(57)【要約】  水性ビヒクル中にI型コラーゲン、骨形成蛋白のような骨原性増殖因子（OSF）、及びポロキサマー407のような逆感熱性生分解性ポリマーを含有する、非侵襲性注射用組成物。製剤は、例えば注射によって、非侵襲的に投与され得、従って、多くの現在市販されている骨誘導製品の制限を回避する。注射用骨原性製剤は、所望の場所で骨形成を効果的に誘導する。この注射用懸濁剤は、骨折治癒及び脊椎固定術において新生骨形成を誘導するために、パテとして鋳型へ及び／代用骨移植片としてスラブへ、生体吸収性骨ミネラル複合材（例えば、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム）及び／又はグリコサミノグリカン（例えば、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸）と共に使用することができる。
2016514030.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性ビヒクル中に骨原性増殖因子（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）（ＯＳＦ）、逆感熱性生分解性ポロキサマー及びＩ型コラーゲンを含む、注射用組成物。
【請求項２】
ＯＳＦが骨形成蛋白（ＢＭＰ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＢＭＰが、ＢＭＰ−２若しくはＢＭＰ−４若しくはＢＭＰ−６若しくはＢＭＰ−７（ＯＰ−１）のホモダイマー又はＢＭＰ−２／７ヘテロダイマー又は選択されたＢＭＰの組み合わせである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ＢＭＰが、コラーゲン−ポロキサマー足場１ｇ当たり３．５  ｍｇ未満の濃度で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
ミネラルをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
ミネラルが、リン酸三カルシウム又は合成若しくは天然ヒドロキシルアパタイトである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
ヒアルロニック化合物をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
ヒアルロニック化合物が分子量  ＞５００Ｄａを有する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
ヒアルロニック化合物が架橋ヒアルロン酸である、請求項１又は請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
室温での組成物粘度が注射器からの注射に適している、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
組成物が≦３０ニュートンの注射器押出力を示す、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
組成物が液体を５０〜８０質量％有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
コラーゲンの平均粒度が７０〜４２５μｍである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
組成物が可鍛性パテである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
水性ビヒクルが、ＯＳＦ、Ｉ型コラーゲン及びポリマーが溶解及び／又は懸濁している緩衝溶液である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
組成物が放射線造影剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
組成物が凍結乾燥混合物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
グリコサミノグリカンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸又はキトサンである、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
骨成長が望まれる部位に請求項１に記載の組成物を注射する工程を含む、その必要がある患者を治療する方法。
【請求項２１】
部位が、患者が脊椎固定を受けた部位である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
部位が骨折部位である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
脊椎固定又は骨折部位を治療するための医薬を製造する方法であって、該医薬が請求項１に記載の組成物を含む、方法。
【請求項２４】
骨成長をもたらすための医薬であって、該医薬が請求項１に記載の組成物を含む、医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2013年3月14日に出願された米国出願第61/783,803号の優先権を主張し、これは参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本発明は、骨成長を促すための組成物、より具体的には、新生骨形成を誘導するための代用骨移植片（BGS）に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
例えば、骨折修復又は脊椎固定用の、現在のBGS製剤の外科的適用は、骨原性増殖因子（osteogenic growth factor）を送達するために開発された送達システムの設計及び形状に起因して、侵襲性であり、時間がかかり、かつ煩雑であり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
概要
本発明者らは、水性ビヒクル中にI型コラーゲン、骨原性増殖因子（OSF）、及び逆感熱性生分解性ポリマーを含有する、非侵襲性注射用組成物を開発した。製剤は、例えば注射によって、非侵襲的に投与され得、従って、多くの現在市販されている骨誘導製品の制限を回避する。注射用骨原性製剤は、例えば、異所性骨形成（bone formulation）の標準ラットモデルによって確立されたように、骨形成を有効に誘導する。感熱性生分解性ポリマーは組成物のレオロジーを制御し、その結果、それは室温で注射され得、その温度が体温（37℃）へ上昇するにつれて、それは、OSFを含有する生体適合性ゲルを送達部位で形成し、従って、有用である場所で組成物（及び特にOSF）が局在化される。組成物中に骨コラーゲン粉末を使用することは、OSFについての適切な送達基質を提供し、骨形成（bone formulation）を促進する生物学的環境を提供する。この注射用組成物は、比較的低いOSF濃度で新生骨形成を可能にする。
【０００５】
組成物の好ましい実施態様において、OSFは、骨形成蛋白（BMP）、例えば、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7（OP-1）である。BMP-2又はBMP-4又はBMP-6又はBMP-7（OP-1）のホモダイマーが使用され得、同様に、選択されたBMPのヘテロダイマー、例えば、BMP-2/7ヘテロダイマーも使用され得る。選択されたBMPの組み合わせを使用してもよい。これらのタンパク質はヒトタンパク質であり得、それらは組換え手段によって作製され得；それらは、感熱性コラーゲン足場1 g当たり3.5mg未満の濃度で存在し得る。組成物はまた、ミネラル、例えば、リン酸三カルシウム又はヒドロキシルアパタイトを含み得る。組成物は、充填剤又は関節内補充薬（visco supplement）、例えば、ヒアルロニック化合物、特に、分子量 >500Daを有するものをさらに含み得る。ヒアルロニック化合物は、移植部位での鋳型又はスラブの形成を促進するために、架橋ヒアルロン酸など、架橋されていてもよい。グリコサミノグリカン、例えば、コンドロイチン硫酸又はキトサンが含まれていてもよい。
