(57)【要約】哺乳動物細胞内で生物活性タンパク質を発現させるための方法および構築物を提供する。一次転写単位および１つまたは複数の二次転写単位を含み、一次転写単位はプロモーター、合成イントロン、選択可能なマーカー遺伝子、およびポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターをコードし、第２の転写単位はプロモーターおよびインスレーター配列で囲まれた目的のポリペプチドをコードし、一次転写単位のイントロン内に配置される、生物活性化合物の産生のために従来にない発現ベクターを作製するための方法が開示される。開示される合成イントロンは、コード配列の５末端に配置され、合成イントロンは二次転写単位を導入して、塩基対は５００〜６０００以上に及んでもよい。【選択図】図１
2016514477.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物活性化合物の産生のための発現カセットであって、二次転写単位の少なくとも１つを含む一次転写単位を含み、
前記一次転写単位はプロモーター１、合成イントロン、選択可能なマーカー遺伝子と、ポリアデニル化シグナルおよび転写ターミネーターの少なくとも１つとの配列をさらに含み、
前記合成イントロンは前記選択可能なマーカー遺伝子のコード配列の５’末端に配置される、発現カセット。
【請求項２】
前記選択可能なマーカー遺伝子はネオマイシン耐性遺伝子およびハイグロマイシン耐性遺伝子の少なくとも１つである、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項３】
前記二次転写単位は約５００〜約６０００に及ぶ塩基対を含む、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項４】
前記プロモーター１は誘導性プロモーターである、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項５】
前記二次転写単位はプロモーター２と、インスレーター配列で囲まれた目的のポリペプチド配列とを含み、前記一次転写単位の前記合成イントロン内に配置される、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項６】
前記目的のポリペプチドはモノクローナル抗体の軽鎖およびモノクローナル抗体の重鎖の少なくとも１つである、請求項５に記載の発現カセット。
【請求項７】
前記プロモーター１および前記プロモーター２は頭尾方向にタンデムに存在する、請求項５に記載の発現カセット。
【請求項８】
前記発現カセットは原核生物宿主および真核生物宿主の少なくとも１つで複製することができるベクターにクローニングされる、請求項５に記載の発現カセット。
【請求項９】
前記一次転写単位はタンデムに配置された第１の二次転写単位および第２の二次転写単位を含み、
前記第１の二次転写単位はプロモーター２と、増幅遺伝子およびレポーター遺伝子の少なくとも１つとの配列を含み；
前記第２の二次転写単位はプロモーター３および目的のポリペプチドの配列を含む、
請求項１に記載の発現カセット。
【請求項１０】
前記目的のポリペプチドはモノクローナル抗体の軽鎖およびモノクローナル抗体の重鎖の少なくとも１つである、請求項９に記載の発現カセット。
【請求項１１】
前記プロモーター１、前記プロモーター２および前記プロモーター３は頭尾方向にタンデムに存在する、請求項９に記載の発現カセット。
【請求項１２】
前記発現カセットは原核生物宿主および真核生物宿主の少なくとも１つで複製することができるベクターにクローニングされる、請求項９に記載の発現カセット。
【請求項１３】
真核細胞内で目的のタンパク質を発現させる方法であって、
二次転写単位の少なくとも１つを含む一次転写単位を含む発現カセットを構築するステップであって、前記一次転写単位はプロモーター１、合成イントロン、選択可能なマーカー遺伝子と、ポリアデニル化シグナルおよび転写ターミネーターの少なくとも１つとの配列をさらに含み、前記二次転写単位は目的のポリペプチドおよび増幅遺伝子の少なくとも１つをコードする、ステップ、
前記発現カセットをベクターにクローニングするステップ、
前記ベクターを真核細胞にトランスフェクトするステップ、
安定な細胞の選択のための選択培地で前記真核細胞を増殖させるステップ、
前記真核細胞を栄養培地で増殖させるステップ、および
前記目的のタンパク質をその発現後に回収するステップ
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本主題は全般的に宿主細胞における生物活性タンパク質の発現の分野に関する。より詳細には本主題は、目的のタンパク質を含む発現カセットの構築、および宿主細胞内でタンパク質を発現させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、機能的な形態でＤＮＡを宿主生細胞に導入するための方法が発見され、多くの基本的な生物学的プロセスを理解する鍵になっている。こうした方法は、多くの重要なタンパク質および他の分子を商業的に有用な量で産生するのに使用される。
【０００３】
一般に、上記に開示された方法にはいくつかの共通の問題があり、そうした問題は、所望のタンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞に導入して発現させ得る効率を制約する場合がある。１つの問題は、ＧＯＩ（ｇｅｎｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ：目的の遺伝子）を含む細胞と、導入手順後も生存しているが、ＧＯＩを含まない細胞とを区別することである。もう１つの問題は、遺伝子を含み、かつ遺伝子によりコードされた高レベルのタンパク質を発現している細胞を同定および単離することである。
