(57)【要約】本発明は、抗クローディン１抗体およびそれらのその使用に関する。特に、本発明は、Ｈ−ＣＤＲ１領域中の配列番号２、Ｈ−ＣＤＲ２領域中の配列番号３、およびＨ−ＣＤＲ３領域中の配列番号４を含む重鎖可変領域；ならびにＬ−ＣＤＲ１領域中の配列番号６、Ｌ−ＣＤＲ２領域中の配列番号７、およびＬ−ＣＤＲ３領域中の配列番号８を含む軽鎖可変領域を含む抗クローディン１抗体（ＣＬＤＮ１）に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈ−ＣＤＲ１領域中の配列番号２、Ｈ−ＣＤＲ２領域中の配列番号３、およびＨ−ＣＤＲ３領域中の配列番号４を含む重鎖可変領域；ならびにＬ−ＣＤＲ１領域中の配列番号６、Ｌ−ＣＤＲ２領域中の配列番号７、およびＬ−ＣＤＲ３領域中の配列番号８を含む軽鎖可変領域を含む抗クローディン１（ＣＬＤＮ１）抗体。
【請求項２】
前記抗体の重鎖可変領域が、配列番号１として示されるアミノ酸配列を有する、請求項１記載の抗クローディン１抗体。
【請求項３】
前記軽鎖可変領域が、配列番号５として示されるアミノ酸配列を有する、請求項１記載の抗クローディン１抗体。
【請求項４】
前記抗体の重鎖可変領域が、配列番号１および３として示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が、配列番号５として示されるアミノ酸配列を有する、請求項１記載の抗クローディン１抗体。
【請求項５】
キメラ抗体、好ましくはキメラマウス／ヒト抗体である、請求項１記載の抗クローディン１抗体。
【請求項６】
ヒト化抗体である、請求項１記載の抗クローディン１抗体。
【請求項７】
Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、およびダイアボディからなる群より選択される、請求項１記載の抗体のフラグメント。
【請求項８】
重鎖を含む抗クローディン１（ＣＬＤＮ１）抗体であって、それにおいて、可変ドメインは以下を含む：
−配列番号２として示す配列と少なくとも９０%または９５%の同一性を有するＨ−ＣＤＲ１、
−配列番号３として示す配列と少なくとも９０%または９５%の同一性を有するＨ−ＣＤＲ２、
−配列番号４として示す配列と少なくとも９０%または９５%の同一性を有するＨ−ＣＤＲ３、
−配列番号６として示す配列と少なくとも９０%または９５%の同一性を有するＬ−ＣＤＲ１、
−配列番号７として示す配列と少なくとも９０%または９５%の同一性を有するＬ−ＣＤＲ２、
−配列番号８として示す配列と少なくとも９０%または９５%の同一性を有するＬ−ＣＤＲ３、および
−それは、可変ドメインが、Ｈ−ＣＤＲ１についての配列番号２、Ｈ−ＣＤＲ２についての配列番号３、およびＨ−ＣＤＲ３についての配列番号４を含む重鎖、ならびに可変ドメインが、Ｌ−ＣＤＲ１についての配列番号６、Ｌ−ＣＤＲ２についての配列番号７、およびＬ−ＣＤＲ３についての配列番号８を含む軽鎖を含む抗体と実質的に同じ親和性を伴い、ＣＬＤＮ１に特異的に結合する。
【請求項９】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群より選択される配列を有するポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項記載の抗体またはフラグメントをコードする核酸配列。
【請求項１１】
請求項１０記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１０記載の核酸または請求項１１記載のベクターによりトランスフェクト、感染、または形質転換されている宿主細胞。
【請求項１３】
検出可能な標識にコンジュゲートされ、抗ＣＬＤＮ１イムノコンジュゲートを形成する、請求項１〜８のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１４】
治療的薬剤にコンジュゲートされている、請求項１〜８のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１５】
治療的薬剤が、化学療法的薬剤、プロドラッグ変換酵素、放射性同位元素または化合物、および毒素からなる群より選択される、請求項１４記載の抗体。
【請求項１６】
（ａ）ＣＬＤＮ１過剰発現に関連付けられる疾患に罹患する可能性が高い被験者の生物学的サンプルを、請求項１〜８のいずれか一項記載の抗体と、この抗体が、ＣＬＤＮ１を発現する生物学的サンプルの細胞と複合体を形成するための十分な条件において接触させること；ならびに（ｂ）前記複合体を検出および／または定量化すること（それにより、前記複合体の検出が、ＣＬＤＮ１過剰発現に関連付けられる疾患を示している）からなる工程を含む、ＣＬＤＮ１過剰発現に関連付けられる疾患を診断する方法。
【請求項１７】
疾患が、癌、特に結腸直腸癌である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜８のいずれか一項記載の抗体の治療的に効果的な量を被験者に投与することを含む、それを必要とする被験者において癌を処置する方法。
【請求項１９】
癌が、結腸直腸癌、婦人科癌、卵巣癌、子宮頸部新生物、メラノーマ、扁平上皮癌、例えば口腔ＳＣＣ、下唇ＳＣＣ、頭頸部、皮膚ＳＣＣ、または扁桃ＳＣＣなど、胃腺癌、甲状腺癌、乳癌、松果体領域の神経上皮乳頭腫（ＰＴＰＲ）、明細胞腎細胞癌、唾液腺の粘表皮癌（ＭＥＣ）、上咽頭癌、上部尿路の尿路上皮癌、食道癌、中皮腫、胸膜転移性腺癌、および膵臓腫瘍からなる群より選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜８のいずれか一項記載の抗体の治療的に効果的な量を被験者に投与することを含む、それを必要とする被験者においてＨＣＶ感染を処置する方法。
【請求項２１】
請求項１〜８のいずれか一項記載の抗体を含む医薬的組成物。
【請求項２２】
請求項１〜８のいずれか一項記載の抗体を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗クローディン１抗体およびそれらのその使用に関する。
【０００２】
発明の背景：
【０００３】
ＣＬＤＮは、タイトジャンクション（ＴＪ）に関連した内在性膜タンパク質である。ＴＪは、上皮細胞および内皮シート中の側膜の最も先端領域に位置付けられる。それらの２つの主要な機能は、細胞極性を維持するフェンス機能、および溶質の拡散を調節する傍細胞バリア機能である（Tsukita and Furuse, 2006）。ＣＬＤＮは、２つの異なる方法で相互作用する：膜の面において横方向（ヘテロマー相互作用）または隣接細胞間での直接の結合（異型相互作用）。それらは、オクルディンおよび／またはＪＡＭと複合体を形成することができる。それらは、短い細胞内Ｎ末端ドメイン、４つの膜貫通ドメイン、２つの細胞外ループ、ならびにリン酸化部位およびクローディンが細胞質足場タンパク質（例えばＴＪ関連タンパク質ＭＵＰＰ１、ＰＡＴＨ、ＺＯ−１、ＺＯ−２およびＺＯ−３、ならびにＭＡＧＵＫなど）と直接的に相互作用することを可能にするＰＤＺドメイン結合モチーフを含む細胞内Ｃ末端ドメインを有する（Lal-Nag and Morin, 2009）。これらのタンパク質は、タイトジャンクション鎖の細胞質表面でアダプターとして機能し、細胞骨格分子およびシグナル伝達分子を含む、他のタンパク質を動員しうる（Tsukita et al., 2001）。調節タンパク質Ｒａｂ３ｂ、Ｒａｂ１３、腫瘍抑制因子（ＰＴＥＮなど）、転写因子（ＺＯＮＡＢなど）、およびＨｕＡＳＨ１を含む、多数の他の細胞質タンパク質および核タンパク質もタイトジャンクション複合体と直接的または間接的に相互作用することが示されている（Singh et al., 2010）。ＣＬＤＮ１は、密接に関連した膜貫通タンパク質の２４のメンバーからなるタンパク質のクローディンファミリーに属する。ＣＬＤＮ１は、結腸直腸癌において、あるいは感染性疾患（例えばＨＣＶなど）の処置のための新興の治療標的である。このように、いくつかの抗ＣＬＤＮ１抗体は、先行技術（ＷＯ２０１００３４８１２、ＥＰ  １１６７  ３８９、またはＵＳ  ６，６２７，４３９中）において記載されている。
【０００４】
発明の概要：
【０００５】
本発明は、抗クローディン１抗体およびそれらのその使用に関する。特に、本発明は、Ｈ−ＣＤＲ１領域中の配列番号２、Ｈ−ＣＤＲ２領域中の配列番号３、およびＨ−ＣＤＲ３領域中の配列番号４を含む重鎖可変領域；ならびにＬ−ＣＤＲ１領域中の配列番号６、Ｌ−ＣＤＲ２領域中の配列番号７、およびＬ−ＣＤＲ３領域中の配列番号８を含む軽鎖可変領域を含む抗クローディン１抗体（ＣＬＤＮ１）に関する。
【０００６】
発明の詳細な説明：
【０００７】
定義：
【０００８】
用語「クローディン１」または「ＣＬＤＮ１」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、タイトジャンクションのクローディン１と関連した内在性膜タンパク質を指す。ＣＬＤＮ１は、最初に、単離されたニワトリ肝臓接合画分からの２２ｋＤポリペプチドとして同定され、それらのマウスホモログをコードするｃＤＮＡがクローン化された（Furuse et al., 1998）。ＣＬＤＮ１（別名＝ＳＥＭＰ１）のヒトｃＤＮＡがクローン化され、配列決定された（Swisshelm et al., 1999）。それは、６３６のヌクレオチドを含む４つのエクソンを含む。翻訳は、２１１のアミノ酸残基の産物を与える。ＣＬＤＮ１は、４つの膜貫通領域を伴うテトラスパン膜トポロジーを有する。細胞内では、ＣＬＤＮ１は、７つのＮ末端アミノ酸、１２のループアミノ酸、および２７の  Ｃ末端アミノ酸を示す。細胞外ループ（ＥＣＬ）１は、２つの保存システインを伴う５３のアミノ酸からなる。ＥＣＬ２は、２７のアミノ酸を有する。用語「ヒトクローディン１またはヒトＣＬＤＮ１」は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿０６６９２４に示される配列を有するタンパク質、またはＨＣＶ許容ヒト集団において一般に見いだされる任意の天然バリアントを指す。クローディン１の用語「細胞外ドメイン」または「外部ドメイン」は、細胞外空間（即ち、細胞の外側の空間）中に拡張するクローディン１配列の領域を指す。
【０００９】
用語「抗ＣＬＤＮ１抗体」は、ＣＬＤＮ１に対して向けられた抗体を指す。
【００１０】
本発明に従い、「抗体」または「免疫グロブリン」は、同じ意味を有し、本発明において等しく使用される。用語「抗体」は、本明細書において使用する通り、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち、免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。そのようなものとして、用語「抗体」は、全抗体分子だけでなく、また、抗体フラグメントならびに抗体および抗体フラグメントの変異体（誘導体を含む）を包含する。天然抗体において、２つの重鎖が、ジスルフィド結合により互いに連結され、各々の重鎖は、ジスルフィド結合により、軽鎖に連結されている。軽鎖の２つの型、ラムダ（ｌ）およびカッパ（ｋ）がある。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主な重鎖クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩＧＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥがある。各々の鎖は、異なる配列ドメインを含む。軽鎖は、２つのドメイン、可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４つのドメイン、可変ドメイン（ＶＨ）および３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３、集合的にＣＨとして言及される）を含む。軽（ＶＬ）および重（ＶＨ）鎖の両方の可変領域が、抗原への結合の認識および特異性を決定する。軽（ＣＬ）および重（ＣＨ）鎖の定常領域ドメインは、重要な生物学的特性（例えば抗体鎖会合、分泌、経胎盤移動、補体結合、およびＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合など）を付与する。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部分であり、１つの軽鎖および１つの重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基の間での構造的相補性に存在する。抗体結合部位は、主に超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基で作られる。時折、非超可変領域またはフレームワーク領域（ＦＲ）からの残基は、全ドメイン構造および、故に、結合部位に影響する。相補性決定領域またはＣＤＲは、天然免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性および特異性を一緒に定めるアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、各々が、３つのＣＤＲを有する（それぞれＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３と命名される）。抗原結合部位は、従って、６つのＣＤＲ（重鎖および軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲセットを含む）を含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲの間に挿入されたアミノ酸配列を指す。
【００１１】
用語「キメラ抗体」は、６Ｆ６Ｃ３抗体に由来する抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメイン、ならびにヒト抗体のＣＨドメインおよびＣＬドメインを含む抗体を指す。
【００１２】
本発明に従い、用語「ヒト化抗体」は、ヒト抗体からの可変領域フレームワーク領域および定常領域を有する抗体を指すが、しかし、６Ｆ６Ｃ３抗体のＣＤＲを保持する。
【００１３】
用語「Ｆａｂ」は、約５０，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体フラグメントを表示し、それにおいて、プロテアーゼであるパパインを用いてＩｇＧを処理することにより得られるフラグメントの内、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分および全Ｌ鎖が、ジスルフィド結合を通じて一緒に結合される。
【００１４】
用語「Ｆ（ａｂ’）２」は、約１００，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体フラグメントを示し、プロテアーゼであるペプシンを用いてＩｇＧを処理することにより得られるフラグメントの内、ヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されるＦａｂよりもわずかに大きい。
【００１５】
用語「Ｆａｂ’」は、約５０，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体フラグメントを指し、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することにより得られる。
【００１６】
一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、共有結合的に連結されたＶＨ：：  ＶＬヘテロダイマー（通常は、ペプチドをコードするリンカーにより連結されたＶＨおよびＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合体から発現される）である。二価および多価抗体フラグメントは、一価ｓｃＦｖの会合により自然に形成することができる、または、ペプチドリンカーにより一価ｓｃＦｖを共役させることにより生成することができる（例えば二価ｓｃ（Ｆｖ）２など）。
【００１７】
用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を伴う小さな抗体フラグメントを指し、そのフラグメントは、同じポリペプチド鎖において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）。同じ鎖上で２つのドメイン間での対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは、別の鎖の相補ドメインと対合し、２つの抗原結合部位を作るように強制される。
【００１８】
「精製された」および「単離された」により、本発明に従った抗体またはヌクレオチド配列を指す場合、示された分子が、同じ型の他の生物学的高分子の実質的な非存在において存在することを意味する。本明細書において使用する用語「精製された」は、好ましくは、同じ型の生物学的高分子の少なくとも７５重量%、より好ましくは少なくとも８５重量%、より好ましくは少なくとも９５重量%、最も好ましくは少なくとも９８重量%が存在することを意味する。特定のポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子は、ポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子を指す；しかし、この分子は、組成物の基本的特徴に有害な影響を及ぼさない、多少の追加の塩基または部分を含みうる。
【００１９】
本発明の抗体：
【００２０】
本発明は、単離された抗ＣＬＤＮ１抗体またはそのフラグメントを提供する。特に、本発明者らは、ハイブリドーマを産生するマウス抗ＣＬＤＮ１抗体（６Ｆ６Ｃ３）を作製している。本発明者らは、前記ｍＡｂ６Ｆ６Ｃ３の軽鎖および重鎖の可変ドメインをクローン化し、特徴付け、このように、表１に記載する通り、前記抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）ドメインを決定した：
【表１】
2016528221.tif 000002
【００２１】
従って、本発明は、可変ドメインが、Ｈ−ＣＤＲ１についての配列番号２、Ｈ−ＣＤＲ２についての配列番号３、およびＨ−ＣＤＲ３についての配列番号４からなる群より選択される配列を有する、少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖を含む、ＣＬＤＮ１についての特異性を有するモノクローナル抗体に関する。
【００２２】
本発明は、また、可変ドメインが、Ｌ−ＣＤＲ１についての配列番号６、Ｌ−ＣＤＲ２についての配列番号７、およびＬ−ＣＤＲ３についての配列番号８からなる群より選択される配列を有する、少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖を含む、ＣＬＤＮ１についての特異性を有するモノクローナル抗体に関する。
【００２３】
本発明のモノクローナル抗体は、可変ドメインが、Ｈ−ＣＤＲ１についての配列番号２、Ｈ−ＣＤＲ２についての配列番号３、およびＨ−ＣＤＲ３についての配列番号４からなる群より選択される配列を有する、少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖および可変ドメインが、Ｌ−ＣＤＲ１についての配列番号６、Ｌ−ＣＤＲ２についての配列番号７、およびＬ−ＣＤＲ３についての配列番号８からなる群より選択される配列を有する、少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖を含む。
【００２４】
特に、本発明は、以下を含む抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体を提供する：
−  Ｈ−ＣＤＲ１領域における配列番号２、Ｈ−ＣＤＲ２領域における配列番号３、およびＨ−ＣＤＲ３領域における配列番号４を含む重鎖可変領域；ならびに
−  Ｌ−ＣＤＲ１領域における配列番号６、Ｌ−ＣＤＲ２領域における配列番号７、およびＬ−ＣＤＲ３領域における配列番号８を含む軽鎖可変領域。
【００２５】
特定の実施形態において、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号１として示されるアミノ酸配列を有し、および／または軽鎖可変領域は、配列番号５として示されるアミノ酸配列を有する。
【００２６】
別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、キメラ抗体、好ましくはキメラマウス／ヒト抗体である。特に、前記マウス／ヒトキメラ抗体は、上で定義する通りの６Ｆ６Ｃ３抗体の可変ドメインを含みうる。
【００２７】
別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体はヒト化抗体である。特に、前記ヒト化抗体において、可変ドメインは、ヒトアクセプターフレームワーク領域、および、場合によりヒト定常ドメイン（存在する場合）、および非ヒトドナーＣＤＲ（例えばマウスＣＤＲなど）（上で定義する通り）を含む。
【００２８】
本発明は、さらに、非限定的に、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、およびダイアボディを含む、前記抗体のＣＬＤＮ１に対して向けられた抗ＣＬＤＮ１フラグメントを提供する。
【００２９】
別の態様において、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群より選択される配列を有するポリペプチドに関する。
【００３０】
本発明の抗体を産生する方法：
【００３１】
本発明の抗ＣＬＤＮ１抗体は、当技術分野において公知の任意の技術（例えば、非限定的に、任意の化学的、生物学的、遺伝的、または酵素的技術など、単独または組み合わせのいずれか）により産生されうる。
