(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つのポリミキシンファミリーの抗生物質と、脂質画分と、１つまたは複数の界面活性剤と、を含む脂質ナノ粒子に関する。本発明はまた、呼吸樹感染の予防および／または治療におけるナノ粒子の使用に関する。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質ナノ粒子であって、
少なくとも１つのポリミキシンファミリーの抗生物質、
モノグリセリドおよび／またはジグリセリドおよび／またはトリグリセリドおよび／または脂肪酸および／またはそれらの混合物からなる群から選択される１つまたは複数の脂質を含む脂質画分、および
１つまたは複数の界面活性剤、
を含む、脂質ナノ粒子。
【請求項２】
前記脂質画分が一つまたは複数の室温で固体の脂質を含む、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項３】
前記脂質画分が、一つまたは複数の室温で固体の脂質と、一つまたは複数の室温で液体の脂質と、の混合物を含む、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項４】
前記脂質画分に対する前記抗生物質の重量比が約０．２５：１０〜約４：１０であり、好ましくは約１：１０である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項５】
固体脂質に対する液体脂質の重量比が約０．５：１０〜約５：１０で、好ましくは１：１０である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項６】
界面活性剤の重量比が、ナノ粒子の全重量に対して約０．５％〜約２％であり、好ましくは約１％である、先行する請求項のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項７】
前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項８】
前記ポリミキシンファミリーの抗生物質が、コリスチンおよびコリスチメテートナトリウムから選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項９】
凍結保護剤を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１０】
凍結乾燥された、請求項１〜９のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子を。１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤または担体と共に含む、医薬組成物。
【請求項１２】
医薬品として使用される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１３】
呼吸樹感染症の治療および／または予防のために使用される、請求項１〜１０および１２のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１４】
前記呼吸樹感染症が緑膿菌および／またはポリミキシンに敏感な微生物によって引き起こされる、請求項１３に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１５】
蒸気またはスプレーまたは粉末形態として、気道への吸入により投与され、前記吸入の粒径が約１μｍ〜約１０μｍ、好ましくは１．５μｍ〜５μｍ、より好ましくは２μｍ〜４μｍである、請求項１〜１０および１２〜１４のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つのポリミキシンファミリーの抗生物質を含む脂質ナノ粒子、前記ナノ粒子を含む医薬組成物、および呼吸樹感染の予防および／または治療における前記ナノ粒子の使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
多剤耐性グラム陰性菌（ＭＤＲＧＮＢ）、例えば緑膿菌による慢性および再発性の感染症が、最も大きな影響をもつ疾患の一つは、嚢胞性線維症である。前記細菌の残存性は、特にバイオフィルム上のその成長と関連しており、表面が粘着している細菌の集団構造であり、細菌自体によって分泌される保護層で被覆され、それでより効果的に殺生物剤及び抗生物質に抵抗する能力を提供し、かなり高用量の抗菌製品にも耐えられ、肺機能障害を引き起すことになる。
【０００３】
これらの感染症の治療のためのいくつかの抗生物質は副作用を持っているため、マイクロシステムおよびナノシステムの使用で、前記抗生物質を投与することには特に興味深い。文献には前記抗生物質のいくつかを含む前記システムの種々の用途を記載しており、例えばＵＳ２００９１６９６３５は、全身投与のためのポリエステル系生分解性ポリマーナノ粒子を開示している。
【０００４】
肺の抗菌剤または抗生物質の局所濃度は、細菌を成功裡に根絶するための最も重要な原因の一つであることを考えると、肺胞および気管支上皮が薬物放出のための最も考えられる場所のようである。
【０００５】
エアロゾルおよび乾燥粉末の投与によって下気道への抗生物質の直接投与は、潜在的な利点を有している。例えば、感染部位の肺胞のところに堆積によって、より高い局所濃度を達成することができるため、投与量が低減されるので、吸入薬は、全身の副作用の発症を低減することができる。
【０００６】
ポリミキシンは抗生物質の一種であり、１９５０年代と１９６０年代に販売されたが、その副作用および後にグラム陰性菌用の他の抗生物質の特効薬の出現によって、販売中止になった（コリスチンの使用を解明する：いまだに空白。Ｅｎｆｅｒｍｅｄａｄｅｓ  Ｉｎｆｅｃｃｉｏｓａｓ  ｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ  Ｃｌｉｎｉｃａ，  ２０１１，  ２９巻，  ４号）。近年では、ＭＤＲＧＮＢ細菌を原因とする感染症の増加、および治療の選択肢がないことにより、ポリミキシン類の抗生物質の使用が再び増加した。しかしながら、その有効性と安全性に関する有効な臨床データはほとんどないため、現在使用されている投与処方が最も適しているかどうかを保証することが困難である。
