(57)【要約】  修飾ライゲーション構成要素、特に修飾リガーゼ補因子、修飾アクセプターおよび修飾ドナーを含有するポリヌクレオチドをライゲーションする方法が本明細書に提供される。この方法は、核酸配列を検出するためのライゲーションベースのアッセイに容易に適用され、修飾補因子の使用がマッチテンプレートとミスマッチテンプレートとの間の識別を改善する。さらに、修飾ライゲーション構成要素の使用が核酸テンプレートの非存在下でライゲーションを低減または排除する。加えて、方法は、ライゲーションプロセスの間、プローブ二量体化を低減または排除する修飾アクセプタープローブおよび修飾ドナープローブを使用する核酸ライブラリーの調製に適用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクセプター：ドナープローブ二量体形成を低減または阻害する核酸ライブラリーを調製する方法であって、
リガーゼ、修飾ドナープローブおよび修飾アクセプタープローブを含む反応混合物中で標的核酸断片をインキュベートして核酸ライブラリーを調製するステップ
を含み、
前記核酸ライブラリーが、３’末端にライゲーションされる前記修飾ドナープローブおよび５’末端にライゲーションされる前記アクセプタープローブを含む標的核酸断片を含有し、
前記修飾ドナープローブと前記修飾アクセプタープローブの二量体化が低減または阻害される、方法。
【請求項２】
核酸ライブラリーがＲＮＡ核酸ライブラリーまたはＤＮＡ核酸ライブラリーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的核酸がＲＮＡ標的核酸またはＤＮＡ標的核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記修飾ドナープローブが式５’−リン酸−Ｘ(n1)−Ｙ(n2)−Ｚ(n3)−３’または５’−アデニル酸−Ｘ(n1)−Ｙ(n2)−Ｚ(n3)−３’を有し、前記修飾アクセプタープローブが式５’−Ｄ(n4)−Ｅ(n5)−Ｆ(n6)−ヒドロキシ−３’を有し、
式中、（ｎ２）、（ｎ３）、（ｎ４）および（ｎ５）が、それぞれ独立に、０または任意の正の整数であり、
（ｎ１）および（ｎ６）が、それぞれ独立に、０、１、２、３または４であり、
Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｄ、ＥおよびＦが、ヌクレオチド位置であり、
Ｘ、Ｙ、ＤまたはＥの少なくとも１つが修飾されていてもよい、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記修飾ドナープローブおよび修飾アクセプタープローブが、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドプローブであってもよい、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記修飾ドナープローブが、前記標的核酸断片の３’末端へライゲーションされる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記修飾アクセプタープローブが、前記標的核酸断片の５’末端へライゲーションされる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記リガーゼが、ＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記リガーゼが、バクテリオファージＴ４  ＤＮＡリガーゼ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡリガーゼ、９°ＮTMＤＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＲＮＡリガーゼ、Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ  ＤＮＡリガーゼ、ヒトＤＮＡリガーゼＩ、ヒトＤＮＡリガーゼＩＩ、ヒトＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ヒトＤＮＡリガーゼＩＶ、ワクチニアウイルスＤＮＡリガーゼ、ＣｈｌｏｒｅｌｌａウイルスＤＮＡリガーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｉｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ａｍｂｉｖａｌｅｎｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  ＤＮＡリガーゼ、Ｃｅｎａｒｃｈｅｏｎ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ  ＤＮＡリガーゼ、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ  ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄａｒｍａｎｕｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓ  ｐｈａｒａｏｓｉｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｈａｌｏｑｕａｄｒａｔｕｍ  ｗａｌｓｂｙｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｌｉｎａｒｕｍ  ＤＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｂｕｒｔｏｎｉｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｈｕｎｇａｔｅｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  ＤＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｔａｄｔｍａｎａｅ  ＤＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｕｍ  ｅｑｕｉｔａｎｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ  ＤＮＡリガーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ  ｔｏｒｒｉｄｕｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｈｉｂａｔａｅ  ＤＮＡリガーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＮＡ１ＤＮＡリガー��、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ  ＤＮＡリガーゼ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ  ＮＡＤ+−ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＤＮＡリガーゼ、テルムス種ＡＫ１６Ｄ  ＤＮＡリガーゼ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＮＡリガーゼ、バクテリオファージＴ７  ＤＮＡリガーゼ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ＤＮＡリガーゼ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ  ＲＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＲＮＡリガーゼ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＲＮＡリガーゼ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ＲＮＡリガーゼ、バクテリオファージＴ４  ＲＮＡリガーゼ１、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ、およびバクテリオファージＴ４  ＲＮＡリガーゼ２からなる群から選択される１つまたは複数のリガーゼを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ライゲーションが、一本鎖ライゲーション、平滑末端ライゲーションおよび付着末端のライゲーションからなる群から選択される１つまたは複数の酵素ライゲーション法を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記修飾ドナープローブと前記修飾アクセプタープローブの二量体化が、非修飾ドナープローブと非修飾アクセプタープローブの二量体化と比べて約５％〜約１００％低減または阻害される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記修飾ドナープローブと前記修飾アクセプタープローブの二量体化が、非修飾ドナープローブと非修飾アクセプタープローブの二量体化と比べて約７５％〜約１００％低減または阻害される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記修飾ドナープローブおよび前記修飾アクセプタープローブが、非修飾ドナープローブおよび非修飾アクセプタープローブを有する前記標的核酸断片へのライゲーションと同様の効率で前記標的核酸断片へライゲーションされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記効率が約５％〜約２００％である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記効率が約５０％〜約２００％である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記効率が約５０％〜約１５０％である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記修飾アクセプターが、式ＩＩの構造：
【化１】
2016514460.tif 000054
（式中、
Ｂ1、Ｂ2およびＢ3は、それぞれ独立に、置換または非置換プリンまたはピリミジン、その任意のアザまたはデアザ誘導体、および好ましくは核酸ポリメラーゼまたはリガーゼによって認識され得る任意の「ユニバーサル塩基」または「縮重塩基」からなる群から選択され、
Ｘ1およびＸ2は、それぞれ独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＣＨ3およびＯＣＨ2ＣＨ3からなる群から選択され、
Ｙ1、Ｙ2およびＹ3は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｆ、ＯＨおよびＯＣＨ3からなる群から選択され、
Ｗは、Ｈまたはオリゴヌクレオチジル残基から選択される）
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記修飾アクセプターが、式ＩＩの構造：
【化２】
2016514460.tif 000055
（式中、
Ｂ1、Ｂ2およびＢ3は、それぞれ独立に、置換または非置換プリンまたはピリミジン、その任意のアザまたはデアザ誘導体、および好ましくは核酸ポリメラーゼまたはリガーゼによって認識され得る任意の「ユニバーサル塩基」または「縮重塩基」からなる群から選択され、
Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は、それぞれ独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＣＨ3、ＢＨ3-およびアルコキシからなる群から選択され、
Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3およびＹ4は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、ＮＨ2およびアルコキシからなる群から選択され、
Ｗは、Ｈまたはオリゴヌクレオチジル残基から選択される）
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記修飾ドナーが、式ＩＩＩの構造：
【化３】
2016514460.tif 000056
（式中、
Ｂ1、Ｂ2およびＢ3は、それぞれ独立に、置換または非置換プリンまたはピリミジン、その任意のアザまたはデアザ誘導体、および好ましくは核酸ポリメラーゼまたはリガーゼによって認識され得る任意の「ユニバーサル塩基」または「縮重塩基」からなる群から選択され、
Ｘ1およびＸ2は、それぞれ独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＣＨ3およびＯＣＨ2ＣＨ3からなる群から選択され、
Ｙ1、Ｙ2およびＹ3は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｆ、ＯＨおよびＯＣＨ3からなる群から選択され、
Ｗは、Ｈまたはオリゴヌクレオチジル残基から選択される）
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記修飾ドナーが、式ＩＩＩの構造：
【化４】
2016514460.tif 000057
（式中、
Ｂ1、Ｂ2およびＢ3は、それぞれ独立に、置換または非置換プリンまたはピリミジン、その任意のアザまたはデアザ誘導体、および好ましくは核酸ポリメラーゼまたはリガーゼによって認識され得る任意の「ユニバーサル塩基」または「縮重塩基」からなる群から選択され、
Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は、独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＣＨ3、ＢＨ3-およびアルコキシからなる群から選択され、
Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3およびＹ4は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、ＮＨ2およびアルコキシからなる群から選択され、
Ｗは、Ｈまたはオリゴヌクレオチジル残基から選択される）
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記修飾ドナーが、式ＩＶの構造：
【化５】
2016514460.tif 000058
（式中、
Ａはアデニンであり、
Ｂ1、Ｂ2およびＢ3は、それぞれ独立に、置換または非置換プリンまたはピリミジン、その任意のアザまたはデアザ誘導体、および好ましくは核酸ポリメラーゼまたはリガーゼによって認識され得る任意の「ユニバーサル塩基」または「縮重塩基」からなる群から選択され、
Ｘ1およびＸ2は、それぞれ独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＣＨ3およびＯＣＨ2ＣＨ3からなる群から選択され、
Ｙ1、Ｙ2およびＹ3は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｆ、ＯＨおよびＯＣＨ3からなる群から選択され、
Ｗは、Ｈまたはオリゴヌクレオチジル残基から選択される）
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記修飾ドナーが、式ＩＶの構造：
【化６】
2016514460.tif 000059
（式中、
Ａはアデニンであり、
Ｂ1、Ｂ2およびＢ3は、それぞれ独立に、置換または非置換プリンまたはピリミジン、その任意のアザまたはデアザ誘導体、および好ましくは核酸ポリメラーゼまたはリガーゼによって認識され得る任意の「ユニバーサル塩基」または「縮重塩基」からなる群から選択され、
Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は、それぞれ独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＣＨ3、ＢＨ3-およびアルコキシからなる群から選択され、
Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3およびＹ4は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、ＮＨ2およびアルコキシからなる群から選択され、
Ｗは、Ｈまたはオリゴヌクレオチジル残基から選択される）
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記修飾アクセプタープローブおよび前記修飾ドナープローブが、前記標的核酸断片への前記プローブのライゲーションを阻止しない、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記修飾アクセプタープローブおよび前記修飾ドナープローブが、一緒にライゲーションされてプローブ二量体を形成する場合、前記二量体の複製を妨げるまたは阻止する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記修飾アクセプタープローブおよび前記修飾ドナープローブが一本鎖核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記修飾アクセプタープローブおよび前記修飾ドナープローブが二本鎖核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記修飾アクセプタープローブが、前記修飾ドナープローブに相補的である、請求項３０に記載の方法。
【請求項２８】
前記相補性が部分的または完全である、請求項３１に記載の方法。
【請求項２９】
アクセプター：ドナープローブ二量体形成を低減または阻害するＲＮＡ核酸ライブラリーを調製する方法であって、
１つまたは複数のＲＮＡリガーゼ、修飾ドナープローブおよび修飾アクセプタープローブを含む反応混合物中でＲＮＡ標的核酸断片をインキュベートしてＲＮＡ核酸ライブラリーを調製するステップ
を含み、
前記ＲＮＡ核酸ライブラリーが、３’末端にライゲーションされる前記修飾ドナープローブおよび５’末端にライゲーションされる前記修飾アクセプタープローブを含むＲＮＡ標的核酸断片を含有し、
前記修飾ドナープローブと前記修飾アクセプタープローブの二量体化が低減または阻害される、方法。
【請求項３０】
アクセプター：ドナープローブ二量体形成を低減または阻害するＲＮＡ核酸ライブラリーを調製する方法であって、
ＡＴＰの非存在下でＲＮＡリガーゼおよびアデニル化修飾ドナープローブを含む反応混合物中でＲＮＡ標的核酸断片をインキュベートして３’−修飾ＲＮＡ標的核酸を産生するステップであって、
前記３’−修飾ＲＮＡ標的核酸の３’末端が、ＲＮＡ核酸ライブラリーの３’末端との前記修飾ドナープローブのライゲーション産物を含む、ステップと、
前記３’−修飾ＲＮＡ標的核酸を、修飾アクセプタープローブおよびＲＮＡリガーゼと共にインキュベートして前記ＲＮＡ核酸ライブラリーを産生するステップと
を含み、
前記ＲＮＡ核酸ライブラリーの各核酸が、前記ＲＮＡ核酸ライブラリーのその３’末端において前記修飾ドナープローブを、その５’末端において前記修飾アクセプタープローブを含み、
前記修飾ドナープローブと前記修飾アクセプタープローブの二量体化が低減または阻害される、方法。
【請求項３１】
前記ＲＮＡ標的核酸断片が、ＡＴＰの存在下で修飾ドナープローブ、修飾アクセプタープローブおよびＲＮＡリガーゼと共にインキュベートされ、
前記修飾ドナープローブが、５’−リン酸化されるか、または５’−アデニル化される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＲＮＡ標的核酸断片が、修飾ドナープローブ、修飾アクセプタープローブおよびＲＮＡリガーゼと共にインキュベートされ、
前記修飾ドナープローブ、前記修飾アクセプタープローブまたは前記修飾ドナープローブと前記修飾アクセプタープローブの組合せが二本鎖である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記修飾ドナープローブと前記修飾アクセプタープローブの二量体化が、非修飾ドナープローブと前記非修飾アクセプタープローブの二量体化と比べて約５％〜約１００％低減または阻害される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記修飾ドナープローブと前記修飾アクセプタープローブの二量体化が、非修飾ドナープローブと前記非修飾アクセプタープローブの二量体化と比べて約７５％〜約１００％低減または阻害される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記修飾ドナープローブおよび前記修飾アクセプタープローブが、非修飾ドナープローブおよび非修飾アクセプタープローブを有する前記ＲＮＡ標的核酸へのライゲーションと同様の効率で前記ＲＮＡ標的核酸へライゲーションされる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記効率が約５％〜約２００％である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記効率が約５０％〜約２００％である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記効率が約５０％〜約１５０％である、請求項３５に記載の方法。アクセプター：ドナープローブ二量体形成を低減または阻害するＤＮＡ核酸ライブラリーを調製する方法であって、
ＤＮＡリガーゼおよび１つまたは複数の二本鎖修飾アダプタープローブを含む反応混合物中でＤＮＡ標的核酸断片をインキュベートするステップ
を含み、
前記二本鎖修飾アダプタープローブが、二本鎖修飾アクセプタープローブにハイブリダイズされる修飾ドナープローブを含み、
互いとの前記二本鎖修飾アダプタープローブの二量体化が低減または阻害される、方法。
【請求項３９】
前記二本鎖修飾アダプタープローブが、５’−リン酸基または５’−アデニル酸基または５’−ヒドロキシル基を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４０】
前記二本鎖修飾アダプタープローブが、アクセプタープローブの修飾もしくはドナープローブの修飾またはアクセプタープローブとドナープローブの両方の修飾を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記二本鎖修飾アダプタープローブが平滑末端を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記二本鎖修飾アダプタープローブがＴ−テイル末端を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記二本鎖修飾アダプタープローブが、末端に１つまたは複数の不対ヌクレオチドを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記不対ヌクレオチドが１〜１０個である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記不対ヌクレオチドが１〜４個である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
インキュベーション混合物が、ニックトランスレーションのための酵素を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
前記修飾ドナープローブと前記修飾アクセプタープローブの二量体化が、非修飾ドナープローブと非修飾アクセプタープローブの二量体化と比べて約５％〜約１００％低減または阻害される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】
前記修飾ドナープローブと前記修飾アクセプタープローブの二量体化が、非修飾ドナープローブと非修飾アクセプタープローブの二量体化と比べて約７５％〜約１００％低減または阻害される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４９】
修飾ドナープローブおよび修飾アクセプタープローブが、非修飾ドナープローブおよび非修飾アクセプタープローブを有するＤＮＡ標的核酸断片へのライゲーションと同様の効率で前記ＤＮＡ標的核酸断片へライゲーションされる、請求項３９に記載の方法。
【請求項５０】
前記効率が約５５〜約２００％である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記効率が約５０〜２００％である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記効率が約５０〜１５０％である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
核酸ライブラリーを調製するためのキットであって、前記ライブラリー調製を実施するための指示書、修飾ドナープローブ、修飾アクセプタープローブ、核酸リガーゼおよび任意選択でリガーゼ補因子を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２００９年７月６日に出願された「Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｏｆａｃｔｏｒｓ，Ｄｏｎｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｃｅｐｔｏｒｓ」と題する米国仮特許出願第６１／２２３，３６４号に関連し、２０１３年３月１５日に出願された「Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｏｆａｃｔｏｒｓ，Ｄｏｎｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｃｅｐｔｏｒｓ」と題する米国特許出願第１３／８３３，６００号の優先権を主張するものであり、それらはどちらもあらゆる目的でそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府による支援の声明
本発明は、国立総合医科学研究所、国立衛生研究所により与えられた認可番号ＧＭ０８５８６０および国立ヒトゲノム研究所、国立衛生研究所により与えられた認可番号ＨＧ００６８２０の政府による支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
核酸をライゲーションするための方法および組成物が本明細書に提供される。特定の態様および実施形態において、この方法および組成物は、マッチ核酸標的とミスマッチ核酸標的との間のリガーゼ特異性を改善し、かつ／または修飾リガーゼ補因子、ドナーおよびアクセプターならびにそれらの組合せを使用してテンプレート非依存性ライゲーションを低減もしくは阻害する。他の特定の態様および実施形態において、この方法および組成物は、プローブ二量体化を低減または阻害する修飾を有するアクセプターおよびドナーアダプタープローブを利用して核酸ライブラリーの形成に対するリガーゼ特異性を改善する。
【背景技術】
【０００４】
以下の説明は、読み手の理解を支援するために提供される。提供される情報または引用される参考文献はいずれも、本発明に対する従来技術であると認めるものではない。
【０００５】
核酸リガーゼは、ＡＴＰまたはＮＡＤ＋などの補因子の存在下で、核酸（例えばＲＮＡまたはＤＮＡ）の隣接する３’−ヒドロキシル末端と５’−ホスホリル末端との間のホスホジエステル結合の形成を触媒する種類の酵素に属する。リガーゼは、核酸配列検出、一塩基多型（ＳＮＰ）検出、タンパク質検出、ライゲーションによるシークエンシングおよびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を含むいくつかの分子生物学用途において用いられる。
【０００６】
生化学的忠実度の実験では、ＤＮＡリガーゼは、様々な核酸基質のミスマッチに許容性を示すことが見出されている。例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは、ミスマッチに対する許容性を有する結果、１０3個のミスマッチ二重鎖に１個を封鎖する傾向がある。Ｓｈｏｗａｌｔｅｒ，Ａ．Ｋ．ら、１０６  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ、３４０〜３６０頁（２００６）。それと比較して、従来のＤＮＡポリメラーゼの誤差率は、１０5〜１０6個のｄＮＴＰ挿入につき約１個という誤差であり、これはリガーゼよりも数桁高い忠実度である。ＤＮＡリガーゼの他の非定型接合反応には、分子内のループ形成（Ｗｅｓｔｅｒｎ，Ｌ．ら、１９  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、８０９〜８１３頁（１９９１））、非オーバーラップの平滑末端二重鎖の接合（Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ，Ｋ．ら、８９  Ｇｅｎｅ、１１７〜１２２（１９９０）、Ｃａｏ，Ｗ．、２２  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３８〜４４（２００４））およびテンプレート非依存性反応（Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ，Ｋ．ら、Ｋｕｈｎ，Ｈ．ら、２７２  ＦＥＢＳ  Ｊ、５９９１〜６０００（２００５））が含まれる。
【０００７】
ＤＮＡライゲーションの忠実度を改善するための様々な手法が記載されている。例えば、Ｌｕｏ，Ｊ．ら、２４  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、３０７９〜３０８５頁（１９９６）は、３’−ＯＨから上流の３番目のヌクレオチドの修飾、ユニバーサル塩基である３−ニトロピロールを有するアクセプターおよびリガーゼタンパク質の部位特異的変異誘発を開示している。Ｔｏｎｇ，Ｊ．ら、２７  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、７８８〜７９４頁（１９９９）；Ｆｅｎｇ，Ｈ．ら、４３  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１２６４８〜１２６５９頁（２００４）；Ｊｅｏｎ，Ｈ．ら、２３７  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．、１１１〜１１８頁（２００４）；Ｌｉｍ，Ｊ．ら、３８８  Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２５３〜２６０頁（２００１）；およびＬｕｏ，Ｊ．ら、２４  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、３０７１〜３０７８頁（１９９６）は、ＤＮＡリガーゼの変異するアミノ酸残基を開示している。Ｃａｏ，Ｗ．、２２  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３８〜４４頁（２００４）は、ライゲーション反応におけるエンドヌクレアーゼの使用を開示している。Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍ．ら、米国特許第６，２９７，０１６号は、アクセプターの修飾を開示している。Ｆｕｎｇ，Ｓ．ら、米国特許第５，５９３，８２６号は、３’−ＮＨ2置換アクセプタープローブを開示している。Ｂａｎｄａｒｕ，Ｒ．ら、米国特許第６，８１１，９８６号および同第６，６３５，４２５号は、ドナーの（５’−リン酸）鎖における５’−チオリン酸の使用を開示している。
【０００８】
修飾リガーゼ補因子は、リガーゼ補因子依存性を決定するために、ライゲーション阻害剤として使用されている。例えば、Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ，Ａ．ら、２７１  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．、２６５〜２６８（１９９０）；Ｓｈｕｍａｎ，Ｓ．、３４  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１６１３８〜１６１４７（１９９５）；Ｒａａｅ，Ａ．ら、８１  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２４〜２７頁（１９７８）；Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ，Ａ．Ｖ．ら、２６９  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５９９３−５９９９頁（２００２）；Ｂｅｌｆｏｒｄ，Ｈ．Ｇ．ら、２６８  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２４４４〜２４５０頁（１９９３）；Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ａ．Ｊ．ら、２７１  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１１０８３〜１１０８９頁（１９９６）；Ｈｏ，Ｃ．Ｋ．ら、７１  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、１９３１〜１９３７頁（１９９７）；Ｌａｉ，Ｘ．ら、６  Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ、４６９〜４７７頁（２００２）；およびＳｒｉｓｋａｎｄａ，Ｖ．ら、２８  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２２２１〜２２２８頁（２０００）参照。
【０００９】
核酸ライブラリー調製スキームは標的核酸の５’末端および３’末端へのアダプター配列の付加を含む。ＲＮＡライブラリーに関して、アダプターは典型的に、Ｔｉａｎ，Ｇ．ら、１０  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、６４（２０１０）に記載されているように、アダプター二量体形成を最小化するために２つの連続したライゲーションステップに加えられる。最初に、３’−アダプタープローブのアデニル化型が、５’−リン酸化プローブより５’−アデニル化を利用するＴ４  ＲＮＡリガーゼ２のトランケート型を使用して、ＡＴＰの非存在下でＲＮＡライブラリーの３’末端にライゲーションされる。次に、５’−アダプタープローブ配列が、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１を使用してＲＮＡライブラリーの５’末端に付加される。アダプター二量体形成を抑制する１つの手法は、Ｎａｋａｓｈｅ，Ｐ．ら、１  Ｊｏｕｒｎａｌ  ＯＭＩＣＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６〜１１頁（２０１１）に記載されているように、３’−アダプターのライゲーション後で５’−アダプターのライゲーションステップの前のｃＤＮＡ合成プライマーのハイブリダイゼーションによる。Ｋａｗａｎｏ，Ｍ．ら、４９  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、７５１〜７５５頁（２０１０）に記載されている別の手法は、下流の複製を遮断するためにアダプター二量体とＬＮＡ配列との間のハイブリダイゼーションステップを用いる。
