(57)【要約】  少なくとも一つの対象物を観察するための本方法は、撮像システムを用いて適用される。それは、以下の工程：  −光源で該対象物（単数又は複数）を照射する工程（１１０）、  −照明方向に沿って対象物が照射される時、該対象物（単数又は複数）によって回折される波の像と一致する回折パターンを、マトリックス受光器を用いて取得する工程（１２０）、を含むものであって、  生物学的実体等の該対象物（単数又は複数）が、該照明方向に沿って該光源と該マトリクス受光器との間に配置されている。  該方法は、該照射工程（１１０）の前に、さらに、該対象物（単数又は複数）と接触する少なくとも一つのマーカーの添加（１００）を含み、前記又はそれぞれのマーカーが、一致する対象物上に結合することが可能であって、前記対象物上の前記マーカーの前記結合は、前記対象物の吸収及び光学位相シフトの中から、少なくとも一つの特徴量を増加することが可能である。【選択図】図４
2016511831.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの対象物（４０）を観察するための方法であって、該方法は、撮像システム（２０）を用いて適用されるものであって、以下の工程：
−光源（２４）を用いて該対象物（単数又は複数）（４０）を照射する工程（１１０）、
−マトリックス受光器（２６）を用いて回折パターンを取得する工程（１２０）、を含む方法であって、
該回折パターンが、該対象物が照明方向（Ｚ）に沿って照射される時に、該対象物（単数又は複数）（４０）によって回折される波の像と一致し、
該対象物（単数又は複数）（４０）、例えば生物学的実体等が、該照明方向（Ｚ）に沿って該光源（２４）と該マトリックス受光器（２６）の間に配置されているものであって、
該方法が、該照射工程（１１０）の前に、さらに、
−該対象物（単数又は複数）（４０）と接触する少なくとも一つのマーカー（５０）の添加（１００）を含むことを特徴とするものであって、前記又はそれぞれのマーカー（５０）が、対応する対象物（４０）上に結合することができるものであり、前記対象物（４０）上の前記マーカー（５０）の結合が、前記対象物の吸収及び光学位相シフトの中から、少なくとも一つの特徴量を増加することができる、方法。
【請求項２】
前記対象物（４０）上の前記マーカー（５０）の結合が、少なくとも１％、好適には、少なくとも１０％、前記対象物の吸収を増加することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象物（４０）上の前記マーカー（５０）の結合が、少なくともπ／１０ラジアン前記対象物の光学位相シフトを増加することができる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記又はそれぞれのマーカー（５０）が、着色剤、蛍光剤、金属粒子及び有機粒子からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記又はそれぞれのマーカー（５０）が、前記又はそれぞれの対象物（４０）の対応する寸法、例えば直径の半分未満の値、好適には前記寸法の１／３未満、より好適には前記寸法の１／１０未満の値の寸法、例えば直径を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該照明方法（Ｚ）に沿った該対象物（単数又は複数）（４０）と該マトリクス受光器（２６）の間の距離（Ｄ２）が、１０ｍｍ未満、好適には５ｍｍ未満である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該光源（２４）が、空間的な干渉性の光源である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記又はそれぞれの対象物（４０）が、１ｍｍ未満の値、好適には１００ｎｍと１００μｍの間に含まれる値の寸法、例えば直径を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該方法が、取得工程（１２０）の後、該マトリックス受光器（２６）によって計測される強度（Ｉ）から、再構築アルゴリズムに従って対象物（単数又は複数）（４０）の光学的特性の再構築（１３０）工程をさらに含むものであって、該再構築アルゴリズムが、該照明方向（Ｚ）に沿って該対象物（単数又は複数）と該マトリックス受光器（２６）の間の距離（Ｄ２）に依存する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
該方法は、少なくとも一つのマーカー（５０）が結合される該対象物（４０）を計数する工程をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
−少なくとも一つの対象物（４０）を照射することができる光源（２４）と、
−照明方向（Ｚ）に沿って対象物が照射される時に該対象物（単数又は複数）（４０）によって回折される波の像と一致する回折パターンを取得することができるマトリックス受光器（２６）と、
−該照明方向（Ｚ）に沿って、該光源（４０）と該マトリックス受光器（２６）との間に配置され、生物学的実体等の該対象物（単数又は複数）を受信するための支持体（２８）と、を含む撮像システム（２０）であって、
該受信支持体（２８）が、さらに、該対象物（単数又は複数）（４０）と接触して配置される少なくとも一つのマーカー（５０）を含むことを特徴づけられるものであって、前記又はそれぞれのマーカー（５０）が、対応する対象物（４０）上に結合することが可能であって、前記対象物（４０）上の前記マーカーの結合が、前記対象物の吸収及び光学位相シフトの中から少なくとも一つの特徴的量を増加することを可能とする、撮像システム（２０）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも一つの対象物、例えば、生物実体等を観察するための方法に関する。該発明は、撮像システムを用いて適用されるものであって、光源を用いた対象物の照射、マトリックス光検出器を用いた回折パターンの取得を含み、該回折パターンは、照明方向に沿って対象物が照射される時、該対象物（単数又は複数）によって回析された波長の像と一致する。該対象物（単数又は複数）は、照明方向に沿って、光源とマトリックス光検出器の間に配置される。
【０００２】
本発明は、照明方向に沿って、例えば生物実体等の少なくとも一つの対象物を照射することが可能な光源、該照明方向に沿って対象物が照射される時、該対象物（単数又は複数）によって回折される波の像と一致する、回折パターンを取得することを可能とするマトリックス光検出器、並びに、該照明方向に沿って該対象物と該マトリックス受光器との間に配置された、該対象物（単数又は複数）を受信するための支持体、を含む、撮像システムにも関する。
【０００３】
本発明は、例えば、対象物を含んだサンプルの像の再構築に適用されるものであって、とりわけ、生物学的実体、例えば、細胞、細菌又はさらなるウイルス等の対象物の光学的性質の再構築に適用される。生物学的粒子とも呼ばれるこれらの生物学的実体は、細胞に対しては１０μｍオーダー、細菌に対しては１μｍオーダーのサイズを有する。サンプルは、例えば、支持体に含まれる液体溶液中に浸漬されるものであって、該支持体は、該源と該マトリックス受光器との間に配置されており、該支持体は、マトリックス受光器に面して配置された透明面を含んでいる。代替的に、該サンプルは、気層に触れた支持体上に配置される。
