(57)【要約】  致死的な鉄欠乏性貧血の迅速かつ効率的な治療のため、葉酸、ニコチン酸（ビタミンＢ９）及びアスコルビン酸（ビタミンＣ）等のマルチビタミンの混合物でキャップされた酸化鉄ナノ粒子の新たな製剤を開発した。１投与量当たり２５ｍｇ鉄元素という低量の酸化鉄−マルチビタミンナノ複合材料の少量単回用量が、投与後わずか４日以内にヘモグロビンレベルを４．４ｇ／ｄｌから１４．６ｇ／ｄｌまで増加させるのに十分であった。このナノ複合材料に使用されるマルチビタミンは、鉄吸収を顕著に増強し、ヘモグロビンの濃度を上昇させた。鉄ナノ複合材料の２つの剤形、すなわち経口投与用のゲルカプセル及び水溶液を開発した。動物予備研究によれば、ラット体重１ｋｇ当たり２．５７ｍｇ（ヒトでは２５ｍｇに相当）の鉄元素を含有する酸化鉄−ビタミンナノ複合材料の単回用量を投与することは、経口投与を介してヘモグロビンレベルを補正し、貧血を治癒するのに十分であることが明らかである。毒性研究によれば、本発明者らの新たな鉄ナノ複合材料のＬＤ５０は、ラット体重１ｋｇ当たり１４２５．３ｍｇであることが明らかであり、このことは、標準的なヒト（体重６０ｋｇ）においてナノサイズの鉄ナノ複合材料のＬＤ５０は１３８５４ｍｇであることを意味する。したがって、鉄欠乏性貧血の迅速な治療に必要な単回用量は、ヒトにおけるＬＤ５０の５５４分の１である。血液学、生化学又は組織病理学的試験において、いかなる毒性も見られなかった。さらに、骨髄の組織病理学的試験によると、使用した酸化鉄−ビタミンナノ複合材料は、より多くのＲＢＣを産生するよう骨髄を刺激するＲＢＣ前駆体の数を増加させることを示唆している。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
葉酸、ニコチン酸およびアスコルビン酸でキャップされた生体適合性のある酸化鉄ナノ複合材料に基づく、貧血治療のための新規製剤。
【請求項２】
（１）で調製したナノサイズの複合材料は、経口投与することができる。
【請求項３】
前記薬物の２つの剤形は製剤化されており、それぞれは、２５ｍｇの鉄元素、ゲルカプセルおよび水溶液を含んでおり、経口投与のための両製剤。
【請求項４】
ナノサイズの酸化鉄、特に、葉酸、ニコチン酸およびアスコルビン酸の混合物でキャップされたＦｅ２Ｏ３ナノ複合材料を含む本発明の新規製剤の単回投与は、貧血治療において十分有効である。これは、投与後４日以内にヘモグロビン（Ｈｂ）レベルを４．４ｇ/ｄＬから１２．２ｇ/ｄＬに向上させ、そして、７日後には１４．６ｇ/ｄＬに向上させる。前記ヘモグロビンレベルは、（実験の全期間にわたる）３ヶ月以上安定する。
【請求項５】
マルチビタミンでキャップされた前記ナノサイズの鉄を基礎とするナノ複合材料は、骨髄を刺激し、何ら明確な毒性無しにＲＢＣＳの生産を促す。
【請求項６】
前記有効な用量はＬＤ５０の５５３分の１であり、任意の栄養補助食品における前記一日の鉄の用量の２分の１である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
鉄は、重要な細胞プロセスに必要とされるタンパク質の構成成分である。鉄を含有するタンパク質は、酸素輸送、ＡＴＰ産生、ＤＮＡ合成及び他の生理学的プロセスに重要な役割を持つ［１〜３］。赤身肉等の生物学的に利用可能な鉄（Ｆｅ）を多く含む食品の摂取が少ないことや出血は、鉄欠乏性貧血の主な原因である。鉄欠乏性貧血の症状として、呼吸困難、頭痛、ふらつき、息切れ、疲労、物忘れ、苛立ち、食欲不振及び体重低下、並びに集中困難が挙げられる。これらの症状は全て、赤血球細胞の酸素運搬能の低下の結果として現れる。したがって、貧血は、健康に関連した生活の質の低下と関連しており、貧血を治療することは、我々の健康及び能力を改善するのに必須である。
【０００２】
発展途上国の５０％の妊娠女性が鉄欠乏性貧血（ＩＤＡ）を有すると推定されている。また、世界保健機関（ＷＨＯ）による報告では、世界の５歳〜１４歳の子供の４６％（その大半が発展途上世界による）がＩＤＡを有すると推定されている。エジプトでは、貧血は、エジプト人の子供及び妊娠女性の鉄の必要性に対処するというだけではなく、国全体の鉄戦略を拡大する必要を示唆する問題として残っている。
【背景技術】
【０００３】
