(57)【要約】  ヒト疾患の病変形成を再現する結腸直腸癌のモデルを開示する。また、結腸直腸がんのモデルを作製する方法、及び腫瘍形成を阻害する化合物をスクリーニングするためのそのモデルの使用方法も提供する。【選択図】図２
2016525358.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結腸粘膜表面にドナー腫瘍形成性細胞移植片を含み、移植が結腸壁の破損に至っていないげっ歯動物。
【請求項２】
ドナー腫瘍形成性細胞移植片が、結腸壁を越えて結腸漿膜表面へ浸潤性増殖することができる、請求項１に記載のげっ歯動物。
【請求項３】
ドナー腫瘍形成性細胞移植片の浸潤性増殖が、腸リンパ節、肝臓又は肺における転移によって特徴付けられる、請求項２に記載のげっ歯動物。
【請求項４】
移植後腹腔内に検出可能な腫瘍形成を示さない、請求項１から３の何れか一項に記載のげっ歯動物。
【請求項５】
ドナー腫瘍形成性細胞移植片が、がん細胞株の細胞を含む、請求項１から４の何れか一項に記載のげっ歯動物。
【請求項６】
がん細胞株が、結腸直腸がん（ＣＲＣ）細胞株である、請求項５に記載のげっ歯動物。
【請求項７】
ドナー腫瘍形成性細胞移植片が無傷腫瘍又はその断片である、請求項１から６の何れか一項に記載のげっ歯動物。
【請求項８】
無傷腫瘍又はその断片が、無傷の悪性腫瘍又はその断片である、請求項７に記載のげっ歯動物。
【請求項９】
無傷腫瘍又はその断片が、無傷の良性腫瘍又はその断片である、請求項７に記載のげっ歯動物。
【請求項１０】
無傷腫瘍又はその断片が、無傷の結腸直腸腫瘍又はその断片である、請求項７に記載のげっ歯動物。
【請求項１１】
無傷腫瘍又はその断片が、無傷の非結腸直腸腫瘍又はその断片である、請求項７に記載のげっ歯動物。
【請求項１２】
マウスである、請求項１から１１の何れか一項に記載のげっ歯動物。
【請求項１３】
マウスが免疫不全である、請求項１２に記載のげっ歯動物。
【請求項１４】
免疫不全マウスが、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス又はＮＯＤ／ＳＣＩＤインターロイキン２受容体ガンマ鎖欠損（ＮＳＧ）マウスである、請求項１３に記載のげっ歯動物。
【請求項１５】
結腸直腸がんのげっ歯動物モデルを作製するための方法であって、
（ａ）宿主げっ歯動物の結腸粘膜表面を露出させること；
（ｂ）一又は複数の腫瘍形成性細胞を結腸粘膜表面に移植すること；及び
（ｃ）一又は複数の移植された腫瘍形成性細胞を含む露出させた結腸を宿主げっ歯動物に再挿入すること
を含み、それにより、結腸直腸がんのげっ歯動物モデルを作製する方法。
【請求項１６】
腫瘍形成性細胞が、結腸壁を越えて結腸漿膜表面へ浸潤性増殖することができる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
結腸直腸がんのげっ歯動物モデルが、腸リンパ節、肝臓又は肺における一又は複数の移植された腫瘍形成性細胞の転移により特徴付けられる、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
げっ歯動物モデルが、移植後腹腔内に検出可能な腫瘍形成を示さない、請求項１５から１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
一又は複数の腫瘍形成性細胞が、一又は複数のドナー腫瘍形成性細胞である、請求項１５から１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
一又は複数の腫瘍形成性細胞が、無傷腫瘍又はその断片中にある、請求項１５から１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
一又は複数の腫瘍形成性細胞ががん細胞株由来である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
げっ歯動物がマウスである、請求項１５から２１の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３】
腫瘍形成性細胞の増殖を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）請求項１のげっ歯動物のドナー腫瘍形成性細胞移植片をげっ歯動物において候補化合物と接触させること；及び
（ｂ）候補化合物が腫瘍形成性細胞の増殖を阻害するかどうかを判定すること
を含み、それにより腫瘍形成性細胞の増殖を阻害する化合物として候補化合物を同定する、方法。
【請求項２４】
腫瘍形成性細胞の増殖を阻害するアジュバントのスクリーニング方法であって、
（ａ）請求項１のげっ歯動物の結腸粘膜表面からドナー腫瘍形成性細胞移植片を取り除くこと；
（ｂ）げっ歯動物に候補化合物を投与すること；及び
（ｃ）候補化合物が腫瘍形成性細胞の増殖を阻害するかどうかを判定すること
を含み、それにより、腫瘍形成性細胞の増殖を阻害するアジュバントとして候補化合物を同定する、方法。
【請求項２５】
候補化合物が腫瘍形成性細胞の増殖を阻害するかどうかを判定することが、腫瘍形成性細胞数の減少又は安定化；腫瘍サイズの縮小又は安定化；腫瘍量の減少又は安定化；腫瘍形成性細胞浸潤の減少又は安定化；及び腫瘍転移の減少又は安定化からなる群より選択される少なくとも一つの反応を引き起こす、候補化合物の能力を評価することを含む、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
候補化合物が、小分子、ペプチド、ポリペプチド、抗体、抗体断片又はイムノコンジュゲートである、請求項２３から２５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ドナー腫瘍形成性細胞移植片が、結腸壁を越えて結腸漿膜表面へ浸潤性増殖することができる、請求項２３から２６の何れか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ドナー腫瘍形成性細胞移植片の浸潤性増殖が、腸リンパ節、肝臓又は肺における転移によって特徴付けられる、請求項２３から２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２９】
げっ歯動物が、移植後腹腔内に検出可能な腫瘍形成を示さない、請求項２３から２８の何れか一項に記載の方法。
【請求項３０】
げっ歯動物がマウスである、請求項２３から２９の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、臨床的に関連する結腸直腸がん（ＣＲＣ）のモデル、及び腫瘍形成を阻害する化合物をスクリーニングするためにそのモデルを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
結腸直腸がん（ＣＲＣ）は、世界で三番目に一般的ながんであり、四番目に一般的な死因である。ＣＲＣはすべてのがん発生の９％を占める。２０１３年には、１４２８２０件のＣＲＣの新規症例が米国で診断され、５０８３０人がＣＲＣで死亡すると予想されている(American Cancer Society: Cancer Facts and Figures 2013. Atlanta, GA, 2013)。ＣＲＣ発生に対する生存率の低さは少なくとも部分的に、進行期で診断される症例の割合が高いことにある。進行期転移性ＣＲＣ患者の５年全相対生存率は１２．５％である(Howlader et al. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2010.  NCI.  Bethesda, MD, 2013)。
【０００３】
ＣＲＣの異種移植モデル、化学誘発モデル、遺伝子操作モデル（例えば、マウスモデル）がＣＲＣの研究のために開発されてきたが、これらのモデルにおける腫瘍は、ヒトのＣＲＣに関連する標的臓器である領域腸リンパ節や肝臓に再現可能に転移しない。したがって、ＣＲＣのヒト疾患の病変形成を再現することができるＣＲＣのモデル開発分野において満たされていないニーズが存在する。このようなＣＲＣのモデルは、治療法を試験し、新たな治療戦略を立てるのに貴重なツールになるであろう。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、結腸直腸がん（ＣＲＣ）のヒト疾患の病変形成を再現する結腸直腸がん（ＣＲＣ）モデル、並びに該モデルの作製及び使用の方法を提供する。
【０００５】
第一の態様において、本発明は、結腸粘膜表面のドナー腫瘍形成性細胞移植片を含む非ヒト哺乳動物を取り上げ、この場合の移植は、結腸壁の破損（例えば、開口、断裂、破裂又は穿刺）には至らない（すなわち、結腸壁の深層は無傷のまま）。一実施態様では、ドナー腫瘍形成性細胞移植片は、結腸壁を越えて結腸漿膜表面へと浸潤性増殖することができる（例えば、外筋層のコラーゲンＩＶに富む基底膜を突破して漿膜面へと至る増殖）。別の実施態様では、ドナー腫瘍形成性細胞移植片の浸潤性増殖は、腸リンパ節、肝臓又は肺のような、ＣＲＣ（例えば、ヒトＣＲＣ）の通常の標的臓器（すなわち、標的転移臓器又は転移組織）における転移によって特徴付けられる。別の実施態様では、非ヒト哺乳動物は、移植後に腹腔内に検出可能な腫瘍形成（例えば、癌性腹膜炎）を示さない。別の実施態様では、ドナー腫瘍形成性細胞移植片は、がん細胞株の細胞を含む。一実施態様では、がん細胞株はＣＲＣ細胞株（例えば、ＨＣＴ１１６）である。別の実施態様では、がん細胞株は非ＣＲＣ細胞株（例えば、肺がん細胞株、肝臓かん細胞株、脳腫瘍細胞株、リンパ節がん細胞株、腎臓がん細胞株、胃がん細胞株、卵巣がん細胞株、皮膚がん細胞株、膵臓がん細胞株、甲状腺がん細胞株、前立腺がん細胞株、又は乳がん細胞株、例えばＭＤＡ−２３１）である。別の実施態様では、ドナー腫瘍形成性細胞移植片は、無傷腫瘍又はその断片である。一実施態様では、無傷腫瘍又はその断片は悪性  （例えば、転移性、領域浸潤性及び／又は遠位浸潤性）であり得る。別の実施態様では、無傷腫瘍又はその断片は良性  （例えば、非転移性及び／又は局所浸潤性）であり得る。幾つかの実施態様では、無傷腫瘍又はその断片は、無傷なＣＲＣ腫瘍又はその断片である。他の実施態様では、無傷腫瘍又はその断片は、無傷な非ＣＲＣ腫瘍又はその断片（例えば、乳がん腫瘍、肺がん腫瘍、肝臓がん腫瘍、脳腫瘍、リンパ節がん腫瘍、腎臓がん腫瘍、胃がん腫瘍、卵巣がん腫瘍、皮膚がん腫瘍、膵臓がん腫瘍、甲状腺がん腫瘍、又は前立腺がん腫瘍、もしくはそれらの断片）である。別の実施態様では、ドナー腫瘍形成性細胞移植片細胞のサブセット（例えば、５％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上）は浸潤性増殖ができる。他の実施態様では、ドナー腫瘍形成性細胞移植片のすべて（すなわち、１００％）の細胞の増殖が浸潤性増殖として特徴付けられうる。別の実施態様では、非ヒト哺乳動物は、げっ歯動物、例えばマウス又はラットである。幾つかの実施態様では、げっ歯動物（例えば、マウス又はラット）は免疫不全又は免疫無防備状態であってよい。特定の実施態様では、免疫不全マウスはＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス又はＮＯＤ／ＳＣＩＤインターロイキン２受容体ガンマ鎖欠損（ＮＳＧ）マウスでありうる。他の実施態様では、非ヒト哺乳動物は、野生型及び／又は免疫適格である（例えば、野生型又は免疫適格マウス��はラットのような、野生型又は免疫適格げっ歯動物）。
【０００６】
第二の態様では、本発明は、宿主非ヒト哺乳動物の結腸粘膜表面を露出させることと、その結腸粘膜表面に一又は複数の腫瘍形成性細胞を移植することと、一又は複数の移植された腫瘍形成性細胞を含む露出された結腸を宿主非ヒト哺乳動物体内に再挿入することとを含む、第一の態様の非ヒト哺乳動物（マウス又はラットのようなげっ歯動物等）（すなわち、ＣＲＣの非ヒト哺乳動物（例えば、げっ歯動物）モデル）を作製するための方法を取り上げる。
【０００７】
第三の態様では、本発明は、本発明の非ヒト哺乳動物のドナー腫瘍形成性細胞移植片を候補化合物と接触させることと、候補化合物が腫瘍形成性細胞の増殖を阻害するかどうかを判定し、それにより腫瘍形成性細胞の増殖を阻害する化合物として候補化合物を同定することを含む、腫瘍形成性細胞の増殖を阻害する（例えば無処置群又は処置対照群と比較して、例えば、腫瘍形成性細胞の増殖を少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上阻害する）化合物をスクリーニングする方法を取り上げる。
【０００８】
第四の態様では、本発明は、ドナー腫瘍形成性細胞移植片を第一の態様の非ヒト哺乳動物の結腸粘膜表面から取り除くことと、非ヒト哺乳動物に候補化合物を投与することと、その候補化合物が腫瘍形成性細胞の増殖を阻害するかどうかを判定し、それにより腫瘍形成性細胞の増殖を阻害するアジュバントとして候補化合物を同定することを含む、腫瘍形成性細胞の増殖を阻害する（例えば無処置群又は処置対照群と比較して、例えば、腫瘍形成性細胞の増殖を少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上阻害する）アジュバントをスクリーニングする方法を取り上げる。
【０００９】
本発明の第三又は第四の態様の一実施態様において、候補化合物が腫瘍形成性細胞の増殖を阻害するかどうかを判定する工程は、腫瘍形成性細胞数の減少又は安定化；腫瘍サイズの縮小又は安定化；腫瘍量の減少又は安定化；腫瘍形成性細胞浸潤の減少又は安定化；及び腫瘍転移の減少又は安定化からなる群より選択される少なくとも一つの反応（例えば、１、２、３、４又は５つの反応）を引き起こす、候補化合物の能力を評価することを含む。第三又は第四の態様の別の実施態様において、候補化合物は、小分子、ペプチド、ポリペプチド、抗体、抗体断片又はイムノコンジュゲートであってよい。第三又は第四の態様の別の実施態様では、ドナー腫瘍形成性細胞移植片は、結腸壁を越えて結腸漿膜表面へと浸潤性増殖することが可能でありうる（例えば、外筋層のコラーゲンＩＶに富む基底膜を突破して漿膜表面へと至る増殖）。第三又は第四の態様の他の実施態様では、腫瘍形成性細胞の浸潤性増殖は、腸リンパ節、肝臓又は肺のような、ＣＲＣ（例えば、ヒトＣＲＣ）の一又は複数（例えば、１、２、３つ以上）の通常の標的臓器（すなわち、標的転移臓器又は転移組織）における転移によって特徴付けられうる。第三又は第四の態様の他の実施態様では、非ヒト哺乳動物は、移植後に腹腔内に検出可能な腫瘍形成（例えば、癌性腹膜炎）を示さない。第三又は第四の態様の別の実施態様では、非ヒト哺乳動物は、げっ歯動物、例えばマウス又はラットである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
本願のファイルはカラーで作成された図面を少なくとも一点含む。カラー図面を伴う本特許又は特許出願のコピーは、請求及び必要な料金の支払いに応じて特許庁より提供される。
【図１Ａ−Ｂ】図１Ａに、９週齢のドナーＡｐｃＭｉｎ／＋；Ｖｉｌｌｉｎ−Ｃｒｅ対照マウスの結腸（上段及び中段の枠）及び肝臓（下段の枠）の画像を示す。肛門を左に置いた状態で結腸を縦に開き、粘膜側から（上）及び漿膜側から（中央）画像化した。矢印は結腸ポリープを指している。肝臓の四角で囲った部分を拡大している。  図１Ｂは、９週齢のドナーＡｐｃＭｉｎ／＋；ＫｒａｓＬＳＬＧ１２Ｄ／＋；Ｖｉｌｌｉｎ−Ｃｒｅマウスの結腸（上段及び中段の枠）及び肝臓（下段の枠）の画像である。肛門を左に置いた状態で結腸を縦に開き、粘膜側から（上）及び漿膜側から（中央）画像化した。矢印は結腸ポリープを指している。肝臓の四角で囲った部分を拡大している。
【図１Ｃ−Ｄ】図１Ｃは、６週齢の、ＡｐｃＭｉｎ／＋；Ｖｉｌｌｉｎ−Ｃｒｅ（ｎ＝５）及びＡｐｃＭｉｎ／＋；ＫｒａｓＬＳＬＧ１２Ｄ／＋；Ｖｉｌｌｉｎ−Ｃｒｅ（ｎ＝４）マウスにおける内因性結腸腫瘍負荷を示すグラフである。各点は各マウスのデータを表す。また、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．も示す。＊Ｐ＜０．０５。  図１Ｄは、ＡｐｃＭｉｎ／＋；Ｖｉｌｌｉｎ−Ｃｒｅ（ｎ＝４９）及びＡｐｃＭｉｎ／＋；ＫｒａｓＬＳＬＧ１２Ｄ／＋；Ｖｉｌｌｉｎ−Ｃｒｅ（ｎ＝１４）マウスについてのカプラン・マイヤー生存曲線を示すグラフである。ＨＲ＝ハザード比
