(57)【要約】カテコールアミンのマススペクトロメトリー分析、検出および定量のための方法が記載される。この方法は、カテコールアミンを４−アミノアンチピリン試薬と反応させるステップ、ならびに反応により生成される付加体を検出および／または定量するステップを含み得る。この方法は、多重化することもできる。反応により形成される化合物も提供される。定量は、例えば、標準物質に対するマススペクトルの比較により行うことができる。標準物質は、内部標準物質または分析物標準物質であってよい。例えば、重原子標識した分析物を使用してよい。重原子標識した分析物は、重原子標識したカテコールアミン、例えば本明細書に記載されているカテコールアミンであってよい。
2016539322.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の１つまたは複数のカテコールアミンの存在を検出する方法であって、
ａ）該試料を４−アミノアンチピリン試薬またはその重原子誘導体と、カテコールアミンが該試料中に存在する場合は該カテコールアミンと反応させるのに十分な条件下で反応させて、４−アミノアンチピリン試薬−カテコールアミン付加体またはその重原子誘導体を形成するステップ、
ｂ）反応させた該試料のマススペクトルを得るステップ、および
ｃ）該マススペクトルを分析して、該試料が、４−アミノアンチピリン試薬−カテコールアミン付加体またはそのイオンフラグメントを含有するか否かを判定するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記１つまたは複数のカテコールアミンが、エピネフリン、イソプレナリン、ノルエピネフリン、ノルデフリン、アドレナロン塩酸塩、エピニン塩酸塩、２−（ジメチルアミノ）−３’，４’−ジヒドロキシ−（８Ｃｌ）、２−（ジメチルアミノ）−３’，４’−ジヒドロキシアセトフェノン、ジオキセテドリン、エチプレナリン、Ｎ−メチルエピネフリン、ジヒドロキシエフェドリン塩酸塩、ブチルノルアドレナリン、エチルノルアドレナリン、３，４−ジヒドロキシ−フェニルアラニン、ドーパミン、またはそれらの塩もしくは水和物、あるいはそれらの任意の組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分析する前記ステップが、前記付加体およびその１つまたは複数のフラグメントのいずれかに関連する１つまたは複数の質量シグナルを検出し、前記試料中における前記カテコールアミンの量を定量することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記４−アミノアンチピリン試薬が、式Ｉ：
【化５５】
2016539322.tif 000059
の化合物であって、式中、
Ｒ１がＨまたは
【化５６】
2016539322.tif 000060
であり、
ｙが１〜６であり；
Ｘがアニオンである
化合物またはその重原子誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
式Ｉの前記重原子誘導体が、式Ｉａ、ＩｂまたはＩｃ
【化５７】
2016539322.tif 000061
の化合物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記アミノアンチピリン−カテコールアミン付加体が、式ＩＩ：
【化５８】
2016539322.tif 000062
の化合物であって、式中、
Ｒ４がＨまたは
【化５９】
2016539322.tif 000063
であり、
Ｒ５が
【化６０】
2016539322.tif 000064
であり、
ｚが１〜６であり、
Ｑがハロゲンである
化合物またはその重原子誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
式ＩＩの前記重原子誘導体が、式ＩＩａまたはＩＩｂ
【化６１】
2016539322.tif 000065
の化合物である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アミノアンチピリン−カテコールアミン付加体の前記イオンフラグメントが、式ＩＩＩ：
【化６２】
2016539322.tif 000066
の化合物であって、式中、
Ｒ６が
【化６３】
2016539322.tif 000067
である化合物またはその重原子誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記試料を４−アミノアンチピリンと、４−アミノアンチピリン−カテコールアミン付加体を形成する条件下で反応させるステップが、炭酸水素アンモニウムおよびＫ２［Ｆｅ（ＣＮ）６］の存在下で、該試料を４−アミノアンチピリンと接触させて、該４−アミノアンチピリン−カテコールアミン付加体を生成するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
式Ｉ：
【化６４】
2016539322.tif 000068
の化合物の重原子誘導体であって、式中、
Ｒ１がＨまたは
【化６５】
2016539322.tif 000069
であり、
ｙが１〜６であり、
Ｘがハロゲンであり、
