(57)【要約】  本発明はインターロイキン１０の発現を誘導する組換えタンパク質の使用に関する。このタンパク質は有鉤条虫組み換えカルレティキュリン（ｒＴｓＣＲＴ）であり、経口または非経口で投与されるよう生理ブドウ糖液中で処方される。本発明のｒＴｓＣＲＴの発現及び精製の方法によって翻訳後修飾無しで発現された組換えタンパク質は免疫調整効果を有し、ＩＬ−４サイトカイン及びＩＬ−１０サイトカインをコードするｍＲＮＡの転写レベルを刺激することができる。ｒＴｓＣＲＴの発現はタグ無しの大腸菌系で行われたが、この発現は原核生物の細胞であるか真核生物の細胞であるかを問わず、どのような発現系にも適用可能である。このｒＴｓＣＲＴの生産は、局所及び全身の炎症性疾患の治療に用いることを目的としている。
2016519131.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン−１０の誘導を必要とする哺乳類の疾患の治療のための薬剤の製剤化における、有鉤条虫組換えカルレティキュリンの使用。
【請求項２】
上記哺乳類がヒトであることを特徴とする、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
経口または非経口で投与されることを特徴とする、請求項１に記載の薬剤。
【請求項４】
上記疾患は炎症性の疾患であることを特徴とする、請求項１に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、治療効果のある組換えタンパク質の使用に関し、より詳しくは、免疫調整を行うサイトカインであるインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の発現誘導剤として用いられる有鉤条虫(Taenia solium)組換えカルレティキュリン（ｒＴｓＣＲＴ）に関し、さらに詳しくは、インターロイキン−１０により制御され得る炎症を病因とする疾患の治療のための薬剤を製剤化するための有鉤条虫組換えカルレティキュリン（ｒＴｓＣＲＴ）に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
自己免疫性疾患、アレルギー性疾患及び炎症性疾患の罹患率は社会経済の発展と比例して、また寄生虫症の存在とは反比例して増加している（衛生仮説）。様々な薬剤があるにも関わらず完璧な薬剤が未だ存在しないことから、これらの免疫障害の治療は現在においても課題になっている。さらに、これらの疾患の症状は抑制することはできても、完治させる治療法は存在していない。
【０００３】
この種の疾患の治療薬として、コルチコステロイド（プレドニゾン、ブデソニド）及び５−アミノサリチル酸（メサラジン、スルファサラジン）、並びに、ＤＮＡの合成を妨げ、主に増殖状態のリンパ球等の細胞に作用して細胞のアポトーシスを引き起こす免疫抑制薬（アザチオプリン、６−メルカプトプリン）等がある。その他、メトトレキサートはプリン及びピリミジンの合成を妨げる薬で、代謝拮抗物質であり、活発な増殖状態にある免疫系細胞等の細胞に作用する葉酸類似体である。メトトレキサートは関節リウマチ及びクローン病の治療に用いられる。炎症の抑制に使用される別の免疫抑制薬として、カルシニューリン阻害剤（シクロスポリン、タクロリムス）がある。これらの薬剤が症状を抑制し、結果として症状の緩和期間を得ることはある。しかし、疾患の兆候が患者の年齢、全体的な健康状態及び精神状態によって大きく異なるために、これらの薬剤が上記効果を発揮するのは一部の患者のみに限られる。また、これらの薬剤は全て副作用を伴うもので、その多くは重度のものであり、メトトレキサートのケースのような肝毒性に加えて、アレルギー反応、発熱、膵炎、吐き気、白血球減少症及び反復感染を引き起こすこともある（Ｂｌｕｍｂｅｒｇ  ＲＳ．  ２００９．  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ：  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．  Ｄｉｇ  Ｄｉｓ．２７：  ４５５−４６４．；  Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＭＪ，  Ｓｎａｐｐｅｒ  ＳＢ，  Ｂｌｕｍｂｅｒｇ  ＲＳ．  ２０１２．  Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ．  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．  ４７：  １−８）。
【０００４】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）として知られる腸炎疾患には大きく分けて、クローン病及び潰瘍性大腸炎の２種類がある。その特徴の１つとして、ＩＢＤは腸上皮のバリアの損傷及び破壊を生じさせたり、常在細菌に対する先天的異常適応性炎症反応と共にＴリンパ球の無制御活性化を引き起こしたりして、遺伝的に感受性の個体における慢性腸炎の原因となることが挙げられる。近年におけるＩＢＤのケースにおいては、症状の減少及び制御という治療目標の他にも、ステロイドの使用を必要とせず、かつ結腸切除を行うことなく結果として緩和期間を得るため、腸内粘膜の再生を促進することが目指されている。臨床試験データにおいては、コルチコステロイドの使用に患者の緩和期間を延長する効果は無く、疾患の再発予防にもならなかった。アザチオプリン及びインフリキシマブの使用は一部の患者における細胞の再生において好ましい効果を示したが、上述の通り、これらもやはり副作用が伴うものである（Ｎｅｕｒａｔｈ  ＭＦ，  Ｔｒａｖｉｓ  ＳＰ．  ２０１２．  Ｍｕｃｏｓａｌ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：  ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ．  Ｇｕｔ．  ６１：  １６１９−１６３５）。
