(57)【要約】  本発明は、Wntタンパク質及び脂質を含む、成体幹細胞の培養のための無血清培養培地に関する。本発明は、そのような方法を用いて成体幹細胞を培養するための方法、及び幹細胞が前記培地中で培養される幹細胞治療方法をさらに含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞のin vitro培養のための方法であって、前記細胞をWntタンパク質及び脂質を含む無血清培養培地中に保持し、該脂質が少なくとも0.1 mMの濃度で利用可能である、方法。
【請求項２】
前記脂質がリポソーム又はミセルの形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記脂質及び前記Wntタンパク質が複合体中で会合する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記リポソームがジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1’-rac-グリセロール) (DMPG)及びコレステロールから成り、好ましくは10：1：10のDMPC：DMPG：コレステロールの比率である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Wntタンパク質がヒトWntタンパク質の群から選択され、好ましくは該タンパク質がWnt3aである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記幹細胞が成体幹細胞であり、好ましくは腸幹細胞であり、より好ましくは十二指腸及び/又は回腸から得られる幹細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記幹細胞の培養がオルガノイド培養である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
Wntタンパク質及び脂質を含む幹細胞の培養のための無血清培養培地であって、前記脂質が少なくとも0.1 mMの濃度で利用可能であり、好ましくは該脂質がリポソーム又はミセルの形態である、無血清培養培地。
【請求項９】
a. 幹細胞を対象から単離する工程、
b. 場合により前記幹細胞を処理する工程であって、該処理を、分化、脱分化、再分化、再プログラム化、変異の導入、遺伝子改変から選択し得る工程、
c. 前記幹細胞を請求項８に記載の無血清培養培地中で培養する工程、
d. 培養した前記幹細胞をそれを必要とする対象に導入する工程
を含む、幹細胞治療のための方法。
【請求項１０】
a. 成体幹細胞を対象から単離する工程、
b. 前記成体幹細胞を請求項８に記載の無血清培養培地中で培養する工程、
c. 培養した前記成体幹細胞を前記対象に再導入する工程
を含む、自己成体幹細胞治療のための方法。
【請求項１１】
a. 成体幹細胞を対象から単離する工程、
b. 前記成体幹細胞を遺伝子改変する工程、
c. 遺伝子改変した前記成体幹細胞を請求項８に記載の無血清培養培地中で培養する工程、
d. 培養した前記成体幹細胞を前記対象に再導入する工程
を含む、自己成体幹細胞治療のための方法。
【請求項１２】
a. 成体幹細胞を対象の器官から単離する工程、
b. 前記成体幹細胞を遺伝子改変する工程、
c. 遺伝子改変した前記成体幹細胞を請求項８に記載の無血清培養培地中で培養する工程、
d. 培養した前記成体幹細胞を前記対象に再導入する工程
を含む成体幹細胞治療のための方法であって、
前記成体幹細胞が遺伝子改変されて疾患の治療のための治療的化合物を生産し、該疾患が工程a.において前記成体幹細胞が由来する器官又は器官系に関連しないか、又は部分的にしか関連しない、方法。
【請求項１３】
a. 成体幹細胞を対象の器官から単離する工程、
b. 前記成体幹細胞を遺伝子改変する工程、
c. 培養した前記成体幹細胞を前記対象に再導入する工程
を含む成体幹細胞治療のための方法であって、
前記成体幹細胞が遺伝子改変されて疾患の治療のための治療的化合物を生産し、該疾患が工程a.において前記成体幹細胞が由来する器官又は器官系に関連しないか、又は部分的にしか関連しない、方法。
【請求項１４】
成体幹細胞治療のための、Wntタンパク質及び脂質を含む無血清培地であって、前記脂質が少なくとも0.1 mMの濃度で利用可能であり、好ましくは該脂質がリポソーム又はミセルの形態であり、前記成体幹細胞治療が、
a. 成体幹細胞を対象から単離する工程、
b. 前記成体幹細胞を前記無血清培地中で培養する工程、
c. 培養した前記成体幹細胞を前記対象に再導入する工程
を含む、無血清培地。
【請求項１５】
成体幹細胞治療のための、Wntタンパク質及び脂質を含む無血清培地であって、前記脂質が少なくとも0.1 mMの濃度で利用可能であり、好ましくは該脂質がリポソーム又はミセルの形態であり、前記成体幹細胞治療が、
a. 成体幹細胞を対象から単離する工程、
b. 前記成体幹細胞を遺伝子改変する工程、
c. 前記成体幹細胞を前記無血清培地中で培養する工程、
d. 培養した前記成体幹細胞を前記対象に再導入する工程
を含む、無血清培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は組織培養の分野に関連し、より重要なことには成体、組織特異的幹細胞の培養、及び治療のための幹細胞の使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
成体幹細胞は、その細胞が発生した元の組織の治療的処置に有用である。しかし、成体幹細胞の培養は非常に困難であることが多い。この点に関して最も難しいことのひとつは、その環境が分化を引き起こす可能性があることが多いということである。この表現型の不安定性は、in vitroの成体幹細胞培養の維持についての主な課題を示している。
【０００３】
組織工学の環境要因は、主に培地により形成され、幹細胞培養の場合は、この培地は通常哺乳類由来の血清を含有している。この血清は、定義によれば、血液中に排出され、及び/又は血液により運ばれた、血清タンパク質及び他の影響を及ぼす化合物などの、未知の因子の供給源である。幹細胞の治療的適用においては、未知の成分の量を最少化することが非常に重要である。生物的材料を患者の体内に導入することを、可能な限り制限するべきであるからである。胚性幹細胞については、無血清培地が同時に開発されてきた(例えばVallier, L., 2011 Meth. Molec. Biol., 690:57-66を参照)。成体ヒト幹細胞株については、無血清培地は未だ提示されていない。
【０００４】
さらに、幹細胞培地は、幹細胞の増殖に必須の全ての栄養素及び他の成分を提供することができなければならないが、幹細胞の生育又は増殖に有害な化合物、又は幹細胞の特定の細胞への未定義のさらなる分化を導くような化合物を含有してはならない。この15年間にわたって、Wntシグナル伝達経路は、胚性幹細胞、並びに消化器系、皮膚及び毛髪、及び神経系などの様々な成体組織幹細胞の両方の自己再生及び細胞の運命決定を制御することが示されてきた(Clevers, H. and Nusse, R., 2012, Cell 149:1192-1205)。これらのデータは、Wntシグナルが培養における幹細胞の自己再生に有益であることを示しており、幹細胞の患者への再導入前のin vitro操作の方法を提供し得ることを示している。複数のヒト及びマウスの成体幹細胞についての培養系が、近年明示されている(Huch, M. et al., 2013, Nature 494:247-250)。これらの系はWnt経路のアゴニストであるR-Spondin1によるものであり、R-Spondin1はLgr5受容体に結合してWntタンパク質によるWntシグナル伝達経路を亢進させることにより作用する。大腸、胃、肝臓について、及びヒト幹細胞については、内在性Wntシグナルは不十分であり、外因性Wnt3aが必要である。しかし、胃のオルガノイドの維持において、精製Wnt3aタンパク質は、血清を含有するWnt3a馴化培地ほど有効でなかったことが認められた ADDIN EN.CITE  ADDIN EN.CITE.DATA (Barker, N. et al., 2010, Cell Stem Cells 6:25-36)。しかし、上記に示したとおり、臨床的適用において血清の存在は望ましくない。
