(57)【要約】  活性薬物と高分子ポリマーとを含み、前記活性薬物と前記高分子ポリマーが化学結合により結合しているポリ結合体において、前記活性薬物がポリエンマクロライド系抗生物質であり、前記高分子ポリマーがポリアミノ酸及びポリアミノヘキソースから選択されるポリ結合体及びその製造方法。前記ポリ結合体は、生物学的、理化学的性質の面で良好な性質を示しており、例えば、活性薬物の溶解性を向上させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性薬物と高分子ポリマーとを含み、前記活性薬物と前記高分子ポリマーが化学結合により結合しているポリ結合体。
【請求項２】
前記活性薬物がポリエンマクロライド系抗生物質である請求項１に記載のポリ結合体。
【請求項３】
前記活性薬物が、アムホテリシンＢ、ナイスタチン、ナタマイシン、トリコマイシン、メパルトリシン、Ｃａｎｎｉｔｒａｃｉｎ、フィリピン、オーレオフンギン、エトルスコマイシン、ハマイシン、ペリマイシンから選ばれるポリエンマクロライド系抗生物質である請求項１〜２に記載のポリ結合体。
【請求項４】
前記高分子ポリマーが、アミノ酸を重合させてなるポリアミノ酸、アミノヘキソースを重合させてなるポリアミノヘキソースから選ばれる請求項１〜３に記載のポリ結合体。
【請求項５】
前記高分子ポリマーが、アミノ酸を重合させてなるポリアミノ酸であり、前記アミノ酸が、カルボン酸系アミノ酸、アミノ系アミノ酸、又はそれらの組み合わせから選ばれる請求項１〜４に記載のポリ結合体。
【請求項６】
前記カルボン酸系アミノ酸が、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、又はそれらの任意比率の組み合わせから選ばれる請求項５に記載のポリ結合体。
【請求項７】
前記アミノ系アミノ酸が、オルニチン（Ｏｒｎ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒドロキシリシン（Ｈｙｌ）、又はそれらの任意比率の組み合わせから選ばれる請求項６に記載のポリ結合体。
【請求項８】
前記ポリアミノ酸を形成するアミノ酸が、Ｄ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸、ＤＬ混合アミノ酸を含む請求項４〜７に記載のポリ結合体。
【請求項９】
前記アミノヘキソースが、グルコサミン、ガラクトサミン、アセチルグルコサミン、アセチルガラクトサミン、又はそれらの組み合わせから選ばれる請求項４に記載のポリ結合体。
【請求項１０】
前記ポリアミノ酸の平均分子量が、５０００〜１０００００ダルトンである請求項４〜９に記載のポリ結合体。
【請求項１１】
前記ポリアミノヘキソースの平均分子量が、１００００〜２０００００ダルトンである請求項４〜９に記載のポリ結合体。
【請求項１２】
前記活性薬物の重量が、該ポリ結合体重量の５〜６０％である請求項１〜１１に記載のポリ結合体。
【請求項１３】
以下の工程：
ｉ）高分子ポリマーを溶媒に溶解させて溶液を形成する工程と；
ii）工程ｉ）で得られた溶液に活性薬物を加えて溶解させる工程と；
iii）工程ii）で得られた溶液に触媒と縮合剤とを加えて高分子ポリマーと活性薬物とを縮合反応させて、高分子ポリマーと活性薬物との両者が化学結合により結合しているポリ結合体を形成する工程と；
iv）得られたポリ結合体を分離採取する工程と；
を含む請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリ結合体の製造方法。
【請求項１４】
工程ｉ）に記載の溶媒が、例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程iii）に記載の触媒が、４−（ジメチルアミノ）ピリジンである請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
工程iii）に記載の縮合剤が、ジシクロヘキシルカルボジイミドである請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
活性薬物と高分子ポリマーとを化学結合により結合させてポリ結合体を形成する工程を含む活性薬物の溶解度向上方法。
【請求項１８】
前記活性薬物が、ポリエンマクロライド系抗生物質である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記活性薬物が、アムホテリシンＢ、ナイスタチン、ナタマイシン、トリコマイシン、メパルトリシン、Ｃａｎｎｉｔｒａｃｉｎ、フィリピン、オーレオフンギン、エトルスコマイシン、ハマイシン、ペリマイシンから選ばれるポリエンマクロライド系抗生物質である請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記高分子ポリマーが、アミノ酸を重合させてなるポリアミノ酸、アミノヘキソースを重合させてなるポリアミノヘキソースから選ばれる請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記高分子ポリマーが、アミノ酸を重合させてなるポリアミノ酸であり、前記アミノ酸が、カルボン酸系アミノ酸、アミノ系アミノ酸、又はそれらの組み合わせから選ばれる請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記カルボン酸系アミノ酸が、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、又はそれらの任意比率の組み合わせから選ばれる請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記アミノ系アミノ酸が、オルニチン（Ｏｒｎ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒドロキシリシン（Ｈｙｌ）、又はそれらの任意比率の組み合わせから選ばれる請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリアミノ酸を形成するアミノ酸が、Ｄ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸、ＤＬ混合アミノ酸を含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記アミノヘキソースが、グルコサミン、ガラクトサミン、アセチルグルコサミン、アセチルガラクトサミン、又はそれらの組み合わせから選ばれる請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリアミノ酸の平均分子量が、５０００〜１０００００ダルトンである請求項１７〜２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリアミノヘキソースの平均分子量が、１００００〜２０００００ダルトンである請求項１７〜２５に記載のポリ結合体。
【請求項２８】
前記活性薬物の重量が、該ポリ結合体重量の５〜６０％である請求項１７〜２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記活性薬物と高分子ポリマーとを化学結合により結合させてポリ結合体を形成する工程が、請求項１３〜１６の方法に従って行なわれる請求項１７〜２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリ結合体、及び任意の薬学的に許容される添加剤を含む薬物組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医用抗真菌薬物に関し、特に感染性疾患の治療に使用できるポリエンマクロライド系抗生物質、例えば、アムホテリシンＢと重合高分子であるペプチド類又は多糖類とを結合させてなるポリ結合体（polyconjunctions）に関し、より詳細には、重合高分子であるペプチド類、多糖類又は糖ペプチド類とポリエンマクロライド系化合物、例えば、アムホテリシンＢとを結合反応させてなるポリエンマクロライド系化合物ポリ結合体、例えばアムホテリシンＢポリ結合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリエン系化合物（ポリエン系抗生物質、ポリエンマクロライド系抗生物質、ポリエン類、ポリエン系抗真菌薬等とも呼ばれる）は、共役ポリエン単位と水酸基を有するマクロライド系化合物であり、代表的な例としては、アムホテリシンＢ、ナイスタチン、ナタマイシン、トリコマイシン、メパルトリシン、Ｃａｎｎｉｔｒａｃｉｎ、フィリピン、オーレオフンギン、エトルスコマイシン、ハマイシン、ペリマイシンなどがある。ポリエン系抗生物質は最も早くに臨床使用された抗真菌薬であり、その作用メカニズムは、感受性真菌細胞膜上のステロールと結合することにより、細胞膜の透過性が損傷され、細胞内の例えば、カリウムイオン、ヌクレオチド及びアミノ酸などの重要な物質が漏れ、細胞の正常な代謝が損なわれ、その成長が抑制されることである。
【０００３】
アムホテリシンＢ（AmphotericinB，本発明では、ＡＢと略称されることがある）は、例えば２０１０年版中国薬典に収載されており、次の構造式、分子式及び分子量を有するものである：
【化１】
2016525129.tif 000002
【０００４】
アムホテリシンＢは臨床的に抗真菌薬である。それは、真菌細胞膜の透過性に影響することにより、真菌成長抑制作用を果たすものである。深在性真菌により引き起こされる重度の内臓または全身感染の治療に多く使用されている。アムホテリシンＢはストレプトマイセス・ノドサス（Streptomycesnodosus）の培養液から分離して得られたポリエン系化合物である。それは、化学的に、トランス共役二重結合を７個有する３８員ラクトン環がＯ−グリコシド結合を介してアミノ糖Ｄ−トレハロースアミンと結合するポリエンマクロライド系物質（polyene macrolide substances）である。それは、ジメチルスルホキシドに溶けやすく、ジメチルホルムアミドに溶けにくく、メタノールに極めて溶けにくく、水、無水エタノール、クロロホルムやジエチルエーテルに溶けない。中性または酸性媒体中で塩を形成でき、塩になったら、水溶性が高くなるが抗菌活性が低くなる。アムホテリシンＢは両性を兼ね備え、分子内に親油性領域と親水性領域とを有することにより、真菌の細胞質膜に存在しているステロールと複合物を形成して細胞膜の透過性を損傷し得るものである。細菌の細胞膜にはステロールが含まれていないため、アムホテリシンＢの抗生物質作用は選択的に真菌に対するものである。
【０００５】
アムホテリシンＢは、実際にいかなるヒト疾患を引き起こす真菌に対する広域スペクトル抗生作用を持つため、全身的にヒト真菌感染症を治療するための第一選択薬である。特に、例えば、ＨＩＶまたは癌患者などの免疫系損傷患者において、侵襲性真菌感染症関連の治療が近年、急激に増加している。
【０００６】
一方、アムホテリシンＢの使用に伴って副作用が生じており、更にこの副作用が相対的にひどい場合がある。全身性真菌症と内臓真菌症の場合、通常、アムホテリシンＢを０．５〜０．７ｍｇ／ｋｇ体重／日の投与量で経静脈投与する。しかし、アムホテリシンＢ耐性が患者によって違うため、投与量を個体により調整又は変化する必要がある。また、免疫系損傷患者は一般的に常用量より高い投与量を必要としており、例えば、（耐性が高い）重症患者の場合、投与量を１ｍｇ／ｋｇ体重／日から１．５ｍｇ／ｋｇ体重／日まで高めることができる。この時、非経口投与の持続時間が数週間から数月まで長くすることができる。
【０００７】
非経口治療の過程において、通常、例えば、発熱、嘔吐及び震え等の典型的な注入反応が生じることがあり、これらの反応に対し、対症治療を行うのが一般的であり、輸液療法を中断する必要はない。しかし、よりひどいのは肝機能不全、特に腎機能不全がよく起こることである。そのため、例えば、治療開始時に、糸球体ろ過率が約４０％低下することがある。治療を受ける患者の多数が全治療過程においてこのように低い糸球体ろ過率を維持している。これによって、血清中クレアチニン濃度と血中尿素濃度が高くなる。たまに、乃至は治療期間後に、不可逆的な損傷が観察された。治療を２〜３週間行った後、貧血が起こることもよくあり、そのことにより、ヘマトクリットレベルが２５〜３０％まで低下する。しかし、血球計数の変化は通常、治療終了後に完全に逆転することができる。
【０００８】
アムホテリシンＢは毒性と副作用を有するため、人命危険がある場合のみ投与すべきである。一方、それは、通常、免疫系障害（例えばエイズや臓器移植）により引き起こされる真菌症において唯一有効な薬物である。
【０００９】
アムホテリシンＢは分子中に親水領域を持っているものの、全体的に顕著な疎水性を示しているため、生理ｐＨで、水にほとんど溶けず、有機溶媒中でもわずかに溶けるにすぎない。そのため、既存の市販製剤は、構造が複雑な薬物形態であり、ある予想外の欠点により制限される。適宜な可溶化剤、例えばデオキシコール酸ナトリウムを用いることにより水溶性を向上することができる。そのため、例えば、ＢＲＩＳＴＯＬ−ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ製輸注用先発薬（ドイツにおいて商品名“Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ”で入手可能なもの）は、凍結乾燥粉末の形であり、水中に再溶解させて水中でのアムホテリシンＢとデオキシコール酸ナトリウムのミセル分散体とすることは必要である。すぐに利用可能な輸液を得ようために、得られた原液を、電解質を含まないキャリアー溶液、例えば５％グルコース溶液のみを用いて所要の最終濃度まで希釈することができる。
