(57)【要約】本発明は、インターロイキン−１０分子（例えば、ペグ化インターロイキン−１０）を含む組成物（例えば、医薬組成物）を本明細書に記載される疾患、障害および病態、ならびに／あるいはその症状の治療ならびに／あるいは予防のために対象に投与する前に、それが特定の製品に関する仕様に適合するかどうかを決定するのに用い得る方法およびその他の技術に関する。【選択図】図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペグ化インターロイキン−１０の整合性を確認する方法であって、
ａ）試験用のＰＥＧ−ＩＬ−１０を断片化して試験用の複数のペプチドを得ることと、
ｂ）前記試験用の複数のペプチドを参照標準品と比較することと
を含み、
前記ペグ化インターロイキン−１０の整合性が前記試験用の複数のペプチドと前記参照標準品との同等性を明らかにすることによって確認される、
方法。
【請求項２】
前記ペグ化インターロイキン−１０の整合性がそのアミノ酸配列を指す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記参照標準品が参照ＰＥＧ−ＩＬ−１０または参照ＩＬ−１０を断片化することから生成される複数の参照ペプチドを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記試験用のＰＥＧ−ＩＬ−１０が前記参照ＰＥＧ−ＩＬ−１０と同じである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記試験用のＰＥＧ−ＩＬ−１０がＰＥＧ−ｈＩＬ−１０である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記断片化することが前記試験用のＰＥＧ−ＩＬ−１０をタンパク質分解試薬と接触させることによって実施される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質分解試薬がペプチダーゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチダーゼがトリプシンまたはグルタミルエンドペプチダーゼ（Ｅｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃ）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記試験用のＰＥＧ−ＩＬ−１０のＥｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃによる断片化が前記試験用のＰＥＧ−ＩＬ−１０のトリプシンによる断片化よりもより分離されたペプチド断片をもたらす、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記試験用の複数のペプチドのペプチドメンバーがクロマトグラフィーによって分離される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記試験用の複数のペプチドのペプチドメンバーが電気泳動によって分離される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記試験用の複数のペプチドの各メンバーの絶対質量を質量分析により決定することをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記質量分析がＥＳＩ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、ＭＡＬＤＩ  ＭＳおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記参照用の複数のペプチドの各メンバーの絶対質量が質量分析により決定されている、請求項３または４に記載の方法。
【請求項１５】
前記参照用の複数のペプチドの各メンバーの絶対質量がデータベースに保管される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
段階ｂ）がコンピュータを用いて実施される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記試験用のＰＥＧ−ＩＬ−１０がＩＬ−１０の少なくとも１つのサブユニットの少なくとも１つのアミノ酸残基に共有結合したＰＥＧ分子を少なくとも１つ含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記試験用のＰＥＧ−ＩＬ−１０がモノ−ペグ化ＩＬ−１０とジ−ペグ化ＩＬ−１０の混合物を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記試験用のＰＥＧ−ＩＬ−１０のＰＥＧ成分が約５ｋＤａ〜約２０ｋＤａの分子質量を有する、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記試験用のＰＥＧ−ＩＬ−１０のＰＥＧ成分が約２０ｋＤａ超の分子質量を有する、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記試験用のＰＥＧ−ＩＬ−１０のＰＥＧ成分が少なくとも約３０ｋＤの分子質量を有する、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記参照ＰＥＧ−ＩＬ−１０の断片化から生成される前記参照ペプチドが前記参照ＩＬ−１０の断片化から生成される前記参照ペプチドとほぼ同等である、請求項３に記載の方法。
【請求項２３】
前記参照ＰＥＧ−ＩＬ−１０の断片化から生成される前記参照ペプチドがＥＳＩ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、ＭＡＬＤＩ  ＭＳまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳに基づいて前記参照ＩＬ−１０の断片化から生成される前記参照ペプチドとほぼ同等である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ペグ化ヒトインターロイキン−１０のアミノ酸配列を確認する方法であって、
ａ）試験用のｈＰＥＧ−ＩＬ−１０をＥｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃで消化して試験用の複数のペプチドを得ることと、
ｂ）前記試験用の複数のペプチドを参照標準品と比較することと
を含み、
前記ペグ化ヒトインターロイキン−１０のアミノ酸配列が前記試験用の複数のペプチドと前記参照標準品との同等性を明らかにすることによって確認される、
方法。
【請求項２５】
前記参照標準品が参照ｈＰＥＧ−ＩＬ−１０または参照ｈＩＬ−１０を消化することから生成される複数の参照ペプチドを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記試験用のＰＥＧ−ｈＩＬ−１０が前記参照ＰＥＧ−ｈＩＬ−１０と同じである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記試験用のＰＥＧ−ｈＩＬ−１０のＥｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃによる消化が前記試験用のＰＥＧ−ｈＩＬ−１０のトリプシンによる消化よりもより分離されたペプチド断片をもたらす、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記試験用の複数のペプチドのペプチドメンバーがクロマトグラフィーによって分離される、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記試験用の複数のペプチドのペプチドメンバーが電気泳動によって分離される、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記試験用の複数のペプチドの各メンバーの絶対質量を質量分析により決定することをさらに含む、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記質量分析がＥＳＩ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、ＭＡＬＤＩ  ＭＳおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳからなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記参照用の複数のペプチドの各メンバーの絶対質量が質量分析により決定されている、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記参照用の複数のペプチドの各メンバーの絶対質量がデータベースに保管される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
段階ｂ）がコンピュータを用いて実施される、請求項２４〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記試験用のＰＥＧ−ｈＩＬ−１０がｈＩＬ−１０の少なくとも１つのサブユニットの少なくとも１つのアミノ酸残基に共有結合したＰＥＧ分子を少なくとも１つ含む、請求項２４〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記試験用のＰＥＧ−ｈＩＬ−１０がモノ−ペグ化ＩＬ−１０とジ−ペグ化ＩＬ−１０の混合物を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記試験用のＰＥＧ−ｈＩＬ−１０のＰＥＧ成分が約５ｋＤａ〜約２０ｋＤａの分子質量を有する、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記試験用のＰＥＧ−ｈＩＬ−１０のＰＥＧ成分が約２０ｋＤａ超の分子質量を有する、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記試験用のＰＥＧ−ｈＩＬ−１０のＰＥＧ成分が少なくとも約３０ｋＤの分子質量を有する、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記参照ＰＥＧ−ｈＩＬ−１０の消化から生成される前記参照ペプチドが前記参照ｈＩＬ−１０の消化から生成される前記参照ペプチドとほぼ同等である、請求項２５に記載の方法。
【請求項４１】
前記参照ＰＥＧ−ｈＩＬ−１０の消化から生成される前記参照ペプチドがＥＳＩ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、ＭＡＬＤＩ  ＭＳまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳに基づいて前記参照ＩＬ−ｈ１０の消化から生成される前記参照ペプチドとほぼ同等である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ペグ化ヒトインターロイキン−１０のＥｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃ消化によって生成される複数のペプチドの同一性を確認する方法であって、前記複数のペプチドをＰＥＧ−ｈＩＬ−１０参照標準品と比較することを含み、前記複数のペプチドの同一性が参照標準品との同等性を明らかにすることによって確認される、方法。
【請求項４３】
前記参照標準品が参照ｈＰＥＧ−ＩＬ−１０または参照ｈＩＬ−１０を消化することから生成される複数の参照ペプチドに対応する複数の参照ペプチドを含む、請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１３年６月１７日に出願された米国特許仮出願第６１／８３６，０３４号の優先権の利益を主張するものであり、上記出願はその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は特に、ペグ化インターロイキン−１０およびその他のペグ化インターロイキン−１０関連分子を含む組成物の同一性および安定性を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
サイトカイン、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、および抗原提示細胞に対する作用を介して多数の免疫応答を調節する多面的サイトカインである。ＩＬ−１０は、活性化単球および活性化マクロファージでのＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦの発現を阻害することによって免疫応答を抑制し得るほか、ナチュラルキラー細胞によるＩＦＮ−γ産生を抑制する。ＩＬ−１０は主としてマクロファージに発現するが、このほか活性化したＴ細胞、Ｂ細胞、肥満細胞、および単球で発現が検出されている。ＩＬ−１０は免疫応答の抑制に加えて、ＩＬ−２で処置した胸腺細胞およびＩＬ−４で処置した胸腺細胞の増殖の刺激、Ｂ細胞の生存能の増強、ならびにＭＨＣクラスＩＩの発現の刺激を含む免疫刺激特性を示す。
【０００４】
ＩＬ−１０には多面的効果があることから、炎症性病態、免疫関連障害、線維性障害および癌を含む様々な疾患、障害および病態と関係があると考えられている。多数の上記疾患、障害および病態に対するＩＬ−１０を用いた臨床および前臨床評価では、ＩＬ−１０の治療効果の可能性が確実視されている。さらに、特定の治療状況下ではペグ化ＩＬ−１０の方が非ペグ化ＩＬ−１０よりも効果が高いことが示されている。
【０００５】
ＩＬ−１０を原因とする疾患、障害および病態の有病率および重症度を考慮すると、ＩＬ−１０の機能の様相を調節するＩＬ−１０関連物質には多大な治療的価値がある。したがって、対象に投与する前にＩＬ−１０関連治療薬の性質の中でも特にその同一性および安定性を確認するための確実で再現性のある方法が大きな関心を集めている。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は部分的には、ペグ化ＩＬ−１０を含む組成物（例えば、医薬組成物）を本明細書に記載される疾患、障害および病態、ならびに／あるいはその症状の治療ならびに／あるいは予防のために対象に投与する前に、それが特定の製品に関する仕様に適合するかどうかを決定するのに用い得る方法およびその他の技術に関する。
【０００７】
「ＩＬ−１０」、「ＩＬ−１０ポリペプチド（１つまたは複数）」、「ＩＬ−１０物質（１つまたは複数）」、および「ＩＬ−１０分子（１つまたは複数）」という用語は、本明細書では互換的に使用されかつヒトおよび非ヒトＩＬ−１０関連ポリペプチドを含み、それらのホモログ、変異体（変異タンパク質を含む）、および断片、ならびに例えばリーダー配列（例えば、シグナルペプチド）を有するＩＬ−１０ポリペプチドを含む。特に明示されない限り、上記用語はほかにも、ＰＥＧ部分の分子量が本明細書に記載される範囲内にあるペグ化型のＩＬ−１０を包含する。のちに使用されるように、「ＰＥＧ−ＩＬ−１０」および「ペグ化インターロイキン−１０」という用語は、一方または両方の単量体がペグ化されており、かつ各ＰＥＧ部分が約５ｋＤａ以上であるＩＬ−１０二量体分子を指す。特定の実施形態では、ＩＬ−１０分子は一方または両方の単量体のＮ末端がペグ化されており、各ＰＥＧ部分が約５ｋＤａ〜約２０ｋＤａである。
【０００８】
生物学的作用物質は、その生産に用いる出発物質および製造工程の変化に対する感受性が高いため、一貫して生成し特徴付けるのが困難であり得る。実際、生物学的製剤の生産には、望ましくないタンパク質修飾が起こる可能性および生物学的製剤の汚染が起こる可能性があることから、極めて厳密な品質管理が必要である。その結果、タンパク質生物学的製剤が、いくつかある性質の中でも特に、不可欠なアミノ酸同一性（例えば、アミノ酸配列）を有するようにするため、そのアミノ酸配列の整合性を生産バッチ毎に確認する必要がある。この確認作業は一般に、ロットリリース評価（例えば、ロットリリース試験）を用いて実施される。ロットリリース試験を用いたアミノ酸同一性の確認では一般に、その生物学的製剤が必要な純度、効力などを有するという指標が得られる。
【０００９】
有用であるためには、ある個人が別個のバッチに異なる設備を用いてリリース試験を実施し；別の個人が最初の個人と同じ設備を用いてリリース試験を実施し；別の個人が最初の個人と異なる設備を用いてリリース試験を実施するという状況を含み、ロットリリース試験によって得られたデータに一貫性および再現性がなければならない。この方法論により、被験分子の性質が分析方法からデータを得る固有の機序に干渉することなく一貫した結果が得られなければならない。したがって、ペグ化分子の場合、ＰＥＧ化の部位（１つまたは複数）について厳密な試験を実施し、リリース方法論から意味のあるデータを得ることができるかどうかを決定する必要がある。
【００１０】
ペプチドマッピングは、ロットリリース評価の過程で頻繁に用いられる有効な方法である。ペプチドマッピングでは分子の一次アミノ酸配列が決定され、したがって、分子の同一性の指標となる。ペプチドマッピングは、タンパク質生物学的製剤を含む、組換えによって得られるタンパク質の品質管理に不可欠な分析方法である。ペプチドマップは実質的には、複数の化学的過程から生じるタンパク質の「フィンガープリント」であり、分析対象のタンパク質の包括的理解を可能にする。ペプチドマッピングでは、酵素的消化または化学的切断によってタンパク質を断片化したのち、その断片を分離し分析する。
【００１１】
本明細書で企図されるＰＥＧ−ＩＬ−１０分子を含む医薬組成物をＩＬ−１０に関連する疾患、障害および病態、ならびに／あるいはその症状の治療ならびに／予防に効果的かつ安全に使用するためには、それが、主として、経時的な一次アミノ酸配列の整合性によって決定される定められた仕様（例えば、医薬組成物の保存期間全体を通じてその安定性が維持されること）を有するべきである。さらに、特異的なペプチド断片の特徴によってＰＥＧ化修飾（１つまたは複数）の位置を決定できる。一実施形態では、本開示は、ＰＥＧ−ＩＬ−１０を含む医薬組成物の特定のバッチ（「ロット」）が、バルク原薬（ＢＤＳ）および最終製剤（ＤＰ）に必要な仕様（例えば、一次アミノ酸配列およびＰＥＧ化部位が維持されること）を満たすかどうかを高い再現性で決定するのに有用な方法およびその他の技術に関する。
【００１２】
本開示はペグ化タンパク質の整合性を確認する方法を企図し、この方法は、ペグ化タンパク質を含む試料を提供し、ペグ化タンパク質を断片化して試験用の複数のペプチドを得、この試験用の複数のペプチドを標準品と比較すること（例えば、コンピュータを用いることによって）を含み；ペグ化タンパク質の整合性は、試験する複数のペプチドと標準品の同等性を明らかにすることによって確認される。
【００１３】
本開示によれば、ペグ化タンパク質と関連して使用される「整合性」という用語はある特徴を指し、その特徴は、あるペグ化タンパク質（例えば、被験ペグ化タンパク質）に存在する場合、そのペグ化タンパク質が別のペグ化タンパク質（例えば、参照ペグ化タンパク質）と同等であることを示す。特定の実施形態では、この特徴はペグ化タンパク質のアミノ酸配列である。したがって、当業者は本明細書に記載される方法を用いて、あるペグ化タンパク質のアミノ酸配列が別のペグ化タンパク質のアミノ酸配列と同等であるかどうかを決定できる。
【００１４】
ある特定の実施形態では、標準品は、参照タンパク質または参照ペグ化タンパク質の断片化によって得られた複数の参照ペプチドを含む。ペグ化タンパク質は、特定の実施形態での参照ペグ化タンパク質と同じものである。
【００１５】
本開示は、ペグ化タンパク質をペプチダーゼなどのタンパク質分解試薬と接触させることによって断片化を実施する実施形態を企図する。ペプチダーゼは、例えば、トリプシンまたはグルタミルエンドペプチダーゼ（Ｅｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃ）であり得る。
【００１６】
特定の実施形態では、試験用の複数ペプチドの上記ペプチドメンバーをクロマトグラフィーまたは電気泳動によって分離する。ある特定の実施形態では、試験用の複数ペプチドの各メンバーの絶対質量を質量分析によって決定することを企図する。質量分析の方法としては、特に限定されないが、ＥＳＩ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、ＭＡＬＤＩ  ＭＳおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳが挙げられる。参照用の複数のタンパク質の各メンバーの絶対質量はデータベースなどの電子媒体に保管することが多い。
【００１７】
本開示の諸実施形態は、ペグ化ヒトインターロイキン−１０のＥｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃ消化によって得られた複数のペプチドをＰＥＧ−ｈＩＬ−１０標準品と比較することによってその同一性を確認する方法に関し、複数のペプチドの同一性は、標準品との同等性を明らかにすることによって確認される。標準品は、参照ｈＰＥＧ−ＩＬ−１０または参照ｈＩＬ−１０を消化することにより得られたペプチドに対応する複数の参照ペプチドを含み得る。
【００１８】
本開示の文脈では、あるグループのペプチド（例えば、試験用の複数のペプチド）と別のグループのペプチド（例えば、参照用の複数のペプチド）との同等性を、当該技術分野で認められている任意の方法を用いて決定できる。例として述べると、特に限定されないが、タンパク質の酵素的消化により得られたペプチドから予測ペプチド質量フィンガープリントが得られるかどうかを評価するのに質量分析を用いることができる。同等性のパラメータは、ペプチド生物学的製剤が特定の必要条件を満たし、したがって、その意図する目的に安全かつ効果的であることを確実にするために規制当局（例えば、ＦＤＡまたはこれと同等の外国の当局）によって確立されたものであり得る。
【００１９】
本開示はまた、ペグ化インターロイキン−１０の整合性（例えば、アミノ酸配列）を確認する方法を提供し、この方法は、被験ＰＥＧ−ＩＬ−１０を含む試料を供給し、被験ＰＥＧ−ＩＬ−１０（例えば、ＰＥＧ−ｈＩＬ−１０）を断片化して試験用の複数のペプチドを得、試験用の複数のペプチドを標準品と比較すること（例えば、コンピュータを用いることによって）を含み；ペグ化インターロイキン−１０の整合性は、試験用の複数のペプチドと標準品との同等性を明らかにするによって確認される。標準品は、参照ＰＥＧ−ＩＬ−１０または参照ＩＬ−１０を断片化することにより得られる複数の参照ペプチドを含み得る。特定の実施形態では、被験ＰＥＧ−ＩＬ−１０は参照ＰＥＧ−ＩＬ−１０と同じである。
【００２０】