該式の１つまたは複数の原子がより重い原子で置き換えられている、重原子誘導体。
【請求項１１】
式Ｉの前記重原子誘導体が、式Ｉａ、ＩｂまたはＩｃ
【化６６】
2016539322.tif 000070
の化合物である、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
式ＩＩ：
【化６７】
2016539322.tif 000071
の化合物の重原子誘導体であって、式中、
Ｒ４がＨまたは
【化６８】
2016539322.tif 000072
であり、
Ｒ５が
【化６９】
2016539322.tif 000073
であり、
ｚが１〜６であり、
Ｑがハロゲンであり、
該式の１つまたは複数の原子がより重い原子で置き換えられている、重原子誘導体。
【請求項１３】
式ＩＩの前記重原子誘導体が、式ＩＩａまたはＩＩｂ
【化７０】
2016539322.tif 000074
の化合物である、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
式ＩＩＩ：
【化７１】
2016539322.tif 000075
の化合物であって、式中、
Ｒ６が
【化７２】
2016539322.tif 000076
である化合物またはその重原子誘導体。
【請求項１５】
前記重原子誘導体が、式ＩＩＩａ
【化７３】
2016539322.tif 000077
の化合物である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
式ＩＩ
【化７４】
2016539322.tif 000078
の化合物を作製する方法であって、式ＩＩの化合物を生成するのに十分な条件下で、
【化７５】
2016539322.tif 000079
を、４−アミノアンチピリン試薬と反応させるステップを含み、式中、
Ｒ４がＨまたは
【化７６】
2016539322.tif 000080
であり、
Ｒ５が
【化７７】
2016539322.tif 000081
であり、
ｚが１〜６であり、
Ｑがハロゲンである、方法。
【請求項１７】
炭酸水素アンモニウムおよびＫ２［Ｆｅ（ＣＮ）６］の存在下で、
【化７８】
2016539322.tif 000082
を、４−アミノアンチピリン試薬と反応させて、式ＩＩの化合物を生成する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記４−アミノアンチピリン試薬が、式Ｉ：
【化７９】
2016539322.tif 000083
の化合物であって、式中、
Ｒ１がＨまたは
【化８０】
2016539322.tif 000084
であり、
ｙが１〜６であり、
Ｘがハロゲンである
化合物またはその重原子誘導体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
４−アミノアンチピリン試薬、１つまたは複数の分析物標準物質、１つまたは複数の内部標準物質、１つまたは複数の試料調製用カートリッジおよびプレート、生体マトリックス、溶媒、チューブ、ＨＰＬＣカラム、ならびに１つまたは複数の液体クロマトグラフィー緩衝液を含むキット。
【請求項２０】
前記４−アミノアンチピリン試薬が、式Ｉ：
【化８１】
2016539322.tif 000085
の化合物であって、式中、
Ｒ１がＨまたは
【化８２】
2016539322.tif 000086
であり、
ｙが１〜６であり、
Ｘがハロゲンである
化合物またはその重原子誘導体である、請求項１９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その内容全体が明細書に参考として援用される２０１３年１０月３０日に出願された米国特許出願第61/897,683号に対する利益を主張する。
【０００２】
分野
本教示は、マススペクトロメトリーの分野およびマススペクトロメトリーに有用な試薬に関する。
【背景技術】
【０００３】
導入
標識化学は、一般に、マススペクトロメトリーシグナルを改善するために使用される。
【０００４】
カテコールアミンは、２つのヒドロキシ側基を有するベンゼン、および側鎖アミンからなるカテコール核を有する分子である。ヒトの体内で最も豊富なカテコールアミンは、エピネフリン（アドレナリン）、ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）およびドーパミンである。カテコールアミンは水溶性であり、５０％が血漿タンパク質に結合し、その結果、これらは血流中を循環する。
【０００５】
これらの分子の正確な分析および定量は、ますます重要になりつつある。しかし、マススペクトロメトリーによるこれらの化合物の分析は従来から困難であるため、これらの化合物のマススペクトロメトリー分析の改善のための標識の必要性は依然存在する。例えば、これらの化合物の多くは、イオン化可能な基を含有しない。したがって、特に低濃度でのこれらの分子の定量は、困難なことがある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
これらの以前からの困難を克服する、これらの分析物を定量する方法の必要性が存在する。
【０００７】
要約
