(57)【要約】【課題】本願発明は、５−クロロ−Ｎ−（｛（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソ−モルフォリン−４−イル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）チオフェン−２−カルボキサミド、すなわち、リバロキサバンのプロドラッグ、その調整プロセス、及び疾患、特に血栓塞栓症の治療及び予防における適用に関する。前記式（Ｂ）化合物であるプロドラッグは、化学的に５−クロロ−Ｎ−ホルミル−Ｎ−（｛（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソモルフォリン−４−イル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）チオフェン−２−カルボキサミドとして表わされる。【化１】2016504348.tif 000039
2016504348.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｂ）の化合物。
【化１】
2016504348.tif 000034
【請求項２】
請求項１に記載の式（Ｂ）化合物の調製方法であって、
ａ）式（ＶＩＩ）化合物を、適当な１又は複数の溶媒中で有機酸と処理をして、新規な式（Ａ）中間体であるＮ−（｛（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソモルフィリン−４−イル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）ホルムアミドを得ること、及び
【化２】
2016504348.tif 000035
ｂ）式（Ａ）化合物を、塩化メチレン、アセトン、トルエン及びエーテルからなる群から選択される適当な溶媒中又はそれらの混合物中で、塩基の存在下、式（ＶＩＩＩ）化合物又は５−クロロチオフェン−２−カルボニトリルと処理して、式（Ｂ）化合物を得ること、
を含み、
【化３】
2016504348.tif 000036
ここで、Ｙが、スルフォニルオキシ、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、アルコキシ、置換アルコキシ、トリハロメトキシ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸アミド、ヒドロキシ、エステル、一級アミン、二級アミン、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、塩素、フッ素、臭素及びヨウ素である、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の式（Ｂ）化合物の調製方法であって、
ａ）式（ＶＩＩ）化合物の酸付加塩を、適当な１又は複数の溶媒中に塩基と処理して、式（ＶＩＩ）化合物を得、これをさらに適当な１又は複数の溶媒中に有機酸と処理して、式（Ａ）の新規な中間体であるＮ−（｛（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソモルフォリン−４−イル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）ホルムアミドを得ること、及び
【化４】
2016504348.tif 000037
ここで、Ａは酸付加塩であり、
ｂ）式（Ａ）化合物を、塩化メチレン、アセトン、トルエン及びエーテルからなる群から選択される適当な溶媒中又はそれらの混合物中で塩基の存在下、式（ＶＩＩＩ）化合物又は５−クロロチオフェン−２−カルボニトリルと処理して、式（Ｂ）化合物を得ること、
を含み、
【化５】
2016504348.tif 000038
ここで、Ｙが、スルフォニルオキシ、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、アルコキシ、置換アルコキシ、トリハロメトキシ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸アミド、ヒドロキシ、エステル類、一級アミン、二級アミン、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシフタルアミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、塩素、フッ素、臭素及びヨウ素である、方法。
【請求項４】
前記有機酸が、ギ酸、シュウ酸及びコハク酸からなる群から選択される１又は複数のカルボン酸である、請求項２又は３に記載の式（Ｂ）化合物。
【請求項５】
洗浄、沈殿、濾過、乾燥及び蒸留の操作の１又は複数の操作の組み合わせにより精製される、請求項２〜４のいずれか１項に記載の式（Ｂ）化合物。
【請求項６】
適当な薬学的に許容可能な添加剤と組み合わせる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の式（Ｂ）化合物を含む医薬組成物。
【請求項７】
ヒト又は動物における血栓塞栓症の治療又は予防のための医薬に含まれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の式（Ｂ）化合物。
【請求項８】
抗凝固剤として用いられる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の式（Ｂ）化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、主に置換オキサゾリジノンのアルデヒド誘導体に関し、特に５−クロロ−Ｎ−（｛（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソモルフォリン−４−イル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）チオフェン−２−カルボキサミドのプロドラッグ、及び当該プロドラッグの調製方法に関する。式（Ｂ）のプロドラッグは、５−クロロ−Ｎ−ホルミル−Ｎ−（｛（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソモルフォリン−４−イル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）チオフェン−２−カルボキサミド、若しくはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物形態、又は水和物形態として表わされる。さらに本願発明は、肺血栓及び深部静脈血栓、特に血栓塞栓症のような疾患の治療及び予防におけるプロドラッグの使用に関する。
【０００２】
【化１】
2016504348.tif 000003
【背景技術】
【０００３】
多くの医薬が、その潜在的な活性成分と比較して改善された生物学的利用性（例えば、物理化学的プロファイル、特に溶解性、積極的又は消極的吸収特性、若しくは組織特異的分布の改善による）を示すプロドラッグとして投与される。効果の至適プロファイルを達成するためには、所望の放出機序と同様に前記プロドラッグ残基のデザインが、その個々の活性成分、その効能、その作用部位、及びその投与経路に非常に正確に適合することが必要である。その主な部分（moiety）が溶解性、安定性、及び経口の生物学的利用性の関係を高めるとき、そのプロドラッグの重要性はより大きくなる。
【０００４】
リバロキサバン（Rivaroxaban）は、様々な塞栓血栓症、特に、肺血栓、深部静脈血栓、心筋梗塞、狭心症、血管形成術又は大動脈冠動脈バイパス術後の再閉塞及び再狭窄、脳卒中、一過性虚血発作、並びに末梢動脈閉塞性疾患の予防及び治療に用いられる、経口で有効なＸａファクター（FXa）の直接阻害薬剤である。
【０００５】
リバロキサバン、すなわち、５−クロロ−Ｎ−（｛（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソモルフォリン−４−イル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）チオフェン−２−カルボキサミドは、ＣＡＳ番号３６６７８９−０２−８、分子式Ｃ１９Ｈ１８ＣｌＮ３Ｏ５Ｓ、及び次の構造を有する。
【０００６】
【化２】
2016504348.tif 000004
【０００７】
リバロキサバンは、様々な血栓塞栓疾患の予防及び治療に有効であるが、しばしば用量及び関連する生物学的利用性の問題を生じる。