【０００４】
光学的性質によってとは、該対象物の吸光、又は、それぞれの対象物によって導入された光学位相シフトを特に意味するものであって、該光学位相シフトとは、位相遅れと呼ばれており、該対象物の複雑な不透過率関数の係数（ｍｏｄｕｌｕｓ）及び引数（ａｒｇｕｍｅｎｔ）をそれぞれ表すこれらのパラメータと理解される。本発明は、特に、これらのパラメータの空間的な分布の決定を許容する。
【０００５】
本発明は、接触撮像とも呼ばれる、レンズを用いない撮像に関するもの、つまり、サンプルとマトリックス受光器の間に配置される倍率光学系が無いので、マトリックス受光器によって、サンプルによって直接透過される放射線によって形成される像の取得に関するものである。マトリックス受光器は、この場合、レンズを有さない撮像デバイスとも呼ばれ、後者から短い距離にて配置される間に、サンプルの像を形成することができる。短い距離とは、１００μｍと数センチの間、好適には１ｃｍ未満を含む距離を意味する。
【背景技術】
【０００６】
前述のタイプの方法は、ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓにて２０１１年に出版された、Ｏ．  Ｍｕｄａｎｙａｌｉ、Ｗ．  Ｂｉｓｈａｒａ  及び  Ａ．  Ｏｚｃａｎの論文「Ｌｅｎｓｆｒｅｅ  ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ｗｅｔｔｉｎｇ  ｆｉｌｍｓ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ」により知られている。当該論文は、生物学的粒子、特に、０．５μｍ未満の寸法を有する生物学的粒子、例えば、大腸菌、精子、栄養体ランブル鞭毛虫（ｌａｍｂｌｉａ  ｇｉａｒｄｉａ）又はさらに赤血球と呼ばれる赤血球等のレンズ無しの撮像について述べている。とりわけ、当該論文は、得られる像を改善するために濡れたフィルムの使用について述べている。濡れているフィルムは非常に薄く、生物学的粒子を含むサンプルの上に配置される。
【０００７】
しかしながら、マトリックス受光器によって得られた回折パターンの像は、何千の粒子を観察するための広い視野の像であって、それぞれから粒子を容易に識別することを許容しない。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の目的は、それゆえ、得られる回折パターンの像を用いることによって、何千もの対象物を常に観察する一方で、サンプルのある対象物の観察を改善することを可能にする観察する方法及び撮像システムを提案することである。
【０００９】
この目的のために、本発明の目的は前述されたタイプの観察方法であって、該方法はさらに、照射する工程の前に、該対象物に接触する少なくとも一つのマーカーの添加を含み、該又はそれぞれのマーカーが、対応する対象物上に結合することが可能であって、該対象物上の該マーカーの該結合が、該対象物の吸収及び光学位相シフトの中から少なくとも一つの特徴量を増加することができるものである。
【００１０】
本発明の他の有利な側面によると、該観察方法は、個別に、又は全ての技術的に可能な組み合わせが取られる、１又は数個の以下の特徴を含む：
【００１１】
−該対象物上の該マーカーの結合は、少なくとも１％、好適には少なくとも１０％該対象物の吸収を増加することが可能である；
【００１２】
−該対象物上の該マーカーの結合は、少なくともπ/10ラジアン該対象物の光学位相シフトを増加することが可能である；
【００１３】
−該又はそれぞれのマーカーは、着色剤、蛍光剤、金属粒子及び有機粒子からなる群から選択される；
【００１４】
−該又はそれぞれのマーカーは、前記又はそれぞれの対象物の対応する寸法、例えば直径等の半分未満、好適には該寸法の３分の１未満、より好適には、該寸法の１０分の１未満の値の寸法、例えば直径等を有する；
【００１５】
−照明方向に沿った該対象物（単数又は複数）とマトリックス受光器との間の該距離は、１０ｍｍ未満、好適には５ｍｍ未満である；
【００１６】
−該光源は、空間的に干渉性の光源である；
【００１７】
−該又はそれぞれの対象物は、１ｍｍ未満の値、好適には１００ｎｍと１００μｍの間に含まれる値の寸法、例えば直径等を有する；
【００１８】
−該方法は、取得する工程の後に、さらに、該マトリックス受光器によって測定される強度から、再構築アルゴリズムに従って、対象物（単数又は複数）の光学的性質の再構築を含むものであって、該再構築アルゴリズムが、照明方向に沿って該対象物（単数又は複数）と該マトリクス受光器との間の距離に依存するものである；及び
【００１９】
−該方法は、少なくとも一つのマーカーが付着される該対象物の係数工程をさらに含む。
【００２０】
本発明の目的もまた、前述のタイプの撮像システムであって、ここで、受信支持体は、さらに、対象物（単数又は複数）と接触する位置に配置される少なくとも一つのマーカーを含むものであって、該又はそれぞれのマーカーが、対応する対象物上に結合することが可能であり、該対象物上の該マーカーの結合が、該対象物の吸収及び光学位相シフトの中から、少なくとも一つの特徴量を増加することができるものである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
本発明の特徴及び利点は、非限定的な例として与えられたり、添付の図面に関して作られただけの、以下の説明を読むと明らかになるものであって、ここで、：
【図１】−図１は、本発明の撮像システムの透視図であり、
【図２】−図２は、図１の撮像システムの分解立体図であり、
【図３】−図３は、図１の撮像システムの略図であって、該撮像システムは、受信支持体上に配置された、サンプルを照射できる光源、及び、該照射されたサンプルによって透過された回折パターンを確立することができるマトリックス受光器を含むものであり、
【図４】−図４は、本発明の観察方法のフローチャートであり、
【図５】−図５は、現状技術の観察方法により得られたサンプルの回折パターンの像であり、
【図６】−図６は、本発明の観察方法により得られたサンプルの回折パターンの像であり、
【図７】−図７は、図５の枠内の領域ＶＩＩの拡大部であり、
【図８】−図８は、図６の枠内の領域ＶＩＩＩの拡大部であり、
【図９】−図９は、現状技術の方法に従った再構築により得られたサンプルの像の、図５の枠内の領域ＶＩＩに対応する領域の拡大部であり、
【図１０】−図１０は、本発明の方法に従った再構築によって得られたサンプルの像の、図６の枠内の領域ＶＩＩＩに対応する領域の拡大部であり、
【図１１】−図１１は、蛍光撮像システムを用いて得られた、サンプルの参照像の、図９及び図１０の同じ領域に対する拡大部であり、
【図１２】−図１２は、本発明の方法に従った再構築によって得られたサンプルの像の図であって、該図は、図１０で描写された拡大部に対する枠内の領域Ｘを含むものであり、そして、
【図１３】−図１３は、第二の代表的な実施態様に従った受信支持体の図であって、該支持体は、現状技術の観察方法に従って観察されるべき溶解された血液を含む第一のウェル、及び、本発明の観察方法に従って観察されるべき溶解された血液と磁気マイクロビーズとしてのマーカーを含んだ第二のウェルを含むものであり、
【図１４】−図１４は、現状技術の観察方法に従って得られた、図１３の枠内の領域ＸＩＶの回折パターンの像であり、
【図１５】−図１５は、本発明の観察方法に従って得られた、図１３の枠内の領域ＸＶの回折パターンの像であり、
