(57)【要約】本発明はブロモドメイン機能を阻害することによってＴｈ２サイトカイン媒介性疾患を治療する方法を提供する。本発明は治療に有効な量のＢＲＤ７及び／またはＢＲＤ９の阻害剤を哺乳動物に投与することを含む哺乳動物のＴＨ２疾患を治療する方法を提供する。本発明はこのほか、ＴＨ２疾患の予防的または治療的処置のためのＢＲＤ７及び／またはＢＲＤ９の阻害剤を提供する。本発明はこのほか、ＴＨ２疾患の治療のための薬剤を調製するためにＢＲＤ７及び／またはＢＲＤ９の阻害剤の使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療に有効な量のＢＲＤ７またはＢＲＤ９の阻害剤を哺乳動物に投与することを含む前記哺乳動物のＴＨ２疾患を治療する方法。
【請求項２】
前記阻害剤がＢＲＤ７を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記阻害剤がＢＲＤ９を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記阻害剤がＢＲＤ７及びＢＲＤ９を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記薬剤がブロモドメインに結合する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記薬剤がＢＲＤ７またはＢＲＤ９のアイソフォーム１に結合する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記薬剤がＢＲＤ７及びＢＲＤ９のアイソフォーム１に結合する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記阻害剤がｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、小分子、または大員環である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＴＨ２疾患が過剰ＴＨ２サイトカインに関連する免疫関連疾患または障害である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴＨ２疾患がアトピー性皮膚炎、アレルギー、アレルギー性鼻炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、好酸球増多症候群、好酸球性食道炎、チャーグ−シュトラウス症候群、及び鼻ポリープから選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＨ２疾患が呼吸障害である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＨ２疾患が喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、及び気道炎症を伴う病態から選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＴＨ２疾患が好酸球障害である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記好酸球障害が喘息、アトピー性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、非アレルギー性鼻炎、慢性好酸球性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、小児脂肪便症、チャーグ−シュトラウス症候群、好酸球性筋肉痛症候群、好酸球増多症候群、浮腫反応、蠕虫感染症、オンコセルカ皮膚炎及び好酸球関連消化管障害から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記好酸球障害が好酸球性食道炎、好酸球性胃炎、好酸球性胃腸炎、好酸球性腸炎及び好酸球性結腸炎、鼻マイクロポリープ及びポリープ、アスピリン不耐症、喘息及び閉塞性睡眠時無呼吸から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記阻害剤が他のブロモドメイン含有タンパク質よりブロモドメイン含有タンパク質ＢＲＤ７に対して少なくとも５倍選択的である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記阻害剤が他のブロモドメイン含有タンパク質よりブロモドメイン含有タンパク質ＢＲＤ９に対して少なくとも５倍選択的である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記阻害剤が他のブロモドメイン含有タンパク質よりブロモドメイン含有タンパク質ＢＲＤ７及びＢＲＤ９に対して少なくとも５倍選択的である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記阻害剤結合が他のブロモドメインよりＢＲＤ７に対して最少５倍選択的である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記阻害剤結合が他のブロモドメインよりＢＲＤ９に対して最少５倍選択的である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記阻害剤結合が他のブロモドメインよりＢＲＤ７及びＢＲＤ９に対して最少５倍選択的である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記阻害剤がＩＬ−４、ＩＬ−５、またはＩＬ−１３の産生を阻害する、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ＴＨ２疾患の予防的または治療的処置のためのＢＲＤ７またはＢＲＤ９の阻害剤。
【請求項２４】
前記阻害剤がＢＲＤ７を阻害する、請求項２３に記載の阻害剤。
【請求項２５】
前記阻害剤がＢＲＤ９を阻害する、請求項２３に記載の阻害剤。
【請求項２６】
前記阻害剤がＢＲＤ７及びＢＲＤ９を阻害する、請求項２３に記載の阻害剤。
【請求項２７】
前記薬剤がブロモドメインに結合する、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項２８】
前記薬剤がＢＲＤ７またはＢＲＤ９のアイソフォーム１に結合する、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項２９】
前記薬剤がＢＲＤ７及びＢＲＤ９のアイソフォーム１に結合する、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項３０】
前記阻害剤がｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、小分子、または大員環である、請求項２３から２９のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項３１】
前記ＴＨ２疾患が過剰ＴＨ２サイトカインに関連する免疫関連疾患または障害である、請求項２３から３０のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項３２】
前記ＴＨ２疾患がアトピー性皮膚炎、アレルギー、アレルギー性鼻炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、好酸球増多症候群、好酸球性食道炎、チャーグ−シュトラウス症候群、及び鼻ポリープから選択される、請求項２３から３０のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項３３】
前記ＴＨ２疾患が呼吸障害である、請求項２３から３０のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項３４】
前記ＴＨ２疾患が喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、及び気道炎症を伴う病態から選択される、請求項２３から３０のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項３５】
ＴＨ２疾患の治療のための薬剤を調製するためのＢＲＤ７またはＢＲＤ９の阻害剤の使用。
【請求項３６】
前記阻害剤がＢＲＤ７を阻害する、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
前記阻害剤がＢＲＤ９を阻害する、請求項３５に記載の使用。
【請求項３８】
前記阻害剤がＢＲＤ７及びＢＲＤ９を阻害する、請求項３５に記載の使用。
【請求項３９】
前記薬剤がブロモドメインに結合する、請求項３５から３８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４０】
前記薬剤がＢＲＤ７またはＢＲＤ９のアイソフォーム１に結合する、請求項３５から３８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４１】
前記薬剤がＢＲＤ７及びＢＲＤ９のアイソフォーム１に結合する、請求項３５から３８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４２】
前記阻害剤がｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、小分子、または大員環である、請求項３５から４１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４３】
前記ＴＨ２疾患が過剰ＴＨ２サイトカインに関連する免疫関連疾患または障害である、請求項３５から４２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４４】
前記ＴＨ２疾患がアトピー性皮膚炎、アレルギー、アレルギー性鼻炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、好酸球増多症候群、好酸球性食道炎、チャーグ−シュトラウス症候群、及び鼻ポリープから選択される、請求項３５から４２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４５】
前記ＴＨ２疾患が呼吸障害である、請求項３５から４２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４６】
前記ＴＨ２疾患が喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、及び気道炎症を伴う病態から選択される、請求項３５から４２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４７】
ＢＲＤ７またはＢＲＤ９の阻害剤及び薬学的許容キャリアを含む、ＴＨ２疾患の治療に使用するための薬剤組成物。
【請求項４８】
前記阻害剤がＢＲＤ７を阻害する、請求項４７に記載の薬剤組成物。
【請求項４９】
前記阻害剤がＢＲＤ９を阻害する、請求項４７に記載の薬剤組成物。
【請求項５０】
前記阻害剤がＢＲＤ７及びＢＲＤ９を阻害する、請求項４７に記載の薬剤組成物。
【請求項５１】