【０００４】
さらに、ヒト疾患に関連する新規な遺伝子の同定および過剰発現も、新規な治療薬剤の開発に向けた重要なステップである。細胞のタンパク質過剰発現を起こすにはｃＤＮＡのクローニングが行われ、こうした細胞は、寄託ライブラリーに寄託される。したがって、このアプローチを用いて新規な遺伝子を同定するため、遺伝子は、寄託ライブラリーで十分に再現されるように十分なレベルで細胞に発現しなければならない。これは、多くの遺伝子は非常に低量で、稀な細胞集団においてまたは短い発生期間においてしか発現しないので問題となる。
【０００５】
さらに、一部のｍＲＮＡはサイズが大きいため、生物活性タンパク質を発現できる全長ｃＤＮＡ分子を産生することは、困難または不可能である。全長ｃＤＮＡ分子が得にくいことは、小さなｍＲＮＡでも観察されており、逆転写により生成される哺乳動物発現系であるメッセージ内の配列、または細菌の増殖中の不安定なメッセージ内の配列に関係すると考えられる。このため、最も完全なｃＤＮＡ寄託ライブラリーでも、考えられる遺伝子の完全なセットのごく一部しか発現しない。
【０００６】
前述の考察を踏まえれば、極めて有用な生物活性タンパク質を哺乳動物宿主細胞内で定常発現させるため、新規な方法および新規な全長構築物が求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以下は、読者に基本的な理解を提供するため本開示の簡単な概略を示す。この概略は、本開示の詳細な概要ではなく、本開示の重要／必須な要素を特定する、または本発明の範囲を詳述するものではない。
【０００８】
本主題の例示的な目的は、プロモーター、合成イントロン、真核宿主細胞において機能的な選択可能なマーカーポリペプチド、ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターをコードする一次転写単位を含むＤＮＡ分子を提供することである。一次転写単位の合成イントロンは、プロモーターおよび目的のポリペプチドをコードする第２の転写単位を含む。
【０００９】
本主題の別の例示的な目的は、プロモーター、合成イントロン、真核宿主細胞において機能的な選択可能なマーカーポリペプチド、ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターをコードする一次転写単位を含むＤＮＡ分子を提供することである。２つの転写単位を含む一次転写単位の合成イントロンは、プロモーター、増幅可能な遺伝子または蛍光レポータータンパク質、およびプロモーター、目的のポリペプチドをコードする。
【００１０】
本主題の別の例示的な目的は、選択可能なマーカータンパク質が、抗生物質などの選択剤の致死作用および／または成長阻害作用に対して耐性を与えることである。
【００１１】
本主題の別の例示的な目的は、誘導性プロモーターを用いて選択可能なマーカータンパク質の調節可能な発現を開発することである。
【００１２】
本主題の別の例示的な目的は、最適な翻訳開始配列を含む目的のポリペプチドコード配列を開発することである。
【００１３】
本主題の別の例示的な目的は、発現の改善およびスプライシング能力のための必要な配列をすべて導入できる合成イントロンを開発することである。
【００１４】
本主題の別の例示的な目的は、５００塩基対から６０００塩基対以上という長い合成イントロンを開発することである。
【００１５】
ある種の実施形態では、目的のポリペプチドは、多量体タンパク質、たとえば免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の一部である。本発明はまた、本発明によるＤＮＡ分子を含む宿主細胞を提供する。
【００１６】
本発明の他の目的および利点は、好ましい実施形態の以下の詳細な説明を添付図面と共に読めば、当業者に明らかになるであろう。添付図面において、同様の要素に対して同様の参照番号を使用した。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】複数のプロモーターをタンデムで使用して、選択可能なマーカー遺伝子および目的のポリペプチドの発現を誘導することを模式的に示す。
【図２】複数のプロモーターをタンデムで使用して、選択可能なマーカー遺伝子、増幅可能な遺伝子／レポータータンパク質遺伝子および目的のポリペプチドの発現を誘導することを模式的に示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｇは長さの異なる合成イントロンを有するプラスミドを示す図である。
【図４】図４Ａ〜４ＣはｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎプラスミドの構築を示す図である。
【図５】図５Ａ〜５ＣはｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−ＧＦＰの構築を示す図である。ｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−ＧＦＰは、ＰＵＢ−ＣＥ−１００−ＮのＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩフラグメント（３５５５ｂｐ）をＰＵＢ−ＧＦＰのＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩフラグメント（１５４０ｂｐ）と連結することにより構築した。
