(57)【要約】  本発明は、新規なバイオプロセステクノロジーを用いた、アワビ用プロバイオティクス微生物を製造するための培養培地及び方法に関する。アワビプロバイオティクスの製造のための商業的に実行可能なバイオプロセスは、現在のところ存在しない。この発明は、細菌プロバイオティクスであるビブリオ・ミダエ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｍｉｄａｅ）若しくは酵母プロバイオティクスであるデバリオマイセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）又はそれらの組み合わせの小容量冷凍培養物から、プロバイオティクス製品への、アワビプロバイオティクスの生物学的製造を容易にするものである。本発明は、接種の手法、発酵方法、バイオマスの採取、並びにアワビの餌に配合することができる液体又は乾燥製品へのバイオマスの製剤化について記載する。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）クエン酸、
（ｉｉ）Ｈ３ＰＯ４、
（ｉｉｉ）約０ｇ／ｌから約４ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、
（ｉｖ）Ｃａ（ＮＯ３）２、
（ｖ）ＭｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、
（ｖｉ）ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、
（ｖｉｉ）ＫＣｌ、
（ｖｉｉｉ）約２０ｇ／ｌから約４０ｇ／ｌのＮａＣｌ、
（ｉｘ）ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、
（ｘ）約４２ｇ／ｌから約２５５ｇ／ｌのコーンスティープリカー、
（ｘｉ）約１ｇ／ｌから約４０ｇ／ｌの転化高品質糖蜜、及び
（ｘｉｉ）約０．５ｍｌ／ｌから約５ｍｌ／ｌの消泡剤
を含み、ｐＨが約５から約８である、細菌増殖培地。
【請求項２】
（ｉ）約１ｇ／ｌのクエン酸、
（ｉｉ）約２．５ｍｌ／ｌのＨ３ＰＯ４、
（ｉｉｉ）約０．４ｇ／ｌのＣａ（ＮＯ３）２、
（ｉｖ）約０．０４０ｇ／ｌのＭｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、
（ｖ）約０．０３２ｇ／ｌのＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、
（ｖｉ）約１ｇ／ｌのＫＣｌ、
（ｖｉｉ）約３０ｇ／ｌのＮａＣｌ、
（ｖｉｉｉ）約２．３ｇ／ｌのＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、
（ｉｘ）約５４．４ｇ／ｌのコーンスティープリカー、
（ｘ）約２４ｇ／ｌの転化高品質糖蜜、及び
（ｘｉ）約１ｍｌ／ｌの消泡剤
を含み、ｐＨが約６．５である、請求項１に記載の細菌増殖培地。
【請求項３】
マリンブロス（ＭＢ）培地より顕著に高い細胞増殖率（ｇ／ｌ／ｈ）を支持する、請求項１又は２に記載の細菌増殖培地。
【請求項４】
接種培地にビブリオ・ミダエ生細胞の培養物を接種することによって、予備発酵培養物を調製する工程、
請求項１から３のいずれか一項に記載の増殖培地に、予備発酵培養物を接種する工程、
ビブリオ・ミダエ細胞の増殖期中、気流、酸素飽和度、背圧、温度及び増殖培地のｐＨを制御する工程、
ビブリオ・ミダエ細胞が安定形態であり且つ生細胞濃度が２×１０８細胞／ｍｌから１×１０１１細胞／ｍｌの範囲である、対数中期と静止期との間に、ビブリオ・ミダエ細胞を採取する工程、並びに
採取したビブリオ・ミダエ細胞を緩衝液中に再懸濁することによって、液体製品を製造する工程
を含む、プロバイオティクス組成物を製造する方法。
【請求項５】
液体製品を、担体、安定剤又は充填剤とブレンドして、バイオマスペーストを形成する工程、及び
バイオマスペーストを乾燥して、乾燥製品を製造する工程
をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
回分法である、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
反応器への気流が０．５から２．０ｖ／ｖ／ｍの範囲であり、好ましくは、反応器への気流が１ｖ／ｖ／ｍである、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
発酵培地中の溶存酸素が、飽和度２０から１００％の範囲であり、好ましくは、溶存酸素を飽和度３０％に維持する、請求項４から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
反応器内の背圧が０から２５０ｋＰａの範囲であり、好ましくは、反応器内の背圧が５０ｋＰａである、請求項４から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ビブリオ・ミダエ細胞を培養培地中で２０から３４℃の範囲の温度にて培養し、好ましくは、ビブリオ・ミダエ細胞を培養培地中で３０℃の温度にて培養する、請求項４から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
培養培地のｐＨが５．０から８．０の範囲であり、好ましくはｐＨが６．５である、請求項４から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ビブリオ・ミダエ細胞を遠心分離又はろ過によって増殖培地から採取する、請求項４から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
採取したビブリオ・ミダエ細胞をリン酸緩衝食塩水中に再懸濁して、液体製品を製造する、請求項４から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
液体製品を、微結晶セルロース、トレハロース、スクロース及びスキムミルク、又はそれらの組み合わせからからなる群から選択される担体と組み合わせて、ブレンド製品を形成する、請求項４から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
バイオマスペーストを押出成形し乾燥して、乾燥製品を形成する、請求項５から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
バイオマスペーストを３０から７０℃の範囲の温度にて押出成形し、好ましくは、バイオマスペーストを４５℃の温度にて押出成形する、請求項５から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１から３のいずれか一項に記載の増殖培地中で培養されたビブリオ・ミダエ生細胞を含み、ビブリオ・ミダエ細胞は、培養物中における生細胞濃度が２×１０８細胞／ｍｌから１×１０１１細胞／ｍｌの範囲である、増殖の対数中期と静止期との間に採取されたものであり、採取されたビブリオ・ミダエ細胞が緩衝液中に再懸濁されている、プロバイオティクス組成物。
【請求項１８】
再懸濁されたビブリオ・ミダエ細胞が、担体、安定剤又は充填剤とブレンドされて、バイオマスペーストを形成しており、バイオマスペーストが乾燥されている、請求項１７に記載のプロバイオティクス組成物。
【請求項１９】
アワビの水産養殖において用いるための、請求項１７又は１８に記載のプロバイオティクス組成物。
【請求項２０】
請求項１７から１９のいずれか一項に記載のプロバイオティクス組成物を含むアワビの餌であって、プロバイオティクス組成物が、餌の押出成形前に予備ブレンドすること、予備調製されたアワビの餌へ真空注入すること、又は既存の餌にトップコーティングすることによって、アワビの餌と組み合わされている、アワビの餌。
【請求項２１】
（ｉ）クエン酸、
（ｉｉ）Ｈ３ＰＯ４、
（ｉｉｉ）約１８ｇ／ｌから約３０ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、
（ｉｖ）ＭｇＳＯ４．７Ｈ２ＳＯ４、
（ｖ）ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、
（ｖｉ）約０ｇ／ｌから約４０ｇ／ｌのＮａＣｌ、
（ｖｉｉ）ＫＨ２ＰＯ４、
（ｖｉｉｉ）約８ｇ／ｌから約２１２ｇ／ｌのコーンスティープリカー、
（ｉｘ）約１ｇ／ｌから約４０ｇ／ｌのグルコース又はＨＴＭ、及び
（ｘ）約０．５ｍｌ／ｌから約５ｍｌ／ｌの消泡剤
を含み、ｐＨが約４から約７である、酵母増殖培地。
【請求項２２】
（ｉ）約２．５ｇ／ｌのクエン酸、
（ｉｉ）約１６．３ｍｌ／ｌのＨ３ＰＯ４、
（ｉｉｉ）約１８．５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、
（ｉｖ）約８．２ｇ／ｌのＭｇＳＯ４．７Ｈ２ＳＯ４、
（ｖ）約０．８ｇ／ｌのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、
（ｖｉ）約０．１ｇ／ｌのＮａＣｌ、
（ｖｉｉ）約１１．３ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、
（ｖｉｉｉ）約２０４ｇ／ｌのコーンスティープリカー、
（ｉｘ）約１０ｇ／ｌのグルコース又はＨＴＭ、及び
（ｘ）約１ｍｌ／ｌの消泡剤
を含み、ｐＨが約５．６である、請求項２１に記載の酵母増殖培地。
【請求項２３】
酵母エキス、ペプトン及びグルコース（ＹＰＤ）培地より顕著に高い細胞増殖率（ｇ／ｌ／ｈ）を支持する、請求項２１又は２２に記載の酵母増殖培地。
【請求項２４】
接種培地にデバリオマイセス・ハンセニイ生細胞の培養物を接種することによって、予備発酵培養物を調製する工程、
請求項２１から２３のいずれか一項に記載の増殖培地に、予備発酵培養物を接種する工程、
デバリオマイセス・ハンセニイ細胞の増殖期中、気流、酸素飽和度、背圧、温度及び増殖培地のｐＨを制御する工程、
生細胞濃度が４×１０７細胞／ｍｌから２×１０１０細胞／ｍｌの範囲である、増殖の対数中期と対数後期との間に、デバリオマイセス・ハンセニイ細胞を採取する工程、並びに
採取したデバリオマイセス・ハンセニイ細胞を緩衝液中に再懸濁することによって、液体製品を製造する工程
を含む、プロバイオティクス組成物を製造する方法。
【請求項２５】
液体製品を、担体、安定剤又は充填剤とブレンドして、バイオマスペーストを形成する工程、及び
バイオマスペーストを乾燥して、乾燥製品を製造する工程
をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
流加回分法である、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
反応器への気流が０．５から２．０ｖ／ｖ／ｍの範囲であり、好ましくは、反応器への気流が１ｖ／ｖ／ｍである、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
発酵培地中の溶存酸素が、飽和度２０から１００％の範囲であり、好ましくは、溶存酸素を飽和度３０％に維持する、請求項２４から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
反応器内の背圧が０から２５０ｋＰａの範囲であり、好ましくは、反応器内の背圧が５０ｋＰａである、請求項２４から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
デバリオマイセス・ハンセニイ細胞を培養培地中で１６から３４℃の範囲の温度にて培養し、好ましくは、デバリオマイセス・ハンセニイ細胞を培養培地中で２４℃の温度にて培養する、請求項２４から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
