(57)【要約】キノリネートを効果的に生産するために、ニコチン酸またはＮＡＤによるフィードバック調節が解除されたＬ−アスパルテートオキシダーゼ変異体、及び該Ｌ−アスパルテートオキシダーゼ変異体を含む微生物を提供する。Ｌ−アスパルテートオキシダーゼ変異体を含んだ微生物を培養することにより、効果的にキノリネートを生産することができる。2016525353.tif 000018
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表示されるアミノ酸配列において第３０２番アミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有する、Ｌ−アスパルテートオキシダーゼ変異体。
【請求項２】
前記他のアミノ酸は、アルギニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン及びヒスチジンから構成された群から選択される、請求項１に記載のＬ−アスパルテートオキシダーゼ変異体。
【請求項３】
ニコチン酸またはＮＡＤによるフィードバック調節が解除されている、請求項１に記載のＬ−アスパルテートオキシダーゼ変異体。
【請求項４】
配列番号１で表示されるアミノ酸配列において第３０２番アミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項５】
調節配列と機能的に連結された請求項４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項６】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む微生物。
【請求項７】
エスケリチア（Escherichia）属に属する、請求項６に記載の微生物。
【請求項８】
キノリネートシンセターゼの活性が強化される、請求項６に記載の微生物。
【請求項９】
内在的キノリネートホスホリボシルトランスフェラーゼの活性が低減される、請求項６に記載の微生物。
【請求項１０】
請求項６に記載の微生物を培地で培養する段階と、
培養培地からキノリネートを得る段階と
を含む、キノリネートを生産する方法。
【請求項１１】
請求項６に記載の微生物を培地で培養する段階と、
培養培地に酸を添加することによって脱炭酸反応を遂行する段階と
を含む、ニコチン酸を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−アスパルテートオキシダーゼ変異体、それをコードする遺伝子を含んだキノリネート生産能を有する微生物、及びそれを利用してキノリネートまたはニコチン酸を高効率で生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニコチン酸は、ニコチンの酸化物であり、ビタミンＢ複合体の一つである。ナイアシン（niacin）またはビタミンＢ３とも呼ばれる水溶性ビタミンであり、動物体・植物体に広く存在する。ニコチン酸が欠乏すれば、ペラグラ病にかかったり神経障害を起こしたりする。ニコチン酸は、生体内において、主にニコチン酸アミド補助酵素、すなわちニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）の形態で存在し、酸化還元反応に関与する。
【０００３】
また、キノリネート（quinolinate）は、キノリン酸（quinolinic acid）とも呼ばれ、キノリンの酸化によって生成される。キノリン酸は、神経毒性があることが知られており、多様な神経疾患を引き起こすことが知られている。また、キノリネートは、ニコチン酸の前駆物質として知られている。
【０００４】
一方、食品及び医薬品で有用に利用されるニコチン酸は、化学的合成方法及び生物学的生産方法を介して生産される。ニコチン酸の化学的合成は、触媒を含んだ多量の有毒な廃棄物を発生させるために、それに対する徹底的な管理が必要であり、廃棄物処理に多くの費用が必要となる。また、前駆物質として使用されるピリミジンは、多様な誘導体を有しており、供給量及び価格の変動が大きいために、ニコチン酸価格の不安定をもたらす。
【０００５】
かような化学的合成方法の問題を解消するために、再生可能な炭水化物由来の材料を利用し、生物学的にニコチン酸を生産する方法が研究された。ニコチン酸の生物学的生産は、大きく見て、２つの経路を介して行われる。一方の経路は、真核生物において、トリプトファンを出発物質としてニコチン酸を生合成する経路であり、他方の経路は、原核生物において、アスパラギン酸を出発物質にする経路である。２つの経路いずれもキノリネートを中間体として含み、キノリネートからキノリネートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｎａｄＣ）、ニコチン酸−モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ（ｎａｄＤ）、ＮＡＤシンセターゼ（ｎａｄＥ）、ニコチンアミドヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ（ＮＭＮｎａｄＲ）、及びニコチンアミダーゼ（ｐｎｃＡ）の作用によってニコチン酸を合成する。
【０００６】
ニコチン酸の生物学的生産方法のうち、アスパラギン酸経路を介してニコチン酸を生産する組み換え大腸菌やコリネバクテリウムグルタミクムを利用した方法が報告された（大韓民国登録特許１０−１２２３９０４（特許文献１））。本発明者らは、ニコチン酸の生物学的生産方法が有する問題点を解消し、キノリネートまたはニコチン酸の生産収率を向上させるための研究を行う過程において、高収率でキノリネートを生産するのに関与する酵素変異体を発見して本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】大韓民国登録特許１０−１２２３９０４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ニコチン酸またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）のフィードバック調節を受けないＬ−アスパルテートオキシダーゼ変異体を提供する。
【０００９】
本発明は、前記Ｌ−アスパルテートオキシダーゼ変異体を含んだキノリネート生産能が向上した微生物を提供する。
【００１０】
本発明は、前記微生物を培養してキノリネートを生産する方法を提供する。
【００１１】
本発明は、前記微生物の培養、及びキノリネートの脱炭酸反応を介して、ニコチン酸を生産する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によるニコチン酸またはＮＡＤのフィードバック調節を受けないＬ−アスパルテートオキシダーゼ変異体を含んだ微生物を培養する場合、効果的にキノリネートを生産することができる。前記微生物を利用したこのような方法を利用することにより、既存に問題になっていた化学的合成法の触媒副産物、高エネルギー、再使用不可能な資源利用による環境的な問題と、生物学的生産での低い収率とを解消し、さらに親環境的であって効率的にキノリネート及びニコチン酸を生産することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一具体例によるニコチン酸の生産方法において、ニコチン酸の生産経路を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
一様相は、配列番号１のアミノ酸配列において、第３０２番アミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有するＬ−アスパルテートオキシダーゼ変異体を提供する。
【００１５】
Ｌ−アスパルテートオキシダーゼは、下記反応式１に示されているように、Ｌ−アスパルテートをイミノコハク酸に酸化させる反応を触媒する活性を有する。
＜反応式１＞
Ｌ−アスパルテート＋フマレート⇔α−イミノコハク酸＋コハク酸＋Ｈ＋
Ｌ−アスパルテート＋酸素⇔過酸化水素＋α−イミノコハク酸＋Ｈ＋
【００１６】
本発明のＬ−アスパルテートオキシダーゼは、配列番号１で表示されるアミノ酸配列を含んでもよい。しかし、微生物種または菌株によって、タンパク質のアミノ酸配列において違いがあるために、それらに制限されるものではない。言い換えれば、前記Ｌ−アスパルテートオキシダーゼは、Ｌ−アスパルテートをイミノスクシネートに酸化させることができる限り、配列番号１で表示されるアミノ酸配列の１以上の位置において、１つまたはさまざまのアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を含むアミノ酸配列を有する突然変異タンパク質、または人為的な変異体でもある。ここで、「さまざまの」は、タンパク質のアミノ酸残基の三次構造の位置または形態によって異なりもするが、具体的には、２ないし２０個、具体的には、２ないし１０個、さらに具体的には、２ないし５個を意味する。また、前記アミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または逆位は、人為的な変異、または、微生物の個体もしくは微生物種の違いに基づく場合の天然突然変異によって引き起こされるものを含む。