【図６】５００〜６０００塩基対のサイズが異なる合成イントロンを含む様々なベクター間の発現の比較を示す図である。
【図７】ｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−ＧＦＰプラスミドの機能性を試験するための一過性発現アッセイを示す図である。
【図８】ｐＵＢ−ＧＦＰおよびｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−ＧＦＰを用いて生じたＣＨＯＫ１の安定なプール間のＧＦＰ発現の比較を示す図である。
【図９】ｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−ＧＦＰを用いて生じた安定なＧＦＰ発現プールとクローンとのＧＦＰ発現の比較を示す図である。
【図１０】ｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−Ａｂ−ＬｃおよびｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｈ−Ａｂ−Ｈｃプラスミドの構築を示す図である。ｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−Ａｂ−Ｌｃは、ＰＵＢ−ＣＥ−１００−ＮのＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩフラグメント（３５５５ｂｐ）を、ＰＵＢ−Ａｂ−ＬｃプラスミドのＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩフラグメント（１５１０ｂｐ）と連結することにより構築した。ｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｈ−Ａｂ−Ｈｃを構築して、ＰＵＢ−ＣＥ−１００−ＨのＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩフラグメント（３８３７ｂｐ）を、ＰＵＢ−Ａｂ−ＨｃプラスミドのＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩフラグメント（２２２４ｂｐ）と連結した。
【図１１】ｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−Ａｂ−ＬｃおよびｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｈ−Ａｂ−Ｈｃを用いて生じたｍＡｂ産生クローンの流加培養試験を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本開示は、その用途において、以下の記載に示したまたは図面に図示した構成の詳細および要素の配置に限定されるものではないことが理解されよう。本開示は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施または行うことができる。さらに、本明細書に使用した表現および用語は、説明を目的とするものであり、限定するものと見なしてはならないことも理解されよう。
【００１９】
「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「を有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびその変化形を使用することは、その後に記載された項目およびその等価物、ならびに追加項目を包含することを意図している。本明細書において「１つの（ａおよびａｎ）」は、量の限定を示すものではなく、むしろ言及された項目の少なくとも１つが存在することを示す。さらに、本明細書において「第１の」、「第２の」および「第３の」ならびに同種のものの用語を使用することは、任意の順序、量または重要性を示すものではなく、むしろある要素を別の要素と区別するために使用される。
【００２０】
図１は、複数のプロモーターをタンデムで使用して、選択可能なマーカー遺伝子および目的のポリペプチドの発現を１つの転写単位において誘導することを模式的に示す。プロモーター−１−合成イントロン−ネオマイシン−ポリアデニル化シグナルは一次転写単位であり、プロモーター−２−目的のポリペプチドは第２の転写単位であり、合成イントロンの一部である。
【００２１】
本開示の例示的態様によれば、スプライスドナー（ＳＤ：Ｓｐｌｉｃｅ  ｄｏｎｅｒ）およびスプライスアクセプター（ＳＡ：Ｓｐｌｉｃｅ  ａｃｃｅｐｔｏｒ）により形成された合成イントロンのスプライシングによって、プロモーター−１からの転写の結果、選択可能なマーカー遺伝子が発現する。
【００２２】
本開示の非限定的な例示的態様によれば、真核生物の転写は５’キャップ依存性であるため、プロモーター２からの転写の結果、目的のポリペプチドが発現する。目的のポリペプチドは発現するが、選択可能なマーカー遺伝子は発現しない。
【００２３】
本開示の例示的態様によれば、プロモーター１は、選択可能なマーカー遺伝子の発現を調節することで選択しやすくするため、誘導性プロモーターであってもよい。プロモーター２は、目的のポリペプチドの高発現が得られる構成的プロモーターであってもよい。
【００２４】
本開示の非限定的な例示的態様によれば、一次転写単位のイントロン内のプロモーター２および目的のポリペプチドのクローニングにより、選択後に目的のポリペプチドの安定な１００％発現プールが得られ、これにより高発現細胞株の単離の可能性が高まる。