前記薬剤がブロモドメインに結合する、請求項４７から５０のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
【請求項５２】
前記薬剤がＢＲＤ７またはＢＲＤ９のアイソフォーム１に結合する、請求項４７から５０のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
【請求項５３】
前記薬剤がＢＲＤ７及びＢＲＤ９のアイソフォーム１に結合する、請求項４７から５０のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
【請求項５４】
前記阻害剤がｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、小分子、または大員環である、請求項４７から５３のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
【請求項５５】
ＴＨ２疾患を治療するのに有用な化合物を同定する方法であって、前記化合物がＢＲＤ７またはＢＲＤ９を阻害するかどうかを決定することを含む、前記方法。
【請求項５６】
前記化合物がＢＲＤ７を阻害するかどうかを決定することを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記化合物がＢＲＤ９を阻害するかどうかを決定することを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記決定することが前記化合物をＢＲＤ７またはＢＲＤ９と接触させること、及び前記ＢＲＤ７またはＢＲＤ９の活性が低下するかどうかを測定することを含む、請求項５５から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記化合物をＢＲＤ７と接触させる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記化合物をＢＲＤ９と接触させる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記測定することが実施例１に記載したとおりに実施される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
哺乳動物がＩＬ−４、ＩＬ−５、またはＩＬ−１３を産生することを阻害する方法であって、前記哺乳動物にＢＲＤ７またはＢＲＤ９の阻害剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項６３】
前記阻害剤がＢＲＤ７を阻害する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記阻害剤がＢＲＤ９を阻害する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記阻害剤がＢＲＤ７及びＢＲＤ９を阻害する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記阻害剤がブロモドメインに結合する、請求項６２から６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記阻害剤がＢＲＤ７またはＢＲＤ９の少なくともアイソフォーム１に結合する、請求項６２から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記阻害剤がＢＲＤ７及びＢＲＤ９の少なくともアイソフォーム１に結合する、請求項６２から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記阻害剤がｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、小分子、または大員環である、請求項６２から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記哺乳動物は、かかる治療の必要な哺乳動物である、請求項１から２２または６２から６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記阻害剤のＢＲＤ７及び／またはＢＲＤ９に対するＩＣ５０が、１０μＭ未満、例えば、１μＭ未満、例えば、１００ｎＭ未満、例えば、１０ｎＭ未満、例えば、１ｎＭである、請求項１から７０のいずれか一項に記載の方法、阻害剤、使用または組成物。
【請求項７２】
前記阻害剤のＢＲＤ７及び／またはＢＲＤ９に対する結合親和性Ｋｄが、１，０００ｎｍ未満、例えば、５００ｎＭ未満、例えば、１００ｎＭ未満、例えば、５０ｎＭ未満である、請求項１から７１のいずれか一項に記載の方法、阻害剤、使用または組成物。
【請求項７３】
前記阻害剤のＢＲＤ７及び／またはＢＲＤ９に対する結合親和性が５００ｎＭ〜１ｐＭである、請求項１から７１のいずれか一項に記載の方法、阻害剤、使用または組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、２０１３年３月１５日に出願した米国特許出願第６１／７９８，６４４号の優先権の利益を主張し、この出願は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
クロマチンは、染色体を構成するＤＮＡ及びタンパク質の複雑な複合体である。クロマチンは真核細胞の核内にみられ、ヘテロクロマチン（凝縮した）及びユークロマチン（伸長した）形態に分けられる。クロマチンの主成分はＤＮＡ及びタンパク質である。ヒストンがクロマチンの主タンパク質成分であり、ＤＮＡが巻き付くスプールの役割を担う。クロマチンの機能は、ＤＮＡが細胞に収まるようにより小さな体積に包むこと、ＤＮＡを有糸分裂及び減数分裂が可能となるよう強化すること、ならびに発現及びＤＮＡ複製を制御する機序としての役割を担うことである。クロマチン構造はヒストンタンパク質に対する一連の翻訳後修飾によって制御される。ヒストンタンパク質としては、特にヒストンＨ３及びＨ４であり、最も一般にはコアヌクレオソーム構造を越えて伸長する「ヒストンテール」内のヒストンタンパク質である。ヒストンテールはタンパク質−タンパク質相互作用に空いている傾向があり、このほか翻訳後修飾を最も受けやすいヒストンの一部である。この修飾としてはアセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化が挙げられる。このエピジェネティックマークは特異的な酵素によって書かれ及び消され、ヒストンテール内の特異的な残基上にタグを付け、これによりエピジェネティックコードを形成し、その後、それは細胞により解釈され、クロマチン構造の遺伝子特異的な調節及びこれによる転写が可能となる。
【０００３】
タンパク質の全クラスのうち、ヒストンが翻訳後修飾を最も受けやすい。ヒストン修飾が特定の刺激に反応して付加されるか、除去される可能性があり、この修飾によりクロマチンに対する構造的変化及び遺伝子転写の変化の双方を指示するため、ヒストン修飾は動的である。酵素の特異的なクラスは、すなわちヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）及びヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、アセチル化または脱アセチル化特異的ヒストンリジン残基（Ｓｔｒｕｈｌ  Ｋ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１９８９，１２，５，５９９〜６０６）である。
【０００４】
ブロモドメインはおよそ１１０アミノ酸長であり、多くのクロマチン関連タンパク質にみられ、およそ７０ヒトタンパク質に確認されており、他のタンパク質モチーフに隣接していることが多い（Ｊｅａｎｍｏｕｇｉｎ  Ｆ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９９７，２２，５，１５１〜１５３；及びＴａｍｋｕｎＪ．Ｗ．ら，Ｃｅｌｌ，１９９２，７，３，５６１〜５７２）。ブロモドメイン及び修飾ヒストンの間の相互作用がクロマチン構造変化及び遺伝子調節を支える重要な機序となる可能性がある。ブロモドメイン含有タンパク質は癌、炎症及びウイルス複製を含む疾患プロセスに関わっている。
現在、ＴＨ２サイトカインに関連する疾患、例えば、免疫関連疾患、アレルギー性疾患、呼吸障害、及び好酸球関連疾患を治療する方法が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｔｒｕｈｌ  Ｋ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１９８９，１２，５，５９９〜６０６
【非特許文献２】Ｊｅａｎｍｏｕｇｉｎ  Ｆ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９９７，２２，５，１５１〜１５３
【非特許文献３】ＴａｍｋｕｎＪ．Ｗ．ら，Ｃｅｌｌ，１９９２，７，３，５６１〜５７２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書に記載したように、ＢＲＤ７及び／またはＢＲＤ９ブロモドメインがＴｈ２サイトカイン、特にＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３の発現に予期しない重要な役割を担うことが示されている。したがって、本発明は治療に有効な量のＢＲＤ７及び／またはＢＲＤ９の阻害剤を哺乳動物に投与することを含む哺乳動物のＴＨ２疾患を治療する方法を提供する。
【０００７】
本発明はこのほか、ＴＨ２疾患の予防的または治療的処置のためのＢＲＤ７及び／またはＢＲＤ９の阻害剤を提供する。
【０００８】
本発明はこのほか、ＴＨ２疾患の治療のための薬剤を調製するためにＢＲＤ７及び／またはＢＲＤ９の阻害剤の使用を提供する。
【０００９】
本発明はこのほか、ＢＲＤ７及び／またはＢＲＤ９の阻害剤及び薬学的許容キャリアを含む、ＴＨ２疾患の治療に使用するための薬剤組成物を提供する。
【００１０】
本発明はこのほか、化合物がＢＲＤ７及び／またはＢＲＤ９を阻害するかどうかを決定することを含むＴＨ２疾患を治療するのに有用な化合物を同定する方法を提供する。
【００１１】
本発明はこのほか、哺乳動物にＢＲＤ７及び／またはＢＲＤ９の阻害剤を投与することを含む、哺乳動物がＩＬ４、ＩＬ５、またはＩＬ１３を産生することを阻害する方法を提供する。
【００１２】
本発明はこのほか、ＩＬ−４、ＩＬ−５、及び／またはＩＬ−１３によって媒介されたＴＨ２疾患（すなわち、ＩＬ−４媒介性疾患、ＩＬ−５媒介性疾患、またはＩＬ−１３媒介性疾患）を治療する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１ａ】４８時間、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体を使用して、ＤＭＳＯ、または異なる濃度の３つのＢＲＤ７／９阻害化合物の存在下で、ヒトＴ  Ｂｌａｓｔｓを刺激した。このほか、ＤＭＳＯの存在下で、刺激していない対照の細胞が含まれた。刺激後に、細胞上澄みを収集し、Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームを使用してサイトカイン濃度を測定した。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、細胞生存性を決定した。図１ａは、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（ＣＴＧ）データの他にＩＬ−４、ＩＬ−５、ＴＮＦ、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７Ｆの濃度に関するデータを示す。図１ｂはさらに９つのサイトカインに関するデータを示す。