ＷＯ０１／４７９１９出願は、様々な血栓塞栓疾患の予防及び治療のための適用を有するリバロキサバンを開示した。さらに、この特許は、式（Ｉ）のリバロキサバンの調製方法について記載している。ここで、４−（４−アミノフェニル）モルフォリン−３−オンを、溶媒の存在下で２−［（２Ｓ）−オキシラン−２−イルメチル］−１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオンと反応させて、２−［（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−｛［４−（３−オキソモルフォリン−４−イル）フェニル］アミノ｝プロピル］−１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオンを得た。これを、さらに、ホスゲン等価物により２−（｛（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソモルフォリン−４−イル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）−１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオンに変換した。フタルアミド（phthalamide）基を脱離して、４−｛４−［（５Ｓ）−５−（アミノメチル）−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−イル］フェニル｝モルフォリン−３−オンを得、最後にこれを塩化５−クロロチオフェン−２−カルボニルと縮合して、５−クロロ−Ｎ−（｛（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソモルフォリン−４−イル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）チオフェン−２−カルボキサミド、すなわち、スキーム−Ｉにおいて式（Ｉ）で示されるリバロキサバンを得た。
【０００８】
【化３】
2016504348.tif 000005
【０００９】
上記開示のプロセスは、長い反応期間、過剰モルの反応物及び試薬、メタノール及び塩化メチレンのような安全でない溶媒の使用を含む。さらに、表題化合物は、商業スケールで容易ではないカラムクロマトグラフィーにより単離される。
【００１０】
米国特許第７，９３２，２７８号公報は、下記合成スキームによる化合物リバロキサバンの調製を開示する。
【００１１】
【化４】
2016504348.tif 000006
【００１２】
本願発明に記載の化合物は、ヒト及び動物における疾患の治療及び／又は予防のための医薬としての使用に好適である。
【００１３】
ＷＯ２００９／０２３２３３は、置換オキサゾリジノン誘導体及びその薬学的に許容可能な塩である化合物を開示する。特に、本願発明は、リバロキサバンの誘導体である新規なオキサゾリジノン化合物に関する。また、本願発明は、本願発明の１又は複数の化合物及び担体を含む発熱物質フリーな組成物、並びに疾患の治療法における開示化合物及び組成物の使用、及びリバロキサバンのようなＸａ因子の選択的な阻害剤を投与することにより有益に治療される条件を提供する。
【００１４】
本願発明は、リバロキサバンのプロドラッグに関する。本願発明に記載の化合物は、特に抗凝固剤として作用する、血液凝固Ｘａ因子（blood coagulation factor Xa）の選択的な阻害剤である。この阻害剤は、特に、好ましい物理化学的特徴をもち、例えば、血栓塞栓症の治療、Ｘａ因子の阻害剤及び／又は血栓塞栓性合併症、の治療上の適用において有利である。
【発明の概要】
【００１５】
主要な側面において、本願発明は、化学的に５−クロロ−Ｎ−ホルミル−Ｎ−（｛（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソモルフォリン−４−イル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）チオフェン−２−カルボキサミドとしてデザインされる、式（Ｂ）の化合物を開示する。
【００１６】
もう一つの側面において、本願発明は、血栓塞栓症のような疾患の予防及び／又は治療、Ｘａ因子の阻害剤、及び／又は血栓塞栓性の合併症のための、式（Ｂ）の化合物の使用について開示する。前記「血栓塞栓症」は、本願発明の文脈において、ＳＴ上昇を有する心筋梗塞（ＳＴＥＭＩ）、ＳＴ上昇を有さない心筋梗塞（非ＳＴＥＭＩ）、安定狭心症、不安定狭心症、血管形成術又は冠状動脈バイパス術のような冠動脈の処置に続く再閉塞及び再狭窄、末梢動脈閉塞疾患、肺栓塞、深部静脈血栓及び腎静脈血栓、一過性虚血発作、並びに血栓性及び血栓塞栓性の発作のような疾患を含む。
【００１７】
さらにもう一つの側面において、本願発明は、例えば、心房細動のような急性、一時的、又は持続性の心臓不整脈を有する患者及び電気的除細動（cardioversion）を発症する患者、また、心臓弁の疾患又は人工心臓弁をもつ患者における、例えば、脳の虚血及び発作並びに全身の血栓塞栓症及び虚血のような、心原性の血栓塞栓症の予防及び治療のための化合物（Ｂ）の使用について開示する。
【００１８】
本願発明のもう１つの側面は、実質的に不純物を含まない式（Ｂ）化合物の調製プロセスを提供することである。
【００１９】
さらに、本願発明のもう１つの側面は、結晶形態の又はアモルファス形態の式（Ｂ）化合物を提供することである。
【００２０】
さらに、もう１つの側面において、本願発明は、式（Ｂ）化合物の薬学的に許容される塩、水和物形態、又は溶媒和物形態の式（Ｂ）の化合物を開示する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
その主な態様において、本願発明は、以下の構造を有し、５−クロロ−Ｎ−ホルミル−Ｎ−（｛（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソモルフォリン−４−イル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）チオフェン−２−カルボキサミドとして化学的にデザインされる、式（Ｂ）化合物を含む。
【００２２】
【化５】
2016504348.tif 000007
【００２３】
または、次の構造を有する、５−クロロ−Ｎ−（｛（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソモルフォリン−４−イル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）チオフェン−２−カルボキサミドとして化学的にデザインされる式（Ｉ）化合物のプロドラッグとして働くその薬学的に許容される塩、溶媒和形態、又は水和物形態を含む。
【００２４】
【化６】
2016504348.tif 000008
【００２５】
用語「プロドラッグ」は、薬学的に活性又は不活性であり得る化合物を含むが、経口摂取されて、生体により酵素的に又は加水分解的に、その活性化合物に変換される。本願発明は、これらの関連事項に関する。インビトロ（in vitro）又はインビボ（in vitro）の動物における研究で開示される、式（Ｂ）化合物は、実施例で明示的に示されるように、優れた溶解性と安定性を示し、それゆえに臨床試験の契機になる。
【００２６】
式（Ｂ）の本願化合物は、立体異性体（エナンチオマー、ジアステレオマー）の形態で存在する。したがって、本願発明は、そのエナンチオマー又はジアステレオマー、及びそれらのそれぞれの混合物を含む。そのようなエナンチオマー及び／又はジアステレオマーの混合物から、既知の様式で立体異性的に統一された形態を単離することができる。本願発明に記載の化合物が互変異生体の形態で存在できるならば、本願発明は全ての互変異生体の形態を含む。
【００２７】
本願発明において、本願発明化合物（式（Ｂ）化合物）の溶解性、安定性、及び放出挙動に関する詳細な研究が実施された。さらに、式（Ｂ）化合物について、インビトロ及びインビボの研究が、例えば、インビトロ肝臓ミクロソーム安定性アッセイ、ラット、マウス及びヒト血漿におけるインビトロ安定性、ＣＹＰ阻害アッセイ、ウィスター系ラットにおける静脈内投与及び経口投与における血漿タンパク結合、静脈内投与用の懸濁液及び経口投与用の溶液、抗凝固活性及び抗血栓活性のように、選択的活性を確立するために実施された。これらの研究は、実施例の項／実施例（Ｂ）において、ベストモードにより十分に具体化され、説明されている。
【００２８】
１つの重要な態様において、本願発明は、下記を含む、式（Ｂ）化合物の調製のためのプロセスを提供する。
