(57)【要約】  治療物質を含むポリマー粒子およびポリマーコンジュゲート粒子を製造するための方法およびデバイスであって、（ａ）第１の溶媒を含む第１の液流を流路内に導入することであって、流路が、流路内に導入された１つ以上の液流を流すように構成された第１の領域と、１つ以上の液流の内容物を混合するための第２の領域とを有すること；（ｂ）第２の溶媒中にポリマーコンジュゲートを含む第２の液流を流路内に導入して、流路内を流れる第１および第２の液流をもたらすこと；（ｃ）流路の第１の領域からの１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流を流路の第２の領域内に流すこと；（ｄ）流路の第２の領域内を流れる１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流の内容物を混合して、ポリマーコンジュゲートナノ粒子を含む第３の液流をもたらすことを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマーコンジュゲートナノ粒子を作製するための方法であって、
（ａ）第１の溶媒を含む第１の液流を流路内に導入することであって、前記流路が、前記流路内に導入された１つ以上の液流を流すように構成された第１の領域と、前記１つ以上の液流の内容物を混合するための第２の領域とを有すること；
（ｂ）第２の溶媒中にポリマーコンジュゲートを含む第２の液流を前記流路内に導入して、前記流路内を流れる第１および第２の液流をもたらすこと；
（ｃ）前記流路の前記第１の領域から、前記１つ以上の第１の液流および前記１つ以上の第２の液流を、前記流路の前記第２の領域内に流すこと；ならびに
（ｄ）前記流路の前記第２の領域内を流れる前記１つ以上の第１の液流および前記１つ以上の第２の液流の内容物を混合して、ポリマーコンジュゲートナノ粒子を含む第３の液流をもたらすこと
を含む、方法。
【請求項２】
前記１つ以上の第１の液流および前記１つ以上の第２の液流の内容物を混合することが、前記１つ以上の第１の液流および前記１つ以上の第２の液流の濃度または相対混合速度を変動させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第３の液流を水性緩衝液で希釈することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第３の液流を希釈することが、前記第３の液流および水性緩衝液を第２の混合構造体内に流すことを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第３の液流を透析濾過して、前記第２の溶媒の量を低減させることをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の溶媒が水性緩衝液である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第２の溶媒が水混和性溶媒である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１および第２の液流の内容物を混合することがカオス的移流を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記マイクロ流路の前記第２の領域が浅浮き彫り構造を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記マイクロ流路の前記第２の領域が、流れの主方向と、内部に画成された少なくとも１つの溝または突起を有する１つ以上の表面とを有し、前記溝または突起が、前記主方向とある角度を形成する配向を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１および第２の液流の内容物を混合することが、マイクロミキサーで混合することを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリマーコンジュゲートが、天然ポリマー、合成ポリマー、半合成ポリマー、それらの誘導体、それらの組み合わせ、およびそれらのコポリマーから選択されるポリマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリマーコンジュゲートが、ポリエチレングリコール、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリリジン、ポリエチレンイミン、セルロース、キチン、アルギネート、カルボキシメチルセルロース、アセチル化カルボキシメチルセルロース、キトサンおよびゼラチン、それらの誘導体、それらの組み合わせ、ならびにそれらのコポリマーから選択されるポリマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリマーコンジュゲートが、１種以上の小分子薬物、核酸、タンパク質、ペプチド、多糖、無機イオン、放射性核種、およびそれらの混合物から選択される治療物質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリマーコンジュゲートが、少なくとも１つのポリエチレングリコールおよび少なくとも１つの治療剤と共有結合したアセチル化カルボキシメチルセルロースである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療剤が化学療法剤である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記治療剤が、パクリタキセル（ＰＴＸ）、ドセタキセル（ＤＴＸ）、カバジタキセル（ＣＢＺ）、ラロタキセル（ＬＴＸ）、カンプトテシン（ＣＭＴ）、およびドキソルビシン（ＤＯＸ）から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
治療物質を含有するポリマー粒子を作製するための方法であって、
（ａ）第１の溶媒中に治療物質を含む第１の液流を流路内に導入することであって、前記流路が、前記流路内に導入された１つ以上の液流を流すように構成された第１の領域と、前記１つ以上の液流の内容物を混合するための第２の領域とを有すること；
（ｂ）第２の溶媒中にポリマーを含む第２の液流を前記流路に導入すること；
（ｃ）前記流路の前記第１の領域から、前記１つ以上の第１の液流および前記１つ以上の第２の液流を、前記流路の前記第２の領域内に流すこと；ならびに
（ｄ）前記流路の前記第２の領域内を流れる前記１つ以上の第１の液流および前記１つ以上の第２の液流の内容物を混合して、治療物質を含有するポリマーナノ粒子を含む第３の液流をもたらすこと
を含む、方法。
【請求項１９】