【０００６】
同様に、好ましい実施態様において、室温又はそれ未満で、組成物粘度は、注射器からの注射に適しており、例えば、組成物は、20 G-l.5"の注射針サイズを有する5 cc注射器から送達される場合、≦30ニュートンの注射器押出力を示す。組成物は可鍛性パテであり得る。組成物は、液体を50〜80質量%有する。コラーゲンの平均粒度は、粒子ふるいによって測定される場合、70〜425μmである。組成物成分は、緩衝溶液又は滅菌水中に溶解及び／又は懸濁している。組成物は放射線造影剤を含むことができ、組成物はヒアルロニック化合物を含む必要がない。
【０００７】
組成物は、所望の骨成長の部位に、例えば骨折部位に、又は脊椎固定術を受けている若しくは受けた患者については、脊椎固定の部位に、組成物を注射することによって骨成長誘導の必要がある患者を治療するために使用され得る。
【０００８】
定義：
ヒアルロニック化合物という用語は、グリコサミノグリカン（例えば、トリ又は細菌供給源などの生きている供給源由来の天然HA、又は合成HA）、並びにヒアルロン酸塩及び前述のものの誘導体、例えば、重合ゲル、架橋ゲル、及び誘導体化ヒアルロン酸を含む。
【０００９】
骨原性増殖因子（OGF）は、自然な骨形成プロセスをもたらす化合物、例えば、増殖及び分化因子（Growth and Differentiation Factor）（GDF）、骨原性タンパク質（Osteogenic Protein）（OP）、骨誘導因子（Osteoinductive Factor）（OIF）を意味する。この用語は、骨形成蛋白（BMP）、例えば、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7（OP-1）を含む。一般に、これらの因子は周知であり、市販されている。
【００１０】
ポロキサマーは、ポリオキシエチレン（ポリ(エチレンオキシド)）の2つの親水性鎖が隣接するポリオキシプロピレン（ポリ(プロピレンオキシド)）の中央疎水性鎖から構成される非イオン性トリブロック共重合体であり得る。一般にUS 3,740,421を参照のこと。ポロキサマーとしては、Synperonics (Croda Inc., Edison NJ)、特にポロキサマー407；プルロニック(BASFCorporation, Florham Park, NJ)；及びKolliphor (BASF Corporation, Tarrytown, NY)、ポリエトキシル化ヒマシ油及びLeGoo（登録商標）血管内閉塞ゲル（これは20%（食塩水中の質量パーセント）の精製ポロキサマー407から構成される）といった製品が挙げられる。ポロキサマーは、逆の、感熱性特性（即ち、温度が上昇するにつれて、粘度が増加する）を有する、生体適合性水溶性ポリマーのファミリーである。特に、使用されるポロキサマーは、無毒性・生体適合性・水溶性であり、その粘度は、使用範囲内で温度の上昇にともなって減少する。室温で、組成物は注射可能であるが、粘着性である。体温へ加熱されると、それは、化学組成の有効な変化無し−硬化無し−に温度誘発性相変化を受け、ポリマープラグ又はスラブを形成する。
【００１１】
本発明の1つ又はそれ以上の実施態様の詳細を、添付の図面及び下記の説明に記載する。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、説明及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかとなるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】新生骨形成の組織学的スコアを示す：PBS（陽性対照）中のBBC上にロードされたBMP-2と比べての、骨形成（bone formulation）を誘導する、20%プルロニックF-127中のBBC上にロードされたBMP-2の能力の評価；BBC、ウシ骨コラーゲン。
【図２Ａ】新生骨形成の組織学的スコアを示す：骨形成を誘導するBMP-2の能力に対する、足場にBBCを加えた場合の（as added scaffold with BBC）、ヒアルロン酸及びプルロニックF-127の効果。
【図２Ｂ】皮下移植片における新生骨形成についての組織学的スコアを示す。BBC/プルロニック酸を有する足場の場合の様々な市販のヒアルロン酸の評価：各ドットは個々の動物を示し、水平バーは群スコア中央値を示す。いずれの群間においても新生骨／軟骨形成（formulation）についての群スコア中央値において有意差はなかった（P>0.05）。
【図３】皮下移植片における新生骨形成（bone formulation）についての組織学的スコアを示す：BBC/22.%プルロニック酸と組み合わせての放射線造影剤（Isov）の評価：各ドットは個々の動物を示し、水平バーは群スコア中央値を示す。キー：+ 第1群対照(22.5% PL + 0μg BMP-2)に対してP<0.01；## 第1群対照に対してP<0.001；^ DGE群に対してP<0.05；PL＝プルロニック。
【図４】皮下移植片における新生骨形成の組織学的スコアを示す：BBC/プルロニック酸/BMPと組み合わせてのサンゴ-ヒドロキシアパタイト足場の評価。各円は個々の動物を示し、水平バーは群中央値である。キー：+ 25 BBC + 0μg BMP + P 対照（第1群）に対してP<0.01及び# P< 0.001；P＝プルロニック。
【図４Ａ】皮下移植片における新生骨形成についての組織学スコアを示す。様々な用量のBMP-2を用いての、臨床的に使用されるウシアキレス腱由来コラーゲン（Heliostat-InFuse, Medtronic）とBBC/プルロニック酸足場との比較。各ドットは個々の動物を示し、水平バーは群スコア中央値を示す。キー；I＝Infuse（登録商標）、BBC＝ウシ骨コラーゲン／プルロネート（pluronate）、〜両方の0μg群に対してP<0.05；A ^ 両方の0μg群に対してP<0.01；# 両方の0μg群に対してP<0.001；+ H-5.4μg群に対してP<0.01；++ H-5.4μg群に対してP<0.001、* H-5.4μg群に対してP<0.05。
【図５】病理学スコアを示す。各円は個々の動物を示し、水平バーは新生骨／軟骨産生についての群スコア中央値を示す。>1μg  BMP-2を含有する移植片を受容する群（第2群〜第12群）のいずれの間でも群スコア中央値の有意差はなかった。キー：+ 第1群に対してP<0.001；* 第1群に対してP<0.01；# 第1群に対してP<0.05。
【図６】サンプル中のタンパク質1グラム当たりのアルカリホスファターゼ活性に対するBBCロット及び足場サイズの効果を示す。
【図７】タンパク質1グラム当たりのアルカリホスファターゼ活性に対するHA及びプルロニックF-127の異なる比率の効果を示す。
【図８】サンプル中のカルシウム濃度に対する異なるBBCロット及び足場サイズの効果を示す。
【図９】サンプル中のカルシウムに対する異なるHA/プルロニックF-127濃度の効果を示す。
【図１０】ラット異所性モデルにおけるBMP-2の骨誘導ポテンシャルに対する異なるコラーゲン足場の効果を示す（担体として22.5%プルロニックF-127）。
【図１１】ラット異所性モデルにおけるBMP-2の骨誘導ポテンシャルに対する担体の効果を示す（足場としてBBC, 70〜425 um）。
【図１２】新生骨/軟骨形成についての病理学スコアを示す。各ドットは個々の動物を示し、水平バーは群スコア中央値を示す。群のいずれの間でも新生骨/軟骨形成についての群スコア中央値の有意差はなかった(P>0.05)。
