(57)【要約】  複雑なサンプルマトリックス中における、バンコマイシンなどのフェノール部分を含有する糖ペプチド抗生物質の濃度の特定を、複雑なサンプルマトリックスの計量部分から、糖ペプチド抗生物質との親和性を有する抽出剤に前記計量部分を曝露し、溶出液の計量部分に抽出剤を曝露して抽出剤から糖ペプチド抗生物質を放出させることによって、糖ペプチド抗生物質を抽出すること；ならびにギブス試薬（２，６‐ジクロロキノン‐４‐クロロイミド）を複雑なサンプルマトリックスまたは溶出液の計量部分に添加し、ギブス試薬を活性化させ、活性化ギブス試薬と抗生物質との間の反応が安定化した後に、前記溶出液中の活性化ギブス試薬と抗生物質との反応生成物を検出し、検出された反応生成物から複雑なサンプルマトリックス中の抗生物質の濃度を特定することによって糖ペプチド抗生物質の濃度を特定すること、によって行うための方法および装置が開示される。こうして得られた濃度を用いて個別化薬物投与レジメンを設計する方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複雑なサンプルマトリックス中におけるフェノール部分を含有する糖ペプチド抗生物質の濃度を特定する方法であって、
前記複雑なサンプルマトリックスの計量部分を、前記糖ペプチド抗生物質と親和性を有する抽出剤に曝露し、そして
前記抽出剤を、第一の有機溶媒である第一の溶出液または第二の有機溶媒／水混合物である第二の溶出液の計量部分に曝露する、
ことによって、前記複雑なサンプルマトリックスの計量部分から前記糖ペプチド抗生物質を抽出する工程、および
前記糖ペプチド抗生物質の量に対して過剰量のギブス試薬（２，６‐ジクロロキノン‐４‐クロロイミド）を前記第一または第二の溶出液の前記計量部分に添加し、
アルカリ性条件下にて前記ギブス試薬を活性化させ、前記活性化ギブス試薬と前記抗生物質との間の反応が安定化した後に、
前記第一または第二の溶出液中の前記活性化ギブス試薬と前記糖ペプチド抗生物質との反応生成物を検出し、そして
前記検出された反応生成物から、前記複雑なサンプルマトリックス中の前記糖ペプチド抗生物質の濃度を特定する、
ことによって、前記糖ペプチド抗生物質の濃度の特定を行う工程、
を含んでなり、
前記濃度は、
前記第一の溶出液の場合は、前記複雑なサンプルマトリックス中の非結合糖ペプチド抗生物質の濃度であり、そして
前記第二の溶出液の場合は、前記複雑なサンプルマトリックス中の結合糖ペプチド抗生物質の濃度である、方法。
【請求項２】
前記第一および／または第二の有機溶媒が、メタノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記曝露工程が前記第一の溶出液によって行われ、前記曝露および前記特定工程を前記第二の溶出液で繰り返すことをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第二の溶出液が、２：１の体積比のメタノール／水混合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記抽出剤を前記第一または第二の溶出液の前記計量部分に曝露する前に、前記抽出剤を少なくとも１つの洗浄工程に曝露して、弱く結合した不純物を前記抽出剤から除去することをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記複雑なサンプルマトリックスが細胞物質を含み、
前記曝露工程が：
既知量の前記複雑なサンプルマトリックスを準備し、
前記既知量を、前記細胞物質の浸透圧よりも低い浸透圧を有する溶解剤で希釈し、
続いて、前記希釈した既知量を、前記抽出剤を含むろ過ステージを通して供給し、所定の時間後に、不安定化させた前記細胞物質から、前記糖ペプチド抗生物質を前記抽出剤に選択的に付着させることによって前記糖ペプチド抗生物質を分離すること、を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記抽出剤が、前記細胞物質を機械的に溶解するための収着剤を含み、前記収着剤は、前記糖ペプチド抗生物質を結合するための親和性を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記収着剤が、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１８、またはＳｔｒａｔａ‐Ｘなどの逆相収着剤である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記検出工程が、前記活性化ギブス試薬と前記糖ペプチド抗生物質との反応生成物を電気化学的にまたは比色によって検出することを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記比色による検出が、５８９ｎｍなどの５８０〜６００ｎｍの範囲の吸収の強度を測定することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記糖ペプチド抗生物質が、バンコマイシンである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記複雑なサンプルマトリックスが、血液、血漿、および血清の１つであるか、またはミルクまたは肉などの食品から得られる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
患者のためのフェノール部分を含有する糖ペプチド抗生物質の個別化投与レジメンを提供する方法であって、
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法に従って前記患者の複雑なサンプルマトリックス中の前記糖ペプチド抗生物質の濃度を特定する工程、
前記複雑なサンプルマトリックス中の前記糖ペプチド抗生物質の前記特定された濃度から、前記患者における前記糖ペプチド抗生物質の代謝特性を誘導する工程、および
前記代謝特性に基づいて、前記個別化糖ペプチド抗生物質投与レジメンを提供する工程、
を含んでなる、方法。
【請求項１４】
前記特定工程が、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法に従って前記患者の複雑なサンプルマトリックス中の前記糖ペプチド抗生物質の前記濃度を定期的に特定することを含み、前記誘導工程が、前記定期的に特定された濃度のトレンドから前記代謝特性を誘導することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
フェノール部分を含有する糖ペプチド抗生物質を、細胞物質を含む複雑なサンプルマトリックスから自動的に抽出するための装置であって、
前記複雑なサンプルマトリックスの定められた量を提供するためのアウトプット部を備えたサンプル受け取りステージと、
前記サンプル受け取りステージのアウトプット部と流体連結された第一のインプット部、溶解剤を受けるための第二のインプット部、および前記複雑なサンプルマトリックスの定められた量および前記溶解剤の混合物を提供するためのアウトプット部を有する混合ステージと、
前記混合ステージのアウトプット部と流体連結されたインプット部、ならびに前記複雑なサンプルマトリックスの定められた量および前記溶解剤の遅延された混合物を提供するためのアウトプット部を有する遅延ステージと、
前記細胞物質を機械的に溶解するための収着剤を含むろ過ステージであて、前記収着剤は前記糖ペプチド抗生物質の結合に対する親和性を有し、前記遅延ステージの前記アウトプット部と流体連結されているインプット部を有するろ過ステージと、
前記複雑なサンプルマトリックスの定められた量および前記溶解剤の混合物の前記遅延ステージを通る流速を制御するためのコントローラーと、
を備え、
前記装置は、前記ろ過ステージと流体連結され、前記糖ペプチド抗生物質と前記活性化ギブス試薬との反応生成物を含む前記ろ過ステージから受けた溶出液の比色スペクトルを特定するように構成された比色測定ステージと、
前記比色測定ステージと連結され、前記比色スペクトル中の特定の波長から前記複雑なサンプルマトリックス中の前記糖ペプチド抗生物質の濃度を誘導するように適合されたプロセッサーと、
をさらに備える、装置。
【請求項１６】
前記糖ペプチド抗生物質が、バンコマイシンであり、前記特定の波長が、５８９ｎｍなどの５８０〜６００ｎｍの範囲である、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記サンプル受け取りステージは、前記サンプル受け取りステージの前記インプット部で受けた複雑なサンプルマトリックスの既知量を抽出するためのロータリーバルブなどの計量デバイスを含む、請求項１５または１６に記載の装置。
【請求項１８】
続いて行われる前記抗生物質の抽出に干渉する物質を前記収着剤から除去するための洗浄剤を前記ろ過ステージに提供するための、前記ろ過ステージと流体連結された流体貯蔵部をさらに含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１９】
前記ろ過ステージが、固相抽出カートリッジを含む、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２０】
