(57)【要約】【課題】新規安定性ペンタデカペプチド塩、その製造方法、医薬製剤の製造におけるその使用及び治療におけるその使用を提供することを課題とする。【解決手段】  新規安定性ペンタデカペプチド塩、その製造方法、医薬製剤の製造におけるその使用及び治療におけるその使用。本発明は、式（Ｉ）：2016513637.tif 000025（式中、ｎは、１、２又は３を表し、及び、ＢＡＡは、塩基性アミノ酸を表す）で表される新規で安定なペンタデカペプチド塩を、その製造方法を、液体及び固体形態にある医薬製剤の製造のためのその使用方法を、並びに、疾患及び疾患状態の治療における予防、防御のための、及び健康補助食品としての使用のための製剤の製造のための、それらの使用を開示する。 【選択図】なし
2016513637.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
2016513637.tif 000023
（式中、ｎは、１、２又は３を表し、及び、ＢＡＡは、塩基性アミノ酸を表す）
で表される新規で安定なペンタデカペプチド塩。
【請求項２】
前記塩基性アミノ酸は、Ｌ−、Ｄ−又はＤＬ−体にあるアルギニン、リジン又はオルニチン等、好ましくはＬ−アルギニンである、式（Ｉ）で表される新規で安定なペンタデカペプチド塩。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１のペンタデカペプチドを、塩基性アミノ酸ＢＡＡと反応させることを特徴とする、一般式（Ｉ）で表される新規で安定なペンタデカペプチド塩の製造方法であって、
室温にて、水性溶液中で、１ｍｏｌの前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１のペンタデカペプチドに対して、１乃至３ｍｏｌのモル比の前記塩基性アミノ酸を反応させ、形成した溶液のｐＨ値を滴定によって調節し、その後、ＨＰＬＣクロマトグラフィー及び凍結乾燥によって、形成された式（Ｉ）で表される塩を固体形態で単離することを特徴とする、前記製造方法。
【化２】
2016513637.tif 000024
【請求項４】
アルギニン、リジン又はオルニチン等が、Ｌ−、Ｄ−又はＤＬ−体にある塩基性アミノ酸として使用され、好ましくはＬ−アルギニンであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
１ｍｏｌの塩基性アミノ酸と１ｍｏｌのペンタデカペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１）との反応により得られた溶液のｐＨ値を、４．１乃至５．０に、好ましくは４．６０±０．０５に調節することを特徴とする、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
２ｍｏｌの塩基性アミノ酸と１ｍｏｌのペンタデカペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１）との反応により得られた溶液のｐＨ値を、６．７乃至７．８に、好ましくは７．４０±０．０５に調節することを特徴とする、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の一般式Ｉで表される、治療的に有効量のペンタデカペプチド塩を含有する、経口、静脈内、直腸内、膣内、筋肉内、局所及び他の使用のための、固体及び液体形態にある、医薬製剤。
【請求項８】
ペンタデカペプチド塩の他に、１種以上の活性物質、好ましくは抗生物質又は抗酸化剤を含有することを特徴とする、請求項７に記載の医薬製剤。
【請求項９】
前記医薬製剤は、アルカリ金属及びアルカリ土類金属炭酸塩又は炭酸水素塩の群より選択される安定性向上剤、好ましくは炭酸水素ナトリウムを含有することを特徴とする、請求項７又は８に記載の医薬製剤。
【請求項１０】
前記医薬製剤は、Ｄ−マンニトール、トレハロース、ソルビトール等のような糖類の群より選択される安定性向上剤、好ましくはＤ−マンニトールを含有することを特徴とする、請求項７、８又は９に記載の医薬製剤。
【請求項１１】
下記疾患、疾患状態及び障害の予防、防御及び治療：
の、ストレスに関連した疾患及び障害、消化管のいずれかの部位における潰瘍、一般の抗炎症活性、消化管炎症病、クローン病、急性膵炎；
器官防護活性即ち：肝臓及び膵臓障害の防御、内皮細胞の防護、癒着形成の予防、心筋梗塞及び脳卒中の予防及び治療、免疫系の防御効果；
特に、Ａ型肝炎菌、ヘルペス菌、Ａ型インフルエンザ及びダニ媒介性脳炎のようなＡＲＢＯウイルス、西ナイル熱、１−４型デング熱、サイトメガロウイルスＣＭＶ及びＬＣＭウイルス、ネコ白血病ウイルスによるウイルス感染の治療；
悪性黒色腫及び関連する腫瘍の治療；
創傷、火傷、骨折の迅速な治療、断裂した神経結合、アキレス腱及び断裂した筋肉、脊髄損傷の再生；
ＮＯ形成に関連した器官異常：高血圧、低血圧、アナフィラキシー、循環性及び敗血性ショック、血小板凝集の治療；
神経疾患及び神経障害：多発性硬化症、重症筋無力症、紅斑性狼瘡、神経症、体性感覚神経の機能障害、喘息、鼻炎、天疱瘡及び湿疹の治療；
カテコールアミン作動性障害、精神分裂病、アンフェタミン、薬物及びアルコール禁断症状；
コルチコステロイド及びＮＳＡＩＤに依存した障害の防御及び解消；
眼球の斑点の扁平上皮の変質の治療；
血液供給の迅速な再構成が必須である全ての疾患における独自の治療；
動物の体重増加のための、及び貯蔵中の精子安定性の向上のための、獣医学、
における使用のための、請求項７乃至１０のうちいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１２】
栄養補助食品用途の製剤の製造のための、請求項１又は２に記載のペンタデカペプチド塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、薬化学の分野に属し、安定なペンタデカペプチド塩であって、以降、式（Ｉ）：
【化１】
2016513637.tif 000003
（式中、ｎは、１、２又は３を表し、及び、ＢＡＡは、塩基性アミノ酸を表す）
で表されるベペシン（ｂｅｐｅｃｉｎ）塩と呼ぶ前記塩、その製造方法、医薬製剤の製造におけるその使用、及び治療におけるその使用に関する。
【０００２】
技術的問題
多数の薬理学的研究が、ヒト及び動物の両方に対して、アミノ酸配列：ＧｌｙＧｌｕＰｒｏＰｒｏＰｒｏＧｌｙＬｙｓＰｒｏＡｌａＡｓｐＡｓｐＡｌａＧｌｙＬｅｕＶａｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１）を有するペンタデカペプチド（略称ＢＰＣ−１５７又はベペシン）の防御、再生及び治療活性を示してきた。現在まで、当該ペプチドは、遊離形態若しくは酢酸塩形態のいずれかにおいて、又はナトリウム塩のような塩基との塩として、常に使用されてきた。全てのこれら形態は、胃液中での全く適切でない安定性を特徴としており、特にこれら化合物の口腔使用を制限してしまい、且つ、同時に、それらの治療的価値を低下させてしまっている。それ故、胃液中及び高い周囲温度の両方において、実質的により安定である形態にある当該ペンタデカペプチドを製造することが必要とされている。そのような製造の形態は、生体への、特に経口送達において、使用されより成功し得る。安定性がより高くなると、同様に、全般的により良好な有効性が期待される。
【背景技術】
【０００３】
従来技術
ペンタデカペプチドＢＰＣ１５７又はベペシン（Ｂｏｄｙ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄの略称）は、下記ペプチド配列：ＧｌｙＧｌｕＰｒｏＰｒｏＰｒｏＧｌｙＬｙｓＰｒｏＡｌａＡｓｐＡｓｐＡｌａＧｌｙＬｅｕＶａｌを有し、及び実際には哺乳動物の胃液中に存在する、天然のＢＰＣタンパク質のＮ−末端部分を表す。天然ＢＰＣタンパク質は、複雑な生化学的方法によって、ヒト又は動物の胃液から得られる（特許文献１）。要望が多い実験であるにもかかわらず、当該得るための方法は、原料源の不確実さ及びウイルスによる汚染のおそれに関して不適切である。それ故、化学合成によって、上記の配列を有するＮ−末端部分のみが製造された（非特許文献１、非特許文献２）。驚くことに、当該フラグメントが天然ＢＰＣタンパク質の全ての効果を事実上保持したことが見出された（特許文献２、特許文献３）。１５のアミノ酸配列を有するＮ−末端部分が、完全なタンパク質の生物学的活性に対して最も応答し得ると思われる。当該化合物は、いかなる毒性も副作用も無く、極端に低い濃度で（体重キログラム当りｎｇからｍｇ以上の範囲で）全ての器官に対して効果を有するため、医療観点から非常に興味深い。
【０００４】
薬理学的研究が、生物中に導入したペンタデカペプチド  ベペシン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１）が、下記：
消化管のいずれの部分の潰瘍（非特許文献３）；（非特許文献４）；
病因学を問わず抗炎症性（非特許文献５）；
消化管炎症病−クローン病に対する効果（非特許文献６）；
肝臓及び膵臓の防護（非特許文献７）；
火傷の治療の促進（非特許文献８；非特許文献９）；
創傷の治療の促進（非特許文献１０）；
放射線に対する防護（非特許文献１１）；
骨折の治療の促進（非特許文献１２）；
アドレナリン作用系とドーパミン作用系の相互作用におけるストレス状態での粘膜の保護（非特許文献１３）；
幾つかの種類の腫瘍（腹水、黒色腫）における抗腫瘍効果（非特許文献１４；非特許文献１５）；
ヘルペスウイルスＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２、ＬＣＭ、ＣＭＶ、インフルエンザウイルスＡ並びにダニ媒介性脳炎ウイルスに対する抗ウイルス効果（非特許文献１４）；
断裂した神経結合の再生の促進（非特許文献１６；非特許文献１７）；
断裂したアキレス腱の治療の促進（非特許文献１８）；
ＮＯ形成に関連した器官異常の除去（非特許文献１９）
の効果を有することを示している。
【０００５】
生体自体の物質の構成部分としてのペプチドベペシンは、いかなる毒性兆候も示さない。ＬＤ５０を決定するために、並びに、急性の、亜慢性の及び慢性の毒性についてのデータを得ることを目的としてマウスについて行った試験は、体重に基づき１０ｎｇ乃至１００ｍｇ／ｋｇの広範な投与量にて、静脈内に、口腔内に又は腹腔内に適用された当該ペプチドが、いかなる毒性変化をも引き起こさなかったために、うまくいっていない。さらには、催奇形性及び遺伝毒性の試験（サルモネラミクロソーム試験）は、そのような作用の兆候を示さなかった。
【０００６】
合成ペンタデカペプチドＢＰＣ−１５７の塩がまた、特許文献４及び特許文献５にもまた開示されている。これらの塩は、元の形態、即ち遊離の酸又は酢酸塩よりも僅かに良好である一方で、それらはまだ胃液中での十分な安定性に欠けている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｐ．Ｓｉｋｉｒｉｃ，Ｒ．ｒｕｃｍａｎ，Ｂ．Ｒｕｃｍａｎ，Ｍ．Ｐｅｔｅｋ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １９９８，Ｐｒｏｃｅｅｄ．ｏｆ  ２５ｔｈ  ＥＰＳ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ  １９９８，ｐ．８１４
【非特許文献２】Ｚ．Ｐｆｌａｕｍ及びＲ．Ｒｕｃｍａｎ，Ａｃｔａ  Ｃｈｉｍ．Ｓｌｏｖ．，２００５，５２，３４−３９
【非特許文献３】Ｐ．Ｓｉｋｉｒｉｃ他，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，１９９４；５４，ＰＬ６３−６８
【非特許文献４】Ｐ．Ｓｉｋｉｒｉｃ他，Ｅｘｐ．ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１９９１，１，１７−２０
【非特許文献５】Ｐ．Ｓｉｋｉｒｉｃ他，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．／Ｐａｒｉｓ／，１９９７，９１，１１３−１２２
【非特許文献６】Ｓｉｋｉｒｉｃ他，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．／Ｐａｒｉｓ／，２００１，９５，２９５−３０１
【非特許文献７】Ｐｒｋａｃｉｎ他，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．／Ｐａｒｉｓ／，２００１，９５，３１５−３２４
【非特許文献８】Ｄ．Ｍｉｋｕｓ，Ｐ．Ｓｉｋｉｒｉｃ他，Ｂｕｒｎｓ  ２００３，２９，３２３−３３４
【非特許文献９】Ｂｕｒｎｓ，２００１，１２７，８１７−８２７
【非特許文献１０】Ｓ．Ｓｅｉｗｅｒｔｈ，Ｐ．Ｓｉｋｉｒｉｃ他，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．／Ｐａｒｉｓ／，１９９７，９１，１７３−１７８
【非特許文献１１】Ｐ．Ｓｉｋｉｒｉｃ，Ｍ．Ｐｅｔｅｋ，Ｒ．Ｒｕｃｍａｎ，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．／Ｐａｒｉｓ／，１９９３，８７，３１３−３２７
【非特許文献１２】Ｂ．Ｓｅｂｅｃｉｃ，Ｖ．Ｍｉｋｌｉｃ，Ｐ．Ｓｉｋｉｒｉｃ他，Ｂｏｎｅ，１９９９，２４，１９５−２０２
【非特許文献１３】Ｐ．Ｓｉｋｉｒｉｃ他，Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．，１９９７，４２，６６１−６７１
【非特許文献１４】Ｐ．Ｓｉｋｉｒｉｃ，Ｍ．Ｐｅｔｅｋ，Ｒ．Ｒｕｃｍａｎ，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．／Ｐａｒｉｓ／，１９９３，８７，３１３−３２７
【非特許文献１５】Ｓ．Ｒａｄｅｌｊａｋ，Ｓ．Ｓｅｉｗｅｒｔ，Ｐ．Ｓｉｋｉｒｉｃ，Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，１４（４），Ａ１４−Ａ１５
