(57)【要約】微生物により引き起こされる若しくは悪化する疾患の治療方法、若しくは疾患の症状の治療方法、又は両方の組み合わせのための方法であって、治療有効量のバリア形成組成物を表面に投与することにより該疾患を治療すること、該疾患の症状を治療すること、若しくは罹患期間を短縮すること、又は両方の組み合わせを含む方法であり、ここで該表面は哺乳動物の粘膜を含み、該哺乳動物は、該微生物により引き起こされる若しくは悪化する該疾患に罹患しているか、又は該疾患の症状を発現している。該バリア形成組成物は抗菌剤を含む。該組成物を投与するにあたり、本方法は、バリア被膜に接触した微生物を殺滅又は中和する効果があるバリア被膜を該表面上に形成することを含む。疾患の症状を軽減する作用のある薬剤を有する組成物も含まれる。
2016504381.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物により引き起こされる若しくは悪化する疾患の治療方法、若しくは該疾患の症状の治療方法、又は両方の組み合わせのための方法であって、
治療有効量のバリア形成組成物を表面に投与することによって、該疾患を治療すること、該疾患の症状を治療すること、若しくは罹患期間を短縮すること、又は両方を行うこと、
ここで該表面は哺乳動物の粘膜を含み、該哺乳動物は、該微生物により引き起こされる若しくは悪化する該疾患に罹患しているか又は該疾患の症状を発現しており、
該バリア形成組成物は抗菌剤を含む；と
バリア被膜に接触した微生物を殺滅又は中和する効果があるバリア被膜を該表面上に形成することと
を含む、方法。
【請求項２】
前記表面の前記微生物の負荷量を効果的に低減させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記疾患又は該疾患の1つ若しくは複数の症状の期間、頻度、又は重症度を減少させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
咳、咽頭痛、及び発熱のうちの1つ又は複数の期間、頻度、又は重症度を減少させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記疾患が、インフルエンザ、ライノウイルス、細菌性上気道又は下気道感染症、ウイルス性上気道又は下気道感染症、連鎖球菌感染症、ブドウ球菌感染症、及び人工呼吸器関連肺炎からなる群より選択される1つ又は複数の疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記疾患が上気道感染症である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
1つ又は複数の前記症状が、以下のうちの少なくとも1つを含む、請求項３に記載の方法：
鼻水、吐き気、咳、頭痛、くしゃみ、副鼻腔の圧迫感、うずきと痛み、涙目、咽頭痛、鼻づまり、悪寒、嘔吐、倦怠感、疲労感、鼻漏、及び発熱。
【請求項８】
上気道感染症の複数の症状が、前記組成物を投与することにより治療される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
治療有効量の前記バリア形成組成物を、1回又は2回以上、少なくとも2回の連続する24時間の期間にわたって前記表面に投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
治療有効量の前記バリア形成組成物を、24時間以内に3回又は4回以上で、少なくとも2回の連続する24時間の期間にわたって前記表面に投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記投与ステップ後約1〜約6時間で、前記微生物の負荷量が約25%〜約99%減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記粘膜が、口腔粘膜、鼻粘膜及び咽頭粘膜のうちの1つ又は複数である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記バリア層が、約6〜約24時間の持続時間にわたる殺菌作用又は静菌作用を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記バリア形成組成物がスプレーにより施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗菌剤が広域スペクトル抗菌剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記微生物が、カンジダ、ニューモニア、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、レンサ球菌、ポルフィロモナス・ジンジバリス、化膿レンサ球菌、肺炎レンサ球菌、ストレプトコッカス・ミュータンス、黄色ブドウ球菌、エルシニア・エンテロコリチカ、アシネトバクター・バウマニ、サングイスレンサ球菌、ストレプトコッカス・オラリス、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・ゴルドニ、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス、フソバクテリウム・ヌクレアタム、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・グラブラータ、上気道感染症を引き起こす微生物、下気道感染症を引き起こす微生物、HIV、ライノウイルス、EBV、及びインフルエンザウイルスからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記微生物が、カンジダ、ニューモニア、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、レンサ球菌、ポルフィロモナス・ジンジバリス、化膿レンサ球菌、肺炎レンサ球菌、ストレプトコッカス・ミュータンス、黄色ブドウ球菌、エルシニア・エンテロコリチカ、アシネトバクター・バウマニ、サングイスレンサ球菌、ストレプトコッカス・オラリス、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・ゴルドニ、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス、フソバクテリウム・ヌクレアタム、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・グラブラータ、ＨＩＶ、ＥＢＶ、インフルエンザウイルス、上気道感染症を引き起こす微生物、下気道感染症を引き起こす微生物、センティペーダ・ペリオドンティイ、アイケネラコローデンス、腸内細菌、フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヌクレアタム、フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ポリモルフム、フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ビンセンティ、フゾバクテリウム・ペリオドンティカム、ポルフィロモナス・エンドドンタリス、プレボテラ（バクテロイデス）・メラニノジェニカ、プレボテラ・インテルメディア、バクテロイデス（バクテロイデス）・レーシェイ、ソロバクテリウム・ムーレイ、タンネレラ・フォーサイシア（バクテロイデス・フォーサイシア）、トレポネーマ・デンティコラ、クロストリジウム・ディフィシレ、百日咳菌、バークホルデリア、アスペルギルス・フミガーツス、ペニシリウム属、クラドスポリウム、HPV、感冒ウイルス、肺炎桿菌、豚コレラ菌、大腸菌（O157:H7）、毛瘡白癬菌、ライノウイルス、RSウイルス、ポリオウイルス1型、ロタウイルスWa株、A型インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス1型及び2型、並びにA型肝炎ウイルスからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗菌剤がモノ第4級アンモニウム化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記バリア被膜が、少なくとも約1時間の持続時間にわたって、該バリア被膜に接触した微生物を捕捉して殺滅する又は中和する効果がある、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記バリア形成組成物が、湿潤剤と、抗菌剤と、任意にガムとを含み、該ガムが存在する場合、該ガムが該バリア形成組成物全体の約0.01重量%〜約0.4重量%の量で存在する、請求項1に記載の方法。
【請求項２１】
前記バリア形成組成物が、以下の要件を満足する、請求項1に記載の方法：
約0.0001%≦C≦約0.4%；
約0.07%≦H≦約70%；かつ
0.0005%＜A
又は
約0%≦C≦約0.4%；
約55%≦H≦約70%；かつ
0.0005%＜Aであり、
ここで、全てのパーセンテージは全組成物の重量によるものであり；
Cは炭水化物ガム；Hは湿潤剤；そしてAは抗菌剤である。
【請求項２２】
前記バリア形成組成物が溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記バリア形成組成物を投与する前記ステップが、以下に対応して発生する、請求項１に記載の方法：
ａ．前記哺乳動物が存在する又は存在することになる汚染環境を特定すること（ここで、該汚染環境は、有害なウイルス、真菌、若しくは細菌で汚染されていると知られている、若しくは予想されるものである）；又は
ｂ．環境内で汚染事象が観察されること（ここで、前記哺乳動物は、高いリスク状態で、該環境に存在する又は該環境に存在することになる）。
【請求項２４】
前記バリア形成組成物が500cps未満の粘度を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項２５】
前記バリア形成組成物が、約6〜約24時間の持続時間にわたる殺菌作用又は静菌作用を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物が、ナノエマルジョン活性を介して微生物を殺滅すること又は抗接着メカニズムにより微生物を寄せ付けないことによって機能することに有効ではない、請求項1に記載の方法。
【請求項２７】
水溶液を含み、以下の要件を満足する、組成物：
約0.0001%≦C≦約0.4%；
約0.07%≦H≦約70%；かつ
0.0005%＜A
又は
約0%≦C≦約0.4%；
約55%≦H≦約70%；かつ
0.0005%＜A、
（ここで、全てのパーセンテージは全該組成物の重量によるものであり；
Cは炭水化物ガム；Hは湿潤剤；そしてAは抗菌剤である）；及び
感染症の症状を軽減する作用のある第二活性物質。
【請求項２８】
以下の要件が満たされている、請求項２７に記載の組成物：
約5%≦H≦約45%；かつ
0.05%＜A≦5%。
【請求項２９】
前記第二活性物質が、炭酸カルシウム及びマグネシウム、水酸化マグネシウム及びアルミニウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、及びC7H5BiO4、レスベラトロール、フラボノイド、アントシアニン、オオバコ種子殻、スルフォラファン、クサソテツ、イソフラボノイド、アルファリノレン酸、オメガ3脂肪酸、チョウセンニンジン、ニンニク油、チオール、カロチン、ユビキノール、アスコルビン酸、ポリフェノール、非特異的免疫刺激剤、内因性免疫刺激剤、デオキシコール酸、マクロファージ刺激物質、合成免疫刺激剤、マクロカイン、イミキモド、レシキモド、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ジサリチル酸ビスマス、メチルセルロース、植物繊維、グアーガム、ふすま、ステルクリア、イサゴール、メチルセルロースなどの吸収剤、オピオイド、ロペラミド塩酸塩、オランザピン、5-HT3受容体アンタゴニスト、ドーパミンアンタゴニスト、ドラセトロン、NK1受容体アンタゴニスト、アプレピタント、ヒスタミンH1受容体アンタゴニスト、シクリジン、ジフェンヒドラミン、カンナビノイド、大麻、ドロナビノール、ベンゾジアゼピン、ミダゾラム、ロラゼパム、抗コリン薬、ヒヨスチン、ステロイド、デキサメタゾン、プロピオン酸誘導体、ナプロキセン、イブプロフェン、酢酸誘導体、インドメタシン、エトドラク、エノール酸誘導体、フェナム酸誘導体、COX-2誘導体、アセトアミノフェン、スルホンアニリド、ジクロフェナク、カプサイシン、NSAIDs、イブプロフェン、トロラミンサリチル酸若しくはサリチル酸メチル、メンサシン、ゾストライクス、プソイドエフェドリン、フェニレフリン、エフェドリン、レボメタンフェタミン、ナファゾリン、オキシメタゾリン、フェニルプロパノールアミン、プロピルヘキセドリン、シネフリン、テトラヒドロゾリン、鎮咳薬、デキストロメトルファン、コデイン、ノスカピン、ブロムヘキシン、アセチルシステイン、去痰剤、粘液溶解薬、蜂蜜、アセチルシステイン、アンブロキソール、グイネフェシン、並びに上気道感染症若しくは上気道感染症の症状を治療する作用のある薬剤のうちの1つ又は複数から選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
微生物により引き起こされる若しくは悪化する疾患の治療方法、若しくは該疾患の症状の治療方法、又は両方の組み合わせのための方法であって、
治療有効量のバリア形成組成物を表面に投与することによって、該疾患を治療すること、該疾患の症状を治療すること、又は両方の組み合わせを行うこと、
ここで該表面は哺乳動物の粘膜を含み、該哺乳動物は、該微生物により引き起こされる又は悪化する該疾患に罹患しており、
該バリア形成組成物は、該微生物の細胞膜に結合して該細胞膜を破壊することにより細胞死を引き起こして作用する抗菌剤を含む；と
該疾患の期間、頻度、若しくは重症度を効果的に減少させること、又は該疾患の1つ又は複数の症状の期間、頻度、若しくは重症度を効果的に減少させることとを含み、
