(57)【要約】  本発明は、ＨＩＶ又は他のレトロウイルスにおいて見出されたｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ（Ｖｉｆ）の自己会合を撹乱する抗ＨＩＶ剤としての小分子の使用に関する。本発明は、Ｖｉｆの自己会合を阻害する薬剤を同定する方法、及びＨＩＶ感染を治療又は予防する方法を含むこれらの薬剤を使用する方法にも関する。
2016504268.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
図９、図１５、図１６、図１７、図１８、又は図１９に記載されている化合物、前記化合物の機能的誘導体、又は薬学的に許容可能なその塩の治療的有効量を、治療又は予防を必要とする患者に投与する工程を含む、患者におけるＨＩＶ感染又はＡＩＤＳの治療又は予防方法。
【請求項２】
図９、図１５、図１６、図１７、図１８、又は図１９に記載されている化合物、前記化合物の機能的誘導体、又は薬学的に許容可能なその塩の抗ウイルス作用に有効な量を、細胞に接触させる工程を含む、細胞におけるレンチウイルスの感染性阻害方法。
【請求項３】
図９、図１５、図１６、図１７、図１８、又は図１９に記載されている化合物、前記化合物の機能的誘導体、又は薬学的に許容可能なその塩の抗ウイルス作用に有効な量を、細胞に接触させる工程を含む、細胞におけるＶｉｆの自己会合の阻害方法。
【請求項４】
Ｖｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定する工程と；
前記薬剤の治療的有効量を治療又は予防を必要とする患者に投与する工程と；
を含む、患者におけるＨＩＶ感染又はＡＩＤＳ治療又は予防方法であって、
前記のＶｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定する工程が、
第二Ｖｉｆタンパク質又は断片に結合される第一Ｖｉｆタンパク質又は断片を含むＶｉｆ：Ｖｉｆ複合体を提供する工程と；
Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体が撹乱したときに検出可能なシグナルを発生させるのに有効な条件下で、Ｖｉｆ複合体を試験薬剤に接触させる工程と；
検出可能な前記シグナルを検出して前記試験薬剤が前記Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体を撹乱するかどうかを決定する工程と；
を含み、ここで、前記試験薬剤による前記Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体の撹乱が、Ｖｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定するものとする、前記方法。
【請求項５】
Ｖｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定する工程と；
前記薬剤の抗ウイルス作用に有効な量を、Ｖｉｆの多量体化を撹乱する又は阻害するのに有効な条件下で細胞に接触させそれによって前記レンチウイルスの感染性を阻害する工程と；
を含む、レンチウイルスの感染性阻害方法であって、前記のＶｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定する工程は、
第二Ｖｉｆタンパク質又は断片に結合される第一Ｖｉｆタンパク質又は断片を含むＶｉｆ：Ｖｉｆ複合体を提供する工程と；
Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体が撹乱したときに検出可能なシグナルを発生させるのに有効な条件下で、Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体を試験薬剤に接触させる工程と；
検出可能な前記シグナルを検出して前記試験薬剤が前記Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体を撹乱するかどうかを決定する工程と；
を含み、ここで、前記試験薬剤による前記Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体の撹乱が、Ｖｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定するものとする、前記方法。
【請求項６】
Ｖｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定する工程と；
前記薬剤の抑制的有効量を細胞におけるＶｉｆの多量体化を撹乱する又は阻害するのに有効な条件下で細胞に接触させ、それによって細胞におけるＶｉｆ自己会合を阻害する工程と；
を含む、細胞におけるＶｉｆ自己会合の阻害方法であって、
前記のＶｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定する工程は、
第二Ｖｉｆタンパク質又は断片に結合される第一Ｖｉｆタンパク質又は断片を含むＶｉｆ：Ｖｉｆ複合体を提供する工程と；
Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体をＶｉｆ：Ｖｉｆ複合体が撹乱したときに検出可能なシグナルを発生させるのに有効な条件下で試験薬剤に接触させる工程と；
検出可能な前記シグナルを検出して前記試験薬剤が前記Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体を撹乱するかどうかを決定する工程と；
を含み、ここで、前記試験薬剤による前記Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体の撹乱が、Ｖｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定するものとする、前記方法。
【請求項７】
前記化合物又は前記薬剤が、医薬的に許容可能な担体を用いて投与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＨＩＶ逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシドＨＩＶ逆転写酵素阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、ＨＩＶ融合阻害剤、ＨＩＶ付着阻害剤、ＣＣＲ５阻害剤、ＣＸＣＲ４阻害剤、ＨＩＶ出芽又は成熟阻害剤、及びＨＩＶインテグラーゼ阻害剤からなる群から選択される、ＨＩＶ治療のための他の薬剤の少なくとも１種の治療的有効量を投与する工程をさらに含む、請求項１又は４に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物又は前記薬剤が、細胞におけるＶｉｆ多量体化を撹乱する又は阻害するのに有効であり、それによって、レンチウイルスの感染性を阻害する、請求項２又は５に記載の方法。
【請求項１０】
前記レンチウイルスが、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２からなる群から選択される、請求項２又は５に記載の方法。
【請求項１１】
前記薬剤が、Ｖｉｆ二量体化ドメインでのＶｉｆ二量体の結合を直接的に又は間接的に阻害することにより二量体化の阻害に有効であり、前記Ｖｉｆ二量体化ドメインが、プロリン−プロリン−ロイシン−プロリン（ＰＰＬＰ）アミノ酸配列を含む、請求項２又は５に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物又は前記薬剤が、細胞におけるＶｉｆ多量体化を撹乱する又は阻害するのに有効であり、それによって、細胞におけるＶｉｆ自己会合を阻害する、請求項３又は６に記載の方法。
【請求項１３】
第二Ｖｉｆタンパク質又は断片に結合される第一Ｖｉｆタンパク質又は断片を含むＶｉｆ：Ｖｉｆ複合体を提供する工程と；
Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体が撹乱したときに検出可能なシグナルを発生させるのに有効な条件下で、Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体を試験薬剤に接触させる工程と；
検出可能な前記シグナルを検出して前記試験薬剤が前記Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体を撹乱するかどうかを決定する工程と；
を含み、ここで、前記試験薬剤による前記Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体の撹乱が、Ｖｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定するものとする、Ｖｉｆの自己会合を撹乱する薬剤の同定方法。
【請求項１４】
前記試験薬剤が、小分子、ペプチド、ポリペプチド、オリゴ糖、多糖、ポリヌクレオチド、脂質、リン脂質、脂肪酸、ステロイド、アミノ酸類似体などからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記試験薬剤が、小分子化合物ライブラリーからのものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記の接触させる工程が、Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体を試験薬剤の１種又は試験薬剤の１種以上と共にインキュベートする工程を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記の接触させる工程が、試験薬剤をＶｉｆ：Ｖｉｆ複合体に直接的又は間接的のいずれかで結合させる工程を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記の検出可能なシグナルが、蛍光法、顕微鏡法、分光光度法、コンピュータ支援視覚化など、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される検出技術を用いて検出される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記の検出可能なシグナルが、蛍光シグナル、リン光シグナル、発光シグナル、吸収性シグナル、発色シグナルからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記蛍光シグナルが、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、蛍光発光強度、及び蛍光寿命（ＦＬ）からなる群から選択される、その蛍光特性によって検出可能である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体が、第一Ｖｉｆタンパク質又は断片と結合した第一検出部分及び第二Ｖｉｆタンパク質又は断片と結合した第二検出部分を備える、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記第一検出部分及び第二検出部分が、距離依存方式で検出可能なシグナルを生成し、そしてＶｉｆ：Ｖｉｆ複合体の撹乱が、第一検出部分及び第二検出部分を検出可能なシグナルを生成するのに有効な距離に分離するのに十分である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第一検出部分及び第二検出部分が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を含み、ここで第一検出部分がＦＲＥＴドナーであり、第二検出部分がＦＲＥＴアクセプターである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ＦＲＥＴドナー及びＦＲＥＴアクセプターが、ＥＧＦＰ−ＲＥＡＣｈ２、ＧＦＰ−ＹＦＰ、ＥＧＦＰ−ＹＦＰ、ＥＧＦＰ−ＲＥＡＣｈ２、ＣＦＰ−ＹＦＰ、ＣＦＰ−ｄｓＲＥＤ、ＢＦＰ−ＧＦＰ、ＧＦＰ若しくはＹＦＰ−ｄｓＲＥＤ、Ｃｙ３−Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ４８８−Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ４８８−Ｃｙ３、ＦＩＴＣ−ローダミン（ＴＲＩＴＣ）、ＹＦＰ−ＴＲＩＴＣ、又はＣｙ３などからなる群から選択されるフルオロフォアの対を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体が、第一Ｖｉｆタンパク質又は断片をコードする第一のプラスミド及び第二Ｖｉｆタンパク質又は断片をコードする第二プラスミドで同時にトランスフェクトされた宿主細胞において提供される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２６】
第二プラスミドに対する第一プラスミドの比率が、Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体が撹乱された場合に検出可能なシグナルの生成を最適化することに有効である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記の最適化された第一プラスミドと第二プラスミドの比率が、約１：４であり、そして前記第一プラスミドは、シグナルドナー部分をさらに含みそして前記第二プラスミドは、シグナルクエンチャー部分をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記宿主細胞が、第一及び第二プラスミドで安定的に又は一時的に、同時にトランスフェクトされる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記宿主細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、細菌細胞、及び真菌細胞からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記宿主細胞が、第一及び第二プラスミドで安定的に同時にトランスフェクトされた細胞株を含む細胞培養物である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記方法が、Ｖｉｆ自己会合を撹乱する薬剤のためのハイスループットスクリーニングアッセイとして構成される、請求項１３に記載の方法。
【請求項３３】
前記ハイスループットスクリーニングアッセイが、約０．５〜約１．０の間のＺ’値を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
検出可能なシグナルを定量化する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項３５】
検出可能なシグナルを増幅する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項３６】
第一エピトープタグを第一Ｖｉｆタンパク質又は断片と結合させそして第二エピトープタグを第二Ｖｉｆタンパク質又は断片と結合させる工程、ここで前記第一及び第二エピトープタグは互いに異なるものとする、をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項３７】
前記第一及び第二エピトープタグが、ＡＵ１エピトープタグ、ＡＵ５エピトープタグ、β−ガラクトシダーゼエピトープタグ、Ｃ−Ｍｙｃエピトープタグ、ＥＣＳエピトープタグ、ＧＳＴエピトープタグ、ヒスチジンエピトープタグ、Ｖ５エピトープタグ、ＧＦＰエピトープタグ、ＨＡエピトープタグなどからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体を撹乱するとして同定された試験薬剤を、前記試験薬剤によるＶｉｆ自己会合の撹乱を確認するのに効果的な検証アッセイに供する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項３９】
Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体を撹乱するとして同定された試験薬剤を、毒性、透過性、及び／又は溶解性アッセイに供する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願に関する相互参照】
【０００１】
本出願は、米国仮出願第６１／７０９，４７１号（２０１２年１０月４日出願）及び米国仮出願第６１／８０７，４８０号（２０１３年４月２日出願）の優先権の利益を主張する。前記出願の開示は、その全体が、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
《連邦政府による資金提供を受けた研究》
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された契約番号Ｒ２１ＮＳ０６７６７１−２の下で、米国政府支援によりなされたものである。米国政府は、この発明において一定の権利を有する。
【０００３】
《発明の技術分野》
本発明は、ＨＩＶ及びその他のレトロウイルスにおいて見出されたｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ（Ｖｉｆ）の自己会合を撹乱する、抗ＨＩＶ剤としての小分子の使用に関する。本発明はまた、ＶＩＦの自己会合を撹乱する薬剤の同定方法並びに既存のＨＩＶ感染の治療及び根絶方法と新しいＨＩＶ感染の防止方法とを含む、これらの薬剤の同定方法にも関する。
【０００４】
《発明の背景》
ＨＩＶ−１は、エイズの原因物質であり、そして現在では、北米だけで約１９０万人が感染していると同時に、世界中では約３３００万人が感染している。最近の研究では、ＨＩＶ／ＡＩＤＳが、途上国において制御されていない世界的流行となっていることが示されている。世界中におけるＨＩＶの薬剤耐性株の急速な出現により、抗レトロウイルス療法の新しいクラスにつながる可能性がある新規な薬剤標的の同定のための革新的なアプローチに、重点が置かれている。
【０００５】
ウイルスは、遺伝子産物の主要な３クラス：（ｉ）構造タンパク質（Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ）；（ｉｉ）必須トランス作用性タンパク質（Ｔａｔ、Ｒｅｖ）；及び（ｉｉｉ）許容細胞における効率的なウイルス複製に必要とされていない「補助」タンパク質（Ｖｐｒ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｎｅｆ）をコードする１０−ｋｂの一本鎖ＲＮＡゲノムを含有している［（１）において報告されている］。Ｖｉｆの主な機能がＡＰＯＢＥＣ３Ｇ又はＡ３Ｇとして知られている細胞の抗ウイルスタンパク質の作用を克服することであるという発見のために、抗ウイルス標的としてのＶｉｆにおける関心の高まりがあった（２）。
【０００６】
《発明の概要》
本発明は、Ｖｉｆの自己会合を撹乱する薬剤を同定することで抗ＨＩＶ治療薬としての使用のための新規薬剤の同定に導くことができるという発見に、一部基づいている。
【０００７】
一観点において、本発明は、Ｖｉｆの自己会合の阻害剤又は撹乱物質（disruptors）として有効な小分子化合物を提供する。さらに、本発明は、これらの化合物の様々な使用に関する。特定の実施態様において、本発明は、図９、図１５、図１６、図１７、図１８、又は図１９に記載されている小分子をＶｉｆの自己会合の阻害剤又は撹乱物質として提供する。
【０００８】
一観点において、本発明は、患者におけるＨＩＶ感染又はＡＩＤＳの治療又は予防方法を提供する。この方法は、図９、図１５、図１６、図１７、図１８、又は図１９に記載されている化合物、前記化合物の機能的誘導体、又は薬学的に許容可能なその塩の治療的有効量を、前記の治療又は予防を必要とする患者に投与する工程を含む。
【０００９】
一観点において、本発明は、細胞におけるレンチウイルスの感染性（infectivity）阻害方法を提供する。この方法は、図９、図１５、図１６、図１７、図１８、又は図１９に記載されている化合物、前記化合物の機能的誘導体、又は薬学的に許容可能なその塩の抗ウイルス作用に有効な量を、細胞に接触させる工程を含む。
【００１０】
一観点において、本発明は、細胞におけるＶｉｆの自己会合の阻害方法を提供する。この方法は、図９、図１５、図１６、図１７、図１８、又は図１９に記載されている化合物、前記化合物の機能的誘導体、又は薬学的に許容可能なその塩の抗ウイルス作用に有効な量を、細胞に接触させる工程を含む。
【００１１】
別の観点において、本発明は、患者におけるＨＩＶ感染又はＡＩＤＳ治療又は予防方法を提供し、そしてこの方法は：Ｖｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定する工程と：前記薬剤の治療的有効量を前記の治療又は予防を必要とする患者に投与する工程とを含み、前記のＶｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定する工程は、第二Ｖｉｆタンパク質又は断片に結合される（associated with）第一Ｖｉｆタンパク質又は断片を含むＶｉｆ：Ｖｉｆ複合体を提供する工程と；Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体が撹乱したときに検出可能なシグナルを発生させるのに有効な条件下で、Ｖｉｆ複合体を試験薬剤に接触させる工程と；検出可能な前記シグナルを検出して、前記試験薬剤が前記Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体を撹乱するかどうかを決定する工程と、ここで、前記試験薬剤による前記Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体の撹乱が、Ｖｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定するものとする、を含む。
【００１２】
別の観点において、本発明は、レンチウイルスの感染性阻害方法を提供し、そしてこの方法は、Ｖｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定する工程と：前記薬剤の抗ウイルス作用に有効な量を、Ｖｉｆの多量体化（multimerization）を撹乱する又は阻害するのに有効な条件下で細胞に接触させそれによって前記レンチウイルスの感染性を阻害する工程とを含み、前記のＶｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定する工程は、第二Ｖｉｆタンパク質又は断片に結合される第一Ｖｉｆタンパク質又は断片を含むＶｉｆ：Ｖｉｆ複合体を提供する工程と；Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体が撹乱したときに検出可能なシグナルを発生させるのに有効な条件下でＶｉｆ：Ｖｉｆ複合体を試験薬剤に接触させる工程と；検出可能な前記シグナルを検出して前記試験薬剤が前記Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体を撹乱するかどうかを決定する工程と、ここで、前記試験薬剤による前記Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体の撹乱が、Ｖｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定するものとする、を含む。
【００１３】
別の観点において、本発明は、細胞におけるＶｉｆ自己会合の阻害方法を提供し、そしてこの方法は、Ｖｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定する工程と：前記薬剤の抑制的有効量（inhibitory-effective amount）を、細胞におけるＶｉｆの多量体化を撹乱する又は阻害するのに有効な条件下で細胞に接触させそれによって細胞におけるＶｉｆ自己会合を阻害する工程とを含み、前記のＶｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定する工程は、第二Ｖｉｆタンパク質又は断片に結合される第一Ｖｉｆタンパク質又は断片を含むＶｉｆ：Ｖｉｆ複合体を提供する工程と；Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体をＶｉｆ：Ｖｉｆ複合体が撹乱したときに検出可能なシグナルを発生させるのに有効な条件下で試験薬剤に接触させる工程と；検出可能な前記シグナルを検出して前記試験薬剤が前記Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体を撹乱するかどうかを決定する工程と、ここで、前記試験薬剤による前記Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体の撹乱が、Ｖｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定するものとする、を含む。
【００１４】
本発明はまた、Ｖｉｆ多量体化拮抗物質活性を有する小分子及びその他の薬剤のためのハイスループット一次スクリーニングを提供する。一つの実施態様では、このＨＴＳ一次スクリーニングは、生細胞クエンチ蛍光共鳴エネルギー移動（live cell quenched fluorescence resonance energy transfer）（ＦＲＥＴ）アッセイに基づいている。
【００１５】
さらに特定の実施態様において、本発明は、Ｖｉｆ多量体化によって媒介されるＦＲＥＴを介した距離依存クエンチング（distance-dependent quenching）を達成するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＶｉｆの蛍光タンパク質キメラの発現に基づく均一系によるアッセイ（homogeneous assay）を提供する。Ｖｉｆ多量体化を撹乱する化合物は、増強された蛍光シグナルを生成する。一次スクリーニングからのヒットは、その後、直交二次スクリーニング（orthogonal secondary screen）に供されることができる（例えば、大腸菌内で）。前記二次スクリーニングからのヒットは、その後、それらの（１）感染性アッセイを通じた抗ウイルス活性；（２）示差的なエピトープでタグ付けされたＶｉｆの免疫共沈降（co-immunoprecipitation）の阻害能力；並びに（３）ＡＰＯＢＥＣ３ＧをＶｉｆ依存性分解（Vif-dependent degradation）から保護する能力について検証されることができる。
【００１６】
本発明のアッセイを用いて同定された化合物は、新規治療薬のための任務（mandate）に対処するための、そしてまたＶｉｆの構造及び機能の研究のための新たな研究試薬を提供するためのリード化合物として使用されることができる。
【００１７】
本発明はまた、本発明のアッセイを使用して同定した抗ＨＩＶ薬剤を用いて患者におけるＨＩＶ感染又はＡＩＤＳの治療又は予防方法を提供する。さらなる観点及び実施態様は、本明細書において以下により詳細に記載されている。
【００１８】
一観点において、本発明は、Ｖｉｆ多量体化を撹乱する小分子同定に効果的なアッセイの技術における欠点に対処し、したがって、抗ＨＩＶ活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
本発明を例示する目的のために、本発明の特定の実施態様の図面が示される。しかしながら、本発明は、図面に示された実施態様の正確な配置及び手段（precise arrangements and instrumentalities）に限定されるものではない。
【００２０】
特許又は出願ファイルは、カラーで作成された図面の少なくとも１つを含むことができる。カラー図面を伴う本特許又は特許出願公報のコピーは、もしあれば、必要な料金の要求及び支払いに応じて、米国特許商標庁によって提供される。
【００２１】
【図１】ＨＩＶ−１のＶｉｆポリペプチドの概略図。
【００２２】
【図２】Ｖｉｆ自己会合がインビボで標的化されることができることを実証するグラフ及びウェスタンブロット。
【００２３】
【図３】Ｖｉｆ自己会合を妨害する小分子を同定するのに使用するためのｑＦＲＥＴアッセイを示す概略図。
【００２４】
【図４Ａ−４Ｂ】本発明のアッセイ方法の一実施態様を用いて、Ｎ−及びＣ−末端にタグ付けしたＶｉｆコンストラクトの様々な結果を示す蛍光及びウェスタンブロット。
【００２５】
【図５】本発明のＦＲＥＴアッセイ用の９６ウェルフォーマットにおいてポジティブコントロールとして使用されたＯｙａ００１ペプチドの予備試験結果を示すグラフ。
【００２６】
【図６Ａ−６Ｃ】（Ａ）正規分布と比較して「ヒット」をスクリーニングするためにバックグラウンド補正されたＺスコア（Background Corrected Z-score）を表示したｑＨＴＳから得られた「ヒット」の概要；（Ｂ）スクリーニング用のＺ’値（Z’-factor）に従った、クエンチの及びポジティブコントロールウェルの平均値、標準偏差、及びＣＶの概要；並びに（Ｃ）オリンパスＩＸ−８０蛍光顕微鏡によって撮像された画面におけるポジティブ及びクエンチ条件の強度プロファイル。
【００２７】
【図７Ａ−７Ｂ】様々な濃度におけるＳＭＶＤＡのＨＩＶ感染性のルシフェラーゼ読み出し（luciferase read out）を示すグラフ及びスクリーニングの結果。
【００２８】
【図８Ａ−８Ｂ】Ｖ５タグＡ３Ｇ及びウイルスカプシドタンパク質であるｐ２４でプローブされた単離されたウイルス粒子のスクリーニング及びウェスタンブロットの結果。コントロール測定に対するＡ３Ｇの倍率に沿ったＡ３Ｇ：ｐ２４の比率測定が以下の各々のレーンに示され、コントロールと比較したＳＭＶＤＡ存在下のビリオン（virions）におけるパッケージされたＡ３Ｇの相対的な量を定量する。
【００２９】
【図９】Ｖｉｆ ＦｑＲＥＴアッセイによる二回目の一次スクリーニング（second primary screen）を介して同定された、Ｖｉｆ自己会合を撹乱するものとして同定された小分子化合物の４２種類の表。前記小分子化合物は、それらの分子構造の形態で及びそれらのＳＭＩＬＥＳ記法（simplified molecular-input line-entry system）の形態で示されている。
【００３０】
【図１０Ａ−１０Ｂ】Ｖｉｆ依存性Ａ３Ｇ−ｍＣｈｅｒｒｙ分解アッセイの（Ａ）一次スクリーニング；及び（Ｂ）二次スクリーニング。
【００３１】
【図１１】Ｖｉｆ依存性Ａ３Ｇ−ｍＣｈｅｒｒｙ分解アッセイのデータ。
【００３２】
【図１２】ヒットした化合物の個々のグラフ。
【００３３】
【図１３】シングルサイクルの感染性（Single Cycle Infectivity）。
【００３４】
【図１４】シングルサイクルの感染性（否定的な結果のフラギング（Flagging Negative Results））。
【００３５】
【図１５】シングルサイクルの感染性データ。
【００３６】
【図１６】リード化合物のスクリーニング概要。
【００３７】
【図１７】リード化合物の感染性概要。
【００３８】
【図１８】ウイルス粒子においてＡ３Ｇを増加させる化合物。
【００３９】
【図１９】リード化合物の毒性の概要。
【発明の詳細な説明】
【００４０】
本発明は、ＨＩＶのｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ（Ｖｉｆ）の自己会合の撹乱が、抗ＨＩＶ剤として使用することができる薬剤の同定における使用のための機能とすることができるという発見に、一部基づいている。
【００４１】
Ｖｉｆは、広範な抗ウイルス宿主防御因子（antiviral host-defense factor）であるＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（本明細書において「Ａ３Ｇ」とも称される）に結合しそして破壊を誘導する。したがって、ＨＩＶ感染にはＶｉｆが必須である。Ｖｉｆサブユニットは相互作用して多量体を形成し、そしてこの特性は、ＨＩＶ感染性のために必要であることが示されている。サブユニットの相互作用を媒介するＶｉｆのセグメントが、プロリン−プロリン−ロイシン−プロリン（ＰＰＬＰ）であると以前に決定されている。しかしながら、今日まで、Ｖｉｆの自己会合を撹乱する薬剤同定のための効果的なハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイは行われていなかった。本発明は、この必要性に対処するために効果的である。
【００４２】
《Ｖｉｆ自己会合の阻害剤》
本発明は、本発明のスクリーニングアッセイを用いて同定した小分子化合物を提供する。前記小分子化合物は、Ｖｉｆ自己会合の阻害剤として有効である。
【００４３】
特定の実施態様では、本発明の化合物は、図９、図１５、図１６、図１７、図１８、又は図１９に記載の化合物、図９、図１５、図１６、図１７、図１８、又は図１９に記載の化合物の機能的誘導体、及び薬学的に許容可能なその塩を含む。
【００４４】
本発明の低分子化合物の機能的誘導体を考慮すると、当業者はＶｉｆ自己会合の阻害剤としてのそれらの機能を維持しながら、化合物の治療的特性を向上させることができ、様々な構造変化を容易に決定することができる。そのような決定に関しては、他に示されない限り、本明細書に提供される定義が適用される場合がある。本発明の目的のために、化学元素は、元素の周期表、ＣＡＳバージョン（CAS version）、化学及び物理学ハンドブック第７５編に従い同定される。さらに、有機化学の一般的原理は、“Organic Chemistry”, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999,及び“March’s Advanced Organic Chemistry”, 5th Ed., Ed.: Smith, M. B. and March, J., John Wiley & Sons, New York: 2001において記載されており、その全体が、参照として本明細書に組み込まれる。
【００４５】
本明細書で用いている「化合物」の記載は、明示的にさらに限定しない限りは、その化合物の塩、溶媒和物、及び包接体（inclusion complexes）を含むことを意味することを、当業者は理解するであろう。特に記載又は示さない限り、本明細書において記載された構造は、例えば、各々の不斉中心がＲＳの立体配置、（Ｚ）及び（Ｅ）二重結合異性体、（Ｚ）及び（Ｅ）構造異性体などの、全ての光学異性体（例えば、エナンチオマー、ジアステレオマー、及びシス−トランス異性体）を含むことを意味する。したがって、単一の立体異性体及び鏡像異性体、ジアステレオマー、並びに本発明の化合物のシス−トランス異性体（又は立体配置）混合物は、本発明の範囲内である。特に記載されない限り、本発明の化合物の全ての互変化合物は、本発明の化合物である。さらに、特に記載されない限り、本明細書に示される構造はまた、同位体濃縮原子の１つ又はそれ以上の存在においてのみ異なる化合物を含むことを意味する。例えば、重水素若しくはトリチウムによる水素の置換、又は１３Ｃ−若しくは１４Ｃ−濃縮炭素による炭素の置換を除いて本構造を有する化合物は、本発明の範囲内である。前記化合物は、例えば、生物学的アッセイにおける分析ツール又はプローブとして有用である。用語「溶媒和物」は、適切な溶媒の分子が結晶格子中に組み込まれた固体状態の式Ｉで表される化合物を意味する。治療的投与のための適切な溶媒は、投与用量で生理学的に許容可能である。治療的投与のために適切な溶媒の例は、エタノール及び水である。水が溶媒である場合、溶媒和物は水和物と呼ばれる。一般に、溶媒和物は、適当な溶媒中で化合物を溶解し、冷却又は逆溶媒（antisolvent）を用いて溶媒和物を分離することにより形成される。溶媒和物は、典型的には周囲条件下で乾燥又は共沸（azeotroped）される。包接体は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 19th Ed. (1995) volume 1, page 176-177において記載されており、この全体が、参照として本明細書に取り込まれる。最も一般的に用いられる包接体は、シクロデキストリンを有するものであり、天然及び合成の全てのシクロデキストリン錯体は、特許請求の範囲内に明確に包含される。
【００４６】
用語「薬学的に許容可能な塩」は、無機酸及び塩基並びに有機酸及び塩基を含む、薬学的に許容可能な非毒性の酸又は塩基から調製された塩を指す。本発明の化合物が塩基性である場合、塩は、無機酸及び有機酸を含む薬学的に許容可能な非毒性の酸から調製することができる。本発明の化合物に適した薬学的に許容可能な酸付加塩は、酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸（ベシレート）、安息香酸、ホウ酸、酪酸、ショウノウ酸、カンファースルホン酸、炭酸、クエン酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、エチレンジアミン四酢酸、ギ酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸、ヒドロキシナフトエ酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリルスルホン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、ナフチレンスルホン酸、硝酸、オレイン酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、ピバル酸、ポリガラクツロン、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、タンニン酸、酒石酸、テオクル酸、ｐ−トルエンスルホン酸などが挙げられる。化合物が酸性の側鎖を含む場合は、本発明の化合物に適した薬学的に許容可能な塩基付加塩は、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、及び亜鉛から製造される金属塩、又はリジン、アルギニン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）、及びプロカインから製造される有機塩を含むが、これらに限定されない。さらなる薬学的に許容可能な塩は、適切な場合、非毒性のアンモニウムカチオン及びカルボキシレート、スルホネート、及び炭素原子１〜２０個を有するアルキル基が結合したホスホネートアニオンをさらに含む。
【００４７】
本発明の化合物が、未加工の化学物質として投与されることは可能であるが、医薬組成物としてそれらを提供することが好ましい。更なる実施態様においては、本発明は、本発明の化合物、又はその薬学的に許容可能な塩、薬学的に許容可能な担体１種以上、及び場合によっては、他の治療成分１種以上を含む医薬組成物を提供する。担体は、製剤の他成分と適合し、その受容者にとって有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。
【００４８】
本明細書で使用される用語「生理学的に機能的な誘導体」は、哺乳動物に対する投与時に、本発明の化合物又はその活性な代謝産物を（直接的又は間接的に）提供することができる、本発明の化合物の薬学的に許容可能な任意の誘導体を意味する。前記誘導体は、例えば、エステル及びアミドは、過度の実験をすることなく、当業者には明らかであろう。Burger’s Medicinal Chemistry And Drug Discovery, 5th Edition, Vol 1: Principles and Practiceの教示を参照することができ、この文献は、その生理学的に機能的な誘導体を教示する範囲においては、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００４９】
本明細書において、用語「有効量」は、例えば、組織、系、動物、又はヒトの研究者又は臨床医によって求められている生物学的又は医学的応答を誘発する薬物又は医薬品の量を意味する。用語「治療的有効量」は、前記の量を受けていない被験者と比較して、改善された治療（treatment）、治癒（healing）、予防（prevention）、又は疾患の改善（amelioration）、障害（disorder）、若しくは副作用、又は疾患若しくは障害の進行速度の減少をもたらす任意の量を意味する。前記用語は、その範囲内に、正常な生理学的機能を増強するのに有効な量も含む。本発明の化合物、並びにその塩、溶媒和物、及び生理学的に機能的な誘導体の治療的有効量は、治療に使用するために、未加工の化学物質（raw chemical）として投与することができる。さらに、活性成分は、医薬組成物として提供することができる。