【非特許文献１６】Ｐ．Ｓｉｋｉｒｉｃ他，Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．，４１，１６０４−１６１４
【非特許文献１７】Ｍ．Ｇｊｕｒａｓｉｎ他，Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．，２００３，４８，１８７９
【非特許文献１８】Ｍ．Ｓｔａｒｅｓｉｎｉｃ，Ｐ．Ｓｉｋｉｒｉｃ他，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐｅｄ．Ｒｅｓ．，２００３，２１，９７６−９８３
【非特許文献１９】Ｐ．Ｓｉｋｉｒｉｃ他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１９９７，３３２，２３−３３
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５２８８７０８号
【特許文献２】欧州特許第０５７２６８８号
【特許文献３】米国特許第６２６８３４６号
【特許文献４】欧州特許第０９８３３００号
【特許文献５】米国特許第６２８８０２８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
技術的課題に対する解決
解決すべき根本的な課題は、高温での当該化合物の安定性、特に胃液中での安定性である。本発明は、有意に改良された熱安定性及びまた胃液中での安定性を有する塩基性アミノ酸を有する新規なペンタデカペプチド塩に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
胃液は、種々の化合物の複雑な混合物であり、そして主要な成分は、水、塩化ナトリウム、塩酸、ムチン、酵素、特にペプシン、及びその他である。胃液は主として酸性であり；そのｐＨ値は１乃至７で、例外的にそれよりも高く変化する。通常のｐＨ値は、ポリペプチド、ペプチド及びタンパク質を分解するペプシンの最大の活性の範囲でもある２乃至５の範囲にある。
【００１１】
従って本発明は、一般式（Ｉ）：
【化２】
2016513637.tif 000004
（式中、ｎは、１、２又は３を表し、及び、ＢＡＡは、塩基性アミノ酸を表す）
で表される新規で安定なペンタデカペプチド塩に関する。
塩基性アミノ酸として、Ｌ−、Ｄ−又はＤＬ−体にある、塩基性アルギニン、リジン、オルニチンその他、好ましくはＬ−アルギニンが使用される。
【００１２】
本発明はまた、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１のペンタデカペプチドを、塩基性アミノ酸ＢＡＡと反応させる、一般式（Ｉ）で表されるペンタデカペプチド塩の製造方法であって、
室温にて、水性溶液中で、１ｍｏｌの前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１のペンタデカペプチドに対して、１乃至３ｍｏｌのモル比の前記塩基性アミノ酸を反応させ、形成した溶液のｐＨ値を滴定によって調節し、その後、ＨＰＬＣクロマトグラフィー及び凍結乾燥によって、形成された式（Ｉ）で表される塩を固体形態で単離することを特徴とする、前記製造方法にも関する。
【化３】
2016513637.tif 000005
【００１３】
本発明の方法の好ましい態様において、１モルの塩基性アミノ酸と１モルのペンタデカペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１）との反応により得られた溶液のｐＨ値は、４．１乃至５．０に、好ましくは４．６０±０．０５に調節される。
【００１４】
本発明の方法の別の好ましい態様において、２モルの塩基性アミノ酸と１モルのペンタデカペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１）との反応により得られた溶液のｐＨ値は、６．７乃至７．８に、好ましくは７．４０±０．０５に調節される。
【００１５】
本発明はさらに、経口、静脈内、直腸内、膣内、筋肉内、局所及び他の使用のための、治療的に有効量の本発明のペンタデカペプチド塩を含有する、固体及び液体形態にある、医薬製剤に関する。
【００１６】
本発明はさらに、本発明のペンタデカペプチド塩の他に、１種以上の他の活性物質、好ましくは抗生物質又は抗酸化剤を含有する、医薬製剤に関する。
【００１７】
本発明はさらに、本発明のペンタデカペプチド塩の他に、アルカリ金属及びアルカリ土類金属炭酸塩又は炭酸水素塩から成る群より選択される安定性向上剤、好ましくは炭酸水素ナトリウムをも含有する、医薬製剤に関する。
【００１８】
本発明はさらに、本発明のペンタデカペプチド塩の他に、トレハロース、ソルビトール又はＤ−マンニトールのような糖類から成る群より選択される安定性向上剤、好ましくはＤ−マンニトールを含有する、医薬製剤に関する。
【００１９】
本発明はさらに、下記疾患及び疾患状態の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）及び治療：
ストレスに関連した疾患及び障害、消化管のいずれかの部位における潰瘍、一般の抗炎症活性の消化管炎症病、クローン病、急性膵炎；
器官防護活性即ち：肝臓及び膵臓障害の防護、内皮細胞の防御、癒着形成の予防、心筋梗塞及び脳卒中の予防及び治療、免疫系の防御効果；
特に、Ａ型肝炎菌、ヘルペス菌、Ａ型インフルエンザ及びダニ媒介性脳炎のようなＡＲＢＯウイルス、西ナイル熱、１−４型デング熱、サイトメガロウイルスＣＭＶ及びＬＣＭウイルス、ネコ白血病ウイルスによるウイルス感染の治療；
悪性黒色腫及び関連する腫瘍の治療；
創傷、火傷、骨折の迅速な治療、断裂した神経結合、アキレス腱及び断裂した筋肉、脊髄損傷の再生；
ＮＯ形成に関連した器官異常：高血圧、低血圧、アナフィラキシー、循環性及び敗血性ショック、血小板凝集の治療；
神経疾患及び神経障害：多発性硬化症、重症筋無力症、紅斑性狼瘡、神経症、体性感覚神経の機能障害、喘息、鼻炎、天疱瘡及び湿疹の治療；
カテコールアミン作動性障害、精神分裂病、アンフェタミン、薬物及びアルコール禁断症状；
コルチコステロイド及びＮＳＡＩＤに依存した障害の防御及び解消；
眼球の斑点の扁平上皮の変質の治療；
血液供給の迅速な再構成が必須である全ての疾患における独自の治療；
動物の体重増加のための、及び貯蔵中の精子安定性の向上のための、獣医薬製剤
に関する。
【００２０】
本発明はさらに、栄養補助食品用途の製剤の製造のための、本発明のペンタデカペプチド塩の使用に関する。
【００２１】
発明の詳細な記載
新規化合物の組成及び構造は、質量分析計の使用により、アミノ酸解析、１Ｈ−ＮＭＲ、ＦＴＩＲ及びＵＶスペクトルにより、決定した。ＵＶスペクトルはバリアン  キャリー５０（Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｒｙ  ５０）分光計において、ＦＴＩＲスペクトルはパーキン  エルマー  ７２７Ｂ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ７２７Ｂ）分光計にて、質量分析はオートスペック  Ｑ（ＡｕｔｏＳｐｅｃ  Ｑ）分光計にて、及び、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルはブルカー  アドヴァンス  ＤＰＸ５００（Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｄｖａｎｃｅ  ＤＰＸ５００）スペクトロメーターにて、記録した。比旋光度［α］Ｄ２８は、パーキン  エルマー１４１型スペクトロメーターを用いて決定した。実施例４３の光画像については、カメラ  ベホ  ディスカバリー  ＶＭＳ−００１（Ｖｅｈｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＶＭＳ−００１），ｘ３０−３０を使用し、サーモグラフィー画像については、ＦＬＩＲ  クイックプロット（ＱｕｉｃｋＰｌｏｔ）ソフトウェア付きの赤外線カメラＴ−３３５（ＦＬＩＲ，ＵＳＡ）を使用した。
【００２２】
上記課題は、新規の、Ｌ−、Ｄ−又はＤＬ−体であり得る塩基性アミノ酸を有するペンタデカペプチドベペシンの塩によって、解決された。典型的なアミノ酸は、アルギニン、リジン、オルニチン、２，４−ジアミノ酪酸、２，６−ジアミノカプロン酸、２，６−ジアミノヘキサン酸、２，５−ジアミノペンタン酸、２，６−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、シトルリン、ホモアルギニン、ホモリジン及び類似体である。これら塩は、１分子のペンタデカペプチド、及び、１、２又は３分子の塩基性アミノ酸から成り得る。
【００２３】
塩溶液のｐＨ値は、塩安定性を調節する塩組成により決まる。Ｌ−アルギニンを有する塩が好ましく使用される。それらは、通常は、水溶液中に１：１乃至１：３（ペンタデカペプチド：塩基性アミノ酸）の範囲のモル比で、ペンタデカペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１）を塩基性アミノ酸と反応させることによって、製造される。最初に、アミノ酸を過剰に添加し、その後、希釈した酢酸を用いて過剰の再滴定を行って、適切なｐＨ値に調節する。モル比１：１（ペンタデカペプチド：ＢＡＡ）を有する塩中の最適なｐＨ値は、４．１乃至５．０であり、好ましくは４．６０±０．０５であり、モル比１：２を有する塩中のｐＨ値は、６．７乃至７．８であり、好ましくは７．４０±０．０５であり、比１：３を有する塩においては、当該値は調節しない。塩溶液はその後、逆相溶媒で充填されたＨＰＬＣカラムで精製される。対応する流出物の凍結乾燥後、高純度のペンタデカペプチド塩が得られる。
【００２４】
得られた塩は、水中において非常に溶け易い。１モルのペンタデカペプチド当り２モルの塩基性アミノ酸を含有するペンタデカペプチドは、最も好ましい特性を有し、好ましいものは、ベペシン  ジ−Ｌ−アルギニン塩（略称：Ａｒｇ−ＢＰＣ）である。
【００２５】
合成の出発化合物である、ペンタデカペプチドＢＰＣ−１５７又はベペシンは、上記の特許文献２、特許文献３において、及び非特許文献２において記載される固体のポリマー性支持体上のペプチド合成によって、製造される。ペンタデカペプチドは、アンモニウム塩若しくはナトリウム塩のような遊離形態で、又は酢酸塩若しくはトリフルオロ酢酸塩の形態でも、あり得る。
【００２６】
高温でのベペシン  ジ−Ｌ−アルギニン塩（１：２，略称Ａｒｇ−ＢＰＣ）の安定性は、ペプチド構造を有する化合物にとって比較的非常に厳しい条件を表す、５０℃及び６５％の相対湿度での加速老化方法によって、決定した。
【００２７】
【表１】
2016513637.tif 000006
【００２８】
当該表はさらに、ベペシン塩への炭酸水素ナトリウムの添加が、高温でのその安定性を高めていることを示している。この添加は、ベペシン１ｍｇ当り０．５ｍｇ乃至３．０ｍｇの範囲である。この特性は、タブレット及びカプセルの組成物において考慮される。特定の糖、例えばトレハロース又はＤ−マンニトールの添加を伴う別の実験が、同様の安定性の改善を示している。
【００２９】
５０℃での１ｇ／１００ｍＬの濃度の水性塩溶液のインキュベーション後に、非常に厳しい条件である１００℃での試験において、分解度を１時間後に決定し、水溶液中でのＬ−アルギニンとのベペシン塩の安定性を決定した。
【００３０】
【表２】
2016513637.tif 000007
【表３】
2016513637.tif 000008
【００３１】
胃液中の化合物の安定性は、特に、ペプシン酵素の存在中で及び酸性媒体中で非常に急速に分解する、ペプチドにおいて重要なパラメータである。胃液中のより良好な安定性は、化合物が吸収及びその治療活性について有用な期間がより長いことを意味する。
【００３２】
人工胃液は、通常のヒト胃液の状態を示し、そして水１０００ｍＬ中に０．０８モルの塩酸、０．０３モルの塩化ナトリウム及び１．０ｇのペプシンを含有する。
３７℃において、ｐＨ値２．０、３．０及び４．０の人工胃液中で、実験した濃度１０ｍｇ／５ｍＬのペプチド塩をインキュベートした。
【００３３】
【表４】
2016513637.tif 000009
【表５】
2016513637.tif 000010
【表６】
2016513637.tif 000011
【００３４】
下記系：
カラム  ：レプロシル  オルペゲン（Ｒｅｐｒｏｓｉｌ  Ｏｒｐｅｇｅｎ）Ｃ１８，１００，５μｍ，２５０×４．６ｍｍ，
移動相Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸／５％アセトニトリル／水
移動相Ｂ：０．１１％トリフルオロ酢酸／４０％アセトニトリル／水
グラジエント：２５分間で１００％Ａから３０％Ａ
温度    ：２０℃
流速    ：１．５ｍＬ／分
検出    ：ＵＶ，２１０ｎｍ
のＨＰＬＣ法によって、試験試料中のペンタデカペプチドＢＰＣ−１５７の量を測定した。
【００３５】
安定性測定の結果は、塩基性アミノ酸を有するベペシン塩がこの件の他の従来既知のペンタデカペプチドの塩よりも実質的に安定であるという驚くべき大きな利点を示している。いずれの場合においても、これらの新規な塩は、極性の分解生成物（１０％以下，構造未定義）を形成する傾向にある特許文献４及び特許文献５に記載の種々のアミン、アルカリ及びアルカリ土類金属を有するベペシン塩よりも良好である。より良好な安定性の結果はまた、そのままの化合物が生体内でより長期間存在し、そしてより効果的な吸収に利用できるために、より良好な生物学的活性である。
【００３６】
光安定性
そのような種類の化合物は、紫外光に対して非常に影響を受けやすい。２０℃におけるＡｒｇ−ＢＰＣの水溶液（１ｇ／１００ｍＬ水）を、２５３．７ｎｍの波長の紫外光により放射し、そして１０分ごとに７０分間以上、２３０乃至３５０ｎｍの範囲の波長で吸光度を測定した。結果を図１に示し、化合物が安定であることを確認した。