【０００５】
Wntタンパク質は、全長350〜400アミノ酸の一群の分泌型脂質修飾(パルミトイル化)シグナル伝達タンパク質である。シグナル伝達配列の後に、20〜24システイン残基の保存されたパターンを有しており、その部分でシステイン残基上にパルミトイル化が起こる。これらのタンパク質は、細胞中の様々な経路を活性化するが、これらは古典的(canonical)及び非古典的(noncanonical)Wnt経路に分類することができる。これらのシグナル伝達経路を介して、Wntタンパク質は胚発生、細胞分化及び細胞極性の形成において様々な重要な役割を担っている。ヒトWnt3a遺伝子は、WNT遺伝子ファミリーの一員である。マウスWnt3Aタンパク質と96%、別のWNT遺伝子産物であるヒトWNT3タンパク質と84%のアミノ酸同一性を示すタンパク質をコードする。Wnt3a遺伝子は、1番染色体のq42領域において、ファミリーの別の構成員であるWNT14遺伝子とクラスター化されている。
【０００６】
Wntタンパク質は、活性を獲得するために脂質部分の連結を必要とする、可溶性のシグナル伝達分子であり、この理由から、疎水性である(Willert, K. et al., 2003, Nature 423:448-452)。 ADDIN EN.CITE  ADDIN EN.CITE.DATA したがって、これらのタンパク質は、その溶解性を維持する界面活性剤の存在下で精製される。しかし、細胞培養培地中で希釈されると、界面活性剤の濃度は、Wntの溶解性を維持するのには不十分であるので、Wntは急激に活性を失い、特に血清の非存在下で顕著である(Fuerer, C. et al., 2010, Dev. Dyn. 239:184-190)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Vallier, L., 2011 Meth. Molec. Biol., 690:57-66
【非特許文献２】Clevers, H. and Nusse, R., 2012, Cell 149:1192-1205
【非特許文献３】Huch, M. et al., 2013, Nature 494:247-250
【非特許文献４】Barker, N. et al., 2010, Cell Stem Cells 6:25-36
【非特許文献５】Willert, K. et al., 2003, Nature 423:448-452
【非特許文献６】Fuerer, C. et al., 2010, Dev. Dyn. 239:184-190
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在、ヒト成体幹細胞は、血清の非存在下では培地中でWnt活性が不十分になるため、効率的に樹立(derive)及び/又は維持することができない。幹細胞培養中での高Wnt活性は、複数の方法で維持することができる：
- 培地を頻繁に補充する方法、これは劇的にコストを増大し、また培養を中断させ、この中断は一般に望ましくない；
- 血清を加える方法、血清は未定義の生成物であり、臨床的適用の妨げとなり、多くの幹細胞の分化を誘導する；
- 精製Wntの代わりにWnt馴化培地(定義は実施例部を参照)。しかし、馴化培地中のWntには血清と同じ欠点がある；
- あるいはグルコサミノグリカン等のWnt安定化化合物を加える。非常に高価であることを別にして、グルコサミノグリカンを加えることの有益な効果が未だ立証されていない。
【０００９】
したがって、成体ヒト幹細胞を培養するためのより定義された培地であって、細胞の増殖が促進され、細胞の分化が阻害される培地を開発する必要がある。そのような培地は優先的には長時間活性のある一種以上のWntタンパク質を含み、またこの培地は血清又は他の未定義の成分を含んでいないことが必要である。そのような無血清成体ヒト幹細胞培養培地が利用可能になることにより、そのような成体幹細胞のさらなる使用も可能になる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は幹細胞のin vitro培養のための方法であって、細胞がWntタンパク質及び脂質を含む無血清培養培地中に保持され、該脂質が少なくとも0.1 mMの濃度で利用可能である培地に関する。好ましくは、前記方法において、脂質はリポソームの形態又はミセルの形態であり、より好ましくは、脂質及びWntタンパク質は複合体中で会合している。好ましくはそのようなリポソームはジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1’-rac-グリセロール) (DMPG)及びコレステロールから成り、好ましくは10：1：10のDMPC：DMPG：コレステロールの比率である。
【００１１】
さらに好ましい実施態様において、Wntタンパク質はヒトWntタンパク質の群から選択され、好ましくはそのタンパク質はWnt3aである。さらに好ましい実施態様において、幹細胞は成体幹細胞であり、好ましくは腸幹細胞であり、より好ましくは十二指腸及び/又は回腸から得られる幹細胞である。さらに好ましいのは、幹細胞培養がオルガノイド培養である、本発明の方法である。
【００１２】
また、本発明は、Wntタンパク質及び脂質を含む幹細胞培養のための無血清培養培地であって、該脂質が少なくとも0.1 mMの濃度で利用可能であり、好ましくは該脂質がリポソーム又はミセルの形態である無血清培養培地を含む。
【００１３】
本発明のさらなる部分は、幹細胞治療のための方法であって、
a. 対象から幹細胞を単離する工程、
b. 場合により前記幹細胞を処理する工程であって、該処理が分化、脱分化、再分化、再プログラム化、変異の導入、遺伝子改変から選択される工程、
c. 前記幹細胞を本発明の無血清培地中で培養する工程、
d. 培養した前記幹細胞をそれを必要とする対象に導入する工程
を含む方法である。
【００１４】
また、本発明には、自己成体幹細胞治療のための方法であって、
a. 対象から成体幹細胞を単離する工程、
b. 前記成体幹細胞を本発明の無血清培地中で培養する工程、
c. 培養した前記成体幹細胞を前記対象に再導入する工程
を含む方法も含まれる。
【００１５】
さらに、本発明は、自己成体幹細胞治療のための方法であって、
a) 対象から成体幹細胞を単離する工程、
b) 前記成体幹細胞を遺伝子改変する工程、
c) 遺伝子改変した前記成体幹細胞を本発明の無血清培地中で培養する工程
d) 培養した前記成体幹細胞を前記対象に再導入する方法
を含む方法も含む。
【００１６】
また、本発明は、成体幹細胞治療のための方法であって、
a. 対象の器官から成体幹細胞を単離する工程、
b. 前記成体幹細胞を遺伝子改変する工程、
c. 遺伝子改変した前記成体幹細胞を本発明の無血清培地中で培養する工程、
d. 培養した前記成体幹細胞を前記対象に再導入する工程
を含み、該成体幹細胞が、疾患の治療のための治療的化合物を生産するように遺伝子改変されており、該疾患が、工程a.において成体幹細胞を得た器官又は器官系に関連しないか、又は一部しか関連しない方法も含む。
【００１７】
本発明は、成体幹細胞治療のための方法であって、
a. 対象の器官から成体幹細胞を単離する工程、
b. 前記成体幹細胞を遺伝子改変する工程、
c. 培養した前記成体幹細胞を前記対象に再導入する工程
を含み、前記成体幹細胞が、疾患の治療のための治療的化合物を生成するように遺伝子改変されており、該疾患が、工程a.において成体幹細胞を得た器官又は器官系に関連しないか、又は一部しか関連しない方法をさらに含む。
【００１８】
本発明は、Wntタンパク質及び脂質を含む成体幹細胞治療のための無血清培地であって、該成体幹細胞治療が、
a. 対象から成体幹細胞を単離する工程、
b. 前記成体幹細胞を本発明の無血清培養培地中で培養する工程、
c. 培養した前記成体幹細胞を前記対象に再導入する工程
を含む無血清培地をさらに含む。