本開示のある特定の実施形態では、被験ＰＥＧ−ＩＬ−１０をタンパク質分解試薬と接触させることによって断片化を実施する。タンパク質分解試薬は、トリプシンまたはＥｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃなどのペプチダーゼであり得る。被験ＰＥＧ−ＩＬ−１０をＥｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃで断片化する方が、被験ＰＥＧ−ＩＬ−１０をトリプシンで断片化するよりも、よく分離されたペプチド断片が得られる。この文脈では、「分離された」という用語は、明確で再現性のあるフィンガープリントが存在することを表す。すなわち、Ｅｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃで消化すると、明確なパターンの分解可能なピークが生じる。これに対して、トリプシンで消化すると、オーバーラップする分解不可能な多数のピークが生じる。
【００２１】
特定の実施形態では、試験する複数のペプチドのペプチドメンバーをクロマトグラフィーによって分離するが、他の実施形態ではそれらを電気泳動によって分離する。試験する複数のペプチドの各メンバーの絶対質量は、以下に挙げる技術：ＥＳＩ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、ＭＡＬＤＩ  ＭＳおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを含む質量分析によって決定し得る。参照用の複数のペプチドに関しては、各メンバーの絶対質量を質量分析によって決定し得る。参照用の複数のペプチドの各メンバーの絶対質量に関するデータは、コンピュータデータベースをはじめとする電子媒体に保管し得る。
【００２２】
いくつかの実施形態では、参照ＰＥＧ−ＩＬ−１０の断片化により得られる参照ペプチドは、例えば、ＥＳＩ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、ＭＡＬＤＩ  ＭＳまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより決定すると、参照ＩＬ−１０の断片化により得られる参照ペプチドとほぼ同等である。本開示では、「ほぼ」および類似の用語の意味は、それらの用語が使用される文脈に基づく。例えば、「参照ＰＥＧ−ｈＩＬ−１０の消化により得られる参照ペプチドは、参照ｈＩＬ−１０の消化により得られる参照ペプチドとほぼ同等である」という記述は、両方の消化により得られるペプチドの大部分が同じであるが、ペグ化タンパク質を含む場合に予想されるように、いくらかの差（ほとんどの場合、わずかなものである）が存在し得ることを表す。
【００２３】
さらなる実施形態では、本開示は、被験ＰＥＧ−ｈＩＬ−１０を含む試料を供給し、被験ｈＰＥＧ−ＩＬ−１０をＥｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃで消化して試験用の複数のペプチドを得、試験用の複数のペプチドを標準品と比較すること（例えば、アルゴリズムまたは何らかの種類のコンピュータ化されたシステムによって）によってペグ化ヒトインターロイキン−１０のアミノ酸配列を確認する方法を企図し；ペグ化ヒトインターロイキン−１０のアミノ酸配列は、試験用の複数のペプチドと標準品との同等性を明らかにすることによって確認される。このような方法では、標準品は、参照ｈＰＥＧ−ＩＬ−１０または参照ｈＩＬ−１０を消化することにより得られる複数の参照ペプチドであり得る。被験ＰＥＧ−ｈＩＬ−１０およびＰＥＧ−ｈＩＬ−１０は特定の実施形態のものと同じである。既に述べたように、被験ＰＥＧ−ｈＩＬ−１０をＥｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃで消化する方が、被験ＰＥＧ−ｈＩＬ−１０をトリプシンで消化するよりもよく分離されたペプチド断片が得られる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるペグ化ＩＬ−１０ポリペプチドは、ＩＬ−１０の少なくとも１つの単量体の少なくとも１つのアミノ酸残基に共有結合した少なくとも１つのＰＥＧ分子を含む。このようなペグ化ポリペプチドは、モノ−ペグ化単量体とジ−ペグ化ＩＬ−１０単量体の混合物を含み得る。本明細書で「モノ−ペグ化」もしくは「ジ−ペグ化」、またはその同等物に言及する場合、それは単にモノ−ペグ化ＩＬ−１０およびジ−ペグ化ＩＬ−１０に言及する場合よりも広義に解釈されるものとする。例を挙げれば、ＩＬ−１０アミノ酸配列に２つ以上の変異を導入した後そのそれぞれをペグ化することによって各ＩＬ−１０単量体の２つ以上の異なる部位を修飾してもよく、あるいは各ＩＬ−１０単量体の１つの部位をＮ末端のペグ化と組み合わせてペグ化してもよい。本明細書には例示的なペグ化条件が記載される。ＰＥＧ成分は、ペプチドによって許容される任意のＰＥＧであり得る。例として述べると、修飾ペプチドのＰＥＧ成分は、いくつかの実施形態では分子質量が５ｋＤａ〜２０ｋＤａであり得、他の実施形態では分子質量が２０ｋＤａ超であり得、あるいはさらにほかの実施形態では分子質量が少なくとも３０ｋＤａであり得る。本明細書ではまた、これ以外の分子質量値を有するＰＥＧが企図され記載される。
【００２５】
特定の実施形態では、本開示は、配列番号２の生物活性に近い生物活性を有するペグ化ポリペプチドを企図する。生物活性は、ケモカイン放出アッセイまたはＭＣ／９細胞増殖アッセイを含む当該技術分野で公知の任意の方法によって決定され得る。本明細書には、このようなアッセイの例示的なプロトコルが記載される。
【００２６】
本開示は、本明細書に記載されるＩＬ−１０分子と、薬学的に許容される希釈剤、担体または添加剤とを含む、医薬組成物を含む。いくつかの実施形態では、添加剤は等張注射液である。医薬組成物は、対象（例えば、ヒト）への投与に適しており、１つまたは複数の追加の予防剤または治療剤を含み得る。ある特定の実施形態では、医薬組成物を無菌容器（例えば、単回使用または複数回使用バイアルまたはシリンジ）に入れる。キットに無菌容器（１つまたは複数）が含まれていてよく、キットはまた、少なくとも１つの追加の予防剤もしくは治療剤または薬理療法に使用し得る他の任意の薬剤を含む１つまたは複数の追加の無菌容器を含み得る。
【００２７】
本開示のほかの実施形態は、対象（例えば、ヒト）において疾患、障害または病態を治療または予防する方法を含み、この方法は、治療有効量の本明細書に記載されるＩＬ−１０分子を投与することを含む。本開示の種々の実施形態では、疾患、障害または病態は、癌（例えば、固形腫瘍または血液学的障害）を含めた増殖性障害；炎症性腸疾患、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、およびアルツハイマー病を含めた免疫障害または炎症性障害；凝固亢進状態を含めた血栓症または血栓性の病態もしくは障害；線維性障害；特に限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびサイトロメガロウイルスを含めたウイルスによる障害；アテローム性動脈硬化症あるいは対象にコレステロール上昇および／またはその他の異常な代謝関連パラメータ（例えば、異常な血糖値、インスリン値、または脂質値）がみられ得る他の心血管関連障害を含めた心血管障害である。
【００２８】
疾患、障害または病態を治療または予防する方法では、治療有効量の本明細書に記載されるポリペプチドの投与は、非経口注射（例えば、皮下）を含むポリペプチドに適した任意の経路によるものであり得る。１つまたは複数の追加の予防剤または治療剤をペプチドとともに（例えば、ペプチドの前に、ペプチドと同時に、またはペプチドの後に）投与してもよく、かつ／あるいはそれをペプチドと別個に、またはペプチドと組み合わせて投与してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】１７８アミノ酸のヒトＩＬ−１０の全配列（配列番号１）を示す図である。１８アミノ酸のシグナルペプチドに下線が施されている。
【図１Ｂ】１６０アミノ酸の成熟ヒトＩＬ−１０の配列（配列番号２）を示す図である。
【図２】Ｅｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃのアミノ酸配列（配列番号３）を示す図である。
【図３Ａ】ヒトＩＬ−１０単量体のタンパク質結晶構造のリボン図（上面図）である。６つのへリックスにＡ〜Ｆの表示が付されている。
【図３Ｂ】ヒトＩＬ−１０ホモ二量体のタンパク質結晶構造のリボン図（上面図）である。一方の単量体が灰色、他方の単量体が黒色である。６つのへリックスにＡ〜Ｆの表示が付されている。
【図３Ｃ】２つのヒトＩＬ１０Ｒ１／α受容体（黒色）に結合したヒトＩＬ−１０ホモ二量体（灰色）のタンパク質結晶構造のリボン図（上面図）である。
【図４】Ｅｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃ消化ならびにｒｈＩＬ−１０（濃いトレース）およびＰＥＧ−ｒｈＩＬ−１０（薄いトレース）のＵＶ検出ペプチドマップを示すクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
（詳細な説明）
本開示についてさらに説明する前に、本開示は本明細書に記載される特定の実施形態に限定されるものではないことが理解されるべきであり、また本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明するのが目的であって、限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。
【００３１】
数値の範囲が記載される場合、その範囲の上限および下限の間に介在し、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き下限の単位の１０分の１までの各数値ならびにその記載される範囲内に記載されるか介在する他の任意の数値が本発明の範囲内に包含されることが理解される。これらの小さい方の範囲の上限値および下限値は、その小さい方の範囲内に独立して含まれ得るものであり、また本発明の範囲内に包含され、記載される範囲内の個別に除外される任意の限界値の対象となるものである。記載される範囲が一方または両方の限界値を含む場合、これらの含まれる限界値の一方または両方を除外した範囲も本発明に含まれる。別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はいずれも、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００３２】
本明細書および添付の「特許請求の範囲」で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、複数形の指示対象を含むことに留意しなければならない。さらに、請求項がいずれかの任意選択の要素を除外するよう起草され得ることが留意される。したがって、この記述は、請求項の構成要素の記載に関連して「単に」、「〜のみ」などのような排他的用語を使用する、または「消極的」限定を用いるための先行する基礎としての役割を果たすことを意図するものである。
【００３３】
本明細書に開示される刊行物は、それが単に本願の出願日よりも前に開示されたため記載されるものである。さらに、記載される公開日が実際の公開日と異なる場合があり、それを個別に確認する必要が生じ得る。
【００３４】
概要
生物学的製剤の生産には、望ましくないタンパク質修飾が起こる可能性があり、かつ生物学的製剤の汚染が起こる可能性が高いことから、極めて厳密な品質管理が必要である。例えば生産バッチ（「ロット」）毎に活性医薬品成分（ＡＰＩ）のアミノ酸配列の整合性を評価し確実にするためには一般にロットリリース試験が用いられる。
【００３５】
本開示は全般的には、ＰＥＧ−ＩＬ−１０を含むペグ化ＩＬ−１０分子に関する。特定の実施形態では、本開示は、ＰＥＧ−ＩＬ−１０分子を含む組成物（例えば、医薬組成物）を様々なＩＬ−１０に関連する疾患、障害および病態、ならびに／あるいはその症状の治療ならびに／あるいは予防のために対象に投与する前に、それらが特定の製品に関する仕様に適合するかどうかを決定するのに有用な、ロットリリース評価を含む方法およびその他の技術に関する。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ−ＩＬ−１０分子およびその組成物（例えば、医薬組成物）を用いて、炎症性および免疫関連障害；血栓性障害、線維性障害、癌および癌関連障害；ならびに心血管障害（例えば、アテローム性動脈硬化症）を治療ならびに／あるいは予防する。特定の実施形態では、ＰＥＧ−ＩＬ−１０分子およびその組成物（例えば、医薬組成物）を用いて、高コレステロール血症を含むコレステロール関連障害を治療および／または予防する。
【００３６】
定義
特に明示されない限り、次に挙げる用語は以下に記載する意味を有するものとする。その他の用語については本明細書全体の他の箇所で定義する。
【００３７】
「患者」または「対象」という用語は互換的に使用され、ヒトまたは非ヒト動物（例えば、哺乳動物）を指す。
【００３８】
「投与」、「投与する」などの用語は、例えば、対象、細胞、組織、器官、または生体液に適用される場合、例えば、ＩＬ−１０（またはＰＥＧ−ＩＬ−１０）、核酸（例えば、天然のヒトＩＬ−１０をコードする核酸）；上記のものを含む医薬組成物、または診断剤の、対象、細胞、組織、器官、または生体液への接触を指す。細胞との関連においては、投与は試薬の細胞への接触（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ）、ならびに試薬の体液への接触を含み、この場合、体液は細胞と接触している。
【００３９】
「治療する」、「治療すること」、「治療」などの用語は、疾患、障害もしくは病態、またはその症状が診断、観察などされたのち、対象が罹患している疾患、障害、もしくは病態の少なくとも１つの根本原因または対象が罹患している疾患、障害もしくは病態に伴う少なくとも１つの症状を一時的または恒久的に除去、軽減、抑制、緩和、または改善するために開始される一連の行動（ＰＥＧ−ＩＬ−１０またはＰＥＧ−ＩＬ−１０を含む医薬組成物を投与することなど）を指す。したがって、治療は、活動性疾患を阻害すること（例えば、疾患、障害もしくは病態またはそれに伴う臨床症状の発現またはさらなる進行を停止させること）を含む。上記用語はまた、例えば、液相またはコロイド相内でＩＬ−１０またはＰＥＧ−ＩＬ−１０がＩＬ−１０受容体に接触する場合など、他の文脈においても使用され得る。
【００４０】
本明細書で使用される「治療を必要とする」という用語は、対象が治療を必要とするか、治療により対象に利益がもたらされるとする、医師またはその他の医療協力者による判断を指す。この判断は、医師または医療協力者の専門知識の領域にある様々な因子に基づいてなされる。
【００４１】
「予防する」、「予防すること」、「予防」などの用語は、一般的には対象が特定の疾患、障害または病態に罹患しやすい状況において、対象に疾患、障害、病態などが発現するリスクを一時的または恒久的に防止、抑制、阻害または軽減する（例えば、臨床症状がみられないことによって判定される）か、疾患、障害、病態などの発症を遅らせるように（例えば、疾患、障害、病態またはその症状の発症前に）開始される一連の行動（ＰＥＧ−ＩＬ−１０またはＰＥＧ−ＩＬ−１０を含む医薬組成物を投与することなど）を指す。ある特定の場合には、上記用語はまた、疾患、障害もしくは病態の進行を遅らせること、またはそれが有害なもしくは望ましくない状態に進行するのを阻害することを指す。
【００４２】
本明細書で使用される「予防を必要とする」という用語は、対象が予防的治療を必要とするか、予防的治療により対象に利益がもたらされるとする、医師またはその他の医療協力者による判断を指す。この判断は、医師または医療協力者の専門知識の領域にある様々な因子に基づいてなされる。
【００４３】
「治療有効量」という語句は、薬剤を対象に投与したとき、疾患、障害または病態の任意の症状、様相、または特徴について任意の検出可能な正の効果を発揮できる量で、単独でまたは医薬組成物の一部として、および単回投与でまたは一連の投与の一部として、対象に薬剤を投与することを指す。治療有効量は、重要な生理学的効果を測定することによって確認でき、また投与レジメンおよび対象の病態の診断分析などに応じて調整できる。例として、投与後に産生される炎症性サイトカイン量を測定すれば、治療有効量が使用されたかどうかの指標となり得る。
【００４４】
「変化をもたらすのに十分な量で」という語句は、特定の治療薬を投与する前（例えば、ベースラインレベル）および後に測定した指標のレベルの間に検出可能な差がみられることを意味する。指標には、任意の客観的パラメータ（例えば、ＩＬ−１０の血清中濃度）または主観的パラメータ（例えば、対象の健康感）が含まれる。
【００４５】
「小分子」という用語は、約１０ｋＤａ未満、約２ｋＤａ未満、または約１ｋＤａ未満の分子量を有する化合物を指す。小分子としては、特に限定されないが、無機分子、有機分子、無機成分を含む有機分子、放射性原子を含む分子、および合成分子が挙げられる。治療の上では、小分子の方が大型の分子よりも細胞への浸透性が高く、分解を受けにくく、かつ免疫応答を誘発しにくいと考えられる。
【００４６】
「リガンド」という用語は、例えば、受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得るペプチド、ポリペプチド、膜関連分子もしくは膜結合分子、またはその複合体を指す。「リガンド」は、天然および合成のリガンド、例えば、サイトカイン、サイトカインの変異体、類似体、変異タンパク質、および抗体に由来する結合組成物を包含する。「リガンド」はまた、小分子、例えば、サイトカインのペプチド模倣物および抗体のペプチド模倣物を包含する。この用語はまた、アゴニストでもアンタゴニストでもないが、受容体の生物学的特性、例えばシグナル伝達または接着に有意な影響を及ぼさずに受容体と結合できる薬剤を包含する。さらに、この用語は、例えば化学法または組換え法によって、可溶型の膜結合リガンドに変化させた膜結合リガンドを含む。リガンドまたは受容体は完全に細胞内にあってもよく、すなわち、それは細胞質ゾル、核、または他の何らかの細胞内区画内に存在していてもよい。リガンドと受容体の複合体は「リガンド−受容体複合体」と呼ばれる。
【００４７】
「阻害剤」および「アンタゴニスト」、または「活性化因子」および「アゴニスト」という用語は、例えばリガンド、受容体、補因子、遺伝子、細胞、組織または器官の活性化に対する、それぞれ阻害分子または活性化分子を指す。阻害剤とは、例えば、遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体、または細胞を減少させる、遮断する、妨害する、活性化遅延させる、不活性化する、脱感作する、またはダウンレギュレーションする分子のことである。活性化因子とは、例えば、遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体、または細胞を増大させる、活性化する、促進する、活性化増強させる、感作する、またはアップレギュレーションする分子のことである。阻害剤はまた、構成的活性を低下させる、遮断する、または不活性化する分子と定義され得る。「アゴニスト」とは、標的と相互作用して標的の活性化の増大を引き起こす、または促進する分子のことである。「アンタゴニスト」とは、アゴニストの作用（１つまたは複数）に拮抗する分子のことである。アンタゴニストはアゴニストの活性を妨害し、低下させ、または中和し、かつアンタゴニストはまた、アゴニストが同定されていない場合でも標的、例えば標的受容体の構成的活性を妨害し、阻害し、または低下させることができる。
【００４８】
「調節する」、「調節」などの用語は、分子（例えば、活性化因子または阻害剤）が、ＩＬ−１０分子（またはそれをコードする核酸分子）の機能または活性を、直接的または間接的に増大または低下させる；あるいは分子の能力を増強してＩＬ−１０分子と同程度の効果を生じさせる能力を指す。「モジュレーター」という用語は、上記の活性をもたらすことができる分子を広義に指すものとする。例として、例えば遺伝子、受容体、リガンド、または細胞のモジュレーターとは、遺伝子、受容体、リガンド、または細胞の活性を変化させる分子のことであり、この場合、活性はその調節特性が活性化され得るか、阻害され得るか、変化し得る。モジュレーターは単独で作用し得るか、補因子、例えば、タンパク質、金属イオン、または小分子を利用し得る。「モジュレーター」という用語は、ＩＬ−１０と同じ作用機序を介して機能し（すなわち、ＩＬ−１０と類似した方法でＩＬ−１０と同じシグナル伝達経路を調節する薬剤）、ＩＬ−１０と同程度の（またはこれより大きい）生物学的応答を引き起こすことができる薬剤を含む。
【００４９】
モジュレーターの例としては、小分子化合物をはじめとする生物有機分子が挙げられる。多数の小分子化合物ライブラリー（例えば、コンビナトリアルライブラリー）が市販されており、モジュレーターを同定する出発点としての役割を果たし得る。当業者は、所望の特性を有する１つまたは複数の化合物を同定するために、このような化合物ライブラリーをスクリーニングできる１つまたは複数のアッセイ（例えば、生化学アッセイまたは細胞ベースのアッセイ）を開発でき；その後、熟練した医薬品化学者がこのような１つまたは複数の化合物を、例えば、その類似体および誘導体を合成し評価することによって、最適化できる。活性化因子の同定において合成研究および／または分子モデリング研究も用いることができる。
【００５０】
分子の「活性」は、分子のリガンドまたは受容体への結合；触媒活性；遺伝子発現または細胞のシグナル伝達、分化、もしくは成熟を刺激する能力；抗原活性；他の分子の活性の調節などを表し得る、または指し得る。この用語はまた、細胞間の相互作用（例えば、接着）の調節もしくは維持における活性、または細胞の構造（例えば、細胞膜）の維持における活性を指し得る。「活性」はまた、比活性、例えば、［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］、または［免疫活性］／［ｍｇタンパク質］、生物学的区画内の濃度などを意味し得る。「増殖活性」という用語は、例えば、正常な細胞分裂のほか、癌、腫瘍、異形成、細胞形質転換、転移、および血管新生を促進する活性、これらに必要な活性、またはこれらに特異的に関連する活性を包含する。
【００５１】