【図１３】28日後のHA市販品移植片中のカルシウム濃度を示す。
【図１４】ラット異所性モデルにおけるBMP-2のための足場としての、BBCの既存のバッチ、ロット番号11848-79と比べての、BBCの新しいバッチ、ロット番号17075-43の骨誘導ポテンシャルを示す。
【図１５】ラット異所性モデルにおけるBMP-2の骨誘導ポテンシャルについての、対照と比べての担体緩衝液、グルタミン酸及びPBSの評価を示す。
【図１６】2つの新たな担体、2.5% HA及び20%プルロニックF-127/2.5% HAと20%プルロニックF-127との比較である。
【図１７】骨形成を誘導するrhBMP-2の能力に対する異なる担体の効果を示す。
【図１８】2匹のラット異所性モデルの比較である：異なる担体中の皮下（SQ）対筋肉内（IM）移植。
【図１９】病理学スコアの散布図グラフである。各ドットは個々の動物を示し、水平バーは群スコア中央値を示す。キー：+ 第1群対照（22.5% PL + 0μg rhBMP-2）に対してP<0.01；# 第1群対照に対してP<0.001；^ DGE群に対してP<0.05；PL = プルロニック。
【図２０】カルシウム濃度に対する異なる担体の効果を示す。
【図２１】移植片中の新生骨/軟骨についての病理学スコアを示す。各ドットは個々の動物を示し、水平バーは群スコア中央値を示す。記号は、対照第1群と比べての統計的有意性を示す。>3μg rhBMP-2が与えられた処置群のいずれの間にも有意差はなかった（P>0.05）。キー：^ 第1群に対してP<0.05；+ 第1群に対してP<0.01；# 第1群に対してP<0.001。
【図２２】カルシウム濃度に対するRBC及びBBCの効果を示す。
【図２３】カルシウム濃度に対する担体中の異なるBBC粒度、足場サイズ及び造影剤の効果を示す。
【図２４】皮下移植片における骨/軟骨産生についての病理学スコアの散布図グラフである。各ドットは個々の動物を示し、水平バーは群スコア中央値である。キー：+ (BMP-4, 3μgに対してP<0.05)；# (BMP-4, 0.3μgに対してP<0.05)；* (BMP-4, 3μgに対してp<0.01)；^ (BMP-4, 3μg及び0.3μgに対してP<0.001)；a (BMP-4, 1μgに対してP<0.05)；b (BMP-4, 0.3μgに対してP<0.01)；PL＝22.5%プルロニック；sqi＝皮下注射。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
詳細な説明
一般に、以下のプロトコルは、注射用骨原性組成物の形成を説明する。OGF、I型コラーゲン、及びポリマー成分は例示のために過ぎず、当業者は、臨床使用について、ヒトの臨床使用に承認されているものから成分が選択されることを理解するであろう。
【００１４】
骨原性溶液調製：
滅菌・不溶性・粒子状のウシ骨由来1型コラーゲンを、0.01 N HCl中の30〜40%エタノール(水中v/v)に溶解させ、ここへ0.01 N HCl又はグルタミン酸緩衝液(pH 4.8)中のBMP溶液を無菌的に添加し、3回ボルテックスし、4℃で1時間インキュベートし、次いで凍結乾燥へ供した。濃縮物中に添加したBMPの量は、コラーゲン25〜200mgに対して1〜100μgの範囲内である。次いで、凍結乾燥コラーゲン/BMP基質(約25 mg)をPBS(pH 7.4)中20〜40%プルロニックポリマー(v/v)150μl中に溶解させ、注射のために室温(RT)で徹底的に混合した。場合によっては、コラーゲン-BMP-プルロニック混合物を充填剤（例えば、ヒアルロン酸、骨ミネラル又はそれらの組み合わせ）と混ぜ合わせた。あるいは、BMP-骨コラーゲン-プルロニックポリマー、ミネラル及びグリコサミノグリカン及び放射線造影剤の混合物を滅菌環境において凍結乾燥することができ、手術室での使用前に水又は緩衝溶液中に懸濁することができる。
【００１５】
骨誘導アッセイ：
注射用骨原性製剤の骨誘導活性は、皮下部位での移植によって、又は齧歯動物の腹部筋膜若しくは骨格筋嚢へ経皮的に注射することによって評価することができる。注射後12〜21日で、移植片を採取し、記載されたように（Sampath. T.K. and Reddi, A.H. 1981）生化学分析（アルカリホスファターゼ及びカルシウム含有量）及び組織学によって骨形成活性についてアッセイした。
【００１６】
OGF：
OGF、例えば、天然又は組換えヒトBMP、例えば、BMP-2若しくはBMP-7（OP-1）若しくはBMP-4若しくはBMP-6、又は混合物は、商業的供給源から得ることができる。
【００１７】
コラーゲン基質：
I型コラーゲンは多数の商業的供給源から得ることができる。下記の実施例は、記載されたように（Sampath. T.K. and Reddi, A.H. 1981）作製されるウシ骨I型コラーゲンを使用する。臨床使用において、I型コラーゲンは、ヒトの治療において使用することができるものであるべきである。
【００１８】
ウシ脱塩骨幹骨基質DBM（70〜420μm）を、標準手順を使用することによって3〜6月齢のウシから作製した。次いで、ウシDBMを4℃で数時間(16〜24時間) 6 Mグアニジンへ供し、次いで水で洗浄し、酸性環境において1時間加熱し、次いで水洗浄し、エタノール処理し、その後、凍結乾燥した。脱塩・不溶性・グアニジン-HCl抽出・酸処理したウシ骨I型コラーゲンを、使用前に3.5メガラドガンマ線へ供することによって滅菌し、次いで、フリーラジカルスカベンジャーを有する滅菌水洗浄及び凍結乾燥へ供した。
【００１９】
ヒアルロン酸（HA）製品：
細菌由来のHA（平均分子量3,000,000）を、Framingham, MAにあるジェンザイム施設においてストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Streptococcus zooepidemicus）の発酵によって精製した。Hylan A（平均分子量 6,000,000）を、Ridgefield, NJにあるジェンザイム施設でニワトリのトサカから製造した。
【００２０】
Prevelle Silk及びDermal Gel Extra（DGE）は皮膚充填物である。それらをRidgefield, NJにあるジェンザイム施設で作製した。
【００２１】
Hylastanは、変形性関節症に起因する疼痛の治療のために使用される関節内補充薬である。それをRidgefield. NJにあるジェンザイム施設で作製した。
【００２２】
Restylaneは皮膚充填物であり、QMED, Swedenから購入した。
【表１】
2016514030.tif 000003
【００２３】
ポロキサマー407ポリマー：
ポロキサマー407/プルロニックF-127共重合体（エチレンオキシド及びプロピレンオキシドブロック）をBASF (Mount Olive, NJ)から購入した。
【００２４】
ポリマーを20〜30% wt/体積の最終ポリマー濃度のためにPBS中に可溶化した。この濃度で、ポリマーは、熱可逆性特性を示し、室温で流体状態及び体温でゲル状態を示す。冷PBS 100 mLへプルロニックF-127 20gを添加することによって20%ゲルを調製し、適切な可溶化のために4℃で一晩撹拌下に置いた。次に、溶液を滅菌のために0.22μmフィルターでろ過した。
【００２５】
組成物の特徴：
組成物は、注射器におけるその使用を可能にする粘度及び押出力を有する。例えば、それは、30ニュートン未満の押出力で20 G-l.5"の注射針サイズを有する5 cc注射器から送達される。
【実施例】
【００２６】
実施例1．注射用骨原性製剤は、異所性骨形成のラットモデル由来のサンプル外植片のアルカリホスファターゼ活性、カルシウム含有量及び組織学的評価によって判断されたように、軟骨内骨形成を誘導した。骨誘導活性のレベルはBMPタンパク質濃度に依存した（図1）。
【００２７】