【図１ｂ】４８時間、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体を使用して、ＤＭＳＯ、または異なる濃度の３つのＢＲＤ７／９阻害化合物の存在下で、ヒトＴ  Ｂｌａｓｔｓを刺激した。このほか、ＤＭＳＯの存在下で、刺激していない対照の細胞が含まれた。刺激後に、細胞上澄みを収集し、Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームを使用してサイトカイン濃度を測定した。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、細胞生存性を決定した。図１ａは、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（ＣＴＧ）データの他にＩＬ−４、ＩＬ−５、ＴＮＦ、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７Ｆの濃度に関するデータを示す。図１ｂはさらに９つのサイトカインに関するデータを示す。
【図２ａ】健常ボランティアの末梢血から分離したヒトナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋）細胞をＴｈ２細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで分極した。６日間の分化後、細胞を洗浄し、４０時間、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体を使用して、ＤＭＳＯ、または異なる濃度の化合物ＢＲＤ７／９（３）及びＢＲＤ７／９（４）の存在下で、再刺激した。このほか、ＤＭＳＯの存在下で、刺激していない対照の細胞が含まれた。Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームを使用して、上澄みのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（ＣＴＧ）及びサイトカイン濃度を測定した。図２ａはＩＬ−５及びＴＮＦデータとともにＣＴＧデータを示す。図２ｂはさらに９つのサイトカインに関するデータを示す。
【図２ｂ】健常ボランティアの末梢血から分離したヒトナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋）細胞をＴｈ２細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで分極した。６日間の分化後、細胞を洗浄し、４０時間、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体を使用して、ＤＭＳＯ、または異なる濃度の化合物ＢＲＤ７／９（３）及びＢＲＤ７／９（４）の存在下で、再刺激した。このほか、ＤＭＳＯの存在下で、刺激していない対照の細胞が含まれた。Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームを使用して、上澄みのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（ＣＴＧ）及びサイトカイン濃度を測定した。図２ａはＩＬ−５及びＴＮＦデータとともにＣＴＧデータを示す。図２ｂはさらに９つのサイトカインに関するデータを示す。
【図３】健常ボランティアの末梢血から分離したヒトナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋）細胞をＴｈ２細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで分極した。６日間の分化後、細胞を洗浄し、４０時間、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体を使用して、ＤＭＳＯ、または異なる濃度の化合物ＢＲＤ７／９（３）及びＢＲＤ７／９（４）の存在下で、再刺激した。このほか、ＤＭＳＯの存在下で、刺激していない対照の細胞が含まれた。Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォーム及びＡｌｐｈａＬＩＳＡ検出方法を使用して、上澄みのＩＬ−５濃度を測定した。
【図４】健常ボランティアの末梢血から分離したヒトナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋）細胞をＴｈ２細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで分極した。６日間の分化後、細胞を洗浄し、２４時間、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体を使用して、ＤＭＳＯ、または１ｕＭ濃度の化合物ＢＲＤ７／９（４）、ＢＲＤ７／９（５）またはＢＲＤ７／９（６）の存在下で、再刺激した。このほか、ＤＭＳＯの存在下で、刺激していない対照の細胞が含まれた。各試料のＧＡＰＤＨの濃度に標準化したＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＩＬ−５及びＩＬ−１３のｍＲＮＡの濃度を計算した。対照の刺激していない細胞（ＤＭＳＯ（−））に対する誘導倍率を計算した。
【図５】健常ボランティアの末梢血から分離したヒトナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋）細胞をＴｈ２細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで分極した。６日間の分化後、細胞を洗浄し、４０時間、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体を使用して、ＤＭＳＯの存在下で、またはさまざまな生化学的力価を有する異なる濃度の８つのＢＲＤ７／９化合物の存在下で、再刺激した。このほか、ＤＭＳＯの存在下で、刺激していない対照の細胞が含まれた。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ検出方法を使用して、上澄みのＩＬ−５及びＩＬ−１３濃度を測定した。
【図６】健常ボランティアの末梢血から分離したヒトナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋）細胞をＴｈ１及びＴｈ１７細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで分極した。６日間の分化後、細胞を洗浄し、４０時間、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体を使用して、ＤＭＳＯ、または異なる濃度の化合物ＢＲＤ７／９（３）及びＢＲＤ７／９（４）の存在下で、再刺激した。このほか、ＤＭＳＯの存在下で、刺激していない対照の細胞が含まれた。Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームを使用して、上澄みのＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７Ａ濃度を測定した。細胞生存度として決定されたＣＴＧ。
【図７】ＤＭＳＯ、または１ｕＭ濃度の化合物ＢＲＤ７／９（３）またはＢＲＤ７／９（４）の存在下で、健常ボランティアの末梢血から分離したヒトナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋）細胞をＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７またはＴｒｅｇ細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで分極した。７日間の分化後、細胞を洗浄し、６時間、ＰＭＡ／Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ＋ＧｏｌｇｉＰｌｕｇを使用して、再刺激した。特異的な標識抗体で細胞内細胞染色を実施し、次にＦＡＣＳを行った。Ｆｌｏｊｏソフトウエアを使用して、データ分析し、グラフ化した。
【図８】ＢａｌｂＣマウスの脾臓から分離したマウスナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋）細胞をＴｈ２細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで分極した。４日間の分化後、細胞を洗浄し、４０時間、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体（ｄｙｎａｂｅａｄｓ）を使用して、ＤＭＳＯ、または異なる濃度の化合物ＢＲＤ７／９（３）、ＢＲＤ７／９（４）、ＢＲＤ７／９（６）及びＢＲＤ７／９（８）の存在下で、再刺激した。このほか、ＤＭＳＯの存在下で、刺激していない対照の細胞が含まれた。Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームを使用して、上澄みのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（ＣＴＧ）及びサイトカイン濃度を測定した。
【図９】アイソフォーム１の配列を使用して、ＢＲＤ７（配列番号１）及びＢＲＤ９（配列番号２）の両者のための組み替えブロモドメインタンパク質を生成した。ＢＲＤ７では、ＤＳＦアッセイ法で使用されるタンパク質の一部は、３行目、残基ＥＥＶで開始し、４行目、残基ＱＥＲで終了する。ＢＲＤ９では、使用した部分は３行目、残基ＡＥＮで開始し、４行目、残基ＭＳＫで終了する。
【図１０】阻害剤治療の際のＢＲＤ９の再局在化。可視領域が拡大率１８０倍で示した個々の核である。Ａ．ＤＭＳＯ対照  Ｂ．１０μＭの化合物「Ａ」による治療  Ｃ．１０μＭの化合物ＢＲＤ７／９（１）による治療
【図１１】ＢＲＤ７／９（８）による治療の際のＢＲＤ９の再局在化を表す用量−反応曲線
【発明を実施するための形態】
【００１４】
定義
本明細書に使用する場合、「ＢＲＤ７」は少なくともＢＲＤ７のアイソフォーム１及び／またはそのアイソフォームまたはブロモドメインを含む自然に生じるバリアントのいずれかを含む。ブロモドメインはアセチル化リジン残基（単数または複数）を結合するタンパク質ドメインとして知られる。ヒトＢＲＤ７アイソフォーム１は以下のＱ９ＮＰＩ１−１（ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ９ＮＰＩ１）のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
