(57)【要約】  本発明は、融合コンストラクト、融合コンストラクトの使用方法及び腫瘍、癌、新生物、及び悪性腫瘍等の有害なもしくは異常な細胞増殖性又は細胞過増殖性疾患を治療する方法に関する。
2016506373.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）レセプタに結合するＦＳＨ断片と溶解ドメインとからなる融合コンストラクトであって、前記ＦＳＨ断片は前記溶解ドメインに結合され、前記溶解ドメインはＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ，及びＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡから選択されるペプチド配列、又はＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ，及びＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡから選択されるペプチド配列を備え、前記ペプチド配列は一又は複数のＫ残基がＦ又はＬ残基のいずれかで置換され、一又は複数のＦ残基がＫ、Ａ、又はＬ残基のいずれかで置換され、一又は複数のＡ残基がＫ、Ｆ、又はＬ残基のいずれかで置換される、融合コンストラクト。
【請求項２】
前記ＦＳＨ断片がＦＳＨβ鎖の断片である、請求項１に記載の融合コンストラクト。
【請求項３】
前記ＦＳＨ断片が哺乳類のＦＳＨ配列の断片である、請求項１に記載の融合コンストラクト。
【請求項４】
前記ＦＳＨ断片がヒトのＦＳＨ配列の断片である、請求項１に記載の融合コンストラクト。
【請求項５】
前記ＦＳＨ断片が
Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ
で記述されるヒトのＦＳＨβ鎖配列の断片である、請求項１に記載の融合コンストラクト。
【請求項６】
前記ＦＳＨ断片は、ＦＳＨβ鎖アミノ酸残基３３−５３、ＦＳＨベータ鎖アミノ酸残基８１−９５、ＦＳＨベータ鎖アミノ酸残基８１−８９、ＦＳＨベータ鎖アミノ酸残基９０−９５、又はＦＳＨベータ鎖アミノ酸残基３３−５３、ＦＳＨベータ鎖アミノ酸残基８１−９５、ＦＳＨベータ鎖アミノ酸残基８１−８９、又はＦＳＨベータ鎖アミノ酸残基９０−９５を含むか又はこれのみから構成され、少なくとも１つのシステイン（Ｃ）残基がアラニン（Ａ）残基で置換される、請求項１に記載の融合コンストラクト。
【請求項７】
前記ＦＳＨ断片はＣＹＴＲＤＬＶＹＫＤＰＡＲＰＫＩＱＫＴＣＴ；  ＱＡＨＡＧＫＡＤＳＤＳＴＤＡＴ；  ＱＣＨＣＧＫＣＤＳＤＳＴＤＣＴ；  ＱＡＨＡＧＫＡＤＳ；  ＱＣＨＣＧＫＣＤＳ，  もしくはＤＳＴＤＣＴ、又は少なくとも１つのＣ残基がＡ残基で置換された前述の配列のいずれかを含むか又はこれのみからなる、請求項１に記載の融合コンストラクト。
【請求項８】
前記ＦＳＨ断片は、ＦＳＨβ鎖の約１から１０、１０から２０、１５から２０、２０から３０、３０から４０、４０から５０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から１００又はそれ以上の数のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むか又は当該アミノ酸配列のみからなる、請求項１に記載の融合コンストラクト。
【請求項９】
前記ＦＳＨ断片が線形又は循環構造を有する、請求項１に記載の融合コンストラクト。
【請求項１０】
前記ＦＳＨレセプタが細胞上に発現される、請求項１に記載の融合コンストラクト。
【請求項１１】
前記細胞は過剰増殖細胞である、請求項１０の融合コンストラクト。
【請求項１２】
前記細胞は乳腺細胞、卵巣細胞、子宮細胞、子宮頚部細胞、前立腺細胞、精巣細胞、副腎細胞、下垂体細胞、又は子宮内膜細胞である、請求項１０に記載の融合コンストラクト。
【請求項１３】
前記溶解ドメイン又はＦＳＨ断片はＬアミノ酸、Ｄアミノ酸、又はＬアミノ酸とＤアミノ酸の混合物を含むか又はこれのみからなる、請求項１に記載の融合コンストラクト。
【請求項１４】
前記溶解ドメインは、約１から１０、１０から２０、１５から２０、２０から３０、３０から４０、４０から５０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から１００又はそれ以上の数のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むか又は当該アミノ酸配列のみからなる、請求項１に記載の融合コンストラクト。
【請求項１５】
前記溶解ドメインは、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むか又は当該アミノ酸配列のみからなる、請求項１に記載の融合コンストラクト。
【請求項１６】
前記溶解ドメインは前記ＦＳＨ断片に対してＮＨ2末端に配置される、請求項１に記載の融合コンストラクト。
【請求項１７】
前記ＦＳＨ断片は前記溶解ドメインに対してＮＨ2末端に配置される、請求項１に記載の融合コンストラクト。
【請求項１８】
前記溶解ドメイン又は前記ＦＳＨ断片は一又は複数のＤアミノ酸を有する、請求項１に記載の融合コンストラクト。
【請求項１９】
前記溶解ドメインはＫ、Ｆ、又はＡ残基のいずれかにおいてＤアミノ酸を有する、請求項１に記載の融合コンストラクト。
【請求項２０】
前記溶解ドメインは両親媒性のアルファへリックスを形成する、請求項１の融合コンストラクト。
【請求項２１】
前記溶解ドメインが連続した又は途中で途切れたＰＮＮＰＮＮＰ反復モチーフを形成し、ここでＰは正の電荷を帯びたアミノ酸であり、Ｎは中性のアミノ酸である、請求項１に記載の融合コンストラクト。
【請求項２２】
第２、第３、第４、第５、第６、又は第７の溶解ドメインをさらに含む、請求項１に記載の融合コンストラクト。
【請求項２３】
前記ＦＳＨ断片及び前記溶解ドメインが共有結合で接合される、請求項１に記載の融合コンストラクト。
【請求項２４】
前記ＦＳＨ断片及び前記溶解ドメインがペプチドリンカによって接合される、請求項１に記載の融合コンストラクト。
【請求項２５】
前記ＦＳＨ断片及び前記溶解ドメインが１から２５個のアミノ酸残基を有するペプチドリンカ配列によって接合される、請求項１に記載の融合コンストラクト。
【請求項２６】
前記ＦＳＨ断片及び前記溶解ドメインが一又は複数のＡ、Ｓ、又はＧアミノ酸残基からなるペプチドリンカ配列によって接合される、請求項１に記載の融合コンストラクト。
【請求項２７】
前記ＦＳＨ断片及び前記溶解ドメインが、ＧＳＧＧＳ又はＡＳＡＡＳを含むか又はこれのみからなるペプチド配列によって接合される、請求項１に記載の融合コンストラクト。
【請求項２８】
前記ＦＳＨ断片及び前記溶解ドメインが非ペプチドリンカによって接合される、請求項１に記載の融合コンストラクト。
【請求項２９】
前記ＦＳＨ断片及び前記溶解ドメインが線形炭素鎖によって接合される、請求項１に記載の融合コンストラクト。
【請求項３０】
前記融合コンストラクトは単離又は精製される、請求項１の融合コンストラクト。
【請求項３１】
前記融合コンストラクトは混合物を含む、請求項１の融合コンストラクト。
【請求項３２】
請求項１に記載の融合コンストラクトを含む組成物。
【請求項３３】
請求項１に記載の融合コンストラクトを含む調剤組成物。
【請求項３４】
有害な細胞増殖又は細胞増殖疾患を有する被験者を治療するために効果のある量の請求項１に記載の融合コンストラクトを含む単位投与量。
【請求項３５】
新生物、腫瘍、又は癌を有する被験者を治療するために効果のある量の請求項１に記載の融合コンストラクトを含む単位投与量。
【請求項３６】
被験者の生殖能力を低減するために効果のある量の請求項１に記載の融合コンストラクトを含む単位投与量。
【請求項３７】
請求項１に記載の融合コンストラクトと、
細胞の増殖を低減又は阻害するため、過剰増殖細胞の増殖を低減又は阻害するため、新生物、腫瘍、又は癌細胞の増殖を低減又は阻害するため、過剰増殖疾患を有する被験者を治療するため、新生物、腫瘍、又は癌を有する被験者を治療するため、又は動物の生殖能力を低減するための指示と、
を含むキット。
【請求項３８】
請求項１に記載の融合コンストラクトと抗細胞増殖又は免疫刺激薬剤とを含む組成物。
【請求項３９】
請求項１に記載の融合コンストラクトをコードする核酸分子。
【請求項４０】
請求項３９に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項４１】
請求項４０に記載のベクターを用いて形質転換した宿主細胞。
【請求項４２】
請求項１に記載の融合コンストラクトを発現する細胞。
【請求項４３】
ＦＳＨレセプタを発現する細胞の増殖を低減又は阻害する方法であって、前記細胞の増殖を低減又は阻害するのに十分な量の請求項１に記載の融合コンストラクトに、前記細胞を接触させる工程を含む方法。
【請求項４４】
ＦＳＨレセプタを発現する過剰増殖細胞の増殖を低減又は阻害する方法であって、前記過剰増殖細胞の増殖を低減又は阻害するのに十分な量の請求項１に記載の融合コンストラクトに、前記細胞を接触させる工程を含む方法。
【請求項４５】
新生物、腫瘍、癌、又は悪性細胞の増殖を低減又は阻害する方法であって、当該新生物、腫瘍、癌、又は悪性細胞の増殖を低減又は阻害するのに十分な量の請求項１に記載の前記融合コンストラクトに、前記細胞を接触させる工程を含む方法。
【請求項４６】
前記新生物、腫瘍、癌、又は悪性細胞がＦＳＨレセプタを発現し、又は前記新生物、腫瘍、癌、又は悪性細胞の血管系がＦＳＨレセプタを発現する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
細胞増殖疾患を有する被験者を治療する方法であって、当該細胞増殖疾患を治療するのに十分な量の請求項１に記載の融合コンストラクトを、前記被験者に投与する工程を含む方法。
【請求項４８】
前記細胞増殖疾患はＦＳＨレセプタを発現する細胞を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞増殖疾患は新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍又はそれらの新血管系を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍の他の部位への転移、又は原発新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍より遠位の他の部位における転移性新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍の形成又は定着を低減又は阻害する方法であって、
前記新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍の他の部位への転移、又は前記原発新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍より遠位の他の部位における転移性新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍の形成又は定着を低減又は阻害するのに十分な量の請求項１に記載の融合コンストラクトを被験者に投与する工程を含む、方法。
【請求項５１】
前記新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍がＦＳＨレセプタを発現する細胞を含み、又は前記新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍の血管系がＦＳＨレセプタを発現する細胞を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍が転移性、非転移性、又は良性である、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍が固形の細胞の塊を含む、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍が造血細胞を含む、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍が、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、腺腫、腺癌、黒色腫、神経膠腫、神経膠芽腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、希突起膠細胞腫、中皮腫、網内系、リンパ性、又は造血性の新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍を含む、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記肉腫がリンパ肉腫、脂肪肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、又は繊維肉腫を含む、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５７】
前記造血性の新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍が骨髄腫、リンパ腫、又は白血病を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍が肺、甲状腺、頭頸部、鼻咽頭、咽喉、鼻腔、脳、脊椎、乳房、副腎、下垂体、甲状腺、リンパ、胃腸（口、食道、胃、十二指腸、回腸、空腸（小腸）、結腸、直腸）、尿生殖路（子宮、卵巣、子宮頸、子宮内膜、膀胱、精巣、陰茎、前立腺）、腎臓、膵臓、肝臓、骨、骨髄、リンパ、血液、筋肉、又は皮膚の新生物、腫瘍、又は癌を含む、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５９】
前記肺の新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍が小細胞肺癌、又は非小細胞肺癌を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍が幹細胞の新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍を含む、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項６１】
前記新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍の再発又は進行を阻害又は低減する、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項６２】
抗細胞増殖、抗新生物、抗腫瘍、抗癌、又は免疫増強治療及び療法を実施する工程をさらに含む、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項６３】
前記治療又は療法は外科的切除、放射線療法、電離又は化学放射線療法、化学療法、免疫療法、局所的又は部位的熱療法（温熱療法）、又はワクチン接種を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記治療又は療法はアルキル化剤、抗代謝産物、植物抽出物、植物アルカロイド、ニトロソ尿素、ホルモン、ヌクレオシド又はヌクレオチド類似体の投与を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記治療又は療法はシクロホスファミド、アザチオプリン、サイクロスポリンＡ、プレドニソロン、メルファラン、クロランブシル、メクロレタミン、ブスルファン、メトトレキセート、６―メルカプトプリン、チオグアニン、５―フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、ＡＺＴ、５―アザシチジン（５―ＡＺＣ）、および５―アザシチジン関連化合物、ブレオマイシン、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾトシン、ヒドロキシウレア、シスプラチン、ミトタン、プロカルバジン、ダカルバジン、タキサン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、又はジブロモマンニトールの投与を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記治療又は療法はリンパ球、形質細胞、マクロファージ、樹枝状細胞、ナチュラルキラー細胞、又はＢ細胞の投与を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
前記治療又は療法は抗体、ホルモン、細胞成長因子、細胞生存因子、細胞分化因子、サイトカイン、又はケモカインの投与を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
前記治療又は療法は、特に本発明に係る融合コンストラクトと組み合わせて用いられるＩＬ−２、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＴＮＦβ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−１、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、エオタキシン、エオタキシン−２、Ｉ−３０９／ＴＣＡ３、ＡＴＡＣ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−２、ＨＣＣ−３、ＬＡＲＣ／ＭＩＰ−３α、ＰＡＲＣ、ＴＡＲＣ、ＣＫβ、ＣＫβ６、ＣＫβ７、ＣＫβ８、ＣＫβ９、ＣＫβ１１、ＣＫβ１２、Ｃ１０、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＥＮＡ−７８、ＧＣＰ−２、ＰＢＰ／ＣＴＡＰＩＩＩβ−ＴＧ／ＮＡＰ−２、Ｍｉｇ、ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１、リンフォタクチン（ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ）、リツキシマブ（リツキサン（登録商標））、トラスツズマブ（ハーセプチン）、ベバシズマブ（アバスチン）、ラニビズマブ（ルセンティス）、セツキシマブ（アービタックス）、アレムツズマブ（キャンパス）、パニツムマブ（ベクチビックス）、ペルツズマブ（パージェタ）、イブリツモマブ・チウキセタン（ゼヴァリン）、イピリムマブ（エルボイ）、トシツモマブ（ベクザー）等の投与が含まれる、請求項６２に記載の方法。前記融合コンストラクトとともに用いられる他の標的薬には、イマチニブ（グリベック）、ゲフィチニブ（イレッサ）、ボルテゾミブ（ベルケイド）、ラパチニブ（タイケルブ）、スニチニブ（スーテント）、ソラフェニブ（ネクサバール）、ニロチニブ（タシグナ）、ザルツムマブ、ダロツズマブ、フィジツムマブ、ラムシルマブ、ガリキシマブ、ファルレツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ（アーゼラ）、トシツムマブ、２Ｆ２（ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０），  ７Ｄ８，  ＩｇＭ２Ｃ６，  ＩｇＧ１  ２Ｃ６，  １１Ｂ８，  Ｂ１，  ２Ｈ７，  ＬＴ２０，  １Ｆ５，  又はＡＴ８０ダクリズマブ（ゼナパックス）、又は抗ＬＨＲＨレセプタ抗体等がある、請求項６２に記載の方法。
【請求項６９】
前記融合コンストラクトは、抗細胞増殖、抗新生物、抗腫瘍、抗癌、又は免疫増強治療又は療法の実施の前、それと実質的に同時、又はその後に投与される、請求項６２に記載の方法。
【請求項７０】
前記被験者は外科的切除、化学療法、免疫療法、電離又は化学放射線療法、局所的又は部位的な熱療法（温熱療法）、又はワクチン接種を受けた、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項７１】
前記被験者は外科的切除、化学療法、免疫療法、電離又は化学放射線療法、局所的又は部位的な熱療法（温熱療法）、又はワクチン接種の候補者である、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項７２】
前記被験者は外科的切除、化学療法、免疫療法、電離又は化学放射線療法、局所的又は部位的な熱療法（温熱療法）、又はワクチン接種の候補者でない、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項７３】
前記治療が、前記新生物、腫瘍、癌、又は悪性細胞の質量、体積、大きさ、又は細胞数の部分的又は完全な破壊を生じ、新生物、腫瘍、癌、又は悪性細胞の壊死、溶解、又はアポトーシスを刺激、誘発、又は増加させ、新生物、腫瘍、癌、又は悪性細胞の体積、大きさ、細胞質量を低減し、新生物、腫瘍、癌、又は悪性細胞の進行又はそれらの体積、質量、大きさ、又は細胞数の増加を阻害又は防止し、又は寿命を延長する、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項７４】
前記治療が、前記新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍に関連する又は起因する有害な症状又は合併症の重症度、持続期間、又は頻度を低減又は縮小する、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項７５】
前記治療により痛み、不快感、吐き気、脱力感、又は無気力が低減又は軽減する、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項７６】
前記治療によりエネルギー、食欲、改善された運動性、又は心理的健康が向上する、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項７７】
動物の生殖能力を低減する方法であって、生殖能力を低減するのに十分な量の請求項１に記載の融合コンストラクトを前記動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項７８】
前記被験者又は動物は哺乳動物である、請求項４９、５０、又は７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記被験者又は動物はヒトである、請求項４９、５０、又は７７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許出願第６１／７２６，９３５号（出願日：２０１２年１１月１５日）に基づく優先権を主張するものであり、この米国特許出願の開示は、参照により全体として本明細書に明示的に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、融合コンストラクト、融合コンストラクトの使用方法及び非転移性及び転移性の新生物、癌、腫瘍及び悪性腫瘍等の有害なもしくは異常な細胞増殖性又は細胞過増殖性疾患を治療する方法に関する。
【０００３】
遠位転移性疾患がある場合の肺癌、結腸直腸癌、乳腺癌及び前立腺癌の患者の５年生存率はわずか１０〜４０％に過ぎない。遠位転移性疾患がある場合の肺癌、結腸直腸癌、乳腺癌及び前立腺癌の患者の５年生存率はわずか１０〜４０％に過ぎない。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、結合部に融合され又は結合された溶解ドメインに少なくとも部分的に基づく。この溶解ドメインは、本明細書において、融合コンストラクト又は結合体と称される。細胞が溶解ドメインに接触すると、細胞膜の破壊を引き起こし、細胞死に至ると考えられている。結合部は、溶解ドメインが破壊する細胞を標的とする。この標的となる細胞には、非転移性及び転移性の新生物、癌、腫瘍及び悪性腫瘍等の有害な又は異常な増殖細胞又は過剰増殖細胞（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）が含まれる。多くの非転移性及び転移性の新生物細胞、癌細胞、腫瘍細胞及び悪性腫瘍細胞は、レセプタやリガンドを過剰に発現する。例えば、多くの非転移性及び転移性の新生物、癌、腫瘍及び悪性腫瘍は、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン／絨毛性ゴナドトロピン（ＬＨ／ＣＧ）や黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）等のホルモン、成長因子、サイトカイン、抗体等と結合するレセプタを発現する。これらは、融合コンストラクトの結合部として用いられる。
【０００５】
融合コンストラクトは、結合部の結合部位を発現させるあらゆる細胞や細胞集団を標的とすることができる。リガンド、抗体及びこれらの断片、成長因子、サイトカイン等の結合部は、溶解ドメインと結び付けられ、レセプタ、抗原、抗体、リガンド等を発現したり含んだりする細胞を標的として破壊し、これにより細胞の増殖や成長を減少させ阻害する。
【０００６】
融合コンストラクトは、標的細胞を破壊するために、細胞が分裂することを必要としない。また、融合コンストラクトは、サイズの面で相対的に小さくなるように生成されるので、免疫原性でないことが多い。さらに、融合コンストラクトは、多剤耐性細胞を破壊する。
【０００７】
本発明によれば、第１及び第２のドメインを含む融合コンストラクトが提供される。一実施形態において、融合コンストラクトは、例えばＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ、及び、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫから選択されるペプチド配列を含み１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８のＬ−又はＤ−アミノ酸配列残基からなる第１のドメインと、標的部もしくは結合部を含み又は当該標的部もしくは当該結合部からなる第２のドメインと、を含み、又は、当該第１のドメインと当該第２のドメインとからなる。他の実施形態における融合コンストラクトは、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ、及び、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫから選択されるＬ−又はＤ−アミノ酸配列からなる第１のドメインと、標的部もしくは結合部を含み又は当該標的部もしくは当該結合部からなる第２のドメインと、を含み、又は、当該第１のドメインと当該第２のドメインとからなる。さらに他の実施形態において、融合コンストラクトは、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ、及び、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫから選択されるＬ−又はＤ−アミノ酸配列からなる第１のドメインと、１−２５のＬ−又はＤ−アミノ酸配列（例えば、標的部もしくは結合部）からなり第１のドメインと異なる第２のドメインと、を含み、又は、当該第１のドメインと当該第２のドメインとからなる。
【０００８】
本発明によれば、第１のドメインを含み、又は、第１のドメインからなる単離され又は精製されたペプチドが提供される。様々な実施形態において、単離され又は精製されたペプチドは、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、又は、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡである。他の実施形態において、単離され又は精製されたペプチドは、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、又は、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡである。ここで、単数又は複数のＫ残基はＦ残基又はＬ残基のいずれかで、単数又は複数のＦ残基はＫ残基、Ａ残基又はＬ残基のいずれかで、単数又は複数のＡ残基はＫ、Ｆ残基又はＬ残基のいずれかで置換することがそれぞれ可能である。
【０００９】
融合コンストラクトは、レセプタ、リガンド又は抗原に結合する結合部を含む。結合部も、リガンド、抗原又は抗体を含む。リガンドは、レセプタアゴニスト又はアンタゴニスト等のレセプタに結合する分子を含み、又は、当該分子からなる。結合部は、線形構造もしくは環状構造を含み、又は、線形構造もしくは環状構造からなる。
【００１０】
結合部は、例えば、単数又は複数のアミノ酸（例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質）、核酸及び炭水化物を含む。結合部の種類には、例えば、レセプタに結合するホルモン、ホルモンアナログ、ホルモン及びホルモンアナログの断片、及び成長因子、サイトカイン、抗体等のキメラ又は融合体が含まれる。
【００１１】
ホルモンの例として、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）もしくはその類似物質、ゴナドトロピン放出ホルモンもしくはその類似物質、黄体形成ホルモンβ鎖、黄体形成ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、絨毛性ゴナドトロピンβサブユニット、メラニン細胞刺激ホルモン、エストラジオール、ジエチルスチルベストロール、ラクトフェリン、ドーパミン、ソマトスタチンもしくはその類似物質、グルココルチコイド、エストロゲン、テストステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロゲン、プロゲステロン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、インスリン、カテコールアミン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、アンジオテンシン、抗利尿ホルモン、カルシトニン、コレシストキニン、ボンベシン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン及びその類似物質、インヒビン、オレキシン、ＫｉＳＳペプチド（ＧＰＲ５４）、キスペプチン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、成長ホルモン、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、葉酸、ビタミンＨ、フェリチン、副甲状腺ホルモン、レラキシン、セクレチン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、エンドセリン、レニン、リポトロピン、メラトニンが含まれる。成長因子の例には、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、形質転換成長因子α及びβ（ＴＧＦα、ＴＧＦβ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、セルロプラスミン等が含まれる。サイトカイン又はリガンドの例には、インターロイキン（例えば、インターロイキン２、インターロイキン１７、ＣＤ１５４、Ｆａｓリガンド等）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦｓ）、インターフェロン等が含まれる。
【００１２】
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の例には、ＦＳＨレセプタに結合するＦＳＨベータ鎖及びＦＳＨアルファ鎖、及びＦＳＨベータ鎖及びＦＳＨＦＳＨアルファ鎖の断片が含まれる。ＦＳＨ配列の例には、ＦＳＨベータ鎖又はＦＳＨアルファ鎖、及びＦＳＨベータ鎖及びＦＳＨＦＳＨアルファ鎖断片の断片などが含まれるが、これらは哺乳類（例えば、人）のＦＳＨ配列である。
【００１３】
従って、特定の実施形態においては、融合コンストラクトはＦＳＨレセプタ及び溶解ドメインに結合する卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）又はＦＳＨ断片、ＦＳＨ類似物質又はＦＳＨキメラを含み、当該ＦＳＨ断片又は類似物質又はキメラは溶解ドメインに結合される。様々な実施形態において、融合コンストラクトはＦＳＨレセプタに結合するＦＳＨ又はＦＳＨ断片又はＦＳＨ類似物質及び溶解ドメインを含み、当該溶解ドメインはＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ，及びＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡから選択されるペプチド配列、又はＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ，及びＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡから選択されるペプチド配列を備えるか又はこれのみからなり、前記ペプチド配列は一又は複数のＫ残基がＦ又はＬ残基のいずれかで置換され、一又は複数のＦ残基がＫ、Ａ、又はＬ残基のいずれかで置換され、一又は複数のＡ残基がＫ、Ｆ、又はＬ残基のいずれかで置換される。
【００１４】
ＦＳＨ及びＦＳＨ断片の例には、以下で記述されるヒトＦＳＨベータ鎖配列のＦＳＨ配列又はＦＳＨ断片がある。ＮＨ2−Ａｓｎ− Ｓｅｒ− Ｃｙｓ− Ｇｌｕ− Ｌｅｕ− Ｔｈｒ− Ａｓｎ− Ｉｌｅ− Ｔｈｒ− Ｉｌｅ− Ａｌａ− Ｉｌｅ− Ｇｌｕ− Ｌｙｓ− Ｇｌｕ− Ｇｌｕ− Ｃｙｓ− Ａｒｇ− Ｐｈｅ− Ｃｙｓ− Ｉｌｅ− Ｓｅｒ− Ｉｌｅ− Ａｓｎ− Ｔｈｒ− Ｔｈｒ− Ｔｒｐ− Ｃｙｓ− Ａｌａ− Ｇｌｙ− Ｔｙｒ− Ｃｙｓ− Ｔｙｒ− Ｔｈｒ− Ａｒｇ− Ａｓｐ− Ｌｅｕ− Ｖａｌ− Ｔｙｒ− Ｌｙｓ− Ａｓｐ− Ｐｒｏ− Ａｌａ− Ａｒｇ− Ｐｒｏ− Ｌｙｓ− Ｉｌｅ− Ｇｌｎ− Ｌｙｓ− Ｔｈｒ− Ｃｙｓ− Ｔｈｒ− Ｐｈｅ− Ｌｙｓ− Ｇｌｕ− Ｌｅｕ− Ｖａｌ− Ｔｙｒ− Ｇｌｕ− Ｔｈｒ− Ｖａｌ− Ａｒｇ− Ｖａｌ− Ｐｒｏ− Ｇｌｙ− Ｃｙｓ− Ａｌａ− Ｈｉｓ− Ｈｉｓ− Ａｌａ− Ａｓｐ− Ｓｅｒ− Ｌｅｕ− Ｔｙｒ− Ｔｈｒ− Ｔｙｒ− Ｐｒｏ− Ｖａｌ− Ａｌａ− Ｔｈｒ− Ｇｌｎ− Ｃｙｓ− Ｈｉｓ− Ｃｙｓ− Ｇｌｙ− Ｌｙｓ− Ｃｙｓ− Ａｓｐ− Ｓｅｒ− Ａｓｐ− Ｓｅｒ− Ｔｈｒ− Ａｓｐ− Ｃｙｓ− Ｔｈｒ− Ｖａｌ− Ａｒｇ− Ｇｌｙ− Ｌｅｕ− Ｇｌｙ− Ｐｒｏ− Ｓｅｒ− Ｔｙｒ− Ｃｙｓ− Ｓｅｒ− Ｐｈｅ− Ｇｌｙ− Ｇｌｕ− Ｍｅｔ− Ｌｙｓ− Ｇｌｕ−ＯＨ。
【００１５】
ＦＳＨ断片の具体例には、ＦＳＨベータ鎖アミノ酸配列３３−５３、ＦＳＨベータ鎖アミノ酸配列８１−９５、ＦＳＨベータ鎖アミノ酸配列８１−８９、ＦＳＨベータ鎖アミノ酸配列９０−９５、又はＦＳＨベータ鎖アミノ酸配列３３−５３、ＦＳＨベータ鎖アミノ酸配列８１−９５、ＦＳＨベータ鎖アミノ酸配列８１−８９、又はＦＳＨベータ鎖アミノ酸配列９０−９５が含まれ、これらにおいては少なくとも１つのシステイン（Ｃ）がアラニン（Ａ）で置換される。特定の態様においては、ＦＳＨ断片はＣＹＴＲＤＬＶＹＫＤＰＡＲＰＫＩＱＫＴＣＴ；  ＱＡＨＡＧＫＡＤＳＤＳＴＤＡＴ；  ＱＣＨＣＧＫＣＤＳＤＳＴＤＣＴ；  ＱＡＨＡＧＫＡＤＳ；  ＱＣＨＣＧＫＣＤＳ，又はＤＳＴＤＣＴ、又はこれらの配列のいずれかにおいて一又は複数のシステイン（Ｃ）残基がアラニン（Ａ）残基で置換されるものを含むか、又はこれのみから構成される。
【００１６】
本明細書において述べる通り、結合部は細胞において発現されてもよい。結合部（例えば、レセプタ、リガンド、抗原、抗体）を発現し、又は、本発明の方法に従って標的とされる細胞には、過増殖性細胞（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ）が含まれる。レセプタ、リガンド、又は抗原を発現し、又は、本発明の方法に従って標的とされる細胞には、乳腺細胞、卵巣細胞、子宮細胞、頸部細胞、前立腺細胞、精巣細胞、膵臓細胞、皮膚細胞、血液細胞、副腎細胞、下垂体細胞、血管又は血管系、及び子宮内膜細胞も含まれる。細胞において発現される結合部の種類の例には、ホルモンレセプタ（ＦＳＨレセプタ、ＬＨＲＨレセプタ、βＣＧレセプタなど）、サイトカイン、成長因子（例えば、ＥＧＦレセプタ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＲＯＲ１）、フェリチン、トランスフェリンレセプタ、細胞接着分子等が含まれる。増殖細胞において発現され、又は、抗体もしくはその断片の標的となる抗原の例には、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ１５４、免疫グロブリン様レセプタ等が含まれる。また、抗原には、例えば、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、癌抗原１２５（ＣＡ−１２５）及び本明細書において開示されるリガンドに結合する他のレセプタ分子が含まれる。
【００１７】
第１及び第２のドメインは、アミノ酸もしくはアミノ酸配列を含み、又は、アミノ酸もしくはアミノ酸配列からなる。具体的には、第１又は第２のドメインは、約１０、１０から２０、１５から２０（すなわち、１５、１６、１７、１８、１９又は２０のアミノ酸）、２０から３０、３０から４０、４０から５０、６０から７０、７０から８０、８０かラ９０、９０カラ１００又はそれ以上のアミノ酸残基を有する。溶解ドメインドメインに含まれるアミノ酸の数は、通常１０から１４、１５から２０（すなわち、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のアミノ酸）、１０から２０、２０から３０、３０から４０、４０から５０であるが、より長く（５０以上）、又はより短く（１０未満）することは任意である。
【００１８】
一態様において、第１のドメインは、両親媒性αヘリックス構造を含み、又は、両親媒性αヘリックス構造からなる。さらなる態様において、第２のドメインはＦＳＨレセプタに結合するＦＳＨアミノ酸配列からなり、当該ＦＳＨアミノ酸配列はＣＹＴＲＤＬＶＹＫＤＰＡＲＰＫＩＱＫＴＣＴ；  ＱＡＨＡＧＫＡＤＳＤＳＴＤＡＴ；  ＱＣＨＣＧＫＣＤＳＤＳＴＤＣＴ；  ＱＡＨＡＧＫＡＤＳ；  ＱＣＨＣＧＫＣＤＳ，又はＤＳＴＤＣＴ、又はＣＹＴＲＤＬＶＹＫＤＰＡＲＰＫＩＱＫＴＣＴ；  ＱＡＨＡＧＫＡＤＳＤＳＴＤＡＴ；  ＱＣＨＣＧＫＣＤＳＤＳＴＤＣＴ；  ＱＡＨＡＧＫＡＤＳ；  ＱＣＨＣＧＫＣＤＳ，又はＤＳＴＤＣＴの何れかの断片、又はＣＹＴＲＤＬＶＹＫＤＰＡＲＰＫＩＱＫＴＣＴ；  ＱＡＨＡＧＫＡＤＳＤＳＴＤＡＴ；  ＱＣＨＣＧＫＣＤＳＤＳＴＤＣＴ；  ＱＡＨＡＧＫＡＤＳ；  ＱＣＨＣＧＫＣＤＳ，又はＤＳＴＤＣＴのいずれかの断片、又はＣＹＴＲＤＬＶＹＫＤＰＡＲＰＫＩＱＫＴＣＴ；  ＱＡＨＡＧＫＡＤＳＤＳＴＤＡＴ；  ＱＣＨＣＧＫＣＤＳＤＳＴＤＣＴ；  ＱＡＨＡＧＫＡＤＳ；  ＱＣＨＣＧＫＣＤＳ，又はＤＳＴＤＣＴのいずれかの断片として記述される。
