(57)【要約】  本発明は、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼの発現（例えば、異種性発現）を通じて、細胞内でイソプレン、イソプレノイド前駆体、および／またはイソプレノイドを生成するための組成物および方法を提供する。
2016511630.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉ）イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｖ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなる、イソプレンを産生できる組換え細胞であって、前記組換え細胞の培養がイソプレンの生成を提供する、イソプレンを産生できる組換え細胞。
【請求項２】
前記ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、メバロン酸５−リン酸からイソペンテニルリン酸への変換を触媒する、請求項１に記載の組換え細胞。
【請求項３】
前記ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、メバロン酸５−ピロリン酸からイソペンテニルリン酸および／またはイソペンテニルピロリン酸への変換を触媒する、請求項１または２に記載の組換え細胞。
【請求項４】
前記ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、古細菌に由来する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項５】
前記古細菌が、デスルフロコッカス目（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スルフォロブス目（Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ）、サーモプロテウス目（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ケナルカエアレス目（Ｃｅｎａｒｃｈａｅａｌｅｓ）、ニトロソプミラレス目（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌａｌｅｓ）、アーキオグロブス目（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロバクテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノコッカス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、メタノセラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａｌｅｓ）、メタノサルシナ目（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ）、メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノミクロビウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、メタノピラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒａｌｅｓ）、サーモコッカス目（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、サーモプラズマ目（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）、コルアーケオタ門（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ）、およびナノアーケオタ門（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａ）からなる群から選択される、請求項４に記載の組換え細胞。
【請求項６】
前記ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、Ｓ３７８Ｐａ３−２、およびアナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）からなる群から選択される微生物に由来する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項７】
前記ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、配列番号１６〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項８】
前記イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、古細菌に由来する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項９】
前記古細菌が、デスルフロコッカス目（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スルフォロブス目（Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ）、サーモプロテウス目（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ケナルカエアレス目（Ｃｅｎａｒｃｈａｅａｌｅｓ）、ニトロソプミラレス目（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌａｌｅｓ）、アーキオグロブス目（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロバクテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノコッカス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、メタノセラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａｌｅｓ）、メタノサルシナ目（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ）、メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノミクロビウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、メタノピラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒａｌｅｓ）、サーモコッカス目（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、サーモプラズマ目（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）、コルアーケオタ門（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ）、およびナノアーケオタ門（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａ）からなる群から選択される、請求項８に記載の組換え細胞。
【請求項１０】
前記イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、メタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、メタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）、およびアナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）からなる群から選択される微生物に由来する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項１１】
前記微生物が、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）またはメタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）である、請求項１０に記載の組換え細胞。
【請求項１２】
前記イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、配列番号１９〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項１３】
前記イソプレンシンターゼポリペプチドが、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項１４】
前記植物イソプレンシンターゼポリペプチドが、クズ属（Ｐｕｅｒａｒｉａ）またはポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）からのポリペプチドまたはその変異体である、請求項１３に記載の組換え細胞。
【請求項１５】
前記植物イソプレンシンターゼポリペプチドが、プエラリア・モンタナ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ）またはプエラリア・ロバタ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｌｏｂａｔａ）、ポプルス・トレムロイデス（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）、セイヨウハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｎｉｇｒａ）、コットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、またはウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）×ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ）雑種からのポリペプチドまたはその変異体である、請求項１３に記載の組換え細胞。
【請求項１６】
前記ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドが、（ａ）２分子のアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｂ）マロニルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｃ）アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素；（ｄ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；および（ｅ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素から選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項１７】
前記ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドが、（ａ）メバロン酸をリン酸化してメバロン酸５−リン酸を形成する酵素；（ｂ）メバロン酸５−リン酸をリン酸化してメバロン酸５−ピロリン酸を形成する酵素；および（ｃ）メバロン酸５ピロリン酸を脱炭酸してイソペンテニルピロリン酸を形成する酵素から選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項１８】
イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項１９】
前記組換え細胞が、メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する弱力化酵素を含んでなる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項２０】
前記組換え細胞が、メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する弱力化酵素を含んでなる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項２１】
前記組換え細胞が、１つまたは複数の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項２２】
前記組換え細胞が、前記１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路の１つまたは複数の弱力化酵素を含んでなる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項２３】
ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、異種核酸をさらに含んでなる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項２４】
前記ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、異種核酸である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項２５】
前記ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、内在性核酸である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項２６】
前記イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、異種核酸である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項２７】
前記イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、内在性核酸である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項２８】
（ｉ）〜（ｉｖ）のポリペプチドをコードする核酸の少なくとも１つが、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターの下に置かれる、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項２９】
（ｉ）〜（ｉｖ）のポリペプチドをコードする核酸の少なくとも１つが、１つまたは複数のマルチコピープラスミドにクローン化される、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項３０】
（ｉ）〜（ｉｖ）のポリペプチドをコードする核酸の少なくとも１つが、前記細胞の染色体に組み込まれる、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項３１】
前記組換え細胞が、グラム陽性細菌細胞、グラム陰性細菌細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、植物細胞、藻類細胞または酵母細胞である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項３２】
前記細菌細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、Ｐ．シトレア（Ｐ．ｃｉｔｒｅａ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ロータス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、Ｂ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、Ｓ．アルバス（Ｓ．ａｌｂｕｓ）、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、Ｓ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、Ｓ．グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、およびＰ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）細胞からなる群から選択される、請求項３１に記載の組換え細胞。
【請求項３３】
前記酵母細胞が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）種、またはカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種からなる群から選択される、請求項３１に記載の組換え細胞。
【請求項３４】
前記組換え細胞が、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）およびアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からなる群から選択される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項３５】
（ｉ）ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉ）イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、および（ｉｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなる、イソプレノイド前駆体を産生できる組換え細胞であって、前記組換え細胞の培養がイソプレノイド前駆体の生成を提供する、イソプレノイド前駆体を産生できる組換え細胞。
【請求項３６】
前記ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、メバロン酸５−リン酸からイソペンテニルリン酸への変換を触媒する、請求項３５に記載の組換え細胞。
【請求項３７】
前記ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、メバロン酸５−ピロリン酸からイソペンテニルリン酸および／またはイソペンテニルピロリン酸への変換を触媒する、請求項３５または３６に記載の組換え細胞。
【請求項３８】
前記ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、古細菌に由来する、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項３９】
前記古細菌が、デスルフロコッカス目（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スルフォロブス目（Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ）、サーモプロテウス目（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ケナルカエアレス目（Ｃｅｎａｒｃｈａｅａｌｅｓ）、ニトロソプミラレス目（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌａｌｅｓ）、アーキオグロブス目（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロバクテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノコッカス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、メタノセラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａｌｅｓ）、メタノサルシナ目（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ）、メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノミクロビウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、メタノピラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒａｌｅｓ）、サーモコッカス目（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、サーモプラズマ目（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）、コルアーケオタ門（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ）、およびナノアーケオタ門（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａ）からなる群から選択される、請求項３８に記載の組換え細胞。
【請求項４０】
前記ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、Ｓ３７８Ｐａ３−２、およびアナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）からなる群から選択される微生物に由来する、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項４１】
前記ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、配列番号１６〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項４２】
前記イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、古細菌に由来する、請求項３５〜４１のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項４３】
前記古細菌が、デスルフロコッカス目（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スルフォロブス目（Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ）、サーモプロテウス目（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ケナルカエアレス目（Ｃｅｎａｒｃｈａｅａｌｅｓ）、ニトロソプミラレス目（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌａｌｅｓ）、アーキオグロブス目（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロバクテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノコッカス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、メタノセラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａｌｅｓ）、メタノサルシナ目（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ）、メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノミクロビウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、メタノピラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒａｌｅｓ）、サーモコッカス目（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、サーモプラズマ目（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）、コルアーケオタ門（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ）、およびナノアーケオタ門（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａ）からなる群から選択される、請求項４２に記載の組換え細胞。
【請求項４４】
前記イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、メタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、メタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）、およびアナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）からなる群から選択される微生物に由来する、請求項３５〜４１のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項４５】
前記微生物が、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）またはメタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）である、請求項４４に記載の組換え細胞。
【請求項４６】
前記イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、配列番号１９〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項３５〜４１のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項４７】
前記ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドが、（ａ）２分子のアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｂ）マロニルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｃ）アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素；（ｄ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；および（ｅ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素から選択される、請求項３５〜４６のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項４８】
前記ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドが、（ａ）メバロン酸をリン酸化してメバロン酸５−リン酸を形成する酵素；（ｂ）メバロン酸５−リン酸をリン酸化してメバロン酸５−ピロリン酸を形成する酵素；および（ｃ）メバロン酸５−ピロリン酸を脱炭酸してイソペンテニルピロリン酸を形成する酵素から選択される、請求項３５〜４７のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項４９】
前記組換え細胞が、メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する弱力化酵素を含んでなる、請求項３５〜４８のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項５０】
前記組換え細胞が、メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する弱力化酵素を含んでなる、請求項３５〜４９のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項５１】
前記組換え細胞が、１つまたは複数の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる、請求項３５〜５０のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項５２】
前記組換え細胞が、前記１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路の１つまたは複数の弱力化酵素を含んでなる、請求項３５〜５１のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項５３】
ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、異種核酸をさらに含んでなる、請求項３５〜５２のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項５４】
前記ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、異種核酸である、請求項３５〜５３のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項５５】
前記ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、内在性核酸である、請求項３５〜５３のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項５６】
前記イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、異種核酸である、請求項３５〜５５のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項５７】
前記イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、内在性核酸である、請求項３５〜５５のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項５８】
（ｉ）〜（ｉｖ）のポリペプチドをコードする核酸の少なくとも１つが、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターの下に置かれる、請求項３５〜５７のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項５９】
（ｉ）〜（ｉｖ）のポリペプチドをコードする核酸の少なくとも１つが、１つまたは複数のマルチコピープラスミドにクローン化される、請求項３５〜５８のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項６０】
（ｉ）〜（ｉｖ）のポリペプチドをコードする核酸の少なくとも１つが、前記細胞の染色体に組み込まれる、請求項３５〜５９のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項６１】
前記組換え細胞が、グラム陽性細菌細胞、グラム陰性細菌細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、植物細胞、藻類細胞または酵母細胞である、請求項３５〜６０のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項６２】
前記細菌細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、Ｐ．シトレア（Ｐ．ｃｉｔｒｅａ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ロータス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、Ｂ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、Ｓ．アルバス（Ｓ．ａｌｂｕｓ）、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、Ｓ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、Ｓ．グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、およびＰ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）細胞からなる群から選択される、請求項６１に記載の組換え細胞。
【請求項６３】
前記酵母細胞が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）種、またはカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種からなる群から選択される、請求項６１に記載の組換え細胞。
【請求項６４】
前記組換え細胞が、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）およびアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からなる群から選択される、請求項３５〜６０のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項６５】
（ｉ）ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉ）イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｖ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなる、イソプレノイドを産生できる組換え細胞であって、適切な培地中における前記組換え細胞の培養がイソプレノイドの生成を提供する、イソプレノイドを産生できる組換え細胞。
【請求項６６】
前記ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、メバロン酸５−リン酸からイソペンテニルリン酸への変換を触媒する、請求項６５に記載の組換え細胞。
【請求項６７】
前記ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、メバロン酸５−ピロリン酸からイソペンテニルリン酸および／またはイソペンテニルピロリン酸への変換を触媒する、請求項６５または６６に記載の組換え細胞。
【請求項６８】
前記ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、古細菌に由来する、請求項６５〜６７のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項６９】
前記古細菌が、デスルフロコッカス目（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スルフォロブス目（Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ）、サーモプロテウス目（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ケナルカエアレス目（Ｃｅｎａｒｃｈａｅａｌｅｓ）、ニトロソプミラレス目（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌａｌｅｓ）、アーキオグロブス目（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロバクテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノコッカス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、メタノセラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａｌｅｓ）、メタノサルシナ目（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ）、メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノミクロビウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、メタノピラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒａｌｅｓ）、サーモコッカス目（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、サーモプラズマ目（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）、コルアーケオタ門（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ）、およびナノアーケオタ門（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａ）からなる群から選択される、請求項６８に記載の組換え細胞。
【請求項７０】
前記ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、Ｓ３７８Ｐａ３−２、およびアナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）からなる群から選択される微生物に由来する、請求項６５〜６７のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項７１】
前記ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、配列番号１９〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項６５〜６７のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項７２】
前記イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、古細菌に由来する、請求項６５〜７１のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項７３】
前記古細菌が、デスルフロコッカス目（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スルフォロブス目（Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ）、サーモプロテウス目（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ケナルカエアレス目（Ｃｅｎａｒｃｈａｅａｌｅｓ）、ニトロソプミラレス目（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌａｌｅｓ）、アーキオグロブス目（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロバクテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノコッカス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、メタノセラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａｌｅｓ）、メタノサルシナ目（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ）、メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノミクロビウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、メタノピラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒａｌｅｓ）、サーモコッカス目（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、サーモプラズマ目（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）、コルアーケオタ門（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ）、およびナノアーケオタ門（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａ）からなる群から選択される、請求項７２に記載の組換え細胞。
【請求項７４】
前記イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、メタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、メタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）、およびアナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）からなる群から選択される微生物に由来する、請求項６５〜７１のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項７５】
前記微生物が、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）またはメタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）である、請求項７４に記載の組換え細胞。
【請求項７６】
イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、配列番号１９〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項６５〜７１のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項７７】
前記イソプレノイドが、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セキテルペン、およびポリテルペンからなる群から選択される、請求項６５〜７６のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項７８】
前記イソプレノイドが、セスキテルペンである、請求項６５〜７６のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項７９】
前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファメセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パトコウロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン、およびバレンセンからなる群から選択される、請求項６５〜７６のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項８０】
前記ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドが、（ａ）２分子のアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｂ）マロニルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｃ）アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素；（ｄ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；および（ｅ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素から選択される、請求項６５〜７９のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項８１】
前記ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドが、（ａ）メバロン酸をリン酸化してメバロン酸５−リン酸を形成する酵素；（ｂ）メバロン酸５−リン酸をリン酸化してメバロン酸５−ピロリン酸を形成する酵素；および（ｃ）メバロン酸５−ピロリン酸を脱炭酸してイソペンテニルピロリン酸を形成する酵素から選択される、請求項６５〜８０のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項８２】
前記組換え細胞が、メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する弱力化酵素を含んでなる、請求項６５〜８１のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項８３】
前記組換え細胞が、メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する弱力化酵素を含んでなる、請求項６５〜８２のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項８４】
前記組換え細胞が、１つまたは複数の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる、請求項６５〜８３のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項８５】
前記組換え細胞が、前記１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路の１つまたは複数の弱力化酵素を含んでなる、請求項６５〜８４のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項８６】
ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、異種核酸をさらに含んでなる、請求項６５〜８５のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項８７】
前記ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、異種核酸である、請求項６５〜８６のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項８８】
前記ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、内在性核酸である、請求項６５〜８７のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項８９】
前記イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、異種核酸である、請求項６５〜８８のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項９０】
前記イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、内在性核酸である、請求項６５〜８９のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項９１】
（ｉ）〜（ｉｖ）のポリペプチドをコードする核酸の少なくとも１つが、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターの下に置かれる、請求項６５〜９０のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項９２】
（ｉ）〜（ｉｖ）のポリペプチドをコードする核酸の少なくとも１つが、１つまたは複数のマルチコピープラスミドにクローン化される、請求項６５〜９１のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項９３】
（ｉ）〜（ｉｖ）のポリペプチドをコードする核酸の少なくとも１つが、前記細胞の染色体に組み込まれる、請求項６５〜９２のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項９４】
前記組換え細胞が、グラム陽性細菌細胞、グラム陰性細菌細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、植物細胞、藻類細胞または酵母細胞である、請求項６５〜９３のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項９５】
前記細菌細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、Ｐ．シトレア（Ｐ．ｃｉｔｒｅａ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ロータス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、Ｂ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、Ｓ．アルバス（Ｓ．ａｌｂｕｓ）、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、Ｓ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、Ｓ．グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、およびＰ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）細胞からなる群から選択される、請求項９４に記載の組換え細胞。
【請求項９６】
前記酵母細胞が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）種、またはカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種からなる群から選択される、請求項９４に記載の組換え細胞。
【請求項９７】
前記組換え細胞が、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）およびアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からなる群から選択される、請求項６５〜９３のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項９８】
（ａ）請求項１〜３４のいずれか一項に記載の組換え細胞を、イソプレンの生成に適した条件下で培養するステップと、（ｂ）前記イソプレンを生成するステップとを含んでなるイソプレンを生成する方法。
【請求項９９】
（ｃ）前記イソプレンを回収するステップをさらに含んでなる、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
（ａ）請求項３５〜６４のいずれか一項に記載の組換え細胞を、イソプレノイド前駆体の生成に適した条件下で培養するステップと、（ｂ）イソプレノイド前駆体を生成するステップとを含んでなる、イソプレノイド前駆体を生成する方法。
【請求項１０１】
（ｃ）前記イソプレノイド前駆体を回収するステップをさらに含んでなる、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
（ａ）請求項６５〜９７のいずれか一項に記載の組換え細胞を、イソプレノイド前駆体の生成に適した条件下で培養するステップと、（ｂ）イソプレノイドを生成するステップとを含んでなる、イソプレノイドを生成する方法。
【請求項１０３】
（ｃ）前記イソプレノイドを回収するステップをさらに含んでなる、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載の組換え細胞によって産生されるイソプレンを含んでなる組成物。
【請求項１０５】
請求項３５〜６４のいずれか一項に記載の組換え細胞によって産生されるイソプレノイド前駆体を含んでなる組成物。
【請求項１０６】
請求項６５〜９７のいずれか一項に記載の組換え細胞によって産生されるイソプレノイドを含んでなる組成物。
【請求項１０７】
ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸であって、前記ポリペプチドが、配列番号１８のアミノ酸配列との少なくとも８５％の配列同一性を含んでなる、単離核酸。
【請求項１０８】
ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有する単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、配列番号１８のアミノ酸配列との少なくとも８５％の配列同一性を含んでなる、単離ポリペプチド。
【請求項１０９】
ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含んでなる単離細胞であって、前記ポリペプチドが、配列番号１８のアミノ酸配列との少なくとも８５％の配列同一性を含んでなる、単離細胞。
【請求項１１０】
ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含んでなる組換え細胞であって、前記ポリペプチドが、配列番号１８のアミノ酸配列との少なくとも８５％の配列同一性を含んでなる、組換え細胞。
【請求項１１１】
ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドを含んでなる細胞抽出物であって、前記ポリペプチドが、配列番号１８のアミノ酸配列との少なくとも８５％の配列同一性を含んでなる、細胞抽出物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、２０１２年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／７４５，５３０号明細書；および２０１３年８月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／８６５，９７８号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
参照による組み込み
以下のＡＳＣＩＩテキストファイルでの提出内容は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する：コンピューター可読形態（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：６４３８４２００４７４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、記録日：２０１３年１２月２０日、サイズ：９９，９９６バイト）。
【０００３】
本発明は、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニルキナーゼ、イソプレノイド前駆体を産生できる、１つまたは複数のメバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチド、イソプレン、およびイソプレノイドを含んでなる組換え細胞と、これらの培養細胞を含む組成物と、それらを生成する方法と、使用する方法とに関する。
【背景技術】
【０００４】
イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、多様な合成ポリマー、中でも注目すべきことには合成ゴムのための重要な出発原料である。イソプレンは、鉱油の分画によって得られ得る；しかしこの材料の精製には、費用と時間がかかる。炭化水素のＣ５ストリームの石油分解法は、わずか約１５％のイソプレンを生じる。年間約８００，０００トンのシスポリイソプレンが、イソプレンの重合から生産され；このポリイソプレンの大部分は、タイヤおよびゴム産業で使用される。イソプレンはまた、履物類、機械製品、医療用品、スポーツ用品、およびラテックスなどのその他の製品中で、合成エラストマーとして使用するために共重合される。イソプレンはまた、多様な微生物、植物、および動物種によって、天然に産生され得る。特に、イソプレンの天然生合成について、メバロン酸（ＭＶＡ）経路および非メバロン酸（ＤＸＰ）経路の２つの経路が同定されている。
【０００５】
２９，０００を超えるイソプレノイド化合物が同定されており、新規イソプレノイドが毎年発見されている。イソプレノイドは、イソプレノイドの比較的複雑な構造を形成するための基本的構成単位として、イソプレノイド前駆体分子を利用する、微生物および植物種などの天然物から単離され得る。イソプレノイドは、大多数の生きている生物および細胞に不可欠であり、細胞膜流動性および電子伝達を維持する手段を提供する。自然界では、イソプレノイドは、植物中の天然殺虫剤などの多様な役割で機能して、シナモン、クローブ、およびショウガに関連づけられる香気に寄与する。さらに製薬および化学産業界は、イソプレノイドを医薬品、栄養補給食品、着香剤、および農業害虫防除剤として利用する。生体系におけるそれらの重要性、および広範な用途における有用性を考慮して、イソプレノイドは、科学者から多くの注目を集めている。
【０００６】
イソプレノイドを得るための従来の手段としては、生物学的材料（例えば、植物、微生物、および動物）からの抽出、および実験室での部分的または完全有機合成が挙げられる。しかしこのような手段は、概して満足のいくものではないことが判明している。特にイソプレノイドでは、それらの分子構造の往々にして複雑な性質を所与として、所望の製品を得るためにいくつかのステップが通常要求されることを考えると、有機合成は非実用的である。さらにこれらの化学合成ステップは、有毒溶媒の使用を伴い得て、生物学的材料からのイソプレノイド抽出もまた同様である。さらに生物学的材料は、典型的に、これらの分子を微量でのみ含有するため、これらの抽出および精製法は、通常、所望のイソプレノイドを比較的低収率でもたらす。不運にも、比較的大量のイソプレノイドを得ることに伴う困難さは、それらの実用的利用を制限してきた。
【０００７】
イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、およびイソプレノイドの生産における最近の進歩は、様々な速度、力価、および純度で、これらの化合物を生産する方法を開示する。例えば、国際公開第２００９／０７６６７６Ａ２号パンフレットを参照されたい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし堅固な商業的方法の要求を満たすのに十分な、生産と収率を改善する代替経路が、なおも必要とされる。
【０００９】
本明細書で提供されるのは、培養組換え細胞、これらの細胞の組成物、ならびにこれらの細胞を使用して、代案の下流のＭＶＡ経路を通じて、イソプレノイド前駆体、イソプレンおよび／またはイソプレノイドなどのメバロン酸から誘導される分子の生成を増大させる方法である。
【００１０】
本明細書全体を通じて、様々な特許、特許出願、およびその他の各種文献（例えば、学術論文）が、参照される。本明細書で引用される全ての特許、特許出願、および出版物の開示は、あらゆる目的のために、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書で提供される発明は、特に、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼを含んでなる組換え細胞を含んでなる物質の組成物と、イソプレン、イソプレノイド前駆体、およびイソプレノイドの生成のために、これらの組換え細胞を作成して使用する方法とを開示する。いくつかの態様では、組換え細胞は、イソプレン、イソプレノイド前駆体、およびイソプレノイドの生成のためのイソペンテニルキナーゼをさらに含んでなる。
【００１２】
したがって一態様では、本発明は、（ｉ）ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉ）イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｖ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなる、イソプレンを産生できる組換え細胞であって、前記組換え細胞の培養がイソプレンの生成を提供する、イソプレンを産生できる組換え細胞を提供する。一実施形態では、核酸は、メバロン酸５−リン酸からイソペンテニルリン酸への変換を触媒する、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、核酸は、メバロン酸５−ピロリン酸からイソペンテニルリン酸および／またはイソペンテニルピロリン酸への変換を触媒する、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、古細菌に由来する。さらなる実施形態では、古細菌は、デスルフロコッカス目（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スルフォロブス目（Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ）、サーモプロテウス目（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ケナルカエアレス目（Ｃｅｎａｒｃｈａｅａｌｅｓ）、ニトロソプミラレス目（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌａｌｅｓ）、アーキオグロブス目（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロバクテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノコッカス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、メタノセラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａｌｅｓ）、メタノサルシナ目（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ）、メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノミクロビウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、メタノピラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒａｌｅｓ）、サーモコッカス目（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、サーモプラズマ目（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）、コルアーケオタ門（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ）、およびナノアーケオタ門（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａ）からなる群から選択される。一実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、Ｓ３７８Ｐａ３−２、およびアナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）からなる群から選択される微生物に由来する。別の実施形態では、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、古細菌に由来する。さらなる実施形態では、古細菌は、デスルフロコッカス目（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スルフォロブス目（Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ）、サーモプロテウス目（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ケナルカエアレス目（Ｃｅｎａｒｃｈａｅａｌｅｓ）、ニトロソプミラレス目（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌａｌｅｓ）、アーキオグロブス目（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロバクテ��ウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノコッカス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、メタノセラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａｌｅｓ）、メタノサルシナ目（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ）、メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノミクロビウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、メタノピラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒａｌｅｓ）、サーモコッカス目（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、サーモプラズマ目（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）、コルアーケオタ門（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ）、およびナノアーケオタ門（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａ）からなる群から選択される。一実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１６〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸配列との少なくとも８５％の配列同一性を含んでなる。別の実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１６〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、メタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、メタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）、およびアナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）からなる群から選択される微生物に由来する。さらなる実施形態では、微生物は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）またはメタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）である。一実施形態では、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１９〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるイソペンテニルキナーゼをコードする核酸配列との少なくとも８５％の配列同一性を含んでなる。別の実施形態では、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１９〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。さらなる実施形態では、植物イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（Ｐｕｅｒａｒｉａ）またはポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）からのポリペプチドまたはその変異体である。別のさらなる実施形態では、植物イソプレンシンターゼポリペプチドは、プエラリア・モンタナ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ）またはプエラリア・ロバタ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｌｏｂａｔａ）、ポプルス・トレムロイデス（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）、セイヨウハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｎｉｇｒａ）、コットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、またはウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）×ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ）雑種からのポリペプチドまたはその変異体である。一実施形態では、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドは、（ａ）２分子のアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｂ）マロニルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｃ）アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素；（ｄ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；および（ｅ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素から選択される。別の実施形態では、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドは、（ａ）メバロン酸をリン酸化してメバロン酸５−リン酸を形成する酵素；（ｂ）メバロン酸５−リン酸をリン酸化してメバロン酸５−ピロリン酸を形成する酵素；および（ｃ）メバロン酸５ピロリン酸を脱炭酸してイソペンテニルピロリン酸を形成する酵素から選択される。本明細書の実施形態のいずれかでは、組換え細胞は、イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。さらなる実施形態では、組換え細胞は、メバロン酸５ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する弱力化酵素を含んでなる。別のさらなる実施形態では、組換え細胞は、メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する弱力化酵素を含んでなる。本明細書の実施形態のいずれかでは、組換え細胞は、１つまたは複数の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。本明細書の実施形態のいずれかでは、組換え細胞は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路の１つまたは複数の弱力化酵素を含んでなる。本明細書の実施形態のいずれかでは、組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、異種核酸をさらに含んでなる。本明細書の実施形態のいずれかでは、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、異種核酸である。本明細書の実施形態のいずれかでは、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、内在性核酸である。本明細書の任意の実施形態では、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、異種核酸である。本明細書の実施形態のいずれかでは、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、内在性核酸である。本明細書の実施形態のいずれかでは、（ｉ）〜（ｉｖ）のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸は、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターの下に置かれる。本明細書の実施形態のいずれかでは、���ｉ）〜（ｉｖ）のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸は、１つまたは複数のマルチコピープラスミドにクローン化される。本明細書の実施形態のいずれかでは、（ｉ）〜（ｉｖ）のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸は、細胞染色体に組み込まれる。本明細書の実施形態のいずれかでは、組換え細胞は、グラム陽性細菌細胞、グラム陰性細菌細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、植物細胞、藻類細胞または酵母細胞である。さらなる実施形態では、細菌細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、Ｐ．シトレア（Ｐ．ｃｉｔｒｅａ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ロータス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、Ｂ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、Ｓ．アルバス（Ｓ．ａｌｂｕｓ）、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、Ｓ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、Ｓ．グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、およびＰ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）細胞からなる群から選択される。その他のさらなる実施形態では、酵母細胞は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、シゾサッカロミセスＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（属）種、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）種、またはカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種からなる群から選択される。一実施形態では、組換え細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  
ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）およびアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からなる群から選択される。
【００１３】
