(57)【要約】  本発明は、一般的に必要とする被験体において処置および/または炎症性疾患、疼痛、痛覚過敏症、心血管疾患および/または虚血性脳疾患の予防における使用のためのブラジキニン受容体モジュレーターとしての新規な生物学的および精製されたペプチドに関する。
2016528192.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
からなる群から選択される単離および精製されたペプチド:
a)1、配列番号：5および配列番号：7、配列番号からなる群から選択されるアミノ酸配列
を有するペプチド;
b)ことを特徴と長さが少なくとも8個の連続残基を有するもの、それぞれの有機断片は、
単離および精製されたペプチドは、ブラジキニン受容体のモジュレーターであります。
【請求項２】
配列番号14：12及び配列番号：8：生物学的破片は、前記した請求項1に記載の単離およ
び精製されたペプチドは、配列番号ID NOからなる群のうち選択されたアミノ酸配列を有
しますいいえ：28とすることを特徴とは、生物学的フラグメントは、ブラジキニン受容体
アゴニスト活性を有すると述べていません。
【請求項３】
1〜2の請求項のいずれかに記載の単離および精製された単離および精製されたペプチド
をコードする核酸分子。
【請求項４】
請求項3の分子単離および精製された核酸の少なくとも1つのコピーを含む発現ベクター
。
【請求項５】
請求項3または発現ベクター4の少なくとも1つのコピーの単離および精製された核酸を
含む組換え宿主細胞。
【請求項６】
2つの薬学的に許容される担体に請求項1から請求項のいずれかに記載の単離および精製
されたペプチドの治療有効量を含む医薬組成物。
【請求項７】
請求項6に記載の医薬組成物または医薬に使用するための請求項1~2のいずれかに記載の
単離および精製されたペプチド。
【請求項８】
鎮痛剤として使用するための請求項6に記載の医薬組成物。
【請求項９】
治療で使用するための請求項6に記載の医薬組成物および/または炎症性疾患の予防、心
臓血管虚血、疼痛、痛覚過敏症、腎疾患、創傷治癒、脳虚血、脳卒中、血管性痴呆、梗塞
性認知症、心筋虚血、冠動脈性心疾患、心筋梗塞、米国、糖尿病または欠陥血流や血管奇
形、組織修復、細胞分化ロッド、血管形成、リンパ管形成、細胞の調節に関連する疾患を
無駄末梢疾患部材および動脈閉塞性疾患の周囲、敗血症、免疫システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に必要とする被験体において処置および/または炎症性疾患、疼痛、
痛覚過敏症、心血管疾患および/または虚血性脳疾患の予防における使用のためのブラジ
キニンの受容体モジュレーターとしての新規な生物学的および精製されたペプチドに関す
る。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、新たな毛細血管や血の開発です。このプロセスは、典型的には、胎児の月
経の開発、排卵および疾患または虚血、神経再生および骨の成長および創傷治癒の分野に
おける側副血管の胎盤開発などの生物学的状況の数が発生します。特に胎児の発育のすべ
てのこれらのイベントは、血管の複雑なネットワークにおける内皮細胞、移動および分化
の非常に急速な成長を必要とします。
【０００３】
健康な個体において起こる血管新生に加えて、血管形成事象は、種々の病理学的プロセ
スに関与している、特に腫瘍の増殖および転移、ならびに他の条件なしの血管増殖もので
、特に微小血管系の、糖尿病性網膜症、乾癬及び関節症のように、増加されます。血管新
生の阻害は、これらの病理学的プロセスを予防または軽減するのに有用です。
【０００４】
そのため、多くの生理学的および病理学的プロセスにおける血管新生の重要な役割のた
めに、血管新生の制御に関与する因子が集中的に研究されています。
【０００５】
また、血管透過性因子またはVEGF-A（VPF）としても知られている内皮細胞増殖因子（V
EGF）は、両方の非正常および異常な血管新生の重要な調節因子として報告されている（
フェラーラとデイビス - スマイス、1997;フェラーラ、1999）。さらに、VEGF-DおよびVE
GF-Cの切断型は、VEGFR-2結合（WO2012/088563）により、血管新生を刺激することが示さ
れました。
【０００６】
血管形成の刺激はまた、ブラジキニンのB1及びB2受容体（WO02/17958）の物質のアゴニ
ストに示されています。
【０００７】
ブラジキニン（BK）はノナペプチドのシーケンスでありますArg-PRO-プロのGly-Pheを-
SER-PRO-Pheを-Argが、カリクレインの活動の結果としてキニノーゲン上のほとんどの組
織や体液中に存在するタンパク質分解酵素群を、生成されました。そのようなのLys-BK（
カリジン）およびMet-Lysの-BKなどBKおよび関連キニンは、ブラジキニンのB2受容体を活
性化することができます。 BKまたはカリジン（Lysの-BK）のC末端のArg残基の除去はdes
Arg9 BK-と-Lysの-desArg9 BKを生成します。これらのペプチドは、キニン、またブラジ
キニンのB1受容体の特異的結合です。解放されると、キニンは、周囲の痛みと痛覚過敏、
刺激およびc-繊維を含む多くの生理学的応答を生成します。キニンは、炎症反応に寄与す
ることをかなりの証拠もあります。
【０００８】
ブラジキニン、痛み、痛覚過敏、心血管および/または脳循環系は、細胞分化、血管新
生、リンパ管の幹、重要な生理的に炎症反応のメディエーターとしてそれらを修飾する生
理作用、血圧降下状態の疾患、組織修復を示すペプチドの上に関連しています、免疫系の
調節、敗血症、条件を無駄に、糖尿病、神経発生、心臓機能およびリモデリング、腎機能
、神経発生および腫瘍発達（F. MarceauとD. Regoli、2004）の細胞。
【０００９】
治療法がある用語の特定の有効性の改善に、炎症性疾患、疼痛、痛覚過敏、心血管系、
および/または脳虚血性疾患の重要な満たされていない血管新生を活性化または阻害する
ための効率的な、より良い治療法の必要性予防および/または治療のままであり、が、副
作用の軽減。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下からなる群より選択される単離および精製されたペプチドを提供します
:
a）配列番号からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド：配列番号1：7。
b）有機それぞれの断片の長さは少なくとも8個の連続残基を有します。
【００１１】
本発明はまた、以下からなる群より選択される単離および精製されたペプチドを提供し
ます。
a）配列番号からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する生物学的変異体：配列番号4
3：49。
b）配列番号からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する有機各フラグメント：配列
番号36：42。
ことを特徴と単離および精製されたペプチドは、ブラジキニン受容体のモジュレーターで
あると述べました。
【００１２】
また、単離された分子と単離および精製されたペプチドをコードする精製された核酸が
開示される核酸分子を含むベクターは、前記細胞を特徴とする組換え宿主細胞は、本発明
の単離および精製されたペプチドを表します。
【００１３】
それらは、本発明による単離および精製されたペプチドを含む医薬組成物を開示し、医
薬組成物の使用は、鎮痛薬として述べ、および炎症性疾患、心血管虚血、疼痛の治療およ
び/または予防における医薬組成物の使用を述べ痛覚過敏症、腎疾患、創傷治癒、脳虚血
、脳卒中、血管性認知症、認知症、梗塞、心筋虚血、冠動脈性心疾患、心筋梗塞部材末梢
疾患、動脈閉塞性疾患周囲、敗血症、消耗状態、糖尿病および/または奇形流不良血管や