前記収着剤が、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１８、またはＳｔｒａｔａ‐Ｘなどの逆相収着剤である、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的サンプル中の分析物濃度の抽出および測定に用いられる細胞溶解の自動化を改善するための方法および装置に関する。特に、本発明は、バンコマイシンの抽出および分析の前に血液細胞を自動的に希釈および溶解するための手段を提供する。
【背景技術】
【０００２】
抗生物質は、その発見以来、細菌によって引き起こされる感染性疾患に対する戦いにおいて極めて重要となっている。しかし、それが広く不適切に用いられることは、薬物耐性を引き起こす最大の原動力の１つである。例えば、Davies, S., Infections and the Rise of Antimicrobial Resistance, Annual Report of the Chief Medical Officer -Volume Two, 2011；Chan, M., Combating Antimicrobial Resistance: Time for Action conference, WHO, 2013；およびJ.W. Ndieyira et al. in Nature Nanotechnology 3(11), pages 691-696, 2008を参照されたい。
【０００３】
新たな感染症の出現や、抗生物質耐性院内「スーパーバグ」、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、およびバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）などの旧敵の再出現、そしてそれに伴う致死率の上昇は、主要な世界的医療問題であり、ＮＨＳ単独でも年間に１０億ポンドの費用が掛かっている。同時に、抗生物質パイプラインは、ほとんど枯渇しており、この４０年間で僅かに数個の新しい種類の抗生物質が発見されたにすぎない。例えば、M.A Cooper et al., Nature 472, page 32, 2011およびM.S. Butler et al. in Journal of Antibiotics 64(6), pages 413-425, 2011を参照されたい。このように新しい強力な薬物が存在しないことは、不治の感染症の抗生物質前の時代に逆戻りするリスクを我々に課すものであり、またはＷＨＯが最近予測したように、「世界はポスト抗生物質の時代へ向かっている」。従って、抗生物質の管理を改善して、抗微生物薬耐性へと繋がることが避けられない細菌への進化的圧力を最小限に抑えるためのツールが緊急に求められている。
【０００４】
診療所では、投与された薬物の濃度は、（糖ペプチド）抗生物質を含む多くの薬物の場合、臨床的判断、平均薬物動態モデル、および治療法の効果を評価する主観的方法の組み合わせに頼っており、その結果、治療法の質が本質的に変動することになる。バンコマイシンなどの糖ペプチド抗生物質を例とする多くの治療薬物の投与は、治療薬物モニタリング（ＴＤＭ）に従っての調節が通常行われ、これは、特に投与の最初の２４時間において、より高い頻度でモニタリングすることにより、大きく改善することができる。結論として、個々の患者、特に小児科、肥満、高齢、免疫低下、集中治療室（ＩＣＵ）、および腫瘍の患者などのリスクを持つ患者集団に対して治療を個別化する新しい技術が緊急に求められている。
【０００５】
さらに、腎毒性の可能性を有する糖ペプチド抗生物質バンコマイシンの特別の場合、同時に腎毒性薬を受けている患者は、望ましくない毒性副作用の高いリスクを有する。従って、特にそのような患者のために、患者レベルで治療法を個別化および最適化する目的で、ポイントオブケアで数分以内に薬物レベルをモニタリングすることが緊急に必要とされている。この必要性は、２００２年には既に認識されており、例えば、CM. Tobin et al., Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 50(5), pages 713-718, 2002を参照されたい。英国国民医薬品集（ＢＮＦ）には、バンコマイシンのピーク血清値が２５〜４０μｇ／ｍＬの範囲であることが推奨されており、これは、１７．３〜２７．６μＭのバンコマイシンに相当し、トラフ値は、１０〜１５μｇ／ｍＬ、併発感染症の場合は１５〜２０の範囲とするべきであり、これらはそれぞれ、６．９〜１０．４μＭおよび１０．４〜１３．８μＭに相当する。小児科の場合、ピーク血清値は、６０μｇ／ｍＬに達してよく、これは、４１．４μＭのバンコマイシンに相当し、トラフ値は、通常、５〜１０μｇ／ｍＬの範囲と測定され、これは、３．５〜６．９μＭのバンコマイシンに相当する。
【０００６】
治療バンコマイシンモニタリングのための診療所での現行技術は、大規模なサンプル調製が必要であり、多くの場合、サンプルは、熟練スタッフのいる専門研究施設へ送る必要がある。M.A Cooper et al., Nature 472, page 32, 2011およびC.M. Tobin et al., Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 50(5), pages 713-718, 2002によっても認識されているように、これは、高価であり、困難で時間の掛かるものであり、試験と結果との間でのタイムラグは避けられず、このことは、重要な治療判断が遅れ、患者の治療への道筋（patient pathways）が、遅く煩雑なものとなり得ることを意味している。
【０００７】
さらに、タンパク質結合は劇的に変化する（１０〜８２％  結合タンパク質）にもかかわらず、通常の薬物モニタリングでは結合受容体の平均割合としてしばし使われる５５％で全抗生物質濃度が測定されているにすぎない。例えば、Zeitlinger et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 55(7), pages 3067-3074, 2011を参照されたい。遊離バンコマイシン濃度の測定は、いくつかの調製工程が必要であり、その結果として、非常に時間が掛かり、高価であることから、医療機関では定期的に実施されるものではない。例えば、Berthoin et al., International Journal of Antimicrobial Agents 34(6), pages 555-560, 2009を参照されたい。遊離薬物分のみが薬理学的に活性であり、血清タンパク質へ結合した薬物分画は不活性であると一般的に認められていることから、このことは問題である。さらに、研究により、遊離分画と全体分画との間の相関は低いことが示唆されている。例えば、Estes & Derendorf, European Journal of Medical Research, 15(12), pages 533-543, 2010およびButterfield et al. Antimicrobial agents and Chemotherapy 55(9), pages 4277-4282 2011を参照されたい。
【０００８】
治療バンコマイシン薬物モニタリングにおける現在の最も基準となる方法は：
英国のアボットダイアグノスティクス（Abbott Diagnostics）からの「ＦＬｘ／ＴＤｘ」などの蛍光偏光免疫測定法（ＦＰＩＡ）
スイスのロシュ（Roche）、ＣＯＢＡＳ（登録商標）からの「オンラインＴＤＭバンコマイシンアッセイ」などの均一酵素免疫測定法
である。
【０００９】
C.M. Tobin et al., Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 50(5), pages 713-718, 2002に開示されるように、２００２年、ＮＨＳブリストルは、バンコマイシンの治療薬物モニタリング（ＴＤＭ）を研究する調査を開始した。そこでは、英国ＮＨＳ病院、英国公衆衛生研究所、英国の私立病院、ならびにその他の欧州および欧州外の病院からの３１０人の参加者に質問を行った。この調査によると、採血、研究所への輸送（微生物部門が依然としてアッセイの主たる提供者であるため）、事務処理の時間、アッセイの実施、結果の報告および解釈を含むバンコマイシンアッセイのコストは、約３５ポンド掛かると算出され、これは、１日２回１ｇの静脈内投与の薬物コストを超えている。
【００１０】
さらに、Tobinの研究から、１日で結果を受け取ったのは全アッセイのうちの約６５％のみであったことも示された。回答者のほとんどすべてである９７％が、英国メイデンヘッドのアボットダイアグノスティクスから購入した蛍光偏光免疫測定法（ＦＰＩＡ）を用いていた。
【００１１】
さらには、Touw et al.によりEuropean Journal of Hospital Pharmacy Science, page 13, 2007に公開された最近の研究では、治療薬物モニタリング（ＴＤＭ）の費用対効果の研究結果が示された。その研究では、アミノグリコシドおよびバンコマイシン治療に対する結果が公開され、統計的に有意なより高い死亡率（６．３％）、より長い入院期間（１２．３％）、より高い聴覚損失（４６．３％）および腎機能障害（３４．０％）、ならびに結果としてのより高い合計費用（６．３％）が、薬剤師管理下の治療法（pharmacist-managed therapies）を行わなかった病院で示され、それには、数学的および薬物動態学的モデルを用いた結果の解釈と組み合わせたＴＭＤ、ならびに続いて行われるそれに応じての医師への助言が含まれる。結論として、バンコマイシン療法は、特に、ＩＣＵ患者、腫瘍患者、および同時に腎毒性薬を受けている患者などのリスクを有する患者集団において、ＴＤＭに従って調節されることが推奨された。
