(57)【要約】本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスに結合し、かつそのようなＢ型肝炎ウイルスに対して広範な中和活性を有する、ヒトモノクローナル抗体など結合分子に関する。本発明は、結合分子をコードする核酸分子および結合分子を含む組成物をさらに提供する。結合分子は、Ｂ型肝炎の診断、予防法、および／または処置において使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、結合分子。
【請求項２】
配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の結合分子。
【請求項３】
配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１または２に記載の結合分子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合分子と、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質上のエピトープへの結合について免疫特異的に競合する結合分子。
【請求項５】
前記結合分子が、インビトロアッセイにおいてＢ型肝炎ウイルスを中和する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項６】
前記結合分子が、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項のいずれか一項に記載の少なくとも１つの結合分子を含み、少なくとも１つのタグをさらに含む免疫複合体。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の結合分子をコードする核酸分子。
【請求項９】
医薬としての使用のための、好ましくは、Ｂ型肝炎ウイルスによって引き起こされるＢ型肝炎感染症の診断、予防法、および／または処置における使用のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の結合分子、請求項７に記載の免疫複合体、および／または請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の結合分子の機能的変異体。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の結合分子および／または請求項７に記載の免疫複合体ならびに薬学的に許容できるキャリヤまたは賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の結合分子およびさらなるＢ型肝炎中和結合分子を含む請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
Ｂ型肝炎ウイルス感染症を検出する方法であって、
（ａ）請求項１〜６に記載の結合分子および／または請求項７に記載の免疫複合体を使用して、生物学的サンプル中のＢ型肝炎ウイルス抗原のレベルをアッセイするステップならびに
（ｂ）Ｂ型肝炎ウイルス抗原のアッセイレベルを対照レベルと比較するステップであって、Ｂ型肝炎ウイルス抗原の対照レベルと比較したＢ型肝炎ウイルス抗原のアッセイレベルの増加が、Ｂ型肝炎ウイルス感染症を示すステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学に関する。本発明は、特に、Ｂ型肝炎ウイルスに結合し、かつ中和することができるヒト結合分子、たとえばモノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関する。そのうえ、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスによって引き起こされる感染症の診断、予防法、および／または処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、世界中の２０億人を超える人々に感染しており、一時的な肝疾患および慢性肝疾患を引き起こす。ＨＢＶに対するワクチンは、１９８２年に導入されたが、世界的に３億５０００万人の人々が慢性的に感染している。慢性感染症の危険性は、感染時の患者の年齢と相関する。感染症は、生後１年以内に感染した乳児の約９０％において持続する。対照的に、感染症は、大人になって感染した患者の１〜５％でしか持続しない。
【０００３】
ＨＢＶの活発な複製は、免疫反応性による可能性が最も高い肝損傷によって特徴付けられる。慢性ＨＢＶ感染症は、肝癌および死に至り得る。小児期の間に慢性的に感染するようになった大人の約２５％は、ＨＢＶ関連性の肝硬変または癌で死亡し、その数は毎年５０万〜１２０万人と推定される。
【０００４】
ＨＢＶに対する免疫応答は、ＨＢＶ感染細胞の排除のための細胞性免疫応答および循環ウイルス粒子のクリアランスに寄与する体液性抗体応答の両方からなる。中和ＨＢＶ抗体の誘発を担う主なウイルス構成成分は、小さなＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）である。
【０００５】
組み換えワクチンはすべて、ＨＢｓＡｇを含有し、これらのワクチンの効能は、高く（乳児、子供、および若年成人の９５％超における保護）、長続きする（＞２０年）。そのうえ、ワクチンはすべて、血清型すべての種類にわたって免疫を誘起する。ＨＢｓＡｇは、１つのＮ結合型グリコシル化部位を有する、２２６アミノ酸からなる。循環ＨＢＶ株の比較は、様々なＨＢｓＡｇ配列の間で高レベルの均一性があることを示した。
【０００６】
慢性ＨＢＶ感染症の処置のための市販の様々な抗ウイルス製品がある。しかしながら、入手可能な抗ウイルス薬剤のどれも感染を取り除くことができず、それらは単に複製を阻害し、したがって、肝損傷を最小限にするだけである。そのため、肝移植は、ＨＢＶ末期肝臓疾患を有する患者のための唯一の処置の選択肢となる。米国では、ＨＢＶ疾患にかかった肝臓は、すべての肝臓移植の５％に相当すると推定されるのに対し、中国では、すべての肝移植のおよそ８５％が、ＨＢＶ感染症によるものである。
【０００７】
肝移植後の新しい肝臓の再感染を予防するために、患者は、現在、抗ウイルス剤と組み合わせたポリクローナルＨＢＶ免疫グロブリン（ＨＢＩｇ）により処置されている。ポリクローナルＨＢＩｇは、免疫化されたドナー由来の血漿のプールから調製され、また、単独でまたはワクチンと組み合わせて、曝露後の予防法としても使用される。ＨＢＩｇ調製物は、ＨＢｓＡｇを含有する血液への急性曝露、ＨＢｓＡｇ陽性の母親への、生まれた乳児の分娩時の曝露、ＨＢｓＡｇ陽性の人への性的な曝露、および急性Ｂ型肝炎ウイルス感染症を有する人への家庭での曝露の処置に必要である。有効性、商品の費用、多量の注射量、有害事象、および血液由来の感染の危険性のようなＨＢＩｇに関連するいくつかの限界があるので、ＨＢＶに対するモノクローナル抗体産物についての医学的な必要性がある。
【０００８】
ＨＢＶに対するいくつかのモノクローナル抗体は、以前に記載されている。ＰＣＴ特許出願ＰＣＴイスラエル国特許出願第９７／００１８３号明細書およびＰＣＴイスラエル国特許出願第９７／００１８４号明細書は、それぞれ、ＨＢＶ表面抗原に対するヒトモノクローナル抗体ｍＡｂ  １７．１．４１およびｍＡｂ  １９．７９．５を開示する。これらの抗体は、様々なＨＢＶサブタイプに結合する。しかしながら、サブタイプａｄｗ２（遺伝子型Ｃ）のＨＢｓＡｇは、前記抗体によって認識されない（Ｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３２，５８８）。遺伝子型Ｃは、大多数の慢性的に感染した人が住む中国において非常に流行している。
【０００９】
国際公開第２００９０６９９１７号パンフレットは、Ｂ型肝炎感染症の予防および処置のためにＢ型肝炎ウイルスを中和することができるヒト抗体を開示する。この抗体がすべての主な血清型および遺伝子型のＨＢＶに結合することは実証されていない。そのうえ、これまで開示された抗体のどれも、大多数の一般に知られているワクチン誘発性および抗ウイルス誘発性のエスケープ突然変異体（ｅｓｃａｐｅ  ｍｕｔａｎｔ）を中和することが示されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、可能性のあるエスケープ突然変異体に加えて、広範囲の血清型および遺伝子型のＨＢＶに結合し、かつ中和し、また、大きな工業規模で製造することができる抗体についての必要性が当技術分野においてある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に特異的に結合し、かつ中和することができる結合分子、特にヒト結合分子を提供する。本発明は、主な血清型および遺伝子型のＨＢＶに結合する結合分子を提供し、それによって、広範な保護を提供する。そのうえ、本発明による結合分子は、すべての主なワクチン誘発性および抗ウイルス誘発性のＨＢＶエスケープ突然変異体に結合する。最終的に、本発明のＨＢＶに対する結合分子は、大規模で効率的に製造することができ、これは、それらを工業生産にとって適切にする。
【００１２】
本発明による結合分子は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【００１３】
ある実施形態において、本発明の結合分子が、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００１４】
他の実施形態において、本発明の結合分子が、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００１５】
本発明はまた、本発明による結合分子と、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質上のエピトープへの結合について特異的に競合する結合分子にも関する。
【００１６】
好ましくは、本発明による結合分子は、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。
【００１７】
本発明はまた、本発明による少なくとも１つの結合分子を含み、少なくとも１つのタグをさらに含む免疫複合体にも関する。
【００１８】
本発明の他の態様は、本発明による結合分子をコードする核酸分子に関する。
【００１９】
本発明の結合分子、免疫複合体、および／または核酸分子は、医薬としての使用に、好ましくは、Ｂ型肝炎ウイルスサブタイプによって引き起こされるＢ型肝炎感染症の診断、予防法、および／または処置における使用に適している。
【００２０】
本発明はまた、本発明による結合分子の機能的な変異体にも関する。
【００２１】
本発明はまた、本発明による結合分子および／または免疫複合体ならびに薬学的に許容できるキャリヤまたは賦形剤を含む医薬組成物にも関する。
【００２２】
本発明はまた、本発明による結合分子およびさらなるＢ型肝炎中和結合分子を含む医薬組成物にも関する。
【００２３】
本発明の他の態様は、Ｂ型肝炎ウイルス感染症を検出する方法であって、
（ａ）本発明による結合分子および／または免疫複合体を使用して、生物学的サンプル中のＢ型肝炎ウイルス抗原のレベルをアッセイするステップならびに
（ｂ）Ｂ型肝炎ウイルス抗原のアッセイレベルを対照レベルと比較するステップであって、Ｂ型肝炎ウイルス抗原の対照レベルと比較したＢ型肝炎ウイルス抗原のアッセイレベルの増加が、Ｂ型肝炎ウイルス感染症を示すステップを含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、ＣＲ８０９６（分離ピークを有する太い線）およびＣＲ８０９７（単一のピークを有する細い線）のＨＰ−ＳＥＣプロファイルのオーバーレイならびにＭＡＬＳ検出によって決定される分子量の割り当てを示す図である。
【図２】図２は、主な血清型／遺伝子型のＨＢＶに相当するＨＢｓＡｇ発現構築物によりそれぞれトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞へのＣＲ８０９７の細胞内ＦＡＣＳ結合の概要を示す図である。擬似ＨＥＫ２９３Ｆ細胞は、ＧＦＰ発現構築物によりトランスフェクトした。
【図３】図３は、２つの異なるサブタイプのＨＢｓＡｇのポリペプチド配列：ａｙｗ３（配列番号１１）およびａｄｒ（配列番号１２）の概要を示す図である。コンセンサス配列は、配列番号１３と同一である。
【図４】図４は、一般に観察されるＨＢｓＡｇエスケープ突然変異体に相当するＨＢｓＡｇ発現構築物によりそれぞれトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞へのＣＲ８０９７の細胞内ＦＡＣＳ結合の概要を示す図である。擬似ＨＥＫ２９３Ｆ細胞は、ＧＦＰ発現構築物によりトランスフェクトした。
【図５】図５は、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ、血清型ａｄｒに対するＣＲ８０９７のインビトロ中和効力を示す図である。
【図６】図６は、ＨＢＶ遺伝子型Ｄ、血清型ａｙｗ３に対するＣＲ８０９７のインビトロ中和効力を示す図である。
