
【００２５】
特定の態様において、本発明に従った、RAを有する患者に対する治療を判断または推奨する方法は、患者の臨床的変数についての決定および/または他の生物学的マーカーについての決定も含む。
【００２６】
遺伝的変動はゲノムにおいて決して分離されないことが一般に認められている。SNPが連続的DNA鎖（すなわち、染色体）の一部であることを考慮すると、非常に類似した頻度で共継承され、したがって関心対象の多型と類似したレベルの情報を含有するであろう、染色体における他の近縁変種が存在すると考えられる。高い相関関係にあるこれらの近縁変種は、連鎖不平衡ブロックとして知られる。全ヒトゲノムを特徴付け、国際的HapMapプロジェクトによって特徴付けされているこれらのブロックは、低い確率の組換えを示す明確に規定された領域である。SNP rs3794271は、SEQ ID NO: 1に規定される連鎖不平衡ブロック内に位置し、これは、PDE3A遺伝子の転写配列の第13エクソン（NCBI参照配列：NM_001244683、参照配列NC_000012.11、GRCh37.p10プライマリアセンブリ、2012年10月30日）から、SLCO1C1転写配列の第6エクソン（NCBI参照配列：NM_001145945、参照配列NC_000012.11、GRCh37.p10プライマリアセンブリ、2012年10月30日）まで延び、2つの遺伝子間には遺伝子間領域が含まれる。この領域内には、SNP rs3794271と非常に高い連鎖不平衡の状態にあるSNP、つまりその対立遺伝子がrs3794271対立遺伝子と非常に有意な相関関係を有するSNPを見出すことが可能である。連鎖不平衡とは、同じ染色体に位置する2つの多型遺伝子座の対立遺伝子頻度間の相関関係についての測定尺度である。ほとんどの場合、連鎖不平衡は、一般的にキロベース範囲内の非常に短い距離まで及ぶ。当技術分野における熟練者が、この領域においてrs3794271と連鎖不平衡の状態にあるSNPは、rs3794271と同じ応答予測能力を示すと理解するであろうことを考慮すると、SEQ ID NO: 1によって規定される領域は、抗TNFα（優先的には、インフリキシマブおよびエタネルセプト）を用いた治療に対する応答不良の遺伝子座を構成する。
【００２７】
したがって、本発明は、RAを有する患者における抗TNFα剤を用いた治療に対する応答予測のマーカーとしての、rs3794271と連鎖不平衡の状態にあるSNPの使用も企図する。特定の態様において、抗TNFα剤はインフリキシマブまたはエタネルセプトである。さらに、本発明は、患者から得られたサンプルからの、rs3794271と連鎖不平衡の状態にあるSNPの遺伝子型の決定を含む、抗TNFα剤を用いた治療に対するRAを有する患者の応答を予測するインビトロ方法を企図し、SNP rs3794271の対立遺伝子Gと相関関係にある少なくとも1つの対立遺伝子の存在は、治療に対する不良な応答の指標である。この同じ局面は、患者から得られたサンプルからの、rs3794271と連鎖不平衡の状態にあるSNPの遺伝子型の決定を含む、抗TNFα療法を用いた治療に対するRAを有する患者の応答を予測するインビトロ方法として示され得、SNP rs3794271の対立遺伝子Gと相関しない2つの対立遺伝子の存在は、治療に対する良好な応答の指標である。特定の態様において、選択される抗TNFαはインフリキシマブまたはエタネルセプトである。
【００２８】
「相関する対立遺伝子」によって、本発明者らは、rs3794271における対立遺伝子G（多型形態G）と連鎖不平衡の状態にある対立遺伝子（多型形態）を理解する（r2＞50％）。これは、SNP rs3794271における対立遺伝子Gおよびそれと相関する対立遺伝子が、非常に高い確率で共継承されることを意味する。
【００２９】
優先的には、本発明に従った連鎖不平衡の状態にあるSNPは、SEQ ID NO: 1によって規定される、インフリキシマブまたはエタネルセプトに対する不良な応答の傾向についての遺伝子座に見出される。
【００３０】
本発明の特定の態様において、SNP rs3794271と連鎖不平衡の状態にあるSNPは、表3に規定されるSNPの群より選択される。別の特定の態様において、連鎖不平衡の状態にあるSNPは、rs3794271と高い連鎖不平衡の状態にあるSNPである。「高い連鎖不平衡」の状態にあるSNPによって、本発明者らは、rs3794271に関する連鎖不平衡係数が0.8よりも高いそうしたSNPに言及する（表3を参照されたい）。