【００２５】
図２は、複数のプロモーターをタンデムで使用して、選択可能なマーカー遺伝子、増幅可能な遺伝子またはレポータータンパク質遺伝子、および目的のポリペプチドの発現を１つの転写単位において誘導することを模式的に示す。プロモーター−１−合成イントロン−選択可能なマーカー遺伝子−ポリアデニル化シグナルが一次転写単位であり、プロモーター−２−増幅可能な遺伝子およびプロモーター３−目的のポリペプチドが、一次転写単位の合成イントロン内にタンデムにクローニングされた二次転写単位である。本開示の非限定的な例示的態様によれば、スプライスドナー−１（ＳＤ−１）およびスプライスアクセプター（ＳＡ）により形成された合成イントロンのスプライシングによって、プロモーター−１からの転写の結果、選択可能なマーカー遺伝子が発現する。
【００２６】
本開示の例示的態様によれば、プロモーター２からの転写の結果、増幅可能な遺伝子またはレポーター遺伝子が発現する。真核生物の転写は５’キャップ依存性である。増幅可能な遺伝子またはレポータータンパク質は発現するが、選択可能なマーカー遺伝子は発現しない。
【００２７】
本開示の非限定的な例示的態様によれば、真核生物の転写は５’キャップ依存性であるため、プロモーター３からの転写の結果、目的のポリペプチドが発現する。目的のポリペプチドは発現するが、選択可能なマーカー遺伝子は発現しない。
【００２８】
本開示の例示的態様によれば、プロモーター１は、選択可能なマーカー遺伝子の発現を調節することで選択しやすくするため、誘導性プロモーターであってもよく、プロモーター２は、増幅可能な遺伝子またはレポータータンパク質遺伝子の発現を調節するため、必要に応じてスイッチをオンにできる誘導性プロモーターであってもよい。プロモーター３は、目的のポリペプチドの高発現を可能にする構成的プロモーターであってもよい。
【００２９】
本開示の非限定的な例示的態様によれば、一次転写単位のイントロン内のプロモーター２−増幅可能な遺伝子またはレポータータンパク質およびプロモーター３−目的のポリペプチドのクローニングにより、選択後に増幅可能な遺伝子またはレポータータンパク質および目的のポリペプチドの安定な１００％発現プールが得られる。増幅可能な遺伝子またはレポータータンパク質は、高発現細胞株の増幅または選択の改善の一助となり、増幅可能な遺伝子を発現する細胞はすべて、多量の目的のポリペプチドも発現することで、高発現細胞株の単離を容易にする。
【００３０】
本開示の非限定的な例示的態様によれば、ＤＮＡ分子は、機能的な選択可能なマーカーポリペプチドをコードする配列を含み、そうしたＤＮＡ分子は、真核宿主細胞において機能的な選択可能なマーカーポリペプチドの翻訳開始効率を低下させる突然変異を含むことを特徴とする。好ましくは、そうしたＤＮＡ分子は、ＧＴＧまたはＴＴＧ開始コドンに続いて他の機能的な選択可能なマーカーコード配列を含む。
【００３１】
本開示の例示的態様によれば、目的のポリペプチドを発現する宿主細胞を得るための方法が開示される。本方法は、発現カセットを複数の前駆宿主細胞に導入すること、選択可能なマーカーポリペプチドの発現を選択する条件下でその細胞を培養すること、および目的のポリペプチドを産生する１つまたは複数の宿主細胞を選択することを含む。
【００３２】
本開示の非限定的な例示的態様によれば、目的のポリペプチドを産生するための方法が開示される。本方法は、宿主細胞および発現カセットを含む宿主細胞を培養することと、発現カセットから目的のポリペプチドを発現させることとを含む。その好ましい実施形態では、目的のポリペプチドはさらに、宿主細胞および／または宿主細胞培養基から単離される。
【００３３】
本開示の例示的態様によれば、発現カセットはさらに、マトリックスまたは足場付着領域（ＭＡＲ／ＳＡＲ：ｍａｔｒｉｘ  ｏｒ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）、インスレーター配列、遍在性クロマチンオープナーエレメント（ＵＣＯＥ：ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｏｐｅｎｅｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）およびアンチリプレッサー配列からなる群から選択される少なくとも１つのクロマチン制御エレメントを含む。発現カセットはさらに、合成イントロンにおいて目的のポリペプチドの発現を誘導するプロモーターの上流、および目的のポリペプチドの下流に位置する。
【００３４】
図３Ａ〜３Ｇは、様々な長さの合成イントロンを有するプラスミドを示す図である。本プロジェクトに使用したプラスミドは、様々な用途向けに異なる技術を用いて精製した。クローニングに使用したプラスミドは、アルカリ溶菌法により、またはＵＢ−Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ウシャバイオテック社（Ｕｓｈａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ）、ハイデラバード（Ｈｙｄｅｒａｂａｄ））を使用して常法に従って単離した。ただし、哺乳動物細胞のトランスフェクションでは、プラスミドは、ＵＢ−Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ウシャバイオテック社、ハイデラバード）を用いて単離した。
【００３５】
ＤＮＡの脱塩：
消化されたプラスミドＤＮＡを、ＵＢ−Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて常法に従って精製した。