血と関連する障害、組織修復、細胞分化、血管形成、リンパ管形成、免疫細胞の調節を生
じます。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】1μMの（（BK）と異なるペプチド濃度PEPD（KPPCVNVFR;2-10配列番号8）の効果を示すアミノ酸残基の数に対応する、ヒトVEGF-D配列の133-141 HUVECの血管新生アッセイにExpasy（http://www.uniprot.org/uniprot/O43915）に記録されています。 * P<0、対照と比較して05（スチューデントt検定）
【図２】1μMのブラジキニンブラジキニンBK）の効果を示し、ペプチドPEPD（KPPCVNVFR;2-10配列番号8）の10μMとPEPD1-10（配列番号：1）、それぞれに対応します免疫優性残基133-141および132から141までの数、UniProtの中に記録されたヒトVEGF-D配列です。（http://www.uniprot.org/uniprot/O43915）およびペパ1-9（FKPSCVPLM;配列番号20）およびペパ（KPSCVPLM;2-9配列番号：27）、残基の数に対応アミノ酸81から73とUniProtの（http://www.uniprot.org/uniprot/P15692）、HUVECアッセイにおける血管新生のヒトVEGF-記録シーケンスの74から81。* P<0、対照と比較して05（スチューデントt検定）
【図３】Expasy（に記録されたヒトVEGF-D配列のアミノ酸残基番号132-140に対応する;それは、1μMのブラジキニン（BK）およびペプチド1-9 PEPD（配列番号15 FKPPCVNVF）の効果を示しますhttp://www.uniprot.org/uniprot/O43915）HUVECの血管新生アッセイに。 * P<0、対照と比較して05（スチューデントt検定）
【図４Ａ】これは、濃度初期刺激後24時間の1μM、10μMの濃度でのPEPC2-10による刺激HUVECの結果を示しています。
【図４Ｂ】これは、濃度初期刺激後24時間の1μM、10μMの濃度でのFIFO2-9による刺激HUVECの結果を示しています。
【図４Ｃ】これは、濃度初期刺激後24時間の0.1、1.0と10μMの濃度でのPEPC1-10による刺激HUVECの結果を示しています。
【図５Ａ】細胞内へのカルシウム流入HUVECはPepD2-10誘発とのFluo-3蛍光によって検出された、B1受容体の活性化に起因することを示しています。図5A: r. F. U. 任意の蛍光単位。 BK 1μMブラジキニン; THGタプシガルギン 10μM。
【図５Ｂ】細胞内へのカルシウム流入HUVECはPepD2-10誘発とのFluo-3蛍光によって検出された、B1受容体の活性化に起因することを示しています。図5B: PepD 2-10 em 10μM; THG タプシガルギン 10μM。
【図５Ｃ】細胞内へのカルシウム流入HUVECはPepD2-10誘発とのFluo-3蛍光によって検出された、B1受容体の活性化に起因することを示しています。図5C: エンシャダ140 (B2受容体アンタゴニスト) 10μM;PepD 2-10 10μM; THGタプシガルギン10μM。
【図５Ｄ】細胞内へのカルシウム流入HUVECはPepD2-10誘発とのFluo-3蛍光によって検出された、B1受容体の活性化に起因することを示しています。図5D: DesArg9-Leu8-BK 10μM; PepD 2-10 10μM; THG タプシガルギン。
【図５Ｅ】細胞内へのカルシウム流入HUVECはPepD2-10誘発とのFluo-3蛍光によって検出された、B1受容体の活性化に起因することを示しています。図5E: PepPL 1-10 (SEQ ID no: 7)。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
増殖因子は、自然に細胞の成長、増殖および細胞分化を刺激することができる物質を発
生しています。増殖因子は、種々の細胞プロセスの調節に重要です。成長因子は、通常、
細胞間シグナル伝達分子として機能します。例えば、骨形成タンパク質は、線維芽細胞成
長因子および血管新生を促進する血管内皮増殖因子などの骨細胞の分化および血管の分化
を刺激します。
【００１６】
個々の増殖因子タンパク質は、構造的及び進化的に関連するタンパク質の大きなファミ
リーのメンバーで発生する傾向があります。例えば、胎盤成長因子（PlGFの、アクセッシ
ョン番号P49763 UniProtの）、血管内皮増殖因子（VEGF-A、アクセッション番号P15692 U
niProtの、VEGF-B、アクセッション番号P49765 UniProtの、VEGF-C、UniProtのアクセッ
ション番号P49767およびVEGF-D、UniProtのアクセッション番号O43915）、及び（PDGF-A
、UniProtのアクセス番号P04085; PDGF-B、UniProtのアクセッション番号P01127）。Plat
elet由来増殖因子。
【００１７】
一態様において、本発明は、以下からなる群より選択される単離および精製されたペプ
チドを提供します。
a）配列番号からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する生物学的変異体：配列番号4
3：49。
b）配列番号からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する有機各フラグメント：配列
番号36：42。
【００１８】
別の局面において、本発明は、以下からなる群より選択される単離および精製されたペ
プチドを提供します。
ａ）配列番号からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する生物学的変異体：配列番号
43：49。
ｂ）配列番号からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する有機各フラグメント：配列
番号36：42。
彼はどこ単離および精製されたペプチドは、ブラジキニン受容体のモジュレーターであ
ると述べました。
【００１９】
本明細書で使用する場合、「タンパク質」、「ポリペプチド」、「ポリペプチド」およ
び「ペプチド」、「下」は、ペプチドは、α-アミノ基の間のペプチド結合によって連結
されたアミノ酸残基の列を指定するために、本明細書中で交換可能に使用され隣接残基の
カルボキシル基。
【００２０】
本発明はまた、生物学的な単離および精製されたペプチドの変異体を含みます。用語「
生物学的変異体」は、天然配列の単離および精製されたペプチドは、保存的アミノ酸置換
によって天然の配列、それによって一つ以上によって異なるアミノ酸配列であり、ある程
度異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指しますアミノ酸が同一の特性とコンフォ
メーションの役割と別で置換されています。アミノ酸配列変異体は、天然アミノ酸配列の
アミノ酸配列内の特定の位置での置換および/または挿入を有します。保存的アミノ酸置
換は、以下の5つのグループのいずれかの中での交換として定義されます。
I．小さい脂肪族残基、非極性またはわずかに極性の残基：Ala、Ser、Thr、Proは、グリ
シン
II．極性、正に荷電した残基：His、Arg、Lys
III．極性、負に帯電した残基とその友人：ASP、Gluの、アスパラギン、グルタミン
IV．大、芳香族残基：Phe、Tyr、Trp
V．大規模な、脂肪族、非極性のV.廃棄物：MET、ロイシン、イソロイシン、ヴァル、のCy
s
【００２１】
本明細書で使用される場合、「生物学的変異体」は、配列番号からなる群から選択され
る配列の突然変異及び/又は少なくとも一つのアミノ酸残基の置換を有する：50、配列番