安全であって有害な副作用がない、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、2013年5月31日に出願した米国仮出願第61/829,608号（「Method for Reducing Microbial Load for Treatment of Disease Caused or Aggravated by Microorganisms or Relieving Symptoms Thereof.」）の優先権の利益を主張する。本願はまた、2013年7月30日に出願した米国仮出願第61/859,960号（「Method for Reducing Duration and Severity of Symptoms of Communicable Disease.」）の優先権の利益を主張する。本願はまた、2013年1月4日に出願した米国仮出願第61/749,195号（「Barrier-Forming Composition with Active Agents and Method.」）の優先権の利益を主張する。当該仮出願の内容全体を参照により本明細書に援用するものとする。
【０００２】
本開示は、微生物により引き起こされる若しくは悪化する疾患又は症状を治療又は緩和するための、バリア形成組成物及び粘膜表面の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
感染症を効果的に防ぐ組成物及びその他の処置法が長年必要とされてきた。これは、感冒ウイルスやインフルエンザウイルスなどのウイルスに特に当てはまる。また、細菌の変異と進化により、従来の抗生物質がその有効性を失いつつあることが懸念されている。免疫不全のある個体など、感染への高いリスクを有する個体に対する特別な懸念がある。
【０００４】
上気道感染症（URIs）は、インフルエンザウイルス及び複数の非インフルエンザウイルスに起因し得る。ごく少数（<10%）の例では、URIsは細菌に起因する。URIsはまた、高い罹患率と死亡率を伴うとみなされている（特にインフルエンザ感染に対して）。その点ついて、米国で10万人当たり約20人のインフルエンザ関連の死亡が、3100万人の通院と>20万人の入院と共に毎年報告されている。非インフルエンザウイルスに関連する感染症は、毎年2000万日の労働及び登校日数の損失の原因となることが知られている。URIsに起因する経済負担は、400億ドル〜870億ドルである。いくつかの予防オプション（例えば、インフルエンザワクチン、抗ウイルス薬）がインフルエンザ抑制のために存在している一方、その有効性および可用性は限られており、また重大な副作用がある場合もある。
【０００５】
多くの解決策が感染症の症状を治療するように設計されている一方、多くは代替効果を誘導することにより症状を隠しているにすぎず、身体がより迅速に感染から回復するのを直接補助したり、実際に病原菌を殺滅してはいない。いくつかのホメオパシー療法、薬草療法、及びビタミン治療は病原菌に対する身体の抵抗力を高めると言われているが、不確かで根拠の無い結果が得られる。実際に病原菌を殺滅するのは、あるとしてもごくわずかである。また、多くの組成物が有害微生物（細菌、ウイルス、及び真菌）の一つの群にのみ作用し、他の群は影響を受けていないままにする。抗生物質の場合には、真菌微生物は増殖する可能性もある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Yang, et al. "Concentrations and Size Distributions of Airborne Influenza A Viruses Measured Indoors at a Health Centre, a Day-Care Centre, and on Aeroplanes," J.R. Soc. Interface (Feb. 7, 2011)
【非特許文献２】Frank-Albert Pitten and Axel Kramer, "Efficacy of Cetylpyridinium Chloride Used as Oropharyngeal Antiseptic," Arzneim.Forsch./Drug Res.51 (II), pp588-595 (2001)
【非特許文献３】Department of Health and Human Services (Food and Drug Administration) (1994) Oral Health Care Drug Products for Over-the-Counter Human Use; Tentative Final Monograph for Oral Antiseptic Drug Products. Proposed Rules (21 CFR Part 356, Docket No. 81N-033A, RIN 0905-AA06). Federal Register 59:6084-124
【非特許文献４】Chandra et al. "In vitro Growth and Analysis of Candida Biofilms" Nature Protocols 3(12):1909-1924 (2008)
【非特許文献５】Harris et al. 2009 J. Biomed. Informal 42(2):377-381
【発明の概要】
【０００７】
一実施形態において、微生物により引き起こされる若しくは悪化する疾患の治療方法、若しくは該疾患の症状の治療方法、又は上記の組み合わせのための方法であって、治療有効量のバリア形成組成物を表面に投与することにより該疾患を治療すること、該疾患の症状を治療すること、若しくは罹患期間を短縮すること、又は上記の組み合わせを含む方法であり、ここで該表面は哺乳動物の粘膜を含み、該哺乳動物は、該疾患に罹患しているか、又は該微生物により引き起こされる若しくは悪化する該疾患の症状を発現している。該バリア形成組成物は抗菌剤を含む。該組成物を投与するにあたり、本方法はバリア被膜に接触した微生物を殺滅又は中和する効果があるバリア被膜を該表面上に形成することを含む。
【０００８】
一実施形態において、前記組成物は、以下の要件を満足する水溶液を含む：
約0.0001%≦C≦約0.4%；
約0.07%≦H≦約70%；かつ
0.0005%＜A
又は
約0%≦C≦約0.4%；
約55%≦H≦約70%；かつ
0.0005%＜Aであり、
ここで、全てのパーセンテージは全組成物の重量によるものであり；
Cは炭水化物ガム；Hは湿潤剤；及びAは抗菌剤である。該組成物は、感染症の症状を軽減する作用のある第二活性物質も含む。
【０００９】
一実施形態において、微生物により引き起こされる若しくは悪化する疾患の治療方法、若しくは該疾患の症状の治療方法、又は両方の組み合わせのための方法であって、治療有効量のバリア形成組成物を表面に投与することにより該疾患を治療すること、該疾患の症状を治療すること、又は両方の組み合わせを含む方法であり、該表面は哺乳動物の粘膜を含み、該哺乳動物は該微生物により引き起こされる若しくは悪化する該疾患に罹患している。該バリア形成組成物は、微生物の細胞膜に結合して細胞膜を破壊し、それにより細胞死を引き起こして作用する抗菌剤を含む。本方法は、該疾患の期間、頻度、若しくは重症度を効果的に減少させること、又は該疾患の1つ若しくは複数の症状の期間、頻度、若しくは重症度を効果的に減少させることを含み、安全であって有害な副作用がない。
【００１０】
本明細書で使用する不定冠詞の「a」及び定冠詞の「the」は、別段の指定がない限り「one or more（1つ又は複数の）」を意味する。