【００１７】
本発明のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１で表示されるアミノ酸配列、またはＬ−アスパルテートオキシダーゼと類似した活性を有する限り、それと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、または具体的には、それと９０％以上の相同性、さらに具体的には、それと９５％以上の相同性、特に具体的には、それと９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んでもよい。最も具体的には、それは、配列番号２４で表示されるポリヌクレオチド配列でもある。
【００１８】
本発明の用語「相同性」とは、互いに異なる２つのアミノ酸配列間の同一性を意味するが、点数（score）、同一性（identity）、類似度（similarity）などの媒介変数（parameter）を計算するＢＬＡＳＴ ２．０を利用する、当業者に周知の方法で決定される。
【００１９】
また、本発明のＬ−アスパルテートオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２４のポリヌクレオチドまたはそこから製造されたプローブと、「厳格な条件（stringent conditions）」下でハイブリダイズすることができ、正常に機能するＬ−アスパルテートオキシダーゼをコードする変形されたポリヌクレオチド配列でもある。本明細書で使用された「厳格な条件」は、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味するものであり、例えば、Molecular Cloning（A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)またはCurrent Protocols in Molecular Biology（F. M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York）に具体的に記載されている。例えば、６５℃のハイブリダイゼーション緩衝液（３．５ＸＳＳＣ、０．０２％ Ficoll、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％牛血清アルブミン、２．５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）でのハイブリダイゼーションを記載している。ＳＳＣは、ｐＨ７の０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウムである。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが転写されているメンブレンを、室温で２Ｘ ＳＳＣで洗浄してから、６８℃の温度で、０．１ないし０．５Ｘ ＳＳＣ／０．１Ｘ ＳＤＳで洗浄する。
【００２０】
本明細書で使用された、「他のアミノ酸」は、変形前のアミノ酸配列に本来（originally）位置したアミノ酸を除いた他のアミノ酸残基を意味する。具体的には、他のアミノ酸は、リシンを除いたアルギニン、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン及びヒスチジンから構成された群から選択されるいずれか１つのアミノ酸を含んでもよい。具体的には、前記他のアミノ酸は、アルギニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン及びヒスチジンから構成された群から選択されるいずれか１つのアミノ酸を含んでもよい。一具体例において、前記他のアミノ酸は、アルギニンでもある。
【００２１】
本明細書で使用された用語「第３０２番（３０２ｎｄ）」は、アミノ酸配列のメチオニンを最初のアミノ酸残基と数えるために、配列番号１で表示されるアミノ酸配列のメチオニンからのアミノ酸の位置を意味する。
【００２２】
一般的に、Ｌ−アスパルテートオキシダーゼは、微生物内に蓄積されたニコチン酸またはＮＡＤによって活性が調節される。言い換えれば、ニコチン酸またはＮＡＤによってそのフィードバック調節が抑制される。前記ニコチン酸またはＮＡＤによるフィードバック調節は、通常のＬ−アスパルテートオキシダーゼとは異なり、本発明のＬ−アスパルテートオキシダーゼ変異体で解除される。
【００２３】
他の様相は、前記Ｌ−アスパルテートオキシダーゼ変異体をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに係わるものである。
【００２４】
一具体例は、配列番号１と記載されたアミノ酸配列において、第３０２番アミノ酸が他のアミノ酸で置換されたＬ−アスパルテートオキシダーゼ変異体をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供する。
【００２５】
前記第３０２番アミノ酸は、アルギニン、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン及びヒスチジンから構成された群から選択されるいずれか１つのアミノ酸を含んでもよい。従って、第３０２番アミノ酸に該当するポリヌクレオチド配列は、適切に置換され得る。一具体例としては、配列番号２４で表示されるヌクレオチド配列において、第９０４番ないし第９０６番の核酸が、ＡＡＧ、ＡＡＡ、ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡを除いたヌクレオチドの組み合わせで適切に置換され得る。
【００２６】
さらに他の様相は、調節配列と機能的に連結された前記ポリヌクレオチドを含んだベクターに係わるものである。
【００２７】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号２４で表示されるヌクレオチド配列において、第９０４番ないし第９０６番の核酸が適切に置換されたヌクレオチド配列を有するものである。一具体例において、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２４で表示されるヌクレオチド配列において、第９０４番ないし第９０６番の核酸が、ＡＡＧ、ＡＡＡ、ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡを除いたヌクレオチドの組み合わせで置換されたヌクレオチド配列を有するものでもある。前記ポリヌクレオチドは、調節配列と機能的に連結される。調節配列は、Ｌ−アスパルテートオキシダーゼの発現を調節する配列であり、プロモーター、ターミネーター、またはエンハンサーなどが含まれてもよい。
【００２８】
本発明で使用されるベクターは、特別に限定されるものではないが、当業界で知られた任意のベクターであってもよい。使用されるベクターは、例えば、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen社、米国）及びｐＥＣＣＧ１１７（ＫＦＣＣ−１０６７３）であってもよいが、それらに限定されるものではない。
【００２９】
前記プロモーターは、ラムダＰＬプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｐＰｒｏプロモーター、ｐＣＪ１プロモーター、またはｐＣＪ７プロモーターであってもよい（大韓民国登録特許１０−０６２００９２）。一具体例において、前記プロモーターは、ｐＣＪ１であってもよいが、これに限定されない。
【００３０】
また、前記プロモーターは、遺伝子をコードする配列と機能的に連結されている。本明細書において、用語「機能的に連結された」は、核酸発現調節配列（例：プロモーター、シグナル配列、転写調節因子結合位置のアレイ、ターミネーターまたはエンハンサー）と、他のヌクレオチド配列との間の機能性の結合を意味し、それにより、前記調節配列は、前記遺伝子をコードするヌクレオチド配列の転写及び／または翻訳を調節する。
【００３１】
本発明の他の様相は、配列番号１のアミノ酸配列において、第３０２番アミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む上述のポリヌクレオチドを含む微生物を提供する。
【００３２】