【図１Ｅ】図１Ｅは、９ｗｐｉで採取した、ドナー皮下同種移植片の単一無傷のＡｐｃＭｉｎ／＋；ＫｒａｓＬＳＬＧ１２Ｄ／＋；Ｖｉｌｌｉｎ−Ｃｒｅ結腸腫瘍断片を内腔移植した野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス結腸の全体画像（上段枠：粘膜側から；下段枠：漿膜側から）のセットである。結腸の四角で囲んだ部分は、それぞれの画像の右側に拡大されている。スケールバーは３ｍｍを表す。
【図１Ｆ−Ｇ】図１Ｆ及び１Ｇは、６３ｗｐｉ（Ｆ；宿主マウス＃３５９；良性）又は７９ｗｐｉ（Ｇ；宿主マウス＃５９０；悪性）で採取された、単一無傷のＡｐｃＭｉｎ／＋；ＫｒａｓＬＳＬＧ１２Ｄ／＋；Ｖｉｌｌｉｎ−Ｃｒｅドナー腫瘍の内腔移植を受けている二匹の宿主野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの結腸（上段及び中段の枠）及び肝臓（下段の枠）の画像である。肛門を左に置き、結腸を粘膜側及び／又は漿膜側から画像化した。矢印は移植されたドナー腫瘍を指している。肝臓の四角で囲った部分を拡大している。図１Ｇでは、リンパ節転移を目立たせるために結腸の四角で囲った部分を拡大している。
【図１Ｈ】図１Ｈは、単一の無傷のＡｐｃＭｉｎ／＋；ＫｒａｓＬＳＬＧ１２Ｄ／＋；Ｖｉｌｌｉｎ−Ｃｒｅドナー腫瘍の野生型Ｃ５７ＢＬ／６宿主マウス結腸への内腔移植後の、良性進行か悪性進行かの発生を示す表である。
【図２】図２は、内腔移植技術の代表的な画像を用いた概略図である。移植前：マウスをイソフルラン吸入によって麻酔し、仰臥位に置き、粘着テープを用いてガーゼで覆った台に四肢を固定する。止血鉗子挿入：先端が尖っていない止血鉗子を肛門に挿入し、粘膜を優しくクラスプ（ｃｌａｓｐ）する。直腸脱誘導：止血鉗子を肛門から抜き、粘膜を露出させる。腫瘍移植：約１０ｍｍ３のドナー腫瘍を露出した結腸の粘膜表面に縫合する。腫瘍縫合完了：縫合糸の端をカットし、ドナー腫瘍を粘膜にしっかりと縫い付ける。直腸脱の回復：針の先端が尖っていない経管栄養針を使用して、縫合されたドナー腫瘍と共に露出している結腸を体内に戻し、直腸脱を戻す。
【図３Ａ−Ｂ】図３Ａは、ドナーマウス＃４７００−２６０の単一のＡｐｃＭｉｎ／＋；ＫｒａｓＬＳＬＧ１２Ｄ／＋；Ｖｉｌｌｉｎ−Ｃｒｅ結腸ポリープを、野生型Ｃ５７ＢＬ／６宿主マウス＃３４４の結腸に内腔移植した後の一連の内視鏡画像であり、内腔移植ＡｐｃＭｉｎ／＋；ＫｒａｓＬＳＬＧ１２Ｄ／＋；Ｖｉｌｌｉｎ−Ｃｒｅ結腸ポリープは良性のままであることを示している。一連の画像は、表示時点の宿主から得たものである。  図３Ｂは、ドナーマウス＃４７００−２６０の単一のＡｐｃＭｉｎ／＋；ＫｒａｓＬＳＬＧ１２Ｄ／＋；Ｖｉｌｌｉｎ−Ｃｒｅ結腸ポリープを、野生型Ｃ５７ＢＬ／６宿主マウス＃３４６の結腸に内腔移植した後の一連の内視鏡画像であり、内腔移植ＡｐｃＭｉｎ／＋；ＫｒａｓＬＳＬＧ１２Ｄ／＋；Ｖｉｌｌｉｎ−Ｃｒｅ結腸ポリープは良性のままであることを示している。一連の画像は、表示時点の宿主から得たものである。
【図４Ａ】図４Ａは、内腔移植後の結腸直腸全体の腫瘍発達の経時的変化を示す一連の画像である。ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ内腔腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの結腸を、移植後０から７週（０−７ｗｐｉ）の間に１週間間隔で採取し、縦に開き画像化した。上段と下段の枠は、それぞれ肛門を左に置き、結腸を粘膜側と漿膜側から写している。
【図４Ｂ−Ｅ】図４Ｂは、ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ内腔移植後の一連の内視鏡画像である。一連の画像は、０から４ｗｐｉの間に同じ宿主から得たものである。２ｗｐｉの点線は、移植された腫瘍の辺縁を示す。  図４Ｃは、内腔移植後の原発腫瘍体積を示すグラフである。時点ごとのマウスの数：０ｗｐｉ（ｎ＝３）、１ｗｐｉ（ｎ＝３）、２ｗｐｉ（ｎ＝６）、３ｗｐｉ（ｎ＝６）、４ｗｐｉ（ｎ＝１１）、５ｗｐｉ（ｎ＝１５）、６ｗｐｉ（ｎ＝１１）、７ｗｐｉ（ｎ＝１８）。データは平均値とｓ．ｅ．ｍ．で表す。  図４Ｄは、ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄドナー腫瘍を移植された宿主結腸の１ｗｐｉ時点の組織学的画像で、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を示している。  図４Ｅは、ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄドナー腫瘍を移植された宿主結腸の１ｗｐｉ時点の組織学的画像で、コラーゲンＩＶ（Ｃｏｌ  ＩＶ；緑）、ＤｓＲｅｄ（赤）、及び４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；青）染色を示している。
【図４Ｆ−Ｉ】図４Ｆは、ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄドナー腫瘍を移植された宿主結腸の３ｗｐｉ時点の組織学的画像で、Ｈ＆Ｅ染色を示している。  図４Ｇ−４Ｉは、図４Ｆに示されている部位を拡大した組織学的画像で、それぞれＣｏｌ  ＩＶ（緑）、ＤｓＲｅｄ（赤）及びＤＡＰＩ（青）染色を示している。
【図５Ａ−Ｃ】図５Ａは、ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍断片の内腔移植直後の、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの結腸の組織学的画像である。  図５Ｂ及び５Ｃは、図５Ａで示されている部位を拡大した組織学的画像で、それぞれＨ＆Ｅ染色を示している。
【図５Ｄ−Ｆ】図５Ｄは、ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍断片の内腔移植直後の、Ｃｏｌ  ＩＶ（緑）、ＤｓＲｅｄ（赤）及びＤＡＰＩ（青）で染色されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの結腸の組織学的画像である。  図５Ｅ及び５Ｆは、図５Ｄに示されている部位を拡大した組織学的画像で、それぞれＣｏｌ  ＩＶ（緑）、ＤｓＲｅｄ（赤）及びＤＡＰＩ（青）染色を示している。
【図５Ｇ】図５Ｇは、腫瘍細胞の播種が移植後１日時点で検出可能でないことを示す、一連の画像及びグラフである。０日目に、ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄドナー腫瘍断片が宿主マウス結腸（ｎ＝２）の粘膜表面に移植された。移植後１日目に内視鏡検査を行い、移植された腫瘍の画像を得た（上段）。次いでマウスを屠殺し、肝臓、肺、腸血管及び血液を採取し、ＤｓＲｅｄ＋細胞のフローサイトメトリーにより評価した。陰性対照は、野生型マウスから採取された組織試料からなる。陽性対照は、ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ＋腫瘍細胞を含有する組織試料からなる。平均５×１０６個の生細胞がフローサイトメトリーにより評価された。ゲートを設けて、各陰性対照試料中のＤｓＲｅｄ＋細胞が検出されないようにした。ゲート内の数はＤｓＲｅｄ＋細胞のパーセンテージを表す。
【図６】図６は、内腔移植後の結腸直腸腫瘍発達の経時的変化を示す、ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ内腔腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの結腸を写した一連の画像である。結腸を０から７ｗｐｉの間に１週間間隔で採取し、縦に開き、固定して切片にし、Ｈ＆Ｅにより染色し（左欄）、又はＣｏｌ  ＩＶ（緑）、ＤｓＲｅｄ（赤）及びＤＡＰＩ（青）により染色した（右欄）。すべての枠で肛門は左に位置し、結腸の内腔は上に向かっている。
【図７Ａ−Ｃ】図７Ａは、ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ内腔腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの７ｗｐｉ時点の結腸全体を写した一連の画像であり、矢印は領域リンパ節転移を示し；左下段の枠はヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）による組織学的染色を示し；  また、青枠で囲われた部分と赤枠で囲われた部分は、それぞれ下部中央又は右の枠に拡大されてＣｏｌ  ＩＶ（緑）、ＤｓＲｅｄ（赤）及びＤＡＰＩ（青）により染色されている。  図７Ｂは、ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ内腔腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの７ｗｐｉ時点の肝臓を写した一連の画像であり、矢印は転移を示し；中央の枠はＨ＆Ｅによる組織学的染色を示し、点線は転移小結節の辺縁を示し、また、四角で囲まれた部分は右枠に拡大されてＣｏｌ  ＩＶ（緑）、ＤｓＲｅｄ（赤）及びＤＡＰＩ（青）により染色されている。  図７Ｃは、ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ内腔腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの７ｗｐｉ時点の肺を写した一連の画像であり、矢印は転移を示し；中央の枠はＨ＆Ｅによる組織学的染色を示し、矢印は転移小結節を示し、また、四角で囲まれた部位は右枠に拡大されてＣｏｌ  ＩＶ（緑）、ＤｓＲｅｄ（赤）及びＤＡＰＩ（青）により染色されている。
【図７Ｄ−Ｅ】図７Ｄは、ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍の内腔移植後のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける腸リンパ節、肝臓及び肺の内部の巨視的転移の数を示すグラフである。時点ごとのマウスの数：０ｗｐｉ（ｎ＝１４）、１ｗｐｉ（ｎ＝３）、２ｗｐｉ（ｎ＝６）、３ｗｐｉ（ｎ＝６）、４ｗｐｉ（ｎ＝１１）、５ｗｐｉ（ｎ＝１５）、６ｗｐｉ（ｎ＝２０）、７ｗｐｉ（ｎ＝１８）。各点は各マウスのデータを表す。また、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．も示す。  図７Ｅは、ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍の内腔移植後のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける腸リンパ節、肝臓及び肺の内部のＤｓＲｅｄ陽性腫瘍細胞負荷を示すグラフである。データは、１ｘ１０６の生存事象（ｖｉａｂｌｅ  ｅｖｅｎｔ）当たりのＤｓＲｅｄ陽性腫瘍細胞の数として示す。時点ごとのマウスの数：０ｗｐｉ（ｎ＝１４）、１ｗｐｉ（ｎ＝３）、２ｗｐｉ（ｎ＝３）、３ｗｐｉ（ｎ＝３）、４ｗｐｉ（ｎ＝８）、５ｗｐｉ（ｎ＝８）、６ｗｐｉ（ｎ＝１３）、７ｗｐｉ（ｎ＝１４）。各点は各マウスのデータを表す。また、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．も示す。
【図７Ｆ−Ｇ】図７Ｆは、ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ内腔腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの３ｗｐｉ時点の肝臓を写した一連の画像であり、中央の枠はＨ＆Ｅによる組織学的染色を示し、右枠はＣｏｌ  ＩＶ（緑）、ＤｓＲｅｄ（赤）及びＤＡＰＩ（青）による染色、また矢印はＤｓＲｅｄ陽性播種性腫瘍細胞を指す。  図７Ｇは、ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ内腔腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの３ｗｐｉ時点の肺を写した一連の画像であり、中央の枠はＨ＆Ｅによる組織学的染色を示し、右枠はＣｏｌ  ＩＶ（緑）、ＤｓＲｅｄ（赤）及びＤＡＰＩ（青）による染色、矢印はＤｓＲｅｄ陽性播種性腫瘍細胞を指し、また矢尻は自家蛍光マクロファージを指す。
【図８Ａ】図８Ａは、内腔移植ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの、Ｈ＆Ｅで染色された６ｗｐｉ時点の結腸の組織学的画像であり、内腔移植結腸直腸腫瘍が、血行性／リンパ性／神経周囲の浸潤だけでなく局所領域的な広がりを示し、巨視的リンパ節転移を起こしていることを表している。
【図８Ｂ−Ｅ】図８Ｂは、図８Ａで示した部位の拡大された組織学的画像で、Ｈ＆Ｅで染色され、矢印で示した原発腫瘍から遠位の局所領域的広がりを示している。  図８Ｃは、図８Ａで示した部位の拡大された組織学的画像で、Ｈ＆Ｅで染色され、点線で輪郭を示した正常粘膜まで腫瘍遊走領域が局所領域的に広がっていることを示している。  図８Ｄは、図８Ａで示した部位の拡大された組織学的画像で、Ｈ＆Ｅで染色され、外筋層貫通を示している。  図８Ｅは、図８Ａで示した部位の拡大された組織学的画像で、Ｈ＆Ｅで染色され、原発腫瘍の生存を示している。
【図８Ｆ−Ｊ】図８Ｆは、図８Ａで示した部位の拡大された組織学的画像で、Ｈ＆Ｅで染色され、矢印で示した原発腫瘍から近位の局所領域的広がりを示している。  図８Ｇは、図８Ａで示した部位の拡大された組織学的画像で、Ｈ＆Ｅで染色され、矢印は血行性浸潤を示している。  図８Ｈは、図８Ａで示した部位の拡大された組織学的画像で、Ｈ＆Ｅで染色され、矢印は神経周囲の浸潤を示している。  図８Ｉは、図８Ａで示した部位の拡大された組織学的画像で、Ｈ＆Ｅで染色され、領域リンパ節コロニー形成を示している。  図８Ｊは、図８Ａで示した部位の拡大された組織学的画像で、Ｈ＆Ｅで染色され、矢印はリンパ浸潤を示している。
【図９Ａ】図９Ａは、内腔移植後の結腸直腸全体の腫瘍発達の経時的変化を示す一連の画像である。ＬＳ１７４Ｔ−ＤｓＲｅｄ内腔腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの結腸を、０から８ｗｐｉの間に採取し、縦に開き画像化した。上段と下段の枠は、肛門を左に置き、それぞれ結腸を粘膜側と漿膜側から写している。矢印は腸リンパ節転移を示す。
【図９Ｂ−Ｅ】図９Ｂは、ＬＳ１７４Ｔ−ＤｓＲｅｄ腫瘍の内腔移植後のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける原発腫瘍の体積を示すグラフである。時点ごとのマウスの数：０ｗｐｉ（ｎ＝９）、１ｗｐｉ（ｎ＝３）、２ｗｐｉ（ｎ＝３）、３ｗｐｉ（ｎ＝３）、４ｗｐｉ（ｎ＝３）、５ｗｐｉ（ｎ＝３）、６ｗｐｉ（ｎ＝３）、７ｗｐｉ（ｎ＝４）、８（ｎ＝１２）。データは平均値とｓ．ｅ．ｍ．で表す。  図９Ｃは、内腔移植ＬＳ１７４Ｔ−ＤｓＲｅｄ腫瘍を有するマウスの７ｗｐｉ時点の肝臓の画像である。矢印は転移を示す。  図９Ｄは、内腔移植ＬＳ１７４Ｔ−ＤｓＲｅｄ腫瘍を有するマウスの８ｗｐｉ時点の肺の画像である。矢印は転移性増殖を示す。  図９Ｅは、ＬＳ１７４Ｔ−ＤｓＲｅｄ腫瘍の内腔移植後のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける腸リンパ節、肝臓及び肺の内部の巨視的転移の数を示すグラフである。時点ごとのマウスの数：０ｗｐｉ（ｎ＝９）、１ｗｐｉ（ｎ＝３）、２ｗｐｉ（ｎ＝３）、３ｗｐｉ（ｎ＝３）、４ｗｐｉ（ｎ＝３）、５ｗｐｉ（ｎ＝３）、６ｗｐｉ（ｎ＝３）、７ｗｐｉ（ｎ＝４）、８ｗｐｉ（ｎ＝１２）。各点は各マウスのデータを表す。また、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．も示す。