本明細書で使用される「同程度の」、「同程度の活性」、「〜と同程度の活性」、「同程度の効果」、「〜と同程度の効果」などは、定量的かつ／または定性的に考えることができる相対的な用語である。上記用語の意味は、その用語が使用される文脈に左右されることが多い。例として、ある１つの受容体を活性化する２つの薬剤は、定性的な観点からは同程度の効果があると考えられるが、当該技術分野で認められている試験（例えば、用量反応試験）または当該技術分野で認められている動物モデルによる決定で、一方の薬剤が他方の薬剤の２０％の活性しか達成できない場合、この２つの薬剤には定量的観点からは同程度の効果がないと考えられる。ある結果を別の結果と比較する（例えば、ある結果を参照標準品と比較する）とき、「同程度の」は多くの場合（必ずというわけではないが）、ある結果が参照標準品から３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、７％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満だけ外れていることを意味する。特定の実施形態では、ある結果が参照標準品から１５％未満、１０％未満、または５％未満だけ外れている場合、その結果は参照標準品と同程度である。例として、特に限定されないが、活性または効果は有効性、安定性、溶解性、または免疫原性を指し得る。既に述べたように、当業者は、異なる方法論を用いることによりｈＩＬ−１０参照標準品よりも活性（タンパク質濃度の計算の違いによる見かけの活性または実際の活性）が高いまたは低いＩＬ−１０が得られることを理解する。当業者であれば、ｈＩＬ−１０に対するＩＬ−１０分子（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）の相対的生物活性を決定するにあたって、このような差を考慮に入れることができる。
【００５２】
例えば細胞、組織、器官、または生物体の「応答」という用語は、生化学的または生理学的挙動、例えば、生物学的区画内での濃度、密度、接着、または移動、遺伝子発現率、または分化状態の変化を包含し、この場合、変化は活性化、刺激、もしくは治療、または遺伝的プログラミングなどの内部機序と相関する。ある特定の文脈では、「活性化」、「刺激」などの用語は、内部機序によって、および外部因子または環境因子によって調節される細胞活性化を指すのに対して、「阻害」、「ダウンレギュレーション」などの用語は、これと逆の効果を指す。
【００５３】
本明細書で互換的に使用される「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は任意の長さの多量体型のアミノ酸を指し、遺伝的にコードされるアミノ酸および非遺伝的にコードされるアミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、および修飾ポリペプチド主鎖を有するポリペプチドが含まれ得る。上記用語は、特に限定されないが、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基の有無を問わず異種および同種のリーダー配列を有する融合タンパク質を含む融合タンパク質；免疫学的にタグ付けしたタンパク質などを含む。
【００５４】
本明細書で使用される「変異体」および「ホモログ」という用語は、それぞれ参照アミノ酸配列または参照核酸配列に類似したアミノ酸配列またはＤＮＡ配列を指すのに互換的に使用される。この用語は、天然の変異体および非天然の変異体を包含する。天然の変異体には、ホモログ（種間でそれぞれアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が異なるポリペプチドおよび核酸）、および対立遺伝子変異体（種内の個体間でそれぞれアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が異なるポリペプチドおよび核酸）が含まれる。したがって、変異体およびホモログは、天然のＤＮＡ配列およびそれによりコードされるタンパク質ならびにそのアイソフォームのほかにも、タンパク質または遺伝子のスプライスバリアントを包含する。上記用語はまた、天然のＤＮＡ配列とは１つまたは複数の塩基が異なるが、遺伝暗号の縮重により依然として天然のタンパク質に対応するアミノ酸配列に翻訳される核酸配列を包含する。非天然の変異体およびホモログには、それぞれアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の変化を含むポリペプチドおよび核酸が含まれ、この場合、配列の変化は人為的に導入されたものである（例えば、変異タンパク質）；例えば、この変化は実験室でヒトの介入（「人の手」）によって生じたものである。したがって、非天然の変異体およびホモログはまた、１つまたは複数の保存的置換および／またはタグおよび／またはコンジュゲートがあることによって天然の配列とは異なっているものを指し得る。
【００５５】
本明細書で使用される「変異タンパク質」という用語は、広義に変異組換えタンパク質を指す。このようなタンパク質は通常、単一または複数のアミノ酸置換を有し、部位特異的変異誘発もしくはランダム変異誘発を施したクローン化遺伝子から、または全合成遺伝子から誘導されることが多い。特に明示されない限り、「ＩＬ−１０の変異体」などの用語を使用する場合、ＩＬ−１０変異タンパク質を指す。
【００５６】
「ＤＮＡ」、「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」などの用語は、本明細書では任意の長さの多量体型のヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド）、またはその類似体を指すのに互換的に使用される。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、直鎖状および環状核酸、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えポリヌクレオチド、ベクター、プローブ、プライマーなどが挙げられる。
【００５７】
本開示のポリペプチドおよび核酸分子に関連して「ヒト」に言及する場合はいずれも、ポリペプチドまたは核酸の入手方法または入手源を限定することを意図するものではなく、その配列が天然のヒトポリペプチドまたは核酸分子の配列に対応し得るという理由でそれに言及するだけであることに留意するべきである。本開示は、ヒトポリペプチドおよびそれをコードする核酸分子に加えて、他の種に由来するＩＬ−１０関連ポリペプチドおよびそれに対応する核酸分子を企図する。
【００５８】
本開示全体を通じて１文字または３文字のコードによってアミノ酸に言及することが理解されよう。読者の便宜のため、１文字および３文字のアミノ酸コードを以下に記載する：
2016528879.tif 000003
【００５９】
本明細書で天然ヒトＩＬ−１０またはＩＬ−１０変異タンパク質に関連して使用される「修飾された」、「修飾」などの用語は、ヒトＩＬ−１０またはＩＬ−１０変異タンパク質の所望の特性を増強する１つまたは複数の変化を指す。このような所望の特性としては、例えば、循環半減期が長くなること、安定性が増大すること、クリアランスが低下すること、免疫原性またはアレルゲン性が変化すること、および検出アッセイに使用する特定の抗体を生じさせること（例えば、固有のエピトープの導入によるもの）が可能になることが挙げられる。のちに詳細に論じるように、実施し得るヒトＩＬ−１０またはＩＬ−１０変異タンパク質の修飾としては、特に限定されないが、ペグ化（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはその誘導体の１つまたは複数の分子の共有結合による付加）；グリコシル化（例えば、Ｎ−グリコシル化）、ポリシアル化およびＨＥＳ化；アルブミン融合；例えば共役脂肪酸鎖を介したアルブミン結合（アシル化）；Ｆｃ融合；およびＰＥＧ模倣物との融合が挙げられる。
【００６０】
本明細書でポリペプチドの構造との関連で使用される「Ｎ末端」（または「アミノ末端」）および「Ｃ末端」（または「カルボキシル末端」）はそれぞれ、ポリペプチドのアミノ側の最末端およびカルボキシル側の最末端を指すのに対して、「Ｎ末端側」および「Ｃ末端側」という用語はそれぞれ、ポリペプチドのアミノ酸配列内でのＮ末端およびＣ末端に向かった相対的位置を指し、それぞれＮ末端およびＣ末端の残基を含み得る。「Ｎ末端側に隣接する」または「Ｃ末端側に隣接する」は、第一のアミノ酸残基と第二のアミノ酸残基が共有結合して連続するアミノ酸配列を形成している場合に第二のアミノ酸残基に対する第一のアミノ酸残基の相対的な位置を指す。
【００６１】
アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列との関連における「〜に由来する」（例えば、ＩＬ−１０ポリペプチド「に由来する」アミノ酸配列）は、ポリペプチドまたは核酸が参照ポリペプチドまたは核酸（例えば、天然のＩＬ−１０ポリペプチドまたはＩＬ−１０をコードする核酸）の配列に基づく配列を有することを表すものであり、タンパク質または核酸の入手源または作製方法を限定するものではない。例として、「〜に由来する」という用語は、参照アミノ酸またはＤＮＡ配列のホモログまたは変異体を含む。
【００６２】
ポリペプチドとの関連において、「単離（された）」という用語は、対象ポリペプチドが天然に存在するものである場合、天然に存在すると考えられる環境とは異なる環境にある対象ポリペプチドを指す。「単離（された）」は、対象ポリペプチドが実質的に富化されている試料および／または対象ポリペプチドが部分的もしくは実質的に精製されている試料中にあるポリペプチドを含むものとする。ポリペプチドが天然に存在するものでない場合、「単離（された）」は、そのポリペプチドが、合成法または組換え方法によって作製された環境から分離されていることを表す。
【００６３】
「富化された」は、対象ポリペプチドが、ａ）生物試料などの出発試料（例えば、ポリペプチドが天然に存在する試料またはポリペプチドが投与後に存在する試料）中のポリペプチドよりも高い（例えば、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも６４倍、またはそれを超える）濃度、あるいはｂ）ポリペプチドが作製された環境（例えば、細菌細胞内のような環境）よりも高い濃度で存在するように、試料が人為的に（例えば、科学者によって）操作されることを意味する。
【００６４】
「実質的に純粋である」は、ある成分（例えば、あるポリペプチド）が組成物の総含有量の約５０％超、および通常は総ポリペプチド含有量の約６０％超を占めることを表す。より通常には、「実質的に純粋である」は、組成物全体の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％またはそれより多くが対象成分である組成物を指す。いくつかの場合には、ポリペプチドが組成物の総含有量の約９０％超、または約９５％超を占める。
【００６５】
「特異的に結合する」または「選択的に結合する」という用語は、それがリガンド／受容体、抗体／抗原、またはその他の結合ペアに関するものである場合、不均一なタンパク質集団をはじめとする生物学的集合の中のそのタンパク質の存在を決定する結合反応を表す。したがって、指定された条件下で、特定のリガンドは特定の受容体に結合するが、試料中に存在する他のタンパク質には有意な量で結合しない。企図される方法の、抗体、または抗体の抗原結合部位に由来する結合組成物は、その抗原、または抗原の変異体もしくは変異タンパク質に、他のあらゆる抗体、またはそれに由来する結合組成物との親和性の少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも１００倍の親和性で結合する。特定の実施形態では、抗体は、例えばスキャッチャード解析（Ｍｕｎｓｅｎら，１９８０  Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０−２３９）による測定で、約１０９リットル／ｍｏｌ超の親和性を有する。
【００６６】
「翻訳後修飾」および「ＰＴＭ」という用語は、タンパク質生合成で、リボソーム翻訳により生じたポリペプチドが成熟タンパク質産物になる前に修飾（例えば、フォールディングおよび切断）を受ける段階を指す。翻訳後、アミノ酸のＰＴＭでは一般に、タンパク質が他の生化学的官能基（例えば、酢酸、リン酸、ならびに様々な脂質および炭水化物）に結合して、アミノ酸の化学的性質が変化するかその構造が変化する（例えば、ジスルフィド結合の形成）ことによって、タンパク質の機能の範囲が拡大する。酵素の活性化または不活性化を含むタンパク質の挙動の制御にはリン酸化などの修飾が関与している。ＰＴＭのほかの具体例は、タンパク質の酵素的切断（例えば、プロペプチドの除去）またはほとんどの新生ポリペプチドがそれによって開始されるメチオニン残基の切断に関連する。ＰＴＭは質量分析によって検出されることが多い。
【００６７】
本明細書で使用される「ロットリリース」という用語は一般に、生物学的作用物質が対象に投与される前に存在しなければならない生物学的製剤に固有の基準（１つまたは複数）を指し、「ロットリリース試験」という用語は一般に、例えば、生物学的製剤に固有の基準（１つまたは複数）が満たされたかどうかを正確かつ再現可能に示すと規制当局が判断したバイオアッセイを指す。生物学的製剤がロットリリースで規制監督を受ける程度はその適応症およびリスク／利益評価と関係があり、考慮事項としては次のものが挙げられる：標的対象集団の年齢；治療の対象となる病的状態（例えば、生死に関わる、急性、または慢性）；予想される治療期間；対象集団の全般的健康状態；治療の目的（例えば、治療、予防または診断）；および対象集団の規模。
【００６８】
ＩＬ−１０およびペグ化ＩＬ−１０
ヒトサイトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ）としても知られる抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−１０は、２型（クラス２）サイトカインに分類され、このサイトカイン集団にはＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２４（Ｍｄａ−７）、およびＩＬ−２６、インターフェロン（ＩＦＮ−α、−β、−γ、−δ、−ε、−κ、−Ω、および−τ）ならびにインターフェロン様分子（リミチン、ＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ、およびＩＬ−２９）が含まれる。
【００６９】
ＩＬ−１０は、免疫調節および炎症に多面的効果のあるサイトカインである。ＩＬ−１０は肥満細胞により産生され、肥満細胞がアレルギー反応部位で発揮する炎症作用に拮抗する。ＩＬ−１０は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦなどの炎症誘発性サイトカインの合成を阻害することができるが、また特定のＴ細胞および肥満細胞に対して刺激性であり、Ｂ細胞の成熟、増殖および抗体産生を刺激する。ＩＬ−１０はＮＦ−κΒ活性を遮断でき、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の調節に関与している。またＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性およびＢ細胞の抗体産生を誘導し、かつマクロファージ活性および腫瘍促進性の炎症を抑制する。ＣＤ８＋Ｔ細胞の調節は用量依存性であり、用量が多いほど細胞傷害応答が強くなる。
【００７０】
ヒトＩＬ−１０は分子質量が３７ｋＤａのホモ二量体であり、各１８．５ｋＤａの単量体は１７８個のアミノ酸を含み、その最初の１８個はシグナルペプチドと、２つの分子内ジスルフィド結合を形成する２組のシステイン残基とを含む。成熟ｈＩＬ−１０の各単量体は１６０個のアミノ酸残基を含む。ＩＬ−１０二量体は、２つの単量体サブユニット間の非共有結合相互作用が崩壊すると生物学的に不活性になる。図１Ａに１７８アミノ酸のヒトＩＬ−１０の全配列を示し（１８アミノ酸シグナルペプチドに下線を施す）、図１Ｂに１６０アミノ酸の成熟ヒトＩＬ−１０の配列を示す。
【００７１】
本開示は、８０％の相同性を示すヒトＩＬ−１０およびマウスＩＬ−１０、ならびにその使用を企図する。さらに、本開示の範囲には、ラット（アクセッョシンＮＰ＿０３６９８６．２；ＧＩ１４８７４７３８２）；ウシ（アクセッションＮＰ＿７７６５１３．１；ＧＩ４１３８６７７２）；ヒツジ（アクセッションＮＰ＿００１００９３２７．１；ＧＩ５７１６４３４７）；イヌ（アクセッションＡＢＹ８６６１９．１；ＧＩ１６６２４４５９８）；およびウサギ（アクセッションＡＡＣ２３８３９．１；ＧＩ３２４２８９６）を含む他の哺乳動物種由来のＩＬ−１０オルソログおよびその修飾型が含まれる。
【００７２】
ＩＬ−１０の結晶構造（Ｚｄａｎｏｖ，Ａ．ら，（１９９５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ）３：５９１−６０１ならびにＷａｌｔｅｒ，Ｍ．およびＮａｇａｂｈｕｓｈａｎ，Ｔ．，（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（３８）：１２１１８−２５）；ならびに可溶性受容体を伴ったｈＩＬ−１０の結晶構造モデル（Ｚｄａｎｏｖ，Ａ．ら，（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．（１０）：１９５５−６２）から得られたデータを含め、多数の入手源から得られた結晶学的データが公開されている。成熟ヒトＩＬ−１０（ｈＩＬ−１０）の１６０アミノ酸の各単量体は、短いループで連結された６つのへリックスを含む。図３Ａに、６つのへリックスにＡ〜Ｆの表示を付したｈＩＬ−１０単量体のタンパク質結晶構造のリボン図を示し、図３Ｂに、各単量体の６つのへリックスにＡ〜Ｆの表示を付したｈＩＬ−１０ホモ二量体のタンパク質結晶構造のリボン図を示す。
【００７３】
ＩＩ型サイトカイン受容体のＩＬ−１０受容体はアルファサブユニットおよびベータサブユニットを含み、これらのサブユニットはそれぞれＲ１およびＲ２とも呼ばれる。ＩＬ−１０受容体結合の機序は十分には明らかにされていないが、ＩＬ−１０シグナル伝達にはＩＬ−１０Ｒ１およびＩＬ−１０Ｒ２の両方の寄与が必要であることが示されている。これは、１つのＩＬ−１０ホモ二量体が単独で、ある種のクラスター形成事象とともにＩＬ−１０Ｒ１およびＩＬ−１０Ｒ２の両方と結合するか、１つのＩＬ−１０ホモ二量体が、ＩＬ−１０Ｒ１およびＩＬ−１０Ｒ２の両方と単一の複合体を形成することによって起こると考えられる。ＩＬ−１０／ＩＬ−１０Ｒ１複合体の結晶構造は既に公開されており（Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ，Ｋ．ら，（２００１）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１）：３５−４６）、図３Ｃに、２つのヒトＩＬ１０Ｒ１／α受容体（黒色）に結合したヒトＩＬ１０ホモ二量体（灰色）のタンパク質結晶構造のリボン図を示す。
【００７４】
本明細書にはまた、ＩＬ−１０断片；ＩＬ−１０単量体をベースとするポリペプチド；異種タンパク質と複合体を形成したＩＬ−１０単量体を含む分子；および１つまたは複数の治療剤（例えば、抗炎症性生物学的製剤）に核酸レベルで融合したＩＬ−１０融合タンパク質を含む他のＩＬ−１０分子が包含される。このような分子は、本明細書に記載される方法または当業者に公知の他の任意の方法を用いて修飾され得る。
【００７５】
本明細書で使用される「ペグ化ＩＬ−１０」という用語は、結合が安定するように一般にはリンカーを介してＩＬ−１０タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸残基に共有結合させた１つまたは複数のポリエチレングリコール分子を有する、ＩＬ−１０分子を指す。「モノペグ化ＩＬ−１０」という用語は、１つのポリエチレングリコール分子が、ＩＬ−１０二量体の一方のサブユニットの単一のアミノ酸残基に一般にはリンカーを介して結合していることを表す。ある特定の実施形態では、本開示で使用されるペグ化ＩＬ−１０とは、１〜９つのＰＥＧ分子が、ＩＬ−１０二量体の一方のサブユニットのＮ末端にあるアミノ酸残基のアルファアミノ基にリンカーを介して共有結合しているモノペグ化ＩＬ−１０のことである。一方のＩＬ−１０サブユニットをモノペグ化すると一般に、サブユニットシャッフリングにより非ペグ化ＩＬ−１０、モノペグ化ＩＬ−１０およびジペグ化ＩＬ−１０の不均一混合物が生じる。さらに、ＰＥＧ化反応を終了するまで進行させると一般に、非特異的な多ペグ化ＩＬ−１０が生じてその生物活性が低下する。本開示のいくつかの実施形態は、本明細書に記載される方法によって作製したモノペグ化ＩＬ−１０とジペグ化ＩＬ−１０との混合物の投与を含む。
【００７６】
特定の実施形態では、ＰＥＧ部分の平均分子量は約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａである。例えば、ＰＥＧ部分は、分子質量が約５ｋＤａより大きく、約１０ｋＤａより大きく、約１５ｋＤａより大きく、約２０ｋＤａより大きく、約３０ｋＤａより大きく、約４０ｋＤａより大きく、または約５０ｋＤａを上回り得る。いくつかの実施形態では、分子質量は、約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約１５ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１５ｋＤａ、約ｌ０ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約２５ｋＤａまたは約１０ｋＤａ〜約３０ｋＤａである。本開示は、特定の方法またはＩＬ−１０に対するペグ結合の特定の部位を必要としないが、ペグ化はＩＬ−１０分子の活性を変化させないか、最小限にのみ変化させることがしばしば有利である。ある特定の実施形態では、ペグ化によって達成される半減期の増加が任意の生物活性低下を上回る。特定の実施形態では、ＭＣ／９細胞増殖アッセイを用いてロットリリースおよびＰＥＧ−ＩＬ−１０の生物活性を測定し、その具体例を実験の節に記載する。いくつかの実施形態では、米国特許第７，０５２，６８６号に記載されているように、細菌抗原（リポ多糖（ＬＰＳ））を負荷してＰＥＧ−ＩＬ−１０で処置した対象の血清中の炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−γ）濃度を評価することによって、ＰＥＧ−ＩＬ−１０の生物活性を測定する。ペグ化のさらなる態様については以降でさらに記載する。
【００７７】
