(57)【要約】【課題】  キトサンおよび液晶形成物質を含み、水性流体上で液晶を形成する遺伝子伝達用組成物を提供すること。【解決手段】  本発明のキトサンおよび液晶形成物質を含む遺伝子伝達用組成物は、キトサンおよび遺伝子間の低い遺伝子結合力を改善し、血清内キトサンナノ複合体の安定性を画期的に改善することによって、高効率の遺伝子伝達力とともに優れた安定性を有するので、遺伝子治療剤として好適に使用可能である。【選択図】  図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）液晶形成剤と、
ｂ）リン脂質(phospholipid)と、
ｃ）液晶硬化剤と、
ｄ）キトサンまたはその塩と、
を含む水性流体上で液晶を形成する遺伝子伝達用組成物。
【請求項２】
前記液晶形成剤は、ソルビタン不飽和脂肪酸エステル(sorbitan unsaturated fatty acid ester)、モノアシルグリセロール(monoacyl glycerol)、ジアシルグリセロール(diacyl glycerol)およびこれらの混合物よりなる群から選択される一種以上である請求項１に記載の遺伝子伝達用組成物。
【請求項３】
前記液晶形成剤は、極性頭基に−ＯＨ（ヒドロキシル、hydroxyl）基が２つ以上存在するソルビタン不飽和脂肪酸エステル(sorbitan unsaturated fatty acid ester)である請求項１に記載の遺伝子伝達用組成物。
【請求項４】
前記ソルビタン不飽和脂肪酸エステルは、モノオレイン酸ソルビタン(sorbitan monooleate)、モノリノール酸ソルビタン(sorbitan monolinoleate)、モノパルミトレイン酸ソルビタン(sorbitan monopalmitoleate)、モノミリストレイン酸ソルビタン(sorbitan monomyristoleate)、セスキオレイン酸ソルビタン(sorbitan sesquioleate)、セスキリノール酸ソルビタン(sorbitan sesquilinoleate)、セスキパルミトレイン酸ソルビタン(sorbitan sesquipalmitoleate)、セスキミリストレイン酸ソルビタン(sorbitan sesquimyristoleate)、ジオレイン酸ソルビタン(sorbitan dioleate)、ジリノール酸ソルビタン(sorbitan dilinoleate)、ジパルミトレイン酸ソルビタン(sorbitan dipalmitoleate)、ジミリストレイン酸ソルビタン(sorbitan dimyristoleate)およびこれらの混合物よりなる群から選択される一種以上である請求項３に記載の遺伝子伝達用組成物。
【請求項５】
前記リン脂質(phospholipid)は、ホスファチジルコリン(phosphatidylcholine)、ホスファチジルエタノールアミン(phosphatidylethanolamine)、ホスファチジルセリン(phosphatidylserine)、ホスファチジルグリセリン(phosphatidylglycerine)、ホスファチジルイノシトール(phosphatidylinositol)、ホスファチジン酸(phosphatidic acid)、スフィンゴミエリン(sphingomyelin)およびこれらの混合物よりなる群から選択される一種以上である請求項１に記載の遺伝子伝達用組成物。
【請求項６】
前記液晶硬化剤は、トリグリセリド(triglyceride)、パルミチン酸レチニル(retinyl palmitate)、酢酸トコフェロール(tocopherol acetate)、コレステロール(cholesterol)、安息香酸ベンジル(benzyl benzoate)、ユビキノン(ubiquinone)およびこれらの混合物よりなる群から選択される一種以上である請求項１に記載の遺伝子伝達用組成物。
【請求項７】
前記キトサンは、水溶性キトサン、不溶性キトサンおよびキトサン誘導体よりなる群から選択される一種以上である請求項１に記載の遺伝子伝達用組成物。
【請求項８】
前記水溶性キトサンは、キトサンＨＣｌ、キトサン酢酸、キトサングルタミン酸およびキトサン乳酸よりなる群から選択される一種以上である請求項７に記載の遺伝子伝達用組成物。
【請求項９】
前記組成物は、遺伝子をさらに含む請求項１に記載の遺伝子伝達用組成物。
【請求項１０】
前記遺伝子は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ、プラスミド状ＤＮＡ、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、触媒的ＲＮＡおよびヌクレオチドよりなる群から選択される一種以上である請求項９に記載の遺伝子伝達用組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、分散剤をさらに含む請求項１に記載の遺伝子伝達用組成物。
【請求項１２】
前記分散剤は、１５ｍｅｒ以上のオリゴマー(oligomer)またはポリマー(polymer)の形態である請求項１１に記載の遺伝子伝達用組成物。
【請求項１３】
前記１５ｍｅｒ以上のオリゴマー(oligomer)またはポリマー(polymer)の形態の分散剤は、ポロキサマー(poloxamer)、ポリビニルアルコール(polyvinylalcohol)、Ｄ−α−トコフェロール-ポリエチレングリコールコハク酸(D-alpha-tocopherol polyethylene glycol succinate)、ポリエチレングリコール−モノオレイン酸グリセリル(polyethylene glycol-glyceryl monooleate)、疎水性修飾された澱粉(hydrophobically modified starch)およびこれらの混合物よりなる群から選択される一種以上である請求項１２に記載の遺伝子伝達用組成物。
【請求項１４】
チアミンピロリン酸(thiamine pyrophosphate)またはその薬学的に許容可能な塩をさらに含む請求項１から請求項１３のうちのいずれか一項に記載の遺伝子伝達用組成物。
【請求項１５】
プロタミン(protamine)またはその薬学的に許容可能な塩をさらに含む請求項１から請求項１３のうちのいずれか一項に記載の遺伝子伝達用組成物。
【請求項１６】
ラウリル硫酸ナトリウム(sodium lauryl sulfate)をさらに含む請求項１から請求項１３のうちのいずれか一項に記載の遺伝子伝達用組成物。
【請求項１７】
マンノース、グルコース、フルクトース、アラビノース、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、イソマルトース、デキストラン、デキストリン、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリンおよびスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンよりなる群から選択される一種以上の糖類をさらに含む請求項１から請求項１３のうちのいずれか一項に記載の遺伝子伝達用組成物。
【請求項１８】
安定化剤、緩衝剤、保存剤、無痛化剤および等張化剤よりなる群から選択される一種以上をさらに含む請求項１から請求項１３のうちのいずれか一項に記載の遺伝子伝達用組成物。
【請求項１９】
前記遺伝子伝達用組成物は、ナノ複合体を形成するものである請求項１に記載の遺伝子伝達用組成物。
【請求項２０】
前記ナノ複合体は、１０〜５００ｎｍのサイズを有する請求項１９に記載の遺伝子伝達用組成物。
【請求項２１】
前記ナノ複合体は、キトサンがコーティングされた形態の複合体である請求項１９に記載の遺伝子伝達用組成物。
【請求項２２】
液晶を含有する溶液と、
キトサンまたはその塩を含有する溶液と、
を含む遺伝子伝達用組成物。
【請求項２３】
前記液晶は、液晶形成剤、リン脂質、液晶硬化剤を含むものである請求項２２に記載の遺伝子伝達用組成物。
【請求項２４】
ａ）液晶形成剤と、
ｂ）リン脂質(phospholipid)と、
ｃ）液晶硬化剤と、
ｄ）キトサンまたはその塩と、
を含む遺伝子伝達組成物の凍結乾燥製剤。
【請求項２５】
ｅ）凍結乾燥用賦形剤をさらに含む請求項２４に記載の遺伝子伝達組成物の凍結乾燥製剤。
【請求項２６】
前記凍結乾燥用賦形剤は、糖アルコールまたは糖類である請求項２５に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２７】
前記糖類は、マンノース、グルコース、フルクトース、アラビノース、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、イソマルトース、デキストラン、デキストリン、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリンおよびスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンよりなる群から選択される一種以上の糖類である請求項２６に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項２８】
請求項９に記載の組成物を含むナノ複合体。
【請求項２９】
前記ナノ複合体は、遺伝子治療剤である請求項２８に記載のナノ複合体。
【請求項３０】
前記ナノ複合体は、注射用製剤である請求項２８に記載のナノ複合体。
【請求項３１】