培養培地のｐＨが４．０から７．０の範囲であり、好ましくはｐＨが５．６である、請求項２４から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
デバリオマイセス・ハンセニイ細胞を遠心分離又はろ過によって増殖培地から採取する、請求項２４から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
採取したデバリオマイセス・ハンセニイ細胞をリン酸緩衝液に再懸濁して、液体製品を製造し、好ましくは、リン酸緩衝液が、約４〜２０％ｍ／ｍのトレハロース、好ましくは１２．５％ｍ／ｍのトレハロースを含み、緩衝液のｐＨが約４から６の範囲であり、好ましくはｐＨが４．５である、請求項２４から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
液体製品を、微結晶セルロース、トレハロース、スクロース及びスキムミルク、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される担体と組み合わせて、ブレンド製品を形成する、請求項２５から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
バイオマスペーストを押出成形し乾燥して、乾燥製品を形成する、請求項２５から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
バイオマスペーストを３０から５０℃の範囲の温度にて押出成形し、好ましくは、バイオマスペーストを４５℃の温度にて押出成形する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項２１から２３のいずれか一項に記載の増殖培地中で培養されたデバリオマイセス・ハンセニイ生細胞を含み、デバリオマイセス・ハンセニイ細胞は、培養物中における生細胞濃度が４×１０７細胞／ｍｌから２×１０１０細胞／ｍｌの範囲である、増殖の対数中期と対数後期との間に採取されたものであり、採取されたデバリオマイセス・ハンセニイ細胞が緩衝液中に再懸濁されている、プロバイオティクス組成物。
【請求項３８】
再懸濁されたデバリオマイセス・ミダエ細胞が、担体、安定剤又は充填剤とブレンドされて、バイオマスペーストを形成しており、バイオマスペーストが乾燥されている、請求項３７に記載のプロバイオティクス組成物。
【請求項３９】
アワビの水産養殖において用いるための、請求項３７又は３８に記載のプロバイオティクス組成物。
【請求項４０】
請求項３７から３９のいずれか一項に記載のデバリオマイセス・ハンセニイプロバイオティクス組成物を含むアワビの餌であって、プロバイオティクス組成物が、餌の押出成形前に予備ブレンドすること、予備調製されたアワビの餌へ真空注入すること、又は既存の餌にトップコーティングすることによって、アワビの餌と組み合わされている、アワビの餌。
【請求項４１】
請求項１７から１９のいずれか一項に記載のビブリオ・ミダエプロバイオティクス組成物と請求項３７から３９のいずれか一項に記載のデバリオマイセス・ハンセニイプロバイオティクス組成物との組み合わせを含む、アワビの餌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なバイオプロセステクノロジーを用いたアワビの水産養殖において用いるための、プロバイオティクス微生物製造用の培養培地及び方法に関する。
【０００２】
アワビプロバイオティクスの製造のためのバイオプロセスは、現在のところ存在しない。本発明は、細菌プロバイオティクスであるビブリオ・ミダエ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｍｉｄａｅ）若しくは酵母プロバイオティクスであるデバリオマイセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）又はそれらの組み合わせの小容量冷凍培養物から、プロバイオティクス製品への、アワビプロバイオティクスの生物学的製造を容易にするものである。本発明は、培養培地、接種の手法、発酵方法、バイオマスの採取、並びにアワビの餌に配合することができる液体及び／又は乾燥製品へのバイオマスの製剤化について記載する。
【背景技術】
【０００３】
アワビ（ミミガイ科（ｆａｍｉｌｙ  Ｈａｌｉｏｔｉｄａｅ））は、沿岸の温暖な海域及び熱帯海域において世界中に分布する海洋古腹足網軟体動物である（Ｄｅｇｎａｎら、２００６年）。アワビのファミリーは、約５６種からなり、全てがアワビ属（ｇｅｎｕｓ  Ｈａｌｉｏｔｉｓ）に属する。アワビは、世界で最も価値ある海産食品種のひとつであり（Ｒｅｄｄｙ−Ｌｏｐａｔａら、２００６年）、長年にわたって活用されてきた極東においては多大な需要がある（Ｆｒａｎｃｉｓら、２００７年）。大抵の場合、アワビの需要は供給をはるかに超え、天然アワビの群体は、違法な採取及び密漁による深刻な苦難の下にある。一定の大きさのアワビの身は、多くの人によって魅力的な食品であると考えられており、世界中で最も高価なタンパク質製品のひとつであると考えられている。その高い価値によって、集約的なアワビ水産養殖の開発及び最適化が進められてきた（Ｐａｒｋら、２００７年）。しかしながら、アワビ水産養殖には、乏しい水質、病気、及びこの海洋軟体動物固有の成長速度の遅さ等の要因による課題がある。
【０００４】
アワビの水産養殖の成功は、適切な栄養分及び病気の排除に依存する（Ｎａｉｄｏｏら、２００６年）。この問題に対する従来の解決法は、アワビの水産養殖において抗微生物薬を用いることであったが、このアプローチは、抗微生物薬に耐性のある微生物の発生につながり（Ｓｃｈｗａｒｚら、２００１年）、環境及びアワビの養殖への悪影響のみならず、消費者の抵抗をも生じることとなった。Ｍａｃｅｙ及びＣｏｙｎｅ（２００６年）は、プロバイオティクスを補足した飼料がアワビの成長及び免疫系を改善すると提案した。
【０００５】
アワビは、極めて成長速度が遅く、市場に受け入れられるサイズに達するまでに約４年かかる。したがって、アワビの成長速度を高め、また病気への耐性を増すための方法を調査することは不可避であった。
【０００６】
アワビ水産養殖が直面する課題への代替アプローチは、プロバイオティクス微生物の使用である。この技術は、環境に優しい水産養殖への需要の増加のために、評判を博している。プロバイオティクスは、適量で投与されて宿主へ健康効果を与える生きた微生物である。それらは、養殖される種の病気を制御し、消化を改善し、全体的な成長及び免疫性を押し上げることが示されている。
【０００７】
デバリオマイセス・ハンセニイ及びビブリオ・ミダエは、アワビであるハリオティス・ミダエ（Ｈａｌｉｏｔｉｓ  ｍｉｄａｅ）の胃腸管からＭａｃｅｙ及びＣｏｙｎｅ（２００６年）によって単離され、プロバイオティクス活性、特にアワビの成長速度を増す能力について評価された。Ｍａｃｅｙ及びＣｏｙｎｅ（２００５年）によって実行された研究によって、アワビの飼料にこれらのプロバイオティクス微生物を補足すると、成長速度の改善につながるということが示された。プロバイオティクス微生物は、アワビの天然海藻飼料中に存在する多糖とタンパク質との複合体を分解することができ、消化効率を高め、それによってアワビの成長速度を改善することができた（Ｃｏｙｎｅら、２００４年）。これらの微生物は、食細胞活性、プロテアーゼ活性及びアミラーゼ活性のようなアワビの消化管内のある特定の活性を増加させる。
【０００８】
最新技術には、水産養殖におけるプロバイオティクスとして、天然の細菌及び酵母を用いることが記載されている。この点に関し、先行技術には、エビ（Ｒｕａｎｇｐａｎら、１９９８年）及び小エビ（Ａｕｓｔｉｎら、１９９５年）の水産養殖において用いるためのプロバイオティクスとして、ビブリオナセアエ科（ｆａｍｉｌｙ  Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ）の細菌を用いることが開示されている。海洋環境から単離された他のビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）種も、プロバイオティクス効果を示し、Ｎａｉｒら（１９８５年）、Ｃａｒｒａｔｕｒｏら（２００６年）及びＣａｓｔｒｏら（２００６年）によって報告されている。
【０００９】
南アフリカ特許２００４／０６７７７並びにＭａｃｅｙ及びＣｏｙｎｅ（２００５年及び２００６年）により行われた研究には、アワビ水産養殖において用いるためのプロバイオティクスとして、ビブリオ・ミダエ及びデバリオマイセス・ハンセニイを用いることが記載されている。この研究の主要部において、ビブリオ・ミダエは、マリンブロス（ＭＢ）中で２２℃にて培養され、デバリオマイセス・ハンセニイは、酵母エキス−ペプトン−グルコースブロス（ＹＰＤ）培地中で２２℃にて培養された。Ｍａｃｅｙ及びＣｏｙｎｅによって行われた研究は、最適な培養条件、細胞培養濃度について調査しておらず、最適な培養密度を測定しておらず、且つ／又はバイオマス製造量を測定していない。Ｍａｃｅｙ及びＣｏｙｎｅによって利用された方法及び製造培地と本発明の方法及び製造培地との比較評価は、本発明者らが、ビブリオ・ミダエ及びデバリオマイセス・ハンセニイの両者についての先行技術に記載されている細胞増殖率よりも、数桁にわたって顕著に細胞増殖率を増加することができたことを明らかにしている（実施例３を参照）。
【００１０】
デバリオマイセス・ハンセニイは、工業用酵母として一般的に用いられている。この酵母に関するこれまでの研究は、概して、細胞全体での生体触媒としてのその使用に焦点を当てたものではなく、グリセロール及びキシロース等の代謝産物の製造のための使用に焦点を当てたものであった（Ａｄｌｅｒ及びＧｕｓｔａｆｓｓｏｎ、１９８０年、並びにＰａｒａｊｏら、１９９７年）。
【００１１】
しかしながら、先行技術は、デバリオマイセス・ハンセニイを、スズキ（Ｔｏｖａｒら、２００２年）及びニジマス（Ａｎｄｌｉｄら、１９９５年）等の水性種の微生物叢の一員として記載している。これらの研究においても、デバリオマイセス・ハンセニイは、酵母エキス−ペプトン−グルコースブロス（ＹＰＤ）中で培養されており、これらの研究のいずれも、最適な培養条件、細胞培養濃度、最適密度又はバイオマス製造については調査していなかった。
【００１２】
本明細書は、ビブリオ・ミダエ及びデバリオマイセス・ハンセニイの培養のための高生産性の新規なバイオプロセス、並びに水産養殖におけるそれらの使用について記載する。この分野におけるこれまでの研究で、アワビプロバイオティクスの大規模製造のための方法を提供するものはない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】南アフリカ特許２００４／０６７７７
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｄｅｇｎａｎら、２００６年
【非特許文献２】Ｒｅｄｄｙ−Ｌｏｐａｔａら、２００６年
【非特許文献３】Ｆｒａｎｃｉｓら、２００７年
【非特許文献４】Ｐａｒｋら、２００７年
【非特許文献５】Ｎａｉｄｏｏら、２００６年
【非特許文献６】Ｓｃｈｗａｒｚら、２００１年
【非特許文献７】Ｍａｃｅｙ及びＣｏｙｎｅ、２００６年
【非特許文献８】Ｍａｃｅｙ及びＣｏｙｎｅ、２００５年
【非特許文献９】Ｃｏｙｎｅら、２００４年
【非特許文献１０】Ｒｕａｎｇｐａｎら、１９９８年
【非特許文献１１】Ａｕｓｔｉｎら、１９９５年
【非特許文献１２】Ｎａｉｒら、１９８５年
【非特許文献１３】Ｃａｒｒａｔｕｒｏら、２００６年
【非特許文献１４】Ｃａｓｔｒｏら、２００６年