【０００５】
モノクローナル抗体はＩＢＤの治療におけるもう１つの選択肢であり、患者が従来の抗炎症薬に反応しない場合に使用することもできる。多くの場合、上述の薬と同様に、モノクローナル抗体は抗炎症薬または非生物学的免疫抑制治療薬と組み合わせて投与する必要がある。インフリキシマブ、アダリムマブ及びセルトリズマブ・ペゴルは、炎症プロセス中に合成される炎症誘発サイトカインの一種であるＴＮＦ−αの機能を妨げるモノクローナル抗体であり、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ等の疾患の治療に用いられる。しかし、これらの分子も過敏症、アレルギー反応、呼吸器疾患、結核再活性化のリスク、多発性硬化症の発生のみならず、リンパ腫症、気道における深刻な感染症等の副作用を伴うものである（Ｒｕｔｇｅｅｒｔｓ  Ｐ，  Ｖａｎ  Ａｓｓｃｈｅ  Ｇ，  Ｖｅｒｍｅｉｒｅ  Ｓ．  ２００６．  Ｒｅｖｉｅｗ  ａｒｔｉｃｌｅ：  ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ−−ｓｅｖｅｎ  ｙｅａｒｓ  ｏｎ．  Ａｌｉｍｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２３：  ４５１−４６３）。ナタリズマブは、細胞表面でα４インテグリンと反応する形でリンパ球の移動を妨げるモノクローナル抗体であり、クローン病及び多発性硬化症（ＭＳ）の管理に用いられる。ナタリズマブは疲労、アナフィラキシー、吐き気等の副作用を伴い、進行性多巣性白質脳症と呼ばれる日和見疾患と関連している（Ｍｅｕｔｈ  ＳＧ，  Ｇｏｂｅｌ  Ｋ，  Ｗｉｅｎｄｌ  Ｈ．  ２０１２．  Ｉｍｍｕｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  −  ｆｕｔｕｒｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．  １８：  ４４８９−４４９７）。これらの副作用に加え、モノクローナル抗体は患者にとって大きな金銭的負担である。
【０００６】
多発性硬化症の場合、グラチラマー酢酸塩（コパキソン）の使用が報告されているが、コパキソンは一般的に疾患の初期段階において緩和期間をもたらすものの、疾患は再発する。また、コパキソンは免疫反応を調整し疾患の再発頻度を減少させる合成ペプチドだが、疾患の進行及び障害の抑止に関する効果は持たない。コパキソンの副作用は、不安症、心臓疾患、呼吸器疾患及びアレルギー反応等である（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＫＰ．  ２０１２．  Ｇｌａｔｉｒａｍｅｒ  ａｃｅｔａｔｅ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｌａｐｓｉｎｇ−ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒ．  １２：  ３７１−３８４）。
【０００７】
これら従来の治療法及び生物学的薬剤（モノクローナル抗体）はある程度の効力を示したが、初期治療に反応しない患者及び緩和期間を得られない患者もおり、その治療は未だ課題になっている。また、長期の継続的治療の後に薬物反応が低下したり、耐性が生じたり、一度は陽性の反応を示した患者が治療に対して抵抗性を持ってしまう可能性もある（Ｃｏｌｏｍｂｅｌ  ＪＦ，  Ｆｅａｇａｎ  ＢＧ，  Ｓａｎｄｂｏｒｎ  ＷＪ，  Ｖａｎ  Ａｓｓｃｈｅ  Ｇ，  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＡＭ．  ２０１２．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｄｒｕｇ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ．１８：  ３４９−３５８）。
【０００８】
このため、新たな治療の選択肢を見つける必要がある。
【０００９】
前述の通り、衛生環境の整った先進国では、自己免疫疾患及びアレルギー性疾患に加え、多発性硬化症及び糖尿病等のその他の炎症性疾患と同様に、炎症性腸疾患の発生率は２０世紀半ばから上昇している（Ｅｌｌｉｏｔｔ  ＤＥ，  Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ  ＪＶ．  ２０１２．  Ｈｅｌｍｉｎｔｈ−ｈｏｓｔ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ａｎｎ  Ｎ  ａｎｄ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １２４７：  ８３−９６）。「衛生仮説」によると、先進国におけるアレルギー性疾患及び炎症性疾患の増加は、特に腸内寄生虫等の感染性の病原との接触機会が減少していること及びヒトのマイクロバイオームを変化させかねない抗生物質の乱用と関連していることが示唆されている（Ｍａｉｚｅｌｓ  ＲＭ．  ２００９．  Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｐａｒａｓｉｔｉｓｍ−ｆｒｏｍ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｙｇｉｅｎｅ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ．  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ．  １３６：  １５４９−１５６４）。