【００１０】
また、該製剤は、限られた治療指数を示すのみであり、即ち、有効量と致死量との間隔が狭い。また、アムホテリシンＢは広域スペクトル抗生作用を持つが、その製剤は、有効物質が真菌感染部位に到達できないか、又は真菌感染部位に到達した濃度が不足なので、当該部位にてアムホテリシンＢ特有の抗真菌作用が発揮できないか、又は作用が十分でない原因で、臨床的に効果が劣る場合もある。
【００１１】
当該先発薬の上記欠点を克服するために、一連の脂質製剤に属するアムホテリシンＢ製剤、例えば、リポイドとアムホテリシンＢとの脂質複合体、コレステロール硫酸とアムホテリシンＢとのコロイド分散体、及びリポソーム中に封入されたアムホテリシンＢが開発されている。用いられる上記形態の薬物は、いずれも大きな治療指数と高い耐性を有し、特に従来のアムホテリシンＢデオキシコール酸塩よりも低い腎臓毒性を有するので、高い投与量で投与することもできるが、高い投与量では、前述した副作用を完全に回避することはできない。
【００１２】
また、これらのアムホテリシンＢ脂質製剤は製造コストが高いため、売価も高いという重大な欠点を有する。また、これらの複雑な形態の薬物は直接投与可能な形態を得るために、手数をかけて再溶解することを必要とする。アムホテリシンＢ脂質製剤の治療範囲が拡大されたが、前述した欠点及びそのほかの欠点を有するため、これらの製剤は市場に広く認められていない。
【００１３】
目下、臨床的にアムホテリシンＢの薬効が認められているが、１．薬物水溶性が劣り、好適な静脈投与剤形がない；２．大きな毒性、副作用を示すため、投与量が限られる；３．投与量が限られるため、投与量を徐々向上できるのみであり、臨床的治療効果が割引されるとともに、臨床的に薬剤耐性が生じやすいという問題がある。
【００１４】
目下、臨床的に使用されるアムホテリシンＢ製剤としては、
最初に臨床的に用いられ、再溶解してコロイド分散液を形成するためにデオキシコール酸ナトリウムを可溶化剤とし、臨床適応症が例えば、敗血症、心内膜炎、髄膜炎（クリプトコッカス及びその他の真菌）、腹部感染症（透析に関連するものを含む）、肺感染症、尿路感染症や眼内炎などの感受性真菌に起因する病状が進行性の深在性真菌感染症である注射用アムホテリシンＢ、例えば、
2016525129.tif 000003
（国薬准字  Ｈ１３０２０２８３）；
例えば、コレステロール硫酸ナトリウム、トロメタミン、ＥＤＴＡ二ナトリウム、ラクトース・一水和物、塩酸から製造され、適応症が深在性真菌感染症患者、腎障害や薬物毒性のためアムホテリシンＢの有効量を使用できない患者、又はアムホテリシンＢで治療したが効果がない患者の病症である注射用アムホテリシンＢリポソーム、例えば、Ｔｈｒｅｅ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．ＬＬＣの輸出品（商品名：アンフォテク，Ａｍｐｈｏｔｅｃ，許可番号  Ｈ２００９０９６４）；
モル比が７：３であるジミリストイルホスファチジルコリン（L-α-dimyristoylphosphatidylcholine，ＤＭＰＣ）とジミリストイルホスファチジルグリセロール（L-α-dimyristoylphosphatidyl glycerol，ＤＭＰＧ）とを脂質成分とし、薬物と前記２種類の脂質成分とを１：１のモル比で複合してなる滅菌無熱源の懸濁タイプ静脈注射液であって、適応症が通常のアムホテリシンＢ治療に対し効果又は耐性がない侵襲性真菌感染症患者の病症であるアムホテリシンＢ脂質複合体注射液、例えば、Ｓｉｇｍａ−ｔａｕ制薬公司製造で、商品名がＡＢＥＬＣＥＴ（登録商標）である製品；
が挙げられる。
【００１５】
注射用アムホテリシンＢリポソーム、ＡｍＢｉｓｏｍ（登録商標）は、静脈注射のための滅菌無熱源の凍結乾燥製品であり、１瓶当たり脂質膜に封入したアムホテリシンＢ５０ｍｇを含有するものである。該脂質膜の組成は水素化大豆レシチン２１３ｍｇ、コレステロール５２ｍｇ、ジステアロイルホスファチジルグリセロール８４ｍｇ、αトコフェロール０．６４ｍｇであり、さらにスクロース９００ｍｇとコハク酸二ナトリウム六水和物２７ｍｇを含有する。当該ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）は発熱、真菌感染と推測される好中球減少症患者の経験的治療、ＨＩＶ感染患者クリプトコックス髄膜炎、アムホテリシンＢデオキシコール酸ナトリウムに対し効果がないアスペルギルス、カンジダ及び／又はクリプトコッカス感染症、又はアムホテリシンＢデオキシコール酸ナトリウムに対し腎損傷リスクがあるか、又は毒性耐性を持たない患者等の治療に適用する。以上で分かるように、リポソームを担体として用いてアムホテリシンＢの欠点、例えば副作用を克服するための方法（剤形）は、臨床的治療に認可されている。
【００１６】
しかし、前述したアムホテリシンＢ脂質複合体注射液ＡＢＥＬＣＥＴ（登録商標）及びＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）の製品明細書には、以下の注意事項が太字で明記されている：リポソームマイクロカプセル化又は脂質複合体へブレンドする場合は、未カプセル化又は脂質と組み合わせない薬物に比べて、全体的に薬物の機能・特性に影響を及ぼすことがある。また、同一の活性薬物を有する異なるリポソーム又は脂質複合体製品は化学組成及び脂質成分の物理形態によって変える可能性がある。このように変えることによる相違はこれらの薬の製品の機能・特性に影響することができる（例えば、http://www.rxlist.com/abelcet-drug.htmを参照）。これで分かるように、当業界では、同一の活性薬物、例えばアムホテリシンＢであっても、その投与担体が異なれば、薬物に全然異なる、予測できない物理的・化学的性質ないし生物学的性質を付与する可能性があることが知られている。
【００１７】
アムホテリシンＢが使用上種々の欠点を有することに鑑み、当業者は、感染性疾患例えば真菌感染により引き起こされる疾患の治療方法を提供することを期待しており、例えば、アムホテリシンＢを活性薬物として上記疾患を治療する方法を提供することを期待しており、また、前記方法であって、当該方法により提供された治療剤が１つ又は多くの面で利点を有することを含む方法を期待している。
【発明の概要】
【００１８】
本発明は、感染性疾患例えば真菌感染により引き起こされる疾患の治療方法を提供すること、例えば、アムホテリシンＢを活性薬物として上記疾患を治療する方法を提供すること、また、前記方法であって、当該方法により提供された治療剤が１つ又は多くの面で利点を有することを含む方法を提供すること、を目的とするものである。本発明は、高分子ポリマーとアムホテリシンＢとを結合してなるアムホテリシンＢポリ結合体が完全に予想外の少なくとも１種の性質、例えば理化性質及び／又は生物学的性質を示すことを意外に見出した。また、本発明は、そのほかのポリエンマクロライド系抗生物質も前記アムホテリシンＢに付与する性質に近い優れた性質を示すことを意外に見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１９】
そのため、本発明の第一態様では、活性薬物と高分子ポリマーとを含み、前記活性薬物と前記高分子ポリマーが化学結合により結合している薬用ポリ結合体を提供する。
【００２０】
本発明の第一態様の実施形態のいずれか１つに記載のポリ結合体において、前記活性薬物は、ポリエンマクロライド系抗生物質である。
【００２１】
本発明の第一態様の実施形態のいずれか１つに記載のポリ結合体において、前記活性薬物は、アムホテリシンＢ、ナイスタチン（nystatin）、ナタマイシン（Natamycin）、トリコマイシン（Trichomycin）、メパルトリシン（mepartricin）、Ｃａｎｎｉｔｒａｃｉｎ（CAS No.84930-92-7，例えば浙江海正薬業から入手する製品、国薬准字H33021810）、フィリピン（Filipin III, CAS No.480-49-9）、オーレオフンギン（aureofungin）、エトルスコマイシン（etruscomycin）、ハマイシン（hamycin, CAS No.1403-71-0）、ペリマイシン（PerimycinA, CAS No.62327-61-1）等から選ばれるポリエンマクロライド系抗生物質である。一実施形態において、前記活性薬物は、アムホテリシンＢ、ナイスタチン（nystatin）、ナタマイシン（Natamycin）、トリコマイシン（Trichomycin）から選ばれるポリエンマクロライド系抗生物質である。
【００２２】
本発明の第一態様の実施形態のいずれか１つに記載のポリ結合体において、前記高分子ポリマーは、アミノ酸を重合させてなるポリアミノ酸、アミノヘキソースを重合させてなるポリアミノヘキソースから選ばれる。
【００２３】
本発明の第一態様の実施形態のいずれか１つに記載のポリ結合体において、前記高分子ポリマーはアミノ酸を重合させてなるポリアミノ酸であり、前記アミノ酸はカルボン酸系アミノ酸、アミノ系アミノ酸、又はそれらの組み合わせから選ばれる。それによってカルボン酸系ポリアミノ酸、又はアミノ系ポリアミノ酸などのポリアミノ酸が形成される。
【００２４】
本発明の第一態様の実施形態のいずれか１つに記載のポリ結合体において、前記カルボン酸系アミノ酸は、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、又はそれらの任意比率の組み合わせから選ばれる。
【００２５】
本発明の第一態様の実施形態のいずれか１つに記載のポリ結合体において、前記アミノ系アミノ酸は、オルニチン（Ｏｒｎ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒドロキシリシン（Ｈｙｌ）、又はそれらの任意比率の組み合わせから選ばれる。
【００２６】
本発明の第一態様の実施形態のいずれか１つに記載のポリ結合体において、前記ポリアミノ酸を形成するアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸、ＤＬ混合アミノ酸を含む。
【００２７】
本発明の第一態様の実施形態のいずれか１つに記載のポリ結合体において、前記アミノヘキソースは、グルコサミン、ガラクトサミン、アセチルグルコサミン、アセチルガラクトサミン、又はそれらの組み合わせから選ばれる。それによってポリグルコサミン、ポリガラクトサミン、ポリアセチルグルコサミン、ポリアセチルガラクトサミンなどのポリアミノヘキソースが形成される。
【００２８】
本発明の第一態様の実施形態のいずれか１つに記載のポリ結合体において、前記ポリアミノ酸の平均分子量は、５０００〜１０００００ダルトン、例えば、１００００〜８００００Ｄａ、例えば、１００００〜５００００ダルトン、例えば、１００００〜４００００ダルトン、例えば、１５０００〜３５０００ダルトンである。
【００２９】
本発明の第一態様の実施形態のいずれか１つに記載のポリ結合体において、前記ポリアミノヘキソースの平均分子量は、１００００〜２０００００ダルトン、例えば、２００００〜１８００００ダルトン、例えば、２００００〜１５００００ダルトン、例えば、２５０００〜１５００００ダルトン、例えば、３００００〜１２００００ダルトン、例えば、４００００〜１０００００ダルトンである。
【００３０】
本発明の第一態様の実施形態のいずれか１つに記載のポリ結合体において、前記活性薬物の重量は、該ポリ結合体重量の５〜６０％であり、即ち、該ポリ結合体において、活性薬物５〜６０％及び残部高分子ポリマーを含有する。例えば、前記活性薬物の重量は、当該ポリ結合体重量の１０〜５０％、例えば、１０〜４０％、例えば、１０〜３５％である。
【００３１】
本発明の第一態様の実施形態のいずれか１つに記載のポリ結合体は、注射用水、０．９％塩化ナトリウム注射液、５％グルコース注射液を薬物投与時の注射用溶媒として用いることができる。
【００３２】
さらに、本発明の第二態様では、以下の工程：
ｉ）高分子ポリマーを溶媒に溶解させて溶液を形成する工程と；
ii）工程ｉ）で得られた溶液に活性薬物を加えて溶解させる工程と；
iii）工程ii）で得られた溶液に触媒と縮合剤とを加えて高分子ポリマーと活性薬物とを縮合反応させて、高分子ポリマーと活性薬物との両者が化学結合により結合しているポリ結合体を形成する工程と；
iv）得られたポリ結合体を分離採取する工程と；
を含む本発明の第１態様のいずれか１項に記載のポリ結合体の製造方法を提供する。
【００３３】
本発明の第二態様の方法において、工程ｉ）に記載の溶媒は、有機溶媒であり、例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等であるが、これらに限られない。
【００３４】
本発明の第二態様の方法において、工程iii）に記載の触媒は、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰと簡略化することができる）である。その使用量は、通常、活性薬物のモル量の０．２〜４倍、例えば、０．５〜２倍、例えば、０．８〜１．５倍、例えば、１．０〜１．２倍であり得る。