前記ナノ複合体は、キトサンがコーティングされた形態の複合体である請求項２８に記載のナノ複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キトサンおよび液晶形成物質を含み、水性流体上で液晶を形成する遺伝子伝達用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病の治療を目的とする遺伝子治療剤への取り組みは持続的に行われてきており、これまでも研究結果を製品化させるための努力が続いている。遺伝子は、ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）およびヌクレオチドの重合体である核酸を含む物質であり、核酸の各モノマーが有するリン酸基に起因する強い陰電荷を有している。一般的な化学治療技術に比べて、遺伝子治療技術は、ＤＮＡやＲＮＡのレベルにおいて活性作用が起こる。しかしながら、遺伝子は、遺伝子分解酵素によって分解され易く、細胞若しくは生体内において短い半減期を有しているため、これを克服するために必ず先行されるべき研究分野が「遺伝子細胞内伝達（ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」技術である。
【０００３】
遺伝子の細胞内伝達方法は、ウィルスの使用有無に応じて、ウィルス性ベクター（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）と非ウィルス性ベクター（ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）とに大別され、これらはそれぞれの特徴および長短所を有している。
【０００４】
ウィルス性ベクターは、ヒト細胞に感染を引き起こすウィルス固有の細胞内浸透機序を利用するため非ウィルス性ベクターよりは細胞内伝達効率が比較的に高いと知られているが、免疫反応による長期投与の行い難さとこれまで病原性を有するウィルスの複製可能性を完全に排除することができないという欠点を有している（ＩＳＲＮ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  ２０１２，  Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ６１６３１０，  １４  ｐａｇｅｓ）。
【０００５】
このようなウィルス性ベクターの欠点および危険性を補うために、現在、非ウィルス性ベクターによる遺伝子伝達技術への取り組みが盛んに行われている。ウィルス性ベクターと比較して、非ウィルス性ベクターの場合に感染の危険性がなく、伝達すべき遺伝子の大きさに制限がなく、体内免疫復元性の問題が比較的に少なく、繰り返し投与を行い易いというメリットを有している。非ウィルス性ベクターは、素材によって陽荷電脂質物質と陽荷電高分子物質とに大別でき、陰電荷を帯びる遺伝子と静電気的引力による結合力を利用するため伝達しようとする遺伝子および陽荷電ベクター間の物理的な混合だけでも複合体を手軽に準備することができるというメリットを有している。
【０００６】
先行技術である大韓民国特許第１０−２０１２−００７８６６１は、カチオン性脂質を合成して遺伝子とのイオン結合複合体を形成して伝達する技術である。具体的に、少なくとも１以上のカチオン性脂質（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ）および様々な界面活性剤からなる溶液に遺伝子を添加することにより、非共有イオン結合を形成する技術である。前記技術において用いられたカチオン性脂質は細胞毒性を有している虞があり、且つ、合成工程によって産生される脂質は高純度の精製が求められる素材であり、品質管理が行い難いが故に量産に問題がある。また、保管および流通過程の安定性が低いという欠点もあるため製品化させ難い。このため、本発明は、合成カチオン性脂質とは異なり、注射可能な脂質の混合物を用いて液晶を形成することにより、高い安定性を有する遺伝子伝達を提供するという点で前記技術とは相違点がある。
【０００７】
他の先行技術であるＵＳ２０１１００３８９４１は、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、脂質および錯化剤（ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）よりなるオリゴヌクレオチド−脂質ナノ粒子を製造するために、１）脂質、錯化剤およびカチオン性ポリマーを水と混合可能な有機溶媒において混合し、２）オリゴヌクレオチドを水溶液に溶かした後、３）１）の混合物を２）の水溶液に注射注入したり、１）の混合物および２）の水溶液を圧力下で混合したりして最終的な溶液を製造し、４）ここから有機溶媒を除去することによりナノ粒子を形成する製造過程を請求している。このような製造過程は、品質管理が行い難く、製造過程に特定の機械が求められる。また、量産し難いため実質的に技術の実施が行い難いという欠点もある。さらに、これらの技術は、広範な種々の物質を請求し、且つ、プロタミン（ｐｒｏｔａｍｉｎｅ）およびキトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）を言及しているが、キトサンを含む遺伝子伝達組成物の例示や本発明が目的とする効果について全く述べていない。加えて、特定の環境を通じた混合過程と有機溶媒の除去を通じたナノ粒子の製造過程を必ず使用しなければならないという点で本発明とは異なる。
【０００８】
液晶（ｌｉｑｕｉｄ ｃｒｙｓｔａｌ）は、液体の中間状態であるといえるが、結晶のように分子の配列が規則的ではないが、通常の液体のように固体から液体への相変移が起きたときに、無定形ではなく、比較的に規則的な状態の定形（ｃｒｙｓｔａｌ）をなす物質であり、液晶または中間相（ｍｅｓｏ−ｐｈａｓｅ）物質とも呼ばれる。
【０００９】
先行特許である大韓民国公開特許第１０−２０１２−００１３３３６号は、アシル脂質を用いて液晶ナノ粒子を製造した後、遺伝子をナノ粒子に存在する水性空洞（ａｑｕｅｏｕｓ  ｃａｖｉｔｙ）に内包させて伝達するシステムを提供している。これらの製剤は、乳酸またはグリコール酸分解産物を生成しないため注射部位の疼痛や炎症を伴わず、薬理学的活性物質を生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で約４週間持続的に放出可能であることが開示されている。しかしながら、前記製剤組成物の核心的な構成成分であるアシル脂質は、安定性が十分に確保されていないため、一般に医薬品の賦形剤として用いられない物質であるという問題がある。また、先行特許は、一部の薬理学的活性物質の活性低下を引き起こす有機溶媒を必須的に使用しなければならないという問題がある（Ｈ．Ｌｊｕｓｂｅｒｇ−Ｗａｈｒｅ，Ｆ．Ｓ．Ｎｉｅｌｓｅ，２９８，３２８−３３２（２００５）；Ｈ．Ｓａｈ，Ｙ．ｂａｈｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０６，５１−６１（２００５））。
【００１０】
遺伝子伝達複合体を製造するに当たって、キトサンは、生体適合性に優れており、且つ、量産し易い天然のカチオン性素材であるため、良質の非ウィルス性伝達体の候補になり得る。特に、キトサンは、生体内に投与された後、リゾチーム（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）によってアミノ糖に分解される物質であり、現在、ラットにおけるのＬＤ５０が１６ｇ／ｋｇであると知られているだけあって、安全なポリマー物質である（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７；１８：１１７−１３１）。
【００１１】
キトサンは、遺伝子とイオン結合をすることができるため、遺伝子を細胞内に伝達するための非ウィルス性伝達体として有力な候補であるが、生理学的ｐＨ（ｐＨ７〜７．４）においてカチオン性電荷が弱くなるが故に遺伝子との結合力が低下する。結果的に、生理学的ｐＨにおいてキトサンは遺伝子との複合体を維持できずに解体されて遺伝子を細胞内に伝達する効力が顕著に低下する虞がある。
【００１２】
たとえキトサンと、遺伝子およびチアミンピロリン酸のみよりなるナノ複合体を製造するとしても、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で遺伝子伝達力を向上させることができるが、生体内では、生体外とは異なり、多量の血清タンパク質および細胞滲出物が存在するためキトサン複合体の遺伝子伝達力が発現されない。これは、キトサンナノ複合体が生体内に投与されたとき、生体内の環境下で血清タンパク質などと凝集し、結果的にこれが沈殿現象を引き起こして遺伝子伝達力を失うためである。これらの理由から、これまで既存のキトサン複合体は生体内で遺伝子伝達力を発現することができず、未だ遺伝子伝達体として製品化されていない（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２０１１；８：３４３−３５７）。
【００１３】
このように、キトサンを遺伝子伝達体として人体に適用するためには、キトサンナノ複合体が生理学的ｐＨにおいて遺伝子伝達効力を有するようにしなければならず、さらに、生体内に注入された後にも血清内凝集が起こらずにナノ複合体の安定性を維持しなければならない。
【００１４】
しかしながら、これまで、キトサンを用いて遺伝子を伝達するに当たって、血清内においてナノ複合体の安定性を維持し、毒性を示さないとともに、効果的に生体内で遺伝子の効果を発現させる技術は報告されておらず、キトサンを用いた効果的な遺伝子伝達体の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】大韓民国特許第１０−２０１２−００７８６６１
【特許文献２】米国特許２０１１００３８９４１
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓａｆｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｔｏ  Ｍｉｎｉｍｉｚｅ  ｔｈｅ  Ｒｉｓｋ  ｏｆ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ：  Ａ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｉｓｓｕｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（ＩＳＲＮ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１２，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ６１６３１０，１４ｐ）