【００３７】
本発明の目的である新規のベペシンの塩は、不活性の医薬的に許容し得るキャリヤーと一緒に、以前から薬理学的実験により決定された、疾病及び疾病状態、生体損傷、創傷、骨折及び火傷並びにウイルス感染の治療に使用されるタブレット及びカプセルのような、適切な形態へと変換される治療的に活性の物質として、使用され得る。
【００３８】
本発明の目的はまた、種々の添加剤が混合された、ベペシン塩のアミノ酸塩を含有する経口医薬製剤である。使用される医薬的に許容し得る添加剤は、当業者に一般的に良く知られた物質である。不活性物質又は医薬添加剤は、下記の群：
充填材、例えば：無水ラクトース、結晶セルロース、デンプン、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、マルトデキストリン、Ｄ−マンニトール、トレハロースその他；
粘結剤、例えば：結晶セルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、ポビドン、セルロースエステル、デンプン又はそれらの混合物；
崩壊剤、例えば：大抵は１乃至１０％の量の、デンプン、架橋されたクロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、結晶セルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースその他；
安定剤、例えば：アルカリ金属及びアルカリ土類金属炭酸水素塩、又は選択された糖、好ましくは炭酸水素ナトリウム及びＤ−マンニトール；
タブレット化に使用される滑剤及び流動促進剤：タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ステアリン酸カリウム及びコロイドシリカ
より選択される。これらの物質は大抵、最終段階において他の成分に添加される。
【００３９】
種々の酸性度を有する溶液中のベペシン塩の安定性の比較は、当該化合物がわずかに酸性、中性又は僅かにアルカリ性の媒体において、好ましくは６．５乃至８．５のｐＨ範囲において、非常に安定であることを示す。合理的に云ってこのことは、医薬製剤を構成するのに考慮されるべきである。タブレット化及びカプセル化のための顆粒の製造においては、安定性を改良する、アルカリ金属及びアルカリ土類金属炭酸水素塩及び炭酸塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カルシウム及び酸化マグネシウムのような塩基性炭酸塩及び酸化物のような僅かにアルカリ性の物質を添加することが適切である。選択された糖の添加は、メイラード反応を抑制する。
【００４０】
医薬製剤は、直接の混合、乾式顆粒化、湿式顆粒化のような既知の方法によって、又は、暖気の向流中の同時乾燥下でのベペシン塩溶液の不活性医薬物質への噴霧によって、製造される。こうして得られた顆粒に対して他の成分が添加され、必要であれば、従来の方法で均質化し且つタブレット化し、又はカプセル化される。最終段階において、タブレット、カプセル又はトローチ剤は、ベペシンが小腸内で放出されるのよりも早く放出しないように、胃液活性に耐性のある防護フィルムで被覆され得る。
【００４１】
本新規塩中のアミノ酸組成は、当該形態における活性物質のより大きな疎水性に理由がある。それ故、生体膜を通したより良好な運搬を予測することが現実的であり、このことがまた、クリーム、軟膏又はパッチのような経皮製剤の製造を提供する。
【００４２】
経皮系は、物質不浸透性の背面層、活性物質の供給源として補助する圧感知ポリマー、活性物質の浸透を許容する幾つかの場所において穿孔された保護フォイル、及び外部保護フォイルから成る。
【００４３】
ベペシン塩は、溶液、浣腸剤、注射剤又は乾式注射剤等の形態で使用され得る。この場合において、６乃至８、好ましくは７．０乃至７．５の至適ｐＨ値を有する緩衝剤水溶液が、溶媒として使用される。当該溶液は、０．２２μｍ孔のフィルタを通して、又は１００℃までの超短時間加熱によって、滅菌され得る。乾式注射剤は、ベペシン塩、緩衝液及び保存剤を含有する滅菌溶液をアンプル中で凍結しそして凍結乾燥する方法で、製造される。
【００４４】
目薬又は鼻薬用の溶液は、７．０乃至７．５の範囲のｐＨ値を有し、活性物質に加えて、ベペシンがまた緩衝液及び保存料を含有し、そして滅菌状態にて濾過された、等張液及び等水性溶液を使用することにより、製造される。
【００４５】
直腸内及び膣内用途の坐薬は、ベペシン水溶液がその中に混合される、ゼラチン、カカオ脂、低融点を有する天然若しくは半合成の脂質、パラフィン、グリセリン、１０００乃至６０００の分子量を有するポリエチレングリコールを採用することにより、製造される。さらには、乳化剤、抗酸化剤及び保存剤が添加される。
【００４６】
ベペシン塩はまた、クリーム、軟膏又はゲルの形態で使用され得る。この場合、保存剤、着色剤、乳化剤、水又は緩衝溶液及び抗酸化剤が添加されている、天然、植物性又は動物性脂質をベースとした親油性、親水性又は両親媒性の脂質ベース、及び天然油が使用される。
【００４７】
ベペシンは、非常に低投与量で作用する化合物である。経口用途の治療投与量は、疾病型及び重症度に応じて、体重の１０−５乃至１０−２ｍｇ／ｋｇの範囲である。タブレット、トローチ又はカプセルにおける共通の投与量は、０．１乃至最大で５ｍｇの範囲である。局所用途における濃度は、０．００１％乃至０．５％の範囲よりも高い。最適投与量の決定は、評価及び経験による。ベペシンがいかなる副作用又は毒性をも示さないことは、非常に重要である。生物に対する上記の及びその多数の好ましい効果に基づき、１日に１μｇ乃至最大で０．１ｍｇの範囲の非常に低投与量にて、食品サプリメントの形態での用途の可能性がある。この目的のために製造された製剤において、ベペシンはまた、ビタミン、ミネラル及び他の好ましく作用する物質と組み合わされ得る。
【００４８】
本発明によると、ベペシンの主要な活性を改善するか又は相乗的に作用する他の単一の活性物質もまた添加され得る。これらは下記の群からの物質である。
抗ウイルス及び抗生活性の両方が同時に達成されることが望ましい、特に局所用途の製剤における、ゲンタマイシン、アジスロマイシン、アンピシリン、セファロスポリン及びドキシサイクリンのような抗生物質活性を有する物質。そのような例は、ダニ咬傷であり、ボレリア及びダニ媒介脳炎を同時に予防するための強度が２倍である。
乾燥緑茶抽出コエンザイムＱ１０、イデベノン、クルクミン、アビゲノール（ａｂｉｇｅｎｏｌ）、ピクノジェノールその他のような、抗酸化活性を有する物質。
【００４９】
コエンザイムＱ１０又はユビキノンとの組み合わせが特に興味深い。コエンザイムＱ１０は、非常に効果的な抗酸化剤及び有機ラジカル捕捉剤であり、さらには、血流低下、高血圧及び心不全の兆候と関連した心臓病において、使用され得る。最近、重要な抗酸化剤はまた、強力な抗腫瘍形成活性を有するクルクミンであることが証明されている。
【００５０】
我々の研究は、神経疾患、例えば多発性硬化症の治療における新規ベペシン塩の非常に好ましい活性を証明した。この炎症性疾患は、脳及び脊髄中の軸索の周りのミエリン鞘に対して損傷を引き起こす。神経細胞は、通常ミエリン鞘が絶縁体である神経繊維軸索を通した電気シグナルを送ることによって繋がっている。ミエリン鞘が損傷している場合には、電気シグナルの伝導が遮断されるか又は非常に妨害される。多発性硬化症においては、身体の免疫系がミエリン鞘を攻撃し且つ傷付ける。多発性硬化症に対する効果的な治療は知られていない。存在する治療は、攻撃後の機能を改善し、新規攻撃を予防することを目的とするが、大抵は、逆効果であるか、又は許容されない。
【００５１】
ベペシンは、抗炎症、修復、防護及び免疫調節活性を有する。
薬理学的研究に基づくと、多発性硬化症に対するベペシンの良好な治療効果が予測される。ベペシン−Ｌ−アルギニン塩との製剤の使用が、ライム病菌（Ｌ．Ｒｅｉｋ他，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，４６，１９８９，７９０−７９５）又は梅毒菌（Ｄ．Ｇｒｅｙ，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，１９８６年７月１２日，７５−７７）による感染により引き起こされる二次創傷及び障害の補助的な治療において有益となり得る。全てのこれらの場合において、ミエリン鞘が傷付いており、脳内の損傷はＭＲＩで可視化される。
【００５２】
多発性硬化症は、１ｍｇ乃至５ｍｇの投与量において、安定化形態にあるベペシン塩を含有する経口製剤によって、治療されるであろう。逆の又は望ましくない副作用は、ベペシン製剤の使用と関連性はなく、そのためそれらは長期用途にも安全である。
【００５３】
動物に対する薬理学的実験に基づき、我々は、適切な医薬製剤の形態にある、塩基性アミノ酸とのベペシン塩の使用が、神経障害、重症筋無力症及びその他のような、他の神経疾患においてもまた有利である。
【００５４】
ベペシンはまた、大腿動脈の重篤な損傷後の側副血管の再組織化に対して非常に有利な効果をも有する。
【００５５】
本方法を明らかにすることを目的とした、限定されない下記実施例によって、本発明をさらに示す。１８乃至４４の実施例は、ベペシンの薬理学的活性を測定するために行った実験を記載している。実際に広く使用されている種々の試験管内及び生体内実験を使用することによって、及び情報元の文献の引用によって、行った。ベペシンは、Ｌ−アルギニンとの塩の形態で、全ての実験において、使用した。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、紫外光により照射したときのベペシン溶液の安定性の概略図であり；試料１乃至７の吸光度は各々１０分間測定した。
【図２】図２は、黒色腫Ｂ−１６細胞に対するベペシンの活性の概略図である。
【図３】図３は、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥ）に対するベペシンの効果の概略図である：  Ａ：ベペシン無しの、１０２のＴＢＥウイルス（ｉ．ｃ．ｖ）及び０．９％ＮａＣｌ食塩水（ｉ．ｐ．）の同時適用を示す。  Ｂ：１０２のＴＢＥウイルス（ｉ．ｃ．ｖ）及びベペシン１０μｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）の同時適用を示す。  感染の兆候は、比較的後の段階で起きている。  Ｃ：１０２のＴＢＥウイルス（ｉ．ｃ．ｖ）による感染の４時間前のベペシン１０μｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）適用を示す。疾患の臨床的兆候は無い。３０日後に動物を安楽死させ、そして脳ホモジェナイゼート（ｈｏｍｏｇｅｎｉｓａｔｅ）を新しい動物に転移した；Ｄを参照されたし。  Ｄ：脳ホモジェナイゼート及び１０２のＴＢＥウイルス（ｉ．ｃ．ｖ）による新規感染の同時適用を示す。５０日後であっても疾患の兆候は無い。
【図４】図４は、Ｄ２Ｏで測定したベペシン塩の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す：  Ａ：ベペシンＬ−リジン塩（１：３）のスペクトルを示し、  Ｂ：ベペシンＬ−アルギニン塩（１：２）のスペクトルを示し、  Ｃ：ベペシンＬ−オルニチン塩（１：２）のスペクトルを示す。
【図５】図５は、側副血管を示す：  Ａ：対照群を、１分間、局所食塩水浴のみに付し、側副血管は見えない；  Ｂ：対照群を、１分間ベペシン浴に付し、多くの腹側血管が完全な相互連結と共に見られる。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
実施例
実施例１．ベペシンＤ−アルギニン塩（１：２）の製造
ベペシントリフルオロ酢酸（５００ｍｇ，０．３４ｍｍｏｌ）を２５ｍＬの水に溶解した。穏やかに撹拌しながら、Ｄ−アルギニン（２１２ｍｇ，１．２２ｍｍｏｌ）を段階的に添加し、そしてさらに１５分間撹拌した。その後、希釈酢酸（５０％）を用いて、溶液のｐＨ値を７．４０±０．０５に調節した。当該溶液を清澄濾過し、そして凍結乾燥した。凍結乾燥物を少量の水に溶解し、そして予め洗浄し且つ純水で平衡としたＨＰＬＣカラム（ＩＤ＝２．２ｃｍ，ｈ＝２５ｃｍ，ソルベント  レプロジル（Ｒｅｐｒｏｓｉｌ）Ｃ１８，１０μｍ）の開始点に適用した。水中のイソプロパノール濃度を上げ：０乃至５％のイソプロパノールで３０分間溶出した。塩及び不純物を含有する最初の画分を廃棄した。採取した主要画分を凍結乾燥した。２モルのＤ−アルギニン／１モルのペンタデカペプチドを含有する５５０ｍｇの乾燥塩を得た。
【００５８】
アミノ酸解析は下記組成に対応していた。
２−Ａｌａ，１−Ｖａｌ，３−Ｇｌｙ，４−Ｐｒｏ，１−Ｌｅｕ，２−Ａｓｐ，１−Ｇｌｕ，１−Ｌｙｓ，２−Ａｒｇ。
ＭＳ（ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳ＋）：Ｍ１＝１４１９．８（ペンタデカペプチド＋Ｈ＋）
Ｍ２＝１７５．１（Ｄ−アルギニン＋Ｈ＋）
ＦＴＩＲ  ｙ（ｃｍ−１）：３２７５，３０５７，２９５８，２８７２，１６２８，１５３３，１４４８，１３９４，１３１５，１２４４，１２０４，１１６１，１０９６，１０４４，９１９，８７５。
比旋光度（ｃ＝１ｇ／１００ｍＬ）［α］Ｄ２８＝−１５４°。ＨＰＬＣ純度：９９．４８％。
【００５９】
実施例２．ベペシンＬ−アルギニン塩（１：１）の製造
実施例１に記載されるように、酢酸ベペシン及びＬ−アルギニンを有する溶液を製造した。希釈酢酸（５０％）を用いて、溶液のｐＨ値を４．６０±０．０５に調節し、そして実施例１のとおりに、得られた溶液を処理した。１ｍｏｌのベペシン当り１ｍｏｌのＬ−アルギニンを含有する２３２ｍｇの非晶性粉末を得た。
【００６０】
アミノ酸解析は下記組成に対応していた。
２−Ａｌａ，１−Ｖａｌ，３−Ｇｌｙ，４−Ｐｒｏ，１−Ｌｅｕ，２−Ａｓｐ，１−Ｇｌｕ，１−Ｌｙｓ，１−Ａｒｇ。