【００１２】
従って、抗生物質レベルを、特にポイントオブケアでの患者の複雑なサンプルマトリックス中の糖ペプチド抗生物質レベルを、特にバンコマイシンレベルをより容易且つ正確に検出して、ポイントオブケアでの迅速なＴＭＤを促進することが長年にわたって求められていることは明らかである。特に、患者のポイントオブケアで、そのような複雑なサンプルマトリックス中の糖ペプチド抗生物質の遊離（非結合）分画および結合分画を正確に検出することが必要とされている。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、（ポリ）フェノール官能基を含む糖ペプチド抗生物質、例えばバンコマイシンの自動検出のための、血液、血漿、または血清を例とする患者の複雑なサンプルマトリックス中のそのような糖ペプチド抗生物質のレベルをポイントオブケアで信頼性高く検出することができる方法および装置を提供することを目的とする。
【００１４】
本発明の態様によると、複雑なサンプルマトリックス中において、フェノール部分を、すなわち、少なくとも１つのフェノール部分を含有する抗生物質の濃度を特定する方法が提供される。この方法は、前記複雑なサンプルマトリックスの計量部分を、前記糖ペプチド抗生物質と親和性を有する抽出剤に曝露し、そして、前記抽出剤を、第一の有機溶媒である第一の溶出液または第二の有機溶媒／水混合物である第二の溶出液の計量部分に曝露することによって、前記複雑なサンプルマトリックスの計量部分から前記糖ペプチド抗生物質を抽出する工程、および前記糖ペプチド抗生物質の量に対して過剰量のギブス試薬（２，６−ジクロロキノン−４−クロロイミド）を前記第一または第二の溶出液の前記計量部分に添加し、アルカリ性条件下にて前記ギブス試薬を活性化させ、前記活性化ギブス試薬と前記抗生物質との間の反応が安定化した後に、前記第一または第二の溶出液中の前記活性化ギブス試薬と前記糖ペプチド抗生物質との反応生成物を検出し、そして、前記検出された反応生成物から、前記複雑なサンプルマトリックス中の前記糖ペプチド抗生物質の濃度を特定することによって、前記糖ペプチド抗生物質の濃度の特定を行う工程を含んでなり、前記濃度は、前記第一の溶出液の場合は、前記複雑なサンプルマトリックス中の非結合糖ペプチド抗生物質の濃度であり、そして前記第二の溶出液の場合は、前記複雑なサンプルマトリックス中の結合糖ペプチド抗生物質の濃度である。
【００１５】
驚くべきことに、バンコマイシンなどのフェノール部分を含有する糖ペプチド抗生物質の複雑なサンプルマトリックスからの抽出は、そのようなサンプルマトリックスからのプロポフォールの抽出のために既に用いられている抽出アッセイを用いて効果的に行うことができることが見出された。国際公開第２０１２／０４９４８６  Ａ１号を参照されたい。
【００１６】
さらに、驚くべきことに、溶出液を適切に選択することにより、そのような抽出アッセイを用いて遊離または結合糖ペプチド抗生物質分画を選択的に抽出することができることも見出された。それは、アッセイにおける糖ペプチド抗生物質の抽出剤との親和性が、遊離分画の場合のように、糖ペプチド抗生物質が抽出剤のみと結合しているのかどうか、または結合分画の場合のように、糖ペプチド抗生物質が、抽出剤および／もしくはタンパク質、脂肪酸、グルコース、尿素、乳酸、電解質などを例とする細胞物質、細胞外物質などの複雑なサンプルマトリックスから抽出された物質と結合しているかどうかに依存することが見出されたからである。従って、バンコマイシンなどの糖ペプチド抗生物質の遊離および結合分画を、単一のアッセイによって正確に特定することができる。
【００１７】
加えて、驚くべきことに、電気化学的にまたは比色によって検出することができる反応生成物を得るために、バンコマイシンなどのフェノール系糖ペプチド抗生物質にギブス反応を用いることができることも見出された。これは、そのような抗生物質では、およびバンコマイシンの特定の場合では、ジヒドロキシベンゼン（糖ペプチド抗生物質の７番目の残基である）のパラ無置換位（６位）が立体障害であり、そのことは、そのような抗生物質に対してギブス反応が良好に完了する確率が低いことを明白に示唆していることから、予想外である。この方法は、ポイントオブケアでの薬物送達の非常により良好な制御を可能とし、感染、患者の治療、安全性、および健康上のアウトカムの管理の改善をもたらし、さらには耐性を悪化させる抗生物質の不適切な使用を抑制する。これは、患者の治療全体を通して、高頻度で、迅速に、正確な情報を提供し、さらには、治療判断の時間を短縮する。
【００１８】
この点で、Rao et al., Indian pharmacist 2(9), page 59-61, 2003の要約、および表題が"Studies on Development and Validation of Analytical Procedures for the Estimation of Selected Drugs through new Rp-HPLC methods"である論文K. Bala Murali Krishna, Acharya Nagarjuna University, chapter 3 on page 69, 2010 [http://shodhganga.inflibnet.ac.in/handle/10603/8209]にて、酸性媒体中でギブス反応を行うことによるバンコマイシン‐ギブス反応生成物の形成が示唆されていることに留意されたい。彼らは、上述の引用文献で、それぞれ４００ｎｍおよび４６０ｎｍに最大吸収波長（λｍａｘ）を有する黄色生成物を得た。しかし、本発明者らは、そのような黄色生成物は、ギブス‐バンコマイシン反応生成物ではなく、活性化ギブス試薬に相当することを見出した。
【００１９】
対照的に、本発明者らは、所望されるギブス‐バンコマイシン反応生成物を、アルカリ性反応条件下で形成することができることを認識し、この場合、最大吸収波長（λｍａｘ）が５８０〜６００ｎｍの範囲である別の紫／マゼンタ色生成物が生成する。
【００２０】
本発明の実施形態は、臨床的に関連する濃度（３．５〜２７．５μＭまたは５〜４０μｇ／ｍＬ）のバンコマイシンなどのフェノール部分を含有する糖ペプチド抗生物質の検出を、上述の最も基準となる方法であるＲｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ  Ｖａｎｃ２アッセイ（１．２μＭ）に匹敵する検出下限にて、研究所ベースのアッセイでの分析のためにサンプルを送付する必要のある場合の数時間と比較して数分以内に薬物の定量が行われるという明らかな有益性と共に行うことを可能とする。
【００２１】
第一および／または第二の有機溶媒はメタノールであってよい。
【００２２】
実施形態では、前記曝露工程が、第一の溶出液で行われ、方法はさらに、第二の溶出液で曝露および特定する工程を繰り返すことを含む。この方法により、複雑なサンプルマトリックス中の糖ペプチド抗生物質の遊離分画および結合分画の両方を、それぞれ第一および第二の溶出液から特定することができる。
【００２３】
特に有利な実施形態では、ギブス反応に干渉し得る弱く結合した不純物を抽出剤から除去する目的で、方法は、抽出剤を、前記第一および／または第二の溶出液の計量部分に曝露する前に少なくとも１つの洗浄工程に曝露して、弱く結合した不純物を抽出剤から除去することをさらに含む。
【００２４】
複雑なサンプルマトリックスは、既に説明したように、細胞物質または細胞外物質などの物質を含んでよく、その場合、曝露工程は、既知量の複雑なサンプルマトリックスを提供すること、前記既知量を、細胞物質の浸透圧よりも低い浸透圧を有する溶解剤で希釈すること、および続いてこの希釈した既知量を、抽出剤を含むろ過ステージを通して供給し、所定の時間後に、細胞物質および細胞外物質を例とする不安定化された物質から、糖ペプチド抗生物質を抽出剤に付着させることによって糖ペプチド抗生物質を分離することを含んでよい。
【００２５】
抽出剤は、細胞物質を機械的に溶解するための収着剤をさらに含んでよく、前記収着剤は、糖ペプチド抗生物質を結合するための親和性を有しており、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１８、またはＳｔｒａｔａ‐Ｘなどの逆相収着剤などである。
【００２６】
実施形態では、検出工程は、活性化ギブス試薬と糖ペプチド抗生物質との反応生成物を電気化学的に検出することを含む。
【００２７】
別の実施形態では、検出工程は、活性化ギブス試薬と糖ペプチド抗生物質との反応生成物を比色によって検出することを含む。これは、さらなる反応を行う必要なく反応生成物を容易に検出することができることから、特に有利である。例えば、バンコマイシンの場合、前記比色検出は、５８９ｎｍでの吸収強度を測定することを含む。
【００２８】
ギブス反応は、適切ないかなる時点で行われてもよく、例えば、前記抽出工程に続いて行われてもよい。
【００２９】