【非特許文献１５】Ａｄｌｅｒ及びＧｕｓｔａｆｓｓｏｎ、１９８０年
【非特許文献１６】Ｐａｒａｊｏら、１９９７年
【非特許文献１７】Ｔｏｖａｒら、２００２年
【非特許文献１８】Ａｎｄｌｉｄら、１９９５年
【非特許文献１９】Ｐａｐｏｕｓｋｏｖａ及びＳｙｃｈｒｏｖａ、２００７年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、ビブリオ・ミダエ及び／若しくはデバリオマイセス・ハンセニイ細胞の生きた培養物並びに／又は生きた培養物の組み合わせを含むプロバイオティクス餌組成物を製造する新規な方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の第１の態様によれば、プロバイオティクス組成物の製造において用いるためのプロバイオティクスの培養用の増殖培地、及びアワビ用のプロバイオティクス餌が提供される。
【００１７】
本発明の一実施形態において、増殖培地は、クエン酸、Ｈ３ＰＯ４、約０ｇ／ｌから約４ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｃａ（ＮＯ３）２、ＭｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、ＫＣｌ、約２０ｇ／ｌから約４０ｇ／ｌのＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、約４２ｇ／ｌから約２５５ｇ／ｌのコーンスティープリカー、約１ｇ／ｌから約４０ｇ／ｌの転化高品質糖蜜、及び約０．５ｍｌ／ｌから約５ｍｌ／ｌの消泡剤を含み、ｐＨが約５から約８である、細菌増殖培地である。好ましくは、細菌増殖培地は、約１ｇ／ｌのクエン酸、約２．５ｍｌ／ｌのＨ３ＰＯ４、約０．４ｇ／ｌのＣａ（ＮＯ３）２、約０．０４０ｇ／ｌのＭｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、約０．０３２ｇ／ｌのＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、約１ｇ／ｌのＫＣｌ、約３０ｇ／ｌのＮａＣｌ、約２．３ｇ／ｌのＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、約５４．４ｇ／ｌのコーンスティープリカー、約２４ｇ／ｌの転化高品質糖蜜、及び約１ｍｌ／ｌの消泡剤を含み、増殖培地のｐＨは、約６．５に維持されている。細菌増殖培地は、マリンブロス（ＭＢ）培地より顕著に高いビブリオ・ミダエの細胞増殖率（ｇ／ｌ／ｈ）を支持する。
【００１８】
本発明の別の一実施形態において、増殖培地は、クエン酸、Ｈ３ＰＯ４、約１８ｇ／ｌから約３０ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２ＳＯ４、ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、約０ｇ／ｌから約４０ｇ／ｌのＮａＣｌ、ＫＨ２ＰＯ４、約８ｇ／ｌから約２１２ｇ／ｌのコーンスティープリカー、約１ｇ／ｌから約４０ｇ／ｌの転化高品質糖蜜、及び約０．５ｍｌ／ｌから約５ｍｌ／ｌの消泡剤を含み、ｐＨが約４から７である、酵母増殖培地である。好ましくは、酵母培地は、約２．５ｇ／ｌのクエン酸、約１６．３ｍｌ／ｌのＨ３ＰＯ４、約３０ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、約８．２ｇ／ｌのＭｇＳＯ４．７Ｈ２ＳＯ４、約０．８ｇ／ｌのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、約０．１ｇ／ｌのＮａＣｌ、約１１．３ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、約２０４ｇ／ｌのコーンスティープリカー、約１０ｇ／ｌのグルコース、及び約１ｍｌ／ｌの消泡剤を含み、増殖培地のｐＨは、約５．６に維持されている。酵母増殖培地は、酵母エキス−ペプトン−グルコース（ＹＰＤ）培地より顕著に高いデバリオマイセス・ハンセニイの細胞増殖率（ｇ／ｌ／ｈ）を支持する。
【００１９】
本発明の第２の態様によれば、（ｉ）接種培地にビブリオ・ミダエ生細胞及び／又はデバリオマイセス・ハンセニイ生細胞の培養物を接種することによって、予備発酵培養物を調製する工程、（ｉｉ）反応器に含有される増殖培地に、予備発酵培養物を接種する工程、（ｉｉｉ）ビブリオ・ミダエ細胞及び／又はデバリオマイセス・ハンセニイ細胞の増殖期中、気流、酸素飽和度、背圧、温度及び増殖培地のｐＨを制御する工程、（ｉｖ）細胞が安定形態であり且つ生細胞濃度が２×１０８細胞／ｍｌから１×１０１１細胞／ｍｌの範囲である、増殖の対数中期と静止期との間に、ビブリオ・ミダエ細胞を採取する工程、或いはまた、生細胞濃度が４×１０７細胞／ｍｌから２×１０１０細胞／ｍｌの範囲である、増殖の対数中期と対数後期との間に、デバリオマイセス・ハンセニイ細胞を採取する工程、並びに（ｖ）採取したビブリオ・ミダエ細胞及び／又はデバリオマイセス・ハンセニイ細胞を緩衝液中に再懸濁することによって、液体製品を製造する工程を含む、プロバイオティクス組成物を製造する方法が提供される。
【００２０】
この明細書に記載されている単離されたビブリオ・ミダエは、ベルギー微生物統合コレクション（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ；ＢＣＣＭ）に、２０１３年７月１日に受託番号ＬＭＧ  Ｐ−２７７２７で寄託されている。同様に、この明細書に記載されている単離されたデバリオマイセス・ハンセニイの培養物は、２０１３年７月１日に受託番号ＭＵＣＬ  ５４９８２で寄託されている。
【００２１】
本方法は、（ｖｉ）液体製品を、担体、安定剤又は充填剤とブレンドして、バイオマスペーストを形成する工程、及び（ｖｉｉ）バイオマスペーストを乾燥して、乾燥製品を製造する工程をさらに含んでもよい。
【００２２】
本発明の方法は、回分法又は流加回分法であってよい。好ましくは、本方法は、ビブリオ・ミダエには回分法であり、デバリオマイセス・ハンセニイには流加回分法である。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態において、流加回分法又は回分法のための反応器への気流は、０．５から２．０ｖ／ｖ／ｍの範囲であってよい。好ましくは、反応器への気流は１ｖ／ｖ／ｍである。
【００２４】
本発明のさらに好ましい実施形態において、発酵培地中の溶存酸素は、飽和度２０から１００％の範囲であることが好ましい。さらに好ましくは、溶存酸素は、飽和度３０％に維持する。
【００２５】
本発明のさらに別の好ましい実施形態において、反応器内の背圧は、０から２５０ｋＰａの範囲であることが好ましい。最も好ましくは、反応器内の背圧は、５０ｋＰａである。
【００２６】
ビブリオ・ミダエ細胞は、培養培地中で２０から３４℃の範囲の温度にて培養されることが好ましい。最も好ましくは、ビブリオ・ミダエ細胞は、３０℃の温度にて培養される。一方、デバリオマイセス・ハンセニイ細胞は、培養培地中で１６から３４℃の範囲の温度にて培養されることが好ましい。最も好ましくは、デバリオマイセス・ハンセニイ細胞は、２４℃の温度にて培養される。
【００２７】
ビブリオ・ミダエ用の培養培地のｐＨは、５．０から８．０の範囲であることが好ましく、最も好ましくはｐＨは６．５である。デバリオマイセス・ハンセニイ用の培養培地のｐＨは、４．０から７．０の範囲であることが好ましく、最も好ましくはｐＨは５．６である。
【００２８】
本発明の方法において用いられる増殖培地は、ビブリオ・ミダエ及び／又はデバリオマイセス・ハンセニイ細胞の増殖のための栄養分を含んでいることが理解される。栄養分は、無機塩、炭素源、窒素、ビタミン、微量元素、消泡剤、及びそれらの混合物からなる群から選択される。さらに、接種培地は、無機塩、炭素源、窒素、ビタミン、微量元素、及びそれらの混合物からなる群から選択される、本発明の方法において用いられるプロバイオティクスの増殖のための栄養分を含むことが理解される。
【００２９】
本発明の一実施形態において、プロバイオティクス微生物は、遠心分離又はろ過によって増殖培地から採取される。好ましい実施形態において、プロバイオティクス微生物は、垂直管遠心分離によって採取される。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態においては、ビブリオ・ミダエプロバイオティクス微生物をリン酸緩衝食塩水中に再懸濁して、液体製品を製造する。同様に、デバリオマイセス・ハンセニイプロバイオティクス微生物をリン酸緩衝液中に再懸濁して、液体製品を製造し、好ましくは、リン酸緩衝液は、約４〜２０％ｍ／ｍのトレハロース、好ましくは１２．５％ｍ／ｍのトレハロースを含み、緩衝液のｐＨは約４から６の範囲であり、好ましくはｐＨは４．５である。
【００３１】
本発明のさらに好ましい実施形態においては、液体製品を、微結晶セルロース、トレハロース、スクロース及びスキムミルク、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される担体と組み合わせて、ブレンド製品を形成する。また別の好ましい実施形態においては、バイオマスペーストを押出成形し乾燥して、乾燥製品を形成する。
【００３２】
担体と組み合わせたビブリオ・ミダエ液体製品の押出成形は、３０から７０℃の範囲の温度にて典型的に行われるが、好ましくは、押出成形は４５℃の温度にて行う。担体と組み合わせたデバリオマイセス・ハンセニイ液体製品の押出成形は、３０から５０℃の範囲の温度にて典型的に行われるが、好ましくは、押出成形は４５℃の温度にて行う。
【００３３】
本発明の第３の態様によれば、本発明の方法に従って作製された液体製品又は乾燥製品を含み、ビブリオ・ミダエ細胞及び／若しくはデバリオマイセス・ハンセニイ細胞並びに／又は二者の組み合わせを含有する、アワビの水産養殖において用いるためのプロバイオティクス組成物が提供される。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態において、本発明の方法に従って作られた液体製品又は乾燥製品は、アワビの餌に製剤化される。さらに、液体製品又は乾燥製品は、餌の押出成形前に予備ブレンドすること、予備調製されたアワビの餌へ真空注入すること、又は既存の餌にトップコーティングすることによって、アワビの餌と組み合わされてもよい。
【００３５】
アワビの餌と組み合わせたビブリオ・ミダエ液体又は乾燥製品の押出成形は、３０から７０℃の範囲の温度が典型的であるが、好ましくは、押出成形は４５℃の温度にて行う。アワビの餌と組み合わせたデバリオマイセス・ミダエ液体又は乾燥製品の押出成形は、３０から７０℃の範囲の温度が典型的であるが、好ましくは、押出成形は、４５℃の温度にて行う。
【００３６】
本発明のまた別の態様は、アワビの餌と、本発明のビブリオ・ミダエプロバイオティクス組成物及びデバリオマイセス・ハンセニイプロバイオティクス組成物との組み合わせを含む、アワビ用のプロバイオティクス組成物を提供する。
【００３７】
ここで、本発明の非限定的な実施形態について、以下の図を参照しながら、単なる例として説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１ａ】ある温度条件範囲（１０℃から４０℃）にわたる２ＬのＢｒａｕｎ  Ｂバイオ反応器内でのビブリオ・ミダエの培養中に得られた細胞増殖率（ＣＦＵ／ｍｌ／ｈ）のデータである。
【図１ｂ】ある温度条件範囲（１０℃から４０℃）にわたる２ＬのＢｒａｕｎ  Ｂバイオ反応器内でのデバリオマイセス・ハンセニイの培養中に得られた細胞増殖率（ＣＦＵ／ｍｌ／ｈ）のデータである。