【００１０】
Ｌｉｎｎａｒｓｓｏｎ，Ｓ．、３１６、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １３３９〜１３４３頁（２０１０）により概説されているように、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）のための調製において二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ライブラリーをタグ付けするいくつかの手法が記載されており、ほとんどはライゲーションステップを含む。１つの手法において、プローブ配列は、５’−リン酸化平滑末端ｄｓＤＮＡライブラリーへの一対の５’−リン酸化平滑末端ｄｓＤＮＡアダプタープローブ（Ｐ１およびＰ２）のライゲーションによってｄｓＤＮＡライブラリーに付加される。Ｐ１およびＰ２アダプター配列は単一のステップにおいてＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用してｄｓＤＮＡライブラリーの両方の末端に付加される。平滑末端アダプターライゲーション戦略は、ＳＯＬｉＤ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）および４５４  ＧＳ  ＦＬＸ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）ワークフローに典型的である。別の手法において、ｄｓＤＮＡライブラリーは、３’末端に単一のＡテイルを含有するｄｓＤＮＡライブラリーを生成する、異なる洗練ステップに供される。Ａ−テイルｄｓＤＮＡライブラリーは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用した単一のステップにおいて３’末端および５’リン酸に単一のＴテイルを含有するｄｓＤＮＡアダプターにライゲーションされる。Ａ−テイルライゲーション戦略はＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に典型的である。３つの手法すべては、Ｌｉｎｎａｒｓｓｏｎ，Ｓ．、３１６、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １３３９〜１３４３頁（２０１０）；Ｑｕａｉｌ，Ｍ．Ａ．ら、５、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １００５〜１０１０頁（２００８）およびＨｕａｎｇ，Ｊ．ら、６、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、ｅ１９７２３（２０１１）に記載されているようにアダプター二量体を形成する傾向がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
核酸ライゲーションのための方法および組成物が本明細書に提供される。これらの方法は、核酸ライゲーション反応における核酸リガーゼ、核酸基質、リガーゼ補因子、ドナー、アクセプターの使用を含む。ある種の態様では、方法は、修飾リガーゼ補因子、修飾ドナー、修飾アクセプターまたはそれらの組合せ（本明細書ではまとめて「修飾リガーゼ構成要素」と呼ぶ）の使用を伴い、これにより、核酸ライゲーションの忠実度を改善する。好ましい実施形態では、修飾リガーゼ補因子は、修飾ＡＴＰおよび修飾ＮＡＤ＋である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一態様によれば、標的核酸の変異を検出する方法が提供される。本明細書に提供される態様のある種の実施形態では、方法は、標的核酸を、補因子依存性核酸リガーゼ、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドを含む反応混合物中でインキュベートするステップであって、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドの１つまたは複数が修飾されているステップと、ドナーおよびアクセプターポリヌクレオチドのライゲーションをモニターするステップであって、ライゲーションの量が、変異の有無を示す、ステップとを含む。
【００１３】
第２の態様では、標的核酸の一塩基多型（ＳＮＰ）部位における代替塩基の１つの有無を検出する方法が提供される。本明細書に提供される態様のある種の実施形態では、方法は、標的核酸を、補因子依存性核酸リガーゼ、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドを含む反応混合物中でインキュベートするステップであって、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドの１つまたは複数が修飾されている、ステップと、ドナーおよびアクセプターポリヌクレオチドのライゲーションをモニターするステップであって、ライゲーションの量が、標的核酸の一塩基多型（ＳＮＰ）部位において代替塩基の１つの有無を示す、ステップとを含む。
【００１４】
第３の態様では、標的核酸中の第１の核酸配列または第２の核酸配列の存在を識別する方法が提供される。本明細書で提供される態様のある種の実施形態では、方法は、標的核酸を、補因子依存性核酸リガーゼ、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドを含む反応混合物中でインキュベートするステップであって、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドの１つまたは複数が修飾されている、ステップと、ドナーおよびアクセプターポリヌクレオチドのライゲーションをモニターするステップであって、ライゲーションした核酸の存在または量が、標的核酸中の第１の核酸配列の存在もしくは量を示し、および／または標的核酸中の第２の核酸配列の非存在を示し、ライゲーションの非存在が、標的核酸中の第１の核酸配列の非存在を示す、ステップとを含む。
【００１５】
第４の態様では、標的核酸の特定の位置における特定のヌクレオチドの有無を決定する方法を提供する。本明細書で提供される態様のある種の実施形態では、方法は、標的核酸を、補因子依存性核酸リガーゼ、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドを含む反応混合物中でインキュベートするステップであって、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドの１つまたは複数が修飾されている、ステップと、ドナーおよびアクセプターポリヌクレオチドのライゲーションをモニターするステップであって、ライゲーションした核酸の存在が、標的核酸の特定の位置における特定のヌクレオチドの存在を示し、ライゲーションの非存在が、標的核酸の特定の位置における特定のヌクレオチドの非存在を示す、ステップを含む。
【００１６】
第５の態様では、本明細書で提供される組成物を含むキットおよび本明細書で提供される方法を実施するためのキットが提供される。本明細書に記載の通りライゲーションを実施するための修飾ライゲーション構成要素を含むキットも提供される。例えばキットは、酵素であるリガーゼおよび修飾補因子を含有して、対立遺伝子に特異的な産物などの共通の核酸標的を検出することができる。修飾ライゲーション構成要素を含有するキットは、核酸ライゲーション用に印を付された容器、核酸ライゲーションを実施するための指示、ならびに／または修飾補因子、核酸リガーゼおよび反応バッファーからなる群から選択される１つもしくは複数の試薬を含むことができる。修飾ライゲーション構成要素を含有するキットは、１つまたは複数のドナーおよびアクセプターポリヌクレオチドを含むこともできる。一実施形態では、修飾ドナーおよびアクセプターポリヌクレオチドは修飾されている。キットは、核酸ライゲーション用に印を付された容器、核酸ライゲーションを実施するための指示、ならびに少なくとも１つの修飾ライゲーション構成要素および／またはリガーゼ補因子、核酸リガーゼ、マグネシウム、ドナー配列、アクセプター配列および反応バッファーからなる群から選択される１つもしくは複数の試薬を含むことができる。
【００１７】
第６の態様では、本明細書に記載の通りライゲーションを実施するための修飾ライゲーション構成要素を同定する方法も提供される。いくつかの実施形態では、方法は、天然ライゲーション構成要素または他の修飾ライゲーション構成要素と比較して改善された特異性を有する修飾補因子を同定する。例えば、方法は、マッチテンプレートまたはミスマッチテンプレートの存在下での修飾補因子の性能を評価することができる。いくつかの実施形態では、ミスマッチ領域はドナープローブにハイブリダイズし、他の実施形態では、ミスマッチ領域はアクセプタープローブにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、修飾補因子の性能は、核酸テンプレートが存在しない場合のライゲーション活性の低減または阻害について評価される。いくつかの実施形態では、方法は、天然または非修飾補因子と比較して、改善されたライゲーション特異性を有する修飾ライゲーション構成要素を同定する。いくつかの実施形態では、方法は、修飾ライゲーション構成要素の使用が、天然または非修飾補因子と比較して類似のライゲーション率をマッチ核酸に提供するような修飾ライゲーション構成要素を同定することができる。他の実施形態では、方法は、天然または非修飾補因子と比較して、ミスマッチ核酸の存在下で改善されたライゲーション特異性を有する修飾ライゲーション構成要素を同定することができる。さらなる他の実施形態では、方法は、ライゲーション接合点またはライゲーション接合点の１０塩基以内において１つまたは複数の塩基対のミスマッチが存在する場合のライゲーションの量または収率について、修飾ライゲーション構成要素を評価する。またさらなる実施形態では、方法は、核酸テンプレートが存在しない場合のライゲーションを低減または阻害する能力について、修飾ライゲーション構成要素を評価する。
【００１８】
第７の態様では、標的核酸が存在しない場合のライゲーションを低減または阻害するための方法が提供される。本明細書で提供される態様のある種の実施形態では、方法は、標的核酸を、補因子依存性核酸リガーゼ、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドを含む反応混合物中でインキュベートするステップであって、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドおよびアクセプターポリヌクレオチドの１つまたは複数が修飾されており、修飾ライゲーション構成要素が存在する場合、標的核酸が存在しない場合のライゲーションが阻害または低減される、ステップを含む。
【００１９】
本明細書に提供される組成物および方法のいくつかの実施形態は、修飾ライゲーション構成要素、特に修飾リガーゼ補因子、修飾アクセプター、修飾ドナーおよびそれらの組合せを含む。特定の実施形態では、修飾ライゲーション構成要素には、本明細書でさらに詳説する式Ｉ〜ＩＩＩに図示されるものが含まれる。
【００２０】
本明細書で提供される方法および組成物の修飾ライゲーション構成要素は、著しい利点を有する。例えば、最終使用者は、非修飾／天然補因子（すなわち、ＡＴＰおよびＮＡＤ＋）、非修飾ドナープローブまたは非修飾アクセプタープローブを用いて既に行っているのと同じまたは類似のライゲーションプロトコールおよび方法を使用することができる。本明細書で提供される方法および組成物の修飾ライゲーション構成要素は、既存のライゲーション系および試薬と適合性があり、追加の酵素または試薬を必要としないが、それらを使用することができる。
【００２１】
本明細書で提供される方法および組成物の修飾ライゲーション構成要素は、相補的な標的の存在下での核酸ライゲーションについて、非修飾ライゲーション構成要素と比較して、好ましくは少なくともほぼ同じ効率を有する。好ましくは、修飾ライゲーション構成要素が、その対応する非修飾ライゲーション構成要素と比較して、ライゲーション反応における試薬として少なくとも５０％有効性が低い場合、その対応する非修飾ライゲーション構成要素と比較して、ライゲーション反応における試薬として好ましくは少なくとも６０％有効性が低い、好ましくは少なくとも７０％有効性が低い、より好ましくは少なくとも８０％有効性が低い、より好ましくは少なくとも９０％有効性が低い、より好ましくは少なくとも９５％有効性が低い、より好ましくは少なくとも９９％有効性が低い、最も好ましくは１００％有効性が低い場合に、非相補的またはミスマッチ標的核酸の存在下でのライゲーションが損なわれるとみなされる。当業者は、修飾ライゲーション構成要素のライゲーション活性および効率のレベルを容易に決定することができる。
【００２２】
本明細書に提供される方法および組成物の修飾ライゲーション構成要素は、非修飾ライゲーション構成要素と比較して、好ましくはミスマッチ標的の存在下での核酸ライゲーション効率をもたず、またはその効率が低い。
【００２３】
第８の態様では、プローブ二量体化を低減または阻害するリガーゼ酵素と共に修飾アクセプターアダプタープローブ（本明細書で「修飾３’−アダプタープローブ」および「修飾アクセプタープローブ」とも称される）および修飾ドナーアダプタープローブ（本明細書で「修飾５’−アダプタープローブ」および「修飾ドナープローブ」とも称される）（本明細書でまとめて「修飾アダプタープローブ」と称される）を利用して核酸ライブラリーを調製する方法が提供される。本発明のこの態様では、修飾アダプタープローブは一本鎖である。ある種の実施形態では、プローブ二量体化を低減または阻害する方法は、核酸リガーゼおよび５’−アデニル化修飾ドナーアダプタープローブを有する反応混合物中で標的核酸ライブラリーをインキュベートする第１のステップ、ならびに補因子依存性核酸リガーゼ、リガーゼ補因子および修飾アクセプターアダプタープローブを含む反応混合物中で標的核酸ライブラリーをインキュベートする第２のステップを含む。ある種の実施形態では、方法は、補因子依存性核酸リガーゼ、リガーゼ補因子、修飾ドナーアダプタープローブおよび修飾アクセプターアダプタープローブを含む反応混合物中で標的核酸ライブラリーをインキュベートするステップを含む。あるいは、リガーゼ補因子もまた、修飾されてもよい。あるいは、修飾ドナーアダプタープローブは５’−リン酸化されてもよい。各ライブラリー調製法は、ライブラリーに対するアダプタープローブの効果的なライゲーションならびにアダプタープローブ二量体化の低減または阻害を提供する。さらに、形成し得る任意のアダプター二量体は２つ以上の連続修飾基を有し、それによって核酸ポリメラーゼによる複製を抑制する。
【００２４】
第９の態様では、プローブ二量体化を低減または阻害するリガーゼ酵素と共に修飾アクセプターアダプタープローブおよび修飾ドナーアダプタープローブを利用して核酸ライブラリーを調製する方法が提供される。本発明のこの態様では、修飾アダプタープローブは二本鎖である。ある種の実施形態では、二本鎖修飾アダプタープローブは修飾ドナーアクセプタープローブにハイブリダイズした修飾アクセプターアダプタープローブを含む。修飾アダプターおよびドナープローブの相補性は完全であってもよく、または部分的であってもよい。ある種の実施形態では、二本鎖修飾アダプタープローブは、修飾ドナーアダプタープローブのみ、修飾アクセプターアダプタープローブのみ、または修飾ドナーアダプタープローブと修飾アクセプターアダプタープローブの両方に対する修飾を含んでもよい。ある種の実施形態では、ライブラリー調製は核酸ライブラリーと二本鎖修飾アダプタープローブとの間に平滑末端ライゲーションステップを含む。他のある種の実施形態では、ライブラリー調製法は、核酸ライブラリーと二本鎖修飾アダプタープローブとの間に相補性の単一ヌクレオチドが存在するライゲーションステップを含む。他のある種の実施形態では、ライブラリー調製法は、核酸ライブラリーと二本鎖修飾アダプタープローブとの間に複数のヌクレオチドに対して１つの相補性の一本鎖領域、例えば、制限エンドヌクレアーゼの使用によって生成される領域が存在するライゲーションステップを含む。ある種の実施形態では、方法は、改善されたライブラリー調製特異性および低減または阻害したプローブ二量体化のための補因子依存性核酸リガーゼ、リガーゼ補因子および１つまたは複数の二本鎖修飾アダプタープローブを含む反応混合物中で標的核酸ライブラリーをインキュベートするステップを含む。ある種の実施形態では、プローブ二量体化を低減または阻害する方法は、核酸リガーゼを有する反応混合物中で５’−リン酸化標的核酸ライブラリーおよびニックトランスレーションに使用される酵素を有する反応混合物中で５’−ヒドロキシルを有する二本鎖修飾アダプタープローブをインキュベートする第１のステップを含む。ある種の実施形態では、プローブ二量体化を低減または阻害する方法は、核酸リガーゼおよび５−アデニル化二本鎖修飾アダプタープローブを有する反応混合物中で標的核酸ライブラリーをインキュベートする第１のステップ、ならびにリガーゼ補因子を反応混合物に加える第２のステップを含む。あるいは、リガーゼ補因子もまた、修飾されてもよい。各ライブラリー調製法は、ライブラリーに対するアダプタープローブの効果的なライゲーションならびにアダプタープローブ二量体化の低減または阻害を提供する。さらに、形成し得る任意のアダプター二量体は２つ以上の連続修飾基を有し、それによって核酸ポリメラーゼによる複製を抑制する。
【００２５】
第１０の態様では、これらの組成物は核酸ライブラリーを調製するためのキットで提供され得る。１つまたは複数の実施形態では、キットは、ライゲーションを実施するための１つまたは複数の修飾ドナーおよびアクセプタープローブ、１つまたは複数のリガーゼ酵素ならびに／または１つまたは複数の修飾補因子を含んでもよい。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「リガーゼ補因子」は、リガーゼのリシンのε−アミノ基が、補因子（例えば、ＡＴＰまたはＮＡＤ＋）のアルファリン酸（すなわち、アデノシン構成要素の５’酸素に直接結合しているリン酸）を攻撃して共有結合性のホスホルアミド酸連結を形成するように（例えば、図１に示す通り）、リガーゼと相互作用する化合物を指す。ある種の実施形態では、リガーゼ補因子は、ＡＴＰ、ＮＡＤ＋またはＧＴＰである。一般にリガーゼは、ＡＴＰ依存性またはＮＡＤ＋依存性である。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「修飾リガーゼ補因子」は、置換基が結合しているリガーゼ補因子を指す。好ましい実施形態では、修飾リガーゼ補因子は、修飾ＡＴＰまたは修飾ＮＡＤ＋である。いくつかの実施形態では、修飾リガーゼ補因子は、２つ以上の置換基を有する。修飾補因子には、本明細書に図示した、例えば式Ｉのものが含まれる。ある種の実施形態では、修飾リガーゼ補因子は、ＡＴＰ−αＳ（すなわち、５’−α−チオアデノシン三リン酸）、ＡＴＰ−γＳ（すなわち、５’−［γ−チオ］−三リン酸）またはＡＭＰ−ＰＮＰ（すなわち、５’−［β，γ−イミド］−三リン酸）ではない。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「修飾リガーゼ補因子」に関連する用語「非修飾リガーゼ補因子」または「天然リガーゼ補因子」は、置換基を含まない対応するリガーゼ補因子を指す。例えば、修飾ＡＴＰに対する非修飾リガーゼ補因子は、ＡＴＰである。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「ドナー」、「ドナーポリヌクレオチド」、「５’−リン酸化ドナーポリヌクレオチド」または「ドナープローブ」は、アクセプターにライゲーションすることができる５’リン酸を有するポリヌクレオチドを指す。ドナーは、核酸ライゲーションに適した条件下で、相補的な標的核酸上のアクセプターの近接でハイブリダイズする場合のライゲーションに適することができ、好ましくは、アクセプターおよびドナーは、相補的な標的核酸上で互いに隣接してハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ドナーは、標的核酸と相補的でない（ミスマッチ）少なくとも１つの核酸部位を有する。特定の実施形態では、ミスマッチは、目的のヌクレオチド（例えばＳＮＰ部位）に存在する。本明細書で提供する方法および組成物に適したさらなる代替のポリヌクレオチドには、限定されるものではないが、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、修飾リン酸−糖−主鎖オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体およびそれらの混合物が含まれる。好ましい実施形態では、ドナーはオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、用語「修飾ドナー」、「修飾ドナーポリヌクレオチド」または「修飾ドナープローブ」は、置換基を有するドナーを指す。好ましくは、置換基は、ライゲーション接合点に近接している（例えば、ライゲーション接合点の１、２、３、４または５ヌクレオチド下流）。好ましい実施形態では、置換基は、リボースおよび／または１つもしくは複数のヌクレオチド間リン酸の２’位置にある。いくつかの実施形態では、修飾ドナーは、２つ以上の置換基を有する。修飾ドナーには、本明細書に図示した、例えば式ＩＩＩのものが含まれる。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「アクセプター」、「アクセプターポリヌクレオチド」、「３’−ヒドロキシル末端アクセプターポリヌクレオチド」または「アクセプタープローブ」は、ドナーにライゲーションすることができる３’ＯＨ基を有するポリヌクレオチドを指す。アクセプターは、核酸ライゲーションに適した条件下で、相補的な標的核酸上のドナーの近接でハイブリダイズする場合のライゲーションに適することができ、好ましくは、アクセプターおよびドナーは、相補的な標的核酸上で互いに隣接してハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、アクセプターは、標的核酸と相補的でない（ミスマッチ）少なくとも１つの核酸部位を有する。特定の実施形態では、ミスマッチは、目的のヌクレオチド（例えばＳＮＰ部位）にある。本明細書に提供する方法および組成物に適したさらなる代替のポリヌクレオチドには、限定されるものではないが、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、修飾リン酸−糖−主鎖オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体およびそれらの混合物が含まれる。好ましい実施形態では、アクセプターはオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、用語「修飾アクセプター」、「修飾アクセプターポリヌクレオチド」または「修飾アクセプタープローブ」は、置換基を有するアクセプターを指す。好ましくは、置換基は、ライゲーション接合点に近接している（例えば、ライゲーション接合点の１、２、３、４または５ヌクレオチド上流）。好ましい実施形態では、置換基は、リボースおよび／または１つもしくは複数のヌクレオチド間リン酸の２’位置にある。いくつかの実施形態では、修飾アクセプターは、２つ以上の置換基を有する。修飾アクセプターには、本明細書に図示した、例えば式ＩＩのものが含まれる。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「修飾アクセプタープローブ」は、５’−修飾アダプタープローブ、修飾ドナーアダプタープローブ、修飾アクセプターアダプタープローブおよび３’−修飾アダプタープローブを指す。修飾アダプタープローブは一本鎖であってもよく、または二本鎖であってもよく、それぞれ、「一本鎖修飾アダプタープローブ」および「二本鎖修飾アダプタープローブ」と呼ぶ。ある種の実施形態において、二本鎖修飾アダプタープローブは、修飾ドナーアダプタープローブにハイブリダイズした修飾アクセプターアダプタープローブを含む。この状況において、修飾アクセプターおよびドナープローブの相補性は完全であってもよく、または部分的であってもよい。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「置換基」は、リガーゼ補因子、ドナーまたはアクセプターに結合することができる任意の化学的な部分を指す。置換基は、限定されるものではないが、リン酸、糖、三リン酸、ヌクレオシド塩基部分およびヌクレオチド間連結を含む位置に結合することができる。置換基は、核酸ライゲーションの過程と適合性のある任意の性質の基であってもよい。好ましい実施形態では、置換基は、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドまたはアクセプターポリヌクレオチドに結合している場合、核酸ライゲーションの特異性または忠実度を増大する（例えば、相補的な核酸をライゲーションし、非相補的な核酸をライゲーションしないか、またはそのライゲーションを低減する能力）。好ましい実施形態では、置換基は、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドまたはアクセプターポリヌクレオチドに結合している場合、置換基が存在しない場合のライゲーションと比較して、非相補的な核酸のライゲーションを低減、阻害または排除する。好ましい実施形態では、置換基は、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドまたはアクセプターポリヌクレオチドに結合している場合、相補的な核酸のライゲーションと比較して、非相補的な核酸のライゲーションを低減、阻害または排除する。好ましい実施形態では、置換基は、リガーゼ補因子、ドナーポリヌクレオチドまたはアクセプターポリヌクレオチドに結合している場合、テンプレートが存在しない場合のライゲーションを低減、阻害または排除する。他の好ましい実施形態では、置換基は、ドナーポリヌクレオチドまたはアクセプターポリヌクレオチドに結合している場合、核酸ライブラリーに対する有効なライゲーションを可能にしながら、アダプター二量体を形成するライゲーションを低減、阻害または排除する。
【００３３】
さらに、置換基は、検出可能な標識を含むことができる。したがって標識化核酸は、ライゲーション後に、大きさ、質量、アフィニティーキャプチャーおよび／または色によって同定することができる。検出可能な標識には、限定されるものではないが、発色団、蛍光部分、酵素、抗原、重金属、磁気プローブ、色素、リン光基、放射性材料、化学発光部分および電気化学的な検出部分が含まれる。検出可能な標識は、好ましくは蛍光色素であり、好ましいアフィニティーキャプチャー標識はビオチンである。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「修飾ライゲーション構成要素」は、修飾リガーゼ補因子、修飾アクセプターおよび修飾ドナーを指し、各構成要素を個々に、まとめて、またはそれらの組合せを指す。例えば、修飾ライゲーション構成要素は、修飾リガーゼ補因子のみ；１種類の修飾を有する修飾リガーゼ補因子；２種類以上の修飾を有する修飾リガーゼ補因子；修飾リガーゼ補因子および修飾ドナー；修飾リガーゼ補因子および修飾アクセプター；または修飾リガーゼ補因子、修飾リガーゼアクセプターおよび修飾リガーゼドナーを指すことができる。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「ライゲーション」または「ライゲーションする」は、ポリヌクレオチドを接合するための、当技術分野で公知の方法を指す。好ましくは、ライゲーションは、アクセプターポリヌクレオチドの３’末端を、ドナーポリヌクレオチドの５’末端に接合することを指す。いくつかの実施形態では、二重鎖核酸のニックがライゲーションされて、ホスホジエステル結合または等価なヌクレオチド間結合を形成し、それによってテンプレート核酸配列のより長い相補的なコピーが形成される。ニックの入った二重鎖核酸は、相補的な核酸テンプレートにハイブリダイズした３’−ヒドロキシル末端アクセプターオリゴヌクレオチドと、アクセプターオリゴヌクレオチドのすぐ下流にハイブリダイズした５’−リン酸化ドナーオリゴヌクレオチドからなる。本明細書で提供する組成物および方法を伴うライゲーションは、核酸リガーゼによる接合と共に、１つまたは複数の修飾補因子、１つまたは複数の修飾ドナーおよび修飾アクセプターポリヌクレオチドを用いることができる。標的核酸上でのドナーおよびアクセプタープローブのライゲーションは、ライゲーションされるプローブのターンオーバーを伴って、またはそれなしに生じ得る。好ましくは、ライゲーションはターンオーバーを伴って生じる。テンプレート核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡおよび／もしくは修飾核酸テンプレート、またはそれらの任意の組合せであってよい。以下に記載の例示的な方法はライゲーションに関するものであるが、本明細書で提供する方法および組成物に適した核酸の酵素的ライゲーションのための数々の他の方法が、当技術分野で公知である。本明細書で使用される場合、用語「ライゲーション接合点」は、ドナープローブとアクセプタープローブがライゲーションされる、テンプレートに沿った２つの隣接する核酸の位置を指す。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「平滑末端ライゲーション」は、テンプレートが存在しない場合のＴ４  ＤＮＡリガーゼによる２つのｄｓＤＮＡ二重鎖の接合を指す。平滑末端ライゲーションは、本質的に効果がより低く、使用するにはより高いリガーゼ濃度を必要とする。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは、Ｔａｂｏｒ，Ｓｔａｎｌｅｙ．ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅｓ．Ｃｈａｐｔｅｒ  ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｏｏｋ  １．２００１  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅに記載されている、平滑末端をアニールするための唯一市販されているＤＮＡリガーゼである。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「リガーゼ」または「核酸リガーゼ」は、核酸をライゲーションすることができる酵素を指す。好ましくは、リガーゼは、アクセプターポリヌクレオチドの３’末端を、ドナーポリヌクレオチドの５’末端にライゲーションすることができる。他の実施形態では、ニックの入った二重鎖は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡおよび／もしくは他の修飾ヌクレオシド、またはそれらの任意の組合せを含有することができる。いくつかの実施形態では、リガーゼは、以下のものの１つである：
バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡリガーゼ、９°ＮTMＤＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＲＮＡリガーゼ、Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ  ＤＮＡリガーゼ、ヒトＤＮＡリガーゼＩ、ヒトＤＮＡリガーゼＩＩ、ヒトＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ヒトＤＮＡリガーゼＩＶ、ワクチニアウイルスＤＮＡリガーゼ、ＣｈｌｏｒｅｌｌａウイルスＤＮＡリガーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｉｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ  ａｍｂｉｖａｌｅｎｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  ＤＮＡリガーゼ、Ｃｅｎａｒｃｈｅｏｎ  ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ  ＤＮＡリガーゼ、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ  ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄａｒｍａｎｕｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓ  ｐｈａｒａｏｓｉｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｈａｌｏｑｕａｄｒａｔｕｍ  ｗａｌｓｂｙｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｌｉｎａｒｕｍ  ＤＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｂｕｒｔｏｎｉｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｈｕｎｇａｔｅｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  ＤＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｔａｄｔｍａｎａｅ  ＤＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｕｍ  ｅｑｕｉｔａｎｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ  ＤＮＡリガーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ  ｔｏｒｒｉｄｕｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｈｉｂａｔａｅ  ＤＮＡリガーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＮＡ１ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ  ＤＮＡリガーゼ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ  ＮＡＤ+−ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＤＮＡリガーゼ、テルムス種ＡＫ１６Ｄ  ＤＮＡリガーゼ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＮＡリガーゼ、バクテリオファージＴ７ＤＮＡリガーゼ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ＤＮＡリガーゼ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＤＮＡリガーゼ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ  ＲＮＡリガーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＲＮＡリガーゼ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＲＮＡリガーゼ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ＲＮＡリガーゼ、バクテリオファージＴ４  ＲＮＡリガーゼ１、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ、およびバクテリオファージＴ４  ＲＮＡリガーゼ２。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「ライゲーションをモニターする」とは、ライゲーションされた核酸の存在を検出すること、非存在を検出すること、および／またはその量を測定することを指す。ライゲーションは、例えば、ゲル電気泳動法もしくは検出可能な標識（例えば、蛍光または化学発光プローブ）を使用してライゲーション産物を検出し、および／もしくはその量を定量化することによって、またはその後の過程による産物の存在および／もしくは量を、ライゲーション産物の存在および／もしくは量と関連付けることによって（例えば、ライゲーションされた産物のその後の増幅の存在および／または量を、ライゲーション産物の量と直接関連付けることによって）、モニターすることができる。またライゲーションをモニターすることは、核酸の大きさを評価してライゲーションが生じたか否かを示し、または試料内に存在するすべての核酸のどの部分がライゲーションされ、どの部分がライゲーションされなかったかを評価する任意の方法を含み、かかる結果は、百分率または比率として表すことができる。ライゲーションをモニターすることは、本明細書に開示の方法ならびに当技術分野で公知の方法のいずれかを含む。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「複製」は、核酸配列のコピーの酵素形成を指す。複製は、典型的に、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼを含んでよい、核酸ポリメラーゼの使用により達成される。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「核酸」は、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはその任意のフラグメント、任意のリボ誘導体もしくはデオキシリボ誘導体を指し、天然および／または修飾ヌクレオチド残基およびヌクレオチド間結合を含有する、天然に存在するまたは合成の分子を指す。これらの句はまた、一本鎖、二本鎖、三本鎖もしくは四本鎖であってよく、センス鎖もしくはアンチセンス鎖を表してもよい天然起源の（例えばゲノムの）もしくは合成起源のＤＮＡもしくはＲＮＡを指し、または任意のＤＮＡのようなもしくはＲＮＡのような材料を指す。ＤＮＡ配列に関する「ＲＮＡ等価物」は、窒素性塩基であるチミンのすべてまたはほとんどの存在がウラシルで置き換えられ、糖主鎖が２’−デオキシリボースの代わりにリボースから構成されていることを除き、参照ＤＮＡ配列と同じ直線状ヌクレオチド配列から構成される。本明細書で提供する方法および組成物に適したさらなる代替の核酸主鎖には、限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロセレノエート、アルキルホスホトリエステル、アリールホスホトリエステル、アルキルホスホネート、アリールホスホネート、Ｌｏｃｋｅｄ核酸（ＬＮＡ）およびペプチド核酸（ＰＮＡ）およびホスホボロネート、ならびにそれらの組合せが含まれる。ＲＮＡは、本明細書に記載の方法において使用することができ、および／または本明細書に記載の方法において使用するために、逆転写によってｃＤＮＡに変換することができる。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、通常は一本鎖の核酸鎖を指し、これは天然に存在するものまたは合成のものであってよい。本願を通して、核酸は５’末端から３’末端で表記される。標準の核酸、例えばＤＮＡおよびＲＮＡは、「３’から５’に」、すなわち成長する核酸の５’末端にヌクレオチドを付加することによって化学的に合成されることが多い。ポリヌクレオチドには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、他の修飾ヌクレオシドまたはそれらの組合せが含まれ得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、リン酸基、５−炭素糖および窒素性塩基からなる核酸のサブユニットを指す。ＲＮＡにおいて見出される５’−炭素糖は、リボースである。ＤＮＡでは、５’−炭素糖は２’−デオキシリボースである。この用語は、かかるサブユニットの類似体も含む。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、約５〜約２００ヌクレオチド、より好ましくは約１０〜約１００ヌクレオチド、より好ましくは約１０〜約７０、より好ましくは約１０〜約５０ヌクレオチド、より好ましくは約１０〜約３０ヌクレオチド、またはより好ましくは約１５〜約２５ヌクレオチドの配列を有するポリヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも３５ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも４５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも５５ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチド、少なくとも６５ヌクレオチド、少なくとも７０ヌクレオチド長、少なくとも７５ヌクレオチド、少なくとも８０ヌクレオチド長、少なくとも９０ヌクレオチド長、少なくとも１００ヌクレオチド長、少なくとも２００ヌクレオチド長、または２００ヌクレオチド未満、１５０ヌクレオチド未満、１００ヌクレオチド未満、９０ヌクレオチド未満、８０ヌクレオチド未満、７０ヌクレオチド未満、６５ヌクレオチド未満、６０ヌクレオチド未満、５５ヌクレオチド未満、５０ヌクレオチド未満、４５ヌクレオチド未満、４０ヌクレオチド未満、３５ヌクレオチド未満、３０ヌクレオチド未満、２５ヌクレオチド未満、２０ヌクレオチド未満、１５ヌクレオチド未満、もしくはそれらの組合せの長さの配列を含む。ある種の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチド長である。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「プライマー」または「オリゴヌクレオチドプライマー」は、酵素をベースとする核酸の伸長反応、例えば増幅およびライゲーションを開始するのに適したポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを指す。当業者は、標的配列の伸長に適したプライマーを設計し、調製することができる。本明細書で提供する方法および組成物において使用するためのプライマーの長さは、ヌクレオチド配列の同一性、およびこれらの核酸をハイブリダイズする温度またはインビトロでの核酸の伸長中に使用される温度を含むいくつかの因子に応じて変わる。特定の配列同一性のプライマーの好ましい長さを決定するのに必要な考慮すべき点は、当業者に周知である。例えば、短い核酸またはオリゴヌクレオチドの長さは、そのハイブリダイゼーションの特異性または選択性に関係し得る。本明細書で使用される場合、用語「プライマー結合性配列」または「ＰＢＳ」は、特異的プライマーに特異的にハイブリダイズし、またはアニールする核酸領域を指す。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「プローブ」または「オリゴヌクレオチドプローブ」は、特異的な核酸の有無を検出するのに適したポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを指す。
【００４５】
本明細書で使用される場合、用語「標的核酸」は、目的の任意の核酸を指す。
【００４６】
本明細書で使用される場合、用語「テンプレート核酸」は、ドナーおよび／またはアクセプターに結合することができる核酸を指す。好ましくは、テンプレート核酸は標的核酸を含む。
【００４７】
本明細書で使用される場合、用語「変異」は、第２の核酸配列と比較した場合の第１の核酸配列の、配列の差異を指す。例えば変異は、第２の核酸配列と比較した第１の標的核酸配列における、核酸の置換（一塩基多型など）、欠失、挿入および転移を含む。第２の核酸配列は、野生型配列または代替の変異部位の配列であってよい。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「ミスマッチ」は、標的ヌクレオチドまたは核酸と相補的でないヌクレオチドまたは核酸を指す。本明細書で使用される場合、用語「ミスマッチテンプレート」または「ミスマッチなテンプレート」は、一方の鎖上の少なくとも１つの塩基残基が、任意の残基と対になっていないか、または不正確な塩基と対になっている（例えば、Ｔと対になっていないＡ、またはＧと対になっていないＣ）二本鎖核酸を指す。１００％未満の忠実度／特異性を有するライゲーション反応は、ミスマッチライゲーション産物を形成する。本明細書で使用される場合、用語「マッチテンプレート」は、あらゆる塩基がドナーおよびアクセプタープローブと相補的な標的核酸を指す。
【００４９】
本明細書で使用される場合、用語「一塩基多型」または「ＳＮＰ」は、ある種または他の特異的な集団の異なる個体間における一塩基の遺伝的配列変異を指す。いくつかの実施形態では、ＳＮＰは、ある集団の正常な個体において異なる配列代替物（対立遺伝子）が存在する、ゲノムＤＮＡの特異的な核酸部位における一塩基対の位置のことであり、この場合最も頻度の低い対立遺伝子は、１％以上、または０．８％以上、または０．５％以上、または０．４％以上、または０．３％以上、または０．２％以上、あるいは０．１％以上の存在度を有する。いくつかの実施形態では、目的のＳＮＰは当業者に公知であり、例えば特定のＳＮＰは、Ｐｕｂｍｅｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／で利用可能）を介して利用できる、Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎａｔｕｒｅ、ＰＮＡＳおよびＮＥＪＭなどの科学誌により発表されている。いくつかの実施形態では、ＳＮＰは、Ｅｎｔｒｅｚ  ＳＮＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｓｎｐで利用可能）に見出されるものなどの多型のデータベースまたはヒトＳＮＰデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ＳＮＰ／で利用可能）に見出すことができる。いくつかの実施形態では、集団は、特定の人種、国籍、地理上の領域、家系、宗教、性別、年齢または特定の時期もしくは時代のヒトの群などのヒト全体またはそのサブセットとしてのあらゆるヒトを含む。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語「一塩基多型部位」、「ＳＮＰ部位」または「ＳＮＰ位置」は、ＳＮＰが存在することが知られている核酸の位置を指す。
【００５１】
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド（好ましくはオリゴヌクレオチド）に関連する用語「末端」は、ポリヌクレオチドの３’または５’末端におけるヌクレオチドを指す。好ましくは、ポリヌクレオチドの末端は、末端の６つのヌクレオチド、より好ましくは末端の５つのヌクレオチド、より好ましくは末端の４つのヌクレオチド、より好ましくは末端の３つのヌクレオチド、より好ましくは末端の２つのヌクレオチド、またはより好ましくは末端のヌクレオチドを含む。
【００５２】
本明細書で使用される場合、用語「標識」または「検出可能な標識」は、標識を検出することによって分子を直接的または間接的に検出できるように分子と結合することができ、またはその他の方法で会合することができる任意の化合物または化合物の組合せを指す。検出可能な標識は、放射性同位体（例えば、炭素、リン、ヨウ素、インジウム、硫黄、トリチウム等）、質量同位体（例えば、Ｈ2、Ｃ13またはＮ15）、色素もしくはフルオロフォア（例えば、シアニン、フルオレセインまたはローダミン）、ハプテン（例えば、ビオチン）、または直接的もしくは間接的に検出され得る任意の他の薬剤であってもよい。標識を、標識化ＮＴＰをアンプリコンまたは他の重合化生成物に組み込んだ後に検出することができる。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語「ハイブリダイズする」または「特異的にハイブリダイズする」は、２つの相補的な核酸鎖が、適切には厳密な条件下で互いにアニールする過程を指す。標的核酸へのハイブリダイゼーションは、典型的に、好ましくはプローブの長さの、好ましくは２０〜１００ヌクレオチド長の核酸分子を用いて実施される。核酸ハイブリダイゼーション技術は、当技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｓｅｃａｕｃｕｓ、Ｎ．Ｊ．（１９９４）参照。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「厳密なハイブリダイゼーション条件」は、完全に相補的でない２つの核酸をハイブリダイゼーションすることができないハイブリダイゼーション条件を指す。
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語「試料」または「試験試料」は、目的の核酸を含むと考えられる任意の液体または固体材料を指す。試験試料は、培養物もしくは組織試料中の細胞などの任意の生物学的な供給源（すなわち生物学的試料）から得ることができ、または化学的に合成されたテンプレートを含み、合成により生成することができる。
【００５６】
本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの文脈（すなわち、オリゴヌクレオチドプライマーまたは標的核酸などのヌクレオチドの配列）における用語「補体」、「相補的な」または「相補性」は、標準のワトソン／クリック塩基対合則を指す。補体配列は、ＤＮＡの配列またはそのＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡまたはその補体配列であってもよく、ｃＤＮＡであってもよい。例えば、配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−３’」は、配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−５’」と相補的である。天然核酸には一般に見出されず、または化学的に合成される特定のヌクレオチドは、本明細書に記載の核酸に含まれ、これらには、限定されるものではないが、イノシン、７−デアザグアノシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン、Ｌｏｃｋｅｄ核酸（ＬＮＡ）およびペプチド核酸（ＰＮＡ）ならびにそれらの組合せなどの、塩基および糖修飾ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸が含まれる。相補性は完全である必要はなく、安定な二重鎖は、ミスマッチ塩基対、変性またはマッチしていないヌクレオチドを含有することができる。核酸技術の分野の当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、塩基組成およびオリゴヌクレオチドの配列、ミスマッチ塩基対の発生率、イオン強度、他のハイブリダイゼーションバッファーの構成要素および条件を含むいくつかの変数を考慮して、二重鎖の安定性を経験的に決定することができる。
【００５７】
相補性は部分的であってもよく、この場合、２つの核酸鎖のヌクレオチド塩基の一部のみが、塩基対合則に従ってマッチしている。相補性は、完全または全体的であってもよく、この場合、２つの核酸鎖のヌクレオチド塩基のすべてが、塩基対合則に従ってマッチしている。相補性がなくてもよく、この場合、２つの核酸鎖のヌクレオチド塩基はいずれも、塩基対合則に従ってマッチしていない。核酸鎖間の相補性の度合いは、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に対して著しい効果を有する。このことは、ライゲーションおよび増幅反応、ならびに核酸間の結合に応じて変わる検出方法では特に重要である。これらの用語は、個々のヌクレオチドに関連して、特にポリヌクレオチドの文脈において使用することもできる。例えば、オリゴヌクレオチドにおける特定のヌクレオチドは、別の核酸鎖におけるヌクレオチドとのその相補性またはその相補性の欠如について、オリゴヌクレオチドの残りと核酸鎖の間の相補性と対照または比較して言及することができる。
【００５８】
本明細書で使用される場合、用語「実質的に相補的な」は、ほぼ厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする２つの配列を指す。当業者は、実質的に相補的な配列が、それらの全長に沿ってハイブリダイズする必要がないことを理解されよう。特に、実質的に相補的な配列は、厳密なハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズする塩基の連続配列の３’または５’に位置する、標的配列にハイブリダイズしない塩基の連続配列を含む。
【００５９】
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、プライマーまたはプローブは、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプライマーのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプライマーハイブリダイゼーション配列が、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプライマーおよび核酸が整列しているときの核酸の一部と少なくとも５０％の配列同一性を有する場合に、核酸に「特異的」である。核酸に特異的なポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプライマーは、適切なハイブリダイゼーションまたは洗浄条件下で、目的の標的にハイブリダイズすることができ、目的とならない核酸配列には実質的にハイブリダイズしないプライマーである。より高レベルの配列同一性が好ましく、それには、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、より好ましくは１００％の配列同一性が含まれる。
【００６０】
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオシド」には、天然の核酸に見出されるあらゆる形態のヌクレオシド塩基およびフラノシドを含む、天然に存在するすべてのヌクレオシドが含まれる。天然に存在するヌクレオシドに最も一般的に見出される塩基環は、プリン環およびピリミジン環である。天然に存在するプリン環には、例えばアデニン、グアニンおよびＮ6−メチルアデニンが含まれる。天然に存在するピリミジン環には、例えば、シトシン、チミンおよび５−メチルシトシンが含まれる。天然に存在するヌクレオシドには、例えば、限定されるものではないが、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、ウリジン、イノシン、７−デアザグアノシン、７−メチルグアノシンのリボ誘導体および２’−デオキシリボ誘導体が含まれる。天然に存在するヌクレオシドは、２’−Ｏ−メチルウリジンに見られるものなどのリボース糖への修飾も含む。
【００６１】
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオシド類似体」、「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド誘導体」は、本明細書に記載の合成ヌクレオシドを含む。ヌクレオシド誘導体には、保護基を伴うまたは伴わない修飾塩基または／および糖部分を有するヌクレオシドも含まれる。かかる類似体には、例えば２’−デオキシ−２’−フルオロウリジン等が含まれる。本明細書で提供する化合物および方法は、かかる塩基環およびその合成類似体、ならびに非天然の複素環で置換された塩基糖、さらに非環式置換塩基糖を含む。さらに、ヌクレオシド誘導体には、他のプリンおよびピリミジン誘導体、例えばハロゲン置換プリン（例えば、６−フルオロプリン）、ハロゲン置換ピリミジン、Ｎ6−エチルアデニン、Ｎ4−（アルキル）−シトシン、５−エチルシトシン等が含まれる。ヌクレオシド誘導体および類似体は、米国特許第６，７６２，２９８号に記載のものなどの多様な修飾を包含する。
【００６２】
本明細書で使用される場合、用語「ユニバーサル塩基」、「縮重塩基」、「ユニバーサル塩基類似体」および「縮重塩基類似体」は、例えば、好ましくはｄＡ、Ａ、ｄＴ、ｄＵ、Ｕ、ｄＣ、Ｃ、ｄＧ、Ｇなどのヌクレオシドの任意の特異的核酸塩基および他の特異的核酸塩基の代用として核酸リガーゼによって認識され得る人工塩基を有する類似体を含む。ユニバーサル塩基または縮重塩基を含有するヌクレオシドを使用することもでき、その例は、Ｌｏａｋｅｓ，Ｄ．、２９  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４３７〜２４４７頁（２００１）；Ｃｒｅｙ−Ｄｅｓｂｉｏｌｌｅｓ，Ｃ．ら、３３  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５３２〜１５４３頁（２００５）；Ｋｉｎｃａｉｄ，Ｋ．ら、３３  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６２０〜２６２８頁（２００５）；Ｐｒｅｐａｒａｔａ，ＦＰ、Ｏｌｉｖｅｒ，ＪＳ、１１  Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７５３〜７６５頁（２００４）；およびＨｉｌｌ，Ｆ．ら、９５  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ４２５８〜４２６３頁（１９９８）に見出すことができる。
【００６３】
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド間結合」は、オリゴヌクレオチドプライマーまたは核酸の２つのヌクレオシドをつなぐ１つまたは複数の結合を指し、天然ホスホジエステル結合または修飾結合であってもよい。
【００６４】
本明細書で使用される場合、用語「アシル」は、基−Ｃ（Ｏ）Ｒaを示し、Ｒaは、水素、低級アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール等である。
【００６５】
本明細書で使用される場合、用語「置換アシル」は、基−Ｃ（Ｏ）Ｒa'を示し、Ｒa'は、置換低級アルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクリル、置換アリール、置換ヘテロアリール等である。
【００６６】
本明細書で使用される場合、用語「アシルオキシ」は、基−ＯＣ（Ｏ）Ｒbを示し、Ｒbは、水素、低級アルキル、置換低級アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール等である。
【００６７】
本明細書で使用される場合、用語「アルカン」は、炭素原子および水素原子を含み、Ｃ−Ｈ結合を含み、さらにメタン以外のアルカンにおいてＣ−Ｃ単結合を含む有機化合物を指す。用語「アルカン」は、１〜２０個の炭素原子を有するアルカンなどの直鎖アルカンを含む。いくつかの実施形態では、アルカンは、メタン、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタンおよびオクタンなどの１〜８個の炭素原子を有するアルカンなどの直鎖アルカンを含む。用語「アルカン」はまた、限定されるものではないが、２−メチルプロパン、２，２−ジメチルプロパン、２−メチルブタン、２，３−ジメチルブタン、２，２−ジメチルブタン、２−メチルペンタン、３−メチルペンタン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン、２，２−ジメチルペンタン、３，３−ジメチルペンタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，２−ジメチルヘキサン、２，３−ジメチルヘキサン、２，４−ジメチルヘキサン、２，５−ジメチルヘキサン、３，３−ジメチルヘキサン、３，４−ジメチルヘキサン、２−メチルヘプタン、３−メチルヘプタン、４−メチルヘプタン、３−エチルペンタン、３−エチル−２−メチルペンタン、３−エチルヘキサンなどの、限定されるものではないが１〜２０個の炭素原子を有する、いくつかの実施形態では１〜８個の炭素原子を有する分岐鎖アルカンなどの分岐鎖アルカンを含む。アルカンのＣ−ＣまたはＣ−Ｈ結合は、ヒドロキシル基、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩなどのハロゲン、スルフヒドリル基、またはアミン基などの別の基との結合で置き換えることができる。かかる基で置き換えられたアルカンは、それぞれ、ヒドロキシアルカン、フルオロアルカン、クロロアルカン、ブロモアルカン、ヨードアルカンなどのハロアルカン、メルカプトアルカンおよびアミノアルカンと呼ぶことができる。
【００６８】
本明細書で使用される場合、用語「アルケニル」は、１つまたは複数の二重結合を有し、別段特定されない限り、約２〜約２０個の炭素原子、好ましくは約２〜約１０個の炭素原子、より好ましくは約２〜約８個の炭素原子、最も好ましくは約２〜約６個の炭素原子を含有する、直鎖または分岐鎖ヒドロカルビルを指す。アルケニル基の例には、ビニル、アリル、１，４−ブタジエニル、イソプロペニル等が含まれる。
【００６９】
本明細書で使用される場合、用語「アルケニルアリール」は、アルケニルで置換されたアリール基を指し、「置換アルケニルアリール」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているアルケニルアリール基を指す。
【００７０】
本明細書で使用される場合、用語「アルケニレン」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有し、典型的に、２〜２０個の炭素原子、好ましくは２〜１２個の炭素原子、好ましくは２〜８個の炭素原子を含有する二価の直鎖または分岐鎖ヒドロカルビル基を指し、「置換アルケニレン」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているアルケニレン基を指す。
【００７１】
本明細書で使用される場合、用語「アルキル」は、通常は１〜２０個の範囲の炭素原子、好ましくは１〜８個の炭素原子の単結合鎖の炭化水素を指し、その例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル等が含まれる。かかるアルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソアミル、ヘキシル、オクチル、ドデカニル等が含まれる。
【００７２】
本明細書で使用される場合、用語「低級アルキル」は、通常は１〜６個の範囲の炭素原子、好ましくは２〜５個の炭素原子の直鎖または分岐鎖の炭化水素を指す。その例には、エチル、プロピル、イソプロピル等が含まれる。
【００７３】
本明細書で使用される場合、用語「アルキレン」は、２つの水素原子が、同じ炭素原子または異なる炭素原子から除去されている、１〜２０個の炭素原子、好ましくは１〜１５個の炭素原子を含有する直鎖または分岐の二価のヒドロカルビルを指す。アルキレンの例には、限定されるものではないが、メチレン（−ＣＨ2−）、エチレン（−ＣＨ2ＣＨ2−）等が含まれる。
【００７４】
本明細書で使用される場合、用語「アルキニル」は、１つまたは複数の三重結合を有し、約２〜２０個の炭素原子、好ましくは約２〜１０個の炭素原子、より好ましくは約２〜８個の炭素原子、最も好ましくは約２〜６個の炭素原子を含有する、直鎖または分岐鎖ヒドロカルビルを指す。アルキニル基の例には、エチニル、プロピニル（プロパルギル）、ブチニル等が含まれる。
【００７５】
本明細書で使用される場合、用語「アルキニルアリール」は、アルキニルで置換されたアリール基を指し、「置換アルキニルアリール」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているアルキニルアリール基を指す。
【００７６】
本明細書で使用される場合、用語「アルコキシ」は、基−ＯＲcを示し、Ｒcは、定義通りの低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、置換アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキルまたは置換シクロヘテロアルキルである。
【００７７】
本明細書で使用される場合、用語「低級アルコキシ」は、基−ＯＲdを示し、Ｒdは低級アルキルである。
【００７８】
本明細書で使用される場合、用語「アルキルアリール」は、アルキルで置換されたアリール基を指し、「置換アルキルアリール」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているアルキルアリール基を指す。
【００７９】
本明細書で使用される場合、用語「アルキルカルボニルアミノ」は、基−ＮＲeＣ（Ｏ）Ｒfを示し、Ｒeは、任意選択で置換されているアルキルであり、Ｒfは、水素またはアルキルである。
【００８０】
本明細書で使用される場合、用語「アルキルスルフィニル」は、基−Ｓ（Ｏ）Ｒgを示し、Ｒgは、任意選択で置換されているアルキルである。
【００８１】
本明細書で使用される場合、用語「アルキルスルホニル」は、基−Ｓ（Ｏ）2Ｒgを示し、Ｒgは、任意選択で置換されているアルキルである。
【００８２】
本明細書で使用される場合、用語「アルキルスルホニルアミノ」は、基−ＮＲeＳ（Ｏ）2Ｒfを示し、Ｒeは、任意選択で置換されているアルキルであり、Ｒfは、水素またはアルキルである。
【００８３】
本明細書で使用される場合、用語「アルキルチオ」は、基−Ｓ−Ｒhを示し、Ｒhはアルキルである。
【００８４】
本明細書で使用される場合、用語「置換アルキルチオ」は、基−Ｓ−Ｒiを示し、Ｒiは置換アルキルである。
【００８５】
本明細書で使用される場合、用語「アルキニレン」は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有し、典型的に、約２〜１２個の範囲の炭素原子、好ましくは約２〜８個の炭素原子を有する二価の直鎖または分岐鎖ヒドロカルビル基を指し、「置換アルキニレン」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているアルキニレン基を指す。
【００８６】
本明細書で使用される場合、用語「アミド」は、基−Ｃ（Ｏ）ＮＲjＲj'を示し、ＲjおよびＲj'は、独立に、水素、低級アルキル、置換低級アルキル、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールであってもよい。
【００８７】
本明細書で使用される場合、用語「置換アミド」は、基−Ｃ（Ｏ）ＮＲkＲk'を示し、ＲkおよびＲk'は、独立に、水素、低級アルキル、置換低級アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールであり、但し、ＲkおよびＲk'の少なくとも一方は水素ではない。ＲkＲk'は、窒素と組み合わさって、任意選択で置換されている複素環式環またはヘテロアリール環を形成することができる。
【００８８】
本明細書で使用される場合、用語「アミジノ」は、基−Ｃ（＝ＮＲm）ＮＲm'Ｒm"を示し、Ｒm、Ｒm'およびＲm"は、独立に、水素または任意選択で置換されているアルキル、アリールもしくはヘテロアリールである。
【００８９】
本明細書で使用される場合、用語「アミノ」または「アミン」は、基−ＮＲnＲn'を示し、ＲnおよびＲn'は、独立に、水素、本明細書に定義の低級アルキル、置換低級アルキル、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールであってもよい。「二価のアミン」は、基−ＮＨ−を示す。「置換されている二価のアミン」は、基−ＮＲ−を示し、Ｒは、低級アルキル、置換低級アルキル、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールである。
【００９０】
本明細書で使用される場合、用語「置換アミノ」または「置換アミン」は、基−ＮＲpＲp'を示し、ＲpおよびＲp'は、独立に、水素、低級アルキル、置換低級アルキル、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリールであり、但し、ＲpおよびＲp'の少なくとも一方は水素ではない。ＲpＲp'は、窒素と組み合わさって、任意選択で置換されている複素環式環またはヘテロアリール環を形成することができる。
【００９１】
本明細書で使用される場合、用語「アリールアルキニル」は、アリールで置換されたアルキニル基を指し、「置換アリールアルキニル」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているアリールアルキニル基を指す。
【００９２】
本明細書で使用される場合、用語「アラルキル」は、アルキルの水素原子が本明細書に定義のアリールによって置き換えられている、本明細書に定義のアルキルを指す。アラルキル基の例には、ベンジル、フェネチル、１−フェニルプロピル、２−フェニルプロピル、３−フェニルプロピル、１−ナフチルプロピル、２−ナフチルプロピル、３−ナフチルプロピル、３−ナフチルブチル等が含まれる。
【００９３】
本明細書で使用される場合、用語「アロイル」は、ベンゾイルなどのアリール−カルボニル種を指し、「置換アロイル」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているアロイル基を指す。
【００９４】
本明細書で使用される場合、用語「アリールアルキル」は、アリールで置換されたアルキル基を指し、「置換アリールアルキル」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているアリールアルキル基を指す。
【００９５】
本明細書で使用される場合、用語「アリール」は、単独または組合せで、任意選択で、好ましくは５〜７個、より好ましくは５〜６個の環員のシクロアルキルを有し、および／またはハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アシルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アルキル、アリールもしくはヘテロアリール基で任意選択で一置換もしくは二置換されているアミノ、アミジノ、アルキル、アリール、ヘテロアリールもしくはヘテロシクリル基で任意選択で置換されている尿素、アルキル、アリールもしくはヘテロアリール基で任意選択でＮ−一置換もしくはＮ，Ｎ−二置換されているアミノスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ等の１〜３個の基もしくは置換基で任意選択で置換されている、フェニル、ナフチルまたは縮合芳香族複素環を指す。