一部の実施形態では、試料中の１つまたは複数のカテコールアミンの存在を検出する方法が提供される。一部の実施形態では、この方法は、ａ）試料を４−アミノアンチピリン（4-aminoantippyrine）試薬またはその重原子誘導体と、カテコールアミンが試料中に存在する場合はそれと反応させるのに十分な条件下で反応させて、４−アミノアンチピリン試薬−カテコールアミン付加体またはその重原子誘導体を形成するステップ；ｂ）反応させた前記試料のマススペクトルを得るステップ；およびｃ）マススペクトルを分析して、試料が４−アミノアンチピリン試薬−カテコールアミン付加体またはそのイオンフラグメントを含有するか否かを判定するステップを含む。
【０００８】
一部の実施形態では、式Ｉ：
【化１】
2016539322.tif 000003
の化合物であって、式中、
Ｒ１がＨまたは
【化２】
2016539322.tif 000004
であり；
ｙが１〜６であり；
Ｘがハロゲンである化合物またはその重原子誘導体が提供される。
【０００９】
一部の実施形態では、式ＩＩ：
【化３】
2016539322.tif 000005
の化合物であって、式中、
Ｒ４がＨまたは
【化４】
2016539322.tif 000006
であり；
Ｒ５が
【化５】
2016539322.tif 000007
であり；
ｚが１〜６であり；
Ｑがハロゲンである化合物またはその重原子誘導体が提供される。
【００１０】
一部の実施形態では、式ＩＩＩ：
【化６】
2016539322.tif 000008
の化合物であって、式中、
Ｒ６が、
【化７】
2016539322.tif 000009
である化合物またはその重原子誘導体が提供される。
【００１１】
一部の実施形態では、式ＩＩ
【化８】
2016539322.tif 000010
の化合物を作製する方法であって、式ＩＩの化合物を生成するのに十分な条件下で、
【化９】
2016539322.tif 000011
を、４−アミノアンチピリン試薬（regent）と反応させるステップを含み、式中、
Ｒ４がＨまたは
【化１０】
2016539322.tif 000012
であり；
Ｒ５が
【化１１】
2016539322.tif 000013
であり；
ｚが１〜６であり；
Ｑがハロゲンである、方法が提供される。
【００１２】
一部の実施形態では、キットが提供される。一部の実施形態では、このキットは、４−アミノアンチピリン試薬、１つまたは複数の分析物標準物質、１つまたは複数の内部標準物質、１つまたは複数の試料調製用カートリッジおよびプレート、生体マトリックス、溶媒、チューブ、ＨＰＬＣカラムならびに１つまたは複数の液体クロマトグラフィー緩衝液を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本教示は、添付の図面を参照することでより完全に理解される図面は本教示を例証することを意図しており、本教示を限定するものではない。
【００１４】
【図１】図１は、実施例１に従って生成された、４−ＡＡＰ−ドーパミン付加体の親イオンのＱ−１ＭＳスキャンを示す。
【００１５】
【図２】図２は、実施例１に従って生成された、４−ＡＡＰ−ドーパミン付加体の娘イオンのＭＳＭＳスキャンを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書では、例として、以下の図面を参照して、様々な実施形態の詳細な説明が以下に提供される。図面は例示に過ぎず、図面のいかなる参照も、例証の目的のためのみに行われ、本明細書中以下で記載されている実施形態の範囲を限定するようには決して意図されていないことが理解される。便宜上、参照の数字は、類似の要素または特徴を指し示すために、図全体を通して繰り返されることもある（オフセットの有無を問わず）。
【００１７】
様々な実施形態の詳細な説明
以下の考察は、明確にするために、出願人による教示の実施形態の様々な態様を詳説するものであるが、省略することが簡便または適切であれば、ある具体的詳細が省略されると理解される。例えば、代替実施形態における同類または類似の特徴の議論は、多少省略されることがある。周知の考えまたは概念も、簡潔にするために、さほど詳細に議論されないことがある。実施形態を完全に理解させるためだけに本明細書で示され、それぞれの実施において具体的に記載されている詳細のいくらかを、一部の実施形態は必要としないことがあると当業者は認識する。同様に、記載されている実施形態には、本開示の範囲から逸脱せずに共通一般知識に従ってわずかな改変または変化を加えることができることが明らかである。出願人の教示の態様は、以下の実施例および様々な実施形態の説明を踏まえてさらに理解することができ、これらは出願人の教示の範囲を限定するとは決して解釈すべきではない。
【００１８】
一部の実施形態によれば、試料中の１つまたは複数のカテコールアミンの存在を検出および／または定量する方法が提供される。検出および／または定量されるカテコールアミンの例は、表１に示されているものを含むが、それらに限定されない。
【表１−１】
2016539322.tif 000014
【表１−２】
2016539322.tif 000015
【００１９】
