(57)【要約】  インスリン抵抗性バイオマーカーおよびバイオマーカーを使用する関連する方法が、提供される。バイオマーカーは、血液バイオマーカーであってもよく、Ｃ−ペプチド、インスリン様増殖因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ−２）およびレプチンを含んでいてもよい。長期身体不活動を経験しているまたは近い将来に長期身体不活動を経験することが予想される対象におけるインスリン抵抗性に対する長期身体不活動の効果を低下させるための方法もまた、提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
長期身体不活動を経験しているか、または近い将来に経験することが予想される対象におけるインスリン抵抗性に対する長期身体不活動の効果を低下させるための方法であって、治療有効量のβ−ヒドロキシ−β−メチルブタン酸（ＨＭＢ）またはこの塩を対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項２】
ＨＭＢが、未治療コントロール対象において長期身体不活動と共に生じるＣ−ペプチドの循環レベルの増加、ＩＧＦＢＰ−２の循環レベルの減少および／またはレプチンの循環レベルの増加を和らげるのに十分な、量、方式でおよび時間にわたって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＨＭＢが、未治療コントロール対象において長期身体不活動と共に生じるＣ−ペプチドの循環レベルの増加を低下させるのに十分な、量、方式でおよび時間にわたって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＨＭＢが、未治療コントロール対象において長期身体不活動と共に生じるレプチンの循環レベルの増加を低下させるのに十分な、量、方式でおよび時間にわたって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＨＭＢが、未治療コントロール対象において長期身体不活動と共に生じるＩＧＦＢＰ−２の循環レベルの減少を弱めるのに十分な、量、方式でおよび時間にわたって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＨＭＢが、身体不活動の３日後またはその後に対象から得られる生物学的サンプルにおけるＣ−ペプチドおよび／またはＩＧＦＢＰ−２のレベルを、身体不活動の初めにまたはこの前に対象から得られる生物学的サンプルにおけるＣ−ペプチドおよび／またはＩＧＦＢＰ−２のベースラインレベルと同等に保つのに十分な、量、方式でおよび時間にわたって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
対象が、ヒト対象である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ヒト対象が、成人のヒト対象である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ヒト対象が、高齢のヒト対象である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
長期間の身体不活動を受けているまたは近い将来に受けることが予想される対象におけるインスリン抵抗性に対する介入の効能を評価するための方法であって、
（ａ）対象が身体不活動になる日またはその前に、対象から得られる生物学的サンプルにおけるＩＧＦＢＰ−２、レプチンおよびＣ−ペプチドから選択される１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定するステップ、
（ｂ）対象に介入を施すステップであって、対象が最初に身体不活動になる日またはその前に介入が対象に最初に施されるステップ、
（ｃ）対象が身体不活動になった３日後またはその後に対象から得られる生物学的サンプルにおけるステップ（ａ）において測定される１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定するステップ、
（ｄ）１つ以上のバイオマーカーのそれぞれについて、ステップ（ａ）および（ｃ）において測定されたレベルの間の差異を計算するステップ、
（ｅ）同等の時点で未治療コントロール対象から得られた同等の生物学的サンプルにおける１つ以上のバイオマーカーのレベルの間の差異に基づいて、ステップ（ｄ）において計算された１つ以上の差異を、１つ以上のコントロール値と比較するステップならびに
（ｆ）ステップ（ｄ）において計算された１つ以上の差異が１つ以上のバイオマーカーについてのそれぞれのコントロール値よりも小さい場合、介入が効果的であるとして特徴付けるステップを含む、方法。
【請求項１１】
バイオマーカーが、Ｃ−ペプチドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
バイオマーカーが、ＩＧＦＢＰ−２である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
バイオマーカーが、レプチンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
対象が、ヒト対象である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
対象が、成人のヒト対象である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
対象が、高齢のヒト対象である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
生物学的サンプルが、血液サンプルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
身体不活動が、床上安静である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
長期間の身体不活動を受けているまたは近い将来に受けることが予想される対象におけるインスリン抵抗性に対する介入の効能を評価するための方法であって、
（ａ）対象に介入を施すステップであって、対象が身体不活動になる日またはその前に介入が対象に最初に施されるステップ、
（ｂ）対象が身体不活動になった３日後またはその後に対象から得られる生物学的サンプルにおけるＣ−ペプチドおよびＩＧＦＢＰ−２から選択される１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定するステップ、
（ｃ）１つ以上のバイオマーカーについて１つ以上のベースラインレベルと（ｂ）において測定されたレベルとを比較するステップならびに
（ｄ）１つ以上のバイオマーカーの測定レベルが、それぞれ、１つ以上のバイオマーカーについてのベースラインレベルと同等である場合、介入が効果的であるとして特徴付けるステップを含む、方法。
【請求項２０】
バイオマーカーが、Ｃ−ペプチドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
バイオマーカーが、ＩＧＦＢＰ−２である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
対象が、ヒト対象である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
対象が、成人の対象である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
対象が、高齢のヒト対象である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
介入が、ＨＭＢ、アルファ−ケトイソカプロエート（ＫＩＣ）およびアルファ−ヒドロキシイソカプロエート（ＨＩＣＡ）から選択されるロイシン代謝物質の投与である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
対象における長期身体不活動に関連するインスリン抵抗性に対する介入の効能を特徴付けるためのシステムであって、
（ａ）身体不活動を受けているまたは近い将来に身体不活動を受けることが予想される対象を同定するためのサブシステム、
（ｂ）対象が身体不活動になる日またはその前に（ａ）において同定された対象から生物学的サンプルを得るためのサブシステム、
（ｃ）対象に介入を施すためのサブシステム、
（ｄ）対象が身体不活動になった３日後またはその後に、（ａ）において同定された対象から生物学的サンプルを得るためのサブシステム、
（ｅ）サブシステム（ｂ）および（ｄ）によって得られた生物学的サンプルにおけるＣ−ペプチド、ＩＧＦＢＰ−２およびレプチンからなる群から選択される１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定するためのサブシステムならびに
（ｆ）（ｂ）および（ｄ）のサブシステムによって得られる生物学的サンプルにおける１つ以上のバイオマーカーのレベルにおける差異を計算するためのサブシステムを含む、システム。
【請求項２７】
（ｇ）同等の期間の身体不活動の初めにおよびこの後に未治療コントロール対象から得られた同等の生物学的サンプルにおける１つ以上のバイオマーカーのレベルにおける差異に基づいて、サブシステム（ｆ）によって計算された１つ以上の差異を、コントロール値と比較するためのサブシステムをさらに含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
生物学的サンプルが、血液サンプルである、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２９】
介入が、ＨＭＢ、アルファ−ケトイソカプロエート（ＫＩＣ）およびアルファ−ヒドロキシイソカプロエート（ＨＩＣＡ）から選択されるロイシン代謝物質の投与である、請求項２６に記載のシステム。
【請求項３０】
長期身体不活動を経験しているまたは近い将来に経験することが予想される対象におけるインスリン抵抗性の治療における使用のための組成物であって、β−ヒドロキシ−β−メチルブタン酸またはこの塩を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１４日に提出された米国特許仮出願第６１／７８３，３０１号、２０１３年６月２８日に提出された米国特許仮出願第６１／８４０，９９０号および２０１３年８月１５日に提出された米国特許仮出願第６１／８６６，０６１号の優先権およびあらゆる利益を主張し、これらの全内容は、参照により本明細書において組み込まれる。
【０００２】
本発明の開示は、バイオマーカーに関する。より詳細には、本発明の開示は、血液中のレベルが長期または長期間の身体不活動の間に変化するインスリン抵抗性バイオマーカーおよびこれらのバイオマーカーを使用するための方法に関する。本発明の開示はまた、ヒト対象における長期間の身体不活動に関連するインスリン抵抗性を低下させるまたは弱めるための方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
様々なシナリオで、成人は、長期にわたる床上安静を受けることが必要とされる。例えば、病気、傷害または外科手術により入院している成人は、長期間、床についていることを必要とされるかもしれない。同様に、リハビリセンターにいるまたは家にいる成人は、長期間にわたって寝たきりかもしれないしまたは身体不活動であるかもしれない。
【０００４】