【００１９】
また、本発明には、Wntタンパク質及び脂質を含む成体幹細胞治療のための無血清培地であって、該成体幹細胞治療が、
a. 対象から成体幹細胞を単離する工程、
b. 前記成体幹細胞を遺伝子改変する工程、
c. 前記成体幹細胞を本発明の無血清培養培地中で培養する工程、
d. 培養した前記成体幹細胞を前記対象に再導入する工程
を含む無血清培地も含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、精製Wnt3aタンパク質ではなくWnt3a馴化培地が腸幹細胞のオルガノイドの樹立をサポートすることを示す。Wnt3a馴化培地、精製Wnt3a、又は精製Wnt3a及び血清の存在下でのヒト十二指腸及び回腸のオルガノイド培養の樹立。写真は樹立後初代培養の後に撮影したオルガノイド培養より。
【図２】図２は、Wnt3a活性が無血清細胞培養培地中で急激に失われることを示す。Wnt3a馴化培地(50%)又は精製Wnt3a(250 ng/ml)を、DMEM中、表示のとおり10% ウシ胎児血清の存在下又は非存在下、37℃で表示の時間インキュベートする。その後残存Wnt3a活性を、LSLアッセイを用いて測定する。CM：馴化培地。
【図３】図３は、短い半減期及び界面活性剤に関連する毒性により、幹細胞の自己再生をサポートするための精製Wnt3aの使用が制限されることを示す。図３Aは、250 ng/mlの精製Wnt3aの各日添加又は3日毎の継代後添加が自己再生へ与える影響を比較する無血清ES細胞自己再生アッセイを示す。Wnt3aを各継代後に加える場合、自己再生は大きく減少し、このことは無血清培養中でのWnt3a活性の急激な消失により、自己再生が制限され、また新しいWnt3aの頻回の補充が必要になることを示している。図３Bは、精製Wnt3aタンパク質が、500 ng/mlの濃度を超えて存在する場合に、ES細胞の自己再生を阻害するように見えることを示している。しかし、等量の界面活性剤CHAPSを含むより低濃度のWnt3aも自己再生を阻害することから、これは界面活性剤に関連する毒性によりもたらされるようである。
【図４−１】図４は、Wnt3aタンパク質が効率的にリポソームと会合し、それにより安定性が高まることを示す。図４Aは、Wnt3aタンパク質と会合した様々な組成のリポソームを超遠心分離により沈降させ、ペレット化したリポソーム及び上清をウエスタンブロットにより分析しWnt3aの存在を調べた図である。図４Bは、Aで示したウエスタンブロットの定量である。
【図４−２】図４Cは、透析後のWnt3aリポソーム中のCHAPSの残留濃度を示す。図４Dは、異なる組成のWntリポソームのWnt3a活性半減期アッセイを示す。
【図５】図５は、精製Wnt3aとWnt3aリポソームとを比較するESC自己再生アッセイを示す。Wnt3aリポソームは、培地を各日補給した場合は、精製Wnt3aタンパク質と同様に機能する。しかし、培地を3日毎の継代の後にのみ補給した場合は、Wnt3aリポソームは精製Wnt3aよりも高レベルのES細胞の自己再生をサポートした。Wnt3aタンパク質の最終濃度は全ての条件で250 ng/mlである。
【図６−１】図６Aは、250 ng/mlの精製Wnt3a、Wnt3aリポソーム(Wnt3aの最終濃度250 ng/ml)、又はベヒクルリポソームの添加後3日間培養したR1-7xTcf-eGFP細胞の落射蛍光画像を示す。精製Wnt3aタンパク質を使用した場合はレポーター活性が減少したが、一方でWnt3aリポソームは強力なレポーター活性を維持する。
【図６−２】図６Bは、フローサイトメトリーによるR1-7xTcf-eGFP細胞のeGFP発現分析を示す。R1-7xTcf-eGFP細胞を表示した長さの時間、250 ng/mlの精製Wnt3aたんぱくしうt、Wnt3aリポソーム(Wnt3aの最終濃度250 ng/ml)、又はベヒクルリポソームの存在下で培養し、フローサイトメトリーによりeGFP発現を分析した。試薬を各日補給した場合、精製Wnt3a及びWnt3aリポソームの両方が、強力なレポーター活性を維持した。しかし、試薬を補給しなかった場合、精製Wnt3aの添加2日後にレポーター活性が減少し始めたが、一方でWnt3aリポソームは4日後でも強力なレポーター活性を維持した。
【図６−３】図６Bの続きを示す。
【図７】図７は、Wnt3aリポソームが腸幹細胞オルガノイドの確立を大いに促進し、自発的な分化を抑制することを示す。Wnt3a馴化培地、精製Wnt3a及び血清、又はWnt3aリポソームの存在下におけるヒト十二指腸及び回腸のオルガノイド培養の樹立。Wnt3aリポソームを用いる場合、より多くのオルガノイドが得られる。また、さらに、分化の兆候、例えばオルガノイドの外見の粗化、出芽の兆候、及び不規則な形状などが、Wnt3aリポソーム含有無血清条件では大きく減少した。写真は、樹立後最初の継代の後に得られたオルガノイド培養より。
【図８】図８は、リポソームが広い範囲の濃度で存在する場合にWnt3aタンパク質の活性を安定化させることを示す。異なる量のDMPC:DMPG:コレステロール 10:1:10のリポソームを、無血清培地に加え、精製Wnt3aタンパク質を別個に、最終濃度500 ng/mlで加えた。半減期活性アッセイにより、リポソームが、試験した濃度範囲全体にわたって、Wnt3aタンパク質の活性を安定化させることが示された。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本願明細書で用いる「成体幹細胞」又は「器官幹細胞」は、発生後に全身に見られる幹細胞であり、増殖、組織のホメオスタシスの維持、損傷した組織の再生をすることができる。これらは、持続的自己複製が可能であり、細胞を得た元の器官の全ての又はほとんどの細胞の種類に分化することができる。これらは、この特徴を示して、「多機能幹細胞」としても知られる。成体幹細胞の中には、例えば精原幹細胞など単分化能(unipotent)のものもある。培養中で、これらは時には由来する組織の組織機構を擬態し、幹細胞及び分化した子孫(offspring)を含有する、いわゆる「オルガノイド(organoid)」を形成することができる。分化した子孫の中には、幹細胞の自己再生及び増幅(expansion)を促進する成長因子を生成し、それにより自己の増幅及び増殖を促進するものもある。幹細胞の中には特定の培養条件下でオルガノイドを形成しないものもあるが、それでも好ましい培地条件下では増幅することができる。これらの幹細胞又は幹細胞を含むオルガノイドは単一の幹細胞から無制限に増幅することができるので、この技術は遺伝子治療の安全な手段を提示することができる。特に、個々の幹細胞の子孫はクローンレベルで分析することができるので、それにより幹細胞を遺伝的に改変し培養する機会や、子孫を有害な変異を含まない幹細胞から選択して、それからその後の移植のために増幅することができる機会が得られる。
【００２２】
Wntシグナル伝達経路は、細胞の増殖及び分化、細胞運命、並びに器官形成を含む、脊椎動物及び無脊椎動物の発生中の様々な細胞プロセスを制御する。加えて、この経路は、ゼブラフィッシュ、Xenopus(アフリカツメガエル)、プラナリア、及び成体のヒトを含む哺乳類において、組織ホメオスタシス及び損傷応答性の再生を制御している。
【００２３】