寄生虫感染症において、その排出を司る免疫反応は主にＴｈ２型であり、プライム細胞、好酸球、好塩基球、Ｂリンパ球及び肺細胞等の様々なタイプの細胞、並びにＩｇＥ、ＩｇＧ１等のエフェクター分子、並びに寄生虫の排出を起こすＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３等のサイトカインがこれに関与している（Ａｌｌｅｎ  ＪＥ，  Ｍａｉｚｅｌｓ  ＲＭ．  ２０１１．  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｉａｌｏｇｕｅ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｈｅｌｍｉｎｔｈｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１：  ３７５−３８８）。免疫病理学ではＴｈ１型またはＴｈ１７型の反応が優位を占める中で、Ｔｈ２反応の刺激には疾病への対抗作用または抑止作用が見込まれている（Ｆｅｎｇ  Ｔ，  Ｑｉｎ  Ｈ，  Ｗａｎｇ  Ｌ，  Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｅ  ＥＮ，  Ｅｌｓｏｎ  ＣＯ，  Ｃｏｎｇ  Ｙ．  ２０１１．  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｔｈ１  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＩＬ−１７  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｎａｔｅ  ＩＬ−１２  ａｎｄ  ＩＬ−２３  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８６：  ６３１３−６３１８）。加えて、制御性Ｔ細胞、Ｔｒ１及びＴｒ３、制御性Ｂ細胞、並びに代替活性化マクロファージ等の免疫調整要素が寄生虫感染症において活性化し、炎症の悪化を防ぐことが証明されており、これらの免疫調整要素はその後の組織の修復に関与する（Ａｌｌｅｎ  ＪＥ，  Ｍａｉｚｅｌｓ  ＲＭ．  ２０１１．  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｉａｌｏｇｕｅ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｈｅｌｍｉｎｔｈｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１：  ３７５−３８８）。また、寄生虫症におけるＩＬ−１０及びＴＧＦ−β等の制御性サイトカインの存在も記録されている（Ｍａｉｚｅｌｓ  ＲＭ．  ２００９．  Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｐａｒａｓｉｔｉｓｍ−ｆｒｏｍ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｙｇｉｅｎｅ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ．  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ．  １３６：  １５４９−１５６４）。さらに、寄生虫が排出された後でも維持されることから、腸内寄生虫によって促進される調整効果は注目を集めている（Ｐｅｒｓａｕｄ  Ｒ，  Ｗａｎｇ  Ａ，  Ｒｅａｒｄｏｎ  Ｃ，  ＭｃＫａｙ  ＤＭ．  ２００７．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｔａｐｅｗｏｒｍ  Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｏｎ−ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ  ｍｏｕｓｅ  ｈｏｓｔ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．  ３７：  ３９３−４０３）。従って、腸内寄生虫またはその生成物は、免疫系機能不全が介在する炎症性疾患を制御または予防するための予防及び治療効果の両方を持つ可能性があると考えられる。
【００１０】
近年、腸炎の研究において開発された実験モデルから、寄生虫感染症が結腸における炎症誘発効果を防ぐという証拠が蓄積されている（Ｚｈａｏ  Ｙ，  Ｚｈａｎｇ  Ｓ，  Ｊｉａｎｇ  Ｌ，  Ｊｉａｎｇ  Ｊ，  Ｌｉｕ  Ｈ．  ２００９．  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  ｏｖａ  ｏｎ  ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．  ２４：  １７７５−１７８０；  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＭＪ，  Ｗａｎｇ  Ａ，  Ｃａｔａｒｉｎｏ  ＭＥ，  Ｂａｌｌ  Ｌ，  Ｐｈａｎ  ＶＣ，  ＭａｃＤｏｎａｌｄ  ＪＡ，  ＭｃＫａｙ  ＤＭ．  ２０１０．  Ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｔａｐｅｗｏｒｍ，  Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ，  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ａｌｌｅｖｉａｔｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ７８：  １３６４−１３７５）。さらに、寄生虫の卵はヒトの炎症性腸疾患の治療及び管理に用いられている（Ｓｕｍｍｅｒｓ  ＲＷ，  Ｅｌｌｉｏｔｔ  ＤＥ，  Ｕｒｂａｎ  ＪＦ，  Ｊｒ，  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｒ，  Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ  ＪＶ  ２００５．  Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ  ｓｕｉｓ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｇｕｔ．  ５４：  ８７−９０；  Ｃｒｏｅｓｅ  Ｊ，  Ｏ’ｎｅｉｌ  Ｊ，  Ｍａｓｓｏｎ  Ｊ，  Ｃｏｏｋｅ  Ｓ，  Ｍｅｌｒｏｓｅ  Ｗ，  Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ  Ｄ，  Ｓｐｅａｒｅ  Ｒ．  ２００６．  Ａ  ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  ｃｏｎｃｅｐｔ  ｓｔｕｄｙ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｎｅｃａｔｏｒ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ  ｉｎ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ  ｄｏｎｏｒｓ．  Ｇｕｔ．  ５５：  １３６−１３７）。寄生虫感染症が腸内レベルだけでなく気道及び神経系においても炎症の重症度を和らげると証明した研究もある（ＭｃＫａｙ  ＤＭ．  ２００９．  Ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｈｅｌｍｉｎｔｈ？；  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  ２５：  １０９−１１４；  Ｐｅｒｓａｕｄ  Ｒ，  Ｗａｎｇ  Ａ，  Ｒｅａｒｄｏｎ  Ｃ，  ＭｃＫａｙ  ＤＭ．  ２００７．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｔａｐｅｗｏｒｍ  Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｏｎ−ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ  ｍｏｕｓｅ  ｈｏｓｔ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．  ３７：  ３９３−４）。また、寄生虫抽出物または寄生虫感染を利用した治療は、Ｔｈ１型の炎症が介在する疾患であるＩ型糖尿病の症状の発生を予防する（Ｅｓｐｉｎｏｚａ−Ｊｉｍｅｎｅｚ  Ａ，  Ｒｉｖｅｒａ−Ｍｏｎｔｏｙａ  Ｉ，  Ｃａｒｄｅｎａｓ−Ａｒｒｅｏｌａ  Ｒ，  Ｍｏｒａｎ  Ｌ，  Ｔｅｒｒａｚａｓ  ＬＩ．  ２０１０．  Ｔａｅｎｉａ  ｃｒａｓｓｉｃｅｐｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ｓ��ｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１０：  ８５０５４１；  Ｚａｃｃｏｎｅ  Ｐ，  Ｂｕｒｔｏｎ  ＯＴ，  Ｇｉｂｂｓ  Ｓ，  Ｍｉｌｌｅｒ  Ｎ，  Ｊｏｎｅｓ  ＦＭ，  Ｄｕｎｎｅ  ＤＷ，  Ｃｏｏｋｅ  Ａ．  ２０１０．  Ｉｍｍｕｎｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ＮＯＤ  ｍｉｃｅ：  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｂｏｔｈ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１０：  ７９５２１０）。多発性硬化症は、中枢神経系におけるミエリンの構成成分に対して特定のＴｈ１リンパ球及びＴｈ１７リンパ球が存在することを特徴とする炎症性疾患の一種であり、脱髄及び軸索消失を引き起こすものである。多発性硬化症の患者が寄生虫に感染するとその症状が軽くなり、非感染の患者と比べると放射線学的にも臨床学的にも病状が改善したことが証明されたことは興味深い。このような寄生虫が介在した予防はＩＬ−１０及びＴＧＦ−β等の、上位の制御性サイトカインと関わりがあり（Ｃｏｒｒｅａｌｅ  Ｊ，  Ｆａｒｅｚ  ＭＦ．  ２０１２．  Ｄｏｅｓ  ｈｅｌｍｉｎｔｈ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ？  Ｆｒｏｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１２：  １−１４）、腸内寄生虫は局所的な効果のみならず全身的な効果を有することを示している。
【００１１】
カルレティキュリン（ＣＲＴ）は、筋細胞の筋小胞体で初めに同定された、多機能かつ遍在的な、高度に保存されたタンパク質であり、現在では殆どの細胞の小胞体に存在するＣａ２＋結合タンパク質の約５０％を構成することで知られている。ＣＲＴの主な機能は様々な細胞プロセスに影響を与えるＣａ２＋恒常性の調整である（Ｍｉｃｈａｌａｋ，  Ｍ．，  Ｃｏｒｂｅｔｔ，  Ｅ．Ｆ．，  Ｍｅｓａｅｌｉ，  Ｎ．，  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｏｐａｓ，  Ｍ．  １９９９．  Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ：  Ｏｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ｏｎｅ  ｇｅｎｅ，  ｍａｎｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ３４４：  ２８１−２９２）。