【００３２】
所望の配列のアミノ酸配列が公知であれば、当業者は、ポリペプチドの産生のための標準的技術により、前記抗体を容易に産生することができる。例えば、それらは、周知の固相方法を使用して、好ましくは、商業的に入手可能なペプチド合成装置（例えば、Applied Biosystems（Foster City, California）により作られたものなど）を使用して、製造業者の指示に従って、合成することができる。あるいは、本発明の抗体は、当技術分野において周知の組換えＤＮＡ技術により合成することができる。例えば、抗体は、発現ベクター中への、抗体をコードするＤＮＡ配列の組み込み、および所望の抗体を発現する、適切な真核生物宿主または原核生物宿主中へのそのようなベクターの導入後、ＤＮＡ発現産物として得ることができ、そこから、それらを、周知の技術を使用して、後に単離することができる。
【００３３】
したがって、本発明のさらなる目的は、本発明に従った抗体をコードする核酸配列に関する。特に、核酸配列は、本発明の抗体の重鎖または軽鎖をコードする。
【００３４】
典型的には、前記核酸はＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり、それは、任意の適切なベクター（例えばプラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージまたはウイルスベクターなど）中に含まれうる。
【００３５】
用語「ベクター」、「クローニングベクター」、および「発現ベクター」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例、外来遺伝子）を宿主細胞中に導入することができ、宿主を形質転換し、導入配列の発現（例、転写および翻訳）を促進する媒体を意味する。
【００３６】
そのため、本発明のさらなる目的は、本発明の核酸を含むベクターに関する。
【００３７】
そのようなベクターは、調節エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）を含み、被験者への投与時に前記抗体の発現を起こしうる、またはそれに向けうる。動物細胞用の発現ベクターにおいて使用されるプロモーターおよびエンハンサーの例は、ＳＶ４０の初期プロモーターおよびエンハンサー、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターおよびエンハンサー、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーターおよびエンハンサーなどを含む。
【００３８】
動物細胞用の任意の発現ベクターを、ヒト抗体Ｃ領域をコードする遺伝子を挿入し、発現させることができる限り、使用することができる。プラスミドの例は、複製起点を含む複製プラスミド、または組込みプラスミド（例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなど）を含む。ウイルスベクターの他の例は、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、およびＡＡＶベクターを含む。そのような組換えウイルスは、当技術分野において公知の技術により（例えばパッケージング細胞をトランスフェクトすることにより、またはヘルパープラスミドもしくはウイルスを用いた一過性トランスフェクションにより）産生されうる。
【００３９】
本発明のさらなる目的は、本発明に従った核酸および／またはベクターによりトランスフェクト、感染、または形質転換された宿主細胞に関する。
【００４０】
用語「形質転換」は、宿主細胞への「外来」（即ち、外因性または細胞外）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の導入を意味し、宿主細胞が、導入された遺伝子または配列を発現し、所望の物質（典型的には、導入された遺伝子または配列によりコードされるタンパク質または酵素）を産生するようにする。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受け、発現する宿主細胞は、「形質転換」されている。
【００４１】
本発明の核酸を使用し、適切な発現系において、本発明の抗体を産生してもよい。用語「発現系」は、適切な条件下での（例、ベクターにより運ばれ、宿主細胞中に導入された外来ＤＮＡによりコードされるタンパク質の発現のための）宿主細胞および適合するベクターを意味する。
【００４２】
一般の発現系は、大腸菌宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳動物宿主細胞およびベクターを含む。宿主細胞の他の例は、非限定的に、原核細胞（例えば細菌など）および真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）を含む。具体的な例は、大腸菌、クルイベロマイセスまたはサッカロマイセス酵母、哺乳動物細胞株（例、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）ならびに初代または確立された哺乳動物細胞培養（例、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから産生される）を含む。例は、また、マウスＳＰ２／０−Ａｇｌ４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、「ＤＨＦＲ遺伝子」として言及する）を欠損しているＣＨＯ細胞、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２、以下、「ＹＢ２／０細胞」として言及する）などを含む。
【００４３】
本発明は、また、本発明に従った抗体を発現する組換え宿主細胞を産生する方法に関し、前記方法は以下の工程を含む：（ｉ）インビトロまたはエクスビボで、組換え核酸またはベクターを、上に記載する通りに、コンピテント宿主細胞中に導入すること、（ｉｉ）インビトロまたはエクスビボで、得られた組換え宿主細胞を培養すること、および（ｉｉｉ）場合により、前記抗体を発現および／または分泌する細胞を選択すること。そのような組換え宿主細胞を、本発明の抗体の産生のために使用することができる。
【００４４】
別の特定の実施形態において、この方法は、（ｉ）６Ｆ６Ｃ３抗体の発現を可能にするために適切した条件下でハイブリドーマ６Ｆ６Ｃ３を培養する工程；および（ｉｉ）発現された抗体を回収する工程を含む。
【００４５】
本発明の抗体は、従来の免疫グロブリン精製手段（例えばプロテインＡセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィーなど）により培養培地から適切に分離される。
【００４６】
特定の実施形態において、本発明のヒトキメラ抗体は、以前に記載された通りに、ＶＬおよびＶＨドメインをコードする核酸配列を得ること、それらを、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用の発現ベクター中に挿入することによりヒトキメラ抗体発現ベクターを構築すること、ならびに発現ベクターを動物細胞中に導入することによりコード配列を発現させることにより産生することができる。
【００４７】
ヒトキメラ抗体のＣＨドメインとして、それは、ヒト免疫グロブリンに属する任意の領域でありうるが、しかし、ＩｇＧクラスのものが適切であり、ＩｇＧクラスに属するサブクラスの任意の１つ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４など）も使用することができる。また、ヒトキメラ抗体のＣＬとして、それは、Ｉｇに属する任意の領域でありうる、および、カッパクラスまたはラムダクラスのものを使用することができる。
【００４８】
キメラ抗体を産生するための方法は、従来の組換えＤＮＡを含み、遺伝子トランスフェクション技術が、当技術分野において周知である（特許文書ＵＳ５，２０２，２３８；およびＵＳ５，２０４，２４４を参照のこと）。
【００４９】
本発明のヒト化抗体を、以前に記載された通りに、ＣＤＲドメインをコードする核酸配列を得ること、それらを、（ｉ）ヒト抗体のものと同一の重鎖定常領域および（ｉｉ）ヒト抗体のものと同一の軽鎖定常領域をコードする遺伝子を有する動物細胞用の発現ベクター中に挿入することによりヒト化抗体発現ベクターを構築すること、ならびに発現ベクターを動物細胞中に導入することにより遺伝子を発現させることにより産生してもよい。
【００５０】
ヒト化抗体発現ベクターは、抗体重鎖をコードする遺伝子および抗体軽鎖をコードする遺伝子が、別々のベクター上に存在する型または両方の遺伝子が同じベクター上に存在する型（タンデム型）のいずれかでありうる。ヒト化抗体発現ベクターの構築の簡単さ、動物細胞中への導入の簡単さ、ならびに動物細胞における抗体ＨおよびＬ鎖の発現レベル間のバランスに関して、タンデム型のヒト化抗体発現ベクターが好ましい。タンデム型のヒト化抗体発現ベクターの例は、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ  ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８などを含む。
【００５１】
従来の組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション技術に基づくヒト化抗体を産生するための方法が、当技術分野において周知である（例、Riechmann L. et al. 1988；Neuberger MS. et al. 1985を参照のこと）。抗体は、当技術分野において公知の種々の技術、例えば、ＣＤＲ移植（ＥＰ  ２３９，４００；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；および第５，５８５，０８９号）、ベニアリングまたはリサーフェイシング（ＥＰ  ５９２，１０６；ＥＰ  ５１９，５９６；Padlan EA (1991)；Studnicka GM et al. (1994)；Roguska MA. et al. (1994)）、および鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を使用してヒト化することができる。そのような抗体の調製のための一般的な組換えＤＮＡ技術も公知である（欧州特許出願ＥＰ１２５０２３および国際特許出願ＷＯ９６／０２５７６を参照のこと）。
【００５２】
本発明のＦａｂは、ＣＬＤＮ１と特異的に反応する抗体を、プロテアーゼであるパパインを用いて処理することにより得ることができる。また、Ｆａｂは、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを、原核生物発現系用のまたは真核生物発現系用のベクター中に挿入すること、および、そのベクターを、原核生物または真核生物（適切に）中に導入し、Ｆａｂを発現させることにより産生することができる。
【００５３】
本発明のＦ（ａｂ’）２は、ＣＬＤＮ１と特異的に反応する抗体を、プロテアーゼであるペプシンを用いて処理して得ることができる。また、Ｆ（ａｂ’）２は、チオエーテル結合またはジスルフィド結合を介して、以下に記載するＦａｂ’を結合することにより産生することができる。
【００５４】
本発明のＦａｂ’は、ＣＬＤＮ１と特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を、還元剤であるジチオスレイトールを用いて処理することにより得ることができる。また、Ｆａｂ’は、抗体のＦａｂ’フラグメントをコードするＤＮＡを、原核生物用の発現ベクターまたは真核生物用の発現のベクター中に挿入すること、および、そのベクターを、原核生物または真核生物（適切に）中に導入し、その発現を実施させることにより産生することができる。
【００５５】
本発明のｓｃＦｖは、以前に記載された通りに、ＶＨおよびＶＬドメインをコードするｃＤＮＡを得ること、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築すること、このＤＮＡを原核生物用の発現ベクターまたは真核生物用の発現ベクター中に挿入すること、次に、この発現ベクターを原核生物または真核生物中に導入し（適切に）、ｓｃＦｖを発現させることにより産生することができる。ヒト化ｓｃＦｖフラグメントを生成するために、ＣＤＲ移植と呼ばれる周知の技術を使用してもよく、それは、相補性決定領域（ＣＤＲ）をドナーｓｃＦｖフラグメントより選択すること、および、それらを、公知の三次元構造のヒトｓｃＦｖフラグメントフレームワーク上に移植することを含む（例、ＷＯ  ９８／４５３２２；ＷＯ  ８７／０２６７１；ＵＳ５，８５９，２０５；ＵＳ５，５８５，０８９；ＵＳ４，８１６，５６７；ＥＰ０１７３４９４を参照のこと）。
【００５６】
本明細書において記載する抗体のアミノ酸配列の改変を熟慮する。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望まれうる。ヒト化抗体が、非ヒト動物から由来する抗体のＶＨおよびＶＬ中のＣＤＲだけを、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲにおいて単に移植することにより産生される場合、抗原結合活性が、非ヒト動物から由来する本来の抗体のものとの比較において、低下することは公知である。非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのいくつかのアミノ酸残基が、ＣＤＲ中だけでなく、また、ＦＲ中でも、抗原結合活性と直接的または間接的に関連付けられることが考慮される。故に、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲから由来する異なるアミノ酸残基を用いた、これらのアミノ酸残基の置換は、結合活性を低下させうる。この問題を解決するために、ヒトＣＤＲを用いて移植された抗体において、試みが、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の内、抗体への結合に直接的に関連付けられる、または、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用する、または、抗体の三次元構造を維持する、および抗原への結合に直接的に関連付けられるアミノ酸残基を同定するために作られなければならない。低下した抗原結合活性は、同定されたアミノ酸を、非ヒト動物から由来する本来の抗体のアミノ酸残基を用いて置換することにより増加しうる。
【００５７】
改変および変化は、本発明の抗体の構造において、およびそれらをコードするＤＮＡ配列において作ってもよく、依然として、望ましい特徴を伴う抗体をコードする機能的分子を得る。
【００５８】
アミノ酸配列において変化を作る際、アミノ酸のヒドロパシー指数を考慮してもよい。タンパク質上に相互作用的な生物学的機能を付与する際のヒドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当技術分野において一般的に理解されている。アミノ酸の相対的なヒドロパシー特徴が、結果としてのタンパク質の二次構造に寄与し、それは、次に、タンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を定めることが受け入れられている。各々のアミノ酸に、それらの疎水性および電荷特徴に基づき、ヒドロパシー指数が割り当てられている。これらは以下の通りである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）  ；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００５９】
本発明のさらなる目的は、また、本発明の抗体の機能−保存的変異体を包含する。
【００６０】
「機能保存変異体」は、タンパク質または酵素中の所与のアミノ酸残基が、ポリペプチドの全体的な立体構造および機能の変化を伴わずに変化させたものであり、しかし、非限定的に、類似の性質（例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香族など）を有するアミノ酸を用いたアミノ酸の置換を含む。保存されているとして示されるアミノ酸以外のアミノ酸は、類似の機能の任意の２つのタンパク質間でのパーセントタンパク質またはアミノ酸配列類似性が変動しうるように、例えば、アライメントスキーム（例えばクラスター方法による、など）に従って決定される通りに７０%〜９９%でありうる（それにおいて類似性はＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づく）ようにタンパク質において異なりうるようにする。「機能保存変異体」は、また、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムにより決定される通り、少なくとも６０%のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも７５%、より好ましくは少なくとも８５%、さらに好ましくは少なくとも９０%、および、さらにより好ましくは少なくとも９５%を有するポリペプチドを含み、それらは、それと比較される天然または親タンパク質と同じまたは実質的に類似の特性または機能を有する。
【００６１】
２つのアミノ酸配列が、より短い配列の全長にわたり、アミノ酸の８０%より大きく、好ましくは８５%より大きく、好ましくは９０%より大きく同一である、または、９０%より大きく、好ましくは９５%より大きく類似している（機能的に同一である）場合、「実質的に相同」または「実質的に類似」である。好ましくは、類似のまたは相同な配列は、アラインメントにより、例えば、ＧＣＧ（Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin）パイルアッププログラム、または配列比較アルゴリズム（例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなど）のいずれかを使用して同定される。
【００６２】
例えば、特定のアミノ酸は、活性のかなりの損失を伴わず、タンパク質構造中の他のアミノ酸により置換されてもよい。タンパク質の相互作用能力および性質は、タンパク質の生物学的機能活性を定めるため、特定のアミノ酸置換は、タンパク質配列中で、および、もちろん、そのＤＮＡコード配列中で作ることができ、それにもかかわらず、同様の特性を伴うタンパク質を得ている。このように、種々の変化が、本発明の抗体配列、または、前記抗体をコードする対応するＤＮＡ配列中で、それらの生物学的活性のかなりの損失を伴わず、なされてもよいことが熟慮される。
【００６３】
特定のアミノ酸を、類似のヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸により置換し、依然として、類似の生物学的活性を伴うタンパク質をもたらしうる、即ち、依然として、生物学的に機能的に等価のタンパク質を得うることが、当技術分野において公知である。
【００６４】
上に概略を示す通り、アミノ酸置換は、一般的に、従って、アミノ酸側鎖置換の相対的な類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。種々の前述の特徴を考慮に入れる例示的な置換が、当業者に周知であり、アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシンを含む。
【００６５】
したがって、本発明は、また、重鎖を含む抗体を提供し、それにおいて、可変ドメインは以下を含む：
−  配列番号２として示す配列と少なくとも９０%または９５%の同一性を有するＨ−ＣＤＲ１、
−  配列番号３として示す配列と少なくとも９０%または９５%の同一性を有するＨ−ＣＤＲ２、
−  配列番号４として示す配列と少なくとも９０%または９５%の同一性を有するＨ−ＣＤＲ３、
−  配列番号６として示す配列と少なくとも９０%または９５%の同一性を有するＬ−ＣＤＲ１、
−  配列番号７として示す配列と少なくとも９０%または９５%の同一性を有するＬ−ＣＤＲ２、
−  配列番号８として示す配列と少なくとも９０%または９５%の同一性を有するＬ−ＣＤＲ３、および
−  それは、可変ドメインが、Ｈ−ＣＤＲ１についての配列番号２、Ｈ−ＣＤＲ２についての配列番号３、およびＨ−ＣＤＲ３についての配列番号４を含む重鎖ならびに可変ドメインが、Ｌ−ＣＤＲ１についての配列番号６、Ｌ−ＣＤＲ２についての配列番号７、およびＬ−ＣＤＲ３についての配列番号８を含む軽鎖を含む抗体と実質的に同じ親和性を伴い、より好ましくは、マウス抗ＣＬＤＮ１抗体６Ｆ６Ｃ３と実質的に同じ親和性を伴い、ＣＬＤＮ１に特異的に結合する。
【００６６】
前記抗体は、当技術分野において公知の任意の方法により、特異的結合についてアッセイされうる。多くの異なる競合的結合アッセイフォーマットを、エピトープビニングのために使用することができる。使用することができるイムノアッセイは、技術（例えばウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降アッセイ、ゲル拡散沈降アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、および補体結合アッセイなど）を使用した競合的アッセイ系を含むが、これらに限定されない。そのようなアッセイは、ルーチン的であり、当技術分野において周知である（例、Ausubel et al., eds, 1994 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & sons, Inc., New Yorkを参照のこと）。例えば、BIACORE（登録商標）（GE Healthcare, Piscaataway, NJ）は、モノクローナル抗体のパネルをエピトープビンするためにルーチン的に使用される種々の表面プラズモン共鳴アッセイフォーマットの１つである。加えて、ルーチン的な交差ブロッキングアッセイ（例えば、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane, 1988において記載されるものなど）を実施することができる。