【図７】図７は、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ、血清型ａｄｒに対するＣＲ８０９７の予防的インビボ効能を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明において使用される用語の定義を下記に示す。
【００２６】
本明細書において使用される用語「含まれる」または「含む」は、語「限定を伴うことなく」が後続するものと見なされる。
【００２７】
本明細書において使用されるように、用語「結合分子」は、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、もしくはヒトモノクローナル抗体などのようなモノクローナル抗体を含むインタクトな免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの結合パートナーへの特異的な結合でインタクトな免疫グロブリンと競合する、免疫グロブリンの断片を含む抗原結合ドメインおよび／もしくは可変ドメインを指す。構造に関係なく、抗原結合断片は、インタクトな免疫グロブリンによって認識されるものと同じ抗原と結合する。抗原結合断片は、結合分子のアミノ酸配列の少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、または２５０の連続アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを含むことができる。
【００２８】
本明細書において使用される用語「結合分子」は、当技術分野において知られているすべての免疫グロブリンクラスおよびサブクラスを含む。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、結合分子は、５つの主なクラスのインタクトな抗体：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに分けることができ、これらのいくつかは、サブクラス、たとえばＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４にさらに分けられてもよい。
【００２９】
抗原結合断片は、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二価単鎖抗体、単鎖ファージ抗体、二特異性抗体、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、（ポリ）ペプチドへの特異的な抗原結合を付与するのに十分である、免疫グロブリンの少なくとも１つの断片を含有する（ポリ）ペプチド、などを含む。上記の断片は、合成してまたはインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって産生されてもよく、またはそれらは、組み換えＤＮＡ技術によって遺伝子的に操作されてもよい。産生の方法は、当技術分野においてよく知られており、たとえば、参照によって本明細書に組み込まれるＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ，Ｌａｎｅ（１９８８），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋにおいて記載される。結合分子またはその抗原結合断片は、１つ以上の結合部位を有していてもよい。１つを超える結合部位がある場合、結合部位は、互いに同一であってもよく、またはそれらは異なっていてもよい。
【００３０】
結合分子は、裸の結合分子または非コンジュゲート結合分子とすることができるが、また、免疫複合体の一部とすることもできる。裸の結合分子または非コンジュゲート結合分子は、とりわけ毒性物質、放射性物質、リポソーム、酵素などのようなエフェクター成分またはタグにコンジュゲートされていない、適切に作用するように連結されていない、または他の場合には物理的にもしくは機能的に関連していない結合分子を指すことが意図される。裸の結合分子または非コンジュゲート結合分子は、安定化された、多量体化された、ヒト化された、またはエフェクター成分もしくはタグの付加によるもの以外で任意の他の方法で操作された結合分子を除外しないことが理解されるであろう。したがって、翻訳後に修飾された裸の結合分子および非コンジュゲート結合分子はすべて、これと共に含まれ、修飾が、天然の結合分子産生細胞環境においてなされる、組み換え結合分子産生細胞によってなされる、および最初の結合分子調製の後に人の手によって導入される場合を含む。もちろん、裸の結合分子または非コンジュゲート結合分子という用語は、結合分子が、身体への投与の後にエフェクター細胞および／または分子との機能的な関連を形成する能力を、そのような相互作用のうちのいくつかが生物学的効果を発揮するのに必要であるので、除外しない。関連するエフェクター基またはタグの欠如は、そのため、インビボではなく、インビトロにおける裸の結合分子または非コンジュゲート結合分子への定義に適用される。
【００３１】
本明細書において使用されるように、用語「生物学的サンプル」は、様々なサンプルタイプを包含し、生物学的な起源の血液および他の液体サンプル、生検組織もしくは組織培養物などのような固体組織サンプル、またはそれに由来する細胞およびその子孫を含む。この用語はまた、試薬による処置、可溶化、またはタンパク質もしくはポリヌクレオチドなどのようなある構成成分についての濃縮によってなどのように、それらの入手の後に任意の方法で操作されたサンプルを含む。この用語は、任意の種から得られた、様々な種類の臨床サンプルを包含し、培養中の細胞、細胞上清、および細胞溶解物もまた含む。
【００３２】
本明細書において使用される用語「相補性決定領域」（ＣＤＲ）は、抗原上で認識されるエピトープに対して形状および電荷分布において相補的である抗原結合部位に通常大幅に寄与する、免疫グロブリンなどのような結合分子の可変領域内の配列を意味する。ＣＤＲ領域は、その未変性のコンホメーションにあるタンパク質上に存在するか、またはある場合には、たとえばＳＤＳ中での可溶化によって変性したタンパク質上に存在するタンパク質またはタンパク質断片の直鎖エピトープ、非連続エピトープ、または立体構造エピトープに対して特異的になり得る。エピトープはまた、タンパク質の翻訳後修飾からなってもよい。
【００３３】
本明細書において使用される用語「欠失」は、１つ以上のアミノ酸残基またはヌクレオチド残基が、それぞれ、参照分子、多くの場合、天然に存在する分子と比較して、不在である、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列における変化を示す。
【００３４】
本明細書において使用される用語「発現調節核酸配列」は、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の発現に必要である、および／または影響を与えるポリヌクレオチド配列を指す。とりわけ適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列、エンハンサー配列；リプレッサーまたはアクチベーター配列；スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルなどのような効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質内ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（たとえばリボソーム結合部位）；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに所望される場合、タンパク質分泌を増強する配列などのような発現調節核酸配列は、最適な宿主生物において活性を示す任意の核酸配列とすることができ、宿主生物に対して同種または異種である、タンパク質をコードする遺伝子に由来することができる。発現調節配列の同定および使用は、当業者にとって慣用的なものである。
【００３５】
本明細書において使用される用語「機能的変異体」は、参照核酸分子または結合分子のヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列と比較して、１つ以上のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸が改変しているヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列を含む核酸分子または結合分子を指す。本発明による結合分子の機能的変異体は、結合パートナー、すなわちＢ型肝炎ウイルスへの結合について、参照結合分子と競合し得る。言いかえれば、参照結合分子のアミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列における修飾は、ヌクレオチド配列によってコードされるかアミノ酸配列を含有する結合分子の結合の特質に有意に影響を与えないかまたはそれを改変せず、すなわち、結合分子は、なお、その標的を認識し、かつ結合することができる。機能的変異体は、ヌクレオチドおよびアミノ酸の置換、追加、および欠失を含む保存的配列修飾を有していてもよい。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発およびランダムＰＣＲ媒介性突然変異誘発などのような、当技術分野において知られている標準的な技術によって導入することができ、また、天然および非天然ヌクレオチドおよびアミノ酸を含んでいてもよい。
【００３６】
保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似する構造的または化学的特性を有するアミノ酸残基と交換されるものを含む。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（たとえばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（たとえばアスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、無極性側鎖（たとえばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（たとえばトレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（たとえばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）を有するアミノ酸を含む。上記に使用されるもの以外のアミノ酸残基ファミリーの他の分類を用いることもできることは当業者に明らかであろう。さらに、変異体は、非保存的アミノ酸置換、たとえば、異なる構造的または化学的特性を有するアミノ酸残基とのアミノ酸の置換を有していてもよい。類似する軽微な変異はまた、アミノ酸の欠失もしくは挿入またはその両方を含んでいてもよい。どのアミノ酸残基が、免疫学的な活性を消失させることなく、置換され得る、挿入され得る、または欠失し得るかの決定における指針は、当技術分野においてよく知られているコンピュータープログラムを使用して見つけられてもよい。
【００３７】
ヌクレオチド配列における突然変異は、トランジション突然変異もしくはトランスバージョン突然変異などの、遺伝子座でなされる単一の改変（点突然変異）とすることができ、またはその代わりに、複数のヌクレオチドを、単一の遺伝子座に挿入しても、欠失させても、または変化させてもよい。そのうえ、１つ以上の改変は、ヌクレオチド配列内の任意の数の遺伝子座でなされてもよい。突然変異は、当技術分野において知られている任意の適した方法によって実行されてもよい。
【００３８】
Ｂ型肝炎ウイルス「血清型」という用語は、特に、ある血清型内のすべての個々のＢ型肝炎ウイルス株を含む。ＨＢＶウイルス株の血清型の分類は、アルゴリズム／決定木を介しての、ＨＢｓＡｇ分子における限られた数のアミノ酸残基に基づく（Ｐｕｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ）。現在まで、ａｄｗ１、ａｄｗ２、ａｄｗ３、ａｄｗ４ｑ＋、ａｄｗ４ｑ−、ａｄｒｑ＋、ａｄｒｑ−、ａｙｗ１、ａｙｗ２、ａｙｗ３、ａｙｗ４の１１の血清型のＨＢＶが記載されている。血清型はまた、「サブタイプ」と呼ばれてもよい。したがって、本明細書において使用されるように、用語「血清型」および「サブタイプ」は、区別なく使用されてもよい。
【００３９】
ＨＢＶ「遺伝子型」という用語は、特に、それぞれの遺伝子型内のすべての個々のＨＢＶウイルス株を含む。ＨＢＶ遺伝子型の分類は、ＨＢＶゲノム全体の系統学的関連性に基づく。ある遺伝子型内のＨＢＶゲノムは、定義によると、系統学的クレード内で４％未満の配列多様性およびクレード外の配列で８％を超える多様性を示す。現在まで、Ａ〜Ｉに指定される９つのＨＢＶ遺伝子型が、定義されている。
【００４０】