前記１つ以上の第１の液流および前記１つ以上の第２の液流の内容物を混合することが、前記１つ以上の第１の液流および前記１つ以上の第２の液流の濃度または相対混合速度を変動させることを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第３の液流を水性緩衝液で希釈することをさらに含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第３の液流を希釈することが、前記第３の液流および水性緩衝液を第２の混合構造体内に流すことを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第３の液流を透析濾過して、前記第２の溶媒の量を低減させることをさらに含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の溶媒が水性緩衝液である、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２の溶媒が水混和性溶媒である、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１および第２の液流の内容物を混合することがカオス的移流を含む、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記マイクロ流路の前記第２の領域が浅浮き彫り構造を含む、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記マイクロ流路の前記第２の領域が、流れの主方向と、内部に画成された少なくとも１つの溝または突起を有する１つ以上の表面とを有し、前記溝または突起が、前記主方向とある角度を形成する配向を有する、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１および第２の液流の内容物を混合することが、マイクロミキサーで混合することを含む、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ポリマーが、天然ポリマー、合成ポリマー、半合成ポリマー、それらの誘導体、それらの組み合わせ、およびそれらのコポリマーから選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリリジン、ポリエチレンイミン、セルロース、キチン、アルギネート、カルボキシメチルセルロース、アセチル化カルボキシメチルセルロース、キトサンおよびゼラチン、それらの誘導体、それらの組み合わせ、ならびにそれらのコポリマーから選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項３１】
前記治療物質が、１種以上の小分子薬物、核酸、タンパク質、ペプチド、多糖、無機イオン、放射性核種、およびそれらの混合物から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項３２】
前記治療物質が化学療法剤である、請求項１８に記載の方法。
【請求項３３】
前記治療物質が、パクリタキセル（ＰＴＸ）、ドセタキセル（ＤＴＸ）、カバジタキセル（ＣＢＺ）、ラロタキセル（ＬＴＸ）、カンプトテシン（ＣＭＴ）、およびドキソルビシン（ＤＯＸ）から選択される、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願への相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１３年７月２６日に出願され、参照によりその全体がここに明示的に組み込まれている、米国特許出願第６１／８５８，９７３号の利益を主張するものである。
【発明の分野】
【０００２】
本発明は、治療物質を含有するポリマー粒子を製造するための方法およびデバイスを提供する。
【発明の背景】
【０００３】
多くの活性な医薬成分（治療物質）にとっての大きな課題は、適正な濃度を標的細胞に送達して生物学的効果を引き出すことができないことである。ある種の治療物質、たとえば多くの化学療法用治療物質は有毒であり、疾患に影響を及ぼすために必要とされる用量で全身投与することができず、一方、他の治療物質、たとえば多くの生物製剤、たとえばオリゴヌクレオチド治療物質は、細胞膜を通過してそれらの作用部位に到達することができない。ポリマーナノ材料は、治療物質をカプセル化し、治療物質を病変細胞および組織に輸送するための有望な解決策である。ポリマーナノ粒子は、健常組織から治療物質を遮蔽することによって毒性を低減させ、病変組織を標的とすることによって治療物質の有効性を増大させ、また治療物質をその作用部位に活性な状態で送達できるようにすることによって、治療物質の治療指数を増大させることができる。
【０００４】
ポリマーナノ粒子は、広範な材料を使用して開発されてきた。そのような材料として、合成ホモポリマー、たとえば、ポリエチレングリコール、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリリジン、ポリエチレンイミン；合成コポリマー、たとえば、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（ラクチド）−ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）−ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ε−カプロラクトン）−ポリ（エチレングリコール）；ならびに天然ポリマー、たとえば、セルロース、キチン、およびアルギネートが挙げられる。
【０００５】
種々のクラスの治療物質が、治療または診断の性能および疾患の予後を向上させるために、ポリマーナノ粒子に封入および／または結合されてきたが、そうした治療物質として、低分子量有機化合物、核酸、タンパク質、ペプチド、無機元素および放射性物質が挙げられる。
【０００６】
ポリマーナノ粒子を製造するための種々の方法が開発されてきた。これらの方法として、自己集合、ナノ沈殿、および均質化が挙げられる。
【０００７】
ポリマーナノ粒子系を製造するための方法は利用できるものの、治療物質を含有するポリマーナノ粒子を調製するための方法およびデバイスを向上させることへの要求が存在する。本発明は、この要求を満たすことを目的とし、関連するさらなる利点を提供する。
【発明の概要】
【０００８】
一側面では、本発明は、ポリマーコンジュゲートナノ粒子を作製するための方法を提供する。
【０００９】
一態様では、方法は、
（ａ）第１の溶媒を含む第１の液流（たとえば、１つ以上の第１の液流）を流路内に導入することであって、流路が、流路内に導入された１つ以上の液流を流すように構成された第１の領域と、１つ以上の液流の内容物を混合するための第２の領域とを有すること；
（ｂ）第２の溶媒中にポリマーコンジュゲートを含む第２の液流（たとえば、１つ以上の第２の液流）を流路内に導入して、流路内を流れる第１および第２の液流をもたらすこと；
（ｃ）流路の第１の領域からの１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流を流路の第２の領域内に流すこと；ならびに
（ｄ）流路の第２の領域内を流れる１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流の内容物を混合して、ポリマーコンジュゲートナノ粒子を含む第３の液流をもたらすこと
を含む。
【００１０】
ポリマーコンジュゲートは、１種以上の分子種（たとえば、治療剤）が共有結合的または非共有結合的に連結されたポリマーである（すなわち、分子種はポリマーにコンジュゲートしている）。適切なポリマーとして、天然ポリマー、合成ポリマー、半合成ポリマー、それらの誘導体、それらの組み合わせ、およびそれらのコポリマーが挙げられる。代表的なポリマーとして、ポリエチレングリコール、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリリジン、ポリエチレンイミン、セルロース、キチン、アルギネート、カルボキシメチルセルロース、アセチル化カルボキシメチルセルロース、キトサン、およびゼラチン、それらの誘導体、それらの組み合わせ、およびそれらのコポリマーが挙げられる、適切な分子種として、小分子薬物、核酸、タンパク質、ペプチド、多糖、無機イオン、放射性核種、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００１１】