ＭＳ（ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳ＋）：Ｍ１＝１４１９．８（ペンタデカペプチド＋Ｈ）
Ｍ２＝１７５．１（Ｄ−アルギニン＋Ｈ）
ＦＴＩＲ  ｙ（ｃｍ−１）：３２６５，３０６０，２９６０，２８７５，１６２９（ＣＯＮＨ），１５３４，１４４８，１３１２，１２４３，１２０２，１１６０，１０４３，９１９，８７３。
比旋光度（ｃ＝１ｇ／１００ｍＬ）［α］Ｄ２８＝−１１９．０°。ＨＰＬＣ純度：９８．５７％。
【００６１】
実施例３．ベペシンＬ−アルギニン塩（１：２）（Ａｒｇ−ＢＰＣと省略する）の製造
酢酸ベペシン（１ｇ，０．７０５ｍｍｏｌ）及びＬ−アルギニン（４２０ｍｇ，２．４１ｍｍｏｌ）を、４ｍＬの水に溶解し（溶液のｐＨ値は８．９２であった）、そして２０分間撹拌した。その後、希釈酢酸（５０％）を用いて、ｐＨ値を７．４０±０．０５に調節した。当該溶液を、予めよく洗浄し且つ純水を用いて平衡としてＨＰＬＣカラム（ＩＤ＝２．２ｃｍ，ｈ＝２５ｃｍ，ソルベント：レプロジルＣ１８，１０μｍ）の開始点に適用した。水中のイソプロパノール濃度を上げ：０乃至５％のイソプロパノールで、段階的に３０分間溶出した。塩及び不純物を含有する画分を廃棄した。主要画分を凍結乾燥した。１．１０ｇの、水中にたやすく溶解し得る白色非晶性の粉末を、得た。
【００６２】
アミノ酸解析は下記組成に対応していた。
２−Ａｌａ，１−Ｖａｌ，３−Ｇｌｙ，４−Ｐｒｏ，１−Ｌｅｕ，２−Ａｓｐ，１−Ｇｌｕ，１−Ｌｙｓ，１−Ａｒｇ。
ＭＳ（ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳ＋）：Ｍ１＝１４１９．８（ペンタデカペプチド＋Ｈ＋）
Ｍ２＝１７５．１（Ｄ−アルギニン＋Ｈ＋）
ＦＴＩＲ  ｙ（ｃｍ−１）：３２７１，３０５７，２９５８，２８７５，１６３２（ＣＯＮＨ），１５３９，１４４８，１３９４，１２４４，１２０５，１１６１，１０９７，１０４４，９１９，８７３，６５２。
比旋光度（ｃ＝１ｇ／１００ｍＬ）［α］Ｄ２８＝−１２４．３°。ＨＰＬＣ純度：９９．５４％。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、図４Ｂに示した。
【００６３】
実施例４．ベペシンＬ−リジン塩（１：３）（Ｌｙｓ−ＢＰＣと省略する）の製造
酢酸ベペシン（５００ｍｇ，０．３４ｍｍｏｌ）及びＬ−リジン（１７６ｍｇ，１．２１ｍｍｏｌ）を、３ｍＬの水に溶解し、そして２０分間撹拌した。溶液をＨＰＬＣカラム上に適用し、そして実施例３に記載されるとおりに精製した。２８３ｍｇの、水中にたやすく溶解し得る白色非晶性の粉末を、得た。
【００６４】
アミノ酸解析は下記組成に対応していた。
２−Ａｌａ，１−Ｖａｌ，３−Ｇｌｙ，４−Ｐｒｏ，１−Ｌｅｕ，２−Ａｓｐ，１−Ｇｌｕ，４−Ｌｙｓ。
ＭＳ（ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳ＋）：Ｍ１＝１４１９．８（ペンタデカペプチド＋Ｈ＋）
Ｍ２＝１４７．１（Ｌ−リジン＋Ｈ＋）
ＦＴＩＲ  ｙ（ｃｍ−１）：３２６９，３０６０，２９５８，２８７５，１９８１，１６２７（ＣＯＮＨ），１５３２，１４４７，１３９３，１３１５，１２４１，１２０３，１１６０，１００８，９１９，８７３，６５４。
比旋光度（ｃ＝１ｇ／１００ｍＬ）［α］Ｄ２８＝−１３０°。ＨＰＬＣ純度：９９．４７％。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、図４Ａに示した。
【００６５】
実施例５．ベペシンＬ−オルニチン塩（１：２）（Ｏｒｎ−ＢＰＣと省略する）の製造
酢酸ベペシン（５００ｍｇ，０．３４ｍｍｏｌ）及びＬ−オルニチン（１．７７ｍｇ，１．０５ｍｍｏｌ）を、５ｍＬの水に溶解し、そして希釈酢酸を用いて、ｐＨ値を７．４０±０．０５に調節した。当該溶液を、上記実施例に記載されるとおりに、ＨＰＬＣカラム上で精製した。４１２ｍｇの、水中にたやすく溶解し得る白色非晶性の粉末を、得た。
【００６６】
アミノ酸解析は下記組成に対応していた。
２−Ａｌａ，１−Ｖａｌ，３−Ｇｌｙ，４−Ｐｒｏ，１−Ｌｅｕ，２−Ａｓｐ，１−Ｇｌｕ，１−Ｌｙｓ，２−Ｏｒｎ。
ＭＳ（ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳ＋）：Ｍ１＝１４１９．８（ペンタデカペプチド＋Ｈ＋）
Ｍ２＝１７０．１（Ｌ−リジン＋Ｈ＋）
ＦＴＩＲ  ｙ（ｃｍ−１）：３２６９，２９５８，２８７５，２１６２，１６３６（ＣＯＮＨ），１５２２，１４４２，１３８９，１３１１，１２４３，１２０３，１１６０，１０９４，１０４０，９１１，８７３，６５４，６１０。
比旋光度（ｃ＝１ｇ／１００ｍＬ）［α］Ｄ２８＝−１３７°。ＨＰＬＣ純度：９９．３０％。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、図４Ｃに示した。
【００６７】
実施例６．表
【表７】
2016513637.tif 000012
【００６８】
実施例７．表−フィルムにて被覆
【表８】
2016513637.tif 000013
【００６９】
実施例８．点眼剤
【表９】
2016513637.tif 000014
【００７０】
実施例９．カプセル
【表１０】
2016513637.tif 000015
【００７１】
実施例１０．局所使用用溶液
【表１１】
2016513637.tif 000016
【００７２】
実施例１１．ゲル
【表１２】
2016513637.tif 000017
【００７３】
実施例１２．クリーム
１００ｇのクリーム用の親油性成分：ステアリン酸、セテアリル及びステアリルアルコール、カプリル及びカプリン酸を有する飽和中鎖トリグリセリド、シリコーン油。合計１６．４ｇのジメチコン及びセテアリル硫酸ナトリウムを６０℃にて溶融した。
親水性成分：滅菌濾過済みの純水（７０ｇ）に、プロピレングリコール（３ｇ）及び保存剤ブチル−４−ヒドロキシベンゾエート（０．５ｇ）を添加し、撹拌し、そして、６０℃に加熱した。０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を用いて、ｐＨ値を６．５に調節した。その後、撹拌下で親水性相を親油性相に添加し、３０乃至３５℃に達するまで冷却しそして撹拌した。抗酸化剤の酢酸トコフェロール（０．０５ｇ）を当該混合液に添加し、良く撹拌し、そして最終的に、１０ｇの、Ａｒｇ−ＢＰＣ（０．１ｇ）を含有する水溶液添加した。当該混合物を良く撹拌し、そして適切な容器内に充填した。
【００７４】
実施例１３．坐薬
【表１３】
2016513637.tif 000018
【００７５】
実施例１４．口内分散性タブレット
【表１４】
2016513637.tif 000019
【００７６】
実施例１５．経皮製剤−パッチ
活性成分：Ａｒｇ−ＢＰＣ（５．０ｍｇ）及びドキシサイクリン（ｄｏｘｏｃｙｃｌｉｎｅ）（１．０ｇ）を、水（１０ｇ）、ジエチレングリコールモノエチルエーテル（１．８ｇ）、ポリエチレングリコールモノラウレート（０．５ｇ）及びジエタノールアミン（０．２ｇ）の混合物中に溶解した。２５ｇの、ポリマー溶液  ＧＥＬ  ＶＡ．ＲＴＭ．２４８４（モンサント（Ｍｏｎｓａｎｔｏ））を添加し、そして良く撹拌した。その後、当該溶液を２０分間置き、脱気した。その後、当該溶液を、不透過性メンブラン（３Ｍ−スコッチパック（Ｓｃｏｔｃｈｐａｃｋ）１００６のような、ポリエチレンフィルム又はアルミ蒸着ポリエチレンフィルム）上に適用し、そして、４０乃至５０℃にて乾燥した。その後、当該層を、浸透し易く制御された物質放出フォイル及び保護フォイルで被覆し、そして適切な寸法に切断した。
【００７７】
実施例１６．長期安定性を有するタブレット
予備処方：
ベペシンＬ−アルギニン塩１：２（１．０ｇ）及びＤ−マンニトールを、２０ｍＬの水に溶解し、滅菌濾過し（０．２２μｍフィルタ）、そして凍結乾燥した。得られた白色非晶性粉末は、ベペシン塩を５０％含有していた。
【００７８】
タブレットの製造：
【表１５】
2016513637.tif 000020
【００７９】
安定性試験：
記載のプロセスに従い製造したタブレットを、−１５℃、＋２５℃及び＋５０℃／ＲＨ６５％にてインキュベートし、そしてＨＰＬＣ法を用いてベペシンのアッセイを測定した。
インキュベーション期間：１８ヶ月
温度：                            −１５℃      ＋２５℃      ＋５０℃
ベペシンのアッセイ（ＨＰＬＣ）：    ９９．８％    ９６．６％    ９２．３５％
外挿法を用いたところ、製造したタブレットは、少なくとも２年間、室温にて安定であると結論され得た。
【００８０】
実施例１７．ベペシンを有する栄養補助食品−発泡タブレット
【表１６】
2016513637.tif 000021
【００８１】
実施例１８．ＮＯ−系に対するベペシンの活性
一酸化窒素（ＮＯ）は、内皮及び神経細胞中のシグナル分子の役割を、そしてまた、免疫細胞により活性化した所謂キラー分子の役割を有している。一般に、ＮＯの過剰又は欠乏において、ＮＯは、高血圧、扁桃炎、勃起不全、循環性及び敗血症性ショック、心不全、不整脈、脳卒中、炎症プロセス、血小板及び白血球の結合及び凝集、創傷及び火傷の良くない治療、筋肉、腱、靭帯及び骨の損傷、消化管障害、糖尿病、膵炎、循環性及び敗血症性ショック、内皮障害、心臓欠陥及びパーキンソン病のような、器官における種々の異常及び障害の形成に強く影響しているようである。
【００８２】
ベペシンは、ＮＯ濃度の放出及び正常化に影響し、そしてＬ−ＮＡＭＥのようなＮＯ阻害物質の適用後の障害に作用し、且つＬ−アルギニンのようなＮＯ前駆体の適用の副作用に対して作用する特性を有している。ＮＯ系に対するベペシンのこの活性は、非常に広範なその薬理活性をある程度明らかにしている。
【００８３】
文献：Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐａｒｉｓ，１００７，９１，１３９−４９；Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．２００９，１５６（１−３），８３−８９；Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ，２００８，１０８（１），７−１；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，２０１２，３，２０１，Ｒｅｇｕｌ．Ｒｅｐｔ．２０１３，１８１Ｃ，５０−６６，Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｍｏｎｉｔ．２００６，１２，３６−４５及びＥｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９７，３３２（１），２３−３３中に記載される方法を用いることによって、我々は、ベペシンが“生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で”ＮＯ放出を引き起こし、そしてＬ−アルギニン及びＬ−ＮＡＭＥの影響に対抗し得ることを、実験的に示した。このように、それは、ＮＯによって結果的に引き起こされる血圧障害を正常化する。
【００８４】
ベペシンはまた、非経口又は経口で体重当り１０ｎｇ乃至１０μｇ／ｋｇの投与量範囲で用いた場合に、イソプレナリン性心筋梗塞、及びメチルジゴキシン（６ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．又はｉ．ｐ．）により引き起こされる不整脈に対して、保護する。ベペシンは、ＮＯ阻害剤であるＬ−ＮＡＭＥによって引き起こされる損傷の悪化を予防する。ベペシンは、高過ぎ且つ低過ぎるＮＯ値によって引き起こされる障害を弱め、そして正常なＮＯ系機能を再構築する。
【００８５】
非経口又は経口で体重当り１０ｎｇ乃至１０μｇ／ｋｇの投与量範囲で使用される場合、ベペシンは通常、ＮＯ系において緩和効果を有する。それにより、ＮＯ阻害剤であるＬ−ＮＡＭＥによって引き起こされる損傷の悪化を予防する。
【００８６】
実施例１９．創傷治療に対する影響
文献：Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２００９，６０（Ｓｕｐｐｌ．７），１９１−１９６；Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．，２０１０，２８，（９），１１５５−１１６１；Ｂｕｒｎｓ，２００５，３１（３），３１０−３１５；Ｂｏｎｅ，１９９９，２４（３），１９５−２０２；Ｓｕｒｇ．Ｔｏｄａｙ，２００７，３７（９），７６８−７７７に特に記載される方法を用いることによって、我々は、血管形成の改良及びコラーゲンの生成による、下記示した疾患の治療を顕著に向上させることを見出した：
皮膚切開；
深い火傷；
消化管創傷のような種々の吻合；糖尿病性創傷；
種々の腫瘍；
種々の組織離断、特に靭帯、腱、筋肉及び神経の離断；
軟組織損傷を含む骨折；
完全な上皮剥離又は角膜潰瘍のような角膜創傷。
これら結果並びにラットとヒトの治療プロセスの間の大きな類似性に基づき、ベペシンは、ヒトにおける創傷、火傷及び骨折を治療するのにうまく用いられるであろう。
【００８７】
実施例２０．内皮保護、血管形成、血栓症及び出血性疾患