【００９６】
本明細書で使用される場合、用語「アリールカルボニルアミノ」は、基−ＮＲqＣ（Ｏ）Ｒrを示し、Ｒqは、水素または低級アルキルもしくはアルキルであり、Ｒrは、任意選択で置換されているアリールである。
【００９７】
本明細書で使用される場合、用語「アリーレン」は、典型的に、６個〜最大１４個の範囲の炭素原子を有する二価の芳香族基を指し、「置換アリーレン」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているアリーレン基を指す。
【００９８】
本明細書で使用される場合、用語「アリールオキシ」は、基−ＯＡｒを示し、Ａｒは、アリールまたは置換アリール基である。
【００９９】
本明細書で使用される場合、用語「アリールスルホニルアミノ」は、基−ＮＲqＳ（Ｏ）2Ｒrを示し、Ｒqは、水素または低級アルキルもしくはアルキルであり、Ｒrは、任意選択で置換されているアリールである。
【０１００】
本明細書で使用される場合、用語「カルバメート基」は、基−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ2を示し、各Ｒは、独立に、Ｈ、本明細書に記載のアルキル、置換アルキル、アリールまたは置換アリールである。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、用語「ジチオカルバメート基」は、基−Ｓ−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ2を示し、各Ｒは、独立に、Ｈ、本明細書に記載のアルキル、置換アルキル、アリールまたは置換アリールである。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、用語「炭素環」は、結合した炭素原子から構成される単環または複数の縮合環を有する、飽和、不飽和または芳香族の基を指す。環は、任意選択で非置換であってもよく、または例えばハロゲン、低級アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アセチレン、アミノ、アミド、カルボキシル、ヒドロキシル、アリール、アリールオキシ、複素環、ヘタリール、置換ヘタリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルファミド等で置換されていてもよい。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、用語「シクロアルケニル」は、３〜２０個の範囲の炭素原子を含有し、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する環式環を含有する基を指し、「置換シクロアルケニル」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているシクロアルケニル基を指す。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、用語「シクロアルキル」は、３〜１５個の炭素原子を含有する単環式または多環式アルキル基を指し、「置換シクロアルキル」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているシクロアルキル基を指す。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、用語「シクロアルキレン」は、約３〜１２個の範囲の炭素原子を含有する二価の環を含有する基を指し、「置換シクロアルキレン」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているシクロアルキレン基を指す。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、用語「グアニジニル」は、基−Ｎ＝Ｃ（ＮＨ2）2を示し、「置換グアニジニル」は、基−Ｎ＝Ｃ（ＮＲ2）2を示し、各Ｒは、独立に、Ｈ、本明細書に記載のアルキル、置換アルキル、アリールまたは置換アリールである。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、用語「ハロ」または「ハロゲン」は、あらゆるハロゲン、すなわち、クロロ（Ｃｌ）、フルオロ（Ｆ）、ブロモ（Ｂｒ）およびヨード（Ｉ）を指す。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアリール」は、５個もしくは６個の環原子を含有する単環式の芳香族環構造を指し、または８〜１０個の原子を有し、Ｏ、ＳおよびＮの群から独立に選択される１つまたは複数の、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、さらにより好ましくは１〜２個のヘテロ原子を含有し、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アシルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アルキル、アリールもしくはヘテロアリール基で任意選択で一置換もしくは二置換されているアミノ、アミジノ、アルキル、アリール、ヘテロアリールもしくはヘテロシクリル基で任意選択で置換されている尿素、アルキル、アリールもしくはヘテロアリール基で任意選択でＮ−一置換もしくはＮ，Ｎ−二置換されているアミノスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ等の１〜３個の基もしくは置換基で任意選択で置換されている二環式芳香族基を指す。ヘテロアリールはまた、スルフィニル、スルホニルおよび第３級の環窒素のＮ−オキシドなどの、酸化したＳまたはＮを含むことを企図する。炭素または窒素原子は、安定な芳香族環が保持されるようなヘテロアリール環構造の結合点である。ヘテロアリール基の例は、フタルイミド、ピリジニル、ピリダジニル、ピラジニル、キナゾリニル、プリニル、インドリル、キノリニル、ピリミジニル、ピロリル、オキサゾリル、チアゾリル、チエニル、イソオキサゾリル、オキサチアジアゾリル、イソチアゾリル、テトラゾリル、イミダゾリル、トリアジニル、フラニル、ベンゾフリル、インドリル等である。置換ヘテロアリールは、利用可能な炭素または窒素に結合して安定な化合物をもたらす置換基を含有する。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、用語「置換ヘテロアリール」は、１つまたは複数の官能基、例えば、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アルキルチオ、アセチレン、アミノ、アミド、カルボキシル、ヒドロキシル、アリール、アリールオキシ、複素環、置換複素環、ヘタリール、置換ヘタリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルファミド等で任意選択で一置換または多置換されている複素環を指す。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアリールカルボニルアミノ」は、基−ＮＲqＣ（Ｏ）Ｒrを示し、Ｒqは、水素または低級アルキルであり、Ｒrは、任意選択で置換されているアリールである。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアリールオキシ」は、基−ＯＨｅｔを示し、Ｈｅｔは、任意選択で置換されているヘテロアリール基である。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアリールスルホニルアミノ」は、基−ＮＲqＳ（Ｏ）2Ｒsを示し、Ｒqは、水素または低級アルキルであり、Ｒsは、任意選択で置換されているヘテロアリールである。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、用語「複素環」は、単環（例えば、モルホリノ、ピリジルもしくはフリル）または複数の縮合環（例えば、ナフトピリジル（ｎａｐｈｔｈｐｙｒｉｄｙｌ）、キノキサリル、キノリニル、インドリジニルもしくはベンゾ［ｂ］チエニル）を有し、その環中に炭素原子とＮ、ＯまたはＳなどの少なくとも１つのヘテロ原子を有する、飽和、不飽和または芳香族の基を指し、これは任意選択で非置換であってもよく、または例えばハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、アルキルチオ、アセチレン、アミノ、アミド、カルボキシル、ヒドロキシル、アリール、アリールオキシ、複素環、ヘタリール、置換ヘタリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルファミド等で置換されていてもよい。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、用語「置換複素環」は、任意の利用可能な点に結合して安定な化合物をもたらす、任意選択で置換されているアルキル、任意選択で置換されているアルケニル、任意選択で置換されているアルキニル、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アシルオキシ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アミノ、アミド、アミジノ、アルキル、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリル基で任意選択で置換されている尿素、アルキル、アリールまたはヘテロアリール基で任意選択でＮ−一置換またはＮ，Ｎ−二置換されているアミノスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ、アシル、カルボキシル、複素環、置換複素環、ヘタリール、置換ヘタリール、ニトロ、シアノ、チオール、スルホンアミドおよびオキソからなる群から選択される、１つまたは複数の、例えば１個、２個または３個の置換基で置換されている複素環を指す。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、用語「ヒドロカルビル」は、その主鎖が炭素および水素だけを含む任意の有機基を指す。したがってヒドロカルビルは、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキル、アリールアルケニル、アルケニルアリール、アリールアルキニル、アルキニルアリール等を包含する。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、用語「置換ヒドロカルビル」は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−（式中、Ｒは、水素、アルキルまたは置換アルキルである）、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（＝ＮＲ’）−、−Ｃ（＝ＣＲ’2）−（式中、Ｒ’は、アルキルまたは置換アルキルである）、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−（ｏｒ−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−、−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）2−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）2−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）2−ＮＲ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−ＮＲ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−、−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−、−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−Ｏ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−、−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−、−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−（または−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−Ｏ−）、−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−、−ＮＲ−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ−、−Ｓ−Ｓ（Ｏ）2−、−Ｓ−Ｓ（Ｏ）2−Ｏ−、−Ｓ−Ｓ（Ｏ）2−ＮＲ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−、−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−Ｏ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）−ＮＲ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）2−、−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）2−Ｏ−、−ＮＲ−Ｏ−Ｓ（Ｏ）2−ＮＲ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）−、−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）−ＮＲ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）2−Ｏ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）2−ＮＲ−、−Ｏ−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）2−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）Ｒ2−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）Ｒ2−、または−ＮＲ−Ｐ（Ｏ）Ｒ2−、（式中、各Ｒは、独立に、水素、アルキルまたは置換アルキル等である）などのリンカー／スペーサー部分によってヒドロカルビル部分に結合している前述の基の２つ以上を含む、ヒドロキシ、ヒドロカルビルオキシ、置換ヒドロカルビルオキシ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリールチオ、置換アリールチオ、アミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、カルボキシ、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ2（式中、各Ｒは、独立に、水素、アルキルまたは置換アルキルである）、ニトロ、シアノ、ハロ、−ＳＯ3Ｍまたは−ＯＳＯ3Ｍ（式中、Ｍは、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、Ｚｎ、Ｃａまたはメグルミンである）、グアニジニル、置換グアニジニル、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、ヒドロカルビルカルボニル、置換ヒドロカルビルカルボニル、ヒドロカルビルオキシカルボニル、置換ヒドロカルビルオキシカルボニル、ヒドロカルビルカルボニルオキシ、置換ヒドロカルビルカルボニルオキシ、アシル、アシルオキシ、複素環式、置換複素環式、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールカルボニル、置換ヘテロアリールカルボニル、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、カルバメート基、ジチオカルバメート基、アロイル、置換アロイル、オルガノスルホニル、置換オルガノスルホニル、オルガノスルフィニル、置換アルキルスルフィニル��アルキルスルホニルアミノ、置換アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、置換アリールスルホニルアミノ、スルホンアミド基、スルフリル等から選択される１つまたは複数の置換基をさらに有している、先に参照したヒドロカルビル基のいずれかを指す。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、用語「ヒドロカルビルオキシ」は、２〜２０個の炭素原子を含有する−Ｏ−ヒドロカルビル基を示し、「置換ヒドロカルビルオキシ」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているヒドロカルビルオキシ基を指す。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、用語「ヒドロカルビルカルボニル」は、２〜２０個の炭素原子を含有する−Ｃ（Ｏ）−ヒドロカルビル基を指し、「置換ヒドロカルビルカルボニル」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているヒドロカルビルカルボニル基を指す。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、用語「ヒドロカルビルオキシカルボニル」は、２〜２０個の炭素原子を含有する−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ヒドロカルビルを指し、「置換ヒドロカルビルオキシカルボニル」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているヒドロカルビルオキシカルボニル基を指す。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、用語「ヒドロカルビルカルボニルオキシ」は、２〜２０個の炭素原子を含有する−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ヒドロカルビル基を指し、「置換ヒドロカルビルカルボニルオキシ」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有しているヒドロカルビルカルボニルオキシ基を指す。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、用語「ヒドロカルビレン」は、その主鎖が炭素および水素だけを含む任意の二価の有機基を指す。したがってヒドロカルビレンは、アルキレン、シクロアルキレン、アルケニレン、シクロアルケニレン、アルキニレン、アリーレン、アルキルアリーレン、アリールアルキレン、アリールアルケニレン、アルケニルアリーレン、アリールアルキニレン、アルキニルアリーレン等を包含し、「置換ヒドロカルビレン」は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換基をさらに有している、先に参照したヒドロカルビレン基のいずれかを指す。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、用語「ヒドロキシル」または「ヒドロキシ」は、基−ＯＨを指す。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、用語「オルガノスルフィニル」は、基−Ｓ（Ｏ）−オルガノを示し、オルガノは、アルキル、アルコキシ、アルキルアミノおよびアリール部分、ならびに置換アルキル、アルコキシ、アルキルアミノおよびアリール部分を包含する。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、用語「オルガノスルホニル」は、基−Ｓ（Ｏ）2−オルガノを示し、オルガノは、アルキル、アルコキシおよびアルキルアミノ部分、ならびに置換アルキル、アルコキシまたはアルキルアミノ部分を包含する。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、用語「オキソ」は、結合炭素と二重結合している酸素の置換基を指す。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、用語「スルフィニル」は、基−Ｓ（Ｏ）−を示す。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、用語「置換スルフィニル」は、基−Ｓ（Ｏ）Ｒtを示し、Ｒtは、低級アルキル、置換低級アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、置換シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、置換ヘテロシクリルアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、置換ヘテロアラルキル、アラルキルまたは置換アラルキルである。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、用語「スルホニル」は、基−Ｓ（Ｏ）2−を示す。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、用語「置換スルホニル」は、基−Ｓ（Ｏ）2Ｒtを示し、Ｒtは、低級アルキル、置換低級アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、置換シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、置換ヘテロシクリルアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、置換ヘテロアラルキル、アラルキルまたは置換アラルキルである。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、用語「スルホニルアミノ」は、基−ＮＲqＳ（Ｏ）2−を示し、Ｒqは、水素または低級アルキルである。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、用語「置換スルホニルアミノ」は、基−ＮＲqＳ（Ｏ）2Ｒuを示し、Ｒqは、水素または低級アルキルであり、Ｒuは、低級アルキル、置換低級アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、置換ヘテロアラルキル、アラルキルまたは置換アラルキルである。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、用語「スルフリル」は、基−Ｓ（Ｏ）2−を示す。
【０１３３】
用語「ほぼ」または「約」は、本明細書で数値に関連して使用される場合、表示値の１０％を意味する。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】ＡＴＰ依存性およびＮＡＤ＋依存性ＤＮＡリガーゼによるホスホジエステル結合形成の機構の概略図である。
【図２】リガーゼが存在しない場合のライゲーション反応（レーン２）、ＡＴＰが存在しない場合のライゲーション反応（レーン３）、核酸テンプレートが存在しない場合のライゲーション反応（レーン４）、および陽性対照（ドナー、アクセプター、ＡＴＰ補因子、リガーゼおよびテンプレート）（レーン５）のＰＡＧＥゲルの結果を示す画像である。
【図３】ライゲーション産物を検出するためのリアルタイムＰＣＲ実験の結果を示す図である。図３Ａはテンプレートが存在しない状態で実施したライゲーションから得た対照（ＮＴＣ）を含む６倍希釈系列のライゲーション産物の増幅曲線を示す。図３Ｂは図３Ａにおいて実施した反応から得た解離曲線である。図３Ｃは標準曲線から抽出したＣｔ値を希釈係数に対してプロットした標準曲線を示す。
【図４】アクセプター鎖の３’末端にマッチ（Ｔ−Ａ）およびミスマッチ（Ｃ−Ａ）塩基対を有するＡＴＰを使用するライゲーション反応と比較した、以下の修飾補因子：７−デアザ−ＡＴＰ、Ｎ１−メチル−ＡＴＰ、２−アミノ−ＡＴＰ、２’−アミノ−２’−デオキシ−ＡＴＰ、３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−ＡＴＰを用いるライゲーション反応から得られたＰＡＧＥゲルの結果を示す画像である。
【図５】アクセプター鎖の３’末端における３つの異なるテンプレートであるミスマッチ塩基対（Ｃ−Ａ、Ｇ−ＡおよびＡ−Ａ）による相対的収率に対する、アクセプター鎖の３’末端におけるマッチ塩基対（Ｔ−Ａ）の存在下での相対的ライゲーション収率について、１０種類の修飾ＡＴＰ補因子を評価する一連の散布図である。好ましくは、非修飾補因子と比較して特異性が改善された修飾補因子は、Ｔ−Ａマッチに対して類似のライゲーション収率（ｙ軸の１に近似の値）およびｘ軸の０に近似のミスマッチライゲーション収率（Ｃ−Ａ、Ｇ−ＡおよびＡ−Ａ）を有する。
【図６】実施例１に記載の通り、アクセプター鎖の３’末端における３つの異なるミスマッチ塩基対（Ｔ−Ｇ、Ｔ−ＣおよびＴ−Ｔ）による相対的収率に対する、アクセプター鎖の３’末端におけるマッチ塩基対（Ｔ−Ａ）の存在下での相対的ライゲーション収率について、修飾アクセプターを評価する一連の散布図である。研究した修飾アクセプターは、以下の単一置換基を含有していた：式ＩＩに定義の通り、ＰＳ（Ｘ１）は、Ｘ1位置のＳを示し、ＰＳ（Ｘ２）は、Ｘ2位置のＳを示し、ＰＭｅ（Ｘ１）は、Ｘ1位置のＭｅを示し、ＰＭｅ（Ｘ２）は、Ｘ2位置のＭｅを示し、２’−ＯＭｅ（Ｙ１）は、Ｙ1位置のＯＣＨ3を示し、２’−ＯＭｅ（Ｙ２）は、Ｙ2位置のＯＣＨ3を示し、２’−ＯＭｅ（Ｙ３）は、Ｙ3位置のＯＣＨ3を示し、２’−Ｆ（Ｙ１）は、Ｙ1位置のＦを示し、２’−Ｆ（Ｙ２）は、Ｙ2位置のＦを示し、２’−Ｆ（Ｙ３）は、Ｙ3位置のＦを示す。好ましくは、非修飾アクセプターと比較して特異性が改善された候補修飾アクセプターは、Ｔ−Ａマッチに対して類似のライゲーション収率（ｙ軸上の１に近似の値）およびｘ軸上の０に近似のミスマッチライゲーション収率（Ｃ−Ａ、Ｇ−ＡおよびＡ−Ａ）を有する。
【図７】実施例１に記載の通り、アクセプター鎖の３’末端における２つの異なるミスマッチ塩基対（Ｔ−ＣおよびＣ−Ａ）による相対的収率に対する、アクセプター鎖の３’末端におけるマッチ塩基対（Ｔ−Ａ）の存在下での相対的ライゲーション収率について、修飾ドナーを評価する一連の散布図である。修飾ドナーは、以下の単一置換基を含有していた：式ＩＩＩに定義の通り、ＰＭｅ（Ｘ１）は、Ｘ1位置のＭｅを示し、ＰＭｅ（Ｘ２）は、Ｘ2位置のＭｅを示し、２’−ＯＭｅ（Ｙ１）は、Ｙ1位置のＯＣＨ3を示し、２’−ＯＭｅ（Ｙ２）は、Ｙ2位置のＯＣＨ3を示し、２’−ＯＭｅ（Ｙ３）は、Ｙ3位置のＯＣＨ3を示す。好ましくは、非修飾ドナーと比較して特異性が改善された修飾ドナーは、Ｔ−Ａマッチに対して類似のライゲーション収率（ｙ軸上の１に近似の値）およびｘ軸上の０に近似のミスマッチライゲーション収率（Ｃ−Ａ、Ｇ−ＡおよびＡ−Ａ）を有する。
【図８】糖および主鎖を修飾したアクセプター鎖を異なる修飾ＡＴＰ補因子と組み合わせて使用した、相対的ライゲーション収率の表である。これらの値は、実施例１に記載の通り、天然アクセプター鎖ならびにアクセプター鎖の３’末端にマッチ（Ｔ−Ａ）およびミスマッチ（Ｔ−Ｃ）塩基対を有するＡＴＰを使用するライゲーション収率に対するものである。マッチしている場合（Ｔ−Ａ）には、点の網掛けセルの値は、０．８５を超える相対的ライゲーション収率を表し、網掛けなしのセルの値は、０．７０〜０．８５の相対的ライゲーション収率を表し、灰色の網掛けセルの値は、０〜０．７０の相対的ライゲーション収率を表す。ミスマッチの場合（Ｔ−Ｃ）には、点の網掛けセルの値は、０．０〜０．０１の相対的ライゲーション収率を表し、網掛けなしのセルの値は、０．０１〜０．１０の相対的ライゲーション収率を表し、灰色の網掛けセルの値は、０．１０〜１．００の相対的ライゲーション収率を表す。好ましい性能基準を有する組合せは、マッチしている場合（Ｔ−Ａ）には０．８５を超える相対的収率を有し（例えば、図８の点の網掛けセル、上の表）、ミスマッチテンプレート（Ｔ−Ｃ）の存在下では０．０１未満の相対的ライゲーション収率を有する（例えば、図８の点の網掛けセル、下の表）。
【図９】アダプタープローブ二量体形成を示すＲＮＡライブラリー調製のための従来の２ステップ法の概略図である。
【図１０】アダプタープローブの二量体化を妨げるまたは阻止する本発明によるＲＮＡライブラリー調製のための修飾した２ステップ法の概略図である。
【図１１】最初のライゲーションステップの後、精製せずにアダプタープローブの二量体化を妨げるまたは阻止する本発明によるＲＮＡライブラリー調製のための修飾した１ステップ法の概略図である。
【図１２】平滑末端二本鎖アダプタープローブを利用するＤＮＡライブラリー調製のための従来の方法の概略図である。
【図１３】各アダプタープローブの両方の鎖に修飾を有する二本鎖アダプタープローブを利用する本発明によるＤＮＡライブラリー調製のための修飾した方法の概略図である。
【図１４】Ｔ−テイルを有する「Ｙ」構造のアダプターを利用するＤＮＡライブラリー調製のための従来の方法の概略図である。
【図１５】各アダプタープローブの両方の鎖に修飾を有する「Ｙ」構造の二本鎖アダプタープローブを利用する本発明によるＤＮＡライブラリー調製のための修飾した方法の概略図である。
【図１６】修飾アダプターを有する補因子依存性リガーゼおよび熱に不安定な保護基を含むリガーゼ補因子を利用する本発明によるＲＮＡライブラリー調製のための修飾した方法の概略図である。
【図１７】（Ａ）修飾５’−アダプターと組み合わせた非修飾３’−アダプターおよび（Ｂ）修飾３’−アダプターと組み合わせた非修飾５’−アダプターを使用したライブラリー調製についての二量体ライゲーション収率の表である。ライゲーション収率は対応する非修飾アダプタープローブに対する（＋＋＋＋：７５〜１００％；＋＋＋：５０〜７４％；＋＋：２５〜４９％；＋：１〜２５％；−：未検出）。
【図１８】修飾５’−および３’−アダプターならびにＴ４  ＲＮＡリガーゼ１を使用したＲＮＡライブラリー調製ワークフローにおけるアダプター二量体抑制についてのライゲーション収率を示すポリアクリルアミドゲル電気泳動画像である。
【図１９】修飾５’−および３’−アダプターならびにＴ４  ＲＮＡリガーゼ１を使用したＲＮＡライブラリー調製についてのライゲーション収率を示すポリアクリルアミドゲル電気泳動画像である。
【図２０】５’および３’修飾を有するアダプター二量体を使用したＲＮＡライブラリー調製についての逆転写酵素活性を示すポリアクリルアミドゲル電気泳動画像である。
【図２１】非修飾アダプターおよび合成ＲＮＡテンプレートの３つの入力を使用した低分子ＲＮＡライブラリー調製ワークフローである。
【図２２】アダプター二量体形成を抑制するための５’−アダプターおよび／または３’−アダプターに対する修飾を用いる低分子ＲＮＡライブラリー調製ワークフローの画像である。
【図２３】アダプター二量体形成を抑制するための３’−修飾アダプタープローブと５’−修飾アダプタープローブの対のスクリーニングの結果の画像である。
【図２４】４つのライブラリー調製ワークフローを比較した次世代シークエンシングデータ分析から決定した発現レベルを示す図である。高、中および低発現レベルで示した選択したｍｉＲＮＡを示す。Ｋｉｔ１はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから得、Ｋｉｔ２はＩｌｌｕｍｉｎａから得た。
【図２５】４つの異なるライブラリー調製ワークフローの間のｍｉＲＮＡ発現レベルの比較分析からの結果を示す図である。
【図２６】修飾二本鎖平滑末端アダプタープローブコンストラクトおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼを形成するようにハイブリダイズした修飾５’−および３’−アダプターを使用したＤＮＡライブラリー調製ワークフローにおけるアダプター二量体抑制を示すポリアクリルアミドゲル電気泳動画像である。
【図２７】修飾二本鎖平滑末端アダプタープローブコンストラクトおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼを形成するようにハイブリダイズした修飾５’−および３’−アダプターを使用したＤＮＡライブラリー調製ワークフローにおけるアダプター二量体抑制およびタグ付きライブラリー形成を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【０１３５】
核酸ライゲーション反応は、（ａ）酵素であるリガーゼのアデニル化、（ｂ）標的核酸へのドナーおよびアクセプターポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、その後（ｃ）アデニル酸をドナー鎖に転移し、ライゲーションして、核酸リガーゼによって接合した核酸配列の相補的なコピーを形成することを含む。しかし、ドナーおよびアクセプターのライゲーションは、１）ドナーおよびもしくはアクセプターが、テンプレート核酸に対してミスマッチを有する（非相補的である）場合、または２）テンプレート核酸が存在しない場合に生じ得る。
【０１３６】
本明細書の方法および組成物は、核酸ライゲーションのための改善された方法および組成物を提供する。特定の態様では、方法および組成物は、酵素的ライゲーション反応において修飾されたライゲーション構成要素を使用することを対象とする。他の態様では、核酸ライゲーションプロセスは、１つまたは複数の修飾補因子、修飾ドナーおよび／または修飾アクセプターを用い、その存在は、テンプレートが存在しない場合またはミスマッチが存在する場合の望ましくないライゲーション産物の形成に障害を与える。
【０１３７】
修飾リガーゼ補因子
本明細書で提供される組成物および方法のある種の態様および実施形態は、少なくとも１つの修飾リガーゼ補因子を含む。好ましい実施形態では、修飾リガーゼ補因子は、１つまたは複数の置換基を有する修飾ＡＴＰである。
【０１３８】
本明細書の態様の実施形態では、本発明の修飾ＡＴＰおよびその誘導体として、式ＩＡの化合物を提供する：
【０１３９】
【化１】
2016514460.tif 000002
（式中、
Ｗ1、Ｗ2、Ｗ3およびＷ4は、それぞれ独立に、Ｎ、ＣＲ1およびＮ+Ｒ1からなる群から選択され、
各Ｒ1は、独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ2、ＳＲ2、ＳｅＲ2、ＮＲ2Ｒ3、Ｎ3、Ｃ（Ｙ）Ｒ4、置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
Ｚ1は、Ｈ、Ｆ、Ｒ2、ＯＲ2、ＳＲ2、ＳｅＲ2、ＮＲ2Ｒ3、ＮＲ2ＯＲ2、ＮＲ2−ＮＲ2Ｒ3、ＣＮ、Ｎ3、（ＢＨ3）-Ｍ+およびＣ（Ｙ）Ｒ4からなる群から選択され、
Ｍ+はカチオンであり、