ある種の態様では、ポリマーコンジュゲートは、少なくとも１つのポリエチレングリコールおよび少なくとも１つの治療剤と共有結合したアセチル化カルボキシメチルセルロースである。適切な治療剤として、化学療法剤が挙げられる。代表的な治療剤として、パクリタキセル（ＰＴＸ）、ドセタキセル（ＤＴＸ）、カバジタキセル（ＣＢＺ）、ラロタキセル（ＬＴＸ）、カンプトテシン（ＣＭＴ）、およびドキソルビシン（ＤＯＸ）が挙げられる。
【００１２】
別の側面では、本発明は、治療物質を含有するポリマーナノ粒子を作製するための方法を提供する。
【００１３】
一態様では、方法は、
（ａ）第１の溶媒中に治療物質を含む第１の液流（たとえば、１つ以上の第１の液流）を流路内に導入することであって、流路が、流路内に導入された１つ以上の液流を流すように構成された第１の領域と、１つ以上の液流の内容物を混合するための第２の領域とを含むこと；
（ｂ）第２の溶媒中にポリマーを含む第２の液流（たとえば、１つ以上の第２の液流）を流路内に導入すること；
（ｃ）流路の第１の領域からの１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流を流路の第２の領域内に流すこと；ならびに
（ｄ）流路の第２の領域内を流れる１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流の内容物を混合して、治療物質を含有するポリマーナノ粒子を含む第３の液流をもたらすこと
を含む。
【００１４】
適切なポリマーとして、天然ポリマー、合成ポリマー、半合成ポリマー、それらの誘導体、それらの組み合わせ、およびそれらのコポリマーが挙げられる。代表的なポリマーとして、ポリエチレングリコール、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリリジン、ポリエチレンイミン、セルロース、キチン、アルギネート、カルボキシメチルセルロース、アセチル化カルボキシメチルセルロース、キトサン、およびゼラチン、それらの誘導体、それらの組み合わせ、ならびにそれらのコポリマーが挙げられる。
【００１５】
適切な治療物質として、小分子薬物、核酸、タンパク質、ペプチド、多糖、無機イオン、放射性核種、およびそれらの混合物が挙げられる。適切な治療物質として、化学療法剤が挙げられる。代表的な化学療法剤として、パクリタキセル（ＰＴＸ）、ドセタキセル（ＤＴＸ）、カバジタキセル（ＣＢＺ）、ラロタキセル（ＬＴＸ）、カンプトテシン（ＣＭＴ）、およびドキソルビシン（ＤＯＸ）が挙げられる。
【００１６】
上記方法のある種の態様では、第１の溶媒は、水性緩衝液である。
【００１７】
上記方法のある種の態様では、第２の溶媒は、水混和性溶媒である。
【００１８】
上記方法のある種の態様では、１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流の内容物を混合することは、１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流の濃度または相対混合速度を変動させることを含む。
【００１９】
上記方法のある種の態様では、第１および第２の液流の内容物を混合することは、カオス的移流を含む。上記方法のある種の態様では、マイクロ流路の第２の領域は、浅浮き彫り構造を含む。上記方法のある種の態様では、マイクロ流路の第２の領域は、流れの主方向と、内部に画成された少なくとも１つの溝または突起を有する１つ以上の表面とを有し、溝または突起は、主方向とある角度を形成する配向を有する。上記方法のある種の態様では、第１および第２の液流の内容物を混合することは、マイクロミキサーで混合することを含む。
【００２０】
本発明の前述の側面および付随する多くの利点は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を参照することによってよりよく理解されるようになれば、より容易に理解されるようになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本発明のナノ粒子を作製するための本発明の代表的な方法の略図である。たとえば、治療物質を含有するポリマーナノ粒子の場合、ポリマー−溶媒および治療物質−水溶液は、マイクロ流体混合デバイスの入口にポンプで送り込まれ；デバイス中のヘリンボーン状の特徴物によって、液流のカオス的移流が誘導され、ポリマー種が水性液流と急速に混合して、ポリマーナノ粒子を形成する。代表的なデバイスでは、混合流路は、幅３００μｍおよび高さ１３０μｍであり、ヘリンボーン状構造は、高さ４０μｍおよび厚さ５３μｍである。
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、本発明の方法およびデバイスを使用して製造された代表的なポリマーコンジュゲートナノ粒子（Ｃｅｌｌａｘ：ポリエチレングリコールおよびドセタキセルにコンジュゲートしたアセチル化カルボキシメチルセルロースポリマー、ここで、アセチル化カルボキシメチルセルロースのアセチル基とアセチル化カルボキシメチルセルロースのカルボン酸基／ポリエチレングリコール／ドセタキセルとのモル比は２．１８：０．８２である）のポリマーコンジュゲート濃度の関数としてプロットされた平均粒径（２Ａ）および多分散性（ＰＤＩ）（２Ｂ）を示す。Ｃｅｌｌａｘ材料は、アセトニトリルに溶解させて所望の初濃度にした。Ｃｅｌｌａｘナノ粒子は、この溶媒を脱イオン水中０．９％（ｗ：ｗ）の塩化ナトリウム水溶液（０．９％ＮａＣｌ）と混合することによって形成した。全流量１８ｍＬ／分および流量比３：１（水溶液：溶媒）を使用した。次いで得られた混合物を、粒子が凝集しないようにピペットで０．９％ＮａＣｌに直ちに入れて１：１に希釈し、２００倍容量の０．９％ＮａＣｌに対して透析して、残留するアセトニトリルを除去した。
【図２Ｂ】（図２Ａの説明と同じ）
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは、本発明の方法およびデバイスを使用して製造された代表的なポリマーコンジュゲートナノ粒子（Ｃｅｌｌａｘ：ポリエチレングリコールおよびドセタキセルにコンジュゲートしたアセチル化カルボキシメチルセルロースポリマー、ここで、アセチル化カルボキシメチルセルロースのアセチル基とアセチル化カルボキシメチルセルロースのカルボン酸基／ポリエチレングリコール／ドセタキセルとのモル比は２．１８：０．８２である）の代表的な製造プロセス条件の関数としてプロットされた平均粒径（３Ａ）および多分散性（ＰＤＩ）（３Ｂ）を示す。すべての試料は、アセトニトリル中２０ｍｇ／ｍＬのＣｅｌｌａｘ初濃度で製造された。水溶液は、０．９％ＮａＣｌを含有するものを使用した；プロセス７−全流量＝１８ｍＬ／分、流量比（水性：有機）＝５：１、マイクロ流体の後希釈なし；プロセス８−全流量＝１８ｍＬ／分、流量比（水性：有機）＝５：１、マイクロ流体を０．９％ＮａＣｌで１：１に後希釈；プロセス９−全流量＝１８ｍＬ／分、流量比（水性：有機）＝３：１、マイクロ流体の後希釈なし；プロセス１０−全流量＝１８ｍＬ／分、流量比（水性：有機）＝３：１、マイクロ流体を０．９％ＮａＣｌで１：１に後希釈。
【図３Ｂ】（図３Ａの説明と同じ）
【発明の詳細な説明】
【００２２】