【非特許文献２】Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈ．Ｌｊｕｓｂｅｒｇ−Ｗａｈｒｅ，Ｆ．Ｓ．Ｎｉｅｌｓｅ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ．２００５；２９８：３２８−３３２（２００５））
【非特許文献３】Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｕｐｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｔ  ｗａｔｅｒ／ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ（Ｈ．Ｓａｈ，Ｙ．ｂａｈｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０６，５１−６１（２００５）
【非特許文献４】Ｃｈｉｔｉｎ／ｃｈｉｔｏｓａｎ：  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｎｌｉｍｉｔｅｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ−ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ（Ｋ．Ｖ．Ｈａｒｉｓｈ  Ｐｒａｓｈａｎｔｈ，Ｒ．Ｎ．Ｔｈａｒａｎａｔｈａｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｃｈ  ２００７，Ｐａｇｅｓ  １１７−１３１）
【非特許文献５】Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｉｙａ  Ｐｒａｋａｓｈ  Ｋａｒｍａｌｉ１  ＆  Ｄｍｉｔｒｉ  Ｓｉｍｂｅｒｇ， Ｐａｇｅｓ  ３４３−３５７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、液晶形成物質（ｌｉｑｕｉｄ ｃｒｙｓｔａｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍａｔｅｒｉａｌ）およびキトサンを含む遺伝子伝達用組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、液晶形成物質と、キトサンおよび遺伝子を含むナノ複合体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、液晶形成剤と、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）と、液晶硬化剤（ｌｉｑｕｉｄ ｃｒｙｓｔａｌ ｈａｒｄｅｎｅｒ）およびキトサンを含む水性流体上で液晶を形成する遺伝子伝達用組成物を提供する。
【００１９】
本発明の液晶形成剤およびキトサンを含む遺伝子伝達用組成物は、キトサンおよび遺伝子間の低い遺伝子結合力を改善し、血清内キトサンナノ複合体の安定性を画期的に改善することにより、高効率の遺伝子伝達力とともに優れた安定性を有するので、遺伝子治療剤として好適に使用可能である。
【００２０】
より具体的に、本発明の液晶形成剤と、リン脂質および液晶硬化剤は、水溶液上で液晶を形成することができる。このようにして形成された液晶は、キトサンおよび遺伝子と安定的なナノ複合体を形成して遺伝子の伝達効能を大幅に向上させることができ、安定性に優れているので、前記複合体が長期に亘って均質な状態を維持することができる。
【００２１】
前記「液晶形成剤（ｌｉｑｕｉｄ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｆｏｒｍｅｒ）」は、非層状構造である液晶を形成する物質であり、ソルビタン不飽和脂肪酸エステル（ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｅｓｔｅｒ）、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロールおよびこれらの混合物よりなる群から１種以上選択される。
【００２２】
また、前記液晶形成剤は、極性頭基に−ＯＨ（ヒドロキシル、hydroxyl）が２つ以上存在するソルビタン不飽和脂肪酸エステルであってもよい。このようなソルビタン不飽和脂肪酸エステルは、下記の化学式１の化合物を意味し、中でも、ソルビタンモノエステルは、Ｒ１＝Ｒ２＝ＯＨ、Ｒ３＝Ｒ、ソルビタンジエステルは、Ｒ１＝ＯＨ、Ｒ２＝Ｒ３＝Ｒ、ここで、Ｒは、炭素数が４〜３０であり、二重結合を一つ以上含むアルキルエステル基を意味する。
【００２３】
【化１】
2016511255.tif 000003
【００２４】
具体的に、本発明のソルビタン不飽和脂肪酸エステルは、植物性油、動物性脂肪および油だけではなく、鯨油および魚油から得られる。好適な植物性オイル類の例としては、カカオ脂、ルリチシャ油、玄米油、緑茶油、大豆油、麻実油、胡麻油、チェリー種油、菜種油、けし油、カボチャ種子油、ブドウ種子油、杏仁油、ココナッツ油、椿油、月見草油、なたね油、ひまわり油、カノーラ油、松実油、胡桃油、ヘーゼルナッツ油、アボカド油、アーモンド油、ピーナッツ油、ホホバ油、ヤシ油、ヒマシ油、オリーブ油、トウモロコシ油、胡麻油、綿実油、紅花種油、ボリジ油およびサクラソウ油などが挙げられ、好適な動物性脂肪および油類の例としては、乳脂肪、牛脂、哺乳類油、爬虫類油および鳥類油が挙げられ、好ましくは、鯨油および魚油から得られる脂肪酸に由来するソルビタンモノエステル(sorbitan monoester)、ソルビタンセスキエステル(sorbitan sesquiester)、ソルビタンジエステル(sorbitan diester)およびこれらの混合物の中から１種以上選択される。
【００２５】
好ましくは、前記ソルビタンモノエステル(sorbitan monoester)は、ソルビタンに1つの脂肪酸基がエステル結合したものであり、モノオレイン酸ソルビタン(sorbitan monooleate)、モノリノール酸ソルビタン(sorbitan monolinoleate)、モノパルミトレイン酸ソルビタン(sorbitan monopalmitoleate)、モノミリストレイン酸ソルビタン(sorbitan monomyristoleate)およびこれらの混合物の中から１種以上選択される。
【００２６】
前記ソルビタンセスキエステル(sorbitan sesquiester)は、ソルビタンに平均1.5個の脂肪酸基がエステル結合したものであり、セスキオレイン酸ソルビタン(sorbitan sesquioleate)、セスキリノール酸ソルビタン(sorbitan sesquilinoleate)、セスキパルミトレイン酸ソルビタン(sorbitan sesquipalmitoleate)、セスキミリストレイン酸ソルビタン(sorbitan sesquimyristoleate)およびこれらの混合物の中から１種以上選択される。
【００２７】
前記ソルビタンジエステル(sorbitan diester)は、ソルビタンに２つの脂肪酸基がエステル結合したものであり、ジオレイン酸ソルビタン(sorbitan dioleate)、ジリノール酸ソルビタン(sorbitan dilinoleate)、ジパルミトレイン酸ソルビタン(sorbitan dipalmitoleate)、ジミリストレイン酸ソルビタン(sorbitan dimyristoleate)およびこれらの混合物の中から１種以上選択される。
【００２８】
また、本発明の他の液晶形成剤であるモノアシルグリセロール(monoacyl glycerol)は、グリセリン(glycerine)からなる極性頭部(polar head)に1つの脂肪酸(fatty acid)基がエステル(ester)結合したものであり、ジアシルグリセロール(diacyl glycerol)は、グリセリンからなる極性頭部に同一または異なる２つの脂肪酸基がエステル結合したものである。
【００２９】
本発明のモノアシルグリセロール(monoacyl glycerol)およびジアシルグリセロール(diacyl glycerol)にエステル結合する脂肪酸基は炭素数４〜３０であり、互いに同一または異なる炭素数を有し、それぞれ独立して飽和または不飽和される。具体的に、前記脂肪酸基は、パルミチン酸(palmitic acid)、パルミトレイン酸(palmitoleic acid)、ラウリン酸(lauric acid)、酪酸(butyric acid)、吉草酸(valeric acid)、カプロン酸(caproic acid)、エナント酸(enanthic acid)、カプリル酸(caprylic acid)、ペラルゴン酸(pelargonic acid)、カプリン酸(capric acid)、ミリスチン酸(myristic acid)、ミリストレイン酸(myristoleic acid)、ステアリン酸(stearic acid)、アラキジン酸(arachidic acid)、ベヘン酸(behenic acid)、リグノセリン酸(lignoceric acid)、セロチン酸(cerotic acid)、リノレン酸(linolenic acid、LA)、アルファリノレン酸（ａｌｐｈａ−ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ  ａｃｉｄ、ＡＬＡ）、エイコサペンタエン酸（ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、ＤＨＡ）、リノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、ＬＡ）、ガンマリノール酸（ｇａｍｍａ−ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、ＧＬＡ）、ジホモガンマ−リノール酸（ｄｉｈｏｍｏ ｇａｍｍａ−ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、ＤＧＬＡ）、アラキドン酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、ＡＡ）、オレイン酸(oleic acid)、バクセン酸(vaccenic acid)、エライジン酸(elaidic acid)、エイコサン酸(eicosanoic acid)、エルカ酸(erucic acid)、ネルボン酸(nervonic acid)およびこれらの混合物の中から１種以上選択される。