【００３５】
本発明の第二態様の方法において、工程iii）に記載の縮合剤は、ジシクロヘキシルカルボジイミド（Dicyclohexylcarbodiimide，ＤＣＣと簡略化することができる）である。その使用量は、通常、活性薬物のモル量の０．５〜２倍、例えば、０．８〜１．５倍、例えば、１．０〜１．２倍であり得る。
【００３６】
本発明の第二態様の方法において、工程iv）に記載の分離採取は、透析法により行われ、この方法により、結合していなかった遊離活性薬物を容易に除去することができる。このような透析法による分離採取法は、当業者に公知のものである。
【００３７】
本発明にかかる方法において、反応条件に縮合剤ＤＣＣと触媒ＤＭＡＰを用いることにより、カルボン酸系ポリアミノ酸例えばポリアスパラギン酸の遊離水酸基と活性薬物分子構造中の水酸基とを縮合させて、ポリエン系抗生物質と当該ポリアミノ酸とが化学結合により結合しているポリ結合体を形成することができる。また、上記のように反応条件に縮合剤ＤＣＣと触媒ＤＭＡＰを用いることにより、アミノ系ポリアミノ酸例えばポリオルニチンの遊離アミノ基と活性薬物（特にカルボキシル基を有する活性薬物）分子構造中のカルボキシル基とを縮合させて、ポリエン系抗生物質と当該ポリアミノ酸とが化学結合により結合しているポリ結合体を形成することができる。また、上記のように反応条件に縮合剤ＤＣＣと触媒ＤＭＡＰとを用いることにより、ポリアミノヘキソース例えばポリグルコサミンの水酸基と活性薬物（特にカルボキシル基を有する活性薬物）分子構造中のカルボキシル基とを縮合させて、ポリエン系抗生物質と当該ポリアミノヘキソースとが化学結合により結合しているポリ結合体を形成することができる。本発明において、当業者が既知の本発明の活性薬物と前記高分子ポリマーとを化学結合により結合させることができる他の方法を用いることもできる。
【００３８】
本発明の方法によれば、本発明のポリ結合体は、溶解度の面でそれに対応する活性薬物よりも顕著に高い溶解性を有するという効果が少なくとも得られることが見られた。例えば、本発明の方法により、本発明で得られたアムホテリシンＢポリ結合体の溶解度（アムホテリシンＢ換算）は、アムホテリシンＢ原薬よりも顕著に向上した。
【００３９】
さらに、本発明の第三態様では、前記活性薬物と前記高分子ポリマーとを化学結合により結合させてポリ結合体を形成する工程を含む活性薬物の溶解度向上方法を提供する。
【００４０】
本発明の第三態様の実施形態のいずれか１つに記載の方法において、前記活性薬物はポリエンマクロライド系抗生物質である。
【００４１】
本発明の第三態様の実施形態のいずれか１つに記載の方法において、前記活性薬物は、アムホテリシンＢ、ナイスタチン（nystatin）、ナタマイシン（Natamycin）、トリコマイシン（Trichomycin）、メパルトリシン（mepartricin）、Ｃａｎｎｉｔｒａｃｉｎ（CAS No.84930-92-7，例えば浙江海正薬業から入手する製品、国薬准字H33021810）、フィリピン（Filipin III, CAS No.480-49-9）、オーレオフンギン（aureofungin）、エトルスコマイシン（etruscomycin）、ハマイシン（hamycin, CAS No. 1403-71-0）、ペリマイシン（PerimycinA, CAS No.62327-61-1）等から選ばれるポリエンマクロライド系抗生物質である。一実施形態において、前記活性薬物は、アムホテリシンＢ、ナイスタチン（nystatin）、ナタマイシン（Natamycin）、トリコマイシン（Trichomycin）から選ばれるポリエンマクロライド系抗生物質である。
【００４２】
本発明の第三態様の実施形態のいずれか１つに記載の方法において、前記高分子ポリマーは、アミノ酸を重合させてなるポリアミノ酸、アミノヘキソースを重合させてなるポリアミノヘキソースから選ばれる。
【００４３】
本発明の第三態様の実施形態のいずれか１つに記載の方法において、前記高分子ポリマーはアミノ酸を重合させてなるポリアミノ酸であり、前記アミノ酸はカルボン酸系アミノ酸、アミノ系アミノ酸、又はそれらの組み合わせから選ばれる。それによってカルボン酸系ポリアミノ酸、又はアミノ系ポリアミノ酸などのポリアミノ酸が形成される。
【００４４】
本発明の第三態様の実施形態のいずれか１つに記載の方法において、前記カルボン酸系アミノ酸は、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、又はそれらの任意比率の組み合わせから選ばれる。
【００４５】
本発明の第三態様の実施形態のいずれか１つに記載の方法において、前記アミノ系アミノ酸は、オルニチン（Ｏｒｎ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒドロキシリシン（Ｈｙｌ）、又はそれらの任意比率の組み合わせから選ばれる。
【００４６】
本発明の第三態様の実施形態のいずれか１つに記載の方法において、前記ポリアミノ酸を形成するアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸、ＤＬ混合アミノ酸を含む。
【００４７】
本発明の第三態様の実施形態のいずれか１つに記載の方法において、前記アミノヘキソースは、グルコサミン、ガラクトサミン、アセチルグルコサミン、アセチルガラクトサミン、又はそれらの組み合わせから選ばれる。それによってポリグルコサミン、ポリガラクトサミン、ポリアセチルグルコサミン、ポリアセチルガラクトサミンなどのポリアミノヘキソースが形成される。
【００４８】
本発明の第三態様の実施形態のいずれか１つに記載の方法において、前記ポリアミノ酸の平均分子量は、５０００〜１０００００ダルトン、例えば、１００００〜８００００ダルトン、例えば、１００００〜５００００ダルトン、例えば、１００００〜４００００ダルトンである。
【００４９】
本発明の第三態様の実施形態のいずれか１つに記載の方法において、前記ポリアミノヘキソースの平均分子量は、１００００〜２０００００ダルトン、例えば、２００００〜１８００００ダルトン、例えば、２００００〜１５００００ダルトン、例えば、３００００〜１２００００ダルトン、例えば、４００００〜１０００００ダルトンである。
【００５０】
本発明の第三態様の実施形態のいずれか１つに記載の方法において、前記活性薬物の重量は、該ポリ結合体重量の５〜６０％であり、即ち、該ポリ結合体において、活性薬物５〜６０％及び残部高分子ポリマーを含有する。例えば、前記活性薬物の重量は、当該ポリ結合体重量の１０〜５０％、例えば、１０〜４０％、例えば、１０〜３５％である。
【００５１】
本発明の第三態様の実施形態のいずれか１つに記載の方法において、前記ポリ結合体は、注射用水、０．９％塩化ナトリウム注射液、５％グルコース注射液を薬物投与時の注射用溶媒として用いることができる。
【００５２】
本発明の第三態様の実施形態のいずれか１つに記載の方法において、前記活性薬物と高分子ポリマーを化学結合により結合させてポリ結合体を製造する工程は、本発明の第二態様のいずれか１つの実施形態の方法に従って行うことができる。
【００５３】
本発明者らは、本発明の第三態様に記載の方法による意外の効果の他に、更に活性薬物の溶解性向上方法で得られたポリ結合体はその他の１種又は複数の従来技術で全く予測できない優れた効果を有することを見出した。
【００５４】
さらに、本発明の第四態様では、本発明の第一態様のいずれか１つの実施形態に記載のポリ結合体及び任意の薬学的に許容される添加剤を含む薬物組成物を提供する。
【００５５】
本発明の第四態様の薬物組成物は、製薬工業におけるいかなる剤形であってもよいが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、経口液剤、経口懸濁液剤などの経口製剤；例えば、小容量注射液、大容量注射液、滅菌粉末製剤（例えば、冷凍乾燥粉末注射剤など）等の注射製剤；例えば、経鼻吸入剤（例えば、吸入用粉末剤又は吸入用溶液剤）等の吸入剤を挙げることができるが、これらに限られない。
【００５６】
前記添加剤の選択は前記薬物組成物の具体的な剤形によって決定される。例えば、当該薬物組成物が錠剤、カプセル剤、顆粒剤等である場合、その薬物組成物において、希釈剤（例えば、澱粉、乳糖、微結晶性セルロース等）、崩壊剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース等）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール等）、潤滑剤又は流動促進剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸、コロイドシリカ等）を必要に応じて含有させることができる。矯味剤、着色剤、被覆剤等を必要に応じて含有させることもできる。
【００５７】
また、例えば、当該薬物組成物が経口液剤、経口懸濁液剤などである場合、その薬物組成物において、水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、分子量が２００〜６００のポリエチレングリコール等の溶媒を含有させることができる。更に、矯味剤、着色剤等を必要に応じて含有させることもできる。
【００５８】
また、例えば、当該薬物組成物が小容量注射液、大容量注射液等である場合、その薬物組成物において、水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、分子量が２００〜６００のポリエチレングリコール等の溶媒を含有させることができ、更に、例えば、塩化ナトリウム、グルコース等の浸透圧調節剤を含有させることもできる。
【００５９】
また、例えば、当該薬物組成物が滅菌粉末製剤等である場合、その薬物組成物において、例えば、マンニトール、グルコース、デキストラン、塩化ナトリウム、ショ糖等の賦形剤を含有させることができる。
【００６０】
これらの剤形とした本発明の薬物組成物の処方及び製法は、当業者に公知の方法及び経験により実現することができる。例えば、錠剤は、湿式造粒打錠法、乾式造粒打錠法、粉末直接打錠法等の方法により製造することができる。また、例えば、冷凍乾燥粉末注射剤は、製剤要求に応じて適量のマンニトールを加え、注射用水を用いて溶解させ、次いで冷凍乾燥することにより製造することができる。
【００６１】
本発明の第四態様の実施形態のいずれか１つに記載の薬物組成物は、注射用水、０．９％塩化ナトリウム注射液、５％グルコース注射液を薬物投与時の注射用溶媒として使用することができる注射用薬物組成物である。
【００６２】
さらに、本発明の第五態様では、治療を要する哺乳動物に、本発明の第一態様のいずれか１つの実施形態のポリ結合体、又は本発明の第四態様のいずれか１つの実施形態の薬物組成物の有効量を投与する工程を含む真菌感染症の治療方法を提供する。
【００６３】
本発明の第五態様の方法において、前記真菌感染症は、真菌が関与するいかなる疾患であり、例えば、既存のいかなるアムホテリシンＢ製剤の適応症を挙げることができ、このような適応症としては、例えば、敗血症、心内膜炎、髄膜炎（クリプトコッカス及びその他の真菌）、腹部感染症（透析に関連するものを含む）、肺感染症、尿路感染症などの、感受性真菌に起因すると明確に診断された及び／又は病状が進行性である深在性真菌感染症を挙げることができる。
【００６４】
本発明の態様のいずれか一つに係る実施形態のいずれか１つは、実施形態同士が矛盾しない限り、その他の実施形態と組み合わせることができる。また、本発明の態様のいずれか一つに係る実施形態のいずれか１つにおいて、技術的特徴のいずれか１つは、技術的特徴同士が矛盾しない限り、その他の実施形態の当該技術的特徴に適応することができる。
【００６５】
本発明の態様のいずれか一つ又は当該態様のいずれか一つにかかる実施形態のいずれか１つが有する技術的特徴のいずれか１つは、それら同士が矛盾しない限り、その他の実施形態のいずれか１つ又はその他の態様のいずれか一つに係る実施形態のいずれか１つに適用することができる。ただし、相互に適用する場合、関連特徴を必要に応じて適宜修飾してもよい。以下、本発明の各態様及び特徴について詳細に説明する。
【００６６】
本発明に引用された文献の全てに記載の内容の全ては引用により本発明に合併され、且つこれらの文献で表現される意味が本発明と相違している場合、本発明に記載の意味通りである。また、本発明で用いられる種々の技術用語及び句は当業者に公知の一般的な意味を有するにもかかわらず、ここで、本発明はこれらの技術用語及び句についてより詳細に説明及び解釈しようとする。言及される技術用語及び句は意味が一般的な意味と相違している場合、本発明に記載の意味通りである。
【００６７】
本発明では、「ポリ結合体」という技術用語は「結合体」や「多量体」等とも呼ばれ、活性薬物単位と高分子ポリマー単位との両方からなり、前記活性薬物単位と前記高分子ポリマー単位が化学結合、例えば、エステル結合又はアミド結合により結合している化学物質をいうから、本発明のポリ結合体は本質的に化合物であり、即ち、本発明のポリ結合体は化合物と呼ぶこともできる。「ポリ」という技術用語は、当業者が熟知する意味を有し、例えば、ポリマー、多量体、高分子物質、高分子化合物、重合高分子等と解釈することができ、例えば、本発明に係るポリアミノ酸（即ち、ポリペプチド）及びポリアミノヘキソース（多糖類、ポリサッカライド）等を挙げることができる。
【００６８】
