(57)【要約】本開示は、卵巣癌のような癌に対する免疫反応を刺激することに使用するための癌幹細胞を提供する。癌幹細胞を調製して精製するための方法が提供される。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製された卵巣癌（ＯＶ）癌幹細胞（ＣＳＣ）集団に由来する腫瘍抗原によって生体外で活性化された樹状細胞を含む、免疫原性組成物。
【請求項２】
腫瘍抗原がＯＶ−ＣＳＣの細胞抽出物を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
腫瘍抗原がＯＶ−ＣＳＣの溶解物を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
腫瘍抗原がインタクトＯＶ−ＣＳＣを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
インタクト細胞が非増殖性にされている、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
インタクト細胞が照射によって非増殖性にされている、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
インタクト細胞が、核架橋剤に前記細胞を暴露することによって非増殖性にされている、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
さらに医薬的に許容可能な担体および／または賦形剤を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
さらにアジュバントを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
アジュバントが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子である、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
活性化樹状細胞およびＯＶ−ＣＳＣを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
ＯＶ−ＣＳＣがＯＶ−ＣＳＣスフェロイドの形態である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
ＯＶ−ＣＳＣが初期ＯＶ−ＣＳＣの形態である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
ＯＶ−ＣＳＣが混合型ＯＶ−ＣＳＣの形態である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
ＯＶ−ＣＳＣがＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣの形態である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の対象者への投与を含む、卵巣癌を治療する方法。
【請求項１７】
免疫原性組成物が複数回で投与され、各投与量が約５〜２０×１０6個の細胞を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
投与量が約１０×１０6個の細胞を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記投与量が毎週２〜５回投与され、続いて毎月３〜６回投与される、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
対象者が免疫原性組成物の６〜１０回の投与を受ける、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項２１は欠落。
【請求項２２】
卵巣癌の治療のための医薬の製造における請求項１〜１５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の使用。
【請求項２３】
卵巣癌の治療のための請求項１〜１５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の使用。
【請求項２４】
卵巣癌（ＯＶ）癌幹細胞（ＣＳＣ）集団を調製するための方法であって、
ＯＶのサンプルを取得し、
前記サンプルの細胞を解離させ、
非付着性基材上の所定の培地中で前記解離細胞をインビトロで培養し、ここで所定の培地は無血清であり、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を通して作用する少なくとも１種類の増殖因子が添加されており、これによってＯＶ−ＣＳＣスフェロイドを形成することを含み、
ここでＯＶ−ＣＳＣスフェロイド集団における少なくとも８０％の細胞はバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ１１７、Ｈｅ−４、ＡＬＤＨ、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、およびＫｉ−６７の２種類以上を発現する、上記方法。
【請求項２５】
ＯＶ−ＣＳＣスフェロイド集団における少なくとも８０％の細胞がさらにバイオマーカーＣＡ１９−９、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＮＣＡＭ、ガングリオシドＣＤ２、エストロゲン受容体α、ビメンチン、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＡＦＰ、テストステロン、ＴＧＦβＲ、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ−７２、ＣＤ４６、ＣＤ４４、ＡＢＣＧ２、Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ、ネスチン、およびＴＰ５３の１種類以上を発現する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＯＶ−ＣＳＣスフェロイド集団における少なくとも９０％の細胞がバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ１１７、Ｈｅ−４、ＡＬＤＨ、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、およびＫｉ−６７の２種類以上を発現する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ＯＶ−ＣＳＣスフェロイドを付着性基材上の所定の培地中で培養することをさらに含み、ここで前記所定の培地は無血清であり、ＭＡＰＫ経路を通して作用する少なくとも１種類の増殖因子が添加されており、これによって初期ＯＶ−ＣＳＣ集団が形成され、ここで前記初期ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも８０％の細胞がバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ＣＤ１７、およびＫｉ−６７の２種類以上を発現する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
初期ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも８０％の細胞がさらにバイオマーカーＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＴＧＦβＲ、およびＣＤ２４の１種類以上を発現する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
初期ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも９０％の細胞がバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ＣＤ１７、およびＫｉ−６７の２種類以上を発現する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
ＯＶ−ＣＳＣスフェロイドを付着性基材上の所定の培地中で培養することをさらに含み、ここで前記所定の培地は血清を含み、これによって混合型ＯＶ−ＣＳＣ集団が形成され、ここで前記混合型ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも８０％の細胞がバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ１１７、ＣＫ８、ＣＫ１８、およびＫｉ−６７の２種類以上を発現する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
所定の培地がＭＡＰＫ経路を通して作用する少なくとも１種類の増殖因子をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
混合型ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも８０％の細胞がさらにバイオマーカーＣＡ１９−９、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＮＣＡＭ、ガングリオシドＣＤ２、エストロゲン受容体α、テストステロン、ＴＧＦβＲ、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ−７２、ＣＤ４６、Ｈｅ−４、ＡＬＤＨ、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＡＢＣＧ２、ネスチン、およびＴＰ５３の１種類以上を発現する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
混合型ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも９０％の細胞がバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ１１７、ＣＫ８、ＣＫ１８、およびＫｉ−６７の２種類以上を発現する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
ＯＶ−ＣＳＣスフェロイドを付着性基材上の所定の培地中で培養することをさらに含み、ここで前記所定の培地は血清を含み、ＭＡＰＫ経路を通して作用する少なくとも１種類の増殖因子が添加されており、これによって上皮間葉転換された（ＥＭＴ）−ＯＶ−ＣＳＣ集団が形成され、ここで前記ＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも８０％の細胞がバイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ、ＣＤ２４、およびＴｗｉｓｔの２種類以上を発現する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
ＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも８０％の細胞がさらにバイオマーカーＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ１３３、Ｎａｎｏｇ、ＣＤ１１７、Ｎ−カドヘリン、ＣＤ４４、およびビメンチンの１種類以上を発現する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも９０％の細胞がバイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ、ＣＤ２４，およびＴｗｉｓｔの２種類以上を発現する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
ＯＶ−ＣＳＣスフェロイド、混合型ＯＶ−ＣＳＣ、またはＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣを付着性基材上の所定の培地中で培養することをさらに含み、ここで前記所定の培地は無血清であり、ＭＡＰＫ経路を通して作用する少なくとも１種類の増殖因子が添加されており、これによって初期ＯＶ−ＣＳＣ集団が形成され、ここで前記初期ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも８０％の細胞はバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ＣＤ１７、およびＫｉ−６７の２種類以上を発現する、請求項２４、３０、または３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
初期ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも８０％の細胞がさらにバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ＣＤ１７、およびＫｉ−６７の１種類以上を発現する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
初期ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも９０％の細胞がバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ＣＤ１７、およびＫｉ−６７の１種類以上を発現する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
ＯＶ−ＣＳＣスフェロイド、初期ＯＶ−ＣＳＣ、またはＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣを付着性基材上の所定の培地中で培養することをさらに含み、ここで前記所定の培地は血清を含み、ＭＡＰＫ経路を通して作用する少なくとも１種類の増殖因子が添加されており、これによって混合型ＯＶ−ＣＳＣ集団が形成され、ここで前記混合型ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも８０％の細胞はバイオマーカーＡＦＰ、ＣＫ７、ＣＫ１９、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｎａｎｏｇ、ＦｏｘＡ２  ＨＮＦ４ａ、およびＡＢＣＧ２の２種類以上を発現する、請求項２４、２７、または３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
所定の培地がＭＡＰＫ経路を通して作用する少なくとも１種類の増殖因子をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
混合型ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも８０％の細胞がさらにバイオマーカーＣＡ１９−９、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＮＣＡＭ、ガングリオシドＣＤ２、エストロゲン受容体α、テストステロン、ＴＧＦβＲ、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ−７２、ＣＤ４６、Ｈｅ−４、ＡＬＤＨ、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＡＢＣＧ２、ネスチン、およびＴＰ５３の１種類以上を発現する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
混合型ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも９０％の細胞がバイオマーカーＡＦＰ、ＣＫ７、ＣＫ１９、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｎａｎｏｇ、ＦｏｘＡ２  ＨＮＦ４ａ、およびＡＢＣＧ２の２種類以上を発現する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
ＯＶ−ＣＳＣスフェロイド、初期ＯＶ−ＣＳＣ、または混合型ＯＶ−ＣＳＣを付着性基材上の所定の培地中で培養することをさらに含み、ここで前記所定の培地は血清を含み、ＭＡＰＫ経路を通して作用する少なくとも１種類の増殖因子が添加されており、これによってＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣ集団が形成され、ここで前記ＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも８０％の細胞はバイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ、ＣＤ２４、およびＴｗｉｓｔの２種類以上を発現する、請求項２４、２７、または３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
ＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも８０％の細胞がさらにバイオマーカーＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ１３３、Ｎａｎｏｇ、ＣＤ１１７、Ｎ−カドヘリン、ＣＤ４４、およびビメンチンの１種類以上を発現する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも９０％の細胞がバイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ、ＣＤ２４、およびＴｗｉｓｔの２種類以上を発現する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
所定の培地が表２に記載されたいずれかの培地である、請求項２４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
所定の培地が表２および表３の組み合わせから得るいずれかの培地である、請求項２４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
所定の培地が表２、表３、および表４の組み合わせから得るいずれかの培地である、請求項２４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
所定の培地が表２および表４の組み合わせから得るいずれかの培地である、請求項２４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
増殖因子が線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、またはアクチビンＡの１種類以上である、請求項２４に記載の方法。
【請求項５２】
ＦＧＦが塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