複雑なサンプルマトリックスは、（ヒト）患者から回収される必要はない。別の実施形態では、複雑なサンプルマトリックスは、ミルクまたは肉などの食品から得られ、このことは、そのような食品中の糖ペプチド抗生物質レベルの迅速な特定を促進するものであり、ほとんどの司法制度において、そのような食品中に（過剰量の）糖ペプチド抗生物質が存在することは禁止されていることから、食品基準の管理をより容易に行うことができるようになる。
【００３０】
本発明の別の態様によると、患者のためのフェノール部分を含有する糖ペプチド抗生物質の個別化投与レジメンを提供する方法が提供され、その方法は、本発明の糖ペプチド抗生物質濃度特定法の実施形態に従って前記患者の複雑なサンプルマトリックス中の糖ペプチド抗生物質の濃度を特定すること、前記複雑なサンプルマトリックス中の糖ペプチド抗生物質の特定された濃度から、前記患者における糖ペプチド抗生物質の代謝特性を誘導すること、および前記代謝特性に基づいて、前記個別化糖ペプチド抗生物質投与レジメンを提供することを含む。
【００３１】
これにより、患者個人の薬物吸着、分布、代謝、および排出に従って薬物用量を所望される目標濃度となるように管理、例えば用量設定すること、蓄積または薬物のクリアランス速度の変化を検出すること、および薬物送達システムの障害を早期に検出することが可能となる。この結果、ポイントオブケアで薬物レベルをモニタリングすることが、患者レベルで治療法を個別化、最適化、および管理する際の重要なツールとなり、従って、患者中の薬物濃度の受動的な「モニタリング」から（予防的）積極的な管理へ向けた重要なステップが提供される。
【００３２】
本発明の実施形態では、特定工程は、複雑なサンプルマトリックス中の糖ペプチド抗生物質の濃度を定期的に特定することを含み、ここで、前記誘導工程は、定期的に特定された濃度のトレンドから前記代謝特性を誘導することを含む。
【００３３】
本発明のさらなる別の実施形態によると、フェノール部分を含有する糖ペプチド抗生物質を、細胞物質および細胞外物質などの物質を含む複雑なサンプルマトリックスから自動的に抽出するための装置が提供され、その装置は、前記複雑なサンプルマトリックスの定められた量を提供するためのアウトプット部を備えたサンプル受け取りステージと、前記サンプル受け取りステージのアウトプット部と流体連結された第一のインプット部、溶解剤を受けるための第二のインプット部、および前記複雑なサンプルマトリックスの定められた量および前記溶解剤の混合物を提供するためのアウトプット部を有する混合ステージと、前記混合ステージのアウトプット部と流体連結されたインプット部、ならびに前記複雑なサンプルマトリックスの定められた量および前記溶解剤の遅延された混合物を提供するためのアウトプット部を有する遅延ステージと、前記細胞物質を機械的に溶解するための収着剤を含むろ過ステージであって、前記収着剤は前記糖ペプチド抗生物質の結合に対する親和性を有し、前記遅延ステージの前記アウトプット部と流体連結されているインプット部を有するろ過ステージと、前記複雑なサンプルマトリックスの定められた量および前記溶解剤の混合物の前記遅延ステージを通る流速を制御するためのコントローラーとを備え、ここで、この装置は、前記ろ過ステージと流体連結され、前記糖ペプチド抗生物質と前記活性化ギブス試薬との反応生成物を含む前記ろ過ステージから受けた溶出液の比色スペクトルを特定するように構成された比色測定ステージと、前記比色測定ステージと連結され、前記比色スペクトル中の特定の波長から前記複雑なサンプルマトリックス中の糖ペプチド抗生物質の濃度を誘導するように適合されたプロセッサーとを、さらに備える。
【００３４】
そのような装置は、そのような複雑なサンプルマトリックス中におけるバンコマイシンなどの１つ以上のフェノール部分を有する糖ペプチド抗生物質のレベルを自動的に検出することができ、従って、ポイントオブケアでの薬物送達の改善された制御、ならびに感染、患者の治療、安全性、および健康上のアウトカムの改善された管理、さらには耐性を悪化させる抗生物質の不適切な使用の抑制が、患者の治療全体を通して、高頻度で、迅速に、正確な情報を提供し、治療判断の時間を短縮することによって促進される。この装置は、装置内において浸透圧による溶解と機械的な溶解とを組み合わせて提供し、好ましくは、目的の分析物に対する親和性を有する収着剤全体に希釈サンプルを通すことによって機械的溶解が達成される。この手法により、バンコマイシンなどのフェノール部分を含有する糖ペプチド抗生物質の収着剤上への放出の効率が高められる。加えて、この装置は、収着剤上に蓄積されたいずれのサンプル物質も、続いて行われる糖ペプチド抗生物質の抽出、および検出／測定になお利用可能であるように構築される。
【００３５】
加えて、この新規な装置は、前処理または希釈の必要性なしに、複雑なサンプルマトリックス全体を機器へ注入することが可能であることから、より効率的な使用を提供する。このことは、用いられる溶解剤の実際の体積を特定する必要がないという重要な利点を有し、それは、計量が実際の複雑なサンプルマトリックスに対して行われ、それによって、溶解剤で希釈されたサンプルから抽出された糖ペプチド抗生物質の量が、複雑なサンプルマトリックス中に存在する糖ペプチド抗生物質の量に直接対応するからであり、すなわち、用いられる溶解剤の量は、細胞物質が充分に不安定化される、例えば破裂することを確保する目的以外には重要ではない。
【００３６】
本発明の実施形態では、特定の波長は、５８０〜６００ｎｍの範囲であり、フェノール部分を含有する糖ペプチド抗生物質がバンコマイシンである場合、好ましくは、５８９ｎｍである。
【００３７】
サンプル受け取りステージは、サンプル受け取りステージのインプット部で受けた複雑なサンプルマトリックスの既知量を抽出するためのロータリーバルブなどの計量デバイスを含んでよい。これにより、サンプル評価がサンプルの一部分のみに対して行われることから、溶解剤などの試薬の必要量が低減される。
【００３８】
装置はさらに、続いて行われる糖ペプチド抗生物質の抽出に干渉する物質を収着剤から除去するための洗浄剤をろ過ステージに提供するための、ろ過ステージと流体連結された流体貯蔵部をさらに含んでよい。これにより、バンコマイシンを例とする糖ペプチド抗生物質のこの装置による検出の精度がさらに向上する。
【００３９】
ろ過ステージは、本発明の装置の再利用を最小限の間接費で促進するために固相抽出カートリッジを含んでよく、それは、そのような再利用可能カートリッジが少ないコストで製造可能であるからである。
【００４０】
実施形態では、収着剤は、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１８、またはＳｔｒａｔａ‐Ｘなどの逆相収着剤であり、それは、そのような収着剤が、１つ以上のフェノール部分を含有する糖ペプチド抗生物質の結合に対する親和性を有しているからである。バンコマイシンの結合には、Ｓｔｒａｔａ‐Ｘが特に好ましい。
【００４１】
本発明の実施形態を、より詳細に、限定されない例により、添付の図面を参照して記載する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、新規なサンプル調製手法を組み込んだ本発明の測定方法の実施形態のフローチャートを概略的に示す。
【図２】図２は、新規なサンプル調製法を組み込んだ本発明のデバイスの実施形態を概略的に示す。
【図３】図３は、バンコマイシンと等モル量のギブス試薬との反応の吸収特性を示す。
【図４】図４（Ａ）は、アルカリ性条件下での１：１のバンコマイシン：ギブス化学量論比に基づく新規なカップリング生成物（Ｃ７２Ｈ７６Ｃｌ４Ｎ１０Ｏ２５）からの同位体質量パターンの理論的予測を示し、一方（Ｂ）は、新規な反応生成物の実験的に測定された質量スペクトルを示す。
【図５】図５は、いくつかのバンコマイシン：ギブス試薬モル比におけるバンコマイシン‐ギブス試薬反応生成物の１Ｈ‐ＮＭＲスペクトルを示す。
【図６】図６は、複雑なサンプルマトリックスから抽出されたバンコマイシンと活性化ギブス試薬との反応の吸収特性を示す。
【図７】図７は、複雑なサンプルマトリックスから抽出されたバンコマイシンと活性化ギブス試薬との反応の吸収特性を示す。
【図８】図８は、本発明の比色法の実施形態を用いて、溶出液中の既知濃度のバンコマイシンに対して特定された差分吸収測定値のフィッティングを示す。
【図９】図９は、本発明の別の実施形態に従う、複雑なサンプルマトリックスから抽出されたバンコマイシンと活性化ギブス試薬との反応の吸収特性を示す。
【図１０】図１０は、本発明の別の実施形態に従う、異なるタンパク質濃度を有するいくつかの複雑なサンプルマトリックスから抽出された遊離バンコマイシン（Ａ）およびタンパク質結合バンコマイシン（Ｂ）と活性化ギブス試薬との反応の吸収特性を示す。
【図１１】図１１は、図１０に示す複雑なサンプルマトリックスから抽出された際の遊離およびタンパク質結合バンコマイシンの濃度の比をプロットしたものである。
【図１２】図１２は、全血清サンプルから抽出されたバンコマイシン、およびその他のフェノール系化合物のギブス反応生成物の吸収特性比較を示す。
【図１３】図１３は、バンコマイシンおよびプロポフォールのギブス反応生成物の吸収スペクトルを示す。
【図１４】図１４は、本発明の別の方法のフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
図面は、単なる概略図であり、スケールを合わせて描かれたものではないことは理解されるべきである。また、同じまたは類似の部分を示すために、図面全体を通して同じ符号が用いられていることも理解されるべきである。