【００５０】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体中に溶解又は分散した追加の薬剤の１つ又はそれ以上の化合物の有効量を含む。語句「薬学的に又は（pharmaceutical）薬理学的に（pharmacologically）許容可能な」は、動物例えばヒトに必要に応じて投与した場合、副作用、アレルギー又は他の有害反応を生じない分子的実体及び組成物を指す。追加の活性成分の少なくとも１種の化合物を含んでいる薬学的組成物の調製は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990により例示されるように、当業者には公知であり、前記文献は参照により本明細書に組み込まれる。さらに、動物（例えば、ヒト）投与のためには、FDA Office of Biological Standardsにより要求される無菌性、発熱性、一般的安全性及び純度基準を満たすべきであることが理解されるであろう。
【００５１】
本明細書で使用される「薬学的に許容可能な担体」は、当業者に公知であるように（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329参照、この文献は参照により本明細書に組み込まれる）、任意及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、色素、前記のような材料、及びこれらの組み合わせを含む。任意の従来の担体が活性成分と不適合である場合を除いて、医薬組成物におけるその使用が企図される。
【００５２】
本明細書で用いられる用語「レンチウイルス」は、この属のウイルスの種々のメンバーのいずれでもあることができる。このレンチウイルスは、例えば、ヒトを含む哺乳動物例えば、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ又は霊長類に感染するレンチウイルスであることができる。典型的な前記のウイルスは、例えば、（羊に感染する）Ｖｉｚｎａウイルス；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、キメラヒト／サル免疫不全ウイルス（ＳＨＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含む。本明細書で使用する「ＨＩＶ」は、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の両方を指す。本明細書における考察の多くは、ＨＩＶ又はＨＩＶ−１に関するものだが、しかしながら、他の適切なレンチウイルスも含まれることが理解されるべきである。
【００５３】
本明細書で使用する用語「哺乳動物」は、任意の非ヒト哺乳動物を意味する。前記哺乳動物は、例えば、齧歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、及びブタである。好ましい非ヒト哺乳動物は、ラット及びマウスを含む齧歯類のファミリーから選択され、より好ましくはマウスである。好ましい哺乳動物はヒトである。
【００５４】
本明細書で使用する場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、交換可能に使用され、そしてペプチド結合によって共有結合的に結合したアミノ酸残基からなる化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、アミノ酸少なくとも２つを含んでいなければならないが、タンパク質又はペプチドの配列を含むことができるアミノ酸の最大数の制限は設けられていない（placed on）。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸２つ以上を含む任意のペプチド又はタンパク質を含む。この用語は、本明細書で使用する場合、当該技術分野において一般的にペプチド例えばオリゴペプチド及びオリゴマーとも呼ばれる単鎖と当該技術分野において一般的に多くの種類があるタンパク質と呼ばれるより長い鎖とを含む。「ポリペプチド」には、とりわけ、例えば、生物学的に活性のある断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、又はそれらの組合せを含む。
【００５５】
「薬学的に許容可能な」とは、ヒト又は獣医学的用途のいずれかに対して、生理学的に許容可能なことを意味する。また、「薬学的に許容可能な」は、生物学的に望ましくない材料、又はそうでなければすなわち望ましくない任意の生物学的現象を引き起こすことなく又はそれが含まれる医薬組成物のその他の成分のいずれかと有害な方法で相互作用することなく、被験者に投与することができる材料を意味する。本質的に、薬学的に許容可能な材料は、被験者に対して非毒性である。担体は、当業者に周知であるように、活性成分の任意の分解を必然的に最小限にし、被験者における任意の有害な副作用を最小にするように選択される。薬学的に許容可能な担体及び医薬組成物の他の成分の議論については、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, 1990を参照されたい。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「医薬組成物」は、ヒト及び獣医学的使用のための製剤を含む。
【００５７】
本明細書で使用する場合、用語「予防する（prevent）」、「予防すること（preventing）」、「予防（prevention）」、「予防的治療（prophylactic treatment）」などは、疾患又は状態を有していないが疾患又は状態に対して感受性であるリスクのある被験者において疾患又は状態が発症する確率を低減することを指す。
【００５８】
本明細書で使用される「試験薬剤」又はそうでなければ「試験化合物」は、本明細書に記載のアッセイの１つ又はそれ以上においてスクリーニングされる薬剤又は化合物を意味する。試験薬剤は、小有機分子、公知の医薬品、ポリペプチド；糖質例えばオリゴ糖及び多糖類;ポリヌクレオチド；脂質又はリン脂質；脂肪酸；ステロイド;又はアミノ酸類似体を含む、一般的なタイプの種々の化合物を含むが、これらに限定されない。試験薬剤は、ライブラリー例えば天然産物ライブラリー及び組み合わせライブラリー（combinatorial libraries）から得ることができる。また、自動化アッセイの方法は、数千の化合物の短期間でのスクリーニングを可能とすることが知られている。
【００５９】
本明細書で使用される用語「治療する（treat）」、「治療すること（treating）」、「治療（treatment）」などは、障害及び／又はそれに関連する症状を減少又は改善することを指す。疾患又は状態を治療することは、疾患、状態、又はそれに関連する症状を完全に排除することを要求しないが、これを除外するものではないことが理解されよう。
【００６０】
本明細書中で使用される「変異体」という用語は、参照の（reference）核酸配列又はペプチド配列とは配列がそれぞれ異なるが、参照分子の本質的な特性を保持する核酸配列又はペプチド配列を指す。核酸変異体の配列における変化は、参照核酸によりコードされるペプチドのアミノ酸配列を変化させないことができ、又はアミノ酸の置換、付加、欠失、融合（fusions）、及び切断（truncations）をもたらすこともできる。ペプチド変異体の配列の変化は典型的には制限され又は保存されており（conservative）、参照ペプチド及び変異体の配列は、全体的に極めて類似しており、多くの領域で同一である。変異体及び参照ペプチドは、置換、付加、欠失の１つ以上の任意の組み合わせにより、アミノ酸配列が異なることができる。核酸又はペプチドの変異体は、例えば対立遺伝子変異体として自然に生じることができ、又は天然に存在することが知られていない変異体であることができる。核酸及びペプチドの天然ではない変異体は、突然変異誘発法又は直接合成により作製することができる。
【００６１】
本明細書において使用される用語「ウイルス感染性」とは、細胞の感染、そのウイルスの複製、及びそれらの結果としてのビリオンの産生のいずれかを意味する。
【００６２】
「ビリオン」は、完全なウイルス粒子；核酸及びカプシドであり、いくつかのウイルスの場合には脂質エンベロープ（lipid envelope）をさらに含む。
【００６３】
《Ｖｉｆ自己会合阻害剤の使用方法》
本明細書に記載されるＶｉｆ自己会合阻害剤は、様々な用途において使用されることができる。
【００６４】
一観点において、本発明は、Ｖｉｆの自己会合の阻害剤又は撹乱物質（disruptors）として有効な小分子化合物を提供する。さらに、本発明は、これらの化合物の様々な使用に関する。特定の実施態様において、本発明は、Ｖｉｆの自己会合の阻害剤又は撹乱物質として図９、図１５、図１６、図１７、図１８、又は図１９に記載されている小分子を提供する。
【００６５】
一観点において、本発明は、患者におけるＨＩＶ感染の治療又は予防方法を提供する。この方法は、図９、図１５、図１６、図１７、図１８、又は図１９に記載されている化合物、前記化合物の機能的誘導体、又は薬学的に許容可能なその塩の治療的有効量を、前記の治療又は予防を必要とする患者に投与する工程を含む。
【００６６】
一観点において、本発明は、細胞においてレンチウイルスの感染性（infectivity）を阻害する方法を提供する。この方法は、図９、図１５、図１６、図１７、図１８、又は図１９に記載されている化合物、前記化合物の機能的誘導体、又は薬学的に許容可能なその塩の抗ウイルス作用に有効な量を、細胞に接触させる工程を含む。
【００６７】
一観点において、本発明は、細胞におけるＶｉｆの自己会合の阻害方法を提供する。この方法は、図９、図１５、図１６、図１７、図１８、又は図１９に記載されている化合物、前記化合物の機能的誘導体、又は薬学的に許容可能なその塩の抗ウイルス作用に有効な量を、細胞に接触させる工程を含む。
【００６８】
別の観点において、本発明は、患者におけるＨＩＶ感染又はＡＩＤＳ治療又は予防方法を提供し、そしてこの方法は：Ｖｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定する工程と：前記薬剤の治療的有効量を前記の治療又は予防を必要とする患者に投与する工程とを含み、前記のＶｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定する工程は、第二Ｖｉｆタンパク質又は断片に結合される第一Ｖｉｆタンパク質又は断片を含むＶｉｆ：Ｖｉｆ複合体を提供する工程と；Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体が撹乱したときに検出可能なシグナルを発生させるのに有効な条件下でＶｉｆ複合体を試験薬剤に接触させる工程と；検出可能な前記シグナルを検出して前記試験薬剤が前記Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体を撹乱するかどうかを決定する工程と、ここで、前記試験薬剤による前記Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体の撹乱が、Ｖｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定するものとする、を含む。
【００６９】
別の観点において、本発明は、レンチウイルスの感染性の阻害方法を提供し、そしてこの方法は、Ｖｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定する工程と：前記薬剤の抗ウイルス作用に有効な量を、Ｖｉｆの多量体化を撹乱する又は阻害するのに有効な条件下で細胞に接触させそれによって前記レンチウイルスの感染性を阻害する工程とを含み、前記のＶｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定する工程は、第二Ｖｉｆタンパク質又は断片に結合される第一Ｖｉｆタンパク質又は断片を含むＶｉｆ：Ｖｉｆ複合体を提供する工程と；Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体が撹乱したときに検出可能なシグナルを発生させるのに有効な条件下でＶｉｆ：Ｖｉｆ複合体を試験薬剤に接触させる工程と；検出可能な前記シグナルを検出して前記試験薬剤が前記Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体を撹乱するかどうかを決定する工程と、ここで、前記試験薬剤による前記Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体の撹乱が、Ｖｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定するものとする、を含む。
【００７０】
別の観点において、本発明は、細胞におけるＶｉｆ自己会合の阻害方法を提供し、そしてこの方法は、Ｖｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定する工程と：前記薬剤の抑制的有効量を、細胞におけるＶｉｆの多量体化を撹乱する又は阻害するのに有効な条件下で細胞に接触させそれによって細胞におけるＶｉｆ自己会合を阻害する工程とを含み、前記のＶｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定する工程は、第二Ｖｉｆタンパク質又は断片に結合される第一Ｖｉｆタンパク質又は断片を含むＶｉｆ：Ｖｉｆ複合体を提供する工程と；Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体が撹乱したときに検出可能なシグナルを発生させるのに有効な条件下でＶｉｆ：Ｖｉｆ複合体を試験薬剤に接触させる工程と；検出可能な前記シグナルを検出して前記試験薬剤が前記Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体を撹乱するかどうかを決定する工程と、ここで、前記試験薬剤による前記Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体の撹乱が、Ｖｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定するものとする、を含む。
【００７１】
一実施態様において、本明細書に記載のＶｉｆの自己会合阻害剤は、患者におけるＨＩＶ感染又はＡＩＤＳの治療又は予防方法において使用されることができる。この方法は、本明細書に記載の化合物の治療的有効量又は薬学的に許容可能なその塩を前記の治療又は予防を必要とする患者に投与する工程を含む。この方法は、さらに、ＨＩＶ逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシドＨＩＶ逆転写酵素阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、ＨＩＶ融合阻害剤、ＨＩＶ付着阻害剤、ＣＣＲ５阻害剤、ＣＸＣＲ４阻害剤、ＨＩＶ出芽又は成熟阻害剤、及びＨＩＶインテグラーゼ阻害剤からなる群から選択される、ＨＩＶ治療用の他の薬剤の少なくとも１種の治療的有効量を投与する工程を含むことができる。
【００７２】
一実施態様において、本明細書に記載のＶｉｆの自己会合阻害剤は、細胞中のレンチウイルスの感染性を阻害するための方法において使用されることができる。この方法は、本明細書に記載の化合物又は薬学的に許容可能なその塩の抗ウイルス有効量を細胞に接触させる工程を含む。
【００７３】
一実施態様において、本明細書に記載のＶｉｆの自己会合阻害剤は、細胞におけるＶｉｆの自己会合を阻害するための方法において使用されることができる。この方法は、本明細書に記載の化合物又は薬学的に許容可能なその塩の阻害的有効量を細胞に接触させる工程を含む。
【００７４】
本発明は、Ｖｉｆの自己会合阻害剤を使用する様々な方法を提供し、その第一工程は、本発明のスクリーニングアッセイを実施してＶｉｆの自己会合阻害剤であるような薬剤を同定する工程を含む。前記の方法が以下に記載される。
【００７５】
一実施態様において、本発明は、レンチウイルスの感染性の阻害方法を提供する。この方法は、本発明のスクリーニング方法を実施することにより、Ｖｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定する工程と前記薬剤の抗ウイルス作用に有効な量を、細胞におけるＶｉｆの多量体化（multimerization）を撹乱する又は阻害するのに有効な条件下で細胞に接触させそれによって前記レンチウイルスの感染性を阻害する工程とを含む。一実施態様においては、前記薬剤は、Ｖｉｆ二量体化ドメイン（Vif dimerization domain）でのＶｉｆ二量体の結合を直接的に又は間接的に阻害することにより二量体化の阻害に有効であり、前記Ｖｉｆ二量体化ドメインはプロリン−プロリン−ロイシン−プロリン（ＰＰＬＰ）アミノ酸配列を含む。
【００７６】
一実施態様において、本発明は、細胞におけるＶｉｆ自己会合の阻害方法を提供する。この方法は、本発明のスクリーニング方法を実施することにより、Ｖｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定する工程と、次いで前記薬剤の抗ウイルス作用に有効な量を、細胞におけるＶｉｆの多量体化を撹乱する又は阻害するのに有効な条件下で細胞に接触させそれによって細胞におけるＶｉｆ自己会合を阻害する工程とを含む。
【００７７】
一実施態様において、本発明は、患者におけるＨＩＶ感染又はＡＩＤＳの治療又は予防方法を提供する。この方法は、本発明のスクリーニング方法を行うことによりＶｉｆの自己会合を撹乱する薬剤を同定する工程と、次いで前記薬剤の治療有効量を前記の治療又は予防を必要とする患者に投与する工程とを含む。
【００７８】
一実施態様において、本発明は、ウイルス感染に関連する疾患、障害、又は状態を治療する方法を提供する。好ましくは、ウイルス感染症はＨＩＶである。この方法は、Ｖｉｆの自己会合を阻害する医薬組成物の治療的有効量を被験者例えば哺乳動物、好ましくはヒトに投与する工程を含む。
【００７９】
本発明は、本明細書の他の箇所で説明したスクリーニング方法を用いて同定される化合物を含む。前記化合物は、ＨＩＶ感染の又はそうでなければＶｉｆ：Ｖｉｆ複合体解離不能に関連付けられた他の障害の治療のための治療剤として使用することができる。
【００８０】
Ｖｉｆの自己会合阻害のための化合物の能力は、ウイルス感染、例えばＨＩＶ感染からの保護又はそうでなければ予防のための治療剤を提供することができる。
【００８１】
したがって、本発明は、医薬組成物を含む。有用である薬学的に許容可能な担体としては、グリセリン、水、生理食塩水、エタノール、並びに他の薬学的に許容可能な塩溶液例えばリン酸塩及び有機酸の塩が含まれるが、これらに限定されない。これらの及び他の薬学的に許容可能な担体の例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences (1991, Mack Publication Co., New Jersey)に記載されており、全体が本明細書に記載されているかのように、その開示は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００８２】
医薬組成物は、無菌の注射可能な水性又は油性懸濁液又は溶液の形態で、調製、包装、又は販売することができる。この懸濁液又は溶液は、公知技術に従って製剤化することができ、活性成分に加えて、本明細書に記載の追加成分例えば分散剤、湿潤剤、又は懸濁剤を含むことができる。前記の無菌の注射可能な製剤は、非毒性の腹腔に許容可能な希釈剤又は溶媒例えば水又は１，３−ブタンジオールを用いて調製することができる。他の許容可能な希釈剤及び溶媒には、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液、及び固定油例えば合成モノ又はジグリセリドが含まれるが、これらに限定されない。