【００１１】
本明細書では「アイテム（item）」及び「装置（apparatus）」という用語を同義に使用する。
【００１２】
本明細書で使用する「治療する（treat）」又は「治療（treating）」という用語は、症状を軽減又は緩和させること又は罹患期間を短縮させることを意味する。
【００１３】
本明細書で使用する「又は」という用語は、別段の指定がない限り排他的な意味を持つものではない。
【００１４】
本明細書で使用する「個体（individual）」又は「哺乳動物（mammal）」という用語は、一般に哺乳動物として定義されるヒト又は動物を意味する。
【００１５】
「病変（lesion）」という用語は、「崩壊（disruption）」とほとんど同じ意味として本明細書で使用されている。
【００１６】
本明細書で使用する「遮断する（block）」又は「遮断（blocking）」という用語は、捕捉することで通過を遮断するという意味を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】バリア形成組成物の一実施形態における、提案された抗菌活性機序を示す図である。
【図２】実験例2において記載する、粘膜表面上のバリアの形成を示す概略図である。
【図３】実験例27〜28において記載する、EHOMアッセイの上部チャンバ及び下部チャンバ内における微生物増殖の評価方法を示す概略図である。
【図４】実験例27〜28において記載する、EHOMアッセイの上部チャンバ及び下部チャンバ内の微生物増殖を示す寒天培地プレートの写真を示す図である。
【図５】実験例31〜32における、バリア形成組成物で処理済み及び未処理の操作ヒト口腔粘膜（EHOM）の拡大断面写真を示す図である。
【図６】実験例33〜40において記載する、未処理のEHOM上、又は例示的なバリア形成組成物で処理したEHOM上における微生物の増殖と、その後のC. albicans（カンジダ・アルビカンス）への感染を示す写真を示す図である。
【図７】実験例33〜40において記載する、未処理のEHOM上、又は製剤で処理したEHOM上における微生物の増殖と、その後のS. mutans（ストレプトコッカス・ミュータンス）への感染を示す写真を示す図である。
【図８】実験例33〜40において記載する、例示的なバリア形成組成物で処理したEHOMの（下部チャンバから収集した）「フロースルー」培地に由来する微生物の増殖を示す写真を示す図である。
【図９】実験例40〜47において記載する、食塩水（対照群）又は例示的なバリア形成組成物で処理したEHOMによるLDH放出と、その後の（A）C. albicans、又は（B）S. mutansへの感染を示すグラフである。
【図１０】実験例63〜69において記載する、細菌に対するバリア形成組成物の事後抗菌効果を示すグラフである。
【図１１】実験例71〜76において記載する、未処理又はバリア形成組成物で処理済みのS. sanguis、 C. albicans及びS. mutansを示す走査型電子顕微鏡写真を示す図である。
【図１２】実験例77〜79において記載する、細菌及び真菌によって形成されるバイオフィルムに対する例示的なバリア形成組成物の活性を示すグラフである。
【図１３】実験例80〜81において記載する、1分間の曝露後の微生物のバイオフィルムに対する例示的なバリア形成組成物の活性を示すグラフである。
【図１４】実験例85〜86において記載する、インフルエンザ（H1N1）に感染したMDCK細胞の細胞変性効果（CPE）に対する例示的なバリア形成組成物の効果を示す蛍光顕微鏡写真を示す図である。
【図１５】実験例85〜86において記載する、H1N1ウイルスに対する例示的なバリア形成組成物の効果を示す蛍光顕微鏡写真を示す図である。
【図１６】実験例87〜88において記載する、バリア形成組成物で処理済み及び未処理の感染細胞中のインフルエンザウイルスのレベル（定量PCRで判定）を示すグラフである。
【図１７】実験例89〜91において記載する、防腐剤及びインフルエンザウイルスに対する抗菌剤（CPC）を用いて又は用いずに調製した例示的なバリア形成組成物の直接抗ウイルス活性（定量PCRで判定）を示すグラフである。
【図１８】H1N1ウイルスに対する例示的なバリア形成組成物の6時間中の活性を示す図であり、パネル（A）は未処理の対照群と比較したウイルス増殖の阻害率を示すグラフであり、パネル（B）及び（C）は、（B）が未処理の細胞の顕微鏡写真、（C）がバリア形成組成物で処理した細胞の顕微鏡写真を示す図である。
【図１９】実験例94〜96において記載する、HIVに対する製剤の活性を示すグラフである。
【図２０】実験例97において記載する、エプスタインバールウイルス（Epstein-Barr Virus：EBV）に対する実験例8の活性を示すウエスタンブロットを示す図である。
【図２１】例示的なバリア形成組成物の口腔粘膜表面被覆能力を証明する写真を示す図である。
【図２２】実験例162〜163において記載する、例示的なバリア形成組成物に1分間晒した後の細菌増殖の経時的顕微鏡検査結果の写真を示す図である。画像はそれぞれ曝露後20分後、120分後、又は360分後の細菌増殖を示す。
【図２３】実験例164〜166において記載する、健康な人間の口腔微生物負荷量に対する例示的なバリア形成組成物の単回投与の効果を示すグラフであり、ベースラインと比較した（A）CFUにおける微生物負荷量、及び（B）微生物負荷量の減少（%）を示す。
【図２４】実験例167〜169において記載する、3人の健康な成人の口腔細菌レベルに対する例示的なバリア形成組成物の5日間にわたる影響を示すグラフである。
【図２５】実験例170〜198において記載する、31人の健康な被験者において例示的なバリア形成組成物を5日間使用した後の、口腔内の微生物負荷量に対する該バリア形成組成物の影響を示すグラフである。
【図２６】実験例170〜198において記載する、代表的な3人の研究参加者から得た口腔試料中の微生物負荷量を示すグラフである。
【図２７】実験例199〜205において記載する、例示的なバリア形成組成物により形成されたバリアを越える微生物の浸透を評価するためのin vitroフィルター挿入ベースモデルを説明する概略図である。
【図２８】実験例219〜224において記載する、PBS（対照、A、C、E）及び実験例7のバリア形成組成物（B、D、F）で処理したシリコーン・エラストマーディスク表面のMRSAバイオフィルムの増殖を示す写真である。
【図２９】実験例252のバリア形成組成物の異なる時間間隔（a）、（b）、及び（c）、並びに実験例253（d）のバリア形成組成物の実施形態で処理した細胞単層を示す写真である。
【図３０】実験例252のバリア形成組成物の異なる時間間隔（a）、（b）、及び（c）、並びに実験例253（d）のバリア形成組成物の実施形態で処理した細胞単層を示す免疫蛍光の写真である。
【図３１】実験例255に対応する水洗浄後の試験組成物と比較物を示すグラフである。
【図３２】実験例256の結果に対応するグラフであり、慢性URIを患う個体における微生物負荷量（log CFUs、好気性）の中央値が、プラセボグループのそれらと比較してアクティブグループで低かったことを示している。
【図３３】実験例256の結果に対応するグラフであり、実験例256臨床試験の期間にわたる、プラセボ及びアクティブグループの3UREsの確率を示している。