各Ｒ2および各Ｒ3は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、任意の置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｒ4は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ2、ＳＲ2、ＳｅＲ2、ＮＲ2Ｒ3、Ｃ（Ｙ）Ｒ2および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、任意の置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ1Ｒ1およびＮＲ1からなる群から選択され、
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3およびＸ4は、それぞれ独立に、Ｒ1、ＮＲ2ＯＲ2、ＮＲ2−ＮＲ2Ｒ3、ＣＮ、Ｎ3、ＮＯ、ＮＯ2、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＯＣＮ、ＳＣＮおよびＳＳＲ2からなる群から選択される）。
【０１４０】
修飾ＡＴＰの好ましい実施形態は、以下の構造を有する：
【０１４１】
【化２】
2016514460.tif 000003
（式中、
Ｗ1、Ｗ2、Ｗ3およびＷ4は、それぞれ独立に、Ｎ、Ｎ+−ＣＨ3、Ｎ+−ＣＨ2ＣＨ3、Ｎ+−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、Ｎ+−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、Ｎ+−ＣＨ（ＣＨ3）2、ＣＨ、Ｃ−ＣＨ3、Ｃ−ＣＨ2ＣＨ3、Ｃ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、Ｃ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、Ｃ−ＣＨ（ＣＨ3）2、Ｃ−ＮＨ2、Ｃ−ＮＨＣＨ3、Ｃ−Ｎ（ＣＨ3）2、Ｃ−Ｎ3、およびＣ−ＯＨからなる群から選択され、
Ｚ1は、Ｈ、Ｆ、ＣＨ3、フェニル、ＯＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＯＣＨ（ＣＨ3）2、ＳＨ、ＳＣＨ3、ＳＣＨ2ＣＨ3、ＳＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＳＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＳＣＨ（ＣＨ3）2、ＳｅＨ、ＳｅＣＨ3、ＳｅＣＨ2ＣＨ3、ＳｅＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＳｅＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＳｅＣＨ（ＣＨ3）2、ＮＨ2、ＮＨＣＨ3、ＮＣＨ3ＣＨ3、ＮＨＯＣＨ3、ＮＣＨ3ＯＣＨ3、ＮＨ−ＮＨ2、ＮＨ−ＮＨＣＨ3、ＮＨ−ＮＣＨ3ＣＨ3、ＮＣＨ3−ＮＨ2、ＮＣＨ3−ＮＨＣＨ3、ＮＣＨ3−ＮＣＨ3ＣＨ3、ＣＮ、Ｎ3、および（ＢＨ3）-Ｍ+からなる群から選択され、
Ｍ+はカチオンであり、
Ｘ1は、Ｈ、ＮＨ2、ＯＨ、ＮＨＣＨ3およびＮ（ＣＨ3）2からなる群から選択され、
Ｘ2は、Ｈ、Ｃｌ、ＯＨ、ＮＨ2、ＮＨＣＨ3およびＮ（ＣＨ3）2からなる群から選択され、
Ｘ3は、Ｈ、Ｆ、ＣＨ3、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ3、ＮＨ2、ＮＨＣＨ3、Ｎ（ＣＨ3）2およびＮ3からなる群から選択され、
Ｘ4は、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、ＯＣＨ3、ＮＨ2、ＮＨＣＨ3、Ｎ（ＣＨ3）2およびＮ3からなる群から選択される）。
【０１４２】
修飾ＡＴＰの好ましい実施形態は、以下の構造を有する：
【０１４３】
【化３】
2016514460.tif 000004
（式中、
Ｗ1、Ｗ2、Ｗ3およびＷ4は、それぞれ独立に、Ｎ、ＣＲ1およびＮ+Ｒ1からなる群から選択され、
各Ｒ1は、独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ2、ＳＲ2、ＳｅＲ2、ＮＲ2Ｒ3、Ｎ3、Ｃ（Ｙ）Ｒ4および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、任意の置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｒ2および各Ｒ3は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、任意の置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｒ4は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ2、ＳＲ2、ＳｅＲ2、ＮＲ2Ｒ3、Ｃ（Ｙ）Ｒ2および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、任意の置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ1Ｒ1およびＮＲ1からなる群から選択される）。
【０１４４】
修飾ＡＴＰの好ましい実施形態は、以下の構造を有する：
【０１４５】
【化４】
2016514460.tif 000005
（式中、
Ｗ1、Ｗ2、Ｗ3およびＷ4は、それぞれ独立に、Ｎ、Ｎ+−ＣＨ3、Ｎ+−ＣＨ2ＣＨ3、Ｎ+−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、Ｎ+−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、Ｎ+−ＣＨ（ＣＨ3）2、ＣＨ、Ｃ−ＣＨ3、Ｃ−ＣＨ2ＣＨ3、Ｃ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、Ｃ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、Ｃ−ＣＨ（ＣＨ3）2、Ｃ−ＮＨ2、Ｃ−ＮＨＣＨ3、Ｃ−Ｎ（ＣＨ3）2、Ｃ−Ｎ3、およびＣ−ＯＨからなる群から選択される）。
【０１４６】
修飾ＡＴＰの好ましい実施形態は、以下の構造を有する：
【０１４７】
【化５】
2016514460.tif 000006
（式中、
Ｚ1は、Ｈ、Ｆ、Ｒ1、ＯＲ1、ＳＲ1、ＳｅＲ1、ＮＲ1Ｒ2、ＮＲ1ＯＲ1、ＮＲ1−ＮＲ1Ｒ1、ＣＮ、Ｎ3、（ＢＨ3）-Ｍ+およびＣ（Ｙ）Ｒ2からなる群から選択され、
Ｍ+はカチオンであり、
各Ｒ1は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、任意の置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｒ2は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ1、ＳＲ1、ＳｅＲ1、ＮＲ1Ｒ1、Ｃ（Ｙ）Ｒ1および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、任意の置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ1Ｒ1およびＮＲ1からなる群から選択される）。
【０１４８】
修飾ＡＴＰの好ましい実施形態は、以下の構造を有する：
【０１４９】
【化６】
2016514460.tif 000007
（式中、
Ｚ1は、Ｈ、Ｆ、ＣＨ3、フェニル、ＯＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＯＣＨ（ＣＨ3）2、ＳＨ、ＳＣＨ3、ＳＣＨ2ＣＨ3、ＳＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＳＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＳＣＨ（ＣＨ3）2、ＳｅＨ、ＳｅＣＨ3、ＳｅＣＨ2ＣＨ3、ＳｅＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＳｅＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、ＳｅＣＨ（ＣＨ3）2、ＮＨ2、ＮＨＣＨ3、ＮＣＨ3ＣＨ3、ＮＨＯＣＨ3、ＮＣＨ3ＯＣＨ3、ＮＨ−ＮＨ2、ＮＨ−ＮＨＣＨ3、ＮＨ−ＮＣＨ3ＣＨ3、ＮＣＨ3−ＮＨ2、ＮＣＨ3−ＮＨＣＨ3、ＮＣＨ3−ＮＣＨ3ＣＨ3、ＣＮ、Ｎ3、および（ＢＨ3）-Ｍ+からなる群から選択され、
Ｍ+はカチオンである）。
【０１５０】
修飾ＡＴＰの好ましい実施形態は、以下の構造を有する：
【０１５１】
【化７】
2016514460.tif 000008
（式中、
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3およびＸ4は、それぞれ独立に、Ｒ1、ＮＲ2Ｒ3、ＮＲ2ＯＲ2、ＮＲ2−ＮＲ2Ｒ3、ＣＮ、Ｎ3、ＮＯ、ＮＯ2、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＯＣＮ、ＳＣＮおよびＳＳＲ2からなる群から選択され、
各Ｒ1は、独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ2、ＳＲ2、ＳｅＲ2、ＮＲ2Ｒ3、Ｃ（Ｙ）Ｒ4および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、任意の置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｒ2および各Ｒ3は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、任意の置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｒ4は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ2、ＳＲ2、ＳｅＲ2、ＮＲ2Ｒ3、Ｃ（Ｙ）Ｒ2および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、任意の置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ1Ｒ1およびＮＲ1からなる群から選択される）。
【０１５２】
修飾ＡＴＰの好ましい実施形態は、以下の構造を有する：
【０１５３】
【化８】
2016514460.tif 000009
（式中、
Ｘ1は、Ｈ、ＮＨ2、ＯＨ、ＮＨＣＨ3およびＮ（ＣＨ3）2からなる群から選択され、
Ｘ2は、Ｈ、Ｃｌ、ＯＨ、ＮＨ2、ＮＨ（ＣＨ3）およびＮ（ＣＨ3）2からなる群から選択され、
Ｘ3は、Ｈ、Ｆ、ＣＨ3、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ3、ＮＨ2、ＮＨＣＨ3、Ｎ（ＣＨ3）2およびＮ3からなる群から選択され、ならびに
Ｘ4は、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ3、ＮＨ2、ＮＨＣＨ3、Ｎ（ＣＨ3）2およびＮ3からなる群から選択される）。
【０１５４】
修飾ＡＴＰの好ましい実施形態は、以下の構造を有する：
【０１５５】
【化９】
2016514460.tif 000010
（式中、
Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は、それぞれ独立に、Ｒ1、ＮＲ2ＯＲ2、ＮＲ2−ＮＲ2Ｒ3、ＣＮ、Ｎ3、ＮＯ、ＮＯ2、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＯＣＮ、ＳＣＮおよびＳＳＲ2からなる群から選択され、
各Ｒ1は、独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ2、ＳＲ2、ＳｅＲ2、ＮＲ2Ｒ3、Ｎ3、Ｃ（Ｙ）Ｒ4、置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｒ2および各Ｒ3は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｒ4は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ2、ＳＲ2、ＳｅＲ2、ＮＲ2Ｒ3、Ｃ（Ｙ）Ｒ2および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ1Ｒ1およびＮＲ1からなる群から選択される）。
【０１５６】
修飾ＡＴＰの好ましい実施形態は、以下の構造を有する：
【０１５７】
【化１０】
2016514460.tif 000011
（式中、
Ｘ1は、Ｈ、ＮＨ2、ＯＨ、ＮＨＣＨ3およびＮ（ＣＨ3）2からなる群から選択され、
Ｘ2は、Ｈ、Ｆ、ＣＨ3、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ3、ＮＨ2、ＮＨＣＨ3、Ｎ（ＣＨ3）2およびＮ3からなる群から選択され、
Ｘ3は、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ3、ＮＨ2、ＮＨＣＨ3、Ｎ（ＣＨ3）2およびＮ3からなる群から選択される）。
【０１５８】
修飾ＡＴＰの好ましい実施形態は、以下の構造を有する：
【０１５９】
【化１１】
2016514460.tif 000012
（式中、
Ｘ1およびＸ2は、それぞれ独立に、Ｒ1、ＮＲ2ＯＲ2、ＮＲ2−ＮＲ2Ｒ3、ＣＮ、Ｎ3、ＮＯ、ＮＯ2、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＯＣＮ、ＳＣＮおよびＳＳＲ2からなる群から選択され、
各Ｒ1は、独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ2、ＳＲ2、ＳｅＲ2、ＮＲ2Ｒ3、Ｎ3、Ｃ（Ｙ）Ｒ4、置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｒ2および各Ｒ3は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｒ4は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ2、ＳＲ2、ＳｅＲ2、ＮＲ2Ｒ3、Ｃ（Ｙ）Ｒ2および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ1Ｒ1およびＮＲ1からなる群から選択される）。
【０１６０】
修飾ＡＴＰの好ましい実施形態は、以下の構造を有する：
【０１６１】
【化１２】
2016514460.tif 000013
（式中、
Ｘ1は、Ｈ、Ｆ、ＣＨ3、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ3、ＮＨ2、ＮＨＣＨ3、Ｎ（ＣＨ3）2およびＮ3からなる群から選択され、
Ｘ2は、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ3、ＮＨ2、ＮＨＣＨ3、Ｎ（ＣＨ3）2およびＮ3からなる群から選択される）。
【０１６２】
修飾ＡＴＰの好ましい実施形態は、以下の構造を有する：
【０１６３】
【化１３】
2016514460.tif 000014
（式中、
Ｗ1およびＷ2は、それぞれ独立に、Ｎ、ＣＲ1およびＮ+Ｒ1からなる群から選択され、
各Ｒ1は、独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ2、ＳＲ2、ＳｅＲ2、ＮＲ2Ｒ3、Ｎ3、Ｃ（Ｙ）Ｒ4および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｒ2および各Ｒ3は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｒ4は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ2、ＳＲ2、ＳｅＲ2、ＮＲ2Ｒ3、Ｃ（Ｙ）Ｒ2および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ1Ｒ1およびＮＲ1からなる群から選択される）。
【０１６４】
修飾ＡＴＰの好ましい実施形態は、以下の構造を有する：
【０１６５】
【化１４】
2016514460.tif 000015
（式中、
Ｗ1およびＷ2は、それぞれ独立に、Ｎ、Ｎ+−ＣＨ3、Ｎ+−ＣＨ2ＣＨ3、Ｎ+−ＣＨ2  ＣＨ2ＣＨ3、Ｎ+−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、Ｎ+−ＣＨ（ＣＨ3）2、ＣＨ、Ｃ−Ｎ3、Ｃ−ＣＨ3、Ｃ−ＣＨ2ＣＨ3、Ｃ−ＣＨ2  ＣＨ2ＣＨ3、Ｃ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、Ｃ−ＣＨ（ＣＨ3）2、Ｃ−ＮＨ2、Ｃ−ＮＨＣＨ3、Ｃ−Ｎ（ＣＨ3）2、およびＣ−ＯＨからなる群から選択される）。
【０１６６】
修飾ＡＴＰのある種の好ましい実施形態は、以下の通りである：
【０１６７】
【化１５】
2016514460.tif 000016
2016514460.tif 000017
2016514460.tif 000018
【０１６８】
本明細書で提供される組成物および方法のある種の態様および実施形態は、少なくとも１つの修飾リガーゼ補因子を含む。好ましい実施形態では、修飾リガーゼ補因子は、１つまたは複数の置換基を有する修飾ＮＡＤ＋である。
【０１６９】
本明細書の態様の実施形態では、本発明の修飾ＮＡＤ＋およびその誘導体は、式ＩＢの化合物を提供する：
【０１７０】
【化１６】
2016514460.tif 000019
（式中、
Ｗ1、Ｗ2、Ｗ3およびＷ4は、それぞれ独立に、Ｎ、ＣＲ1およびＮ+Ｒ1からなる群から選択され、
各Ｒ1は、独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ2、ＳＲ2、ＳｅＲ2、ＮＲ2Ｒ3、Ｃ（Ｙ）Ｒおよび置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｒ2および各Ｒ3は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｒ4は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ2、ＳＲ2、ＳｅＲ2、ＮＲ2Ｒ3、Ｃ（Ｙ）Ｒ2および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｃ（Ｒ1）2およびＮＲ1からなる群から選択され、
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3およびＸ4は、それぞれ独立に、Ｒ1、ＮＲ2ＯＲ2、ＮＲ2−ＮＲ2Ｒ3、ＣＮ、Ｎ3、ＮＯ、ＮＯ2、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＯＣＮ、ＳＣＮおよびＳＳＲ2からなる群から選択される）。
【０１７１】
修飾ＮＡＤ＋の好ましい実施形態は、以下の構造を有する：
【０１７２】
【化１７】
2016514460.tif 000020
（式中、
Ｗ1、Ｗ2、Ｗ3およびＷ4は、それぞれ独立に、Ｎ、Ｎ+−ＣＨ3、Ｎ+−ＣＨ2ＣＨ3、Ｎ+−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、Ｎ+−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、Ｎ+−ＣＨ（ＣＨ3）2、ＣＨ、Ｃ−ＣＨ3、Ｃ−ＣＨ2ＣＨ3、Ｃ−ＣＨ2  ＣＨ2ＣＨ3、Ｃ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、Ｃ−ＣＨ（ＣＨ3）2、Ｃ−ＮＨ2、Ｃ−ＮＨＣＨ3、Ｃ−Ｎ（ＣＨ3）2、Ｃ−Ｎ3、およびＣ−ＯＨからなる群から選択され、
Ｘ1は、Ｈ、ＮＨ2、ＯＨ、ＮＨＣＨ3およびＮ（ＣＨ3）2からなる群から選択され、
Ｘ2は、Ｈ、Ｃｌ、ＯＨ、ＮＨ2、ＮＨ（ＣＨ3）およびＮ（ＣＨ3）2からなる群から選択され、
Ｘ3は、Ｈ、Ｆ、ＣＨ3、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ3、ＮＨ2、ＮＨＣＨ3、Ｎ（ＣＨ3）2およびＮ3からなる群から選択され、
Ｘ4は、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、ＯＣＨ3、ＮＨ2、ＮＨＣＨ3、Ｎ（ＣＨ3）2およびＮ3からなる群から選択される）。
【０１７３】
修飾ＮＡＤ＋の好ましい実施形態は、以下の構造を有する：
【０１７４】
【化１８】
2016514460.tif 000021
（式中、
Ｗ1、Ｗ2、Ｗ3およびＷ4は、それぞれ独立に、Ｎ、ＣＲ1およびＮ+Ｒ1からなる群から選択され、
各Ｒ1は、独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ2、ＳＲ2、ＳｅＲ2、ＮＲ2Ｒ3、Ｎ3、Ｃ（Ｙ）Ｒ4および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、任意の置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｒ2および各Ｒ3は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、任意の置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｒ4は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ2、ＳＲ2、ＳｅＲ2、ＮＲ2Ｒ3、Ｃ（Ｙ）Ｒ2および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、任意の置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ1Ｒ1およびＮＲ1からなる群から選択される）。
【０１７５】
修飾ＮＡＤ＋の好ましい実施形態は、以下の構造を有する：
【０１７６】
【化１９】
2016514460.tif 000022
（式中、
Ｗ2、Ｗ3、Ｗ4およびＷ5は、それぞれ独立に、Ｎ、Ｎ+−ＣＨ3、Ｎ+−ＣＨ2ＣＨ3、Ｎ+−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、Ｎ+−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、Ｎ+−ＣＨ（ＣＨ3）2、ＣＨ、Ｃ−ＣＨ3、Ｃ−ＣＨ2ＣＨ3、Ｃ−ＣＨ2  ＣＨ2ＣＨ3、Ｃ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、Ｃ−ＣＨ（ＣＨ3）2、Ｃ−ＮＨ2、Ｃ−ＮＨＣＨ3、Ｃ−Ｎ（ＣＨ3）2、Ｃ−Ｎ3、およびＣ−ＯＨからなる群から選択される）。
【０１７７】
修飾ＮＡＤ＋の好ましい実施形態は、以下の構造を有する：
【０１７８】
【化２０】
2016514460.tif 000023
（式中、
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3およびＸ4は、それぞれ独立に、Ｒ1、ＮＲ2ＯＲ2、ＮＲ2−ＮＲ2Ｒ3、ＣＮ、Ｎ3、ＮＯ、ＮＯ2、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＯＣＮ、ＳＣＮおよびＳＳＲ2からなる群から選択され、
各Ｒ1は、独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ2、ＳＲ2、ＳｅＲ2、ＮＲ2Ｒ3、Ｃ（Ｙ）Ｒ4および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｒ2および各Ｒ3は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｒ4は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ2、ＳＲ2、ＳｅＲ2、ＮＲ2Ｒ3、Ｃ（Ｙ）Ｒ2および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ1Ｒ1およびＮＲ1からなる群から選択される）。
【０１７９】
修飾ＮＡＤ＋の好ましい実施形態は、以下の構造を有する：
【０１８０】
【化２１】
2016514460.tif 000024
（式中、
Ｘ1は、Ｈ、ＮＨ2、ＯＨ、ＮＨＣＨ3およびＮ（ＣＨ3）2からなる群から選択され、
Ｘ2は、Ｈ、Ｃｌ、ＯＨ、ＮＨ2、ＮＨ（ＣＨ3）およびＮ（ＣＨ3）2からなる群から選択され、
Ｘ3は、Ｈ、Ｆ、ＣＨ3、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ3、ＮＨ2、ＮＨＣＨ3、Ｎ（ＣＨ3）2およびＮ3からなる群から選択され、
Ｘ4は、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、ＯＣＨ3、ＮＨ2、ＮＨＣＨ3、Ｎ（ＣＨ3）2およびＮ3からなる群から選択される）。
【０１８１】
修飾ＮＡＤ＋の好ましい実施形態は、以下の構造を有する：
【０１８２】
【化２２】
2016514460.tif 000025
（式中、
Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は、それぞれ独立に、Ｒ1、ＮＲ2ＯＲ2、ＮＲ2−ＮＲ2Ｒ3、ＣＮ、Ｎ3、ＮＯ、ＮＯ2、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＯＣＮ、ＳＣＮおよびＳＳＲ2からなる群から選択され、
各Ｒ1は、独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ2、ＳＲ2、ＳｅＲ2、ＮＲ2Ｒ3、Ｃ（Ｙ）Ｒ4および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｒ2および各Ｒ3は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｒ4は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ2、ＳＲ2、ＳｅＲ2、ＮＲ2Ｒ3、Ｃ（Ｙ）Ｒ2および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ1Ｒ1およびＮＲ1からなる群から選択される）。
【０１８３】
修飾ＮＡＤ＋の好ましい実施形態は、以下の構造を有する：
【０１８４】
【化２３】
2016514460.tif 000026
（式中、
Ｘ1は、Ｈ、ＮＨ2、ＯＨ、ＮＨＣＨ3およびＮ（ＣＨ3）2からなる群から選択され、
Ｘ2は、Ｈ、Ｆ、ＣＨ3、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ3、ＮＨ2、ＮＨＣＨ3、Ｎ（ＣＨ3）2およびＮ3からなる群から選択され、
Ｘ3は、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、ＯＣＨ3、ＮＨ2、ＮＨＣＨ3、Ｎ（ＣＨ3）2およびＮ3からなる群から選択される）。
【０１８５】
修飾ＮＡＤ＋の好ましい実施形態は、以下の構造を有する：
【０１８６】
【化２４】
2016514460.tif 000027
（式中、
Ｘ1およびＸ2は、それぞれ独立に、Ｒ1、ＮＲ2ＯＲ2、ＮＲ2−ＮＲ2Ｒ3、ＣＮ、Ｎ3、ＮＯ、ＮＯ2、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＯＣＮ、ＳＣＮおよびＳＳＲ2からなる群から選択され、
各Ｒ1は、独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ2、ＳＲ2、ＳｅＲ2、ＮＲ2Ｒ3、Ｃ（Ｙ）Ｒ4および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｒ2および各Ｒ3は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｒ4は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ2、ＳＲ2、ＳｅＲ2、ＮＲ2Ｒ3、Ｃ（Ｙ）Ｒ2および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ1Ｒ1およびＮＲ1からなる群から選択される）。
【０１８７】
修飾ＮＡＤ＋の好ましい実施形態は、以下の構造を有する：
【０１８８】
【化２５】
2016514460.tif 000028
（式中、
Ｘ1は、Ｈ、Ｆ、ＣＨ3、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ3、ＮＨ2、ＮＨＣＨ3、Ｎ（ＣＨ3）2およびＮ3からなる群から選択され、
Ｘ2は、Ｈ、Ｆ、ＯＨ、ＯＣＨ3、ＮＨ2、ＮＨＣＨ3、Ｎ（ＣＨ3）2およびＮ3からなる群から選択される）。
【０１８９】
修飾ＮＡＤ＋の好ましい実施形態は、以下の構造を有する：
【０１９０】
【化２６】
2016514460.tif 000029
（式中、
Ｗ1およびＷ2は、それぞれ独立に、Ｎ、ＣＲ1およびＮ+Ｒ1からなる群から選択され、
各Ｒ1は、独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ2、ＳＲ2、ＳｅＲ2、ＮＲ2Ｒ3、Ｎ3、Ｃ（Ｙ）Ｒ4および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｒ2および各Ｒ3は、独立に、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｒ4は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ2、ＳＲ2、ＳｅＲ2、ＮＲ2Ｒ3、Ｃ（Ｙ）Ｒ2および置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルからなる群から選択され、各置換基はそれぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択で含有することができ、
各Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＣＲ1Ｒ1およびＮＲ1からなる群から選択される）。
【０１９１】
修飾ＮＡＤ＋の好ましい実施形態は、以下の構造を有する：
【０１９２】
【化２７】
2016514460.tif 000030
（式中、
Ｗ1およびＷ2は、それぞれ独立に、Ｎ、Ｎ+−ＣＨ3、Ｎ+−ＣＨ2ＣＨ3、Ｎ+−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、Ｎ+−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、Ｎ+−ＣＨ（ＣＨ3）2、ＣＨ、Ｃ−Ｎ3、Ｃ−ＣＨ3、Ｃ−ＣＨ2ＣＨ3、Ｃ−ＣＨ2  ＣＨ2ＣＨ3、Ｃ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3、Ｃ−ＣＨ（ＣＨ3）2、Ｃ−ＮＨ2、Ｃ−ＮＨＣＨ3、Ｃ−Ｎ（ＣＨ3）2、およびＣ−ＯＨからなる群から選択される）。
【０１９３】
修飾ＮＡＤ＋の好ましい実施形態は、以下の構造を有する：
【０１９４】
【化２８】
2016514460.tif 000031
【０１９５】
修飾アクセプター
本明細書で提供される組成物および方法のある種の態様および実施形態は、少なくとも１つの修飾アクセプターを含む。好ましい実施形態では、修飾アクセプターは、１つまたは複数の置換基を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物を伴う使用に適した修飾アクセプターには、当技術分野で説明されているもの、例えばＥｇｈｏｌｍ，Ｍ．ら、米国特許第６，２９７，０１６号のＰＮＡ−ＤＮＡキメラプローブおよび３’−ＮＨ2置換プローブ（Ｆｕｎｇ，Ｓ．ら、米国特許第５，５９３，８２６号）が含まれる。
【０１９６】
本明細書の態様の実施形態では、本発明の修飾アクセプターおよびその誘導体は、式ＩＩの化合物を提供する：
【０１９７】
【化２９】
2016514460.tif 000032
（式中、
Ｂ1、Ｂ2およびＢ3は、それぞれ独立に、置換または非置換プリンまたはピリミジン、その任意のアザまたはデアザ誘導体、および好ましくは核酸ポリメラーゼまたはリガーゼによって認識され得る任意の「ユニバーサル塩基」または「縮重塩基」からなる群から選択され、
Ｘ1およびＸ2は、それぞれ独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＣＨ3およびＯＣＨ2ＣＨ3からなる群から選択され、
Ｙ1、Ｙ2およびＹ3は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｆ、ＯＨおよびＯＣＨ3からなる群から選択され、
Ｗは、Ｈまたはオリゴヌクレオチジル残基から選択される）。
【０１９８】
修飾アクセプターの好ましい実施形態は、以下の構造を有する：
【０１９９】
【化３０】
2016514460.tif 000033
（式中、
Ｂ1、Ｂ2およびＢ3は、それぞれ独立に、置換または非置換プリンまたはピリミジン、その任意のアザまたはデアザ誘導体、および好ましくは核酸ポリメラーゼまたはリガーゼによって認識され得る任意の「ユニバーサル塩基」または「縮重塩基」からなる群から選択され、
Ｘ1は、独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ2ＣＨ3およびＣＨ3からなる群から選択され、
Ｘ2は、独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ2ＣＨ3およびＣＨ3からなる群から選択され、
Ｙ1、Ｙ2およびＹ3は、それぞれ独立に、ＨおよびＯＣＨ3からなる群から選択され、
Ｗは、Ｈまたはオリゴヌクレオチジル残基から選択される）。
【０２００】
修飾ドナー
本明細書で提供される組成物および方法のある種の態様および実施形態は、少なくとも１つの修飾ドナーを含む。好ましい実施形態では、修飾ドナーは、１つまたは複数の置換基を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物を伴う使用に適した修飾アクセプターには、当技術分野で説明されているもの、例えばドナーの（５’−リン酸）鎖における５’−チオリン酸の使用が含まれる（Ｂａｎｄａｒｕ，Ｒ．ら、米国特許第６，８１１，９８６号および同第６，６３５，４２５号）。
【０２０１】
本明細書の態様の実施形態では、本発明の修飾ドナーおよびその誘導体は、式ＩＩＩの化合物を提供する：
【０２０２】
【化３１】
2016514460.tif 000034
（式中、
Ｂ1、Ｂ2およびＢ3は、それぞれ独立に、置換または非置換プリンまたはピリミジン、その任意のアザまたはデアザ誘導体、および好ましくは核酸ポリメラーゼまたはリガーゼによって認識され得る任意の「ユニバーサル塩基」または「縮重塩基」からなる群から選択され、
Ｘ1およびＸ2は、それぞれ独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＣＨ3およびＯＣＨ2ＣＨ3からなる群から選択され、
Ｙ1、Ｙ2およびＹ3は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｆ、ＯＨおよびＯＣＨ3からなる群から選択され、
Ｗは、Ｈまたはオリゴヌクレオチジル残基から選択される）。
【０２０３】
修飾ドナーの好ましい実施形態は、以下の構造を有する：
【０２０４】
【化３２】
2016514460.tif 000035
（式中、
Ｂ1、Ｂ2およびＢ3は、それぞれ独立に、置換または非置換プリンまたはピリミジン、その任意のアザまたはデアザ誘導体、および好ましくは核酸ポリメラーゼまたはリガーゼによって認識され得る任意の「ユニバーサル塩基」または「縮重塩基」からなる群から選択され、