本発明は、ポリマー粒子を製造するための方法およびデバイスを提供する。ある種の態様では、ポリマー粒子は、治療物質を含有するナノ粒子である。他の態様では、ポリマー粒子は、ポリマーコンジュゲート、たとえば、ポリマー薬物コンジュゲートを含有するナノ粒子である。
【００２３】
治療物質を含有するポリマーナノ粒子を作製するための方法
一態様では、本発明は、治療物質を含有するポリマーナノ粒子を作製するための方法であって、
（ａ）第１の溶媒中に治療物質を含む第１の液流（たとえば、１つ以上の第１の液流）を流体デバイス（たとえば、マイクロ流体デバイス）内に導入することであって、デバイスが、デバイス内に導入された１つ以上の液流を流すように構成された第１の領域と、１つ以上の液流の内容物を混合する（たとえば、マイクロ流体ミキサーを用いて）ための第２の領域とを含むこと；
（ｂ）第２の溶媒中にポリマーを含む第２の液流（たとえば、１つ以上の第２の液流）をデバイス内に導入すること；
（ｃ）デバイスの第１の領域からの１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流をデバイスの第２の領域内に流すこと；ならびに
（ｄ）デバイスの第２の領域内の１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流の内容物を混合して、治療物質を含有するポリマーナノ粒子を含む第３の液流をもたらすこと
を含む方法を提供する。
【００２４】
別の態様では、本発明は、治療物質を含有するポリマーナノ粒子を作製するための方法であって、
（ａ）第１の溶媒中に治療物質を含む第１の液流（たとえば、１つ以上の第１の液流）を流路（たとえば、マイクロ流路）内に導入することであって、流路が、流路内に導入された１つ以上の液流を流すように構成された第１の領域と、１つ以上の液流の内容物を混合するための第２の領域とを含むこと；
（ｂ）第２の溶媒中にポリマーを含む第２の液流（たとえば、１つ以上の第２の液流）を流路内に導入すること；
（ｃ）流路の第１の領域からの１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流を流路の第２の領域に流すこと；ならびに
（ｄ）流路の第２の領域内を流れる１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流の内容物を混合して、治療物質を含有するポリマーナノ粒子を含む第３の液流をもたらすこと
を含む方法を提供する。
【００２５】
さらなる態様では、本発明は、治療物質を含有するポリマーナノ粒子を作製するための方法であって、
（ａ）第１の溶媒中に治療物質を含む第１の液流（たとえば、１つ以上の第１の液流）を流路（たとえば、マイクロ流路）内に導入することであって、流路が、流路内に導入された１つ以上の液流を流すように構成された第１の領域と、１つ以上の液流の内容物を混合するための第２の領域とを含むこと；
（ｂ）第２の溶媒中にポリマーを含む第２の液流（たとえば、１つ以上の第２の液流）を流路内に導入すること；
（ｃ）流路の第１の領域からの１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流を、２つの液流の物理的分離を維持しながら流路の第２の領域内に流すことであって、１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流が、流路の第２の領域に到達するまで混合しないこと；ならびに
（ｄ）流路の第２の領域内を流れる１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流の内容物を混合して、治療物質を含有するポリマーナノ粒子を含む第３の液流をもたらすこと
を含む方法を提供する。
【００２６】
ポリマーコンジュゲートナノ粒子を作製するための方法
さらなる態様では、本発明は、ポリマーコンジュゲートナノ粒子を作製するための方法であって、
（ａ）第１の溶媒を含む第１の液流（たとえば、１つ以上の第１の液流）を流体（たとえば、マイクロ流体）デバイス内に導入することであって、デバイスが、デバイス内に導入された１つ以上の液流を流すように構成された第１の領域と、１つ以上の液流の内容物を混合する（たとえば、マイクロ流体ミキサーを用いて）ための第２の領域とを有すること；
（ｂ）第２の溶媒中にポリマーコンジュゲートを含む第２の液流（たとえば、１つ以上の第２の液流）をデバイス内に導入すること；
（ｃ）デバイスの第１の領域からの１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流をデバイスの第２の領域内に流すこと；ならびに
（ｄ）デバイスの第２の領域内の１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流の内容物を混合して、ポリマーコンジュゲートナノ粒子を含む第３の液流をもたらすこと
を含む方法を提供する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、ポリマーコンジュゲートナノ粒子を作製するための方法であって、
（ａ）第１の溶媒を含む第１の液流（たとえば、１つ以上の第１の液流）を流路（たとえば、マイクロ流路）内に導入することであって、流路が、流路内に導入された１つ以上の液流を流すように構成された第１の領域と、１つ以上の液流の内容物を混合するための第２の領域とを有すること；
（ｂ）第２の溶媒中にポリマーコンジュゲートを含む第２の液流（たとえば、１つ以上の第２の液流）を流路内に導入すること；
（ｃ）流路の第１の領域からの１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流を、２つの液流の物理的分離を維持しながら流路の第２の領域内に流すことであって、１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流が、流路の第２の領域に到達するまで混合しないこと；ならびに
（ｄ）流路の第２の領域内を流れる１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流の内容物を混合して、ポリマーコンジュゲートナノ粒子を含む第３の液流をもたらすこと
を含む方法を提供する。
【００２８】
上記方法のある種の態様では、流体デバイスはマイクロ流体デバイスであり、流路はマイクロ流路である。
【００２９】
上記方法のある種の態様では、１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流の内容物を混合することは、１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流の濃度または相対混合速度を変動させることを含む。
【００３０】
上記方法のある種の態様では、方法は、第３の液流を水性緩衝液で希釈することをさらに含む。ある種の態様では、第３の液流を希釈することは、第３の液流および水性緩衝液を第２の混合構造体内に流すことを含む。
【００３１】
上記方法のある種の態様では、方法は、治療物質を含有するポリマーナノ粒子を含む水性緩衝液をさらなる水性緩衝液で透析濾過して、第２の溶媒の量を低減させることをさらに含む。上記方法のある種の態様では、方法は、ポリマーコンジュゲートナノ粒子を含む水性緩衝液をさらなる水性緩衝液で透析濾過して、第２の溶媒の量を低減させることをさらに含む。
【００３２】