【図３４】実験例256に対応するグラフであり、別々の治験訪問で分析された、プラセボ及びアクティブグループの3UREsを患う参加者の口腔微生物負荷量の分布を示している。
【図３５】実験例256に対応するグラフであり、別々の治験訪問で、3UREsを患う個体間で比較された好気性微生物のlog CFUsの中央値（+/-標準誤差）を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本願は、個体（哺乳動物）の微生物負荷量を低減させるための安定なバリア形成組成物を開示し、それは疾患の予防及び／若しくは既存の疾患を治療すること、又は疾患の症状の期間、頻度、若しくは重症度を減少させるのに有効である。一実施形態において、バリア形成組成物は、治療有効量において、哺乳動物に無毒であり安全である。「安全」という用語は、この文脈において、正常な皮膚や粘膜細胞若しくは創傷に損傷を与えることはなく、又は創傷治癒速度の低下を引き起こすことはないということを含む。さらに前記組成物は、有害な副作用がない。
【００１９】
バリア形成組成物は、活性化病原性微生物が貫通するのを阻害するバリア被膜を形成する。バリア形成組成物は、静菌作用又は殺菌作用により微生物の増殖を長時間にわたって阻止する及び既存の微生物を殺滅する抗菌成分を含む。一実施形態において、抗菌剤は、微生物の細胞膜に結合して細胞膜を破壊し、それにより細胞死を引き起こすことで作用する。結合したバリア被膜と抗菌剤は、相乗的に作用して、処理表面に既存する微生物を補足して殺滅する若しくは中和する、並びに／又はバリア形成組成物の塗布が実施された後に、バリア上部、すなわちバリア被膜の露出している表面に付着する微生物を補足して殺滅する若しくは中和する。前記組成物は、長時間持続し、抗菌剤単独よりも非常に強力な抗菌機能を提供する。
【００２０】
理論に縛られるものではないが、バリア形成組成物は、口腔咽頭粘膜、その他粘膜、又は開いた病変部の、病原菌負荷量が高い領域の微生物負荷量を減少させることで、症状を緩和させる及び／又は、哺乳動物が既に感染している、微生物により引き起こされる若しくは悪化する疾患又は疾患の症状を治療するよう作用すると考えられる。そうすることで、身体は、その自然防御能を、既にその個体に感染している疾患と闘うことに集中させることができる。この目的のための前記組成物の有効性は、病気の症状（頻度、重症度、及び／又は期間）の減少、並びに感染の期間及び／又は重症度の減少によって証明することができ得る。基本的に、口腔咽頭粘膜上の接触可能な病原菌を殺滅することにより、前記組成物は、身体の資源が感染症と闘うための補助として作用し、身体がその資源を、全身に散財して人工抗菌剤に接触しづらい有害微生物に集中させることを可能にする。
【００２１】
一実施形態において、本組成物の活性は、身体に反対作用効果を誘導し、症状を曖昧にする又は覆い隠すことによってのみ作用する組成物―例えば、シクロオキシゲナーゼ（COX）の阻害若しくはヒスタミン作用の抑制により痛みを抑制又は麻痺させて熱を下げる活性のある感冒及びインフルエンザ治療薬と区別される。そのような治療薬は、どれも効果的に病原菌を殺滅して症状を治療することはなく、根本的な疾患を治療することもない。抗生剤及び抗ウイルス剤は、粘膜治療薬ではなく、バリア形成組成物ではなく、またウイルス、細菌、及び真菌を共に殺滅できる広域スペクトル抗菌剤ではない。
【００２２】
本明細書に開示する組成物は、広範囲の病原体（細菌、ウイルス、及び真菌）を長時間にわたり殺滅するのに非常に効果的であると証明された。理論に縛られるものではないが、バリア形成組成物の作用機序は、まず形成したバリア被膜内で細菌を捕捉し、その後抗菌活性成分によって殺滅する、相乗的な二重作用機序に基づくものである。一実施形態において、バリア形成組成物は、親水性でなく、理論に縛られるものではないが、持続的有効性を増強することが理論付けられている。
【００２３】
後述の実施例に示すように、少なくとも下記の10種類のアプローチを使用して、本発明のバリア形成組成物の特性並びに多種多様な伝染病の鎮静及び微生物負荷量の低減に対する有効性の評価を行った。（1）in vitro抗微生物感受性テスト、（2）in vitroタイムキルアッセイ、（3）in vitroバイオフィルムモデル、（4）in vitroフィルターインサートベースモデル、（5）in vivo様操作ヒト口腔粘膜（EHOM）モデル、（6）電子顕微鏡評価、（7）疎水性アッセイ、（8）物理化学的適合性アッセイ、（9）単層のヒト細胞株を使用した細胞培養ベースモデル、及び（10）ヒト臨床試験。
【００２４】
微生物により引き起こされる若しくは悪化する疾患を治療する方法、該疾患の症状を治療する方法、若しくは該疾患の期間、若しくは重症度を減少させる方法、又は上記の組み合わせの一実施形態において、バリア形成組成物は治療有効量で表面に投与され、ここで該表面は、個体の口腔粘膜、鼻粘膜、若しくは咽頭粘膜、又は皮膚病変部を含む。バリア形成組成物は、一旦投与されると、少なくとも約1時間の持続時間にわたってバリア被膜に接触した微生物を捕捉して殺滅する又は捕捉して中和する効果があるバリア被膜を表面上に形成し、それにより表面の微生物負荷量を効果的に減少させ、身体が内在の病原体戦闘資源を必要とされる他の場所に集中させることを可能にする。
【００２５】
本方法により治療される疾患には、哺乳動物の体が内在の免疫系反応を介して対抗することができるような疾患が含まれる。これには、例えば、インフルエンザ、ライノウイルス、細菌性上気道／下気道感染症、市中感染の連鎖球菌感染症、市中感染のブドウ球菌感染症、及びこれら疾患の院内感染症、並びに人工呼吸器関連肺炎が含まれる。一実施形態において、疾患は、伝染性微生物によって引き起こされる全身性疾患である。
【００２６】
一実施形態において、症状の治療又は緩和方法のための投与計画は、治療有効量のバリア形成組成物を分割用量で、例えば約1〜12時間毎、約2〜8時間毎、又は約4〜6時間毎に投与することを含む。別の実施形態において、治療有効量のバリア形成組成物は、約2〜12時間毎、例えば約3〜8時間毎、又は約4〜6時間毎に表面に投与される。「約2〜12時間毎」に投与するとは、1回の治療有効用量が投与された後、次の用量が約2時間後〜最長約12時間後に投与され、追加の用量が服用される場合は、その後に約2時間〜最長約12時間単位で投与されることを意味する。
【００２７】
一実施形態において、バリア形成組成物は、治療有効量で、24時間以内に3回又は4回以上を、2回の24時間の期間又はそれ以上にわたって、例えば、4〜12回、又は6〜10回、を6〜10日にわたって、又は7〜30日にわたって投与される。別の実施形態において、症状の治療方法又は緩和方法は、疾患の症状が発現しなくなるまで、又は他の医療処置や方法によって哺乳動物が疾患を患っていないと診断されるまで、続けられる。別の実施形態において、3回又は4回以上の用量は、日照時間内にのみ又は個体が起きている時間内にのみ、例えば6 AM〜6 PM、又は9 PM〜5 PMに投与されてもよい。一実施形態において、個体は、職場や、高い病原体負荷量が予想される別の人が集まる公共の場などの高いリスク状態がある場所で、そこにいる間に保護を提供する投与計画に従うことができる。