Ｘ1およびＸ2は、それぞれ独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ2ＣＨ3またはＣＨ3からなる群から選択され、
Ｙ1、Ｙ2およびＹ3は、それぞれ独立に、ＨおよびＯＣＨ3からなる群から選択され、
Ｗは、Ｈまたはオリゴヌクレオチジル残基から選択される）。
【０２０５】
本明細書の態様の実施形態では、本発明の修飾ドナーおよびその誘導体は、式ＩＶの化合物を提供する：
【０２０６】
【化３３】
2016514460.tif 000036
（式中、
Ａはアデニンであり、
Ｂ1、Ｂ2およびＢ3は、それぞれ独立に、置換または非置換プリンまたはピリミジン、その任意のアザまたはデアザ誘導体、および好ましくは核酸ポリメラーゼまたはリガーゼによって認識され得る任意の「ユニバーサル塩基」または「縮重塩基」からなる群から選択され、
Ｘ1およびＸ2は、それぞれ独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＣＨ3およびＯＣＨ2ＣＨ3からなる群から選択され、
Ｙ1、Ｙ2およびＹ3は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｆ、ＯＨおよびＯＣＨ3からなる群から選択され、
Ｗは、Ｈまたはオリゴヌクレオチジル残基から選択される）。
【０２０７】
修飾リガーゼ補因子、修飾アクセプターおよび修飾ドナーの組合せ
本明細書で提供される組成物および方法のある種の態様および実施形態は、修飾リガーゼ補因子、修飾アクセプターおよび修飾ドナーの組合せの使用を含む。２つ以上の任意の可能な組合せが使用されてもよい。いくつかの実施形態において、２種類以上のリガーゼ補因子、修飾アクセプターまたは修飾ドナーが使用されてもよい。
【０２０８】
例示的な組合せには、以下のような群から選択される２つ以上の修飾リガーゼ補因子、修飾アクセプターおよび修飾ドナーの組合せが含まれる：
【０２０９】
修飾アクセプター：
【化３４】
2016514460.tif 000037
（式中、
Ｂ1、Ｂ2およびＢ3は、それぞれ独立に、置換または非置換プリンまたはピリミジン、その任意のアザまたはデアザ誘導体、および好ましくは核酸ポリメラーゼまたはリガーゼによって認識され得る任意の「ユニバーサル塩基」または「縮重塩基」からなる群から選択され、
Ｘ1およびＸ2は、それぞれ独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＣＨ3およびＯＣＨ2ＣＨ3からなる群から選択され、
Ｙ1、Ｙ2およびＹ3は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｆ、ＯＨおよびＯＣＨ3からなる群から選択され、
Ｗは、Ｈまたはオリゴヌクレオチジル残基から選択される）。
【０２１０】
修飾ドナー：
【化３５】
2016514460.tif 000038
（式中、
Ｂ1、Ｂ2およびＢ3は、それぞれ独立に、置換または非置換プリンまたはピリミジン、その任意のアザまたはデアザ誘導体、および好ましくは核酸ポリメラーゼまたはリガーゼによって認識され得る任意の「ユニバーサル塩基」または「縮重塩基」からなる群から選択され、
Ｘ1およびＸ2は、それぞれ独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＣＨ3およびＯＣＨ2ＣＨ3からなる群から選択され、
Ｙ1、Ｙ2およびＹ3は、それぞれ独立に、Ｈ、Ｆ、ＯＨおよびＯＣＨ3からなる群から選択され、
Ｗは、Ｈまたはオリゴヌクレオチジル残基から選択される）。
【０２１１】
修飾補因子：
【化３６】
2016514460.tif 000039
2016514460.tif 000040
2016514460.tif 000041
【０２１２】
修飾リガーゼ構成要素の特に好ましい組合せは、以下のような修飾アクセプター、修飾ドナーおよび修飾補因子から選択される：
【０２１３】
修飾アクセプター：
【化３７】
2016514460.tif 000042
（式中、
Ｂ1、Ｂ2およびＢ3は、それぞれ独立に、置換または非置換プリンまたはピリミジン、その任意のアザまたはデアザ誘導体、および好ましくは核酸ポリメラーゼまたはリガーゼによって認識され得る任意の「ユニバーサル塩基」または「縮重塩基」からなる群から選択され、
Ｘ1は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ2ＣＨ3およびＣＨ3からなる群から選択され、
Ｘ2は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ2ＣＨ3およびＣＨ3からなる群から選択され、
Ｙ1、Ｙ2およびＹ3は、それぞれ独立に、ＨおよびＯＣＨ3からなる群から選択され、
Ｗは、Ｈまたはオリゴヌクレオチジル残基から選択される）。
【０２１４】
修飾ドナー：
【化３８】
2016514460.tif 000043
（式中、
Ｂ1、Ｂ2およびＢ3は、それぞれ独立に、置換または非置換プリンまたはピリミジン、その任意のアザまたはデアザ誘導体、および好ましくは核酸ポリメラーゼまたはリガーゼによって認識され得る任意の「ユニバーサル塩基」または「縮重塩基」からなる群から選択され、
Ｘ1およびＸ2は、それぞれ独立に、ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ2ＣＨ3およびＣＨ3からなる群から選択され、
Ｙ1、Ｙ2およびＹ3は、それぞれ独立に、ＨおよびＯＣＨ3からなる群から選択され、
Ｗは、Ｈまたはオリゴヌクレオチジル残基から選択される）。
【０２１５】
修飾補因子：
【化３９】
2016514460.tif 000044
【０２１６】
一態様では、本明細書の方法および組成物は、修飾リガーゼ構成要素を提供する。いくつかの実施形態では、修飾リガーゼ構成要素は、１つのみの置換基を有することができる。他の実施形態では、修飾リガーゼ構成要素は、塩基、三リン酸鎖、糖またはそれらの組合せにおける修飾などの２つ以上の置換基を含有することができる。他の実施形態では、修飾リガーゼ構成要素は、２種類以上の置換基を含有することができる。修飾リガーゼ構成要素は、本明細書に記載の式Ｉ〜ＩＩＩの化学式を有することができる。
【０２１７】
別の態様では、本明細書にさらに記載の式Ｉ〜ＩＩＩに図示した化学構造を有する修飾リガーゼ構成要素の合成方法を本明細書に提供する。置換基は、既存の合成法または酵素的方法を使用することによって、リガーゼ補因子、アクセプターまたはドナーに組み込むことができる。本明細書で提供する方法および組成物の修飾リガーゼ構成要素は、当技術分野で周知の任意の方法によって合成することができる。修飾リガーゼ構成要素の合成および精製後、いくつかの異なる手順を利用して、構造および純度の観点から修飾リガーゼ構成要素の受容性を決定することができる。かかる手順の例は、核磁気共鳴分光法、質量分析、蛍光分光法、紫外分光法、高速液体クロマトグラフィーである。これらの手順は当業者に周知である。当技術分野の分離、精製および分析に用いられている現在の方法は、本発明で提供する方法および組成物の修飾リガーゼ構成要素に対しても同様に適用することができる。
【０２１８】
本明細書で提供する方法および組成物の目的を達成する置換基であれば、いずれも利用することができる。置換基は、その使用が、修飾リガーゼ構成要素が用いられるライゲーション反応条件下で望ましくないライゲーション産物の形成を低減し、またはそれに障害を与える置換基であるべきである。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、修飾ライゲーション構成要素によって、対応する非修飾リガーゼ構成要素と比較してライゲーション特異性が改善される。ライゲーションの改善とは、マッチ核酸とミスマッチ核酸を識別するリガーゼの能力を指す。好ましくは、修飾ライゲーション構成要素が存在する場合、標的核酸（例えば、テンプレート）と比較して、ドナーおよび／またはアクセプターにおいて１つのミスマッチがある場合、ライゲーションが低減または防止される。他の実施形態では、修飾ライゲーション構成要素によって、ミスマッチ（非相補的な）核酸標的のライゲーション効率が低下することにより、ライゲーション特異性が改善される。好ましい実施形態では、修飾ライゲーション構成要素によって、マッチ核酸と比較して、少なくとも１つの塩基対のミスマッチを有する核酸のライゲーション効率が低下することにより、ライゲーション特異性が改善される。好ましい実施形態では、修飾ライゲーション構成要素を伴うライゲーションによって、ライゲーション特異性が、少なくとも０．１％、０．２％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、または少なくとも４００％改善される。
【０２２０】
いくつかのライゲーション反応では、ライゲーション反応におけるすべてのリガーゼ補因子、アクセプターおよび／またはドナー分子が、置換基を含有するわけではない。好ましくは、修飾リガーゼ補因子と非修飾リガーゼ補因子の両方の混合物でも、修飾リガーゼ補因子を全く使用しない場合と比較して、混合集団におけるライゲーションの効率および特異性が改善される。好ましくは、初期の変性温度におけるインキュベーションの前に、修飾リガーゼ補因子は、すべてのリガーゼ補因子分子の少なくとも２５％、好ましくはすべてのリガーゼ補因子分子の少なくとも５０％、好ましくはすべてのリガーゼ補因子分子の少なくとも７５％、好ましくはすべてのリガーゼ補因子分子の少なくとも９０％、好ましくはすべてのリガーゼ補因子分子の少なくとも９５％、好ましくはすべてのリガーゼ補因子分子の少なくとも９８％、より好ましくはすべてのリガーゼ補因子分子の少なくとも９９％、より好ましくはすべてのリガーゼ補因子分子の１００％を構成する。別の実施形態では、２種、３種、４種以上の種類のリガーゼ補因子分子を、ライゲーション反応において用いることができる。
【０２２１】
一実施形態では、１種類のみの修飾リガーゼ補因子が、ライゲーション反応において存在する。他の実施形態では、様々な種類の修飾リガーゼ補因子が、同じライゲーション反応において存在できる。別の実施形態では、２種類以上の修飾リガーゼ補因子が、同じライゲーション反応において存在できる。別の実施形態では、３種類以上の修飾リガーゼ補因子が、同じライゲーション反応において存在できる。別の実施形態では、４種類以上の修飾リガーゼ補因子が、同じライゲーション反応において存在できる。
【０２２２】
本明細書で提供する修飾リガーゼ構成要素を伴う使用に適した例示的なライゲーション方法には、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．ら、２４１  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１０７７〜１０８０頁（１９８８））、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｉｅｄｍａｎｎ，Ｍ．ら、３  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ、Ｓ５１〜６４頁（１９９４））、リガーゼ媒介ＰＣＲ（ＬＭ−ＰＣＲ）（Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｐ．Ｒ．ら、２４６  Ｓｃｉｅｎｃｅ、７８０〜７８６頁（１９８９）、Ｐｆｅｉｆｅｒ，Ｇ．Ｐ．ら、２４６  Ｓｃｉｅｎｃｅ、８１０〜８１３頁（１９８９））、ＰＣＲライゲーション検出反応（ＰＣＲ−ＬＤＲ）（Ｃｈｅｎｇ，Ｙ．Ｗ．ら、１６  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ、２８２〜２８９頁（２００６））、Ｐａｄｌｏｃｋプローブ（Ａｎｔｓｏｎ，Ｄ．ら、２８  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、ｅ５８（２０００））、ＰＣＲオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＰＣＲ−ＯＬＡ）（Ｄｅｌａｈｕｎｔｙ，Ｃ．ら、５８  Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ、１２３９〜１２４６頁（１９９６））、ギャップＬＣＲ手法（Ａｂｒａｖａｙａ，Ｋ．ら、２３  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、６７５〜６８２（１９９５））、ＳＮＰｌｅｘ（Ｄｅ  ｌａ  Ｖｅｇａ，Ｆ．Ｍ．ら、５７３  Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ、１１１〜１３５頁（２００５）、Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．１４  Ｇｅｎｅｔ  Ａｎａｌ、１４３〜１４９頁（１９９９））、ＭＬＰＡ（多重ライゲーション依存性プローブ増幅）（Ｓｃｈｏｕｔｅｎ，Ｊ．Ｐ．ら、３０  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、ｅ５７（２００２））、ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ遺伝子型解析アッセイ（Ｆａｎ，Ｊ．Ｂ．ら、６８  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｓｙｍｐ  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ、６９〜７８頁（２００３）、Ｏｌｉｐｈａｎｔ，Ａ．ら、Ｓｕｐｐｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、５６〜５８頁、６０〜５１頁（２００２）、Ｓｈｅｎ，Ｒ．ら、５７３  Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ、７０〜８２頁（２００５））、および分子反転プローブアッセイ（Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．ら、２５１  Ｓｃｉｅｎｃｅ、７６７〜７７３頁（１９９１）、Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｈ．Ｓ．ら、１  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０９〜１１１頁（２００４）、Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｈ．ら、１４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ、４１４〜４２５頁（２００４）、Ｐｅａｓｅ，Ａ．Ｃ．ら、９１  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、５０２２〜５０２６頁（１９９４））、近接ライゲーション（Ｇｕｓｔａｆｓｄｏｔｔｉｒ，Ｓ．ら、３４５  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２〜９頁（２００５）、Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇ，Ｏ．ら、２８  Ｇｅｎｅｔ  Ｅｎｇ（ＮＹ）、８５〜９３頁（２００７））、およびライゲーションによる次世代シークエンシングが含まれる。
【０２２３】
本明細書で提供する修飾リガーゼ構成要素を伴う使用に適した配列検出のための例示的なライゲーション系手法には、Ｂａｒａｎｙ，Ｆ．ら、米国特許第７，２４４，８３１号、同第６，３１２，８９２号に記載のもの、ならびに高い忠実度の熱安定性リガーゼの使用（米国特許第６，９４９，３７０号）、ＬＤＲおよびＰＣＲの組合せ（Ｂａｒａｎｙ，Ｆ．ら、米国特許第７，０９７，９８０号、同第６，７９７，４７０号、同第６，２６８，１４８号、同第６，０２７，８８９号、同第７，１６６，４３４号）、エンドヌクレアーゼを使用するライゲーション（Ｂａｒａｎｙ，Ｆ．ら、米国特許第７，１９８，８９４号、同第７，０１４，９９４号）、ＯＬＡ／ＰＣＲ（Ｅｇｇｅｒｄｉｎｇ，Ｆ．、米国特許第５，９１２，１４８号、同第６，１３０，０７３号）、ライゲーション／増幅（Ｌａｏ，Ｋ．Ｑ．、米国特許第７，２５５，９９４号）、段階的ライゲーションおよび切断（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．ら、米国特許第５，７１４，３３０号、同第５，５５２，２７８号）、近接ライゲーション（Ｇｕｓｔａｆｓｄｏｔｔｉｒ，Ｓ．ら、３４５  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２〜９頁（２００５）、Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇ，Ｏ．ら、２８  Ｇｅｎｅｔ  Ｅｎｇ（ＮＹ）、８５〜９３頁（２００７）、Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ，Ｓ．ら、２０  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、４７３〜４７７頁（２００２））、病原体検出のための近接ライゲーション（Ｇｕｓｔａｆｓｄｏｔｔｉｒ，Ｓ．Ｍ．ら、５２  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、１１５２〜１１６０頁（２００６））、サイトカイン検出（Ｇｕｌｌｂｅｒｇ，Ｍ．ら、１０１  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８４２０〜８４２４頁（２００４））、胞子検出（Ｐａｉ，Ｓ．ら、３３  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、ｅ１６２（２００５））、がんバイオマーカー検出（Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ，Ｓ．ら、４  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、３２７〜３２９頁（２００７））、ならびにタンパク質−ＤＮＡ相互作用の強度を測定するための近接ライゲーション（Ｇｕｓｔａｆｓｄｏｔｔｉｒ，Ｓ．ら、３４５  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２〜９頁（２００５）、Ｓｃｈａｌｌｍｅｉｎｅｒ，Ｅ．ら、４  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１３５〜１３７頁（２００７））が含まれる。
【０２２４】
本明細書で提供する修飾リガーゼ構成要素を伴う使用に適した例示的なライゲーション系診断アッセイには、ＨＩＶ薬物耐性株の検出（Ｌａｌｏｎｄｅ，Ｍ．ら、４５  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２６０４〜２６１５頁（２００７））、対立遺伝子に特異的な産物の多重検出（Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，Ｓ．Ｊ．ら、６  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ、Ｒ１０５（２００５））、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）を含むライゲーションによるＳＮＰ検出（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．ら、２４１  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１０７７〜１０８０頁（１９８８））、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｉｅｄｍａｎｎ，Ｍ．ら、３  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ、Ｓ５１〜６４頁（１９９４））、ライゲーションとリガーゼ媒介ＰＣＲ（ＬＭ−ＰＣＲ）を含むＰＣＲの組合せを使用するＳＮＰ検出（Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｐ．Ｒ．ら、２４６  Ｓｃｉｅｎｃｅ、７８０〜７８６頁（１９８９）、Ｐｆｅｉｆｅｒ，Ｇ．Ｐ．ら、２４６  Ｓｃｉｅｎｃｅ、８１０〜８１３頁（１９８９））、ＰＣＲライゲーション検出反応（ＰＣＲ−ＬＤＲ）（Ｃｈｅｎｇ，Ｙ．Ｗ．ら、１６  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ、２８２〜２８９頁（２００６））、Ｐａｄｌｏｃｋプローブ（Ａｎｔｓｏｎ，Ｄ．ら、２８  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、ｅ５８（２０００））、ＰＣＲオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＰＣＲ−ＯＬＡ）（Ｄｅｌａｈｕｎｔｙ，Ｃ．ら、５８  Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ、１２３９〜１２４６頁（１９９６））、ならびにギャップＬＣＲ手法（Ａｂｒａｖａｙａ，Ｋ．ら、２３  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、６７５〜６８２頁（１９９５））、ＳＮＰｌｅｘ（Ｄｅ  ｌａ  Ｖｅｇａ，Ｆ．Ｍ．ら、５７３  Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ、１１〜１３５頁（２００５）、Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．１４  Ｇｅｎｅｔ  Ａｎａｌ、１４３〜１４９頁（１９９９））、ＭＬＰＡ（多重ライゲーション依存性プローブ増幅）（Ｓｃｈｏｕｔｅｎ，Ｊ．Ｐ．ら、３０  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、ｅ５７（２００２））、ＩｌｌｕｍｉｎａのＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ遺伝子型解析アッセイ（Ｆａｎ，Ｊ．Ｂ．ら、６８  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｓｙｍｐ  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ、６９〜７８頁（２００３）、Ｏｌｉｐｈａｎｔ，Ａ．ら、Ｓｕｐｐｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、５６〜５８頁、６０〜５１頁（２００２）、Ｓｈｅｎ，Ｒ．ら、５７３  Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ、７０〜８２頁（２００５））、ならびにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイ上での分子反転プローブアッセイ（Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．ら、２５１  Ｓｃｉｅｎｃｅ、７６７〜７７３頁（１９９１）、Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｈ．ら、１  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０９〜１１１頁（２００４）、Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｈ．ら、１４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ、４１４〜４２５頁（２００４）、Ｐｅａｓｅ，Ａ．Ｃ．ら、９１  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、５０２２〜５０２６頁（１９９４））が含まれる。
【０２２５】
本明細書で提供する修飾リガーゼ構成要素を伴う使用に適したさらなる例示的なライゲーションアッセイには、従来のＳａｎｇｅｒジデオキシシークエンシング（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ら、７４  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、５４６３−５４６７（１９７７）および４５４シークエンシングシステムなどの次世代シークエンシングアッセイ、Ｉｌｌｕｍｉｎａゲノム分析器、Ｋｎｏｍｅ’ｓ  ＫｎｏｍｅＣＯＭＰＬＥＴＥTMゲノムシークエンシングサービス、ならびにＡＢＩ  ＳＯＬｉＤTMシステムによるシークエンシング技術およびライゲーションアッセイによる他のシークエンシング（Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｍ．、１１  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ、３−１１（２００１）、Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ，Ａ．、１２  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２７−３２（１９９４）、Ｓｃｈｍａｌｚｉｎｇ，Ｄ．ら、２０  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、３０６６−３０７７（１９９９））が含まれる。
【０２２６】
修飾リガーゼ補因子、修飾アクセプタープローブおよび修飾ドナープローブを利用する核酸ライブラリーの調製
次世代シークエンシング技術は従来のＳａｎｇｅｒジデオキシシークエンシングよりはるかに進歩している。低いコストでギガベースのシークエンシングデータを迅速に生成する能力を含む、ＮＧＳ技術によって提示されているいくつかの顕著な利点が存在する。ＮＧＳ試料調製における１つの一般的なステップは、開始ＤＮＡまたはＲＮＡライブラリーの５’末端および３’末端への、アダプターと呼ばれる一定の配列のライゲーションである。ライゲーションステップは、間にライブラリーのセグメントを有さない、互いに対するアダプター配列の望ましくない接合の結果、アダプター二量体形成を生じることにより悩まされ場合がある（図９、１２および１４）。アダプター二量体を除去する手法が開発されているが、ほとんどは精製ステップまたは選択的プライミングステップを含み、少量の配列の配列バイアスまたは喪失を生じ得る。ライブラリーの複雑性に対する意図的でない変化が生じることを回避するために、ライゲーションステップにおいてアダプター二量体形成を遮断することは有益である。
【０２２７】
核酸ライブラリー調製スキームは標的核酸の５’末端および３’末端へのアダプター配列の付加を含む。ＲＮＡライブラリーに関して、アダプターは典型的に、Ｔｉａｎ，Ｇ．ら、１０  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、６４（２０１０）に記載されているように、アダプター二量体形成を最小化するために２つの連続したライゲーションステップに加えられる。最初に、３’−アダプタープローブのアデニル化型が、５’−リン酸化プローブより５’−アデニル化を利用するＴ４ＲＮＡリガーゼ２のトランケート型を使用して、ＡＴＰの非存在下でＲＮＡライブラリーの３’末端にライゲーションされる。次に、５’−アダプタープローブ配列が、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ１を使用してＲＮＡライブラリーの５’末端に付加される。アダプター二量体形成を抑制する１つの手法は、Ｎａｋａｓｈｅ，Ｐ．ら、１  Ｊｏｕｒｎａｌ  ＯＭＩＣＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６−１１（２０１１）に記載されているように、および米国特許出願公開第２０１３０１５７８６９（Ａ１）号に記載されているように、３’−アダプターのライゲーション後で５’−アダプターのライゲーションステップの前のｃＤＮＡ合成プライマーのハイブリダイゼーションによる。Ｋａｗａｎｏ，Ｍ．ら、４９  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、７５１−７５５（２０１０）に記載されている別の手法は、下流の複製を遮断するためにアダプター二量体とＬＮＡ配列との間のハイブリダイゼーションステップを利用する。米国特許第８５７５０７１（Ｂ２）号に記載されているヘアピンアダプターを用いるアダプター二量体を抑制する他の手法は、ＵＳ２０１３０３２３７２５に記載されているアダプター二量体を分解するための制限消化酵素の使用、およびＵＳ２０１００１６７９５４（Ａ１）に記載されているＰＣＲプライマーに対する修飾の使用を用いる。低分子ＲＮＡに対する典型的な次世代シークエンシング実験は低分子ＲＮＡ−Ｓｅｑと呼ばれ、ＲＮＡに対する次世代シークエンシング実験はＲＮＡ−Ｓｅｑと呼ばれる。ＲＮＡ−Ｓｅｑワークフローのバリエーションには、Ｈｅａｄ，Ｓ．Ｒ．ら  ５６  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６１〜７７頁（２０１４）に記載されている、ＲＮＡ免疫沈降試料単離（ＲＩＰ−Ｓｅｑ）、ＣＬＩＰ−Ｓｅｑ（架橋および免疫沈降を含むＲＩＰ−ｓｅｑのバリエーション）が含まれる。
【０２２８】
従来の試料調製は、典型的に、３つのステップを含む：１）シークエンシング機器の読み取り長さに適合するサイズへの入力ライブラリーの断片化、２）ライブラリーの５’および３’末端へのアダプタープローブ配列の導入（図９）、ならびに３）増幅。アダプタープローブ配列は、プローブライゲーションにより、またはトランスポゾンベースの手法などの代替の戦略を介して導入され得る。トランスポゾンの使用は大いに有望であるが、ライブラリーバイアスに関する懸念が存在する。ライブラリー調製のためのライゲーションベースの戦略の範囲内で、高効率のライゲーション条件が開発されている。しかし、５’−および３’−アダプタープローブ配列が互いにライゲーションして二量体を形成する傾向が強くなる（図９）。「アダプタープローブ二量体」は、それらがＮＧＳ試行における機能的読み取りの数を減少させ、多くの場合、それらを除去するための精製ステップを必要とするため、望ましくない。精製または選択的プライミングステップがワークフロー内に導入され得るが、特に集団内の少量の配列に関してライブラリーの複雑性は減少され得る。
【０２２９】
本発明の一態様は、ＲＮＡライブラリーを調製する場合、アダプタープローブ二量体形成を最小化するために２つの連続したライゲーションステップにおいてライブラリー調製反応に加えられる３’−修飾アダプタープローブおよび５’−修飾アダプタープローブ（すなわち、それぞれ修飾アクセプタープローブおよび修飾ドナープローブ）を提供する（図１０）。最初に、３’−修飾アダプタープローブのアデニル化型が、５’−リン酸化プローブより５’−アデニル化を使用するＴ４  ＲＮＡリガーゼの特殊化した型を使用して、ＡＴＰの非存在下でＲＮＡライブラリーの３’末端へライゲーションされる。次に、５’−修飾アダプタープローブ配列がＴ４  ＲＮＡリガーゼ１を使用してＲＮＡライブラリーの５’末端へ加えられる。この手法において、一対の修飾５’−および３’−アダプタープローブコンストラクトは、アダプタータグ付きＲＮＡライブラリーの効果的な形成を可能にしながら、アダプタープローブ二量体形成を遮断する。図２１に示されるように、アダプター二量体形成は、特に低いＲＮＡ入力レベルにおいて重要な問題である。さらに、修飾アダプタープローブの使用は図２２および２３に示されるようにライブラリー調製の特異性および収率を改善できる。図２４および２５はライブラリー調製のための市販の方法に対するこの方法のいくつかの比較データを示し、これらの技術間で良好な相関関係が得られる。
【０２３０】
本発明の一態様は、１つのステップに組み合わされる低分子ＲＮＡライブラリー調製の２つの反応ステップに関する（図１１）。ワークフローのこのさらなる合理化はいくつかの理由のために有益である。第１に、図９に概説される２つの任意選択の精製ステップは単一の任意選択の精製ステップに低減される。第２に、２つの酵素についての必要性がワークフローから排除される。第３に、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼの特殊化した型を除去することによって、３’−修飾アダプタープローブの５’−アデニル化型の使用をもはや必要としない。５’−アデニル化プローブより５’−リン酸化アダプタープローブを使用する切り替えは３’−アダプタープローブ構成要素のコストを低減させる。さらに、この手法はアデニル化プローブを調製するための複雑化した酵素ステップの必要性をなくす。第４の利点は、２つの隣接する修飾の存在（アダプター二量体のみに存在する）が、アダプタータグ付きライブラリーの選択的ｃＤＮＡ合成を可能にする、下流のステップで使用される逆転写酵素の伸長を遮断できることである。これは、プロトコールから別の精製ステップを排除する可能性がある。別の態様において、３’−修飾アダプタープローブおよび５’−修飾アダプタープローブが、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＩｏｎ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｋｉｔ  ｖ２などのスプリンテッドライゲーション（ｓｐｌｉｎｔｅｄ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）ワークフローにおいて使用され得る。
【０２３１】
一態様において、核酸ライブラリーへの修飾アダプタープローブのライゲーション後、様々な下流プロセシングステップが実施され得る。一実施形態において、得られた反応混合物は、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼなどの核酸ポリメラーゼ、または逆転写酵素によって複製される。任意のアダプター二量体形成がライブラリー調製ワークフローから生じるならば、そのアダプター二量体は２つの隣接する修飾を含有する。これらの連続修飾の存在は未修飾アダプター二量体に対する核酸ポリメラーゼによって修飾アダプター二量体の複製を低減または阻害する。この特性は最終的なライブラリーにおいてアダプター二量体のレベルをさらに抑制し、より特異的なライブラリー形成および下流の次世代シークエンシングを可能にする。
【０２３２】
この態様の一実施形態において、３’−および５’−修飾アダプタープローブは熱に不安定な置換基をさらに含む（図１６）。置換基はリガーゼ反応の最初の熱変性ステップの間および後に切断または解離する。熱に不安定な置換基を有するドナープローブ、アクセプタープローブおよび補因子は、２０１２年１月３日に出願された特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２０１０９により詳細に記載されており、その全体は参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、熱不安定性置換基は修飾アダプタープローブに結合され、例えば、修飾アクセプタープローブの３’末端または修飾ドナープローブの５’末端に近接した大きなＰＴＥヌクレオチド間結合を生じる。大きなＰＴＥ基は、最初の熱変性ステップ（ホットスタート活性化ステップ）の前に核酸テンプレート（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）上で隣接するアクセプタープローブの３’−ヒドロキシル基と修飾ドナープローブの５’−ホスホリル末端との間のリガーゼにより触媒されるホスホジエステル結合形成を妨げる。修飾ドナーおよびアクセプタープローブは単一の置換部位または複数の置換部位を有し得る。