【図２ａ】あるｐＨ条件範囲（５．０から８．０）にわたる２ＬのＢｒａｕｎ  Ｂバイオ反応器内でのビブリオ・ミダエの培養中に得られた細胞増殖率（ＣＦＵ／ｍｌ／ｈ）のデータである。
【図２ｂ】あるｐＨ条件範囲（４．０から７．０）にわたる２ＬのＢｒａｕｎ  Ｂバイオ反応器内でのデバリオマイセス・ハンセニイの培養中に得られた細胞増殖率（ＣＦＵ／ｍｌ／ｈ）のデータである。
【図３ａ】１５ＬのＢｒａｕｎ  Ｃバイオ反応器内での様々な濃度のＣＬＳを含有する発酵培地中での当該生物の培養中に測定されたビブリオ・ミダエの細胞増殖率である。
【図３ｂ】１５ＬのＢｒａｕｎ  Ｃバイオ反応器内での様々な濃度のＣＬＳを含有する発酵培地中での当該生物の培養中に測定されたデバリオマイセス・ハンセニイの細胞増殖率である。
【図４ａ】１５ＬのＢｒａｕｎ  Ｃバイオ反応器内での様々な濃度のＴＳＡＩを含有する発酵培地中での当該生物の培養中に測定されたビブリオ・ミダエの細胞増殖率である。
【図４ｂ】１５ＬのＢｒａｕｎ  Ｃバイオ反応器内での様々な濃度のＴＳＡＩを含有する発酵培地中での当該生物の培養中に測定されたデバリオマイセス・ハンセニイの細胞増殖率である。
【図５】生物の高い細胞密度生成を達成するための社内開発増殖培地中でのビブリオ・ミダエの増殖である。
【図６】１５ＬのＢｒａｕｎ  Ｃバイオ反応器内での最適な発酵培地中でのビブリオ・ミダエの増殖のための操作パラメータを示す発酵プロファイルである。
【図７】５４．４ｇ／ｌのＣＳＬ及び２５ｇ／ｌのＨＴＭを補足した培地中でのビブリオ・ミダエの培養中に得られ評価された主要な応答である。
【図８】生物の高い細胞密度生成を達成するための社内開発増殖培地中でのデバリオマイセス・ハンセニイの増殖である。
【図９】１５ＬのＢｒａｕｎ  Ｃバイオ反応器内での最適な発酵培地中でのデバリオマイセス・ハンセニイの増殖のための操作パラメータを示す発酵プロファイルである。
【図１０】２４ｇ／ｌのＣＳＬ及び１０ｇ／ｌのＨＴＭを補足した培地中でのデバリオマイセス・ハンセニイ株の培養中に得られた主要な応答である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
ここで、本発明について、本発明の全てではないがいくつかの実施形態が示されている添付の図面を参照しながら、以下により完全に説明する。
【００４０】
説明される本発明は、開示される特定の実施形態に限定されるべきものではなく、改変及び他の実施形態が本発明の範囲内に含まれることが意図されている。本明細書においては特定の用語が使用されるが、それらは一般的で且つ記述的な意味においてのみ用いられ、限定を目的とするものではない。
【００４１】
単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」等のその単語の変化形は、「含むがそれに限定されない」ことを意味し、例えば、他の添加剤、構成成分、整数又は工程を排除することを意図しない。
【００４２】
本明細書において用いる場合、用語「細菌生細胞」又は「酵母生細胞」は、生きており複製及び／若しくは繁殖が可能な微生物、又は生きているが休止期、冷凍、保存若しくは再構成状態にあって培養可能ではない微生物を指す。
【００４３】
本明細書において用いる場合、用語「生存細胞収率」又は「生存細胞濃度」は、リットル、ミリリットル、キログラム、グラム又はミリグラム等の測定単位当たりの、液体培養物中の濃縮又は保存状態の生存細胞の数を指し、生きているが培養可能ではない細菌及び／又は酵母生細胞を含んでもよい。
【００４４】
本明細書において用いる場合、用語「細胞保存」は、休止期細胞を取り、生存能力を経時的に保つ代謝的に不活性な状態にそれを保存するプロセスを指す。本明細書において用いる場合、用語「製品」は、他の構成成分とブレンドすることができ且つ生存細胞を特定濃度で含有する、販売され用いられ得る微生物の組成物を指す。
【００４５】
本明細書において用いる場合、用語「プロバイオティクス」は、宿主生物に有益な効果を与える１種又は複数種の生きた微生物を指す。消化管内でのプロバイオティクス微生物の定着に由来する有益性には、病原体負荷の軽減、改善された微生物発酵パターン、改善された栄養分吸収、改善された免疫機能、及び補助された消化が含まれる。
【００４６】
本明細書において用いる場合、用語「発酵」は、１つの物質を他の物質へ変換し、その際に細胞が細胞エネルギーを得ることができる、生物によって行われる代謝プロセス、例えば、生物がグルコースを利用し、それを乳酸又はプロピオン酸へ変換するときを指す。本願においては、発酵プロセスを用いて細胞エネルギーを生成して、細菌及び／又は酵母株の再生産を容易にし、それによってこれらの微生物をより多く製造する。
【００４７】
本発明の方法は、細菌であるビブリオ・ミダエ若しくは酵母であるデバリオマイセス・ハンセニイ又は二者の組み合わせを含むアワビの餌の製造を提供する。
【００４８】
本プロバイオティクスは、高生産性の発酵方法におけるこれらの微生物の複製によって製造される。
【００４９】
本発明の発酵方法は、回分法又は流加回分法であってもよい。しかしながら、好ましくは、本方法は、ビブリオ・ミダエには回分法であり、デバリオマイセス・ハンセニイには流加回分法である。
【００５０】
発酵気流は、ビブリオ・ミダエ又はデバリオマイセス・ハンセニイのいずれについても、０．５から２．０ｖ／ｖ／ｍの範囲であり、好ましくは１ｖ／ｖ／ｍである。発酵撹拌速度は、ビブリオ・ミダエ又はデバリオマイセス・ハンセニイのいずれについても、溶存酸素を飽和度２０から１００％の範囲、好ましくは飽和度３０％に維持するように制御される。発酵酸素利用率は、ビブリオ・ミダエ又はデバリオマイセス・ハンセニイのいずれについても、１０から２１０ｍＭｏｌ／ｌ／ｈの範囲であり、名目上は、ビブリオ・ミダエについては１６０ｍＭｏｌ／ｌ／ｈであり、デバリオマイセス・ハンセニイについては２００ｍＭｏｌ／ｌ／ｈである。
【００５１】
発酵背圧は、０から２５０ｋＰａの範囲であり、発酵背圧は５０ｋＰａが最適である。
【００５２】
発酵温度は、ビブリオ・ミダエについては、２０から３４℃の範囲であり、３０℃が最適であり（図１ａ）、デバリオマイセス・ハンセニイについては、１６から３４℃の範囲であり、２４℃が最適である（図１ｂ）。
【００５３】
発酵ｐＨは、ビブリオ・ミダエについては、５．０から８．０の範囲であり、６．５が最適であり（図２ａ）、デバリオマイセス・ハンセニイについては、４．０から７．０の範囲であり、５．６が最適である（図２ｂ）。発酵ｐＨは、酸又は塩基を用いて制御される。酸は好ましくは硫酸であり、塩基は好ましくは水酸化アンモニウムである。
【００５４】
増殖培地は、塩を含み、ビブリオ・ミダエについては、（塩化マグネシウム六水和物、塩化カリウム、クエン酸、硝酸カルシウム、硫酸第一マンガン四水和物、硫酸鉄七水和物及びリン酸）が好ましく、デバリオマイセス・ハンセニイについては、（クエン酸、硫酸マグネシウム七水和物、塩化カルシウム無水物、リン酸二水素カリウム及びリン酸）が好ましい。
【００５５】
増殖培地は、無機窒素源、ＮａＣｌ、消泡剤、炭化水素及び有機栄養源を含む。無機窒素源は、ビブリオ・ミダエについては、０から１５ｇ／ｌの範囲、好ましくは０から４ｇ／ｌ、最も好ましくは０ｇ／ｌ、デバリオマイセス・ハンセニイについては、１５から５０ｇ／ｌの範囲、好ましくは１８から３０、最も好ましくは１８．５ｇ／ｌの硫酸アンモニウムであってもよい。ＮａＣｌ源は、ブリオ・ミダエについては、１０から５０ｇ／ｌの範囲、好ましくは２０から４０ｇ／ｌ、最も好ましくは３０ｇ／ｌであり、デバリオマイセス・ハンセニイについては、０から１０ｇ／ｌの範囲、好ましくは０．１ｇ／ｌである。増殖培地は、０．５から１０ｍｌ／ｌの範囲、好ましくは１から５ｍｌ／ｌ、最も好ましくは１ｍｌ／ｌの消泡剤を含む。有機栄養源は、コーンスティープリカー（以下、「ＣＳＬ」という）、ペプトン、酵母エキス及び又はカザミノ酸であってよく、好ましくは、ビブリオ・ミダエについては４２から２５５ｇ／ｌの範囲で最適濃度が５４．４ｇ／ｌ（図３ａ）、デバリオマイセス・ハンセニイについては８から２１２ｇ／ｌの範囲で最適濃度が２０４ｇ／ｌ（図３ｂ）である、液体フィターゼ処理限外ろ過ＣＳＬであってよい。炭化水素源は、グルコース、フルクトース、スクロース又は糖蜜であってよいが、好ましくは、ビブリオ・ミダエについては１から４０ｇ／ｌ転化全糖（以下、「ＴＳＡＩ」という）の範囲で最適濃度が２４ｇ／ｌ（図４ａ）、デバリオマイセス・ハンセニイについては１から４０ｇ／ｌＴＳＡＩ（グルコース又はＨＴＭ）の範囲で最適濃度が１０ｇ／ｌ（図４ｂ）である、転化高品質糖蜜（以下、「ＨＴＭ」という）である。
【００５６】
微生物は、生産性及びロバスト性を改善するため、ビブリオ・ミダエについては、（塩化マグネシウム六水和物、塩化カリウム、クエン酸、硝酸カルシウム、硫酸第一マンガン四水和物、硫酸鉄七水和物、リン酸、酵母エキス、カザミノ酸及びペプトン）、又はデバリオマイセス・ハンセニイについては、（クエン酸、硫酸マグネシウム七水和物、塩化カルシウム無水物、リン酸二水素カリウム、リン酸及び酵母エキス）を含む、増殖培地に類似の接種培地中で、接種段階において育てられる。
【００５７】
発酵生産性は、ビブリオ・ミダエについては、１．０×１０８から１．６×１０１３細胞／ｌ／ｈの範囲であり、最適には１．５×１０１３細胞／ｌ／ｈであり、デバリオマイセス・ハンセニイについては、３．０×１００４から７．０×１０１１細胞／ｌ／ｈの範囲であり、最適には６．４×１０１１細胞／ｌ／ｈである。
【００５８】
発酵微生物細胞濃度は、ビブリオ・ミダエについては、２×１０８から１×１０１１細胞／ｍｌの範囲であり、最適には９．２×１０１０細胞／ｍｌであり、デバリオマイセス・ハンセニイについては、４．０×１０７から２．０×１０１０細胞／ｍｌの範囲であり、最適には１．６×１０１０細胞／ｍｌである。
【００５９】
培養されたビブリオ・ミダエ又はデバリオマイセス・ハンセニイは、発酵ブロスから遠心分離又はろ過、好ましくは垂直管遠心分離及び／又は連続遠心分離によって採取する。
【００６０】
バイオマスは、適した緩衝液、好ましくはＮａＣｌを含有するリン酸緩衝液に製剤化して、プロバイオティクス液体製品を得てもよい。或いはまた、デバリオマイセス・ハンセニイについては、リン酸緩衝液は、約４〜２０％ｍ／ｍのトレハロース、好ましくは１２．５％ｍ／ｍのトレハロースを含み、緩衝液のｐＨは約４から６の範囲であり、好ましくはｐＨは４．５である。
【００６１】
液体製品形態は、乾燥担体、安定剤又は充填剤、例えば、微結晶セルロース（以下、「ＭＣＣ」という）、トレハロース、スクロース又はスキムミルク、好ましくは、トレハロースとＭＣＣとの組み合わせと共に、バイオマスペーストへ製剤化してもよい。
【００６２】
バイオマスペーストは、押出成形し乾燥して、プロバイオティクス乾燥製品を得てもよい。バイオマスペーストは、３０から５０℃の範囲の温度にて押出成形してもよいが、好ましくは、バイオマスペーストは４５℃の温度にて押出成形する。
【００６３】
プロバイオティクス液体製品又はプロバイオティクス乾燥製品は、餌の押出成形前に予備ブレンドすること、又は既存の餌へ真空注入すること、又は既存の餌にトップコーティングすることによって、アワビの餌に製剤化してもよい。
【００６４】
本明細書に記載の微生物を、先行技術における記載より高い細胞密度培養物中で又は顕著に高い細胞増殖率（ｇ／ｈ／ｌ）で製造することを示唆する文献証拠は見出されていない。さらに、標準的な方法は、１×１０９細胞／ｍｌの細胞力価を典型的に生じるが、驚くべきことに、この明細書に記載の方法を用いると、顕著に高い細胞力価を生じる（デバリオマイセス・ハンセニイは１．５７×１０１０細胞／ｍｌ、ビブリオ・ミダエは９．７２×１０１０細胞／ｍｌ）。