【００８３】
本発明の方法において有用である医薬組成物は、経口、直腸、膣内、腹腔内、局所、肺、鼻内、頬、眼、又は別の投与経路に適した製剤の形態で、投与、調製、包装、及び／又は販売することができる。その他の予定される製剤は、投射されたナノ粒子（projected nanoparticles）、リポソーム製剤、活性成分を含有する再封入された赤血球、及び免疫学に基づく製剤を含む。
【００８４】
本発明の組成物は、経口、直腸、膣内、腹腔内、局所、肺、鼻腔内、口腔内、又は眼投与経路を含むがこれらに限定されない多数の経路を介して投与されることができる。投与経路は、当業者には容易に明らかとなり、そして治療されている疾患のタイプ及び重症度、治療されている動物又はヒトの患者の年齢及びタイプなどを含む、任意の数の要因に依存する。
【００８５】
本明細書で使用される、医薬組成物の「腹膜投与」は、組織中の割れ目（breach）を通った医薬組成物の投与及び被験者組織の物理的な割れ目によって特徴付けられる任意の投与経路を含む。腹膜投与は、したがって、組成物の注射により、外科的切開（surgical incision）を介して組成物を適用することにより、そして組織貫通非外科的創傷（tissue-penetrating non-surgical wound）を通して組成物を適用することなどにより、医薬組成物を投与することを含むが、これらに限定されない。特に、腹膜投与には、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内注射、及び腎臓透析注入技術が含まれることが意図されるが、これらに限定されない。
【００８６】
医薬組成物は、被験者への投与に適した形態で、単独の活性成分から成ることができ、又は医薬組成物は、活性成分と薬学的に許容可能な担体の１つ以上、任意成分の１つ以上、又はこれらのいくつかの組み合わせを含むことができる。当該技術分野で周知であるように、活性成分は、生理学的に許容可能なエステル又は塩の形態で、例えば、生理学的に許容可能なカチオン又はアニオンと組み合わせて、医薬組成物中に存在することができる。
【００８７】
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、公知の又は今後薬理学の分野で開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、前記の調製方法は、活性成分と担体又は他の副成分の１つ以上とを会合させる工程を含み、その後必要である又は望ましい場合、製品を、所望の単回又は複数回用量単位に成型又は包装する。
【００８８】
本明細書において提供される医薬組成物の記載は、主にヒトへの倫理的投与（ethical administration）に適する医薬組成物に関するが、そのような組成物は、あらゆる種類の動物への投与のために一般的に適していることが当業者によって理解されるであろう。
様々な動物への投与に適した組成物を提供する（render）ためのヒトへの投与に適した医薬組成物の改変は周知であり、そして当業者である獣医薬理学者は、前記の改変を、もしあれば単なる通常の実験を設計して実施することができる。本発明の医薬組成物の投与対象としては、ヒト及び他の霊長類、商業的に関連する哺乳動物例えばウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、及びイヌを含む哺乳動物が意図されているが、これらに限定されない。
【００８９】
本発明の医薬組成物の制御放出性又は徐放性製剤は、従来技術を用いて作製することができる。
【００９０】
腹腔内投与に適した医薬組成物の製剤は、薬学的に許容可能な担体例えば滅菌水又は滅菌等張生理食塩水と組み合わせた活性成分を含む。前記の製剤は、ボーラス投与又は連続投与に適した形態で、調製、包装、又は販売することができる。注射用製剤は、単位剤形において例えばアンプル又は防腐剤を含む複数回用量容器において、調製、包装、又は販売することができる。腹膜投与用の製剤としては、懸濁液、溶液、油性又は水性ビヒクルにおけるエマルジョン、ペースト、及び移植可能な徐放性又は生分解性製剤が含まれるが、これらに限定されない。前記の製剤は、懸濁剤、安定剤、又は分散剤を含むがこれらに限定されない追加の成分の１種以上をさらに含むことができる。腹腔内投与のための製剤の一実施態様において、活性成分は、再構成組成物の腹腔内投与の前に適切なビヒクル（例えば、滅菌ピロゲンフリー水）で再構成するための乾燥（すなわち、粉末又は顆粒）形態で提供される。
【００９１】
医薬組成物は、無菌の注射可能な水性又は油性懸濁液又は溶液の形態で、調製、包装、又は販売することができる。この懸濁液又は溶液は、公知技術に従って製剤化することができ、そして活性成分に加えて、追加成分例えば本明細書に記載の分散剤、湿潤剤、又は懸濁剤を含むことができる。前記の無菌の注射可能な製剤は、非毒性の腹腔に許容可能な希釈剤又は溶媒例えば水又は１，３−ブタンジオールなどを用いて調製することができる。他の許容可能な希釈剤及び溶媒には、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液、及び固定油例えば合成モノ又はジグリセリドが含まれるが、これらに限定されない。有用である他の非経口的に投与可能な製剤には、リポソーム製剤において、又は生分解性ポリマー系の成分として、微結晶形の活性成分を含むものが含まれる。徐放性の又は移植（implantation）用の組成物は、薬学的に許容可能なポリマー又は疎水性材料例えばエマルジョン、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、又は難溶性塩を含むことができる。
【００９２】
局所投与に適した製剤としては、液体又は半液体製剤、例えば、リニメント剤、ローション剤、油中水型又は水中油型エマルジョン例えばクリーム、軟膏又はペースト、及び溶液又は懸濁液を含むが、これらに限定されない。活性成分の濃度は溶媒中の活性成分の溶解限度と同様に高くてもよいが、局所投与のための製剤は、例えば、約１％〜約１０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含むことができる。局所投与のための製剤は、さらに、本明細書に記載の追加成分の１種以上を含むことができる。
【００９３】
典型的には、動物、好ましくはヒトに投与することができる本発明の化合物の投与量は、治療されている動物の種類及び疾患状態の種類、動物の年齢、並びに投与経路を含むがこれには限定されない任意の数の要因に依存して変化する。
【００９４】
化合物は、毎日数回の頻度で動物に投与することができ、又はさらに少ない頻度、例えば、１日１回、週１回、２週間に１回、月１回、又はさらに少ない頻度、例えば、数ヶ月毎、１年に１回以下の頻度で投与することができる。投与の頻度は、当業者には容易に明らかとなり、そして例えば治療されている疾患の重症度及び種類、動物の年齢などが含まれるがこれには限定されない要因の任意の数に依存する。好ましくは、化合物は、注射後少なくとも１日持続する効果を提供するボーラス注射として投与されるが、投与されなくともよい。ボーラス注射は、腹腔内に提供することができる。
【００９５】
《スクリーニング方法》
本発明は、Ｖｉｆの自己会合（本明細書において、Ｖｉｆ二量体化及びＶｉｆの多量体化とも称する）を撹乱する薬剤（例えば、小分子化合物）のスクリーニング方法に関する。
【００９６】
一観点では、本発明は、Ｖｉｆの自己会合を撹乱する薬剤の同定方法を提供する。この方法は、（ｉ）第二Ｖｉｆタンパク質又は断片に結合される第一Ｖｉｆタンパク質又は断片を含むＶｉｆ：Ｖｉｆ複合体を提供する工程と；（ｉｉ）Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体が撹乱したときに検出可能なシグナルを発生させるのに有効な条件下でＶｉｆ：Ｖｉｆ複合体を試験薬剤に接触させる工程と；（ｉｉｉ）検出可能な前記シグナルを検出して前記試験薬剤が前記Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体を撹乱するかどうかを決定する工程と、ここで、前記試験薬剤による前記Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体の撹乱が、Ｖｉｆ自己会合を撹乱する薬剤を同定するものとする、を含む。
【００９７】
適切な試験薬剤は、小分子、ペプチド、ポリペプチド、オリゴ糖、多糖、ポリヌクレオチド、脂質、リン脂質、脂肪酸、ステロイド、アミノ酸類似体などを含むことができる。一実施態様では、試験薬剤は、小分子化合物ライブラリーからのものである。
【００９８】
一実施態様では、前記の接触させる工程は、Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体を試験薬剤の１種又は試験薬剤の１種以上と共にインキュベートする工程を含む。
【００９９】
別の実施態様においては、前記の接触させる工程は、試験薬剤をＶｉｆ：Ｖｉｆ複合体に直接的に又は間接的にのいずれかで結合させる（associating）工程を含む。
【０１００】
検出可能なシグナルは、蛍光法、顕微鏡法、分光光度法、コンピュータ支援視覚化（computer-aided visualization）など、又はこれらの組み合わせからなる群から選択されることができる検出技術を用いて検出することができる。
【０１０１】
検出可能なシグナルは、蛍光シグナル、リン光シグナル、発光シグナル、吸収性シグナル、発色シグナルからなる群から選択されることができる。
【０１０２】
一実施態様では、蛍光シグナルは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、蛍光発光強度、及び蛍光寿命（ＦＬ）からなる群から選択される、その蛍光特性によって検出可能である。
【０１０３】
一実施態様では、Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体は、第一Ｖｉｆタンパク質又は断片と結合した第一検出部分及び第二Ｖｉｆタンパク質又は断片と結合した第二検出部分を含む。
【０１０４】
一実施態様では、第一検出部分及び第二検出部分は、距離依存的に検出可能なシグナルを生成し、そしてＶｉｆ：Ｖｉｆ複合体の撹乱が、第一検出部分及び第二検出部分を検出可能なシグナルを生成するのに有効な距離に分離するのに十分である。
【０１０５】
一実施態様では、第一検出部分及び第二検出部分は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を含み、ここで第一検出部分がＦＲＥＴドナーであり、第二検出部分がＦＲＥＴアクセプターである。ＦＲＥＴドナー及びＦＲＥＴアクセプターは、ＥＧＦＰ−ＲＥＡＣｈ２、ＧＦＰ−ＹＦＰ、ＥＧＦＰ−ＹＦＰ、ＧＦＰ−ＲＥＡＣｈ２、ＣＦＰ−ＹＦＰ、ＣＦＰ−ｄｓＲＥＤ、ＢＦＰ−ＧＦＰ、ＧＦＰ若しくはＹＦＰ−ｄｓＲＥＤ、Ｃｙ３−Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ４８８−Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ４８８−Ｃｙ３、ＦＩＴＣ−ローダミン（ＴＲＩＴＣ）、ＹＦＰ−ＴＲＩＴＣ、又はＣｙ３などからなる群から選択されるフルオロフォアの対を含むことができる。
【０１０６】
一実施態様では、Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体は、第一Ｖｉｆタンパク質又は断片をコードする第一のプラスミド及び第二Ｖｉｆタンパク質又は断片をコードする第二プラスミドで同時にトランスフェクトされた宿主細胞において提供される。
【０１０７】
一実施態様では、第二プラスミドに対する第一プラスミドの比率は、Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体が撹乱された場合の検出可能なシグナルの生成を最適化することに有効である。最適化された第一プラスミドと第二プラスミドの比率は、約１：４であり、前記第一プラスミドは、シグナルドナー部分（signal donor moiety）をさらに含みそして前記第二プラスミドは、シグナルクエンチャー部分（signal quencher moiety）をさらに含む。
【０１０８】
一実施態様において、宿主細胞は、第一及び第二プラスミドで安定的に又は一時的に、同時にトランスフェクトされる。
【０１０９】
一実施態様において、宿主細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、細菌細胞、及び真菌細胞からなる群から選択される。適切な哺乳動物細胞は、ヒト細胞を含むことができる。
【０１１０】
一実施態様において、宿主細胞は、第一及び第二プラスミドで安定的に同時にトランスフェクトされた細胞株を含む細胞培養物である。
【０１１１】
本発明のＶｉｆの自己会合を撹乱する薬剤の同定方法は、ハイスループットスクリーニングアッセイとして構成することができる。前記ハイスループットスクリーニングアッセイは、約０．５〜約１．０の間のＺ’値を有することができる。
【０１１２】
本発明のＶｉｆ自己会合を撹乱する薬剤の同定方法は、（ｉ）検出可能なシグナルを定量化する工程と；（ｉｉ）検出可能なシグナルを増幅する工程と；（ｉｉｉ）第一エピトープタグを第一Ｖｉｆタンパク質又は断片と結合させそして第二エピトープタグを第二Ｖｉｆタンパク質又は断片と結合させる工程と、ここで前記第一及び第二エピトープタグは互いに異なるものとする、をさらに含むことができる。
【０１１３】
一実施態様では、第一及び第二エピトープタグは、ＡＵ１エピトープタグ、ＡＵ５エピトープタグ、β−ガラクトシダーゼエピトープタグ、Ｃ−Ｍｙｃエピトープタグ、ＥＣＳエピトープタグ、ＧＳＴエピトープタグ、ヒスチジンエピトープタグ、Ｖ５エピトープタグ、ＧＦＰエピトープタグ、ＨＡエピトープタグなどからなる群から選択される。
【０１１４】
本発明のＶｉｆ自己会合を撹乱する薬剤の同定方法は、Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体を撹乱するとして同定された試験薬剤を、前記試験薬剤によるＶｉｆ自己会合の撹乱を確認するのに効果的な検証アッセイに供する工程をさらに含むことができる。
【０１１５】
本発明のＶｉｆ自己会合を撹乱する薬剤の同定方法は、Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体を撹乱するとして同定された試験薬剤を、毒性、透過性、及び／又は溶解性アッセイに供する工程をさらに含むことができる。
【０１１６】
本明細書に開示される方法並びに他の方法のバリエーションは、本発明の記載から明らかになるであろう。例えば、試験化合物を固定又は増加させることができ、複数の化合物又はタンパク質を一度に試験することができる。
【０１１７】
本明細書に提示される開示に基づいて、本発明のスクリーニング方法は、マイクロタイタープレートにおけるハイスループット化合物ライブラリースクリーニングのための強固な蛍光クエンチ共鳴エネルギー移動（robust Foerster quenched resonance energy transfer）（ＦｑＲＥＴ）アッセイに適用可能である。前記アッセイは、Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体撹乱の報告を可能にする色素タンパク質（chromoproteins）又は発色団（chromophores）の選択的な配置に基づいている。例えば、Ｖｉｆ二量体間で四量体が形成された場合には、適切な配置のＦＲＥＴドナー及びＦＲＥＴクエンチャーは「暗」シグナルをもたらし、Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体が撹乱された場合は、「明」シグナルをもたらす。
【０１１８】
当業者はまた、本明細書に提供される開示を考慮して、公知技術の標準的な又は将来開発される結合アッセイを使用して試験化合物の存在下又は非存在下においてＶｉｆ自己会合の撹乱を評価してそして有用な化合物を同定することができる。したがって、本発明は、この方法を用いて同定される任意の化合物を含む。
【０１１９】
前記スクリーニング方法は、組換えＶｉｆ二量体を含む混合物を試験化合物に接触させる工程とＶｉｆ：Ｖｉｆ複合体の存在を検出する工程とを含み、ここで、前記試験化合物欠乏下又はコントロールにおける量と比較したＶｉｆ：Ｖｉｆ複合体のレベルの減少は、前記試験化合物がＶｉｆ自己会合を阻害することを示すものとする。特定の実施態様では、前記コントロールは、異なる濃度での前記試験化合物により実施されるものと同じであるアッセイ又は前記試験薬剤欠乏におけるものと同じアッセイなどである。
【０１２０】
Ｖｉｆ：Ｖｉｆ複合体の形成を妨害する試験化合物の能力の決定は、例えば、タグ、放射性同位体、又は酵素標識によるＶｉｆ二量体のカップリングにより達成され、前記複合体において標識された成分を検出することによりＶｉｆ：Ｖｉｆ複合体を測定することができる。例えば、前記複合体の成分（例えば単一のＶｉｆタンパク質）は、３２Ｐ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、又は３Ｈにより直接的又は間接的のいずれかで標識することができ、そして放射性同位体は、放射線放出の直接計数により、またはシンチレーション計数により検出されることができる。あるいは、前記複合体の成分は、酵素的に、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はルシフェラーゼで標識することができ、そして前記酵素標識は、その後、適切な基質からの生成物への変換を測定することにより検出される。
【０１２１】
本明細書で議論される刊行物は、記載されている出願の出願日前の開示のためにのみ提供される。本明細書におけるいずれの記載も、本発明が先行発明による前記刊行物に先行する資格がないことの承認として解釈されるべきではない。また、提供される刊行物の日付は、実際の公開日と異なっていてもよく、そして独立して確認される必要がある可能性がある。
【実施例】
【０１２２】
以下の実施例は、記載された発明をどのように作製しそして使用するかの完全な開示及び記載を当業者に提供するために提案され、発明者が発明としてみなすものの範囲を制限することも、以下の実験が実施される実験の全てを又は唯一を示すことも意図しない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関して正確さを保証するための努力がなされているが、ある程度の実験誤差及び偏差は考慮されるべきである。特に断らない限り、部（parts）は重量部（parts by weight）であり、分子量は量平均分子量（weight average molecular weight）であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧又は大気圧付近である。
【０１２３】
《実施例１》
ハイスループット分子スクリーニングアッセイ開発
Ｉ．特定の目的
研究は、クエンチＦＲＥＴに基づく新規なハイスループットスクリーニングを開発して、Ｖｉｒａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ Ｆａｃｔｏｒ（Ｖｉｆ）として知られているＨＩＶタンパク質に結合しその自己会合を破壊する小分子を同定することを目的としている。Ｖｉｆの主な機能は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（Ａ３Ｇ）として知られている宿主防御因子に結合して、ポリユビキチン化依存性プロテアソーム経路を介してＡ３Ｇ分解を誘導することである。Ｖｉｆは十年以上前に発見されているが、その必要条件は「非許容細胞の感染のために不可欠であること」としてのみ知られていた。Ｖｉｆの機能は、宿主防御因子としてのＡ３Ｇの発見で明らかになった。Ａ３Ｇは、一本鎖複製ＨＩＶ ＤＮＡに結合しそしてＶｉｆの非存在下でＨＩＶタンパク質コード鎖においてｄＧをｄＡ変異にテンプレートする、マイナス鎖におけるｄＣからｄＵへの複数の変異を誘導する。ＨＩＶ感染の後期段階の間、Ａ３Ｇは、感染時のウイルス複製の間に新生ＤＮＡと相互作用する位置にあるようにビリオンによりパッケージングになることができる。Ａ３Ｇの細胞の存在度をも減少させる一方で、ＶｉｆはＡ３Ｇのウイルスパッケージングを妨害し、それによってウイルス感染性を促進する。