【０００７】
この事実を考慮して、従って、技術水準の欠点を克服して呼吸樹感染症の治療のための薬剤を開発する必要がある。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、少なくとも１つのポリミキシンファミリーの抗生物質を含む脂質ナノ粒子を開発し、前記ナノ粒子は気道の粘膜層や細菌自身によって生成されたバイオフィルムに付着、またはそれらと相互作用することができ、前記ナノ粒子によって抗生物質のより低い治療用量で最適な最小発育阻止濃度の結果を得た。
【０００９】
本発明のナノ粒子は、早期分解から防止され、さらに肺胞及び気管支上皮への抗生物質の持続放出を提供する。
【００１０】
従って、本発明の一態様では、少なくとも１つのポリミキシンファミリーの抗生物質、並びにモノグリセリドおよび／またはジグリセリドおよび／またはトリグリセリドおよび／または脂肪酸および／またはそれらの混合物からなる群から選択される１つまたは複数の脂質を含む脂質画分、を含む脂質ナノ粒子を提供する。
【００１１】
本発明の他の態様は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤または担体と共に上記で定義された脂質ナノ粒子を含む医薬組成物に関する。
【００１２】
本発明の他の態様は、以下の工程を含む、上記で定義された脂質ナノ粒子を調製する方法に関する：
ａ）有機溶媒中に脂質画分および少なくとも１つの抗生物質を有する溶液／混合物を調製する。
ｂ）１つまたは複数の界面活性剤の水溶液を調製する。
ｃ）油相ａ）と水相ｂ）を混合してエマルジョンを得る。
ｄ）溶媒を蒸発させて除去する。
ｅ）得られたナノ粒子を遠心分離および／または限外ろ過によって洗浄する。
【００１３】
本発明の他の態様は、医薬品として使用される上記で定義された脂質ナノ粒子に関する。
【００１４】
本発明の他の態様は、以下の工程を含む、上記で定義された脂質ナノ粒子を調製する方法に関する：
ａ）固体脂質の融点よりわずかに高い温度で加熱することによって、脂質と少なくとも１つの抗生物質との混合物を調製する。
ｂ）１つまたは複数の界面活性剤の水溶液を調製する。
ｃ）水溶液ｂ）を油相ａ）と同じ温度に加熱する。
ｄ）水相ｂ）を油相ａ）に入れて、混合してエマルジョンを得る。
ｅ）脂質が再結晶化するまで５℃±３℃の温度で維持し、ナノ粒子を生じさせる。
ｆ）得られたナノ粒子を遠心分離および／または限外ろ過によって洗浄する。
【００１５】
本発明の脂質ナノ粒子は、感染、特に呼吸樹感染症の治療に有用である。従って、本発明の他の態様は、医薬品として使用される上記で定義された脂質ナノ粒子に関する。
【００１６】
本発明の他の態様は、呼吸樹感染症の治療および／または予防のために使用される上記で定義された脂質ナノ粒子に関する。従って、本態様は、感染症の治療および／または予防のための医薬品を調製するための上記で定義された脂質ナノ粒子の使用に関し、好ましくは呼吸樹の感染症であり、好ましくは緑膿菌および／または近縁種および／またはポリミキシンに敏感な微生物によって引き起こされる。
【００１７】
本発明の他の態様は、感染症を治療および／または予防する方法に関し、好ましくは呼吸樹の感染症であり、当該感染症は好ましくは緑膿菌および／または近縁種および／またはポリミキシンに敏感な微生物によって引き起こされる。前記方法は、薬学的に許容される賦形剤または担体と共に上記で定義された脂質ナノ粒子を治療の有効量で、ヒトを含むその治療および／または予防が必要な対象に投与することを含む。
【００１８】
この意味では、発明者らは下記の目的のための、前記脂質ナノ粒子、ならびに前記ナノ粒子を含む医薬組成物および／または医薬品の能力を実証している：
−抗生物質の持続したおよび／または安定化した放出効果を有する安定な脂質ナノ粒子を得る；
−抗生物質を早期分解から保護する；
−気道投与のための好適な粒子サイズを得る；
−細菌自体によって生成されたバイオフィルムを透過する能力を有する；および
−遊離抗生物質よりも優れた安全性と有効性を得る。
【００１９】
本発明のこれらおよび他の利点、および特徴は、図面および本発明の詳細な説明を考慮してから明らかになるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、室温で固体脂質を含む脂質画分を有する、抗生物質を負荷した脂質ナノ粒子を示す説明図面である。
【図２】図２は、室温で固体脂質、室温で液体脂質の混合物を含む脂質画分を有する、抗生物質を負荷した脂質ナノ粒子を示す説明図面である。
【図３】図３は、本発明の脂質ナノ粒子の一実施形態の顕微鏡写真である。
【図４】図４は、脂質ナノ粒子の経時抗生物質放出曲線を示す図面である。
【図５】図５は、ＣＤ１マウスに投与した後、蛍光マイクロスフェアの肺分布を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な開示
本発明者らによって開発された脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのポリミキシンファミリーの抗生物質、並びにモノグリセリドおよび／またはジグリセリドおよび／またはトリグリセリドおよび／または脂肪酸および／またはそれらの混合物、並びに１つまたは複数の界面活性剤からなる群から選択される１つ以上の脂質を含む脂質画分、を含む。
【００２２】
本発明の説明書において、用語「脂質ナノ粒子」は、脂質および／または親油性コアを含むマトリックスを指し、好ましくは固化脂質コアである。固化脂質コアは、固化前の液体状態中に脂質を有するナノ区画を含み、前記コアをカプセル化する親水性相に囲まれていたものであってもよい。
【００２３】