前記活性薬物は、ポリエンマクロライド系抗生物質であり、ポリエンマクロライド系物質、ポリエン類等とも呼ばれ、例えば、アムホテリシンＢ、ナイスタチン（nystatin）、ナタマイシン（Natamycin）、トリコマイシン（Trichomycin）、メパルトリシン（mepartricin）、Ｃａｎｎｉｔｒａｃｉｎ、フィリピン（Filipin III）、オーレオフンギン（aureofungin）、エトルスコマイシン（etruscomycin）、ハマイシン（hamycin, CAS No. 1403-71-0）、ペリマイシン（PerimycinA）等を挙げることができる。
【００６９】
アムホテリシンＢは多くの国の薬物規格に収載されており、且つ市場から容易に購入することができ、下記構造式を持つことが知られている。
【化２】
2016525129.tif 000004
【００７０】
例えば、２０１０年版中国薬典では、それは、［１Ｒ−（１Ｒ＊，３Ｓ＊，５Ｒ＊，６Ｒ＊，９Ｒ＊，１１Ｒ＊，１５Ｓ＊，１６Ｒ＊，１７Ｒ＊，１８Ｒ＊，１９Ｅ，２１Ｅ，２３Ｅ，２５Ｅ，２７Ｅ，２９Ｅ，３１Ｅ，３３Ｒ＊，３５Ｓ＊，３６Ｒ＊，３７Ｓ＊）］−３３−［（３−アミノ−３，６−ジデオキシ−β−Ｄ−マンノピラノシル）オキシ］−１，３，５，６，９，１１，１７，３７−オクタヒドロキシ−１５，１６，１８−トリメチル−１３−オキソ−１４，３９−ジオキサビシクロ［３３．３．１］ノナトリアコンタン−１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１−ヘプタエン−３６−カルボン酸と記載されている。代表的に、アムホテリシンＢは、複数の水酸基及びカルボキシル基を有し、特に３７位の水酸基が縮合反応において優位性を有しているため、水酸基とカルボキシル基との２種類の活性基により、カルボキシル基、アミノ基又は水酸基を有する本発明記載の高分子ポリマーと化学結合により縮合してポリ結合体を形成することができる。もちろん、当業者であれば、理論的にアムホテリシンＢ中の３７位以外の他の位置における水酸基も高分子ポリマーのカルボキシル基と化学結合により縮合してポリ結合体を形成する可能性を有することを知っており、ここで、本発明はこのような可能性を除外しないだけでなく、このような可能性を含んでいる。
【００７１】
また、ナイスタチン（nystatin, CAS No.1400-61-9）は２０１０年版英国薬典に収載されており、且つ下記構造式を持つことが知られている。
【化３】
2016525129.tif 000005
【００７２】
代表的に、ナイスタチンもアムホテリシンＢの特徴に類似する水酸基とカルボキシル基を有しており、この２種類の活性基により、カルボキシル基、アミノ基及び／又は水酸基を有する本発明記載の高分子ポリマーと化学結合により縮合してポリ結合体を形成することができる。
【００７３】
また、ナタマイシン（Natamycin, CAS No.7681-93-8）は米国薬典ＵＳＰ３５−ＮＦ３０に収載されており、下記構造式を持つことが知られている。
【化４】
2016525129.tif 000006
【００７４】
代表的に、ナタマイシンもアムホテリシンＢの特徴に類似する水酸基とカルボキシル基を有しており、この２種類の活性基により、カルボキシル基、アミノ基及び／又は水酸基を有する本発明記載の高分子ポリマーと化学結合により縮合してポリ結合体を形成することができる。
【００７５】
また、トリコマイシン（Trichomycin, CAS No.1394-02-1）は日本薬局方第ＸＶＩ版（ＪＰ１６）に収載されており、下記構造式を持つことが知られている。
【化５】
2016525129.tif 000007
【００７６】
代表的に、トリコマイシンもアムホテリシンＢの特徴に類似する水酸基とカルボキシル基を有しており、この２種類の活性基により、カルボキシル基、アミノ基及び／又は水酸基を有する本発明記載の高分子ポリマーと化学結合により縮合してポリ結合体を形成することができる。
【００７７】
また、メパルトリシン（mepartricin,CAS No.11121-32-7，例えばＵＳ３７８０１７３を参照）は下記構造式を持っている。
【化６】
2016525129.tif 000008
【００７８】
メパルトリシンは、アムホテリシンＢの特徴に類似する水酸基と既にメチルエステル化したカルボキシル基とを有しており、これらの水酸基と所定の条件下でエステル化したカルボキシル基との２種類の基により、カルボキシル基、アミノ基及び／又は水酸基を有する本発明記載の高分子ポリマーと化学結合により縮合してポリ結合体を形成することができる。
【００７９】
また、フィリピン（Filipin III, CAS No.480-49-9）は下記構造式を持っている。
【化７】
2016525129.tif 000009
【００８０】
フィリピンは、アムホテリシンＢの特徴に類似する水酸基を有しており、これらの水酸基により、カルボキシル基を有する本発明記載の高分子ポリマーと化学結合により縮合してポリ結合体を形成することができる。
【００８１】
ペリマイシン（PerimycinA,CAS No.62327-61-1）は下記構造式を持っている。
【化８】
2016525129.tif 000010
【００８２】
ペリマイシンは、アムホテリシンＢの特徴に類似する水酸基を有しており、これらの水酸基により、カルボキシル基を有する本発明記載の高分子ポリマーと化学結合により縮合してポリ結合体を形成することができる。
【００８３】
その他のポリエンマクロライド系化合物、例えば、Ｃａｎｎｉｔｒａｃｉｎ（CAS No.84930-92-7，例えば浙江海正薬業から入手する製品、国薬准字H33021810）、オーレオフンギン（aureofungin）、エトルスコマイシン（etruscomycin）、ハマイシン（hamycin, CAS No. 1403-71-0）などは、いずれもアムホテリシンＢの特徴に類似する水酸基及び／又はカルボキシル基を有しており、これらの活性基により、カルボキシル基、アミノ基及び／又は水酸基を有する本発明記載の高分子ポリマーと化学結合により縮合してポリ結合体を形成することができる。
【００８４】
本発明では、高分子ポリマー単位は、アミノ酸を重合させてなるポリアミノ酸であってもよいし、アミノヘキソースを重合させてなるポリアミノヘキソースであってもよい。
【００８５】
ポリアミノ酸にとって、そのアミノ酸は、カルボン酸系アミノ酸、アミノ系アミノ酸、又はそれらの組み合わせから選ばれ、それによってカルボン酸系ポリアミノ酸、又はアミノ系ポリアミノ酸などのポリアミノ酸が形成される。カルボン酸系アミノ酸は、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、又はそれらの任意比率の組み合わせから選ばれる。アミノ系アミノ酸は、オルニチン（Ｏｒｎ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒドロキシリシン（Ｈｙｌ）、又はそれらの任意比率の組み合わせから選ばれる。これらのアミノ酸は、それらのＤタイプ、Ｌタイプ、ＤＬ混合タイプを含んでいる。ポリアミノ酸の製造方法は、当業者に公知のものであり、例えば、ＵＳ５６１０２６４には、ポリアスパラギン酸の合成方法が開示されており、S. Rowetonら（Journal of Environmental Polymer Degradation, Vol.5, No.3, 1997:175）には、ポリアスパラギン酸の合成方法が開示されている。類似的には、その他のポリアミノ酸の合成方法も多くの文献に開示されており、これらの合成方法の条件を制御することにより、所望の重合度を有するポリアミノ酸を有利に得ることができ、即ち、所望の分子量又は分子量範囲のポリアミノ酸を有利に得ることができる。また、例えば、ナトリウム塩（例えば、ポリアスパラギン酸）、塩酸塩（例えば、ポリオルニチン）等の上記ポリアミノ酸の薬学的に許容される塩を用いることもできる。また、上記ポリアミノ酸は市場から購入できる。例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から、所望の重合度又は分子量又は分子量範囲を有するポリアミノ酸が容易に購入でき、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から、製品番号がＰ６７６２で、分子量が１５０００〜５００００ダルトンであるポリ−Ｌ−アスパラギン酸が容易に購入できる。本発明において、特別な説明がない限り、用いられるポリアミノ酸は、市場から購入されるものとする。
【００８６】
ポリアミノヘキソースにとって、アミノヘキソースは、グルコサミン、ガラクトサミン、アセチルグルコサミン、アセチルガラクトサミン、又はそれらの組み合わせから選択することができる。それによってポリグルコサミン、ポリガラクトサミン、ポリアセチルグルコサミン、ポリアセチルガラクトサミン等のポリアミノヘキソースが形成される。これらのポリアミノヘキソースの製造方法は当業者に公知のものであり、例えば、邵健ら（中国医薬工業雑誌，１９９９，３０（１１）：４８１）により、特定分子量を有するポリグルコサミンが開示されており、当業者は、当該文献を参照にし、これらの合成方法の条件を制御することにより、所望の重合度を有するポリグルコサミンを有利に得ることができ、即ち、所望の分子量又は分子量範囲を有するポリグルコサミンを有利に得ることができる。また、これらのポリグルコサミンは市場から購入することもでき、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から、所望の重合度又は分子量又は分子量範囲を有するポリグルコサミンを購入することができ、ある国内社、例えば、
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や石家庄拓冶社から、所望の重合度又は分子量又は分子量範囲を有するポリグルコサミンを購入することもできる。本発明において、特別な説明がない限り、用いられるポリグルコサミンは、市場から購入されるものとする。
【００８７】
本発明の１つの実施形態において、本発明は、ポリエンマクロライド系物質、例えば、アムホテリシンＢの欠点を克服し、新規な重合高分子とポリエンマクロライド系物質、例えば、アムホテリシンＢとを結合させてなるポリ（ポリエンマクロライド系物質）、例えば、ポリアムホテリシンＢポリ結合体を研究・設計した。
【００８８】
本発明のポリ結合体の１つの実施形態において、１個の重合高分子に複数のポリエンマクロライド系物質、例えば、アムホテリシンＢを結合することができる。
【００８９】
本発明のポリエンマクロライド系物質はアムホテリシンＢを例とし、本発明により提供されるポリ結合体はアムホテリシンＢのプロドラッグであると理解でき、ポリアムホテリシンＢは体内でエステル加水分解酵素又はアミノ酸加水分解酵素の作用により次第に加水分解してアムホテリシンＢを放出し、重合高分子も次第に加水分解して小分子になり、体内から排出される。本発明の重合高分子とアムホテリシンＢとを結合させてなる新規なアムホテリシンＢポリ結合体はポリアムホテリシンＢ又はこれに類似する用語とも呼ばれる。ポリアムホテリシンＢは重合高分子とアムホテリシンＢが化学結合（エステル結合またはアミド結合）により結合してなる高分子−アムホテリシンＢポリ結合体である。このポリ結合体中の１個の高分子担体に複数のアムホテリシンＢ分子が結合している。本発明のポリアムホテリシンＢは、良好な水溶性、小さな毒性・副作用及びアムホテリシンＢ徐放性などの新規な特性を有し、新世代アムホテリシンＢである。ポリアムホテリシンＢは、従来のアムホテリシンＢの水溶性が劣り、毒性・副作用が大きいという欠点を克服した。重合高分子担体は毒性及び過敏性を有さず、且つ良好な生体適合性及び生分解性を有する。ポリアムホテリシンＢは体内でエステル加水分解酵素とアミノ酸加水分解酵素の作用により次第に分子上から加水分解され、アムホテリシンＢを放出し、血中濃度を長時間維持して抗真菌治療目的をより効果的に達成することができる。重合高分子担体も体内で次第に加水分解されて小分子になって体内から排出される。
【００９０】
本発明の１つの実施形態において、本発明のポリ結合体は、カルボン酸系ポリアミノ酸とポリエンマクロライド系物質、例えば、アムホテリシンＢとを結合させて得られるものである。例えば、ポリアミノ酸分子におけるカルボキシル基とアムホテリシンＢ分子における水酸基とを結合させてなるエステル結合により結合してなるものである。例えば、ポリアスパラギン酸とアムホテリシンＢとで形成されたポリ結合体を例とし、その化学結合様式の一例を以下に示す。
【００９１】
【化９】
2016525129.tif 000012
【００９２】