【００３１】
本発明は、RAを有する患者における抗TNFα、優先的にはインフリキシマブまたはエタネルセプトを用いた治療に対する応答の予測のためのマーカーとしての、rs3794271と連鎖不平衡の状態にあるSNPの組み合わせ、ならびに本発明に従った、rs3794271と連鎖不平衡の状態にあるSNPの組み合わせにおける遺伝子型の決定を含む、RAを有する患者の治療に対する応答を予測するインビトロ方法も企図する。ある特定の態様において、rs3794271を、rs3794271と連鎖不平衡の状態にある少なくとも1種のSNP、優先的には、SEQ ID NO: 1に規定される、インフリキシマブまたはエタネルセプトに対する不良な応答の傾向についての遺伝子座に位置し、かつ表3に示されているSNPと組み合わせる。他の態様において、組み合わせるSNPは、rs10770707、rs1473993、rs10770704、rs10770702、rs959346、rs3751218、rs11045392、rs11045390、rs74406912、rs954866、およびrs10770701からなる群より選択される。特定の態様において、組み合わせはrs3794271およびrs11045392を含む。
【００３２】
本発明の方法を実行するのに必要なサンプルは、患者の身体から得られた任意の組織または体液、例えば血液、血清、血漿、唾液、尿、または毛髪であり得る。本発明の特定の態様において、サンプルは血液または唾液である。別の特定の態様において、患者から得られたサンプルはDNAのサンプルである。しかしながら、本発明の方法は、患者からのサンプル回収工程を含むわけではない。
【００３３】
特定の態様において、患者は、コーカサス人集団、アジア人集団、および中米人集団からなる群より選択される集団である。
【００３４】
技法の最先端技術は、特定の領域における遺伝子型を決定する種々の方法を提供する。例えば、特定の態様において、遺伝子型の決定は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の使用による、SNPが位置する核酸鎖領域の増幅を含む。最先端技術は、公知の核酸鎖内の任意の所望の領域を増幅するようにプライマーを設計する方法を含む。プライマー設計は、当技術分野における熟練者にとって利用可能であるバイオインフォマティクスプログラムを用いて自動的に行われ得る。
【００３５】
特定の態様において、遺伝子型の決定は、回収されたサンプルの核酸鎖のすべてまたは一部のシーケンシングを含む。別の態様において、遺伝子型の決定は、サンプルの核酸鎖と特異的プローブとのハイブリダイゼーションを含む。優先的には、ハイブリダイゼーションは、高い特異性の条件で実施される。
【００３６】
別の態様において、遺伝子型の決定は、制限酵素断片長多型（RFLP）、多型DNAのランダム増幅（RAPD）、増幅断片長多型（AFLPD）からなる群より選択される1種または複数種のDNA解析技法を用いて実施され、そのすべては、当技術分野における熟練者に周知であるジェノタイピング技法である。
【００３７】
遺伝子型の決定は、上述の技法のうちのいくつかを必要とし得る。例えば、遺伝子型の決定は、増幅およびハイブリダイゼーションを用いて、または増幅およびシーケンシングを用いて、または増幅およびRAPDを用いて実施され得る。当技術分野における熟練者は、遺伝子型を決定するためにどれが最も適当な技法であるかを、それぞれの場合において判断する。
【００３８】
別の局面において、本発明は、抗TNFα剤、優先的にはインフリキシマブまたはエタネルセプトの中より選択される抗TNFα剤を用いた治療に対するRAを有する患者の応答を予測するための、以前に記載されているインビトロ方法における、SNP rs3794271、および/またはrs3794271と連鎖不平衡の状態にある少なくとも1種のSNPについての遺伝子型を決定する方法の使用に言及する。特定の態様において、手段は、SNP rs3794271に対して、またはrs3794271と連鎖不平衡の状態にあるSNPに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブである。別の特定の態様において、手段は、SEQ ID NO: 1の増幅に対して、またはSEQ ID NO: 1内に含まれる任意の領域に対して特異的なプライマーである。別の特定の態様において、手段は、RAPDを用いて遺伝子型の決定を実施するための特異的プライマーである。