固体脂質ナノ粒子としても知られている室温で固体の脂質を含むナノ粒子と、室温で固体脂質及び液体脂質の混合物を含むナノ構造脂質担体と、が本発明の範囲に含まれる。
【００２４】
特定の実施形態において、本発明のナノ粒子は、約１０ｎｍから約１０００ｎｍの間、好ましくは約１００ｎｍから約５００ｎｍの間の平均サイズを有することを特徴とする。
【００２５】
「平均サイズ」は、本発明の脂質ナノ粒子の集団の平均直径として理解される。平均サイズは、当業者にとって公知の標準的な方法、および以下の実施例セクション等に記載された方法によって測定することができる。
【００２６】
粒径は、抗生物質の持続放出を決定する要因の一つである。
【００２７】
一般的に、ナノ粒子表面上に位置する抗生物質が最初に放出される。ナノ粒子サイズが小さいほど、それらが持っている固有の相互作用面も大きくなり、そのため抗生物質の初期の放出がより多くなる。
【００２８】
他の実施形態において、ナノ粒子は、大きさ約−３０ｍＶから約−５ｍＶの間、好ましくは−３０ｍＶから−１６ｍＶの間の範囲の表面電荷（ゼータ電位測定による）を有する。一般に、表面電荷は、脂質ナノ粒子の安定性に影響を与えるパラメータの一つである。それらが正または負に帯電しているという事実は、ナノ粒子間の反発力によって固結を防止し、より優れた分散性を呈するのに資する。
【００２９】
細菌自身によって生成したバイオフィルム、および／または肺の粘膜に存在する細菌膜のリポ多糖の正電荷を考慮すると、本発明のナノ粒子の負の表面電荷は、ナノ粒子−細菌結合を助力し、ナノ粒子の作用部位での保持および密着性を最適化し、抗生物質のより良い持続的な治療効果を助力する。
【００３０】
他の実施形態において、本発明のナノ粒子は、多分散性指数（ＰＤＩ）が０．５以下の値を有する。前記指数は、混合物中に存在するナノ粒子サイズの多様性に関する一種の見解を提供する。それがゼロに近いほど、ナノ粒子はより均一になり、これは製造バッチの均一なサイズ分布の指標である。
【００３１】
平均サイズ、ゼータ電位およびナノ粒子のＰＤＩ値は、主に脂質成分の量、界面活性剤の量、ならびに調製方法のパラメータ、例えば攪拌の強さや種類、両相の温度または混合相の持続時間によって影響される。
【００３２】
脂質画分
特定の実施形態において、本発明の脂質ナノ粒子は、脂質画分としてナノ粒子コアの一部を形成する、室温で固体の脂質を少なくとも一つ含む。
【００３３】
本発明のために、室温とは２０−２５℃である。ただし、本発明の明細書における「室温で固体脂質」とは、飽和または不飽和であり、４５℃で固体形態のままである脂質として理解される。前記定義は、限定するものではないが、トリグリセリド（例えばトリステアリン）、ならびに／またはモノ−もしくはジグリセリド（例えばモノ−およびジグリセリドの誘導体および混合物）、ならびに／または脂肪酸（例えばステアリン酸）もしくはその誘導体、ならびに／またはそれらの混合物、ステロイド（例えばコレステロール）、およびワックス（例えばパルミチン酸セチル）、を含んでもよい。これらのグリセリドの各脂肪酸および単独の脂肪酸は、通常１０〜２８個の炭素原子の鎖を有することを特徴とする。エステルまたはアミドに炭化水素鎖の置換基としてヒドロキシル基を有するこれらの脂肪酸は、脂肪酸の誘導体の定義に含まれる。
【００３４】
特定の実施形態において、脂質画分は、モノグリセリド、ジグリセリドおよび／またはトリグリセリドの混合物を含んでなる。
【００３５】
好ましい実施形態においては、脂質画分はグリセリルパルミトステアレート（例えばＰｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ５）のモノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリドの混合物を含む。
【００３６】
別の特定の実施形態において、ナノ粒子の脂質画分は、一つまたは複数の室温で固体の脂質と、一つまたは複数の室温で液体の脂質と、の混合物を含んでなる。
【００３７】
本発明の説明書において、「室温で液体の脂質」とは、飽和または不飽和であり、４５℃で液体形態のままである脂質として理解される。前記定義は、限定するものではないが、油、および／またはトリグリセリド、および／またはモノグリセリド、および／またはジグリセリド、および／または脂肪酸、および／または脂肪酸エステル、および／またはそれらの混合物、を含んでもよい。これらのグリセリドの各脂肪酸および単独の脂肪酸は、通常１０未満の炭素原子の鎖を有することを特徴とする。
【００３８】
特定の実施形態において、液体脂質画分はトリグリセリドを含む。
【００３９】
好ましい実施形態においては、カプリル酸トリグリセリドおよびカプリン酸トリグリセリド（例えばＭｉｇｌｙｏｌ（登録商標）８１２）は、液体脂質として使用されている。
【００４０】
液体脂質がより少ない秩序構造を提供し、ナノ粒子コア中の抗生物質の含有容量を増大させる。
【００４１】
図１および図２は、脂質ナノ粒子の特定の例を示す説明図面であり、図１は、固体脂質１と、抗生物質２とを共に含み、図２は、固体と液体の脂質の混合物３と、抗生物質２とを共に含む。
【００４２】
本発明の一実施形態においては、固体脂質に対する液体脂質の重量比（重量／重量）は約０．５：１０〜約５：１０で構成される。
【００４３】
本発明の一実施形態においては、固体脂質に対する液体脂質の重量比（重量／重量）は約１：１０で構成される。
【００４４】
固体脂質と液体脂質との使用によって、ナノ粒子に次のような利点を与える：
−生物および組織における生理的に許容される脂質の使用による許容範囲が改善され、
−異なる製剤方法を使用し、親油性と親水性の両方の薬物をカプセル化でき、
−それらは、生物学的な毒性を示せず、および
−必要に応じて抗生物質の放出を調節することが可能である。抗生物質に富むコーティングを有するナノ粒子は大幅な初期放出を持ち、一方、薬剤に富むコアを有するナノ粒子は、その持続的な放出を可能にした。
【００４５】
界面活性剤