一部の実施形態では、１つまたは複数の検出および／または定量されるカテコールアミンは、表１の群から選択される。一部の実施形態では、検出および／または定量されるカテコールアミンは、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、またはそれらの塩もしくは水和物、あるいはそれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、１つまたは複数のカテコールアミンは、エピネフリン、イソプレナリン、ノルエピネフリン、ノルデフリン、アドレナロン塩酸塩、エピニン塩酸塩、２−（ジメチルアミノ）−３’，４’−ジヒドロキシ−（８Ｃｌ）、２−（ジメチルアミノ）−３’，４’−ジヒドロキシアセトフェノン、ジオキセテドリン、エチプレナリン、Ｎ−メチルエピネフリン、ジヒドロキシエフェドリン塩酸塩、ブチルノルアドレナリン、エチルノルアドレナリン、３，４−ジヒドロキシ−フェニルアラニン、ドーパミン、またはそれらの塩もしくは水和物、あるいはそれらの任意の組合せである。
【００２０】
一部の実施形態では、この方法は、ａ）試料を４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）試薬またはその重原子誘導体と、カテコールアミンが試料中に存在する場合はそれと反応させるのに十分な条件下で反応させて、４−アミノアンチピリン試薬−カテコールアミン付加体またはその重原子誘導体を形成するステップ；ｂ）反応させた前記試料のマススペクトルを得るステップ；およびｃ）マススペクトルを分析して、試料が４−アミノアンチピリン試薬−カテコールアミン付加体またはそのイオンフラグメントを含有するか否かを判定するステップを含む。マススペクトル分析は、付加体またはそのイオンフラグメントが存在するか否かを指し示す。付加体またはそのフラグメントがマススペクトルに存在するなら、付加体またはそのイオンフラグメントの存在は、カテコールアミンも試料中に存在することを指し示す。
【００２１】
一部の実施形態では、分析するステップは、前記付加体および１つまたは複数のそのフラグメントのいずれかに関連する１つまたは複数の質量シグナルを検出することを含む。質量シグナルの検出は、任意の標準的なマススペクトロメーター、例えば、これに限定されないが、ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００マススペクトロメーターを用いて使用できる。マススペクトロメーターは、直接注入モードで使用できる。具体的なマススペクトロメーターおよび操作モードは重大ではないので、機械および機械を使用する変動要素は、使用者の選好に応じて変更できる。
【００２２】
一部の実施形態では、この方法は、試料中のカテコールアミンの量を定量することを含む。定量は、例えば、標準物質に対するマススペクトルの比較により行うことができる。標準物質は、内部標準物質または分析物標準物質であってよい。例えば、重原子標識した分析物を使用してよい。重原子標識した分析物は、重原子標識したカテコールアミン、例えば本明細書に記載されているカテコールアミンであってよい。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「重原子」という用語は、１つまたは複数の原子がより重い原子で置き換えられている分子を指す。例えば、水素は重水素で置き換えられ得る。１２Ｃ炭素は１３Ｃ炭素で置き換えられ得る。分子が１つを超える水素を有する場合、水素の１つもしくは複数またはすべてが、より重い水素原子で置き換えられ得る。分子が１つを超える炭素を有する場合、炭素の１つもしくは複数またはすべてが、より重い炭素原子で置き換えられ得る。
【００２４】
標準物質として使用できる重原子標識された分析物の例は：
【化１２】
2016539322.tif 000016
（ドーパミン−１，１，２，２−ｄ４塩酸塩）、
【化１３】
2016539322.tif 000017
（エピネフリン（メチル−１３Ｃ，ｄ３）および
【化１４】
2016539322.tif 000018
（ノルエピネフリン−２，５，６，α，β，β−ｄ６）
を含むが、それらに限定されない。これらは非限定的な例であり、他の重原子分析物も使用してよい。
【００２５】
一部の実施形態では、４−アミノアンチピリン試薬は、式Ｉ：
【化１５】
2016539322.tif 000019
の化合物であって、式中、
Ｒ１がＨまたは
【化１６】
2016539322.tif 000020
であり、
ｙが１〜６であり；
Ｘ−がアニオンである
化合物またはその重原子誘導体である。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「その重原子誘導体」という用語が化合物を指す場合、この用語は、化合物中の炭素の１つまたは複数が１３Ｃ炭素で置き換えられていることを意味する。一部の実施形態では、炭素のすべてが置き換えられている。置き換えは、試料中のカテコールアミンの分析、検出、および／または定量を促進するために使用できる。
【００２７】
一部の実施形態では、式Ｉの重原子誘導体は、式Ｉａ、ＩｂまたはＩｃ
【化１７】
2016539322.tif 000021
の化合物である。
【００２８】