ａ）式（ＩＩ）の４−（４−アミノフェニル）モルフォリン−３−オンを、式（ＩＩＩ）の２−［（２Ｓ）−オキシラン−２−イルメチル］−１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオンと、適当な溶媒中で反応し、式（ＩＶ）の２−［（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−｛［４−（３−オキソモルフォリン−４−イル）フェニル］アミノ｝プロピル］−１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオンを得ること。
【００２９】
【化７】
2016504348.tif 000009
【００３０】
ｂ）式（ＩＶ）の化合物を、式（Ｖ）のジ−１Ｈ−イミダゾール−１−イルメタノンと反応させることにより、式（ＶＩ）の化合物を調製すること。
【００３１】
【化８】
2016504348.tif 000010
【００３２】
選択的に、適当な溶媒中で、式（ＩＶ）の化合物を塩基の存在下、式（ＶＩ）の化合物に変換すること。
【００３３】
【化９】
2016504348.tif 000011
【００３４】
ｃ）適当な溶媒中で適当な脱保護剤及び酸を用いて、式（ＶＩ）の化合物からフタルアミド基を脱離して、式（ＶＩＩ）の４−｛４−［（５Ｓ）−５−（アミノメチル）−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−イル］フェニル｝モルフォリン−３−オンの酸付加塩を得ること。
【００３５】
【化１０】
2016504348.tif 000012
【００３６】
Ａが酸付加塩の場合、選択的に、式（ＶＩＩ）の化合物は遊離塩基として単離することもできる。式（ＶＩＩ）の化合物の合成は、酸付加塩としても遊離塩基としても既知であり、したがってクレームされていない。式（ＶＩＩ）の化合物は如何なる既知の方法によっても調整することができる。
【００３７】
ｄ）酸付加塩の式ＶＩＩの化合物は、塩基存在下に酸と反応させて、式（Ａ）の新規中間体であるＮ−（｛（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソモルフォリン−４−イル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）ホルムアミドを得る。
【００３８】
【化１１】
2016504348.tif 000013
【００３９】
選択的に、式（ＶＩＩ）の化合物が遊離塩基の場合、酸と直接反応して、式（Ａ）の新規中間体であるＮ−（｛（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソモルフォリン−４−イル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）ホルムアミドを与える。
【００４０】
ｅ）式（ＶＩＩＩ）の化合物を、適当な溶媒及び塩基中で、任意に触媒及び／又は活性化剤の存在下、式（ＶＩＩＩ）又は５−クロロチオフェン−２−カルボニトリルと反応させて、式（Ｂ）化合物を得ること。
【００４１】
【化１２】
2016504348.tif 000014
【００４２】
ここで、Ｙは、スルフォニルオキシ、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、アルコキシ、置換アルコキシ、トリハロメトキシ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸アミド、ヒドロキシ、エステル、一級アミン、二級アミン  ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシフタルアミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、塩素、フッ素、臭素、及びヨウ素であり得る。用いる塩基は、無機又は有機塩基であり得る。
【００４３】
式（Ｂ）化合物は、式（Ｉ）の構造をもち、リバロキサバンとして広範に知られた式（Ｉ）化合物のプロドラッグである。
【００４４】
【化１３】
2016504348.tif 000015
【００４５】
式（Ｂ）化合物のアルデヒド基が、酸又は塩基環境にさらされて脱離する場合、活性部分であるリバロキサバンに変換される。したがって、式（Ｂ）化合物が適当な溶媒中で酸又は塩基で処理されると、式（Ｂ）化合物からアルデヒド基が脱離して、式（Ｉ）の表題化合物であるリバロキサバンを得る。
【００４６】
【化１４】
2016504348.tif 000016
【００４７】
さらに本願発明は、酸−塩基処理又は溶媒結晶化による追加の如何なる精製もせずに精製された化合物を得るため、式（ＶＩＩ）化合物の酸付加塩の調製に関する。
【００４８】
工程（ａ）及び（ｃ）で使用される溶媒は同一でも異なってもよい。ここで、前記溶媒は、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、ジアルキルホルムアミド、エーテル類、冠状エーテル、置換冠状エーテル、アルコール類、ケトン類、ジアルキルスルホキサイド、ジアルキルアセタミド、ニトリル、イオン化液体、ハロゲン化脂肪族炭化水素、及び水を含む群から選択される有機溶媒、又はそれらの混合物であるが、より好ましくは反応物にとって中性の溶媒である。
【００４９】
前記工程（ａ）は、０℃から９５℃の範囲の温度で行うことができる。通常、前記反応は前記溶媒の還流温度までの温度で行うことができる。
【００５０】
式（ＶＩ）化合物の調製のために工程（ｂ）で用いられる溶媒は、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、ジアルキルホルムアミド、エーテル類、冠状エーテル、置換冠状エーテル、ケトン類、ジアルキルスルホキサイド、ジアルキルアセタミド、ニトリル類、イオン化液体、ハロゲン化脂肪族炭化水素を含む群から選択される有機溶媒、又はそれらの混合物である。
【００５１】
工程（ｃ）で用いられる溶媒は、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、ジアルキルホルムアミド、エーテル類、冠状エーテル、置換冠状エーテル、ジアルキルスルホキサイド、ジアルキルアセタミド、ニトリル類、イオン化液体、ハロゲン化脂肪族炭化水素、及び水を含む群から選択される有機溶媒、又はそれらの混合物である。さらに、式（ＶＩＩ）の化合物は、無機又は有機酸を用いることにより酸付加塩として調製することができる。
【００５２】
工程（ｄ）において、式（ＶＩＩ）の化合物は、遊離塩基形態又はその酸付加塩で用いることができる。工程（ｄ）で用いられる溶媒は有機溶媒であり、混合物又は水及び有機溶媒であり得る。工程（ｄ）で用いられるホルミル化剤はギ酸、ギ酸アルキルなどであり得る。当該反応で用いられる溶媒は、芳香族炭化水素、ニトリル類、脂肪族炭化水素、エーテル類であり、好ましくは芳香族炭化水素、より好ましくはトルエン及びキシレンである。工程（ｄ）で用いられる塩基は、有機又は無機の塩基から選択される。
【００５３】
工程（ｅ）において、式（Ａ）の化合物は、式（ＶＩＩＩ）化合物と、任意に、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、ジアルキルホルムアミド、エーテル類、環状エーテル、置換冠状エーテル、ジアルキルスルホキサイド、ジアルキルアセタミド、ニトリル類、イオン化液体、エーテル類、ハロゲン化脂肪族炭化水素、ケトン、環状アミド、及び水を含む群から選択される有機溶媒、又はそれらの混合物中で、無機又は有機であり得る塩基の存在下で処理され、式（Ｂ）のリバロキサバン前駆体を得る。工程（ｅ）の反応で用いられる活性化剤には、ＣＤＩ、ＤＣＣ、ＨＯＢｔ、ＤＭＡＰ、ＥＤＣＩ、ホウ酸（boric acid）、ボロン酸（boronic acid）、ボロン酸フェニル（phenyl boronic acid）など、及びそれらの混合物が含まれる。
【００５４】
さらに、もう1つの態様にしたがって、本願発明は式（Ｂ）の化合物の調製法を提供する。本調製法は、式（Ａ）の化合物を式（ＶＩＩＩ）の化合物と反応させて式（Ｂ）の化合物を得ることを含む。
【００５５】
【化１５】
2016504348.tif 000017
【００５６】
【化１６】
2016504348.tif 000018
【００５７】
【化１７】
2016504348.tif 000019
【００５８】