先述のように、本発明のナノ粒子は、一つまたは複数の界面活性剤を含む。特定の実施形態において、親油性コアを囲むナノ粒子の親水性相は、界面活性剤を含む。本発明の明細書において、界面活性剤とは、異なる相の表面張力を低下させる乳化剤または乳化用剤であり、ナノ粒子の製造と、これらの優れた介在と、ゆえにナノ粒子の形成と、のために必要である。
【００４６】
界面活性剤は、カチオン性、アニオン性または非イオン性であってもよく、それらは、それらの表面電荷に応じて分類される。カチオン性界面活性剤の例としては、限定されないが、セトリミドおよび／または塩化セチルピリジニウムが挙げられる；アニオン性界面活性剤の例としては、限定されないが、ドキュセートナトリウム、リン脂質、および／またはラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。
【００４７】
用語「非イオン性界面活性剤」は、疎水性部分と親水性部分を有し、任意の正味電荷を有しない化合物として理解される。
【００４８】
好ましい実施形態において、ナノ粒子は、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤を含み、その主な機能は、粒子サイズを制御し、安定性を付与し凝集体の形成を防止することである。非イオン性界面活性剤の例としては、限定されないが、ポリソルベート、ポリエチレングリコールコポリマーおよび／またはポリプロピレングリコールコポリマーが挙げられる。好ましい実施形態において、非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート８０および／またはポロキサマーである。
【００４９】
特定の実施形態において、非イオン性界面活性剤の比率は、ナノ粒子の全重量に対して０．５重量％〜２重量％であり、好ましくは１％である。
【００５０】
抗生物質
抗生物質や抗菌剤は、細菌の増殖を阻害すること、または細菌の溶解をもたらす一連の生化学的事象を生じさせることにより、細菌感染に対して作用する薬剤である。
【００５１】
本発明においては、脂質ナノ粒子は、ポリミキシンファミリー、例えばポリミキシンＡ、ポリミキシンＢ、ポリミキシンＣ、ポリミキシンＤおよびポリミキシンＥの少なくとも１つの抗生物質を含む。
【００５２】
好ましい実施形態においては、脂質ナノ粒子は、コリスチンまたはコリスチメテートナトリウムタイプの少なくとも１つの抗生物質を含む。
【００５３】
抗生物質の放出、並びに抗菌作用は、脂質画分に対する抗生物質の重量比によって調節することができる。特定の実施形態において、脂質画分に対する抗生物質の重量比は約０．２５：１０〜約４：１０であり、好ましくは約１：１０である。
【００５４】
抗生物質の抗菌作用は、最小発育阻止濃度を用いて測定することができる。これは、ｐＨ７．２の好気性無タンパク質培地中、一晩のインキュベーション期間で、急速な成長期における１０４−５細菌をインキュベーションした後、細菌の増殖を防止するために必要な抗生物質の濃度である。この用語は、特定の抗生物質への細菌の感受性を確定するために使用される。
【００５５】
感染症の文脈において、用語「感受性」とは、治療用量での治療の場合、微生物の増殖および／または微生物の死亡の抑制を意味する。
【００５６】
本発明の異なる実施形態の抗生物質−脂質画分の重量比は、遊離抗生物質よりも低い最小阻害濃度を示した。この事実は、コストの面で有利であることに加えて、同じ治療効果のために必要とされる抗生物質の量が少ないので、細菌耐性の獲得の可能性を低減させるのに有利である。
【００５７】
本発明の明細書において、用語「細菌耐性の獲得」とは、細菌が、他の細菌から、および／または変異過程を経て耐性遺伝子の獲得を通じて獲得される耐性を意味するすると理解される。細菌耐性は、特に抗菌治療における不適当な用量または不適当な継続時間での使用に、直接に関連している。
【００５８】
調製方法
本発明の脂質ナノ粒子は溶媒乳化／蒸発技術によって、またはホットメルト均質化技術によって調製することができる。
【００５９】
第一の技術は、以下のステップを含む：
ａ）有機溶媒内の少なくとも１つの抗生物質と、脂質画分とを含む溶液／混合物を調製する。
ｂ）１つまたは複数の界面活性剤の水溶液を調製する。
ｃ）油相ａ）及び水相ｂ）を混合してエマルジョンを得る。
ｄ）溶媒を蒸発させて除去する。
ｅ）得られたナノ粒子を遠心分離によって洗浄する。
【００６０】
特定の実施形態において、脂質画分を１〜１０％（重量／体積）、好ましくは３％〜７％、特に好ましくは５％で、少なくとも１つの抗生物質と共に有機溶液に溶解させる。一方、少なくとも１つの界面活性剤の水溶液を調製する。水相を油相に添加し、混合物を特定の時間で超音波処理によって乳化させる。ナノ粒子サイズ、多分散性指数およびカプセル化効率は、超音波パワーおよび超音波処理時間に依存する。好ましくは、１０Ｗ〜３０Ｗ、特に好ましくは１５Ｗ〜２５Ｗで、１５秒〜４０秒、好ましくは２５秒〜３５秒、特に好ましくは２９秒〜３１秒で、超音波処理をする。エマルジョンが得られたら、溶媒を２時間室温で磁気撹拌下に蒸発させる。蒸発後、得られたナノ粒子を１〜１０回、好ましくは２〜５回、特に好ましくは３回遠心分離および濾過により洗浄する。
【００６１】
第二の技術は、以下のステップを含む：
ａ）固体脂質の融点よりわずかに高い温度に加熱することによって脂質の混合物と少なくとも１つの抗生物質を調製する。
ｂ）１つまたは複数の界面活性剤の水溶液を調製する。
ｃ）油相ａ）と同じ温度に水溶液ｂ）を加熱する。
ｄ）油相ａ）に水相ｂ）を入れて、混合してエマルジョンを得る。
ｅ）脂質が再結晶化するまで５℃±３℃の温度で維持する。
ｆ）得られたナノ粒子を遠心分離／限外ろ過によって洗浄する。
【００６２】
