(57)【要約】  本発明は、特定の薬物抗体比（ＤＡＲ）を有する抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を有する組成物を得るための方法。ＡＤＣ混合物と疎水性樹脂とを、１５％未満の６以上の薬物負荷種を含む組成物が得られるように接触させることによって、６以上の薬物負荷種を含むＡＤＣを有するＡＤＣ混合物を精製する方法が、本発明に含まれる。本発明はまた、存在するＡＤＣの７０％以上が４以下の薬物負荷種を有し、ＡＤＣが抗ＥＧＦＲ抗体およびオーリスタチンを含む組成物を提供する。
2016519070.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を含む組成物を得る方法であって、
４以下の薬物負荷種および６以上の薬物負荷種を含むＡＤＣ混合物と疎水性樹脂とを接触させるステップであって、ＡＤＣ混合物と接触させる疎水性樹脂の量が、６以上の薬物負荷種を樹脂に結合させるために十分であるが、４以下の薬物負荷種を有意に結合できないものであるステップ、および
疎水性樹脂を、ＡＤＣを含む組成物が得られるように、ＡＤＣ混合物から除去するステップを含み、
前記組成物が１５％未満の６以上の薬物負荷種を含み、
前記ＡＤＣがオーリスタチンと複合体化された抗体を含む方法。
【請求項２】
組成物が、１０％未満の６以上の薬物負荷種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組成物が、５％以下の６以上の薬物負荷種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
疎水性樹脂重量が、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の３から１２倍である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
疎水性樹脂重量が、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の４から８倍である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
疎水性樹脂重量が、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の５から１０倍である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
疎水性樹脂重量が、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の６から１２倍であり、ＡＤＣ混合物が、０から１ＮのＮａＣｌまたはこれと等価のイオン強度を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
疎水性樹脂重量が、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の３から６倍であり、ＡＤＣ混合物が、１から２ＮのＮａＣｌまたはこれと等価のイオン強度を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
疎水性樹脂重量が、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の３から７倍であり、オーリスタチンがモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
疎水性樹脂重量が、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の５から１０倍であり、オーリスタチンがモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
疎水性樹脂重量が、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の３から７倍であり、オーリスタチンがモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
４．５以下の平均薬物抗体比（ＤＡＲ）を有するＡＤＣを含み、１５％未満の望ましくないＡＤＣを含む組成物の調製方法であって、
ＡＤＣ混合物と疎水性樹脂とを接触させ、ＡＤＣ混合物と接触させる疎水性樹脂の量が、望ましくないＡＤＣと結合させるために十分であるステップ、および
疎水性樹脂を、４．５以下の平均ＤＡＲを有し、１５％未満の望ましくないＡＤＣを含む組成物が調製されるように、ＡＤＣ混合物から除去するステップを含み、
前記ＡＤＣが、オーリスタチンと複合体化された抗体を含む方法。
【請求項１３】
４．５以下の平均ＤＡＲを有する組成物が、１０％未満の望ましくないＡＤＣを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
望ましくないＡＤＣが６および８の薬物負荷種である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＡＤＣ混合物に加えられる疎水性樹脂の量が、ＡＤＣ混合物中の望ましくないＡＤＣの重量の３から１２倍の樹脂重量である、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ＡＤＣ混合物に加えられる疎水性樹脂の量が、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の４から８倍の樹脂重量である、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＡＤＣ混合物に加えられる疎水性樹脂の量が、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の５から７倍の樹脂重量である、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
疎水性樹脂重量が、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の６から１２倍であり、ＡＤＣ混合物が０から１ＮのＮａＣｌまたはこれと等価のイオン強度を含む、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
疎水性樹脂重量が、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の３から６倍であり、ＡＤＣ混合物が１から２ＮのＮａＣｌまたはこれと等価のイオン強度を含む、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
疎水性樹脂重量が、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の３から７倍であり、オーリスタチンがモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
疎水性樹脂重量が、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の５から１０倍であり、オーリスタチンがモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
疎水性樹脂重量が、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の３から７倍であり、オーリスタチンがモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
組成物が、４以下の平均ＤＡＲを有する、請求項１３から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
組成物が、３．５以下の平均ＤＡＲを有する、請求項１３から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
組成物が、３以下の平均ＤＡＲを有する、請求項１３から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
組成物が、２．５以下の平均ＤＡＲを有する、請求項１３から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ＡＤＣ混合物が、限外ろ過／透析ろ過工程の後で得られたものである、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
疎水性樹脂がブチル疎水性樹脂である、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
バッチ工程、循環工程またはフロースルー工程である、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ＡＤＣが、抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体を含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
抗ＥＧＦＲ抗体が、それぞれ、配列番号７、配列番号８および配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含み、配列番号２、配列番号３および配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
抗ＥＧＦＲ抗体が、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
オーリスタチンが、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）のいずれかである、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ＭＭＡＥが、バリン−シトルリン（ｖｃ）リンカーを介して抗体と複合体化される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＭＭＡＦが、マレイミドカプロイル（ｍｃ）リンカーを介して抗体と複合体化される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１から３５の方法のいずれか１つにより得られる組成物。
【請求項３７】
対象において癌を治療する方法であって、請求項３６に記載の組成物を、癌が治療されるように対象に投与するステップを含む方法。
【請求項３８】
存在するＡＤＣの７０％が４以下の薬物負荷種を有し、前記ＡＤＣが、抗ＥＧＦＲ抗体およびオーリスタチンを含む、ＡＤＣを含む組成物。
【請求項３９】
存在するＡＤＣの７５％が４以下の薬物負荷種を有する、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
存在するＡＤＣの８０％が４以下の薬物負荷種を有する、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４１】
存在するＡＤＣの８５％が４以下の薬物負荷種を有する、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４２】
存在するＡＤＣの９０％が４以下の薬物負荷種を有する、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４３】
存在するＡＤＣの９５％が４以下の薬物負荷種を有する、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４４】
抗ＥＧＦＲ抗体が、それぞれ、配列番号７、配列番号８および配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含み、配列番号２、配列番号３および配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域を含む、請求項３８から４３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
抗ＥＧＦＲ抗体が、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項３８から４３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
オーリスタチンが、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）のいずれかである、請求項３８から４５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４７】
ＭＭＡＥが、バリン−シトルリン（ｖｃ）リンカーを介して抗体と複合体化される、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
ＭＭＡＦが、マレイミドカプロイル（ｍｃ）リンカーを介して抗体と複合体化される、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４９】
請求項３８から４８のいずれか一項に記載の組成物および医薬として許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項５０】
対象において癌を治療する方法であって、請求項４９に記載の医薬組成物を、癌が治療されるように対象に投与するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１５日出願の米国特許仮出願第６１／７９２，８３４号明細書の利益を主張するものである。前述の優先権書類の内容は、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、新興クラスの強力な抗癌剤であり、これらは近年著しい臨床的利益を実証している。ＡＤＣは、安定なリンカーを介して抗体と結合された細胞障害性薬で構成される。推定的に、細胞表面における抗原結合、エンドサイトーシス、リソソームへの輸送、ＡＤＣ分解、ペイロードの放出、細胞プロセシング（例えば、有糸分裂）の中断およびアポトーシスを含む一連の事象により、ＡＤＣは、細胞表面タンパク質の過剰発現を保有する癌細胞を破壊することができる。ＡＤＣは、モノクローナル抗体の抗原駆動性標的化特性と、細胞障害性薬の強力な抗腫瘍効果とを併せ持つ。例えば、２０１１年には、ＡＤＣＥＴＲＩＳ（Ｒ）（抗ＣＤ３０抗体−ＭＭＡＥ  ＡＤＣ）は、難治性ホジキンリンパ腫および全身性未分化リンパ腫の治療に対して規制上の承認を得た。
【０００３】
研究により、高薬物負荷ＡＤＣの有害作用が実証されている（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｎａｌｙ．Ｃｈｅｍ．８２：５２１９）。高レベルの複合体のこれらの有害作用としては、凝集体の形成に対する増加傾向が挙げられる（Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４３３６；Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  １９：３５８；Ｂｕｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ２０：１２４２；およびＺｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５４：３６０６）。
【０００４】
ＡＤＣの薬物負荷の調整は、（ｉ）抗体に対して、モル過剰の薬物−リンカー中間体またはリンカー試薬を制限すること、（ｉｉ）複合体化反応の時間または温度を制限すること、および（ｉｉｉ）システインチオール修飾のための還元条件を部分的にする、または制限すること、を含むさまざまな方法を使用して試みられている。抗体の結合部位の数を制限する還元方法が、少数の薬物／抗体を有するＡＤＣを得るために使用されてきているが（Ａｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ａｍｅｒ  Ａｓｓｏｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４５：Ａｂｓｔ  ６２７）、最適な薬物負荷種を提供できる方法および組成物に対する必要性が依然として存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｎａｌｙ．Ｃｈｅｍ．８２：５２１９
【非特許文献２】Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４３３６
【非特許文献３】Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  １９：３５８
【非特許文献４】Ｂｕｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ２０：１２４２
【非特許文献５】Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５４：３６０６
【非特許文献６】Ａｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ａｍｅｒ  Ａｓｓｏｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４５：Ａｂｓｔ  ６２７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、異なる薬物負荷を有する抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を分離する有効な方法およびこのような方法を使用して得られる組成物を提供する。本発明はまた、高薬物負荷種のＡＤＣが除去された組成物も提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一実施形態において、本発明は、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を含む組成物を得る方法であって、４以下の薬物負荷種および６以上の薬物負荷種を含むＡＤＣ混合物と疎水性樹脂とを接触させるステップであって、ＡＤＣ混合物と接触させる疎水性樹脂の量が、６以上の薬物負荷種を樹脂に結合させるために十分であるが、４以下の薬物負荷種を有意に結合できないものであるステップ、および疎水性樹脂を、ＡＤＣを含む組成物が得られるように、ＡＤＣ混合物から除去するステップを含み、前記組成物が１５％未満の６以上の薬物負荷種を含み、前記ＡＤＣがオーリスタチンと複合体化された抗体を含む方法を特徴とする。一実施形態において、組成物は、１０％未満の６以上の薬物負荷種を含む。別の実施形態において、組成物は、５％以下の６以上の薬物負荷種を含む。
【０００８】
一実施形態において、本発明の方法は、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の３から１２倍の疎水性樹脂重量の使用を含む。一実施形態において、疎水性樹脂重量は、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の４から８倍である。さらなる実施形態において、疎水性樹脂重量は、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の５から１０倍である。
【０００９】
さらに別の実施形態において、疎水性樹脂重量は、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の６から１２倍であり、ＡＤＣ混合物が、０から１ＮのＮａＣｌまたはこれと等価のイオン強度を含む。さらなる実施形態において、疎水性樹脂重量は、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の３から６倍であり、ＡＤＣ混合物が、１から２ＮのＮａＣｌまたはこれと等価のイオン強度を含む。さらに別の実施形態において、疎水性樹脂重量は、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の３から７倍であり、オーリスタチンがモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。さらなる実施形態において、疎水性樹脂重量は、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の５から１０倍であり、オーリスタチンがモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である。さらなる実施形態において、疎水性樹脂重量は、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の３から７倍であり、オーリスタチンがモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。
【００１０】
本発明は、さらに、４．５以下の平均薬物抗体比（ＤＡＲ）を有するＡＤＣを含み、１５％未満の望ましくないＡＤＣを含む組成物の調製方法であって、ＡＤＣ混合物と疎水性樹脂とを接触させ、ＡＤＣ混合物と接触させる疎水性樹脂の量が、望ましくないＡＤＣと結合させるために十分であるステップ、および疎水性樹脂を、４．５以下の平均ＤＡＲを有し、１５％未満の望ましくないＡＤＣを含む組成物が調製されるように、ＡＤＣ混合物から除去するステップを含み、前記ＡＤＣが、オーリスタチンと複合体化された抗体を含む方法を提供する。一実施形態において、４．５以下の平均ＤＡＲを有する組成物は、１０％未満の望ましくないＡＤＣを含む。一実施形態において、望ましくないＡＤＣは６および８の薬物負荷種である。一実施形態において、望ましくないＡＤＣは８の薬物負荷種である。
【００１１】
一実施形態において、ＡＤＣ混合物に加えられる疎水性樹脂の量は、ＡＤＣ混合物中の望ましくないＡＤＣの重量の３から１２倍の樹脂重量である。
【００１２】
さらなる実施形態において、ＡＤＣ混合物に加えられる疎水性樹脂の量は、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の４から８倍の樹脂重量である。さらに別の実施形態において、ＡＤＣ混合物に加えられる疎水性樹脂の量は、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の５から７倍の樹脂重量である。さらなる実施形態において、疎水性樹脂重量は、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の６から１２倍であり、ＡＤＣ混合物が０から１ＮのＮａＣｌまたはこれと等価のイオン強度を含む。一実施形態において、疎水性樹脂重量は、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の３から６倍であり、ＡＤＣ混合物が１から２ＮのＮａＣｌまたはこれと等価のイオン強度を含む。別の実施形態において、疎水性樹脂重量は、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の３から７倍であり、オーリスタチンがモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。さらに別の実施形態において、疎水性樹脂重量は、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の５から１０倍であり、オーリスタチンがモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である。さらに別の実施形態において、疎水性樹脂重量は、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の３から７倍であり、オーリスタチンがモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。一実施形態において、疎水性樹脂重量は、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の５から１０倍であり、オーリスタチンがモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である。
【００１３】
一実施形態において、本発明の方法は、４．５以下の平均ＤＡＲを有するＡＤＣを含む組成物を得るために使用される。一実施形態において、本発明の方法は、４以下の平均ＤＡＲを有するＡＤＣを含む組成物を得るために使用される。一実施形態において、本発明の方法は、３．５以下の平均ＤＡＲを有するＡＤＣを含む組成物を得るために使用される。一実施形態において、本発明の方法は、３以下の平均ＤＡＲを有するＡＤＣを含む組成物を得るために使用される。一実施形態において、本発明の方法は、２．５以下の平均ＤＡＲを有するＡＤＣを含む組成物を得るために使用される。
【００１４】
一実施形態において、本発明の方法は、疎水性樹脂をＡＤＣ混合物に加えて、樹脂混合物を形成し、該樹脂混合物が該ＡＤＣ混合物以上のイオン強度を有するステップを特徴とする。
【００１５】
本発明のさらなる実施形態において、ＡＤＣ混合物は限外ろ過／透析ろ過工程の後で得られる。
【００１６】
一実施形態において、本発明で使用される疎水性樹脂はブチル疎水性樹脂である。
【００１７】
一実施形態において、本発明の方法はバッチ工程、循環工程またはフロースルー工程である。
【００１８】
一実施形態において、本発明は、本明細書に記載の方法を使用して得られる組成物を特徴とする。
【００１９】
本発明は、さらに、存在するＡＤＣの７０％が４以下の薬物負荷種を有し、前記ＡＤＣが、抗ＥＧＦＲ抗体およびオーリスタチンを含む、ＡＤＣを含む組成物を特徴とする。本発明の一実施形態において、該組成物は、存在するＡＤＣの７５％が４以下の薬物負荷種を有する。本発明の別の実施形態において、該組成物は、存在するＡＤＣの８０％が４以下の薬物負荷種を有する。本発明の一実施形態において、該組成物は、存在するＡＤＣの８５％が４以下の薬物負荷種を有する。本発明のさらなる実施形態において、該組成物は、存在するＡＤＣの９０％が４以下の薬物負荷種を有する。一実施形態において、本発明の組成物は、存在するＡＤＣの９５％が４以下の薬物負荷種を有する。別の実施形態において、本発明の組成物は、ＡＤＣの７０％以上が４から１、３から１または２から１の薬物負荷種を有するＡＤＣを含む。
【００２０】