号56は、好ましくは、前記変異体配列番号36：配列番号からなる生物学、49（受容体モジ
ュレーターは、生物学的変異体がより好ましいと述べ、さらにより好ましくは、生物学的
な変異体は、抗血管新生剤であると述べました。
【００２２】
別の局面において、本発明は、以下からなる群より選択される単離および精製されたペ
プチドを提供します。
ａ）配列番号からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド：配列番号1：7。
ｂ）有機それぞれの断片の長さは少なくとも8個の連続残基を有します。
【００２３】
本発明はまた、以下からなる群より選択される単離および精製されたペプチドを提供し
ます。
ａ）配列番号からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド：配列番号1：7。
ｂ）有機それぞれの断片の長さは少なくとも8個の連続残基を有します。
それがどこに書かれている単離および精製されたペプチドは、ブラジキニン受容体のモジ
ュレーターです。
【００２４】
好ましくは、工程bは、配列番号からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する有機
断片から成る配列番号8：28は、最も好ましくは、フラグメントは、生物学的な（受容体
アゴニスト活性を有すると述べました。
【００２５】
それは、単離されたペプチドおよび/または精製された「生物学的断片」のそれぞれの
配列と長さの少なくとも50％のアミノ酸を共有する配列をいいます。これらの配列は、そ
れらが、それらが由来する天然配列と同一の特性を示すように使用することができます。
好ましくは、これらの配列は、それぞれ配列、単離および/または精製されたペプチドと
の長さの70％以上、好ましくは80％以上、特に90％以上のアミノ酸を共有します。
これらの断片は、化学合成のような当該技術分野で公知の方法および種々の技術によっ
て調製することができます。
【００２６】
これらの断片は、化学合成のような当該技術分野で公知の方法および種々の技術によっ
て調製することができます。
【００２７】
活性ペプチド（L字型）に固有の問題は、分解は、天然のプロテアーゼによるものであ
るので、また、本発明のペプチドは、D型および/またはペプチドの「レトロ - インベル
ソ異性体」を含むように調製することができます。好ましく小品、変異体又は本発明のペ
プチドの組合せのレトロ - 逆異性体を調製しました。
【００２８】
天然タンパク質分解からペプチドを保護することは、単離および精製されたペプチドの
有効性を高めるべきです。天然プロテアーゼによる分解からの保護のため含むアナログ非
レトロ - インベルソと比較した場合、ペプチドを含有するレトロインベルソのための大
生物活性が期待されています。さらに、彼らは増加した安定性と低免疫原性（セラM.とジ
スマンE.、1997）を示すことが示されています。
M. SelaとE. Zisman、1997年に記載されているように、例えばレトロインベルソペプチ
ドは、既知の配列のペプチドのために調製されます。
【００２９】
「レトロ - インベルソ異性体」とは、配列の方向が逆転し、各アミノ酸残基のキラリ
ティーが反転した線状ペプチドの異性体を意味します。このように、何の補完的なエンド
・オブ・グループが存在することはできません。
また、本発明によってカバーされ、通常、in vivoまたはin vitroペプチド、P内の化学
的誘導体を含む、主要なクエリを変更しないペプチドの改変されています。 EX、アセチ
ル化またはカルボキシル化。また、グリコシル化の修飾、Pも含まれています。例えば、
それらは、p、その合成およびプロセッシング中またはさらなる処理工程におけるペプチ
ドのグリコシル化パターンを改変することによって行いました。例えば、グリコシル化P
に影響を与える酵素にペプチドを暴露することによって。例えば、哺乳動物のグリコシル
化または脱グリコシル化酵素。また、リン酸化アミノ酸残基を有する配列、pが含まれま
す。 EX、ホスホチロシン、ホスホセリンまたはホスホ。
それらは当然、そのような他のポリペプチドと関連付けられている現在のを実質的に含
まないまたは遊離発明の材料に応じて、そのようなペプチドをコードする核酸または本発
明のペプチドである状態を意味する用語「単離および精製された」、または核酸、それら
がそれらの天然の環境で見出されると酸、またはそのような製剤は、インビトロで実施組
換えDNA技術によるもので、それらが調製される環境（例えば細胞培養）。
【００３０】
配列番号1：7（表１）実施形態において、本発明は、配列番号からなる群から選択され
る単離および精製されたペプチドを提供します。
本発明の別の実施形態によれば、単離および精製されたペプチドは、配列番号からなる
群から選択される：1、配列番号：7は、好ましくは、（受容体モジュレーターB2ブラジキ
ニン受容体のモジュレーターであります。
より好ましくは、単離および精製されたペプチドは、配列番号からなる群から選択され
る：1、配列番号：7は、（B2受容体のアゴニストです。
【００３１】
【表１】
2016528192.tif 000003
【００３２】
8、配列番号：14（表２）本発明の別の実施形態では、単離および精製されたペプチド
は、配列番号からなる群から選択された生物学的フラグメントです。
1つの新たな実施形態では、ペプチドは、単離および精製された長さが少なくとも8個の
連続する残基の生物学的フラグメントの配列番号からなる群から選択される：8、配列番
号：14のフラグメントが、生物学的であることを特徴と（受容体モジュレーター、好まし
くは、（B2受容体モジュレーター。
より好ましくは、単離および精製されたペプチドは、配列番号からなる言った：8、配
列番号：14は、（B2受容体のアゴニストです。
【００３３】
【表２】
2016528192.tif 000004
【００３４】
本発明の次の実施形態では、単離および精製されたペプチドは、配列番号からなる群か
ら選択された生物学的フラグメントである：配列番号15：21（表３）。
後者は、（受容体モジュレーター、好ましくはブラジキニンB1受容体モジュレーターで
す。
より好ましくは、単離および精製されたペプチドは、ブラジキニンB1受容体アゴニスト
です。
【００３５】
【表３】
2016528192.tif 000005
【００３６】
本発明の別の実施形態では、単離および精製されたペプチドは、長さが少なくとも8個
の連続する残基の生物学的フラグメントからなり、配列番号からなる群から選択される：
配列番号22：28（表４）。好ましくは、生物学的フラグメントは、B1ブラジキニン受容体
モジュレーターです。より好ましくは、生物学的な部分は、ブラジキニンB1受容体アゴニ
ストです。
【００３７】
【表４】
2016528192.tif 000006
【００３８】
本発明の別の実施形態では、配列番号からなる、単離および精製されたペプチド：1、S
EQ ID NO：6、配列番号8、配列番号：15、配列番号ID NO：20またはSEQID番号：27。
【００３９】
本発明はまた、以下からなる群より選択される単離および精製されたペプチドを提供し
ます。
ａ）配列番号からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する生物学的変異体：配列番号
43：49。
ｂ）配列番号からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する有機各フラグメント：配列
番号36：42。
それがどこに書かれている単離および精製されたペプチドは、ブラジキニン受容体のモ
ジュレーターです。
【００４０】
配列番号36：49（表６及び７）は、本発明の別の実施形態によれば、ペプチドは、配列
番号からなる群から選択された生物学的変異体で単離し、精製します。