【００３９】
本発明のさらなる局面は、SNP rs3794271、および/またはrs3794271と連鎖不平衡の状態にある少なくとも1種のSNPについての遺伝子型を決定する手段、ならびに該決定を行うための指示および結果の解釈のための指示を含む、RAを有する患者における抗TNFα剤を用いた治療に対する応答を予測するためのキットに言及し、結果の解釈のためのこれらの指示は、SNP rs3794271に関して少なくとも1つの対立遺伝子Gの存在、および/または連鎖不平衡の状態にあるSNPに関してrs3794271の対立遺伝子Gと相関する少なくとも1つの対立遺伝子の存在が、治療に対する不良な応答の指標であることを示している。あるいは、または以前のものと合わせて、結果の解釈のための該指示は、SNP rs3794271に関してG以外の2つの対立遺伝子の存在、および/または連鎖不平衡の状態にあるSNPにおけるrs3794271の対立遺伝子Gと相関しない2つの対立遺伝子の存在が、治療に対する良好な応答の指標であることを示している。本発明の本局面の特定の態様において、キットは、インフリキシマブまたはエタネルセプトの中より選択される抗TNFαに対する応答を予測する。
【００４０】
特定の態様において、キットは、SNP rs3794271の遺伝子型を決定するための手段、ならびに該決定を実施するための指示および結果の解釈のための指示を含み、結果の解釈のためのこれらの指示は、SNP rs3794271における2つの対立遺伝子Gの存在が、治療に対する不良な応答の指標であることを示している。
【００４１】
本説明および特許請求の範囲を通して、「含む」という単語およびその変化形は、他の技術的な特徴、付加物、構成要素、または工程を除外しようとはしない。また、「含む」という単語には、「からなる」という場合が含まれる。当技術分野における熟練者にとって、本発明の他の目的、利点、および特徴は、説明から部分的に、および本発明の実践から部分的に導き出されるであろう。以下の実施例は例証として提供されるものであり、本発明を限定することを意図するわけではない。また、本発明は、本明細書において示される特定のかつ好ましい態様のすべての考え得る組み合わせを網羅する。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００４２】
患者
本調査には、合計315人のRA患者が含まれた。すべての患者は、免疫介在性炎症疾患コンソーシアム（Immune-Mediated Inflammatory Disease Consortium）（IMIDC）の一環として集められた。RA患者は、12箇所のスペインの大学病院からのリウマチ学科の外来診療所から集められた。選択基準は以下のとおりであった：a）RAに関する1987年のアメリカリウマチ学会（American College of Rheumatology）分類基準を満たす、b）＞18歳、c）スペインで生まれたコーカサス系ヨーロッパ人、d）最初の生物学的治療として抗TNFα療法（インフリキシマブ、エタネルセプト、またはアダリムマブ）を受けている、およびg）≧3.2のベースラインDAS28スコア。
【００４３】
インフォームドコンセントはすべての参加者から得られ、かつプロトコールは地域施設内審査委員会によって審査されかつ承認された。本調査は、ヘルシンキ宣言の原則に従って行われた。
【００４４】
治療応答の定義
抗TNFα治療に対する応答を、絶対的および相対的なDAS28変化、ならびにEULAR応答を用いて測定した。終点DAS28を、治療の12週目に測定した。絶対的DAS28変化（ΔDAS28）は、ベースラインおよび終点のスコア間でのDAS28変化（DAS28ベースライン−DAS2812週目）として定義され；EULARは、抗TNFαに対する応答を3つのカテゴリー：良好な応答者、中程度の応答者、および無応答者に分ける。
【００４５】
DNA抽出、SNP選択、およびジェノタイピング