【００３０】
具体的に、本発明のモノアシルグリセロール(monoacyl glycerol)は、モノ酪酸グリセロール(glycerol monobutyrate)、モノベヘン酸グリセロール(glycerol monobehenate)、モノカプリル酸グリセロール(glycerol monocaprylate)、モノラウリン酸グリセロール(glycerol monolaurate)、モノメタクリル酸グリセロール(glycerol monomethacrylate)、モノパルミチン酸グリセロール(glycerol monopalmitate)、モノステアリン酸グリセロール(glycerol monostearate)、モノオレイン酸グリセロール(glycerol monooleate)、モノリノール酸グリセロール(glycerol monolinoleate)、モノアラキジン酸グリセロール(glycerol monoarachidate)、モノアラキドン酸グリセロール(glycerol monoarachidonate)、モノエルカ酸グリセロール(glycerol monoerucate)およびこれらの混合物の中から１種以上選択される。
【００３１】
好ましくは、下記の[化学式 ２]のモノオレイン酸グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ；ＧＭＯ）が使用可能である。
【００３２】
【化２】
2016511255.tif 000004
【００３３】
また、本発明のジアシルグリセロール(diacyl glycerol)は、ジベヘン酸グリセロール(glycerol dibehenate)、ジラウリン酸グリセロール(glycerol dilaurate)、ジメタクリル酸グリセロール(glycerol dimethacrylate)、ジパルミチン酸グリセロール(glycerol dipalmitate)、ジステアリン酸グリセロール(glycerol distearate)、ジオレイン酸グリセロール(glycerol dioleate)、ジリノール酸グリセロール(glycerol dilinoleate)、ジエルカ酸グリセロール(glycerol dierucate)、ジミリスチン酸グリセロール(glycerol dimyristate)、ジリシノレイン酸グリセロール(glycerol diricinoleate)、ジパルミトレイン酸グリセロール(glycerol dipalmitoleate)およびこれらの混合物の中から１種以上選択される。好ましくは、下記の[化学式 ３]のジオレイン酸グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｄｉｏｌｅａｔｅ；ＧＤＯ）が使用可能である。
【００３４】
【化３】
2016511255.tif 000005
【００３５】
本発明の「リン脂質(phospholipid)」は、従来よりリポソーム(liposome)などの層状構造（ｌａｍｅｌｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の製造に必須的に使用されてきた物質であるが、独自的には非層状構造（ｎｏｎ−ｌａｍｅｌｌａｒ  ｐｈａｓｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の液晶を形成することはできない。ところが、本発明の液晶形成剤によって触発される非層状構造に参加して液晶を安定化させる役割を果たす。
【００３６】
具体的に、本発明のリン脂質は、植物または動物に由来する形態であり、 好ましくは、飽和または不飽和された炭素数４〜３０のアルキルエステル基を有し、極性頭部の構造に応じてホスファチジルコリン(phosphatidylcholine)、ホスファチジルエタノールアミン(phosphatidylethanolamine)、ホスファチジルセリン(phosphatidylserine) 、ホスファチジルグリセリン(phosphatidylglycerine)、ホスファチジルイノシトール(phosphatidylinositol)、ホスファチジン酸(phosphatidic acid)、スフィンゴミエリン(sphingomyelin) およびこれらの混合物の中から１種以上選択される。リン脂質に結合されるアルキルエステル基(alkyl ester group)としては、モノおよびジパルミトイル(mono- and dipalmitoyl)、モノおよびジミリストイル(mono- and dimyristoyl)、モノおよびジラウリル(mono- and dilauryl)、モノおよびジステアリル(mono- and distearyl) などの飽和脂肪酸エステルやモノおよびジリノレイル(mono- or dilinoleyl)、モノおよびジオレイル(mono- and dioleyl)、モノおよびジパルミトレイル(mono- and dipalmitoleyl)、モノおよびジミリストレイル(mono- and dimyristoleyl)などの不飽和脂肪酸エステルが挙げられ、飽和脂肪酸エステルおよび不飽和脂肪酸エステルが共存する形態であってもよい。
【００３７】
本発明においては、好適な例として、前記リン脂質(phospholipid)がホスファチジルコリン(phosphatidylcholine)、ホスファチジルエタノールアミン(phosphatidylethanolamine)、ホスファチジルセリン(phosphatidylserine)、ホスファチジルグリセリン(phosphatidylglycerine)、ホスファチジルイノシトール(phosphatidylinositol)、ホスファチジン酸(phosphatidic acid)、スフィンゴミエリン(sphingomyelin)およびこれらの混合物の中から選択される一種以上である遺伝子伝達用組成物を提供する。
【００３８】
本発明の「液晶硬化剤(liquid crystal hardener)」は、独自的には液晶形成剤のように非層状構造を形成することができないうえ、リン脂質のようにリポソームなどの層状構造を形成することもできない。ところが、本発明の液晶硬化剤は、液晶形成剤によって触発される非層状構造に参加して非層状構造の曲率（ｃｕｒｖａｔｕｒｅ、ねじれ）を高めて油水（ｏｉｌ、ｗａｔｅｒ）の規則的な混在程度をさらに高める結果をもたらす。また、分子構造の内部に極性が非常に制限的に存在すると同時に、非極性を示す部位の体積が大きい（ｂｕｌｋｙ）ほど液晶硬化剤として用いて好適である。
【００３９】
ところが、本発明の液晶硬化剤は、実際には、非常に特異的に、直接かつ反復的な実験によってのみ、人体に投与可能で生体に適した物質が選択され、その結果、本発明の組成物に適した液晶硬化剤は、それぞれが異なる分子構造を持っており、1つの構造で説明することはできなかった。但し、本発明の組成物に適した液晶硬化剤を解明した後、これらの構造の特性を観察してみたところ、カルボキシル基やアミン基などのイオン化基を有せず、疎水性部分は全体炭素数１５〜４０のバルキーな(bulky)トリアシル基または炭素環構造を有する物質であることを確認することができた。
【００４０】
本発明の液晶硬化剤は、好ましくは、カルボキシル基やアミン基などのイオン化基を有せず、弱い極性部分として水酸化基およびエステル構造を最大１個有し、相対的に疎水性部分は全体炭素数２０〜４０のバルキーなトリアシル基または炭素環構造を有する物質である。具体的に、トリグリセリド(triglyceride)、パルミチン酸レチニル(retinyl palmitate)、酢酸トコフェロール(tocopherol acetate)、コレステロール(cholesterol)、安息香酸ベンジル(benzyl benzoate)、ユビキノン(ubiquinone)およびこれらの混合物の中から選択されるが、これに限定されるものではない。
【００４１】
本発明においては、液晶硬化剤の好適な例として、前記液晶硬化剤が、トリグリセリド(triglyceride)、パルミチン酸レチニル(retinyl palmitate)、酢酸トコフェロール(tocopherol acetate)、コレステロール(cholesterol)、安息香酸ベンジル(benzyl benzoate)、ユビキノン(ubiquinone)およびこれらの混合物よりなる群から選択される一種以上である遺伝子伝達用組成物を提供する。
【００４２】
前記液晶は、液晶形成物質と、リン脂質および液晶硬化剤に加えて、界面活性剤を追加的に用いて形成することができる。追加的に使用可能な界面活性剤は、好ましくは、ソルビタン脂肪酸エステルにエチレンオキシドを結合したポリオキシエチレン高級脂肪族アルコールであるポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０であり、さらに好ましくは、ポリソルベート８０である。
【００４３】
本発明の「キトサン」は、（１→４）２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ−グルカンの構造を有する、天然に存在する非常に安全なカチオン性多糖類である。キトサンは、天然の甲殼類などから得られるキチン（ｃｈｉｔｉｎ）を脱アセチル化させて遊離アミン基を生成したポリマーの形態である。ここで、キトサンは、分子量が１〜５００ｋＤａであり、遊離アミン基が５０％以上であってもよく、好ましくは、キトサンの分子量が１５０〜４００ｋＤａであり、遊離アミン基が８０％以上であってもよいが、本発明がこれに制限されることはない。