好ましくは、変異体は、ブラジキニン受容体の生物学的調節因子であると述べました。
より好ましくは、生物学的な変異体は、抗血管新生および/または抗リンパ管です。
用語「生物学的変異体」は、保存的アミノ酸置換により、天然配列から変化したアミノ
酸配列である天然配列および/または精製されたポリペプチドを単離し、ある程度異なる
アミノ酸配列を有するポリペプチドを指すもので以上のアミノ酸が同じ特性とコンフォメ
ーションの役割と別で置換されています。アミノ酸配列変異体は、天然アミノ酸配列のア
ミノ酸配列内の特定の位置での置換および/または挿入を有します。保存的アミノ酸置換
は、以下の5つのグループのいずれかの中での交換として定義されます。
I．小さい脂肪族残基、非極性またはわずかに極性の残基：Ala、Ser、Thr、Proは、グリ
シン
II．極性、正に荷電した残基：His、Arg、Lys
III．極性、負に帯電した残基およびそれらのアミド：Asp、Gluの、アスパラギン、グル
タミン
IV．大、芳香族残基：Phe、Tyr、Trp
V．大規模な、脂肪族、非極性のV.廃棄物：MET、ロイシン、イソロイシン、ヴァル、のCy
s。
【００４１】
本明細書で使用する場合、用語「抗血管新生」は、血管新生および/またはリンパ管新
生を阻害する任意の分子を指します。
【００４２】
本明細書において、用語「抗血管新生リンパ」はリンパ管の成長に関連するリンパ管新
生を阻害する任意の分子を指します。
【００４３】
29、配列番号：35（表５）の別の態様によれば、本発明は、配列番号からなる群から選
択されるアミノ酸配列を有する単離および精製されたペプチドを提供します。
【００４４】
好ましくは、タンパク質加水分解により単離および精製されたペプチドは、1ブラジキ
ニン受容体モジュレーターを上昇させると述べました。より好ましくは、タンパク質加水
分解によって生成された単離および精製されたペプチドは、ブラジキニン受容体のアゴニ
ストです。
【００４５】
【表５】
2016528192.tif 000007
【００４６】
SEQ  ID NO36：42（表６）の別の態様によれば、本発明は、配列番号からなる群から選
択されるアミノ酸配列を有する有機バリアントからなる、単離および精製されたペプチド
を提供します。
【００４７】
好ましい実施形態によれば、単離および精製されたペプチドは、ブラジキニン受容体の
モジュレーターであります。
【００４８】
別の態様によれば、配列番号からなる、単離および精製されたペプチドが提供される：
SEQ ID NO36：42がここでペプチドは、抗血管新生剤であると述べました。
【００４９】
【表６】
2016528192.tif 000008
【００５０】
別の態様によれば、本発明は、配列番号からなる群から選択されるアミノ酸配列を有す
る有機バリアントからなる、単離および精製されたペプチドを提供する：配列番号43：49
、ここで、前記ペプチドは、VEGF、PlGFのまたはPDGF受容体モジュレーター（表７）です
。
【００５１】
好ましくは、単離および精製されたペプチドは、抗血管新生です。
【００５２】
【表７】
2016528192.tif 000009
【００５３】
【表８】
2016528192.tif 000010
【００５４】
別の局面において、本発明は、以下からなる群より選択される単離および精製されたペ
プチドを提供します。
ａ）配列番号からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド：配列番号1：7。
ｂ）有機それぞれの断片の長さは少なくとも8個の連続残基を有します。
どこで単離および精製されたペプチドは、ブラジキニン受容体B1やB2を発現している内皮
細胞でエントリーカルシウムを誘導するブラジキニン受容体モジュレーターです。
【００５５】
好ましくは、ステップb、配列番号からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するそ
れらの生物学的フラグメント：配列番号8：単離および精製されたペプチドは、ブラジキ
ニン受容体モジュレーターである、請求項28は、エントリを誘導ブラジキニンB1やB2受容
体を発現する内皮細胞中のカルシウム。
【００５６】
別の局面において、本発明は、以下からなる群より選択される単離および精製されたペ
プチドを提供します。
ａ）配列番号からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド：配列番号1：7。
ｂ）有機それぞれの断片の長さは少なくとも8個の連続残基を有します。
どこに書き込みを単離し、精製したペプチドは、血管新生を誘導するブラジキニン受容体
モジュレーターです。
【００５７】
B1とB2アゴニストの予想されるその他の作用は、炎症反応、低血圧状態、疼痛、痛覚過
敏、心臓血管および/または脳循環器疾患、組織修復、幹細胞の分化、血管形成、リンパ
管形成、免疫細胞の調節、敗血症、ありますユナイテッド消耗、糖尿病、糖尿病性神経障
害、アレルギー、脳浮腫における塩の神経新生、心臓機能およびリモデリング、腎バラン
ス機能と神経新生、腫瘍発達（F. MarceauとD. Regoli、2004; Trujillo C.A.ら、2012）
。
【００５８】
好ましくは、ステップb、配列番号からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するそ
れらの生物学的フラグメント：配列番号8：28は、ここで単離および精製されたペプチド
は、ブラジキニン受容体モジュレーターは、血管新生を誘導あります。
【００５９】
本発明はまた、SS架橋を介して二量体、ホモまたはヘテロ二量体を形成し得るCys残基
を有するペプチドに関し、そのような二量体はホモ二量体またはヘテロ（P。例、ダイマ
ー配列番号8として活性であり得ます）それ自体と、または配列番号8、配列番号23の二量
体、例えば。本発明はまた、他の方法により得られたホモまたはヘテロ二量体を企図しま
す。
【００６０】
別の態様において、本発明は、配列番号1の任意の環状ペプチドを意味する：配列番号1
：56。
【００６１】
本発明の単離および精製されたペプチドは、生物工学的方法によって得られた及び/又
は天然源から抽出された、化学合成によって提供することができます。
【００６２】
好ましくは、単離および精製されたペプチドは、化学合成によって提供されます。ペプ
チドの文脈において、用語「化学合成」は、SPPS、ペプチドの液相合成または両方の組合
せを指すことができます。ここでは、合成は、通常、側鎖（直交保護基）で保護したアミ
ノ酸の段階的なカップリングに基づきます。通常、合成の間に、ペプチド鎖はN末端からC
末端から成長します。しかし、代替的な方法は、ペプチドが存在し、N末端からC末端に成
長しており、そこです。今日では、最も一般的な方法は、例えば、Pのような少なくとも2
つの異なる状態で切断可能な保護基、少なくとも2つの異なるタイプのベース。例えば、
フルオレニル-9-メトキシカルボニル/ tert-ブチルbutanyl-カルボニル（Fmoc／T  BU）
（戦術グループレジメンシェパード）を保護またはtert-ブトキシカルボニル/ベンジルカ
ルボニル（Boc / Bzlの）グループスキーム（メリフィールド戦術）を保護。
あるいは、またはさらに、ペプチドは、例えば、当該技術分野で公知の任意の結合方法
により別の二つ以上のペプチド鎖（複数可）の組み合わせによって予測することができま
す。
【００６３】
ネイティブケミカルライゲーション（NCL）、マレイミド - チオール結合化学、ライゲ
ーション抱合酵素タンパク質、生化学的および/または可溶性操作の組み合わせをクリッ
クします。
あるいは、単離および精製されたペプチドは、生物工学的方法によって得ることができ
ます。今日では、多数の生物工学的方法は、当該技術分野で知られており、例えば、過剰