Wntシグナル伝達はWntタンパク質と、膜貫通型受容体Frizzled (Fz)ファミリーのメンバー及び低比重リポタンパク質受容体関連タンパク質(LRP)ファミリーのメンバー(例えばLRP5/LRP6)を含む様々な受容体との相互作用により開始する。細胞外Wntシグナルは、核内の遺伝子発現を制御する古典的経路(Logan CY and Nusse, R. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 20:781 -810, 2004参照)及び複数の非古典的経路(Kohn, AD and Moon, RT, Cell Calcium, 38: 439-446, 2005による総説)を含む細胞内シグナル伝達カスケードを刺激する。簡潔に言えば、古典的経路を介したWntシグナル伝達により、β-カテニンの安定化及び核への局在を起こし、β-カテニンは転写因子であるT細胞因子/リンパ系エンハンサー因子(TCF/LEF)ファミリーのメンバーと会合して複合体を形成し、通常は転写を活性化する。Wntシグナルの非存在下では、β-カテニンは代わりにβ-カテニン分解複合体による分解のターゲットにされ、TCF/LEFは、通常転写を抑制する複合体を形成する。Wntシグナルの非存在下では、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK3)及びカゼインキナーゼ1(CK1)等のキナーゼがβ-カテニンをリン酸化し、その結果としてβカテニンがユビキチン化されプロテアソームによる分解のターゲットとなる。したがってWnt経路の活性化は、β-カテニンのリン酸化の減少をもたらし、それによりその安定化につながる。複数の内在性タンパク質がWntシグナルの阻害剤として同定されているが、これらにはDickkopf (Dkk)、ブレイクポイントクラスター領域タンパク質(Bcr)、WIF(Wnt阻害因子)ドメインを含むタンパク質等が含まれる。
【００２４】
用語「Wnt」又は「Wntタンパク質」は、天然に存在するWntタンパク質のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はWnt受容体に結合してWntシグナル伝達を活性化するという天然に存在するタンパク質の能力を少なくとも部分的には保っているその断片、バリアント若しくは誘導体を指す。集団中に存在し得るWnt配列の天然に存在するアレルのバリアントに加えて、実質的に全てのタンパク質でそうであるが、ポリペプチドの機能的(生物学的)活性を実質的に変更することなく様々な変化を配列中に導入することができることが認識される。そのようなバリアントは、用語「Wnt」、「Wntタンパク質」等の範囲内に含まれる。Wntは、複数の種にわたって、配列が互いに関連しており、構造及び機能が良好に保存されている。したがって、ある種において活性を呈するWntタンパク質を他の種において用い、そのような種におけるWnt経路を活性化することができ、同様の活性を呈することを予期することができる。WntファミリーのメンバーにはWnt1、Wnt2、Wnt2b(Wntl3とも呼ばれる)、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt7c、Wnt8、Wnt8a、Wnt8b、Wnt8c、Wnt9a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt14、Wnt15、又はWntlが含まれる。Wnt遺伝子及びタンパク質の配列は公知である。当業者は、公開されているデータベース中に、Wntファミリーメンバー並びに本願明細書において対象となる他の遺伝子及びタンパク質の遺伝子ID、アクセッション番号、及び配列情報を容易に見つけることができる。Wntタンパク質は、天然に存在する供給源(例えばタンパク質を天然に生産する哺乳類又は昆虫の細胞)から単離してもよく、組換え発現技術を用いて真核細胞又は原核生物において生産してもよく、又は化学的に合成してもよい。可溶性の、生物学的に活性なWntタンパク質は、公知の方法を用いて精製した形で調製してもよい。例えば、米国特許公報第20040248803号及びWillert, K., et al., Nature, 423: 448-52, 2003を参照。ある実施態様において、可溶性の生物学的に活性なWntタンパク質はWnt3aである。ある実施態様において、Wntタンパク質は、そのWntタンパク質を天然に発現する宿主細胞中で生産される場合、発生時に翻訳中修飾又は翻訳後修飾される。他の実施態様において、Wntタンパク質は天然で起こるような翻訳中修飾又は翻訳後修飾を受けない。あるの実施態様において、可溶性の生物学的に活性なWntタンパク質は、パルミトイル化等、脂質部分で修飾される。脂質部分は、保存されたシステインに付着されてもよい。例えば、ある実施態様において、Wntタンパク質は、周知のように保存されたシステインにおいてパルミトイル化される。ある実施態様において、Wntタンパク質は、そのWntタンパク質を天然に発現する哺乳類の宿主細胞中で生産される場合、発生時にグリコシル化される。他の実施態様において、Wntタンパク質は天然で見られるようにはグリコシル化されない。組換えマウスWnt3aは、市販されている(例えばMilliporeから、カタログ番号GF 145、又はR&D Systemsから、カタログ番号1324-WN-002)。
【００２５】
Wnt3aは、好ましくは細胞培養中、例えば昆虫細胞を用いるか若しくは哺乳類細胞を用いる系中で生産される(Willert, K. et al、上記を参照)か、又は米国特許第7,153,832号に説明される系中で生産されるが、これは参照により本願明細書に組み込まれる。その後、これらからタンパク質を単離することができる。
【００２６】
Wnt3aは、約1 ng/ml、約5 ng/ml、約10 ng/ml、約20 ng/ml、約30 ng/ml、約40 ng/ml、約50 ng/ml、約60 ng/ml、約70 ng/ml、約80 ng/ml、約90 ng/ml、約100 ng/ml、約110 ng/ml、約120 ng/ml、約130 ng/ml、約140 ng/ml、約150 ng/ml、約160 ng/ml、約170 ng/ml、約180 ng/ml、約190 ng/ml、約200 ng/ml、約210 ng/ml、約220 ng/ml、約230 ng/ml、約240 ng/ml、約250 ng/ml、約260 ng/ml、約270 ng/ml、約280 ng/ml、約290 ng/ml、約300 ng/ml、約325 ng/ml、約350 ng/ml、約375 ng/ml、約400 ng/ml、約450 ng/ml、約500 ng/ml、約550 ng/ml、約600 ng/ml、約650 ng/ml、約700 ng/ml、約750 ng/ml、約800 ng/ml、約850 ng/ml、約900 ng/ml、約950 ng/ml又は約1000 ng/mlの濃度で存在してもよい。また、これより高い濃度で存在することもできる。
【００２７】
Wnt3aは、成体幹細胞の培養において非常に有利に用いられるタンパク質である。しかし、精製Wnt3aタンパク質を無血清条件のヒト十二指腸及び回腸のオルガノイド培養中に加えた場合、これらの培養は2世代後に死滅した。Wnt馴化培地、すなわち血清を含有する培地を用いた場合は、オルガノイド培養はうまく確立し維持された(図1)。Wnt3a馴化培地は高い割合の血清を含有しているので、血清を加えることにより精製Wnt3aを用いたオルガノイドの確立が改善されるかをさらに試験した。確かに、Wnt3a馴化培地を用いて得られたレベルまでではなかったが、血清を精製Wnt3aタンパク質と共に加えることにより、十二指腸及び回腸の両方のオルガノイド培養の樹立効率が改善された(図1)。これらのデータは、血清がWnt3aとの組み合わせでオルガノイド培養を促進することを示唆している。最近のデータは、血清がWnt3aタンパク質の活性を安定化させることを示しており(Fuerer et al.、上記を参照)、したがって無血清条件におけるWnt活性の減少によりオルガノイドの樹立をサポートできないことが説明されるかをさらに調査した。
【００２８】
成体幹細胞培養の確立及び維持は、Wntタンパク質(を含む培地)に、少なくとも0.1 mMの濃度で脂肪性の物質を加えることにより可能であるようである。そのような脂肪性の物質は、好ましくはリン脂質又は界面活性剤活性を有する脂質、すなわち両親媒性の分子であり、リポソーム又はミセルの形態で供給される。生物学的影響、すなわちWntタンパク質活性の安定化は、リポソーム又はミセルがWntタンパク質と会合し、その後培地に加えられる場合にのみ達成される訳ではなく、タンパク質及び脂肪性の物質を培地に別個に加える場合にも達成される。ミセルに関して、ミセルの形態において界面活性剤を加える場合には、より大量の培養培地中に導入されたときにミセルが維持されるような濃度にするように注意するべきであることを強調すべきである。これは、与えられるミセルが比較的低い臨界ミセル濃度を有するべきであることを意味する。当業者は、そのような低い臨界ミセル濃度を有するミセルを調製する方法を知っている。