【００４４】
キトサンの可溶化の側面からみて、水溶性キトサンおよび不溶性キトサン、キトサンの分子を変化させたキトサン誘導体もまた本発明のキトサンの範囲に含まれ、好ましくは、水溶性キトサンが使用可能である。
【００４５】
前記水溶性キトサンは、キトサンＨＣｌと、キトサン酢酸と、キトサングルタミン酸およびキトサン乳酸の中から選択される一種以上であってもよい。水溶性キトサンは、分子構造内のアミン基が塩酸または酢酸、グルタミン酸、乳酸などの酸性物質と当量比にて塩を形成しているため水に溶解可能である。水溶性キトサンは、注射剤の製造過程において細菌および異物が除去可能であるというメリットがある。
【００４６】
また、本発明は、前記遺伝子伝達用組成物が遺伝子をさらに含む遺伝子伝達用組成物を提供する。
【００４７】
前記遺伝子とは、ヌクレオチドおよびヌクレオチドの重合体である核酸を含む物質のことをいい、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ（デオキシリボ核酸, deoxyribonucleic acid）、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ（リボ核酸, ribonucleic acid）、プラスミド状のＤＮＡ、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ, small interfering RNA）、アンチセンスオリゴヌクレオチド(oligonucleotide)、リボザイム、触媒的ＲＮＡおよびヌクレオチドの中から選択される一種以上であってもよい。好ましくは、前記遺伝子は、プラスミド状ＤＮＡ、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの中から選択される一種以上である。前記遺伝子は遺伝子薬物であってもよく、ここで、遺伝子薬物とは、一つ以上の疾病治療または予防を薬効として示す遺伝子のことをいう。
【００４８】
さらに、本発明は、前記組成物が分散剤をさらに含む遺伝子伝達用組成物を提供する。
【００４９】
「分散剤」は、分子内に親油性および親水性の相反する性質を有する一種の界面活性剤であり、液体中に分散され難い無機・有機などの微細な粒子を均一に分散させて粒子の沈降や凝集を防いで安定的な組成を形成する薬剤である。
【００５０】
本発明の分散剤としては、１５ｍｅｒ以上のオリゴマー(oligomer)またはポリマー(polymer)の形態の分散剤が使用可能であり、好ましくは、ポロキサマー(poloxamer)、ポリビニルアルコール(polyvinylalcohol)、Ｄ−α−トコフェロール-ポリエチレングリコールコハク酸(D-alpha-tocopherol polyethylene glycol succinate)、ポリエチレングリコール−モノオレイン酸グリセリル(polyethylene glycol-glyceryl monooleate)、疎水性改質された澱粉(hydrophobically modified starch)およびこれらの混合物の中から選択され、さらに好ましくは、ポロキサマー、Ｄ−α−トコフェロール-ポリエチレングリコールコハク酸およびこれらの混合物の中から一種以上選択される。
【００５１】
また、本発明は、前記遺伝子伝達用組成物がチアミンピロリン酸(thiamine pyrophosphate)またはその薬学的に許容可能な塩をさらに含む遺伝子伝達用組成物を提供する。
【００５２】
前記チアミンピロリン酸は、ビタミンＢ１を体内に投与したとき、生体内において形成されるビタミンＢ１の活性型の形態を示す安全な物質であり、構造的に陽イオンおよび陰イオンを両方とも有しているためキトサンと遺伝子との間の弱い結合力を補う機能を有する。
【００５３】
また、本発明は、前記遺伝子伝達用組成物がプロタミン(protamine)またはその薬学的に許容可能な塩をさらに含む遺伝子伝達用組成物を提供する。
【００５４】
プロタミンは、アルギニンリッチな天然のカチオン性タンパク質であり、医薬品賦形剤として用いられている。プロタミンは、動物の精巣のうち特に鮭をはじめとする魚類の精子核に多量存在する物質であり、ヒストンのようにＤＮＡとの会合または解離を通じて遺伝情報の発現に与るタンパク質であることが知られている。抽出されたプロタミンの分子量は約４，０００〜１０，０００であり、構成アミノ酸の７０％以上がアルギニンとして存在するが、本発明はこれに何ら限定されない。具体的に、本発明のプロタミンの塩は、塩酸塩または硫酸塩をはじめとする酸性物質による塩の形態を網羅する。プロタミンは、塩の形成なしにも水に溶解可能であり、塩の形態もまた水に溶解可能であるため、いかなる形態をとるにせよ、本発明の遺伝子伝達用組成物に適用可能である。
【００５５】
また、本発明は、前記遺伝子伝達用組成物がラウリル硫酸ナトリウム(sodium lauryl sulfate)をさらに含む遺伝子伝達用組成物を提供する。
【００５６】
ラウリル硫酸ナトリウムは代表的なアニオン性界面活性剤であり、化学式はＣＨ３(ＣＨ２)１０ＣＨ２ＯＳＯ３Ｎａであり、白色または薄い黄色の結晶であり、アルキル硫酸ナトリウムの混合物である。互いによく混合されない液体や固体を液体に均一に分散させるために用いられ、本発明の組成物において粒子の凝集や沈降を防ぐ機能を有する。なお、ラウリル硫酸ナトリウムは、追加される含量比に応じて遺伝子伝達用組成物の剤形を調節することができる。
【００５７】
さらに、本発明は、前記遺伝子伝達用組成物が、マンノース、グルコース、フルクトース、アラビノース、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、イソマルトース、デキストラン、デキストリン、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリンおよびスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンよりなる群から選択される一種以上の糖類をさらに含む遺伝子伝達用組成物を提供する。
【００５８】
加えて、本発明は、前記遺伝子組成物が、薬剤学的に許容される添加剤として安定化剤、緩衝剤、保存剤、無痛化剤および等張化剤よりなる群から選択される一種以上をさらに含む遺伝子伝達用組成物を提供する。
【００５９】
安定化剤は、抗酸化剤、還元剤およびキレート剤成分などを含み、緩衝剤は、ｐＨの調節のための有機または無機の塩類などを含み、保存剤は、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、クレゾール、クロロクレゾールおよびベンジルアルコールなどの防腐性成分などを含み、無痛化剤は、ベンジルアルコール、およびクロロブタノールなどの局所麻酔成分を含み、等張化剤は、浸透圧の調節のための糖類および無機塩類成分などを含む。
【００６０】
また、本発明の前記遺伝子伝達用組成物は、形成されたナノ複合体を含む。前記ナノ複合体は、液晶形成剤と、リン脂質および液晶硬化剤を含む液晶と、キトサンおよび遺伝子を混合して形成することができる。前記ナノ複合体は、好ましくは、１０〜５００ｎｍ、より好ましくは、１０〜３００ｎｍ、さらに好ましくは、５０〜３００ｎｍ、１００〜３００ｎｍ、１５０〜３００ｎｍ、２００〜３００ｎｍのサイズのナノ複合体である。前記ナノ複合体の構造において、キトサンは表面に位置し、好ましくは、キトサンが表面にコーティングされた構造を有する。
【００６１】
さらに、本発明は、液晶を含有する溶液およびキトサンまたはその塩を含有する溶液を含む遺伝子伝達用組成物を提供する。
【００６２】
前記液晶は、液晶形成剤と、リン脂質および液晶硬化剤を含み、本発明の目的を阻害しない範囲内において界面活性剤などの物質をさらに含む。
【００６３】
また、本発明は、液晶形成剤と、リン脂質と、液晶硬化剤およびキトサンまたはその塩を含む遺伝子伝達用組成物の凍結乾燥製剤を提供する。
【００６４】
前記凍結乾燥製剤は、好ましくは、凍結乾燥用賦形剤をさらに含み、凍結乾燥用賦形剤は、好ましくは、糖アルコールまたは糖類であり、さらに好ましくは、糖類である。
【００６５】
前記糖アルコールは、好ましくは、マンニトール、エリスリトール、イノシトール、ソルビトールであり、前記糖類は、マンノース、グルコース、フルクトース、アラビノース、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、イソマルトース、デキストラン、デキストリン、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリンおよびスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンよりなる群から選択される一種以上の糖類であることが好ましく、さらに好ましくは、トレハロースまたはグルコースである。
【００６６】
前記凍結乾燥製剤の好適な形態の例として、凍結乾燥製剤は、ｐＨ調節剤、酸化防止剤、防腐剤、浸透圧調節剤などをさらに含む。
【００６７】
また、本発明の凍結乾燥製剤は、当業界における通常の凍結乾燥製造方法によって凍結乾燥され、凍結乾燥後に再水和しても本発明の遺伝子伝達の目的を達成することができるという良好な再構成特性を有する。すなわち、任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって非常に容易に再溶解し、凍結乾燥前の遺伝子伝達用組成物を再構築することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生理食塩水、その他の通常の輸液（例えば、葡萄糖、アミノ酸輸液）などが使用可能であるが、これに何ら限定されない。
【００６８】
この凍結乾燥製剤を再水和させた溶液は、静脈、筋肉、皮下、子宮内膜、脳血管などの注射剤などによって非経口投与することができる。