特定の実施形態において、一方では、固体および／または液体脂質および抗生物質を一緒に混合し、固形脂質の融点よりわずかに高い温度に加熱する。一方では、少なくとも１つの界面活性剤の水溶液を調製します。油性溶液および水溶液は同じ温度に加熱され、両方の相が同じ温度に達すると、水溶液を油性溶液に加える。混合物を超音波処理によって乳化させる。前述の方法と同様に、ナノ粒子サイズ、多分散性指数とカプセル化効率は、超音波処理パワーと超音波処理時間に依存する。このましくは、１０Ｗ〜３０Ｗ、特に好ましくは１５Ｗ〜２５Ｗで、１０秒〜３０秒、好ましくは１２秒〜１６秒、特に好ましくは１４秒〜１５秒で、超音波処理をする。得られたエマルジョンは少なくとも、５時間〜３０時間、好ましくは１０時間〜２０時間、特に好ましくは１１時間〜１３時間、非常に好ましくは１２時間で、１℃〜１０℃、好ましくは２℃〜６℃、特に好ましくは３℃〜５℃で、保存される。脂質は、この期間内に再結晶化してナノ粒子を形成する。時間が経過したら、ナノ粒子を１〜１０回、好ましくは２〜５回、特に好ましくは３回、１０００ｒｐｍ〜３５００ｒｐｍ、好ましくは２０００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ、特に好ましくは約２５００ｒｐｍで、１０分〜３０分、好ましくは１２分〜１６分、特に好ましくは１４分〜１５分で、遠心分離および濾過により洗浄する。この方法の１つの利点は、有機溶剤を使用しないことである。そのため、ヒトに使用のナノ粒子の実用化の前に、有機溶媒の痕跡を確認するための試験を実施する必要性がなくなる。
【００６３】
本発明の一態様は、前記技術によって得られうる製品に関する。
【００６４】
凍結乾燥
特定の実施形態において、脂質ナノ粒子は凍結乾燥されたナノ粒子である。凍結乾燥は、脂質ナノ粒子を含む乾燥粉末を得られる。これは、ナノ粒子の分解およびナノ粒子が懸濁している溶液に抗生物質の早期の放出を防止できるため、懸濁液中の脂質ナノ粒子よりも高い安定性を提供する。
【００６５】
凍結乾燥は、下記の実施例の項等に記載の、および当業者に知られている標準的な方法によって行ってもよい。
【００６６】
一実施形態において、本発明の脂質ナノ粒子は、凍結保護剤を含む。凍結保護剤は、凍結乾燥プロセスの凍結プロセス中のナノ粒子の安定化に有利に働く。前記凍結保護剤は、限定されないが、コロイド状のＳｉＯ２、グリシン、ラクトース、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、重炭酸ナトリウムおよびホウ酸ナトリウムから選択することができる。
【００６７】
好ましい実施形態において、ナノ粒子は、凍結保護剤としてトレハロースを含む。
一実施形態において、脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子の重量に対して、凍結保護剤を約５重量％〜約２０重量％、好ましくは５重量％〜１５重量％で含む。
【００６８】
感染
本発明の一態様は、感染症（好ましくは呼吸樹感染）の治療および／または予防に使用するための本発明の脂質ナノ粒子に関する。
【００６９】
本発明の別の態様は、感染症（好ましくは呼吸樹感染）の治療および／または予防のための医薬を調製するための本発明の脂質ナノ粒子の使用に関する。
【００７０】
本発明の別の態様は、感染症（好ましくは呼吸樹感染）を治療または予防する方法に関する。前記方法は、その治療および／または予防を必要とする対象（ヒトを含む）に、医薬的に許容される賦形剤または担体と、上記で定義された脂質ナノ粒子の治療有効量とを投与することを含む。
【００７１】
用語「感染症」とは、グラム陰性菌および／またはポリミキシンファミリーの抗生物質に敏感な細菌や微生物による任意の感染症が含まれる。
【００７２】
用語「呼吸樹」とは、鼻腔、咽頭、喉頭、気管、主気管支や肺が含まれる。
【００７３】
本明細書において、用語「予防または治療」は、前述細菌感染症に罹患しているかまたは罹患するリスクがある患者の健康を維持するための、本発明に係るナノ粒子の投与を意味する。前記用語はまた、細菌感染に伴う１つまたは複数の症状を予防、改善、軽減または排除するために、本発明のナノ粒子を投与することを含む。本発明の説明書において、「改善」という用語は、治療される患者の状況の任意の改善を意味すると理解される。それは主観的改善（患者がどう感じるか）または客観的改善（測定パラメータ）のいずれかである。
【００７４】
特定の実施形態において、呼吸器樹内の感染は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に起因する。
【００７５】
本発明のナノ粒子は、細菌によって生成されたバイオフィルムまたは呼吸樹組織の実際の粘液に付着する能力が実証された。したがって、特定の実施形態において、本発明は、嚢胞性線維症および／または気管支拡張症に伴う肺感染症における、本発明の脂質ナノ粒子の使用に関する。
【００７６】
本発明の脂質ナノ粒子は、医薬組成物の一部を形成することができる。前記医薬組成物は、経口（経腸、舌下または直腸）、局所（経皮または眼科）、非経口（皮内、皮下、筋肉内、静脈内または腹腔内）用、または呼吸器樹内の直接投与のための任意の固体、半固体または液体組成物を含む。
【００７７】
医薬組成物は、ヒトを含むその治療および／または予防を必要とする対象に、薬学的に許容される賦形剤または担体と、脂質ナノ粒子とを含む。当業者はどのような追加の成分が使用できるかを判断することができ、またそれらが必要な場合、それらの多くが一般的に医薬組成物に使用されている。
【００７８】
本発明の説明書において、用語「治療有効量」とは、一回の投与で細菌感染に由来する１つまたは複数の症状を十分に予防または治療するのに組成物の量である。本発明に従って特定の投与用量は、事例に関する特定の状況、例えば投与される化合物、投与経路、特定の治療条件およびこのような考慮に応じて決定される。
【００７９】
用語「薬学的に許容される賦形剤または担体」は、薬学的に許容される物質、組成物またはビヒクルを意味する。各組成成分は、前記医薬組成物の他の成分と相容できるという意味で、薬学的に許容されなければならない。また、それらは、合理的なリスク・ベネフィット比に応じて、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性や他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび動物の組織または器官と接触して使用するのに適していなければならない。