上記方法では、第１および第２の溶媒は、同一であっても異なっていてもよい。たとえば、ある種の態様では、第１および第２の溶媒は異なっている（たとえば、治療物質は、水性緩衝液である第１の溶媒に含まれ、ポリマーは、水混和性溶媒（たとえば、有機溶媒）である第２の溶媒に含まれる）。他の態様では、第１および第２の溶媒は、同一または実質的に同一である（たとえば、両方とも水性溶媒である）。上記方法のある種の態様では、第１の溶媒は、水または水性緩衝液である。代表的な第１の溶媒として、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液（リン酸緩衝食塩水）、および生理食塩水が挙げられる。適切な第２の溶媒として、それにポリマーコンジュゲートが可溶であり、第１の溶媒と混和性である溶媒が挙げられる。適切な第２の溶媒として、水（たとえば、水性緩衝液）、有機酸、およびアルコールが挙げられる。代表的な第２の溶媒として、水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトン、ジメチルスルホキシド、およびジメチルホルムアミドが挙げられる。
【００３３】
上記方法のある種の態様では、第１および第２の液流の内容物を混合することは、カオス的移流を含む。上記方法のある種の態様では、第１および第２の液流の内容物を混合することは、マイクロミキサーで混合することを含む。
【００３４】
上記方法のある種の態様では、１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流を混合することは、第１の領域内ではバリアによって防止されている。ある種の態様では、バリアは、流路壁、シース液、または同心管である。
【００３５】
上記方法のある種の態様では、第１および第２の液流は、第１の領域内では層流状態下で流れる。
【００３６】
さらなる態様では、本発明は、ポリマーコンジュゲートナノ粒子（たとえば、ポリマー薬物コンジュゲートナノ粒子）を作製するための方法を提供する。方法は、
（ａ）第１の溶媒を含む第１の液流（たとえば、１つ以上の第１の液流）を流路（たとえば、マイクロ流路）内に導入することであって、流路が、流路内に導入された１つ以上の液流を流すように構成された第１の領域と、１つ以上の液流の内容物を混合するための第２の領域とを有すること；
（ｂ）第２の溶媒中にポリマーコンジュゲートを含む第２の液流（たとえば、１つ以上の第２の液流）を流路に導入して、流路内を流れる第１および第２の液流をもたらすこと；
（ｃ）流路の第１の領域からの１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流を、流路の第２の領域内に流すこと、ならびに
（ｄ）流路の第２の領域内を流れる１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流の内容物を混合して、ポリマーコンジュゲートナノ粒子を含む第３の液流をもたらすこと
を含む。
【００３７】
一態様では、流路はマイクロ流路である。
【００３８】
ある種の態様では、流路は、流体デバイス（たとえば、マイクロ流体デバイス）内に配置される。
【００３９】
上記方法の一態様では、第１および第２の液流は、第１の領域内では層流状態下で流れる。
【００４０】
上記方法では、第１および第２の液流の内容物は、カオス的移流によって混合することができる。一態様では、１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流の内容物を混合することは、１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流の濃度または相対混合速度を変動させることを含む。
【００４１】
ポリマーコンジュゲートナノ粒子を含有する第３の液流をさらに安定化させるために、該方法は、第３の液流を水性緩衝液で希釈することを含むことができるが、さらに含むことを必ずしも要しない。一態様では、第３の液流を希釈することは、第３の液流および水性緩衝液を第２の混合構造体内に流すことを含む。別の態様では、ポリマーコンジュゲートナノ粒子を含む水性緩衝液を透析して第２の溶媒の量を低減させる。
【００４２】
この態様では、適切な第１の溶媒として、水および水性緩衝液が挙げられる。代表的な第１の溶媒として、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液（リン酸緩衝食塩水）、および生理食塩水が挙げられる。
【００４３】
第２の液流は、第２の溶媒中にポリマーコンジュゲートを含む。適切な第２の溶媒として、それにポリマーコンジュゲートが可溶であり、第１の溶媒と混和性である溶媒が挙げられる。適切な第２の溶媒として、水（たとえば、水性緩衝液）、有機酸、およびアルコールが挙げられる。代表的な第２の溶媒として、水、アセトニトリル、エタノール、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトン、ジメチルスルホキシド、およびジメチルホルムアミドが挙げられる。
【００４４】
本発明の方法がマイクロ流体を混合する方法である場合、これらの方法は他のマイクロ流体混合法とは幾つかの点で区別される。ある種の公知の方法が、水性溶媒と有機溶媒の等しいまたは実質的に等しい割合（すなわち、１：１）を必要とするのに対して、本発明の方法は一般に１：１を超える水性対有機の溶媒比を利用する。ある種の態様では、水性対有機の溶媒比は約２：１である。ある種の態様では、水性対有機の溶媒比は約３：１である。ある種の態様では、水性対有機の溶媒比は約４：１である。ある種の他の態様では、水性対有機の溶媒比は、約５：１、約１０：１、約５０：１、約１００：１、またはそれ以上である。
【００４５】
本発明のポリマーナノ粒子は、有利には、比較的急速な混合および高流量を利用するマイクロ流体プロセスで形成される。急速に混合すると、ポリマーナノ粒子は、有利な性質、たとえば、粒径、均一性、およびカプセル化効率を有するようになる。本発明の方法を実施する際に使用される混合速度の範囲は、約１００マイクロ秒から約１０ミリ秒までである。代表的な混合速度として、約１ミリ秒から約５ミリ秒が挙げられる。流体力学的流れに着目した方法は、比較的低流量（たとえば、５から１００μＬ／分）で、比較的低容量のポリマーナノ粒子で動作するのに対して、本発明の方法は、比較的高流量で比較的大容量のポリマーナノ粒子で動作する。ある種の態様では、単一の混合領域（すなわち、ミキサー）を実装する方法の場合、流量は約１から約３０ｍＬ／分である。本発明の方法がミキサーアレイ（たとえば、１０個のミキサー）を利用する場合、２００ｍＬ／分の流量が用いられる（１００個のミキサーの場合、流量は２０００ｍＬ／分）。よって、本発明の方法は、容易に規模を増減して、生産必要高の要求に必要な量のポリマーナノ粒子を提供することができる。実現される有利な粒径、均一性、およびカプセル化効率と相まって、本発明の方法は、ポリマーナノ粒子を製作するための公知のマイクロ流体法の不利な点を克服する。ポリマーナノ粒子を作製するための本発明の方法の１つの利点は、この方法がスケーラブルであることであり、すなわち、この方法は、規模を増減しても変化せず、規模を増減しても優れた相関性がある。
【００４６】
ポリマーナノ粒子およびポリマーコンジュゲートナノ粒子を作製するためのデバイス
別の側面では、本発明は、ポリマーナノ粒子（たとえば、治療物質、ポリマーコンジュゲートナノ粒子を含有するポリマーナノ粒子）を製作するためのデバイス（たとえば、マイクロ流体デバイス）を提供する。
【００４７】
一態様では、デバイス（１００）は、
（ａ）第１の溶液（たとえば、治療物質を含む第１の溶媒）を受け入れるための第１の入口（１０２）；