広範に検討した証拠に基づき（Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐａｒｉｓ．１９９３；８７，３１３−２７，Ｉｎｆｒａｍｍｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００６；１４，２１４−２１，Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  ２０１０；１６，１２２４−３４，Ｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００９，Ｄｅｃ．，６０，Ｓｕｐｐｌ．７，１６１−５、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，２０１２，５月，１２９（５），６５２−９）、我々は、ベペシンが血管完全性の損失後の活性に影響することを証明した。ベペシンは、無水アルコール胃内点滴後の内皮完全性維持を助け（即ち、細胞保護効果を示す）、そしてまた、ベペシンは、消化管及び消化管外の組織の損傷の両方に対して迅速な創傷治療効果を示す。結果的に我々は、ラットにおける腹部大動脈吻合後に、ベペシンの適用が、少なくとも２４時間、閉塞性血栓の形成を防止し、そして既に形成された血栓及び血管閉塞の存在中で与えられた場合に、下肢の機能を助けるとともに、既に形成された閉塞性血栓を迅速に破壊することを、示した。
【００８８】
我々は、ラットにおいて実施した他の実験において、切断後に、ベペシンが一貫して長期の出血及び血小板減少症を弱めるだけでなく、アスピリン、ワルファリン及びヘパリンによる長期の出血をもまた弱めることを示した。ベペシンは、腹腔内、静脈内又は小腸内に投与された（体重当り１０μｇ／ｋｇ、１０ｎｇ／ｋｇ）。
【００８９】
既に形成された血餅、長期出血、並びにアスピリン、ワルファリン及びヘパリンによる長期出血により引き起こされた血小板減少症、並びにヘパリン（２５０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）、ワルファリン（１．５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｇ．  ３日連続で１日１回）、アスピリン（０．１ｇ／ｋｇ  ｉ．ｇ．  ３日連続で１日１回又は１．０ｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．１回）の多投与量により引き起こされた血小板減少症を防止しそして除去する重要な発見は、ベペシンがそれ自体により凝固パラメータに影響しなかったということであった。
【００９０】
結果的に、ベペシンを用いた治療は、血栓症又は血液障害のいずれかが存在している全ての関連ある状態に対応され得る。ベペシンはまた、ｅｒｇ−１及び／又はｎａＢ２の機能が損傷する状態において独創的な治療でもあり得る。
【００９１】
実施例２１．癒着形成
我々の以前の研究は、炎症過程及びその結果に対するベペシンの独特の効果を証明した。さらには、我々はまた、癒着形成（癒着（ｓｔｉｃｋｉｎｇ））に対するベペシンの治療効果を、及び癒着の発達に対する防御（又は少なくとも相当の減少）をも証明した。
【００９２】
幾つかの適切な方法（即ち、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２０１０，１３８，（５，Ｓｕｐｐｌ．１）７５３；Ｓｕｒｇ．Ｔｏｄａｙ，２００７，３７（９），７６８−７７７に従った回腸−直腸吻合；Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．，２００９，５４（１０），２０７０−２０８３に従った空腸−直腸吻合に記載される方法に従ったラットの壁側腹膜の外科切除）によって、我々は、ベペシンが概して、機能改善（即ち、吻合は通常の水準まで動物の体重増加を強める）に関連した癒着形成（肉眼的に及び顕微鏡的にの両方）を低減させることを示した。ベペシンは、非経口的に、経口的に又は局所的に、体重当り１０ｎｇ乃至１０μｇ／ｋｇの範囲のその通常の低投与量で使用した。動物モデル及びヒト器官の状態の間に存在する一致点を考慮し、我々は、これら障害におけるベペシンの治療用途を主張する。
【００９３】
実施例２２．免疫修飾
天然の又は合成の物質により誘発される免疫修飾（特に必須のマクロファージ機能として）は、感染症及び腫瘍性疾患の両方の予防及び治療についての良好な選択肢として考慮される。
【００９４】
Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２００９，６０，Ｓｕｐｐｌ．２，６９，に記載の方法を使用することによって、マウスの主要な免疫学的に活性な細胞としてマクロファージの活性を向上させる“生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）”でのベペシンの効能（即ち、高いマクロファージ移動性、単核白血球と多核白血球との間のＭ／Ｐ比の回復）を評価した。３日連続で、体重当り５０μｇ又は１００μｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）の用量のベペシンを、マウスに毎日注射した。
【００９５】
活性化マクロファージは、免疫修飾作用にとって重要であるＢ−、Ｔ−及びＮＫ細胞の機能を制御する因子の生成及び放出を誘発した。このベペシンの免疫修飾作用は、幾つかの感染症及び腫瘍性疾患の治療の目的として、有利に使用されるであろう。
【００９６】
実施例２３．ＮＳＡＩＤ類−非ステロイド性抗炎症薬
既に見出されたように、ベペシンは、全ての炎症性パラメータに対して強力な作用を有すると同時に、治療を改善し、そして特にＮＳＡＩＤ類の使用後の損傷及び創傷を防止した。パラセタモール、アスピリン、ジクロフェナク、イブプロフェン及びインドメタシンは、文献：Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２０１０，６１（２），２４１−２５０；Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２０１０，１３８，５，Ｓｕｐｐｌ．１，Ｓ−３６９に記載される多数の副作用を誘発する。このことは特に、胃、小腸、肝臓及び脳の損傷の形成及び長期出血及び種々の行動障害（痙攣を含む）によって、証明された。これらは全て、非経口又は経口のいずれかのベペシン用途によって、緩和された。
【００９７】
多量出血の他に、ベペシンはまた、非経口で、胃内で又は飲料水中の投与で、体重当り１０ｎｇ乃至１０μｇ／ｋｇの範囲内の非常に低投与量で、アスピリン（１ｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）又はジクロフェナク（１２．５ｍｇ  体重／ｋｇ，ｉ．ｐ．）の使用後の血小板減少症に効果的に拮抗した。
ベペシンは、ＮＳＡＩＤ類の副作用を緩和する。さらには、急性及び慢性炎症（ＮＳＡＩＤ類が使用される）に対するその有利な効果を考慮すると、最良の方法は、ＮＳＡＩＤ類を使用せずベペシン単独を使用することであろう。
【００９８】
実施例２４．アナフィラキシー及びアナフィラキシー性反応
非経口で卵白及びデキストランを与えた場合、ラットにおいて重篤なアナフィラキシー性反応を誘発する（Ｂ．Ｎ．Ｈａｌｐｅｒｎ，Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ，Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．，Ｊ．及びＡ．Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｔｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９５６，９２−１２３及びＨ．Ｓｅｌｙｅ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９３７，２１，１６９）。天然及び合成ポリマーは、大量の内因性ヒスタミン放出を誘発してしまう。麻酔された動物に対し、６％、１０％、２０％、４０％、６０％、８０％、９０％の濃度の静脈内用のデキストラン溶液及び／又は卵白溶液（１ｍＬ／ラット又は０．１５ｍＬ／マウス）を、その尾内に与えた。顕著な浮腫が、顔面、上唇及び下唇、鼻面、足及び陰嚢に現れた（極端なチアノーゼと共に与えられた）。デキストラン及び／又は卵白の適用後に、動物は呼吸が乏しくなり、そして数匹は死亡した。対照的に、処方におけるベペシン（１０μｇ、１μｇ、１０ｎｇ、１０ｐｇ／ｋｇ）は、効果的に、アナフィラキシー性反応及び血管虚脱を予防し、且つまた、単独ではわずかに効果的であるにすぎないか若しくは全く効果無しであるクロミプラミン（２０ｍｇ／ｋｇ）及びシメチジン（１０ｍｇ／ｋｇ）のような抗ヒスタミン剤の作用を顕著に改善させた。
従って、使用したモデルが、ヒトアナフィラキシー性反応と似た正規モデルであるという事実を考慮すると、アナフィラキシー性状態におけるベペシンの有利な効果が提供された。
【００９９】
実施例２５．コルチコステロイド
特に全身的に与えられたコルチコステロイドは、重篤な障害（即ち、免疫抑制、創傷治癒遅効等）を引き起こしてしまう。文献：Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｍｏｎｉｔ．，２０１０，１６（３），ＢＲ８１−８８；及びＢｕｒｎｓ，２００５，３１（３），３１０−３１５に記載される方法を使用することによって、ベペシンが、コルチコステロイドで失敗した創傷の治療（即ち、マウス及びラット腹腔内投与において、体重当り１ｍｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの６−α−メチルプレドニゾロン）、全身的なコルチコステロイド処理した筋肉圧挫損傷、深い火傷、離断したアキレス腱若しくは中部側副靭帯、種々のフィステル、胃、結腸及び皮膚の不具合又はコルチコステロイド免疫抑制（脾臓細胞の試験）に完全に対抗する、ということが見出された。
クリームの薄層（即ち、１μｇ／ｇの中性クリーム）として、非経口で、口腔で又は局所的に、体重当り１０ｎｇ乃至１０μｇ／ｋｇの範囲の投与量で、ベペシンを使用した。
このように、ヒトの環境との相当の重複を与えると、ベペシンは、コルチコステロイドの使用により誘発される障害をなくすのに、及び／又は、コルチコステロイドの代わりの幾つかの兆候において、使用され得る。
【０１００】
実施例２６．高血圧、低血圧及び血圧の調節
Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐａｒｉｓ．１９９３，８７（５），３１３−３２７及びＥｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９７，３３２（１），２３−３３において記載されるとおりに行った実験によって、ベペシンが、正常血圧の動物における血圧には効果を有しないが、高血圧を低下させ得及び低血圧を上昇させ得る、ということが示された。特に、ベペシンは、２個の腎臓−２ＫＩＣ−又は１個の腎臓−１Ｋ１Ｃ−のゴールドブラット高血圧を有する高血圧動物、即ち、長期間、高フルクトース（８０％）又は高塩分（１５％）食餌のいずれかを与えたラット；ＮＯ阻害剤であるＬ−ＮＡＭＥ（５ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｖ．）又は大投与量のＫＣｌ  ｉ．ｐ．を用いて処理したラット；の高血圧を低下させた。ベペシンは、低血圧に対して作用する、即ち、慢性心疾患を有するラットの血圧、及び上昇した血清エンドセリン１値、ドキソルビシンで誘発された低血圧を正常化し（２．５ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．  １５日間で６回）、そしてまた、慢性心疾患を良好にする。
【０１０１】
また、ベペシンは、ＮＯ−前駆体であるＬ−アルギニンで処理した（１００ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）ラットの低血圧を和らげる。定期的に、ベペシンを予防的に又は治療的に与えた。
非経口で又は経口での、１０ｎｇ乃至１０μｇ／ｋｇの投与量のベペシンによって、他の損傷及びこれらのプロセスで存在する他の障害をかなり減少させ、又は全く消失させた。
血液量減少性ショックにおいて、ベペシンは、血圧を回復し、及び他の致命的な転帰を防いだ。ベペシンはまた、他の死を引き起こし得る血液量の損失を回復させ得た。
血圧障害のモデルとヒト血圧障害との間の有意な類似性を与えると、ベペシンは、血圧障害、高血圧及び低血圧、及び関連する障害の治療において、正当であった。
【０１０２】
実施例２７．アルコール−急性及び慢性中毒、麻酔
Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．，２０１０；１６（１０），１２２４−１２３４；Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２００９，６０（Ｓｕｐｐｌ．７），１７７−１８１；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９９，３６４（１），２３−３１；Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，１９９４，５４，（５），ＰＬ６８；Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．，１９９７．４２（５），１０２９−１０３７に記載される方法を使用することによって、アルコール中毒におけるベペシン効果の研究を行った。
【０１０３】
非経口で又は経口での、体重当り１０ｎｇ乃至１０μｇ／ｋｇの範囲の用量のベペシンが、急性アルコール中毒、離脱、並びに、急性及び慢性胃腸及び肝臓損傷、並びに、急性アルコール摂取又は長期慢性アルコール飲酒の結果としての門脈圧亢進症の影響を予防し及び阻害した。類推によって、ベペシンは、モルヒネ依存のマウスの離脱症状に拮抗した。さらには、ナロキソン（１０ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ．）と同様に、ベペシンは、モルヒネ（１６ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ．）の麻酔作用に拮抗した。プロトタイプとしてアルコールを採用した場合、ベペシンは、プロポフォール、チオペンタール及びケタミンの効果に対抗して作用した。ベペシンは、麻酔及び強硬症（即ち、フェンタニル、デヒドロベンズペリドール）の両方の影響を低減させた。