一具体例として、配列番号１のアミノ酸配列の第３０２番アミノ酸の置換に従い、配列番号２４の配列を有するヌクレオチド配列のうち一部が置換され得る。例えば前記ポリヌクレオチドは、配列番号２４のヌクレオチド配列のおける第９０４番ないし第９０６番のヌクレオチドが他のヌクレオチドで置換されたポリヌクレオチドを含み得る。
【００３３】
また、前記ポリヌクレオチドは、ランダムな突然変異を介して、または遺伝工学的な操作を介して得ることができる。また、そのように得られたポリヌクレオチドを微生物に形質転換させ、配列番号１のアミノ酸配列の一部が置換された微生物を作製することができる。
【００３４】
本明細書で使われる用語「形質転換」とは、遺伝子を宿主細胞内に導入し、宿主細胞内で発現させることを意味する。形質転換された遺伝子は、宿主細胞内で発現されさえすれば、宿主細胞の染色体内に挿入されたものでも、染色体外に位置しているものでもいずれも含まれる。また、前記遺伝子は、ポリペプチドをコードすることができるポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。例えば、前記遺伝子は、自主的に発現されるのに必要な全ての要素を含むポリヌクレオチド構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入される。前記発現カセットは、通常前記遺伝子に機能的に連結されているプロモーター、転写終結シグナル、リポソーム結合部位、及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製が可能な発現ベクター形態でもある。また、前記遺伝子は、それ自体、またはポリヌクレオチド構造体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞での発現に必要な配列と機能的に連結されているものでもある。
【００３５】
本明細書で使用された用語「キノリネート生産能を有する微生物」は、培地中の炭素源からキノリネートを生産して蓄積させることができる微生物を意味する。
【００３６】
キノリネートの生産能を向上させるために、微生物が多量のキノリネートを生成するようにし、生成したキノリネートが異なる経路で利用されずに蓄積されるようにしなければならない。従って、本発明の一具現例において、キノリネートの生産能が向上した微生物は、キノリネートの分解経路で作用するキノリネートホスホリボシルトランスフェラーゼの活性を除去したり弱化させたりする方法、キノリン酸の合成経路で作用するキノリネートシンセターゼの発現を強化させたり、その活性を増大させたりする方法、またはそれらの組み合わせによって生産される。
【００３７】
一具体例としては、キノリネート生産能が向上した微生物は、キノリネートシンセターゼの活性が強化されるようにさらに変形される。特に、前記キノリネートシンセターゼ活性の強化は、キノリネートシンセターゼを追加して導入し、微生物内においてキノリネートシンセターゼの発現量が増加することによって達成され得る。またキノリネートシンセターゼ活性の強化は、微生物内のキノリネートシンセターゼと連結されたプロモーターを、強力なプロモーターで置換することによっても達成され得る。さらに、キノリネートシンセターゼ活性の強化は、キノリネートシンセターゼ自体の活性を増大することによって達成してもよい。
【００３８】
また、異種（heterogenous）キノリネートシンセターゼを導入する場合、この酵素をコードするポリヌクレオチドを導入し、ポリヌクレオチドの発現を増加させてもよい。前記キノリネートシンセターゼをコードするポリヌクレオチドは、微生物内でプラスミド上で発現されるか、または微生物の染色体に挿入されて発現される。
【００３９】
前記キノリネートシンセターゼは、配列番号２９で表示されるアミノ酸配列、またはそれと相同性を有するアミノ酸配列を有することができる。言い換えれば、微生物種または菌株によって、タンパク質のアミノ酸配列において違いがあるために、それらに制限されるものではない。前記キノリネートシンターゼは、イミノスクシネートからキノリン酸を合成することができる限り、配列番号２９で表示されるアミノ酸配列の１以上の位置において、１つまたはさまざまのアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を含むアミノ酸配列を有する突然変異タンパク質、または人為的な変異体でもある。前記酵素をコードする遺伝子ｎａｄＡの配列は、文献（Mol Syst Biol. 2006; 2: 2006. 0007. Epub 2006 Feb 21）に公開された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のゲノム配列（ｇｉ：ＧＩ：８９１０９３８０）や、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）及び日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のようなデータベースから得ることができる。また、本発明のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２９で表示されるアミノ酸配列、またはＬ−アスパルテートオキシダーゼと類似した活性を有する限り、それと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、または具体的には、それと９０％以上の相同性、さらに具体的には、それと９５％以上の相同性、特に具体的には、それと９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。最も具体的には、それは、配列番号２６で表示されたポリヌクレオチド配列でもある。
【００４０】
キノリネートシンセターゼは、下記反応式２に示されているように、イミノコハク酸からキノリン酸を合成する活性を有する。
＜反応式２＞
α−イミノコハク酸＋ジヒドロキシアセトンリン酸⇔キノリネート＋ホスフェート＋２Ｈ２Ｏ
【００４１】
従って、キノリネートシンセターゼをコードする遺伝子の発現や、該酵素の活性を強化する場合、細胞内でキノリネートの生産を増加させることができる。
【００４２】
一具現例において、キノリネート生産能を有する微生物において、アスパルテートオキシダーゼ及びキノリネートシンセターゼ活性は、内在的プロモーターの強力なプロモーターへの置換、プロモーターの変異誘発または遺伝子コピー数増加によって強化される。前記強力なプロモーターで置換するために、一般的に強力なプロモーターとして知られるｐＴａｃ、ｐＴｒｃ、ｐＰｒｏ、ｐＲ、ｐＬ、ｐＣＪ１、ｐＣｙｓＫなどのプロモーターが使用される。
【００４３】
また一具体例としては、キノリネートホスホリボシルトランスフェラーゼの活性が低減されるか除去された、キノリネートを産生する改善された能力を有する微生物を提供する。
【００４４】
キノリネートホスホリボシルトランスフェラーゼの活性は、キノリネートホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を修飾することによって、または転写を抑制するマイクロＲＮＡを使用することによって、低減または除去され得る。
【００４５】
前記キノリネートホスホリボシルトランスフェラーゼは、配列番号３０で表示されるアミノ酸配列、またはそれと高い相同性を有するアミノ酸配列を有することができる。言い換えれば、微生物種または菌株によって、タンパク質のアミノ酸配列において違いがあるために、それらに制限されるものではない。前記キノリネートホスホリボシルトランスフェラーゼは、キノリネートからニコチン酸（ニコチネート）モノヌクレオチドを合成することができる限り、配列番号３０で表示されるアミノ酸配列の１以上の位置において、１つまたはさまざまのアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を含むアミノ酸配列を有する突然変異タンパク質または人為的な変異体でもある。
【００４６】
キノリネートホスホリボシルトランスフェラーゼは、下記反応式３に示されているように、キノリネートをニコチン酸モノヌクレオチドに合成する活性を有する。従って、該活性を有する遺伝子を除去したり、あるいはその発現を弱化させたりする場合、細胞内におけるキノリネートの生産を増加させることができる。
＜反応式３＞
５−ホスホ−α−Ｄ−リボース１−ジホスフェート＋キノリネート＋２Ｈ＋⇔ＣＯ２＋ジホスフェート＋ニコチン酸リボヌクレオチド
【００４７】
前記キノリネートホスホリボシルトランスフェラーゼ活性の弱化または欠失は、キノリネートホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする内在的遺伝子を、酵素活性が弱化または欠失するように修飾された遺伝子で置換する方法、前記遺伝子のプロモーターを、内在的プロモーターより弱いプロモーターに交換する方法、または前記遺伝子を染色体から欠失させる方法によって遂行される。