所定の培地にアクチビンが添加されていない、請求項２４〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
所定の培地にＯＶ幹細胞の自発的分化を防ぐのに効果的な量でアクチビンＡ作用剤が添加されている、請求項２４〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
培地が、さらにアクチビンＡ拮抗剤を含み、前記拮抗剤がホリスタチン、またはアクチビンＡと特異的に結合する抗体である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
培地に抗酸化剤が添加されてない、請求項２４〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
抗酸化剤がスーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオン、プトレッシン、またはβ−メルカプトエタノールである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
培地にグルタチオンが添加されている、請求項２４〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
付着性基材が足場依存性細胞と付着して収集するように構成されている、請求項２４〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
足場依存性細胞が線維芽細胞である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
非付着性基材が超低付着性ポリスチレン表面である、請求項２４〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
付着性基材が、ＲＧＤトリペプチドモチーフが豊富なタンパク質でコーティングされた表面を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
請求項２４〜５８のいずれか１項に記載の方法によって調製される精製されたＯＶ−ＣＳＣ細胞である、集団。
【請求項６４】
精製されたＯＶ−ＣＳＣ細胞がＯＶ−ＣＳＣスフェロイドである、請求項６３に記載の集団。
【請求項６５】
精製されたＯＶ−ＣＳＣ細胞が初期ＯＶ−ＣＳＣである、請求項６３に記載の集団。
【請求項６６】
精製されたＯＶ−ＣＳＣ細胞が混合型ＯＶ−ＣＳＣである、請求項６３に記載の集団。
【請求項６７】
精製されたＯＶ−ＣＳＣ細胞がＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣである、請求項６３に記載の集団。
【請求項６８】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法によって調製される、ＯＶ−ＣＳＣ細胞株。
【請求項６９】
ＯＶ−ＣＳＣがＯＶ−ＣＳＣスフェロイドである、請求項６８に記載のＯＶ−ＣＳＣ細胞株。
【請求項７０】
ＯＶ−ＣＳＣが初期ＯＶ−ＣＳＣである、請求項６８に記載のＯＶ−ＣＳＣ細胞株。
【請求項７１】
ＯＶ−ＣＳＣが混合型ＯＶ−ＣＳＣである、請求項６８に記載のＯＶ−ＣＳＣ細胞株。
【請求項７２】
ＯＶ−ＣＳＣがＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣである、請求項６８に記載のＯＶ−ＣＳＣ細胞株。
【請求項７３】
当該方法を必要とする対象者における卵巣癌に対する免疫反応を刺激する方法であって、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、請求項６３〜６７のいずれか１項に記載のＯＶ−ＣＳＣ細胞、または請求項６８〜７２のいずれか１項に記載のＯＶ−ＣＳＣ細胞株の前記対象者への投与を含む、上記方法。
【請求項７４】
卵巣癌の治療のための医薬の製造における請求項６３〜６７のいずれか１項に記載のＯＶ−ＣＳＣ細胞、または請求項６８〜７２のいずれか１項に記載のＯＶ−ＣＳＣ細胞株の使用。
【請求項７５】
卵巣癌の治療のための請求項６３〜６７のいずれか１項に記載のＯＶ−ＣＳＣ細胞、または請求項６８〜７２のいずれか１項に記載のＯＶ−ＣＳＣ細胞株の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連案件の相互参照
本出願は、２０１３年３月１２日出願した米国特許仮出願第６１／７７８，２２５号の３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権を主張する。また本出願は、２０１３年８月６日出願した国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５３８５０号の一部継続であり、２０１２年８月１５日出願した米国特許仮出願第６１／６８３，４７７号および２０１２年１０月２５日出願した第６１／７１８，６４３号の３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権を主張する。これらすべての全体が本明細書の参照によって組み込まれる。
本開示は、卵巣癌幹細胞、これに由来する免疫原性組成物、ならびにこの作製方法および利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
卵巣癌は卵巣を覆う上皮に起源を有し、そのため腺癌の組織学的特性を有すると考えられる。卵巣癌幹細胞はＳＫＯＶ３およびＡ２２４細胞株における主集団（ＭＰ）から選択される亜集団または「サイドポピュレーション」（ＳＰ）として既に報告されており、幹細胞マーカー遺伝子（Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇ）、トランスポーター遺伝子（ＡＢＣＧ２、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＢ１）、およびＣＤマーカー（ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＣＤ１７７）を発現し、癌に分化する可能性があり、異なる組織構造を有しており、幹細胞の多能性特性が示唆される。このような細胞の分離は蛍光ＤＮＡ−結合色素Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２の排除を用いて達成された。
【０００３】
特定の癌幹細胞集団は新生物の起源である可能性があり、治療された癌の再発の原因となり得る。また、組織における癌幹細胞の亜集団は、ある種のシグナルに暴露されたとき、増殖サイクルを再開して腫瘍を再確立できる細胞を産生できる。適切なシグナル化が増殖サイクルへの再開を誘発するまで、癌幹細胞の生態学的地位は休止状態である。再開のシグナルは、外傷、細胞損傷、微生物攻撃（ウイルス、細菌、または真菌）など、あるいは局所増殖因子、サイトカイン、または細胞間伝達によって仲介される局所事象から生じ得る。またホルモンも組織特異的な生態学的地位にある幹細胞を調節することができる。幹細胞の生態学的地位の欠如または変異は前記機能の混乱をもたらし得る。新生物はこのような混乱から生じることができ、これらには細胞周期の制御に影響するランダム変異が含まれる。癌をもたらす変異は個人によって異なる。このような変動は、ある乳癌患者と別の乳癌患者のような１つの型の癌を有する者の間、あるいは卵巣癌とメラノーマのような異なる癌の型の間で認められる。卵巣癌では、ＴＰ５３遺伝子に対する損傷が多くの症例で特定されているが、この変異は腫瘍細胞表現型に必ずしも反映されない。
また一貫性のないマーカーが腫瘍細胞と様々な割合で関連しており、免疫反応を誘発する上でうまく使用されることもそうでないこともある。腫瘍関連抗原を用いるような治療法は、ＣＡ１２５、Ｈｅｒ−２、Ｍｕｃ−１、Ｎｅｕ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、または腫瘍由来熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のような種々のタンパク質またはペプチドを使用する。
自家免疫療法は、患者自身の腫瘍組織を使用して免疫系を感作して腫瘍細胞に取り付かせる。溶解物または全細胞処方が単独または腫瘍に対する免疫反応を高めるために使用されているアジュバントとともに投与される。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書では、卵巣癌（ＯＶ）癌幹細胞（ＣＳＣ）、ＯＶ−ＣＳＣ細胞株、および卵巣癌の治療のためのＯＶ−ＣＳＣ負荷樹状細胞を含む免疫原性組成物が開示される。
具体的には、本明細書は、本明細書で開示される精製された卵巣癌（ＯＶ）癌幹細胞（ＣＳＣ）集団から得られる腫瘍抗原によって生体外で活性化された樹状細胞を含む免疫原性組成物を提供する。一つの実施形態では、腫瘍抗原はＯＶ−ＣＳＣの細胞抽出物を含む。別の実施形態では、腫瘍抗原はＯＶ−ＣＳＣの溶解物を含む。別の実施形態では、腫瘍抗原はインタクトＯＶ−ＣＳＣを含む。別の実施形態では、腫瘍抗原は生体外で樹状細胞にトランスフェクションされたメッセンジャーＲＮＡを含む。
別の実施形態では、インタクトＯＶ−ＣＳＣは非増殖性にされる。別の実施形態では、インタクトＯＶ−ＣＳＣは照射によって非増殖性にされる。さらに別の実施形態では、インタクトＯＶ−ＣＳＣは、ＯＶ−ＣＳＣを核またはタンパク質架橋剤に暴露することによって非増殖性にされる。
【０００５】
一つの実施形態では、免疫原性組成物はさらに医薬的に許容可能な担体および／または賦形剤を含む。別の実施形態では、免疫原性組成物はさらにアジュバントを含む。別の実施形態では、アジュバントは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子である。
さらに別の実施形態では、免疫原性組成物は活性化樹状細胞およびＯＶ−ＣＳＣを含む。別の実施形態では、ＯＶ−ＣＳＣはＯＶ−ＣＳＶスフェロイド、初期ＯＶ−ＣＳＣ、混合型ＯＶ−ＣＳＣ、またはＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣの形態である。
また、当該方法を必要とする対象者における卵巣癌を治療する方法が提供され、対象者への本明細書で開示される免疫原性組成物の投与が含まれる。一つの実施形態では、免疫原性組成物は、各投与量が約５〜２０×１０6個の細胞を含む複数回で投与される。別の実施形態では、投与量には約１０×１０6個の細胞を含む。別の実施形態では、投与は週に２〜５回投与され、次いで月に３〜６回投与される。さらに別の実施形態では、対象者は免疫原性組成物を６〜１０回投与される。
また、卵巣癌の治療用医薬の製造における本明細書で開示される免疫原性組成物、本明細書で開示されるＯＶ−ＣＳＣ、本明細書で開示されるＯＶ−ＣＳＣ細胞ラインの利用が提供される。
また、卵巣癌の治療のための本明細書で開示される免疫原性組成物、本明細書で開示されるＯＶ−ＣＳＣ、本明細書で開示されるＯＶ−ＣＳＣ細胞株の利用が提供される。
【０００６】
さらに本明細書では卵巣癌（ＯＶ）癌幹細胞（ＣＳＣ）集団を調製するための方法が提供され、当該方法は、ＯＶのサンプルを取得し、サンプルの細胞を解離させ、解離細胞を非付着性基材上の所定の培地中でインビトロ培養すること含み、ここで所定の培地は無血清であり、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を通して作用する少なくとも１種類の増殖因子が添加されており、これによってＯＶ−ＣＳＣスフェロイドが形成され、ここでＯＶ−ＣＳＣスフェロイド集団における少なくとも８０％の細胞がバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ１１７、Ｈｅ−４、ＡＬＤＨ、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、およびＫｉ−６７の２種類以上を発現する。別の実施形態では、ＯＶ−ＣＳＣスフェロイド集団における少なくとも８０％の細胞はさらにバイオマーカーＣＡ１９−９、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＮＣＡＭ、ガングリオシドＣＤ２、エストロゲン受容体α、ビメンチン、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＡＦＰ、テストステロン、ＴＧＦβＲ、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ−７２、ＣＤ４６、ＣＤ４４、ＡＢＣＧ２、Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ、ネスチン、およびＴＰ５３の１種以上を発現する。別の実施形態では、ＯＶ−ＣＳＣスフェロイド集団における少なくとも９０％の細胞がバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ１１７、Ｈｅ−４、ＡＬＤＨ、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、およびＫｉ−６７の２種類以上を発現する。
【０００７】
別の実施形態では、本発明はさらに付着性基材上の所定の培地中でＯＶ−ＣＳＣスフェロイドを培養すること含み、ここで所定の培地は無血清であり、ＭＡＰＫ経路を通して作用する少なくとも１種類の増殖因子が添加されており、これによって初期ＯＶ−ＣＳＣ集団を形成し、ここで初期ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも８０％の細胞はバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ＣＤ１７、およびＫｉ−６７の２種類以上を発現する。別の実施形態では、初期ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも８０％の細胞はさらにバイオマーカーＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＴＧＦβＲ、およびＣＤ２４の１種類以上を発現する。さらに別の実施形態では、初期ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも９０％の細胞はバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ＣＤ１７、およびＫｉ−６７の２種類以上を発現する。
【０００８】
別の実施形態では、本発明はさらに付着性基材上の所定の培地中でＯＶ−ＣＳＣスフェロイドを培養すること含み、ここで所定の培地は血清を含み、これによって混合型ＯＶ−ＣＳＣ集団を形成し、ここで混合型ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも８０％の細胞はバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ１１７、ＣＫ８、ＣＫ１８、およびＫｉ−６７の２種類以上を発現する。別の実施形態では、所定の培地はさらにＭＡＰＫ経路を通して作用する少なくとも１種類の増殖因子を含む。さらに別の実施形態では、所定の培地は低カルシウムの所定培地である。別の実施形態では、混合型ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも８０％の細胞はさらにバイオマーカーＣＡ１９−９、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＮＣＡＭ、ガングリオシドＣＤ２、エストロゲン受容体α、テストステロン、ＴＧＦβＲ、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ−７２、ＣＤ４６、Ｈｅ−４、ＡＬＤＨ、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＡＢＣＧ２、ネスチン、およびＴＰ５３の１種類以上を発現する。さらに別の実施形態では、混合型ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも９０％の細胞はバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ１１７、ＣＫ８、ＣＫ１８、およびＫｉ−６７の２種類以上を発現する。
【０００９】
別の実施形態では、本発明はさらに付着性基材上の所定の培地中でＯＶ−ＣＳＣスフェロイドを培養すること含み、ここで所定の培地は血清を含み、ＭＡＰＫ経路を通して作用する少なくとも１種類の増殖因子が添加されており、これによって上皮間葉転換された（ＥＭＴ）−ＯＶ−ＣＳＣ集団を形成し、ここでＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも８０％の細胞はバイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ、ＣＤ２４、およびＴｗｉｓｔの２種類以上を発現する。別の実施形態では、ＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも８０％の細胞はさらにバイオマーカーＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ１３３、Ｎａｎｏｇ、ＣＤ１１７、Ｎ−カドヘリン、ＣＤ４４、およびビメンチンの１種類以上を発現する。別の実施形態では、ＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも９０％の細胞はバイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ、ＣＤ２４、およびＴｗｉｓｔの２種類以上を発現する。
【００１０】
別の実施形態では、本方法はさらにＯＶ−ＣＳＣスフェロイド、混合型ＯＶ−ＣＳＣ、またはＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣを付着性基材上の所定の培地中で培養し、ここで所定の培地は無血清であり、ＭＡＰＫ経路を通して作用する少なくとも１種類の増殖因子が添加されており、これによって初期ＯＶ−ＣＳＣを形成し、ここで初期ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも８０％の細胞はバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ＣＤ１７、およびＫｉ−６７の２種類以上を発現する。別の実施形態では、初期ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも８０％の細胞はさらにバイオマーカーＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＴＧＦβＲ、およびＣＤ２４の１種類以上を発現する。さらに別の実施形態では、初期ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも９０％の細胞はバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ＣＤ１７、およびＫｉ−６７の２種類以上を発現する。