本発明はさらに、４．５以下の平均ＤＡＲを有するＡＤＣを含み、該ＡＤＣが抗ＥＧＦＲ抗体（例えば抗体１）およびオーリスタチン（例えば、ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦ）を含む組成物を特徴とする。本発明の一実施形態において、組成物は、４以下の平均ＤＡＲを有するＡＤＣを含む。別の実施形態において、組成物は、４以下の平均ＤＡＲを有するＡＤＣを含む。さらに別の実施形態において、組成物は、３．５以下の平均ＤＡＲを有するＡＤＣを含む。一実施形態において、組成物は、３以下の平均ＤＡＲを有するＡＤＣを含む。さらに別の実施形態において、組成物は、２．５以下の平均ＤＡＲを有するＡＤＣを含む。別の実施形態において、本発明の組成物は、４．５から０．００１、４から０．００１、３．５から０．００１、３から０．００１または２．５から０．００１の平均ＤＡＲを有する抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣ（例えば、ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦと複合体化された抗体１）を含む。
【００２１】
一実施形態において、本発明の方法および組成物は、抗上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体を含むＡＤＣを含む。
本発明の一実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、それぞれ、配列番号７、配列番号８および配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含み、配列番号２、配列番号３および配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む。本発明の別の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００２２】
本発明の別の実施形態において、抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、配列番号６のアミノ酸配列で示される軽鎖可変領域に記載のＣＤＲ（即ち、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）および配列番号１のアミノ酸配列に記載のＣＤＲ（即ち、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を含む。
【００２３】
さらなる実施形態において、本発明の方法および組成物は、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）のいずれかであるオーリスタチンを特徴とする。
【００２４】
一実施形態において、ＭＭＡＥは、バリン−シトルリン（ｖｃ）リンカー（ｖｃ−ＭＭＡＥ）を介して抗体と複合体化される。別の実施形態において、ＭＭＡＦは、マレイミドカプロイル（ｍｃ）リンカー（ｍｃ−ＭＭＡＦ）を介して抗体と複合体化される。
一実施形態において、本発明の組成物は医薬組成物である。
【００２５】
本明細書に記載の組成物を、癌が治療されるように対象に投与するステップを含む、対象において癌を治療する方法もまた、本発明に含まれる。一実施形態において、癌は、扁平上皮腫瘍（肺、頭部および頸部、子宮頸部などの扁平上皮腫瘍を含む。）、神経膠芽腫、グリオーマ、非小細胞肺癌、肺癌、結腸癌、頭部および頸部癌、乳癌、扁平上皮細胞腫瘍、肛門癌、皮膚癌および外陰癌からなる群から選択される。
【００２６】
一実施形態において、本発明の組成物は、多形性神経膠芽腫の治療に使用される。
【００２７】
一実施形態において、本発明の組成物は、ＥＧＦＲの過剰発現を有する固形腫瘍の治療に使用される。一実施形態において、本発明の組成物は、ＥＧＦＲを過剰発現する可能性のある進行性固形腫瘍を有する対象の治療に使用される。
【００２８】
一実施形態において、本発明の組成物は、静脈内投与される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】抗体１の還元、抗体１とｖｃＭＭＡＥとの複合体化およびＨＩＣ樹脂によるバッチ精製を使用するＡＤＣの精製を含む、実施例に記載の工程の概要を提供する図である。
【図２】ＨＩＣ樹脂によるバッチ精製の前後の抗体１ＡＤＣ溶液のＨＩＣ  ＨＰＬＣ分析を、グラフで表した図である。
【図３】２．７、４および５．５の平均ＤＡＲを有するＡＤＣ混合物を精製するための、実施例６に記載の工程の概要を提供する図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
Ｉ．定義
本発明をより容易に理解可能にするために、特定の用語をまず定義する。加えて、パラメーターの値または値の範囲が列挙されるときは常に、列挙された値に介在する値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図されることに留意するべきである。
【００３１】
「抗体薬物複合体」または「ＡＤＣ」という用語は、場合により治療薬または細胞障害性薬であり得る１以上の化学薬物（複数可）（本明細において薬剤（複数可）とも称される。）と化学的に連結された、抗体またはこれらの抗原結合断片などの結合タンパク質を指す。好ましい実施形態において、ＡＤＣは、抗体、細胞障害性薬または治療薬および薬物と抗体とを結合または複合体化可能なリンカーを含む。ＡＤＣは、通常、２、４、６または８の薬物負荷種を含む、抗体と複合体化された１から８の範囲の薬物を有する。ＡＤＣに含まれ得る薬剤の限定されない例は、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、免疫調節剤、遺伝子療法用のベクター、アルキル化剤、抗血管新生剤、代謝拮抗薬、ホウ素含有剤、化学保護薬、ホルモン、抗ホルモン剤、コルチコステロイド、光活性治療薬、オリゴヌクレオチド、放射性核種剤、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤および放射線増感剤である。
【００３２】
「抗上皮成長因子抗体薬物複合体」、「抗ＥＧＦＲ抗体薬物複合体」または「抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣ」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、ＥＧＦＲに特異的に結合して、これによって、抗体が１または複数の薬剤と複合体化される抗体を含むＡＤＣを指す。一実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体薬物複合体は、オーリスタチン、例えばＭＭＡＥまたはＭＭＡＦと複合体化された抗体１である。抗体１の軽鎖および重鎖に対応するアミノ酸配列は、配列番号１−１０で提供される。
【００３３】
本明細書において使用する場合、「オーリスタチン」という用語は、抗有糸分裂剤のファミリーを指す。オーリスタチン誘導体もまた「オーリスタチン」という用語の定義内に含まれる。オーリスタチンの例としては、限定するものではないが、、オーリスタチンＥ（ＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）およびドラスタチンの合成類似体が挙げられる。
【００３４】
「薬物抗体比」または「ＤＡＲ」という用語は、ＡＤＣの抗体に結合された薬物、例えば、オーリスタチンの数を指す。ＡＤＣのＤＡＲは、１から８の範囲であり得るが、抗体の連結部位の数に依存して、より高い負荷、例えば１０も可能である。ＤＡＲという用語は、個別の抗体に負荷された薬物の数に関して使用されても、またはＡＤＣの群の平均または中間ＤＡＲに関して使用されてもよい。
【００３５】
本明細書において使用する場合、「望ましくないＡＤＣ種」という用語は、異なる薬物負荷を有するＡＤＣから分離されるべき任意の薬物負荷種を指す。一実施形態において、望ましくないＡＤＣ種という用語は、６以上の薬物負荷種、即ち、ＤＡＲ６、ＤＡＲ７、ＤＡＲ８および８を超えるＤＡＲを含む６以上のＤＡＲを有するＡＤＣ（即ち、６、７、８または８を超える薬物負荷種）を指すことができる。個別の実施形態において、望ましくないＡＤＣ種という用語は、８以上の薬物負荷種、即ち、ＤＡＲ８および８を超えるＤＡＲを含む８以上のＤＡＲを有するＡＤＣ（即ち、８または８を超える薬物負荷種）を指すことができる。
【００３６】
本明細書において使用する場合、「ＡＤＣ混合物」という用語は、不均一なＤＡＲ分布のＡＤＣを含有する組成物を指す。一実施形態において、ＡＤＣ混合物は、１から８、例えば２、４、６および８のＤＡＲ分布を有するＡＤＣ（即ち、２、４、６および８の薬物負荷種）を含有する。特に、分解産物は、１、３、５および７のＤＡＲもまた混合物中に含まれるようにもたらし得る。さらに、混合物中のＡＤＣは、８を超えるＤＡＲを有してもよい。ＡＤＣ混合物は、鎖間ジスルフィド還元、続く複合体化から得られる。一実施形態において、ＡＤＣ混合物は、４以下のＤＡＲを有するＡＤＣ（即ち、４以下の薬物負荷種）および６以上のＤＡＲを有するＡＤＣ（即ち、６以上の薬物負荷種）の両方を含む。
【００３７】
本明細書において使用する場合、「疎水性樹脂」または「疎水性相互作用樹脂」という用語は、分子の混合物を精製する目的のために使用される疎水性リガンドからなり、混合物中の分子上の疎水性表面部分の存在が、相互作用する分子が少なくとも一時的に媒体に結合されるように、媒体との相互作用を容易にする媒体を指す。一実施形態において、疎水性樹脂は、アルキル部分、例えばＣ４−Ｃ８アルキル疎水性樹脂を含む樹脂であり、固体支持体（例えば、アガロース、シリカなど）に結合された、４から８員の線形または分枝型の炭素鎖のアルカン基、例えば、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチルまたはオクチル基を含む樹脂である。疎水性アルキル樹脂の例としては、疎水性ブチル樹脂または疎水性ヘキシル樹脂が挙げられる。一実施形態において、疎水性樹脂は、アリール部分を含む樹脂、例えば、疎水性フェニル樹脂である。一実施形態において、疎水性樹脂はアルケニル部分を含む。一実施形態において、疎水性樹脂はエーテル部分を含む。さらに別の実施形態において、疎水性樹脂はフェニル部分を含む。疎水性部分（例えば、アルキル、アリールなど）は、不活性物質（例えば、シリカ、アガロースおよび／または他の多糖類ポリマー）に連結されてもよい。一実施形態において、樹脂はメタクリレート樹脂である。
【００３８】
「イオン強度」という用語は、溶液中のイオンの濃度の基準、即ち、溶液の伝導性を広範囲に指す。溶液のイオン強度を調節するために使用可能な塩の例としては、限定するものではないが、臭化ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、臭化カリウム、塩化カリウム、クエン酸カリウム、ヨウ化カリウム、リン酸カリウム、硫酸カリウム、塩化セシウム、塩化リチウムまたは他のアンモニア塩（例えば、ＮＨ４Ｃｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４）、カーボネート（ＮａＨＣＯ３）、クエン酸（ＮａＨ２（Ｃ３Ｈ５Ｏ（ＣＯＯ）３）、Ｎａ２Ｈ（Ｃ３Ｈ５Ｏ（ＣＯＯ）３）、Ｎａ３Ｈ（Ｃ３Ｈ５Ｏ（ＣＯＯ）３））、リン酸（例えば、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、Ｋ３ＰＯ４）、ニトレート（ＫＮＯ３）またはこれらの成分の任意の混合物が挙げられる。当業者は、当業者に公知の陰イオンおよび陽イオンの両方が、十分なイオン強度が、沈殿または他の望ましくない副作用なしに提供される限り、変更可能であることを、認識している。
【００３９】
「抗ＥＧＦＲ抗体」という用語は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗体を指すことを意味する。対象となる抗原、即ちＥＧＦＲに「結合する」抗体は、抗体が、抗原を発現する細胞の標的化に有用であるような、十分な親和性を有するこの抗原に結合できる抗体である。抗体１は、抗ＥＧＦＲ抗体の例である。
【００４０】
「抗体」という用語は、一般的に、４つのポリペプチド鎖、即ち２つの重鎖（Ｈ）および２つの軽鎖（Ｌ）で構成される免疫グロブリン（Ｉｇ）分子またはＩｇ分子の本質的標的結合特徴を保有する任意の機能性断片、突然変異体、変異体もしくはこれらの誘導体を広範囲に指す。
【００４１】
完全長抗体において、各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＨＣＶＲまたはＶＨと略される。）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＬＣＶＲまたはＶＬと略される。）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域と、フレームワーク（ＦＲ）と称されるより保存的な散剤する領域とにさらに分割可能である。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから成り、アミノ末端からカルボキシ末端へ、次の順番：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置されている。免疫グロブリン分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）およびクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであってよい。
【００４２】
抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）という用語は、本明細書において使用する場合、抗原（例えばｈＩＬ−１３）に特異的に結合する能力を保有する抗体の１以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片により実施可能であることが示されている。このような抗体の実施形態は、二特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）、二重特異性（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）または多重特異性フォーマット；２以上の異なる抗原への特異的結合であってよい。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価の断片（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域においてジスルフィド結合により連結された２つのＦａｂ断片を含む２価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）単一の可変ドメインを含むｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０５１４４Ａ１、参照により本明細書に組み込まれる。）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別の遺伝子によりコードされるが、これらは、組換え法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域対が１価の分子を形成する一本鎖タンパク質として作製可能にする合成リンカーにより接続することができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えばＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照されたい。）。このような一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含されることが意図される。一本鎖抗体の他の形態、例えばダイアボディもまた包含される。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが一本鎖ポリペプチドに発現されるが、短すぎて同じ鎖の上の２つのドメインの間で対形成できないリンカーを使用し、これによって、別の鎖の相補性ドメインと対形成させ、２つの抗原結合部位を作り出す、２価の二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照されたい。）。このような抗体結合部分は当分野において公知である（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ  ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００１）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．７９０ｐｐ．（ＩＳＢＮ３−５４０−４１３５４−５）。
【００４３】
「単離抗体」は、本明細書において使用する場合、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図される（例えば、ＥＧＦＲと特異的に結合する単離抗体は、ＥＧＦＲ以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない。）。しかし、ＥＧＦＲと特異的に結合する単離抗体は、他の抗原、例えば他の種由来のＥＧＦＲ分子との交差反応性を有してもよい。さらに、単離抗体は、他の細胞性材料および／または化学薬品を実質的に含んではいけない。
【００４４】
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種（例えばマウス）由来の重鎖および軽鎖可変領域の配列を含むが、ＶＨおよび／またはＶＬ配列の少なくとも一部が、より「ヒト様」、即ち、ヒト生殖細胞系可変配列により類似しているように改変されている抗体を指す。特定の実施形態において、「ヒト化抗体」という用語は、対象となる抗原に特異的に結合し、ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク（ＦＲ）領域を含み、非ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有するＣＤＲを含む抗体または抗体の変異体、誘導体もしくは断片を指す。本明細書において使用する場合、ＣＤＲに関連する「実質的」という用語は、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲを指す。一実施形態において、ヒト化抗体の１つの型は、ヒトＣＤＲ配列を非ヒトＶＨおよびＶＬ配列に導入して、対応する非ヒトＣＤＲ配列を置き換えた、ＣＤＲグラフト化抗体である。
【００４５】
本明細書において使用する場合、「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域のそれぞれに３つのＣＤＲが存在し、これらは、可変領域のそれぞれがＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と名付けられる。「ＣＤＲセット」という用語は、本明細書において使用する場合、抗原に結合可能な単一の可変領域内で発生する３つのＣＤＲの群を指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なる系に従って定義が異なっている。Ｋａｂａｔにより記載される系（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７）および（１９９１））は、抗体の任意の可変領域に適用可能な明確な残基ナンバリング系を提供するだけでなく、３つのＣＤＲを定義する正確な残基の境界もまた提供する。これらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと呼ぶことができる。Ｃｈｏｔｈｉａおよび共同研究者（Ｃｈｏｔｈｉａ  ＆Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）およびＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３（１９８９））は、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ内の特定のさらに小さい部分が、アミノ酸配列のレベルで大きな多様性を有するにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格構造に適用されることを見出した。これらのさらに小さい部分は、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３またはＨ１、Ｈ２およびＨ３と名付けられ、「Ｌ」および「Ｈ」は、それぞれ軽鎖および重鎖領域を示している。これらの領域はＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲと称され、これらは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複する境界を有する。Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複するＣＤＲを定義する他の境界は、Ｐａｄｌａｎにより記載されている（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３−１３９（１９９５））およびＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６２（５）：７３２−４５（１９９６））。さらに他のＣＤＲ境界の定義は、上記の系の１つに厳密に従ってはいないが、それでもＫａｂａｔ  ＣＤＲとは重複するものであり、特定の残基または残基の群またはさらにＣＤＲ全体が、抗原結合に重要な影響を与えないという予測または実験的発見を考慮して、これらは短縮または伸長されてよい。本明細書において使用される方法は、これらの系のいずれかに従って定義されるＣＤＲを利用可能であるが、好ましい実施形態は、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａにより定義されるＣＤＲを使用する。
【００４６】
「障害」という用語は、本発明の製剤による治療から利益を受ける任意の病態、例えば、製剤中の抗ＥＧＦＲ抗体による治療を必要とする障害を指す。これは、慢性および急性の障害または疾患を含み、対象を問題となる障害にかかりやすくする病態を含む。
【００４７】
「癌」という用語は、通常、制御不能な細胞成長により特徴付けられる、哺乳動物における病態を指す、または説明することを意味する。癌の例としては、限定するものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病またはリンパ系腫瘍が挙げられる。このような癌のより具体的な例としては、神経膠芽腫、非小細胞肺癌、肺癌、結腸癌、頭部および頸部癌、乳癌、扁平上皮細胞腫瘍、肛門癌、皮膚癌および外陰癌が挙げられる。一実施形態において、本発明の組成物は、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を含有する腫瘍（複数可）を有する患者に投与され、これによって、腫瘍がＥＧＦＲ  ｄｅ２−７の切断型を発現する。一実施形態において、ＡＤＣ１を含む本発明の製剤は、結腸直腸癌、頭部および頸部癌（限定するものではないが、下咽頭癌、口腔咽頭癌、食道癌、喉頭癌、および口腔癌を含む。）、非小細胞肺癌、膵臓癌、胃癌、および乳癌の治療のために対象に投与することができる。このような癌のより具体的な例としては、扁平上皮腫瘍（肺、頭部および頸部、子宮頸部などの扁平上皮腫瘍を含む。）、神経膠芽腫、グリオーマ、非小細胞肺癌、肺癌、結腸癌、頭部および頸部癌、乳癌、扁平上皮細胞腫瘍、肛門癌、皮膚癌および外陰癌が挙げられる。本発明の一実施形態において、組成物は、固形腫瘍、例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を過剰発現する可能性のある固形腫瘍または多形性神経膠芽腫を有する対象の治療に使用される。
【００４８】
「投与する」という用語は、本明細書において使用する場合、治療目的（例えば、ＥＧＦＲ関連障害の治療）を達成するための物質（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体薬物複合体）の送達を指すことを意味する。投与の様式は、非経口、経腸および局所であってよい。非経口投与は、普通は注射であり、限定するものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内および胸骨下（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）の注射および注入が挙げられる。
【００４９】
抗体の「治療有効量」または「有効量」という用語は、本明細書において使用する場合、抗体が有効である治療のために、障害の症状の予防または治療または緩和に有効な量を指す。
【００５０】
「治療」という用語は、治療および予防もしくは防止的基準の両方を指す。治療の必要な患者は、既に障害を有する患者および障害を防止されるべき患者を含む。
【００５１】
本発明のさまざまな態様を、下記の項においてさらに詳細に記載する。
【００５２】
ＩＩ．抗体薬物複合体の精製方法およびこれらの組成物
本発明は、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を精製する方法を提供し、ＡＤＣの望ましくない種、例えば、６以上の薬物負荷種をＡＤＣの混合物から除去する有効な手段を提供する。本発明の方法は、任意の薬物負荷種を分離するために使用することができるが、好ましい実施形態において、本明細書に記載の方法は、高薬物負荷ＡＤＣを、最適な薬物抗体比（ＤＡＲ）、例えば４以下のＤＡＲを有するＡＤＣから分離するために使用される。ある実施形態において、本発明の方法は、分別およびその後の分画のプールを必要としないので、回収の改善を含む、伝統的なカラムクロマトグラフィーを上回る多数の有利性を提供することができる。全体を通して記載される方法および組成物は、抗ＥＧＦＲ抗体−オーリスタチンＡＤＣ、特に、ある実施形態において、マレイミドカプロイルリンカーを介してＭＭＡＦ（ｍｃ−ＭＭＡＦ）に結合された抗体１またはマレイミドカプロイルバリンシトルリンリンカーを介してＭＭＡＥ（ｖｃ−ＭＭＡＥ）に結合された抗体１のいずれかを含む抗−ＥＧＦＲ  ＡＤＣを精製するために使用できることを理解するべきである。
【００５３】
本発明の方法は、全体として、望ましくないＡＤＣ、即ち、高薬物負荷ＡＤＣが樹脂に結合し、混合物から選択的に除去され得るように、疎水性樹脂をＡＤＣ混合物に加えるステップを含む。ある実施形態において、ＡＤＣの分離は、ＡＤＣ混合物（例えば、４以下のＡＤＣ薬物負荷種および６以上のＡＤＣ薬物負荷種を含む混合物）を、疎水性樹脂と接触させ、樹脂の量が、ＡＤＣ混合物から除去されるべき薬物負荷種を結合させるために十分であることによって達成することができる。樹脂およびＡＤＣ混合物は、除去されるＡＤＣ種（例えば、６以上の薬物負荷種）が樹脂と結合し、ＡＤＣ混合物中の他のＡＤＣ種から分離され得るように、一緒に混合される。この方法に使用される樹脂の量は、除去される種と樹脂との間の重量比に基づき、使用される樹脂の量は、所望の薬物負荷種の有意な結合を可能にするものではない。従って、本発明は、ＡＤＣ混合物の平均ＤＡＲを、例えば５．５から４未満に低減させる方法を提供する。さらに、本発明で説明される精製方法は、任意の所望の範囲の薬物負荷種、例えば、４以下の薬物負荷種、３以下の薬物負荷種、２以下の薬物負荷種、１以下の薬物負荷種を有するＡＤＣを単離するために使用することができる。