別の態様では、本発明は、（ｉ）ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉ）イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、および（ｉｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなる、イソプレノイド前駆体を産生できる組換え細胞であって、前記組換え細胞の培養がイソプノイド前駆体の生成を提供する、イソプレノイド前駆体を産生できる組換え細胞を提供する。一実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、メバロン酸５−リン酸からイソペンテニルリン酸への変換を触媒する。別の実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、メバロン酸５−ピロリン酸からイソペンテニルリン酸および／またはイソペンテニルピロリン酸への変換を触媒する。さらに別の実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、古細菌に由来する。さらなる実施形態では、古細菌は、デスルフロコッカス目（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スルフォロブス目（Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ）、サーモプロテウス目（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ケナルカエアレス目（Ｃｅｎａｒｃｈａｅａｌｅｓ）、ニトロソプミラレス目（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌａｌｅｓ）、アーキオグロブス目（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロバクテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノコッカス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、メタノセラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａｌｅｓ）、メタノサルシナ目（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ）、メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノミクロビウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、メタノピラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒａｌｅｓ）、サーモコッカス目（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、サーモプラズマ目（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）、コルアーケオタ門（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ）、およびナノアーケオタ門（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａ）からなる群から選択される。一実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、Ｓ３７８Ｐａ３−２、およびアナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）からなる群から選択される微生物に由来する。一実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１６〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸配列との少なくとも８５％の配列同一性を含んでなる。別の実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１６〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。別の実施��態では、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、古細菌に由来する。さらなる実施形態では、古細菌は、デスルフロコッカス目（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スルフォロブス目（Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ）、サーモプロテウス目（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ケナルカエアレス目（Ｃｅｎａｒｃｈａｅａｌｅｓ）、ニトロソプミラレス目（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌａｌｅｓ）、アーキオグロブス目（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロバクテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノコッカス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、メタノセラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａｌｅｓ）、メタノサルシナ目（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ）、メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノミクロビウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、メタノピラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒａｌｅｓ）、サーモコッカス目（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、サーモプラズマ目（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）、コルアーケオタ門（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ）、およびナノアーケオタ門（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａ）からなる群から選択される。一実施形態では、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、メタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、メタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）、およびアナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）からなる群から選択される微生物に由来する。さらなる実施形態では、微生物は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）またはメタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）である。一実施形態では、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１９〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるイソペンテニルキナーゼをコードする核酸配列との少なくとも８５％の配列同一性を含んでなる。別の実施形態では、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１９〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドは、（ａ）２分子のアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｂ）マロニルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｃ）アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素；（ｄ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；および（ｅ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素から選択される。別の実施形態では、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドは、（ａ）メバロン酸をリン酸化してメバロン酸５−リン酸を形成する酵素；（ｂ）メバロン酸５−リン酸をリン酸化してメバロン酸５−ピロリン酸を形成する酵素；および（ｃ）メバロン酸５ピロリン酸を脱炭酸してイソペンテニルピロリン酸を形成する酵素から選択される。なおも別の実施形態では、組換え細胞は、メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する弱力化酵素を含んでなる。一実施形態では、組換え細胞は、メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する弱力化酵素を含んでなる。本明細書の実施形態のいずれかでは、組換え細胞は、１つまたは複数の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。本明細書の実施形態のいずれかでは、組換え細胞は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路の１つまたは複数の弱力化酵素を含んでなる。本明細書の実施形態のいずれかでは、組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、異種核酸をさらに含んでなる。本明細書の実施形態のいずれかでは、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、異種核酸である。本明細書の実施形態のいずれかでは、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、内在性核酸である。本明細書の実施形態のいずれかでは、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、内在性核酸である。本明細書の実施形態のいずれかでは、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、内在性核酸である。本明細書の実施形態のいずれかでは、（ｉ）〜（ｉｖ）のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸は、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターの下に置かれる。本明細書の実施形態のいずれかでは、（ｉ）〜（ｉｖ）のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸は、１つまたは複数のマルチコピープラスミドにクローン化される。本明細書の実施形態のいずれかでは、（ｉ）〜（ｉｖ）のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸は、細胞染色体に組み込まれる。本明細書の実施形態のいずれかでは、組換え細胞は、グラム陽性細菌細胞、グラム陰性細菌細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、植物細胞、藻類細胞または酵母細胞である。さらなる実施形態では、細菌細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、Ｐ．シトレア（Ｐ．ｃｉｔｒｅａ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ロータス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、Ｂ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、Ｓ．アルバス（Ｓ．ａｌｂｕｓ）、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、Ｓ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、Ｓ．グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、およびＰ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）細胞からなる群から選択される。なおもさらなる実施形態では、酵母細胞は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、シゾサッカロミセスＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（属）種、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）種、またはカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種からなる群から選択される。一実施形態では、組換え細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）およびアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からなる群から選択される。
【００１４】
別の態様では、本発明は、（ｉ）ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉ）イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｖ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなる、イソプレノイド前駆体を産生できる組換え細胞であって、適切な培地中における前記組換え細胞の培養がイソプレノイドの生成を提供する、イソプレノイド前駆体を産生できる組換え細胞を提供する。一実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、メバロン酸５−リン酸からイソペンテニルリン酸への変換を触媒する。別の実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、メバロン酸５−ピロリン酸からイソペンテニルリン酸および／またはイソペンテニルピロリン酸への変換を触媒する。さらに別の実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、古細菌に由来する。さらなる実施形態では、古細菌は、デスルフロコッカス目（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スルフォロブス目（Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ）、サーモプロテウス目（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ケナルカエアレス目（Ｃｅｎａｒｃｈａｅａｌｅｓ）、ニトロソプミラレス目（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌａｌｅｓ）、アーキオグロブス目（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロバクテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノコッカス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、メタノセラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａｌｅｓ）、メタノサルシナ目（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ）、メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノミクロビウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、メタノピラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒａｌｅｓ）、サーモコッカス目（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、サーモプラズマ目（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）、コルアーケオタ門（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ）、およびナノアーケオタ門（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａ）からなる群から選択される。一実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、Ｓ３７８Ｐａ３−２、およびアナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）からなる群から選択される微生物に由来する。一実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１６〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸配列との少なくとも８５％の配列同一性を含んでなる。別の実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１６〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列��少なくとも８５％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。別の実施形態では、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、古細菌に由来する。さらなる実施形態では、古細菌は、デスルフロコッカス目（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スルフォロブス目（Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ）、サーモプロテウス目（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ケナルカエアレス目（Ｃｅｎａｒｃｈａｅａｌｅｓ）、ニトロソプミラレス目（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌａｌｅｓ）、アーキオグロブス目（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロバクテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノコッカス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、メタノセラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａｌｅｓ）、メタノサルシナ目（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ）、メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノミクロビウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、メタノピラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒａｌｅｓ）、サーモコッカス目（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、サーモプラズマ目（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）、コルアーケオタ門（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ）、およびナノアーケオタ門（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａ）からなる群から選択される。一実施形態では、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、メタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、メタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）、およびアナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）からなる群から選択される微生物に由来する。さらなる実施形態では、微生物は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）またはメタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）である。一実施形態では、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１９〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるイソペンテニルキナーゼをコードする核酸配列との少なくとも８５％の配列同一性を含んでなる。別の実施形態では、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１９〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。一実施形態では、イソプレノイドは、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セキテルペン、およびポリテルペンからなる群から選択される。別の実施形態では、イソプレノイドは、セスキテルペンである。さらに別の実施形態では、イソプレノイドは、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファメセ���、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パトコウロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン、およびバレンセンからなる群から選択される。なおも別の実施形態では、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドは、（ａ）２分子のアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｂ）マロニルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｃ）アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素；（ｄ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；および（ｅ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素から選択される。一実施形態では、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドは、（ａ）メバロン酸をリン酸化してメバロン酸５−リン酸を形成する酵素；（ｂ）メバロン酸５−リン酸をリン酸化してメバロン酸５−ピロリン酸を形成する酵素；および（ｃ）メバロン酸５ピロリン酸を脱炭酸してイソペンテニルピロリン酸を形成する酵素から選択される。一実施形態では、組換え細胞は、メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する弱力化酵素を含んでなる。別の実施形態では、組換え細胞は、メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する弱力化酵素を含んでなる。本明細書の実施形態のいずれかでは、組換え細胞は、１つまたは複数の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。本明細書の実施形態のいずれかでは、組換え細胞は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路の１つまたは複数の弱力化酵素を含んでなる。本明細書の実施形態のいずれかでは、組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、異種核酸をさらに含んでなる。本明細書の実施形態のいずれかでは、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、異種核酸である。本明細書の実施形態のいずれかでは、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、内在性核酸である。本明細書の実施形態のいずれかでは、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、異種核酸である。本明細書の実施形態のいずれかでは、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、内在性核酸である。本明細書の実施形態のいずれかでは、（ｉ）〜（ｉｖ）のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸は、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターの下に置かれる。本明細書の実施形態のいずれかでは、（ｉ）〜（ｉｖ）のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸は、１つまたは複数のマルチコピープラスミドにクローン化される。本明細書の実施形態のいずれかでは、（ｉ）〜（ｉｖ）のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸は、細胞染色体に組み込まれる。本明細書の実施形態のいずれかでは、組換え細胞は、グラム陽性細菌細胞、グラム陰性細菌細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、植物細胞、藻類細胞または酵���細胞である。さらなる実施形態では、細菌細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、Ｐ．シトレア（Ｐ．ｃｉｔｒｅａ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ロータス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、Ｂ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、Ｓ．アルバス（Ｓ．ａｌｂｕｓ）、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、Ｓ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、Ｓ．グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、およびＰ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）細胞からなる群から選択される。その他のさらなる実施形態では、酵母細胞は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、シゾサッカロミセスＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（属）種、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）種、またはカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種からなる群から選択される。一実施形態では、組換え細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）およびアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からなる群から選択される。
【００１５】
一態様では、本発明は、（ａ）本明細書で開示される組換え細胞のいずれかを、イソプレンの生成に適した条件下で培養するステップと、（ｂ）イソプレンを生成するステップとを含んでなる、イソプレンを生成する方法もまた提供する。さらなる実施形態では、方法は、（ｃ）イソプレンを回収するステップをさらに含んでなる。
【００１６】
別の態様では、本発明は、（ａ）本明細書で開示される組換え細胞のいずれかを、イソプレノイド前駆体の生成に適した条件下で培養するステップと、（ｂ）イソプレノイド前駆体を生成するステップとを含んでなる、イソプレノイド前駆体を生成する方法もまた提供する。さらなる実施形態では、方法は、（ｃ）イソプレノイド前駆体を回収するステップをさらに含んでなる。
【００１７】
さらに別の態様では、本明細書の発明は、（ａ）本明細書で開示される組換え細胞のいずれかを、イソプレノイドの生成に適した条件下で培養するステップと、（ｂ）イソプレノイドを生成するステップとを含んでなる、イソプレノイドを生成する方法もまた提供する。さらなる実施形態では、方法は、（ｃ）イソプレノイドを回収するステップをさらに含んでなる。
【００１８】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される組換え細胞によって産生されるイソプレンを含んでなる組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞によって産生されるイソプレンを含んでなる組成物は、本明細書で検討される任意の方法によって生成され得る。
【００１９】
なおも別の態様では、本発明は、本明細書に記載される組換え細胞によって産生されるイソプレノイド前駆体を含んでなる組成物もまた提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞によって産生されるイソプレノイド前駆体を含んでなる組成物は、本明細書で検討される任意の方法によって生成され得る。
【００２０】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載される組換え細胞によって産生されるイソプレノイドを含んでなる組成物もまた提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞によって産生されるイソプレノイドを含んでなる組成物は、本明細書で検討される任意の方法によって生成され得る。
【００２１】
別の態様では、本発明は、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸を提供し、前記ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列との少なくとも８５％の配列同一性を含んでなる。別の態様では、本発明は、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有する単離ポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列との少なくとも８５％の配列同一性を含んでなる。
【００２２】
一態様では、これもまた本明細書で提供されるのは、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含んでなる単離細胞であり、前記ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列との少なくとも８５％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、核酸は、異種核酸である。いくつかの実施形態では、核酸は、内在性核酸である。いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含んでなる組換え細胞であり、前記ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列との少なくとも８５％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、核酸は、異種核酸である。いくつかの実施形態では、核酸は、内在性核酸である。
【００２３】
いくつかの態様では、本発明は、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドを含んでなる細胞抽出物を提供し、前記ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列との少なくとも８５％の配列同一性を含んでなる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】イソプレン、イソプレノイド前駆体、およびイソプレノイドを生成するための、上流および古典的下流ＭＶＡ経路およびＤＸＰ経路を示す（Ｆ．Ｂｏｕｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４４：３５７−４２９，２００５に基づく）。以下の説明は、経路中の各ポリペプチドの代案の名称と、示されるポリペプチドの活性を測定するためのアッセイを開示する参考文献を含む。メバロン酸経路：ＡＡＣＴ；アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＭｖａＥ、ＥＣ２．３．１．９．アッセイ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４：２１１６−２１２２，２００２；ＨＭＧＳ；ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡシンターゼ、ＭｖａＳ、ＥＣ２．３．３．１０．アッセイ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４：４０６５−４０７０，２００２；ＨＭＧＲ；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ還元酵素、ＭｖａＥ、ＥＣ１．１．１．３４．アッセイ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４：２１１６−２１２２，２００２；ＭＶＫ；メバロン酸キナーゼ、ＥＲＧ１２、ＥＣ２．７．１．３６．アッセイ：Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ  １９：９−１４，１９９１．ＰＭＫホスホメバロン酸キナーゼ、ＥＲＧ８、ＥＣ２．７．４．２、アッセイ：Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１１：６２０−６３１，１９９１；ＤＰＭＤＣ；ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、ＭＶＤ１、ＥＣ４．１．１．３３．アッセイ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：１３３５５−１３３６２，１９９４；ＩＤＩ；イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ、ＩＤＩ１、ＥＣ５．３．３．２．アッセイ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１９１６９−１９１７５、１９８９．ＤＸＰ経路：ＤＸＳ；１−デオキシキシルロース５−リン酸シンターゼ、ｄｘｓ、ＥＣ２．２．１．７アッセイ：ＰＮＡＳ，９４：１２８５７−６２，１９９７；ＤＸＲ；１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ、ｄｘｒ、ＥＣ２．２．１．７アッセイ：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：４４４６−４４５７，２００２；ＭＣＴ；４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ、ＩｓｐＤ、ＥＣ２．７．７．６０アッセイ：ＰＮＡＳ，９７：６４５１−６４５６，２０００；ＣＭＫ；４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ、ＩｓｐＥ、ＥＣ２．７．１．１４８アッセイ：ＰＮＡＳ，９７：１０６２−１０６７，２０００；ＭＣＳ；２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ、ＩｓｐＦ、ＥＣ４．６．１．１２アッセイ：ＰＮＡＳ，９６：１１７５８−１１７６３，１９９９；ＨＤＳ；１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸シンターゼ、ｉｓｐＧ、ＥＣ１．１７．４．３アッセイ：Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，７０：９１６８−９１７４，２００５；ＨＤＲ；１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸還元酵素、ＩｓｐＨ、ＥＣ１．１７．１．２アッセイ：ＪＡＣＳ，１２６：１２８４７−１２８５５，２００４。
【図２】ＤＸＰ経路と平行して示される、イソプレン、イソプレノイド前駆体、およびイソプレノイドを生成するための代案の下流ＭＶＡ経路の概略図である。メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭｅｖＤＣ）；イソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）；イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）。代案の下流ＭＶＡ経路は、例えば、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）などのいくつかの古細菌生物中に存在する。
【図３】ｐＭＣＭ２２００のプラスミドマップである。
【図４】ｐＭＣＭ２２０１のプラスミドマップである。
【図５】ｐＭＣＭ２２１２のプラスミドマップである。
【図６】ｐＭＣＭ２２４４のプラスミドマップである。
【図７】ｐＭＣＭ２２４６のプラスミドマップである。
【図８】ｐＭＣＭ２２４８のプラスミドマップである。
【図９】ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。レーン：１）１０μＬのマーカー、２）Ｈｉｓ−タグのある、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＡＴＣＣ  ２３７７９ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、３）Ｈｉｓ−タグのない、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＡＴＣＣ  ２３７７９ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、４）Ｈｉｓ−タグのある、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＡＴＣＣ  ２３７７９イソペンテニルリン酸キナーゼ、５）Ｈｉｓ−タグのない、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＡＴＣＣ  ２３７７９イソペンテニルリン酸キナーゼ、６）Ｈｉｓ−タグのある、Ｓ３７８Ｐａ３−２ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、７）Ｈｉｓ−タグのない、Ｓ３７８Ｐａ３−２ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
【図１０】４時間にわたるＩＰＴＧ誘導後における、４つの異なる培地調合物中の、ＭＣＭ２２５７、ＭＣＭ２２５８、ＭＣＭ２２５９、ＭＣＭ２２６０、ＭＣＭ２２６１、およびＭＣＭ２２６２株の増殖を示す、一連のグラフである。
【図１１】４時間にわたるＩＰＴＧ誘導後における、４つの異なる培地調合物中の、ＭＣＭ２２５７、ＭＣＭ２２５８、ＭＣＭ２２５９、ＭＣＭ２２６０、ＭＣＭ２２６１、およびＭＣＭ２２６２株によるイソプレン産生を示す、一連のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
メバロン酸は、アセチルＣｏＡをイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）に変換する、メバロン酸依存性経路の中間体である。アセチルＣｏＡのメバロン酸への変換は、上流ＭＶＡ経路のチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、およびＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性によって触媒され得る。古典的下流ＭＶＡ経路は、ＭＶＡ経路の最終生成物として、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰを生成するための基質として、メバロン酸を利用する。ＤＸＰ経路もまた、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰを生成する。ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰは、どちらもイソプレンならびにイソプレノイドの前駆体である。ＭＶＡ経路は、典型的に、動物、植物、および多数の細菌に見られるが、古細菌生物の際立った特徴は、イソプレノイドがそれらの膜脂質の主要成分を構成することであるが、それにもかかわらず、完全なＭＶＡ経路は古細菌中で同定されていない。推定イソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）が、古細菌から同定され特性解析されており、古細菌中でイソプレノイドを生成するための、修正メバロン酸経路の可能な利用が示唆される。しかしメバロン酸５−リン酸からイソペンテニルリン酸への変換を触媒するホスホメバロン酸デカルボキシラーゼは、これまで記載されていなかった。
【００２６】
本明細書で提供される発明は、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドを発現するように改変された組換え細胞内で、イソプレノイド前駆体分子、イソプレンおよび／またはイソプレノイドを生成するための組成物と方法を特に開示する。本発明のホスホメバロン酸デカルボキシラーゼは、メバロン酸５−リン酸および／またはメバロン酸５−ピロリン酸を基質として利用し得る。特定の実施形態では、本発明は、メバロン酸５−リン酸からイソペンテニルリン酸への変換を触媒できる、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドを発現するように改変された組換え細胞中で、イソプレノイド前駆体分子、イソプレンおよび／またはイソプレノイドを生成するための組成物および方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、メバロン酸５−ピロリン酸からイソペンテニルリン酸および／またはイソペンテニルピロリン酸への変換を触媒できる、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドを発現するように改変された組換え細胞内で、イソプレノイド前駆体分子、イソプレンおよび／またはイソプレノイドを生成するための組成物および方法を提供する。
【００２７】
一般技術
特に断りのない限り、本発明の実施は、当該分野の技術範囲内である、（組換え技術をはじめとする）従来の分子生物学技術、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学を採用する。このような技術は、文献、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，編．，１９８７，ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｕｐｄａｔｅｓ）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，編，１９９４）．Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第２版，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４）、およびＭａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  第４版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９２）で詳しく説明され、当業者に、本出願で使用される多くの用語について、一般的指針を提供する。
【００２８】
定義
本明細書の用法では、「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド断片、および融合ポリペプチドを含む。
【００２９】
本明細書の用法では、「単離ポリペプチド」は、２、５、１０、２０、５０以上の異なるポリペプチドライブラリーなどのポリペプチドライブラリーの一部でなく、それが自然界で一緒に存在する少なくとも１つの構成要素から分離される。単離ポリペプチドは、例えば、ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって得られ得る。
【００３０】
「異種ポリペプチド」とは、宿主細胞とは異なる生物、種、または株に由来する核酸配列によってコードされる、ポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、異種ポリペプチドは、自然界で同一宿主細胞に見られる、野生型ポリペプチドと同じでない。
【００３１】
本明細書の用法では、「核酸」は、一本鎖または二本鎖形態のどちらかで、共有結合的に共に連結した２つ以上のデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを指す。
【００３２】
「組換え核酸」とは、それに関心のある核酸が由来する生物の天然ゲノム中で、関心のある核酸の側面に位置する１つまたは複数の核酸（例えば、遺伝子）を含まない、関心のある核酸を意味する。したがって用語は、例えば、ベクターに、自己複製プラスミドまたはウイルスに、または原核生物または真核生物ゲノムＤＮＡに、組み込まれた組換えＤＮＡ、またはその他の配列から独立した別個の分子（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生じる、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、またはｃＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。
【００３３】
「異種核酸」とは、宿主細胞とは異なる生物、種または株に由来する核酸配列を意味する。いくつかの実施形態では、異種核酸は、自然界で同一宿主細胞に見られる野生型核酸と同じでない。例えば、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）および／またはＳ３７８Ｐａ３−２からのホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ遺伝子によってコードされ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換するのに使用される核酸は、異種核酸である。
【００３４】
本明細書の用法では、「ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ」、「ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ酵素」、「ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチド」、および「ＰＭｅｖＤＣ」という用語は、同義的に使用されて、メバロン酸５−リン酸をイソペンテニルリン酸に変換する、および／またはメバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルリン酸および／またはイソペンテニルピロリン酸に変換する、ポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドは、メバロン酸５−リン酸からイソペンテニルリン酸への変換を触媒する。別の実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドは、メバロン酸５−ピロリン酸からイソペンテニルリン酸への変換を触媒する。別の実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドは、メバロン酸５−ピロリン酸からイソペンテニルピロリン酸への変換を触媒する。いくつかの実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドは、メバロン酸５−ピロリン酸からイソペンテニルリン酸およびイソペンテニルピロリン酸への変換を触媒する。
【００３５】
本明細書の用法では、「イソペンテニルキナーゼ」、「イソペンテニルキナーゼ酵素」、「イソペンテニルキナーゼポリペプチド」、「イソペンテニルリン酸キナーゼ」、および「ＩＰＫ」という用語は同義的に使用され、イソペンテニルリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換するポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、イソペンテニルキナーゼポリペプチドは、イソペンテニルリン酸からイソペンテニルピロリン酸への変換を触媒する。
【００３６】
「イソプレン」という用語は、２−メチル−１，３−ブタジエン（ＣＡＳ番号７８−７９−５）を指す。それは、３，３−ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）からのピロリン酸除去から得られる、直接最終揮発性Ｃ５炭化水素生成物である。それはＩＰＰ分子のＤＭＡＰＰ分子への連結または重合を伴わなくてもよい。「イソプレン」という用語は、本明細書で特に断りのない限り、一般に、その生成方法に制限されることは意図されない。
【００３７】
本明細書の用法では、「イソプレノイド」という用語は、各単位が特定パターンに配列された５つの炭素原子からなる、２つ以上の炭化水素単位から構成される天然有機化合物クラスの大規模かつ多様なクラスを指す。本明細書の用法では、「イソプレン」は、「イソプレノイド」の定義から明示的に除外される。
【００３８】
本明細書の用法では、「イソプレノイド前駆体」は、テルペノイドまたはイソプレノイドの生合成において、生物によって使用される任意の分子を指す。イソプレノイド前駆体分子の非限定的例としては、例えば、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）が挙げられる。
【００３９】
本明細書の用法では、「質量収率」という用語は、百分率として表される、組換え細胞によって消費されたグルコース質量で除した、組換え細胞によって生成された生成物の質量を指す。
【００４０】
「比生産性」とは、生成物生成時間、細胞密度、および培養物容積で除した、組換え細胞によって生成された生成物の質量を意味する。
【００４１】
「力価」は、培養液の容積で除した、組換え細胞によって生成された生成物の質量を意味する。
【００４２】
本明細書の用法では、「細胞生産性指標（ＣＰＩ）」という用語は、培養物中に生じた組換え細胞の質量で除した、組換え細胞によって産生された生成物の質量を指す。
【００４３】
本明細書で特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００４４】
本明細書の用法では、単数の用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明白に別段の記載がない限り、複数への言及を含む。
【００４５】
本明細書全体を通じて記載されるあらゆる最大数値限界は、あたかもより低い数値限界が本明細書に明示的に記載されているかのように、あらゆるより低い数値限界を含むことが意図される。本明細書全体を通じて示されるあらゆる最小数値限界は、あたかもより高い数値限界が本明細書に明示的に記載されているかのように、あらゆるより高い数値限界を含む。本明細書全体を通じて示されるあらゆる数値範囲は、あたかもより狭い数値範囲が本明細書に明示的に記載されているかのように、このようなより広い数値範囲に含まれるあらゆるより狭い数値範囲を含む。
【００４６】
「約」に言及する本明細書の値またはパラメータは、その値またはパラメータそれ自体を対象とする実施形態もまた含む（そして記載する）。
【００４７】
本明細書に記載される本発明の全ての態様および実施形態は、「含んでなる」、「からなる」、および「から本質的になる」態様および実施形態を含むものと理解される。列挙された構成要素「から本質的になる」方法または組成物は、規定のステップまたは材料、そしてこれらの方法および組成物の基本的および新規特性に実質的に影響を及ぼさないものみを含むものと理解される。
【００４８】
記載される特別な手順、プロトコル、および試薬は、当業者によって使用される文脈に応じて変動することもあるため、本発明は、これらに限定されないものと理解される。
【００４９】
ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ
メバロン酸依存性生合成経路（ＭＶＡ経路）は、全ての高等真核生物および特定の細菌に存在する、主要代謝経路である。タンパク質プレニル化、細胞膜保守、タンパク質固着、およびＮ−グリコシル化などの多様なプロセスで使用される分子を生成するために重要であるのに加えて、メバロン酸経路は、テルペン、テルペノイド、イソプレノイド、およびイソプレン生合成のための基礎原料の役割を果たす、イソプレノイド前駆体分子ＤＭＡＰＰおよびＩＰＰの主要な供給源を提供する。
【００５０】
完全なＭＶＡ経路は、上流および下流経路の２つのグループにさらに分割し得る（図１）。ＭＶＡ経路の上流部分では、（ａ）（ｉ）チオラーゼ活性または（ｉｉ）アセトアセチルＣｏＡシンターゼ活性、（ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性、および（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ酵素活性のいずれかを有するポリペプチドの作用によって、細胞代謝中に生成されたアセチルＣｏＡがメバロン酸に変換される。最初に、アセチルＣｏＡが、チオラーゼまたはアセトアセチルＣｏＡシンターゼ（アセチルＣｏＡおよびマロニルＣｏＡを利用する）の作用によって、アセトアセチルＣｏＡに変換される。次にアセトアセチルＣｏＡは、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの酵素作用によって、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）に変換される。このＣｏＡ誘導体は、ＨＭＧＣｏＡ還元酵素によってメバロン酸に還元され、これはイソプレノイド生成のメバロン酸経路の律速段階である。古典的下流ＭＶＡ経路では、メバロン酸は、次にメバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）作用によって、メバロン酸−５−リン酸（ＰＭ）に変換され、それは引き続いてホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）の酵素活性によって、５−ジホスホメバロン酸（ＤＰＭ）に変換される。最後に、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＤＰＭＤＣ）としてもまた知られている酵素メバロン酸−５−ピロリン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）の活性によって、５−ジホスホメバロン酸からＩＰＰが生成される。「古典的下流メバロン酸経路」または「古典的下流ＭＶＡ経路」という用語は、酵素メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）、およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）によって触媒される、細胞内の一連の反応を指す。
【００５１】
本明細書で提供されるように、メバロン酸がメバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）の作用によってメバロン酸−５−リン酸（ＰＭ）に変換され、引き続いてホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭｅｖＤＣ）の酵素活性によってイソペンテニルリン酸に変換され、イソペンテニルリン酸がイソペンテニルキナーゼ（ＩＰＫ）の酵素活性によって（ＩＰＰ）に変換される、代案の下流ＭＶＡ経路（例えば、メバロン酸一リン酸経路）が同定されている（図２）。「代案の下流メバロン酸経路」または「代案の下流ＭＶＡ経路」という用語は、酵素メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭｅｖＤＣ）、およびイソペンテニルキナーゼ（ＩＰＫ）によって触媒される、細胞内の一連の反応を指す。
【００５２】
したがって特定の実施形態では、本発明の組換え細胞は、メバロン酸一リン酸経路によってイソプレノイド前駆体、イソプレンまたはイソプレノイドを産生する能力を有する組換え細胞であり、組換え細胞は、（ｉ）メバロン酸５−リン酸からイソペンテニルリン酸を合成できるホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸、（ｉｉ）イソペンテニルリン酸からイソペンテニルピロリン酸を合成できるイソペンテニルキナーゼをコードする核酸、（ｉｉｉ）１つまたは複数のＭＶＡポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｖ）宿主細胞内で、アセトアセチルＣｏＡからのイソプレノイド前駆体、イソプレンまたはイソプレノイドの合成を可能にする、イソプレノイド前駆体、またはイソプレンまたはイソプレノイド生合成に関与する１つまたは複数の異種核酸を含んでなる。別の実施形態では、本発明の組換え細胞は、（ｉ）メバロン酸５−ピロリン酸からイソペンテニルリン酸を合成できるホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸、（ｉｉ）イソペンテニルリン酸からイソペンテニルピロリン酸を合成できるイソペンテニルキナーゼをコードする核酸、（ｉｉｉ）１つまたは複数のＭＶＡポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｖ）宿主細胞内で、アセトアセチルＣｏＡからのイソプレノイド前駆体、イソプレンまたはイソプレノイドの合成を可能にする、イソプレノイド前駆体、またはイソプレンまたはイソプレノイド生合成に関与する１つまたは複数の異種核酸を含んでなる、イソプレノイド前駆体、イソプレンまたはイソプレノイドを産生する能力を有する組換え細胞である。別の実施形態では、本発明の組換え細胞は、（ｉ）メバロン酸５−ピロリン酸からイソペンテニルピロリン酸を合成できるホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸、（ｉｉ）イソペンテニルリン酸からイソペンテニルピロリン酸を合成できるイソペンテニルキナーゼをコードする核酸、（ｉｉｉ）１つまたは複数のＭＶＡポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｖ）宿主細胞内で、アセトアセチルＣｏＡからのイソプレノイド前駆体、イソプレンまたはイソプレノイドの合成を可能にする、イソプレノイド前駆体、またはイソプレンまたはイソプレノイド生合成に関与する１つまたは複数の異種核酸を含んでなる、イソプレノイド前駆体、イソプレンまたはイソプレノイドを産生する能力を有する組換え細胞である。
【００５３】
例示的なホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ核酸およびポリペプチド
ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ酵素は、メバロン酸５−リン酸からイソペンテニルリン酸への変換を触媒する。特定の実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼは、メバロン酸５−ピロリン酸からイソペンテニルリン酸への変換を触媒できる。別の実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼは、メバロン酸５−ピロリン酸からイソペンテニルピロリン酸への変換を触媒できる。したがって、理論により拘束されることなく、本明細書に記載されるホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの発現は、炭素源（例えば、炭水化物）から生成されるイソペンテニルリン酸および／またはイソペンテニルピロリン酸の量の増大をもたらし得る。イソペンテニルリン酸は、イソペンテニルピロリン酸に変換し得て、それは、イソプレンを生成するのに使用し得て、またはイソプレノイドを生成するためのイソプレノイド前駆体として使用し得る。したがって炭素源から生成されるこれらの化合物の量が、増大してもよい。代案としては、増大をより高い細胞内濃度に反映させることなく、イソペンテニルリン酸およびイソペンテニルピロリン酸の生成を増大させ得る。特定の実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ反応が起こっているにもかかわらず、細胞内イソペンテニルリン酸およびイソペンテニルピロリン酸濃度は不変であり、または低下することさえある。
【００５４】
例示的なホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ核酸としては、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる（実施例２を参照されたい）。さらに表１は、以本発明の実施形態内で利用してもよい、例示的なホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードしてもよい核酸がある種の、非限定的一覧を提供する。
【００５５】
【表１】
2016511630.tif 000003
【００５６】
【表２】
2016511630.tif 000004
【００５７】
使用し得るその他のホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとしては、ヘルペトシフォン目（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎａｌｅｓ）（例えば、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＡＴＣＣ  ２３７７９）およびアナエロリネア綱（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａｅ）（例えば、アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）などのクロロフレクサス門（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ）のメンバーが挙げられる。これもまた本明細書で提供されるのは、Ｓ３７８Ｐａ３−２と称される、土壌から調製されたメタゲノムライブラリーから単離された、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼである。本明細書で明示的に開示されない限り、Ｓ３７８Ｐａ３−２は、一リン酸デカルボキシラーゼと、一リン酸デカルボキシラーゼがそれに由来する微生物とを記述するのに、区別なく使用される。
【００５８】
Ｓ３７８Ｐａ３−２と称される新規生物は、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性があり、配列番号１８のアミノ酸配列を含んでなる、ポリペプチドを発現する。この生物およびこの生物からの細胞抽出物が、本明細書で開示される方法および組成物で有用であることが、本明細書で検討される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性があるポリペプチド）を発現し得る核酸を含んでなる、単離細胞（例えば、Ｓ３７８Ｐａ３−２細胞）である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性があるポリペプチドをコードする核酸を含んでなる細胞抽出物であり、細胞抽出物は、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性があるポリペプチド（例えば、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性があるポリペプチド）をコードする核酸を含んでなる、単離細胞（例えば、Ｓ３７８Ｐａ３−２細胞）に由来する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性があるポリペプチドを含んでなる細胞抽出物であり、細胞抽出物は、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性があるポリペプチド（例えば、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性があるポリペプチド）をコードする核酸を含んでなる、単離細胞（例えば、Ｓ３７８Ｐａ３−２細胞）に由来する。いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性があるポリペプチドをコードする単離核酸であり、ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列を含んでなる。いくつかの実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸配列は、配列番号１８のアミノ酸配列を含んでなるホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸配列との、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を含んでなる。いくつかの実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸配列は、配列番号１８のアミノ酸配列と、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、配列番号１８のアミノ酸配列（またはそのポリペプチド変異体）を含んでなるポリペプチドをコードする単離核酸は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）である。配列番号１８のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド（またはそのポリペプチド変異体）をコードする単離核酸は、核酸の１つまたは複数のコピーの最適発現のために、適切なベクター（本明細書に記載されるベクターなどの）中に入れ得る。例えば、配列番号１８のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする単離核酸（またはそのポリペプチド変異体）は、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターの下に置き得る。別の例として、配列番号１８のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードする単離核酸（またはそのポリペプチド変異体）は、１つまたは複数のマルチコピープラスミドにクローン化し得て、または宿主細の胞染色体に組み込み得る。宿主細胞は、グラム陽性細菌細胞、グラム陰性細菌細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、植物細胞、藻類細胞、古細菌細胞、または酵母細胞などの本明細書に記載される任意の宿主細胞であり得る。したがって本明細書で提供されるのは、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性があるポリペプチドをコードする核酸を含んでなる組換え細胞であり、ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列またはそのポリペプチド変異体を含んでなる。例えば、組換え細胞は、配列番号１８のアミノ酸を含んでなるポリペプチドをコードする核酸を含んでなり得て、および／または配列番号１８のアミノ酸配列と、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸を含んでなり得る。これもまた本明細書で提供されるのは、配列番号１８のアミノ酸を含んでなる単離ポリペプチドまたはその変異体である。例えば、単離ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸を含んでなり得て、または配列番号１８のアミノ酸配列と、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性があるアミノ酸配列を含んでなり得る。これもまた本明細書で提供されるのは、配列番号１８のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドであり、ポリペプチドは、リンカー（例えば、親和性タグ、ラベルなど）、またはポリペプチドの合成、精製、または同定を助けるその他の配列をさらに含んでなり、ポリペプチドの固体担体への結合を増強し、またはポリペプチドの溶解度を増大させる。例示的なリンカーとしては、ポリヒスチジンタグ（例えば、６ｘＨｉｓタグ）、マルトース結合タンパク質タグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼタグ、フラグエピトープ、ＭＹＣエピトープなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。これもまた本明細書で検討されるのは、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る核酸をコードする細胞（例えば、Ｓ３７８Ｐａ３−２細胞）を培養する方法である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドを発現するのに適した条件下で、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る核酸をコードする細胞（例えば、Ｓ３７８Ｐａ３−２細胞）を培養する方法である。
【００５９】
本発明のいくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、微生物から単離されたホスホメバロン酸デカルボキシラーゼである。いくつかの態様では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼは、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、好気的細菌、嫌気的細菌、好熱性細菌、好冷細菌、好塩性細菌またはラン藻からなる群から単離される。いくつかの態様では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼは、古細菌から単離される。その他の態様では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼは、土壌メタゲノムライブラリーから単離される。いくつかの態様では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼは、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、またはＳ３７８Ｐａ３−２から単離される。
【００６０】
本明細書で提供されるのは、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性があるポリペプチドをコードする核酸である。いくつかの態様では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性があるポリペプチドをコードする核酸配列は、古細菌から単離された核酸配列を含んでなる。さらなる態様では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性があるポリペプチドをコードする核酸配列は、デスルフロコッカス目（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スルフォロブス目（Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ）、サーモプロテウス目（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ケナルカエアレス目（Ｃｅｎａｒｃｈａｅａｌｅｓ）、ニトロソプミラレス目（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌａｌｅｓ）、アーキオグロブス目（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロバクテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノコッカス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、メタノセラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａｌｅｓ）、メタノサルシナ目（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ）、メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノミクロビウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、メタノピラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒａｌｅｓ）、サーモコッカス目（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、サーモプラズマ目（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）、コルアーケオタ門（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ）、およびナノアーケオタ門（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａ）からなる群から選択される古細菌から単離された核酸配列を含んでなる。その他の態様では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性があるポリペプチドをコードする核酸配列は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、またはＳ３７８Ｐａ３−２から単離された核酸配列を含んでなる。その他の態様では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性があるポリペプチドをコードする核酸配列は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、またはＳ３７８Ｐａ３−２から単離されたホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸配列との、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を含んでなる。その他の態様では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１６〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸配列との、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも���５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を含んでなる。その他の態様では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１６〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
【００６１】
これもまた本明細書で提供されるのは、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性があるポリペプチドである。いくつかの態様では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性があるポリペプチドは、古細菌に由来する。さらなる態様では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性があるポリペプチドは、デスルフロコッカス目（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スルフォロブス目（Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ）、サーモプロテウス目（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ケナルカエアレス目（Ｃｅｎａｒｃｈａｅａｌｅｓ）、ニトロソプミラレス目（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌａｌｅｓ）、アーキオグロブス目（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロバクテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノコッカス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、メタノセラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａｌｅｓ）、メタノサルシナ目（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ）、メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノミクロビウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、メタノピラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒａｌｅｓ）、サーモコッカス目（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、サーモプラズマ目（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）、コルアーケオタ門（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ）、およびナノアーケオタ門（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａ）からなる群から選択される古細菌に由来する。その他の態様では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性があるポリペプチドは、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、またはＳ３７８Ｐａ３−２に由来する。いくつかの態様では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性があるポリペプチドは、配列番号１６〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる。本明細書で開示されるホスホメバロン酸デカルボキシラーゼのいずれかの変異体もまた、検討される。いくつかの態様では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性があるポリペプチドは、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、またはＳ３７８Ｐａ３−２から単離されたホスホメバロン酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列との、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を含んでなる。いくつかの態様では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性があるポリペプチドは、配列番号１６〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列との、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少���くとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を含んでなる。
【００６２】
標準法を使用して、ポリペプチドがメバロン酸５−リン酸をイソペンテニルリン酸に変換する能力を測定することで、ポリペプチドが、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するかどうかを判定し得る。ポリペプチドが、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するかどうかを判定する別の方法は、ポリペプチドが、メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルリン酸またはイソペンテニルピロリン酸に変換する能力を測定することである。例えば、反応の基質から生成物への変換は、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）によって検出し得る。別の例示的なアッセイでは、発現停止されたＤＸＰ経路と不活性化された古典的下流ＭＶＡ経路を有するように改変された株を使用して、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性があるポリペプチドを同定し得る。このアッセイでは、ＭＶＫおよびＩＤＩの発現に影響を及ぼすことなく、下流古典的ＭＶＡ経路のＰＭＫおよびＭＶＤが不活性化されて、イソペンテニルキナーゼ活性があるポリペプチドをコードする遺伝子カセット（例えば、Ｍ．ヤンナスキイ（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ＩＰＫ）で置換される。引き続いて改変株は、可能な一リン酸デカルボキシラーゼ活性がある候補ポリペプチドをコードする核酸で形質転換され、ＩＰ補足培地中で増殖される。補足培地中の改変株の増殖は、ＩＰがＩＰＰおよびＤＭＡＰＰに変換されたことを示唆し、候補ポリペプチドが、一リン酸デカルボキシラーゼ活性を有することを立証する。本明細書に記載されるようなホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有すると同定された任意のポリペプチドは、本発明で使用するのに適する。
【００６３】
ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼはまた、タンパク質発現、タンパク質溶解度、および活性をはじめとするが、これに限定されるものではない、生化学的特性に基づいて選択し得る。ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼは、異なるタイプの生物間の多様性（例えば、細菌、古細菌）、所望の種の近縁種（例えば、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）など）、および熱耐性をはじめとするが、これに限定されるものではない、その他の特性に基づいて選択し得る。
【００６４】
本明細書で提供されるように、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼは、イソプレノイド前駆体（例えば、ＩＰＰ）、イソプレン、および／またはイソプレノイドの生成を可能にする。本明細書で提供されるのは、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼを含んでなる組換え宿主であり、細胞は、イソプレノイド前駆体（例えば、ＩＰＰ）、イソプレン、および／またはイソプレノイドの生成について、少なくとも１つの関心のある特性を示す。いくつかの実施形態では、組換え宿主は、イソペンテニルキナーゼをさらに含んでなる。いくつかの態様では、前記少なくとも１つの関心のある特性は、比生産性、収率、力価、および細胞性能指数からなる群から選択されるが、これに限定されるものではない。
【００６５】