【００４８】
一具体例においては、キノリネート生産能を有する微生物において、キノリネートをニコチン酸モノヌクレオチドに転換させる酵素であるキノリネートホスホリボシルトランスフェラーゼの活性を除去することができる。そのために、相同性組み換え（homologous recombination）によって、キノリネートホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｎａｄＣを、微生物の遺伝体から除去することができる。遺伝子ｎａｄＣの配列は、文献（Mol Syst Biol. 2006; 2: 2006. 0007. Epub 2006 Feb 21）に公開された大腸菌のゲノム配列（ＧＩ：８９１０６９９０）、または米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）及び日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のようなデータベースから得ることができる。また、前記アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３０で表示されるアミノ酸配列、またはＬ−アスパルテートオキシダーゼと類似した活性を有する限り、それと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、または具体的には、それと９０％以上の相同性、さらに具体的には、それと９５％以上の相同性、特に具体的には、それと９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。最も具体的には、それは、配列番号２５で表示されたポリヌクレオチド配列でもある。
【００４９】
本発明の一具体例において、キノリネート生産能を有する微生物は、体内でキノリネートを生産することができる原核微生物菌株及び真核微生物菌株でもある。
【００５０】
本発明の一具体例において、キノリネート生産能を有する微生物は、エンテロバクター（Enterbacter）属、エスケリチア（Escherichia）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、プロビデンシア（Providencia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、及びブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物でもあるが、それらに限定されるものではない。
【００５１】
本発明の一具体例において、キノリネート生産能を有する微生物は、エスケリチア属に属する微生物であってもよい。
【００５２】
具体的には、キノリネート生産能を有する微生物は、大腸菌（Escherichia coli）であってもよい。
【００５３】
本発明の他の様相は、配列番号１のアミノ酸配列において、第３０２番アミノ酸が他のアミノ酸で置換されたＬ−アスパルテートオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含む微生物を培養する段階と、培養物からキノリネートを得る段階とを含む、キノリネートを生産する方法を提供する。
【００５４】
キノリネート生産能を有する微生物の培養は、当業界に知られた適切な培地と培養条件とによって行われる。かような培養過程は、当業者であれば、選択される微生物によって、容易に調整して使用することができる。培養方法は、回分式、連続式、及び流加式の培養を含むが、それらに限定されるものではない。微生物の多様な培養方法は、例えば、「Biochemical Engineering: James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp. 138-176」に開示されている。
【００５５】
培養に使用される培地は、特定の微生物の要求条件を適切に満たさなければならない。多様な微生物の培地は、例えば、文献（Manual of Methods for General Bacteriology: the American Society for Bacteriology, Washington D. C., 米国, 1981）に開示されている。例えば前記培地は、多様な炭素源、窒素源、及び微量元素成分を含む。
【００５６】
培養用培地に利用可能な炭素源の例は、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、果糖、マルトース、澱粉、セルロースのような炭水化物；大豆油、ひまわり油、ひまし油、ココナッツ油のような脂肪；パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸；グリセルロール及びエタノールのようなアルコール；酢酸のような有機酸を含むが、それらに限定されるものではない。炭素源は、単独または組み合わされて使用される。
【００５７】
培養用培地に利用可能な窒素源の例は、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、とうもろこし浸漬液（ＣＳＬ）及び大豆ミールのような有機窒素源、及び尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムのような無機窒素源を含むが、それらに限定されるものではない。窒素源は、単独または組み合わされて使用される。
【００５８】
培養用培地は、リンの供給源の例として、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、及び相応するナトリウム含有塩を含んでもよい。いくつかの態様において、培養用培地は、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含んでもよい。いくつかの態様において、培養用培地は、上で列挙した成分に加え、アミノ酸、ビタミン、及び適切な前駆体などを含んでもよい。微生物培養用培地または個別成分は、培養液に回分式または連続式で添加される。
【００５９】
いくつかの態様において、培養中に、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸のような化合物を、微生物培養液に適切な方式で添加し、培養液のｐＨを調整することができる。また、培養中に、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して、気泡生成を抑制することができる。培養液の好気状態を維持するために、培養液内に酸素または酸素含有気体（例えば、空気）を注入する。培養液の温度は、通常約２０℃ないし約４５℃、具体的には、約２５℃ないし約４０℃である。培養期間は、所望するキノリネートの生成量が得られるまで持続され、具体的には、約１０時間ないし１６０時間である。
【００６０】
さらに他の様相は、配列番号１のアミノ酸配列において、第３０２番アミノ酸が他のアミノ酸で置換されたＬ−アスパルテートオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含む微生物を培養する段階と、培養物に酸を添加し、脱炭酸反応を行う段階とを含むニコチン酸を生産する方法を提供する。
【００６１】
本明細書で使用された用語「脱炭酸反応」は、キノリン酸からカルボン酸を除去し、二酸化炭素を放出させることによってニコチン酸を生成する反応を意味する。
【００６２】
さらに具体的には、キノリネート生産能を有する微生物の培養後に得られたキノリネート含有培養液から、遠心分離または膜濾過方法を介して微生物を除去する。その後、脱炭酸反応を促進させるために、キノリネートを含む培養液に水素基を提供する酸を添加する。培養液に水素基を提供することができれば、添加される酸の種類は、制限されるものではない。
【００６３】
いくつかの具現例において、前記キノリネートが含まれた培養液は、精製なしに利用される。
【００６４】
一具現例において、前記培養液に添加される酸は、塩酸または硫酸でもある。
【００６５】
一具現例において、前記酸の添加後、培養液のｐＨは、約５以下、または具体的には約２ないし約３の範囲内であってよい。
【００６６】
一具現例において、前記培養液の脱炭酸反応時の温度は、約１００℃ないし約１５０℃、または具体的には、約１２０℃ないし約１３５℃の範囲内であってよい。
【００６７】
一具現例において、前記培養液の脱炭酸反応は、約０．１ＭＰａないし約０．５Ｍｐａ、あるいは具体的には約０．２ＭＰａないし約０．４ＭＰａの圧力で行われる。
【００６８】
キノリネートを含む発酵液に酸を添加した後、約１時間ないし３時間、高温及び高圧の条件下で脱炭酸反応を行えば、下記反応式４に表示されているように、培養液内のキノリネートがニコチン酸に変換される。
<反応式４＞
キノリネート＋２Ｈ＋⇔ＣＯ２＋ニコチン酸