本明細書に使用する場合、「ＢＲＤ９」は少なくともＢＲＤ９のアイソフォーム１、及び／またはそのアイソフォームまたはブロモドメインを含む自然に生じるバリアントのいずれかを含む。上に記載したように、ブロモドメインはアセチル化リジン残基（単数または複数）を結合するタンパク質ドメインとして知られる。ヒトＢＲＤ９アイソフォーム１は以下のＱ９Ｈ８Ｍ２−５（ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ−ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ９Ｈ８Ｍ２）のアミノ酸配列を含む。
【００１６】
阻害の１つの好ましい実施形態では、阻害剤はＢＲＤ７及び／またはＢＲＤ９のアイソフォーム１に結合する。さらにもう一つの好ましい実施形態では、阻害剤はヒトＢＲＤ７及び／または９のアイソフォーム１に結合する。
【００１７】
本明細書に使用する場合、「ＴＨ２疾患」は、非定型の症状がＴＨ２サイトカインの体内の局所及び／または全身の濃度または活性によって発現する可能性がある、過剰ＴＨ２サイトカイン及び／またはＴＨ２サイトカイン活性に関連する免疫関連疾患または障害である。かかるＴＨ２サイトカインがＴＨ２細胞または他の細胞の型、例えば、生得的リンパ系細胞によって発現する可能性がある。本明細書に使用する場合、ＴＨ２サイトカインは以下のＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３のいずれか１つまたは組み合わせである。特定の実施形態では、ＴＨ２疾患は呼吸障害または好酸球障害である。ＴＨ２疾患の例としては、アトピー性皮膚炎、アレルギー、アレルギー性鼻炎、喘息、繊維症（特発性肺繊維症を含む）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、好酸球増多症候群、好酸球性食道炎、チャーグ−シュトラウス症候群、及び鼻ポリープが挙げられる。
【００１８】
「ＩＬ−４媒介性疾患」は、非定型の症状がＩＬ−４の体内の局所及び／または全身の濃度または活性によって発現する可能性がある、過剰ＩＬ−４濃度または活性に関連する疾患を意味する。ＩＬ−４媒介性疾患の例としては、癌（例えば、非ホジキンリンパ腫、膠芽腫）、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、喘息、繊維症、肺炎症性障害（例えば、肺繊維症例えば、ＩＰＦ）、ＣＯＰＤ、及び肝繊維症が挙げられる。
【００１９】
「ＩＬ−５媒介性疾患」は、非定型の症状がＩＬ−５の体内の局所及び／または全身の濃度または活性によって発現する可能性がある、過剰ＩＬ−５濃度または活性に関連する疾患を意味する。ＩＬ−５媒介性疾患の例としては、癌（例えば、非ホジキンリンパ腫、膠芽腫）、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、喘息、繊維症、肺炎症性障害（例えば、肺繊維症例えば、ＩＰＦ）、ＣＯＰＤ、及び肝繊維症が挙げられる。
【００２０】
「ＩＬ−１３媒介性疾患」は、非定型の症状がＩＬ−１３の体内の局所及び／または全身の濃度または活性によって発現する可能性がある、過剰ＩＬ−１３濃度または活性に関連する疾患を意味する。ＩＬ−１３媒介性疾患の例としては、癌（例えば、非ホジキンリンパ腫、膠芽腫）、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、喘息、繊維症、肺炎症性障害（例えば、肺繊維症例えば、ＩＰＦ）、ＣＯＰＤ、及び肝繊維症が挙げられる。
【００２１】
用語「呼吸障害」には喘息、気管支炎（例えば、慢性気管支炎）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）（例えば、肺気腫（例えば、喫煙誘導肺気腫））、気道炎症を伴う病態、好酸球増多、繊維症及び過剰粘液産生、例えば、嚢胞性繊維症、肺繊維症（例えば、特発性肺繊維症）、及びアレルギー性鼻炎が含まれるが、これらに限定されない。気道炎症を特徴とすることができる疾患の例は、過剰気道分泌、及び喘息を含む気道閉塞、慢性気管支炎、気管支拡張症、及び嚢胞性繊維症である。
【００２２】
用語「好酸球障害」は、非定型の症状が好酸球の体内の局所または全身の濃度または活性によって発現する可能性がある、過剰な好酸球数に関連する障害を意味する。過剰な好酸球の数または活性に関連する障害としては喘息（アスピリン過敏喘息を含む）、アトピー性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎（季節性アレルギー性鼻炎を含む）、非アレルギー性鼻炎、喘息、重症喘息、慢性好酸球性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、小児脂肪便症、チャーグ−シュトラウス症候群（結節性動脈周囲炎の他にアトピー）、好酸球性筋肉痛症候群、好酸球増多症候群、偶発性血管性浮腫を含む浮腫反応、蠕虫感染症、好酸球に保全的役割がある可能性がある場合、オンコセルカ皮膚炎及び好酸球関連消化管障害（好酸球性食道炎、好酸球性胃炎、好酸球性胃腸炎、好酸球性腸炎及び好酸球性結腸炎が挙げられるが、これらに限定されない）、鼻マイクロポリープ及びポリープ、アスピリン不耐症、喘息及び閉塞性睡眠時無呼吸が挙げられるが、これらに限定されない。このほか、好酸球由来分泌産物が、腫瘍の脈管形成及び結合組織形成の促進及び病状、例えば、慢性喘息、強皮症及び心内膜心筋繊維症にみられる線維性反応に関連している（Ｍｕｎｉｔｚ  Ａ、Ｌｅｖｉ−Ｓｃｈａｆｆｅｒ  Ｆ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ２００４；５９：２６８〜７５、Ａｄａｍｋｏら、Ａｌｌｅｒｇｙ２００５；６０：１３〜２２、Ｏｌｄｈｏｆｆら、Ａｌｌｅｒｇｙ２００５；６０：６９３〜６）。他の例としては、癌（例えば、膠芽腫（例えば、多形成膠芽腫）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、喘息、繊維症、肺繊維症（特発性肺繊維症（ＩＰＦ）及び硬化症に続発する肺繊維症を含む）、ＣＯＰＤ、肝繊維症が挙げられる。
【００２３】
本明細書に使用する場合、「阻害剤」は、所与のブロモドメイン含有タンパク質（例えばＢＲＤ７またはＢＲＤ９含有タンパク質）の発現及び／または機能を阻害することができる任意の化合物または治療を含み、遺伝子の転写、ＲＮＡ成熟、ＲＮＡ翻訳、タンパク質の翻訳後修飾、タンパク質をアセチル化リジン標的に結合すること（例えば、本明細書の実施例１に記載した阻害アッセイ）などを阻害する任意の化合物または治療を含む。したがって、「ブロモドメイン含有タンパク質ＢＲＤ７を阻害すること」は、ブロモドメイン含有タンパク質ＢＲＤ７の発現及び／または機能を阻害することを含む。同様に、「ブロモドメイン含有タンパク質ＢＲＤ９を阻害すること」は、ブロモドメイン含有タンパク質ＢＲＤ９の発現及び／または機能を阻害することを含む。例えば、特定の実施形態では、阻害剤は、例えば、本明細書に記載したアッセイを使用して測定できるほどブロモドメイン含有タンパク質の発現レベルまたは生物活性を阻害する。特定の実施形態では、阻害剤はブロモドメイン含有タンパク質の発現レベルまたは生物活性を少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％阻害する。阻害剤は所与のブロモドメイン含有タンパク質（例えばＢＲＤ７またはＢＲＤ９含有タンパク質）の発現及び／または機能を阻害するによってＩＬ−４、ＩＬ−５、及び／またはＩＬ−１３の産生を阻害する可能性がある。
【００２４】
阻害剤は天然または合成由来とすることができる。例えば、阻害剤は核酸、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、または有機化合物とすることができる。１つの実施形態では、阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、小分子、または大員環である。
【００２５】
ＢＲＤ９阻害剤は、一般的にＢＲＤ９ブロモドメインのアセチルリジン結合部位に結合し、タンパク質がアセチルリジンまたはアセチルリジン修飾ペプチドに結合することを阻害する。アセチルリジンに接触すると予測されるＢＲＤ９の残基としては、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＱ９Ｈ８Ｍ２（図９）に従って残基に番号がつけられた（これらに限定されないが）Ｖａｌ１６５、Ａｌａ１７０、Ｔｙｒ１７３、Ａｌａ２１２、Ａｓｎ２１６、及びＴｙｒ２２２が挙げられる。残基Ａｓｎ２１６が特に重要であり、ＢＲＤ９阻害剤がＡｓｎ２１６と相互に作用しあうと予測される。さらに、ＢＲＤ７阻害剤がＢＲＤ７ブロモドメインのアセチルリジン結合部位と相互に作用しあう。アセチルリジンに接触すると予測されるＢＲＤ７の残基としては、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＱ９ＮＰＩ１（図９）に従って残基に番号がつけられた（これらに限定されないが）Ｖａｌ１６０、Ａｌａ１６５、Ｔｙｒ１６８、Ａｌａ２０７、Ａｓｎ２１１、及びＴｙｒ２１７が挙げられる。残基Ａｓｎ２１１が特に重要であり、ＢＲＤ７阻害剤がＡｓｎ２１１と相互に作用しあうと予測される。
【００２６】
１つの実施形態では、阻害剤は特異的なブロモドメイン含有タンパク質に選択的に結合する。例えば、阻害剤は、選択したアッセイ（例えば、本明細書の実施例３に記載したアッセイ）で他のブロモドメイン含有タンパク質より特定のブロモドメイン含有タンパク質に対して少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、または少なくとも１，０００倍選択的である。１つの実施形態では、阻害剤は、他のブロモドメイン含有タンパク質よりブロモドメイン含有タンパク質ＢＲＤ７に対して少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、または少なくとも１，０００倍選択的である。１つの実施形態では、阻害剤は、他のブロモドメイン含有タンパク質よりブロモドメイン含有タンパク質ＢＲＤ９に対して少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、または少なくとも１，０００倍選択的である。１つの実施形態では、阻害剤は、他のブロモドメイン含有タンパク質よりブロモドメイン含有タンパク質ＢＲＤ７及びＢＲＤ９に対して少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、または少なくとも１，０００倍選択的である。他のブロモドメイン含有タンパク質の非限定例としては、ＡＳＨ１Ｌ、ＡＴＡＤ２、ＡＴＡＤ２Ｂ、ＢＡＺ１Ａ、ＢＡＺ１Ｂ、ＢＡＺ２Ａ、ＢＡＺ２Ｂ、ＢＰＴＦ、ＢＲＤ１、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤ７、ＢＲＤ８、ＢＲＤ９、ＢＲＤＴ、ＢＲＰＦ１、ＢＲＰＦ３、ＢＲＷＤ１、ＢＲＷＤ３、ＣＥＣＲ２、ＣＲＥＢＢＰ（別名、ＣＢＰ）、ＥＰ３００、ＧＣＮ５Ｌ２、ＫＩＡＡ２０２６、ＭＬＬ、ＭＬＬ４、ＰＢＲＭ、ＰＣＡＦ、ＰＨＩＰ、ＳＭＡＲＣＡ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＰ１００、ＳＰ１１０、ＳＰ１４０、ＳＰ１４０Ｌ、ＴＡＦ１、ＴＡＦ１Ｌ、ＴＲＩＭ２４、ＴＲＩＭ２８、ＴＲＩＭ３３、ＴＲＩＭ６６、ＺＭＹＮＤ８、及びＺＭＹＮＤ１１が挙げられる。タンパク質が１つ以上のブロモドメインを含有する場合、各ブロモドメインに対する選択性を測定することができる。