本発明の結合分子に関して本明細書において使用される「中和する」という用語は、中和が実現される機序に関係なく、インビトロにおいておよび／または対象内で、Ｂ型肝炎ウイルスの複製を阻害する結合分子を指す。したがって、中和は、たとえば、細胞表面へのウイルスの付加もしくは付着を阻害することによってまたは標的細胞へのウイルスの付加後にウイルスおよび細胞膜の融合を阻害することによってまたは感染細胞からのウイルスの放出を阻害することによって、ならびにその他同種のものによって、実現することができる。
【００４１】
本発明の結合分子に関して本明細書において使用される用語「交差中和する」または「交差中和」は、異なる血清型および／または遺伝子型のＢ型肝炎ウイルスを中和するための本発明の結合分子の能力を指す。
【００４２】
本明細書において使用される用語「宿主」は、クローニングベクターまたは発現ベクターなどのようなベクターが導入された生物または細胞を指すことが意図される。生物または細胞は、原核生物または真核生物であってもよい。好ましくは、宿主単離された宿主細胞、たとえば培養中の宿主細胞。用語「宿主細胞」は、細胞が本発明の結合分子の（過剰）発現のために修飾され、これらの結合分子を本来発現し、細胞が、不死化、増幅、発現の増強などによって、結合分子を過剰発現するように修飾されたＢ細胞を含むことを単に示す。宿主という用語は、特定の対象となる生物または細胞だけではなく、そのような生物または細胞の子孫もまた同様に指すことが意図されることを理解されたい。ある修飾が突然変異または環境上の影響により続く世代に生じ得るので、そのような子孫は、実際に、親の生物または細胞と同一ではなくてもよいが、なお、本明細書において使用される用語「宿主」の範囲内に含まれる。
【００４３】
用語「ヒト」は、本明細書において定義される結合分子に対して適用される場合、ヒトに直接由来するかまたはヒトの生殖系の配列に基づく分子を指す。結合分子がヒト配列に由来しまたはヒト配列に基づき、続いて修飾される場合、明細書の全体にわたって使用されるように、それは、ヒトであるとなお考えられる。言いかえれば、ヒトという用語は、結合分子に対して適用される場合、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来しまたはヒトもしくはヒトリンパ球において生じる可変領域もしくは定常領域に基づき、何らかの形で修飾された可変領域および定常領域を有する結合分子を含むことが意図される。したがって、ヒト結合分子は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含んでいてもよく、置換および／または欠失（たとえば、例としてランダムもしくは部位特異的突然変異によってインビトロにおいてまたは体細胞変異によってインビボにおいて導入された突然変異）を含む。
【００４４】
本明細書において使用される「に基づく」は、核酸配列が、鋳型から正確にもしくはエラープローンＰＣＲ法によってなどのように軽微な突然変異を伴ってコピーされてもよく、または合成して作製し、鋳型と正確にもしくは軽微な修飾を伴ってマッチしてもよいという状況を指す。
【００４５】
用語「追加」としても知られている用語「挿入」は、親配列と比較して、それぞれ、１つ以上のアミノ酸残基またはヌクレオチド残基の追加をもたらす、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列における変化を示す。
【００４６】
用語「単離された」は、本明細書において定義される結合分子に対して適用される場合、他のタンパク質またはポリペプチドが実質的になく、特に、異なる抗原特異性を有する他の結合分子がなく、また、他の細胞性物質および／または化学物質も実質的にない結合分子を指す。たとえば、結合分子が組み換えで産生される場合、それらは、好ましくは、培養培地構成成分が実質的になく、結合分子が化学合成によって産生される場合、それらは、好ましくは、化学前駆物質または他の化学物質が実質的にない、すなわち、それらは、タンパク質の合成に関与する化学前駆物質または他の化学物質から分離される。用語「単離された」は、本明細書において定義される結合分子をコードする核酸分子に対して適用される場合、結合分子をコードするヌクレオチド配列に、他のヌクレオチド配列、特に、他の結合パートナーに結合する結合分子をコードするヌクレオチド配列がない核酸分子を指すことが意図される。さらに、用語「単離された」は、その天然の宿主における天然の核酸分子に天然に付随する、それが天然に関連している他の細胞の構成成分、たとえばリボソーム、ポリメラーゼ、またはゲノム配列から実質的に分離された核酸分子を指す。さらに、ｃＤＮＡ分子などのような「単離された」核酸分子は、組み換え技術によって産生された場合に他の細胞性物質もしくは培養培地が実質的にないかまたは化学的に合成される場合、化学前駆物質もしくは他の化学物質が実質的にないものとすることができる。
【００４７】
本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」は、単一の特異性の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。したがって、用語「ヒトモノクローナル抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来するもしくは基づくまたは完全に合成の配列に由来する可変領域および定常領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体を指す。モノクローナル抗体を調製する方法は、結合特異性にとって重要ではない。
【００４８】
ある物体に対して適用されるように本明細書において使用される用語「天然に存在する」は、物体または化合物を自然界で見つけることができるという事実を指す。たとえば、自然界の供給源から単離することができ、研究所において人によって意図的に修飾されていない生物中に存在するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【００４９】
本発明において使用される用語「核酸分子」は、ヌクレオチドのポリマー形態を指し、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成形態ならびに上記のものの混合ポリマーのセンス鎖ならびにアンチセンス鎖の両方を含む。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態を指す。この用語はまた、ＤＮＡの一本鎖および二本鎖形態を含む。そのうえ、ポリヌクレオチドは、天然に存在するおよび／または天然に存在しないヌクレオチド連結によって互いに連結された、天然に存在するヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドのいずれかまたは両方を含んでいてもよい。核酸分子は、当業者によって容易に理解されるように、化学的にもしくは生化学的に修飾されてもよく、または非天然ヌクレオチド塩基もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有してもよい。そのような修飾は、たとえば標識、メチル化、類似体との１つ以上の天然に存在するヌクレオチドの置換、非荷電連結（たとえばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）、荷電連結（たとえばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、ペンダント成分（たとえばポリペプチド）、インターカレーター（たとえばアクリジン、ソラレンなど）、キレート剤、アルキル化剤、および修飾連結（たとえばアルファアノマー核酸など）などのようなヌクレオチド間修飾を含む。上記の用語はまた、一本鎖、二本鎖、部分的二重、三重、ヘアピン、環状、およびパドロックコンホメーションを含む任意の位相幾何学的コンホメーションを含むことが意図される。水素結合および他の化学的相互作用を介して、指定される配列に結合するそれらの能力においてポリヌクレオチドを模倣する合成分子もまた含まれる。そのような分子は、当技術分野において知られており、たとえば、ペプチド連結が分子の主鎖においてホスフェート連結と置換されるものを含む。核酸配列への言及は、別段の定めがない限り、その相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を包含する。したがって、特定の配列を有する核酸分子への言及は、その相補的配列と共に、その相補鎖を包含することを理解されたい。相補鎖はまた、たとえば、アンチセンス療法、ハイブリダイゼーションプローブ、およびＰＣＲプライマーにも有用である。
【００５０】
用語「作動可能に連結された」は、通常物理的に連結され、互いに機能的な関係にある２つ以上の核酸配列エレメントを指す。たとえば、プロモーターがコード配列の転写または発現を開始または調節することができる場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されており、この場合、コード配列は、プロモーター「のコントロール下に」あるとして理解されるはずである。
【００５１】
「薬学的に許容できる賦形剤」によって、適当なまたは好都合な剤形を調製するための薬剤、作用物質、または結合分子などのような活性分子と組み合わせられる任意の不活性物質を意味する。「薬学的に許容できる賦形剤」は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに対して無毒性である賦形剤であり、薬剤、作用物質、または結合分子を含む製剤の他の成分と適合性である。薬学的に許容できる賦形剤は、広く適用され、当技術分野において知られている。
【００５２】
結合分子、たとえば抗体およびその結合パートナー、たとえば抗原の相互作用に関して、本明細書において使用される用語「特異的に結合する」は、相互作用が、特定の構造、たとえば、結合パートナー上の抗原決定基またはエピトープの存在に依存性であることを意味する。言いかえれば、抗体は、結合パートナーが他の分子または生物の混合物中に存在する場合でさえ、結合パートナーに優先的に結合するかまたはそれを認識する。結合は、共有結合もしくは非共有結合相互作用またはその両方の組み合わせによって媒介されてもよい。さらに言いかえれば、用語「特異的に結合する」は、抗原決定基またはエピトープに免疫特異的に結合し、他の抗原決定基またはエピトープに免疫特異的に結合しないことを意味する。抗原に特異的に結合する結合分子は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはＳＰＲ、ＢＬＩなどの無標識技術または当技術分野において知られている他のアッセイなどのようなエンドポイントアッセイによって決定されるように、低い親和性で、他のペプチドまたはポリペプチドに結合してもよい。ある抗原に免疫特異的に結合する結合分子またはその断片は、同じエピトープを持つ関係する抗原と交差反応性であってもよい。好ましくは、ある抗原に免疫特異的に結合する結合分子またはその断片は、他の抗原と交差反応しない。
【００５３】
本明細書において使用される「置換」は、それぞれ、異なるアミノ酸またはヌクレオチドによる、１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドの置換を示す。
【００５４】
用語「治療有効量」は、Ｂ型肝炎ウイルスによる感染から結果として生じる状態を予防する、寛解させる、および／または処置するのに有効である、本明細書において定義される結合分子の量を指す。本明細書において使用される寛解は、Ｂ型肝炎感染症の目に見えるまたは感知可能な疾患症状、ウイルス血症、または任意の他の測定可能な症状発現の低下を指してもよい。
【００５５】
用語「処置」は、疾患進行を取り除くまたは停止させるまたは少なくとも遅らせるための治療上の処置および予防的または防止的手段を指す。処置を必要とする人々は、Ｂ型肝炎ウイルスによる感染から結果として生じる状態に既に罹っている人々およびＢ型肝炎ウイルスによる感染を予防する人々を含む。Ｂ型肝炎ウイルスによる感染から部分的にまたは完全に回復した対象もまた、処置を必要とする場合がある。予防は、Ｂ型肝炎ウイルスの蔓延を阻害するもしくは低下させることまたはＢ型肝炎ウイルスによる感染に関連する１つ以上の症状の発症、発生、もしくは進行を阻害するもしくは低下させることを包含する。
【００５６】
用語「ベクター」は、第２の核酸分子を、それが複製され、ある場合には発現される宿主の中に導入するために挿入することができる核酸分子を示す。言いかえれば、ベクターは、それが連結された核酸分子を輸送することができる。クローニングベクターおよび発現ベクターは、本明細書において使用されるように、用語「ベクター」によって企図される。ベクターは、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、および酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ならびにバクテリオファージまたは植物または動物（ヒトを含む）ウイルスに由来するベクターを含むが、これらに限定されない。ベクターは、提唱される宿主によって認識される複製開始点を含み、発現ベクターの場合には、宿主によって認識されるプロモーターおよび他の調節領域を含む。第２の核酸分子を含有するベクターは、形質転換、トランスフェクション、またはウイルスの侵入メカニズムの利用によって、細胞の中に導入される。あるベクターは、それらが導入される宿主において自律複製ができる（たとえば、細菌複製開始点を有するベクターは、細菌において複製することができる）。他のベクターは、宿主の中への導入と同時に宿主のゲノムの中に統合することができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。