その中では、アムホテリシンＢは、ＤＣＣを縮合剤とする化学縮合反応において、優位な反応活性を示す３７位の水酸基（活性水酸基）がポリアスパラギン酸のカルボキシル基と反応し、分子間脱水させてエステル結合（−ＣＯＯ−）を形成することができ、ポリアスパラギン酸のペプチド結合における複数の遊離水酸基に、縮合反応の具体的な条件（例えば、原料投入量、反応温度、反応時間等）により、所望量のアムホテリシンＢを結合させることができ、例えば、得られたポリアミノ酸とアムホテリシンＢとの両単位からなるポリ結合体において、アムホテリシンＢの重量は当該ポリ結合体重量の５〜６０％（例えば、１０〜５０％，例えば、１０〜４０％、例えば、１０〜３５％）を占めることができ、次いで、得られたポリ結合体と塩基性物質とを反応させて薬学的に許容される塩を形成することができ、例えば、ナトリウム塩を形成させることができる。前述したように、具体的な所要に応じて、理論的に、縮合反応の条件を調整することにより、アムホテリシンＢのその他の水酸基とポリアスパラギン酸とを縮合させてポリ結合体を形成することもできる。後述するように、本発明では、紫外法とＨＰＬＣ法により、物理結合（例えば、水素結合）でなく、化学結合で形成されたポリ結合体であることが確認された。このポリ結合体の化学結合による結合位置は特に限定されない。上記カルボン酸系ポリアミノ酸の代表的な例としては、Ｄ−アスパラギン酸（Aspartic acid, Ａｓｐ）、Ｌ−アスパラギン酸、ＤＬ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸（Glutamic acid, Ｇｌｕ）、Ｌ−グルタミン酸、ＤＬ−グルタミン酸、及これらの組み合わせが挙げられるが、これらに限られず、例えば、任意の配置のアスパラギン酸と任意の配置のグルタミン酸とを任意の割合、例えば、０〜９９％の混合割合で重合させてなるカルボン酸系ポリアミノ酸を挙げることができる。
【００９３】
本発明の１つの実施形態において、本発明のポリ結合体は、アミノ系ポリアミノ酸とポリエンマクロライド系物質、例えば、アムホテリシンＢとを結合させてなるものである。例えば、ポリアミノ酸分子における遊離アミノ基（−ＮＨ2）とアムホテリシンＢ分子における遊離カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を触媒の存在下で分子間脱水させてアミド結合（−ＣＯＮＨ−）を形成することにより、両分子を結合させてなるポリアミノ酸−アムホテリシンＢである。例えば、ポリオルニチンとアムホテリシンＢとで形成されたポリ結合体を例とし、その化学結合様式の一例を以下に示す。
【００９４】
【化１０】
2016525129.tif 000013
【００９５】
前記ポリアスパラギン酸−アムホテリシンＢポリ結合体に類似し、ポリオルニチンペプチド鎖における複数の遊離アミノ基に、縮合反応の具体的な条件（例えば、原料投入量、反応温度、反応時間等）により所望量のアムホテリシンＢを結合することができ、次いで、得られたポリ結合体と酸性物質とを反応させて薬学的に許容される塩を形成することができ、例えば、塩酸塩を形成させることができる。類似的には、後述するように、本発明では、紫外法とＨＰＬＣ法により、物理結合（例えば、水素結合）でなく、化学結合で形成されたポリ結合体であることが確認された。このポリ結合体の化学結合による結合位置は特に限定されない。上記アミノ系ポリアミノ酸の代表的な例としては、Ｄ−オルニチン（Ornithine, Ｏｒｎ）、Ｌ−オルニチン、ＤＬ−オルニチン、Ｄ−リシン（Lysine, Ｌｙｓ）、Ｌ−リシン、ＤＬ−リシン、Ｄ−アルギニン（Ａｒｇ）、Ｌ−アルギニン、ＤＬ−アルギニン、Ｄ−ヒドロキシリシン（Ｈｙｌ）、Ｌ−ヒドロキシリシン、ＤＬ−ヒドロキシリシン、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限られず、例えば、任意の配置のオルニチン酸と任意の配置のリシンとを任意の割合、例えば、１〜９９％の混合割合で重合させてなるカルボン酸系ポリアミノ酸を挙げることができる。
【００９６】
本発明的１つの実施形態において、本発明のポリ結合体は、ポリアミノヘキソースとポリエンマクロライド系物質、例えば、アムホテリシンＢとを結合させてなるものである。例えば、ポリアミノヘキソース（ポリグルコサミン）分子における遊離水酸基（−ＯＨ）とアムホテリシンＢ分子における遊離カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）とを触媒の存在下で分子間脱水させてエステル結合（−ＣＯＯ−）を形成することにより、両分子を結合させてなるポリグルコサミン−アムホテリシンＢである。例えば、ポリアミノグルコースとアムホテリシンＢとで形成されたポリ結合体を例とし、その化学結合様式の一例を以下に示す。
【００９７】
【化１１】
2016525129.tif 000014
【００９８】
ポリアスパラギン酸−アムホテリシンＢポリ結合体に類似し、ポリグルコサミン鎖における複数の遊離水酸基に、縮合反応の具体的な条件（例えば、原料投入量、反応温度、反応時間等）により所望量のアムホテリシンＢを結合することができる。類似的には、後述するように、本発明では、紫外法とＨＰＬＣ法により、物理結合（例えば、水素結合）でなく、化学結合で形成されたポリ結合体であることが確認された。このポリ結合体の化学結合による結合位置は特に限定されない。ポリアミノヘキソースの代表的な例としては、ポリグルコサミン、ポリガラクトサミン、ポリアセチルグルコサミン、ポリアセチルガラクトサミン等のポリアミノヘキソースが挙げられるが、これらに限られない。
【００９９】
本発明の物質の製造方法において、反応に用いられる各原料は、当業者が既知の知識により製造して得ることができるもの、又は文献により知られている方法により製造して得ることができるもの、又は商業的に入手可能なものである。本発明の反応スキームに用いられる中間体、原料、試薬、反応条件はいずれも当業者が既知の知識により適宜調整し得る事項である。
【０１００】
本発明のポリ結合体は、例えば、アレルギーなどの不利な作用が生じない限り、そのほかの有効成分と組み合わせて使用することもできる。
【０１０１】
本発明のポリ結合体は、唯一の薬物として使用してもよいし、本発明の物質と生理学的活性で相乗効果及び／又は効果向上作用を示す１種又は複数の薬物と併用してもよい。併用する治療方法は、各々の成分を同時、順序又は間隔して投与することにより実現される。
【０１０２】
本発明に用いられる用語「薬物組成物」は、所定成分を所定量で含有する製品、及び直接又は間接的に所定量の各所定成分を組み合わせて得られる如何なる製品を含むことを意味する。本発明では、用語「薬物組成物」と用語「組成物」とを互いに置き換えて用いることができる。
【０１０３】
本発明の薬物組成物中の各有効成分の事実上の調剤レベルは、特定の患者、化合物、及び投与形態に対する所望の治療上の反応を達成するために有効な有効物質量が得られるように調整され得る。調剤レベルは、特定の有効物質の活性、投与経路、処置される症状の深刻度及び処置される患者の病状及びこれまでの病歴に依存する。しかしながら、当業界では、有効物質の量を、所望の治療効果を達成するために必要以下のレベルから開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に増大させるようにすることは、通常である。
【０１０４】
上記本発明の治療及び／又は予防或いはその他の治療及び／又は予防に用いる場合、治療及び／又は予防有効量の本発明ポリ結合体を単独で使用することができる。あるいは、上記ポリ結合体は、当該目的ポリ結合体と薬物に許容される１種類又は複数の賦形剤との薬物組成物として投与することができる。用語「治療及び／又は予防有效量」の本発明ポリ結合体は、如何なる医学治療及び／又は予防に適用する合理的な効果／リスク比で障害を治療するのに十分な量のポリ結合体をいう。なお、本発明ポリ結合体と薬物組成物の総日用量は、担当医により、信頼できる医学的判断範囲において決定されなければならない。如何なる特定の患者に対して、具体的な治療有効量は、複数の要因により決定されなければならない。上記要因としては、治療される障害の程度；用いられる具体ポリ結合体の活性；用いられる具体薬物組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康状況、性別及び飲食；用いられる具体薬物組成物の投与時間、投与経路及び排せつ率；治療持続時間；用いられる薬物組成物と組み合わせて使用するか又は同時に用いられる他の薬物；及び医療分野公知の類似要因がある。例えば、当業界では、有効物質の量を、所望の治療効果を達成するために必要以下のレベルから開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に増大させるようにすることは、通常である。一般的に、本発明のポリ結合体の哺乳動物特にヒトへの用量は、上記ポリエンマクロライド系化合物として０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、例えば、０．００１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重／日、例えば、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日である。
【０１０５】
当業者によく知られている薬物担体を用いることにより、有効量の本発明ポリ結合体を含有する薬物組成物を製造することができる。そのため、本発明は、１種又は複数の薬物的に許容される無毒担体と配合された本発明ポリ結合体を含む薬物組成物を提供する。前記薬物組成物は、特別に経口投与用、非経口注射用又は直腸投与用の固体又は液体剤形に調製され得る。
【０１０６】
上記薬物組成物は、投与便宜の点から、例えば、経口製剤（例えば、錠剤、カプセル剤、溶液又は懸濁液）；注射可能な製剤（例えば、注射可能な溶液又は懸濁液）、又は注射前に注射水を加えた直後使用できる注射可能な乾燥粉末）等の各種の剤形に調製され得る。上記薬物組成物中の担体は、経口製剤に用いられる結合剤（例えば、デンプン、典型的にはコーン、小麦やコメデンプン、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン）、希釈剤、潤滑剤（例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸またはその塩、典型的には、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム、及び／又はポリエチレングリコール）、及び必要に応じて例えば、デンプン、寒天、アルギン酸またはその塩、典型的にはアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、及び／又は発泡性混合物、可溶化剤、安定化剤、懸濁化剤、着色剤、矯味剤など、注射可能な製剤に用いられる防腐剤、可溶化剤、安定化剤等；局所製剤に用いられるマトリックス、希釈剤、潤滑剤等を含んでいる。薬物製剤は経口又は非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所）投与することができ、ある薬物が胃部の条件下で非安定である場合、それを腸溶錠剤に調製することができる。
【０１０７】
より詳細には、本発明の薬物組成物は、経口投与、直腸投与、非経口投与、槽内投与、膣内投与、腹腔内投与、局所（例えば散剤、軟膏剤又は点滴剤による）投与、頬側から、あるいは口腔スプレー若しくは鼻用スプレーとして、ヒト及び他の動物に投与される。本明細書に用いられる用語「非経口」投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下及び関節内注射及び輸液を含む投与形態に関する。
【０１０８】
非経口注射に適用する薬物組成物は、生理的に許容される滅菌水性又は非水性溶液剤、分散剤、懸濁剤又は乳剤、及び注射可能な滅菌溶液剤又は分散剤の再構成のための滅菌散剤を含むことができる。好適な水性又は非水性担体、希釈剤、溶媒又は媒体の例としては、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン等）、植物油（例えば、オリーブ油）、注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）及びこれらの適当な混合物がある。
【０１０９】
これらの薬物組成物は、例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などの添加剤を含有することもできる。微生物の働きの予防は、例えば、パラベン類、トリクロロ−ｔ−ブタノール、フェノール、ソルビン酸等の種々の抗細菌剤及び抗真菌剤によって確保され得る。例えば、糖類、塩化ナトリウム等の等張化剤を含むことが望ましいこともある。注射可能な薬物の形態の遅延される吸収は、吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によって実現される。
【０１１０】
懸濁剤は活性化合物の他に、更に懸濁剤、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天及びトラガカントゴム又はこれらの混合物等を含有してもよい。
【０１１１】
いくつかの場合、薬物の働きを延長するために、皮下又は筋肉内注射からの薬物の吸收を遅らせることが望ましい。このことは、例えば、水溶性の乏しい結晶又はアモルファス物質の液体懸濁液の使用によって達成され得る。このように、薬物の吸収速度はその溶解速度に依存し、その溶解速度は結晶の大きさ及び結晶の形状に依存する。あるいは、非経口投与される薬物の徐放性吸収は、油性媒体中での薬物の溶解又は懸濁によって達成され得る。
【０１１２】
注射可能なデポ製剤は、生分解性ポリマー、例えば、ポリラクチド−ポリグリコリドに薬物のマイクロカプセルマトリックスを形成することにより製造することができる。薬物とポリマーとの比及び用いられる具体ポリマー性質により、薬物の放出速度を制御することができる。その他の生分解性ポリマーの例としては、ポリオルトエステル類及びポリ酸無水物類を挙げることができる。また、注射可能なデポ製剤は、薬物を生体組織適合性リポソーム又はマイクロエマルジョンに包埋させることにより製造することもできる。