【図１０Ａ−Ｃ】図１０Ａは、ステージＩＩのヒト患者の内腔移植結腸直腸腫瘍を有するマウスの結腸を写した画像であり、ステージＩＩ患者の内腔移植腫瘍は非転移性で良性のままであることを示している。  図１０Ｂは、ステージＩＩＩのヒト患者の内腔移植結腸直腸腫瘍を有するマウスの結腸を写した画像であり、ステージＩＩＩ患者の内腔移植腫瘍がリンパ節転移を起こしていることを示している。  図１０Ｃは、ステージＩＩ及びステージＩＩＩドナー腫瘍から生じる巨視的転移の数を示したグラフである。各点は各マウスのデータを表す。また、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．も示す。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図１１Ａ−Ｂ】図１１Ａは、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ又はＮＳＧマウスへのＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍の内腔又は皮下移植後の様々な臓器内の巨視的転移の数を示すグラフである。マウス数：ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  内腔（肝臓、肺、リンパ節用  ｎ＝２２；副腎、腎臓、脾臓、脳用  ｎ＝４）；ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  皮下（ｎ＝１０）；ＮＳＧ  内腔（ｎ＝１６）；ＮＳＧ  皮下（ｎ＝１０）。各点は各マウスのデータを表す。また、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．も示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ｎ．ｓ．＝有意性なし。ｎ．ｄ．＝未検。  図１１Ｂは、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ又はＮＳＧマウスへのＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍の内腔又は皮下移植後の様々な臓器内のＤｓＲｅｄ陽性腫瘍細胞負荷を示すグラフである。データは、１×１０６の生存事象当たりのＤｓＲｅｄ陽性腫瘍細胞の数として示す。マウス数：ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  内腔（肝臓、肺、リンパ節用  ｎ＝１３；副腎、腎臓、脾臓、脳、骨髄用  ｎ＝４）；  ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  皮下（ｎ＝１０）；ＮＳＧ  内腔（肝臓、肺、リンパ節用  ｎ＝７；副腎、腎臓、脾臓、脳、骨髄用  ｎ＝３）；ＮＳＧ  皮下（ｎ＝１０）。各点は各マウスのデータを表す。また、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．も示す。＊Ｐ＜０．０５；＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ｎ．ｓ．＝有意性なし。ｎ．ｄ．＝未検。
【図１１Ｃ−Ｆ】図１１Ｃは、ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ内腔腫瘍を有するＮＳＧマウスの７ｗｐｉ時点の結腸全体の画像であり、矢印は原発腫瘍及び領域リンパ節転移を示している。  図１１Ｄは、ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ内腔腫瘍を有するＮＳＧマウスの７ｗｐｉ時点の結腸の組織学的画像であり、結腸はＨ＆Ｅで染色され、四角で囲まれた部位は右枠に拡大されてＣｏｌ  ＩＶ（緑）、ＤｓＲｅｄ（赤）及びＤＡＰＩ（青）により染色されている。矢印は領域リンパ節転移を示す。  図１１Ｅは、ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ内腔腫瘍を有するＮＳＧマウスの７ｗｐｉ時点の様々な臓器の画像であり、肝転移がはっきりと表れており、肺転移は矢印で示されている。  図１１Ｆは、ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ内腔腫瘍を有するＮＳＧマウスの７ｗｐｉ時点の肝臓の組織学的画像であり、肝臓はＨ＆Ｅで染色され（左枠）、Ｃｏｌ  ＩＶ（緑）、ＤｓＲｅｄ（赤）及びＤＡＰＩ（青）により染色されている（右枠）。点線は、肝転移小結節の辺縁を示す。
【図１１Ｇ−Ｉ】図１１Ｇは、ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ内腔腫瘍を有するＮＳＧマウスの７ｗｐｉ時点の肺の組織学的画像であり、肺はＨ＆Ｅで染色され（左枠）、Ｃｏｌ  ＩＶ（緑）、ＤｓＲｅｄ（赤）及びＤＡＰＩ（青）により染色されている（右枠）。  図１１Ｈは、ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ皮下腫瘍を有するＮＳＧマウスの７ｗｐｉ時点の肝臓及び肺の画像である。  図１１Ｉは、図１１ＨのＮＳＧマウスの皮下腫瘍に関係する原発性皮下腫瘍の画像である。
【図１１Ｊ】図１１Ｊは、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ又はＮＳＧマウスへのＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍の内腔又は皮下移植後６−７ｗｐｉ時点での循環性腫瘍細胞の数を示すグラフである。データは、平均値及びｓ．ｅ．ｍ．で表され、１×１０６の生存事象当たりの血液中のＤｓＲｅｄ陽性腫瘍細胞の数として示される。マウス数：ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  内腔（ｎ＝１２）；ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  皮下（ｎ＝９）；ＮＳＧ  内腔（ｎ＝９）；ＮＳＧ  皮下ｎ＝１０）。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１２Ａ−Ｃ】図１２Ａは、内腔移植ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの表示されている臓器の７ｗｐｉ時点の画像である。  図１２Ｂは、皮下移植ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの７ｗｐｉ時点の肝臓と肺の画像である。  図１２Ｃは、ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍細胞（ｎ＝１０）の皮下移植後の原発腫瘍体積を示したグラフである。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．で表す。
【図１３Ａ−Ｅ】図１３Ａは、Ｈ＆Ｅで染色された、内腔移植ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍の６ｗｐｉ時点の組織学的画像である。  図１３Ｂは、Ｈ＆Ｅで染色された、皮下移植ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍の６ｗｐｉ時点の組織学的画像である。  図１３Ｃは、ＭＥＣＡ−３２（緑）及びＤＡＰＩ（青）で染色された、内腔移植ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍の６ｗｐｉ時点の組織学的画像である。  図１３Ｄは、ＭＥＣＡ−３２（緑）及びＤＡＰＩ（青）で染色された、皮下移植ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍の６ｗｐｉ時点の組織学的画像である。  図１３Ｅは、内腔（ｎ＝７）又は皮下（ｎ＝７）に移植されたＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍の６ｗｐｉ時点の血管密度を示したグラフである。データは、平均値及びｓ．ｅ．ｍ．で表され、ＤＡＰＩ陽性生存腫瘍の総面積に対するＭＥＣＡ−３２陽性の血管面積の比×１００で示される。＊Ｐ＜０．０５。
【図１４Ａ−Ｂ】図１４Ａは、内腔移植ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける、１−７ｗｐｉ時点のリンパ節転移負荷と肝転移負荷との相関関係を示す。データは、巨視的リンパ節転移の総数に対する巨視的肝転移の総数（上）か、又はリンパ節内のＤｓＲｅｄ＋  腫瘍細胞の総数に対する巨視的肝転移の総数（下）である。  図１４Ｂは、内腔移植ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍を有するＮＳＧマウスにおける５−７ｗｐｉ時点のリンパ節転移負荷と肝転移負荷との相関関係を示すグラフである。データは、巨視的リンパ節転移の総数に対する巨視的肝転移の総数（上）か、又はリンパ節内のＤｓＲｅｄ＋腫瘍細胞の総数に対する巨視的肝転移の総数（下）である。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、表示されている抗体処置後に内腔移植されたＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの６−７ｗｐｉ時点の結腸全体の画像である。矢尻は腸リンパ節転移を示す。
【図１４Ｄ−Ｅ】図１４Ｄは、表示されている抗体処置後に又は抗体処置なしで内腔移植されたＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの６−７ｗｐｉ時点の原発腫瘍体積を示すグラフである。処置条件当たりのマウスの数：無処置（ｎ＝２２）、抗ＶＥＧＦ−Ａ（ｎ＝９）、抗ＶＥＧＦ−Ｃ（ｎ＝８）、抗ＶＥＧＦ−Ａ／Ｃ（ｎ＝１０）。各点は各マウスのデータを表す。また、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．も示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ｎ．ｓ．＝有意性なし。  図１４Ｅは、表示されている抗体処置後に又は抗体処置なしで内腔移植されたＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの６−７ｗｐｉ時点での巨視的リンパ節転移の数を示すグラフである。処置条件当たりのマウスの数：無処置（ｎ＝２２）、抗ＶＥＧＦ−Ａ（ｎ＝９）、抗ＶＥＧＦ−Ｃ（ｎ＝８）、抗ＶＥＧＦ−Ａ／Ｃ（ｎ＝１０）。各点は各マウスのデータを表す。また、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．も示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ｎ．ｓ．＝有意性なし。
【図１４Ｆ−Ｈ】図１４Ｆは、表示されている抗体処置後に又は抗体処置なしで内腔移植されたＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの６−７ｗｐｉ時点での巨視的肝転移の数を示すグラフである。処置条件当たりのマウスの数：無処置（ｎ＝２２）、抗ＶＥＧＦ−Ａ（ｎ＝９）、抗ＶＥＧＦ−Ｃ（ｎ＝８）、抗ＶＥＧＦ−Ａ／Ｃ（ｎ＝１０）。各点は各マウスのデータを表す。また、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．も示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ｎ．ｓ．＝有意性なし。  図１４Ｇは、表示されている抗体処置後に内腔移植されたＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの６−７ｗｐｉ時点の肝臓全体を写した画像である。矢尻は肝転移を示す。  図１４Ｈは、腫瘍負荷のないマウス（ｎ＝８）の対照分析を加えた、肝臓内のＤｓＲｅｄ陽性腫瘍細胞負荷を示したグラフであり、データは、表示されている抗体処置後に又は抗体処置なしで内腔移植されたＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの６−７ｗｐｉ時点での、１×１０６生存事象に当たりのＤｓＲｅｄ陽性腫瘍細胞の数として表される。処置条件当たりのマウスの数：無処置（ｎ＝１３）、抗ＶＥＧＦ−Ａ（ｎ＝９）、抗ＶＥＧＦ−Ｃ（ｎ＝８）、抗ＶＥＧＦ−Ａ／Ｃ（ｎ＝９）。各点は各マウスのデータを表す。また、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．も示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００。ｎ．ｓ．＝有意性なし。
【図１４Ｉ−Ｊ】図１４Ｉは、肝マクロ転移あり又はなしの、内腔移植ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの６−７ｗｐｉ時点での数を比較した偶然性解析であり、データは、各カテゴリーにおけるマウスのパーセンテージで表される。処置条件当たりのマウスの数：無処置（ｎ＝１３）、抗ＶＥＧＦ−Ａ（ｎ＝９）、抗ＶＥＧＦ−Ｃ（ｎ＝８）、抗ＶＥＧＦ−Ａ／Ｃ（ｎ＝９）。また、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．も示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ｎ．ｓ．＝有意性なし。  図１４Ｊは、巨視的転移の出現の前に肝微小転移性ＤｓＲｅｄ＋細胞あり又はなしの、内腔移植ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの３ｗｐｉ時点での数を比較した偶然性解析であり、データは、各カテゴリーにおけるマウスのパーセンテージで表される。また、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．も示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ｎ．ｓ．＝有意性なし。
【図１４Ｋ−Ｌ】図１４Ｋは、表示されている抗体処置後に又は抗体処置なしで内腔移植されたＬＳ１７４Ｔ−ＤｓＲｅｄ腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの８ｗｐｉ時点での、巨視的リンパ節転移の数を示すグラフである。処置条件当たりのマウスの数：無処置（ｎ＝７）、抗ＶＥＧＦ−Ａ（ｎ＝３）、抗ＶＥＧＦ−Ｃ（ｎ＝１３）、抗ＶＥＧＦ−Ａ／Ｃ（ｎ＝５）。各点は各マウスのデータを表す。また、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．も示す。＊Ｐ＜０．０５。ｎ．ｓ．＝有意性なし。  図１４Ｌは、肝マクロ転移あり又はなしの内腔移植ＬＳ１７４Ｔ−ＤｓＲｅｄ腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの８ｗｐｉ時点での数を比較した偶然性解析であり、データは、各カテゴリーにおけるマウスのパーセンテージで表される。処置条件当たりのマウスの数：無処置（ｎ＝７）、抗ＶＥＧＦ−Ａ（ｎ＝３）、抗ＶＥＧＦ−Ｃ（ｎ＝１３）、抗ＶＥＧＦ−Ａ／Ｃ（ｎ＝５）。各点は各マウスのデータを表す。また、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．も示す。＊＊Ｐ＜０．０１。ｎ．ｓ．＝有意性なし。