【００４４】
本発明は、バンコマイシンなどの目的とする糖ペプチド抗生物質分析物を、複雑なサンプル、特に生物学的サンプルから抽出する必要がある状況に適用することができる。特に、血液または食品サンプルからの糖ペプチド抗生物質検体の抽出に適用可能である。このようなサンプルでは、サンプル中に含有される目的とする１もしくは複数の分析物の一部が、通常は、血液細胞またはタンパク質を例とするサンプルの成分と結合している。サンプル中の１もしくは複数の分析物の濃度を測定するためには、１もしくは複数の分析物は、実際の検出または測定工程の前に、サンプル調製工程の過程でこのような成分から抽出される必要のある場合が多い。本発明は、血液サンプルからのバンコマイシンなどの糖ペプチド抗生物質の抽出に関して主に説明されるが、細胞または類似の構造物などの物質を含有するサンプルを例とするその他の複雑なサンプルマトリックスにも同様に適用可能である。
【００４５】
一般的に、本発明の実施形態は、細胞を分解して細胞成分と結合した目的の分析物を分析に利用可能な状態とするために、希釈、浸透圧溶解、および機械的溶解の組み合わせを用いる。この目的を達成するために、サンプルは、脱イオン水、洗剤、尿素、酸、またはこれらの組み合わせを含有する溶液を例とする溶解剤を用いてまず希釈され、溶解剤の実際の選択は、サンプルの特性に依存し、適切な溶解剤は、細胞溶解の分野の当業者に公知である。希釈工程の結果、血液サンプル中に含有される細胞は、溶解剤の成分（例：水）を取り込むことで膨潤または分解する。サンプル中に含有される細胞は、従って、破裂してその内容物を放出するか、またはより脆弱な状態となる（例：水での希釈による浸透圧溶解の例における赤血球ゴーストの形態）。
【００４６】
遅延ステージの後（典型的には、数秒から数分間のオーダー）、希釈サンプルは、次に、固相抽出カートリッジに通される。ＳＰＥカートリッジの直前に、追加のプレフィルターが組み込まれてもよい。先行技術と比較したそのようなプレフィルターの利点は、それが本発明の装置の流体ライン中に配置されることから、それも機械的溶解に用いて、続いて行われる適切な溶出液を用いての目的の分析物の抽出に供することができることである。
【００４７】
ＳＰＥカートリッジまたはフィルター／ＳＰＥカートリッジの組み合わせの作用によって導入されるせん断力は、溶解剤への希釈後に残留する無傷の赤血球、赤血球ゴースト、およびその他の細胞断片を分解することによって溶解効率を高めるように働く。カートリッジまたはプレフィルター中の収着剤の組成は、それが、サンプルマトリックスの成分の存在下にて目的の分析物、すなわちバンコマイシンなどの糖ペプチド抗生物質を結合することができるように選択される。溶解剤によるサンプルの希釈およびせん断力による残った細胞の溶解の作用の組み合わせにより、固相抽出カラムの収着剤上への抽出に利用可能である目的の分析物が増加する。
【００４８】
また、サンプルマトリックスの成分の一部（例：未溶解細胞またはその断片）が、収着剤層またはプレフィルターの上に蓄積されて、収着剤を通過されない可能性もある。続いての工程において、収着剤カートリッジは、１つ以上の適切な洗浄剤を用いて洗浄される。洗浄剤の選択は、目的の分析物に依存し、洗浄剤は、好ましくは、収着剤からの干渉物（interferents）、および吸着床の上に蓄積されたサンプル物質を除去する一方、収着剤またはフィルター材に結合した目的の分析物は残すべきである。
【００４９】
加えて、本発明の１の実施形態では、洗浄剤は、吸着床上に蓄積された細胞片の分解を補助し、抽出に利用可能な分析物を増加させる。
【００５０】
洗浄工程に続いて、目的の分析物は、収着剤、プレフィルター、および／または収着剤／フィルター材の上に蓄積された物質から溶出される。この溶出工程は、収着剤またはフィルター材から、さらには収着剤もしくはフィルターの上に残された物質から目的の分析物を溶解することができる適切な抽出剤を用いる。以降でより詳細に示されるように、適切な溶出液を用いることにより、収着剤から目的の分析物の特定分を選択的に抽出することが可能であり得、例えば、収着剤のみに結合した目的の分析物は、収着剤および／または複雑なサンプルマトリックス中に存在する細胞物質と結合した目的の分析物と比較して、異なる溶出液を用いて除去することができる。
【００５１】
続いて、溶出液は、検出チャンバーへ送られ、そこで、目的の分析物が検出されるか、または溶出液中の目的の分析物の量が定量される。目的の分析物に応じて、様々な検出または測定技術が利用可能である。例えば、糖ペプチド抗生物質の例としてバンコマイシンの場合、比色または電気化学的検出技術が用いられてよい。
【００５２】
目的の糖ペプチド抗生物質は、その活性化ギブス試薬との反応の反応生成物として検出される。バンコマイシンなどのフェノール部分を含有する糖ペプチド抗生物質に対する提案される反応スキーム１を以下に示す。これはまだ確認されていない単なる提案された反応スキームであり、別の反応スキームが適用され得ることには留意されたい。
【００５３】
【化１】
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【００５４】
しかし、ギブス反応を過剰量のギブス試薬を用いてアルカリ性条件下（すなわち、ｐＨ＞７）で行う場合、バンコマイシンと活性化ギブス試薬との間でギブス反応を効果的に行うことができることが実証されたことから（実施例参照）、このことは、本発明の教示事項に影響を与えるものではなく、ここで、過剰量は、好ましくは、そのような異なる生成物および断片の形成を回避するために、糖ペプチド抗生物質のモル量に対して５倍のモル量のギブス試薬までに制限される。
【００５５】
本発明の１つの限定されない実施形態が、図２と併せて図１においてより詳細に記載され、それは、この方法を実行することができる装置２０を示す。本実施形態は、以下の工程を含むが、そのうちの一部は、図１に破線ボックスで示されるように、必須ではない。以下において溶出液または洗浄剤として水が言及される場合、これは、水自体だけでなく、水性緩衝液も意味することを意図していることには留意されたい。
【００５６】
１．流体システムへのサンプル体積の導入
サンプルの装置２０への導入は、手動または自動方式を例とする適切ないかなる方法で行われてもよい。
【００５７】
濃度測定が装置２０によって行われている場合、このサンプルの既知体積が、装置２０によるさらなる処理に利用可能とされることが好ましい。サンプルから既知体積を計量することは、サンプル計量モジュール２１を用いて行われてよい。既知体積を供給する方法の適切な実行の例としては、これに限定されないが、流体システムに接続された６ポート２ポジション式ロータリーバルブが挙げられる。このバルブを用いて、目的のサンプルの既知体積を含有する、ある長さの配管２２を、流体システムの残りの部分へ切り替えることができる。これは、図２においてバルブポジションＡとして示される。既知サンプル体積を流体システムへ導入するその他の方法は、当業者に公知である。
【００５８】
あるいは、既知体積のサンプルは、手動で、または最初から自動で導入されてもよい。
【００５９】
１つの特定の実施形態では、サンプルは、体液サンプルであり、例えば、血液、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液などである。別の実施形態では、サンプルは、食品または食品抽出物であってよく、例えば、ミルクまたは肉抽出物である。
【００６０】
本発明の好ましい実施形態では、サンプルは、目的の分析物として薬物バンコマイシンを含有し、それは、そのようなサンプル中のこの薬物の特定が不正確である場合、薬物投与レジメンの効果が著しく損なわれる可能性があり、上記でより詳細に説明したように、微生物をそのような抗生物質に対して耐性としてしまう可能性があるからである。本発明の方法およびデバイスでは、バンコマイシンを例とするフェノール官能基を有する糖ペプチド抗生物質を、他に類を見ない精度でそのようなサンプルから抽出することが可能であり、それにより、以降でより詳細に説明するように、糖ペプチド抗生物質にギブス反応を行うことによって、例えば比色により、そのような糖ペプチド抗生物質の検出が容易となる。
【００６１】
２．サンプルの溶解剤への希釈
血液サンプルまたはその一部、例えばそのサンプルの計量体積は、続いて、配管２３を介して装置２０に導入されてよい溶解剤と混合される。溶解剤の選択は、サンプルおよび続いての抽出工程に応じて行われる。それは、例えば、脱イオン水、サンプルよりも低い浸透圧の塩水溶液、塩化アンモニウム、洗剤、尿素、酸、またはこれらの組み合わせを含有する溶液であってよい。目的の分析物（バンコマイシン）が続いて逆相抽出される状況では、脱イオン水への希釈による浸透圧溶解が好ましい。
【００６２】
希釈自体は、図２に示される配管２４など、サンプル計量モジュールをバイパスする既知長さの配管の使用によって行われてよい。サンプル計量ラインおよびバイパスラインの相対抵抗が、サンプルの希釈を可能とするように選択され、例えば、サンプルの１倍から１００倍の希釈率で希釈される（好ましくは１５倍）。あるサンプルの正確な希釈率は、その粘度に応じて変動する。相対抵抗を調整する方法は、当業者に公知であり、配管の長さおよび内径の制御、および流量制限器の組み込みが挙げられ得るが、これらに限定されない。そのような原理自体は、例えばマイクロフルイディクスの分野から知られていることから、簡潔に説明することのみを理由としてさらなる詳細な説明は割愛する。