実施例2．20〜30%の範囲のポロキサマー407濃度をこれらの研究において調べた。全てのポロキサマー含有製剤が骨形成を誘導したが、インビボでゲル形成を促進するための観察されたポロキサマー407の最適濃度は20〜25%であった（図2A）。
【００２８】
実施例3．プルロニック酸有り又は無しでの高分子量ヒアルロン酸（Hyal-A又はHyalastin）溶液を有するコラーゲン-BMP基質の経皮注射も新生骨形成（bone formulation）を誘導した（図2B）。
【００２９】
実施例4．注射用骨原性製剤の臨床使用は意図される送達部位への蛍光透視による誘導を必要とし得るので、本発明者らは、製剤への放射線造影剤の添加はインビボでの骨形成（bone formulation）を妨げなかったことを実証した。注射用骨原性製剤に、臨床的に適切な濃度の放射線造影剤（例えば、Isovue-370）を補い、異所性骨形成（bone formulation）のラットモデルで試験した。この研究の結果は、放射線造影剤は骨形成のこの動物モデルにおいて骨誘導を妨げなかったことを明らかにした（図3）。
【００３０】
実施例5．サンゴ由来のヒドロキシアパタイトは骨として使用されてきて、フィラー、及びミネラル足場を自家骨移植片で充填することを回避できるので、本発明者らは、新生骨形成についてのProOsteon（登録商標）500R (Interporc, Cross International)の効果を調べた。結果は、サンゴ-ヒドロキシアパタイトは、BBC/プルロニック酸と生体適合性であり、脊椎固定についての代用骨移植片として使用するための成形性パテとして生じることを示唆した（図4）。
【００３１】
実施例6．InFuse (Medtronic, MN)は腰椎椎体間固定の使用について承認されている。Infuseは、ウシアキレス腱由来（Achilles tendon derived）I型コラーゲンのシートに浸漬され、チタン金属ケージのポケット中へ挿入された12 mgのBMP-2を使用し、新生骨形成（bone formulation）を刺激し、腰椎の隣接するセグメントを固定する。本発明者らは、InFuse-ウシアキレスコラーゲンとBBC/プルロニック注射用懸濁剤とを皮下移植において様々な用量のBMP-2で比較した。結果は、組織学的スコアによって証明されたように、匹敵する新生骨形成を誘発するために、BBC/プルロニック酸懸濁剤は、コラーゲン移植片の所定の体積について10〜50倍より少ないBMP-2を使用することを示した。（図5）。
【００３２】
実施例7（09-4662）：
この実施例は以下を調べた
・ラット異所性モデルにおけるコラーゲン担体ロットの骨誘導ポテンシャル
・骨誘導ポテンシャルに対する足場質量の効果及びコラーゲン/BMP比
・ラット異所性モデルにおける骨誘導に対する担体/ポリマー比率の変動
【００３３】
研究設計：
12群(n=4)の4〜5週齢の雄性Long Evansラットの胸部に両側性皮下移植片を受容させた。外科用移植片は、様々な濃度のHA/プルロニックF-127（担体）及び様々な量のBBC（足場）中に0〜10μg BMP-2（シグナル）を含有した。
【００３４】
研究設計の詳細を下記表1に概説する。
【００３５】
全てのラットを第14日にCO2窒息によって犠牲にし、サンプルを分析のために採取した。
【００３６】
【表２】
2016514030.tif 000004
【００３７】
各サンプルを2ピースに切断した。サンプルの半分を10%中性緩衝ホルマリン中に固定し、メタクリル酸メチル中に包埋し、およそ5ミクロンの切片にし、ヘマトキシリン-エオシン（H&E）、フォン・コッサ、及びトルイジンブルーで染色した。組織病理学的評価は、表2に概説するスコアリングシステムを使用しての、サンプル中の新生軟骨及び骨形成の定性的及び半定量的評価を含んだ。新生骨/軟骨形成の分布パターンも各サンプルについて採点した（表3）（Lucy Phillips, B.V.Sc., A.C.V.P, Pathology Department, ジェンザイム・コーポレーション）。
【００３８】
【表３】
2016514030.tif 000005
【００３９】
【表４】
2016514030.tif 000006
【００４０】
サンプルの他方の半分から付着組織を取り除いた。サンプルを2 mlの氷冷0.15 M NaCl/3 mM NaHCO3中に置き、次いで、Polytronホモジナイザーを用いてホモジナイズした。次いで、それを遠心分離し；上澄みをデカンテーションし、Randox Daytona化学分析装置によって総タンパク質濃度（TP）及びアルカリホスファターゼ活性（ALP）について分析した。（Michelle Searles, Department of harmacology/Toxicology; ジェンザイム・コーポレーション）。
【００４１】
残留物を20 mMリン酸緩衝液5 ml中で2回洗浄し、次いで4℃で一晩0.6 N HCL 5 ml中で抽出した。次いで、それを遠心分離し；上澄みをデカンテーションし、カルシウム分析に送った。サンプルは、Martin Hanus, Department of Analytical Research and Development; ジェンザイム・コーポレーションによって396 nm発光でVarian ICP-OESにおいて分析された。
【００４２】
結果：組織病理学的評価
病理学スコアの散布図グラフを図5に示す。
【００４３】
新生骨/軟骨の程度及び分布パターンは、25又は50 mgのBBC, ロット番号18034-124を含有するサンプル中において、及びロット番号18034-124(新しい)又はロット番号10834-104(古い)を含有するサンプル中において、匹敵した。
【００４４】
様々な濃度のHA/プルロニックF-127担体を含有するサンプルについて、新生骨産生の程度の差はなかった；しかし、HA濃度が増加するにつれて、BBC足場を含有する空洞化中心（cavitated center）周りの縁に新生骨が生じ、出血する、顕著な傾向があった。
【００４５】
アルカリホスファターゼ活性
・3μg BMP-2を含有する移植片について、アルカリホスファターゼ濃度の差はなかった。
・BBC足場を25から50 mgへ増加させることは（同じBBC/BMP-2比で）、より高いアルカリホスファターゼ濃度を生じさせなかった。
・5μg BMP-2で、担体中のHAの濃度を増加させかつプルロニックF127の濃度を減少させることは、アルカリホスファターゼ濃度の差を生じさせなかった。
・10μg BMP-2ロードで、より高いHA濃度(6%)を有するサンプルは、より高いアルカリホスファターゼ濃度を有したが、アッセイにおける変動を超えなかった。
【００４６】
カルシウム評価
・3μg BMP-2を含有する移植片について、新しいロット(ロット番号10834-124)と比較してBBCの古いロット(ロット番号10834-104)についてより高いCa含有量の僅かな傾向があった。
・BBC足場を25から50 mgへ増加させることは（同じBBC/BMP-2比で）、より高いCa含有量を生じさせなかった。
・5μgのBMP-2で、担体中のHAの濃度を増加させかつプルロニックF127の濃度を減少させることは、Ca濃度のいかなる差も生じさせなかった。
・10μg BMP-2及び1.5% F-127/6% HA担体を有するサンプルは、試験した他の製剤と比べて25%より高いCa濃度を有した。
【００４７】
結論：
・新生骨/軟骨の程度及び分布パターン、カルシウム及びアルカリホスファターゼ濃度は、25及び50 mgのBBCを含有する移植片において、並びにロット番号10834-124及びロット番号10834-104 BBC足場を含有する移植片において、匹敵した。
・担体中に様々な濃度のHA及びプルロニックF-12を含有する移植片について、新生骨産生の程度の差はなかった；しかし、HA濃度が増加するにつれて、BBC足場を含有する空洞化中心の周りの縁として新生骨が生じ、出血する、顕著な傾向があった。