【図１５Ａ−Ｂ】図１５Ａは、内腔移植ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍を有する６−７ｗｐｉ時点のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの領域リンパ節転移の形成に対する血管新生及び／又はリンパ脈管新生を標的とすることの効果を示すグラフであり、巨視的リンパ節転移の数を原発腫瘍体積に対して正規化している。データは、原発腫瘍１ｍｍ３当たりの巨視的転移の数で示される。処置条件当たりのマウスの数：無処置（ｎ＝２２）、抗ＶＥＧＦ−Ａ（ｎ＝９）、抗ＶＥＧＦ−Ｃ（ｎ＝８）、抗ＶＥＧＦ−Ａ／Ｃ（ｎ＝１０）。各点は各マウスのデータを表す。また、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．も示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ｎ．ｓ．＝有意性なし。  図１５Ｂは、内腔移植ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍を有する６−７ｗｐｉ時点のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの遠隔肝転移の形成に対する血管新生及び／又はリンパ脈管新生を標的とすることの効果を示すグラフであり、巨視的肝転移の数を原発腫瘍体積に対して正規化している。処置条件当たりのマウスの数：無処置（ｎ＝２２）、抗ＶＥＧＦ−Ａ（ｎ＝９）、抗ＶＥＧＦ−Ｃ（ｎ＝８）、抗ＶＥＧＦ−Ａ／Ｃ（ｎ＝１０）。各点は各マウスのデータを表す。また、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．も示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ｎ．ｓ．＝有意性なし。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、一つには、臨床的に関連する部位への転移を示す結腸直腸がんのモデルの作製に基づく。
【００１２】
特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。Singleton et al. Dictionary of Microbiology and Molecular Biology. 2nd Ed. J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994).本発明の目的のために、以下の用語が下記の通りに定義される。
【００１３】
定義
本明細書で使用される用語「抗体」は最も広い意味で使用され、二つの重鎖及び二つの軽鎖を含む任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、並びに所望の生物活性（例えば、エピトープ結合活性）を示す限り、その任意の断片、突然変異体、変異体又は誘導体を指す。抗体の例は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体及び抗体断片を含む。
【００１４】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、少量で存在しうる自然に生じる可能性のある変異変異体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。更に、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体によって汚染されずに合成されうるという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を指しており、抗体を何か特定の方法で作製しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明により使用されるモノクローナル抗体は、Ohler et al., Nature 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法により作製されてもよく、又は組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４８１６５６７参照）により作製されてもよい。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)及びMarks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)に記載されている技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。
【００１５】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、例えばインタクトな抗体の抗原結合領域又は可変領域を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。特定の実施態様では、抗体断片は、インタクトな抗体が結合するのと同じ抗原に結合する。
【００１６】
用語「がん」及び「がん性」とは、無秩序な細胞増殖によって典型的に特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指す。がんの例は、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病を含む。このようながんの更なる具体例は、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃腸がん、膵臓がん、膠芽細胞腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓がん、腎がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝細胞癌、及び種々のタイプの頭頚部がんを含む。
【００１７】
「転移」とは、原発部位から体内の他の場所へのがんの広がりを意味する。がん細胞は原発腫瘍から脱離してリンパ管や血管に入り込んで血流中を循環し、体内の他の場所の正常組織内の遠位の病巣で増殖（転移）することができる。転移は局所又は遠位でありうる。転移は経時的な過程であり、原発性腫瘍から切り離れ、血流又はリンパ管に乗って移動し、遠位部位に止まる腫瘍細胞に付随するものである。別の部位で停止した後、腫瘍細胞は血管又はリンパ壁を再び貫通して増殖し続けることができ、やがて別の腫瘍を形成する。新たな部位で、細胞は、血液供給を確立し、成長して生命を脅かすかたまりを形成する。特定の実施態様では、この新たな腫瘍は転移性（又は二次）腫瘍と呼ばれる。特定の実施態様では、転移性腫瘍という用語は、転移することが可能であるが、まだ体内の他の場所にある組織又は臓器に転移していない腫瘍を指す。特定の実施態様では、転移性腫瘍という用語は、体内の他の場所にある組織又は臓器に転移した腫瘍を指す。特定の実施態様では、転移性腫瘍は、転移性腫瘍細胞から構成されている。
【００１８】
「転移性臓器」又は「転移性組織」は最も広い意味で用いられ、原発腫瘍の癌細胞又は身体の他の部分のがん細胞が中で広がっている臓器又は組織を指す。転移臓器及び転移性組織の例は、限定されないが、肺、肝臓、脳、卵巣、骨、骨髄及びリンパ節を含む。結腸直腸がん（ＣＲＣ）に関して、主な転移性臓器及び転移性組織は領域腸リンパ節、肝臓及び肺である。
【００１９】
「微小転移」とは、原発腫瘍から身体の他の部分に広がった少数の細胞を意味する。微小転移は、スクリーニング又は診断検査で検出されることも、されないこともある。
【００２０】
「マクロ転移」とは、原発腫瘍から身体の他の部分に広がった、検出可能な多数の細胞を意味する。
【００２１】
「非転移性」とは、良性であるがん、或いは原発部位に留まっているがん（例えば、局所浸潤がん）で、リンパ管系若しくは血管系又は原発部位以外の組織に浸透していないがんを意味する。特定の実施態様では、非転移性がんはステージ０、Ｉ又はＩＩのがんである任意のがんである。
【００２２】
本明細書で用いられる場合「浸潤性」又は「浸潤性増殖」とは、がん又は腫瘍の、それが生じた組織部位を離れ、体の異なる部位（例えば、近位部位又は遠位部位）で増殖し続ける能力を指す。幾つかの実施態様では、がんは「局所浸潤性」であり得、例えば周囲組織等の身体の近位部位において増殖し続けることができる。他の実施態様では、がんは「領域浸潤性」又は「遠位浸潤性」であり得、それぞれ、身体の局所部位又は遠位部位において増殖し続けることができる。
【００２３】
がん又は腫瘍を、「ステージ０」、「ステージＩ」、「ステージＩＩ」、「ステージＩＩＩ」又は「ステージＩＶ」と呼ぶことは、当該技術分野で周知の総合ステージ分類又はローマ数字ステージ分類法を用いた腫瘍又はがんの分類を示している。がんの実際のステージはがんの種類によるものの、一般的に、ステージ０のがんはｉｎ  ｓｉｔｕ病変であり、ステージＩのがんは小さな局所腫瘍であり、ステージＩＩのがんは局所進行腫瘍であり、ステージＩＩＩのがんは、局所リンパ節の転移を示す局所進行腫瘍であり、また、ステージＩＶのがんは転移性がんを表す。腫瘍の各種類の具体的なステージは、熟達した臨床医に知られている。
【００２４】
本明細書において使用される「腫瘍」とは、悪性又は良性であるかを問わず、すべての腫瘍性細胞増殖、並びにすべての前がん性及びがん性の細胞と組織を指す。用語「がん」、「がん性」、「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」とは、本明細書において言及される場合、互いを排除しない。腫瘍は、例えば結腸の腫瘍（ＣＲＣ腫瘍）のような固形腫瘍、又は白血病等の非固形若しくは軟部腫瘍（ｓｏｆｔ  ｔｕｍｏｒ）であってもよい。軟部組織腫瘍の例は、白血病（例：慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、成熟Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、リンパ性白血病又はヘアリー細胞白血病）又はリンパ腫（例：非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫又はホジキン病）を含む。固形腫瘍は、血液、骨髄又はリンパ系以外の体組織の任意のがんを含む。固形腫瘍は、上皮細胞由来のものと非上皮細胞由来のものに更に分けることができる。固形腫瘍の例は、結腸、乳房、前立腺、肺、腎臓、肝臓、膵臓、卵巣、頭頚部、口腔、胃、十二指腸、小腸、大腸、胃腸管、肛門、胆嚢、唇、鼻咽頭、皮膚、子宮、男性生殖器、泌尿器、膀胱お及び皮膚の腫瘍を含む。非上皮由来の固形腫瘍は、肉腫、脳腫瘍及び骨腫瘍を含む。本明細書で使用される用語「腫瘍」はまた、「ポリープ」も含むこと意味する。
【００２５】
「原発腫瘍」又は「原発がん」とは、対象の体内の他の組織、臓器又は部位に位置する転移性病変ではなく、元のがんを意味する。特定の実施態様では、原発腫瘍は、原発腫瘍細胞から構成されている。
【００２６】
「良性腫瘍」又は「良性がん」とは、発生部位に局在したままであり、且つ、浸潤する能力、侵入する能力、又は遠位部位に転移する能力を有さない腫瘍を意味する。
【００２７】
本明細書で使用される「腫瘍形成性細胞」とは、異常な増殖状態を示すか、又は細胞の正常増殖状態を、最終的に腫瘍を形成するような異常増殖状態へと変化させることができる任意の細胞（例えば、ヒトがん細胞又は非ヒトがん細胞等のがん細胞）を指す。腫瘍形成性細胞は、一般的には細胞の無制御な増殖の結果である腫瘍を形成することができる。腫瘍形成性細胞は、その腫瘍形成表現型に基づいて非腫瘍形成性細胞と区別されうる（例えば、Al-Hajrj, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 100: 3983-8, 2003;米国特許公開第２００２／０１１９５６５号;米国特許公開第２００４／００３７８１５号;米国特許公開第２００５／０２３２９２７号;国際公開第０５／００５６０１号;米国特許公開第２００５／００８９５１８号;米国特許出願第１０／８６４２０７号;Al- Hajj et al. Oncogene. 23. 7274, 2004; 及びClarke et al. Ann Ny Acad. Sci. 1044. 90, 2005等を参照のこと。また、これらのすべては、全文があらゆる目的のために参照により本明細書に援用される）。腫瘍形成性細胞は、限定されないが、腫瘍細胞、胚細胞、異常な増殖を有するように操作された細胞、がん細胞株、並びにこれらのいずれの細胞型の細胞集団を含む。
【００２８】
用語「移植片」及びその変化形は、移植された細胞、例えば、レシピエント宿主に導入され、レシピエントの移植部位で実質的に安定して確立されたままである腫瘍形成性細胞（例えば、無傷腫瘍又はその断片）を指す。
【００２９】
「ドナー」細胞、腫瘍又は腫瘍形成性細胞とは、レシピエント宿主の臓器に由来せず、同系（ドナーとレシピエントが遺伝的に同一である場合）、同種異系（ドナーとレシピエントが異なる遺伝的起源を有するが同じ種である場合）、又は異種（ドナーとレシピエントが異なる種である場合）でありうる細胞、腫瘍又は腫瘍形成性細胞を意味する。例えば、ドナー細胞、腫瘍又は腫瘍形成性細胞は、ヒトに由来してもよい。本明細書で用いられる「ドナー腫瘍形成性細胞移植片」とは、レシピエント生物体以外の供給源に由来する移植された腫瘍形成性細胞を指す。
【００３０】
「腫瘍量」とは、体内のがんの量を意味する。腫瘍量は腫瘍負荷とも呼ばれ、腫瘍数と腫瘍サイズとの関数であってもよい。
【００３１】
本明細書における「アジュバント療法」は、疾患の再発のリスクを低減するために手術後に施される治療であって、残存疾患のエビデンスが検出されない療法を指す。アジュバント療法の目的は、がんの再発を防ぎ、したがってがん関連死の可能性を低下させることである。
【００３２】
本明細書で「小分子」とは、約５００ダルトン未満の分子量を有すると定義される。
【００３３】
「イムノコンジュゲート」とは、細胞傷害性剤を含むがそれに限定されない、一又は複数の異種分子にコンジュゲートした抗体（例えば、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ））を意味する。
【００３４】
「減少させる」又は「阻害する」とは、例えば、２０％以上、５０％以上、或いは７５％、８５％、９０％、９５％以上の全体的減少を引き起こす能力を意味する。特定の実施態様では、減少又は阻害は腫瘍形成性細胞又は腫瘍の増殖に関し、それは腫瘍形成性細胞の数、腫瘍のサイズ、腫瘍量、腫瘍形成性細胞又は腫瘍の浸潤性及び／又は腫瘍転移の減少又は阻害により測定されうる。
【００３５】
用語「非ヒト動物」は、ヒトを除くすべての動物を指し、限定されないが、鳥、家畜（例えば、ウシ）、競技用動物（例えば、ウマ）、魚類、爬虫類及び非ヒト哺乳動物（例えば、ネコ、イヌ及びげっ歯類）を含む。
【００３６】
用語「非ヒトの哺乳動物」は、ヒトを除く哺乳綱のすべてのメンバーを指す。
【００３７】
用語「げっ歯動物」は、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター及びモルモットを含む、げっ歯目のすべてのメンバーを指す。
【００３８】
詳細な説明
結腸直腸がん（ＣＲＣ）は、最初は大腸の粘膜表面に良性のポリープとして現れる。非切除のままにした場合、こうしたポリープは、結腸直腸壁の粘膜下層及び外筋層を貫通して漿膜側に到達する浸潤腺癌へと進行する可能性がある。結果としての、腸リンパ節への領域的な広がり及び遠く離れた肝臓への広がりが、ＣＲＣ死亡率の主要な原因である肉眼的転移の増殖をもたらす。したがって、これらの部位へのＣＲＣの転移経路を解明することは、死亡率に影響を与えうる治療機会を見出す可能性を有する。しかし、転移経路の調査は、ＣＲＣの適切なインビボ転移モデルの利用可能性の欠如によって妨げられてきた。実際、ＣＲＣの異種移植モデル、化学誘発モデル及び遺伝子操作モデル（例えば、マウスモデル）(Heijstek et al. Dig. Surg. 22: 16-25, 2005. Epub 2005 Apr 14; Kobaek-Larsen et al. Comp. Med. 50(1): 16-26, 2000; Rosenberg et al. Carcinogenesis. 30(2): 183-196, 2009. Epub 2008 Nov 26; Taketo et al. Gastroenterology. 136(3): 780-798, 2009)といった多様な利用可能性にもかかわらず、これらのモデルにおける腫瘍は、ヒトＣＲＣに関連する標的臓器である領域腸リンパ節や肝臓に再現可能に転移しない。
【００３９】
結腸直腸がんの内腔移植モデル
本発明は、少なくとも一つには、結腸直腸がん（ＣＲＣ）の臨床的に関連するモデルの開発に基づいている。ＣＲＣの既知のモデルとは対照的に、本発明のＣＲＣのモデルは新規な内腔移植技術によって作製され、重要なことには、ヒトＣＲＣの発症を再現することが可能である。
【００４０】