【００５４】
本発明は、分子（複数可）の特定の種を、この種と疎水性樹脂との間の疎水性相互作用に基づき、表面に結合させる精製方法を提供する。一実施形態において、本発明の方法は、疎水性樹脂とＡＤＣの混合物との混合に頼る精製過程を指し、混合物に加える樹脂の量は、どの種（例えば、６以上のＤＡＲを有するＡＤＣ）が結合するかを決定する。
【００５５】
発現系（例えば、哺乳動物発現系）から抗体を作製および精製後、抗体は還元され、複合体化反応を介して薬物に結合される。得られたＡＤＣ混合物は、多くの場合、一定範囲のＤＡＲ、例えば１から８を有するＡＤＣを含有する。一実施形態において、ＡＤＣ混合物は、４以下の薬物負荷種および６以上の薬物負荷種を含む。本発明の方法に従って、ＡＤＣ混合物は、４以下の薬物負荷種を有するＡＤＣが選択され、より高い薬物負荷を有するＡＤＣ（例えば、６以上の薬物負荷種を有するＡＤＣ）から分離されるように、例えば、限定するものではないが、バッチ処理などの処理を使用して精製することができる。とりわけ、本明細書に記載の精製方法は、任意の所望の範囲のＤＡＲ、例えば４以下のＤＡＲ、３以下のＤＡＲ、２以下のＤＡＲを有するＡＤＣを単離するために使用することができる。
【００５６】
従って、一実施形態において、本発明の方法は４以下の薬物負荷種および６以上の薬物負荷種を含むＡＤＣ混合物を疎水性樹脂と接触させ、樹脂混合物を形成することができ、ＡＤＣ混合物と接触させる疎水性樹脂の量は、６以上の薬物負荷種と樹脂とを結合させるために十分であるが、４以下の薬物負荷種は有意に結合できない；また、ＡＤＣを含む組生物が得られるように、疎水性樹脂をＡＤＣ混合物から除去することができ、組成物は１５％未満の６以上の薬物負荷種を含み、ＡＤＣはオーリスタチンと複合化された抗体を含む。別個の実施形態において、本発明の方法は、４以下の薬物負荷種および６以上の薬物負荷種を含むＡＤＣ混合物と、疎水性樹脂とを接触させ、樹脂混合物を形成させ、ＡＤＣ混合物と接触させる疎水性樹脂の量が６以上の薬物負荷種を樹脂に結合させるために十分であるが、４以下の薬物負荷種を有意に結合させることができないステップ、および疎水性樹脂を、ＡＤＣを含む組成物が得られるように、ＡＤＣ混合物から除去して、該組成物が１５％未満の６以上の薬物負荷種を含み、該ＡＤＣがオーリスタチンと複合体化された抗体を含み、該疎水性樹脂の重量がＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の３から１２倍であるステップを含むことができる。
【００５７】
本発明の方法は低および高ＤＡＲ  ＡＤＣを分離する効果的な方法を提供する。一実施形態において、該方法は、バッチ精製方法を使用して実施することができる。バッチ精製処理は、概して、ＡＤＣ混合物を、容器中の疎水性樹脂に加えるステップ、混合するステップ、およびその後、樹脂を上清から分離するステップを含む。例えば、バッチ精製の文脈において、疎水性樹脂は、所望の平衡バッファー中で調製され得るか、またはこれに平衡化され得る。疎水性樹脂のスラリーは、このようにして得ることができる。その後、ＡＤＣ混合物をスラリーと接触させ、疎水性樹脂により分離されるべきＡＤＣの特定の種（複数可）を吸着させることができる。疎水性樹脂材料と結合しない所望のＡＤＣを含む溶液を、その後、例えばろ過によりスラリーから分離する、またはスラリーを沈殿させて、上清から除去することができる。得られたスラリーは、１以上の洗浄ステップに供することができる。結合したＡＤＣを溶出するために、塩濃度を低下することができる。一実施形態において、本発明に使用される工程は、５０ｇ以下の疎水性樹脂を含む。
【００５８】
従って、本発明の一実施形態において、バッチ方法を使用して、４以下の薬物負荷種および６以上の薬物負荷種を含むＡＤＣ混合物と疎水性樹脂とを接触させ、樹脂混合物を形成することができ、ＡＤＣ混合物と接触させる疎水性樹脂の量は、６以上の薬物負荷種を樹脂に結合させるために十分であるが、４以下の薬物負荷種を有意に結合できず、疎水性樹脂は、ＡＤＣを含む組成物が得られるようにＡＤＣ混合物から除去することができ、該組成物は１５％未満の６以上の薬物負荷種を含み、該ＡＤＣがオーリスタチンと複合体化された抗体を含む。別個の実施形態において、バッチ方法を使用して、４以下の薬物負荷種および６以上の薬物負荷種を含むＡＤＣ混合物と疎水性樹脂とを接触させ、樹脂混合物を形成し、ＡＤＣ混合物と接触させる疎水性樹脂の量は、６以上の薬物負荷種を樹脂に結合させるために十分であるが、４以下の薬物負荷種を有意に結合できず、疎水性樹脂は、ＡＤＣを含む組成物が得られるようにＡＤＣ混合物から除去することができ、該組成物は１５％未満の６以上の薬物負荷種を含み、該ＡＤＣはオーリスタチンと複合体化された抗体を含み、疎水性樹脂の重量は、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の３から１２倍である。
【００５９】
または、別個の実施形態において、本発明は、樹脂を容器に充填し、ＡＤＣ混合物を、分離されるべき特定種のＡＤＣ（複数可）が除去されるまで疎水性樹脂床を通過させる、循環処理を使用して実施することができる。その後、（所望のＡＤＣ種を含有する）上清を、容器からポンプで汲み出し、樹脂床を洗浄ステップに供することができる。
【００６０】
また、循環処理を使用して、４以下の薬物負荷種および６以上の薬物負荷種を含むＡＤＣ混合物と疎水性樹脂とを接触させ、樹脂混合物を形成することができ、ＡＤＣ混合物と接触させる疎水性樹脂の量は、６以上の薬物負荷種を樹脂に結合させるために十分であるが、４以下の薬物負荷種を有意に結合できず；疎水性樹脂は、ＡＤＣを含む組成物が得られるようにＡＤＣ混合物から除去することができ、該組成物は１５％未満の６以上の薬物負荷種を含み、該ＡＤＣはオーリスタチンと複合体化された抗体を含む。別個の実施形態において、循環処理を使用して、４以下の薬物負荷種および６以上の薬物負荷種を含むＡＤＣ混合物と疎水性樹脂とを接触させ、樹脂混合物を形成し、ＡＤＣ混合物と接触させる疎水性樹脂の量は、６以上の薬物負荷種を樹脂に結合させるために十分であるが、４以下の薬物負荷種を有意に結合できず、疎水性樹脂は、ＡＤＣを含む組成物が得られるようにＡＤＣ混合物から除去することができ、該組成物は１５％未満の６以上の薬物負荷種を含み、該ＡＤＣはオーリスタチンと複合体化された抗体を含み、疎水性樹脂の重量は、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の３から１２倍である。
【００６１】
または、本発明の別個の実施形態において、精製方法は、樹脂を容器、例えばカラムに充填し、ＡＤＣ混合物を、所望のＡＤＣ種が樹脂と実質的に結合しないように、充填された樹脂を通過させ、樹脂を通して流して、望ましくないＡＤＣ種が樹脂に結合される、フロースルー処理を使用して実施することができる。フロースルー処理は、シングルパス様式（対象となるＡＤＣ種が、容器の樹脂の単回通過の結果として得られる。）またはマルチパス様式（対象となるＡＤＣ種が、容器の樹脂の複数回通過の結果として得られる。）で実施することができる。フロースルー処理は、選択された樹脂の重量が望ましくないＡＤＣ集団と結合して、所望のＡＤＣ（例えばＤＡＲ２−４）が樹脂の間を流れ、１または複数回の通過の後でフロースルーにおいて回収されるように実施される。
【００６２】
本発明の一実施形態において、フロースルー処理を使用して、４以下の薬物負荷種および６以上の薬物負荷種を含むＡＤＣ混合物と疎水性樹脂とを接触させることができ、ＡＤＣ混合物と接触させる疎水性樹脂の量は、６以上の薬物負荷種を樹脂に結合させるために十分であるが、４以下の薬物負荷種を有意に結合できず、４以下の薬物負荷種を樹脂の間を流し、その後、所望のＡＤＣ（例えばＤＡＲ２−４）を含む組成物が得られるように、１または複数回通過後回収し、該組成物は１５％未満の６以上の薬物負荷種を含み、ＡＤＣはオーリスタチンと複合体化された抗体を含む。別個の実施形態において、フロースルー処理を使用して、４以下の薬物負荷種および６以上の薬物負荷種を含むＡＤＣ混合物と疎水性樹脂とを、ＡＤＣ混合物を樹脂の間に通すことによって接触させ、ＡＤＣ混合物と接触させる疎水性樹脂の量は、６以上の薬物負荷種を樹脂に結合させるために十分であるが、４以下の薬物負荷種を有意に結合できず、４以下の薬物負荷種を樹脂の間に通し、その後、ＡＤＣを含む組成物が得られるように回収し、該組成物は１５％未満の６以上の薬物負荷種を含み、該ＡＤＣはオーリスタチンと複合体化された抗体を含み、疎水性樹脂の重量は、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の３から１２倍である。
【００６３】
本発明の一実施形態において、（洗浄ろ液中に見出される）所望のＤＡＲ範囲を有するＡＤＣをさらに回収するために、樹脂は、フロースルー工程に従って１以上の洗浄液により洗浄される。例えば、漸減伝導性を有する複数の洗浄液は、対象となるＤＡＲを有するＡＤＣをさらに回収するために使用することができる。樹脂の洗浄から得られる溶出物質は、その後、対象となるＤＡＲを有するＡＤＣの回収を改善するためのフロースルー工程から得られるろ液と統合されてよい。
【００６４】
本発明の精製方法は、ＡＤＣの高薬物負荷種と低薬物負荷種とを分離するための疎水性樹脂の使用に基づくことができる。疎水性樹脂は、ＡＤＣの疎水特性と相互作用する疎水性基を含む。ＡＤＣの疎水性基は、疎水性樹脂内の疎水性基と相互作用する。タンパク質が疎水性であるほど、疎水性樹脂との相互作用は強くなると思われる。
【００６５】
疎水性樹脂は普通、疎水性リガンド（例えば、アルキルまたはアリール基）が結合する、基材マトリックを含む（例えば、架橋されたアガロースまたは合成コポリマー材料）。多くの疎水性樹脂は市販されている。例としては、限定するものではないが、低置換度または高置換度のＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）；Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）；Ｏｃｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）；Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＰｒｏｐｙｌまたはＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  Ｐｈｅｎｙｌカラム（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（商標）ＭｅｔｈｙｌまたはＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（商標）ｔ−Ｂｕｔｙｌ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；ＷＰ  ＨＩ−Ｐｒｏｐｙｌ（Ｃ３）（商標）（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）；およびＴｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）エーテル、ヘキシル、フェニルまたはブチル（ＴｏｓｏＨａａｓ，ＰＡ）が挙げられる。一実施形態において、疎水性樹脂は、ブチル疎水性樹脂である。別の実施形態において、疎水性樹脂はフェニル疎水性樹脂である。別の実施形態において、疎水性樹脂はヘキシル疎水性樹脂、オクチル疎水性樹脂またはデシル疎水性樹脂である。一実施形態において、疎水性樹脂は、ｎ−ブチルリガンド（例えばＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（Ｒ）Ｂｕｔｙｌ−６００Ｍ）を有するメタクリル系ポリマーである。
【００６６】
本発明の方法は、疎水性樹脂が、特定のＤＡＲを有するＡＤＣに選択的に結合するための特定量で使用することができるという発見に、少なくとも一部基づく。樹脂と所与のＤＡＲを有するＡＤＣとの間の結合は、ＡＤＣ混合物から除去されるべきＡＤＣの重量に対する樹脂の重量に依存する。ＡＤＣ混合物中の特定の薬物負荷種に対する、ＡＤＣ混合物と接触させる（乾燥重量に基づき計算された）樹脂投入量を変更することによって、樹脂は、例えば８以上のＤＡＲを有するＡＤＣ、６−８のＤＡＲを有するＡＤＣ、５−８のＤＡＲを有するＡＤＣ、などと選択的に結合するものである。従って、疎水性樹脂の選択性は、樹脂と、樹脂により除去されるべきＡＤＣの重量との重量比に依存する。一実施形態において、ＡＤＣ混合物と接触させる疎水性樹脂の重量は、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の３から１２倍である。一実施形態において、ＡＤＣ混合物と接触させる疎水性樹脂の重量は、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の４から８倍である。一実施形態において、ＡＤＣ混合物と接触させる疎水性樹脂の重量は、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の５から１０倍である。別の実施形態において、ＡＤＣ混合物と接触させる疎水性樹脂の重量は、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の５から７倍である。別の実施形態において、ＡＤＣ混合物と接触させる疎水性樹脂の重量は、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の５から６倍である。例えば、下記の実施例の表５に記載のように、約５−１０重量の樹脂（乾燥）を、６および８の薬物負荷種を低減させるために用い（３．２ｍｇの樹脂／０．５４ｍｇの６／８負荷種＝およそ６）濃縮された（６未満のＤＡＲを有するＡＤＣが濃縮された）組成物を得た。別の実施例において、下記の表７に記載するように、６および８の薬物負荷種の重量のおよそ８から１２倍の樹脂重量が、ＡＤＣ混合物からこれらの種を低減させるために有効であることが証明された。さらになる実施例において、下記の表７に記載のように、６および８の薬物負荷種の重量のおよそ４倍の樹脂重量が、ＡＤＣ混合物からこれらの種を有意に低減させるために有効であることが証明された。
【００６７】
樹脂のＡＤＣに対する選択性は、樹脂混合物のイオン強度と、特定の所望のＤＡＲ分布、例えば６−８のＤＡＲ分布を有するＡＤＣの選択的結合をもたらす、適切な負荷樹脂：ＡＤＣの重量比を提供することが本明細書において同定された比率との組み合わせにより影響を受け得る。概して、樹脂混合物のイオン強度を低下させることによって、疎水性樹脂の吸着は低くなり、一方、樹脂混合物のイオン強度の上昇は、より強い吸着性樹脂を提供する。疎水性樹脂へのＡＤＣの吸着は高い塩濃度を好むが、実際の濃度は、ＡＤＣの特性および選択された特定の疎水性樹脂に依存して、広範囲にわたって変更可能である。概して、Ｎａ、ＫまたはＮＨ４の硫酸塩が、疎水性樹脂におけるリガンド−タンパク質の相互作用を有効に促進する。下記の関係により示される、相互作用の強度に影響を与える塩を処方することができる：（ＮＨ４）２ＳＯ４＞Ｎａ２ＳＯ４＞ＮａＣｌ＞ＮＨ４Ｃｌ＞ＮａＢｒ＞ＮａＳＣＮ。一般に、約０．７５から約２Ｍの間の硫酸アンモニウムの塩濃度または約１から４Ｍの間のＮａＣｌの塩濃度が有用である。一実施形態において、樹脂混合物は、０−２ＮのＮａＣｌのイオン強度を有する。ＡＤＣ混合物のイオン強度は、疎水性樹脂の添加の前、同時またはその後で、調整することができる。
【００６８】
一実施形態において、本発明の方法は、ＡＤＣ混合物が０から１ＮのＮａＣｌのイオン強度またはこれらの等価のイオン強度を有する場合、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の６から１２倍の疎水性樹脂重量を使用する。別個の実施形態において、本発明の分離方法は、ＡＤＣ混合物が１から２ＮのＮａＣｌまたはこれらのイオン強度と等価のイオン強度を有する場合、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の３から６倍の疎水性樹脂重量を使用して実施される。本方法はまた、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の３から７倍の疎水性樹脂重量を使用して実施されてもよく、オーリスタチンはモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。６以上の薬物負荷種を分離するためのさらなる方法としては、ＡＤＣ混合物と、６以上の薬物負荷種の重量の５から１０倍の重量の疎水性樹脂重量との接触が挙げられ、オーリスタチンはモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である。
【００６９】
さらなる精製または処理ステップは、本明細書に記載の方法の前または後に実施することができる。例えば、一実施形態において、ＡＤＣ混合物は、限外ろ過／透析ろ過工程の後で得られる。別の実施形態において、ＡＤＣの精製組成物が、限外ろ過／透析ろ過に供される。
【００７０】
一実施形態において、本発明の方法は、ＡＤＣ混合物と、疎水性樹脂を接触させ、ＡＤＣ混合物と接触させる疎水性樹脂の量が、６以上の薬物負荷種を樹脂に結合させるために十分であるが、４以下の薬物負荷種を有意に結合できないものであるステップ、および疎水性樹脂をＡＤＣ混合物から除去するステップを含む。疎水性樹脂は、高薬物負荷種、例えば、６以上の薬物負荷種を結合するが、低薬物負荷種、例えば、４以下の薬物負荷種は上清中に大部分が残留したままである。ＡＤＣ混合物と接触させて、４以下の薬物負荷種と有意に結合できない疎水性樹脂の量は、一実施形態において、３５％以下の、４以下の薬物負荷種を結合する樹脂の量である。ある実施形態において、４以下の薬物負荷種の有意な結合は、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下または５％以下であると定義される。他の実施形態において、薬物負荷種の有意な結合は、３０％から１％、２５％から１％、２０％から１％、１５％から１％、１０％から１％または５％から１％であると定義される。
【００７１】
一実施形態において、本発明の方法は、低レベルの望ましくないＡＤＣ種、例えば、６以上の薬物負荷種を有する組成物を得るために使用できる。一実施形態において、本発明の組成物は、１５％以下の、６以上の薬物負荷種を有する。一実施形態において、本発明の組成物は、１４％以下の、６以上の薬物負荷種を有する。一実施形態において、本発明の組成物は、１３％以下の、６以上の薬物負荷種を有する。一実施形態において、本発明の組成物は、１２％以下の、６以上の薬物負荷種を有する。一実施形態において、本発明の組成物は、１１％以下の、６以上の薬物負荷種を有する。一実施形態において、本発明の組成物は、１０％以下の、６以上の薬物負荷種を有する。一実施形態において、本発明の組成物は、９％以下の、６以上の薬物負荷種を有する。一実施形態において、本発明の組成物は、８％以下の、６以上の薬物負荷種を有する。一実施形態において、本発明の組成物は、７％以下の、６以上の薬物負荷種を有する。一実施形態において、本発明の組成物は、６％以下の、６以上の薬物負荷種を有する。一実施形態において、本発明の組成物は、５％以下の、６以上の薬物負荷種を有する。一実施形態において、本発明の組成物は、４％以下の、６以上の薬物負荷種を有する。さらなる実施形態において、組成物は、１５％から１％の、６以上の薬物負荷種、１０％から１％の、６以上の薬物負荷種、５％から１％の、６以上の薬物負荷種、１０％から０．５％の、６以上の薬物負荷種、５％から０．５％の、６以上の薬物負荷種を有する。
【００７２】
一実施形態において、本発明の方法は、４の平均ＤＡＲを有するＡＤＣを含む組成物を調製するために使用できる。このような組成物は、ＡＤＣ混合物と、ある量の疎水性樹脂とをある種を吸着させる工程において接触させて、樹脂混合物を形成させ、ＡＤＣ混合物が、４以下の薬物負荷種および６以上の薬物負荷種を含み、疎水性樹脂の量が、ＡＤＣ混合物中の６以上の薬物負荷種の重量の５から１０倍であるステップ、および樹脂混合物から、４以下の平均ＤＡＲを有するＡＤＣを含む組成物が調製されるように、上清を得るステップにより得ることができる。一実施形態において、本発明の組成物は、３．５以下の平均ＤＡＲを有するＡＤＣを含む。本発明の一実施形態において、組成物は、３以下の平均ＤＡＲを有するＡＤＣを含む。一実施形態において、本発明の組成物は、２−４の平均ＤＡＲを有するＡＤＣを含む。本発明の一実施形態において、組成物は、２．４−３．６の平均ＤＡＲを有するＡＤＣを含む。一実施形態において、組成物はＡＤＣを含み、ＡＤＣは４以下の平均ＤＡＲまたは３．５以下の平均ＤＡＲ、３以下の平均ＤＡＲもしくは２．５以下の平均ＤＡＲを有する。
【００７３】
一実施形態において、本発明の方法は、４以下の平均薬物抗体比（ＤＡＲ）を有するＡＤＣを含み、１５％未満の望ましくないＡＤＣを含む組成物を調製するために使用できる。この方法は、ＡＤＣ混合物と疎水性樹脂とを接触させるステップであって、ＡＤＣ混合物と接触させる疎水性樹脂の量が、望ましくないＡＤＣを結合させるために十分であるステップ、および４以下の中間ＤＡＲを有し、１５％未満の望ましくないＡＤＣを含む組成物が調製されるように、疎水性樹脂をＡＤＣ混合物から除去するステップを含む。一実施形態において、望ましくないＡＤＣは、６および８の薬物負荷種である。一実施形態において、ＡＤＣ混合物に加える疎水性樹脂の量は、ＡＤＣ混合物中の望ましくないＡＤＣの重量の５から１０倍の樹脂量である。別の実施形態において、ＡＤＣ混合物に加える疎水性樹脂の量は、ＡＤＣ混合物中の望ましくないＡＤＣの重量の５から７倍の樹脂量である。一実施形態において、ＡＤＣ混合物に加える疎水性樹脂の量は、ＡＤＣ混合物中の望ましくないＡＤＣの重量の３から１２倍の樹脂量である。
【００７４】
ＡＤＣのＤＡＲは、当分野において公知の一般的な方法に従って測定することができ、限定するものではないが、ＡＤＣのＵＶ／ＶＩＳ分光分析および解析的ＨＩＣおよびＨＰＬＣ、例えば、ＨＰＬＣ−ＭＳを含む。
【００７５】
ＩＩＩ．抗体薬物複合体
本明細書に記載の組成物および方法は、オーリスタチンと複合体化された、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗ＥＧＦＲ抗体またはこれらの抗原結合部位を含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）に、少なくとも一部基づく。
【００７６】
特に、本発明は、腫瘍原性、過剰増殖性または異常な細胞中に見出されるＥＧＦＲエピトープを認識する抗体またはこれらの抗原結合部分を含み、該エピトープが正常または野生型細胞において検出不能である、抗ＥＧＦＲ抗体薬物複合体を含む方法および組成物に関する。好ましくは、抗体またはこれらの抗原結合部位は、過剰発現が不在であり、正常なＥＧＦＲの翻訳後修飾が存在する、正常または野生型ＥＧＦＲエピトープを含有する正常細胞または野生型細胞と結合しないか、またはこれらを認識しない。
【００７７】
本組成物および方法に従った使用に適切な抗ＥＧＦＲ抗体は、通常モノクローナルであり、例えば、キメラ（例えば、ヒト定常領域およびマウス可変領域を有する。）、ヒト化またはヒト抗体、一本鎖抗体などを含んでよい。免疫グロブリン分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）または免疫グロブリン分子のサブクラスであってよい。例えば、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体薬物複合体に使用される抗ＥＧＦＲ抗体は、抗体１であってよい。抗体１の配列および特徴は、下記の通りである（また、ＷＯ２０１１／０４１３１９およびＵＳ２０１１００７６２３２を参照されたい（例えば、図５５の抗体配列を参照されたい。）、この全体が参照により本明細書に組み込まれる。）。抗体１は、上皮由来の全ての癌の５０％に存在する、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の過剰発現形態を標的化する。
【００７８】
本発明の特定の実施形態において、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体薬物複合体に使用される抗ＥＧＦＲ抗体は、増幅された野生型ＥＧＦＲおよびｄｅ２−７ＥＧＦＲを認識する。本発明の抗ＥＧＦＲ抗体は、ｄｅ２−７ＥＧＦＲおよび増幅されたＥＧＦＲを認識するが、正常、野生型のＥＧＦＲまたはｄｅ２−７ＥＧＦＲの特徴である特有の接合部ペプチドを認識しないという点で、有用な特異性を実証している。抗体１の配列を下記に提供する。
【００７９】
上記のように、抗体１はヒト化抗ＥＧＦＲ抗体である。抗体１の重鎖の可変（ＶＨ）領域および定常（ＣＨ）領域は、それぞれ、下記の配列番号１および５のように示される。ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（それぞれ、配列番号：２、３および４）は、下線により示される。
【００８０】
重鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号１）（ＣＤＲは下線で示される。）：
【００８１】
【化１】
2016519070.tif 000003
【００８２】
重鎖定常領域アミノ酸配列（配列番号５）：
【００８３】
【化２】
2016519070.tif 000004
【００８４】
抗体１の軽鎖の可変（ＶＬ）領域および定常（ＣＬ）領域は、それぞれ、下記の配列番号６および１０ように示される。ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（それぞれ、配列番号７、８および９）は、下線により示される。
【００８５】
軽鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号６）（ＣＤＲは下線で示される。）：
【００８６】
【化３】
2016519070.tif 000005
【００８７】
軽鎖定常領域アミノ酸配列（配列番号１０）：
【００８８】
【化４】
2016519070.tif 000006
【００８９】
従って、一実施形態において、（本明細書に記載のＡＤＣに使用される）抗ＥＧＦＲ抗体は、それぞれ、配列番号７、配列番号８および配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含み、配列番号２、配列番号３および配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域を含む。
【００９０】