発現および/または異種発現、細菌、昆虫細胞および哺乳動物細胞、酵母細胞内で1つ以上
の遺伝子のクローニングに基づいて、特に異種発現のために、または植物細胞。単離およ
び精製されたペプチドは、当該技術分野で公知の任意の手段によって抽出することができ
ます。
【００６４】
あるいは、単離および精製されたペプチドは、当該分野で公知の任意の手段によって、
天然源から抽出することができます。さらに、単離および精製されたペプチドは、例えば
、一つ以上のクロマトグラフィー法、一つ以上のスクリーニング方法であって、一つ以上
の電気泳動法、一つ以上の方法に基づいて、当該分野で公知の任意の手段によって精製す
ることができます沈殿、一つ以上の透析法又は二つ以上の添加の組み合わせ。天然源は、
任意の生物学的物質、例えば、細菌物質、植物材料、動物材料又は布グラムなどの真菌材
料であってもよいです。や液体または分泌。天然源から得られる単離および精製されたペ
プチドはまた、消化され、または部分的に、そのようなプロテアーゼのような1つ以上の
酵素によって消化することができます。
それは、当業者によって理解され、単離および精製されたペプチドを提供するために、
上記の方法はまた、互いに組み合わせることができます。具体的には、生物工学的方法ま
たは天然源で得られたブラジキニン受容体アゴニストは、さらに精製および/または当技
術分野で公知の化学的手段によって修飾することができます。
【００６５】
別の態様によれば、本発明は、単離および精製された単離および精製されたペプチドを
コードする核酸分子を提供します。
【００６６】
本明細書中で使用することができるDNAは、電子を含む任意のポリデオキシヌクレオチ
ドです。グラム。二本鎖DNA、一本鎖DNA、一方または両方の鎖が、二つ以上の断片から構
成され、二本鎖DNA、DNAの一方または両方の鎖が二本鎖バックボーン中断されないホスホ
ジエステルDNAされ、そのDNA二重鎖DNA鎖は、円形のみ部分的に相補的である、一本鎖及
びDNA鎖が完全に相補的である二本鎖、二本鎖DNAの一つ以上の部品の一つ以上を含んでDN
A、共有結合的に閉じており、直鎖DNA DNAが共有結合したDNAを架橋し、cDNAは、化学的
に合成されたDNAの半合成DNA、DNAの生合成が自然に単離されたDNAは、DNAは、DNAは、こ
のような放射性標識されたDNAと蛍光色素として、DNAを切断ラベル、酵素によって消化-e
tiquetada DNA、核酸の1つ以上の非天然種を含むDNA。
【００６７】
単離および精製されたペプチド、またはその一部をコードするDNA配列は、標準的な化
学技術によって合成することができ、例えば、ホスホトリエステル法または自動化合成法
およびPCR法を介して。精製および単離されたDNA配列は、酵素的技術により製造すること
ができる本発明の符号化に従って単離および精製されたペプチド。したがって、制約は、
ペプチドをコードすることが事前に定義された認識配列で切断する核酸分子は、DNA（ま
たはRNA）などの核酸配列を含むより大きな核酸分子から核酸配列を単離するために使用
することができる酵素単離精製されたまたはその一部。
【００６８】
本発明はまた、1つまたはそれ以上のヌクレオチドが同じ特性を有する別のものに置換
されることにより、保存的ヌクレオチド置換により参照配列から変化するヌクレオチド配
列であり、上記の配列の変異体を含みます。
【００６９】
好ましい実施形態によれば、本発明は、本発明の単離および精製された単離および精製
されたペプチドをコードするcDNA分子に関する。
【００７０】
この文書では、「cDNA」という用語は、メッセンジャーRNA、一から合成されたDNAの一
本鎖相補的なDNAである相補的なDNAを指し、逆転写酵素および/または発現ベクターへの
その後のライゲーションに適したメッセンジャーRNAから合成された二本鎖の相補的DNAに
よるメッセンジャーRNA。
【００７１】
本発明の別の主題は、本発明の核酸分子を含むベクターです。ベクターは、真核生物、
原核生物または真核生物と原核生物で複製可能な。これは、宿主細胞ゲノム（Gバクテリ
オファージラムダ）、または染色体外に存在するベクター（例えば、プラスミド）への統
合が可能なベクターであり得ます。好ましくは、ベクターはプラスミドです。
【００７２】
さらに、ベクターは、I発現ベクターであってもよいです。 E。 DNA配列が単離され、
精製されたベクターは、プロモーターに作動可能＆＃1072にリンクされています。これは
、DNA配列を単離し、精製し、本発明の単離および精製されたペプチドの発現、および転
写を可能にする適切な調節配列の制御下にコードすることを意味します。そして、翻訳が
挿入され、次の単離および精製されたDNAにリンクされています。原核宿主細胞に適した
発現ベクターは、サントスら、Molecular  Cloningに記載されています。特に章1-4およ
び哺乳動物細胞におけるクローニングされた遺伝子の発現に適したベクター17研究室マニ
ュアル、第2版（1989）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレスは、サ
ントスら、第16章の適切なベクターに記載されています。これらは、プロモーター配列、
ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、マーカー遺伝子および適切な他の配列を含む
適切な調節配列を含有する、選択または構築することができます。
【００７３】
本発明の好ましい実施形態によれば、発現ベクターは、本発明の単離および精製された
ペプチドをコードする、精製および単離されたcDNA分子の少なくとも1コピーを含みます
。
【００７４】
又は材料を伴うことなく、または「トランスフェクション」は、前記細胞外DNAの任意
のプロセスを意味する「真核生物または原核生物の宿主細胞への精製されたDNAを導入す
る」という用語は、宿主細胞に入ります。または「トランスフェクトされた細胞」は、用
語「トランスフェクトされた細胞」は、細胞外DNAが導入された細胞を意味し、従って、
細胞外DNAを保有します。核酸が染色体のメンバーとして、または染色体外エレメントと
してのいずれかで複製可能であるようにDNAを細胞に導入することができます。
【００７５】
発現ベクター/宿主の組み合わせの多様な本発明のDNA配列を発現に用いることができま
す。ベクターは、有用な発現、例えば、染色体DNA配列、非染色体および合成のセグメン
トから構成されてもよいです。適切なベクターは、SV40の誘導体、既知の細菌プラスミド
、Pが含まれます。例えば、大腸菌のプラスミドpBR322のPCRL、pMB9およびそれらの誘導
体、RP4のようなプラスミドのCOLエル;ファージDNAを、P、EX、ファージX、Pの多数の誘
導体。例えば、NM989、および他のファージDNA、P。例えば、M13および糸状一本鎖DNAフ
ァージ;このような2Uプラスミドまたはその誘導体のような酵母プラスミド;例えば、昆虫
または哺乳動物細胞において有用なベクターなどの真核細胞において有用なベクター。フ
ァージDNAまたは他の発現制御配列を使用するように改変されたプラスミドのようなプラ
スミドおよびファージDNAの組み合わせに由来するベクター、等が挙げられます。
【００７６】
発現制御配列の多種多様な（すなわち、作動可能に連結されたそのDNA配列の発現を制
御する配列）は、本発明のDNA配列を発現させるためにこれらのベクターにおいて使用さ
れ得ます。このような配列の有用な制御式は、例えば、SV40の初期または後期プロモータ
ー、CMV、ワクシニア、ポリオーマまたはアデノウイルス、lac系、trp系、TAC系、TRC系
、LTR系、メジャー3-ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素、ファージXの酸
性ホスファターゼのプロモーター、fdのコートタンパク質の制御領域（P。例：、PHO5）