任意の種、亜種、遺伝的変異体、組織変異体又はこれらの組み合わせの非ヒト動物（例えば、非ヒト哺乳動物）が、ＣＲＣの内腔移植モデル（ＬＩＭ）の作製に使用されうる。非ヒト哺乳動物は、例えば、げっ歯動物であってよい。げっ歯類の例は、限定されないが、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、モルモット及びアレチネズミを含む。非ヒト哺乳動物はオス又はメスであってよい。非ヒト哺乳動物は、内腔移植技術を首尾よく実施できる限り何歳でもよい。したがって、非ヒト哺乳動物は、例えば、１週齢未満、約１週齢から約５歳まで、約１週齢から約３歳まで、約２週齢から約２歳まで、約３週齢から約１歳まで、約４週齢から約６月齢まで、約６週齢から約３月齢まで、約８週齢から約１２週齢まで、３歳より上、又は５歳より上でありうる。
【００４１】
非ヒト哺乳動物は、野生型（例えば、免疫適格）又は免疫不全であってよい。例えば、レシピエント宿主非ヒト哺乳動物の内腔に、異種（例えば、ヒト）のドナー細胞、腫瘍又は腫瘍形成性細胞を移植する場合、宿主非ヒト哺乳動物は免疫不全である。しかし、レシピエント宿主非ヒト哺乳動物の内腔に、同系のドナー細胞、腫瘍又は腫瘍形成性細胞を移植する場合は、宿主非ヒト哺乳動物は非免疫不全（例えば、野生型）である。
【００４２】
特定の場合、非ヒト哺乳動物はマウスである。マウスはヌードマウスであってよい。マウスは、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス、例えば、ＮＯＤ／ＳＣＩＤインターロイキン２受容体ガンマ鎖欠損（ＮＳＧ）マウスであってよい。ＮＳＧマウスは、Pearson et al. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 324:25-51, 2008; Shultz et al. Curr Top Microbiol Immunol. 324:25-51, 2005; Strom et al. Methods Mol. Biol. 640:491-509, 2010; McDermott et al. Blood.116(2): 193- 200, 2010; Lepus et al. Hum. Immunol. 70(10):790-802, 2009; Brehm et al. Clin Immunol. 135(l):84-98, 2010に記載されている。任意の適切な免疫不全非ヒト哺乳動物が使用されうる。げっ歯類を含む適切な非ヒト哺乳動物は、メイン州バーハーバーのジャクソン・ラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、マサチューセッツ州ウィルミントンのチャールズ・リバー・ラボラトリーズ・インターナショナル（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ）、及びインディアナ州インディアナポリスのハーラン・ラボラトリーズ（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のような供給源から得ることができる。
【００４３】
内腔移植技術は、結腸壁を破ることなく結腸の粘膜表面（内腔側）に移植可能な一又は複数（例えば、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９又は１０１０以上）のドナー腫瘍形成性細胞を移植することを含む。ドナー腫瘍形成性細胞は、レシピエント非ヒト哺乳動物宿主に対し、同系（ドナーとレシピエントが遺伝的に同一である場合）、同種異系（ドナーとレシピエントが異なる遺伝的起源を有するが同じ種である場合）、又は異種（ドナーとレシピエントが異なる種、例えば、ヒトである場合）でありうる。ドナー腫瘍形成性細胞は、浸潤性又は非浸潤性、良性又は悪性、転移性又は非転移性であってよい。腫瘍形成性細胞は腫瘍細胞であってもよいし、或いは、例えば、胚細胞、異常な増殖を有するように操作された細胞、がん細胞株、及びこれらの細胞型のいずれの細胞集団であってよい。
【００４４】
一より多いドナー腫瘍形成性細胞を移植する場合、移植される細胞は無傷腫瘍又はその断片でありうる。無傷腫瘍又はその断片は、例えば、ドナー生物体内で（例えば、腸リンパ節における）領域転移を起こすステージＩＩＩ  ＣＲＣ腫瘍、又はドナー生物体内で（例えば、肝臓又は肺における）遠隔転移を起こすステージＩＶ  ＣＲＣ腫瘍のような無傷の悪性腫瘍若しくはその断片でありうる。或いは、無傷腫瘍又はその断片は、原発部位又は原発組織に限定される、ステージ０、ステージＩ又はステージＩＩ  ＣＲＣ腫瘍若しくはその断片等の無傷の良性又は局所浸潤性腫瘍若しくはその断片でありうる。
【００４５】
無傷腫瘍又はその断片はＣＲＣ腫瘍又はその断片に限定されない。例えば、無傷腫瘍又はその断片は、限定されないが、乳がん腫瘍、肺がん腫瘍、肝臓がん腫瘍、脳腫瘍、リンパ節がん腫瘍、腎臓がん腫瘍、胃がん腫瘍、卵巣がん腫瘍、皮膚がん腫瘍、膵臓がん腫瘍、甲状腺がん腫瘍、又は前立腺がん腫瘍若しくはそれらの断片等の無傷の非ＣＲＣ腫瘍又はその断片でありうる。
【００４６】
レシピエント非ヒト哺乳動物宿主の結腸粘膜表面に移植された無傷腫瘍又はその断片は、固形腫瘍（例えば、結腸／ＣＲＣ腫瘍、乳がん腫瘍、肺がん腫瘍又は肝臓がん腫瘍）又はその断片でありうる。無傷腫瘍又はその断片は、ヒト又はマウス等の任意の適切なドナー生物体に由来しうる。無傷腫瘍又はその断片は、ＣＲＣ細胞株（例えば、ＨＣＴ１１６、ＬＳ１７４Ｔ又はＬｏＶｏ初代ヒトＣＲＣ由来細胞株）又は乳がん細胞株（例えば、ＭＤＡ−２３１ヒト乳がん細胞株）のような特定の細胞株由来でありうる。
【００４７】
移植された一又は複数のドナー腫瘍形成性細胞は任意の集団サイズであってよい。無傷腫瘍又はその断片が移植された場合、該無傷腫瘍又はその断片は、約０．１−１００ｍｍ３のサイズ、例えば、約１−１００ｍｍ３のサイズ、例えば、約１０ｍｍ３のサイズである。
【００４８】
移植部位は、非ヒト哺乳動物の結腸の粘膜表面の任意の領域に沿っていてよい。特定の実施態様では、移植部位から移植された腫瘍を除去する選択肢を可能にするために、移植部位は、レシピエント非ヒト哺乳動物の肛門付近に位置している。例えば、マウスにおいて、腫瘍の移植距離は、宿主マウスの肛門から約１−２０ｍｍ（例えば、約５−１５ｍｍ、例えば、約１１−１２．５ｍｍ）離れていることが好ましい。
【００４９】
一般的には、ＣＲＣのマウスＬＩＭは、マウスを（例えば、イソフルラン吸入により）麻酔し、四肢を固定した仰臥位でマウスを置き、先の尖っていない止血鉗子（ファイン・サイエンス・ツールズ社（Ｆｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ）のマイクロモスキート、１３０１０−１２番）又は約１ｃｍの他の適切な道具を肛門に挿入し、（例えば、最初のノッチまで止血鉗子を締めることにより）単一の粘膜皺襞をクラスプし、露出した粘膜を体内に戻し、（例えば、ポビドン／ヨウ素で）洗浄し、（例えば、乳酸リンゲル液で）すすぎ、ブロッティング乾燥（ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｒｙ）することにより作製されうる。次いで、一又は複数のドナー腫瘍形成性細胞（例えば、〜１０ｍｍ３のドナー腫瘍断片又は無傷のポリープ）が、縫合糸が確実に表面の粘膜層のみを通るように、（例えば、吸収性４−０ビクリル（ｖｉｃｒｙｌ）縫合糸（エチコン（Ｅｔｈｉｃｏｎ））を使用して）粘膜に縫合されうる。ＰＢＳで粘膜を再水和した後、縫合された腫瘍と一緒に露出した結腸を再挿入し、ひいては直腸脱を戻すことができる。排便時の腫瘍の損傷を最小限にするため、ケージの床敷き上にマウスを収容し、１００％げっ歯類液体飼料（ＡＩＮ−７６Ａ、繊維なしカゼイン加水分解物；ＢｉｏＳｅｒｖｅ）を、手術約３日前から手術後約７日まで与えた。
【００５０】
下記の実施例の項で実証されている通り、作製されたＣＲＣの非ヒト哺乳動物ＬＩＭは既成のＣＲＣモデルに対して多くの利点を有している。ＬＩＭのこうした利点は、限定されないが、（ｉ）既存の盲腸移植モデルにおける実際の転移ではなく腫瘍細胞の脱落による腹腔全体にわたる広範な腫瘍播種と比べ、臨床的に関連する部位へ遠隔転移を起こす潜在能力：（ｉｉ）既存の細胞懸濁液注入モデルにおいて見られるような腫瘍構造を維持することができない細胞懸濁液の代わりに、無傷の腫瘍断片を宿主マウスに移植できること；及び（ｉｉｉ）既存の細胞懸濁液注入モデルにおいて見られるような結腸壁を破る可能性と比べ結腸壁の完全性の維持をもたらすといった、既存の盲腸移植モデルにおける漿膜表面上への腫瘍移植と対比される、粘膜表面への腫瘍の移植を含む。
【００５１】
腫瘍形成を阻害する候補化合物のスクリーニング
ＬＩＭは、例えば、抗がん活性を有する候補化合物（例えば、腫瘍形成性細胞の増殖を阻害する化合物）のスクリーニングに有用である。抗がん活性は、腫瘍の増殖及び／又は発生を予防、遅延、軽減若しくは阻害するのに任意の効果を直接的又は間接的に媒介し、有益な効果を宿主に提供しうる活性を含みうる。したがって候補化合物の抗がん活性は、候補化合物が直接的又は間接的に、限定されないが次のものを減少又は安定化させる能力に反映されうる：腫瘍形成性細胞の数（例えば、腫瘍形成性細胞の数を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上減少させる）、腫瘍サイズ（例えば、腫瘍のサイズを少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上縮小させる）、腫瘍量又は負荷（例えば、腫瘍量又は負荷を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上減少させる）、腫瘍形成性細胞浸潤（例えば、近位組織への浸潤を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上低減させる）、及び／又は腫瘍転移（例えば、転移、及び／又は転移性臓器若しくは組織の数を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上減少させる）。したがって、候補化合物の抗がん活性は、ＬＩＭにおける腫瘍形成性細胞の増殖の阻害に関連する、例えば、一又は複数の上記の効果の有無を判定することにより評価することができ、腫瘍形成性細胞増殖に対する一又は複数の効果の存在は、候補化合物が抗がん活性を有することを示す。例えば、腫瘍サイズ及び／又は数に対する効果の判定に関して、その判定ステップは、第一の時点と第二の時点で腫瘍サイズ及び／又は数を測定し、第一の時点で測定した腫瘍サイズ及び／又は数を、第一の時点で測定したものと比較することを含みうる。幾つかの例では、腫瘍の浸潤及び転移に関して、判定ステップが、腫瘍浸潤（例えば、結腸壁を越えて結腸漿膜表面への浸潤性腫瘍増殖）又は転移（例えば、腸リンパ節、肝臓、及び／又は肺における転移）の有無を肉眼的分析により（例えば、マクロ転移を検出する場合）、及び／又は組織学的若しくは細胞計数分析により検出することを含みうる。
【００５２】
本発明のＬＩＭを用いて抗がん活性についてスクリーニングされうる候補化合物は、限定されないが、小分子、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、抗体及びイムノコンジュゲート等の合成、天然又は組換え作製された分子を含む。候補化合物は、合成又は天然化合物のライブラリーを含む多種多様な供給源から得られうる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現を含む、多種多様な有機化合物及び生体分子のランダム合成及び指向性合成のために多くの手段が利用可能である。或いは、細菌、真菌、植物及び動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能であるか、又は容易に作成される。更に、天然又は合成的に作成されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理的及び生化学的手段によって容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーを作成するためにも使用されうる。既知の薬剤は、構造類似体を作製するために、アシル化、アルキル化、エステル化及びアミド化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等の指向性又はランダ化学修飾に供されてもよい。
【００５３】
候補化合物は、医療実施基準と一致し、また抗がん活性を調べるために適切な及び／又は所望の任意の方式で処方、投薬及び投与されうる。候補化合物は、任意選択の生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤と所望の純度を有する活性成分とを混合することによって、当該技術分野で周知の標準的な方法を用いて治療製剤に調製されうる(Remington’s Pharmaceutical Sciences (20th edition), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA)。許容される賦形剤は、生理食塩水、又はバッファー、例えばリン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類及び他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトール又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はＰＥＧを含む。
【００５４】
任意選択的に、製剤は、生理的濃度付近で薬学的に許容される塩（例えば、塩化ナトリウム）を含有する。任意選択的に、本発明の製剤は、薬学的に許容される防腐剤を含有しうる。幾つかの実施態様では、防腐剤濃度は、通常ｖ／ｖで０．１から２．０％の範囲である。適切な防腐剤は、製薬技術分野で知られているものを含む。ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン及びプロピルパラベンは好ましい防腐剤である。任意選択的に、本発明の製剤は、０．００５から０．０２％の濃度の薬学的に許容される界面活性剤を含みうる。
【００５５】
候補化合物は、単独で投与されても、又は、特に化合物の併用投与が相乗効果をもたらしうる場合、二種以上（例えば、３、４又は５種以上の候補化合物）の組み合わせで併用されてもよい。
【００５６】
結腸直腸がんのアジュバントモデル及びアジュバントのスクリーニング
ＬＩＭはまた、その後に、例えば抗がん活性を有するアジュバント（例えば、腫瘍形成性細胞の増殖を阻害する化合物）のスクリーニングにおいて、使用されるＣＲＣのアジュバントモデルを作製するためにも利用されうる。この目的のために、移植された原発腫瘍は移植後に外科的に除去され、次いで、上述した腫瘍形成の増殖を阻害する化合物のスクリーニングと類似の方法で、候補化合物を用いたアジュバントのスクリーニングが非ヒト哺乳動物（例えば、マウス又はラット等のげっ歯動物）アジュバントモデルで実施されうる。
【００５７】
この結腸直腸がんのアジュバントモデルにおいて、移植原発腫瘍の外科的除去は、ＣＲＣ疾患の進行の異なるステージ（例えば、ステージ０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶ）に応じた移植後の様々な時点で実施されうる。次いで、同じ又は異なる候補化合物の、ＣＲＣの異なるステージの治療におけるアジュバントとしての有効性が試験されうる。
【００５８】
アジュバント設定において、無処置又は対照処置の対応するアジュバントモデルと比較して、腫瘍形成細胞の増殖／又は再増殖を阻害する候補化合物はアジュバントであることがわかる。
【００５９】
アジュバント療法の臨床試験の期間、並びにアジュバント候補又は確認されたアジュバントの処方、投薬及び投与経路は、上記の通り、一次治療用の候補化合物と同様に、医療実施基準と一致する適切な及び／又は所望の任意の方式で適宜変更されうる。
【実施例】
【００６０】
以下の実施例によって本発明を例証するが、これらの実施例は本発明の限定を意図するものではない。
【００６１】
実施例１．材料及び方法
当業者は、本明細書に記載の材料及び方法と類似もしくは等価である多くの材料及び方法を認識するであろうし、それらは本発明の実施に使用可能であろう。実際、本発明は、下記の材料及び方法に決して限定されない。
【００６２】
マウス