【０１２４】
我々の及びその他の研究所による研究により、Ｃ−末端モチーフである１６１ＰＰＬＰ１６４を介したＶｉｆの多量体化が、ＶｉｆとＡ３Ｇとの相互作用に必要とされることが明らかにされた。このモチーフを介してのＶｉｆ自己会合の重要性はまた、細胞に侵入するために、ＨＩＶ ＴＡＴ膜伝達モチーフを含有しているＶｉｆ多量体化拮抗物質ペプチドで実証された。このペプチドは、Ｖｉｆの共免疫沈降を防止し、Ｖｉｆ依存性Ａ３Ｇ破壊を著しく減少させ、そしてＶｉｆ存在下におけるＡ３Ｇ抗ウイルス活性を回復させる。Ｖｉｆ多量体化拮抗活性を有する最終的な小分子は、薬剤業界におけるより大きな長期的価値がある。生細胞中のペプチドの抗ウイルス能力を考えると、我々はＶｉｆ多量体化が、Ａ３Ｇ−Ｖｉｆ相互作用と等しく重要であるインビボにおける到達可能（accessible）な標的であると考えている。実際には、Ｃ末端の自己会合モチーフは比較的小さく、ＶｉｆのＮ末端における比較的大きなＡ３Ｇ−Ｖｉｆ相互作用ドメイン（残基４０−４４及び５２−７２）よりもおそらくより魅力的な標的とする他のＶｉｆ又はＡ３Ｇ相互作用ドメインのいずれかとは重複していない。
【０１２５】
我々は、一次及び二次スクリーニングを開発しそして（直接的に又はアロステリックに）Ｖｉｆの多量体化するための能力を撹乱する小分子のための検証アッセイを使用しＶｉｆ媒介阻害からＡ３Ｇ抗ウイルス活性を保護した。市販されている現在の抗ウイルス薬に耐性であるＨＩＶ株の増加優勢を考えると、新規標的例えばＶｉｆ多量体化に対する治療はＨＩＶ／ＡＩＤＳの世界的流行に大きな影響を与えるだろう。
【０１２６】
特定の目的１。Ｖｉｆ多量体化及びクエンチＦＲＥＴに基づいた３８４ウェルフォーマットでの一次ハイスループットスクリーニングを最適化する。ＥＧＦＰ−Ｖ５−Ｖｉｆ（蛍光ドナー）とＶｉｆ−ＨＡ−ＲＥＡＣｈ２（ＥＧＦＰ蛍光をクエンチするアクセプター及び非蛍光ＹＦＰ変異体）を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において共発現した。Ｖｉｆ多量体を解離させる化合物は、これをＶｉｆ自己会合を撹乱する小分子についてのポジティブスクリーニングにするＥＧＦＰ蛍光を誘導するであろう。
【０１２７】
特定の目的２。マイクロタイターウェルフォーマットでの二次スクリーニングを開発して最適化し一次スクリーニングからの「ヒット」を検証する。この大腸菌ベースのアッセイでは、Ｖｉｆの１つはペリプラズム輸送シグナルペプチド（periplasmic transporter signal peptide）ｓｓＴｏｒＡに結合し、別のＶｉｆは、ラクタマーゼ（Ｂｌａ）に結合している。細胞はアンピシリン選択下で生き残るためには、ｓｓＴｏｒＡｇａと結合しているＶｉｆがＢｌａと結合しているＶｉｆと多量体化し、それによってアンピシリンを中和するペリプラズムへのＢｌａの輸送を可能にする必要がある。Ｖｉｆの自己会合を破壊する小分子の存在下では、細菌は、アンピシリンの存在下で増殖しない。
【０１２８】
特定の目的３。「ヒット」の検証アッセイを実施し一次及び二次スクリーニングにより選別された小分子が、それらのＶｉｆ自己会合拮抗作用を介して抗ウイルス活性を有することを確認する。マイクロタイタープレートフォーマットでの感染ＴＺＭ−ｂｌ細胞を用いたウイルス感染ルシフェラーゼレポーターアッセイにより、各化合物について抗ウイルス活性を検証する。Ｖｉｆ−Ｖｉｆ相互作用を阻害する各化合物の能力を、共免疫沈降によって評価する。全細胞抽出物とウイルスＤＮＡ及びＡ３Ｇでトランスフェクトした細胞とから精製されたウイルス粒子のウェスタンブロット分析により、Ｖｉｆ依存性分解からＡ３Ｇを保護する上での化合物の有効性が実証され、それによってビリオン内のＡ３Ｇパッケージングが可能となる。
【０１２９】
ＩＩ．背景と異議
ウイルスには、遺伝子産物の主要な３クラス：（ｉ）構造タンパク質（Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＥｎｖ）；（ｉｉ）必須トランス作用性タンパク質（Ｔａｔ、Ｒｅｖ）；並びに許容細胞における効率的なウイルス複製のために必要とされていない「補助」タンパク質（Ｖｐｒ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｎｅｆ）［（１）において報告されている］をコードする１０−ｋｂの一本鎖ＲＮＡゲノムが含まれる。Ｖｉｆの主な機能はＡＰＯＢＥＣ３Ｇ又はＡ３Ｇとして知られている細胞性抗ウイルスタンパク質の作用を克服することであるという発見から、抗ウイルス標的としてのＶｉｆの関心の高まりがあった（２）。許容細胞（例えば、２９３Ｔ、ＳＵＰＴ１及びＣＥＭ−ＳＳ Ｔ細胞株）において、ｖｉｆ欠失ＨＩＶ−１クローンは野生型ウイルスのそれと本質的に同一の効率で複製する。しかし、非許容細胞（例えば、一次Ｔ細胞、マクロファージ、又はＣＥＭ、Ｈ９及びＨＵＴ７８ Ｔ細胞株）において、ｖｉｆ欠失ＨＩＶ−１クローンは、１００−１０００倍低下した効率で複製する（３−８）。逆転写産物を蓄積し非許容細胞において統合するプロウイルスを生成するＶｉｆ欠損ＨＩＶ−１変異体の不具合は、新生プロウイルス一本鎖ＤＮＡにおけるＡ３Ｇの変異原活性同様に、ウイルス複製複合体と相互作用しそしてそれらの発育を損なうＡ３Ｇの能力によるものである（２，９−１１）。
【０１３０】
Ａ３Ｇの発見。抗ウイルス宿主因子としてのＡ３Ｇ（かつてはＣＥＭ１５と名付けられていた）の機能は、Ｖｉｆの発現が必要となるであろう非許容細胞における宿主細胞因子を同定するために設計された実験において、２００２年に発見された（２）。非許容及び許容細胞から成るヘテロカリオンは、Ｖｉｆ欠損ウイルスについての非許容表現型を保持し、このことが、非許容細胞における支配的な中和因子の発現を示している（３，４）。サブトラクティブトランスクリプトーム解析（Subtractive transcriptome analysis）により、一本鎖核酸上で活性のあるシチジンデアミナーゼとしてＡ３Ｇ（２）をコードするｃＤＮＡが同定された（１２，１３）。Ａ３Ｇ ｃＤＮＡによる許容細胞のトランスフェクションは、Ｖｉｆ欠損ＨＩＶ−１感染性のための非許容表現型への変換のために必要かつ十分であった（２）。
【０１３１】
Ａ３Ｇの抗ウイルスメカニズム。複数の研究室は、Ａ３Ｇ及びそのＨＩＶビリオン内のパッケージングのデアミナーゼ依存性抗ウイルス機能を明らかにした（９−１１）。プロウイルスゲノムのシーケンスにより、逆転写の間にＡ３ＧがｄＣからｄＵへの変異を有するマイナス鎖を有することと一致して（１１）、Ａ３Ｇを含むビリオンに感染した細胞が、タンパク質をコードするプラス鎖の至る所にｄＧからｄＡへの高頻度変異を有していたことが明らかになった（９−１１）。さらに、Ａ３Ｇは、ＨＩＶ ＤＮＡ鋳型（１４，１５）のその領域に変異を有するマイナス鎖に沿って３’から５’へ前進的に作用し、そしての領域においては、ＨＩＶ ＤＮＡはＨＩＶ逆転写の間の最も長い期間で一本鎖である（１６，１７）。前記高頻度変異は、複数の未成熟終始コドン及びウイルスに負に影響するコドンセンス変化（codon sense changes）を誘導する（９−１１）。マイナス鎖ウイルスＤＮＡ中のｄＵ変異は、ビリオン（１８，１９）に補充されたウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）によって媒介されるウラシル塩基除去経路をトリガーすることができ、これにより宿主ＤＮＡ（１０）への統合前のウイルスＤＮＡの切断が導かれる（１０）。プロウイルスＤＮＡの減少はまた、Ａ３Ｇによって逆転写するための物理的障害であることが提案されているものを介して発生する可能性がある（５，６，２０−２２）。
【０１３２】
Ａ３Ｇ抗ウイルス活性のＶｉｆ依存性阻害。Ｖｉｆを発現するウイルスは、Ａ３Ｇのウイルスパッケージングを抑制しそしてプロテアソーム分解のためにそれを標的にすることによってＡ３Ｇを克服する（２３〜２６）。Ｖｉｆは、ユビキチン化機構（ubiquitination machinery）に結合するその能力を介してＡ３Ｇの分解を促進する。ＶｉｆのＣ末端（残基１４４−ＳＬＱＹＬＡ−１４９、図１の青いバー）におけるコンセンサスＳＯＣＳ（サイトカインシグナル伝達の抑制因子）−ｂｏｘは、Ｃｕｌｌｉｎ ５及び Ｅｌｏｎｇｉｎ Ｂを含むＥ３ユビキチンリガーゼ複合体のＥｌｏｎｇｉｎ Ｃサブユニットに結合する（２６）。Ｖｉｆはまた、Ｃｕｌｌｉｎ ５との相互作用を付与する（２７）亜鉛結合ＨＣＣＨモチーフ（残基１０８−ＨＸ５−ＣＸ１８ＣＸ５Ｈ−１３８、図１の緑色のバー）を含む。Ｖｉｆは、Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体においてＥｌｏｎｇｉｎ Ｃ及びＣｕｌｌｉｎ ５とのＡ３Ｇのブリッジとして機能し、それによりＶｉｆ及びＡ３Ｇの両方のポリユビキチン化が導かれる（２５−２７）。最近の研究では、リジン残基１６個の１つ以上でのＶｉｆのポリユビキチン化のみがＡ３Ｇ及びＶｉｆのプロテオソーム分解のために必要とされることが示された（２８）。部位特異的変異誘発（Site-directed mutagenesis）により、Ａ３Ｇ内の単一アミノ酸の変化がＶｉｆ相互作用に影響を与える可能性があることが示された（２９−３１）。Ａ３Ｇ中の１２８位のアスパラギン酸が、ＨＩＶ−１ ＶｉｆがヒトＡ３Ｇを分解するのに必要とされる一方で、１２８位のリジンは、アフリカミドリザルＶｉｆからのサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶａｇｍ）がａｇｍＡ３Ｇを分解するために必要とされる（２９−３１）。Ａ３Ｇのアラニンスキャン変異解析（Alanine scanning mutation analysis）により、Ｄ１２８に隣接する残基、具体的には１２９位プロリン及び１３０位アスパラギン酸がＡ３ＧとのＶｉｆの相互作用のためにも重要であることが明らかになった（３２）。一方では、ＶｉｆのＮ末端内の比較的大きな領域が、Ａ３Ｇとの相互作用に関与している。Ｖｉｆの欠失及び点突然変異解析により、残基４０−ＹＲＨＨＹ−４４及び５２−７２が、ＶｉｆのＡ３Ｇ相互作用及び分解に関与するＶｉｆ内の重要な領域であるとして同定された（図１、下線を引いた残基及び赤いバーは、Ａ３Ｇ−Ｖｉｆ相互作用に影響を与える点変異体を表している）（３３−３６）。
【０１３３】
Ｖｉｆ自己会合。２００１年にトーマスジェファーソン大学におけるＺｈａｎｇの研究室でのＶｉｆ欠失変異体の分析により、残基１５１から１６４は、非許容細胞（３７）の感染性のために必要となる相互作用であるＶｉｆ多量体化のために重要であることが明らかになった。その後のファージディスプレイにより、ＰＸＰモチーフを有するペプチドはＶｉｆ内のＰＰＬＰに結合し（残基１６１−１６４、図１の紫色のバー）、そしてそうすることで、インビトロでＶｉｆ多量体化を妨害することが明らかになった（３８）。Ｖｉｆの細胞導入ペプチド（cell transducing peptide）とＰＰＬＰを含むペプチドとの結合の際に、Ｚｈａｎｇの研究室（アンテナペディアホメオドメイン（antennapedia homeodomain）ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫを使用）及び我々のラボ（ＨＩＶ ＴＡＴ形質導入ドメインＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧを使用）の両方が、これらのペプチドキメラが形質導入された細胞及び生ＨＩＶ感染性の妨害を明らかにした（３８，３９）。ウイルス粒子へのＡ３Ｇの取り込みは、ＨＩＶ感染性の顕著な抑制をもたらすペプチドの存在下で増強された（３９）。Ｄｏｎａｈｕｅらは、ＰＰＬＰモチーフのＡＡＡＰへの変異によりＡ３Ｇ抗ウイルス活性が可能となることを実証した。さらに重要なことに、彼らは、Ｖｉｆ多量体化変異体が顕著に低下したＡ３Ｇとの相互作用を有することを、共免疫沈降解析により示した。一方、Ｖｉｆ変異体は、野生型Ｖｉｆと同じ方法でＥｌｏｎｇｉｎ ＣとＣｕｌｌｉｎ ５との相互作用を保持した（４０）。前記データにより、Ａ３ＧとのＶｉｆ相互作用及びウイルス感染性の両方にＶｉｆ自己会合が必須であることが明らかになった。また、Ｖｉｆ多量体化ドメインはインビボで撹乱されることができ、このことは、その薬物標的としての可能性を実証している。
【０１３４】
Ｖｉｆ自己会合を標的とする利点。現在までに、Ｖｉｆ−Ａ３Ｇ相互作用の４つの特徴が、薬物標的としての潜在的興味を作るために十分に詳細に研究されている。これらは：（ｉ）Ｖｉｆ自己会合、（ｉｉ）Ｖｉｆ−Ａ３Ｇ複合体のインターフェースに寄与するＶｉｆの表面及び（ｉｉｉ）Ａ３Ｇの表面、並びに（ｉｖ）Ｖｉｆポリユビキチン化である。
【０１３５】
Ｖｉｆポリユビキチン化は、Ｖｉｆにはポリユビキチン化可能なリジン１６個があることから、選択的に標的とするための最も難しいＶｉｆの機能性である可能性がある。ユビキチン媒介分解が細胞の主要部分でありそしてこの標的上の「ヒット」が毒性につながるオフターゲット効果を持っている可能性があることを考えると、Ｖｉｆのユビキチン化に影響する小分子は、毒性である可能性が高い。分解されていないＡ３Ｇに結合するＶｉｆはおそらくＡ３Ｇウイルスパッケージングを妨げるであろう。
【０１３６】
Ｖｉｆ−Ａ３Ｇインターフェースに関するいくつかの有望な仕事があった。Ｇａｂｕｚｄａの研究室は、Ｖｉｆ領域の１５量体ペプチドを、Ｖｉｆ−Ａ３Ｇの相互作用に拮抗するそれらの能力について評価した。インビトロでＶｉｆ−Ａ３Ｇの相互作用を妨害するＶｉｆの５７−７１位のアミノ酸を含むペプチドが同定された。しかし、インビボにおける抗ウイルスとしてのこのペプチドの有効性は、まだ決定されていない。Ｒａｎａの研究室では、蛍光タグＡ３ＧのＶｉｆ依存性分解に基づくＨＴＳを通じてＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡ３ＧのＶｉｆ依存性分解を妨害可能な小分子を同定した。小分子の分子標的とその作用機序は不明である（４２）。
【０１３７】
Ａ３Ｇを薬物標的として考えると、Ｖｉｆの結合に関係するＡ３ＧのＮ末端領域を標的とするための主な注意点は、Ａ３Ｇの同じ領域もまた、その細胞及び抗ウイルス活性についての重要な相互作用に関与しているという事実である。Ａ３Ｇの１０４−１５６残基がＨＩＶＧａｇ結合及びウイルスパッケージングのために重要であることが、欠失分析により明らかになった（４３，４４）。また、スキャニングアラニン突然変異誘発により、アミノ酸１２４−ＹＹＦＷ−１２７がウイルスパッケージングのために特に重要であることが示された（３２）。Ｓｍｉｔｈの研究室により、Ａ３Ｇの残基１１３−１２８において、Ａ３Ｇの核への侵入を妨げる未だ同定されていない細胞質のパートナーと相互作用する細胞質保持シグナルがあることが最近示された（４５）。関連するタンパク質であるＡＰＯＢＥＣ１及びＡＩＤは核へ出入りしなければならないが（traffic to）、それらの核への取り込み及びゲノムＤＮＡへのアクセスは、厳密に規制され（４６）、ＤＮＡデアミナーゼ活性による潜在的な遺伝毒性を防止する（４７−５３）。したがって、Ａ３ＧのＡ３Ｇ残基１２８−１３０におけるＶｉｆへの結合を妨げる小分子（３２）は、Ａ３Ｇウイルスパッケージングに影響を与えるか又はゲノムへのＡ３Ｇのアクセスを可能にするのに潜在的に否定的な結果を有している。
【０１３８】
我々は、Ｖｉｆ多量体化ドメインは、薬物開発のための魅力的な標的であることを提案する。Ｖｉｆ自己会合を妨げることは、インビボにおける到達しやすい標的であり、そしてＡ３Ｇの分解及びその抗ウイルス活性の保存を阻害するであろう方法において、Ｖｉｆ自己会合の撹乱によりＶｉｆ−Ａ３Ｇ相互作用が妨げられることが証明されている（３８，３９）。Ｖｉｆ多量体化のためにバイアスされているＨＴＳの開発のためにＶｉｆを使用する実用性が、予備データにより実証されるであろう。
【０１３９】
これらの留意事項に基づくと、この提案の目的は、一次ＨＴＳ及びＶｉｆ自己会合に拮抗する小分子のための、大腸菌における直交二次スクリーニングとして、ヒト細胞ベースの均一系測定（homogenous assay）を開発することである。ウイルス感染性アッセイ、示差的にタグ付けされたＶｉｆサブユニットの共免疫沈降及び全細胞Ａ３Ｇの定量、並びにＡ３Ｇウイルスカプシド形成は、予備的なライブラリースクリーニングから得られたヒットを検証する機能の評価項目（endpoints）として提供される。
【０１４０】
ＩＩＩ．予備段階の結果
Ｖｉｆ自己会合は到達可能な標的である。Ｖｉｆ多量体モチーフとＨＩＶ ＴＡＴ伝達モチーフとを含むペプチドを用いた我々の研究により、Ｖｉｆ自己会合が、インビボで到達可能であることが実証された。ペプチドは、Ａ３Ｇを内生的に発現するＨ９及びＭＴ−２ Ｔ細胞株の生ＨＩＶウイルス感染を防止した。感染の２０日後、コントロールのウイルスなし細胞又は強力な抗ウイルスＡＺＴで処理された細胞と同等のレベルに細胞上清中の逆転写酵素（ＲＴ）活性を低下させて、ペプチドはウイルス感染を阻止した（図２）。感染性の低下はＶｉｆとＡ３Ｇの存在に依存しており（３９）、そして（＋）及び（−）ペプチドのＡ３Ｇウェスタンブロットシグナルがｐ２４ｇａｇ回復について正規化された場合から明らかであるように、ペプチドは、具体的には２．６倍以上のＡ３Ｇがウイルス粒子に侵入することを可能にする（図２、右のパネル）。これは、Ｖｉｆ自己会合を標的にすることでＡ３ＧウイルスパッケージングのＶｉｆ依存性への阻害が軽減されることを実証していた。
【０１４１】
クエンチＦＲＥＴ一次スクリーニングの開発。ＥＧＦＰはＦＲＥＴドナーでありそしてＲＥＡＣｈ２（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ａｃｃｅｐｔｉｎｇ Ｃｈｒｏｍｏｐｒｏｔｅｉｎ ２）は、非蛍光ＦＲＥＴアクセプターである（５４）。非蛍光ＲＥＡＣｈ２は、それらが相互作用するドメインに連結されたときに、距離依存的にＥＧＦＰシグナルをクエンチすることができる。しかしながら、相互作用が存在しない場合は、ＥＧＦＰ及びＲＥＡＣｈ２は、近位ではなく、クエンチングは発生しない。これは、ＦＲＥＴ対に連結されているＶｉｆ分子と相互作用することが原因で、デフォルト条件がクエンチされたシグナルであるＨＴＳのための理想的なシステムである。小分子の「ヒット」は、Ｖｉｆ自己会合に干渉すること及びクエンチを緩和することにより、ポジティブな蛍光シグナルを生成する（図３）。
【０１４２】
我々は、末端Ｎ−及びＣ−末端にタグ付けされた様々な組み合わせのＶｉｆコンストラクトを試験し、そしてＥＧＦＰ−Ｖ５−Ｖｉｆ及びＶｉｆ−ＨＡ−ＲＥＡＣｈ２が最も顕著なクエンチを得られることを決定した（図４Ｂ）。システムは、高いトランスフェクション効率（ＦＵＧＥＮＥ６又はＨＤ（登録商標）リポフェクション試薬を用いて９０％まで）のためにＨＥＫ２９３Ｔ細胞の使用を採用しており、そしてこれらの細胞中のＶｉｆの確立された機能性（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）が、多くの研究者によって実証された（２４，２９，３２，４２）。一時的なトランスフェクションは、強いＦＲＥＴシグナルのために重要なタンパク質の高度発現を可能にする。また、一時的にトランスフェクトされた細胞は、ＥＧＦＰ−Ｖ５−Ｖｉｆより高いＲＥＡＣｈ２−ＨＡ−Ｖｉｆ発現レベルを維持する能力を有し、細胞中でクエンチされたタンパク質の最大量を確保する。実際に、ＦＲＥＴ対を発現する安定的な細胞株が確立されているが、これらは一時的にトランスフェクトされた細胞より低いＶｉｆ発現を示し、そしてその結果、非常に低い信号を有することが証明された。
【０１４３】
ＲＥＡＣｈ２及びＥＧＦＰの４：１と等しい又はより大きなＤＮＡ比率により、細胞の大部分においてクエンチされたシグナルが維持された。ＥＧＦＰ−Ｖ５−Ｖｉｆは、単独で強力なベースライン蛍光を有している（図４Ａ、左上）。ＥＧＦＰ−Ｖ５−Ｖｉｆ及びＶｉｆ−ＨＡ−ＲＥＡＣｈ２が共発現されたとき、ＥＧＦＰシグナルのＲＥＡＣｈ２クエンチングにより、蛍光強度の顕著な減少が見られた（図４Ａ、中央上）。Ｖｉｆ多量体化拮抗物質ペプチド（上記）５０μＭの添加により、ＥＧＦＰ−Ｖ５−Ｖｉｆが遊離され、クエンチを軽減する（図４Ａ、右上）。ペプチド拮抗物質で処理された細胞は、アッセイにおいてポジティブコントロール条件となる。