【００５７】
第１の態様において、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス株に特異的に結合することができ、かつ前記Ｂ型肝炎ウイルス株を中和することができる結合分子を提供する。結合分子は、インビトロおよびインビボの両方においてＢ型肝炎ウイルスを中和することができる。
【００５８】
本発明による結合分子は、配列番号１〜３において記載されるＣＤＲ配列を含む重鎖および配列番号４〜６において記載されるＣＤＲ配列を含む軽鎖を含む。本発明によれば、ＣＤＲ領域は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔにおいて記載されるように、Ｋａｂａｔら（１９９１）に従って決定される。
【００５９】
したがって、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスに特異的に結合することができ、かつＢ型肝炎ウイルスを中和することができる結合分子であって、結合分子が、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３ならびに配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、結合分子を提供する。
【００６０】
ある実施形態において、本発明の結合分子が、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。他の実施形態において、本発明の結合分子が、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００６１】
好ましくは、本発明による結合分子は、ヒト結合分子である。好ましい実施形態において、結合分子が、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。
【００６２】
本発明の結合分子は、生存可能な、生きている、および／もしくは感染性のまたは不活性化／弱毒化形態をしたＢ型肝炎ウイルスに特異的に結合することができてもよい。ウイルス、たとえばＢ型肝炎ウイルスを不活性化する／弱毒化するための方法は、当技術分野においてよく知られており、ホルマリン、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、マーシオレート、および／または紫外線による処置を含むが、これらに限定されない。
【００６３】
本発明の結合分子はまた、とりわけ、Ｂ型肝炎ウイルスのサブタイプに由来する１つ以上のタンパク質および／もしくは（ポリ）ペプチドまたはＢ型肝炎ウイルスの１つ以上の組み換えで産生されたタンパク質および／もしくはポリペプチドの調製物などのような、Ｂ型肝炎ウイルスの１つ以上の断片に特異的に結合することができてもよい。様々なＢ型肝炎株のタンパク質のヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて見つけることができる。この研究において使用されるＨＢｓＡｇ配列は、６０００超のＨＢＶ配列を含有する大きな日本のＮＩＧ  ＨＢＶデータベースから選択した（リンクについては、ｈｔｔｐ：／／ｓ２ａｓ０２．ｇｅｎｅｓ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／を参照されたい）。それぞれのデータベースにおいてそのような配列を見つけることは当業者の範囲内に十分にある。
【００６４】
本発明の結合分子は、少なくとも以下の血清型由来のＨＢｓＡｇペプチドに結合することができる：ａｄｗ２（遺伝子型Ｂ）、ａｙｗ２（遺伝子型Ｄ）、ａｙｗ１（遺伝子型Ｂ）、ａｄｒｑ−（遺伝子型Ｃ）、ａｙｒ（遺伝子型Ｃ）、ａｄｗ４ｑ＋（遺伝子型Ａ）、ａｄｒｑ＋（遺伝子型Ｃ）、ａｙｗ４（遺伝子型Ｄ）、ａｄｗ４ｑ−（遺伝子型Ｆ）、ａｄｗ３、ａｙｗ３（遺伝子型Ｄ）、ａｄｗ２（遺伝子型Ｉ）、ａｙｗ１（遺伝子型Ａ）、ａｄｗ２（遺伝子型Ａ）、ａｄｗ２（遺伝子型Ｃ）。これは実施例２において例証した。これと共に、本発明の結合分子は、驚いたことに、主な血清型および遺伝子型のＨＢＶに結合することによって、非常に広範な保護を提供する。
【００６５】
他の実施形態において、本発明の結合分子が、前述のタンパク質および／またはポリペプチドの断片に特異的に結合することができ、断片が、本発明の結合分子によって認識されるエピトープを少なくとも含む。本明細書において使用される「エピトープ」は、検出可能な抗原結合分子複合体を形成するのに十分に高い親和性で本発明の結合分子に結合することができる成分である。
【００６６】
そのうえ、本発明による結合分子は、驚いたことに、たとえばＰ１２０Ｔ、Ｑ１２９Ｒ、Ｍ１３３Ｉ、Ｄ１４４Ｒ、Ｇ１４５Ｒ、Ｇ１４５Ａ、Ｅ１６４Ｄ、Ｉ１９５Ｍ、Ｗ１９６Ｓなど、ＨＢｓＡｇにおける、すべての主なワクチン誘発性および抗ウイルス誘発性のＨＢＶエスケープ突然変異体に結合する（実施例３）。そのため、本発明の結合分子は、ＨＢＶに対して、全般に使用することができる。
【００６７】
本発明の結合分子は、モノクローナル抗体などのようなインタクトな免疫グロブリン分子とすることができ、または結合分子は、重鎖および軽鎖可変領域、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二価単鎖抗体、単鎖ファージ抗体、二特異性抗体、トリアボディ、テトラボディ、ならびにＢ型肝炎ウイルス株もしくはその断片への特異的な抗原結合を付与するのに十分である、免疫グロブリンの少なくとも１つの断片を含有する（ポリ）ペプチドを含むが、これらに限定されない、その抗原結合断片とすることができる。好ましい実施形態において、本発明の結合分子が、ヒトモノクローナル抗体および／またはその抗原結合断片である。結合分子はまた、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、アルファボディ（ａｌｐｈａｂｏｄｙ）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ＦＮ３ドメイン足場およびＡｄｎｅｃｔｉｎ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ、Ｄａｒｐｉｎ、Ｃｅｎｔｙｒｉｎなどのような（ヒト）リピートタンパク質におけるドメインに基づく他の足場、またはエピトープ結合配列を含む他の足場であってもよい。
【００６８】
本発明の結合分子は、非単離または単離形態で使用することができる。さらに、本発明の結合分子は、単独でまたは本発明の少なくとも１つの結合分子（またはその変異体もしくは断片）およびＢ型肝炎に結合し、Ｂ型肝炎ウイルス阻害効果を有する１つ以上の他の結合分子を含む混合物で、使用することができる。言いかえれば、結合分子は、たとえば、２つ以上の結合分子、その変異体、または断片を含む医薬組成物として、組み合わせて使用することができる。たとえば、異なるが相補的な活性を有する結合分子は、所望の予防的な効果、治療上の効果、または診断効果を実現するために、単一の療法において組み合わせることができるが、その代わりに、同一の活性を有する結合分子もまた、所望の予防的な効果、治療上の効果、または診断効果を実現するために、単一の療法において組み合わせることができる。任意選択で、混合物はまた、本発明による少なくとも１つの結合分子および少なくとも１つの他の治療剤を含んでいてもよい。好ましくは、たとえばヌクレオシド類似体（たとえばラミブジン、アデホビル）および／または免疫調節剤（たとえばインターフェロンに基づく療法）などのような治療剤は、Ｂ型肝炎ウイルス感染症の予防法および／または処置に有用である。
【００６９】
典型的に、本発明による結合分子は、その結合パートナー、すなわちＢ型肝炎ウイルスおよび／またはその断片に、０．２×１０−４Ｍ、１．０×１０−５Ｍ、１．０×１０−６Ｍ、１．０×１０−７Ｍよりも低い、好ましくは１．０×１０−８Ｍよりも低い、より好ましくは１．０×１０−９Ｍよりも低い、より好ましくは１．０×１０−１０Ｍよりも低い、さらにより好ましくは１．０×１０−１１Ｍよりも低い、特に１．０×１０−１２Ｍよりも低い平衡解離定数（ＫＤ）で、結合することができる。平衡解離定数は、抗体アイソタイプによって変動し得る。たとえば、ＩｇＭアイソタイプに対する結合は、少なくとも約１．０×１０−７Ｍの平衡解離定数を表す。結合反応速度は、たとえば、表面プラズモン共鳴法またはバイオレイヤー干渉法（ｂｉｏｌａｙｅｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）などのような無標識技術を使用して得ることができる。
【００７０】
本発明の結合分子は、中和活性を示す。中和活性は、たとえば、本明細書において記載されるように測定することができる。典型的に、本発明による結合分子は、実施例４および５において記載されるように、インビトロウイルス中和反応アッセイ（ＶＮＡ）において決定されるように、１０００ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは５００ｎｇ／ｍｌ以下の中和活性、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ以下、さらにより好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ以下の中和活性を有する。本発明による結合分子は、たとえばサンプル中でもしくは懸濁液中でなどのように可溶性形態のＢ型肝炎ウイルスもしくはその断片に結合してもよく、またはキャリヤもしくは土台、たとえばマイクロタイタープレート、膜、およびビーズなどに結合したもしくは付加されたＢ型肝炎ウイルスもしくはその断片に結合してもよい。キャリヤまたは土台は、ガラス、プラスチック（たとえばポリスチレン）、多糖、ナイロン、ニトロセルロース、またはテフロンなどからできていてもよい。そのような支持体の表面は、固体また多孔性であってもよく、任意の好都合な形状をしていてもよい。さらに、結合分子は、精製／単離または非精製／非単離形態でＢ型肝炎ウイルスに結合してもよい。
【００７１】
上記に議論されるように、ある実施形態における本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス上のエピトープを認識し、かつ結合することができる単離ヒト結合分子であって、前記結合分子が、インビトロおよびインビボの両方においてＢ型肝炎ウイルスに対する中和活性を有する単離ヒト結合分子を提供する。
【００７２】
本発明の他の態様は、上記に定義される結合分子の機能的変異体を含む。変異結合分子がＢ型肝炎ウイルスまたはその断片に免疫特異的に結合することについて、「親」または「参照」結合分子と競合することができる場合、分子は、本発明による結合分子の機能的変異体であると考えられる。言いかえれば、機能的変異体がＢ型肝炎ウイルスまたはその断片の同じまたは重複するエピトープになお結合することができる場合、分子は、本発明による結合分子の機能的変異体であると考えられる。本出願のために、「親」および「参照」は、同義語として使用し、参照もしくは親分子の情報または物理的な分子それ自体が変異についての基準を形成し得ることを意味する。機能的変異体は、Ｆｃ受容体もしくはエフェクター機能に関与する他の領域において修飾を有し、ならびに／またはたとえば、親結合分子において見つけられない化学的および／もしくは生化学的なインビトロもしくはインビボ修飾を含有するものを含む、一次構造配列が実質的に類似する誘導体を含むが、これらに限定されない。そのような修飾は、とりわけ、アセチル化、アシル化、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、架橋、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、酸化、ペグ化、タンパク分解性プロセシング、リン酸化、およびその他同種のものを含む。その代わりに、機能的変異体は、親結合分子のアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失、またはその組み合わせを含有するアミノ酸配列を含む本発明において定義される結合分子とすることができる。さらに、機能的変異体は、アミノまたはカルボキシル末端のいずれかまたは両方にアミノ酸配列の切断を含むことができる。本発明による機能的変異体は、親結合分子と比較して、同じまたは異なる、より高いまたはより低い結合効力を有してもよいが、Ｂ型肝炎ウイルスまたはその断片になお結合することができる。たとえば、本発明による機能的変異体は、親結合分子と比較して、Ｂ型肝炎ウイルスまたはその断片に対する結合効力が増加していてもよく、または減少していてもよい。ある実施形態において、フレームワーク領域、超可変領域、特にＣＤＲ３領域を含むが、これらに限定されない可変領域のアミノ酸配列が、修飾される。一般に、軽鎖および重鎖可変領域は、３つのＣＤＲを含む、３つの超可変領域およびより保存された領域、いわゆるフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。超可変領域は、ＣＤＲ由来のアミノ酸残基および超可変ループ由来のアミノ酸残基を含む。本発明の範囲内にあることが意図される機能的変異体は、本明細書において定義される親結合分子と、少なくとも約８０％〜約９９％、好ましくは少なくとも約７０％〜約９９％、より好ましくは少なくとも約８０％〜約９９％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％〜約９９％、最も好ましくは少なくとも約９５％〜約９９％、特に少なくとも約９７％〜約９９％のアミノ酸配列同一性および／または相同性を有する。とりわけ、当業者に知られているＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔなどのようなコンピューターアルゴリズムは、比較されることになっているアミノ酸配列を最適にアライメントし、かつ類似するまたは同一のアミノ酸残基の定めるために使用することができる。機能的変異体は、エラープローンＰＣＲ、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、ならびに重鎖および／または軽鎖シャッフリングを含むが、これらに限定されない、当技術分野において知られている一般的な分子生物学の方法によって、親結合分子またはその一部分を改変することによって得ることができる。