【００６７】
本発明の操作された抗体は、改変が、例えば、抗体の特性を改善するために、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に作られている抗体を含む。典型的には、そのようなフレームワーク改変は、抗体の免疫原性を減少させるために作られる。例えば、１つのアプローチは、対応する生殖細胞系列配列に、１つ以上のフレームワーク残基を「復帰突然変異」させることである。より具体的には、体細胞突然変異を受けた抗体は、抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含みうる。そのような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖系列配列と比較することにより同定することができる。フレームワーク領域配列をその生殖系列構成に戻すために、体細胞変異は、例えば、部位特異的変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発により、生殖系列配列に「復帰突然変異」させることができる。そのような「復帰突然変異」抗体も、本発明により包含されることが意図される。別の型のフレームワーク改変は、フレームワーク領域内、または、さらに、１つ以上のＣＤＲ領域内の１つ以上の残基を変異させることを含み、Ｔ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の潜在的な免疫原性を低下させる。このアプローチは、「脱免疫化」としても言及され、Carr et al.による米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号においてさらに詳細に記載されている。
【００６８】
フレームワーク領域またはＣＤＲ領域内で作られる改変に加え、またはその代わりに、本発明の抗体は、Ｆｃ領域内に修飾を含むように操作し、典型的には、抗体の１つ以上の機能的特性（例えば血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存性細胞傷害性など）を変化させてもよい。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾することができる（例えば、１つ以上の化学的部分を抗体に結合させることができる）、または、再び、そのグリコシル化を改変するように修飾し、抗体の１つ以上の機能的特性を変化させることができる。これらの実施形態の各々が、以下にさらに詳細に記載されている。Ｆｃ領域中の残基のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスのナンバリングである。
【００６９】
一実施形態において、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変わる（例、増加または減少する）ように修飾される。このアプローチは、Bodmer et al.による米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数を変化させ、例えば、軽鎖および重鎖の組み立てを促進させる、または抗体の安定性を増加もしくは減少させる。
【００７０】
別の実施形態において、抗体のＦｃヒンジ領域を変異させ、抗体の生物学的半減期を減少させる。より具体的には、１つ以上のアミノ酸変異が、抗体が天然ＦｃヒンジドメインＳｐＡ結合と比べ、損なわれたブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）結合を有するように、ＦｃヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域中に導入される。このアプローチは、Ward et al.による米国特許第６，１６５，７４５号にさらに詳細に記載されている。
【００７１】
別の実施形態において、抗体を改変させ、その生物学的半減期を増加させる。種々のアプローチが可能である。例えば、以下の変異の１つ以上を導入することができる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ（Wardによる米国特許第６，２７７，３７５号に記載される通り）。あるいは、生物学的半減期を増加させるために、抗体を、ＣＨ１またはＣＬ領域内で変化させ、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取られたサルベージ受容体結合エピトープを含むことができる（Presta et al.による米国特許第５，８６９，０４６号および第６，１２１  ，０２２号に記載する通り）。
【００７２】
さらに他の実施形態において、Ｆｃ領域を、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置換することにより変化させ、抗体のエフェクター機能を変化させる。例えば、１つ以上のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置換することができ、抗体が、エフェクターリガンドについて変化させた親和性を有するが、しかし、親抗体の抗原結合能力を保持するようにする。親和性を変化させたエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であることができる。このアプローチは、米国特許第５，６２４，８２１号および第５，６４８，２６０号（両方がWinter et al.による）にさらに詳細に記載されている。
【００７３】
別の実施形態において、アミノ酸残基より選択される１つ以上のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置換することができ、抗体が、変化したＣ１ｑ結合および／または低下もしくは消失した補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を有するようにする。このアプローチは、ldusogie et al.による米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳細に記載されている。
【００７４】
別の実施形態において、１つ以上のアミノ酸残基を変化させ、それにより、補体を固定する抗体の能力を変化させる。このアプローチは、Bodmer et al.によるＰＣＴ公開ＷＯ  ９４／２９３５１にさらに記載されている。
【００７５】
さらに別の実施形態において、Ｆｃ領域を、１つ以上のアミノ酸を改変することにより改変させ、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する、および／またはＦｃ受容体についての抗体の親和性を増加させる抗体の能力を増加させる。このアプローチは、ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開ＷＯ  ００／４２０７２にさらに記載されている。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃＲｎについてのヒトＩｇＧＩ上の結合部位がマッピングされ、改善された結合を伴う変異体が記載されている（Shields, R. L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604，ＷＯ  ２０１０１０６１８０を参照のこと）。
【００７６】
さらに別の実施形態において、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、非グリコシル化抗体を作ることができる（即ち、抗体はグリコシル化を欠く）。グリコシル化を変化させ、例えば、抗原についての抗体の親和性を増加させることができる。そのような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つ以上の部位を変化させることにより達成することができる。例えば、１つ以上のアミノ酸置換を作り、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除をもたらし、それにより、その部位でのグリコシル化を排除することができる。そのような非グリコシル化は、抗原についての抗体の親和性を増加させることができる。そのようなアプローチは、Co et al.による米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号にさらに詳細に記載されている。
【００７７】
加えて、または、あるいは、変化した型のグリコシル化を有する抗体を作ることができる（例えば、低下量もしくは無フコシル残基を有する低フコシル化もしくは非フコシル化抗体、または、増加した二等分ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体など）。そのような変化させたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが実証されている。そのような炭水化物修飾は、例えば、変化させたグリコシル化機構を伴う宿主細胞中で抗体を発現させることにより達成することができる。変化させたグリコシル化機構を伴う細胞が、当技術分野において記載されており、本発明の組換え抗体を発現させる宿主細胞として使用し、それにより、変化させたグリコシル化を伴う抗体を産生することができる。例えば、Hang et al.によるＥＰ  １，１７６，１９５には、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を伴う細胞株が記載されており、それはフコシルトランスフェラーゼをコードし、そのような細胞株において発現された抗体は、低フコシル化を示すか、フコシル残基を欠いている。従って、一実施形態において、本発明の抗体は、低フコシル化または非フコシル化パターンを示す細胞株（例えば、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子の欠損発現を伴う哺乳動物細胞株）における組換え発現により産生することができる。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開ＷＯ  ０３／０３５８３５には、変異体ＣＨＯ細胞株Ｌｅｃｌ３細胞（フコースをＡｓｎ（２９７）連結炭水化物に付着させる能力が低下し、その宿主細胞中で発現される抗体の低フコシル化ももたらす）が記載されている（また、Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740を参照のこと）。ＵｍａｎａらによるＰＣＴ公開ＷＯ  ９９／５４３４２には、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ（例、ベータ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧＩＩＩ））を発現するように操作された細胞株が記載されており、操作された細胞株で発現された抗体は、抗体の増加したＡＤＣＣ活性をもたらす、増加した二等分ＧｌｃＮａｃ構造を示す（また、Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180を参照のこと）。ユーレカ治療薬は、さらに、フコシル残基を欠く、変化された哺乳動物グリコシル化パターンを伴う抗体を産生することが可能である、遺伝的に操作されたＣＨＯ哺乳動物細胞を記載する。あるいは、本発明の抗体は、哺乳動物様グリコシル化パターンについて操作され、グリコシル化パターンとしてフコースを欠く抗体を産生することが可能である酵母または糸状菌において産生することができる（例えば、ＥＰ１２９７１７２Ｂ１を参照のこと）。
【００７８】
本発明により熟慮される、本明細書における抗体の別の修飾は、ペグ化である。抗体をペグ化し、例えば、抗体の生物学的（例、血清中）半減期を増加させることができる。抗体をペグ化するために、抗体またはそのフラグメントは、１つ以上のＰＥＧ基が、抗体または抗体フラグメントに付着する条件下で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えばＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体など）と反応させる。ＰＥＧ化は、アシル化反応または反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアルキル化反応により行うことができる。本明細書において使用する通り、用語「ポリエチレングリコール」は、他のタンパク質を誘導体化するために使用されてきたＰＥＧの任意の形態（モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシまたはアリールオキシポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコールマレイミドなど）を包含することを意図する。特定の実施形態において、ペグ化される抗体は、アグリコシル化抗体である。タンパク質をＰＥＧ化するための方法は、当技術分野において公知であり、本発明の抗体に適用することができる。例えば、ＥＰ  Ｏ  １５４  ３１６（Nishimura et al.による）およびＥＰ  ０  ４０１  ３８４（Ishikawa et al.による）を参照のこと。
【００７９】
本発明により熟慮される抗体の別の修飾は、コンジュゲート、または本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域の、血清タンパク質（例えば、結果として得られる分子の半減期を増加させるヒト血清アルブミンまたはそのフラグメントなど）へのタンパク質融合体である。そのようなアプローチは、例えば、Ballance et al., ＥＰ０３２２０９４において記載されている。
【００８０】
別の可能性は、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域の、血清タンパク質（例えば、結果として得られる分子の半減期を増加させるためのヒト血清アルブミンなど）に結合することが可能であるタンパク質への融合である。そのようなアプローチは、例えば、Nygren et al.，ＥＰ  ０  ４８６  ５２５に記載されている。
【００８１】
イムノコンジュゲート：
【００８２】
本発明の抗体は、検出可能な標識とコンジュゲートさせ、抗ＣＬＤＮ１イムノコンジュゲートを形成することができる。適切な検出可能な標識は、例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生物発光標識、またはコロイド金を含む。そのような検出可能に標識されたイムノコンジュゲートを作製および検出する方法は、当業者に周知であり、以下により詳細に記載されている。
【００８３】
検出可能な標識は、オートラジオグラフィーにより検出される放射性同位体でありうる。本発明の目的のために特に有用である同位体は、３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、および１４Ｃである。
【００８４】
抗ＣＬＤＮ１イムノコンジュゲートは、また、蛍光化合物を用いて標識することができる。蛍光標識された抗体の存在は、適当な波長の光にイムノコンジュゲートを曝露し、得られた蛍光を検出することにより決定される。蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、およびフルオレサミンを含む。
【００８５】
あるいは、抗ＣＬＤＮ１イムノコンジュゲートは、抗体を化学発光化合物に共役することにより、検出可能に標識することができる。化学発光タグ付きイムノコンジュゲートの存在は、化学反応の過程の間に生じる発光の存在を検出することにより決定される。化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルを含む。
【００８６】
同様に、生物発光化合物を使用し、本発明の抗ＣＬＤＮ１イムノコンジュゲートを標識することができる。生物発光は、触媒タンパク質によって、化学発光反応の効率が増加する生物系において見出される化学発光の型である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより決定される。標識のために有用な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンを含む。
【００８７】
あるいは、抗ＣＬＤＮ１イムノコンジュゲートは、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体を酵素に連結することにより、検出可能に標識することができる。抗ＣＬＤＮ１−酵素コンジュゲートを、適当な基質の存在においてインキュベートする場合、酵素部分は、基質と反応し、例えば、分光光度計、蛍光光度計または視覚的手段により検出することができる化学部分を産生する。多重特異性イムノコンジュゲートを検出可能に標識するために使用することができる酵素の例は、βガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼを含む。
【００８８】
当業者は、本発明に従って用いることができる他の適切な標識を知っているであろう。マーカー部分の、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体への結合は、当技術分野で公知の標準的な技術を使用して達成することができる。
【００８９】
さらに、免疫化学的検出の利便性および汎用性は、アビジン、ストレプトアビジン、およびビオチンとコンジュゲートされている抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体を使用することにより増強させることができる。
【００９０】
別の態様において、本発明は、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体−薬物コンジュゲートを提供する。本明細書において使用する「抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体−薬物コンジュゲート」は、治療的薬剤にコンジュゲートされた、本発明の抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体を指す。そのような抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体−薬物コンジュゲートは、被験者、例えば、ＣＬＤＮ１発現癌を伴う被験者に投与した場合、典型的には、単独で、しかし、また、他の治療的薬剤と組み合わせて投与した場合、ＣＬＤＮ１発現細胞に対して臨床的に有益な効果を産生する。
【００９１】
典型的な実施形態において、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体は、細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされ、結果として得られた抗体−薬物コンジュゲートが、細胞により取り込まれた、または内在化された場合、ＣＬＤＮ１発現細胞（例、ＣＬＤＮ１発現癌細胞）に対して細胞傷害性または細胞分裂阻害効果を発揮するようにする。抗体へのコンジュゲーションのための特に適切な部分は、化学療法的薬剤、プロドラッグ変換酵素、放射性同位元素もしくは化合物、または毒素である。例えば、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体は、細胞傷害性薬剤、例えば化学療法的薬剤または毒素（例、細胞分裂阻害剤または細胞破壊剤、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素など）などにコンジュゲートされることができる。
【００９２】
細胞傷害性薬剤の有用なクラスは、例えば、抗チューブリン薬剤、アウリスタチン、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化薬剤（例、白金錯体、例えばシスプラチン、モノ（白金）、ビス（白金）および三核白金錯体など、ならびにカルボプラチン）、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸剤、代謝拮抗剤、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール、前形成化合物、プリン代謝拮抗剤、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどを含む。
【００９３】