【図１６】−図１６は、顕微鏡を用いて得られた、図１３の枠内の領域ＸＩＶの像であり、
【図１７】−図１７は、顕微鏡を用いて得られた、図１３の枠内の領域ＸＶの画像であり、
【図１８】−図１８は、顕微鏡を用いて得られた、図１３の第二のウェルの異なった領域の連結された像のセットであり、
【図１９】−図１９は、本発明の観察方法に従って得られた、図１３の第二のウェルの異なった領域の回折パターンの連結された像のセットであり、
【図２０】−図２０は、図１８の矢印で示されたパターンの拡大部のセットであり、
【図２１】−図２１は、図１９の矢印で示されたパターンの拡大部のセットであり、
【図２２】−図２２は、本発明の観察方法に従って得られた、図１３の第二のウェルの像であり、
【図２３】−図２３は、参照像であり、
【図２４】−図２４は、図２２と図２３の像の間の自己相関由来の閾値によって得られた検出像であり、
【図２５】−図２５は、第三の代表的な実施態様の受信支持体の図であり、該支持体は、現状技術の観察方法に従って観察されるべきマクロファージを含んだ第一のウェル、及び、本発明の観察方法に従って観察されるべきマクロファージと磁気マイクロビーズとしてのマーカーを含む第二のウェルを含むものであり、
【図２６】−図２６は、顕微鏡を用いて得られた、図２５の第一のウェルの異なった領域の像のセットであり、
【図２７】−図２７は、現状技術の観察方法に従って得られた、図２５の第一のウェルの異なった領域の回折パターン像のセットであり、
【図２８】−図２８は、図２７の像に相当する階調の曲線のセットであり、
【図２９】−図２９は、顕微鏡を用いて得られた、図２５の第二のウェルの異なった領域の像のセットであり、
【図３０】−図３０は、本発明の観察方法に従って得られた、図２５の第二のウェルの異なった領域の回折パターン像のセットであり、そして、
【図３１】−図３１は、図３０の像に相当する階調の曲線のセットである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
慣習的に、本出願においては、表現「実質上〜と等しい（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｅｑｕａｌ  ｔｏ）」とは、プラスマイナス５％以内と等しい関係を表している。
【００２３】
図１において、サンプル２２を観察するために意図された撮像システム２０は、サンプル２２を照射可能な光源２４、及び、照明方向、例えば、実質的に垂直方向Ｚに沿って照射されたサンプル２２により透過された回折パターンを確立することができるマトリックス受光器２６とを含んでいる。
【００２４】
撮像システム２０は、サンプル２２を受信するための支持体２８を含み、該支持体２８は、照明方向Ｚに沿った光源２４とマトリックス受光器２６との間に配置されている。受信支持体２８は、解析されるべきサンプル２２を受信することを目的としている。
【００２５】
撮像システム２０は、図３で示されるように、プロセッサー３２と、サンプル２２の光学的性質を再構築するためのソフトウエア３６を保存することができるメモリ３４とを含んだ、情報処理ユニット３０も含むものであって、該光学的性質とは、マトリックス受光器２６によって測定される強度Ｉから、再構築アルゴリズムに従って再構築されるものである。
【００２６】
撮像システム２０は、図２に図示されるように、内部に、とりわけ、マトリックス受光器２６及び情報処理ユニット３０を備えた、保護ケーシング３８を含んでる。
【００２７】
サンプル２２は、対象物４０、例えば、生物学的粒子とも呼ばれる、つまり、細胞（例えば、赤血球、白血球又は血小板）又は細胞、細菌若しくは細菌のコロニーの凝集塊、又は、さらなるウイルス等の生物学的存在等を含む。
【００２８】
サンプル２２は、例えば、支持体２８に含まれた液体培地中において浸漬されるものであって、該支持体２８は、透明な表面４２を含み、該対象物４０は、例えば、該支持体の透明な表面４２と接触している。あるいは、サンプル２２は、空気と接触している支持体２８の上に配置されており、該対象物４０は、該支持体の透明な表面４２上に配置されている。
【００２９】
光源２４は、対象物４０を含むサンプル２２を照射するために、照明方向、例えば垂直方向Zに沿って光線４４を放出することができる。照明方向は、サンプル２２が光線４４で照射される方向である。照明方向は、光源２４から発する光線４４に沿った方向である必要はなく、特に光線４４が、光源２４からサンプル２２までの直線経路に従わない場合、光線４４は、例えば、光源２４とサンプル２２との間を移動する間に、鏡によって反射される。
【００３０】
光源２４は、照明方向Ｚに沿って受信支持体２８から第一の距離Ｄ１に配置される。第一の距離Ｄ１は、好適には、１ｍｍと３０ｃｍの間に含まれた値を有する。
【００３１】
光源２４は、好適には、空間的に干渉性の源であり、例えば、ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ−Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｄｉｏｄｅ）とも呼ばれる、発光ダイオード４６等の点光源、及び、有利には、ＬＥＤ４６と接触して配置される絞り（ｄｉａｐｈｒａｇｍ）４８を含む。これは、光放射の空間的干渉性の増加を許容する。光源２４がＬＥＤ４６を含む場合、第一の距離Ｄ１は、例えば、５ｃｍと等しい。
【００３２】
あるいは、光源２４は、空間的に及び時間干渉光源、例えば、レーザーダイオード（ＬＤ）又はさらにＶＣＳＥＬ（垂直共振器型面発光レーザー）型のレーザーダイオードである。レーザーダイオードは、例えば、実質的に６７０ｎｍと等しい波長を有する。光源２４がレーザーダイオードである時、第一の距離Ｄ１は、例えば、１ｃｍに等しい。当該技術分野において技術を有する者であれば、光源２４の位置に関わらず、光源２４によって放出される波が平面波であることが与えられるので、第一の距離Ｄ１の値、つまり、光源２４とサンプル２２との間の距離の値は、回折パターン上の入射角（ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ）を有さないことに留意するであろう。
【００３３】
さらにあるいは、光源２４は、発光ダイオード４６からなり、絞りは含まない。発光ダイオード４６は、空間的に干渉するように考慮さえるように、十分に減少された寸法を有しており、該発光ダイオードの直径は、この発光ダイオード４６を受信支持体２８から離れた第一の距離Ｄ１の１０分の１未満である。
【００３４】
マトリックス受光器２６は、サンプル２２によって作られる回折パターンを確立することができるものであり、該又はそれぞれの回折パターンは、一つ又は数個の対象物４０によって回折された波の像と一致するものであり、該像は、サンプル２２の照射中に、マトリックス受光器２６にて形成されるものである。具体的には、それぞれの回折パターンは、対象物によって回折される波の干渉によって形成される像を含む。マトリックス受光器２６及び光源２４は、照明方向Ｚに沿ってサンプル２２のいずれか側に配置される。
【００３５】
マトリックス受光器２６は、示されていない、複数の画素を含む。マトリックス受光器２６のそれぞれの画素は、１０μｍ若しくは４μｍと同等又はそれ未満の寸法を有している。それぞれの画素は、例えば、正方形型であり、辺が、１０μｍ若しくは４μｍと同等又はそれ未満の値である。あるいは、それぞれの画素は、一辺が２．２μｍの正方形型である。
【００３６】