【００２７】
特定の実施形態では、阻害剤のＢＲＤ７及び／またはＢＲＤ９に対するＩＣ５０は、１０μＭ未満、例えば、１μＭ未満、例えば、１００ｎＭ未満、例えば、１０ｎＭ未満、例えば、１ｎＭである。
【００２８】
特定の実施形態では、阻害剤のＢＲＤ７及び／またはＢＲＤ９に対する結合親和性Ｋｄは、１，０００ｎｍ未満、例えば、５００ｎＭ未満、例えば、１００ｎＭ未満、例えば、５０ｎＭ未満である。特定の実施形態では、阻害剤のＢＲＤ７及び／またはＢＲＤ９に対する結合親和性は５００ｎＭ〜１ｐＭである。
【００２９】
１つの実施形態では、阻害剤はブロモドメイン含有タンパク質の転写または対応メッセンジャーＲＮＡの翻訳を阻害することができるアンチセンス核酸である。アンチセンス配列は、ＤＮＡ  ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）、リボソームなどとすることができる。それは、一本鎖または二本鎖とすることができる。このほか、それはアンチセンス遺伝子によってコードされるＲＮＡとすることができる。当業者が市販されているソフトウエアを使用して、ＢＲＤ７またはＢＲＤ９の遺伝子配列に基づいてｓｉＲＮＡ分子を設計することができる。
【００３０】
１つの実施形態では、阻害剤はポリペプチド、例えば、ブロモドメイン含有タンパク質の領域を含有するペプチドとすることができる。ポリペプチドはこのほか、ブロモドメイン含有タンパク質に対する抗体、またはそのフラグメントまたは誘導体、例えば、Ｆａｂフラグメント、ＣＤＲ領域、または一本鎖抗体とすることができる。
【００３１】
用語「小分子」は、分子量が約１０００ａｍｕ未満である有機分子を含む。１つの実施形態では、小分子は分子量が約８００ａｍｕ未満とすることができる。もう１つの実施形態では、小分子は分子量が約５００ａｍｕ未満とすることができる。
【００３２】
本発明の特定の実施形態に使用することができる小分子としては、以下の化合物が挙げられる。
【化１】
2016519672.tif 000002
この小分子を調製するために使用することができる合成中間体及び方法が国際特許出願公開ＷＯ  ２０１３／０９７６０１に記載されている。
【００３３】
用語「大員環」は、９または１０個以上の原子を含有する環を有する有機分子を含む。１つの実施形態では、大員環は９〜約２４個の原子を含有する環を有する。もう１つの実施形態では、大員環は約１２〜約１６個の原子を含有する環を有する。一般的に、小分子の分子量は約１２００ａｍｕ未満である。１つの実施形態では、大員環の分子量が約１０００ａｍｕ未満である。もう１つの実施形態では、大員環の分子量が約８００ａｍｕ未満である。
【００３４】
本明細書に使用する場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及びその文法的変化、例えば、「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」）は、治療される個人の自然経過を変えるための臨床的介入を意味し、予防のためまたは臨床病理学の経過の間に実施することができるものである。治療の望ましい効果としては、疾患の発症または再発を防ぐこと、症状の軽減、疾患の直接または間接的な病理的結果の減少、疾患進行率を低下させること、疾患病態の改善または好転、及び寛解または改善した予後が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
阻害剤が十分に塩基性または酸性である場合、阻害剤の薬剤学的に許容できる塩の投与が適切であるとすることができる。薬剤学的に許容できる塩の例は、生理学的に許容できるアニオンを形成する酸、例えば、トシラート、メタンスルホナート、アセタート、シトラート、マロナート、タルタラート、スクシナート、ベンゾアート、アスコルバート、α−ケトグルタラート、及びα−グリセロホスファートにより形成された有機酸添加塩である。このほか、好適な無機塩を形成することができ、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩及び炭酸塩が挙げられる。
【００３６】
薬剤学的に許容できる塩は、当技術分野でよく知られる標準的な方法を使用して、例えば、十分に塩基性の化合物、例えば、アミンと生理学的に許容できるアニオンをもたらす好適な酸を反応させることによって得ることができる。このほか、カルボン酸のアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウムまたはリチウム）またはアルカリ土類金属（例えばカルシウム）塩を生成することができる。
【００３７】
阻害剤は薬剤組成物として製剤化して、選択した投与の経路にふさわしいさまざまな形態、すなわち、経口または非経口、静脈内により、筋肉内、局所または皮下経路で哺乳動物宿主、例えば、ヒト患者に投与することができる。
【００３８】
したがって、阻害剤は、薬剤学的に許容できるビヒクル、例えば、不活性希釈剤または同化性食用キャリアと組み合わせて、例えば、経口で全身に投与することができる。阻害剤は、ハードまたはソフトシェルゼラチンカプセルに封入することができ、圧縮して錠剤にすることができ、または直接患者の食事の食品と混合することができる。経口治療的投与では、阻害剤は１つ以上の賦形剤と組み合わせ、摂取可能な錠剤、口内錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、オブラート剤などの形態で使用することができる。かかる組成物及び調剤は少なくとも０．１％の阻害剤を含有しなければならない。組成物及び調剤のパーセンテージは言うまでもなく、変えることができ、使いやすく所与の単位剤型の重量の約２〜約６０％とすることができる。かかる治療に有用な組成物中の有効化合物の量は、効果的な投与濃度が得られるようにする。
【００３９】
錠剤、トローチ、丸薬、カプセルなどは、このほか、結合剤、例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチン、賦形剤、例えば、リン酸ニカルシウム、崩壊剤、例えば、コーンスターチ、馬鈴薯澱粉、アルギン酸など、潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムを含有することができ、甘味剤、例えば、蔗糖、果糖、乳糖もしくはアスパルテーム、または香味剤、例えば、ハッカ、冬緑油、またはチェリー香味剤を添加することができる。単位剤型がカプセルである場合、上記の型の物質に加えて、液体キャリア、例えば、植物油またはポリエチレングリコールを含有することができる。種々の他の物質が被覆剤として、またはその他の方法で固体単位剤型の物理的な形態を変更するように存在することができる。例えば、錠剤、丸薬、またはカプセルをゼラチン、ワックス、セラック、または糖などで被覆することができる。シロップまたはエリキシル剤が有効化合物、甘味剤として蔗糖または果糖、防腐剤としてメチル及びプロピルパラベン、染料及び香味剤、例えば、チェリーまたはオレンジフレーバーを含有することができる。言うまでもなく、単位剤型を調製するのに使用される任意の物質は、薬剤学的に許容できるものにし、用いられる量で実質的に非毒性のものにしなければならない。また、持効性調剤及びデバイスに有効化合物を組み入れることができる。
【００４０】
阻害剤はこのほか、点滴または注射により静脈内にまたは胸腔内に投与することができる。水に、任意で非毒性界面活性剤と混合して有効化合物の溶液またはその塩を調製することができる。このほか、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン及びこれらの混合物、ならびに油に分散液を調製することができる。貯蔵及び使用の通常の条件下では、これらの調剤が微生物の成長を防止するために防腐剤を含有する。
【００４１】
注射または点滴に好適な薬剤剤型は、無菌の注射可能または点滴可能な溶液または分散液の即時調製に適合しており、任意でリポソームに封入した有効成分を含む無菌水性溶液もしくは分散液、または無菌粉末を含むことができる。いずれの場合でも、最終剤型は、製造及び貯蔵の条件下で、無菌、流動的であり及び安定していなければならない。液体キャリアまたはビヒクルは、溶媒または液体分散液媒質、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性グリセリルエステル、及び好適なこれらの混合物を含むことができる。例えば、リポソームの形成によって、分散液の場合必要な粒子径の維持によって、または界面活性剤の使用によって適切な流動性を維持することができる。種々の抗菌及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって微生物の作用を防止することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、緩衝剤、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。組成物での吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンの使用により、注射可能組成物の持続的吸収をもたらすことができる。
【００４２】
このほか、好適な溶媒中の必要な量の阻害剤を上に列挙した種々の他の成分に組み入れ、必要に応じて、濾過殺菌により無菌の注射可能溶液を調製する。無菌の注射可能溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、あらかじめ無菌濾過した溶液に存在する任意の追加の所望の成分を加えて有効成分の粉末を生成する。
【００４３】
局所投与では、阻害剤は純粋形態で（すなわち、阻害剤が液体である場合）塗布することができる。しかし、一般的に皮膚病学的に許容できるキャリア（固体または液体とすることができる）と組み合わせて組成物または配合物として皮膚に阻害剤を投与することが好ましい。
【００４４】
有用な固体キャリアとしては、微粉固体、例えば、タルク、クレー、微結晶セルロース、シリカ、アルミナなどが挙げられる。有用な液体キャリアとしては、水、アルコールまたはグリコールまたは水−アルコール／グリコールブレンドが挙げられ、この中に本化合物を効果的な濃度で、任意で非毒性界面活性剤を使って溶解させる、または分散させることができる。補助剤、例えば、芳香剤及び追加の抗菌剤を添加して、所与の使用の特性を最適化することができる。包帯及び他の手当用品に含浸させるために使用される吸収パッドから、得られた液体組成物を塗布することができる、またはポンプ式またはエアゾールスプレーを使用して患部に吹き付けることができる。
【００４５】
このほか、増粘剤、例えば、合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩及びエステル、脂肪アルコール、改質セルロースまたは改質無機物質を液体キャリアとともに使用して、使用者の皮膚に直接塗布するために塗り広げられるペースト、ゲル、軟膏、石鹸などを形成することができる。