【００８０】
前記医薬組成物は、他の成分、例えば、限定されないがシクロデキストリン、レシチンおよび／もしくはグリセロールモノステアレートを含む粘度調節剤、防腐剤、可溶化剤；限定されないがロイシンを含む抗凝集剤；ならびに／または限定されないがアルギン酸塩、アルギン酸および／もしくはトレハロースを含む安定剤、を含むことができる。これらの成分は、前記成分の性質に応じて、親油性または親水性相に添加される。
【００８１】
特定の実施形態において、医薬組成物は、ポリミキシン、凍結保護剤、抗ケーキング剤および他の賦形剤の脂質ナノ粒子を含む。医薬の形態は、直接投与用の溶液中または乾燥粉末に噴霧化される粉末であってもよい。
【００８２】
好ましい実施形態において、医薬組成物は、気道への吸入により投与される。
【００８３】
吸入による投与は、本発明のナノ粒子および／または医薬組成物および／または薬剤を単独で、または他の薬物と一緒に含有する液体または固体の調製物である。吸入されるための粒子のサイズは、それらが呼吸樹の下側部分に分布されるために適すべきであり、また、粒径を測定するための適切な方法によって制御されるべきである。当業者は、蒸気またはエアロゾルまたは粉末を用いて、最適な投与に適用するプロセスおよび／またはデバイスを判断することができる。
【００８４】
本発明の別の態様では、前記吸入粒径が１μｍ〜１０μｍ、好ましくは２μｍ〜８μｍ、特に好ましくは３μｍ〜５μｍ、から構成される。前記サイズであれば、治療有効量で完全なる肺泡堆積および肺保持が可能である。特定の実施形態において、前記サイズは、乾燥粉末として投与される場合ではナノ粒子を凝集させることにより、または噴霧によって投与される場合では適当な担体と噴霧を生成することによって得られる。
【００８５】
本発明の特徴および利点を明らかに示すいくつかの例示的な実施例を以下で説明する。しかしながら、これらの実施例は、特許請求の範囲に定義された本発明の目的を限定するものと解釈してはならない。
【実施例】
【００８６】
実施例１：溶媒乳化／蒸発法を用いた抗生物質を含む脂質ナノ粒子の調製
実施例１ａ：
コリスチメテートナトリウム１０ｍｇを、１００ｍｇの５％のステアリン酸グリセリル（例えばＰｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ  ５）のジクロロメタン（最終体積２ｍＬ）溶液中に混合した。
【００８７】
一方、界面活性剤の水溶液（１％のポロキサマー１８８および１％のポリソルベート８０）を調製した。水相を油相に添加し、そして混合物を３０秒間２０Ｗで超音波処理することにより乳化させた。次に、それを２時間磁気撹拌し、溶媒を蒸発させた。
【００８８】
蒸発後、得られたナノ粒子を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ウルトラ（ミリポア）フィルタを用いて１５分間２５００ｒｐｍで３回遠心分離することにより洗浄した。
【００８９】
実施例１ｂ：
これらのナノ粒子の一部を、次の手順で処理し凍結乾燥した：
ａ）脂質画分の総重量に対して１５％のトレハロースを添加した。
ｂ）−２０℃で、その後、−８０℃で凍結した。
ｃ）１０，０００ｍｂａｒの圧力、−５０℃で３時間凍結した。
ｄ）−５０℃で０．２０ｍｂａｒの圧力を得るまで真空にした。
ｅ）０．２０ｍｂａｒの圧力、−５０℃で５時間乾燥した。
ｆ）０．２０ｍｂａｒの圧力、２０℃で７時間乾燥した。
ｇ）常圧、２０℃で２４時間乾燥した。
【００９０】
実施例２：ホットメルト均質化技術を用いた抗生物質を含む脂質ナノ粒子の調製
実施例２ａ：
固体脂質の融点よりわずかに高い温度で、コリスチメテートナトリウム１００ｍｇと一緒に、Ｐｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ  ５とＭｉｇｌｙｏｌ（登録商標）８１２との１０：１の割合での混合物１０００ｍｇを調製した。
【００９１】
一方、界面活性剤の水溶液（０．６％のポロキサマー１８８、および１．３％のポリソルベート８０）を調製した。
【００９２】
脂質溶液および水性溶液を同じ温度に加熱した（脂質の融点よりも５℃〜１０℃高い程度の温度に）。
【００９３】
水相を油相に添加し、そして混合物を１５秒間２０Ｗで超音波処理することにより乳化させた。得られたエマルジョンを４℃で１２時間保存し、脂質が再結晶およびナノ粒子を形成できるようにした。
【００９４】
得られたナノ粒子を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ウルトラ（ミリポア）フィルタを用いて１５分間２５００ｒｐｍで３回遠心分離することにより洗浄した。
【００９５】
実施例２ｂ：
これらのナノ粒子の一部を、実施例１ｂに記載された手順で処理し、凍結乾燥した。
【００９６】
実施例３（参考例）：抗生物質を含まない脂質ナノ粒子の調製
いくつかのバッチで、実施例２に記載の方法に従って、固体脂質に対する液体脂質の異なる重量比を有する、かつ抗生物質を有しない脂質ナノ粒子を調製した。比率は以下のとおりであった：０．５：１０、１：１０、２．５：１０および５：１０。
【００９７】
実施例４：ナノ粒子の特性解析
粒径およびゼータ電位を、ゼータサイザーナノＺＳを用いて解析した。以下の表に、実施例１、２及び３に従って製造されたバッチを用いて得られた平均結果を記載する：
【００９８】
【表１】
2016525506.tif 000003
【００９９】
この表から、良好なナノ粒子安定性と均一性のための最適なサイズ、ゼータ電位およびＰＤＩを有するナノ粒子が得られたことは分かる。
【０１００】
実施例５：カプセル化効率
抗生物質のカプセル化効率を、実施例１および２に記載の洗浄工程後の上澄液中に存在する抗生物質の量を測定することによって確認した。上澄液中に存在する抗生物質は、Ｗａｔｅｒｓ  １５２５  ＨＰＬＣバイナリポンプ（ウォーターズ社、ミルフォード、米国）、ウォーターズ２４８７紫外線検出器およびウォーターズ７１７プラスオートインジェクターを用いてＨＰＬＣにより測定した。Ｎｏｖａｐａｋ  Ｃ１８×１５０ｎｍ  ポアサイズ４μｍカラムを使用した。