のプロモーターのプロモーターのオペレーター領域と、酵母因子のプロモーター交配およ
び原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現、およびそれらの様々な
組み合わせを制御することが知られている他の配列。
【００７７】
本発明の別の主題は、その特徴の組換え宿主細胞は、上記で定義された細胞は、好まし
くはcDNA分子、特に宿主細胞をDNA分子を単離し、精製を発現することができるペプチド
または宿主細胞を発現すると述べていますこれは、安定して該DNA分子を含む発現ベクタ
ーで形質転換されます。
【００７８】
用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本発明の一つ以上のDNAまたはベクタ
ーに挿入された真核細胞または原核細胞を示すために本明細書中で交換可能に使用されま
す。このような用語は特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的子
孫を指すだけでなく、ことが理解されます。特定の修飾が変異または環境の影響のいずれ
かで、このような子孫はないに世代で起こり得るので、実際に、親細胞と同一ではなく、
本明細書で使用されるまだ用語の範囲内に含まれます。
【００７９】
「真核細胞」は、任意の哺乳動物細胞または非哺乳動物真核生物ものをいいます。実施
例の非限定的な方法は、細胞培養条件下で維持し、その後トランスフェクトすることがで
きる任意の真核細胞は、本発明に含まれます。細胞の種類は、特に、P好ましいが含まれ
ます。例えば、細胞、胚性幹細胞、チャイニーズハムスターの卵巣幹細胞（CHO）細胞、B
HK21、NIH3T3、HeLa細胞、C2C12、癌細胞、および一次分化または未分化細胞からです。
他の適切な宿主細胞は当業者に知られています。
【００８０】
単細胞宿主細胞の多様な本発明のDNA配列を発現するのに有用です。これらのホストは
、大腸菌、シュードモナス、バチルス属、ストレプトミセス、酵母などの真菌、および動
物細胞、例えばCHO、YB / 20、NSO、SP2 / 0は、Rなどの原核および真核既知のホストを
含むことができます。 L、BW細胞とLM、腎臓アフリカミドリ細胞ジャック（P。例えば、C
OS-1、COS 7、BSC1、BSC40、およびBMT10）、昆虫細胞（P。例：は、Sf9）細胞および起
源のヒト細胞と組織培養における植物細胞。好ましくは、宿主細胞は、細菌細胞、より好
ましくは、セルEがあります。
【００８１】
これは、全てのベクター、発現制御配列及び宿主は、本発明のDNA配列を発現するため
に等しく良好に機能することが理解されるであろう。ていないすべてのホストが同じ発現
システムと同様に動作。しかしながら、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、
所望の発現を達成するために過度の実験を行うことなく、適切なベクター、発現制御配列
、および宿主を選択することができます。ベクターは、その中で機能しなければならない
ので、例えば、ベクターを選択するには、ホストを考慮しなければなりません。ベクター
のコピー数、コピー数および抗生物質マーカーなどのベクターによってコードされる任意
の他のタンパク質の発現を制御する能力もまた考慮されます。
【００８２】
発現制御配列の選択において、種々の要因が正常とみなされます。これらは、潜在的な
二次構造に関して、特にとして、例えば、相対的なシステムの強度、その制御性、および
発現されるべき特定のDNA配列との互換性を含みます。適当な単細胞宿主は、p、を考慮す
ることによって選択されます。例えば、選択されたベクターとの適合性、その分泌特性、
タンパク質を正しく折り畳む能力、およびそれらの発酵要件、ならびに発現されるべきDN
A配列によりコードされる産物の宿主に対する毒性、および精製の容易さ製品の式。
【００８３】
発酵または大規模培養動物に本発明のDNA配列を発現するこれらおよび他の因子は、当
業者が様々な組み合わせを構築することができるであろうシーケンス/ベクトル制御の宿
主/発現考慮。
【００８４】
本発明の単離および精製されたペプチドを産生するために用いられる宿主細胞は種々の
培地において培養することができます。そのようなハムのF10（シグマ）、最小必須培地
（MEM、シグマ）、RPMI-1640（シグマ）及びダルベッコ培地改変イーグル培地（DMEM、シ
グマ）などの市販の培地が宿主細胞の培養に適しています。また、ハムら、1979に記載さ
れたメディアのいずれか;バーンズら、1980。 U. S.特許第4767704、4657866、4927762、
4560655または5122469、WO90/03430、WO87/00195またはWO宿主細胞のための培養培地とし
て使用されてもよいです。これらの培地のいずれも、ホルモンおよび/または（例えば、
インスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子）、他の成長因子（例えば、塩化ナト
リウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、緩衝液（例えばして必要に応じ
て補足することができますHEPESのような）、ヌクレオチド（例えばアデノシン及びチミ
ジン）、抗生物質（ゲンタマイシン薬のような）、元素（最終濃度がマイクロモル範囲で
通常存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー
源を追跡します。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含
まれてもよいです。温度、pHなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で使用
されるものであり、当業者には明らかであろう。
【００８５】
本発明の別の主題は、本発明の単離および精製されたペプチドを含む医薬組成物です。
【００８６】
薬学的に許容される担体、希釈剤およびアジュバントと組み合わせて、必要に応じて上
記で定義される本発明のさらなる主題は、活性物質として単離および精製されたペプチド
の薬学的有効量を含む医薬組成物です。好ましくは、本発明の医薬組成物は、アジュバン
ト、希釈剤および薬学的に許容される担体を含みます。このような許容される担体、希釈
剤およびアジュバントは非毒性であるべきであり、活性成分の有効性を妨害してはなりま
せん。この医薬組成物は、好ましくは、炎症性疾患、心血管虚血、疼痛、痛覚過敏症、腎
疾患、治癒、心血管虚血、創傷、脳虚血、脳卒中の治療および/または予防のための医薬
の製造のための剤として使用されます血管性認知症、認知症、梗塞、心筋虚血、冠動脈性
心疾患、心筋梗塞、末梢疾患および動脈閉塞性疾患の周辺、敗血症のメンバー、加盟国、
奇形流量又は血液血管に関連する糖尿病および/または障害を無駄欠陥のある組織修復、
細胞分化、血管形成、リンパ管形成、免疫細胞の調節を生じます。
【００８７】
医薬組成物は、溶液、懸濁液、粉末、凍結乾燥、軟膏またはチンキ剤の形態で、例えば
、任意の適切な形態であってもよいです。組成物は、例えば、任意の適切な方法によって
投与することができます。注射当たり（全身または局所）、または局所的に。担体または
他の物質の正確な性質は、例えば、静脈内または皮内、経口、局所、または注射によって
であってもよい、投与経路に依存します。
経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液体であってもよいです
。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントなどの固体担体を含むことができます。液体医薬
組成物は、一般に、水、石油、動物もしくは植物油、鉱油または合成油などの液体担体を
含みます。
【００８８】