特定の実施形態では、本明細書で利用するための、適切なホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとしては、可溶性ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼが挙げられる。タンパク質溶解度を測定するための技術は、当該技術分野で周知であり、本明細書の実施例で開示されるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書で利用するためのホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとしては、全細胞ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼタンパク質の２０％の溶解度があるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼタンパク質溶解度は、全細胞ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼタンパク質の約５％〜約１００％、約１０％〜約１００％、約１５％〜約１００％、約２０％〜約１００％、約２５％〜約１００％、約３０％〜約１００％、約３５％〜約１００％、約４０％〜約１００％、約４５％〜約１００％、約５０％〜約１００％、約５５％〜約１００％、約６０％〜約１００％、約６５％〜約１００％、約７０％〜約１００％、約７５％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約８５％〜約１００％、または約９０％〜約１００％のいずれかである。いくつかの実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼタンパク質の溶解度は、全細胞ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼタンパク質の約５％〜約１００％である。いくつかの実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼタンパク質の溶解度は、全細胞ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼタンパク質の５％〜１００％である。いくつかの実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼタンパク質の溶解度は、全細胞ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼタンパク質の約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０％のいずれか未満であるが、約５％以上である。いくつかの実施形態では、溶解度は、全細胞ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼタンパク質の約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５％のいずれかを超える。
【００６６】
所望の動力学的特徴があるホスホメバロン酸デカルボキシラーゼは、イソプレンの生成を増大させる。動態特性としては、比活性、Ｋｃａｔ、Ｋｉ、およびＫｍが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの態様では、ｋｃａｔは、少なくとも約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、または５．０である。いくつかの態様では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼは、少なくとも約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、または５．０のｋｃａｔで、ホスホメバロン酸の脱炭酸を触媒する。その他の態様では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼは、少なくとも約０．００１、０．００５、０．０１０、０．０１５、０．０２０、０．０２５、０．０３０、０．０３５、０．０４０、０．０４５、０．０５０、０．０５５、０．０６０、０．０６５、０．０７０、０．０７５、０．０８０、０．０８５、０．０９０、０．０９５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、または５．０のｋｃａｔで、ジホスホメバロン酸の脱炭酸を触媒する。いくつかの態様では、Ｋｍは、少なくとも約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１６、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３０．５、３１、３１．５、３２、３２．５、３３、３３．５、３４、３４．５、３５、３５．５、３６、３６．５、３７、３７．５、３８、３８．５、３９、３９．５、４０、４０．５、４１、４１．５、４２、４２．５、４３、４３．５、４４、４４．５、４５、４５．５、４６、４６．５、４７、４７．５、４８、４８．５、４９、４９．５、５０、５０．５、５１、５１．５、５２、５２．５、５３、５３．５、５４、５４．５、５５、５５．５、５６、５６．５、５７、５７．５、５８、５８．５、５９、５９．５、６０、６０．５、６１、６１．５、６２、６２．５、６３、６３．５、６４、６４．５、６５、６５．５、６６、６６．５、６７、６７．５、６８、６８．５、６９、６９．５、または７０である。いくつかの態様では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼは、少なくとも約２．５、３、３．５、４、４．５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１６、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３０．５、３１、３１．５、３２、３２．５、３３、３３．５、３４、３４．５、３５、３５．５、３６、３６．５、３７、３７．５、３８、３８．５、３９、３９．５、４０、４０．５、４１、４１．５、４２、４２．５、４３、４３．５、４４、４４．５、４５、４５．５、４６、４６．５、４７、４７．５、４８、４８．５、４９、４９．５、５０、５０．５、５１、５１．５、５２、５２．５、５３、５３．５、５４、５４．５、５５、５５．５、５６、５６．５、５７、５７．５、５８、５８．５、５９、５９．５、６０、６０．５、６１、６１．５、６２、６２．５、６３、６３．５、６４、６４．５、６５、６５．５、６６、６６．５、６７、６７．５、６８、６８．５、６９、６９．５、または７０のｋＭで、ホスホメバロン酸の脱炭酸を触媒する。その他の態様では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼは、少なくとも約２．５、３、３．５、４、４．５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１６、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３０．５、３１、３１．５、３２、３２．５、３３、３３．５、３４、３４．５、３５、３５．５、３６、３６．５、３７、３７．５、３８、３８．５、３９、３９．５、４０、４０．５、４１、４１．５、４２、４２．５、４３、４３．５、４４、４４．５、４５、４５．５、４６、４６．５、４７、４７．５、４８、４８．５、４９、４９．５、５０、５０．５、または５１のｋｃａｔで、ジホスホメバロン酸の脱炭酸を触媒する。
【００６７】
関心のある特性としては、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドを含まない組換え細胞と比較した、細胞内活性、比生産性、収率、および細胞性能指数の増大が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、比生産性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。一実施形態では、イソプレン比生産性は、約１５ｍｇ／Ｌ／ＯＤ／ｈｒである。いくつかの実施形態では、イソプレン収率は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。別の実施形態では、細胞性能指数は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【００６８】
イソペンテニルキナーゼポリペプチド、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチド、およびＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドを発現する組換え細胞
本明細書で提供されるように、代案の下流ＭＶＡ経路（例えば、メバロン酸一リン酸経路）が同定され、その中ではホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭｅｖＤＣ）が、メバロン酸５−リン酸および／またはメバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルリン酸に変換する。イソプレン、イソプレノイド前駆体、および／またはイソプレノイドの生成のために、イソペンテニルキナーゼ（ＩＰＫ）が、イソペンテニルキナーゼ（ＩＰＫ）によるイソペンテニルリン酸からイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）への変換を触媒する。したがって、代案の下流ＭＶＡ経路からのホスホメバロン酸デカルボキシラーゼおよびイソペンテニルキナーゼの使用は、古典的下流ＭＶＡ経路のＰＭＫおよびＭＶＤによって媒介される酵素段階をバイパスし得る。古典的下流ＭＶＡ経路のＰＭＫおよびＭＶＤによって媒介される各酵素段階は、ＡＴＰを利用する。代案の下流ＭＶＡ経路では、ＩＰＫによって媒介される酵素段階は、ＡＴＰを利用する。理論により拘束されることなく、代案の下流ＭＶＡ経路中でＰＭｅｖＤＣによって媒介される酵素段階は、ＡＴＰ利用をもたらさず、したがって古典的下流ＭＶＡ経路と比較して、代案の下流ＭＶＡ経路を通じたメバロン酸５−リン酸からのイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）生成中に消費されるＡＴＰの総量が、低下する可能性がある。
【００６９】
したがって特定の実施形態では、本発明の組換え細胞は、代案の下流ＭＶＡ経路を通じて、イソプレノイド前駆体、イソプレンまたはイソプレノイドを産生する能力を有する組換え細胞であり、組換え細胞は、（ｉ）メバロン酸５−リン酸からイソペンテニルリン酸を合成できるホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸、（ｉｉ）イソペンテニルリン酸からイソペンテニルピロリン酸を合成できるイソペンテニルキナーゼをコードする核酸、（ｉｉｉ）１つまたは複数のＭＶＡポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｖ）宿主細胞内で、アセトアセチルＣｏＡからのイソプレノイド前駆体、イソプレンまたはイソプレノイドの合成を可能にする、イソプレノイド前駆体、またはイソプレンまたはイソプレノイド生合成に関与する１つまたは複数の異種核酸を含んでなる。別の実施形態では、本発明の組換え細胞は、（ｉ）メバロン酸５−ピロリン酸からイソペンテニルリン酸を合成できるホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸、（ｉｉ）イソペンテニルリン酸からイソペンテニルピロリン酸を合成できるイソペンテニルキナーゼをコードする核酸、（ｉｉｉ）１つまたは複数のＭＶＡポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｖ）宿主細胞内で、アセトアセチルＣｏＡからのイソプレノイド前駆体、イソプレンまたはイソプレノイドの合成を可能にする、イソプレノイド前駆体、またはイソプレンまたはイソプレノイド生合成に関与する１つまたは複数の異種核酸を含んでなる、イソプレノイド前駆体、イソプレンまたはイソプレノイドを産生する能力を有する組換え細胞である。別の実施形態では、本発明の組換え細胞は、（ｉ）メバロン酸５−ピロリン酸からイソペンテニルピロリン酸を合成できるホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸、（ｉｉ）イソペンテニルリン酸からイソペンテニルピロリン酸を合成できるイソペンテニルキナーゼをコードする核酸、（ｉｉｉ）１つまたは複数のＭＶＡポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｖ）宿主細胞内で、アセトアセチルＣｏＡからのイソプレノイド前駆体、イソプレンまたはイソプレノイドの合成を可能にする、イソプレノイド前駆体、またはイソプレンまたはイソプレノイド生合成に関与する１つまたは複数の異種核酸を含んでなる、イソプレノイド前駆体、イソプレンまたはイソプレノイドを産生する能力を有する組換え細胞である。本明細書の実施形態のいくつかでは、イソプレノイド前駆体、イソプレンまたはイソプレノイドを生成するための、代案の下流ＭＶＡ経路によって利用されるＡＴＰの総量は、イソプレノイド前駆体、イソプレン、またはイソプレノイドを生成するための、古典的下流ＭＶＡ経路によって利用されるＡＴＰの総量と比較して低下する。いくつかの実施形態では、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）からメバロン酸５−リン酸を生成するための、代案の下流ＭＶＡ経路によって利用されるＡＴＰの総量は、メバロン酸５−リン酸からイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）を生成するための、古典的下流ＭＶＡ経路によって利用されるＡＴＰの総量と比較して、正味１ＡＴＰ分低下した。
【００７０】
本明細書で開示される任意のホスホメバロン酸デカルボキシラーゼを、本発明で使用し得ることが検討される。したがって、特定の態様では、本明細書で検討されるホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸のいずれか、または本明細書で検討されるホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性があるポリペプチドのいずれかを、本明細書に記載される方法のいずれかの組換え細胞内で発現させ得る。ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸は、組換え細胞内で、マルチコピープラスミド上で発現させ得る。プラスミドは、高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド、または中程度コピー数プラスミドであり得る。代案としては、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸は、宿主細胞の染色体に組み込み得る。プラスミド上の、または宿主細胞の染色体に組み込まれた部分としての双方の、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸の異種性発現で、核酸の発現は、誘導性プロモーターまたは構成的発現プロモーターのどちらかによって駆動され得る。プロモーターは、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸発現の強力な駆動機構であり得て、それは発現の弱い駆動機構であり得て、またはそれは発現の中程度の駆動機構であり得る。いくつかの実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、異種核酸である。いくつかの実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、内在性核酸である。
【００７１】
上流ＭＶＡ経路核酸およびポリペプチド
ＭＶＡ経路の上流部分は、（ａ）（ｉ）チオラーゼ活性または（ｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡ活性、（ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素、および（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ酵素活性のいずれかを有するポリペプチドの作用によって、メバロン酸に変換される最初の基質として、細胞代謝中に生じるアセチルＣｏＡを使用する。最初に、アセチルＣｏＡが、チオラーゼまたはアセトアセチルＣｏＡシンターゼ（アセチルＣｏＡおよびマロニルＣｏＡを利用する）の作用によって、アセトアセチルＣｏＡに変換される。次に、アセトアセチルＣｏＡは、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの酵素作用によって、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）に変換される。このＣｏＡ誘導体は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素によってメバロン酸に還元され、これはイソプレノイド生成のメバロン酸経路の律速段階である。
【００７２】
上流ＭＶＡ経路ポリペプチドの非限定的例としては、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ）ポリペプチド、アセトアセチルＣｏＡシンターゼポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素）ポリペプチドが挙げられる。上流ＭＶＡ経路ポリペプチドとしては、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。例示的な上流ＭＶＡ経路核酸としては、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なＭＶＡ経路ポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する、天然ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。したがって、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする任意の遺伝子を、本発明で使用し得ることが、本明細書で検討される。
【００７３】
特定の実施形態では、Ｌ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）および／またはＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）からのｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子の様々な選択肢が、単独で、または上流ＭＶＡ経路からの１つまたは複数のタンパク質をコードするその他のｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子との組み合わせで、本発明の範囲内で検討される。別の実施形態では、本発明の範囲内で、（ｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチドおよび３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素）ポリペプチドをコードする１つまたは複数のその他の遺伝子との組み合わせで、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子が検討される。したがって、特定の態様では、本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、本明細書で検討される遺伝子組み合わせのいずれかを組換え細胞内で発現させ得る。
【００７４】
本明細書で使用し得る上流ＭＶＡ経路ポリペプチドの追加的な非限定的例は、国際公開第２００９／０７６６７６号パンフレット；国際公開第２０１０／００３００７号パンフレット、および国際公開第２０１０／１４８１５０号パンフレットに記載される。
【００７５】
特定の実施形態では、Ｌ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）および／またはＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）からのｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子の様々な選択肢が、単独で、または上流ＭＶＡ経路からの１つまたは複数のタンパク質をコードするその他のｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子との組み合わせで、本発明の範囲内で検討される。Ｌ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、およびＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）中で、ｍｖａＥ遺伝子は、チオラーゼおよびＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性の双方を持つポリペプチドをコードする。事実上、ｍｖａＥ遺伝子産物は、真正細菌中で発見された最初のＩＰＰ生合成の二機能性酵素、および天然で別のタンパク質に融合するＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の最初の例に相当する（Ｈｅｄｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００２年４月；１８４（８）：２１１６−２１２２）。他方、ｍｖａＳ遺伝子は、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【００７６】
したがって、組換え細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、Ｌ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）および／またはＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）からの１つまたは複数のｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子を発現して、メバロン酸を産生するように改変し得る。１つまたは複数のｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子は、マルチコピープラスミド上で発現させ得る。プラスミドは、高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド、または中程度コピー数プラスミドであり得る。代案としては、１つまたは複数のｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子は、宿主細胞の染色体に組み込み得る。プラスミド上の、または宿主細胞の染色体に組み込まれた部分としての双方の、１つまたは複数のｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子の異種性発現で、遺伝子の発現は、誘導性プロモーターまたは構成的発現プロモーターのどちらかによって駆動され得る。プロモーターは、１つまたは複数のｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子発現の強力な駆動機構であり得て、それは発現の弱い駆動機構であり得て、またはそれは発現の中程度の駆動機構であり得る。
【００７７】
例示的なｍｖａＥポリペプチドおよび核酸
ｍｖａＥ遺伝子は、チオラーゼおよびＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性の双方を持つポリペプチドをコードする。ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるポリペプチドのチオラーゼ活性が、アセチルＣｏＡをアセトアセチルＣｏＡに変換するのに対し、ポリペプチドのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の酵素活性は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡをメバロン酸に変換する。例示的なｍｖａＥポリペプチドおよび核酸としては、ｍｖａＥポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。
【００７８】
変異ｍｖａＥポリペプチドとしては、ｍｖａＥポリペプチド活性（すなわちアセチルＣｏＡをアセトアセチルＣｏＡに変換する能力、ならびに３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡをメバロン酸に変換する能力）を保ちながら、その中で１つまたは複数のアミノ酸残基がアミノ酸置換を受けたものが挙げられる。アミノ酸置換は、保存的または非保存的であり得て、このような置換アミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされ得て、またはコードされ得ない。標準的な２０のアミノ酸「アルファベット」が、それらの側鎖類似性に基づいて、化学物質ファミリーに分類されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のあるアミノ酸が挙げられる。「保存的アミノ酸置換」は、その中でアミノ酸残基が、化学的に類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである（すなわち塩基性側鎖を有するアミノ酸が、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸で置換される）。「非保存的アミノ酸置換」は、その中でアミノ酸残基が、化学的に異なる側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである（すなわち塩基性側鎖を有するアミノ酸が、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸で置換される）。
【００７９】
ｍｖａＥポリペプチド内にアミノ酸置換を導入して、分子の機能性を改善し得る。例えば、基質に対するｍｖａＥポリペプチドの結合親和性を増大させ、またはアセチルＣｏＡをアセトアセチルＣｏＡに変換する能力および／または３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡをメバロン酸に変換する能力を改善するアミノ酸置換をｍｖａＥポリペプチドに導入し得る。いくつかの態様では、変異ｍｖａＥポリペプチドは、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含有する。
【００８０】
一態様では、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン、および／またはイソプレノイドを生成するために、分解されないまたは分解を起こしにくいｍｖａＥタンパク質を使用し得る。使用し得る、分解されないまたは分解を起こしにくいｍｖａＥの遺伝子産物の例としては、生物Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、Ｅ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、およびＬ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）からのものが挙げられるが、これに限定されるものではない。当業者は、任意の標準的分子生物学的技術によって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）中でｍｖａＥタンパク質を発現させて、断片の不在を探し得る。例えば、断片の不在は、Ｈｉｓタグ媒介精製に続いて、Ｓａｆｅｓｔａｉｎ染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で同定し得て、またはメバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体、またはイソプレノイド産生大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１内で発現される場合は、本明細書に記載される検出方法を使用して同定し得る。
【００８１】
Ｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００２年４月；１８４（８）：２１１６−２１２２）に記載されるものなどの標準法を使用して、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼならびにＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を測定することで、ポリペプチドがｍｖａＥ活性を有するかどうかを判定し得る。例示的なアッセイでは、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ活性が、分光光度計によって測定され、アセトアセチルＣｏＡの形成またはチオ開裂に伴う３０２ｎｍにおける吸光度の変化が、モニターされる。アセトアセチルＣｏＡの合成を判定するための各反応の標準アッセイ条件は、１ｍＭのアセチルＣｏＡ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのトリス、ｐＨ１０．５であり、反応は酵素の添加によって開始される。アッセイは、２００μｌの最終容量を採用し得る。アッセイでは、１酵素単位（ｅｕ）が、１分間の１μｍｏｌアセトアセチルＣｏＡ中の合成またはチオ開裂に相当する。別の例示的なアッセイでは、分光光度計によって、３４０ｎｍにおけるＮＡＤＰ（Ｈ）の出現または消失によって、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性をモニターし得る。ＨＭＧ−ＣｏＡのメバロン酸への還元脱アシル化を示すために測定される各反応の標準アッセイ条件は、０．４ｍＭのＮＡＤＰＨ、１．０ｍＭの（Ｒ，Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡ、１００ｍＭのＫＣｌ、および１００ｍＭのＫｘＰＯ４、ｐＨ６．５である。アッセイは、２００μｌの最終容量を採用する。反応は、酵素を添加することで開始される。アッセイでは、１ｅｕは、１分間の１μｍｏｌのＮＡＤＰ（Ｈ）中の代謝回転に相当する。これは、０．５μｍｏｌのＨＭＧ−ＣｏＡまたはメバロン酸の代謝回転に相当する。
【００８２】
代案としては、組換え細胞内のメバロン酸の生成は、制限なしに、ガスクロマトグラフィー（米国特許出願公開第２００５／０２８７６５５Ａ１号明細書を参照されたい）またはＨＰＬＣ（米国特許出願公開第２０１１／０１５９５５７号明細書Ａ１を参照されたい）によって測定し得る。例示的なアッセイとして、１つまたは複数の抗生物質で補足されたＬＢブロスを含有する振盪管に、培養物を接種して、３４℃、２５０ｒｐｍで、１４時間培養し得る。次に、１％グルコース、０．１％酵母抽出物、および２００μＭのＩＰＴＧで補足されたＴＭ３培地を含有するウェルプレート内で、培養物を０．２の最終ＯＤに希釈し得る。次にプレートをＢｒｅａｔｈ  Ｅａｓｉｅｒメンブレン（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で密封し、振盪機／インキュベーター内で、３４℃、６００ｒｐｍで２４時間培養する。次に１ｍＬの各培養物を３，０００×ｇで５分間遠心分離する。次に上清を２０％硫酸に添加して、氷上で５分間インキュベートする。次に混合物を３０００×ｇで５分間遠心分離して、ＨＰＬＣ分析のために上清を収集する。サンプル中のメバロン酸濃度は、メバロン酸（Ｓｉｇｍａ）の標準曲線と比較することで判定される。グルコース濃度は、当該技術分野で公知のいずれかの方法に従って、グルコースオキシダーゼアッセイを実施することでさらに測定し得る。ＨＰＬＣを使用して、各サンプルの屈折率応答と、既知濃度の様々なメバロン酸を含有する溶液を通過させて得られる検量線とを比較することにより、メバロン酸レベルを定量化し得る。
【００８３】
例示的なｍｖａＥ核酸としては、ｍｖａＥポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なｍｖａＥポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。例示的なｍｖａＥ核酸としては、例えば、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）ＤＳＭ  ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＥＧ２、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、および／またはエンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）から単離されたｍｖａＥ核酸が挙げられる。リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）ＤＳＭ  ２０６０１  ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号７と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号８と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＥＧ２ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号９と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号１０と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるｍｖａＥ核酸は、以前、メバロン酸を産生する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で開示されたｍｖａＥ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る（米国特許出願公開第２００５／０２８７６５５Ａ１号明細書；Ｔａｂａｔａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｓ．−Ｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２６：１４８７−１４９１，２００４を参照されたい）。
【００８４】
リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）ＤＳＭ  ２０６０１  ｍｖａＥの配列
【化１】
2016511630.tif 000005
【００８５】
エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）ｍｖａＥの配列
【化２】
2016511630.tif 000006
【００８６】
エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＥＧ２  ｍｖａＥの配列
【化３】
2016511630.tif 000007
【００８７】
エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）ｍｖａＥの配列
【化４】
2016511630.tif 000008
【００８８】
ｍｖａＥ核酸は、組換え細胞内で、マルチコピープラスミド上で発現させ得る。プラスミドは、高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド、または中程度コピー数プラスミドであり得る。代案としては、ｍｖａＥ核酸は、宿主細胞の染色体に組み込み得る。プラスミド上の、または宿主細胞の染色体に組み込まれた部分としての双方の、ｍｖａＥ核酸の異種性発現で、核酸の発現は、誘導性プロモーターまたは構成的発現プロモーターのどちらかによって駆動され得る。プロモーターは、ｍｖａＥ核酸発現の強力な駆動機構であり得て、それは発現の弱い駆動機構であり得て、またはそれは発現の中程度の駆動機構であり得る。
【００８９】
例示的なｍｖａＳポリペプチドおよび核酸
ｍｖａＳ遺伝子は、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を持つポリペプチドをコードする。このポリペプチドは、アセトアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）に変換し得る。例示的なｍｖａＳポリペプチドおよび核酸としては、ｍｖａＳポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。
【００９０】
変異ｍｖａＳポリペプチドとしては、ｍｖａＳポリペプチド活性（すなわちアセトアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡに変換する能力）を保ちながら、その中で１つまたは複数のアミノ酸残基がアミノ酸置換を受けたものが挙げられる。ｍｖａＳポリペプチドにアミノ酸置換を導入して、分子機能性を改善し得る。例えば、ｍｖａＳポリペプチドの基質に対する結合親和性を増大させ、またはアセトアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡに変換する能力を改善するアミノ酸置換を、ｍｖａＳポリペプチドに導入し得る。いくつかの態様では、変異ｍｖａＳポリペプチドは、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含有する。
【００９１】
Ｑｕａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，１９８９，２６２：１５９−１６４）に記載されるものなどの標準法を使用して、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を測定することで、ポリペプチドがｍｖａＳ活性を有するかどうかを判定し得る。例示的なアッセイでは、３０３ｎｍにおける吸光度の変化をモニターすることで、アセトアセチルＣｏＡのエノール形態の消失を分光光度的に測定することで、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性をアッセイし得る。３０℃で、５０ｍｍのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、および０．２ｍＭのジチオスレイトールを含有する、標準１ｍｌアッセイシステム；５ｍＭ−アセチルリン酸、１０，Ｍアセトアセチル−ＣｏＡ、および５μｌの抽出物サンプルを添加し得て、アセチルＣｏＡ（１００μＭ）および１０単位のＰＴＡの同時添加がそれに続く。次にＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性をアセチルＣｏＡ添加前後の速度差として測定する。使用された条件下（ｐＨ８．０、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ２）におけるアセトアセチルＣｏＡの吸収係数は、１２．２×１０３Ｍ−１ｃｍ−１である。定義上、１単位の酵素活性は、１分あたり１μｍｏｌのアセトアセチルＣｏＡの変換を引き起こす。
【００９２】
代案としては、組換え細胞内のメバロン酸の生成は、制限なしに、ガスクロマトグラフィー（米国特許出願公開第２００５／０２８７６５５Ａ１号明細書を参照されたい）またはＨＰＬＣ（米国特許出願公開第２０１１／０１５９５５７号明細書Ａ１を参照されたい）によって測定し得る。例示的なアッセイとして、培養物を、１つまたは複数の抗生物質で補足されたＬＢブロスを含有する振盪管に接種して、３４℃、２５０ｒｐｍで、１４時間培養し得る。次に、１％グルコース、０．１％酵母抽出物、および２００μＭのＩＰＴＧで補足されたＴＭ３培地を含有するウェルプレート内で、培養物を０．２の最終ＯＤに希釈し得る。次に、プレートをＢｒｅａｔｈ  Ｅａｓｉｅｒメンブレン（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で密封し、振盪機／インキュベーター内で、３４℃、６００ｒｐｍで２４時間培養する。次に、１ｍＬの各培養物を３，０００×ｇで５分間遠心分離する。次に、上清を２０％硫酸に添加して、氷上で５分間インキュベートする。次に、混合物を３０００×ｇで５分間遠心分離して、ＨＰＬＣ分析のために上清を収集する。サンプル中のメバロン酸濃度は、メバロン酸（Ｓｉｇｍａ）の標準曲線と比較することで判定される。グルコース濃度は、当該技術分野で公知のいずれかの方法に従って、グルコースオキシダーゼアッセイを実施することでさらに測定し得る。ＨＰＬＣを使用して、各サンプルの屈折率応答と、既知濃度の様々なメバロン酸を含有する溶液を通過させて得られる検量線とを比較することにより、メバロン酸レベルを定量化し得る。
【００９３】
例示的なｍｖａＳ核酸としては、ｍｖａＳポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なｍｖａＳポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。例示的なｍｖａＳ核酸としては、例えば、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）ＤＳＭ  ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＥＧ２、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、および／またはエンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）から単離されたｍｖａＳ核酸が挙げられる。リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）ＤＳＭ  ２０６０１  ｍｖａＳ遺伝子によってコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号１１と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）ｍｖａＳ遺伝子によってコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号１２と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＥＧ２  ｍｖａＳ遺伝子によってコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号１３と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）ｍｖａＳ遺伝子によってコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号１４と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）ｍｖａＳ遺伝子によってコードされるｍｖａＳ核酸は、以前、メバロン酸を産生する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で開示されたｍｖａＥ遺伝子と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る（米国特許出願公開第２００５／０２８７６５５Ａ１号明細書；Ｔａｂａｔａ、Ｋ．ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｓ．−Ｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２６：１４８７−１４９１，２００４を参照されたい）。
【００９４】
リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）ＤＳＭ  ２０６０１  ｍｖａＳの配列
【化５】
2016511630.tif 000009
【００９５】
エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）ｍｖａＳの配列
【化６】
2016511630.tif 000010
【００９６】
エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＥＧ２  ｍｖａＳの配列
【化７】
2016511630.tif 000011
【００９７】
エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）ｍｖａＳの配列
【化８】
2016511630.tif 000012
【００９８】
ｍｖａＳ核酸は、組換え細胞内で、マルチコピープラスミド上で発現させ得る。プラスミドは、高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド、または中程度コピー数プラスミドであり得る。代案としては、ｍｖａＳ核酸は、宿主細胞の染色体に組み込み得る。プラスミド上の、または宿主細胞の染色体に組み込まれた部分としての双方の、ｍｖａＳ核酸の異種性発現で、核酸の発現は、誘導性プロモーターまたは構成的発現プロモーターのどちらかによって駆動され得る。プロモーターは、ｍｖａＳ核酸発現の強力な駆動機構であり得て、それは発現の弱い駆動機構であり得て、またはそれは発現の中程度の駆動機構であり得る。
【００９９】
アセトアセチルＣｏＡシンターゼ核酸およびポリペプチド
アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子（別名ｎｐｈＴ７）は、マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有して、２つのアセチルＣｏＡ分子からアセトアセチルＣｏＡを合成する最小の活性（例えば、皆無の活性）を有する酵素をコードする遺伝子である。ｎｐｈＴ７に関する教示については、例えば、その内容を本明細書に明示的に援用する、Ｏｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  Ｖｏｌ  １０７，Ｎｏ．２５，ｐｐ．１１２６５−１１２７０（２０１０）を参照されたい。ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の放線菌ＣＬ１９０株からのアセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、日本国特開２００８−６１５０６号公報Ａおよび米国特許出願公開第２０１０／０２８５５４９号明細書に記載される。
【０１００】
本明細書に記載されるいずれかの態様または実施形態において、マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する能力を有する酵素を使用し得る。このような酵素の非限定的例は、本明細書に記載される。本明細書に記載される特定の実施形態では、マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有する、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の放線菌に由来するアセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝を使用し得る。このようなアセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子の一例は、配列番号１５のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子である。このようなタンパク質は、マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有するアセトアセチルＣｏＡシンターゼに対応する配列番号１５のアミノ酸配列を有し、２つのアセチルＣｏＡ分子からアセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有しない。
【０１０１】
アセトアセチルＣｏＡシンターゼの配列
【化９】
2016511630.tif 000013
【０１０２】
ポリペプチドのアセトアセチルＣｏＡシンターゼ活性は、下述するように評価し得る。具体的には、評価されるポリペプチドをコードする遺伝子を、その中で遺伝子が発現し得るように、最初に宿主細胞に導入し、クロマトグラフィーなどの技術によるタンパク質の精製がそれに続く。評価される得られたタンパク質含有する緩衝液に、基質としてマロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡを添加し、例えば、所望の温度（例えば、１０℃〜６０℃）での培養がそれに続く。反応完了後、失われた基質量および／または生成された生成物量（アセトアセチルＣｏＡ）を判定する。したがって試験されるタンパク質が、マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有するかどうかを評価し、合成程度を評価することが可能である。このような場合、評価される得られたタンパク質を含有する緩衝液に、基質としてアセチルＣｏＡのみを入れて、失われた基質量および／または生成された生成物量を同様に判定することで、タンパク質が２つのアセチルＣｏＡ分子から、アセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有するかどうかを調べることが可能である。
【０１０３】
古典的および代案の下流ＭＶＡ経路核酸およびポリペプチド
本明細書で提供されるように、古典的下流メバロン酸生合成経路は、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）、およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）を含んでなる。これもまた本明細書で提供されるように、代案の下流ＭＶＡ経路は、古典的下流ＭＶＫポリペプチドを利用し、したがってメバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭｅｖＤｃ）、およびイソペンテニルキナーゼ（ＩＰＫ）を含んでなる。いくつかの態様では、古典的下流ＭＶＡ経路は、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）をさらに含んでなり得る。いくつかの態様では、代案の下流ＭＶＡ経路は、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）をさらに含んでなり得る。代案の下流ＭＶＡ経路および古典的下流ＭＶＡ経路の双方で使用されるＭＶＫポリペプチドは、メタノサルシナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）に、より具体的にはメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）に由来し得る。いくつかの実施形態では、ＭＶＫポリペプチドは、Ｍ．ブルトニイ（Ｍ．ｂｕｒｔｏｎｉｉ）に由来し得る。下流ＭＶＡ経路ポリペプチドの追加的な例は、ＭＶＫポリペプチドおよびＭＶＫポリペプチド変異体に関して、その内容全体を明示的に参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１０／００８６９７８号明細書にある。
【０１０４】
好ましい実施形態では、本明細書で提供される細胞は、１つまたは複数の上流ＭＶＡ経路ポリペプチド、および１つまたは複数の代案の下流ＭＶＡ経路ポリペプチドを含んでなる。代案のより下流のＭＶＡ経路のポリペプチドは、（ａ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する；（ｂ）メバロン酸５−リン酸をイソペンテニルリン酸に変換する；（ｃ）メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルリン酸に変換する；（ｄ）メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する；および（ｅ）イソペンテニルリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する、任意の酵素であり得る。好ましい実施形態では、代案のより下流のＭＶＡ経路のポリペプチドは、（ａ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する；（ｂ）メバロン酸５−リン酸をイソペンテニルリン酸に変換する；および（ｃ）イソペンテニルリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する、任意の酵素であり得る。より具体的には、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素は、Ｍ．マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）メバロン酸キナーゼ、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ＣＬ１９０メバロン酸キナーゼポリペプチド、およびＭ．ブルトニイ（Ｍ．Ｂｕｒｔｏｎｉｉ）メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群に由来し得る。別の態様では、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素は、Ｍ．マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）メバロン酸キナーゼである。いくつかの態様では、メバロン酸５−リン酸をイソペンテニルリン酸に変換する酵素は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチド、アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチド、およびＳ３７８Ｐａ３−２ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドからなる群に由来し得る。別の態様では、イソペンテニルリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）イソペンテニルキナーゼポリペプチド、メタノカルドコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）イソペンテニルキナーゼポリペプチド、およびメタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）イソペンテニルキナ��ゼポリペプチドからなる群に由来し得る。
【０１０５】
本明細書に記載される細胞のいずれかは、ＭＶＫ核酸（例えば、ＭＶＫポリペプチドをコードする内在性または異種核酸）を含んでなり得る。いくつかの態様では、ＭＶＫ核酸は、Ｍ．マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス・サケイ（ＬａｃｔｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）、酵母、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ＣＬ１９０、およびＭ．ブルトニイ（Ｍ．Ｂｕｒｔｏｎｉｉ）からなる群に由来する。本明細書に記載される細胞のいずれかは、ＰＭｅｖＤＣ核酸（例えば、ＰＭｅｖＤＣポリペプチドをコードする内在性または異種核酸）を含んでなり得る。いくつかの態様では、ＰＭｅｖＤＣ核酸は、古細菌に由来し得る。いくつかの態様では、ＰＭｅｖＤＣ核酸は、ヘルペトシフォン属（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ）に由来し得る。いくつかの態様では、ＰＭｅｖＤＣ核酸は、ヘルペトシフォン・アウランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、またはＳ３７８Ｐａ３−２からなる群に由来する。本明細書に記載される細胞のいずれかは、ＩＰＫ核酸（例えば、ＩＰＫポリペプチドをコードする内在性または異種核酸）を含んでなり得る。いくつかの態様では、ＩＰＫ核酸は、古細菌に由来し得る。いくつかの態様では、ＩＰＫ核酸は、メタノカルドコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノブレビバクター属（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）、およびヘルペトシフォン属（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ）からなる群から選択される属に由来し得る。いくつかの態様では、ＩＰＫ核酸は、ヘルペトシフォン・アウランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、メタノカルドコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、またはメタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）に由来する。
【０１０６】
一態様では、本明細書に記載される細胞のいずれかは、ＰＭＫポリペプチドをコードする核酸を含んでなり得る。ＰＭＫをコードする核酸は、異種核酸または内在性核酸であり得る。別の態様では、本明細書に記載される細胞のいずれかは、ＭＶＤポリペプチドをコードする核酸を含んでなり得る。ＭＶＤをコードする核酸は、異種核酸または内在性核酸であり得る。場合によっては、ＭＶＫ、ＰＭｅｖＤＣ、およびＩＰＫ遺伝子の発現がある細胞内の内在性ＰＭＫ遺伝子および／または内在性ＭＶＤ遺伝子の活性を弱力化することは、弱力化された内在性ＰＭＫ遺伝子および／または内在性ＭＶＤ遺伝子発現を有しない細胞と比較して、代案の下流ＭＶＡ経路内へのより多くの炭素流をもたらす。いくつかの態様では、ＰＭＫおよび／またはＭＶＤの活性は、内在性ＰＭＫ遺伝子および／または内在性ＭＶＤ遺伝子活性の弱力化によって調節される。いくつかの態様では、内在性ＰＭＫ遺伝子および／または内在性ＭＶＤ遺伝子の欠失によって、内在性ＰＭＫおよび／または内在性ＭＶＤ遺伝子発現が弱められる。いくつかの態様では、内在性ＰＭＫ遺伝子および／または内在性ＭＶＤ遺伝子の変異によって、内在性ＰＭＫおよび／または内在性ＭＶＤ遺伝子発現が弱められる。本明細書で提供される態様のいずれかのいくつかの態様では、細胞は、弱力化された内在性ＰＭＫ遺伝子および／または内在性ＭＶＤ遺伝子発現を有しない微生物と比較して、低下した量のメバロン酸５−ピロリン酸を産生する。本明細書で提供される態様のいずれかのいくつかの態様では、内在性ＰＭＫ遺伝子および／または内在性ＭＶＤ遺伝子活性の弱力化は、弱力化された内在性ＰＭＫ遺伝子および／または内在性ＭＶＤ遺伝子発現を有しない微生物と比較して、代案の下流ＭＶＡ経路内へのより多くの炭素流をもたらす。その他の態様では、本明細書の細胞のいずれかは、ＰＭＫポリペプチドおよび／またはＭＶＤポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなる。場合によっては、ＭＶＫ、ＰＭｅｖＤＣ、およびＩＰＫ遺伝子の発現がある細胞内の異種ＰＭＫ遺伝子および／または異種ＭＶＤ遺伝子の活性を弱めることは、弱力化された異種ＰＭＫ遺伝子および／または異種ＭＶＤ遺伝子発現を有しない細胞と比較して、代案の下流ＭＶＡ経路内へのより多くの炭素流をもたらす。いくつかの態様では、ＰＭＫおよび／またはＭＶＤの活性は、異種ＰＭＫ遺伝子および／または異種ＭＶＤ遺伝子活性の弱力化によって調節される。いくつかの態様では、異種ＰＭＫおよび／または異種ＭＶＤ遺伝子発現は、異種ＰＭＫ遺伝子および／または異種ＭＶＤ遺伝子の欠失によって弱められる。いくつかの態様では、異種ＰＭＫおよび／または異種ＭＶＤ遺伝子発現は、異種ＰＭＫ遺伝子および／または異種ＭＶＤ遺伝子の変異によって弱められる。いくつかの態様では、本明細書の細胞のいずれかは、ＰＭＫポリペプチドおよび／またはＭＶＤポリペプチドをコードする異種核酸を含まない。
【０１０７】
いくつかの態様では、（例えば、古典的および代案の）下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、異種ポリペプチドである。いくつかの態様では、細胞は、（例えば、古典的および代案の）下流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする異種核酸の２つ以上のコピーを含んでなる。いくつかの態様では、（例えば、古典的および代案の）下流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする異種核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、（例えば、古典的および代案の）下流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする異種核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、（例えば、古典的および代案の）下流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする異種核酸は、強力なプロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、（例えば、古典的および代案の）下流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする異種核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。下流ＭＶＡ経路ポリペプチド（例えば、古典的および代案の）をコードする異種核酸は、細胞のゲノムに組み込み得て、または安定して細胞内で発現させ得る。（例えば、古典的および代案の）下流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする異種核酸は、さらにベクター上に存在し得る。
【０１０８】
本発明のいくつかの態様では、本明細書に記載される組成物または方法のいずれかに記載される細胞は、（例えば、古典的および代案の）下流メバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。いくつかの態様では、（例えば、古典的および代案の）下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、内在性ポリペプチドである。いくつかの態様では、（例えば、古典的および代案の）下流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする内在性核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、（例えば、古典的および代案の）下流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする内在性核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、（例えば、古典的および代案の）下流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする内在性核酸は、強力なプロモーターと作動可能に連結する。特別な態様では、野生型細胞と比較して、細胞は、（例えば、古典的および代案の）内在性下流ＭＶＡ経路ポリペプチドを過剰発現するように改変される。いくつかの態様では、（例えば、古典的および代案の）下流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする内在性核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。
【０１０９】
本明細書に記載されるプロモーター（例えば、誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターをはじめとする、本明細書に記載される本開示の実施例で同定されるいずれかのプロモーター）を使用して、本明細書に記載されるＭＶＡポリペプチドのいずれかの発現を駆動し得る。
【０１１０】
（例えば、古典的および代案の）下流ＭＶＡ経路ポリペプチドとしては、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。例示的な下流ＭＶＡ経路核酸としては、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的な下流ＭＶＡ経路ポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。さらに、より良いイソプレン生成の結果をもたらす下流ＭＶＡ経路ポリペプチド変異体もまた使用し得る。
【０１１１】
本明細書に記載される細胞のいずれかは、ＩＤＩ核酸（例えば、ＩＤＩをコードする内在性または異種核酸）を含んでなり得る。イソペンテニル二リン酸イソメラーゼポリペプチド（イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼまたはＩＤＩ）は、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）とジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の相互変換を触媒する（例えば、ＩＰＰをＤＭＡＰＰに変換し、および／またはＤＭＡＰＰをＩＰＰに変換する）。例示的なＩＤＩポリペプチドとしては、ＩＤＩポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。（本明細書に記載されるものなどの）標準法を使用して、ポリペプチドが試験管内で、細胞内抽出物中で、または生体内で、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰを相互転換する能力を測定することで、ポリペプチドがＩＤＩポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。例示的なＩＤＩ核酸としては、ＩＤＩポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なＩＤＩポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。
【０１１２】
イソペンテニルキナーゼポリペプチドおよび核酸
イソペンテニルキナーゼ酵素は、イソペンテニルリン酸からイソペンテニルピロリン酸への変換を触媒する。したがって、理論により拘束されることなく、本明細書に記載されるイソペンテニルキナーゼの発現は、炭素源（例えば、炭水化物）から生成されるイソペンテニルピロリン酸の量の増大をもたらし得る。イソペンテニルピロリン酸は、イソプレンを生成するのに使用し得て、またはイソプレノイドを生成するためのイソプレノイド前駆体として使用し得る。したがって炭素源から生成されるイソペンテニルピロリン酸の量が、増大してもよい。代案としては、増大をより高い細胞内濃度に反映させることなく、イソペンテニルピロリン酸の生成を増大させ得る。特定の実施形態では、イソペンテニルキナーゼ反応が起こっているにもかかわらず、細胞内イソペンテニルピロリン酸濃度は不変であり、または低下することさえある。
【０１１３】
例示的なイソペンテニルキナーゼ核酸としては、イソペンテニルキナーゼポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なイソペンテニルキナーゼポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる（実施例１を参照されたい）。さらに表２は、本発明の実施形態内で利用してもよい、例示的なイソペンテニルキナーゼをコードするまたはコードしてもよい核酸がある種の、非限定的一覧を提供する。
【０１１４】
【表３】
2016511630.tif 000014
【０１１５】
【表４】
2016511630.tif 000015
【０１１６】
使用し得るその他のイソペンテニルキナーゼとしては、ヘルペトシフォン目（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎａｌｅｓ）（例えば、ヘルペトシフォン・アウランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＡＴＣＣ  ２３７７９）などのクロロフレクサス門（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ）のメンバーが挙げられる。
【０１１７】
本明細書で提供されるのは、微生物から単離されたイソペンテニルキナーゼである。いくつかの態様では、イソペンテニルキナーゼは、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、好気的細菌、嫌気的細菌、好熱性細菌、好冷細菌、好塩性細菌またはラン藻からなる群から単離される。いくつかの態様では、イソペンテニルキナーゼは、古細菌から単離される。いくつかの態様では、イソペンテニルキナーゼは、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、メタノカルドコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、またはメタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）から単離される。本明細書で提供されるのは、イソペンテニルキナーゼ活性があるポリペプチドをコードする核酸である。いくつかの態様では、イソペンテニルキナーゼ活性があるポリペプチドをコードする核酸配列は、古細菌から単離された核酸配列を含んでなる。さらなる態様では、イソペンテニルキナーゼ活性があるポリペプチドをコードする核酸配列は、デスルフロコッカス目（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スルフォロブス目（Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ）、サーモプロテウス目（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ケナルカエアレス目（Ｃｅｎａｒｃｈａｅａｌｅｓ）、ニトロソプミラレス目（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌａｌｅｓ）、アーキオグロブス目（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロバクテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノコッカス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、メタノセラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａｌｅｓ）、メタノサルシナ目（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ）、メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノミクロビウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、メタノピラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒａｌｅｓ）、サーモコッカス目（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、サーモプラズマ目（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）、コルアーケオタ門（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ）、およびナノアーケオタ門（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａ）からなる群から選択される古細菌から単離された核酸配列を含んでなる。その他の態様では、イソペンテニルキナーゼ活性があるポリペプチドをコードする核酸配列は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、メタノカルドコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、またはメタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）から単離された核酸配列を含んでなる。その他の態様では、イソペンテニルキナーゼ活性があるポリペプチドをコードする核酸配列は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、メタノカルドコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、またはメタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）から単離されたイソペンテニルキナーゼをコードする核酸配列との、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を含んでなる。その他の態様では、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１９〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるイソペンテニルキナーゼをコードする核酸配列との、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を含んでなる。その他の態様では、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１９〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
【０１１８】
これもまた本明細書で提供されるのは、イソペンテニルキナーゼ活性があるポリペプチドである。いくつかの態様では、イソペンテニルキナーゼ活性があるポリペプチドは、古細菌に由来する。さらなる態様では、イソペンテニルキナーゼ活性があるポリペプチドは、デスルフロコッカス目（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スルフォロブス目（Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ）、サーモプロテウス目（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ケナルカエアレス目（Ｃｅｎａｒｃｈａｅａｌｅｓ）、ニトロソプミラレス目（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌａｌｅｓ）、アーキオグロブス目（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロバクテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノコッカス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、メタノセラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａｌｅｓ）、メタノサルシナ目（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ）、メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノミクロビウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、メタノピラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒａｌｅｓ）、サーモコッカス目（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、サーモプラズマ目（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）、コルアーケオタ門（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ）、およびナノアーケオタ門（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａ）からなる群から選択される古細菌に由来する。その他の態様では、イソペンテニルキナーゼ活性があるポリペプチドは、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、メタノカルドコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、またはメタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）に由来する。いくつかの態様では、イソペンテニルキナーゼ活性があるポリペプチドは、配列番号１９〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる。本明細書で開示されるイソペンテニルキナーゼ変異体のいずれかも、また検討される。いくつかの態様では、イソペンテニルキナーゼ活性があるポリペプチドは、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、メタノカルドコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、またはメタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）から単離されたイソペンテニルキナーゼのアミノ酸配列との、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を含んでなる。いくつかの態様では、イソペンテニルキナーゼ活性があるポリペプチドは、配列番号１９〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列との、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を含んでなる。
【０１１９】
標準法を使用して、ポリペプチドがイソペンテニルリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する能力を測定することで、ポリペプチドがイソペンテニルキナーゼ活性を有するかどうかを判定し得る。例えば、基質の反応生成物への変換は、ＬＣ／ＭＳによって検出し得る。別の例示的なアッセイでは、古典的下流ＭＶＡ経路を発現するように改変された株を、候補イソペンテニルキナーゼを発現するプラスミドで形質転換して、ＩＰで補足された培地中で増殖させる。補足培地中の改変株の増殖は、ＩＰがＩＰＰおよびＤＭＡＰＰに変換されたことを示唆し、候補ポリペプチドが、イソペンテニルキナーゼ活性を有することを立証する。本明細書に記載されるようなイソペンテニルキナーゼ活性を有すると同定された任意のポリペプチドは、本発明で使用するのに適する。
【０１２０】
例示的なイソペンテニルキナーゼの生化学的特性としては、タンパク質発現、タンパク質溶解度、および活性が挙げられるが、これに限定されるものではない。イソペンテニルキナーゼは、異なるタイプの生物間の多様性（例えば、細菌、古細菌）、所望の種の近縁種（例えば、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、メタノカルドコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）など）、および熱耐性をはじめとするが、これに限定されるものではない、その他の特性に基づいて選択し得る。
【０１２１】
本明細書で提供されるのは、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼおよびイソペンテニルキナーゼを含んでなる組換え宿主であり、細胞は、イソプレノイド前駆体（例えば、ＩＰＰ）、イソプレン、および／またはイソプレノイドの生成を改善する、少なくとも１つの関心のある特性を示す。いくつかの態様では、前記少なくとも１つの関心のある特性は、比生産性、収率、力価、および細胞性能指数からなる群から選択されるが、これに限定されるものではない。
【０１２２】
特定の実施形態では、本明細書で利用するための適切なイソペンテニルキナーゼとしては、可溶性イソペンテニルキナーゼが挙げられる。タンパク質溶解度を測定するための技術は、当該技術分野で周知であり、本明細書の実施例で開示されるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書で利用するためのイソペンテニルキナーゼとしては、全細胞イソペンテニルキナーゼタンパク質の少なくとも２０％の溶解度があるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、イソペンテニルキナーゼタンパク質溶解度は、全細胞イソペンテニルキナーゼタンパク質の約５％〜約１００％、約１０％〜約１００％、約１５％〜約１００％、約２０％〜約１００％、約２５％〜約１００％、約３０％〜約１００％、約３５％〜約１００％、約４０％〜約１００％、約４５％〜約１００％、約５０％〜約１００％、約５５％〜約１００％、約６０％〜約１００％、約６５％〜約１００％、約７０％〜約１００％、約７５％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約８５％〜約１００％、または約９０％〜約１００％のいずれかである。いくつかの実施形態では、イソペンテニルキナーゼタンパク質の溶解度は、全細胞イソペンテニルキナーゼタンパク質の約５％〜約１００％である。いくつかの実施形態では、イソペンテニルキナーゼタンパク質の溶解度は、全細胞イソペンテニルキナーゼタンパク質の５％〜１００％である。いくつかの実施形態では、イソペンテニルキナーゼタンパク質の溶解度は、全細胞、イソペンテニルキナーゼタンパク質の約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０％のいずれか未満であるが、約５％以上である。いくつかの実施形態では、溶解度は、全細胞イソペンテニルキナーゼタンパク質の約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５％のいずれかを超える。