【００１１】
別の実施形態では、本発明はさらに付着性基材上の所定の培地中でＯＶ−ＣＳＣスフェロイド、初期ＯＶ−ＣＳＣ、またはＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣを培養すること含み、ここで所定の培地は血清を含み、ＭＡＰＫ経路を通して作用する少なくとも１種類の増殖因子が添加されており、これによって混合型ＯＶ−ＣＳＣ集団を形成し、ここで混合型ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも８０％の細胞はバイオマーカーＡＦＰ、ＣＫ７、ＣＫ１９、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｎａｎｏｇ、ＦｏｘＡ２  ＨＮＦ４ａ、およびＡＢＣＧ２の２種類以上を発現する。別の実施形態では、所定の培地はさらにＭＡＰＫ経路を通して作用する少なくとも１種類の増殖因子を含む。さらに別の実施形態では、所定の培地は低カルシウムの所定培地である。別の実施形態では、混合型ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも８０％の細胞はさらにバイオマーカーＣＡ１９−９、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＮＣＡＭ、ガングリオシドＣＤ２、エストロゲン受容体α、テストステロン、ＴＧＦβＲ、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ−７２、ＣＤ４６、Ｈｅ−４、ＡＬＤＨ、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＡＢＣＧ２、ネスチン、およびＴＰ５３の１種類以上を発現する。さらに別の実施形態では、混合型ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも９０％の細胞はバイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ１１７、ＣＫ８、ＣＫ１８、およびＫｉ−６７の２種類以上を発現する。
【００１２】
別の実施形態では、本発明はさらに付着性基材上の所定の培地中でＯＶ−ＣＳＣスフェロイド、初期ＯＶ−ＣＳＣ、または混合型ＯＶ−ＣＳＣを培養すること含み、ここで所定の培地は血清源を含み、ＭＡＰＫ経路を通して作用する少なくとも１種類の増殖因子が添加されており、これによってＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣ集団を形成し、ここでＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも８０％の細胞はバイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ、ＣＤ２４、およびＴｗｉｓｔの２種類以上を発現する。別の実施形態では、ＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも８０％の細胞はさらにバイオマーカーＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ１３３、Ｎａｎｏｇ、ＣＤ１１７、Ｎ−カドヘリン、ＣＤ４４、およびビメンチンの１種類以上を発現する。別の実施形態では、ＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも９０％の細胞はバイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ、ＣＤ２４、およびＴｗｉｓｔの２種類以上を発現する。
【００１３】
一つの実施形態では、所定の培地は表２に記載のいずれかの培地、表２および表３の組み合わせから得るいずれかの培地、表２、表３、および表４の組み合わせから得るいずれかの培地、または表２および表４の組み合わせから得るいずれかの培地である。
一つの実施形態では、増殖因子は線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、またはアクチビンＡの１種類以上である。別の実施形態では、ＦＧＦは塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）である。別の実施形態では、所定の培地はアクチビンＡが添加されていない。さらに別の実施形態では、所定の培地はＯＶ幹細胞の自発的分化を防ぐのに効果的な量でアクチビンＡ作用剤が添加されている。別の実施形態では、培地はアクチビンＡ拮抗剤を含み、拮抗剤はホリスタチンまたはアクチビンＡと特異的に結合する抗体である。
別の実施形態では、培地は抗酸化剤が添加されていない。別の実施形態では、抗酸化剤はスーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオン、プトレッシン、またはβ−メルカプトエタノールである。さらに別の実施形態では、培地はグルタチオンが添加されている。
別の実施形態では、付着性基材は線維芽細胞のような足場依存性細胞に付着して任意に収集するように構成される。別の実施形態では、非付着性基材は超低付着性ポリスチレン表面である。さらに別の実施形態では、付着性基材はＲＧＤトリペプチドモチーフが豊富なタンパク質でコーティングされた表面を含む。
【００１４】
また本明細書で開示される方法のいずれかによって調製される精製したＯＶ−ＣＳＣ細胞集団が提供される。特定の実施形態では、ＯＶ−ＣＳＣはＯＶ−ＣＳＣスフェロイド、初期ＯＶ−ＣＳＣ、混合型ＯＶ−ＣＳＣ、またはＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣである。
また本明細書で開示される方法のいずれかによって調製されるＯＶ−ＣＳＣ細胞株が提供される。特定の実施形態では、ＯＶ−ＣＳＣはＯＶ−ＣＳＣスフェロイド、初期ＯＶ−ＣＳＣ、混合型ＯＶ−ＣＳＣ、またはＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣである。
また当該方法を必要とする対象者における卵巣癌に対する免疫反応を刺激する方法が提供され、本明細書で開示される免疫原性組成物、本明細書で開示されるＯＶ−ＣＳＣ細胞、または本明細書で開示されるＯＶ−ＣＳＣ細胞株の投与を含む。
また卵巣癌の治療用医薬の製造における本明細書で開示されるＯＶ−ＣＳＣ細胞または本明細書で開示されるＯＶ−ＣＳＣ細胞株の利用が提供される。
また卵巣癌の治療のために本明細書で開示されるＯＶ−ＣＳＣ細胞または本明細書で開示されるＯＶ−ＣＳＣ細胞株の利用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】切除した腫瘍（実線の枠および矢印）あるいは針生検または腹腔洗浄のような小サンプル（破線の枠および矢印）から得る卵巣（ＯＶ）癌幹細胞（ＯＶ−ＣＳＣ）からスフェロイドへ分離、増殖、および収集の過程のフローチャートを示す図である。スフェロイドの産生後、ＯＶ−ＣＳＣ亜集団を産生する経路は共通の経路である。
【図２】非付着条件で不規則な細胞集塊を生じる確立された腫瘍細胞株（ＯＶＣＡＲ３）を示し、これによる高い分化度を示す図である。（位相コントラスト、２０×）
【図３】非付着条件で典型的な球形を生じる患者由来卵巣癌幹細胞を示し、これによる癌幹細胞の存在および増殖を示す図である。
【図４】癌幹細胞バイオマーカーＥｐＣＡＭおよびＮＣＡＭについて標識された患者由来の卵巣癌幹細胞培養を示す図である（図４Ａ）。細胞は１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含む５％血清含有培地にプレート播種された。図４ＢはＮＣＡＭ陽性細胞を反映する図４Ａの細胞の赤色チャンネル画像を示す図である。図４Ｃは細胞の上皮間葉転換（ＥＭＴ）と関連する現象におけるＥｐＣＡＭの減少を示す図４Ａの緑色チャンネル画像を示す図である。図４Ｄはビスベンズイミド核染色の青色チャンネル画像を示す図である。
【図５】ＥＭＴバイオマーカーＳｌｕｇ／ＳｎａｉｌおよびＣＤ１１７について標識された患者由来の卵巣癌幹細胞培養を示す図である（図５Ａ）。細胞は１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含む５％血清含有培地にプレート播種された。図５Ｂは図５Ａの多数の細胞がＳｌｕｇ／Ｓｎａｉｌについて陽性であることを示す赤色チャンネル画像を示す図である。図５Ｃは図５Ａの細胞がＣＤ１１７について陽性であることを示す緑色チャンネル画像を示す図である。図５Ｄはビスベンズイミド核染色の青色チャンネル画像を示す図である。
【図６】癌幹細胞バイオマーカーネスチンについて標識された患者由来の卵巣癌幹細胞培養を示す図である（図６Ａ）。細胞は１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含む５％血清含有培地にプレート播種された。図６Ｂは多数の細胞がネスチンについて陽性であることを示す赤色チャンネル画像を示す図である。この現象はＥＭＴと関連する。図６Ｃはビスベンズイミド核染色の青色チャンネル画像を示す図である。
【図７】ゼラチン上で５％ＦＢＳを含む培地中の患者由来卵巣癌幹細胞培養を示す図である。（位相コントラスト、１０×）
【図８】ゼラチン上で５％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、および１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含む培地中の患者由来卵巣癌幹細胞培養を示す図である。（位相コントラスト、１０×）
【図９】ゼラチン上で無血清培地中の患者由来卵巣癌幹細胞培養を示す図である。（位相コントラスト、１０×）
【図１０】ゼラチン上で１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含む無血清培地中の患者由来卵巣癌幹細胞培養を示す図である。（位相コントラスト、１０×）
【図１１】１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、および５ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを含む無血清培地中の患者由来卵巣癌幹細胞の小コロニーを示す図である（位相コントラスト、４０×）。細胞の大きさの約９０％を示す大きな核を有する小細胞が密集したコロニーで観察され、非常に初期の癌幹細胞が示唆された（胚幹細胞様、「初期」ＯＶ−ＣＳＣ）。
【図１２】卵巣癌バイオマーカーＣＡ１２５およびＭＵＣ−１について標識された患者由来卵巣癌幹細胞培養を示す図である（ＦＩＧ．１２Ａ）。細胞は１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含む無血清培地にプレート播種された。図１２Ｂは細胞の９０％以上がＣＡ１２５について陽性であることを示す図１２Ａの細胞の赤色チャンネル画像を示す図である。図１２Ｃは多数の細胞が様々な強度でＭＵＣ−１について陽性であることを示す図１２Ａの細胞の緑色チャンネル画像を示す図である。図１２Ｄはビスベンズイミド核染色の青色チャンネル画像を示す図である。
【図１３】卵巣癌バイオマーカーＣＫ８および増殖マーカーＫｉ６７について標識された患者由来卵巣癌幹細胞培養を示す図である（ＦＩＧ．１３Ａ）。細胞は１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含む無血清培地にプレート播種された。図１３Ｂは強い増殖を示す（Ｋｉ６７マーカーが陽性）図１３Ａの細胞の赤色チャンネル画像を示す図である。図１３Ｃは多数の細胞がＣＫ８について陽性であることを示す図１３Ａの細胞の緑色チャンネル画像を示す図である。図１３Ｄはビスベンズイミド核染色の青色チャンネル画像を示す図である。
【図１４】卵巣癌バイオマーカーＥｐＣＡＭおよびＮＣＡＭについて標識された患者由来卵巣癌幹細胞培養を示す図である。細胞は１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含む無血清培地にプレート播種された。図１４Ｂは細胞のいくつかにおけるＮＣＡＭの弱い核周辺発現を示す図１４Ａの細胞の赤色チャンネル画像を示す図である。図１４Ｃは多数の細胞がＥｐＣＡＭｇａ陽性であり、細胞の上皮特性を実証することを示す図１４Ａの細胞の緑色チャンネル画像を示す図である。図１４Ｄはビスベンズイミド核染色の青色チャンネル画像を示す図である。
【図１５】卵巣癌バイオマーカーＣＤ４４およびネスチンについて標識された患者由来卵巣癌幹細胞培養を示す図である（図１５Ａ）。細胞は１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含む無血清培地にプレート播種された。図１５Ｃは多数の細胞がＣＤ４４陽性であることを示す図１５Ａの細胞の緑色チャンネル画像を示す図である。図１５Ｂはほとんどが核周辺でネスチンについていくつかの陽性細胞を示す図１５Ａの細胞の赤色チャンネル画像を示す図である。図１５Ｄはビスベンズイミド核染色の青色チャンネル画像を示す図である。
【図１６】卵巣癌バイオマーカーＣＤ１３３について標識された患者由来卵巣癌幹細胞培養を示す図である（図１６Ａ）。細胞は１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含む無血清培地にプレート播種された。図１６Ｂは多数の細胞がＣＤ１３３陽性であることを示す図１６Ａの細胞の緑色チャンネル画像を示す図である。図１６Ｃはビスベンズイミド核染色の青色チャンネル画像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本開示の詳細な説明
本開示はヒト卵巣癌（ＯＶ）腫瘍から得られる、主に高純度癌幹細胞からなる細胞集団を提供する。実施形態では、細胞集団の純度は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％癌幹細胞である。これらの癌幹細胞は卵巣癌前駆体であり、継続的な自己再生およびあるレベルまで分化する能力を有する。また本開示は、癌の自家免疫療法のための抗原源としてさらに使用するため、ＯＶ由来幹細胞の精製した集団を産生する方法に関する。
試験およびスクリーニングする実施形態も包含される。本開示は遺伝子分析のために高純度ＯＶ幹細胞集団を使用して、個別化医療の組成物を決める独自の変化を特定するために使用する。本開示はインビトロで修正される新規細胞株を提供し、この修正はＯＶの免疫刺激性特性を高める。ＯＶ細胞株は粗腫瘍調製物を用いた同様な技術を超える改良であり、優れた抗原の信号対ノイズ比を示す。細胞株は、インビトロまたはインビボでの適用を変化または縮小し得る線維芽細胞のような混入細胞集団をほとんど含まない。また本開示の典型的な細胞株はＯＶを治療するための薬剤の製造のために使用される。
【００１７】
本明細書で使用されるとき、用語「に由来する」は、１つ以上の癌細胞に由来するペプチドの文脈では、癌細胞または癌細胞集団から当該ペプチドを得るいかなる方法も包含される。癌細胞は、例えばホモジナイザーまたは浸透圧破裂によって破壊することができ、粗抽出物が得られる。粗抽出物のペプチド、オリゴペプチド、およびポリペプチドは樹状細胞に暴露することができ、その後樹状細胞によるペプチドの処理が続く。また、用語「に由来する」はインタクト癌細胞を包含し、癌細胞は生きている、または癌細胞は照射によって処理されているが依然として代謝的に活性である、または架橋剤で処理されており、従って依然としてペプチドを含む。また「に由来する」は癌細胞デブリ、遊離癌細胞タンパク質、および照射された癌細胞の混合物を含み、これらは従って癌細胞に由来する。また、用語「に由来する」は抗原提示できるように樹状細胞を生体外でトランスフェクションするのに使用するため、癌細胞または癌幹細胞からのメッセンジャーＲＮＡの分離または増幅を含む。
【００１８】
「投与」は、ヒト、哺乳動物、哺乳動物対象、動物、獣医対象、プラセボ対象、研究対象、実験対象、細胞、組織、器官、または生物学的液体に適用されるとき、限定されないが、対象、細胞、組織、器官、または生物学的液体などへの外因性リガンド、試薬、プラセボ、小分子、医薬剤、治療剤、診断剤、または組成物の接触を意味する。「投与」は例えば治療法、薬理動態法、診断法、研究法、プラセボ法、および実験法を意味することができる。投与はヒトまたは動物対象のインビボ治療を意味することができる。細胞の処理は試薬と細胞の接触、ならびに液体が細胞と接触している場合の試薬と液体の接触を包含する。また「投与」は、試薬、診断剤、結合組成物、または別の細胞による細胞などのインビトロおよび生体外処理を包含する。
「効果的な量」は、限定されないが、医学的状態または疾患の少なくとも１つの症状または徴候を改善する、覆す、軽減する、予防する、または診断することができる量を包含する。別に、明確に、または文脈によって記載がない限り、「効果的な量」は、目的の結果を達成するのに十分な最小量に限定されず、目的の結果を達成するのに最適な量にも限定されない。
【００１９】
疾患または障害の重篤度、ならびに疾患または障害を予防、治療、または軽減する（目的の結果を達成する）処置能力は、限定されるものではないが、バイオマーカーまたは臨床パラメーターによって測定できる。バイオマーカーには血球数、血清中、尿中、または脳脊髄液中の代謝産物量、腫瘍細胞数、癌幹細胞数、腫瘍量が含まれる。腫瘍量は固形癌の治療効果判定（ＲＥＣＩＳＴ）基準（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ，ｅｔ  ａｌ．  （２００９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．４５：２２８−２４７）によって測定できる。発現マーカーにはｍＲＮＡの遺伝子発現または遺伝子増幅、抗原の発現、およびポリペプチドの発現が包含される。臨床パラメーターには、無増悪生存（ＰＦＳ）、６カ月ＰＦＳ、無病生存（ＤＦＳ）、進行までの期間（ＴＴＰ）、遠隔転移までの期間（ＴＤＭ）、および全生存率が含まれるが、限定されるものではない。
「標識された」組成物は、分光法、光化学法、生化学法、免疫化学法、同位体法、または化学法によって、直接的または間接的に検出できる。使用される標識には、例えば、32Ｐ、33Ｐ、35Ｓ、14Ｃ、3Ｈ、125Ｉ、安定同位体、エピトープタグ蛍光色素、電子密度試薬、基質、または酵素が含まれ、例として酵素結合免疫測定、またはフルオレット（ＵＳ６，７４７，１３５で開示され、フルオレットに関するその開示すべてが本明細書で参照によって組み込まれている）で使用される。
【００２０】