一実施形態において、本発明は、配列番号６のアミノ酸配列に記載されたＣＤＲを含む軽鎖可変領域、配列番号１のアミノ酸配列に記載されたＣＤＲを含む重鎖可変領域を有する（オーリスタチンと複合体化された）抗ＥＧＦＲ抗体を含むＡＤＣを含む製剤を提供する。
【００９１】
一実施形態において、（本明細書に記載のＡＤＣに使用される）抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００９２】
好ましい実施形態において、本発明の方法および組成物に使用されるＡＤＣは、抗ＥＧＦＲ抗体、例えば抗体１およびオーリスタチンを含む。一実施形態において、オーリスタチンはモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、例えばｖｃ−ＭＭＡＥである。一実施形態において、オーリスタチンは、またはモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、例えばｍｃ−ＭＭＡＦである。
【００９３】
または他のオーリスタチン系ＡＤＣが、本発明の方法に従って作製可能であり、オーリスタチン−ＡＤＣの作製に使用可能な抗体の例としては、キメラ抗体、ヒト抗体およびヒト化抗体が挙げられる。
【００９４】
抗ＥＧＦＲ抗体薬物複合体を含むＡＤＣの作製に使用可能な、抗ＥＧＦＲ抗体を含む抗体は、当分野において公知の任意の適切な方法により作製可能である。
例えば、モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマの使用、組換え法およびファージディスプレイ技術またはこれらの組み合わせを含む広範囲の技術を使用して調製することができる。ハイブリドーマ技術は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，１９８８）；およびＨａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，ｐｐ．５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）において大まかに考察されている。抗ＣＤ７０抗体の調製に使用できるファージディスプレイ法の例としては、例えば、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０；Ａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４：９５２−９５８；Ｐｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８；Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；および米国特許第５，６９８，４２６号明細書；５，２２３，４０９号明細書；第５，４０３，４８４号明細書；第５，５８０，７１７号明細書；第５，４２７，９０８号明細書；第５，７５０，７５３号明細書；第５，８２１，０４７号明細書；第５，５７１，６９８号明細書；第５，４２７，９０８号明細書；第５，５１６，６３７号明細書；第５，７８０，２２５号明細書；第５，６５８，７２７号明細書；第５，７３３，７４３号明細書および第５，９６９，１０８号明細書に開示された技術が挙げられる（これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。）。
【００９５】
本発明の組換え抗体を発現するための哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を、例えば、Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（１９８２年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載のＤＨＦＲ選択可能マーカーと共に使用することを含む。）およびＤＧ４４またはＤＵＸＢ１１細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１２：５５５；Ｈａｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１１：６８７−７０６；Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１４６９−１４７５）、ＮＳ０骨髄腫細胞、サル腎臓系（例えば、ＣＶＩおよびＣＯＳ、例えばＣＯＳ７細胞）、ＳＰ２細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞、例えばＨＥＫ−２９３細胞、チャイニーズハムスター線維芽細胞（例えば、Ｒ１６１０）、ヒト子宮頸癌（例えば、ＨＥＬＡ）、ネズミ線維芽細胞（例えば、ＢＡＬＢｃ／３Ｔ３）、ネズミ骨髄腫（Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３；ＮＳ０；ＳＰ２／Ｏ）、ハムスター腎臓系（例えば、例えば、ＨＡＫ）、ネズミＬ細胞（例えば、Ｌ−９２９）、ヒトリンパ球（例えば、ＲＡＪＩ）、ヒト腎臓（例えば、２９３および２９３Ｔ）が挙げられる。宿主細胞系は、通常市販品として利用可能（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、Ｋｙ．；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．などから）またはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．）から入手可能である。
【００９６】
抗体をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合、抗体は、宿主細胞を、宿主細胞中における抗体の発現または宿主細胞が成長する培養培地への分泌に十分な期間培養することによって作製される。抗体は、標準的タンパク質精製方法を使用して培養培地から回収することができる。
【００９７】
抗体の組換え発現のための例示的系において、抗体重鎖および抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターが、カルシウム−ホスフェート介在性形質移入によりｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入される。組換え発現ベクター内で、抗体の重鎖および軽鎖ｃＤＮＡが、それぞれ、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター制御要素に動作可能に連結され、ｃＤＮＡの高レベルの転写が駆動される。組換え発現ベクターはまた、ＤＨＦＲをコードするｃＤＮＡを担持し、ＤＨＦＲは、メトトレキセート選択／増幅を使用して、ベクターを形質移入されているＣＨＯ細胞の選択を可能にする。選択された組換え宿主細胞を培養して、抗体の重鎖および軽鎖を発現させ、無傷抗体が培養培地から回収される。標準的分子生物学技術を使用して、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞に形質移入し、組み換え体を選択し、宿主細胞を培養し、培養培地から抗体を回収する。またさらに、本発明は、本発明の宿主細胞を、適切な培養培地において抗体が合成されるまで培養することによって、抗体を合成する方法を提供する。この方法は、培養培地から抗体を単離するステップをさらに含み得る。
【００９８】
好ましい実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体またはこれらの抗原結合部分は、オーリスタチン（１以上）と複合体化される。オーリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解および／または核および細胞分裂に干渉し、抗癌および／または抗真菌活性を有することが示されている。オーリスタチンは、微小管動態およびＧＴＰ加水分解に干渉し、これによって細胞分裂を阻害することによって抗癌活性を保有することが一般に示されている、ドラスタチン類似体の群を表す。例えば、オーリスタチンＥ（米国特許第５，６３５，４８３号明細書、参照により本明細書に組み込まれる。）は、海洋天然物のドラスタチン１０の合成類似体であり、チューブリンにおいて抗癌薬のビンクリスチンと同じ部位に結合することによってチューブリン重合を阻害する化合物である（Ｇ．Ｒ．Ｐｅｔｔｉｔ，Ｐｒｏｇ．Ｃｈｅｍ．Ｏｒｇ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ，７０：１−７９（１９９７））。ドラスタチン１０、オーリスタチンＰＥおよびオーリスタチンＥは４個のアミノ酸を有する線形ペプチドであり、このうちの３個は、ドラスタチンクラスの化合物に特有である。有糸分裂阻害剤のオーリスタチンサブクラスの例示的実施形態としては、限定するものではないが、モノメチルオーリスタチンＤ（ＭＭＡＤまたはオーリスタチンＤ誘導体）、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥまたはオーリスタチンＥ誘導体）、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦまたはＭＭＡＦ誘導体）、オーリスタチンＦフェニレンジアミン（ＡＦＰ）、オーリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、オーリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）および５−ベンゾイル吉草酸−ＡＥエステル（ＡＥＶＢ）が挙げられる。オーリスタチン誘導体の合成および構造は、米国特許出願公開第２００３−００８３２６３号明細書、第２００５−０２３８６４９号明細書および第２００５−０００９７５１号明細書；国際特許公開第ＷＯ０４／０１０９５７号パンフレット、国際特許公開第ＷＯ０２／０８８１７２号パンフレットおよび米国特許第６，３２３，３１５号明細書；第６，２３９，１０４号明細書；第６，０３４，０６５号明細書；第５，７８０，５８８号明細書；第５，６６５，８６０号明細書；第５，６６３，１４９号明細書；第５，６３５，４８３号明細書；第５，５９９，９０２号明細書；第５，５５４，７２５号明細書；第５，５３０，０９７号明細書；第５，５２１，２８４号明細書；第５，５０４，１９１号明細書；第５，４１０，０２４号明細書；第５，１３８，０３６号明細書；第５，０７６，９７３号明細書；第４，９８６，９８８号明細書；第４，９７８，７４４号明細書；第４，８７９，２７８号明細書；第４，８１６，４４４号明細書および第４，４８６，４１４号明細書に記載されており、これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９９】
一実施形態において、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体は、少なくとも１つのＭＭＡＦ（モノメチルオーリスタチンＦ）と複合体化される。モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）は、チューブリンの重合を遮断することによって細胞分裂を阻害する。ＭＭＡＦは、この非荷電対応物のＭＭＡＥと比較して、この細胞障害性活性を弱める荷電Ｃ末端フェニルアラニン残基を有する。この毒性のために、ＭＭＡＦは、これ自体を薬剤として使用することはできないが、ＭＭＡＦを癌細胞に向かわせるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と連結することができる。一実施形態において、リンカーと抗ＥＧＦＲ抗体とは、細胞外液中で安定であるが、複合体がひとたび腫瘍細胞に進入すると、カテプシンにより切断され、抗有糸分裂機序が活性化される。一実施形態において、抗体１は、非切断性マレイミドカプロイル（ｍｃ）連結を使用して、ＭＭＡＦと複合体化される。ＭＭＡＦの構造は図１に提供される。
【０１００】
一実施形態において、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体は、少なくとも１つのＭＭＡＥ（モノメチルオーリスタチンＥ）と複合体化される。モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ、ベドチン）は、チューブリンの重合を遮断することによって細胞分裂を阻害する。この非常に強い毒性のため、ＭＭＡＥもまたこれ自体を薬物として使用することはできない。近年の癌療法の開発において、ＭＭＡＥは癌細胞において特異的マーカー発現を認識するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に連結され、ＭＭＡＥを癌細胞に向かわせる。一実施形態において、ＭＭＡＥと抗ＥＧＦＲ抗体とを連結するリンカーは、細胞外液（即ち、細胞の外側の媒体または環境）中で安定であるが、ひとたびＡＤＣが特異的癌細胞抗原と結合し、癌細胞に進入するとカテプシンにより切断され、毒性ＭＭＡＥを放出し、強力な抗有糸分裂機序を活性化する。ＭＭＡＥの構造は図１に提供される。
【０１０１】
治療薬とタンパク質、特に抗体とを複合体化する技術は周知である（例えば、Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，」Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，２ｎｄ  ｅｄ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８５）；およびＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８９／１２６２４も参照されたい。）。
【０１０２】
一実施形態において、抗ＥＧＦＲ−ＡＤＣは、細胞障害性薬物と抗体との間にリンカー領域を含む。例えば、このようなリンカー、スペーサーおよび／または伸長体（ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ）化合物としては、限定するものではないが、下記のアミノ安息香酸スペーサー（例えば、限定するものではないが、米国特許第７，０９１，１８６号明細書および第７，５５３，８１６号明細書を参照されたい、これらはそれぞれ、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる。）；マレイミドカプロイル；ｐ−アミノベンジルカルバモイル（ＰＡＢ）；リソソーム酵素切断性リンカー（例えば、限定するものではないが、米国特許第６，２１４，３４５号明細書を参照されたい、この全体が参照により本明細書に組み込まれる。）；マレイミドカプロイル−ポリエチレン２０グリコール（ＭＣ（ＰＥＧ）６−ＯＨ）；Ｎ−メチル−バリンシトルリン；Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）（例えば、限定するものではないが、Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，３９５−３９９を参照されたい、この全体が参照により本明細書に組み込まれる。）；Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）（例えば、限定するものではないが、米国特許第４，５６３，３０４号明細書参照されたい、この全体が参照により本明細書に組み込まれる。）；Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）；バリン−シトルリン（ｖｃ）ならびに他のリンカー、スペーサーおよび／または伸長体（ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ）化合物（例えば、限定するものではないが、米国特許第７，０９０，８４３号明細書、第７，２２３，８３７号明細書および第７，６５９，２４１号明細書ならびに米国特許公開第２００４／００１８１９４号明細書、第２００４／０１２１９４０号明細書、第２００６／０１１６４２２号明細書、第２００７／０２５８９８７号明細書、第２００８／０２１３２８９号明細書、第２００８／０２４１１２８号明細書、第２００８／０３１１１３６号明細書、第２００８／０３１７７４７号明細書および第２００９／００１０９４５号明細書を参照されたい、これらはそれぞれ、この全体が参照により本明細書に組み込まれる。）が挙げられる。一般的に言えば、上記の薬剤および他の薬剤と本発明の特異的結合メンバー、特に抗体およびこれらの断片とを結合および／または複合体化するための技術は、当分野において公知である。例えば、限定するものではないが、Ａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  （２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｅｗ」，Ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）およびＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）を参照されたく、これらはそれぞれ、この全体を参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０３】
多数の異なる反応が、薬物と抗体との共有結合に利用可能である。これは、多くの場合、リジンのアミノ基、グルタミン酸およびアスパラギン酸の遊離カルボン酸基、システインのスルフヒドリル基および芳香族アミノ酸のさまざまな部分を含む、抗体分子のアミノ酸の残基の反応により達成される。共有結合の最も一般的に使用される非特異的方法の１つは、化合物のカルボキシ（またはアミノ）基と抗体のアミノ（またはカルボキシ）基とを連結するためのカルボジイミド反応である。さらに、二官能性薬剤、例えば、ジアルデヒドまたはイミドエステルは、化合物のアミノ基と抗体分子のアミノ基とを連結するために使用されている。さらに、シッフ塩基反応が、薬物と抗体との結合に利用可能である。この方法は、グリコールまたはヒドロキシ基を含有する薬物の過ヨウ素酸酸化を伴い、従って、その後抗体分子と反応するアルデヒドを形成する。結合は、抗体分子のアミノ基とのシッフ塩基の形成を介して起こる。イソチオシアネートは、薬物を抗体に共有結合させるカップリング剤として使用することができる。他の技術は当業者に公知であり、本発明の範囲内である。このような技術の限定されない例は、例えば、米国特許第５，６６５，３５８号明細書；第５，６４３，５７３号明細書および第５，５５６，６２３号明細書に記載されており、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
ある実施形態において、リンカーの前駆体である中間体は、適切な条件下で薬物と反応される。ある実施形態において、反応基が薬物および／または中間体に対して使用される。薬物および中間体、または誘導体化された薬物との間の反応の生成物は、その後、適切な条件下で抗ＥＧＦＲ抗体と反応される。
【０１０５】
複合体化方法の他の例は、米国特許第７，８３７，９８０号明細書（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、Ｃａｒｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｅｎｔｅｒ（２００８年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ，１４（３）：１５４および米国出願公開第２００４−０１５７７８２Ａ１号明細書および第２００５−０２３８６４９号明細書および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０３８３９２号に記載されている。
【０１０６】
一実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体またはこれらの抗原結合部位は、ＭＭＡＦであるオーリスタチンと複合体化される。一実施形態において、抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、抗体１−ｍｃ−ＭＭＡＦである。抗体１−ｍｃ−ＭＭＡＦは、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）の１以上の分子に共有結合された抗体１（上記の配列番号１から１０）を含む（構造は図１を参照）。抗体１−ｍｃ−ＭＭＡＦを作製するために、抗体１の鎖間ジスルフィド結合が、スルフヒドリル基に還元される。ＭＭＡＦはその後、これらのスルフヒドリル基によって抗体と結合される。抗体１−ｍｃ−ＭＭＡＦは、図１に示すように、非切断性リンカー、即ち、非切断性マレイミドカプロイル（ｍｃ）連結を使用して作製される。
【０１０７】
本発明の一実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体またはこれらの抗原結合部位は、ＭＭＡＥであるオーリスタチンと複合体化される。一実施形態において、抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、抗体１−ｖｃ−ＭＭＡＥを含む。抗体１−ｖｃ−ＭＭＡＥは、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）の１以上の分子と共有結合された抗体１（上記の配列番号１から１０）を含む（構造は図１を参照）。抗体１−ｖｃ−ＭＭＡＥを作製するために、抗体１の鎖間ジスルフィド結合がスルフヒドリル基に還元される。ｖｃＭＭＡＥはその後、これらのスルフヒドリル基によって抗体と結合される。抗体１−ｖｃ−ＭＭＡＥは、図１に示すようにバリンシトルリンリンカー（ｖｃ）を使用して作製され、このようにして抗体１−ｖｃ−ＭＭＡＥが作製される。
【０１０８】
ＩＶ．組成物の使用
本発明の方法に従って、所望の平均ＤＡＲを有する抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣを含む組成物は、抗ＥＧＦＲ抗体による治療と必要とする障害を有する（または有するリスクのある）対象に投与される。
【０１０９】
本明細書において使用する場合、「ＥＧＦＲ活性が有害である障害」という用語は、障害を患う対象においてＥＧＦＲの存在が、障害の病理生態学の原因であるか、もしくは障害の悪化に寄与する要因のいずれかであることが示されている、またはこのように疑われる、疾患および他の障害を含むことが意図される。従って、ＥＧＦＲ活性が有害である障害は、ＥＧＦＲ活性の阻害が、障害の症状および／または進行を緩和することが期待される障害である。このような障害は、例えば、ＥＧＦＲの活性の増加または障害を患う対象由来の生体試料中に存在するＥＧＦＲの量の増加（例えば、対象の組織試料中、血清、血漿、滑液などのＥＧＦＲ濃度の上昇）により証明することができ、これらは、例えば、抗ＥＧＦＲ抗体を使用して検出可能である。
【０１１０】
従って、例えば２−４の平均ＤＡＲを有する本発明のＡＤＣ組成物は、癌の治療に使用可能である。治療可能な癌の例としては、限定するものではないが、、神経膠芽腫、非小細胞肺癌、扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、結腸癌、頭部および頸部癌、乳癌、扁平上皮細胞腫瘍、肛門癌、皮膚癌および外陰癌が挙げられる。所望の平均ＤＡＲを有するＡＤＣ組成物は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を過剰発現する可能性のある固形腫瘍または多形性神経膠芽腫を有する対象を治療するために使用可能である。
【０１１１】
一実施形態において、例えば２−４の平均ＤＡＲを有する本発明の精製されたＡＤＣ組成物は、結腸直腸癌、頭部および頸部癌（限定するものではないが、下咽頭癌、腔咽頭癌、食道癌、喉頭癌および口腔癌を含む。）、非小細胞肺癌、扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膵臓癌、胃癌、固形腫瘍、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を過剰発現する可能性のある固形腫瘍、多形性神経膠芽腫および乳癌の治療のため使用される。このような癌のさらなる例としては、扁平上皮腫瘍（肺、頭部および頸部、子宮頸部などの扁平上皮腫瘍を含む。）、神経膠芽腫、グリオーマ、肺癌、結腸癌、頭部および頸部癌、乳癌、扁平上皮細胞腫瘍、肛門癌、皮膚癌および外陰癌が挙げられる。
【０１１２】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣを含む組成物の特異性は、多数の腫瘍原性細胞型、および腫瘍型、例えば、限定するものではないが、神経膠芽腫、非小細胞肺癌、肺癌、結腸癌、頭部および頸部癌、乳癌、扁平上皮細胞腫瘍、肛門癌、皮膚癌、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を過剰発現する可能性のある固形腫瘍、多形性神経膠芽腫および外陰癌を、以前から知られているＥＧＦＲ抗体に見ることができる正常組織の取込みに関する問題を伴わずに、同定、特徴付け、標的化および治療、低減または排除するための診断的および治療的使用を提供する。従って、（例えば、突然変異体または変異体ＥＧＦＲの増幅または発現により）ＥＧＦＲを過剰発現する細胞、および特定の実施形態において、異常な翻訳後修飾を表す細胞が、本発明の抗体（複数可）またはこれらの断片を利用して、認識、単離、特徴付け、標的化および治療または排除され得る。腫瘍中のＥＧＦＲの発現を検出するための方法は、当分野において公知であり、例えば、ＥＧＦＲ  ｐｈａｒｍＤｘ（商標）Ｋｉｔ（Ｄａｋｏ）である。対照的に、「ＥＧＦＲ陰性腫瘍」は、免疫組織化学的技術により決定される、腫瘍試料中のバックグラウンドを超えたＥＧＦＲ膜染色が存在しない腫瘍として定義される。
【０１１３】
本発明の一態様において、本明細書に記載の組成物のいずれかにおいて治療有効量の抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣを投与するステップを含み、対象が組成物中の抗ＥＧＦＲ抗体による治療を必要とする障害（例えば、腫瘍、癌性病態、前癌病態および過剰増殖性細胞成長に関連する、またはこれからもたらされる任意の病態）を有する、対象を治療するための方法が提供される。
【０１１４】
従って、抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣを含む組成物は、染色またはＥＧＦＲの過剰発現、特に増幅および／またはＥＧＦＲの突然変異、特にｄｅ２−７ＥＧＦＲが存在する、腫瘍または細胞を認識する別な方法により、ＥＧＦＲ腫瘍または腫瘍原性細胞の性質を分類することができる。
【０１１５】
従って、本発明のさらなる態様において、抗体１を含む抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣを含む本発明の組成物の投与を含む、腫瘍、癌性病態、前癌性病態および過剰増殖性細胞成長に関連する、またはこれからもたらされる任意の病態の治療方法を提供する。