マトリックス受光器２６は、照明方向Ｚに沿って受信支持体２８からの第二の距離Ｄ２に配置される。第二の距離Ｄ２は、１００μｍと数ｃｍ、好適には１０ｍｍ未満、好適には５ｍｍ未満の間を含み、より好適には２００μｍと２ｍｍの間を含む値を有する。記述された代表的な実施態様において、第二の距離Ｄ２は実質的に５００μｍと等しい。
【００３７】
マトリックス受光器２６と受信支持体２８との間の小さな値、つまり短い距離の第二の距離Ｄ２に対して与えている優先する事実は、サンプル２２が照射されるとき、異なった対象物によって生じる異なる回折パターンの間の干渉現象の限定を許容する。
【００３８】
マトリックス受光器２６は、２次元画像センサー、つまり、照明方向Ｚに対して垂直な平面である。マトリックス受光器２６は、画素化された画像センサー、例えば、ＣＭＯＳ（相補的金属酸化物半導体素子）センサーである。あるいは、マトリックス受光器２６は、ＣＣＤ（電荷結合素子）センサーである。
【００３９】
マトリックス受光器２６は、付加的に、ここでは示されない、マイクロレンズを含むものであって、それぞれのマイクロレンズは対応する画素上に配置される。このようなマイクロレンズは、該センサーに統合されている。それらは、収集効率を改善する可能性を与え、受信支持体２８とマトリックス受光器２６の間に配置された倍率光学系を形成しない。
【００４０】
マトリックス受光器２６によって得られる像は、受信支持体２８とマトリックス受光器２６の間に配置される倍率光学系無しで、サンプル２２によって直接透過された放射線によって形成される。マトリックス受光器２６は、レンズ無し撮像デバイスとも呼ばれ、後者から短い距離に配置される間に、サンプル２２の像を形成することができる。短い距離によってとは、前に示したように、数センチメートル未満の距離、好適には、１ｃｍ未満を意味し、第二の距離Ｄ２であれば、例えば、５００μｍと等しい。
【００４１】
受信支持体２８は、サンプル２２を支持する透明面４２を含む。第一の距離Ｄ１はその時、照明方向Ｚに沿って光源２４と透明面４２の間の距離と一致する。第二の距離Ｄ２はその時、照明方向Zに沿ってマトリックス受光器２６と透明面４２の間の距離と一致する。
【００４２】
受信支持体２８は、光源２４とマトリックス受光器２６の間に配置され、透明面４２は、図３に記載されるように、光源２４によって、サンプル２２の照明方向に相当する照明方向Ｚと実質的に垂直である。
【００４３】
受信支持体２８は、本発明において、対象物（単数又は複数）４０と接触して配置される、少なくとも一つのマーカー５０をさらに含み、該又はそれぞれのマーカー５０は、相当する対象物４０上に取り付けられることができ、該対象物４０上の該マーカー５０の結合は、該対象物４０の吸収及び光学位相シフトの中から、少なくとも特徴量を増加することができる。
【００４４】
このように、一般的に、サンプル２２は、与えられる方向に沿って照射され、マトリックス受光器２６が、該方向に対して垂直に配置されている。
【００４５】
ソフトウエア３６の再構築部分は、測定された強度Ｉから、構築アルゴリズムに従って、サンプル２２の光学特性を再構築することができる。
【００４６】
それ自体知られている、再構築アルゴリズムの例は、以下の数式を満たす：
【数１】
2016511831.tif 000003
【００４７】
ここで、Ｉはマトリックス受光器２６によって測定された強度を表し、
【００４８】
ｘ、ｙは、垂直方向Ｚに対して平面に直交する座標を表し、＊は、重畳積（the convolution product）を表し、
【００４９】
Ｚｒは、再構築の高さを表し、
【００５０】
λは、光源２４の波長を表し、ｊは虚数ユニット数（imaginary unit number）を表し、
【００５１】
aは、対象物４０の複素不透過関数（complex opacity function）を表し、a*は、aの共役複素数（the conjugate complex）を表し、そして
【００５２】
hzは、以下の数式：
【数２】
2016511831.tif 000004
で定義される。
【００５３】
数式（１）は以下の数式：
【数３】
2016511831.tif 000005
から得られ、
ここで、Ａｚは、透過率ｔ（ｘ，ｙ）のフレネル変換である。
【００５４】
透過係数  ｔ（ｘ，ｙ）は、その時、以下の方法：
【数４】
2016511831.tif 000006
【数５】
2016511831.tif 000007
で定義される。
【００５５】
強度Ｉは、その時、以下の方法：
【数６】
2016511831.tif 000008
で定義される。
【００５６】
以下の数式：
【数７】
2016511831.tif 000009
と一致するフレネル変換の二重特性は、
その時、再構築の数式（１）を得る可能性を与える。
【数８】
2016511831.tif 000010
【００５７】
再構築の高さＺｒは、マトリックス受光器と解析される対象物との間の距離に相当する。
【００５８】
代替物によれば、解析される対象物が、透明壁４２と接触して配置されたとき、再構築の高さＺｒは、例えば、照明方向Ｚに沿って透明面４２とマトリックス受光器２６の間の第二の距離Ｄ２の値より厳密に小さい値を有する。再構築の高さＺｒは、好適には第二の距離Ｄ２の０．９倍未満、より好適には第二の距離Ｄ２の０．８倍未満である。
【００５９】
保護ケース３８は、例えば、図１及び図２で記載されるように、筒型である。保護ケーシング３８は、垂直方向Ｚに沿った高さＨ、及び、垂直方向Ｚに垂直の半径方向に沿った半径Ｒを有する。ケーシング３８の高さＨ及び半径Ｒは、例えば、センチメートルの寸法である。
【００６０】
対象物４０は、１ｍｍ未満のサイズ、好適には１００ｎｍと１００μｍの間を含むサイズを有する。対象物４０のサイズは、与えられた方向に沿った最も大きい寸法に相当する。対象物４０が球形であるとき、対象物４０のサイズは、球形の相当する直径と等しい。細菌は、１μｍオーダーの直径を有し、細胞は１０μｍオーダーの直径を有する。
【００６１】
対象物４０のサイズは、一般的には、光源２４によって発せられるビーム４４の波長λの０．１倍と２５倍の間が含まれる。図５〜１２の例において、ビーム４４の波長λは、５５５ｎｍと等しく、対象物４０のサイズは１０μｍオーダー、つまり波長λの約２０倍と等しい。
【００６２】
対象物４０は、例えば、前に記載したような、細菌若しくは他の微生物、又はさらに細胞等の生物学的実体である。細胞は、例えば、血液細胞、つまり、赤血球、白血球、若しくは生物学的液体中に存在する他の細胞である。
【００６３】
透明面４２は、例えば、照明方向Ｚに沿って１７０μｍと実質的に等しい厚さを有する透明なスライドの形状を有する。
【００６４】
光線４４は、光源２４と受信支持体の間に配置される倍率光学系が無くても、サンプル２２を直接照射することができる。
【００６５】
発光ダイオード４６は、例えば、１ｎｍと４０ｎｍの間を含む帯域幅、好適には５ｎｍと等しい帯域幅の単色である。発光ダイオード４６は、例えば、５００ｎｍと６００ｎｍの間を含む放出波長、及び、１ワットオーダーの電力を有する。
【００６６】
絞り４８は、５０μｍと５００μｍの間の直径を有し、ＬＥＤ源４６と接触して配置される。
【００６７】
それぞれのマーカー５０は、着色剤、蛍光剤、金属粒子及び有機粒子からなる群から選択される。
【００６８】
マーカー５０が蛍光剤の時、これは、例えば、ＤＡＰＩとも呼ばれる、４’６−ジアミジノ−２−フェニルインドールである。
【００６９】