【００３６】
制限消化：
５〜１０ｕｇのＤＮＡを、製造者により記載された適切な反応条件にて常法に従って１〜５単位（Ｕ）の酵素で消化した。反応は、２０ｕｌの反応容量で推奨温度にて１〜２時間通常通り行った。ＤＮＡフラグメントは、０．８〜１％アガロースゲルを用いた電気泳動後、ＵＶトランスイルミネーターおよびゲルドキュメンテーションシステム（シンジーン（ＳｙｎＧｅｎｅ）、ケンブリッジ、英国）で可視化した。消化されたサンプルと一緒に、市販されているＤＮＡサイズマーカー（１ｋｂおよび１００ｂｐのＤＮＡラダー）を泳動して制限酵素断片のサイズを比較および推定した。
【００３７】
アガロースゲル電気泳動：
プラスミドＤＮＡの分離は、１×トリス酢酸：ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）エレクトロポレーション緩衝液ｐＨ８．３（２ｍＭのトリス−アセテート／０．０５ＭのＥＤＴＡ）中、０．８〜１％アガロースゲル上で常法に従って行った。アガロースゲルを、０．５ｐｇ／ｍｌのエチジウムプロミドを含む１×ＴＡＥ緩衝液にキャストした。ＤＮＡサンプルを１／６容量の６×ローディングダイ（ＮＢＥ、ベバリー、マサチューセッツ州）と混合し、制御された５Ｖ／ｃｍの電圧下、電気泳動に供した。サンプルと一緒に適切なＤＮＡサイズマーカー（１Ｋｂまたは１００ｂｐのＤＮＡラダー）を泳動してＤＮＡフラグメントのサイズおよび濃度を推定した。ＤＮＡは、ＵＶトランスイルミネーターおよびゲルドキュメンテーションシステム（シンジーン、ケンブリッジ、英国）で可視化した。
【００３８】
一過性トランスフェクション：
ＣＨＯ−Ｋ１のリポフェクション：
製造者の指示に従いリポフェクタミン２０００試薬（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いてリポフェクションを行った。簡単に説明すると、５ｕｇのＤＮＡを含む２５０ｕｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地、および１５ｕｌのリポフェクタミン２０００を含む２５０ｕｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地を室温で調製し、５分間インキュベートした。ＤＮＡおよびリポフェクタミン２０００を組み合わせ、一緒にさらに２０分間インキュベートしてから、７０〜８０％コンフルエントで６ウェルプレートの細胞に加えた。４８時間後細胞を、ＦＡＣＳ（ＢＤ）を用いて解析した。
【００３９】
安定トランスフェクション：
エレクトロポレーション：
安定な細胞株の発現のため、エレクトロポレーションを常法に従って使用した。指数増殖期のＣＨＯ−Ｋ１細胞（７０〜８０％コンフルエント）をＥＤＴＡ／ＰＢＳで剥離し、１×ＰＢＳで洗浄し、エレクトロポレーション緩衝液に５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。再懸濁した２００ｕｌの細胞をエレクトロポレーションキュベット（２ｍｍ）（シグマ（ｓｉｇｍａ））に分割し、キュベットに２ｇの直鎖ＤＮＡを加え、ただし、陰性対照には等量の１×ＰＢＳを加えた。Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（エッペンドルフ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ））を用いて細胞を５５０Ｖ、４０μｓｅｃ、１パルスでパルスした。パルス後細胞を３７℃で１０分間インキュベートしてから、５ｍｌの増殖培地に移した。細胞を８００ｒｐｍで１０分間遠心し、次いで１２ｍｌの増殖培地に再懸濁し、Ｔ７５（ＢＤ、インド）のフラスコに移した。トランスフェクションから２４時間後細胞を１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８で選択した。
【００４０】
フローサイトメトリー解析：
提示されたデータはすべて、青色レーザー（４８８ｎｍ励起波長）に同調させたＢＤ（商標）ＬＳＲ  ＩＩ  フローサイトメーターで収集した。データはＨｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。生存集団の特定には前方および側方散乱光のゲーティングを使用し、ダブレットの除去には前方およびパルス幅散乱のゲーティングを使用した。解析は、６００細胞／秒を超えないイベントレートで維持し、１サンプル当たり合計２５，０００イベントを取得した。
【００４１】
限界希釈法による単細胞クローニング：
安定なクローンを限界希釈法により常法に従って単離した。プレーティングの当日、細胞のカウントを行い、細胞を増殖培地で５細胞／ｍｌに希釈し、２００ｕｌ／ウェルでプレーティングした。次いでプレートを３７℃のインキュベーターで１５日間インキュベートした。さらに使用するため、顕微鏡下の観察により単一クローンを含むウェルをマークした。
【００４２】
モノクローナル抗体産生性に関する流加培養試験：
２５０ｍｌの振盪フラスコで流加培養試験を行った。０日目に細胞を遠心し、５×１０５細胞／ｍｌでＰｏｗｅｒ  ＣＨＯ２  Ｍｅｄｉａに再懸濁した。フラスコを振盪させながら３７℃のインキュベーターでインキュベートした。１ｍｌの培養液を２４時間毎に集めて細胞数および抗体産生性を判定した。
【００４３】