【００４８】
実施例8（09-3467）：
この実施例は以下を調べた
・軟骨粒度の効果
・骨誘導に対する担体中のポリマー濃度の効果
・担体/ポリマー比率の効果
・造影剤の効果
【００４９】
研究設計：12群の4〜5週齢の雄性Long Evansラットの胸部に両側性皮下注射を受容させた。
【００５０】
3群に、異なる比率の造影剤(Isovue-370)／担体としてのプルロニックF-127を有する25 mgのウシ骨コラーゲン（BBC、ロット番号17075-43、足場）上にロードされた5μg BMP-2（シグナル）を含有する外科用移植片を受容させた（第1群〜第3群）。8群に、PBS中のプルロニックF-127（担体）中の25 mgの様々なコラーゲン（足場）上にロードされた5μg BMP-2（シグナル）を含有する外科用移植片を受容させた。この研究において使用したコラーゲンは以下を含んだ：
・BBC、ロット番号17075-43、70〜425 um
・BBC、ロット番号17075-128、70〜250 um
・可溶性コラーゲン（MP Biologics）
・線維性コラーゲン（Instant MCH, Ethicon)
【００５１】
2群に、20%プルロニックF-127/2.5% HA又はDermal Gel Extra (DGE)担体中、25 mgのBBC（ロット番号17075-43）足場上にロードされた5μg BMP-2（シグナル）を含有する外科用移植片を受容させた。
【００５２】
全てのラットを第14日にCO2窒息によって犠牲にし、サンプルを分析のために採取した。
【００５３】
研究設計の詳細を下記表4に概説する。
【００５４】
【表５】
2016514030.tif 000007
【００５５】
移植片を採取し、40%アルコール中に固定し、メタクリル酸メチル中に包埋し、およそ5ミクロンの切片にし、ヘマトキシリン-エオシン（H&E）及びトルイジンブルーで染色した。
【００５６】
組織病理学的分析は、Kuber Sampath(ジェンザイム)によって行われ、表5に概説するスコアリングシステムを使用しての、移植片中の新生骨産生の半定量的評価を含んだ。
【００５７】
【表６】
2016514030.tif 000008
【００５８】
結果：線維性コラーゲン足場を有する移植片は、採取時に確認することができなかった。従って、サンプルを採取しなかった（第8群）。
【００５９】
データを表6並びに図10及び11に示す。
【００６０】
【表７】
2016514030.tif 000009
【００６１】
・1μg rhBMP-2用量について、25 mgのより小さな粒子BBCを含有する移植片は、用量当量の大きな粒子BBC群と比べてより大きな新生骨産生の傾向を示した。
・5μg rhBMP-2用量について、異なる粒度を有するBBC移植片は匹敵する新生骨産生を示した。
・可溶性コラーゲンは、BBCの両方のロットと比較して非常に乏しい骨産生を示した。
・22.5%プルロニックF-127担体への20又は40% Isovueの添加は、骨誘導ポテンシャルに対して効果を有さなかった。
・80% IsovueをプルロニックF-127へ添加した場合、移植片中の新生骨/軟骨産生はより低い傾向であった。
・HAをプルロニックF-127へ添加した場合、又はDGEを唯一の担体として使用した場合、移植片中の新生骨/軟骨産生はより低い傾向であった。
【００６２】
結論：
・BBC粒度はBMP-2骨誘導ポテンシャルに対して効果を有さなかった。
・可溶性コラーゲンは非常に乏しい新生骨産生を有した。
・22.5%プルロニックF-127担体へのIsovueの添加は、骨誘導ポテンシャルに対して効果を有さなかった。
・HAをプルロニックF-127へ添加した場合、又はDGEを唯一の担体として使用した場合、移植片中の新生骨/軟骨産生はより低かった。
【００６３】
実施例9（09-3468）：
この実施例は以下を調べた
・ポリマー有り又は無しでのBMP用量反応
・組換えBMPによる骨誘導
・担体を変えること
【００６４】
研究設計：13群(n=4/群)の4〜5週齢の雄性Long Evansラットの胸部に両側性皮下移植片を受容させた。
【００６５】
8群に、25 mgのウシ骨コラーゲン（BBC、ロット番号17075-43、足場）上にロードされた10μg BMP-2（シグナル）を含有し、異なるヒアルロン酸（HA）市販品（担体）と共に処方された外科用移植片を受容させた。
【００６６】
5群に、25 mgのBBC上にロードされた3〜10μg  BMP-2又はBMP-4をプルロニック（登録商標）F-127と共に含有する外科用移植片を受容させた。
【００６７】
全てのラットを第14日又は第28日にCO2窒息によって犠牲にし、サンプルを分析のために採取した。
【００６８】
研究設計の詳細を下記表7に概説する。
【００６９】
【表８】
2016514030.tif 000010
【００７０】
評価：
サンプルを検死時（14又は28日）に各試験サイトから収集した。各サンプルを2ピースに切断した。サンプルの半分を10%中性緩衝ホルマリン中に固定し、メタクリル酸メチル中に包埋し、およそ5ミクロンの切片にし、ヘマトキシリン-エオシン（H&E）、フォン・コッサ、及びトルイジンブルーで染色した。組織病理学的評価は、サンプル中の新生軟骨及び骨形成の定性的及び半定量的評価を含み、表8に概説するスコアリングシステムを使用した。新生骨/軟骨形成の分布パターンも各サンプルについて採点した（表9）（Lucy Phillips, B.V.Sc., A.C.V.P, Pathology Department, ジェンザイム・コーポレーション）。
【００７１】
【表９】
2016514030.tif 000011
【００７２】
【表１０】
2016514030.tif 000012
【００７３】
サンプルの他方の半分から付着組織を取り除いた。サンプルを2 mlの氷冷0.15 M NaCl 
3 mM NaHCO3中に置き、次いで、Polytronホモジナイザーを用いてホモジナイズした。次いで、それを遠心分離し；上澄みをデカンテーションした。
【００７４】
残留物を20 mMリン酸緩衝液5 ml中で2回洗浄し、次いで4℃で一晩0.6 N HCL 5 ml中で抽出した。次いで、それを遠心分離し；上澄みをデカンテーションし、カルシウム分析に送った。サンプルは396 nm発光でVarian ICP-OESにおいて分析された（Martin Hanus, Department of Analytical Research and Development; ジェンザイム・コーポレーション）。
【００７５】
結果：
第14日での検死時に、BMP-4を有する全ての移植片（第11群及び第12群）を確認することができず、従って、サンプルを採取しなかった。
【００７６】
第28日での検死時に、22.5%プルロニックF-127を有する全ての移植片（第10群）を確認することができず、従って、サンプルを採取しなかった。
【００７７】
組織病理学的評価
第14日及び第28日でのHA製品についての病理学スコアの散布図グラフを図12に示す。
・全ての群が、使用したHA担体に関係なく、第14日又は第28日に移植片中の新生骨/軟骨形成についての匹敵するスコア中央値を有した（P>0.05）。
・群のいずれにおいても新生骨/軟骨の一貫した分布パターンはなかった。
【００７８】
カルシウム評価
DGE及びPrevelle Silkを有する移植片は、Hylastan及びRestylaneと比較してより高い%Ca濃度の傾向を有した。
【００７９】
結論：
・第14日に、BMP-4を有する移植片を確認することができなかった。
・第28日に、22.5%プルロニックF-127を有する移植片は完全に再吸収された。
・第14日及び第28日に、rhBMP-2、BBC及びHA市販品を有する移植片は、使用したHA担体に関係なく、匹敵する新生骨/軟骨形成を有した。
・第28日に、足場上にロードされたrhBMP-2及びHA市販品を含有する移植片は、使用したHA担体に関係なく、匹敵するCa濃度を有した。