【００６５】
以下の実施例は、例証として提示されるものであり、限定として提示されるものではない。
【実施例１】
【００６６】
ビブリオ・ミダエのアワビプロバイオティクスの製造
本明細書に記載のビブリオ・ミダエは、生存できるが培養できない（ＶＮＢＣ）状態に入ることが知られている。しかしながら、本明細書に記載の方法及び培地は、ビブリオ・ミダエがこれらのプロバイオティクスの大規模製造のための培養可能な状態に入ることを可能にする。
ビブリオ・ミダエ接種源
ビブリオ・ミダエの冷凍バイアルを１つのみ用いて、各接種フラスコ（１．８リットル、フェルンバッハ）に接種した。各フラスコ中の増殖培地は、１ｇ／ｌのクエン酸、２．５ｍｌ／ｌのＨ３ＰＯ４、３ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．４ｇ／ｌのＣａ（ＮＯ３）２、０．０４ｇ／ｌのＭｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．０３２ｇ／ｌのＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、１ｇ／ｌのＫＣｌ、３０ｇ／ｌのＮａＣｌ、２．３ｇ／ｌのＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、５ｇ／ｌのカザミノ酸、５ｇ／ｌの酵母エキス、１０ｇ／ｌのペプトン（Ｂｉｏｌａｂ）及び１０ｇ／ｌのグルコースからなるものであった。増殖培地のｐＨは、１２１℃にて１５分間の殺菌の前に、１０％ｖ／ｖのＨ２ＳＯ４又は２５％ｖ／ｖのＮＨ４ＯＨを用いて６．５に調整した。接種に続いて、フラスコを３０℃にてオービタルシェーカー（Ｉｎｎｏｖａ  ２３００、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、エジソン、ニュージャージー、米国）において１８０ｒｐｍの速度で４．５時間インキュベートした（ＯＤ６６０ｎｍ約２．０）。
ビブリオ・ミダエ発酵方法
接種したフラスコを１つのみ用いて、各発酵槽に接種した。発酵方法は、１５リットルのＢｉｏｓｔａｔ  Ｃ（商標）発酵槽（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＢＢＩ  ｓｙｓｔｅｍｓ、メルズンゲン、独国）中で稼働容積１０リットルにて実行した。
【００６７】
発酵槽中で用いた増殖培地は、以下の培地構成成分を含有していた：１ｇ／ｌのクエン酸、２．５ｍｌ／ｌのＨ３ＰＯ４、０．４ｇ／ｌのＣａ（ＮＯ３）２、０．０４０ｇ／ｌのＭｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．０３２ｇ／ｌのＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、１ｇ／ｌのＫＣｌ、３０ｇ／ｌのＮａＣｌ、２．３ｇ／ｌのＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、５４．４ｇ／ｌのＣＳＬ、及び２４ｇ／ｌのＨＴＭ。増殖培地塩、消泡剤（１ｍｌ／ｌのＰｌｕｒｉｏｌ（商標）Ｐ２０００、ＢＡＳＦ、ルートヴィヒスハーフェン、独国）及びＣＳＬを初期充填物に加え、９．３リットルにした。初期充填物の殺菌に続いて、別個に殺菌したＨＴＭ溶液を加えた。発酵温度は３０℃に維持した。スターラーの速度は、５００ｒｐｍに設定し、１０００ｒｐｍへ勾配させて、溶存酸素が飽和度３０％を超えるように維持した。ｐＨを１０％ｖ／ｖのＨ２ＳＯ４又は２５％ｖ／ｖのＮＨ４ＯＨを用いて６．５に維持した。通気は１ｖ／ｖ／ｍに設定した。
ビブリオ・ミダエ株の後処理
Ｓｈａｒｐｌｅｓ−Ｓｔｏｋｅｓ遠心分離器（Ｐｅｎｎｗａｌｔ、仏国）を用いて、発酵ブロスを遠心分離した。遠心管速度は１５７００ｇであり、発酵ブロス供給速度は３０リットル／ｈであった。上澄み液を捨て、リン酸緩衝液（ＫＨ２ＰＯ４  ０．１１、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．７１、ＮａＣｌ  ２．９１、Ｈ２Ｏ  ９６．２７％ｍ／ｍ）を用いてバイオマスを製剤化した。オーバーヘッドスターラー（パドル式撹拌機）を用いて、液体製品を均一化した（１０００ｒｐｍ）。
【００６８】
押出成形乾燥製品形態のため、細菌（リン酸緩衝食塩水中に製剤化したもの）をＭＣＣ（液体製品対ＭＣＣが質量基準で１：１）及びトレハロース（５％ｍ／ｍ）と、フードミキサーＫＭＸ５０（Ｋｅｎｗｏｏｄ、ロンドン、英国）中でブレンドした。ブレンド物を篩型押出成形機Ｎｉｃａ  Ｅ−１４０  ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｉｒｏ−Ａｅｒｏｍａｔｉｃ、サウサンプトン、英国）を通して冷押出成形し、その後、ベンチスケールのＡｅｒｏｍａｔｉｃ流動床乾燥機（Ａｅｒｏｍａｔｉｃ  ＡＧ、独国）を用いて約１０％ｍ／ｍまで対流乾燥した。注入気流は、５０ｍ３／ｈ及び周囲温度に設定した。
【００６９】
アワビの餌のため、遠心分離したバイオマスを人口塩水（ＡＳＷ）緩衝液中に再懸濁した。再懸濁した緩衝液を、アワビの餌に加え、スクリュー押出成形機を用いて冷押出成形し、対流オーブン（３０℃）中で最終含水率約１０％ｍ／ｍまで乾燥した。再懸濁したバイオマスは、３０から７０℃の範囲の温度にて押出成形した。しかしながら、バイオマスペーストは、４５℃の温度にて押出成形することが好ましい。
結果
ビブリオ・ミダエを２４ｇ／ｌのＨＴＭ及び５４．４ｇ／ｌのＣＳＬを含有する培地中で培養したとき、６時間培養後に、最大細胞濃度９．７×１０１０細胞／ｍｌ及び最適密度１１．１が得られた。（図５）。
【００７０】
気流及び温度は、発酵全体を通して１ｖ／ｖ／ｍ及び３０℃を維持した。ｐＨは、１０％ｖ／ｖのＨ２ＳＯ４又は２５％ｖ／ｖのＮＨ４ＯＨを用いて６．５に自動制御した。ＰＯ２は、必要な場合には撹拌速度を高めて３０％超に維持した。この発酵において、最大酸素利用速度（ＯＵＲ）１６０ｍＭｏｌ／ｌ／ｈを達成した（図６）。
【００７１】
測定した主要な応答は、増殖速度、細胞濃度、細胞増殖率、並びにタンパク質（ＹＰＰ）、糖（ＹＰＳ）及び酸素（ＹＰＯ）に対する細胞収率であった（図７）。
【００７２】
１．０／ｈの増殖速度が観察された。ビブリオ・ミダエを発酵培地中で培養することによって、最大細胞濃度９．７×１０１０細胞／ｍｌ及び細胞増殖率１．６×１０１３細胞／ｍｌ／ｈが得られた。タンパク質、糖及び酸素に対するビブリオ・ミダエ細胞収率は、それぞれ１．８×１０１３細胞／ｇ、４．１×１０１２細胞／ｇ及び２．０×１０１０細胞／ｇであった（図７）。
【００７３】
液体製品は、半減期が１００日である（４℃で貯蔵）。初期カウント２×１０１０ＣＦＵ／ｍｌの最終製品に製剤化すると、有効期間は６６９日である（最終製品カウント１×１０８ＣＦＵ／ｍｌまで）。
【００７４】
押出成形製品は、半減期が４．８６日である（４℃で貯蔵）。初期カウント２×１０１０ＣＦＵ／ｍｌの最終製品に製剤化すると、有効期間は３１．５日である（最終製品カウント１×１０８ＣＦＵ／ｍｌまで）。
【００７５】
アワビの餌は、半減期が２２．４日である（４℃で貯蔵）。初期カウント２×１０１０ＣＦＵ／ｍｌの最終製品に製剤化すると、有効期間は１５６．８日である（最終製品カウント１×１０８ＣＦＵ／ｍｌまで）。
【００７６】
ビブリオ・ミダエの増殖、培養及び維持に関しては、限られた情報しかこれまで入手できなかった。この生物の増殖についての情報を与え且つこの生物を単離した個人によって提供された文献は１つしかない（Ｍａｃｅｙ及びＣｏｙｎｅ、２００６年）。彼らの刊行物において、彼らは、標準マリンブロスＭＢ中での２２℃の温度及びｐＨ約７．０でのビブリオ・ミダエの培養を教示している。
【００７７】
一方、本発明は、ビブリオ・ミダエの生産性を２７％増加し、製造コストの実質的削減（１０９１０８％）することにつながる細菌増殖培地を提供する。
【００７８】
さらに、Ｍａｃｅｙ及びＣｏｙｎｅ、２００６年の教示では、最適増殖温度は２２℃であることが示唆されているが、３０℃まで温度を高めると細胞増殖率が１０７７倍改善することにつながることが分かった。しかも、記載した細菌増殖培地と共に用いると、ｐＨをやや酸性である６．５に調整することによって、細胞増殖率が３３３％さらに改善する結果となった。
【００７９】
栄養源としてＣＳＬを用いることによって、最適ｐＨ及び温度において、本方法の実績は顕著に改善され、驚くべきことに、細胞濃度が２４％増加、細胞増殖率が２７５０倍増加、製造コストが１．８２×１０６％低下するという結果となった。
【００８０】
さらに、炭素源としてＨＴＭを含むことによって、本方法は、細胞濃度が１８１％増加、細胞増殖率が５７０５倍増加、製造コストが３．７４×１０６％低下するという結果をもたらした。
【００８１】
上述した要因の組み合わせは、生産性、濃度及び収率の顕著な増加に加えてこの生物の製造コストの実質的削減を伴う、プロバイオティクスとしてのビブリオ・ミダエを製造するための新規な方法の開発につながった。
【００８２】
本明細書に記載の培養培地においてビブリオ・ミダエの培養することと、この実施例の方法を使用することとの累積的効果は、これまでの製造方法よりも生産性が３１１７倍増加するという結果となった。この増加した生産高は、最適温度及びｐＨの使用を伴う新規な増殖培地に起因する可能性がある。本方法の生産性は、普通に用いられている窒素及び炭化水素原をＣＳＬ及びＨＴＭに置換することによって、さらに８３％改善された。９９％のコストの低下が、最後のプロセス最適化工程において観察された。この研究は、ビブリオ・ミダエの培養に関する多大な量の新たな知識を提供する。
【実施例２】
【００８３】
デバリオマイセス・ハンセニイのアワビプロバイオティクスの製造
デバリオマイセス・ハンセニイ接種源
デバリオマイセス・ハンセニイの冷凍バイアル（５．９×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を１つのみ用いて、各接種フラスコ（１．８リットル、フェルンバッハ）に接種した。各フラスコ中の増殖培地は、２．５ｇ／ｌのクエン酸、１６．３ｍｌ／ｌのＨ３ＰＯ４、３０ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、８．２ｇ／ｌのＭｇＳＯ４．７Ｈ２ＳＯ４、０．８ｇ／ｌのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ｌのＮａＣｌ、１１．３ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、１０ｇ／ｌの酵母エキス及び１０ｇ／ｌのグルコースからなるものであった。増殖培地のｐＨは、１２１℃にて１５分間の殺菌の前に、１０％ｖ／ｖのＨ２ＳＯ４又は２５％ｖ／ｖのＮＨ４ＯＨを用いて５．６に調整した。接種に続いて、フラスコを２４℃にてオービタルシェーカー（Ｉｎｎｏｖａ  ２３００、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、エジソン、ニュージャージー、米国）において１８０ｒｐｍの速度で２２時間インキュベートした（ＯＤ６６０ｎｍ約４．０）。
デバリオマイセス・ハンセニイ発酵方法
接種したフラスコを１つのみ用いて、各発酵槽に接種した。発酵方法は、１５リットルのＢｉｏｓｔａｔ  Ｃ（商標）発酵槽（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＢＢＩ  ｓｙｓｔｅｍｓ、メルズンゲン、独国）中で稼働容積１０リットルにて実行した。
【００８４】