ここで、式（ＶＩＩＩ）において、Ｙは、スルフォニルオキシ、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、アルコキシ、置換アルコキシ、トリハロメトキシ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸アミド、ヒドロキシ、エステル、一級アミン、二級アミンｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシフタルアミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、塩素、フッ素、臭素及びヨウ素であり得る。用いられる塩基は無機又は有機であり得る。
【００５９】
前記反応に用いる溶媒は、式（Ｂ）のリバロキサバン前駆体を得るために、無機でも有機でもよく、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、ジアルキルホルムアミド、エーテル類、環状エーテル、置換環状エーテル、ジアルキルスルフォキシド、ジアルキルアセタミド、ニトリル類、イオン性液体、エステル類、ハロゲン化脂肪族炭化水素、ケトン類、環状アミド及び水からなる群から選択される溶媒中又はこれらの混合物中で行うことができる。本反応で使用される活性化剤は、ＣＤＩ、ＤＣＣ、ＨＯＢｔ、ＤＭＡＰ、ＥＤＣＩ、ホウ酸、ボロン酸、フェニルボロン酸等、及びこれらの混合物を含む。使用される塩基は、有機又は無機の塩基から選択され、任意に、式（Ｂ）化合物は次の反応のために精製することもでき、そのまま用いることもできる。
【００６０】
本願発明のさらにもう１つの態様にしたがって、遊離塩基又は酸の付加塩である式（ＶＩＩ）化合物のラセミ体は酵素平衡分離法（enzymatic kinetic resolution）を用いて行うことができる。
【００６１】
【化１８】
2016504348.tif 000020
【００６２】
ここで、Ａは酸付加塩であり、酸は無機又は有機酸であり得る。
【００６３】
本願発明のさらにもう１つの態様にしたがって、式（Ｉ）のリバロキサバンを得るために、前述の工程で使用される塩基は無機又は有機であり、溶媒は、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、ジアルキルホルムアミド、エーテル類、環状エーテル、置換環状エーテル、ジアルキルスルフォキシド、ジアルキルアセタミド、ニトリル類、イオン性液体、エステル類、ハロゲン化脂肪族炭化水素、ケトン類、環状アミド類及び水からなる群から選択され、又はこれらの混合物である。本反応で用いられる活性化剤は、ＣＤＩ、ＤＣＣ、ＨＯＢｔ、ＤＭＡＰ、ＥＤＣＩ、ホウ酸、ボロン酸、フェニルボロン酸等、及びこれらの混合物を含む。
【００６４】
本発明で用いられるように、用語「水和物（hydrate）」は、非共有結合の分子内力により結合する化学平衡的又は非化学平衡的な量の水をさらに含む化合物を意味する。本発明で用いられるように、用語「溶媒和物（solvate）」は、非共有結合の分子内力により結合する化学平衡的又は非化学平衡的な量の、例えば、水、アセトン、エタノール、メタノール、ジクロロメタン、２−プロパノールなどの溶媒をさらに含む化合物を意味する。
【００６５】
本願発明は以下に示す実施例に記述され、さらに、これらの実施例は本願発明をただ説明するために提供され、したがって、本願発明の範囲を限定するように理解されるべきではない。
【００６６】
実施例Ａ
略字及び頭字語
ＬＣ−ＭＳ：      連結された液体クロマトグラフィー／質量分析器
ＨＰＬＣ：        高速液体クロマトグラフィー
ＬＬＱＱ：        定量の下限（Lower limit of quantification）
ＳＤ：            標準偏差
ＡＵＣ：          曲線下の面積
ＤＭＳＯ：        ジメチルスルホキサイド
ＮＡＤＰＨ：      ニコチンアミド  アデニン  ジヌクレオチドリン酸
ＣＹＰ：          チトクロム
ＢＬＯＱ：        定量の下限（below limit of quantification）
ＳＩＦ：          人工腸液
ＳＧＦ：          人工胃液
ＣＶ：            濃度値 
Ｃｍａｘ：        最大濃度 
【００６７】
詳細な説明における下記の実施態様は、本願発明を説明するものであるが、操作をともなうこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６８】
実施例１
Ｎ−（｛（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソモルフォリン−４−イル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）フォルムアミド（一級アミンのアルデヒド）の調製；
４口丸底フラスコに、４−｛４−［（５Ｓ）−５−（アミノメチル）−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−イル］フェニル｝モルフォリン−３−オンの遊離塩基（５０ｇ）、トルエン（３５０ｍＬ）及びギ酸（２１．６３ｇ）を入れた。次に、反応物をディーン・スターク装置（dean-stark apparatus）を用いて１１０〜１２０℃まで３〜４時間、共沸加熱した（共沸で水を除去）。反応物を２５〜３０℃に冷却した。得られた個体を濾過し、トルエンで洗浄した。収率９６％。
【００６９】
実施例２
５−クロロ−Ｎ−ホルミル−Ｎ−（｛（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソモルフォリン−４−イル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）チオフェン−２−カルボキサミド（式（Ｂ）化合物）の調製
Ｎ−（｛（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソモルフォリン−４−イル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）ホルムアミド（１ｇ）、ジクロロメタン（２５ｍＬ）を洗浄乾燥した２５〜３０℃の４口丸底フラスコにとった。この澄明な溶液に、炭酸カリウム（０．８９ｇ）を加え、２５〜３０℃で３０分間撹拌した。この反応物に、塩化５−クロロチオフェン−２−カルボニル（１．０ｇ）及びジクロロメタン（５ｍＬ）の溶液を徐々に加えた。次に、得られた反応物を２５〜３０℃で５〜６時間撹拌した。反応物に水（２５ｍＬ）を加え、有機層を分離した。次に、得られた有機層を水で（２５ｍＬ×２）洗浄した。最後に、有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下濃縮して残渣を得た。この残渣にメタノール（５ｍＬ）を加えて、加熱還流し、澄明な溶液を得た。この得られて澄明な溶液を１５〜２０℃まで徐々に冷却した。次に、析出した個体を濾過し、冷やしたメタノール（１ｍＬ）で洗浄した。
【００７０】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００Ｍｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ），δ＝３．７４−３．７７（ｍ，２Ｈ）， ３．８４−３．８７（ｍ，１Ｈ），４．０２−４．０５（ｍ，２Ｈ），４．０７−４．１１（ｍ，２Ｈ），４．１２−４．１５（ｍ，１Ｈ），４．３４−４．４１（ｍ，３Ｈ），４．９４−５．００（ｍ，１Ｈ），７．００−７．０１（ｄ，１Ｈ：チオフェン），７．３０−７．３１（ｄ，１Ｈ：チオフェン），７．３３−７．３７（ｄｔ，２Ｈ：芳香環），７．５５−７．５８（ｄｔ，２Ｈ：芳香環），９．２８（ｓ，１Ｈ：アルデヒド）
【００７１】
本実施例２を、アセトン、トルエン及びエーテルのような異なる溶媒中において、下記に示す収率で変動する同一のモル比／部を用いて、実施した。
【００７２】
【表１】
2016504348.tif 000021
【００７３】
実施例３
５−クロロ−Ｎ−（｛（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソモルフォリン−４−イル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）チオフェン−２−カルボキサミドの調製（ニトリル経路）