【０１４４】
野生型Ｖｉｆと同等の条件において、多量体欠損４Ａ−Ｖｉｆ変異体（１６１−ＰＰＬＰ−１６４からＡＡＡＡ）にクエンチはなかった（図４Ａ、中央下）。予想されたように、変異体４Ａ−Ｖｉｆを発現する細胞へのペプチドの添加は、さらなる蛍光を促進しなかった（図４Ａ、右下）。ＨＡ及びＶ５のウェスタンは、トランスフェクトされたコンストラクトの一貫した発現を示し、これにより、図４Ａにおける蛍光の欠失は、ＥＧＦＰ−Ｖ５−Ｖｉｆの発現減少のためではなく、実際はクエンチされたＦＲＥＴのためであることが確認できる（図４Ｂ）。
【０１４５】
９６及び３８４ウェルフォーマットへのクエンチＦＲＥＴの適用
９６ウェル及び３８４ウェルフォーマットへのクエンチＦＲＥＴアッセイの適応に関する実験を以下に示す：
・試薬及び読み出し情報の説明：我々は現在、９６ウェルフォーマットで小さなライブラリーをスクリーニングすることが可能であり、そして３８４ウェルフォーマットのための最適化されたトランスフェクションを有している。アッセイは、プラスミド２つの細胞ベースの一時的なトランスフェクションである。プラスミドの１つには、ＥＧＦＰ−Ｖ５−Ｖｉｆ（ＥＶＶ）が含まれ、他方にはＶｉｆ−ＨＡ−ＲＥＡＣｈ２（ＶＨＲ）が含まれている。ＲＥＡＣｈ２は、ＦＲＥＴを介してＥＧＦＰをクエンチする非蛍光ＹＦＰ変異体であり、したがって、デフォルトの状態においてＶｉｆは二量体化しそしてＥＧＦＰシグナルはクエンチされ、相互作用に影響する化合物は、相互作用するタンパク質からのＦＲＥＴの欠乏のために蛍光の増加を引き起こす（「クエンチの放出」としても知られる）。我々の読み出し情報は、ＰＥ Ｖｉｃｔｏｒ ３プレートリーダーにおけるＧＦＰの励起及び発光の蛍光である。良好なクエンチを確保するために、我々はＥＧＦＰよりも４倍高くＲＥＡＣｈ２タンパク質を発現する必要があり、そして一時的なトランスフェクションにより達成することができる比率及び発現レベルを、安定的な細胞株において一貫して再現することができなかった。
・データの確認アッセイのプロトコル：我々は、ＨＴＳに最適なＺ’値及びＣＶを得るために、トラブルシューティングを相当な量経験した。また、プレート内及びプレート間のばらつきを考慮するために、バックグラウンド補正も行った。この最適化されたプロトコルを使用して、前記Ｚ’値が、我々の手で０．５を常に超えるようにした。我々は、Ｚ’値が３より大きな用量依存性の「ヒット」として登録しポジティブコントロールとして試験したペプチドを有している。我々はまた、毒性及び抗ウイルス活性についてのカウンタースクリーニングによる二次検証を通過した、ＮＣＣライブラリーからのいくつかの有望な小分子を有している。
十分な強度のシグナル：ＧＦＰ／ＦＩＴＣの４８５及び５３５の励起及び発光を用いて、ＰＥ Ｖｉｃｔｏｒ ３マルチラベルプレートリーダーにおいてそれぞれクエンチされたシグナルは、典型的にはバックグラウンドより大きな２０，０００ＲＦＵ超であり、ポジティブコントロールはクエンチされた条件より大きな１００，０００ＲＦＵ超である。これらの値は、プレート読み取りの露光時間及び開口サイズに応じて変えることができるが、これは通常の開口サイズ設定を使用して読み出しを典型的な１秒のシグナルの範囲で行ったものである。
ＣＶ及びＺ値：
パイロットスクリーニングからの９６ウェルフォーマットの数：
・ＣＶクエンチ＝２．４％
・ＣＶポジティブコントロール＝３．６％
・Ｚ値＝０．５１
３８４ウェルフォーマットの数
・ＣＶクエンチ＝１．４％
・ＣＶポジティブコントロール＝３．３％
・Ｚ値＝０．６６
Ｏｙａ００１ペプチドの「ヒット」コントロール（図６）。
・９８０の標準偏差＝１のＺスコア（1 Z-score）
・この実験はＯｙａ００１ペプチド及びクエンチされそしてポジティブであるシグナルのためのコントロールの１５種の各々の濃度についての試験ウェル３つを含む。プレートの読み取りを、ペプチドを添加する前及びペプチドの添加１．５時間後に実施した。これらの２つの間の読み取りの差を分析に用いた（ＲＦＵ）。
・ＣＶクエンチ＝１．７％
・ＣＶポジティブコントロール＝１．９％
・Ｚ値＝０．６３
・このペプチドが我々の標的に直接的に影響を与えることを示すデータを、我々は発表している（３９）。図５中のデータにより、Ｏｙａ００１ペプチド１２．５、２５、５０及び７５Ｍについての百分率９１．２ｔｈ、９７．４ｔｈ、９９．９ｔｈ、及び＞９９．９ｔｈにそれぞれ関連したＺスコア１．３６、１．９６、３．０１、及び４．３７を表している、ＨＴＳアッセイにおけるペプチドとの明確な用量依存性が示される。
・コントロールのパラメーターの情報
ＤＭＳＯ耐性
・アッセイは、０．１−１％において明白にＤＭＳＯを許容する、ＳＭＶＤＡ又はＤＭＳＯ単独で１％を添加された、報告された毒性試験を参照されたい。さらに、パイロットスクリーニング全てをＤＭＳＯ ０．１％未満で実施し、そしてＨＩＶ感染性カウンタースクリーンにおいてＳＭＶＤＡ又はＤＭＳＯ（コントロール）を単独で０．１−０．５％の間のいずれかで細胞に添加した。
プレート間における変動（図７、プレート毎にサンプル４０±を有する３８４ウェルプレート）
・プレート１：
・ＣＶクエンチ＝１．４％
・ＣＶポジティブコントロール＝５．２％
・Ｚ値＝０．６３
・プレート２：
・ＣＶクエンチ＝１．６％
・ＣＶポジティブコントロール＝４．７％
・Ｚ値＝０．６６
・プレート３：
・ＣＶクエンチ＝２．０％
・ＣＶポジティブコントロール＝５．９％
・Ｚ値＝０．５９
・プレート１−３からの平均ＲＦＵ値についてのＣＶ
・ＣＶクエンチ＝０．９％
・ＣＶポジティブコントロール＝２．５％
バックグラウンド補正
・Ｚスコア正規化は、式１及び４に示されるプレート変動補正手順を介して全プレートの平均（all plate means）と標準偏差を等しくすることにより、実験データ点のプレート横断比較を可能にする。さらに体系的な変動（systematic variability）の計算（式２）及び補正の適用（式３）は、プレーティング、細胞成長、又は他の体系的なエラーにおけるエラーのための変動について制御する。最後に、Ｚスコアの変換により、データを正規分布に対して適合させることができるようになる。これは「相対蛍光単位（Relative Fluorescent Units）」の任意の性質（arbitrary nature）を利用しており、Ｚスコア、又は偏差に照らしてデータをフレーム化する（frames）。ＨＴＳのヒットは、サンプル集団からの偏差の関数として一般的に選択され、したがって、このことは、この正規化手順を介して容易に解釈されるコンテキストにおけるデータをフレーム化する。
・式：
最初のプレート正規化
2016504268.tif 000003
データ（Ｘｉ）を正規化し、そしてプレートの平均（μ）とプレート標準偏差（σ）とがそれぞれ０及び１となる。
ウェルのバックグラウンド計算
2016504268.tif 000004
プレートセット１、２、・・・、Ｎのプレートｊにわたるウェルｉのデータポイントｘ’の平均からの体系的なバックグラウンドＺｉを計算する。Ｎ≦１００となる場合には、ｘ’≧３となる全てのデータポイントは除外される。
ウェルのバックグラウンド補正
2016504268.tif 000005
バックグラウンド補正されたデータポイントｘ’’から得られた正規化されたデータポイントｘ’から体系的なバックグラウンドｚｉを減算する。
バックグラウンド補正後の再正規化（Re-normalization）
2016504268.tif 000006
プレート平均μを減算しそしてプレート標準偏差（σ）で除算した補正されたデータｘ’’を用いた最終的な再正規化。これによりプレートμ及びσは、プレート間比較についてもとの０及び１に補正される。
【０１４６】
《実施例２》
Ｖｉｆ多量体化撹乱物質のスクリーニング、検証、及び詳細な調査（Vetting）
第一部。アッセイの検証。クエンチＦＲＥＴを介したＶｉｆ−Ｖｉｆ多量体化のＨＴＳ分析は、Ｖｉｆ−ＨＡ−ＲＥＡＣｈ２（クエンチャー）及びＥＧＦＰ−Ｖ５−Ｖｉｆ（フルオロフォア）をプラスミドが２９３Ｔに一時的にトランスフェクションするのに最適な比率で利用する。Ｖｉｆ分子の相互作用により、ＲＥＡＣｈ２によるＥＧＦＰシグナルのクエンチングが可能となる。Ｖｉｆ−Ｖｉｆ相互作用を妨げるこのドメインを模倣するペプチド又はＶｉｆ−Ｖｉｆ相互作用に重要であるＰＰＬＰ内の変異のいずれかを使用したコントロールの実験は、クエンチングを妨げ、そしてより強い蛍光シグナルを有する（図４Ａ参照）。説明文は使用される略語について説明している。トランスフェクトされた細胞抽出物のウェスタンブロットは、コントロールと比較した場合、ペプチド処理された細胞におけるドナー／クエンチャー対突然変異体コンストラクト及びドナー／クエンチャー対と同等の発現を示した（図４Ｂ参照）。
【０１４７】
第二部。小ライブラリーのスクリーニング。スクリーニングは、９６ウェルフォーマットにおいてＣＶ３％未満及びＺ値０．６１をもたらすように最適化されている（図６Ａ−６Ｃ）。現在までに、ライブラリーの２つが、５０、２５、及び５μＭの濃度でｑＨＴＳによってテストされたより小さなサブセットで、化合物の合計２４４６種が５μＭでスクリーニングされている。これらのライブラリーでは小分子の８種は、自家蛍光のために除外されなければならなかった。スクリーニングにおけるプレート位置でのばらつきの値のバックグラウンド補正及び正規化の後に、小分子２６種をヒットであるとして決定した（小分子Ｖｉｆ多量体化拮抗物質１−２６についてのＳＭＶＤＡ）。ヒット率は、１％以下であった。
【０１４８】
ヒットは３つの基準：１）高ヒット（Ｚスコアが１．８〜９７％でありそして正規分布より高い）、２）重複ヒット（Multiple hits）（試験された濃度３つのうち２つ以上のＺスコアの値が０．９〜８２％でありそして正規分布より高い）、及び３）用量依存性、に基づいて選別された（図６Ａ〜６Ｃ参照）。これらの基準のうちの少なくとも１つを有する全ての小分子を評価したところ、トップ２６のうちの２４個は、条件３つのうち少なくとも２つを有していた。除外された２つは、基準を１つのみ満たしていたＳＭＶＤＡ２及びＳＭＶＤＡ１７であった（ＳＭＶＤＡ２は、最も低い濃度で試験された高ヒットであり、そしてＳＭＶＤＡ１７は、試験された最も低い濃度の両方について１．４のＺスコアを有していた。（したがって比較的高ヒットのカットオフの１．８に近い））。
【０１４９】
第三部。毒性についてのヒットの詳細な調査。我々は次に毒性についてヒットを分析した。我々は、複数の濃度において用量依存性を示すか又は「高ヒット」であったヒットに焦点を当てた。我々は、ＡＴＰ濃度を決定するＰｒｏｍｅｇａのルシフェラーゼベースアッセイＣｅｌｌ−ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏを使用して、化合物の毒性を５０、２５、及び５μＭにおいて分析した。２９３Ｔ細胞を１０，０００細胞／ウェルで９６ウェルフォーマットにプレーティングし、そして小分子を３回投与し、そして２４時間後にＣｅｌｌ−ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏキットを使用して分析した。データにより、ＳＭＶＤＡ１−１４は全ての投与において毒性が全くないか低く、一方でＳＭＶＤＡ１５−１７は５０及び２５μＭにおいて毒性があることが示された（図７Ａ、７Ｂ、８Ａ、及び８Ｂ参照）。
【０１５０】
いくつかのヒットは、ＨＴＳアッセイにおいて矛盾したヒット（inconsistent hits）であったことから、毒性について評価されず、そしてこれらには：５０μＭでのＨＴＳアッセイにおける「高ヒット」であるが用量依存性がないＳＭＶＤＡ２０−２２；５０μＭで「中ヒット」であり２５μＭで高であり５μＭで低であるＳＭＶＤＡ２３−２５、そして５０μＭ及び５μＭで「高ヒット」であり２５μＭで低であるＳＭＶＤＡ２６が含まれる（図６Ａ〜６Ｃ参照）。
【０１５１】
第四部。抗ウイルス活性についてのヒットの詳細な調査。偽ＨＩＶ（psuedotyped HIV）に感染したシングルラウンド感染におけるヒットの抗ウイルス活性を評価した。アッセイは、Ａ３Ｇを発現する又は発現しないプロデューサー細胞及びＶｉｆを発現する又は発現しないウイルスを使用して実施した。野生型ＨＩＶプロウイルスベクターは、ｎｅｆ（ＥＧＦＰに置き換えた）及びｅｎｖを除く全てのＨＩＶ遺伝子についてコードしていた。デルタＶｉｆプロウイルスベクターは、ｖｉｆ遺伝子内の上流（early）に停止コドンを含んでいることを除いて野生型と同じである。デルタＶｉｆ＋Ａ３Ｇは、Ｖｉｆの存在がないために、このアッセイのための強力なポジティブコントロールであり、Ａ３Ｇは、ウイルス粒子内にカプシド化されそして強い抗ウイルス効果を有することが可能である。あるいは、Ａ３Ｇの非存在下では、野生型及びデルタＶｉｆウイルスの両方が良好な感染性を持っている必要がある。
【０１５２】
ウイルスは、＋Ａ３Ｇ条件におけるＶ５−ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（Ａ３Ｇ）と同様に、これらのベクターを別のベクターからのＶＳＶ−Ｇコートタンパク質によりトランスフェクションすることにより作製された。別のベクター上のコートタンパク質をトランスフェクトさせることにより、シングルラウンドの感染のみが可能となる。プロウイルスＤＮＡ：ＶＳＶ−Ｇ：Ａ３Ｇの比率は１：０．５：０．０５に設定し、これにより、Ａ３Ｇのレベルは外来のＡ３Ｇと同等に設定される。トランスフェクションの５時間後に細胞に化学物質を投与し、そしてウイルス粒子をトランスフェクションの２４時間後に０．４５ミクロンシリンジフィルターを通して濾過することにより培地から回収した。ウイルス負荷を、ｐ２４ＥＬＩＳＡキット（Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ、Ｂｕｆｆａｌｏ、ＮＹ）で正規化した。その後、等しいウイルス負荷を、ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターからのルシフェラーゼを発現するＴＺＭ−ｂｌレポーター細胞に三連で（in triplicate）添加した。感染の４８時間後に、ルシフェラーゼレベルをＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて評価した。
【０１５３】
最初に試験した化学物質は用量依存性を示し、ＨＴＳにおいて高化合物濃度での高ヒットであった。ＳＭＶＤＡ１、ＳＭＶＤＡ１１−１５、及びＳＭＶＤＡ１８−１９を第一感染性アッセイにおいてＡ３Ｇ存在下で５０及び２５μＭで試験した。抗ウイルス活性を有する化合物としての基準は、ＤＭＳＯのみのコントロールに対する感染性の百分率に基づいていた（図７Ａ、７Ｂ、８Ａ、及び８Ｂ参照）。コントロールの感染性の６０％未満まで阻害したヒットは、抗ウイルス活性を有すると考えられた。ＳＭＶＤＡ１、１８、及び１９のみが、両方の濃度において、感染力の有意な減少を示すことができたが、ＳＭＶＤＡ１８及び１９は、毒性はなかったがＨＴＳアッセイにおける５μＭでのポジティブのヒットではなかったことから、さらなる評価を行っていない。
【０１５４】
低用量で抗ウイルス活性を有した化学物質及びＳＭＶＤＡ１を、５μＭにおける感染性アッセイにおいて試験した（図７Ａ、７Ｂ、８Ａ、及び８Ｂ参照）。より高用量で試験されたＳＭＶＤＡ１−６と同程度までは影響されなかったが、感染性のレベルは、コントロールの６０％未満まで感染性を低下させることができた。ＳＭＶＤＡ７−１０は５μＭで感染性に対する最小の効果を有しており、さらなる検討から除外した。
【０１５５】
ＳＭＶＤＡ１は、これまでのところ最良の候補であると思われたので、我々は、構造をよく見たところ、関連する化学物質は一次スクリーンにおいても存在したが、それは強い自己蛍光シグナルを有していたので、除外されていたことに気付いた（ＳＭＶＤＡ１．１と命名されている）。そのＳＭＶＤＡ１との密接な関係を考慮して、我々はＳＭＶＤＡ１の５、１、及び０．５μＭを用いて、ＳＭＶＤＡ１．１を感染性アッセイにおいてさらに並べて試験した。ＳＭＶＤＡ１は、５０及び２５μＭで強い影響を有する一方で（図７Ａ、７Ｂ、８Ａ、及び８Ｂ参照）、低濃度でのその抗ウイルス活性は、５及び１μＭで感染性を５０％以下にノックダウンすることにより、強力とは言えないがやや効果があり、０．５μＭでは最も小さな感染性への影響を有した（図７Ａ、７Ｂ、８Ａ、及び８Ｂ参照）。一方、試験した全ての濃度３種において、ＳＭＶＤＡ１．１は、コントロールの３０％未満の感染性にまで減少させることができた（図７Ａ、７Ｂ、８Ａ、及び８Ｂ参照）。
【０１５６】
この段階で、我々は＋Ａ３Ｇの感染性アッセイに基づいた、抗ウイルス活性を有する化合物を７種類有していた。全てのヒットの７種類を、＋Ｖｉｆ＆Ａ３Ｇ及び−Ｖｉｆ＆Ａ３Ｇ間の感染力の差異を示すそれらの能力についてさらに試験した。ここでの理論的根拠は、これらの化合物が本当にＶｉｆ二量体化の拮抗物質として作用し、Ａ３Ｇを使用しない（sparing）場合、それらは、Ｖｉｆ選択的反応を示すはずであるということである。この方向で、ＳＭＶＤＡ４−６は、＋／‐Ｖｉｆ＆Ａ３Ｇ間で有意差を有しておらず、したがって、さらなる検討からそれらを除外した（図７Ａ−７Ｂ参照）。これは、２条件間においてＳＭＶＤＡ１、１．１、２、及び３の全てに差異をもたらした。これは、特定のレベルの標的特異性を示唆している。最も有意な差異は、ＳＭＶＤＡ１についての５μＭ及びＳＭＶＤＡ１．１についての０.５μＭであった（図７Ａ−７Ｂ参照）。
【０１５７】
第五部。Ａ３Ｇウイルス粒子含量についてのヒットの詳細な調査。標的特異性を観察するための別の方法は、ウイルス粒子内に封入されているＡ３Ｇの量を調べることである。ＶｉｆはＡ３Ｇがウイルスに侵入することを妨害することから、より多くのＡ３Ｇが、Ｖｉｆの機能を無効にする小分子を投与された細胞から単離されたウイルス粒子中に存在するはずである。これはＳＭＶＤＡ１及び１．１の場合に観察され、感染性のデータに見られるように、ＳＭＶＤＡ１．１は低用量でより良い働きをし、５μＭではウイルス中のＡ３Ｇを最も多く有しているように見えた（図８Ａ−８Ｂ参照）。高用量が細胞毒性でありそれによりウイルスの低い収率がもたらされることを示唆している他の小分子と比較して、より多くの量が、ＳＭＶＤＡ１．１が１１及び５μＭによりｐ２４負荷を正規化するために必要とされたことに留意する必要がある。ＳＭＶＤＡ１．１の最低用量ですら有効であったという事実は、Ｖｉｆの真の影響を効果的に示唆した。ＳＭＶＤＡ２及び３を投与されたウイルス粒子中には投与量の広い範囲にわたりＡ３Ｇがほとんど存在しないという発見は、この結論を支持した。これは、それらの抗ウイルス活性が、Ｖｉｆについて選択的ではなかったことを示唆している（図８Ａ−８Ｂ参照）。
【０１５８】
最初のスクリーニングからのヒットの我々の完全な分析は、我々のテストの全てに合格した関連化合物の２つ（ＳＭＶＤＡ１及び１．１）を私たちに残した。これらの化合物間の密接な関係を考えると、これらの化合物の私達の選別は、ＳＡＲがナノモル標的選択性及びより低い細胞毒性について最適化できることが化学型の又は化学的骨格（chemical scaffold）の１つにより特定されていることを示唆している。さらに、これらの化合物の低マイクロモルの効力は、医薬品物質が、ナノモルで抗ウイルスのＩＣ５０とＩＣ９５とを有する化合物を同定することができることを示唆している。
【０１５９】
《実施例３》
Ｖｉｆ多量体化撹乱物質についての小分子の試験
一次スクリーニングを使用して、Ｖｉｆ二量体化についてのＦｑＲＥＴセルベースアッセイを用いて二連で試験した３３６，０６１化合物のスクリーニングの後に、化合物６８２個をヒットとして決定した。
【０１６０】
医薬品化学物質分析を、他のバイオアッセイにおけるヒットの偏在（ubiquity）に基づいて化合物を排除するであろう一連の基準を用いて行い、そしてさらに、医薬品化学物質のための化学基の扱いやすさ（tractability）により化合物２４７個を除外し、４３５個に減少した二次分析用のヒットリストがもたらされた。
【０１６１】