【０１１６】
さまざまな送達系が公知であり、本発明の抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣ組成物を投与するために使用可能である。導入方法としては、限定するものではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられる。ＡＤＣは、例えば、注入またはボーラス注入により、上皮または皮膚粘膜の内膜（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収により投与することができ、他の生物学的活性剤、例えば、化学療法剤と一緒に投与することができる。投与は全身性または局所的であってよい。一実施形態において、本発明の製剤は、静脈内的に対象に送達される。別の実施形態において、本発明の製剤は、皮下的に対象に送達される。一実施形態において、対象が、彼自身／彼女自身に製剤を投与する（自己投与）。
【０１１７】
製剤中の抗ＥＧＦＲ抗体による治療を必要とする障害、例えば癌の治療または予防に有効なＡＤＣの量は、標準的臨床技術により決定することができる。加えて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイが場合により用いられ、最適な投薬量範囲の同定を手助けすることができる。本製剤で採用される正確な用量は、投与の経路、免疫学的障害のステージまたはＥＧＦＲ発現癌に依存し、開業医の判断および各患者の状況に従って決定され得る。一実施形態において、治療有効量の製剤が投与される。抗体の「治療有効量」または「有効量」という用語は、本明細書において使用する場合、抗体が有効である治療のために、障害の症状を予防または治療または緩和に有効な量を指す。製剤中の治療有効量の例は、有害なＥＧＦＲ活性を阻害するため、またはＥＧＦＲ活性が有害である障害を治療するために十分な量である。
【０１１８】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣの用量は、例えば、毎日、週に一回（毎週）、週に２回、週に３回、週に４回、週に５回、２週間に１回、３週間に１回、月に１回もしくは４週間に１回、２週投与／１週休薬または必要に応じて別の方法で投与することができる。
【０１１９】
従って、本発明に従った医薬組成物は、本発明に従った使用のために、有効成分（ＡＤＣ）に加えて、医薬として許容される賦形剤、担体、バッファー、安定剤、または当業者に周知の他の材料を含んでよい。このような材料は非毒性でなければならず、有効成分の効力に干渉してはならない。担体または他の材料の正確な特性は、投与の経路に依存すると思われ、投与経路としては、経口または注射、例えば静脈内である。一実施形態において、医薬組成物は、ＡＤＣ（例えば、ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦと複合体化された抗体１などの抗ＥＧＦＲ抗体）および医薬として許容される担体を含む。本明細書において使用する場合、「医薬として許容される担体」としては、生理学的に適合性である、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。医薬として許容される担体の例としては、水、食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの１以上、およびこれらの組み合わせが挙げられる。多くの場合、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。
【０１２０】
ある実施形態において、抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、癌治療のための１以上のさらなる治療薬と共に、対象に同時投与することができる。「同時投与」という用語は、同じ医薬組成物または別の医薬組成物において組み合わせて対象に投与される、２以上の異なる医薬品または治療（例えば、放射線治療）の投与を意味する。従って、同時投与は、２以上の医薬品を含む単一の医薬組成物での同時投与、または２以上の異なる組成物の同じ対象への同時もしくは異なる時点における投与を伴う。
【０１２１】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、薬剤の例としては、例えば、放射線、アルキル化剤、血管新生阻害薬、抗体、代謝拮抗薬、抗有糸分裂薬、抗増殖薬、抗ウイルス薬、オーロラキナーゼ阻害剤、アポトーシスプロモーター（例えば、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗおよびＢｆｌ−１）阻害剤、細胞死受容体経路の活性化物質、Ｂｃｒ−Ａｂｌキナーゼ阻害剤、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞誘導）抗体、抗体薬物複合体、生体応答調節剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤、ＤＶＤ（二重可変ドメイン抗体）、白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＥｒｂＢ２）受容体阻害剤、成長因子阻害剤、ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）−９０阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、ホルモン療法薬、免疫薬、アポトーシスタンパク質阻害剤（ＩＡＰ）の阻害剤、インターカレート抗生物質（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）、キナーゼ阻害剤、キネシン阻害剤、Ｊａｋ２阻害剤、哺乳動物標的のラパマイシン阻害剤、マイクロＲＮＡ阻害剤、マイトジェン活性化細胞外シグナル制御キナーゼ阻害剤、多価結合タンパク質、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ポリＡＤＰ（アデノシン二リン酸）−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤、プラチナ化学療法薬、ポロ様キナーゼ（Ｐｌｋ）阻害剤、ホスホイノシチド−３キナーゼ（ブロモドメイン）阻害剤、プロテオソーム阻害剤、プリン類似体、ピリミジン類似体、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤、レチノイド（ｅｔｉｎｏｉｄｓ）／デルトイド（ｄｅｌｔｏｉｄｓ）植物アルカノイド、低分子阻害性リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、トポイソメラーゼ阻害剤、テモゾロミド、ユビキチンリガーゼ阻害剤などが挙げられ、これらの薬剤の１以上との組み合わせて同時投与することもできる。
【０１２２】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、ＢｉＴＥ抗体を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、ＢｉＴＥ抗体は、Ｔ細胞と癌細胞とを同時に結合することによって、Ｔ細胞に癌細胞を攻撃するように仕向ける二重特異性抗体である。その後、Ｔ細胞は標的癌細胞を攻撃する。ＢｉＴＥ抗体の例としては、アデカツムマブ（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ  ＭＴ２０１）、ブリナツモマブ（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ  ＭＴ１０３）などが挙げられる。理論に縛られるものではないが、Ｔ細胞が標的癌細胞のアポトーシスを誘発する機序の１つは、パーフォリンおよびグランザイムＢを含む細胞溶解性顆粒成分のエキソサイトーシスによるものである。これに関して、Ｂｃｌ−２は、パーフォリンおよびグランザイムＢの両方によるアポトーシスの誘導を弱めることが示されてきた。これらのデータは、癌細胞を標的化する場合、Ｂｃｌ−２の阻害が、Ｔ細胞によって誘発される細胞障害性効果を強化し得ることを示唆している（Ｖ．Ｒ．Ｓｕｔｔｏｎ，Ｄ．Ｌ．Ｖａｕｘ  ａｎｄ  Ｊ．Ａ．Ｔｒａｐａｎｉ，Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９７，１５８（１２），５７８３）。
【０１２３】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、ｓｉＲＮＡを含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができる。ＳｉＲＮＡは、内在性ＲＮＡの塩基または化学修飾されたヌクレオチドを有する分子である。修飾は、細胞活性を無効にすることはなく、むしろ安定性の増加および／または細胞の分化能（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｏｔｅｎｃｙ）の増加をもたらす。化学修飾の例としては、ホスホロチオエート基、２’−デオキシヌクレオチド、２’−ＯＣＨ３−含有リボヌクレオチド、２’−Ｆ−リボヌクレオチド、２’−メトキシエチルリボヌクレオチド、これらの組み合わせなどが挙げられる。ｓｉＲＮＡは、さまざまな長さ（例えば、１０−２００ｂｐｓ）および構造（例えば、ヘアピン、一本鎖／二本鎖、バルジ、ニック／ギャップ、ミスマッチ）を有することができ、細胞内でプロセシングされ、活性遺伝子のサイレンシングを提供する。二本鎖ｓｉＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、同じ数のヌクレオチドを各鎖に有しても（平滑末端）、または非対称の末端（オーバーハング）を有してもよい。１−２ヌクレオチドのオーバーハングは、センスおよび／またはアンチセンス鎖に存在してもよく、所与の鎖の５’−および／または３’−末端に存在してもよい。
【０１２４】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、ＤＶＤおよび他の多価結合タンパク質を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができる。多価結合タンパク質は、２以上の抗原結合部位を含む結合タンパク質である。多価結合タンパク質は、３以上の抗原結合部位を有するように遺伝子操作されており、一般に天然の抗体ではない。「多重特異的結合タンパク質」という用語は、２以上の関連する標的または関連しない標的を結合できる結合タンパク質を意味する。二重可変ドメイン（ＤＶＤ）結合タンパク質は、２以上の抗原結合部位を含む４価または多価の結合タンパク質結合タンパク質である。このようなＤＶＤは、単一特異的（即ち１つの抗原に結合できる。）であっても、または多重特異的（即ち２以上の抗原に結合できる。）であってもよい。２つの重鎖ＤＶＤポリペプチドおよび２つの軽鎖ＤＶＤポリペプチドを含むＤＶＤ結合タンパク質は、ＤＶＤ  Ｉｇと称される。ＤＶＤ  Ｉｇの各半分は、重鎖ＤＶＤポリペプチド、軽鎖ＤＶＤポリペプチドおよび２つの抗原結合部位を含む。各結合部位は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、合計６つのＣＤＲが抗原結合／抗原結合部位に関与する。多重特異性ＤＶＤは、ＤＬＬ４とＶＥＧＦと、またはＣ−ｍｅｔとＥＧＦＲと、またはＥｒｂＢ３とＥＧＦＲとを結合させるＤＶＤ結合タンパク質を含む。
【０１２５】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、アルキル化剤を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができる。アルキル化剤としては、アルトレタミン、ＡＭＤ−４７３、ＡＰ−５２８０、アパジコン、ベンダムスチン、ブロスタリシン、ブスルファン、カルボコン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、クロラムブシル、ＣＬＯＲＥＴＡＺＩＮＥ（Ｒ）（ラロムスチン、ＶＮＰ４０１０１Ｍ）、シクロホスファミド、デカルバジン、エストラムスチン、フォテムスチン、グルホスファミド、イホスファミド、ＫＷ−２１７０、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、マホスファミド、メルファラン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ニムスチン、ナイトロジェンマスタードＮ−オキシド、ラニムスチン、テモゾロミド、チオテパ、ＴＲＥＡＮＤＡ（Ｒ）（ベンダムスチン）、トレオスルファン、ロホスファミドなどが挙げられる。
【０１２６】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、血管新生阻害剤を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができる。血管新生阻害剤としては、無内皮特異的受容体型チロシンキナーゼ（Ｔｉｅ−２）阻害剤、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、インスリン成長因子−２受容体（ＩＧＦＲ−２）阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）阻害剤、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）阻害剤、トロンボスポンジン類似体、血管内皮成長因子受容体チロシンキナーゼ（ＶＥＧＦＲ）阻害剤などが挙げられる。
【０１２７】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣ（または抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣを含む製剤）は、代謝拮抗薬を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができる。代謝拮抗薬としては、ＡＬＩＭＴＡ（Ｒ）（ペメトレキセド二ナトリウム、ＬＹ２３１５１４、ＭＴＡ）、５−アザシチジン、ＸＥＬＯＤＡ（Ｒ）（カペシタビン）、カルモフール、ＬＥＵＳＴＡＴ（Ｒ）（クラドリビン）、クロファラビン、シタラビン、シタラビンオクホスフェート、シトシンアラビノシド、デシタビン、デフェロキサミン、ドキシフルリジン、エフロルニチン、ＥＩＣＡＲ（５−エチニル−１−β−Ｄ−リボフラノシルイミダゾール−４−カルボキサミド）、エノシタビン、エトニルシチジン、フルダラビン、５−フルオロウラシル単独またはロイコボリンと組み合わせた５−フルオロウラシル、ＧＥＭＺＡＲ（Ｒ）（ゲムシタビン）、ヒドロキシ尿素、ＡＬＫＥＲＡＮ（Ｒ）（メルファラン）、メルカプトプリン、６−メルカプトプリンリボシド、メトトレキセート、ミコフェノール酸、ネララビン、ノラトレキセド、オクホスフェート、ペリトレキソール、ペントスタチン、ラルチトレキセド、リバビリン、トリアピン、トリメトレキサート、Ｓ−１、チアゾフリン、テガフール、ＴＳ−１、ビダラビン、ＵＦＴなどが挙げられる。
【０１２８】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、抗ウイルス薬を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができる。抗ウイルス薬としては、リトナビル、ヒドロキシクロロキンなどが挙げられる。
【０１２９】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、オーロラキナーゼ阻害薬を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができる。オーロラキナーゼ阻害薬としては、ＡＢＴ−３４８、ＡＺＤ−１１５２、ＭＬＮ−８０５４、ＶＸ−６８０、オーロラＡ特異的キナーゼ阻害剤、オーロラＢ特異的キナーゼ阻害剤およびパンオーロラキナーゼ阻害薬などが挙げられる。
【０１３０】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣ（または抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣを含む製剤）は、Ｂｃｌ−２タンパク質阻害剤を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができる。Ｂｃｌ−２タンパク質阻害剤としては、ＡＴ−１０１（（−）ゴシポール）、ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（Ｒ）（Ｇ３１３９またはオブリメルセン（Ｂｃｌ−２標的化アンチセンスオリゴヌクレオチド））、ＩＰＩ−１９４、ＩＰＩ−５６５、Ｎ−（４−（４−（（４’−クロロ（１，１’−ビフェニル）−２−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（ジチルアミノ）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−ニトロベンゼンスルホンアミド）（ＡＢＴ−７３７）、Ｎ−（４−（４−（（２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジチル−１−クロロヘキサ−１−エン−１−イル）メチル）ピペラジン−１−イル）ベンゾイル）−４−（（（１Ｒ）−３−（モルホリン−４−イル）−１−（（フェニルスルファニル）メチル）プロピル）アミノ）−３−（（トリフルオロメチル）スルホニル）ベンゼンスルホンアミド（ＡＢＴ−２６３）、ＧＸ−０７０（オバトクラックス）、ＡＢＴ−１９９などが挙げられる。
【０１３１】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、Ｂｃｒ−Ａｂｌキナーゼ阻害剤を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、Ｂｃｒ−Ａｂｌキナーゼ阻害剤としては、例えば、ＤＡＳＡＴＩＮＩＢ（Ｒ）（ＢＭＳ−３５４８２５）、ＧＬＥＥＶＥＣ（Ｒ）（イマチニブ）などが挙げられる。
【０１３２】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、ＣＤＫ阻害剤を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができる。ＣＤＫ阻害剤としては、ＡＺＤ−５４３８、ＢＭＩ−１０４０、ＢＭＳ−０３２、ＢＭＳ−３８７、ＣＶＴ−２５８４、フラボピリドール、ＧＰＣ−２８６１９９、ＭＣＳ−５Ａ、ＰＤ０３３２９９１、ＰＨＡ−６９０５０９、セリシクリブ（ＣＹＣ−２０２、Ｒ−ロスコビチン）、ＺＫ−３０４７０９などが挙げられる。
【０１３３】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、ＣＯＸ−２阻害剤を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができる。ＣＯＸ−２阻害剤としては、ＡＢＴ−９６３、ＡＲＣＯＸＩＡ（Ｒ）（エトリコキシブ）、ＢＥＸＴＲＡ（Ｒ）（バルデコキシブ）、ＢＭＳ３４７０７０、ＣＥＬＥＢＲＥＸ（Ｒ）（セレコキシブ）、ＣＯＸ−１８９（ルミラコキシブ）、ＣＴ−３、ＤＥＲＡＭＡＸＸ（Ｒ）（デラコキシブ）、ＪＴＥ−５２２、４−メチル−２−（３，４−ジメチルフェニル）−１−（４−スルファモイルフェニル−１Ｈ−ピロール）、ＭＫ−６６３（エトリコキシブ）、ＮＳ−３９８、パレコキシブ、ＲＳ−５７０６７、ＳＣ−５８１２５、ＳＤ−８３８１、ＳＶＴ−２０１６、Ｓ−２４７４、Ｔ−６１４、ＶＩＯＸＸ（Ｒ）（ロフェコキシブ）などが挙げられる。
【０１３４】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、他のＥＧＦＲ阻害剤を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができる。ＥＧＦＲ阻害剤としては、ＥＧＦＲ抗体、ＡＢＸ−ＥＧＦ、抗ＥＧＦＲイムノリポソーム、ＥＧＦ−ワクチン、ＥＭＤ−７２００、ＥＲＢＩＴＵＸ（Ｒ）（セツキシマブ）、ＨＲ３、ＩｇＡ抗体、ＩＲＥＳＳＡ（Ｒ）（ゲフィチニブ）、ＴＡＲＣＥＶＡ（Ｒ）（エルロチニブまたはＯＳＩ−７７４）、ＴＰ−３８、ＥＧＦＲ融合タンパク質、ＴＹＫＥＲＢ（Ｒ）（ラパチニブ）などが挙げられる。
【０１３５】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、ＨＥＲ２阻害剤を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができる。ＥｒｂＢ２受容体阻害剤としては、ＣＰ−７２４−７１４、ＣＩ−１０３３（カルネチニブ）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（Ｒ）（トラスツズマブ）、ＴＹＫＥＲＢ（Ｒ）（ラパチニブ）、ＯＭＮＩＴＡＲＧ（Ｒ）（２Ｃ４、ペツズマブ）、ＴＡＫ−１６５、ＧＷ−５７２０１６（イオナファルニブ）、ＧＷ−２８２９７４、ＥＫＢ−５６９、ＰＩ−１６６、ｄＨＥＲ２（ＨＥＲ２ワクチン）、ＡＰＣ−８０２４（ＨＥＲ−２ワクチン）、抗ＨＥＲ／２ｎｅｕ二重特異性抗体、Ｂ７．ｈｅｒ２ＩｇＧ３、ＡＳ  ＨＥＲ２三官能性二重特異性抗体、ｍＡＢ  ＡＲ−２０９、ｍＡＢ  ２Ｂ−１などが挙げられる。
【０１３６】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、ヒストン脱アセチラーゼ阻害剤を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、ヒストン脱アセチラーゼ阻害剤としては、例えば、デプシペプチド、ＬＡＱ−８２４、ＭＳ−２７５、トラポキシン、スベロイラニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、ＴＳＡ、バルプロ酸などが挙げられる。
【０１３７】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、ＨＳＰ−９０阻害剤を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、ＨＳＰ−９０阻害剤としては、１７−ＡＡＧ−ｎａｂ、１７−ＡＡＧ、ＣＮＦ−１０１、ＣＮＦ−１０１０、ＣＮＦ−２０２４、１７−ＤＭＡＧ、ゲルダナマイシン、ＩＰＩ−５０４、ＫＯＳ−９５３、ＭＹＣＯＧＲＡＢ（Ｒ）（ＨＳＰ−９０に対するヒト組換え抗体）、ＮＣＳ−６８３６６４、ＰＵ２４ＦＣｌ、ＰＵ−３、ラディシコール、ＳＮＸ−２１１２、ＳＴＡ−９０９０  ＶＥＲ４９００９などが挙げられる。
【０１３８】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、アポトーシス阻害剤タンパク質の阻害剤を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、アポトーシス阻害剤タンパク質の阻害剤としては、例えば、ＨＧＳ１０２９、ＧＤＣ−０１４５、ＧＤＣ−０１５２、ＬＣＬ−１６１、ＬＢＷ−２４２などが挙げられる。
【０１３９】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、他のＡＤＣを含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、他のＡＤＣとしては、例えば、抗ＣＤ２２−ＭＣ−ＭＭＡＦ、抗ＣＤ２２−ＭＣ−ＭＭＡＥ、抗ＣＤ２２−ＭＣＣ−ＤＭ１、ＣＲ−０１１−ｖｃＭＭＡＥ、ＰＳＭＡ−ＡＤＣ、ＭＥＤＩ−５４７、ＳＧＮ−１９Ａｍ  ＳＧＮ−３５、ＳＧＮ−７５  ＡＤＣなどが挙げられる。
【０１４０】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、細胞死受容体経路のアクチベーターを含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、細胞死受容体経路のアクチベーターとしては、例えば、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬまたは細胞死受容体（例えばＤＲ４およびＤＲ５）を標的化する抗体または他の薬剤、例えばアポマブ、コナツムマブ、ＥＴＲ２−ＳＴ０１、ＧＤＣ０１４５、（レクサツムマブ）、ＨＧＳ−１０２９、ＬＢＹ−１３５、ＰＲＯ−１７６２およびトラスツズマブが挙げられる。
【０１４１】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、キネシン阻害剤を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、キネシン阻害剤としては、例えば、ＡＺＤ４８７７、ＡＲＲＹ−５２０などのＥｇ５阻害剤；ＧＳＫ９２３２９５ＡなどのＣＥＮＰＥ阻害剤などが挙げられる。
【０１４２】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、ＪＡＫ−２阻害剤を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、ＪＡＫ−２阻害剤としては、例えば、ＣＥＰ−７０１（レサウルチニブ）、ＸＬ０１９およびＩＮＣＢ０１８４２４などが挙げられる。
【０１４３】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、ＭＥＫ阻害剤を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、ＭＥＫ阻害剤としては、例えば、ＡＲＲＹ−１４２８８６、ＡＲＲＹ−４３８１６２  ＰＤ−３２５９０１、ＰＤ−９８０５９などが挙げられる。
【０１４４】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣ（または抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣを含む製剤）は、ｍＴＯＲ阻害剤を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、ｍＴＯＲ阻害剤としては、例えば、ＡＰ−２３５７３、ＣＣＩ−７７９、エベロリムス、ＲＡＤ−００１、ラパマイシン、テムシロリムス、ＰＩ−１０３、ＰＰ２４２、ＰＰ３０、Ｔｏｒｉｎ１を含むＡＴＰ−競合性ＴＯＲＣ１／ＴＯＲＣ２阻害剤などが挙げられる。