【００７３】
ある実施形態において、本発明の機能的変異体が、Ｂ型肝炎ウイルスに対する中和活性を有する。中和活性は、親結合分子と比較して、同一であってもよく、またはより高いかもしくはより低くてもよい。本出願において使用されるように、用語（ヒト）結合分子が使用される場合、これはまた、（ヒト）結合分子の機能的変異体をも包含する。ある実施形態において、機能的変異体が、配列番号７と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５アミノ酸突然変異などのような１つ以上のアミノ酸突然変異を含む重鎖可変配列および／または配列番号８と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５アミノ酸突然変異などのような１つ以上のアミノ酸突然変異を含む軽鎖可変領域を含む結合分子である。
【００７４】
ある実施形態において、本発明による結合分子が、医薬として使用するためのもの、好ましくは、異なる血清型および遺伝子型由来のＢ型肝炎ウイルスによって引き起こされるＢ型肝炎感染症の治療上のおよび／または予防的な処置において使用するためのものである。
【００７５】
本発明はまた、本発明による少なくとも１つの結合分子および少なくとも１つの薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００７６】
他の実施形態において、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス感染症の予防法および／または処置のための医薬の調製における本発明による結合分子の使用に関する。特に、本発明による結合分子は、新たに移植された肝臓のＢ型肝炎ウイルスによる再感染を予防するために使用される。
【００７７】
さらなる態様において、本発明は、免疫複合体、すなわち、本明細書において定義される少なくとも１つの結合分子を含み、とりわけ検出可能な成分／作用物質などのような少なくとも１つのタグをさらに含む分子を提供する。本発明による免疫複合体の混合物または本発明による少なくとも１つの免疫複合体および治療剤またはもう１つの結合分子もしくは免疫複合体などのような他の分子の混合物もまた、本発明において企図される。さらなる実施形態において、本発明の免疫複合体が、１つを超えるタグを含んでいてもよい。これらのタグは、同じまたは互いに別個のものとすることができ、結合分子に非共有結合でつなぐ／コンジュゲートすることができる。タグはまた、共有結合を通してヒト結合分子に直接つなぐ／コンジュゲートすることもできる。その代わりに、タグは、１つ以上の連結化合物により結合分子につなぐ／コンジュゲートすることができる。タグを結合分子にコンジュゲートするための技術は、当業者によく知られている。
【００７８】
本発明の免疫複合体のタグは、治療剤であってもよいが、それらはまた、検出可能な成分／作用物質とすることもできる。療法および／または予防において適したタグは、毒素またはその機能的部分、抗生物質、酵素、食作用または免疫刺激を増強する他の結合分子であってもよい。検出可能な作用物質を含む免疫複合体は、たとえば、対象がＢ型肝炎ウイルスに感染しているかどうかを評価するためにまたはたとえば所定の処置レジメンの効能を決定するために、臨床試験手順の一部としてＢ型肝炎ウイルス感染症の発達もしくは進行をモニターするために、診断上で使用することができる。しかしながら、それらはまた、他の検出および／または分析および／または診断目的のために使用されてもよい。検出可能な成分／作用物質は、酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、ポジトロン放出物質、および非放射性常磁性金属イオンを含むが、これらに限定されない。検出および／または分析および／または診断目的のために、結合分子を標識するために使用されるタグは、とりわけ、（組織）サンプルの免疫組織化学的染色、フローサイトメトリー検出、レーザースキャニングサイトメトリー検出、蛍光イムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、バイオアッセイ（たとえば食作用アッセイ）、ウェスタンブロッティング適用などのような、使用される特定の検出／分析／診断技術および／または方法に依存する。当技術分野において知られている検出／分析／診断技術および／または方法に適した標識は、当業者の範囲内に十分にある。
【００７９】
さらに、本発明のヒト結合分子または免疫複合体はまた、Ｂ型肝炎ウイルスまたはその断片のインビトロイムノアッセイまたは精製のために特に有用である固体支持体に付加することができる。そのような固体支持体は、多孔性もしくは非多孔性、平面または非平面であってもよい。本発明の結合分子は、精製を容易にするために、ペプチドなどのようなマーカー配列に融合することができる。その代わりに、抗体は、第２の抗体にコンジュゲートし、抗体ヘテロコンジュゲートを形成することができる。他の態様において、本発明の結合分子が、１つ以上の抗原にコンジュゲート／付加されてもよい。好ましくは、これらの抗原は、結合分子−抗原コンジュゲートが投与される対象の免疫系によって認識される抗原である。抗原は、同一であってもよいが、また、互いに異なっていてもよい。抗原および結合分子を付加するためのコンジュゲーション方法は、当技術分野においてよく知られており、架橋剤の使用を含むが、これらに限定されない。本発明の結合分子は、Ｂ型肝炎ウイルスに結合するであろう、また、結合分子に付加された抗原は、コンジュゲートに対する強力なＴ細胞攻撃を開始し、これは、最終的に、Ｂ型肝炎ウイルスの破壊に至るであろう。
【００８０】
免疫複合体を化学的に産生することに次いで、直接または間接的に、たとえばリンカーを介してコンジュゲートすることによって、免疫複合体は、本発明の結合分子および適したタグを含む融合タンパク質として産生することができる。融合タンパク質は、たとえば、組み換えで、適したタグをコードするヌクレオチド配列とインフレームで、結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を構築し、次いで、核酸分子を発現させることによってなどのように、当技術分野において知られている方法によって産生することができる。
【００８１】
本発明による少なくとも１つの結合分子、機能的変異体、または免疫複合体をコードする核酸分子を提供することは、本発明の他の態様である。そのような核酸分子は、上記に記載されるように、クローニング目的のために、たとえば、親和性成熟のプロセスにおいて、中間体として使用することができる。好ましい実施形態において、核酸分子が、単離または精製される。
【００８２】
当業者は、これらの核酸分子の機能的変異体もまた本発明の一部となることが意図されることを十分に理解するであろう。機能的変異体は、標準的な遺伝子コードを使用して直接翻訳され、親核酸分子から翻訳されたものと同一のアミノ酸配列を提供することができる核酸配列である。
【００８３】
好ましくは、核酸分子は、上記に記載されるように、ＣＤＲ領域を含む結合分子をコードする。さらなる実施形態において、核酸分子が、本発明の結合分子の２、３、４、５、またはさらに６つすべてのＣＤＲ領域を含む結合分子をコードする。
【００８４】
他の実施形態において、核酸分子が、上記に記載されるように、可変重鎖配列を含む重鎖を含む結合分子をコードする。他の実施形態において、核酸分子が、上記に記載されるように、可変軽鎖配列を含む軽鎖を含む結合分子をコードする。本発明の結合分子の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、下記に示される。
【００８５】
ベクター、すなわち、本発明による１つ以上の核酸分子を含む核酸構築物を提供することは、本発明の他の態様である。ベクターは、とりわけＦ、Ｒ１、ＲＰ１、Ｃｏｌ、ｐＢＲ３２２、ＴＯＬ、Ｔｉなどのようなプラスミド；コスミド；ラムダ、ラムドイド、Ｍ１３、Ｍｕ、Ｐ１、Ｐ２２、Ｑβ、Ｔ−ｅｖｅｎ、Ｔ−ｏｄｄ、Ｔ２、Ｔ４、Ｔ７などのようなファージ；植物ウイルスに由来し得る。ベクターは、本発明の結合分子のクローニングのためにおよび／または発現のために使用することができ、遺伝子療法目的のためにさらに使用されてもよい。１つ以上の発現調節核酸分子に作動可能に連結された本発明による１つ以上の核酸分子を含むベクターもまた、本発明によってカバーされる。ベクターの選択は、従う組み換え手順および使用される宿主に依存性である。宿主細胞におけるベクターの導入は、とりわけリン酸カルシウムトランスフェクション、ウイルス感染、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性のトランスフェクション、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎトランスフェクション、またはエレクトロポレーションによって達成することができる。ベクターは、自己複製してもよく、またはそれらが統合された染色体と一緒に複製してもよい。好ましくは、ベクターは、１つ以上の選択マーカーを含有する。マーカーの選択は、当業者によく知られているように、これは本発明に重大ではないが、最適な宿主細胞に依存してもよい。それらは、カナマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシン、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）、マウス由来のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ｄｈｆｒ）を含むが、これらに限定されない。ヒト結合分子を単離するために使用することができるタンパク質またはペプチドをコードする１つ以上の核酸分子に作動可能に連結された、上記に記載されるヒト結合分子をコードする１つ以上の核酸分子を含むベクターもまた、本発明によってカバーされる。これらのタンパク質またはペプチドは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、金属結合ポリヒスチジン、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、およびベータ−ガラクトシダーゼを含むが、これらに限定されない。
【００８６】