従って、本明細書では癌幹細胞の精製されたスフェロイド集団またはスフェロイドに由来する単一細胞調製物を調製するための方法が開示され、当該方法はＯＶの生検を取得し、生検の細胞を解離し、解離された細胞を基材上の所定の培地中でインビトロ培養することを含み、ここで所定の培地はＯＶ幹細胞の精製されたスフェロイド集団または単一細胞調製物を得るために、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を通して作用する少なくとも１種類の増殖因子が添加されている。精製されたＯＶ−ＣＳＣ集団における癌幹細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＧ５２９８２．１）、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＣＤ４６、ＣＤ１１７、サイトケラチン１８（ＣＫ１８）、サイトケラチン８（ＣＫ８），α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００２３４５．２）、Ｋｉ−６７、Ｎａｎｏｇ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０２４８６５．２，ＮＰ＿０７９１４１．２０）、Ｎ−カドヘリン、神経細胞接分子（ＮＣＡＭ；ＣＤ５６）、Ｏｃｔ３／４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００２６９２．２；ＮＰ＿９７６０３４．４；ＮＰ＿００１１６７００２．１；ＮＰ＿０６８８１２．１０）、Ｓｌｕｇ（ＳＮＡＩ２）／Ｓｎａｉｌ（ＳＮＡＩ１）（Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ）、Ｔｗｉｓｔ、ビメンチン、癌抗原−１２５（ＣＡ−１２５）、細胞表面ムチン１細胞（ＭＵＣ−１）、ヒト精巣上体タンパク質（Ｈｅ−４）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）、癌抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ガングリオシドＣＤ２、エストロゲン受容体α、テストステロン、形質転換増殖因子β受容体（ＴＧＦβＲ）、Ｓｏｘ２、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ−７２）、ネスチン、および腫瘍タンパク質ｐ５３（ＴＰ５３）の１種類以上を発現する。ＯＶ−ＣＳＣは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、αヒト絨毛性ゴナドトロピン（αＨＣＧ）、βヒト絨毛性ゴナドトロピン（βＨＣＧ）、およびデスミンのいずれもほとんど発現しない。本明細書で使用されるとき、用語「ほとんど」は指標マーカーが細胞の２０％未満で発現される細胞または細胞集団を意味する。他の実施形態では、バイオマーカーは細胞の１５％未満、細胞の１０％未満、または細胞の５％未満で発現される。開示される細胞集団形成のフローチャートを図１に示す。
【００２１】
本明細書で使用されるとき、用語「スフェロイド」は無血清培地における癌細胞の培養によって形成される癌幹細胞の球状集塊を意味する。スフェロイドを形成する能力は癌幹細胞の特性である。
特定の実施形態では、ＯＶ−ＣＳＣスフェロイド集団における少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％の細胞は、バイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ１１７、Ｈｅ−４、ＡＬＤＨ、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、Ｋｉ−６７、ＣＡ１９−９、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＮＣＡＭ、ガングリオシドＣＤ２、エストロゲン受容体α、ビメンチン、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＡＦＰ、テストステロン、ＴＧＦβＲ、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ−７２、ＣＤ４６、ＣＤ４４、ＡＢＣＧ２、Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ、ネスチン、およびＴＰ５３の２種類以上を発現する。他の実施形態では、ＯＶ−ＣＳＣスフェロイド集団における少なくとも約８０％の細胞は、バイオマーカーＡＦＰ、ＣＫ７、ＣＫ１９、ＥｐＣＡＭ、Ｅ−カドヘリン、Ｏｖ１、およびＯＶ６の２種類以上を発現する。別の実施形態では、ＯＶ−ＣＳＣスフェロイド集団における少なくとも約９０％の細胞は、バイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ１１７、Ｈｅ−４、ＡＬＤＨ、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、およびＫｉ−６７の２種類以上を発現する。
【００２２】
スフェロイド集団は培地組成および基材のような培養条件を変えることによって３種類の亜集団の１つにさらに増殖させることができる。バルク腫瘍、スフェロイド、初期、混合型、およびＥＭＴのＯＶ−ＣＳＣ集団の特性を表１に示す。
【表１】
2016512423.tif 000003
2016512423.tif 000004
【００２３】
さらに、初期ＯＶ−ＣＳＣ、混合型ＯＶ−ＣＳＣ、またはＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣ集団のいずれも、表１に示すように培地または条件を変えることによってＯＶ−ＣＳＣスフェロイド、初期ＯＶ−ＣＳＣ、混合型ＯＶ−ＣＳＣ、またはＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣから得られる。
一つの実施形態では、ＯＶ−ＣＳＣスフェロイドはさらにアクチビンＡ、ＦＧＦ、および無血清培地（選択培地）の存在する付着性基材上で培養されて胚幹細胞の特性を有するＯＶ−ＣＳＣの「初期」集団として本明細書では呼ばれる小細胞を有するコロニーを生じ、初期ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％の細胞は、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ＣＤ１１７、およびＫｉ−６７の２種類以上を発現する。別の実施形態では、初期ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも約８０％の細胞は、バイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ＣＤ１１７、Ｋｉ−６７、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＴＧＦβＲ、およびＣＤ２４の２種類以上を発現する。別の実施形態では、初期ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも約９０％の細胞は、バイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ＣＤ１１７、およびＫｉ−６７の２種類以上を発現する。
【００２４】
別の実施形態では、ＯＶ−ＣＳＣスフェロイドはさらに血清含有（増殖培地）における低カルシウム条件下の付着性基材上で培養されて単層を有する混合されたコロニーを生じ、ここで当該細胞は異種の形態を有する。培養培地は任意にＥＧＦを含む。これらの細胞は混合された分化プロファイルを有するＯＶ−ＣＳＣの「混合型」集団として本明細書では呼ばれ、混合型ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％の細胞は、バイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ１１７、ＣＫ８、ＣＫ１８、およびＫｉ−６７の２種類以上を発現する。別の実施形態では、混合型ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも約８０％の細胞は、バイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ１１７、ＣＫ８、ＣＫ１８、Ｋｉ−６７、ＣＡ１９−９、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＮＣＡＭ、ガングリオシドＣＤ２、エストロゲン受容体α、テストステロン、ＴＧＦβＲ、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ−７２、ＣＤ４６、Ｈｅ−４、ＡＬＤＨ、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＡＢＣＧ２、ネスチン、およびＴＰ５３の２種類以上を発現する。別の実施形態では、混合型ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも約９０％の細胞は、バイオマーカーＥｐＣＡＭ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ１１７、ＣＫ８、ＣＫ１８、およびＫｉ−６７の２種類以上を発現する。
【００２５】
さらに別の実施形態では、ＯＶ−ＣＳＣスフェロイドはさらにＦＧＦおよび血清含有培地（増殖培地）の存在する付着性基材上で培養されて本明細書では間葉様ＯＶ−ＣＳＣまたは「ＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣ」（上皮間葉転換した［ＥＭＴ］癌幹細胞）として呼ばれる紡錘型または不規則な形状の細胞の単層を生じる。この集団では、スフェロイドは上皮バイオマーカーＣＫ８、ＣＫ１８、およびＥｐＣＡＭの少なくとも１種類、またはすべての発現の欠如を特徴とするＥＭＴの過程を経ている。本明細書で使用されるとき、バイオマーカーの発現の欠如は、発現が検出されない、あるいは細胞の４０％（または以下）における発現、細胞の３０％（または以下）における発現、細胞の２０％（または以下）における発現、または細胞の１０％（または以下）における発現を意味する。さらにＥＭＴ過程は、対象のバイオマーカーを発現する集団における細胞の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％までが間葉バイオマーカーＳｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ、Ｔｗｉｓｔ、ＣＤ４４、ＮＣＡＭ、Ｎ−カドヘリン、およびビメンチンの少なくとも１種類またはすべての発現を増加することを特徴とする。
【００２６】
一つの実施形態では、ＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％の細胞は、バイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ、ＣＤ２４、およびＴｗｉｓｔの２種類以上を発現する。さらに別の実施形態では、ＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも約８０％の細胞は、バイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ、ＣＤ２４、Ｔｗｉｓｔ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、Ｎ−カドヘリン、ＣＤ４４、ビメンチン、ＣＤ３３、Ｎａｎｏｇ、およびＣＤ１１７の２種類以上を発現する。さらに別の実施形態では、ＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣ集団における少なくとも約９０％の細胞は、バイオマーカーＮＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ、ＣＤ２４、およびＴｗｉｓｔの２種類以上を発現する。
細胞集団の特定の実施形態では、細胞は示されたバイオマーカーの１種類以上を発現する。他の実施形態では、細胞は示されたバイオマーカーの２種類以上、３種類以上、４種類以上、５種類以上、６種類以上、７種類以上、８種類以上、９種類以上、または１０種類以上を発現する。さらに他の実施形態では、細胞は示されたバイオマーカーの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５種類を発現する。
【００２７】
単一細胞、細胞集団、あるいは単層またはスフェロイドのような特定構造で配置された細胞集団によるバイオマーカーの発現は、バイオマーカーのポリペプチド型またはバイオマーカーのｍＲＮＡ型の発現を測定することによって測定できる。ポリペプチド発現は標識抗体を用いて測定でき、一方、核酸発現はハイブリダイゼーション法によって測定でき、従来技術を利用できる。オリゴ糖または小分子代謝物のようなポリペプチドまたは核酸ではないバイオマーカーも、従来技術を利用した方法によって測定できる。
また、様々なサイズ（１ｍｇから数ｇまで）の卵巣腫瘍サンプルから分離されたＯＶ幹細胞の純粋な集団を得る方法が本明細書で開示される。腫瘍サンプルは新鮮または凍結することができ、機械的および／または酵素処理によって解離され、あるいは最小の機械的断片化によって直接的に培養される。
【００２８】
また本明細書における開示では、非付着性基材は抗生物付着特性を有する生物適合性材料または一般的な培養表面に適用される（含水表面上の細胞の蓄積を低下する）抗生物付着特性を有するコーティングである。コーティングはアミノ−シランなどのコーティング剤を用いて塗布できる。非付着性または抗生物付着性基材の場合、この基剤は、０〜２１日、５〜２０日、５〜１０日、１０〜２０日、または０〜２５日のいずれ間の期間のような約０〜２５日の間で使用できる。
付着性基材を使用する本方法の別の実施形態では、付着性基材はＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）トリペプチドモチーフが豊富な基材であることができる（例、コラーゲン、ゼラチン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ(商標)）。付着性基材は足場依存性細胞に付着して収集するように構成される表面である。さらに、基材は線維芽細胞である足場依存性細胞に付着して収集するように構成された付着性基材であることができる。またＲＧＤペプチドは、ポリスチレン、ヒアルロン酸、ポリ乳酸、またはこれらの組み合わせのようなポリマー骨格上に結合させることができる。さらに骨格はプロテオグリカンを含むことができる。プロテオグリカンは線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、アクチビンＡ、またはホリスタチンのような増殖因子を含むことができる。
【００２９】
非付着性基材は癌幹細胞を有する培養の迅速で効率的な増加をもたらすことができる。非付着性基材は、外科的に切除された腫瘍などの十分な大きさのサンプルが得られるときに使用することができ、ＯＶ−ＣＳＣの精製を直ちに開始できる。サンプルが針吸引または腹腔洗浄のように非常に小さく、非吸着性培養が適さない場合、付着培養を最初の増殖に使用でき、ついで非付着性基材での精製段階、そして付着性条件下での別の増殖が続く。代替処理方法を図１（破線および枠）および下記に示す。
【００３０】
特定の培養実施形態では、最初の培養期間は付着性基材上で行われ、ついで非付着性基材上の第二培養期間が続く。また最初の培養期間は非付着性基材上で行われ、ついで付着性基材上での第二培養期間が続く。期間は例えば、半日、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日など、あるいは２〜４日、または８〜１０日などのようないずれかの範囲であることができる。さらに、サイクルは付着培養の次に非付着培養、次いで付着培養などのように繰り返すことができる。別の実施形態では、サイクルは非付着培養の次に付着培養、次いで非付着培養などのように繰り返すことができる。
別の実施形態では、所定の培地はマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）を通して作用する少なくとも１種類の増殖因子が添加される。一つの実施形態では、増殖因子はＦＧＦおよびＥＧＦの１つまたは両方、あるいはこれらに似たものである。一つの実施形態では、ＦＧＦは塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）である。別の実施形態では、所定の培地はアクチビンＡが添加される。別の実施形態では、所定の培地はアクチビンＡが添加されない。また、ＯＶ幹細胞の自発的分化を防ぐのに効果的な量でアクチビンＡ作用剤が添加されている所定の培地が開示される。他の実施形態では、所定の培地は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）２、４、または７の１種類またはすべてが添加される。
また、患者の原発性卵巣腫瘍から得られる各患者に独自なＯＶ−ＣＳＣ細胞株が提供され、この細胞株は（ａ）自己再生および多能性の幹細胞特性ならびに分化能力を有し、（ｂ）５０％超などの多数の細胞に独特なゲノム癌識別特性を有する。
【００３１】
本開示は、核酸、遺伝子産物、ポリペプチド、およびペプチドフラグメントを包含し、固有性は慣用名のみによって合理的に確立される。また、核酸、遺伝子産物、ポリペプチド、およびペプチドフラグメントは特定のＧｅｎＢａｎｋ登録番号に基づいて包含され、核酸、ポリペプチドなどはＧｅｎＢａｎｋのものと少なくとも５０％の配列同一性、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有し、生化学的機能または生理学的機能が、少なくとも部分的に共有され、または選択的には機能と無関係である。
対象者における癌に対する免疫反応が本明細書で開示される組成物の一つによって刺激される方法が提供される。刺激される免疫反応にはＣＤ４+Ｔ細胞反応、ＣＤ８+Ｔ細胞反応、およびＢ細胞反応の１つ以上が含まれる。特定の実施形態では、ＣＤ４+Ｔ細胞反応、ＣＤ+Ｔ細胞反応、またはＢ細胞反応は、従来技術の当業者によって知られているアッセイに従い、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイ、テトラマーアッセイ、または抗原特異的抗体産生の検出によって測定できる。免疫反応には２年全生存（ＯＳ）のような生存期間を含むことができ、２年全生存は少なくとも６０％である。患者における免疫反応はまた、腫瘍学臨床試験で使用される評価項目によって評価でき、客観的反応（ＲＥＣＩＳＴ基準）、全生存、無増悪生存（ＰＦＳ）、無病生存、遠隔転移までの期間、６か月ＰＦＳ，１２か月ＰＦＳなどを含む。
【００３２】
また本明細書では、ＯＶ−ＣＳＣまたはこれに由来する抗原によって生体外で刺激された樹状細胞が、卵巣癌の治療に使用するために開示される。本明細書では、生体外でＯＶ−ＣＳＣを負荷（暴露）された樹状細胞を含む、ワクチン組成物のような免疫原性組成物が包含される。特定の実施形態では、樹状細胞および腫瘍細胞は同一のヒト対象者から得られるが（自家）、樹状細胞およびＯＶ細胞が異なる対象者から得られる実施形態も本開示の範囲内である。