発酵槽中で用いた増殖培地は、以下の培地構成成分（ｇ／ｌ）を含有していた：２．５ｇ／ｌのクエン酸、１６．３ｍｌ／ｌのＨ３ＰＯ４、３０ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、８．２ｇ／ｌのＭｇＳＯ４．７Ｈ２ＳＯ４、０．８ｇ／ｌのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ｌのＮａＣｌ、１１．３ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、２０４ｇ／ｌのＣＳＬ、及び１０ｇ／ｌのグルコース又はＨＴＭ。増殖培地塩、消泡剤（１ｍｌ／ｌのＰｌｕｒｉｏｌ（商標）Ｐ２０００、ＢＡＳＦ、ルートヴィヒスハーフェン、独国）及びＣＳＬを初期充填物に加え、９．３リットルにした。初期充填物の殺菌に続いて、別個に殺菌したＨＴＭ溶液を加えた。発酵温度は２４℃に維持した。スターラーの速度は、５００ｒｐｍに設定し、１０００ｒｐｍへ勾配させて、溶存酸素が飽和度３０％を超えるように維持した。ｐＨを１０％ｖ／ｖのＨ２ＳＯ４又は２５％ｖ／ｖのＮＨ４ＯＨを用いて５．６に維持した。通気は１ｖ／ｖ／ｍに設定した。
デバリオマイセス・ハンセニイ株の後処理
Ｓｈａｒｐｌｅｓ−Ｓｔｏｋｅｓ遠心分離器（Ｐｅｎｎｗａｌｔ、仏国）を用いて、発酵ブロスを遠心分離した。遠心管速度は１５７００ｇであり、発酵ブロス供給速度は３０リットル／ｈであった。上澄み液を捨て、リン酸緩衝液（ＫＨ２ＰＯ４  ０．１１、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．７１、ＮａＣｌ  ２．９１、Ｈ２Ｏ  ９６．２７％ｍ／ｍ）を用いてバイオマスを製剤化した。オーバーヘッドスターラー（パドル式撹拌機）を用いて、液体製品を均一化した（１０００ｒｐｍ）。
【００８５】
押出成形乾燥製品形態のため、デバリオマイセス・ハンセニイ（リン酸緩衝液中に製剤化したもの）をＭＣＣ（液体製品対ＭＣＣが質量基準で１：１）及びトレハロース（５％ｍ／ｍ）と、フードミキサーＫＭＸ５０（Ｋｅｎｗｏｏｄ、ロンドン、英国）中でブレンドした。ブレンド物を篩型押出成形機Ｎｉｃａ  Ｅ−１４０  ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｉｒｏ−Ａｅｒｏｍａｔｉｃ、サウサンプトン、英国）を通して冷押出成形し、その後、ベンチスケールのＡｅｒｏｍａｔｉｃ流動床乾燥機（Ａｅｒｏｍａｔｉｃ  ＡＧ、独国）を用いて約１０％ｍ／ｍまで対流乾燥した。注入気流は、５０ｍ３／ｈ及び周囲温度に設定した。
【００８６】
アワビの餌の製剤化のため、遠心分離したバイオマスを人口塩水（ＡＳＷ）緩衝液中に再懸濁した。再懸濁した緩衝液を、アワビの餌に加え、スクリュー押出成形機を用いて冷押出成形し、対流オーブン（３０℃）中で最終含水率約１０％ｍ／ｍまで乾燥した。再懸濁したバイオマスは、３０から５０℃の範囲の温度にて押出成形した。しかしながら、バイオマスペーストは、４５℃の温度にて押出成形することが好ましい。
結果
デバリオマイセス・ハンセニイを２５ｇ／ｌのＨＴＭ及び２４ｇ／ｌのＣＳＬを含有する培地中で培養したとき、２２時間培養後に、最大細胞濃度８．４×１０９細胞／ｍｌ及び最適密度３７．９が得られた。（図８）。
【００８７】
気流及び温度は、発酵全体を通して１ｖ／ｖ／ｍ及び２４℃を維持した。ｐＨは、１０％ｖ／ｖのＨ２ＳＯ４又は２５％ｖ／ｖのＮＨ４ＯＨを用いて５．６に自動制御した。ＰＯ２は、必要な場合には撹拌速度を高めて３０％超に維持した。この発酵において、最大酸素利用速度（ＯＵＲ）２００ｍＭｏｌ／ｌ／ｈを達成した（図９）。
【００８８】
測定した主要な応答は、増殖速度、細胞濃度、細胞増殖率、並びにタンパク質（ＹＰＰ）、糖（ＹＰＳ）及び酸素（ＹＰＯ）に対する細胞収率であった（図１０）。
【００８９】
０．３／ｈの増殖速度が観察された。デバリオマイセス・ハンセニイを発酵培地中で培養することによって、最大細胞濃度８．４×１００９細胞／ｍｌ及び細胞増殖率３．８×１０１１細胞／ｍｌ／ｈが得られた。タンパク質、糖及び酸素に対するデバリオマイセス・ハンセニイ細胞収率は、それぞれ３．６×１０１１細胞／ｇ、３．５×１０１１細胞／ｇ及び４．２×１０１１細胞／ｇであった（図１０）。
【００９０】
液体製品は、半減期が３８１日であった（４℃で貯蔵）。初期カウント２×１０１０ＣＦＵ／ｍｌの最終製品に製剤化すると、有効期間は２５３５日である（最終製品カウント１×１０８ＣＦＵ／ｍｌまで）。
【００９１】
押出成形製品は、半減期が２７．５日であった（４℃で貯蔵）。初期カウント２×１０１０ＣＦＵ／ｍｌの最終製品に製剤化すると、有効期間は１９２．５日である（最終製品カウント１×１０８ＣＦＵ／ｍｌまで）。
【００９２】
デバリオマイセス・ハンセニイのアワビの餌は、半減期が１０１．２日である（４℃で貯蔵）。初期カウント２×１０１０ＣＦＵ／ｍｌの最終製品に製剤化すると、有効期間は７０８．４日である（最終製品カウント１×１０８ＣＦＵ／ｍｌまで）。
【００９３】
デバリオマイセス・ハンセニイプロバイオティクスのための製造技術は、これまで知られていなかった。濃度、生産性、及びバイオマスの収率又は細胞数等の、商業的実績のためのパラメータに従った実際の酵母製造についての報告は、文献にはない。Ｐａｐｏｕｓｋｏｖａ及びＳｙｃｈｒｏｖａ（２００７年）は、キシリトールの製造のために、２３℃の培養温度及びｐＨ６．５を提案している（彼らの目的は、バイオマスを製造することではなかった）。他の論文は、２８〜３０℃の最適温度範囲に言及している。この酵母のバイオマス製造に関連する先例は、Ｍａｃｅｙ及びＣｏｙｎｅ（２００６年）の研究からの増殖についての記載のみである。これらの研究は、標準ＹＰＤ培地、２０℃の温度及びｐＨ７．０を用いることを記載している。
【００９４】
本発明は、細胞増殖率を３０％改善し且つ製造コストを４２．７％削減する独自開発した酵母増殖培地を用いた、デバリオマイセス・ハンセニイの商業的製造のための方法について記載する。
【００９５】
さらに、我々の検討による知見は、これまでの記載に反して、本明細書に記載の方法のための最適温度は２４℃であるという結論につながった。この新規な培養温度は、細胞増殖率が４４９倍改善するという結果となった。ｐＨを５．６に調整することによって、さらに細胞増殖率が９５％改善することが観察された。
【００９６】
栄養源としてＣＳＬを用いることによって、最適ｐＨ及び温度において、本方法の実績は顕著に改善され、驚くべきことに、細胞濃度が１７６％増加、細胞増殖率が２３８２倍増加、製造コストが６４４％低下するという結果となった。
【００９７】
上述した要因の組み合わせは、生産性、濃度及び収率の顕著な増加に加えて製造コストの実質的削減を伴う、プロバイオティクスとしてのデバリオマイセス・ハンセニイの商業的製造のための新規な方法の開発につながった。
【００９８】
この実施例の方法の累積的効果は、これまでに知られている製造方法よりも生産性が２０７５倍増加するという結果となった。この増加した生産高は、新規な増殖培地を最適温度及びｐＨを共に使用することに起因する可能性がある。本方法の生産性は、栄養分としてＣＳＬを用いることによってさらに改善され、これは、デバリオマイセス・ハンセニイを製造するこれまでの最良の方法と比較して、さらに、細胞増殖率が１５％増加し、製造材料コストが６６％低くなるという結果となった。
【実施例３】
【００９９】
製造培地及び培養条件の比較評価
本発明の方法とＭａｃｅｙ及びＣｏｙｎｅ（２００６年）によって記載された方法との比較評価を実行した。本発明者らは、本発明の製造培地に対し、Ｍａｃｅｙ及びＣｏｙｎｅにおいて提示されている条件及び培地に従って育てられた培養物の製造コスト及び細胞増殖率を調査した。
【０１００】
Ｍａｃｅｙ及びＣｏｙｎｅは、以下のように調合されたマリンブロス（ＭＢ）中で２２℃にて１００ｒｐｍで振とうしながらビブリオ・ミダエを培養し［（ｗｔ／ｖｏｌ）３％のＮａＣｌ、０．２３％のＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、０．０３％のＫＣｌ、０．２％のグルコース、０．５％のカザミノ酸、０．１％の酵母エキス］、マリンアガー（ＭＡ）［２％の細菌用アガー（ｗｔ／ｖｏｌ）を補足したＭＢ、Ｕｎｉｌａｂ］上に維持した。著者らは、以下のように調合された酵母ペプトンＤ−グルコース（ＹＰＤ）ブロス中でデバリオマイセス・ハンセニイを培養し［（ｗｔ／ｖｏｌ）１％の酵母エキス、２％のペプトン、２％のＤ−グルコース）、ＹＰＤアガー［１．５％の細菌用アガー（ｗｔ／ｖｏｌ）を補足したＹＰＤブロス、Ｕｎｉｌａｂ］上で維持した。
結果
本発明の増殖培地及び方法並びに先行技術の増殖培地及び方法の比較評価の結果を、表１に提示する。
【０１０１】
本明細書に記載の培地及び方法は、最大で４６．０ｇ／ｌまでのビブリオ・ミダエバイオマス濃度、及び１１．４ｇ／ｌ／ｈのバイオマス生産性をもたらした。同様に、本明細書に記載の培地及び方法は、最大で１３３．７ｇ／ｌまでのデバリオマイセス・ハンセニイバイオマス濃度、及び６．１ｇ／ｌ／ｈのバイオマス生産性をもたらした。
【０１０２】
【表１】
2016506725.tif 000003
【０１０３】
表１の結果から、水産養殖におけるプロバイオティクスとして用いるためのビブリオ・ミダエ及びデバリオマイセス・ハンセニイの製造のために本発明者らによって開発された増殖培地及び集約的製造方法は、それぞれの培養物の対応する生産性向上と共にこれらの微生物の商業的製造のための顕著なコスト削減へとつながったことが明らかである。
【０１０４】
参考文献
【０１０５】
【表２】
2016506725.tif 000004
2016506725.tif 000005
2016506725.tif 000006
【図１ａ】
2016506725.tif 000007
【図１ｂ】
2016506725.tif 000008
【図２ａ】
2016506725.tif 000009
【図２ｂ】
2016506725.tif 000010
【図３ａ】
2016506725.tif 000011
【図３ｂ】
2016506725.tif 000012
【図４ａ】
2016506725.tif 000013
【図４ｂ】
2016506725.tif 000014
【図５】
2016506725.tif 000015
【図６】
2016506725.tif 000016
【図７】
2016506725.tif 000017
【図８】
2016506725.tif 000018
【図９】
2016506725.tif 000019
【図１０】
2016506725.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成27年10月8日(2015.10.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）クエン酸、
（ｉｉ）Ｈ３ＰＯ４、
（ｉｉｉ）約０ｇ／ｌから約４ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、
（ｉｖ）Ｃａ（ＮＯ３）２、
（ｖ）ＭｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、
（ｖｉ）ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、
（ｖｉｉ）ＫＣｌ、
（ｖｉｉｉ）約２０ｇ／ｌから約４０ｇ／ｌのＮａＣｌ、
（ｉｘ）ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、
（ｘ）約４２ｇ／ｌから約２５５ｇ／ｌのコーンスティープリカー、
（ｘｉ）約１ｇ／ｌから約４０ｇ／ｌの転化高品質糖蜜、及び
（ｘｉｉ）約０．５ｍｌ／ｌから約５ｍｌ／ｌの消泡剤
を含み、ｐＨが約５から約８である、細菌増殖培地。