【００６９】
一具現例において、本発明のニコチン酸を生産する方法は、ニコチン酸を回収して精製する段階をさらに含んでもよい。
【００７０】
一具現例において、本発明において、ニコチン酸の回収は、培養液の濾過過程及び結晶化過程を含む本発明が属する技術分野で公知の一般的な方法によって行われる。
【００７１】
以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７２】
実施例１．ＮＡＤフィードバック調節が解除されたＬ−アスパルテートオキシダーゼ変異体の獲得
＜１−１＞Ｌ−アスパルテートオキシダーゼ発現プラスミドの構築
Ｌ−アスパルテートオキシダーゼ変異体を調製するために、まず大腸菌由来の野生型Ｌ−アスパルテートオキシダーゼをコードするｎａｄＢ遺伝子を発現ベクターにクローニングした。そのために、テンプレートとしては、大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０菌株の染色体を利用した。菌株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した（ＡＴＣＣ番号２３２５７）。米国国立衛生研究所のＧｅｎＢａｎｋ（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から得た配列番号２４に示すｎａｄＢ遺伝子のヌクレオチド配列（ＮＣＢＩ登録番号「ＧＩ：８９１０９３８０」）に基づく。制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩの認識部位を有する配列番号２及び３のプライマーを構築して、遺伝子クローニングのために、ｎａｄＢ遺伝子のＯＲＦ部分を増幅する。
【００７３】
（表１）
2016525353.tif 000003
【００７４】
前記大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、配列番号２及び３のオリゴヌクレオチドに対して、プライマーを使用してＰＣＲを行った。ポリメラーゼは、ＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社、米国）を使用し、ＰＣＲは、９６℃で３０秒変性、５０℃で３０秒アニーリング、及び７２℃で２分の伸張によって構成されたサイクルを３０回反復して行った。ＰＣＲを介して、ｎａｄＢ ＯＲＦ遺伝子と、制限酵素ＮｄｅＩ及び制限酵素ＢａｍＨＩの認識部位とを含んだ約１．９ｋｂの増幅された遺伝子を得た。
【００７５】
前記ＰＣＲを介して得られたｎａｄＢ遺伝子は、アガロースゲル溶出（agarose gel elution）を介して回収した後、制限酵素ＮｄｅＩ及び制限酵素ＢａｍＨＩで処理した。その後、制限酵素ＮｄｅＩ及び制限酵素ＢａｍＨＩで処理したｐＰｒｏＬａｒ（CloneTech社、米国）ベクターにライゲーションした。それを介して、ｐＰｒｏプロモーターに連結されたｎａｄＢ遺伝子から、Ｌ−アスパルテートオキシダーゼを発現させた。結果として得られたベクターを「ｐＰｒｏ−ｎａｄＢベクター」と命名した。
【００７６】
＜１−２＞Ｌ−アスパルテートオキシダーゼ変異体のプラスミドライブラリの構築
Ｌ−アスパルテートオキシダーゼ変異体を獲得するために、ｄＧＴＰとＭｎＳＯ４の存在下でエラープローンＰＣＲ方法によって、前記＜１−１＞で得たｐＰｒｏ−ｎａｄＢベクターを用いて、変異型ｎａｄＢ遺伝子ライブラリを構築した。
【００７７】
ｐＰｒｏ−ｎａｄＢ組み換えベクターをテンプレートにし、プライマー４及び５を利用した、エラープローンＰＣＲにおいて、ＧＣの割合及びエラーの割合を調節するために使用したＰＣＲミックス内のｄＧＴＰとＭｎＳＯ４の濃度は、それぞれ２ｍＭおよび８ｍＭであり、使用したポリメラーゼはＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社、米国）であった。ＰＣＲは、９６℃で３０秒変性、５０℃で３０秒アニーリング、及び７２℃で２分の伸張によって構成されたサイクルを３０回反復して行い、ＰＣＲ後、約１．９ｋｂのＤＮＡ切片を獲得し、それを、アガロースゲル溶出を介して精製した後、制限酵素ＤｐｎＩ（ＮＥＢ社、米国）で約１時間処理した後、ＣａＣｌ２方法により大腸菌ＤＨ５α菌株（Invitrogen社、米国）に形質転換した。形質転換された大腸菌ＤＨ５α菌株を、Luria-Bertani（ＬＢ）−カナマイシン（Ｋｍ）（酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／Ｌ）平板培地に塗抹し、３７℃で一晩培養した。カナマイシン耐性を有するコロニーを選抜し、無作為に１０個のクローンを選び、シーケンシングを確認した結果、ｎａｄＢ遺伝子の変異保有率は、約４．５ヌクレオチド／１ｋｂと推定された。得られたｎａｄＢ遺伝子の変異を保有した菌株は、約３Ｘ１０５個以上であった。
【００７８】
（表２）
2016525353.tif 000004
【００７９】
＜１−３＞解除されたＮＡＤフィードバック調節を示すＬ−アスパルテートオキシダーゼ変異体の選別
＜１−３−１＞Ｌ−アスパルテートオキシダーゼ欠損菌株の構築
ｎａｄＢ遺伝子は、ＮＡＤによってフィードバックを受けており、それは、キノリネート生産において否定的な影響を及ぼす（J Biol Chem. 1982 Jan 25; 257 (2): 626-32）。このため、ＮＡＤによるフィードバック調節が解除されたｎａｄＢ遺伝子の発見は重要である。変異型ｎａｄＢ遺伝子のさらに明確な選別のために、菌株から内因性ｎａｄＢ遺伝子を除去した。米国国立衛生研究所のＧｅｎＢａｎｋ（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から得た配列番号２４に示すｎａｄＢ遺伝子のヌクレオチド配列（ＮＣＢＩ登録番号「ＧＩ：８９１０９３８０」）に基づき、ｎａｄＢ遺伝子の下流部分を増幅する配列番号６及び７のプライマー、ｎａｄＢの上流部分を増幅する配列番号８及び９のプライマー、ｌｏｘｐＣｍを増幅する配列番号１０及び１１のプライマーを合成した。
【００８０】
（表３）
2016525353.tif 000005
【００８１】
大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ番号２３２５７）をテンプレートとし、配列番号６及び７並びに８及び９のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、それぞれ０．４ｋｂのｎａｄＢ遺伝子の上流部分及び下流部分を増幅した。また、ｌｏｘｐＣｍを含んでいるプラスミドベクターｐＬｏｘｐＣａｔ２ベクターをテンプレートにして、配列番号１０及び１１のオリゴヌクレオチドをプライマーにしてＰＣＲを行い、両末端にｎａｄＢ遺伝子と相同配列を有する１．０ｋｂのｌｏｘｐＣｍ遺伝子を増幅した。ポリメラーゼは、ＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社、米国）を使用し、ＰＣＲは、９６℃で３０秒の変性、５３℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で１分の伸張によって構成されたサイクルを３０回反復して行った。その後、アガロースゲル溶出を介して、ｎａｄＢ−上流切片、ｎａｄＢ−下流切片、ｌｏｘｐＣｍ切片を獲得した。獲得された切片をテンプレートにしてＰＣＲを行い、ＰＣＲ条件は、９６℃での６０秒の変性、５０℃での６０秒の変性、及び７２℃での１分の伸張によって構成されたサイクルを１０回反復し、配列番号７及び８のプライマー添加後、サイクルを２０回反復するものであった。その結果、１．８ｋｂのｎａｄＢ遺伝子上流部分−ｌｏｘｐＣｍ−ｎａｄＢ遺伝子下流部分を含んだｎａｄＢ除去カセットを獲得した。
【００８２】
ラムダレッド組み換え酵素（lambda red recombinase）発現ベクターであるｐＫＤ４６を含んだ大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０菌株に対して電気穿孔を介して、ｎａｄＢ除去カセットを形質転換させ、選別マーカーであるクロラムフェニコールが含有されたＬＢ平板培地（トリプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、クロラムフェニコール１５μｇ／Ｌ、及びアガー１．５％）上に塗抹し、３７℃で一晩培養した後、クロラムフェニコールに対する耐性を示す菌株を選別した。
【００８３】
選別された菌株を直接テンプレートにして、配列番号７及び８のプライマーを用いて同じ条件でＰＣＲを行った。１．０％アガロースゲル上で、遺伝子の大きさが、野生株である場合は２．４ｋｂ、ｎａｄＢ除去菌株である場合は０．８ｋｂであるということを確認することにより、大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０においてｎａｄＢ遺伝子の欠失を確認した。それにより、Ｗ３１１０−△ｎａｄＢと命名されたｎａｄＢ除去菌株の構築が完成した。