【００２９】
幅広い範囲の脂質を、リポソーム又はミセルの作製に用いることができる。リポソームの調製に通常用いられる脂質及びリン脂質を用いてもよい。リポソームの形成のために特に適切な成分は、ホスファチジルコリン、例えば1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)、1-ミリストイル-2-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(MPPC)、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)及びこれらの組み合わせである。Morrellら(PLos ONE 2008, 3:e2930)において示されるように、DMPCが上述の脂質の中で最善の選択のようである。それでもなお、他の脂質、例えばリゾホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、コレステロール等のステロール、又はスフィンゴミエリン等のスフィンゴ脂質、糖脂質(saccharolipid)及びPEG化リン脂質、並びにアシル鎖の長さ、飽和の量、極性の頭部及び電荷の性質等において多様性を有する上記の脂質のさらなるバリアントが、その代わりとして有用であると考えられる。ミセルの形態で使用し得る脂質分子については、石鹸、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、リグニンスルホン酸塩、脂肪アルコール及びアルキルフェノール化合物などの任意の種類の界面活性剤(surfactant、detergent)を使用してもよい。このカテゴリーの例としては、SDS、オクチルチオグルコシドおよびCTAB(臭化セトリモニウム)がある。
【００３０】
また、本発明に用いることのできるリポソーム、ミセル又は他の脂質凝集体は、上記の脂質分子の組み合わせにより形成されてもよい。例えば、リポソームが2つ又は3つの異なる脂質分子から作られることは非常に一般的である。通常、含まれる成分は、基礎としてホスファチジルコリン化合物、それを安定化させるホスファチルグリセロール化合物、及びコレステロール等のステロールである。異なる形態のリポソーム及びそれらの調製方法の優れた概説が、Akbarzadeh, A. et al., Nanoscale Res. Lett. 2013, 8:102, doi:10.1186/1556-276X-8-102中に記されている。
【００３１】
製造方法、リポソーム又はミセルのサイズ、Wntタンパク質とリポソーム又はミセルとの濃度比、並びにさらなる界面活性剤、凍結保護剤及びタンパク質構造の安定化のためのさらなる賦形剤の存在又は不存在は、決定的ではないように思われる。これらは広範囲で変動することができるようである。しかし、Wntタンパク質は、組織培養培地中の最終脂質濃度が0.1 mMを超える場合に最も安定である。したがって、組織培養培地中の脂質濃度は、0.1 mMより高く、0.2 mMより高く、0.3 mMより高く、0.4 mMより高く、0.5 mMより高く、0.6 mMより高く、0.7 mMより高く、0.8 mMより高く、0.9 mMより高く、又はそれより高くてもよい。1.0 mMより多く、2mmより高くまで、3 mMより高くまで、及び最高10 mMの値であっても、Wntタンパク質安定性に対する脂質の有益な効果を妨げることなく用いることができる。
【００３２】
天然の若しくは組換えWntタンパク質、又はWntタンパク質の活性を擬態するそれらのペプチド若しくはバリアントを用いることができる。Wntタンパク質は、他のタンパク質、例えばリポタンパク質又は糖タンパク質等と、又はその活性若しくは溶解性をサポートする他の分子と会合して存在することができる。
【００３３】
上記の脂質成分を供給された培養培地は、Wntタンパク質と会合していても、Wntタンパク質とは別個に加えられても、血清以外の幹細胞培養培地中に見られる通常の成分をさらに含有する。したがって、培養培地は、緩衝化合物、界面活性剤、充填剤、栄養成分、成長因子、並びに幹細胞、特に成体幹細胞の維持及び/又は増殖に必要となり得る他の科学的若しくは生物学的化合物をさらに含有してもよい。また、培養は、細胞外マトリックス成分、例えばコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、及び他の巨大分子、又はこれらの混合物であって、生物由来又は合成由来のもの、例えばマトリゲル、ヒアルロン酸、ポリ（D、L-ラクチド-co-グリコリド）ファイバーマトリックス、ポリグラクチン繊維、アルギン酸カルシウムゲル、ハイドロゲル、シリコーン化合物、又は他の合成ポリマーも含有してもよい。
【００３４】
上述のとおり、リポソーム又は他の脂質凝集体を用いた成体幹細胞の安定化により、前記幹細胞を、血清を含まない培地中で培養することが今や可能である。これにより、治療的用途、特に幹細胞治療の分野におけるそのような幹細胞の利用可能性が大きく向上する。したがって、本発明は、本発明の培養培地、すなわちWntタンパク質及び脂質が含まれる培地中で成体幹細胞を培養するための方法を含む。
【００３５】
複数の幹細胞について、レシピエントへ移植できることが過去に示されてきた。そのような移植幹細胞は、永久的に生着し、通常の機能を発揮することができる。既存の臨床的適用は、造血幹細胞を含む骨髄の白血病患者への移植である。移植幹細胞は、健康な血液細胞を生成し、これらはがん組織と置き換わり、患者を永久的に治癒する。固形組織幹細胞の研究では、造血幹細胞と同様の進展はなされていないが、これは固形の器官に存在する必要な、かつ正確な3D配置、並びに緊密な細胞-細胞及び細胞-細胞外マトリクスの相互作用を再現することが困難なためである。しかし、組織幹細胞は宿主の微小環境及び発生の合図(developmental cue)の制御下で組織の細胞構築へ同化する能力があるので、細胞置換療法に理想的である。複数の他の種類の(成体)幹細胞の移植及び生着が、動物モデルにおいて実証されており、ヒト治療への試験が現在行われている。
【００３６】
そのような幹細胞治療を用いることができる(及び動物試験又は偶発的なヒト治療において機能することが実証されてきた)疾患及び分野は多数ある。幹細胞治療についてのウィキペディアの記事には、現在、多数の領域又は器官が列挙され、成体幹細胞はこれらに由来し、これらの器官に罹患する疾患を治療するために用いられており、例えば失明の治療のための角膜幹細胞、難聴の治療のための蝸牛幹細胞、パーキンソン病又はアルツハイマー病の治療のための神経幹細胞、心筋梗塞の治療のための脂肪組織由来幹細胞、整形外科的欠陥の治療のための間葉系幹細胞などである。もちろん、これらの治療は全て獣医学的応用にも適している。
【００３７】
したがって、本発明は、成体幹細胞を用いた幹細胞治療のための方法であって、該成体幹細胞が本発明の培養培地中で培養された、方法を含む。
【００３８】
幹細胞治療の分野における主要な欠点の一つは、幹細胞の適用により引き起こされ得る免疫反応により生じる。したがって、近年、自己幹細胞移植とも呼ばれる、患者自身の幹細胞を使用する治療の発達が試みられつつある。本発明が、患者自身の幹細胞を用いるそのような治療をも向上させることは明確である。患者から取得した生検からの幹細胞の単離及び培養は、本発明の培養培地により大きく改善され、容易になる。
【００３９】
したがって、本発明は、自己幹細胞移植のための方法であって、幹細胞を対象から単離する(該対象は動物でもヒトでもよい)工程、該幹細胞を本発明の培養培地中でin vitro培養する工程、及び培養した該幹細胞を同じ対象へ再導入する工程を含む、方法を含む。
【００４０】
また、免疫原性反応の可能性があるのでそれほど望ましくはないが、これらの治療には全て同種異系(allogeneic)幹細胞を用いることもできる。
【００４１】