【０１４５】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）としては、例えば、ＡＭＩＧＥＳＩＣ（Ｒ）（サルサレート）、ＤＯＬＯＢＩＤ（Ｒ）（ジフルニサル）、ＭＯＴＲＩＮ（Ｒ）（イブプロフェン）、ＯＲＵＤＩＳ（Ｒ）（ケトプロフェン）、ＲＥＬＡＦＥＮ（Ｒ）（ナブメトン）、ＦＥＬＤＥＮＥ（Ｒ）（ピロキシカム）、イブプロフェンクリーム、ＡＬＥＶＥ（Ｒ）（ナプロキセン）およびＮＡＰＲＯＳＹＮ（Ｒ）（ナプロキセン）、ＶＯＬＴＡＲＥＮ（Ｒ）（ジクロフェナク）、ＩＮＤＯＣＩＮ（Ｒ）（インドメタシン）、ＣＬＩＮＯＲＩＬ（Ｒ）（スリンダク）、ＴＯＬＥＣＴＩＮ（Ｒ）（トルメチン）、ＬＯＤＩＮＥ（Ｒ）（エトドラク）、ＴＯＲＡＤＯＬ（Ｒ）（ケトロラク）、ＤＡＹＰＲＯ（Ｒ）（オキサプロジン）などが挙げられる。
【０１４６】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、ＰＤＧＦＲ阻害剤を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、ＰＤＧＦＲ阻害剤としては、例えば、Ｃ−４５１、ＣＰ−６７３、ＣＰ−８６８５９６などが挙げられる。
【０１４７】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、プラチナ化学療法薬を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、プラチナ化学療法薬としては、例えば、シスプラチン、ＥＬＯＸＡＴＩＮ（Ｒ）（オキサリプラチン）、エプタプラチン、ロバプラチン、ネダプラチン、ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ（Ｒ）（カルボプラチン）、サトラプラチン、ピコプラチンなどが挙げられる。
【０１４８】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、ポロ様キナーゼ阻害剤を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、ポロ様キナーゼ阻害剤としては、例えば、ＢＩ−２５３６などが挙げられる。
【０１４９】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、ホスホイノシチド−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、ホスホイノシチド−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤としては、例えば、ウォルトマンニン、ＬＹ２９４００２、ＸＬ−１４７、ＣＡＬ−１２０、ＯＮＣ−２１、ＡＥＺＳ−１２７、ＥＴＰ−４５６５８、ＰＸ−８６６、ＧＤＣ−０９４１、ＢＧＴ２２６、ＢＥＺ２３５、ＸＬ７６５などが挙げられる。
【０１５０】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、トロンボスポンジン類似体を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、トロンボスポンジン類似体としては、例えばＡＢＴ−５１０（トロンボスポンジン模倣体）、ＡＢＴ−５６７、ＡＢＴ−８９８（トロンボスポンジン−１模倣体ペプチド）、ＴＳＰ−１などが挙げられる。
【０１５１】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、ＶＥＧＦＲ阻害剤を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、ＶＥＧＦＲ阻害剤としては、例えば、ＡＶＡＳＴＩＮ（Ｒ）（ベバシズマブ）、ＡＢＴ−８６９、ＡＥＥ−７８８、ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（商標）（血管新生を阻害するリボザイム（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ．）およびＣｈｉｒｏｎ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ））、アキシチニブ（ＡＧ−１３７３６）、ＡＺＤ−２１７１、ＣＰ−５４７，６３２、ＩＭ−８６２、ＭＡＣＵＧＥＮ（ペガプタミブ）、ＮＥＸＡＶＡＲ（Ｒ）（ソラフェニブ、ＢＡＹ４３−９００６）、パゾパニブ（ＧＷ−７８６０３４）、バタラニブ（ＰＴＫ−７８７、ＺＫ−２２２５８４）、ＳＵＴＥＮＴ（Ｒ）（スニチニブ、ＳＵ−１１２４８）、ＶＥＧＦ  ｔｒａｐ、ＺＡＣＴＩＭＡ（商標）（バンデタニブ、ＺＤ−６４７４）、ＧＡ１０１、オファツムマブ、ＡＢＴ−８０６（ｍＡｂ−８０６）、ＥｒｂＢ３特異的抗体、ＢＳＧ２特異的抗体、ＤＬＬ４特異的抗体およびＣ−ｍｅｔ特異的抗体などが挙げられる。
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、抗生物質を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、抗生物質としては、例えば、インターカレート抗生物質のアクラルビシン、アクチノマイシンＤ、アムルビシン、アンナマイシン、アドリアマイシン、ＢＬＥＮＯＸＡＮＥ（Ｒ）（ブレオマイシン）、ダウノルビシン、ＣＡＥＬＹＸ（Ｒ）またはＭＹＯＣＥＴ（Ｒ）（リポソーマルドキソルビシン）、エルサミトルシン、エピルブシン、グラルブイシン、ＺＡＶＥＤＯＳ（Ｒ）（イダルビシン）、ミトマイシンＣ、ネモルビシン、ネオカルジノスタチン、ぺプロマイシン、ピラルビシン、レベッカマイシン、スチマラマー、ストレプトゾシン、ＶＡＬＳＴＡＲ（Ｒ）（バルルビシン）、ジノスタチンなどが挙げられる。
【０１５２】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、トポイソメラーゼ阻害剤を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、トポイソメラーゼ阻害剤としては、例えば、アクラルビシン、９−アミノカンプトテシン、アモナフィド、アムサクリン、ベカテカリン、ベロテカン、ＢＮ−８０９１５、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（Ｒ）（イリノテカンヒドロクロリド）、カンプトテシン、ＣＡＲＤＩＯＸＡＮＥ（Ｒ）（デクスラゾキシン）、ジフロモテカン、エドテカリン、ＥＬＬＥＮＣＥ（Ｒ）またはＰＨＡＲＭＯＲＵＢＩＣＩＮ（Ｒ）（エピルビシン）、エトポシド、エキサテカン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、ギマテカン、ルルトテカン、ミトキサントロン、オラテシン、ピラルブシン、ピクロサントロン、ルビテカン、ソブゾキサン、ＳＮ−３８、タフルポシド、トポテカンなどが挙げられる。
【０１５３】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、治療用抗体を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、治療用抗体としては、例えば、ＡＶＡＳＴＩＮ（Ｒ）（ベバシズマブ）、ＣＤ４０特異的抗体、ｃｈＴＮＴ−１／Ｂ、デノスマブ、ＥＲＢＩＴＵＸ（Ｒ）（セツキシマブ）、ＨＵＭＡＸ−ＣＤ４（Ｒ）（ザノリムマブ）、ＩＧＦ１Ｒ特異的抗体、リンツズマブ、ＰＡＮＯＲＥＸ（Ｒ）（エドレコロマブ）、ＲＥＮＣＡＲＥＸ（Ｒ）（ＷＸ  Ｇ２５０）、ＲＩＴＵＸＡＮ（Ｒ）（リツキシマブ）、チシリムマブ、トラスツジマブ、ＣＤ２０抗体Ｉ型およびＩＩ型などが挙げられる。
【０１５４】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣ（または抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣを含む製剤）は、ホルモン療法薬を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、ホルモン療法薬としては、例えば、ＡＲＩＭＩＤＥＸ（Ｒ）（アナストロゾール）、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（Ｒ）（エキセメスタン）、アルゾキシフェン、ＣＡＳＯＤＥＸ（Ｒ）（ビカルタミド）、ＣＥＴＲＯＴＩＤＥ（Ｒ）（セトロレリクス）、デガレリクス、デスロレリン、ＤＥＳＯＰＡＮ（Ｒ）（トリロスタン）、デキサメタゾン、ＤＲＯＧＥＮＩＬ（Ｒ）（フルタミド）、ＥＶＩＳＴＡ（Ｒ）（ラロキシフェン）、ＡＦＥＭＡ（商標）（ファドロゾール）、ＦＡＲＥＳＴＯＮ（Ｒ）（トレミフェン）、ＦＡＳＬＯＤＥＸ（Ｒ）（フルベストラント）、ＦＥＭＡＲＡ（Ｒ）（レトロゾール）、ホルメスタン、グルココルチコイド、ＨＥＣＴＯＲＯＬ（Ｒ）（ドキセルカルシフェロール）、ＲＥＮＡＧＥＬ（Ｒ）（セベラマーカルボネート）、ラソフォキシフェン、ロイプロリドアセテート、ＭＥＧＡＣＥ（Ｒ）（メゲステロール）、ＭＩＦＥＰＲＥＸ（Ｒ）（ミフェプリストン）、ＮＩＬＡＮＤＲＯＮ（商標）（ニルタミド）、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（Ｒ）（タモキシフェンシトレート）、ＰＬＥＮＡＸＩＳ（商標）（アバレリクス）、プレドニゾン、ＰＲＯＰＥＣＩＡ（Ｒ）（フィナステリド）、リロスタン、ＳＵＰＲＥＦＡＣＴ（Ｒ）（ブセレリン）、ＴＲＥＬＳＴＡＲ（Ｒ）（黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ））、ＶＡＮＴＡＳ（Ｒ）（ヒストレリンインプラント）、ＶＥＴＯＲＹＬ（Ｒ）（トリロスタンまたはモドラスタン）、ＺＯＬＡＤＥＸ（Ｒ）（ホスレリン、ゴセレリン）などが挙げられる。
【０１５５】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、デルトイドおよびレチノイドを含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、デルトイドおよびレチノイドとしては、例えば、セオカルシトール（ＥＢ１０８９、ＣＢ１０９３）、レクサカルシトール（ＫＨ１０６０）、フェンレチニド、ＰＡＮＲＥＴＩＮ（Ｒ）（アリレチノイン）、ＡＴＲＡＧＥＮ（Ｒ）（リポソーマルトレチノイン）、ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（Ｒ）（ベキサロテン）、ＬＧＤ−１５５０などが挙げられる。
【０１５６】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、ＰＡＲＰ阻害剤を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、ＰＡＲＰ阻害剤としては、例えば、ＡＢＴ−８８８（ベリパリブ）、オラパリブ、ＫＵ−５９４３６、ＡＺＤ−２２８１、ＡＧ−０１４６９９、ＢＳＩ−２０１、ＢＧＰ−１５、ＩＮＯ−１００１、ＯＮＯ−２２３１などが挙げられる。
【０１５７】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、植物アルカロイドを含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、植物アルカロイドとしては、例えば、限定するものではないが、、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビンなどが挙げられる。
【０１５８】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、プロテアソーム阻害剤を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、プロテアソーム阻害剤としては、例えば、ＶＥＬＣＡＤＥ（Ｒ）（ボルテゾミブ）、ＭＧ１３２、ＮＰＩ−００５２、ＰＲ−１７１などが挙げられる。
【０１５９】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、免疫薬を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができる。免疫薬の例としては、インターフェロンおよび他の免疫強化剤が挙げられる。インターフェロンとしては、インターフェロンアルファ、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ−１ａ、ＡＣＴＩＭＭＵＮＥ（Ｒ）（インターフェロンガンマ−１ｂ）またはインターフェロンガンマ−ｎ１、これらの組み合わせなどが挙げられる。他の薬剤としては、ＡＬＦＡＦＥＲＯＮＥ（Ｒ）、（ＩＦＮ−α）、ＢＡＭ−００２（酸化型グルタチオン）、ＢＥＲＯＭＵＮ（Ｒ）（タソネルミン）、ＢＥＸＸＡＲ（Ｒ）（トシツモマブ）、ＣＡＭＰＡＴＨ（Ｒ）（アレムツズマブ）、ＣＴＬＡ４（細胞障害性リンパ球抗原４）、デカルバジン、デニロイキン、エプラツズマブ、ＧＲＡＮＯＣＹＴＥ（Ｒ）（レノグラスチム）、レンチナン、白血球アルファインターフェロン、イミキモド、ＭＤＸ−０１０（抗ＣＴＬＡ−４）、メラノーマワクチン、ミツモマブ、モルグラモスチム、ＭＹＬＯＴＡＲＧ（商標）（ゲムツズマブオゾガマイシン）、ＮＥＵＰＯＧＥＮ（Ｒ）（フィルグラスチム）、ＯｎｃｏＶＡＣ−ＣＬ、ＯＶＡＲＥＸ（Ｒ）（オレゴボマブ）、ぺムツモマブ（Ｙ−ｍｕＨＭＦＧ１）、ＰＲＯＶＥＮＧＥ（Ｒ）（シプロイセル−Ｔ）、サルガラモスチム、シゾフィラン、テセロイキン、ＴＨＥＲＡＣＹＳ（Ｒ）（バチルス・カルメット−ゲリン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ））、ウベニメクス、ＶＩＲＵＬＩＺＩＮ（Ｒ）（免疫療法薬、Ｌｏｒｕｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｚ−１００（丸山ワクチン（ＳＳＭ））、ＷＦ−１０（テトラクロロデカオキシド（ＴＣＤＯ））、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（Ｒ）（アルデスロイキン）、ＺＡＤＡＸＩＮ（Ｒ）（チマルファシン）、ＺＥＮＡＰＡＸ（Ｒ）（ダクリズマブ）、ＺＥＶＡＬＩＮ（Ｒ）（９０Ｙ−イブリツモマブチウキセタン）などが挙げられる。
【０１６０】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、生体応答調節剤を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、生体応答調節剤としては、生命体の防御機序または組織細胞の生存、成長もしくは分化などの生体応答を調整して、抗腫瘍活性を有するよう仕向ける薬剤であり、クレスチン、レンチナン、シゾフィラン、ピシバニールＰＦ−３５１２６７６（ＣｐＧ−８９５４）、ウベニメクスなどが挙げられる。
【０１６１】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、ピリミジン類似体を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、ピリミジン類似体としては、例えば、シタラビン（ａｒａＣまたはアラビノシドＣ）、シトシンアラビノシド、ドキシフルリジン、ＦＬＵＤＡＲＡ（Ｒ）（フルダラビン）、５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）、フロクスウリジン、ＧＥＭＺＡＲ（Ｒ）（ゲムシタビン）、ＴＯＭＵＤＥＸ（Ｒ）（ラチトレキセド）、ＴＲＯＸＡＴＹＬ（商標）（トリアセチルウリジントロキサシタビン）などが挙げられる。
【０１６２】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、プリン類似体を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、プリン類似体としては、例えば、ＬＡＮＶＩＳ（Ｒ）（チオグアニン）およびＰＵＲＩ−ＮＥＴＨＯＬ（Ｒ）（メルカプトプリン）が挙げられる。
【０１６３】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、抗有糸分裂薬を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、抗有糸分裂薬としては、例えば、バタブリン、エポチロンＤ（ＫＯＳ−８６２）、Ｎ−（２−（（４−ヒドロキシフェニル）アミノ）ピリジン−３−イル）−４−メトキシベンゼンスルホンアミド、イキサベピロン（ＢＭＳ２４７５５０）、パクリタキセル、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（Ｒ）（ドセタキセル）、ＰＮＵ１００９４０（１０９８８１）、パツピロン、ＸＲＰ−９８８１（ラロタキセル）、ビンフルニン、ＺＫ−ＥＰＯ（合成エポチロン）などが挙げられる。
【０１６４】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、ユビキチンリガーゼ阻害剤を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、ユビキチンリガーゼ阻害剤としては、例えば、ＭＤＭ２阻害剤、例えばヌトリン、ＮＥＤＤ８阻害剤、例えばＭＬＮ４９２４などが挙げられる。
【０１６５】
本発明の化合物は、放射線療法の有効性を強化する放射線増感剤としても使用することができる。放射線療法の例としては、外部ビーム放射線療法、遠隔放射線療法、小線源療法および密封、非密封線源放射線療法などが挙げられる。
【０１６６】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、化学療法薬を含む、治療有効量の１以上の癌治療薬と同時投与することができ、化学療法薬としては、例えば、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）（ＡＢＩ−００７）、ＡＢＴ−１００（ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤）、ＡＤＶＥＸＩＮ（Ｒ）（Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３ワクチン）、ＡＬＴＯＣＯＲ（Ｒ）もしくはＭＥＶＡＣＯＲ（Ｒ）（ロバスタチン）、ＡＭＰＬＩＧＥＮ（Ｒ）（ポリＩ：ポリＣ１２Ｕ、合成ＲＮＡ）、ＡＰＴＯＳＹＮ（Ｒ）（エクシスリンド）、ＡＲＥＤＩＡ（Ｒ）（パミドロン酸）、アルグラビン、Ｌ−アスパラギナーゼ、アタメスタン（１−メチル−３，１７−ジオン−アンドロスタ−１，４−ジエン）、ＡＶＡＧＥ（Ｒ）（タザロテン）、ＡＶＥ−８０６２（コンブレスタチン誘導体）ＢＥＣ２（ミツモマブ）、カケクチンもしくはカケキシン（腫瘍壊死因子）、カンバキシン（ワクチン）、ＣＥＡＶＡＣ（Ｒ）（癌ワクチン）、ＣＥＬＥＵＫ（Ｒ）（セルモロイキン）、ＣＥＰＬＥＮＥ（Ｒ）（ヒスタミンジヒドロクロリド）、ＣＥＲＶＡＲＩＸ（Ｒ）（ヒトパピローマウイルスワクチン）、ＣＨＯＰ（Ｒ）（Ｃ：ＣＹＴＯＸＡＮ（Ｒ）（シクロホスファミド）；Ｈ：ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（Ｒ）（ヒドロキシドキソルビシン）；Ｏ：ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（Ｒ））；Ｐ：プレソニゾン）、ＣＹＰＡＴ（商標）（シプロテロンアセテート）、コンブレスタチンＡ４Ｐ、ＤＡＢ（３８９）ＥＧＦ（Ｈｉｓ−Ａｌａリンカーを介してヒト上皮成長因子に融合しているジフテリア毒素の触媒ドメインおよび転移ドメイン）もしくはＴｒａｎｓＭＩＤ−１０７Ｒ（商標）（ジフテリア毒素）、ダカルバジン、ダクチノマイシン、５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ）、エニルウラシル、ＥＶＩＺＯＮ（商標）（スクアラミンラクテート）、ＤＩＭＥＲＩＣＩＮＥ（Ｒ）（Ｔ４Ｎ５リポソームローション）、ディスコデルモライド、ＤＸ−８９５１ｆ（エキサテカンメシレート）、エンザスタウリン、ＥＰＯ９０６（エピチロンＢ）、ＧＡＲＤＡＳＩＬ（Ｒ）（四価ヒトパピローマウイルス（６型、１１型、１６型、１８型）組換えワクチン）、ＧＡＳＴＲＩＭＭＵＮＥ（Ｒ）、ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（Ｒ）、ＧＭＫ（ガングリオシド結合型ワクチン）、ＧＶＡＸ（Ｒ）（前立腺癌ワクチン）、ハロフギノン、ヒステレリン、ヒドロキシカルバミド、イバンドロン酸、ＩＧＮ−１０１、ＩＬ−１３−ＰＥ３８、ＩＬ−１３−ＰＥ３８ＱＱＲ（シントレデキンベスドトクス）、ＩＬ−１３−シードモナス外毒素、インターフェロン−α、インターフェロン−γ、ＪＵＮＯＶＡＮ（商標）もしくはＭＥＰＡＣＴ（商標）（ミファムルチド）、ロナファルニブ、５，１０−メチレンテトラヒドロフォレート、ミルテホシン（ヘキサデシルホスホコリン）、ＮＥＯＶＡＳＴＡＴ（Ｒ）（ＡＥ−９４１）、ＮＥＵＴＲＥＸＩＮ（Ｒ）（トリメトレキサートグルクロネート）、ＮＩＰＥＮＴ（Ｒ）（ペントスタチン）、ＯＮＣＯＮＡＳＥ（Ｒ）（リボヌクレアーゼ酵素）、ＯＮＣＯＰＨＡＧＥ（Ｒ）（メラノーマワクチン処置）、ＯＮＣＯＶＡＸ（Ｒ）（ＩＬ−２ワクチン）、ＯＲＡＴＨＥＣＩＮ（商標）（ルビテカン）、ＯＳＩＤＥＭ（Ｒ）（抗体系細胞薬）、ＯＶＡＲＥＸ（Ｒ）ＭＡｂ（ネズミモノクローナル抗体）、パクリタキセル、ＰＡＮＤＩＭＥＸ（商標）（２０（Ｓ）プロトパナキサジオール（ａＰＰＤ）および２０（Ｓ）プロトパナキサトリオール（ａＰＰＴ）を含むチョウセンニンジンのアグリコンのサポニン）、パニツムマブ、ＰＡＮＶＡＣ（Ｒ）−ＶＦ（治験中の癌ワクチン）、ペグアスパラガーゼ、ＰＥＧインターフェロンＡ、フェノキソジオール、プロカルバジン、レビマスタット、ＲＥＭＯＶＡＢ（Ｒ）（カツマキソマブ）、ＲＥＶＬＩＭＩＤ（Ｒ）（レナリドミド）、ＲＳＲ１３（エファプロキシラル）、ＳＯＭＡＴＵＬＩＮＥ（Ｒ）ＬＡ（ランレオチド）、ＳＯＲＩＡＴＡＮＥ（Ｒ）（アシトレチン）、ステウロスポリン（ストレプトマイセス・スタウロスポレス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｅｓ））、タラボスタット（ＰＴ１００）、ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（Ｒ）（ベキサロテン）、ＴＡＸＯＰＲＥＸＩＮ（Ｒ）（ＤＨＡ−パクリタキセル）、ＴＥＬＣＹＴＡ（Ｒ）（カンホスファミド、ＴＬＫ２８６）、テミリフェン、ＴＥＭＯＤＡＲ（Ｒ）（テモゾロミド）、テスミリフェン、サリドマイド、ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（Ｒ）（ＳＴｎ−ＫＬＨ）、チミタク（２−アミノ−３，４−ジヒドロ−６−メチル−４−オキソ−５−（４−ピリジルチオ）キナゾリンジヒドロクロリド）、ＴＮＦＥＲＡＤＥ（商標）（アデノベクター：腫瘍壊死因子−αに関する遺伝子を含有するＤＮＡ担体）、ＴＲＡＣＬＥＥＲ（Ｒ）もしくはＺＡＶＥＳＣＡ（Ｒ）（ボセンタン）、トレチノイン（レチン−Ａ）、テトランドリン、ＴＲＩＳＥＮＯＸ（Ｒ）（三酸化ヒ素）、ＶＩＲＵＬＩＺＩＮ（Ｒ）、ウクライン（クサノオウ植物由来のアルカロイドの誘導体）、ビタキシン（抗−アルファｖベータ３抗体）、ＸＣＹＴＲＩＮ（Ｒ）（モテキサフィンガドリニウム）、ＸＩＮＬＡＹ（商標）（アトラセンタン）、ＸＹＯＴＡＸ（商標）（パクリタキセルポリグルメックス）、ＹＯＮＤＥＬＩＳ（Ｒ）（トラベクテジン）、ＺＤ−６１２６、ＺＩＮＥＣＡＲＤ（Ｒ）（デクスラゾキサン）、ＺＯＭＥＴＡ（Ｒ）（ゾレドロン酸）、ゾルビシンなどが挙げられる。
【０１６７】
一実施形態において、抗ＥＧＦＲ−ＡＤＣを含む製剤は、放射線および／またはＴＥＭＯＤＡＲ（Ｒ）（テモゾロミド）と組み合わせて、神経膠芽腫を有する対象に静脈内投与される。
【０１６８】
さらに、一実施形態において、本発明の組成物は、（ａ）凍結乾燥形態の抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣを含有する容器および（ｂ）注射用の医薬として許容される希釈剤（例えば、滅菌水）を含有する第２の容器を含む医薬キットとして提供することができる。医薬として許容される希釈剤は、凍結乾燥ＡＤＣの再構成または希釈に使用することができる。場合により、このような容器（複数可）は、医薬品もしくは生物学的製品の製造、使用もしくは販売を管理している政府機関により規定された形態の注意書きを伴うことができ、この注意書きは、ヒトへの投与に関する製造、使用もしくは販売の機関による承認を反映する。
【０１６９】
本発明は、下記の実施例においてさらに記載されるが、この実施例は、本発明の範囲を限定する意図のものではない。
【実施例】
【０１７０】
［実施例１］
オーリスタチンｖｃ−ＭＭＡＥと抗ＥＧＦＲ抗体１との複合体化
下記の実施例は、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するための抗体とオーリスタチンとの複合体化、特に、ＭＭＡＥと抗ＥＧＦＲ抗体１との複合体化を記載する。ｖｃ−ＭＭＡＥ分子／抗体の低い薬物負荷を有する抗体１ＡＤＣの作製は、下記に詳細に記載のように、ｍＡｂの部分的還元、その後の完全な複合体化のためのＶａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥ（ｖｃＭＭＡＥ）との反応を伴う。
【０１７１】
抗体のジスルフィド還元
抗体１の還元を、ＴＣＥＰ（トリカルボキシエチルホスフィン）を使用して達成した。組換えモノクローナル抗体１を、形質移入されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系により作製し、Ａｂｂｏｔｔ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）において精製した。抗体精製の後で、抗体溶液（１４８ｍｇ／ｍＬ、６ｍＬ）を、５０ｍＬのポリプロピレン遠心管に装入した。その後、抗体溶液を、ＰＢＳＥ  バッファー（３６０ｍＬ；１２５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；６．３ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．７）を加えることによって合計体積４１ｍＬに希釈した。タンパク質含有量は、Ａ２８０において決定して、２１．６ｍｇ／ｍｌであった。１９ｍｌの抗体溶液、合計４１０．６ｍｇを、反応器に装入した。抗体溶液を３７℃に温めた。その後、抗体１（２０ｍｇ／ｍＬ）を、ＴＣＥＰ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））を抗体溶液に加えることによって部分的に還元した。特に、９．６７ｍＭ  ＴＣＥＰ溶液（０．５９２ｍＬ、２．０５当量）を抗体溶液に加えた（ＴＣＥＰのモル当量：ｍＡｂは２．０５であった。）。ＴＣＥＰの添加後、抗体溶液を、３７℃において１時間インキュベートした。還元反応液を、その後２０℃に冷ました。この工程により、抗体１のジスルフィド結合の還元がもたらされた。
【０１７２】
ＭＭＡＥと抗体１との複合体化
下記に、ＭＭＡＥを、抗体の還元後の例示的抗体１と複合体化する工程を記載する。
【０１７３】