長期にわたる床上安静は、全身および筋肉のインスリン感受性を減少させて（Ａｌｉｂｅｇｏｖｉｃ，Ａ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５８：２７４９−２７５６，２００９）、血中グルコースコントロールを衰えさせ、糖耐性を害することが示された（Ｍｉｋｉｎｅｓ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２５７：Ｅ４３−４８，１９８９）。これらの有害な代謝変化は、不良なクオリティー・オブ・ライフの転帰に至り得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ａｌｉｂｅｇｏｖｉｃ，Ａ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５８：２７４９−２７５６，２００９
【非特許文献２】Ｍｉｋｉｎｅｓ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２５７：Ｅ４３−４８，１９８９
【発明の概要】
【０００６】
ヒト対象においてインスリン抵抗性に対する長期身体不活動の効果を低下させるまたは和らげるための方法が、本明細書において提供される。方法は、長期身体不活動を経験しているまたは近い将来に長期身体不活動を経験することが予想される対象に、治療有効量のβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレート（ＨＭＢ）を投与するステップを含む。ある実施形態では、未治療コントロール対象において長期身体不活動と共に生じる、Ｃ−ペプチド、インスリン様増殖因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ−２）および／またはレプチンの循環レベルの増加または減少を和らげるのに十分な、量、方式でおよび時間にわたって、ＨＭＢが対象に投与される。一実施形態では、未治療コントロール対象において長期身体不活動と共に生じるＣ−ペプチドの増加を低下させるのに十分な、量、方式でおよび時間にわたって、ＨＭＢが投与される。他の実施形態では、未治療コントロール対象において長期身体不活動と共に生じる循環レプチンの増加を低下させるのに十分な、量、方式でおよび時間にわたって、ＨＭＢが投与される。他の実施形態では、未治療コントロール対象において長期身体不活動と共に生じる循環ＩＧＦＢＰ−２の減少を弱めるのに十分な、量、方式でおよび時間にわたって、ＨＭＢが投与される。他の実施形態では、対象が身体不活動になった３日後またはその後に対象から得られる生物学的サンプルにおけるＣ−ペプチドおよび／またはＩＧＦＢＰ−２のレベルを、Ｃ−ペプチドおよび／またはＩＧＦＢＰ−２のベースラインレベルと同等に保つのに十分な、量、方式でおよび時間にわたって、ＨＭＢが投与される。
【０００７】
対象における長期身体不活動に関連するインスリン抵抗性に対する介入の効能を評価するための方法もまた、提供される。一実施形態では、方法が、（ａ）対象が身体不活動になる日またはこの日に先立って、対象から得られる生物学的サンプルにおけるＩＧＦＢＰ−２、レプチンおよびＣ−ペプチドからなる群から選択される１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定するステップ、（ｂ）対象に介入を施すステップであって、対象が身体不活動になる日またはその前に介入が対象に最初に施されるステップ、（ｃ）対象が身体不活動になった３日後またはその後に対象から得られる生物学的サンプルにおける前記１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定するステップ、（ｄ）前記１つ以上のバイオマーカーのそれぞれについて、ステップ（ａ）および（ｃ）において測定されたレベルの間の差異を計算するステップ、（ｅ）同等の時点で未治療コントロール対象から得られた同等の生物学的サンプルにおける前記１つ以上のバイオマーカーのレベルにおける差異に基づいて、（ｄ）において計算された１つ以上の差異を、１つ以上のコントロール値と比較するステップならびに（ｆ）（ｄ）において計算された１つ以上の差異が前記１つ以上のバイオマーカーについてのコントロール値よりも小さい場合、介入が効果的であるとして特徴付けるステップを含む。
【０００８】
他の実施形態では、対象における長期身体不活動に関連するインスリン抵抗性に対する介入の効能を評価するための方法が、（ａ）対象に介入を施すステップであって、対象が身体不活動になる日またはその前に介入が対象に最初に施されるステップ、（ｂ）対象が身体不活動になった３日後またはその後に対象から得られる生物学的サンプルにおけるＣ−ペプチドおよびＩＧＦＢＰ−２から選択される前記１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定するステップ、（ｃ）１つ以上のバイオマーカーについて１つ以上のベースラインレベルと（ｂ）において測定されたレベルとを比較するステップならびに（ｄ）前記１つ以上のバイオマーカーの測定レベルが、それぞれ、前記１つ以上のバイオマーカーについてのベースラインレベルと同等である場合、介入が効果的であるとして特徴付けるステップを含む。
【０００９】
対象における長期身体不活動に関連するインスリン抵抗性に対する介入の効能を決定するためのシステムもまた、提供される。一実施形態では、システムが、（ａ）身体不活動を受けているまたは近い将来に身体不活動を受けることが予想される対象を同定するためのサブシステム、（ｂ）対象が身体不活動になる日またはその前に（ａ）において同定された対象から生物学的サンプルを得るためのサブシステム、（ｃ）対象に介入を施すためのサブシステム、（ｄ）対象が身体不活動になった３日後またはその後に、（ａ）において同定された対象から生物学的サンプルを得るためのサブシステムならびに（ｅ）サブシステム（ｂ）および（ｄ）を使用して得られる生物学的サンプルにおけるＣ−ペプチド、ＩＧＦＢＰ−２およびレプチンから選択される１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定するためのサブシステムならびに（ｆ）サブシステム（ｂ）および（ｄ）を使用して得られる生物学的サンプルにおける１つ以上のバイオマーカーのレベルにおける差異を計算するためのサブシステムを含む。ある実施形態では、システムが、同等の期間にわたって未治療コントロール対象から得られた同等の生物学的サンプルにおける１つ以上のバイオマーカーのレベルにおける差異に基づいて、（ｆ）のサブシステムによって計算された１つ以上の差異を、１つ以上のコントロール値と比較するためのサブシステムをさらに含む。
【００１０】
例示的な一実施形態では、長期身体不活動を経験しているまたは近い将来に経験することが予想される対象におけるインスリン抵抗性の治療における使用のための組成物が、提供される。組成物は、β−ヒドロキシ−β−メチルブタン酸（ＨＭＢ）またはこの塩を含む。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、ここで、より詳細な実施形態に対する参照により説明する。しかしながら、本発明は、様々な形態で例示されてもよいが、本明細書において記載される実施形態に限定されるように解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が、十分で完全なものとなり、当業者らに対して本発明の範囲が十分に伝わるために提供される。
【００１２】
特に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する当技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の説明において本明細書において使用される用語は、特定の実施形態の説明ためだけのものであり、本発明を限定するようには意図されない。本発明および添付の請求項の記載において使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に示さない限り、同様に、複数形を含むことが意図される。
【００１３】
別段の指示がない限り、明細書および請求項において使用される成分の量、分子量、反応条件などのような特性を表現するすべての数は、用語「約」によってすべての事例において修飾されるとして理解されたい。従って、別段の指示がない限り、以下の明細書および請求項において示される数の特性は、本発明の実施形態において得られることが試みられる所望の特性に依存して変動してもよい近似値である。本発明の広範な範囲を示す数の範囲およびパラメーターは、近似値であるにもかかわらず、特定の実施例において示される数値は、できるだけ正確に報告される。あらゆる数値は、しかしながら、それぞれの測定値において見つけられる誤差から必然的に結果として生じる一定の誤差を本質的に含有する。
【００１４】
本明細書において言及される刊行物、特許出願、特許および他の参考文献はすべて、これらの全体が参照により組み込まれる。
【００１５】
本発明の方法は、３つの循環インスリン抵抗性バイオマーカーのレベルが、１０日間の床上安静を受けている１８人の健康な高齢の対象において統計的に著しい量、変化する、即ち増加するまたは減少するという本発明者らの発見に、少なくとも部分的に基づく。方法はまた、ＨＭＢによる介入が、インスリン抵抗性に関連する３つの循環バイオマーカーのレベルにおける変化を改変するという本発明者らの発見に、少なくとも部分的に基づく。
【００１６】
治療方法および組成物
対象におけるインスリン抵抗性に対する長期不活動の効果を弱めるまたは低下させるための方法が、本明細書において提供される。一実施形態では、方法が、長期間の身体不活動を経験しているまたは近い将来に、即ち次の数日間、次の数週間もしくは次の数か月以内に、長期間の身体不活動を経験することが予想されるヒト対象に治療有効量のＨＭＢを投与するステップを含む。例えば、対象は、次の１、２、３、４、５、６か月以内などで、長期間の身体不活動に至り得る処置（例えば外科手術）を受ける予定であってもよい。本明細書において使用されるように、用語「長期間の不活動」は、３日間以上続く不活動の期間を指す。本明細書において使用されるように、用語「身体不活動」は、対象が彼または彼女の肢または身体をめったに移動させない状態または状況を指す。ある実施形態では、本発明の方法およびシステムが、入院を経験している対象に対して使用される。本発明の方法およびシステムは、活性が他人によって制限される対象、例えば、医師または他の医療提供者によって床上安静に制限される対象に対して使用されてもよい。本発明の方法およびシステムは、外科手術、傷害、虚弱質、虚弱、老いなどにより活性が限られている対象に対して使用されてもよい。本発明の方法およびシステムは、身体不活動が自分で決めたものである対象に対して使用されてもよく、例えば、対象が、うつ病である。
【００１７】
長期身体不活動を経験しているまたは近い将来に経験することが予想される対象におけるインスリン抵抗性の治療における使用のための組成物もまた、本明細書において提供される。組成物は、ＨＭＢまたはこの塩を含む。ある実施形態では、対象が、入院を経験している。ある実施形態では、対象の活性が、他人によって制限される、例えば、医師または他の医療提供者によって床上安静に制限される対象である。ある実施形態では、対象が、外科手術、傷害、虚弱質、虚弱、老いなどにより長期身体不活動を経験している。本発明の方法およびシステムは、身体不活動が自分で決めたものである対象に対して使用されてもよく、例えば、対象が、うつ病である。
【００１８】
本明細書において使用されるように、用語「治療有効量」は、インスリン抵抗性に関連する症状、合併症または状態の少なくとも１つの予防、治療または管理において任意の治療上の利益を提供する、ＨＭＢの量を指すとして理解されたい。ある実施形態では、身体不活動が始まる前に、ＨＭＢが、対象に最初に投与される。ある実施形態では、対象が身体不活動になった場合に、即ち、対象が身体不活動になるこの日にまたは対象が身体不活動になった後、１もしくは２日以内に、ＨＭＢが、最初に投与される。ある実施形態では、ＨＭＢが、身体不活動の全期間を通じて対象に投与される。ある実施形態では、ＨＭＢが、身体不活動の期間の前におよびこの一部またはすべてを通じて対象に投与される。ある実施形態では、身体不活動の期間が終了した後、ＨＭＢが、対象に投与される。ある実施形態では、ＨＭＢが、１年間まで、対象に投与される。ある実施形態では、ＨＭＢが、１年間以上、対象に投与される。