確認スクリーニング（ｑＨＴＳ及び毒性試験）を行った。一次スクリーニングの定量的なバージョンを８用量の範囲にわたって実施し、用量依存性曲線を取得しそしてＣ列（column C）においてＥＣ５０の値を決定した。２９３Ｔ細胞における同じ用量についての毒性試験を同時に行い、Ｄ列においてＣＣ５０値を得た（ＣＣ５０／ＥＣ５０＝治療指数（Therapuetic index））。図９に記載された化合物４２種は、最も低いＥＣ５０値及び最も高い治療指数による化合物４３５個からの化合物である。
【０１６２】
《実施例４》
Ｖｉｆ多量体化撹乱物質の二次スクリーニング
乾燥粉末３２種を、一次アッセイおよび二次アッセイ１からのリードのように分析した。図１０−１９には、二次アッセイ２及び３から得られた方法とデータの概要が含まれており、Ｔ細胞株における毒性スクリーニング（図１９）、二次アッセイ４、Ｖｉｆ依存性Ａ３Ｇ分解アッセイ（図１０−１２及び１６）、並びに二次アッセイ６、ウイルス粒子内のＡ３Ｇ分析（図１８）によるシングルサイクル感染性アッセイ（図１３−１５及び１７）である。二次アッセイ５は、代わりにタグ付けされたＶｉｆの共免疫沈降法（Co-IP）により、特にＶｉｆタンパク質による方法と矛盾することが証明された。ＣＢＦｂと呼ばれる豊富な細胞タンパク質により細胞内で安定化されるＶｉｆの最近の発見は、Ａ３Ｇ及びＶｉｆ又はＣＢＦｂ及びＶｉｆのいずれかの間の共免疫沈降法と比較してＶｉｆ共免疫沈降法が劣っていることの理由を明らかにしている。細胞溶解物中のタンパク質の（すなわちＡ３Ｇ及び／又はＣＢＦｂの）安定化の減少は、共免疫沈降法におけるベイト（bait）としてＶｉｆを使用する場合にＶｉｆ安定化に弊害をもたらす可能性があり、そしてＣＢＦｂ同時過剰発現を介したさらなる最適化は、Ｖｉｆ二量体化に対する影響についての化学物質の分析のための共免疫沈降法の十分な清潔さを得るために必要とされる可能性がある。
【０１６３】
以下の概要は、我々が、医薬品化学物質の最適化のための主要なリードであると考えられている二次アッセイ２、３、４及び６からの肯定的な結果を有する化学物質３種を保有していることを示している。独立した活性におけるリードからの医薬品物質（Ｏ２−１６と名付けられた、内部スクリーンからの最初のヒットＯ２−０１の１６番目の誘導体）は、ここで報告された３種と同様の属性を有する化合物を生産しており、Ａ３．０１（Ａ３Ｇ＋）及びＣＥＭ−ＳＳ（Ａ３Ｇ−）Ｔ細胞株におけるＨＩＶ ＩＩＩＢ感染を広げている生ウイルスを進行すらし、そして完全なＡ３Ｇ依存性を示し、そしてシングルサイクル感染性実験において３０ｍＭで最も有効であるにも関わらず、別々の試験２つにおいて下位のｍＭの範囲（sub mM range）で有効である。Ｏ２−１６のデータは、我々がＶｉｆ及びＡ３Ｇ抗ウイルス経路ターゲット上にある化学プローブを得る際に有益であることを示唆しているので、これは、抗ウイルス化合物のために、ここで提示されたリードにおけるＶｉｆ二量体化の標的志向性（targetability）の両方の信頼性を提供している。
【０１６４】
下記は、図１０−１９に関するさらなる概要である。
【０１６５】
図１０Ａ−１０Ｂ：Ｖｉｆ依存性Ａ３Ｇ−ｍＣｈｅｒｒｙ分解アッセイ。
Ａ３Ｇ−ｍＣｈｅｒｒｙを、２９３Ｔ細胞においてピューロマイシン選択下（puromycin selection）で安定的に発現する。Ｖｉｆ５０ｎｇを３８４ウェルフォーマットにおいてＴｕｒｂｏｆｅｃｔを用いて一時的に細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後に化学物質を（０．５〜１６μＭ）の範囲で細胞に添加した。化学物質を添加した２４時間後に、ｍＣｈｅｒｒｙシグナルをＢｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ４プレートリーダーで読み取った。プレーティングされたがＶｉｆでトランスフェクトされていない細胞からのシグナルを平均化しそして１００％に設定し（左の画像）、ＶｉｆでトランスフェクトされそしてＤＭＳＯのみで処理された細胞を平均化しそして０％に設定した（右の画像）。プロテアソーム分解経路にＡ３Ｇをシャペロン（chaperone）するＶｉｆの能力を阻害する化学物質は、ＤＭＳＯのみのコントロールと比較して増加したｍＣｈｅｒｒｙシグナルをもたらすであろう。そしてＶｉｆなしポジティブコントロールよりもより高い任意のシグナルは、化学物質それ自体からの自己蛍光に起因する可能性がある。
【０１６６】
図１１：Ｖｉｆ依存性Ａ３Ｇ−ｍＣｈｅｒｒｙ分解アッセイのデータ。
番号付けを簡素化するために、化合物を元のバイアルにおいてプレーティングされたものと同じ順番で１〜３２まで番号を付け、そしてブロード（Broad）によりバイアルとともに送付された元の乾燥粉末リスト（Dry Powder list）上にリストした。カラムチャートは、１〜３２の順番で化学物質の全てについて異なる日に実施された重複した実験を並べて示し、グループ分けにおいては１００−０％間で設定されたＹ軸により１６〜０．５μＭの高から低濃度、換言すればポジティブ及びネガティブコントロールと比較したｍＣｈｅｒｒｙシグナル量とした。第一の化合物はＯ２−１６であり、この化合物は、上述された以前の生ウイルス試験における強いＡ３Ｇ依存性によるＯｙａｇｅｎスクリーニングからのリードであり、そして設定された最後のデータは、０％のマークを設定するために平均化されたＤＭＳＯコントロールである。青いボックスに入った領域は、全ての濃度での強い信号又は固体用量依存性（solid dose dependency）のいずれかを有していた化学物質１５種を強調している。
【０１６７】
図１２：ヒットであった化合物についての個々のグラフ。
ヒットの１５種について、図１１からのスクリーニング２つの平均からのデータを、用量依存性を表示するためにトレンドラインによる個々のＸＹ散布図として表している。
【０１６８】
図１３：シングルサイクル感染性。
この図は、シングルサイクルの感染性実験がどのように行われたかを視覚的に表現したものである。それらは、ウイルス粒子中Ａ３Ｇのウェスタンブロット検出用のウイルス粒子精製を行うために十分なウイルスを得るために、６ウェルフォーマットである。偽ＨＩＶによるシングルラウンド感染におけるヒットの抗ウイルス活性は、＋／− Ａ３ＧのＨＥＫ２９３Ｔプロデューサー細胞及び＋／− Ｖｉｆであるウイルスを使用して行った。野生型ＨＩＶプロウイルスベクターは、ｎｅｆ（ＥＧＦＰに置き換えられている）及びｅｎｖを除くＨＩＶ遺伝子の全てをコードしている。ΔＶｉｆプロウイルスベクターは、Ｖｉｆ遺伝子内の上流に停止コドンを含んでいることを除いて野生型と同一である。ΔＶｉｆの存在なしで、Ａ３Ｇは、ウイルス粒子内にカプシド化されることができ、そして強力な抗ウイルス活性を有することができるので、ΔＶｉｆ＋Ａ３Ｇは、このアッセイのための強力なポジティブコントロールである。あるいは、Ａ３Ｇの非存在下では、野生型及びΔＶｉｆウイルスの両方は、高い感染力を有している必要がある。
【０１６９】
シングルラウンド感染性アッセイでは、Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた＋Ａ３Ｇ条件におけるＶＳＶ−Ｇコートタンパク質ベクター及びＶ５−Ａ３Ｇによるウイルスベクターの一時的なトランスフェクションを利用した。プロウイルスＤＮＡ：ＶＳＶ−Ｇ：Ａ３Ｇを、内因性Ａ３Ｇに相当するＡ３Ｇのレベルを確立する比率１：０．５：０．０４で細胞に添加した。これらのウイルスプロデューサー細胞に、トランスフェクションの４時間後に化学物質を投与し、そしてトランスフェクションの２４時間後に、０．４５ミクロンシリンジフィルターを通して濾過することにより、ウイルス粒子を培地から回収した。次いでウイルス負荷を、ｐ２４ ＥＬＩＳＡ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて正規化した。
【０１７０】
感染は、ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターにより駆動された安定的に組み込まれたルシフェラーゼを含むＴＺＭ−ｂｌレポーター細胞を利用しており、したがって、ルシフェラーゼはＨＩＶ感染が成功した際に発現される。５００ｐｇ ｐ２４／ウェルによる１０，０００細胞／ウェルでの９６ウェルプレート中における三連の感染を、各々のウェルにＳｔｅａｄｙＧｌｏＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｐｒｏｍｅｇａ）を３０分間添加する前に、４８時間進行させた。化学物質なしによる相対発光単位（ＲＬＵ）が１００％に設定されているコントロールと比較して、発光を、各々の化合物と感染性の変化についての定量的測定基準（quantitative metric）として測定した。
【０１７１】
図１４：シングルサイクル感染性（否定的な結果のフラギング）
この図は、実験方法においてどこで否定的な結果が生じたかを強調することを意図している。スクリーニングのこの時点までの化合物の全ては、１次及び２次スクリーニングではほとんど又は全く毒性を示さないが、細胞がウイルス産生に挑戦する場合は、細胞は細胞経路を追い越す（overtaking）ウイルスタンパク質及び化学物質からの任意の有害な影響に対して戦わなければならないため、それらは化学反応からの毒性に対してより敏感である。これは、プレートからの接着細胞のリフトオフ（lifting off）と一緒にウイルス産生を行うことができない細胞を介して感染性アッセイに侵入するためには十分ではないウイルス及び化学物質の存在下において細胞により表示される細胞毒性及びウイルス産生とともに、化学物質は毒性でありそしてオフターゲットであるとフラグすることができる（赤いノーサイン（Red No Sign））。プロデューサー細胞が健康でありそして感染性試験のための十分なウイルスを作成する場合は、３種類の起こり得る結果がありそして２つは、プローブの開発を前進するための任意の化学物質のために望ましくない。第一は、抗ウイルス活性の欠如であり、第二は、Ｖｉｆ及びＡ３Ｇ発現から独立している抗ウイルス活性である（黄色いノーサイン（Yellow No Sign））。最後に、代表的なもの（gold standard）は、Ｖｉｆ及びＡ３Ｇ依存性抗ウイルス活性である。これは、Ｖｉｆ及びＡ３Ｇの存在下対Ｖｉｆ及びＡ３Ｇの非存在下における感染性の間の、最高の感染力の差異として表される。
【０１７２】
図１５：シングルサイクル感染性データ
この図は、Ａ３Ｇ分解アッセイを通過した化学物質の１５種、及びそれらがどのようにシングルサイクル感染性アッセイで調製されたかの概要である。６種は、細胞毒性でありそして実験を進めるのに十分でないウイルスが産生された。構造的類似性は、特に化学物質１及び２９間で明らかであり、２及び４、並びに８及び２８間においてはあまり明らかではない。化学物質６、７、及び１９は、試験されたいずれの濃度においても抗ウイルス活性なしで野生型のレベルの感染性を示した。また、３、５、及び２７が抗ウイルス性であった一方で、Ｖｉｆ及びＡ３Ｇが存在せずそして＋／− Ｖｉｆ及びＡ３Ｇの差異を示さなかった場合に、それらは等しく抗ウイルス性であった。これらのカテゴリーの化合物間では明らかな構造的類似性は認められなかった。最後に、ウイルス粒子中Ａ３Ｇの増加に伴って＋／− Ｖｉｆ及びＡ３Ｇ感染による抗ウイルス活性差を示したリード化合物３種が存在した。化合物９及び２４は、環２つとその環内の窒素４個における共通の構造要素を共有する。３種全てがフッ素を含む一方で、化合物２１及び２４の両方は、５員環外にトリフルオロメチル基を有している。
【０１７３】
図１６：リード化合物スクリーニングの概要
この図は、並べて比較するために、単用量（８μＭ）でのＤＭＳＯストックテスト（１２月に乾燥粉末目にＯｙａｇｅｎに送付された）の添加を用いる一次及び二次スクリーニングにおいてどのようにリード化合物３種が成型されたかを要約している。化合物９はＤＭＳＯストックテストについては低いが、これは乾燥粉末テストにおける低いＥＣ５０と一致していることが注目される。一番下の化学物質は、一次ｑＨＴＳ及び二次毒性スクリーニング（tox screen）のリードであるがＤＭＳＯ及び乾燥粉末形態で試験に使用することができなかった元のリストにおける化合物の４２種である。化合物２１に対するその構造的類似性及び一次スクリーニングにおける同程度のＥＣ５０のために注目される。
【０１７４】
図１７：リード化合物感染性の概要
各々の化合物を異なる感染性アッセイにおいて複数の濃度で試験した。濃度は最上層にリストされており、＋及び−Ｖｉｆ及びＡ３Ｇ条件の両方についての化学物質なしのコントロールと比較した感染性が次に記載されており、そして一番下の大きな数字は、Ａ３Ｇなしの−Ｖｉｆウイルスに対する＋Ｖｉｆウイルス及び同時にトランスフェクトされたＡ３Ｇによる感染性の間の差異である（紫の数字はよい値でありそして青い数字は弱い値である）。化合物２４及び９は、１５μＭより低い試験した全ての濃度で有効性を示したが、１５μＭより高い濃度ではわずかな毒性を有していた。化合物９については、化学物質なしのコントロールと比較した感染性の低下は＋Ｖｉｆ及びＡ３Ｇ感染性についての化合物２１及び２４ほど低くはないが、乾燥粉末感染性Ｂ及びＣにおいて２４及び２１の０．３３及び０．４４より低い＋／− Ｖｉｆ及び３Ｇウイルス間の差異を作成するコントロールと比較して−Ｖｉｆ及びＡ３Ｇ感染性において増加していた。ｐ２４によるウイルス負荷の正規化は培地における全ウイルス粒子のみを占めたが、成熟と未成熟ビリオンとを区別することがでないことが注目される。化学物質なしのコントロールと比較した成熟ビリオンのパーセンテージに影響を与える場合は、これらのビリアルプレップ（virial preps）の両方は化学物質を含有しそして感染性アッセイにおけるウイルス集団に対する同様の影響を有すると考えられるので、コントロールと比較してウイルス感染性の値に影響がある可能性がある。他方で、化合物２１は、１５μＭで＋Ｖｉｆ及びＡ３Ｇ感染性の５６％を有するが、−Ｖｉｆ及びＡ３Ｇ感染性は０．８８しか差異がないたった６３％である。上記の３０μＭを超えるものは、乾燥粉末感染性Ａ及びＣについて０．６５及び０．５７で許容できる範囲における差異であるが、シングルサイクル感染性アッセイにおける濃度で影響を与える毒性がないことに注目するべきである。
【０１７５】
シングルサイクル感染性はＶｉｆ及びＡ３Ｇ依存性の良好な指標であり、有効濃度は、必ずしも生ウイルス実験に変換されない。例えば、以前のスクリーニングからのリードのＯ２−１６は、３０μＭ超でのみ強い差異のあるシングルサイクル感染性アッセイにおいて作用するが、生ウイルス実験においてはＨＩＢ ＩＩＩＢによる１４日間の急性感染において０．４μＭでのＣＥＭＳＳ（−Ａ３Ｇ細胞）の感染に全く影響はないが、０．４μＭでＡ３．０１（＋ Ａ３Ｇ細胞）におけるウイルスの培養の完全な滅菌がある。また、コントロールと比較した感染性の差（すなわち、９についての増加及び２１についての減少）は、シングルサイクルの実験又は２９３Ｔ細胞に特異的である可能性がある。
【０１７６】
図１８：リード化合物はウイルス粒子中のＡ３Ｇを増加させる
乾燥粉末感染性Ｂ及びＣと並行して、ウイルス粒子（３０ｎｇのｐ２４）を２０％スクロースクッション（sucrose cushion）を通じてペレット化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに溶解しそしてＶ５タグ付けＡ３Ｇ及びｐ２４についてウェスタンブロットを行った。（ウイルス負荷コントロールとして）ｐ２４と比較したＡ３Ｇの収量を、走査デンシトメトリー（scanning densitometry）によって定量化し、抗ウイルスメカニズムを検証した。最初の２レーンは、Ａ３Ｇによる−Ｖｉｆウイルス（ポジティブコントロール）とＡ３Ｇによる＋Ｖｉｆウイルス（ネガティブコントロール）である。ネガティブコントロールについてのＡ３Ｇ：ｐ２４の比率を１に設定した（比率をウェスタンの下にリストした）。化学物質２４は、ネガティブコントロールの５及び１５倍増加していた。一方で化学物質９はコントロールの５５及び７６倍増加しており、これらの両方はネガティブコントロールよりも４８倍増加しているポジティブコントロールよりも高かった。しかし、ポジティブコントロールは、９よりも全体的な感染性および差異が少ない。ウイルス粒子単離の注意点の１つは、スクロースクッションを介してウイルス粒子から細胞からのエキソソーム材料を分離することができないことであり、したがって、プレップ中のエキソソーム含量を増加させる化学物質、特に化学物質９の場合のようにウイルス負荷が低くそしてより多くのウイルス培地がｐ２４の３０ｎｇを正規化するために必要とされる場合の結果としてＡ３Ｇをウイルスペレット中で人為的に強化することが可能である。ＶｉｆとＡ３Ｇ両方あり又はなしの感染性の全体的な増加に伴ったウイルス粒子中のＡ３Ｇの増加は、化学物質９が、この感染性アッセイに独特の影響を有していることを示唆しているが、２４に対する構造的類似性と同様のウイルス粒子における低い差異及び高いＡ３Ｇがそれを追求することが興味深い骨格にしている。化学物質２１では、他の２つの４及び５倍の増加と比べてウイルス粒子中Ａ３Ｇの適度な増加があったが、しかし文献は、同じ程度に低いウイルス粒子中Ａ３Ｇが、高頻度変異を引き起こすのに十分であることを示唆している。重要なことに、２１と比較して同様のレベルで＋Ｖｉｆ及びＡ３Ｇ抗ウイルス活性を有するがＶｉｆ及びＡ３Ｇ依存性ではない化学物質２７は、ネガティブコントロールに対する増加を示さなかった。全体的に、変化にかかわらず、これらの化合物３種は、ウイルス粒子中Ａ３Ｇの用量依存性の増加とともに繰り返しの強いＶｉｆ及びＡ３Ｇ依存性抗ウイルス活性を示す。
【０１７７】
図１９：リード化合物の毒性の概要
この点に対するスクリーニングの全ては、２９３Ｔ細胞とＢＲＤを利用した。２９３Ｔ毒性スクリーニングは、３０μＭに至るまで２９３Ｔ細胞においてこれらの化合物について有意な毒性を示さなかったが、生ウイルス試験及びインビボにおいてＨＩＶにより影響される細胞を考慮して、我々は化学物質２４、９及び２１の毒性についてＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ａｓｓａｙを用いて試験した。理論的根拠は、進行しているこれらの骨格から作成された化合物由来の医薬品化学物質を測定するためにＴ細胞におけるＣＣ５０基準を設定することである。両方がＡ３Ｇ依存性について感染性を広げる生ウイルスにおいて比較するために使用することができるＴ細胞由来ＣＥＭであるために、ＣＥＭＳＳ（−Ａ３Ｇ）及びＡ３．０１（＋Ａ３Ｇ）を選択した。化学物質２４はこれらの細胞株において９．７及び４．９μＭのＣＣ５０値でこれらの細胞株において有意な毒性を示し、そして医薬品化学物質は、２４の骨格の周囲のこれらの数に対する改善を模索する必要があり、注目すべきは、元のヒットＯ２−０１がＴ細胞において２４より低いものであるが有意な毒性を示すことであり、しかし、医薬品化学物質を、有効性を維持する一方でＣＣ５０における１３．５倍の減少を有するＯ２−１６を開発するために利用した。実際には、シングルサイクルアッセイでのＶｉｆ依存表現型にもかかわらず、Ｏ２−０１は、生ウイルスにおいてＡ３Ｇ依存性ではなく、おそらく毒性の影響のために、Ｏ２−１６が毒性を排除した場合にＡ３Ｇ依存性は生ウイルス試験において完全に明確であった。一方で、化学物質９及び２１は、２５μＭ超の全てで上記のＣＣ５０値を有していた。これらの値は、シングルサイクル感染性アッセイにおいて３０μＭで最も効果的であったにもかかわらず０．４μＭでＡ３．０１細胞における有効な抗ウイルスであった、Ｏ２−１６と同等である。
【０１７８】
本発明を、特定の実施態様を参照しながら説明してきたが、様々な変更を行うことができそして等価物が本発明の真の要旨及び範囲から逸脱することなく置換されていてもよいことは、当業者によって理解されるべきである。さらに、本発明の目的の要旨及び範囲に対して、特定の状況、材料、物質、プロセス、プロセスステップ又はステップに適用されるために多くの改変がなされることができる。そのような改変の全ては、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【０１７９】
《参照文献》
本明細書における参照文献の引用は、前記参照文献が本発明に対する先行技術であると認めるものであると解釈してはならない。本明細書に引用される全ての参照文献は、本明細書にその全体が参照として援用される。以下に、本明細書に引用された参照文献のリストは以下のとおりである：