マーカー５０が、金属粒子、つまり、金属タイプの無機粒子である時、これらは、例えば、金粒子、プラチナ粒子又はさらに磁気ビーズである。磁気ビーズは、例えば、磁気ナノ粒子であって、とりわけ、これらは、問合せ番号１３０−０４５−０８１の下、ミルテニバイオテック社により市販されている。
【００７０】
最後に、マーカーが有機粒子である時、これらは、例えば、ポリマー粒子、ミセル、ナノエマルジョンタイプの脂質粒子、又はさらに造影剤を封入したリポソームである。造影剤は、例えば、蛍光体、着色剤、ナノ結晶（量子ドット）とも呼ばれる半導体ナノメートル粒子（ｓｅｍｉ−ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  ｎａｎｏｍｅｔｒｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）、又はさらなる金属錯体である。
【００７１】
相当する対象物４０上のマーカー５０の結合は、とりわけ、マーカー５０が着色剤又は蛍光剤であるとき、少なくとも１％、好適には少なくとも１０％、該対象物４０の吸収を増加することができる。
【００７２】
相当する対象物４０上のマーカー５０の結合は、とりわけ、マーカー５０が金属粒子又は有機粒子であるとき、該対象物の位相シフト、つまり、位相遅れを、少なくともπ/10 ラジアン増加することができる。
【００７３】
それぞれのマーカー５０は、相当する対象物４０のサイズの半分未満、好適には該サイズの３分の１未満、さらに好適には、該サイズの１０分の１未満のサイズの値を有する。それぞれのマーカー５０のサイズは、与えられた方向に沿った最も大きい寸法に相当する。マーカー５０が球状であるとき、マーカー５０のサイズは、相当する球体の直径に等しい。
【００７４】
それぞれのマーカー５０は、相当する対象物４０に結合されることができるように機能化されている。換言すると、マーカー５０は、標識されるべき対象物４０と特異的親和性を有する。これは、例えば、化学的親和性、電気的親和性又はさらに形状親和性である。
【００７５】
マーカー５０の機能化は、周囲の媒体（液体、他の対象物）に比較して対象物４０の回折力を特異的に補強する可能性、つまり、少なくとも該対象物の吸収及び光学位相シフトの中から特徴量を増加する可能性を与える。マーカー５０は、そのとき、回折マーカーと呼ばれる。実際に、マーカー５０の機能化は、周囲の媒体に関し、対象物４０の表面において、後者の強力な集中を得る可能性を与える。
【００７６】
マーカー５０の機能化は、例えば、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、タンパク質（例えば、抗体）、又はさらにＤＮＡ若しくはＲＮＡフラグメント等の標的剤と融合することによって得られる。標的剤は、例えば、対象物４０の分子と複合体化又はハイブリダイゼーション化によって相互作用してもよい。マーカー５０に標的剤を融合させることは、標識されるべき対象物４０と化学的親和性を確立する可能性を与える。
【００７７】
あるいは、マーカー５０は、静電気力を介して対象物４０に対して結合できる粒子である。標識されるべき対象物４０に対する静電気力を有したこれらの粒子は、例えば、問合せ番号１０１６４４０００１又は１０１６４４０００５にてメルク  ミリポア社より販売されている、マグプレップ（登録商標）シリカ  ＭＳ粒子である。
【００７８】
あるいは、マーカー５０は、標識されるべき対象物４０の該一部と形状親和性を確立するために、少なくとも対象物４０の一部を接合する形状とみなすことができる特異的分子インプリントを有する材料である。
【００７９】
対象物４０が、抗原ＣＤ４５を有する白血球であるとき、マーカー５０は、例えば、抗原ＣＤ４５の特異的抗体が結合されたフルオレセインイソチオシアネートの粒子であって、該フルオレセインイソチオシアネートは蛍光体である。これらの抗原ＣＤ４５の特異的抗体と結合されたフルオレセインイソチオシアネート粒子は、例えば、問合せ番号５５５４８２にてベクトン  ディッキンソン（ＢＤ）社によって、又は、問合せ番号１３０−０９８−０４３にてミルテニバイオテック社によって、又はさらには問合せ番号ＭＣＡ８７Ｆにてバイオ−ラッドグループのＡｂＤ  セロテック社によって市販されている。あるいは、対象物４０が抗原ＣＤ４５を有する白血球であるとき、マーカー５０は、例えば、問合せ番号１３０−０４５−８０１にてミルテニバイオテック社によって市販された磁気ナノ粒子である。さらにあるいは、対象物４０が抗原ＣＤ４５を有する白血球のとき、マーカー５０は、例えば、問合せ番号Ｑ２２１５４にてインビトロジェン社によって市販される、蛍光マイクロ粒子Ｑ６５５である。
【００８０】
対象物４０が抗原ＣＤ６１を有する血小板であるとき、マーカー５０は、例えば、問合せ番号５５５７５３にてベクトン  ディッキンソン（ＢＤ）社より、又は問合せ番号ａｂ７８４４７にてアバカム社により市販されるような、抗原ＣＤ６１の特異的抗体に結合されたフルオレセインイソチオシアネート粒子である。あるいは、対象物４０が抗原ＣＤ６１を有する血小板であるとき、マーカー５０は、例えば、ファンレンス１３０−０５１−１０１にてミリテニバイオテック社によって市販された、ナノ粒子である。
【００８１】
本発明の再構築の方法は、図４の手段によってこれから記載される。
【００８２】
最初の工程１００の間、マーカー（単数又は複数）５０は、サンプル２２へと添加され、該又はそれぞれのマーカー５０は、前に述べたように、それぞれのマーカー５０と相当する対象物４０との間の親和性により、相当する対象物４０に対して結合することが可能である。
【００８３】
続く工程１１０の間、サンプル２２は、光源２２を用いて照射され、光線４４が、サンプル２２を照射するとき、光線４４は照明方向Ｚに沿って向けられている。
【００８４】
照射されたサンプル２２によって透過された放射線の強度Ｉは、そのとき、工程１２０の間に、マトリックス受光器２６によって測定される。さらに具体的には、マトリクス受光器２６は、照射されたサンプル２２によって透過された回折パターンの強度Iを測定するものであって、それぞれの回折パターンは、サンプル２２を照らすとき、対象物４０によって回折される波に相当するものであって、ある対象物４０は、さらに１又は数個の対応するマーカー５０を伴っている。回折された波は、入射波に干渉する。
【００８５】
対象物４０の、光学的性質、特に吸収と位相シフトとも呼ばれる位相遅れは、工程１３０の間、前に記載された再構築アルゴリズムに従って、測定された強度Ｉより、再構築手段３６を用いて、最終的には再構築される。位相遅れは、複素不透過関数（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｐａｃｉｔｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）ａの引数と一致し、吸収は、前に定義した複素不透過関数aの係数（ｍｏｄｕｌｕｓ）と一致する。一般的に、再構築像は、吸収又は位相遅れの空間的分布を表す。
【００８６】
図５から１２の例において、発光ダイオード４６は、５５５ｎｍに等しい放射波長及び１．７Ｗに等しい電力を有する。第一の距離Ｄ１は、実質的に５ｃｍに等しく、第二の距離Ｄ２は、実質的に５００μｍと等しい。
【００８７】