また、ＣＲＴはレクチン様シャペロンとしても機能し、各種の糖タンパク質のフォールディングに干渉する。カルボキシル末端において小胞体に保持されるＫＤＥＬテトラペプチドが示されているにもかかわらず、ＣＲＴは様々な細胞の表面だけでなく、多くの寄生虫の排泄物及び分泌物（Ｅ／Ｓ）でも見つかっている（Ｓｕｃｈｉｔｒａ  Ｓ，  Ｊｏｓｈｉ  Ｐ．  ２００５．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ  ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ  ｓｕｇｇｅｓｔｓ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｅｖａｓｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐａｒａｓｉｔｅ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  １７２２：  ２９３−３０３）、（Ｇｕｉｌｌｏｕ，  Ｆ．，  Ｒｏｇｅｒ，  Ｅ．，  Ｍｏｎｅ，  Ｙ．，  Ｒｏｇｎｏｎ，  Ａ．，  Ｇｒｕｎａｕ，  Ｃ．，  Ｔｈｅｒｏｎ，  Ａ．，  Ｍｉｔｔａ，  Ｇ．，  Ｃｏｕｓｔａｕ，  Ｃ．，  Ｇｏｕｒｂａｌ，  Ｂ．Ｅ．  ２００７．  Ｅｘｃｒｅｔｏｒｙ−ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｏｆ  ｌａｒｖａｌ  Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ  ａｎｄ  Ｅｃｈｉｎｏｓｔｏｍａ  ｃａｐｒｏｎｉ，  ｔｗｏ  ｐａｒａｓｉｔｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｐｈａｌａｒｉａ  ｇｌａｂｒａｔａ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．  １５５：４５−５６）。トリパノソーマ症、住血吸虫症及び糸状虫症の患者が抗ＣＲＴ抗体を有することから、ＣＲＴは宿主の免疫系と相互に作用する（Ｒｏｋｅａｃｈ，  Ｌ．Ａ．，  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，  Ｐ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｕｎｎａｓｃｈ，  Ｔ．Ｒ．  １９９４．  Ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ  ＲＡＬ１  ａｎｔｉｇｅｎ，  ａ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ｓｅｒａ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｏｎｃｈｏｃｅｒｃｉａｓｉｓ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎｅ  ６２：  ３６９６−３７０４）、（Ｍａｒｃｅｌａｉｎ，  Ｋ．，  Ｃｏｌｏｍｂｏ，  Ａ．，  Ｍｏｌｉｎａ，  Ｍ．Ｃ．，  Ｆｅｒｒｅｉｒａ，  Ｌ．，  Ｌｏｒｃａ，  Ｍ．，  Ａｇｕｉｌｌｏｎ，  Ｊ．Ｃ．，  Ｆｅｒｒｅｉｒａ，  Ａ．  ２０００．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ  ｃａｌｒｅｔｉｃ���ｌｉｎ，  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ．  Ａｃｔａ  Ｔｒｏｐ．  ７５：２９１−３００）。一方、ＣＲＴが免疫調整の役割を担っている可能性があるとの報告もあり、慢性腸管寄生虫症のマウスにおいてＣＲＴが過剰発現したことは注目を集めた（Ｍｏｒｇａｎ  Ｃ，  ＬａＣｏｕｒｓｅ  ＥＪ，  Ｒｕｓｈｂｒｏｏｋ  ＢＪ，  Ｇｒｅｅｔｈａｍ  Ｄ，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＪＶ，  Ｂａｒｒｅｔｔ  Ｊ，  Ｂａｉｌｅｙ  Ｋ，  Ｂｒｏｐｈｙ  ＰＭ．  ２００６．  Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｏｆ  ａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃ  ｎｅｍａｔｏｄｅ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｈｏｓｔ  ｓｔｒａｉｎｓ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．  ６：  ４６３３−４６４５）。これに関して、植物線虫の一種であるメロイドジン・インコグニタがＣＲＴを分泌し、防御機構に関与する遺伝子の発現を阻害する植物免疫反応を抑制することも証明されている（Ｊａｏｕａｎｎｅｔ  Ｍ，  Ｍａｇｌｉａｎｏ  Ｍ，  Ａｒｇｕｅｌ  ＭＪ，  Ｇｏｕｒｇｕｅｓ  Ｍ，  Ｅｖａｎｇｅｌｉｓｔｉ  Ｅ，  Ａｂａｄ  Ｐ，  Ｒｏｓｓｏ  ＭＮ．  Ｔｈｅ  ｒｏｏｔ−ｋｎｏｔ  ｎｅｍａｔｏｄｅ  ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ  Ｍｉ−ＣＲＴ  ｉｓ  ａ  ｋｅｙ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．  ２０１２  Ａｕｇ  ２）。また、寄生虫性のＣＲＴが、樹状細胞と相互作用すること及び免疫反応の対象をＴｈ２のプロファイルに向けることが可能な病原体に関わる分子パターンを示し、炎症プロセスの調整における自身の機能を助けている可能性があるとも提唱されている（Ｍｅｎｄｌｏｖｉｃ  Ｆ，  Ｆｌｉｓｓｅｒ  Ａ．  ２０１０．  