鉄は非常に重要であるが、鉄の過剰摂取や鉄の貯蔵の著しい増加は、身体にとって毒性である場合がある。科学者らは、鉄が脂質の過酸化を増加させ、癌の形成を誘導することができることを明らかにした。脂質過酸化のプロセスは、ヒドロキシルラジカル等の活性酸素種によって開始され、過剰量の鉄イオンによって刺激される。一方、鉄欠乏ラットは、正常なラットに比べ８倍もの銅を急速に蓄積し、結果として、過剰な銅もまた鉄のように脂質過酸化を触媒することとなる。
【０００４】
さらに、銅又は鉄欠乏ラットでは、肝臓及び血漿中にトリグリセリドを蓄積することが示されている。高濃度のトリグリセリドは、脂質過酸化においてより多くの脂質基質を提供することとなる。このことは、欠乏ラットにおける肝臓及び腎臓の高レベルのマロンジアルデヒドに寄与している可能性がある。
【０００５】
さらに、鉄過剰が癌の発症に影響を及ぼし得る幾つかの機構が提案されている。過剰な鉄は、免疫状態を変更し、ヒドロキシルラジカル産生及び脂質過酸化の触媒と同様に発癌補助物質として作用することが示唆されている。活性酸素種は、ＤＮＡ付加物の産生、ＤＮＡ鎖切断、及び遺伝子発現を調節する能力を有するため、発癌性を有するとされている。また、高食餌性鉄レベルは、銅及びマンガン（Ｍｎ）等の他のミネラルの吸収を妨げることによって酸化ストレスを増強することができ、それらの枯渇は、抗酸化酵素活性、特に、銅−亜鉛（Ｃｕ、Ｚｎ）及びマンガンスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）の抗酸化酵素活性の減少をもたらす可能性がある。以上より、鉄欠乏性貧血の問題に対処するために、特に子供及び妊娠女性に対して鉄サプリメントを処方するべきであるが、推奨されるにとどまっている。鉄は体外に排泄されにくいことから、細胞の鉄蓄積、並びに脂質過酸化、酸化ストレス及び癌を引き起こすことを避けるため、十分な注意が必要である。これらの課題から、Ｉ）高い級収率によって体内での鉄アベイラビリティを確保することができ、２）短い時間経過で鉄欠乏性貧血を治療する能力を有し、３）著しく低いＨｂレベルに起因する致死的な状況を克服するための高い効果を有する、新たな剤形／調整剤の必要性が高まっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これらの課題に対処するため、本発明者らは、３種の異なるビタミン、すなわち、全ての細胞形成に必須であるビタミンＢ９（葉酸）及びビタミンＢ３（ニコチン酸）、並びに抗酸化剤であるビタミンＣ（アスコルビン酸）を含むナノサイズの酸化鉄粒子の製剤を作製した。この製剤は、鉄吸収を促進し、鉄の染色体異常誘発作用から保護する［４］。ニコチン酸の生化学的機能は、そのピリジンヌクレオチドへの合成及びその後の細胞呼吸における役割であることが知られている。未成熟な有核赤血球は呼吸し、おそらくは、この呼吸においてピリジンヌクレオチドを利用しなければならない。赤血球の寿命は非常に短いことが分かっているため、赤血球の要求に対するニコチン酸の必要性は大きい。よって、ニコチン酸の供給が減少するため、細胞発生の最も初期の段階における補酵素の欠損に由来して、貧血が発症する可能性がある［５］。
【０００７】
身体の鉄貯蔵が枯渇すると（低い血清鉄、血清フェリチン及びトランスフェリン飽和率）、赤血球形成は、鉄が制限となる。これは、低い平均赤血球容積及び平均赤血球ヘモグロビン、低酸素性赤血球及び網状赤血球の低ヘモグロビン（Ｈｂ）含有量の割合の増加に反映され得る［６］。鉄の経口投与することでＨｂを補正でき、時間が制限されない場合には、かなりの用量（２００ｍｇ）が認容され得る。鉄の経口投与後、Ｈｂが上昇し始めるまでに２週間〜３週間、正常レベルまで戻るのに２ヶ月、鉄貯蔵が十分になるまでに６ヶ月を要するのに対し、静脈内鉄Ｈｂは１週間で上昇し始め、応答する患者の割合はより高く、鉄貯蔵は十分である［７］。鉄貯蔵の増加は、特に赤血球生成促進剤（ＥＳＡ）を投与している患者にとって有利である［８］。
【０００８】
現在、静脈内投与用の安全な新たな３種の鉄製品、すなわち、グルコン酸鉄、含糖鉄、及び低分子量デキストラン鉄が存在する。最も良好には、１週間後にＨＰレベルが上昇し、１週間に２回の静脈内投与用量による１ヶ月の治療の後、正常レベルまで戻る。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、葉酸（ビタミンＢ９）、ニコチン酸（ビタミンＢ３）、及び／又はアスコルビン酸（ビタミンＣ）でキャップされた酸化鉄ナノ複合材料を貧血治療のための新たな製剤又は食品補助剤として使用でき、それが１週間未満の内に正常値までＲＢＣを上昇し、ＨＰレベルを補正することを発見した。