アルコールの摂取はヒトにおいても同様の影響を与えるため、ベペシンは、急性及び慢性アルコール中毒及び離脱症状（また、例えば、モルヒネ及び同様の物質における）において、使用され得、及びまた、麻酔薬について、その麻酔効果を緩和した。
【０１０４】
実施例２８．腫瘍に対するベペシンの活性
実験腫瘍の研究用の一般的なモデルは、マウスの癌腫及び黒色腫Ｂ−１６の転移の数の評価を含む。これらの実験腫瘍は、ヒトの腫瘍との相当の類似性を有している。
エールリッヒ腹水腫瘍（ＥＡＴ）は、マウスの全ての種族において生長し、そしてこれら実験において共通して認識できるようにして使用した。
ＥＡＴ腫瘍細胞で感染させたマウスは、最長２５日間生存した。予めベペシン（２μｇ／ｍＬ）を用いたマウスのインキュベーションによって、動物の生存は、最長で観察の終結まで（４５日間）延長した。ベペシンはまた、シクロホスファミド細胞増殖抑制剤の使用後の、好中球減少症の発生を阻害し、網状赤血球を低減させ、及びヘモグロビン値を改善させた。
【０１０５】
“ｉｎ  ｖｉｔｒｏ”（生体外）実験
リン酸緩衝剤及び抗生物質で補った、ＲＰＭＩ１８４０媒体中のヒト黒色腫細胞培養において、黒色腫細胞に対する活性を研究した。３７℃及び５％のＣＯ２を有する湿った環境のインキュベータ中で、細胞培養を育成させた。良好に育成した細胞培養に対して、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ−１０ｎｇ／ｍＬ）と組み合わせ、４８時間の間、各々、２ｐｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ及び１０ｎｇ／ｍＬの濃度でベペシンを添加した。光学顕微鏡によって、及びフローサイトメトリーによって、細胞形態を観察した。細胞培地へのベペシンの添加後、メラニン細胞の密度は大幅に低下した。さらには、細胞表現型が、円形のメラニン細胞から、微細に形成した細胞の交絡を有する紡錘状の上皮細胞へと、変化した。１０ｎｇ／ｍＬのベペシン濃度において、最も発現された結果が明確であった。同様の変化がまた、ＶＥＧＦで、そしてその後ベペシンで最初に刺激した細胞の場合に、観察された（図２）。
【０１０６】
フローサイトメトリー解析によって、Ｓ−相中の細胞数は、対照と比較して、２ｐｇ／ｍＬの濃度のベペシンにおいては２０％低下し、そして２ｎｇ／ｍＬ及び１０ｎｇ／ｍＬの濃度のベペシンにおいては５５％低下することが示された。
ウェスタンブロット解析によって、ベペシンが、ＶＥＧＦ因子に相当するマイトジェンで活性化したタンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）を阻害することによって、抗分裂促進的に作用することが明らかとなった。
ベペシンは、抗腫瘍能を明白に示した。動物モデル及びヒトの状態の間の類似性、並びに、生体内及び生体外実験の両方で得られた有益な結果を考慮することによって、ベペシンは、抗腫瘍治療において効果的であるだろう。ベペシンはまた、細胞増殖抑制の副作用を低減するためにも有益である。
【０１０７】
実施例２９．消化管損傷
幾つかの実験潰瘍モデル（例えば、２４時間の拘束ストレス、皮下の又は直腸内のシステアミン、胃への９６％エタノールの点滴、ＮＳＡＩＤ−損傷、ＤＮＦＢ（ジニトロフルオロベンゼン）損傷、前−、共−及び後−処理における逆流性食道炎）の対照標準と比較して、１０ｎｇ乃至１０μｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．、ｉ．ｇ．）の範囲の用量でのベペシンの治療活性の決定のために、多数の刊行物に記載される方法及び材料（Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．，２０１０，１６（１０），１２２４−３４；Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００９，６０（Ｓｕｐｐｌ．７），１０７−１１４；Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．２００８，１０８（１１），（７−１７）；Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．２００９，５４（１）４６−５６）を使用した。当該方法の全てにおいて、ベペシンを非経口で又は経口で、成功裏に使用した。ベペシンは、全てのモデルの存在する個体の、創傷の出現を効果的に阻害し、そして治療を促進した。
ヒトの障害との相当の類似性を考慮すると、ベペシンは、全ての消化管損傷の治療において成功裏に適用され得る。
【０１０８】
実施例３０．カリウム−高カリウム血症及び低カリウム血症
カリウムは、心臓平滑筋、消化管、骨格筋及び神経の通常の機能にとって重要である。通常のカリウム濃度は、心調律にとって非常に重要であり、そのため、低すぎる濃度（低カリウム血症）及び高すぎる濃度（高カリウム血症）の両方とも、心調律障害及び器官の多数のその他の異常を引き起こす。
【０１０９】
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｃａｒｄｉｏｌｏｇ．２０１２，３，２０１；Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．，２０１３，１８１Ｃ，５０−６６に記載される方法を適用することによって、フロセミド（１００ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）を適用し、そして９０−１５０分後に、ＰＲ、ＲＲ、ＱＲＳ、ＱＴ間隔の時間、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ波、及びそれらの振幅を、心電図的にモニターし；さらに、我々は、心室ブロック、心室性期外収縮、心室性頻脈の発現を解析した。存在する低カリウム血症にもかかわらず、全てのベペシン（１０μｇ／ｋｇ及び１０ｎｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．及びｉ．ｇ．）群は、洞調律を維持し、心室性期外収縮、心室性頻脈、心室ブロックは無く、振幅が低下することなく間隔及び波の延長も無かった。フロセミド（低カリウム血症、第３段階心室ブロック及び／又は心室性頻脈が存在する）後に、９０分間ベペシンを与えた。５−１０分以内に、ベペシン群は、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ波、ＰＲ、ＲＲ、ＯＲＳ、ＱＴ間隔の時間、Ｒ、Ｓ、Ｔ波振幅、全ての心室ブロックを正常化し、及び心室性頻脈を消滅させた。
【０１１０】
Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２００７，１０４（１），７−１８；Ｊ．Ｐｈａｒａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２００６，１０２（３），２６９−２７７において前記した方法を使用して、ＫＣｌ過剰投与（腹腔（ｉ）、胃内（ｉｉ）、生体外（ｉｉｉ））に対するベペシンの完全な緩和性能を示した。このように、ベペシンは、低カリウム血症及び高カリウム血症の兆候に応じて発現する全ての障害を正常化する独特の治療として有益であり得る。
【０１１１】
実施例３１．カルシウム−高カルシウム血症
カルシウムは、心筋、血管及び神経の細胞に作用するため、器官において重要な役割を有している。高すぎるカルシウム濃度−高カルシウム血症の最もありがちな原因は、第一に、副甲状腺機能亢進症であり、そして第二の原因は、悪性腫瘍及び肉芽腫症である。高カルシウム血症は、高血圧、軟組織及び眼の角膜の石灰化、腎石症及び消化性潰瘍のような、種々の疾病の原因となり得る。
【０１１２】
病態生理学的なカルシウム血は、破骨細胞活性及び骨の再吸収を増加させる疾患によって引き起こされ、このことに腎臓が従うことが出来ない。それはまた、ビタミンＤの過剰用量において生じ、カルシウムの代用品、即ち制酸剤及びチアジド利尿剤の使用により生ずる。非常に一般的な原因は、大抵、高血圧の患者におけるカルシウムチャネル遮断薬の使用である。ベペシンは、高カルシウム血症に効果的であることが示され、ＣａＣｌ２過剰投与量の影響を緩和した。同様に、ベペシンは、カルシウムチャネル遮断薬の過剰用量の影響を緩和することができた。カルシウムの過剰投与量及び長期の高カルシウム血症は即ち、ラットにおいて、急性膵炎及びＱＴｃ間隔の短縮及びＰＱ間隔の延長を引き起こした。ラットに、ＣａＣｌ２溶液（２００ｍｇ及び４００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を与えた。継続的に、ＥＣＧを記録し、そしてＫ、Ｎａ、Ｃｌ、アミラーゼ、クレアチンキナーゼ及びＬＤＨ（５、１０、１５、２０及び６０分において）、及び６０分の急性膵炎を、Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．，１９９６，４１（７），１５１８−１５２６；Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．，２００９，１５６（１−３），８３−８９；Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２００４，９５（１），１９−２６に記載されるとおりに測定した。ベペシン（１０μｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）をまた、ＣａＣｌ２の３０分前に、予防的に投与した。ラットに、ベラパミル（４０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を急速投与した。ベラパミルの３０分前に（前処理）又は５分後の後処理として、ベペシン（１０μｇ／ｋｇ及び１０ｎｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を投与した。
【０１１３】
ベペシンは、重篤な高カルシウム血症の影響を緩和し、ＱＴｃ間隔の短縮及びＰＱ間隔の延長の両方を解消し、並びに、他の重篤な急性膵炎を緩和し、且つ血清アミラーゼ値を低下させた。
ベラパミルは、投与５分後３０乃至４５分間継続した第２度房室ブロックとともに、徐脈（２００乃至２３０／分）を誘発した。ベペシンによって、洞調律を保っているか又は回復した（治療的適用において、房室ブロックもまた解消した）。
実験によって、ベペシンは、高カルシウム血症の全ての結果を予防したか又は良好なものにしたことを示した。このように、ベペシンは、高カルシウム血症の兆候とともに現れる全ての障害を正常化するための独自の治療として有益であり得る。
【０１１４】
実施例３２．筋無力症候群への影響
重症筋無力症を悪化させることで知られる多数の種々の薬物による、増強された筋弛緩を兆候とした、筋無力症候群を、過剰投与量の硫酸マグネシウムの腹腔内投与を用いた、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃａｎｄ．，Ｓｕｐｐｌ．，１９８４，１００，３９−４７に従って、誘発した。硫酸マグネシウム（体重当り５００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を与えた２００乃至３００ｇの体重の雄及び雌のラットは、既に５分後に顕著な筋無力症を示し（進行性の衰弱、虚弱、筋肉の衰弱）、完全に動かなくなった。ベペシンを、硫酸マグネシウム（体重当り１０μｇ／ｋｇ及び１０ｎｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の１５分前に又は同時に適用したところ、硫酸マグネシウムの障害を完全に緩和し、そして全ての動物が正常に活動的となった。
【０１１５】
トレッドミルランニング試験によって、ベペシン適用後の通常のラットにおいては、その能力が改善され、そしてそれらは以前よりもずっと長く走ることができたことが明らかとなった。
このように、概して、ベペシンは、筋無力症候群として現れる全ての障害を正常化し、及び特に、マグネシウムを用いた治療とともに現れる全ての障害を緩和するための独自の治療として有益であり得る。同様に、ベペシンは、概して、骨格筋機能を改善するための独自の治療であり得る。
【０１１６】
実施例３３．神経筋疾患及び神経精神病学的疾患
ドーパミン系は運動機能に不可欠であると、一般に考えられている（Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ．Ｔｒａｎｓｍ．２０１０  １２月；１１７（１２）；１３５９−６９）。Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２００１  ３月９日；６８（１６），１９０５−１２．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐａｒｉｓ．２０００  ３月−４月；９４（２）１０５−１１０中の前記の方法を使用することによって、ベペシンが、ドーパミン受容体阻害剤、強硬症、並びに、ハロペリドール、フルフェナジン及びクロザピンのような種々の神経弛緩薬によって誘発される体性感覚障害の結果、ドーパミン小嚢の消耗、神経毒である１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）によって誘発される黒質線条体ドーパミン破壊を緩和することを与える、特定の経路で、ドーパミン系と強く相互作用することが示された。ベペシンは、ＭＰＴＰで傷付いた体性感覚方向性を強く改善し、そしてＭＰＴＰで誘発された多動性、及び最も重要には、ＭＰＴＰによる運動障害（震え、運動低下症、強硬症−又は非常に顕著な塩類制御）を低減させ、管理されたＭＰＴＰ処理の他の正常の致死に至る進行を殆ど完全に停止させた。