【００６３】
３．サンプルおよび溶解剤が混合して互いに反応するための時間の提供
溶解剤およびサンプルが互いに相互作用を起こすことができるように、希釈サンプルは、図２の機械的溶解ステージ２７へ送られる前に、ある程度の時間が与えられる。この時間は、研究されているサンプル、および用いられている溶解法の性質に依存するが、好ましくは、１秒から数分間のオーダーである。この時間は、希釈サンプル中に含有されるいずれの細胞も機械的溶解ステージのために充分に脆弱となるように、充分に長くするべきである。
【００６４】
この遅延時間は、図２に示される遅延ステージ２５などの遅延ステージで発生されてよい。この遅延ステージ２５は、好ましくは、流体の制御された流速と合わせてサンプルのある時間にわたるインキュベートを可能とする、ある定められた長さの配管から成る。
【００６５】
４．希釈サンプルの機械的溶解
遅延ステージ２５の後、希釈サンプルは、機械的溶解ステージ２７に通される。この機械的溶解ステージ２７の目的は、細胞の残り、赤血球ゴースト、および細胞膜断片を、せん断力によって機械的に溶解（分解）することである。この工程の第一の目的は、細胞、細胞成分、および細胞膜からのバンコマイシンを例とする目的の抗生物質の放出を促進し、それによって、続いて行われる収着剤への抽出においてより多くを利用可能とすることである。この工程の第二の目的は、最初の化学／浸透圧および機械的溶解工程の後に残された大型の無傷の細胞および細胞断片が、続いての工程（例：工程６〜８）の過程においてそれらから効率的に分析物が抽出されるように充分に分解可能となるまで保持されることである。
【００６６】
１つの好ましい実施形態では、機械的溶解ステージ２７は、適切な収着剤を含有する固相抽出カートリッジから成る。収着剤は、粉末形態または共焼結形態であってよい。それは、適切なフリットを用いて所定の位置に保持されてよい。好ましくは、固相抽出収着剤はまた、ライセートから目的の分析物を抽出する能力も有するべきである。別の実施形態では、フィルター２６、またはフィルター２６と固相抽出収着剤との組み合わせが用いられてよく、フィルター２６は、プレフィルター工程１３を提供し、やはり無傷細胞および大型の細胞断片を保持することによって機械的溶解を補助する。ガラス／金属／ポリマーファイバー、粉末、または焼結ポリマー膜が挙げられるがこれらに限定されない多孔性材料が、機械的溶解のためのフィルターとして用いられてよい。多孔性材料を作製するその他の方法は、当業者に公知である。希釈サンプルを収着剤および／または多孔性材料に通すことで細胞および細胞断片にせん断力が適用され、それが細胞を分解する。せん断力を適用するその他の方法は、当業者に公知である。
【００６７】
希釈および溶解サンプルは、次に、適切な収着剤またはフィルター材と接触される。収着剤またはフィルター材の組成は、希釈および溶解サンプルに優先してバンコマイシンを例とする目的の糖ペプチド抗生物質を結合することができるように選択される。この工程の目的は、サンプルから目的の分析物を抽出し、それを収着剤またはフィルター材に結合させることである。
【００６８】
本発明の１つの実施形態では、収着剤またはフィルター２６、および機械的溶解ステージ２７は、１つのユニットに組み合わされる。本発明の好ましい実施形態では、収着剤またはフィルターは、機械的溶解ステージの多孔性材料として用いられる。
【００６９】
例えば、バンコマイシンが目的の分析物である場合、固相抽出の当業者に公知であり、Ｃ８、Ｃ１８、およびＳｔｒａｔａ‐Ｘなどの物質を含む物質から作られた逆相収着剤カートリッジが好ましい。
【００７０】
本発明の好ましい実施形態では、収着剤は、固相抽出カートリッジ中に含有される。
【００７１】
５．サンプル計量およびバイパスセクションのパージング
すべての希釈サンプルが、遅延ステージを介して機械的溶解／分析物抽出モジュールへと移された後、サンプル計量、バイパス、遅延、および機械的溶解のセクションは、続いて、沈澱したすべての細胞がこれらのラインから確実にパージされて抽出ステージへと移されるように、大過剰の溶解剤でフラッシングされてよい。これを行うために、図２に示されるように、バルブ２１はポジションＢの位置とされる。
【００７２】
６．洗浄工程
収着剤カートリッジおよび／またはフィルターは、次に、１つ以上の適切な洗浄剤を用いて洗浄されてよい。この洗浄工程の目的は、収着剤カートリッジまたはフィルターに吸着された物質から、続いて行われる目的の分析物の検出に干渉し得るいずれの物質をも除去することである。弱く結合した不純物を除去するために、水を用いた第一の洗浄工程が適用されてよい。この洗浄工程は、必要に応じて繰り返されてよく、例えば、この目的のために、１ｍＬの脱イオン水による２回の洗浄工程が適用されてよい。洗浄工程は、例えば弱く結合された不純物、特にタンパク質との不要なギブス反応を抑制することにより、糖ペプチド抗生物質（バンコマイシン）の遊離および結合分画の特定の精度を大きく向上させることが見出されている。
【００７３】
これに続いて、ギブスカップリング反応に干渉する可能性があり、相互汚染に繋がり得る、プロポフォールなどであるがこれに限定されない親油性および疎水性種を除去するために、メタノールを例とする純有機溶媒による第二の洗浄工程が行われてよい。
【００７４】
第二の洗浄工程において、これまでに説明したように、溶出液としてメタノールなどの有機溶媒を用いてバンコマイシンなどの遊離（非結合）糖ペプチド抗生物質の濃度が特定されることになる場合、回収が行われてよい。この場合、不要な（競合する）ギブス反応をこのシナリオでは完全に除外することは困難であり得るが（以下の実施例５参照）、過剰量のギブス試薬を用いることで、充分な量のギブス試薬が糖ペプチド抗生物質との反応に確実に残されることにより、非結合糖ペプチド抗生物質の濃度を正確に特定可能であることが確保される。
【００７５】
第一および第二の洗浄工程は、必要に応じて繰り返されてよく、例えば、複数回の第一の洗浄工程を行った後に、複数回の第二の工程を実施することによる。第二の洗浄工程のうちの最初の回だけが、バンコマイシンなどの遊離（非結合）糖ペプチド抗生物質の濃度を特定するために回収される必要があり得るが、同じ目的のために、複数回分の第二の洗浄工程の溶出液が１つにまとめられてもよい。
【００７６】
７．収着剤またはフィルターからの目的の分析物の抽出
次に、標準的な技術が用いられて収着剤またはフィルターから目的の分析物が抽出され、サンプル物質は、収着剤および／またはフィルター上に残される。例えば、収着剤および／またはフィルターに対して目的の分析物を選択的に溶解／結合する既知体積の適切な溶媒が収着剤および／またはフィルターを通されて、収着剤および／またはフィルターから目的の分析物が除去されてよい。このような技術は、当業者に公知である。
【００７７】
バンコマイシンが目的の分析物である場合、Ｓｔｒａｔａ‐Ｘを例とする逆相収着剤などの収着剤からの非結合バンコマイシンの抽出に、メタノールが用いられてよく、一方Ｓｔｒａｔａ‐Ｘを例とする逆相収着剤などの収着剤からの複雑なサンプルマトリックスの血清成分に結合したバンコマイシンの抽出には、１部（体積部）の水および２部（体積部）のメタノールの分量が用いられてよく、その他の適切な抽出剤および抽出方法は、固相抽出の分野の当業者に公知である。
【００７８】
遊離分画、およびタンパク質結合バンコマイシン濃度を例とする結合分画の別々の定量が行われる特別の場合では、ある体積のメタノールなどの有機溶媒が第一の溶出液として用いられ、遊離濃度定量のために回収されてよい。これに続いて、１部（体積部）の水および２部（体積部）のメタノールの分量の使用および回収が行われ、それによって、収着剤および／またはフィルターのバンコマイシンの結合分画が除去される。
【００７９】
８．溶出液中の目的の分析物の検出または濃度測定
収着剤および／またはフィルターからの溶出液は、検出ステージ２８に送られ、次にそこでは、抽出液中の分析物の濃度、すなわち、血液サンプル中の元の濃度を、適切な検出システムを用いて特定することができる。必要とされる検出システムは、目的の分析物に応じて様々である。特に好ましい実施形態では、検出ステージ２８は、目的のフェノール部分含有抗生物質とのギブス反応生成物の比色スペクトル（colorimetric spectrum）を特定するための比色計を含む。プロポフォールが関与するギブス反応生成物の比色検出は、McGaughran et al in Journal of Clinical Monitoring and Computing, vol. 20, no. 5, pp. 381-381, 2006に開示されており、その教示事項は、必要な変更を加えて適用される。分析物検出のためのその他の適切な方法としては、これらに限定されないが、電気化学、蛍光、または重量による手法が挙げられ得る。その他の検出方法は、当業者に公知である。糖ペプチド抗生物質とギブス試薬との反応は、過剰のギブス試薬が用いられる場合に特に良好であることが見出された（以下を参照）。既に説明したように、約５倍過剰が特に好ましい。
【００８０】