【００１９】
第１及び第２のドメインは、互いに対してＮＨ2末端又はＣ末端のいずれに位置してもよい。このように、一実施形態において、第１の（溶解ペプチド）ドメインは、第２の（結合部又はリガンド）ドメインに対して、ＮＨ2末端に位置する。また、他の実施形態において、第２の（結合部又はリガンド）ドメインは、第１の（溶解ペプチド）ドメインに対してＣ末端に配置される。
【００２０】
第１及び第２のドメインは、単数又は複数のＤ−アミノ酸及び／又は単数又は複数のＬ−アミノ酸からなるようにしてもよい。具体的には、第１のドメインは、Ｋ、Ｆ又はＡ残基等にＤ−アミノ酸を有する。
【００２１】
第１及び第２のドメインは、追加的なドメインを更に含んでもよく、又は、追加的なドメインからなるようにしてもよい。従って、様々な態様において、融合コンストラクトは第３、第４、第５、第６、第７等のドメインを含むことができ、これらのいずれか又はすべては互いに同一か又は異なっている。
【００２２】
第１及び第２の（及びさらなる）ドメインは、共有結合によって結合されてもよい。例えば、第１及び第２のドメインは、ペプチドリンカー又は非ペプチドリンカーによって結合されてもよい。具体的には、第１及び第２のドメインは、約１から２５のアミノ酸残基を有するペプチド（リンカ）配列又は線状炭素鎖などの非ペプチド（リンカ）によって結合される。さらに他の態様において、第１及び第２のドメインは、単数又は複数のＡ、Ｓ又はＧアミノ酸残基を含む、又は、単数又は複数のＡ、Ｓ又はＧアミノ酸残基からなるペプチド（リンカ）配列によって結合される。さらなる特定の態様において、第１及び第２のドメインを結合するペプチド（リンカ）配列は、ＧＳＧＧＳ，  ＡＳＡＡＳ，  ＧＳ，  ＡＦ，  ＦＫ，  ＶＫ，  ＦＦＫ，  ＦＡ，  ＧＳＧＲＳＡ，  ＲＶＲＲＳＶ，  ＳＳ，  Ｃｉｔ−Ｖ  （Ｃｉｔ  ＝  シトルリン  （Ｈ2ＮＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ2）3ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯ2Ｈ）；  Ｖａｌ  ＝  バリン），  Ｆ−Ｃｉｔ  （Ｆ＝フェニルアラニン，  Ｃｉｔ  ＝  シトルリン，  又は非ペプチド（リンカ）線状炭素鎖，  Ｃn，  ここでｎは鎖内の炭素（Ｃ）の数  （例えば、１から１００），  例えば、Ｃ，  ＣＣ，  ＣＣＣ，  ＣＣＣＣ，  ＣＣＣＣＣ，  ＣＣＣＣＣＣ，  ＣＣＣＣＣＣＣ，  ＣＣＣＣＣＣＣＣなどを含むか、またはこれからなる。
【００２３】
融合コンストラクトは、単離され精製された剤形を含み、又は、単離され精製された剤形からなる。融合コンストラクトは、混合物を含み、又は、混合物からなる。かかる製剤及び混合物は組成物を含み、この組成物は、例えば、融合コンストラクトと被験者への投与やインビボ接触に適しており薬学的に許容されたキャリアもしくは賦形剤との混合物、又は、融合コンストラクトと抗細胞増殖剤もしくは免疫刺激剤との混合物である。
【００２４】
融合コンストラクトは、単位投与剤形を含み、又は、単位投与剤形からなる。一実施形態における融合コンストラクトは、有害な細胞増殖又は細胞増殖疾患を有する被験者を治療するために効果のある量の単位投与量である。他の実施形態における融合コンストラクトでは、新生物、腫瘍又は癌を有する被験者を治療するために効果のある量が単位投与量になる。他の実施形態の融合コンストラクトにおいては、被験者の生殖能力を減少させるために有効な量が単位投与量になる。
【００２５】
融合コンストラクトは、キットに含まれていてもよく、特に方法を実行するための説明書とともにキットに含まれていてもよい。      一実施形態におけるキットは、細胞の増殖を減少又は抑制し、過剰増殖細胞の増殖を減少又は抑制し、新生物細胞、腫瘍細胞又は癌細胞の増殖を減少又は抑制し、過増殖疾患を有する被験者を治療し、新生物、腫瘍又は癌を有する被験者を治療し、又は、動物の生殖能力を減少させるための融合コンストラクト及び説明書を含む。
【００２６】
本発明によれば、融合コンストラクトをコードする核酸が提供される。一実施形態において、核酸は、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ、及び、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫから選択されるペプチド配列を含み１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７もしくは２８のＬ−又はＤ−アミノ酸配列残基からなる第１のドメインと、標的部もしくは結合部を含み又は当該標的部もしくは当該結合部からなる第２のドメインと、を含む融合コンストラクトをコードし、又は、当該第１のドメインと当該第２のドメインとからなる融合コンストラクトをコードする。他の実施形態において、核酸は、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ、及び、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫから選択されるＬ−又はＤ−アミノ酸配列からなる第１のドメインと、標的部もしくは結合部を含み又は当該標的部もしくは当該結合部からなる第２のドメインと、を含む融合コンストラクトをコードし、又は、当該第１のドメインと当該第２のドメインとからなる融合コンストラクトをコードする。さらに他の実施形態における核酸は、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ、及び、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫから選択されるＬ−又はＤ−アミノ酸配列からなる第１のドメインと、１−２５のＬ−又はＤ−アミノ酸配列（例えば、標的部もしくは結合部）からなり第１のドメインと異なる第２のドメインと、を含む融合コンストラクトをコードし、又は、当該第１のドメインと当該第２のドメインとからなる融合コンストラクトをコードする。
【００２７】
核酸は、細胞内で発現して融合コンストラクトをコードする発現ベクター等のベクターに含まれていてもよい。宿主細胞は、核酸によってコードされた融合コンストラクトを当該細胞が発現するようにベクターに含まれる核酸によって形質転換される。
【００２８】
融合コンストラクトは、例えば、細胞増殖を減少させ又は阻害するため、過剰増殖細胞の増殖を減少させ又は阻害するため、新生物細胞、腫瘍細胞、癌細胞又は悪性腫瘍細胞の増殖を減少させ又は阻害するため、過剰増殖細胞や過増殖疾患等の有害な又は異常な細胞の増殖を治療するために用いられる。過増殖疾患の例には、良性過形成、非転移性及び転移性の新生物、癌、腫瘍及び悪性腫瘍（例えば、固形又は液性腫瘍、骨髄腫、リンパ腫、白血病、上皮性悪性腫瘍、肉腫、黒色腫、神経系腫瘍、網内系腫瘍及び造血細胞腫瘍）を含む。
【００２９】
本発明によれば、細胞増殖を減少させ又は阻害する方法、過剰増殖細胞の増殖を減少させ又は阻害する方法、及び、新生物細胞、腫瘍細胞、癌細胞又は悪性腫瘍細胞の増殖を減少させ又は阻害する方法が提供される。様々な実施形態に係る方法は、細胞の増殖を減少させ又は阻害するために十分な量の融合コンストラクトを細胞に接触させること、過剰増殖細胞の増殖を減少させ又は阻害するために十分な量の融合コンストラクトを細胞に接触させること、及び、新生物細胞、腫瘍細胞、癌細胞又は悪性腫瘍細胞の増殖を減少させ又は阻害するために十分な量の融合コンストラクトを細胞に接触させることを含む。
【００３０】
本発明によれば、レセプタ（例えば、ＦＳＨ、ＬＨＲＨ、βＣＧなどに結合するホルモンレセプタ）や抗原を発現させる細胞の増殖を選択的に減少させ又は阻害し、レセプタ（例えば、ＦＳＨ、ＬＨＲＨ、βＣＧなどに結合するホルモンレセプタ）や抗原を発現する過剰増殖細胞の増殖を選択的に減少させ又は阻害し、レセプタ（例えば、ＦＳＨ、ＬＨＲＨ、βＣＧなどに結合するホルモンレセプタ）や抗原を発現させる新生物細胞、腫瘍細胞、癌細胞又は悪性腫瘍細胞の増殖を選択的に減少させ又は阻害する方法が提供される。様々な実施形態に係る方法は、細胞の増殖を減少させ又は阻害するために十分な量の融合コンストラクトを細胞に接触させることを含む。また、様々な実施形態に係る方法は、当該細胞によって発現されるレセプタ（例えば、ＦＳＨ、ＬＨＲＨ、βＣＧなどに結合するホルモンレセプタ）、リガンド又は抗原にペプチドの結合部が結合し、過剰増殖細胞の増殖を減少させ又は阻害するために十分な量の融合コンストラクトを細胞に接触させることを含む。また、様々な実施形態に係る方法は、当該過剰増殖細胞によって発現されるレセプタ（例えば、ＦＳＨ、ＬＨＲＨ、βＣＧなどに結合するホルモンレセプタ）、リガンド又は抗原にペプチドの結合部が結合し、さらに、新生物細胞、腫瘍細胞、癌細胞又は悪性腫瘍細胞の増殖を減少させ又は阻害するために十分な量の融合コンストラクトを細胞に接触させることを含み、当該細胞によって発現されるレセプタ（例えば、ＦＳＨ、ＬＨＲＨ、βＣＧなどに結合するホルモンレセプタ）、リガンド又は抗原にペプチドの結合部が結合する。
【００３１】
本発明の方法に従って標的とされる細胞は、性ステロイドホルモンや性腺ステロイドホルモン又は性ステロイドホルモンレセプタや性腺ステロイドホルモンレセプタ等のホルモンレセプタ等のレセプタ（例えば、ＦＳＨ、ＬＨＲＨ、βＣＧなどに結合するホルモンレセプタ）や抗原を含む。本発明の方法に従って標的とされる細胞には、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ゴナドトロピン放出ホルモンＩ、ゴナドトロピン放出ホルモンＩＩ、ヤツメウナギＩＩＩ黄体形成ホルモン放出ホルモン、黄体形成ホルモンβ鎖、黄体形成ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、絨毛性ゴナドトロピンβサブユニット、メラニン細胞刺激ホルモン、エストラジオール、ジエチルスチルベストロール、ドーパミン、ソマトスタチン、グルココルチコイド、エストロゲン、テストステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、プロゲステロン、アンドロゲン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、抗利尿ホルモン、アンジオテンシン、カテコールアミン、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子−１及び−２（ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２）、成長ホルモン（ＧＨ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ビタミンＨ、葉酸、トランスフェリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、エンドセリン、ボンベシン、レニン、リポトロピン、メラトニンホルモン、レラキシン、セクレチン、成長ホルモン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血管作動性腸管ペプチド、ラクトフェリン、インテグリン（例えば、α５β１インテグリン）、神経成長因子、形質転換成長因子α及びβ（ＴＧＦ−α及びβ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＣＤ−３３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＲＯＲ１、ＩＧＦ−１、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌抗原１２５（ＣＡ−１２５）、インターロイキン１７、ＣＤ１５４、可溶性インターロイキン−２（ＩＬ−２）レセプタ、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、糖タンパク質（ｇｐ）７５、ｇｐ１００、βカテニン、ＰＲＡＭＥ、ＭＵＭ−１、ＺＥＰ１６１、ユビキチン−１、ＨＯＸ−Ｂ６、ＹＢ−１、オステオネクチン、ＩＬＦ３、葉酸又は葉酸誘導体、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーメンバー、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β（リンフォトキシン、ＬＴ）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）、ＬＩＧＨＴ、４１ＢＢ、形質転換成長因子α、形質転換成長因子β、インスリン、セルロプラスミン、ＨＩＶ−ｔａｔ、ＲＧＤ配列モチーフを含むペプチド又はタンパク質、単糖、二糖、オリゴ糖、シアル酸、ガラクトース、マンノース、フコース、又はアセチルノイラミン酸に結合するレセプタを発現する細胞も含まれる。
【００３２】
実行される方法には、例えば、過剰増殖細胞や有害な増殖細胞のような細胞の増殖、生存、分化、死又は活動を抑制・減少させ又は避けることが必要な被験者に接触することを含む。被験者の例には、有害な又は異常な細胞の増殖又はその危険がある被験者、良性過形成を有し又はその危険がある被験者、又は、非転移性もしくは転移性の新生物、癌、腫瘍又は悪性腫瘍（例えば、固形又は液性腫瘍、骨髄腫、リンパ腫、白血病、上皮性悪性腫瘍、肉腫、黒色腫、神経系腫瘍、網内系腫瘍及び造血細胞腫瘍）を有し又はその危険がある被験者が含まれる。
【００３３】
本発明によれば、過増殖疾患を有する被験者を治療する方法、及び、被験者新生物、腫瘍、癌又は悪性腫瘍（転移性の、非転移性の又は良性のもの）を有する被験者を治療する方法がさらに提供される。様々な実施形態における方法には、過増殖疾患を治療するために十分な量の融合コンストラクトを被験者に投与すること、新生物、腫瘍、癌又は悪性腫瘍の増殖を減少させ又は阻害するために十分な量の融合コンストラクトを被験者に投与すること、及び、新生物、腫瘍、癌又は悪性腫瘍の血管系の増殖を減少させ又は阻害するために十分な量の融合コンストラクトを被験者に投与すること、が含まれる。
【００３４】
方法には、転移やその危険がある被験者を治療する方法が含まれる。例えば、腫瘍、癌又は新生物が被験者の体内の他部位又は多領域へ拡散し播種することを減少させ又は阻害するために効果のある量の融合コンストラクトを投与することが含まれる。様々な実施形態に係る方法は、原発腫瘍又は癌が単数又は複数の他の部位への転移、及び、単数又は複数の他部位における転移の形成を減少又は抑制し、それによって腫瘍や癌の再発又は腫瘍や癌の進行を減少又は抑制する。他の実施形態に係る方法において、転移の可能性があり又は実際に転移している腫瘍細胞又は癌細胞（例えば、播種性腫瘍細胞）の成長、増殖、移動度又は侵潤性を減少又は抑制し、原発部位から離れた単数又は複数の部位へ原発腫瘍や癌から起こる転移の形成を減少又は抑制し、転移が形成された後に原発部位から離れた単数又は複数の他部位における転移が成長し増殖することを減少又は抑制し、又は、転移が形成された後にさらに転移が形成されることを減少又は抑制する。さらに他の実施形態に係る方法においては、新生物、腫瘍、癌又は悪性腫瘍の再発又は進行が減少又は抑制される。
【００３５】
本発明によれば、新生物、腫瘍、癌又は悪性腫瘍の他部位への転移を減少又は抑制し、原発性の新生物、腫瘍、癌又は悪性腫瘍から遠位にある他部位において転移性の新生物、腫瘍、癌又は悪性腫瘍が形成されることを減少又は抑制する方法が提供される。様々な実施形態に係る方法には、新生物、腫瘍、癌又は悪性腫瘍の他部位への転移を減少又は抑制するため、又は、原発性の新生物、腫瘍、癌又は悪性腫瘍から遠位にある他部位において転移性の新生物、腫瘍、癌又は悪性腫瘍が形成することを減少又は抑制するために十分な量の融合コンストラクトを被験者へ投与することが含まれる。
【００３６】
本発明に従って治療可能な新生物、腫瘍、癌及び悪性腫瘍には、固形細胞塊、造血細胞又は上皮性悪性腫瘍、肉腫（例えば、リンパ肉腫、脂肪肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫又は線維肉腫）、リンパ腫、白血病、腺腫、腺癌、黒色腫、神経膠腫、膠芽細胞腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、オリゴデンドロサイトーマ（オリゴデンドログリオーマ）、中皮腫、網内系・リンパ系・造血系新生物、腫瘍、癌又は悪性腫瘍（例えば、骨髄腫、リンパ腫又は白血病）が含まれる。
【００３７】
本発明に従って治療可能な新生物、腫瘍、癌及び悪性腫瘍は、肺（肺小細胞癌又は非小細胞肺癌）、甲状腺、頭部もしくは頸部、鼻咽頭、咽喉部、鼻部もしくは鼻腔部、脳、脊椎、乳腺、副腎、下垂体、甲状腺、リンパ液、胃腸（口腔、食堂、胃、十二指腸、回腸、空腸（小腸）、結腸、直腸）、泌尿生殖器（子宮、卵巣、頸部、子宮内膜、膀胱、睾丸、陰茎、前立腺）、腎臓、膵臓、肝臓、骨、骨髄、リンパ液、血液、筋肉、皮膚、又は幹細胞の新生物、腫瘍、癌、もしくは悪性腫瘍に存在することがある。
【００３８】
方法は、外科的切除、放射線治療、電離放射線治療もしくは化学放射線治療、化学療法、免疫療法、局所温熱療法又はワクチン接種等の他の治療方法とともに実施される。このような治療方法は、融合コンストラクトの投与前に、（融合コンストラクトとは別に又は融合コンストラクトと混合して）融合コンストラクトと同時に、又は、融合コンストラクトの投与後に、実施される。一実施形態における方法には、抗細胞増殖治療、抗新生物治療、抗腫瘍治療、抗癌治療又は免疫増強治療を実施することが含まれる。さらなる実施形態における方法は、アルキル化剤、抗代謝産物、植物抽出物、植物アルカロイド、ニトロソ尿素、ホルモン、ヌクレオシド又はヌクレオチド類似体、シクロホスファミド、アザチオプリン、シクロスポリンＡ、プレドニゾロン、メルファラン、クロラムブシル、メクロレタミン、ブスルファン、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、チオグアニン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、５−アザシチジン（５−ＡＺＣ）及び５−アザシチジン関連化合物、ブレオマイシン、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾトシン、ヒドロキシ尿素、シスプラチン、カルボプラチン、オキシプラチン、ミトタン、プロカルバジン、ダカルバジン、タキサン（例えば、タキソール又はパクリタキセル）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン又はジブロモマン二トール、トポイソメラーゼ阻害剤、（イリノテカン、トポテカン、エトポシド、テニポシド）、ゲムシタビン、ペメトレキセドなどの投与を含む。細胞治療又は免疫治療には、リンパ球、形質細胞、マクロファージ、樹枝状細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞もしくはＢ細胞、抗体、細胞成長因子、細胞生存因子、細胞分化因子、ホルモン、又は、サイトカインもしくはケモカイン（例えばインターロイキンＩＬ−２、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭＣＦＣ）、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＴＮＦβ、ＭＩＰ−１α，  ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−１、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、エオタキシン、エオタキシン−２、Ｉ−３０９／ＴＣＡ３、ＡＴＡＣ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−２、ＨＣＣ−３、ＬＡＲＣ／ＭＩＰ−３α、ＰＡＲＣ、ＴＡＲＣ、ＣＫβ、ＣＫβ  ６、ＣＫβ７、ＣＫβ８、ＣＫβ９、ＣＫβ１１、ＣＫβ１２、Ｃ１０、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＥＮＡ−７８、ＧＣＰ−２、ＰＢＰ／ＣＴＡＰＩＩＩβ−ＴＧ／ＮＡＰ−２、Ｍｉｇ、ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１、もしくはリンフォタクチン（ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ）等）が含まれる。
【００３９】
融合コンストラクトとともに用いることができる追加剤は、抗体や小分子等の標的薬又は生物薬剤である。モノクロナール抗体には、特に本発明に係る融合コンストラクト等と組み合わせて用いられるリツキシマブ（リツキサン（登録商標）））、トラスツズマブ（ハーセプチン）、ベバシズマブ（アバスチン）、セツキシマブ（アービタックス）、アレムツズマブ（キャンパス）、パニツムマブ（ベクチビックス）、ベルツズマブ（パージェタ）、イブリツモマブ・チウキセタン（ゼヴァリン）、イピリムマブ（エルボイ）、トシツモマブ（ベクザー）等が含まれる。本発明の融合コンストラクトとともに用いられる他の標的薬には、イマチニブ（グリベック）、ゲフィチニブ（イレッサ）、ボルテゾミブ（ベルケイド）、ラパチニブ（タイケルブ）、スニチニブ（スーテント）、ソラフェニブ（ネクサバール）、ニロチニブ（タシグナ）、ザルツムマブ、ダロツズマブ、フィジツムマブ、ラムシルマブ、ガリキシマブ、ファルレツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ（アーゼラ）、トシツムマブ、２Ｆ２（ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０），  ７Ｄ８，  ＩｇＭ２Ｃ６，  ＩｇＧ１  ２Ｃ６，  １１Ｂ８，  Ｂ１，  ２Ｈ７，  ＬＴ２０，  １Ｆ５，  又はＡＴ８０ダクリズマブ（ゼナパックス）、クローンＡ９Ｅ４，  Ｆ１Ｇ４，  ＡＴ２Ｇ７，  ＧＮＲＨ０３，  ＧＮＲＨＲ２６９などの抗ＬＨＲＨレセプタ抗体等がある。
【００４０】
本発明の方法によって、被験者に便益が供される。特定の実施形態において、治療の方法は、新生物、腫瘍、癌又は悪性細胞の質量、体積、サイズ、個数を部分的又は完全に破壊して、新生物、腫瘍、癌又は悪性細胞の壊死、溶解、アポトーシスを刺激、誘発、又は増加させ、新生物、腫瘍、癌又は悪性腫瘍の体積、サイズ、細胞質量を低減し、新生物、腫瘍、癌又は悪性腫瘍の体積、質量、サイズ、又は個数の進行又は増加を防止し、又は寿命を延長し、副作用又は新生物、腫瘍、癌又は悪性腫瘍に関連する又はそれらによって引き起こされる合併症の重症度、持続期間、又は頻度を低減し、痛み、不快感、吐き気、脱力感、又は無気力を低減し、又はエネルギー、食欲、改善された運動性、又は心理的健康を向上させる。
【００４１】
本発明によれば、動物の生殖能力を減少させる方法、又は、子宮内膜症、良性の前立腺過形成、子宮筋腫もしくはポリープを治療し減少させる方法が提供される。様々な実施形態における方法には、受胎能力を減少させるために十分な量の融合コンストラクトを動物（例えば、ヒト等の哺乳類）に投与すること、子宮内膜症を治療し減少させるために十分な量の融合コンストラクトを動物（例えば、ヒト等の哺乳類）に投与すること、良性の前立腺過形成を治療し減少させるために十分な量の融合コンストラクトを動物（例えば、ヒト等の哺乳類）に投与すること、及び、子宮筋腫又はポリープを治療し減少させるために十分な量の融合コンストラクトを動物（例えば、ヒト等の哺乳類）に投与すること、が含まれる。
【００４２】
この方法によって治療が可能な被験者には、哺乳動物が含まれる。特定の実施形態において、被験者はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ＬＨＲＨ−Ｐｈｏｒ２１が、Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａよりも速く癌細胞を破壊することを示す。ヒトの乳腺癌細胞（様々な継代数のＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ．ｌｕｃ）がＰｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａ又はＬＨＲＨ−Ｐｈｏｒ２１を使って培養された。
【００４４】
【図２】２１（Ｐｈｏｒ２１）、１８（Ｐｈｏｒ１８（３３８９８３）＝ＣＬＩＰ７１）及び１５（Ｐｈｏｒ１５）アミノ酸を溶解ドメインに有するβＣＧ−ａｌａ融合コンストラクトのＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ．ｌｕｃ細胞（マイクロモルＩＣ50）に対する細胞毒性を、Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａと比較して示す。
【００４５】
【図３】βＣＧ−ａｌａ及びＬＨＲＨ融合コンストラクトのＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ．ｌｕｃ細胞（マイクロモルＩＣ50）に対する細胞毒性を示す。Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａよりもＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ．ｌｕｃ細胞に対する毒性が強い融合コンストラクトが図の右側に列挙されている。
【００４６】
【図４】ＬＨＲＨ融合コンストラクトのＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ．ｌｕｃ細胞（マイクロモルＩＣ50）に対する細胞毒性を示す。当該融合コンストラクトは、３２３０３３＝Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａ、３３７４７９＝ＬＨＲＨ−Ｐｈｏｒ２１、３３７４８０＝Ｐｈｏｒ２１−ＬＨＲＨ、３３８６１１＝Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ２１−ＬＨＲＨ、３３８６１２＝Ｐｈｏｒ１８−ＡＳＡＡＳ−ＬＨＲＨ、３３８６１３＝Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ、３３９３８５＝Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ、及び３３９３４７＝Ｐｈｏｒ１８−ルプロンである。
【００４７】
【図５】βＣＧ−ａｌａ及びＬＨＲＨ融合コンストラクトのヒトの赤血球に対する急性溶血活性（マイクロモルＨＡ50）を、Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａと比較して示す。ＬＨＲＨ−Ｐｈｏｒ２１、Ｐｈｏｒ２１−ＬＨＲＨ及びＰｈｏｒ１８−ルプロン（ＱＨＷＳＹ（Ｄ−Ｌｅｕ）ＬＲＰＮＥｔ＝ルプロン）を除く全ての融合コンストラクトは、Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａよりも非常に低い溶血活性を示した。
【００４８】
【図６】細胞毒性と溶血活性とを比較して示す。矢印で示されたペプチドは、Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａよりも細胞毒性が強い。
【００４９】
【図７】治療計画を概略的に示す。
【００５０】
【図８Ａ】３βＣＧ結合体での治療期間中及び評価終了時における腫瘍の状態の概要を、非結合Ｐｈｏｒ２１、非結合Ｐｈｏｒ１８（３３８９８３）＝（ＣＬＩＰ７１）及び（ＫＫＫＦＡＦＡ）3と比較して示す。図８Ａ〜図８Ｊにおいては、融合コンストラクトのコード、すなわち、３３＝Ｐｈｏｒ２１β−ＣＧ−ａｌａ、７６＝Ｐｈｏｒ１８−βＣＧ−ａｌａ、８１＝Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａ、８５＝Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ、４７＝Ｐｈｏｒ１８−ルプロン、１３＝Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ、１１＝Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ２１−ＬＨＲＨ、１２＝Ｐｈｏｒ１８−ＡＳＡＡＳ−ＬＨＲＨ、７１＝Ｐｈｏｒ１５−βＣＧ−ａｌａ、及び７４＝Ｐｈｏｒ１５−Ｃ６−βＣＧ−ａｌａの後に、評価に用いられたコンストラクトの量が示されている。
【図８Ｂ】３βＣＧ結合体による治療の期間中及び評価終了時における腫瘍の状態の概要を、非結合Ｐｈｏｒ２１、非結合Ｐｈｏｒ１８（３３８９８３）＝（ＣＬＩＰ７１）及び（ＫＫＫＦＡＦＡ）3と比較して示す。
【図８Ｃ】３βＣＧ結合体による治療の期間中及び評価終了時における腫瘍の状態の概要を、非結合Ｐｈｏｒ２１、非結合Ｐｈｏｒ１８（３３８９８３）＝（ＣＬＩＰ７１）及び（ＫＫＫＦＡＦＡ）3と比較して示す。
【図８Ｄ】３βＣＧ結合体による治療の期間中及び評価終了時における腫瘍の状態の概要を、非結合Ｐｈｏｒ２１、非結合Ｐｈｏｒ１８（３３８９８３）＝（ＣＬＩＰ７１）及び（ＫＫＫＦＡＦＡ）3と比較して示す。
【図８Ｅ】３βＣＧ結合体による治療の期間中及び評価終了時における腫瘍の状態の概要を、非結合Ｐｈｏｒ２１、非結合Ｐｈｏｒ１８（３３８９８３）＝（ＣＬＩＰ７１）及び（ＫＫＫＦＡＦＡ）3と比較して示す。
【図８Ｆ】３βＣＧ結合体による治療の期間中及び評価終了時における腫瘍の状態の概要を、非結合Ｐｈｏｒ２１、非結合Ｐｈｏｒ１８（３３８９８３）＝（ＣＬＩＰ７１）及び（ＫＫＫＦＡＦＡ）3と比較して示す。
【図８Ｇ】３βＣＧ結合体による治療の期間中及び評価終了時における腫瘍の状態の概要を、非結合Ｐｈｏｒ２１、非結合Ｐｈｏｒ１８（３３８９８３）＝（ＣＬＩＰ７１）及び（ＫＫＫＦＡＦＡ）3と比較して示す。
【図８Ｈ】３βＣＧ結合体による治療の期間中及び評価終了時における腫瘍の状態の概要を、非結合Ｐｈｏｒ２１、非結合Ｐｈｏｒ１８（３３８９８３）＝（ＣＬＩＰ７１）及び（ＫＫＫＦＡＦＡ）3と比較して示す。
【図８Ｉ】３βＣＧ結合体による治療の期間中及び評価終了時における腫瘍の状態の概要を、非結合Ｐｈｏｒ２１、非結合Ｐｈｏｒ１８（３３８９８３）＝（ＣＬＩＰ７１）及び（ＫＫＫＦＡＦＡ）3と比較して示す。
【図８Ｊ】３βＣＧ結合体による治療の期間中及び評価終了時における腫瘍の状態の概要を、非結合Ｐｈｏｒ２１、非結合Ｐｈｏｒ１８（３３８９８３）＝（ＣＬＩＰ７１）及び（ＫＫＫＦＡＦＡ）3と比較して示す。
【００５１】
【図９Ａ】３０日までの図示された時間における生理食塩水及びＰｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａ（３３）の基準値と比較した治療グループの腫瘍体積を示す。
【図９Ｂ】３０日までの図示された時間におけるＤ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ２１−ＬＨＲＨ（１１）の基準値と比較した治療グループの腫瘍体積を示す。
【図９Ｃ】３０日までの図示された時間におけるＰｈｏｒ１８−ルプロン（４７）の基準値と比較した治療グループの腫瘍体積を示す。
【図９Ｄ】３０日までの図示された時間におけるＰｈｏｒ１８−ＡＳＡＡＳ−ＬＨＲＨ（１２）の基準値と比較した治療グループの腫瘍体積を示す。
【図９Ｅ】３０日までの図示された時間におけるＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（１３）の基準値と比較した治療グループの腫瘍体積を示す。
【図９Ｆ】３０日までの図示された時間における（ＫＫＫＦＡＦＡ）3−ＬＨＲＨの基準値と比較した治療グループの腫瘍体積を示す。
【図９Ｇ】３０日までの図示された時間におけるＤ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（８５）の基準値と比較した治療グループの腫瘍体積を示す。
【図９Ｈ】基準値との比較を示す。
【００５２】
【図１０Ａ】ＬＨＲＨ結合体による治療の終了時におけるＰｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａと比較した腫瘍質量を示す。ここで、３３８６１４＝（ＫＫＫＦＡＦＡ）3ＬＨＲＨ、３３８６１２＝Ｐｈｏｒ１８−ＡＳＡＡＳ−ＬＨＲＨ、３３８６１３＝Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ、及び３３９３８５＝Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨである。
【図１０Ｂ】ＬＨＲＨ結合体による治療の終了時におけるＰｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａと比較した基準値からの腫瘍質量の変動を示す。
【図１０Ｃ】ＬＨＲＨ結合体による治療の終了時におけるＰｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａと比較した生存腫瘍細胞の総数を示す。
【図１０Ｄ】ＬＨＲＨ結合体による治療の終了時におけるＰｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａと比較した生存腫瘍細胞の総数の基準値からの変動を示す。
【図１０Ｅ】ＬＨＲＨ結合体による治療の終了時におけるＰｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａと比較した体重を示す。
【００５３】
【図１１】表示された量のドキソルビシン存在下において、濃度を増加させたＰｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａとともに培養される多剤耐性の卵巣癌細胞（ＯＶＣＡＲ３）、及び、最も高濃度のドキソルビシンにおける２００因子による細胞破壊の効果を示す。
【００５４】
【図１２】ＬＨＲＨ及びＰｈｏｒ２１融合コンストラクト、βＣＧ及びＰｈｏｒ２１融合コンストラクトを用いた場合における、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ．ｌｕｃ細胞と比較したＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣由来の樹立細胞株）及びＴＭ４細胞の細胞毒性を示す。ＴＭ４細胞はＬＨＲＨレセプタ陰性、ＣＨＯ細胞はＣＧレセプタ陰性であり、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ．ｌｕｃ細胞はＬＨＲＨレセプタ及びＣＧレセプタをいずれも発現する。
【００５５】
【図１３】ＦＳＨ溶解ペプチド結合体が生体内でヒト前立腺癌細胞の成長を阻害することを示す。通常の生理食塩水（基剤コントロール）、ＦＳＨ90-95  （１ｍｇ／ｋｇ），  ＦＳＨ90-95−Ｐｈｏｒ１８  （０．１ｍｇ／ｋｇ，  １ｍｇ／ｋｇ  ），  ＦＳＨ81-95  （１ｍｇ／ｋｇ），  ＦＳＨ81-95−Ｐｈｏｒ１８  （０．１ｍｇ／ｋｇ，  １ｍｇ／ｋｇ），  及びＦＳＨ33-53  （１ｍｇ／ｋｇ），  ＦＳＨ33-53−Ｐｈｏｒ１８  （０．１ｍｇ／ｋｇ，  １ｍｇ／ｋｇ  ）の治療薬で治療したヌードマウス内の腫瘍体積の変化。データは腫瘍体積の平均値±標準誤差として提示される（ｎ＝８）。（＊ｐ＜０．０５）
【００５６】
【図１４Ａ】解剖時の腫瘍体積を示す。
【図１４Ｂ】解剖時の腫瘍体積を示す。
【図１４Ｃ】解剖時の腫瘍体積を示す。データは平均値±標準誤差を示す（ｎ＝８）。解剖時の腫瘍体積は、基剤で処理したグループと比較して、ＦＳＨ90-95−Ｐｈｏｒ１８、ＦＳＨ81-95Ｐｈｏｒ１８、ＦＳＨ33-53−Ｐｈｏｒ１８で治療したマウス内で有意に減少した。（＊ｐ＜０．０５）
【００５７】
【図１５Ａ】解剖時の腫瘍質量を示す。
【図１５Ｂ】解剖時の腫瘍質量を示す。
【図１５Ｃ】解剖時の腫瘍質量を示す。データは平均値±標準誤差を示す（ｎ＝８）。解剖時の腫瘍質量は、基剤で処理したグループと比較して、ＦＳＨ90-95−Ｐｈｏｒ１８及びＦＳＨ81-95Ｐｈｏｒ１８で治療したマウス内で有意に減少した。（＊ｐ＜０．０５）
【００５８】
【図１６】体重を示す。データは平均値±標準誤差を示す（ｎ＝８）。解剖時の体重は治療グループ間で差異がなかった。
【００５９】
【図１７】１μＭのＦＳＨ81-89Ｐｈｏｒ１８及びＦＳＨ81-89ａＰｈｏｒ１８の相対活性を単独及びＦＳＨの存在下の場合ごとに示す。１０μＭ  （ｐ＜０．０５）のＦＳＨ濃度において、活性の喪失が顕著であった。ＦＳＨ81-89Ｐｈｏｒ１８及びＦＳＨ81-89ａＰｈｏｒ１８は、ＭＥＳ−ＳＡ−Ｄｘ５子宮内腫細胞（Ｎ＝６）上のＦＳＨレセプタを特異的に標的とする。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本発明は、第２のドメイン結合部に結合又は融合される第１のドメインの溶解部を含む融合コンストラクトに少なくとも部分的に基づく。典型的な構成において、融合コンストラクトの第１のドメインは溶解部を含み、この溶解部は細胞に対して直接又は間接の毒性を有し、その毒性によって細胞の増殖や生存を減少させ、又は、細胞の死、死滅又はアポトーシスを活性化、促進、増加又は増進させる。融合コンストラクトの第２のドメインは、細胞を標的とする部分を含む。この第２のドメインの細胞を標的とする部分は、結合部と称される。
【００６１】
本発明によれば、第１「溶解」ドメインを含み又は第１「溶解」ドメインからなり、さらに、第２「標的」又は「結合」ドメインを含み又は第２「標的」又は「結合」ドメインからなる融合コンストラクトが提供される。一実施形態に係る融合コンストラクトは、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ、及び、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫ等のペプチド配列（このペプチド配列は、リジン＝Ｋ、フェニルアラニン＝Ｆ、及びアラニン＝Ａ等のアミノ酸から選択される。）を含み、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７もしくは２８のＬ−又はＤ−アミノ酸配列残基からなる第１のドメインと、標的部もしくは結合部を含み又は標的部もしくは結合部からなる第２のドメインと、を含む。他の実施形態に係る融合コンストラクトは、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ、及び、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫから選択されるＬ−又はＤ−アミノ酸配列からなる第１のドメインと、標的部もしくは結合部を含み又は標的部もしくは結合部からなる第２のドメインと、を含む。さらに他の実施形態において、融合コンストラクトは、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ、及び、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫから選択されるＬ−又はＤ−アミノ酸配列からなる第１のドメインと、１−２５のＬ−又はＤ−アミノ酸配列（例えば、標的部もしくは結合部）からなり第１のドメインと異なる第２のドメインと、を含み、又は、当該第１のドメインと当該第２のドメインとからなる。