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｕｔ：  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｈｅｌｍｉｎｔｈｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１０：  ２５０５６３）、（Ｔｅｒｒａｚａｓ  ＣＡ，  Ｔｅｒｒａｚａｓ  ＬＩ，  Ｇｏｍｅｚ−Ｇａｒｃｉａ  Ｌ．  ２０１０．  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  ｐａｒａｓｉｔｅｓ：  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｔｏ  ｓｕｒｖｉｖｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１０：  ３５７１０６）。最近では、ヘリグモソモイデス・ポリギルスのＣＲＴは分泌されるだけでなくＩＬ−４及びＩＬ−１０（Ｔｈ２型制御性サイトカイン）の生産を誘導すること、並びに樹状細胞がＡスカベンジャー受容体によって結合されることも証明されている。しかしここで、サイトカインの誘導における効果が、組換えタンパク質では観察されず、ネイティブなタンパク質でのみ観察されることには触れておくべきである。Ｔリンパ球培養物において、ネイティブなタンパク質はＩＬ−４及びＩＬ−１０の生産を誘導した一方、組換えタンパク質は何らの免疫学的効果を示さなかった。このことについて著者は、組換えタンパク質が効果を欠く原因は、ネイティブなタンパク質との構造的な違いによるものであり、これはＣＲＴの精製促進の為に実験的に��われた転写後の変化によって説明できると主張している（Ｒｚｅｐｅｃｋａ  Ｊ，  Ｒａｕｓｃｈ  Ｓ，  Ｋｌｏｔｚ  Ｃ，  Ｓｃｈｎｏｌｌｅｒ  Ｃ，  Ｋｏｒｎｐｒｏｓｂｓｔ  Ｔ，  Ｈａｇｅｎ  Ｊ，  Ｉｇｎａｔｉｕｓ  Ｒ，  Ｌｕｃｉｕｓ  Ｒ，  Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ｓ．  ２００９．  Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｎｅｍａｔｏｄｅ  Ｈｅｌｉｇｍｏｓｏｍｏｉｄｅｓ  ｐｏｌｙｇｕｒｕｓ  ｉｓ  ａ  Ｔｈ２−ｓｋｅｗｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｒｉｎｅ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ａ．  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４６：  １１０９−１１１９）。
【００１２】
ＩＬ−１０は多機能性のサイトカインで、その主な機能はＴｈ１、Ｔｈ２及びＴｈ１７の炎症反応の調整であり、これにより発病前の免疫反応を制御し、アレルギー性疾患、自己免疫性疾患及び炎症性疾患等において起こる制御されていない炎症プロセスを原因とする免疫病理を減少させるものである。ＩＬ−１０サイトカインは、様々なＴリンパ球亜群に加え、マクロファージ、樹状細胞、Ｂリンパ球、ケラチン生成細胞、プライム細胞等の様々な異なる種類の細胞によって生産され得る。ＩＬ−１０サイトカインの主な免疫調整効果は、抗原提示細胞に対して間接的に働き、共刺激分子の発現及び抗原提示を抑制することである。また、ＩＬ−１０サイトカインはリンパ球と直接的に相互作用し、炎症誘発サイトカインの活性化、増殖及び生産を阻害する（Ｂｏｕａｂｅ  Ｈ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｍｉｃｅ：  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｃａｓｅ  ｏｆ  ＩＬ−１０．  ２０１２．  Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７５：  ５５３−５６７；  Ｗｉｌｋｅ  ＣＭ，  Ｗｅｉ  Ｓ，  Ｗａｎｇ  Ｌ，  Ｋｒｙｃｚｅｋ  Ｉ，  Ｋａｏ  Ｊ，  Ｚｏｕ  Ｗ．  ２０１１．  Ｄｕａｌ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ６０：  １５２９−１５４１）。さらに、ＩＬ−１０サイトカインは腸粘膜内の制御性Ｔリンパ球を刺激すること及び特定のＦｏｘｐ３転写因子の発現を維持することができ、また、生得的反応の調整を行うことができるため、腸内恒常性において重要なメディエータであると考えられている（Ｐａｕｌ  Ｇ，  Ｋｈａｒｅ  Ｖ，  Ｇａｓｃｈｅ  Ｃ．  Ｉｎｆｌａｍｅｄ  ｇｕｔ  ｍｕｃｏｓａ：  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０．  ２０１２．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ４２：  ９５−１０９）。ヒトと腸炎モデルとにおいて、タンパク質そのものまたはその受容体においてＩＬ−１０が欠乏したり、突然変異が存在したりすると、その機能を損なうとともに炎症プロセスを引き起こしてしまう（Ｋｏｔｌａｒｚ  Ｄ，  Ｂｅｉｅｒ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ，  ２０１２．  Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．  １４３：  ３４７−３５５）。
【００１３】
寄生虫の治療への使用は提唱されているものの、起こり得る副作用及び医原性感染症に関連する倫理規定を評価及び考慮することは重要である。副作用を克服する手段として、ＩＬ−１０発現の強力な誘導因子である有鉤条虫組換えカルレティキュリン（ｒＴｓｃＲＴ）をはじめとする、免疫調整の誘導が可能である純粋なタンパク質の使用がある。