「保存的アミノ酸置換」という語句は、タンパク質中のアミノ酸（１つまたは複数）を側鎖の酸性度、塩基性度、電荷、極性、または大きさが類似したアミノ酸に置き換えることによって、タンパク質の活性を保存する置換を指す。保存的アミノ酸置換では一般に、次に挙げるグループ内でのアミノ酸残基が必要である：１）Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｆ；２）Ｒ、Ｋ；３）Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｗ、Ｒ；４）Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｓ；５）Ｑ、Ｎ；および６）Ｄ、Ｅ。置換、挿入、または欠失の誘導は、様々な変異体タンパク質または様々な種のタンパク質のアミノ酸配列のアライメントに基づいてよい。したがって、本開示は、任意の天然のＩＬ−１０ポリペプチドに加えて、アミノ酸置換を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個、通常は２０個、１０個、または５個以下のアミノ酸置換を有するものを企図し、この場合、置換は通常、保存的アミノ酸置換である。部位特異的コンジュゲーションを促進する１つの方法として、ＩＬ−１０に１つまたは複数の非天然アミノ酸を導入し得ることに留意するべきである。
【００７８】
本開示はまた、成熟ＩＬ−１０に由来する連続するアミノ酸残基を含む、成熟ＩＬ−１０の活性断片（例えば、サブ配列）を企図する。ペプチドまたはポリペプチドサブ配列の連続するアミノ酸残基の長さは、そのサブ配列が由来する具体的な天然のアミノ酸配列によって異なる。一般に、ペプチドおよびポリペプチドは約２０アミノ酸〜約４０アミノ酸、約４０アミノ酸〜約６０アミノ酸、約６０アミノ酸〜約８０アミノ酸、約８０アミノ酸〜約１００アミノ酸、約１００アミノ酸〜約１２０アミノ酸、約１２０アミノ酸〜約１４０アミノ酸、約１４０アミノ酸〜約１５０アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約１５５アミノ酸、約１５５アミノ酸〜最大で完全長ペプチドまたはポリペプチドであり得る。
【００７９】
さらに、ＩＬ−１０ポリペプチドは、一定の長さの連続するアミノ酸（例えば、「比較ウィンドウ」）にわたって参照配列と比較した一定の配列同一性を有し得る。比較のための配列アライメントの方法は当該技術分野で周知である。比較のための最適な配列アライメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のローカル相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の相同性検索法、コンピュータを用いた上記アルゴリズムの実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または手作業によるアライメントおよび視認によって実施できる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９５，補遺）を参照されたい）。
【００８０】
一例として、適切なＩＬ−１０ポリペプチドは、連続する約２０アミノ酸〜約４０アミノ酸、約４０アミノ酸〜約６０アミノ酸、約６０アミノ酸〜約８０アミノ酸、約８０アミノ酸〜約１００アミノ酸、約１００アミノ酸〜約１２０アミノ酸、約１２０アミノ酸〜約１４０アミノ酸、約１４０アミノ酸〜約１５０アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約１５５アミノ酸、約１５５アミノ酸〜最大で完全長ペプチドまたはポリペプチドの長さに対し、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００８１】
のちにさらに論じるように、ＩＬ−１０ポリペプチドは天然の入手源（例えば、その天然の環境以外の環境）から単離してよく、また組換えによって作製してもよく（例えば、細菌、酵母、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、昆虫細胞などの遺伝的に改変した宿主細胞で）、この場合、遺伝的に改変した宿主細胞はＩＬ−１０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で改変される。ＩＬ−１０ポリペプチドはまた、合成により（例えば、無細胞化学合成により）作製してもよい。
【００８２】
それらの天然または非天然アイソフォーム、対立遺伝子変異体およびスプライスバリアントを含む、ＩＬ−１０分子をコードする核酸分子が本開示によって企図される。本開示はまた、天然のＤＮＡ配列とは１つまたは複数の塩基が異なるが、遺伝暗号の縮重により依然としてＩＬ−１０ポリペプチドに対応するアミノ酸配列に翻訳される核酸配列を包含する。
【００８３】
ＩＬ−１０の作製方法
本開示のポリペプチドは、非組換え法（例えば、化学合成）および組換え法を含む任意の適切な方法によって作製できる。
【００８４】
Ａ．化学合成
ポリペプチドを化学的に合成する場合、液相または固相を介して合成を進め得る。固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）では非天然のアミノ酸の組み込みおよび／またはペプチド／タンパク質主鎖の修飾が可能である。本開示のポリペプチドの合成には、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）およびｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）などの様々な形態のＳＰＰＳを用いることができる。化学合成の詳細は当該技術分野で公知である（例えば、Ｇａｎｅｓａｎ  Ａ．（２００６）Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６：３−１０；およびＣａｍａｒｅｒｏ  Ｊ．Ａ．ら，（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｌｅｔｔ．１２：７２３−８）。
【００８５】
Ｂ．組換えによる作製
ヒト（およびマウス）ＩＬ−１０の調製について記載している方法が、例えば米国特許第５，２３１，０１２号にみることができ、この特許には組換えをはじめとする合成技術を含め、ＩＬ−１０活性を有するタンパク質の作製方法が教示されている。ＩＬ−１０はウイルス起源であってもよく、エプスタイン・バーウイルス由来のウイルスＩＬ−１０（ＢＣＲＦ１タンパク質）のクローン化および発現が、Ｍｏｏｒｅら，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：１２３０に開示されている。ＩＬ−１０は、本明細書に記載されるものなどの当該技術分野で公知の標準的な技術を用いた多数の方法で入手できる。組換えヒトＩＬ−１０もまた、例えばＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社（ロッキーヒル、ニュージャージー州）から市販されている。
【００８６】
部位特異的変異誘発（部位指定変異誘発およびオリゴヌクレオチド指定変異誘発とも呼ばれる）を用いてＤＮＡに特異的変異を生じさせ、改善された特性または所望の特性を有する合理的に設計された本開示のタンパク質（例えば、そのドメインを含む、特定のＩＬ−１０変異タンパク質をはじめとする修飾型のＩＬ−１０）を作製できる。部位特異的変異誘発の技術は当該技術分野で周知である。初期の部位特異的変異誘発法（例えば、Ｋｕｎｋｅｌの方法；カセット変異誘発；ＰＣＲ部位指定変異誘発；およびＳＰＲＩＮＰを含む、全プラスミド変異誘発）は、Ｄｅｌｉｔｔｏ  ｐｅｒｆｅｔｔｏ法（Ｓｔｏｒｉｃｉ  Ｆ．およびＲｅｓｎｉｃｋ  ＭＡ，（２００６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４０９：３２９−４５）；トランスプレイスメント（ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）  「ポップイン・ポップアウト（ｐｏｐ−ｉｎ  ｐｏｐ−ｏｕｔ）」法；ＰＣＲおよび１つの再利用可能なマーカーによる直接的な遺伝子欠失および部位特異的変異誘発；長い相同領域を用いたＰＣＲおよび１つの再利用可能なマーカーによる直接的な遺伝子欠失および部位特異的変異誘発；および合成オリゴヌクレオチドによるｉｎ  ｖｉｖｏ部位指定変異誘発を含む様々なｉｎ  ｖｉｖｏ法などのより正確で効率的な方法に取って代わられている（ほかにも例えば、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），第２版，ＩＳＢＮ  ９７８−０８９６０３９１００を参照されたい）。さらに、部位特異的変異誘発を実施するためのツールが市販されている（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ラホヤ、カリフォルニア州）。
【００８７】
組換え技術を用いてポリペプチドを作製する場合、任意の適切な構築物および任意の適切な宿主細胞を用いて、細胞内タンパク質または分泌タンパク質としてポリペプチドを作製でき、宿主細胞は原核細胞または真核細胞、例えばそれぞれ細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））または酵母などの宿主細胞であってよい。宿主細胞として使用し得る真核細胞の他の具体例としては、昆虫細胞、哺乳動物細胞、および／または植物細胞が挙げられる。哺乳動物宿主細胞を使用する場合、宿主細胞としては、ヒト細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、Ｈ９細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞）；マウス細胞（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｌ細胞、およびＣ１２７細胞）；霊長類細胞（例えば、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７およびＣＶ１）；およびハムスター細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）が挙げられる。
【００８８】
当該技術分野で公知の標準的な方法に従って、ポリペプチドの発現に適した様々な宿主−ベクター系を使用し得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ編を参照されたい。宿主細胞内に遺伝物質を導入する方法としては、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、コンジュゲーション、リン酸カルシウム法などが挙げられる。導入したポリペプチドをコードする核酸が安定に発現するように導入方法を選択できる。ポリペプチドをコードする核酸は遺伝性のエピソーム要素（例えば、プラスミド）として提供することも、ゲノムに組み込むことも可能である。対象ポリペプチドの作製に使用される様々な適切なベクターが市販されている。
【００８９】
ベクターは宿主細胞での染色体外維持を提供でき、または宿主細胞ゲノム内への組み込みを提供できる。発現ベクターは転写および翻訳制御配列を提供し、コード領域が転写開始領域、ならびに転写および翻訳終止領域の転写制御下で作動可能に連結された、誘導的または構成的発現をもたらし得る。一般に、転写および翻訳制御配列としては、特に限定されないが、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を挙げ得る。プロモーターは構成性であっても誘導性であってもよく、強力な構成性プロモーター（例えば、Ｔ７）であってもよい。
【００９０】
発現構築物は一般に、プロモーター配列付近に位置し対象タンパク質をコードする核酸配列の挿入をもたらすのに好都合な制限部位を有する。ベクターを含む細胞の選択を容易にするため、発現宿主内で作動可能な選択マーカーが存在し得る。さらに、発現構築物は追加的要素を含んでもよい。例えば、発現ベクターは、１つまたは２つの複製系を有することで、生物体内、例えば、発現のための哺乳動物細胞または昆虫細胞内でおよびクローン化および増幅のための原核宿主内で維持することが可能になり得る。さらに、発現構築物は、形質転換した宿主細胞の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含み得る。選択可能な遺伝子は当該技術分野で周知であり、使用する宿主細胞によって異なる。
【００９１】
当該技術分野で公知の方法に従って、タンパク質の単離および精製を実施できる。例えば、タンパク質を恒常的にかつ／または導入時に発現するよう遺伝的に改変した細胞の溶解物からタンパク質を単離でき、あるいは一般に試料を抗タンパク質抗体と接触させ、非特異的に結合した物質を洗浄して除去し、かつ特異的に結合したタンパク質を溶出する免疫アフィニティー精製によって、タンパク質を合成反応混合物から単離できる。単離したタンパク質は、透析をはじめとするタンパク質精製に通常用いられる方法によってさらに精製できる。一実施形態では、金属キレートクロマトグラフィー法を用いてタンパク質を単離し得る。タンパク質は単離を容易にする修飾を含み得る。
【００９２】
ポリペプチドは実質的に純粋なまたは単離された形態（例えば、他のポリペプチドを含まない）で調製され得る。ポリペプチドは、存在し得る他の成分（例えば、他のポリペプチドまたはその他の宿主細胞の成分）に比べてポリペプチドが富化された組成物中に存在し得る。例えば、精製ポリペプチドは、他の発現タンパク質が実質的に含まれない組成物中に存在するように、例えば、約９０％未満、約６０％未満、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満または約１％未満で提供し得る。
【００９３】
異なるＩＬ−１０関連核酸を操作する当該技術分野で公知の組換え技術を用いてＩＬ−１０ポリペプチドを作製してＩＬ−１０ポリペプチドをコードできる構築物を得てもよい。特定のアミノ酸配列が得られたとき、当業者であれば、自身の例えば分子生物学の経歴および経験を踏まえて、そのようなアミノ酸配列をコードする様々な異なる核酸分子を認識することが理解されよう。
【００９４】
ＩＬ−１０の修飾
Ａ．アミド結合置換
いくつかの場合には、ＩＬ−１０はペプチド結合以外の１つまたは複数の結合を含み、例えば、少なくとも２つの隣接するアミノ酸がアミド結合以外の結合を介して連結されている。例えば、望ましくないタンパク質分解または他の分解の発生源を減少させる、もしくは除去するために、および／または血清中での安定性を増大させるために、および／または立体配座の柔軟性を制限する、もしくは増大させるために、ＩＬ−１０主鎖内の１つまたは複数のアミド結合を置換し得る。
【００９５】
また別の例では、ＩＬ−１０中の１つまたは複数のアミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を、アミド結合のアイソスターである結合、例えば−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−または−ＣＨ２ＳＯ−などに置き換えることができる。ＩＬ−１０中の１つまたは複数のアミド結合を、例えば、還元アイソスター偽ペプチド結合に置き換えることもできる。Ｃｏｕｄｅｒら（１９９３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４１：１８１−１８４を参照されたい。このような置換およびそれらの実施方法は当業者に公知である。
【００９６】
Ｂ．アミノ酸置換
ＩＬ−１０ポリペプチドに１つまたは複数のアミノ酸置換を実施できる。次に挙げるのは非限定的な例である：
ａ）アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、ノルロイシン、（Ｓ）−２−アミノ酪酸、（Ｓ）−シクロヘキシルアラニンまたは分岐状、環状および直鎖状のアルキル、アルケニルまたはアルキニル置換を含むＣ１〜Ｃ１０炭素から脂肪族側鎖によって置換されたその他の単純アルファアミノ酸を含む、アルキル置換疎水性アミノ酸の置換；
ｂ）フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、スルホチロシン、ビフェニルアラニン、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、２−ベンゾチエニルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、ヒスチジンを含み、上記芳香族アミノ酸のアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アザ、ハロゲン化（フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード）またはアルコキシ（Ｃ１〜Ｃ４から）置換型（その具体例には、２−、３−または４−アミノフェニルアラニン、２−、３−または４−クロロフェニルアラニン、２−、３−または４−メチルフェニルアラニン、２−、３−または４−メトキシフェニルアラニン、５−アミノ−、５−クロロ−、５−メチル−または５−メトキシトリプトファン、２’−、３’−または４’−アミノ−、２’−、３’−または４’−クロロ−、２、３または４−ビフェニルアラニン、２’−、３’−または４’−メチル−、２−、３−または４−ビフェニルアラニンおよび２−または３−ピリジルアラニンがある）を含む、芳香族置換疎水性アミノ酸の置換；
ｃ）アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン、２，３−ジアミノプロピオン酸、ホモアルギニンを含み、置換基がヘテロ原子（アルファ窒素、または１つもしくは複数の遠位窒素）上にあるか、アルファ炭素上にあるのかを問わず、例えばプロＲ位にある、上記アミノ酸のアルキル、アルケニル、またはアリール置換（分岐状、直鎖状、または環状のＣ１〜Ｃ１０から）誘導体を含む、塩基性側鎖を含むアミノ酸の置換。具体例となる化合物としては、Ｎ−イプシロン−イソプロピル−リジン、３−（４−テトラヒドロピリジル）−グリシン、３−（４−テトラヒドロピリジル）−アラニン、Ｎ，Ｎ−ガンマ、ガンマ’−ジエチル−ホモアルギニンが挙げられる。またアルキル基がアルファ炭素のプロＲ位を占めるアルファ−メチル−アルギニン、アルファ−メチル−２，３−ジアミノプロピオン酸、アルファ−メチル−ヒスチジン、アルファ−メチル−オルニチンなどが挙げられる。またアルキル、芳香族、ヘテロ芳香族（ヘテロ芳香族基が１つまたは複数の窒素、酸素または硫黄原子を単一で、または組み合わせて有する場合）、カルボン酸または酸塩化物、活性エステル、活性アゾリドおよび関連する誘導体などの多数の周知の活性化誘導体のいずれかと、リジン、オルニチン、または２，３−ジアミノプロピオン酸とから形成されるアミドが挙げられる；
ｄ）アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、チロシン、２，４−ジアミノプリオピオン酸（ｄｉａｍｉｎｏｐｒｉｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）のアルキル、アリール、アリールアルキル、およびヘテロアリールスルホンアミド、オルニチンまたはリジンならびにテトラゾール−置換アルキルアミノ酸を含む、酸性アミノ酸の置換；
ｅ）アスパラギン、グルタミン、およびアスパラギンもしくはグルタミンのアルキルまたは芳香族置換誘導体を含む、側鎖アミド残基の置換；ならびに
ｆ）セリン、トレオニン、ホモセリン、２，３−ジアミノプロピオン酸、およびセリンもしくはトレオニンのアルキルまたは芳香族置換誘導体を含む、ヒドロキシル含有アミノ酸の置換。
【００９７】
いくつかの場合には、ＩＬ−１０は、天然に存在する非遺伝的にコードされているＬ−アミノ酸、合成Ｌ−アミノ酸、またはアミノ酸のＤ鏡像異性体を１つまたは複数含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１０はＤ−アミノ酸のみを含む。例えば、ＩＬ−１０ポリペプチドは次に挙げる残基を１つまたは複数含み得る：ヒドロキシプロリン、β−アラニン、ｏ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノメチル安息香酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、オルニチン、シトルリン、ｔ−ブチルアラニン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、ナフチルアラニン、ピリジルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、β−２−チエニルアラニン、メチオニンスルホキシド、ホモアルギニン、Ｎ−アセチルリジン、２，４−ジアミノ酪酸、ｒｈｏ−アミノフェニルアラニン、Ｎ−メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン、ε−アミノヘキサン酸、ω−アミノヘキサン酸、ω−アミノヘプタン酸、ω−アミノオクタン酸、ω−アミノデカン酸、ω−アミノテトラデカン酸、シクロヘキシルアラニン、α，γ−ジアミノ酪酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、δ−アミノ吉草酸、および２，３−ジアミノ酪酸。
【００９８】
Ｃ．ＩＬ−１０の追加的修飾
ＩＬ−１０ポリペプチドにシステイン残基またはシステイン類似体を導入して、ジスルフィド結合を介した別のペプチドとの結合を生じさせるか、ＩＬ−１０ポリペプチドの環化を生じさせることができる。システインまたはシステイン類似体を導入する方法は当該技術分野で公知である（例えば、米国特許第８，０６７，５３２号を参照されたい）。
【００９９】
ＩＬ−１０ポリペプチドを環化することができる。ＩＬ−１０ポリペプチドに１つまたは複数のシステインまたはシステイン類似体を導入でき、この場合、導入されたシステインまたはシステイン類似体は第二の導入されたシステインまたはシステイン類似体とジスルフィド結合を形成し得る。その他の環化の方法としては、オキシムリンカーまたはランチオニンリンカーの導入が挙げられる；例えば、米国特許第８，０４４，１７５号を参照されたい。環化結合を形成できるアミノ酸（または非アミノ酸部分）の任意の組合せを使用および／または導入できる。架橋の導入を可能にする官能基を有するアミノ酸の任意の組合せ（またはアミノ酸および−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−または−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ６Ｈ４−ＣＯ−）を用いて環化結合を生じさせることができる。いくつかの具体例には、ジスルフィド、−（ＣＨ２）ｎ−カルバ架橋などのジスルフィド模倣物、チオアセタール、チオエーテル架橋（シスタチオニンまたはランチオニン）およびエステルとエーテルとを含む架橋がある。これらの例では、ｎは任意の整数であってよいが、多くの場合、１０未満である。