上記に言及されるベクターの１つ以上のコピーを含有する宿主は、本発明のさらなる態様である。好ましくは、宿主は、宿主細胞である。宿主細胞は、哺乳類、植物、昆虫、真菌、または細菌起源の細胞を含むが、これらに限定されない。細菌細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのようなエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属のいくつかの種などのような、グラム陽性細菌またはグラム陰性菌由来の細胞を含むが、これらに限定されない。真菌細胞のグループにおいて、好ましくは、酵母細胞が、使用される。酵母における発現は、とりわけピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）などのような酵母株を使用することによって実現することができる。さらに、ショウジョウバエおよびＳｆ９由来の細胞などのような昆虫細胞を、宿主細胞として使用することができる。それに加えて、宿主細胞は、とりわけ森林植物などのような作物由来の細胞または穀物植物もしくは薬用植物などのような食品および原料物質を提供する植物由来の細胞または観賞植物由来の細胞または球根作物由来の細胞などのような植物細胞とすることができる。形質転換（トランスジェニック）植物または植物細胞は、知られている方法、たとえばアグロバクテリウム媒介性の遺伝子導入、葉片の形質転換、ポリエチレングリコール誘発性のＤＮＡ移入によるプロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、超音波処理、マイクロインジェクション、または微粒子銃遺伝子移入によって産生される。そのうえ、適した発現系は、バキュロウイルス系とすることができる。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、またはＢｏｗｅｓメラノーマ細胞などのような哺乳類細胞を使用する発現系は、本発明において好まれる。哺乳類細胞は、哺乳類起源の天然の分子に非常に類似する翻訳後修飾を有する発現タンパク質を提供する。本発明はヒトに投与しなければならない可能性がある分子を扱うので、完全ヒト発現系が、特に好まれると思われる。そのため、さらにより好ましくは、宿主細胞は、ヒト細胞である。ヒト細胞の例は、とりわけＨｅＬａ、９１１、ＡＴ１０８０、Ａ５４９、２９３、およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。好ましい実施形態において、ヒトプロデューサー細胞が、発現できる構成をしたアデノウイルスＥ１領域をコードする核酸配列の少なくとも１つの機能的部分を含む。さらにより好ましい実施形態において、前記宿主細胞が、９１１細胞または番号９６０２２９４０の下で欧州細胞カルチャーコレクション（ＥＣＡＣＣ）、ＣＡＭＲ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ  ＳＰ４  ＯＪＧ、Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎに委託され、商標ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）（ＰＥＲ．Ｃ６は、Ｃｒｕｃｅｌｌ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｂ．Ｖ．の登録商標である）の下で市販されている細胞株などのように、ヒト網膜に由来し、アデノウイルスＥ１配列を含む核酸により不死化される。本出願の目的のために、「ＰＥＲ．Ｃ６細胞」は、番号９��０２２９４０の下で委託された細胞または祖先、上流もしくは下流の継代および委託された細胞の祖先由来の子孫および前述のもののいずれかの誘導体を指す。宿主細胞における組み換えタンパク質の生成は、当技術分野においてよく知られている方法に従って実行することができる。関心のあるタンパク質についての産生プラットフォームとしての商標ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）の下で市販されている細胞の使用は、国際公開第００／６３４０３号パンフレットにおいて記載されており、この開示は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００８７】
本発明による結合分子を産生する方法は、本発明のさらなる態様である。方法は、ａ）結合分子の発現を促す条件下で本発明による宿主を培養するステップおよびｂ）任意選択で、発現された結合分子を回収するステップを含む。発現された結合分子は、無細胞抽出物から回収することができるが、好ましくは、それらは、培養培地から回収される。産生するための上記の方法はまた、本発明の結合分子および／または免疫複合体の機能的変異体を作製するために使用することもできる。無細胞抽出物または培養培地から、結合分子などのようなタンパク質を回収するための方法は、当業者によく知られている。上記の方法によって入手可能な結合分子、機能的変異体、および／または免疫複合体もまた、本発明の一部である。
【００８８】
その代わりに、宿主細胞などのような宿主における発現とは別に、本発明の結合分子および免疫複合体は、従来のペプチドシンセサイザーによって合成してまたは本発明によるＤＮＡ分子に由来するＲＮＡ核酸を使用する無細胞翻訳系において産生することができる。上記に記載される合成産生方法または無細胞翻訳系によって入手可能な結合分子および免疫複合体もまた、本発明の一部である。
【００８９】
他の実施形態において、本発明の結合分子がまた、とりわけウサギ、ヤギ、または雌ウシなどのようなトランスジェニック非ヒト哺乳動物において産生し、たとえばその乳の中に分泌することもできる。
【００９０】
他の代替の実施形態において、本発明による結合分子が、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するたとえばトランスジェニックマウスまたはウサギなどのようなトランスジェニック非ヒト哺乳類によって生成されてもよい。好ましくは、トランスジェニック非ヒト哺乳類は、上記に記載されるヒト結合分子のすべてまたは一部分をコードするヒト重鎖トランスジーンおよびヒト軽鎖トランスジーンを含むゲノムを有する。トランスジェニック非ヒト哺乳類は、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＢｓＡｇ、またはその断片の精製または濃縮調製物により免疫化することができる。非ヒト哺乳類を免疫化するためのプロトコールは、当技術分野において十分に確立されている。開示が、参照によって本明細書に組み込まれるＵｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ，Ｄ．Ｌａｎｅ（１９９８）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  ＹｏｒｋおよびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ（２００１）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。免疫化プロトコールは、多くの場合、フロインド完全アジュバントおよびフロインド不完全アジュバントなどのようなアジュバントを用いるまたは用いない複数の免疫化を含むが、また、裸のＤＮＡによる免疫化を含んでいてもよい。他の実施形態において、ヒト結合分子が、トランスジェニック動物に由来するＢ細胞、形質細胞、および／または記憶細胞によって産生される。さらに他の実施形態において、ヒト結合分子が、上記に記載されるトランスジェニック非ヒト哺乳類から得られたＢ細胞の不死化細胞への融合によって調製されるハイブリドーマによって産生される。上記に記載されるトランスジェニック非ヒト哺乳類から入手可能なＢ細胞、形質細胞、およびハイブリドーマならびに上記に記載されるトランスジェニック非ヒト哺乳類、Ｂ細胞、形質細胞、および／または記憶細胞ならびにハイブリドーマから入手可能なヒト結合分子もまた、本発明の一部である。
【００９１】
さらなる態様において、本発明は、本発明による少なくとも１つの結合分子、好ましくはヒトモノクローナル抗体、少なくとも１つのその機能的変異体、本発明による少なくとも１つの免疫複合体、および／またはその組み合わせを含む組成物を提供する。それに加えて、組成物は、とりわけ、アルブミンもしくはポリエチレングリコールなどのような安定化分子または塩を含んでいてもよい。好ましくは、使用される塩は、結合分子の所望の生物学的活性を保持し、いかなる望まれない毒性の影響をも与えない塩である。必要である場合、本発明のヒト結合分子は、結合分子を不活性化し得る酸または他の天然もしくは非天然の条件の作用からそれらを保護するために、ある物質中でまたはある物質上でコーティングされてもよい。
【００９２】
さらなる態様において、本発明は、本発明において定義される少なくとも１つの核酸分子を含む組成物を提供する。組成物は、塩（たとえばＮａＣｌもしくは上記に記載される塩）、洗浄剤（たとえばＳＤＳ）、および／または他の適した構成成分を含有する水溶液などのような水溶液を含んでいてもよい。
【００９３】
さらに、本発明は、本発明のヒトモノクローナル抗体などのような少なくとも１つの結合分子（またはその機能的断片もしくは変異体）、本発明による少なくとも１つの免疫複合体、本発明による少なくとも１つの組成物、またはその組み合わせを含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容できる賦形剤をさらに含む。薬学的に許容できる賦形剤は、当業者によく知られている。本発明による医薬組成物は、少なくとも１つの他の治療剤をさらに含んでいてもよい。適した作用物質もまた、当業者によく知られている。
【００９４】
単一のエピトープに対して向けられるモノクローナル抗体産物は、時に、ポリクローナル抗体と比較して、ウイルスの変異に対してより弱くなり得る。これは、エスケープ突然変異体の発生の危険性を増加させる可能性がある。別個のエピトープを認識する２つのモノクローナル抗体の組み合わせは、この欠点を回避し得る。
【００９５】
そのため、ある実施形態において、本発明による医薬組成物は、少なくとも１つのさらなる結合分子を含む、すなわち、医薬組成物は、結合分子のカクテルまたは混合物とすることができる。医薬組成物は、本発明による少なくとも２つの結合分子または本発明による少なくとも１つの結合分子ならびにＨＢｓＡｇタンパク質上のもう１つのエピトープに対してもしくはＢ型肝炎ウイルス上に存在する他の抗原構造に対して向けられる他の抗体などのような少なくとも１つのさらなるＢ型肝炎ウイルス結合および／もしくは中和分子ならびに／または１つ以上の他の病原体を中和する結合分子を含んでいてもよい。他の実施形態において、さらなる結合分子が、同時の別々のまたは連続的な投与のために製剤されてもよい。
【００９６】
ある実施形態において、結合分子が、組み合わせて使用される場合、相乗的な中和活性を示す。本明細書において使用されるように、用語「相乗的な」は、組み合わせて使用される場合の結合分子の効果の組み合わせが、個々に使用された場合のそれらの相加的効果よりも大きいことを意味する。相乗的に作用する結合分子は、Ｂ型肝炎ウイルスの同じまたは別個の断片上の異なる構造に結合してもよい。相乗効果を計算する方法は、コンビネーションインデックス（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）によるものである。コンビネーションインデックス（ＣＩ）の概念は、Ｃｈｏｕ  ａｎｄ  Ｔａｌａｌａｙ（１９８４）によって記載されている。組成物は、たとえば、中和活性を有する１つの結合分子および１つの非中和結合分子を含んでいてもよい。非中和および中和結合分子はまた、Ｂ型肝炎ウイルスを中和する際に相乗的に作用してもよい。
【００９７】
ある実施形態において、医薬組成物が、本発明による少なくとも１つの結合分子ならびに少なくとも１つのさらなる結合分子、好ましくはさらなるＢ型肝炎ウイルス中和結合分子を含んでいてもよい。医薬組成物における結合分子は、好ましくは、異なるサブタイプのＢ型肝炎ウイルスと反応することができる。結合分子は、高い結合効力および広範な特異性を有していてもよい。好ましくは、両方の結合分子は、それらが、それぞれ、異なるサブタイプのＢ型肝炎ウイルスを中和するという点で、交差中和分子である。そのうえ、好ましくは、それらは、それぞれの異なるＢ型肝炎ウイルスサブタイプの可能な限り多くの株を中和する。
【００９８】
ある実施形態において、医薬組成物が、少なくとも１つの他の予防剤および／または治療剤を含む。好ましくは、前記さらなる治療剤および／または予防剤は、Ｂ型肝炎ウイルス感染症および／またはそのような感染症から結果として生じる状態を予防および／または処置することができる作用物質である。治療剤および／または予防剤は、抗ウイルス剤を含むが、これらに限定されない。そのような作用物質は、結合分子、小分子、有機または無機化合物、酵素、ポリヌクレオチド配列、抗ウイルスペプチドなどとすることができる。これらは、本発明の結合分子と組み合わせて使用することができる。本明細書における「組み合わせて」は、同時に、別々の製剤としてもしくは１つの単一の組み合わせられた製剤としてまたは別々の製剤として連続的な投与レジメンに従って、任意の順序で、を意味する。実験の段階にある、Ｂ型肝炎ウイルスによる感染症および／またはそのような感染症から結果として生じる状態を予防および／または処置することができる作用物質もまた、本発明において有用な他の治療剤および／または予防剤として使用される可能性がある。
【００９９】
本発明の結合分子または医薬組成物は、ヒトにおける使用前に、適した動物モデル系において試験することができる。そのような動物モデル系は、マウス、フェレット、およびサルを含むが、これらに限定されない。
【０１００】