（ｂ）（第１の溶液を含む第１の液流をもたらすように）第１の入口と流体連通する第１の取入流路（１０３）（たとえば、マイクロ流路）；
（ｃ）第２の溶液（たとえば、ポリマーを含む第２の溶媒）を受け入れるための第２の入口（１０４）；
（ｄ）（第２の溶液を含む第２の液流をもたらすように）第２の入口と流体連結する第２の取入流路（１０５）（たとえば、マイクロ流路）；
（ｅ）第１および第２の液流を受け入れるための第３の流路（１１０）（たとえば、マイクロ流路）
を含み、第３の流路が、流路に導入された第１および第２の液流を流すように構成された第１の領域（１１１）と、第１および第２の液流の内容物を混合して第３の液流（たとえば、治療物質を含有するポリマーナノ粒子を含む）をもたらすように構成された第２の領域（１１２）とを有する。第３の液流は、デバイスから出口１２０を通して導くことができる。
【００４８】
本発明の方法を実行するのに有用な代表的なデバイスが、図１に略図で示される。上述の符号は、図１に示されるデバイスについて指している。
【００４９】
一態様では、デバイスは第３の液流を希釈するための手段をさらに含んで、治療物質を含有する安定化されたポリマーコンジュゲートナノ粒子を含む希釈された液流をもたらす。
【００５０】
一態様では、デバイスは第３の液流を希釈するための手段をさらに含んで、（たとえば、治療物質を含有する安定化されたポリマーナノ粒子を含む）希釈された液流をもたらす。ある種の態様では、第３の液流を希釈するための手段は、マイクロミキサーを含む。
【００５１】
ある種の態様では、本発明のデバイスは、１つ以上のマイクロ流路（すなわち、その最大寸法が１ミリメートル未満の流路）を含むマイクロ流体デバイスである。ある種の態様では、マイクロ流路は、約２０から約３００μｍまでの直径を有する。上述のように、流路は２つの領域を有する。第１の領域は、少なくとも２つの液流（たとえば、１つ以上の第１の液流および１つ以上の第２の液流）をデバイス内に受け入れて、流すための領域である。第１および第２の液流の内容物は、マイクロ流路の第２の領域で混合される。一態様では、流路（たとえば、マイクロ流路）の第２の領域は、浅浮き彫り構造を含む。一態様では、第２の領域は、マイクロミキサーを含む。一態様では、参照によりその全体がここに明示的に組み込まれている、米国特許出願公開第２００４／０２６２２２３号に記載されるように、マイクロ流路の第２の領域は、流れの主方向と、内部に画成された少なくとも１つの溝または突起を有する１つ以上の表面とを有し、溝または突起は、主方向とある角度を形成する配向を有する（たとえば、スタガードヘリンボーンミキサー（staggered herringbone mixer））。一態様では、マイクロ流路の第２の領域は、浅浮き彫り構造を有する。最大混合速度を達成するためには、混合領域の前に過度の流体抵抗を避けることが有利である。よって、本発明の一態様は、１０００ミクロンより大きい寸法を有する非マイクロ流体流路を使用して、流体を単一の混合流路に送達するデバイスである。
【００５２】
一態様では、マイクロ流体デバイスは、微細加工された原型をエラストマー中にレプリカ成形するソフトリソグラフィによって製作した。デバイスは２つの入口、すなわち、上で調製した溶液それぞれのためのものと、１つの出口とを有する。デバイスは、高さおよそ４０μｍおよび厚さ７５μｍの特徴物によって形成されるヘリンボーン状構造を流路の天井部に有する、幅３００μｍおよび高さおよそ１３０μｍの混合流路を特徴とする。このデバイスを、デバイスの入口および出口ポートに合うように穿孔された３つの１．５ｍｍの孔を有する４０×３６×２ｍｍのスライドガラスに、酸素プラズマ処理を使用して封止した。
【００５３】
第２の態様では、マイクロ流体デバイスは、硬い熱可塑性物質、たとえば、環状オレフィンコポリマーから製作する。雌型（negative tool）はＣＮＣ加工機を使用して機械加工し、デバイスは射出成形を使用して形成した。流路の寸法は、垂直面に１°〜５°の範囲内の抜き勾配を追加して保持した。種々の技法、たとえば、これらに限定されないが、貼り合わせ、溶剤接着、加熱圧着およびそれらの組み合わせを使用して、成形品をブランク基板に封止した。接着したデバイスをアニールして製作プロセスから残留応力を除去した。形成後に、デバイスを、エラストマーデバイスと同様に特注の装置に装着し、使用した。
【００５４】
他の態様では、第１および第２の液流は、他のマイクロミキサーで混合される。適切なマイクロミキサーとして、液滴型ミキサー（droplet mixer）、Ｔ字管型ミキサー、ジグザグ型ミキサー（zigzag mixer）、多層流型ミキサー（multilaminate mixer）、または他の能動型ミキサーが挙げられる。
【００５５】
第１および第２の液流を混合することは、第１および第２の液流の濃度および相対流量を変動させるための手段でも遂行することができる。
【００５６】
ある種の態様では、デバイスは、第１および第２の液流の流量を変動させるための手段をさらに含む。
【００５７】
ある種の態様では、デバイスは、第１の領域内で１つ以上の第１の液流を１つ以上の第２の液流から物理的に分離するのに有効なバリアをさらに含む。
【００５８】
最大混合速度を達成するためには、混合領域の前に過度の流体抵抗を避けることが有利である。よって、一態様では、デバイスは、流体を単一の混合流路に送達するために使用される非マイクロ流体流路（たとえば、１０００ミクロンより大きい寸法を有する流路）を含む。このデバイスは、治療物質を含有するポリマーナノ粒子またはポリマーコンジュゲートナノ粒子を製作するために使用されてもよく、このデバイスは、
（ａ）治療物質を含む第１の溶媒（または第１の溶媒）を含む第１の液流とポリマー（またはポリマーコンジュゲート）を含む第２の溶媒を含む第２の液流の両方を受け入れるための単一の入口マイクロ流路；
（ｂ）第１および第２の液流の内容物を混合して、治療物質を含むポリマーナノ粒子（またはポリマーコンジュゲートナノ粒子）を含む第３の液流をもたらすように構成された第２の領域
を含む。
【００５９】
かかる態様では、第１および第２の液流は、単一の入口によって、または微小寸法を有していない１つもしくは２つの流路によって、たとえば、１０００μｍより大きい（たとえば、１５００または２０００μｍ以上の）寸法を有する１つまたは複数の流路によって、マイクロ流路内に導入される。これらの流路は、隣接したまたは同心のマクロサイズの流路を使用して入口マイクロ流路内に導入されてもよい。
【００６０】
治療物質
ここで使用される場合、用語「治療物質」は、薬理活性を備えていることが意図されている物質、あるいはさもなければ、疾患の診断、治癒、緩和、治療、もしくは予防に直接的な効果を有するまたは生理機能の回復、是正、もしくは変更に直接的な効果を有することが意図される物質として定義される。
【００６１】
治療物質として、小分子薬物、核酸、タンパク質、ペプチド、多糖、無機イオンおよび放射性核種が挙げられるが、これらに限定されない。小分子薬物は、約７５０ｇ／モル未満、約５００ｇ／モル未満、または約３５０ｇ／モル未満の分子量を有する治療剤である。
【００６２】
適切な治療物質として、治療剤、たとえば、化学療法剤（たとえば、タキサン）が挙げられる。代表的な化学療法剤として、パクリタキセル（ＰＴＸ）、ドセタキセル（ＤＴＸ）、カバジタキセル（ＣＢＺ）、ラロタキセル（ＬＴＸ）、カンプトテシン（ＣＭＴ）、およびドキソルビシン（ＤＯＸ）が挙げられる。
【００６３】
ポリマー