【０１１７】
前述のように、ベペシンは、吻合をして又はせずとも、筋離断又は筋挫傷後の筋肉の治療、及び神経離断後の神経治療を改善した。結果的に、このことは、ベペシンが、神経筋接合部の障害及び神経から筋肉へのシグナル伝達を改善するのにもまた適していることを、意味している。
実際に、ベペシンは、概して、筋機能の障害を改善するのに使用され得る。動物モデルとヒト疾患における、前述のドーパミン及びセロトニン系の共通の重要性を考慮すると、ベペシンは、対応する神経精神病学（ｎｅｕｒｏｐｓｙｈｉａｃｈｉａｔｒｉｃ）疾患、特にドーパミン及び／又はセロトニン系に関連したものにおいて、使用され得る。
【０１１８】
実施例３４．インスリン−糖尿病
Ｓｋｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００６，１９（５），２６６−２７４，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐａｒｉｓ，１９９９  １２月；９３（６），５０１−４において前記した手順を使用して、局所的に与えられたベペシンは、糖尿病動物の皮膚創傷の治療を向上させ得た。ベペシンは、アロキサンで誘発された潰瘍、フルクトース摂取により誘発された高血圧、及びインスリン耐性の進行を阻害する、ということがさらに示された。同様に、抗腫瘍ペプチドとして、インスリン直後に（ｉ）腹腔内又は（ｉｉ）胃内に適用したベペシン（１０μｇ／ｋｇ）は、胃潰瘍の他に、全てのインスリン（２５０ＩＵ／ｋｇ  ｉ．ｐ．の過剰投与量）疾患及び致死的転帰（即ち、脳卒中（致死と同等））、大脳皮質及び海馬の重大に損傷した神経、肝肥大、脂肪肝、非常な低血糖による肝臓グリコーゲンの破損を緩和し得た。このように、ベペシン治療の成功は、イスリン監視下におけるベペシンの潜在的な役割を示し得、そして、ベペシンは、過剰のインスリン適用後の１以上の原因となる過程に影響し、それによって、糖尿病患者の種々の障害、及び特にインスリン治療の使用（乱用）を抑える用途に影響を与えた。
【０１１９】
実施例３５．抗炎症活性、痛み及び温度
広く検討された証拠（Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐａｒｉｓ．１９９３；８７，３１３−２７，Ｉｎｆｌａｍｍｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００６；１４，２１４−２１，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．２０１０；１６，１２２４−３４）に基づくと、ベペシンは、生体外及び生体内での、炎症媒介体（即ち、ミエロペルオキシダーゼ、ロイコトリエンＢ４、トロンボキサンＢ２）の放出を低減した。ベペシンは、急性の、非特定の炎症（即ち、カラギーナン、テレピン油、コットンペレット）並びにＤＮＦＢ−障害の幾つかのモデルと拮抗した。さらには、ベペシンは、温度低下（即ち、浸水試験）及び上昇（酵母による誘発）に対して作用した。結果的に、ベペシンは、炎症性の痛み（酢酸）及び非炎症性の痛み（ＭｇＳＯ４）の両方に拮抗した。さらには、ベペシンは、ラットのカラギーナン試験における痛み閾値を上昇させ、そしてランダルセリット試験において抗痛覚過敏効果を示した。離断した坐骨神経の場合において、吻合の有無にかかわらず、ベペシンは、神経症の痛みを強く低減させた。 
【０１２０】
アジュバント関節炎（フロイントアジュバントにより動物において誘発される）のような炎症性病変、及び消化管損傷を誘発する非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＡ）に対するベペシンの効果を、ラットにおいて同時に実験し、そして非常に説得力あることが分かった。
大きく発達したアジュバント関節炎の治療において、ベペシンの有利な効果は、早ければ治療の２週間後に示され、そして適用のほぼ１年後には明確に示された。
従って、ベペシンは、急性の又は慢性の炎症の後遺症を低減させるための、体温を正常化するための、及び特に、痛みを低減させるための、独自の治療として、使用され得る。
【０１２１】
実施例３６．神経損傷に対する効果
Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．，２０１０年２月；１６０（１−３），３３−４１において前記した方法を使用して、ラットの離断した坐骨神経の治療、並びに、吻合部位における損傷後（腹腔内／胃内／局所的）すぐに適用したベペシン（１０μｇ／ｋｇ、１０ｎｇ／ｋｇ）により達成された改善を、示した。当該改善は、臨床的に（自己切断）、顕微鏡的に／形態計測学的に及び機能的に（ＥＭＧ、損傷後１ヶ月又は２ヶ月間、週ごとの間隔での歩行回復）示された。ベペシンで処理されたラットは、より速い軸索再生を：組織的に（ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）（繊維、神経鞘及び神経周囲の密度及び寸法の増加、有髄線維径の増加、ミエリン鞘の厚さ、面積当りの有髄線維の数）、電気生理学的に（運動作用の増加）、並びに、機能的に（ＳＦＩ因子の改善）、示した。
【０１２２】
このように、ベペシンは、ラットの坐骨神経の治療を顕著に改善した。実験モデルとヒト病理学との間の顕著な類似性を考慮すると、これら知見は、種々の神経損傷の治療において事実上有益であり得る。
【０１２３】
実施例３７．体性感覚ニューロン、運動神経損傷、脳損症及び神経／筋肉間のシグナル伝達妨害
体性感覚ニューロンの機能障害又は機能亢進のいずれかを、糖尿病、帯状疱疹、帯状疱疹後神経痛、アトピー性皮膚炎、損傷した組織の誤った治療、乾癬、湿疹、喘息、慢性関節リューマチ等によって引き起こされた固有の神経感覚の神経症のような、種々の障害において、証明した。
【０１２４】
体性感覚ニューロンは、外傷に対する最初の防衛ラインのシステムである。それらは、ホメオスタシスを制御し、そしてまた、危険な場合の適切な手段を開始する。それらの保護能を、カプサイシンを用いた皮膚及び胃腸粘膜の実験的損傷によって、証明した。高用量で与えられた当該物質は、知覚繊維を分解するが、低用量（０．５ｍｇ／ｋｇ未満）では、神経伝達物質の放出を活性化し、そして粘膜に対する保護効果を有する。Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．，１９９６，４１（８），１６０４−１６１４に記載された実験において、高用量のカプサイシンを使用して、知覚繊維を分解した。動物体重当り１０ｎｇ乃至１０μｇ／ｋｇの用量で使用するベペシンを、経口で又は局所的に投与すると、カプサイシンの影響を強く低減させた。
【０１２５】
ベペシンはまた、落錘によって誘発された動物の脳損傷の結果を強く低減させた。当該モデルは、Ｒｅｇｕｌａｔ．Ｐｅｐｔ．，２０１０，１６０（１−３），２６−３２に記載される。右側筋肉−四頭筋へのスクシニルコリン注射（０．２ｍｇ／ｋｇ）による実験によってもまた、神経から筋肉へのシグナル伝達の不具合による筋肉作用における神経筋疾患を誘発した。スクシニルコリン注射の前又は後に投与したベペシンは、スクシニルコリンの局所的な影響を完全に解消した。
【０１２６】
ベペシンの神経保護効果、実験モデルとヒト病理学との間の顕著な類似性を考慮することによって、これら知見は、種々の神経損傷の治療における臨床的性能を高めることについて事実上適用し得る。
【０１２７】
実施例３８．脳障害及び多発性硬化症への効果
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１１，６６７，３２２−９；Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２０１１，８８，５３５−４２；Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１０，６１，２４１−５０；Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２００９，６０  Ｓｕｐｐｌ．７，１０７−１４；Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．，２０１０．１６０．２６−３２において前記した方法を使用することによって、ベペシンが、ＮＳＡＩＤの過剰投与による脳障害へと結果的に導く全ての要因に対して作用することが、示された。さらにベペシンは、インスリンの過剰投与後に現れる脳損傷に対しても作用した。ベペシンは、生死に関わるインスリン毒性及び致命的な脳卒中、大脳皮質及び海馬中の深刻に損傷した神経に対して、作用した。ベペシンはさらに、外傷に起因する脳損傷を低減し得た。現在、多発性硬化症及びクローン病の治療において、α４−インテグリン分子の細胞粘着に対するヒト化モノクローナル抗体である、ナタリズマブが、有利に使用されている。種々の型の潰瘍性大腸炎におけるベペシンの予めの適用及びその有効性、損傷した筋肉、神経及び脳損傷の治療における既に言及したベペシンの有効性を考慮すると、ベペシンの有利な効果は、多発性硬化症に対する適切なモデルにおいて予測され得る。
【０１２８】
アレルギー脳炎の種々のモデルのうち、クプリゾンが最も信頼できるものとして主張された。最近記載のプロトコル（Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１３，Ｂｒａｉｎ，２００６，１２９，１９４０−１９５２）を使用した。４日後の安楽死まで、ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットに対して、飲料水への１０μｇ／ｋｇ若しくは１０ｍｇ／ｋｇ、０．１６μｇ／ｍＬ／１２ｍＬ／１日／ラットでの、又は０．１６ｎｇ／ｍＬ／１２ｍＬ／１日／ラットでの、ベペシンの添加と組み合わせた食餌計画において、２．５％のクプリゾンを投与し；１日１回、胃内に１ｇ／ｋｇのクプリゾンをさらに与え、且つ、胃内にベペシンを１０μｇ／ｋｇ又は１０ｎｇ／ｋｇ与えた。このように、食餌中の過剰投与量のクプリゾンを繰り返してラットに与えて、損傷の形成を促進した。結果として、脳の種々の部位において神経損傷が観察され、最も顕著な損傷が、脳梁、背外側視床（ｌａｔｅｒｏｄｏｒｓａｌ  ｔｈａｌａｍｕｓ）及び核再結合部（ｎｕｃｌｅｕｓ  ｒｅｕｎｉｏｎ）において生じた。クプリゾン及びベペシンで処理したラットは、一貫して、全ての部位において損傷がより少なかった。ベペシンは、最も影響を受けた部位において最も有利な効果を示した。
【０１２９】
結果的に、実験結果に基づくと、ベペシンは、炎症性腸疾患及び多発性硬化症の両方の治療に適することを証明した。ベペシンはさらに、種々の脳障害の初期治療であり得る。
【０１３０】
実施例３９．抗ウイルス活性
アルボウイルス、肝炎、ヘルペス及びＬＣＭウイルス
正誤２４時間の、雄及び雌のＢＡＬＢ−Ｃ系統のマウスにおいて、抗ウイルス活性を研究した。アルボウイルス（ＴＢＥ＝ダニ媒介性脳炎ウイルス、バニア（Ｂｈａｎｉａ）、１、２、３及び４型デング、シンドビス、西ナイル及びカロボ（Ｃａｌｏｖｏ）ウイルス）、Ａ型肝炎ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎（ＬＣＭ）ウイルス及び１型及び２型ヘルペスウイルスを、１０−２の稀釈率（０．０２ｍＬ／マウス）のウイルス懸濁液として、ｉ．ｃ．（又はＡ型肝炎についてはｐ．о．）として使用した。０．０２ｍＬ  ｉ．ｃ．（又はＡ型肝炎についてはｐ．о．）／マウスでＬＤ１００と同等となるように投与量を調節し、そして稀釈率１０−２で接種した。ベペシン（２０μｇ／体重ｋｇ）又は０．９％ＮａＣｌ溶液（０．０２ｍＬ／マウス）を下記のとおり、ｉ．ｃ．又はｉ．ｐ．で使用した。
（ｉ）ウイルス感染の２時間前の処理（−２ｈ）、
（ｉｉ）ウイルス感染と同時（０）
（ｉｉｉ）感染兆候の発現後４日。
結果を表７に示した。
【０１３１】
ベペシンをウイルス感染前に適用した場合（ｉ）、観察時において疾患又は致死の兆候は見られなかった。ベペシンを感染と同時に投与した場合（ｉｉ）、障害の兆候は、２０日後の相当後の段階において現れた（ベペシン投与なしの対照群においては、全ての動物が５日以内に死亡した）。ベペシンを第一の兆候の発現において与えた場合、障害の発生が有意に遅延した（ｉｉｉ）。
表７の数字は、感染させた全ての動物が死亡したときの日数を表す（対照群含む）。健康な未処理の動物から成る第二の参照群においては、死亡ケースは無かった。記号“＋”は経口投与を示し、記号“ａ”はＡＲＢＯウイルスを示し、そして記号“ｎ．ｄ．”は、死亡ケースが無かったことを意味する。全ての動物を、感染後４０日間観察した。
【０１３２】
ダニ媒介性脳炎ウイルス
試験マウスにおけるダニ媒介性脳炎ウイルスに対するベペシンの活性を、図３に明確に示した。ベペシンを、０．０２ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で使用した。ベペシンは、適した投与量によって、試験動物の生存期間を相当に延長したか、又は感染を殆ど防止した。
使用したウイルス懸濁液の毒性についての結果を検証するため、ＴＢＥウイルスを用いて前もって感染させた動物の脳組織の一部及びベペシンを採って、そして懸濁液としての脳ホモジェナイゼートを調製した。当該懸濁液を使用して、新規ウイルス懸濁液（ＴＢＥ）によって新規動物に接種し、そして感染させた。処理した動物は、およそ５０日後もいかなる疾患の兆候も示さなかったが、脳ホモジェナイゼートの代わりに生理的食塩水のみを与えられた動物は、５日間で死亡した。
【０１３３】
【表１７】
2016513637.tif 000022
【０１３４】
ヘルペスウイルス
ＶＥＲＯ細胞（ＴＩＣＤ５０、ＨＳＶ−１、１０１０、ＩＤ５０／２００μＬ及びＨＳＶ−２：１０１１、ＩＤ５０／１００μＬ、２４、４８及び７２時間のインキュベーション）を用いた実験によって、ヘルペスウイルスＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２で接種された生体外細胞系において、ベペシンが、ＨＳＶウイルスの再生成を阻害し、そしてＨＳＶウイルスの細胞変性作用に対して細胞を保護することが、示された。