【００１０】
本研究の目的は、１週間以内に致死的な鉄欠乏性貧血ラットを治療するためのビタミン混合物（葉酸、ニコチン酸及びアスコルビン酸）でキャップされたナノサイズの酸化鉄（マグネタイト）粒子の単回用量の能力を試験することである。ナノサイズとマクロサイズの鉄供給の間の有効性を測定し、区別するために、結果を塩化第二鉄治療群（親鉄供給源）と比較した。本発明者らは、種々のビタミンでキャップされた酸化鉄ナノ粒子を調製した。本発明者らは、これらのナノ複合材料がヘモグロビンレベルを増加し、またＲＢＣの形成を増加することを発見した。
【００１１】
鉄欠乏性貧血の治療におけるビタミンＢ３、Ｂ９及びＣでキャップされた酸化鉄ナノ粒子の有効性を保証するため、動物予備実験を行った。哺乳動物において、ヘモグロビンレベルを４．６ｇ／ｄｌに減少させ、その後、本発明者の提案する薬物の新たな製剤の単回用量を哺乳動物に経口で導入した。ヘモグロビンレベル及びＲＢＣは、４日以内に正常まで戻った。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の開示
Ｉ部：ナノサイズの鉄ナノ複合材料の調整：
・ビタミンの混合物（葉酸、ニコチン酸、及びアスコルビン酸）でキャップされた生体適合性のナノサイズの酸化鉄の調製
・透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を使用した粒子のサイズ及び形状の決定。ＴＥＭ画像を図１に示す。
・誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）を使用するナノ複合材料中の鉄元素の調製ストック溶液の鉄含有量の定量的測定。
【００１３】
ＩＩ部：動物予備実験計画
・Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｈｏｌｔｚｍａｎ系統の５週齢のアルビノラット、体重１５０ｇ〜１６０ｇを以下に示すように、６つの群に分けた。
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・本明細書中で使用した全ての方法は、ＮＩＨガイドラインに従って行われた。
【００１４】
１．出血性貧血の誘導
群１〜群５のラットに眼の内眼角からの採血を毎日行った。ヘパリン添加チューブに採取した血液試料のヘモグロビン濃度を商業的に入手可能なキット（ドラブキン溶液）を使用して比色法により測定した。全ての実験動物において、ラットの肝臓が危険な状態になり、かつ、ヘモグロビンが４ｇ／ｄＬ〜５ｇ／ｄＬの範囲に達した時に、採血を中止した。対照群のラットには何らの採血も行わなかった。
【００１５】
２．用量及び処置
致死的な出血性貧血を誘導した後、種々の処置及び用量によって経口投与を行う前に、全てのラットを６時間にわたって絶食した。群１〜群３には、種々の濃度（それぞれ、ラット体重１ｋｇ当たり２．５７ｍｇ、５．１４ｍｇ、及び１０．２８ｍｇ、これはヒトでは２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇにそれぞれ相当する）のナノサイズの鉄（マグネタイト）をラット１匹当たり１．０ｍｌ投与した。群４には、ラット体重１ｋｇ当たり１０．２８ｍｇの塩化第二鉄を投与した（ラット１匹当たり１ｍｌ、マグネタイトの親材料）。２つの対照群、すなわち、ラットが致死的な出血性貧血に曝されて、ナノサイズのマグネタイトと共に溶解されたビタミン混合物（アスコルビン酸、葉酸、及びニコチン酸）を処置された群５と、ラットが貧血を起こしておらず、蒸留水を投与された群６と、をこのパイロット実験に割り当てた（表１）。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
３．種々の処置後のヘモグロビン濃度
種々の処置による経口投与を行った後、種々の群のラットを３日間飼育し、鉄を含有する調整食及び清潔な水道水で自由給餌した。投薬後４日目及び７日目に血液試料を採取し、比色法を使用してＨｂ濃度を測定した。
【００１８】
実験結果
【表２】