図４Ａ〜４Ｃは、ｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎプラスミドの構築を示す図である。ｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎは、ｐＵＢ−ＧＦＰプラスミドのＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩフラグメント（２０８４ｂｐ）を、ＪＭ  １０９で増殖させたｐＭＫ−ＲＱ−ＣＥ１００−ＮプラスミドのＢａｍＨＩフラグメント（１５０６ｂｐ）と連結することにより構築した。
【００４４】
図５Ａ〜５Ｃは、ｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−ＧＦＰの構築を示す図である。ｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−ＧＦＰは、ｐＵＢ−ＣＥ−１００−ＮのＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩフラグメント（３５４９ｂｐ）をｐＵＢ−ＧＦＰのＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩのフラグメント（１５４０ｂｐ）と連結することにより構築した。
【００４５】
図６は、５００〜６０００塩基対のサイズが異なる合成イントロンを含む様々なベクター間の発現の比較を示すグラフである。
【００４６】
図７は、ｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−ＧＦＰプラスミドの機能性を試験するための一過性発現アッセイを示す図である。
【００４７】
図８Ａおよび８Ｂは、ｐＵＢ−ＧＦＰおよびｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−ＧＦＰを安定的にトランスフェクトしたＣＨＯＫ１細胞間のＧＦＰ発現の比較を示すグラフである。
【００４８】
【表１】
2016514477.tif 000003
【００４９】
様々な長さの合成イントロン（ｐＵＢ−ＳＩ−５００−ＧＦＰ、ｐＵＢ−ＳＩ−１０００−ＧＦＰ、ｐＵＢ−ＳＩ−２０００−ＧＦＰ、ｐＵＢ−ＳＩ−４０００−ＧＦＰ、ｐＵＢ−ＳＩ−６０００−ＧＦＰ）を含むプラスミドを、スプライスドナー配列を有するフォワードプライマー、およびスプライスアクセプター配列を有するリバースプライマー（表−１）を用いてＰＣＲ増幅により構築した。ＰＣＲ増幅したフラグメントをｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクターにクローニングし、次いでＳａＩＩおよびｍｌｕＩ制限末端を用いてｐＵＢ−ＧＦＰプラスミドにサブクローニングした。ｐＵＢ−５００−ＧＦＰの構築では、各オリゴのスプライス供与部位およびスプライス受容部位を用いてＰＣＲ増幅を行った。
【実施例】
【００５０】
実施例１
サイズに関するイントロン機能の解析：
イントロンのサイズのスプライシングに対する影響を立証するため、図３Ａ〜３Ｇに示すように一連の発現ベクター（ｐＵＢ−ＳＩ−５００−ＧＦＰ、ｐＵＢ−ＳＩ−１０００−ＧＦＲ、ｐＵＢ−ＳＩ−２０００−ＧＦＰ、ｐＵＢ−ＳＩ−４０００−ＧＦＰ、ｐＵＢ−ＳＩ−６０００−ＧＦＰ）を構築した。合成イントロン（ＳＩ−５００、ＳＩ−１０００、ＳＩ−２０００、ＳＩ−４０００、ＳＩ−６０００）は、Ｂｅｔａ−Ｇｌｏｂｉｎ  Ｌａｒｇｅ  Ｉｎｔｒｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅの最小のスプライスドナーおよび最小のスプライスアクセプター配列を有するフォワードおよびリバースプライマーを用いてＴａｑ  ＤＮＡコード配列のＰＣＲ増幅により構築した。スプライシングの非存在下で発現の対照を得るため、スプライスドナーおよびスプライスアクセプター配列を含まない５００ｂｐフラグメントのプラスミド（ｐＵＢ−５００−ＧＦＰ）も構築した。
【００５１】
発現ベクターｐＵＢ−ＧＦＰ、ｐＵＢ−５００−ＧＦＰ、ｐＵＢ−ＳＩ−５００−ＧＦＰ、ｐＵＢ−ＳＩ−１０００−ＧＦＰ、ｐＵＢ−ＳＩ−２０００−ＧＦＰ、ｐＵＢ−ＳＩ−４０００−ＧＦＰ、ｐＵＢ−ＳＩ−６０００−ＧＦＰ（図３）は、リポフェクタミン２０００を用いてＣＨＯＫ１細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、ＢＤ（商標）ＬＳＲ  ＩＩ  フローサイトメーターを用いて、細胞についてＧＦＰ発現を解析した。ＧＦＰ発現の平均値およびＧＦＰ発現細胞の％を比較し、ＧＦＰ発現の平均値およびＧＦＰ発現細胞の％は、図６に示した通りであった。
【００５２】
合成イントロンを含むプラスミドはすべて、一過性トランスフェクション後にＧＦＰ発現を示した。ｐＵＢ−５００−ＧＦＰはＧＦＰ発現細胞をまったく示さなかったことから、合成イントロンを含むプラスミドからの発現がスプライシングによることが示された。しかしながら、ＧＦＰ発現の平均値およびＧＦＰ発現細胞の％は、合成イントロンのサイズの増加に伴い減少した。合成イントロンのサイズの増加に伴うＧＦＰの平均値およびＧＦＰ発現細胞の％の減少は、プラスミドのサイズによる可能性がある。プラスミドのサイズは、一過性トランスフェクションの効率に影響を与えることが知られている。
【００５３】
上記の実験から、最小合成ドナー配列および最小合成アクセプター配列は、６０００ｂｐ配列まで使えることが立証された。
【００５４】
実施例２
一次転写単位のイントロンにクローニングした二次転写単位からのＧＦＰの発現を試験するための一過性発現アッセイ：