また、成体幹細胞を含む身体の全ての組織を生成することができる胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞より組織特異的幹細胞を得てもよい。人工多能性幹細胞は、リプログラミング因子(Oct4、Sox2及びKlf4であることが多いが他のものも可能)をヒト又は動物のドナー由来の細胞中で発現させることにより得ることができる。このように、患者又はドナー由来の細胞は再プログラム化されて多機能細胞になることができ、これらを組織特異的幹細胞に分化させることができる。
【００４２】
Wntリポソームは、成体幹細胞培養の確立及び維持に役立つだけでなく、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、又は他の幹細胞から成熟細胞種又は他の幹細胞種への分化の誘導にも役立つ可能性がある。
【００４３】
自己幹細胞移植では、身体から単離された幹細胞を処理して改変することも可能である。多くの場合には、そのような処理は特定の遺伝子改変である。そのような幹細胞による遺伝子治療は、文献に記述されている(例えばWatts, K. et al., 2011, Cytotherapy 13:1164-1171 and Kohn, D. et al., 2013, Biol. Blood Marrow, Transplant, 19:S64-S69 for hematopoietic stem cells and San, S. et al., 2010, Hum. Gene Ther. 21:1327-1334 for endothelial precursor cells)。Kohnらの論文中に入念に述べられているとおり、今日までは、置換遺伝子の安定的添加(cDNA、〜グロビン小遺伝子座(mini-locus)、又はゲノム分節)、又は内在性遺伝子のin situ改変に努力が注がれてきた。標的の疾患は、原発性免疫不全症、ヘモグロビン異常症、及びリソソーム蓄積障害であった。本発明の幹細胞の培養方法が、改良された自己幹細胞治療も可能にし、遺伝子改変のための幹細胞の単離及び培養の機会も提供することは明らかである。
【００４４】
本発明の培養方法は、正しい遺伝子改変を有するクローンを容易に単離できるようにし、遺伝子異常が無いことを確認できるようにするので、この点において特に有利である。これらの工程を、本発明の自己幹細胞治療方法に従って、追加的に行ってもよい。
【００４５】
培養方法に関わらず、遺伝子改変された成体幹細胞は、その幹細胞が由来する器官に関連する疾患の治療に有用であるばかりでなく、そのような幹細胞は他の器官の疾患に対して有効な化合物の生産にも有用であることが仮定される。したがって、本発明の一部は、自己成体幹細胞治療のための方法であって、成体幹細胞を対象(ヒトでも動物でもよい)の器官から単離し、続いて遺伝子改変し、該対象へ再導入し、該遺伝子改変により該幹細胞の治療的化合物の生産が引き起こされ、該化合物は該幹細胞が由来する器官以外の別の器官の疾患に対して有効である、方法である。本願明細書で用いられる用語「器官」は、共通の機能を果たし、合わさって一つの構造単位になることができる、組織又は組織の集合の表示のために用いられることが理解される。皮膚又は血液など、器官の中には単一の閉じられた構造を形成しないものがあるので、用語「構造単位」は、構造よりも広く解釈されるべきである。器官は、合わさってより広範な機能単位である器官系になり、血液の場合はこの系は循環器系によって形成され、ここには心臓及び血管も含まれる。より限定された意味では、本発明は、自己成体幹細胞治療のための方法であって、該成体幹細胞を対象(ヒトでも動物でもよい)の器官から単離し、続いて遺伝子改変し、該対象へ再導入し、該遺伝子改変により該幹細胞の治療的化合物の生産が引き起こされ、該化合物は該幹細胞が由来する器官が属する系以外の別の器官系の疾患に対して有効である、方法を含む。
【００４６】
遺伝子改変された幹細胞により生産される治療的因子は、治療的に有効なあらゆる化合物であってよく、タンパク質により形成することができるが、二次代謝物から形成してもよい。その薬理学的活性に基づき、5つの群に分けることができる：(a) 欠乏しているか又は異常なタンパク質を置換する；(b) 既存の経路を増強させる；(c) 新規の機能又は活性を与える；(d) 分子又は器官に干渉する；及び(e) 前述のエフェクタータンパク質の群の標的部位。また、治療的タンパク質は、抗体ベースの薬物、Fc融合タンパク質、抗凝固剤、血液因子、骨形成タンパク質、人工的タンパク質足場、酵素、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、及び血栓溶解剤を含む、分子の種類に基づいてグループ化することもできる。また、活性の分子機構に基づいて、(a) 標的に非共有結合的に結合する、例えばmAbs；(b) 共有結合に作用する、例えば酵素；(c) 特定の相互作用をしないで活性を発揮する、例えば血清アルブミン、として分類することもできる。幹細胞を、このような治療的タンパク質を生産するように遺伝子改変することができる。体内に再導入されると、幹細胞はレシピエントの器官内で細胞へと分化し、タンパク質を生産し始める。タンパク質は、その後リンパ流及び/又は血液に進入し、生物学的化合物の「通常の」投与、例えば経口投与又は非経口投与によっても到達される血液濃度に達する。幹細胞の助力による治療的タンパク質の供給は、疾患の永久的な治癒につながり得るが、これは幹細胞がレシピエントの残りの生存期間の間、体内に維持され得るためである。遺伝子的に変化させた成体ヒト幹細胞により生産され得るタンパク質を用いる幹細胞治療の特定の例は、ポンぺ病(グリコーゲン蓄積症タイプII)の治療として用いられる酸性α-グルコシダーゼ(GAA)と呼ばれる酵素を生産することができるように遺伝子的に変化させた腸幹細胞の使用である。このように、この例では、腸に由来する成体幹細胞は、遺伝子的に改変され、その器官(腸)に全く関連しない疾患を治療するために用いられる。ポンぺ病は、通常主に、無関係な骨格筋及び心筋の細胞に影響する。治療が通常の遺伝子産物を用いる治療により形成される、他の常染色体疾患又は他の遺伝子疾患、例えば糖尿病(インスリンの投与)、フェニルケトン尿症
(フェニルアラニンリアーゼ、PALという酵素)、及び成長ホルモンの投与により治療が形成される成長ホルモン欠乏症について、同様のアプローチをとることができる。治療が、培養した幹細胞が配置される器官における問題、及び無関係の器官における問題の両方に対処し得ることは明らかである。
【００４７】
本願明細書に記載したものと同様の効果は、二次代謝産物の生産及び排出をもたらす幹細胞の遺伝子形質転換によっても得ることができる。そのような方法により生産することができる化合物は、ホルモン、例えばエストロゲンであり、これは乳癌又は卵巣癌の治療において、並びに閉経中、閉経後及び性別適合療法におけるホルモン調節ために、有用である。あるいは、ホルモンアンタゴニストの生産は、持続的な避妊又は化学的去勢までももたらす可能性がある。また、コルチゾール及びアルドステロンの生産を、例えばアジソン病の治療のために用いることができる。
【００４８】
本発明は、続く実施例によってさらに例示される。実施例は、本発明の範囲を制限するものとして解釈されては決してならない。
【実施例】
【００４９】
「材料及び方法」
［腸幹細胞培養の樹立］