【００６２】
本明細書において用いられているとおり、「融合」又は「キメラの」という語及びそれらの文法的変形は、コンストラクトに関して用いられる場合には、そのコンストラクトが、互いに区別され自然には共存しないことが一般的な２つの異なる分子的実体から派生し、当該分子的実体から得られもしくは単離され、又は当該分子的実体を基礎としもしくはモデルとした部分もしくは部位を含むことを意味する。つまり、例えば、融合コンストラクトの一部分が溶解部を含み又は溶解部からなるとともに、そのコンストラクトの第２の部分が、結合能を有する構成部分等の標的部を含み又は当該標的部からなり、第１及び第２のドメインは構造的に異なっている。融合コンストラクトは、「結合体」と称されることもあり、この「結合体」は、第１のドメインの溶解部及び第２のドメインの標的部もしくは結合部を含み、又は、第１のドメインの溶解部及び第２のドメインの標的部もしくは結合部からなる。
【００６３】
融合コンストラクトの第１のドメイン及び／又は第２のドメインは、アミノ酸配列（ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、レクチン）、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）及び炭水化物（単糖類、シアル酸、ガラクトース、マンノース、フコース、アセチルノイラミン酸等）を含み、又はこれらの要素からなる。「アミノ酸配列」、「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語は、本明細書において交換可能に用いられ、アミド結合又はそれと等価な結合によって共有結合された２つ以上のアミノ酸、又は「残基」を指し示す。融合コンストラクトのアミノ酸残基は、共有又は非共有結合によって接合できる。共有結合の非限定的な例としては、アミド結合、非天然及び非アミド化学結合があり、これらは例えば、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、又はＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を含む。アミド結合に代わる連結基には、例えば、ケトメチレン（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−に代えて−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2−）、アミノメチレン（ＣＨ2−ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ＝ＣＨ）、エーテル（ＣＨ2−Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ2−Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ4−）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、又はエステル（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ（１９８３年），  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｖｏｌ．  ７，  ｐｐ  ２６７−３５７，  “Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，”  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，  ＮＹを参照）がある。
【００６４】
融合コンストラクト又はキメラの第１及び第２のドメインは、Ｌ−アミノ酸配列、Ｄ−アミノ酸配列、及びＬ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸の混合物を有するアミノ酸配列を含む。第１及び第２のドメインのアミノ酸配列は、線形の又は環状の構造を有し、他の部分（例えば、第３、第４、第５、第６、第７のドメイン等）と結合され、分子内又は分子間ジスルフィド結合を形成し、さらに、同一の又は異なるアミノ酸配列やその他の分子を有する高次マルチマー又はオリゴマーを形成する。
【００６５】
融合コンストラクトの長さは、例えば、約５から１５、２０から２５、２５から５０、５０から１００、１００から１５０、１５０から２００、もしくは２００から３００又はそれ以上の数のアミノ酸残基の長さになる。一実施形態において、第１又は第２のドメインは、約１から１０、１０から２０、１５から２０、２０から３０、３０から４０、４０から５０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から１００又はそれ以上の数の残基からなるアミノ酸配列を含み、又は当該アミノ酸配列からなる。さらに詳細な実施形態において、第１のドメインは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２８又はそれ以上の数のアミノ酸配列残基からなる。
【００６６】
融合コンストラクトの第１のドメインは、それ自体で又は第２のドメインと組み合わされて、両親媒性αヘリックスを構成してもよい。両親媒性αヘリックスは、αヘリックスの一方側に大部分が親水性のアミノ酸を含み、他方側に大部分が疎水性のアミノ酸を含む。このαヘリックスは、３．６残基ごとに１回転するので、両親媒性αヘリックスのアミノ酸配列は、３から４残基ごとに親水性残基と疎水性残基とが交互に入れ替わる。ＰＮＮＰＮＮＰ繰り返しパターン又は繰り返しモチーフは、両親媒性αヘリックスを形成すると考えられる。ここで、Ｐは正に帯電したアミノ酸残基を示し、Ｎは電荷を帯びていないアミノ酸残基を示す。ＰＮＮＰＮＮＰ繰り返しパターンは、膜相互作用又は膜貫通のために、負に帯電した細胞膜及び疎水性部位に対して、溶解ペプチド用のカチオン結合部を提供する。したがって、融合コンストラクトは、単数又は複数の連続したＰＮＮＰＮＮＰ繰り返しパターン又は繰り返しモチーフ又は単数又は複数の途中で途切れたＰＮＮＰＮＮＰ繰り返しパターン又は繰り返しモチーフを有する第１のドメインを含んでおり、これらのＰＮＮＰＮＮＰ繰り返しパターン又は繰り返しモチーフは両親媒性αヘリックスを形成することができる。例えば、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫやＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ等の１５又は１８残基アミノ酸配列は、連続した又は途中で途切れたＰＮＮＰＮＮＰ繰り返しモチーフを有する。
【００６７】
標的部もしくは結合部等の融合コンストラクトの第２のドメインは、リガンド、抗体（又は抗体の抗原結合断片）、抗原、インテグリン、インテグリンレセプタ（例えば、単糖、二糖、オリゴ糖、シアル酸、ガラクトース、マンノース、フコース、アセチルノイラミン酸等の「ＲＧＤ」配列モチーフを含むタンパク質又はペプチド及び細胞外基質（ＥＣＭ）に存在する成分）、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、レセプタ、抗体、抗原、インテグリン、インテグリンレセプタ（例えば、単糖、二糖、オリゴ糖、シアル酸、ガラクトース、マンノース、フコース、アセチルノイラミン酸等の「ＲＧＤ」配列モチーフを含むタンパク質又はペプチド、及び細胞外基質（ＥＣＭ）に存在する成分）、成長因子レセプタ、サイトカインレセプタ、及びケモカインレセプタに結合する標的部及び結合部を含み、又は、これらの要素からなる。
【００６８】
「レセプタ」は、例えば、膜レセプタや細胞内に存在することが一般的である。レセプタは、細胞膜表面に結合し、又は、細胞膜を通過する。例えば、レセプタタンパク質は、細胞膜を貫通する膜貫通ドメインを有し、細胞質性の部分もしくは細胞外の部分又はその両方を有していてもよい。したがって、レセプタは、細胞外部分、膜貫通部分又は細胞質部分を有する完全長のインタクトな天然レセプタ、及び、完全長のインタクトな天然レセプタの短縮型又は断片（例えば、細胞外部分、膜貫通部分もしくは細胞質部分又はレセプタの部分配列、又はこれらの組み合わせ）を含む。例えば、水溶性のレセプタは膜を貫通しないことが通常であり、（天然レセプタに存在する場合には）天然の細胞外領域又は細胞質領域の全部又は一部を有しないこともある。このような短縮型レセプタ又は断片は、リガンドと少なくとも部分的に結合することができる。
【００６９】
融合コンストラクトの標的部及び結合部ドメインは、レセプタと結合するレセプタリガンドと呼ばれる実体を含み、又は当該実体からなる。標的部及び結合部の例には、ホルモンレセプタに結合するホルモン・ホルモンアナログ・ホルモンもしくはホルモンアナログの断片、レセプタに結合する成長因子・成長因子アナログ・成長因子もしくは成長因子アナログの断片、ホルモンもしくはホルモンレセプタに結合するホルモンレセプタもしくはリガンド、及び、ホルモンレセプタに結合するホルモン・ホルモンアナログ・ホルモンもしくはホルモンアナログの断片に結合する標的部及び結合部、ホルモンもしくはホルモンレセプタに結合するホルモンレセプタもしくはリガンドに結合する標的部及び結合部、レセプタに結合する成長因子・成長因子アナログ・成長因子もしくは成長因子アナログの断片に結合する標的部及び結合部、成長因子又は成長因子レセプタに結合する成長因子レセプタ又はリガンドに結合する標的部及び結合部等が含まれる。
【００７０】
結合部として利用されるホルモンの例には、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ゴナドトロピン放出ホルモンＩ、ゴナドトロピン放出ホルモンＩＩ、ヤツメウナギＩＩＩ黄体形成ホルモン放出ホルモン、黄体形成ホルモンβ鎖、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）、絨毛性ゴナドトロピンβサブユニット（β−又はβ−ＣＧ）、メラニン細胞刺激ホルモン、エストラジオール、ジエチルスチルベストロール、ドーパミン、ソマトスタチン、グルココルチコイド、エストロゲン、テストステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、プロゲステロン、アンドロゲン及びこれらの誘導体が含まれる。結合部として用いられるホルモンレセプタの例には、ゴナドトロピン放出ホルモンＩレセプタ、ゴナドトロピン放出ホルモンＩＩレセプタ、ヤツメウナギＩＩＩ黄体形成ホルモン放出ホルモンレセプタ、黄体形成ホルモンレセプタ、絨毛性ゴナドトロピンレセプタ、メラニン細胞刺激ホルモンレセプタ、エストラジオールレセプタ、ドーパミンレセプタ、ソマトスタチンレセプタ、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）レセプタ、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）レセプタ、成長ホルモン（ＧＨ）レセプタ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプタ、グルココルチコイド、ホルモンレセプタ、エストロゲンレセプタ、テストステロンレセプタ、プロゲステロンレセプタ及びアンドロゲンレセプタが含まれる。
【００７１】
成長因子の例には、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、成長ホルモン（ＧＨ）、及びＨｅｒ２／ｎｅｕが含まれる。成長因子レセプタの例には、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）レセプタ、成長ホルモン（ＧＨ）レセプタ、及びＨｅｒ２／ｎｅｕレセプタ、ＩＧＦ−１が含まれる。
【００７２】
標的部もしくは結合部の例には、ＦＳＨ、ＬＨＲＨ、及びβＣＧ、ＦＳＨ、ＬＨＲＨ、及びβＣＧの機能性（結合）断片、ＦＳＨ、ＬＨＲＨ、及びβＣＧのアナログ、及びＦＳＨ、ＬＨＲＨ、及びβＣＧのキメラが含まれる。ＬＨＲＨは、完全機能性リガンドであり、シグナル変換経路の活性化等のリガンドレセプタ相互作用を通じて薬理学的効果を引き出すことができる。βＣＧ−ａｌａは、如何なる薬理学的効果も引き起こすことなく細胞膜と結合することができるｈＣＧ断片である。ＦＳＨレセプタ標的部もしくは結合部の具体例には、Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ；  及びその断片が含まれ、例えば、ＦＳＨβ鎖アミノ酸残基３３−５３、ＦＳＨβ鎖アミノ酸残基８１−９５、ＦＳＨβ鎖アミノ酸残基８１−８９、ＦＳＨβ鎖アミノ酸残基９０−９５、又はＦＳＨβ鎖アミノ酸残基３３−５３、ＦＳＨβ鎖アミノ酸残基８１−９５、ＦＳＨβ鎖アミノ酸残基８１−８９、又はＦＳＨβ鎖アミノ酸残基９０−９５であるが、ここで少なくとも１つのシステイン（Ｃ）残基はアラニン（Ａ）残基と置換されている。さらに具体的な例において、ＦＳＨ断片はＣＹＴＲＤＬＶＹＫＤＰＡＲＰＫＩＱＫＴＣＴ；  ＱＡＨＡＧＫＡＤＳＤＳＴＤＡＴ；  ＱＣＨＣＧＫＣＤＳＤＳＴＤＣＴ；  ＱＡＨＡＧＫＡＤＳ；  ＱＣＨＣＧＫＣＤＳ，又はＤＳＴＤＣＴ、又はこれらの配列のいずれかにおいて一又は複数のシステイン（Ｃ）残基がアラニン（Ａ）残基で置換されるもの、又はＣＹＴＲＤＬＶＹＫＤＰＡＲＰＫＩＱＫＴＣＴ；  ＱＡＨＡＧＫＡＤＳＤＳＴＤＡＴ；  ＱＣＨＣＧＫＣＤＳＤＳＴＤＣＴ；  ＱＡＨＡＧＫＡＤＳ；  ＱＣＨＣＧＫＣＤＳ，又はＤＳＴＤＣＴのいずれかの断片を含むか、又はこれのみから構成される。ＦＳＨレセプタに結合するＦＳＨ断片及びアナログの具体例には、ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ａｓｎ−ａｌａ−ｔｈｒ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ａｓｎ−ａｌａ−ｔｈｒ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｓｅｒ；  及び  ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ａｓｎ−ａｌａ−ｔｈｒ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−ａｓｎ−ａｌａ−ｔｈｒ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｓｅｒが含まれる。ＦＳＨレセプタに結合するＦＳＨキメラの具体例は、以下の文献に記載されている：米国特許第７，２０２，２１５号、米国特許出願第２００８／０２３４１８６号、Ｗｅｅｎｅｎその他，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  ８９：５２０４  （１９８９）；  Ｋｌｅｉｎその他．，  Ｆｅｒｔｉｌ．  Ｓｔｅｒｉｌ．  ７７：１２４８  （２００２）；  及び  Ｐｅａｒｌその他．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １５１：３８８  （２０１０）。
【００７３】
標的部分及び結合部は、新生物細胞、腫瘍細胞又は癌細胞、及び、新生物細胞、腫瘍細胞又は癌細胞に関連するリンパ管又は血管を排他的又は選択的に発現する抗原又はリガンドをさらに含む。このような抗原は、「腫瘍関連抗原」又は「ＴＡＡ」と便宜上称される。このような抗原には、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＡ−１２５（残存上皮性卵巣癌）、可溶性インターロイキン−２（ＩＬ−２）レセプタ、ＲＡＧＥ−１、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、糖タンパク質（ｇｐ）７５、ｇｐ１００、βカテニン、ＰＲＡＭＥ、ＭＵＭ−１、ＺＥＰ１６１、ユビキリン−１、ＨＯＸ−Ｂ６、ＹＢ−１、オステオネクチン、及びＩＬＦ３、ＩＧＦ−１が含まれる。標的とされる他の抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ１５４、免疫グロブリン様レセプタ等である。
【００７４】
標的部分及び結合部はさらに、トランスフェリン、葉酸及びその誘導体（例えば、葉酸塩）、並びに、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β（リンフォトキシン、ＬＴ）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）、ＬＩＧＨＴ、４１ＢＢ等の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーメンバー及びＴＮＦレセプタを含む。
【００７５】
第２のドメインが標的ドメイン又は結合ドメインを含み又はこれらの標的ドメイン又は結合ドメインからなる融合コンストラクトは、次のものを生成し又は発現する細胞に結合することができる。つまり、融合コンストラクトは、抗原、レセプタもしくはリガンド、インテグリン、抗体もしくは抗原、又は第２のドメインが結合するＴＡＡを生成し又は発現する細胞に結合することができる。細胞の例には、過増殖性細胞及び異常な又は有害な過増殖を示す細胞が含まれる。一実施例において、このような細胞には、非転移性及び転移性の新生物細胞、癌細胞、腫瘍細胞及び悪性腫瘍細胞、並びに、播種性の新生物細胞、癌細胞、腫瘍細胞及び悪性腫瘍細胞及び休眠状態の新生物細胞、癌細胞、腫瘍細胞及び悪性腫瘍細胞が含まれる。さらなる例には、例えば、新生物、癌、又は腫瘍の血管系の輪郭を形成する内皮細胞などの血管系の細胞が含まれる。抗原、レセプタ、リガンド、インテグリン、ＴＡＡ等を、非標的（例えば、通常）の細胞又は非過剰増殖細胞と比較して高レベルまで発現させる細胞は、かかる細胞に対する選択性を提供する。このように、標的部もしくは結合部は、過増殖性細胞（例えば、非転移性及び転移性の新生物、癌、腫瘍及び悪性腫瘍、並びに、播種性で休眠状態の新生物細胞、癌細胞、腫瘍細胞及び悪性腫瘍細胞）などの標的細胞において発現され、又はそのような標的細胞によって生成される抗原、レセプタ、リガンド、インテグリン又はＴＡＡに結合することができる。これらの抗原、レセプタ、リガンド、インテグリン又はＴＡＡは、通常の細胞又は非過増殖性細胞によっては、検出可能な程度までは発現されず、又は、相対的に低レベルで生成され又は発現される。これにより、選択的に細胞が標的化される。抗原、レセプタ、リガンド、インテグリン又はＴＡＡを発現する細胞又は組織の種類には、例えば、乳腺細胞、卵巣細胞、子宮細胞、頸部細胞、前立腺細胞、精巣細胞、副腎細胞、下垂体細胞、膵臓細胞、肝臓細胞、胃腸細胞、皮膚細胞、筋肉細胞、子宮内膜細胞、及び血管系細胞が含まれる。
【００７６】
結合部の例には、抗体及び抗体断片がさらに含まれる。「抗体」は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、及びこれらのサブクラス等のあらゆるモノクロナール免疫グロブリン分子又はポリクロナール免疫グロブリン分子を意味する。ＩｇＧのサブクラスの例には、ＩｇＧ1，  ＩｇＧ2，  ＩｇＧ3，及び  ＩｇＧ4がある。抗体には、Ｂ細胞等の細胞によって生成され又は当該細胞において発現されるものが含まれる。抗体断片又は抗体部分配列は、比較完全長抗体の少なくとも部分的な抗原結合能を有する完全長抗体の一部分を表す。抗体断片の具体的な例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖｓ  （ｓｄＦｖ）、ＶL、ＶH、三重特異性（Ｆａｂ3）、二重特異性（Ｆａｂ2）、二重特異性抗体（（ＶL−ＶH）2又は（ＶH−ＶL）2）、三重特異性抗体（三価）、四重特異性抗体（四価）、小型特異性抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）（（ｓｃＦｖ−ＣH３）2）、二重特異性単鎖Ｆｖ（Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ）、ＩｇＧｄｅｌｔａＣH２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）2−Ｆｃ、又は完全な免疫グロブリンの他の抗原結合断片が含まれる。
【００７７】
融合コンストラクトには、アミノ末端に第１のドメインを有するとともにカルボキシル末端に第２のドメインを有するものが含まれる。また、融合コンストラクトには、カルボキシル末端に第１のドメインを有するとともにアミノ末端に第２のドメインを有するものが含まれる。さらにドメインが存在する場合には（例えば、第３、第４、第５、第６、第７ドメイン等）、第１のドメインが第２のドメインに対してＮＨ2末端に配置されるか、又は、第２のドメインが第１のドメインに対してＮＨ2末端に配置される。
【００７８】
ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ、及び、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫ等の様々なアミノ酸配列の部分配列及びアミノ酸置換、又は、結合部も含まれる。一実施形態において、第１又は第２のドメインの部分配列は、少なくとも５から１０、１０から１５、１５から２０、２０から２５、２５から３０、３０から３５又はそれ以上のアミノ酸残基を有する。
【００７９】
したがって、本発明は、第１又は第２のドメインのいずれか又は両方の置換、付加、欠失等の修飾や変異を含む。このように、ペプチド配列の第１又は第２のドメインを含む融合コンストラクトは、第１又は第２のドメインの活性（溶解又は結合）を破壊しない限り、あらゆる数の保存又は非保存アミノ酸置換を組み込むことができる。このように、例えば、修飾された溶解部（第１のドメイン）は、修飾されていない第１のドメインが有する細胞破壊やアポトーシス等の溶解活性を少なくとも部分的に有し、修飾された結合部又はその模倣体は、修飾されていない結合部の結合活性を少なくとも部分的に有する。
【００８０】
“同類置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）”とは、生物学的に、化学的に又は構造的に類似の残基によって、一つのアミノ酸を置換することである。生物学的に類似するとは、置換が溶解活性等の生物学的活性に適合することを意味する。構造的に類似であるとは、アラニン、グリシン、及びセリンなどのようにアミノ酸が類似の長さを有する、又は類似のサイズを有する側鎖を持ち、又は両親媒性のアルファへリックスのように第１、第２、又はさらなるドメインの構造が維持されることを意味する。化学的に類似するとは、残基が同じ極性に帯電しているか、両者ともに親水性又は疎水性であることを意味する。この例には、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニン等の疎水性残基の置換が含まれ、さらに極性残基の置換が含まれ、さらに、リジンのアルギニンによる置換、アスパラギン酸のグルタミン酸による置換、又は、アスパラギンのグルタミンによる置換、トレオニンのセリンによる置換等が含まれる。融合コンストラクト変異体が溶解活性や結合活性等の活性を有するかを定めるには、ルーチン分析が用いられる。
【００８１】
実施例には、ペプチドの第１又は第２のドメインの単数又は複数のアミノ酸残基（例えば、１−３、３−５、５−１０、１０−２０、又はそれ以上）の置換又は欠失が含まれる。修飾された融合コンストラクトは、参照配列（例えば、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ、もしくはＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫ等の第１のドメイン又は結合部等の第２のドメイン）に対して、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又はそれ以上の同一性を有するペプチド配列を有していてもよい。
【００８２】
一実施形態において、融合コンストラクトは、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ、及び、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫから選択されるペプチドを含む１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７もしくは２８のＬ−アミノ酸配列残基又はＤ−アミノ酸配列残基を含み、又は当該Ｌ−アミノ酸配列残基又はＤ−アミノ酸配列残基からなるペプチドの第１のドメインを含む。ここで、単数又は複数のＫ残基はＦ残基又はＬ残基で、単数又は複数のＦ残基はＫ残基、Ａ残基又はＬ残基で、単数又は複数のＡ残基はＫ、Ｆ残基又はＬ残基でそれぞれ置換される。他の実施形態において、融合コンストラクトは、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ、及び、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫから選択されるＬ−又はＤ−アミノ酸配列からなるペプチドの第１のドメイン、及び、結合部を含み又は結合部からなるペプチドの第２のドメインを含む。ここで、単数又は複数のＫ残基はＦ残基又はＬ残基で、単数又は複数のＦ残基はＫ残基、Ａ残基又はＬ残基で、単数又は複数のＡ残基はＫ、Ｆ残基又はＬ残基でそれぞれ置換される。さらに他の実施例において、融合コンストラクトは、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ、及び、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫから選択されるＬ−又はＤ−アミノ酸配列からなるペプチドの第１のドメインと、１−２５のＬ−又はＤ−アミノ酸配列（例えば、標的部もしくは結合部）からなり第１のドメインと異なるペプチドの第２のドメインと、を含み、又は、当該第１のドメインと当該第２のドメインとからなる。ここで、単数又は複数のＫ残基はＦ残基又はＬ残基で、単数又は複数のＦ残基はＫ残基、Ａ残基又はＬ残基で、単数又は複数のＡ残基はＫ、Ｆ残基又はＬ残基でそれぞれ置換される。
【００８３】
「同一（ｉｄｅｎｔｉｄｙ）」、「相同（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」及びこれらの文法的変形は、２つ以上の実体が同じであることを意味する。２つのアミノ酸配列が同一である場合には、これらは同じアミノ酸配列を持つ。「同一のエリア（ａｒｅａ）、領域（ｒｅｇｉｏｎ）又はドメイン（ｄｏｍａｉｎ）」は、２つ以上の実体の一部分が同じであることを意味する。このように、２つのアミノ酸配列は、単数又は複数の配列領域（ｒｅｇｉｏｎ）において同一又は相同であり、これらの領域で共に同一性を有する。「相補的」という用語は、核酸配列を示す際に用いた場合、対象領域が１００％相補的であること、すなわち、不一致なしの１００％ベースの対形成を示すことを意味する。
【００８４】
構造的及び機能的に関連するタンパク質間における配列保存の量は様々なので、機能や活性（例えば、溶解又は結合）を保持するために必要な配列同一性の量は、そのタンパク質、領域、及びその領域の機能や活性に依存する。例えば、溶解ペプチド配列については、多重ＰＮＮＰＮＮＰ配列繰り返しパターン又は繰り返しモチーフは存在しえるが、単数又は複数の連続した又は途中で途切れたＰＮＮＰＮＮＰ配列繰り返しパターン又は繰り返しモチーフは存在する必要がない。
【００８５】
２つの配列の間の一致の程度は、当該技術分野で知られたコンピュータプログラム及び数値計算アルゴリズムを使用して確かめることができる。このような配列パーセント一致率（相同性）を計算するアルゴリズムは、通常、比較領域における配列ギャップ及び不一致を計算する。例えば、ＢＬＡＳＴ（例えば、ＢＬＡＳＴ２．０）探索アルゴリズム（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３、１９９０年（ＮＣＢＩを通じて入手可能）を参照）は、例として、次のような検索パラメータを使用している：Ｍｉｓｍａｔｃｈ  −２；  ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ５；  ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ２。ポリペプチド配列を比較する場合には、典型的には、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを、ＰＡＭ１００，  ＰＡＭ  ２５０，  ＢＬＯＳＵＭ  ６２  又はＢＬＯＳＵＭ  ５０のようなスコアリング行列と組み合わせて使用する。一致の程度を定量化するのに、ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）及びＳＳＥＡＲＣＨ配列比較プログラムも使用されている（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８年）；  Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １３２：１８５（２０００年）；  及びＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５（１９８１年））。ドロネー（Ｄｅｌａｕｎａｙ）ベースの位相マッピングを使用して、タンパク質構造類似性を定量化するプログラムも開発されている（Ｂｏｓｔｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３０４：３２０（２００３年））。
【００８６】
個々の残基及び第１、第２、及び付加ドメインは、共有結合又は非共有結合によって結合されてもよい。共有結合の非限定的な例としては、アミド結合、非天然及び非アミド化学結合があり、これらは例えば、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、又はＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を含む。アミド結合に代わる連結基には、例えば、ケトメチレン（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−に代えて−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2−）、アミノメチレン（ＣＨ2−ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ＝ＣＨ）、エーテル（ＣＨ2−Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ2−Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ4−）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、又はエステル（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ（１９８３年），  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｖｏｌ．  ７，  ｐｐ  ２６７−３５７，  “Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，”  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，  ＮＹを参照）がある。
【００８７】
第１及び第２のドメインは、共有結合又は非共有結合によってただちに融合又は結合されて互いに近接する。第１及び第２のドメインは、第１及び第２のドメイン間に位置するヒンジ、スペーサ、リンカー等の介在領域によって分離される。リンカ又はスペーサの例としては、連続的炭素原子（Ｃ）鎖（例えば、ＣＣＣＣＣ）などの非ペプチドリンカ又はスペーサがある。複数炭素鎖は、グルタル酸、コハク酸及びアジピン酸等のカルボン酸（例えば、ジカルボン酸）を含む。具体的な例としては、アルファ−アミノカプロン酸などの六炭素リンカがあるが、これには限定されない。
【００８８】
他の実施形態において、第１及び第２のドメインは、第１及び第２のドメイン間に位置するアミノ酸、又はペプチドのヒンジ、スペーサ又はリンカーによって結合される。ペプチドのヒンジ、スペーサ又はリンカー配列は、どのような長さでもよいが、典型的には、およそ１−１０、１０−２０、２０−３０、３０−４０、又は４０−５０アミノ酸残基の範囲に分布している。一実施形態において、第１及び第２のドメイン間に位置するペプチドのヒンジ、スペーサ又はリンカーは、１から２５のＬ−又はＤ−アミノ酸残基か、又は１から６Ｌ−又はＤ−アミノ酸残基である。第１及び第２のドメインの間に位置する配列に含まれる具体的なアミノ酸残基には、Ａ、Ｓ、又はＧアミノ酸残基のうちの一又は複数が含まれる。第１及び第２のドメインの間に位置するペプチドの具体的な例としては、以下に含まれる配列があるが、これには限定されない。ＧＳＧＧＳ、ＡＳＡＡＳ、又は特定のリンカ配列の反復（ＧＳＧＧＳ）ｎ又は（ＡＳＡＡＳ）ｎ、ここでｎ＝１−５，５−１０，１０−２０など。アミノ酸及びペプチドの誘導体が２つ（又はそれ以上）のドメインの間に位置してもよい。アミノ酸誘導体の具体的な例としては、リジン誘導体があるが、これには限定されない。
【００８９】
ヒンジ、スペーサもしくはリンカー、又は第３、第４、第５、第６、第７ドメイン等を有する又は有しない融合コンストラクトは、全体が天然アミノ酸、合成非天然アミノ酸又はアミノ酸アナログからなるか、又は、誘導化型を含む。様々な実施形態において、融合コンストラクトは、第１又は第２のドメインにおいて、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸とＬ−アミノ酸との混合物、又は全体がＤ−アミノ酸残基からなる配列を置換する単数又は複数のＤ−アミノ酸を含む。
【００９０】
融合コンストラクトは、非天然の構造を有する構成要素の任意の組合せを含むことができ、これらの構成要素は以下の３つの構造グループからなる。ａ）天然のアミド結合（「ペプチド結合」）以外の残基連結グループ、ｂ）自然に発生するアミノ酸残基の代わりの非天然残基、又はｃ）二次的な構造的擬態を誘発する、すなわち、二次的な構造、例えばアルファへリックスコンフォーメーションを誘発又は安定化する残基。融合コンストラクトは、分子内又は分子間ジスルフィド結合のアミノ末端とカルボキシル末端との末端アミド結合等の環状構造を含む。融合コンストラクトは、インビトロ又はインビボで修飾される。例えば、糖類又は炭水化物残基、リン酸基、脂肪酸、脂質等を含むように翻訳後修飾される。
【００９１】
付加の例には、第３、第４、第５、第６、又は第７のドメインが含まれる。このように、第１及び第２のドメインを有する融合コンストラクトは、共有結合により連結されて別個の又は補完的な機能や活性を与える単数又は複数の付加ドメイン（第３、第４、第５、第６、第７のドメイン等）を含む。付加的なドメインの例としては、単離を容易にするドメインがあり、このドメインは例えば、固定された金属に対する精製を可能にするポリヒスチジントラクト及びヒスチジントリプトファンモジュールなどの金属キレートペプチド、固定された免疫グロブリンに対する精製を可能にするプロテインＡドメイン、及びＦＬＡＧＳ拡張／親和性精製システムで用いられるドメイン（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ，  Ｓｅａｔｔｌｅ  ＷＡ）を含む。精製ドメインと融合コンストラクトとの間に、第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼ等の開裂可能な配列を入れることもまた、精製を促進するために利用できる。例えば、発現ベクターは、チオレドキシン及びエンテロキナーゼ開裂部位に先立つ６個のヒスチジン残基に連結する融合コンストラクト−コード核酸配列を含んでもよい。このヒスチジン残基は、融合コンストラクトの検出及び生成を促進し、エンテロキナーゼ開裂部位は、タンパク質の残部から融合コンストラクトを精製する手段を提供する（例えば、Ｋｒｏｌｌ，  ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １２：４４１（１９９３）参照。）。
【００９２】
融合コンストラクトの活性は様々な因子によって影響をうけるので、融合コンストラクトは、単数又は複数のそのような因子を考慮に入れて生成又は最適化される。このような因子には、融合コンストラクトの長さが含まれる。融合コンストラクトの長さは、細胞に対する毒性に影響を与えることがある。細胞溶解性ペプチドドメインを形成するアルファへリックスの細胞殺滅活性は、当該へリックスの安定性にも依存し得る。ヒンジ及びスペーサは、第１のドメインの膜相互作用及びペプチド溶解ドメインのヘリカル構造に影響を与えることがある。例えば、スペーサ又はヒンジを含むことができる２１以下のアミノ酸で構成されるコンストラクト等のより短い融合コンストラクトは、ヘリックスがより安定しているため、より強い細胞毒性を示すことがある。特に、ＡＳＡＡＳや６−アミノカプロン酸等のスペーサは、相対的に短い融合コンストラクトの毒性を増加させる傾向がある。ドメインに存在する特定のアミノ酸残基によって定められる溶解ペプチドドメインの帯電も殺細胞能に影響を与えることがある。
【００９３】
溶解ドメイン（Ｎ末端又はＣ末端）に対する結合部の位置も融合コンストラクトの殺細胞活性に影響を与えることがある。例えば、溶解ドメインに対してＣ末端に配置されている結合部は、溶解ドメインに対してＮ末端に配置される場合よりも大きな殺細胞活性を有する。
【００９４】
天然に存在しないアミノ酸や誘導体を単数又は複数有する融合コンストラクトペプチドドメインを構成することによって、融合コンストラクトの生体内半減期が増加し得る。例えば、Ｄ−アミノ酸（例えば、全残基の３０％以上がＤ光学異性体である）を有する融合コンストラクトは、タンパク質分解に耐性があるため、より長期間活性を保つことができ、これによりインビボでの効果を増加させることができる。また、天然に存在しないアミノ酸や誘導体を単数又は複数有する融合コンストラクトペプチドドメインを構成することによって、溶血活性を減少させることができる。このようなＤ光学異性体を有する融合コンストラクトは、溶液中でモノマーになる傾向が強く、顕著な凝集は起こらない。