Chemagic Magnetic Separation Module I（PerkinElmer）を用いて、ゲノムDNAを静脈血サンプルから単離した。合計4種のSNPをジェノタイピングのために選択した：i）核内受容体サブファミリー2、グループF、メンバー2（NR2F2）遺伝子（染色体15q26.2）の5'末端から約727kbにおけるrs10520789、ii）「マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ」6（MAP2K6）遺伝子（染色体17q24.3）の3'末端から約264kbにおけるrs11870477、iii）「セレベリン（cerebellin）2前駆体」（CBLN2）遺伝子（染色体18q22.3）の3'末端から約955kbにおけるrs1539909、iv）「溶質キャリア有機アニオン輸送体ファミリー、メンバー1C1」（SLCO1C1）遺伝子（染色体12p12.2）の第4イントロンにおけるrs3794271。
【００４６】
TaqMan genotypingプラットフォーム（Life Technologies）を用いて、SNPジェノタイピングを実施した。選択されたTaqmanアッセイは、C__30397748_20（rs10520789、NR2F2）、C__32133788_10（rs11870477、MAP2K6）、C___7536165_10（rs1539909、CBLN2）、およびC__27502188_10（rs3794271、SLCO1C1）であった。サーマルサイクル条件は以下のとおりであった：50℃2分間および95℃10分間、その後に40サイクルの92℃15秒間および60℃1分間が続いた。ABI PRISM 7900 HT sequence detection system（Life Technologies）を用いて、すべてのPCRおよび終点の蛍光読み取りを実施した。サンプルの10％を二つ組でジェノタイピングすることによって、ジェノタイピング誤差を概算した。
【００４７】
統計解析
多変量線形回帰を用いて、ベースラインDAS28を共変量として用い、疾患活動性スコア（ΔDAS28）の絶対的変化との関連性を試験した。対立遺伝子Χ2試験を用いて、欧州リウマチ学会（European League Against Rheumatism）（EULAR）応答との関連性について試験した。有意性レベルについてのボンフェローニ（Bonferroni）調整を実施して、多重試験を説明した（α＝0.0124）。R統計ソフトウェア（http://cran.r-project.org/）を用いて、すべての関連性解析を実施した。Quanto（v 1.2.4、http://hydra.usc.edu/gxe/）およびオンラインのGenetic Power Calculator（http://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/gpc/）を用いて、検出力算出を実施した。すべてのSNPを、ハーディ・ワインベルク（Hardy-Weinberg）平衡からの逸脱について試験した。
【００４８】
EULAR応答との観察された遺伝的関連性についての潜在的交絡因子の影響を検討するために、ロジスティック回帰モデルを適合させた。評価された変数は、診断時の年齢、抗TNFα治療時の年齢、疾患継続期間、ベースラインDAS28、喫煙習慣、性別、びらんの数、リウマチ因子（RF）の存在、および抗環状シトルリン化ペプチド抗体（抗CCP）の存在であった。Plantら（上記）に記載されているように、SNP遺伝子型と抗TNFα療法タイプとの間の相互作用項を含むロジスティック回帰モデルを適合させることによって、薬物タイプ特異的な影響の存在も評価した。
【００４９】
結果
315人のRA患者のコホートを用いて、抗TNFα応答について4種の候補遺伝子座を試験した。コール率は＞99％であり、ジェノタイピング誤差は0％であった。4種すべてのSNPは、ハーディ・ワインベルク平衡の状態にあった（P＞0.5）。本発明者らの患者コホートの臨床的特性は、表1に示されている。
【００５０】
（表１）患者の臨床的特徴
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a 現在の喫煙者。
b 12週目に判定された。
【００５１】
EULARの良好な応答対無応答において、SNP rs3794271と治療応答との間に統計的に高度に有意な関連性が見出された（P＝1.74E-5、OR（95％ CI）＝2.63（1.68〜4.12））。さらに、抗TNFα応答者のEULAR中程度群を良好な応答者群に加えると、関連性はさらに高度に有意であった（P＝2.69E-4、オッズ比（OR、95％ CI）＝1.98（1.37〜2.89））。試験された他のマーカーのいずれも、公称レベル（P＜0.05）でさえも有意な関連性を示さなかった。3つすべてのEULARカテゴリーについてのrs3794271遺伝子型頻度、および平均ΔDAS28値は、表2に示されている。