生理食塩水、デキストロースまたは他のサッカライド溶液あるいはグリコール、プロピ
レングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれていてもよいで
す。
【００８９】
苦痛の部位への静脈内注射または注入、活性成分は、発熱物質を含まず、安定性、適切
なpHおよび等張性を有し、非経口経路によって許容される水溶液の形態であろう。当業者
は、例えばを用いて適切な溶液を調製することもできる、例えば塩化ナトリウム注射液、
リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張性ビヒクル。
必要に応じて、防腐剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤および/または他の添加剤が含ま
れていてもよいです。
【００９０】
それぞれの薬学的効果量は、治療すべき疾患および投与方法、治療される特定の患者に
依存することができます。さらに、薬学的に有効な量は、ポリペプチドは、さらに、細胞
毒性の成分が含まれているか、いない場合は特に、使用される特定のポリペプチドに依存
します。治療は、通常、通常、数時間、数日または数週間の間隔で、医薬組成物の複数の
投与を含みます。投与単位のポリペプチドの薬学的有効量は100μ治療すべき患者のグラ
ム/ kg体重ngの範囲0.001であるのが典型的です。
【００９１】
任意の薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤と所望の純度を有する、上で定義さ
れたように、本発明に従って使用される医薬組成物は、単離および精製されたペプチドの
薬学的有効量を混合することによって貯蔵のために調製される（レミントン製薬科学第16
版、Osol、A.編1980）、凍結乾燥製剤または水溶液の形態です。許容される担体、賦形剤
、または安定剤は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン
酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝液を含みます。アスコルビン酸およびメチ
オニンを含む抗酸化剤; （;フェノール、ブチルorbenzylアルコール;メチル又はプロピル
パラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール; 3-ペ
ンタノール;およびm-クレゾールかかるオクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩
化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムなど）、防腐剤、低分
子量ポリペプチド（約10残基未満）。例えばアルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン
などのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、
アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸;単糖類、二糖類
、及びグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物; EDTAなどのキレ
ート剤;スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖;ナトリウム
のような対イオンを塩形成;金属錯体（亜鉛 - タンパク質複合体の例）。及び/又はTWEEN
、PLURONICSまたはポリエチレングリコール（PEG）などの非イオン性界面活性剤。
【００９２】
本発明のさらなる主題は、医薬に使用するための医薬組成物にも関します。
【００９３】
本発明の別の主題は、鎮痛薬として使用するための本発明の単離および精製されたペプ
チドを含む医薬組成物です。
【００９４】
好ましくは、本発明の医薬組成物は、炎症性疾患、心血管虚血、疼痛、痛覚過敏症、腎
疾患、創傷治癒、脳虚血、脳卒中、血管性痴呆、梗塞性認知症、虚血の治療及び/又は予
防に使用され、状態、糖尿病および/または血流不良や血管奇形、組織修復に関連する障
害、細胞分化幹を無駄冠状動脈性心臓病、心筋梗塞、末梢疾患部材および動脈閉塞性疾患
の周囲、敗血症、 、血管形成、リンパ管、免疫系の調節の細胞。
特に、本発明の医薬組成物は、炎症性疾患、疼痛、痛覚過敏症、虚血性心血管疾患およ
び/または脳および/またはそれを必要とする被験体における血管新生およびリンパ管新生
に関連する疾患の治療及び/又は予防に使用されます。
より好ましくは、本発明の医薬組成物は、それを必要とする対象において血管新生およ
びリンパ管新生に関連する疾患の治療および/または予防に使用されます。
【００９５】
「処置」とは、治療的処置および予防的または防止的手段の両方を意味します。治療を
必要とするものには、既に障害を有するものならびに障害が予防されているものが挙げら
れます。したがって、本明細書に分類される哺乳動物は、疾患を有すると診断されていて
もよい、またはかかりやすいか、または疾患の影響を受けやすいです。
【００９６】
治療のための「哺乳動物」などイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、サル、などのヒト、家畜およ
び農場の人間、動物、動物園、スポーツまたはペット動物を含む、哺乳動物として分類さ
れる任意の動物を意味します好ましくは、哺乳動物はヒトです。
【００９７】
（例）
【００９８】
（例１）
マトリゲル上の試験管内血管新生アッセイで
血管新生アッセイをPaschoalin Tに記載されているプロトコル、ら（2007）に従って実
施しました。
ヒト臍帯静脈（HUVEC）からの内皮細胞は、10mMのN-2-ヒドロキシエチル - N '-2-エタ
ンスルホン酸（HEPES）、24mMの重炭酸ナトリウム、10％を補充した完全RPMI1640培地、p
Hを7.2に維持しました。不活性化ウシ胎児血清熱（FCS）ギブコ（ミネアポリス、ミネソ
タ州、米国）と40μG / mlの硫酸ゲンタマイシン（Hipolabor医薬品、サバラ、MG、ブラ
ジル）。
【００９９】
前述のようにマトリゲル上でインビトロ血管形成アッセイを行った中で（Paschoalinら
、2007）。簡単に言うと、（B＆Dバイオサイエンス、ベッドフォード、マサチューセッツ
州、米国）マトリックスBDマトリゲルは、15×（37℃HXで96ウェルプレート（ウェルあた
り50μL）で配布し、1時間重合させ、氷上で解凍し103細胞/ウェル）は、RPMI培地を100 
/μLは、2％FCSを補充することができ、血管形成活性のペプチドの存在下で各ウェルに加
え懸濁させました。脈管形成刺激剤および阻害剤は、必要に応じて、マトリゲルに添加す
る前に細胞とインキュベートすることができます。プレートを18時間37℃でインキュベー
トし、次いで、画像は、倒立顕微鏡に結合されたソニーサイバーショットカメラでX 8の
倍率で撮影しました。血管新生促進構造の数は、（内皮細胞の拡張は、樹状細胞に由来す
る環を閉じた）4つの異なるウェルからカウントした、その平均値を各試料について測定
しました。
【０１００】
そのようなBKなどの血管新生因子によって刺激された場合には、HUVEC細胞は、血管新
生促進構造の開発を経て、血管新生または抗血管新生分子を研究することができます。血
管新生促進構造の数を計数し、コントロールとBKと比較されます。
一般的に、VEGF-Aに由来するペプチド、VEGF-Dペプチド、VEGF-CのペプチドはPEPC命名
した、ペパ発明命名されているが、PEPD命名し、胎盤成長因子ペプチドをPepPl命名しま
した。
【０１０１】
1μM、10μM、50μM濃度：図1はPEPD 2-10（配列番号8）によるHUVECの刺激の結果を示