【０２３３】
本明細書に開示される熱に不安定な置換基を含む修飾アダプタープローブは２つの状態を有する。第１の状態において、修飾アダプタープローブは、初期活性化温度、多くの場合、９５℃に到達する前にライゲーション産物の形成を妨げる、置換基の存在に起因して不活性である。初期活性化温度に到達すると、修飾アダプタープローブは、熱に誘導される分子内または分子間フラグメンテーション反応によって置換基を放出し、第２の状態に変換する。第２の状態において、置換基の部分的または完全解離または切断は、好ましくは、約０．１〜１２０分間、約９５℃での修飾アダプタープローブのインキュベーション後に生じる。ある種の実施形態において、修飾アダプタープローブからの置換基の解離が温度に関連して生じ、他の酵素、化学物質または特異的ライゲーション反応条件を必要としない。熱不安定性置換ヌクレオチド間結合は、Ｂｅａｕｃａｇｅら、米国特許第６７６２２９８号；Ｚｏｎら、米国特許第８３６１７５３（Ｂ２）号；Ｌｅｂｅｄｅｖ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  ２００９、ｕｎｉｔ  ４．３５．；Ａｓｈｒａｆｉら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  ２００９、ｕｎｉｔ  １５．９．  Ｈｉｄａｌｇｏ−Ａｓｈｒａｆｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２００９、４７（３）：７８９〜９０頁；Ｌｅｂｅｄｅｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００８、３６（２０）：１３１；Ｓｈｕｍら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００９、３８８：２６６〜２７２頁；Ｈｉｄａｌｇｏ−Ａｓｈｒａｆｉら  ＢＳＣ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００９、１０：１１３に記載されている。
【０２３４】
本発明の別の態様は、次世代シークエンシング実験におけるＲＮＡライブラリーの使用である。低ＲＮＡに対する典型的な次世代シークエンシング実験は低分子ＲＮＡ−Ｓｅｑと呼ばれ、ＲＮＡに対する次世代シークエンシング実験はＲＮＡ−Ｓｅｑと呼ばれる。ＲＮＡ−Ｓｅｑワークフローのバリエーションには、Ｈｅａｄ，Ｓ．Ｒ．ら、５６  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６１〜７７頁（２０１４）に記載されている、ＲＮＡ免疫沈降試料単離（ＲＩＰ−Ｓｅｑ）、ＣＬＩＰ−Ｓｅｑ（架橋および免疫沈降を含むＲＩＰ−ｓｅｑのバリエーション）が含まれる。本明細書に記載される方法はこれらのワークフローに適用されてもよい。
【０２３５】
Ｌｉｎｎａｒｓｓｏｎ，Ｓ．、３１６、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １３３９〜１３４３頁（２０１０）により概説されているように、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）のための調製において二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ライブラリーをタグ付けするいくつかの手法が記載されており、ほとんどはライゲーションステップを含む。１つの手法において、プローブ配列は、５’−リン酸化平滑末端ｄｓＤＮＡライブラリーへの一対の５’−リン酸化平滑末端ｄｓＤＮＡアダプタープローブ（Ｐ１およびＰ２）のライゲーションによってｄｓＤＮＡライブラリーに付加される。Ｐ１およびＰ２アダプター配列は単一のステップにおいてＴ４ＤＮＡリガーゼを使用してｄｓＤＮＡライブラリーの両方の末端に付加される。ニックトランスレーションに関するものを含む、平滑末端アダプターライゲーション戦略は、ＳＯＬｉＤまたはＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）および４５４  ＧＳ  ＦＬＸ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）ワークフローに典型的である。別の手法において、ｄｓＤＮＡライブラリーは、３’末端に単一のＡテイルを含有するｄｓＤＮＡライブラリーを生成する、異なる洗練ステップに供される。Ａ−テイルｄｓＤＮＡライブラリーは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用した単一のステップにおいて３’末端および５’リン酸に単一のＴテイルを含有するｄｓＤＮＡアダプターにライゲーションされる。Ａ−テイルライゲーション戦略はＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に典型的である。３つの手法すべては、Ｌｉｎｎａｒｓｓｏｎ，Ｓ．、３１６、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １３３９〜１３４３頁（２０１０）；Ｑｕａｉｌ，Ｍ．Ａ．ら、５，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １００５〜１０１０頁（２００８）およびＨｕａｎｇ，Ｊ．ら、６、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、ｅ１９７２３（２０１１）に記載されているようにアダプター二量体を形成する傾向がある。Ｂｏｒｍａｎｎ  Ｃｈｕｎｇ  Ｃ．Ａ．ら  ５ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ｅ９３２０（２０１０）に記載されているように、平滑末端ｄｓＤＮＡアダプタープローブは５’リン酸化されていないという点で、ニックトランスレーションワークフローは平滑末端アダプターライゲーション戦略のものと異なる。ＤＮＡに対する典型的な次世代シークエンシング実験はまとめてＤＮＡ−Ｓｅｑと呼ばれ、Ｄａｖｅｙ，Ｊ．Ｗ．９、Ｂｒｉｅｆ  Ｆｕｎｃｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４１６〜２３頁（２０１０）に記載されているＲＡＤ−Ｓｅｑ（制限部位関連ＤＮＡシークエンシング）ならびに両方ともＨｅａｄ，Ｓ．Ｒ．ら、５６  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６１〜７７頁（２０１４）に記載されているＣｈｉｐ−ｓｅｑ（染色体免疫沈降シークエンシング）およびＭｅｔｈｙｌｓｅｑ（メチル化ＤＮＡ残基についての選択を含む）を含むいくつかのバリエーションがある。
【０２３６】
本発明の別の態様は、ｄｓＤＮＡライブラリーを調製するときにアダプタープローブ二量体形成を最小化するために利用され得る、加えられる修飾二本鎖アダプタープローブを提供する。修飾アダプタープローブは二本鎖であり、３’−修飾アダプタープローブと５’−修飾アダプタープローブとの間のハイブリダイゼーションの結果である。３’−修飾アダプタープローブと５’−修飾アダプタープローブとの間の相補性は完全であってもよく、または部分的であってもよい。修飾二本鎖アダプタープローブは、平滑末端であってもよい（図１３）か、または重複するヌクレオチドを有してもよい（図１５）か、またはＤａｖｅｙ，Ｊ．Ｗ．９、Ｂｒｉｅｆ  Ｆｕｎｃｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４１６〜２３頁（２０１０）に記載されている、ＲＡＤ−Ｓｅｑ（制限部位関連ＤＮＡシークエンシング）に使用される場合、末端に１つもしくは複数の不対ヌクレオチド（１〜１０、より好ましくは１〜４）を有してもよい。さらに、二本鎖アダプタープローブは、５’−リン酸、５’−アデニル酸または５’−ヒドロキシルを含有してもよい。従来の手法（図１２および１４）において、二本鎖アダプター配列はＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用してｄｓＤＮＡライブラリーの両方の末端に加えられる。平滑末端二本鎖アダプターライゲーション戦略、Ｔ−テイル二本鎖アダプターライゲーション戦略、制限部位関連ライゲーション戦略およびニックトランスレーション戦略はｄｓＤＮＡライブラリーを調製するための典型的なプラットフォームである。これらの手法の各々はアダプター二量体を形成する傾向がある。アダプタープローブ二量体形成を克服するために、二本鎖アダプタープローブの修飾型は望ましくない副反応を遮断する（図２６）。２つの修飾が各々の二重鎖アダプタープローブコンストラクト上に示されているが、プローブコンストラクトの単一の修飾（センス（アクセプター）またはアンチセンス（ドナー）鎖のいずれかに対する）がアダプター−アダプターライゲーションの抑制を提供できる。この手法において、ライゲーション接合部における２つ以上の修飾の存在がアダプタープローブ二量体のライゲーションを抑制する。加えて、修飾二本鎖アダプタープローブが標的ｄｓＤＮＡ断片と組み合わされてもよく、従来の方法と比較してアダプター二量体形成を低減する（図２７）。さらに、アダプタープローブ二量体における修飾によるライゲーションおよびＤＮＡポリメラーゼ伸長の二重抑制は、ワークフローのステップ１から精製ステップを排除する可能性を有する。
【０２３７】
Ｄａｖｅｙ，Ｊ．Ｗ．  ９、Ｂｒｉｅｆ  Ｆｕｎｃｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４１６〜２３頁（２０１０）に記載されている、ＤＮＡ−Ｓｅｑ、ＲＡＤ−Ｓｅｑ（制限部位関連ＤＮＡシークエンシング）ならびに両方ともＨｅａｄ，Ｓ．Ｒ．ら、５６  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６１〜７７頁（２０１４）に記載されている、Ｃｈｉｐ−ｓｅｑ（染色体免疫沈降シークエンシング）およびＭｅｔｈｙｌｓｅｑ（メチル化ＤＮＡ残基についての選択を含む）を含む、本明細書に記載される方法から産生したｄｓＤＮＡライブラリーは次世代シークエンシングワークフローに使用され得る。
【０２３８】
修飾は、５’−アダプタープローブの３’末端に近接して、および３’−アダプタープローブの５’末端に近接して導入される。これらの修飾には、２’−フルオロ−および２’−メトキシ糖修飾ならびにホスホロチオエートおよびメチルホスホネートなどの主鎖修飾が含まれ、これらのすべてはＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼと適合性がある。より具体的には、これらの修飾を含有するアダプタープローブは、核酸ライブラリーに接合される場合、ライゲーションおよび複製を顕著に抑制または妨げない。アダプタープローブ二量体形成を抑制する修飾５’−および３’−アダプタープローブの能力は、５’−リン酸化合成ＲＮＡの非存在下でライゲーション実験によって決定される。これらの実験において、修飾５’−アダプタープローブは、非修飾５’−アダプタープローブと比較してライゲーション収率を抑制しない修飾５’−アダプタープローブを評価するために非修飾３’−アダプタープローブの存在下でライゲーションされる（＋＋＋から＋＋＋＋のスコア、図１７Ａ）。同様に、３’−アダプタープローブは、非修飾３’アダプタープローブと比較してライゲーション収率の抑制を生じない非修飾５’−アダプタープローブに対するライゲーションによって評価される（＋＋＋から＋＋＋＋のスコア、図１７Ａ）。アダプタープローブ二量体形成を抑制する組合せを同定するために、望ましい結果を提供する修飾５’−および３’−アダプタープローブが組み合わされ、互いにライゲーションされる（−から＋のスコア、図１８）。
【０２３９】
次に、アダプタープローブ二量体形成を抑制する修飾５’−および３’−アダプタープローブ対は単一の５’−リン酸化合成ＲＮＡ配列と組み合わされる。これらの実験において、修飾５’−および３’−アダプタープローブ対の各々は、合成５’−リン酸化ＲＮＡおよびＴ４  ＲＮＡリガーゼＩとの反応に加えられ、アダプター二量体の抑制およびＲＮＡに対するライゲーション効率が評価される（図１９）。
【０２４０】
次に、ライブラリーへのアダプタープローブのライゲーション効率およびアダプター二量体形成の抑制を決定するアッセイが開発される（図２０）。反応はＴ４  ＲＮＡリガーゼ１、１ｍＭ  ＡＴＰを含有し、非修飾５’−および３’−アダプタープローブ対、合成ｌｅｔ−７ｄ  ｍｉＲＮＡ、１０％ＰＥＧ  ８０００を１６℃にてインキュベートした。得られた試料を、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ核酸染色で染色した変性ポリアクリルアミドゲル上で分析した。この実験において、構成要素の各々は、どのライゲーション産物が形成したかを推定するために反応に体系的に加えられる。アダプター二量体およびアダプタータグ付きライブラリーを形成するライゲーション産物は明白である。開始点としてこの反応設定を使用して、アダプタープローブの修飾型が、アダプター二量体形成の抑制および効果的なタグ付きライブラリー形成について試験され得る。
【０２４１】
修飾が停止を引き起こさないことを確実にするためにｃＤＮＡ合成ステップを使用して以前のステップからのライゲーション産物を試験する。これらの実験において、変性しているポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析によるｃＤＮＡ合成産物の分析と共に、３’−アダプタープローブの３’末端に相補的である短いＤＮＡプライマーをアニーリングし、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素を使用して、得られたライゲーション産物に沿って伸長する（図２１）。理想的な修飾アダプタープローブ対は、アダプタープローブ二量体形成を抑制し、十分な完全長産物を産生するものである。加えて、修飾アダプタープローブ二量体における２つの隣接する修飾の効率が、二量体の逆転写を遮断するそれらの能力を決定するために評価される。
【０２４２】
本発明の方法はまた、タグ付きＲＮＡライブラリーを調製するために使用され得る。５’−リン酸化合成ＲＮＡライブラリーは、一定の長さならびにＲＮＡの５’末端および３’末端において無作為化した配列（等モル比のＡ：Ｃ：Ｇ：Ｕ）の３つのヌクレオチドを有する配列（約２０ヌクレオチド）を有するように設計される。次に、修飾３’−および５’−アダプタープローブ対が、図１１におけるワークフローを使用してＲＮＡライブラリーをタグ付けするために使用される。比較のために、ライブラリーはまた、図９に示される従来のプロトコールを使用して調製される。修飾されたアダプタープローブがライブラリーへライゲーションされた後、逆転写酵素を使用したライブラリーに沿ったＤＮＡプライマーの伸長によってｃＤＮＡコピーが生成される。次いでｃＤＮＡ合成産物が、ライブラリー構成要素の量を維持するためにエマルションＰＣＲによって増幅される。得られた単位複製配列はベクター内でクローニングされ、個々のコロニーを単離するために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内に形質転換される。プラスミドが個々に選択されたコロニーから単離され、Ｓａｎｇｅｒジデオキシシークエンシングに供される。統計的に有意な数の配列が、アダプタープローブ二量体化、ＲＮＡライブラリーのコンカテマー化の程度および入力ライブラリーの組成の維持の抑制について分析される。
【０２４３】
本発明の別の態様は低分子ＲＮＡからライブラリーを調製する方法を提供する。低分子ＲＮＡは典型的に２０から３０の間のヌクレオチド長であり、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびＰｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）などのクラスを含む。Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１を使用した低分子ＲＮＡライブラリー調製のためのライゲーションベースの手法は、低分子ＲＮＡ試料の５’（Ｃ＞Ｕ≧Ａ＞Ｇ）および３’末端（Ａ＞Ｇ〜Ｇ＞Ｕ）における効果的なライゲーションのための配列バイアスを実証している。加えて、低分子ＲＮＡディープシークエンシング（ｓｍＲＮＡ−Ｓｅｑ）についての試料調製ワークフローは、それらの類似したサイズに起因してアダプタータグ付きライブラリーからライゲーションしていないアダプターおよびアダプター二量体を除去するためにＡＭＰｕｒｅなどのサイズ増加ステップを含むことができない。結果として、ゲル精製ステップが一般にアダプタータグ付きライブラリーを濃縮するために使用される。
【０２４４】
ゲル精製ステップを必要とすることによって与えられるｓｍＲＮＡ−Ｓｅｑワークフローの制限は、アダプター二量体形成を抑制する２つのｍｉＲＮＡライブラリー調製手法の最近の説明によってさらに証明される。第１の手法において、アダプター二量体形成は、３’−アダプターのライゲーション後で５’−アダプターライゲーションステップの前にｃＤＮＡ合成プライマーのハイブリダイゼーションによって抑制される。このハイブリダイゼーションステップは、アダプター二量体を形成するライゲーションを抑制する３’−アダプターを有する二重鎖を生じる。成功しているが、この手法は追加のステップをワークフローに加え、ライブラリー調製の時間を増加させる。さらに、この方法は、バーコーディングのように、１つより多いｃＤＮＡ合成プライマーが必要とされるならば、さらに複雑になり得る。第２の手法において、アダプター二量体に相補的であるＬＮＡ配列が、逆転写酵素によってｃＤＮＡプライマー伸長を遮断するライゲーションステップの後にハイブリダイズされる。この手法は追加の配列をワークフローに加え、修飾のために費用が増える。ハイブリダイゼーション手法の場合のように、ＬＮＡベースのワークフローは、バーコードアダプターが利用される事象においてさらに複雑になる。低分子ＲＮＡ試料調製に適用される本発明の修飾アダプタープローブは、ハイブリダイゼーションステップを必要とせずに、アダプタータグ付きライブラリーの効果的な形成を可能にしながら、アダプター二量体の形成を遮断する。
【０２４５】
本発明の別の態様において、平滑末端ＤＮＡライブラリーワークフローを使用してアダプター：アタプターライゲーションを抑制する、センスおよびアンチセンス修飾アダプタープローブが提供される。これらのプローブはアダプタープローブのセンスおよびアンチセンス鎖の両方に対する単一の修飾を含有し、この修飾は、２’−フルオロ−および２’−メトキシ糖修飾ならびにホスホロチオエートおよびメチルホスホネートなどの主鎖修飾を含む。修飾Ｐ１アダプタープローブのヘアピン型は、センスおよびアンチセンス鎖が等モル濃度であることを確実にするために使用される。一実施形態において、修飾ヘアピンアダプタープローブのＰ１型のみが、アダプター二量体形成に対する修飾の効果の解釈を単純化するために使用される。修飾ヘアピンアダプタープローブの各々は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用して合成の約４０塩基対の５’−リン酸化ｄｓＤＮＡ配列の存在下および非存在下でライゲーションされ、（ａ）アダプタープローブ二量体形成の抑性について、および（ｂ）合成５’−リン酸化ｄｓＤＮＡ配列に対する効果的なライゲーションについてランク付けされる。
【０２４６】
一旦、修飾ヘアピンアダプタープローブが選択されると、対応する修飾Ｐ１およびＰ２アダプタープローブが合成される。修飾Ｐ１およびＰ２アダプタープローブは、修飾ヘアピンプローブで試験した同じ合成５’−リン酸化ｄｓＤＮＡ配列を使用して、アダプタープローブ二量体の抑制および効果的なタグ付きライブラリー形成について非修飾プローブコンストラクトと比較される。得られたタグ付きライブラリーは、Ｐ１およびＰ２アダプタープローブの修飾が下流の複製を遮断しないことを確実にするためにＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用するプライマー伸長反応のためのテンプレートとして使用される。
【０２４７】
合成５’−リン酸化ｄｓＤＮＡライブラリーは、修飾Ｐ１およびＰ２アダプタープローブが、アダプタータグ付きｄｓＤＮＡライブラリーを調製するために使用され得ることを確認するために調製される。５’−リン酸化合成ｄｓＤＮＡライブラリーは、一定の長さならびにＤＮＡの５’末端および３’末端における無作為化した配列（等モル比のＡ：Ｃ：Ｇ：Ｔ）の１つまたは２つのヌクレオチドを有する配列（約４０塩基対）を有するように設計される。最初の修飾Ｐ１およびＰ２アダプタープローブコンストラクトは、図１３におけるワークフローを使用してｄｓＤＮＡライブラリーをタグ付けするために使用される。比較のために、ライブラリーはまた、図１２に示される従来のプロトコールを使用して調製される。次いでアダプタータグ付きライブラリーは、相対量のライブラリー構成要素を維持するためにエマルションＰＣＲによって増幅され、ベクター内にクローニングされ、個々のコロニーを単離するためにＥ．ｃｏｌｉ内に形質転換される。プラスミドが個々に選択されたコロニーから単離され、Ｓａｎｇｅｒジデオキシシークエンシングに供される。統計的に有意な数の配列が、修飾アダプタープローブ二量体化、ＤＮＡライブラリーのコンカテマー化の程度および入力ライブラリーの組成の維持の抑制について分析される。
【０２４８】
ここで、本発明で提供される方法および組成物を、以下の非限定的な実施例を参照することによってより詳細に記載する。
【実施例１】
【０２４９】
ＰＡＧＥ分析を使用するライゲーション収率の検出
プライマー結合配列（「ＰＢＳ」）を有するドナーおよびアクセプター（それぞれＬＰ３’Ｔアクセプターｗ／ＰＢＳおよびＣｏｍ３Ｆドナーｗ／ＰＢＳ）を、相補的なテンプレート（Ａｌｇテンプレート）の存在下で、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって接合されるそれらの能力について評価した。４つの実験的設定を実施した（図２）。ドナー、アクセプター、ＡＴＰ補因子、テンプレートを含み、リガーゼを含まない第１のライゲーション反応混合物を設定した。ライゲーションは検出されなかった。ドナー、アクセプター、ＡＴＰ補因子、リガーゼを含み、テンプレートを含まない第２のライゲーション反応混合物を設定した。ライゲーションは検出されなかった。ドナー、アクセプター、リガーゼ、テンプレートを含む第３のライゲーション反応混合物を設定し、追加のＡＴＰ補因子は添加しなかった。少量のライゲーション産物を検出し、これは、精製過程中に単離された少量のアデニル化リガーゼによる可能性が高い。ドナー、アクセプター、ＡＴＰ補因子、リガーゼおよびテンプレートを含む第４のライゲーション反応混合物を設定した。大部分のドナーおよびアクセプターが消費され、接合ライゲーション産物に効率的に変換された。
【０２５０】
各２０μＬの反応を、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのジチオトレイトール、２５μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含有するバッファー中で実施した。１ｍＭのＡＴＰを、バッファーに別個に添加した。ドナー（ＬＰ３’Ｔ／ＰＢＳ）、アクセプター（Ｃｏｍ３Ｆ  ｗ／ＰＢＳ）およびテンプレート（Ａｌｇ）は、０．１μＭの等モル量であった。アクセプター、ドナーおよびテンプレートを９５℃で３分間変性させ、４℃で３分間アニールした。Ｔ４  リガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）４００単位を各反応物に添加することによって、ライゲーションを開始した。ライゲーションを１６℃で２０分間進行させた。反応物を６５℃で１０分間加熱し、同体積の２×ＴＢＥ−尿素バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加することによって、ライゲーションを終了させた。試料を、６％ＴＢＥ−尿素Ｎｏｖｅｘゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で泳動した。ゲルを、製造者のプロトコールに従ってＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ核酸染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。
【０２５１】
【表１】
2016514460.tif 000045
【実施例２】
【０２５２】
リアルタイムＰＣＲ分析を使用するライゲーション収率の検出
ドナーポリヌクレオチドとアクセプターポリヌクレオチド（それぞれＬＰ３’Ｔアクセプターｗ／ＰＢＳおよびＣｏｍ３Ｆドナーｗ／ＰＢＳ）の間のライゲーション産物を、リアルタイム定量的ＰＣＲを使用して検出した。ライゲーション反応を、相補的なテンプレート（Ａｌｇテンプレート）の存在下でＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて実施し、リアルタイムＰＣＲを使用して検出した。ライゲーション反応から得た産物の連続希釈物（１０4〜１０9倍希釈のライゲーション産物）を、その後のＰＣＲ反応におけるテンプレートとして使用した。反応混合物は、反応物２５μｌ中、１×ＰＣＲバッファー（２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．４）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2）、アクセプター（ＬＰ３’Ｔ  Ｆｏｒ）の５’末端およびドナー（Ｃｏｍ３Ｆ  Ｒｅｖ）の３’末端（各０．１μＭ）に設計したプライマー結合部位に特異的なＰＣＲプライマー、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／ｕｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ核酸色素（１：６０，０００希釈）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＲＯＸ参照色素（１：３０，０００希釈）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からなっていた。熱サイクル条件は、初期変性では９５℃で１０分間とし、その後は９５℃で４０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で１分間を４０サイクル行い、最終的な伸長ステップを７２℃で７分間行って終了した。反応は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ３００５Ｐ（登録商標）ＱＰＣＲシステム機器で実施した。図３から見られ得るように、増幅プロットを使用して６つの希釈物のそれぞれを検出すると（図３Ａ）、ＮＴＣ（テンプレートが存在しない状態で実施したライゲーション）は、著しく遅いＣｔを伴う増幅曲線を有していた。解離曲線（図３Ｂ）によって、テンプレートの存在下で実施したすべてのライゲーションが同じ融解温度を有しており、ＮＴＣはより低い融解温度を有していることが明らかになり、このことは、Ｃｏｍ３Ｆドナーｗ／ＰＢＳに沿ってＣｏｍ  ３Ｆ  Ｒｅｖが伸長したことに起因する可能性が高い。最後に、Ｃｔ値を標準曲線から抽出し、ライゲーション反応のすべての希釈物を、良好な直線性を伴って検出することができた（図３Ｃ）。このアッセイは、核酸標的を定量化するその能力に起因して、修飾ライゲーション構成要素の、この場合は修飾リガーゼ補因子の効率におけるわずかな差異を引き出すのに重要性が高い。
【実施例３】
【０２５３】
ＰＡＧＥ分析を使用するマッチテンプレートとミスマッチテンプレートの間の修飾補因子の識別評価
ＡＴＰ類似体を、マッチテンプレートおよびミスマッチテンプレートを接合するそれらの能力について、対応する天然ＡＴＰ補因子と比較した（図４）。ＡＴＰ類似体を、マッチテンプレート（ＬＰ３’Ｔアクセプターｗ／ＰＢＳおよびＡｌｇテンプレート；アクセプター鎖の３’末端におけるＴ−Ａマッチ塩基対）の存在下での相対的ライゲーション収率について、ミスマッチテンプレート（ＬＰ３’Ｃアクセプターｗ／ＰＢＳおよびＡｌｇテンプレート；アクセプター鎖の３’末端上のＣ−Ａミスマッチ塩基対）を使用した場合の相対的収率に対して評価した。反応は、目的の補因子を濃度１ｍＭで反応物に入れて、実施例１に記載の通り実施した。天然ＡＴＰ基質を、以下の修飾補因子：７−デアザ−ＡＴＰ（７−デアザ−アデノシン−５’−三リン酸）、Ｎ１−メチル−ＡＴＰ（Ｎ１−メチル−アデノシン−５’−三リン酸）、２−アミノ−ＡＴＰ（２−アミノ−アデノシン−５’−三リン酸）、２’−アミノ−２’−デオキシ−ＡＴＰ（２’−アミノ−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸）、３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−ＡＴＰ（３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−三リン酸）と比較した（図４）。マッチテンプレートを用いた場合には、あらゆる修飾補因子によって、天然ＡＴＰと類似の効率でライゲーションが支持された。しかし、ミスマッチテンプレートを用いた場合には、修飾補因子の使用によって、天然ＡＴＰと比較してライゲーション収率が著しく低下した。
【実施例４】
【０２５４】
特異性数値の決定
目的のライゲーション構成要素（例えば、修飾リガーゼ補因子、修飾ドナーまたは修飾アクセプター）のライゲーション収率を決定する一方法は、特異性数値を割り当てることである。特異性数値は、例えばマッチしている場合のライゲーション収率を、そのマッチしている場合と比較して一塩基対が一致していないミスマッチの場合のライゲーション収率で割ることによって決定することができる。まず、実施例１に示す通り、ＰＡＧＥゲルの濃度測定の読み取りによってライゲーション収率を決定する。次いで、その収率を同じ反応におけるテンプレートの読み取りに対して正規化し、その後１．０の正規化収率を有する天然（ＡＴＰ）補因子を含む反応物のライゲーション収率に対して正規化する。例えば、２’−デオキシ−ＡＴＰ（２’−デオキシ−アデノシン−５’−三リン酸；図４）の場合、マッチしている場合（ＬＰ３’Ｔアクセプターｗ／ＰＢＳおよびＡｌｇテンプレート；アクセプター鎖の３’末端上のＴ−Ａマッチ塩基対）のライゲーション収率は、１．３４であった。ミスマッチの場合（ＬＰ３’Ｃアクセプターｗ／ＰＢＳおよびＡｌｇテンプレート；アクセプター鎖の３’末端上のＣ−Ａミスマッチ塩基対）には、ライゲーション収率は０．１８であった。したがって、Ｃ−Ａミスマッチの場合の２’−デオキシ−ＡＴＰに割り当てられた特異性数値は、１．３４÷０．１８、すなわち７．４４であった。これを超える値は、改善されたライゲーション特異性を示す。これ未満の値は、低いライゲーション特異性を示す。
【実施例５】
【０２５５】
マッチテンプレートとミスマッチテンプレートの間の修飾補因子の識別を同定するためのマトリックス評価
ＡＴＰ類似体を、アクセプターの３’末端上にミスマッチ塩基対を含有するテンプレート：１）ＬＰ３’Ｃアクセプターｗ／ＰＢＳおよびＡｌｇテンプレート；Ｃ−Ａミスマッチ、２）ＬＰ３’Ｇアクセプターｗ／ＰＢＳおよびＡｌｇテンプレート；Ｇ−Ａミスマッチ、ならびに３）ＬＰ３’Ａアクセプターｗ／ＰＢＳおよびＡｌｇテンプレート；Ａ−Ａミスマッチの収率に対して、マッチテンプレート（ＬＰ３’Ｔアクセプターｗ／ＰＢＳおよびＡｌｇテンプレート；アクセプター鎖の３’末端上のＴ−Ａマッチ塩基対）の存在下での相対的ライゲーション収率に関して、マッチテンプレートおよびミスマッチテンプレートを接合するそれらの能力について天然ＡＴＰ補因子と比較した（図５）。反応は、目的の補因子を濃度１ｍＭで反応物に入れて、実施例１に記載の通り実施した。天然ＡＴＰ補因子を、以下の１０種類の修飾補因子：５’−α−チオ−アデノシン−５’−トリホスフェート（１−チオ−ＡＴＰ）、２’アミノ−２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート（２’−アミノ−２’−デオキシ−ＡＴＰ）、２−アミノ−２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート（２−アミノ−２’−デオキシ−ＡＴＰ）、２’−フルオロ−２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート（２’−フルオロ−２’−デオキシ−ＡＴＰ）、３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート（３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−  ＡＴＰ）、３’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート（３’−デオキシ−ＡＴＰ）、７−デアザ−アデノシン−５’−トリホスフェート（７−デアザ−ＡＴＰ）、２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート（２’−デオキシ−ＡＴＰ）、Ｌ−異性体−２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート（２’−デオキシ−ＡＴＰのＬ−異性体）、およびＮ１−メチル−アデノシン−５’−トリホスフェート（Ｎ１−メチル−ＡＴＰ）と比較した。目的の４つの異なる塩基対：Ｔ−Ａ、Ｇ−Ａ、Ｃ−ＡおよびＡ−Ａに関するライゲーション収率のＰＡＧＥ分析から得た積分結果を、一連の３つの散布図にプロットした。各散布図によって、マッチテンプレート（Ｔ−Ａ）について正規化した収率を、３つの異なるミスマッチテンプレート（Ｃ−Ａ、Ｇ−ＡおよびＡ−Ａ）のそれぞれについて正規化した収率と比較する（図５）。目的の主な修飾は、マッチしている場合（Ｔ−Ａ）には天然ＡＴＰに匹敵するライゲーション収率を有し、ミスマッチテンプレート（Ｃ−Ａ、Ｇ−ＡおよびＡ−Ａ）の存在下ではライゲーション収率は低い。類似体のこのパネルから、５’−アルファ−チオ−アデノシン−５’−三リン酸、２’−デオキシ−アデノシン−５’−三リン酸および３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−三リン酸が、目的の主な修飾と同定された。
【実施例６】
【０２５６】
マッチテンプレートとミスマッチテンプレートの間の修飾アクセプターの識別を同定するためのマトリックス評価