個々の細胞毒性剤は、例えば、アンドロゲン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、アスパラギナーゼ、５アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ＣＣ−１０６５（Li et al., Cancer Res. 42:999-1004, 1982）、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シチジンアラビノシド、サイトカラシンＢ、ダカルバジン、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ダウノルビシン、デカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エストロゲン、５フルオロデオキシウリジン（５−ｆｌｕｏｒｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）、エトポシドリン酸塩（ＶＰ−１６）、５フルオロウラシル、グラミシジンＤ、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン、メルファラン、６メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂｉｚｉｎｅ）、ストレプトゾトシン、テノポシド（ＶＭ−２６）、６チオグアニン、チオテパ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンを含む。
【００９４】
特に適切な細胞傷害性薬剤は、例えば、ドラスタチン（例、アウリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ）、ＤＮＡ副溝結合剤（例、エンジインおよびレキシトロプシン）、デュオカルマイシン、タキサン（例、パクリタキセルおよびドセタキセル）、ピューロマイシン、ビンカアルカロイド、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン）、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、エキノマイシン、コンブレタスタチン、ネトロプシン、エポチロンＡおよびＢ、エストラムスチン、クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）、セマドチン、メイタンシノイド、ディスコデルモライド、エリュテロビン、およびミトキサントロンを含む。
【００９５】
特定の実施形態において、細胞傷害性薬剤は、従来の化学療法剤、例えば、ドキソルビシン、パクリタキセル、メルファラン、ビンカアルカロイド、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、またはエトポシドなどである。また、強力な薬剤（例えばＣＣ−１０６５アナログ、カリケアマイシン、メイタンシン、ドラスタチン１０のアナログ、リゾキシン、およびパリトキシンなど）は、抗ＣＬＤＮ１発現抗体に連結することができる。
【００９６】
特定のバリエーションにおいて、細胞傷害性または細胞分裂停止薬剤は、アウリスタチンＥ（また、当技術分野においてドラスタチン１０として公知である）またはその誘導体である。典型的には、アウリスタチンＥ誘導体は、例えば、アウリスタチンＥとケト酸との間に形成されるエステルである。例えば、アウリスタチンＥは、パラアセチル安息香酸またはベンゾイル吉草酸と反応し、それぞれＡＥＢおよびＡＥＶＢを産生することができる。他の典型的なアウリスタチン誘導体は、ＡＦＰ（ジメチルバリン−バリン−ドライソロイシン−ドラプロリン−フェニルアラニン−ｐ−フェニレンジアミン）、ＭＭＡＦ（ドバリン−バリン−ドライソロイシン−ドラプロリン−フェニルアラニン）、およびＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ）を含む。アウリスタチンＥおよびその誘導体の合成および構造は、米国特許出願公開第２００３００８３２６３号；国際特許公開ＷＯ２００２／０８８１７２およびＷＯ  ２００４／０１０９５７；および米国特許第６，８８４，８６９号；第６，３２３，３１５号；第６，２３９，１０４号；第６，０３４，０６５号；第５，７８０，５８８号；第５，６６５，８６０号；第５，６６３，１４９号；第５，６３５，４８３号；第５，５９９，９０２号；第５，５５４，７２５号；第５，５３０，０９７号；第５，５２１，２８４号；第５，５０４，１９１号；第５，４１０，０２４号；第５，１３８，０３６号；第５，０７６，９７３号；第４，９８６，９８８号；第４，９７８，７４４号；第４，８７９，２７８号；第４，８１６，４４４号；および第４，４８６，４１４号に記載されている。
【００９７】
他のバリエーションにおいて、細胞傷害性薬剤はＤＮＡ副溝結合薬剤である（例、米国特許第６，１３０，２３７号を参照のこと）。例えば、特定の実施形態において、副溝結合薬剤はＣＢＩ化合物である。他の実施形態において、副溝結合薬剤はエンジイン（例、カリケアマイシン）である。
【００９８】
特定の実施形態において、抗体−薬物コンジュゲートは、抗チューブリン薬剤を含む。抗チューブリン薬剤の例は、例えば、タキサン（例、タキソール（登録商標）（パクリタキセル）、タキソテール（登録商標）（ドセタキセル））、Ｔ６７（Ｔｕｌａｒｉｋ）、ビンカアルキロイド（ｖｉｎｃａ  ａｌｋｙｌｏｉｄ）（例、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビン）、およびドラスタチン（例、アウリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ）を含む。他の抗チューブリン薬剤は、例えば、バッカチン誘導体、タキサンアナログ（例、エポチロンＡおよびＢ）、ノコダゾール、コルヒチンおよびコルセミド（ｃｏｌｃｉｍｉｄ）、エストラムスチン、クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）、セマドチン、メイタンシノイド、コンブレタスタチン、ディスコデルモライド、ならびにエリュテロビンを含む。一部の実施形態において、細胞傷害性薬剤は、メイタンシノイド、抗チューブリン薬剤の別の群である。例えば、特定の実施形態において、メイタンシノイドは、メイタンシンまたはＤＭ−１である（ImmunoGen, Inc.；また、Chari et al., 1992, Cancer Res. 52: 127-131を参照のこと）。
【００９９】
他の実施形態において、細胞傷害性薬剤は、代謝拮抗剤である。代謝拮抗剤は、例えば、プリンアンタゴニスト（例、アザチオプリン（ａｚｏｔｈｉｏｐｒｉｎｅ）またはミコフェノール酸モフェチル）、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤（例、メトトレキサート）、アシクロビル、ガンシクロビル（ｇａｎｇｃｙｃｌｏｖｉｒ）、ジドブジン、ビダラビン、リバビリン（ｒｉｂａｖａｒｉｎ）、アジドチミジン、シチジンアラビノシド、アマンタジン、ジデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、ホスカルネット（ｐｏｓｃａｒｎｅｔ）、またはトリフルリジンでありうる。
【０１００】
他の実施形態において、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体は、プロドラッグ変換酵素にコンジュゲートされる。プロドラッグ変換酵素は、公知の方法を使用し、抗体に組み換え的に融合させる、または化学的にそれにコンジュゲートすることができる。例示的なプロドラッグ変換酵素は、カルボキシペプチダーゼＧ２、βグルクロニダーゼ、ペニシリンＶアミダーゼ、ペニシリンＧアミダーゼ、βラクタマーゼ、βグルコシダーゼ、ニトロレダクターゼ、およびカルボキシペプチダーゼＡである。
【０１０１】
分子を抗体にコンジュゲートするための技術は、当技術分野において周知である（例、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy（Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985）；Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery,” in Controlled Drug Delivery（Robinson et al. eds., Marcel Deiker, Inc., 2nd ed. 1987）；Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,” in Monoclonal Antibodies ‘84: Biological And Clinical Applications（Pinchera et al. eds., 1985）；“Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy（Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985）；およびThorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照のこと。また、ＰＣＴ公開ＷＯ  ８９／１２６２４．を参照のこと）。典型的には、核酸分子は、Ｎヒドロキシスクシンイミドエステルまたはマレイミド官能基をそれぞれ通じて、抗体上のリジンまたはシステインに共有結合的に付着される。操作されたシステインを使用したコンジュゲーションまたは非天然アミノ酸の取り込みの方法が、コンジュゲートの均一性を改善することが報告されている（Axup,J.Y., Bajjuri, K.M., Ritland, M., Hutchins, B.M., Kim, C.H., Kazane, S.A., Halder, R., Forsyth, J.S., Santidrian, A.F., Stafin, K., et al. (2012). Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 16101-16106.; Junutula, J.R., Flagella, K.M., Graham, R.A., Parsons, K.L., Ha, E., Raab, H., Bhakta, S., Nguyen, T., Dugger, D.L., Li, G., et al.(2010).Engineered thio-trastuzumab-DM1 conjugate with an improved therapeutic index to target humanepidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer. Clin. Cancer Res.16, 4769-4778.）。Junutula et al. (2008)は、従来のコンジュゲーション方法と比較し、改善された治療指数を呈することが要求される「ＴＨＩＯＭＡＢ」（ＴＤＣ）と呼ばれるシステインベースの部位特異的コンジュゲーションを開発した。抗体中に取り込まれた非天然アミノ酸へのコンジュゲーションも、ＡＤＣについて探索されている；しかし、このアプローチの一般性は、まだ確立されていない（Axup et al., 2012）。特に、当業者は、また、ポリペプチド操作（例、ポリペプチド上でのアミノ酸欠失、挿入、置換、または変異を介して）により反応性に作製されたアシル供与体グルタミン含有タグ（例、Ｇｉｎ含有ペプチドタグまたはＱタグ）または内因性グルタミンを用いて操作されたＦｃ含有ポリペプチドも予想することができる。次に、トランスグルタミナーゼは、アミン供与体薬剤（例、反応性アミンを含む、またはそれに付着された小分子）を用いて、共有結合的に架橋し、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートの安定で均一な集団を形成することができ、アミン供与体薬剤は、アシル供与体グルタミン含有タグまたは接近可能な／曝露された／反応性の内因性グルタミンを通じてＦｃ含有ポリペプチドに部位特異的にコンジュゲートされている（ＷＯ  ２０１２０５９８８２）。抗体をコンジュゲートするための他の方法も、ＷＯ／２０１３／０９２９９８およびＷＯ２０１３０９２９８３に記載されている。
【０１０２】
診断的使用：
【０１０３】
本発明のさらなる目的は、疾患、特にＣＬＤＮ１レベルが改変（増加または減少）される疾患を診断および／またはモニタリングするための、本発明の抗ＣＬＤＮ１抗体に関する。典型的には、疾患は、癌、特に結腸直腸癌である。
【０１０４】
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、検出可能な分子または物質（例えば蛍光分子、放射性分子、または上に記載する当技術分野において公知の任意の他の標識など）を用いて標識することができる。例えば、本発明の抗体は、当技術分野において公知の任意の方法により、放射性分子を用いて標識することができる。例えば、放射性分子は、シンチグラフィー試験用の放射性原子（例えばＩ１２３、Ｉ１２４、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８など）を含むが、これらに限定されない。本発明の抗体は、また、核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴映像、ＭＲＩとしても公知）のためのスピン標識（例えばヨウ素１２３、ヨウ素１３１、インジウムＩｌｌ、フッ素１９、炭素１３、窒素１５、酸素１７、ガドリニウム、マンガン、または鉄など）を用いて標識することができる。抗体の投与後、患者内での抗体の分布を検出する。任意の特定の標識の分布を検出するための方法が、当業者に公知であり、任意の適当な方法を使用することができる。一部の非限定的な例は、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、蛍光、化学発光、および超音波検査を含む。
【０１０５】
本発明の抗体は、ＣＬＤＮ１  過剰発現に関連付けられる癌の診断およびステージ分類のために（例、放射性イメージングにおいて）有用でありうる。ＣＬＤＮ１  過剰発現に関連付けられる癌疾患は、典型的には、結腸直腸癌、婦人科癌（Szabo et al., 2009）、卵巣癌（English and Santin 2013）、子宮頸部新生物（Sobel, 2005）、メラノーマ（Leotlela et al., 2007）、いくつかの扁平上皮癌（ＳＣＣ）、例えば口腔ＳＣＣ（Dos Reis et al., 2008）、下唇ＳＣＣ（de Aquino, 2012）、頭頸部、皮膚ＳＣＣ（Ouban, 2012）、扁桃ＳＣＣ（Kondoh, 2011）、胃腺癌（Wu et al., 2008, Resnick, 2005)）、甲状腺癌（Nemeth et al., 2010）、乳癌（Myal et al., 2010）、松果体領域の神経上皮乳頭腫（ＰＴＰＲ）（Montange 2012）、明細胞腎細胞癌（Shin et al., 2011）、唾液腺の粘表皮癌（ＭＥＣ）（Aro, 2011）、上咽頭癌（Hsueh 2010）、上部尿路の尿路上皮癌（Nakanishi, 2008）、食道癌（Takala, 2007）、中皮腫、胸膜転移性腺癌（Soini, 2006）、一部の膵臓腫瘍（Tsukahara, 2005）、転移性前立腺癌（Szasz et al., 2009）、肺腺癌（Chao et al., 2009）、乳癌（Lu et al., 2012）を含むが、これらに限定されない。また、増加したＣＬＤＮ１発現が、潰瘍性大腸炎関連腫瘍（ＵＣ）（Kinugasa et al., 2010）における、および炎症性腸疾患関連新生物（Weber CR）における形質転換の初期段階に含まれうることが推測されている。ＣＬＤＮ１タンパク質は、従って、これらの患者のサーベイランスのための良好な候補となりうる。
【０１０６】
本発明の抗体は、ＣＬＤＮ１発現が増加または減少した（可溶性または細胞ＣＬＤＮ１の形態）癌以外の疾患を診断するために有用でありうる。
【０１０７】
典型的には、前記の診断方法は、患者から得た生物学的サンプルの使用を含む。本明細書において使用する通り、「生物学的サンプル」は、被験者から得られた種々のサンプルの型を包含し、診断またはモニタリングアッセイにおいて使用することができる。生物学的サンプルは、血液および生物学的由来の他の液体サンプル、固体組織サンプル、例えば生検標本または組織培養物またはそれから由来する細胞、およびその子孫などを含むが、これらに限定されない。例えば、生物学的サンプルは、ＣＬＤＮ１過剰発現に関連付けられる癌疾患、好ましい実施形態において、結腸直腸癌を有する疑いのある個体から回収された組織サンプルから得られた細胞を含む。従って、生物学的サンプルは、臨床サンプル、培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的液体、および組織サンプルを包含する。
【０１０８】
特定の実施形態において、本発明は、本発明の抗体を使用して被験者からの細胞上でＣＬＤＮ１を検出することにより、被験者におけるＣＬＤＮ１過剰発現に関連付けられる癌疾患を診断する方法である。特に、前記の診断方法は、（ａ）ＣＬＤＮ１過剰発現に関連付けられる癌疾患に罹患する可能性が高い被験者の生物学的サンプルを、本発明に従った抗体と、この抗体が、ＣＬＤＮ１を発現する生物学的サンプルの細胞と複合体を形成するための十分な条件において接触させること；および（ｂ）前記複合体を検出および／または定量化すること（それにより、前記複合体の検出は、ＣＬＤＮ１過剰発現に関連付けられる癌疾患を示す）からなる工程を含みうる。
【０１０９】
癌疾患をモニターするために、本発明に従った診断方法を、異なる時間間隔で反復してもよく、サンプルへの抗体結合が増加または減少するかを決定し、それにより、癌疾患が、進行または退縮するかを決定する。
【０１１０】
典型的には、抗体は、免疫組織化学（ＩＨＣ）方法において使用してもよい。ＩＨＣは、具体的には、ｉｎ  ｓｉｔｕでサンプルまたは組織サンプル中の標的を検出する方法を提供する。サンプルの全体的な細胞の完全性が、ＩＨＣにおいて維持され、このように、目的の標的（例、ＣＬＤＮ１）の存在および位置の両方の検出を可能にする。典型的には、サンプルを、ホルマリンを用いて固定し、パラフィン中に包埋し、染色および光学顕微鏡によるその後の検査のために切片に切断した。現在のＩＨＣの方法では、直接的な標識または二次抗体ベースもしくはハプテンベースの標識のいずれかを使用する。公知のＩＨＣシステムの例は、例えば、EnVision（商標）（DakoCytomation）、Powervision（登録商標）（Immunovision, Springdale, AZ）、NBA（商標）キット（Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA）、HistoFine（登録商標）（Nichirei Corp, Tokyo, Japan）を含む。特定の実施形態において、組織切片（例、卵丘細胞を含むサンプル）は、抗ＣＬＤＮ１抗体とのインキュベーション後、スライドまたは他の支持体に乗せてもよい。次に、適切な固体支持体上に乗せられたサンプル中の微視的な検査を実施してもよい。顕微鏡写真の産生のために、サンプルを含む切片を、選択的な染色ＣＬＤＮ１により強調するために、スライドガラスまたは他の平面状の支持体に乗せてもよい。従って、ＩＨＣサンプルは、例えば（ａ）卵丘細胞を含む調製物、（ｂ）固定し、包埋された前記細胞、および（ｃ）前記細胞サンプル中でＣＬＤＮ１を検出することを含みうる。一部の実施形態において、ＩＨＣ染色手順は、組織を切断およびトリミングすること、固定、脱水、パラフィン浸透、薄い切片への切断、ガラススライド上に乗せること、ベーキング、脱パラフィン、再水和、抗原回収、ブロッキング工程、一次抗体（即ち、抗ＣＬＤＮ１抗体）を適用すること、洗浄、二次抗体（場合により、適切な検出可能な標識に共役されている）を適用すること、洗浄、対比染色、および顕微鏡検査などの工程を含みうる。
【０１１１】
治療的使用：
【０１１２】
本発明の抗体、フラグメント、またはイムノコンジュゲートは、ＣＬＤＮ１発現に関連付けられる任意の疾患を処置するために有用でありうる。本発明の抗体は、単独で、または任意の適切な薬剤との組み合わせにおいて使用されうる。
【０１１３】
一実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ１抗体（またはそれを含むイムノコンジュゲート）は、癌、特に結腸直腸癌の処置のために使用されうる。ＣＬＤＮ１  過剰発現に関連付けられる癌疾患は、典型的には、結腸直腸癌、婦人科癌（Szabo et al., 2009）、卵巣癌（English and Santin 2013）、子宮頸部新生物（Sobel, 2005）、メラノーマ（Leotlela et al., 2007）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、例えば口腔ＳＣＣ（Dos Reis et al., 2008）、下唇ＳＣＣ（de Aquino, 2012）、頭頸部、皮膚ＳＣＣ（Ouban, 2012）、扁桃ＳＣＣ（Kondoh, 2011）など、胃腺癌（Wu et al., 2008, Resnick, 2005)）、甲状腺癌（Nemeth et al., 2010）、乳癌（Myal et al., 2010）、松果体領域の神経上皮乳頭腫（ＰＴＰＲ）（Montange 2012）、明細胞腎細胞癌（Shin et al., 2011）、唾液腺の粘表皮癌（ＭＥＣ）（Aro, 2011）、上咽頭癌（Hsueh 2010）、上部尿路の尿路上皮癌（Nakanishi, 2008）、食道癌（Takala, 2007）、中皮腫、胸膜転移性腺癌（Soini, 2006）、一部の膵臓腫瘍（Tsukahara, 2005）を含むが、これらに限定されない。
【０１１４】