しています。結果は、2PEPD今1-10使用して、同様の試験の結果を示す2-10μM 1及び図10
のPEPD濃度の血管新生促進効果を示す（配列番号1）
PEPD 2-10（配列番号：8）ペパ1-9（配列番号：20）およびペパ（配列番号27）2-9 10μM
の濃度は、BK 1μMとペプチドを含まないコントロールが追加されました。明らかにPEPD 
1-10、2-10 PEPD、ペパペパ1-9と2-9は、血管新生を誘導することができます。
【０１０２】
図3は、1-9 PEPDによってHUVEC刺激の結果を示す（配列番号：15; FKPPCVVF）10 M BK 
1μMと比較した場合、制御のために。これは、1-9 PEPDが血管新生を誘導することが可能
であることを示しています。
図4は、1μM、10μMの濃度及びPEPC1-10（図4C）0.1でのPEPC2-9（図4B）とPEPC2-10（
図4A）によるHUVECの刺激の結果を示しています、10μMの1.0および濃度、初期刺激後24
時間。PEPC PEPC2-10と1-10は、血管新生を誘導することができる、とPEPC2-9ことを示し
ています。
* P<0.05、スチューデントのt検定は、HUVEC培養を制御するための3つの異なるウェル
の血管新生促進構造の平均数を比較すると。
【０１０３】
（例２）
HUVECを細胞内カルシウムの測定はPEPD、2-10ペプチドで刺激、
細胞内カルシウム測定はBagnaresi Pら、2012  Lungato L、Et al、2012に記載された
方法に従って行いました。
【０１０４】
ヒト臍帯静脈からの内皮細胞は、10％の熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）、重炭酸ナト
リウムの24ミリメートル、ゲンタマイシン40 mg / mlで、10mMのHEPES、pHが7.4を含むRP
MI 1640培地（GIBCO）中で培養しました5％CO 2の湿潤雰囲気中で37℃です。 5×104細胞
が皿の60ミリメートル（コスター3260）に播種し、遮断薬プロベネシドチャンネルを含む
緩衝液中で37℃で40分間、5μMのFluo-3 AM（インビトロジェン社、カリフォルニア州）
を含む培地で培養しました（40ミリモル）、残りの細胞外プローブを廃棄する培地で3回
洗浄しました。次いで、細胞を、505から530 nmで488 nmで励起し、発光を有する蛍光顕
微鏡（ツァイスLSM 510 META）の段階で、37℃で培養チャンバーに入れました。インキュ
ベーションカルシウムプローブアッセイは、1μMのブラジキニン（BK）、10mMのPEPD 2-1
0を用いて行った後。 （10マイクロメートルの受容体アンタゴニストのB1 ARG9-DES-Leu
の8-BK（10マイクロメートル）と拮抗B2鍬-140レシーバ：; PEPD（8  2-10号配列番号KPP
CVNVFR）によって活性化されるB受容体を実証するために、）を添加する前に10分間の細
胞培養HUVECに追加場所：2-10  PEPD（10μM）または5μMタプシガルギン（THG）。
【０１０５】
蛍光データは、FmaxのTHGがERのCa 2+ ATPアーゼを阻害剤Bagnaresiら2012を追加する
ことによって放出細胞内Ca 2+を用いて得られた最大蛍光であるF / FMAXとして標準化し
ました。 THGブロックカルシウムポンプは、細胞質カルシウムの細胞質を回収しました。
細胞質カルシウムの作用によりTHGは、その最大濃度に達します。
【０１０６】
ソフトウェアベースの分析は、フィールド全体で、または時間の関数（画像J 1.47時間
、NIH、USA）として選択された細胞の蛍光画像を許可されました。これは、（グラフパッ
ドプリズム6をsofwtare）与えられたフレーム画像の関心（例えば、全細胞）の領域を定
義し、経時的に強度のグラフィカル表現を構築するためのソフトウェアを誘導することに
よって達成されました。 15細胞は、細胞集団における細胞内カルシウムの変化の蛍光を
表す個々のトレースの典型的な応答は、（Lungatoら、2012）を分析しました。
【０１０７】
図5および細胞HUVECへのカルシウム流入がPepD2-10を誘導し、フルオ-3、蛍光によって
検出されたことを示しているが、ブラジキニンB1受容体の活性化に起因するものです。
【０１０８】
図5Aは、（1：50）HUVEC培養BKへの追加の効果を示すための制御には約2時20分での蛍
光の増加によって示されるように、細胞質内カルシウムの増加を誘導します。タプシガル
ギンは、最後に、細胞内カルシウムの最大の増加は、比計算に使用することができました
。
【０１０９】
図5Bは、10μM PEPD 2-10もHUVEC細胞における細胞質カルシウムの増加を誘導すること
を示しています。 HOE140前ブラジキニンB2受容体拮抗薬の追加のカルシウムの侵入を阻
止するが、明らかにカルシウム破断パターンの増加を示していない、図5bに示すように、
観察された効果でB2受容体の関与を示します。図5 D 2に示すように観察された効果でB1
受容体の関与を実証するカルシウム誘発性PEPDの侵入を阻止する、完全にブロックPEPD 2
-10の影響、DesArg9-Leu8-BKはブラジキニンB1受容体拮抗薬を追加する前に-10。
【０１１０】
B2は、B2のHOE140受容体のアンタゴニストをロックした後、カルシウムエントリポイン
トB2受容体活性に関するデータ（図5）、それがB1受容体の活性を示す（図5Cおよび図5D
）のアンタゴニストによって遮断することができますB1受容体DesArg9-Leu8-BK。それはP
EPD 2-10 PEPD 2-9に変換されている可能性があります。 B2アゴニストでアゴニストB1に
なることがあります。B2は2-10 PEPDアゴニスト（図5B）であるが、カルシウムチャネル
の結果を図5に示し、アゴニスト活性B1に起因しています。
【表９】
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【０１１１】
図5EはPepPL1-10秒100、10μMにおけるB1受容体拮抗薬DesArg9-Leu8-BKの存在下でのHU
VEC細胞培養物に追加されます：紙1-10の効果（配列番号7）を表示します。以前に10μM
の濃度で培養PepPl1-10で蛍光カルシウム指示薬フルオ-3で処理したHUVEC細胞に適用した
場合に起因する細胞質へのカルシウムの侵入への細胞の蛍光の増加を誘導します。これは
、約5分間持続し、細胞質カルシウムの増加に対応する蛍光の一過性の増加が観察されま
す。タプシガルギンは、その後細胞質へのカルシウム含有量のすべてを解放するために追
加され、これらの条件下で予想されうる最大蛍光の測定値を与えます。
【０１１２】
図5A：FU - 任意の蛍光単位; BK1μMブラジキニン; 10μMタプシガルギンTHG。
図5B：2-10 PEPD10μM; 10μMタプシガルギンTHG。
図5C：40鍬図5（B2受容体拮抗薬）10μM; PEPD2-1010μM。10μMタプシガルギンTHG。
図5D：DesArg9-Leu8-BK10μM; PEPD2-1010μM。10μMタプシガルギンTHG。
図5E：AXNが10選択したセルの平均信号です。PepPlは、胎盤由来増殖因子（;FSPSCVSLLR
配列番号7）の配列1-10あります。
【０１１３】
（参考文献一覧表）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2016528192.tif 000019
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2016528192.tif 000024
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