野生型ＮＯＤ／ＳＣＩＤメスマウス（８−１２週齢）をチャールズ・リバー・ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から購入した。野生型ＮＳＧメスマウス（８−１２週齢；ストックナンバー００５５５７）、ＡｐｃＭｉｎ／＋マウス（ストックナンバー００２０２０）及び１２．４ＫｂＶｉｌＣｒｅマウス（ストックナンバー００４５８６；Ｖｉｌｌｉｎ−Ｃｒｅと称される）をジャクソン・ラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から購入した。ＫｒａｓＬＳＬＧ１２Ｄ／＋  マウスは、マサチューセッツ工科大学のタイラージャックス（Ｔｙｌｅｒ  Ｊａｃｋｓ）からライセンスを受けた。コロニーナンバー４０２８由来のＡｐｃ／Ｋｒａｓ複合変異体マウスを、ジャクソン・ラボラトリーから購入したＣＡＧ−ｍＲＦＰ１マウス（ストックナンバー００５８８４）と交配させた。コロニーナンバー４７００由来のＡｐｃ／Ｋｒａｓ複合変異体マウスを、ジャクソン・ラボラトリーから購入したＲｏｓａ２６−ＣＡＧ−ＬＳＬ−ｔｄＴｏｍａｔｏマウス（ストックナンバー００７９０９）と交配させた。すべての実験は、ジェネンテックのＡｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
【００６３】
細胞培養及び遺伝子導入
ＨＣＴ１１６、ＬＳ１７４Ｔ及びＬｏＶｏ初代ヒト結腸直腸がん由来の細胞株をＡＴＣＣから購入し、完全ＲＰＭＩ培地（１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンで補完されたＲＰＭＩ  １６４０）中、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。細胞を、８ｍｇ ｍｌ−１のポリブレンで補完された完全ＲＰＭＩ培地中、３７℃、５％ＣＯ２で６時間、ＴＺＶ−ＣＭＶ−ディスコソマ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ）赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）レンチウイルスベクター（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて感染多重度（ＭＯＩ）１０で形質導入した。培養液中４継代後、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での蛍光活性化セルソーティングによりＤｓＲｅｄ陽性細胞を単離した。ソートしたＤｓＲｅｄ陽性細胞を２−３継代の間増やし、その後液体窒素中に保存した。初期の継代細胞は、すべてのインビボ実験に使用された。
【００６４】
内腔移植技術
マウスを、イソフルラン吸入によって麻酔し、仰臥位に置き、テープを用いてガーゼで覆った台に四肢を固定した。先の尖っていない止血鉗子（ファイン・サイエンス・ツールズ社（Ｆｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ）のマイクロモスキート、１３０１０−１２番）を肛門に〜１ｃｍ挿入し、粘膜に向かって止血鉗子を動かして僅かに開き、最初のノッチまで止血鉗子を締めることにより単一の粘膜皺襞をクラスプするようにした。止血鉗子を肛門から抜き、クラスプされて露出した粘膜をポビドン／ヨウ素で洗浄し、乳酸リンゲル液ですすぎ、ブロッティング乾燥した。〜１０ｍｍ３のドナー腫瘍断片又は無傷のポリープを、縫合糸が確実に表面の粘膜層のみを通るように、吸収性４−０ビクリル縫合糸（エチコン）を使用して粘膜に縫合した。ＰＢＳで粘膜を再水和した後、止血鉗子を外し、先の尖っていない経管栄養針を使用して露出した結腸を縫合された腫瘍と一緒に再挿入し、直腸脱を戻す。腫瘍移植の平均距離は、肛門から１１．８±０．５ｍｍであった（ｎ＝１８）。術後死亡率は１％未満で、２−４ｗｐｉで５％未満のマウスにおいて可逆的な直腸脱に起因する疾患状態、また７ｗｐｉで腫瘍負荷の増加に因る体重減少が原因の疾患状態が見られた。排便時の腫瘍の損傷を最小限にするため、ケージの床敷き上にマウスを収容し、１００％げっ歯類液体飼料（ＡＩＮ−７６Ａ、繊維なしカゼイン加水分解物；ＢｉｏＳｅｒｖｅ）を、手術３日前から手術後７日まで与えた。
【００６５】
皮下腫瘍発生
細胞株を、トリプシン処理を介して回収し、トリパンブルーで計数して生存率を評価し、１００×１０６細胞／ｍｌの濃度で冷完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁した。冷マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、５０×１０６細胞／ｍｌの最終細胞濃度を達成するために１：１の比で細胞懸濁液に添加した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの左脇腹に、１００μｌの容量の５×１０６個の細胞を皮下注射した。ノギスを用いて腫瘍の寸法を測定し、腫瘍体積は０．５２３×長さ×幅×厚みと算出した。内腔移植技術のためのドナーとして使用される皮下腫瘍について、腫瘍を、１０００−２０００ｍｍ３の間に採取し、壊死組織は顕微鏡下で肉眼的に切り離し、また、残りの生存組織を、１０ｍｍ３の断片に分割して完全ＲＰＭＩ培地中の氷上に置いた。
【００６６】
内視鏡検査
内視鏡イメージングの前に、マウスを、イソフルラン吸入により麻酔し、仰臥位に配置し、経管栄養針を使用して結腸から便を出す。内視鏡イメージング装置は、検査及び保護用シース（ａｎ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｈｅａｔｈ）で覆われたＨｏｐｋｉｎｓ  ＩＩテレスコープ（０°  直視用  外径１．９ｍｍ）、Ｍｉｋａｔａ  Ｐｏｉｎｔ  Ｓｅｔｔｅｒテレスコープ把持装置に取り付けられたＩｍａｇｅ−Ｉ高解像度３チップデジタルカメラ、Ｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｙｓｔｅｍキセノン光源接続の光ファイバーライトガイドケーブル、イメージング中の結腸へのガス注入を維持するためのＣＯ２自動注入器、及び高解像度カラーモニター（Ｋａｒｌ  Ｓｔｏｒｚ）に接続されたＡＩＤＡ  Ｃｏｎｎｅｃｔ高解像度文書管理システムから構成される。内視鏡動画像は、ＶＬＣメディアプレーヤー（ＶｉｄｅｏＬＡＮ  Ｔｅａｍ）を使って見直し、また静止画像は動画像から取り込んだ。
【００６７】
臓器全体イメージング及びマクロ転移の評価
結腸を無傷で採取し、ＰＢＳで洗浄し、縦に開き、薄いボール紙の上に留め、粘膜と漿膜の両方から画像化した。肝臓と肺を採取し、ＰＢＳで洗浄し、画像化した。すべての臓器をＭ８０実体顕微鏡（ライカ）に取り付けられたＤＦＣ２９５カラーデジタルカメラ（ライカ）を使用して画像化した。Ｓ４実体顕微鏡（ライカ）を使用し、巨視的転移の形成を視覚的に評価した。腸リンパ節に関しては、リンパ節転移のエビデンスがないか肛門から胃までの腸管全体を調べ、マクロ転移の数を定量した。肝臓と肺に関しては、臓器の全外表面を調べ、マクロ転移の数を定量した。マクロ転移の定量化に続き、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで臓器を一晩固定した。肺は、４％パラホルムアルデヒドで一晩固定する前に、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで潅流した。原発結腸直腸の寸法を、基準測定尺度（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｓｃａｌｅ）を用いて測定し、腫瘍体積は０．５２３×長さ×幅×厚みと算出した。
【００６８】
組織消化及びフローサイトメトリー
組織全体を、ＧｅｎｔｉｅＭＡＣＳ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で処理し、１ｍｇ／ｍｌのコラゲネーゼ／ディスパーゼで補充した完全ＲＰＭＩ培地中、２１０ｒｐｍで撹拌しながら３０分間３７℃で消化させ、７０μｍ濾過器で濾過した。赤血球溶解と遠心分離に続き、細胞を、２％ウシ胎児血清、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムで補充したＰＢＳ中に再懸濁し、濾過してＦＡＣＳ用チューブに移し、ＦＡＣＳＡｒｉａフローサイトメーター（ＢＯ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。ＦＡＣＳ対照については、非担腫瘍マウスからの正常組織を用い、また、ゼロＤｓＲｅｄ陽性事象（ｚｅｒｏ  ＤｓＲｅｄ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｅｖｅｎｔｓ）を対照組織試料中で検出できるようにＤｓＲｅｄ陽性解析ゲートを設けた。試料当たり平均５×１０６の生存事象を解析した。データは、１×１０６生存事象当たりのＤｓＲｅｄ陽性細胞の数を示す。
【００６９】
循環性腫瘍細胞
ＣＯ２吸入によってマウスを安楽死させた。呼吸が収まった直後、胸郭を広げて心臓を露出させた。２７ゲージ針を付けた注射器を右心室（ｒｉｇｈｔ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｒｔ）に挿入し、血液〜５０μｌを採取した。直ちに、血液を、ＥＯＴＡでコーティングしたＭｉｃｒｏｔａｉｎｅｒチューブ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移した。赤血球溶解後、２％ウシ胎児血清、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムで補充したＰＢＳに血液試料を再懸濁し、フローサイトメトリーで解析した。ＦＡＣＳ対照については、非担腫瘍マウスからの血液を用い、また、ゼロＤｓＲｅｄ陽性事象を対照血液試料中で検出できるようにＤｓＲｅｄ陽性解析ゲートを設けた。試料当たり平均５×１０６の生存事象を解析した。データは、１×１０６生存事象当たりのＤｓＲｅｄ陽性細胞の数を示す。
【００７０】
ヒト結腸直腸がん臨床試料
連邦及び州のガイドラインに従って、同意患者からの切除したてのヒト結腸直腸がん試料をＢｉｏ−ｏｐｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．より入手した。試料は、１０％ウシ胎児血清、グルタミン、バンコマイシン、メトロニダゾール、セフォタキシム、アンホテリシンＢ、ペニシリン、ストレプトマイシン及びプロテアーゼ阻害カクテルで補充したＤＭＥＭ高グルコース培地中４℃で終夜輸送された試料を、〜２ｍｍ３の腫瘍断片に切断し、個々の断片を、Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙから購入した無胸腺ｎｕ／ｎｕオスマウス（６−８週齢）の腎臓被膜下に移植した。移植の６ヶ月後、腎臓被膜下で成長した腫瘍をドナー腫瘍として使用し、〜２ｍｍ３のドナー腫瘍断片をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの結腸内腔に移植した。
【００７１】
抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体及び抗ＶＥＧＦ−Ｃ抗体
抗ＶＥＧＦ−Ａモノクローナル抗体Ｇ６−３１は既に記載されている（米国特許第７７５８８５９号；Liang et al. J. Biol. Chem. 281(2): 951-961, 2006. Epub 2005 Nov 7）。抗ＶＥＧＦ−Ｃモノクローナル抗体ＶＣ４．５は、ヒトＶＥＧＦ−Ｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の成熟形態に対する選択により、単一のフレームワーク上に構築された合成ファージ抗体ライブラリーから単離された(Lee et al. J. Mol. Biol. 340: 1073-1093, 2004)。完全長ＩｇＧのような一つの陽性クローンＶＣ４は、ヒトＶＥＧＦ−ＣとヒトＶＥＧＦＲ３との間の相互作用を遮断し、ＶＥＧＦ−Ｃに誘導される細胞活性及び交差結合性マウスＶＥＧＦ−Ｃを阻害することが確認された。ＶＣ４は、既に記載され(Lee et al. Blood. 108: 3103-3111, 2006. Epub 2006 Jul 13)、ＶＥＧＦ−Ｃの受容体結合及び細胞シグナル伝達を妨げるその効力の改善が示されている通り、ファージディスプレー選択を用いてＶＣ４．５へと更に親和性改良された。チップ上にＶＣ４．５ＩｇＧ又はＶＥＧＦ−Ｃの何れかを固定化したＢＩＡｃｏｒｅ装置を用いた表面プラズモン共鳴測定によって決定された場合、ＶＣ４．５は、ヒト及びマウスＶＥＧＦ−Ｃに対して同じような親和性を示す（Ｋｄ＝０．３−１ｎＭ）。所望の場合、他の抗ＶＥＧＦ−Ａ又は抗ＶＥＧＦ−Ｃ抗体を利用してもよい。
【００７２】
血管標的化
内腔移植の一日前、腹腔内注射により、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを機能阻害モノクローナル抗体である抗ＶＥＧＦ−Ａ（Ｇ６−３１；ＰＢＳ中５ｍｇ／ｋｇ）及び／又は抗ＶＥＧＦ−Ｃ（ＶＣ４．５；ＰＢＳ中４０ｍｇ／ｋｇ）で処理した。０日目に、ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍断片を結腸粘膜に移植した。抗体は週に１回投与された。
【００７３】
病理組織学及び免疫染色
組織を、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド中に一晩固定し、ＰＢＳ中ですすぎ、ＰＢＳ中の３０％スクロース中で一晩４℃で凍結保護し、最適切断温度（ＯＣＴ）化合物に包埋し、−８０℃で凍結させ、８μｍで切断した。病理組織学的分析のために、Ｊｕｎｇ  オートステイナーＸＬ（ライカ）を使用してヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で組織切片を染色し、ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ（浜松）を用いて組織切片全体のスキャンを得た。免疫組織化学的分析のために、組織切片を、４℃で一晩一次抗体と共に、また、室温で３０分間二次抗体と共にインキュベートした。使用された一次抗体は、ウサギ抗コラーゲンＩＶ（ポリクローナルａｂ６５８６；Ａｂｃａｍ；１：１００希釈）、ヤギ抗ＤｓＲｅｄ（ポリクローナル  ｓｃ−３３３５４；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１：１００希釈）、及びラット抗パン内皮細胞マーカー（クローン  ＭＥＣＡ−３２；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；２μ／ｍｌ）であった。使用された二次抗体は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８又は５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にコンジュゲートされていた。画像は、ＯＲＣＡ−ＥＲデジタルカメラ（浜松）を備えたＡｘｉｏｐｌａｎ  ２イメージング顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）から入手した。血管密度を、ＤＡＰＩ陽性生存腫瘍の総面積に対するＭＥＣＡ−３２陽性血管面積の割合に１００を乗じて表した。組織学試料は、ＣＲＣ疾患の専門知識を有する熟練の病理学者により評価された。
【００７４】
統計解析
群間差を両側スチューデントｔ検定により評価した。相関関係を、ピアソン相関係数により評価した。偶然性解析は、入力データとして実際のマウスの数を用いた両側カイ二乗検定により評価された。カプラン・マイヤー生存分析については、ログランク検定を用いてＰ値を算出し、ハザード比は、ＡｐｃＭｉｎ／＋；Ｖｉｌｌｉｎ−Ｃｒｅマウスをコンパレータとして使用して算出した。０．０５未満のＰ値を有意とみなした。
【００７５】
実施例２．臨床的に関連する結腸直腸がんの内腔移植モデルの開発