【００２８】
一実施形態において、哺乳動物が疾患の症状を発現していることに対応して、最初の投与量が投与されてもよい。例えば、哺乳動物は、本方法の投与ステップの最初の反復の前に、症状を最大約48時間、例えば約1〜36時間、約3〜24時間、又は約6〜12時間発現している。
【００２９】
症状には、例えば、以下のうちの少なくとも1つが含まれる：鼻水、吐き気、咳、頭痛、くしゃみ、副鼻腔の圧迫感、うずきと痛み、涙目、咽頭痛、鼻づまり、悪寒、嘔吐、倦怠感、疲労感、鼻漏、及び発熱。そのような症状は、治療計画を開始する時期を決定するのに利用されてもよく、治療計画を開始した後に期間、重症度、又は頻度が減少する症状であり得る。一実施形態において、症状の改善は、最初の治療薬が投与された約1時間〜約2日後、例えば約0.5日〜1.5日後、又は約8時間〜24時間後に現れ得る。症状の改善は、最初の1回分〜9回分の投薬の後、例えば2回分〜6回分、3回分〜6回分の投薬の後に現れ得る。一実施形態において、咳及び咽頭痛の症状は、期間若しくは重症度の減少があり、並びに／又はそれらの頻度は減少する。
【００３０】
一実施形態において、哺乳動物は、例えば1日3回の前記組成物の投与による持続的な投与計画、例えば、約1〜90日間、若しくは約2〜75日間、若しくは約1〜10週間、若しくは約22日間〜7週間、又は約90日よりも長い間にわたって、1日3回の前記組成物の服用に従う。本実施形態において、微生物負荷量の減少、症状の期間、頻度、及び重症度の更なる改善、並びに疾患の重症度若しくは期間の減少、又は疾患の予防が、実現され得る。また、二次感染を予防することもある。その上、疾患予防効果は、投与計画終了後も継続することもある。例えば、疾患からの予防は、投与計画終了後最大約3週間、例えば投与計画終了後約2週間又は1週間後にまで継続することもある。
【００３１】
投与計画は、異なる高いリスク状態にある人によって、異なってもよい。例えば、既に疾患に罹患している個体、及び感染又は感染からの合併症の高いリスクがある個体、例えば免疫不全の患者などは、積極的に一日中、毎日、そして特に汚染環境にいるとき、又は汚染事象を観察した際に、バリア形成組成物を投与してもよい。既に疾患に罹患している個体、及び高いリスクがある個体、又は手術を受ける人などの他の短期間の高いリスク状態がある個体は、病院などの高い病原体リスク（汚染）環境にさらされる前に又はさらされている間に、バリア形成組成物を投与してもよい。
【００３２】
以下の実施例に示すように、このような投与計画は、ヒト臨床試験での微生物負荷量を実質的に減少させることが示されている。in vivo試験では、継続的な投与方法に従う人の約80%が、5日間の治療で約50%以上の口腔内微生物負荷量の減少を示すことが示された。
【００３３】
一実施形態において、本明細書に記載されている中でも、例えば上気道感染症を引き起こす微生物、感冒ウイルス、又はインフルエンザウイルスを含む空気中の病原体などの微生物によって引き起こされる疾患を予防するために、前記組成物は投与される。以下の実施例に示すように、前記組成物の一実施形態はヒトの80%で有効であり、1日3回の前記組成物の投与の6日目に、約50%以上の口腔内微生物負荷量の減少を示す。一実施形態において、前記組成物は、投与ステップ後に口腔内微生物負荷量を65%〜88%減少させる効果もある。
【００３４】
実験例256の臨床試験は、微生物負荷量減少のデータを更にサポートし、毎日の投与計画に従うことにより疾患を患うリスクが大幅に減少されることを示す。
【００３５】
例えば、一実施形態の前記組成物を服用することにより、例えば、上記の延長した投与計画では、哺乳動物は、更なる保護を受ける、すなわち、感染及び感染性微生物により引き起こされる疾患からある程度予防される。一実施形態において、疾患に感染するリスクは、投与計画に従うことでプラセボと比較して約60%までダウンし、例えば、同疾患又は追加疾患による再感染を含む、疾患からの感染の頻度の減少は、プラセボと比較して約55%〜25%、又は約50%〜1%であった。
【００３６】
実験例256の臨床試験データは、病気になる可能性を実質的に減少させる（すなわち疾患の予防となる）前記組成物の有効性をサポートするデータだけでなく、疾患、特に上気道疾患の症状の期間、頻度、及び重症度も減少させる有効性をサポートするデータも提供する。また、既に罹患していて症状緩和の治療を受けている人も、二次疾患を患うのを回避するため、特に免疫系が既存の疾患との闘いに既に酷使されている場合、前記組成物の予防的側面から恩恵を受けることがある。
【００３７】
前記組成物で処理される粘膜は、例えば鼻咽頭（上咽頭）、中咽頭（咽頭）又は咽喉頭（下咽頭）のような口腔、鼻腔又は喉頭すなわち咽頭腔の粘膜表面であってよい。外耳道と鼻腔を含むが、これらに限定されない哺乳動物の他の開口部の粘膜を処理することにより有益な結果が得られる場合もある。
【００３８】
一実施形態において、バリア形成組成物は皮膚又は粘膜病変部に投与される。その後の投与量は、上述の投与間隔に従い塗布される。一実施形態において、病変部が治癒したとき、すなわち病変部が新しい皮膚又は粘膜組織で覆われたとき、又は疾患が治癒したとき若しくは症状の発現が見られなくなったときに、皮膚又は粘膜病変部への投与計画は終了される。
【００３９】
一実施形態において、バリア形成組成物を投与するステップが次のいずれかの条件に対応して発生する：（a）微生物により引き起こされる又は悪化する疾患と診断された場合、（b）疾患の症状を感じる場合、又は（c）（a）及び（b）の後、並びに高い微生物負荷量への曝露が発生する汚染環境若しくは汚染事象との接触の直前又はその間。場合によって、癌やAIDsが進行した段階の人、又は危篤状態の若しくは生命を脅かす状態にある個体などでは、最小の投与間隔に従わない場合がある。一実施形態において、投与ステップの約1〜48時間前、例えば約2〜36時間前から、又は最初に発現した疾患の症状の約24時間後から、治療を受ける哺乳動物は症状を発現している。別の実施形態において、哺乳動物は前記組成物の投与の前から、1週間より長い期間、又は1ヶ月より長い期間を含む長期間、症状を発現している。
【００４０】
汚染環境には、高い微生物負荷量への曝露の高いリスクが発生するような、後述する環境が含まれる。
【００４１】
汚染事象には、個体のくしゃみ、咳、若しくは嘔吐、又は更に一般的に、体液若しくは体から出る物質が付着する場合などが含まれる。一実施形態において、汚染事象は個体の近くにあり、投与反応を誘発する。個体の近くとは、同じ部屋、乗り物、又は個体の約10ヤード以内にいることと定められてよい。
【００４２】
バリア形成組成物は、高いリスク状態にある個体に特に有用である。例えば、有害なウイルス、細菌、又は真菌微生物にさらされる高いリスク；ウイルス、細菌、又は真菌微生物による感染の高いリスクを引き起こす状態；ウイルス、細菌、又は真菌微生物に起因する感染から生じる重い合併症の高いリスクなど。例えば、本明細書に記載の方法及び組成物は、ヒト若しくはより一般的には哺乳動物が、損傷した皮膚又は粘膜を有する場合、又は免疫抑制状態に陥るような条件を有する場合、又はその他の状況で感染の危険性がある場合に、特に有用であり得る。そのような人は、全体的な微生物負荷量の継続的低減、疾患の予防、及び疾患の期間若しくは重症度の低減、又は症状の期間、頻度、若しくは重症度の低減のための反復投与でのバリア形成組成物の投与から恩恵を受けることがある。一実施形態において、投与は、汚染環境の特定又は汚染事象の観察に応じるものであってよい。