【０１０１】
移動相を、７７％の水溶液と２３％のアセトニトリルとから作った。水相を、硫酸ナトリウム（７．１ｇ）と、酢酸（０．６ｇ）と、リン酸（２．２ｇ）と、を溶解することによって調製し、トリエチルアミン水溶液１リットルでｐＨを２．５に調整した。コリスチメテートナトリウムは、２０６ｎｍの波長で検出された。流量は、定組成溶離１．５ｍｌ／分であった。試料５０μｌを水に溶解し注入した。１００〜８００μｇ／ｍｌでは線形測定として観察され、干渉が検出されなかった。
【０１０２】
カプセル化効率は次の式を用いて決定した：
【０１０３】
【数１】
2016525506.tif 000004
【０１０４】
実施例１に記載の製造方法に従って製造されたバッチは、８０±７％の平均値を示し、実施例２に記載の方法に従って製造されたバッチは、９５±４％の平均値を示した。これらの値から、製造方法の有効性は１００％に近い値を有し、製造プロセスに加えた抗生物質が最大限の利用が確保されることを示唆する。
【０１０５】
実施例６：最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定するためのインビトロ分析
嚢胞性線維症の患者３１人から取得した１０４コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬの３１緑膿菌株（そのうち１３株は粘液生産者である）を、コリスチメテートナトリウム、並びに実施例１ｂおよび２ｂにより得られた異なる濃度のナノ粒子（０．２５未満、０．２５、０．５、１、２、４、８および３２／ｍｌ）の存在下、、陽イオン調整ミューラーヒントンブロス（Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  ｂｒｏｔｈ，  ｃａｔｉｏｎ−ａｄｊｕｓｔｅｄ、ＭＨＢＣＡ）培地（リットル当たり２０〜２５ｍｇのカルシウム、およびリットル当たり１０ｍｇ〜１２．５ｍｇのマグネシウムに相当）中３７℃で２４時間インキュベートして、緑膿菌の結果の再現性を確保した。
【０１０６】
コリスチメテートナトリウムの場合は、２μｇ／ｍｌのＭＩＣが４８％の株において得られ、１μｇ／ｍｌのＭＩＣが２５％の株において得られ０．５μｇ／ｍｌのＭＩＣが１６％の株において得られた。４μｇ／ｍｌのＭＩＣが、残りの株において得られた。
【０１０７】
実施例１ｂに従って得られたナノ粒子の場合は、２μｇ／ｍｌのＭＩＣが５２％の株において得られ、１μｇ／ｍｌのＭＩＣが２５％の株において得られ、０．５μｇ／ｍｌのＭＩＣが１３％の株において得られた。４μｇ／ｍｌのＭＩＣが、残りの株において得られた。
【０１０８】
実施例２ｂに従って得られたナノ粒子の場合は、１μｇ／ｍｌのＭＩＣが４２％の株において得られ、０．５μｇ／ｍｌのＭＩＣが２３％の株において得られ、０．２５μｇ／ｍｌのＭＩＣが１０％の株において得られ、０．２５μｇ／ｍｌ未満のＭＩＣが３％の株において得られ、２μｇ／ｍｌのＭＩＣが１６％の株において得られ、４μｇ／ｍｌより高いＭＩＣが、残りの株において得られた。
【０１０９】
これらの結果は、本発明のナノ粒子は、遊離抗生物質よりも良好なＭＩＣ値を有することを示している。
【０１１０】
実施例７：放出研究
一方で、実施例１ｂに記載の方法に従って調製したナノ粒子サンプル２５ｍｇを、他方で、実施例２ｂに記載した方法に従って調製したナノ粒子サンプル２５ｍｇを、それぞれ５ｍｌのＰＢＳ中でインキュベートした。サンプルは、事前に確立された回数、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ウルトラ（ミリポア）フィルタを用いて１５分間遠心分離した。上澄液中に存在する抗生物質を、実施例５に記載のＨＰＬＣにより測定した。遠心分離によって除去されたＰＢＳを、新しいＰＢＳに交換した。図４は、各種類のナノ粒子についての、時間（ｈｏｕｒｓ）に対する、ナノ粒子にカプセル化された抗生物質の総量に占める放出された抗生物質の百分率を示す。
【０１１１】
それらの大きさを考慮すると、脂質ナノ粒子は大きな比表面積を有する。それらがＰＢＳに接触している場合には、ナノ粒子表面に結合しているか、またはナノ粒子表面に非常に近い薬物が最初に放出される。この最初の迅速な放出相はバーストと呼ばれる。第二段階で、活性成分は、分解／侵食または粒子コアの膨潤によって、徐放相を生じて放出される。抗菌療法の場合には、抗生物質のレベルは、インビトロで緑膿菌細菌の増殖を阻害するために最適であった。
【０１１２】
実施例８：ＣＤ１マウスにおける実施例１ｂおよび２ｂに従って製造されたナノ粒子のインビボ毒性分析および分布
本発明のナノ粒子のインビボ毒性および有効性分析を行うためには、げっ歯動物感染モデルを確立する必要があった。粘膜を生成する、マイクロスフェアに含まれる緑膿菌を異なる濃度でＣＤ１マウスに気管内投与した（濃度１：５×１０４ＣＦＵ、濃度２：２．４×１０７ＣＦＵ、および濃度３：３．８９ｘ１０１０ＣＦＵ）。ここで、前記緑膿菌は嚢胞性線維症患者から得られ、ＰＢＳに懸濁された。各げっ歯類に異なる濃度を投与することで、げっ歯類の即死を引き起こすことなく適切な肺感染症を発症する最適な濃度を確立する。マウスは３日を超えて生き残り、かつそれらは肺感染症を有していたことが屠殺後に確認されたことから、最適濃度は２．４×１０７ＣＦＵであると結論づけた。
【０１１３】
実施例１ｂおよび２ｂに従って製造されたナノ粒子の気管内投与の毒性試験を行った。ＰＢＳ  ５０μｌ中の１．２ｍｇナノ粒子（過剰な混合物の密度を防止するための最適な量）を、１６匹のＣＤ１マウスの群に投与した。また、それに応じて製品を投与しない対照群（５匹）を設定した。投与した後の最大３日間、すべてのマウスは、刺激に応答し、正常に動いて、標準的な動きを示した。その三日間の後、マウスを屠殺し、気管支肺胞洗浄を実施し、肺サンプルを得て、それらの解剖学−病理学的研究の分析のために調製した。サンプルの研究では、研究組織内に本発明のナノ粒子によって引き起こされ得る任意の炎症や損傷が発見されなかった。