【００１９】
ある実施形態では、対象が、成人のヒト対象、即ち２０歳以上の対象である。ある実施形態では、対象が、高齢のヒト対象、即ち５０歳以上のヒト対象である。
【００２０】
ある実施形態では、未治療コントロール対象において長期身体不活動と共に生じる、Ｃ−ペプチド、ＩＧＦＢＰ−２およびレプチンの循環レベルの増加または減少を和らげるのに十分な、量、方式でおよび時間にわたって、ＨＭＢが投与される。一実施形態では、未治療コントロール対象において長期身体不活動と共に生じる循環Ｃ−ペプチドレベルの増加を低下させるのに十分な、量、方式でおよび時間にわたって、ＨＭＢが投与される。他の実施形態では、未治療コントロール対象において長期身体不活動と共に生じる循環レプチンレベルの増加を低下させるのに十分な、量、方式でおよび時間にわたって、ＨＭＢが投与される。他の実施形態では、未治療コントロール対象において長期身体不活動と共に生じる循環ＩＧＦＢＰ−２レベルの減少を弱めるのに十分な、量、方式でおよび時間にわたって、ＨＭＢが投与される。他の実施形態では、身体不活動の３日目またはその後に対象から得られる生物学的サンプルにおけるＣ−ペプチドおよび／またはＩＧＦＢＰ−２のレベルを、身体不活動の期間の初めにまたはこの前に対象から得られる生物学的サンプルにおけるＣ−ペプチドおよび／またはＩＧＦＢＰ−２のベースラインレベルと同等に保つのに十分な、量、方式でおよび時間にわたって、ＨＭＢが投与される。本明細書において使用されるように、２つの生物学的サンプルにおけるバイオマーカーのレベルは、これらが２０％以下しか異ならない場合、「同等である」。
【００２１】
ＨＭＢ
β−ヒドロキシ−β−メチルブタン酸またはβ−ヒドロキシ−イソ吉草酸とも呼ばれる用語ＨＭＢは、遊離酸形態において（ＣＨ３）２（ＯＨ）ＣＣＨ２ＣＯＯＨとして表わすことができる。ＨＭＢはロイシンの代謝物質であり、筋肉におけるα−ケトイソカプロエート（ＫＩＣ）へのアミノ基転移、この後に続く、肝臓の細胞質ゾルにおけるＫＩＣの酸化によってＨＭＢがもたらされる。本発明の関連の範囲内でＨＭＢの任意の適した形態を使用することができるが、好ましくは、ＨＭＢは、遊離酸、塩、エステルおよびラクトンからなる群から選択され、より好ましくは、ＨＭＢは、無毒性で食用の塩の形態をしている。好ましくは、ＨＭＢ塩は水溶性であるまたは患者の胃もしくは腸において水溶性になる。より好ましくは、ＨＭＢ塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、クロム塩およびカルシウム塩からなる群から選択される。しかしながら、他のアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩などのような他の無毒性の塩を使用することができる。
【００２２】
同様に、任意の医薬として許容されるエステルは、本発明の関連において使用することができる。望ましくは、ＨＭＢエステルは、この遊離酸形態をしたＨＭＢに速やかに変換される。好ましくは、ＨＭＢエステルは、メチルエステルまたはエチルエステルである。ＨＭＢメチルエステルおよびＨＭＢエチルエステルは、ＨＭＢの遊離酸形態に速やかに変換される。同様に、任意の医薬として許容されるラクトンは、本発明の関連において使用することができる。望ましくは、ＨＭＢラクトンは、この遊離酸形態をしたＨＭＢに速やかに変換される。好ましくは、ＨＭＢラクトンは、イソバレリルラクトンまたは同様のラクトンである。このようなラクトンは、ＨＭＢの遊離酸形態に速やかに変換される。
【００２３】
ＨＭＢおよびこの誘導体を生成するための方法は、当技術分野においてよく知られている。例えば、ＨＭＢは、ジアセトンアルコールの酸化によって合成することができる。ある適した手順は、Ｃｏｆｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８０：２８８２−２８８７（１９５８）によって記載される。ここに記載されるように、ＨＭＢは、ジアセトンアルコールのアルカリ性次亜塩素酸ナトリウム酸化によって合成される。産物は、遊離酸形態で回収され、これは、所望の塩に変換することができる。例えば、３−ヒドロキシ−３−メチルブタン酸（ＨＭＢＡ）は、冷たい水性のハイポクロライト（漂白剤）を使用する酸化を介して、ジアセトンアルコール（４−ヒドロキシ−４−メチルペンタン−２−オン）から合成することができる。ＨＣｌを使用して反応混合物を酸性化した後、ＨＭＢＡ産物は、酢酸エチルを使用する抽出および抽出混合物から有機層を分離し、保持することによって、回収される。酢酸エチルは、蒸発によって除去され、残留物は、エタノール中に溶解される。Ｃａ（ＯＨ）２の追加および冷却の後に、結晶ＣａＨＭＢはろ過によって回収することができ、結晶は、エタノールにより洗浄され、次いで、乾燥させる。または、ＨＭＢのカルシウム塩は、Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ、ＵｔａｈのＴｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｓｏｕｒｃｉｎｇ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＴＳＩ）から入手可能である。
【００２４】
ＨＭＢを投与するためのルートは、経口の食事、経管栄養法および末梢または完全静脈栄養法を含む。本発明の方法のための好ましい実施形態は、経口ルートによるものである。経口の摂食に対する代替物は、鼻腔、経鼻十二指腸、食道瘻造設、胃瘻造設または空腸瘻造設チューブによる経管栄養法である。
【００２５】
所望の場合、ＨＭＢは、担体を伴うことなく、単独で投与されてもよい。ＨＭＢは、単純に水中に溶解され、患者によって摂取されてもよい。または、ＨＭＢは、食品の上に振りかけられてもよい、コーヒーの中に溶解されてもよい、などであってもよい。患者についての１日の総用量は広く変動するであろうが、典型的に、患者は、少なくとも２ｇ／日のＨＭＢの摂取から利益を得るであろう。または、１日の総用量は、２０から４０ｍｇ／体重ｋｇ／日であってもよい。
【００２６】
さらなる実施形態では、ＨＭＢが、丸剤、カプセル、速やかに溶解される錠剤、ロゼンジなどの中に組み込まれてもよい。活性な用量は、広く変動し得るが、典型的に、２５０ｍｇから１ｇ／用量の範囲にわたり、患者は、最低２ｇ／日の目標を実現するために２から８用量／日を摂取するであろう。このような投薬形態を調製する方法は、当技術分野においてよく知られている。読者の注意は、このような投薬形態を調製する方法についての手引きについてのＲｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最近の版に向けられる。
【００２７】
さらなる実施形態では、ＨＭＢが、アミノ酸などのような他の栄養補助食品と組み合わせられてもよい。このようなサプリメントの１つの例は、Ｊｕｖｅｎ（Ｒ）、１．５グラムのＨＭＢ、５グラムのアルギニンおよび５グラムのグルタミンを含有する粉末（小袋（ｓａｃｈｅｔ））である。
【００２８】
栄養マトリックス
ＨＭＢは、単一の要素として投与されてもよいが、これは、典型的に、食品の中に組み込まれ、患者によって彼らの食事または軽食の間に摂取されるであろう。所望の場合、患者は、単純に、食物の作り方を変更してもよく、彼らは、食品の上に振りかける、コーヒーの中に溶解するなどによって通常摂取する。
【００２９】
さらなる実施形態では、ＨＭＢが、ＨＭＢの嗜好性を増強しおよび代替の形態の選択を増加させ、これによって、患者／消費者の受け入れを増強するように特異的にデザインされた飲料、バー、クッキーなどの中に組み込まれるであろう。
【００３０】
典型的に、ＨＭＢは、食事置換飲料の中に組み込まれるであろう。ＨＭＢはまた、食事置換バーの中に組み込まれてもよい。または、ＨＭＢは、ジュース、炭酸飲料、瓶詰め飲料水などの中に組み込まれてもよい。そのうえ、ＨＭＢは、特異的疾患状態を支持するようにデザインされた医学的栄養物（ｍｅｄｉｃａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ）の中に組み込まれてもよい。このような食品のいずれかを産生する方法は、当業者らによく知られている。以下の議論は、このような食品およびこれらの調製を例証することが意図される。
【００３１】
ほとんどの食事置換産物（例えばバーまたは液体）は、脂肪、炭水化物およびタンパク質由来のカロリーを提供する。これらの産物はまた、これらが唯一の栄養源としての使用に適していることが意図されるので、典型的に、ビタミンおよびミネラルをも含有する。これらの食事置換産物は、唯一の栄養源として役立ってもよいが、これらは典型的に役立たない。個人は、１日当たり１回もしくは２回の食事を補充するためにまたは健康な軽食をまかなうためにこれらの産物を摂取する。本発明の栄養産物は、これらの実施形態のいずれも含むように解釈されるべきである。
【００３２】
栄養処方箋を作製する当業者らに知られているように、食事置換は、適した炭水化物、脂質およびタンパク質を含有するであろう。適した炭水化物は、蝋様または非蝋様の形態をした、コーン、タピオカ、米またはジャガイモから供給される、加水分解された、未変化の、自然におよび／または化学的に修飾されたデンプン；グルコース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、高フルクトースコーンシロップ、コーンシロップ固形物、フラクトオリゴ糖およびこの混合物などのような糖を含むが、これらに限定されない。
【００３３】
適したタンパク質供給源は、ミルク、ホエーおよびホエー画分、大豆、米、肉（例えば牛肉）、動物および野菜（例えばエンドウ、ジャガイモ）、卵（卵アルブミン）、ゼラチンならびに魚を含むが、これらに限定されない。適した未変化のタンパク質供給源は、大豆ベースの、ミルクベースの、カゼインタンパク質、ホエータンパク質、米タンパク質、牛肉コラーゲン、エンドウタンパク質、ジャガイモタンパク質およびこの混合物を含むが、これらに限定されない。
【００３４】
場合により、未変化のタンパク質供給源は、バリン、イソロイシン、ロイシン、トレオニン、チロシンおよびフェニルアラニンを含む大型中性アミノ酸（ＬＮＡＡ）が豊富である。典型的に、カゼイン、ホエーおよび大豆タンパク質供給源の約４０％は、大型中性アミノ酸である。例えば、カゼイネートは、約３８ｗｔ／ｗｔ％  ＬＮＡＡを含有し、ホエータンパク質濃縮物は、約３９ｗｔ／ｗｔ％  ＬＮＡＡを含有し、大豆タンパク質分離物は、約３４ｗｔ／ｗｔ％  ＬＮＡＡを含有する。典型的に、食事置換は、１日当たり約１から２５グラムのＬＮＡＡ、好ましくは１日当たり約１から２０グラムのＬＮＡＡ、より好ましくは１日当たり約４から２０グラムのＬＮＡＡを送達するであろうタンパク質供給源が配合される。例として、４．８グラムのＬＮＡＡを含むタンパク質を含有する、１日当たり３回摂取される食事置換は、１日当たり１４．４グラムのＬＮＡＡを送達する。
【００３５】
食事置換はまた、好ましくは、処方箋を受けている人の毎日の栄養所要量を供給するまたは補足するようにデザインされた量でビタミンおよびミネラルを含有する。当業者らは、栄養処方箋は、多くの場合、これらが産物の有効期間にわたって目標とされるレベルを満たすことを確実にするために、あるビタミンおよびミネラルの過剰量を含むことを認識する。当業者らはまた、あるミクロ成分は、患者が罹患しているあらゆる基礎疾病または疾患に左右されている人々に対して潜在的な有益性を有し得ることをも認識する。例えば、癌患者は、ベータ−カロテン、ビタミンＥ、ビタミンＣおよびセレンのような酸化防止剤から利益を得る。食品は、好ましくは、以下のビタミンおよびミネラルを含むが、これらに限定されない：カルシウム、リン、ナトリウム、塩化物、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレン、ヨウ素、クロム、モリブデン、条件付き必須栄養素ｍ−イノシトール、カルニチンおよびタウリンならびにビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＫおよびＢ複合体ならびにこの混合物。