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【００１９】
【表３】
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【００２０】
結果は以下に要約され得る。
Ａ．表３に示したように、種々の用量のナノサイズの鉄サプリメントを致死的な鉄欠乏性貧血ラットに処置した結果、マグネタイト投与後わずか４日以内にヘモグロビン濃度が顕著に上昇した。
Ｂ．マグネタイトを処置した群におけるヘモグロビン濃度は、対照である処置７日後の非貧血群を含めた全ての他の群の数値よりも大きいという結果であった。
Ｃ．２．５ｍｇのマグネタイトの用量は、投与後４日目において、他の２つの用量、５０ｍｇ及び１００ｍｇよりも良好に貧血ラットにおけるヘモグロビンの濃度を補正することができた。
Ｄ．７日以内にＨＢレベルが４．４ｇ／ｄｌから１４．６ｇ／ｄｌへと上昇し、投与後８０日を超えて１３．６ｇ／ｄｌで安定した。
Ｅ．貧血ラットに塩化第二鉄を投与することにより、Ｈｂ濃度が補正された。しかし、ナノサイズマグネタイトを投与した群におけるレベルにも、対照である非貧血ラットにおけるレベルにも達しなかった。
Ｆ．貧血ラットにビタミン混合物（アスコルビン酸、葉酸、及びニコチン酸）を投与することは、鉄吸収を顕著に増加させることができ、ヘモグロビン濃度を上昇させた。しかし、他のいずれか群と同じレベルには到達せず、それを超えることもなかった。
Ｇ．肝臓、脾臓、十二指腸、腎臓及び脳の組織病理学的検査の結果は、いかなる毒性の兆候も示さなかった。
Ｈ．貧血の誘導後、ＲＢＣ前駆体に枯渇が観察され、図４に示したように、ナノサイズ鉄複合材料の単回投与の後に補正された。
【００２１】
結論
ビタミン混合物（Ｂ３、Ｂ９、及びＣ）でキャップされたナノサイズ酸化鉄ナノ粒子のラット体重１ｋｇ当たり２．５７ｍｇ、これは、ヒトでは２５ｍｇに相当する、の単回投与によって、鉄欠乏に起因する貧血は４日以内に回復した。使用した用量は、ヒトにおけるマグネタイト（Ｍａｇｎｉｔｉｔｅ）ナノ粒子のＬＤ５０の５５４分の１であるため、安全であることは明らかである。また、マグネタイトナノ粒子は既にＦＤＡ承認もされている（１０）。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、本特許の思想（鉄欠乏性貧血の迅速かつ効率的な治療のための鉄系ナノ複合材料の新規な製剤）を実証する図である。
【図２】図２は、ビタミン混合物（Ｂ３、Ｂ９、及びＣ）でキャップされたナノサイズ酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ画像である。
【図３】図３は、対照群以外の全ての群において、貧血が誘導されたことを示すグラフである。
【図４】図４は、貧血を誘導し、次いで、ビタミンを含む鉄ナノ複合材料２５ｍｇを単回投与処置した後のＨＢレベルを示すグラフである。
【図５】図５は、貧血ラット（左）、及びナノサイズ鉄−ビタミン複合体を単回投与した後（右）の骨髄切片を示しており、ビタミン混合物（Ｂ３、Ｂ９、及びＣ）は鉄ナノ粒子の安定化剤として、またそれをキャップするために使用した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年3月19日(2014.3.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によりキャップされた、ニコチン酸鉄、アスコルビン酸鉄、及び葉酸鉄のナノ粒子の混合物を含む組成物。
【請求項２】
前記ナノ粒子の平均径が３ｎｍ〜５ｎｍである、
請求項１に記載の組成物のナノ粒子。
【請求項３】
単回経口用量の請求項１の組成物を、それを必要とする患者に投与するステップを含み、
前記用量が５ｍｇ〜１０ｍｇの範囲である、
鉄欠乏性貧血（ＩＤＡ）の治療方法。
【請求項４】
第１週目にＨｂレベルが６．５ｇ／ｄＬから１２．８ｇ／ｄＬに上昇し、第２週目に１４．９ｇ／ｄＬに上昇し、２ヶ月にわたって定常状態のＨｂレベルに達することによってＩＤＡを治療する、
請求項３に記載の単回経口投与法。
【請求項５】
請求項２に記載の粒子サイズ範囲内であり、
有害事象を最小化する、
請求項３に記載の単回用投与法。
【国際調査報告】
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