【００５２】
（表２）3つのEULARカテゴリーについてのrs3794271の遺伝子型頻度および平均ΔDAS28値
2016525876.tif 000003
【００５３】
結果は、SNP rs3794271が、抗TNFα療法に対する応答の予測と関連していることを実証している。（良好な応答者と比較して）EULAR基準に従った不良な応答者であるそうした患者を予測し得る該SNPの能力、および（彼らを良好および中程度と区別する、）EULAR基準に従った不良な応答者であるそうした患者を予測し得る該SNPの能力も非常に高い。
【００５４】
二次解析において、潜在的交絡因子を制御した後に、観察された遺伝的関連性についてそれを評価した。潜在的交絡因子として解析された任意の臨床的変数に関して、該SNP回帰係数の変化および統計的有意性は無視できる程度であった。この結果は、該SNPと抗TNF応答との間の関係が安定しておりかつ任意の臨床的変数から独立していることを裏付けている。また、ロジスティック回帰モデルにさらなる相互作用項を加えることによって、臨床的共変量のそれぞれとの相互作用の存在を試験したが、どれ一つとして有意であるとは見出されなかった。この結果は、該SNP関連性が、他の任意の臨床的変数とは相互作用しないことを裏付けている。しかしながら、薬物タイプ特異的な影響について試験すると、アダリムマブの存在と抗TNFα応答との間に有意な相互作用が見出された（P＝0.045）。ブレスロー・デイ（Breslow-Day）法を用いて、他の2種の治療（インフリキシマブおよびエタネルセプト）に対するアダリムマブで治療した患者の間の関連性の相違について試験すると、不均一性の示唆的証拠が見出された（P＝0.078）。各治療を別個に試験すると、SNP rs3794271とアダリムマブ治療患者における応答との有意な関連性は見出されなかったが（P＝0.37）、一方でインフリキシマブ（P＝0.0046）およびエタネルセプト（P＝0.00028）に対する関連性の実質的証拠が存在した。これらの結果は、抗TNFα療法に対する応答を予測し得るSNP rs3794271の能力は、それが抗TNFα薬物のインフリキシマブおよびエタネルセプトに言及する場合により正確であることを表している。
【００５５】
加えて、メタ解析を実施して、本調査からの、SNP rs3794271と抗TNFα療法に対する応答との間の関連性の証拠を、Krintelら（上記）によって実施された以前のGWASからのものと組み合わせた。「rmeta」Rパッケージで実行される固定効果モデルを用いて、要約オッズ比（OR）を概算した。組み合わせたP値を算出するためのMETALソフトウェアツール（http://www.sph.umich.edu/csg/abecasis/metal/index.html）を用いた。この手法において、有意な値は、各調査のサンプルサイズに従って重み付けされている。マイナー対立遺伝子に従っておよびEULAR「無応答者」であるリスクに従って、ORを算出した。So HCらによって提案された手法（「Evaluating the heritability explained by known susceptibility variants: a survey of ten complex diseases」, Genet Epidemiol, 2011, vol. 35, pp. 310-7）を用いて、SNP rs3794271によって説明される易罹患性の分散を反復サンプルにおいて概算した。GWASおよび本関連調査からの統計的証拠を組み合わせると、PDE3A-SLO1C1 SNP rs3794271と抗TNFα治療応答とのゲノム規模での有意な関連性が見出された（P＝3.34E-10）。この遺伝的関連性に対する概算された要約効果量は、OR（95％ CI）＝2.91（2.57〜3.25）であった。
【００５６】
本発明者らは、マイナー対立遺伝子（G）の1つまたは2つのコピーに関する効果量を比較することによって、対立遺伝子用量効果を評価した。ヘテロ接合性遺伝子型に対する効果量は、OR（95％ CI）＝3.0（1.6〜5.9）であった。ホモ接合体に対する効果量は、OR（95％ CI）＝8.1（3.3〜19.7）とさらにより大きかった。これらの結果は、SNP rs3794271位置におけるGヘテロ接合性個体について抗TNFα治療に対する不良な応答の間の関連性が非常に高いこと、およびこの関連性がGGホモ接合性個体についてより大きいことを表している。