【００３６】
繊維に加えて、食事置換はまた、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）またはグルコオリゴ糖（ＧＯＳ）などのようなオリゴ糖を含有してもよい。オリゴ糖は、大腸に生息する嫌気性微生物によって短鎖脂肪酸に速やかに広範囲に発酵される。これらのオリゴ糖は、ほとんどのビフィドバクテリウム属種にとって優先的なエネルギー源となるが、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｉｎｇｅｎｓ）、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）またはエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ）などのような潜在的な病原体によって利用されない。
【００３７】
典型的に、ＦＯＳは、０から５ｇ／食事置換の１人分、好ましくは１から５ｇ／１人分、より好ましくは２から４ｇ／食事置換の１人分を含む。
【００３８】
食事置換はまた、この嗜好性を増強するために香料を含有してもよい。人工甘味料は、香料を補足し、塩味を遮断するために追加されてもよい。有用な人工甘味料は、サッカリン、ニュートラスイート、スクラロース（ｓｕｃｒａｌｏｓｅ）、アセスルファーム−Ｋなど（ａｃｅ−Ｋ）を含む。食事置換は、当業者らによく知られている技術を使用して製造することができる。
【００３９】
バー、クッキーなどのような固形組成物は、当業者らに知られている技術を利用して製造されてもよい。例えば、これらは、当技術分野において知られているように冷間押出し技術を使用して製造されてもよい。このような組成物を調製するために、典型的に、粉末状の構成成分はすべて、互いにドライブレンドされるであろう。このような構成要素は、典型的に、タンパク質、ビタミンプレミックス、ある炭水化物などを含む。次いで、脂溶性の構成成分は、互いにブレンドされ、上記の粉末状のプレミックスと混合される。次いで、最終的に、任意の液体構成成分は、組成物の中に混合され、可塑性物質様の組成物または練り粉を形成する。
【００４０】
上記の工程は、冷間成形または押出しとして知られている手順によって、さらなる物理的または化学的変化が生じることなく、次いで形作ることができる可塑性の塊をもたらすことが意図される。この工程では、可塑性の塊は、押出し型を通して比較的低い圧力で押し付けられ、これにより所望の形状が与えられる。結果として生じた押出し物は、次いで、所望の重量の産物をもたらすために適切な位置でカットされる。所望の場合、固形産物は、次いで、嗜好性を増強するためにコーティングされ、分配のためにパッケージされる。
【００４１】
本発明の固形組成物はまた、シリアル、クッキーおよびクラッカーを産生するために、焼付接着（ｂａｋｅｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）または加熱押出し（ｈｅａｔｅｄ  ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）を通して製造されてもよい。当業者は、多くの製造工程の１つを選択することができるであろう。
【００４２】
上記に言及されるように、ＨＭＢはまた、ジュース、非炭酸飲料、炭酸飲料、電解質溶液、風味をつけた水（総称して「飲料」）などの中に組み込まれてもよい。ＨＭＢは、典型的に、０．５から２ｇ／飲料の１人分を含むであろう。このような飲料を産生する方法は、当技術分野においてよく知られている。読者の注意は、米国特許第６，１７６，９８０号明細書および米国特許第５，７９２，５０２号明細書に向けられ、それぞれの内容は、参照によりこれによって組み込まれる。例えば、ＨＭＢを含む成分はすべて、適切な体積の水の中に溶解される。次いで、香料、着色料、ビタミンなどは、場合により追加される。次いで、混合物は、低温殺菌され、パッケージされ、出荷まで保管される。
【００４３】
幾つかの実施形態では、Ｅｎｓｕｒｅ  Ｃｌｅａｒ（Ｒ）などのようなＨＭＢを含有する栄養産物が、脂肪を欠く。
【００４４】
投薬
ヒト対象において長期身体不活動に関連するインスリン抵抗性を低下させるのに十分なＨＭＢの量は、コントロール対象の集団を用いる臨床研究において決定することができる。投薬はまた、長期間の身体不活動を受けている対象に対して最適化することができる。ある実施形態では、投薬が、下記に記載されるように、身体不活動の期間の経過にわたってバイオマーカーの循環レベルをモニターし、ＨＭＢ介入の効能を評価することによって、長期間の身体不活動を受けている対象に対して最適化される。
【００４５】
ある症例では、組成物は、最低２週間、一日に約２回、経口的に投与される；用量は、１日当たり少なくとも約２グラムのＨＭＢ；例えば、典型的な７０ｋｇの人に対して１日当たり１から１０グラム、より理想的には、１日当たり約２から５グラムを提供するのに十分である。体重ベースの投薬は、体重１ｋｇ当たり約０．０１から約０．１０グラム、より理想的には体重１ｋｇ当たり０．０２から０．０７グラムの範囲にわたってもよい。
【００４６】
評価方法
長期身体不活動、例えば床上安静、固定などに関連するインスリン抵抗性に対する介入の効能を評価するための方法およびシステムもまた、提供される。一実施形態では、方法が、（ａ）対象が身体不活動になる日またはその前に、対象から得られる生物学的サンプルにおけるＩＧＦＢＰ−２、レプチンおよびＣ−ペプチドから選択される１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定するステップ、（ｂ）対象に介入を施すステップであって、介入が、身体不活動の期間に先立ってまたはこの期間の初めに対象に最初に施されるステップ；（ｃ）対象が身体不活動になった３日後またはその後に対象から得られる生物学的サンプルにおけるステップ（ａ）において測定される１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定するステップ、（ｄ）（ａ）において測定された１つ以上のバイオマーカーのレベルおよび（ｃ）において測定された１つ以上のバイオマーカーのレベルの間の差異を計算するステップ；（ｅ）同等の時点で未治療コントロール対象から得られた同等の生物学的サンプルにおける１つ以上のバイオマーカーのレベルにおける差異に基づいて、（ｄ）において計算された１つ以上の差異を、１つ以上のコントロール値と比較するステップならびに（ｆ）（ｄ）において計算された１つ以上の差異が１つ以上のコントロール値よりも小さい場合、介入が効果的であるとして特徴付けるステップを含む。
【００４７】
ある実施形態では、方法が、１つ以上のバイオマーカーの１つとしてＣ−ペプチドを用いる。下記の表１において示されるように、Ｃ−ペプチドの循環レベルは、１０日間の床上安静を経験した未治療コントロール対象において増加する。統計的に有意な量、この増加を低下させる介入は、効果的であると特徴付けられる。
【００４８】
ある実施形態では、方法が、１つ以上のバイオマーカーの１つとしてレプチンを用いる。下記の表１において示されるように、レプチンの循環レベルは、１０日間の床上安静を経験した未治療コントロール対象において増加する。統計的に有意な量、この増加を低下させる介入は、効果的であると特徴付けられる。
【００４９】
ある実施形態では、方法が、１つ以上のバイオマーカーの１つとしてＩＧＦＢＰ−２を用いる。下記の表１において示されるように、ＩＧＦＢＰ−２の循環レベルは、１０日間の床上安静を経験した未治療コントロール対象において減少する。統計的に有意な量、この減少を弱める介入は、効果的であると特徴付けられる。
【００５０】
ある実施形態では、介入が、身体不活動の期間の初めに、即ち、身体不活動の期間が始まるこの日に、対象に最初に施される。他の実施形態では、介入が、身体不活動の期間が始まる前に、例えば、身体不活動の期間が始まる１日もしくは２日または数週間前に、対象に最初に施される。ある実施形態では、介入が、試験期間を通じて、継続的に施される。ある実施形態では、介入が、身体不活動の全期間を通じておよび身体不活動の期間が終了した後、対象に施される。従って、介入が対象に施される期間は、身体不活動の期間よりも長くてもよい。
【００５１】
第１の生物学的サンプルは、１つ以上のバイオマーカーについてのベースライン値を決定するために使用される。従って、第１の生物学的サンプルは、身体不活動の期間に先立ってまたはこの期間の初めに対象から得られてもよい。第１の比較生物学的サンプルは、身体不活動の期間が開始した３日後またはその後に、および介入がスタートした３日後またはその後に、対象から得られる。ある実施形態では、比較生物学的サンプルが、不活動の期間が開始した１０日後またはその後に、対象から得られる。ある実施形態では、比較生物学的サンプルが、不活動の期間が開始した３から７日後、対象から得られる。ある実施形態では、比較生物学的サンプルが、不活動の期間が開始した後および／または介入が始まった１から４週間後、対象から得られる。ある実施形態では、比較生物学的サンプルが、不活動の期間が開始した１から３か月後、対象から得られる。ある実施形態では、１つを超える比較サンプルが、対象から得られる。
【００５２】
他の実施形態では、長期身体不活動に関連するインスリン抵抗性に対する介入の効能を評価するための方法が、（ａ）対象に介入を施すステップであって、介入が、身体不活動に先立ってまたはこの期間の初めに対象に最初に施されるステップ；（ｂ）身体不活動始まった３日後またはその後に対象から得られる生物学的サンプルにおけるＣ−ペプチドおよびＩＧＦＢＰ−２から選択される前記１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定するステップ、（ｃ）身体不活動の期間に先立ってまたはこの期間の初めに対象から得られる生物学的サンプルにおける前記１つ以上のバイオマーカーの１つ以上のベースラインレベルと（ｂ）において測定されたレベルとを比較するステップならびに（ｄ）ステップ（ｂ）において測定された前記１つ以上のバイオマーカーのレベルが、前記１つ以上のバイオマーカーについての１つ以上のベースラインレベルと同等である場合、介入が効果的であるとして特徴付けるステップを含む。本明細書において記載されるように、バイオマーカーのベースラインレベルおよびステップ（ｂ）において測定されたレベルの間の差異が２０％以下である場合、レベルは、同等である。
【００５３】
生物学的サンプル
本発明の方法における使用に適した生物学的サンプルは、全血サンプル、血清および血漿を含むが、これらに限定されない血液画分のサンプルを含むが、これらに限定されない。サンプルは、新鮮血もしくは保存血（例えば血液バンクにおける）または血液画分であってもよい。サンプルは、本発明のアッセイのために特別に得られた血液サンプルまたは本発明のアッセイのためにサブサンプルをとることができる、他の目的のために得られた血液サンプルであってもよい。
【００５４】
一実施形態では、血液サンプルが、全血である。全血は、標準的で臨床的な手順を使用して、対象から得られてもよい。他の実施形態では、血液サンプルが、血漿である。血漿は、抗凝固血液の遠心分離によって全血サンプルから得られてもよい。このような工程により、白血球成分のバフィーコートおよび血漿の上清が提供される。他の実施形態では、血液サンプルが、血清である。血清は、抗凝固薬がないチューブ中に収集された全血サンプルの遠心分離によって得られてもよい。血液は、遠心分離に先立って凝血してもよい。遠心分離によって得られる赤黄色の（ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ−ｒｅｄｄｉｓｈ）体液は、血清である。