【０１１３】
注射可能な製剤は、例えば、細菌濾過器でろ過するか、又は滅菌固体組成物のような滅菌剤を混合することにより滅菌することができる。上記固体組成物を使用直前に滅菌水又はその他の注射可能な滅菌媒体に溶解又は分散させることができる。
【０１１４】
本発明の化合物又はその薬物組成物を経口投与法又は非経口投与法を用いて投与することができる。経口投与製剤は錠剤、カプセル剤、コーティング剤であり得る。非経口投与製剤としては、注射剤及び坐剤等が挙げられる。これらの製剤は、当業者に熟知されている方法により製造されるものである。錠剤、カプセル剤、コーティング剤の製造のために用いられる添加剤は、一般的に使用される添加剤であり、例えば、デンプン、ゼラチン、アラビアゴム、シリカ、ポリエチレングリコールを挙げることができる。液体剤形に用いられる溶媒は、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、植物油（例えば、コーン油、ピーナッツ油、オリーブ油等）である。本発明の化合物を含有する製剤は、更に、例えば、界面活性剤、潤滑剤、崩壊剤、防腐剤、矯味剤及び色素等の他の添加剤を含有する。錠剤、カプセル剤、コーティング剤、注射剤及び坐剤への本発明ポリ結合体の含有量は、単位剤形に存在しているポリエンマクロライド系化合物の量で算出されるものである。単位剤形中の本発明ポリエンマクロライド系化合物の含有量は、通常０．０１ｍｇ〜５０００ｍｇ、好ましくは０．１〜５００ｍｇ、更に好ましくは１〜５００ｍｇである。詳細には、本発明で提供できる経口投与用の固体剤形としては、カプセル剤、錠剤、ピル、散剤及び顆粒剤が挙げられる。このような固体剤形において、活性化合物は、少なくとも１つの不活性な、薬物に許容される賦形剤又は担体と混合してもよく、ここで、その様な薬物に許容される賦形剤又は担体は、クエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウム並びに／或いはａ）充填剤又は増量剤；ｂ）結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、及びアラビアゴム；ｃ）保湿剤、例えばグリセリン；ｄ）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ポテト又はタピオカデンプン、アルギン酸、あるケイ酸塩、及び炭酸ナトリウム；ｅ）溶液遅延剤、例えばパラフィン；ｆ）吸収促進剤、例えば第４級アンモニウム化合物；ｇ）湿潤剤、例えばセチルアルコール及びグリセロールモノステアレート；ｈ）吸着剤、例えばカオリン及びベントナイト；並びにｉ）潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体のポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、並びにそれらの混合物を含む。カプセル、錠剤及びピルの場合、当該剤形は更に緩衝剤を含んでもよい。
【０１１５】
類似のタイプの固体組成物は乳糖及び高分子量のポリエチレングリコール等の賦形剤を用い、更に軟カプセル及び硬カプセル中の充填剤として用いることもできる。
【０１１６】
錠剤、糖衣錠（dragees）、カプセル、ピル、及び顆粒の固体剤形は、コーティング及びシェル、例えば、腸溶性コーティング及び医薬製造業界で周知の他のコーティングを用いて製造され得る。これらの固体剤形は不透明剤を含んでもよく、そして有効成分を腸管のみ又は好ましくは腸管のある部分において、任意に徐放性で放出させるような組成であってもよい。使用できる包埋組成物の例としては、ポリマー物質及びロウがある。有効物質は、適切な場合、１種又は複数の上記賦形剤と共にマイクロカプセル型剤形に調製されてもよい。
【０１１７】
経口投与のための液体剤形としては、薬学的に許容される乳剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤及びエリクシル剤がある。有効物質に加えて、当該液体剤形は、当業界で一般的に使用されている不活性希釈剤、例えば水又は他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に綿実油、落花生油、コーン油、胚油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセリン、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタン脂肪酸エステル、並びにそれらの混合物を含むことができる。経口投与組合物は、不活性希釈剤に加えて、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、甘味剤、矯味剤などの添加剤を含むことができる。
【０１１８】
直腸又は膣腔投与のための組成物は好ましくは坐剤である。坐剤は、本発明のポリ結合体と好適な非刺激性賦形剤又は担体、例えばカカオ脂、ポリエチレングリコール又は坐剤ワックスを混合することにより製造することができる。それらは室温において固体で、体温において液体となるため、直腸又は膣腔内で溶けて活性化合物を放出することができる。
【０１１９】
本発明のポリ結合体及びその薬物組成物を局所投与用とすることも考慮される。本発明の化合物の局所的投与のための剤形としては、粉末、スプレー、軟膏剤及び吸入薬がある。滅菌条件下で、有効物質と、薬学的に許容される担体及び如何なる必要な防腐剤、緩衝液、又は噴霧剤とを混合する。眼用製剤、眼軟膏剤、散剤及び溶液剤も、本発明の範囲内であるとみなされる。
【０１２０】
本発明のポリ結合体はまた、リポソームの形態で投与され得る。当業界で知られている様に、リポソームは通常リン脂質又は他の脂質物質から製造して得られる。リポソームは、水性媒体中に分散される単層又は多層の水和性液体結晶によって形成される。リポソームを形成し得る、如何なる非毒性の、生理的に許容され、かつ代謝可能な脂質が使用され得る。リポソーム形態の本発明化合物は、本発明の化合物に加えて、安定化剤、防腐剤、賦形剤等を含むことができる。好ましい脂質は、天然、そして合成のリン脂質及びホスファチジルコリン（レシチン）である。それらを単独で使用してもよいし、併用してもよい。リポソームを形成する方法は当業界で知られている。例えばPrescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p.33を参照する。
【０１２１】
本発明者らは、本発明のポリ結合体が生物的及び／又は物理的及び／又は化学的の面で予想外の有益な効果を示すことを見出した。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】アムホテリシンＢの紫外可視光のスペクトログラム。
【図２】ポリアスパラギン酸の紫外可視光のスペクトログラム。
【図３】ポリアスパラギン酸−アムホテリシンＢポリ結合体（ＰＡ−ＡＢ）の紫外可視光のスペクトログラム。
【図４】アムホテリシンＢ（ＡＢ，２８μｇ／ｍｌ）の高速液体クロマトグラム。
【図５】ポリアスパラギン酸（製造例１に用いられ、ＰＡ，８０μｇ／ｍｌ）の高速液体クロマトグラム。
【図６】ポリアスパラギン酸−アムホテリシンＢポリ結合体の高速液体クロマトグラム。
【図７】ポリアスパラギン酸−アムホテリシンＢポリ結合体と遊離アムホテリシンＢとの物理的混合物の高速液体クロマトグラム。
【図８】ポリアスパラギン酸−アムホテリシンＢ（ＰＡ−ＡＢ）の水素核磁気共鳴（1Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル。
【図９】ポリアスパラギン酸−アムホテリシンＢ（ＰＡ−ＡＢ）の炭素核磁気共鳴（13Ｃ−ＮＭＲ）スペクトル。
【図１０】ポリアスパラギン酸−アムホテリシンＢ（ＰＡ−ＡＢ）の高速液体（ＨＰＬＣ）紫外測定（ＵＶ）スペクトル。
【図１１】ポリアスパラギン酸−アムホテリシンＢ（ＰＡ−ＡＢ）の高速液体（ＨＰＬＣ）質量分析（ＭＳ）スペクトル。
【図１２】アムホテリシンＢ（ＡＢ）の高速液体（ＨＰＬＣ）紫外測定（ＵＶ）スペクトル。
【図１３】アムホテリシンＢ（ＡＢ）の高速液体（ＨＰＬＣ）質量分析（ＭＳ）スペクトル。
【発明を実施するための形態】
【０１２３】
以下、製造例と試験例により本発明をより詳細に説明するが、これらの例は、より詳細に説明するためのものとして解されるべきであり、本発明に対し何らの制限があるものとして解されるべきではない。
【０１２４】
本発明は試験中で用いる材料及び試験方法について一般的及び／又は詳細な記載をする。本発明の目的を実現するために用いる多くの材料及び操作方法は当業界に知られているものであるが、ここで、本発明は依然としてなるべく詳細な記載をする。当業者に知られているように、以下、特別な説明がない限り、本発明で用いる材料及び操作方法は、当業界に知られているものである。
【０１２５】
Ａ、ポリ結合体の測定方法
測定方法１：紫外可視分光光度法
アムホテリシンＢ（２５ｇ／ｍｌ，ＤＭＳＯを溶媒とし、且つブランクとする）に対し、紫外可視分光光度法のスペクトル走査を行ない、その結果を図１に示す。図１において、波長３００ｎｍ未満及び５００ｍｎ超の範囲にほとんど吸収ピークを有さず、波長３５０〜４５０ｎｍ範囲に吸収ピークを有し、且つ３７１ｎｍ、３９１ｎｍ、４１５ｎｍに典型的な吸収ピークを示すことが示されている。
【０１２６】
ポリアスパラギン酸（製造例１に用いられ、１００μｇ／ｍｌ、水を溶媒とする）に対し、紫外可視分光光度法のスペクトル走査を行ない、その結果を図２に示す。図２において、波長２５０ｎｍ超の波長範囲に吸収ピークを有さず、波長２５０ｎｍ未満の範囲に典型的な末端吸収ピークを有することが示されているから、波長２５０ｎｍ超の範囲では、ポリアスパラギン酸は、ポリ結合体又はアムホテリシンＢの吸光度に寄与しないことが判明された。
【０１２７】
ポリアスパラギン酸−アムホテリシンＢポリ結合体（ＰＡ−ＡＢ）（製造例１で得られ、１００μｇ／ｍｌ、水を溶媒とする）に対し、紫外可視分光光度法のスペクトル走査を行ない、その結果を図３に示す。図３において、波長５００ｎｍ超の範囲に吸収ピークを有さず、波長２５０ｎｍ未満の範囲に典型的な末端吸収ピークを有し（ポリアスパラギン酸から寄与）、波長３００〜４５０ｎｍの範囲に吸収ピークを有し（主にアムホテリシンＢから寄与）、且つ３６６ｎｍ、３８５ｎｍ、４０９ｎｍに典型的な吸収ピークを示すことが示されている。３つの典型的な吸収ピークは図１に示すアムホテリシンＢの３つの吸収ピークに対応する波長とややシフトし、化学結合してなるポリ結合体が形成されたことによるものと考えられるが、全体的にアムホテリシンＢの典型的な吸收スペクトルを示す。
【０１２８】
以上の図１〜３にてポリアスパラギン酸、アムホテリシンＢ、両者から形成されたポリ結合体の紫外可視分光光度法のスペクトログラムのスペクトル特徴を分析した結果、３種類の物質は分光光度法で夫々独自のスペクトル挙動及びスペクトル寄与を有することが判明され、それによって、３種類の物質をＨＰＬＣ法により定性及び定量分析することが可能となる。
【０１２９】
また、本発明者らは、更なる試験を行なった結果、その他の種類のポリアミノ酸及びポリアミノヘキソース、その他の種類のポリエンマクロライド抗生物質、及びその他の種類のポリアミノ酸又はポリアミノヘキソース−ポリエンマクロライド抗生物質ポリ結合体は、いずれも上記ポリアスパラギン酸、アムホテリシンＢ及びそれらのポリ結合体に類似する紫外可視分光光度法のスペクトログラムのスペクトル特徴を有し、３種類の物質は分光光度法で夫々独自のスペクトル挙動及びスペクトル寄与を有し、それによって、３種類の物質をＨＰＬＣ法により定性及び定量分析することが可能となることを見出した。例えば、ポリオルニチン、ポリグルコサミン、ポリグルタミン酸等は上記ポリアスパラギン酸に類似し、アムホテリシンＢのスペクトログラムのスペクトル特征に影響／妨害を及ぼさない。また、例えば、ポリアスパラギン酸、ポリオルニチン、ポリグルタミン酸、ポリグルコサミン、ポリガラクトサミン等は、ナタマイシンのスペクトログラムのスペクトル特征に影響／妨害を及ぼさない。
【０１３０】
測定方法２：高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ法）
中国薬典２０１０年版二部３２８頁  アムホテリシンＢ関連物質測定事項に記載の方法を参照し、測定条件は、Ｃ１８クロマトカラム（４．６＊３０ｍｍ，５μｍ）、移動相：アセトニトリル−メタノール−エチレンジアミン四酢酸０．０７３％含有０．０５ｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム溶液（ｐＨを氷酢酸を用いて５．０に調整した）（２６０：４５０：３２０）、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ；測定波長４０５ｎｍである。図４は、アムホテリシンＢ（ＡＢ，２８μｇ／ｍｌ）の高速液体クロマトグラムであり、その中では、アムホテリシンＢは約１２ｍｉｎにピークを有することが示されている。
【０１３１】