図５から１２の例において、対象物４０は、１％の抗生物質、つまりペニシリンとストレプトマイシン（ギブコ社より市販）、及び１０％の新生子牛血清（パン  バイオテック社より市販）を含むＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）とも呼ばれる変法イーグル培地を基礎とした完全培地にて培養された、線維芽細胞、つまり、問合せ番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６４８のＮＩＨ３Ｔ３である。６０，０００個のＮＩＨ３Ｔ３細胞は、このように、透明なスライド、例えば、サイト  チップス社によって市販されたスライド等の上に付着されており、該スライドはそのとき、３７℃にて３時間インキュベーターに置かれる。
【００８８】
図６、８、１０及び１２の例において、線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３は、さらに、例えば、問合せ番号Ｐ３６９３１にてインビトロジェン社によって市販される、４’６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含む溶液によって標識される。換言すると、図６、８、１０及び１２の実施態様において、マーカーは、４’６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）分子である。
【００８９】
図５は、ＤＡＰＩを含む溶液を添加する前の、細胞４０に相当する回折パターンの像２００を表し、つまり、現状技術の観察方法により得られたものであり、図７は図５の枠内の領域ＶＩＩの拡大部２１０であり、図９は図５の枠内の領域ＶＩＩに相当する領域に対するものであって、ソフトウエア３６及び続く前述の数式（１）〜（８）を用いて、像２００から再構築されて得られた像の、拡大部２２０である。
【００９０】
図６は、ＤＡＰＩを含む溶液を添加後の、細胞４０に対する回折パターン２３０を表し、つまり、本発明の観察方法に従って得られたものであり、図８は図６の枠内の領域ＶＩＩＩの拡大部２４０であり、図１０は、図６の枠内の領域ＶＩＩＩに相当する領域に対するものであって、再構築ソフトウエア３６及び続く前述の数式（１）〜（８）を用いて、像２３０から再構築されて得られた像２６０の、拡大部２５０である。図１０は、図１２の枠内の領域Ｘの拡大部であり、図１２は像２３０から再構築することで得られた像２６０を表している。
【００９１】
換言すると、図５、７及び９は、細胞４０に接触するマーカーを添加する前に、つまり、現状技術の方法で得られたものであり、図６、８、１０及び１２は、細胞４０に接触するマーカーを添加後、つまり、本発明の観察方法に従って、作製されたものである。
【００９２】
図７及び図８の比較は、本発明の方法に従って標識した後に作製された回折パターンが、現状技術の方法に従って標識する前に作製された回折パターンよりも輪郭が明瞭になることを明確に示す。
【００９３】
本発明の方法に従って作製された回折パターンが、細胞４０の核の局在、計数、及び測定できること可能性を明確に与える。
【００９４】
図１１は、蛍光撮像システムを用いて得られた、図９及び図１０の拡大部と同じ領域であって、サンプル２２の参照像の、拡大部２７０である。
【００９５】
図１０と図１１の比較は、本発明の方法に従って得られた回折パターンから再構築された像２６０が、蛍光イメージングによって得られた参照像の正確な写真であることを示す。反対に、図９と図１１の比較は、現状技術の方法に従って得られた回折パターンから再構築された像が、細胞の密度が高い時には、役立たないことを示す。
【００９６】
図６、８、１０及び１２の例において、本発明の方法に従ったＤＡＰＩを含む溶液の添加は、細胞４０の吸収の増加の可能性を与え、細胞４０の標識化が、細胞４０の核に役立ち、特異的になりうる回折パターンの観察を許容する。
【００９７】
本発明の観察方法及び撮像システム２０は、回折パターンの像を用いて何千もの対象物４０を常に観察する一方、サンプル２２のある対象物４０の観察を改善する可能性を与えることが考えうる。
【００９８】
一方では図１３〜２４に関連し、他方では図２５〜３１に関連して実質的に記載される両方の代表的な実施態様は、対象物４０、とりわけリンパ球上に選択的に融合されるマイクロビーズのような回折マーカー５０の添加が、レンズ無し撮像によるこれら対象物４０の選択的観察を許容することを示す。
【００９９】
マイクロビーズのような回折マーカー５０は、異なる対象物４０の間の計数又は比率を評価するためのタイプの適用のための、レンズ無し撮像の適用の可能性を与える。適用は、例えば、ＨＩＶ、結核又はマラリア等の病理の診断に関する。
【０１００】
第二の代表的な実施態様は、図１３〜２４に関連して記載されている。この第二の代表的な実施態様によれば、観察されたサンプル２２は、チューブで調整されている新鮮な血液及び、例えば、直径約４．５μｍを有する磁気マイクロビーズ等のマーカー５０を含む。
【０１０１】
１００μＬの血液が採取され、それは赤血球を溶血するために、qspの超純水（Ｈ2Ｏ  ＵＰ）にて＋４℃、１０分間インキュベートされる。続いて、チューブは５分間、５００Ｇにて遠心分離され、上清が取り除かれ（後者は赤血球の残骸を実質的に含む）、そして、その沈殿物は、ＰＢＳ（リン酸緩衝塩類溶液）とも記述される塩類リン酸緩衝液（ｓａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）１．５ｍＬ中に再び取り込まれる。この操作は、一度繰り返される。
【０１０２】
次に、ＣＤ４５は白血球の共通表面マーカーであるので、モノクローナルマウス抗ＣＤ４５（ＩｇＧ２ａ）抗体により機能化された約４．５μｍの直径を有する磁気ビーズのような回折マーカー５０を５０μＬと、前述の沈殿由来の溶血された血液細胞４５０μＬとを含む、チューブが準備される。
【０１０３】
回折５０とともにインキュベートされていない溶血された血液はコントロールとして使用され、１０μＬが、インビトロジェンTM、例えば、ライフテクノロジー社の問合せ番号カウンテス（登録商標）セルカウンティングチャンバースライドにて市販される、図１３にて表される、受信支持体２８の第一のウェル３００中に加えられる。
【０１０４】
弱い攪拌にて室温で３０分インキュベートした後、１０μＬの量が回収され、顕微鏡及びレンズを有さない撮像をもって観察のために、図１３で示される、受信支持体２８のウェル３０２中に加えられる。
【０１０５】
図１３は、インビトロジェンTMスライドの形態において、受信支持体２８のレンズ無しの撮像により取得したものを示す。受信支持体２８は、それゆえ、第一のウェル３００中に１０μＬの溶血された血液を含む溶液を含み、第二のウェル３０２においては、溶血した血液であるが、磁気マイクロビーズ  ダイナビーズ（登録商標）ＣＤ４５等の回折マーカー５０を用いた白血球を標識後の、同じ溶液を含む。
【０１０６】
像は、アプティナ  イメージングTMにより市販されているセンサーＭＴ９Ｊ００３等のマトリックス受光器２６、及び５３４ｎｍ±４２ｎｍでフィルターされたＬＥＤ照明等の光源２４を含み、レンズ２０を有さない、撮像システムを用いて得られる。スライド等の受信支持体２８は、ニューポートコーポレーション社によって市販さている、２つのステージのＭ．ＩＬＳ−１００ＰＰを用いて走査され、基本像は、スライドのそれぞれの部位において得られる。同一スライド上で得られる基本像は、最終像を形成するために並列される。図１４及び図１５にて描かれている例は、４５の基本像のモザイクを形成することで得られる。
【０１０７】