【０１２３】
所望の動力学的特徴があるイソペンテニルキナーゼは、イソプレンの生成を増大させる。動態特性としては、比活性、Ｋｃａｔ、Ｋｉ、およびＫｍが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの態様では、ｋｃａｔは、少なくとも約０．００１、０．００５、０．０１０、０．０１５、０．０２０、０．０２５、０．０３０、０．０３５、０．０４０、０．０４５、０．０５０、０．０５５、０．０６０、０．０６５、０．０７０、０．０７５、０．０８０、０．０８５、０．０９０、０．０９５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１６、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、または３０である。いくつかの態様では、イソペンテニルキナーゼは、少なくとも約０．００１、０．００５、０．０１０、０．０１５、０．０２０、０．０２５、０．０３０、０．０３５、０．０４０、０．０４５、０．０５０、０．０５５、０．０６０、０．０６５、０．０７０、０．０７５、０．０８０、０．０８５、０．０９０、０．０９５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１６、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、または３０のｋｃａｔで、イソペンテニルリン酸からイソペンテニルピロリン酸への変換を触媒する。いくつかの実施形態では、イソペンテニルキナーゼは、少なくとも約２７．５のｋｃａｔで、イソペンテニルリン酸からイソペンテニルピロリン酸への変換を触媒する。別の実施形態では、イソペンテニルキナーゼは、少なくとも約８．０のｋｃａｔで、イソペンテニルリン酸からイソペンテニルピロリン酸への変換を触媒する。なおも別の実施形態では、イソペンテニルキナーゼは、少なくとも約０．０３のｋｃａｔで、イソペンテニルリン酸からイソペンテニルピロリン酸への変換を触媒する。
【０１２４】
いくつかの態様では、Ｋｍは、少なくとも約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１６、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３０．５、３１、３１．５、３２、３２．５、３３、３３．５、３４、３４．５、３５、３５．５、３６、３６．５、３７、３７．５、３８、３８．５、３９、３９．５、４０、４０．５、４１、４１．５、４２、４２．５、４３、４３．５、４４、４４．５、４５、４５．５、４６、４６．５、４７、４７．５、４８、４８．５、４９、４９．５、５０、５０．５、５１、５１．５、５２、５２．５、５３、５３．５、５４、５４．５、５５、５５．５、５６、５６．５、５７、５７．５、５８、５８．５、５９、５９．５、６０、６０．５、６１、６１．５、６２、６２．５、６３、６３．５、６４、６４．５、６５、６５．５、６６、６６．５、６７、６７．５、６８、６８．５、６９、６９．５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、または２７５である。いくつかの態様では、イソペンテニルキナーゼは、少なくとも約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１６、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３０．５、３１、３１．５、３２、３２．５、３３、３３．５、３４、３４．５、３５、３５．５、３６、３６．５、３７、３７．５、３８、３８．５、３９、３９．５、４０、４０．５、４１、４１．５、４２、４２．５、４３、４３．５、４４、４４．５、４５、４５．５、４６、４６．５、４７、４７．５、４８、４８．５、４９、４９．５、５０、５０．５、５１、５１．５、５２、５２．５、５３、５３．５、５４、５４．５、５５、５５．５、５６、５６．５、５７、５７．５、５８、５８．５、５９、５９．５、６０、６０．５、６１、６１．５、６２、６２．５、６３、６３．５、６４、６４．５、６５、６５．５、６６、６６．５、６７、６７．５、６８、６８．５、６９、６９．５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、または２７５のｋＭで、イソペンテニルリン酸からイソペンテニルピロリン酸への変換を触媒する。いくつかの実施形態では、イソペンテニルキナーゼは、少なくとも約１２．７のｋＭで、イソペンテニルリン酸からイソペンテニルピロリン酸への変換を触媒する。別の実施形態では、イソペンテニルキナーゼは、少なくとも約４．４のｋＭで、イソペンテニルリン酸からイソペンテニルピロリン酸への変換を触媒する。なおも別の実施形態では、イソペンテニルキナーゼは、少なくとも約２５６のｋＭで、イソペンテニルリン酸からイソペンテニルピロリン酸への変換を触媒する。
【０１２５】
関心のある特性としては、イソペンテニルキナーゼポリペプチドを含まない組換え細胞と比較した、細胞内活性、比生産性、収率、および細胞性能指数の増大が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、比生産性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。一実施形態では、イソプレン比生産性は、約１５ｍｇ／Ｌ／ＯＤ／ｈｒである。いくつかの実施形態では、イソプレン収率は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。別の実施形態では、細胞性能指数は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５倍以上増大する。別の実施形態では、細胞内活性は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上増大する。
【０１２６】
本明細書で開示される任意のイソペンテニルキナーゼを、本発明で使用し得ることが、検討される。したがって、特定の態様では、本明細書で検討されるイソペンテニルキナーゼをコードする核酸のいずれか、または本明細書で検討されるイソペンテニルキナーゼ活性があるポリペプチドのいずれかを、本明細書に記載される方法のいずれかの組換え細胞内で発現させ得る。イソペンテニルキナーゼをコードする核酸は、組換え細胞内でマルチコピープラスミド上で発現させ得る。プラスミドは、高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド、または中程度コピー数プラスミドであり得る。代案としては、イソペンテニルキナーゼをコードする核酸を、宿主細胞の染色体に組み込み得る。プラスミド上の、または宿主細胞の染色体に組み込まれた部分としての双方の、イソペンテニルキナーゼをコードする核酸の異種性発現で、核酸の発現は、誘導性プロモーターまたは構成的発現プロモーターのどちらかによって駆動され得る。プロモーターは、イソペンテニルキナーゼをコードする核酸発現の強力な駆動機構であり得て、それは発現の弱い駆動機構であり得て、またはそれは発現の中程度の駆動機構であり得る。いくつかの実施形態では、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、異種核酸である。いくつかの実施形態では、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、内在性核酸である。
【０１２７】
代案のメバロン酸一リン酸経路を利用できる組換え細胞
本明細書に記載される組換え細胞（例えば、組換え細菌細胞）は、代案の下流ＭＶＡ経路を通じて、メバロン酸からイソペンテニルピロリン酸を産生し得る。いくつかの態様では、組換え細胞は、本明細書に記載される様々な酵素経路に対するいかなる操作もない同一細胞よりも大きな量および／または濃度で、代案の下流ＭＶＡ経路を通じて、メバロン酸からイソペンテニルピロリン酸を産生する。したがって本明細書に記載される組換え細胞は、代案の下流ＭＶＡ経路を通じた、イソペンテニルピロリン酸の生成で有用である。
【０１２８】
したがって、特定の態様では、本発明は、イソペンテニルピロリン酸を産生できる組換え細胞を提供し、細胞は、（ｉ）ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉ）イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、および（ｉｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、細胞は、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸および／またはイソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含まない細胞と比較して、増大した量のイソペンテニルピロリン酸を産生する。
【０１２９】
特定の態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、またはＳ３７８Ｐａ３−２からのホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸を含んでなる。特定の態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、またはＳ３７８Ｐａ３−２から単離された、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする、異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、配列番号１６〜１８からなる群から選択されるアミノ酸を含んでなる、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。別の態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、またはＳ３７８Ｐａ３−２からの、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする、内在性核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。特定の態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、メタノカルドコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、またはメタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）からのイソペンテニルキナーゼをコードする核酸を含んでなる特定の態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、メタノカルドコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、またはメタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）から単離されたイソペンテニルキナーゼをコードする異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。いくつかの態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、配列番号１９〜２３からなる群から選択されるアミノ酸を含んでなる、イソペンテニルキナーゼをコードする異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。別の態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、メタノカルドコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、またはメタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）からのイソペンテニルキナーゼをコードする内在性核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。特定の態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、Ｍ．マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）、酵母、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ＣＬ１９０、またはＭ．ブルトニイ（Ｍ．ｂｕｒｔｏｎｉｉ）から単離されたＭＶＫをコードする異種核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。
【０１３０】
一実施形態では、組換え細胞は、Ｌ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、および／またはＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）からのｍｖａＥおよびｍｖａＳポリペプチドをコードする異種核酸の１つまたは複数のコピーをさらに含んでなる。別の実施形態では、組換え細胞は、アセトアセチルＣｏＡシンターゼをコードする核酸、および上流ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。本明細書の実施形態のいずれかでは、組換え細胞は、（ａ）２分子のアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｂ）マロニルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｃ）アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素；（ｄ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；および（ｅ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素から選択される、上流ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドを含んでなる。
【０１３１】
本明細書の実施形態のいずれかでは、組換え細胞は、（ａ）メバロン酸をリン酸化してメバロン酸５−リン酸を形成する酵素；（ｂ）メバロン酸５−リン酸をリン酸化してメバロン酸５−ピロリン酸を形成する酵素；および（ｃ）メバロン酸５ピロリン酸を脱炭酸してイソペンテニルピロリン酸を形成する酵素から選択される、古典的下流ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをさらに含んでなる。本明細書の実施形態のいずれかでは、組換え細胞は、メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する弱力化酵素（例えば、ＰＭＫ）、および／またはメバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する弱力化酵素（例えば、ＭＶＤ）を含んでなる。
【０１３２】
ホスホケトラーゼ核酸およびポリペプチド
ホスホケトラーゼ酵素は、キシルロース５−リン酸からグリセルアルデヒド３−リン酸およびアセチルリン酸への変換、および／またはフルクトース６−リン酸からエリスロース４−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒する。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、セドヘプツロース−７−リン酸から生成物（例えば、リボース−５−リン酸）およびアセチルリン酸への変換を触媒する。したがって理論により拘束されることなく、本明細書に記載されるホスホケトラーゼの発現は、炭素源（例えば、炭水化物）から生成されるアセチルリン酸の量の増大をもたらし得る。このアセチルリン酸は、アセチルＣｏＡに変換され得て、次にそれは、ＭＶＡ経路の酵素機能によって利用され、メバロン酸、イソプレノイド前駆体分子、イソプレンおよび／またはイソプレノイドが生成し得て、またはそれは、ＭＶＡ経路の酵素機能によって利用されて、アセチルＣｏＡ由来代謝産物が生成し得る。したがって炭素源から生成されるこれらの化合物の量が、増大してもよい。代案としては、増大をより高い細胞内濃度に反映させることなく、アセチル−ＰおよびＡｃＣｏＡの生成を増大させ得る。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼ反応が起こっているにもかかわらず、細胞内アセチル−ＰまたはアセチルＣｏＡ濃度は不変であり、または低下することさえある。
【０１３３】
本明細書の用法では、「アセチルＣｏＡ由来代謝産物」という用語は、アセチルＣｏＡから前記代謝産物への触媒性変換から生じる、代謝産物を指し得る。変換は、一段階反応または多段階合成反応であり得る。例えば、アセトンは、１）アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼによる、２分子のアセチルＣｏＡのアセトアセチルＣｏＡへの縮合；２）アセチルＣｏＡまたはブチリルＣｏＡの生成をもたらす、酢酸または酪酸との反応による、アセトアセチルＣｏＡのアセトアセテートへの変換；および３）アセトアセテートデカルボキシラーゼによって触媒される脱炭酸ステップによる、アセトアセテートのアセトンへの変換の三段階反応（例えば、多段階合成反応）によってアセチルＣｏＡから生成される、アセチルＣｏＡ由来代謝産物である。アセトンは、引き続いてイソプロパノール、イソブテンおよび／またはプロペンに変換され得て、それらもまたアセチルＣｏＡ由来代謝産物であることが、本明細書で明示的に検討される。いくつかの実施形態では、アセチルＣｏＡ由来代謝産物は、ポリケチド、ポリヒドロキシ酪酸、脂肪アルコール、および脂肪酸からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アセチルＣｏＡ由来代謝産物は、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、プロリン、アルギニン、メチオニン、スレオニン、システイン、コハク酸、リジン、ロイシン、およびイソロイシンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アセチルＣｏＡ由来代謝産物は、アセトン、イソプロパノール、イソブテン、およびプロペンからなる群から選択される。したがって炭水化物基質から生成されるこれらの化合物（例えば、アセチルＣｏＡ、アセチルＣｏＡ−由来代謝産物、アセチル−Ｐ、Ｅ４Ｐなど）の量が増大してもよい。
【０１３４】
したがって、特定の実施形態では、本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、本明細書に記載される組換え細胞は、ホスホスホケトラーゼポリペプチドまたはホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、内在性ポリペプチドである。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、強力なプロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする２つ以上の内在性核酸（例えば、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする内在性核酸の２、３、４つ以上のコピー）が使用される。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性ホスホケトラーゼポリペプチドを過剰発現するように改変される。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。
【０１３５】
例示的なホスホケトラーゼ核酸としては、ホスホケトラーゼポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なホスホケトラーゼポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼをコードする核酸は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、ラクトバチルス・ロイテリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・パラプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマーリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ガルドネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、フェリモナス・バレアリカ（Ｆｅｒｒｉｍｏｎａｓ  ｂａｌｅａｒｉｃａ）、ムシラギニバクター・パルジス（Ｍｕｃｉｌａｇｉｎｉｂａｃｔｅｒ  ｐａｌｕｄｉｓ）、ノストック・パンクチフォルメ（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）、ノストック・パンクチフォルメ（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）ＰＣＣ７３１０２、パントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、ペドバクター・サルタンス（Ｐｅｄｏｂａｃｔｏｒ  ｓａｌｔａｎｓ）、ラーネラ・アクアチリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）、および／またはサーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）に由来する。その他の態様では、ホスホケトラーゼをコードする核酸は、マイコバクテリウム・ギルバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ）、シューワネラ・バルチカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ブルセラ・ミクロチ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ロドコッカス・イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ストレプトミセス・ガーナエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）種、および／またはネオサルトリア・フィスケリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）に由来する。その他の態様では、ホスホケトラーゼをコードする核酸は、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・サッカロリチクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、マイコプラズマ・アリガトリス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｌｌｉｇａｔｏｒｉｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、メリッソコッカス・プルトニウス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｔｏｎｉｕｓ）、テトラジェノコッカス・ハロフィルス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、および／またはマイコプラズマ・アルスリチディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）に由来する。なおも別の態様では、ホスホケトラーゼをコードする核酸は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、キンゲラ・オラリス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、グラニュリカテラ・アディアセンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・クロコディリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｉ）、マイコバクテリウム・ボービス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、エレモコッカス・��レオコラ（Ｅｒｅｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｌｅｏｃｏｌａ）、グラニュリカテラ・エレガンス（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、アエロコッカス・ウリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓｕｒｉｎａｅ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ストレプトコッカス・アウストラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・クリセチ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｉ）、および／またはマイコプラズマ・コランビナム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｌｕｍｂｉｎｕｍ）に由来する。ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする核酸の一例は、配列番号２４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、核酸配列である。本明細書で使用し得るホスホケトラーゼ酵素の追加的な例は、全て参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，７８５，８５８号明細書、国際公開第２０１１／１５９８５３号パンフレット、および米国特許出願公開第２０１３／００８９９０６号明細書に記載される。
【０１３６】
マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）ＡＴＣＣ  ２３１１４からのホスホケトラーゼポリペプチドのアミノ酸配列
【化１０】
2016511630.tif 000016
【０１３７】
例示的なホスホケトラーゼの生化学的特性としては、タンパク質発現、タンパク質溶解度、および活性が挙げられるが、これに限定されるものではない。ホスホケトラーゼはまた、異なる生物タイプ（例えば、グラム陽性細菌、ラン藻、放線菌）間の多様性、通性低温嫌気性菌、所望の種の近縁種（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、および熱耐性をはじめとするが、これに限定されるものではない、その他の特性に基づいて選択し得る。場合によっては、生物のゲノム中にホスホフルクトキナーゼ遺伝子が欠失していれば、特定の生物からのホスホケトラーゼを選択し得る。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼは、米国特許出願公開第２０１３／００８９９０６号明細書に記載される、アッセイおよび／または方法に基づいて選択し得る。例えば、（ａ）ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでなり、グルコースまたはキシロースを炭素源とする培養条件下で、トランスケトラーゼ活性（ｔｋｔＡＢ）に欠陥がある、組換え細胞を培養するステップと；（ｂ）組換え細胞の細胞増殖を評価するステップと；（ｃ）観察された細胞増殖の量に基づいて、前記ポリペプチドの生体内ホスホケトラーゼ活性の存在を判定するステップとを含んでなる、ポリペプチドの生体内ホスホケトラーゼ活性の存在を判定する方法が本明細書で提供される。
【０１３８】
標準法を使用して、ペプチドが、Ｄ−フルクトース６−リン酸またはＤ−キシルロース５−リン酸をアセチル−Ｐに変換する能力を測定することで、ポリペプチドが、ホスホケトラーゼペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。次にアセチル−Ｐを分光光度法で検出し得るフェリルアセチルヒドロキサム酸に変換し得る（Ｍｅｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂａｃｔ．１８３：２９２９−２９３６）。本明細書に記載されるようなホスホケトラーゼペプチド活性を有すると同定された任意のポリペプチドは、本発明で使用するのに適する。
【０１３９】
本明細書の実施形態のいずれかでは、組換え細胞は、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡおよび／またはｒｐｉＢ）、Ｄ−リブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡおよび／またはｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼＢ（ｔａｌＢ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａおよび／またはｅｕｔＤ）からなる群から選択される遺伝子の１つまたは複数の活性を増大させるように、さらに改変し得る。別の実施形態では、組換え細胞は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、６−ホスホフルクトキナーゼ−１（ｐｆｋＡおよび／またはｐｆｋＢ）、フルクトースビスホスフェートアルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、および／またはｆｂａＣ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡおよび／またはｇａｐＢ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、ＥＩ（ｐｔｓＩ）、ＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）、ＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）、および／またはＨＰｒ（ｐｔｓＨ）遺伝子をはじめとする、１つまたは複数の遺伝子の活性を低下させるように、さらに改変し得る。
【０１４０】
いくつかの態様では、上記および／または本明細書の実施形態のいずれかにおいて、適切な培地中の組換え細胞の培養は、細胞内のエリスロース４−リン酸の量、細胞内のグリセルアルデヒド３−リン酸の量、またはアセチルリン酸の収率の１つまたは複数を増大させる。その他の態様では、上記および／または本明細書の実施形態のいずれかにおいて、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドは、キシルロース５−リン酸からグリセルアルデヒド３−リン酸およびアセチルリン酸を合成できる。その他の態様では、上記および／または本明細書の実施形態のいずれかにおいて、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドは、フルクトース６−リン酸からエリスロース４−リン酸およびアセチルリン酸を合成できる。
【０１４１】
イソプレンを産生できる組換え細胞
イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、幅広い用途で使用される重要な有機化合物である。例えば、イソプレンは、合成ゴムの製造をはじめとする、多数の化学薬品組成物およびポリマーの合成において、中間体または出発原料として用いられる。イソプレンはまた、多数の植物および動物によって天然に合成される生物学的材料として、重要である。
【０１４２】
イソプレンは、イソプレンシンターゼの酵素作用によって、ＤＭＡＰＰから生成される。したがって、理論により拘束されることなく、上述の組成物および方法のいずれかによって、組換え細胞内の代案の下流ＭＶＡ経路を通じて、メバロン酸からのイソペンテニルピロリン酸の細胞産生を増大させることは、同様により大量のイソプレンの生成をもたらすと考えられる。グルコースからのイソペンテニルピロリン酸生成のモル収率を増大させることは、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニルキナーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（例えば、代案の下流ＭＶＡ経路）の、およびイソプレンおよびイソプレノイド生成のためのその他の適切な酵素の、適切な酵素活性レベルと組み合わせると、グルコースから生成されるイソプレンおよび／またはイソプレノイドのより高いモル収率につながる。
【０１４３】
本明細書に記載されるように、本発明は、（ｉ）ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉ）イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｖ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなり、適切な培地中における組換え細胞の培養がイソプレンの生成を提供する、イソプレンを産生できる組換え細胞を提供する。さらなる実施形態では、組換え細胞は、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。特定の実施形態では、本発明は、（ｉ）ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉ）イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｖ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなる、イソプレンを産生できる組換え細胞を提供し、細胞は、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸および／またはイソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含まないイソプレン産生細胞と比較して、増大した量のイソプレンを産生する。さらなる実施形態では、組換え細胞は、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。実施形態のいくつかでは、本明細書で提供されるのは、（ｉ）ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉ）イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｖ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなる、イソプレンを産生できる組換え細胞であり、イソプレンの生成中に、細胞によって利用されるＡＴＰの総量は、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸および／またはイソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含まない、イソプレン産生細胞と比較して、低下する。いくつかの実施形態では、イソプレンの生成中に細胞によって利用されるＡＴＰの総量は、少なくとも正味１ＡＴＰ、正味２ＡＴＰ、正味３ＡＴＰ、正味４ＡＴＰまたは正味５ＡＴＰ低下する。いくつかの実施形態では、イソプレンの生成中に細胞によって利用されるＡＴＰの総量は、正味１ＡＴＰ低下する。
【０１４４】
イソプレンの生成はまた、酵素活性が調節されて、メバロン酸に向かう生成炭素流動が増大される、酵素経路操作の１つまたは複数をさらに含んでなる、本明細書に記載される組換え宿主細胞のいずれかを使用して実施し得る。メバロン酸生成への炭素流動増大のために操作された様々な酵素経路を有する、本明細書に記載される組換え細胞を使用して、イソプレンを生成し得る。一実施形態では、組換え細胞は、ホスホケトラーゼをコードする核酸をさらに含んでなる。別の実施形態では、組換え細胞は、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡおよび／またはｒｐｉＢ）、Ｄ−リブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡおよび／またはｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼＢ（ｔａｌＢ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａおよび／またはｅｕｔＤ）からなる群から選択される遺伝子の１つまたは複数の活性を増大させるように、さらに改変し得る。別の実施形態では、組換え細胞は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、６−ホスホフルクトキナーゼ−１（ｐｆｋＡおよび／またはｐｆｋＢ）、フルクトースビスホスフェートアルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、および／またはｆｂａＣ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡおよび／またはｇａｐＢ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、ＥＩ（ｐｔｓＩ）、ＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）、ＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）、および／またはＨＰｒ（ｐｔｓＨ）遺伝子をはじめとする、１つまたは複数の遺伝子の活性を低下させるように、さらに改変し得る。
【０１４５】
イソプレンシンターゼ核酸およびポリペプチド
本発明のいくつかの態様では、本明細書に記載される組成物また方法のいずれかに記載される細胞（本明細書に記載されるように改変された宿主細胞を含む）は、イソプレンシンターゼポリペプチド、またはイソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、内在性ポリペプチドである。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、強力なプロモーターと作動可能に連結する。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性イソプレンシンターゼ経路ポリペプチドを過剰発現するように改変される。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。
【０１４６】
いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは異種ポリペプチドである。いくつかの態様では、細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸の２つ以上のコピーを含んでなる。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、強力なプロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（Ｐｕｅｒａｒｉａ）またはポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）またはウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）×ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ）などの雑種からのポリペプチドまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、プエラリア・モンタナ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ）またはプエラリア・ロバタ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｌｏｂａｔａ）、ポプルス・トレムロイデス（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）、セイヨウハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｎｉｇｒａ）、およびコットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）からのポリペプチドまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ユーカリノキに由来する。
【０１４７】
イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸は、宿主細胞ゲノムに組み込み得て、または細胞内で安定して発現させ得る。イソプレシンターゼンをコードする核酸は、さらにベクター上に存在し得る。
【０１４８】
例示的なイソプレンシンターゼ核酸としては、イソプレンシンターゼポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。イソプレンシンターゼポリペプチドは、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）をイソプレンに変換する。例示的なイソプレンシンターゼポリペプチドとしては、イソプレンシンターゼポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なイソプレンシンターゼポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。さらに、イソプレンシンターゼ変異体は、改善された酵素活性などの改善された活性を有し得る。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼ変異体は、改善された安定性（例えば、熱安定性）、および／または改善された溶解度などのその他の改善された特性を有する。
【０１４９】
標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内で、細胞抽出物中で、または生体内で、ＤＭＡＰＰをイソプレンに変換する能力を測定することで、ポリペプチドがイソプレンシンターゼポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。細胞抽出物中のイソプレンシンターゼポリペプチド活性は、例えば、Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３０１０−１３０１６，１９９５に記載されるようにして、測定し得る。１つの例示的なアッセイでは、窒素流下で、ＤＭＡＰＰ（Ｓｉｇｍａ）を蒸発するまで乾燥させて、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．２中で１００ｍＭの濃度に再水和して、−２０℃で保存し得る。アッセイを実施するために、金属ねじ蓋およびテフロン被覆ケイ素隔壁付き２０ｍｌのＨｅａｄｓｐａｃｅバイアル（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内の２５μＬの細胞抽出物に、５μＬの１Ｍ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭの（２５０μｇ／ｍｌ）ＤＭＡＰＰ、６５μＬの植物抽出緩衝液（ＰＥＢ）（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、５％グリセロール、および２ｍＭのＤＴＴ）の溶液を添加して、振盪しながら３７℃で１５分間培養し得る。反応は、２００μＬの２５０ｍＭ  ＥＤＴＡを添加することでクエンチし、ＧＣ／ＭＳによって定量化し得る。
【０１５０】
いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（Ｐｕｅｒａｒｉａ）からのイソプレンシンターゼまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）からのイソプレンシンターゼまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ポプライソプレンシンターゼポリペプチドまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、葛イソプレンシンターゼポリペプチドまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、柳イソプレンシンターゼポリペプチドまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ユーカリノキイソプレンシンターゼポリペプチドまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（Ｐｕｅｒａｒｉａ）またはポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）、またはウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）×ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ）の雑種からのポリペプチドまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ハリエンジュ属（Ｒｏｂｉｎｉａ）、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）、またはメラレウカ属（Ｍｅｌａｌｅｕｃａ）またはその変異体に由来する。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、植物イソプレンシンターゼは、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）、ヤナギ科（Ｓａｌｉｃａｃｅａｅ）、またはブナ科（Ｆａｇａｃｅａｅ）に由来する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は、プエラリア・モンタナ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ）（葛）（Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １３７：７００−７１２，２００５）、プエラリア・ロバタ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｌｏｂａｔａ）、ポプラ（ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）、セイヨウハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｎｉｇｒａ）、コットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、またはウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）×ヤマナラシ（ｔｒｅｍｕｌａ）（ＣＡＣ３５６９６）など（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ  ２１３：４８３−４８７，２００１）、アスペン（ポプルス・トレムロイデス（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）など（Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ  ２７０（２２）：１３０１０−１３１６，１９９５）、ヨーロッパナラ（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｏｂｕｒ）（Ｚｉｍｍｅｒらに付与された国際公開第９８／０２５５０号パンフレット）からのポリペプチドまたは核酸、またはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、プエラリア・モンタナ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ）、プエラリア・ロバタ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｌｏｂａｔａ）、ポプルス・トレムロイデス（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）、セイヨウハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｎｉｇｒａ）、またはコットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）からのイソプレンシンターゼまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）からのイソプレンシンターゼまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼは、ポプルス・バルサミフェラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＪＮ１７３０３７）、ポプルス・デルトイデス（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＪＮ１７３０３９）、ポプルス・フレモンチイ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｆｒｅｍｏｎｔｉｉ）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＪＮ１７３０４０）、ポプルス・グランディデンタータ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｇｒａｎｄｉｄｅｎｔａｔａ）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＪＮ１７３０３８）、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＪＮ１７３０４３）、ニセアカシア（Ｒｏｂｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａ）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＪＮ１７３０４１）、フジ属（Ｗｉｓｔｅｒｉａ）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＪＮ１７３０４２）、ユーカリノキ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｌｏｂｕｌｕｓ）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＢ２６６３９０）またはメラロイカ・アルテーニフローラ（Ｍｅｌａｌｅｕｃａ  ａｌｔｅｒｎｉｆｌｏｒａ）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＹ２７９３７９）またはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼ（例えば、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）からのイソプレンシンターゼま���はその変異体）をコードする核酸は、コドン最適化される。
【０１５２】
いくつかの態様では、イソプレンシンターゼ核酸またはポリペプチドは、天然ポリペプチドまたは核酸（例えば、ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）からの天然ポリペプチドまたは核酸）である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼ核酸またはポリペプチドは、野生型または天然ポリペプチドまたは核酸でない。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼ核酸またはポリペプチドは、野生型または天然ポリペプチドまたは核酸の変異体（例えば、ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）からの野生型または天然ポリペプチドまたは核酸の変種）である。
【０１５３】
いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、変種である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、野生型または天然起源イソプレンシンターゼの変種である。いくつかの態様では、変種は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼと比較して、改善された触媒活性などの改善された活性を有する。活性（例えば、触媒活性）の増大は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のいずれかであり得る。いくつかの態様では、触媒活性などの活性の増大は、少なくとも約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、または１００倍のいずれかである。いくつかの態様では、触媒活性などの活性の増大は、約１０％〜約１００倍（例えば、約２０％〜約１００倍、約５０％〜約５０倍、約１倍〜約２５倍、約２倍〜約２０倍、または約５倍〜約２０倍）である。いくつかの態様では、変種は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼと比較して、改善された溶解度を有する。溶解度の増大は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のいずれかであり得る。溶解度の増大は、少なくとも約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、または１００倍のいずれかであり得る。いくつかの態様では、溶解度の増大は、約１０％〜約１００倍（例えば、約２０％〜約１００倍、約５０％〜約５０倍、約１倍〜約２５倍、約２倍〜約２０倍、または約５倍〜約２０倍）である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、天然起源イソプレンシンターゼの変異体であり、天然起源イソプレンシンターゼと比較して、改善された安定性（熱安定性など）を有する。
【０１５４】
いくつかの態様では、変異体は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼの少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％の活性を有する。変異体は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼと、配列類似性を共有し得る。いくつかの態様では、野生型または天然起源イソプレンシンターゼの変異体は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼと、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％のいずれかのアミノ酸配列同一性を有し得る。いくつかの態様では、野生型または天然起源イソプレンシンターゼの変異体は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼと、約７０％〜約９９．９％、約７５％〜約９９％、約８０％〜約９８％、約８５％〜約９７％、または約９０％〜約９５％のアミノ酸配列同一性のいずれかを有する。
【０１５５】
いくつかの態様では、変異体は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼ中に、変異を含んでなる。いくつかの態様では、変異体は、少なくとも１つのアミノ酸置換、少なくとも１つのアミノ酸挿入、および／または少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する。いくつかの態様では、変異体は、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの態様では、変異体と、野生型または天然起源イソプレンシンターゼの間で異なるアミノ酸残基の数は、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０以上のアミノ酸残基など、１つまたは複数であり得る。天然起源イソプレンシンターゼとしては、例えば、葛イソプレンシンターゼ、ポプライソプレンシンターゼ、ヨーロッパナライソプレンシンターゼ、柳イソプレンシンターゼ、およびユーカリノキイソプレンシンターゼなど、植物からの任意のイソプレンシンターゼが挙げられる。いくつかの態様では、変異体は、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）からのイソプレンシンターゼの変異体である。いくつかの態様では、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）からのイソプレンシンターゼの変異体は、少なくとも１種のアミノ酸置換、少なくとも１種のアミノ酸挿入、および／または少なくとも１種のアミノ酸欠失を有する。いくつかの態様では、変異体は、トランケート型ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）イソプレンシンターゼである。いくつかの態様では、変異体（例えば、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）からのイソプレンシンターゼの変異体をコードする核酸は、コドン最適化される（例えば、その中で異種イソプレンシンターゼが発現される宿主細胞に基づいてコドン最適化される）。
【０１５６】
適切なイソプレンシンターゼとしては、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ３４１４３１、ＡＹ３１６６９１、ＡＢ１９８１８０、ＡＪ２９４８１９．１、ＥＵ６９３０２７．１、ＥＦ６３８２２４．１、ＡＭ４１０９８８．１、ＥＦ１４７５５５．１、ＡＹ２７９３７９、ＡＪ４５７０７０、およびＡＹ１８２２４１で同定されるものが挙げられるが、これに限定されるものではない。本明細書に記載される組成物、またはイソプレンシンターゼをコードする微生物を作成する方法をはじめとする方法のいずれかで、使用し得るイソプレンシンターゼのタイプは、イソプレンシンターゼおよびイソプレンシンターゼ変異体に関して、その内容全体を明示的に参照によって本明細書に援用する、国際公開第２００９／０７６６７６号パンフレット、国際公開第２０１０／００３００７号パンフレット、国際公開第２００９／１３２２２０号パンフレット、国際公開第２０１０／０３１０６２号パンフレット、国際公開第２０１０／０３１０６８号パンフレット、国際公開第２０１０／０３１０７６号パンフレット、国際公開第２０１０／０１３０７７号パンフレット、国際公開第２０１０／０３１０７９号パンフレット、国際公開第２０１０／１４８１５０号パンフレット、国際公開第２０１０／１２４１４６号パンフレット、国際公開第２０１０／０７８４５７号パンフレット、および国際公開第２０１０／１４８２５６号パンフレット、米国特許出願公開第２０１０／００８６９７８号明細書、米国特許出願公開第１３／２８３５６４号明細書、およびＳｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｉｓｏｐｒｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  Ｇｅｎｅｓ  Ｆｏｒｍ  Ａ  Ｍｏｎｏｐｈｙｌｅｔｉｃ  Ｃｌａｄｅ  Ｏｆ  Ａｃｙｃｌｉｃ  Ｔｅｒｐｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅｓ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｔｐｓ−Ｂ  Ｔｅｒｐｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  Ｆａｍｉｌｙ”，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（２０１２）（ＤＯＩ：１０．１１１１／ｅｖｏ．１２０１３において、オンラインで利用できる）にもまた記載される。
【０１５７】
本明細書に記載されるプロモーター（例えば、誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターをはじめとする、本明細書に記載される本開示の実施例で同定されるプロモーター）のいずれかを使用して、本明細書に記載されるイソプレンシンターゼのいずれかの発現を駆動し得る。
【０１５８】
イソプレン生合成経路
イソプレンは、２種の異なるアルコール、３−メチル−２−ブテン−１−オール、および２−メチル−３−ブテン−２−オールから生成され得る。例えば、二段階イソプレン生合成経路では、シンターゼ（例えば、２−メチル−３−ブテン−２−オールシンターゼ）などの酵素によって、ジメチルアリル二リン酸が２−メチル−３−ブテン−２−オールに変換され、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼによる、２−メチル−３−ブテン−２−オールのイソプレンへの変換がそれに続いた。別の例として、三段階イソプレン生合成経路では、ジメチルアリル二リン酸を３−メチル−２−ブテン−１−オールに変換できるホスファターゼまたはシンターゼ（例えば、ゲラニオールシンターゼまたはファルネソールシンターゼ）のどちらかによって、ジメチルアリル二リン酸が３−メチル−２−ブテン−１−オールに変換され、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼによって、３−メチル−２−ブテン−１−オールが２−メチル−３−ブテン−２−オールに変換され、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼによって、２−メチル−３−ブテン−２−オールがイソプレンに変換される。例えば、米国特許出願公開第２０１３０３０９７４２Ａ１号明細書、および米国特許出願公開第２０１３０３０９７４１Ａ１号明細書を参照されたい。
【０１５９】
本発明のいくつかの態様では、本明細書に記載される組成物または方法のいずれかに記載される細胞（本明細書に記載されるように改変された宿主細胞を含む）は、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼ、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼ、および３−メチル−２−ブテン−１−オールシンターゼからなる群から選択される、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドは、内在性ポリペプチドである。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする内在性核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする内在性核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする内在性核酸は、強力なプロモーターと作動可能に連結する。特定の態様では、細胞が、野生型細胞と比較して、イソプレン生合成経路の内在性ポリペプチドを過剰発現するように改変される。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする内在性核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。
【０１６０】
いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドは、異種ポリペプチドである。いくつかの態様では、細胞は、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする異種核酸の２つ以上のコピーを含んでなる。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする異種核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする異種核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする異種核酸は、強力なプロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする異種核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。
【０１６１】
イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする核酸は、宿主細胞ゲノムに組み込み得て、または細胞内で安定して発現させ得る。イソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする核酸は、さらにベクター上に存在し得る。
【０１６２】
例示的なイソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする核酸としては、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼポリペプチド、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼポリペプチド、および３−メチル−２−ブテン−１オールシンターゼポリペプチドなどの、イソプレン生合成経路のポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なイソプレン生合成経路のポリペプチド、およびイソプレン生合成経路のポリペプチドをコードする核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。さらに、イソプレン生合成経路のポリペプチドの変異体（例えば、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼポリペプチド、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼポリペプチド、および３−メチル−２−ブテン−１−オールシンターゼポリペプチド）は、改善された酵素活性などの改善された活性を有し得る。
【０１６３】
いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドは、ホスファターゼである。例示的なホスファターゼとしては、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）からのホスファターゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、ホスファターゼは、３−メチル−２−ブテン−１−オールシンターゼポリペプチドまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドは、テルペンシンターゼ（例えば、ゲラニオールシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、リナロールシンターゼまたはネロリドールシンターゼ）である。例示的なテルペンシンターゼとしては、スイートバジル（Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）、レモンエゴマ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）、エゴマ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、シナモマム・テヌイピル（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｔｅｎｕｉｐｉｌｅ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）またはイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）からのテルペンシンターゼが挙げられる。追加的な例示的テルペンシンターゼとしては、クラルキア・ブレウェリ（Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、セトエゴマ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｓｅｔｏｅｎｓｉｓ）、エゴマ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、サルナシ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ａｒｇｕｔａ）、マタタビ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ｐｏｌｙｇａｍａ）、クソニンジン（Ａｒｔｅｍｅｓｉａ  ａｎｎｕａ）、スイートバジル（Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）、ミズハッカ（Ｍｅｎｔｈａ  ａｑｕａｔｉｃａ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、コットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、エゾヘビイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ  ｖｅｓｃａ）、またはオランダイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ  ａｎａｎａｓｓａ）からのテルペンシンターゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、テルペンシンターゼは、３−メチル−２−ブテン−１−オールシンターゼポリペプチドまたはその変異体である。例えば、本明細書に記載されるテルペンシンターゼは、ジメチルアリル二リン酸から３−メチル−２−ブテン−１−オールへの変換を触媒し得る（例えば、３−メチル−２−ブテン−１−オールシンターゼ）。いくつかの態様では、本明細書に記載されるテルペンシンターゼは、ジメチルアリル二リン酸から２−メチル−３−ブテン−２−オールへの変換を触媒し得る（例えば、２−メチル−３−ブテン−２−オールシンターゼ）。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドは、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼポリペプチド（例えば、アキンコラ・ターチアリカルボニス（Ａｑｕｉｎｃｏｌａ  ｔｅｒｔｉａｒｉｃａｒｂｏｎｉｓ）からの２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼポリペプチド）またはその変異体である。いくつかの態様では、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼポリペプチドは、リナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼポリペプチド（例えば、カステラニエラ・デフラグランス（��ａｓｔｅｌｌａｎｉｅｌｌａ  ｄｅｆｒａｇｒａｎｓ）Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＦＲ６６９４４７からのリナロールデヒドラターゼイソメラーゼポリペプチド）またはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチドは、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼポリペプチドまたはその変異体である。いくつかの態様では、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼポリペプチドは、リナロールデヒドラターゼ−イソメラーゼポリペプチド（例えば、カステラニエラ・デフラグランス（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｅｌｌａ  ｄｅｆｒａｇｒａｎｓ）Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＦＲ６６９４４７からのリナロールデヒドラターゼイソメラーゼポリペプチド）またはその変異体である。
【０１６４】
標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ＤＭＡＰＰをイソプレンに変換する能力を測定することで、ポリペプチドが所望のイソプレン生合成経路酵素活性（例えば、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼ活性、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼ活性、および３−メチル−２−ブテン−１−オール活性）を有するかどうかを判定し得る。例えば、米国特許出願公開第２０１３０３０９７４２Ａ１号明細書、および米国特許出願公開第２０１３０３０９７４１Ａ１号明細書を参照されたい。
【０１６５】
いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチド（例えば、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼポリペプチド、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼポリペプチド、および３−メチル−２−ブテン−１−オールシンターゼポリペプチド）は、変異体である。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路のポリペプチド（例えば、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼポリペプチド、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼポリペプチド、および３−メチル−２−ブテン−１−オールシンターゼポリペプチド）は、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチドの変異体である。いくつかの態様では、変異体は、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチドと比較して、改善された触媒活性などの改善された活性を有する。活性（例えば、触媒活性）の増大は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のいずれかであり得る。いくつかの態様では、触媒活性などの活性の増大は、少なくとも約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、または１００倍のいずれかである。いくつかの態様では、触媒活性などの活性の増大は、約１０％〜約１００倍（例えば、約２０％〜約１００倍、約５０％〜約５０倍、約１倍〜約２５倍、約２倍〜約２０倍、または約５倍〜約２０倍）である。いくつかの態様では、変異体は、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチドと比較して、改善された溶解度を有する。溶解度の増大は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のいずれかであり得る。溶解度の増大は、少なくとも約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、または１００倍のいずれかであり得る。いくつかの態様では、溶解度の増大は、約１０％〜約１００倍（例えば、約２０％〜約１００倍、約５０％〜約５０倍、約１倍〜約２５倍、約２倍〜約２０倍、または約５倍〜約２０倍）である。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路ポリペプチドは、イソプレン生合成経路の天然起源ポリペプチドの変異体であり、イソプレン生合成経路の天然起源ポリペプチドと比較して、改善された安定性（熱安定性など）を有する。
【０１６６】
いくつかの態様では、変異体は、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチド（例えば、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼポリペプチド、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼポリペプチド、および３−メチル−２−ブテン−１−オールシンターゼポリペプチド）の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％の活性を有する。変異体は、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチドと、配列類似性を共有し得る。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチドの変異体は、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチド（例えば、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼポリペプチド、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼポリペプチド、および３−メチル−２−ブテン−１−オールシンターゼポリペプチド）と、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％のいずれかのアミノ酸配列同一性を有し得る。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチドの変異体は、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチド（例えば、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼポリペプチド、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼポリペプチド、および３−メチル−２−ブテン−１−オールシンターゼポリペプチド）と、約７０％〜約９９．９％、約７５％〜約９９％、約８０％〜約９８％、約８５％〜約９７％、または約９０％〜約９５％のいずれかのアミノ酸配列同一性を有する。
【０１６７】
いくつかの態様では、変異体は、イソプレン生合成経路の野生型または天然起源ポリペプチド（例えば、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼポリペプチド、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼポリペプチド、および３−メチル−２−ブテン−１−オールシンターゼポリペプチド）中に、変異を含んでなる。いくつかの態様では、変異体は、少なくとも１つのアミノ酸置換、少なくとも１つのアミノ酸挿入、および／または少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する。いくつかの態様では、変異体は、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの態様では、イソプレン生合成経路の変異体と、野生型または天然起源ポリペプチドの間で異なるアミノ酸残基の数は、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０以上のアミノ酸残基など、１つまたは複数であり得る。いくつかの態様では、変異体（例えば、２−メチル−３−ブテン−２−オールデヒドラターゼポリペプチド、２−メチル−３−ブテン−２−オールイソメラーゼポリペプチド、および３−メチル−２−ブテン−１−オールシンターゼポリペプチド）をコードする核酸は、コドン最適化される（例えば、イソプレン生合成経路の異種ポリペプチドがその中で発現される宿主細胞に基づいて、コドン最適化される）。