上記ＨＰＬＣ法に従い、ポリアスパラギン酸（ＰＡ，８０μｇ／ｍｌ）を測定して高速液体クロマトグラムを得た。図５に示されるように、約３ｍｉｎに小さなピークを示しており、ピークが小さい原因は、測定波長４０５ｎｍにＰＡの吸収が弱いものと考えられる。
【０１３２】
上記ＨＰＬＣ法に従い、ポリアスパラギン酸−アムホテリシンＢポリ結合体（ＰＡ−ＡＢ，製造例１の生成物，１０５μｇ／ｍｌ，その中では、含まれるアムホテリシンＢの濃度は図４の試料溶液中のアムホテリシンＢの濃度と相当する）を測定して高速液体クロマトグラムを得た。図６に示されるように、約１２ｍｉｎにピークがほとんど検出されていない（遊離ＡＢなし）が、約３ｍｉｎに図４と相当するピーク面積を有するピークが示されている。これから、当該ＰＡ−ＡＢポリ結合体において遊離ＡＢがほとんどなく（面積百分率法で算出した面積率は１％未満）、本発明の方法によれば、高純度ＰＡ−ＡＢポリ結合体（ＡＢとして計算した純度は９９％超）を得ることが可能であり、ＰＡ−ＡＢが化学結合により安定な化合物を形成し、クロマトグラフ条件下で分離できず、且つポリアミノ酸の大きな極性により当該ＰＡ−ＡＢポリ結合体のクロマトグラムはＰＡに近い挙動を維持し、即ち、ＰＡのピークを示すことが判明されている。また、前記ＨＰＬＣ法に図４の測定結果を結び付けることにより、当該ポリ結合体中のＡＢの含有率、即ち、活性薬物の含量を計算することができ、このように計算したところ、製造例１の活性薬物の含量は、２３．４％（ｗ／ｗ）であった。
【０１３３】
上記ＨＰＬＣ法に従い、ポリアスパラギン酸−アムホテリシンＢポリ結合体と遊離アムホテリシンＢとの物理的混合物（ＰＡ−ＡＢ，１００μｇ／ｍｌ；ＡＢ，２６μｇ／ｍｌ）の高速液体クロマトグラムを得た。図７に示されるように、約１２ｍｉｎにＡＢの添加量に一致するＡＢピークが検出されており、且つ約３ｍｉｎにＰＡ−ＡＢの添加量に一致するＰＡ−ＡＢピークが検出されている。これから、当該ＰＡ−ＡＢポリ結合体と遊離ＡＢとの両者は、独自のクロマトグラフ挙動を示し、互いに妨害しないことが判明された。
【０１３４】
同様には、上記ＨＰＬＣ法は、アムホテリシンＢとその他の高分子ポリマーとからなるポリ結合体に適用し、ないしはＨＰＬＣ条件をほとんど変化させずにこれらのポリ結合体を定性・定量分析することが可能である。
【０１３５】
同様には、上記ＨＰＬＣ法は、その他のポリエンマクロライド系化合物と高分子ポリマーとからなるポリ結合体に適用し、特にＨＰＬＣ条件、例えば、移動相等を適宜変化することによりこれらのポリ結合体を定性・定量分析することが可能である。例えば、その他の薬品基準又は文献に記載のその他のポリエンマクロライド系化合物のＨＰＬＣ分析方法又は分析条件を参照することができる。例えば、トリコマイシンはＪＰ１６における同種類事項に記載のＨＰＬＣ分析方法又は分析条件を参考して行なうことができる。
【０１３６】
Ｂ、ポリ結合体の製造例
製造例１．ポリアスパラギン酸−アムホテリシンＢポリ結合体の化学合成
概略的合成経路を下記に示す。
【０１３７】
【化１２】
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【０１３８】
合成手順：ポリアスパラギン酸８００．０ｍｇ（分子量２８０００Ｄａ）をジメチルホルムアミド５ｍｌに溶けた。次いで上記ジメチルホルムアミド溶液にアムホテリシンＢ２８０．０ｍｇ（０．３０ｍｏｌ）を加え、撹拌してアムホテリシンＢを溶解させた。更にジシクロヘキシルカルボジイミド６２．５ｍｇ（０．３０ｍｏｌ）と４−（ジメチルアミノ）ピリジン３７．０ｍｇ（０．３０ｍｏｌ）を取り、それらを上記ジメチルホルムアミド溶液に加え、室温（２３〜２５℃）条件下で、１２時間磁気撹拌した。上記反応液に１ＭＮａＨＣＯ3溶液１００ｍｌを加え、１時間磁気撹拌し、得られた塩基性溶液を透析バッグに入れ、脱イオン水を用いて５時間透析した後、溶液を０．２μろ過膜を通し、冷凍、乾燥して、ポリアスパラギン酸−アムホテリシンＢポリ結合体１０３３．４ｍｇを得た。
【０１３９】
図８は、本製造例で得られたポリアスパラギン酸−アムホテリシンＢポリ結合体の水素核磁気共鳴1Ｈ−ＮＭＲ）スペクトルで、当該ポリ結合体に一致するスペクトル線を示している。
【０１４０】
図９は、本製造例で得られたポリアスパラギン酸−アムホテリシンＢポリ結合体の炭素核磁気共鳴（13Ｃ−ＮＭＲ）スペクトルで、当該ポリ結合体に一致するスペクトル線を示している。
【０１４１】
図１０は、本製造例で得られたポリアスパラギン酸−アムホテリシンＢポリ結合体の高速液体（ＨＰＬＣ）紫外測定（ＵＶ）スペクトルである。
【０１４２】
図１１は、図１０のＨＰＬＣ条件下で、本製造例で得られたポリアスパラギン酸−アムホテリシンＢポリ結合体の高速液体（ＨＰＬＣ）質量分析（ＭＳ）スペクトルである。当該スペクトルにおいて、アムホテリシンＢで形成された若干のフラグメントが示されている。これから、アムホテリシンＢは、当該ポリ結合体に存在しており、且つ高分子ポリマー単位に伴ってＨＰＬＣ系にて溶離されることが判明された。
【０１４３】
図１２は、別の測定条件下で、本製造例で得られたポリアスパラギン酸−アムホテリシンＢポリ結合体の高速液体（ＨＰＬＣ）紫外測定（ＵＶ）スペクトルである。
【０１４４】
図１３は、図１２のＨＰＬＣ条件下で、本製造例で得られたポリアスパラギン酸−アムホテリシンＢポリ結合体の高速液体（ＨＰＬＣ）質量分析（ＭＳ）スペクトルである。図において、アムホテリシンＢで形成された若干のフラグメントが示されている。これから、アムホテリシンＢは、ポリ結合体に存在しており、且つ高分子ポリマー単位に伴ってＨＰＬＣ系で溶離されることが判明された。
【０１４５】
測定したところ、活性薬物含量＝２３．４％（ｗ／ｗ）、遊離活性薬物含量＜０．２％（図６において、ＡＢピークのピーク面積割るＰＡ−ＡＢピークのピーク面積かける１００％で得られたパーセンテージ）であった。
【０１４６】
製造例２．ポリオルニチン−アムホテリシンＢポリ結合体の化学合成
概略的合成経路を下記に示す。
【０１４７】
【化１３】
2016525129.tif 000016
【０１４８】
合成手順：ポリ−Ｄ−オルニチン２５０．０ｍｇ（分子量３４０００Ｄａ）をジメチルホルムアミド３ｍｌに溶けた。次いで上記ジメチルホルムアミド溶液にアムホテリシンＢ７５．０ｍｇ（０．０８ｍｍｏｌ）を加え、アムホテリシンＢを溶解させた。さらにジシクロヘキシルカルボジイミド１６．７ｍｇ（０．０８ｍｍｏｌ）と４−（ジメチルアミノ）ピリジン１０．０ｍｇ（０．０８ｍｍｏｌ）を取り、それらを上記ジメチルホルムアミド溶液に加え、室温（２３〜２５℃）条件下で、１２時間磁気撹拌した。上記反応液に水５０ｍｌを加え、得られた溶液を透析バッグに入れ、脱イオン水を用いて５時間透析した後、溶液を０．２μろ過膜を通し、冷凍、乾燥して、ポリオルニチン−アムホテリシンＢポリ結合体３２３．０ｍｇを得た。
【０１４９】
製造例１で得られた生成物に対し測定を行なう紫外可視分光光度法、ＨＰＬＣ法、水素核磁気共鳴（1Ｈ−ＮＭＲ）法、炭素核磁気共鳴（13Ｃ−ＮＭＲ）法、ＨＰＬＣ−ＵＶ法、ＨＰＬＣ−ＭＳ法を用いて測定したところ、化学結合により結合しているポリ結合体が形成されたことが示されている。
【０１５０】
測定したところ、活性薬物含量＝２０．８％（ｗ／ｗ）、遊離活性薬物含量０％（検出されていない）であった。
【０１５１】
製造例３．ポリグルコサミン−アムホテリシンＢポリ結合体の化学合成
概略的合成経路を以下に示す。
【０１５２】
【化１４】
2016525129.tif 000017
【０１５３】
合成手順：ポリグルコサミン５３２．０ｍｇ（分子量８５０００Ｄａ）をジメチルスルホキシド６ｍｌに溶けた。次いで上記ジメチルスルホキシド溶液にアムホテリシンＢ３０５．０ｍｇ（０．３３ｍｍｏｌ）を加え、アムホテリシンＢを溶解させた。さらにジシクロヘキシルカルボジイミド６８．１ｍｇ（０．３３ｍｍｏｌ）と４−（ジメチルアミノ）ピリジン４０．３ｍｇ（０．３３ｍｍｏｌ）を取り、それらを上記ジメチルスルホキシド溶液に加え、室温（２３〜２５℃）条件下で、１２時間磁気撹拌した。上記反応液に０．１Ｍ  ＨＣｌ  ８０ｍｌを加え、得られた酸性溶液を透析バッグに入れ、脱イオン水を用いて５時間透析した後、溶液を０．２μろ過膜を通し、冷凍、乾燥して、ポリグルコサミン−アムホテリシンＢポリ結合体８０３．５ｍｇを得た。
【０１５４】
製造例１で得られた生成物に対し測定を行なう紫外可視分光光度法、ＨＰＬＣ法、水素核磁気共鳴（1Ｈ−ＮＭＲ）法、炭素核磁気共鳴（13Ｃ−ＮＭＲ）法、ＨＰＬＣ−ＵＶ法、ＨＰＬＣ−ＭＳ法を用いて測定したところ、化学結合により結合しているポリ結合体が形成されたことが示されている。
【０１５５】
測定したところ、活性薬物含量＝３３．６％（ｗ／ｗ）、遊離活性薬物含量＜０．４％であった。
【０１５６】
製造例４．高分子ポリマー−アムホテリシンＢポリ結合体の化学合成
高分子ポリマーとしてポリ−ＤＬ−アスパラギン酸１４００．０ｍｇ（分子量１５０００Ｄａ）を用いること以外、製造例１と同様にして、ポリ結合体１５１１．５ｍｇを得た。得た生成物を測定したところ、活性薬物含量＝１５．７％（ｗ／ｗ）、遊離活性薬物含量＜０．８％であった。
【０１５７】
製造例５．高分子ポリマー−アムホテリシンＢポリ結合体の化学合成
高分子ポリマーとしてポリ（Ｌ−オルニチン／Ｌ−アルギニン（モル比１：１））１０００ｍｇ（分子量２５０００Ｄａ）を用いること以外、製造例１と同様にして、ポリ結合体１１９１ｍｇを得た。得た生成物を測定したところ、活性薬物含量＝１９．８％（ｗ／ｗ）、遊離活性薬物含量０％（検出されていない）であった。
【０１５８】
製造例６．高分子ポリマー−アムホテリシンＢポリ結合体の化学合成
高分子ポリマーとしてポリガラクトサミン（分子量１５００００Ｄａ）を用いること以外、製造例３と同様にして、ポリ結合体８１１ｍｇを得た。得た生成物を測定したところ、活性薬物含量＝２３．５％（ｗ／ｗ）、遊離活性薬物含量＜０．３％であった。
【０１５９】
製造例６．高分子ポリマー−アムホテリシンＢポリ結合体の化学合成
高分子ポリマーとしてポリアセチルグルコサミン（分子量２５０００Ｄａ）を用い、活性薬物の使用量が９０ｍｇであること以外、製造例３と同様にして、ポリ結合体６０２ｍｇを得た。得た生成物を測定したところ、活性薬物含量＝１１．２％（ｗ／ｗ）、遊離活性薬物含量０．２％であった。
【０１６０】
製造例７．高分子ポリマー−活性薬物ポリ結合体の化学合成
活性薬物としてナイスタチンを用いること以外、製造例１と同様にした。得られた生成物を測定したところ、活性薬物含量＝３１．１％（ｗ／ｗ）、遊離活性薬物含量＜０．３％であった。
【０１６１】
製造例８．高分子ポリマー−活性薬物ポリ結合体の化学合成
活性薬物としてナタマイシンを用いること以外、製造例２と同様にした。得られた生成物を測定したところ、活性薬物含量＝１８．７％（ｗ／ｗ）、遊離活性薬物含量＜０．２％であった。
【０１６２】
製造例９．高分子ポリマー−活性薬物ポリ結合体の化学合成
活性薬物としてトリコマイシンを用いること以外、製造例３と同様にした。得られた生成物を測定したところ、活性薬物含量＝２０．４％（ｗ／ｗ）、遊離活性薬物含量＜０．２％であった。
【０１６３】
製造例１０．高分子ポリマー−活性薬物ポリ結合体の化学合成
活性薬物としてそれぞれメパルトリシン、ｃａｎｎｉｔｒａｃｉｎ、フィリピン、オーレオフンギン、エトルスコマイシン、ハマイシン、ペリマイシンを用いること以外、製造例１と同様にして、それぞれ７種類の高分子ポリマー−活性薬物ポリ結合体を得た。それらはいずれも活性薬物含量が１０〜３５％の範囲にあり、且つ遊離活性薬物含量＜１．０％であった。
【０１６４】
製造例２１．ポリ結合体の化学合成（００１０５６２５５，ＣＮ１３１００２５Ａ，Εｘ４）
ポリ（グルタミン酸／アスパラギン酸）（分子量２８０００Ｄａ）とパクリタキセルとのポリマーと薬物を、４：１（モル比率）になるようにＮ，Ｎ−ＤＭＦに溶け、ＤＣＣをカップリング剤として用いた。ポリ（ジペプチド）３８３ｍｇをＤＭＦ８ｍｌに溶解し、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリミジン８．５ｍｇとパクリタキセル２０９．４ｍｇにＤＣＣ（１５２．２ｍｇ）を加えてから上記混合液に加えた。この反応液を、室温で２２時間撹拌した。尿素をろ過して、生じた溶媒をクロロホルムに加えた。この生成物をろ過して、重炭酸ナトリウムに再溶解し、蒸留水を用いて透析した後（１００００ダルトンでカットオフ）、生成物を凍結乾燥させて重さを計ったところ６１１ｍｇであった。得られた生成物を測定したところ、活性薬物含量＝２３．８％（ｗ／ｗ）、遊離活性薬物含量３．６％であった。
【０１６５】
製造例２２．ポリ結合体の化学合成（０２８１２１９５３，ＣＮ１５９６１２９Ａ，Ｅｘ１−Ｅｘ２）
ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）１３０ｋＤの酸化：１０ｇのヒドロキシエチルデンプン（１３０ｋＤ）を反応容器に入れ、そしてできるだけ少容量の水中に溶解させる。２ｍｌの０．１Ｎヨウ素溶液とほぼ３ｍｌの０．１Ｎ  ＮａＯＨ溶液を攪拌（マグネチックスターラー）しながらこの溶液に添加する。Ｉ2を示す色が消えるまで、この混合物を攪拌する。合計１０ｍ１の０．１Ｎヨウ素溶液と２０ｍｌの０．１Ｎ  ＮａＯＨ溶液を添加するまで、ヨウ素溶液及び／又はＮａＯＨ溶液の添加を数回繰り返す。次に、得られた溶液をＨ、イオン交換体カラム（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ１２０）に添加し、引き続いて透析管中で４〜６ｋＤの除去限界により蒸留水に対して２０時間透析する。この透析生成物を凍結乾燥し、そして酸化度をＳＯＭＯＧＹＩの方法により測定した。酸化度の定量：形成された酸化ＨＥＳ（ｏｘ−ＨＥＳ）を測定するために、ＳＯＭＯＧＹＩの方法を採用した（Meth.Carbohydrate Chem.I、384-386、1962）。この方法は、Ｃｕ2+のＣｕ+への還元による遊離アルデヒド基の定量に基づいている。ヨウ化物とヨウ素酸塩から形成されるヨウ素により、Ｃｕ+を再度Ｃｕ2+に酸化する。その後、過剰のヨウ素をチオ硫酸塩により滴定する。