【０１１４】
さらに、投与技術が有効であったこと、およびマイクロスフェアが効果的に肺の大部分に堆積することを確認するために、蛍光試薬または蛍光団（励起波長：６３０−６６０ｎｍおよび発光波長６７０−７２０ｎｍ）搭載の５０μｌ中の６μｍマイクロスフェア（感染を誘導するために使用されるものに相当）を投与した。図５は、１×１０６個蛍光マイクロスフェアを気管内投与した後のＣＤ１マウスの肺の画像を示している。動物を、マイクロスフェアを投与して５分後に屠殺した。マイクロスフェア（ＡｌｉｇｎＦｌｏｗＴＭポリスチレンマイクロスフェア  直径６．０μｍ、λｅｘ：６３０−６６０ｎｍ、λｅｍ：６７０−７２０ｎｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を、５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁して投与した。位置特定はパール・インパルスイメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ＵＳＡ）を用いて行った。画像は、げっ歯類の肺全体１における蛍光試薬２の均一な分布を示している。
【０１１５】
実施例９：実施例１ｂおよび２ｂに従って製造されたナノ粒子のＣＤ１マウスにおけるインビボ有効性分析
５匹のマウスを対照群として使用し、また、粘膜を生成する緑膿菌株の細菌接種で感染させた６４匹のマウスを使用した。前記緑膿菌株は、実施例８で説明した濃度が２．４×１０７ＣＦＵのものであった。感染した動物は、８匹の４群に分け、媒体（ＰＢＳ）と、遊離抗生物質（コリスチメテートナトリウム）と、実施例３に従って製造されたナノ粒子と、実施例１ｂおよび２ｂに従って製造されたナノ粒子の形態の等量の抗生物質と、をそれぞれ気管内接種後の第３日目に動物に投与した。投与量は、マウスの体重を考慮し、ヒトにおける推奨用量を調整して算出した（３０００  ＩＵ、０．２４ｍｇの遊離コリスチメテートナトリウムに相当、２．８８ｍｇの実施例１ｂに従って製造されたナノ粒子に相当、および２．５２ｍｇの実施例２ｂに従って製造されたナノ粒子に相当）。
【０１１６】
麻酔および気管内投与の継続投与による過剰な被害をマウスに与えることを防ぐために、一日一回投与し、治療を３日間継続した。前記時間が経過した後、動物を屠殺し、肺を抽出して均質化し、そして緑膿菌の細菌計数を可能とするために寒天培地を調製した。得られた結果から、本発明のナノ粒子は、対応する遊離コリスチメタートよりもカウントが著しく低いため、高い殺菌効果を有すると結論できた。下記の表は、それぞれの場合において得られた結果の詳細を示す。
【０１１７】
【表２】
2016525506.tif 000005
【０１１８】
実施例１０：ヒト細胞中における実施例１ｂおよび２ｂに従って製造されたナノ粒子のメジアン阻害濃度値（ＩＣ５０）分析
メジアン阻害濃度値（ＩＣ５０）は、５０％の細胞集団の成長を阻害するのに必要な分析サンプルの濃度を意味する。今回の場合、細胞生存率の分析はヒト細胞（ヒト腺癌の上皮細胞に由来する不死化されたＡ５４９およびＨ４４１細胞株）で実行されるため、毒性マーカーとしてはＩＣ５０値を評価した。細胞（９６ウェルプレート中でウェルあたり１２，０００細胞の密度で）を、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間、ダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させ、前記培地には１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）と、１％のＬ−グルタミンと、１％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液と、１％のＭＥＭ非必須アミノ酸溶液×１００（ＭＥＭ−ＮＥＡＡ）と、を添加している。１０ｍｇ／ｍｌから０．０７８１２ｍｇ／ｍｌまで濃度を漸減させたナノ粒子１ｂおよび２ｂ並びに遊離コリスチメテートナトリウムを前記細胞に添加し、０．５％の血清を補充したＤＭＥＭで希釈し、そして、３７℃±２℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。細胞生存率は、洗浄工程後に細胞計数キット８（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ  ８）を用いて評価した。そのために、１０％のＣＣＫ−８試薬を各ウェルに添加し、３７℃±２℃および５％ＣＯ２で、４時間湿式チャンバー内でインキュベートした。その後、吸光度を、４５０ｎｍおよび参照波長として６５０ｎｍで読み取った。前記吸光度は、培養中の生存細胞の数に直接比例した。その結果は、生存細胞の５０％、すなわちこの投与量は集団の５０％の成長を阻害したことを意味する。試験は各サンプルについて三回ずつ行った。この研究は、抗生物質のナノカプセル化がそのＩＣ５０値を下げることと、そのゆえ毒性の少ない処方を提供できたことを明らかにした。また、このＩＣ５０値はＭＩＣとして報告された１〜２μｇ／ｍｌよりも多いことを強調すべきである。以下の表に、それぞれの場合について得られた結果の詳細を示す：
【０１１９】
【表３】
2016525506.tif 000006
【図１】
2016525506.tif 000007
【図２】
2016525506.tif 000008
【図３】
2016525506.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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2016525506.tif 000013
2016525506.tif 000014
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