オルガノイド培養は新鮮なヒト十二指腸及び回腸の組織サンプルから説明されているように確立した(Sato, T. et al., 2011, Gastroenterol. 141:1762-1772)。端的に言うと、腸の組織を洗浄し、外科用ハサミを用いて下層の筋層を剥ぎ取った。組織を細かく切っておよそ5 mm角の小片にし、冷PBSでさらに洗浄した。次に、組織断片を2 mmol/L EDTA冷キレート緩衝液(5.6 mmol/L Na2HPO4、8.0 mmol/L KH2PO4、96.2 mmol/L NaCl、1.6 mmol/L KCl、43.4 mmol/L スクロース、54.9 mmol/L d-ソルビトール、0.5 mmol/L dl-ジチオスレイトールを含む蒸留水)中で30分間、氷上でインキュベートした。EDTA緩衝液を除去後、10-mLピペットを用いて組織断片を冷キレート緩衝液中に激しく再懸濁し、腸陰窩を単離した。組織断片を標準重力下で1分間沈降させ、上清を除去して倒立顕微鏡による検査に供した。再懸濁化/沈降手順は典型的には6〜8回であり、陰窩を含まない上清を廃棄した。陰窩を含む上清をウシ血清アルブミンでコーティングされた50-mLファルコンチューブに回収した。単離した陰窩をペレット化し、冷キレート緩衝液で洗浄し、150〜200gで3分間遠心分離して単細胞から陰窩を分離した。次にこれらを氷上のマトリゲル(グロースファクターリデュースト、フェノールレッドフリー；BD Biosciences)に包埋し、48ウェルプレートに播種した(ウェルあたり500 陰窩/断片又は1000 単細胞/25 μLのマトリゲル)。マトリゲルを37℃、10分間重合して、その後250 μL/ウェルの50 ng/ml マウスEGF、100 ng/ml マウスnoggin、1 μg/ml ヒトR-spondin-1、1 mM ガストリン、10 mM ニコチンアミド、500 nM A83-01、10 μM SB202190を含む基本培地(ペニシリン/ストレプトマイシン、10 mmol/L HEPES、Glutamax、1× N2、1× B27 [全てInvitrogenより]、及び1 mmol/L N-アセチルシステイン [Sigma]を補ったadvanced(血清低減) Dulbecco's改変Eagle培地/F12)を満たした。50% Wnt3a馴化培地、又は250 ng/ml 精製Wnt3aタンパク質、又は250 ng/ml 精製Wnt3aタンパク質と併せた10% ウシ胎児血清のいずれかを、表示したように、培地にさらに補った。
【００５０】
培地全体を2日毎に交換し、オルガノイドを毎週1:5に継代した。継代については、培養培地を新鮮な基本培養培地と置き換えた。オルガノイド及びマトリゲルをP1000ピペットを用いて機械的に破壊し、15-mlのファルコンチューブに移した。ファイアーポリッシュパスツールピペットを用いてさらなる機械的破壊を行った。破壊したオルガノイドを10 mLの基本培養培地で洗浄し、200gで2分間遠心分離した。上述のとおり、上清を廃棄し、ペレットをマトリゲルで再懸濁し、培養培地を加えた。
【００５１】
［Wnt3a馴化培地の作製］
Wnt3a馴化培地を作製するために、L-Wnt3a細胞(ATCC CRL-2647)をコンフルエントまで培養し、トリプシン処理して、10%ウシ胎児血清を補ったDMEM培地中、6倍大きい面に再プレーティングした。1週間後、培地を回収し、15000 rpmで5分間遠心分離して浮遊細胞を取り除き、0.22マイクロメートルのフィルターを通して濾過し、使用するまで4°Cで保存した。
【００５２】
［Wnt3aタンパク質の精製］
組換えマウスWnt3aタンパク質を、懸濁培養中のショウジョウバエ(Drosophila) S2細胞において生産し、記載の通りBlue Sepharoseアフィニティーゲル濾過クロマトグラフィーにて精製した(Willert, Brown et al. 2003)。
【００５３】
［精製及びリポソームWnt3a試薬の活性測定］
Wnt経路の活性化に応答してルシフェラーゼを発現するマウスLSL細胞(Mikels, A. and Nusse, R., 2006, PLos Biol. 4:e115)を、 ADDIN EN.CITE  ADDIN EN.CITE.DATA 37℃、5% CO2で、DMEM、10% FBS及び1% ペニシリン/ストレプトマイシン中で培養した。活性測定用に、25,000 LSL細胞/ウェルを96ウェルプレートにプレーティングし、24時間増殖させた。その後、DMEM、10% ウシ胎児血清、1% ペニシリン/ストレプトマイシンの培地中で、又はDMEM、1% ペニシリン/ストレプトマイシンの培地中で、37°C、96ウェルプレート中、様々な時間、別々にインキュベートしたWnt試薬で細胞を処理した。表示した試薬でさらにオーバーナイトでインキュベートした後、ルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイ試薬(Promega)を用いて、メーカーの取扱説明書に従って測定した。活性を、対照のLSL細胞に対して、3サンプルの平均としてプロットした。
【００５４】
［胚性幹細胞アッセイ］
まずゼラチンでコーティングし、それからウシ胎児血清でコーティングしたプレート上のN2B27培地中でES細胞を維持した。N2B27培地(Ying, Q. et al., 2003, Nat. Biotechnol. 21:183-186)は、1体積のDMEM/F12と1体積のNeurobasal培地の組み合わせから成り、0.5% N2サプリメント、1% B27サプリメント、0.033% ウシ血清アルブミン 7.5%溶液、50 μM β-メルカプトエタノール、2 mM Glutamax、100 単位/ml ペニシリン及び100 μg/ml ストレプトマイシン(全てInvitrogenより)を補った。細胞を、0.25% トリプシン-EDTAを用いて単細胞の懸濁液として継代した。継代後、トリプシンを大豆トリプシンインヒビター(Sigma)を用いてクエンチした。
【００５５】
複数回の継代にわたる自己再生を定量化するために、単細胞を100 細胞/cm2の密度でゼラチン及び血清コーティングした6ウェルプレート及びゼラチン及び血清コーティングした24ウェルプレートに3連でプレーティングした。3日毎に、6-ウェルプレートをトリプシン処理して単細胞にし、100 細胞/cm2を超えないができる限り近くなるような希釈で、新しいプレート一式に継代した。同時に、24ウェルプレートを、SCR004キット(Millipore)を用いてアルカリホスファターゼを染色した。染色したプレートを水で濯ぎ、乾燥させて、陽性のコロニー数を手動で計数した。コロニーの累積数を、コロニーカウントに継代に用いた希釈係数を乗じることにより決定した。結果を、3つのウェルの平均±標準誤差としてプロットした。
【００５６】
［Wnt3aリポソームの調製］
リポソームの調製のために、異なる種類のリン脂質を試験した。全ての場合において、リン脂質(コレステロールを含まない)の最終濃度を同一に保った。ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)、DMPG(1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1’-rac-グリセロール)を、Lipoid AG (Ludwigshaven、ドイツ)より入手した。コレステロールを、Sigma Aldrich Co. LLC (st. Louis, MO、米国)より入手した。
【００５７】
Wnt3aリポソームの調製のために、第一の脂質を括弧内に示した特定のモル比で混合した：DMPC/DMPG (10:1)、DMPC/DMPG/コレステロール (10:1:1)、DMPC/DMPG/コレステロール (10:1:4)、DMPC/DMPG/コレステロール (10:1:10)。脂質混合物を、クロロホルム/メタノール、比率9/1 (v/v)中に溶解させた。その後、有機層をロータリーエバポレーター(rotavapor)で真空下において徐々に蒸発させ、フィルム層を形成した。残留有機溶媒は窒素ガスフラッシングにより取り除いた。その後、脂質フィルムを88 mMリン脂質の濃度でHBS中に懸濁させた。窒素圧力下、Lipex高圧押出機を用いて、脂質懸濁液を押し出し、孔径がそれぞれ200 nm及び100 nmの2つの重ねたポリカーボネートフィルターに10回通した。最終リン脂質濃度を、ホスフェートアッセイにより決定した。リポソームのサイズ及び分散度を、動的光散乱により決定した。
【００５８】
リポソームとの会合のために、1% CHAPS、PBS中、50-80 ug/mlの精製Wnt3aタンパク質をリポソーム及びPBSと混合し、総濃度を7-10 ug/ml Wnt3a及び18.5 mMリン脂質にした。その後、混合物をローラーコースター型インキュベーター上で4℃、1時間インキュベートした。分画分子量10 kDの透析膜を用いた、4℃、各1時間で3回のPBS中での透析によりCHAPSをWntリポソームから取り除いた。