【０１３５】
１０１０ＩＤ５０／μＬの濃度のＨＳＶ−１及び１０１１ＩＤ５０／１００μＬの濃度のＨＳＶ−２による脳内接種を用いたＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウス新生児に対する実験によって、ベペシンの“生体内”の活性を測定した。ベペシンＬ−アルギニン塩を、１０μｇ／ｋｇ及び１００μｇ／ｋｇの投与量で適用した。比較の目的のために、未処理の動物群を補い：これら動物を、１０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇの投与量で、生理的食塩水及びアシクロビルのみを用いて処理した。一群については、全ての薬剤を４８時間適用し、そして、他をウイルス感染後にさらに７２時間適用した。結果は、ベペシンが、致死的に感染したマウスにおける病気の動物の数を顕著に低下させ、そして認められた薬剤であるアシクロビルよりもさらに効果的であることを、示した。アシクロビルを用いて処理したマウスの生存時間は、１１２／１０５／１１５時間（平均／最小／最大）であったが、ベペシン（より少ない投与量）を用いて処理したマウスの生存時間は、有意に長い、１３１／１２８／１３５時間であった。
【０１３６】
１０μｇ／ｋｇ及び１００μｇ／ｋｇの投与量のベペシンの効率は、同一の試験条件下の、より高い投与量の１０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇのアシクロビルよりも良好であることが、証明された。
サイトメガロウイルスＣＭＶを用いた感染の場合においても、同様の結果が得られた。
【０１３７】
Ａ型インフルエンザウイルス
Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２型のＡ型インフルエンザウイルスに対するベペシンの活性の実験を、ＭＤＣＫモデル（メイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞由来）について行った。培地媒体として、５％ウシ胎児血清及び抗生物質で補ったＭＥＭ（最小必須培地）（Ｎａｒｕｓｅ  Ｎ．他．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，１９９１，４４，７３３−７４０）を使用した。ベペシンは、非常に低濃度である３２μｇ／ｍＬにおいてさえも、Ａ型インフルエンザウイルスン位対して強い阻害効果を示し、そして、これまで既知の使用された化合物よりもかなり効果的であった。
【０１３８】
ネコ白血病ウイルス
ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）はレトロウイルスであり、そしてまたＲＮＡウイルスとして伝染するが、ＲＮＡはＤＮＡに逆転写しない。当該ウイルスは、唾液又は鼻水でネコ間に伝染する。動物の免疫系は破綻し、そして感染は動物にとって致死的である。この型の疾患は、血液リンパ球の癌（白血病）の型である。
【０１３９】
当該疾患に対する予備ワクチン接種をしなかった、年齢６ヶ月から５年の３２匹のネコ（両方の性）について行った試験により、ベペシンの活性を研究した（オーナーの同意により）。ネコの全てが、強く発現した疾患スタジアム（ｓｔａｄｉｕｍ）にあり、コンボＦｅＬＶ／ＦＩＶ試験が陽性であった。全ての動物が４１．５℃の高い体温、並びに、重篤な疾患の兆候：黄疸、下痢、頻脈、腹痛、脱水症状及び鬱を有していた。診断後、全てのネコに、最初の８日間は１日１回で、１μｇ／ｋｇ体重の投与量で（１ｍＬ中）、皮下注射の形態で、その後は計１月まで同じ投与量を経口で、ベペシン溶液を与えた。
【０１４０】
直ちに改善が観察され、体温はちょうど３０分で最低でも１℃低下し、そして１週間以内には通常の状態に回復した。しかしながら、数匹の動物の状態が、４乃至５日後に２４時間、一時的に再度悪化したが、６日目に再度改善し、その後およそ１０日間で完全な回復が観察された。
【０１４１】
結論：１μｇ／ｋｇ体重のベペシン投与量を毎日投与した場合には、予備ワクチン接種せずそしてネコ白血病によって悪化したネコは、１０日以内に完全に回復し得た。これまでは、ワクチン接種を除き、当該疾患に対する有効な薬剤、及び非常に廉価なインターフェロンωが無かった。
【０１４２】
類似の遺伝学的特徴のサブタイプのウイルスに基づくと、ベペシンは、幾つかの他のウイルス感染：例えば、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ又はＨＨＶ−３）、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルスＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、ＨＨＶ−８（カポジ肉腫）及びチクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）の場合においても効果的であることが、予測され得る。
これらウイルスの幾つかが、ヒトにおいてもまた同様の疾患現象を引き起こす、という事実を考慮すると、我々は、ヒトにおけるこれら疾患、とりわけ、患者の容体が非常に好ましくないもの（例えば、ＡＩＤＳ及びＡＩＤＳに関連した症候群）の治療においても、ベペシンが使用され得ると信じる。
【０１４３】
実施例４０．括約筋動作
実験試験方法は、特に、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２００７，１０４（１），７−１８及びＪ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２００６，１０２（３），２６９−２７７及びＲｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．，２０１３．１８１Ｃ，５０−６６において記載されている。ベペシン（１０ｎｇ／ｋｇ乃至１０μｇ／ｋｇ体重、非経口で又は経口で）が、そうでなくば障害を受けてしまう、ラットの括約筋機能（食道括約筋、幽門括約筋及び尿道括約筋）、及び括約筋内の圧力を保持することが、分かった。さらには、ベペシンはまた、長く続く疾患（即ち、食道炎、急性膵炎）の後、又は種々のストレス性尿失禁の後でさえも、括約筋機能及びその圧力を急速に回復させ得た。さらに、ベペシンはまた、食道炎及び括約筋の不具合を起因とした他の疾患（急性膵炎；種々のストレス性尿失禁）を緩和し、及び解消させた。
このように、使用したモデルとヒト病理学との類似性を考慮すると、ベペシンは、不具合を生じた括約筋機能に関連した全ての疾患の独自の治療であり得る。
【０１４４】
実施例４１．動物の体重増加−獣医学
Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．，２００９，５４（１），４５−５６に記載の方法を使用することによって、広域の小腸切除による、進行した短腸症候群及び進行性の体重減少を有するラットを、４週間にわたり研究した。術後、動物の疲労は、第１週以内の、体重減少、腺窩の深さの２倍増加、筋肉厚の４倍増加、空腸及び回腸の膨張、及び空腸／回腸比の障害に伴って、増加した。ベペシン適用後直ちに、一定の体重増加が観察され、そして下記：絨毛高さ、腺窩の深さ及び筋肉厚（環状筋層）が増加した。１０ｎｇ／ｋｇ乃至１０μｇ／ｋｇ体重、ｉ．ｍ．又はｐ．о．の投与量のベペシンで処理したラットは、空腸及び回腸の直径に相違は無かった。それらは、一定の空腸／回腸比及び向上した吻合破断点を有していた。
【０１４５】
従って、１日目から２１日目までの前記投与量のベペシンで処理した子豚は、実質的により良好な体重増加を示し、そして下痢は起こさなかった。
このように、使用したモデルと動物病理学との類似性を考慮すると、ベペシンは、短腸機能に関連した全ての疾患の独自の治療であり得る。さらには、従って、ベペシンは、家畜動物の体重増加をも改善し得る。
【０１４６】
実施例４２．精子保存に対するベペシンの影響
精子の保存における精子凍結プロセスは、温度変化及び浸透作用によって、精子の運動性のおよそ５０％の低下を引き起こすことが、一般的に既知である。精子膜の統合、浸透性、及び液体組成によって、形態変化が生じる。
我々は、わずかに改変した標準方法に従い凍結した（凍結前にベペシンを媒体に添加した）、ウシ精子の運動性に対するベペシンの有利な作用を見出した。
実験の第一部は、凍結前にそのような手法で精子を処理した場合の、解凍後の精子の質に対する、２０ｎｇ／ｍＬのベペシンの生体内最大効果投与量の効果を決定することを目的とした。第二部は、精子の形状に対する効果を実験した。位相差顕微鏡によって、及びＣＡＳＡコンピュータ加工によって、結果を評価した。
【０１４７】
媒体の凍結前のベペシンによる処理は、対照の精子試料（ｐ＜０．０５；主観的方法：ｐ＝０．００４６；ＣＡＳＡ：ｐ＝０．０１４）と比較して、３７℃での解凍後の運動性を改善した。
解凍後すぐのベペシンによる精子の共処理は、対照試料（ｐ＜０．０５；主観的方法：ｐ＝０．００１８；ＣＡＳＡ：ｐ＝０．０１４）と比較して、その運動性を改善した。
【０１４８】
結果を考慮すると、ベペシンの添加によるウシ精子の凍結は、解凍後の精子の“ｉｎ  ｖｉｔｒｏ“（生体外）の質に対して非常に良好な効果を有することが結論づけられ得る。これら結果を確認するためには、さらなる”ｉｎ  ｖｉｖｏ”（生体内）研究が有益であろう。
結論：現時点で利用できる結果に従うと、ベペシンは、凍結保存における精子の質に対して望ましい効果を有していた。
【０１４９】
実施例４３．血管摘出後の効果
ベペシンは、動脈除去後に特に有利な効果を有する。Ｌ−ＮＡＭＥ及びＬ−アルギニンとは異なり、ベペシンは、血管の断端の間の欠損部を急速に埋め、このため、最悪のシナリオの場合においてさえ、急速に血液補給を再編する。
重大な寸法の血管障害の形成に従う血管生涯内の二次的な血管の付与を研究するために、ラットの大腿動脈の一部（上腹動脈（ｅｐｉｇａｓｔｒｉｃａ  ｃａｕｄａｌｉｓ）と回旋外側動脈（ｆｅｍｏｒａｌｉｓ  ｃｉｒｃｕｍｆｌｅｘａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓ）との間）を除去した。Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．１９９７  ９月  ；３５（３）：５４７−５２中のミクロ血管造影評価について記載された方法に従い、血管障害内の二次的な血管の付与を評価した。赤外線カメラを使用して、サーモグラフィーイメージングを行った。
【０１５０】
血管障害の発現のすぐ後に局所的な１分間の生理的食塩水（１ｍＬ／ラット、５ｍＬ／ｋｇ）浴を受けさせたラットの大腿動脈の予め決めた部分の除去後５乃至１０分の対照群においては、血管障害内の二次的な血管の付与は観察されなかった（図５Ａ）。
血管障害の発現のすぐ後に局所的な１分間のＬ−アルギニン（１ｍＬ／ラット、１００ｍｇ／ｋｇ）浴を受けさせたラットの大腿動脈の予め決めた部分の除去後５乃至１０分の血管障害内においては、未だ相互連結なく、わずかな血管が付与された。
血管障害の発現のすぐ後に局所的な１分間のＬ−ＮＡＭＥ（１ｍＬ／ラット、５ｍｇ／ｋｇ）浴を受けさせたラットの大腿動脈の予め決めた部分の除去後５乃至１０分の血管欠損内においては、血管障害の部分は完全に無く、且つ二次的な血管は付与されなかった。
ベペシン適用の場合においては、血管障害の発現のすぐ後に局所的な１分間のベペシン（１ｍＬ／ラット、１０μｇ／ｋｇ）浴を受けさせたラット大腿動脈の予め決めた部分の除去後５乃至１０分の血管障害内において、架橋したネットワーク及び機能的なネットワークを形成した完全な相互連結を有する二次的血管が観察され得た（サーモグラフィーレコーディングによって、確認した）（図５Ｂ）。
【０１５１】
当該証拠は、ベペシンが媒介した適応が、大腿動脈の除去及び閉塞のすぐ後の既存の二次的血管内で現れて、血管の伝導性を回復し、そしてそれ故、四肢の血流を回復したことを示している。実際に、後期適応は、二次的動脈の再構築のプロセスである動脈形成である一方で、早期適応は、血管拡張である（Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．２０１０  １月；５１（１）：１６５−７３）。いずれにせよ、Ｌ−アルギニンとベペシンとの間の相違が、早期適応、及び血管欠損それ自体内でなく、これまで調査した、（血管損傷後の日にち期間で（分期間ではない））が簡単な血管拡張ではなく、特定のベペシンで媒介された架橋プロセスである、ということを証明した。我々は、永続的な手法で側枝を介した血流の初期の増加に対してかなりの効果を有する重要なプロセスについて言うことができる。結果的に、非常に高度な段階及び改良された最終結果（双方の断端からの血管枝の形成）に到達した。
実験結果に基づくと、ベペシンは、血液供給の急速な再編成が必須となる全ての状態の独自の治療となり得る。
【０１５２】
実施例４４．急性毒性
全ての実験において、ベペシンは非常に安全な特性を示した。腹腔内で、静脈内で又は胃内で、かなり高い投与療法で、即ち１ｇ／ｋｇ体重で、雄及び雌の両方のウィスターアアルビノのラットに与えた、ジ−Ｌ−アルギニン塩（１：２）、並びに全ての他の塩形態としてのベペシンは、毒性も、及び副作用も、示さなかった。
【図１】
2016513637.tif 000026
【図２】
2016513637.tif 000027
【図３】
2016513637.tif 000028
【図４】
2016513637.tif 000029
【図５】
2016513637.tif 000030
【配列表】
2016513637000001.app
【国際調査報告】
2016513637.tif 000031
2016513637.tif 000032