作成されたスペクトルは、プロセッサー２９によって収集されてよく、そこで、バンコマイシンの場合は５８０〜６００ｎｍの範囲、好ましくは５８９ｎｍでの、または活性化ギブス試薬と別のフェノール官能基含有糖ペプチド抗生物質とのギブス反応生成物の場合は別の適切な波長での吸収の強度から、複雑なサンプルマトリックス中の糖ペプチド抗生物質濃度が特定される。プロセッサー２９は、検出ステージ２８の一部を形成してよく、または検出ステージ２８とは別々であってもよい。この結果として、バンコマイシンなどのフェノール部分含有糖ペプチド抗生物質の複雑なマトリックス中の濃度を低コストで数分以内に特定するための完全に自動化された方法および装置が提供される。
【００８１】
本発明の装置が、溶出液に対してギブス反応を行うためのそれぞれの試薬を含有する、検出ステージ２８と流体連結された１つ以上の貯蔵部など、その他の有用な特徴を含んでよいことが明らかであることには留意されたい。貯蔵部および検出ステージ２８の間には、検出ステージ２８に供給される試薬の量を計量するためのそれぞれの計量デバイスが存在してよい。そのような計量デバイスは、例えば、プロセッサー２９または別のプロセッサーによって制御されてよい。
【００８２】
本発明の方法を用いることによる全血清サンプルからの遊離（非結合）および結合バンコマイシンの良好な抽出の概念実証は、以下の実施例の補助と共に示される。これらの実施例が、本発明の範囲を限定することを意図するものではないこと、および別の種類のサンプルまたは別の糖ペプチド抗生物質の使用を例とするこの実施例に対する変更が、本発明の教示事項から逸脱することなく実行可能であることは理解されるべきである。
【実施例】
【００８３】
合成実施例１
バンコマイシンなどの糖ペプチド抗生物質を活性化ギブス試薬と反応させることができるプロトコルを本発明者らが開発したことを実証するために、０．８ｍＭのバンコマイシンをホウ酸緩衝液（０．４Ｍ  ＮａＯＨ）に溶解し、アルカリ性条件下、メタノールとホウ酸緩衝液との混合物中にて、活性化ギブス試薬の等モル量と反応させた。図３は、２つの出発物質、バンコマイシン（ｉ）および活性化ギブス試薬（ｉｉ）、ならびに新規な紫／マゼンタ色カップリング生成物（ｉｉｉ）のＵＶ‐可視スペクトルを示す。新たに形成されたカップリング生成物の最大吸収波長（λｍａｘ）は、５８９ｎｍであり（図３中のボックスで強調）、その濃度は、ランベルトベールの法則によって算出することができる。ギブス試薬の量を増加させながら反応を繰り返し行い（バンコマイシン：活性化ギブス試薬のモル比  １：２、１：３、１：４、１：５、および１：６５）、過剰のギブス試薬を用いた場合に完全なカップリング反応が得られることが示された。
【００８４】
図４の上側のパネルは、アルカリ性条件下での１：１のバンコマイシン：ギブス化学量論比に基づく新規なカップリング生成物（Ｃ７２Ｈ７６Ｃｌ４Ｎ１０Ｏ２５）からの同位体質量パターンの理論的予測を示す。図４の下側のパネルは、新規な反応生成物の実験的に測定された質量スペクトルを示す。質量スペクトルは、アジレント（Agilent）（アジレント、米国カリフォルニア州サンタクララ）製のエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）プローブを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＧ１９４６Ｄを用い、一体型ＨＰＬＣ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣシステム）を用いて反応生成物を精製した後に特定した。図から分かるように、理論的および実験的質量スペクトルは、非常に優れた一致を示していることから、バンコマイシン：ギブス反応生成物の形成が明らかに示唆される。
【００８５】
図５は、いずれもアルカリ性条件下の出発物質バンコマイシンおよびギブス試薬、ならびに合成実施例１で用いたギブス試薬の当量を増加させたいくつかの反応生成物を含むいくつかの１Ｈ‐ＮＭＲスペクトルを示す。ＮＭＲスペクトルは、Ｄ２Ｏ中０．４Ｍ  ＮａＯＤを含む体積比での１／３  Ｄ２Ｏ＋２／３  ＭｅＯＤ中にて、ブルカー（Bruker）（ブルカー、米国マサチューセッツ州ビルリカ）製Ａｖａｎｃｅ  ＩＩＩ  ６００  Ｃｒｙｏ  ＮＭＲ分光計で記録した。ＰＰＭの較正には、水のピークを用いた。ギブス当量を増加させることによって点線ボックスで強調した６ｐｐｍのすぐ下にある２つのピークが消滅したことは、反応スキーム１に示されるように、芳香環にギブスがカップリングしていることの明らかな証拠を提供する。ギブス付加によって不変に維持されたその他のすべてのバンコマイシンプロトンの帰属は、バンコマイシンの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを開示しているAntipas et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 88(6), pages 742-750, 2000およびPearce and Williams, J. Chem. Soc, Perkin Trans. 2(1), pages 153-157, 1995と良く一致している。
【００８６】
実施例１
バンコマイシンがスパイクされた１ｍＬの全血清サンプルを、フェノメネックス（Phenomenex）（登録商標）からの３０ｍｇ／１ｍＬ逆相Ｓｔｒａｔａ‐Ｘ（商標）ＳＰＥカラムに適用する。まず、カラムを２ｍＬの水で洗浄して弱く結合した不純物を除去し、続いて、メタノールなどであるがこれに限定されない純有機溶媒のおよそ２ｍＬで洗浄して、カップリング反応に干渉する可能性があり、相互汚染に繋がり得る、プロポフォールなどであるがこれに限定されない親油性、疎水性種のそれぞれを除去する。全血清サンプル中に存在する血清成分に結合したバンコマイシンは、次に、既知体積（０．５ｍＬ）の３分の１が水、３分の２がメタノールである混合物（いずれも体積基準）を用いて、ＳＰＥカラムから溶出される。
【００８７】
次に、溶出液の３５０μＬ分をバイアルに移す。続いて、メタノール中３．６２５ｍＭ  ギブスの５０μＬを添加し、続いてホウ酸緩衝液または水中の０．４Ｍ  水酸化ナトリウムの４０μＬを添加すると、カップリング反応が開始し、その結果、直ちに色が変化する。振とう後、典型的にはこの混合物の３５０μＬをキュベットに移し、そのスペクトルを分光光度計で測定する。
【００８８】
比較実施例１
比較実施例１は、バンコマイシンを含まない１ｍＬの全血清サンプルを、３０ｍｇ／１ｍＬ逆相Ｓｔｒａｔａ‐Ｘ（商標）ＳＰＥカラムに適用する点が異なる以外は実施例１と同じである。
【００８９】
図６は、血清からの２つのＳＰＥ溶出液、実施例１からのバンコマイシンでスパイクしたサンプル（ａ）および比較実施例１からのバンコマイシンを含まないレファレンス（ｂ）のギブス標識物（Gibbs labelling）の典型的なＵＶ／可視スペクトルを示す。スペクトル（ｃ）は、サンプルとレファレンスとのスペクトルの差である。５８９ｎｍでの吸収は、Ｓｔｒａｔａ‐Ｘおよび続いてのギブス試薬による標識を介することで、合成実施例１および図３に匹敵する形で、およびそれと非常に良好に一致して、複雑なサンプルマトリックスからバンコマイシンを回収することができることを示唆している。続いて、対応するバンコマイシン濃度を、ランベルトベールの法則によって算出することができる。
【００９０】
実施例２
本方法の精度を検証するために、全血清に異なる濃度のバンコマイシン（それぞれ、１．２μＭ、２．４μＭ、４．８μＭ、９．５μＭ、１４．３μＭ、および２１．５μＭ）をスパイクし、実施例１に記載のようにアッセイ全体に付した。各溶出液の２つの画分を別々にギブス試薬で標識して、この新規なバンコマイシンアッセイの精度を推定した。図７は、ギブス反応完了後の種々の溶出液のＵＶ‐可視差分吸収スペクトルを、比較実施例１のレファレンスに対して示しており、これは、この新規なアッセイにより、治療ウィンドウ内、３〜２９μＭのバンコマイシンの検出が達成可能であることを明らかに実証するものである。
【００９１】
このことはさらに、図８によって裏付けられており、その図は、５８９ｎｍでの差分吸収スペクトルから得られた溶出液濃度の、フィッティング関数ｙ＝ａ＋ｂ＊ｘを用いた直線フィッティングを示しており、ここで、ａは、−０．０４２±０．００４であることが見出され、ｂは、０．０１±０．００４であることが見出され、Ｒ２値は０．９９４であり、従って、スパイクレベルと、これらのレベルのスパイクを含む血清サンプルから抽出された溶出液から得られた濃度との間の非常に優れたフィッティングが示される。
【００９２】
実施例３
バンコマイシンがスパイクされた１ｍＬの全血清サンプル（ＷＨＳ）を、フェノメネックス（登録商標）からの３０ｍｇ／１ｍＬ逆相Ｓｔｒａｔａ‐Ｘ（商標）ＳＰＥカラムに適用する。まず、カラムを２ｍＬの水で洗浄して弱く結合した不純物を除去する。この洗浄工程は、必要に応じて繰り返されてよい。続いて、メタノールなどであるがこれに限定されない有機溶媒の既知体積（１ｍＬ）を用いて、遊離バンコマイシン分画を収着剤から溶出する。これに続いて、所望に応じて、別の有機洗浄工程が行われてよく、例えば、溶出工程で用いられたものと同じ溶媒または異なる溶媒であってよい有機溶媒での別の洗浄工程である。結合バンコマイシン分画は、次に、既知体積（０．５ｍＬ）の３分の１が水、３分の２がメタノールである混合物（いずれも体積基準）を用いて、ＳＰＥカラムから溶出される。
【００９３】