【０１００】
その他の修飾としては、例えば、Ｎ−アルキル（またはアリール）置換（Ψ［ＣＯＮＲ］）、またはラクタムをはじめとする環状構造を構築するための主鎖架橋が挙げられる。その他の誘導体としては、Ｃ末端ヒドロキシメチル誘導体、ｏ−修飾誘導体（例えば、Ｃ末端ヒドロキシメチルベンジルエーテル）、アルキルアミドおよびヒドラジドなどの置換アミドを含むＮ末端修飾誘導体が挙げられる。
【０１０１】
いくつかの場合には、ＩＬ−１０ポリペプチド内の１つまたは複数のＬ−アミノ酸を１つまたは複数のＤ−アミノ酸に置き換える。
【０１０２】
いくつかの場合には、ＩＬ−１０ポリペプチドはレトロインベルソ類似体である（例えば、ＳｅｌａおよびＺｉｓｍａｎ（１９９７）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１１：４４９を参照されたい）。レトロインベルソペプチド類似体とは、直鎖ポリペプチドの異性体で、例えばＬ−アミノ酸ではなくＤ−アミノ酸を用いて、アミノ酸配列の方向を逆（レトロ）にし、その中の１つまたは複数のアミノ酸のキラリティー、Ｄ型またはＬ型を逆転（インベルソ）させた異性体のことである［例えば、Ｊａｍｅｓｏｎら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：７４４；およびＢｒａｄｙら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：６９２を参照されたい］。
【０１０３】
ＩＬ−１０ポリペプチドは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、オルガネラ膜、または小胞膜の横断を促進するポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または有機もしくは無機分子を指す「タンパク質形質導入ドメイン」（ＰＴＤ）を含み得る。別の分子と結合したＰＴＤは、その分子が膜を横断する、例えば細胞外空間から細胞内空間に、または細胞質ゾルからオルガネラ内に移動するのを促進する。いくつかの実施形態では、ＰＴＤをＩＬ−１０ポリペプチドのアミノ末端に共有結合させ、他の実施形態では、ＰＴＤをＩＬ−１０ポリペプチドのカルボキシル末端に共有結合させる。例示的なタンパク質形質導入ドメインとしては、特に限定されないが、最小ウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを含むＨＩＶ−１  ＴＡＴの残基４７〜５７に対応する；配列番号４）；細胞内への移行を指令するのに十分な多数のアルギニン残基を含むポリアルギニン配列（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０〜５０アルギニン）；ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９（６）：４８９−９６）；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）アンテナペディアタンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉら（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２（７）：１７３２−１７３７）；短縮ヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎら（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：１２４８−１２５６）；ポリリジン（Ｗｅｎｄｅｒら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１３００３−１３００８）；ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号５）；トランスポータンＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号６）；ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号７）；およびＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号８）が挙げられる。例示的なＰＴＤとしては、特に限定されないが、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４）；ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号９）；３アルギニン残基〜５０アルギニン残基のアルギニンホモポリマーが挙げられ；例示的なＰＴＤドメインアミノ酸配列としては、特に限定されないが、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４）；ＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号１０）；ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号１１）；ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号１２）；およびＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号１３）のうちのいずれかが挙げられる。
【０１０４】
ＩＬ−１０ポリペプチドのＣ末端のアミノ酸のカルボキシル基ＣＯＲ３は、遊離型（Ｒ３＝ＯＨ）または生理学的に耐容性があるアルカリもしくはアルカリ土類塩の形態、例えば、ナトリウム、カリウムもしくはカルシウム塩などの形態で存在し得る。カルボキシル基はまた、第一級、第二級または第三級アルコール、例えばメタノール、分岐または不分岐Ｃ１〜Ｃ６−アルキルアルコール、例えばエチルアルコールまたはｔｅｒｔ−ブタノールなどでエステル化されていてもよい。カルボキシル基はまた、第一級または第二級アミン、例えばアンモニア、分岐または不分岐Ｃ１〜Ｃ６−アルキルアミンまたはＣ１〜Ｃ６ジ−アルキルアミン、例えばメチルアミンまたはジメチルアミンでアミド化されていてもよい。
【０１０５】
ＩＬ−１０ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸ＮＲ１Ｒ２のアミノ基は、遊離型（Ｒ１＝Ｈであり、かつＲ２＝Ｈである）または生理学的に耐容性がある塩、例えば塩化物または酢酸塩などの形態で存在し得る。アミノ基はまた、Ｒ１＝ＨかつＲ２＝アセチル、トリフルオロアセチル、またはアダマンチルとなるように酸でアセチル化されていてもよい。アミノ基は、ペプチド化学で従来通りに用いられる上記のようなアミノ保護基など（例えば、Ｆｍｏｃ、ベンジルオキシ−カルボニル（Ｚ）、Ｂｏｃ、およびＡｌｌｏｃ）によって保護された形態で存在し得る。アミノ基は、Ｒ１および／またはＲ２＝Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ２〜Ｃ８アルケニルまたはＣ７〜Ｃ９アラルキルとなるようにＮ−アルキル化されていてもよい。アルキル残基は、直鎖状、分岐鎖状または環状（例えば、それぞれエチル、イソプロピルおよびシクロヘキシル）であり得る。
【０１０６】
Ｄ．ＩＬ−１０機能を増強および／または模倣するＰＥＧ化およびその他の修飾
多くの場合、本明細書に開示される治療様式（例えば、ＩＬ−１０分子）および／またはこれを投与する方法の１つまたは複数の物理学的特性を改善するのが有益であり、かつ不可欠な場合もある。物理学的特性の改善としては、例えば、免疫原性の調節；溶解性、バイオアベイラビリティ、血漿半減期を増大させる方法；および生物活性の調節が挙げられる。ある特定の修飾もまた、例えば、検出アッセイに使用する抗体を得る（例えば、エピトープタグ）ため、およびタンパク質精製を容易にするために有用であり得る。このような改善は一般に、治療様式の生物活性に悪影響を及ぼさず、かつ／またはその免疫原性を増大させずに得られるものでなければならない。本開示が企図するＩＬ−１０分子の修飾としては、特に限定されないが、ＰＥＧ化、グリコシル化（Ｎ−およびＯ−結合）；ポリシアル化；血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カニクイザル血清アルブミン、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を含むアルブミン融合分子；例えば共役脂肪酸鎖（アシル化）を介したアルブミン結合；およびＦｃ−融合タンパク質が挙げられる。
【０１０７】
特定の実施形態では、ポリペプチド配列を、任意の様々な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンにコンジュゲートまたは連結することによってＩＬ−１０分子を修飾する。これは、タンパク質および非タンパク質性ポリマー、例えばＰＥＧの両方に共有結合する連結部分によって実施することが多い。このようなＰＥＧコンジュゲート生体分子は、物理学的安定性および熱安定性の向上；酵素分解を受けないように保護すること；溶解性の増大；より長い血漿中半減期およびクリアランスの減少；免疫原性および抗原性の低下；ならびに毒性の低下を含む臨床的に有用な特性を有することが示されている。
【０１０８】
ＰＥＧ化が薬物動態パラメータに有益な効果を及ぼすことに加えて、ＰＥＧ化自体が活性を増強し得る。例えば、ペグ化ＩＬ−１０は、特定の癌に対して非ペグ化ＩＬ−１０よりも効果があることが示されている（例えば、欧州特許出願公開第２０６６３６号（Ａ２）を参照されたい）。
【０１０９】
ＰＥＧ化分子の治療的価値は十分に実証されている。以前のおよび／または現在の医薬品としては、ＯＭＯＮＴＹＳ（Ａｆｆｙｍａｘ社／Ｔａｋｅｄａ社）；ペグロチカーゼ（Ｓａｖｉｅｎｔ社）；ＣＩＭＺＩＡ（Ｎｅｋｔａｒ社／ＵＣＢ  Ｐｈａｒｍａ社）；ＭＡＣＵＧＥＮ（Ｐｒｉｚｅｒ社）；ＮＥＵＬＡＳＴＡ（Ａｍｇｅｎ社）；ＳＯＭＡＶＥＲＴ（Ｐｒｉｚｅｒ社）；ＰＥＧＡＳＹＳ（Ｒｏｃｈｅ社）；ＤＯＸＩＬ（Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）およびＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ社）が挙げられる。
【０１１０】
ポリペプチド配列へのコンジュゲーションに適したＰＥＧは一般に、室温で水に可溶であり、一般式Ｒ（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯ−Ｒを有し、式中、Ｒは水素またはアルキルもしくはアルカノール基などの保護基であり、ｎは１〜１０００の整数である。Ｒが保護基である場合、それは一般に１〜８個の炭素を有する。ポリペプチド配列にコンジュゲートするＰＥＧは直鎖であっても分岐鎖であってもよい。分岐鎖ＰＥＧ誘導体、「星型ＰＥＧ」および多腕型のＰＥＧが本開示により企図される。本開示で使用されるＰＥＧの分子量（分子質量）は、いかなる特定の範囲にも限定されない。ある特定の実施形態では分子量が５ｋＤａ〜２０ｋＤａであり、他の実施形態では分子量が４ｋＤａ〜１０ｋＤａである。さらなる分子量を有するＰＥＧについては本明細書の他の箇所に記載されている。
【０１１１】
本開示はまた、ＰＥＧのｎ値が異なり、したがって様々な異なるＰＥＧが特定の比で存在する、コンジュゲートの組成物を企図する。例えば、いくつかの組成物は、ｎ＝１、２、３および４であるコンジュゲートの混合物を含む。いくつかの組成物では、ｎ＝１であるコンジュゲートの割合が１８〜２５％であり、ｎ＝２であるコンジュゲートの割合が５０〜６６％であり、ｎ＝３であるコンジュゲートの割合が１２〜１６％であり、ｎ＝４であるコンジュゲートの割合が最大５％である。このような組成物は当該技術分野で公知の反応条件および精製方法によって作製できる。例示的な反応条件については本明細書全体を通して記載されている。陽イオン交換クロマトグラフィーを用いてコンジュゲートを分離した後、例えば、所望の数のＰＥＧが結合したコンジュゲートを含む画分を特定し、未修飾タンパク質配列および他の数のＰＥＧが結合したコンジュゲートを含まないよう精製し得る。
【０１１２】
ＰＥＧ化は、ポリペプチドのＮ末端のアルファアミノ基、リジン残基側鎖のイプシロンアミノ基、およびヒスチジン残基側鎖のイミダゾール基で最も頻繁に起こる。ほとんどの組換えポリペプチドは単一のアルファアミノ基と多数のイプシロンアミノ基およびイミダゾール基を有するため、リンカーの化学的性質によって多数の位置異性体が生じ得る。本明細書では、当該技術分野で公知の一般的なＰＥＧ化戦略を適用し得る。１つまたは複数のポリペプチド配列の遊離アミノ基またはカルボキシル基とポリエチレングリコールとの結合を仲介する末端反応基（「スペーサー」）を介して、ＰＥＧを本開示のポリペプチドに結合させ得る。遊離アミノ基に結合し得るスペーサーを有するＰＥＧとしてはＮ−ヒドロキシスクシニルイミドポリエチレングリコールが挙げられ、これはポリエチレングリコールとＮ−ヒドロキシスクシニルイミドとのコハク酸エステルを活性化することによって調製され得る。遊離アミノ基に結合し得る別の活性化ポリエチレングリコールには２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−クロロ−ｓ−トリアジンがあり、これはポリエチレングリコールモノメチルエーテルと塩化シアヌルとを反応させることによって調製され得る。遊離カルボキシル基に結合する活性化ポリエチレングリコールとしては、ポリオキシエチレンジアミンが挙げられる。
【０１１３】
スペーサーを有するＰＥＧへの１つまたは複数の本開示のポリペプチド配列のコンジュゲーションは、様々な従来の方法によって実施し得る。例えば、コンジュゲーション反応はｐＨ５〜１０の溶液中、例えば１：１；１．５：１；４：１〜３０：１の試薬とタンパク質のモル比を用いて、温度４℃〜室温にて３０分〜２０時間で実施し得る。所望の程度の置換が主に生じるように反応を進めるよう反応条件を選択し得る。一般に、低温、低ｐＨ（例えば、ｐＨ＝５）、および短い反応時間が結合するＰＥＧの数を減少させる傾向があり、高温、中性〜高ｐＨ（例えば、ｐＨが７以上）、およびより長い反応時間が結合するＰＥＧの数を増加させる傾向がある。当該技術分野で公知の様々な方法を用いて反応を停止させ得る。いくつかの実施形態では、反応混合物を酸性化し、例えば−２０℃で凍結させることによって反応を停止させる。様々な分子のＰＥＧ化が、例えば、米国特許第５，２５２，７１４号；同第５，６４３，５７５号；同第５，９１９，４５５号；同第５，９３２，４６２号；および同第５，９８５，２６３号で論じられている。ペグ化ＩＬ−１０については、例えば米国特許第７，０５２，６８６号に記載されている。本明細書で使用する具体的な反応条件については実験の節に記載されている。
【０１１４】
上述の通り、ペグ化は、Ｎ末端、リジン残基の側鎖、およびヒスチジン残基側鎖のイミダゾール基で最も頻繁に起こる。このようなペグ化の有用性は、例えば、反応条件の最適化および精製工程の改善による改良によって増大されている。より近年の残基特異的化学反応により、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、セリン、トレオニン、およびチロシン、ならびにカルボキシ末端のペグ化が可能になった。これらのアミノ酸残基は特異的にペグ化できるものもあれば、より無差別であるいはある特定の条件下で部位特異的にペグ化されるだけのものもある。
【０１１５】
さらなるアミノ酸残基のペグ化を可能にする現在用いられている方法としては、架橋ペグ化（ジスルフィド架橋）、酵素的ペグ化（グルタミンおよびＣ末端）およびグリコペグ化（糖タンパク質のグリカンのＯ−およびＮ−グリコシル化部位）、およびヘテロ二官能性ペグ化が挙げられる。さらなる方法には、非天然アミノ酸を含むタンパク質のペグ化、Ｃ末端ペグ化のためのインテイン融合タンパク質、トランスグルタミナーゼによるペグ化、ソルターゼＡによるペグ化、ならびに解離可能な非共有結合によるペグ化に関するものがある。さらに、特異的ペグ化法と遺伝子工学技術とを組み合わせることにより、例えば、ポリペプチド内の特異的アミノ酸残基をオルト配向の（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）反応基を有する天然または非天然アミノ酸で置換することによって、ポリエチレングリカンポリマーを実質的にタンパク質表面の任意の位置でカップリングさせることが可能になった。一般的には、例えば、Ｐａｓｕｔ，Ｇ．およびＶｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．，（２０１２）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １６１：４６１−７２；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｊ．ら，（２０１２）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．６４：１１６−２７；Ｊｅｖｓｅｖａｒ，Ｓ．ら，（２０１０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．５：１１３−２８；ならびにＹｏｓｈｉｏｋａ，Ｙ．（２０１１）Ｃｈｅｍ．Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｊ．５：２５を参照されたい。
【０１１６】
本開示はまた、ＰＥＧ模倣物の使用を企図する。ＰＥＧの特質（例えば、血清中半減期の増加）を保持しながら、ほかのいくつかの有利な特性を付与する組換えＰＥＧ模倣物が開発されている。例として、ＰＥＧと類似の延長した立体配座を形成可能な単純なポリペプチド鎖（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、ＳｅｒおよびＴｈｒを含む）を組換えにより、対象とするペプチドまたはタンパク質薬に既に融合した状態で作製できる（例えば、Ａｍｕｎｉｘ社のＸＴＥＮ技術；マウンテンビュー、カリフォルニア州）。これにより、製造工程中に追加のコンジュゲーション段階が不要になる。さらに、確立された分子生物学技術により、ポリペプチド鎖の側鎖の組成物を制御し、免疫原性および製造特性の最適化が可能になる。
【０１１７】
本開示のポリペプチド配列を修飾するのに用いる上記構成要素および分子（例えば、ポリエチレングリコール）はいずれも、任意選択でリンカーを介してコンジュゲートし得る。適切なリンカーとしては、修飾するポリペプチド配列と、連結する構成要素および分子との間でいくらかの動きを可能にするのに一般に十分な長さの「柔軟なリンカー」が挙げられる。リンカー分子は一般に、約６〜５０原子の長さである。リンカー分子はまた、例えば、アリールアセチレン、２〜１０単量体単位を含むエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二酸、アミノ酸、またはその組合せであり得る。適切なリンカーは容易に選択でき、１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１０〜２０アミノ酸、２０〜３０アミノ酸、３０〜５０アミノ酸または５０アミノ酸を超えるなどの任意の適切な長さであり得る。
【０１１８】
例示的な柔軟なリンカーとしては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（例えば、ｎが少なくとも１である整数である（ＧＳ）ｎ、ＧＳＧＧＳｎ（配列番号１４）およびＧＧＧＳｎ（配列番号１５））、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、およびその他の柔軟なリンカーが挙げられる。グリシンポリマーおよびグリシン−セリンポリマーは比較的非構造的であり、したがって、構成要素間の中性のテザーとなり得る。例示的な柔軟なリンカーとしては、特に限定されないが、ＧＧＳＧ（配列番号１６）、ＧＧＳＧＧ（配列番号１７）、ＧＳＧＳＧ（配列番号１８）、ＧＳＧＧＧ（配列番号１９）、ＧＧＧＳＧ（配列番号２０）、およびＧＳＳＳＧ（配列番号２１）が挙げられる。
【０１１９】
リリース試験
生物学的作用物質は、その作製に用いる出発物質および製造工程の変化に対して感受性があるため、一貫して生産し特徴付けするのが困難であり得る。したがって、生物学的製剤には、一般に精密な化学的方法によって合成される小分子よりもさらに規制要件および監督が課せられる。各バッチまたは「ロット」内の生物学的製剤が、必要な効力（例えば、生体内安定性と関係がある効力）を有し、一貫して同じＡＰＩを含有し、かつ人に使用するのに安全であることを確実にするため、ロットリリース評価を用いる。
【０１２０】
本明細書に記載されるように、生物学的製剤は、原料の入手源および管理レベル；製造工程の複雑性、ロバスト性および管理レベル；原薬および製剤の化学的複雑性；ならびに原薬および製剤の同一性、純度、および効力を評価するのに用いる方法の信頼性および複雑性を含む、それに特異的なパラメータに基づいて評価される。
【０１２１】
ペプチドマッピング
生物学的製剤の生産には、望ましくないタンパク質修飾および汚染が起こる可能性があることから、極めて厳密な品質管理が必要である。この厳密な品質管理の要素には、タンパク質生物学的製剤の各生産バッチ（ロット）に対するアミノ酸配列の整合性の確認が必要である。ペプチドマッピング（「ペプチドマスフィンガープリンティング」とも呼ばれる）は、構造決定およびタンパク質生物学的製剤の配列同一性の確認のための有効な方法であり、組換えによって得られたタンパク質の品質管理に不可欠な分析方法である。
【０１２２】
ペプチドマップは実質的に、いくつかの化学的過程から生じるタンパク質の「フィンガープリント」であり、分析対象のタンパク質の包括的理解を可能にする。ペプチドマッピングの最も基本的なレベルでは、タンパク質の酵素的消化または化学的切断、得られた断片の分離、およびその断片の分析を実施する。この方法を用いて、時間のかかるペプチドシーケンシングの実施を必要とせずに、タンパク質が実際に対象タンパク質であることを確認できる。
【０１２３】
酵素的消化および化学的切断の薬剤を表１に記載する。
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【０１２４】
消化および切断によって得られるペプチドの分離に用いられる技術としては、ＲＰ−ＨＰＬＣ；ＩＥＣ；ＨＩＣ；ＰＡＧＥ；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；ＣＥ；ＰＣＨＶ電気泳動；およびＨＶＰＥが挙げられる。
【０１２５】