式Ｉ、Ｉａ、ＩｂまたはＩｃの化合物の一部の実施形態では、Ｒ１はＨである。一部の実施形態では、Ｒ１は
【化１８】
2016539322.tif 000022
である。
【００２９】
式Ｉ、Ｉａ、ＩｂまたはＩｃの化合物の一部の実施形態では、ＸはＣｌ、Ｆ、ＩまたはＢｒである。一部の実施形態では、ＸはＢｒである。
【００３０】
一部の実施形態では、この方法は、式ＩＩ：
【化１９】
2016539322.tif 000023
のアミノアンチピリン−カテコールアミン付加体化合物であって、式中、
Ｒ４がＨまたは
【化２０】
2016539322.tif 000024
であり；
Ｒ５が
【化２１】
2016539322.tif 000025
であり；
ｚが１〜６であり；
Ｑがハロゲンである付加体化合物、またはその重原子誘導体を生成する。当業者には明白なように、様々なＲ５基は、本明細書に記載されている方法に従って検出および定量できる様々な例示的なカテコールアミンに特異的である。側鎖はまた、表１において見ることができる。
【００３１】
一部の実施形態では、式ＩＩの重原子誘導体は、式ＩＩａまたはＩＩｂ
【化２２】
2016539322.tif 000026
の化合物である。
【００３２】
式ＩＩ、ＩＩａまたはＩＩｂの化合物の一部の実施形態では、Ｒ４は
【化２３】
2016539322.tif 000027
である。一部の実施形態では、Ｒ４はＨである。
【００３３】
式ＩＩ、ＩＩａまたはＩＩｂの化合物の一部の実施形態では、ｚは３である。
【００３４】
式ＩＩ、ＩＩａまたはＩＩｂの化合物の一部の実施形態では、ｚは３である。
【００３５】
式ＩＩ、ＩＩａまたはＩＩｂの化合物の一部の実施形態では、ＱはＣｌ、Ｆ、ＩまたはＢｒである。一部の実施形態では、ＱはＢｒである。
【００３６】
一部の実施形態では、この方法は、アミノアンチピリン−カテコールアミン付加体のイオンフラグメントを生成する。一部の実施形態では、イオンフラグメントは、試料中のカテコールアミンの量を定量するために検出および／または使用される。一部の実施形態では、イオンフラグメントは、式ＩＩＩ：
【化２４】
2016539322.tif 000028
の化合物であって、式中、Ｒ６が
【化２５】
2016539322.tif 000029
である化合物またはその重原子誘導体である。当業者に明白なように、様々なＲ６基は、本明細書に記載されている方法に従って検出および定量できる、様々な例示的なカテコールアミンに特異的である。側鎖はまた、表１において見ることができる。
【００３７】
一部の実施形態では、試料を４−アミノアンチピリン試薬と、カテコールアミンが存在する場合は４−アミノアンチピリン−カテコールアミン付加体を形成する条件下で反応させる。一部の実施形態では、この方法は、炭酸水素アンモニウム（すなわち、緩衝剤）およびＫ２［Ｆｅ（ＣＮ）６］（すなわち酸化剤）の存在下で、試料を４−アミノアンチピリン試薬と接触させて、４−アミノアンチピリン−カテコールアミン付加体を生成するステップを含む。一部の実施形態では、カテコールアミンは、塩酸塩の形態である。一部の実施形態では、炭酸水素アンモニウムは緩衝液である。一部の実施形態では、緩衝液は、約ｐＨ８〜９のｐＨである。成分は、一緒に混合し、５〜３０、５〜２０または５〜１５分間にわたり反応させることができる。一部の実施形態では、混合物は、少なくとも、または約５、１０、１５もしくは２０分間にわたり反応させる。一部の実施形態では、混合物は２０分間未満にわたり反応させる。この混合物は、マススペクトロメーターで分析される前にフィルタリングしてもよい。フィルタの例は、Ｃ１８（５００ｍｇ）カートリッジであるが、それに限定されない。他の緩衝液、例えば、リン酸塩緩衝液も使用してよいが、それに限定されない。緩衝液のｐＨ範囲は、約８から約１１であってよい。他の酸化剤の例は、過酸化水素、硫酸銅または過硫酸ナトリウムを含むが、それらに限定されない。カテコールアミンが試料中に存在する場合に、酸化剤が、４−アミノアンチピリン試薬およびカテコールアミンの反応を促進できるのであれば、いかなる適切な酸化剤も使用してよい。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「試料」という用語は、カテコールアミンを含有していても、していなくてもよい試料を指す。一部の実施形態では、試料は、カテコールアミンを含有することがわかっている。一部の実施形態では、試料は、カテコールアミンを含有することが予想される。「試料」は、「試験試料」と呼ぶこともできる。
【００３９】
一部の実施形態によれば、式Ｉ：
【化２６】
2016539322.tif 000030
の化合物であって、式中、
Ｒ１がＨまたは
【化２７】
2016539322.tif 000031
であり；
ｙが１〜６であり；
Ｘがハロゲンである化合物またはその重原子誘導体が提供される。
【００４０】
一部の実施形態では、式Ｉの重原子誘導体は、式Ｉａ、ＩｂまたはＩｃ
【化２８】
2016539322.tif 000032
の化合物である。
【００４１】
式Ｉ、Ｉａ、ＩｂまたはＩｃの化合物の一部の実施形態では、Ｒ１は
【化２９】
2016539322.tif 000033
である。一部の実施形態では、Ｒ１はＨである。