【００４６】
阻害剤を皮膚に塗布するために使用することができる有用な皮膚病学的組成物の例が、当技術分野で知られており、例えば、Ｊａｃｑｕｅｔら（米国特許第４，６０８，３９２号）、Ｇｅｒｉａ（米国特許第４，９９２，４７８号）、Ｓｍｉｔｈら（米国特許第４，５５９，１５７号）及びＷｏｒｔｚｍａｎ（米国特許第４，８２０，５０８号）を参照されたい。
【００４７】
本発明の特定の実施形態では阻害剤分子としてＲＮＡｉ分子の使用が提供される。ＲＮＡｉ分子としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び、例えば、特異的なｍＲＮＡ分子を分解することによって、特に標的遺伝子からのタンパク質発現を阻害する他の小ＲＮＡ分子が挙げられる。特定の実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、ＢＲＤ７及び／またはＢＲＤ９、例えば、ＢＲＤ７及び／またはＢＲＤ９のアイソフォーム１を標的にする。特定の実施形態では、ＲＮＡｉ分子はヒトＢＲＤ７及び／またはＢＲＤ９を標的にする。当業者は市販されているソフトウエアを使用して、ＢＲＤ７またはＢＲＤ９の遺伝子配列に基づいてＲＮＡｉ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ分子）を設計することができる。当技術分野で知られる方法を使用して、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、またはウイルストランスファーにより、ＲＮＡｉ分子を治療の必要な被験者に与える（例えば、投与する）ことができる。
【００４８】
動物モデルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性、及びｉｎ  ｖｉｖｏ活性を比較することによって阻害剤の有用な用量を決定することができる。効果的な用量をマウス、及び他の動物、ヒトに外挿する方法が当技術分野で知られており、例えば、米国特許第４，９３８，９４９号を参照されたい。
【００４９】
治療に使用するために必要な阻害剤の量は、選択した特定の塩だけでなく、投与の経路、治療される病態の性質ならびに患者の年齢及び病態で変わり、最終的に担当医師または臨床医の裁量によるものとなる。
【００５０】
阻害剤は、使いやすく単位剤型に製剤化され、例えば、１単位剤型当たり５〜１０００ｍｇ、使いやすく１０〜７５０ｍｇ、最も使いやすく、５０〜５００ｍｇの有効成分を含有する。１つの実施形態では、本発明は、かかる単位剤型に製剤化された阻害剤を含む組成物を提供する。
【００５１】
望ましい投与量は、使いやすく一回量または適切な間隔に投与される分割投与量、例えば、１日当たり２、３、４またはそれ以上の分割投与量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）で示すことができる。分割投与量自体をさらに、例えば、いくつかのばらばらに厳密でなく間隔をあけた投与（例えば、吹入器による複数回の吸入または複数の小滴を眼球に差すことによる）に分割することができる。
【００５２】
これより以下の非限定例によって本発明を説明する。
【実施例】
【００５３】
（実施例１）
阻害試験
物質及び方法
Ｔ−Ｂｌａｓｔｓ調製及び再刺激
【００５４】
フィコール（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）密度勾配遠心分離法を使用して健常ボランティアの末梢血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。１０ｕｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｐ（Ｓｉｇｍａ  Ｌ８７５４）を添加し、１０％のＦＢＳ及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有するＲＰＭＩ（Ｇｌｕｔａｍａｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して１Ｅ６細胞／ｍｌで４日間、細胞を培養した。４日後、細胞をプールし洗浄し、１Ｅ６細胞／ｍｌで１日間、ＲＰＭＩ培地で、ＰＨＡ−Ｐ（ｌ０ｕｇ／ｍｌ）及びｒｈＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ）Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（２０２−ＩＬ）（４ｎｇ／ｍｌ）で、再植種した。再刺激のため細胞を洗浄し、凍結した。１０％のＦＢＳ及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有するＤＭＥＭ（Ｇｌｕｔａｍａｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、１Ｅ６細胞／ｍｌで再刺激した。決定点ごとに２Ｅ５細胞を使用した。ＤＭＳＯ（０．５％）または化合物（０．５％ＤＭＳＯ最終）の存在下で、５ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５５５３３６）及び５ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５５５７２６）とともに４８時間、細胞を刺激した。Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォーム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）またはＡｌｐｈａＬＩＳＡプラットフォーム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して製造者の仕様書を使用して、サイトカイン濃度を測定した。
【００５５】
ヒトナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋）の分離及び分極条件
【００５６】
フィコール（ＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）密度勾配遠心分離法を使用して健常ボランティアの末梢血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。ヒトナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞分離ＫｉｔＩＩ（１３０−０９４−１３１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、非Ｔヘルパー細胞及び記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞の磁気除去により、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞をＰＢＭＣから分離した。ＴＨ１７分化の誘導のために、ヒトＴ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してナイーブＣＤ４Ｔ細胞を活性化し、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、以下のカクテル：ＴＧＦ−β（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＬ−２３（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ヒトＩＦＮ−γ（１０ｕｇ／ｍｌ、クローンＢ１４０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び抗ヒトＩＬ−４（１０ｕｇ／ｍｌ、クローン８Ｄ４−８、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の存在下で、６日間、培養した。ＴＨ１条件では、以下のカクテル：ＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＬ−２（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ヒトＩＬ−４（ｌ０ｕｇ／ｍｌ、クローン８Ｄ４−８、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。ＴＨ２条件は、ＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ヒトＩＦＮ−γ（１０ｕｇ／ｍｌ、クローンＢ１４０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び抗ヒトｐ４０（５ｕｇ／ｍｌ、クローンＣ８．４ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）であった。ｉＴｒｅｇでは、以下、ＴＧＦ−β（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。それぞれの条件下で、６〜８日間、ナイーブＣＤ４Ｔ細胞を分極した。
【００５７】
マウスナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋）の分離及び分極条件
【００５８】
６〜８週齢の雌ＢａｌｂＣマウスの脾臓からＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞を分離した。７０μｍナイロン細胞ストレーナ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、脾細胞の単一細胞懸濁液を調製した。塩化アンモニウム溶解緩衝液（Ｒ７７５７、Ｓｉｇｍａ）を使用して赤血球を溶解し、ｃＲＰＭＩ１０％ＦＢＳ（６１８７０−０３６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄した。磁気活性化した細胞選別ビーズ（１３０−０９３−２２７、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ナイーブＣＤ４Ｔ細胞を精製した。選別したナイーブ細胞の純度は９０％超であった。６ウェルプレートでナイーブＣＤ４Ｔ細胞を培養し（１ｘ１０６細胞／ｍｌ）、抗ＣＤ３／ＣＤ２８被覆ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  １１４５２Ｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、４日間、ＴＨ２分極条件：ＩＬ−４  １０ｎｇ／ｍｌ（２１４−１４、Ｐｅｐｒｏ）、ＩＬ−２  １０ｎｇ／ｍｌ（４０２−ＭＬ、Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１０μｇ／ｍｌ抗ＩＦＮ−γ抗体（５５４４０８、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及び５ｕｇ／ｍｌ抗ＩＬ−１２抗体（５５４４７５、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）下で、刺激した。