４−｛４−［（５Ｓ）−５−（アミノエチル）−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−イル］フェニル｝モルフォリン−３−オン  塩酸塩（５．７ｇ）のエタノール（７０ｍＬ）溶液に、炭酸カリウム（７．１ｇ）を加え、この混合物を２５〜３０℃で２時間撹拌し、次に濾過して４−｛４−［（５Ｓ）−５−（アミノメチル）−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−イル］フェニル｝モルフォリン−３−オン（遊離塩基）を得た。もう１つのフラスコに、窒素雰囲気下、エタノール−塩酸（１２ｍＬ）中に５−クロロチオフェン−２−カルボニトリル（２．９ｇ）を加え、白色析出物が得られるまで室温で５時間撹拌した。湿気を避けるために窒素雰囲気下で蒸留し、得られた残渣を４−｛４−［（５Ｓ）−５−（アミノメチル）−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−イル］フェニル｝モルフォリン−３−オンの溶液に加えた。この混合物を、還流温度で１６〜１８時間撹拌した。水性エタノール（５ｍＬ）を加え、混合物を還流温度で１０〜１２時間加熱し、５−クロロ−Ｎ−（｛（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソモルフォリン−４−イル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）チオフェン−２−カルボキサミド（粗製物）を得、これをさらにカラムクロマトグラフィーで精製した。
【００７４】
実施例４
Ｎ−（｛（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソモルフォリン−４−イル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）ホルムアミドの調製
４口丸底フラスコに、４−｛４−［（５Ｓ）−５−（アミノメチル）−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−イル］フェニル｝モルフォリン−３−オン  塩酸塩（２５０ｇ）、ジクロロメタン（１２５０ｍＬ）及びアンモニア（２５０ｍＬ）を入れた。この溶液を１５分撹拌し、層分離した。有機層に、水（５００ｍＬ）及びギ酸（１４０．６ｇ）とともに、トルエン（１２５０ｍＬ）を加えた。次に、反応物をディーン・スターク装置を用いて、１１０〜１２０℃まで３〜４時間、共沸加熱した（水を共沸で除いた）。反応物を２５〜３０℃に冷却した。次に、得られた個体を濾過し、トルエンで洗浄した。収率＝８０．０％。
【００７５】
実施例５
５−クロロ−Ｎ−ホルミル−Ｎ−（｛（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソモルフォリン−４−イル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）チオフェン−２−カルボキサミドの調製
Ｎ−（｛（５Ｓ）−２−オキソ−３−［４−（３−オキソモルフォリン−４−イル）フェニル］−１，３−オキサゾリジン−５−イル｝メチル）ホルムアミド（１２０ｇ）、ジクロロメタン （２４００ｍＬ）を２５〜３０℃の洗浄乾燥した４口丸底フラスコにとり、反応物を０〜５℃に冷却した。この溶液にジイソプロピルエチルアミン（１４５．７ｇ）を滴下して加え、０〜５℃の塩化５−クロロチオフェン−２−カルボニル（１７０ｇ）及びジクロロメタン（２４０ｍＬ）の溶液を加えた。次に、得られた反応物を２５〜３０℃で撹拌し、１２時間加熱還流した。この反応物を２５〜３０℃に冷却し、１０％クエン酸溶液（２×３６０ｍＬ）で洗浄し、有機層を分離した。次に、得られた有機層を水（６００ｍＬ×２）で洗浄し、減圧下で濃縮し、残渣を得た。残渣にメタノール（６００ｍＬ）を加え、２０分間撹拌した。次に、析出した個体を濾過し、メタノール（２４０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し及び湿ったケーキ状物をメタノール（６００ｍＬ）を入れたフラスコに吸い込み、次に、この溶液を３０分間撹拌し、次に個体を濾過し、メタノール（２４０ｍＬ）で洗浄した。収率＝８５．０％
【００７６】
実施例Ｂ
式Ｂ化合物のＳＣＧ及びＳＩＦ液体における安定性の測定
式（Ｂ）化合物をＤＭＳＯに溶解し、次にメタノール−水（９０：１０）で希釈した。様々なｐＨの緩衝液及びＳＩＦ／ＳＣＧ溶媒（medium）における安定性を検討した。
【００７７】
式（Ｂ）化合物５．７ｍｇを２ｍＬのＨＰＬＣバイアルに量りとり、０．２５０ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。式（Ｂ）化合物溶液２μＬをそれぞれ２５０μＬの緩衝溶液に加え、インキュベーター振盪機に２４時間室温で維持した。インキュベーションし時間の完了時に、この溶液を遠心分離し、上清を採取した。この上清にＩＳを含む冷アセトニトリルを加え、振盪し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに注入した。
【００７８】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法：
ＡＰＩ４０００、ＥＳＩ  アジレント  １１００カラム：ジェミニ  Ｎｘ１００ｍｍ×４．６ｍｍ  ５μ；カラム温度：３０℃；溶出液Ａ：０．１％ギ酸水溶液、溶出液Ｂ：アセトニトリル；グラジエント：０−２．５分  ９５％Ａ、５％Ｂ；２．５−２．６分  ５％Ａ、９５％Ｂ；２．６−４．２分  ９５％Ａ、５％Ｂ；流速：０．８ｍＬ／分；ＥＳＩ．Ｑ１：４６４．０９８、Ｑ３：１４４．２５５
【００７９】
これらの溶液における実施例の化合物の分解をｐＨ７．４及びｐＨ７．８で観察した。
【００８０】
用いた溶液：
０．１モルのクエン酸及び０．２モルのリン酸水素二ナトリウムの水溶液を調製した。ｐＨ２．２、及び７．８の緩衝液を、クエン酸及びリン酸水素二ナトリウムを用い、ｐＨを０．１Ｎ塩酸又は１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ調整することにより調製した。ｐＨ７．４：リン酸水素二ナトリウム８．８９ｇ（水溶液Ａ）を水１Ｌに加え、リン酸二水素ナトリウム１．５６０１ｇ（水溶液Ｂ）を水で１Ｌとした。水溶液Ａ（１９ｍＬ）と水溶液Ｂ（８１ｍＬ）を混合した。
ＳＩＦ／ＳＣＧ：ＳＩＦオリジナル粉末（バイオ関連媒体）をミリＱ水１Ｌに溶解した。本溶液のｐＨを、０．１Ｎ塩酸で、ＳＩＦ（７．４）及びＳＣＧ（２．２）に調整した。開始時間におけるピーク面積に対する各時間点におけるピーク面積の比（Ｆ）を算出した。これらの人工ＳＩＦ及びＳＣＧの検討サンプルにおいて、０分に比べた腸及び胃のｐＨ条件の異なる様々な時間点において未変化のまま残留する化合物の程度を観察するために、式（Ｂ）化合物の人口液安定性を評価した。本ピーク面積（Ｆ）は、ＬＣ−ＭＳ法により定量される試験化合物量に直接相関する。
【００８１】
人口腸及び胃液において、式（Ｂ）化合物の面積を０分から１２０分の面積と比較した。本化合物の面積は１２０分を超えても同じように、腸の条件における安定性を示し、同様の結果が人工胃の条件でも観察された。
【００８２】
ｐＨ２．２及び７．４における緩衝液安定性
ｐＨ２．２、４及び７．８のｐＨ条件を変動させるこの緩衝液安定性において、様々なｐＨ条件における式（Ｂ）化合物の安定性を、０分又は１点検量の純粋な水性標準（single point calibration neat aqueous standard）と比べた特定の時間点における未変化のままの化合物量を観察するために評価した。これらｐＨ７．４及び２．２のｐＨ条件において、ＬＣ−ＭＳにより測定されるリバロキサバンの生成が認められる。これらのｐＨ条件において分解やリバロキサバンへの変換が認められるが、ｐＨ２．２及び４．０において観察される式（Ｂ）化合物の存在が認められる。
【００８３】
興味あることに、ＬＣ−ＭＳにより測定されるリバロキサバンの変換が認められた。これにより、式（Ｂ）化合物は様々なｐＨの緩衝液条件で分解し、リバロキサバンの生成が観察されることが証明される。ｐＨ緩衝液においてｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件でリバロキサバンへの変換が認められ、これは、ラットにおけるｉｎ  ｖｏｖｏ薬物動態研究における証拠により支持される、ｉｎ  ｖｏｖｏ条件における変換（translating）としても観察される。また、リバロキサバンへの変換は、マウス、ラット及びヒトにおけるミクロソーム及び血漿安定性による代謝安定性研究のような様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて見出される。
【００８４】
このアッセイでは、様々なｐＨ条件において、試験物質（式（Ｂ）化合物）と同様に、リバロキサバンの生成が認められた。しかしながら、式（Ｂ）試験化合物は人工腸の条件において安定である。様々なｐＨ条件における式（Ｂ）化合物の安定性比較のプロットが、表１、２及び３に十分に示されている。