ここで使用される場合、用語「ポリマー」は、１つ以上のモノマーの重合から誘導される、繰返し単位を含む化合物を指す。単一のモノマーから調製されるポリマーは、ホモポリマーである。２種以上のモノマーから調製されるポリマーは、コポリマーである。ブロックコポリマーは、２つ以上のブロックを含むコポリマーであり、この場合、各ブロックはホモポリマーまたはコポリマーである。かかるポリマーには、多数の天然、合成、および半合成ポリマーのいずれかが含まれる。
【００６４】
天然ポリマー。  用語「天然ポリマー」は、天然に由来する幾つものポリマー種を指す。かかるポリマーとして、多糖、たとえば、セルロース、キチン、およびアルギネートが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
合成ポリマー。  用語「合成ポリマー」は、天然に見出せない幾つもの合成ポリマー種を指す。かかる合成ポリマーとして、合成ホモポリマーおよび合成コポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。合成ホモポリマーとして、ポリエチレングリコール、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリリジン、およびポリエチレンイミンが挙げられるが、これらに限定されない。「合成コポリマー」は、２種以上の合成ホモポリマーサブユニットから作られた幾つもの合成ポリマー種を指す。かかる合成コポリマーとして、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（ラクチド）−ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）−ポリ（エチレングリコール）、およびポリ（ε−カプロラクトン）−ポリ（エチレングリコール）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
半合成ポリマー。  用語「半合成ポリマー」は、天然ポリマーの化学または酵素処理によって誘導される幾つものポリマーを指す。かかるポリマーとして、カルボキシメチルセルロース、アセチル化カルボキシメチルセルロース、シクロデキストリン、キトサン、およびゼラチンが挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、ポリマーはカルボキシメチルセルロースである。別の態様では、ポリマーはアセチル化カルボキシメチルセルロースである。
【００６７】
ポリマーコンジュゲート。  ここで使用される場合、用語「ポリマーコンジュゲート」は、１種以上の分子種（たとえば、治療剤）が共有結合的または非共有結合的に連結されたポリマー（すなわち、分子種はポリマーにコンジュゲートしている）を指す。かかるポリマーコンジュゲートとして、ポリマー薬物コンジュゲート（ここでは、ポリマー−治療物質コンジュゲートとも呼ばれる）が挙げられるが、これらに限定されない。「ポリマー−治療物質コンジュゲート」または「ポリマー薬物コンジュゲート」は、コンジュゲートしている分子種の１種以上が治療物質または薬物であるポリマーコンジュゲートを指す。代表的な薬物として、治療剤、たとえば化学療法剤（たとえば、パクリタキセル（ＰＴＸ）、ドセタキセル（ＤＴＸ）、カバジタキセル（ＣＢＺ）、ラロタキセル（ＬＴＸ）、カンプトテシン（ＣＭＴ）、およびドキソルビシン（ＤＯＸ））が挙げられる。適切なポリマー薬物コンジュゲートとして、セルロース系薬物コンジュゲートが挙げられるが、これらに限定されない。代表的なセルロース系薬物コンジュゲートは、少なくとも１つのポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）および少なくとも１つの薬物（たとえば、疎水性の薬物）と共有結合したアセチル化カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ−Ａｃ）である。適切なセルロース系薬物コンジュゲートは、米国特許第８，５９１，８７７号およびＷＯ２０１４／０１５４２２に記載されており、それぞれ参照によりその全体がここに明示的に組み込まれている。これらのセルロース系薬物コンジュゲートは、「Ｃｅｌｌａｘ」コンジュゲートと呼ばれる。本発明の方法に有用な、代表的なアセチル化カルボキシメチルセルロース−ポリエチレングリコール−薬物コンジュゲートとして、Ｃｅｌｌａｘ−ＰＴＸ、Ｃｅｌｌａｘ−ＤＴＸ、Ｃｅｌｌａｘ−ＣＢＺ、Ｃｅｌｌａｘ−ＬＴＸ、Ｃｅｌｌａｘ−ＣＭＴ、およびＣｅｌｌａｘ−ＤＯＸが挙げられる。
【００６８】
以下は、ポリマーコンジュゲートナノ粒子系を作製するための代表的な方法およびデバイスの説明である。
【００６９】
急速に混合すると、単分散のポリマーコンジュゲートナノ粒子が生成する。カオス的移流を誘導し、制御された混合環境をもたらすように設計されたマイクロ流体ミキサー（図１）内で、ポリマーコンジュゲート−アセトニトリル溶液を水性緩衝液と急速に混合することによって、ポリマーコンジュゲートナノ粒子の製剤を行った。流体流路はヘリンボーンを含有し、ヘリンボーンは、その構造の配向を半周期ごとに変えて局所的な回転流および伸長流の中心を周期的に変化させることによって、カオス流を生じる。
【００７０】
以下の代表的な例は、ポリエチレングリコールおよびドセタキセルにコンジュゲートしたアセチル化カルボキシメチルセルロースポリマーを含むポリマーコンジュゲートを利用するものであり、ここで、アセチル化カルボキシメチルセルロースのアセチル基とアセチル化カルボキシメチルセルロースのカルボン酸基／ポリエチレングリコール／ドセタキセルとのモル比は２．１８：０．８２である。このポリマーコンジュゲートは、この例では「Ｃｅｌｌａｘ」と呼ばれる。
【００７１】
Ｃｅｌｌａｘをアセトニトリル中で可溶化し、マイクロ流体混合デバイスを使用して、脱イオン水中０．９％ｗ：ｗ塩化ナトリウムを含有する（０．９％ＮａＣｌ）水性緩衝液と混合した。形成したＣｅｌｌａｘナノ粒子を、形成後直ちに０．９％ＮａＣｌに入れて１：１に希釈し、エタノール含有率をおよそ１２．５体積％に低減させた。
【００７２】
図２Ａおよび２Ｂならびに図３Ａおよび３Ｂに示す結果から、スタガードヘリンボーンミキサーを含有するマイクロ流体デバイスは、ポリマー薬物コンジュゲートを使用した単分散ナノ粒子を生じるために使用することができることが明示される。得られたナノ粒子は、ポリマーの濃度、全流量、流量比、およびマイクロ流体後希釈を含めたプロセス条件に極めて影響されやすい。
【００７３】
本発明の流体デバイスおよび方法を使用すれば、Ｃｅｌｌａｘを使用して１００ｎｍ以下の粒径のＣｅｌｌａｘナノ粒子を形成することができる。Ｃｅｌｌａｘナノ粒子の形成に関して、混合の速度および比率は重要なパラメータである。アセトニトリル−ポリマーコンジュゲート溶液を水性緩衝液と急速に混合すると、媒体の極性が増大するので溶解したポリマーコンジュゲートの溶解性が低減し、それによってポリマーコンジュゲートが溶液から析出してナノ粒子を形成する。急速に混合すると、溶液は、混合容積全体にわたってすぐにポリマーコンジュゲートが高度に過飽和した状態となり、ナノ粒子の急速かつ均質な核生成がもたらされる。ナノ粒子の核生成および成長が増大すると、遊離ポリマーコンジュゲートの周囲の液体が枯渇するので、遊離ポリマーの凝集によるその後の成長が制限される。
【００７４】