次に、各溶出液の３５０μＬ分を別々のバイアルに移す。続いて、メタノール中３．６２５ｍＭのギブスの５０μＬを各バイアルに添加し、続いてホウ酸緩衝液または水中０．４Ｍの水酸化ナトリウムの４０μＬを添加すると、カップリング反応が開始し、その結果、直ちに色が変化する。振とう後、典型的には各混合物の３５０μＬをキュベットに移し、それらのスペクトルを分光光度計で測定する。
【００９４】
図９は、２９μＭ  バンコマイシンでスパイクされた同じＷＨＳサンプルの遊離分画および結合分画の差分ＵＶ‐可視スペクトルを、比較実施例３から差し引いたものを示す。新たに形成されたカップリング生成物の最大吸収波長（λｍａｘ）は、５８９ｎｍであり（グラフ中縦線で強調）、対応する遊離分画および結合分画の濃度は、ランベルトベールの法則から算出することができる。
【００９５】
比較実施例２
比較実施例２は、バンコマイシンを含まない１ｍＬの全血清サンプルを、３０ｍｇ／１ｍＬ逆相Ｓｔｒａｔａ‐Ｘ（商標）ＳＰＥカラムに適用する点が異なる以外は実施例３と同じである。
【００９６】
実施例４
実施例３で提示した方法の精度を検証するために、水に溶解したいくつかの異なる濃度の血清タンパク質、ここではヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むサンプル（６００μＭ、３００μＭ、１５０μＭ、７５μＭ、および０μＭ）、ならびに全ヒト血清（ＷＨＳ）を、同じバンコマイシン濃度（２９μＭ）でスパイクした。６００μＭが全ヒト血清中の血清アルブミンの濃度に相当することには留意されたい。これらのサンプルを、実施例３に記載のようにアッセイ全体に付した。有機溶出液、および３分の１が水、３分の２がメタノールである混合物（体積基準）の溶出液の両方の溶出液からの回収液を別々にギブス試薬で標識して、この新規な遊離および結合バンコマイシンアッセイの精度を推定した。
【００９７】
図１０ＡおよびＢは、それぞれ、いくつかのタンパク質濃度および全ヒト血清（ＷＨＳ）に対してＵＶ‐可視分光分析で得られた、有機溶出液（Ａ）および水／有機混合溶出液（Ｂ）の差分吸収を示す。新規なカップリング生成物の最大吸収波長（λｍａｘ＝５８９ｎｍ）における遊離分画および結合分画の対応する吸収値を用いて、遊離分画および結合分画に含まれるバンコマイシンのパーセント［％］を算出し、それを図１１にグラフで示す。
【００９８】
市販の全ヒト血清では、典型的には、６３±１２％が遊離分画であり、３７±２％が結合分画であることが見出された。誤差は、３つの独立した測定（ｎ＝３）からの標準偏差より誘導し、図１１にエラーバーとして示す。
【００９９】
実施例５
バンコマイシンなどの１つ以上のフェノール部分を持つ糖ペプチド抗生物質に対する抽出プロトコルの特異性を実証するために、４つの全血清サンプルを、干渉する可能性のあるフェノール系化合物として０．１μＭ  ドパミン、１３２μＭ  パラセタモール、および５６．１μＭ  プロポフォール、ならびに２９μＭ  バンコマイシンと共に調製した。カラムを、まず２ｍＬの水で２回洗浄して、弱く結合した不純物を除去する。次に、既知体積（１ｍＬ）のメタノールを用いて、遊離バンコマイシン分画を収着剤から溶出する。所望に応じて、これに続いて、別の有機洗浄工程、例えばメタノールによる別の洗浄工程を行ってもよい。続いて、既知体積（０．５ｍＬ）の３分の１が水、３分の２がメタノールである混合物（体積基準）を用いて、結合バンコマイシン分画をＳＰＥカラムから溶出する。
【０１００】
各洗浄／溶出工程の後、洗浄剤／溶出液を回収し、実施例１の反応条件を用いてギブス試薬と反応させ、反応生成物を、実施例１で説明したように評価した。結果を図１２に示す。
【０１０１】
水による第一および第二の洗浄工程によって収着剤から除去されるフェノール系化合物は、無視できるほどの量であるが、第一のメタノール溶出液では、既に示したように、バンコマイシンの非結合分画、さらにはプロポフォールの少なくとも一部が除去されることが分かる。所望に応じて続いて行ってよいメタノールによる洗浄工程では、バンコマイシンの一部がさらに除去され、それによって、第一の溶出液をこの洗浄工程で用いられるメタノールと合わせることで、非結合バンコマイシンの特定の精度をさらに向上させることができる。第二の溶出液（メタノール／水）では、非常に優れた特異性でバンコマイシンの結合分画が除去される。
【０１０２】
従って、提案される抽出プロトコルを用いることで、フェノール系化合物の存在下、バンコマイシンなどの糖ペプチド抗生物質を収着剤から良好な選択性で除去することができることが実証された。プロポフォールは、第一の溶出液（メタノール）ではある程度の干渉を示すが、これは、第二の溶出液から誘導される糖ペプチド抗生物質の結合分画の特定には影響を与えないことには留意されたい。
【０１０３】
糖ペプチド抗生物質の非結合分画の特定におけるプロポフォールの考え得る干渉を回避するために、以下の対策が考慮されてよい。プロポフォールは、患者中に天然に存在するものではないことから、バンコマイシンなどの糖ペプチド抗生物質の非結合分画の特定は、患者がプロポフォールの影響下にない時に行われてよい。あるいは、例えば国際公開第２０１２／０４９４８６  Ａ１号に開示されるプロトコルを用いることにより、プロポフォールの濃度は別の抽出アッセイで独立して特定されてもよく、それによって、プロポフォールの特定全体に対する寄与を差し引いて、非結合糖ペプチド抗生物質濃度を得ることができる。
【０１０４】
さらに、図１３に示されるように、プロポフォール／ギブス反応生成物が、青色であり、従って５９５ｎｍのλｍａｘを有し、バンコマイシン／ギブス反応生成物が、５８９ｎｍのλｍａｘを有する紫／マゼンタ色であることから、固定波長（すなわち、５８９ｎｍ）ではなく、適切なスペクトル範囲全体にわたってＵＶ／可視スペクトルを測定することにより、特定された全体濃度からプロポフォールの寄与を抜き出すことが可能となり得る。例えば、５００〜７００ｎｍからを例とするウィンドウにおける吸収を測定することにより、サンプル中に存在するプロポフォール：ギブス反応生成物の濃度によって引き起こされる６００ｎｍ超で見られるショルダーを用いて、プロポフォール：ギブス反応生成物の５８９ｎｍでの吸収に対する寄与を算出する、例えば差し引くことができる。
【０１０５】
図６〜１３から分かるように、例えば図８に影を付けた領域で識別されるその治療ウィンドウ内のバンコマイシンレベルを正確に特定することが可能である。このことは、有利には、バンコマイシンなどのフェノール部分を含有する抗生物質の患者のための個別化投与レジメンに用いることができる。本発明を用いて、バンコマイシンなどのフェノール部分を含有する抗生物質の患者のための個別化投与レジメンを決定するそのような方法の例を、図１４に示す。
【０１０６】
工程７２では、前記患者の複雑なサンプルマトリックス中の抗生物質濃度が、図１の補助の下に上記で詳細に記載した本発明の方法の実施形態に従って特定される。工程７４では、特定された濃度は、バンコマイシンを例とするフェノール部分含有抗生物質の投与量に対して比較され、その患者における抗生物質の代謝特性が誘導される。特に、特定された濃度が、その抗生物質の治療ウィンドウ内に依然として収まっているかどうかを判断することができる。
【０１０７】
実施形態では、工程７２は、患者における抗生物質の代謝特性を誘導する前に、前記患者の複雑なサンプルマトリックス中の抗生物質濃度を定期的に特定することを含んでよく、それは、そのような定期的測定を用いて、特定された濃度のトレンドを判断することができ、従って、患者における抗生物質の代謝特性についてのさらなる見識が得られるからである。例えば、そのようなトレンドは、抗生物質の投与量に対する代謝速度を示し得る。
【０１０８】
工程７６では、患者における抗生物質の特定された代謝特性を用いて、患者の代謝中の抗生物質の量を治療ウィンドウ内に確実に維持するために、患者のための個別化抗生物質投与レジメンが設計され、こうすることで、治療が無効となるリスクが、バンコマイシンを例とする投与された抗生物質に対して治療の標的微生物が抵抗性となるという深刻な結果がもたらされる可能性と共に大きく低減される。
【０１０９】
この点で、バンコマイシンを例とするフェノール官能基含有抗生物質が関与するギブス反応は、好ましくは、収着剤および／またはフィルター材からの抗生物質の抽出後に、すなわち、溶出液中で行われることに留意されたい。
【０１１０】
上述の実施形態は、本発明を限定するのではなく、説明するものであること、および当業者であれば、添付の請求項の範囲から逸脱することなく、多くの別の実施形態を設計することができることには留意されたい。請求項において、丸括弧内に記載されるいずれの引用符号も、請求項を限定するものとして解釈されてはならない。「含んでいる」の単語は、請求項に挙げられる要素または工程以外の要素または工程の存在を除外するものではない。要素の前に記載される単数への言及「１つの（a）」または「１つの（an）」は、そのような要素の複数の存在を除外するものではない。本発明は、いくつかの個別の要素を含むハードウェアによって実行されてよい。いくつかの手段を列挙するデバイス請求項では、これらの手段のうちの複数が、１つの同じハードウェアによって実現されてよい。単に互いに異なる従属請求項に特定の方策が列挙されているという事実は、これらの方策の組み合わせを有利に用いることができないことを示すものではない。
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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