治療用モノクローナル抗体が抗体により特異的に認識される抗原を持つ細胞の枯渇に導きうることが周知である。この枯渇は、少なくとも３つの機構を通じて媒介されうる：抗体媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性溶解、および抗体により標的化された抗原を介して与えられるシグナルを通じた腫瘍成長の直接的な抗腫瘍阻害。「補体依存性細胞傷害性」または「ＣＤＣ」は、補体の存在における標的細胞の溶解を指す。古典的な補体経路の活性化は、同族抗原に結合した抗体への補体系の第１成分の結合により開始される。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイ（例、Gazzano-Santoro et al. (1997)に記載される通り）を実施してもよい。「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」または「ＡＤＣＣ」は、細胞傷害性の形態を指し、それにおいて、特定の細胞傷害性細胞（例、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、単球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上に結合した分泌抗体によって、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が、抗原を持つ標的細胞に特異的に結合し、その後に標的細胞を殺すことが可能になる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、インビトロＡＤＣＣアッセイ（例えば米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されるものなど）を実施してもよい。
【０１１５】
本発明の抗クローディン１抗体は、また、ＨＣＶ感染を処置および／または防止するための治療的および予防的方法において使用されうる。抗クローディン１抗体は、細胞表面上のクローディン１の細胞外ドメインに結合することにより、ＨＣＶ宿主細胞の相互作用に干渉し、それにより、細胞中へのＨＣＶ進入および／または細胞のＨＣＶ感染を低下、阻害、遮断、または防止する（ＷＯ２０１００３４８１２）。本発明の抗体を、種々の治療的または予防的方法において使用してもよい。特に、本発明は、肝臓疾患または病理を被験者において処置または防止するための方法を提供し、それは被験者に有効量の本発明の抗体を投与することを含み、それはＨＣＶが被験者の細胞に侵入または感染することを阻害し、それにより肝臓疾患または病理を被験者において処置または防止するようにする。肝臓疾患または病理は、ＨＣＶ感染に関連付けられる肝臓の炎症、肝線維症、肝硬変、および／または肝細胞癌（即ち、肝臓癌）でありうる。本発明は、また、ＨＣＶ関連疾患または状態（肝臓疾患を含む）を被験者において処置または防止するための方法を提供し、それは被験者に有効量の本発明の抗体を投与することを含み、それはＨＣＶが被験者の細胞に侵入または感染することを阻害し、それによりＨＣＶ関連疾患または状態を被験者において処置または防止するようにする。本発明の特定の実施形態において、抗体または組成物を、急性Ｃ型肝炎と診断された被験者に投与する。本発明の他の実施形態において、抗体または組成物を、慢性Ｃ型肝炎と診断された被験者に投与する。一実施形態において、本発明の方法を使用して、肝臓移植の結果として被験者の感受性細胞がＨＣＶに感染する可能性を低下させてもよい。既に上で述べた通り、罹患肝臓がＨＣＶ感染患者から除去された場合、血清ウイルスレベルが急落する。しかし、健康な肝臓移植片を受けた後、ウイルスレベルがリバウンドし、数日以内に移植前レベルを上回りうる。肝臓移植患者は、肝細胞の表面上でクローディン１の外部ドメインに結合する本発明の抗体の投与から利点を得て、それにより細胞中へのＨＣＶ侵入を低下、阻害、遮断、または防止しうる。投与は、肝臓移植前、肝臓移植の間、および／または肝臓移植後に実施してもよい。
【０１１６】
本明細書において記載する処置方法の実施形態の各々において、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体または抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体−薬物コンジュゲートは、処置が求められる疾患または障害の管理に関連付けられる従来の方法論と一致する様式で送達される。本明細書における開示に従い、抗体または抗体−薬物コンジュゲートの有効量は、疾患または障害を防止または処置するために十分な時間および条件下で、そのような処置を必要とする被験者に投与される。
【０１１７】
このように、本発明の目的は、本発明の抗体、フラグメント、またはイムノコンジュゲートの治療的な有効量を用いて、それを必要とする被験者に投与することを含む、ＣＬＤＮ１の発現に関連付けられる疾患を処置するための方法に関する。
【０１１８】
本明細書において使用する通り、用語「処置する」または「処置」は、そのような用語が適用される障害または状態、あるいはそのような障害または状態の１つ以上の症状の進行を逆転、緩和、阻害する、または防止することを意味する。
【０１１９】
本発明に従い、用語「患者」または「それを必要とする患者」は、ＣＬＤＮ１の過剰発現に関連付けられる疾患に罹患した、または罹患する可能性が高いヒトについて意図される。
【０１２０】
本発明の抗体の「治療的に効果的な量」により、任意の医学的処置に適用可能な合理的な利益／リスク比で前記癌を処置するための十分な量の抗体を意味する。しかし、本発明の抗体および組成物の毎日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医により決められることが理解されるであろう。任意の特定の患者についての特定の治療的に効果的な用量レベルは、以下を含む種々の因子に依存する：処置されている障害および障害の重症度；用いられる特定の抗体の活性；用いられる特定の組成物、患者の年齢、体重、一般健康、性別、および食事；投与の時間、投与の経路、および用いられる特定の抗体の排泄の速度；処置の持続時間；用いられる特定の抗体との組み合わせでまたはそれと同時に使用される薬物；および医学的技術分野において周知の同様の因子。例えば、所望の治療的効果を達成するために、および、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させるために要求されるものよりも低いレベルで化合物の用量を開始することは、当業者の技術内で周知である。
【０１２１】
特定の実施形態において、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体または抗体−薬物コンジュゲートは、疾患または障害の処置のための第２の薬剤との組み合わせにおいて使用される。癌を処置するために使用される場合、本発明の抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体または抗体−薬剤コンジュゲートは、従来の癌治療（例えば外科手術、放射線療法、化学療法、またはこれらの組み合わせなど）との組み合わせにおいて使用されうる。特定の態様において、本発明に従った抗ＣＬＤＮ１抗体または抗体−薬物コンジュゲートとの併用癌治療のために有用な他の治療的薬剤は、抗血管新生剤を含む。一部の態様において、本発明に従った抗体または抗体−薬物コンジュゲートは、サイトカイン（例、腫瘍に対する免疫応答を刺激するサイトカイン）と同時投与される。一部の実施形態において、本明細書において記載する抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体または抗体−薬物コンジュゲートは、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）との組み合わせにおいて使用される。一部の実施形態において、本明細書において記載する抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体または抗体−薬物コンジュゲートは、別の治療的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）との組み合わせにおいて使用される。トラスツズマブ（Herceptin, Roche）、ベバシズマブ（Avastin, Roche）、およびセツキシマブ（Erbitux, Merck）が、承認されている３つのそのようなｍＡｂである。他のｍＡｂは、インフリキシマブ（Remicade, Johnson&Johnson）、リツキシマブ（Rituxan, Roche）、アダリムマブ（Humira, Abbott）、およびナタリズマブ（Tysabri, Biogen）を含むが、これらに限定されない。
【０１２２】
医薬的組成物：
【０１２３】
投与のために、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体または抗体−薬物コンジュゲートは、医薬的組成物として製剤化される。抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体または抗体−薬物コンジュゲートを含む医薬的組成物は、医薬的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って製剤化することができ、それにより、治療的分子が、混合物中で、医薬的に許容可能な担体と組み合わされる。組成物は、その投与がレシピエント患者により耐容される場合、「医薬的に許容可能な担体」であると言われる。無菌リン酸緩衝生理食塩水は、医薬的に許容可能な担体の一例である。他の適切な担体が、当業者に周知である（例、Gennaro (ed.), Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995)を参照のこと）。製剤は、さらに、１つ以上の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面上でのタンパク質損失を防止するためのアルブミンなどを含みうる。
【０１２４】
医薬的組成物の形態、投与の経路、投与量、および投与計画は、処置される状態、疾病の重症度、患者の年齢、体重、および性別などに自然に依存する。
【０１２５】
本発明の医薬的組成物を、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、または眼内投与などのために製剤化することができる。
【０１２６】
好ましくは、医薬的組成物は、注射することが可能な製剤用の医薬的に許容可能である賦形剤を含む。これらは、特に等張性の無菌生理食塩溶液（リン酸一ナトリウムまたはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムなど、あるいはそのような塩の混合物）、または乾燥した、特に凍結乾燥組成物でありうるが、それらは、場合に依存して、滅菌水または生理学的食塩水の添加時に、注射用溶液の構成を許す。
【０１２７】
投与のために使用される用量を、種々のパラメーターの関数として、特に、使用される投与の様式、関連する病理、または、あるいは、処置の所望の持続期間の関数として適応することができる。
【０１２８】
医薬的組成物を調製するために、抗体の効果的な量を、医薬的に許容可能な担体または水性媒質中に溶解または分散させてもよい。
【０１２９】
注射可能な使用のために適切な医薬的形態は、無菌水溶液または分散剤；ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および無菌の注射可能な溶液または分散剤の即時調製のための無菌粉末を含む。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、簡単な注射可能性が存在する程度まで液体でなければならない。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、微生物（例えば細菌および真菌など）の汚染作用に対して保存されなければならない。
【０１３０】
遊離塩基または薬理学的に許容可能な塩としての活性化合物の溶液は、界面活性剤（例えばヒドロキシプロピルセルロースなど）と適切に混合し、水中で調製することができる。分散剤は、また、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物ならびに油中で調製することができる。保存および使用の普通の条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための保存剤を含む。
【０１３１】
本発明の抗体は、中性または塩の形態で、組成物中に製剤化することができる。医薬的に許容可能な塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）を含み、それらは、無機酸、例えば、塩酸またはリン酸、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩は、また、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄など、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から由来しうる。
【０１３２】
担体は、また、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、および野菜油を含む溶媒または分散媒質でありうる。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えばレシチンなど）の使用により、要求される粒子サイズの維持により（分散剤の場合において）、および界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌薬剤および抗真菌薬剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によりもたらすことができる。多くの場合において、等張薬剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含むことが好ましいであろう。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤の組成物（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）中での使用によりもたらすことができる。
【０１３３】
無菌の注射可能な溶液は、上に列挙する種々の他の成分を伴う適当な溶媒中に、要求される量で活性化合物を取り込ませることにより調製し、要求に応じて、ろ過滅菌が続く。一般的に、分散剤は、種々の滅菌活性成分を、基礎分散媒質および上に列挙するものからの要求される他の成分を含む無菌賦形剤中に取り込ませることにより調製する。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合において、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥技術であり、それによって、活性成分＋先に無菌ろ過したその溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末がもたらされる。
【０１３４】
直接注射用のより多くの、または高度に濃縮された溶液の調製も熟慮され、そこでは、溶媒としてのＤＭＳＯの使用が、極めて迅速な浸透をもたらし、高濃度の活性薬剤を小さな腫瘍面積に送達する。
【０１３５】
製剤化時に、溶液は、投与製剤と適合する様式で、治療的に効果的な量で投与されうる。製剤は、種々の投与形態（例えば上に記載する注射用溶液の型など）で簡単に投与されるが、しかし、薬物放出カプセルなどを用いることもできる。
【０１３６】
水溶液中での非経口投与のために、例えば、溶液は、必要な場合、適切に緩衝化し、液体希釈剤は、最初に、十分な生理食塩水またはグルコースを用いて等張にすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与のために特に適切である。これに関連して、用いることができる無菌水性媒質は、本開示に照らして当業者に公知であろう。例えば、１投与量を、１mlの等張性ＮａＣｌ溶液中に溶解し、１０００mlの皮下注入液に添加するまたは提案された注入部位に注射しうる（例えば、“Remington’s Pharmaceutical Sciences”15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照のこと）。投与量におけるいくらかの変動は、処置されている患者の状態に依存して必ず生じる。投与に責任のある人は、任意の事象において、個々の被験者のために適当な用量を決定する。
【０１３７】
本発明の抗体を、治療用混合物内で製剤化し、約０．０００１〜１．０ミリグラム、または約０．００１〜０．１ミリグラム、または約０．１〜１．０、またはさらには約１０ミリグラム／用量かそこらを含みうる。複数用量を投与することもできる。
【０１３８】
非経口投与（例えば静脈内または筋肉内注射など）のために製剤化される化合物に加えて、他の医薬的に許容可能な形態は、例えば、経口投与のための錠剤または他の固体；徐放カプセル；および現在使用されている任意の他の形態を含む。
【０１３９】
特定の実施形態において、リポソームおよび／またはナノ粒子の使用が、宿主細胞中への抗体の導入のために熟慮される。リポソームおよび／またはナノ粒子の形成および使用は、当業者に公知である。
【０１４０】
ナノカプセルは、一般的に、安定な再現性のある方法で、化合物を捕捉することができる。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を避けるために、そのような超微粒子（およそ０．１μmのサイズ）は、一般的に、インビボで分解されることができるポリマーを使用して設計される。これらの要求を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が、本発明における使用のために熟慮され、そのような粒子は簡単に作られうる。
【０１４１】
リポソームは、水性媒質中に分散されたリン脂質から形成され、多層同心二重層小胞（また、多層小胞（ＭＬＶ）と呼ばれる）を自然に形成する。ＭＬＶは、一般的に、２５nm〜４μmの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、２００〜５００Ａの範囲の直径を伴い、コア中に水性溶液を含む、小さな単層小胞（ＳＵＶ）の形成をもたらす。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。
【０１４２】
キット：
【０１４３】
最後に、本発明は、また、本発明の少なくとも１つの抗体を含むキットを提供する。本発明の抗体を含むキットは、ＣＬＤＮ１発現（増加または減少）を検出する際に、または治療的もしくは診断的アッセイにおいて使用を見出す。本発明のキットは、固体支持体、例えば、組織培養プレートまたはビーズ（例、セファロースビーズ）に共役した抗体を含むことができる。インビトロでの、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、またはＩＨＣにおいて、ＣＬＤＮ１の検出および定量化のための抗体を含むキットを提供することができる。検出のために有用なそのような抗体は、標識（例えば蛍光または放射標識など）と共に提供されうる。
【０１４４】
本発明は、さらに、以下の図面および実施例により例証される。しかし、これらの実施例および図面は、本発明の範囲を限定するものとして任意の方法で解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１Ａ】結腸の臨床サンプル上でのＣＬＤＮ１免疫化学を示す。Ａ）３つの型の結腸組織におけるＣＬＤＮ１染色の例：ＮＭ＝正常粘膜；ＡＤ＝腺腫；ＡＤＫ＝腺癌（×１００）Ｂ）標識強度として、またはＣ）標識細胞の%として評価されたＣＬＤＮ１発現。Ｄ）ＣＬＤＮ１の局在化は、４５名の結腸直腸患者の各々の組織について示されている。Ｅ）１３の一対組合せの組織サンプルからのＣＬＤＮ１発現のウエスタンブロット分析。ＮＭ＝正常粘膜；ＰＴ＝原発腫瘍。Ｆ）２つの原発腫瘍サンプルの細胞内分画。Ｃ＝細胞質、Ｍ＝膜、Ｎ＝核。βチューブリン、ＣＤ７１およびヒストンＨ３は、細胞内マーカーとして使用した。
【図１Ｂ】結腸の臨床サンプル上でのＣＬＤＮ１免疫化学を示す。Ａ）３つの型の結腸組織におけるＣＬＤＮ１染色の例：ＮＭ＝正常粘膜；ＡＤ＝腺腫；ＡＤＫ＝腺癌（×１００）Ｂ）標識強度として、またはＣ）標識細胞の%として評価されたＣＬＤＮ１発現。Ｄ）ＣＬＤＮ１の局在化は、４５名の結腸直腸患者の各々の組織について示されている。Ｅ）１３の一対組合せの組織サンプルからのＣＬＤＮ１発現のウエスタンブロット分析。ＮＭ＝正常粘膜；ＰＴ＝原発腫瘍。Ｆ）２つの原発腫瘍サンプルの細胞内分画。Ｃ＝細胞質、Ｍ＝膜、Ｎ＝核。βチューブリン、ＣＤ７１およびヒストンＨ３は、細胞内マーカーとして使用した。
【図１Ｃ】結腸の臨床サンプル上でのＣＬＤＮ１免疫化学を示す。Ａ）３つの型の結腸組織におけるＣＬＤＮ１染色の例：ＮＭ＝正常粘膜；ＡＤ＝腺腫；ＡＤＫ＝腺癌（×１００）Ｂ）標識強度として、またはＣ）標識細胞の%として評価されたＣＬＤＮ１発現。Ｄ）ＣＬＤＮ１の局在化は、４５名の結腸直腸患者の各々の組織について示されている。Ｅ）１３の一対組合せの組織サンプルからのＣＬＤＮ１発現のウエスタンブロット分析。ＮＭ＝正常粘膜；ＰＴ＝原発腫瘍。Ｆ）２つの原発腫瘍サンプルの細胞内分画。Ｃ＝細胞質、Ｍ＝膜、Ｎ＝核。βチューブリン、ＣＤ７１およびヒストンＨ３は、細胞内マーカーとして使用した。
【図１Ｄ】結腸の臨床サンプル上でのＣＬＤＮ１免疫化学を示す。Ａ）３つの型の結腸組織におけるＣＬＤＮ１染色の例：ＮＭ＝正常粘膜；ＡＤ＝腺腫；ＡＤＫ＝腺癌（×１００）Ｂ）標識強度として、またはＣ）標識細胞の%として評価されたＣＬＤＮ１発現。Ｄ）ＣＬＤＮ１の局在化は、４５名の結腸直腸患者の各々の組織について示されている。Ｅ）１３の一対組合せの組織サンプルからのＣＬＤＮ１発現のウエスタンブロット分析。ＮＭ＝正常粘膜；ＰＴ＝原発腫瘍。Ｆ）２つの原発腫瘍サンプルの細胞内分画。Ｃ＝細胞質、Ｍ＝膜、Ｎ＝核。βチューブリン、ＣＤ７１およびヒストンＨ３は、細胞内マーカーとして使用した。