二次転写単位の機能性を試験するため、ネオマイシン耐性遺伝子をコードする一次転写単位の５’イントロンにＣＭＶ−ＧＦＰをクローニングした（図５Ｃ）。ＧＦＰの発現を試験するため、リポフェクタミン法を用いてｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−ＧＦＰをＣＨＯＫ１細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、ＧＦＰ発現細胞を蛍光顕微鏡により解析した。本実験ではｐＵＢ−ＧＦＰ（陽性対照）（図７Ｃ１およびＣ２）およびｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ（陰性対照）（図７Ａ１およびＡ２）を対照として使用した。図７Ｂ１およびＢ２に示すように、ｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−ＧＦＰトランスフェクト細胞におけるＧＦＰ発現の存在から、一次転写単位のイントロン内の二次転写単位の配置がＧＦＰの発現に影響を与えないことが示された。
【００５５】
実施例３：
安定なトランスフェクション後の一次および二次転写単位の機能性の解析：
一次転写単位は、多くの場合、誘導性メタロチオネインプロモーターの制御下にあった、抗生物質で選択可能なマーカー遺伝子であり、二次転写単位は、多くの場合、構成的ＣＭＶプロモーターの制御下にある目的のポリペプチドである。誘導性プロモーターを使用すると、選択後のネオマイシン耐性遺伝子の発現スイッチをオフにするのに資する。一次および二次転写単位の両方の機能性を試験するため、エレクトロポレーションを用いてｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−ＧＦＰをＣＨＯＫ１細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション直後に２５ｎｍのＺｎＳｏ４でネオマイシン耐性遺伝子の発現を誘導した。トランスフェクションから２４時間後、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８で細胞を選択した。トランスフェクションおよび選択から１５日後、ＢＤ（商標）ＬＳＲ  ＩＩ  フローサイトメーターを用いてＧ４１８耐性細胞についてＧＦＰ発現を解析した。ｐＵＢ−ＧＦＰ（ネオマイシンおよびＧＦＰの発現の対照）およびｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ（ネオマイシン耐性遺伝子の発現の対照）もＣＨＯＫ１細胞にトランスフェクトし、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８で選択した。
【００５６】
すべてのプラスミド（ｐＵＢ−ＧＦＰ、ｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ、ｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−ＧＦＰ）が選択後にＧ４１８耐性コロニーを生じたことから、すべてのトランスフェクタントにおいてネオマイシン耐性遺伝子の発現が存在することが示された。しかしながら、安定な組み込みの効率は、ｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎに比較してｐＵＢ−ＧＦＰの方が高いことが明らかになり、ｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎは、ｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−ＧＦＰに比較して高いことが明らかになった（表２）。ｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−ＣＭＶ−ＧＦＰのＧ４１８耐性コロニー数の減少は、一次転写単位（ネオマイシン耐性遺伝子）のイントロン内の二次転写単位（ＣＭＶ−ＧＦＰ）の配置による可能性がある。考えられる理由として、リードスルー転写およびプロモーターオクルージョン（ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）が挙げられる。
【００５７】
【表２】
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【００５８】
トランスフェクションおよび選択から１５日後、ＢＤ（商標）ＬＳＲ  ＩＩ  フローサイトメーターを用いて、安定なプールについてＧＦＰ発現を解析した。ｐＵＢ−ＧＦＰ、ｐＵＢ−ＣＥ−１００−ＮおよびｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−ＧＦＰ間でＧＦＰの平均および発現細胞の％を比較した。ｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−ＧＦＰは、ｐＵＢ−ＧＦＰに比較して０．３倍高いＧＦＰ発現の平均値、および５倍高いＧＦＰ発現細胞の％を示した（図８）。自己蛍光の可能性は、非トランスフェクトサンプルおよびｐＵＢ−ＣＥ−１００−ＮトランスフェクトサンプルでＧＦＰ発現がないため除外された。ｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−ＧＦＰで高いＧＦＰ発現の平均値およびＧＦＰ発現細胞の％が存在することは、選択の改善に起因し得る。
【００５９】
上記の実施例から、一次転写単位（ネオマイシン耐性遺伝子）のイントロン内の二次転写単位（ＧＦＰ）の位置は、ネオマイシン耐性遺伝子の発現に影響を与えたが、ＧＦＰ遺伝子に影響を与えなかったことが立証された。こうした設計はさらに、通常のプラスミドに比較して安定な高発現プールを得るのにも役立つ。高発現プールはさらに、高発現細胞株の迅速な単離にも資する。