【００６９】
以上の構成成分を含有する本発明の組成物は、下記のようにして製造可能であるが、本発明はこれに何ら限定されない。
【００７０】
製造方法として、１）遺伝子、ラウリル硫酸ナトリウム若しくはチアミンピロリン酸とプロタミン、水溶性キトサンを水中において混合して前複合体（ｐｒｅ−ｃｏｍｐｌｅｘ）を製造するステップと、２）ここに液晶が分散された溶液を添加して最終的な液晶ナノ複合体の形態を形成するステップと、を含む製造方法が使用可能である。このときに形成されるナノ複合体は、細胞内への導入時に求められる粒子径を満たすように１０〜５００ｎｍのサイズを有し、好ましくは、１０〜３００ｎｍ、さらに好ましくは、５０〜３００ｎｍ、１００〜３００ｎｍ、１５０〜３００ｎｍ、２００〜３００ｎｍのサイズを有する。
【００７１】
本発明における前記遺伝子前複合体は、遺伝子、ラウリル硫酸ナトリウム若しくはチアミンピロリン酸とプロタミン、水溶性キトサンを混合し且つ攪拌して製造し、好ましくは、遺伝子および水溶性キトサンを１：０．３〜２０の重量比にて混合して製造する。ラウリル硫酸ナトリウム、チアミンピロリン酸、プロタミンは、前複合体に選択的に含まれ、好ましくは、遺伝子とラウリル硫酸ナトリウムは１：１の重量比にて、遺伝子とチアミンピロリン酸は１：１〜６の重量比にて、遺伝子とプロタミンは１：０．６の重量比にて混合して攪拌する。
【００７２】
本発明における前記液晶が分散された溶液は、液晶形成剤、リン脂質、液晶硬化剤を混合して攪拌して形成する。より具体的に、液晶形成剤、リン脂質、液晶硬化剤を常温下で攪拌して脂質溶液を製造し、製造された脂質溶液に分散剤を添加した後に均質化して製造する。好ましくは、前記液晶形成剤、リン脂質、液晶硬化剤は、０．２０〜１：１〜１．５：０．０５〜０．２の重量比にて混合して製造する。
【００７３】
本発明において、前記遺伝子前複合体と液晶が分散された溶液を混合し且つろ過して最終的に液晶ナノ複合体の形態を形成し、製造されたナノ複合体は、キトサンがコーティングされた形態であってもよい。
【００７４】
本発明の凍結乾燥製剤は、上記において最終的に製造された液晶ナノ複合体に糖アルコールまたは糖類、好ましくは、糖類を賦形剤として添加して混合した後、冷凍して製造する。前記糖類は、２０〜４０％、好ましくは、３０％の溶液状に製造された糖類であり、−５０〜−８０℃、好ましくは、−７０℃に冷凍して固体相として製造される。
【００７５】
また、本発明は、前記遺伝子伝達用組成物を含むナノ複合体を提供する。
【００７６】
前記ナノ複合体は、遺伝子治療剤として使用可能であり、キトサンが表面に存在しながら液晶および遺伝子をコーティングする形態で存在する。前記遺伝子治療剤は、ヒトなどの哺乳動物に適切な経路を経て、例えば、注射、経肺、経鼻、経口、直腸投与の形態で適用可能である。好ましくは、注射投与の形態として、静脈投与、筋肉投与、皮下投与、子宮内膜投与、脳血管投与などが挙げられ、必要に応じて、特定の組織臓器および癌組織に直接的に投与される。
【００７７】
本発明において、前記遺伝子治療剤の投与量は、１日につき１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内において調節可能である。但し、投与されるべき最適な投与量は、当業者によって容易に決定され、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有されている有効成分および他の成分の含量、剤形の種類および患者の年齢、体重、一般健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路、治療期間および併用される薬物をはじめとする様々な因子によって調節される。
【発明の効果】
【００７８】
本発明のキトサンおよび液晶形成物質を含む遺伝子伝達用組成物は、キトサンおよび遺伝子間の低い遺伝子結合力を改善し、血清内キトサンナノ複合体の安定性を画期的に改善することによって、高効率の遺伝子伝達力とともに優れた安定性を有するので、遺伝子治療剤として好適に使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】実施例２、実施例６の水性流体上における液晶の構造を確認した結果を示す図である。
【図２】実施例２、実施例６、実施例１０の急速凍結電子顕微鏡写真を示す図である。
【図３】実施例７、実施例１０、実施例１２、実施例１３、実施例１４、実施例１７、実施例１９と比較例１の粒子径を確認した結果を示す図である。
【図４】実施例７、実施例１０、実施例１２、実施例１３、実施例１４、実施例１７、実施例１９と比較例１の標的タンパク質の発現抑制力を観察した結果を示す図である。
【図５】実施例１０、実施例１７、実施例１８、実施例１９と比較例２、比較例３の血清内粒子安定性を確認した結果を示す図である。
【図６】実施例２３および実施例２４の凍結乾燥後の粒子径を確認した結果を示す図である。
【図７】実施例１０および比較例４の腫瘍増殖抑制力を観察した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
以下、実施例および実験例によって本発明を具体的に説明する。但し、これらの実施例および実験例は本発明の例示に過ぎないものであり、本発明の範囲を限定するものでない。
【実施例】
【００８１】
実施例１〜６.液晶を形成する脂質組成物の製造
[表１]に示す重量にてリン脂質、ソルビタン不飽和脂肪酸エステル（ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｅｓｔｅｒ）、液晶硬化剤、エタノールを添加して常温下で攪拌した後、均質な状態の脂質溶液を製造した。
【００８２】
脂質溶液０．１５ｍｌを１．１％のポロキサマー４０７水溶液５ｍｌに添加し、２０〜７５℃の温度で超音波粉砕器若しくはホモジナイザー（ＰｏｗｅｒＧｅｎｍｏｄｅｌ１２３，Ｆｉｓｈｅｒ）１，０００〜３，０００ｒｐｍの条件下で５〜１０分間均質化させて溶液相の液晶(liquid crystal)組成物を製造した。[表１]は、製造された組成物の最終成分に対する重量比を示す。
【００８３】
【表１】
2016511255.tif 000006
【００８４】
１)Ｌｉｐｏｉｄ Ｓ−１００は、ホスファチジルコリン(phosphatidylcholine)、ホスファチジルエタノールアミン(phosphatidylethanolamine)、ホスファチジルイノシトール(phosphatidylinositol)およびリゾホスファチジルコリン(lysophosphatidylcholine)からなり、主成分としてホスファチジルコリンを９４％以上含有している。
【００８５】
実施例７〜１３．遺伝子、キトサン、プロタミン、ラウリル硫酸ナトリウムおよび液晶を形成する脂質組成物間の複合体の製造
下記[表２]に示す重量にてリン脂質、ソルビタン不飽和脂肪酸エステル(sorbitan unsaturated fatty acid ester)、液晶硬化剤、エタノールを添加して常温下で攪拌した後、均質な状態の脂質溶液を製造した。
【００８６】
製造された脂質溶液０．１５ｍｌを１．１％のポロキサマー４０７水溶液５ｍｌに添加し、２０〜７５℃の温度で超音波粉砕器若しくはホモジナイザー（ＰｏｗｅｒＧｅｎｍｏｄｅｌ１２３，Ｆｉｓｈｅｒ）１，０００〜３，０００ｒｐｍの条件下で５〜１０分間均質化させて溶液相の液晶(liquid crystal)組成物を製造した。
【００８７】
ラウリル硫酸ナトリウムを追加的に含めて遺伝子を伝達する場合、活性物質として伝達されるべきサバイビン(Ｓｕｒｖｉｖｉｎ)ｓｉＲＮＡとラウリル硫酸ナトリウムを重量比１：１ｗ／ｗにて混合し、注射用水を用いて２０ｍｇ／ｍｌの濃度に製造した。分子量１５０ｋＤａのキトサンＨＣｌ、プロタミンとポロキサマー４０７を下記[表２]に示す重量比にて注射用水を用いて８ｍｇ／ｍｌの濃度に製造した後、製造された２０ｍｇ／ｍｌのサバイビンｓｉＲＮＡ、ラウリル硫酸ナトリウム溶液と体積比１：２．５ｖ／ｖにて混合して攪拌した。ラウリル硫酸ナトリウムを含んでいないサバイビンｓｉＲＮＡ混合液も、ラウリル硫酸ナトリウムを混合するステップを除いては、上記の方法と同様にして製造した。
【００８８】
最後に、製造された液晶組成物にサバイビンｓｉＲＮＡ混合液を[表２]に示す重量比にて追加して複合体を製造し、０．２２μｍのフィルターでろ過した。サバイビンｓｉＲＮＡは、センス：５’−ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＡＵＣ  ＡＡＣ  ＡＵＵ  ＵＵＣ  Ａ（ｄＴｄＴ）−３’、アンチセンス：５’−ＵＧＡ  ＡＡＡ  ＵＧＵ  ＵＧＡ  ＵＣＵ  ＣＣＵ  Ｕ（ｄＴｄＴ）−３’を有する配列を用いた。[表２]は、製造された組成物の最終成分に対する重量比を示す。
【００８９】
【表２】
2016511255.tif 000007
【００９０】
実施例１４〜１９．遺伝子、キトサン、プロタミン、チアミンピロリン酸および液晶を形成する脂質組成物を含む複合体の製造
下記[表３]に示す重量にてリン脂質、ソルビタン不飽和脂肪酸エステル(sorbitan unsaturated fatty acid ester)、液晶硬化剤、エタノールを添加して常温下で攪拌した後、均質な状態の脂質溶液を製造した。
【００９１】
製造された脂質溶液０．１５ｍｌを１．１％のポロキサマー４０７水溶液５ｍｌに添加し、２０〜７５℃の温度で超音波粉砕器若しくはホモジナイザー（ＰｏｗｅｒＧｅｎｍｏｄｅｌ１２３，Ｆｉｓｈｅｒ）１，０００〜３，０００ｒｐｍの条件下で５〜１０分間均質化させて溶液相の液晶(liquid crystal)組成物を製造した。
【００９２】
活性物質として伝達されるべき遺伝子であるサバイビンｓｉＲＮＡ２０ｍｇと分子量１５０ｋＤａのキトサンＨＣｌ３０ｍｇ、チアミンピロリン酸(thiamine pyrophosphate)３０ｍｇおよびプロタミン１ｍｇをそれぞれ注射用水１ｍｌに溶かして溶液を製造した。チアミンピロリン酸を含んでいないサバイビンｓｉＲＮＡ混合液も、チアミンピロリン酸を混合するステップを除いては、上記の方法と同様にして製造した。