【００９５】
本発明によれば、単数又は複数のＰｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１−ＧＳＧＧＳ−βＣＧ−ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１−ＡＳＡＡＳ−βＣＧ−ａｌａ、又はＰｈｏｒ１４−βＣＧ−ａｌａよりも高い抗細胞増殖性を有する融合コンストラクトが提供される。高い抗細胞増殖性を有することは、低ＩＣ50値で確認される。ＩＣ50値は、細胞毒性を実現するために必要な融合コンストラクトの量を示す。また、本発明によれば、Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１−ＧＳＧＧＳ−βＣＧ−ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１−ＡＳＡＡＳ−βＣＧ−ａｌａ、又はＰｈｏｒ１４−βＣＧ−ａｌａよりも低い溶血活性を有する融合コンストラクトが提供される。溶血活性が低いことは、ＩＣ50／ＨＡ50比（溶血活性）によって示される。本発明によれば、０．０２、０．０１、又は０．００５よりも小さな溶血活性を有する融合コンストラクトがさらに提供される。この溶血活性は、ＩＣ50／ＨＡ50比（溶血活性）によって表される。細胞毒性及び溶血活性を測定するための代表的な分析条件は、実施例１において示される。
【００９６】
ペプチド及びペプチド模倣体は、当業者に知られた手法を用いて生成され単離される。ペプチドは、当業者に知られた化学的手法によって、その全体又は一部が合成される（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  （１９８０）．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．  ２１５；  Ｈｏｒｎ  （１９８０）及び  Ｂａｎｇａ，  Ａ．Ｋ．，  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （１９９５）  Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，  ＰＡを参照。  ）。ペプチドの合成は、様々な固相法（例えば、Ｒｏｂｅｒｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２  （１９９５年）；  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２８９：３（１９９７年）参照）を用いて行うことができ、また、製造者の指示に従って、例えば、ＡＢＩ  ４３１Ａ  ペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、自動化合成を実現してもよい。ペプチド及びペプチド模倣体は、組み合わされた手法を用いて実現することもできる。模倣体を含んでいる合成残基及びポリペプチドは、本発明の技術分野において知られている様々な手法及び手段を用いて合成される（例えば、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ  Ｖｏｌｕｍｅｓ，  Ｇｉｌｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ｅｄｓ）  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  ＮＹを参照）。化学修飾法を用いて修飾されたペプチドを生産することができる（例えば、Ｂｅｌｏｕｓｏｖ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３４４０  （１９９７年）；  Ｆｒｅｎｋｅｌ，  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．  １９：３７３  （１９９５年）；  ａｎｄ  Ｂｌｏｍｍｅｒｓ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：７８８６  （１９９４年）参照）。
【００９７】
本発明によれば、本発明の融合コンストラクトをコードする核酸、及び、融合コンストラクトをコードする核酸を含むベクターが提供される。一実施例における核酸は、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ、及び、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫから選択されるペプチド配列を含む１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７もしくは２８のアミノ酸配列残基からなる第１のドメインと、標的部もしくは結合部を含み又は標的部もしくは結合部からなる第２のドメインと、を含む融合コンストラクトをコードする。他の実施形態において、核酸は、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ、及び、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫから選択されるアミノ酸配列からなる第１のドメインと、標的部もしくは結合部を含み又は当該標的部もしくは当該結合部からなる第２のドメインと、を含む融合コンストラクトをコードする。さらに他の実施形態において、核酸は、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ、及び、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫから選択されるアミノ酸配列からなる第１のドメインと、１−２５のアミノ酸配列（例えば、標的部もしくは結合部）からなり第１のドメインと異なる第２のドメインと、を含む融合コンストラクトをコードし、又は、当該第１のドメインと当該第２のドメインとからなる融合コンストラクトをコードする。
【００９８】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド配列、プライマ、オリゴヌクレオチドまたはプローブとも称されうる核酸は、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドまたは混合されたポリリボ―ポリデオキシリボヌクレオチドおよびそのαアノマー型のいずれかである任意の長さの、自然または修飾されたプリンおよびピリミジン含有ポリマーをさす。２つ以上のプリン及びピリミジン含有ポリマーは、典型的には、リン酸エステル結合やリン酸エステル類似体によって連結される。これらの用語は互いに同じ意味で用いられ、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む全ての形態の核酸を示すために用いられる。核酸は、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖のいずれであってもよく、直線状であっても環状であってもよい。核酸には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及びアンチセンスＤＮＡが含まれる。ＲＮＡ核酸は、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡのいずれであってもよく、これらはスプライシングされていてもされていなくともよい。核酸には、自然に存在するもの、人工的に合成されたものが含まれ、ヌクレオチド類似体及び誘導体も含まれる。
【００９９】
遺伝情報の縮重の結果、核酸には、本発明の融合コンストラクトをコードする配列を縮重する配列が含まれる。このように、融合コンストラクトをコードする縮重核酸配列が提供される。
核酸は、数多く知られている標準的なクローン合成手法及び化学的合成手法を用いて生成される。また、部位特異的突然変異誘発法やその他の当業者に知られた組み換え技術によって、意図的に核酸を変異させることができる。ポリヌクレオチドの純度は、シークエンシング、ゲル電気泳動法、又は紫外分光測定法によって定めることができる。
【０１００】
核酸は核酸構造体の中に挿入され、その中で核酸の発現は、本明細書において「発現カセット」と呼ばれる「発現制御要素」によって影響され、又は調整されている。「発現抑制要素」という用語は、核酸配列の発現を調整し又はそれに影響する一又は複数の核酸配列要素を指す。発現制御要素には、適宜、プロモータ、エンハンサー、転写ターミネータ、遺伝子サイレンサー、タンパク質をコードする遺伝子に先立つ開始コドン（例えば、ＡＴＧ）等が含まれる。
【０１０１】
核酸配列に機能可能に連結される発現制御要素は転写を制御し、必要に応じて核酸配列の翻訳も制御する。「機能可能に連結した」という用語は、参照された要素が、その意図した方法で機能することを許容する関係にある並列（ｊｕｘｔａｐｏｓｉｔｉｏｎ）を表す。典型的には、発現制御要素は、遺伝子の５´末端又は３´末端に並列されるが、イントロンであってもよい。
【０１０２】
発現制御要素には、構造的に転写を活性化する要素が含まれる。発現制御要素は、誘導的（つまり、活性化のために外部信号を必要とする）、又は、抑制解除的（つまり、転写をオフにする信号を必要とし、その信号が存在しなくなると、転写が活性化され又は「抑制解除される」）である。本発明の発現カセットには、特定種類の細胞や組織について遺伝子発現を制御可能にする制御因子がさらに含まれる（つまり、組織特異的な制御因子である。  ）。このような制御因子は、典型的には、コード配列の上流又は下流（つまり、５´及び３´）に位置する。プロモータは、一般的に、コード配列の５´に位置する。プロモータは、ＤＮＡ組み換え又は合成技術によって生成され、プロモータを用いて本発明のポリヌクレオチドの転写が行われる。「プロモータ」という用語は、転写を行わせるための最小限の配列要素を意味する。
【０１０３】
核酸は、プラスミドへ挿入されて宿主細胞の中へ複製され、必要に応じて遺伝子操作のために用いられる。プラスミドは、宿主細胞において安定的に増殖することができる核酸である。プラスミドは、核酸の発現を引き起こすために発現制御要素を含んでいてもよい。ベクターという用語は、本明細書においてプラスミドの同意語として用いられ、宿主細胞における発現のための発現制御要素という意味を含むことがある。プラスミド及びベクターは、一般的に、細胞内での増殖のための複製起点及びプロモータを含む。プラスミド及びベクターは、例えば、核酸をコードする融合コンストラクトの遺伝子操作、融合コンストラクトやアンチセンス核酸の生成、及び、宿主細胞や有機体における融合コンストラクトの発現のために用いられる。
【０１０４】
細菌系プロモータは、Ｔ７、及びバクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモータ）、及びテトラサイクリン応答性プロモータなどの誘導性プロモータを含む。昆虫細胞系プロモータには、構成的プロモータ又は誘導性プロモータ（例えば、エクジソン）が含まれる。哺乳類細胞の構成的プロモータには、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）及びその他のウイルスプロモータ、又は、哺乳類細胞のゲノム由来の誘導性プロモータ（例えば、メタロチオネインＩＩＡプロモータや熱ショックプロモータ）、又は、哺乳類ウイルス由来のプロモータ（例えば、アデノウイルス後期プロモータや誘導性のマウス乳癌ウイルスの長い末端反復）が含まれる。また、レトロウイルスゲノムは遺伝子的に修飾されて、適当な宿主細胞において融合コンストラクトの発現を導入し指令することができる。
【０１０５】
発現系は、インビボ用途に準備されたベクターをさらに含む。このようなベクターの例には、アデノウイルスベクター（米国特許第５，７００，４７０号及び５，７３１，１７２号参照）、アデノウイルス関連性ベクター（米国特許第５，６０４，０９０号参照）、単純ヘルペスウイルスベクター（米国特許第５，５０１，９７９号参照）、レトロウイルスベクター（米国特許第５，６２４，８２０号、５，６９３，５０８号及び５，６７４，７０３号参照）、ＢＰＶベクター（米国特許第５，７１９，０５４号参照）及びＣＭＶベクター（米国特許第５，５６１，０６３号参照）が含まれる。
【０１０６】
酵母ベクターは、構成的および誘導性プロモータを含む（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻、第１３章、編，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ．＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８；Ｇｒａｎｔ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６（１９８７），編．Ｗｕ  ＆  Ｇｒｏｓｓｍａｎ；Ｂｉｔｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５２：６７３（１９８７），編．Ｂｅｒｇｅｒ  ＆  Ｋｉｍｍｅｌ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；およびＳｔｒａｔｈｅｒｎ等、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（１９８２）編．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，第ＩおよびＩＩ巻を参照）。ＡＤＨまたはＬＥＵ２等の構成的イーストプロモータまたはＧＡＬ等の誘導性プロモータが用いられうる（Ｒ．Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第１１巻、第３章、編．Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，ワシントンＤ．Ｃ．，１９８６）。例えば相同的組み換えによる、イースト染色体への外来核酸配列の組み入れを促進するベクターは、従来技術において周知である。挿入されるポリヌクレオチドが、従来のベクターに大きすぎる（例えば約１２Ｋｂ以上）場合に、イースト人工染色体（ＹＡＣ）が典型的に使用される。
【０１０７】
発現ベクターは、選択圧に対する抵抗を付与する選択マーカー又は同定可能なマーカー（例えば、β−ガラクトシダーゼ）を含むことができ、これにより、ベクターを有する細胞が選択され、成長され、また、増大される。また、選択マーカーは、融合コンストラクトをコードする核酸を含む第１のベクターとともに宿主細胞に導入される第２のベクターに含まれていてもよい。
【０１０８】
選択系は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １１：２２３  （１９７７））、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ４８：２０２６  （１９６２））、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ２２：８１７｀（１９８０））を含むがこれらに限られない。これらの遺伝子は、ｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞又はａｐｒｔ細胞内でそれぞれ用いられる。さらに、抗代謝耐性が、メトトレキセートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｏ’Ｈａｒｅ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７（１９８１））；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ遺伝子（Ｍｕｌｌｉｇａｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））；アミノグリコシドＧ―４１８に対する耐性を与えるネオマイシン遺伝子（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ―Ｇａｒａｐｉｎ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１））；ピューロマイシン；およびハイグロマイシンに対する耐性を与えるハイグロマイシン遺伝子（Ｓａｎｔｅｒｒｅ等、Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４））の選択の基礎として用いられうる。追加的な選択可能遺伝子には、細胞がトリプトファンに代えてインドールを利用することを許容するｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンに代えてヒスチノールを利用することを許容するｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：８０４７（１９８８））；およびオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤２―（ジフルオロメチル）―ＤＬ―オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を与えるＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）が含まれる。
【０１０９】
融合コンストラクトを発現する宿主細胞、並びに、融合コンストラクトをコードする核酸及び融合コンストラクトをコードする核酸を含むベクターを用いて形質転換される宿主細胞も提供される。一実施形態において、宿主細胞は、原核細胞である。他の実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。様々な態様において、真核細胞は、イースト細胞又は哺乳類細胞（例えば、ヒト、霊長類等）である。
【０１１０】
本明細書における用法の通り、「宿主細胞」は、核酸が導入された細胞である。ここで、核酸は、増殖、転写、又はコード化された発現融合コンストラクトであってもよい。「宿主細胞」という用語には、宿主細胞の子孫細胞やサブクローンも含まれる。宿主細胞には、融合コンストラクトを発現する細胞及び融合コンストラクトを発現しない細胞が含まれる。融合コンストラクトを発現しない宿主細胞は、融合コンストラクトをコードする核酸やアンチセンスを含む核酸やベクターを増殖するために用いられる。
【０１１１】
宿主細胞には、バクテリアやイースト等の微生物、植物細胞、昆虫細胞及び哺乳類細胞が含まれるが、これらには限定されない。例えば、組み替えファージ核酸発現ベクター、プラスミド核酸発現ベクター又はコスミド核酸発現ベクターを用いて形質転換されたバクテリア、組み替えイースト発現ベクターを用いて形質転換されたイースト、組み替えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）やタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））で感染され、又は、組み替えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系、組み換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系、及び、組み換えウイルス発現ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）で感染された動物細胞系、又は、一過性又は安定的な増殖又は発現のために操作された形質転換動物細胞系も含まれる。
【０１１２】
融合コンストラクト、融合コンストラクトをコードする核酸、ベクター、及び融合コンストラクトを発現させ又は融合コンストラクトをコードする核酸及びアンチセンスで形質転換された宿主細胞は、単離され精製された形態を含む。「単離された」という用語は、発明の構成要素を修飾するために用いられる場合には、組成物が人工的に作成され、又は、自然に存在するインビボ環境から実質的に完全に又は部分的に分離されることを意味する。一般的に、単離された組成物は、単数又は複数のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、細胞膜等のように天然に普通に存在する単数又は複数の物質を実質的に含まない。「単離された」という用語は、組成物の代替的な物理的形態を除外するものではない。代替的な物理的形態は、例えば、マルチマー／オリゴマー、変異体、修飾体、誘導体、又は人工的に生成された宿主細胞で発現される形態である。「単離された」という用語は、人工的に生成されたものの組み合わせが存在する形態（例えば、医薬組成物及び医薬組み合わせ組成物）を排除しない。
【０１１３】
「単離された」組成物は、その組成物が自然において典型的に結びつく物質の一部、大部分、又は全ての部分が存在しない場合に、「精製され」ている。このように、単離され、また、実質的に純粋な融合コンストラクトは、タンパク質ライブラリのタンパク質又はゲノムライブラリやｃＤＮＡライブラリにおける核酸等の、数百万もの他の配列中に存在するポリペプチドやポリヌクレオチドを含まない。「精製された」組成物は、単数又は複数の他の分子と組み合わせられる。
【０１１４】
本発明によれば、融合コンストラクトの混合物及び組み合わせ組成物が提供される。一実施形態に係る混合物には、単数又は複数の融合コンストラクト及び薬学的に許容されたキャリア又は賦形剤が含まれる。他の実施形態における混合物には、単数又は複数の融合コンストラクト及び抗細胞増殖治療薬、抗腫瘍治療薬、抗癌治療薬もしくは抗新生物治療薬又は抗細胞増殖剤、抗腫瘍剤、抗癌剤もしくは抗新生物剤が含まれる。さらに他の実施形態における混合物には、単数又は複数の融合コンストラクト及び免疫増強剤が含まれる。薬学的に許容されたキャリア又は賦形剤に含まれる単数又は複数の融合コンストラクト等の混合物であって、単数又は複数の抗細胞増殖治療薬、抗腫瘍治療薬、抗癌治療薬もしくは抗新生物治療薬又は抗細胞増殖剤、抗腫瘍剤、抗癌剤もしくは抗新生物剤と、免疫増強剤とを組み合わせたものが提供される。
【０１１５】
本発明の融合コンストラクト、例えば、第１の溶解ドメイン及び第２の結合部ドメインを含むアミノ酸配列を有するポリペプチド等は、標的細胞を溶解させ、細胞死させ又はアポトーシスさせるために用いられる。このような細胞は、選択的に標的とされる。例えば、レセプタ、リガンド、抗原又は抗体を発現する細胞は、融合コンストラクトによって標的とされ、レセプタ、リガンド、抗原又は抗体の発現が少ない細胞と比較して、特異的に破壊される。
【０１１６】
本発明によれば、細胞の増殖を減少させ阻害する方法が提供され、また、細胞増殖を減少させ又は阻害する方法が提供される。一実施形態における方法は、細胞を、過剰増殖細胞の増殖を減少させ阻害するために十分な量の融合コンストラクトに接触させることを含む。他の実施形態における方法は、細胞増殖を減少させ阻害するために十分な量の融合コンストラクトに細胞を接触させることを含む。
【０１１７】
さらなる実施形態として、過剰増殖細胞（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）の増殖を減少させ阻害する方法、及び過増殖性細胞（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ）の増殖をを減少させ阻害する方法が提供される。一実施形態における方法は、過剰増殖細胞又は過増殖性細胞を、増殖を減少させ阻害するために十分な量の融合コンストラクトと接触させることを含む。
【０１１８】
さらなる実施形態として、非転移性の又は転移性の新生物細胞、癌細胞、腫瘍細胞及び悪性腫瘍細胞の増殖を減少させ阻害させる方法が提供される。一実施形態における方法は、新生物細胞、癌細胞、腫瘍細胞及び悪性腫瘍細胞を、当該細胞の増殖を減少させ阻害するために十分な量の融合コンストラクトに接触させることを含む。
【０１１９】
さらなる実施形態として、休眠状態又は非分裂性で非転移性又は転移性の新生物細胞、癌細胞、腫瘍細胞及び悪性腫瘍細胞の増殖を減少させ阻害させる方法が提供される。一実施形態における方法は、休眠状態又は非分裂性の新生物細胞、癌細胞、腫瘍細胞及び悪性腫瘍細胞を、休眠状態又は非分裂性の細胞の増殖を減少させ阻害するために十分な量の融合コンストラクトに接触させることを含む。
【０１２０】
追加の実施形態として、レセプタ、リガンド、抗体又は抗原を発現させる細胞（例えば、過剰増殖細胞）の増殖を選択的に減少させ又は阻害する方法が提供される。一実施形態における方法は、細胞（例えば、過剰増殖細胞）を、当該細胞の増殖を減少させ又は阻害するために十分な量の融合コンストラクトに接触させることを含み、当該細胞によって発現されるレセプタ、リガンド又は抗原にペプチドの結合部が結合する。
【０１２１】
さらに追加の実施形態として、レセプタ、リガンド、抗体又は抗原を発現させる新生物細胞、腫瘍細胞、癌細胞又は悪性腫瘍細胞の増殖を選択的に減少させ阻害させる方法が提供される。一実施形態における方法は、新生物細胞、腫瘍細胞、癌細胞又は悪性腫瘍細胞の増殖を減少させ又は阻害するために十分な量の融合コンストラクトを当該細胞に接触させることを含み、当該細胞によって発現されるレセプタ、リガンド又は抗原に融合コンストラクトの結合部が結合する。
【０１２２】
「接触」という用語は、２つ以上の実体の間（例えば、融合コンストラクトと細胞との間）での直接又は間接の結合又は相互作用を意味する。本明細書で使用されているように、接触には、溶液中で、固相で、インビトロで、エクスビボで、細胞内で、及びインビボでの接触が含まれる。インビボでの接触は、投与と称されることがある。
【０１２３】
増殖を減少させ又は阻害する標的となる細胞は、融合コンストラクトの結合部が結合する分子を発現させる細胞を非選択的又は選択的に含む。細胞の例には、レセプタ（例えば、ホルモンレセプタ、成長因子レセプタ、サイトカインレセプタ、ケモカインレセプタ）、リガンド（例えば、ホルモン、成長因子、サイトカイン、ケモカイン）又は抗体もしくは抗原、又はインテグリンもしくはインテグリンレセプタ（「ＲＧＤ」配列モチーフを含むペプチド）、又は単糖、二糖もしくはオリゴ糖などの細胞外基質（ＥＣＭ）に存在する成分、シアル酸、ガラクトース、マンノース、フコース、アセチルノイラミン酸、「ＲＧＤ」配列モチーフを含むペプチド等を発現する細胞が含まれる。
【０１２４】
標的細胞には、次の物質を発現させる細胞、すなわち、性ステロイドホルモンや性腺ステロイドホルモン又は性ステロイドホルモンレセプタや性腺ステロイドホルモンレセプタを発現させる細胞が含まれる。標的細胞には、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ゴナドトロピン放出ホルモンＩ、ゴナドトロピン放出ホルモンＩＩ、ヤツメウナギＩＩＩ黄体形成ホルモン放出ホルモン、黄体形成ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、メラニン細胞刺激ホルモン、エストラジオール、ジエチルスチルベストロール、ドーパミン、ソマトスタチン、グルココルチコイド、エストロゲン、テストステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、プロゲステロン、アンドロゲン、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ビタミンＨ、葉酸又は葉酸誘導体（例えば、葉酸塩）、トランスフェリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、エンドセリン、ボンベシン、成長ホルモン、血管作動性腸管ペプチド、ラクトフェリン、インテグリン（例えば、α５β１インテグリン）、神経成長因子、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ１５４、免疫グロブリン様レセプタ、ＲＯＲ１、ＩＧＦ−１、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、形質転換成長因子α、形質転換成長因子β、インスリン様成長因子、血管内皮成長因子、インスリン、セルロプラスミン、又はＨＩＶ−ｔａｔと結合するレセプタを発現させる細胞が含まれる。
【０１２５】
標的細胞には、性ステロイドホルモンもしくは性腺ステロイドホルモン又は性ステロイドホルモンレセプタもしくは性腺ステロイドホルモンレセプタに結合するレセプタを発現させる細胞がさらに含まれる。標的細胞には、次の物質に結合するレセプタを発現させる細胞がさらに含まれる。すなわち、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ゴナドトロピン放出ホルモンＩ、ゴナドトロピン放出ホルモンＩＩ、ヤツメウナギＩＩＩ黄体形成ホルモン放出ホルモン、黄体形成ホルモンβ鎖、黄体形成ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、絨毛性ゴナドトロピンβサブユニット、メラニン細胞刺激ホルモン、エストラジオール、ジエチルスチルベストロール、ドーパミン、ソマトスタチン、グルココルチコイド、グルココルチコイド、エストロゲン、テストステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、プロゲステロン、アンドロゲン、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ビタミンＨ、葉酸又は葉酸誘導体（例えば、葉酸塩）、トランスフェリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、エンドセリン、ボンベシン、成長ホルモン、血管作動性腸管ペプチド、ラクトフェリン、インテグリン（例えば、α５β１インテグリン）、神経成長因子、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ１５４、免疫グロブリン様レセプタ、ＲＯＲ１、ＩＧＦ−１、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、形質転換成長因子α、形質転換成長因子β、インスリン、セルロプラスミン、ＨＩＶ−ｔａｔ、又はこれらの類似体（例えば、ミフェプリストン、フルタミンド、ルプロン、ゾラデックス、サプレリン、シナテルトリプトレリン（ｓｙｎａｔｅｌ    ｔｒｉｐｔｏｒｅｌｉｎ）、ブセレリン、セトロレリクス、ガニレリクス、アバレリクス、アンチド、テベレリクス又はデガレリクス（Ｆｅ２００４８６）に結合するレセプタを発現させる細胞が標的細胞にさらに含まれる。
【０１２６】
増殖を減少させ又は阻害する標的細胞には、非選択的又は選択的に、次の物質を発現させる細胞がさらに含まれる。すなわち、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）等の「腫瘍関連抗原」、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＡ１２５（残存上皮性卵巣癌）、可溶性インターロイキン−２（ＩＬ−２）レセプタ、ＲＡＧＥ−１、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、糖タンパク質（ｇｐ）７５、ｇｐ１００、βカテニン、ＰＲＡＭＥ、ＭＵＭ−１、ＺＥＰ１６１、ユビキリン−１、ＨＯＸ−Ｂ６、ＹＢ−１、オステオネクチン、及びＩＬＦ３を発現させる細胞が、増殖を減少させ又は阻害する標的細胞に含まれる。増殖を減少させ又は阻害する標的細胞には、非選択的又は選択的に、次の物質を発現させる細胞がさらに含まれる。すなわち、トランスフェリン、葉酸及び葉酸誘導体（例えば、葉酸塩）、及びＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β（リンフォトキシン、ＬＴ）等の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーメンバー、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）、ＬＩＧＨＴ、及び４１ＢＢ、及びこれらのためのレセプタを発現させる細胞が、増殖を減少させ又は阻害する標的細胞に含まれる。
【０１２７】
融合コンストラクト及び本発明の方法は、有害な又は異常な細胞の増殖及び過増殖疾患を治療するためにも用いられる。このように、本発明によれば、有害な又は異常な細胞の増殖及び過増殖疾患を治療する方法が提供される。一実施形態における方法は、有害な又は異常な細胞の増殖又は過増殖疾患を治療するために十分な量の融合コンストラクトを治療の必要な被験者へ投与することを含む。
【０１２８】
「過増殖疾患」という用語は、有害な又は異常な細胞生存（例えば、プログラムされた細胞死又はアポトーシスに至らないこと）、成長又は増殖を表す。この「過増殖疾患」には、良性過形成、非転移性及び転移性の新生物、癌、腫瘍及び悪性腫瘍が含まれる。有害な又は異常な細胞の増殖及び過増殖疾患は、被験者のあらゆる細胞、組織、臓器に影響を与えうる。有害な又は異常な細胞の増殖及び過増殖疾患は、被験者において、局所的、局部的又は全身にわたって存在する。過増殖疾患は、多くの組織又は臓器において発生しうる。このような組織又は臓器には、次のものが含まれる。すなわち、乳腺、肺（例えば、肺小細胞又は非小細胞）、甲状腺、頭部もしくは頸部、脳、鼻咽頭、咽喉部、鼻部もしくは鼻腔部、リンパ球、副腎、下垂体、甲状腺、リンパ液、胃腸（口腔、食堂、胃、十二指腸、回腸、空腸（小腸）、結腸、直腸）、泌尿生殖器（子宮、卵巣、膣頸部、子宮内膜、卵管、膀胱、睾丸、陰茎、前立腺）、腎臓、膵臓、肝臓、骨、骨髄、リンパ液、血液、筋肉、皮膚、及び幹細胞が過増殖疾患が発生しうる臓器又は組織に含まれる。これらは、他の二次的な部位又は位置へ転移する可能性もしない可能性もある。
【０１２９】
融合コンストラクト及び本発明の方法は、あらゆる細胞、臓器または組織を起源とする転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍又は新生物にも用いることができ、またあらゆる細胞、臓器または組織を起源とする転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍又は新生物の血管系にも用いることができる。このような疾患は、ほとんどあらゆる種類の組織に影響を与え得る。例えば、上皮性悪性腫瘍、肉腫、黒色腫、神経系新生物疾患、及び網内系新生物疾患又は造血細胞新生物疾患（例えば、骨髄腫、リンパ腫又は白血病）に影響を与えうる。
【０１３０】
本明細書で用いられるように、「新生物」及び「腫瘍」という用語は、正常の場合よりも成長、増殖、又は生存が増強された、例えば、細胞増殖又は分化疾患を有する細胞、又は細胞の集団を指す。腫瘍は、他と区別できる腫瘤又は発生物を形成する。「癌」又は「悪性腫瘍」という用語は、近接する場所、組織又は臓器に侵入する可能性がある新生物又は腫瘍を表す。「転移」という用語は、播種性を持ち、又は、原発部位から被験者体内の原発腫瘍又は原発癌から離れた位置にある単数又は複数の二次的位置又は二次的部位へ拡散する新生物、腫瘍、癌又は悪性腫瘍を表す。
【０１３１】
新生物細胞、腫瘍細胞、癌細胞及び悪性腫瘍細胞（転移性又は転移性のもの）は、休眠状態の新生物細胞、腫瘍細胞、癌細胞及び悪性腫瘍細胞又は残存新生物細胞、残存腫瘍細胞、残存癌細胞及び残存悪性腫瘍細胞を含む。通常、このような細胞は分裂していない残存腫瘍細胞から構成される（Ｇ０−Ｇ１停止）。このような細胞は、播種性の新生物細胞、腫瘍細胞、癌細胞又は悪性腫瘍細胞又は微小残存病変として原発部位にとどまる。このような休眠状態の新生物細胞、腫瘍細胞、癌細胞又は悪性腫瘍細胞は無症状であるが、休眠状態の細胞が増殖することによって症状や死に繋がる可能性がある。本発明の方法は、休眠状態の新生物細胞、腫瘍細胞、癌細胞又は悪性腫瘍細胞の増殖を減少させ又は阻害するための用いることができ、これにより、腫瘍、癌、再発、腫瘍又は癌の転移や進行を阻害又は減少させることができる。
【０１３２】
本発明によれば、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍、又は新生物を有する被験者を治療する方法が提供される。一実施形態における方法は、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍又は新生物を治療する（例えば、増殖を減少させ又は阻害する）ために十分な量の融合コンストラクトを治療を必要とする被験者へ投与することを含む。
【０１３３】
転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍、又は新生物は、どの段階にあってもよく、例えば、段階Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖなど、早期の又は進行した段階となり得る。転移性又は
非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍、又は新生物は、前治療が行われたものでも、安定化状態（非進行）でも、寛解状態でもよい。
【０１３４】
転移については、本発明の方法は、原発腫瘍や癌の他の部位への転移や、原発腫瘍や癌から離れた部位における転移性の腫瘍や癌の形成を減少させ又は阻害し、これにより、腫瘍や癌の再発又は腫瘍や癌の進行を阻害し又は減少させることができる。このように、本発明の方法には、例えば、１）転移の可能性があり又は実際に転移している腫瘍細胞又は癌細胞（例えば、播種性腫瘍細胞、ＤＴＣ）の成長、増殖、移動度又は侵潤性を減少又は抑制し、２）原発部位から離れた単数又は複数の部位における原発腫瘍や癌から起こる転移の形成を減少又は抑制し、３）転移が形成された後に原発部位から離れた単数又は複数の他部位において転移が成長し増殖することを減少又は抑制し、及び、４）転移が形成された後にさらに転移が形成されることを減少又は抑制すること、が含まれる。
【０１３５】
転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍又は新生物の細胞は、凝集されて「固形」の細胞塊になることがあり、分散又は拡散されることもある。「固形」腫瘍は、典型的には、凝集して塊を形成する癌、新生物又は転移癌を表す。この例には、黒色腫、乳腺癌、膵臓癌、子宮癌及び卵巣癌、セミノーマを含む精巣癌、胃癌又は結腸癌、肝臓癌、副腎癌、腎臓上皮性悪性腫瘍、膀胱上皮性悪性腫瘍、肺癌、頭部もしくは頸部癌及び脳腫瘍／癌等の内臓腫瘍が含まれる。
【０１３６】