【００５５】
サンプルは、適切なバッファー溶液中での希釈によって必要に応じて前処理されてもよい、ヘパリン処理されてもよい、所望の場合、濃縮されてもよいまたは超遠心分離、高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）による分画を含むが、これらに限定されない任意の数の方法によって分画されてもよい。生理学的ｐＨの、リン酸、Ｔｒｉｓまたはその他同種のものなどのような様々なバッファーのうちの１つを用いる、多くの標準的な水性バッファー溶液のいずれも、使用することができる。
【００５６】
本発明の方法において使用されてもよい他の生物学的サンプルは、尿および唾液を含むが、これらに限定されない。
【００５７】
バイオマーカーのレベルの測定
対象の血液サンプルにおけるバイオマーカーのそれぞれのレベルは、それぞれのバイオマーカーと免疫反応性であるポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を使用することによってまたはフェーズディスプレイライブラリー（ｐｈａｓｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ）由来の結合標的に適したアプタマーもしくはタンパク質ドメインなどのような他の結合剤を使用することによってなどのような様々な方法によって決定することができる。例えば、ＩＧＦＢＰ−２に対して免疫特異的な（ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体は、標準的な手順を使用して作製され、標識され、次いで、サンプルにおけるＩＧＦＢＰ−２の存在を検出するためにイムノアッセイにおいて用いられてもよい。適したイムノアッセイは、例として、ラジオイムノアッセイ、固相および液相の両方の蛍光結合アッセイ、競合イムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着アッセイを含む。ある実施形態では、イムノアッセイがまた、サンプル中に存在するバイオマーカーの量を定量化するためにも使用される。
【００５８】
バイオマーカーのそれぞれは、酸化タンパク質またはペプチド断片に対して免疫特異的な抗体を産生するために免疫原として使用することができる。用語「免疫特異的な」は、抗体が、他のタンパク質に対してよりも免疫原に対して実質的に大きな親和性を有することを意味する。このような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖およびＦａｂ断片を含むが、これらに限定されない。
【００５９】
選択されるバイオマーカー種に対して産生される抗体は、確立された手順に従って産生される。一般に、バイオマーカーは、宿主動物を免疫化するために使用される。適した宿主動物は、ウサギ、マウス、ラット、ヤギおよびモルモットを含むが、これらに限定されない。様々なアジュバントは、宿主動物において免疫応答を増加させるために使用されてもよい。使用されるアジュバントは、少なくとも部分的に宿主種に依存する。このような動物は、ポリクローナル抗体と呼ばれ、免疫化された動物の血清に由来してもよい、抗体分子の不均質の集団を産生する。
【００６０】
ポリクローナル抗体は、宿主動物にバイオマーカーを投与することによって従来の技術を使用して生成される。宿主種に依存して、様々なアジュバントは、免疫応答を増加させるために使用されてもよい。ヒトにおいて使用されるアジュバントの中で、カルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）およびコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）が、とりわけ好ましい。従来のプロトコールもまた、免疫化された動物から血液を収集し、血液から血清および／またはＩｇＧ画分を単離するために使用される。
【００６１】
モノクローナル抗体の調製については、従来のハイブリドーマ技術が、使用される。このような抗体は、培養中の無限継代固定細胞系によって産生される。モノクローナル抗体を調製するのに適した技術は、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術およびＥＢＶハイブリドーマ技術を含むが、これらに限定されない。
【００６２】
様々なイムノアッセイは、所望の特異性を有する抗体を同定するためのスクリーニングに使用されてもよい。これらは、競合結合アッセイまたはイムノラジオメトリックアッセイを含み、典型的に、それぞれのバイオマーカーおよび抗体の間の複合体形成の測定を含むプロトコールを含む。
【００６３】
本発明の抗体は、対象由来の生物学的サンプルにおけるバイオマーカーの存在を検出するためにまたはこの量を測定するために使用されてもよい。方法は、個人から得られたサンプルを、１つ以上の本発明の抗体と接触させるステップならびに抗体およびサンプル中のバイオマーカーの間の複合体の形成についてアッセイするステップを含む。検出の容易さのために、抗体は、カラム、プラスチック皿、マトリックスまたは膜、好ましくはニトロセルロースなどのような基板に付加することができる。ある実施形態では、方法が、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはウエスタン免疫ブロット手順を用いる。
【００６４】
１つ以上のバイオマーカーの存在または量は、それぞれのマーカーおよび任意のさらなるバイオマーカーが使用される場合、このようなさらなるバイオマーカーに特異的に結合する抗体を使用して決定することができる。使用することができる抗体の例は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、免疫グロブリン分子、ジスルフィド結合Ｆｖ、モノクローナル抗体、親和性成熟、ｓｃＦｖ、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、ＣＤＲ移植抗体、二特異性抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、Ｆａｂ、二重特異的抗体（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ＤＶＤ、Ｆａｂ’、二重特異性抗体、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよびこの組み合わせを含む。例えば、免疫学的方法は、（ａ）（ｉ）試験サンプルを少なくとも１つの捕捉抗体と接触させるステップ、ここで、捕捉抗体が、バイオマーカー上のエピトープまたはこの断片に結合して捕捉抗体−抗原複合体を形成する；（ｉｉ）捕捉抗体−抗原複合体を、検出可能な標識を含む少なくとも１つの検出抗体と接触させるステップ、ここで、検出抗体が、捕捉抗体が結合しないバイオマーカー（抗原）上のエピトープに結合し、捕捉抗体−抗原−検出抗体複合体を形成する；および（ｉｉｉ）（ａ）（ｉｉ）において形成された捕捉抗体−抗原−検出抗体複合体において検出可能な標識によって生成されたシグナルに基づいて試験サンプルにおけるバイオマーカーレベルを決定することによってバイオマーカーのレベルを測定するステップを含む。任意のイムノアッセイが利用されてもよい。イムノアッセイは、例えば酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、フォワードもしくはリバース競合阻害アッセイなどのような競合阻害アッセイ、蛍光偏光測定法または競合結合測定法であってもよい。ＥＬＩＳＡは、サンドイッチＥＬＩＳＡであってもよい。マーカーへの抗体の特異的免疫学的結合は、抗体に付加された蛍光もしくは発光性タグ、金属および放射性核種などのような直接的な標識を介してまたはアルカリホスファターゼもしくはホースラディッシュペルオキシダーゼなどのような間接的な標識を介して検出することができる。
【００６５】
固定された抗体またはこの断片の使用は、イムノアッセイの中に組み込まれてもよい。抗体は、磁気またはクロマトグラフィーマトリックス粒子、アッセイプレート（マイクロタイターウェルなど）の表面、数個の固形基板材料、およびその他同種のものなどのような様々な支持上に固定されてもよい。アッセイストリップは、固体支持体上のアレイにおける抗体または複数の抗体をコーティングすることによって調製することができる。次いで、このストリップは、試験生物学的サンプルの中に浸漬され、次いで、着色したスポットなどのような測定可能なシグナルを生成するように、洗浄および検出ステップによって素速く処理することができる。
【００６６】
サンドイッチＥＬＩＳＡは、抗体の２つの層（即ち捕捉抗体および検出抗体（検出可能な標識により標識されてもよい。））の間の抗原の量を測定する。測定されることとなるマーカーは、抗体に結合することができる少なくとも２つの抗原部位を含有してもよい。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかが、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて捕捉抗体および検出抗体として使用されてもよい。
【００６７】
一般に、少なくとも２つの抗体が、試験または生物学的サンプルにおける興味のあるマーカー（および任意のさらなるバイオマーカー）を分離し、定量化するために用いられる。より詳細には、少なくとも２つの抗体は、マーカーのあるエピトープに結合し、「サンドイッチ」と呼ばれる免疫複合体を形成する。１つ以上の抗体は、試験サンプルにおけるマーカーを捕捉するために使用することができ（これらの抗体は、たびたび「捕捉」抗体と呼ばれる。）、１つ以上の抗体は、サンドイッチに検出可能な（即ち定量化可能な）標識を結合するために使用される（これらの抗体は、たびたび「検出」抗体と呼ばれる。）。サンドイッチアッセイでは、これらのエピトープに結合する両方の抗体は、このそれぞれのエピトープへのアッセイにおける任意の他の抗体の結合によって衰えてはならない。言いかえれば、抗体は、マーカーを含有することが疑われる試験サンプルと接触させた１つ以上の第１の抗体が、第２のまたは次の抗体によって認識され、これによって、１つ以上の第２の検出抗体がマーカーに結合する能力に干渉するエピトープのすべてまたは一部に結合しないように、選択されてもよい。
【００６８】
好ましい実施形態では、マーカーを含有することが疑われる試験または生物学的サンプルが、少なくとも１つの第１の捕捉抗体（または抗体）および少なくとも１つの第２の検出抗体と同時にまたは経時的に接触させることができる。サンドイッチアッセイ方式では、マーカーを含有することが疑われる試験サンプルは、第１の抗体−マーカー複合体の形成を可能にする条件下で特定のエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの第１の捕捉抗体と最初に接触させる。１つを超える捕捉抗体が使用される場合、第１の複数の捕捉抗体−マーカー複合体が形成される。サンドイッチアッセイでは、抗体、好ましくは、少なくとも１つの捕捉抗体は、試験サンプルにおいて予想されるマーカーの最大量のモル超過量で使用される。
【００６９】
場合により、試験サンプルを少なくとも１つの第１の捕捉抗体と接触させる前に、少なくとも１つの第１の捕捉抗体は、試験サンプルからの第１の抗体−マーカー複合体の分離を容易にする固体支持体に結合させることができる。ウェル、チューブまたはビーズの形態をした高分子材料で作製される固体支持体を含むが、これらに限定されない、当技術分野において知られている任意の固体支持体を、使用することができる。抗体は、吸着によって、化学カップリング剤を使用する共有結合によってまたは当技術分野において知られている他の手段によって、固体支持体に結合させることができる、ただし、このような結合が、マーカーに結合する抗体の能力に干渉しないことを条件とする。さらに、必要ならば、固体支持体は、抗体上の様々な官能基との反応を可能にするように誘導体化することができる。このような誘導体化は、無水マレイン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどのようなあるカップリング剤の使用を必要とする。