【００４２】
式Ｉ、Ｉａ、ＩｂまたはＩｃの化合物の一部の実施形態では、ｙは３である。
【００４３】
式Ｉ、Ｉａ、ＩｂまたはＩｃの化合物の一部の実施形態では、ＸはＣｌ、Ｉ、ＦまたはＢｒである。一部の実施形態では、ＸはＢｒである。
【００４４】
一部の実施形態によれば、式ＩＩ：
【化３０】
2016539322.tif 000034
の化合物であって、式中、
Ｒ４がＨまたは
【化３１】
2016539322.tif 000035
であり；
Ｒ５が
【化３２】
2016539322.tif 000036
であり；
ｚが１〜６であり；
Ｑがハロゲンである化合物またはその重原子誘導体が提供される。
【００４５】
一部の実施形態では、式ＩＩの重原子誘導体は、式ＩＩａまたはＩＩｂ
【化３３】
2016539322.tif 000037
の化合物である。
【００４６】
式ＩＩ、ＩＩａもしくはＩＩｂ、またはＩｃの化合物の一部の実施形態では、Ｒ４は
【化３４】
2016539322.tif 000038
である。一部の実施形態では、Ｒ４はＨである。
【００４７】
式ＩＩ、ＩＩａもしくはＩＩｂ、またはＩｃの化合物の一部の実施形態では、ｚは３である。一部の実施形態では、ＱはＦ、Ｉ、ＣｌまたはＢｒである。一部の実施形態では、ＱはＢｒである。
【００４８】
一部の実施形態によれば、式ＩＩＩ：
【化３５】
2016539322.tif 000039
の化合物であって、式中、
Ｒ６が
【化３６】
2016539322.tif 000040
である化合物またはその重原子誘導体が提供される。一部の実施形態では、重原子誘導体は式ＩＩＩａ
【化３７】
2016539322.tif 000041
の化合物である。
【００４９】
一部の実施形態では、式ＩＩ
【化３８】
2016539322.tif 000042
の化合物であって、式中、
Ｒ４がＨまたは
【化３９】
2016539322.tif 000043
であり；
Ｒ５が
【化４０】
2016539322.tif 000044
であり；
ｚが１〜６であり；
Ｑがハロゲンである化合物を作製する方法が提供される。
【００５０】
一部の実施形態では、この方法は、式ＩＩの化合物を生成するのに十分な条件下で、
【化４１】
2016539322.tif 000045
を、４−アミノアンチピリン試薬と反応させるステップを含み、式中、
Ｒ４はＨまたは
【化４２】
2016539322.tif 000046
であり；
Ｒ５は
【化４３】
2016539322.tif 000047
であり；
ｚは１〜６であり；
Ｑはハロゲンである。
【００５１】
一部の実施形態では、この方法は、緩衝液および酸化剤の存在下で、
【化４４】
2016539322.tif 000048
（すなわち、カテコールアミン）を４−アミノアンチピリン試薬と反応させて、式ＩＩの化合物を生成するステップを含む。一部の実施形態では、緩衝液は、約８から約１１のｐＨである。一部の実施形態では、緩衝液は炭酸水素アンモニウム緩衝液である。一部の実施形態では、緩衝液はリン酸塩緩衝液である。一部の実施形態では、酸化剤はＫ２［Ｆｅ（ＣＮ）６］である。一部の実施形態では、酸化剤は過酸化水素、硫酸銅または過硫酸ナトリウムである。本明細書で考察されているように、カテコールアミンおよび４−アミノアンチピリン試薬を互いに反応させて式ＩＩの化合物を形成させるのであれば、具体的な緩衝液および酸化剤は指定されない。
【００５２】
一部の実施形態では、４−アミノアンチピリン試薬は、式Ｉ：
【化４５】
2016539322.tif 000049
の化合物であって、式中、
Ｒ１がＨまたは
【化４６】
2016539322.tif 000050
であり；
ｙが１〜６であり；
Ｘがハロゲンである
化合物またはその重原子誘導体である。
【００５３】
一部の実施形態によれば、キットも提供される。一部の実施形態では、このキットは、４−アミノアンチピリン試薬、例えば、限定されないが本明細書に記載されているもの、１つまたは複数の分析物標準物質、１つまたは複数の内部標準物質、１つまたは複数の試料調製用カートリッジおよびプレート、生体マトリックス、溶媒、チューブ、ＨＰＬＣカラムならびに１つまたは複数の液体クロマトグラフィー緩衝液を含む。一部の実施形態では、４−アミノアンチピリン試薬は、式Ｉ：
【化４７】
2016539322.tif 000051
の化合物であって、式中、
Ｒ１がＨまたは
【化４８】
2016539322.tif 000052
であり；
ｙが１〜６であり；
Ｘがハロゲンである
化合物またはその重原子誘導体である。
【００５４】