【０１６８】
本明細書に記載されるプロモーター（例えば、誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターをはじめとする、本明細書に記載される本開示の実施例で同定されるプロモーター）のいずれかを使用して、本明細書に記載されるイソプレン生合成経路のポリペプチドのいずれかの発現を駆動し得る。
【０１６９】
ＤＸＰ経路核酸およびポリペプチド
本発明のいくつかの態様では、（本明細書に記載されるように改変された宿主細胞をはじめとする）本明細書に記載される組成物また方法のいずれかに記載される細胞は、ＤＸＳポリペプチドまたはその他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなる。いくつかの態様では、細胞は、ＤＸＳポリペプチドまたはその他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする内在性核酸の染色体のコピーをさらに含んでなる。いくつかの態様では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、ＩＤＩポリペプチドおよびＤＸＳポリペプチドまたはその他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。いくつかの態様では、１つの核酸が、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、およびＤＸＳポリペプチドまたはその他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、１つのプラスミドが、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、およびＤＸＳポリペプチドまたはその他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、複数のプラスミドが、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、およびＤＸＳポリペプチドまたはその他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする。
【０１７０】
例示的なＤＸＳポリペプチドとしては、ＤＸＳポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。（本明細書に記載されるものなどの）標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸に変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。例示的なＤＸＳポリペプチドおよび核酸およびＤＸＳ活性を測定する方法は、国際公開第２００９／０７６６７６号パンフレット、国際公開第２０１０／００３００７号パンフレット、国際公開第２００９／１３２２２０号パンフレット、および米国特許第２００９／０２０３１０２号明細書、米国特許第２０１０／０００３７１６号明細書、および米国特許第２０１０／００４８９６４号明細書に、より詳細に記載される。
【０１７１】
例示的なＤＸＰ経路ポリペプチドとしては、ＤＸＰ経路ポリペプチドの１つまたは２つ以上の活性を有する、ＤＸＳポリペプチド、ＤＸＲポリペプチド、ＭＣＴポリペプチド、ＣＭＫポリペプチド、ＭＣＳポリペプチド、ＨＤＳポリペプチド、ＨＤＲポリペプチド、およびポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）のいずれかが挙げられるが、これに限定されるものではない。特に、ＤＸＰ経路ポリペプチドとしては、ＤＸＰ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なＤＸＰ経路核酸としては、ＤＸＰ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なＤＸＰ経路ポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。例示的なＤＸＰ経路ポリペプチド、および核酸、およびＤＸＰ経路ポリペプチド活性を測定する方法は、国際公開第２０１０／１４８１５０号パンフレットにより詳細に記載される。
【０１７２】
例示的なＤＸＳポリペプチドとしては、ＤＸＳポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。（本明細書に記載されるものなどの）標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸に変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。例示的なＤＸＳポリペプチド、および核酸、およびＤＸＳ活性を測定する方法は、国際公開第２００９／０７６６７６号パンフレット、国際公開第２０１０／００３００７号パンフレット、国際公開第２００９／１３２２２０号パンフレット、および米国特許第２００９／０２０３１０２号明細書、米国特許第２０１０／０００３７１６号明細書、および米国特許第２０１０／００４８９６４号明細書により詳細に記載される。
【０１７３】
特に、ＤＸＳポリペプチドは、ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸を変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
【０１７４】
ＤＸＲポリペプチドは、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ＤＸＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＲポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
【０１７５】
ＭＣＴポリペプチドは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）を４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ＭＥＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＭＣＴポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
【０１７６】
ＣＭＫポリペプチドは、４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）を２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ＣＤＰ−ＭＥを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＣＭＫポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
【０１７７】
ＭＣＳポリペプチドは、２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２、４−シクロ二リン酸（ＭＥ−ＣＰＰまたはｃＭＥＰＰ）に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ＣＤＰ−ＭＥＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＭＣＳポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
【０１７８】
ＨＤＳポリペプチドは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２、４−シクロ二リン酸を（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブテ−２−エン−１−イル二リン酸（ＨＭＢＰＰまたはＨＤＭＡＰＰ）に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ＭＥ−ＣＰＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＨＤＳポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
【０１７９】
ＨＤＲポリペプチドは、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブテ−２−エン−１−イル二リン酸をイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ＨＭＢＰＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＨＤＲポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
【０１８０】
イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、およびＤＸＰ経路ポリペプチドの起源生物
イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、および／またはＤＸＰ経路核酸（およびそれらがコードするポリペプチド）は、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、および／またはＤＸＰ経路核酸を天然で含有する、任意の生物から得られ得る。イソプレンは、細菌、酵母、植物、および動物などの多様な生物によって天然に形成される。いくつかの生物が、イソプレンを生成するためのＭＶＡ経路を含有する。イソプレンシンターゼ核酸は、例えば、イソプレンシンターゼを含有する任意の生物から得られ得る。ＭＶＡ経路核酸は、例えば、ＭＶＡ経路を含有する任意の生物から得られ得る。ＩＤＩおよびＤＸＰ経路核酸は、例えば、ＩＤＩおよびＤＸＰ経路を含有する任意の生物から得られ得る。
【０１８１】
イソプレンシンターゼ、ＤＸＰ経路、および／またはＩＤＩ核酸の核酸配列は、細菌、真菌、植物、藻類、またはラン藻から単離され得る。例示的な起源生物としては、例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）種などの酵母、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）種などの細菌、またはメタノサルシナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）の種（例えば、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）、葛またはポプラ（例えば、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）またはウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）×ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ）ＣＡＣ３５６９６）またはアスペン（例えば、ポプルス・トレムロイデス（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ））などの植物が挙げられる。使用し得る例示的なイソプレンシンターゼ、および／またはＩＤＩポリペプチド起源は、国際公開第２００９／０７６６７６号パンフレット、国際公開第２０１０／００３００７号パンフレット、国際公開第２００９／１３２２２０号パンフレット、国際公開第２０１０／０３１０６２号パンフレット、国際公開第２０１０／０３１０６８号パンフレット、国際公開第２０１０／０３１０７６号パンフレット、国際公開第２０１０／０１３０７７号パンフレット、国際公開第２０１０／０３１０７９号パンフレット、国際公開第２０１０／１４８１５０号パンフレット、国際公開第２０１０／０７８４５７号パンフレット、および国際公開第２０１０／１４８２５６号パンフレットにもまた記載される。
【０１８２】
いくつかの態様では、起源生物は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）種、またはカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種などの酵母である。
【０１８３】
いくつかの態様では、起源生物は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）またはＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の株、Ｐ．シトレア（Ｐ．ｃｉｔｒｅａ）などのパントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ）の株、Ｐ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）などのシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の株、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）またはＳ．ルビギノーサス（Ｓ．ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ）などのストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の株、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）の株、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒの株、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の株、またはメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）などの古細菌の株などの細菌である。
【０１８４】
本明細書の用法では、「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」としては、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ロータス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、およびＢ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）をはじめとするが、これに限定されるものではない、当業者に知られているような「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」内の全ての種が挙げられる。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、分類学の再編成を継続的に受けていることが認識されている。したがって本属は、現在は「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（ＧｅｏＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」と命名されている、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの生物をはじめとするが、これに限定されるものではない、再分類された種を含むことが意図される。酸素の存在下における耐性内生胞子の生成は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）を決定付ける特徴と見なされるが、この特徴は、最近命名された、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アンフィバチルス属（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アネウリニバチルス属（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アノキシバチルス属（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、フィロバチルス属（Ｆｉｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、グラシリバチルス属（Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハロバチルス属（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サリバシルス属（Ｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サーモバチルス属（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ウレイバチルス属（Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびバルジバチルス属（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）にも当てはまる。
【０１８５】
いくつかの態様では、起源生物は、グラム陽性細菌である。非限定的例としては、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）（例えば、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、Ｓ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、またはＳ．グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）、およびバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の株が挙げられる。いくつかの態様では、起源生物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種などのグラム陰性細菌である。
【０１８６】
いくつかの態様では、起源生物は、マメ亜科（Ｆａｂｏｉｄｅａｅ）などのマメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）からの植物などの植物である。いくつかの態様では、起源生物は、葛、ポプラ（ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）×ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ）ＣＡＣ３５６９６など）、アスペン（ポプルス・トレムロイデス（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓなど）、またはヨーロッパナラ（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｒｏｂｕｒ）である。
【０１８７】
いくつかの態様では、起源生物は、緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類、ユーグレナ藻類、クロミスタ、または渦鞭毛藻類などの藻類である。
【０１８８】
いくつかの態様では、起源生物は、形態学に基づいて、以下の群のいずれかに分類されるラン藻などのラン藻である：クロオコッカス目（Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、プレウロカプサ目（Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａｌｅｓ）、ユレモ目（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ）、ネンジュモ目（Ｎｏｓｔｏｃａｌｅｓ）、またはスティゴネマ目（Ｓｔｉｇｏｎｅｍａｔａｌｅｓ）。
【０１８９】
代案の下流ＭＶＡ経路を通じてイソプレンを産生できる組換え細胞
したがって、本明細書に記載される組換え細胞（本明細書に記載されるように改変された宿主細胞を含む）は、同一条件下で培養された場合、（ｉ）ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉ）イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｖ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を欠いている同一細胞を上回る濃度のイソプレンを産生する能力を有する。細胞は、ＩＤＩポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなり得る。いくつかの態様では、細胞は、ホスホケトラーゼをコードする１つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなり得る。
【０１９０】
いくつかの態様では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、およびイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸は、宿主細胞の染色体のヌクレオチド配列に組み込まれた異種核酸である。その他の態様では、１つまたは複数の異種核酸は、プラスミドに組み込まれる。なおも別の態様では、１つまたは複数の異種核酸の少なくとも１つが、細胞の染色体のヌクレオチド配列に組み込まれる一方で、１つまたは複数の異種核酸配列の少なくとも１つは、プラスミドに組み込まれる。組換え細胞はホスホメバロン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドを含まないイソプレン産生細胞と比較して、少なくとも５％高い量のイソプレンを産生し得る。代案としては、組換え細胞は、包括的に、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％高い、ならびにこれらの数の間の任意の数値分高いイソプレンを産生し得る。
【０１９１】
本発明の一態様では、本明細書で提供されるのは、（ｉ）ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉ）イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、（ｉｖ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸、および（ｖ）１つまたは複数のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなる組換え細胞である。細胞は、ＩＤＩポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなり得る。いくつかの態様では、細胞は、ホスホケトラーゼをコードする１つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなり得る。１つまたは複数の異種核酸のいずれかが、構成的プロモーターと作動可能に連結し得て、誘導性プロモーターと作動可能に連結し得て、または誘導性および構成的プロモーターの組み合わせと作動可能に連結し得る。１つまたは複数の異種核酸は、さらに、強力なプロモーター、弱いプロモーター、および／または中程度のプロモーターと、作動可能に連結し得る。ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニルキナーゼ、メバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチド、ＤＸＰ経路ポリペプチド、およびイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸の１つまたは複数を、宿主細胞のゲノムに組み込み得て、または細胞内で安定して発現させ得る。１つまたは複数の異種核酸は、さらにベクター上に存在し得る。
【０１９２】
本明細書に記載される組成物また方法のいずれかに従った細胞によるイソプレンの生成は、増大させ得る（例えば、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチド、イソペンテニルキナーゼポリペプチド、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＭＶＡ経路ポリペプチド、および／またはＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸の発現によって増大させる）。本明細書の用法では、「増大した」イソプレン生成とは、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸を有しない細胞と比較して、本明細書に記載される組成物および方法のいずれかによって記載される細胞による、イソプレンの細胞生産性指標（ＣＰＩ）増大、イソプレンの力価増大、イソプレンの質量収率増大、および／またはイソプレンの比生産性増大を指す。本明細書に記載される特定の実施形態では、宿主細胞は、さらに改変されて、ＭＶＡ生成への炭素流を増大させる。
【０１９３】
本明細書に記載される組換え細胞によるイソプレンの生成は、約５％から約１，０００，０００倍増大させ得る。特定の態様では、イソプレンの生成は、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を発現しない細胞によるイソプレンの生成と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍、または約５０〜約２００倍）増大させ得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、宿主細胞をさらに修飾および／または改変して、ＭＶＡ生成への炭素流を増大させ、それによってホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸が発現されず、メバロン酸生成への炭素流を増大させるために修飾および／または改変されていない細胞によるイソプレンの生成と比較して、イソプレンの生成増大を提供する。
【０１９４】
その他の態様では、本明細書に記載される組換え細胞によるイソプレンの生成は、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を発現しない細胞によるイソプレンの生成と比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍、または１，０００，０００倍のいずれかで増大させ得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、宿主細胞をさらに修飾および／または改変して、ＭＶＡ生成への炭素流を増大させ、それによってホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸が発現されず、メバロン酸生成への炭素流を増大させるために修飾および／または改変されていない細胞によるイソプレンの生成と比較して、イソプレンの生成増大を提供する。
【０１９５】
組換え細胞を使用して代案の下流ＭＶＡ経路を通じてイソプレンを生成する方法
これもまた本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される組換え細胞のいずれかを培養するステップを含んでなる、イソプレンを生成する方法である。一態様では、イソプレンは、（ｉ）ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉ）イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｖ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなる組換え細胞を培養することで生成し得る。別の態様では、イソプレンは、本明細書に記載される酵素経路のいずれかの調節と、（ｉ）ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉ）イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｖ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸とを含んでなる組換え細胞を培養することで生成し得る。特定の態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、またはＳ３７８Ｐａ３−２からの、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする、内在性核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。特定の態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、メタノカルドコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、またはメタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）からのイソペンテニルキナーゼをコードする核酸を含んでなる。
【０１９６】
したがって、本明細書で提供されるのは、（ａ）イソプレンの生成に適した条件下で、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸と、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸とを含んでなる細胞を培養するステップと、（ｂ）イソプレンを生成するステップとを含んでなる、イソプレンを生成する方法である。細胞は、上述のＭＶＡ経路ポリペプチド（例えば、上流ＭＶＡ経路およびＭＶＫ）、および上述のイソプレンシンターゼポリペプチド（例えば、クズ属（Ｐｕｅｒａｒｉａ）イソプレンシンターゼ）のいずれかをコードする、１つまたは複数の核酸分子をさらに含んでなり得る。いくつかの態様では、組換え細胞は、本明細書に記載される細胞のいずれか１つであり得る。本明細書に記載されるイソプレンシンターゼまたはその変異体のいずれか、本明細書に記載される宿主細胞株のいずれか、本明細書に記載されるプロモーターのいずれか、および／または本明細書に記載されるベクターのいずれかはまた、本明細書に記載される方法で使用し得る、本明細書に記載されるエネルギー源（例えば、グルコースまたは任意のその他の六炭糖）のいずれかを使用して、イソプレンを生成するのにも使用し得る。いくつかの態様では、イソプレンを生成する方法は、イソプレンを回収するステップをさらに含んでなる。特定の態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、またはＳ３７８Ｐａ３−２からの、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする、内在性核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。特定の態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、メタノカルドコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、またはメタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）からのイソペンテニルキナーゼをコードする核酸を含んでなる。
【０１９７】
特定の態様では、本明細書で提供されるのは、（ａ）イソプレンを生成するのに適切な条件下で、ヘルペトシフォン・アウランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、またはＳ３７８Ｐａ３−２からのホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドと、ヘルペトシフォン・アウランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、メタノカルドコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、またはメタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）からのイソペンテニルキナーゼポリペプチドとをコードする、１つまたは複数の異種核酸を含んでなる組換え細胞を培養するステップと、（ｂ）イソプレンを生成するステップとを含んでなる、イソプレンを生成する方法である。細胞は、上述の上流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸分子と、上述の任意のＭＶＫポリペプチドと、上述のイソプレンシンターゼポリペプチドのいずれかとをさらに含んでなり得る。いくつかの態様では、組換え細胞は、本明細書に記載される細胞のいずれかであり得る。
【０１９８】
メバロン酸生成への炭素流動増大のために操作された様々な酵素経路を有する、本明細書に記載される組換え細胞を使用して、イソプレンを生成し得る。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなり得る。いくつかの実施形態では、組換え細胞をさらに改変して、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡおよび／またはｒｐｉＢ）、Ｄ−リブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡおよび／またはｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼＢ（ｔａｌＢ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａおよび／またはｅｕｔＤ）からなる群から選択される遺伝子の１つまたは複数の活性を増大させる得る。別の実施形態では、これらの組換え細胞は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、６−ホスホフルクトキナーゼ−１（ｐｆｋＡおよび／またはｐｆｋＢ）、フルクトースビスホスフェートアルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、および／またはｆｂａＣ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡおよび／またはｇａｐＢ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、ＥＩ（ｐｔｓＩ）、ＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）、ＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）、および／またはＨＰｒ（ｐｔｓＨ）遺伝子をはじめとする、１つまたは複数の遺伝子の活性を低下させるように、さらに改変し得る。
【０１９９】
いくつかの態様では、組換え細胞は、組換え細胞によるイソプレンの生成を可能にする条件下において、培地中で培養される。いくつかの実施形態では、イソプレン量は、ピーク絶対生産性の時点で評価される。いくつかの実施形態では、細胞のピーク絶対生産性は、本明細書で開示されるイソプレン量のいずれかに関する。「ピーク絶対生産性」とは、特定期間にわたる細胞培養（例えば、特定の発酵作業中の細胞培養）中の発生気体中のイソプレンの最大絶対量を意味する。「ピーク絶対生産性時点」とは、特定期間にわたる細胞培養（例えば、特定の発酵作業中の細胞培養）中に、発生気体中のイソプレンの絶対量が最大である、発酵作業中の時点を意味する。
【０２００】
いくつかの実施形態では、イソプレン量は、ピーク比生産性時点で評価される。いくつかの実施形態では、細胞の比生産性は、本明細書で開示される細胞あたりイソプレン量のいずれかに関する。「ピーク比生産性」とは、特定期間にわたる細胞培養（例えば、特定の発酵作業中の細胞培養）中に、細胞あたりで生成するイソプレンの最大量を意味する。「ピーク比生産性時点」とは、細胞あたりで生成するイソプレン量が最大である、特定期間にわたる細胞培養（例えば、特定の発酵作業中の細胞培養）中の時点を意味する。ピーク比生産性は、６００ｎｍ（ＯＤ６００）の光学濃度における測定で、総生産性を細胞量で除して判定される。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、イソプレン量は、ピーク比容積生産性の時点で測定される。いくつかの実施形態では、細胞のピーク比容積生産性は、本明細書で開示される容積あたり時間あたりのイソプレン量のいずれかに関する。「ピーク容積生産性」とは、特定期間にわたる細胞培養（例えば、特定の発酵作業中の細胞培養）中に、ブロス容積（細胞および細胞培地の容積を含む）あたりで生成するイソプレンの最大量を意味する。「ピーク比容積生産性時点」とは、ブロス容積あたりで生成するイソプレン量が最大である、特定期間にわたる細胞培養（例えば、特定の発酵作業中の細胞培養）中の時点を意味する。ピーク比容積生産性は、総生産性をブロス容積および時間で除して判定される。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、イソプレン量は、ピーク濃度の時点で測定される。いくつかの実施形態では、細胞のピーク濃度は、本明細書で開示されるイソプレン量のいずれかに関する。「ピーク濃度」とは、特定期間にわたる細胞培養（例えば、特定の発酵作業中の細胞培養）中に生成する、イソプレンの最大量を意味する。「ピーク濃度時点」とは、細胞あたりで生成するイソプレン量が最大である、特定期間にわたる細胞培養（例えば、特定の発酵作業中の細胞培養）中の時点を意味する。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、細胞の平均比容積生産性は、本明細書で開示される容積あたり時間あたりのイソプレン量のいずれかに関する。「平均容積生産性」とは、特定期間にわたる細胞培養（例えば、特定の発酵作業中の細胞培養）中に、ブロス容積（細胞および細胞培地の容積を含む）あたりで生成するイソプレンの平均量を意味する。平均容積生産性は、総生産性をブロス容積および時間で除して、判定される。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、イソプレンの累積総量が測定される。いくつかの実施形態では、細胞の累積総生産性は、本明細書で開示されるイソプレン量のいずれかに関する。「累積総生産性」とは、特定期間にわたる細胞培養（例えば、特定の発酵作業中の細胞培養）中に生成する、イソプレンの累積総量を意味する。
【０２０５】
いくつかの態様では、（細胞が培養中にある実施例では）本明細書に記載される組換え細胞のいずれかは、１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００ｎｍｏｌｅイソプレン／ｇ湿潤細胞重量／時間（ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ）以上のいずれかをほぼ超える、またはそのいずれかのイソプレンを産生する。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約２〜約１００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１００〜約５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１５０〜約５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約５００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１，０００〜約２，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、または約２，０００〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒなど、約２〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒである。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１００〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約２００〜約２，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約２００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約３００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、または約４００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒである。
【０２０６】
ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒの単位中のイソプレンの量は、特にイソプレン生成測定に関して、その内容全体を参照によって援用する、米国特許第５，８４９，９７０号明細書で開示されるように測定し得る。例えば、ｎ−オクタン／ｐｏｒａｓｉｌ  Ｃカラム（Ａｌｌｔｅｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌ．）を用いて等温的に（８５℃）操作され、ＲＧＤ２酸化第二水銀還元ガス検出器（Ｔｒａｃｅ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）と連結されたシステムなどの標準的ガスクロマトグラフィーシステムを使用して、２ｍＬのヘッドスペース（例えば、２００ｒｐｍで振盪しながら密封したバイアル内で３２℃でおよそ３時間培養した２ｍＬの培養物などからのヘッドスペース）をイソプレンについて分析する（例えば、特にイソプレン生成の測定に関して、それぞれその全体を参照によって本明細書に援用する、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，Ａｔｍｏｓ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．２７Ａ：２６８９−２６９２，１９９３；Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９７：１５８８−１５９１，１９９１を参照されたい）。ガスクロマトグラフィーの面積単位は、標準的イソプレン濃度検量線によって、ナノモルのイソプレンに変換される。いくつかの実施形態では、湿潤細胞重量の細胞グラム数は、細胞培養サンプルのＡ６００値を得て、次に既知のＡ６００値がある細胞培養の湿潤重量の検量線に基づいて、Ａ６００値を細胞グラム数に変換することで、計算される。いくつかの実施形態では、細胞のグラム数は、Ａ６００値が１の１リットルのブロス（細胞培地および細胞を含む）が、１グラムの湿潤細胞重量を有すると仮定して推定される。値はまた、３時間などの培養実施時間数で除される。
【０２０７】
いくつかの態様では、培養中の組換え細胞は、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、１００，０００ｎｇイソプレン／ｇ湿潤細胞重量／ｈｒ（ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ）以上のイソプレンを生成する。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約２〜約１００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１００〜約５００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約５００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１，０００〜約２，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、または約２，０００〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈなどの約２〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈである。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１００〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約２００〜約２，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約２００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約３００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、または約４００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈである。ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ単位のイソプレンの量は、上で論じたｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ単位のイソプレン生成量の値に、（下の式５に記載されるようにして）６８．１を乗じて計算し得る。
【０２０８】
いくつかの態様では、培養中の組換え細胞は、１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００ｍｇイソプレン／Ｌブロス（ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、式中、ブロス容積は、細胞および細胞培地の容積を含む）以上のいずれかをほぼ超える、またはそのいずれかである、イソプレンの累積力価（総量）を生成する。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈなどの約２〜約１００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、約１００〜約５００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、約５００〜約１，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、約１，０００〜約２，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、または約２，０００〜約５，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈである。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、約１００〜約５，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、約２００〜約２，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、約２００〜約１，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、約３００〜約１，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、または約４００〜約１，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈである。
【０２０９】
振盪フラスコまたは類似培養物からのイソプレンｍｇ／Ｌヘッドスペース単位のイソプレンの比生産性は、ＯＤ６００値がおよそ１．０の細胞培養から１ｍｌのサンプルを採取して、それを２０ｍＬのバイアルに入れて３０分間培養し、次にヘッドスペース内のイソプレンの量を測定することで評価し得る。ＯＤ６００値が１．０でない場合、測定値をＯＤ６００値で除して、１．０のＯＤ６００値について正規化し得る。ｍｇイソプレン／Ｌヘッドスペースの値は、３８を乗じることで、ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ／培養ブロスＯＤ６００に変換し得る。ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ／ＯＤ６００単位の値に、時間数とＯＤ６００値を乗じて、ｍｇイソプレン／Ｌブロス単位の累積力価が得られ得る。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、培養中の組換え細胞は、約０．１、１．０、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１１００、１２００、１３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、３，０００、３，１００、３，２００、３，３００、３，４００、３，５００ｍｇイソプレン／Ｌブロス／ｈｒ（ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、式中、ブロス容積は、細胞および細胞培地の容積を含む）以上のイソプレンの平均容積生産性を有する。いくつかの実施形態では、イソプレンの平均容積生産性は、約０．１〜約１００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、約１００〜約５００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、約５００〜約１，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、約１，０００〜約１，５００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、約１，５００〜約２，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、約２，０００〜約２，５００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、約２，５００〜約３，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、または約３，０００〜約３，５００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒなどの約０．１〜約３，５００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒである。いくつかの実施形態では、イソプレンの平均容積生産性は、約１０〜約３，５００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、約１００〜約３，５００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、約２００〜約１，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、約２００〜約１，５００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、約１，０００〜約３，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、または約１，５００〜約３，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒである。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、培養中の組換え細胞は、約０．５、１．０、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１１００、１２００、１３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、３，０００、３，１００、３，２００、３，３００、３，４００、３，５００、３，７５０、４，０００、４，２５０、４，５００、４，７５０、５，０００、５，２５０、５，５００、５，７５０、６，０００、６，２５０、６，５００、６，７５０、７，０００、７，２５０、７，５００、７，７５０、８，０００、８，２５０、８，５００、８，７５０、９，０００、９，２５０、９，５００、９，７５０、１０，０００、１２，５００、１５，０００ｍｇイソプレン／Ｌブロス／ｈｒ（ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、式中、ブロス容積は、細胞および細胞培地の容積を含む）以上のイソプレンのピーク容積生産性を有する。いくつかの実施形態では、イソプレンのピーク容積生産性は、約０．５〜約１０ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、約１．０〜約１００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、約１００〜約５００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、約５００〜約１，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、約１，０００〜約１，５００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、約１，５００〜約２，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、約２，０００〜約２，５００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、約２，５００〜約３，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、約３，０００〜約３，５００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、約３，５００〜約５，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、約５，０００〜約７，５００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、約７，５００〜約１０，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、約１０，０００〜約１２，５００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈ、または約１２，５００〜約１５，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒなどの約０．５〜約１５，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒである。いくつかの実施形態では、イソプレンのピーク容積生産性は、約１０〜約１５，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、約１００〜約２，５００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、約１，０００〜約５，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、約２，５００〜約７，５００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、約５，０００〜約１０，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、約７，５００〜約１２，５００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ、または約１０，０００〜約１５，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒである。
【０２１２】
発酵槽内における、ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ単位の瞬間イソプレン生成速度は、発酵槽発生気体のサンプルを採取して、イソプレンの量（ｍｇイソプレン／Ｌｇａｓなどの単位）について分析し、この値に、発生気体が１リットルのブロス通過する速度（例えば、１ｖｖｍ（空気量／ブロス容積／分間）では、これは毎時６０Ｌｇａｓである）を乗じることで、評価し得る。したがって、１ｍｇ／Ｌガスのレベルの発生気体は、１ｖｖｍの気流における、６０ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒの瞬間生成速度に相当する。所望ならば、ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ単位の値をＯＤ６００値で除して、ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ／ＯＤ単位の比速度が得られ得る。ｍｇイソプレン／Ｌｇａｓの平均値に、発酵中に発酵ブロス１リットルあたりで散布された発生気体の総量を乗じることで、この平均発生気体イソプレン濃度を、総生成物生産性（発酵ブロス１リットルあたりのイソプレングラム数、ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ）に変換し得る。したがって、１ｖｖｍで１０時間にわたる０．５ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒの平均発生気体イソプレン濃度は、３００ｍｇイソプレン／Ｌｂｒｏｔｈの総生成物濃度に相当する。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、培養中の細胞は、細胞培養液中の約０．００１５、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、２．０、２．２、２．４、２．６、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０、１５．０、１６．０、１７．０、１８．０、１９．０、２０．０、２１．０、２２．０、２３．０、２３．２、２３．４、２３．６、２３．８、２４．０、２５．０、３０．０、３１．０、３２．０、３３．０、３５．０、３７．５、４０．０、４５．０、４７．５、５０．０、５５．０、６０．０、６５．０、７０．０、７５．０、８０．０、８５．０、または９０．０モル濃度％以上の炭素をイソプレンに変換する。いくつかの実施形態では、炭素からイソプレンへの変換百分率は、約０．００２〜約０．００５％、約０．００５〜約０．０１％、約０．０１〜約０．０５％、約０．０５〜約０．１５％、０．１５〜約０．２％、約０．２〜約０．３％、約０．３〜約０．５％、約０．５〜約０．８％、約０．８〜約１．０％、約１．０〜約１．６％、約１．６〜約３．０％、約３．０〜約５．０％、約５．０〜約８．０％、約８．０〜約１０．０％、約１０．０〜約１５．０％、約１５．０〜約２０．０％、約２０．０〜約２５．０％、約２５．０％〜３０．０％、約３０．０％〜３５．０％、約３５．０％〜４０．０％、約４５．０％〜５０．０％、約５０．０％〜５５．０％、約５５．０％〜６０．０％、約６０．０％〜６５．０％、約６５．０％〜７０．０％、約７５．０％〜８０．０％、約８０．０％〜８５．０％、または約８５．０％〜９０．０％などの約０．００２〜約９０．０モル濃度％である。いくつかの実施形態では、炭素からイソプレンへの変換百分率は、約０．００２〜約０．４モル濃度％、０．００２〜約０．１６モル濃度％、０．０４〜約０．１６モル濃度％、約０．００５〜約０．３モル濃度％、約０．０１〜約０．３モル濃度％、約０．０５〜約０．３モル濃度％、約０．１ｔｏ０．３モル濃度％、約０．３〜約１．０モル濃度％、約１．０〜約５．０モル濃度％、約２〜約５．０モル濃度％、約５．０〜約１０．０モル濃度％、約７〜約１０．０モル濃度％、約１０．０〜約２０．０モル濃度％、約１２〜約２０．０モル濃度％、約１６〜約２０．０モル濃度％、約１８〜約２０．０モル濃度％、約１８〜２３．２モル濃度％、約１８〜２３．６モル濃度％、約１８〜約２３．８モル濃度％、約１８〜約２４．０モル濃度％、約１８〜約２５．０モル濃度％、約２０〜約３０．０モル濃度％、約３０〜約４０．０モル濃度％、約３０〜約５０．０モル濃度％、約３０〜約６０．０モル濃度％、約３０〜約７０．０モル濃度％、約３０〜約８０．０モル濃度％、または約約３０〜約９０．０モル濃度％である。
【０２１４】
炭素からイソプレンへの変換百分率（「％炭素収率」とも称される）は、生成されたイソプレン中のモル炭素モル数を、炭素源中の炭素モル数（バッチ添加されおよび供給されたグルコースおよび酵母抽出物中の炭素モル数など）で除して、この数に１００％を乗じて、（式１に示されるような）百分率値を得る。
式１
％炭素収率＝（生成されたイソプレン中の炭素モル数）／（炭素源中の炭素モル数）＊１００
【０２１５】
炭素からイソプレンへの変換百分率は、式２に示されるように計算し得る。
式２
％炭素収率＝（３９．１ｇイソプレン＊１／６８．１ｍｏｌ／ｇ＊５Ｃ／ｍｏｌ）／［（１８１２２１ｇグルコース＊１／１８０ｍｏｌ／ｇ＊６Ｃ／ｍｏｌ）＋（１７７８０ｇ酵母抽出物＊０．５＊１／１２ｍｏｌ／ｇ）］＊１００＝０．０４２％
【０２１６】
当業者は、イソプレン生成速度またはイソプレン生成量を、任意のその他の単位に容易に変換し得る。単位間の相互変換のための例示的な方程式を下に列挙する。
（総および比）イソプレン生成速度単位
式３
１ｇイソプレン／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ＝１４．７ｍｍｏｌイソプレン／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ（総容積速度）
式４
１ｎｍｏｌイソプレン／ｇｗｃｍ／ｈｒ＝１ｎｍｏｌイソプレン／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ／ＯＤ６００（この変換は、ＯＤ６００値が１である１リットルのブロスが、１グラムの湿潤細胞重量を有すると想定する。）
式５
１ｎｍｏｌイソプレン／ｇｗｃｍ／ｈｒ＝６８．１ｎｇイソプレン／ｇｗｃｍ／ｈｒ（イソプレンの分子量を与える）
式６
（１Ｌの培養ブロスあたり９０Ｌ／ｈｒのＯ２流速における）１ｎｍｏｌイソプレン／ＬｇａｓＯ２／ｈｒ＝９０ｎｍｏｌイソプレン／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ
式７
６０Ｌｇａｓ／Ｌｂｒｏｔｈ（１ｖｖｍ）の流速における、１μｇイソプレン／Ｌｇａｓ発生気体中のイソプレン＝６０μｇイソプレン／Ｌｂｒｏｔｈ／ｈｒ
（総および比）力価単位
式８
１ｎｍｏｌイソプレン／ｍｇ細胞タンパク質＝１５０ｎｍｏｌイソプレン／Ｌｂｒｏｔｈ／ＯＤ６００（この変換は、ＯＤ６００値が１である１リットルのブロスが、およそ１５０ｍｇの全細胞タンパク質を有すると想定する）（比生産性）
式９
１ｇイソプレン／Ｌｂｒｏｔｈ＝１４．７ｍｍｏｌイソプレン／Ｌｂｒｏｔｈ（総力価）
【０２１７】
所望ならば、式１０を使用して、細胞の湿潤重量をはじめとする任意の単位を、細胞の乾燥重量をはじめとする対応する単位に変換し得る。
式１０
細胞乾燥重量＝（細胞湿潤重量）／３．３
【０２１８】
発明に包含されるいくつかの実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする１つまたは複数の異種核酸と、イソペンテニルリン酸キナーゼをコードする１つまたは複数の異種核酸とを含んでなる細胞は、基本的に同一条件下で増殖させた、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルリン酸キナーゼをコードする異種核酸のない対応する細胞から生成されるイソプレンの量よりも、少なくともまたはおよそ２倍、３倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、４００倍以上の量のイソプレンを産生する。
【０２１９】
いくつかの態様では、培養中の組換え細胞によって産生されるイソプレンは、容量基準で発酵発生気体の、少なくとも約１、２、５、１０、１５、２０、または２５％を構成する。いくつかの態様では、イソプレンは、発生気体の容量基準で約５〜約１５％、約１５〜約２５％、約１０〜約２０％、または約１〜約１０％などの約１〜約２５％を構成する。
【０２２０】
特定の実施形態では、イソプレンを生成する方法は、（ａ）ホスホメバロン酸ポリペプチドを内因的に発現せず、（ｉ）イソペンテニルキナーゼを発現する１つまたは複数の核酸、（ｉｉ）１つまたは複数のＭＶＡ経路ペプチド、および（ｉｉｉ）イソプレンシンターゼと共に、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドをコードする遺伝子の１つまたは複数のコピーを異種性に発現する組換え細胞（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない）を培養するステップと、（ｂ）イソプレンを生成するステップとを含んでなり得て、組換え細胞は、ホスホメバロン酸ポリペプチドをコードする遺伝子の１つまたは複数の異種コピーを欠く同一細胞と比較して、低下した酸素取り込み速度（ＯＵＲ）を示す。特定の実施形態では、ホスホメバロン酸ポリペプチドをコードする遺伝子の１つまたは複数の異種コピーを発現する組換え細胞は、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドを発現しない組換え細胞と比較して、ＯＵＲに最大で１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍または７倍の低下を示す。別の実施形態では、イソプレンを生成する方法は、（ａ）ホスホメバロン酸ポリペプチドおよびイソペンテニルキナーゼを内因的に発現せず、（ｉ）１つまたは複数の核酸を発現する１つまたは複数のＭＶＡ経路ペプチド、および（ｉｉ）イソプレンシンターゼと共に、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドおよびイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする遺伝子の１つまたは複数のコピーを異種性に発現する組換え細胞（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない）を培養するステップと、（ｂ）イソプレンを生成するステップとを含んでなり得て、組換え細胞は、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドおよびイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする遺伝子の１つまたは複数の異種コピーを欠く同一細胞と比較して、低下した酸素取り込み速度（ＯＵＲ）を示す。特定の実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドおよびイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする遺伝子の１つまたは複数の異種コピーを発現する組換え細胞は、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドおよびイソペンテニルキナーゼポリペプチドを発現しない組換え細胞と比較して、ＯＵＲに最大で１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍または７倍の低下を示す。
【０２２１】
一態様では、本明細書に記載されるのは、イソプレンを含んでなる組成物である。いくつかの実施形態では、イソプレンを含んでなる組成物は、本明細書に記載される組換え細胞のいずれかによって産生される。例えば、イソプレンを含んでなる組成物は、（ｉ）ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉ）イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｖ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなる組換え細胞によって産生され得て、前記組換え細胞の培養がイソプレンの生成を提供する。いくつかの実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、古細菌に由来する。さらなる実施形態では、古細菌は、デスルフロコッカス目（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スルフォロブス目（Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ）、サーモプロテウス目（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ケナルカエアレス目（Ｃｅｎａｒｃｈａｅａｌｅｓ）、ニトロソプミラレス目（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌａｌｅｓ）、アーキオグロブス目（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロバクテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノコッカス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、メタノセラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａｌｅｓ）、メタノサルシナ目（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ）、メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノミクロビウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、メタノピラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒａｌｅｓ）、サーモコッカス目（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、サーモプラズマ目（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）、コルアーケオタ門（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ）、およびナノアーケオタ門（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、Ｓ３７８Ｐａ３−２、およびアナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）からなる群から選択される微生物に由来する。いくつかの実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１６〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、古細菌に由来する。さらなる実施形態では、古細菌は、デスルフロコッカス目（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スルフォロブス目（Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ）、サーモプロテウス目（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ケナルカエアレス目（Ｃｅｎａｒｃｈａｅａｌｅｓ）、ニトロソプミラレス目（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌａｌｅｓ）、アーキオグロブス目（Ａｒｃ��ａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロバクテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノコッカス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、メタノセラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａｌｅｓ）、メタノサルシナ目（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ）、メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノミクロビウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、メタノピラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒａｌｅｓ）、サーモコッカス目（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、サーモプラズマ目（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）、コルアーケオタ門（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ）、およびナノアーケオタ門（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、メタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、メタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）、およびアナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）からなる群から選択される微生物に由来する。いくつかの実施形態では、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１９〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。さらなる実施形態では、植物イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（Ｐｕｅｒａｒｉａ）またはポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）からのポリペプチドまたはその変異体である。別のさらなる実施形態では、植物イソプレンシンターゼポリペプチドは、プエラリア・モンタナ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ）またはプエラリア・ロバタ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｌｏｂａｔａ）、ポプルス・トレムロイデス（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）、セイヨウハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｎｉｇｒａ）、コットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、またはウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）×ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ）雑種からのポリペプチドまたはその変異体である。いくつかの実施形態では、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドは、（ａ）２分子のアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｂ）マロニルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｃ）アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素；（ｄ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；および（ｅ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素から選択される。いくつか���実施形態では、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドは、（ａ）メバロン酸をリン酸化してメバロン酸５−リン酸を形成する酵素；（ｂ）メバロン酸５−リン酸をリン酸化してメバロン酸５−ピロリン酸を形成する酵素；および（ｃ）メバロン酸５ピロリン酸を脱炭酸してイソペンテニルピロリン酸を形成する酵素から選択される。いくつかの実施形態では、イソプレンを含んでなる組成物は、イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる組換え細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、イソプレンを含んでなる組成物は、メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する弱力化酵素を含んでなる、組換え細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、イソプレンを含んでなる組成物は、メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する弱力化酵素を含んでなる、組換え細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、イソプレンを含んでなる組成物は、１つまたは複数の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる、組換え細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、イソプレンを含んでなる組成物は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路の１つまたは複数の弱力化酵素を含んでなる、組換え細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、イソプレンを含んでなる組成物は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、異種核酸をさらに含んでなる、組換え細胞によって産生される。本明細書の実施形態のいずれかでは、関心のあるポリペプチドをコードする核酸（例えば、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチド、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドなど）は、異種核酸または内在性核酸であり得る。
【０２２２】
イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを産生できる組換え細胞
イソプレノイドは、多数の生物中で、ＭＶＡ経路の最終生成物であるイソプレノイド前駆体分子の合成から生成され得る。上述のように、イソプレノイドは、重要なクラスの化合物に相当し、例えば、食品および飼料補給剤、フレーバーおよび臭気化合物、および抗がん、抗マラリア、抗真菌、および抗菌化合物を含む。
【０２２３】
分子クラスとして、イソプレノイドは、化合物に含まれるイソプレン単位数に基づいて分類される。モノテルペンは、１０個の炭素または２個のイソプレン単位を含んでなり、セスキテルペンは、１５個の炭素または３個のイソプレン単位を含んでなり、ジテルペンは、２０炭素または４個のイソプレン単位を含んでなり、セステルテルペンは、２５個の炭素または５個のイソプレン単位を含んでなり、以下同じように続く。ステロイド（一般的に約２７個の炭素を含んでなる）は、イソプレノイドの切断または再構成生成物である。
【０２２４】
イソプレノイドは、イソプレノイド前駆体分子ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰから生成され得る。これらの多様な化合物は、これらの比較的単純な汎用前駆体から誘導され、保存的ポリプレニルピロリン酸シンターゼのグループによって合成される（Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１年３月；１５５（３）：１０７９−９０）。それらの特有の生理学的機能を反映する、これらの直鎖プレニルピロリン酸の様々な鎖長は、一般に、アリル性基質（ジメチルアリル二リン酸（Ｃ５−ＤＭＡＰＰ）、ピロリン酸ゲラニル（Ｃ１０−ＧＰＰ）、ピロリン酸ファルネシル（Ｃ１５−ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニルピロリン酸（Ｃ２０−ＧＧＰＰ））と、対応する数のイソペンテニルピロリン酸（Ｃ５−ＩＰＰ）との縮合反応を通じて、ポリプレニルピロリン酸シンターゼの非常に発達した活性部位によって判定される（Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１年３月；１５５（３）：１０７９−９０）。