上皮性悪性腫瘍は、上皮組織又は内分泌組織の悪性腫瘍を表し、呼吸器系の上皮性悪性腫瘍、消化器系上皮性悪性腫瘍、泌尿生殖器系の上皮性悪性腫瘍、精巣上皮性悪性腫瘍、乳腺上皮性悪性腫瘍、前立腺上皮性悪性腫瘍、内分泌系上皮性悪性腫瘍、及び黒色腫を含む。上皮性悪性腫瘍の例には、子宮、頸部、肺、前立腺、乳腺、頭部もしくは頸部、結腸、膵臓、睾丸、副腎、腎臓、食堂、胃、肝臓及び卵巣から形成されるものが含まれる。上皮性悪性腫瘍の用語は、例えば、癌組織及び肉腫組織からなる悪性腫瘍等の癌肉腫を含む。腺癌は、腺組織の上皮性悪性腫瘍又は腫瘍が腺様構造を形成する上皮性悪性腫瘍を含む。
【０１３７】
肉腫は、間葉細胞に由来する悪性腫瘍を表す。肉腫の例には、例えば、リンパ肉腫、脂肪肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫及び線維肉腫が含まれる。
【０１３８】
神経系新生物には、神経膠腫、膠芽細胞腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫及びオリゴデンドログリオーマが含まれる。
【０１３９】
通常は固形塊を形成しないためにびまん性の新生物をさす「液性腫瘍」。具体例には、リンパ腫、骨髄腫および白血病等の、細網内皮系または造血系の新生物が含まれる。白血病の例には、急性及び慢性のリンパ芽球性、骨髄芽球性、及び多発性の骨髄腫が含まれる。通常、そのような疾患は、赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病等の未分化の急性白血病から生じる。具体的な骨髄疾患には、以下に限定されることはないが、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）が含まれる。リンパ性悪性疾患には、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）が含まれる。この急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）には、Ｂ細胞系統のＡＬＬ及びＴ細胞系統のＡＬＬ、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＬＬ）ならびにヴァルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）が含まれる。具体的な悪性リンパ腫には、非ホジキンリンパ腫およびその異型、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大型顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病、およびリード―シュテルンベルク病が含まれるがこれに限られない。
【０１４０】
本明細書において述べられているように、有害な又は異常な細胞の増殖又は過増殖疾患は、子宮、乳腺、膣、頸部及び卵管から生じえる。子宮内膜症は、子宮細胞が子宮外で成長することによって、又は、卵巣、膀胱又は腸管等の子宮外の領域へ成長することによって発生する。子宮筋腫及びポリープは、子宮、乳腺、膣、頸部及び卵管に影響を与えることがある。
【０１４１】
このように、本発明によれば、子宮内膜症及び子宮筋腫又はポリープを治療する方法が提供される。一実施形態における方法には、子宮内膜症を治療するために十分な量の融合コンストラクトを被験者へ投与することが含まれる。他の実施形態における方法には、子宮筋腫又はポリープを治療するために十分な量の融合コンストラクトを被験者へ投与することが含まれる。
【０１４２】
標的細胞は、生殖に関与し又は生殖に必要とされる細胞を含む。したがって、本発明によれば、動物の生殖能力を減少させる方法が提供される。一実施形態における方法には、生殖能力を減少させ、妊娠の可能性を減少させ、又は、雄の哺乳類が生成する精子を減少させるために十分な量の融合コンストラクトを被験者へ投与することが含まれる。
【０１４３】
本明細書において述べられるように、有害な又は異常な細胞の増殖又は過増殖疾患は、前立腺においても発生する。このように、本発明によれば、良性の前立腺過形成又は転移性の前立腺新生物を治療する方法が提供される。一実施形態における方法には、良性の前立腺過形成又は転移性の前立腺新生物を治療するために十分な量の融合コンストラクトを被験者へ投与することが含まれる。
【０１４４】
抗細胞増殖性又は抗細胞増殖効果を有するあらゆる組成物、治療法、治療手順、治療方法又はレジメンが、融合コンストラクトと組み合わされ、又は、本発明の方法と組み合わせて用いられる。したがって、融合コンストラクト及び本発明の方法は、抗増殖性、抗腫瘍、抗癌、抗新生物及び抗転移性の治療法、治療手順及び治療方法を含む。これらの治療法、治療手順及び治療方法には、腫瘍、癌、悪性腫瘍又は新生物の成長、進行、転移、増殖又は生存等の過増殖疾患やインビトロ又はインビボでの悪化を阻害し、減少させ、抑制し、遅延させ、減少させ、防止する、上述した以外のあらゆる組成物、治療法、治療手順又は治療レジメンが含まれる。抗増殖（例えば腫瘍）療法の非限定的な具体例には、化学療法、免疫療法、放射線療法（電離又は化学的）、局所的熱（温熱療法）療法、外科用切除、及びワクチン接種が含まれる。融合コンストラクトは、抗細胞増殖治療薬、抗新生物治療薬、抗腫瘍治療薬、抗癌治療薬、抗転移性治療薬又は免疫増強治療薬の投与前に、これらの投与と実質的に同時に、又はこれらの投与後に、投与することができる。融合コンストラクトは、抗細胞増殖治療薬、抗新生物治療薬、抗腫瘍治療薬、抗癌治療薬、抗転移性治療薬又は免疫増強治療薬とともに組み合わせ組成物として投与することができる。
【０１４５】
抗増殖、抗新生物、抗腫瘍、抗癌、及び抗転移組成物、療法、プロトコルまたは治療は、細胞周期進行または細胞増殖を防止、妨害、中断、阻害または遅延させ；アポトーシスまたは細胞死を刺激または増強し、核酸またはタンパク質合成または代謝を阻害し、細胞分裂を阻害し、または細胞生存、または必要な細胞生存因子、成長因子またはシグナリング経路（細胞外または細胞内）の産生または利用を減少、低減または阻害するものを含む。抗細胞増殖活性、抗新生物活性、抗腫瘍活性、抗癌活性及び抗転移性活性を有する化学物質のクラスの種類には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、植物エキス、植物性アルカロイド、ニトロソウレア、ホルモン、ヌクレオシド及びヌクレオチド類似体が含まれる。抗細胞増殖、抗新生物、抗腫瘍、抗癌、及び抗転移活性を有する薬物の具体的な例には、シクロホスファミド、アザチオプリン、サイクロスポリンＡ、プレドニソロン、メルファラン、クロランブシル、メクロレタミン、ブスルファン、メトトレキセート、６―メルカプトプリン、チオグアニン、５―フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、ＡＺＴ、５―アザシチジン（５―ＡＺＣ）、およびデシタビン（５―アザ―２’デオキシシチジン）、シタラビン、１―ベータ―Ｄ―アラビノフラノシル―５―アザシトシンおよびジヒドロ―５―アザシチジン等の５―アザシチジン関連化合物、ブレオマイシン、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾトシン、ヒドロキシウレア、シスプラチン、ミトタン、プロカルバジン、ダカルバジン、タキサン（例えば、タキソール又は、パクリタキセル）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ドキソルビシンおよびジブロモマンニトールが含まれる。
【０１４６】
融合コンストラクト及び方法とともに用いることができる追加剤が、本発明の技術分野において知られており、利用可能である。例えば、抗体、細胞成長因子、細胞生存因子、細胞分化因子、サイトカイン及びケモカイン等の生物製剤を投与することができる。モノクロナール抗体には、特に本発明に係る融合コンストラクト等と組み合わせて用いられるリツキシマブ（リツキサン（登録商標）））、トラスツズマブ（ハーセプチン）、ベバシズマブ（アバスチン）、ラニビズマブ（ルセンティス）、セツキシマブ（アービタックス）、アレムツズマブ（キャンパス）、パニツムマブ（ベクチビックス）、ベルツズマブ（パージェタ）、イブリツモマブ・チウキセタン（ゼヴァリン）、イピリムマブ（エルボイ）、トシツモマブ（ベクザー）等が含まれる。本発明の融合コンストラクトとともに用いられる他の標的薬には、イマチニブ（グリベック）、ゲフィチニブ（イレッサ）、ボルテゾミブ（ベルケイド）、ラパチニブ（タイケルブ）、スニチニブ（スーテント）、ソラフェニブ（ネクサバール）、ニロチニブ（タシグナ）、ザルツムマブ、ダロツズマブ、フィジツムマブ、ラムシルマブ、ガリキシマブ、ファルレツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ（アーゼラ）、トシツムマブ、２Ｆ２（ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０），  ７Ｄ８，  ＩｇＭ２Ｃ６，  ＩｇＧ１  ２Ｃ６，  １１Ｂ８，  Ｂ１，  ２Ｈ７，  ＬＴ２０，  １Ｆ５，  又はＡＴ８０ダクリズマブ（ゼナパックス）、及び抗ＬＨＲＨレセプタ抗体等がある。細胞成長因子、細胞生存因子、細胞分化因子、サイトカイン、及びケモカインの例としては、ＩＬ−２、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＴＮＦβ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−１、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、エオタキシン、エオタキシン−２、Ｉ−３０９／ＴＣＡ３、ＡＴＡＣ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−２、ＨＣＣ−３、ＬＡＲＣ／ＭＩＰ−３α、ＰＡＲＣ、ＴＡＲＣ、ＣＫβ、ＣＫβ６、ＣＫβ７、ＣＫβ８、ＣＫβ９、ＣＫβ１１、ＣＫβ１２、Ｃ１０、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＥＮＡ−７８、ＧＣＰ−２、ＰＢＰ／ＣＴＡＰＩＩＩβ−ＴＧ／ＮＡＰ−２、Ｍｉｇ、ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１、及びリンフォタクチン（ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ）があるが、これらには限定されない。
【０１４７】
追加例には、免疫増強治療法が含まれる。免疫増強治療法には、細胞を用いた治療（ｃｅｌｌ  ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）が含まれる。特に、免疫増強治療法には、リンパ球、形質細胞、マクロファージ、樹枝状細胞、ナチュラルキラー細胞及びＢ細胞を投与することが含まれる。
【０１４８】
転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍又は新生物を治療する方法、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍又は新生物を有し又は有するおそれがある被験者を治療する方法、及び、抗増殖治療、抗腫瘍治療、抗癌治療、抗新生物治療又は抗悪性腫瘍治療の効果を向上させ又は改善する方法が提供される。各実施形態における方法は、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍又は新生物を有し又は有するおそれがある被験者へ、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍又は新生物を治療するために十分な量の融合コンストラクトを投与すること、当該被験者を治療するために十分な量の融合コンストラクトを当該被験者へ投与すること、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍又は新生物の治療を受けている被験者へ、抗増殖治療、抗腫瘍治療、抗癌治療、抗新生物治療又は抗悪性腫瘍治療の効果を向上させ又は改善するために十分な量の融合コンストラクトを投与すること、を含む。
【０１４９】
本発明の方法は、有害なもしくは異常な細胞の増殖又は過増殖の疾患、疾病、又は病状が１つ又は複数の症状によって発見される前に（つまり、予防）、又は発見と同時に、又は発見後に用いられる。被験者における有害なもしくは異常な細胞の増殖又は過増殖疾患の症状が進展する前に、進展と同時に、又は進展した後に融合コンストラクトを投与することによって、有害なもしくは異常な細胞の増殖又は過増殖疾患、疾病、又は病状の１つ又は複数の症状の発生、頻度、重症度、進行、又は継続期間を減少させることができる。また、有害なもしくは異常な細胞の増殖又は過増殖疾患、疾病又は病状の１つ又は複数の症状の進展の前に、進展と同時に、又は進展のすぐ後に融合コンストラクトを投与することによって、過剰増殖細胞（例えば、転移）が被験者の他の部位又は位置へ拡散又は播種し、又は、被験者の他の部位、位置、組織又は臓器において過剰増殖細胞（例えば、転移癌）が形成されることを阻害し、減少させ、又は防止することができる。
【０１５０】
融合コンストラクト及び治療方法等の本発明の方法は、検出可能な又は測定可能な被験者に対する治療上の効果又は改善効果を提供する。治療的利益または改善は、被験者に対する任意の測定可能または検出可能、客観的または主観的、一時的、一過性、または長期的利益、または、被験者の組織、臓器、細胞または細胞集団の、状態、疾患または病気、有害な症状、または根本原因の任意の程度の改善である。治療上の効果及び改善効果には、疾患、疾病もしくは病状、根本の原因もしくは疾患、疾病もしくは病状の結果に関連付けられる１つ又は複数の症状又は合併症の発生、頻度、重症度、進行、又は継続期間を減少させることが含まれるが、これらには限られない。したがって、融合コンストラクト及び本発明の方法には、被験者に対する治療上の効果又は改善効果を提供することが含まれる。
【０１５１】
本発明の方法における治療上の効果又は改善効果が望ましい効果である場合には、本発明の融合コンストラクトは、十分な又は効果のある量が被験者に投与される。「十分な量」又は「効果のある量」は、単回投与又は複数回投与によって、単独で又は単数又は複数の他の組成物（化学療法薬や免疫刺激薬等の治療薬）、治療方法、治療手順もしくは治療レジメンと組み合わせて、継続期間（長期又は短期）における検出可能な反応や、任意の継続時間（例えば、数時間、数日、数ヶ月、数年、又は治癒まで）において測定可能な又は検出可能な程度の被験者における望ましい結果又は被験者に対する効果を提供する量である。（例えば、治療的利益または改善を提供するための）治療のための用量または「十分な量」または「有効な量」は、典型的には、疾患、病気または状態、または疾患、病気または状態の一つ、複数または全ての有害な症状、影響または合併症を、測定可能な程度まで向上させるために有効であるが、疾患、病気または状態または症状の進行または悪化の抑制または阻害は、良好な結果であると考えられる。
【０１５２】
用語「向上する」は、被験者の状態の検出可能な客観的または主観的な改善を意味する。検出可能な改善は、疾患、疾病もしくは病状によって生じ又はこれらに関連する症状の発生、頻度、重症度、進行、又は継続期間の主観的な又は客観的な減少、疾患、疾病もしくは病状の根本的な原因もしくは結果についての主観的な又は客観的な改善、又は、疾患、疾病もしくは病状の主観的な又は客観的な好転を含む。
【０１５３】
したがって、治療によって、疾患、疾病もしくは病状、関連する症状もしくは結果、又は根本の原因が阻害、減少、又は防止され、疾患、疾病、病状、症状、もしくは結果又は根本の原因の悪化、又は、疾患、疾病、病状もしくは症状の単数又は複数の追加的症状のさらなる悪化又は発生が阻害、減少、又は防止される。このように、治療が成功すると、「治療上の効果」や「効果」につながり、１つ又は複数の症状の発生、頻度、重症度、進行、もしくは継続期間、又は、被験者の病状、疾患、疾病もしくは症状の根本の原因もしくは結果を阻害し、減少させ、又は防止することができる。病状、疾患、疾病もしくは症状の単数又は複数の根本の原因に影響を与える治療方法は、それゆえ、効果があると考えられる。疾患又は病状の進行又は悪化を安定させ又は阻害することも、治療の成功と考えられる。
【０１５４】
このように、治療上の効果又は改善効果は、病状、疾患もしくは疾病に関連する症状、合併症、結果もしくは根本の原因の１つ、大部分、又は全ての完全な除去である必要はない。このように、被験者の病状に漸進的な改善があり、発生、頻度、重症度、進行、又は継続期間に部分的な減少があり、又は、単数又は複数の関連する望ましくない症状もしくは合併症又は結果もしくは根本の原因、短期間又は長期間（数時間、数日、数週、又は数ヶ月）における疾患もしくは疾病の単数又は複数の生理学的な、生化学的なもしくは細胞的な発現又は特質の悪化又は進行の阻害又は好転（例えば、病状、疾患もしくは疾病の１つ又は複数の症状又は合併症を安定化すること）があれば、評価項目が十分に達成される。
【０１５５】
一実施形態における治療方法は、新生物細胞、腫瘍細胞、癌細胞又は悪性腫瘍細胞の質量、体積、サイズもしくは細胞数を部分的にもしくは完全に破壊し、新生物細胞、腫瘍細胞、癌細胞又は悪性腫瘍細胞壊死、溶解もしくはアポトーシスを活性化、促進もしくは増加させ、新生物、腫瘍、癌又は悪性腫瘍の体積、サイズ、細胞質量を減少させ、新生物、腫瘍、癌又は悪性腫瘍の体積、質量、サイズもしくは細胞数の増加もしくは進行を抑制もしくは防止し、過剰増殖細胞（例えば、転移癌）が被験者の他の（二次的な）部位、位置、組織又は臓器へ拡散又は播種すること、又は、過剰増殖細胞（例えば、転移癌）が被験者の他の（二次的な）部位、位置、組織において形成されることを阻害し減少させ、被験者の寿命を延ばす。追加的な実施形態における治療方法は、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍又は新生物に関連する又はこれらによって引き起こされる有害な症状や合併症の重症度、継続時間もしくは頻度を減少させる。
【０１５６】
十分な量又は効果のある量を、一度の投与で提供することもできるが必ずしもその必要はなく、また、単独で又は他の組成物（例えば、化学療法剤又は免疫強化剤もしくは免疫刺激剤）、治療方法、治療手順もしくは治療レジメンと組み合わせて提供することができるが必ずしもその必要はない。例えば、十分な量又は効果のある量は、患者の必要性、治療中の疾患、疾病もしくは病状の現状、又は治療の副作用に応じて増加させることができる。また、十分な量又は効果のある量は、他の組成物（例えば、化学療法剤又は免疫刺激剤）、治療方法、治療手順又は治療レジメンを用いない場合には、単回の又は複数回の投与によって提供される必要は必ずしもなく、元々の投与に加えて投与回数、投与量又は投与時間を追加するか、追加の組成物（例えば、化学療法剤又は免疫刺激剤）、治療方法、治療手順又は治療レジメンを加えて、被験者にとって効果的又は十分と考えられる量にすることができる。十分と考えられる量には、他の治療方法、治療レジメン又は治療手順の使用を減らすことができる量も含まれる。
【０１５７】
十分な量又は効果のある量は、予防のため又は治療のために処置される被験者の全ての者にとって効果的である必要は必ずしもなく、所定のグループもしくは母集団の過半数の被験者にとって効果的である必要もない。治療方法において一般的なように、所定の治療方法、治療レジメン又は治療手順に対してより大きな反応性を示す被験者とより小さな反応性を示す被験者とが存在する。十分な量又は効果のある量は、特定の被験者に関しての十分さ又は有効性を意味するものであり、グループや一般的な母集団に関しての十分さ又は有効性を意味するものではない。このような量は、有害、異常、または不正常な細胞増殖または過剰増殖性疾患（例えば転移性又は非転移性の癌、腫瘍、悪性病変又は新生物）のタイプまたはステージ等の治療される状態、所望の治療効果、ならびに個々の被験者（例えば被験者における生物学的利用能、被験者の性別、年齢等）に部分的に依存する。
【０１５８】
有害な又は異常な細胞の増殖、例えば、過増殖疾患（例えば、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍又は新生物）に対する治療上の効果又は改善効果の例には、細胞のサイズ、質量もしくは体積を減少させること、細胞のサイズ、質量もしくは体積の増加を阻害すること、悪化又は進行を遅延させ又は阻害すること、細胞の壊死、溶解もしくはアポトーシスを刺激すること、新生物の転移もしくは腫瘍悪性腫瘍の転移を阻害しもしくは減少させること、死亡率を減少させること、及び被験者の寿命を延ばすことが含まれる。このように、細胞のサイズ、質量もしくは体積の増加、又は転移を阻害し又は遅延させることにより、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍又は新生物を完全に除去できないとしても、数日間、数週間又は数ヶ月間であったとしても寿命を延ばし死亡率を減少させることができる。過増殖疾患（例えば、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍又は新生物）に関連する望ましくない症状及び合併症で減少又は削減可能なものには、例えば、痛み、吐き気、不快感、食欲不振、倦怠感及び衰弱が含まれる。このように、過増殖疾患（例えば、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍又は新生物）等の有害な又は異常な細胞の増殖の症状の発生、頻度、重症度、進行、又は継続期間を減少させること、例えば、主観的な感情の改善（例えば、活力や食欲の増加、吐き気の減少、移動度の改善や精神的充足感等）は、全て、治療上の効果又は改善効果の例である。
【０１５９】
例えば、有害な又は異常な細胞の増殖、過増殖疾患（例えば、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍又は新生物）等の治療に必要な化学療法剤、放射線治療又は免疫療法が融合コンストラクトの投与によって少なくて済んだ場合に、融合コンストラクトの十分な又は効果のある量は、治療上の効果を有すると考えられる。
【０１６０】
「被験者」という用語は、動物を意味し、典型的には哺乳類を意味する。哺乳類には、ヒトやヒト以外の霊長類（類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、マカク）、愛玩動物（イヌ及びネコ）、家畜（ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）及び実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）等が含まれる。被験者には、融合コンストラクトのインビボ分析のための疾患動物モデルが含まれる。疾患動物モデルは、例えば、過増殖疾患（例えば、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍又は新生物）等の有害な又は異常な細胞増殖の動物モデルである。
【０１６１】
治療に適切な被験者には、寛解期の被験者を含めて、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性病変または新生物を有するかそのリスクがある者、抗増殖（例えば、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性病変または新生物）療法を将来受けるか現在または既に受けている者が含まれる。「リスクがある」被験者は、有害な又は異常な細胞の増殖、過形成（例えば、腫瘍）の形成に関連する危険因子を持っていることが一般的である。
【０１６２】
「リスクがある」被験者又は候補被験者には、融合コンストラクトが結合することができるレセプタ、リガンド、抗原又は抗体を発現する細胞を有するものが含まれる。特に、壊死、溶解、死滅もしくは破壊される標的細胞が、標的細胞以外の細胞よりも多くのレセプタ、リガンド、抗原又は抗体を発現する。このような細胞は、選択的に又は特異的に壊死、溶解又は破壊の標的とされうる。
【０１６３】
「リスクがある」被験者には、外科的切除、化学療法、免疫療法、電離放射線治療もしくは化学放射線治療、局部的もしくは局所的温熱療法（温熱療法）、又はワクチン接種を受ける候補者となるもの又は受けたものも含まれる。よって、本発明は、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍もしくは新生物又は転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍又は新生物に関連する合併症のリスクがある被験者の治療に用いられる。合併症は、例えば、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍又は新生物が安定期又は寛解期の後に再発又は再成長することによって生じる。
【０１６４】
危険因子には、性別、生活習慣（食事、喫煙）、職業（医療従事者、農業又は畜産業従事者）、環境因子（発癌性物質への露出）、家族歴（自己免疫疾患、糖尿病等）、遺伝性素因等が含まれる。例えば、黒色腫が形成されるリスクのある被験者には、過度の太陽光への露出（紫外線）、白い皮膚、母斑が多いこと（異形成母斑）、患者表現型、家族歴、又は黒色腫の病歴等の危険因子がある。このように、癌が形成されるリスクのある被験者は、生活習慣、職業、環境因子、家族歴、及び腫瘍関連遺伝子、遺伝子欠失、又は遺伝子の突然変異の遺伝子検査によって特定される。例えば、乳癌を発症するリスクがある被験者は、Ｂｒｃａｌを欠く。結腸癌が形成されるリスクのある被験者は、例えば、若年において又は頻繁にポリープが形成され、大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ）等の腫瘍抑制遺伝子が欠失し又は突然変異している。
【０１６５】
被験者には、他の治療方法の適応がないものも含まれる。例えば、被験者は、外科的切除、化学療法、免疫療法、電離放射線治療もしくは化学放射線治療、局部的もしくは局所的温熱療法（温熱療法）、又はワクチン接種に適していない可能性がある。このように、本発明の治療方法の候補被験者には、外科的切除、化学療法、免疫療法、電離放射線治療もしくは化学放射線治療、局部的もしくは局所的温熱療法（温熱療法）、又はワクチン接種の適応がないものも含まれる。
【０１６６】
融合コンストラクトを、単位投与量又は単位投与剤形単位で調剤することができる。一実施例において、融合コンストラクトは、有害なもしくは異常な細胞の増殖又は過増殖疾患を有する被験者を治療するために効果のある量である。追加的な実施形態において、融合コンストラクトは、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍又は新生物を有する被験者を治療するために効果のある量である。さらに他の実施形態において、融合コンストラクトは、被験者の生殖能力を減少させるために効果のある量である。単位投与量の範囲の一例は次の通りである。すなわち、約２５−２５０、２５０−５００、５００−１０００、１０００−２５００又は２５００−５０００、５０００−２５０００、５０００−５００００（単位はｎｇ）、約２５−２５０、２５０−５００、５００−１０００、１０００−２５００又は２５００−５０００、５０００−２５０００、５０００−５００００（単位はμｇ）、及び、２５−２５０、２５０−５００、５００−１０００、１０００−２５
００又は２５００−５０００（単位はｍｇ）である。
【０１６７】
本発明の組成物及び方法は、インビトロで、エクスビボで、又はインビボで接触され又は提供される。組成物は、意図する効果を提供するために、単回の投与又は複数回の投与によって、効果のある又は十分な量が投与される。投与量の範囲の一例は次の通りである。約２５−２５０、２５０−５００、５００−１０００、１０００−２５００又は２５００−５０００、５０００−２５-０００、５０００−５００００（単位はｐｇ／ｋｇ）、約５０−５００、５００−５０００、５０００−２５０００又は２５０００−５００００（単位はｎｇ／ｋｇ）、及び、約２５−２５０、２５０−５００、５００−１０００、１０００−２５００又は２５００−５０００、５０００−２５０００、５０００−５００００（単位はμｇ／ｋｇ）、又は約２５−２５０、２５０−５００、５００−１０００、１０００−２５００又は２５００−５０００、５０００−２５０００（単位はｍｇ／ｋｇ）である。投与は、毎日、一日おきに、又は、断続的に行われる。単回の投与又は複数回の投与を、毎日、一日おきに、又は、断続的に行うことができる。
【０１６８】
組成物の投与は、あらゆる投与方法で、全身的に、局所的に、又は局部的に行うことができる。また、方法についても、あらゆる経路で、全身的に、局所的に、又は局部的に行うことができる。例えば、融合コンストラクトは、全身的に、局所的もしくは局部的に、静脈投与の方法で、経口で（例えば、経口摂取もしくは吸入）、筋肉注射で、腹腔内に、皮内注射の方法で、皮下注射の方法で、腔内、頭蓋内に、経皮的に（局所的）、経粘膜投与もしくは経直腸的投与等の非経口的方法で投与することができる。医薬組成物を含む本発明の組成物及び方法は、（マイクロ）カプセル化された投与システムによって投与することができ、又は、投与のためにインプラントの中に詰め込むことができる。
【０１６９】
本発明は、融合コンストラクト及び融合コンストラクトが医薬組成物に含まれている方法をさらに提供する。医薬組成物は、「薬学的に許容された」及び「生理学的に許容された」担体、希釈剤又は賦形剤を意味する。本明細書で使用されるところの、担体、希釈液または賦形剤をさす場合の「薬学的に許容された」および「生理学的に許容された」という用語は、医薬品投与および製剤の他の成分に適合する、溶媒（水性または非水性）、界面活性剤、溶液、乳剤、分散媒、コーティング、および等張性の吸収促進又は遅延薬剤を含む。このような処方は、錠剤（コーティングされたもの又はされていないもの）、カプセル（ハード又はソフト）、マイクロビーズ、乳剤、粉末剤、顆粒剤、結晶剤、懸濁剤、シロップ剤又はエリキシル剤に含められる。
【０１７０】
医薬組成物は、特定の投与法とともに用いることができるように処方される。非経口投与、皮内投与、又は皮下投与用の組成物は、水等の殺菌された希釈剤、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレン・グリコール、グリセリン、プロピレン・グリコール及びその他の合成溶剤を含むことができる。調合液には、微生物の成長を防ぐための単数又は複数の防腐剤（例えば、ベンジルアルコールやメチルパラベン等の抗菌剤、アスコルビン酸や亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化物質、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤、アセテート等のバッファ、クエン酸塩、又はリン酸塩及び塩化ナトリウムやブドウ糖等の張度調整剤）を含むことができる。
【０１７１】
注射用の医薬組成物には、殺菌された注射可能な溶液や分散液を調合調剤するための殺菌水溶液（水溶性）又は分散液及び殺菌粉末が含まれる。静脈投与のための安定的な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ニュージャージー州ＰａｒｓｉｐｐａｎｙのＢＡＳＦ社）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。この担体は、溶剤又は分散媒であってもよい。このような溶剤又は分散媒には、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及びポリエチレングリコール）、及び、これらの適切な混合物が含まれる。レシチン等のコーティングや界面活性剤を用いることによって流動性を維持することができる。抗菌剤及び抗真菌剤には、例えば、パラベン、クロロフタノール、フェノール、アスコルビン酸及びチメロサールが含まれる。モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の吸収を遅延させる薬剤を含めることによって、注射される組成物の吸収時間を長くすることができる。
【０１７２】
本発明の技術分野において知られている他の医薬組成物及び投与システムを、本発明の方法において用いることができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （１９９０）  １８ｔｈ  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ  （１９９６）  １２ｔｈ  ｅｄ．，  Ｍｅｒｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，  ＮＪ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．，  Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，  Ｐａ．，  （１９９３）、及びＰｏｚｎａｎｓｋｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｒ．  Ｌ．  Ｊｕｌｉａｎｏ，  ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８０），  ｐｐ．  ２５３−３１５を参照。）。
【０１７３】
本発明は、本発明の融合コンストラクト、組み合わせ組成物及びその医薬組成物を含むキットを提供する。このキットは、適当な包装材で包装されている。キットは、構成物のインビトロ、インビボ又はエクスビボでの使用に関する組成物の説明や説明書を含むラベル又は包装挿入物を含んでもよい。説明書の例には、細胞増殖を減少させ又は阻害し、過剰増殖細胞等の有害な又は異常な細胞の増殖を減少させ又は阻害し、転移性又は非転移性の腫瘍細胞、癌細胞、悪性腫瘍細胞又は新生物細胞の増殖を減少させ又は阻害し、過増殖疾患を有する被験者を治療し、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍又は新生物を有する被験者を治療し、又は、動物の生殖能力を減少させるするための説明書を含む。
【０１７４】
キットは、例えば、２つ以上の融合コンストラクトを、それ単独で、又は他の治療に用いられる組成物（例えば、抗増殖性薬剤や免疫増強薬剤）とともに含むことができる。
【０１７５】
「包装材」という用語は、キットの構成物を収容する物理的な構造を意味する。包装材は、構成物を滅菌された状態に保つことができ、包装材として通常用いられる材料（例えば、紙、ダンボール、ガラス、プラスチック、ホイル、プラスチック容器、ビン、チューブ等）で作られる。
【０１７６】
本発明のキットには、ラベル又は挿入物が含められる。ラベル又は挿入物には、例えば、紙やボール紙等の「印刷物」が含まれる。この印刷物は、キットの構成物、キット又は包装材（例えば、包装箱）とは別体とされるか、これらに添付されており、キットの構成物を含むアンプル、チューブ又はビンに添付されていてもよい。ラベル又は挿入物は、コンピュータ読み取り可能な媒体を追加的に含んでいてもよい。このようなコンピュータ読み取り可能な媒体には、ディスク（例えば、フロッピーディス、ハードディスク、ジップディスク）、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−ＲＡＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ＤＶＤ等の光ディスク、ＭＰ３、磁気テープ、又はＲＡＭやＲＯＭ等の電気的ストレージメディア、又はこれらの組み合わせからなる磁気／光ストレージメディア等のメディア、ＦＬＡＳＨメディア又はＦＬＡＳＨメモリ又はメモリ型カードが含まれる。
【０１７７】
ラベル又は挿入物には、一の又は複数のコンポーネントを識別する情報を含めることができ、例えば、ドーズ量、作用メカニズムを含む有効成分の臨床薬理学、薬物動態および薬力学の情報を含めることができる。ラベル又は挿入物には、製造者情報、ロット番号、製造場所、及び製造日に関する情報を含むこともできる。
【０１７８】
ラベル又は挿入物には、キットの構成物が用いられる病状、疾患、疾病もしくは症状に関する情報が含まれていてもよい。ラベル又は挿入物には、方法、治療方法、治療手順又は治療レジメンにおいて単数又は複数のキットの構成物を用いるための、臨床医又は被験者向けの説明書を含んでもよい。説明書には、投与量、投与頻度、投与時間、本明細書において説明される方法、治療方法、治療手順又は治療レジメンを実施するための指示が含まれていてもよい。説明書の例には、有害な又は異常な細胞の増殖、過剰増殖細胞及び疾患（例えば、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍又は新生物）の治療に関する指示が含まれていてもよい。本発明のキットは、本明細書において説明される本発明の方法（治療方法を含む）を実施するための指示に関するラベル又は説明書をさらに含んでもよい。
【０１７９】
ラベル又は挿入物は、キットの構成物が提供する効果、例えば、予防上又は治療上の効果、に関する情報を含んでもよい。ラベル又は挿入物には、有害な副作用の可能性についての情報を含めることができる。このような副作用の可能性に関する情報には、特定の組成物を使用するのが適当ではない状況に関しての、被験者や臨床医に対する警告を含んでもよい。有害な副作用は、キットに含まれる組成物と同時に服用することができない単数又は複数の他の薬剤を被験者が所持し、服用し、又はこれから服用する場合に起こりえる。または、キットに含まれる組成物と同時に行うことができない治療方法、治療手順又は治療レジメンを患者が現に受けており、又はこれから受ける場合にも、有害な副作用が発生しうる。そこで、かかる禁忌に関する情報を説明書に含めるようにしてもよい。
【０１８０】
本発明のキットは、他の構成物をさらに含むことができる。キットの構成物は、個別の包装容器に入れられていてもよく、全ての構成物が一つの包装材に入れられていてもよい。本発明のキットは、冷蔵で保存するように生成することもできる。本発明のキットは、本発明の融合コンストラクトを発現し、又は、融合コンストラクトをコードする核酸を含む宿主細胞をさらに含んでもよい。このキットに含まれる細胞は、使用されるまで、適切な保存条件において保存することができる。例えば、単数又は複数の細胞を含むキットは、細胞が融解され培養されることができるように、適切な細胞保存用媒体を含むことができる。
【０１８１】
別に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術的及び化学的用語は、本発明の技術分野における当業者によって一般に理解される意味を持つ。本明細書において好ましい方法及び物質が記載されているが、本明細書において説明されたものと同様の又は均等な方法及び物質を本発明を実施し又は試験する場合に用いることができる。
【０１８２】
全ての出願、出願公開、特許及びそれ以外の参考文献、本明細書において引用されたＧｅｎＢａｎｋの引用及びＡＴＣＣの引用は、全体として、本明細書に組み込まれる。齟齬がある場合には、本明細書及びそこに含まれる定義が優先される。