【００８５】
【表２】
2016504348.tif 000022
【００８６】
【表３】
2016504348.tif 000023
【００８７】
【表４】
2016504348.tif 000024
【００８８】
備考（表１、２及び３）
このアッセイでは、様々なｐＨ条件において、試験物質（式（Ｂ）化合物）と同様に、リバロキサバンの生成が認められた。しかしながら、式（Ｂ）試験化合物は人工腸の条件において安定である。様々なｐＨ条件における式（Ｂ）化合物の安定性比較のプロットが、表１、２及び３に十分に示されている。
【００８９】
２．ラット、マウス及びヒト血漿におけるインビトロ（in vitro）安定性（ＬＣ−ＭＳ検出）
式（Ｂ）化合物１ｍｇを１．５エッペンチューブ（microfuge tube）に量りとり、ＤＭＳＯに溶解した。本アッセイにおける試験化合物の最終濃度は５μモルであった。式（Ｂ）化合物をラット、ヒト又はマウス血漿に加え、３７℃でインキュベートした。時間点における１００μＬ分を取り出し、ＩＳ（２００ｍｕ．Ｌ）を含む氷冷アセトニトリルで希釈して反応を停止させた。サンプルは１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、タンパク質を析出させた。上清をエッペンチューブ（micro centrifuge tubes）に移し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析のため−２０℃で保存した。試験物質の残存未変化体率を、０分におけるピーク面積に対する各時間点におけるピーク面積の比として計算し、これに１００を乗じた。式（Ｂ）化合物はリバロキサバンに変換されたことが観察された。
【００９０】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法：
ＡＰＩ  ４０００、ＥＳＩ  アジレント１１００カラム：ジェミニＮｘ１００ｍｍ×４．６ｍｍ  ５．μ；カラム温度：３０℃；溶出液Ａ：０．１％ギ酸水溶液、溶出液Ｂ：アセトニトリル；グラジエント：０−２．５分  ９５％Ａ、５％Ｂ；２．５−２．６分  ５％Ａ、９５％Ｂ；２．６−４．２分  ９５％Ａ、５％Ｂ；流速：０．８ｍＬ／分；ＥＳＩ．Ｑ１：４６４．０９８、Ｑ３：１４４．２５５
【００９１】
備考（表４）
表４は、式（Ｂ）の試験化合物及びリバロキサバンのヒト、ラット及びマウスにおける血漿安定性を示す。
【００９２】
【表５】
2016504348.tif 000025
【００９３】
備考（表４）
表４は、式（Ｂ）化合物ラット、マウス及びヒトの血漿マトリクスにおける安定性を示す。本実験は、式（Ｂ）化合物のリバロキサバンへの変換がマウス、ラット及びヒトの血漿マトリクスで生じるか否かを観察すると同様に、式（Ｂ）化合物の安定性を測定するために、実施された。リバロキサバンへの急速な変換が、３種全てを用いて実施した実験で観察された。
【００９４】
表４は、式（Ｂ）化合物のラット、マウス及びヒトの血漿マトリクスにおける安定性を示す。本実験は、式（Ｂ）化合物のリバロキサバンへの変換がマウス、ラット及びヒトの血漿マトリクスで生じるか否かを観察すると同様に、式（Ｂ）化合物の安定性を測定するために、実施された。リバロキサバンへの急速な変換が、３種全てを用いて実施した実験で観察された。式（Ｂ）化合物の無視できる量がインビトロ血漿安定性試験で観察され、リバロキサバンへの急速な変換が、被検種からの血漿サンプルを用いてインビトロ条件において観察された。
【００９５】
ＣＹＰ阻害アッセイ
ヒトにおいてＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｊ２及びＣＹＰ３Ａ４を阻害する物質の性能を、ＣＹＰアイソフォーム特異的代謝物を生成する標準基質（下記参照）の存在下で、酵素源としてのプールしたヒト肝臓ミクロソームを用いて検討した。阻害効果は、式（Ｂ）化合物の非存在下において標準物質のＣＹＰアイソフォーム特異的代謝物の生成量と比較した、８種の異なる濃度の試験化合物（０．００１、０．０１、０．１、０．３、１、３、１０μＭ）を用いて検討し、対応するＩＣ５０値を算出した。ＣＹＰアイソフォームを特異的に阻害する標準阻害剤は、得られた結果のコントロールとして役立つ。
【００９６】
操作：
各検討として、８種の異なる濃度の式（Ｂ）化合物（潜在的な阻害剤である）の存在下に、ヒト肝臓ミクロソームとともにフェナセチン、ジクロフェナック、デキストロメトルファン、メフェノトイン（mephenotoin）、アルベンダゾール（albendazole）及びテストステロンとのインキュベーションを３７℃のインキュベーターで行った。標準インキュベーション混合物には、全体で２００μＬの容量に１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中のＮＡＤＰＨ及び基質が含まれる。試験化合物をアセトニトリルに溶解した。３７℃で一定時間、プールされたヒト肝臓ミクロソームとインキュベートした。この反応は、適当な内部標準が常に含まれる１００μＬのアセトニトリルを添加することにより停止させた。析出したタンパク質を遠心分離で除去し、上清をＬＣ−ＭＳにより分析した。このデータは、３μＭから外挿されたＩＣ５０（μＭ）濃度を示す。
【００９７】
【表６】
2016504348.tif 000026
【００９８】
表５において、プローブ基質法（probe substrate method）を用いたＣＹＰ阻害研究を、異なるＣＹＰアイソフォームを阻害するのに必要な濃度を測定するために実行した。これは、薬物−薬物相互作用を評価するための本質的なパラメータである。式（Ｂ）化合物は、アッセイされるＣＹＰアイソフォーム（＞１μＭ）の最小阻害を示した。
【００９９】
３．インビトロ（in vitro）肝臓ミクロソーム安定性アッセイ
肝臓ミクロソーム安定性アッセイは、リン酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．４）中のＮＡＤＰＨを用いて、肝臓ミクロソームタンパク質１ｍｇ／ｍＬで行った。試験化合物（本願発明の式（Ｂ）化合物）を２０％メタノール−水の溶液として調製し、アッセイ混合物（最終アッセイ濃度１μＭ）へ添加し、３７℃でインキュベートした。０、１５及び３０分の時点で一定量（１００μＬ）を採取し、ＩＳ（ｍｕ．Ｌ）を含む氷冷アセトニトリルで希釈して反応を停止させた。サンプルを１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、タンパク質を析出させた。上清をエッペンチューブに移し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析のために−２０℃で保存した。試験物質の残存未変化体％を、０分におけるピーク面積に対する各時間点におけるピーク面積の比として計算し、これに１００を乗じた。式（Ｂ）化合物は、ミクロソームアッセイでリバロキサバンに変換された。
【０１００】
表６
試験化合物（式（Ｂ））及びリバロキサバンのヒト、ラット及びマウスにおけるミクロソーム安定性を示す。
【０１０１】
【表７】
2016504348.tif 000027
【０１０２】
備考（表６）
表６に示されたデータにより、式（Ｂ）化合物は、ラット、マウス及びヒトにおいて、種を超えて急速に代謝された。このＬＣ−ＭＳによるミクロソーム安定性実験で、リバロキサバンへの急速な変換が観察された。また、生成されたリバロキサバンは、種を超えてミクロソーム実験で代謝されることが観察された。
【０１０３】
表６に示されたデータにより、式（Ｂ）化合物は、ラット、マウス及びヒトにおいて、種を超えて急速に代謝された。このＬＣ−ＭＳによるミクロソーム安定性実験で、リバロキサバンへの急速な変換が観察された。また、生成されたリバロキサバンは、種を超えてミクロソーム実験で代謝されることが観察された。
【０１０４】
４．血漿蛋白結合の測定
本願発明にしたがって、１つの化合物溶液（１ｍＭのＤＭＳＯ溶液）を、ラット、ヒト又はマウスそれぞれの血漿マトリクスに添加した。
透析ウェル（dialysis well）の受け入れ側にリン酸緩衝液１５０μＬを加えた。式（Ｂ）化合物５μＭを添加した（spiked）血漿１５０μＬを、透析ウェルのサンプル側に加え、６時間透析した。アセトニトリルで析出し、分析前にサンプルを１．５ｍＬポリプロピレンチューブで希釈した。透析ウェルのサンプル側から５０μＬを取り、リン酸緩衝液５０μＬとＩＳを含むアセトニトリル３００μＬとを加えた。透析ウェルの緩衝液側から５０μＬを取り、それぞれの血漿マトリクス５０μＬとアセトニトリル３００μＬとを加えた。次に、振盪し、５分間遠心分離した。上清をとり、ＬＣ−ＭＳに注入した。