【００６０】
実施例４
ｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−ＧＦＰを用いて作製された安定なＧＦＰ発現プールおよびクローンの比較：
その設計が独特で選択条件が厳しいｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−ＧＦＰでは、クローンの安定なプールに似た安定な高発現プールが得られる。クローンとプールとのＧＦＰ発現の平均値および発現集団の％を比較するため、実施例３と同様に安定なトランスフェクションを繰り返した。トランスフェクションから２４時間後、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８で細胞を選択して、Ｔ７５フラスコ中で安定なプールを、９６ウェルプレートで安定なクローンを得た。選択から１５日後、ＢＤ（商標）ＬＳＲ  ＩＩ  フローサイトメーターを用いてＧ４１８耐性プールおよびクローンについてＧＦＰ発現を解析した。
【００６１】
ｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−ＧＦＰの安定なプールは、ＧＦＰ発現の平均値およびＧＦＰ発現集団の％に関してクローンのそれと類似している（図９）。プールの安定性を試験するため、選択を行わずにプールを３０日間培養した。安定なプールは、ＧＦＰ発現集団の％に関して３０日間を超えて不活発で安定であることが明らかになった。しかしながら、ＧＦＰ発現の平均値は、わずかに低下した。
【００６２】
ＧＦＰ発現細胞の高い％、ＧＦＰの高い平均および高い安定性により、ｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−ＧＦＰの安定なプールは、薬剤開発の初期における前臨床材料の生産のためバイオリアクターにスケールアップするのに理想的である。
【００６３】
実施例５
ｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−Ａｂ−ＬｃおよびｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｈ−Ａｂ−Ｈｃプラスミドを用いて作製した抗体産生クローンの流加培養試験：
本発明のベクター系による抗体産生性を軽鎖および重鎖プラスミドのコトランスフェクションにより試験した。この場合、ｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−Ａｂ−Ｌｃのネオマイシン耐性遺伝子のイントロン内に軽鎖を配置し（図１０）、ｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｈ−Ａｂ−Ｈｃのハイグロマイシン耐性遺伝子のイントロン内に重鎖プラスミドを配置した（図１０）。本発明の発現ベクターの効率を試験するため、エレクトロポレーションを用いてｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｎ−Ａｂ−ＬｃおよびｐＵＢ−ＣＥ−１００−Ｈ−Ａｂ−ＨｃをＣＨＯＫ１細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクション直後に２５ｎｍのＺｎＳｏ４でネオマイシン耐性遺伝子およびハイグロマイシン耐性遺伝子の発現を誘導した。トランスフェクションから２４時間後、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８および２００ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンで細胞を選択した。トランスフェクションおよび選択から１５日後、Ｇ４１８およびハイグロマイシン耐性細胞について抗体産生性を解析し、クローンを単離するため細胞を９６ウェルプレートに蒔いた。プレーティングから１５〜２０日後、クローンについて生産性を解析し、流加培養試験用に最良のクローン１つを選定した。
【００６４】
多くの場合、抗体産生に最適な方法である流加培養法でモノクローナル抗体産生性を解析した。流加培養試験は、２５０ｍｌの振盪フラスコで行った。抗体産生クローンを７０ｍｌのＰｏｗｅｒ  ＣＨＯ２培地に５×１０５細胞／ｍｌで播種した。培養液にＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ５を３日目、５日目および７日目に５％量で供給した。サンプルを２４時間毎に集めて細胞数（血球計算器（Ｈａｅｍｏｃｙｔｏｍｅｒ））および抗体産生性（ＥＬＩＳＡ）を判定した。細胞密度および抗体産生性をプロットし、図１１に示した。データから、抗体産生クローンは最大細胞密度６．６４×１０６細胞／ｍｌ、および最大産生性９１１ｍｇ／Ｌを示したことが明らかになった。
【００６５】
さらに、当業者は、前述の記載から本発明が様々な形態で実施できることを理解できるであろう。したがって、本発明の実施形態をその特定の例に関連付けて記載してきたが、図面および以下の特許請求の範囲を検討すれば、他の変形例も当業者には明らかになるため、本発明の実施形態の真の範囲は、そのように限定されるべきではない。
【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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