【０１８３】
本明細書において用いられている通り、文脈上明らかに別の意味に理解される場合を除き、単数形の「ａ」、「ａｎｄ」及び「ｔｈｅ」によって複数の指示対象が指示される。例えば、「融合コンストラクト（ａ  ｆｕｓｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」又は「溶解ドメイン（ａ  ｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ）」に関する言及は、複数の融合コンストラクトや溶解ドメインに関する言及を含む。
【０１８４】
本明細書において用いられる全ての数値及び数値の範囲は、文脈上明らかに別の意味に理解される場合を除き、当該範囲内にある整数、並びに、本明細書において用いられている数値の端数及び数値の範囲内の整数の端数を含む。したがって、例えば、９０−１００％の範囲への言及には、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％等が含まれ、また、９１．１％、９１．２％、９１．３％、９１．４％、９１．５％、９２．１％、９２．２％、９２．３％、９２．４％、９２．５％等が含まれる。
【０１８５】
本発明は、様々な実施形態を説明するために、一般に肯定的な文言を用いて開示されている。本発明には、特定の発明主題、例えば、物質や材料、方法の工程及び条件、手順、作業手続、又は検査や分析が全体として又は部分的に除外される実施形態も含まれる。このように、本発明が含まないものについては本明細書において明確に表現されていないが、本発明に含まれるとして明示されていない態様についても、本明細書において開示されているものと理解される。
【０１８６】
本発明の多数の実施形態を説明した。しかしながら、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、様々な変更が行われうることが理解されよう。したがって、以下に示す実施例は、請求項に記載された発明の内容を説明するためのものであり、発明の内容を限定することを意図したものではない。
【実施例】
【０１８７】
実施例１
第１の評価研究には、溶解ペプチド部とリガンドとの間に区別されたヒンジ配列を含み、Ｄアミノ酸（Ｄ光学異性体）を３０％含み、溶解ペプチド部が１８及び１５の長さのアミノ酸であり、ヒンジ配列又はそのＤ光学異性体を含む２８の溶解ドメインペプチドのインビトロスクリーニングが含まれる。α−アミノカプロン酸の２１、１８及び１５アミノ酸Ｐｈｏｒ２１アナログへのスペーサとして導入が試験された。この試験のために選択されたリガンドは、βＣＧ−ａｌａ、絨毛性ゴナドトロピンβ鎖の結合部の１５アミノ酸断片、及びＬＨＲＨ、完全機能性リガンドを表すデカペプチドを含む。
実施例２
【０１８８】
本実施例は、ヒトの乳腺癌細胞株を用いた細胞毒性（ＩＣ50）及び溶血活性のスクリーニングについて説明する。
【０１８９】
１８のβＣＧ−ａｌａ及び８のＬＨＲＨが結合された融合コンストラクトの検討を行い、Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａ及び非結合Ｐｈｏｒ２１及びＰｈｏｒ１８（３３８９１３）＝ＣＬＩＰ７１ペプチドと比較した。絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）及び黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）レセプタを過剰に発現するヒトの乳腺癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ．ｌｕｃを用い、継代数２４８−２５２でスクリーンした。このＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ．ｌｕｃ細胞株は、フォチヌス・ピラリス・ルシフェラーゼ遺伝子及び抗体抵抗遺伝子を含むプラスミドＰＲＣ／ＣＭＶ−ｌｕｃを有する安定したトランスフェクションによって、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から得られたＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞株から構成された。安定的にトランスフェクトされた細胞株はＧ４１８を用いて選択され、ルシフェラーゼ遺伝子に対する最も高い発現性を有するそのクローンが、ＬＨ及びＬＨＲＨレセプタ発現のためにテストされた。
【０１９０】
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ．ｌｕｃ細胞を、ＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地、１０％ウシ胎仔血清、０．０１ｍｇ／ｍｌのウシインスリン、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００マイクロｇ／ｍｌのストレプトマイシン、において培養した。この細胞は、密閉されたフラスコ内で培養された。この培養は、９６ウェルプレートを用いて行い、各プレートで１００００個の細胞を培養した。細胞は一般的な方法で９６ウェルプレートに播いた。培地を４８時間の培養の後に交換した。各アッセイは、溶解ペプチド−結合ドメイン結合体を、濃度を増加させながら投与して行った。この濃度は、０、０．００１、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、５、１０及び１００マイクロモルであった。溶解ペプチドドメイン−結合ドメイン結合体は、凍結乾燥された状態で提供され、生理食塩水中で解凍して細胞に添加した。培養時間は、概ね２４時間であった。細胞生存率アッセイは、ホルマザン変換アッセイ（ＭＴＴアッセイ）を用いて行った。コントロールは、それぞれ０及び１００％の細胞死の基準として、生理食塩水又は０．１％のトリトンを含んでいた。
【０１９１】
データは、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｚｍ４（商標）ソフトウエア（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｚｍ，  Ｉｎｃ）を用いて処理し分析した。有意性に対する統計解析を両側のスチューデントのＴ検定によって行った。各調査は、Ｎを少なくとも８にするように実施した。
【０１９２】
融合コンストラクトの長さを増加させることの効果が確認された（Ｊａｖａｄｐｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ３９：３１０７  （１９９６）、Ｊａｖａｄｐｏｕｒ  ａｎｄ  Ｂａｒｋｅｌｅｙ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：９５４０    （１９９７）、Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｎｓｅｌ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ，  １０：２２９９  （２００４）、及びＬｅｕｓｃｈｎｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｎｓｅｌ，  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ７３：２５５  （２００５））。Ｃ末端においてβＣＧ−ａｌａに結合された溶解ペプチドは、コンストラクトの長さの増加によって毒性が増加することを示した。様々な長さを有するペプチドのＩＣ50は次の通りであった。すなわち、１４アミノ酸（Ｐｈｏｒ１４）については５．７４μＭ、１５アミノ酸（Ｐｈｏｒ１５）については１．９２μＭ、１８アミノ酸（Ｐｈｏｒ１８＝ＣＬＩＰ７１）については１．０９μＭ、２１アミノ酸（Ｐｈｏｒ２１）については２．３１μＭ、２８アミノ酸（Ｐｈｏｒ２８）については１．３６μＭであった（表３−１及び３−２）。
【０１９３】
結合部の配置（Ｎ又はＣ末端）の効果を確認した。つまり、Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａ（Ｃ末端）融合コンストラクト、βＣＧ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ２１（Ｎ末端）融合コンストラクト、ＬＨＲＨ−Ｐｈｏｒ２１（Ｎ末端）融合コンストラクト、及びＰｈｏｒ２１−ＬＨＲＨ（Ｃ末端）融合コンストラクトを観察した。これらのペプチドのＩＣ50は次の通りであった。すなわち、Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａについては２．３μＭ、βＣＧ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ２１については４．７μＭ、ＬＨＲＨ−Ｐｈｏｒ２１については２．６５μＭ、Ｐｈｏｒ２１−ＬＨＲＨについては１．７１μＭであった。このデータはβＣＧ−ａｌａ及びＬＨＲＨの結合部をＣ末端に配置することで、当該結合部がＮ末端に配置される場合よりも強い毒性を示すことを実証している。
【０１９４】
ＬＨＲＨ−レセプタは、多くのヒトの癌に存在する（表１参照）。ＬＨＲＨの結合部としての活性を結合部としてのβＣＧ−ａｌａと比較した。
【０１９５】
ＬＨＲＨ−Ｐｈｏｒ２１及びＰｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａの毒性を、２時間又は２４時間培養されたヒトのＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ．ｌｕｃ乳腺癌細胞でインビトロで比較した。これらのデータによれば、ＬＨＲＨ−Ｐｈｏｒ２１は、Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａよりも短時間で細胞を破壊した。ＬＨＲＨ−Ｐｈｏｒ２１は、２時間以内に細胞破壊を引き起こした（図１）。
【表１】
2016506373.tif 000003
【０１９６】
ヒンジ、スペーサ又はリンカー配列を溶解ドメインと結合部との間に導入することによって、Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａよりも優れた細胞破壊能力を持つペプチドが得られた（図２、表２）。  Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａ融合コンストラクトにヒンジ配列又はスペーサを導入しても殺細胞活性は有意には変わらなかったが、ヒンジ配列であるＡＳＡＡＳの影響によって、βＣＧ結合体のための１５アミノ酸を有する溶解ペプチドの毒性を有意に向上させた。この効果は、βＣＧ結合されたペプチドＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ及びＰｈｏｒ１８−ＡＳＡＡＳ−ＬＨＲＨ並びにＬＨＲＨ結合されたペプチドＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ及びＰｈｏｒ１８−ＡＳＡＡＳ−ＬＨＲＨについては観察されず、インビトロで同等の効果を示した（表２、図４）。同様の効果は、ヒンジ配列が６カーボンスペーサで代替されたα−アミノカプロン酸の場合にも観察された（表２）。第２のヒンジ配列（ＧＳＧＧＳ）においてアラニンをグリシンで置換することにより、活性が有意に低下した。このことは、グリシンがヘリックスを不安定化させる効果を持っていたことを示唆する（図２、表２）。
【表２】
2016506373.tif 000004
【０１９７】
Ｄ−アミノ酸置換の効果を確認するために、Ｄ融合コンストラクトＰｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａがＤ−光学異性体として合成された（以下、「Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａ」と称する。）。この融合コンストラクトは、インビトロで、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ．ｌｕｃ乳腺癌細胞に対して同様の毒性を示した。Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａは２．３１μＭ、Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａは２．１５μＭ（表３−１及び３−２）、Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ１８−βＣＧ−ａｌａはＰｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａと比較して１．４倍の効果（ＩＣ50が１．６μＭ）、ＬＨＲＨ結合体は、０．７５μＭのＩＣ50を有するＤ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ２１−ＬＨＲＨ、１．４２μＭのＩＣ50を有するＤ−Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ及び１．９５μＭのＩＣ50を有するＰｈｏｒ１８−ルプロンと比較して、Ｄ−光学異性体として有意に大きな効果を示した（Ｐｈｏｒ２１−ＬＨＲＨのＩＣ50は１．３１μＭ）。
【０１９８】
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ．ｌｕｃ乳腺癌細胞におけるβＣＧ−ａｌａ結合及びＬＨＲＨ結合された溶解ペプチドのＩＣ50値が、表３−１及び３−２及び図３にまとめられている。表に示されているように、Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａのＩＣ50（２．３１±０．１６）に比べて有意に低いＩＣ50を有するペプチドは次の通りであった。すなわち、Ｐｈｏｒ２８−βＣＧ−ａｌａ（１．３６±０．０９μＭ、ｐ＜０．０００１）、Ｐｈｏｒ１５−ＡＳＡＡＳ−βＣＧ−ａｌａ（１．４８±０．２４μＭ、ｐ＜０．００５）、Ｐｈｏｒ１５−Ｃ6−βＣＧ−ａｌａ（１．３１±０．１７μＭ、ｐ＜０．００４）（Ｃ6は６アミノカプロン酸）、Ｐｈｏｒ１８−βＣＧ−ａｌａ（１．０９±０．１７μＭ、ｐ＜０．０００１）、Ｐｈｏｒ２１−ＬＨＲＨ（１．３１±０．１μＭ、ｐ＜０．０００１）、Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ２１−ＬＨＲＨ（０．７５±０．１μＭ、ｐ＜０．０００１）、Ｐｈｏｒ１８−ＡＳＡＡＳ−ＬＨＲＨ（０．８８±０．１２μＭ、ｐ＜０．０００１）、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（０．８７±０．１１μＭ、ｐ＜０．０００１）、（ＫＫＫＦＡＦＡ）3−ＬＨＲＨ（０．７８±０．２１μＭ、ｐ＜０．０００４）、及びＤ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（１．４２±０．０８μＭ、ｐ＜０．００４）であった。
【０１９９】
全般に、βＣＧ−ａｌａ融合コンストラクトよりも、ＬＨＲＨ融合コンストラクトの方が効果が高かった（より毒性が強く、短時間で効果が出た。図１参照。）。つまり、Ｐｈｏｒ２１−ＬＨＲＨ、Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ２１−ＬＨＲＨ、Ｐｈｏｒ１８−ＡＳＡＡＳ−ＬＨＲＨ、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ及びペプチドコントロール３３８６１４（（ＫＫＫＦＡＦＡ）3は不活性ペプチド）は、Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａと比較して、ヒトの乳腺癌細胞に対する毒性が有意に強かった（ｐ＜０．００３）。次の例外を除く全てのＬＨＲＨ融合コンストラクトについてほぼ同様の効果が見られた。例外は、ＬＨＲＨ−Ｐｈｏｒ２１であり、結合部が溶解部に対してＣ末端にあるときに有意に効果が低かった。Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨは、Ｐｈｏｒ２１−ＬＨＲＨと同等の効果を示し、Ｐｈｏｒ１８−ルプロンは、Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａと比較して毒性が低かった。（図４、表３−１及び３−２を参照。ルプロンはＱＨＷＳＹ（Ｄ−Ｌｅｕ）ＬＲＰＮＥｔである。
【０２００】
Ｐｈｏｒ２１−ＬＨＲＨのＩＣ50値（１．３４±０．１μＭ）よりも有意に小さなＩＣ50値を示した融合コンストラクトは次の通りである。すなわち、Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ２１−ＬＨＲＨ（０．７５±０．１２μＭ、ｐ＜０．００２）、Ｐｈｏｒ１８−ＡＳＡＡＳ−ＬＨＲＨ（０．８８±０．１１μＭ、ｐ＜０．０００１）、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（０．８７±０．１２μＭ、ｐ＜０．００４）、及び（ＫＫＫＦＡＦＡ）3−ＬＨＲＨ（０．７８±０．２１μＭ、ｐ＜０．０４）である。同じ融合コンストラクトについて、βＣＧ−ａｌａ結合部とＬＨＲＨ結合部とを比較したところ、全てのケースで、ＬＨＲＨ融合コンストラクトの持つ毒性が、対応するβＣＧ−ａｌａが持つ毒性よりも有意に高かった。
【表３−１】
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【表３−２】
2016506373.tif 000006
【０２０１】
Ｐｈｏｒ１８−ルプロン及びＤ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨを含む２１融合コンストラクトの急性溶血活性が調査された。調査結果は、図５、図６、および表３−１及び３−２にまとめれている。
【０２０２】
溶血活性は、９６ウェルプレートにおいて、０．５％ヒトＲＢＣに露出されたペプチドを連続希釈することによって測定された。コントロールには、生理食塩水（ＲＢＣが生存）又は０．１％のトリトンＸ１００（１００％ＲＢＣ溶解）を用いた。ペプチド濃度は、０μＭから１００μＭの範囲とした。培養は２時間行った。
【０２０３】
異なるヒト癌細胞株における様々な融合コンストラクトのＩＣ50を、シスプラチンとの比較において確認するために、融合コンストラクトのＩＣ50を、表３−１及び３−２に示すように評価した。評価結果は次の通りである。
【表４】
2016506373.tif 000007
【０２０４】
このデータは、調査された融合コンストラクトの溶血活性が極めて低いことを示している。例外は、Ｐｈｏｒ２１−ＬＨＲＨ、ＬＨＲＨ−Ｐｈｏｒ２１及びＰｈｏｒ１８−ルプロンである。同様の条件で、以下の融合コンストラクトは溶血活性を全く示さなかった（図５参照）。すなわち、Ｐｈｏｒ１５−アミノカプロン酸−β−ＣＧ−ａｌａ（３３７４７４）、Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ２１β−ＣＧ−ａｌａ（３３７４８１）＞１５００００μＭ、Ｐｈｏｒ２１、非結合Ｐｈｏｒ１８＝ＣＬＩＰ７１、（ＫＫＫＦＡＦＡ）3−βＣＧ−ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１（３３８９８２）、Ｐｈｏｒ１８＝ＣＬＩＰ７１（３３８９８３）、Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３９３８５）、及び（ＫＫＫＦＡＦＡ）3−ＬＨＲＨ（３３８９８４）は、全く溶血活性を示さなかった。Ｄ−アミノ酸光学異性体は、測定可能な溶血活性を示さなかった。
【０２０５】
５０μＭより小さな溶血活性を示した融合コンストラクトは、Ｐｈｏｒ２１−ＬＨＲＨ（２５μＭ）、ＬＨＲＨ−Ｐｈｏｒ２１（３３μＭ）、及びＰｈｏｒ１８−ルプロン（２１μＭ）であった。
【０２０６】
１００μＭより大きな溶血活性を示した融合コンストラクトは、Ｐｈｏｒ１８−β−ＣＧ−ａｌａ（３３７４７６）、及びＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）であった。
【０２０７】
５０〜１００μＭの間の溶血活性を示した融合コンストラクトは、（ＫＫＫＦＡＦＡ）3−ＬＨＲＨ（９５μＭ）、Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａであった。Ｐｈｏｒ２１−ＡＳＡＡＳ−βＣＧ−ａｌａは、７０μＭのＨＡ50を示した。
【０２０８】
４００〜１３００μＭの間の溶血活性を示した融合コンストラクトは、Ｐｈｏｒ１４−βＣＧ−ａｌａ（３３７４６４）、Ｐｈｏｒ１８ＧＳＧＧＳ  β−ＣＧ−ａｌａ（３３７４６７）、Ｐｈｏｒ１８ＡＳＡＡＳβ−ＣＧ−ａｌａ（３３７４７０）、Ｐｈｏｒ１５ＡＳＡＡＳβ−ＣＧ−ａｌａ（３３７４７１）、Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ２１−ＬＨＲＨ（３３８６１１）、及びＰｈｏｒ１８−ＡＳＡＡＳ−ＬＨＲＨ（３３８６１２）であった。
【０２０９】
臨床的に重要な基準は、細胞毒性（ＩＣ50）の溶血活性（ＨＡ50）に対する比、つまりＩＣ50／ＨＡ50（図６、表３−１及び３−２）である。インビボ実験は、１０μＭの最大濃度の融合コンストラクトを用いて実施された。この値は大部分の融合コンストラクトについて計測されるＨＡ50よりも数因子分低い値である。
【０２１０】
Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ２１、Ｐｈｏｒ１８−ＡＳＡＡＳ、Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ１８及びＰｈｏｒ１８を有するＬＨＲＨ結合体は、０．００１〜０．００６のきわめて低いＩＣ50／ＨＡ50を示した（Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａは０．０３との比較）。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ．ｌｕｃ細胞に対する毒性は、Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａとの比較において有意に高かった。Ｄ−ａｌａ）Ｐｈｏｒ２１−ＬＨＲＨは、Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａよりも３倍毒性が高く、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ及びＰｈｏｒ１８−ＡＳＡＡＳ−ＬＨＲＨは２倍毒性が高く、Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨは１．５倍毒性が高かった（図６）。
【０２１１】
毒性が増加し溶血活性が低い（ＩＣ50／ＨＡ50比）と評価された融合コンストラクトは次の通りである。すなわち、Ｐｈｏｒ１８−βＣＧ−ａｌａ、Ｐｈｏｒ１８−ＡＳＡＡＳ−βＣＧ−ａｌａ、Ｐｈｏｒ１５−ＡＳＡＡＳ−βＣＧ−ａｌａ、Ｐｈｏｒ１５−Ｃ６−βＣＧ−ａｌａ、Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ２１−ＬＨＲＨ、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ、Ｐｈｏｒ１８−ＡＳＡＡＳ−ＬＨＲＨ、及びＤ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨである。
実施例３
【０２１２】
本実施例は、様々な種類及び投与量のβＣＧ−融合コンストラクト及びＬＨＲＨ−融合コンストラクトの投与を受けた乳腺癌のマウス異種移植モデルでのインビボ実験について説明する。
【０２１３】
雌のＮｕ／Ｎｕマウスに、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ．ｌｕｃ／マトリゲルＨＣ懸濁液（１ｘ１０6細胞）を皮下注射した。治療スケジュールが図７に示される。治療は、腫瘍細胞注射の１３日後に開始され、その注射から１９日後及び２５日後まで続けられた。治療剤は、生理食塩水コントロール、Ｐｈｏｒ２１（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｐｈｏｒ１８（５ｍｇ／ｋｇ）、（ＫＫＫＦＡＦＡ）3ペプチド−βＣＧ−ａｌａ（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａ（０．０１、１及び５ｍｇ／ｋｇ）、Ｐｈｏｒ１８−βＣＧ−ａｌａ（０．０１、１及び５ｍｇ／ｋｇ）、Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａ（０．０１、１及び５ｍｇ／ｋｇ）を用い、１グループあたり８−１２のマウス、１４のグループで行われた。週に１度、体重１ｋｇあたり５ｍｇ、１ｍｇ及び０．０１ｍｇを、ボーラス単回投与によって投与した。
【０２１４】
全てのグループのマウスが注射に耐えた。各治療タイミングにおいて、一匹ずつが３３７４７６を５ｍｇ／ｋｇを投与した際に死亡した。これらのマウスは急性死であった。これ以外の治療グループについては全てのマウスが生存した。注射後１０分以上経過してから死亡したマウスは存在しなかった。
【０２１５】
原発腫瘍への溶血ペプチド注射の効果が図８Ａ−８Ｊにおいて説明される。図８Ａ〜８Ｃは、試験実施中の各ペプチドに対する腫瘍の体積を示す。図８Ｄ〜８Ｇは、解剖された腫瘍の特徴を示す。図８Ｄは腫瘍の体積、図８Ｅは腫瘍の重量、図８Ｆは生存していた腫瘍細胞、図８Ｇは腫瘍の状態をそれぞれ示す。
【０２１６】
治療の有効性は、治療開始時の測定結果と実験終了時の測定結果との差分として計算された（図８Ｈ〜８Ｉ）。図８Ｊは、解剖時におけるマウスの体重を示す。細胞の生存率は、実験終了時に細胞のルシフェラーゼ活性を測定したときに求められた。
【０２１７】
腫瘍の体積は、βＣＧをリガンド（ＩＩ、Ａ）（ｐ＜０．０５）として含むペプチドを用いて治療をした全ての動物において、０．０１ｍｇ／ｋｇでの基準値（ただし、３２３０３３は除く。）、（ＫＫＫＦＡＦＡ）3−βＣＧ−ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１及び非結合Ｐｈｏｒ１８＝ＣＬＩＰ７１コントロールとの比較において有意に減少した。腫瘍の体積は、全ての治療グループにおいて、生理食塩水コントロールと比較して有意に減少した。ただし、（ＫＫＫＦＡＦＡ）3−βＣＧ−ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１及びＰｈｏｒ１８は例外であり、これらについては異種移植片の体積を減少させる効果がなかった。
【０２１８】
腫瘍の質量も、βＣＧ結合ペプチドを有する全ての治療グループにおいて、生理食塩水又は（ＫＫＫＦＡＦＡ）3ペプチドで治療された個体と比較して有意に減少した（ｐ＜０．００１）。腫瘍細胞の生存率は、ルシフェラーゼ活性で測定され、腫瘍の質量及び腫瘍の体積の変化の観察結果と高い相関性が見られた。
【０２１９】
治療の有効性を、基準値と比較した場合の腫瘍の質量又は生存した腫瘍細胞の減少量で決定した。この治療の有効性は、３２３０３３及び３３７４７６については、治療反応が濃度に依存することが示された。３３７４８１は、０．０１、１及び５ｍｇ／ｋｇのいずれを投与した場合にも腫瘍質量及び生存腫瘍細胞が減少することを示した。３２３０３３は、１ｍｇ／ｋｇを投与した場合に最も高い効果を示し、これは５ｍｇ／ｋｇを投与した場合よりも大きかった（事前の実験で観察していた通りであった。）。しかし、最も少量の投与を行った際には、有意な相違が見られたのは生理食塩水コントロールとの間のみであった。融合コンストラクト３３７４７６及び３３７４８１については、５及び０．０１ｍｇ／ｋｇにおいて、３２３０３３と比較して有意に高い効果があり（ｐ＜０．０００１）、腫瘍質量及び生存腫瘍細胞を基準値よりも減少させる（ｐ＜０．００４）。融合コンストラクト３３７４８１は、濃度への依存性を示さず、試験された全てのコンストラクトの中で最も高い有効性を示した。
【０２２０】
嚢胞性腫瘍は、融合コンストラクト３３７４７６及び３３７４８１で治療したマウスにおいて確認された。嚢胞性腫瘍は、８０−９０％のマウスで見られたが、１ｍｇ／ｋｇの３２３０３３で治療を行った治療グループについては３０％のみで発見された。（嚢胞の形成は、この異種移植モデルにおいてはみられなかった。嚢胞は液性のカプセルからなる。）明確には分からないが、嚢胞性腫瘍の発生は、急速に成長する腫瘍において細胞が急激に破壊される際に起こると考えられている。嚢胞は、Ｐｈｏｒ２１で治療される前立腺腫瘍異種移植では存在しなかった。
【０２２１】
治療グループについての血液化学及び完全血球算定結果によって、治療は、肝臓、腎臓、及び心臓の機能には全く影響を与えていないことが分かった。血小板数、ＷＢＣ数及びＲＢＣ数は正常範囲内であり、この治療は腫瘍細胞を特異的に破壊することが示された。また、この治療は、貧血を起こさず、これら以外の生命維持に必要な身体機能についても影響を与えなかった。融合コンストラクトは、長期の副作用がなく、投与に耐えることは容易であった。
【０２２２】
上述のインビボ腫瘍の有効性データによれば、Ｐｈｏｒ１８−βＣＧ−ａｌａ（３３７４７６）及びＤ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａ（３３７４８１）は、基準となるＰｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａ（３２３０３３）よりも、基準値と比較した腫瘍質量の減少（ｐ＜０．０００１）及び生存腫瘍細胞（ｐ＜０．００４）の破壊に関して有意に有効性が高い。この両方の融合コンストラクトは、インビボで溶血を起こさず、使用した最高投与量（５ｍｇ／ｋｇ）でも継続的な副作用を示さなかった。１回当たり投与量を最低量にした場合であっても、複数回注射することで、Ｐｈｏｒ１８−βＣＧ−ａｌａの有効性を高めることができる可能性がある。
【０２２３】
ＬＨＲＨ融合コンストラクトについては、乳腺癌用のマウス異種移植モデルを用いた。非近交系で５週齢の雌Ｎｕ／Ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社）にＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ．ｌｕｃ／マトリゲルＨＣ懸濁液（１ｘ１０6細胞）を皮下注射した。治療は、腫瘍細胞注射の２１日後に開始され、その注射から２６日後及び２９日後まで続けられた。週に１度、体重１ｋｇあたり２ｍｇ、０．２ｍｇ及び０．０２ｍｇの融合コンストラクトをボーラス単回投与によって投与した。腫瘍細胞の注射から３４日後に、全てのマウスを解剖した。腫瘍質量の基準値は治療開始時に８匹のマウスを犠牲死することで得られた。原発腫瘍、肝臓、腎臓、膵臓、心臓、肺、及び及び脾臓はが摘出され、ホルマリンでの組織学的評価のために準備がなされた。腫瘍の質量を解剖時に記録し、腫瘍の一部はルシフェラーゼアッセイ測定のために−８０℃で冷凍保存された。
【０２２４】
治療グループは、生理食塩水コントロール、Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａ−３２３０３３（０．０２、０．２及び２ｍｇ／ｋｇ）、Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ２１−ＬＨＲＨ−３３８６１１（０．０２、０．２及び２ｍｇ／ｋｇ）、（ＫＫＫＦＡＦＡ）3ＬＨＲＨ−３３８６１４（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ−３３８６１３（０．０２、０．２及び２ｍｇ／ｋｇ）、Ｐｈｏｒ１８−ＡＳＡＡＳ−ＬＨＲＨ−３３８６１２  （０．０２、０．２及び２ｍｇ／ｋｇ）、Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ−３３９３８５（０．０２、０．２及び２ｍｇ／ｋｇ）、及びＰｈｏｒ１８−ルプロン−３３９３４７（０．０２、０．２及び２ｍｇ／ｋｇ）、グループ当たり１２匹のマウスであった。
【０２２５】
全てのグループのマウスが注射に耐えた。Ｐｈｏｒ１８−ＡＳＡＡＳ−ＬＨＲＨ２ｍｇ／ｋｇの２回目及び３回目の注射の際に、２匹のマウスのみが死亡した（この２匹のマウスは同じケージに入れられていた。）。これらのマウスは急性死であった。これ以外の治療グループについては全てのマウスが生存した。注射後１０分以上経過してから死亡したマウスは存在しなかった。
【０２２６】
図９Ａ−９Ｈは、原発腫瘍への融合コンストラクト注射の効果を説明する。腫瘍の体積は、各コンストラクトの実験期間中に測定された。次の例外を除く全ての治療グループにおいて、腫瘍の体積は治療期間において減少した。例外は、（ＫＫＫＦＡＦＡ）3−ＬＨＲＨ結合体又は生理食塩水コントロールで治療されたマウスであり、これらのマウスでは急激な腫瘍の成長が観察された。治療後３０日に記録された腫瘍の体積は、全ての融合コンストラクトの基準値との比較において減少した（ｐ＜０．０１）。腫瘍の体積が最も小さくなったのは、Ｐｈｏｒ１８−ＡＳＡＡＳ−ＬＨＲＨ及びＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨを投与した治療グループであった。
【０２２７】
解剖時の腫瘍の特徴は、図１０Ａないし図１０Ｅに示される。図１０Ａは腫瘍の質量を示す。図１０Ｂは、腫瘍の質量の基準値からの変動を示す。図１０Ｃは、生存腫瘍細胞の総数を示す。図１０Ｄは、生存腫瘍細胞の総数の基準値からの変動を示す。図１０Ｅは、基準値と解剖時における体重を示す。細胞の生存率は、実験終了時に細胞のルシフェラーゼ活性を測定して求めた。治療の有効性は、治療開始時の測定結果と実験終了時の測定結果との差分として計算した（図１０Ｂ及び１０Ｄ）。
【０２２８】
腫瘍質量及び生存腫瘍細胞の総数は、ＬＨＲＨ結合体が与えられた場合には、最小の投与単位である０．０２ｍｇ／ｋｇを投与した場合にも、全ての治療グループの全ての個体について、生理食塩水コントロールや（ＫＫＫＦＡＦＡ）3−ＬＨＲＨが結合したペプチドと比較して有意に減少した（ｐ＜０．０００１）。腫瘍の総質量は、ＬＨＲＨを含む２ｍｇ／ｋｇのペプチド及び０．０２、０．２及び２ｍｇ／ｋｇのＤ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（Ａ）を用いて治療された全ての個体において、基準値との比較において有意に減少した（ｐ＜０．０５）。
【０２２９】
次の濃度において、腫瘍質量は基準値と同程度となった。すなわち、Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａ−３２３０３３）については０．０２ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０７）及び０．２（ｐ＜０．０６）、Ｐｈｏｒ１８−ルプロンについては０．２及び０．０２ｍｇ／ｋｇ、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨについては０．２ｍｇ／ｋｇ、及び、Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ２１−ＬＨＲＨについては０．２ｍｇ／ｋｇのときに、腫瘍質量が基準値と同程度となった。総腫瘍質量については、Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａを０．０２ｍｇ／ｋｇ投与した場合よりも、Ｐｈｏｒ１８−ＡＳＡＡＳ−ＬＨＲＨを０．０２ｍｇ／ｋｇ投与する場合及びＤ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨを０．０２ｍｇ／ｋｇ投与する場合の方が優れた効果を示した（ｐ＜０．０５）。
【０２３０】
生存腫瘍細胞の数が測定され、図１０Ｃに生存腫瘍細胞の総数としてプロットされ、図１０Ｄに生存腫瘍細胞の基準値からの変動としてプロットされている。ルシフェラーゼ活性で評価される細胞の生存率は、腫瘍質量及び腫瘍体積の観察された変化と相関関係があった。例外はＰｈｏｒ１８−ＡＳＡＡＳ−ＬＨＲＨ及びＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨであり、これらについては生存腫瘍細胞の減少が観察された。Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３９３８５）及びＰｈｏｒ１８−ＡＳＡＡＳ−ＬＨＲＨ（３３８６１２）を用いた治療は、Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａを２ｍｇ／ｋｇ投与した場合よりも優れた効果を示した（ｐ＜０．０４）。
【０２３１】
治療の有効性は、基準値と比較した腫瘍質量や生存腫瘍細胞の減少として測定され、次の例外を除く全ての融合コンストラクトに関して、濃度に依存した治療反応を示した。例外は、腫瘍質量及び生存腫瘍細胞に関するＤ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ２１−ＬＨＲＨである。Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨについては、１回当たり０．０２、２及び２ｍｇ／ｋｇのいずれを投与した場合にも一貫して腫瘍質量及び生存腫瘍細胞の減少が見られた。本実験において最も有効であった融合コンストラクトは、Ｐｈｏｒ１８−ＡＳＡＡＳ−ＬＨＲＨ（３３８６１２）、Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３９３８５）であり、１回当たり２ｍｇ／ｋｇを投与したときに生存腫瘍細胞の数及び腫瘍質量を減少させた。Ｐｈｏｒ１８−ＡＳＡＡＳ−ＬＨＲＨ及びＤ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨは、１回当たり２及び０．０２ｍｇ／ｋｇのＰｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａ（ｐ＜０．０５）を投与した場合よりも優れた効果を示した。Ｐｈｏｒ１８−ルプロンは、腫瘍質量及び生存腫瘍細胞の減少という点で最も有効性が低かった。
【０２３２】
治療グループについての血液化学及び完全血球算定結果によって、治療は、肝臓、腎臓、及び心臓の機能には全く影響を与えていないことが分かった。血小板数、ＷＢＣ数及びＲＢＣ数は正常範囲内であり、この治療は腫瘍細胞を特異的に破壊することが示された。また、この治療は、貧血を起こさず、これら以外の生命維持に必要な身体機能についても影響を与えなかった。Ｐｈｏｒ１８−ルプロン、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ及びＤ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ２１−ＬＨＲＨを注射されたマウスについて、生理食塩水コントロールと比較して１．５倍に上昇したカリウム値が観察された。融合コンストラクトは、長期の副作用がなく、投与に耐えることは容易であった。