質量分析計（例えば、ＥＳＩ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、ＭＡＬＤＩ  ＭＳおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）により断片の絶対質量を決定した後、既知のタンパク質について既に決定されているペプチド質量（例えば、コンピュータデータベースに保管されているタンパク質に固有のペプチド質量データ）と比較する。本発明との関連においては一般に、測定したペプチド質量を、上記のものと同様の方法論を用いてＩＬ−１０について既に決定されているペプチド質量と比較する。他の質量分析ベースの分析的プロテオミクス技術と同じように、タンパク質同定の質はＭＳデータ自体の質、データベースの正確さ、ならびに用いる検索アルゴリズムおよびソフトウェアの性能によって左右される。
【０１２６】
最適な分析を可能にするため、酵素的消化によって得られるペプチドの望ましい大きさの範囲はこれまで、約６００〜５，０００Ｄａとされてきた。しかし、近年、ソフトウェアおよび質量分析技術（例えば、電子移動解離（ＥＴＤ）および電子捕獲解離（ＥＣＤ））の進歩、ならびに衝突活性化解離（ＣＡＤ）と組み合わせられる可能性のため、この大きさの範囲は約６００〜２０，０００Ｄａに広がっている。それでもなお、一部のペプチドは望ましい大きさの範囲から上下に外れており、タンパク質の分析範囲が狭くデータ収集が不完全である。
【０１２７】
トリプシンによるタンパク質消化（「トリプシンマッピング」；のちにさらに説明する）はタンパク質分析の主要な方法である。タンパク質の分析範囲を広げるため、代替プロテイナーゼが導入されている。代替プロテイナーゼを単独で、または他のプロテイナーゼと組み合わせて用いれば、トリプシン消化ではみられないペプチド配列を含み得る独特のペプチドマップが得られる。さらに、代替プロテイナーゼによる消化で得られたペプチドを重ね合わせることにより、タンパク質の分析範囲およびタンパク質同定の全体的な信頼度が増大する。代替酵素の使用により、特定の分析機器で最適に用いるには大き過ぎるペプチドを、より小型で扱いやすい断片に切断し得る。
【０１２８】
代替プロテイナーゼはまた、プロテイナーゼが必要な部位に接近するのを妨げるＰＴＭによって引き起こされる不完全な消化の克服、および転移パートナーの同定に役立ち得る。
【０１２９】
トリプシンマッピング
本明細書に示されるように、トリプシンによるタンパク質消化（「トリプシンマッピング」）はタンパク質の構造を決定するための（例えば、新たに発見されたタンパク質を含む）主要な方法である。トリプシンによる酵素的消化は、ＬｙｓおよびＡｒｇ残基のＣ末端側で切断し、適切な条件下では一般に定量的であり、４Ｍもの高濃度の尿素に耐え、ならびにグリコシル化部位およびジスルフィド結合の位置を特定するのに使用可能であることから有利である。トリプシンマッピングは、ロット間の製品の一貫性、発現エラー、変異および脱アミノ化部位に関する情報を提供し、組換えタンパク質の品質管理のためのバイオテクノロジーにおいてより頻繁に使用されている。
【０１３０】
トリプシンマッピングは広く用いられているが、制限および欠点がないわけではない。マップを正確に再現するには高レベルのカラム分離能およびシステムの精度が必要である。さらに、トリプシンマッピングには多数のピークが現れるため、１〜５％のレベルで夾雑タンパク質に起因する断片を同定するのが困難である。さらに、ある特定のペグ化タンパク質のトリプシン消化物は、再現可能なかつ／または意義のあるデータをもたらさない。
【０１３１】
エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃマッピング
表１に記載されているように、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ（Ｅｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃ）はタンパク質消化の代替酵素である。Ｅｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃは組換えによって作製されるセリンプロテアーゼ（クローン化しバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で発現させた黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）プロテアーゼＶ８遺伝子）であり、タンパク質を高い特異性でグルタミン酸およびアスパラギン酸残基のＣ末端で切断し、したがって質量分析に利用可能な独特のペプチド断片が得られる。Ｅｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃは数十年の間タンパク質の特徴付けに使用されているが、近年、質量分析技術の進歩により、その重要性が増している。Ｅｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃ試薬は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社（イプスウィッチ、マサチューセッツ州）およびＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社（レイクウッド、ニュージャージー州）を含む多数の供給業者から市販されている。
【０１３２】
Ｅｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃのアミノ酸配列を図２に記載する。タンパク質のＣ末端には６−Ｈｉｓ−タグが含まれている。Ｅｎｄｏ  Ｇｌｕ−ＣはＳＤＳ−ＰＡＧＥでは単一のバンドとして現れ、少量の酵素には、そのＮ末端にさらに２つのＡｌａ残基が含まれ得る。
【０１３３】
Ｅｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃは、アスパラギン酸残基での切断速度がグルタミン酸残基での切断速度よりも１００〜３００倍遅い。さらに、Ｅｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃの特異性は緩衝液の組成による影響を受け、リン酸緩衝液ではグルタミン酸およびアスパラギン酸残基の両方が切断されるのに対して、重炭酸アンモニウム緩衝液および酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．０）ではグルタミン酸残基のみが切断される。
【０１３４】
ＩＬ−１０およびペグ化ＩＬ−１０の消化
酵素的消化および化学的消化により、本明細書に記載されるＩＬ−１０、ＰＥＧ−ＩＬ−１０、およびその他のＩＬ−１０関連分子の断片化を実施し得る。上の表１に記載した薬剤を断片化の候補として評価し得る。その他の因子も適切であり得るが、異なる消化により得られるペプチドのメンバーと比べより少数の、より分離されたペプチドのメンバーを含むペプチドマップが得られるＩＬ−１０の消化が、様々なロットおよび条件にわたる解釈により容易である。
【０１３５】
本開示の特定の実施形態は、ペプチダーゼなどのタンパク質分解試薬による消化を企図する。いくつかの実施形態では、ペプチダーゼはトリプシンであり、他の実施形態では、ペプチダーゼはＥｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃである。ヒトＩＬ−１０二量体構造の各単量体には１７か所のＥｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃ消化部位（すなわち、グルタミン酸およびアスパラギン酸残基）および２１か所のトリプシン消化部位がある。したがって、Ｅｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃでの消化によりより少ないペプチド断片が得られ、消化物の解釈がより容易である。ペプチド断片がより少ないことはまた、重要なリリース試験中に発生する問題が少なくなる可能性がある。さらに、Ｅｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃによる消化で得られるデータの方がトリプシンによる消化で得られるデータよりも確実である（例えば、質量分析により得られるピークがより明瞭である）。
【０１３６】
ペグ化タンパク質のペプチドマッピングには、対応する非ペグ化タンパク質のペプチドマッピングにはみられない検討事項が伴うことが多い。Ｅｎｄｏ−Ｇｌｕ−ＣによるＰＥＧ−ＩＬ−１０消化によりトリプシンによるＰＥＧ−ＩＬ−１０消化よりも優れた結果が得られる。ＰＥＧ−ＩＬ−１０トリプシンマップでは実質的に、ジ−ペグ化ＩＬ−１０とモノ−ペグ化ＩＬ−１０の混合物の一貫した「マップ」が得られず、バルク原薬（ＢＤＳ）および最終製剤（ＤＰ）のリリース基準を設定するための再現性が得られない。ＰＥＧ−ＩＬ−１０に関して特に重要なのは、Ｅｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃによる消化では、ロットリリース試験によって一貫した再現性のあるデータが得られることである。このような一貫性および再現性は、ある個人が異なる設備を用いてリリース試験を実施するのか；別の個人が最初の個人と同じ設備を用いてリリース試験を実施するのか；別の個人が最初の個人と異なる装置を用いてリリース試験を実施するのかに関係なく観察される。
【０１３７】
Ｅｎｄｏ  Ｇｌｕ−ＣペプチダーゼでのＩＬ−１０およびＰＥＧ−ＩＬ−１０の消化により、トリプシンでの消化よりもより確実で再現性の高いデータが得られる。実験の節に記載される方法論を用いて、ＩＬ−１０およびＰＥＧ−ＩＬ−１０のＥｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃ消化物およびＵＶ検出ペプチドマップにより、分離され解釈が容易なピークが得られた（図４を参照されたい）。図４に示されるクロマトグラムからも、ペプチドマップがｒｈＩＬ−１０（濃いトレース）およびＰＥＧ−ｒｈＩＬ−１０（薄いトレース）について実質的にほぼ同じトレースを示していることがわかる。ＰＥＧ−ＩＬのＥｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃ消化後にＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを用いると、ピークは分離しているが、ＰＥＧ部分を容易に特徴付けるためには分解能が不十分なペプチドマップが得られたことに留意されたい。当業者であれば、Ｅｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃに用いることができる他の検出方法を評価できるであろう。
【０１３８】
上記のように、トリプシンでのＩＬ−１０消化により、Ｅｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃでの消化よりも多くのペプチド断片が得られる。この数が増加したペプチド断片は、追加の、時間を要する解釈を必要とする。さらに、トリプシンで得られたペプチド断片の質量分析（例えば、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）では分離のより少ないピークが得られる。
【０１３９】
したがって、Ｅｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃペプチダーゼにより、ペグ化インターロイキン−１０およびその他のペグ化インターロイキン−１０関連分子を含む組成物の同一性（例えば、アミノ酸配列）および安定性に関して確実で一貫性のある結果が得られる。結果として、ＰＥＧ−ｒｈＩＬ−１０のロットリリース試験にはＥｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃによる消化が理想的である。
【０１４０】
治療的使用および予防的使用
本開示は、様々な疾患、障害および／または病態、ならびに／あるいはその症状の治療または予防における本明細書に記載されるＩＬ−１０分子（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）の使用を企図する。以下に特定の使用について詳細に記載するが、本開示はそれに限定されないことを理解するべきである。さらに、以下に特定の疾患、障害および病態の一般的なカテゴリーを記載するが、これらの疾患、障害および病態には２つ以上のカテゴリーのメンバーになり得るもの（例えば、癌関連障害および繊維関連障害）もあれば、本開示のいずれのカテゴリーのメンバーにもなり得ないものもある。
【０１４１】
本開示は、ＩＬ−１０（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）剤を診断剤またはその成分として使用する実施形態を企図する。さらなる実施形態では、本開示は、ＩＬ−１０分子と、少なくとも１つのほかの治療剤または診断剤とを用いて、増殖性病態、癌、腫瘍、または前癌状態を治療する方法を提供し、本明細書の他の箇所にその具体例を記載する。
【０１４２】
線維性障害および癌
本開示に従って、本明細書に記載されるＩＬ−１０分子（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）を、癌および癌関連疾患、障害または病態を含む、増殖性疾患、障害または病態の治療または予防に使用できる。本開示は、例えば、調節Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を調節することによって、腫瘍細胞または癌細胞抗原に対する寛容性を低下させることを企図する（例えば、Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｍｏｎｔａｇｕｔら（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：３１８０−８７；およびＳａｗａｙａら（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：１５０１−０９を参照されたい）。特定の実施形態では、腫瘍または癌は、結腸癌、卵巣癌、乳癌、黒色腫、肺癌、膠芽腫、または白血病である。癌関連疾患、障害および病態という用語（１つまたは複数）の使用は、癌に直接的または間接的に関連する病態を広義に指すことを意図するものであり、例えば、異形成などの血管新生および前癌状態がこれに含まれる。
【０１４３】
心血管疾患およびコレステロール関連障害
本開示はまた、ある特定の心血管疾患および／または関連する代謝関連疾患、障害および病態、ならびにこれに関連する障害の治療および／または予防のための本明細書に記載されるＩＬ−１０剤（ＰＥＧ−ＩＬ−１０）の使用を企図する。
【０１４４】
本明細書で使用される「心血管疾患」、「心疾患」などの用語は、心血管系を冒すあらゆる疾患、主として心疾患、脳および腎臓の血管疾患、ならびに末梢動脈疾患を指す。心血管疾患とは、冠動脈心疾患（すなわち、虚血性心疾患または冠動脈疾患）、アテローム性動脈硬化症、心筋症、高血圧症、高血圧性心疾患、肺性心、不整脈、心内膜炎、脳血管疾患、および末梢動脈疾患を含む疾患群のことである。心血管疾患は世界の死因の第１位を占め、通常、高齢者が罹患するものであるが、心血管疾患に先行する疾患、特にアテローム性動脈硬化症は若年期に発症する。
【０１４５】
本開示の特定の実施形態は、コレステロールおよびトリグリセリドなどの脂肪物質が沈着することによって動脈壁が肥厚しプラークを形成する慢性病態である、アテローム性動脈硬化症の治療および／または予防のためのＩＬ−１０ポリペプチドの使用に関する。アテローム性動脈硬化症では多くの場合、動脈壁に慢性炎症性応答がみられ、これは主としてマクロファージの集積に起因し、機能的高密度リポタンパク質によるマクロファージからの脂肪およびコレステロールの十分な除去がなく低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）により促進されるものである。アテローム性動脈硬化病巣が慢性的に拡大することによって内腔が完全に閉塞することがあるが、これは、内腔狭窄が非常に重度になり下流組織（１つまたは複数）への血液供給が不足し、虚血が生じて初めて発現し得る。
【０１４６】
ＩＬ−１０ポリペプチドは、例えば心血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症）、脳血管疾患（例えば、脳卒中）、および末梢血管疾患に関連し得るコレステロール関連障害の治療および／または予防に特に有利であり得る。特に限定されないが例を挙げると、ＩＬ−１０ポリペプチドを、対象の血中コレステロール値を低下させるのに使用し得る。対象が高コレステロール血症であるかどうかを決定するにあたっては、正常なコレステロール値と異常なコレステロール値との間に確固とした境界はなく、他の健康状態および危険因子と関連させて数値を解釈する必要がある。それでも米国では一般に、次に挙げるガイドラインが用いられている：総コレステロールは２００ｍｇ／ｄＬ未満を望ましい値とし、２００〜２３９ｍｇ／ｄＬを高境界値、２４０ｍｇ／ｄＬ以上を高値とする。総コレステロール値が高いほど心血管疾患のリスクが増大し、ＬＤＬ値または非ＨＤＬコレステロール値はともに、将来の冠動脈心疾患の予測因子である。高コレステロール血症を評価する場合、全リポタンパク質の減算値（ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬ）を測定するのが有用であることが多い。具体的な治療目標のひとつは、ＨＤＬを維持または増加させながらＬＤＬを減少させることである。
【０１４７】
血栓症および血栓性病態
循環系を流れる血流の閉塞をもたらす、血管内側での塞栓（血餅）の形成である血栓症は、以下の（ウィルヒョウの三徴）：凝固能亢進、内皮細胞損傷、または血流障害（うっ血、乱流）のうち１つまたは複数に異常が生じることよって起こり得る。
【０１４８】
血栓症は一般に、静脈血栓症と動脈血栓症とに分類され、それぞれいくつかのサブタイプで表すことができる。静脈血栓症としては、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、門脈血栓症、腎静脈血栓症、頸静脈血栓症、バッド・キアリ症候群、パジェット・シュレッター病、および脳静脈洞血栓症が挙げられる。動脈血栓症としては、脳卒中および心筋梗塞が挙げられる。
【０１４９】
心房血栓症ならびに、骨髄がＲＢＣ、ＷＢＣおよび／または血小板を過剰に産生する骨髄増殖性血液障害である真性赤血球増加症（紅斑症、原発性赤血球増加症および真性一次性赤血球増加症としても知られる）を含む他の疾患、障害および病態が本開示によって企図される。
【０１５０】
さらに、例えばコレステロールまたは喫煙によって損傷を受けた血管はプラークを生じ、このような血管が破裂してプラークに血餅を形成させることがある。この応答は出血が起こらなくても発生する。
【０１５１】
免疫病態および炎症性病態
本明細書で使用される「免疫疾患」、「免疫病態」、「免疫障害」、「炎症性疾患」、「炎症性病態」、「炎症性障害」などの用語は、任意の免疫関連または炎症関連病態（例えば、病理学的炎症および自己免疫疾患）を広義に包含するものとする。このような病態はしばしば他の疾患、障害および病態と密接に絡み合っている。例として、「免疫病態」は、感染症（急性および慢性）、腫瘍、および免疫系により除去に抵抗性のある癌を含む、癌、腫瘍、および血管新生などの増殖性病態を指し得る。
【０１５２】
例えば炎症性サイトカインに起因し得る、免疫関連および炎症関連疾患、障害および病態の非限定的なリストとしては、関節炎（例えば、関節リウマチ）、腎不全、狼瘡、喘息、乾癬、大腸炎、膵炎、アレルギー、線維症、外科合併症（例えば、炎症性サイトカインが治癒を妨げる場合）、貧血、および線維筋痛症が挙げられる。慢性炎症に関連し得る他の疾患および障害としては、アルツハイマー病、うっ血性心不全、脳卒中、大動脈弁狭窄症、動脈硬化症、骨粗鬆症、パーキンソン病、感染症、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）、アレルギー性接触皮膚炎をはじめとする湿疹、全身性硬化症、移植ならびに多発性硬化症が挙げられる。
【０１５３】
ウイルス性疾患
ウイルス性疾患におけるＩＬ−１０の役割が注目を集めつつある。ＩＬ−１０は、例えば、その受容体結合活性に応じて、刺激作用と阻害作用の両方をもたらすと仮定されてきた。
【０１５４】
抗ウイルス免疫およびワクチン効力を増大させるためにＩＬ−１０機能を阻害することの効果が考えられてきた（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｅ．，（２０１１）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５０：３９−６５を参照されたい）。さらに、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）機能におけるＩＬ−１０の役割が研究されてきた。１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）複製の阻害に加えて、ＩＬ−１０はまた、エフェクター免疫機序の不活性化によってウイルス存続を促進し得る（Ｎａｉｃｋｅｒら（２００９）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２００（３）：４４８−４５２）。別の研究では、慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染においてＴ細胞免疫を調節できるＢ細胞のＩＬ−１０産生サブセットが特定されている。ＩＬ−１０レベルとウイルス負荷量の変動との間に密接で一時的な相関関係が認められており、またｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＬ−１０を遮断すると多機能性ウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が救済されることが見出された（Ｄａｓ，Ａ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｓｅｐｔ．１２，２０１２  １１０３１３９（オンライン））。
【０１５５】