【００４３】
ウイルス、細菌、又は真菌微生物による感染の高いリスクを引き起こす様々な状態には、疾患若しくは薬物治療により機能が低下した免疫系を有すること、臓器移植、皮膚移植、若しくは骨髄移植などの移植のレシピエントであること、30日以内に手術を受けたこと、人工呼吸器治療を受けていること、HIV、AIDS、嚢胞性線維症、癌、COPD、若しくは糖尿病を患っていること、皮膚や粘膜に病変があること、又は皮膚や粘膜の病変を引き起こす状態にあることが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
また、特定の病状は、皮膚又は粘膜病変の発生率の増加を引き起こすことが知られている。例えば、HIV及びAIDSを含むがこれらに限定されない性病、癌、乾癬、座瘡、糖尿病、並びに狼瘡など。
【００４５】
高いリスク状態は、ウイルス、細菌、又は真菌微生物により引き起こされる感染から生じる重い合併症の高いリスクに起因する場合がある。高いリスクは、例えば、概して免疫不全であること、長期ステロイド治療を受けていること、19歳以下で長期アスピリン治療を受けていること、病的肥満であること、妊娠していること、65歳以上であること、2歳未満の小児、HIV、AIDS、癌、代謝性疾患、ミトコンドリア障害、肝障害、腎障害、喘息、血液疾患、内分泌疾患、心臓疾患、慢性肺疾患、脳性麻痺、てんかん、脳卒中、筋ジストロフィー、および脊髄損傷の状態の1つ又は複数に起因することがあるが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
別の高いリスク状態において、個体は長時間毎日、又は1週間に少なくとも4若しくは5日、長時間有害微生物にさらされる高いリスクを有する。この高いリスク状態において、個体は一度有害な微生物にさらされれば感染の高いリスクも有する必要はなく、又は一度感染されれば合併症の高いリスクも有する必要はないが、代わりに有害な微生物及び／又はより高い微生物負荷量へさらされるリスクが高い。例えば曝露のリスクは、飛行機、電車、バス、船、ボート、学校内、図書館、寮、ホテル、アパートの建物、裁判所、矯正施設、空港、レストラン、映画館、劇場、ショッピングモール、小売店、特別イベントアリーナ、特別イベントスタジアム、宗教に集まる場所、老人ホーム、病院、その他の医療施設、オフィス、若しくはデイケア施設に個体が住む又は働いていることに起因して上昇する。
【００４７】
汚染環境としては、例えば公共交通機関の車両、公共の集合場所、病気であることが知られている又は予想される哺乳動物を収容した部屋若しくは車両、又は病気であることが知られている又は予想される哺乳動物の近傍が挙げられる。汚染環境として一般に認識される航空機、保育所、保健センター等の環境に関する更なる情報は、Yang, et al. "Concentrations and Size Distributions of Airborne Influenza A Viruses Measured Indoors at a Health Centre, a Day-Care Centre, and on Aeroplanes," J.R. Soc. Interface (Feb. 7, 2011)に開示されている（当該文献の内容を参照により本明細書に援用する）。
【００４８】
より具体的には、一実施形態において、公共輸送車両は例えば航空機、バス又はタクシーであり得る。公共の集合場所としては、例えば診療所、病院、学校、保育所、教会、ホテル又はレストランが挙げられる。病気であることが知られている又は予想される哺乳動物の近傍としては、例えば当該哺乳動物の半径1フィート（30.48cm）以内、又は当該哺乳動物と自動車に同乗する場合が挙げられる。公共の航空機は、多くの場合汚染環境として特定される環境の一般的かつとりわけ注目すべき例として挙げられる。航空会社に勤務するような人、又は週2~3回など非常に頻繁に公共の飛行機で旅行するような人は、微生物への曝露が多いことに起因する高いリスク状態にあると考えることができる。
【００４９】
一実施形態において、高いリスクは、人工呼吸器の使用（人工呼吸器に関連し、患者と接触する医療機器を含む）などの活動関連治療に関与することに起因することがある。本実施形態において、汚染アイテムとしては医療機器、又は歯科装置が挙げられる。人工呼吸器などの医療機器、又は歯科装置に接することは、高い曝露のリスク及び高い感染のリスクの両方とみなされてもよい。個体が既に免疫不全状態にあり、さらに病院内若しくは他の医療施設環境内にいる場合の院内感染も、曝露の高いリスク並びに感染の高いリスク及び重い合併症の高いリスクの一方または両方とみなされてもよい。
【００５０】
in vitro試験により、バリア形成組成物の諸実施形態が約2時間以上、約6時間以上、約16時間以上、約24時間以上を含む長時間にわたり全ての活性細菌がバリアを貫通するのを防止することが証明された。in vitro試験から、バリア形成組成物の諸実施形態に曝露したウイルスでは、増殖が約2日間以上（インフルエンザ等）〜約9日間以上（HIV等）阻止され得ることが分かり、その後もウイルス数は例えば約2〜3日間の長期間にわたってMICを下回ることが示された。インフルエンザウイルスに対する阻害活性は最大48時間観察された。
【００５１】
バリア形成組成物は、臨床試験において、ヒトの微生物負荷量を減少させる活性を示した。例えば、投与ステップの約1〜約6時間後からの、約25%〜約99%の、例えば約33%〜約95%、又は約50%〜約90%の驚くほど効果的な微生物負荷量の減少が実証された。諸実施形態において、微生物負荷量は投与ステップの約1〜約6時間後に約10%より多く、約25%より多く、又は約70%より多く減少することがある。その上、微生物負荷量のこれらの減少範囲は、開示の投薬計画と長期間持続可能である。
【００５２】
図1に示すバリア形成組成物の提案される機序を示す一実施形態において、バリア形成組成物は抗ウイルス活性をもたらす。ウイルスが細胞に接触すると宿主細胞上の受容体に結合する。5〜6時間が経過すると、ウイルスは宿主細胞によって取り込まれ宿主細胞内で増殖し、他の宿主細胞に感染する追加のウイルス粒子を発生させる細胞溶解を誘発する。
【００５３】
対照的に、バリア形成組成物で処理した細胞では、保護バリアは宿主細胞の表面上にある。バリアは、細胞及び細胞上の受容体を覆うのに十分なほど厚く、ウイルス粒子が細胞受容体に結合するのを阻止する。このため感染及び溶解も防止される。バリア形成組成物は、約1時間以上、約2時間以上、約6時間以上、約16時間以上、約16時間〜約24時間、又は約24時間以上という長い持続時間にわたってバリアを保持し、それにより宿主細胞を保護し感染を予防する。殺菌作用又は静菌作用も、約2時間以上、約6時間以上、約16時間以上、約24時間以上、又は約48時間以上という長い持続時間にわたって保持され、それにより微生物を殺滅し、微生物負荷量を減少させる。これら持続はウイルス、細菌、及び真菌に適用可能である。生きている有害微生物による細胞受容体との接触を防止することで、身体に内在の感染抵抗メカニズムが確保されて体内に既存の感染に集中できることが理論化されている。