【０２２５】
イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドは、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド生成のための、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸とイソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸とを含んでなる、組換え宿主細胞のいずれかを使用して生成し得る。いくつかの態様では、これらの細胞は、上述のＭＶＡ経路、ＩＤＩ、および／またはＤＸＰ経路のポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸と、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸とをさらに含んでなる。理論により拘束されることなく、上述の組成物および方法のいずれかによって、組換え細胞内で、代案の下流ＭＶＡ経路を通じて、メバロン酸からのイソペンテニルピロリン酸の細胞産生を増大させることは、同様により大量のイソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイド生成をもたらすと考えられる。グルコースからのメバロン酸生成のモル収率を増大させることは、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニルキナーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、およびイソプレンおよびイソプレノイド生成のためのその他の適切な酵素の適切な酵素活性レベルとグルコースを組み合わせると生成される、イソプレンをはじめとするイソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドのより高いモル収率につながる。本明細書に記載される、メバロン酸生成への炭素流動増大のために操作された様々な酵素経路を有する組換え細胞を使用して、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを生成し得る。いくつかの態様では、組換え細胞をさらに改変して、ｒｐｉＡ、ｒｐｅ、ｔｋｔＡ、ｔａｌＢ、ｐｔａおよび／またはｅｕｔＤからなる群から選択される、遺伝子の１つまたは複数の活性を増大させ得る。別の態様では、これらの株をさらに改変して、ｚｗｆ、ｐｆｋＡ、ｆｂａ、ｇａｐＡ、ａｃｋＡ、ｇｌｔＡおよび／またはｐｔｓ遺伝子をはじめとする、１つまたは複数の遺伝子の活性を低下させ得る。
【０２２６】
イソプレノイドのタイプ
本発明の組換え細胞は、イソプレノイドおよびイソプレノイド前駆体分子ＤＭＡＰＰおよびＩＰＰを産生できる。イソプレノイドの例としては、制限なしに、ヘミテルペノイド、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、セステルテルペノイド、トリテルペノイド、テトラテルペノイド、より高級なポリテルペノイドが挙げられる。いくつかの態様では、ヘミテルペノイドは、プレノール（すなわち３−メチル−２−ブテン−１−オール）、イソプレノール（すなわち３−メチル−３−ブテン−１−オール）、２−メチル−３−ブテン−２−オール、またはイソ吉草酸である。いくつかの態様では、モノテルペノイドは、制限なしに、ピロリン酸ゲラニル、ユーカリプトール、リモネン、またはピネンであり得る。いくつかの態様では、セスキテルペノイドは、ピロリン酸ファルネシル、アルテミシニン、またはビサボロールである。いくつかの態様では、ジテルペノイドは、制限なしに、ゲラニルゲラニルピロリン酸、レチノール、レチナール、フィトール、タキソール、フォルスコリン、またはアフィジコリンであり得る。いくつかの態様では、トリテルペノイドは、制限なしに、スクアレンまたはラノステロールであり得る。イソプレノイドはまた、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファメセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パトコウロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン、およびバレンセンからなる群から選択し得る。
【０２２７】
いくつかの態様では、テトラテルペノイドは、リコペンまたはカロテン（カロテノイド）である。本明細書の用法では、「カロテノイド」という用語は、植物の葉緑体および有色体中、藻類などのいくつかのその他の光合成生物の葉緑体および有色体中、ある種の真菌およびいくつかの細菌中に生じる、一群の天然有機色素を指す。カロテノイドとしては、酸素含有キサントフィルおよび酸素非含有カロテンが挙げられる。いくつかの態様では、カロテノイドは、キサントフィルおよびカロテンからなる群から選択される。いくつかの態様では、キサントフィルは、ルテインまたはゼアキサンチンである。いくつかの態様では、カロテノイドは、α−カロテン、β−カロテン、γ−カロテン、β−クリプトキサンチンまたはリコペンである。
【０２２８】
ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸
本発明のいくつかの態様では、本明細書の組成物または方法のいずれかに記載される細胞は、上述のメバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、ならびにポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、内在性ポリペプチドであり得る。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結し得て、または同様に誘導性プロモーターと作動可能に連結し得る。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、強力なプロモーターとさらに作動可能に連結し得る。代案としては、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結し得る。特に、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドを過剰発現するように改変し得る。
【０２２９】
いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、異種ポリペプチドである。本発明の細胞は、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸の２つ以上のコピーを含んでなり得る。いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、強力なプロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。
【０２３０】
ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする核酸は、宿主細胞ゲノムに組み込み得て、または細胞内で安定して発現させ得る。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする核酸は、さらにベクター上に存在し得る。
【０２３１】
例示的なポリプレニルピロリン酸シンターゼ核酸としては、ポリプレニルピロリン酸シンターゼの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、イソプレノイド前駆体分子をより複雑なイソプレノイド化合物に変換する。例示的なシンターゼポリペプチドとしては、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。さらに、ポリプレニルピロリン酸シンターゼ変異体は、改善された酵素活性などの改善された活性を有し得る。いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼ変異体は、改善された安定性（例えば、熱安定性）、および／または改善された溶解度などのその他の改善された特性を有する。例示的なポリプレニルピロリン酸シンターゼ核酸としては、制限なしに、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）シンターゼ、ピロリン酸ファルネシル（ＦＰＰ）シンターゼ、およびゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）シンターゼ、または任意のその他の既知のポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドなどのポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。
【０２３２】
本発明のいくつかの態様では、本明細書の組成物または方法のいずれかに記載される細胞は、ピロリン酸ファルネシル（ＦＰＰ）シンターゼをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。ＦＰＰシンターゼポリペプチドは、内在性遺伝子によってコードされる内在性ポリペプチドであり得る。いくつかの態様では、ＦＰＰシンターゼポリペプチドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で、内在性ｉｓｐＡ遺伝子によってコードされる。ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結し得て、または同様に誘導性プロモーターと作動可能に連結し得る。ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、強力なプロモーターとさらに作動可能に連結し得る。特に、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性ＦＰＰシンターゼポリペプチドを過剰発現するように改変し得る。
【０２３３】
いくつかの態様では、ＦＰＰシンターゼポリペプチドは異種ポリペプチドである。本発明の細胞は、ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸の２つ以上のコピーを含んでなり得る。いくつかの態様では、ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、強力なプロモーターと作動可能に連結する。
【０２３４】
ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードする核酸は、宿主細胞ゲノムに組み込み得て、または細胞内で安定して発現させ得る。ＦＰＰシンターゼをコードする核酸は、さらにベクター上に存在し得る。
【０２３５】
標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内で、細胞抽出物中で、または生体内で、ＩＰＰを高級イソプレノイドに変換する能力を測定することで、ポリペプチドがポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。これらの方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許第７，９１５，０２６号明細書、Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１年３月；１５５（３）：１０７９−９０；Ｄａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１１年４月１２日［印刷前のデジタル出版］；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１１年３月２４日［印刷前のデジタル出版］］；Ｋｅｅｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．２０１１年３月７日；１１：４３；  Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．２０１０年１１月２１日；１０：２２６；Ｋｕｍｅｔａ＆Ｉｔｏ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１０年１２月；１５４（４）：１９９８−２００７；およびＫｏｌｌｎｅｒ＆Ｂｏｌａｎｄ，Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ．２０１０年８月２０日；７５（１６）：５５９０−６００に記載される。
【０２３６】
代案の下流ＭＶＡ経路を通じたイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを産生できる組換え細胞
本明細書に記載される組換え細胞（例えば、組換え細菌細胞）は、同一条件下で培養された場合、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドをコードする核酸の１つまたは複数のコピー、イソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする核酸の１つまたは複数のコピー、ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする異種核酸１つまたは複数のコピー、およびポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を欠く同一細胞を上回る量および／または濃度で、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを産生する能力を有する。特定の態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、またはＳ３７８Ｐａ３−２からの、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする、内在性核酸の１つまたは複数のコピーを含んでなる。特定の態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、メタノカルドコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、またはメタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）からのイソペンテニルキナーゼをコードする核酸を含んでなる。
【０２３７】
実施形態のいくつかでは、本明細書で提供されるのは、（ｉ）ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉ）イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、および（ｉｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなる、イソプレノイドを産生できる組換え細胞であり、イソプレノイド前駆体生成中に細胞によって利用されるＡＴＰの総量は、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸および／またはイソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含まない、イソプレノイド前駆体産生細胞と比較して低下した。いくつかの実施形態では、イソプレノイド前駆体生成中に細胞によって利用されるＡＴＰの総量は、少なくとも正味１ＡＴＰ、正味２ＡＴＰ、正味３ＡＴＰ、正味４ＡＴＰまたは正味５ＡＴＰ低下した。いくつかの実施形態では、イソプレノイド前駆体の生成中に、細胞によって利用されるＡＴＰの総量は、正味１ＡＴＰ低下した。実施形態のいくつかでは、本明細書で提供されるのは、（ｉ）ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉ）イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｖ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなる、イソプレノイドを産生できる組換え細胞であり、イソプレノイド生成中に細胞によって利用されるＡＴＰの総量は、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸および／またはイソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含まない、イソプレノイド産生細胞と比較して低下した。いくつかの実施形態では、イソプレノイドの生成中に細胞によって利用されるＡＴＰの総量は、少なくとも正味１ＡＴＰ、正味２ＡＴＰ、正味３ＡＴＰ、正味４ＡＴＰまたは正味５ＡＴＰ低下した。いくつかの実施形態では、イソプレノイドの生成中に細胞によって利用されるＡＴＰの総量は、正味１ＡＴＰ低下した。
【０２３８】
いくつかの態様では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドをコードする核酸の１つまたは複数のコピー、イソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする核酸の１つまたは複数のコピー、ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする異種核酸１つまたは複数のコピー、およびポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸は、宿主細胞の染色体に組み込まれた異種核酸である。組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドを含まない、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体産生組換え細胞と比較して、少なくとも５％高い量のイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを産生し得る。代案としては、組換え細胞は、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする核酸の１つまたは複数のコピーを発現しない、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体産生細胞による、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体の生成と比較して、包括的に、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％高い、ならびにこれらの数字の間の任意の数値分高い、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを産生し得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、本明細書の方法は、さらに修飾および／または改変されて、ＭＶＡ生成への炭素流が増大された宿主細胞を含んでなり、それによってホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を発現せず、メバロン酸生成への炭素流を増大させるように修飾および／または改変されていない、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体産生細胞によるイソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体の生成と比較して、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体の生成増大を提供する。
【０２３９】
本発明の一態様では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、１つまたは複数のＭＶＡ経路ポリペプチド（すなわち上流ＭＶＡ経路およびＭＶＫ）をコードする１つまたは複数の異種核酸、ポリプレニルピロリン酸シンターゼをコードする１つまたは複数の異種核酸および／またはＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなる、組換え細胞が提供される。細胞は、ＩＤＩポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなり得る。細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなり得る。さらにポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、ＦＰＰシンターゼポリペプチドであり得る。特定の実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸は、ヘルペトシフォン・アウランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、またはＳ３７８Ｐａ３−２に由来する。特定の実施形態では、イソペンテニルキナーゼをコードする核酸は、ヘルペトシフォン・アウランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、メタノカルドコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、またはメタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）に由来する。１つまたは複数の核酸が、構成的プロモーターと作動可能に連結し得て、誘導性プロモーターと作動可能に連結し得て、または誘導性および構成的プロモーターの組み合わせと作動可能に連結し得る。１つまたは複数の核酸は、さらに、強力なプロモーター、弱いプロモーター、および／または中程度のプロモーターと、作動可能に連結し得る。ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチド、イソペンテニルキナーゼポリペプチド、１つまたは複数のＭＶＡ経路ポリペプチド（すなわち上流ＭＶＡ経路およびＭＶＫ）、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および／またはＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸は、宿主細胞ゲノムに組み込み得て、または細胞内で安定して発現させ得る。１つまたは複数の核酸は、１つまたは複数のベクター上に存在し得る。
【０２４０】
本明細書で提供されるのは、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを産生できる組換え細胞である。組換え細胞は、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチド、イソペンテニルキナーゼポリペプチド、１つまたは複数のＭＶＡ経路ポリペプチド（すなわち上流ＭＶＡ経路およびＭＶＫ）、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸の発現によって、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを産生する。特定の実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸は、ヘルペトシフォン・アウランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、またはＳ３７８Ｐａ３−２に由来する。特定の実施形態では、イソペンテニルキナーゼをコードする核酸は、ヘルペトシフォン・アウランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、メタノカルドコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、またはメタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）に由来する。本明細書の用法では、「増大した」イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド生成とは、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチド、イソペンテニルキナーゼポリペプチド、１つまたは複数のＭＶＡ経路ポリペプチド（すなわち、上流ＭＶＡ経路およびＭＶＫ）、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を有しない細胞と比較した、本明細書に記載される組成物および方法のいずれかによって記載される細胞による、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド生成の細胞生産性指標（ＣＰＩ）増大、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの力価増大、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの質量収率増大、および／またはイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの比生産性増大を指す。イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド生成は、約５％〜約１，０００，０００倍増大させ得る。イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生成は、ホスホケトラーゼをコードする１つまたは複数の異種核酸を発現しない細胞によるイソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体の生成と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍、または約５０〜約２００倍）増大させ得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、組換え宿主細胞をさらに修飾および／または改変して、ＭＶＡ生成への炭素流を増大させ、それによってホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ��リペプチドおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を発現せず、メバロン酸生成への炭素流を増大させるように修飾および／または改変されていない、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体産生細胞によるイソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体の生成と比較して、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体の生成増大を提供する。
【０２４１】
別の実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞はまた、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド生成を提供し得て、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を発現しない、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド産生組換え細胞によるイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生成と比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍、または１，０００，０００倍のいずれかで増大させ得る。
【０２４２】
組換え細胞を使用して代案の下流ＭＶＡ経路を通じてイソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体分子を生成する方法
これもまた本明細書で提供されるのは、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチド、イソペンテニルキナーゼポリペプチド、およびポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸を含んでなる、組換え細胞（例えば、組換え細菌細胞）を培養するステップを含んでなる、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを生成する方法である。特定の実施形態では、組換え細胞は、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドおよびＭＶＫポリペプチドをコードする、１つまたは複数の１つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなる。イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドは、本明細書に記載される細胞のいずれかから、本明細書に記載される方法のいずれかに従って、生成され得る。グルコースなどの六炭糖をはじめとする炭素源（例えば、炭水化物）から、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを生成する目的で、細胞のいずれかを使用し得る。
【０２４３】
特定の態様では、本明細書で提供されるのは、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、またはＳ３７８Ｐａ３−２に由来するホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ；ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、メタノカルドコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、またはメタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）に由来するイソペンテニルキナーゼ；Ｌ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、および／またはＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）に由来するｍｖａＥおよびｍｖａＳポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸を含んでなる組換え細胞を、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドの生成に適した条件下で培養するステップと、（ｂ）イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを生成するステップとを含んでなる、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを生成する方法である。細胞は、上述の代案の下流ＭＶＡ経路ポリペプチド（例えば、ＭＶＫおよび／またはＩＤＩ）をコードする１つまたは複数の核酸分子、および上述のポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドのいずれかをさらに含んでなり得る。いくつかの態様では、組換え細胞は、本明細書に記載される細胞のいずれかであり得る。本明細書に記載されるポリプレニルピロリン酸シンターゼまたはその変異体のいずれか、本明細書に記載される宿主細胞株のいずれか、本明細書に記載されるプロモーターのいずれか、および／またはベクター本明細書に記載されるのいずれかもまた使用して、本明細書に記載されるエネルギー源（例えば、グルコースまたは任意のその他の六炭糖）のいずれかを使用して、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを生成し得る。いくつかの態様では、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを生成する方法は、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを回収するステップをさらに含んでなる。
【０２４４】
イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを生成する方法は、同様に、組換え細胞（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない）を培養するステップと；（ｂ）イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを生成するステップとを含んでなり得て、（ａ）ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドを内因的に発現せず、イソペンテニルキナーゼを発現する１つまたは複数の核酸と共に、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドをコードする遺伝子の１つまたは複数のコピーを異種性に発現する組換え細胞は、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドを含まないイソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体産生細胞と比較して、より大きな量のイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを産生する。
【０２４５】
イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを生成する当該方法は、ホスホケトラーゼポリペプチドを含まない、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体産生組換え細胞と比較して、少なくとも５％高い量のイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを生成し得る。代案としては、組換え細胞は、包括的に、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％高いイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを生じ得る。いくつかの態様では、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを生成する方法は、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを回収するステップをさらに含んでなる。
【０２４６】
本明細書で提供されるのは、上述の細胞のいずれかを使用して、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体分子生成を増大させる方法である。細胞によるイソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイド産生は、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチド、イソペンテニルキナーゼポリペプチド、１つまたは複数のＭＶＡ経路ポリペプチド（すなわち、上流ＭＶＡ経路およびＭＶＫ）をコードする１つまたは複数の核酸、およびポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸の発現によって増大させ得る。本明細書の用法では、「増大した」イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド生成とは、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチド、イソペンテニルキナーゼポリペプチド、１つまたは複数のＭＶＡ経路ポリペプチド（すなわち、上流ＭＶＡ経路およびＭＶＫ）、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を有しない細胞と比較した、本明細書に記載される組成物および方法のいずれかによって記載される細胞による、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド生成の細胞生産性指標（ＣＰＩ）増大、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの力価増大、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの質量収率増大、および／またはイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの比生産性増大を指す。イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドの生成は、約５％〜約１，０００，０００倍増大させ得る。イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドの生成は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を発現しない細胞によるイソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドの生成と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍、または約５０〜約２００倍）増大させ得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、方法は、さらに修飾および／または改変されて、ＭＶＡ生成への炭素流が増大された組換え宿主細胞を含んでなり、それによってホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を発現せず、メバロン酸生成への炭素流を増大させるように修飾および／または改変されていない、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体産生細胞によるイソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体の生成と比較して、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体の生成増大を提供する。
【０２４７】
イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドの生成はまた、本明細書に記載される方法によって、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドの発現をコードする１つまたは複数の核酸のない、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド産生細胞によるイソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドの生成と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍、または１，０００，０００倍のいずれかで、増大させ得る。本明細書に記載される特定の実施形態では、方法は、さらに修飾および／または改変されて、ＭＶＡ生成への炭素流が増大された組換え宿主細胞を含んでなり、それによってホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を発現せず、メバロン酸生成への炭素流を増大させるように修飾および／または改変されていない、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体産生細胞によるイソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体の生成と比較して、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体の生成増大を提供する。
【０２４８】
一態様では、本明細書に記載されるのは、イソプレノイド前駆体を含んでなる組成物である。いくつかの実施形態では、イソプレノイド前駆体を含んでなる組成物が、本明細書に記載される組換え細胞のいずれかによって産生される。例えば、イソプレノイド前駆体を含んでなる組成物は、（ｉ）ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉ）イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、および（ｉｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなる組換え細胞によって産生され得て、前記組換え細胞の培養がイソプノイド前駆体の生成を提供する。いくつかの実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、古細菌に由来する。さらなる実施形態では、古細菌は、デスルフロコッカス目（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スルフォロブス目（Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ）、サーモプロテウス目（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ケナルカエアレス目（Ｃｅｎａｒｃｈａｅａｌｅｓ）、ニトロソプミラレス目（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌａｌｅｓ）、アーキオグロブス目（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロバクテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノコッカス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、メタノセラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａｌｅｓ）、メタノサルシナ目（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ）、メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノミクロビウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、メタノピラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒａｌｅｓ）、サーモコッカス目（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、サーモプラズマ目（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）、コルアーケオタ門（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ）、およびナノアーケオタ門（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、Ｓ３７８Ｐａ３−２、およびアナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）からなる群から選択される微生物に由来する。いくつかの実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、配列番号１６〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、古細菌に由来する。さらなる実施形態では、古細菌は、デスルフロコッカス目（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スルフォロブス目（Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ）、サーモプロテウス目（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ケナルカエアレス目（Ｃｅｎａｒｃｈａｅａｌｅｓ）、ニトロソプミラレス目（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌａｌｅｓ）、アーキオグロブス目（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロ��クテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノコッカス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、メタノセラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａｌｅｓ）、メタノサルシナ目（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ）、メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノミクロビウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、メタノピラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒａｌｅｓ）、サーモコッカス目（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、サーモプラズマ目（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）、コルアーケオタ門（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ）、およびナノアーケオタ門（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、メタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、メタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）、およびアナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）からなる群から選択される微生物に由来する。いくつかの実施形態では、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１９〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドがは、（ａ）２分子のアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｂ）マロニルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｃ）アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素；（ｄ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；および（ｅ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素から選択される。いくつかの実施形態では、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドは、（ａ）メバロン酸をリン酸化してメバロン酸５−リン酸を形成する酵素；（ｂ）メバロン酸５−リン酸をリン酸化してメバロン酸５−ピロリン酸を形成する酵素；および（ｃ）メバロン酸５ピロリン酸を脱炭酸してイソペンテニルピロリン酸を形成する酵素から選択される。いくつかの実施形態では、イソプレノイド前駆体を含んでなる組成物は、メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する弱力化酵素を含んでなる、組換え細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、イソプレノイド前駆体を含んでなる組成物は、メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する弱力化酵素を含んでなる、組換え細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、イソプレノイド前駆体を含んでなる組成物は、１つまたは複数の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする、１つまたは複���の核酸をさらに含んでなる、組換え細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、イソプレノイド前駆体を含んでなる組成物は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路の１つまたは複数の弱力化酵素を含んでなる、組換え細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、イソプレノイド前駆体を含んでなる組成物は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、異種核酸をさらに含んでなる、組換え細胞によって産生される。本明細書の実施形態のいずれかでは、関心のあるポリペプチドをコードする核酸（例えば、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチド、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドなど）は、異種核酸または内在性核酸であり得る。
【０２４９】
一態様では、本明細書に記載されるのは、イソプレノイドを含んでなる組成物である。いくつかの実施形態では、イソプレノイドを含んでなる組成物が、本明細書に記載される組換え細胞のいずれかによって産生される。例えば、イソプレノイドを含んでなる組成物は、（ｉ）ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉ）イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、（ｉｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、および（ｉｖ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含んでなる組換え細胞によって産生され得て、前記組換え細胞の培養がイソプレノイドの生成を提供する。いくつかの実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、古細菌に由来する。さらなる実施形態では、古細菌は、デスルフロコッカス目（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スルフォロブス目（Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ）、サーモプロテウス目（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ケナルカエアレス目（Ｃｅｎａｒｃｈａｅａｌｅｓ）、ニトロソプミラレス目（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌａｌｅｓ）、アーキオグロブス目（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロバクテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノコッカス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、メタノセラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａｌｅｓ）、メタノサルシナ目（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ）、メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノミクロビウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、メタノピラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒａｌｅｓ）、サーモコッカス目（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、サーモプラズマ目（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）、コルアーケオタ門（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ）、およびナノアーケオタ門（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、Ｓ３７８Ｐａ３−２、およびアナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）からなる群から選択される微生物に由来する。いくつかの実施形態では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、配列番号１６〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、古細菌に由来する。さらなる実施形態では、古細菌は、デスルフロコッカス目（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、スルフォロブス目（Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ）、サーモプロテウス目（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ケナルカエアレス目（Ｃｅｎａｒｃｈａｅａｌｅｓ）、ニトロソプミラレス目（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌａｌｅｓ）、ア��キオグロブス目（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロバクテリウム目（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノコッカス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、メタノセラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａｌｅｓ）、メタノサルシナ目（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｌｅｓ）、メタノバクテリウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、メタノミクロビウム目（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ）、メタノピラレス目（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒａｌｅｓ）、サーモコッカス目（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、サーモプラズマ目（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）、コルアーケオタ門（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ）、およびナノアーケオタ門（Ｎａｎｏａｒｃｈａｅｏｔａ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、メタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、メタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）、およびアナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）からなる群から選択される微生物に由来する。いくつかの実施形態では、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１９〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドはは、（ａ）２分子のアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｂ）マロニルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｃ）アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素；（ｄ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；および（ｅ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素から選択される。いくつかの実施形態では、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドは、（ａ）メバロン酸をリン酸化してメバロン酸５−リン酸を形成する酵素；（ｂ）メバロン酸５−リン酸をリン酸化してメバロン酸５−ピロリン酸を形成する酵素；および（ｃ）メバロン酸５ピロリン酸を脱炭酸してイソペンテニルピロリン酸を形成する酵素から選択される。いくつかの実施形態では、イソプレノイドを含んでなる組成物は、メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する弱力化酵素を含んでなる、組換え細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、イソプレノイドを含んでなる組成物は、メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する弱力化酵素を含んでなる、組換え細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、イソプレノイドを含んでなる組成物は、１つまたは複数の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリ���プチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる、組換え細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、イソプレノイドを含んでなる組成物は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路の１つまたは複数の弱力化酵素を含んでなる、組換え細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、イソプレノイドを含んでなる組成物は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、異種核酸をさらに含んでなる、組換え細胞によって産生される。本明細書の実施形態のいずれかでは、関心のあるポリペプチドをコードする核酸（例えば、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチド、イソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドなど）は、異種核酸または内在性核酸であり得る。本明細書の実施形態のいずれかでは、組成物は、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セキテルペン、およびポリテルペンからなる群から選択されるイソプレノイドを含んでなり得る。本明細書の実施形態のいずれかでは、組成物は、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファメセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パトコウロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピンデン、およびバレンセンからなる群から選択されるイソプレノイドを含んでなり得る。
【０２５０】
ベクター
本明細書に記載される組成物および方法のいずれかにおいて、適切なベクターを使用し得る。例えば、適切なベクターを使用して、特定の宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニルキナーゼ、ｍｖａＥおよびａｎｍｖａＳポリペプチドをはじめとするがこれに限定されるものではない上流ＭＶＡ経路ポリペプチド、下流ＭＶＡ経路ポリペプチド（例えば、ＭＶＫおよびＩＤＩ）、イソプレンシンターゼ、またはポリプレニルピロリン酸シンターゼをコードする遺伝子の１つまたは複数のコピーの発現を最適化し得る。いくつかの態様では、ベクターは選択マーカーを含有する。選択可能なマーカーの例としては、抗生物質耐性核酸（例えば、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン、またはクロラムフェニコール）および／または宿主細胞に対する栄養上の利点などの代謝上の利点をもたらす核酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの態様では、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ；イソペンテニルキナーゼ；ｍｖａＥおよびａｎｍｖａＳポリペプチドをはじめとするが、これに限定されるものではない上流ＭＶＡ経路ポリペプチド；下流ＭＶＡ経路ポリペプチド（例えば、ＭＶＫおよびＩＤＩ）；Ｌ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、および／またはＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）からのｍｖａＥおよびｍｖａＳ核酸；イソプレンシンターゼ；またはポリプレニルピロリン酸シンターゼ核酸の１つまたは複数のコピーが、選択マーカーなしで宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
【０２５１】
本明細書で特徴付けられている、または本開示の実施例で使用されるベクターのいずれかを本発明で使用し得る。
【０２５２】
形質転換方法
一リン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニルキナーゼ、ｍｖａＥおよびａｎｍｖａＳポリペプチドをはじめとするがこれに限定されるものではない上流ＭＶＡ経路ポリペプチド、下流ＭＶＡ経路ポリペプチド、および／または下流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする核酸の１つまたは複数のコピーを、適切な技術を使用して細胞中に挿入し得る。さらに、形質転換、電気穿孔、核マイクロインジェクション、形質導入、形質移入（例えば、リポフェクション媒介またはＤＥＡＥ−デキストリン媒介形質移入または組換えファージウイルスを使用した形質移入）、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿によるインキュベーション、ＤＮＡ被覆マイクロプロジェクタイルでの高速衝撃、およびプロトプラスト融合などの、宿主細胞にＤＮＡコンストラクトまたはベクターを導入するための標準的な技術を使用して、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路、および／またはポリプレニルピロリン酸シンターゼ核酸またはそれらを含有するベクターを、宿主細胞（例えば、本明細書に記載される植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、または細菌細胞）中に挿入し得る。一般的形質転換技術は、当該技術分野で公知である（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（編．）Ｃｈａｐｔｅｒ  ９，１９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９；およびＣａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６，１９８９を参照されたい）。導入された核酸は、染色体ＤＮＡに組み込まれ、または染色体外自己複製配列として維持され得る。形質転換体は、当該技術分野で公知の任意の方法によって選択し得る。形質転換体を選択する適切な方法は、国際公開第２００９／０７６６７６号パンフレット、米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号明細書、国際公開第２０１０／００３００７号パンフレット、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号明細書、国際公開第２００９／１３２２２０号パンフレット、および米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号明細書に記載される。
【０２５３】
例示的な宿主細胞
当業者は、発現ベクターが、特定の宿主株について遺伝子発現を最適化する特定構成要素を含有するように、デザインされることを認識するであろう。このような最適化構成要素としては、複製起点、プロモーター、およびエンハンサーが挙げられるが、これに限定されるものではない。本明細書で言及されるベクターおよび構成要素は、例示的な目的のために記載され、本発明の範囲を狭めることは意図されない。
【０２５４】
遺伝子を異種性に発現するのに使用し得る任意の細胞またはその子孫を使用して、イソペンテニルキナーゼ、１つまたは複数のＭＶＡ経路ペプチド、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路ポリペプチド、および／またはポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドを発現する１つまたは複数の異種核酸と共に、ヘルペトシフォン・アウランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、および／またはＳ３７８Ｐａ３−２から単離された一リン酸デカルボキシラーゼの１つまたは複数を発現し得る。例示的な宿主細胞としては、例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）の種（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌、メタノサルシナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）の種（例えば、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）などの古細菌、葛またはポプラ（例えば、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）またはウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）×ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ）ＣＡＣ３５６９６）またはアスペン（例えば、ポプルス・トレムロイデス（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ））などの植物が挙げられる。
【０２５５】
グラム陽性またはグラム陰性細菌をはじめとする細菌細胞を使用して、上述の異種遺伝子のいずれかを発現し得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、グラム陽性細菌である。非限定的例としては、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）（例えば、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、Ｓ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、Ｓ．ルビギノーサス（Ｓ．ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ）、またはＳ．グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）またはＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）（例えば、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）（例えば、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、またはラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば、ラクトバチルス種（Ｌ．ｓｐｐ））の株が挙げられる。いくつかの実施形態では、起源生物は、グラム陰性細菌である。非限定的例としては、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、Ｐ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、パントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ）（例えば、Ｐ．シトレア（Ｐ．ｃｉｔｒｅａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、またはヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）（Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）の株が挙げられる。特に、本明細書に記載される核酸は、Ｐ．シトレア（Ｐ．ｃｉｔｒｅａ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ロータス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、Ｂ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ｃ．アセトアシドフィルム（ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、Ｃ．エフィシエンス（Ｃ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、Ｃ．ジフテリア、Ｃ．ボビス（Ｃ．ｂｏｖｉｓ）、Ｓ．アルバス（Ｓ．ａｌｂｕｓ）、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、Ｓ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、Ｓ．グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、およびＰ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）細胞のいずれか１つの中で発現され得る。
【０２５６】
本発明の組成物および方法で宿主細胞として使用し得る、多数のタイプの嫌気性細胞がある。本発明の一態様では、本明細書に記載される組成物また方法のいずれかに記載される細胞は、偏性嫌気性細胞およびその子孫である。偏性嫌気性菌は、典型的に、酸素が存在する条件では、たとえ増殖したとしても、十分に増殖しない。小量の酸素は存在してもよいものと理解され、すなわち、低レベルの酸素に対して偏性嫌気性菌が有する、いくらかの耐性レベルがある。一態様では、イソプレノイド前駆体、イソプレン、およびイソプレノイドを産生するように改変された偏性嫌気性菌は、本明細書に記載される方法および／または組成物のいずれかのための宿主細胞の役割を果たし得て、存在する酸素量が嫌気性菌の増殖、維持、および／または発酵に有害でない実質的酸素非含有条件下で増殖される。
【０２５７】
本発明の別の態様では、本明細書に記載される組成物また方法のいずれかで記載されおよび／または使用される宿主細胞は、通性嫌気性細胞およびその子孫である。通性嫌気性菌は、酸素が存在すれば、好気性呼吸（例えば、ＴＣＡ回路の利用）によって細胞ＡＴＰを産生し得る。しかし通性嫌気性菌は、酸素不在下でもまた増殖し得る。これは、より多量の酸素の存在下で死滅し、または不十分に増殖する、偏性嫌気性菌とは対照的である。したがって一態様では、通性嫌気性菌は、本明細書で提供される組成物および／または方法のいずれかのための宿主細胞の役割を果たし得て、イソプレノイド前駆体、イソプレン、およびイソプレノイドを産生するように改変し得る。通性嫌気性宿主細胞は、存在する酸素量が嫌気性菌の増殖、維持、および／または発酵に有害でない、実質的に酸素非含有の条件下で増殖し得て、または代案としてはより多量の酸素の存在下で増殖し得る。
【０２５８】
宿主細胞はさらに、糸状菌細胞およびその子孫であり得る。（例えば、Ｂｅｒｋａ＆Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ，（１９８９），７（２）：１２７−１５４を参照されたい）。いくつかの態様では、糸状菌細胞は、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、Ｔ．ビリデ（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ）、Ｔ．コニンギイ（Ｔ．ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、Ｔ．ハルジアヌム（Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅｎｓ）、Ｈ．ラヌギノース（Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅ）、Ｈ．グリセア（Ｈ．ｇｒｉｓｅａ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、Ｃ．ルクノウェンス（Ｃ．ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、グリオクラジウム属（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）種、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、ショウユコウジカビ（Ａ．ｓｏｊａｅ）、Ａ．ジャポニカス（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、またはＡ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）などのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、Ｆ．ロゼウム（Ｆ．ｒｏｓｅｕｍ）、Ｆ．グラミヌム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｕｍ）、Ｆ．セレアリス（Ｆ．ｃｅｒｅａｌｉｓ）、Ｆ．オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、またはＦ．ベネナツム（Ｆ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）などのフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）などのニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種、ヒポクレア属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）種、Ｍ．ミーヘイ（Ｍ．ｍｉｅｈｅｉ）などのケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）種、クモノスカビ属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）種またはエメリセラ属（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）種のいずれかであり得る。いくつかの態様では、真菌は、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ａ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、Ａ．アクレアトウス（Ａ．ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．ジャポニカス（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、Ｔ．ビリデ（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ）、Ｆ．オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、またはＦ．ソラニ（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）である。特定の実施形態では、本明細書において利用するためのプラスミドまたはプラスミド構成要素としては、米国特許公開第２０１１／００４５５６３号明細書に記載されるものが挙げられる。
【０２５９】
宿主細胞はまた、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）種、またはカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種などの酵母であり得る。いくつかの態様では、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，（１９９２），８（６）：４２３−４８８を参照されたい）。特定の実施形態では、本明細書で利用するためのプラスミドまたはプラスミド構成要素としては、米国特許第７，６５９，０９７号明細書、および米国特許出願公開第２０１１／００４５５６３号明細書に記載されるものが挙げられる。
【０２６０】
宿主細胞はまた、マメ亜科（Ｆａｂｏｉｄｅａｅ）などのマメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）からの植物などの植物種であり得る。いくつかの態様では、宿主細胞は、葛、ポプラ（ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）×ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ）ＣＡＣ３５６９６など）、アスペン（ポプルス・トレムロイデス（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓなど）、またはヨーロッパナラ（Ｑｕｅｒｃｕｓｒｏｂｕｒ）である。
【０２６１】
宿主細胞は、さらに、緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類、ユーグレナ藻類、クロミスタ、または渦鞭毛藻類などの藻類種であり得る。（例えば、Ｓａｕｎｄｅｒｓ＆Ｗａｒｍｂｒｏｄｔ，”Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｇｉ，Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｙｅａｓｔ，”（１９９３），Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ，Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤを参照されたい）。特定の実施形態では、本明細書において利用するためのプラスミドまたはプラスミド構成要素としては、米国特許公開第２０１１／００４５５６３号明細書に記載されるものが挙げられる。いくつかの態様では、宿主細胞は、形態学に基づいて、以下の群のいずれかに分類されるラン藻などのラン藻である：クロロコックム目（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、プレウロカプサ目（Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａｌｅｓ）、ユレモ目（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ）、ネンジュモ目（Ｎｏｓｔｏｃａｌｅｓ）、またはスティゴネマ目（Ｓｔｉｇｏｎｅｍａｔａｌｅｓ）。（例えば、Ｌｉｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，（２０１０）１２（１）：７０−７９を参照されたい）。特定の実施形態では、本明細書で利用するためのプラスミドまたはプラスミド構成要素としては、米国特許出願公開第２０１０／０２９７７４９号明細書；米国特許出願公開第２００９／０２８２５４５号明細書、および国際公開第２０１１／０３４８６３号パンフレットに記載されるものが挙げられる。