【図１Ｅ】結腸の臨床サンプル上でのＣＬＤＮ１免疫化学を示す。Ａ）３つの型の結腸組織におけるＣＬＤＮ１染色の例：ＮＭ＝正常粘膜；ＡＤ＝腺腫；ＡＤＫ＝腺癌（×１００）Ｂ）標識強度として、またはＣ）標識細胞の%として評価されたＣＬＤＮ１発現。Ｄ）ＣＬＤＮ１の局在化は、４５名の結腸直腸患者の各々の組織について示されている。Ｅ）１３の一対組合せの組織サンプルからのＣＬＤＮ１発現のウエスタンブロット分析。ＮＭ＝正常粘膜；ＰＴ＝原発腫瘍。Ｆ）２つの原発腫瘍サンプルの細胞内分画。Ｃ＝細胞質、Ｍ＝膜、Ｎ＝核。βチューブリン、ＣＤ７１およびヒストンＨ３は、細胞内マーカーとして使用した。
【図１Ｆ】結腸の臨床サンプル上でのＣＬＤＮ１免疫化学を示す。Ａ）３つの型の結腸組織におけるＣＬＤＮ１染色の例：ＮＭ＝正常粘膜；ＡＤ＝腺腫；ＡＤＫ＝腺癌（×１００）Ｂ）標識強度として、またはＣ）標識細胞の%として評価されたＣＬＤＮ１発現。Ｄ）ＣＬＤＮ１の局在化は、４５名の結腸直腸患者の各々の組織について示されている。Ｅ）１３の一対組合せの組織サンプルからのＣＬＤＮ１発現のウエスタンブロット分析。ＮＭ＝正常粘膜；ＰＴ＝原発腫瘍。Ｆ）２つの原発腫瘍サンプルの細胞内分画。Ｃ＝細胞質、Ｍ＝膜、Ｎ＝核。βチューブリン、ＣＤ７１およびヒストンＨ３は、細胞内マーカーとして使用した。
【図２】選択された３つのハイブリドーマのＣＬＤＮ１に対する反応性を示す。ＣＬＤＮ１陽性細胞株（ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１およびＳＷ６２０  ｓｈＬＵＣ）への選択されたハイブリドーマの結合を示すＦＡＣＳヒストグラム。
【図３Ａ】ＣＬＤＮ１に対する６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂの反応性および特異性を示す。Ａ）異なる結腸直腸細胞株におけるウエスタンブロッティングにより評価されたＣＬＤＮ１発現。Ｂ）GeneSnap fom Syngeneを使用したＣＬＤＮ１のＧＡＰＤＨ標準化発現。Ｃ）ＦＡＣＳ実験により決定された、ネガティブおよびポジティブ−ＣＬＤＮ１細胞株上での精製６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂ（１０μg/ml）の反応性。Ｄ）６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂ結合の蛍光強度は、少なくとも３つの独立した実験での平均±ＳＤとして提示される。Ｅ）ＳＷ４８０およびＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１からのＣＬＤＮ１の、６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂとの免疫沈降；複合体は、ＪＡＹ−８抗ＣＬＤＮ１抗体により明らかにされた（ＩＰ＝免疫沈降、ＦＴ＝フロースルー）。Ｆ）免疫蛍光実験は、一次抗体として６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂを使用して実施した。画像は、ライカ倒立顕微鏡上で、６３ＸＮＡ対物レンズを使用して記録した。Ｇ）ＣＬＤＮ１膜抽出物上での６Ｆ６Ｃ３と無関係な抗体の相互作用の表面プラズモン共鳴測定。６Ｆ６Ｃ３と無関係な抗体の結合は、Biacore 3000機器で、２５℃で、ＰＢＳ中で実施した。膜抽出物を、製造業者の仕様書に従って、２６００ＲＵで、ＨＰＡセンサーチップ表面上に固定化した。無関係な抗体と６Ｆ６Ｃ３抗体を、１０分間、流速２μＬ／分で、固定化ＬＰＳ上に６６０nＭで注射し、ＰＢＳ泳動緩衝液を用いた６００秒の解離工程が続いた。
【図３Ｂ】ＣＬＤＮ１に対する６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂの反応性および特異性を示す。Ａ）異なる結腸直腸細胞株におけるウエスタンブロッティングにより評価されたＣＬＤＮ１発現。Ｂ）GeneSnap fom Syngeneを使用したＣＬＤＮ１のＧＡＰＤＨ標準化発現。Ｃ）ＦＡＣＳ実験により決定された、ネガティブおよびポジティブ−ＣＬＤＮ１細胞株上での精製６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂ（１０μg/ml）の反応性。Ｄ）６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂ結合の蛍光強度は、少なくとも３つの独立した実験での平均±ＳＤとして提示される。Ｅ）ＳＷ４８０およびＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１からのＣＬＤＮ１の、６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂとの免疫沈降；複合体は、ＪＡＹ−８抗ＣＬＤＮ１抗体により明らかにされた（ＩＰ＝免疫沈降、ＦＴ＝フロースルー）。Ｆ）免疫蛍光実験は、一次抗体として６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂを使用して実施した。画像は、ライカ倒立顕微鏡上で、６３ＸＮＡ対物レンズを使用して記録した。Ｇ）ＣＬＤＮ１膜抽出物上での６Ｆ６Ｃ３と無関係な抗体の相互作用の表面プラズモン共鳴測定。６Ｆ６Ｃ３と無関係な抗体の結合は、Biacore 3000機器で、２５℃で、ＰＢＳ中で実施した。膜抽出物を、製造業者の仕様書に従って、２６００ＲＵで、ＨＰＡセンサーチップ表面上に固定化した。無関係な抗体と６Ｆ６Ｃ３抗体を、１０分間、流速２μＬ／分で、固定化ＬＰＳ上に６６０nＭで注射し、ＰＢＳ泳動緩衝液を用いた６００秒の解離工程が続いた。
【図３Ｃ】ＣＬＤＮ１に対する６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂの反応性および特異性を示す。Ａ）異なる結腸直腸細胞株におけるウエスタンブロッティングにより評価されたＣＬＤＮ１発現。Ｂ）GeneSnap fom Syngeneを使用したＣＬＤＮ１のＧＡＰＤＨ標準化発現。Ｃ）ＦＡＣＳ実験により決定された、ネガティブおよびポジティブ−ＣＬＤＮ１細胞株上での精製６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂ（１０μg/ml）の反応性。Ｄ）６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂ結合の蛍光強度は、少なくとも３つの独立した実験での平均±ＳＤとして提示される。Ｅ）ＳＷ４８０およびＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１からのＣＬＤＮ１の、６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂとの免疫沈降；複合体は、ＪＡＹ−８抗ＣＬＤＮ１抗体により明らかにされた（ＩＰ＝免疫沈降、ＦＴ＝フロースルー）。Ｆ）免疫蛍光実験は、一次抗体として６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂを使用して実施した。画像は、ライカ倒立顕微鏡上で、６３ＸＮＡ対物レンズを使用して記録した。Ｇ）ＣＬＤＮ１膜抽出物上での６Ｆ６Ｃ３と無関係な抗体の相互作用の表面プラズモン共鳴測定。６Ｆ６Ｃ３と無関係な抗体の結合は、Biacore 3000機器で、２５℃で、ＰＢＳ中で実施した。膜抽出物を、製造業者の仕様書に従って、２６００ＲＵで、ＨＰＡセンサーチップ表面上に固定化した。無関係な抗体と６Ｆ６Ｃ３抗体を、１０分間、流速２μＬ／分で、固定化ＬＰＳ上に６６０nＭで注射し、ＰＢＳ泳動緩衝液を用いた６００秒の解離工程が続いた。
【図３Ｄ】ＣＬＤＮ１に対する６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂの反応性および特異性を示す。Ａ）異なる結腸直腸細胞株におけるウエスタンブロッティングにより評価されたＣＬＤＮ１発現。Ｂ）GeneSnap fom Syngeneを使用したＣＬＤＮ１のＧＡＰＤＨ標準化発現。Ｃ）ＦＡＣＳ実験により決定された、ネガティブおよびポジティブ−ＣＬＤＮ１細胞株上での精製６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂ（１０μg/ml）の反応性。Ｄ）６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂ結合の蛍光強度は、少なくとも３つの独立した実験での平均±ＳＤとして提示される。Ｅ）ＳＷ４８０およびＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１からのＣＬＤＮ１の、６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂとの免疫沈降；複合体は、ＪＡＹ−８抗ＣＬＤＮ１抗体により明らかにされた（ＩＰ＝免疫沈降、ＦＴ＝フロースルー）。Ｆ）免疫蛍光実験は、一次抗体として６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂを使用して実施した。画像は、ライカ倒立顕微鏡上で、６３ＸＮＡ対物レンズを使用して記録した。Ｇ）ＣＬＤＮ１膜抽出物上での６Ｆ６Ｃ３と無関係な抗体の相互作用の表面プラズモン共鳴測定。６Ｆ６Ｃ３と無関係な抗体の結合は、Biacore 3000機器で、２５℃で、ＰＢＳ中で実施した。膜抽出物を、製造業者の仕様書に従って、２６００ＲＵで、ＨＰＡセンサーチップ表面上に固定化した。無関係な抗体と６Ｆ６Ｃ３抗体を、１０分間、流速２μＬ／分で、固定化ＬＰＳ上に６６０nＭで注射し、ＰＢＳ泳動緩衝液を用いた６００秒の解離工程が続いた。
【図３Ｅ】ＣＬＤＮ１に対する６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂの反応性および特異性を示す。Ａ）異なる結腸直腸細胞株におけるウエスタンブロッティングにより評価されたＣＬＤＮ１発現。Ｂ）GeneSnap fom Syngeneを使用したＣＬＤＮ１のＧＡＰＤＨ標準化発現。Ｃ）ＦＡＣＳ実験により決定された、ネガティブおよびポジティブ−ＣＬＤＮ１細胞株上での精製６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂ（１０μg/ml）の反応性。Ｄ）６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂ結合の蛍光強度は、少なくとも３つの独立した実験での平均±ＳＤとして提示される。Ｅ）ＳＷ４８０およびＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１からのＣＬＤＮ１の、６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂとの免疫沈降；複合体は、ＪＡＹ−８抗ＣＬＤＮ１抗体により明らかにされた（ＩＰ＝免疫沈降、ＦＴ＝フロースルー）。Ｆ）免疫蛍光実験は、一次抗体として６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂを使用して実施した。画像は、ライカ倒立顕微鏡上で、６３ＸＮＡ対物レンズを使用して記録した。Ｇ）ＣＬＤＮ１膜抽出物上での６Ｆ６Ｃ３と無関係な抗体の相互作用の表面プラズモン共鳴測定。６Ｆ６Ｃ３と無関係な抗体の結合は、Biacore 3000機器で、２５℃で、ＰＢＳ中で実施した。膜抽出物を、製造業者の仕様書に従って、２６００ＲＵで、ＨＰＡセンサーチップ表面上に固定化した。無関係な抗体と６Ｆ６Ｃ３抗体を、１０分間、流速２μＬ／分で、固定化ＬＰＳ上に６６０nＭで注射し、ＰＢＳ泳動緩衝液を用いた６００秒の解離工程が続いた。
【図３Ｆ】ＣＬＤＮ１に対する６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂの反応性および特異性を示す。Ａ）異なる結腸直腸細胞株におけるウエスタンブロッティングにより評価されたＣＬＤＮ１発現。Ｂ）GeneSnap fom Syngeneを使用したＣＬＤＮ１のＧＡＰＤＨ標準化発現。Ｃ）ＦＡＣＳ実験により決定された、ネガティブおよびポジティブ−ＣＬＤＮ１細胞株上での精製６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂ（１０μg/ml）の反応性。Ｄ）６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂ結合の蛍光強度は、少なくとも３つの独立した実験での平均±ＳＤとして提示される。Ｅ）ＳＷ４８０およびＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１からのＣＬＤＮ１の、６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂとの免疫沈降；複合体は、ＪＡＹ−８抗ＣＬＤＮ１抗体により明らかにされた（ＩＰ＝免疫沈降、ＦＴ＝フロースルー）。Ｆ）免疫蛍光実験は、一次抗体として６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂを使用して実施した。画像は、ライカ倒立顕微鏡上で、６３ＸＮＡ対物レンズを使用して記録した。Ｇ）ＣＬＤＮ１膜抽出物上での６Ｆ６Ｃ３と無関係な抗体の相互作用の表面プラズモン共鳴測定。６Ｆ６Ｃ３と無関係な抗体の結合は、Biacore 3000機器で、２５℃で、ＰＢＳ中で実施した。膜抽出物を、製造業者の仕様書に従って、２６００ＲＵで、ＨＰＡセンサーチップ表面上に固定化した。無関係な抗体と６Ｆ６Ｃ３抗体を、１０分間、流速２μＬ／分で、固定化ＬＰＳ上に６６０nＭで注射し、ＰＢＳ泳動緩衝液を用いた６００秒の解離工程が続いた。
【図３Ｇ】ＣＬＤＮ１に対する６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂの反応性および特異性を示す。Ａ）異なる結腸直腸細胞株におけるウエスタンブロッティングにより評価されたＣＬＤＮ１発現。Ｂ）GeneSnap fom Syngeneを使用したＣＬＤＮ１のＧＡＰＤＨ標準化発現。Ｃ）ＦＡＣＳ実験により決定された、ネガティブおよびポジティブ−ＣＬＤＮ１細胞株上での精製６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂ（１０μg/ml）の反応性。Ｄ）６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂ結合の蛍光強度は、少なくとも３つの独立した実験での平均±ＳＤとして提示される。Ｅ）ＳＷ４８０およびＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１からのＣＬＤＮ１の、６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂとの免疫沈降；複合体は、ＪＡＹ−８抗ＣＬＤＮ１抗体により明らかにされた（ＩＰ＝免疫沈降、ＦＴ＝フロースルー）。Ｆ）免疫蛍光実験は、一次抗体として６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂを使用して実施した。画像は、ライカ倒立顕微鏡上で、６３ＸＮＡ対物レンズを使用して記録した。Ｇ）ＣＬＤＮ１膜抽出物上での６Ｆ６Ｃ３と無関係な抗体の相互作用の表面プラズモン共鳴測定。６Ｆ６Ｃ３と無関係な抗体の結合は、Biacore 3000機器で、２５℃で、ＰＢＳ中で実施した。膜抽出物を、製造業者の仕様書に従って、２６００ＲＵで、ＨＰＡセンサーチップ表面上に固定化した。無関係な抗体と６Ｆ６Ｃ３抗体を、１０分間、流速２μＬ／分で、固定化ＬＰＳ上に６６０nＭで注射し、ＰＢＳ泳動緩衝液を用いた６００秒の解離工程が続いた。
【図４Ａ】いくつかの癌細胞株のＣＬＤＮ１発現および６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂの反応性を示す。Ａ）ポリクローナル抗ＣＬＤＮ１抗体（ＪＡＹ−８）を使用したウエスタンブロットにより決定された全ＣＬＤＮ１発現。ヒストグラムは、発現を標準化するための比率ＣＬＤＮ１／ＧＡＰＤＨを表す。Ｂ）細胞株に対する６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂ（灰色）または無関係なＡｂ（点線）の反応性。定量化は、６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂおよび無関係な抗体のＧｍｅａｎ比率を使用して行った。
【図４Ｂ】いくつかの癌細胞株のＣＬＤＮ１発現および６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂの反応性を示す。Ａ）ポリクローナル抗ＣＬＤＮ１抗体（ＪＡＹ−８）を使用したウエスタンブロットにより決定された全ＣＬＤＮ１発現。ヒストグラムは、発現を標準化するための比率ＣＬＤＮ１／ＧＡＰＤＨを表す。Ｂ）細胞株に対する６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂ（灰色）または無関係なＡｂ（点線）の反応性。定量化は、６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂおよび無関係な抗体のＧｍｅａｎ比率を使用して行った。
【図５Ａ】他のＣＬＤＮに対する６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂの交差反応性分析を示す。Ａ）ＳＷ４８０またはＣＬＤＮトランスフェクトＳＷ４８０から由来する細胞溶解物を、ウエスタンブロッティングによりテストした。Ｂ）６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂ（１０μg/ml灰色ヒストグラム）または６Ｆ６Ｃ３（点線ヒストグラム）もしくは無関係な抗体３５Ａ７（黒色ヒストグラム）を伴わない対照の、異なるＣＬＤＮへの結合のＦＡＣＳヒストグラム。
【図５Ｂ】他のＣＬＤＮに対する６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂの交差反応性分析を示す。Ａ）ＳＷ４８０またはＣＬＤＮトランスフェクトＳＷ４８０から由来する細胞溶解物を、ウエスタンブロッティングによりテストした。Ｂ）６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂ（１０μg/ml灰色ヒストグラム）または６Ｆ６Ｃ３（点線ヒストグラム）もしくは無関係な抗体３５Ａ７（黒色ヒストグラム）を伴わない対照の、異なるＣＬＤＮへの結合のＦＡＣＳヒストグラム。
【図６Ａ】細胞株の生存に対する６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂのインビトロでの効果を示す。Ａ）Ｃａｃｏ−２結腸直腸細胞株でのクローン原性アッセイ：２５０個の細胞を６ウェルプレート上に播種し、３７℃で一晩付着させる。次に、抗体（最終濃度５０または１００μg/ml）を伴う、または伴わないＲＰＭＩの１ミリリットルを加え、６日間にわたりインキュベートした。フリー培地中でのさらに６日間の後、プレートを洗浄した；コロニーを固定し（エタノール／酢酸）、クリスタルバイオレット（０．５%ｗ／ｖ）を用いて染色し、実体顕微鏡を使用してカウントした。Ｂ）処理を伴う、および伴わないＣａｃｏ２細胞株のコロニーの割合。Ｃ）１００μg/mlの６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂを用いて処理された、または処理されていないいくつかの細胞株でのクローン形成アッセイ；ヒストグラムは、阻害の%を表す（無処理ウェル中での%コロニー−処理ウェル中での%コロニー）。
【図６Ｂ】細胞株の生存に対する６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂのインビトロでの効果を示す。Ａ）Ｃａｃｏ−２結腸直腸細胞株でのクローン原性アッセイ：２５０個の細胞を６ウェルプレート上に播種し、３７℃で一晩付着させる。次に、抗体（最終濃度５０または１００μg/ml）を伴う、または伴わないＲＰＭＩの１ミリリットルを加え、６日間にわたりインキュベートした。フリー培地中でのさらに６日間の後、プレートを洗浄した；コロニーを固定し（エタノール／酢酸）、クリスタルバイオレット（０．５%ｗ／ｖ）を用いて染色し、実体顕微鏡を使用してカウントした。Ｂ）処理を伴う、および伴わないＣａｃｏ２細胞株のコロニーの割合。Ｃ）１００μg/mlの６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂを用いて処理された、または処理されていないいくつかの細胞株でのクローン形成アッセイ；ヒストグラムは、阻害の%を表す（無処理ウェル中での%コロニー−処理ウェル中での%コロニー）。
【図６Ｃ】細胞株の生存に対する６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂのインビトロでの効果を示す。Ａ）Ｃａｃｏ−２結腸直腸細胞株でのクローン原性アッセイ：２５０個の細胞を６ウェルプレート上に播種し、３７℃で一晩付着させる。次に、抗体（最終濃度５０または１００μg/ml）を伴う、または伴わないＲＰＭＩの１ミリリットルを加え、６日間にわたりインキュベートした。フリー培地中でのさらに６日間の後、プレートを洗浄した；コロニーを固定し（エタノール／酢酸）、クリスタルバイオレット（０．５%ｗ／ｖ）を用いて染色し、実体顕微鏡を使用してカウントした。Ｂ）処理を伴う、および伴わないＣａｃｏ２細胞株のコロニーの割合。Ｃ）１００μg/mlの６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂを用いて処理された、または処理されていないいくつかの細胞株でのクローン形成アッセイ；ヒストグラムは、阻害の%を表す（無処理ウェル中での%コロニー−処理ウェル中での%コロニー）。