樹状細胞はＯＶ−ＣＳＣのようなＯＶ腫瘍細胞の全細胞、細胞溶解物、細胞抽出物、照射された細胞、またはタンパク質誘導体によって負荷できる。樹状細胞免疫原性組成物は従来技術の当業者によって知られているように調製、および１種類以上の投与経路によってヒト対象者に投与できる。
特定の実施形態では、ＯＶ−ＣＳＣ細胞は照射またはそれ以外で処理して細胞分裂を妨げてから、樹状細胞に負荷する。照射に代えて、細胞分裂を防ぐ核酸架橋剤が含まれる。また、例えば自家免疫療法用の抗原源として、先に開示されたように、ＯＶ−ＣＳＣ集団の使用が提供され、ＯＶ−ＣＳＣは放射エネルギー（例、γ線、ＵＶ、Ｘ線）、温度（例、加熱または冷却）、または化学的（例、細胞増殖抑制、アルデヒド、アルコール）方法、あるいはこれらの組み合わせによって不活性化する。他の実施形態では、ＯＶ−ＣＳＣは樹状細胞の生体外活性化のための抗原源として使用される。
【００３３】
本開示は、調製されたＯＶ細胞（ＯＶ−ＣＳＣ）を提供し、調製されたＯＶ細胞によって負荷されたＤＣを提供し、調製されたＯＶ細胞が負荷された樹状細胞を含む免疫原性組成物（またはワクチン）を提供する。限定されないが、本開示の免疫原性組成物は、ＯＶスフェロイドで負荷されたＤＣ、スフェロイドを含む細胞集団で負荷されたＤＣ、ＤＣに負荷する前に付着表面上で増殖されたスフェロイド由来細胞集団で負荷されたＤＣ、ＤＣに負荷する前にホモジナイゼーションまたは超音波処理が加えられたスフェロイドで負荷されたＤＣ、ＤＣに負荷する前にホモジナイゼーションまたは超音波処理が加えられた増殖細胞集団で負荷されたＤＣなどを含むことができる。他の実施形態では、ＤＣは初期ＯＶ−ＣＳＣ、混合型ＯＶ−ＣＳＣ、またはＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣで負荷される。
また本明細書では、少なくとも１種類のＯＶ特異抗原を発現する細胞に対する効果的な免疫反応を刺激できるＯＶ−ＣＳＣ集団が開示され、ここでＯＶ−ＣＳＣ集団は少なくとも１つの樹状細胞と接触され、ここでＯＶ−ＣＳＣ集団は樹状細胞によって生体内または生体外で処理され、ここで対象者への少なくとも１つの樹状細胞の投与に反応して効果的な免疫反応が対象者に生じる。
【００３４】
本開示の組成物の免疫刺激量は、限定されないが、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果が測定可能量で増加する量、ＩＣＳアッセイの結果が測定可能量で増加する量、テトラマーアッセイの結果が測定可能量で増加する量、血液の抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞集団が測定可能量で増加する量、血液の抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞集団が測定可能な量で増加する量、あるいは増加は適切な対照と比べたときに少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１．５倍、２．０倍、３．０倍などである。適切な対照は対照組成物であることができ、この場合、樹状細胞はＯＶ細胞で負荷されない、またはＯＶ細胞由来のペプチドで負荷されない。
また本開示は、医薬、試薬、診断用キットを含むキットを提供し、ここで医薬、試薬、およびキットは樹状細胞（ＤＣ）、抗体、または抗原を含む。また、少なくとも１つの樹状細胞および少なくとも１つの抗原を含む組成物を投与するための方法、抗体形成を刺激するための方法、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を刺激するための方法、補体依存性細胞毒性を刺激するための方法、ならびに臨床試験または通常の医療処置と関連する患者の組み入れ／除外基準を測定するため、および当該医薬または試薬に対する反応を予測するために患者の適性を測定するための方法およびキットが提供される。本開示の医薬組成物、試薬、および関連方法は、ＣＤ８３陽性樹状細胞を包含し、ＣＤ８３はＩＦＮ−γ処理または未処理の癌細胞の負荷によって誘発される。本開示のＣＤ８３の態様では、ＣＤ８３は少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、６％、７％、８％、９％、１０％などまで誘発される。別の態様では、ＤＣ試薬またはＤＣ関連方法は除外され、この場合樹状細胞上のＣＤ８３はＩＮＦ−γの負荷によって検出できるほど誘発されない。
【００３５】
一つの実施形態では、本明細書で開示される方法によって腫瘍サンプルからＯＶ−ＣＳＣスフェロイド、初期ＯＶ−ＣＳＣ、混合型ＯＶ−ＣＳＣ、および／またはＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣを産生するためのすべての試薬、および／またはＯＶ−ＣＳＣスフェロイド、初期ＯＶ−ＣＳＣ、混合型ＯＶ−ＣＳＣ、および／またはＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣを特性化するための試薬ならびにＯＶ−ＣＳＣスフェロイド、初期ＯＶ−ＣＳＣ、混合型ＯＶ−ＣＳＣ、および／またはＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣを産生および／または特性化するための説明書を含むキットが提供される。別の実施形態では、キットは追加または代替で、樹状細胞を分離する、樹状細胞をＯＶ−ＣＳＣで負荷する、および／または対象者にＤＣ−ＯＶ組成物を投与するための試薬および説明書を含む。
【００３６】
腫瘍サンプル処理
本開示の卵巣癌（ＯＶ）幹細胞集団は患者の腫瘍の新鮮または凍結したサンプルを起源とすることができる。腫瘍サンプルは生検またはＯＶ細胞を含む腹腔の洗浄であることができる。ＯＶ幹細胞は針生検および洗浄液から分離される。
【００３７】
腫瘍サンプルは、０〜１００％濃度の動物やヒト血清または０〜０．５％濃度のアルブミン、あるいは生理学的浸透圧を確保する高分子のようなタンパク質源を含む、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、ウィリアムス、またはこれらの組み合わせなどの約７．４（±０．６）のｐＨを有する一般的な緩衝化培地に移すことができる。天然または人工的な高分子の例は、限定されないが、ヒアルロン酸、デキストラン、ポリビニルアルコールである。ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンのような抗生物質を、任意にアンフォテリシンＢ、ＦＵＮＧＩＺＯＮＥ(商標)（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のような抗真菌剤と併用して培地に使用し、抗菌特性を付与して輸送の際の汚染のリスクを低下させることができる。
【００３８】
腫瘍サンプルは培地温度を２〜３０℃に低下させることによって代謝活性状態を低く維持でき、これによって処理前の制限された時間（０〜７２時間）に生存能力を維持できる。包装（例、断熱包装）を使用して、輸送の際の適切な温度コントロールを確保することができる。
ついで、固形腫瘍組織を鋭利な刃または組織粉砕装置を用いた機械的な解離によって処理して、小さい（縦横高さいずれの寸法も）１ｍｍ未満の断片にする。
固形組織は任意にさらに酵素による解離によって処理する。様々な酵素を使用して単一細胞を分離できる。トリプシンおよびペプシンのような非特異的なタンパク質溶解酵素が十分に使用できる。コラゲナーゼ、ジスパーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、またはこれらの組み合わせを含む、最小の細胞膜損傷を標的化する特異的酵素を本開示の方法で使用できる。デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）を使用して、細胞調製物の望ましくない粘性に関与する細胞デブリの遊離ＤＮＡを分解することができる。解離後、懸濁液中の細胞は５０〜１００μｍメッシュに通して過剰の酵素およびデブリから洗浄し、緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、ＨＢＳＳ）または細胞培養培地中で遠心分離を繰り返す。
【００３９】
細胞培養条件およびスフェロイド産生
前述の単一細胞懸濁液は、分離、幹細胞の増殖、ならびに分化した細胞および／または正常細胞の抑制を促進する培養条件に移す。これは物理的条件、化学的条件、および操作の調和によって達成される。
細胞懸濁液を細胞付着させない非付着性（抗生物付着性）基材に暴露する。成熟細胞は一般的に足場依存性であり、適切な付着性基材が与えられない場合、急速に消失する。抗生物付着性基材には、超低付着性フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、天然の疎水性特性を有するポリマー（ポリビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、フルオロ−ポリマー）、または寒天−寒天、デンプンなどの天然炭水化物ポリマーでのコーティングのような市販製品を使用できる。
癌幹細胞は、高純度の癌幹細胞を含むスフェロイド組成で集塊および／またはコロニー増殖する。癌幹細胞集塊の培養は図３に示すように様々のサイズの容易に特定できるスフェロイド構造を有する。成熟細胞は分離されて非付着性のままである。分別する重力分離を使用でき、単に時限垂直沈降または短時間の低遠心力遠心分離（１００×Ｇ未満）させることによって、単一細胞から大型スフェロイドを選択できる。説明される選択方法は、（ａ）一般的に成熟した正常細胞である足場依存性細胞を排除させ、（ｂ）付着非依存性である幼若幹細胞の小クランプまたはスフェロイドにおけるコロニー増殖を促進し、（ｃ）幹細胞のコロニー増殖の結果として局所的な自己分泌を促進し、（ｄ）正常な線維芽細胞または卵巣細胞によって分泌されるアクチビンＡの自己分泌源を排除することを達成するように設計される。
【００４０】
球体を形成する細胞の能力は、部分的にはインテグリンといわれる細胞表面タンパク質から生じる。細胞表面上に発現される同種親和性インテグリンは、同型の細胞が「一緒に滞在する」ことを確実にする。培養のごく初期では単一細胞懸濁であるが、スフェロイドは酵素消化から直接的に形成される、あるいはいつでも凍結したサンプルまたは現存する付着培養から形成できる。酵素消化播種は、特定の表面特性を有する細胞を取り込むこの球体形成をもたらす。
例えば、線維芽細胞はスフェロイドに取り込まれず、重力を加えた際に培養から取り除かれる。使用される培地は付着を促進する分子を欠如しており、同種親和性特性を有さない細胞の非特異的集塊を防ぎ、培養容器表面への付着を防ぐ。このような細胞付着分子（ＣＡＭｓ）は一般的に動物またはヒトの血清中に認められる。従って無血清である培地組成物は、非付着性スフェロイドの培養に適している。
【００４１】
無血清培養培地では、培地への添加剤には増殖および維持の支持、またはそれ以外の細胞の生理および機能の目的の態様のために必要とされるホルモン、栄養素、ミネラル、およびビタミンを含むことができる。いくつかの例では、ＦＧＦファミリーおよびＥＧＦのようなマイトジェン活性を有する増殖因子の量の添加または調整によって幹細胞増殖を刺激および維持することができる。
癌幹細胞の球体を含む細胞の球体（スフェロイド）は、固定および標識抗体による染色、ついで共焦点顕微鏡検査によって可視化する方法によってバイオマーカー発現について特徴付けできる。またバイオマーカーはフローサイトメトリーなどの他の免疫化学的方法によって測定できる。球体は例えば、新鮮な腫瘍、または付着細胞として増殖に適合した細胞から得る懸濁液から調製できる。球体の形態は例えば、大きくて不規則に対して小さくて密集のように、培地の選択によって影響され得る。
別の実施形態では、抗生物付着コーティングに付着する細胞集団は、タンパク質キナーゼＢ（ＡＫＴ）によって仲介されるソニックヘッジホッグシグナル化および焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）シグナル化の逸脱した活性に基づいて分離できる。これらの現象はメタロプロテアーゼまたは解離に使用される酵素（トリプシン／コラゲナーゼ）のような酵素によって誘発される膜の変更によって高められる。このような細胞集団は急速な増殖性および侵襲性腫瘍と関連し得る。ソニックヘッジホッグシグナル化の正常または異常な活性を評価する方法は市販されており、従来技術の当業者に知られている。
【００４２】
細胞培養に使用される培地
ＯＶ幹細胞の分離に使用される所定の培地は、細胞の生存を促進し、選択用に特に組成化されている。培地は炭水化物および脂質を多く含むが、最少量のタンパク質を有する（０．１〜３％アルブミンまたは１〜５％血清）。全カルシウムを１．５ｍＭ未満で含み、無機鉄化合物を含まず、むしろ鉄はトランスフェリンのようなトランスポーターと完全に結合されている。培地は必須および非必須アミノ酸ならびに必須脂質（α−リノレン酸およびリノール酸）が過剰に加えられる（表４）。任意に培地はアクチビンＡを含まずに、ホリスタチンのようなアクチビンＡ受容体ブロッカーを含むことができる。また任意に培地はスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）またはカタラーゼのような抗酸化剤を含まずに、グルタチオンのようなチオール抗酸化剤を含む。
特定の実施形態では、培養培地は０．１〜１．５ｍＭの低量カルシウムを例えば塩化カルシウムの形態で１０〜１５０ｍｇ／Ｌ含む。
【００４３】
培養培地は表２に示すように、タンパク質（ある種の組成）、アミノ酸、抗酸化剤、エネルギー基質（グルコース、ガラクトース、Ｌ−グルタミン）、ビタミン（Ｂ１２）、ホルモン（甲状腺ホルモン、インスリン）、および増殖因子（ＦＧＦ、ＥＧＦ）が添加されたＤＭＥＭ、Ｆ１２、ウィリアムス、ＲＰＭＩ、リーボビッツのような基本組成で構成される。
タンパク質は０．１〜０．５％濃度のアルブミン、０．５〜２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）であることができる。タンパク質は０．１〜０．５％の範囲の濃度のデキストラン、ヒアルロナン、ポリ−ビニルアルコールのような高分子で代替できる。このような培地の組成物を表２、表３、および表４に示す。添加剤は培地に加えられ、細胞培養に供給するために混合される。
【００４４】
培地は週に３日の予定（月曜日−水曜日−金曜日）で交換でき、増殖が速い場合は例えば一日おき、または毎日のように、より頻繁に交換できる。連続供給または小バッチ供給バイオリアクターを増殖期に使用できる。
【００４５】
培地は、ＦＧＦおよびＥＧＦのようなＭＡＰＫ経路を通して作用する増殖因子を含む。これらの増殖因子の濃度は０．１〜１００ｎｇ／ｍＬで変えられ、一般的には約１０ｎｇ／ｍＬである。 
【００４６】
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【００４７】
【表３】
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【００４８】
【表４】
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脂質混合物はＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、ホスファチジルコリン、Ｔｗｅｅｎ  ８０、シクロデキストリン、またはこれらの混合物を用いた水中油型エマルションによって調製される
【００４９】
一つの実施形態では、培地はＦＧＦが約０．１〜１００ｎｇ／ｍＬ、約０．５〜５０ｎｇ／ｍＬ、約１〜４０ｎｇ／ｍＬ、約２〜３０ｎｇ／ｍＬ、約３〜２０ｎｇ／ｍＬ、約５〜１５ｎｇ／ｍＬ、約６〜１４ｎｇ／ｍＬ、約７〜１３ｎｇ／ｍＬ、約８〜１２ｎｇ／ｍＬ、約９〜１１ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬで添加される。他の実施形態では、ＦＧＦは培地に約５ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、約１１ｎｇ／ｍＬ、約１２ｎｇ／ｍＬ、約１３ｎｇ／ｍＬ、約１４ｎｇ／ｍＬ、または約１５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。
【００５０】
別の実施形態では、培地はＥＧＦが約０．１〜１００ｎｇ／ｍＬ、約０．５〜５０ｎｇ／ｍＬ、約１〜４０ｎｇ／ｍＬ、約２〜３０ｎｇ／ｍＬ、約３〜２０ｎｇ／ｍＬ、約５〜１５ｎｇ／ｍＬ、約６〜１４ｎｇ／ｍＬ、約７〜１３ｎｇ／ｍＬ、約８〜１２ｎｇ／ｍＬ、約９〜１１ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬで添加される。他の実施形態では、ＥＧＦは培地に約５ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、約１１ｎｇ／ｍＬ、約１２ｎｇ／ｍＬ、約１３ｎｇ／ｍＬ、約１４ｎｇ／ｍＬ、または約１５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。
【００５１】
また、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）またはカタラーゼの１つまたは両方が添加されない培地が提供される。抗酸化剤の利用は、肯定的および否定的の両方の結果を有することができる。癌幹細胞はフリーラジカルおよび糖分解代謝に対して正常細胞よりもはるかに耐性である。従って、高密度、低頻度な培地交換、培地における高濃度な代謝物のような準最適化培養では、正常な感受性の細胞が最初に排除される可能性が最も高い。培地に抗酸化剤を含まないことによって、選択され得る細胞集団は正常細胞よりも耐性のある癌を起源とする可能性がある。従って、特定の実施形態では、カタラーゼおよびＳＯＤ阻害剤のような抗酸化剤が培養培地に添加され、他の実施形態では、これらの化合物は培養培地から除外される。
【００５２】
代替方法では、アクチビン／ホリスタチン系を使用して、非常に初期の癌幹細胞を分離できる。アクチビンの添加によってアクチビンＡ耐性ＯＶ幹細胞の亜集団を選択できる。ホリスタチンは、特に線維芽細胞および正常卵巣細胞のようなアクチビンＡを内因的に分泌する多数の細胞が存在する場合に、アクチビンＡ受容体のブロッキングおよびＯＶ幹細胞の自発的分化の防止に使用される。細胞がアクチビンＡに対して感受性がない、またはホリスタチンが内因的に分泌される高純度なＯＶ幹細胞集団にある場合、ホリスタチンの使用は効果を有さない。
【００５３】