様々な実施形態によれば、このキットは、緩衝液、１つまたは複数のクロマトグラフカラム、ならびに任意選択で、この方法またはアッセイの実行に有用な他の試薬および／または成分を含み得る。一部の実施形態では、このキットは、例えば、使用者が試料を加えることしか必要としないような均一アッセイを含み得る。一部の実施形態では、このキットは、較正もしくは標準化試薬または標準物質を含み得る。アッセイを行うために使用できる、または使用すべき機器設定に関係する情報も、キットに含まれ得る。一部の実施形態では、試料調製、動作条件、体積量、温度設定などに関係する情報がキットと共に含まれる。キットは、１つまたは複数の試薬容器および適切な説明書を含有する密閉容器にも包装され得る。電子媒体がキットに含まれることがあり、電子媒体に保存されている電子情報は、１つまたは複数のアッセイ、測定値、トランジションペア、操作説明書、操作実行用ソフトウェア、それらの組合せなどに関係する。様々な実施形態によれば、方法は、４−アミノアンチピリン試薬およびその中間体の合成のために提供され得る。一部の実施形態では、キットは、既知の濃度の既知のカテコールアミン分析物を含む、少なくとも１つの標準物質を含み得る。一部の実施形態によれば、キットは、カテコールアミン分析物を標識、定量および検出するための説明書を含み得る。
【００５５】
本明細書において考察されているように、この方法は、既知のカテコールアミンを含む標準物質を提供するステップをさらに含み得る。内部標準物質は、同一のマススペクトル分析で、カテコールアミンの量の検出および定量の両方に使用できる。例えば、２つの異なる標識された内部標準物質および試薬を、本明細書に記載されている方法に従って、試料を標識するために使用できる。試料の「標識」は、付加体の形成を指す。すなわち、カテコールアミンは、存在する場合、４−アミノアンチピリン試薬で標識される。標識した後で、試料を混合し、例えば、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析して、２つの異なる試料中に存在する分析物の定量情報を得ることができる。この方法の非限定的な例は、以下の通りである：
・試料１＋内部標準物質１→試料調製→試薬１を用いた標識
・試料２＋内部標準物質２→試料調製→試薬２を用いた標識
・上の反応物を混合し、分析する。これは二重の例であり、これは任意の他の多重フォーマットへと拡大できる。
【００５６】
例えば、試料がドーパミンを含有していた場合、内部標準物質１は：
【化４９】
2016539322.tif 000053
ドーパミン−１，１，２，２−ｄ４塩酸塩
であってよく、内部標準物質２は：
【化５０】
2016539322.tif 000054
ドーパミン１３Ｃ６
であってよい。第１の４−アミノアンチピリン試薬（試薬１）は、
【化５１】
2016539322.tif 000055
であってよく、第２の４−アミノアンチピリン試薬（試薬２は
【化５２】
2016539322.tif 000056
であってよい。異なる内部標準物質および異なる試薬を使用することにより、試料の混合物において異なる試料中のカテコールアミンの有無を判定し、また同一のまたは異なる試料中において同時に定量および検出できる。これにより、多くの試料を同時に分析し、ひいてはスループットを増加させる望外の利点が得られる。
【００５７】
一部の実施形態では、カテコールアミン分析物の相対濃度を得ることができる。他の実施形態では、既知の濃度の標準物質を使用することにより、カテコールアミン分析物の絶対定量を得ることができる。
【００５８】
様々な実施形態によれば、１つまたは複数のカテコールアミン分析物の相対定量のための方法は、１つまたは複数の分析物を標識し、続いて、マススペクトロメトリーを使用して分析するステップを含み得る。一部の実施形態によれば、１つまたは複数のカテコールアミン分析物および／またはその塩もしくは水和物は定量できる。本明細書において考察されているように、標識は４−アミノアンチピリン試薬またはその重原子誘導体であってよい。標識は、本明細書に記載されている反応条件に従って行うことができる。
【００５９】
カテコールアミン分析物の絶対定量は、標準物質が既知の濃度のカテコールアミン分析物を有する場合、相対定量について上に記載したものと同一の手段で行われ得ることを理解すべきである。また、カテコールアミン分析物および／またはカテコールアミン分析物の塩もしくは水和物が上で言及されている場合、いかなるカテコールアミン分析物を使用してもよいことを理解すべきである。
【００６０】
様々な実施形態によれば、１つまたは複数のカテコールアミンを含有する試料は、分析する前に、様々な方法により濃縮してもよい。濃縮方法は、試料の種類、例えば血液（鮮血または乾血）、血漿、血清、尿または唾液によって決まり得る。例示的な濃縮方法は、タンパク質沈殿、液液抽出、固液抽出、親和性捕捉／放出、抗体媒介濃縮および限外濾過を含み得るが、限定されない。他の濃縮方法、または２つもしくはそれ超の濃縮方法の組合せを使用してもよい。試料は、分析に適したいかなる種類の試料、例えば、血液（鮮血または乾血）、血漿、血清、尿または唾液でもよいが、それらに限定されない。
【００６１】
一部の実施形態では、カテコールアミン分析物の分析は、例えば、マススペクトロメーターにおける高エネルギー衝突を経由して、レポーターイオンを発生させるステップ、および定量のためにレポーターイオンの強度またはピーク面積を利用するステップを含み得る。例として、上に示されている付加体は、高エネルギー衝突（ＭＳＭＳ）中にニュートラルロスを起こして、荷電分析物種をレポーターイオンとして残すことができ、次いで、レポーターイオンをＭＳ３分析に供することができる。一部の実施形態では、付加体は、高エネルギー衝突の際にタグフラグメントを生成することができ、次いで、タグフラグメントをＭＳ３分析に供することができる。タグフラグメントの例は、式ＩＩＩの化合物として示されている。