腸のがんの中で最も広く利用されている遺伝子組み換えマウスモデルはＡｐｃＭｉｎ／＋マウスであり、これは、Ａｐｃの対立遺伝子の一方にドミナントナンセンス突然変異（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｏｎｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を有する(Su et al. Science. 256(5057): 668-670, 1992)。ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスは、腸管内に多数の腺腫を生じるが、これらの腺腫が浸潤性又は転移性の腺癌に進行することはほとんどない(Moser et al. Science. 247(4940): 322-324, 1990)。その上、こうした腺腫は主に小腸に局在しており、結腸においては比較的少数の腺腫しか顕在化しない(Moser et al. Science. 247(4940): 322-324, 1990)。Ａｐｃ突然変異体バックグラウンドへの発がん性Ｋｒａｓの導入は腸管腺腫の多様性を促進し(Janssen et al. Gastroenterology. 131(4): 1096-1109, 2006. Epub 2006 Aug 16; Luo et al. Int. J. Exp. Pathol. 90(5): 558-574, 2009)、結腸に関連する解剖学的部位における腫瘍発生の著しい増加を伴う(Luo et al. Int. J. Exp. Pathol. 90(5): 558-574, 2009)浸潤性への進行を早める(Janssen et al. Gastroenterology. 131(4): 1096-1109, 2006. Epub 2006 Aug 16; Haigis et al. Nat. Genet. 40(5): 600-608, 2008. Epub 2008 Mar 30; Sansom et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103(38): 14122-14127, 2006. Epub 2006 Sep 7)。腸リンパ節転移の発生はＡｐｃ／Ｋｒａｓ複合変異体マウスにおいては観察されておらず、肝臓への遠隔転移のみが導入遺伝子ＲＴ−ＰＣＲ法(Janssen et al. Gastroenterology. 131(4): 1096-1109, 2006. Epub 2006 Aug 16)又は肉眼観察(Hung et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107: 1565-1570, 2010)により２０−２７％のＡｐｃ／Ｋｒａｓ複合変異体マウスで検出されている。本出願人らは、ＡｐｃＭｉｎ／＋；ＫｒａｓＬＳＬＧ１２Ｄ／＋；Ｖｉｌｌｉｎ−Ｃｒｅ複合変異体マウス（ＡｐｃＭｉｎ／＋をバックグラウンドとするＫｒａｓ（ＫｒａｓＬＳＬＧ１２Ｄ）のＣｒｅ依存性活性化対立遺伝子を有し、腸全体にＣｒｅリコンビナーゼの発現を導くＶｉｌｌｉｎ−Ｃｒｅ導入遺伝子を有するマウスと交配させたマウス）を作製し、ＡｐｃＭｉｎ／＋；Ｖｉｌｌｉｎ−Ｃｒｅ対照マウスと比較した、結腸における腫瘍成長の亢進を確認した（図１Ａ−１Ｃ）。しかし、加速した腸腫瘍形成の結果として、ＡｐｃＭｉｎ／＋；ＫｒａｓＬＳＬＧ１２Ｄ／＋；Ｖｉｌｌｉｎ−Ｃｒｅマウスは、過去の報告(Luo et al. Int. J. Exp. Pathol. 90(5): 558-574, 2009; Haigis et al. Nat. Genet. 40(5): 600-608, 2008. Epub 2008 Mar 30)と違わず、著しく短くなった寿命を示した（図１Ｄ）。特に、結腸壁の漿膜側へ浸潤せず、肝臓で転移形成しない原発性結腸腫瘍によって証明されるように、約９週齢での発症時の疾患状態は良性のままである（図１Ｂ）。
【００７６】
Ａｐｃ／Ｋｒａｓ複合変異体腫瘍が早期悪性進行の特徴を示す(Janssen et al. Gastroenterology. 131(4): 1096-1109, 2006. Epub 2006 Aug 16; Haigis et al. Nat. Genet. 40(5): 600-608, 2008. Epub 2008 Mar 30; Sansom et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103(38): 14122-14127, 2006. Epub 2006 Sep 7)ならば、本出願人らは、Ａｐｃ／Ｋｒａｓ突然変異体マウスの短縮された寿命より長く複合変異体腫瘍をインビボで維持することが転移能の実現を可能にすると仮定した。したがって、本出願人らは、単一の無傷のＡｐｃＭｉｎ／＋；ＫｒａｓＬＳＬＧ１２Ｄ／＋；Ｖｉｌｌｉｎ−Ｃｒｅドナー腫瘍を宿主野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス結腸の粘膜層内に移植することを目的とした。なぜなら、それが、ステージＩＶ疾患へと進行する可能性のある臨床ステージ０の同所性原発性結腸直腸腫瘍を忠実に表すためである。がん細胞懸濁液の直腸粘膜(Donigan et al. Surg. Endosc. 24(3): 642-647, 2010. Epub 2009 Aug 18)又は盲腸の漿膜壁(Cespedes et al. Am. J. Patho1. 170(3): 1077-1085, 2007)への直接注入、腫瘍細胞の取り込みを促進するための、粘膜の電気凝固に続く腫瘍細胞懸濁液の結腸内腔への滴下注入(Bhullar et al. J. Am. Call. Surg. 213(1): 54-60; discussion 60-61, 2011. Epub 2011 Mar 31)、及び無傷の腫瘍断片の盲腸壁の漿膜側への外科的移植(Fu et al. Natl. Acad. Sci. USA. 88(20): 9345-9349, 1991; Jin et al. Tumour. Biol. 32(2): 391-397, 2011. Epub 2010 Nov 19)を含む、幾つかの結腸同所性移植技術が現在までに記述されている。盲腸移植技術の欠点の一つは、腫瘍が、盲腸壁の漿膜側に移植され、それにより、転移が起こるための、粘膜を貫く漿膜への原発腫瘍浸潤という要件を回避するという事実である。重要なこととして、こうしたすべての確立された技術の主な注意点は、腫瘍細胞の粘膜への注入時に結腸壁の裂け目からであれ、或いは腹腔へ戻した後の盲腸移植片からの腫瘍細胞の脱落からであれ、腫瘍細胞が腹腔内へ偶然播種する可能性である。実際、腸リンパ節、肝臓及び肺に転移を形成するとされている結腸直腸がん（ＣＲＣ）のマウスモデルを作製するのにこうした技術が利用されてきたものの、これらの技術は広範な癌性腹膜炎も引き起こす(Bhullar et al. J. Am. Call. Surg. 213(1): 54-60; discussion 60-61, 2011. Epub 2011 Mar 31; Cespedes et al. Am. J. Patho1. 170(3): 1077-1085, 2007; Fu et al. Natl. Acad. Sci. USA. 88(20): 9345-9349, 1991; Jin et al. Tumour. Biol. 32(2): 391-397, 2011. Epub 2010 Nov 19)。したがって、これらの二次部位における腫瘍形成は真の転移ではなく、腹膜播種の結果であろうというのが妥当である。癌性腹膜炎はヒト転移性ＣＲＣの顕著な特徴ではない(Klaver et al. World. J. Gastroenterl. 18(39): 5489-5494, 2012)ことが、転移性播種の経路を調査するためのこれらのモデルの限定された有用性を更に示唆している。
【００７７】
これらの問題を回避するために、本出願人らは、宿主結腸の内腔を露出させ、したがって結腸粘膜表面の外科的処置を行いやすくする直腸脱誘導技術を開発した（図２）。６−９週齢のＡｐｃＭｉｎ／＋；ＫｒａｓＬＳＬＧ１２Ｄ／＋；Ｖｉｌｌｉｎ−Ｃｒｅマウスをドナーとして使用し、本出願人らは、単一無傷のドナー結腸腫瘍を野生型Ｃ５７Ｂｌ／６宿主結腸へ外科的に移植した。注目すべきことに、ドナー腫瘍は、移植前に個々の細胞に解離されずに無傷の腫瘍組織として維持され、これにより腫瘍細胞−間質細胞間の相互作用及び腫瘍細胞−細胞外マトリックス間の相互作用が保持された。こうした無傷のドナー腫瘍は粘膜層内に確立し、一連の内視鏡検査（図３Ａ及び３Ｂ）及び９ｗｐｉでの結腸全体の生体組織検査（図１Ｅ）によって証明されるように、インビボでの長期残存を示した。加齢による病的状態による宿主マウス屠殺時点で、移植されたドナー腫瘍の大半は良性のままであったのに対し（図１Ｆ、３Ａ及び３Ｂ）、マウスのサブセットは、結腸壁を貫くドナー腫瘍の浸潤、及び同時に生じる腸リンパ節及び肝転移形成を伴う悪性進行（図１Ｇ）を示した。移植後５１−９２週（ｗｐｉ；図１Ｈ）時点の宿主マウス１７匹中３匹のみ（１７．６％）で悪性進行が観察されたことを考えると、本出願人らのデータは、腫瘍進行及び転移が起こるためには、更に遺伝的、非遺伝的及び／又は微小環境の長期に亘る変化が必要であることをサポートする。
【００７８】
実施例３．ＣＲＣの内腔移植モデルを用いた転移性播種の経路
本出願人らのモデルにおける悪性進行の時間枠を短縮して転移の経路を調べることができるように、本出願人らは、低分化型ＨＣＴ１１６ヒトＣＲＣ由来細胞株に本出願人らの内腔移植技術を適用した。ドナー異種移植腫瘍を発生させるために、赤色蛍光タンパク質であるＤｓＲｅｄをコードする遺伝子をＨＣＴ１１６細胞に形質導入し、その細胞をマウスに皮下移植した。宿主ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス結腸の粘膜表面へ〜１０ｍｍ３のドナー腫瘍断片を外科的に移植した後、エクスビボ全体イメージング法（図４Ａ）及びインビボ内視鏡検査法（図４Ｂ）を活用し、腫瘍の生着率及び経時的成長（図４Ｃ）を観察した。移植された腫瘍は、結腸の内腔内で最初に確立し、成長し（図４Ａ及び４Ｂ）、１ｗｐｉで単一の腫瘍病巣が粘膜内癌として検出可能となった（図４Ｄ及び４Ｅ）。移植後すぐの組織学的評価では、結腸の粘膜表面のみに原発腫瘍が局在し（図５Ａ、５Ｂ、５Ｄ及び５Ｅ）、より深層部の完全性が保たれている（図５Ｃ及び５Ｆ）ように、移植手技により結腸壁が傷つくことはなかったと確認された。フローサイトメトリーで評価した場合、移植後１日時点の腫瘍細胞播種のエビデンスは何もなかった（図５Ｇ）。
【００７９】
ステージ０ポリープは必ず、粘膜下／外筋層を破るステージＩ腫瘍へと，進行し、２−３ｗｐｉまでには外筋層のコラーゲンＩＶに富む基底膜を突破して(Vreemann et al. Biol. Chem. 390. 481-492, 2009)結腸壁の漿膜側に達する浸潤性ステージＩＩ腺癌がはっきり表れた（図４Ａ及び６）。注目すべきことに、３ｗｐｉ時点で、浸潤性腫瘍細胞の個々のクラスターが結腸壁内部で、原発性腺癌に隣接して（図４Ｆ−４Ｈ）及び原発性腺癌から離れて（図４Ｆ及び４Ｉ）検出可能であった。原発性腺癌の継続的な増殖は結腸壁の漿膜側で主に発生し（図４Ａ及び６）、その程度は、７ｗｐｉの収集エンドポイントであっても内腔の閉塞が明らかではなかったほどであった。７ｗｐｉ時点での動物の疾患状態は、むしろ原発腫瘍負荷が原因の体重減少に主に起因したのであり、更に後の疾患ステージのＣＲＣ患者にも観察される一般的な症状である(Jellema et al. BMJ. 340: 1269, 2010)。
【００８０】
ステージＩＩ腺癌に進行するステージ０の結腸直腸腫瘍を作製するための有望な技術として内腔移植を開発し、次に本出願人らはステージＩＩＩ／ＩＶ疾患に該当する領域進行及び／又は遠隔転移進行のエビデンスについて担腫瘍マウスを評価した。６−７ｗｐｉ時点で、領域腸リンパ節転移は、漿膜に隣接して位置する巨視的腫瘍小結節として、結腸壁と平行に走る排出リンパ管網（ｄｒａｉｎｉｎｇ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｎｅｔｗｏｒｋ）内で検出可能であった（図７Ａ、８Ａ及び８Ｉ）。結腸壁内部における腫瘍細胞の局所領域的広がりも、原発腫瘍部位の近位（図８Ａ及び８Ｆ）及び遠位（図７Ａ及び８Ａ−８Ｃ）の両方で顕著であった。重要なことには、マウスは、血行性（図８Ｇ）、リンパ性（図８Ｊ）及び神経周囲性（図８Ｈ）腫瘍細胞浸潤も示し、また、遠位の巨視的ＤｓＲｅｄ陽性肝（図７Ｂ）及び肺（図７Ｃ）転移も呈した。巨視的転移の発現時期をよりよく特徴付けるために、本出願人らは、肉眼検査で転移負荷の時間的評価を行い、マクロ転移が最初に現れたのは〜４ｗｐｉであったと判定した（図７Ｄ）。しかし、マクロ転移の表れは、顕微鏡的な疾患伝播の正確な時期に関する情報はもたらさない。したがって、本出願人らは、肝臓、肺及び腸周縁部の脈管（腸管傍リンパ節、中間リンパ節及び主リンパ節を含む）すべてを、フローサイトメトリーにより単一の細胞に解離し、ＤｓＲｅｄ陽性腫瘍細胞がないかどうかモニターした。播種性腫瘍細胞は、〜３ｗｐｉ時点、すなわち肉眼で見えるマクロ転移が現れる一週間前に最初に検出可能であった（図７Ｅ）。本出願人らは、肉眼的レベル又は病理組織学的レベルの何れにおいても検出可能な疾患がないにもかかわらず、ＤｓＲｅｄの免疫蛍光により３ｗｐｉ時点の肝臓及び肺の内部での播種性腫瘍細胞の存在を確認した（図７Ｆ及び７Ｇ）。これらの結果は、ＨＣＴ１１６結腸直腸腫瘍の内腔移植が、ヒト疾患に関連する局所部位及び遠隔部位へ経時的に転移する、有望なインビボモデルであることを実証する。
【００８１】
次に、本出願人らは、異なる起源の結腸直腸腫瘍をドナーとして使用した場合、内腔移植技術が類似の進行及び転移プロファイルをもたらすかどうか判定した。この目的のために、本出願人らは、十分に分化した初代ヒトＣＲＣ由来ＬＳ１７４Ｔ細胞株を使用した。本出願人らは、ＤｓＲｅｄをコードするレンチウイルスをＬＳ１７４Ｔ細胞に形質導入し、ドナーマウスにおいてＬＳ１７４Ｔ−ＤｓＲｅｄ皮下腫瘍を作製し、宿主マウス結腸の粘膜表面上にドナー腫瘍断片を移植した。内腔移植ＨＣＴ１１６腫瘍と同様に、内腔移植ＬＳ１７４Ｔ腫瘍は最初に粘膜層内で増殖し、最終的には結腸壁を越えて浸潤し、原発腫瘍負荷の大部分が８ｗｐｉの収集エンドポイント時点で結腸壁の漿膜側に位置していた（図９Ａ及び９Ｂ）。特に、肝臓、肺及び領域リンパ節における転移性増殖は、ＨＣＴ１１６腫瘍を有するマウスにおけるよりも長い潜伏期間ではあるものの、このモデルにおいても明らかであった（図９Ａ及び９Ｃ−９Ｅ）。一次ヒト患者ＣＲＣ腫瘍をドナーとして使用して、本出願人らは、ステージＩＩ患者から内腔移植された腫瘍が、ステージＩＩＩの患者から内腔移植された腫瘍が腸リンパ節転移を生じたのに対し、非転移性のままであったことを示すことにより、このモデルの有用性を更に実証した（図１０Ａ−１０Ｃ）。
【００８２】
表１は、ＣＲＣの内腔移植モデル（ＬＩＭ）を使用して、様々なタイプと供給源の結腸直腸ドナー腫瘍を種々な株の宿主マウスに内腔移植した後の腫瘍の生着率をまとめたものである。生着率は、外科的移植が試みられた宿主マウスの総数で割ったドナー腫瘍移植が成功した宿主マウスの総数として定義され、百分率で表される。これらの結果は、ＬＩＭにおける疾患進行の臨床的関連性を際立たせる。
2016525358.tif 000003
【００８３】
実施例４．ＣＲＣの内腔移植モデルを用いた、臨床的に関連する部位への強固な転移