1. Frankel, A.D. and Young, lA. (1998) HIV-l: fifteen proteins and an RNA. Annu Rev Biochem, 67,1-25. 
2. Sheehy, A.M., Gaddis, N.C., Choi, lD., Malim, M.H. (2002) Isolation of a human gene that inhibits HIV-l infection and is suppressed by the viral Vifprotein. Nature, 418, 646-650. 
3. Madani, N. and Kabat, D. (1998) An endogenous inhibitor of human immunodeficiency virus in human lymphocytes is overcome by the viral Vif protein. J Virol, 72, 10251-10255. 
4. Simon, lH., Gaddis, N.C., Fouchier, R.A. and Malim, M.H. (1998) Evidence for a newly discovered cellular anti-HIV-l phenotype. Nat Med, 4,1397-1400. 
5. Sova, P. and Volsky, D.l (1993) Efficiency of viral DNA synthesis during infection of permissive and nonpermissive cells with vif-negative human immunodeficiency virus type 1. J Virol, 67, 6322-6326. 
6. von Schwedler, D., Song, l, Aiken, C. and Trono, D. (1993) Vif is crucial for human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA synthesis in infected cells. J Virol, 67, 4945-4955. 
7. Simon, lH. and Malim, M.H. (1996) The human immunodeficiency virus type 1 Vif protein modulates the postpenetration stability of viral nucleoprotein complexes. J Virol, 70, 5297-5305. 
8. Courcoul, M., Patience, c., Rey, F., Blanc, D., Harmache, A., Sire, J., Vigne, R. and Spire, B. (1995) Peripheral blood mononuclear cells produce normal amounts of defective Vif- human immunodeficiency virus type 1 particles which are restricted for the preretrotranscription steps. J Virol, 69,2068-2074. 
9. Mangeat, B., Turelli, P., Caron, G., Friedli, M., Perrin, L. and Trono, D. (2003) Broad antiretroviral defence by human APOBEC3G through lethal editing of nascent reverse transcripts. Nature, 424, 99-103. 
10. Harris, R.S., Bishop, K.N., Sheehy, A.M., Craig, H.M., Petersen-Mahrt, S.K., Watt, LN., Neuberger, M.S. and Malim, M.H. (2003) DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection. Cell, 113,803-809. 
11. Zhang, H., Yang, B., Pomerantz, R.l, Zhang, c., Arunachalam, S.C. and Gao, L. (2003) The cytidine deaminase CEM15 induces hypermutation in newly synthesized HIV-l DNA. Nature, 424, 94-98. 
12. Jarmuz, A., Chester, A., Bayliss, l, Gisbourne, l, Dunham, I., Scott, J. and Navaratnam, N. (2002) An anthropoid-specific locus of orphan C to D RNA-editing enzymes on chromosome 22. Genomics, 79, 285-296. 
13. Wedekind, J.E., Dance, G.S., Sowden, M.P. and Smith, H.C. (2003) Messenger RNA editing in mammals: new members of the APOBEC family seeking roles in the family business. Trends Genet, 19, 207-216. 
14. Pham, P., Chelico, L. and Goodman, M.F. (2007) DNA deaminases AID and APOBEC3G act processively on single-stranded DNA. DNA Repair (Amst), 6, 689-692; author reply 693-684. 
15. Chelico, L., Pham, P., Calabrese, P. and Goodman, M.P. (2006) APOBEC3G DNA deaminase acts processively 3’ --> 5’ on single-stranded DNA. Nat Struct Mol BioI, 13,392-399. 
16. Suspene, R., Rusniok, c., Vartanian, J.P. and Wain-Hobson, S. (2006) Twin gradients in APOBEC3 edited HIV -1 DNA reflect the dynamics of lentiviral replication. Nucleic Acids Res, 34, 4677-4684. 
17. Yu, Q., Konig, R., Pillai, S., Chiles, K., Kearney, M., Palmer, S., Richman, D., Coffin, J.M. and Landau, N.R. (2004) Single-strand specificity of APOBEC3G accounts for minus-strand deamination of the HIV genome. Nat Struct Mol BioI, 11,435-442. 
18. Willetts, K.E., Rey, F., Agostini, I., Navarro, J.M., Baudat, Y., Vigne, R. and Sire, 1 (1999) DNA repair enzyme uracil DNA glycosylase is specifically incorporated into human immunodeficiency virus type 1 viral particles through a Vpr-independent mechanism. J Virol, 73, 1682-1688. 
19. Bouhamdan, M., Benichou, S., Rey, F., Navarro, J.M., Agostini, I., Spire, B., Camonis, l, Slupphaug, G., Vigne, R., Benarous, R. et al. (1996) Human immunodeficiency virus type 1 Vpr protein binds to the uracil DNA glycosylase DNA repair enzyme. J Virol, 70, 697-704. 
20. Bishop, K.N., Holmes, R.K. and Malim, M.H. (2006) Antiviral potency of APOBEC proteins does not correlate with cytidine deamination. J Virol, 80, 8450-8458. 
21. Guo, F., Cen, S., Niu, M., Saadatmand, 1 and Kleiman, L. (2006) Inhibition of formula-primed reverse transcription by human APOBEC3G during human immunodeficiency virus type 1 replication. J Virol, 80, 11710-11722. 
22. Li, X.Y., Guo, F., Zhang, L., Kleiman, L. and Cen, S. (2007) APOBEC3G inhibits DNA strand transfer during HIV-l reverse transcription. J BioI Chern, 44, 32065-32074. 
23. Mariani, R., Chen, D., Schrofelbauer, B., Navarro, F., Konig, R., Bollman, B., Munk, C., NymarkMcMahon, H. and Landau, N.R. (2003) Species-specific exclusion of APOBEC3G from HIV-l virions by Vif. Cell, 114, 21-31. 
24. Stopak, K., De Noronha, c., Yonemoto, W., and Greene, W.c. (2003) HIV -1 Vif Blocks the Antiviral Activity of APOBEC3G by Impairing both Its Translation and Intracellular Stability. Mol Cell, 12,591-601. 
25. Yu, X., Yu, Y., Liu, B., Luo, K., Kong, W., Mao, P. and Yu, X.F. (2003) Induction of APOBEC3G ubiquitination and degradation by an HIV -1 Vif-CuI5-SCF complex. Science, 302, 1056-1060. 
26. Mehle, A., Goncalves, 1, Santa-Marta, M., McPike, M. and Gabuzda, D. (2004) Phosphorylation of a novel SOCS-box regulates assembly of the HIV -1 Vif-Cul5 complex that promotes APOBEC3G degradation. Genes Dev, 18,2861-2866. 
27. Mehle, A., Thomas, E.R., Rajendran, K.S. and Gabuzda, D. (2006) A zinc-binding region in Vifbinds Cul5 and determines cullin selection. J BioI Chern, 281, 17259-17265. 
28. Dang, Y., Siew, L.M. and Zheng, Y.H. (2008) APOBEC3G is degraded by the proteasomal pathway in a Vif-dependent manner without being polyubiquitylated. J BioI Chern, 283, 13124-13131. 
29. Schrofelbauer, B., Chen, D. and Landau, N.R. (2004) A single amino acid of APOBEC3G controls its species-specific interaction with virion infectivity factor (Vif). Proc Natl Acad Sci USA, 101,3927-3932. 
30. Xu, H., Svarovskaia, E.S., Barr, R., Zhang, Y., Khan, M.A., Strebel, K. and Pathak, V.K. (2004) A single amino acid substitution in human APOBEC3G antiretroviral enzyme confers resistance to HIV-l virion infectivity factor-induced depletion. Proc Natl Acad Sci USA, 101,5652-5657. 
31. Mangeat, B., Turelli, P., Liao, S. and Trono, D. (2004) A single amino acid determinant governs the species-specific sensitivity of APOBEC3G to Vif action. J BioI Chern, 279,14481-14483. 
32. Huthoff, H. and Malim, M.H. (2007) Identification of amino acid residues in APOBEC3G required for regulation by human immunodeficiency virus type 1 Vif and Virion encapsidation. J Virol, 81, 3807-3815. 
33. Russell, R.A. and Pathak, V.K. (2007) Identification of two distinct human immunodeficiency virus type 1 Vif determinants critical for interactions with human APOBEC3G and APOBEC3F. J Virol, 81,8201-8210. 
34. Schrofelbauer, B., Senger, T., Manning, G. and Landau, N.R. (2006) Mutational alteration of human immunodeficiency virus type 1 Vif allows for functional interaction with nonhuman primate APOBEC3G. J Virol, 80, 5984-5991. 
35. Pery, E., Rajendran, K.S., Brazier, A.1 and Gabuzda, D. (2009) Regulation of APOBEC3 proteins by a novel YXXL motif in human immunodeficiency virus type 1 Vif and simian immunodeficiency virus SIVagm Vif. J Virol, 83, 2374-2381. 
36. He, Z., Zhang, W., Chen, G., Xu, R. and Yu, X.F. (2008) Characterization of conserved motifs in HIV-l Vif required for APOBEC3G and APOBEC3F interaction. J Mol BioI, 381, 1000-10 11. 
37. Yang, S., Sun, Y. and Zhang, H. (2001) The multimerization of human immunodeficiency virus type I Vif protein: a requirement for Vif function in the viral life cycle. J BioI Chern, 276, 4889-4893. 
38. Yang, B., Gao, L., Li, L., Lu, Z., Fan, X., Patel, C.A., Pomerantz, RJ., DuBois, G.C. and Zhang, H. (2003) Potent suppression of viral infectivity by the peptides that inhibit multimerization of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-l) Vifproteins. J BioI Chern, 278, 6596-6602. 
39. Miller, 1H., Presnyak, V. and Smith, H.C. (2007) The dimerization domain of HI V-I viral infectivity factor Vif is required to block virion incorporation of APOBEC3G. Retrovirology, 4,81. 
40. Donahue, 1P., Vetter, M.L., Mukhtar, N.A. and D’Aquila, R.T. (2008) The HIV-l VifPPLP motif is necessary for human APOBEC3G binding and degradation. Virology, 377, 49-53. 
41. Mehle, A, Wilson, H., Zhang, c., Brazier, A1, McPike, M., Pery, E. and Gabuzda, D. (2007) Identification of an APOBEC3G binding site in human immunodeficiency virus type 1 Vif and inhibitors of Vif-APOBEC3G binding. J Virol, 81, 13235-13241. 
42. Nathans, R, Cao, H., Sharova, N., Ali, A, Sharkey, M., Stranska, R., Stevenson, M. and Rana, T.M. (2008) Small-molecule inhibition ofHIV-1 Vif. Nat Biotechnol, 26,1187-1192. 
43. Luo, K., Liu, B., Xiao, Z., Yu, Y., Yu, X., Gorelick, R. and Yu, X.P. (2004) Amino-terminal region of the human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid is required for human APOBEC3G packaging. J Virol, 78, 11841-11852. 
44. Cen, S., Guo, F., Niu, M., Saadatmand, 1, Deflassieux, 1 and Kleiman, L. (2004) The interaction between HIV-1 Gag and APOBEC3G. J BioI Chem, 279, 33177-33184. 
45. Bennett, RP., Presnyak, V., Wedekind, 1E. and Smith, H.C. (2008) Nuclear Exclusion of the HIV-1 host defense factor APOBEC3G requires a novel cytoplasmic retention signal and is not dependent on RNA binding. J BioI Chem, 283, 7320-7327. 
46. Bennett, RP., Diner, E., Sowden, M.P., Lees, J.A, Wedekind, 1E. and Smith, H.C. (2006) APOBEC-1 and AID are nucleo-cytoplasmic trafficking proteins but APOBEC3G cannot traffic. Biochem Biophys Res Commun, 350, 214-219. 
47. Oppezzo, P., Vuillier, F., Vasconcelos, Y., Dumas, G., Magnac, C., Payelle-Brogard, B., Pritsch, O. and Dighiero, G. (2003) Chronic lymphocytic leukemia B cells expressing AID display dissociation between class switch recombination and somatic hypermutation. Blood, 101,4029-4032. 
48. Okazaki, LM., Hiai, H., Kakazu, N., Yamada, S., Muramatsu, M., Kinoshita, K. and Honjo, T. (2003) Constitutive expression of AID leads to tumorigenesis. J Exp Med, 197, 1173-1181. 
49. Yamanaka, S., M. Balestra, L. Ferrell, J. Fan, K. S. Arnold, S. Taylor, 1 M. Taylor, Innerarity, T. L. (1995) Apolipoprotein B mRNA editing protein induces hepatocellular carcinoma and dysplasia in transgenic animals. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 92,8483-8487. 
50. Yamanaka, S., Poksay, K.S., Arnold, K.S. and Innerarity, T.L. (1997) A novel translational repressor mRNA is edited extensively in livers containing tumors caused by the transgene expression of the apoB mRNA- editing enzyme. Genes Dev, 11, 321-333. 
51. Babbage, G., Ottensmeier, C.H., Blaydes, 1, Stevenson, F.K. and Sahota, S.S. (2006) Immunoglobulin heavy chain locus events and expression of activation-induced cytidine deaminase in epithelial breast cancer cell lines. Cancer Res, 66, 3996-4000. 
52. Duquette, M.L., Pham, P., Goodman, M.P. and Maizels, N. (2005) AID binds to transcription-induced structures in c-MYC that map to regions associated with translocation and hypermutation. Oncogene, 24,5791-5798. 
53. Rucci, P., Cattaneo, L., Marrella, V., Sacco, M.G., Sobacchi, C., Lucchini, F., Nicola, S., Della Bella, S., Villa, M.L., Imberti, L. et al. (2006) Tissue-specific sensitivity to AID expression in transgenic mouse models. Gene, 377,150-158. 
54. Ganesan, S., Ameer-Beg, S.M., Ng, T.T., Vojnovic, B. and Wouters, F.S. (2006) A dark yellow fluorescent protein (YFP)-based Resonance Energy-Accepting Chromoprotein (REACh) for Forster resonance energy transfer with GFP. Proc Natl Acad Sci USA, 103,4089-4094. 
55. Lee, P.A, Tullman-Ercek, D. and Georgiou, G. (2006) The bacterial twin-arginine translocation pathway. Annu Rev Microbiol, 60, 373-395. 
56. DeLisa, M.P., Tullman, D. and Georgiou, G. (2003) Folding quality control in the export of proteins by the bacterial twin-arginine translocation pathway. Proc Natl Acad Sci USA, 100,6115-6120. 
57. Waraho, D. and Delisa, M.P. (2009) Versatile selection technology for intracellular protein-protein interactions mediated by a unique bacterial hitchhiker transport mechanism. Proc Natl Acad Sci USA, 106,3692-3697. 
58. Lee, L.L., Ha, H., Chang, Y.T. and DeLisa, M.P. (2009) Discovery of amyloid-beta aggregation inhibitors using an engineered assay for intracellular protein folding and solubility. Protein Sci, 18,277-286. 
59. Bennett, RP., Salter, 1D., Liu, X., Wedekind, 1E. and Smith, H.C. (2008) APOBEC3G subunits selfassociate via the C-terminal deaminase domain. J BioI Chem, 283, 33329-33336. 
60. Soros, V.B., Yonemoto, W. and Greene, W.C. (2007) Newly synthesized APOBEC3G is incorporated into HIV virions, inhibited by HIV RNA, and subsequently activated by RNase H. PLoS Pathog, 3, e15. 
61. Wichroski, MJ., Ichiyama, K. and Rana, T.M. (2005) Analysis of HIV-l viral infectivity factormediated proteasome-dependent depletion of APOBEC3G: correlating function and subcellular localization. J BioI Chern, 280, 8387-8396. 
62. Platt, E.J., Wehrly, K., Kuhmann, S.E., Chesebro, B. and Kabat, D. (1998) Effects of CCR5 and CD4 cell surface concentrations on infections by macrophage tropic isolates of human immunodeficiency virus type 1. J Virol, 72, 2855-2864. 
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図９−７】
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【図９−８】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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