【００７０】
マーカーを含有することが疑われる試験サンプルを少なくとも１つの第１の捕捉抗体と接触させた後、試験サンプルは、第１の捕捉抗体（または複数の抗体）−マーカー複合体の形成を可能にするためにインキュベートされる。インキュベーションは、約４．５から約１０．０のｐＨで、約２℃から約４５℃の温度で、少なくとも約１（１）分から約１８（１８）時間、約２から６分または約３から４分の期間、実行することができる。
【００７１】
第１の／複数の捕捉抗体マーカー複合体の形成の後に、次いで、複合体は、少なくとも１つの第２の検出抗体と接触させられる（第１の／複数の抗体−マーカー第２の抗体複合体の形成を可能にする条件下で）。第１の抗体−マーカー複合体を、１つを超える検出抗体と接触させたら、第１の／複数の捕捉抗体−マーカー−複数の抗体検出複合体が形成される。第１の抗体のように、少なくとも第２の（および次の）抗体が第１の抗体−マーカー複合体と接触させられる場合、上記に記載されたものと同様の条件下でのインキュベーションの期間が、第１の／複数の抗体−マーカー−第２の／複数の抗体複合体の形成のために必要とされる。好ましくは、少なくとも１つの第２の抗体は、検出可能な標識を含有する。検出可能な標識は、第１の／複数の抗体−マーカー−第２の／複数の抗体複合体の形成に先立って、これと同時にまたはこの後に、少なくとも１つの第２の抗体に結合させることができる。当技術分野において知られている任意の検出可能な標識を使用することができる。
【００７２】
方法を実行するためのキット
上記に記載される方法を実行するために使用されてもよいキットが、本明細書において提供される。キットは、（１）対象から単離された生物学的サンプルにおけるマーカーのレベルを定量化するために、マーカーに特異的に結合することができる試薬；（２）マーカーのレファレンスレベルを示す標準試料、ここで、少なくとも１つの試薬が、マーカーに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗体を含む；および（３）標準試料を提供してもよい。キットは、少なくとも１つのさらなるバイオマーカーに特異的に結合することができる少なくとも１つの試薬（即ち抗体）および存在する場合、評価される状態の少なくとも１つのさらなるバイオマーカーのレファレンスレベルを示す標準試料をさらに含んでいてもよい。
【００７３】
キットは、抗体および抗体を投与するための手段を含んでいてもよい。キットは、キットを使用し、分析、モニタリングまたは治療を行うための説明書をさらに含むことができる。
【００７４】
キットはまた、それぞれの容器が個別の試薬を含有する、バイアルまたはボトルなどのような１つ以上の容器を含んでいてもよい。キットは、書面の説明書をさらに含んでいてもよく、これは、本明細書において記載される分析、モニタリング、治療または方法を実行するまたは判断する方法を記載してもよい。
【００７５】
例えば、キットは、イムノアッセイ、例えば化学発光微粒子イムノアッセイ（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）によって１つ以上のバイオマーカーについて試験サンプルをアッセイするための説明書を含むことができる。説明書は、紙形態またはディスク、ＣＤ、ＤＶＤもしくはその他同種のものなどのようなコンピューター読み取り可能な形態とすることができる。抗体は、検出抗体（検出可能な標識により標識された抗体を意味する。）とすることができる。例えば、キットは、関心のある抗原またはバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つの捕捉抗体を含有することができる。キットはまた、それぞれの捕捉抗体に対するコンジュゲート抗体（検出可能な標識により標識された抗体など）を含有することができる。またはそのうえ、キットは、例えば、精製され、場合により凍結乾燥されたキャリブレーターもしくはコントロールおよび／またはアッセイを行うための少なくとも１つの容器（例えば、抗バイオマーカーモノクローナル抗体により既にコーティングすることができるチューブ、マイクロタイタープレートもしくはストリップ）および／またはどちらかの一方を濃縮溶液、検出可能な標識（例えば酵素標識）に対する基質溶液もしくは停止溶液として提供することができるアッセイバッファーもしくは洗浄バッファーなどのようなバッファーを含むことができる。好ましくは、キットは、アッセイを実行するのに必要な構成成分、即ち試薬、標準物質、バッファー、希釈剤などをすべて含む。説明書はまた、関心のあるバイオマーカーを定量化する目的のために、標準曲線または標準試料を生成するための説明書を含むことができる。
【００７６】
上記に示唆されるように、バイオマーカーに対して特異的な組換え抗体などのような、キットにおいて提供される任意の抗体は、フルオロフォア、放射性成分、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光標識もしくはその他同種のものなどのような、検出可能な標識を組み込むことができるまたはキットは、抗体を標識するための試薬または抗体を検出するための（例えば検出抗体）および／もしくは分析物を標識するための試薬または分析物を検出するための試薬を含むことができる。抗体、キャリブレーターおよび／またはコントロールは、個別の容器において提供することができるまたは適切なアッセイ方式の中に、例えばマイクロタイタープレートの中にあらかじめ分注することができる。
【００７７】
場合により、キットは、品質管理構成成分（例えば感度パネル、キャリブレーターおよびポジティブコントロール）を含む。品質管理試薬の調製は、当技術分野においてよく知られており、様々な免疫診断産物についてのインサートシート上に記載される。感度パネル部材は、アッセイパフォーマンス特性を確立するために場合により使用され、場合により、イムノアッセイキット試薬の完全性およびアッセイの標準化についての有用な指標となる。
【００７８】
キットはまた、バッファー、塩、酵素、酵素補助因子、基質、検出試薬およびその他同種のものなどのような、診断アッセイを行うまたは品質管理評価を容易にするために必要とされる他の試薬を場合により含むことができる。試験サンプルの単離および／または処理のためのバッファーおよび溶液などのような他の構成成分（例えば前処理試薬）もまた、キット中に含むことができる。キットは、そのうえ、１つ以上の他のコントロールを含むことができる。キットの１つ以上の構成成分は、凍結乾燥することができ、この場合、キットは、凍結乾燥された構成成分の還元に適した試薬をさらに含むことができる。
【００７９】
キットの様々な構成成分は、場合により、必要に応じて適した容器、例えばマイクロタイタープレートにおいて提供される。キットは、サンプルを保持するまたは保管するための容器（例えば血液サンプルのための容器またはカートリッジ）をさらに含むことができる。適切な場合、キットはまた、場合により、試薬または試験サンプルの調製を容易にする反応槽、混合容器および他の構成成分を含有することができる。キットはまた、シリンジ、ピペット、ピンセット、計量スプーンまたはその他同種のものなどのような、試験サンプルを得るのを支援する１つ以上の器具を含むことができる。
【００８０】
検出可能な標識が、少なくとも１つのアクリジニウム化合物である場合、キットは、少なくとも１つのアクリジニウム−９−カルボキサミド、少なくとも１つのアクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルまたはこの任意の組み合わせを含むことができる。検出可能な標識が少なくとも１つのアクリジニウム化合物である場合、キットはまた、バッファー、溶液などのような過酸化水素の供給源および／または少なくとも１つの塩基性溶液を含むこともできる。
【００８１】
所望の場合、キットは、磁性粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子、フィルム、ろ紙、水晶振動子、ディスクまたはチップなどのような固相を含有することができる。キットはまた、検出抗体として機能する抗体などのような抗体にコンジュゲートすることができるまたはコンジュゲートする検出可能な標識を含んでいてもよい。検出可能な標識は、例えば、直接的な標識とすることができ、これは、酵素、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子、化学発光団（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｐｈｏｒｅ）、フルオロフォア、蛍光消光剤、化学発光消光剤またはビオチンであってもよい。キットは、場合により、標識を検出するのに必要な任意のさらなる試薬を含んでいてもよい。
【００８２】
所望の場合、キットは、関心のある他の状態のバイオマーカーなどのようなバイオマーカーとすることができる他の分析物について試験サンプルをアッセイするための、単独でのまたは説明書とさらに組み合わせた、１つ以上の構成成分をさらに含むことができる。血清サンプルなどのようなサンプルもまた、ＴＯＦ−ＭＳおよび内部標準を使用して、さらなるバイオマーカーについてアッセイすることができる。
【００８３】
本明細書において記載されるように、イムノアッセイによって試験サンプルにおけるバイオマーカーの濃度を決定するためのキット（またはこの構成成分）および方法は、例えば米国特許第５，０８９，４２４号明細書および米国特許第５，００６，３０９号明細書において記載されるように、また、例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）としてＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）によって市販されているように、様々な自動化および半自動化システムにおける使用に適していてもよい（固相が微粒子を含むものを含む。）。
【００８４】
非自動化システム（例えばＥＬＩＳＡ）との自動化または半自動化システムの間の差異の幾つかは、第１の特異的な結合パートナー（例えば分析物抗体または捕捉抗体）が付加される基板（これはサンドイッチ形成および分析物反応に影響を与え得る。）ならびに捕捉の長さおよびタイミング、検出ならびに／または任意の任意選択の洗浄ステップを含む。ＥＬＩＳＡなどのような非自動化方式は、サンプルおよび捕捉試薬との比較的長いインキュベーション時間（例えば約２時間）を必要とし得るのに対して、自動化または半自動化方式（例えばＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）および任意の後継プラットフォーム、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、比較的短いインキュベーション時間（例えばＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）についてはおよそ１８分間）を有し得る。同様に、ＥＬＩＳＡなどのような非自動化方式は、比較的長いインキュベーション時間（例えば約２時間）、コンジュゲート試薬などのような検出抗体をインキュベートし得るのに対して、自動化または半自動化方式（例えばＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）および任意の後継プラットフォーム）は、比較的短いインキュベーション時間（例えばＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）および任意の後継プラットフォームについてはおよそ４分間）を有し得る。