【００８４】
＜１−３−２＞Ｌ−アスパルテートオキシダーゼ変異体の選別
ＮＡＤフィードバック調節に抵抗性を有するｎａｄＢを求めるために、ニコチン酸類似体（nicotinic acid analogue）である６−アミノピリジン−３−カルボン酸（６−ＮＡ；Aldrich社（米国）から購入）と、ニコチンアミド類似体（nicotinamide analogue）である６−アミノニコチンアミド（６−Ｎｍ；Aldrich社（米国）から購入）とを利用した。正確には、６−ＮＡＤ類似体を使用しなければならないが、ＮＡＤの構造上、ニコチン酸とニコチンアミドとに構造的類似性が存在するので、ニコチン酸類似体とニコチンアミド類似体とを使用して、耐性を有するｎａｄＢを一次選別し、次いで選別されたｎａｄＢ変異株の各々に対してＮＡＤフィードバック抵抗性（feedback resistance）を確認した（参照：Journal of bacteriology, june1983, p. 1126-1136）。実施例１の＜１−２＞で構築したＬ−アスパルテートオキシダーゼ変異体のプラスミドライブラリーを、ＣａＣｌ２法を介してＷ３１１０−△ｎａｄＢ菌株に形質転換した。
【００８５】
形質転換したＷ３１１０−△ｎａｄＢ菌株は、Ｍ９−（６，ＮＡ）−（６，Ｎｍ）（ＮａＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ １２．８ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ３ｇ、ＮａＣｌ ０．５ｇ、ＮＨ４Ｃｌ １ｇ、ＭｇＳＯ４ ２ｍＭ、ＣａＣｌ２ ０．１ｍＭ、カザミノ酸１ｇ、６−アミノピリジン−３−カルボン酸（６，ＮＡ）０．３ｇ／Ｌ、６−アミノニコチンアミド（６，Ｎｍ）０．３ｇ／Ｌ）平板培地に塗抹し、野生型ｎａｄＢと比較し、生育が早いコロニーを選別した。１ｘ１０７個の全コロニーをスクリーニングして最終３種を選別し、選別された３種は、ｐＰｒｏ−ｎａｄＢ６４、ｐＰｒｏ−ｎａｄＢ６７、ｐＰｒｏ−ｎａｄＢ１１０と命名した。選別された３種を、Ｍ９−（６，ＮＡ）−（６，Ｎｍ）（ＮａＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ １２．８ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ３ｇ、ＮａＣｌ ０．５ｇ、ＮＨ４Ｃｌ １ｇ、ＭｇＳＯ４ ２ｍＭ、ＣａＣｌ２０．１ｍＭ、カザミノ酸１ｇ、６−アミノピリジン−３−カルボン酸（６，ＮＡ）０．３ｇ／Ｌ、６−アミノニコチンアミド（６，Ｎｍ）０．３ｇ／Ｌ）液体培地に接種して培養した後、その光学濃度（ＯＤ）を比較した。その結果、ｐＰｒｏーｎａｄＢ６７がｐＰｒｏーｎａｄＢ６４及びｐＰｒｏーｎａｄＢ７２に対し、６−ＮＡ及び６−Ｎｍが含まれた培地において生育が早いということを確認することができた（表４）。これにより、ｐＰｒｏーｎａｄＢ６７番を選択し、その配列を特定した。その結果、開始メチオニンから第３０２番アミノ酸であるリシンがアルギニンに変わった変異体であるということを確認した。
【００８６】
ｎａｄＣ遺伝子が除去され、変異型ｎａｄＢ遺伝子の発現ベクターとしてｐＰｒｏｌａｒベクターを利用することによりｐＰｒｏ−ｎａｄＢ６７（Ｌｙｓ３０２Ａｒｇ）−ｐＣＪ ｎａｄＡを含む大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０を、ＣＶ０１−０５１８と命名した。これを、２０１３年６月２０日付けでブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ：Korean Culture center of Microorganisms）に、受託番号ＫＣＣＭ１１４３４Ｐで寄託した。
【００８７】
（表４）６−ＮＡと６−Ｎｍとを含む液体培地での３種の変異型ｎａｄＢの生育比較
2016525353.tif 000006
【００８８】
実施例２．変異型ｎａｄＢ間のキノリン酸生産量の比較
＜２−１＞キノリネートホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損菌株の構築
本実施例では、大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡをテンプレートにしたＰＣＲを介して、キノリネート分解経路に関与するｎａｄＣ遺伝子を得た。米国国立衛生研究所のＧｅｎＢａｎｋ（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から得た配列番号２５に示されるｎａｄＣ遺伝子のヌクレオチド配列（ＮＣＢＩ登録番号「ＧＩ：８９１０６９９０」）に基づいて、ｎａｄＣ遺伝子の下流部分を増幅する配列番号１２及び１３のプライマー、ｎａｄＣの上流及び下流部分とｌｏｘｐＣｍとを増幅する配列番号１４及び１５のプライマー、ｎａｄＣ遺伝子の上流部分を増幅する配列番号１６及び１７のプライマーを合成した。
【００８９】
（表５）
2016525353.tif 000007
【００９０】
大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡをテンプレートにして、配列番号１２及び１３、並びに１６及び１７のオリゴヌクレオチドをプライマーにしてＰＣＲを行い、それぞれ０．５ｋｂ及び０．３ｋｂのｎａｄＣ遺伝子の上流部分及び下流部分を増幅した。また、ｌｏｘｐＣｍを含んでいるプラスミドベクターｐＬｏｘｐＣａｔ２ベクターをテンプレートにして、配列番号１４及び１５のオリゴヌクレオチドをプライマーにしてＰＣＲを行い、両末端にｎａｄＣ遺伝子と相同配列を有する１．０ｋｂのｌｏｘｐＣｍ遺伝子を増幅した。ポリメラーゼは、ＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社、米国）を使用し、ＰＣＲは、９６℃で３０秒の変性、５３℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で１分の伸張によって構成されたサイクルを３０回反復して行った。その後、前述のＰＣＲ反応を介して得られたｎａｄＣ−上流切片、ｎａｄＣ−下流切片、ｌｏｘｐＣｍ切片をテンプレートにしてＰＣＲを行い、ＰＣＲ条件は、９６℃での６０秒の変性、５０℃での６０秒の変性、及び７２℃での１分の伸張によって構成されたサイクルを１０回反復し、配列番号１２及び１７のプライマー添加後、サイクルを２０回反復するものであった。その結果、１．８ｋｂのｎａｄＣ遺伝子の上流部分−ｌｏｘｐＣｍ−ｎａｄＣ遺伝子の下流部分を含んだｎａｄＣ欠損カセットを獲得した。
【００９１】
ｎａｄＣ欠損カセットで、ラムダレッド組み換え酵素（lambda red recombinase）発現ベクターであるｐＫＤ４６を含んだ大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０を、電気穿孔により形質転換させ、次いでこの菌株を、選別マーカーであるクロラムフェニコールを含むＬＢ平板培地（トリプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ及びアガー１．５％）上に塗抹し、３７℃で一晩培養した後、クロラムフェニコールに対する耐性を示す菌株を選別した。
【００９２】
選別された菌株を直接テンプレートにして、配列番号１３及び１６のプライマーを利用して、同じ条件でＰＣＲを行った後、１．０％アガロースゲル上で、遺伝子の大きさが、野生株である場合は１．６ｋｂ、ｎａｄＣ除去菌株である場合は１．３ｋｂであるということを確認することにより、大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０においてｎａｄＣ遺伝子の欠失を確認した。Ｗ３１１０−△ｎａｄＣと命名されたｎａｄＣ除去菌株の構築が完成した。
【００９３】
＜２−２＞アスパルテートオキシダーゼ発現用及びキノリネートシンセターゼ発現用のプラスミドの構築
キノリネートを生産するためには、アスパルテートオキシダーゼとキノリネートシンセターゼとの２つの酵素が必要である。従って、該２酵素をコードするｎａｄＢ及びｎａｄＡの遺伝子が共に発現されるプラスミドを作った。まず、大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲを介して、キノリネートシンセターゼをコードする遺伝子ｎａｄＡを得た。米国国立衛生研究所のＧｅｎＢａｎｋ（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から得た配列番号２６のｎａｄＡ遺伝子のヌクレオチド配列（ＮＣＢＩ登録番号「ＧＩ：８９１０７６０１」）をに基づいて、ＡＴＧ及びＴＡＡ部分を含むｎａｄＡ遺伝子のＯＲＦ部分を増幅することができ、制限酵素ＡｐａＩ及び制限酵素ＮｏｔＩの認識部位を有する配列番号１８及び１９のプライマーを合成した。