【００６２】
本明細書に記載されているように、標準物質および試料の分析物は、一緒に混合し、分析して、試料中における分析物の濃度を判定してよい。分析は、混合物を分離して、分離した分析物を形成するステップ、分離した分析物を分析するステップを含み得る。使用できる分離方法として、ガスクロマトグラフ法、液体クロマトグラフ法、他のクロマトグラフ法、電気泳動法、電気浸透法、質量差分離方法などが挙げられる。例示的な実施形態では、液体クロマトグラフィーを使用して、混合物中の様々な分析物を分離し、このようにして分離した分析物を形成する。
【００６３】
一部の実施形態では、逆相カラムでクロマトグラフ分離を行ってよく、カラムから溶出するピークを後続の分析に供してもよい。一部の実施形態では、後続の分析は、マススペクトロメトリー、あるいはより詳細には、親娘イオントランジションモニタリング（ＰＤＩＴＭ）を含み得る。ＰＤＩＴＭの結果を比較することで、以下により詳細に記載されているように、試料中のカテコールアミン分析物の濃度が判定できる。ＰＤＩＴＭに関するさらなる詳細およびその使用は、公開出願ＵＳ２００６／０１８３２３８Ａ１で見出すことができ、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６４】
本教示の様々な実施形態に従って使用できる、様々な液体クロマトグラフィーおよびマススペクトロメトリー法、システムおよびソフトウェアとして、２００９年５月３１日に申請されている米国仮特許出願第６１／１８２，７４８号、および２００６年８月１７日に公開された米国特許出願第ＵＳ２００６／０１８３２３８Ａ１号に記載されているものが挙げられる。これらの参考文献の両方が、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６５】
本教示の態様は、以下の実施例を踏まえるとさらに理解でき、この実施例は、本教示の範囲を限定するとは決して解釈すべきではない。
【実施例】
【００６６】
（実施例１）
１００ｍＭの炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ８〜９）中のドーパミン塩酸塩（１ｍｇ／ｍＬ）および４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ、１ｍｇ／ｍＬ）の溶液０．５ｍＬに、Ｋ２［Ｆｅ（ＣＮ）６］の溶液（０．１ｍＬ、水中に０．２５ｍｇ／ｍＬ）を加え、混合した。そのように生成した紫色の溶液を、Ｃ１８（５００ｍｇ）カートリッジを通して濾過し、ＭＳ／ＭＳにより分析した。この反応により、以下のスキームに従って、以下の付加体が生成された：
【化５３】
2016539322.tif 000057
【００６７】
すべての化学物質は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから（form）購入した。反応は、４−ＡＡＰおよびＫ２［Ｆｅ（ＣＮ）６］水溶液の炭酸水素アンモニウム緩衝ドーパミン溶液への添加、ならびに紫色の４−ＡＡＰ−ドーパ付加体が形成されたら、周囲温度で５分間にわたりボルテックスすることを伴う。Ｃ１８カートリッジを通した脱塩後、ＱＴＲＡＰ（登録商標）５５００マススペクトロメーターで、直接注入モードを使用して親イオンおよび娘イオンについて生成物を分析した。
【００６８】
ｍ／ｚ３５３．１（ＭＨ＋）で親イオンが観察され、フラグメント化後にｍ／ｚ＝１５０．５、１５９．５、１８７．５、２０２．８（強）、２０４．７（強）、３２４．９および３３６．０で娘イオンが観察された。これらのトランジションはすべて、ＭＲＭモニタリングに使用できる。１つの構造特異的なフラグメントは、（観察質量＝２０４．７）
【化５４】
2016539322.tif 000058
と同定した。図１および２は、化学種を同定するスペクトルを示す。
【００６９】
本明細書で使用されている章の見出しは、体系化する目的のために過ぎず、記載されている主題を限定するとは決して解釈されない。
【００７０】
出願人の教示は、様々な実施形態と共に記載されているが、出願人の教示がそのような実施形態に限定されることを意図していない。それどころか、出願人の教示は、当業者により理解されるような、様々な代替物、変更物および均等物を包含する。
【００７１】
上記の説明は、様々な実施形態の例および具体的な詳細を提供するが、記載されている実施形態の一部の特徴および／または機能は、記載されている実施形態の範囲から逸脱せずに変更することを認めると理解される。上の説明は、本発明を例証することを意図しており、本発明の範囲は、本明細書に添付されている特許請求の範囲の言葉によってしか限定されない。本教示の他の実施形態は、本明細書の検討および本明細書で開示されている本教示の実践から、当業者に明らかである。本明細書および実施例は、例示に過ぎないとみなされることが意図されている。
【図１】
2016539322.tif 000087
【図２】
2016539322.tif 000088
【国際調査報告】
2016539322.tif 000089
2016539322.tif 000090