アクチビンＡは形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのメンバーであるタンパク質である。培養培地に添加または含まれるとき、アクチビンは幹細胞の多能性および自己再生の維持に役立つ。しかし、アクチビンＡは受容性のある幼若卵巣細胞および癌細胞の変異および分化を促進する。従って最初の目標は、培養に適切な自己分泌環境を生じることによって癌幹細胞の増殖も維持する腫瘍のインビトロにおける速い増殖である。アクチビンＡによって非常に幼若な癌幹細胞の亜集団が選択される可能性があるが、製造の初期に適用されるこのような条件は増殖を非常に遅らせて、バルクに非常に濃度の低い肝癌幹細胞を生じるだろう。例えば、「速い増殖」は培養容器中の培地が明らかな消費の証拠（例えばｐＨの変化）を有し、増加したコンフルエンスによって反映されて細胞数が日ごとに目視で増える結果となる。
【００５４】
速い増殖のためには、アクチビンＡは培養増殖の速度を遅くするため、好ましくは除外されて添加されない。いくつかの適用では、目的は非常に初期の幹細胞集団を得ることであり、アクチビンＡの使用によってその細胞集団が選択される。従って一つの実施形態では、アクチビンＡ含有増殖が開始され、アクチビンＡ活性化培養細胞を含む第一組成物が対象者に投与され、ついでアクチビンＡを含まない培養におけるアクチビンＡの感受性のない細胞の分離が続き、アクチビンＡを含まずに培養した細胞を含む第二組成物を対象者に投与する。
一つの実施形態では、培地はアクチビンＡが約０．０１〜１０ｎｇ／ｍＬ、約０．０５〜９ｎｇ／ｍＬ、約０．１〜８ｎｇ／ｍＬ、約０．５〜７ｎｇ／ｍＬ、約１〜６ｎｇ／ｍＬ、約１〜５ｎｇ／ｍＬで添加される。他の実施形態では、アクチビンＡは約０．５ｎｇ／ｍＬ、約０．７ｎｇ／ｍＬ、約０．９ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約１．２５ｎｇ／ｍＬ、約１．５ｎｇ／ｍＬ、約１．７５ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約２．２５ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約２．７５ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ、約３．５ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約４．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬで培地に存在する。
また、培地がアクチビンＡ拮抗剤、限定されないが、ホリスタチンまたはアクチビンＡと特異的に結合する抗体などで添加される実施形態が開示される。
【００５５】
別の実施形態では、培地はホリスタチンが約０．１〜１００ｎｇ／ｍＬ、約０．５〜５０ｎｇ／ｍＬ、約１〜４０ｎｇ／ｍＬ、約２〜３０ｎｇ／ｍＬ、約３〜２０ｎｇ／ｍＬ、約５〜１５ｎｇ／ｍＬ、約６〜１４ｎｇ／ｍＬ、約７〜１３ｎｇ／ｍＬ、約８〜１２ｎｇ／ｍＬ、約９〜１１ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬで添加される。他の実施形態では、ホリスタチンは約５ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、約１１ｎｇ／ｍＬ、約１２ｎｇ／ｍＬ、約１３ｎｇ／ｍＬ、約１４ｎｇ／ｍＬ、または約１５ｎｇ／ｍＬで培地に存在する。
【００５６】
マイトジェン（例、ＦＧＦ／ＥＧＦ）、アクチビンＡ、および付着性基材の組み合わせは、線維芽細胞または星細胞のような正常細胞の増殖に増加をもたらすことができる。このため条件は、豊富な環境におけるアクチビンＡに感受性がない非常に初期のＯＶ幹細胞または前駆体、または富栄養または封入特性を有する細胞（例、線芽細胞、星細胞）によって構成される「間質」の増殖を促進するように作製される。ＯＶのコロニーは細胞培養の次の数日から数週間の期間で間質に沿って発達して空間的に置換することが漸進的に観察される。この方法で使用される培地は表２、表３、および表４で説明される組成の組み合わせである。
ＦＧＦ、ＥＧＦ、およびアクチビンＡと「非常に初期の」ＯＶ癌幹細胞との間には関連がある。ＦＧＦおよびＥＧＦは、非常に初期を含むどのような分化状態でもＯＶ幹細胞の増殖をもたらす。アクチビンＡが細胞培養培地中にある場合、アクチビンＡに感受性がない非常に初期のＯＶ幹細胞の増殖に、アクチビンＡは排他的に寛容である（増殖させる）。ＯＶ幹細胞が感受性になる場合、増殖はアクチビンＡによって停止または低下される。
ＦＧＦおよびＥＧＦに対する不感受性は一般的でなく、天然のブロッカーはない。アクチビンＡに対する不感受性は、アクチビン受容体の天然ブロッカーであるホリスタチンによって仲介できる。ホリスタチンは同様な腫瘍細胞または腫瘍を囲む細胞によって分泌されることができる。アクチビンＡは典型的には腫瘍を囲む細胞によって分泌され、従って腫瘍の増殖は（阻害する）周辺細胞に依存し、（増殖を促進する）腫瘍による可能性がある。アクチビンＡに対する受容体の欠如は、非常に初期の未分化癌幹細胞の特徴であり、周辺組織による腫瘍の制御を妨げる可能性がある。
インビトロ培養は胚幹細胞様コロニーを含む。これらのコロニーは正常な線維芽細胞、分化した腫瘍細胞、または間葉転換した腫瘍細胞であることができる間質細胞によって囲まれる可能性がある。
【００５７】
本開示はＯＶ−ＣＳＣを調製するための方法を提供し、培地の交換、再播種、遠心分離、および沈降のような操作に必要とする時間を含む全培養時間は、５か月未満、４か月未満、３か月未満、２か月未満、１か月未満、１５０日未満、１２０日未満、９０日未満、６０日未満、３０日未満、または１５０日（±２０日）未満、１２０日（±２０日）未満、９０日（±２０日）未満、６０日（±２０日）未満、３０日未満（±２０日）である。排他的な実施形態では、本開示は癌幹細胞を調製するいかなる方法、および当該方法によって調製されるいかなる癌幹細胞集合も排除でき、この場合、操作に必要とされる時間は前述で開示された時間枠の１つよりも長い。また、前述の時間枠の１つによって示される付着培養における時間が提供される。また、前述の時間枠の１つによって示される非付着培養における時間が提供される。さらに前述の時間枠の１つによって特定される付着培養および非付着培養の合わせた時間が提供される。
【００５８】
上皮間葉転換（ＥＭＴ）
上皮起源の腫瘍は間葉状態に退行または分化転換することが知られている。上皮表現型は不動性であり、起源組織に限定された腫瘍の容積増加に関与し、典型的にはさらに分化される。ＥＭＴが起こるとき、細胞は移動性を得て隣接組織浸潤および遠隔転移を生じる。また転換した細胞は幹細胞様表現型を得、起源（原発性）腫瘍の特性を有するホスト組織に新しい腫瘍（転移）をもたらす複製および分化する能力を伴う。ＥＭＴによって、腫瘍細胞はさらなる免疫抑制能、薬剤ポンプ、および放射線耐性を得る。
培地組成物および物理的選択法はインビトロでのＥＭＴ現象を促進する。免疫原としてＥＭＴ転換集団を用いる利点は腫瘍再発の防止である。ＥＭＴ癌細胞の抗原性によって、免疫系は転移の原因である移動性癌細胞を認識して破壊できる可能性があるだろう。転移過程では、これらの細胞は非常に少ない数で移動し、ホスト組織に播種され、上皮細胞表現型（ＭＴＥ転換）に戻り、原発性腫瘍と類似した特性を有する新しい腫瘍を形成する。インビトロでＥＭＴを生じるために必要な条件は、無血清培地におけるスフェロイド形成、ｂＦＧＦによる刺激、ＢＭＰ２、４、または７による刺激、そしてＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）ペプチドモチーフを含む付着性基材（例、コラーゲン、ゼラチンなど）上でのプレート播種である。
【００５９】
ＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣ亜集団は、ＯＶスフェロイド、初期ＯＶ、または混合型ＯＶを表１および図１に示す培養条件で培養して得られる。
本明細書で使用されるとき、用語「ＯＶ−ＣＳＣ」は通常、ＯＶ−ＣＳＣスフェロイド、初期ＯＶ−ＣＳＣ、混合型ＯＶ−ＣＳＣ、またはＥＭＴ−ＯＶ−ＣＳＣを意味することができる。
【００６０】
腫瘍の少量源からのＯＶ−ＣＳＣの獲得
ＯＶ幹細胞選択の代替方法は、サンプル細胞の数が少ないときに使用される。例示では、腫瘍から得られる少数の生きた細胞は、酵素による解離後に１０×１０6個未満である。本開示の目的では、少量サンプルは例として針生検または腹腔洗浄から得られるサンプルを意味し、これに対して切除された腫瘍から得られるサンプルは、典型的には少量サンプルとは考えられず、少なくとも０．５から５〜１０ｇの重量である。コア生検は１８、１６、または１４ゲージ針を用いて行われ、５〜５０ｍｇのサンプルが得られる。真空補助下生検と呼ばれる比較的新しい方法も１１ゲージ針および真空補助デバイス（ＶＡＤ）によって行われる。真空補助デバイスと組み合わせた１１ゲージ端子は、典型的には９４ｍｇの各コアサンプルを採取する。真空補助を用いた１４ゲージ針は典型的には３７ｍｇ採取するが、自動生検装置と組み合わせたときには１７ｍｇだけである。この代替方法では、図１に示すように（破線枠および囲み）、腫瘍サンプルから得られる細胞は、解離の前または後に、ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）が豊富な化合物（例、コラーゲン、ゼラチン、またはＭＡＴＲＩＧＥＬ(商標)）を含む付着性基材に、本明細書で説明される選択（無血清）培養培地の存在下に移される。説明される選択方法は、（ａ）少数で存在する個別癌幹細胞の最初のクローン性増殖を促進して、（ｄ）幹細胞のクローン性増殖の結果として局所自己分泌活性を促進するように設計される。
【００６１】
付着性基材はコラーゲンまたはゼラチンのようなＲＧＤが豊富なタンパク質である。基材はタンパク質またはペプチドをポリスチレンポリカーボネート、環状オレフィンコポリマー、またはガラスなどの様々な材料に結合させて構築することができる。ＲＧＤペプチドはヒアルロン酸、ポリ乳酸、およびこれらの組み合わせのようなポリマー骨格に結合することができる。このようなポリマーはさらにプロテオグリカン（例、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラチン硫酸など）のような増殖因子のための担体末端で高めることができる。
細胞培養表面は、直接的に使用、またはアミノシランのようなコーティング剤を用いることができる。コーティングは細胞に対する付着特性（基材）を有する化合物であり、増殖容器材の最上部に塗布される。コラーゲンまたはゼラチンのような天然化合物であることができ、また言及されたラジカル／末端を有するより合成的なポリマーで構成されることができる。コーティング剤（シランのような接着剤）を使用して、培養容器材（ガラスなど）へのコーティングの付着を改善することができる。シランは、所望のラジカルまたは末端基を含む場合は単独で使用できる。
本方法および組成によって、多数の細胞を比較的短期間に得ることができる。細胞を１０3〜１０6個含む針生検のような数ｍｇから組織サンプルの培養を開始して、３〜４週間で約１０8個の細胞に増殖できる。
【００６２】
ＯＶ幹細胞培養の増殖および亜集団の産生
ＯＶ−ＣＳＣは幹細胞の追加特性として、独立して繁殖および増殖することができる。さらに、ＯＶ−ＣＳＣは部分的または全体として分化できる。幹細胞増殖条件が取り除かれる場合、ＯＶ幹細胞は増殖を遅延または停止し、形態および表現型をより分化した細胞型に変えることができる。形態は、より成熟した卵巣細胞または星細胞の特性である多核を有する平坦、類上皮、または星状になることができる。
付着培養は単一細胞懸濁液に解離して非付着性（抗生物付着性）条件に移し、足場依存性分化細胞を取り除くことができる。２〜３日後、幹細胞は、分化による沈降に基づいて、単一細胞から分離できる小スフェロイドに凝集してコロニーとして増殖する傾向にある。スフェロイドは付着条件で再度プレート播種でき、さらに繁殖できる。この方法は、培養が分化した細胞または線維芽細胞のような正常細胞が上回っている場合に、１〜３０％から９０〜９９％の幹細胞含量に培養幹細胞含量を精製する。本方法は必要な回数繰り返して幹細胞純度を復元できる。
【００６３】
小スフェロイドは一般的には０．１ｍｍ〜２ｍｍの直径を有する。小スフェロイドあたりの細胞数であるサイズ分布は、一般的には細胞が１０〜１０，０００個である。小スフェロイドの形状は球形または楕円形であることができ、また球形または楕円形構造の集塊として生じることができる。
患者特異的ＯＶ−ＣＳＣ細胞株を使用して、同一患者から得る正常組織と比べて新生物形質転換に関与するゲノム変異を特定することができる。ゲノム変異は分化のすべての段階で発現されない可能性がある。いくつかの調節タンパク質、または転写因子は、一時的にだけ発現され、変異の際に消失する可能性があり、そのため奇形細胞でも正常なタンパク質を有する。変異を最大限発現する細胞集団の特定およびこの集団の免疫系への暴露は、癌幹細胞を免疫療法の抗原源として使用する大きな利点であることができる。
【００６４】
ゲノム変異を特定することによって、個人向け組成物、例えば小分子、ＤＮＡ配列、アンチセンスＲＮＡ、または併用などが癌の治療のために作製できる。
このような細胞株をさらに使用して、薬剤発見のためのスクリーニングプレート（例えば９６ウェル）を作製できる。様々な患者から得る多ラインを単一プレートで組み合わせて個人間の変動を検討できる。
卵巣癌幹細胞はタンパク質、増殖因子、およびホルモンの分泌のような起源組織のいくつかの特性を保持し得る（機能的腫瘍）。これらの特性は、細胞株に不死特性を与えて、同一患者に使用できる「自己」タンパク質の産生に利用できる（例えば、アルブミン、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、インスリン、グルカゴン、ＤＯＰＡなど）。細胞は同一患者に使用するために、小型バイオリアクターに導入して分泌産物を収集し、精製および保存することができる。この方法は比較的多い従来のバイオシミラーのような免疫耐性を患者が発症しないことが特に利点である。
【００６５】
樹状細胞の負荷
患者から得る個別ＯＶ−ＣＳＣ細胞を使用して免疫療法用の抗原を産生することができる。精製した幹細胞株を使用する利点は、優れたシグナル対ノイズ比にある。腫瘍から得る、より成熟した細胞は抗原性を覆うことができて免疫系によって特定されないようにできる可能性がある代償機構を有することができる。抗原源として、ＯＶ−ＣＳＣには、生きている、有糸分裂が不活性、生きられない、または断片化されたものを使用できる。様々の方法が最適な抗原暴露のために細胞を改変するのに使用でき、放射エネルギー（例、γ線、ＵＶ、Ｘ線）、温度（例、加熱または冷却）、または化学的（例、細胞増殖抑制、アルデヒド、アルコール）、あるいはこれらの組み合わせである。
【００６６】
例示の実施では、本開示はＧＭ−ＣＳＦ、トール様受容体（ＴＬＲ）作用剤としてＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（ＴＬＲ９）、イミキモド（ＴＬＲ７）、ポリ（Ｉ：Ｃ）（ＴＬＲ３）、グルコピラノシル脂質Ａ（ＴＬＲ４）、ムレイン（ＴＬＲ２）、フラジェリン（ＴＬＲ５）などのような１種類以上の免疫アジュバント、ならびにＣＤ４０リガンドなどのＣＤ４０作用剤、またはサイトカイン、インターフェロン−γ、プロスタグランジンＥ２などのアジュバントとともに、樹状細胞（ＤＣ）を活性化するための試薬および方法を包含する。それぞれが本明細書において参考文献によってすべて取り込まれてＤＣの活性化に関して開示する、例えば米国特許ＵＳ７，９９３，６５９、ＵＳ７，９９３，６４８、ＵＳ７，９３５，８０４などを参照する。本開示は、前述のアジュバント試薬の１種類以上によるＤＣの生体外処置、または追加として、または代替として、ヒト対象、動物対象、または獣医対象へのアジュバントの投与を包含する。
【００６７】
免疫系は細胞免疫、体液免疫、および補体反応を包含する。細胞免疫は細胞のネットワーク、ならびに樹状細胞、ＣＤ８+細胞（細胞毒性Ｔ細胞、細胞毒性リンパ球）、およびＣＤ４+Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）を伴う事象を含む。樹状細胞（ＤＣ）は抗原を捕捉し、この場合、これらの抗原はＤＣの外側から捕捉される、または感染生物によってＤＣの内側で生合成され得る。ＤＣはポリペプチドを処理し、アミノ酸が約１０個の長さのペプチドを生じ、ペプチドをＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩのいずれかに移送して複合体を形成し、複合体をＤＣの表面に戻す。ＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体を有するＤＣがＣＤ８+Ｔ細胞と接触するとき、結果はＣＤ８+Ｔ細胞の活性化および増殖である。ＭＨＣクラスＩＩの役割に関して、ＭＨＣクラスＩＩ／ペプチド複合体を有するＤＣがＣＤ４+Ｔ細胞と接触するとき、結果はＣＤ４+Ｔ細胞の活性化および増殖である。Ｔ細胞に抗原を提示する樹状細胞はこのＴ細胞を「活性化」するが、活性化されたＴ細胞は効果的な免疫反応を開始できない可能性がある。ＣＤ８+Ｔ細胞による効果的な免疫反応はしばしば多くの相互作用の１つ以上によるＤＣの前刺激を必要とする。これらの相互作用にはＣＤ４+Ｔ細胞とＣＤの直接的な接触（ＣＤ４+Ｔ細胞のＣＤ４０リガンドとＤＣのＣＤ４０受容体の接触による）、またはＴＬＲ作用剤と樹状細胞のトール様受容体（ＴＬＲ）の１つの直接的な接触が含まれる。
【００６８】
体液免疫はＢ細胞および抗体を意味する。Ｂ細胞は形質転換して形質細胞になり、形質細胞は抗体を発現して分泌する。生来のＢ細胞はマーカーＣＤ２７を発現しないことで区別され、一方、抗原特異的Ｂ細胞はＣＤ２７を発現する。分泌された抗体は続いて腫瘍細胞の表面に存在する抗原と結合できる。感染した細胞または腫瘍細胞は抗体でタグ化される結果となる。抗体の感染細胞または腫瘍細胞との結合で、結合した抗体は感染細胞または腫瘍細胞の致死を仲介し、この場合、致死はＮＫ細胞によるものである。ＮＫ細胞は特定の標的抗原を認識するように構成されていないが、Ｔ細胞が標的抗原を認識するように構成されており、抗体の定常領域と結合するＮＫ細胞の能力によって、ＮＫ細胞は抗体でタグ化された細胞を特異的に殺すことができる。ＮＫ細胞の抗体認識は、（ＮＫ細胞の）Ｆｃ受容体と抗体のＦｃ部分の結合によって仲介される。このタイプの致死は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）と呼ばれる。ＮＫ細胞はまた、ＡＤＣＣのメカニズムと無関係に細胞を殺すことができ、この場合この殺滅には、標的細胞で失われる、または欠如するＭＨＣクラスＩの発現を必要とする。
【００６９】
どのような特定のメカニズムにも拘束されることを望むものではなく、本開示は癌幹細胞抗原の投与、または癌幹細胞抗原で負荷された樹状細胞の投与を包含し、抗原は１種類以上の癌幹細胞抗原を特異的に認識する抗体の産生を刺激し、抗体はＡＤＣＣを仲介する。抗原で負荷されたという語句は、生きた細胞を捕捉する、壊死細胞を捕捉する、死滅細胞を捕捉する、ポリペプチドを捕捉する、またはペプチドを捕捉する樹状細胞の能力を意味する。腫瘍抗原は、ＯＶ−ＣＳＣの細胞抽出物、ＯＶ−ＣＳＣの溶解物、またはインタクトＯＶ−ＣＳＣ細胞を含む。別の実施形態では、腫瘍抗原は生体外で樹状細胞にトランスフェクションされたメッセンジャーＲＮＡを含む。