典型的に、医薬組成物は、製造および保存の条件下で滅菌され、安定していなければならない。本発明の結合分子、免疫複合体、または組成物は、送達の前にまたはその時に適切な薬学的に許容できる賦形剤において還元するための粉末形態をしていてもよい。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、調製の好ましい方法は、そのあらかじめ滅菌ろ過された溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を産出する真空乾燥および凍結乾燥（冷凍乾燥）である。
【０１０１】
その代わりに、本発明の結合分子、免疫複合体、または組成物は、溶液とすることができ、適切な薬学的に許容できる賦形剤は、単位投薬量の注射用形態を提供するために送達の前にまたはその時に追加および／または混合することができる。好ましくは、本発明において使用される薬学的に許容できる賦形剤は、高薬剤濃度に適しており、適切な流動性を維持することができ、必要である場合、吸収を遅延させることができる。
【０１０２】
医薬組成物の最適な投与ルートの選択は、組成物内の活性分子の物理化学的特性、臨床状況の緊急性、および所望の治療効果と活性分子の血漿濃度の関係を含むいくつかの因子によって影響を及ぼされるであろう。たとえば、必要である場合、本発明の結合分子は、移植片、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化された送達系を含む放出制御製剤などのように、急速な放出からそれらを保護するであろうキャリヤと共に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などのような、生分解性で生体適合性のポリマーは、とりわけ使用することができる。さらに、ヒト結合分子の不活性化を予防する物質または化合物により結合分子をコーティングすることまたはそれと結合分子を同時投与することが必要であってもよい。たとえば、結合分子は、適切なキャリヤ、たとえばリポソームまたは希釈剤中で対象に投与されてもよい。
【０１０３】
投与ルートは、２つの主なカテゴリー、経口および非経口投与に分けることができる。好ましい投与ルートは、静脈内または吸入によるなどのような非経口投与である。
【０１０４】
本発明の医薬組成物は、非経口投与のために製剤することができる。非経口投与のための製剤は、とりわけ、水性または非水等張滅菌無毒性注射溶液または注入溶液または懸濁液の形態をとることができる。溶液または懸濁液は、１，３−ブタンジオール、リンガー溶液、ハンクス溶液、等張食塩水、油、脂肪酸、局所的麻酔薬、保存剤、バッファー、粘性または溶解性を増加させる作用物質、水溶性酸化防止剤、油溶性酸化防止剤、および金属キレート剤などのような、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに無毒性の作用物質を含んでいてもよい。
【０１０５】
さらなる態様において、本発明のヒトモノクローナル抗体（その機能的断片および変異体）などのような結合分子、免疫複合体、組成物、または医薬組成物は、医薬または診断薬として使用することができる。そのため、本発明の結合分子、免疫複合体、組成物、または医薬組成物を使用するＢ型肝炎ウイルス感染症の診断、処置、および／または予防の方法は、本発明の他の態様である。前述の分子は、とりわけ、Ｂ型肝炎ウイルスによって引き起こされた感染症の診断、予防法、処置、またはその組み合わせにおいて使用される。それらは、Ｂ型肝炎ウイルス感染症に罹患しているまだ未処置の患者およびＢ型肝炎ウイルス感染症について処置されたまたは処置されている患者の処置に適している。特定の実施形態において、それらは、移植の後に新しい肝臓のＢ型肝炎ウイルスによる再感染を予防するのに適している。
【０１０６】
前述の分子または組成物は、診断、予防法、および／または処置に有用な他の分子と共に用いられてもよい。それらは、インビトロ、エクスビボ、またはインビボにおいて使用することができる。たとえば、本発明のヒトモノクローナル抗体（もしくはその機能的変異体）などのような結合分子、免疫複合体、組成物、または医薬組成物は、Ｂ型肝炎ウイルスに対するワクチン（入手可能である場合）と同時投与することができる。その代わりに、ワクチンはまた、本発明の分子の投与の前にまたはその後に投与されてもよい。ワクチンの代わりに、抗ウイルス剤もまた、本発明の結合分子と共に用いることもできる。適した抗ウイルス剤は、上記に言及される。
【０１０７】
分子は、典型的に、治療または診断有効量で、本発明の組成物および医薬組成物において製剤される。その代わりに、それらは、製剤され、別々に投与されてもよい。たとえば、抗ウイルス剤などのような他の分子は、全身的に適用されてもよいが、本発明の結合分子は、静脈内に適用されてもよい。
【０１０８】
処置は、Ｂ型肝炎ウイルスに対して曝露される患者グループを標的にしてもよい。そのような患者グループは、たとえば、ＨＢＶのために肝移植を受けている患者、ＨＢｓＡｇ陽性の母親から生まれた乳児、ＨＢｓＡｇを含有する血液に曝露された医療労働者、ＨＢｓＡｇ陽性の個人に対する性的なおよび／または家庭での接触のためにＨＢＶに曝露した人、ならびに抗ウイルス化合物により処置されたが、不適当な抗ウイルス応答を示した慢性的に感染した患者を含むが、これらに限定されない。
【０１０９】
投薬量レジメンは、最適な所望の応答（たとえば治療応答）を提供するように調節することができる。適した投薬量範囲は、たとえば、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０１〜１５ｍｇ／ｋｇ体重であってもよい。さらに、たとえば、単一のボーラスが、投与されてもよく、いくつかの分けられた用量が、ある期間にわたって投与されてもよく、または治療上の状況の要件によって示されるように、用量は、比例して、低下させてもよく、または増加させてもよい。本発明による分子および組成物は、好ましくは、滅菌されている。これらの分子および組成物を滅菌にするための方法は、当技術分野においてよく知られている。診断、予防法、および／または処置に有用な他の分子は、本発明の結合分子について提唱される同様の投薬量レジメンで投与することができる。他の分子が別々に投与される場合、それらは、本発明の１つ以上のヒト結合分子または医薬組成物の投与の前に（たとえば、２分、５分、１０分、１５分、３０分、４５分、６０分、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、７日、２週間、４週間、もしくは６週間前）、それと同時に、またはそれに続いて（たとえば、２分、５分、１０分、１５分、３０分、４５分、６０分、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、７日、２週間、４週間、もしくは６週間後）、患者に投与されてもよい。厳密な投薬レジメンは、通常、ヒト患者における臨床試験の間に解決される。
【０１１０】
ヒト結合分子およびヒト結合分子を含む医薬組成物は、インビボ治療剤として人に投与されることになっている場合、投与された抗体に対するレシピエントの免疫応答が、多くの場合、実質的に、モノクローナルマウス、キメラ、またはヒト化結合分子の投与によって引き起こされるもの未満であると思われるので、特に有用であり、多くの場合、好まれる。
【０１１１】
他の態様において、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス感染症の診断、予防法、処置、またはその組み合わせのための医薬の調製における、本発明による中和ヒトモノクローナル抗体（その機能的断片および変異体）などのような結合分子、免疫複合体、核酸分子、組成物、または医薬組成物の使用に関する。
【０１１２】
それに次いで、本発明による中和ヒトモノクローナル抗体（その機能的断片および変異体）などのような少なくとも１つの結合分子、少なくとも１つの免疫複合体、少なくとも１つの核酸分子、少なくとも１つの組成物、少なくとも１つの医薬組成物、少なくとも１つのベクター、少なくとも１つの宿主、またはその組み合わせを含むキットもまた、本発明の一態様である。任意選択で、本発明のキットの上記に記載される構成成分は、適した容器中に充填され、また、示される状態の診断、予防法、および／または処置について標識される。前述の構成成分は、水性、好ましくは滅菌溶液としてまたは還元用の凍結乾燥された、好ましくは滅菌製剤として単位または多用量容器中に保存されてもよい。容器は、ガラスまたはプラスチックなどのような様々な物質から形成されてもよく、滅菌出入り口を有していてもよい（たとえば、容器は、皮下注射針によって貫通可能な栓を有する静脈注射溶液バッグまたはバイアルであってもよい）。キットは、薬学的に許容できるバッファーを含む、より多くの容器をさらに含んでいてもよい。それは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、注射器、１つ以上の適した宿主のための培養培地、および場合により、さらに少なくとも１つの他の治療剤、予防剤、または診断薬を含む、営利的なおよび使用者の見地から望ましい他の物質をさらに含んでいてもよい。たとえば、そのような治療、予防、または診断製品の使用に関する徴候、使用法、投薬量、製造、投与、禁忌、および／または警告についての情報を含有する、治療、予防、または診断製品の市販パッケージに通常含まれる説明書が、キットに付随してもよい。
【０１１３】
本発明による結合分子はまた、Ｂ型肝炎ウイルスの検出のためのインビトロ方法において診断薬として好都合に使用することができる。本発明は、したがって、サンプル中のＢ型肝炎サブタイプウイルスを検出する方法にさらに関し、方法は、
（ａ）本発明による結合分子および／または本発明による免疫複合体を使用して、生物学的サンプル中のＢ型肝炎ウイルス抗原のレベルをアッセイするステップならびに
（ｂ）Ｂ型肝炎ウイルス抗原のアッセイレベルを対照レベルと比較するステップであって、Ｂ型肝炎ウイルス抗原の対照レベルと比較したＢ型肝炎ウイルス抗原のアッセイレベルの増加が、Ｂ型肝炎ウイルス感染症を示すステップを含む方法に関する。
【０１１４】
生物学的サンプルは、血液、血清、排便、痰、鼻咽頭吸引液、気管支洗浄液、尿、組織、もしくは感染した（可能性のある）対象由来の他の生体物質を含むが、これらに限定されない生物学的サンプルまたは水、飲料などのような非生物学的サンプルなどであってもよい。感染した（可能性のある）対象は、本発明のヒト結合分子または免疫複合体を使用してウイルスの存在について試験される可能性がる、Ｂ型肝炎ウイルスのキャリヤとして疑われるヒト対象であってもよいが、また、動物であってもよい。サンプルは、それを検出の方法にとってより適したものにするために最初に操作されてもよい。操作は、とりわけ、ウイルスが、タンパク質、（ポリ）ペプチド、または他の抗原断片などのような抗原構成成分に分解されるような方法で、ウイルスを含有することが疑われるおよび／または含有しているサンプルを処置することを意味する。好ましくは、本発明のヒト結合分子または免疫複合体を、ヒト結合分子およびサンプル中に存在し得るウイルスまたはその抗原構成成分の間で免疫学的複合体の形成を可能にする条件下で、サンプルと接触させる。免疫学的複合体の形成は、もしあれば、サンプル中のウイルスの存在を示すが、次いで、適した手段によって検出され、測定される。そのような方法は、とりわけ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光検査法、免疫組織化学的検査、ＦＡＣＳ、ＳＰＲ、ＢＬＩ、およびウェスタンブロット分析などのような均一および不均一結合イムノアッセイを含む。
【０１１５】
とりわけ患者血清および血液および血液由来産物の大規模臨床スクリーニングのための好まれるアッセイ技術は、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット技術である。ＥＬＩＳＡ試験は、特に好まれる。これらのアッセイにおける試薬として使用するために、本発明の結合分子または免疫複合体は、マイクロタイターウェルの内部表面に好都合に結合される。本発明の結合分子または免疫複合体は、マイクロタイターウェルに直接結合されてもよい。しかしながら、ウェルへの本発明の結合分子または免疫複合体の最大の結合は、本発明の結合分子または免疫複合体の追加前にポリリシンによりウェルをあらかじめ処置することによって、達成されてもよい。さらに、本発明の結合分子または免疫複合体は、知られている手段によってウェルに共有結合で付加されてもよい。一般に、結合分子または免疫複合体は、コーティングのために０．０１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で使用されるが、より高いおよびより低い量もまた、使用されてもよい。次いで、サンプルは、本発明の結合分子または免疫複合体によりコーティングされたウェルに追加される。
【０１１６】
本発明は、対象におけるＢ型肝炎ウイルス感染症を処置または予防する方法であって、治療または予防有効量の本発明の結合分子、免疫複合体、および／または医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法をさらに提供する。ある実施形態において、対象が、哺乳類、好ましくはヒトである。