【００８５】
Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能な他のプラットフォームは、ＡｘＳＹＭ（Ｒ）、ＩＭｘ（Ｒ）（例えば、この全体が参照によりこれによって組み込まれる米国特許第５，２９４，４０４号明細書を参照されたい。）、ＰＲＩＳＭ（Ｒ）、ＥＩＡ（ビーズ）およびＱｕａｎｔｕｍ（商標）ＩＩならびに他のプラットフォームを含むが、これらに限定されない。そのうえ、アッセイ、キットおよびキット構成成分は、他の方式において、例えば、電気化学または他の携帯型もしくは簡易迅速（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）アッセイシステム上で用いることができる。本発明の開示は、例えば、サンドイッチイムノアッセイを実行する市販のＡｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（Ｒ）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）電気化学イムノアッセイシステムに適用可能である。免疫センサーならびに使い捨て試験デバイスにおける製造およびオペレーションのこれらの方法は、例えばこれに関するこれらの教示について参照によりこれらの全体が組み込まれる米国特許第５，０６３，０８１号明細書、米国特許出願公開第２００３／０１７０８８１号明細書、米国特許出願公開第２００４／００１８５７７号明細書、米国特許出願公開第２００５／００５４０７８号明細書および米国特許出願公開第２００６／０１６０１６４号明細書において記載される。
【００８６】
特に、Ｉ−ＳＴＡＴ（Ｒ）システムへのアッセイの適応に関して、以下の構成が好ましい。微細加工シリコーンチップは、１対の金の電流測定作用電極および銀−塩化銀の基準電極により製造される。一方の作用電極上で、固定された捕捉抗体を有するポリスチレンビーズ（０．２ｍｍの直径）を、電極にわたって、模様のついたポリビニルアルコールのポリマーコーティングに付着させる。このチップは、イムノアッセイに適した流体工学方式を有するＩ−ＳＴＡＴ（Ｒ）カートリッジの中にアセンブルされる。カートリッジのサンプル保持チャンバーの壁の部分の上に、アルカリホスファターゼ（または他の標識）により標識された検出抗体を含む層がある。カートリッジの流体ポーチ（ｆｌｕｉｄ  ｐｏｕｃｈ）内に、ｐ−アミノフェノールホスフェートを含む水性試薬がある。
【００８７】
オペレーションにおいて、バイオマーカーを含有することが疑われるサンプルは、試験カートリッジの保持チャンバーに追加され、カートリッジは、Ｉ−ＳＴＡＴ（Ｒ）読み取り装置に挿入される。第２の抗体（検出抗体）がサンプルの中に溶解された後、カートリッジ内のポンプエレメントは、チップを含有するコンジットの中にサンプルを押し込む。ここで、これは、第１の捕捉抗体、バイオマーカーおよび標識された第２の検出抗体の間でのサンドイッチの形成を促進するように振動する。アッセイの最後から二番目のステップにおいて、流体は、ポーチからコンジットの中に押出され、チップから廃棄物チャンバーにサンプルを洗い流す。アッセイの最終ステップにおいて、アルカリホスファターゼ標識は、ｐ−アミノフェノールホスフェートに反応して、リン酸基を切断し、遊離ｐ−アミノフェノールを作用電極で電気化学的に酸化させる。測定された電流に基づいて、読み取り装置は、組み込まれたアルゴリズムおよび工場で決定された検量線によって、サンプルにおけるバイオマーカーの量を計算することができる。
【００８８】
対象
本発明の方法は、長期間の身体不活動を経験しているまたは経験することが予想される哺乳動物対象に使用されてもよい。ある実施形態では、対象が、成人のヒト対象である。本明細書において使用されるように、用語「成人のヒト対象」は、年齢２０歳以上のヒト対象を指す。従って、成人のヒト対象は、３０、４０または５０歳以上である。ある実施形態では、対象は、高齢、即ち５０歳以上である。評価方法は、対象が長期間の不活動を経験するであろう、例えば、対象が数日間、例えば１０日間以上、ベッドにいるであろう臨床研究に関与する対象において使用されてもよい。治療および評価方法は、院内、リハビリテーション施設または個人の家などにおいて長期間の不活動を経験しているまたは経験することが予想される対象において使用されてもよい。例えば、対象は、傷害、疾病または外科手術によりベッドに制限され得るまたは制限されるであろう対象であってもよい。対象はまた、長期間の不活動を自分で決める対象、例えばうつ病の対象であってもよい。
【００８９】
コントロール値
不活動の３日目またはその後に試験対象から得られる生物学的サンプルにおける１つ以上のバイオマーカーのレベルの間の差異が、コントロール値と比較される。コントロール値は、コントロール集団、例えば、同等の期間の長期身体不活動、例えば３から１０日間以上の床上安静を経験したヒト対象の一般集団または選抜集団（ｓｅｌｅｃｔ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）から得られた同等の生物学的サンプルにおける１つ以上のバイオマーカーのレベルにおける差異に基づく。例えば、選抜集団は、男性の対象もしくは女性の対象または高齢の対象などで構成されてもよい。従って、選択されるコントロール値は、試験対象が分類されるカテゴリーを考慮に入れてもよい。適切なカテゴリーは、当業者らによって単なるルーチン的な実験により選択することができる。
【００９０】
差異、従ってコントロール値は、様々な形態をとることができる。例えば、コントロール値は、同様の日数の不活動の間に未治療コントロール対象で見られるバイオマーカーの循環レベルの、ｍｇ／ｍｌ、ｎｇ／ｍｌなどでの負または正の差異とすることができる。コントロール値は、同等の期間の不活動の間の未治療コントロール対象におけるバイオマーカーの循環レベルにおける負または正の変化パーセントであってもよい。
【００９１】
コントロール値は、参照により本明細書において明確に組み込まれる７Ｋｎａｐｐ，Ｒ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｃ．（１９９２）．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．Ｗｉｌｌｉａｍ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｈａｒｕａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｐａ．において記載されるように、一般集団または選抜集団における大きいサンプルの個人をアッセイすることによってならびに陽性基準を選択するための予測値方法（ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｖａｌｕｅ  ｍｅｔｈｏｄ）などのような統計モデルまたは最適な特異度（最も高い真陰性率）および感度（最も高い真陽性率）を定める受診者動作特性曲線を使用することによって、確立される。そのうえ、一般集団または選抜集団についての基準範囲または期待値は、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ），ｄｏｃｕｍｅｎｔ  Ｃ２８−Ａ３ｃ（２０１１）の手引きに従うことによって確立することができる。
【００９２】
介入
本発明の方法を使用して試験されてもよい介入は、栄養の介入を含むが、これらに限定されない。このような栄養の介入の例は、ＨＭＢ、高タンパク質食（例えば＞１または１．２ｇタンパク質／体重ｋｇ／日）、高用量のロイシン（約１５ｇ／日）またはアルファ−ケトイソカプロエート（ＫＩＣ）およびアルファ−ヒドロキシイソカプロエート（ＨＩＣＡ）などのようなロイシン代謝物質を含有するサプリメントならびに高用量の必須アミノ酸（少なくとも１５ｇのロイシンを含有する約４５ｇ／日）を含むが、これらに限定されない。
【００９３】
介入の効能を評価するためのシステム
ヒト対象における長期身体不活動に関連するインスリン抵抗性に対する介入の効能を決定するためのシステムもまた、提供される。一実施形態では、システムが、（ａ）長期間の身体不活動を受けているまたは近い将来に受けることが予想される対象を同定するためのサブシステム、（ｂ）身体不活動に先立ってまたはこの初めに（ａ）において同定された対象から生物学的サンプルを得るためのサブシステム、（ｃ）対象に介入を施すためのサブシステム、（ｄ）対象が身体不活動になった３日後またはその後に、（ａ）において同定された対象から生物学的サンプルを得るためのサブシステム、（ｅ）サブシステム（ｂ）および（ｄ）によって得られる生物学的サンプルにおけるＣ−ペプチド、ＩＧＦＢＰ−２およびレプチンからなる群から選択される１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定するためのサブシステムならびに（ｆ）サブシステム（ｂ）および（ｃ）によって得られる生物学的サンプルにおける１つ以上のバイオマーカーのレベルにおける差異を計算するためのサブシステムを含む。ある実施形態では、システムが、同等の期間の身体不活動の初めにおよびこの後に未治療コントロール対象から得られた同等の生物学的サンプルにおける１つ以上のバイオマーカーのレベルにおける差異に基づいて、サブシステム（ｄ）によって計算された差異を、１つ以上のコントロール値と比較するためのサブシステムをさらに含む。
【００９４】
ある実施形態では、長期間の不活動を受けているまたは受けることが予想される対象を同定するためのサブシステムが、典型的に３日間以上の床上安静の期間に至る処置を受けることが予定される対象を同定する。サブシステムはまた、典型的に３日間以上の床上安静の期間に至る疾病を有する対象を同定してもよい。高齢の対象が、典型的に、若い対象よりも、外科手術、疾病などの後に、より長い期間の不活動を受けるので、システムはまた、対象の年齢を同定するサブシステムを含んでいてもよい。この後者のサブシステムは、対象の状態、即ち、対象が長期身体不活動の期間を受けるかどうかおよびいつ受けるのかを同定するサブシステムと同じであってもよいまたは異なっていてもよい。
【００９５】
本発明のシステムは、例えば病院、リハビリセンター、養護ホームなどのような、長期間の間、長期間の不活動（例えば床上安静）を受けている、受け得るまたは受けることが予想される対象を収容する施設によって使用されてもよい。サブシステムはすべて、施設によって直接使用されてもよい。または、サブシステムの幾つかは、対象を収容する施設によってある試験を実行するように伝えるまたは指示される研究所などのような試験施設によって使用されてもよい。本発明のシステムはまた、病院、リハビリテーション施設、自宅などで長期間の不活動を受けている、受け得るまたは受けることが予想される対象のケアを指示する医師によって使用されてもよい。本発明のシステムはまた、ヒト対象における長期身体不活動に関連するインスリン抵抗性を低下させることを目的とする介入を開発する会社によって使用されてもよい。
【実施例】
【００９６】
本発明の方法は、３つの循環インスリン抵抗性バイオマーカーのレベルが、１０日間の床上安静を受けている１８人の健康な高齢の対象において統計的に著しい量、増加するまたは減少するという本発明者らの発見に、少なくとも部分的に基づく。方法はまた、ＨＭＢによる介入が、これらの循環バイオマーカーのレベルにおける変化を改変したという本発明者らの発見に、少なくとも部分的に基づく。
【００９７】
対象