【請求項２】
（ｉ）約１ｇ／ｌのクエン酸、
（ｉｉ）約２．５ｍｌ／ｌのＨ３ＰＯ４、
（ｉｉｉ）約０．４ｇ／ｌのＣａ（ＮＯ３）２、
（ｉｖ）約０．０４０ｇ／ｌのＭｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、
（ｖ）約０．０３２ｇ／ｌのＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、
（ｖｉ）約１ｇ／ｌのＫＣｌ、
（ｖｉｉ）約３０ｇ／ｌのＮａＣｌ、
（ｖｉｉｉ）約２．３ｇ／ｌのＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、
（ｉｘ）約５４．４ｇ／ｌのコーンスティープリカー、
（ｘ）約２４ｇ／ｌの転化高品質糖蜜、及び
（ｘｉ）約１ｍｌ／ｌの消泡剤
を含み、ｐＨが約６．５である、請求項１に記載の細菌増殖培地。
【請求項３】
マリンブロス（ＭＢ）培地より顕著に高い細胞増殖率（ｇ／ｌ／ｈ）を支持する、請求
項１又は２に記載の細菌増殖培地。
【請求項４】
接種培地にビブリオ・ミダエ生細胞の培養物を接種することによって、予備発酵培養物
を調製する工程、
請求項１から３のいずれか一項に記載の増殖培地に、予備発酵培養物を接種する工程、
ビブリオ・ミダエ細胞の増殖期中、気流、酸素飽和度、背圧、温度及び増殖培地のｐＨ
を制御する工程、
ビブリオ・ミダエ細胞が安定形態であり且つ生細胞濃度が２×１０８細胞／ｍｌから１
×１０１１細胞／ｍｌの範囲である、対数中期と静止期との間に、ビブリオ・ミダエ細胞
を採取する工程、並びに
採取したビブリオ・ミダエ細胞を緩衝液中に再懸濁することによって、液体製品を製造
する工程
を含む、プロバイオティクス組成物を製造する方法。
【請求項５】
液体製品を、担体、安定剤又は充填剤とブレンドして、バイオマスペーストを形成する
工程、及び
バイオマスペーストを乾燥して、乾燥製品を製造する工程
をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
回分法である、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
反応器への気流が０．５から２．０ｖ／ｖ／ｍの範囲であり、好ましくは、反応器への
気流が１ｖ／ｖ／ｍである、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
発酵培地中の溶存酸素が、飽和度２０から１００％の範囲であり、好ましくは、溶存酸
素を飽和度３０％に維持する、請求項４から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
反応器内の背圧が０から２５０ｋＰａの範囲であり、好ましくは、反応器内の背圧が５
０ｋＰａである、請求項４から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ビブリオ・ミダエ細胞を培養培地中で２０から３４℃の範囲の温度にて培養し、好まし
くは、ビブリオ・ミダエ細胞を培養培地中で３０℃の温度にて培養する、請求項４から９
のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
培養培地のｐＨが５．０から８．０の範囲であり、好ましくはｐＨが６．５である、請
求項４から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ビブリオ・ミダエ細胞を遠心分離又はろ過によって増殖培地から採取する、請求項４か
ら１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
採取したビブリオ・ミダエ細胞をリン酸緩衝食塩水中に再懸濁して、液体製品を製造す
る、請求項４から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
液体製品を、微結晶セルロース、トレハロース、スクロース及びスキムミルク、又はそ
れらの組み合わせからからなる群から選択される担体と組み合わせて、ブレンド製品を形
成する、請求項４から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
バイオマスペーストを押出成形し乾燥して、乾燥製品を形成する、請求項５から１３の
いずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
バイオマスペーストを３０から７０℃の範囲の温度にて押出成形し、好ましくは、バイ
オマスペーストを４５℃の温度にて押出成形する、請求項５から１５のいずれか一項に記
載の方法。
【請求項１７】
請求項１から３のいずれか一項に記載の増殖培地中で培養されたビブリオ・ミダエ生細
胞を含み、ビブリオ・ミダエ細胞は、培養物中における生細胞濃度が２×１０８細胞／ｍ
ｌから１×１０１１細胞／ｍｌの範囲である、増殖の対数中期と静止期との間に採取され
たものであり、採取されたビブリオ・ミダエ細胞が緩衝液中に再懸濁されている、プロバ
イオティクス組成物。
【請求項１８】
再懸濁されたビブリオ・ミダエ細胞が、担体、安定剤又は充填剤とブレンドされて、バ
イオマスペーストを形成しており、バイオマスペーストが乾燥されている、請求項１７に
記載のプロバイオティクス組成物。
【請求項１９】
アワビの水産養殖において用いるための、請求項１７又は１８に記載のプロバイオティ
クス組成物。
【請求項２０】
請求項１７から１９のいずれか一項に記載のプロバイオティクス組成物を含むアワビの
餌であって、プロバイオティクス組成物が、餌の押出成形前に予備ブレンドすること、予
備調製されたアワビの餌へ真空注入すること、又は既存の餌にトップコーティングするこ
とによって、アワビの餌と組み合わされている、アワビの餌。
【請求項２１】
（ｉ）クエン酸、
（ｉｉ）Ｈ３ＰＯ４、
（ｉｉｉ）約１８ｇ／ｌから約３０ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、
（ｉｖ）ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、
（ｖ）ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、
（ｖｉ）約０ｇ／ｌから約４０ｇ／ｌのＮａＣｌ、
（ｖｉｉ）ＫＨ２ＰＯ４、
（ｖｉｉｉ）約８ｇ／ｌから約２１２ｇ／ｌのコーンスティープリカー、
（ｉｘ）約１ｇ／ｌから約４０ｇ／ｌのグルコース又はＨＴＭ、及び
（ｘ）約０．５ｍｌ／ｌから約５ｍｌ／ｌの消泡剤
を含み、ｐＨが約４から約７である、酵母増殖培地。
【請求項２２】
（ｉ）約２．５ｇ／ｌのクエン酸、
（ｉｉ）約１６．３ｍｌ／ｌのＨ３ＰＯ４、
（ｉｉｉ）約１８．５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、
（ｉｖ）約８．２ｇ／ｌのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、
（ｖ）約０．８ｇ／ｌのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、
（ｖｉ）約０．１ｇ／ｌのＮａＣｌ、
（ｖｉｉ）約１１．３ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、
（ｖｉｉｉ）約２０４ｇ／ｌのコーンスティープリカー、
（ｉｘ）約１０ｇ／ｌのグルコース又はＨＴＭ、及び
（ｘ）約１ｍｌ／ｌの消泡剤
を含み、ｐＨが約５．６である、請求項２１に記載の酵母増殖培地。
【請求項２３】
酵母エキス、ペプトン及びグルコース（ＹＰＤ）培地より顕著に高い細胞増殖率（ｇ／
ｌ／ｈ）を支持する、請求項２１又は２２に記載の酵母増殖培地。
【請求項２４】
接種培地にデバリオマイセス・ハンセニイ生細胞の培養物を接種することによって、予
備発酵培養物を調製する工程、
請求項２１から２３のいずれか一項に記載の増殖培地に、予備発酵培養物を接種する工
程、
デバリオマイセス・ハンセニイ細胞の増殖期中、気流、酸素飽和度、背圧、温度及び増
殖培地のｐＨを制御する工程、
生細胞濃度が４×１０７細胞／ｍｌから２×１０１０細胞／ｍｌの範囲である、増殖の
対数中期と対数後期との間に、デバリオマイセス・ハンセニイ細胞を採取する工程、並び
に
採取したデバリオマイセス・ハンセニイ細胞を緩衝液中に再懸濁することによって、液
体製品を製造する工程
を含む、プロバイオティクス組成物を製造する方法。
【請求項２５】
液体製品を、担体、安定剤又は充填剤とブレンドして、バイオマスペーストを形成する
工程、及び
バイオマスペーストを乾燥して、乾燥製品を製造する工程
をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
流加回分法である、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
反応器への気流が０．５から２．０ｖ／ｖ／ｍの範囲であり、好ましくは、反応器への
気流が１ｖ／ｖ／ｍである、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
発酵培地中の溶存酸素が、飽和度２０から１００％の範囲であり、好ましくは、溶存酸
素を飽和度３０％に維持する、請求項２４から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
反応器内の背圧が０から２５０ｋＰａの範囲であり、好ましくは、反応器内の背圧が５
０ｋＰａである、請求項２４から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
デバリオマイセス・ハンセニイ細胞を培養培地中で１６から３４℃の範囲の温度にて培
養し、好ましくは、デバリオマイセス・ハンセニイ細胞を培養培地中で２４℃の温度にて
培養する、請求項２４から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
培養培地のｐＨが４．０から７．０の範囲であり、好ましくはｐＨが５．６である、請
求項２４から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
デバリオマイセス・ハンセニイ細胞を遠心分離又はろ過によって増殖培地から採取する
、請求項２４から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
採取したデバリオマイセス・ハンセニイ細胞をリン酸緩衝液に再懸濁して、液体製品を
製造し、好ましくは、リン酸緩衝液が、約４〜２０％ｍ／ｍのトレハロース、好ましくは
１２．５％ｍ／ｍのトレハロースを含み、緩衝液のｐＨが約４から６の範囲であり、好ま
しくはｐＨが４．５である、請求項２４から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
液体製品を、微結晶セルロース、トレハロース、スクロース及びスキムミルク、又はそ
れらの組み合わせからなる群から選択される担体と組み合わせて、ブレンド製品を形成す
る、請求項２５から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
バイオマスペーストを押出成形し乾燥して、乾燥製品を形成する、請求項２５から３４
のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
バイオマスペーストを３０から５０℃の範囲の温度にて押出成形し、好ましくは、バイ
オマスペーストを４５℃の温度にて押出成形する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項２１から２３のいずれか一項に記載の増殖培地中で培養されたデバリオマイセス