【００５９】
細胞生存性
【００６０】
存在するＡＴＰ（Ｇ７５７２、Ｐｒｏｍｅｇａ）の定量化に基づいて生細胞数を決定するＣｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ  Ｇｌｏ（登録商標）を使用して、細胞生存性を評価した。
【００６１】
ヒトＴｈ２細胞の再刺激
【００６２】
６日間分化したＴｈ２細胞を洗浄し、１０％ＦＢＳ及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有する通常の培地ＤＭＥＭ（Ｇｌｕｔａｍａｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベータにＯＮで放置した。次の日、決定点ごとに２Ｅ５細胞を使用した。ＤＭＳＯ（０．５％）または化合物（０．５％ＤＭＳＯ最終）の存在下で、５ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５５５３３６）及び５ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５５５７２６）とともに２４または４８時間、細胞を刺激した。Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォーム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）またはＡｌｐｈａＬＩＳＡプラットフォーム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して製造者の仕様書を使用して、サイトカイン濃度を測定した。
【００６３】
マウスＴｈ２細胞の再刺激
【００６４】
４日間分化したＴｈ２細胞を洗浄し、１０％ＦＢＳ及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有する通常の培地ＲＰＭＩ（Ｇｌｕｔａｍａｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベータにＯＮで放置した。次の日、決定点ごとに２Ｅ５細胞を使用した。ＤＭＳＯ（０．５％）または化合物（０．５％ＤＭＳＯ最終）の存在下で、抗ＣＤ３／ＣＤ２８被覆ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  １１４５２Ｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１：１比）で、４８時間、細胞を刺激した。Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォーム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、サイトカイン濃度を測定した。
【００６５】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
【００６６】
製造者のプロトコルに従ってＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、細胞からＲＮＡを精製した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素を使用して、第一鎖ｃＤＮＡを合成した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＭｘＰｒｏ３００５ｐで、タンパク質ＩＬ−５、ＩＬ−１３をコードする転写物のためのＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ）及びＴａｑｍａｎプローブ、ならびに標準化のために使用したＧＡＰＤＨを使用して、定量的リアルタイムＰＣＲを実施した。
【００６７】
細胞内サイトカイン染色
【００６８】
細胞内染色のために、５時間、Ｇｏｌｇｉｐｌｕｇ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を添加して、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ、５０ｎｇ／ｍｌ）及びイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ、５００ｎｇ／ｍｌ）で、細胞を再刺激した。再刺激後、細胞を洗浄し、続いてＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  Ｋｉｔ（５５４７１４、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して固定化、透過化し、ヒトＩＬ−１７Ａ（５６０４８７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＩＦＮγ（１７−７３１９、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＩＬ−４（１２−７０４９−４２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｆｏｘｐ３（１２−４７７７−４１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を検出するため、細胞内サイトカインについて染色した。Ｆｏｘｐ３細胞内染色のために、Ｆｏｘｐ３／転写因子染色キット（００−５５２３−００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、細胞を固定化、透過化した。ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上に細胞を得て、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアを使用してデータを分析した。
【００６９】
ＤＳＦアッセイ法
【００７０】
ＢＲＤ７／９ＤＳＦプロトコル：化合物（１０ｍＭ）またはＤＭＳＯをＤＳＦアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ）中で希釈し、０．５ｍＭ化合物溶液または５％ＤＭＳＯを生成した。ＤＳＦアッセイ緩衝液中にタンパク質／色素ミックス（１２．５Ｘ  ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ及びブロモドメインタンパク質、ＢＲＤ７用６．２５ｍＭ及びＢＲＤ９用７．５ｍＭ）を調製する。３ｍｌの０．５ｍＭ化合物溶液または５％ＤＭＳＯを３８４ウェルＰＣＲプレートに移す。１２ｍｌのタンパク質／色素ミックスを化合物プレートに添加し、プレートを密封し、１０００ｒｐｍで１分間、回転させた。プレートを、２５℃〜８５℃で、ランプ速度０．０５℃／秒でＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＩＩにかけた。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＳＷ１．５．０．のＴｍ  Ｃａｌｌｉｎｇモジュ−ルで、データを分析した。
【００７１】
方法及び結果
【００７２】
ヒストンの共有結合修飾が、遺伝子発現の制御の基本的機序、及び真核細胞で行われる主要な後生機序の１つである（Ｋｏｕｚａｒｉｄｅｓ、Ｃｅｌｌ  １２８：  ６９３〜７０５  （２００７））。特異的な転写状態が基本的な細胞過程、例えば、細胞型の指定、分化系列決定、細胞活性化及び細胞死を定めるため、それらの異常調節が種々の疾患の中心にある（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：６９２〜７０３（２００９）；Ｐｏｒｔｅｌａら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１０５７〜１０６８（２０１０））。遺伝子発現の後生制御の基本的な構成要素が、かかる修飾に結合する特殊モチーフを有するタンパク質によるヒストン修飾の解釈である。このうち、ブロモドメインが発生してアセチル化ヒストンに結合し、これによりクロマチン構造及び遺伝子転写の間で基本的な結合となる（Ｆｉｌｌｉｐａｋｏｐｐｏｕｌｏｓら、Ｃｅｌｌ  １４９：２１４〜２３１（２０１２））。２つのタンパク質、ＢＲＤ７及びＢＲＤ９（ＢＲＤ７／９と記載することができる）にあるブロモドメインに薬理学的に干渉することによって、免疫媒介性疾患を治療する方法が、本明細書に記載されている。
【００７３】
ＢＲＤ７／９ブロモドメインが免疫媒介性疾患の治療の標的となるかどうかを検討するため、ＢＲＤ７／９ブロモドメインに結合するように設計した強力な及び選択的小分子阻害剤化合物を使用することの機能的影響、これによりクロマチン中のアセチル化ヒストンと結合することを妨げることを検討した。これらの実験では、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、この細胞が自己免疫及び炎症に重要な役割を担うことが知られているため、使用した。小分子阻害剤がオフターゲット効果を有することができるため、かかるオフターゲット効果を除外するように、さまざまな生化学的力価を有する異なる化学系列の化合物のパネル（以下の表１を参照）を試験した。
【００７４】
第１の実験セットでは、健常ドナーからヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を精製し、ＰＨＡ−ｐ及びヒト組み替えインターロイキン（ＩＬ）−２の存在下で培養した。この方法はＰＢＭＣ調製物に存在する全ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化及び膨張を誘導し、元のＰＢＭＣ調製物（Ｔ  ｂｌａｓｔｓ）に存在する全サブセットを示す事前に活性化したＴ細胞の高富化混合物を与える。抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体の組み合わせを使用したＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を介したかかる細胞の活性化では、培地で容易に測定することができるサイトカインの発現及び分泌がもたらされる。図１ａに示したように、ＢＲＤ７／９阻害剤ＢＲＤ７／９（１）、ＢＲＤ７／９（２）及びＢＲＤ７／９（３）が、Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームを使用して測定したとおり、用量依存的に、ＩＬ−４及びＩＬ−５の産生を低下させるが、他のサブセットを示すサイトカイン、例えば、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）またはＩＬ−１７Ｆの産生を低下させないことが示された。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、ジェネリック炎症促進性サイトカインは阻害されなかった。重要なことに、細胞生存性（ＡＴＰ産生として測定した）が、いずれの化合物にも影響を受けなかった（図１ａ）。さらに、９つの追加のサイトカインの広いパネルへのこれらの阻害剤の影響を検討した。化合物全体に、これらのサイトカインのいずれに対する有意で安定した効果がみられなかった（図１ｂ）。