図１４及び図１５は、レンズ無しイメージングによって得られた図１３の枠内の領域XIV及びXVの詳細を示す。前に示した様に、図１４及び図１５はそれぞれ、回折マーカーを用いない、及び、ダイナビーズ（登録商標）ＣＤ４５マイクロビーズ等の機能化された磁気マイクロビーズ等の回折マーカー５０を用いた、溶血された血液領域を示す。
【０１０８】
図１６及び図１７は、それぞれ、５０と等しい倍率の対物レンズを使用した透過顕微鏡を用いて、それぞれ、第一のウェル３００及び第二のウェル３０２において得られる像を示す。赤血球の多くの残骸が観察される。これらの図の観察の視野は、レンズ無し撮像によって得られる図の観察視野よりも小さい。
【０１０９】
第一のウェル３００において（図１４）、現状技術の観察方法を用いて、レンズ無し撮像によって得られる取得物を用いて、対象物４０、とりわけリンパ球を区別することは不可能であり、後者は、サンプル２２において広く少数である（１０００に対して１）。サンプル２２にて提示される異なる粒子は、それぞれに対して過剰に混雑している。それゆえ、回折スポットは混ぜ合わせる。顕微鏡下で得られた図１６は、赤血球の残骸の観察を確認する。
【０１１０】
第二のウェル３０２（図１５）において、本発明に従って、機能化された磁気マイクロビーズのような回折マーカー５０を含むと、レンズ無しの撮像によって得られた像は、像の背景から区別される回折パターンを示し、回折マーカーを有さない現状技術の方法に従って得られた像（図１４）では回折パターンは示されない。これらの回折パターンは、図１５中の矢印Ｆ１によって位置が示されている。顕微鏡下で得られた図１７は、機能化された磁気マイクロビーズで標識されたリンパ球の周りでマイクロビーズの凝集（矢印Ｆ２）が形成されることを確認するものであり、これは、残骸、マイクロビーズ及び他の粒子からそれらを区別されることを許容している。
【０１１１】
レンズ無し撮像（図１９）と透過顕微鏡（図１８）によって得られる取得の照合は、レンズ無し撮像によって検出される回折パターンが、磁気マイクロビーズで標識されたリンパ球と実質的に一致することを示す。図１８及び図１９において、像の中心のスポット（点）は、インクスポットに相当し、参照ポイントとして使用されている。
【０１１２】
図１８の透過顕微鏡によって得られた取得物上の矢印Ｆ３によって示された全てのパターンは、図２０にて詳述されており、図１９のレンズ無し撮像によって得られた取得物上の矢印Ｆ４によって示された全てのパターンは、図２１にて詳述される。
【０１１３】
図１９の矢印Ｆ４によって示されたパターンは、図１８及び図２０で可視化されるように、５０と等しい倍率を有する対物レンズを用いて、透過顕微鏡によって得られた参照像で確認されるように、磁気マイクロビーズのような回折マーカー５０で標識されたリンパ球と実際に一致する。マイクロビーズのような回折マーカー５０で標識されたリンパ球に一致するレンズ無しの撮像によって記録された回折パターンは、多くの粒子の周辺に存在するにも関わらず、強いコントラストを有する。
【０１１４】
手作業でこれらの回折パターンを検出することは可能であり、標識された粒子の存在を明らかにする。自動検出のために、それ自体知られている像処理方法が適用され、この方法は、像の参照パターンに対して、階調閾値を与えること、又は調査することを含んでいる。後者においては、比較が、事前に確立された、レンズ無し撮像デバイスによって得られる像（図２２）と参照パターン（図２３）との間で比較がなされ、後者は回折パターンの代表として考慮される。
【０１１５】
図２２において示されている該取得像、Ｉ1と、図２３において示されている参照像Ｉ2のと間の標準化された自己相関がその後実施される。これは、自己相関の結果から実施される閾値付与の実施後に、図２４において示される、相関像、Ｉ3を得る可能性を与える。この最後の像において、検出像におけるそれぞれの強度ピークは、回折パターンの中心の位置と一致する。
【０１１６】
もし、Ｉ1（ｘ、ｙ）とＩ2（ｉ、ｊ）がそれぞれ、観察される像と基本の参照回折パターンを示す場合、好適には標準化された、自己相関関数の適用は、
【数９】
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のような相関像Ｉ3（ｘ、ｙ）を導く。
【０１１７】
図２２〜図２４の例において、標準化された自己相関関数による検出方法は、マイクロビーズのような回折マーカー５０で標識された約２３０のリンパ球の検出を引き起こす。
【０１１８】
このように、この第二の代表的な実施態様は、リンパ球上に磁気マイクロビーズを融合することにより、回折マーカーを適用することが、レンズ無し撮像によって、複雑で不均質の溶血した血液溶液１０μＬ中における、リンパ球の効率的な検出を許容することを示す。
【０１１９】
磁気マイクロビーズのような回折マーカー５０を用いた対象物４０の標識化は、標識化された対象物４０の計数を実施する可能性を与えるものと解される。
【０１２０】
第三の代表的な実施態様は、図２５〜図３１に関して記載される。この第三の代表的な実施態様に従って、観察されたサンプル２２は、マウスのマクロファージを含み、マーカー５０もまた磁気マイクロビーズの形態であって、約４．５μｍの直径を有している。
【０１２１】
系統Ｊ７７４Ａ．１由来のマクロファージのような、マウスのマクロファージは、制御された雰囲気を有し、９５％に等しい湿度水準及び５％の二酸化炭素を有するインキュベーター中において、維持培養される。コンフルエントになったとき、つまり、マクロファージが培養支持体を覆ったとき、マクロファージは、こすり落とすことで該支持体から回収される。約２５０，０００のマクロファージ細胞が、塩類リン酸緩衝液ＰＢＳを含む１．５ｍＬチューブに沈殿する。
【０１２２】
該細胞は、ライフテクノロジー社によって市販されるダイナビーズ（登録商標）ＣＤ４５マイクロビーズ（インビトロジェンTM  １１１．５３Ｄ）等の機能化された磁気マイクロビーズのような回折マーカー５０の１／１０の存在下において、弱い攪拌を行いながら３０分間インキュベートされる。
【０１２３】
インキュベート後、ＰＢＳ中にて１／１００希釈が実施される。１０μＬの量がその時、顕微鏡下で、レンズ無し撮像にて観察するために、例えば、例えばライフテクノロジーズ社より問合せ番号カウンテス（登録商標）細胞カウンティングチャンバースライドで市販される、インビトロジェンTMスライド等の、図２５に示される、受信支持体２８の第二のウェル３０２に加えられる。希釈は、観察されるべき細胞の数を減少することを許容する。回折マーカーを伴う非インキュベートされたマクロファージの溶液は、コントロールとして使用され、１０μＬは、図２５で示される、受信支持体２８の第一のウェル３００に加えられる。
【０１２４】
図２５は、スライドのような受信支持体２８のレンズ無し撮像による取得像を示す。受信支持体２８はそれゆえ、第一のウェル３００中に、１０μＬの溶液はマクロファージを含んでおり、第二のウェル３０２中には、磁気マイクロビーズ  ダイナビーズ（登録商標）ＣＤ４５等の回折マーカー５０でマクロファージを標識した後の、１０μＬのマクロファージの同様の溶液を含んでいる。
【０１２５】
像は、アプティナ  イメージングTM社のＭＴ９Ｊ００３等のマトリックス受光器２６、及び６１０ｎｍ±２０ｎｍでフィルターされたＬＥＤ照明のような光源２４を含むレンズ無し撮像システム２０を用いることで得られる。スライドのような受信支持体２８は、ニューポートコーポレーション社の２つのＭ．ＩＬＳ−１００ＰＰステージを用いて走査され、基本像は該スライドのそれぞれの位置で取得される。
【０１２６】