交差提示による捕捉は本開示によって包含される。また、マクロファージまたはＢ細胞のような樹状細胞でない抗原提示細胞の使用も包含される。
「遅延型過敏反応」の技術を主に細胞免疫または主に体液免疫を含む免疫反応間を区別するために使用できる。遅延型過敏反応の陽性シグナルは細胞反応を示す。
【００７０】
本開示は、腫瘍が放射線、核酸架橋剤、ポリペプチド結合剤、またはこれらの組み合わせなどによって不活性化される組成物および方法を提供する。架橋結合は、一次化学結合によって鎖の特定の炭素原子と結合する要素、基、または化合物のいずれかからなる架橋によるポリマー分子の２つの鎖の結合である。架橋結合は、ケラチンまたはインスリンにおけるような２つのシステイン残基を含むジスルフィド結合、成熟コラーゲンの三価ピリジノリンおよびピロール架橋結合、ならびにグルタミン残基のγ−カルボキシ−アミン基とリジン残基のε−アミノ基の間の共有ε−（γ−グルタミル）リジン架橋結合を含む血液凝固における架橋結合によって結合されるポリペプチド鎖からなる物質中で自然に発生する。
【００７１】
架橋結合は、化学物質（架橋剤）の添加、または高エネルギー放射線をポリマー加えることによって、タンパク質に人工的にもたらすことができる。固定剤および熱誘発凝集による架橋結合は免疫反応を高め、完全に増殖を阻害することが認められている。ＯＶ−ＣＳＣの表面上のタンパク質を架橋結合する、従って増殖を完全に阻害するのに使用される物質には、限定されないが、１０％中性緩衝液ホルマリン、４％パラホルムアルデヒド、１％グルタルアルデヒド、０．２５〜５ｍＭスベルイミノ酸ジメチル、氷冷１００％アセトン、または１００％メタノールが含まれる。さらに、０．１Ｍリン酸緩衝溶液中の１％グルタルアルデヒドと４％パラホルムアルデヒドの併用も使用される。
【００７２】
ホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドは、ともに１型および２型ヘルパーＴ細胞の活性を誘発することが認められている。特に抗原の加熱による凝集も細胞毒性Ｔリンパ球のインビボでのプライミングを高めることが認められている。３，３’−ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオナート)による抗原の架橋結合は、抗原と樹状細胞の結合増加をもたらし、架橋結合した抗原は抗原提示のプロテオソーム経路を通して処理される。さらに、ホルマリン固定された卵巣癌腫瘍細胞は、増殖の証拠を有さず、臨床試験で使用されている。
一つの実施形態では、全ＯＶ−ＣＳＣは架橋剤で固定され、ついで樹状細胞と組み合わせる抗原源として使用される。
【００７３】
別の実施形態では、細胞の核酸が架橋結合される。例となる核酸アルキル化剤はβ−アラニン、Ｎ−（アクリジン−９−イル）、２−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］エチルエステルである。ソラレンのような架橋剤の例は、しばしば紫外線（ＵＶＡ）照射と併用され、ＤＮＡを架橋結合する能力を有するが、タンパク質は修飾されずにそのままである。例えば、核酸を標的とする化合物は４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（Ｓ−５９）であることができる。細胞は１５０μＭソラレンＳ−５９および３Ｊ／ｃｍ2ＵＶＡ光（ＦＸ１０１９照射装置、Ｂａｘｔｅｒ  Ｆｅｎｗａｌ，Ｒｏｕｎｄ  Ｌａｋｅ，ＩＬ）で不活性化できる。ＵＶ光を用いたＳ−５９による不活性化は光化学的処理といわれ、処理条件は細胞分裂が完全に阻害されるが、ポリペプチド抗原を含むポリペプチドの損傷は最小現にする範囲で架橋結合ＤＮＡを調整または量設定することができる。細胞は０、１、１０、１００、および１０００ｎＭのソラレンＳ−５９を含む生理食塩水５ｍＬに懸濁できる。サンプルは約２Ｊ／ｃｍ2の量でＵＶＡ照射できる。ついで各サンプルを１５ｍＬ試験管に移し、遠心分離して上清を取り除いてから５ｍＬの生理食塩水で洗浄し、遠心分離して上清を取り除き、最終ペレットを０．５ｍＬの生理食塩水に懸濁させる。本明細書にすべてが参考文献によって組み入れられて、細胞の不活性化について開示されている米国特許７，８３３，７７５および７，６９１，３９３を参照する。
【００７４】
架橋剤で処理された細胞調製物について、分裂能力は従来技術の当業者によって、標準的な培地で少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも２か月、少なくとも３か月、少なくとも４か月などインキュベーションまたは培養して試験できる。細胞分裂は、染色体を明らかにし、細胞分裂が実施されているかいないかを明らかにする染色によって評価できる。細胞分裂はまた、細胞計数によって測定できる。そのため、培養プレート中の細胞数が２週、１か月、または２か月などの期間で安定し続ける場合、細胞は分裂できていないと合理的に結論付けられる。
一つの実施形態では、樹状細胞免疫原性組成物は皮下（ＳＣ）に投与される。さらなる実施形態では、負荷樹状細胞の約５〜２０百万個の範囲の各投与量が、６〜１０回の一連の投与で繰り返される。特定の実施形態では、全６〜１０回の投与は、２、３、４、５、または６回の投与が５日毎、毎週、１０日毎、隔週、または３週毎に実施され、次いで２、３、４、５、または６回の投与のために２週毎、３週毎、４週毎、毎月、５週毎、または６週毎の投与が続く。一つの実施形態では、最初の４回の注射は１か月で毎週、ついで次の４回の注射は月に１回で行う。代替の実施形態では、全８回の投与は、３週間は週に１回、ついで５か月間は月に１回である。
【００７５】
各投与は、約５〜２０×１０6負荷ＤＣ、約５〜１７×１０6個の負荷ＤＣ、約６〜１６×１０6個の負荷ＤＣ、約７〜１５×１０6個の負荷ＤＣ、約７〜１４×１０6個の負荷ＤＣ、約８〜１３×１０6個の負荷ＤＣ、約８〜１２×１０6個の負荷ＤＣ、または約９〜１１×１０6個の負荷ＤＣを含む。さらなる実施形態では、各投与は、約８×１０6個の負荷ＤＣ、約９×１０6個の負荷ＤＣ、約１０×１０6個の負荷ＤＣ、約１１×１０6個の負荷ＤＣ、約１２×１０6個の負荷ＤＣを含む。負荷ＤＣは、ＤＣおよびＤＣによって取り込まれなかった残存ＯＶ−ＣＳＣの混合物を含む。投与される用量はこれらの細胞の混合物を含み、投与量はこの混合物を反映する。
別の実施形態では、負荷ＤＣは医薬的に許容可能な担体または賦形剤とともに投与される。本明細書で説明される医薬的に許容可能な賦形剤、例えば、ビヒクル、アジュバント、基剤、または希釈剤は、従来技術の当業者によってよく知られており、市販されて容易に入手可能である。医薬的に許容可能な担体または賦形剤は、負荷ＤＣに対して化学的に不活性であり、使用条件下で有害な副作用または毒性を有さないことが好ましい。
【００７６】
賦形剤または担体の選択は、特定の治療組成物、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって、ある程度は決定される。本明細書で説明される組成物は、単なる例示であり、限定するものではない。
生理学的に許容可能な担体は、しばしば水性のｐＨ緩衝化溶液である。生理学的に許容可能な担体の例には、限定されないが、生理食塩水、溶媒、分散メディア、細胞培養培地、水性緩衝剤であるリン酸、クエン酸、および他の有機酸など、アスコルビン酸を含む抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質である血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど、親水性ポリマーであるポリビニルピロリドンなど、アミノ酸であるグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンなど、単糖、二糖、および他の炭水化物であるグルコース、マンノース、またはデキストリンなど、キレート剤であるＥＤＡＴなど、糖アルコールであるマンニトールまたはソルビトールなど、塩形成対イオンであるナトリウムなど、および／または非イオン性界面活性剤であるＴＷＥＥＮTM，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳTMなどが含まれる。
いくつかの例の実施では、アジュバントはすべての投与で同時に加えられる。特定の実  施形態では、細胞はアジュバントを含む基剤に懸濁される。これに代わる例の実施では、アジュバントは投与されるが、すべてが単回投与ではない。他の例の実施では、アジュバントは全く使用しない。一つの実施形態では、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦである。
【００７７】
限定されないが、樹状細胞（例、自家または同種異系樹状細胞）は、細胞溶解物、酸溶出物、細胞抽出物、部分的に精製した抗原、精製した抗原、分離した抗原、部分的に精製したペプチド、精製したペプチド、分離したペプチド、合成ペプチド、またはこれらのいずれかの組み合わせとしての癌幹細胞抗原と接触させる。そして樹状細胞は対象者、例えばＯＶを有する対象者、またはＯＶを有さない対照対象者に投与される。例の実施では、樹状細胞は皮下、腹腔内、結節内、筋肉内、静脈内、鼻腔内、吸入、経口、腸管腔への適用などの１つ以上の経路によって、接触、注入、または投与される。さらに免疫原性組成物は腫瘍または転移の部位に直接的に投与できる。
実施例
【実施例１】
【００７８】
実施例１．卵巣腫瘍サンプルからの癌幹細胞株の作製
患者３名の卵巣腫瘍サンプルを適切な同意後に外科処置の際に得た。サンプルは抗生物質を含む培地中で組織処理施設に輸送され、輸送中は４〜１０℃の温度に維持された。
サンプルを外科用の刃で無菌ペトリ皿に刻み、ついで断片を組織の硬度に応じて組織１ｇあたり３０００ＵＩ〜６０００ＵＩのコラゲナーゼ−Ｉを含む溶液に連続撹拌しながら暴露した。
解離した細胞を培地中で洗浄して計数し、後で使用するために１５％ＦＢＳおよび１０％ＤＭＳＯを含むＲＰＭＩ培地に小分けして凍結した。
小分けは典型的には１０〜３０×１０6個の細胞を含み、融解したときの予測生存率は４０％〜７５％である。小分けは癌幹細胞の後で行う精製および増殖に使用できる。
【実施例２】
【００７９】
実施例２．ＯＶ−ＣＳＣ分離および増殖に最適な培地組成物
市販されている卵巣癌細胞株を、卵巣癌患者から得た３種類の異なるサンプルから解離した凍結保存腫瘍細胞と比較した。
癌幹細胞の球体形成特性を使用して癌幹細胞を分離した。文献で報告された組成物（Ｌｉｔ−Ｍ）および独自の組成物（ＣＳＣ−Ｍ）からなる表５に示す２種類の異なる培地を使用して、腫瘍ラインの球体形成特性を評価した。
市販のＯＶＣＡＲ−３、ＳＫＯＶ−３、およびＴＯＶ−２１Ｇ細胞株ならびに患者由来の酵素消化した腫瘍をマスター細胞バンクから融解した。計数および生存評価後、各細胞株から得た生きた細胞５０，０００個／ｃｍ2を適切な表示をした超低吸着性フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。
培養で７日間増殖させ、培地は２日毎または月曜日−水曜日−金曜日の予定で交換した。培養を供給するため、細胞懸濁液を５０ｍＬ試験管に収集し、１５０ｒｃｆで３分間遠心分離し、上清を新鮮なＣＳＣ−ＭまたはＬｉｔ−Ｍ培地に交換した。
７日後、細胞を標準的な細胞培養フラスコに移し、培地をＬｉｔ−ＥおよびＣＳＣ−Ｅ（増殖用）組成物に交換した（表５）。ＣＳＣ−Ｅ培地は増殖培地であり、血清を含む。ＣＳＣ−Ｍは無血清選択培地である。ＣＳＣ−ＥおよびＣＳＣ−Ｍはともに表２〜４の基礎培地に基づいている。スフェロイドは最初にコラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ混合で５〜１０分間解離させ、優しくピペッティングし、ついで酵素を遠心分離によって取り除き、培地で置換した。細胞は月曜日−水曜日−金曜日の供給予定に従い、その日ごとに細胞を１０，０００個／ｃｍ2の密度で再播種し、２継代増殖させた。最後に細胞を免疫細胞化学分析のため、９６ウェルプレートに５，０００〜１０，０００個／ウェルの密度で移した。２日後にプレートを４％パラホルムアルデヒドで固定して、マーカーであるＮａｎｏｇ、ネスチン、ｏｘ２、ＣＤ１３３、ＣＤ１１７、ＮＣＡＭ、ＥｐＣＡＭ、Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ、ＣＤ２４、ＣＡ−１２５、ＡＬＤＨ、ＣＤ４６、ＣＥＡ、Ｈｅ−４、Ｍｕｃ−１、ＣＤ４４、およびＨＥＲ−２について染色した。
【表５】
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【００８０】
超低付着性条件における増殖の７日後の最後で、市販の細胞株はＬｉｔ−ＭまたはＣＳＣ−Ｍ培地のいずれでも典型的な癌幹細胞スフェロイドを形成しなかった。その代わり、これらは不規則な形状の緩い細胞集塊を形成した（図２）。患者腫瘍は、７日間にわたって漸進的に増殖した幹細胞スフェロイドを再集合させた典型的な密集した球状構造を形成した。
細胞を付着条件に移した後、培養は上皮細胞の単層を再集合させながらゆっくり増殖した。細胞のいくつかは小さい立方細胞の表現型の速い増殖を示し、いくつかは空胞化細胞質または小さな紡錘型の再集合した間葉細胞を有する大型の上皮細胞のような形状を示した。市販細胞株はＬｉｔ−Ｅ培地と比べてＣＳＣ−Ｅ培地で速く増殖した。患者細胞株は同一条件でよりゆっくり増殖し、継代が難しく、細胞質空胞、基材からの脱着、および広範囲な細胞死を示す。
【００８１】
本実験で我々は、市販細胞株はより多く分化して均一な表現型であり、高濃度のＦＢＳ（１５％）に適応するが、典型的なスフェロイド形成特性の欠如によって癌幹細胞を含まない可能性があることを認めた。それに代わり、患者サンプルは予測される密集した球体を産生するのに十分な癌幹細胞を含んだ。１５％血清含有培地に移すと、患者細胞株は市販細胞株と比べて乏しくなり、球体播種直後に適切な免疫細胞化学的な特徴付けができなかった。
【表６】
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【００８２】
ＩＣＣ結果によって示されるように（表６）、培養はＥｐＣＡＭが低く、ＮＣＡＭ（図４Ａ〜Ｄ）、Ｓｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ（Ｓｌｇ／Ｓｎｌ）、ＣＤ１１７（図５Ａ〜Ｄ）、およびネスチン（図６Ａ〜Ｃ）が高く、ＥＭＴ表現型（上皮間葉転換）を示す。
結論として、１）市販細胞株はＣＳＣ含量に関して新鮮な患者サンプルと同等でない、２）ＯＶ−ＣＳＣは培地組成および物理的操作に感受性があり、試験した条件では継代に耐えない、３）独自の培養組成物（ＣＳＣ−ＭおよびＣＳＣ−Ｅ）はＯＶ−ＣＳＣの増殖に有利だった、および４）試験した培養条件はＥＭＴに好都合である。
【実施例３】
【００８３】
実施例３．腫瘍細胞の単回プレート培養増殖
典型的なインビトロ細胞培養は細胞を低密度でプレート播種して密集に達するまで増殖させ、ついで解離して再び低密度で広い表面上に再度播種する（継代化）サイクル工程である。我々の先の観測から、ＯＶ−ＣＳＣは分化による継代の際の物理的および酵素的操作、ならびに広範な細胞死および上皮間葉転換に敏感であると結論された。この現象を克服するため、次の実験では、能動的な特異的免疫療法（ＡＳＩ）に要求される全細胞数を得ることができる最終表面上に低密度で細胞を播種して、ＯＶ−ＣＳＣの一継代増殖の可能性を試験した。一般的な細胞培養条件では、培養装置内の培養スペースを省き、周期的な酵素的解離および接触阻止の回避によって細胞増殖を刺激するため、単回増殖は避けられる。
この方法では、細胞は５，０００、１０，０００、および１５，０００個／ｃｍ2の様々な低密度でプレート播種し、４日間増殖させた。培養は月曜日−水曜日−金曜日の供給計画で、最初の組成物は１５％ＦＢＳの代わりに５％ＦＢＳのみを含むＣＳＣ−Ｅ培地（表５）を供給した。最後に、細胞を計数して表現型を分析した。
【００８４】
様々な条件における細胞数は、倍加時間に関して有意な差を示さなかった。免疫細胞化学（ＩＣＣ）によって、最初の播種密度と関係なく同一プロファイルが示された（表７）。
【表７】
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【００８５】
細胞の損失および機械的または酵素的解離によって生じる分化を避けるため、最初に低密度で播種して目的の数まで細胞を増殖させ、反復継代なしで密集が到達するまで培養を増殖させて最後に収集する方法を使用できる。さらに高い濃度の血清の先の実験（表６）と同様なＩＣＣプロファイル（表７）により、５％ＦＢＳを含有する培地はＥＭＴをもたらした。
【実施例４】
【００８６】
実施例４．初期卵巣癌幹細胞の選択用の細胞培地条件の測定
先の実験で示されたように、ＦＢＳ含有培地は癌幹細胞の分化およびＥＭＴをもたらす。この現象は骨形成タンパク質（ＢＭＰ４）のような血清に含まれる因子によって生じる可能性がある。ＦＢＳを含む培養、またはＢＭＰ４の添加によって、細胞は大きく、上皮の外観および十分分化した癌に典型的な遅い倍加速度を有する。増殖因子がこの培地に加えられる場合、ＥＭＴが観察される。体内で卵巣癌は、腹膜細胞によって分泌される多量の増殖因子が腫瘍増殖を刺激する腹腔内で、ほとんど排他的に増殖する。このような増殖因子には、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ、アクチビンＡ、およびＴＧＦβが含まれる。
【００８７】
次の実験では、卵巣癌幹細胞の速い増殖が可能な培地および基材組成物を研究した。
患者由来卵巣腫瘍細胞を１％ゼラチンまたはＭＡＴＲＩＧＥＬ(商標)（１：６０）のプレイン組織培養プラスチックのプレートに播種した。各基材条件では、５％ＦＢＳに変更したＣＳＣ−Ｅ、ＣＳＣ−Ｍ（表５）、上皮細胞（角膜実質細胞）用に組成化された市販培地ＫＧＭ−ＧＯＬＤTM（Ｌｏｎｚａ）、およびヒト胚幹細胞培養に使用される無血清培地組成物（ＳＴＥＭＢＬＡＳＴ(商標)）である種々の培地組成物を使用した。各条件は増殖因子ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加または無添加で試験した。
ＫＧＭ−ＧＯＬＤTM基礎培地は上皮細胞増殖用に低下カルシウムで組成化されている。ＳＴＥＭＢＬＡＳＴ(商標)は胚幹細胞の培養に使用される無血清組成であり、５ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを含有する。ＭＡＴＲＩＧＥＬ(商標)はラミニン、コラーゲン、およびプロテオグリカンを含有する複合細胞外マトリックスである。
【００８８】
形態学的分析および増殖能力はこれらの条件で１週間の培養後に実施し、表８にまとめた。
【表８】
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【００８９】
ＭＡＴＲＩＧＥＬ(商標)はすべての培地または増殖因子条件で腫瘍細胞の増殖を阻害した。組織培養プラスチック（プラズマ処理）は最初のプレート播種で少ない細胞付着を示したが、すべての条件で腫瘍細胞の十分な増殖を支持した。ゼラチン（０．１％）コーティングは最初に優れた付着をさせ、腫瘍細胞の速い増殖を支持した。