以下の組み入れ基準をスクリーニングで検証した：≧６０から≦７９歳の男性または女性；≧２０であるが≦３５のボディマス指数（ＢＭＩ）；≧９のＳｈｏｒｔ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｂａｔｔｅｒｙ（ＳＰＰＢ）スコアを有する歩行（ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ）（完全に機能的であり、運動制限なし）；決められた活性レベルの遵守。除外基準により、最近大手術を受けた、活性な悪性疾患を有した（例外、基底細胞癌もしくは扁平上皮細胞皮膚癌または子宮頚部の上皮内癌）；深部静脈血栓症（ＤＶＴ）または他の凝固亢進障害の病歴；不応性貧血；糖尿病の病歴または空腹時血糖値＞１２６ｍｇ／ｄＬ；部分的または完全義肢の存在；腎疾患または血清中クレアチニン＞１．４ｍｇ／ｄＬ；安静または運動負荷ＥＫＧの間に評価される心臓血管系疾患の証拠；未治療甲状腺機能低下症；肝臓疾患；慢性または急性ＧＩ疾患；コントロール不良の重度の下痢、悪心または嘔吐；積極的に減量を続行していた；他の臨床試験に登録した；床上安静研究期間にわたって喫煙を控えることができなかったまたは床上安静期間にわたって抗凝固療法を中止することができなかった対象を除外した。潜在的な対象もまた、彼らが、タンパク質代謝に影響を与えることが知られているいかなる医薬品（例えばプロゲステロン作用薬、ステロイド、成長ホルモン、ドロナビノール、マリファナ、ＨＭＢ、遊離アミノ酸サプリメント、減量を補助するための健康補助食品）をも服用していた場合、除外した。
【００９８】
研究に最初に含まれた２４人の健康な対象は、２つのグループに無作為抽出した。治療グループにおける対象は、さらなる甘味料および調味料群と共に１．５グラムのＣａ−ＨＭＢ（ＴＳＩ、Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ、Ｕｔａｈ）、４グラムのマルトデキストリンおよび２００ｍｇのカルシウムを含有する２つのβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレート（ＨＭＢ）の小袋を受けた。コントロール群における対象は、Ｃａ−ＨＭＢを除外したＨＭＢ小袋と同一の２つのコントロール小袋を受けた。この研究は、二重盲検研究とした。調査者も対象も、研究の臨床期間の間に研究産物のいずれの特徴についても知らされなかった。対象は、彼らの好みのノンカロリー、非カフェイン添加、非炭酸、非ミルクベース飲料の中にそれぞれの小袋を混合することによって毎日２回摂取するように命じられた。ＨＭＢまたはコントロールによる治療は、床上安静の５日前に始め、リハビリテーション期間の終わりまで継続した。
【００９９】
前床上安静および床上安静期間にわたる食事安定化のために、対象は、タンパク質摂取（１日当たり０．８ｇタンパク質／体重ｋｇ）のためにＲＤＡを提供する代謝的に管理された食事を与えられた。総カロリー必要量は、以下の方程式に従う安静エネルギー消費についてのＨａｒｒｉｓ−Ｂｅｎｅｄｉｃｔ方程式を使用して推定した：女性については＝［６５５＋（９．５６×ｋｇでの体重）＋（１．８５×ｃｍでの身長）−（４．６８×年での年齢）×ＡＦまたは男性については＝［６６＋（１３．７×ｋｇでの体重）＋（５×ｃｍでの身長）−（６０８×年での年齢］×ＡＦ、ここで、ＡＦ＝歩行については１．６および床上安静期間については１．３５の活性因子である。総カロリーおよびタンパク質摂取を考慮して、食事の残りは、炭水化物から約６０％および脂肪から４０％の非タンパク質カロリーを保つように操作した。水は、適宜、提供した。
【０１００】
５日間（歩行期間）の食事安定化の後に、対象は、１０日間続けてベッドにいたままであった。床上安静に制限されたが、対象は、排尿のためにベッドサイドのトイレを使用することが可能であったまたは排せつのために車椅子に乗った。対象は、スポンジバスに入るまたは車椅子でシャワーを浴びる選択肢を与えられた。深部静脈血栓症を検出し、予防するために、血液ｄ−ダイマー試験、この後に続く超音波検査を含む予防的な対策をとり、ｄ−ダイマー試験が陽性であった場合、床上安静の間に他動的関節可動域訓練、床上安静期間にわたりＴＥＤホースおよびＳＣＤを使用した。対象は、あお向けに関連する逆流の問題を軽減するのを支援するために医薬品を提供された。対象は、看護職員によって絶えずモニターされ、研究医師による毎日の身体検査を受けた。
【０１０１】
絶食時の血液サンプルは、バイオマーカーの測定のために、床上安静の１日目におよび床上安静の終わりに対象から収集した。
【０１０２】
対象は、彼らが前床上安静期間（１日目から５日目）の間に常時、産物を中止した場合または彼らが床上安静期間の間に産物を中止し、８日間未満で床上安静を終えた場合、研究を終了した。深部静脈血栓症（ＤＶＴ）診断について陽性のｄ−ダイマー試験または超音波を有する対象もまた、研究を終了した。
【０１０３】
対象の転帰のデータは、１つ以上の以下の事象が生じた場合、分析にとって評価不能であるとして分類した：Ａ．対象が、無作為化手法に反して、間違った産物を受けた、Ｂ．対象が、体重または代謝に影響を与える医薬品または健康補助食品として定められる、除外される同時の治療を受けた（例えばプロゲステロン作用薬、ステロイド、成長ホルモン、ドロナビノール、マリファナ、ＨＭＢ、遊離アミノ酸サプリメント、減量を補助するための健康補助食品および魚油サプリメント）、Ｃ．対象が、産物消費記録によって決定されるように最終訪問／終了時に全研究産物消費量が＜６７％であった。
【０１０４】
最終分析サンプルサイズは、対象ｎ＝１８、コントロールグループにおいてｎ＝８（男性ｎ＝１、女性ｎ＝７）および実験ＨＭＢグループにおいてｎ＝１０（男性ｎ＝２、女性ｎ＝８）である。
【０１０５】
バイオマーカー分析
ＲＢＭ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｍａｐ  ｖ１．０から生成されたＲｕｌｅｓ  Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＲＢＭ、Ｍｙｒｉａｄ、ＴＸ）データは、１８人の高齢の対象から前床上安静および床上安静後の２つの時点で収集した血清において測定したｎ＝１８７バイオマーカーからなる。それぞれのマーカーの分布を評価した。それぞれのマーカーは、２０のブランクサンプルの平均＋３標準偏差（ＳＤ）として定められる最小検出可能用量（ＬＤＤ）値を有する。マーカー結果が≦ＬＤＤであったいかなる対象についても、ＲＢＭによって提供されるＬＤＤ値をインピュテーションした（ｉｍｐｕｔｅ）。マーカー結果が≧ＬＤＤであった場合、本来の結果を使用した。すべての対象の結果の≧３０％がインピュテーションされたいかなるマーカーも、さらなる統計分析から除外した。最初のｎ＝１８７  ＲＢＭマーカー（付録１）のうち、ＲＢＭデータセットからのｎ＝６３マーカー（付録２）をさらなる分析から除外し、評価にｎ＝１２４マーカーを残した。
【０１０６】
統計評価
ＲＢＭバイオマーカーにおける変化
コントロールグループは、どのインスリン抵抗性バイオマーカーが床上安静にわたって変化したかを調べるために検査した。個々の一変量の対応のあるｔ−検定を、１２４のマーカーのそれぞれに対して実行した。コントロールグループ内で床上安静にわたってマッチしたデータを有した参加者は合計８人であった。最初の一変量の分析から、３つのインスリン抵抗性マーカーが、床上安静にわたって統計的に有意な変化を示し、未調整ｐ−値は０．０５未満であった。
【０１０７】
ＡＮＣＯＶＡ検定の有意性
ＨＭＢ介入によって媒介され得る床上安静にわたるマーカーにおける変化を評価するために、個々の一変量のＡＮＣＯＶＡ分析は、複数の対応のあるｔ−検定からの３つの（未調整）有意なインスリン抵抗性マーカーのそれぞれに対して続いて実行した。０．００３８（０．０５／１３）のＢｏｎｆｅｒｏｎｎｉの調整ｐ−値を使用すると、３つのインスリン抵抗性マーカーが有意であった。この結果は、ベースライン（前床上安静）時の既存の差異をコントロールする限り、これらの３つのインスリン抵抗性マーカーが、コントロールおよびＨＭＢグループの間で、床上安静の後に統計的な差異を示したことを示す。
【０１０８】
［実施例１］：１０日間の床上安静を経験した対象におけるＩＧＦＢＰ−２の循環レベルに対するＨＭＢ介入の効果
ＩＧＦ結合タンパク質は、ＩＧＦの半減期を延ばし、これらの細胞表面受容体とのＩＧＦの相互作用を改変する。循環ＩＧＦＢＰ−２の減少は、ヒト対象においてインスリン抵抗性の増加に関連する。
【０１０９】
表１において示されるように、１０日間の床上安静の後に８人のコントロール対象においてＩＧＦＢＰ−２の循環レベルの−３０．５４ｎｇ／ｍｌの平均の減少または−２４．５６％の減少があった。対照的に、ＨＭＢにより治療した１０人の対象からの血液におけるＩＧＦＢＰ−２レベルの平均の減少は、はるかに少なかった。表１において示されるように、これらのＨＭＢ治療対象におけるＩＧＦＢＰ−２の血中レベルにおいて−２０．８９ｎｇ／ｍｌの平均の減少または−１５．６３％の減少があった。これらの結果は、ＨＭＢが、長期床上安静の間にコントロール対象において生じるＩＧＦＢＰ−２の血中レベルにおける減少を低下させるまたは弱めることを示す。
【０１１０】
［実施例２］：１０日間の床上安静を経験した対象におけるＣ−ペプチドの循環レベルに対するＨＭＢ介入の効果
Ｃ−ペプチド（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号：Ｐ０１３０８）は、プロインスリン分子（インスリン前駆物質）の一部として膵臓のベータ細胞によって産生される。循環Ｃ−ペプチドにおける増加は、ヒト対象においてインスリン抵抗性に関連する。
【０１１１】
表１において示されるように、１０日間の床上安静の後に８人のコントロール対象においてＣ−ペプチドの循環レベルの０．５４ｎｇ／ｍｌの平均の増加または４３．０％の平均の増加があった。対照的に、１０人のＨＭＢ治療対象からの血液におけるＣ−ペプチドレベルの平均の増加は、はるかに少なかった。表１において示されるように、１０日間の床上安静の後にこれらのＨＭＢ治療対象においてＣ−ペプチドの血中レベルの０．２８ｎｇ／ｍｌの平均の増加または２９．５９％の増加があった。これらの結果は、ＨＭＢが、長期床上安静の間に未治療コントロール対象において生じるＣ−ペプチドの血中レベルにおける増加を低下させるまたは弱めることを示す。
【０１１２】
［実施例３］：１０日間の床上安静を経験した対象におけるレプチンの循環レベルに対するＨＭＢ介入の効果
レプチンは、遊離および結合形態で、血清中で循環する１６ｋＤａの脂肪細胞由来のホルモンである。（Ｍａｎｔｚｏｒｏｓ  ＣＳ，Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １９９９；１３０：６７１−６８０．研究により、インスリン抵抗性が、体脂肪率と無関係に、血漿レプチンレベルの上昇に関連することが示された。（Ｓｅｇａｌ  ＫＲ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９６；４５：９８８−９９１．）
表１において示されるように、１０日間の床上安静の後に８人のコントロール対象においてレプチンの循環レベルの５．０６ｎｇ／ｍｌの平均の増加があった。対照的に、１０日間の床上安静の後に、１０人のＨＭＢ治療対象においてレプチンの循環レベルの４．１１ｎｇ／ｍｌのより低い平均の増加があった。これらの値は、コントロール値よりも有意に低い。これらの結果は、ＨＭＢが、長期床上安静の間に未治療コントロール対象において生じるレプチンの血中レベルにおける増加を低下させるまたは弱めることを示す。
【０１１３】
結論：総合的に考えると、３つのマーカーはすべて、ヒト対象における長期身体不活動の間のインスリン抵抗性の発症に対するＨＭＢの保護効果を示す。
【０１１４】
【表１】
2016513701.tif 000002
【国際調査報告】
2016513701.tif 000003
2016513701.tif 000004
2016513701.tif 000005
2016513701.tif 000006
2016513701.tif 000007