【０１０５】
０．１μＭ〜２０μＭの範囲の異なる試験濃度をメタノール−水（９０：１０）溶液でつくった。試験溶液を、血漿−リン酸緩衝液（５０：５０）を含む予め混合したマトリクスに加えた。ＩＳを含む氷冷アセトニトリル３００μＬで析出し、振盪して遠心分離した。上清を取り、ＬＣ／ＭＳに注入した。
【０１０６】
血漿蛋白結合％は、計算式（２）：非結合フラクション％＝（緩衝液側濃度／サンプル側濃度）×１００により得た。
【０１０７】
【表８】
2016504348.tif 000028
【０１０８】
備考（表7）
ヒト、ラット及びマウスにおける蛋白結合を示す。式（Ｂ）化合物の血漿蛋白結合を、ラット、マウス及びヒトの異なる種を用いて、血漿マトリクスにおいて測定した。これは、マウス、ラットからヒト種を超えて、血漿マトリクスにおける式（Ｂ）化合物のリバロキサバンへの変換を観察すると同様に、式（Ｂ）化合物の血漿蛋白結合を観察することを、意図している。３種全てを用いて行われた実験で、リバロキサバンへの急速な変換が観察された。式（Ｂ）化合物がインビトロ血漿安定性実験において観察されたのは無視できる量であり、種を超えたインビトロ条件でリバロキサバンへの急速な変換が観察された。また、生成したリバロキサバンは、種を超えて、血漿蛋白に結合していた。
【０１０９】
５．ウィスター系ラットにおける静脈内及び経口投与による薬物動態
前記物質の投与前日に、イソフルラン（Isofluran）（登録商標）麻酔下、血液採取用のカテーテルを実験動物（雄性ウィスター系ラット、体重２００−２５０ｇ）の頸静脈に移植した（implanted）。
実験当日、式（Ｂ）化合物の所定用量を尾静脈に溶液で急速投与（bolus administration）し、懸濁液又は溶液で経口投与を行った。血液サンプル（８〜１０の時点）を、前記物質の投与後２４時間にわたって、連続的にカテーテルにより採取した。投与量は、雄性ウィスター系ラットにおいて、経口投与で１０ｍＬ／ｋｇであり、静脈内投与で１ｍＬ／ｋｇであった。静脈内投与としては２％Ｎ，Ｎ−ジメチルアセタミド／１０％エタノール／３０％ＰＥＧ４００／水の製剤により、経口投与としてはＴｗｅｅｎ８０／ＰＥＧ４００／無菌水の製剤により、行った。
静脈内投与の場合、０．０８、０．２５、０．５、１、２、３、４、６、８及び１２時間後に採血し、経口投与の場合、０．２５、０．５、１．０、２、３、４、６、８及び１２時間後に採血した。
【０１１０】
ヘパリンチューブ（heparinized tube）でサンプルを遠心分離して、血漿を得た。ＩＳを含むアセトニトリルを、時点ごとの所定量の血漿に添加して蛋白質を析出させた。遠心分離後、式（Ｂ）化合物、適当な場合には、上清中の式（Ｂ）化合物の分解産物を、適当なＬＣ／ＭＳ−ＭＳ法を用いて定量した。
【０１１１】
測定した血漿濃度は、ＡＵＣ、Ｃｍａｘ、Ｔ１／２（半減期）及びＣＬ（クリアランス）のようなものに依存しない、前記試験物質及び有効成分化合物（Ａ）の薬物動態パラメータを計算するために用いた。
前記化合物の静脈内投与後、前記試験物質は初めの測定時点でさえも、もはや血漿中に検出されなかった。有効成分のみが２４時間の時点にまで検出された。
前記化合物の経口投与後、これらの物質は初めの測定時点でさえも、もはや血漿中に検出されなかった。有効成分（実施例１）のみが２４時間の時点にまで検出された。
【０１１２】
ＩＳ含有アセトニトリルを、研究サンプル、検量サンプル及びＱＣｓに添加し、前記蛋白質をアセトニトリルを用いて析出させた。振盪し、４０００ｒｐｍで遠心分離し、上清をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（ＡＰＩ４０００、ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ社製）に注入した。クロマトグラフィー分離は島津社製ＵＦＬＣにより行った。注入量は１０μＬであった。用いた分離カラムは、３０℃の温度に調整したフェノメネックス社製（Phenomenex）  ジェミニ（Gemini）ＮＸ（４．６×５μ  １００ｍｍ）であった。８００ｍｕ．Ｌ／分の二次元移動相グラジエント（binary mobile phase gradient）を用いた（Ａ：０．１％ギ酸水溶液、Ｂ：アセトニトリル：ＡＰＩ４０００、ＥＳＩアジレント１１００カラム：ジェミニＮｘ（１００ｍｍ×４．６ｍｍ  ５μ；カラム温度：３０℃；溶出液Ａ：０．１％ギ酸水溶液、溶出液Ｂ：アセトニトリル；グラジエント：０−２．５分  ９５％Ａ、５％Ｂ；２．５−２．６分  ５％Ａ、９５％Ｂ；２．６−４．２分  ９５％Ａ、５％Ｂ；流速：０．８ｍＬ／分；ＥＳＬ  Ｑ１：４６４．０９８、Ｑ３：１４４．２５５）。ターボＶ（Turbo V）のイオン源は５００℃であった。以下のＭＳ装置のパラメータ（カーテンガス：２０ユニット、イオンスプレー電圧：５ｋＶ、ガス１：５０ユニット、ガス２：５０ユニット、ＣＡＤガス：６ユニット）。前記物質は、特異的ＭＲＭ実験（specific MRM experiments）の抽出イオンクロマトグラム（extracted ion chromatograms）を用いて、ピーク高又は面積により定量した。
【０１１３】
測定された血漿の濃度／時間のプロットを、検証された薬物動態計算プログラムにより、ＡＵＣ、Ｃｍａｘ、ＭＲＴ（平均保持時間）、Ｔ１／２（半減期）、及びＣＬ（クリアランス）のような薬物動態パラメータを計算するために用いた。
【０１１４】
６．静脈内投与用の懸濁液
組成物：
本願発明にかかる化合物２．２ｍｇは、０．２２ｍＬのエタノール（１０％）、０．６６ｍＬＰＥＧ４００（３０％）、１．２７ｍＬの静注用水（５８％）及び０．０４ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルアセタミド（２％）に溶解した。本願発明にかかる化合物の単回投与量１ｍｇは、静注溶液１ｍＬに相当する。
【０１１５】
調製：
試験化合物の必要量をガラスバイアルに秤量した。これに、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセタミドを加え、振盪した。次に、エタノール、ＰＥＧ４００を加え、振盪した。最後に、静注水を加え、混合し、振盪して、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度にするために超音波処理を行った。最終溶液は、外見で澄明で無色であった。
【０１１６】
７．経口投与用の溶液
組成物：
式（Ｂ）化合物８．３ｇに、Ｔｗｅｅｎ８０、ＰＥＧ４００及び無菌静注水（water for injection）を加えた。試験化合物の必要量をガラスバイアルに秤量した。これに、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセタミドを加え、振盪した。次に、エタノール、ＰＥＧ４００を加え、振盪した。最後に、静注水を加え、混合し、振盪して、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度にするために超音波処理を行った。最終溶液は、外見で澄明で無色であった。
【０１１７】
調製：
式（Ｂ）化合物の必要量をガラスバイアルに秤量した。これに、Ｔｗｅｅｎ８０を加え、振盪した。次に、エタノール、ＰＥＧ４００を加え、振盪した。最後に、静注水を加え、混合し、振盪して、０．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度にするために超音波処理を行った。最終溶液は、外見で澄明で無色であった。
【０１１８】
１０ｍｇ／ｋｇの用量における試験化合物の静脈内投与後のリバロキサバンの濃度−時間プロファイル
【０１１９】
【表９】
2016504348.tif 000029
【０１２０】
１０ｍｇ／ｋｇの用量における試験化合物の経口投与後のリバロキサバンの濃度−時間プロファイル
【０１２１】
【表１０】
2016504348.tif 000030
【０１２２】
表８及び９は、式（Ｂ）化合物が、リバロキサバンと比べて上昇したＣｍａｘと同様に、ＡＵＣに関する上昇した出現（exposure）を示した。このことは、式（Ｂ）化合物が急速に吸収され、即座にリバロキサバンに変換されることを示唆する。
【０１２３】
８．抗凝固作用の測定