【０１６６】
アンホテリシンＢ−ヒドロキシエチルデンプン結合体の合成：反応容器中で、６５０ｍｇ（１．５×１０-5モル）の乾燥したｏｘ−ＨＥＳ（１３０ｋＤ、酸化度ほぼ１００％）と２．８ｍｇ（３．０×１０-6モル）のアンホテリシンＢを攪拌しながら、約４ｍｌの無水ＤＭＳＯに窒素雰囲気中室温で溶解する。この混合物を７０℃で２４時間遮光反応させる。１０容量のＨ2Ｏの添加後、遮光下で、この水を４回交換しながら４℃で４８時間、水に対して透析することにより、この反応生成物を処理する。引き続いて生成物を凍結乾燥して、僅かに黄色の粉末を得た。得られた生成物を測定したところ、活性薬物含量＝０．５８％（ｗ／ｗ）、遊離活性薬物含量４．８％であった。
【０１６７】
Ｃ、試験例
試験例１：本発明のポリ結合体の溶解性の測定
各製造例で得られた高分子ポリマー−活性薬物ポリ結合体の溶解度を、水を溶媒とし、室温（２２〜２５℃）下で測定し、溶解できたポリ結合体中の活性薬物量を溶解度として示す。例えば、水１００ｍｌにポリ結合体１０ｇを溶解でき且つ当該ポリ結合体中の活性薬物量が２５％である場合、活性薬物量で示す溶解度は２．５％である。
【０１６８】
測定したところ、製造例１〜製造例９のポリ結合体の全ては、溶解度が１．４％より大きく、１．４〜２．８％の範囲にある。例えば、製造例１の溶解度は約１．９５％であった。しかしながら、製造例１０で得られた７種類のポリ結合体の溶解度はいずれも０．５％より小さく０．１３〜０．４７％の範囲にある点で、残念である。例えば、ポリアスパラギン酸−メパルトリシンポリ結合体の溶解度は０．２７％であった。
【０１６９】
また、製造例２１で得られた生成物中の活性薬物の溶解度は０．５３％であり、製造例２２で得られた生成物中の活性薬物であるアムホテリシンＢの溶解度は０．０２６％であった。
【０１７０】
試験例２：本発明のポリ結合体の溶血性の測定
ＣＮ１５９６１２９Ａ（フレゼニウスカービ）の明細書第１２〜１４頁の実施例３の方法に従って溶血性試験を行なう。溶血を示す時のポリエンマクロライド系物質の濃度（ｍｇ／ｍｌ）を被測定物質の溶解性として示す。当該文献方法では、市販製剤は僅か０．１ｍｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ濃度で強い溶血を示し、アムホテリシンＢ−ＨＥＳポリ結合体は０．４ｍｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ濃度で溶血を示す。
【０１７１】
測定したところ、本発明の製造例１〜製造例９のポリ結合体、及び製造例１０のメパルトリシンポリ結合体、ｃａｎｎｉｔｒａｃｉｎポリ結合体の１１個のポリ結合体はいずれも溶血濃度が２．２ｍｇ／ｍｌより大きく２．２〜４．６ｍｇ／ｍｌの範囲にある。例えば、製造例２の溶血濃度は３．５６ｍｇ／ｍｌである。これから、本発明のポリ結合体は良好な安全性を有することが判明された。これに対し、製造例１０のその他のポリ結合体、及び製造例２１、製造例２２で得られたポリ結合体はいずれも溶血濃度が０．７ｍｇ／ｍｌより低く、例えば製造例１０のフィリピンポリ結合体、製造例２１のポリ結合体、製造例２２のポリ結合体の溶血濃度はそれぞれ０．４５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌであった。
【０１７２】
試験例３：本発明のポリ結合体の体内挙動の測定
趙栄生らの文献（アムホテリシンＢリポソーム注射剤と市販注射剤の家兎体内での薬物動態的挙動の比較，北京大学学報（医学版），２００１，３３（３）：２４３）に記載の方法に従って行なう。
【０１７３】
測定用試料は、製造例１、２、３で得られた３種類のアムホテリシンＢポリ結合体である。比較製剤は、注射用アムホテリシンＢリポソーム（商品名：Ａｍｐｈｏｔｅｃ，製品登録番号：Ｈ２００９０９６３，アムホテリシンＢ  １００ｍｇ／瓶，Ｔｈｒｅｅ  Ｒｉｖｅｒｓ社）である。それらを使用直前に５％グルコース注射液を用いて滅菌溶液に調製した。（本発明のポリ結合体は、０．９％塩化ナトリウム注射液又は５％グルコース注射液を用いて溶解させた後注射投与し、この２種類の溶媒と共に良好な溶解性を有するが、市販注射用アムホテリシンＢリポソーム、例えば、Ａｍｐｈｏｔｅｃは０．９％塩化ナトリウム注射液と混合して使用することはできない）。
【０１７４】
雌雄半分ずつの体重２．７〜３．２ｋｇの家兎を１群当たり５羽ずつ群分けする。一晩絶食させた家兎を無作為に群分けし、それぞれ交互に耳介静脈から上記４種類の測定用試料を１ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で注射した。投与その時、及び０（投与前３０ｍｉｎ）、投与後から０．２５、０．５、１、２、３、４、６、８、１０、１２、１５、１８、２１、２４、２８、３２、３６時間の時点で耳介静脈から血液試料２ｍｌを採取し、それをヘパリン抗凝固剤チューブに入れ、３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離して血漿を分離した。上記操作以外、当該文献と同様にした。
【０１７５】
その結果、製造例１、２、３の３種類のポリ結合体のＡＵＣは、それぞれ比較製剤ＡＵＣの１．６２、１．８４、１．７７倍である。また、各試料の血中濃度曲線を描き、各試料に対し、それぞれの血中濃度が０．５ｍｇ／Ｌより高い持続時間を算出し（趙栄生らの文献には、アムホテリシンＢ市販注射剤は投与後から約３時間まで血中濃度が０．５ｍｇ／Ｌに下げたことが記載されており、ここで、我々は当該０．５ｍｇ／Ｌを最低の有効治療血中濃度と仮定した）、製造例１、２、３の３種類のポリ結合体はそれぞれ１８．４ｈｒ（投与後から０．８２ｈｒ〜１９．２ｈｒ期間）、２１．８ｈｒ、１７．４１ｈｒであり、これに対し、比較製剤の持続時間は１１．７ｈｒ（投与後から１ｈｒ〜１１．７ｈｒ期間）である。０．５ｍｇ／Ｌ超を最低の有効血中濃度と仮定した場合、同等の剤量では、本発明のポリ結合体は、顕著に長い有効治療時間を維持することができる。本発明のポリ結合体の血液中での遊離薬物濃度が、従来の注射投与の血中濃度曲線（例えば、比較製剤の血中濃度が最大値になるまでの時間は０ｈ）でなく、経口投与に近い血中濃度曲線（例えば、製造例１のポリ結合体の血中濃度が最大値になるまでの時間は７．２ｈ）を示し、それによって、従来の注射投与の血中濃度曲線における投与初期の高血中濃度の回避が可能となり、ひいては、高血中濃度が自体毒性の大きいアムホテリシンＢにもたらした副作用の回避又は低減が可能となることは、意外に見出されている。
【０１７６】
試験例４：溶解性試験
試料：本発明製造例１〜製造例１０で得られたポリ結合体、市販注射用アムホテリシンＢリポソーム（商品名：Ａｍｐｈｏｔｅｃ）。
【０１７７】
テスト１：上記各試料適量（有効成分１００ｍｇ含有）をそれぞれ２０ｍｌ、５０ｍｌ又は１００ｍｌの注射用水を用いて溶解させ、薬液の溶解様子を観察し、特に不溶の顆粒物があるかを観察した。次いで溶解した薬液を４℃の冷蔵庫に入れて６時間放置し、薬液の溶解様子を観察し、特に不溶の顆粒物があるかを観察した。更に溶解した薬液を３０℃で６時間放置し、薬液の溶解様子を観察し、特に不溶の顆粒物があるかを観察した。上記３つの条件下で観察した結果、製造例１〜製造例１０で得られたポリ結合体のいずれにも不溶の顆粒物が観察されていないが、Ａｍｐｈｏｔｅｃが３０℃で６時間放置した後、不溶の顆粒物が観察された。
【０１７８】
テスト２：上記各試料適量（有効成分１００ｍｇ含有）をそれぞれ２０ｍｌ、５０ｍｌ又は１００ｍｌの０．９％塩化ナトリウム注射液を用いて溶解させ、上記「テスト１」の方法に従って３つの条件における薬液の溶解様子を観察した。上記３つの条件下で観察した結果、製造例１〜製造例１０で得られたポリ結合体のいずれにも不溶の顆粒物が観察されていないが、Ａｍｐｈｏｔｅｃが３０℃で６時間放置した後、不溶の顆粒物が観察された。
【０１７９】
テスト３：上記各試料適量（有効成分１００ｍｇ含有）をそれぞれ２０ｍｌ、５０ｍｌ又は１００ｍｌの５％グルコース注射液を用いて溶解させ、上記「テスト１」の方法に従って３つの条件における薬液の溶解様子を観察した。上記３つの条件下で観察した結果、製造例１〜製造例１０で得られたポリ結合体及びＡｍｐｈｏｔｅｃのいずれにも不溶の顆粒物が観察されていない。
【０１８０】
試験例５：薬物安全性試験
アムホテリシンＢラット静脈投与のＬＤ５０値は１．６ｍｇ／ｋｇである（www.pfizer.com/.../Amphotericin%20B%20 INJECTION.pdf, MATERIAL SAFETY DATA SHEET, Revision date: 20-Dec-2007,Version: 1.1, Page3）ことが知られている。また、文献資料には、マウスとラットにおけるアムホテリシンＢのＬＤ５０値はそれぞれ２．３ｍｇ／ｋｇと１．６ｍｇ／ｋｇであることも記載されている（R T Proffitt, A Saiorius, S M Chiang, L Sullivan, J P Adler-Moore, J Antimicrob Chemother. 1991 Oct; 28 Suppl B:49-61 1778892 Cit:108）。
【０１８１】
本試験では、動物に対して本発明の製造例１で得られたポリアスパラギン酸−アムホテリシンＢポリ結合体（以下、ＰＡ−ＡＢと略書することがあり、活性薬物含量は２３．４％）の安全性を測定した。
【０１８２】
試験用薬液の調製：ＰＡ−ＡＢを滅菌生理塩水を用いて溶解させて濃度５ｍｇ／ｍｌ（溶液１ｍｌに含有される薬物の量は原薬のアムホテリシンＢとして５ｍｇである）の溶液を試験用薬液として調製した。
【０１８３】
ラット（雌性）を１群３匹で６群に無作為に分けた。比較群に滅菌生理塩水（投薬量１５ｍｇ／ｋｇの群と同様な注射容量）を投与し、残りの７群に、それぞれ５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇの上記試験用薬液を静脈注射により投与し、各群動物をそれぞれ０日目（投与前）、及び投与後から１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目で動物の体重を量り、各群動物の平均体重及び当該群動物体重の０日目体重に対する体重増加パーセンテージを計算し、その結果を表１に示す。
【０１８４】
また、上記方法と同様な方法により、本発明製造例２〜製造例１０で得られた各ポリ結合体に対し、１５ｍｇ／ｋｇの投薬量で試験した結果、いずれでも８日目に動物の死亡が見られず、さらに試験終了時に各動物の体重が元の体重レベルに回復した。本試験の結果から、本発明のポリ結合体は投薬量が１５ｍｇ／ｋｇと高く達しても、動物の死亡が見られいことが示されており、文献に記載されているアムホテリシンＢのＬＤ５０値は１．６ｍｇ／ｋｇであるから、本発明のポリ結合体は原薬より遥かに高い安全性を有することが明らかである。
【０１８５】
【表１】
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注：表中、＊ＰＡ−ＡＢとして投与し、投薬量はアムホテリシンＢとして算出したものである。＃１８ｍｇ／ｋｇの量で投与した群は３日目と４日目にそれぞれ１匹の動物の死亡が観察されており、３０ｍｇ／ｋｇの量で投与した群は、２日目に２匹の動物の死亡が観察されており、３日目に１匹の動物の死亡が観察されている。その他の群は、動物の死亡が観察されておらず、且つ試験終了時に各動物の体重は元の体重レベルに回復した。
【０１８６】
試験例６：  薬力学実験：
試験方法：マウスを常法により免疫系損傷を行い（血中白血球の計数≦１００）、モデル構築に成功したマウスをカンジダ・アルビカンスを用いて感染し、次いで動物を１群２０匹で８群無作為に分け、各群の動物を下記表２に示す群分け及び投薬量（各群の投薬量はいずれもアムホテリシンＢとして計算した量である）で尾静脈注射投与した。その後、マウスの生存状況を毎日観察し、７日持続し、第７日に各群のマウスの死亡数を統計し、その結果を表２に示す。
【０１８７】
【表２】
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【０１８８】
以上の試験結果から、比較群（原薬のアムホテリシンＢを投与した動物）の半分は有効量が約１ｍｇ／ｋｇであること；試験群（ポリ結合体を投薬した動物）の半数は有効量が０．２５ｍｇ／ｋｇ〜０．１２５ｍｇ／ｋｇの範囲であることが分かった。これから、本発明のポリ結合体を形成したアムホテリシンＢは、その原薬に比べて顕著に向上した薬力を有することが判明された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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