【０２３３】
上述のインビボ腫瘍の有効性データによれば、Ｐｈｏｒ１８−ＡＳＡＡＳ−ＬＨＲＨ（３３８６１２）及びＤ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３９３８５）は、基準となるＰｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａよりも、腫瘍質量の減少（ｐ＜０．０５）及び生存腫瘍細胞の減少（ｐ＜０．０４）の点で有意に有効性が高い。Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａと同等に高い有効性を示したのは、Ｄ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ２１−ＬＨＲＨ及びＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨであった。この両方の融合コンストラクトは、インビボで溶血を起こさず、他の副作用も示さなかった。１回当たり投与量を最低量にした場合であっても、複数回注射することで、Ｐｈｏｒ１８−ＡＳＡＡＳ−ＬＨＲＨ（３３８６１２）及びＤ−ａｌａ−Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３９３８５）の有効性を高めることができる可能性がある。
実施例４
【０２３４】
本実施例は、インビトロ及びインビボでのレセプタの発現及び特異性の実験について説明する。
【０２３５】
治療がレセプタの発現低下をもたらすか確認するために、治療前後におけるＬＨレセプタ発現密度が分析される。ウエスタンブロットアッセイ及び定量のためのＲＩＡと比較される免疫細胞化学。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ．ｌｕｃ細胞、ＣＨＯ及びＴＭ４細胞において、チャンバースライドを有するＩＨＣ及びウエスタンブロット法を用いてＬＨ及びＬＨＲＨレセプタの測定。各細胞株の同じ継代数のものを用いて、溶解ペプチドＣＧ及び溶解ペプチドＬＨＲＨに対する感度が試験される。
【０２３６】
ＬＨレセプタ融合コンストラクトの特異性は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ．ｌｕｃ細胞（ＬＨＲＨ及びＣＧレセプタの両方）、ＴＭ４細胞（ＬＨＲＨレセプタ無し）及びＣＨＯ細胞（ＣＧレセプタ無し）において分析される。ＩＣ50データは、ＭＤＡ−ＭＤ−４３５Ｓ．ｌｕｃ細胞（２．３μＭ）との比較において、ＴＭ４細胞のＬＨＲＨ−Ｐｈｏｒ２１に対する感度が有意に減少することを示し（１０．９μＭ）、その一方、ＣＨＯ細胞のＰｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａに対する感度が低い（２４．６μＭ）ことを示す（図１２）。
【０２３７】
インビボレセプタ発現は、融合コンストラクト治療に関連して測定される。インビボレセプタ発現は、融合コンストラクト治療の開始時と終了時に測定される。
実施例５
【０２３８】
本実施例は、融合コンストラクト及び化学療法剤を用いる併用治療について説明する。
【０２３９】
準備のために、卵巣癌細胞株（ＯＶＣＡＲ−３細胞、多剤耐性）がＰｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａ及びドキソルビシンとともに４８時間培養された。細胞の生存率は、フォルマゾンの減少として測定される。Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａと同時に培養されるドキソルビシンの量を増加させて治療を行う場合のＩＣ50の減少。この減少は、０、０．５、２及び１０μｇ／ｍｌのドキソルビシン濃度において、１０μＭから０．９、０．３、０．０５μＭまで見られる（図１１）。Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａを用いた治療によって、ドキソルビシンへの反応が高められた。このデータによって、細胞をドキソルビシンとともに培養することにより、Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａが、より有効になる（１３倍）ことが示された。
【０２４０】
ドキソルビシン又はシスプラチンを用いて癌細胞を前治療し、その後、ＬＨ又はＬＨＲＨとともに、ＬＨ又はＬＨＲＨを除いて、ＬＨ融合コンストラクト又はＬＨＲＨ融合コンストラクトを用いて治療を行った。これにより、コンストラクトに対する細胞毒性が修正されたかが示される。
【０２４１】
併用治療のインビボでの有効性は、異種移植腫瘍モデル（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ）で試験された。マウスは、融合コンストラクトと化学療法剤の混合物を用いて治療され、適当なコントロールと比較される。マウスは、この薬剤の標準的なスケジュールに従って治療され、融合コンストラクトを用いて週１回、３週間にわたって治療される。
【０２４２】
この融合結合体は、溶血活性、最大耐性容量（ＭＴＤ）（最大で１６〜２５ｍｇ／ｋｇ）等のパラメータに関して、抗腫瘍に効果のある容量（０．０２又は０．０１ｍｇ／ｋｇ）と比較して高い安全マージンを有している。Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａに関する安全マージンは１６であり、一方、Ｐｈｏｒ１８−βＣＧ−ａｌａ及びＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨに関しては８００である。比較のために、Ｐｈｏｒ１８−ルプロンの安全マージンはわずか８である。
【表６】
2016506373.tif 000008
レーティングコード
割り付けられたポイント：１    ２    ３
インビトロ活性    １ｘ    ２ｘ    ３ｘ
ＨＡ50  ＜  ５０  ５０−１００  ＞  １００
ＩＣ50／ＨＡ50  ＜０．０３  ＜０．００６  ＜０．００４
インビボでの有効性
３３との比較    同等    より良い
３３と比較されたＭＴＤ    同等    より良い
１）  ３３のＩＣ50は２．３１μＭ、３３のＩＣ50／ＩＣ50ペプチドとして表現された値
２）  ＨＡ50［μＭ］として表現された溶血活性
３）  インビボパフォーマンスは、ペプチド３３の同じパラメータと比較される基準値と対比した腫瘍質量の減少及び生存腫瘍細胞の減少における有意性を意味する。
４）  注射された投与薬によって６６．６％生存（急性及び注射後８−１４日経過時）
ペプチドコード
３３  ＝  Ｐｈｏｒ２１βＣＧ−ａｌａ
７６  ＝  Ｐｈｏｒ１８−βＣＧ−ａｌａ
８１  ＝  Ｄ  ａｌａ  Ｐｈｏｒ２１−βＣＧ−ａｌａ
８５  ＝  Ｄ  ａｌａ  Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ
４７  ＝  Ｐｈｏｒ１８−Ｌｕｐｒｏｎ
１３  ＝  Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ
１１  ＝  Ｄ  ａｌａ  Ｐｈｏｒ２１−ＬＨＲＨ
１２  ＝  Ｐｈｏｒ１８−ＡＳＡＡＳ−ＬＨＲＨ
７１  ＝  Ｐｈｏｒ１５−βＣＧ−ａｌａ
７４  ＝  Ｐｈｏｒ１５−Ｃ６−βＣＧ−ａｌａ
実施例６
【０２４３】
本実施例は、インビトロ動態試験における様々な癌細胞株におけるペプチドＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧ（Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３））について説明する。
【０２４４】
標準的な化学療法剤は、ＤＮＡ挿入（ＤＮＡ  ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎ）や微小管相互作用を通じて相互作用し、又はシグナル変換経路の阻害剤である。したがって、これらの作用メカニズムが標的細胞を破壊するための所要時間を定める。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ等のヒト乳腺癌細胞を破壊するドキソルビシンインビトロの反応速度は４時間程度の速さであるが、これ以外の標準的な治療方法についてはより長い時間が必要との報告がなされている。癌細胞を破壊する最も一般的な作用機序はアポトーシスである。可逆的なプロセスとして、また、多剤耐性（ＭＤＲ）の発生や、ＭＤＲ癌細胞内の薬剤分子を排出するＰｇｐポンプの働きによって、標準的な治療方法の効果がなくなる可能性がある。
【０２４５】
化学療法剤とは対照的に、生体膜への直接作用によって、癌細胞を数分間で破壊することができる。カチオン溶解ペプチド等の膜活性化合物には、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）（ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧ）が含まれる。
【０２４６】
細胞毒性の動態を測定するために、詳細な経時変化分析が実施された。この経時変化分析は、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）を用いて、標的とされていない溶解ペプチド部Ｐｈｏｒ１８＝ＣＬＩＰ７１（３３８９８３）との比較において、ＬＨＲＨ標的レセプタを様々なレベルで発現する様々な細胞株においてなされた。非癌性の細胞株の細胞膜は中性であり、癌細胞株とは対照的に、細胞溶解ペプチドに対する耐性がある。これは、外膜に、ホスファチジン酸を有する。
【０２４７】
試験された乳腺癌細胞株は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ（エストロゲンレセプタα陰性）、ＭＣＦ−７及びＴ４７Ｄ（エストロゲンレセプタα陽性）、卵巣癌細胞株（ＯＶＣＡＲ−３及びＳＫＯＶ−３）、前立腺癌（ＬＮＣａＰ）、非悪性乳腺上皮細胞株ＭＣＦ−１０Ａ及びマウス線維芽細胞細胞株ＮＩＨ：３Ｔ３であった。Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）の薬効におけるＬＨＲＨレセプタの役割も評価された。
【０２４８】
細胞を、９６ウェルプレートに１００００細胞／ウェルの濃度で播いた。治療は、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）（ＡＰＣ３３８６１３、Ｌｏｔ＃Ｐ０８０４０１）又はＰｈｏｒ１８（ＡＰＣ３３８９８３、Ｌｏｔ＃Ｗ０８０３３Ｃ１）が、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、５、１０、５０及び１００μＭの濃度で播かれてから４８時間後に開始した。コントロールには、ＵＳＰ生理食塩水又は０．１％トリトンＸ−１００（商標）を、それぞれ０及び１００％の細胞死の基準として含ませた。培養は、２分後、５分後、１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、６時間後、２４時間後、及び４８時間に、培地を取り除くことによって終了させた。細胞の生存率は、ホルマザン変換アッセイ（ＭＴＴアッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｇ３５８２）を用いて評価された。ホルマザン変換は、ＢｉｏＲａｄ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｌｕｓマイクロプレート分光光度計の４９０／６３０ｎｍデュアル波長を用いて室温で測定した。
【０２４９】
データは、１００％の細胞死を表すウェルを含むトリトンＸ−１００（商標）における吸収率として、ウェルを含む生理食塩水０％の細胞死と対比して計算された。ＩＣ50の測定は、米国カリフォルニア州サンディエゴのＧｒａｐｈＰａｄ  ＳｏｆｔｗａｒｅのＷｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍのバージョン５．０１において、様々な傾きを有するシグモイド型容量反応のためのプログラムを使用し、０％及び１００％の制約値を用いて行った。２つの９６ウェルプレートの各セットの４ウェルを比較及び分析した。有意性に対する統計解析を両側のスチューデントのＴ検定によって行った。
【０２５０】
ＭＤＡ−ＭＢ  ４３５Ｓ細胞（ｐ２５０）において、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、培養を１時間行った後に最大の効果を示した。一方、ＣＬＩＰ７１の培養によって、培養時間が増えるにつれて、１００、１０９、１７１、１４５、１４８、８６、５４．５、５５．１（２４時間）、及び３［μＭ］（４８時間）（ｐ＜０．００５）のＩＣ50値が得られた。Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、非結合溶解ペプチドＣＬＩＰ７１（＞１００μＭ）と比べて即効性のある薬剤である（０．５時間後に１．２μＭ、及び１時間後に０．６μＭ）。
【０２５１】
ＭＣＦ−７細胞（ｐ１５２）において、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、培養を１時間行った後に最大の効果を示した。一方、ＣＬＩＰ７１の培養によって、培養時間が増えるにつれて、９２、９５、５０及び２２［μＭ］（ｐ＜０．００５）のＩＣ50値が得られた。Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、非結合ＣＬＩＰ７１と比較して即効性のある薬剤である（３．４−１．８μＭ）。
【０２５２】
ＯＶＣＡＲ−３細胞（ｐ４７）において、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、培養を１時間行った後に最大の効果を示した。一方、非結合Ｐｈｏｒ１８＝ＣＬＩＰ７１の培養によって、培養時間が増えるにつれて、３３７、１２６、８５．５、５２．５、２２．９及び２３．１［μＭ］（ｐ＜０．００５）のＩＣ50値が得られた。Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、培養時間が増えるにつれて、６．７、５．６、５．３、１．６、１．５、０．５及び０．５［μＭ］（ｐ＜０．００５）のＩＣ50値を有する即効性のある薬剤である。この即効性に関するデータは、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）とＰｈｏｒ１８とは異なる作用機序で細胞を破壊しており、薬効を高められることを示唆している。
【０２５３】
ＳＫＯＶ−３細胞（ｐ４０）においては、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、培養を２４時間行った後に最大の効果（１１．５μＭ）を示した。一方、Ｐｈｏｒ１８の培養によって、培養時間が増えるにつれて、８６、９６、５３及び５０［μＭ］（ｐ＜０．００５）のＩＣ50値が得られた。Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、機能的ＬＨＲＨレセプタを発現させないＳＫＯＶ−３細胞にとって適切な標的ではない。
【０２５４】
機能的ＬＨＲＨレセプタを発現させる全ての細胞株、例えば、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）を用いて治療する乳腺癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５及びＭＣＦ−７）及びＯＶＣＡＲ−３は、０．５−１時間の培養で、その最大の効果（μＭ単位のＩＣ50）を発揮した。対照的に、Ｐｈｏｒ１８．が最大限の効果を発揮するには２４時間の培養が必要であった。Ｔ４７Ｄ、ＬＮＣａＰ等の機能的ＬＨＲＨレセプタを発現する細胞株においても、同様の結果が得られた。機能的ＬＨＲＨレセプタを発現しない細胞株（ＳＫＯＶ−３及びＨＥＫ  １Ａ）においては、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）及びＰｈｏｒ１８は、２４時間培養後に、それぞれ１０．３及び１１．８μＭのＩＣ50値を有する同様の細胞毒性を示した。非癌性細胞株３Ｔ３は、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）及びＰｈｏｒ１８に対する高い抵抗性を示した。例えば、ＩＣ50値がＰｈｏｒ１８に対して４０μＭ以上、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）に対して１０μＭ以上であった。
【０２５５】
これらの結果は、ＬＨＲＨターゲティングはＰｈｏｒ１８の薬効を向上させること、及び、非癌性細胞株はカチオン細胞溶解ペプチドによる細胞破壊に対する耐性があることを示している。Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、レセプタ標的メカニズムによって１時間以内で癌細胞を破壊する高い薬効を示す。Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、数分間以内に効果を発揮し、細胞内取り込みや代謝経路及び増殖機構への干渉に薬効を依存する標準的な化学療法よりも優れている。また、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、多剤耐性癌細胞にも作用することができる。
実施例７
【０２５６】
本実施例は、ペプチドＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧ（Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３））が乳腺癌細胞に対して有するインビトロでのあり得る作用機序を示すデータを含む。
【０２５７】
インビトロでのあり得る作用機序を確認するため、ＬＨＲＨレセプタを過剰に発現するヒト乳腺癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５において、蛍光顕微鏡を用いた観察を行った。ヒト乳腺癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、継代数２５２）を培養皿に播いた。ＥＰ１００を加える前に次のマーカーが導入された。すなわち、ＡｌｅｘｉｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社のＤＲＡＱ５（商標）（青）を核を着色するために用い、無傷ミトコンドリアを視覚化するためにオレゴン州のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．社のＭｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓ（Ｍ７５１２）を用いた。細胞膜は、小麦胚芽アレクサ緑色蛍光結合体（オレゴン州のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．社）によって着色した。
【０２５８】
取扱説明に従って、まず、Ｍｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ染料とともに細胞を装着した。生理食塩水で液状に戻したＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）が最終的に１０μＭとなるまで加えられ、５〜１０分間培養された。生理食塩水の培養皿はコントロールとしてのみ用いた。培養上清が取り除かれ、残された細胞が蛍光顕微鏡での画像化のために準備された。
【０２５９】
インビトロで機能的ＬＨＲＨレセプタを発現させる乳腺癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５を蛍光顕微鏡で観察したところ、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）（１０μＭ）に５分間露出させた後、細胞膜が崩壊したことが確認された。この観察結果から、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）が細胞膜を破壊し、数分間以内に細胞死を引き起こしたことが分かる。
【０２６０】
２μＭのＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）ＦＩＴＣとともに培地で３０分間培養されたＳＫＯＶ−３（ｐ４１）細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ（ｐ２５０）細胞の蛍光顕微鏡評価によって、ＳＫＯＶ−３細胞においては細胞内取り込みが起こらず、細胞膜のブレブ形成が起こらず、また、ミトコンドリアの染色が維持されたことがわかった。対照的に、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞では、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）ＦＩＴＣの細胞内取り込みが３０分以内に観察され、細胞膜の広範囲にわたってブレブ形成が観察され、その後、外膜にベシクルが形成され、ミトコンドリア染色が退色した。この観察結果によれば、数分間で細胞死が起こったことがわかる。
【０２６１】
Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、機能的ＬＨＲＨレセプタを発現させる細胞を数分間で破壊した。Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、細胞膜の外側を崩壊させて癌細胞を破壊し、壊死させた。この作用機序は、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）と機能的標的を発現させる細胞の細胞膜との間に急速な相互作用が発生したことを強く示唆している。ＬＨＲＨレセプタ陰性の細胞は標的ではなく無傷であった。
【０２６２】
これらのデータによって、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）が、高い特異性と抗癌剤としての高い薬効を有することが分かった。Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、数分間で薬効を発揮し、細胞内取り込みを必要とし代謝経路及び代謝経路及び増殖機構への干渉に薬効を依存する標準的な化学療法と比較して大きな利点を有していた。また、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、多剤耐性癌細胞にも作用することができた。
実施例８
【０２６３】
本実施例には、ペプチドＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧ（Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３））が異種移植モデルにおける抗癌効果を有することを示す評価研究が含まれる。
【０２６４】
インビボ薬効評価が、単剤療法又は標準治療とともに併用療法として実施された。この試験は、ヒト乳腺癌異種移植片ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ．ｌｕｃ（ｓ．ｃ．）、ＭＣＦ−７（エストロゲンレセプタα陽性）、ヒト卵巣癌異種移植片ＯＶＣＡＲ−３（ｓ．ｃ．）、ヒト前立腺癌異種移植片ＰＣ−３（アンドロゲンレセプタ陰性）を有するヌードマウスを用いて行った。生理食塩水（０．０２、０．２及び２ｍｇ／ｋｇ）に溶解したＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）を、１週間に１度又は２度の頻度で３週間にわたってボーラス単回投与によって側面尾静脈に注射した。
【０２６５】
Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）併用治療を、ＭＣＦ−７乳腺癌異種移植モデルを用いて行った。
【０２６６】
マウスは、最後の注射から１週間後に犠牲死させ、生化学検査のために血液を採取するとともに、腫瘍質量及び体重が記録した。腫瘍の一部は、組織学的評価のために１０％ＰＢＳ緩衝液とともにホルマリン固定した。インビボでの移植組織片観察の結果が表７に示されている。
【表７】
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【０２６７】
単回投与レジメンでＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ移植組織片の質量をを減少させるための最小有効量を定めるために、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ（継代数２４９）／マトリゲルＨＣ懸濁液（２．４ｘ１０6細胞／マウス）を非近交系で５週齢の雌Ｎｕ／Ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社）の肩甲骨間部に注射した（Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ  ２００６）。Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）（ＩＤ：３３８６１３ｌｏｔ＃Ｐ０８０４０１）（０．００００２、０．０００２、０．００２、０．０２、０．２及び１ｍｇ／ｋｇ）及び非結合Ｐｈｏｒ１８＝ＣＬＩＰ７１（ＡＰＣ３３８９８３、Ｌｏｔ＃Ｗ０８０３３Ｃ１）及びＬＨＲＨ（０．２／０．１２２ｍｇ／ｋｇ、（［Ｄ−Ｔｒｐ６］−ＬＨＲＨ、Ｓｉｇｍａ    Ｌ９７６１、ｌｏｔ＃０３７Ｋ１１０３）を、投与前に、ＵＳＰ生理食塩水で液状に戻した。投与は、週１度３週間にわたって、単回ボーラス静脈注射を用いて、側面尾静脈から行った。
【０２６８】
各グループは１６匹のマウスからなり、この各マウスが週１度３週間にわたって注射を受けた。基準値とするために、１６匹のグループの１つを治療開始時点において犠牲死させた。生理食塩水が注射されるグループは、コントロールグループとして用いた。試験期間中、腫瘍体積を１週間に２度記録した。
【０２６９】
腫瘍細胞注射後１６日の腫瘍が形成された時点で治療を開始し、２３日目及び３０日目まで継続した。腫瘍細胞の注射から３７日後に、全ての生存しているマウスを解剖した。
【０２７０】
治療反応は、生理食塩水コントロール及び非標的Ｐｈｏｒ１８治療との比較における、解剖時の腫瘍質量及び腫瘍質量の変動によって定めた。原発腫瘍を摘出し、計量して、組織学的評価のために１０％ＰＢＳ緩衝液とともにホルマリン固定した。データセットの統計的評価はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍ  ４で行った。有意性は、ウイルコクソン符号付き順位検定によって計算した。
【０２７１】
腫瘍体積及び腫瘍質量は、生理食塩水コントロール及びＣＬＩＰ７１及びＬＨＲＨで治療されたマウスにおいて増加した。０．０００２ｍｇ／ｋｇのＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）で治療されたマウスにおける腫瘍体積及び腫瘍質量は、生理食塩水コントロールと比較して有意に減少した。０．００２ｍｇ／ｋｇという少量のＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）を用いた治療により、基準値と比較して腫瘍体積及び腫瘍質量が有意に減少した（ｐ＜０．０００２）。
【０２７２】
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ異種移植マウスから摘出され、ヘマトキシリン・エオシンで染色された腫瘍部位の組織学的評価は、生理食塩水コントロール内及びＰｈｏｒ１８／ＬＨＲＨで治療されたマウスに生存可能な腫瘍細胞が存在することを示す。対照的に、０．０００２ｍｇ／ｋｇという少量のＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）の投与によって治療されたマウスから摘出した腫瘍において、有意な壊死が明確に確認された。非標的カチオン溶解ペプチドＰｈｏｒ１８は、腫瘍質量を減少させず、腫瘍組織を破壊しなかった。
【０２７３】
Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、０．００２ｍｇ／ｋｇという少量の投与で、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ異種移植片の腫瘍質量を減少させる高い効果を有しており、治療された腫瘍組織を壊死させた。溶血ペプチドを用いた非標的治療は、効果がない。
【０２７４】
複数回投与レジメンにおいてＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ移植組織片の質量を減少させるために必要となる最小有効量を定めるために、上述のように、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ（継代数２５３）／マトリゲルＨＣ懸濁液（２ｘ１０6細胞／マウス）を、非近交系で８週齢の雌Ｎｕ／Ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社）の肩甲骨間部に注射した。Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）（ＩＤ：３３８６１３ｌｏｔ＃Ｐ０８０４０１）（０．００２及び０．２ｍｇ／ｋｇ）を、投与前に、ＵＳＰ生理食塩水で液状に戻した。この投与は、腫瘍細胞の接種後１５、１６、１７、２０、２１、２２、２３、２７、２８、２９、３０、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４１、４２日目に、単回ボーラス静脈注射として側面尾静脈から行った。生理食塩水が注射されるグループは、コントロールグループとして用いた。
【０２７５】
各グループは１６匹のマウスからなるようにした。試験期間中、腫瘍体積を１週間に２度記録した。最終解剖を腫瘍細胞の接種から４５日後に行った。大部分のマウスで尾静脈閉塞が起こったため、注射を一時中断しその後に再開した。試験の最後に体重及び腫瘍質量を測定し、１０％リン酸緩衝生理食塩水とともに腫瘍をホルマリン固定した。
【０２７６】
複数回静脈注射によるＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）を用いた治療によって、いずれの投与レベルにおいても腫瘍の後退が見られた。０．００２ｍｇ／ｋｇを投与した２３グループのうち６グループで腫瘍のないマウスが観察され、０．２ｍｇ／ｋｇを投与した２０グループのうち１グループで腫瘍のないマウスが観察された。残渣塊は、典型的には、マトリゲルからなるものであった。０．２ｍｇ／ｋｇを投与したグループのマウス１匹は治療に反応しなかった。
【０２７７】
尾部の壊死は観察されなかった。尾部の発赤は存在しなかった。試験期間を通じて、体重には治療の影響は見られなかった。
【０２７８】
治療したマウスの生存率は１００％であった。対照的に、生理食塩水コントロールグループの８匹のマウスが、腫瘍体積が２５００ｍｍ3を超えたため、腫瘍細胞注射後３０日で（試験終了前に）死亡した。
【０２７９】
０．００２及び０．２ｍｇ／ｋｇのＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）の複数回注射レジメンで治療されたマウスから摘出したＨ＆Ｅ染色された腫瘍の組織学的評価によって、治療マウスにおいて腫瘍細胞が根絶されたことが示された。対照的に、生理食塩水コントロールマウスにおいては、生存可能な腫瘍細胞が存在していた。
【０２８０】
Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）は腫瘍細胞を破壊し腫瘍質量を有意に減少させた。また、治療マウスの寿命を延ばした。この治療は、体重や臓器検査に特段の影響を与えなかった。
実施例９
【０２８１】
本実施例は、乳腺癌異種移植モデル、卵巣癌異種移植モデル及び前立腺癌異種移植モデルにおける、ペプチドＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧ（Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３））の有効性評価について説明する。
【０２８２】
本実施例におけるインビトロ評価によれば、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）には即効性があり、接触から数分間で癌細胞を破壊することが示された。標的治療の初期段階での乳腺癌異種移植片におけるＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）の効果を測定するため、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）の単回注射後の乳腺癌移植組織片モデルにおけるＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）による細胞破壊の動態を調査した。
【０２８３】
実施例１０で説明されるように、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ移植組織片の質量を減少させるための最小有効量を定量するために、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ（継代数２４９）／マトリゲルＨＣ懸濁液（２．４ｘ１０6細胞／マウス）を、非近交系で５週齢の雌Ｎｕ／Ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社）の肩甲骨間部に注射した。Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）（ＩＤ：３３８６１３ｌｏｔ＃Ｐ０８０４０１）（０．２及び２ｍｇ／ｋｇ）を、投与前に、ＵＳＰ生理食塩水で液状に戻した。投与は、単回ボーラス静脈注射を用いて、側面尾静脈から行った。
【０２８４】
マウスは、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）又は生理食塩水による治療開始から１、２及び１６時間後に犠牲死とした。試験の最後に体重及び腫瘍質量を測定し、１０％リン酸緩衝生理食塩水とともに腫瘍をホルマリン固定した。
【０２８５】
腫瘍のＨ＆Ｅ染色された部分の組織学的評価によって、生理食塩水標的マウスにおいて、複数の有糸分裂像を有する生存能力のある腫瘍細胞が示された。Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）０．２及び２ｍｇ／ｋｇを投与した治療によって、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ異種移植片から発生した腫瘍が注射後１時間という短期間に破壊されたことが確認された。
【０２８６】
Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、投与後１時間という短期間で腫瘍を破壊した。このことは、壊死による細胞死を引き起こす即効性のある機序の存在を示唆している。これらのデータによって、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、腫瘍細胞を提示するＬＨＲＨレセプタへの細胞膜を通じた接触によって作用することが確認された。
【０２８７】
ヒト疾患類似の卵巣癌異種移植片におけるＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）の有効性を測定するため、単回及び複数回投与による評価が行われた。この評価においては、機能的ＬＨＲＨレセプタを発現するＯＶＣＡＲ−３ヒト卵巣癌細胞株の移植組織片モデルが用いられた。ＯＶＣＡＲ−３は、成長が遅い移植組織片モデルであり、腫瘍マーカー（癌抗原１２５、ＣＡ１２５）を分泌する。その分泌は治療反応として用いることができ、薬物活性を計ることができる。
【０２８８】
本移植組織片評価は、卵巣癌モデルにおけるＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）を試験するために行われ、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）の週１度の単回投与が、多剤耐性で成長の遅い腫瘍モデルにおいてインビボの有効性を示すか否かを決定した。非近交系で５週齢の雌Ｎｕ／Ｎｕマウス（Ｈａｒｌａｎ−Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ社）に、ＮＩＨ、つまり、ＯＶＣＡＲ−３細胞／マトリゲルＨＣ懸濁液（４．６ｘ１０6細胞／マウス）を皮下注射した。治療開始は、腫瘍が形成された腫瘍細胞注射後３３日目とし、４１日目及び４７日目まで治療を継続した。週１度の投与が３回行われ、投与量は体重１ｋｇ当たり０．０２、０．２及び２ｍｇ／ｋｇとした。３３日目、４１日目及び４７日目に、側面尾静脈から、単回ボーラス静脈注射で週１度の投与を行った。解剖は５２日目に行った。データは、平均の標準誤差で表される。矢印は投与を示す。
【０２８９】
治療グループには、生理食塩水コントロール（Ｎ＝１０）、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）（３３８６１３、Ｖ０９１０８Ｘ１）（０．０２（Ｎ＝１０）、０．２（Ｎ＝１０）、及び２ｍｇ／ｋｇ（Ｎ＝９））、及び非結合Ｐｈｏｒ１８＝ＣＬＩＰ７１（ＡＰＣ３３８９８３、Ｌｏｔ＃Ｖ０４００４Ｘ１）（２ｍｇ／ｋｇ  （Ｎ＝１０））、生理食塩水のシスプラチン／ＣＰ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、Ｃａｔ２３２１２０、Ｄ０００５４９５）（１０ｍｇ／ｋｇ、３ｑｄ（Ｎ＝１０））、基準値（Ｎ＝９）が含まれる。
【０２９０】
腫瘍を有するマウス９匹のグループを３３日目に犠牲死とし、基準値グループとして用いた。全てのマウスを、腫瘍細胞注射から５１〜５２日目に解剖した。腫瘍体積及び体重を評価期間中週に１度、合計２回記録した。また、獣医師の総合的な診断を行った。
【０２９１】