様々な糖および主鎖修飾アクセプター鎖を、マッチテンプレートおよびミスマッチテンプレートを接合するそれらの能力について、天然非修飾アクセプター鎖と比較した。修飾アクセプター鎖を、テンプレートの３’末端においてミスマッチ塩基対を含有するテンプレート：１）ＬＰ３’Ｔアクセプターｗ／ＰＢＳおよびＧｌｇテンプレート；Ｔ−Ｇミスマッチ、２）ＬＰ３’Ｔアクセプターｗ／ＰＢＳおよびＣｌｇテンプレート；Ｔ−Ｃミスマッチ、ならびに３）ＬＰ３’Ｔアクセプターｗ／ＰＢＳおよびＴｌｇテンプレート；Ｔ−Ｔミスマッチの収率に対して、マッチテンプレート（ＬＰ３’Ｔアクセプターｗ／ＰＢＳおよびＡｌｇテンプレート；アクセプターの３’末端上のＴ−Ａマッチ塩基対）の存在下での相対的ライゲーション収率について評価した。反応は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用し、目的のアクセプター鎖を濃度１μＭで反応物に入れて、実施例１に記載の通り実施した。ＮＡＤ依存性リガーゼであるＥ．ｃｏｌｉリガーゼを用いてさらなる実験を実施して（示さず）、天然アクセプター鎖の性能を、以下に示す式を有する１０種類の修飾アクセプターと比較した：
【０２５７】
【化４０】
2016514460.tif 000046
（式中、
Ｘ1および2は、それぞれ独立に、ＯＨ、ＳＨおよびＣＨ3からなる群から選択され、
Ｙ1、Ｙ2およびＹ3は、それぞれ独立に、Ｈ、ＦおよびＯＣＨ3からなる群から選択され、
Ｗは、オリゴヌクレオチジル残基である）。
【０２５８】
天然アクセプターでは、Ｘ1およびＸ2はＯＨであり、Ｙ1、Ｙ2およびＹ3はＨである（図６、修飾なし）。１０種類の修飾アクセプターのそれぞれは、天然アクセプターと比較して、Ｘ1がＳＨまたはＣＨ3であり（図６、それぞれＰＳ（Ｘ１）およびＰＭｅ（Ｘ１））、Ｘ2がＳＨまたはＣＨ3であり（図６、それぞれＰＳ（Ｘ２）およびＰＭｅ（Ｘ２））、Ｙ1がＦまたはＯＣＨ3であり（図６、それぞれ２’−Ｆ（Ｙ１）または２’−ＯＭｅ（Ｙ１））、Ｙ2がＦまたはＯＣＨ3であり（図６、それぞれ２’−Ｆ（Ｙ２）または２’−ＯＭｅ（Ｙ２））、Ｙ3がＦまたはＯＣＨ3である（図６、それぞれ２’−Ｆ（Ｙ３）または２’−ＯＭｅ（Ｙ３））ように、部位Ｘ1、Ｘ2、Ｙ1、Ｙ2またはＹ3の１つにおいて修飾を有する。
【０２５９】
目的の４つの異なる塩基対：Ｔ−Ａ、Ｔ−Ｇ、Ｔ−ＣおよびＴ−Ｔについて、ＰＡＧＥゲル分析により決定したライゲーション収率を、一連の３つの散布図にプロットした。各散布図によって、マッチテンプレート（Ｔ−Ａ）について正規化した収率を、３つの異なるミスマッチテンプレート（Ｔ−Ｇ、Ｔ−ＣおよびＴ−Ｔ）のそれぞれについて正規化した収率と比較した（図６）。目的の主な修飾は、マッチしている場合（Ｔ−Ａ）にはＡＴＰに匹敵するライゲーション収率を有し、ミスマッチテンプレート（Ｔ−Ｇ、Ｔ−ＣおよびＴ−Ｔ）の存在下ではライゲーション収率は低い。修飾アクセプターのこのパネルから、Ｘ1位置におけるＣＨ3修飾（図６、ＰＭｅ（Ｘ１））およびＹ2位置におけるＯＣＨ3修飾（図６、２’−ＯＭｅ（Ｙ２））が、目的の主なアクセプター修飾と同定された。
【実施例７】
【０２６０】
マッチテンプレートとミスマッチテンプレートの間の修飾ドナーの識別を同定するためのマトリックス評価
様々な糖および主鎖修飾ドナー鎖を、マッチテンプレートおよびミスマッチテンプレートを接合するそれらの能力について、天然ドナー鎖と比較した。修飾ドナー鎖を、テンプレートの３’末端においてミスマッチ塩基対を含有するテンプレート：１）Ｃｏｍ３Ｆドナーｗ／ＰＢＳ、ＬＰ３’Ｔアクセプターｗ／ＰＢＳおよびＣｌｇテンプレート；Ｔ−Ｃミスマッチ、ならびに２）Ｃｏｍ３Ｆ  ｗ／ＰＢＳ、ＬＰ３’Ｃ  ｗ／ＰＢＳおよびＡｌｇ；Ｃ−Ａミスマッチの収率に対して、マッチテンプレート（Ｃｏｍ３Ｆドナーｗ／ＰＢＳ、ＬＰ３’Ｔアクセプターｗ／ＰＢＳおよびＡｌｇテンプレート；アクセプター鎖の３’末端上のＴ−Ａマッチ塩基対）の存在下での相対的ライゲーション収率について評価した。反応は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよび目的のドナー鎖を濃度１μＭで各反応物に入れて、実施例１に記載の通り実施した。ＮＡＤ依存性リガーゼであるＥ．ｃｏｌｉリガーゼを用いてさらなる実験を実施した（示さず）。天然ドナー鎖を、以下の５種類の修飾ドナーと比較した：
【０２６１】
【化４１】
2016514460.tif 000047
（式中、Ｘ1およびＸ2は、それぞれ別個にＯＨまたはＣＨ3で置換されており、Ｙ1、Ｙ2およびＹ3は、それぞれ別個にＨまたはＯＣＨ3で置換されている）。
【０２６２】
天然ドナーでは、Ｘ1およびＸ2はＯＨであり、Ｙ1、Ｙ2およびＹ3はＨである（図７、修飾なし）。５種類の修飾ドナーのそれぞれは、天然ドナーと比較して、Ｘ1がＣＨ3であり（図７、ＰＭｅ（Ｘ１））、Ｘ2がＣＨ3であり（図７、ＰＭｅ（Ｘ２））、Ｙ1がＯＣＨ3であり（図７、２’−ＯＭｅ（Ｙ１））、Ｙ2がＯＣＨ3であり（図７、２’−ＯＭｅ（Ｙ２））、またはＹ3がＯＣＨ3である（図７、２’−ＯＭｅ（Ｙ３））ように、部位Ｘ1、Ｘ2、Ｙ1、Ｙ2またはＹ3の１つにおいて修飾を有する。
【０２６３】
目的の３つの異なる塩基対：Ｔ−Ａ、Ｔ−ＣおよびＣ−Ａについて、ＰＡＧＥゲル分析により決定した正規化ライゲーション収率を、一連の３つの散布図にプロットした。各散布図によって、マッチテンプレート（Ｔ−Ａ）を、３つの異なるミスマッチテンプレート（Ｔ−ＣおよびＣ−Ａ）のそれぞれと比較した（図７）。目的の主な修飾は、マッチしている場合（Ｔ−Ａ）におけるＡＴＰと匹敵するライゲーション収率を有し、ミスマッチ（Ｔ−ＣおよびＣ−Ａ）の存在下では、ライゲーション収率は低い。修飾アクセプターのこのパネルから、Ｘ1（ＰＭｅＸ1）およびＸ2（ＰＭｅＸ2）位置におけるＣＨ3修飾が、目的の主なドナー修飾と同定された。
【実施例８】
【０２６４】
マッチテンプレートとミスマッチテンプレートを最も良好に識別する修飾ＡＴＰ補因子と組み合わせた修飾アクセプターの同定の評価
実施例１、３、４および５に記載した研究に続き、いくつかの修飾ＡＴＰ補因子と組み合わせたいくつかの糖および主鎖修飾アクセプター鎖を、マッチテンプレート対ミスマッチテンプレートを接合するそれらの能力について、天然アクセプター鎖およびＡＴＰと比較した。これらの研究によって、テンプレート鎖の３’末端上にミスマッチ塩基対を含有する単一テンプレート：１）Ｃｏｍ３Ｆドナーｗ／ＰＢＳ、ＬＰ３’Ｔアクセプターｗ／ＰＢＳおよびＣｌｇテンプレート；Ｔ−Ｃミスマッチを用いた場合の相対的収率に対する、マッチテンプレート（Ｃｏｍ３Ｆドナーｗ／ＰＢＳ、ＬＰ３’Ｔアクセプターｗ／ＰＢＳおよびＡｌｇテンプレート；アクセプター鎖の３’末端上のＴ−Ａマッチ塩基対）の存在下での相対的ライゲーション収率について、修飾アクセプター鎖と修飾ＡＴＰ補因子の組合せを評価した。反応は、目的のアクセプター鎖を濃度１μＭで各反応物に入れ、ＡＴＰ補因子を濃度１ｍＭで入れて、実施例１に記載の通り実施した。これらの研究では、天然アクセプター鎖の性能を、以下の５種類の修飾アクセプターと比較した：
【０２６５】
【化４２】
2016514460.tif 000048
（式中、Ｘ1は、独立に、ＯＨ、ＳＨおよびＣＨ3からなる群から選択され、Ｘ2は、独立に、ＯＨおよびＣＨ3からなる群から選択され、Ｙ1およびＹ2は、それぞれ独立に、ＨおよびＯＣＨ3からなる群から選択される）。
【０２６６】
天然アクセプターでは（図８、修飾なし）、Ｘ1およびＸ2はＯＨであり、Ｙ1およびＹ2はＨである。５種類の修飾アクセプターのそれぞれは、天然アクセプターと比較して、Ｘ1がＳＨであり（図８、ＰＳ（Ｘ１））、Ｘ1がＣＨ3であり（図８、ＰＭｅ（Ｘ１））、Ｘ2がＣＨ3であり（図８、ＰＭｅ（Ｘ２））、Ｙ1がＯＣＨ3であり（図８、２’−ＯＭｅ（Ｙ１））、またはＹ2がＯＣＨ3である（図８、２’−ＯＭｅ（Ｙ２））ように、部位Ｘ1、Ｘ2、Ｙ1またはＹ2の１つにおいて修飾を有する。
【０２６７】
これらの５種類の修飾アクセプター鎖を２’−デオキシ−ＡＴＰ（２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート）、１−チオ−ＡＴＰ（５’−α−チオ−アデノシン−５’−トリホスフェート）、２’−アミノ−２’−デオキシ−ＡＴＰ（２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート）、２−アミノ−ＡＴＰ（２−アミノ−アデノシン−５’−トリホスフェート）、３’−アミノ−２’、３’−ジデオキシ−ＡＴＰ（３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート）、および２−アミノ−２’−デオキシ−ＡＴＰ（２−アミノ−２’−デオキシ−アデノシン−５’−トリホスフェート）を含む６種類の修飾ＡＴＰ類似体と組み合わせてアッセイした。ＡＴＰ類似体および修飾アクセプター鎖のあらゆる可能な組合せを試験した。
【０２６８】
目的の２つの異なる塩基対：Ｔ−ＡおよびＴ−Ｃについて、ＰＡＧＥゲル分析により決定したライゲーション収率（ＡＴＰに対して正規化）を、表（図８）に記録した。これらの表は、糖および主鎖修飾アクセプター鎖を異なる修飾ＡＴＰ補因子と組み合わせて使用する相対的ライゲーション収率を含む。これらの値は、実施例１に記載の通り、天然アクセプター鎖ならびにアクセプター鎖の３’末端にマッチ（Ｔ−Ａ）およびミスマッチ（Ｔ−Ｃ）塩基対を有するＡＴＰを使用するライゲーション収率に対するものである。マッチしている場合（Ｔ−Ａ）には、点の網掛けセルの値は、０．８５を超える相対的ライゲーション収率を表し、網掛けなしのセルの値は、０．７０〜０．８５の相対的ライゲーション収率を表し、灰色の網掛けセルの値は、０〜０．７０の相対的ライゲーション収率を表す。ミスマッチの場合（Ｔ−Ｃ）には、点の網掛けセルは、０〜０．０１の相対的ライゲーション収率を表し、網掛けなしのセルは、０．０１〜０．１の相対的ライゲーション収率を表し、灰色のセルは、０．１０〜１．００の相対的ライゲーション収率を表す。提示されたすべての収率を、ＡＴＰと非修飾アクセプター鎖の組合せに対して正規化した。好ましい性能基準を有する組合せは、マッチしている場合（Ｔ−Ａ）には０．８５を超える相対的収率を有し（例えば、図８の点の網掛けセル、上の表）、ミスマッチテンプレート（Ｔ−Ｃ）の存在下では０．０１未満の相対的ライゲーション収率を有する（例えば、図８の点の網掛けセル、下の表）。これらの可能な組合せから、３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−ＡＴＰ（３’−アミノ−２’，３’−ジデオキシ−アデノシン−５’−三リン酸）を伴うＸ１位置におけるＣＨ３の修飾（図８、ＰＭｅ（Ｘ１））が、目的の主な修飾補因子および修飾アクセプターの組合せと同定され、マッチ収率は１．２２であり、ミスマッチ収率は０．００であった。
【実施例９】
【０２６９】
二量体形成を抑制するための修飾プローブコンストラクトの評価
以下の表に示される以下の修飾アダプタープローブを調製した。これらの修飾アダプタープローブを、アダプタープローブ二量体形成を抑性するそれらの能力について評価した。図１１に概説される手法に従って、一連の修飾５’−および３’−アダプタープローブを調製し、ＲＮＡの非存在下でＴ４  ＲＮＡリガーゼ１に対する基質として試験した。最初に１０種類の修飾５’−アダプタープローブコンストラクトを、非常に高いライゲーション収率が実証されている修飾プローブを同定するために３’−アダプタープローブの非修飾型と組み合わせて試験した。並行して、１０種類の修飾３’−アダプタープローブコンストラクトを、３’−アダプタープローブの非修飾型と組み合わせて試験した。これらのデータを図１７に要約する。修飾プローブのほとんどは対応する非修飾プローブによるライゲーションを実証し、５’−アダプタープローブに対する修飾はライゲーション収率に対してより大きな効果を有した。
【０２７０】
【表２】
2016514460.tif 000049
【０２７１】
次に、非修飾プローブで非常に高いライゲーション収率を示した修飾５’−および３’−アダプタープローブコンストラクト（それぞれ、２’−メトキシ修飾およびメチルホスホネート修飾）の対（図１７）を、アダプタープローブ二量体形成の抑制について試験した（図１８）。これらの修飾アダプタープローブは非修飾プローブに効果的にライゲーションし（＋＋＋）、アダプタープローブ二量体収率を顕著に抑制した（＋）。これらの見解は、修飾が、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩと適合性があると同定され得ることを立証している。さらに、このデータは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを伴うｄｓＤＮＡライブラリー調製ワークフローに使用するための同様の種類の修飾が同定され得ることを示唆している。
【実施例１０】
【０２７２】
ＲＮＡライブラリー調製のための１ステッププロトコールの開発
次に、ライブラリーへのアダプタープローブのライゲーションの効率およびアダプター二量体形成の抑制を決定するためのアッセイを開発した（図１９）。反応物は、１０μＬの反応体積中に１×Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１バッファー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製）、１ｍＭのＡＴＰ、非修飾５’−および３’−アダプタープローブ対（実施例９に記載されており、１または２μＭ濃度）、合成ｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡ（５’Ｐ−ＣＵＡＵＡＣＧＡＣＣＵＧＣＵＧＣＣＵＵＵＣＵ３’；０．１または０．５μＭ；（配列番号５７））、１０％のＰＥＧ  ８０００および２０ＵのＴ４  ＲＮＡリガーゼ１を含有した。反応混合物を１６℃にて１６時間インキュベートし、等体積のＴＢＥ−尿素ゲルローディングバッファーでクエンチした。得られた試料を１０％変性ポリアクリルアミドゲル上にロードし、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ核酸染色で染色した。実験は、どのライゲーション産物が形成したかを推定するために反応物中に構成要素のそれぞれを体系的に加えるように設定した。アダプター二量体およびアダプタータグ付きライブラリーを形成するライゲーション産物が明らかになった。出発点としてこの反応設定を使用して、次いでアダプタープローブの修飾型を、アダプター二量体形成の抑制について、および効果的なタグ付きライブラリー形成について試験できる。
【実施例１１】
【０２７３】
逆転写を遮断する能力についての修飾プローブコンストラクトの評価
これらの研究の目標は、２つの連続した修飾の存在がアダプタープローブ二量体と共に完全長逆転写産物の形成を遮断するかどうかを決定することであった。ＦＡＭ標識化リバースプライマー（５’−ＦＡＭ−ＡＴＡＧＴＣＴＣＧＴＧＣＣＣＴＧＣ−３’；（配列番号５８））を調製し、実施例９から得たアダプタープローブ二量体ライゲーション産物にアニールし、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素の存在下でインキュベートした（図２０）。アダプタープローブ二量体が非修飾であった場合（レーン１）、完全長伸長への完全な変換が観察された。アダプタープローブ二量体を単独で修飾した場合（レーン３および４）、トランケートされた発現のいくつかの指標が明らかになったが、完全長伸長までの顕著なリードスルーが存在した。アダプタープローブ二量体が二重に修飾された場合（レーン２）、伸長産物の大部分はトランケートされた。このデータは、アダプタープローブ二量体上の２つの隣接する修飾の存在が逆転写を遮断でき、それによりアダプタータグ付きライブラリーの集団をさらに増加させるという仮説を支持するのに役立つ。
【実施例１２】
【０２７４】
従来の方法に対する、修飾プローブコンストラクトで低分子ＲＮＡライブラリーを調製するためのプロトコールの比較
本発明の低分子ＲＮＡライブラリー調製プロトコールを、高、中および低発現レベルで肝臓内に存在する１０個のｍｉＲＮＡの相対比を模倣する合成偽低分子ＲＮＡライブラリーを調製することを利用する従来の低分子ＲＮＡライブラリープロトコールと比較する（表３）。合成偽低分子ＲＮＡライブラリーを、ＴｒｕＳｅｑ低分子ＲＮＡ試料調製キット（従来のプロトコール；Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と比較する最適化１ステップライブラリーワークフローを使用するライブラリー調製のためのテンプレートとして使用する。得られたアダプタータグ付きライブラリーは、偽低分子ＲＮＡライブラリーの相対存在量が手法の間で維持されるかどうかを決定するためにリアルタイムＰＣＲを使用して定量する。次に、低分子ＲＮＡのために濃縮したヒト肝臓全ＲＮＡ試料を、最適化１ステッププロトコールおよび従来のプロトコロールを使用するライブラリー調製のためのテンプレートとして使用する。修飾アダプタープローブをライブラリーへライゲーションした後、ｃＤＮＡコピーを、逆転写酵素伸長、続いてＰＣＲ増幅によって生成する。得られたライブラリーを、Ｈｉ−Ｓｅｑ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）上でペアエンドリード（ｐａｉｒｅｄ  ｅｎｄ  ｒｅａｄ）においてシークエンシングする。バーコードの使用に起因する記録されるバイアスを回避するために、各手法から生成したタグ付きライブラリーを、シークエンシングの試行およびデータ分析はＧＥＮＥＷＩＺによって実施して、機器上の独立したレーンでそれぞれシークエンシングする。このデータセットにより、アダプタープローブ二量体抑制、ＲＮＡライブラリーのコンカテマー化の程度、およびライブラリー調製ワークフローからワークフローまでの入力ライブラリーの組成の維持の分析を可能にする試料中のｍｉＲＮＡのそれぞれの相対存在量をカウントするのに十分なデータが得られる。
【０２７５】
【表３】
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【実施例１３】
【０２７６】
２ステップ低分子ＲＮＡライブラリー調製ワークフローにおける３’−修飾アダプタープローブおよび５’修飾アダプタープローブの評価
一連の３’修飾アダプタープローブおよび５’修飾アダプタープローブを、図１０に示した低分子ＲＮＡライブラリー調製ワークフローにおいて評価した。修飾アダプターコンストラクトを評価する前に、アダプタープローブ二量体化の抑制を評価できる反応条件をスクリーニングした。この実験において、非修飾アダプターを使用したワークフローのライゲーションは、合成低分子ＲＮＡライブラリーの３種類の濃度の入力を使用することに従った（図２１）。ライゲーション条件は、ステップ１（３’−アデニル化アダプターのライゲーション）について、２５℃にて２時間、２０ｕＬの反応体積中のライゲーションバッファー、アデニル化３’アダプター（Ｔｒｕｓｅｑ３’Ａｄ−Ａｐｐ、２μＭ）、合成低分子ＲＮＡライブラリー（７０、７または０．７ｎｇ）、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２  ＫＱ（２００Ｕ）およびＲＮａｓｅ阻害剤（４０Ｕ）によるインキュベーションを伴うことに従い、続いて６５℃にて２０分間、リガーゼを不活性化した。ステップ２（５’−アダプターのライゲーション）は、３７℃にて２時間、２０μＬの反応体積中のライゲーションバッファー、５’−アダプター（Ｓｏｌｅｘａ−Ａｃｃ；２μＭ）、ＡＴＰ（１ｍＭ）、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１（２０Ｕ）およびＲＮＡｓｅ阻害剤（４０Ｕ）によるステップ１から得た１０μＬのライゲーション産物のインキュベーションを伴った。得られた産物を、５０℃にて１時間、１２．５μＬの反応体積中のＲＴバッファー、ＲＴプライマー（Ｔｒｕｓｅｑ  ＲＴプライマー、０．８μＭ）、２００Ｕ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素、ＲＮＡｓｅ阻害剤（４０Ｕ）、０．４ｍＭのｄＮＴＰおよびＤＴＴ（０．８ｍＭ）による、ライゲーションステップ２から得た６μＬの産物のインキュベーションによって逆転写した。得られたＲＴ産物のすべてを、５０μＬ反応体積中の１×Ｑ５  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、フォワードプライマー（Ｔｒｕｓｅｑ  ＰＣＲプライマー１、０．５μＭ）およびリバースプライマー（Ｔｒｕｓｅｑ  ＰＣＲプライマー２（インデックス１）、０．５μＭ）を用いるＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。４％アガロースゲルにより分析しながら１２の熱サイクルを実施した。
【０２７７】
図２１に示した分析に基づくと、ステップ１のライゲーションは７日間および０．７ｎｇのＲＮＡ入力で効果的であった。ステップ２のライゲーションの分析により、７または０．７ｎｇのＲＮＡ入力においてアダプター二量体形成のより大きな傾向が明らかになった。ＲＴ−ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析により、７および０．７ｎｇのＲＮＡ入力においてアダプター二量体形成が確認され、０．７ｎｇにおいて、より多くのアダプター二量体形成が確認された。したがって、７ｎｇまたは０．７ｎｇ入力における合成ライブラリーの使用を、修飾アダプタープローブコンストラクトを評価するために選択した。
【０２７８】
次に、５’−アダプタープローブおよび３’−アダプタープローブの両方を修飾する必要があるかどうかを評価するために同様のワークフローに従った（図２２）。以下を除いて上記のワークフローに従った。入力ＲＮＡは７ｎｇの入力における合成低分子ＲＮＡランダマーライブラリーであった。第１のステップは２８℃にて１時間のインキュベーションを伴い、第２のステップは２８℃にて１時間のインキュベーションを伴った。アデニル化３’−アダプタープローブは非修飾または修飾のいずれかであり（それぞれ、Ｔｒｕｓｅｑ３’Ａｄ２８−ＡｐｐまたはＴｒｕｓｅｑ３’Ａｄ２８Ｐｍｅ（ｎ−１）−ＡＰＰ）、５’−アダプタープローブは非修飾または修飾のいずれかであった（それぞれ、Ｓｏｌｅｘａ−ＡｃｃまたはＳｏｌｅｘａ−Ａｃｃ−２’−ＯＭｅ（ｎ））。得られたＲＴ−ＰＣＲ産物の分析により、アダプタープローブ対における１つのプローブのみの修飾はアダプター二量体形成を抑制できるが、両方のプローブが修飾された場合、より効果的なアダプター二量体抑制が可能になることが明らかになった。
【０２７９】
これらの研究に基づいて、異なるアダプタープローブの組合せのスクリーニングを実施した（図２３は代表的なスクリーニングから得た結果を示す）。これらの研究において、ＲＮＡのより低い、０．７ｎｇの入力を用いる以前からの反応条件に従った。特に、非修飾アデニル化３’−アダプタープローブおよび修飾アデニル化３’−アダプタープローブ（それぞれ、Ｔｒｕｓｅｑ３’Ａｄ２８−ＡｐｐまたはＴｒｕｓｅｑ３’Ａｄ２８  Ｐｍｅ（ｎ−１）−Ａｐｐ）の１つの型を使用するワークフローを、Ｓｏｌｅｘａ−Ａｃｃ親配列（Ｍｏｄ  Ａ＝ＰＳ（ｎ）、Ｍｏｄ  Ｂ＝ＰＳ（ｎ−２）、Ｍｏｄ  Ｃ＝ＰＭｅ（ｎ）、Ｍｏｄ  Ｄ＝ＰＭｅ（ｎ−１）、Ｍｏｄ  Ｅ＝２’−ＯＭｅ（ｎ）、Ｆ＝２’−ＯＭｅ（ｎ−１）、Ｇ＝２’−ＯＭｅ（ｎ−２）、Ｈ＝２’−Ｆ（ｎ）、Ｉ＝２’−Ｆ（ｎ−２）、Ｊ＝２’−ＦＡＮＡ（ｎ）、Ｋ＝２’−Ｆ（ｎ−１）、Ｌ＝２’−ＦＡＮＡ（ｎ−１）、Ｍ＝２’−ＦＡＮＡ（ｎ−２）、Ｎ＝ＰＳ（ｎ，ｎ−１）、Ｏ＝ＰＳ（ｎ−１，ｎ−２）、Ｐ＝ＰＳ（ｎ，ｎ−２））に由来する一連の修飾５’−アダプタープローブに対してスクリーニングした。ライブラリー調製ワークフローから得たＲＴ−ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析により、例えば修飾対Ｅなどの、ライブラリー調製の特異性およびアダプター二量体形成の顕著な抑制を改善するいくつかの候補アダプター対が存在することが示された。３’−修飾アダプタープローブにおいて評価されている他の修飾には、表２および表４の下に示される、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、２’−メトキシ、２’−フルオロおよび２’−Ｆ−ＡＮＡが含まれる。
【０２８０】
【表４】
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2016514460.tif 000052
【実施例１４】
【０２８１】
次世代シークエンシングのための他の市販のキットに対する修飾アダプタープローブを使用する低分子ＲＮＡライブラリー調製ワークフローの性能の評価
これらの研究において、実施例１３に記載される低分子ＲＮＡライブラリー調製ワークフローを、非修飾Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター対（Ｔｒｕｓｅｑ３’Ａｄ２８−ＡｐｐおよびＳｏｌｅｘａ−Ａｃｃ）およびテンプレートとして１μｇのヒト脳全ＲＮＡの１つの主な修飾アダプター対（Ｔｒｕｓｅｑ３’Ａｄ２８ＰＭｅ（ｎ−１）−ＡｐｐおよびＳｏｌｅｘａ−Ａｃｃ−２’−ＯＭｅ（ｎ））を使用して実施した。非修飾および修飾アダプター対を用いた反応を３連で実施し、２つの市販のキット：ＩｌｌｕｍｉｎａのＴｒｕＳｅｑ低分子ＲＮＡ試料調製キットおよびＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）用のＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂのＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）低分子ＲＮＡライブラリー調製セットに対してベンチマークした。４つの手法のそれぞれについて、試料調製ワークフローを３連で実施し、ＰＣＲステップ後に停止した。ＰＣＲステップは、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンサーと適合するバーコードを導入したプライマーを用いた。得られた試料をＳｃｒｉｐｐｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおける次世代シークエンシングコアに提供し、そこでＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  Ｂｅａｄｓを使用してすべての試料のサイズを大きくし、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ分析により定量し、プールし、アガロースゲル切除により精製した。得られたプールした試料を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ（登録商標）システム上で単一のペアリードにおいてシークエンシングした。得られた生のシークエンシングデータをトリムし、受け取った生データは所与の試料中の各ｍｉＲＮＡの相対存在量であった。各キットによって検出したｍｉＲＮＡの数は以下の通りであった：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓにより１３７１個、Ｉｌｌｕｍｉｎａにより１３４４個、非修飾アダプターを使用して１４８８個および修飾アダプターを使用して１４４１個。生データをｍｉＲＮＡにより分類し、各ライブラリー調製プロトコールの３つの複製のそれぞれの代表的な平均を算出した。高、中および低レベルで選択した異なるｍｉＲＮＡを選択した。各ｍｉＲＮＡの平均存在量を棒グラフにおけるキットの関数としてプロットした（図２４）。ライブラリー調製プロトコールの間にいくつかの差異が存在するが、データのこの最初の所見では、方法の間で主要なバイアスが明らかにならなかった。
【０２８２】
次に、各方法から決定した各ｍｉＲＮＡの相対発現レベルをより詳細に調べた。所与のキットの対により検出したｍｉＲＮＡの相対発現レベルを比較した一連の散布図を作成した（図２５）。全体的に、使用した各方法の間で差異が見出された。特に、修飾および非修飾アダプターワークフローは最も強力な相関を有し、試料調製ワークフローのわずかな変化が顕著な効果を生じ得ることが示される。
【実施例１５】
【０２８３】
アダプター二量体形成を抑制するための修飾二本鎖アダプタープローブの評価
これらの研究において、二本鎖修飾アダプタープローブコンストラクトの使用が、平滑末端ライブラリー調製スキームにおいてアダプター二量体形成を抑制するために使用できるという仮説を試験した。これらの研究において、２’−フルオロおよび２’−メトキシ修飾コンストラクトを含むアダプタープローブについての複数の糖バリアントを試験した（以下の表を参照）。糖修飾に加えて、二本鎖アダプタープローブの２つのバリアント（５’−リン酸を有するものおよび５’−アデニル酸を有するもの）を調製した。二本鎖アダプタープローブをドナーおよびアクセプタープローブのハイブリダイゼーションによって形成した。二本鎖修飾アダプタープローブコンストラクト（０．１５μＭ）を、２２℃にて２時間、５０μＬの反応体積中の１×反応バッファー（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＤＴＴ、５％のＰＥＧ  ４０００およびＡＴＰ（５’−リン酸化アダプターについては０．５ｍＭおよび５’−アデニル化アダプターについては０ｍＭ）の存在下でインキュベートした。ライゲーション産物を１０％の天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。結果は、ライゲーションが５’−リン酸化または５’−アデニル化アダプターを用いて行われ得ることを示す。さらに、結果は、複数の二本鎖修飾アダプタープローブコンストラクトについてアダプター二量体形成の抑制を実証する。
【０２８４】
【表５】
2016514460.tif 000053
【実施例１６】
【０２８５】
ライブラリー調製スキームにおけるアダプター二量体形成を抑制するための修飾二本鎖アダプタープローブの評価
この実験において、実施例１３に示した研究を、二本鎖ＤＮＡライブラリーへの平滑末端ライゲーションを含むようにさらに拡張した。これらの研究において、２’−フルオロ、２’−メトキシ、２’−ＦＡＮＡおよび２’−ヒドロキシを含むアダプタープローブについての複数の糖バリアントを試験し、同様に複数の修飾主鎖（ホスホロチオエート、メチルホスホネート）、修飾コンストラクト（配列に関しては実施例１５の表を参照）を試験した。二本鎖アダプタープローブのそれぞれは５’−アデニル化ドナープローブを用いて調製した。二本鎖修飾アダプタープローブコンストラクト（０．１５μＭ）および二本鎖ＤＮＡライブラリー（０．０１μＭ）を、２２℃にて２時間、５０μＬの反応体積中の１×反応バッファー（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＤＴＴ）および５％のＰＥＧ  ４０００の存在下でインキュベートした。ライゲーション産物を１０％の天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。ゲル組み込みにより、二本鎖ＤＮＡライブラリーへの効果的なライゲーションを可能にしながら、糖修飾プローブコンストラクトの少なくとも５つおよび主鎖修飾プローブコンストラクトの少なくとも１つがアダプター二量体形成を抑制したことが明らかになった。
【０２８６】
別段定義されない限り、本明細書で使用されるあらゆる技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【０２８７】
本明細書に例示的に記載した本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の１つまたは複数の要素、１つまたは複数の制限なしに適切に実施され得る。したがって、本発明を説明する状況（特に、以下の特許請求の範囲の状況）における、例えば「一つの（ａ）」および「一つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」という用語および類似の指示対象は、本明細書で別段指定されない限り、または状況と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する」等は、広範囲に解釈されるものであり、限定的ではない（例えば、「それに限定されるものではないが含む」を意味する）。本明細書における値の範囲の記述は、本明細書で別段指定されない限り、単にその範囲に含まれるそれぞれ別個の値を個々に参照するための省略法として働くことを企図され、それぞれ別個の値は、それがあたかも本明細書に個々に列挙されるように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のあらゆる方法は、本明細書で別段指定されない限り、または状況と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供される任意のすべての例または例示的用語（例えば「など」）の使用は、単に本発明をより明らかにするためのものであり、別段特許請求されない限り、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書におけるいかなる用語も、本発明の実施に必須のものとして特許請求されていない任意の要素を示すと解釈されるべきではない。さらに、本明細書で用いた用語および表現は、限定的ではない説明用語として使用されており、示し記載した特徴またはその一部の任意の等価物を排除するような用語および表現の使用を企図するものではないが、特許請求される本発明の範囲内で様々な改変が可能であることを認識されたい。したがって、本発明を好ましい実施形態によって具体的に開示してきたが、当業者は、本明細書に開示の実施形態において具体化される本発明の任意の特徴、改変および変更を用いることができ、かかる改変および変更は、本発明の範囲に含まれるとみなされることを理解されたい。したがって、本発明を好ましい実施形態によって具体的に開示してきたが、当業者は、本明細書に開示の実施形態において具体化される本発明の任意の特徴、改変、改善および変更を行うことができ、かかる改変、改善および変更は、本発明の範囲に含まれるとみなされることを理解されたい。本明細書で提供される材料、方法および例は、好ましい実施形態の代表的なものであり、例示的であり、本発明の範囲を制限するものではない。
【０２８８】
本発明は、本明細書において広範に一般的に記載されている。属の開示に含まれる下位の種および亜属群のそれぞれも、本発明の一部を形成する。本発明は、条件付きで本発明の属の説明を含み、またはその属から任意の対象を除去する否定的な制限を、削除されるその材料が本明細書に具体的に列挙されるか否かに関わらず含む。
【０２８９】
加えて、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群の観点から説明される場合、本発明は、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたは複数メンバーのサブグループの観点からも説明されることを当業者は認識されよう。
【０２９０】
本明細書で言及したあらゆる刊行物、特許出願文書、特許文書および他の参考文献は、あたかもそのそれぞれが参照によって個々に組み込まれるのと同程度に、それらの全体が参照によって明確に組み込まれる。不一致が生じる場合には、定義を含む本明細書が優先する。
【０２９１】
出願人らは、かかる任意の論文、特許文書、特許出願文書または他の物質的文書および電子文書からの任意のあらゆる材料および情報を本願に物理的に組み込む権利を有する。
【０２９２】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内に記載される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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