【００１４】
これらのことから、本発明は、組換えタンパク質であるにも関わらず抗炎症効果を引き起こす、インターロイキン−１０誘導効果を有する有鉤条虫組換えカルレティキュリン（ｒＴｓＣＲＴ）を初めて立証することによって開示され、実験的な発現系で生産可能であるという点においてさらに有利なものである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、インターロイキン−１０誘発調整が有利な結果をもたらす、炎症を病因とする疾患を治療するための薬剤の製剤化における有鉤条虫組換えカルレティキュリン（ｒＴｓＣＲＴ）の使用である。
【００１６】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、βアクチンを参照遺伝子として用い、ＩＬ−４（パネルＡ及びＢ）及びＩＬ−１０（パネルＣ及びＤ）をコードしているメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の相対的な発現を示している。実験は感染前（ナイーブ）、感染後日数（ＤＰＩ）１０日、２０日及び３０日のハムスターの腸間膜リンパ節（ＮＬＭ）または脾臓から得られた細胞を使用して行われた。成熟したｒＴｓＣＲＴを刺激として翻訳後修飾無しで使用するか（各セットの２本目のバー）、または有鉤条虫の粗抽出物（ＴｓＣＥ）を使用した（各セットの３本目のバー）。また、ＲＰＭＩ培地をネガティブコントロールとして使用し（各セットの１本目のバー）、コンカナバリンＡ分裂誘発物質を細胞増殖のポジティブコントロールとして使用した（各セットの４本目のバー）。ＩＬ−１０のｍＲＮＡの増加は実際に全セットの細胞において有意に認められ、非感染の動物から得た細胞及び成虫の条虫を寄生させたハムスターから得た細胞のいずれにおいても翻訳後修飾無しのｒＴｓＣＲＴがＩＬ−１０の生産を刺激したことを示している。
【００１７】
〔発明の詳細な説明〕
有鉤条虫カルレティキュリン（ＴｓＣＲＴ）は我々の研究所で同定され、我々はこれが成虫期の有鉤条虫の排泄物及び分泌物（Ｅ／Ｓ）の一部であること、並びに筋細胞及び成体の寄生体亜区域細胞、並びに胚形成及び配偶子形成で発現することを立証した（Ｍｅｎｄｌｏｖｉｃ  Ｆ，  Ｃａｒｒｉｌｌｏ−Ｆａｒｇａ  Ｊ，  Ｔｏｒｒｅｓ  Ｊ，  Ｌａｃｌｅｔｔｅ  ＪＰ，  Ｆｌｉｓｓｅｒ  Ａ．  ２００６．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  Ｔａｅｎｉａ  ｓｏｌｉｕｍ．  Ｊ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ  ９２：  ７８９−７９５）。ｒＴｓＣＲＴはＣａ２＋結合機能タンパク質として大腸菌内で組換え技術によって発現された。ＴｓＣＲＴ前駆タンパク質はアミノ末端における１〜１８番のアミノ酸（ＭＡＶＰＡＦＬＩＡＬＬＦＶＶＮＴＲＡ）からなるシグナルペプチドを示すものである。このシグナルペプチドはタンパク質を分泌の対象にする上で必須だが、成熟タンパク質を生産するために切断される。ここで、本発明のｒＴｓＣＲＴが成熟タンパク質としてのシグナルペプチドを持たない点について説明する。ｒＴｓＣＲＴは他のカルレティキュリンと５０％以下の同一性を有しており、ＴｓＣＲＴ前駆タンパク質の完全なアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋで開示されている（Ａｃｃｅｓｓ  Ｎｏ．  ＡＦ３４０２３２，  ３９５アミノ酸）。一般に、アフィニティークロマトグラフィ精製に用いられる組換えタンパク質が、金属イオンを使用する方法によって生産される場合、ポリヒスチジンタグと呼ばれる６個のヒスチジンから構成される配列が含まれる。ここで、ヒスチジンがその金属イオンと結合し、それゆえに、残留するタンパク質から分離される。しかし、タンパク質のタグは生物活性及びその機能に欠陥を生じさせることがあり、このためにｒＴｓＣＲＴの発現は精製タグを含まずに行われた（Ｍｅｎｄｌｏｖｉｃ，  Ｆ．，  Ｏｓｔｏａ−Ｓａｌｏｍａ，  Ｐ．，  Ｓｏｌｉｓ，  Ｃ．Ｆ．，  Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｏｃａｎａ，  Ｊ．，  Ｆｌｉｓｓｅｒ，  Ａ．，  Ｌａｃｌｅｔｔｅ，  Ｊ．Ｐ．  ２００４．  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｅｎｉａ  ｓｏｌｉｕｍ  ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ．  Ｊ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．  ９０：  ８９１−８９３）。バクテリア発現性ｒＴｓＣＲＴを２０％のショ糖溶液に溶解してその精製に用い、超音波処理の後、分画遠心分離処理を行った。この組換えタンパク質を含む画分はｒＴｓＣＲＴに対応するレーンをゲルから分離する電気溶出法により精製され、この精製には残留ＬＰＳの混入を排除するためにエンドトキシン除去カラム（Ｄｅｔｏｘｉ−ｇｅｌ）が使用された（Ｆｏｎｓｅｃａ−Ｃｏｒｏｎａｄｏ，  Ｓ．，  Ｒｕｉｚ−Ｔｏｖａｒ，  Ｋ．，  Ｐｅｒｅｚ−Ｔａｐｉａ，  Ｍ．，  Ｍｅｎｄｌｏｖｉｃ，  Ｆ．，  Ｆｌｉｓｓｅｒ，  Ａ．  ２０１１．  Ｔａｅｎｉａ  ｓｏｌｉｕｍ：  Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｏｒａｌ  ｏｒ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｅｘｐ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．  １２７：３１３）。
【００１８】