ここに述べる本発明のポリマーナノ粒子および該ナノ粒子を作製するための方法は、列挙した構成要素および工程を含む（include）（すなわち、含む（comprise））。ある種の態様では、本発明のポリマーナノ粒子および方法は、列挙した構成要素と、粒子および方法の特性に影響を及ぼさない他の追加的構成要素とを含む（すなわち、ポリマーナノ粒子および方法は、列挙した構成要素から本質的になる）。ポリマーナノ粒子および方法の特性に影響を及ぼす追加的構成要素には、たとえば、粒子の治療プロファイルおよび効力を不利に変えるまたは影響を及ぼす追加的材料または工程、列挙した治療用構成要素を可溶化する該粒子の能力を不利に変えるまたは影響を及ぼす追加的構成要素または工程、ならびに列挙した治療用構成要素の細胞取り込みまたは生物学的利用能を増大させる該粒子の能力を不利に変えるまたは影響を及ぼす追加的構成要素または工程、のような構成要素が含まれる。他の態様では、本発明のポリマーナノ粒子および方法は、列挙した構成要素または工程のみを含む（すなわち、列挙した構成要素または工程のみからなる）。
【００７５】
以下の例は、例示を目的として提供するものであり、特許請求される発明を限定するものではない。
【００７６】
［実施例］
例１
ポリマーコンジュゲートナノ粒子の調製：渦流混合法
この例では、渦流（大容量）混合法を使用するポリマーコンジュゲートナノ粒子の調製について説明する。
【００７７】
Ｃｅｌｌａｘポリマーコンジュゲートナノ粒子を、Ｅｒｎｓｔｉｎｇら、「Ａ  ｄｏｃｅｔａｘｅｌ−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｏｕｔｐｅｒｆｏｒｍｓ  ｔｈｅ  ａｐｐｒｏｖｅｄ  ｔａｘａｎｅ  ｎａｎｏｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ａｂｒａｘａｎｅ，ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌｓ  ｗｉｔｈ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、第１６２巻、第３号、２０１２年９月２８日、５７５〜５８１頁に記載される方法に従って調製した。１０ｍｇのＣｅｌｌａｘポリマーコンジュゲート（ポリエチレングリコールおよびドセタキセルにコンジュゲートしたアセチル化カルボキシメチルセルロースポリマー、このときのアセチル化カルボキシメチルセルロースのアセチル基とアセチル化カルボキシメチルセルロースのカルボン酸基／ポリエチレングリコール／ドセタキセルとのモル比は２．１８：０．８２）をアセトニトリル（ＭｅＣＮ、１ｍＬ）に溶解してポリマーコンジュゲートの最終濃度を１０ｍｇ／ｍＬとし、渦流撹拌している０．９％生理食塩水中にピペットで入れた。得られた粒子溶液を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  １０，０００ＭＷＣＯカートリッジ中で０．２２−μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＰＶＤＦフィルターを通して、０．９％生理食塩水に対して一晩透析し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２０ユニット（ＭＷＣＯ  １０，０００）を使用して濃縮した。粒径およびゼータ電位をＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｎａｎｏ−ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、マルバーン、英国）で測定した。
【００７８】
例２
ポリマーコンジュゲートナノ粒子の調製：マイクロ流体ミキサー法
この例では、本発明の方法を使用する、代表的なポリマーコンジュゲートを用いたポリマーコンジュゲートナノ粒子の調製を説明する。
【００７９】
ポリマーコンジュゲートの濃度が０．５ｍｇ／ｍＬから８．７５ｍｇ／ｍＬである溶液を調製した。ポリエチレングリコールおよびドセタキセルに結合したアセチル化カルボキシメチルセルロースポリマーを含有するポリマーコンジュゲート溶液を、２〜３５ｍｇ／ｍＬの濃度でアセトニトリルに溶解した。このときのアセチル化カルボキシメチルセルロースのアセチル基：アセチル化カルボキシメチルセルロースのカルボン酸基／ポリエチレングリコール／ドセタキセルのモル比は２．１８：０．８２である。図１は、この例で使用するマイクロ流体器具の略図である。このデバイスは、２つの入口、すなわち、上で調製した溶液のためのものと、水性緩衝液のためのものと、１つの出口とを有する。マイクロ流体デバイスは、微細加工された原型をエラストマー中にレプリカ成形するソフトリソグラフィによって製作した。デバイスは、高さおよそ４０μｍおよび厚さ７５μｍの特徴物によって形成されるヘリンボーン状構造を流路の天井部に有する、幅３００μｍおよび高さおよそ１３０μｍの混合流路を特徴とする。このデバイスを、デバイスの入口および出口ポートに合うように穿孔された３つの１．５ｍｍの孔を有する４０×３６×２ｍｍのスライドガラスに、酸素プラズマ処理を使用して封止した。デバイスを装置に封止するためのＯリング付きトッププレートと、シリンジ中の試薬を装入するためのルアーフィッティング（luer fitting）付きバックプレートとを有する特注の装置内に、接着したデバイスを装着した。デバイスおよび試薬が装入した後、装置は、流体を所定の速度でデバイスに分注するシリンジポンプとして作用した。各液流の流量は、３ｍＬ／分から１５ｍＬ／分まで変動させた。装置は２種の溶液をマイクロ流体デバイス内に導入し、そこで２種の溶液がＹ接合部で接触する。この時点で、拡散による層流下でわずかな混合が起きるが、２種の溶液は、ヘリンボーン状構造に沿って蛇行する流路を回りながら通過するときに混合状態となる。
【００８０】
混合は、これらの構造内でカオス的移流によって起こり、それによって層流（laminate stream）特有の分離が徐々に少なくなるので、急速な拡散が促進される。この混合はミリ秒の時間スケールで起こり、混合によってポリマーコンジュゲートは次第により水性の環境に移されるので、その溶解性が低減して、ナノ粒子が自ずと形成される。ポリマーナノ粒子は、全流量１２〜１８ｍＬ／分および水溶液：溶媒の流量比３：１〜５：１で形成された。マイクロ流体デバイス内での混合に続き、ポリマーコンジュゲートナノ粒子を、１倍容量の緩衝液を含有するポリスチレン製バイアル内にピペットで急速に入れることによって希釈することが一般的であった。最後に、残留するアセトニトリルを０．９％ＮａＣｌに対する透析を通して除去した。
【００８１】
粒径および多分散性を、Ｍａｌｖｅｒｎ製Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｎａｎｏ−ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、マルバーン、英国）を使用する動的光散乱法によって決定した。数加重および強度加重分布データを使用した。
【００８２】
例示的態様を示し、説明してきたが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、そこに種々の変更を行うことができることが理解されよう。
【００８３】
排他的所有権または特権を主張する本発明の態様を以下に規定する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【国際調査報告】
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