【００９３】
このようにして製造された液晶組成物とそれぞれの水溶液を[表３]に示す重量比にて添加して複合体を製造し、０．２２μｍのフィルターでろ過した。[表３]は、製造された組成物の最終成分に対する重量比を示す。
【００９４】
【表３】
2016511255.tif 000008
【００９５】
実施例２０〜２４．遺伝子、キトサン、プロタミン、ラウリル硫酸ナトリウムおよび液晶を形成する脂質組成物間の複合体の凍結乾燥物の製造
下記[表４]に示す重量にてリン脂質、ソルビタン不飽和脂肪酸エステル(sorbitan unsaturated fatty acid ester)、液晶硬化剤、エタノールを添加して常温下で攪拌した後、均質な状態の脂質溶液を製造した。
【００９６】
製造された脂質溶液０．１５ｍｌを１．１％のポロキサマー４０７水溶液５ｍｌに添加し、２０〜７５℃の温度で超音波粉砕器若しくはホモジナイザー（ＰｏｗｅｒＧｅｎｍｏｄｅｌ１２３，Ｆｉｓｈｅｒ）１，０００〜３，０００ｒｐｍの条件下で５〜１０分間均質化させて溶液相の液晶(liquid crystal)組成物を製造した。
【００９７】
サバイビンｓｉＲＮＡとラウリル硫酸ナトリウムを重量比１：１ｗ／ｗにて混合し、注射用水を用いて２０ｍｇ／ｍｌの濃度に製造した。分子量１５０ｋＤａのキトサンＨＣｌ、プロタミンとポロキサマー４０７を重量比１：２：４ｗ／ｗにて混合し、注射用水を用いて８ｍｇ／ｍｌの濃度に製造した後、前記２０ｍｇ／ｍｌのサバイビンｓｉＲＮＡ、ラウリル硫酸ナトリウム溶液と１：２.５ｖ／ｖの体積比にて混合して攪拌した。ラウリル硫酸ナトリウムを含んでいないサバイビンｓｉＲＮＡ混合液も、ラウリル硫酸ナトリウムを混合するステップを除いては、上記の方法と同様にして製造した。
【００９８】
このようにして製造された液晶組成物にサバイビンｓｉＲＮＡ混合液を[表４]に示す重量比にて添加して複合体を製造し、０．２２μｍのフィルターでろ過した。製造された複合体を凍結乾燥させるために、予め３０％の溶液状に製造された糖類の賦形剤を[表４]に示す重量比にて混合した後に−７０℃に冷凍し、且つ、凍結乾燥して固体相を製造した。
【００９９】
【表４】
2016511255.tif 000009
【０１００】
比較例１．遺伝子、プロタミン、ラウリル硫酸ナトリウムおよび液晶を形成する脂質組成物間の複合体の製造
キトサンの有無による、遺伝子伝達のための複合体の生成能を比較するために、キトサンを含んでいない遺伝子伝達複合体を製造して比較した。具体的に、[表５]に示す重量にてリン脂質、ソルビタン不飽和脂肪酸エステル(sorbitan unsaturated fatty acid ester)、液晶硬化剤、エタノールを添加して常温下で攪拌した後、均質な状態の脂質溶液を製造した。
【０１０１】
製造された脂質溶液０．１５ｍｌを１．１％のポロキサマー４０７水溶液５ｍｌに添加し、２０〜７５℃の温度で超音波粉砕器若しくはホモジナイザー（ＰｏｗｅｒＧｅｎｍｏｄｅｌ１２３，Ｆｉｓｈｅｒ）１，０００〜３，０００ｒｐｍの条件下で５〜１０分間均質化させて溶液相の液晶(liquid crystal)組成物を製造した。
【０１０２】
サバイビンｓｉＲＮＡとラウリル硫酸ナトリウムを重量比１：１ｗ／ｗにて混合し、注射用水を用いて２０ｍｇ／ｍｌの濃度に製造した。プロタミンとポロキサマー４０７を重量比２：４ｗ／ｗにて混合し、注射用水を用いて８ｍｇ／ｍｌの濃度に製造した後、前記２０ｍｇ／ｍｌのサバイビンｓｉＲＮＡ、ラウリル硫酸ナトリウム溶液と１：２.５ｖ／ｖの体積比にて混合して攪拌した。ラウリル硫酸ナトリウムを含んでいないサバイビンｓｉＲＮＡ混合液も、ラウリル硫酸ナトリウムを混合するステップを除いては、上記の方法と同様にして製造した。
【０１０３】
上記の方法に従い製造された脂質溶液とサバイビンｓｉＲＮＡ混合液を[表５]に示す重量比にて添加して複合体を製造し、０．２２μｍのフィルターでろ過した。
【０１０４】
【表５】
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【０１０５】
比較例２および３．遺伝子、キトサン、チアミンピロリン酸およびプロタミンよりなる遺伝子薬物間の複合体の製造
液晶を形成する物質を含んでいない場合、遺伝子薬物の伝達のための複合体が効果的に形成可能であるか否かを確認するために、液晶を形成する物質を含んでいない複合体を製造した。
【０１０６】
まず、分子量１５０ｋＤａのキトサンＨＣｌ３０ｍｇ、チアミンピロリン酸２ｍｇ、プロタミン０．５ｍｇをそれぞれ注射用水１ｍｌに溶かした溶液を製造し、製造された水溶液を[表６]に示す重量比にて混合して複合体を製造した。
【０１０７】
【表６】
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【０１０８】
比較例４．遺伝子、水溶性キトサン、プロタミン、ラウリル硫酸ナトリウムおよび液晶を形成する脂質組成物間の複合体の製造
活性物質として含まれる遺伝子が効果的に伝達されて目的を達成するか否かを確認するために、サバイビンｓｉＲＮＡの代わりに腫瘍増殖抑制能のない遺伝子であるフルオレセイン標識ｄｓＲＮＡオリゴマー（Fluorescein-labeled dsRNA oligomer、ＦＬ ｄｓＲＮＡ、インビトロジェン社製）を含む比較群を製造して、遺伝子伝達の効力を比較するための対照群として用いた。
【０１０９】
まず、下記[表７]に示す重量にてリン脂質、ソルビタン不飽和脂肪酸エステル(sorbitan unsaturated fatty acid ester)、液晶硬化剤、エタノールを添加して常温下で攪拌した後、均質な状態の脂質溶液を製造した。
【０１１０】
製造された脂質溶液０．１５ｍｌを１．１％のポロキサマー４０７水溶液５ｍｌに添加し、２０〜７５℃の温度で超音波粉砕器若しくはホモジナイザー（ＰｏｗｅｒＧｅｎｍｏｄｅｌ１２３，Ｆｉｓｈｅｒ）１，０００〜３，０００ｒｐｍの条件下で５〜１０分間均質化させて溶液相の液晶組成物を製造した。
【０１１１】
ＦＬ ｄｓＲＮＡとラウリル硫酸ナトリウムを重量比１：１ｗ／ｗにて混合し、注射用水を用いて２０ｍｇ／ｍｌの濃度に製造し、ＦＬ  ｄｓＲＮＡとしては、５’−ＵＵＧ  ＵＵＵ  ＵＧＧ  ＡＧＣ  ＡＣＧ  ＧＡＡ  Ａ（ｄＴｄＴ）−３’配列を用いた。分子量１５０ｋＤａのキトサンＨＣｌ、プロタミンとポロキサマー４０７を重量比１：２：４ｗ／ｗにて注射用水を用いて８ｍｇ／ｍｌの濃度に製造した後、このようにして製造された２０ｍｇ／ｍｌのサバイビンｓｉＲＮＡ、ラウリル硫酸ナトリウム溶液と１：２.５ｖ／ｖの体積比にて混合して攪拌した。
【０１１２】
上記の方法によって製造された脂質溶液とＦＬ ｄｓＲＮＡ混合液を[表７]に示す重量比にて添加して複合体を製造し、０．２２μｍのフィルターでろ過した。
【０１１３】
【表７】
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【０１１４】
実験例１．水性流体上における液晶(liquid crystal)の構造の確認
実施例１〜実施例６に従い製造された脂質組成物が水性流体上で形成した液晶の結晶構造を偏光顕微鏡（Ｍｏｔｉｃ、ＢＡ ３００ Ｐｏｌ）を用いて確認するために、実施例１〜実施例６の脂質組成物をスライドガラスに非常に薄く塗布した後、３次蒸留水入りシャーレに４時間放置してスライドガラス上で液晶を形成した。気泡が入らないようにカバーガラスを覆った後、偏光顕微鏡（Ｍｏｔｉｃ、ＢＡ  ３００ Ｐｏｌ）を２００倍率に固定した後に観察した。
結果を図１に示す。
【０１１５】
図１に示すように、実施例２および６の結晶構造は優れた粒子安定性を提供する典型的な形態である六方晶系(hexagonal)の構造を示すことを確認した。
【０１１６】
実験例２．遺伝子、キトサン、ラウリル硫酸ナトリウム、プロタミンおよび液晶を形成する脂質組成物間の複合体を用いた急速凍結電子顕微鏡の観察
【０１１７】
急速凍結電子顕微鏡（Ｔｅｃｎａｉ  １２ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、フィリップス社製、オランダ）を用いて実施例２、実施例６および実施例１０の組成物を観察して、遺伝子伝達のための液晶複合体組成物の形成を確認した。製造された組成物を薄い水膜状にグリッドの上に載せた後に−１７０℃で急速凍結させた。また、製造社の解説書に従い、グリッド上の急速凍結された組成物の複合体を観察した。
結果を図２に示す。
【０１１８】
図２に示すように、実施例２および実施例６の脂質組成物は水性流体上で球状の六方晶系の網を形成するので典型的な液晶を形成することを確認した。また、実施例１０において、遺伝子、水溶性キトサン、ラウリル硫酸ナトリウム、プロタミンおよび液晶を形成する脂質組成物よりなる遺伝子伝達用液晶複合体組成物は典型的な球状のナノ複合体を形成することを確認した。
【０１１９】
実験例３．遺伝子、キトサン、ラウリル硫酸ナトリウム、チアミンピロリン酸、プロタミンおよび液晶を形成する脂質組成物間の複合体を用いた粒子径の測定
比較例１、実施例７、１０、１２、１３、１４、１７、１９の組成物に対して、電気泳動光散乱光度計（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、ＥＬＳ−Ｚ、大塚社製、日本）を用いて粒子径を測定した。製造された組成物の粒子径は、電気泳動光散乱光度計の製造社の解説書に従い、粒子径セル（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ ｃｅｌｌ）を用いて測定した。
結果を図３に示す。
【０１２０】
図３に示すように、遺伝子、水溶性キトサンおよび液晶を形成する脂質組成物が選択的にプロタミンを含んでいないか（実施例７、１４）、または、ラウリル硫酸ナトリウム（実施例１０、１２、１３）またはチアミンピロリン酸（実施例１７、１９）をさらに含む遺伝子伝達用液晶複合体組成物はいずれも２００〜３００ｎｍの均一な粒子径を有するのに対し、キトサンが含有されていない比較例１の組成物は粒子が均質ではなく、大きくなることを確認することができた。したがって、遺伝子の伝達のために欠かせない細胞の透過に適したナノ直径を有する複合体を形成する上でキトサンが必須的であることを確認した。