上に挙げた研究はＩＬ−１０阻害が有益であり得ることを示しているが、ＣＤ８＋Ｔ細胞要素を含む特定のウイルス感染症は、ＩＬ−１０剤（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）の投与による治療および／または予防の候補となり得る。このことは、ＩＬ−１０が調節Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の調節によってある特定の癌において果たす正の役割により裏付けられる。ウイルスとの関連でＩＬ−１０療法を用いることについては他の箇所でも論じられている（例えば、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｊｕｌｙ  ２０１１  ｖｏｌ．８５  ｎｏ．１４  ６８２２−６８３；およびＬｏｅｂｂｅｒｍａｎｎ  Ｊら（２０１２）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７（２）：ｅ３２３７１．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００３２３７１を参照されたい）。
【０１５６】
本開示は、ＩＬ−１０による治療が有益であり得る任意のウイルス性疾患、障害または病態の治療および／また予防におけるＩＬ−１０分子（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）の使用を企図する。企図されるウイルス性疾患、障害および病態の具体例としては、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ、ヘルペスウイルスおよびサイトロメガロウイルス（ＣＭＶ）が挙げられる。
【０１５７】
投与経路および医薬組成物
本開示のＩＬ−１０分子（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）は、対象への投与に適した組成物の形態であり得る。このような組成物は一般に、本明細書に記載されるＩＬ−１０剤と、１つまたは複数の薬学的または生理的に許容される希釈剤、担体または添加剤とを含む「医薬組成物」である。ある特定の実施形態では、ＩＬ−１０剤は治療上許容される量で存在する。医薬組成物は本開示の方法で使用でき、したがって、例えば、本明細書に記載される治療および予防方法ならびに使用を実施するために、医薬組成物をｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで対象に投与できる。
【０１５８】
本開示の医薬組成物は、意図する方法または投与経路に適合するよう製剤化できる。本開示は、任意のしかるべき方法で、本明細書に記載されるＩＬ−１０分子（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）、およびその組成物を投与することを企図する。適切な投与経路としては、非経口（例えば、筋肉内、静脈内、皮下（例えば、注射または埋植）、腹腔内、槽内、関節内、腹腔内、脳内（実質内および脳室内）、経口、経鼻、経膣、舌下、眼内、経直腸、局所（例えば、経皮）、舌下および吸入が挙げられる。本開示の特定の実施形態は非経口投与を企図し、さらなる特定の実施形態では、非経口投与は皮下投与である。
【０１５９】
当業者であれば、医薬組成物およびその様々な成分を調製するための方法論に精通している。医薬組成物は通常、治療有効量のＩＬ−１０剤（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）と、１つまたは複数の薬学的および生理的に許容される希釈剤、担体または特に限定されないが、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸および硫酸水素ナトリウム）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、メチルパラベン、エチルまたはｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸）、乳化剤、懸濁化剤、分散剤、溶媒、充填剤、増量剤、界面活性剤、緩衝剤、賦形剤、希釈剤、および／または補助剤を含む添加剤とを含む。
【０１６０】
例えば、適切な賦形剤は生理食塩水またはクエン酸緩衝生理食塩水であってよく、場合によっては、非経口投与用の医薬組成物によく用いられる他の物質をこれに添加する。血清アルブミンと混合した中性の緩衝生理食塩水または生理食塩水が、さらなる賦形剤の具体例である。当業者であれば、本明細書で企図される医薬組成物および剤形に使用できる様々な緩衝剤を容易に認識するであろう。典型的な緩衝剤としては、特に限定されないが、薬学的に許容される弱酸、弱塩基、またはそれらの混合物が挙げられる。一例として、緩衝剤成分は水溶性物質、例えばリン酸、酒石酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびそれらの塩などであり得る。許容される緩衝剤としては、例えば、トリス緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、およびＮ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）が挙げられる。
【０１６１】
医薬組成物を製剤化した後、これを溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、固体、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として無菌バイアル中に保管し得る。このような製剤は、そのまま使用できる形態、使用前に再構成する必要がある凍結乾燥形態、使用前に希釈する必要がある液体形態、またはその他の許容される形態のいずれかで保管し得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物を使い捨て容器（例えば、使い捨てのバイアル、アンプル、注射器、または自己注射器（例えば、ＥｐｉＰｅｎ（登録商標）と同様のもの）に入れて提供し、他の実施形態では、複数回使用できる容器（例えば、複数回使用できるバイアル）を提供する。インプラント（例えば、埋め込みポンプ）およびカテーテルシステム、緩徐注入ポンプおよび装置を含む任意の薬物送達装置を用いてＩＬ−１０を送達してもよく、これらの装置はいずれも当業者に周知のものである。
【０１６２】
一般に皮下または筋肉内に投与する蓄積注射を用いて、本明細書に開示されるＩＬ−１０分子を一定の期間にわたって放出させてもよい。蓄積注射は通常、固体または油をベースとし、一般に本明細書に記載される製剤成分を少なくとも１つ含む。当業者であれば、蓄積注射に可能な製剤および使用に精通している。
【０１６３】
医薬組成物は無菌注射用水性懸濁液または油性懸濁液の形態であってもよい。この懸濁液は、本明細書に記載される適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用い、既知の技術に従って製剤化し得る。無菌注射用製剤はまた、無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注射用液または懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール溶液であり得る。用い得る許容される希釈剤、溶媒および分散媒としては、水、リンガー溶液、等張塩化ナトリウム溶液、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ社、パーシッパニー、ニュージャージー州）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、およびそれらの適切な混合物が挙げられる。さらに、溶媒または懸濁媒として無菌の不揮発性油が従来用いられている。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の無菌不揮発性油を使用し得る。さらに、注射剤の調製にオレイン酸などの脂肪酸が使用される。吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチン）を含めることによって、特定の注射用製剤を持続的に吸収させることができる。
【０１６４】
本明細書で企図されるＩＬ−１０分子を含む医薬組成物は、別の投与経路に適した剤形を含め、現在知られている、または今後開発される他の剤形であってもよい。例えば、ＩＬ−１０分子は、経口投与に適した錠剤またはカプセル剤、経直腸投与用の坐剤、および経鼻または吸入に使用するスプレー剤の形態であり得る。
【０１６５】
製剤中のＩＬ−１０剤の濃度は大幅に変化してよく（例えば、約０．１重量％未満〜、通常、約２重量％でまたは少なくとも約２重量％から２０重量％〜５０重量％またはそれを超える）、例えば選択する具体的な投与様式に応じて、主として液量、粘度、および対象に基づく因子に基づいて通常は選択される。
【０１６６】
併用療法
本開示は、本開示によって企図される疾患、障害および病態を治療または予防するために１つまたは複数の活性な治療剤（例えば、サイトカイン）またはその他の予防様式もしくは治療様式（例えば、放射線照射）と組み合わせたＩＬ−１０分子（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）の使用を企図する。このような併用療法では、様々な活性な薬剤が異なる相補的な作用機序を有することが多い。このような併用療法は、１つまたは複数の薬剤の用量を低減でき、それにより１つまたは複数の薬剤に関連する有害作用を軽減または除去することによって、特に有利であり得る。さらに、このような併用療法は、基礎となる疾患、障害、または病態に対し相乗的な治療効果または予防効果を有し得る。
【０１６７】
本明細書で使用される「併用」は、個別に投与され得る治療剤、例えば、個別投与のために個別に製剤化される（例えば、キットで提供され得る）治療剤、および単一の製剤（すなわち、「共製剤化」）で一緒に投与され得る治療剤を含むものとする。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、例えば、ある薬剤を１つまたは複数の他の薬剤を投与する前に投与する場合、ＩＬ−１０ポリペプチド（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）を逐次的に投与または適用する。他の実施形態では、例えば、２つ以上の薬剤を同時にまたはほぼ同時に投与する場合、ＩＬ−１０ポリペプチドを同時に投与し、この２つ以上の薬剤は２つ以上の個別の製剤中に存在しても、単一の製剤に組み合わされてもよい（すなわち、共製剤化）。２つ以上の薬剤を逐次的に投与するか、同時に投与するかに関係なく、これらは本開示の目的のために併用投与されると見なされる。
【０１６９】
本開示のＩＬ−１０ポリペプチド（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）は、諸状況下に適した任意の方法で、薬学的に許容される塩、酸またはそれらの誘導体を含む、少なくとも１つの他の（活性な）薬剤と併用し得る。一実施形態では、少なくとも１つの活性な薬剤と少なくとも１つの本開示のＩＬ−１０ポリペプチドとによる治療を一定期間にわたって維持する。別の実施形態では、少なくとも１つの活性な薬剤による治療を減らすか中断し（例えば、対象が安定している場合）、一方で本開示のＩＬ−１０ポリペプチドによる治療を一定の投与レジメンで維持する。さらなる実施形態では、少なくとも１つの活性な薬剤による治療を減らすか中断し（例えば、対象が安定している場合）、一方で本開示のＩＬ−１０ポリペプチドによる治療を減らす（例えば、用量を減量する、投与頻度を減らす、または治療レジメンを短くする）。さらに別の実施形態では、少なくとも１つの活性な薬剤による治療を減らすか中断し（例えば、対象が安定している場合）、かつ本開示のＩＬ−１０ポリペプチドによる治療を増やす（例えば、用量を増量する、投与頻度を増やす、または治療レジメンを長くする）。さらに別の実施形態では、少なくとも１つの活性な薬剤による治療を維持し、かつ本開示のＩＬ−１０ポリペプチドによる治療を減らすか中断する（例えば、用量を減量する、投与頻度を減らす、または治療レジメンを短くする）。さらに別の実施形態では、少なくとも１つの活性な薬剤による治療と本開示のＩＬ−１０ポリペプチドによる治療を減らすか中断する（例えば、用量を減量する、投与頻度を減らす、または治療レジメンを短くする）。
【０１７０】
本開示は、線維性障害および癌（増殖性病態を含む）；免疫および炎症性病態；ウイルス性疾患；ならびに血栓性障害の治療、予防、および／または診断に有用な様式を含む、１つまたは複数の予防様式または治療様式（現在知られているもの、または今後開発されるもの）と組み合わせたＩＬ−１０分子（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）の使用を企図する。
【０１７１】
さらに、いくつかの実施形態は、心血管疾患の治療、予防、および／または診断のための併用療法に関する。例として、特に限定されないが、ＩＬ−１０剤（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）と、コレステロールの酵素的合成を阻害するスタチン（例えば、ＣＲＥＳＴＯＲ、ＬＥＳＣＯＬ、ＬＩＰＩＴＯＲ、ＭＥＶＡＣＯＲ、ＰＲＡＶＡＣＯＬ、およびＺＯＣＯＲ）；コレステロールを捕捉してその吸収を妨げる胆汁酸レジン（例えば、ＣＯＬＥＳＴＩＤ、ＬＯ−ＣＨＯＬＥＳＴ、ＰＲＥＶＡＬＩＴＥ、ＱＵＥＳＴＲＡＮ、およびＷＥＬＣＨＯＬ）；コレステロール吸収を遮断するエゼチミブ（ＺＥＴＩＡ）；トリグリセリドを減少させてＨＤＬを適度に増加させ得るフィブリン酸（例えば、ＴＲＩＣＯＲ）；ＬＤＬコレステロールおよびトリグリセリドを適度に減少させるナイアシン（例えば、ＮＩＡＣＯＲ）；ならびに／あるいは上記薬剤の組合せ（例えば、ＶＹＴＯＲＩＮ（エゼチミブとシンバスタチン）を含む高コレステロール血症（およびアテローム性動脈硬化症）の治療様式とを併用し得る。本明細書に記載されるＩＬ−１０ポリペプチドとの併用の候補となり得る別のコレステロール治療法としては、高コレステロール血症および関連病変を治療するためのプロタンパク質転換酵素スブチリシンケキシン９（ＰＣＳＫ９）の阻害剤が挙げられる。このような様式としては、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、アンチセンスＲＮＡｉ、小分子、および組換えアドネクチンの使用が挙げられる。
【０１７２】
投与
本開示のＩＬ−１０ポリペプチド（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）は、例えば、投与の目標（例えば、所望の解消の程度）；製剤を投与する対象の年齢、体重、性別、および健康状態；投与経路；ならびに疾患、障害、病態またはその症状の性状に応じた量で対象に投与し得る。投与レジメンはまた、投与する薬剤（１つまたは複数）に関連する何らかの有害作用の存在、性状、および程度を考慮してもよい。効果的な投与量および投与レジメンは、例えば、安全性および用量漸増試験、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験（例えば、動物モデル）をはじめとする当業者に公知の方法から容易に決定できる。
【０１７３】
投与パラメータは一般に、投与量が、対象に不可逆的な毒性を示し得る量に満たない量（最大耐量（ＭＴＤ））であり、かつ対象に測定可能な効果をもたらすのに必要な量以上であることが要求される。このような量は、投与経路をはじめとする因子を考慮に入れたうえで、例えば、ＡＤＭＥに関連した薬物動態および薬力学パラメータによって決定される。
【０１７４】
有効量（ＥＤ）とは、薬剤を服用した対象の何割かに治療反応または所望の効果をもたらす用量または量のことである。薬剤の「半数有効量」またはＥＤ５０とは、薬剤を投与した集団の５０％に治療反応または所望の効果をもたらす用量または量のことである。ＥＤ５０は薬剤の効果を妥当に予測する尺度としてよく用いられるが、必ずしも臨床医が関連するあらゆる因子を考慮に入れて適切であると判断するであろう用量であるとは限らない。したがって、有効量がＥＤ５０計算値を上回る場合もあれば、有効量がＥＤ５０計算値を下回る場合もあり、さらに別の場合には、有効量はＥＤ５０計算値と同じである。
【０１７５】
さらに、本開示のＩＬ−１０分子（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）の有効量は、１つまたは複数の用量で対象に投与する場合に健常対象に比して所望の結果をもたらす量であり得る。例えば、ある特定の障害が認められる対象では、有効量は、その障害の診断のパラメータ、尺度、マーカーなどを少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または９０％を超えて改善するものであり得、この場合、１００％は、健常対象によって示される診断のパラメータ、尺度、マーカーなどとして定義される。
【０１７６】
本明細書に記載される疾患、障害または病態を治療するのに必要なＩＬ−１０（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）分子の量は、当該技術分野で公知のＩＬ−１０活性アッセイによって決定され得るコンジュゲートタンパク質のＩＬ−１０活性に基づく。例として、腫瘍との関連で適切なＩＬ−１０活性としては、例えば、腫瘍部位へのＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤、これらの浸潤細胞からのＩＬ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＲＡＮＫ−Ｌなどの炎症性サイトカインの発現、ならびに生物試料中のＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−γ濃度の上昇が挙げられる。
【０１７７】
ＩＬ−１０分子の治療有効量は、約０．０１〜約１００μｇタンパク質／（ｋｇ体重／日）、約０．１〜２０μｇタンパク質／（ｋｇ体重／日）、約０．５〜１０μｇタンパク質／（ｋｇ体重／日）、または約１〜４μｇタンパク質／（ｋｇ体重／日）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１０分子を持続注入により投与して、約５０〜８００μｇタンパク質／（ｋｇ体重／日）（例えば、約１〜１６μｇタンパク質／（ｋｇ体重／日）のＩＬ−１０分子）を送達する。注入速度は、例えば、有害作用および血液細胞計数の評価によって異なり得る。特定の実施形態では、ＰＥＧ−ＩＬ−１０分子を皮下に投与する。
【０１７８】
経口剤の投与には、有効成分を１．０〜１０００ミリグラム、具体的には、有効成分を１．０ミリグラム、３．０ミリグラム、５．０ミリグラム、１０．０ミリグラム、１５．０ミリグラム、２０．０ミリグラム、２５．０ミリグラム、５０．０ミリグラム、７５．０ミリグラム、１００．０ミリグラム、１５０．０ミリグラム、２００．０ミリグラム、２５０．０ミリグラム、３００．０ミリグラム、４００．０ミリグラム、５００．０ミリグラム、６００．０ミリグラム、７５０．０ミリグラム、８００．０ミリグラム、９００．０ミリグラム、および１０００．０ミリグラム含有する錠剤、カプセル剤などの形態で組成物を提供できる。
【０１７９】
ある特定の実施形態では、本開示のＩＬ−１０ポリペプチドの用量は「単位投与剤形」中に含まれている。「単位投与剤形」という語句は、物理的に分離された単位であり、それぞれが所望の効果を得るのに十分な、所定量の本開示のＩＬ−１０ポリペプチドを単独で、または１つまたは複数のほかの薬剤とともに含有する単位を指す。単位投与剤形のパラメータは具体的な薬剤および得るべき効果によって決まることが理解されよう。
【０１８０】
キット
本開示はまた、ＩＬ−１０（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）、およびその医薬組成物を含むキットを企図する。キットは一般に、以下に記載するように様々な構成要素を収納する物理的構造の形態であり、例えば、上記の方法（例えば、コレステロールホメオスタシスを回復させる必要のある対象にＩＬ−１０分子を投与すること）を実施する際に使用され得るものである。
【０１８１】
キットは、対象に投与するのに適した医薬組成物の形態であり得る、１つまたは複数の本明細書に開示されるＩＬ−１０ポリペプチド（例えば、無菌容器に入れて提供される）を含み得る。ＩＬ−１０ポリペプチドは、そのまま使用できる形態または投与前に例えば再構成または希釈を必要とする形態で提供され得る。ＩＬ−１０ポリペプチドが使用者によって再構成される必要がある場合、キットはまた、ＩＬ−１０ポリペプチドと一緒にまたは個別に包装された緩衝剤、薬学的に許容される添加剤などを含み得る。併用療法が企図される場合、キットが複数の薬剤を個別に含んでいても、複数の薬剤が既にキット内で組み合わさっていてもよい。キットの各構成要素は個々の容器に入っていてよく、また様々な容器がすべて単一の包装に含まれていてよい。本開示のキットは、そこに収納される構成要素を適切に維持するのに必要な状態（例えば、冷蔵または冷凍）に合うように設計され得る。
【０１８２】
キットは、その中の構成要素に関する識別情報およびそれらの使用に関する指示（例えば、作用機序、薬物動態および薬力学、有害作用、禁忌などを含む、投与パラメータ、有効成分（１つまたは複数）の臨床薬理学的特徴）を含むラベルまたは添付文書を含み得る。ラベルまたは添付文書は、ロット番号および使用期限などの製造業者情報を含み得る。ラベルまたは添付文書は、例えば、構成要素を収納する物理的構造に組み込まれていても、物理的構造内に個別に含まれていても、キットの構成要素（例えば、アンプル、チューブまたはバイアル）に貼り付けられていてもよい。
【０１８３】
ラベルまたは添付文書はさらに、ディスク（例えば、ハードディスク、カード、メモリディスク）、ＣＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭ、ＤＶＤなどの光ディスク、ＭＰ３、磁気テープ、あるいはＲＡＭおよびＲＯＭなどの電子記憶媒体または磁気／光記憶媒体などのこれらのハイブリッド、ＦＬＡＳＨ媒体もしくはメモリ型カードなどのコンピュータに読み込み可能な媒体を含むか、これらに組み込まれていてもよい。いくつかの実施形態では、実際の指示書はキット内に存在しないが、遠隔の入手源から指示書を入手するためのガイダンスが、例えばインターネットを介して提供される。
実施例
【０１８４】
以下の実施例は、当業者に本発明を作製し使用する方法を完全に開示し説明するために記載されるものであって、本発明であると見なされるものの範囲を限定することを意図するものではなく、また以下の実験を実施したが、それが実施し得る実験のすべてであることを示すことを意図するものでもない。現在時制で書かれている例示的な説明は必ずしも実施されたものであるとは限らず、むしろ、その説明を実施して、そこに記載されているデータを得ることができるということを理解するべきである。用いる数値（例えば、量、温度など）については正確を期するよう努めたが、実験上の多少の誤差および偏差は考慮に入れるべきである。