ＫＧＭ−ＧＯＬＤTMは、基材または増殖因子の存在に関わらず、腫瘍細胞の速い増殖は支持せず、大きい細胞体および空胞化細胞質の外観を示す卵巣癌細胞の老化をもたらした。
５％ＦＢＳ含有ＣＳＣ−Ｅ培地はｂＦＧＦおよびＥＧＦの存在下でのみ細胞の速い増殖を支持したが（図７および８）、無血清培地条件では増殖因子の存在に関係なく、速い増殖を支持した（図９および１０）。動物血清は卵巣腫瘍細胞の速い増殖を阻害している因子を含み、それが受容体チロシンキナーゼに対するリガンドである増殖因子（ＦＧＦ、ＥＧＦ）の添加による相殺をもたらすように考えられる。ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＰＤＧＦのような受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）に対する他のリガンドは、腫瘍細胞増殖に同様な効果を有する可能性がある。ＦＧＦおよびＥＧＦが添加された無血清培地で増殖した細胞の形態は、小さい立方型で高密度であり、胚幹細胞培養と似た同種コロニーである。
【００９０】
ＳＴＥＭＢＬＡＳＴ(商標)は増殖因子の存在でのみ良好な増殖を支持した。ＳＴＥＭＢＬＡＳＴ（商標）におけるＥＧＦ、ＦＧＦ，およびアクチビンＡの関連では、小さい細胞体ならびに多数の細胞および最小限の細胞質を占有する大きな核を有する胚幹細胞培養と非常に類似した形態を生じた（図１１）。
無血清培地における一般的な卵巣および癌幹細胞マーカーに関する免疫細胞学的分析は、癌幹細胞表現型および無視できる程度のＥＭＴを示した。
卵巣癌上皮マーカーＣＡ１２５が細胞の９０％超で認められた（ＦＩＧ．１２Ｂ）。もう一つの卵巣癌上皮マーカーであるＭＵＣ−１が様々な発現強度で細胞の約６０％に認められた（図１２Ｃ）。卵巣癌サイトケラチンマーカーＣＫ８が細胞の８０％超に存在した（図１３Ｂ）。
【００９１】
培養条件によって癌幹細胞の増殖が促進されたことが、ＥｐＣＡＭ（図１４Ｃ）、ＣＤ４４（図１５Ｃ）、およびＣＤ１３３（図１６）を発現する細胞が高い割合（７５％以上）で存在することによって実証された。培養では、大多数の細胞におけるＫｉ６７増殖マーカー（図１３Ｂ）の高量発現によって、速い増殖が示される。
我々は、ＲＴＫに対する最少量のリガンドを有する無血清培地またはＲＴＫ（ＦＧＦ、ＥＧＦなど）の対するリガンド（ＦＧＦ、ＥＧＦなど）が添加された培地における低濃度動物血清が、卵巣癌幹細胞集団を維持して最適に増殖させられると結論付けた。血清量の増加およびＲＴＫリガンドの低下は、ＣＳＣの分化をもたらすであろう。血清濃度の増加およびＲＴＫリガンド濃度の増加はＥＭＴをもたらすであろう。ＲＴＫリガンドおよびアクチビンＡを含有する無血清培地は、胚幹細胞様である非常に初期の幹細胞状態を維持できる。
ゼラチン（コラーゲン）コーティングの存在は最初の細胞付着を増加したが、細胞の増殖速度または表現型を有意に変化させなかった。
これらの実験は、卵巣腫瘍からＣＳＣを分離、精製、および増殖し、分化またはＥＭＴのために操作する我々の能力を示す。本明細書で説明される細胞集団は、バルク腫瘍の希薄化された抗原性と比べて、全細胞の能動的自家免疫療法のための高品質な抗原源として使用できる。
【実施例５】
【００９２】
実施例５．負荷樹状細胞組成物の産生
抗原源は患者の新鮮な腫瘍組織に由来する継続的に増殖して自己再生する細胞から得る自家腫瘍細胞である。これらの細胞は腫瘍幹細胞の特性を有する。外科的および病理学的な設定では常に生検はサンプルが無菌であることを確実にするために、無菌プロトコールを厳密に順守して取り扱われる。
病理学者は患者の腫瘍の生検から新鮮な組織を得る。無菌の外科用メスおよび鉗子を用いて、標本を１０ｍｍスライスに切断して、輸送培地を含む輸送試験管に移し、標本を乾燥させないため素早く作業する。標本は翌日到着の輸送業者によって調製施設に、外科的切除から４８時間以内に輸送される。
調製施設では、サンプルをクリーンルームで単一細胞懸濁液に解離して、ＯＶ−ＣＳＣを豊富にして増殖させるように設計された細胞培養条件にする。腫瘍標本の処理の間、リンパ球、間質細胞、および結合組織のような正常細胞は取り除かれる。増殖および精製段階の終了時、多量化した増殖性ＯＶ−ＣＳＣ（腫瘍細胞、ＴＣ）は照射によって不活性化され、気相式液体窒素保存される。この工程は８週間までかかる可能性があり、腫瘍標本の量と質に依存する。
【００９３】
腫瘍細胞産物が品質保証を通過すると、患者は白血球除去療法（通常６Ｌ処置）と呼ばれる処置を実施することが通知される。この処置は血液をろ過して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を収集することを必要とする。収集されたＰＢＭＣは、エルトリエーションと呼ばれる向流式密度遠心分離によるさらなる精製のために、翌日到着の配達業者によって調製施設に輸送される。エルトリエーションは単球を他のリンパ球から精製する工程であり、抗原提示細胞または樹状細胞になり得る細胞を豊富にする。樹状細胞を産生するため、エルトリエーション処理された単球は、サイトカインＧＭ−ＣＦＳおよびインターロイキン−４（ＩＬ−４）とともに６日間インキュベーションする。
６日目に、精製した腫瘍細胞産物を凍結保存から取り出し、融解して樹状細胞と１８〜２４時間混合する。この工程はＤＣの「抗原負荷」をもたらす。最終産物は全体がＤＣか、またはいくつかの残存する照射されたＴＣを含む可能性があり（許容されると考えられる）、ＤＣ−ＴＣと呼ばれる。混合した樹状細胞／腫瘍細胞混合物を収集し、樹状細胞の生存を保つために凍結保存し、気相式液体窒素に保存する。
品質管理測定が終了して自家細胞療法産物を引き渡す時、バッチは気相式液体窒素下で治療施設に輸送される。到着後、細胞療法産物は投与のために調製するまで、気相式液体窒素下で保存する。
【実施例６】
【００９４】
実施例６．卵巣癌を有する患者におけるｏｖａｐｕｌｄｅｎｃｅｌ−Ｔ対ＧＭ−ＣＳＦにおける自家末梢血単核細胞の二重盲検、無作為臨床試験
本試験は、減量手術および補助化学療法後に第ＩＩＩ病期または第ＩＶ病期の上皮卵巣、卵管、または原発性腹膜癌を有する患者における維持または二次療法の構成要素として、ｏｖａｐｕｌｄｅｎｃｅｌ−Ｔ（ＧＭ−ＣＳＦにおける照射した自家ＯＶ−ＣＳＣを負荷した樹状細胞）対ＧＭ−ＣＳＦにおける自家末梢血単核細胞（ＭＣ）に関する二重盲検、無作為、一施設の第二相試験である。本試験の目的は、ｏｖａｐｕｌｄｅｎｃｅｌ−Ｔで治療された患者をＧＭ−ＣＳＦにおける自家血単核細胞で治療された患者である対照と、無作為データから得る全生存（ＯＳ）を比較することである。ｏｖａｐｕｌｄｅｎｃｅｌ−Ｔは実施例５の方法に従って調製される。
外科的減量および化学療法を受ける可能性がある、新たに第ＩＩＩまたはＩＶ病期の卵巣癌と診断された１８歳以上の女性対象者が本試験の候補である。全身状態は、ＡＳＩ治療の組み入れ時点でＥＣＯＧスコアが０または１でなければならない。
組み入れ基準には、上皮卵巣、卵管、または原発性腹膜癌の組織学的診断、進行した（転移性、第ＩＩＩまたはＩＶ病期）上皮卵巣、卵管、または原発性腹膜癌および短期間腫瘍細胞株を確立する試みのために新鮮な腫瘍組織を得る外科的な減量の対象者、年齢が１８歳超、各患者が自分の疾患過程の新生物の性質を理解して腫瘍細胞株を確立する試みのための腫瘍組織の操作に積極的に同意していること、患者がＡＳＩ治療の投与の治療施設に通う能力および意欲を有していること、が含まれる。
【００９５】
除外基準には、ＥＣＯＧ全身状態が２以上、既知であるＢ型またはＣ型肝炎、あるいはＨＩＶの陽性、妊娠または授乳中の女性、積極的な治療を必要とする心筋機能不全またはアテローム性動脈硬化症と関連する不安定な狭心症に関わるあるいは動脈または静脈末梢血管疾患の治療下にある心臓疾患を有する、今後５年以内に命に関わるおよび／または卵巣以外の癌の抗癌療法を受けると考えられる（５年前以前に診断された前立腺癌または乳癌のためのホルモン療法の継続など）、活動的な感染あるいは活発な血液凝固または出血性素因を含む著しく生命を脅かし得る他の活動的な病状、治療時の活動的な中枢神経系転移、既知の自己免疫疾患、免疫不全、または免疫抑制療法の使用を含む疾患過程、悪性度が低い可能性のある腫瘍、あるいは最初の投与の２８日以内での別の研究用試薬の投与、が含まれる。
細胞株が成功裏に確立され、無作為化時点でＡＳＩ治療に対して適格であり、試験への参加およびＡＳＩ治療に治療について同意した、第ＩＩＩまたはＩＶ病期の上皮卵巣、卵管、または腹膜癌を有する約９９名の患者を対象とする。  
【００９６】
患者が減量手術から回復後、化学療法を開始する前に、患者は自家樹状細胞または単核細胞を取り出すＰＢＭＣを得るために白血球除去療法を受ける。白血球除去療法後、このような患者に対する標準的な介護によって、患者はタキサンおよびプラチナ化学療法剤を含む一次補助化学療法の計画された６サイクルを受ける。
患者は、（１）補助化学療法の際の進行または補助化学療法の終わりに検出される疾患に基づくプラチナ耐性、または（２）増加した血液ＣＡ−１２５および／または他の腫瘍マーカーおよび／または身体検査またはイメージングによる疾患の検出によって、補助療法の終わりで疾患の証拠がない（ＮＥＤ）、プラチナ感受性に分類される。
分類後、患者はｏｖａｐｕｌｄｅｎｃｅｌ−ＴまたはＭＣ治療群に２：１の比で無作為に分けられる。この方法によって２群の臨床的に類似した患者集団を作り出し、治療の時期を標準化し、細胞株の使用を最大にし、維持または二次補助療法に関する標準的実施を組み込む。
プラチナ耐性疾患を有する患者は、担当医によって二次療法で治療され、同時にｏｖａｐｕｌｄｅｎｃｅｌ−ＴまたはＭＣ治療を受ける。
【００９７】
ＮＥＤであるプラチナ感受性患者は、担当医による維持療法を受け（典型的には１年までパクリタキセル）、同時にｏｖａｐｕｌｄｅｎｃｅｌ−ＴまたはＭＣ治療を受ける。
ｏｖａｐｕｌｄｅｎｃｅｌ−Ｔ群に無作為分類された患者は、患者に特異的な療法を生み出すために照射された自家ＯＶ−ＣＳＣを加えられた自家樹状細胞を受ける。ｏｖａｐｕｌｄｅｎｃｅｌ−Ｔは５００μｇのＧＭ−ＣＳＦ中で週に１回ずつ３週間、ついでそれに続く維持または二次療法が行われる時点で３週から４週毎に投与され、ワクチン療法の全８回までの投与は、維持または二次療法の時期に応じて４から６週にわたって実施される。
ＭＣ群に無作為分類された患者は、５００μｇのＧＭ−ＣＳＦ中で投与される自家単核細胞を週に１回ずつ３週間、ついでそれに続く維持または二次療法が行われる時点で３週から４週毎に受け、ＡＳＩ療法の全８回までの投与は、維持または二次療法の時期に応じて４から６週にわたって実施される。
試験中に疾患が進行する患者は、８回すべての治療が投与されるまで、担当癌専門医による処方に従って他の標準的な全身療法を併用してＡＳＩを続けることができる。
第一の試験目的は、ｏｖａｐｕｌｄｅｎｃｅｌ−Ｔによって治療された患者の無作為化のデータから得る全生存（ＯＳ）を、対照であるＧＭ−ＣＳＦにおける自家血単核細胞で治療された患者と比較することである。
本試験の第一の評価項目は、無作為化の日から全生存（ＯＳ）の計測を用いたどのような要因からでも生じた死である。無増悪生存（ＰＦＳ）は第二の評価項目であり、治療のために無作為化した日から主観的な腫瘍の進行または死までの時間として計算される。進行は治療する医師によって主観的に定められ、腫瘍マーカー量（例、ＣＡ−１２５）および／またはイメージングに基づく。二次的に、ＰＦＳおよびＯＳは減量手術の日から定められる。
【００９８】
試験への参加が適格とされたすべての患者は、無作為化の日から５年まで、または死亡するまでのいずれか早い方の日まで経過観察される。
カプランマイヤー曲線は各治療群の生存期間を示す。対数順位検定はＯＳを分析するために使用して治療差のない帰無仮説を検定する。コックス回帰モデルおよびワルド検定は、治療における何らかの差がある場合、治療と関連するハザード比を評価して可能性のある予後因子の重要性およびそれらの影響を特定するために使用される。インテンション・トゥ・トリート集団に基づく分析が一次分析として考察され、パープロトコール集団に基づく分析が感受性分析として考察される。ＯＳ評価項目の下位群分析は、プラチナ耐性患者およびプラチナ感受性患者について別々に、第一評価項目に関して決められた計画を模倣する。
別段の指示がない限り、本明細書および請求項で使用される材料の量、分子量のような特性、反応条件などを表現するすべての数字は、用語「約」によってすべての場合で修飾されるものとして理解されるべきである。本明細書で使用されるとき、用語「約（ａｂｏｕｔ）」および「おおよそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は１０〜１５％以内、好ましくは５〜１０％以内を意味する。従って、それとは反対の指示がない限り、本明細書および添付の請求項で示される数値パラメーターは、本発明によって得られることが求められる目的の特性に依存して変わる可能性がある近似値である。少なくとも、請求項の範囲に均等論の適用を制限する試みとしてではなく、各数値パラメーターは報告された重要な桁数を踏まえて、通常の丸め方法を適用することによって理解されるべきである。本発明の広範な範囲を示す数値範囲およびパラメーターが近似値であるにも関わらず、特定の実施例で示される数値はできるだけ正確に報告される。しかし数値にはその各試験測定で認められる標準偏差から必ず生じるある種の誤差が本質的に含まれる。
【００９９】
本発明を説明する文脈（特に後述の請求項の文脈）で使用される用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および同様な指示は、本明細書に別段の指示がない、または文脈によって明らかに否定されない限り、単数および複数の両方を網羅するものと理解されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、当該範囲内にあるそれぞれ別の値を個別に言及する簡略表記法として使用することが単に意図されている。本明細書に別段の指示がない限り、それぞれの個別の値は本明細書に個別に引用されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書で説明されるすべての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに否定されない限り、いかなる適切な順序でも実施することができる。本明細書で用いられる、いずれのおよびすべての例、または例示語（例、「のような」）の使用は、本発明を単により明らかにすることが意図されているにすぎず、別に請求される本発明の範囲を制限するものではない。本明細書における用語は、本発明の実施に必須な請求されていない要素を示すもと理解されるべきではない。
【０１００】
本明細書で開示される発明の代替要素または実施形態のグループ化は、限定されるものとして解釈されるべきでない。各グループメンバーは、個別あるいはグループの他のメンバーまたは本明細書で認められる他の要素と組合せて引用または請求されてもよい。グループの１つ以上のメンバーが、便宜上および／または特許性の理由のためにグループに含まれる、またはグループから削除される可能性があることが予測される。このような組み入れまたは削除が生じる場合、本明細書は別添の請求項で使用されるすべてのマーカッシュグループの記載を実行するように修正されたグループを含むものとみなされる。
【０１０１】
本発明の特定の実施形態は、本発明を実施するのに発明者が知る最良の態様を含めて本明細書で説明される。もちろんこれらの説明された実施形態における変動は、従来技術の当業者が前述の説明を読むときに明らかになるであろう。本発明者は、従来技術の当業者がこのような変動を適切なものとして使用することを予期し、本発明者は本発明が本明細書で具体的に説明される以外の方法で実施されることを意図する。従って、本発明は適用法によって容認されるときに本明細書に添付された請求項に引用された主題のすべての変更および同等を含む。さらに前述の要素のすべて可能な変更における組み合わせは、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに否定されない限り、本発明によって包含される。
【０１０２】
本明細書で開示される具体的な実施形態は、からなるまたは本質的にからなるという用語を用いた請求項でさらに限定される可能性がある。請求項で使用される場合、出願または修正による追加に関わらず、転換用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、請求項で特定されない要素、段階、または材料を除外する。転換用語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は特定された材料または段階ならびに基本的および新規の特性に大きく影響しないこれらに対する請求項の範囲を限定する。このように請求される本発明の実施形態は、本明細書に本質的または明確に説明され可能にされる。
【０１０３】
さらに、多くの参考文献が本明細書の全体を通して特許および刊行物によって構成されている。上記の参考文献および刊行物のそれぞれは、参考文献によってそれらの全体が本明細書に個別に組み込まれている。
最後に、本明細書で開示される発明の実施形態は、本発明の原理の説明であると理解されるべきである。実施され得る他の変更は本発明の範囲内である。そのため、例示によって、限定されないが、本発明の代替構成は、本明細書における教示に従って利用することができる。従って、本発明は、正確に示されて説明されたものに限定されない。
そのため、例の実施および／またはその態様に適用される本開示の基本的な新しい特徴が示され、説明されて指摘されているが、その例の実施、開示、および態様の形態および詳細における様々な削除、再構成および置換、ならびに変更は、本開示および／または請求項の精神から逸脱せずに従来技術の当業者によってなされ得る。例えば、同一結果を達成するほとんど同一な方法におけるほとんど同一な機能を実施するこれらの要素および／または方法段階のすべての組み合わせは、本開示の範囲内であることが明確に意図されている。さらに、開示された形態または実施との関連で示されるおよび／または説明される構造および／または要素および／または方法段階は、設計選択の一般的事柄として他の開示、説明、または示唆された形態または実施に組み入れられることができる。従って、本開示の範囲を制限しない意図である。このようなすべての変更は本明細書に別添されている請求項の範囲内であることが意図される。
【０１０４】
本明細書で引用されるすべての刊行物、特許、特許出願、参考文献、および配列リストは、本明細書にすべてが明記されるように、本参考文献によって本明細書に組み入れられる。
要約書は、読者が本技術的開示の性質および要点を素早く確認できるように３７ＣＦＲ§１．７２（ｂ）に従って提供される。要約書は請求項の範囲または意味を解釈または制限するために使用されないとの理解によって提示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【国際調査報告】
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