【０１１７】
さらに、本発明の結合分子は、Ｂ型肝炎ウイルスの特異的な結合構造を同定するために使用することができる。結合構造は、タンパク質および／またはポリペプチド上のエピトープとすることができる。それらは、直鎖とすることができるが、また構造的および／または立体構造的とすることもできる。一実施形態において、結合構造が、ＰＥＰＳＣＡＮ分析によって分析することができる（とりわけ国際公開第８４／０３５６４号パンフレットおよび国際公開第９３／０９８７２号パンフレット、Ｓｌｏｏｔｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６を参照されたい）。その代わりに、Ｂ型肝炎ウイルスのタンパク質由来のペプチドを含むランダムペプチドライブラリーは、本発明の結合分子に結合することができるペプチドについてスクリーニングすることができる。
【０１１８】
本発明は、以下の実施例および図においてさらに例証される。実施例は、本発明の範囲を限定するようには決して意図されない。
【実施例】
【０１１９】
実施例１
ＣＲ８０９７抗体の安定したコンホメーション
いくつかの抗体のパネルを、異なる血清型／遺伝子型のＨＢＶに結合し、かつ中和するそれらの能力について試験した。１つの抗体が、驚いたことに、パネルの他のものより優れていた。しかしながら、この抗体は、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ（サイズ排除クロマトグラフィー−マトリックス支援光散乱）分析によって実証される不均一なコンホメーションを示した。図１は、前記抗体が、類似する分子量（太い線）を有する２つの単量体種に相当する２つの別々のピークでｇ３０００ＳＷＸＬカラムから溶出することを示す。この問題に対処するために、抗体を突然変異させた。図１において実証されるように、これは、ＭＡＬＳによって直接測定されるように、ＩｇＧ１について期待されるＭＷを有する単一の均一のピーク（細い線）でＳＥＣカラムから溶出した安定した単量体抗体調製物の産生をもたらした。
【０１２０】
したがって、本発明によるＨＢＶに対する結合分子（ＣＲ８０９７）は、効率的に製造されることが証明され、これは、それを大規模の工業生産にとって適切にする。
【０１２１】
実施例２
ＦＡＣＳによって測定されるＣＲ８０９７の結合の幅
ＦＡＣＳ染色は、どれくらいの血清型のＨＢＶがｍＡｂ  ＣＲ８０９７によって認識されるかを評価するために、特異的なＨＢｓＡｇ血清型を発現する構築物によりそれぞれトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞に対して実行した。この研究において使用されるＨＢｓＡｇ配列は、６０００以上のＨＢＶ配列を含有する大きな日本のＮＩＧ  ＨＢＶデータベースから選択した（リンクについては、ｈｔｔｐ：／／ｓ２ａｓ０２．ｇｅｎｅｓ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／を参照されたい）。株の選択は、残基１００〜２０７にわたるＨＢｓＡｇの細胞外ループ配列に基づく、データベースにおけるすべてのＨＢｓＡｇ配列の血清型の分類およびそれぞれの血清型（現在、１１の血清型が定められている）について最も主要な株の続く推定によって実行した。次に、それぞれの血清型について、最も主要な株に最も近い株を選択した（表１を参照されたい）。このように、最も代表的なＨＢＶ血清型を選択することができた。そのうえ、それぞれの選択された血清型の遺伝子型を決定し（可能な場合）、２つの主な血清型（ａｙｗ１およびａｄｗ２）について、可能な限り多くの遺伝子型を含めるためにさらなる遺伝子型を選択した（表１を参照されたい）。合計１５の異なるＨＢｓＡｇにおいて、配列を選択し、合成し、発現ベクターの中にクローニングした。
【０１２２】
細胞内ＦＡＣＳ染色は、細胞の固定（ＰＢＳ中３％パラホルムアルデヒドとのＲＴでの１５分間のインキュベーション）、細胞の透過処理（ＰＢＳ中０．１％トリトンおよび１％ＢＳＡとのＲＴでの３０分間のインキュベーション）、その後に続く、遮断バッファー（０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０および１％ＢＳＡを有するＰＢＳ）中での４μｇ／ｍｌのＣＲ８０９７または無関係のＩｇＧとのＲＴでの１時間の細胞のインキュベーションによって、トランスフェクションの４８時間後に実行した。ＣＲ８０９７または無関係のＩｇＧの検出は、ＲＴで、１時間、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ  ６４７標識ヤギ抗ヒト抗体（遮断バッファー中で１０００×希釈）と共にインキュベートすることによって実行した。ＦＡＣＳ分析は、陰性対照として二次抗体のみと共にインキュベートしたトランスフェクト細胞を使用して、ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＣａｎｔｏ  ＩＩで実行した。
【０１２３】
【表１】
2016504015.tif 000002
【０１２４】
図２における結合データは、先行技術において、たとえば、ＨＢｓＡｇサブタイプａｄｗ２（遺伝子型Ｃ）を認識しなかった（Ｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３２，５８８）、ＰＣＴイスラエル国特許出願第９７／００１８３号明細書およびＰＣＴイスラエル国特許出願第９７／００１８４号明細書において開示される結合分子とは対照的に、ＣＲ８０９７がすべての主なサブタイプのＨＢＶを認識することを示す。
【０１２５】
実施例３
ＨＢｓＡｇエスケープ突然変異体へのＣＲ８０９７の結合
いくつかの選択肢が、ＨＢＶ感染症の処置または予防のために利用可能であり、これには、数ある中でも、組み換えＨＢｓＡｇを使用するワクチン接種、ＨＢＩｇによる免疫療法、またはポリメラーゼインヒビターによる処置がある。それぞれのこれらの処置は、ＨＢｓＡｇタンパク質における突然変異を誘発し得、ＨＢＶエスケープメカニズムにとって本質的なものであり、またはこれらの突然変異は、重複するポリメラーゼ遺伝子における突然変異の結果として導入される（概説については、Ｓｈｅｌｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ＪＡＣ（２００８）ｐ７６６−７６８を参照されたい）。そのようなエスケープ突然変異体がＣＲ８０９７の結合に影響を与えるかどうかを評価するために、ＨＢｓＡｇ突然変異体のパネルを、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞において組み換えで発現させ、その後、細胞内ＦＡＣＳ分析を続けた。この分析のために、最もよく観察されるＨＢｓＡｇエスケープ突然変異（表２を参照されたい）を選択し、ａｙｗおよびａｄｒのＨＢｓＡｇの２つの異なる野生型配列に導入した。野生型配列を図３に示す。細胞内ＦＡＣＳ染色は、細胞の固定（ＰＢＳ中３％パラホルムアルデヒドとのＲＴでの１５分間のインキュベーション）、細胞の透過処理（ＰＢＳ中０．１％トリトンおよび１％ＢＳＡとのＲＴでの３０分間のインキュベーション）、その後に続く、遮断バッファー（０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０および１％ＢＳＡを有するＰＢＳ）中での４μｇ／ｍｌのＣＲ８０９７または無関係のＩｇＧとのＲＴでの１時間の細胞のインキュベーションによって、トランスフェクションの４８時間後に実行した。ＣＲ８０９７または無関係のＩｇＧの検出は、ＲＴで、１時間、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ  ６４７標識ヤギ抗ヒト抗体（遮断バッファー中で１０００×希釈）と共にインキュベートすることによって実行した。ＦＡＣＳ分析は、陰性対照として二次抗体のみと共にインキュベートしたトランスフェクト細胞を使用して、ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＣａｎｔｏ  ＩＩで実行した（図４）。
【０１２６】
データは、生成されたすべてのＨＢｓＡｇ突然変異体がＣＲ８０９７によって認識されたことを示す（図４）。
【０１２７】
【表２】
2016504015.tif 000003
【０１２８】
実施例４
インビトロ中和アッセイによって測定されるＨＢＶ特異的ＩｇＧの中和効力
抗ＨＢＶモノクローナル抗体のインビトロ中和効力は、ヒト肝臓を移植し、続いて、血清型ａｄｒ（遺伝子型Ｃ）のＢ型肝炎ウイルスおよび血清型ａｙｗ３（遺伝子型Ｄ）のＢ型肝炎ウイルスに感染させたマウス由来の血清を使用して、インビトロ中和アッセイにおいて評価した。このアッセイにおいて、抗体希釈液を、一定量のＨＢＶ含有血清と共に最初にインキュベートし、その後、ウイルスを、分化したＨｅｐａＲＧ細胞（ＨＢＶ感染症に対して感受性のヒト肝癌細胞株）に感染させ、これらを２４ウェルプレートにおいて培養した。感染の１１日後に、感染力を、市販のＥＬＩＳＡを使用して、ＨＢｓＡｇ発現レベルを測定することによって検出した。測定したＯＤ値を４パラメーターフィットを使用してフィットさせ、これからＩＣ５０値を計算した（ＩＣ５０値は、５０％の中和が観察される濃度を示すことに注意されたい）。
【０１２９】
これらのデータ（図５および図６を参照されたい）から、ＣＲ８０９７の効力が、試験したＨＢＩｇ群よりも少なくとも１００倍高いことが明らかである。
【０１３０】
実施例５
抗ＨＢＶ特異的ＩｇＧのインビボ効能をＰＸＢマウス（登録商標）を使用して評価した。これらのマウスは、アルブミンエンハンサー／プロモーター駆動ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベータートランスジェニック／重症複合型免疫不全疾患（ｕＰＡ／ＳＣＩＤ）レシピエントマウスにヒト肝臓細胞を移植し、その後に続くＢ型肝炎ウイルス（遺伝子型Ｃ、血清型ａｄｒ）による感染によって生成した。ＨＢＶ接種の１日前に、それぞれのグループのマウスにＩｇＧを静脈内に投薬した。０日目に、マウスに、１×１０５コピーのＨＢＶを静脈内に接種した。対照マウスは、ＨＢＶのみを接種したが、ＩｇＧを受けなかった。ＮａｂｉのＮａｂｉ−ＨＢは、このＨＢＩｇがＨＢＶ（遺伝子型Ｃ、血清型ａｄｒ）に対して最も高いインビトロ中和効力を示すので、ＨＢＩｇの供給源として使用した。
【０１３１】
ＨＢＶ感染症は、マウス血清におけるＨＢＶ力価を測定することによって毎週モニターした（Ｑ−ＰＣＲによるＨＢＶゲノム当量／ｍｌ）。ＩｇＧ用量の保護効果は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｊｅｒ曲線から計算した時間対感染として表現した。グループの５０％におけるＨＢＶ力価が４０００ＨＢＶコピー／ｍｌである検出限界よりも高かった場合、マウスはもはや保護されなかった。対照グループにおいて、保護は、２週間しか得られなかった。最高用量のＣＲ８０９７（０．２および０．０２ｍｇ／ｋｇ）を与えた場合、保護は１０週間よりも長い間得られた。０．２ｍｇ／ｋｇ  ＨＢＩｇの保護は、０．００２ｍｇ／ｋｇ  ＣＲ８０９７の保護と同等であり、３週間であり（図７を参照されたい）、これは、ＣＲ８０９７の予防効果がＨＢＩｇよりも約１００倍高いことを示す。
【０１３２】
配列
＞ＣＲ８０９７  ＶＨ  ＣＤＲ１（配列番号１）
【化１】
2016504015.tif 000004
＞ＣＲ８０９７  ＶＨ  ＣＤＲ２（配列番号２）
【化２】
2016504015.tif 000005
＞ＣＲ８０９７  ＶＨ  ＣＤＲ３（配列番号３）
【化３】
2016504015.tif 000006
＞ＣＲ８０９７  ＶＬ  ＣＤＲ１（配列番号４）
【化４】
2016504015.tif 000007
＞ＣＲ８０９７  ＶＬ  ＣＤＲ２（配列番号５）
【化５】
2016504015.tif 000008
＞（配列番号６）
【化６】
2016504015.tif 000009
＞ＣＲ８０９７  ＶＨ（配列番号７）
【化７】
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＞ＣＲ８０９７  ＶＬ（配列番号８）
【化８】
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＞ＣＲ８０９７  ＨＣ（配列番号９）
【化９】
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＞ＣＲ８０９７  ＬＣ（配列番号１０）
【化１０】
2016504015.tif 000013
【図５】
2016504015.tif 000014
【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【配列表】
2016504015000001.app
【国際調査報告】
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2016504015.tif 000022
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