臨床では、特定のタイプの腫瘍は特定の臓器に特異的に転移する(Fidler et al. Nat. Rev. Cancer. 3(6): 453-458, 2003)。実際、ＣＲＣは主に、領域腸リンパ節、肝臓及び肺に転移するが、一方、他の臓器は大部分免れる(Chambers et al. Nat. Rev. Cancer. 2(8): 563-572, 2002)。ＣＲＣのＬＩＭが、ヒトで観察される選択的な標的臓器特異性を正確に再現するかどうかを判定するために、本出願人らは、肉眼検査とＤｓＲｅｄ陽性腫瘍細胞フローサイトメトリーの両方で様々な内臓における６−７ｗｐｉ時点の転移腫瘍負荷を評価した。内腔移植ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、肝臓、肺及び腸リンパ節に選択的に転移を形成し、副腎、腎臓、脾臓、脳及び骨髄では最小限の転移負荷が検出できたにすぎなかった（図１１Ａ、１１Ｂ及び１２Ａ）。高度免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤインターロイキン−２受容体ガンマ鎖欠損（ＮＳＧ）マウス株の結腸にＨＣＴ１１６腫瘍を移植した場合（図１１Ｃ−１１Ｇ）、ＮＯＤ／ＳＣＩＤにおける場合（図７Ｂ、７Ｃ、１１Ａ及び１１Ｂ）と比較して、ＮＳＧにおいて肝臓、肺及び腸リンパ節内部の転移腫瘍負荷が有意に増加した（図１１Ａ及び１１Ｂ）したものの、この選択的標的臓器ホーミングは維持された。この原発腫瘍の転移能の亢進は、過去の報告(Ikoma et al. Oncol. Rep. 14(3): 633-637, 2005; Quintana et al. Nature. 456: 593-598, 2008)と一致して、ＮＳＧマウスにおけるナチュラルキラー細胞活性の欠如に一部起因しうる。重要なことには、本出願人らは、移植された本出願人らのＮＯＤ／ＳＣＩＤ又はＮＳＧ宿主マウスの何れにおいても、現在までに既に報告されているＣＲＣモデル(Bhullar et al. J. Am. Call. Surg. 213(1): 54-60; discussion 60-61, 2011. Epub 2011 Mar 31; Cespedes et al. Am. J. Patho1. 170(3): 1077-1085, 2007; Fu et al. Natl. Acad. Sci. USA. 88(20): 9345-9349, 1991; Jin et al. Tumour. Biol. 32(2): 391-397, 2011. Epub 2010 Nov 19)の広く知られている特徴である癌性腹膜炎を観察することはなかった。癌性腹膜炎はヒトＣＲＣでは一般的な症状ではない(Klaver et al. World. J. Gastroenterl. 18 (39) 5489-5494, 2012)ことを考えると、本出願人らの試験結果は、これらの文献で報告されているモデルに対する本出願人らの転移性ＣＲＣモデルの妥当性及び優位性を更に際立たせる。
【００８４】
移植部位に関係なくＨＣＴ１１６細胞が転移することができたかどうかを判定するために、本出願人らは、ＮＯＤ／ＳＣＩＤとＮＳＧマウス両方にＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ細胞を皮下移植し、転移負荷を評価した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（図１１Ａ、１１Ｂ、１２Ｂ及び１２Ｃ）とＮＳＧ（図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｈ及び１１Ｉ）の両方のマウス株において、皮下移植腫瘍は、内腔移植腫瘍に比べて容易に転移しなかった。皮下部位及び内腔部位に移植された一次患者結腸直腸腫瘍試料についても同様の結果が観察された。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいてサイズ一致及び時間一致の６ｗｐｉ  ＨＣＴ１１６腫瘍を組織学的に評価したところ、皮下移植腫瘍が広範囲で壊死状態であったのに対し、内腔移植腫瘍はほとんど壊死していなかった（図１３Ａ及び１３Ｂ）。この壊死がないことは、内皮細胞のＭＥＣＡ−３２免疫染色により明らかなように（図１３Ｃ−１３Ｅ）、内腔移植腫瘍における血管新生の増加に帰せられ、ひいては粘膜における血管密度が皮下移植部位と比較して上昇することに帰せられる。内腔移植腫瘍が、皮下移植腫瘍と比べて転移が増大することに伴う血管密度の上昇を示したことを考え、本出願人らは、臨床で報告されているように(Cohen et al. J. Clin. Oncol. 26(19): 3213-3221, 2008)、循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）数が転移能を反映しうるのかどうかを判定しようとした。内腔移植腫瘍は一貫して、皮下移植腫瘍より〜１００倍多いＣＴＣをＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスとＮＳＧマウスの両方において生じさせ、内腔移植ＮＳＧマウスは、内腔移植ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスより約２．５倍多いＣＴＣ数を示した（図１１Ｊ）。したがって、内腔移植後の強固な転移形成は、原発腫瘍の血管新生の増加と関連しており、ひいては腫瘍細胞の血行への流入増加とも関連している。まとめると、これらの結果は、ＨＣＴ１１６腫瘍における固有の転移性表現型をサポートするのではなく、むしろ同じ腫瘍細胞が、その原発腫瘍の微小環境次第で劇的に異なる転移能を発揮しうるという事実を際立たせる。
【００８５】
実施例５．結腸直腸がん細胞の肝転移はリンパ節転移を介さず独立に起こりうる。
同所に確立された原発性結腸直腸腫瘍から遠位で予測可能且つ再現可能な、関連する標的臓器内部での転移性増殖を実証したＣＲＣのインビボモデルは、今まで存在しなかった(Heijstek et al. Dig. Surg. 22: 16-25, 2005. Epub 2005 Apr 14; Kobaek-Larsen et al. Comp. Med. 50(1): 16-26, 2000; Rosenberg et al. Carcinogenesis. 30(2): 183-196, 2009. Epub 2008 Nov 26; Taketo et al. Gastroenterology. 136(3): 780-798, 2009)。利用可能なモデルの欠如は、遠隔臓器への転移拡散の経路に関する調査を不可能にしてきた。臨床では、結腸直腸がんの肝転移が、領域腸リンパ節の最初のコロニー形成の次に起こるのか、或いはリンパ節転移の増殖とは無関係に、原発腫瘍から直接の血行性拡散を介して起こるのかわかっていない(Bacac et al. Annu. Rev. Pathol. 3: 221-247, 2008)。第一の仮説は、（ｉ）ステージ分類基準は、がんの広がりの程度に基づいており；腸リンパ節転移のみの臨床症状はステージＩＩＩ疾患を示唆し、肝転移の存在は更に進行したステージＩＶ診断の理由である(Schwartz et al. Am. J. Health. Syst. Pharm. 65 (11) S8-14, S22-24, 2008)、（ｉｉ）遠隔肝転移と腸リンパ節転移の併発がかなり報告されている(Derwinger et al. World. J. Surg. Oncol. 6. 127, 2008)、（ｉｉｉ）原発腫瘍のリンパ管密度は、リンパ節への転移と肝臓への転移の両方に関係がある(Saad et al. Mod. Pathol. 19 (10) 1317-1323 Epub 2006 Jun 23)、及び（ｉｖ）腫瘍細胞のリンパ管への流入は、不連続な基底膜及び周皮細胞被覆の欠如が原因で、血管系（ｈｅｍａｔｏｇｅｎｏｕｓ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）への流入よりおそらく容易である(Saharinen et al. Trends. Immunol. 25(7): 387-395, 2004)という観察によってサポートされる。（ｉ）一部のＣＲＣ患者が、リンパ節転移なしに肝転移を呈したこと(Derwinger et al. World. J. Surg. Oncol. 6: 127, 2008)、（ｉｉ）ステージＩＩＩのＣＲＣ患者において数が増加した排出腸リンパ節の外科的除去が全生存を改善しえないこと(Prandi et al. Ann. Surg. 235(4): 458-463, 2002; Tsikitis et al. J. Am. Coll. Surg. 208(1): 42-47, 2009; Wong et al. JAMA. 298(18): 2149-2154, 2007)、及び（ｉｉｉ）ＣＲＣにおいて、原発腫瘍の静脈浸潤が遠隔肝転移形成の独立した予後指標であること(Suzuki et al. Am. J. Surg. Pathol. 33(11): 1601-1607, 2009)を含む幾つかの観察が第二の仮説をサポートする。ヒトＣＲＣの転移指向性を再現する臨床的に関連するモデルとしてＬＩＭを開発したが、本出願人らは独自に播種経路の調査に取り組んだ。患者において、リンパ節転移の存在／非存在と肝転移の存在／非存在との間に相関関係が存在する(Derwinger et al. World. J. Surg. Oncol. 6: 127, 2008)。本出願人らのＮＯＤ／ＳＣＩＤ内腔移植モデルとＮＳＧ内腔移植モデルの両方において、リンパ節転移負荷（リンパ節内の、転移したリンパ節の総数とＤｓＲｅｄ陽性腫瘍細胞負荷の合計の両方）は、肝転移負荷と相関しなかった（図１４Ａ及び１４Ｂ）が、これは、リンパ節への播種と肝臓への播種が異なる経路を介して発生したかもしれないことを示唆する。
【００８６】
主に血管新生及びリンパ管新生をそれぞれ促進する機能を果たすＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦ−Ｃ(Adams et al. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8: 464-478, 2007; Oh et al. Dev. Biol. 188: 96-109, 1997)によって血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が原発腫瘍の血管新生において重要な役割を果たす(Carmeliet et al. Nature. 473(7347): 298-307, 2011)ことを考え、本出願人らは、本出願人らのモデルにおいて、血管内皮増殖因子に対する機能遮断抗体の転移性播種に及ぼす効果を評価した。この目的のために、本出願人らは、中和抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体(Liang et al. J. Biol. Chem. 281(2): 951-961, 2006. Epub 2005 Nov 7)を利用し、抗ＶＥＧＦ−Ｃ抗体を作製した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ宿主マウスを、ＨＣＴ１１６−ＤｓＲｅｄ又はＬＳ１７４Ｔ−ＤｓＲｅｄ腫瘍移植の１日前から始めて週に１回抗体で処理し、それぞれの転移形成を６−７ｗｐｉ時点又は８ｗｐｉ時点で評価した。抗ＶＥＧＦ−Ａは、肝臓における巨視的転移形成を阻害した（図１４Ｆ及び１４Ｇ）が、これは、ＤｓＲｅｄ−陽性腫瘍細胞負荷  の低下（図１４Ｈ）と肝転移を呈したマウスの割合の低下（図１４Ｉ）の両方によって確認された。抗ＶＥＧＦ−Ａはまた、血管新生の促進により転移性リンパ節腫瘍の増殖を助けるというＶＥＧＦ−Ａの役割(Niki et al. Clin. Cancer. Res. 6: 2431-2439, 2000)と一致して、肉眼で見えるリンパ節転移の増殖を減じた（図１４Ｅ及び１４Ｋ）ものの終わらせることはなかった（図１４Ｃ）。逆に抗ＶＥＧＦ−Ｃは、リンパ節転移（図１４Ｅ及び１４Ｋ）のほぼ完全な抑止にもかかわらず肝転移形成を有意に阻害せず（図１４Ｆ及び１４Ｇ）、したがって肝臓内のＤｓＲｅｄ陽性腫瘍細胞負荷を軽減しなかった（図１４Ｈ）。抗ＶＥＧＦ−Ｃはまた、ＨＣＴ１１６又はＬＳ１７４Ｔ  ＬＩＭのいずれにおいても、肝臓へのマクロ転移を呈するマウスの割合の低減に対して全く効果がなかった（図１４Ｉ及び１４Ｌ）。抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体と抗ＶＥＧＦ−Ｃ抗体の併用治療は、リンパ節と肝臓の両方の転移形成を阻害した（図１４Ｅ−１４Ｉ及び１４Ｌ）。抗体処理後の原発腫瘍体積の差（図１４Ｃ及び１４Ｄ）を説明するために、本出願人らはすべての治療群の原発腫瘍体積に対する肝転移負荷を正規化し、リンパ節転移の抗ＶＥＧＦ−Ｃ媒介性遮断が肝転移の形成に全く影響を与えなかったことを確認した（図１５Ａ及び１５Ｂ）。本出願人らのデータは、ＶＥＧＦ−ＣではなくＶＥＧＦ−ＡのＣＲＣ肝転移形成における役割をサポートするが、既に肝臓に播種した腫瘍細胞の増殖を抗ＶＥＧＦ−Ａが阻害したのか、或いは抗ＶＥＧＦ−Ａが直接原発腫瘍細胞の肝臓への播種を阻害したのかは不明なままであった。この疑問に答えるため、本出願人らは、担腫瘍マウスを抗ＶＥＧＦ−Ａで処理し、巨視的肝転移出現の前である３ｗｐｉ時点（図７Ｄ及び７Ｅ）で、肝臓の微小転移性ＤｓＲｅｄ陽性腫瘍細胞をフローサイトメトリーにより評価した。抗ＶＥＧＦ−Ａは、肝臓内に検出可能な播種性腫瘍細胞を有するマウスの数を有意に減少させた（図１４Ｊ）。まとめると、これらの結果は、原発腫瘍から肝臓へのＣＲＣ細胞の転移は、リンパ節転移の媒介とは無関係に、直接の血行性拡散を介して起こりうることを実証する。
【００８７】
その他の実施態様
特定の実施態様に就き本発明を説明してきたが、一般的に、本発明の原理に則しており、且つ本発明が関連する技術分野における周知又は慣行の範囲内であって上に記載の本質的特徴に適用され得る本開示からの逸脱を含む、如何なる変形、使用又は適合をも本願は包含していることが意図される。
【００８８】
本明細書で引用又は言及されるすべての特許、特許出願、特許出願公開及び他の刊行物は、あたかも独立した各々の特許、特許出願、特許出願公開又は刊行物が具体的且つ個別に参照により援用されることが表示されているのと同程度に、本明細書に参照により援用される。具体的に、そのような特許出願は、米国特許仮特許出願第６１／８５７６３８号（２０１３年７月２３日出願）及び同第６１／９５４７８８号（２０１４年３月１８日出願）を含み、本願はこれらの出願に基づく利益を主張する。
【図１Ａ−Ｂ】
2016525358.tif 000004
【図１Ｃ−Ｄ】
2016525358.tif 000005
【図１Ｅ】
2016525358.tif 000006
【図１Ｆ−Ｇ】
2016525358.tif 000007
【図１Ｈ】
2016525358.tif 000008
【図２】
2016525358.tif 000009
【図３Ａ−Ｂ】
2016525358.tif 000010
【図４Ａ】
2016525358.tif 000011
【図４Ｂ−Ｅ】
2016525358.tif 000012
【図４Ｆ−Ｉ】
2016525358.tif 000013
【図５Ａ−Ｃ】
2016525358.tif 000014
【図５Ｄ−Ｆ】
2016525358.tif 000015
【図５Ｇ】
2016525358.tif 000016
【図６】
2016525358.tif 000017
【図７Ａ−Ｃ】
2016525358.tif 000018
【図７Ｄ−Ｅ】
2016525358.tif 000019
【図７Ｆ−Ｇ】
2016525358.tif 000020
【図８Ａ】
2016525358.tif 000021
【図８Ｂ−Ｅ】
2016525358.tif 000022
【図８Ｆ−Ｊ】
2016525358.tif 000023
【図９Ａ】
2016525358.tif 000024
【図９Ｂ−Ｅ】
2016525358.tif 000025
【図１０Ａ−Ｃ】
2016525358.tif 000026
【図１１Ａ−Ｂ】
2016525358.tif 000027
【図１１Ｃ−Ｆ】
2016525358.tif 000028
【図１１Ｇ−Ｉ】
2016525358.tif 000029
【図１１Ｊ】
2016525358.tif 000030
【図１２Ａ−Ｃ】
2016525358.tif 000031
【図１３Ａ−Ｅ】
2016525358.tif 000032
【図１４Ａ−Ｂ】
2016525358.tif 000033
【図１４Ｃ】
2016525358.tif 000034
【図１４Ｄ−Ｅ】
2016525358.tif 000035
【図１４Ｆ−Ｈ】
2016525358.tif 000036
【図１４Ｉ−Ｊ】
2016525358.tif 000037
【図１４Ｋ−Ｌ】
2016525358.tif 000038
【図１５Ａ−Ｂ】
2016525358.tif 000039
【国際調査報告】
2016525358.tif 000040
2016525358.tif 000041