【００５７】
rs3794271を有するゲノム領域の調査も実施した。本調査により、PDE3A遺伝子の転写配列の第13エクソンおよびSLCO1C1遺伝子の転写配列の第6エクソンにおいて、ゲノムの残りの部分から明確に区別される連鎖不平衡ブロックの境界を定める、高い組換えレベルの2つのピーク（「ホットスポット」領域）の存在が明らかとなった。SEQ ID NO: 1によって規定されるこのブロックには、rs3794271と高い連鎖不平衡の状態にあるSNPが集中している。これらの結果は、SEQ ID NO: 1によって規定される連鎖不平衡ブロックが、抗TNFα治療に対する応答の傾向を与える遺伝子座を構成することを表している。傾向を与えるこの遺伝子座に含まれる、PDE3A遺伝子断片に相当する配列は、SEQ ID NO: 1の位置1から位置33,662に及ぶ。傾向を与えるこの遺伝子座に含まれる、SLCO1C1遺伝子断片に相当する配列は、配列番号1の位置44,910から位置61,065に及ぶ。SEQ ID NO: 1は、PDE3AとSLCO1C1との間（位置33,663〜位置44,909）に遺伝子間配列も含有する。SNP rs3794271は、SEQ ID NO: 1における位置56,714に位置する。
【００５８】
表3は、治療に対する不良な応答の傾向を与える配列（SEQ ID NO: 1）からの、rs3794271と連鎖不平衡の状態にあるそうしたSNP、ならびにマイナー対立遺伝子（A1）、メジャー対立遺伝子（A2）、およびそれらのそれぞれについて変種Gと相関する対立遺伝子（リスク対立遺伝子）を含む。リスク対立遺伝子とは、SNP rs3794271の対立遺伝子Gと連鎖不平衡の状態にある各SNPの位置における多型形態である。したがって、リスク対立遺伝子は、治療応答の傾向に関して同じ情報をもたらす。
【００５９】
（表３）インフリキシマブまたはエタネルセプト治療に対する不良な応答の傾向についての遺伝子座における、SNP rs3794271と連鎖不平衡の状態にあるSNP
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1 LD＝連鎖不平衡係数
2 2個以上のヌクレオチドは、SNPが挿入/欠失であることを意味する
3 コーカサス人集団において算出された
【００６０】
要約すると、PDE3AおよびSLCO1C1遺伝子によって規定される遺伝子座、ならびにそれらの遺伝子間領域、特にSEQ ID NO: 1によって規定される領域と、RAを有する患者における抗TNFα治療に対する応答との間の関連性に対して、有力な証拠が見出された。得られた結果に基づくと、この関連性は、インフリキシマブまたはエタネルセプト薬物に対して、ならびにSNP rs3794271位置におけるGGホモ接合性患者に対して特に有意である。
【００６１】
SLCO1C1は、OATP1有機アニオン輸送ポリペプチドファミリーに属する細胞膜タンパク質である。このグループのタンパク質は広い基質特異性を有し、かつメトトレキサートを含めた薬物の吸収、分布、および排泄において重要な役割を担うことが示されている。現在までのところ、SLCO1C1によってコードされるタンパク質は、甲状腺ホルモンおよびエストラジオールの輸送に主に関連付けされている。しかしながら、この遺伝子が4つの異なる転写産物変種をコードするという事実は、より多くの機能性が同定されるであろうという見込みを増加させる。
【００６２】
PDE3Aは、cAMPおよびcGMPのような重要なセカンドメッセンジャーを加水分解するホスホジエステラーゼ（PDE）をコードする。環状ヌクレオチドPDEは重要な免疫調節機能を示しており、かつそれらは、それ自体が、RAを含めた自己免疫疾患の管理のための重要な標的として見なされている。例えば、PDE阻害は、リポ多糖により刺激された単球においてTNF産生を低下させることを示している。
【配列表】
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【国際調査報告】
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