抗体１のチオールを、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥ（ｖｃ−ＭＭＡＥ）と複合体化する。Ｖａｌ−Ｃｉｔ（パラ−アミノベンジルカーバメート−モノメチルオーリスタチンＥ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））を、ｖｃ−ＭＭＡＥ：還元システイン（Ｃｙｓ）の最終モル比が１．１５になるように抗体溶液に加えた。複合体化反応を、１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））の存在下で実施し、２０℃において４５分間進行させた。
【０１７４】
複合体化反応の後で、過剰の遊離Ｎ（アセチル）−システイン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）（ｖｃＭＭＡＥ装入量に対して２．３当量）を加え、未反応のｖｃ−ＭＭＡＥをクエンチして、Ｎ（アセチル）−Ｃｙｓ−ｖｃ−ＭＭＡＥを作製した。Ｎ（アセチル）−Ｃｙｓクエンチ反応を、２０℃においておよそ３０分間進行させた。クエンチされた反応混合物（粗製溶液とも称される。）を、その後、下記の実施例２のように精製した。
【０１７５】
または、下記のプロトコルを小規模反応にさらに使用した。複合体化を、１０ｍＭ  ｖｃＭＭＡＥ  ＤＭＳＯ溶液（１．３２ｍＬ、４．７２当量）を装入することによって実施した。ＤＭＳＯ（０．８６ｍＬ）を装入した。反応混合物を、その後周囲温度において１時間撹拌した。過剰の薬物リンカーを、５０ｍＭ  Ｎ−（アセチル）システイン（０．５３ｍＬ）の添加によりクエンチした。その後、混合物を、約１５分間撹拌した。反応混合物を冷蔵庫において保存した。
【０１７６】
反応混合物の解析的分析
反応混合物の解析的分析を実施した。上清試料の分析を、疎水性相互作用クロマトグラフィー−高性能液体クロマトグラフィー（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）により、ＴＳＫゲル  Ｂｕｔｙｌ−ＮＰＲカラム（４．６ｍｍ  ＩＤ×３．５ｃｍ、２．５ｕｍ；Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ、Ｊａｐａｎ））を使用して達成した。
【０１７７】
タンパク質含有量のＵＶ分析は、３８６．４ｍｇのタンパク質を示した。ＨＩＣ微量分析は、下記の表１に記載のように、抗体１−ｖｃＭＭＡＥの平均薬物抗体比（ＤＡＲ）が３．８５であったことを示した。平均ＤＡＲは、ＰＡ％と必要な薬物負荷とを掛け、２、４、６および８のＡＤＣ産物を集計して１００で割ることによって決定した（ＰＡ％は、Ａ２８０におけるピークの下の測定面積により決定された、ピーク面積パーセントである。）、例えば、［（６．３ＰＡ％×０）＋（２４．８ＰＡ％×２）＋（３４．８×４）＋（２０．９×６）＋（８．８×８）］／１００＝３．８５。
【０１７８】
【表１】
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【０１７９】
表１に記載するように、複合体化反応は、さまざまな範囲の薬物負荷、即ち２から８のＤＡＲを有するＡＤＣの種の混合物をもたらした。わずかな割合のＡＤＣは、表１に記載のように薬物負荷が無かった。
【０１８０】
［実施例２］
疎水性樹脂を使用する、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）のバッチ精製
下記の実施例は、ＡＤＣ（抗体１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）のバッチ精製を記載し、得られた精製組成物は２．８の平均ＤＡＲを有した。下記の精製工程は、高負荷ＡＤＣ、即ち、６および８の薬剤負荷種を選択的に除去し、低次の薬物負荷種、即ち２−４のＤＡＲを含む精製された分布をもたらす。精製工程は、さまざまな程度の複合体化のＡＤＣを選択的に除去するために、滴定できる少量の疎水性樹脂を粗製抗体溶液（または混合物）に利用した。
【０１８１】
精製工程は、鎖間ジスルフィドの部分的還元およびその後のｖｃ−ＭＭＡＥまたはｍｃ−ＭＭＡＦによるアルキル化からもたらされる、オーリスタチンＥおよびオーリスタチンＦ両方の複合体の分布を選択的に調節するための、実際的な拡張可能な工程を提供する。下記の精製方法は、バッチ様式または循環様式のいずれかにおいて、ミリグラムから数グラム両方の規模において収率８６％で精製分布をもたらすことが実証されてきている。抗体の還元、複合体化および精製工程の概説を、図１に記載する。
【０１８２】
材料および方法
本明細書に記載のバッファーは下記の通りに調製した：
バッファーＡ（５０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４バッファー  ｐＨ７バッファー／２Ｍ  ＮａＣｌ）を、Ｋ２ＨＰＯ４（０．８７ｇ）（Ｋ２ＨＰＯ４；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＮａＣｌ（１１．７ｇ）（ＮａＣｌ；ＥＭＤ）を装入して、ＷＩＦＩでおよそ９０ｍＬに希釈することによって調製した。得られた溶液を、１．０Ｎ  ＨＣｌで最終ｐＨ７．０に処理し、合計体積１００ｍＬにさらに希釈した。
【０１８３】
バッファーＡ’（５０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４／４Ｍ  ＮａＣｌ）を、ＮａＣｌ（２．９２ｇ）をフラスコに装入して、次いで移動相Ａを、最終体積２５ｍＬを得るまで装入することによって調製した。
【０１８４】
バッファーＢ（５０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４バッファー  ｐＨ７  バッファー）を、Ｋ２ＨＰＯ４（０．８７ｇ）およびＮａＣｌ（１１．７ｇ）を装入し、ＷＩＦＩ（注射用水（ｗａｔｅｒ−ｉｎｔｅｎｄｅｄ  ｆｏｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）；Ｇｉｂｃｏ）でおよそ９０ｍＬに希釈することによって調製した。得られた溶液を、１．０Ｎ  ＨＣｌ（１．０Ｎ  ＨＣｌ；ＪＴ  Ｂａｋｅｒ）で最終ｐＨ７．０に処理して、合計体積１００ｍＬにさらに希釈した。
【０１８５】
前処理されたＢｕｔｙｌ−ＨＩＣ（Ｂｕ−ＨＩＣ）樹脂を、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ−６００Ｍ樹脂スラリー（ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｂｕ−ＨＩＣ  Ｒｅｓｉｎ（６００Ｍ）；Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のバルク容器を短時間混合することによって調製し、粗いポリプロピレンフィルターに注ぎ出した（１グラム）。このスラリーをろ過して、バッファーＡ（３×２ｍＬ）ですすいだ。湿潤ケーキの間にろ過された窒素を通過させることによって、１０分間または粗い漏斗の底に液滴が観察されなくなるまで湿潤ケーキを乾燥させた。乾燥重量ベースを、湿潤ケーキに存在する水の量を差し引くことによって計算した。水分量は、Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｈｅｒ分析により計算した（通常、５５％の水を含有する。）。
【０１８６】
ＡＤＣ  ＤＡＲ２−４に対する条件を決定するための滴定によるスクリーニング研究
固相滴定研究を実施して、６−８のＤＡＲを有するＡＤＣを除去するための条件を決定した。上清試料の分析は、疎水性相互作用クロマトグラフィー−高性能液体クロマトグラフィー（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）により、ＴＳＫゲル  Ｂｕｔｙｌ−ＮＰＲカラム（４．６ｍｍ  ＩＤ×３．５ｃｍ、２．５ｕｍ；Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ、Ｊａｐａｎ））を使用して達成した。この方法は、１００％のバッファーＡ［２５ｍＭ  リン酸ナトリウム、１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．０］から１００％のバッファーＢ［７５％ｖ／ｖの２５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、２５％ｖ／ｖのイソプロパノール］への１２分の線形勾配からなった。流速は、０．８ｍＬ／分、注入３０ｕＬに設定し、温度は３０℃に設定し、２８０ｎｍにおいて検出した。
【０１８７】
ＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析のための試料調製
試料を、反応混合物スラリーを５ｕｍのシリンジフィルターを通してろ別することによって調製した。ろ液をバッファーＡ（３０ｕＬ／注入）で５倍希釈した。
【０１８８】
８種の条件（アッセイ−Ｂｕ−０、Ｂｕ−１、Ｂｕ−２、Ｂｕ−４、Ｂｕ−８、Ｂｕ−１６、Ｂｕ−３２およびスケールアップ）を、さまざまな量の樹脂でそれぞれにおいて試験した。アッセイ−Ｂｕ−０を、１００ｕＬの粗製抗体１−ｖｃＭＭＡＥ反応溶液（実施例１）（１８ｍｇ／ｍＬ）をバイアルに装入することによって実施した。バッファーＡ’（１００ｕＬ）を加え、次いで１００ｕＬのバッファーＢを加えた。その後、この溶液を最も低い設定（オービタルミキサー）において振とうした。上清の試料を２０分において採取した。上清をサンプリングして、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにより測定した。詳細には、試料調製を、３０ｕＬの上清を取り出し、１２０ｕＬのバッファーＡで希釈して、含有量をＨＩＣ−ＨＰＬＣにより測定することによって実施した。分布の要約については表５を参照されたい。
【０１８９】
アッセイ−Ｂｕ−１からＢｕ−３２は全てアッセイ−Ｂｕ−０の変形であり、アッセイ−Ｂｕ−０はいずれの疎水性相互作用樹脂も含有していない対照であった。アッセイ−Ｂｕ−１は、０．８ｍｇの前処理されたｎ−Ｂｕ  ＨＩＣ  ６００Ｍ樹脂を、バッファーＢを加える前に溶液に加えたことを除き、アッセイ−Ｂｕ−０と同じであった。アッセイ−Ｂｕ−２は、１．６ｍｇの前処理されたｎ−Ｂｕ  ＨＩＣ  ６００Ｍ樹脂を、バッファーＢを加える前に加えたことを除き、アッセイ−Ｂｕ−０と同じであった。アッセイ−Ｂｕ−４は、３．２ｍｇの前処理されたｎ−Ｂｕ  ＨＩＣ  ６００Ｍ樹脂を、バッファーＢを加える前に加えたことを除き、アッセイ−Ｂｕ−０と同じであった。アッセイ−Ｂｕ−８は、６．４ｍｇの前処理されたｎ−Ｂｕ  ＨＩＣ  ６００Ｍ樹脂を、バッファーＢを加える前に加えたことを除き、アッセイ−Ｂｕ−０と同じであった。アッセイ−Ｂｕ−１６は、１２．８ｍｇの前処理されたｎ−Ｂｕ  ＨＩＣ  ６００Ｍ樹脂を、バッファーＢを加える前に加えたことを除き、アッセイ−Ｂｕ−０と同じであった。アッセイ−Ｂｕ−３２は、２５．６ｍｇの前処理されたｎ−Ｂｕ  ＨＩＣ  ６００Ｍ樹脂を、バッファーＢを加える前に加えたことを除き、アッセイ−Ｂｕ−０と同じであった。これらの各実験に関して、最終ＮａＣｌ濃度は１．３Ｍ  ＮａＣｌであった。８種の条件からの結果を、下記の表２から５に要約する。
【０１９０】
表２は、さまざまなＡＤＣ種（例えば、抗体単独／非複合体化（ｍＡｂ％）、２のＤＡＲを有するＡＤＣ（２負荷の％）、４のＤＡＲを有するＡＤＣ（４負荷の％）など）の分布の概要を提供する。表２に記載の負荷対タンパク質比は、樹脂の乾燥重量対計算による抗体タンパク質重量を表す。ＡＤＣの重量は、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収により測定された総タンパク質含有量に、薬物負荷種のピーク面積パーセントを掛けることによって計算する。表２に記載のように、樹脂投入量：タンパク質比が、特定のＤＡＲを有するＡＤＣの％に影響を与えた。例えば、総タンパク質に対する樹脂投入量が１．８（または５．９重量の樹脂対６−８負荷；表２の「アッセイ−Ｂｕ−４」の列を参照されたい。）であれば、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにより決定した場合、９４％の純度の２または４の薬物負荷種（それぞれ４７％）をもたらし、６または８のＤＡＲを有するＡＤＣは検出不能レベルであった。表３は、表２に記載の各実験に対して加えたＢｕ−ＨＩＣ樹脂の量を記載しており、一方、表４は、スクリーニングにおいて存在する薬物負荷種の正味重量の計算を記載している。
【０１９１】
【表２】
2016519070.tif 000008
【０１９２】
【表３】
2016519070.tif 000009
【０１９３】
【表４】
2016519070.tif 000010
【０１９４】
上記の解析的ＨＩＣの結果は、特定の薬物負荷種（６−８のＤＡＲを有するＡＤＣ）の存在を低減させるために十分な選択性を実証した。表２および５のデータは、約１．３Ｍ  ＮａＣｌ濃度の終了イオン強度またはこれと等価のイオン強度の存在下で、８負荷種の低減は、０．５（詳細には０．４４％ｗｔ）ｗｔの樹脂装入量を利用することによって十分達成可能であり、６／８負荷種の低減は、粗製複合体反応混合物に対して約２重量の疎水性樹脂の添加によって達成可能であることを示唆している。４−８の薬物負荷種は、総タンパク質（表５の「アッセイ−Ｂｕ−８」の列を参照されたい。）に対して約３．５重量の樹脂を使用することによって十分除去可能であり、２−８負荷種は、総タンパク質（表５の「アッセイ−Ｂｕ−１６」の列を参照されたい。）に対して約７重量の樹脂を利用することによって除去可能である。これらのデータは、乾燥重量ベースで（総タンパク質に対して）４重量負荷または２重量負荷が、高薬物負荷の除去おいて選択的であり、２または４の薬物負荷種の減少が最小であったことをさらに示唆している。
【０１９５】
低減されるべき種に対する樹脂投入量の重量比を計算し、表５に要約した。
【０１９６】
解析的ＨＩＣ研究の結果の要約を、表５に提供する。
【０１９７】
【表５】
2016519070.tif 000011
【０１９８】
要約
要約すると、実施例１により得られた反応混合物を、バッファーＡ’（４Ｎ  ＮａＣｌ、０．０５Ｍ  ｐＨ７  Ｋ２ＨＰＯ４リン酸バッファー、１ｍＬ／ｍＬ複合体化反応混合物）で希釈した。希釈された反応混合物を、計算量の予備処理Ｂｕ−ＨＩＣ樹脂で処理して、粗いポリプロピレンフィルターを通してろ過し、バッファーＢ（０．０５Ｍ  ｐＨ７  Ｋ２ＨＰＯ４リン酸バッファー、１ｍＬ／ｍＬ複合体化反応混合物）でさらに希釈した。表５に示す樹脂の計算量は、粗製混合物から除去されるべき薬物負荷種に依存する。例えば、６および８の薬物負荷種のおよそ５から１０倍の樹脂重量が、粗製混合物からこれらの種を除去するために有効であることが証明された。樹脂／希釈反応混合物を適切な時間撹拌して、指定された薬物複合体産物の低減に関して、解析的疎水性相互作用クロマトグラフィーによりモニターした。
【０１９９】
［実施例３］
疎水性相互作用によるＡＤＣのバッチ精製のスケールアップ
滴定によるスクリーニングから同定された高ＤＡＲ  ＡＤＣを除去するための最適な条件を、より大規模な精製にスケールアップした。
【０２００】
まず抗体を還元するために、抗体１を含有する溶液（１５１ｍｇ／ｍＬ、５０ｍＬ、７．５２ｇ）を５００ｍＬのフラスコに加えた。この溶液を、ｐＨ６、１５ｍＭヒスチジンバッファー（３０ｍＬ）およびＰＢＳＥバッファー（３６０ｍＬ；１２５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；６．３ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．７）と混合することによって調製された溶液を加えて、合計体積３９５ｍＬに希釈した。得られた抗体溶液を３７℃に温めた。その後、１０．９８ｍＭ  ＴＣＥＰ溶液（１２．１ｍＬ、２．０５当量）を溶液に加え、これを３０分間撹拌した。その後、抗体溶液を、２０分かけて周囲温度に冷却した。
【０２０１】
ひとたび還元されたら、１０ｍＭ  ｖｃＭＭＡＥ  ＤＭＳＯ溶液（２８．８ｍＬ、４．７２当量）を抗体溶液に加えることによって、抗体１をｖｃＭＭＡＥと複合体化させた。次に、ＤＭＳＯ（２１．２ｍＬ）を加え、すぐに周囲温度において４５分間撹拌した。過剰な薬物リンカーを、５０ｍＭ  Ｎ−アセチルシステイン（９．７ｍＬ）を加えることによってクエンチさせた。この溶液を１５分間撹拌した。ＵＶタンパク質濃度が、抗体１とｖｃＭＭＡＥとを複合体化した後で７．４ｇのタンパク質であることを決定し、ＨＩＣ分析は、４．１のＤＡＲ（６−８薬物負荷種と併せて約２５ＰＡ％（または１．８５ｇ））を示した。
【０２０２】
その後、粗製反応混合物を等体積の４Ｎ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  ｐＨ７  Ｋ２ＨＰＯ４バッファーで希釈した。３０．７ｇの事前に洗浄したＢｕ  ＨＩＣ湿潤樹脂（ＫＦ＝５６ｗｔ％水分、乾燥重量ベースで正味１７．２ｇ樹脂；総タンパク質に対して２．３重量の樹脂；６−８負荷種に対して９．３重量の樹脂）をその後加え、次いで、５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４  ｐＨ７バッファー（４６０ｍＬ）を加えた。抗体樹脂溶液を、３時間、室温において穏やかに撹拌した。または、この溶液を１２時間冷蔵庫において保存して、その後、さらに２．５時間撹拌した。
【０２０３】
その後、樹脂を、粗いポリプロピレンフィルターを通してろ別した。透明なろ液を新しい容器に注ぎいれた。１４６９ｇの重量（密度＝１．０６ｇ／ｍＬ）を決定した。精製されたＡＤＣ溶液の解析的分析により、この溶液が、ＵＶタンパク質含有量３．７ｍｇ／ｍｌまたは総タンパク質５．０７ｇ（全収量６７％）を有することが示された。ＨＩＣ微量分析は、２．８のＤＡＲを示した。
【０２０４】
精製前後の抗体溶液のＨＩＣ−ＨＰＬＣのオーバーレイを示すグラフを、図２に提供する。図２の２つの後期溶出ピークは、６−８のＤＡＲを有するＡＤＣ（それぞれ、保持時間：８．６分および９．６分）を表す。これらのピークは精製後なくなり、０、２および４のＤＡＲのＡＤＣ種に影響を及ぼさず、高（例えば、６−８）ＤＡＲ  ＡＤＣ種だけを除去するという点で、この精製工程が選択的であることを実証している。
【０２０５】
ＵＦ／ＤＦ（濃度および最終バッファー交換）
精製後、精製されたＡＤＣ溶液を限外ろ過／透析ろ過（ＵＦ／ＤＦ）および最終バッファー交換に供した。ろ液をＵＦ／ＤＦリザーバ―に加え、溶液を約５０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、１４００ｇをＰａｌｌ  Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ  Ｏｍｅｇａ  ３０Ｋ  ＬＶ１  ｐａｒｔ  ＯＳ０３０Ｃ１２Ｐ１  シリアル番号３１０６１０５８Ｒに膜間圧約２５ｐｓｉ、ぜん動ポンプ速度８０−１００ｍＬ／分（濃縮までおよそ１時間）で取り出した。約５０ｍｇ／ｍＬに濃縮後、１０ＤＶの１５ｍＭ  ｐＨ６．０  ヒスチジンバッファーを流した。ＵＦ／ＤＦ系を排出させ、その後１５ｍＭ  ｐＨ６．０  ヒスチジンバッファー（２×２０ｍＬ）で流した。濃度が（１２７ｇ溶液）４０．１ｍｇ／ｍＬであることを測定した。１５ｍＭヒスチジン  ｐＨ６．０バッファーで、３５．１ｍｇ／ｍＬ（１４１ｇ  ＢＤＳ）の濃度まで希釈した。ＢＤＳを、０．４５ミクロンのシリンジフィルターを通してろ過し、次いで、０．２ミクロンにより滅菌ろ過した。ろ液を、１２のバイアルにそれぞれ１００ｍｇおよびファルコンチューブ（３×３５ｍＬ）に装入した。
【０２０６】
上記のＵＦ／ＤＦ工程は、バッチ精製工程の前後に使用可能である。
【０２０７】
別個の実施形態において、２グラムの前処理されたＴｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ−６００Ｍ  ＨＩＣ樹脂（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊａｐａｎ）／１グラムのｍＡｂを０．０５Ｍ  ｐＨ７  Ｋ２ＨＰＯ４リン酸バッファーでさらに希釈して、周囲温度において６時間撹拌した。このスラリーを、粗いポリプロピレンフィルターを通してろ過し、バッファーＡ（２湿潤ケーキ床体積）で洗浄した。得られたろ液とすすぎ液とを併せ、バッファーを透析により０．０１５Ｍ  ｐＨ６ヒスチジンバッファーに交換して、精製された抗体１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥを得、抗体１−ｖｃＭＭＡＥｐと称した。この実施例において、全収率は６７％の抗体１−ｖｃＭＭＡＥｐであった。粗製反応混合物中の０−４薬物負荷種の量に基づき、精製収率は８７％であった。
【０２０８】
［実施例４］
抗ＥＧＦＲ抗体１／ｍｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの精製
下記の実施例は、抗ＥＧＦＲ抗体１  ｍｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの調製を記載する。
【０２０９】
抗ＥＧＦＲ抗体１の還元
抗体の精製後、抗体溶液（１５１ｍｇ／ｍＬ、８６ｍＬ）を１Ｌのフラスコに装入した。その後抗体溶液を、ＰＢＳＥバッファー（６００ｍＬ；１２５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；６．３ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．７）および１５ｍＭヒスチジンバッファー（４３ｍＬ、ｐＨ６）を加えることによって、合計体積７２９ｍＬに希釈した。タンパク質含有量は、ＵＶ分光分析（Ａ２８０）により決定して、２０．０ｍｇ／ｍｌであった。抗体１を含有する溶液を３７℃に加熱した。９．６７ｍＭ  ＴＣＥＰ溶液（０．５９２ｍＬ、２．０５当量）を、抗体１の溶液に加え、３０分間撹拌した。反応液を、その後周囲温度に２０分かけて冷却した。
【０２１０】
ｍｃＭＭＡＦと抗ＥＧＦＲ抗体１との複合体化
抗ＥＧＦＲ抗体１をその後、マレイミドカプロイル−ＭＭＡＦと複合体化した（抗体１−ｍｃＭＭＡＦ）。１０ｍＭ  ｍｃＭＭＡＦ／ＤＭＳＯ（３８ｍＬ、４．７２当量）を装入した。ＤＭＳＯ（１８．６ｍＬ）を装入した。周囲温度において１時間撹拌した。過剰なｍｃ−ＭＭＡＦを、１００ｍＭ  Ｎ−アセチルシステイン（７．６ｍＬ）を加え、１５分間撹拌することによってクエンチした。クエンチされた反応液を、冷蔵庫に配置した。
【０２１１】
粗製抗体１−ｍｃＭＭＡＦ反応混合物の分析
反応混合物を分析して、タンパク質濃度を決定した。ＵＶ分光分析（Ａ２８０）により、タンパク質濃度は１７．７ｍｇ／ｍＬであることが示された。得られたＨＩＣ微量分析により、３．９３のＤＡＲが明らかにされた（表６）。平均ＤＡＲを、ＰＡ％に必要な薬物負荷をかけた２、４、６および８のＡＤＣ産物の合計を１００で割ることによって決定した、例えば［（５．７２ＰＡ％×０）＋（２７．２７ＰＡ％×２）＋（４１．０８×４）＋（１６．７９×６）＋（９．１３×８）］／１００＝３．９３。
【０２１２】
【表６】
2016519070.tif 000012
【０２１３】
表６に記載のように、複合体化反応は、さまざまな薬物負荷、即ち、２から８のＤＡＲを有するＡＤＣの種の混合物をもたらした。わずかな割合のＡＤＣは、表６に記載のように薬物負荷が無かった。
【０２１４】
ＵＦ／ＤＦ（濃度および最終バッファー交換）
精製されたＡＤＣ溶液を、限外ろ過／透析ろ過（ＵＦ／ＤＦ）および最終バッファー交換に供した。タンジェンシャルフローろ過を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂｉｏｍａｘ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ３  ８８ｃｍ２膜において実施した。試料を、２０ｐｓｉ（ＴＭＰ）および４０ｍＬ／分のクロスフローにおいて１００ｍｇ／ｍＬに濃縮した。その後、タンパク質を、およそ２０ｐｓｉ（ＴＭＰ）、速度４０ｍＬ／分において１０ＤＶを実施することによって、１５ｍＭヒスチジンバッファー（ｐＨ６）で６０ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。得られた溶液を０．４５μｍのＭｉｌｌｉｐａｋ２０フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通してろ過した。タンパク質濃度が５９．７ｍｇ／ｍＬであることを、ＵＶ分光分析（Ａ２８０）によって決定した。ＵＦ／ＤＦ精製されたバルクｍｃ−ＭＭＡＦ抗体１溶液の５８．６ｍＬの試料を、その後、１５ｍＭヒスチジンバッファー（ｐＨ６．０）で、最終体積１００ｍＬに希釈した。ＵＶ分光分析により決定された濃度は３５．７ｍｇ／ｍＬであった。その後、タンパク質溶液を、０．２μｍのＭｉｌｌｉｐａｋ２０フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して、１２５ｍｌの滅菌ＰＥＴＧボトルにろ過した。精製されたｍｃ−ＭＭＡＦ抗体１溶液を、−８０℃の低温冷凍庫において凍結および保存した。
【０２１５】
［実施例５］
疎水性樹脂を使用した、ｍｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣのバッチ精製
実施例４の精製された抗体１−ｍｃ−ＭＭＡＦを、樹脂処理精製によるスクリーニングに供した。スクリーニングを、さまざまな合計樹脂装入量（０．５、１、２および３ｗｔ；精製された抗体１−ｍｃ−ＭＭＡＦは、９．５ｍｇ／ｍＬから３４ｍｇ／ｍＬに変更された。）、ＮａＣｌ濃度（０Ｎ、０．６５Ｎ、１．３Ｎ）および滞留時間（０．５時間、４時間および２０時間）により実施した。表７は、樹脂装入量、ＮａＣｌ濃度および滞留時間の関数としてのさまざまなＡＤＣの分布の要約を提供する。ＤＡＲ値は、上記のようにＨＩＣ微量分析により決定した。計算による収率は、ＵＶ分光分析により決定し、表８に要約した。
【０２１６】
【表７】
2016519070.tif 000013
2016519070.tif 000014
2016519070.tif 000015
【０２１７】
【表８】
2016519070.tif 000016
【０２１８】
要約すると、樹脂滴定によるスクリーニングを、表７および８に記載し、樹脂滴定によるスクリーニングを実施して、実施例４のＵＦ／ＤＦにより精製された抗体１−ｍｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣから得られた、精製工程に対する樹脂投入量、ＮａＣｌ濃度および滞留時間の影響（ＤＡＲ、タンパク質濃度）を決定した。表７に示された樹脂の計算量は、粗製分布から除去されるべき薬物負荷種に依存する。実施例４の抗体１−ｍｃＭＭＡＦを使用する一連の反応条件を、下記のように試験した（表７および８において言及）。バッファーＡは下記を含有する：４．３５ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４；５８．５ｇ  ＮａＣｌ；４９５ｍＬの水（ＷＦＩ）；ｐＨは、５ｍＬの１Ｎ  ＨＣｌで７．０に調整。