試験物質（式（Ｂ）化合物）及びリバロキサバンの抗凝固作用は、ヒト血漿を用いてインビトロで測定された。この実験に用いたヒト血漿は、抗凝固剤であるクエン酸ナトリウムに回収された血液から分離された。プロトロンビン時間（ＰＴ）を市販の試験キット（スタギット（Stagid）社製のネオプラチン）を用いて測定し、ＡＰＴＴをＩＬ社製のシンタジル（Synthasil）キットを用いて同定した。用いた試験物質及びリバロキサバンの異なる濃度は、コントロールである相当する溶液に沿って、０．１〜１．０μｇ／ｍＬであった。ＰＴ同定のために、試験物質及びリバロキサバンを３７℃で１０分間、血漿とインキュベートした。次に、トロンボプラスチンの添加により凝固を開始させ、凝固発生時間を測定した。ＰＴＴの測定のために、試験化合物及びリバロキサバンを、塩化カルシウム添加後、３７℃で１０分間、血漿とともにインキュベートした。アッセイの結果は、試験化合物（式（Ｂ）化合物）が有意な抗凝固作用を有することを示した。
【０１２４】
この発明の１つの態様において、式（Ｂ）化合物は、前述の目的で使用するため、通常、１又は複数の非活性、無毒性、薬学的に適当な賦形剤とともに医薬に含有さることができる。
【０１２５】
前記化合物は、全身的及び／又は局所的に作用させるために投与することができる。この目的のために、これらの化合物を、例えば、経口的、経皮的、肺又は鼻経由で、好ましくは経口的のような適当な方法及び形態で投与することができる。
【０１２６】
経口投与にとっては、先行技術にしたがって機能し、本願発明にしたがって急速に及び／又は修飾された様式で前記化合物を送達し、結晶性の及び／又は非晶質の及び／又は溶解した形態の本願発明にかかる化合物を含む、例えば、錠剤（例えば、腸用被覆又は不溶な又は遅延性溶解性を有し、本願発明にかかる化合物の放出を制御するような被覆を有する、非被覆又は被覆錠剤）、口内で急速に崩壊する錠剤、またはフイルム／薄片（wafer）、フイルム／凍結乾燥物、カプセル（例えば、ハード又はソフトのゼラチンカプセル）、糖被覆錠剤、顆粒、ペレット、粉末、エマルジョン、懸濁液、エアロゾル又は溶液、の投与形態が好ましい。
【０１２７】
９．ウィスター系ラットにおける静脈内投与及び経口投与の排泄プロファイル
前記物質の投与前日に、イソフルラン麻酔下、採血用のカテーテルを実験動物（雄性ラット、体重２００−２５０ｇ）の頸静脈に移植した（implanted）。
【０１２８】
実験当日、式（Ｂ）化合物の所定用量を尾静脈に溶液で急速投与（bolus administration）し、懸濁液又は溶液で経口投与を行った。尿及び糞を、前記物質の投与後１４４時間にわたって代謝ケージから採取した。投与量は、雄性ウィスター系ラットにおいて、経口投与で１０ｍＬ／ｋｇであり、静脈内投与で１ｍＬ／ｋｇであった。静脈内投与としてはＮ，Ｎ−ジメチルアセタミド（２％）／エタノール（１０％）／ＰＥＧ４００（３０％）／静注用水（５８％）の製剤により、経口投与としてはＴｗｅｅｎ８０／ＰＥＧ４００／無菌水の製剤により、行った。尿及び糞の回収は、静脈内投与及び経口投与の場合、０−４、４−８、８−２４、２４−４８、４８−７２、７２−９６、９６−１２０、１２０−１４４時間後であった。
【０１２９】
尿及び糞を処理し、ＩＳ含有アセトニトリルを所定の尿／糞に加え、沈殿させた。遠心分離後、上清中の式（Ｂ）化合物及び、適当な場合、式（Ｂ）化合物の既知の分解物を、適当なＬＣ／ＭＳ−ＭＳ法を用いて定量した。
【０１３０】
測定した尿及び糞の濃度を、例えば、ＡＵＣ及びＣｍａｘのようなものに依存しない、試験物質及び有効成分化合物（Ａ）のパラメータを計算するために用いた。
【０１３１】
前記化合物の静脈内投与後に、前記試験物質は最初の測定時点でさえも尿及び糞中にもはや検出できなかった。有効成分のみが、尿及び糞の両方で検出できた。
【０１３２】
前記化合物の経口投与後に、これらの物質は最初の測定時点でさえも尿及び糞中にもはや検出できなかった。有効成分（実施例１）のみが、糞中でも尿中でも検出できた。
【０１３３】
ＩＳ含有アセトニトリルを、研究サンプル、検量サンプル及びＱＣｓに添加し、前記蛋白質をアセトニトリルを用いて析出させた。振盪し、遠心分離し、上清をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（ＡＰＩ４０００、ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ社製）に注入した。クロマトグラフィー分離は島津社製ＵＦＬＣにより行った。注入量は１０μＬであった。用いた分離カラムは、３０℃の温度に調整したフェノメネックス（Phenomenex）社製  ジェミニ（Gemini）ＮＸ（４．６×５μ  １００ｍｍ）であった。８００ｍｕ．Ｌ／分の二次元移動相グラジエントを用いた（Ａ：０．１％ギ酸水溶液、Ｂ：アセトニトリル：ＡＰＩ４０００、ＥＳＩアジレント１１００カラム：ジェミニＮｘ（１００ｍｍ×４．６ｍｍ  ５μ；カラム温度：３０℃；溶出液Ａ：０．１％ギ酸水溶液、溶出液Ｂ：アセトニトリル；グラジエント：０−２．５分  ９５％Ａ、５％Ｂ；２．５−２．６分  ５％Ａ、９５％Ｂ；２．６−４．２分  ９５％Ａ、５％Ｂ；流速：０．８ｍＬ／分；ＥＳＬ  Ｑ１：４６４．０９８、Ｑ３：１４４．２５５）。
ターボＶ（Turbo V）のイオン源は５００℃であった。以下のＭＳ装置のパラメータ（カーテンガス：２０ユニット、イオンスプレー電圧：５ｋＶ、ガス１：５０ユニット、ガス２：５０ユニット、ＣＡＤガス：６ユニット）を用いた。前記物質は、特異的ＭＲＭ実験（specific MRM experiments）の抽出イオンクロマトグラム（extracted ion chromatograms）を用いて、ピーク高又は面積により定量した。
【０１３４】
１０．静脈内投与用の懸濁液：
組成物：
本願発明にかかる化合物２．２ｍｇを、０．２２ｍＬのエタノール（１０％）、０．６６ｍＬＰＥＧ４００（３０％）、１．２７ｍＬの静注用水（５８％）及びＮ，Ｎ−ジメチルアセタミド（２％）に溶解した。本願発明にかかる化合物の単回投与量１ｍｇは、静注溶液１ｍＬに相当する。
【０１３５】
調製：
試験化合物の必要量をガラスバイアルに秤量した。これに、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセタミドを加え、振盪した。次に、エタノール、ＰＥＧ４００を加え、振盪した。最後に、静注水を加え、混合し、振盪して、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度にするために超音波処理を行った。最終溶液は、外見で澄明で無色であった。
【０１３６】
１１．経口投与用の溶液：
組成物：
式（Ｂ）化合物に、Ｔｗｅｅｎ８０、ＰＥＧ４００及び無菌静注水を加えた。試験化合物の必要量をガラスバイアルに秤量した。これに、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセタミドを加え、振盪した。次に、エタノール、ＰＥＧ４００を加え、振盪した。最後に、静注水を加え、混合し、振盪して、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度にするために超音波処理を行った。最終溶液は、外見で澄明で無色であった。
【０１３７】
調製：
式（Ｂ）化合物の必要量をガラスバイアルに秤量した。これに、Ｔｗｅｅｎ８０を加え、振盪した。次に、エタノール、ＰＥＧ４００を加え、振盪した。最後に、静注水を加え、混合し、振盪して、超音波処理を行った。最終溶液は、外見で澄明で無色であった。
【０１３８】
１ｍｇ／ｋｇの用量における試験化合物（式（Ｂ）化合物）の静脈内投与及び１０ｍｇ／ｋｇの用量における試験化合物後の経口投与の後のリバロキサバンの濃度−時間プロファイル
【０１３９】
【表１１】
2016504348.tif 000031
【０１４０】
【表１２】
2016504348.tif 000032
【０１４１】
【表１３】
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【０１４２】
表１０（Ａ）、１０（Ｂ）及び１０（Ｃ）は、血漿出現（exposure）がリバロキサバンより試験生成物（式（Ｂ）化合物）において高かったことを示した。リバロキサバン及び試験化合物（式（Ｂ）化合物）の尿排泄プロファイルは同様の排泄プロファイルを示したが、非吸収のリバロキサバンは、試験生成物（式（Ｂ）化合物）の経口投与でより少なかった。
【０１４３】
式（Ｂ）化合物は、糞中に存在するリバロキサバンがリバロキサバン単独と比べてより少ない量であることを示した。これは、リバロキサバンに比べて、血漿中のより高い出現及び糞中へのより低い排泄を示した。
【国際調査報告】
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