【０１２１】
実験例４．遺伝子、キトサン、ラウリル硫酸ナトリウム、チアミンピロリン酸、プロタミンおよび液晶を形成する脂質組成物間の複合体を用いた標的タンパク質の発現抑制力の観察
前記比較例１、実施例７、１０、１２、１３、１４、１７、１９の組成物処理群および遺伝子単独処理群の標的タンパク質の発現を抑える効力を評価するために、サバイビンＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．ＳＶＥ００）を用いて下記の方法を用いて実験を行った。ヒトの前立腺癌細胞株（ＰＣ−３、ＡＴＣＣ）を６ウェルプレートに１つのウェル当たりに１Ｘ１０５を分注して１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ：ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）培地の組成（ｐＨ７．２）にて３７℃、５％のＣＯ２の条件下で４８時間培養した。遺伝子薬物を投与する前に１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する新たな培地（ｐＨ７．２）に交換した後、２時間安定化させた。次いで、比較例１の組成物、実施例７、１０、１２、１３、１４、１７、１９の組成物、遺伝子単独をそれぞれ前立腺癌細胞株に添加し、３７℃、５％のＣＯ２の条件下で細胞を４８時間培養した。このときに投与される遺伝子薬物は２μｇ／ｗｅｌｌにした。培養が終わると、培地を除去した後に細胞溶解緩衝液（ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、セル・シグナリング・テクノロジー社製）５００μＬを添加して前立腺癌細胞株を回収した。また、回収物から細胞残渣および上澄液を分離するために、１２，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離した。上澄液１００μＬを用いて標的タンパク質発現抑制力を比較し、サバイビンＥＬＩＳＡキットを用いて製造社の解説書に従い培地サンプルに含まれているサバイビンのタンパク質の発現量を測定した。
結果を図４に示す。
【０１２２】
図４に示すように、遺伝子、水溶性キトサンおよび液晶を形成する脂質組成物が選択的にプロタミンを含んでいないか（実施例７、１４）、または、ラウリル硫酸ナトリウム（実施例１０、１２、１３）またはチアミンピロリン酸（実施例１７、１９）をさらに含む遺伝子伝達用液晶複合体組成物は、遺伝子が効果的に細胞内に伝達されることにより標的タンパク質の発現が顕著に抑えられた。これに対し、遺伝子単独処理およびキトサンのない複合体（比較例１）の場合にタンパク質の発現を全く抑えられないことを確認した。この結果から、たとえカチオン性のプロタミンを有しているとしても、効果的な遺伝子伝達効果を示すためにはカチオン性を帯びるキトサンが必要であるということが分かる。すなわち、本発明の複合体においてキトサンは核心的な遺伝子伝達機能を有し、本発明の組成からキトサンが排除される場合に遺伝子伝達機能が完全に失われることが分かる。
【０１２３】
実験例５．遺伝子、キトサン、ラウリル硫酸ナトリウム、チアミンピロリン酸、プロタミンおよび液晶を形成する脂質組成物間の複合体を用いた血清における粒子安定性の評価
キトサンを遺伝子伝達体として用いて生体内に適用するためには血清内における粒子安定性を確保することが必須的であるが、血清内において沈殿の形成が引き起こされて遺伝子伝達力を示さないという問題が指摘されてきた。このため、本発明の遺伝子伝達用液晶複合体組成物が血清内において安定的な粒子を形成するか否かを確認するために、液晶形成剤を含んでいない比較例２、３と本発明の実施例を比較した。
【０１２４】
具体的に、比較例２、３と実施例１０、１７、１８、１９を５０％の血清状態になるように混合し、３時間後に電気泳動光散乱光度計（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、ＥＬＳ−Ｚ、大塚社製、日本）を用いて粒子径の変化を測定した。製造された組成物は、電気泳動光散乱光度計の製造社の解説書に従い、それぞれ粒子径セル(particle size cell)を用いて粒子径を測定した。
結果を図５に示す。
【０１２５】
図５に示すように、遺伝子、水溶性キトサン、プロタミンおよび液晶を形成する脂質組成物が選択的にラウリル硫酸ナトリウム（実施例１０）またはチアミンピロリン酸（実施例１７、１８、１９）をさらに含む遺伝子伝達用液晶複合体組成物は、血清内においても製造初期の２００〜３００ｎｍの粒子径をそのまま維持した。これに対し、液晶を形成するための脂質組成物を除き、製造された遺伝子伝達用複合体（比較例２、比較例３）の場合には各１，５００ｎｍ、１，２００ｎｍ以上の粒子径が特定されて、血清内におけるタンパク質との凝集が激しく起きて粒子安定性が維持されないことを確認することができた。
【０１２６】
したがって、本発明は、キトサンと、液晶を形成する脂質組成物と、を構成成分として含むことにより、血清内における粒子の安定性を確保することができるので、既存の技術の問題を解消することができ、しかも、目的とする遺伝子を効果的に伝達することができることを確認した。
【０１２７】
実験例６．遺伝子、キトサン、ラウリル硫酸ナトリウム、プロタミンおよび液晶を形成する脂質組成物間の複合体を用いた凍結乾燥物の製造および粒子径の測定
保管し易さおよび流通し易さのために本発明の遺伝子伝達用液晶複合体組成物の凍結乾燥の可否を確認するために前記組成物を凍結乾燥させた後、再分散させ粒子径を確認した。
【０１２８】
具体的に、糖類であるトレハロースおよびグルコースをさらに含む実施例２３〜実施例２４の組成物を凍結乾燥させた後に遺伝子が１００μｇ／ｍｌになるように精製水で再分散させた後、電気泳動光散乱光度計（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、ＥＬＳ−Ｚ、大塚社製、日本）を用いて粒子径を観察した。製造された組成物の粒子径は、電気泳動光散乱光度計の製造社の解説書に従い、それぞれ粒子径セル(particle size cell)を用いて測定した。
結果を図６に示す。
【０１２９】
図６に示すように、実施例２３および実施例２４の組成物は、凍結乾燥後に再水和しても約２００ｎｍの初期粒子径を維持することを確認した。このことから、糖類をさらに添加して凍結乾燥し、生体適用時に再分散しても凍結乾燥前と同じレベルの粒子の安定性が維持されるので、保管および流通の過程において遺伝子伝達用液晶複合体組成物を凍結乾燥物の形態で安定的に保管することができるということが分かる。
【０１３０】
実験例７．遺伝子、キトサン、ラウリル硫酸ナトリウム、プロタミンおよび液晶を形成する脂質組成物間の複合体を用いた生体内における腫瘍増殖抑制力の評価
本発明の遺伝子伝達用液晶組成物によって伝達される遺伝子が生体内に伝達されて目的とする効果を効果的に示すか否かを確認するために、サバイビンｓｉＲＮＡを遺伝子として含む実施例１０の組成物および腫瘍抑制能力のない遺伝子ＦＬｄｓＲＮＡを遺伝子として含む比較例４の組成物による腫瘍抑制効果を確認した。生体内における遺伝子薬物伝達能を評価するために、前立腺癌が移植された免疫不全マウスモデルを用いた。前立腺癌が移植された免疫不全マウスモデルを構築するために、ＲＰＭＩ培養液５０μＬに再分散された前立腺癌細胞株２ｘ１０６個をマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＢＤバイオサイエンス社製）５０μＬと混合し、これを５週齢の免疫不全雄性マウスの皮下に注射した。腫瘍の大きさが１００ｍｍ３になるまで増殖させた後、遺伝子量が２００μｇ／ｍｌになるように製造された実施例１０の組成物および比較例４の組成物をマウスの尻尾静脈に注射した。このとき、一回の遺伝子薬物の投与量は４０μｇであり、２週間で合計６回投与した。
結果を図７に示す。
【０１３１】
図７に示すように、前立腺癌が移植された免疫不全マウスモデルに遺伝子、水溶性キトサン、ラウリル硫酸ナトリウム、プロタミンおよび液晶を形成する脂質組成物からなる遺伝子伝達用複合体組成物（実施例１０）を静脈注射した場合、生体内において腫瘍の増殖が顕著に抑えられるということを観察した。本発明の実施例１０の組成物が静脈注射された群は、未処理群と比較して、最後の投与日（Ｄａｙ  １１）とその日から一週間が経過した後（Ｄａｙ  １８）にそれぞれ約６３％および約７０％の腫瘍抑制率を示す。これに対し、未処理群および腫瘍増殖抑制力のない遺伝子を含む複合体組成物（比較例４）は腫瘍の増殖が抑えられず、増殖され続けることを確認した。この結果から、本発明の遺伝子伝達用複合体組成物が実際に生体内静脈注射によって遺伝子を効果的に伝達することができ、伝達された遺伝子が目的とする効果を手軽に達成するということが分かる。
【０１３２】
結果的に、本発明の組成物が実際に生体内全身投与に際して遺伝子伝達効果を効果的に発現することを証明し、既存のキトサン素材が遺伝子伝達用医薬品として実際に生体に適用できない原因である低い遺伝子結合力および血清内不安定性を両方とも払拭することができるということを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
本発明のキトサンおよび液晶形成物質を含む遺伝子伝達用組成物は、キトサンおよび遺伝子間の低い遺伝子結合力を改善し、血清内キトサンナノ複合体の安定性を画期的に改善することによって、高効率の遺伝子伝達力とともに優れた安定性を有するので、遺伝子治療剤として好適に使用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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