【００８０】
実施例10（08-3212）：
この実施例は以下を調べた
・ラット異所性モデルにおけるコラーゲン担体ロットの骨誘導ポテンシャル
・骨誘導に対する担体中のポリマー濃度の効果
・担体/ポリマー比率の効果
【００８１】
研究設計：16群の雄性6週齢Long Evansラットをこの研究において使用した。試験物を胸部の両側の皮下ポケット内に外科的に移植した。
・2群に、グルタミン酸緩衝液（担体）中20%プルロニックF-127 150μl中25 mgのBBC（ロット番号17075-43、足場）上にロードされた1.5又は5μg BMP-2（シグナル）を含有する移植片を受容させた（第1群及び第2群）。
・4群に、PBS（担体）中20% プルロニックF-127 150μl中25 mgのBBC（ロット番号17075-43、足場）上にロードされた0〜5μg BMP-2（シグナル）を含有する移植片を受容させた（第3群〜第6群）。
・2群に、グルタミン酸緩衝液（担体）中20%プルロニックF-127 + 2.5% HA 150μl中25
mgのBBC（ロット番号17075-43、足場）上にロードされた1.5又は5μg BMP-2（シグナル）を含有する移植片を受容させた（第7群及び第8群）。
・4群に、40μl PBS（陽性対照）中25 mgのBBC（ロット番号17075-43、足場）上にロードされた0〜5μg BMP-2（シグナル）を含有する移植片を受容させた（第9群〜第12群）。
・3群に、PBS（担体）中20% プルロニックF-127 150μl中25 mgのBBC（ロット番号11848-79、足場）上にロードされた0〜5μg BMP-2（シグナル）を含有する移植片を受容させた（第13群〜第15群）。
・1群に、グルタミン酸緩衝液（担体）中2.5% HA 150μl中25 mgのBBC（ロット番号17075-43、足場）上にロードされた1.5μg BMP-2（シグナル）を含有する移植片を受容させた（第16群）。
【００８２】
ラットをCO2窒息によって移植後第14日に犠牲にし、移植片を採取した。
【００８３】
研究設計の詳細を下記表10に概説する。
【００８４】
【表１１】
2016514030.tif 000013
【００８５】
評価：
移植片を採取し、40%アルコール中に固定し、メタクリル酸メチル中に包埋し、およそ5ミクロンの切片にし、ヘマトキシリン-エオシン（H&E）及びトルイジンブルーで染色した。
【００８６】
組織病理学的分析は、Kuber Sampath(ジェンザイム)によって行われ、表2に概説するスコアリングシステムを使用しての、移植片中の新生骨産生の半定量的評価を含んだ。
【００８７】
【表１２】
2016514030.tif 000014
【００８８】
結果：
データを表12並びに図14、15及び16に示す。
【００８９】
【表１３】
2016514030.tif 000015
【００９０】
5μg rhBMP-2用量について、両方のBBCバッチで移植片は匹敵する骨誘導ポテンシャルを示した。1.5μg rhBMP-2用量について、新しいバッチのBBC（ロット番号17075-43）はより大きな骨誘導ポテンシャルを示した。
【００９１】
全てのrhBMP-2用量について、2つの緩衝液は匹敵する骨誘導ポテンシャルを示した。2.5% HA及び20%プルロニックF-127/2.5% HAを有する移植片は、可変の組織学スコアを有し、20%プルロニックF-127群におけるよりも小さかった。
【００９２】
結論：
・試験したBBCの2つのバッチは、5μg BMP-2用量で、匹敵する骨誘導ポテンシャルを有した。
・20%プルロニックF-127/2.5% HA及び2.5% HAは、20%プルロニックF-127よりも低い骨誘導ポテンシャルを有した。
・2つの緩衝液、グルタミン酸緩衝液及びPBSは、匹敵する骨誘導ポテンシャルを示した。
【００９３】
実施例11（09-2764）：
研究目的：
・異なる濃度のOGF担体を評価すること
【００９４】
研究設計
12群の4〜5週齢の雄性Long Evansラットの胸部に両側性皮下移植片を受容させた。外科用移植片体積を250μlで一定に保持し、BMP-2を5μg用量（シグナル）で使用した。担体をBBCの存在下又は非存在下で試験した。ラットをCO2窒息によって移植後第14日に犠牲にし、移植片を採取した。
【００９５】
研究設計の詳細を下記表13に概説する。
【００９６】
【表１４】
2016514030.tif 000016
【００９７】
評価：
移植片を採取し、40%アルコール中に固定し、メタクリル酸メチル中に包埋し、およそ5ミクロンの切片にし、ヘマトキシリン-エオシン（H&E）及びトルイジンブルーで染色した。
【００９８】
組織病理学的分析は、Kuber Sampath(ジェンザイム)によって行われ、表14に概説するスコアリングシステムを使用しての、移植片中の新生骨産生の半定量的評価を含んだ。
【００９９】
【表１５】
2016514030.tif 000017
【０１００】
結果：
BBCを含有しなかったサンプル（第2群、第4群、第7群、第9群及び第11群）並びに担体を含有しなかったサンプル（第1群）は、組織採取時に確認することができず、従って、これらの群についてはサンプルを収集しなかった。
【０１０１】
病理学スコアを表15及び図17に示す。
【０１０２】
【表１６】
2016514030.tif 000018
【０１０３】
結論：
・BBCの存在は、rhBMP-2がロードされた移植片の骨形成を誘導する能力のために必須であった。
・担体として20%プルロニックを含有する製剤のみが、一貫して十分な骨形成を誘導した。
【０１０４】
実施例12（08-2973）：
研究目的：
・2匹のラット異所性モデルを比較すること：皮下（SQ）対筋肉内（IM）移植。
・異なる濃度のOGF担体を評価すること。
【０１０５】
研究設計：
12群(n=3/群)の4〜5週齢の雄性Long Evansラットに両側性移植片を受容させた。これらのうち、6群の胸部に両側性皮下移植片を受容させ(第1群〜第6群)、6群の背部に筋肉内移植片を受容させた(第7群〜第12群)。2個の外科用移植片（対照）は、25 mg BBC(足場)と共にグルタミン酸緩衝液125μl中5μg BMP-2(シグナル)を含有した。10個の外科用移植片は、25 mg BBC(足場)と共に様々な担体150μl中5μg BMP-2(シグナル)を含有した。ラットをCO2窒息によって移植後第14日に犠牲にし、移植片を採取した。
【０１０６】
研究設計の詳細を下記表16に概説する。
【０１０７】
【表１７】
2016514030.tif 000019
【０１０８】
評価：
移植片を採取し、40%アルコール中に固定し、メタクリル酸メチル中に包埋し、およそ5ミクロンの切片にし、ヘマトキシリン-エオシン（H&E）及びトルイジンブルーで染色した。
【０１０９】
組織病理学的分析は、Kuber Sampath(ジェンザイム)によって行われ、表17に概説するスコアリングシステムを使用しての、移植片中の新生骨産生の半定量的評価を含んだ。
【０１１０】
【表１８】
2016514030.tif 000020
【０１１１】
結果：
データを表18及び図18に示す。
【０１１２】
【表１９】
2016514030.tif 000021
【０１１３】
・2つのモデル間で新生骨産生についてのスコアの差はなかった。
・異なるプルロニックF-127濃度を有する製剤は、同様の組織学スコアを示し、対照と同様であった。
・2.5% HA及びHylan Aを含む移植片は、対照と比較してより低い組織学スコアを有した。
【０１１４】
結論：
・皮下及び筋肉内移植部位に移植された製剤は、全ての担体で、匹敵する骨誘導スコアを示した。
・全てのプルロニック担体は陽性対照と同様のレベルの骨形成を誘導し、2つのHA担体は陽性対照よりも低い骨形成を誘導した。
【０１１５】
実施例13（09-4064）：
研究目的：
・造影剤の効果