Ｊ．Ｒｚｅｐｅｃｋａら（Ｒｚｅｐｅｃｋａ  Ｊ，  Ｒａｕｓｃｈ  Ｓ，  Ｋｌｏｔｚ  Ｃ，  Ｓｃｈｎｏｌｌｅｒ  Ｃ，  Ｋｏｒｎｐｒｏｂｓｔ  Ｔ，  Ｈａｇｅｎ  Ｊ，  Ｉｇｎａｔｉｕｓ  Ｒ，  Ｌｕｃｉｕｓ  Ｒ，  Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ｓ．  ２００９．  Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｎｅｍａｔｏｄｅ  Ｈｅｌｉｇｍｏｓｏｍｏｉｄｅｓ  ｐｏｌｙｇｙｒｕｓ  ｉｓ  ａ  Ｔｈ２−ｓｋｅｗｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｒｉｎｅ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ａ．  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４６：  １１０９−１１１９）は、Ｔリンパ球培養物においてヘリグモソモイデス・ポリギルスのＣＲＴのネイティブなタンパク質はＩＬ−４及びＩＬ−１０の生産を誘導する一方、組換えタンパク質は何らの免疫学的効果も持たないことを立証し、組換えタンパク質が効果を欠く原因はネイティブなタンパク質との構造的な違いにあるという可能性を主張した。ここで、本願で開示するｒＴｓＣＲＴの発現及び精製に用いた方法では翻訳後修飾が不要な組換えタンパク質が得られ、かつこのタンパク質は、ＩＬ−４サイトカイン及びＩＬ−１０サイトカインをコードするｍＲＮＡの転写レベルを脾臓細胞及びＮＬＭ細胞において刺激する免疫調整効果を有するものであることに注目することが重要である。また、この発現はタグ無しの大腸菌系で行われたが、原核生物の細胞であるか真核生物の細胞であるかを問わず、どのような発現系にも適用可能である。
【００１９】
〔実施例〕
ヒトの条虫感染を再現するため、ゴールデンハムスター（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ  ａｕｒａｔｕｓ）をそれぞれ有鉤条虫の嚢虫４匹に感染させた。各ハムスターを異なる感染後日数（ＤＰＩ）の間犠牲にして、その後分離した脾臓細胞及びＮＬＭ細胞を、濃度１０μｇ／ｍｌの精製済みｒＴｓＣＲＴ、条虫粗抽出物（ＴｓＣＥ）、またはＴリンパ球の分裂誘発物質であるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）をそれぞれの増殖のポジティブコントロールとして用いて刺激した。これらの異なる物質で刺激された細胞を５日間の培養期間の後採取し、ＳＹＢＲグリーン及びＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０装置（ロシュ社）を用いた逆転写及び定量ＰＣＲ分析にかけるためにＲＮＡを分離した。図１はβアクチンを参照遺伝子として用いて、ＩＬ−４及びＩＬ−１０をコードしているメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の相対的な発現を示している。非感染のハムスターのＮＬＭ細胞においてｒＴｓＣＲＴはＩＬ−４の発現を誘導したが、脾臓細胞では誘導せず（図１Ａ）、ＴｓＣＥまたはＣｏｎＡを用いた刺激はいずれも感染後日数１０日及び２０日においてＩＬ−４（Ｔｈ２サイトカイン）の発現を増加させた（図１Ｂ）。一方ｒＴｓＣＲＴは、ＮＬＭ細胞及び脾臓細胞の両方におけるＩＬ−１０の発現を増加させた（感染後日数２０日のＮＬＭ細胞を除く）（図１Ｃ及びＤ）。ＣｏｎＡまたはＴｓＣＥを使用した刺激はＩＬ−１０をコードするｍＲＮＡの翻訳レベルに対しては有効な刺激にはならなかった。
【００２０】
我々の実験結果から、ｒＴｓＣＲＴはＩＬ−１０免疫調整性サイトカインの有力な誘導因子であることがわかる。ＩＬ−１０がＴｈ１反応だけでなく環境アレルゲンが引き起こすＴｈ２免疫病理も抑制することができることから、この発見は意味深いものである。そのため我々は、インターロイキン−１０反応性の炎症を病因とする疾患の治療向けの免疫調整薬の製剤化にｒＴｓＣＲＴを使用することを提案する。
【００２１】
ｒＴｓＣＲＴによる免疫付与により、炎症誘発サイトカインの減少と並行して増加するＩＬ−１０及びＩＬ−４を原因とする炎症の重症度を和らげることができる。原理上は、ｒＴｓＣＲＴは腸炎のみならず多発性硬化症、Ｉ型糖尿病及び肥満等、炎症を由来とする他の疾患に対する調節剤として使用できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】βアクチンを参照遺伝子として用い、ＩＬ−４（パネルＡ及びＢ）及びＩＬ−１０（パネルＣ及びＤ）をコードしているメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の相対的な発現を示している。実験は感染前（ナイーブ）、感染後日数（ＤＰＩ）１０日、２０日及び３０日のハムスターの腸間膜リンパ節（ＮＬＭ）または脾臓から得られた細胞を使用して行われた。成熟したｒＴｓＣＲＴを刺激として翻訳後修飾無しで使用するか（各セットの２本目のバー）、または有鉤条虫の粗抽出物（ＴｓＣＥ）を使用した（各セットの３本目のバー）。また、ＲＰＭＩ培地をネガティブコントロールとして使用し（各セットの１本目のバー）、コンカナバリンＡ分裂誘発物質を細胞増殖のポジティブコントロールとして使用した（各セットの４本目のバー）。ＩＬ−１０のｍＲＮＡの増加は実際に全セットの細胞において有意に認められ、非感染の動物から得た細胞と成虫の条虫を寄生させたハムスターから得た細胞のいずれにおいても翻訳後修飾無しのｒＴｓＣＲＴがＩＬ−１０の生産を刺激したことを示している。
【図１】
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【国際調査報告】
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