【図７】３Ｄ細胞株の成長に対する６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂの効果を示す。処理細胞は、播種前に、５０μg/mlのｍＡｂ（６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂまたは無関係のｍＡｂ）を用いて２時間にわたりインキュベートした。超低付着プレート上で成長したスフェロイドの代表的な画像が、９６時間の成長後に撮られた。
【図８Ａ】Ｂｏｙｄｅｎチャンバーを使用した遊走アッセイを示す。Ａ）Ｂｏｙｄｅｎチャンバー膜の下側から、１００μg/ml細胞で６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂ  により処理された、または処理されていないＨＵＨ−７細胞の写真。Ｂ）１００μg/mlの６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂまたは無関係のｍＡｂを用いて処理された４つの細胞株についての、３つの独立した実験における遊走細胞の数。細胞は、添加前に、ｍＡｂを用いて１時間にわたりプレインキュベートした。
【図８Ｂ】Ｂｏｙｄｅｎチャンバーを使用した遊走アッセイを示す。Ａ）Ｂｏｙｄｅｎチャンバー膜の下側から、１００μg/ml細胞で６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂ  により処理された、または処理されていないＨＵＨ−７細胞の写真。Ｂ）１００μg/mlの６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂまたは無関係のｍＡｂを用いて処理された４つの細胞株についての、３つの独立した実験における遊走細胞の数。細胞は、添加前に、ｍＡｂを用いて１時間にわたりプレインキュベートした。
【図９】１２５Ｉ  ６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂの生体内分布を示す。移植マウスに、尾静脈を介した５００μＣｉの１２５Ｉ  ６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂの静脈内注射を与え、画像を、注射後２日と３日目に取得した。
【図１０Ａ】無胸腺ヌードマウスにおけるＳＷ６２０異種移植片の成長に対する６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂのインビボでの効果の試験を示す。Ａ）１５mg/kgで６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂにより週２回（灰色線）または１５mg/kgで週３回（濃い灰色線）処置された、あるいは、処置されていない（黒色線）ＳＷ６２０を伴う異種移植マウスでの腫瘍成長動態。処置は、腫瘍が１００mm3に達した際に開始した。Ｂ）腫瘍が１５００mm3の決定容積に達するために要した時間を使用した、適合されたカプラン・マイヤー曲線。黒色実線は、ＮＴ（未処置）に対応し、灰色実線は、第１実験に、灰色点線は、第２実験に対応する。
【図１０Ｂ】無胸腺ヌードマウスにおけるＳＷ６２０異種移植片の成長に対する６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂのインビボでの効果の試験を示す。Ａ）１５mg/kgで６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂにより週２回（灰色線）または１５mg/kgで週３回（濃い灰色線）処置された、あるいは、処置されていない（黒色線）ＳＷ６２０を伴う異種移植マウスでの腫瘍成長動態。処置は、腫瘍が１００mm3に達した際に開始した。Ｂ）腫瘍が１５００mm3の決定容積に達するために要した時間を使用した、適合されたカプラン・マイヤー曲線。黒色実線は、ＮＴ（未処置）に対応し、灰色実線は、第１実験に、灰色点線は、第２実験に対応する。
【図１１Ａ】肝転移の形成に対する６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂのインビボでの効果を示す。Ａ）未処置マウスおよび６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂ処置マウスからの肝臓における代表的なＳＷ６２０転移性腫瘍；画像は、実験エンドポイント（手術から５週間）で撮った。Ｂ）両群間での転移の数の分布および中央値の比較（Ｐ＝０．０８、マン−  ホイットニー）。Ｃ）肝転移の数に従ったマウスの再分割。＜１＝無転移または１つの微小転移；１−１０＝１を上回り、１０未満の転移；＞１０＝１０を上回る転移。
【図１１Ｂ】肝転移の形成に対する６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂのインビボでの効果を示す。Ａ）未処置マウスおよび６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂ処置マウスからの肝臓における代表的なＳＷ６２０転移性腫瘍；画像は、実験エンドポイント（手術から５週間）で撮った。Ｂ）両群間での転移の数の分布および中央値の比較（Ｐ＝０．０８、マン−  ホイットニー）。Ｃ）肝転移の数に従ったマウスの再分割。＜１＝無転移または１つの微小転移；１−１０＝１を上回り、１０未満の転移；＞１０＝１０を上回る転移。
【図１１Ｃ】肝転移の形成に対する６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂのインビボでの効果を示す。Ａ）未処置マウスおよび６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂ処置マウスからの肝臓における代表的なＳＷ６２０転移性腫瘍；画像は、実験エンドポイント（手術から５週間）で撮った。Ｂ）両群間での転移の数の分布および中央値の比較（Ｐ＝０．０８、マン−  ホイットニー）。Ｃ）肝転移の数に従ったマウスの再分割。＜１＝無転移または１つの微小転移；１−１０＝１を上回り、１０未満の転移；＞１０＝１０を上回る転移。
【０１４６】
実施例：
【０１４７】
材料＆方法
【０１４８】
１−結腸臨床サンプルでのＣＬＤＮ１免疫化学
【０１４９】
組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を、５２名の患者からの一対組合せの正常粘膜および一対組合せの腺腫の、結腸癌の３つの組織コア（各々０．６mm直径）を使用し、以前に記載された通りに（Granci et al., 2008）構築した。ＴＭＡの３μmの薄いミクロン切片を脱パラフィン化し、段階的なアルコール中で再水和させた。スライドは、その後、ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ９）を伴う水浴中に浸漬することにより、熱誘導エピトープ回収に供した。内因性ペルオキシダーゼ活性の中和後、ＴＭＡ切片を、ポリクローナル抗ＣＬＤＮ１抗体（JAY-8,Zymed laboratories Inc., CA, USA）または希釈剤のみを用いて、６０分間にわたりインキュベートした。一次抗体結合を、Dako autostainer（登録商標）（Dako, Glostrup, Denmark）を伴うEnvision（登録商標）システムを使用して可視化した。染色は、抗体希釈液を用いてインキュベートしたスライド上では観察されなかった。サンプリングされた５２症例の内、一対組合せの正常組織、腺腫、および腫瘍を伴う４５サンプルが、免疫組織化学後に評価可能である。各々のスポットを、印の付けられた細胞の割合について、および染色強度（０：なし；１：軽微；２：中程度；３強）について個々に割り当てた。
【０１５０】
２−細胞株
【０１５１】
使用したヒト結腸直腸癌細胞株：ＳＷ４８０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２２８）、ＳＷ６２０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２２７）、Ｃａｃｏ−２（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３７）、Ｄｉｆｉ（（Olive et al., 1993））（Montagut博士からの寄贈）、ＨＣＴ１１６（ＣＣＬ−２４７）、ＬＳ１７４Ｔ（ＡＴＣＣ  ＣＬ−１８８）。
【０１５２】
使用した他の癌細胞株：膵臓癌ＰＡＮＣ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４６９）、ＢＸＰＣ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６８７）、卵巣癌ＳＫＯＶ−３（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−７７）、ＩＧＲＯＶ１（Benard et., al 1985）、および肝細胞癌ＨｕＨ７（ＪＣＲＢ０４０３）。
【０１５３】
ＣＬＤＮ１陽性ＳＷ４８０細胞株（ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１）を得るために、本発明者らは、jetPRIME（商標）トランスフェクション試薬（Polyplus-transfection Inc., France）を使用し、ヒトＣＬＤＮ１  ｃＤＮＡクローン（Invitrogen MGCコレクション、参照４５００５３４、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６）を用いて、ＳＷ４８０細胞株に安定的にトランスフェクトした。安定クローンを、選択試薬としてジェネティシンを使用して生成した。ｓｈＲＮＡ標的ルシフェラーゼ（ＳＷ６２０  ｓｈＬＵＣ）、またはＣＬＤＮ１（ＳＷ６２０ｓｈＣＬＤＮ１）を発現するＳＷ６２０細胞株を、ｐＳＩＲＥＮベクターのレトロウイルス遺伝子形質導入により得た。標的配列：ＳｈＬｕｃ（RNAi-Ready pSIREN-RetroQベクターキットから、Clontech Mountain View, CA, USA）。形質導入から２４時間後、細胞を、１μg/mlのピューロマイシンを用いて選択し、安定なクローンをプールした。
【０１５４】
全ての細胞株は、完全培地、即ち、１０%熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および２mM  Ｌグルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃で、５%ＣＯ２を含む加湿雰囲気下で成長させ、トリプシン（０．５mg/mL）およびＥＤＴＡ（０．２mg/mL）を使用したトリプシン処理により継代した。全ての培地サプリメントは、Life Technologies, Inc.（Gibco BRL, Gaithersburg, MD）から購入した。トランスフェクト細胞について、ジェネティシン（０．６７%）を培地中に加えた。
【０１５５】
３−モノクローナル抗体：
【０１５６】
抗ＣＬＤＮ１  ｍＡｂ：マウスハイブリドーマは、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、最初の注射用の完全フロイントアジュバント（Sigma）、および、その後の注射用の不完全フロイントアジュバント（Sigma）中のＮＩＨ−ＣＬＤＮ１として言及されるＣＬＤＮ１を用いて一過性にトランスフェクトされた４００万のマウスＮＩＨ細胞を用いて、２週間間隔で５回腹腔内に免疫化することにより生成した。ＮＩＨ−ＣＬＤＮ１の静脈内ブースター注射は、５回目の免疫化後３ヶ月目に与えられた。３日後、免疫化マウス由来の脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ．８．６５３と融合させた。新たに生成されたクローンからの上清を、ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１を使用し、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によりスクリーニングした。上清のＣＬＤＮ１についての特異性は、ＳＷ６２０結腸直腸細胞株として、ＣＬＤＮ１陽性細胞上で確認した。
【０１５７】
対照として使用したＭＡｂ：対照実験において、抗ＣＥＡモノクローナル抗体３５Ａ７（ＣＥＡ  Ｇｏｌｄ  ２エピトープについて特異的（Haskell et al., 1983; Hammarstrom et al., 1989））および無関係の正常マウスＩｇＧ３（sc-3880, Santa Cruz Biotechnology）。
【０１５８】
４−ウエスタンブロット解析
【０１５９】
患者の組織サンプルを、Mixer Mill（登録商標）mm300（Qiagen, Valencia, CA）を使用し、溶解緩衝液（ＮａＣｌ  １５０mM、１０mM  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ７．４、１mM、ＥＤＴＡ、１mM  ＥＧＴＡ、１%  ＳＤＳ、１%  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５%  ＮＰ−４０、２mM  ＰＭＳＦ、１００mM  ＮａＦ、１０mMオルトバナジウム酸ナトリウム、１０mlについてカクテルプロテアーゼ阻害剤１錠）中で直接的に破壊した。タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Pierce Coomassie Plus Protein Assay）を用いて測定した。次に、５０μgの全タンパク質を１２%ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、ニトロセルロース膜（Whatman（登録商標）Protran（登録商標）、孔サイズ０．４５μmの細孔）上に転写した。非特異的結合部位を、室温で１時間にわたりＰＢＳ−Ｔ（０．１%（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｗｅｅｎ２０を伴うＰＢＳ）中の５%（ｗｔ／ｖｏｌ）脱脂乳を用いてブロッキングし、次に、ポリクローナル抗ＣＬＤＮ１抗体（ＪＡＹ−８）と４℃で一晩インキュベートした。膜を次に洗浄し、適当な西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体と１時間にわたりインキュベートした。顕色は、化学発光システム（Amersham Biosciences）を用いて実施した。βチューブリン発現を使用し、標準化した。
【０１６０】
５−組織サンプルからの細胞内タンパク質抽出
【０１６１】
各々のサンプルについて、２０μm厚スライドを、クリオトームを用いて切断し、混合し、液体窒素中に回収し、マイクロ乳棒を用いて穏やかに粉砕した。細胞内タンパク質抽出のために、ProteoExtract Subcellular Proteome Extraction Kitを、製造者の指示（Calbiochem）に従って使用した。各々の細胞内画分の１０μgを１２%ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にロードした。イムノブロッティング  は、上に記載する通りに行った。以下の一次抗体を使用した：抗ＣＬＤＮ１（ＪＡＹ−８）、抗ＣＤ７１（Invitrogen）、抗ヒストンＨ３（Pierce）、および抗βチューブリン（Sigma T4026）
【０１６２】
６−フローサイトメトリー実験
【０１６３】
ハイブリドーマまたはｍＡｂ結合を、ＦＡＣＳｃａｎ蛍光活性化セルソーター（Quanta装置、Beckman Coulter）を用いて決定した。細胞を、２５cm2フラスコ（２×１０５細胞／フラスコ）中に播種した。４８時間の静置後、１００万の細胞をペレット化し、ＰＢＳ−１%ＢＳＡを用いて洗浄し、１時間にわたり氷上で、ハイブリドーマまたはｍＡｂとインキュベートした。洗浄後、適当な抗マウスＦＩＴＣ結合モノクローナル抗体（１：６０希釈；（Invitrogen））を氷上で４５分間にわたり加え、一次抗体を検出した。細胞と二次抗体との直接的なインキュベーションを、バックグラウンド測定（陰性対照）のために使用した。
【０１６４】
７−免疫沈降試験
【０１６５】
ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１およびＳＷ４８０細胞培養ディッシュを冷ＰＢＳで洗浄し、次に、付着細胞を、冷溶解緩衝液（２５mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０mM  ＮａＣｌ、１mM  ＥＤＴＡ、１%ＮＰ４０、およびプロテアーゼ阻害剤１錠）を使用して掻爬した。遠心分離後、２００μgの細胞溶解物を、１mlの６Ｆ６Ｃ３ハイブリドーマ培養上清および１００μlのＧセファロースビーズと混合した。溶解物ビーズ混合物を、ロータリー撹拌下で、４℃で２時間にわたりインキュベートした。複合体を、ビーズから溶出し、ウエスタンブロット用のゲル上で泳動した。ＣＬＤＮ１の顕色は、市販の抗ＣＬＤＮ１抗体（ＪＡＹ−８）を使用して行った。
【０１６６】
８−免疫蛍光試験
【０１６７】
細胞を、１２mmのガラスカバースリップを含む培養ディッシュ中に蒔いた。プレーティングの１日後、カバースリップ上の細胞を、４%パラホルムアルデヒド／ＰＢＳを用いて、室温で１０分間にわたり固定し、５%ＢＳＡを含むＰＢＳを用いて、３７℃で３０分間にわたりブロッキングした。細胞は、１時間にわたり、６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂ（１０μg/ml）とインキュベートした。二次抗体は、ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Invitrogen）であった。ＤＡＰＩを使用し、核を染色した。染色された細胞をMoviol中に乗せ、画像は、Leica倒立顕微鏡上で、６３ＸＮＡ対物レンズを使用して記録した。
【０１６８】
９−膜抽出物
【０１６９】
氷上で、ＳＷ４８０−Ｃｌｄｎ１細胞（〜１０７／７５cm2）を、冷ＰＢＳを用いて３回洗浄し、１mlのＴｒｉｓ  １０mM  ｐＨ７．２と３０分間にわたりインキュベートした。次に、細胞を掻爬し、５秒間にわたり４回超音波処理した。タンパク質抽出物は、７０００ｇで１５分間にわたり遠心分離し、上清を１５分間、２０００００ｇで超遠心分離した。ペレットをＰＢＳ中で超音波処理し、再懸濁した。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬（Pierce）により評価した。
【０１７０】
１０−三次元スフェロイドの確立
【０１７１】
超低付着９６ウェル丸底プレート（Costar）を使用し、スフェロイドを形成した。細胞を、密度５×１０４（ＳＷ４８０、ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１、ＳＷ６２０）または２×１０４細胞／ウェル（ＨｕＨ−７）で蒔いた。細胞が凝集し、２４〜４８時間内に、スフェロイド配置を伴う三次元（３Ｄ）の球体に融合した。ウェルの画像は、１０または５対物レンズを使用した位相差顕微鏡を用いて撮られた。
【０１７２】
１１−Ｂｏｙｄｅｎチャンバー中での腫瘍細胞遊走についてのアッセイ
【０１７３】
細胞遊走をＢｏｙｄｅｎチャンバー中で試験した。簡単には、細胞をトリプシン処理し、無血清培地を用いて３回洗浄し、５００００個（ＩＧＲＯＶ、ＢＸＰＣ３）または１０００００個（Ｃａｃｏ２、ＨｕＨ−７）の細胞を、８μmの細孔を伴うトランスウェルインサート（BDFalcon（登録商標）HTS Fluoroblok（商標）インサート）中に加えた。チャンバーの下ウェルを、１０%ＦＣＳを補充した培地で満たした。２１時間のインキュベーション後、遊走細胞を、４μg/mlのカルセイン（Sigma-Aldrich 17783-AM）を用いて１時間にわたり染色した。蛍光遊走細胞の数は、ImageJソフトウェアを使用し、１２の異なる視野においてカウントした。
【０１７４】
１２−放射能標識およびＳＰＥＣＴ−ＣＴイメージング
【０１７５】
１２５Ｉは、Perkin Elmerから得て、６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂは、以前に記載された通り（Santoro et al., 2009）のＩＯＤＯ−ＧＥＮ（Pierce Chemical Co.）を使用し、ＳＰＥＣＴイメージングのために３７０MBq/mgの比活性で放射性標識した。全ての動物実験は、フランス政府のガイドラインおよび実験動物試験のためのInstitut National de la Sante et de la Recherche Medicaleの基準（合意ＣＥＥＡ−ＬＲ−１２０５２）を遵守して実施された。
【０１７６】
ヌードマウス（６〜８週齢の雌無胸腺ヌードマウス）は、Harlan（Gannat, France）から購入し、実験的な使用の前に１週間にわたり順化させた。それらは、１２時間の明暗サイクルを伴う、２２℃、５５%湿度で収容した。食料および水は自由に利用可能であった。マウスは、イメージングの前日にルゴール溶液で強制給餌し、安定なヨウ素を、全実験期間にわたり飲料水に加えた。
【０１７７】