・ポリマー濃度を評価すること
・担体 OGF比を評価すること
・様々な担体を評価すること
【０１１６】
研究設計：
10群(n=4/群)の4〜5週齢の雄性Long Evansラットの胸部に両側性皮下移植片を受容させた。外科用移植片は、150μの体積を有し、0又は10μg BMP-2(シグナル)、25 mgのウシ骨コラーゲン（BBC、ロット番号17075-183、足場）及び様々なタイプの担体を含有した。
【０１１７】
研究設計の詳細を下記表19に概説する。全てのラットを第14日にCO2窒息によって犠牲にし、サンプルを分析のために採取した。
【０１１８】
【表２０】
2016514030.tif 000022
【０１１９】
評価：
サンプルを検死時に各試験サイトから収集した。
【０１２０】
各サンプルを2ピースに切断した。サンプルの半分を10%ホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋し、およそ5ミクロンの切片にし、ヘマトキシリン-エオシン（H&E）で染色した。
【０１２１】
組織病理学的評価は、表20に概説するスコアリングシステムを使用しての、サンプル中の新生軟骨及び骨形成の定性的及び半定量的評価を含んだ。新生骨/軟骨形成の分布パターンも各サンプルについて採点した；表21（Lucy Phillips, B.V.Sc., A.C.V.P, Pathology Department, ジェンザイム・コーポレーション）。
【０１２２】
【表２１】
2016514030.tif 000023
【０１２３】
【表２２】
2016514030.tif 000024
【０１２４】
サンプルの他方の半分から付着組織を取り除いた。サンプルを2 mlの氷冷0.15 M NaCl/3 mM NaHCO3中に置き、次いで、Polytronホモジナイザーを用いてホモジナイズした。次いで、それを遠心分離し；上澄みをデカンテーションした。
【０１２５】
残留物を20 mMリン酸緩衝液5 ml中で2回洗浄し、次いで4℃で一晩0.6 N HCL 5 ml中で抽出した。次いで、それを遠心分離し；上澄みをデカンテーションし、カルシウム分析に送った。サンプルは396 nm発光でVarian ICP-OESにおいて分析された（Martin Hanus, Department of Analytical Research and Development; ジェンザイム・コーポレーション）。
【０１２６】
結果：
組織病理学的評価
病理学スコアの散布図グラフを図19に示す。
・プルロニックF-127濃度を30%へ増加させることは、新生骨/軟骨スコア中央値に対して効果を有さなかった(P>0.05)。
・22.5%プルロニックF-127担体への20%又は80% Isovue-370の添加は、新生骨/軟骨スコア中央値に対して効果を有さなかった(P>0.05)。
・プルロニックF-127への2.5%又は5% HAの添加は、新生骨/軟骨スコア中央値を低下させる傾向があったが、これは統計的に有意ではなかった(P>0.05)。
・プルロニックF-127へ添加された又は単独でのDGEは、新生骨/軟骨スコア中央値を低下させる傾向があったが、これは統計的に有意ではなかった(P>0.05)。
・Prevelle silkは新生骨/軟骨スコア中央値を低下させる傾向があったが、これは統計的に有意ではなかった(P>0.05)。
・プルロニックF-127、プルロニックF-127+ Isovue 370又はプルロニックF-127+ HAを含有する群は、移植片全体にわたる骨の「ソリッド（solid）」分布を有する傾向があったか、又はソリッド領域（パターンC）及び増殖性間葉細胞の中央焦点の周りの縁形成の領域（パターンB）の両方が存在した混合パターンを有した。
・DGE又はPrevelle silkを含有する群は、BBC足場及びDGE/ Prevelle silk材料を含有する中央空洞化領域の周りの新生骨の縁を形成する傾向があった（パターンD及びE）。
【０１２７】
カルシウム評価
・担体中のHA/F-127の濃度の増加は、Ca濃度のいかなる差も生じさせなかった
・22.5%プルロニックF-127への20%又は80% Isovueの添加は、Ca濃度に対して効果を有さなかった。
・プルロニックF-127を含む移植片（第2群〜第7群及び第10群）は、プルロニックF-127を含まない移植片（第8群及び第9群）よりも高いカルシウム濃度を有した。
【０１２８】
結論：
・プルロニックF-127含有移植片は、新生骨/軟骨の主にソリッドな分布パターンを有する傾向があり、一方、DGE及びPrevelle silk移植片は、足場及び担体を含有する中央空洞化領域の周りに新生骨形成の縁を有することが多かった。
・HA若しくはDGEをプルロニックF-127へ添加した場合、又はDGE若しくはPrevelle Silkを唯一の担体として使用した場合、移植片中の新生骨/軟骨産生はより低い傾向であった。
・22.5%プルロニックF-127担体への20%又は80% Isovueの添加は、骨誘導ポテンシャルに対して効果を有さなかった。
・プルロニックF-127を含む移植片（第2群〜第7群及び第10群）は、プルロニックF-127を含まない移植片（第8群及び第9群）よりも高いカルシウム濃度を有した。
【０１２９】
実施例14（09-4063）：
研究目的：
1．様々なコラーゲンを評価すること
2．造影剤の効果
3．軟骨粒度を評価すること
4．軟骨質量の効果を評価すること
5．ラット異所性モデルにおいてDermal Gel Extra (DGE)でOGFを評価すること
6．様々な担体を評価すること
【０１３０】
研究設計：
12群(n=4/群)の4〜5週齢の雄性Long Evansラットの胸部に両側性皮下移植片を受容させた。
・10群に、0〜10μg BMP-2(シグナル)、PBS(担体)中22.5%プルロニック（登録商標）F-127 150μl、並びに様々な量及びタイプの骨コラーゲン(足場)を有する移植片を受容させた。
・1群に、3μg BMP-2(シグナル)、150μl 22.5% プルロニック/80% Isovue 370(担体)及び25 mg BBC(足場)を有する移植片を受容させた。
・1群に、150μl DGE(担体)中50μg BMP-2(シグナル)を有する移植片を受容させた。
【０１３１】
研究設計の詳細を下記表22に概説する。
【０１３２】
全てのラットを第14日にCO2窒息によって犠牲にし、サンプルを分析のために採取した。
【０１３３】
【表２３】
2016514030.tif 000025
【０１３４】
評価：
各サンプルを2ピースに切断した。サンプルの半分を40%アルコール中に固定し、メタクリル酸メチル中に包埋し、およそ5ミクロンの切片にし、ヘマトキシリン-エオシン（H&E）で染色した。
【０１３５】
組織病理学的評価は、表23に概説するスコアリングシステムを使用しての、サンプル中の新生軟骨及び骨形成の定性的及び半定量的評価を含んだ。新生骨/軟骨形成の分布パターンも各サンプルについて採点した（表24）（Lucy Phillips, B.V.Sc., A.C.V.P, Pathology Department, ジェンザイム・コーポレーション）。
【０１３６】
【表２４】
2016514030.tif 000026
【０１３７】
【表２５】
2016514030.tif 000027
【０１３８】
サンプルの他方の半分から付着組織を取り除いた。サンプルを2 mlの氷冷0.15 M NaCl/3 mM NaHCO3中に置き、次いで、Polytronホモジナイザーを用いてホモジナイズした。次いで、それを遠心分離し；上澄みをデカンテーションした。
【０１３９】
残留物を20 mMリン酸緩衝液5 ml中で2回洗浄し、次いで4℃で一晩0.6 N HCL 5 ml中で抽出した。次いで、それを遠心分離し；上澄みをデカンテーションし、カルシウム分析に送った。サンプルは396 nm発光でVarian ICP-OESにおいて分析された（Martin Hanus, Department of Analytical Research and Development; ジェンザイム・コーポレーション）。