【０２６２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞を使用して、イソペンテニルキナーゼ、１つまたは複数のＭＶＡ経路ポリペプチド、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路ポリペプチド、および／またはポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸と共に、ヘルペトシフォン・アウランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、またはＳ３７８Ｐａ３−２からの１つまたは複数の一リン酸デカルボキシラーゼ酵素を発現し得る。一態様では、宿主細胞は、イソペンテニルキナーゼ、１つまたは複数のＭＶＡ経路ペプチド、イソプレンシンターゼ、およびＩＤＩを発現する１つまたは複数の異種核酸と共に、ヘルペトシフォン・アウランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、またはＳ３７８Ｐａ３−２からの一リン酸デカルボキシラーゼをコードする１つまたは複数の核酸を発現する、イソプレンを産生できる大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の組換え細胞またはその子孫である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞は、イソペンテニルキナーゼ、１つまたは複数のＭＶＡ経路ペプチド、イソプレンシンターゼ、およびＩＤＩを発現する、１つまたは複数の異種核酸と共に、ヘルペトシフォン・アウランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、またはＳ３７８Ｐａ３−２からの一リン酸デカルボキシラーゼをコードする、異種性に発現された１つまたは複数の核酸を欠く同一細胞を上回る、量、ピーク力価、および細胞生産性でイソプレンを産生し得る。さらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で１つまたは複数のＭＶＡ経路ペプチドを発現する１つまたは複数の異種核酸と共に、ヘルペトシフォン・アウランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、またはＳ３７８Ｐａ３−２からの一リン酸デカルボキシラーゼをコードする、１つまたは複数の異種性に発現された核酸は、（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体に組み込まれた）染色体のコピーであり得る。その他の態様では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は培養中にある。いくつかの態様では、１つまたは複数の一リン酸デカルボキシラーゼは、ヘルペトシフォン・アウランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、またはＳ３７８Ｐａ３−２に由来する。
【０２６３】
例示的な宿主細胞修飾
クエン酸シンターゼ経路
クエン酸シンターゼは、オキサロ酢酸とアセチルＣｏＡの縮合を触媒して、トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路の代謝産物である、クエン酸を形成する（Ｎｅｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．１９８３．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２：５２４３−５２４９；Ｂｈａｙａｎａ，Ｖ．ａｎｄ  Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ，Ｈ．１９８４．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：２９００−２９０５）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内では、ｇｌｔＡによってコードされるこの酵素は、二量体サブユニットの三量体のように挙動する。六量体形態は、酵素が、ＮＡＤＨによってアロステリックに調節され得るようにする。この酵素は、幅広く試験されている（Ｗｉｅｇａｎｄ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｓ．１９８６．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１５：９７−１１７；Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．１９８７．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｓｙｍｐ．５４：８３−９２；Ｓｔｏｃｋｅｌｌ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３５４３５−４３；Ｍａｕｒｕｓ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４２：５５５５−５５６５）。ＮＡＤＨによるアロステリックな阻害を回避するために、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼによる置換またはその添加が考察された（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：１０７１−１０８１；Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｍｅｔ．Ｅｎｇ．７：２２９−２３９）。
【０２６４】
どちらも基質としてアセチルＣｏＡを有するために、クエン酸シンターゼによって触媒される反応は、メバロン酸経路の最初のステップを触媒するチオラーゼと直接競合する（Ｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８４：２１１６−２１２２）。したがって、当業者は、クエン酸シンターゼ発現を調節して（例えば、酵素活性を低下させる）、より多くの炭素をメバロン酸経路に流動させ得て、それによってメバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体、およびイソプレノイドの最終生成量を増大させる。クエン酸シンターゼ活性の低下は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、酵素活性の低下は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％低下する。いくつかの態様では、クエン酸シンターゼの活性は、内在性クエン酸シンターゼ遺伝子の活性を低下させることで調節される。これは、ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼをコードする導入遺伝子による、内在性クエン酸シンターゼ遺伝子の染色体置換によって、またはバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来する、ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼをコードする導入遺伝子を使用することで、達成し得る。クエン酸シンターゼの活性はまた、合成構成的低発現性プロモーターによって内在性クエン酸シンターゼ遺伝子プロモーターを置換することで、調節し得る（例えば、低下させる）。クエン酸シンターゼをコードする遺伝子はまた、欠失し得る。クエン酸シンターゼの活性の低下は、クエン酸シンターゼの発現低下を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多量の炭素流をもたらし得る。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。クエン酸シンターゼイソ酵素の活性調節（例えば、低下）もまた、本明細書で検討される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、クエン酸シンターゼイソ酵素の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。
【０２６５】
ホスホトランスアセチラーゼおよび／または酢酸キナーゼが関与する経路
ホスホトランスアセチラーゼ（（（ｉ）ｐｔａ（Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．１９６９．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９１：５５０−５５８  または（ｉｉ）ｅｕｔＤ（Ｂｏｌｏｇｎａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｊ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．４８：６２９−６３６）によって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でコードされるが、アセチルＣｏＡとアセチルリン酸（アセチル−Ｐ）の間の可逆的変換を触媒するのに対し、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡによって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でコードされる）（Ｋａｋｕｄａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：９１６−９２２）は、アセチル−Ｐを使用して酢酸を形成する。これらの遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でオペロンとして転写され得る。これらは一緒に、ＡＴＰの放出と共に、酢酸の異化を触媒する。したがって、ホスホトランスアセチラーゼの活性を高めることで、アセチルＣｏＡに向かうアセチル−Ｐの量を増大させることが可能である。特定の実施形態では、強化は、上方制御されたプロモーターを染色体中の遺伝子上流に配置させることで、または遺伝子のコピーをプラスミド上の適切なプロモーターの後に配置させることで、達成される。酢酸に向かうアセチルＣｏＡの量を低下させるために、酢酸キナーゼ遺伝子（例えば、内在性酢酸キナーゼ遺伝子）の活性を低下させまたは弱め得る。特定の実施形態では、減衰は、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）を欠失させることで達成される。これはクロラムフェニコールカセットによって遺伝子を置換し、それに続いてカセットをループアウトすることで実施される。いくつかの態様では、酢酸キナーゼの活性は、内在性酢酸キナーゼの活性を低下させることで調節される。これは合成構成的低発現性プロモーターによって、内在性酢酸キナーゼ遺伝子プロモーターを置換することで、達成し得る。特定の実施形態では、酢酸処理を施したキナーゼ遺伝子の弱力化は、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）遺伝子の発現を妨害することで、実施されるべきである。酢酸は、様々な理由で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によって産生される（Ｗｏｌｆｅ，Ａ．２００５．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６９：１２−５０）。理論により拘束されることなく、ａｃｋＡの欠失は、（ａｃｋＡはアセチルＣｏＡを利用するので）酢酸生成に転用される炭素量の低下をもたらし得て、したがってメバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレンおよび／またはイソプレノイドを増大させる。
【０２６６】
いくつかの態様では、本明細書に記載される組換え細胞は、弱力化された内在性酢酸キナーゼ遺伝子発現、または増大されたホスホトランスアセチラーゼを有しない細胞と比較して、低下した量の酢酸を産生する。生成する酢酸の量の低下は、当業者に知られている既知の日常的アッセイによって測定し得る。酢酸の量は、内在性酢酸キナーゼ遺伝子発現またはホスホトランスアセチラーゼ遺伝子発現に分子操作が実施されない場合と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低下する。
【０２６７】
ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａおよび／またはｅｕｔＤ）の活性は、酵素のその他の分子操作によって増大させ得る。酵素活性の増大は、操作が実施されなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の増大であり得る。場合によっては、酵素活性増大は少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％増大する。一実施形態では、ｐｔａの活性は、染色体上のプロモーターおよび／またはｒｂｓを改変することで、またはそれをプラスミドから発現させることで増大される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現された核酸を含んでなり、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａおよび／またはｅｕｔＤ）の活性を増大させるようにさらに改変された、組換え細胞である。ホスホトランスアセチラーゼイソ酵素の活性調節（例えば、増大）もまた、本明細書で検討される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａおよび／またはｅｕｔＤ）イソ酵素の活性を増大させるようにさらに改変された、組換え細胞である。
【０２６８】
酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）の活性はまた、酵素のその他の分子操作によって低下させ得る。酵素活性の低下は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、酵素活性は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低下する。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるようなホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現された核酸を含んでなり、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。酢酸キナーゼイソ酵素の活性調節（例えば、低下）もまた、本明細書で検討される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、酢酸キナーゼイソ酵素の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。
【０２６９】
場合によっては、内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性の弱力化は、弱力化された内在性酢酸遺伝子発現を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多くの炭素流をもたらす。
【０２７０】
乳酸デヒドロゲナーゼが関与する経路
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内では、Ｄ乳酸は、酵素乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡによってコードされる）を通じて、ピルビン酸から生成される（Ｂｕｎｃｈ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４３：１８７−１９５）。乳酸の生成はＮＡＤＨの酸化を伴い、したがって酸素が制限されており、全ての還元当量に対応し得ない場合に、乳酸が生成する。したがって、乳酸の生成は、炭素消費の原因になり得る。したがって、メバロン酸生成（および所望ならば、イソプレン、イソプレノイド前駆体、およびイソプレノイド生成）への炭素流動を改善するために、当業者は、酵素の活性を低下させることなどによって、乳酸デヒドロゲナーゼの活性を調節し得る。
【０２７１】
したがって、一態様では、乳酸デヒドロゲナーゼの活性は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性の弱力化によって調節し得る。このような弱力化は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失によって達成され得る。当業者に知られている乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を弱力化するその他の方法もまた、使用してもよい。乳酸デヒドロゲナーゼが関与する経路を操作することで、組換え細胞は、弱力化された内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子発現を有しない細胞と比較して、低下した量の乳酸を産生する。生成する乳酸量の低下は、当業者に知られている既知の日常的アッセイによって測定し得る。乳酸の量は、分子操作が実施されない場合と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低下する。
【０２７２】
乳酸デヒドロゲナーゼの活性はまた、酵素のその他の分子操作によって低下させ得る。酵素活性の低下は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、酵素活性は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低下する。
【０２７３】
したがって、場合によっては、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性の弱力化は、弱力化された内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子発現を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多くの炭素流をもたらす。
【０２７４】
グリセルアルデヒド３−リン酸が関与する経路
グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡおよび／またはｇａｐＢ）は、グリセルアルデヒド３−リン酸の１，３−ビスホスホ−Ｄ−グリセリン酸塩への変換を触媒する、解糖の重要な酵素である（Ｂｒａｎｌａｎｔ  Ｇ．ａｎｄ  Ｂｒａｎｌａｎｔ  Ｃ．１９８５．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５０：６１−６６）。
【０２７５】
特定の態様では、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなる組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードするもう１つの核酸をさらに含んでなる。ホスホケトラーゼ酵素に向けて炭素を誘導するために、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ発現を調節して（例えば、酵素活性を低下させて）、フルクトース６−リン酸およびキシルロース５−リン酸に向けてより多くの炭素が流動するようにし得て、それによってメバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレンおよび／またはイソプレノイドの最終生成量を増大させる。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性の低下は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、酵素活性の低下は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％低下する。いくつかの態様では、内在性グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性を低下させることで、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性が調節される。これは構成的低発現性プロモーターによって、内在性グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを置換することで、達成し得る。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子はまた、欠失し得る。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子はまた、同一反応を触媒するが、ＮＡＤＰＨでなくＮＡＤＨを生じる、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）酵素によって置換され得る。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性の低下は、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの発現低下を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多くの炭素流をもたらし得る。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡおよび／またはｇａｐＢ）の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼイソ酵素の活性調節（例えば、低下）もまた、本明細書で検討される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現された核酸を含んでなり、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡおよび／またはｇａｐＢ）イソ酵素の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。
【０２７６】
エントナー・ドウドロフ経路が関与する経路
エントナー・ドウドロフ（ＥＤ）経路は、エンデン・メイヤーホフ・パルナス（ＥＭＰ−解糖）経路の代替物である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のようないくつかの生物がＥＤおよびＥＭＰ経路の双方を持つ一方で、その他の生物はそのどちらか一方のみを有する。バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）がＥＭＰ経路のみを有するのに対し、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）はＥＤ経路のみを有する（Ｐｅｅｋｈａｕｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｗａｙ．１９９８．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８０：３４９５−３５０２；Ｓｔｕｌｋｅ  ａｎｄ  Ｈｉｌｌｅｎ．２０００．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４，８４９−８８０；Ｄａｗｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９６６．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．９８：７９５−８０３）。フルクトース二リン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、および／またはｆｂａＣ）は、エントナー・ドウドロフ経路と相互作用して、フルクトース−１，６−二リン酸からジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）およびグリセルアルデヒド３−リン酸（ＧＡＰ）への変換を可逆的に触媒する（Ｂａｌｄｗｉｎ  Ｓ．Ａ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．（１９７８）１６９（３）：６３３−４１）。
【０２７７】
ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｅｄｄ）が、６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸塩から１分子のＨ２Ｏを除去して、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸塩６−リン酸を形成するのに対し、２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）は、アルドール切断を触媒する（Ｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｊ．Ｂａｃｔ．１７４：４６３８−４６４６）。２つの遺伝子は、オペロン中にある。
【０２７８】
特定の態様では、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなる組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードするもう１つの核酸をさらに含んでなる。ホスホケトラーゼ経路に向けられ得る代謝産物はまた、ＥＤ経路にも転用され得る。代謝産物が、ＥＤ経路に失われるのを回避するために、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子（例えば、内在性ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子）および／または２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼ遺伝子（例えば、内在性２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼ遺伝子）活性が弱力化される。弱力化を達成する一方法は、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｅｄｄ）および／または２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）を欠失させることである。これはクロラムフェニコールまたはカナマイシンカセットによって片方または双方の遺伝子を置換し、それに続いてカセットをループアウトすることで達成し得る。これらの酵素機能がなければ、より多くの炭素がホスホケトラーゼ酵素に流動し得て、したがってメバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレンおよび／またはイソプレノイドの収率を増大させる。
【０２７９】
ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｅｄｄ）および／または２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）の活性はまた、酵素のその他の分子操作によって低下させ得る。酵素活性の低下は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、酵素活性の低下は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低下される。
【０２８０】
場合によっては、内在性ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子および／または内在性２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼ遺伝子の活性の弱力化は、弱力化された内在性ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子および／または内在性酢酸キナーゼ−２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼ遺伝子発現を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多くの炭素流をもたらす。
【０２８１】
ホスホケトラーゼ経路に向けられ得る代謝産物はまた、ＥＤ経路またはＥＭＰ経路にも転用され得る。代謝産物の欠損を回避して、フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）濃度を増大させるために、フルクトース二リン酸アルドラーゼ（例えば、内在性フルクトース二リン酸アルドラーゼ）活性が弱力化される。場合によっては、内在性フルクトース二リン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、および／またはｆｂａＣ）遺伝子の活性の弱力化は、弱力化された内在性フルクトース二リン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、および／またはｆｂａＣ）遺伝子発現を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多くの炭素流をもたらす。いくつかの態様では、弱力化は、フルクトース二リン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、および／またはｆｂａＣ）を欠失させることで達成される。欠失は、クロラムフェニコールまたはカナマイシンカセットによって遺伝子を置換し、それに続いてカセットをループアウトすることで達成し得る。いくつかの態様では、フルクトース二リン酸アルドラーゼの活性は、内在性フルクトース二リン酸アルドラーゼの活性を低下させることで調節される。これは合成構成的低発現性プロモーターによって、内在性フルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子プロモーターを置換することで、達成し得る。これらの酵素機能がなければ、より多くの炭素がホスホケトラーゼ酵素に流動し得て、したがって代案の下流ＭＶＡ経路（例えば、ＭＶＫ、ＰＭｅｖＤＣ、ＩＰＫ、および／またはＩＤＩ）による、イソプレン、イソプレノイド前駆体、およびイソプレノイドの収率を増大させる。フルクトース二リン酸アルドラーゼの活性はまた、酵素のその他の分子操作によって低下させ得る。酵素活性の低下は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、酵素活性の低下は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低下される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、フルクトース二リン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、および／またはｆｂａＣ）の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。フルクトース二リン酸アルドラーゼイソ酵素の活性調節（例えば、低下）もまた、本明細書で検討される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、フルクトース二リン酸アルドラーゼイソ酵素の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。
【０２８２】
ペントースリン酸経路の酸化分岐が関与する経路
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ペントースリン酸経路を使用してヘキソースとペントースを分解し、細胞様々な同化経路のための中間体を提供する。それはまた、ＮＡＤＰＨの主な産生者でもある。ペントースリン酸経路は、酸化分岐（グルコース６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ｐｇｌ）または６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｎｄ）のような酵素がある）、および非酸化分岐（トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡおよび／またはｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼ（ｔａｌＡまたはｔａｌＢ）、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼおよび（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼ、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡおよび／またはｒｐｉＢ）および／またはリブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）などの酵素がある）から構成される（Ｓｐｒｅｎｇｅｒ．１９９５．Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６４：３２４−３３０）。
【０２８３】
特定の態様では、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなる組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードするもう１つの核酸をさらに含んでなる。ホスホケトラーゼ酵素に向けて炭素を誘導するために、ペントースリン酸経路の非酸化分岐（トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼおよび（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼ、リボース−５−リン酸イソメラーゼＡ、リボース−５−リン酸イソメラーゼＢ、および／またはリブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ）の発現を調節し（例えば、酵素活性を増大させ）、フルクトース６−リン酸およびキシルロース５−リン酸に向けてより多くの炭素が流動するようにし得て、それによって代案の下流ＭＶＡ経路（例えば、ＭＶＫ、ＰＭｅｖＤＣ、ＩＰＫ、および／またはＩＤＩ）による、イソプレン、イソプレノイド前駆体、およびイソプレノイドの最終生成量を増大させる。トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼおよび（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼ活性の増大は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の増大であり得る。場合によっては、酵素活性は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％増大する。いくつかの態様では、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼおよび（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼの活性は、内在性トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ、および（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼの活性を増大させることで、調節される。これは合成構成的高発現性プロモーターによって、内在性トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼおよび（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼ遺伝子プロモーターを置換することで達成し得る。トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼおよび（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼをコードする遺伝子はまた、適切なプロモーターの後のプラスミド上にクローン化し得る。トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼおよび（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼの活性の増大は、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼおよび（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼの発現増大を有しない細胞と比較して、一リン酸メバロン酸依存性生合成経路へのより多くの炭素流をもたらし得る。
【０２８４】
本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現された核酸を含んでなり、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡおよび／またはｔｋｔＢ）の活性を増大させるようにさらに改変された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡおよび／またはｔｋｔＢ）の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、トランスアルドラーゼ（ｔａｌＡまたはｔａｌＢ）の活性を増大させるようにさらに改変された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡおよび／またはｒｐｉＢ）の活性を増大させるようにさらに改変された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、リブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）の活性を増大させるようにさらに改変された、組換え細胞である。グルコース６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ｐｇｌ）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｎｄ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡおよび／またはｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼ（ｔａｌＡまたはｔａｌＢ）、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ、リボース−５−リン酸エピメラーゼ、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡおよび／またはｒｐｉＢ）および／またはリブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）イソ酵素の活性調節（例えば、低下または増大）もまた、本明細書で検討される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、グルコース６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）イソ酵素の活性を増大させるようにさらに改変された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡおよび／またはｔｋｔＢ）イソ酵素の活性を増大させるようにさらに改変された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡおよび／またはｔｋｔＢ）イソ酵素の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、トランスアルドラーゼ（ｔａｌＡまたはｔａｌＢ）イソ酵素の活性を増大させるようにさらに改変された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡおよび／またはｒｐｉＢ）イソ酵素の活性を増大させるようにさらに改変された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、リブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）イソ酵素の活性を増大させるようにさらに改変された、組換え細胞である。
【０２８５】
特定の態様では、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなる組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードするもう１つの核酸をさらに含んでなる。ホスホケトラーゼ酵素に向けて炭素を誘導するために、グルコース６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼを調節し得る（例えば、酵素活性を低下させる）。いくつかの態様では、グルコース６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）（例えば、内在性グルコース６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ遺伝子）の活性は、低下または弱力化し得る。特定の実施形態では、グルコース６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼを欠失させることで、弱力化が達成される。いくつかの態様では、グルコース６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼの活性は、内在性グルコース６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼの活性を低下させることで調節される。これは構成的低発現性プロモーターによって、内在性グルコース６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを置換することで、達成し得る。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現された核酸を含んでなり、グルコース６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。グルコース−６リン酸−１−デヒドロゲナーゼイソ酵素の活性調節（例えば、低下）もまた、本明細書で検討される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現された核酸を含んでなり、グルコース６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）イソ酵素の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。
【０２８６】
ホスホフルクトキナーゼが関与する経路
ホスホフルクトキナーゼは、フルクトース−６−リン酸のリン酸化を触媒する、解糖の重要な酵素である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ｐｆｋＡおよびｐｆｋＢによってコードされる２つのイソ酵素を有する。細胞中のホスホフルクトキナーゼ活性の大部分は、ｐｆｋＡに起因する（Ｋｏｔｌａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．１９７５  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３８１：２５７−２６８）。
【０２８７】
特定の態様では、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなる組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードするもう１つの核酸をさらに含んでなる。ホスホケトラーゼ酵素に向けて炭素を誘導するために、ホスホフルクトキナーゼ発現を調節し（例えば、酵素活性を低下させ）、フルクトース−６−リン酸およびキシルロース−５−リン酸に向けてより多くの炭素が流動するようにし得て、それによって代案の下流ＭＶＡ経路（例えば、ＭＶＫ、ＰＭｅｖＤＣ、ＩＰＫ、および／またはＩＤＩ）による、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体、およびイソプレノイドの最終生成量を増大させる。ホスホフルクトキナーゼ活性の低下は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、酵素活性の低下は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％低下される。いくつかの態様では、ホスホフルクトキナーゼの活性は、内在性ホスホフルクトキナーゼの活性を低下させることで調節される。これは合成構成的低発現性プロモーターによって、内在性ホスホフルクトキナーゼ遺伝子プロモーターを置換することで、達成し得る。ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子はまた、欠失し得る。ホスホフルクトキナーゼの活性の低下は、ホスホフルクトキナーゼの発現低下を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多量の炭素流をもたらし得る。
【０２８８】
本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、フルクトース６−リン酸（ｐｆｋＡａｎｄ／ｏｒｐｆｋＢ）の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。フルクトース６−リン酸イソ酵素の活性調節（例えば、低下）もまた、本明細書で検討される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、フルクトース−６−リン酸イソ酵素の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。
【０２８９】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体が関与する経路
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体は、ピルビン酸からアセチルＣｏＡへの脱炭酸を触媒し、遺伝子ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、およびｌｐｄＡによってコードされるタンパク質から構成される。これらの遺伝子の転写は、いくつかの調節因子によって調節される。したがって、当業者は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性を調節することで、アセチルＣｏＡを増大させ得る。変化は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性および／または発現の増大（例えば、持続的発現）であり得る。これは、例えば、ＰＬ．６（ａａｔｔｃａｔａｔａａａａａａｃａｔａｃａｇａｔａａｃｃａｔｃｔｇｃｇｇｔｇａｔａａａｔｔａｔｃｔｃｔｇｇｃｇｇｔｇｔｔｇａｃａｔａａａｔａｃｃａｃｔｇｇｃｇｇｔｇａｔａｃｔｇａｇｃａｃａｔｃａｇｃａｇｇａｃｇｃａｃｔｇａｃｃａｃｃａｔｇａａｇｇｔｇ−λプロモーター、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＣ＿００１４１６）のような強力な構成的プロモーターを、オペロンの前に配置させる、または１つまたは複数の合成構成的発現プロモーターを使用するなどの異なる方法によって、達成され得る。
【０２９０】
したがって、一態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性は、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、および（ｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼからなるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の１つまたは複数の酵素の活性を増大させることで、調節される。ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性増大のために、これらの酵素をコードする遺伝子の任意の１、２または３つを操作し得るものと理解される。別の態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性は、内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサーの活性の弱力化によって調節し得て、詳細は下述される。内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサーの活性は、内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子の欠失によって弱力化し得る。
【０２９１】
場合によっては、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体をコードする１つまたは複数の遺伝子は、内在性遺伝子である。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性を増大させる別の方法は、細胞に、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、および（ｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼからなる群からの１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を導入することである。
【０２９２】
これらの方法のいずれかを使用することで、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性が調節されていない細胞と比較して、組換え細胞は、増大した量のアセチルＣｏＡを生じ得る。ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することは、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの発現調節を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多くの炭素流をもたらし得る。
【０２９３】
ホスホトランスフェラーゼ系が関与する経路
ホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼシステム（ＰＴＳ）は、解糖作用中間体ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）によって提供されるエネルギーに依存するプロセス中で、その炭水化物基質を膜を越えて輸送し、同時にリン酸化する多要素システムである。ＰＴＳを調節する遺伝子は、大部分がオペロン中でクラスター化する。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のｐｔｓオペロン（ｐｔｓＨＩｃｒｒ）は、ホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）の中核を成す３つのタンパク質、ＨＰｒ（ｐｔｓＨ）、酵素Ｉ（ｐｔｓＩ）、およびＥＩＩＩＧｌｃ（ｃｒｒ）タンパク質をコードする、ｐｔｓＨ、ｐｔｓＩ、およびｃｒｒ遺伝子から構成される。これらの３つの遺伝子は複合オペロンに編成され、その中では、遠位遺伝子ｃｒｒの発現の大部分が、ｐｔｓＩ内のプロモーター領域から開始される。ｐｔｓオペロンの遺伝子に加えて、ｐｔｓＧは、ホスホトランスフェラーゼ系のグルコース特異的輸送体、ｐｔｓＧをコードする。このプロモーター領域からの転写は、異化産物活性化タンパク質（ＣＡＰ）−環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の正の制御下にあり、グルコース（ＰＴＳ基質）の存在下における増殖中に増大される。さらにｐｐｓＡ遺伝子は、ホスホトランスフェラーゼシステム（ＰＴＳ）の活性に必要なホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）を生成するための、ホスホエノールピルビン酸シンセターゼをコードする。炭素流は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ経路またはＰＴＳ経路を通じて、ホスホエノールピルビン酸シンセターゼによって誘導される。その内容全体を参照によって本明細書に援用する、Ｐｏｓｔｍａ，Ｐ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．（１９９３），５７（３）：５４３−９４）を参照されたい。
【０２９４】
本明細書に記載される特定の実施形態では、オペロンの下方制御（例えば、弱力化）は、宿主細胞による酢酸利用を高め得る。ＰＴＳオペロンの下方制御は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、複合体の活性低下は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低下される。特定の実施形態では、弱力化は、ｐｔｓオペロンを欠失させることで達成される。いくつかの態様では、ＰＴＳ系の活性は、内在性ｐｔｓオペロンの活性を低下させることで調節される。これは構成的低発現性プロモーターによって、ｐｔｓオペロン中の内在性プロモーターを置換することで達成し得る。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、ｐｔｓオペロンの活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、ＥＩ（ｐｔｓＩ）の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、ＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、ＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、ＨＰｒ（ｐｔｓＨ）の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。グルコース取り込みのためのＰＥＰプールを増大させながら、ピルビン酸デヒドロゲナーゼを通じて失われる炭素を低下させるために、ホスホエノールピルビン酸シンセターゼ（ｐｐｓＡ）の活性を増大させ得る。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、ホスホエノールピルビン酸シンセターゼ（ｐｐｓＡ）の活性を増大させるようにさらに改変された、組換え細胞である。本発明の任意のさらなる態様では、ＰＴＳは下方制御され、グルコース輸送経路は上方制御される。グルコース輸送経路としては、ガラクトース（ｇａｌＰ）およびグルコキナーゼ（ｇｌｋ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、ｐｔｓオペロンは下方制御され、ガラクトース（ｇａｌＰ）遺伝子は上方制御され、グルコキナーゼ（ｇｌｋ）遺伝子は上方制御される。ＰＴＳのイソ酵素の活性調節（例えば、低下）もまた本明細書で検討される。本発明の任意の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなり、ＰＴＳイソ酵素の活性を低下させるようにさらに改変された、組換え細胞である。
【０２９５】
キシロース利用が関与する経路
特定の態様では、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなる組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードするもう１つの核酸をさらに含んでなる。本明細書に記載される特定の実施形態では、メバロン酸など、イソプレノイド前駆体、イソプレンおよび／またはイソプレノイドなどの所望の生成物に、植物バイオマスに由来する糖を変換するのに、キシロースの利用が望ましい。生物によっては、キシロース利用は、代謝のためのフルクトース−６−リン酸への変換のために、ペントースリン酸経路の使用を必要とする。生物は、グルコースによる異化代謝産物抑制の不活性化、またはその他の生物に見られるキシロースオペロンからの遺伝子の異種性発現のどちらかによって、キシロース利用増大のために改変し得る。キシルロース経路は、下述されるように改変して、ホスホケトラーゼ経路による、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレンおよび／またはイソプレノイドの生成を高め得る。
【０２９６】
キシロース取り込みの強化、そしてキシルロース−５−リン酸への変換と、それに続くホスホケトラーゼ経路への直接流入は、有利である。理論により拘束されることなく、これは炭素流が、ペントースリン酸経路をバイパスできるようにする（が、必要に応じて、いくらかのグリセルアルデヒド−３−リン酸がＰＰＰ内に循環されてもよい）。キシルロキナーゼの発現増大を使用して、キシルロース−５−リン酸の総生成を増大させ得る。キシルロキナーゼの発現および活性の最適化を使用して、ホスホケトラーゼ経路のある株中でキシロース利用を高め得る。所望のキシルロキナーゼは、宿主の内在性酵素、または宿主に適合性の任意の異種キシルロキナーゼのどちらであってもよい。一実施形態では、キシロースオペロンのその他の構成要素（例えば、キシロースイソメラーゼ）を過剰発現させて、便益を増大させ得る。別の実施形態では、その他のキシロース経路酵素（例えば、キシロース還元酵素）を弱力化する（例えば、活性低下または欠失）必要があるかもしれない。
【０２９７】
したがって、本明細書に記載されるようなホスホケトラーゼ酵素を有するように改変された宿主細胞をさらに改変して、内在性形態または異種形態のどちらかのキシルロースイソメラーゼおよび／またはキシルロキナーゼを過剰発現させて、代案の下流ＭＶＡ経路（例えば、ＭＶＫ、ＰＭｅｖＤＣ、ＩＰＫ、および／またはＩＤＩ）による、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレンおよび／またはイソプレノイドの全収率および生産性を改善し得る。
【０２９８】
ペントースリン酸経路のトランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼ酵素が関与する経路
特定の態様では、本明細書で開示されるような一リン酸デカルボキシラーゼおよび／またはイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現された核酸を含んでなる組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードするもう１つの核酸をさらに含んでなる。嫌気性またはヘテロ発酵性増殖できるいくつかの微生物は、解糖経路の代わりに、またはそれに加えて、ホスホケトラーゼ経路を組み入れている。この経路は、ペントースリン酸経路酵素である、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼの活性に依存する。したがって、本明細書に記載されるようなホスホケトラーゼ酵素有するように改変された宿主細胞をさらに改変して、内在性形態または異種形態のどちらかのトランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼを過剰発現させて、経路流動を改善し、潜在的に毒性の中間体のレベルを低下させ、中間体の非生産的経路への転用を低下させ、代案の下流ＭＶＡ経路（例えば、ＭＶＫ、ＰＭｅｖＤＣ、ＩＰＫ、および／またはＩＤＩ）による、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレンおよび／またはイソプレノイドの全収率および生産性を改善し得る。
【０２９９】
変異の組み合わせ
本明細書に記載される酵素および／または酵素経路のいずれかについて、本明細書に記載される酵素および／または酵素経路の（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４個の）任意の組み合わせを調節する分子操作が、明示的に検討されるものと理解される。組み合わせの列挙を容易にするために、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）をＡと表し、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）をＢと表し、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）をＣと表し、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）をＤと表し、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐ）をＥと表し、およびピルビン酸デカルボキシラーゼ（ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、および／またはｌｐｄＡ）をＦと表し、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｅｄｄ）をＧと表し、２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）Ｈをと表し、ホスホフルクトキナーゼをＩと表し、トランスアルドラーゼをＪと表し、トランスケトラーゼをＫと表し、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼをＬと表し、リボース−５−リン酸エピメラーゼをＭと表し、キシルロキナーゼをＮと表し、キシロースイソメラーゼをＯと表し、およびキシリトール還元酵素をＰと表し、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉ）をＱと表し、Ｄ−リブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）をＲと表し、ホスホエノールピルビン酸シンセターゼ（ｐｐｓ）をＳと表し、フルクトース二リン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）をＴと表し、ＥＩ（ｐｔｓＩ）をＵと表し、ＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）をＶと表し、ＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）をＷと表し、ＨＰｒ（ｐｔｓＨ）をＸと表し、ガラクトース（ｇａｌＰ）をＹと表し、グルコキナーゼ（ｇｌｋ）をＺと表し、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）をＡＡと表す。上で考察されるように、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を増大させるために、ピルビン酸デカルボキシラーゼ複合体のａｃｅＥ、ａｃｅＦ、および／またはｌｐｄＡ酵素を単独で、３酵素の内２つを、または３酵素の内３つを使用し得る。したがって、本明細書でＡ−Ｍと称する任意のおよび全ての酵素組み合わせが明示的に検討され、Ａ−ＡＡと称する任意のおよび全ての酵素組み合わせについても同様である。さらに、上述の任意の組み合わせは、本明細書に記載される酵素および／または酵素経路のいずれか（例えば、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニルキナーゼ、ホスホケトラーゼ、ＭＶＡ経路ポリペプチド、ＩＤＩ、イソプレンシンターゼ、ＤＸＰ経路ポリペプチド）と組み合わせて使用し得る。
【０３００】
生成増大のためのその他の制御因子および要素
その他の分子操作を使用して、メバロン酸生成に向かう炭素流を増大させ得る。一方法は、メバロン酸経路に供給する経路に対する負の制御因子の効果を削減し、低下させまたは排除することである。例えば、場合によっては、遺伝子ａｃｅＥＦ−ｌｐｄＡはオペロン中にあり、４番目の遺伝子はｐｄｈＲ上流にある。遺伝子ｐｄｈＲは、そのオペロンの転写の負の制御因子である。ピルビン酸不在下では、それはその標的プロモーターに結合して、転写を抑制する。それはまた、ｎｄｈおよびｃｙｏＡＢＣＤを同様に調節する（Ｏｇａｓａｗａｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８９：５５３４−５５４１）。一態様では、ｐｄｈＲ制御因子の欠失は、ピルビン酸の供給を改善し得て、したがって代案の下流ＭＶＡ経路（例えば、ＭＶＫ、ＰＭｅｖＤＣ、ＩＰＫ、および／またはＩＤＩ）による、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン、およびイソプレノイドの生成を改善する。
【０３０１】
別の実施形態では、結果として得られた上述の株のいずれかをさらに改変して、エントナー・ドウドロフ経路の活性を調節し得る。ホスホグルコン酸デヒドラターゼまたはアルドラーゼをコードする遺伝子は、弱力化または欠失させ得る。別の実施形態では、結果として生じる上述の株のいずれかもまた、酢酸キナーゼまたはクエン酸シンターゼの活性を低下させまたは除去するように改変してもよい。別の実施形態では、株のいずれか結果として生じる株はまた、ホスホフルクトキナーゼの活性を低下させまたは除去するように改変してもよい。別の実施形態では、上述の結果として生じる株のいずれかはまた、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節するように改変してもよい。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性は、その活性を低下させることで調節し得る。別の実施形態では、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼおよび（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼなどの、ペントースリン酸経路の非酸化分岐からの酵素を過剰発現させ得る。
【０３０２】
その他の態様では、宿主細胞をさらに改変して、セドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼ／フルクトース−１，６−二リン酸アルドラーゼおよびセドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼ／フルクトース−１，６−二リン酸ホスファターゼをコードする異種核酸を導入することで、細胞内アセチル−リン酸濃度を増大させ得る。特定の実施形態では、これらの分子操作を有する宿主細胞は、弱力化されまたは欠失しているトランスアルドラーゼ（ｔａｌＢ）およびホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋＡおよび／またはｐｆｋＢ）遺伝子と組み合わせ得て、それによってエリスロース４−リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、およびグリセルアルデヒド３−リン酸のセドヘプツロース７−リン酸およびフルクトース１−リン酸へのより迅速な変換を可能にする。
【０３０３】
その他の態様では、ＰＧＬが欠失している細胞（様々な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株など）内への６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）の導入を使用して、代案の下流ＭＶＡ経路（例えば、ＭＶＫ、ＰＭｅｖＤＣ、ＩＰＫ、および／またはＩＤＩ）による、メバロン酸、イソプレノイド前駆体、イソプレン、およびイソプレノイドの生成を改善し得る。ＰＧＬは、染色体への組み込みまたはプラスミドなどの染色体外媒介物を使用した、コード遺伝子導入によって、導入してもよい。
【０３０４】
本明細書に記載される様々な酵素経路を調節するための宿主細胞（例えば、細菌宿細胞）変異は、メバロン酸生成に向けて炭素流を増大させるが、それに加えて、本明細書に記載される宿主細胞は、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニルキナーゼ、ならびにｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子産物をはじめとするがこれに限定されないＭＶＡ経路からのその他の酵素をコードする遺伝子を含んでなる。ＭＶＡ経路ポリペプチドの非限定的例としては、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素）ポリペプチド、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチド、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）ポリペプチド、イソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）ポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、およびＭＶＡ経路ポリペプチドの２つ以上の活性を有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）が挙げられる。ＭＶＡ経路ポリペプチドとしては、ＭＶＡ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なＭＶＡ経路核酸としては、ＭＶＡ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なＭＶＡ経路ポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する、天然ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。態様によっては、宿主細胞は、ホスホケトラーゼをコードする遺伝子をさらに含んでなる。
【０３０５】
使用し得るＭＶＡ経路ポリペプチドの非限定的例は、国際公開第２００９／０７６６７６号パンフレット；国際公開第２０１０／００３００７号パンフレット、および国際公開第２０１０／１４８１５０号パンフレットに記載される。
【０３０６】
例示的な細胞培養液
本明細書の用法では、「最少培地」または「最少培地」という用語は、常時ではないが、通常、１つまたは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のアミノ酸）の存在がない、細胞増殖に可能な最少栄養素を含有する増殖培地を指す。最少培地は、典型的に、（１）宿主細胞（例えば、細菌細胞）増殖のための炭素源；（２）宿主細胞種および培養条件の間で変動し得る、様々な塩類；および（３）水を含有する。下でより詳細に考察されるように、炭素源は、グルコースのような単糖類から、酵母抽出物などのその他のバイオマスのより複雑な加水分解物まで、顕著に変動し得る。塩類は、概してマグネシウム、窒素、リン、およびイオウなどの不可欠な構成要素を提供し、細胞がタンパク質と核酸を合成できるようにする。最少培地はまた、抗生物質などの選択的作用因子で補足して、特定のプラスミドの維持などについて選択し得る。例えば、微生物が、アンピシリンまたはテトラサイクリンなどの特定の抗生物質に耐性を示す場合、耐性を欠く細胞が増殖するのを妨ぐために、その抗生物質を培地に添加し得る。培地は、必要に応じてその他の化合物で補足して、特定のアミノ酸などの所望の生理学的または生化学的特性について選択し得る。
【０３０７】
任意の最少培地調合物を使用して、宿主細胞を培養し得る。例示的な最少培地調合物としては、例えば、Ｍ９最少培地およびＴＭ３最少培地が挙げられる。１リットルのＭ９最少培地あたり、以下を含有する：（１）２００ｍｌの無菌Ｍ９塩（１リットルあたり、６４ｇのＮａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ、１５ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．５ｇのＮａＣｌ、および５．０ｇのＮＨ４Ｃｌ）；（２）２ｍｌの１Ｍ  ＭｇＳＯ４（無菌）；（３）２０ｍｌの２０％（ｗ／ｖ）グルコース（またはその他の炭素源）；および（４）１００μｌの１Ｍ  ＣａＣｌ２（無菌）。１リットルのＴＭ３最少培地あたり、以下を含有する：（１）１３．６ｇのＫ２ＨＰＯ４；（２）１３．６ｇのＫＨ２ＰＯ４；（３）２ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；（４）２ｇのクエン酸一水和物；（５）０．３ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム；（６）３．２ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４；（７）０．２ｇの酵母抽出物；および（８）１ｍｌの１０００×微量成分溶液；ｐＨは約６．８に調節され、溶液は濾過滅菌される。１リットルの１０００×微量成分あたり、以下を含有する：（１）４０ｇのクエン酸一水和物；（２）３０ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ；（３）１０ｇのＮａＣｌ；（４）１ｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；（４）１ｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ；（５）１ｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；（６）１００ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ；（７）１００ｍｇのＨ３ＢＯ３；および（８）１００ｍｇのＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ；ｐＨは約３．０に調節される。
【０３０８】
追加的な例示的最少培地は、以下を含む：（１）リン酸カリウムＫ２ＨＰＯ４、（２）硫酸マグネシウムＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、（３）クエン酸一水和物Ｃ６Ｈ８Ｏ７＊Ｈ２Ｏ、（４）クエン酸第二鉄アンモニウムＮＨ４ＦｅＣ６Ｈ５Ｏ７、（５）酵母抽出物（ｂｉｏｓｐｒｉｎｇｅｒからの）、（６）１０００×修正微量金属溶液、（７）硫酸５０％ｗ／ｖ、（８）ｆｏａｍｂｌａｓｔ  ８８２（Ｅｍｅｒａｌｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）、および（９）マクロ塩類溶液３．３６ｍｌ。全ての構成要素を脱イオンＨ２Ｏに共に添加して溶解し、次に加熱滅菌する。室温への冷却に続いて、ｐＨを水酸化アンモニウム（２８％）で７．０に調節して、所定容積にする。滅菌およびｐＨ調節後、ビタミン溶液およびスペクチノマイシンを添加する。
【０３０９】
宿主細胞は、任意の炭素源を使用して培養し得る。「炭素源」という用語は、宿主細胞または生物によって代謝されることができる、１つまたは複数の炭素含有する化合物を指す。例えば、宿主細胞を培養するのに使用される細胞培地としては、宿主細胞の生存率維持または増殖に適した任意の炭素源が挙げられる。いくつかの態様では、炭素源は、炭水化物（単糖、二糖類、オリゴ糖、または多糖類など）、または転化糖（例えば、酵素処理スクロースシロップ）である。
【０３１０】
いくつかの態様では、炭素源は、酵母抽出物、または酵母抽出物の１つまたは複数の構成要素を含む。いくつかの態様では、酵母抽出物の濃度は、０．１％（ｗ／ｖ）、０．０９％（ｗ／ｖ）、０．０８％（ｗ／ｖ）、０．０７％（ｗ／ｖ）、０．０６％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）、０．０４％（ｗ／ｖ）、０．０３％（ｗ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）、または０．０１％（ｗ／ｖ）の酵母抽出物である。いくつかの態様では、炭素源は、酵母抽出物（またはその１つまたは複数の構成要素）と、グルコースなどの別の炭素源との双方を含む。
【０３１１】
例示的な単糖類としては、グルコースおよびフルクトースが挙げられ；例示的なオリゴ糖としては、乳糖およびスクロースが挙げられ；および例示的な多糖類としては、デンプンおよびセルロースが挙げられる。例示的な炭水化物としては、Ｃ６糖（例えば、フルクトース、マンノース、ガラクトース、またはグルコース）およびＣ５糖（例えば、キシロースまたはアラビノース）が挙げられる。
【０３１２】
いくつかの態様では、本明細書に記載される細胞は、エネルギーおよび／または炭素源として合成ガスを使用できる。いくつかの実施形態では、合成ガスは、少なくとも一酸化炭素および水素を含む。いくつかの実施形態では、合成ガスはさらに、二酸化炭素、水、または窒素の１つまたは複数をさらに含む。いくつかの実施形態では、合成ガス中の水素と一酸化炭素のモル比は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、３．０、４．０、５．０、または１０．０である。いくつかの実施形態では、合成ガスは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０容量％の一酸化炭素を含んでなる。いくつかの実施形態では、合成ガスは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０容量％の水素を含んでなる。いくつかの実施形態では、合成ガスは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０容量％の二酸化炭素を含んでなる。いくつかの実施形態では、合成ガスは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０容量％の水を含んでなる。いくつかの実施形態では、合成ガスは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０容量％の窒素を含んでなる。
【０３１３】
合成ガスは、天然または合成源に由来してもよい。それから合成ガスが由来する起源は、「原材料」と称される。いくつかの実施形態では、合成ガスは、バイオマス（例えば、木材、スイッチグラス、農業廃棄物、都市廃棄物）または炭水化物（例えば、糖）に由来する。別の実施形態では、合成ガスは、石炭、鉱油、油母、タールサンド、油母頁岩、または天然ガスに由来する。別の実施形態では、合成ガスは、タイヤゴムなどからのゴムに由来する。
【０３１４】
合成ガスは、メタン改質、石炭液化、混焼、発酵反応、酵素反応、およびバイオマス気化をはじめとする様々な処理によって、原材料から誘導され得る。バイオマス気化は、反応器内において、化学量論的量よりも少ない酸素の存在下、７００℃を超える温度で、バイオマスを部分的酸化することで達成される。酸素は、空気、純酸素、または蒸気の形態でバイオリアクターに導入される。気化は、３つの主要段階で起こり得る：１）バイオマス中に包埋されたあらゆる水分を乾燥させる初期加熱；２）酸化剤の不在下でバイオマスが３００〜５００℃へ加熱されて、ガス、タール、オイル、および固体炭化物残渣を生じる、熱分解；および３）合成ガスの主成分を生じる、固体炭化物、タール、およびガスの気化。混焼は、石炭／バイオマス混合物の気化によって達成される。合成ガス構成要素のアイデンティティーおよびモル比などの合成ガスの組成は、それが由来する原材料と、原材料を合成ガスに変換する方法とに応じて変動し得る。
【０３１５】
合成ガスは、不純物を含有し得て、その性質と量は、製造で使用される原材料と工程の双方に応じて変動する。発酵は、いくつかの不純物に耐性であってもよいが、発酵槽と関連装置を汚染するかもしれないタールや微粒子などの物質を合成ガスから除去する必要性がなおもある。揮発性有機化合物、酸性ガス、メタン、ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、キシレン、Ｈ２Ｓ、ＣＯＳ、ＣＳ２、ＨＣｌ、Ｏ３、有機イオウ化合物、アンモニア、窒素酸化物、窒素含有有機化合物、および重金属蒸気などの、イソプレン生成物を汚染するかもしれない化合物を除去することもまた、賢明である。合成ガスからの不純物除去は、ガス洗浄、固相吸着剤での処理、およびガス透過性膜を使用した精製をはじめとする、いくつかの手段によって達成し得る。