【００９４】
（表６）
2016525353.tif 000008
【００９５】
大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡをテンプレートにして、前記配列番号１８及び１９のオリゴヌクレオチドをプライマーにしてＰＣＲを行った。ポリメラーゼは、ＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社、米国）を使用し、ＰＣＲは、９６℃での３０秒の変性、５０℃での３０秒のアニーリング、及び７２℃での１分の伸張によって構成されたサイクルを３０回反復して行った。その結果、ｎａｄＡ遺伝子と、制限酵素ＡｐａＩ及び制限酵素ＮｏｔＩの認識部位とを含んだ約１．０ｋｂの増幅された遺伝子を獲得した。
【００９６】
また、大韓民国公開特許１０−２００６−００６８５０５を基に、テンプレートとしてｐＣＪ１プロモーターを含んだプラスミドを用いたＰＣＲを介して、ｐＣＪ１プロモーターを得た。ｐＣＪ１プロモーターと、前述の増幅されたｎａｄＡ遺伝子とをライゲーションさせるために、制限酵素ＢａｍＨＩ及び制限酵素ＡｐａＩの認識部位を有する配列番号２０及び２１のプライマーを合成した。
【００９７】
（表７）
2016525353.tif 000009
【００９８】
大腸菌Ｋ１２ Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡをテンプレートにして、前記配列番号２０及び２１のオリゴヌクレオチドをプライマーにしてＰＣＲを行った。ポリメラーゼは、ＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社、米国）を使用し、ＰＣＲは、９６℃での３０秒の変性、５０℃での３０秒のアニーリング、及び７２℃での１分の伸張によって構成されたサイクルを３０回反復した。その結果、ｐＣＪ１プロモーターと、制限酵素ＢａｍＨＩ及び制限酵素ＡｐａＩとを含んだ約０．３ｋｂの増幅された遺伝子を獲得した。
【００９９】
前記ＰＣＲを介して獲得したｎａｄＡ遺伝子を、制限酵素ＡｐａＩ及び制限酵素ＮｏｔＩで処理し、増幅されたｐＣＪ１プロモーター切片をＡｐａＩ及びＢａｍＨＩで処理した。制限酵素で処理したｎａｄＡ遺伝子及びｐＣＪ１プロモーター切片を、制限酵素ＮｏｔＩ及び制限酵素ＢａｍＨＩで処理した前記＜１−１＞で得られたｐＰｒｏ−ｎａｄＢベクターに、ライゲーションを介してクローニングし、最終的に、５．９ＫｂのｐＰｒｏ−ｎａｄＢ−ｐＣＪ１−ｎａｄＡ組み換えベクターを構築した。該ベクターにおいて、ｎａｄＢ遺伝子発現は、構成的プロモーターであるｐＰｒｏプロモーターによって調節を受け、ｎａｄＡ遺伝子は、ｐＣＪ１プロモーターによって調節を受ける。構築されたｐＰｒｏ−ｎａｄＢ−ｐＣＪ１−ｎａｄＡは、配列番号２７の配列を有する。また、前述のような方法で、変異型ｎａｄＢと野生型ｎａｄＡとが組み換えられたベクターｐＰｒｏ−ｎａｄＢ６７−ｐＣＪ１−ｎａｄＡを製作した。構築したｐＰｒｏ−ｎａｄＢ６７−ｐＣＪ１−ｎａｄＡは、配列番号２８に示される配列を有した。
【０１００】
＜２−２−１＞ｐＰｒｏ−ｎａｄＢ６７−ｐＣＪ１−ｎａｄＡのｎａｄＢ遺伝子の第３０２番目アミノ酸をリシンおよびアルギニンを除いたアミノ酸で置換したベクターの構築
Ｌ−アスパルテートオキシダーゼのメチオニンから開始して第３０２番アミノ酸であるリシンの代わりにアルギニンを含む変異型ｎａｄＢ６７遺伝子のＮＡＤフィードバック調節に対する抵抗性を確認するために、ｎａｄＢ遺伝子の第３０２番のアミノ酸を、リシン及びアルギニンを除いた１８種の異なるアミノ酸の各々で置換した。ｐＰｒｏ−ｎａｄＢ６７−ｐＣＪ１−ｎａｄＡをテンプレートにして、迅速な突然変異誘発を行った。ポリメラーゼは、ＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社、米国）を使用し、ＰＣＲは、９６℃での３０秒の変性、５５℃での３０秒のアニーリング、及び６８℃での１５分の伸張によって構成されたサイクルを１８回反復することによって実施した。ＰＣＲ産物は、ＤｐｎＩ（ＮＥＢ社、米国）で処理した後、大腸菌ＤＨ５α菌株（Invitrogen社、米国）に対して、ＣａＣｌ２方法を介して形質転換した。形質転換された大腸菌ＤＨ５α菌株を、ＬＢ−Ｋｍ（酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／Ｌ）平板培地に塗抹し、３７℃で一晩培養した。カナマイシン耐性を有するコロニーを選抜し、プラスミド抽出およびシーケンシングに供し、１８種の異なるアミノ酸による第３０２番アミノ酸の置換を確認した。その結果、プラスミドとして１８種のｎａｄＢ変異体を獲得することができ、その名称は表２の通りである。
【０１０１】
（表８）第３０２番アミノ酸が他のアミノ酸に置換されたＬ−アスパルテートオキシダーゼ変異体
2016525353.tif 000010
【０１０２】
＜２−３＞ＮＡＤ濃度別の野生型ｎａｄＢと変異型ｎａｄＢ６７のキノリネート生産能の評価
野生型ｎａｄＢと変異型ｎａｄＢ遺伝子におけるＮＡＤ濃度別キノリネート生産能を比較するために、下記キノリネート力価アッセイを進めた。前記実施例２の＜２−１＞で得られたキノリネート生産菌株（Ｗ３１１０−△ｎａｄＣ）に、実施例２の＜２−２＞で構築したプラスミドｐＰｒｏ−ｎａｄＢ６７−ｐＣＪｑ１−ｎａｄＡ、および実施例２の＜２−２−１＞で構築した１８種のｎａｄＢ６７変異体の各々を、ＣａＣｌ２方法を介して形質転換した。形質転換した菌株を３７℃の培養器でＬＢ−Ｋｍ平板培地内で一晩培養し、得られた単一コロニーを、キノリネート力価アッセイのための培地２５ｍｌに、１白金耳（platinum loop）ずつ接種し、２５０ｒｐｍで振とうさせながら３７℃で２４ないし７２時間培養した。表９は、キノリネート生産用培地の組成を示す。ｎａｄＢ６７を含んだ変異体のＮＡＤフィードバック抵抗性を確認するために、培地にニコチン酸（ＮＡ）を濃度別で添加し、キノリネートの生産量を比較した。
【０１０３】
（表９）キノリネート力価アッセイ用培養培地の組成
2016525353.tif 000011
【０１０４】
各々の培養液中のキノリネート（キノリン酸、ＱＡ）の量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析した。結果を表１０に示す。表１０は、ＮＡＤ濃度による変異型ｎａｄＢ６７のキノリネートの生産能を示す。
【０１０５】
（表１０）ＮＡＤ濃度によるキノリネート生産量
2016525353.tif 000012
【０１０６】
（表１１）ＮＡＤ濃度によるキノリネートの相対的生産率
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【０１０７】
プラスミドｐＰｒｏ−ｎａｄＢ６７（Ｄ）−ｐＣＪ−ｎａｄＡおよびｐＰｒｏ−ｎａｄＢ６７（Ｅ）−ｐＣＪ−ｎａｄＡを含む二つのキノリネート産生変異体について、ｎａｄＢは壊れて活性は喪失した。結果としてキノリネート産生変異体は主に、キノリネート（ＱＡ）値が非常に低く、その低値を残存相対生産率に換算してパーセンテージ（％）で計算した。これは、ニコチン酸（ＮＡ）が０μＭであるときのＱＡ生産量を１００％として示した。
【０１０８】
表１１から分かるように、野生型ｎａｄＢ遺伝子を含むｐＰｒｏ−ｎａｄＢ−ｐＣＪ−ｎａｄＡプラスミドを用い、培地内のニコチン酸が５μＭ以上であるとき、キノリネート生産量が５０％未満であるのに比べ、ｐＰｒｏ−ｎａｄＢ６７−ｐＣＪ−ｎａｄＡプラスミドと、変異型ｎａｄＢ遺伝子を含む第３０２番変異体組換えプラスミドは、キノリネート生産量７０％以上を維持する。Ｗ３１１０−△ｎａｄＣ菌株は、ＮＡＤを外部から供給してこそ生育が可能なＮＡＤ栄養素要求株である菌株である。Ｗ３１１０−△ｎａｄＣは、ＮＡＤを直接に受け入れることができず、外部のニコチン酸（ＮＡ）またはニコチンアミド（Ｎｍ）を利用してＮＡＤを生成する。しかし、細胞内のＮＡＤの含量が１ｍＭ以上になれば、ｎａｄＢ遺伝子はフィードバック調節を受け、細胞内ＮＡＤの含量が一定に維持される。これにより、フィードバック調節を受けるｎａｄＢ遺伝子により、ＱＡ生産に限界があることになる。培地にＮＡを添加することは、事実上、菌株内ＮＡＤ増加と見ることができる。したがって、培地に様々な濃度でＮＡを添加した菌株間でＱＡ生産量を比較することで、ＮＡＤ濃度による変異型ｎａｄＢ遺伝子におけるフィードバック調節の程度が確認される。結果として、第３０２番目のアミノ酸が置換されたｎａｄＢ遺伝子の変異体は、ＮＡＤによるフィードバックが解除されたことが見出された。
【０１０９】
＜２−４＞脱炭酸反応を介したニコチン酸の生産