【０１４０】
結果：
組織病理学的評価
病理学スコアの散布図グラフを図21に示す。
【０１４１】
評価した処置群のいずれの間にも骨産生スコア中央値において有意差はなかった；しかし、以下の傾向が顕著であった：
・10μg rhBMP-2用量について、25 mgのより小さな粒子BBCを含有する移植片（第8群）は、用量当量の大きな粒子BBC群（第3群、P>0.05）及び10 mg小粒子BBC群（第6群、P>0.05）と比べてより大きな新生骨産生の傾向を示した。
・25 mg BBC + 3μg  rhBMP-2 + 22.5% プルロニックF-127を含有する移植片について、Isovue造影剤の添加は、新生骨の産生に有意に影響を与えなかった（P>0.05、第4群対第2群）。
・3及び10μg群（第10群及び第11群）は0μg対照（第9群）と比較して統計的有意性を達成しなかったので、ウサギ骨コラーゲン移植片は、新生骨産生の評価についてあまりロバストでないモデルであった。
・ウサギ骨コラーゲン断片は、70<420 mmウシ骨断片よりもしばしば大きいことが注意され、これは移植片当たりの新生骨産生の量に影響を与えた可能性がある。
・25 mgのBBCを含有する移植片は、10 mgのBBCを含有する移植片と匹敵する骨産生スコア中央値を有した（第7群及び第8群対第5群及び第6群）。
・足場を有さないDGE移植片は、この研究において最高用量のrhBMP-2を含有したが、新生骨産生スコアは可変であった。さらに、この群における新生骨の分布パターンもまた、他の群と比べてより可変であった。
【０１４２】
カルシウム評価
この研究において使用したBMP-2の2つの用量で、BBC移植片（第2群及び第3群）及びRBC移植片（第10群及び第11群）は、匹敵するCa濃度を示した。しかし、RBCと比べて、BBCを含有する移植片について、より高いCa濃度の傾向があった。
【０１４３】
評価した処置群のいずれの間でもCa濃度において差はなかった。
【０１４４】
結論：
・この研究において使用したBMP-2の2つの用量で、BBC及びRBC移植片は、匹敵する骨産生スコア中央値及びCa濃度を示した。BBC及びRBC含有群において、新生骨分布は、限局性から多発性の（focal to multifocal）ソリッドパターンである傾向があった。
・担体である22.5%プルロニック中80%造影剤は、新生骨産生及びCa濃度のいずれにも影響を与えなかった。
・足場質量の変化は、新生骨産生及びCa濃度のいずれにも影響を与えなかった。
・より小さな粒子BBCを含有する移植片は、用量当量の大きな粒子BBC群と比べてより大きな新生骨産生の傾向を示した。
・DGE群（これは足場を含有しなかった）新生骨産生スコアは低くかつ可変であった。
【０１４５】
実施例15（09-3469）：
研究目的：
・2つの骨増殖因子：rhBMP-2及びrhBMP-4の骨原性ポテンシャルを比較すること
・様々な担体を評価すること
・ラット異所性モデル中のrhBMP-2の骨原性ポテンシャルに対する外科的方法（移植対注射）の効果を評価すること
【０１４６】
研究設計：
12群の4〜5週齢の雄性Long Evansラットの胸部に両側性皮下移植片を受容させた。外科用移植片は、PBS中22.5% プルロニックF-127、PBS中2.5% HA/22.5% プルロニックF-127、又はDGE（担体）150μl中に0〜3μg BMP-2(シグナル)、並びに25 mgのウシ骨コラーゲン（BBC、ロット番号17075-114、足場）を含有した。
【０１４７】
3群の4〜5週齢の雄性Long Evansラットの胸部に両側性皮下移植片を受容させた。外科用移植片は、PBS中22.5% プルロニックF-127 150μl中に0.3〜3μg BMP-4(シグナル)並びに25 mgのBBC(足場)を含有した。
【０１４８】
2群の4〜5週齢の雄性Long Evansラットに、14G又は20G注射針を使用して皮下注射した。外科用移植片は、PBS中22.5% プルロニックF-127 150μl中に3μg  BMP-2(シグナル)並びに25 mgのBBC(足場)を含有した。
【０１４９】
全てのラットを第14日にCO2窒息によって犠牲にし、サンプルを分析のために採取した。
【０１５０】
研究設計の詳細を下記表25に概説する。
【０１５１】
【表２６】
2016514030.tif 000028
【０１５２】
評価：
サンプルを検死時に各試験サイトから収集した。
【０１５３】
移植片を10%中性緩衝ホルマリン中に固定した。組織を脱炭し、ルーチン的に処理し、パラフィン中に包埋し、およそ5ミクロンの切片にし、光学顕微鏡評価のためにヘマトキシリン-エオシン（H&E）及びトルイジンブルーで染色した。
【０１５４】
組織病理学的評価は、サンプル中の新生軟骨及び骨形成の定性的及び半定量的評価を含み、表26に概説するスコアリングシステムを使用した。新生骨/軟骨形成の分布パターンも各サンプルについて採点した（表27）（Lucy Phillips, B.V.Sc., A.C.V.P, Pathology
Department, ジェンザイム・コーポレーション）。
【０１５５】
【表２７】
2016514030.tif 000029
【０１５６】
【表２８】
2016514030.tif 000030
【０１５７】
結果：
組織病理学的評価
病理学スコアの散布図グラフを図24に示す。
・0〜3μgのrhBMP-2がロードされた外科用移植片内において、新生骨及び軟骨産生の用量反応的増加があった。
・用量に関係なく、rhBMP-4がロードされた足場内において、最小限の骨産生があった。
・骨/軟骨産生についてのスコア中央値は、プルロニック又はHA/プルロニックで送達された3μg rhBMP-2を含有する外科用移植片について最も高かった。
・DGEを含む移植片は、僅かにより低いスコア中央値を有し、DGE及びBBC足場を含有する空洞化中心の周りに骨産生の縁をしばしば生じさせた。
・骨/軟骨産生についてのスコア中央値は、皮下注射と比較して、外科的移植によって送達されたrhBMP-2について僅かにより高い傾向があった。
・さらに、外科的移植は、新生骨の主に散在性の分布を与え、一方、皮下注射は、可変の分布パターン（散在性、又は空洞化若しくは多孔質中心（cellular center）の周りの新生骨の縁の形成）を生じさせた。
【０１５８】
結論：
・プルロニックF-127と共にBBC上にロードされた0〜3μgのrhBMP-2を含む移植片について、組織学スコアの用量反応的増加があった。
・用量に関係なく、rhBMP-4がロードされた足場内において、最小限の骨産生があった。
・3μg rhBMP-2及びプルロニックF-127又はHA/プルロニックF-127を含む足場は、DGEを含むものと比較して、より多い骨/軟骨産生についての非統計的傾向を有した。
・プルロニックF-127又はHA/プルロニックF-127を含む移植片は、移植片の全体にわたる骨の散在性の分布を有し、一方、DGEは、空洞化中心の周りに新生骨の縁を有した。
・皮下注射ではなく外科的移植で、僅かにより多くの骨/軟骨産生についての非統計的傾向があった。さらに、皮下注射は可変の分布パターンを生じさせた。
【０１５９】
本発明の多数の実施態様を説明した。それにもかかわらず、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、様々な修飾がなされ得ることが理解される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図４Ａ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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