図２７及びそれぞれの３０は、現状技術の方法を用いて標識すること無く、観察されたマクロファージを示しており、それぞれは、磁気マイクロビーズ、ダイナビーズＣＤ４５のような回折マーカー５０の標識化を用いた本発明に従って、これらの回折像はレンズ無し撮像によって取得される。
【０１２７】
図２６及び図２９は、５０と等しい倍率を有する対物レンズを用いた透過顕微鏡を用いて、第一のウェル３００及び第二のウェル３０２のそれぞれを観察することによって取得される。これらの図２６及び図２９は、第一のウェル３００のマクロファージが実質的には回折マーカーを有さず、一方で、第二のウェル３０２のマクロファージが、細胞表面に磁気マイクロビーズ等のいくつかの回折マーカー５０を含んでいることを示す。
【０１２８】
図２７と図３０の比較によって、回折パターンは、観察された対象物４０が標識されている（図３０）又は標識されていない（図２７）かどうかに依存して異なることが観察される。この違いは、例えば、図２８で示される、マーカーを有さない第一のウェル３００の場合、及び、図３１における、磁気マイクロビーズのような回折マーカー５０を有する第二のウェル３０２の場合に、回折パターンの特性が観察される。図２８及び図３１における回折パターンの特性は、縦座標において階調で表現された強度Ｉ  対、  横座標にてμｍとして表現された距離Ｘを用いて、曲線として毎回表現される。
【０１２９】
回折パターンの特性における中心のピークは、回折マーカー５０で標識された対象物４０が観察されたときに、例えば、より強力である。それゆえ、回折マーカー５０で標識された対象物４０を非標識対象物４０から区別するために、中心の階調の閾値、例えば、図２８及び図３１の例の中の１３０の値を適用することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図１４】
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【図１６】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年10月28日(2015.10.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの対象物（４０）を観察するための方法であって、該方法は、撮像システム（２０）を用いて適用されるものであって、以下の工程：
−光源（２４）を用いて該対象物（単数又は複数）（４０）を照射する工程（１１０）、
−マトリックス受光器（２６）を用いて回折パターンを取得する工程（１２０）、を含む方法であって、
該回折パターンが、該対象物が照明方向（Ｚ）に沿って照射される時に、該対象物（単数又は複数）（４０）によって回折される波の像と一致し、
該対象物（単数又は複数）（４０）が、該照明方向（Ｚ）に沿って該光源（２４）と該マトリックス受光器（２６）の間に配置されているものであって、
該方法が、該照射工程（１１０）の前に、さらに、
−該対象物（単数又は複数）（４０）と接触する少なくとも一つのマーカー（５０）の添加（１００）を含むことを特徴とするものであって、前記又はそれぞれのマーカー（５０）が、対応する対象物（４０）上に結合することができるものであり、前記対象物（４０）上の前記マーカー（５０）の結合が、前記対象物の吸収及び光学位相シフトの中から、少なくとも一つの特徴量を増加することができる、方法。
【請求項２】
前記対象物（４０）上の前記マーカー（５０）の結合が、少なくとも１％、好適には、少なくとも１０％、前記対象物の吸収を増加することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象物（４０）上の前記マーカー（５０）の結合が、少なくともπ／１０ラジアン前記対象物の光学位相シフトを増加することができる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記又はそれぞれのマーカー（５０）が、着色剤、蛍光剤、金属粒子及び有機粒子からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記又はそれぞれのマーカー（５０）が、前記又はそれぞれの対象物（４０）の対応する寸法の半分未満の値の寸法を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該照明方法（Ｚ）に沿った該対象物（単数又は複数）（４０）と該マトリクス受光器（２６）の間の距離（Ｄ２）が、１０ｍｍ未満である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該光源（２４）が、空間的な干渉性の光源である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記又はそれぞれの対象物（４０）が、１ｍｍ未満の値の寸法を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該方法が、取得工程（１２０）の後、該マトリックス受光器（２６）によって計測される強度（Ｉ）から、再構築アルゴリズムに従って対象物（単数又は複数）（４０）の光学的特性の再構築（１３０）工程をさらに含むものであって、該再構築アルゴリズムが、該照明方向（Ｚ）に沿って該対象物（単数又は複数）と該マトリックス受光器（２６）の間の距離（Ｄ２）に依存する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
該方法は、少なくとも一つのマーカー（５０）が結合される該対象物（４０）を計数する工程をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
−少なくとも一つの対象物（４０）を照射することができる光源（２４）と、
−照明方向（Ｚ）に沿って対象物が照射される時に該対象物（単数又は複数）（４０）によって回折される波の像と一致する回折パターンを取得することができるマトリックス受光器（２６）と、
−該照明方向（Ｚ）に沿って、該光源（４０）と該マトリックス受光器（２６）との間に配置され、該対象物（単数又は複数）を受信するための支持体（２８）と、を含む撮像システム（２０）であって、
該受信支持体（２８）が、さらに、該対象物（単数又は複数）（４０）と接触して配置される少なくとも一つのマーカー（５０）を含むことを特徴づけられるものであって、前記又はそれぞれのマーカー（５０）が、対応する対象物（４０）上に結合することが可能であって、前記対象物（４０）上の前記マーカーの結合が、前記対象物の吸収及び光学位相シフトの中から少なくとも一つの特徴的量を増加することを可能とする、撮像システム（２０）。
【請求項１２】
該マーカー（５０）の前記寸法が直径であって、前記又はそれぞれの対象物（４０）の前記対応する寸法が直径である、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
該対象物（４０）が生物学的実体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
該対象物（４０）の該寸法が直径である、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
該対象物（４０）が生物学的実体である、請求項１１に記載のシステム。
【国際調査報告】
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