【０２１９】
反応１：０Ｎ  ＮａＣｌ；樹脂なし：
１）抗体１−ｍｃＭＭＡＦ（１．００ｍＬ、３５ｍｇ）を４ｍＬのバイアルに装入
２）０ｍｇのＢｕ−ＨＩＣ樹脂を装入
３）振とう
４）上清試料を０．５、４および２０時間において採取（シリンジフィルターを通して５０μＬを取り出し、この上清試料の２０μＬを、２Ｎ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  ｐＨ７バッファー（バッファーＡ）で希釈して×１／５０を得る。）。
５）ＵＶタンパク質濃度をアッセイして、ＨＩＣ分析を実施する。
【０２２０】
反応２：０Ｎ  ＮａＣｌ；０．５ｗｔの樹脂：
１）抗体１−ｍｃＭＭＡＦ（１．００ｍＬ、３５ｍｇ）を４ｍＬのバイアルに装入
２）１７．５ｍｇのＢｕ−ＨＩＣ樹脂を装入
３）振とう
４）上清試料を０．５、４および２０時間において採取（シリンジフィルターを通して５０μＬを取り出し、この上清試料の２０μＬを、２Ｎ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  ｐＨ７バッファー（バッファーＡ）で希釈して×１／５０を得る。）。
５）ＵＶタンパク質濃度をアッセイして、ＨＩＣ分析を実施する。
【０２２１】
反応３：０Ｎ  ＮａＣｌ；１ｗｔの樹脂：
１）抗体１−ｍｃＭＭＡＦ（１．００ｍＬ、３５ｍｇ）を４ｍＬのバイアルに装入
２）３５０ｍｇのＢｕ−ＨＩＣ樹脂を装入
３）振とう
４）上清試料を０．５、４および２０時間において採取（シリンジフィルターを通して５０μＬを取り出し、この上清試料の２０μＬを、２Ｎ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  ｐＨ７バッファー（バッファーＡ）で希釈して×１／５０を得る。）。
５）ＵＶタンパク質濃度をアッセイして、ＨＩＣ分析を実施する。
【０２２２】
反応４：０Ｎ  ＮａＣｌ；２ｗｔ樹脂：
１）抗体１−ｍｃＭＭＡＦ（１．００ｍＬ、３５ｍｇ）を４ｍＬのバイアルに装入
２）７０ｍｇのＢｕ−ＨＩＣ樹脂を装入
３）振とう
４）上清試料を０．５、４および２０時間において採取（シリンジフィルターを通して５０μＬを取り出し、この上清試料の２０μＬを、２Ｎ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  ｐＨ７バッファー（バッファーＡ）で希釈して×１／５０を得る。）。
５）ＵＶタンパク質濃度をアッセイして、ＨＩＣ分析を実施する。
【０２２３】
反応５：０Ｎ  ＮａＣｌ；３ｗｔの樹脂：
１）抗体１−ｍｃＭＭＡＦ（１．００ｍＬ、３５ｍｇ）を４ｍＬのバイアルに装入
２）１０５ｍｇのＢｕ−ＨＩＣ樹脂を装入
３）振とう
４）上清試料を０．５、４および２０時間において採取（シリンジフィルターを通して５０μＬを取り出し、この上清試料の２０μＬを、２Ｎ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  ｐＨ７バッファー（バッファーＡ）で希釈して×１／５０を得る。）。
５）ＵＶタンパク質濃度をアッセイして、ＨＩＣ分析を実施する。
【０２２４】
反応６：０．６５Ｎ  ＮａＣｌ；樹脂なし：
１）抗体１−ｍｃＭＭＡＦ（１．００ｍＬ、３５ｍｇ）を４ｍＬのバイアルに装入
２）０．１９５ｍＬの４Ｎ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  ｐＨ７バッファー（バッファーＡ’）を装入。
３）０ｍｇのＢｕ−ＨＩＣ樹脂を装入
４）振とう
５）上清試料を０．５、４および２０時間において採取（シリンジフィルターを通して５０μＬを取り出し、この上清試料の２０μＬを、２Ｎ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  ｐＨ７バッファー（バッファーＡ）で希釈して×１／５０を得る。）。
６）ＵＶタンパク質濃度をアッセイして、ＨＩＣ分析を実施する。
【０２２５】
反応７：０．６５Ｎ  ＮａＣｌ；０．５ｗｔの樹脂：
１）抗体１−ｍｃＭＭＡＦ（１．００ｍＬ、３５ｍｇ）を４ｍＬのバイアルに装入
２）０．１９５ｍＬの４Ｎ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  ｐＨ７バッファー（バッファーＡ’）を装入。
３）１７．５ｍｇのＢｕ−ＨＩＣ樹脂を装入
４）振とう
５）上清試料を０．５、４および２０時間において採取（シリンジフィルターを通して５０μＬを取り出し、この上清試料の２０μＬを、２Ｎ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  ｐＨ７バッファー（バッファーＡ）で希釈して×１／５０を得る。）。
６）ＵＶタンパク質濃度をアッセイして、ＨＩＣ分析を実施する。
【０２２６】
反応８：０．６５Ｎ  ＮａＣｌ；１ｗｔの樹脂：
１）抗体１−ｍｃＭＭＡＦ（１．００ｍＬ、３５ｍｇ）を４ｍＬのバイアルに装入
２）０．１９５ｍＬの４Ｎ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  ｐＨ７バッファー（バッファーＡ’）  を装入。
３）３５ｍｇのＢｕ−ＨＩＣ樹脂を装入
４）振とう
５）上清試料を０．５、４および２０時間において採取（シリンジフィルターを通して５０μＬを取り出し、この上清試料の２０μＬを、２Ｎ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  ｐＨ７バッファー（バッファーＡ）で希釈して×１／５０を得る。）。
６）ＵＶタンパク質濃度をアッセイして、ＨＩＣ分析を実施する。
【０２２７】
反応９：０．６５Ｎ  ＮａＣｌ；２ｗｔの樹脂：
１）抗体１−ｍｃＭＭＡＦ（１．００ｍＬ、３５ｍｇ）を４ｍＬのバイアルに装入
２）０．１９５ｍＬの４Ｎ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  ｐＨ７バッファー（バッファーＡ’）を装入。
３）７０ｍｇのＢｕ−ＨＩＣ樹脂を装入
４）振とう
５）上清試料を０．５、４および２０時間において採取（シリンジフィルターを通して５０μＬを取り出し、この上清試料の２０μＬを、２Ｎ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  ｐＨ７バッファー（バッファーＡ）で希釈して×１／５０を得る。）。
６）ＵＶタンパク質濃度をアッセイして、ＨＩＣ分析を実施する。
【０２２８】
反応１０：０．６５Ｎ  ＮａＣｌ；３ｗｔの樹脂：
１）抗体１−ｍｃＭＭＡＦ（１．００ｍＬ、３５ｍｇ）を４ｍＬのバイアルに装入
２）０．１９５ｍＬの４Ｎ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  ｐＨ７バッファー（バッファーＡ’）を装入。
３）１０５ｍｇのＢｕ−ＨＩＣ樹脂を装入
４）振とう
５）上清試料を０．５、４および２０時間において採取（シリンジフィルターを通して５０μＬを取り出し、この上清試料の２０μＬを、２Ｎ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  ｐＨ７バッファー（バッファーＡ）で希釈して×１／５０を得る。）。
６）ＵＶタンパク質濃度をアッセイして、ＨＩＣ分析を実施する。
【０２２９】
反応１１：１．３Ｎ  ＮａＣｌ；樹脂なし：
１）抗体１−ｍｃＭＭＡＦ（１．００ｍＬ、３５ｍｇ）を４ｍＬのバイアルに装入
２）０．４８ｍＬの４Ｎ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  ｐＨ７バッファー（バッファーＡ’）を装入。
３）０ｍｇのＢｕ−ＨＩＣ樹脂を装入
４）振とう
５）上清試料を０．５、４および２０時間において採取（シリンジフィルターを通して５０μＬを取り出し、この上清試料の２０μＬを、２Ｎ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  ｐＨ７バッファー（バッファーＡ）で希釈して×１／５０を得る。）。
６）ＵＶタンパク質濃度をアッセイして、ＨＩＣ分析を実施する。
【０２３０】
反応１２：１．３Ｎ  ＮａＣｌ；０．５ｗｔの樹脂：
１）抗体１−ｍｃＭＭＡＦ（１．００ｍＬ、３５ｍｇ）を４ｍＬのバイアルに装入
２）０．４８ｍＬの４Ｎ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  ｐＨ７バッファー（バッファーＡ’）を装入。
３）１７．５ｍｇのＢｕ−ＨＩＣ樹脂を装入
４）振とう
５）上清試料を０．５、４および２０時間において採取（シリンジフィルターを通して５０μＬを取り出し、この上清試料の２０μＬを、２Ｎ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  ｐＨ７バッファー（バッファーＡ）で希釈して×１／５０を得る。）。
６）ＵＶタンパク質濃度をアッセイして、ＨＩＣ分析を実施する。
【０２３１】
反応１３：１．３Ｎ  ＮａＣｌ；１ｗｔの樹脂：
１）抗体１−ｍｃＭＭＡＦ（１．００ｍＬ、３５ｍｇ）を４ｍＬのバイアルに装入
２）０．４８ｍＬの４Ｎ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  ｐＨ７バッファー（バッファーＡ’）を装入。
３）３５ｍｇのＢｕ−ＨＩＣ樹脂を装入
４）振とう
５）上清試料を０．５、４および２０時間において採取（シリンジフィルターを通して５０μＬを取り出し、この上清試料の２０μＬを、２Ｎ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  ｐＨ７バッファー（バッファーＡ）で希釈して×１／５０を得る。）。
６）ＵＶタンパク質濃度をアッセイして、ＨＩＣ分析を実施する。
【０２３２】
反応１４：１．３Ｎ  ＮａＣｌ；２ｗｔの樹脂：
１）抗体１−ｍｃＭＭＡＦ（１．００ｍＬ、３５ｍｇ）を４ｍＬのバイアルに装入
２）０．４８ｍＬの４Ｎ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  ｐＨ７バッファー（バッファーＡ’）を装入。
３）７０ｍｇのＢｕ−ＨＩＣ樹脂を装入
４）振とう
５）上清試料を０．５、４および２０時間において採取（シリンジフィルターを通して５０μＬを取り出し、この上清試料の２０μＬを、２Ｎ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  ｐＨ７バッファー（バッファーＡ）で希釈して×１／５０を得る。）。
６）ＵＶタンパク質濃度をアッセイして、ＨＩＣ分析を実施する。
【０２３３】
反応１５：１．３Ｎ  ＮａＣｌ；３ｗｔの樹脂：
１）抗体１−ｍｃＭＭＡＦ（１．００ｍＬ、３５ｍｇ）を４ｍＬのバイアルに装入
２）０．４８ｍＬの４Ｎ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  ｐＨ７バッファー（バッファーＡ’）を装入。
３）１０５ｍｇのＢｕ−ＨＩＣ樹脂を装入
４）振とう
５）上清試料を０．５、４および２０時間において採取（シリンジフィルターを通して５０μＬを取り出し、この上清試料の２０μＬを、２Ｎ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  ｐＨ７バッファー（バッファーＡ）で希釈して×１／５０を得る。）。
６）ＵＶタンパク質濃度をアッセイして、ＨＩＣ分析を実施する。
【０２３４】
樹脂の調製および計算：
樹脂のＫａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ（ＫＦ）滴定：
ブチル＝水７２ｗｔ％（有効量２８％）。樹脂の全装入量は、乾燥重量に基づくことに留意されたい。
【０２３５】
乾燥重量の樹脂装入量の試料計算：３５ｍｇの樹脂装入量／０．２８乾燥重量有効量＝１２５ｍｇの湿潤樹脂装入量
概して、樹脂の有効量は、１００％−Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｈｅｒ分析による水のｗ／ｗ％により計算した。
【０２３６】
［実施例６］
２．７、４および５．５の平均ＤＡＲを有するＡＤＣ混合物の精製
下記の実施例は、２．７の平均ＤＡＲまたはより負荷の重い５．５の平均ＤＡＲのいずれかを有する、抗体１−ｖｃ−ＭＭＡＥまたは抗体１−ｍｃ−ＭＭＡＦのいずれかを含む幾つかの異なるＡＤＣ混合物のバッチ精製を記載する。さらに、４の平均ＤＡＲを有する抗体１−ｖｃＭＭＡＥを含むＡＤＣ混合物もまた記載する。より詳細には、スクリーニングを実施して、精製工程に投入されるさまざまな量の６および８の負荷種を含む、２種の異なる負荷のＡＤＣ（抗体１−ｖｃ−ＭＭＡＥおよび抗体１−ｍｃ−ＭＭＡＦ）の精製工程に対する、樹脂重量、ＮａＣｌ濃度の影響（ＤＡＲ、タンパク質濃度）を決定した。一連の反応条件を、下記のように試験した。
【０２３７】
実施例６に使用した５種の粗製ＡＤＣ混合物（１−５）を、下記のように調製した。４種の粗製ＡＤＣ混合物（１）抗体１−ｖｃＭＭＡＥ  ＤＡＲ２．７（平均）、（２）抗体１−ｍｃＭＭＡＦ  ＤＡＲ２．７（平均）、（３）抗体１−ｖｃＭＭＡＥ  ＤＡＲ５．５（平均）および（４）抗体１−ｍｃＭＭＡＦ  ＤＡＲ５．５（平均）を、実施例１および図１に記載の方法に従って調製し、抗体１の還元は、ＴＣＥＰ（１．３または２．６５モル当量）を使用して達成し、複合体化は、ｍｃ−ＭＭＡＦまたはｖｃＭＭＡＥ（３または６当量）のいずれかを使用して達成し、ＤＡＲが２．７（平均）および５．５（平均）の抗体１−ｖｃＭＭＡＥのＡＤＣ混合物ならびにＤＡＲが２．７（平均）および５．５（平均）の抗体１−ｍｃＭＭＡＦのＡＤＣ混合物が調製された。さらに５番目の粗製ＡＤＣ混合物（５）抗体１−ｖｃＭＭＡＥ、ＤＡＲ４（平均）を、実施例１に従って調製した。
【０２３８】
スクリーニング手順を、下記のプロトコルに従って実施した。まず、それぞれの量の湿潤Ｂｕ−ＨＩＣ樹脂（代表的には、実施例２の材料および方法の項に記載のように調製される。）を、４ｍＬのバイアルに秤量した。樹脂の量は、幾つかの計算に基づいた。まず、必要な乾燥樹脂の量は、６および８負荷種の質量に基づいた。質量は、粗製ＡＤＣ出発材料溶液に基づいて、下記のように計算した：
除去される種の質量
Σ（６負荷＋８負荷）、ｍｇ＝２０ｍｇの粗製ＡＤＣ（１−５）×（Σ（６負荷ｐａ％＋８負荷ｐａ％））／１００
【０２３９】
例えば、バイアル１３では：
Σ（６負荷＋８負荷）、ｍｇ＝２０ｍｇのｍＡｂ×（１０．７／１００）＝２．１４ｍ  ｇΣ（６負荷＋８負荷）
【０２４０】
次に、６負荷および８負荷の全質量に、樹脂の標的重量を掛けた。例えば、バイアル１３では：
５重量の樹脂＝５×２．１４ｍｇ  Σ（６負荷＋８負荷）＝１０．７ｍｇの乾燥樹脂
７．５重量の樹脂＝７．５×２．１４ｍｇ  Σ（６負荷＋８負荷）＝１６．１ｍｇの乾燥樹脂
１０重量の樹脂＝１０×２．１４ｍｇ  Σ（６負荷＋８負荷）＝２１．４ｍｇの乾燥樹脂
【０２４１】
最後に、樹脂を、水、塩化ナトリウムおよびＫ２ＨＰＯ４の含有量に対して補正した。樹脂は、既にろ過により単離され、１．９５Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４溶液で洗浄されたので、無機塩濃度の補正を行った。（Ｂｕ−ＨＩＣ樹脂をろ過し、１．９５Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４溶液で複数回洗浄した。樹脂の水分含有量は、ＫＦ（Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｈｅｒ水分滴定）分析により、５９．０ｗ／ｗ％であると決定した。洗浄成分のｗ／ｗ％濃度（１０．６ｗ／ｗ％  ＮａＣｌ、０．８ｗ／ｗ％  Ｋ２ＨＰＯ４、８８．６％水）を、その後、湿潤樹脂中のＮａＣｌおよびＫ２ＨＰＯ４の質量（５１．８ｇ湿潤樹脂、３０．６ｇ水、３．６ｇ  ＮａＣｌおよび０．３ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４）を評価するために使用し、その後これを差し引いて、乾燥樹脂量を計算した（１７．３ｇ）。）。
【０２４２】
例えば、バイアル１３では５重量の乾燥樹脂において：
１０．７ｍｇ乾燥樹脂／（０．３３４ｍｇ乾燥樹脂／ｍｇ湿潤樹脂）＝３２．０ｍｇ湿潤樹脂
Ｂｕ−ＨＩＣ樹脂の添加後、粗製ＡＤＣ混合物（１−５）（１．１−１．２ｍＬ、２０ｍｇ）を、４ｍＬのバイアルに装入した。粗製ＡＤＣ溶液の体積を、総タンパク質２０ｍｇを目標として調整した。
【０２４３】
次に、さまざまな塩化ナトリウム溶液を調製した。０．５５−０．６ｍＬ（ＡＤＣ溶液の体積のおよそ１／２）の塩化ナトリウム溶液のそれぞれのモル濃度／５０ｍＭ  Ｋ２ＰＯ４／ｐＨ７を、さまざまなバイアルに装入した。ＮａＣｌ溶液の初期濃度は、５０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ７の一定濃度において、０Ｍ、１．９５Ｍ、３．９Ｍおよび５．８５Ｍであった。ＡＤＣ溶液への添加後、ＮａＣｌ濃度は、希釈により０、０．６５、１．３および１．９５Ｍ  ＮａＣｌに低下した。その後、バイアル内容物（ＤＡＲ２．５またはの５．５のＡＤＣ＋さまざまな濃度の塩溶液）を、一晩振とうした（およそ２０時間）。
【０２４４】
一晩（＞２０時間）撹拌後、上清試料を採取した（シリンジフィルターを介して０．６ｍＬを取り出し、７５μＬのこの上清試料を、９２４μＬの１．９５Ｎ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４  ｐＨ７  バッファーで希釈した。）。その後、ＨＰＬＣ−ＨＩＣ分析を実施して、各負荷種のＰＡ％およびタンパク質の回収を決定した。研究の結果を、下記の表９および１０に示す。
【０２４５】
【表９】
2016519070.tif 000017
2016519070.tif 000018
【０２４６】
【表１０】
2016519070.tif 000019
【０２４７】
要約すると、実施例６、表９および１０に記載した樹脂滴定によるスクリーニングを実施して、２．７から５．５の範囲のＤＡＲ（平均）を保有する粗製抗体１−ｍｃＭＭＡＦおよび抗体１−ｖｃＭＭＡＥのＡＤＣ混合物（１）−（５）から得られた、精製工程に対する、樹脂投入量およびＮａＣｌ濃度の影響（ＤＡＲ、タンパク質濃度）を決定した。樹脂の計算量を、表９および１０に示すが、これらは、粗製分布から除去されるべき薬物負荷種に依存する。例えば、６および８の薬物負荷種の重量のおよそ５から１０倍の樹脂重量が、これらの種を粗製反応混合物から除去するために有効であることが証明された。
【０２４８】
［実施例７］
抗体１−ｖｃ−ＭＭＡＥのバッチ精製およびフロースルー精製
バッチ精製方法
ＡＤＣ、即ち抗体１−ｖｃ−ＭＭＡＥの粗製分布の作製を、実施例１に記載の方法に従って実施した。
【０２４９】
反応混合物を、５０ｍＭリン酸カリウム、２Ｍ  ＮａＣｌおよびバッファー、ｐＨ６．８であらかじめ洗浄されたＢｕ−ＨＩＣ樹脂で処理した。その後、樹脂／反応混合物を撹拌し、（先行する実施例に記載の方法に従って）解析的疎水性相互作用クロマトグラフィーにより、薬物複合体産物の除去に関してモニターした。抗体１−ｖｃ−ＭＭＡＥのバッチ精製を説明するこの追加の実験の結果を、表１１に記載する。表１１において言及される解析的ＨＰＬＣ分析の保持時間は、化合物が溶出されて出てくるまでの時間である。
【０２５０】
【表１１】
2016519070.tif 000020
【０２５１】
表１１に記載のように、抗体１−ｖｃ−ＭＭＡＥのバッチ精製により、初期反応混合物と比較して低い平均ＤＡＲがもたらされた。
【０２５２】
フロースルー精製方法
または、抗体１−ｖｃ−ＭＭＡＥの精製は、フロースルー精製様式を使用して実施することができる。
【０２５３】
フロースルー精製は、概して、下記の方法に従って実施した。Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｕｔｙｌ  ６００Ｍ樹脂の２リットルのバッチを作製した。樹脂を、２Ｌの焼結漏斗でろ過した（漏斗はあらかじめＩＰＡで洗浄して乾燥させてあったことに留意されたい。）。ろ過した樹脂を、２×２Ｌの５０ｍＭリン酸カリウム、２Ｍ  ＮａＣｌリン酸バッファー、ｐＨ６．８で洗浄した。樹脂の有効量が、Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｈｅｒ水分分析により２７％であることを決定した（分析により、７３ｗ／ｗ％の水の存在が示された；この実施例において、わずかの量の無機の残余（ＮａＣｌおよびＫ２ＨＰＯ４）は、樹脂の有効量の計算には使用されなかったことに留意されたい。）。
【０２５４】
実施例１に記載の還元／複合体化方法を使用して、１３４．９ｇの抗体１で開始した。実施例１に記載のプロトコルと比較した１つの変更は、２．１５当量のＴＣＥＰを使用したことである（これにより、わずかに高い平均ＤＡＲがもたらされた。）。この工程は、３３．８ｐａ％の６−８負荷種をもたらた。従って、４５．６ｇの６−８負荷種が、粗製反応混合物中に存在した。
【０２５５】
５倍負荷の疎水性樹脂を使用すると、２２８．５ｇの乾燥重量の疎水性樹脂が必要であった（即ち、４５．６ｇの６−８負荷種×５＝２２８．５ｇの有効量調整樹脂）。２７％の樹脂有効量において（樹脂の有効量は、１００％−Ｋａｒｌ  Ｆｉｓｈｅｒ分析による水のｗ／ｗ％により計算される。）、８５６ｇの湿潤樹脂重量は２２８．５グラムの有効量調整樹脂と等価である（即ち、計算：２２８．５グラムの有効量調整樹脂／（２７グラムの乾燥樹脂重量／１００グラムの湿潤樹脂））＝８５６ｇの必要湿潤樹脂）を、４インチ×７インチのステンレススチールカラムに負荷した。その後、粗製反応混合物を、滅菌２０Ｌのカーボイから樹脂床の上に圧力センサーおよびぜん動ポンプを介し、サイズ３５のＰｈａｒｍｅｄチューブを使用してポンプにより汲み上げ、第２の２０Ｌの滅菌カーボイに、１８５ｍｌ／分でポンプに汲み入れた。その後、回収されたろ液を、ポンプにより再度樹脂床を通し、最終ろ液中の低ＤＡＲ種を含有する所望のＡＤＣ混合物を回収した。使用したフロースルー工程は、ダブルパス工程であった。
【０２５６】
その後、樹脂床を数回洗浄し、残留する未結合の低ＤＡＲ種を除去し、樹脂に結合した高ＤＡＲ種（薬物負荷６−８）はそのままにしておいた。詳細には、まず、樹脂床を、６００ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム、２Ｍ  ＮａＣｌをＷＦＩで１２００ｍｌに希釈することによって調製された１２００ｍＬの１Ｎ  ＮａＣｌ（９５ｍＳ）で洗浄した。その後、樹脂床を、４５０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム、２Ｍ  ＮａＣｌをＷＦＩで１２００ｍＬに希釈することによって調製された１２００ｍｌの０．７５Ｎ  ＮａＣｌ（７１ｍＳ）で洗浄した。第３の洗浄は、３００ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム、２Ｍ  ＮａＣｌを９００ｍｌのＷＦＩで希釈することによって調製された１２００ｍＬの０．５Ｎ  ＮａＣｌ（５０ｍＳ）を使用して実施した。第４の洗浄は、１５０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム、２Ｍ  ＮａＣｌをＷＦＩで１２００ｍｌに希釈することによって調製された１２００ｍＬの０．２５Ｎ  ＮａＣｌ（２６ｍＳ）を使用して実施した。樹脂洗浄由来のろ液を、大部分回収して、上記のフロースルー工程由来の最終ろ液と統合し、バルク（即ち、最終ろ液＋洗浄液）を得た。
【０２５７】
特に、精製された２−４のＤＡＲを有するＡＤＣは、上記の初期のマルチパス手順由来の最終ろ液中に得られるので、樹脂床の洗浄は任意選択である。最初の洗浄液は、洗浄液から約１０％の回収を提供し、一方、その後の洗浄液は約１−２％の回収をもたらした。
【０２５８】
このバルクを、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）によりおよそ１２００ｇの濃縮ＡＤＣ溶液に濃縮し、その後、１０ダイアボリューム（ｄｉａｖｏｌｕｍｅｓ）の１５ｍＭヒスチジンバッファー、ｐＨ６に交換して、所望の抗体１−ｖｃ−ＭＭＡＥのＤＡＲ０−４種を、最終タンパク質濃度３５ｍｇ／ｍＬ（８１グラムを単離、６６％の収率、ＤＡＲ０−４に対して９１％回収率）で得た。従って、フロースルー精製方法は、ＤＡＲ種、即ち、６−８の高負荷種を、低ＤＡＲ種から分離することに成功した（下記の表１２により詳細に記載）。
【０２５９】
バッチ精製様式とフロースルー精製様式との比較を実施した（表１２）。どちらの場合においても、タンパク質に対する樹脂投入量は、抗体１−ｖｃ−ＭＭＡＥの高負荷ＤＡＲ６−８種の質量に対して５重量の樹脂であった。個別の種の相対量のわずかな不一致は、（フロースルー実験例に使用したＴＣＥＰのわずかに高い当量のため）存在したが、両方の方法の高ＤＡＲ種除去の有効性は同等であった。表１２において言及される材料の「フロースルー方法」の列は、フロースルー方法由来のろ液と洗浄液由来の材料とを統合したものを含む（併せて「バルク」と称される。）。
【０２６０】
【表１２】
2016519070.tif 000021
【０２６１】
結論として、バッチおよびフロースルー精製方法の両方を使用して、２−４のＤＡＲを有するＡＤＣを濃縮した。両方の精製方法は、タンパク質（ＡＤＣ）重量（高薬物負荷種の分画と併せた。）と、使用する樹脂投入量との比に頼っており、ＡＤＣ混合物中の６−８（６以上）薬物負荷種の重量の５から６倍の疎水性樹脂重量が、６−８のＤＡＲを有するＡＤＣのレベルの実質的低下をもたらした。表１２に記載のように、両方の工程が、少なくとも９５％の、４以下のＤＡＲを有するＡＤＣを含む組成物または４％未満の、６以上薬物負荷種を含むＡＤＣを含む組成物をもたらした。
【０２６２】
本明細書に記載の実施例および実施形態が、単なる例示目的であること、およびこれらを考慮してさまざまな変形および変更が当業者には示唆されること、および添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれることは理解されるものと思われる。本明細書に引用されたすべての出版物、特許および特許出願は、すべての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
2016519070.tif 000022
【図２】
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【図３】
2016519070.tif 000024
【配列表】
2016519070000001.app
【国際調査報告】
2016519070.tif 000025
2016519070.tif 000026
2016519070.tif 000027