【００５９】
［CHAPS含有量の測定］
CHAPS濃度を、HPLC(Aliance Waters 2695, Waters、米国)で、逆相クロマトグラフィー及び210 nmのUV検出(Dual λ Absorbance detector, Waters、米国)を用いて測定した。カラムは、LiChrospher 100、RP-18 (5 μM)であった。移動相として、4% アセトニトリル、95.9% 水、及び0.1% 過塩素酸を用い、流速は1.0 ml/分であった。キャリブレーションカーブは50〜1000 μg/mlの範囲であった。
【００６０】
「実施例１  Wnt3aタンパク質は無血清培地中で急速に活性を失う」
安定性を評価するために、Wnt3aタンパク質を細胞培養培地中で様々な時間、37℃でインキュベートし、残った活性をLSLレポーターアッセイ(Mikels A. and Nusse R., 2006, PLos Biol. 4:e115)を用いて測定した。LSL細胞は、Wnt応答性プロモーターによって作動するルシフェラーゼレポーターを含有し、それによりWnt活性の定量的読み出し値を与える。これらのアッセイにより、精製Wnt3aは無血清培地中ではその活性を数時間以内に失うが、一方で血清の存在下ではこの時間が1日より長く延長されることが立証された(図2)。さらに、Wnt3a馴化培地は、数日間にわたってその活性を保持した(図2)。したがって、無血清条件でのWnt3a活性の急激な消失によって、これらの条件下でオルガノイド培養をサポートできない理由が説明される可能性がある。
【００６１】
Wnt半減期の幹細胞自己再生への影響を定量化するために、培養中のWnt活性レベルに非常に感受性が高い、無血清マウス胚性幹細胞(ESC)自己再生アッセイを利用した(ten Berge, D. et al., 2011, Nat. Cell Biol. 13:1070-1075)。Wnt3aを各日ではなく3日毎に加えた場合、ESCの自己再生が顕著に減少したことが見出され(図3a)、これは、Wnt3aタンパク質の短い半減期によってESCの自己再生をサポートするWnt3aタンパク質の能力が制限されることを示唆している。培地中のWnt3aタンパク質の量を増加させることにより、この制限を克服しようと試みたところ、ある閾値を超えると、高濃度のWnt3aにより自己再生が抑制されることが観察された(図3b)。しかし、これは界面活性剤CHAPSの毒性作用によるものであるように思われた(図3b)。CHAPSは精製Wnt3aタンパク質中に高濃度で存在し、その活性維持に必要である(Willert, K. et al., 2003, Nature 423:448-452)。したがって、 ADDIN EN.CITE  ADDIN EN.CITE.DATA Wnt3a活性が無血清細胞培養において急激に減少するだけでなく、Wntタンパク質製剤中のCHAPSの存在によって、細胞培養に加えることができるWnt3aタンパク質量の厳しい上限値が課せられ、活性を維持するための新しいWnt3aタンパク質の頻回の追加が妨げられる。
【００６２】
「実施例２：脂質小胞との会合によりWnt3aタンパク質活性が安定化される」
Wnt3aリポソームを調製するために、異なる脂質の懸濁液をまず押し出して均一なサイズのリポソームを得た。次に、これらをWnt3aタンパク質と混合して、タンパク質をリポソームと会合させた。リポソーム中のリン脂質DMPCが、Wnt3a活性の維持に有益であることを以前示した(Morell, N. et al., 2008, PLos One 3:e2930)。 ADDIN EN.CITE  ADDIN EN.CITE.DATA 電荷が無いため、純粋なDMPCリポソームは凝集する傾向があるが、これはDMPG等の荷電リン脂質を加えることで防ぐことができる。コレステロールの存在により、リポソームの物理的安定性をさらに高めることができる。調製後、リポソームのサイズ、多分散指数、Wnt3a含有量、CHAPS含有量、及びWnt3a活性について分析した。
【００６３】
サイズ及び多分散指数の測定により、Wnt3aとの会合がこれらのリポソームの物理的特性に影響しないことが示された。Wnt3aタンパク質の組み込みを測定するために、リポソームを超遠心分離により沈降させ、リポソーム及び上清のWnt3a含有量をウエスタンブロッティングにより定量した(図4a)。総Wnt3aタンパク質の82%〜87%が、リポソームと会合していることが見出され(図4a、b)、これは以前の測定値と一致していた(Morell et al.、上記を参照)。その後のWnt3aリポソームの透析により、 ADDIN EN.CITE  ADDIN EN.CITE.DATA CHAPS濃度を無視できる程度まで減少させることに成功した(図4c)。さらに、LSLアッセイを用いた活性測定により、リポソームとの会合により無血清培地でのWnt3aの活性が大幅に延長されることが示され、特にDMPC:DMPG:コレステロールの比率が10:1:10の混合物から成るリポソームを用いた場合に顕著であった(図4d)。これらのデータは、Wnt3aタンパク質の脂質小胞への組み込みにより、CHAPSの非存在下であってもその活性が安定化されることを示しており、これにより、細胞へのより長く持続するWnt刺激剤を提供できる可能性がある。加えて、有毒な界面活性剤CHAPSの必要性を取り除くことにより、培地により多量のWnt3aを加えることが可能となる。
【００６４】
［リポソーム安定化Wntリガンドは、無血清幹細胞培養への優れたサポートをもたらす］
最初に、ESC自己再生アッセイにおけるWnt3aリポソームの機能的性能を評価した。これにより、3日毎の細胞の継代後にWnt3aリポソームを細胞に1回加えることで、精製Wnt3aよりも3倍多い未分化細胞の増殖を促進したことが示された(図5)。さらに、Wnt応答性GFPレポーターを保有するR1-7xTcf-eGFP細胞(ten Berge, D. et al., 2008, Cell Stem Cell 3:508-518)を用いることにより、Wnt3a-リポソームが添加4日後でも強力なレポーター活性を維持した一方で、精製Wnt3aを加えた最初の日以降、レポーター活性が着実に減少し始めたことを見出した(図6a、b)。これらのデータにより、新規のWnt3aリポソームの持続的な活性が、標的遺伝子の活性化を維持する能力、及び幹細胞増殖をサポートする能力の大幅な向上につながることが示される。
【００６５】
最後に、ヒト十二指腸及び回腸のオルガノイド培養の樹立及び維持をWnt3aリポソームがサポートする能力を試験した。精製Wnt3aとは対照的に、Wnt3aリポソームは無血清条件において両方の組織からのオルガノイド培養の効率的な確立及び維持をサポートした(図7)。また、さらに、Wnt3aリポソームは、Wnt3a馴化培地、又は血清と組み合わせた精製Wnt3aと比較して、オルガノイドの樹立を強力に増進させ、分化の兆候の大幅な減少を示した(図7)。これは、血清中及びWnt3a馴化培地中の因子がオルガノイド幹細胞の分化を促進することを示している。これらのデータは、Wnt3aリポソームにより、定義された条件におけるオルガノイド培養が確立されるだけでなく、培養系から分化誘導因子を排除することで樹立及び培養の効率も増加することを示している。
【００６６】
［脂質小胞との会合によりWnt3aタンパク質の活性が安定化する］
さらに、培地への添加前にWnt3aタンパク質をリポソームと複合化させることが必須であるかを試験した。細胞培養培地に別個に添加した場合も、リポソームがWnt3aタンパク質の活性を安定化させることを見出した(図8)。加えて、リポソームが総リン脂質0.1 mM〜3.2 mMで変動する範囲の濃度で存在する場合、Wnt3aタンパク質の安定化に効果的であること(図8)、及びこの範囲の外の濃度でも効果的である可能性が高いことを見出した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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