【００７５】
ＩＬ−４及びＩＬ−５（ＩＬ−１３とともに）は、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴヘルパー（Ｔｈ）型２サブセットによって選択的に生成されたサイトカインであり、アレルギー反応、例えば、喘息及びアレルギー性鼻炎を媒介することが知られている（Ｆａｎｔａ、Ａｓｔｈｍａ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６０：１００２〜１０１４（２００９））。ＢＲＤ７／９阻害剤が安定して及び選択的にこれらのＴｈ２サイトカインを阻害したため、ＢＲＤ７／９阻害がＴｈ２細胞のサイトカイン産生を阻害する効率的な方法であるとすることができると提案された。この仮説を試験するため、精製したナイーブヒトＣＤ４＋Ｔ細胞からＴｈ２細胞を調製した。これらのナイーブＴ細胞は、そのマーカーＣＤ４５ＲＡの表面発現により同定し、及びその後、方法の節に記載したように、サイトカインの標準的及び確立した混合により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させることができる。図２ａに示したように、ＢＲＤ７／９阻害剤ＢＲＤ７／９（３）及びＢＲＤ７／９（４）が、用量依存的に、ＩＬ−５の産生を低下させることが示された。図１に示したデータのとおり、ＴＮＦ−αまたは細胞生存性がいずれの化合物にも影響されなかった。９つの追加のサイトカインの広いパネルでは、図１ｂに記載したデータのとおり、ＩＬ−１０、もう一つのＴｈ２富化サイトカインを除いて、試験したいずれの化合物の影響もみられなかった（図２ｂ）。図３に示したように、ＢＲＤ７／９阻害剤ＢＲＤ７／９（３）及びＢＲＤ７／９（４）が、Ｌｕｍｉｎｅｘ及びＡｌｐｈａＬＩＳＡ  プラットフォームを使用して測定したとおり、用量依存的に、ＩＬ−５の産生を低下させることが示された。
【００７６】
本明細書に示したデータがＴｈ２サイトカイン産生にＢＲＤ７／９ブロモドメインの重要な役割を示すため、及びブロモドメインがクロマチンへの結合を媒介するタンパク質モチーフであるため、ＢＲＤ７／９ブロモドメイン阻害がＴｈ２サイトカインをコードする遺伝子の転写に影響を与える可能性があるという仮説を立てた。図４に示したように、ＢＲＤ７／９阻害剤ＢＲＤ７／９（４）、ＢＲＤ７／９（５）及びＢＲＤ７／９（６）がＩＬ−５及びＩＬ−１３（標準的なＴｈ２サイトカイン）の遺伝子転写物の蓄積量を低下させることが示された。
【００７７】
さらにＴｈ２サイトカイン産生への影響がＢＲＤ７／９ブロモドメイン阻害によって媒介されたことを示すために、生化学的力価が異なる阻害剤の大きなパネルの影響を検討した追加の実験セットを実施した。図５に示したように、全化合物にＩＬ−５及びＩＬ−１３の産生への選択的影響があった。この影響は用量依存的であり、生化学的力価に比例した大きさであった。
【００７８】
Ｔｈ２細胞にみられたＢＲＤ７／９ブロモドメイン阻害の効果がこの系統に選択的であったかどうかを検討した。Ｔｈ１及びＴｈ１７細胞にナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を分化した、及びそのサイトカイン特性、特に、標準的なサイトカインのその特性：Ｔｈ１細胞中のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、及びＴｈ１７細胞中のＩＬ１７Ａへの阻害剤の効果を検討した。図６に示したように、ＢＲＤ７／９（３）及びＢＲＤ７／９（４）阻害剤がＴｈ１細胞中のＩＦＮ−γに影響を与えなかった。同様に、ＢＲＤ７／９（４）阻害剤のＩＬ−１７Ａへの影響がＴｈ１７細胞にみられず、ＢＲＤ７／９（３）のそのサイトカインへのきわめて少ない影響だけがみられた。
【００７９】
まとめると、ここまでに記載したデータがＢＲＤ７／９ブロモドメインの阻害が選択的及び用量依存的にＴｈ２−特異的なサイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３の阻害をもたらすことを示す。
【００８０】
ＢＲＤ７／９ブロモドメイン阻害が主要なＣＤ４＋Ｔ細胞サブセット、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７及びＴ調節（Ｔｒｅｇ）細胞、のいずれかの分化に影響を与えたかどうかを検討した。その目的のため、方法の節に記載したサイトカインの好適な標準的及び確立したカクテルによりヒトナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を分化した、及び阻害剤ＢＲＤ７／９（３）及びＢＲＤ７／９（４）の効果を検討した。ＩＦＮ−γ発現細胞（Ｔｈ１）、ＩＬ−４発現細胞（Ｔｈ２）、ＩＬ−１７Ａ発現細胞（Ｔｈ１７）及びＦｏｘＰ３発現細胞（Ｔｒｅｇ）を数え上げる蛍光活性化細胞分取法（ＦＡＣＳ）を使用して分化を評価した。図７に示したように、ナイーブＴ細胞がＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７またはＴｒｅｇに分化する間にＢＲＤ７／９ブロモドメイン阻害の機能的影響がみられなかった。特に、Ｔｈ１培養物中のＩＦＮ−γ発現細胞、またはＴｈ２培養物中のＩＬ−４発現細胞、またはＴｈ１７培養物中のＩＬ−１７Ａ発現細胞、またはＴｒｅｇ培養物中のＦｏｘＰ３発現細胞の数への有意な効果がみられなかった。
【００８１】
最後に、本明細書に報告した試験に含まれないＢＲＤ７／９ブロモドメインの重要な役割は他の種、例えば、マウスに保存されたかどうかを検討した。４日間、マウスナイーブＴ細胞をＴｈ２細胞に分化し、その後、４０時間、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で再刺激した。図８に示したように、ＢＲＤ７／９ブロモドメイン阻害が標準的なＴｈ２サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３の有意な及び用量依存的な阻害をもたらしたが、ジェネリック炎症促進性サイトカインＴＮＦ−αはわずかに影響を受けただけであった。細胞生存性への有意な効果を示した化合物はなかった（図８）。
【００８２】
要約すると、本明細書に記載したように、ＢＲＤ７／９ブロモドメインがヒト及びマウスＴｈ２サイトカイン、特にＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３の発現に予期しないが重要な役割を担うが、他のサイトカインの発現では不可欠ではないことを示した。さらに、ＢＲＤ７／９ブロモドメイン阻害では、試験したいずれのＴ細胞サブセット（Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７及びＴｒｅｇ）の分化に効果がみられなかった。Ｔｈ２サイトカインがアレルギー性疾患を媒介するため、かかる疾患（これらに限定されないが、喘息、好酸球重症喘息、好酸球性症候群、アレルギー性鼻炎及びアレルギー性皮膚炎などが挙げられる）を治療する効果的な方法が発見されている。
【００８３】
以下の表１が、ＢＲＤ７／９化合物の生化学的データを提供する。以下に記載したＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイ法を使用して、表１のＩＣ５０値を生成した。
ＩＣ５０値を測定するためのＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイ法
【化２】
2016519672.tif 000003
【００８４】
以下の反応緩衝液を調製した：
【化３】
2016519672.tif 000004
【化４】
2016519672.tif 000005
１Ｘ反応緩衝液
溶液Ａ（１ウェル当たり６．３ｕＬ）及び溶液Ｂ（１ウェル当たり６．３ｕＬ）を混合し、２０分間、室温でインキュベートした。うす暗い光で、６．３ｕＬのビーズＣ溶液を添加した。マイクロプレートＴｏｐＳｅａｌで得られた溶液に蓋をし、９０分間、暗所で、室温でインキュベートした。Ｅｎｖｉｓｉｏｎでプレートを読んだ（プロトコル：修正されたＡｌｐｈａＬｉｓａ__ＰｒｏｘｉＰｌａｔｅ  Ｆｌａｔｆｉｅｌｄを使用して）。手作業で、またはＡｃｔｉｖｉｔｙ  ｂａｓｅ（Ａｂａｓｅ）を使用して、または手作業でデータを分析した。手作業で処理したデータでは一般的に、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５及び４つのパラメーターの用量−反応当てはめを使用してＩＣ５０データを生成した。結果を表１に提供する。
表１．生化学的なｉｎ  ｖｉｔｒｏでの力価を含む本試験に使用されるＢＲＤ７／９化合物のリスト。
【表１】
2016519672.tif 000006
【００８５】
（実施例２）
阻害剤治療の際のＢＲＤ９局在化を視覚化するためのアッセイ
【００８６】
１ウェル当たり２０，０００細胞で誘導性ＢＲＤ９蛍光融合タンパク質を保持する安定した細胞系を植種した。１６時間、３７℃でドキシサイクリン２μｇ／ｍｌの添加により融合の発現を誘導した。その後、６０分間、室温でドキシサイクリンを含まない培地に試験阻害剤を添加した。４％ＰＦＡで細胞を固定化し、その後、３０分間、ヘキスト染色した。緑及び青チャンネルの両者の画像を得た。選択した最小の大きさの緑ＢＲＤ９点を「ピット」として同定し、阻害剤への反応を「１細胞当たりのピット」として示した。
【００８７】
図１０Ａ〜１０Ｃは、ＢＲＤ９融合タンパク質が主に阻害剤のないクロマチンに局在化されていること、及び化合物の添加の際に大きな点にみられることを示している。図１１は、ＢＲＤ９の存在下で、化合物ＢＲＤ７／９（８）を使用して、生成した用量−反応曲線を示す。
（実施例３）
他のブロモドメインを上回るＢＲＤ９に対する選択性の決定
【００８８】
ＢＲＤ９に対して上にに記載したものとほぼ同じプロトコル（実施例１）を使用して、ＡｌｐｈａＬｉｓａ_により化合物ＢＲＤ７／９（８）が種々ブロモドメインへ結合することを試験した。表２の選択性比率は、示したブロモドメインのＩＣ５０をＢＲＤ９のＩＣ５０で割ったものである。
表２．結合選択性
【表２】
2016519672.tif 000007
【００８９】
理解を明確にするため例証及び例示により本発明をある程度詳細に記載したが、説明及び例が本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。本明細書に引用した全特許及び科学文献の開示は、それらの全体が明確に参照として組み入れられる。
【図１０Ａ】
2016519672.tif 000008
【図１０Ｂ】
2016519672.tif 000009
【図１０Ｃ】
2016519672.tif 000010
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
2016519672.tif 000016
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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