変異型ｎａｄＢを導入したキノリネート生産菌株のニコチン酸生産能を確認するために、表１０で生産されたキノリネートを利用して、ニコチン酸生産を確認した。ニコチン酸生産方法は、大韓民国公開特許１０−２０１２−００８２６７３号を基にし、培養液において、キノリネートを含んだ培養液中のキノリネートをニコチン酸で転換するために、高温・高圧条件で脱炭酸反応を行った。まず、キノリネート培養液中の細胞を除去するために、約３，０００ｒｐｍないし約４，０００ｒｐｍで、約１０分間ないし約３０分間遠心分離を行った。遠心分離後、得られたキノリネート含有上澄み液を分離し、脱炭酸反応の試料として使用した。
【０１１０】
脱炭酸反応は、約１３５℃及び約０．２ＭＰａの条件下で約３時間行い、使用された試料の条件は、下記の表１２の通りであった。脱イオン水に溶解したキノリネート水溶液（Sigma−Aldrich社の標準品）を対照群として使用した。各試料のキノリネート水溶液は、水酸化ナトリウム、アンモニア水、塩酸、または硫酸を利用して滴定し、ニコチン酸へのキノリネートの転換は、ｐＨ２で生じた。下記の表１２は、表１０に記載されたキノリネートから高温高圧反応により転換されたニコチン酸の生産量を表示する。
【０１１１】
（表１２）
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【０１１２】
先行文献である中国公開特許１０１３５３３２２号に開示されるように、キノリネート水溶液（脱イオン水）をニコチン酸に転換する実験を、１３５℃及び０．２ＭＰａで、約３時間行った。温度及び圧力レベルは、先行文献においてそれぞれ１５０℃ないし２５０℃より低かった。結果を前記表１２に示す。
【０１１３】
実施例３．Ｌ−アスパルテートオキシダーゼ変異体のＮＡＤフィードバック抵抗性活性の確認
＜３−１＞Ｌ−アスパルテートオキシダーゼ過発現プラスミドの構築
Ｌ−アスパルテートオキシダーゼ変異体のＮＡＤフィードバック抵抗性活性をさらに明確にするために、＜実施例１−３−２＞で選択された変異型ｎａｄＢ６７がコードするＬ−アスパルテートオキシダーゼ変異体のＮＡＤフィードバック抵抗性を確認した。ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグを含むｐＣＤＦ−ｄｕｅｔベクターに、野生型ｎａｄＢ及び変異型ｎａｄＢをクローニングするために、野生型ｐＰｒｏ−ｎａｄＢプラスミドとｐＰｒｏ−ｎａｄＢ６７とをそれぞれのテンプレートにしてＰＣＲを行った。ＰＣＲに使用するため、ＡＴＧ及びＴＡＡ部分を含む野生型ｎａｄＢ遺伝子と変異型ｎａｄＢ６７遺伝子のＯＲＦ部分を増幅することができ、制限酵素認識部位ＢａｍＨＩと制限酵素認識部位ＮｄｅＩとを有する配列番号２２及び２３のプライマーを合成した。
【０１１４】
（表１３）
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【０１１５】
ポリメラーゼは、ＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社、米国）を使用し、ＰＣＲは、９６℃で３０秒変性、５０℃で３０秒アニーリング、及び７２℃で２分の伸張によって構成されたサイクルを３０回反復して行った。それにより、制限酵素ＢａｍＨＩ及び制限酵素ＮｄｅＩの認識部位を含んだ野生型ｎａｄＢと変異型ｎａｄＢ６７との約１．９ｋｂの増幅された遺伝子を得た。
【０１１６】
前記ＰＣＲを介して得られた野生型ｎａｄＢと変異型ｎａｄＢ６７との遺伝子を制限酵素ＢａｍＨＩ及び制限酵素ＮｄｅＩで処理し、制限酵素ＢａｍＨＩ及び制限酵素ＮｄｅＩで処理したｐＣＤＦ−ｄｕｅｔベクターに、ライゲーション（ligation）を介してクローニングした。最終的に、常時発現プロモーターであるＴ７プロモーターによって発現調節を受け、タンパク質精製が可能なＨｉｓタグを含む、野生型ｎａｄＢおよび変異型ｎａｄＢ６７の遺伝子をそれぞれ含む組換えベクターを構築した。構築した組換えベクターは、それぞれｐＴ７−ｎａｄＢおよびｐＴ７−ｎａｄＢ６７と命名した。同様の方法で、ｎａｄＢ３０２番がそれぞれバリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジンで置換されたベクターも構築し、それぞれｐＴ７−ｎａｄＢ６７（Ｖ）、ｐＴ７−ｎａｄＢ６７（Ｌ）、ｐＴ７−ｎａｄＢ６７（Ｉ）、ｐＴ７−ｎａｄＢ６７（Ｈ）と命名した。
【０１１７】
＜３−２＞Ｌ−アスパルテートオキシダーゼの精製
ｐＴ７−ｎａｄＢ、ｐＴ７−ｎａｄＢ６７、ｐＴ７−ｎａｄＢ６７（Ｖ）、ｐＴ７−ｎａｄＢ６７（Ｌ）、ｐＴ７−ｎａｄＢ６７（Ｉ）、またはｐＴ７−ｎａｄＢ６７（Ｈ）の組換えベクターをtuner菌株に、ＣａＣｌ２方法を介して形質転換した後、ＬＢ−ＳＰ（酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、スペクチノマイシン５０μｇ／Ｌ）平板培地に塗抹し、３７℃で一晩培養した。その後、スペクチノマイシン耐性を有するコロニーを選抜した。そのうち１コロニーを選別し、ＬＢ−ＳＰ（酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、スペクチノマイシン５０μｇ／Ｌ）液体培地に培養し、増殖の光学濃度（ＯＤ）が０．４になったとき、イソプロピルー１−チオーβーＤ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導体を添加し、約１８℃で一晩培養した。過発現された野生型Ｌ−アスパルテートオキシダーゼとＬ−アスパルテートオキシダーゼ変異体とを含む細胞を培養液から回収し、Ｎｉ−ＮＴＡ spin kit（Quiagen社、米国）を利用して、回収された細胞から野生型Ｌ−アスパルテートオキシダーゼとＬ−アスパルテートオキシダーゼ変異体の精製を行い、このときに回収されたタンパク質は、総タンパク質の５０％であり、そのうち約２％がＬ−アスパルテートオキシダーゼとして回収された。
【０１１８】
＜３−３＞Ｌ−アスパルテートオキシダーゼ変異体の活性テスト
Ｌ−アスパルテートオキシダーゼは、アスパテートを基質にして、ＦＡＤをコファクターとして使用して、イミノアスパルテートを生成し、それは、オキサロアセテートに変換される。上記の反応を介して生成された過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を利用してｎａｄＢの活性を確認した。生成されるＨ２Ｏ２を、Amplex Red（Invitrogen社、韓国）と反応させて生成される物質を、吸光度５６０ｎｍで測定し、ｎａｄＢの活性を測定した。このとき、ＮＡＤを濃度別に添加し、ＦＡＤとの競争的阻害条件を作り、ＮＡＤによるフィードバック調節に対するＬ−アスパルテートオキシダーゼの抵抗性を確認した。ＮＡＤ濃度１ｍＭでの野生型Ｌ−アスパルテートオキシダーゼの相対活性率は、５０％未満であったが、同じ濃度でのＬ−アスパルテートオキシダーゼ変異体の場合、７０％以上の相対活性率を保有していた（表１４）。これにより、Ｌ−アスパルテートオキシダーゼ変異体は、ＮＡＤによるフィードバック調節が解除されたということを確認した。
【０１１９】
（表１４）ＮＡＤ濃度別のＬ−アスパルテートオキシダーゼの活性比較
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【０１２０】
寄託機関：韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）（国際寄託当局）
アクセッション番号：ＫＣＣＭ１１４３４
寄託日：２０１３年６月２０日
【０１２１】
本発明は、その例示的態様を参照して特に示し記載してきたが、添付の特許請求の範囲の真意および範囲から逸脱することなく、形式および詳細において様々な変更がなされ得ることが理解されるであろう。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明は、キノリネートを効果的に生産するために、ニコチン酸またはＮＡＤのフィードバック調節を受けないＬ−アスパルテートオキシダーゼ変異体に係わるものである。かようなＬ−アスパルテートオキシダーゼ変異体を含んだ微生物を培養する場合、効果的にキノリネートを生産することができる。また、追加してキノリネートシンセターゼの活性を強化するか、あるいはキノリネートホスホリボシルトランスフェラーゼの活性が弱化された微生物を提供することにより、効果的にキノリネートを生産することができる。かような形質転換を介して、キノリネートまたはニコチン酸の生産収率を向上させることができるので、産業的に非常に有用である。
【０１２３】
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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