原発腫瘍、肝臓、腎臓、膵臓、心臓、肺、脾臓を摘出し、ホルマリンに固定して組織学的評価のために準備した。腫瘍質量を解剖時に測定した。腫瘍の一部分を、ＬＨ／ＣＧ及びＬＨＲＨレセプタアッセイ定量のために−８０°Ｃで冷凍保存した。
【０２９２】
薬物活性のためのバイオマーカーとして、ＣＡ１２５を血清中で特定し、解剖時に酵素結合免疫測定法を用いて各マウス個体から収集した。収集したＣＡ１２５は、卵巣癌抗原ＣＡ１２５の定量のために用いた（カリフォルニア州サンディエゴのＢｉｏｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．  社のＡｓｓａｙ  ｋｉｔ  Ｇｅｎｗａｙ、カタログ番号４０−０５２−１１５００９、＃ＢＣ−１０１３）。
【０２９３】
ＬＨＲＨレセプタレベルは、ホルマリン固定された腫瘍を用いて評価される。双方向顕微鏡（Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ）に接続されたコンピュータを利用した画像分析補助システムである定量免疫ペルオキシダーゼ画像分析を行った。この定量分析は、形態学的分析及び比色分析を含むＨｅｒ２／ｎｅｕレセプタの定量化プログラムを用いて行った。レセプタ状態は、ＬＨＲＨレセプタ染色が陽性を示す細胞の割合として報告された。その基準は次の通りである。すなわち、免疫反応性無しの場合は０、１−２５％の細胞が陽性の場合は１＋、２６−５０％の細胞が陽性の場合は２＋、５１−７５％の細胞が陽性の場合は３＋である。
【０２９４】
全てのグループのマウスが注射に耐えた。Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）2ｍｇ／ｋｇの１回目の注射の際に、１匹のマウスのみが死亡した。この１匹のマウスは急性死であり、医療処置に関するものであったが、腫瘍に関連して死亡したものではなかった。これ以外の治療グループについては全てのマウスが生存した。注射後１０分以上経過してから注射の結果として死亡したマウスは存在しなかった。
【０２９５】
腫瘍体積は、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）を用いた治療期間中に減少した。対照的に、Ｐｈｏｒ１８、シスプラチン又は生理食塩水コントロール中で治療されたマウスは、腫瘍の成長が観察された。腫瘍細胞注射から４２日後に記録された腫瘍体積は、０．２ｍｇ／ｋｇという低濃度のＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）（体重）を投与した場合に、基準値と比べて減少した（ｐ＜０．００１）。
【０２９６】
解剖時における腫瘍の特徴（腫瘍質量の中央値及び腫瘍質量の中央値の基準値からの変動）を定量した。生理食塩水コントロール及び非結合Ｐｈｏｒ１８＝ＣＬＩＰ７１（ｐ＜０．０５）と比較して減少した腫瘍質量は、２及び０．２ｍｇ／ｋｇのＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）を投与したグループにおいて得られた。腫瘍が無いマウスは、０．２及び２ｍｇ／ｋｇのＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）を投与したグループにおいて見られた。治療開始時と比較した腫瘍の退行として観測される治療反応は、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）を０．２ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０３対基準値）投与して治療したマウスにおいて最も大きかった。シスプラチン及び非結合Ｐｈｏｒ１８＝ＣＬＩＰ７１には、腫瘍質量を減少させる効果がなかった。
【０２９７】
生理食塩水コントロール、ＣＬＩＰ７１及びシスプラチンで治療されたマウスは、安定した腫瘍の成長を示した。ＣＡ１２５の血清レベルは、腫瘍質量（ｒ2＝０．６６）に対応するものであった。ＣＡ１２５の分泌は、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）で治療されたマウスにおいて減少した。また、ＣＡ１２５の分泌は、生理食塩水コントロールと比べて０．２及び２ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０００２）のＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）で治療されたマウスにおいて最も大きかった。
【０２９８】
０．０２ｍｇ／ｋｇのＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）で治療された後にＯＶＣＡＲ−３移植組織片を有するマウスから摘出された腫瘍のサイズは生理食塩水コントロールと比較して減少、壊死していた。治療された腫瘍では、ＬＨＲＨレセプタレベルが１−２ポイント減少した。ヘマトキシリン・エオシンで染色された腫瘍部位では、０．０２ｍｇ／ｋｇのＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）で治療された場合、有意な壊死が見られた。移植組織片を有するマウスでは、シスプラチン又はＣＬＩＰ７１で治療された場合、腫瘍体積、ＬＨＲＨレセプタレベルの減少は見られなかったが、組織学的評価の後に生存可能な腫瘍細胞が見られた。
【０２９９】
Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）での治療によって、腫瘍の後退、原形質におけるＣＡ１２５腫瘍マーカーの減少、ＬＨＲＨレセプタレベルの減少及び卵巣移植組織片モデルにおける壊死が見られた。したがって、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、多剤耐性卵巣癌異種移植片を破壊する効果を有する。
【０３００】
前立腺癌異種移植片におけるＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）の効果を定量するために、成長の速い移植組織片モデルにおいて、インビボでＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）を評価した。未治療のＰＣ−３異種移植片では、マウスに有意な体重減少が見られた。
【０３０１】
ＰＣ−３細胞／マトリゲルＨＣ懸濁液（１ｘ１０6細胞／マウス）を、非近交系で６週齢の雌Ｎｕ／Ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社）に皮下注射した。治療開始は、腫瘍が形成された腫瘍細胞注射後１５日目とし、２２日目及び２９日目まで治療を継続した。週１度の注射を３度行った。投与量は０．０２、０．２及び２ｍｇ／ｋｇ（体重）とし、側面尾静脈から、単回ボーラス静脈注射を行った。治療グループには、生理食塩水コントロール（Ｎ＝１２）、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）（ＡＰＣ３３８６１３Ｌｏｔ＃Ｖ０９１０８Ｘ１）（０．００２（Ｎ＝１２）、０．０２（Ｎ＝１２）、０．１２（Ｎ＝１２）及び１２２ｍｇ／ｋｇ（Ｎ＝１２））、及び非結合Ｐｈｏｒ１８＝ＣＬＩＰ７１（３３８９８３、Ｌｏｔ＃Ｖ０４００４Ｘ１）（５ｍｇ／ｋｇ（Ｎ＝１２）、基準値（Ｎ＝１２）が含まれる。
【０３０２】
腫瘍を有するマウス１２匹のグループを１５日目に犠牲死とし、基準値グループとして用いた。全てのマウスを、腫瘍細胞注射から３５〜３６日目に解剖した。腫瘍体積及び体重を評価期間中週に１度、合計２回記録した。また、獣医師の総合的な診断を行った。
【０３０３】
原発腫瘍、肝臓、腎臓、膵臓、心臓、肺、脾臓を摘出し、ホルマリンに固定して組織学的評価のために準備した。腫瘍質量を解剖時に測定した。腫瘍の一部分を、ＬＨ／ＣＧ及びＬＨＲＨレセプタアッセイ定量のために−８０°Ｃで冷凍保存した。
【０３０４】
全てのグループのマウスが注射に耐えた。また、全てのマウスが生存していた。注射によって死亡したマウスは存在しなかった。
【０３０５】
腫瘍体積は、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）を０．００２、０．０２、０．２及び２ｍｇ／ｋｇを投与した場合に、治療期間中において減少した。Ｐｈｏｒ１８又は生理食塩水コントロールにおいて治療されたマウスにおいては、腫瘍の成長が確認された。腫瘍細胞注射から２２日後の時点で記録された腫瘍体積は、０．００２ｍｇ／ｋｇ（体重）という低濃度のＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）を投与した場合に、生理食塩水コントロール及びＣＬＩＰ７１と比較して減少していることが確認された（ｐ＜０．００１）。腫瘍質量は、生理食塩水コントロール及びＣＬＩＰ−７１治療グループと比較して、Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）治療グループにおいて有意に減少した（０．００１）。
【０３０６】
ＰＣ−３異種移植片は、ヌードマウスに体重減少をもたらすことが知られている。Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）で治療されたマウスについては、０．００２、０．０２、０．２及び２ｍｇ／ｋｇのＰｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）を投与して治療されたグループにおいて、生理食塩水コントロール及びＰｈｏｒ１８を投与した場合と比較して、腫瘍体積の減少が確認された。解剖時の腫瘍質量の中央値は、生理食塩水コントロール及びＰｈｏｒ１８と比較して有意に減少した（ｐ＜０．００１）。コントロールグループにおけるマウスは、悪疫質であり、治療したマウスと比較して１０ｇ以上多く体重が減少した。
【０３０７】
Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、ＰＣ−３異種移植片において腫瘍の成長を阻止し、腫瘍による深刻な体重減少を避ける効果を有する。非結合Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）は効果がない。
【０３０８】
上述した評価によれば、ペプチドＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧ（Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３））は、インビボで乳腺癌、卵巣癌及び前立腺癌異種移植片を破壊する効果があることが分かった。Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、治療したマウスにおいて腫瘍を壊死させる。この壊死は、注射後１時間という早い時期に確認された。Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）は効果的である。Ｐｈｏｒ１８−ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、治療後のＬＨＲＨレセプタレベルを減少させる。このことは、標的細胞が破壊されることと整合する。
実施例１０
【０３０９】
本実施例はβ鎖ＦＳＨ断片／溶解ペプチド融合コンストラクト／結合体を説明する。
【０３１０】
前立腺癌、乳癌、結腸癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、精巣癌、及び卵巣癌への供給を行う血管の輪郭を形成する内皮細胞は、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のレセプタを発現する（Ｒａｄｕ等，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，  ３６３：１６２１  （２０１０年））。ＦＳＨレセプタは内腔内皮表面に発現され、ここに循環リガンドを結合させることができる。ＦＳＨ配列及び溶解ペプチド（Ｐｈｏｒ１８）の結合体は、腫瘍の血管系の輪郭を形成する内皮細胞を標的化して破壊し、よって血液の供給を破壊して腫瘍を退行させる。
【０３１１】
インビボのスクリーニングのために、ヒト卵胞刺激ホルモンのβ鎖の断片で構成される３つの溶解ペプチド結合体を用いた。これらの配列は以下のＦＳＨレセプタに結合する断片から選択した。すなわち、ｈＦＳＨ−β−３３−５３，  ｈＦＳＨ−β−８１−９５，及び  ｈＦＳＨ−β−９０−９５  である（Ｓａｎｔａ−Ｃｏｌｏｍａ  ＴＡ等，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６５：５０３７  （１９９０年）；  Ｇｒａｓｓｏ  Ｐ等，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２８：２７４５  （１９９１年）；  及び  Ａｇｒｉｓ  ＰＦ  Ｊ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ  １１：４９５  （１９９２年））。
【０３１２】
β鎖のＦＳＨ断片のアミノ酸配列は以下の通りであった。
ｈＦＳＨ−β−３３−５３：  ＣＹＴＲＤＬＶＹＫＤＰＡＲＰＫＩＱＫＴＣＴ；
ｈＦＳＨ−β−８１−９５：  ＱＣＨＣＧＫＣＤＳＤＳＴＤＣＴ；  及び
ｈＦＳＨ−β−９０−９５：  ＤＳＴＤＣＴ
【０３１３】
これらのペプチド配列は、Ｆｍｏｃ［Ｎα−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）］を用いた標準固相化学法によって、ＫＦＡＫＦＡＫ  ＫＦＡＫＦＡＫ  ＫＦＡＫの配列を有しＰｈｏｒ１８として知られる溶解ペプチドドメインにＣ末端において結合され、また標準逆相高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって精製された。チオール含有アミノ酸がペプチド内に存在し、開裂用混合薬剤を調整してトリフルオロ酢酸を９５％、水を２．５％、エタンジチオールを２．５％、及びトリイソプロピルシランを１％含ませた。合成されたペプチド結合体の純度は９５％を超えた。
実施例１１
【０３１４】
本実施例は、３つの種類及び投与量のβ−ＦＳＨ−Ｐｈｏｒ１８融合コンストラクト（ｈＦＳＨ−β−３３−５３；  ｈＦＳＨ−β−８１−９５，及び  ｈＦＳＨ−β−９０−９５）の投与を受けたヒト前立腺癌（ＰＣ−３）のマウス異種移植モデルでのインビボ実験について説明する。
【０３１５】
雄Ｎｕ／Ｎｕマウスの皮下にＰＣ−３／Ｍａｔｒｉｇｅｌ懸濁液（１×１０6細胞）を注射した。腫瘍細胞接種の２１日後に、各治療グループにマウスを８匹ずつ割り当てた。治療は１日目に開始し、第５、８、１２、１５、及び１９日に継続して行われた。凍結乾燥されたペプチド及びペプチド結合体を生理食塩水に溶解した。治療剤は、生理食塩水コントロール、ｈＦＳＨ−β−９０−９５  （１  ｍｇ／ｋｇ），  ｈＦＳＨ−β−８１−９５  （１  ｍｇ／ｋｇ），  ｈＦＳＨ−β−３３−５３  （１  ｍｇ／ｋｇ），  Ｐｈｏｒ１８  ｈＦＳＨ−β−９０−９５  （０．１，  １，  及び２  ｍｇ／ｋｇ），    Ｐｈｏｒ１８  ｈＦＳＨ−β−８１−９５  （０．１，  １，  及び２  ｍｇ／ｋｇ），  及びＰｈｏｒ１８  ｈＦＳＨ−β−３３−５３  （０．１，  １，  及び２  ｍｇ／ｋｇ）を用いた。投与は単回ボーラス注射によって週に２度行われた。
【０３１６】
全てのグループのマウスが注射に耐えた。治療グループの全てのマウスが生存した。
【０３１７】
原発腫瘍に対するペプチド結合体注射及び非結合ｈＦＳＨ−β配列の効果が図１３において説明される。腫瘍体積の時間に関連した増加が、すべてのコントロールグループ及び非結合ＦＳＨ断片を注射したグループで観察された。基剤及び非結合リガンドペプチドで治療したグループと比較すると、Ｐｈｏｒ１８  ｈＦＳＨ−β−９０−９５  （Ｐ＝０．０２７），  Ｐｈｏｒ１８  ｈＦＳＨ−β−８１−９５  （Ｐ＝０．０２９），及び  Ｐｈｏｒ１８  ｈＦＳＨ−β−３３−５３  （Ｐ＝０．１３４）で治療したマウスにおいて、腫瘍体積は有意に低いレベルに維持された。
【０３１８】
投与されたＰｈｏｒ１８  ｈＦＳＨ−β−９０−９５，  Ｐｈｏｒ１８  ｈＦＳＨ−β−８１−９５，及び  Ｐｈｏｒ１８  ｈＦＳＨ−β−３３−５３が前立腺癌細胞の成長を阻害したことが、測定された腫瘍体積によって示された（図１４Ａ−１４Ｃ）。解剖時の腫瘍質量は、Ｐｈｏｒ１８  ｈＦＳＨ−β−９０−９５  及び  Ｐｈｏｒ１８  ｈＦＳＨ−β−８１−９５で治療したグループにおいて減少していた（ｐ＜０．０５）。Ｐｈｏｒ１８  ｈＦＳＨ−β−３３−５３は体重１ｋｇにつき１ｍｇを投与した場合に、腫瘍体積の有意な減少が見られなかった（図１５Ａ−１５Ｃ）。Ｐｈｏｒ１８  ｈＦＳＨ−β−９０−９５の最小有効投与量は体重１ｋｇにつき１ｍｇであり、Ｐｈｏｒ１８  ｈＦＳＨ−β−８１−９５の最小有効投与量は体重１ｋｇにつき０．１ｍｇであった。非結合のｈＦＳＨ−β−９０−９５，  ｈＦＳＨ−β−８１−９５，  又は  ｈＦＳＨ−β−３３−５３は、腫瘍体積又は腫瘍質量に影響しなかった。
【０３１９】
体重はこれらの治療のいずれによっても影響を受けなかった（図１６）。
【０３２０】
全血球計算又は血液化学の結果には差異がなく、このことはコントロールと治療対象の個体との間で肝臓及び腎臓の機能検査に変化がないことを示している。
【０３２１】
ＦＳＨＲ抗体３２３を用いた腫瘍の免疫組織化学分析（Ｎｉｃｏｌａｅ  Ｇｈｉｎｅａ，仏国立保健医学研究所）により、ＦＳＨレセプタ陽性の内皮細胞はコントロールマウスの腫瘍に対する供給を行う多くの脈管に見られるが、ＦＳＨ−β断片Ｐｈｏｒ１８結合体のいずれかを用いて治療した腫瘍内にはほとんど存在しないことが示された。試験されたこれらの結合体の中で、Ｐｈｏｒ１８ｈＦＳＨ−β−８１−９５がヌードマウスにおいて最も効果的にＦＳＨレセプタを持つ内皮細胞を破壊し、ＰＣ−３異種移植片の腫瘍の成長を阻害した。
実施例１２
【０３２２】
本実施例はＦＳＨレセプタ発現癌細胞株に対するＦＳＨ標的化Ｐｈｏｒ１８結合体の活性を説明する。
【０３２３】
ＦＳＨに対するレセプタは、とりわけ正常な前立腺、良性の前立腺形成不全（ＢＰＨ）、前立腺癌（Ｄｉｒｎｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｓｔａｅ  ３５：２１２  （１９９８）；  Ｂｅｎ−Ｊｏｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．  Ｕｒｏｌ．  １６１：９７０  （１９９９）；  Ｍａｒｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．  Ｕｒｏｌ．  １７５：２０７２  （２００６）  及び卵巣癌（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ２６７：２６  （２００７）；  Ｍｅｒｔｅｎｓ−Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．  ３２４：１５２  （２０１２））において検出されている。
【０３２４】
ＦＳＨ−β断片と溶解ペプチド（Ｐｈｏｒ１８）との結合体はさらに改変されてシステインが除去され、前立腺癌及び子宮肉腫細胞株をを破壊するようにインビトロで試験した。
【０３２５】
インビトロの研究において、ヒト卵胞刺激ホルモンのβ鎖の断片で構成される３つの溶解ペプチド結合体のスクリーニングを行った。配列はｈＦＳＨ−β−８１−９５配列から改変された（Ｓａｎｔａ−Ｃｏｌｏｍａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６５：５０３７  （１９９０））。
【０３２６】
ｈＦＳＨ−β−８１−９５（ＱＣＨＣＧＫＣＤＳＤＳＴＤＣＴ）のアミノ酸配列内の４つのシステインをアラニンと置換することによって、合成を容易にし、非還元条件下におけるジスルフィドによるマルチマーではなくモノマーとなる溶液中のペプチド結合体の均一性を得た。
【０３２７】
ｈＦＳＨ−β鎖を８１から８９個のアミノ酸配列に短縮することで、Ｐｈｏｒ１８結合体の電荷を７＋（Ｐｈｏｒ１８−ｈＦＳＨ−β８１−９５ａ）から９＋（Ｐｈｏｒ１８−ｈＦＳＨ−β８１−８９  及び  Ｐｈｏｒ１８−ｈＦＳＨ−β８１−８９ａ）に増加させた。各結合体は、溶解ペプチド結合体の当初のへリックス長（１−２０）、及びＦＳＨレセプタに結合するために必要なリガンドドメイン内のアミノ酸を保持していた。
【０３２８】
β鎖のＦＳＨ断片のアミノ酸配列は以下の通りであった。
ｈＦＳＨ−β  ８１−９５ａ：ＱＡＨＡＧＫＡＤＳＤＳＴＤＡＴ；
ｈＦＳＨ−β  ８１−８９：ＱＣＨＣＧＫＣＤＳ；及び
ｈＦＳＨ−β  ８１−８９ａ：ＱＡＨＡＧＫＡＤＳ．
【０３２９】
これらのペプチド配列は、Ｆｍｏｃ［Ｎα−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）］を用いた標準固相化学法によって、ＫＦＡＫＦＡＫ  ＫＦＡＫＦＡＫ  ＫＦＡＫの配列を有するＰｈｏｒ１８である溶解ペプチドドメインにＣ末端において結合され、また標準逆相高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって精製された。
実施例１３
【０３３０】
本実施例では、３つの前立腺細胞株及び１つの子宮肉腫細胞株に対する３つのＦＳＨ−β−Ｐｈｏｒ１８結合体の活性のインビトロでの試験について説明する。
【０３３１】
ヒト前立腺癌細胞株（ＰＣ−３  （ｐ  ３５），  ＬＮＣａＰ  （ｐ  ２２）  及び  ＤＵ１４５  （ｐ  ６４））及びヒト子宮肉腫細胞株ＭＥＳ−ＳＡ−Ｄｘ５  （ｐ  ５８）（多剤耐性クローン）をＡＴＣＣ推奨培地で培養した。この培地は、ウシ胎児血清を１０％、ウシインスリンを０．０１ｍｇ／ｍｌ、ペニシリンを１００ＩＵ／ｍｌ、ストレプトマイシンを１００μｇ／ｍｌ含む。細胞は一般的な方法で９６ウェルプレートに播いた（ウェルごとに２，０００細胞）。培地を４８時間の培養の後に交換した。各アッセイは、溶解ペプチド−結合ドメイン結合体を、濃度を増加させながら投与して行った。この濃度は、０、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、５、１０、及び２５マイクロモルであった（Ｎ＝６）。溶解ペプチドドメイン−結合ＦＳＨ結合体は、凍結乾燥された状態で提供され、生理食塩水中で解凍して細胞に添加した。培養の継続時間は２時間及び２４時間であり、３７℃に設定された。膜完全性は２時間後に発光測定法を用いて行われ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｙｔｏｔｏｘ  Ｇｌｏ  Ｇ  ６０７  Ａ，  ｌｏｔ  ＃  ２９７５３５０１）、これにより崩壊した細胞から放出される死細胞プロテアーゼを測定する。細胞生存率は２４時間後に発光測定法（Ｐｒｏｍｅｇａ，  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ，  Ｇ７５５Ｂ，  ｌｏｔ  ＃３１５１１２０２）を用いて評価された。コントロールは、それぞれ０及び１００％の細胞死の基準として、生理食塩水又は０．１％のトリトンを含んでいた。
【０３３２】
データはＷｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．００（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて処理及び分析した。有意性に対する統計解析を両側のスチューデントのＴ検定によって行った。各調査は、Ｎを少なくとも６にするように実施した。
【０３３３】
インビトロの活性は各細胞株、時点、及び試験された化合物に対するＩＣ50値で表現され、これらはヒルの式を用いて計算される（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｚｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）。
【０３３４】
ＦＳＨレセプタレベルはフローサイトメトリーによって測定された。相対的な汚染レベルはバックグラウンドとシグナルレベルを比較することによって得られた。ＰＣ−３前立腺癌細胞（ｐ３５）はＦＳＨレセプタ陰性であり、ＭＥＳ−ＳＡ−Ｄｘ５（ｐ５８）は最大の汚染値９を有し、ＤＵ１４５は５．６、ＬＮＣａＰ細胞は３．３の汚染レベルであった。より高い汚染レベルは、低ミクロモル領域のＩＣ50値を有するＦＳＨ  Ｐｈｏｒ１８結合体の各々に対するより大きな感受性と相関関係にあった（相関関数は、Ｐｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β−８１−９５ａがｒ2＝０．９２５０、Ｐｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β−８１−８９がｒ2＝０．８６８５、Ｐｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β−８１−８９ａがｒ2＝０．９３３５であった）。
【０３３５】
ＩＣ50値として計測されるインビトロ活性は、前立腺癌細胞株においては中低ミクロモル領域にあった。前立腺癌細胞株はＦＳＨレセプタ（Ｐｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β  ８１−９５ａ；  Ｐｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β  ８１−８９；  Ｐｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β  ８１−８９ａ）を発現していた。ＬＮＣａＰ細胞株は、２時間後に１４．６±１．８，  ７．４±０．６，及び７．９±０．４μＭのＩＣ50値となり、２４時間後に１０．５±０．５  （ｐ＜０．０００１），  ３．９±０．４  （ｐ＜０．０００４  対  Ｐｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β  ８１−８９ａ）  及び  ６．３±０．１  μＭのＩＣ50値となった。ＤＵ１４５細胞は、２時間後に１４．８±０．８，  ９．７±０．７  及び  １１．３±０．３  μＭの感受性を示し、２４時間後には１０．１±０．３  （ｐ＜０．０００１），  ２．７±０．５  （ｐ＜０．０００２  対  Ｐｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β  ８１−８９ａ）  及び  ６．２±０．３  μＭのＩＣ50値となる感受性の増加を示した。最も高い感受性を示したのは子宮肉腫細胞株（ＭＥＳ−ＳＡ−Ｄｘ５）であり、これは最高レベルのＦＳＨレセプタを有していた。すなわち、ＩＣ50値は２時間後には２．５±０．６，  １．１±０．３  及び  ２．０±０．４  μＭとなり、２４時間後には２．７±０．３  （ｐ＜０．０００１），  ０．４７±０．０４  （ｐ＜０．０１６  対  Ｐｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β  ８１−８９ａ）  及び  ０．７６±０．０５  μＭとなった（表８）。
【０３３６】
電荷の増加により、Ｐｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β  ８１−８９  及び  Ｐｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β  ８１−８９ａ  （ｐ＜０．０００１；  ｐ＜０．０００１  及び  ｐ＜０．０００１）は、Ｐｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β  ８１−９５ａと比較して、前立腺癌細胞株ＤＵ１４５及びＬＮＣａＰ及び子宮肉腫細胞株ＭＥＳ−ＳＡ−Ｄｘ５におけるＦＳＨレセプタ陽性細胞株での毒性が高まった。ＬＮＣａＰ，  ＤＵ１４５，及びＭＥＳ−ＳＡ−Ｄｘ５細胞株においては、Ｐｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β  ８１−８９はＰｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β  ８１−８９ａ  （ｐ＜０．０００４，  ｐ＜０．０００２  及び  ｐ＜０．０１６）よりも高い活性を有していた。ＤＵ１４５，  ＬＮＣａＰ，及びＭＥＳ−ＳＡ−Ｄｘ５細胞株においては、２時間で膜崩壊が観察された。
【０３３７】
データは短縮された結合体がＦＳＨレセプタ陽性癌細胞を特異的に殺滅することを示した。アラニンによる置換は、システインによる場合と比較すると薬効が低くなるが、低ミクロモル領域における十分な活性を示した。
【表８】
2016506373.tif 000010
実施例１４
【０３３８】
本実施例では、２つの短縮されたＦＳＨ−Ｐｈｏｒ結合体（Ｐｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β  ８１−８９  及び  Ｐｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β  ８１−８９ａ）の、ＦＳＨレセプタに対する細胞殺滅の特異性を示す。上記２つのＦＳＨ−Ｐｈｏｒ１８結合体はＦＳＨレセプタ陽性の子宮肉腫細胞株（ＭＥＳ−ＳＡ−Ｄｘ５）においてＦＳＨの濃度を高めながら一定の投与量で試験した。
【０３３９】
９６ウェルの不透明プレートにおいて１ウェル当たり２，０００細胞を用いて、指数関数的に成長する培養物から酵素を使わない細胞遊離によって、ＭＥＳ−ＳＡ−Ｄｘ５  （ｐ  ５９）細胞からの細胞培養物を作製した。細胞培養物を４８時間にわたって付着させた。生理食塩水に溶解させたより高濃度のＦＳＨ（Ｓｉｇｍａ−Ｆ４０２１，ヒト下垂体，０９０Ｍ１３３６）を、０，  １，  １０，  ２５，  及び５０μＭの投与量で添加した。凍結乾燥された状態のＰｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β  ８１−８９  及び  Ｐｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β  ８１−８９ａを新たに生理食塩水に溶解し、１μＭの最終濃度で
マルチウェルプレートに添加した。細胞生存率は、３７℃で６時間培養した後に発光アッセイキット（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ  Ｇ７５５，  Ｐｒｏｍｅｇａ  ｌｏｔ  ３１６９９６０１）を用いて測定した。コントロールは、０および１００％細胞死に対する参照として、それぞれＵＳＰ食塩水または０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ＴＭを含んだ。データはＷｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．００（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）を用いて処理及び分析した。有意性に対する統計解析を両側のスチューデントのＴ検定によって行った。各調査は、Ｎを少なくとも６にするように実施した。
【０３４０】
生理食塩水コントロールのレベルを１００％として、それに対する相対的なレベルとしてインビトロ活性を表した。
【０３４１】
ＦＳＨの存在下での１μＭのＰｈｏｒ１８−ＦＳＨ−８１−８９  及び  Ｐｈｏｒ１８−ＦＳＨ−８１−８９ａ単独の相対的な活性は、活性の損失を示し、それは１０μＭ  （ｐ＜０．０５）の濃度で顕著であった。Ｐｈｏｒ１８−ＦＳＨ−８１−８９  及び  Ｐｈｏｒ１８−ＦＳＨ−８１−８９ａは、  ＭＥＳ−ＳＡ−Ｄｘ５子宮肉腫細胞上のＦＳＨレセプタを特異的に標的化する。
【０３４２】
Ｐｈｏｒ１８−ＦＳＨ−８１−８９  及び  Ｐｈｏｒ１８−ＦＳＨ−８１−８９ａは、類似のインビトロ活性によって、ＭＥＳ−ＳＡ−Ｄｘ５子宮肉腫細胞上のＦＳＨレセプタを特異的に標的化する。ＦＳＨが１０μＭの濃度で存在すると、活性を顕著に阻害し、２５μＭの濃度で完全に活性が失われる。これらのデータは、Ｐｈｏｒ１８−ＦＳＨ−８１−８９  及び  Ｐｈｏｒ１８−ＦＳＨ−８１−８９ａがともにＦＳＨレセプタに結合することによってＦＳＨレセプタ発現細胞を特異的に標的化することを示している（図１７）。
実施例１５
【０３４３】
本実施例では、２つの卵巣癌細胞株、１つの膵臓癌細胞株、及び１つの乳癌細胞株に対する３つのＦＳＨ−β−Ｐｈｏｒ１８結合体の活性を、非結合Ｐｈｏｒ１８とインビトロで比較して説明する。
【０３４４】
ヒト卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ−３  （ｐ  ４１），  ＳＫＯＶ−３  （ｐ  ３５）、ヒト子宮肉腫細胞株ＭＥＳ−ＳＡ−Ｄｘ５  （ｐ  ６１）（多剤耐性クローン）、ヒト膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ−１（継代数１８）、及びヒト三重陰性乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（継代数４７）をＡＴＣＣ推奨培地で培養した。この培地は、ウシ胎児血清を１０％、ペニシリンを１００ＩＵ／ｍｌ、ストレプトマイシンを１００μｇ／ｍｌ含む。細胞は一般的な方法で９６ウェルプレートに播いた（ウェルごとに２，０００細胞）。培地を４８時間の培養の後に交換した。各アッセイは、溶解ペプチド−結合ドメイン結合体及び非結合Ｐｈｏｒ１８を、濃度を増加させながら投与して行った。この濃度は、０、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、５、１０、及び２５マイクロモルであった（Ｎ＝６）。Ｐｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β  ８１−８９結合体の各々は、凍結乾燥された状態で提供され、生理食塩水中で解凍して細胞に添加した。培養の継続時間は４時間であり、３７℃に設定された。細胞生存率は４時間後に発光測定法（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ，  Ｇ７５５Ｂ，  ｌｏｔ  ＃００００００３１４２１）を用いて評価された。コントロールは、それぞれ０及び１００％の細胞死の基準として、生理食塩水又は０．１％のトリトンを含んでいた。
【０３４５】
データはＷｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．００（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）を用いて処理及び分析した。有意性に対する統計解析を両側のスチューデントのＴ検定によって行った。各調査は、Ｎを少なくとも６にするように実施した。
【０３４６】
インビトロの活性は各細胞株、時点、及び試験された化合物に対するＩＣ50値で表現され、これらはヒルの式を用いて計算される（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｚｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）。
【０３４７】
ＩＣ50値として計測されるインビトロ活性は、卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ−３，  Ｐａｎｃ−１，  及びヒト三重陰性乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１においては中低ミクロモル領域にあり、最も高い活性はＭＥＳ−ＳＡ−Ｄｘ５細胞におけるＰｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β  ８１−８９によって示され、Ｐｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β  ８１−８９ａがそれに続いた。Ｐｈｏｒ１８−ｈＦＳＨ−８１−８９はＰｈｏｒ１８−ｈＦＳＨ−８１−８９ａ  （ｐ＜０．００３）よりも有意に効果が大きかった。活性が最も低かったのは、一貫してＰｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β  ８１−９５ａ  （ｐ＜０．０００１）であった。
【０３４８】
４つの異なる細胞株において、４時間後のインビトロ活性はＰｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β  ８１−８９及びＰｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β  ８１−８９ａがＰｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β  ８１−９５ａと比較して有意に高かった（表９）。Ｐｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β  ８１−８９は非結合Ｐｈｏｒ１８の３倍から９３倍の活性を有した。
【０３４９】
これらのデータはＰｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β  ８１−８９結合体がＦＳＨレセプタ陽性癌細胞を特異的に殺滅することを示した。アラニンによる置換（Ｐｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β  ８１−８９ａ）は、システインによる場合（Ｐｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β  ８１−８９）と比較すると薬効が低くなるが、Ｐｈｏｒ−１８−ｈＦＳＨ−β  ８１−９５ａよりも優れた活性を示した。
【表９】
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【図１】
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【図７】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８Ａ】
2016506373.tif 000019
【図８Ｂ】
2016506373.tif 000020
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図８Ｊ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図１０Ａ】
2016506373.tif 000037
【図１０Ｂ】
2016506373.tif 000038
【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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