【０１８５】
特に明示されない限り、一部は重量部のことであり、分子量は重量平均分子量のことであり、温度はセ氏温度（℃）で表され、圧力は大気圧または大気圧付近である。次に挙げるものを含む標準的な略記を用いる：ｂｐ＝塩基対（複数を含む）；ｋｂ＝キロベース（複数を含む）；ｐｌ＝ピコリットル（複数を含む）；ｓまたはｓｅｃ＝秒（複数を含む）；ｍｉｎ＝分（複数を含む）；ｈまたはｈｒ＝時間（複数を含む）；ａａ＝アミノ酸（複数を含む）；ｋｂ＝キロベース（複数を含む）；ｎｔ＝ヌクレオチド（複数を含む）；ｎｇ＝ナノグラム；μｇ＝マイクログラム；ｍｇ＝ミリグラム；ｇ＝グラム；ｋｇ＝キログラム；ｄｌまたはｄＬ＝デシリットル；μｌまたはμＬ＝マイクロリットル；ｍｌまたはｍＬ＝ミリリットル；１またはＬ＝リットル；ｎＭ＝ナノモル；μΜ＝マイクロモル；ｍＭ＝ミリモル；Ｍ＝モル；ｋＤａ＝キロダルトン；ｉ．ｍ．＝筋肉内（に）；ｉ．ｐ．＝腹腔内（に）；ｓ．ｃ．＝皮下（に）；ＱＤ＝連日；ＢＩＤ＝１日２回；ＱＷ＝週１回；ＱＭ＝月１回；ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー；ＢＷ＝体重；Ｕ＝単位；ｎｓ＝統計的に有意ではない；ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水；ＰＣＲ＝ポリメラーゼ連鎖反応；ＮＨＳ＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；ＤＭＥＭ＝ダルベッコ改変イーグル培地；ＧＣ＝ゲノムコピー；ＥＬＩＳＡ＝酵素結合免疫吸着測定法；ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸；ＰＭＡ＝酢酸ミリスチン酸ホルボール；ｒｈＩＬ−１０＝組換えヒトＩＬ−１０；ＬＰＳ＝リポポリサッカーハイド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃａｒｈｉｄｅ）；ＥＳＩ−ＭＳ＝エレクトロスプレーイオン化質量分析；ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ＝ＥＳＩタンデム質量分析；ＴＩＣ＝全イオンクロマトグラフィー；ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ＝ＥＳＩ飛行時間型質量分析；ＭＡＬＤＩ＝マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ＝マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析；ＲＰ−ＨＰＬＣ＝逆相高速液体クロマトグラフィー；ＩＥＣ＝イオン交換クロマトグラフィー；ＨＩＣ＝疎水性相互作用クロマトグラフィー；ＰＡＧＥ＝ポリアクリルアミドゲル電気泳動；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＝ドデシル硫酸ナトリウム−ＰＡＧＥ；ＣＥ＝キャピラリー電気泳動；ＰＣＨＶ＝ペーパークロマトグラフィー−高電圧電気泳動；ＨＶＰＥ＝高電圧濾紙電気泳動；ＰＥＧ−ｒｈＩＬ−１０ＤＳ＝ペグ化組換えヒトインターロイキン１０原薬；Ｅｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃ＝エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ；ＤＴＴ＝ジチオスレイトール；ＵＶ＝紫外線。
【０１８６】
材料および方法
以下の実施例では、次のような一般的な材料および方法を用い得る。
【０１８７】
分子生物学の標準的な方法が記載されている（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；ならびにＡｕｓｕｂｅｌら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１〜４巻，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい。後者には細菌細胞でのクローン化およびＤＮＡ変異誘発（第１巻）、哺乳動物細胞および酵母でのクローン化（第２巻）、グリココンジュゲートおよびタンパク質発現（第３巻）およびバイオインフォマティクス（第４巻）が記載されている）。
【０１８８】
科学文献には、免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、および結晶化を含むタンパク質の精製方法のほか、タンパク質の化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質作製、およびグリコシル化が記載されている（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１〜２巻，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹを参照されたい）。
【０１８９】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の作製、精製、および断片化が記載されており（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）；リガンド／受容体相互作用の特徴を明らかにするための標準的な技術が利用可能であり（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第４巻，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，ＮＹを参照されたい）；蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含む、フローサイトメトリーの方法が利用可能であり（例えば、Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪを参照されたい）；例えば診断試薬として使用するための核酸プライマーおよびプローブ、ポリペプチド、ならびに抗体を含む、核酸の修飾に適した蛍光試薬が利用可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ．；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．）。
【０１９０】
免疫系の標準的な組織学的方法が記載されている（例えば、Ｌｏｕｉｓら（２００２）Ｂａｓｉｃ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：Ｔｅｘｔ  ａｎｄ  Ａｔｌａｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい）。
【０１９１】
抗体仲介による除去によって免疫細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞）を枯渇させ得る。例えば、ＣＤ４−またはＣＤ８−特異的抗体２５０μｇを週１回注射し、ＦＡＣＳおよびＩＨＣ解析を用いて細胞枯渇を確認し得る。
【０１９２】
例えば、抗原性断片、リーダー配列、タンパク質フォールディング、機能ドメイン、グリコシル化部位、および配列アライメントを決定するためのソフトウェアパッケージおよびデータベースが利用可能である（例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）；およびＤｅＣｙｐｈｅｒ（商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ社、クリスタルベイ、ネバダ州を参照されたい）。
【０１９３】
Ｊａｃｋｓｏｎ研究所（バーハーバー、メイン州）から免疫正常Ｂａｌｂ／ＣマウスまたはＢ細胞欠損Ｂａｌｂ／Ｃ  マウスを入手し、標準的手順に従って用いた（例えば、Ｍａｒｔｉｎら（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９（１１）：７０６７−７３およびＣｏｍｐｔｏｎら（２００４）Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ．５４（６）：６８１−８９を参照されたい）。本開示によって企図される実験作業に適したその他のマウス系統は当業者に公知であり、一般にＪａｃｋｓｏｎ研究所から入手可能である。
【０１９４】
特に明示されない限り、本明細書に記載される実験には皮膚のＰＤＶ６扁平上皮癌を用いた（例えば、Ｌａｎｇｏｗｓｋｉら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４２：４６１−４６５を参照されたい）。Ｅｐ２乳癌、ＣＴ２６結腸癌、および４Ｔ１乳癌モデルなどの他の腫瘍関連モデルおよび細胞系を用いてもよく（例えば、Ｌａｎｇｏｗｓｋｉら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４２：４６１−４６５を参照されたい）、これらは当業者に公知である。非腫瘍学関連モデルおよび細胞系（例えば、炎症モデル）も用いてよく、これらは当業者に公知である。
【０１９５】
血清中ＩＬ−１０濃度レベルおよび曝露レベルは当該技術分野で用いられる標準的な方法で決定され得る。例えば、マウスの尾を切断して全血（約５０μｌ／マウス）を単純な毛細管に採取し、遠心分離により血清と血液細胞とを分離し、標準的なＥＬＩＳＡキットおよび技術によりＩＬ−１０曝露レベルを決定することによって、血清曝露レベルアッセイを実施できる。
【０１９６】
ペグ化ＩＬ−１０の作製
本開示は、当業者に公知の任意の方法によるペグ化ＩＬ−１０の合成を企図する。以下のモノ−ペグ化ＩＬ−１０およびモノ／ジ−ペグ化ＩＬ−１０混合物を作製するためのいくつかの代替合成スキームに関する記載は、単に例示を意図するものである。モノ−ペグ化ＩＬ−１０およびモノ／ジ−ペグ化ＩＬ−１０混合物はともに同じ特性を多く有するが、選択的にペグ化したモノ−およびジ−ペグ化ＩＬ−１０の混合物では最終的なペグ化生成物の収率が向上する（例えば、米国特許第７，０５２，６８６号および米国特許出願公開第２０１１／０２５０１６３号を参照されたい）。
【０１９７】
当業者であれば、本開示の実施に適したＰＥＧ（およびその他の薬物送達技術）を作製および使用するにあたって自身の技能を活用することに加えて、多数のＰＥＧ関連技術（およびその他の薬物送達技術）の販売業者にも精通している。例として、ＮＯＦ  Ａｍｅｒｉｃａ社（アーバイン、カリフォルニア州）は単官能性直鎖ＰＥＧ、二官能性ＰＥＧ、多腕型ＰＥＳ、分岐ＰＥＧ、ヘテロ官能性ＰＥＧ、フォーク型ＰＥＧ、および解離性ＰＥＧを提供しており；Ｐａｒｃｈｅｍ社（ニューロシェル、ニューヨーク州）はＰＥＧ製品をはじめとする特殊な原材料の世界的な販売業者である。
【０１９８】
例示的なペグ化ＩＬ−１０合成スキーム１
ＩＬ−１０を１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析し得る。次いで、透析したＩＬ−１０を、透析緩衝液を用いて３．２倍に希釈し４ｍｇ／ｍＬの濃度にし得る。リンカー、ＳＣ−ＰＥＧ−１２Ｋ（Ｄｅｌｍａｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ研究所；メイウッド、イリノイ州）を加える前に、９体積の希釈したＩＬ−１０に１体積の１００ｍＭ四ホウ酸Ｎａ（ｐＨ９．１）を加えて、ＩＬ−１０溶液のｐＨを８．６に上げ得る。ＳＣ−ＰＥＧ−１２Ｋリンカーを透析緩衝液に溶かし、希釈したＩＬ−１０溶液にしかるべき体積のリンカー溶液（１モルのＩＬ−１０当たり１．８〜３．６モルのリンカー）を加えて、ペグ化反応を開始し得る。反応速度を制御するため、５℃で反応を実施し得る。ペグ化反応の間、反応溶液を穏やかに攪拌し得る。モノ−ペグ化ＩＬ−１０の収率が、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）により決定して、４０％付近になったとき、１Ｍグリシン溶液を最終濃度３０ｍＭになるまで加えることによって反応を停止させる。ＨＣｌ溶液を用いて反応溶液のｐＨを７．０になるまで徐々に調整し、次いで、０．２ミクロンフィルターを用いて反応溶液をろ過し、−８０℃で保管する。
【０１９９】
例示的なペグ化ＩＬ−１０合成スキーム２
メトキシ−ＰＥＧ−アルデヒド（ＰＡＬＤ−ＰＥＧ）（Ｉｎｈａｌｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ハンツビル、アラバマ州；このほか、ＮＯＦ  Ａｍｅｒｉｃａ社（アーバイン、カリフォルニア州）からも入手可能である）をリンカーとして用いてモノ−ペグ化ＩＬ−１０を調製する。ＰＡＬＤ−ＰＥＧは分子量が５ＫＤａ、１２ＫＤａ、または２０ＫＤａであり得る。ＩＬ−１０を上記のように透析して希釈するが、反応緩衝液のｐＨは６．３〜７．５にする。活性化したＰＡＬＤ−ＰＥＧリンカーを反応緩衝液に１：１のモル比で加える。反応混合物にシアノ水素化ホウ素を加えて最終濃度を０．５〜０．７５ｍＭにする。反応を室温（１８〜２５℃）で１５〜２０時間、穏やかに攪拌しながら実施する。１Ｍグリシンにより反応を停止させる。ＳＥ−ＨＰＬＣにより収率を分析する。モノ−ペグ化ＩＬ−１０をゲルろ過クロマトグラフィーにより未反応のＩＬ−１０、ＰＥＧリンカーおよびジ−ペグ化ＩＬ−１０から分離し、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびバイオアッセイ（例えば、ＩＬ−１０応答性の細胞または細胞系の刺激）によって特徴を明らかにする。
【０２００】
例示的なＰＥＧ−ＩＬ−１０合成スキーム３
ＩＬ−１０（例えば、げっ歯類または霊長類）を５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨの範囲は５〜７．４）に対して透析する。０．７５〜３０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下、モル比が１：１〜１：７の５Ｋ  ＰＥＧ−プロピルアデヒド（ｐｒｏｐｙｌａｄｅｈｙｄｅ）を濃度１〜１２ｍｇ／ｍＬのＩＬ−１０と反応させる。あるいは、同様の方法によりピコリンボランで反応物を活性化してもよい。反応物を５〜３０℃で３〜２４時間インキュベートする。
【０２０１】
ペグ化反応物のｐＨを６．３に調整し、７．５ｍｇ／ｍＬのｈＩＬ−１０をＰＥＧと反応させて、ＰＥＧリンカーに対するＩＬ−１０の比を１：３．５にする。シアノ水素化ホウ素の最終濃度を約２５ｍＭとし、反応を１５℃で１２〜１５時間実施する。モノ−およびジ−ペグ化ＩＬ−１０が最も多い反応生成物であり、それぞれの終了時の濃度は約４５〜５０％である。グリシンまたはリジンなどのアミノ酸、あるいはトリス緩衝液を用いて反応を停止させ得る。ゲルろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、およびサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）などの多数の精製方法を用いて所望のペグ化ＩＬ−１０分子を分離できる。
【０２０２】
例示的なペグ化ＩＬ−１０合成スキーム４
ＩＬ−１０を１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析する。透析したＩＬ−１０を透析緩衝液を用いて３．２倍に希釈し約０．５〜１２ｍｇ／ｍＬの濃度にする。リンカー、ＳＣ−ＰＥＧ−１２Ｋ（Ｄｅｌｍａｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ研究所、メイウッド、イリノイ州）を加える前に、９体積の希釈したＩＬ−１０に１体積の１００ｍＭ四ホウ酸Ｎａ（ｐＨ９．１）を加えて、ＩＬ−１０溶液のｐＨを８．６に上げる。ＳＣ−ＰＥＧ−１２Ｋリンカーを透析緩衝液に溶かし、希釈したＩＬ−１０溶液にしかるべき体積のリンカー溶液（１モルのＩＬ−１０当たり１．８〜３．６モルのリンカー）を加えて、ペグ化反応を開始する。反応速度を制御するため、５℃で反応を実施し、反応溶液を穏やかに攪拌する。モノ−ペグ化ＩＬ−１０の収率が、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）により決定して、４０％付近になったとき、１Ｍグリシン溶液を最終濃度３０ｍＭになるまで加えることによって反応を停止させる。ＨＣｌ溶液を用いて反応溶液のｐＨを７．０になるまで徐々に調整し、反応物を０．２ミクロンでろ過し、−８０℃で保管する。
【０２０３】
修飾型ＩＬ−１０の生物活性を決定するアッセイ
本開示は、本明細書に記載されるＩＬ−１０分子（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）の生物活性を決定するために当該技術分野で公知の任意のアッセイおよび方法論を用いることを企図する。以下に記載するＭＣ／９細胞増殖アッセイは代表的なものであって、排他的なものではない。
【０２０４】
ＭＣ／９細胞増殖アッセイ
ＭＣ／９細胞（肥満細胞の特徴を有するマウス細胞系で、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（ダンバーズ、マサチューセッツ州）から入手可能である）にＩＬ−１０を投与すると、用量依存性に細胞増殖が増大する。
【０２０５】
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ−Ｓｎｉｐｅｓ，Ｌ．ら（（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：５０７−１０）は、ＭＣ／９細胞にＩＬ３＋ＩＬ１０およびＩＬ３＋ＩＬ４＋ＩＬ１０を添加する標準的なアッセイプロトコルについて記載している。いくつかの供給業者（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国；およびＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ダンバーズ、マサチューセッツ州）は、ｒｈＩＬ１０のロットリリース試験としてこのアッセイを用いている。当業者であれば、細胞にＩＬ−１０のみを添加するようにＴｈｏｍｐｓｏｎ−Ｓｎｉｐｅｓ，Ｌ．らに記載されている標準的なアッセイプロトコルを変更できるであろう。
【０２０６】
Ｅｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃを用いた消化によるＰＥＧ−ｒｈＩＬ−１０ＤＳの同定
ペグ化組換えヒトＩＬ−１０原薬（ＰＥＧ−ｒｈＩＬ−１０ＤＳ）の整合性を明らかにするため、ＰＥＧ−ｒｈＩＬ−１０ＤＳをＥｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃで消化した後、ＤＴＴで還元し、ＲＰ−ＨＰＬＣにＵＶ検出を用いて分析した。ＰＥＧ−ｒｈＩＬ−１０ＤＳは、モノ−ペグ化ＩＬ−１０とジ−ペグ化ＩＬ−１０の約１：１の比の混合物を含み、Ｎ末端にＰＥＧ化がみられる。ＰＥＧ−ＩＬ−１０分子のＰＥＧ成分は分子質量が約５ｋＤａであった。
【０２０７】
最初に、市販のソフトウェアを用いて、ＰＥＧ−ｒｈＩＬ−１０ＤＳの理論的消化およびその後のペプチド質量の決定を予測した。Ｅｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃ消化を実施し、ここでは、製剤マトリックス中の０．１ｍｇのＰＥＧ−ｒｈＩＬ−１０を酵素４０μｇと２５±２℃で６時間混合した後、５００ｍＭ  ＤＴＴ  ３７μＬを３７±２℃で１時間加えた。次いでこの溶液を、ＵＶ検出器、自動注入装置、グラジエント分析ポンプ、カラムヒータおよびしかるべきデータ収集システムを備えたＨＰＬＣシステム、Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ３００  Ｃ１８、３．５ｍｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ社；ミルフォード、マサチューセッツ州）で分離した。ＬＣ／ＭＳによりペプチド質量を決定した。理論的ペプチド消化質量と測定ペプチド質量が一致しており、１００％の消化を示し、この方法が同一性試験に適した方法であることが示された。
【０２０８】
次いで、Ｅｍｐｏｗｅｒソフトウェアパッケージ（Ｅｍｐｏｗｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ；オーランド、フロリダ州）を用いたＵＶベースの検出方法により、上記のペプチド検出方法が有効であることを確認した。ＵＶベースの方法はＬＣ／ＭＳ方法論に比してより確実で振り替え可能であった。
【０２０９】
次いで、ＰＥＧ−ｒｈＩＬ−１０およびｒｈＩＬ−１０をＥｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃｔで消化し、ＵＶ検出マップを作成した。図４に記載のクロマトグラムに図示されるように、Ｅｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃ消化により分離したピークが得られ、ｒｈＩＬ−１０（濃いトレース）とＰＥＧ−ｒｈＩＬ−１０（薄いトレース）のペプチドマップで実質的にほぼ同じトレースが得られた。このように、Ｅｎｄｏ  Ｇｌｕ−Ｃペプチダーゼにより、ペグ化インターロイキン−１０およびその他のペグ化インターロイキン−１０関連分子を含む組成物の同一性（例えば、アミノ酸配列）および安定性に関して確実な結果が得られた。
【０２１０】
本明細書には、本発明者らの知る本発明を実施するのに最良の形態を含め、本発明の特定の実施形態が記載されている。上記の説明を読めば、当業者には本開示の実施形態の変形形態が明らかになると思われるとともに、その当業者が必要に応じてこのような変形形態を用い得ると予想される。したがって、本発明が、本明細書に具体的に記載される以外の方法で実施されること、および本発明が、適用法によって許容される範囲内で、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載される主題のあらゆる変更形態および等価物を含むことが意図される。さらに、本明細書に特に明示される場合、または明らかに文脈と矛盾する場合を除いて、上記要素の可能なあらゆる変形形態での任意の組合せが本発明に包含される。
【０２１１】
本明細書に引用される刊行物、特許出願、アクセッション番号をはじめとする参考文献はすべて、個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により本明細書に組み込まれることが明示された場合と同様に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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