【０３１６】
例示的な細胞培養条件
本発明の組換え細胞の維持および増殖に適した材料および方法は、例えば、実施例セクションで後述される。細菌培養の維持および増殖に適したその他の材料および方法もまた、技術分野で周知である。例示的な技術は、国際公開第２００９／０７６６７６号パンフレット、米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号明細書、国際公開第２０１０／００３００７号パンフレット、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号明細書、国際公開第２００９／１３２２２０号パンフレット、米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号明細書、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，編），米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ），Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）、またはＢｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第２版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．にある。いくつかの態様では、細胞は、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチド；イソペンテニルキナーゼポリペプチド；ならびにｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子産物をはじめとするがこれに限定されるものではない上流および下流ＭＶＡ経路からのその他の酵素；宿主細胞中に挿入された核酸によってコードされるイソプレンシンターゼ、ＤＸＰ経路（例えば、ＤＸＳ）、ＩＤＩ、またはＰＧＬポリペプチドの発現ができるようにする条件下で、培地中で培養される。
【０３１７】
標準的細胞培養条件を使用して、細胞を培養し得る（例えば、国際公開第２００４／０３３６４６号パンフレットと、その中で引用される参考文献を参照されたい）。いくつかの態様では、細胞は、適切な温度、ガス混合物、およびｐＨ（約２０°Ｃ〜約３７°Ｃ、約６％〜約８４％ＣＯ２、およびｐＨ約５〜約９など）で、増殖され維持される。いくつかの態様では、細胞は、適切な細胞培地中で３５°Ｃで増殖される。いくつかの態様では、発酵のためのｐＨ範囲は、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ９．０（約ｐＨ６．０〜約ｐＨ８．０または約６．５〜約７．０など）である。細胞は、宿主細胞の要件に基づいて、好気性、無酸素性、または嫌気性条件下で増殖し得る。さらに、より特異的な細胞培養条件を使用して、細胞を培養し得る。例えば、いくつかの実施形態では、組換え細胞（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞など）は、低コピー数から中程度コピー数プラスミド中で、強力なプロモーターの制御下にある、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼポリペプチド；イソペンテニルキナーゼポリペプチド；ならびにｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子産物をはじめとするが、これに限定されるものではない上流からの酵素；Ｌ．グレイー（Ｌ．ｇｒａｙｉ）、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）および／またはＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）からのｍｖａＥおよびｍｖａＳポリペプチドをコードする、１つまたは複数の異種核酸を含んでなり、３４℃で培養される。
【０３１８】
使用し得る標準的培養条件と、バッチ、流加、または連続発酵などの発酵様式は、国際公開第２００９／０７６６７６号パンフレット、米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号明細書、国際公開第２０１０／００３００７号パンフレット、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号明細書、国際公開第２００９／１３２２２０号パンフレット、米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号明細書に記載される。バッチおよび流加発酵は一般的で、当該技術分野で周知であり、例は、Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第２版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．にある。
【０３１９】
いくつかの態様では、細胞は、グルコース制限条件下で培養される。「グルコース制限条件」とは、添加されるグルコースの量が、細胞によって消費されるグルコース量の約１０５％以下（約１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％など）であることを意味する。特定の態様では、培地に添加されるグルコースの量は、特定期間中に細胞によって消費されるグルコースの量と、ほぼ同じである。いくつかの態様では、細胞増殖速度は、細胞培地中のグルコースの量が支持し得る速度で、細胞が増殖するように、グルコースの添加量を制限することで制御される。いくつかの態様では、グルコースは、細胞の培養時間中に蓄積されない。様々な態様において、細胞は、グルコース制限条件下で、約１、２、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、または７０時間以上培養される。様々な態様において、細胞は、細胞が培養される総時間の５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、または１００％以上にわたって、グルコース制限条件下で培養される。いかなる特定の理論による拘束も意図されないが、グルコース制限条件は、細胞のより良好な制御を可能にすると考えられる。
【０３２０】
いくつかの態様では、組換え細胞は、バッチ培養中で増殖される。組換え細胞はまた、流加培養または連続培養中で増殖させ得る。さらに、組換え細胞は、上述の最少培地のいずれかをはじめとするが、これに限定されるものではない最少培地中で培養し得る。最少培地は、１．０％（ｗ／ｖ）以下のグルコースまたは任意のその他の六炭糖で、さらに補足し得る。具体的には、最少培地は、１％（ｗ／ｖ）、０．９％（ｗ／ｖ）、０．８％（ｗ／ｖ）、０．７％（ｗ／ｖ）、０．６％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）、０．４％（ｗ／ｖ）、０．３％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）、または０．１％（ｗ／ｖ）のグルコースで補足し得る。さらに、最少培地は、０．１％（ｗ／ｖ）以下の酵母抽出物で補足し得る。具体的には、最少培地は、０．１％（ｗ／ｖ）、０．０９％（ｗ／ｖ）、０．０８％（ｗ／ｖ）、０．０７％（ｗ／ｖ）、０．０６％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）、０．０４％（ｗ／ｖ）、０．０３％（ｗ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）、または０．０１％（ｗ／ｖ）のグルコースで補足し得る。代案としては、最少培地に、１％（ｗ／ｖ）、０．９％（ｗ／ｖ）、０．８％（ｗ／ｖ）、０．７％（ｗ／ｖ）、０．６％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）、０．４％（ｗ／ｖ）、０．３％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）、または０．１％（ｗ／ｖ）グルコースおよびｗｉｔｈ０．１％（ｗ／ｖ）、０．０９％（ｗ／ｖ）、０．０８％（ｗ／ｖ）、０．０７％（ｗ／ｖ）、０．０６％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）、０．０４％（ｗ／ｖ）、０．０３％（ｗ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）、または０．０１％（ｗ／ｖ）の酵母抽出物を添加し得る。
【０３２１】
例示的な精製法
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法のいずれかは、生成された化合物（例えば、イソプレン、イソプレノイド前駆体、またはイソプレノイド）を回収するステップをさらに含む。いくつかの態様では、本明細書に記載される方法のいずれかは、イソプレンを回収するステップをさらに含む。例えば、ガスストリッピング、膜強化分離、分画、吸着／脱離、浸透気化法、固相からのイソプレンの加熱または真空脱離、または固相に固定化または吸収されたイソプレンの溶剤抽出などの標準的な技術を使用して、本発明の組成物および方法を使用して生成されたイソプレンを回収し得る（例えば、特にイソプレン回収および精製法に関して、それぞれその全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第４，７０３，００７号明細書および米国特許第４，５７０，０２９号明細書を参照されたい）。一態様では、イソプレンは、吸収ストリッピングによって回収される（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０１７８２６１号明細書を参照されたい）。特定の態様では、アルコール（エタノール、メタノール、プロパノール、またはそれらの組み合わせなど）による抽出蒸留を使用して、イソプレンを回収する。いくつかの態様では、イソプレンの回収は、液体形態のイソプレン（無希釈イソプレン溶液または溶剤中のイソプレン溶液など）の単離を伴う。ガスストリッピングは、発酵発生気体ストリームから、イソプレン蒸気を連続様式で除去することを伴う。このような除去は、固相への吸着、液相中への分配、または直接凝縮（凝縮コイルへの曝露に起因する、または圧力増大に起因する凝縮など）をはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの異なる方法で達成し得る。いくつかの態様では、蒸気の露点を超える希釈イソプレン蒸気流のメンブレン濃縮は、液体イソプレンの凝縮をもたらす。いくつかの態様では、イソプレンは圧縮および濃縮される。
【０３２２】
イソプレンの回収は、一段階または複数段階を伴ってもよい。いくつかの態様では、発酵発生気体からのイソプレン蒸気の除去、およびイソプレンの液相への変換は、同時に実施される。例えば、発生気体ストリームからイソプレンを直接濃縮して、液体を形成し得る。いくつかの態様では、発酵発生気体からのイソプレン蒸気の除去、およびイソプレンの液相への変換は、順次実施される。例えば、イソプレンを固相に吸着させて、次に溶剤によって固相から抽出してもよい。一態様では、イソプレンは、米国特許出願第１２／９６９，４４０号明細書（米国特許出願公開第２０１１／０１７８２６１号明細書）に記載されるような吸収ストリッピングを使用して、回収される。
【０３２３】
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法のいずれかは、イソプレンを精製するステップをさらに含む。例えば、標準的な技術を使用して、本発明の組成物および方法を使用して生成されたイソプレンを精製し得る。精製とは、それを通じてイソプレンが、イソプレン生成時に存在する１つまたは複数の構成要素から分離される工程を指す。いくつかの態様では、イソプレンは、実質的に純粋な液体として得られる。精製法の例としては、（ｉ）液体抽出剤中の溶液からの蒸留、および（ｉｉ）クロマトグラフィーが挙げられる。本明細書の用法では、「精製イソプレン」は、イソプレンが、イソプレン生成時に存在する１つまたは複数の構成要素から分離されていることを意味する。いくつかの態様では、イソプレンは、重量基準で少なくとも約２０％、イソプレン生成時に存在するその他の構成要素を含まない。様々な態様において、イソプレンは、重量基準で、少なくともまたはおよそ２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、または９９％の純度である。純度は、例えば、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ分析、またはＧＣ−ＭＳ分析などの任意の適切な方法によって、アッセイし得る。適切な精製法は、米国特許出願公開第２０１０／０１９６９７７Ａ１号明細書に、より詳細に記載される。
【０３２４】
いくつかの態様では、イソプレンを除去するための１つまたは複数の回収ステップ後に残る気相の少なくとも一部は、イソプレンを生成するための細胞培養システム（発酵槽など）に気相を導入することで、再循環される。
【０３２５】
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法のいずれかは、イソプレノイド前駆体またはイソプレノイドを回収するステップをさらに含む。
【０３２６】
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法のいずれかは、異種核酸を回収するステップをさらに含む。いくつかの態様では、本明細書に記載される方法のいずれかは、異種ポリペプチドを回収するステップをさらに含む。
【０３２７】
発明は、以下の実施例を参照してより完全に理解されるであろう。しかしこれらは、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。本開示全体を通じて、全ての引用は、本明細書に参照によって明示的に援用する。
【実施例】
【０３２８】
実施例１：候補古細菌イソペンテニルキナーゼ（ＩＰＫ）およびホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭｅｖＤＣ）の試験管内および生体内試験
イソペンテニルキナーゼ（ＩＰＫ）は、古細菌ゲノム中に容易に見つけられるが、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭｅｖＤＣ）活性があるポリペプチドをコードする古細菌候補遺伝子については、非常に限定的な情報のみが得られ、直接の生化学的証拠は入手できない。ＭＶＡ経路クラスター重点を置いた比較ゲノム分析に基づいて古細菌ゲノム分析と組み合わせて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で機能性古細菌下流ＭＶＡ経路を確立する能力について、メタノカルドコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）およびメタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）からのＩＰＫおよびＰＭｅｖＤＣ候補遺伝子をそれぞれ試験した。Ｇｒｏｃｈｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８８（９）：３１９２−８，（２００６）、およびＭａｔｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６２（１）３９−５２，（２０１１）を参照されたい。
【０３２９】
Ｍ．ヤンナスキイ（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）およびＭｂｂ．ルミナンチウム（Ｍｂｂ．ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）からの２つのＩＰＫを染色体ＤＮＡから増幅して、ｐＥＴ発現ベクターにクローン化した。ＩＰＫをコードするｐＥＴ発現ベクターを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１内で確立されたＴ７発現系に形質転換した。形質転換細菌から単離された細胞溶解産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、クローン遺伝子によってコードされるタンパク質の強力な発現を実証した。さらに、タンパク質溶解度は、少なくとも５０％以上であった。ＧＣ／ＭＳまたはＬＣ／ＭＳ分析によって、誘導された細胞の粗抽出物を試験管内ＩＰＫ活性について試験すると、痕跡量のイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）のみが、イソペンテニルリン酸（ＩＰ）から生成された。ＩＰＰシグナルは、バックグラウンドを最小限度のみ上回り、１３Ｃ標識実験を実施した場合でさえも、顕著な基質消費は実証され得なかった。
【０３３０】
生体内ＩＰＫ活性分析では、古典的下流ＭＶＡ経路を発現して、Ｍ．ヤンナスキイ（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）またはＭｂｂ．ルミナンチウム（Ｍｂｂ．ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）のどちらかからのＩＰＫ遺伝子を発現するプラスミドで形質転換された、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣＭ７２４  ＤｉｓｐＧ  ＤｉｓｐＨ株内で、ＩＰ変換が試験された。外来性ＭＶＡの不在下では、株は増殖し得なかった一方で、５００μＭのＭＶＡ添加は、増殖を完全に回復させた。培地への６００μＭのＩＰ添加もまた制約を受けない増殖（「ＩＰレスキュー」）を可能にし、双方のメタン細菌からのクローン化ＩＰＫ遺伝子の生体内活性を明確に示す。ＩＰが補給されると、メタン細菌ＩＰＫを発現する組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が増殖し得るという発見は、生体内活性に基づくスクリーニングのための宿主の構築を可能にした。
【０３３１】
ＩＰＫ遺伝子のクローニングと同様に、Ｍ．ヤンナスキイ（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）およびＭｂｂ．ルミナンチウム（Ｍｂｂ．ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）からの候補ＰＭｅｖＤＣを染色体ＤＮＡから増幅して、ｐＥＴ発現ベクターにクローン化した。候補ＰＭｅｖＤＣをコードするｐＥＴ発現ベクターを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１内で確立されたＴ７発現系に形質転換した。細菌からの細胞溶解産物の予備分析は、候補ＰＭｅｖＤＣの溶解度が５０％以下であることを実証した。したがって溶解度増強因子をタンパク質に融合させ、引き続く溶解度分析は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔ７システムにおける発現後、合成されたタンパク質の少なくとも５０％が、可溶性画分中に見られることを実証した。候補ＰＭｅｖＤＣの天然および融合タンパク質を含有する、対応する無細胞抽出物を作成し、試験管内ＰＭｅｖＤＣ活性について試験した。抽出物作成は、メタノサーモバクター・サームオートトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）細胞抽出物から得られる低分子量画分（＜３ｋＤａ濾液）の添加を含めた、異なる設定で実施され、古細菌内に存在するが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内には存在しない小型分子が補完された。追加的な設定は、酵素アッセイはじめとする厳密な無酸素条件下における下流プロセッシングと組み合わされた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の無酸素性培養および発現を含んでなる。試験したシステムでは、天然または融合タンパク質について、試験管内ＰＭｅｖＤＣ活性は実証されなかった。厳密な無酸素条件下で完全に同じように処理された、Ｍ．サームオートトロフィカス（Ｍ．ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）の無細胞抽出物は、基質ＭＶＡおよびメバロン酸リン酸に対する活性を示すが、ＩＰに対する活性は示さない抽出物をもたらした。
【０３３２】
ＩＰＫ活性の生体内試験で行われたのと同様のＩＰレスキュー実験を、ＰＭｅｖＤＣ活性の生体内試験について実施した。Ｍ．ヤンナスキイ（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）またはＭｂｂ．ルミナンチウム（Ｍｂｂ．ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）の同一供与生物のＩＰＫと共に、ＰＭｅｖＤＣをコードする二重コンストラクトを作り出した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣＭ７２４  ＤｉｓｐＧ  ＤｉｓｐＨ株内で発現させると、ＩＰの添加は細胞増殖をもたらしたので、コンストラクトは、ＩＰＫ活性があるタンパク質を発現することが示された。しかしＩＰの代わりにメバロン酸リン酸が培地補給されると、増殖は維持されなかった。しかしＭＶＡの補給は、増殖を回復させた。したがってこれらのメタン細菌からのＰＭｅｖＤＣ候補遺伝子は、この大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株内では活性形態で発現し得ず、別のタンパク質が欠損していた、またはクローン化した候補遺伝子は、研究中のＰＭｅｖＤＣ−活性をコードしなかったと結論付けられた。
【０３３３】
実施例２：活性に基づく候補ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭｅｖＤＣ）のスクリーニング
メタン細菌からのＩＰＫを用いた実験が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で、対応する遺伝子の生体内活性を実証した場合、この発見を使用して、最終的に活性に基づくスクリーニングのために利用される宿主をデザインした。活性に基づく新規のより下流のＭＶＡ経路のスクリーニングの基本的要求は、ＤＭＡＰＰを合成する代替経路または活性の不在であった。ホスミドマイシン誘導性サイレンシングは、標準大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の内在性ＤＸＰ−経路が、スクリーニング目的に適さないことを示した。したがってＤＸＰ経路の安定した遺伝的不活性化が、探求された。ＤＸＰ経路を不活性化するために、ＨＭＢＰＰシンターゼ（ｉｓｐＧ）およびＨＭＰＰＰ還元酵素（ｉｓｐＨ）をコードする遺伝子を不活性化して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣＭ７２４株を作成した。この二重変異大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、小型挿入メタゲノムライブラリーで補足され得ず、これは、メタゲノム資源からのスクリーニングのために利用される宿主ベースとしてのその利用を可能にする重要な発見であった。スクリーニング宿主を作成するために、ＭＣＭ７２４株を使用して、強力な構成的プロモーター制御下で、染色体にコードされる合成古典的下流ＭＶＡ経路を発現させた。合成古典的下流ＭＶＡ経路は、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）、およびイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）を含んでなる。新規代替下流ＭＶＡ経路を構成する酵素のスクリーニングを可能にするために、増殖を同時に維持しながら、合成下流ＭＶＡ経路内の特定酵素を不活性化する必要があった。古典的下流ＭＶＡ経路の不活性化は、Ｍ．ヤンナスキイ（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）からのＩＰＫと、クロラムフェニコール耐性マーカーとをコードする遺伝子カセットで、ＰＭＫおよびＭＶＤを置換することで実施された。新規遺伝子の導入は、ＭＶＫおよびＩＤＩの発現に影響を及ぼさなかった。さらに、ＭＣＭ７２４は、あらかじめ遺伝子ｉｓｐＧおよびｉｓｐＨが不活性化されていたので、このスクリーニング宿主は、ＭＶＡ栄養要求性の変異株であった。得られた株は、ＭＶＡの存在下または不在下で成長せず、ＬＢ−培地に補給された６００μＭのＩＰの存在下でのみ増殖し得た（「ＩＰレスキュー」）。このスクリーニング宿主は、Ｖ．０５と称された。Ｖ．０５が、Ｍ．ヤンナスキイ（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）からのＰＭｅｖＤＣ候補遺伝子をコードするプラスミドをさらに保有する場合、それはＶ．０６と称された。
【０３３４】
活性に基づくスクリーニングでは、別のメタン細菌、好塩細菌、スルフォロブス目（Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ）を含んでなる古細菌種、および古細菌原核生物に富む環境サンプルからのバイオマスまたは染色体ＤＮＡを試験した。染色体のライブラリーは、長いインサートの転写を確実にするようにデザインされた、抗転写終結を用いるベクターｐＵＲ２内で構築された。ライブラリーは、Ｍ．ヤンナスキイ（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）およびＭｂｂ．ルミナンチウム（Ｍｂｂ．ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）のゲノムＤＮＡからの６〜８ｋｂｐの平均挿入サイズで構築された。３つの異なるスルフォロブス属（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）株からプールされた、ゲノムＤＮＡの追加的なライブラリーが作成された。合わせるとライブラリーは、ＣＯＧ１３５５、１５８６、および３４０７などの全種類の候補ＰＭｅｖＤＣ遺伝子をコードした。Ｍａｔｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６２（１）３９−５２，（２０１１）を参照されたい。各ライブラリーの質は、各ゲノムの少なくとも２×カバー度をｐ＝０．９９で保証した。スクリーニング宿主Ｖ．０５およびＶ．０６を用いて、スクリーニングを実施した。ゲノムの古細菌ライブラリーの予備スクリーニングは、いかなるクローンももたらさず、そのため土壌サンプルからメタゲノムライブラリーを構築して、さらなるスクリーニングのために使用した。メタゲノムライブラリーのスクリーニングのための宿主Ｖ．０５の利用は、５００μＭのＭＶＡの存在下で増殖するコロニーの単離をもたらした。３つのクローンの挿入分析は、重複性を実証し、さらなる実験のために１つのクローンを選択した。このそれぞれのクローンは、Ｓ３７８Ｐａ３−２と称された。
【０３３５】
プラスミドＤＮＡからのクローンＳ３７８Ｐａ３−２を単離して、３回の独立した試行で、スクリーニング宿主Ｖ．０５に再形質転換し、毎回成功した（すなわちＭＶＡ存在下における持続性の増殖）。再形質転換クローンは、５００μＭのＭＶＡが供給されると、さもなければ阻害濃度のホスミドマイシン（３２μｇ／ｍｌ）の存在下で、制約を受けずに増殖し、相補性が、ＤＸＰ経路を通じてでなく、ＭＶＡ経路を通じてであることが実証された。単離されたプラスミドは、４．６ｋｂｐのメタゲノムＤＮＡをコードした。４つのコード配列（ｃｄｓ）をメタゲノムＤＮＡ挿入断片中で特定し、各ｃｄｓを発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓ２ｂにサブクローニングした。個々のベクターをスクリーニング宿主Ｖ．０５に形質転換して戻した。ｃｄｓ＃２をコードするベクターのみが、スクリーニング宿主Ｖ．０５内で、下流ＭＶＡ経路を補完できた。
【０３３６】
ｃｄｓ＃２によってコードされるタンパク質の生物情報学分析は、細菌界のクロロフレクサス群に属する細菌に見られる遺伝子との限定的類似性を明らかにした。新規の単離遺伝子によってコードされるタンパク質は、ｗｗｗ．ＢＬＡＳＴ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ．ｃｇｉにある、国立生物工学センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）Ｎｏｎ−Ｒｅｄｕｎｄａｎｔ（ＮＲ）データベース中のヘルペトシフォン・アウランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）のコード配列と、わずか４６％のアミノ酸配列同一性のみを示した。このＨ．アウランチアカス（Ｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）は、推定ＤＰＭｅｖＤＣと注釈されている。メタン細菌またはＭ．ヤンナスキイ（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ゲノム中には、Ｓ３７８Ｐａ３−２配列のいかなるホモログ遺伝子も検出されなかった。比較はまた、候補ＰＭｅｖＤＣ遺伝子ＣＯＧ１３５５、１５８６、および３４０７に属するデカルボキシラーゼのクラスターからの明確な位置付けも明らかにした。Ｓ３７８Ｐａ３−２配列と、ＮＲデータベースの全配列との大規模なペアワイズ比較（ＣＬＡＮＳ分析）は、既知の配列空間辺縁における、Ｓ３７８Ｐａ３−２の比較的隔離された位置付けを実証した。したがってＰＭｅｖＤＣの生化学的活性は、公共データベースで入手できるいかなるタンパク質とも非常に限定的な相関のみを示すタンパク質を初めて実証し、発見の新規性を明確に実証する。さらに新規遺伝子によってコードされる酵素活性は、Ｍｔｂ．サームオートトロフィカス（Ｍｔｂ．ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）に見られる活性と同一である。
【０３３７】
実施例３：候補古細菌イソペンテニルキナーゼ（ＩＰＫ）およびホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭｅｖＤＣ）を発現するイソプレン産生株の構築
候補ＩＰＫ（図４）およびＰＭｅｖＤＣ（図３および５）遺伝子のＨｉｓ標識バージョンをコードするプラスミドを合成した（表３）。遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の発現のためにコドン最適化され、Ｎ末端６ｘＨｉｓタグとそれに続くＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含んだ。プラスミドを精製し、製造業者のプロトコルに従って、化学的コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃４４−０３０７）に形質転換した。形質転換体は、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールで補足されたＬＢプレート上において、３７°Ｃで一晩の培養後に選択した。培養物を引き続いてタンパク質発現解析で使用した。
【０３３８】
【表５】
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【０３３９】
古典的下流ＭＶＡ経路をコードするプラスミド（ｐＭＣＭ２２４４、図６）を作成するために、製造業者のプロトコルに従って、ｄＮＴＰｓ  ＣｏｍｂｏがあるＨｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ（カタログ番号６００６７９）を使用した。ベクターを増幅するために、３５μＬのｄｄＨ２Ｏ、０．５μＬのｄｄＮＴＰｓ、１．２５μｌの各１０μＭプライマー、１μＬのｐＭＣＭ８８１、および１μＬの酵素からなる反応液中で、プライマーＭＣＭ８５１およびＭＣＭ８５２を使用して、約５０ｎｇ／μｌのプラスミドｐＭＣＭ８８１にＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応は、次のようにサイクルさせた：９５℃で２分間；（９５℃で２０秒間；５５℃で２０秒間；７２℃で２分間）を３０サイクル；および７２℃で３分間後に４℃で保持する。この反応液を２μｌのＤｐｎＩ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて一晩３７℃で処理し、次にＱｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（カタログ番号２８１０６）を使用して精製した。同様に、プライマーＭＣＭ８４９およびＭＣＭ８５０を使用して、ＭＤ３１４またはＭＤ０９−３１４としてもまた知られているＨＭＢ株の５０ｎｇ／μＬの染色体ＤＮＡから、下流ＭＶＡ経路挿入断片を増幅した（米国特許出願第１３／２８３，５６４号明細書を参照されたい）（表４）。３５μＬのｄｄＨ２Ｏ、０．５μＬのｄｄＮＴＰｓ、１．２５μｌの各１０μＭプライマー、１μＬのＨＭＢ  ＤＮＡ、および１μＬの酵素からなる４つの反応液を次のようにサイクルさせた：９５℃で２分間；（９５℃で２０秒間；５５℃で２０秒間；７２℃で４分間）を３０サイクル；および７２℃で３分間後に４℃で保持する。ＧＥＮＥＡＲＴ（登録商標）Ｓｅａｍｌｅｓｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ１３２８８）を使用して、ベクターおよび挿入断片を構築した。約１μＬのｄｄＨ２Ｏ、２μＬのベクターアンプリコン（ｐＭＣＭ８８１）、４μＬの挿入断片アンプリコン（下流ＭＶＡ経路挿入断片）、２μＬの緩衝液、および１μｌの酵素を混合いて、室温で３０分間インキュベートした。６μＬのアリコートを使用して、化学的にコンピテントなＰｉｒ２細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃ１１１１−１０）を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンで補足されたＬＢプレート上で３０℃で一晩培養する選択前に、形質転換反応をＬＢ培地中で３０分間回復させた。形質転換体は、ＰＣＲによってスクリーニングし、挿入断片はＤＮＡ配列決定によって確認した。ＭＣＭ２２４４株は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＰＭＫおよびＭＶＤと、Ｍ．マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）からのＭＶＫとをコードする、Ｒ６Ｋ下流経路融合から予測された配列を有する、ｐＭＣＭ２２４４を保有する。
【０３４０】
【表６】
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【０３４１】
Ｈ．アウランチアカス（Ｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＰＭｅｖＤＣと共に、またはＳ３７８Ｐａ３−２ＰＭｅｖＤＣと共に、Ｈ．アウランチアカス（Ｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＩＰＫを発現する系を作成するために、製造業者のプロトコルに従って、ｄＮＴＰｓ  ＣｏｍｂｏがあるＨｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ（カタログ番号６００６７９）キットを使用して、ＰＣＲによってＤＮＡ断片を増幅した（表５）。３５μＬのｄｄＨ２Ｏ、０．５μＬのｄＮＴＰｓ、各１．２５μＬの１０μＭ順方向および逆方向プライマー、１μＬのテンプレート（約５０ｎｇ／μＬ）、および１μＬの酵素からなる反応液を次のようにサイクルさせた：９５℃で２分間；（９５℃で２０秒間；５５℃で２０秒間；７２℃、表５で言及されるように）を３０サイクルおよび７２℃で３分間後に４℃で一晩保持する。
【０３４２】
【表７】
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【０３４３】
反応液を２μＬのＤｐｎＩ（Ｒｏｃｈｅ）によって３７℃で２時間処理し、次にＱｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（カタログ番号２８１０６）を使用して精製した。ＧＥＮＥＡＲＴ（登録商標）Ｓｅａｍｌｅｓｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ１３２８８）を使用して、線状化ｐＭＣＭ２２４４プラスミドをＨ．アウランチアカス（Ｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＩＰＫに、およびＨ．アウランチアカス（Ｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＰＭｅｖＤＣに、またはＳ３７８Ｐａ３−２ＰＭｅｖＤＣに融合させた。１μＬのｄｄＨ２Ｏ、各２μＬの３つのアンプリコン、２μＬの緩衝液、および１μＬの酵素の混合物を混合して、室温で３０分間インキュベートした。５μＬの混合物サンプルを使用して、化学的にコンピテントなＰｉｒ２細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃ１１１１−１０）を形質転換して、形質転換反応液をＳＯＣ培地中で３０分間、３０℃で回復させ、５０μｇ／ｍｌカナマイシンで補足されたＬＢプレート上で一晩３０℃で培養して、形質転換体を選択した。形質転換体をＰＣＲによってスクリーニングし、ＤＮＡ配列決定によって挿入断片配列を確認した（表６、図７、および８）。
【０３４４】
【表８】
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【０３４５】
プラスミドｐＭＣＭ８２（米国特許出願公開第２０１１／０１５９５５７号明細書を参照されたい）と、ｐＤＷ７２としてもまた知られているｐＣＨＬ２４３（米国特許出願第１３／２８３，５６４号明細書を参照されたい）との双方をＭＣＭ２２４４、ＭＣＭ２２４６、およびＭＣＭ２２４８株中に電気穿孔した。電気穿孔のために、５０μｇ／ｍｌカナマイシンで補足されたＬＢプレート内で細胞を培養し、冷ｄｄＨ２Ｏで３回洗浄して、２５ｕＦＤ、２００Ω、および２．５ｋＶで、２ｍｍ電気穿孔キュベット内で、各１μＬのプラスミドで電気穿孔した。反応液を５００μＬのＬＢ培地で即座にクエンチし、振盪しながら３７℃で１時間回復させた後、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンで補足されたＬＢプレート上、または５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン、および５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンで補足されたＬＢプレート上に播種して、３７℃で一晩培養した。培養後、選択プレートを室温に８時間移した後、形質転換体をパッチに植えて、株の生成のために室温で３日間培養した（表７）。ＭＣＭ２２５７株は、古典的下流ＭＶＡ経路およびイソプレンシンターゼを発現したが、上方ＭＶＡ経路は発現しなかった。ＭＣＭ２２５８およびＭＣＭ２２５９株は、代替下流ＭＶＡ経路およびイソプレンシンターゼを発現したが、上方ＭＶＡ経路は発現しなかった。ＭＣＭ２２６０株は、上方ＭＶＡ経路、古典的下流ＭＶＡ経路、およびイソプレンシンターゼを発現した。ＭＣＭ２２６１およびＭＣＭ２２６２株は、上方ＭＶＡ経路、代替下流ＭＶＡ経路、およびイソプレンシンターゼを発現した。
【０３４６】
【表９】
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【０３４７】
実施例４：候補ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの特性解析
Ｓ３７８Ｐａ３−２、およびヘルペトシフォン・アウランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＡＴＣＣ  ２３７７９から単離されたＰＭｅｖＤＣの基質特異性、溶解度、および動態特性を試験して、特性解析した。
【０３４８】
（ｉ）材料と方法
増殖、発現、およびタンパク質精製
適切な抗生物質を含有するＬＢブロス中で３４℃で培養された一晩培養物から、ＭＣＭ２２５７、ＭＣＭ２２５８、ＭＣＭ２２５９、ＭＣＭ２２６０、ＭＣＭ２２６１、およびＭＣＭ２２６２株を、適切な抗生物質を含有する１リットルのＬＢ培地に接種して、３４℃で７時間培養した（表７）。ＯＤ０．５〜０．７の培養物を２００μＭのＩＰＴＧで誘導した。誘導後、細胞を１００００×ｇｆｏｒ１０分間の遠心分離によって収集した。上清の除去後、細胞ペレットを５０ｍＭのＫＰＯ４、ｐＨ８．０、０．３ＭのＮａＣｌ、０．０２ｍＭのイミダゾール、１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、および１ｍｇ／ｍＬのＤＮＡａｓｅを含有する４０ｍＬの溶解緩衝液に再懸濁した。フレンチ圧力セルを使用して１４，０００ｐｓｉで細胞を溶解し、細胞溶解産物を５０，０００×ｇで１時間遠心分離した。上清を収集して、Ｎｉ親和性樹脂の上に通過させた後、５０ｍＭイミダゾールを含有する１０カラム容積の溶解緩衝液で樹脂を洗浄した。２５０ｍＭのイミダゾールを含有する５カラム容積の溶解緩衝液で、タンパク質を溶出した。収集された画分を濃縮して、緩衝液交換のためにＰＤ−１０カラムの上に通過させ、最終収集タンパク質サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によれば＞９５％純粋であった。精製サンプルをＴＥＶプロテアーゼと共に、４℃で一晩インキュベートして、精製タンパク質からヒスチジンタグを除去した。引き続いて消化サンプルをＮｉ親和性樹脂の上に通過させ、通過物を収集して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０３４９】
デカルボキシラーゼの動態特性解析
メバロン酸、ホスホメバロン酸、ジホスホメバロン酸、ＡＴＰ、ＭｇＣｌ２の存在下でＰＭｅｖＤＣをインキュベートして、反応生成物をＬＣ−ＭＳによって確認した。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）を参照として使用した。ＡＤＰ生成をピルビン酸合成および乳酸低下と共役させる、修正分光光度法アッセイを使用して、デカルボキシラーゼの触媒機能を評価した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）上で、ＮＡＤＨ消失の初速度を３４０ｎｍでモニターして、ＰＭｅｖＤＣによって触媒される反応速度を測定した。反応速度試験のためのサンプルは、０．８ｍＭのホスホエノールピルビン酸、０．０５ｍＭのＤＴＴ、０．３２ｍＭのＮＡＤＨ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、４Ｕの乳酸デヒドロゲナーゼ、４Ｕのピルビン酸キナーゼ、５ｍＭのＡＴＰ、および１０〜２５０μＭの（Ｒ）−ホスホメバロン酸または１０〜２５０μＭの（Ｒ）−ジホスホメバロン酸を含有した。全ての反応は３４℃で実施した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを使用して反応速度データを処理し、Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈを使用して動態学パラメータを判定した。
【０３５０】
（ｉｉ）結果
Ｈｉｓ標識されてＴＥＶプロテアーゼ切断されたＰＭｅｖＤＣおよびＩＰＫのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析は、株が可溶性酵素を発現したことを明らかにした。Ｈ．アウランチアカス（Ｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＰＭｅｖＤＣ（レーン２および３）、Ｈ．アウランチアカス（Ｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＩＰＫ（レーン４および５）、およびＳ３７８Ｐａ３−２ＰＭｅｖＤＣ（レーン６および７）は、付着するＨｉｓタグありまたはＨｉｓタグなしで、これらが発現されたかどうかに関わりなく、全て可溶性であった（図９）。
【０３５１】
酵母ＭＶＤ、Ｓ３７８Ｐａ３−２ＰＭｅｖＤＣ、およびＨ．アウランチアカス（Ｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＰＭｅｖＤＣのＫＭおよびｋｃａｔ触媒定数を判定した（表８）。結果は、デカルボキシラーゼが、それらの基質特異性に基づいて区別され得ることを示唆する。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＶＤは、４４μＭのＫＭおよび１１．６ｓ−１のｋｃａｔで、ジホスホメバロン酸の変換を触媒するが、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＶＤが触媒するホスホメバロン酸の脱炭酸の反応速度は検出されなかった。アッセイの検出限界に基づいて、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）デカルボキシラーゼによって触媒されるホスホメバロン酸の脱炭酸の触媒速度は、１ｍＭのホスホメバロン酸を使用して０．０２ｓ−１未満であった。Ｓ３７８Ｐａ３−２ＰＭｅｖＤＣは、２６μＭのＫＭおよび２．９ｓ−１のｋｃａｔで、ホスホメバロン酸の脱炭酸を触媒し、２２μＭのＫＭおよび１．０９ｓ−１のｋｃａｔで、ジホスホメバロン酸の脱炭酸を触媒した。ヘルペトシフォン・アウランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＡＴＣＣ  ２３７７９  ＰＭｅｖＤＣは、３．３ｓ−１のｋｃａｔおよび５７μＭのＫＭで、ホスホメバロン酸の脱炭酸を触媒したが、記載されるようなアッセイ条件を使用したジホスホメバロン酸の脱炭酸は検出不能であった。アッセイ検出限界に基づいて、ヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＡＴＣＣ  ２３７７９デカルボキシラーゼによって触媒されるジホスホメバロン酸の脱炭酸の触媒速度は、１ｍＭのジホスホメバロン酸を使用して、０．０２ｓ−１未満であった。
【０３５２】
【表１０】
2016511630.tif 000022
【０３５３】
実施例５：古細菌ＰＭｅｖＤＣおよびＩＰＫを発現する組換え細胞中の代謝産物生成
Ｓ３７８Ｐａ３−２およびヘルペトシフォン・オーランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＡＴＣＣ  ２３７７９から単離されたＰＭｅｖＤＣによる、基質変換および生成物形成を試験して分析した。
【０３５４】
（ｉ）材料
ＴＭ３培地レシピ（１リットルの発酵培地あたり）：
１３．６ｇのＫ２ＨＰＯ４、１３．６ｇのＫＨ２ＰＯ４、２ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２ｇのクエン酸一水和物、０．３ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム、３．２ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２ｇの酵母抽出物、１ｍｌの１０００×微量金属溶液。全ての構成要素をｄｉＨ２Ｏに一緒に添加して、溶解させた。水酸化アンモニウム（３０％）によってｐＨを６．８に調節し、所定容積にした。培地を０．２２ミクロンのフィルターで濾過滅菌した。ｐＨ調節および滅菌後、１０．０ｇのグルコースと、抗生物質とを添加した。
【０３５５】
ＴＭ３＋１％Ｇｌｕ＋０．０２％ＹＥ培地レシピ（１リットルあたり）：
１３．６ｇのＫ２ＨＰＯ４、１３．６ｇのＫＨ２ＰＯ４、２ｇのクエン酸一水和物、０．３ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム、３．２ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｍｌの１０００×微量金属溶液。０．０２％の酵母抽出物で補足した。全ての構成要素をｄｉＨ２Ｏに一緒に添加して、溶解させた。水酸化アンモニウム（３０％）によってｐＨを６．８に調節し、所定容積にした。培地を０．２２ミクロンのフィルターで濾過滅菌した。ｐＨ調節および滅菌後、１０．０ｇのグルコースと、抗生物質とを添加した。
【０３５６】
補足ＴＭ３＋１％Ｇｌｕ＋０．１％ＹＥ培地レシピ（１リットルあたり）：
１３．６ｇのＫ２ＨＰＯ４、１３．６ｇのＫＨ２ＰＯ４、２ｇのクエン酸一水和物、０．３ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム、３．２ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｍｌの１０００×微量金属溶液。０．１％の酵母抽出物で補足した。全ての構成要素をｄｉＨ２Ｏに一緒に添加して、溶解させた。水酸化アンモニウム（３０％）によってｐＨを６．８に調節し、所定容積にした。培地を０．２２ミクロンのフィルターで濾過滅菌した。ｐＨ調節および滅菌後、１０．０ｇのグルコースと、抗生物質とを添加した。
【０３５７】
補足ＴＭ３＋１％Ｇｌｕ＋０．０２％ＹＥ＋１％ｃａｓ−アミノ酸培地レシピ（１リットルあたり）：
１３．６ｇのＫ２ＨＰＯ４、１３．６ｇのＫＨ２ＰＯ４、２ｇのクエン酸一水和物、０．３ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム、３．２ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｍｌの１０００×微量金属溶液。０．０２％の酵母抽出物および０．１％のｃａｓアミノ酸で補足した。全ての構成要素をｄｉＨ２Ｏに一緒に添加して、溶解させた。水酸化アンモニウム（３０％）によってｐＨを６．８に調節し、所定容積にした。培地を０．２２ミクロンのフィルターで濾過滅菌した。ｐＨ調節および滅菌後、１０．０ｇのグルコースと、抗生物質とを添加した。
【０３５８】
ＬＢ培地レシピ＋１％グルコース（１リットルあたり）：
滅菌後、ルリアブロス（ＬＢ）培地を１０．０ｇグルコースと、抗生物質とで補足した。
【０３５９】
１０００×修正微量金属溶液（１リットルあたり）：
４０ｇのクエン酸＊Ｈ２Ｏ、３００ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、１０ｇのＮａＣｌ、１ｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、１ｇのＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＨ３ＢＯ３、１００ｍｇのＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ。各構成要素をＤｉ  Ｈ２Ｏに１つずつ溶解して、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０に調節し、次に溶液を所定容積にして、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
【０３６０】
（ｉｉ）実験手順
試験管内代謝産物測定
ｐＭＣＭ２２１２を過剰発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０ｂからの粗抽出物に、試験管内アッセイを実施した。この大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、いかなる既知のＭＶＡ遺伝子もコードしなかった。挿入なしのｐＴｒｃＨｉｓ２ｂを持つ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抽出物に、陰性対照アッセイを実施した。試験管内変換のための基質は、メバロン酸（ＭＶＡ）と、メバロン酸５−リン酸とも称されるメバロン酸リン酸（ＭＶＰ）と、メバロン酸５−ピロリン酸とも称されるメバロン酸二リン酸（ＭＶＰＰ）と、イソペンテニルリン酸（ＩＰ）であった。基質変換および生成物形成は、ＬＣ／ＭＳによって分析した。
【０３６１】
生体内代謝産物測定
５ｍｌのＬＢ培地と適切な抗生物質を含有する振盪管に、グリセロール培養原液を接種した（表７）。培養物を３０℃、２２０ｒｐｍで、およそ１５時間培養した。２ｍＬの培養物サンプルを０．２の最終ＯＤ６００に希釈して、１）１％グルコースおよび０．０２％ＹＥ添加ＴＭ３、２）１％グルコースおよび０．１％ＹＥ添加ＴＭ３、３）１％グルコース、０．０２％ＹＥ、０．１％ｃａｓ−アミノ酸添加ＴＭ３、および４）１％グルコース添加ＬＢの４タイプの培地の内、１つを含有する４８ウェル無菌ブロックの各ウェルに入れた。ブロックをＢｒｅａｔｈｅ  Ｅａｓｉｅｒメンブレンで密封し、６００ｒｐｍおよび３４℃で、１．５時間培養した。１．５時間の増殖後、マイクロタイタープレート内でＯＤ６００を測定し、２００μＭの最終濃度のＩＰＴＧで、細胞を誘導した。ＯＤ６００読み取りおよび比生産性試料採取は、ＩＰＴＧ誘導の２時間および４時間後に実施した。マイクロタイタープレート内においてＴＭ３培地中の適切な希釈で、ＯＤ６００を測定した。測定は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して実施した。１０００μＬの細胞培養サンプルを収集して遠心分離し、ペレットを収集した。引き続いて細胞内代謝産物単離のための第１の抽出段階として、細胞ペレットを１００μＬメタノールでクエンチした。サンプルを１００μｌの７５％メタノール／１０ｍＭＮＨ４Ａｃ緩衝液（ｐＨ７．０）でさらに抽出した後、７０μｌの７５％メタノール／１０ｍ  ＭＮＨ４Ａｃ緩衝液（ｐＨ７．０）で最終抽出した。合わせた抽出物の容積は２７０μＬであり、得られたサンプルをＬＣ／ＭＳによって分析した。
【０３６２】
ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｉｍ三連四重極装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、代謝産物の質量分光分析を実施した。システム制御、データ取得、およびデータ解析は、ＸＣａｌｉｂｕｒおよびＬＣＱｕａｎソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって実行された。製造会社推奨保護カートリッジを装着したＣ１８  Ｓｙｎｅｒｇｉ  ＭＡＸ−ＲＰ  ＨＰＬＣカラム（１５０×２ｍｍ、４ｕＭ、８０Ａ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）に、約１０μＬのサンプルを適用した。ＭｉｌｌｉＱ等級水中の１５ｍＭの酢酸＋１０ｍＭのトリブチラミン（溶媒Ａ）と、Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ，Ｂｕｒｄｉｃｋ＆ＪａｃｋｓｏｎからのＬＣＭＳ等級メタノール（溶媒Ｂ）との勾配で、カラムを溶出した。１４分間の勾配は、次のとおりであった：ｔ＝０分間、２０％Ｂ；ｔ＝１分間、３０％Ｂ；ｔ＝９分間、５５％Ｂ；ｔ＝１０分間、９０％Ｂ；ｔ＝１２分間、９０％Ｂ；ｔ＝１３分間、２０％Ｂ；ｔ＝１４分間、２０％Ｂ；流速０．４ｍＬ／分、カラム温度３５℃。質量検出は、３．０〜３．５ｋＶのＥＳＩ噴霧電圧およびイオン移動管の温度３５０℃で、負イオンモードのエレクトロスプレーイオン化を使用して実施された。関心のある代謝産物のために、以下のＳＲＭ遷移を選択した：メバロン酸リン酸（ＭＶＰ）では４０ｅＶで２２７→７９、メバロン酸二リン酸（ＭＶＰＰ）では１７ｅＶで３０７→２０９、イソペンテニル（ＩＰ）では４０ｅＶで１６５→７９、およびイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）では４０ｅＶで２４５→７９。１．７ｍＴｏｒｒにおける衝突ガスとして、アルゴンを使用し、各ＳＲＭ遷移のスキャン時間は、０．７ｍ／ｚに設定したスキャン幅で、０．１ｓであった。細胞抽出物中の代謝産物濃度は、０．５ｐｐｍ〜５０ｐｐｍの最終濃度で、２０％メタノール／５０ｍＭ  ＮＨ４Ａｃ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した、市販の標準物質の注入によって得られる較正曲線を基準にして判定した。使用された代謝産物標準物質は、ＭＶＰ＊Ｌｉ（Ｓｉｇｍａ）、ＭＶＰＰ＊４Ｌｉ（Ｓｉｇｍａ）、ＩＰ＊２ＮＨ４（Ｓｉｇｍａ）、およびＩＰＰ＊４ＮＨ４（Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）であった。
【０３６３】
（ｉｉｉ）結果
粗抽出物から単離された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０ｂ過剰発現Ｓ３７８Ｐａ３−２は、ＭＶＰに対する活性と、ＭＶＰＰに対するいくらかの活性を実証した一方で、ＭＶＡおよびＩＰは、この酵素の基質として使用されなかった（表９）。ＭＶＰはＩＰに定量的に変換され、ＭＶＰＰはＩＰＰに変換され、Ｓ３７８Ｐａ３−２のいくらか緩い基質スペクトルが示唆される。ＭＶＰＰで補足されたサンプル中のＩＰのいくらか上昇したレベルは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抽出物中の市販のＭＶＰＰおよび／またはＩＰＰホスファターゼ活性中にある、小量のＭＶＰの存在によって説明された。対照アッセイは、ＩＰＰおよびＭＶＰＰに作用する、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内の内在性ホスファターゼ機能の存在を明らかにし、ＭＶＡ経路の改善の標的が示唆された。
【０３６４】
【表１１】
2016511630.tif 000023
【０３６５】
ＭＣＭ２２５７、ＭＣＭ２２５８、ＭＣＭ２２５９、ＭＣＭ２２６０、ＭＣＭ２２６１、およびＭＣＭ２２６２株から単離された粗抽出物をＭＶＰ、ＭＶＰＰ、ＩＰ、およびＩＰＰ形成について分析した（表１０）。ＬＢ培地中で２時間培養された株内の代謝産物形成の解析は、完全な上方ＭＶＡ経路と古典的下流ＭＶＡ経路を発現するＭＣＭ２２６０株をＴＭ３培地中で２時間または４時間培養すると、ＩＰＰをそれぞれ０．６６ｍＭまたは０．９１ｍＭで優勢に産生することを実証した。ＭＣＭ２２６０株はまた、ＬＢ培地中で培養すると、ＴＭ３培地中で培養した場合より低くはあるが、４時間で０．１３ｍＭの優勢により多くのＩＰＰを産生した（表１０）。Ｓ３７８Ｐａ３−２ＰＭｅｖＤＣがある完全上方ＭＶＡ経路および下流ＭＶＡ経路を発現したＭＣＭ２２６１株は、ＴＭ３培地中で２時間または４時間培養すると、それぞれ１２．６８ｍＭまたは３１．０５ｍＭで、優勢にＭＶＰを産生した。ＭＣＭ２２６１株はまた、ＬＢ培地中で培養すると、４時間にわたり３０．２４ｍＭでより多くのＭＶＰを産生した。しかしＭＣＭ２２６０株と比較して、ＭＣＭ２２６１株は、全ての条件下で、そしてＬＢ培地中で４時間培養した場合などの特定の条件下でより多くのＩＰを産生し、ＩＰＰ産生においてＭＣＭ２２６０株を凌いだ。ＩＰおよびＩＰＰ産生に関して、Ｈ．アウランチアカス（Ｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＰＭｅｖＤＣがある完全上方経路および下流ＭＶＡ経路を発現する、ＭＣＭ２２６２株中で同様の結果が見られた。ＭＣＭ２２６０株と比較して、ＭＣＭ２２６２株は、全ての条件下で、そしてＬＢ培地中で４時間培養した場合などの特定の条件下でより多くのＩＰを産生し、ＩＰＰ産生においてＭＣＭ２２６０株を凌いだ。ＭＣＭ２２６１株とは対照的に、ＭＣＭ２２６２株は高レベルのＭＶＰを蓄積しなかった。
【０３６６】
【表１２】
2016511630.tif 000024
【０３６７】
実施例６：ＰＭｅｖＤ、ＩＰＫ、および上方ＭＶＡ経路を発現する組換え宿主細胞による小規模のイソプレン生産
上方ＭＶＡ経路および代替古細菌下流ＭＶＡ経路を発現する株によるイソプレン生成を、上方ＭＶＡ経路および古典的下流経路を発現する株と比較した。
【０３６８】
（ｉ）材料
ＴＭ３培地レシピ（１リットルの発酵培地あたり）：
１３．６ｇのＫ２ＨＰＯ４、１３．６ｇのＫＨ２ＰＯ４、２ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２ｇのクエン酸一水和物、０．３ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム、３．２ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２ｇの酵母抽出物、１ｍｌの１０００×微量金属溶液。全ての構成要素をｄｉＨ２Ｏに一緒に添加して、溶解させた。水酸化アンモニウム（３０％）によってｐＨを６．８に調節し、所定容積にした。培地を０．２２ミクロンのフィルターで濾過滅菌した。ｐＨ調節および滅菌後、１０．０ｇのグルコースと、抗生物質とを添加した。
【０３６９】
ＴＭ３＋１％Ｇｌｕ＋０．０２％ＹＥ培地レシピ（１リットルあたり）：
１３．６ｇのＫ２ＨＰＯ４、１３．６ｇのＫＨ２ＰＯ４、２ｇのクエン酸一水和物、０．３ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム、３．２ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｍｌの１０００×微量金属溶液。０．０２％の酵母抽出物で補足した。全ての構成要素をｄｉＨ２Ｏに一緒に添加して、溶解させた。水酸化アンモニウム（３０％）によってｐＨを６．８に調節し、所定容積にした。培地を０．２２ミクロンのフィルターで濾過滅菌した。ｐＨ調節および滅菌後、１０．０ｇのグルコースと、抗生物質とを添加した。
【０３７０】
補足ＴＭ３＋１％Ｇｌｕ＋０．１％ＹＥ培地レシピ（１リットルあたり）：
１３．６ｇのＫ２ＨＰＯ４、１３．６ｇのＫＨ２ＰＯ４、２ｇのクエン酸一水和物、０．３ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム、３．２ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｍｌの１０００×微量金属溶液。０．１％の酵母抽出物で補足した。全ての構成要素をｄｉＨ２Ｏに一緒に添加して、溶解させた。水酸化アンモニウム（３０％）によってｐＨを６．８に調節し、所定容積にした。培地を０．２２ミクロンのフィルターで濾過滅菌した。ｐＨ調節および滅菌後、１０．０ｇのグルコースと、抗生物質とを添加した。
【０３７１】
補足ＴＭ３＋１％Ｇｌｕ＋０．０２％ＹＥ＋１％ｃａｓ−アミノ酸培地レシピ（１リットルあたり）：
１３．６ｇのＫ２ＨＰＯ４、１３．６ｇのＫＨ２ＰＯ４、２ｇのクエン酸一水和物、０．３ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム、３．２ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｍｌの１０００×微量金属溶液。０．０２％の酵母抽出物および０．１％のｃａｓ−アミノ酸で補足した。全ての構成要素をｄｉＨ２Ｏに一緒に添加して、溶解させた。水酸化アンモニウム（３０％）によってｐＨを６．８に調節し、所定容積にした。培地を０．２２ミクロンのフィルターで濾過滅菌した。ｐＨ調節および滅菌後、１０．０ｇのグルコースと、抗生物質とを添加した。
【０３７２】
ＬＢ培地レシピ＋１％グルコース（１リットルあたり）：
滅菌後、ルリアブロス（ＬＢ）培地を１０．０ｇグルコースと、抗生物質とで補足した。
【０３７３】
１０００×修正微量金属溶液（１リットルあたり）：
４０ｇのクエン酸＊Ｈ２Ｏ、３００ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、１０ｇのＮａＣｌ、１ｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、１ｇのＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＨ３ＢＯ３、１００ｍｇのＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ。各構成要素をＤｉ  Ｈ２Ｏに１つずつ溶解して、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０に調節し、次に溶液を所定容積にして、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
【０３７４】
（ｉｉ）実験手順
成長速度測定
５ｍｌのＬＢ培地と適切な抗生物質を含有する振盪管に、グリセロール培養原液を接種した（表７）。培養物を３０℃、２２０ｒｐｍで、およそ１５時間培養した。２ｍＬの培養物サンプルを０．２の最終ＯＤ６００に希釈して、１）１％グルコースおよび０．０２％ＹＥ添加ＴＭ３、２）１％グルコースおよび０．１％ＹＥ添加ＴＭ３、３）１％グルコース０．０２％ＹＥ、０．１％ｃａｓ−アミノ酸添加ＴＭ３ｗｉｔｈ、および４）１％グルコース添加ＬＢの４タイプの培地の内、１つを含有する４８ウェル無菌ブロックの各ウェルに入れた。ブロックをＢｒｅａｔｈｅ  Ｅａｓｉｅｒメンブレンで密封し、６００ｒｐｍおよび３４℃で、１．５時間培養した。１．５時間の増殖後、マイクロタイタープレート内でＯＤ６００を測定し、２００μＭの最終濃度のＩＰＴＧで、細胞を誘導した。４時間のＩＰＴＧ誘導後、ＯＤ６００読み取りおよび比生産性試料を毎時採取した。マイクロタイタープレート内においてＴＭ３培地中の適切な希釈で、ＯＤ６００を測定した。測定は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して実施した。
【０３７５】
イソプレン比生産性測定
イソプレンヘッドスペースアッセイでは、４時間のＩＰＴＧ誘導後、９６ウェルガラスブロック内に、１００μｌの培養サンプルを毎時収集した。ガラスブロックをアルミホイルで密封し、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒを使用して、４５０ｒｐｍで振盪しながら３４℃で３０分間培養した。３０分後、７０℃の水浴中で２分間にわたりブロック細胞を死滅させ、ガスクロマトグラフィー質量分析法を使用して、ヘッドスペース内のイソプレンレベル測定値を判定した。１００μｌ培養物ヘッドスペースからの測定されたイソプレンをＯＤ正規化イソプレン比生産性に変換した。
【０３７６】
（ｉｉｉ）結果
Ｈ．アウランチアカス（Ｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＩＰＫおよびＳ３７８Ｐａ３−２  ＰＭｅｖＤＣを発現する改変大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（ＭＣＭ２２６１株）、またはＨ．アウランチアカス（Ｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＩＰＫおよびＨ．アウランチアカス（Ｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＰＭｅｖＤＣを発現する改変大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（ＭＣＭ２２６２株）による増殖の解析は、試験した４種の異なる培地組成物にわたり、ＩＰＴＧ誘導の存在下で、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＭＫおよびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＶＤを発現する対照大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（ＭＣＭ２２６０株）と、同等の増殖を実証した（図１０）。
【０３７７】
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＭＫおよびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＶＤを発現する対照大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（株ＭＣＭ２２６０）と比較した、Ｈ．アウランチアカス（Ｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＩＰＫおよびＳ３７８Ｐａ３−２  ＰＭｅｖＤＣを発現する改変大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（ＭＣＭ２２６１株）、またはＨ．アウランチアカス（Ｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＩＰＫおよびＨ．アウランチアカス（Ｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＰＭｅｖＤＣを発現する改変大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（ＭＣＭ２２６２株）によってグルコースから生成されるイソプレンの解析は、Ｈ．アウランチアカス（Ｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＩＰＫなどの古細菌ＩＰＫの存在下で、Ｓ３７８Ｐａ３−２  ＰＭｅｖＤＣおよびＨ．アウランチアカス（Ｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ＰＭｅｖＤＣの双方が、対照株と同等レベルのイソプレンの生成を可能にしたことを実証した（図１１）。さらにイソプレン収率の増大は、ＩＰＴＧ誘導の増大と相関する。試験株によって産生されたイソプレンの量は、使用された増殖培地によって変動した（図１１）。
【０３７８】
全体的に、これらの結果は、組換え細胞中で、ＰＭＫおよびＭＶＤなどの古典的下流ＭＶＡ経路酵素の代わりに、古細菌ＰＭｅｖＤＣおよび古細菌ＩＰＫなどの代替下流ＭＶＡ経路酵素を利用して、イソプレンを生成し得ることを実証した。
【０３７９】
実施例７：ＰＭｅｖＤ、ＩＰＫ、および上方ＭＶＡ経路を発現する組換え宿主細胞による
１５Ｌ規模のイソプレン生産
上方ＭＶＡ経路および代替古細菌下流ＭＶＡ経路を発現する株によるイソプレン生成を、上方ＭＶＡ経路および古典的下流経路を発現する株と比較する。
【０３８０】
（ｉ）材料
ＴＭ３培地レシピ（１リットルの発酵培地あたり）：
１３．６ｇのＫ２ＨＰＯ４、１３．６ｇのＫＨ２ＰＯ４、２ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２ｇのクエン酸一水和物、０．３ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム、３．２ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２ｇの酵母抽出物、１ｍｌの１０００×微量金属溶液。全ての構成要素をｄｉＨ２Ｏに一緒に添加して、溶解させる。水酸化アンモニウム（３０％）によってｐＨを６．８に調節し、所定容積にする。培地を０．２２ミクロンのフィルターで濾過滅菌する。ｐＨ調節および滅菌後、グルコース１０．０ｇおよび抗生物質を添加する。
【０３８１】
１０００×微量金属溶液（１リットルの発酵培地あたり）：
４０ｇのクエン酸＊Ｈ２Ｏ、３０ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、１０ｇのＮａＣｌ、１ｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、１ｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＨ３ＢＯ３、１００ｍｇのＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ。各構成要素を１つずつｄｉＨ２Ｏに溶解する。ｐＨをＨＣｌ／ＮａＯＨで約３．０に調節し、次に溶液を所定容積にして、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌する。
【０３８２】
（ｉｉ）実験手順
ルリア・ベルターニブロス＋抗生物質中で、細胞を一晩培養する。翌日、（２５０ｍＬ調節板付きエルレンマイアーフラスコ内の）５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン、２５ｕｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、および５０ｕｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有する２０ｍＬのＴＭ３培地中で、これらを０．１のＯＤ６００に希釈して、３４℃および２００ｒｐｍで培養する。２時間の増殖後、ＯＤ６００を評価して、２００μＭのＩＰＴＧを添加する。発酵経過中に、サンプルを定期的に採取する。各時点で、ＯＤ６００を測定をする。また、ガスクロマトグラフ質量分光計（ＧＣ−ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）ヘッドスペースアッセイを使用して、イソプレン発生気体分析も実施する。１００マイクロリットルの全ブロスを密封ＧＣバイアルに入れて、３４℃および２００ｒｐｍで、３０分間の所定時間にわたり培養する。７０℃で７分間のインキュベーションからなる熱殺菌ステップに続いて、サンプルをＧＣに装入する。報告された比生産性は、培養時間（３０分間）と測定されたＯＤ６００で除した、ＧＣによるμｇ／Ｌ読み取り単位のイソプレン量である。
【０３８３】
実施例８：ＰＭｅｖＤ、ＩＰＫ、および上方ＭＶＡ経路を発現する組換え宿主細胞によるイソプレノイド生成
上方ＭＶＡ経路および代替古細菌下流ＭＶＡ経路を発現する株によるイソプレノイド生成を、上方ＭＶＡ経路および古典的下流経路を発現する株と比較する。
【０３８４】
（ｉ）材料
ＴＭ３培地レシピ（１リットルの発酵培地あたり）：
１３．６ｇのＫ２ＨＰＯ４、１３．６ｇのＫＨ２ＰＯ４、２ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２ｇのクエン酸一水和物、０．３ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム、３．２ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２ｇの酵母抽出物、１ｍｌの１０００×微量金属溶液。全ての構成要素をｄｉＨ２Ｏに一緒に添加して、溶解させる。水酸化アンモニウム（３０％）によってｐＨを６．８に調節し、所定容積にする。次に培地を０．２２ミクロンのフィルターで濾過滅菌する。滅菌およびｐＨ調節後、１０．０ｇのグルコースおよび抗生物質を添加する。
【０３８５】
１０００×微量金属溶液（１リットルの発酵培地あたり）：
４０ｇのクエン酸＊Ｈ２Ｏ、３０ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、１０ｇのＮａＣｌ、１ｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、１ｇのＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＨ３ＢＯ３、１００ｍｇのＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ。各構成要素を１つずつｄｉＨ２Ｏに溶解する。ｐＨをＨＣｌ／ＮａＯＨで約３．０に調節し、次に溶液を所定容積にして、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌する。
【０３８６】
（ｉｉ）実験手順
ルリア・ベルターニブロス＋抗生物質中で、細胞を一晩培養する。翌日、（２５０ｍＬ調節板付きエルレンマイアーフラスコ内の）５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンおよび５０ｕｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有する２０ｍＬのＴＭ３培地中で、これらを０．０５のＯＤ６００に希釈して、３４℃および２００ｒｐｍで培養する。接種前に、先に記載されたようにして、培養物フラスコに２０％（ｖ／ｖ）ドデカン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のオーバーレイを添加して、揮発性セスキテルペン生成物を捕捉する（Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９５：６８４−６９１，２００６）。
【０３８７】
２時間の増殖後、ＯＤ６００を評価して、０．０５〜０．４０ｍＭのイソプロピルβ−ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加する。発酵経過中に、サンプルを定期的に採取する。各時点でＯＤ６００を測定する。また、ドデカンオーバーレイを酢酸エチル中で希釈することで、有機層内のイソプレノイド濃度もアッセイする。ドデカン／酢酸エチル抽出物は、以前記載されたようにして、ＧＣ−ＭＳ方法によって分析する（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３，２１：９６−８０２）。既知濃度のイソプレノイドサンプルを注入して、イソプレノイドの標準曲線を作成する。イソプレノイド標準曲線を使用して、サンプルあたりのイソプレノイド量を計算する。
【０３８８】
配列
ｐＭＣＭ２２００核酸配列
【化１１】
2016511630.tif 000025
【化１２】
2016511630.tif 000026
ｐＭＣＭ２２０１核酸配列
【化１３】
2016511630.tif 000027
【化１４】
2016511630.tif 000028
【化１５】
2016511630.tif 000029
ｐＭＣＭ２２１２核酸配列
【化１６】
2016511630.tif 000030
【化１７】
2016511630.tif 000031
ｐＭＣＭ２２４４核酸配列
【化１８】
2016511630.tif 000032
【化１９】
2016511630.tif 000033
【化２０】
2016511630.tif 000034
ｐＭＣＭ２２４６核酸配列
【化２１】
2016511630.tif 000035
【化２２】
2016511630.tif 000036
【化２３】
2016511630.tif 000037
ｐＭＣＭ２２４８核酸配列
【化２４】
2016511630.tif 000038
【化２５】
2016511630.tif 000039
ヘルペトシフォン・アウランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列
【化２６】
2016511630.tif 000040
アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列
【化２７】
2016511630.tif 000041
Ｓ３７８Ｐａ３−２ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列
【化２８】
2016511630.tif 000042
ヘルペトシフォン・アウランチアカス（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）イソペンテニルキナーゼのアミノ酸配列
【化２９】
2016511630.tif 000043
メタノカルドコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ＤＳＭ２６６１イソペンテニルキナーゼのアミノ酸配列
【化３０】
2016511630.tif 000044
メタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）イソペンテニルキナーゼのアミノ酸配列
【化３１】
2016511630.tif 000045
メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）イソペンテニルキナーゼのアミノ酸配列
【化３２】
2016511630.tif 000046
アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）イソペンテニルキナーゼのアミノ酸配列
【化３３】
2016511630.tif 000047
【図１】
2016511630.tif 000048
【図２】
2016511630.tif 000049
【図３】
2016511630.tif 000050
【図４】
2016511630.tif 000051
【図５】
2016511630.tif 000052
【図６】
2016511630.tif 000053
【図７】
2016511630.tif 000054
【図８】
2016511630.tif 000055
【図９】
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【図１０】
2016511630.tif 000057
【図１１】
2016511630.tif 000058
【配列表】
2016511630000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成27年8月19日(2015.8.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2016511630.tif 000071
2016511630.tif 000072
2016511630.tif 000073
2016511630.tif 000074
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