ＳＰＥＣＴ−ＣＴイメージング：全身ＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像を、１６ＭＢｑ／５０マイクログラムの放射性標識１２５Ｉ−６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂの尾静脈注射後、種々の時間（４８、７２、および９６時間）で取得した。マウスを２%イソフルランで麻酔し、４ヘッド多重マルチピンホールNanoSPECTカメラ（Bioscan Inc., Washington, USA）のベッド上に位置付けた。エネルギーウィンドウは、±２０%幅を伴い、２８keVを中心とし、取得時間は、２４投影を伴う、各々の投影について３００００カウントを得るように定めた。画像および最大強度投影（ＭＩＰ）を、専用ソフトウェアInvivoscope（登録商標）（Bioscan, Inc., Washington, USA）およびMediso InterViewXP（登録商標）（Mediso, Budapest, Hungary）を使用して再構築した。同時マイクロＣＴ全身画像は、ＳＰＥＣＴデータを伴う、解剖学的な同時登録について実施した。ＳＰＥＣＴおよびＣＴからの再構成データを可視化し、Invivoscope（登録商標）を使用して同時登録した。
【０１７８】
１３−脾臓内肝コロニー形成モデル
【０１７９】
２０匹の６−８週齢の雌無胸腺ヌードマウスに、２００万個のＳＷ６２０−ＬＵＣ細胞（ルシフェラーゼ発現ＳＷ６２０細胞）を用いて注射した。脾臓を、細胞注射後に除去した。１日目に、マウスを、各々１０匹の２群に無作為に分けた。１群は、１５mg/kgで６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの腹腔内注射を受け、第２群は、賦形剤０．９%  ＮａＣｌだけを受けた。６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂを用いた処置は、１週間当たり１５mg/kgでの３回の注射からなった。週１回、転移の形成および播種を評価するために、ルシフェラーゼ発現を、ルシフェリンの注射後の発光イメージングによりモニターした。手術から５週間目に、マウスを屠殺し、肝臓表面上の転移の数およびサイズを記録した。
【０１８０】
結果：
【０１８１】
１−結腸組織におけるＣＬＤＮ１発現
【０１８２】
各々の患者についての正常粘膜、腺腫、および腺癌のサンプルを含む４５名の結腸直腸癌患者からのＴＭＡを使用し、ＣＬＤＮ１の発現を決定した。本発明者らは、正常粘膜から腺腫まで（ｐ＜０．００１）、腺癌（ｐ＜０．００１）まで、および、腺腫から腺癌（標識細胞または密度について、それぞれｐ＝０．０４７またはｐ＝０．００１）まで、ＣＬＤＮ１染色の統計学的に有意な増加を示した（図１）。この結果は、評価したいずれの基準：標識細胞の%（図１Ａ）または標識強度の平均値（図１Ｂ）でも同じであった。ＣＬＤＮ１免疫組織化学シグナルは、腫瘍細胞の膜ならびに細胞質において見られた。ＣＬＤＮ１染色は、正常粘膜（３９／４５の患者）における、および腺腫の半分（１８／４５）における細胞質中で独占的に見出されたが、腺腫の第２の半分（２５／４５）および腺癌（３６／４５）において、本発明者らは、膜および細胞質の両方の染色を観察した。さらに、腺癌の９%（４／４５）は、独占的に膜染色を呈した（図１Ｃ）。これらの結果は、位置の変化と一緒に、結腸癌におけるＣＬＤＮ１の発現増加を示す。
【０１８３】
２−ヒトＣＬＤＮ１に対するｍＡｂの選択
【０１８４】
ＣＬＤＮ１に対するｍＡｂの選択のために、本発明者らは、ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１細胞（全長ＣＬＤＮ１  ｃＤＮＡを用いた安定なトランスフェクションに続き、ＣＬＤＮ１発現を獲得していたＳＷ４８０）を生成し、陽性標的として使用した。Ｍａｂスクリーニングは、陰性対照としてＳＷ４８０を使用したＦＡＣＳ実験により実施した。確認スクリーニングを、ＳＷ６２０細胞およびＳＷ６２０−ｓｈＣＬＤＮ１細胞で実施した。全てのこれらの株を、最初に、ウエスタンブロットにより、ＣＬＤＮ１発現についてチェックした。このスクリーニングに基づき、本発明者らは、ＣＬＤＮ１に対するｍＡｂを分泌する３つのハイブリドーマを選択した。限界希釈によるその後のクローニング後、本発明者らは６Ｆ６Ｃ３、１４Ｂ７Ｄ４、および１５Ｅ７Ｂ１０と名付けられた３つのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を得た（図２Ｂ）。抗体アイソタイピングによって、６Ｆ６Ｃ３はＩｇＧ３ｋであり、１４Ｂ７Ｄ４および１５Ｅ７Ｂ１０はＩｇＭ抗体であることが明らかになった。
【０１８５】
３−６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂの反応性および特異性の分析
【０１８６】
６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂの特異性は、異なるＣＬＤＮ１発現を伴う結腸直腸細胞株を使用したフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により分析した。ウエスタンブロット実験を結腸直腸癌細胞株（ＳＷ４８０、ＳＷ４８０、ＣＬＤＮ１、ＳＷ６２０、ＳＷ６２０ｓｈＬＵＣ、ＳＷ６２０−ｓｈＣＬＤＮ１、ＨＣＴ１１６、ＬＳ１７４Ｔ、およびＣａｃｏ２を含む）からの全細胞溶解物を使用して実施した。市販の抗ＣＬＤＮ１抗体を使用して、本発明者らは、最初に、細胞株におけるＣＬＤＮ１の全発現を評価し（図３Ａ、３Ｂ）、４つの細胞株がＣＬＤＮ１を発現し（ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１、ＳＷ６２０、ＳＷ６２０ｓｈＬＵＣ、およびＣａｃｏ２）、４つが少数または無のＣＬＤＮ１発現を呈する（ＳＷ４８０、ＳＷ６２０−ｓｈＣＬＤＮ１、ＬＳ１７４Ｔ、ＨＣＴ１１６）ことを示した。次に、本発明者らは、これらの細胞株での６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂの結合をＦＡＣＳによりテストした（図３Ｃ、３Ｄ）。６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂは、ＣＬＤＮ１を発現する結腸癌細胞株だけと反応した。さらに、６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂは、親ＳＷ４８０細胞と反応しなかったが、しかし、その反応性は、ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１を用いて強く増加した。逆に、ＳＷ６２０結腸直腸細胞との６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂの反応性は、ＣＬＤＮ１発現が、ＣＬＤＮ１特異的ｓｈＲＮＡを用いた形質導入によりノックダウンされた場合、少なくとも８５%だけ低下した。
【０１８７】
ＣＬＤＮ１への６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂの結合をさらに評価するために、細胞溶解物をＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１およびＳＷ４８０から調製し、次に、免疫沈降分析に供した。その結果、６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂは、ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１溶解物上だけで、ＣＬＤＮ１を特異的に沈殿させた（図３Ｅ）。
【０１８８】
免疫蛍光試験により、本発明者らは、６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂが、非透過処理ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１の表面には結合することができるが、ＳＷ４８０細胞には結合することができないことを示した（図３Ｆ）。まとめると、これらの結果は、６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂが、ＣＬＤＮ１について特異的であることを示唆する。
【０１８９】
最後に、６Ｆ６Ｃ３のＣＬＤＮ１結合が、ＢＩＡＣＯＲＥ分析により確認された（図３Ｇ）。Ｂｉａｃｏｒｅ分析は、Cancer Research Institute Montpellierに位置する相互作用施設（ＰＰ２Ｉプラットフォーム、M. Pugnieres）を使用して実施した。相互作用ＣＬＤＮ１および６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂは、BIACORE3000機器を使用した表面プラズモン共鳴（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）により決定した。ＣＬＤＮ１−膜抽出物をＨＰＡセンサーチップ表面上に固定化した。特異的な相互作用は、６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂだけで見られ、無関係な抗体では見られなかった（図３Ｇ）。
【０１９０】
本発明者らは、また、ＣＬＤＮ１発現について、他の癌細胞株（卵巣、膵臓、乳房、および前立腺）をテストしている。本発明者らは、最初に、ウエスタンブロッティングにより、市販の抗ＣＬＤＮ１抗体を使用して全ＣＬＤＮ１発現を評価した（図４Ａ）。このように、本発明者らは、ＦＡＣＳにより、６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂの反応性をテストした。ＣＬＤＮ１を過剰発現する４つの細胞株（ＢＸＰＣ３、ＰＡＮＣ−１、ＳＫＯＶ−３、およびＩＧＲＯＶ−１）は６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂによって認識されたのに対して、任意の反応性は、ＣＬＤＮ１陰性細胞株を用いて見られた（図４Ｂ）。これらの結果によって、６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂのヒトＣＬＤＮ１特異性が確認された。また、これらの細胞株を使用し、他の癌型に対する６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂの生物学的効果をテストすることができる。
【０１９１】
４−他のＣＬＤＮとの交差反応性の分析
【０１９２】
ＣＬＤＮ８のヒトｃＤＮＡクローン（sc320974, Origene technologies, USA）およびＣＬＤＮ１のマウスｃＤＮＡクローン（IRAVp968A105D, LifeScience）の、ＳＷ４８０細胞での一過性トランスフェクション後、本発明者らは、ＦＡＣＳにより６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂの交差反応性を分析した。図５Ａに示す通り、全てのトランスフェクションが、トランスフェクトＣＬＤＮの過剰発現を示し、既に記載された通り、ＳＷ４８０は、ＣＬＤＮ７ならびにＣＬＤＮ３およびＣＬＤＮ４を発現した（Dhawan et al., 2011）。６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂは、ＳＷ４８０−ｍＣＬＤＮ１とも、ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ８とも、ＳＷ４８０とも反応しなかった（図５Ｂ）。これらの結果は、６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂがＣＬＤＮ８、ＣＬＤＮ７、ならびに、恐らくは、ＣＬＤＮ３およびＣＬＤＮ４を認識しなかったことを示す。さらに、６Ｆ６Ｃ３は、細胞外レベルでヒトＣＬＤＮ１と９４%および９２%の同一性を有するマウスＣＬＤＮ１と交差反応しなかった（表２）。
【表２】
2016528221.tif 000003
【０１９３】
５−  ｍＡｂ６Ｆ６Ｃ３のインビトロでの生物学的効果
【０１９４】
生存。細胞の生存に対する６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂの効果は、コロニーに成長する単一細胞の能力に基づく、クローン原性アッセイによりテストされた（Franken et al., 2006）。６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂによる処理によって、Ｃａｃｏ２結腸直腸癌細胞についてのコロニー形成細胞の数が低下した（図６Ａ）。この低下は濃度依存的であった。なぜなら、それは５０μg/mlでの６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂについて３７%および１００μg/mlについて６８%であったためである（図６Ｂ）。観察された効果がＣＬＤ１に特異的であることを確認するために、本発明者らは、ＣＬＤＮ１を過剰発現する他の６つの細胞株（ＢＸＰＣ３、ＰＡＮＣ−１、ＳＫＯＶ−３、ＩＧＲＯＶ−１、ＨｕＨ−７、およびＳＷ６２０）で、および陰性対照としてのＳＷ４８０でクローン原性アッセイを実施した。図６Ｃに示す通り、６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂは、ＣＬＤＮ１陰性細胞株ＳＷ４８０を除く全ての細胞株についてコロニーの形成を阻害することができ、この効果が、６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂによるＣＬＤＮ１結合に特異的であることを示している。
【０１９５】
成長。細胞成長に対する６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂの効果を３Ｄ培養中で試験した。３Ｄ球体の形状は、使用した細胞株に依存して変動した。ＳＷ４８０およびＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１は、単一の堅固な球状の、および規則的なスフェロイドを形成し、ＨｕＨ−７も形成したが、しかし、それほど規則的ではなく、マイクロスフェロイドを伴い、ＳＷ６２０は凝集体を形成した（図７）。細胞を６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂとインキュベートした場合、本発明者らは、３つのＣＬＤＮ１陽性細胞株について、非処理細胞または無関係のｍＡｂで処理した細胞と比較し、球の大きさの減少を観察した（図７）。任意の効果が、ＣＬＤ１陰性細胞株ＳＷ４８０で示された。これらの結果によって、６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂが、ＣＬＤＮ１陽性細胞株の細胞成長に影響することが実証された。
【０１９６】
遊走。遊走に対する６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの効果を、Ｂｏｙｄｅｎチャンバーアッセイにより測定した。細胞を、６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂまたは無関係のｍＡｂにより処理した。結果（図８）によって、６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂが、テストした全てのＣＬＤＮ１陽性細胞株の遊走に有意に影響することができることが示された。
【０１９７】
まとめると、膜ＣＬＤＮ１上の６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの結合は、ＣＬＤＮ１陽性細胞株の成長および生存、ならびにそれらの遊走能に影響する。
【０１９８】
６−生体分布
【０１９９】
腫瘍取り込み、およびインビボでＣＬＤＮ１を特異的に標的とする６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂの能力を決定するために、本発明者らは、小動物ＳＰＥＣＴ／ＣＴ試験（単一光子放射型コンピュータ断層撮影法）を実施した（M. Busson, Plate-forme Imagerie du Petit Animal par Bioluminescence et Scintigraphie, IRCM）。２匹の雌の無胸腺ヌードマウスに、右脇腹中にＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１（３．１０６）細胞を、左脇腹中にＳＷ４８０を注射することにより、皮下に移植した。５０μg（５００μＣｉ）の１２５Ｉ標識６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの静脈内注射を、腫瘍が１００mm3に達した場合に実施した。次に、ＣＴおよびＳＰＥＣＴスキャンを、注射後４８時間、７２時間、および９６時間に取得した。４８時間目に、本発明者らは、ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１移植腫瘍中および胃中およびラダー中に、１２５Ｉ標識６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの強い局在化を観察したが、ＳＷ４８０移植腫瘍中では観察しなかった。注射後７２時間目のＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングによって、ＳＷ４８０−ＣＬＤＮ１移植腫瘍中だけで１２５Ｉ標識６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの高い特異的な取り込みが示された（図９）。この結果によって、インビボで、ヒトＣＬＤＮ１への６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂの特異性が確認される。
【０２００】
７−インビボでの腫瘍成長阻害試験：
【０２０１】
全てのインビボ実験が、実験動物試験のためのフランスのガイドライン（合意ＣＥＥＡ−ＬＲ−１２０５３）に準拠して実施された。ヌードマウス（６〜８週齢の雌無胸腺ヌードマウス）は、Harlan（Gannat, France）から購入した。
【０２０２】
ＳＷ６２０（３．１０６）細胞を培養培地中に懸濁し、無胸腺ヌードマウスの右脇腹中に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍を持つマウスは、腫瘍がほぼ同じ容積（１００mm3）に達した際に、無作為に異なる群にした。マウスは、０．９%ＮａＣｌまたはｍＡｂ６Ｆ６Ｃ３を用いて腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により処置した。注射したｍＡｂの量は、１５mg/kg/注射であった（第１実験について連続的に３週間にわたり週２回、および第２実験について１５mg/kgで週３回注射）。
【０２０３】
腫瘍の寸法を、キャリパーを用いて隔週で測定し、以下の式により算出した：Ｄ１×  Ｄ２×Ｄ３／２。
【０２０４】
結果は、異種移植マウスの腫瘍成長速度により表され（図１０Ａ）、ｍＡｂ６Ｆ６Ｃ３処置群が、対照群と比較して、有意な（ｐ＝００１８）成長の低下を有することを示した。また、この効果は用量依存的であった。なぜなら、本発明者らは、第１実験と第２実験の間に有意な成長の差（ｐ＝０．０１１）を観察したからである。
【０２０５】
適合させたカプラン−マイヤー生存曲線は、腫瘍が１５００mm3の決定された量に到達するために要した時間を使用し（図１０Ｂ）、遅延の中央値が、対照ＮａＣｌ群と比較して、処置群について７日長いことを示した。（遅延の中央値は、マウスの５０%が、決定された容積に達する腫瘍を有する時間として定義した）
【０２０６】
８−脾臓内肝コロニー形成
【０２０７】
肝臓における転移の形成に対するｍＡｂ６Ｆ６Ｃ３の効果を評価するために、ＳＷ６２０−ＬＵＣ細胞を、脾臓内／門脈経路を通じてマウス中に注射した。マウスは、６Ｆ６Ｃ３ｍＡｂを用いて処置されている、または処置されていなかった。実験のエンドポイントで、肝臓を検証し、転移の数を両群において決定した。以前の報告（Dhawan et al., 2005）と一致して、ＳＷ６２０は肝臓に転移していた。対照群において、肝臓は、処置群と比較して、より高い率で侵入することが示された（図１１Ａ）。実際に、転移の数の中央値は、対照群において増加した（図１１Ｂ）。さらに、対照群において、全てのマウスが転移を有し、５０%が１０を上回る肝転移を有していたが、処置群のマウスの３０%が無転移または微小転移だけを有した（図１１Ｃ）。
【０２０８】
９−  ｍＡｂ６Ｆ６Ｃ３の配列：
【０２０９】
本発明者らは、前記６Ｆ６Ｃ３  ｍＡｂの軽鎖および重鎖の可変ドメインをクローン化し、特徴付け、このように、前記抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を決定した。モノクローナル抗体は、ＩｇＧ３重鎖およびカッパ軽鎖の免疫グロブリンである（表１上記）。
参考文献：
【０２１０】
本願を通して、種々の参考文献が、本発明が関係する技術分野の状態を記載する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により、本明細書により組み入れられる。
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【図１Ａ】
2016528221.tif 000004
【図１Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図６Ａ】
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【図８Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｇ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ｂ】
2016528221.tif 000023
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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