・ハンセニイ生細胞を含み、デバリオマイセス・ハンセニイ細胞は、培養物中における生
細胞濃度が４×１０７細胞／ｍｌから２×１０１０細胞／ｍｌの範囲である、増殖の対数
中期と対数後期との間に採取されたものであり、採取されたデバリオマイセス・ハンセニ
イ細胞が緩衝液中に再懸濁されている、プロバイオティクス組成物。
【請求項３８】
再懸濁されたデバリオマイセス・ハンセニイ細胞が、担体、安定剤又は充填剤とブレンドされて、バイオマスペーストを形成しており、バイオマスペーストが乾燥されている、請求項３７に記載のプロバイオティクス組成物。
【請求項３９】
アワビの水産養殖において用いるための、請求項３７又は３８に記載のプロバイオティ
クス組成物。
【請求項４０】
請求項３７から３９のいずれか一項に記載のデバリオマイセス・ハンセニイプロバイオ
ティクス組成物を含むアワビの餌であって、プロバイオティクス組成物が、餌の押出成形
前に予備ブレンドすること、予備調製されたアワビの餌へ真空注入すること、又は既存の
餌にトップコーティングすることによって、アワビの餌と組み合わされている、アワビの
餌。
【請求項４１】
請求項１７から１９のいずれか一項に記載のビブリオ・ミダエプロバイオティクス組成
物と請求項３７から３９のいずれか一項に記載のデバリオマイセス・ハンセニイプロバイ
オティクス組成物との組み合わせを含む、アワビの餌。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本発明の別の一実施形態において、増殖培地は、クエン酸、Ｈ３ＰＯ４、約１８ｇ／ｌから約３０ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、約０ｇ／ｌから約４０ｇ／ｌのＮａＣｌ、ＫＨ２ＰＯ４、約８ｇ／ｌから約２１２ｇ／ｌのコーンスティープリカー、約１ｇ／ｌから約４０ｇ／ｌの転化高品質糖蜜、及び約０．５ｍｌ／ｌから約５ｍｌ／ｌの消泡剤を含み、ｐＨが約４から７である、酵母増殖培地である。好ましくは、酵母培地は、約２．５ｇ／ｌのクエン酸、約１６．３ｍｌ／ｌのＨ３ＰＯ４、約３０ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、約８．２ｇ／ｌのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、約０．８ｇ／ｌのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、約０．１ｇ／ｌのＮａＣｌ、約１１．３ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、約２０４ｇ／ｌのコーンスティープリカー、約１０ｇ／ｌのグルコース、及び約１ｍｌ／ｌの消泡剤を含み、増殖培地のｐＨは、約５．６に維持されている。酵母増殖培地は、酵母エキス−ペプトン−グルコース（ＹＰＤ）培地より顕著に高いデバリオマイセス・ハンセニイの細胞増殖率（ｇ／ｌ／ｈ）を支持する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
アワビの餌と組み合わせたビブリオ・ミダエ液体又は乾燥製品の押出成形は、３０から７０℃の範囲の温度が典型的であるが、好ましくは、押出成形は４５℃の温度にて行う。アワビの餌と組み合わせたデバリオマイセス・ハンセニイ液体又は乾燥製品の押出成形は、３０から７０℃の範囲の温度が典型的であるが、好ましくは、押出成形は、４５℃の温度にて行う。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
増殖培地は、塩を含み、ビブリオ・ミダエについては、（塩化マグネシウム六水和物、塩化カリウム、クエン酸、硝酸カルシウム、硫酸第一マンガン七水和物、硫酸鉄七水和物及びリン酸）が好ましく、デバリオマイセス・ハンセニイについては、（クエン酸、硫酸マグネシウム七水和物、塩化カルシウム無水物、リン酸二水素カリウム及びリン酸）が好ましい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
微生物は、生産性及びロバスト性を改善するため、ビブリオ・ミダエについては、（塩化マグネシウム六水和物、塩化カリウム、クエン酸、硝酸カルシウム、硫酸第一マンガン七水和物、硫酸鉄七水和物、リン酸、酵母エキス、カザミノ酸及びペプトン）、又はデバリオマイセス・ハンセニイについては、（クエン酸、硫酸マグネシウム七水和物、塩化カルシウム無水物、リン酸二水素カリウム、リン酸及び酵母エキス）を含む、増殖培地に類似の接種培地中で、接種段階において育てられる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
バイオマスは、適した緩衝液、好ましくはＮａＣｌを含有するリン酸緩衝液に製剤化して、プロバイオティクス液体製品を得てもよい。或いはまた、デバリオマイセス・ハンセニイについては、リン酸緩衝食塩水は、約４〜２０％ｍ／ｍのトレハロース、好ましくは１２．５％ｍ／ｍのトレハロースを含み、緩衝液のｐＨは約４から６の範囲であり、好ましくはｐＨは４．５である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
発酵槽中で用いた増殖培地は、以下の培地構成成分を含有していた：１ｇ／ｌのクエン酸、２．５ｍｌ／ｌのＨ３ＰＯ４、０．４ｇ／ｌのＣａ（ＮＯ３）２、０．０４０ｇ／ｌのＭｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．０３２ｇ／ｌのＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、１ｇ／ｌのＫＣｌ、３０ｇ／ｌのＮａＣｌ、２．３ｇ／ｌのＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、５４．４ｇ／ｌのＣＳＬ、及び２４ｇ／ｌのＨＴＭ。増殖培地塩、消泡剤（１ｍｌ／ｌのＰｌｕｒｉｏｌ（商標）Ｐ２０００、ＢＡＳＦ、ルートヴィヒスハーフェン、独国）及びＣＳＬを初期充填物に加え、９．３リットルにした。初期充填物の殺菌に続いて、別個に殺菌したＨＴＭ溶液を加えた。発酵温度は３０℃に維持した。スターラーの速度は、５００ｒｐｍに設定し、１０００ｒｐｍへ勾配させて、溶存酸素が飽和度３０％を超えるように維持した。ｐＨを１０％ｖ／ｖのＨ２ＳＯ４又は２５％ｖ／ｖのＮＨ４ＯＨを用いて６．５に維持した。通気は１ｖ／ｖ／ｍに設定した。
ビブリオ・ミダエ株の後処理
Ｓｈａｒｐｌｅｓ−Ｓｔｏｋｅｓ遠心分離器（Ｐｅｎｎｗａｌｔ、仏国）を用いて、発酵ブロスを遠心分離した。遠心管速度は１５７００ｇであり、発酵ブロス供給速度は３０リットル／ｈであった。上澄み液を捨て、リン酸緩衝食塩水（ＫＨ２ＰＯ４  ０．１１、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．７１、ＮａＣｌ  ２．９１、Ｈ２Ｏ  ９６．２７％ｍ／ｍ）を用いてバイオマスを製剤化した。オーバーヘッドスターラー（パドル式撹拌機）を用いて、液体製品を均一化した（１０００ｒｐｍ）。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
デバリオマイセス・ハンセニイのアワビプロバイオティクスの製造
デバリオマイセス・ハンセニイ接種源
デバリオマイセス・ハンセニイの冷凍バイアル（５．９×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を１つのみ用いて、各接種フラスコ（１．８リットル、フェルンバッハ）に接種した。各フラスコ中の増殖培地は、２．５ｇ／ｌのクエン酸、１６．３ｍｌ／ｌのＨ３ＰＯ４、３０ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、８．２ｇ／ｌのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．８ｇ／ｌのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ｌのＮａＣｌ、１１．３ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、１０ｇ／ｌの酵母エキス及び１０ｇ／ｌのグルコースからなるものであった。増殖培地のｐＨは、１２１℃にて１５分間の殺菌の前に、１０％ｖ／ｖのＨ２ＳＯ４又は２５％ｖ／ｖのＮＨ４ＯＨを用いて５．６に調整した。接種に続いて、フラスコを２４℃にてオービタルシェーカー（Ｉｎｎｏｖａ  ２３００、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、エジソン、ニュージャージー、米国）において１８０ｒｐｍの速度で２２時間インキュベートした（ＯＤ６６０ｎｍ約４．０）。
デバリオマイセス・ハンセニイ発酵方法
接種したフラスコを１つのみ用いて、各発酵槽に接種した。発酵方法は、１５リットルのＢｉｏｓｔａｔ  Ｃ（商標）発酵槽（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＢＢＩ  ｓｙｓｔｅｍｓ、メルズンゲン、独国）中で稼働容積１０リットルにて実行した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
発酵槽中で用いた増殖培地は、以下の培地構成成分（ｇ／ｌ）を含有していた：２．５ｇ／ｌのクエン酸、１６．３ｍｌ／ｌのＨ３ＰＯ４、３０ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、８．２ｇ／ｌのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．８ｇ／ｌのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ｌのＮａＣｌ、１１．３ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、２０４ｇ／ｌのＣＳＬ、及び１０ｇ／ｌのグルコース又はＨＴＭ。増殖培地塩、消泡剤（１ｍｌ／ｌのＰｌｕｒｉｏｌ（商標）Ｐ２０００、ＢＡＳＦ、ルートヴィヒスハーフェン、独国）及びＣＳＬを初期充填物に加え、９．３リットルにした。初期充填物の殺菌に続いて、別個に殺菌したＨＴＭ溶液を加えた。発酵温度は２４℃に維持した。スターラーの速度は、５００ｒｐｍに設定し、１０００ｒｐｍへ勾配させて、溶存酸素が飽和度３０％を超えるように維持した。ｐＨを１０％ｖ／ｖのＨ２ＳＯ４又は２５％ｖ／ｖのＮＨ４ＯＨを用いて５．６に維持した。通気は１ｖ／ｖ／ｍに設定した。
デバリオマイセス・ハンセニイ株の後処理
Ｓｈａｒｐｌｅｓ−Ｓｔｏｋｅｓ遠心分離器（Ｐｅｎｎｗａｌｔ、仏国）を用いて、発酵ブロスを遠心分離した。遠心管速度は１５７００ｇであり、発酵ブロス供給速度は３０リットル／ｈであった。上澄み液を捨て、リン酸緩衝食塩水（ＫＨ２ＰＯ４  ０．１１、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．７１、ＮａＣｌ  ２．９１、Ｈ２Ｏ  ９６．２７％ｍ／ｍ）を用いてバイオマスを製剤化した。オーバーヘッドスターラー（パドル式撹拌機）を用いて、液体製品を均一化した（１０００ｒｐｍ）。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０】
2016506725.tif 000021
【国際調査報告】
2016506725.tif 000022
2016506725.tif 000023
2016506725.tif 000024