【００５４】
有害微生物とは、微生物に起因する伝染病などの疾患を引き起こす又は悪化させることが知られている微生物、例えばカンジダ属（例えばC. albicans（カンジダ・アルビカンス）、 C. glabrata（カンジダ・グラブラータ）、 C. krusei（カンジダ・クルセイ）, C. tropicalis（カンジダ・トロピカリス）等）、ブドウ球菌種（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、MRSAを含む）、連鎖球菌種（例えばS. sanguis（ストレプトコッカス・サングイス）、S. oralis（ストレプトコッカス・オラリス）、S. mitis（ストレプトコッカス・ミティス）、S. salivarius（ストレプトコッカス・サリバリウス）、S. gordonii（ストレプトコッカス・ゴルドニ）、S. pneumoniae（肺炎レンサ球菌））、アシネトバクター・バウマニ、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス、フゾバクテリウム・ヌクレアタム等の微生物、上気道感染症を引き起こす微生物、下気道感染症及び感冒（ライノウイルス）を引き起こすその他の微生物、及びインフルエンザウイルス、及びニューモニア、ポルフィロモナス・ジンジバリス、エルシニア・エンテロコリチカ、アシネトバクター・バウマニ、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス、クロストリジウム・ディフィシレ、百日咳菌、バークホルデリア、アスペルギルス・フミガーツス、ペニシリウム属、クラドスポリウム、肺炎桿菌、豚コレラ菌、大腸菌（O157:H7）、毛瘡白癬菌、ライノウイルス39型、RSウイルス、ポリオウイルス1型、ロタウイルスWa株、A型インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス1型及び2型、及びA型肝炎ウイルスであり、これらに起因する感染症の処理及び予防である。一実施形態において、本明細書に記載のバリア形成組成物並びに治療方法は、例えばヒト免疫不全ウイルス（HIV）、単純ヘルペス又はヒトパピローマウイルス（HPV）に起因する感染症などの性感染症の治療などに有用である可能性がある。
【００５５】
バリア形成組成物は、例えば約30nm以上、例えば約100nm（HIV；球状）、約100nm〜約300nm（インフルエンザ；細長球状）、約120nm〜約260nm（EBV；球状／ディスク状）、約30nm（ライノウイルス；球状）の直径を有する微生物に対して有効性を示した。したがって、バリア組成物は約30nm又は約30nm超の直径を有する他の微生物に対しても有効性を有することになる。
【００５６】
バリア形成組成物は、根絶させるのがかなり困難であるバイオフィルムへの、強力で目覚ましい抑制活性まで示した。一実施形態において、本願の方法はバリア形成組成物を粘膜や病変部に形成したバイオフィルムに投与することを含む。
【００５７】
微生物は空気中の微生物であってもよい。一実施形態において、微生物とは、伝染病を引き起こすようなものである。一実施形態において、微生物とは、アレルギー反応又は歯科疾患、例えば、虫歯（カリエス）、歯肉炎、又は季節性アレルギーなどを引き起こすようなものを含まない。同様に、一実施形態において、本治療方法は、歯科疾患又はアレルギー反応、例えば、虫歯（カリエス）、歯肉炎、又は季節性アレルギーなどを、単独で又は追加的に治療はしない。
【００５８】
しかし、別の実施形態において、一般的にアレルゲンと分類されるような真菌、その他アレルゲン、及び空気中の粘膜刺激物のような微生物は、本願のバリア及び方法によって遮断される。
【００５９】
バリア組成物の治療有効量には、粘膜又は病変部上に形成するバリア層となるバリア被膜を形成するバリア形成組成物で標的粘膜又は病変部を被覆するのに十分な量が含まれる。例えば、洗口製剤では約100μL〜約10mL、例えば約1mL〜約8mL、約2mL〜約5mL等、スプレー製剤では約0.125mL〜約2mL、例えば約0.5mL〜約1mLである。投与量は平方センチメートル当たりの体積換算で表すことができ、例えば洗口製剤では約0.5μL/cm2〜約50μL/cm2、例えば約5μL/cm2〜約40μL/cm2又は約10μL/cm2〜約25μL/cm2、又はスプレー製剤では約0.625μL/cm2〜約10μL/cm2、例えば約2.5μL/cm2〜約5μL/cm2とすることができる。溶解性ストリップ等の他の送達媒体は、濃度及び当業者に知られる他の要因を調整して、これらの範囲に由来する投与量を有することができる。また、バリア形成組成物から粘膜上に形成される薄膜の平均厚さは、例えば約0.001mm〜約0.2mm、例えば約0.01mm〜約0.1mm又は約0.08mm〜約0.15mmの範囲であり得る。例えば、所与のヒト又は動物について、治療有効量は処置被験体となる哺乳動物の年齢又は体重又はサイズに基づいて決定することができ、投与量は上記のものであってよい。特に非ヒト哺乳動物の場合、投薬量は、上記の平方センチメートル当たりの値と、処置被験体の粘膜表面又は体腔の表面積の近似値とに従って調整可能である。
【００６０】
前記組成物を粘膜に直接塗りつける液体充填トローチ剤、飲み込まれるスプーン又はカップの液体などの他の送達媒体は、濃度及び当業者に知られる他の要因を調整して、これらの範囲に由来する投与量を有することができる。
【００６１】
バリア形成組成物から粘膜又は粘膜若しくは皮膚病変表面上に形成される薄膜又は被膜の平均厚さは、例えば約0.001mm〜約0.2mm、例えば約0.01mm〜約0.1mm又は約0.08mm〜約0.15mmの範囲であり得る。
【００６２】
機械的作用ポンプスプレー装置又はエアロゾル化スプレー装置が使用されてもよい。エアロゾル化の実施形態において、バリア形成組成物は、CO2、窒素、及び炭化水素などの一般的な推進剤と混合されてもよい。しかし、バッグオンバルブの実施形態も使用されてよく、前記組成物は、推進剤と該組成物成分の分離が必要とならないほど十分に安定である。
【００６３】
ロールオン式の塗布器を含むが、これに限定されない塗布器を、濃度及び当業者に知られる他の要因を調整して、記載の範囲に由来する投与量と使用してもよい。 
【００６４】
バリア技術で前処理されたワイプ、包帯又は他の塗布された材料を使用し、損傷粘膜を含む患部に直接塗布してもよい。これらは、濃度及び当業者に知られる他の要因を調整した記載の範囲に由来する投与量を有していてもよい。
【００６５】
一実施形態において、バリア形成組成物は炭水化物ガム（C）、湿潤剤（H）、及び抗菌剤（A）を含み、以下の要件を満足する：
約0.0001%≦C≦約0.4%；
約0.07%≦H≦約70%；かつ
0.0005%＜A
又は
約0%≦C≦約0.4%；
約55%≦H≦約70%；かつ
0.0005%＜Aであり、
ここで、全てのパーセンテージは全組成物の重量によるものである。本実施形態の範囲は、下記表VのMIC試験で報告された、超低希釈時におけるバリア形成組成物の、多くの微生物に対する殺菌力の実証効果を反映している。効果的に塗布された後、バリア層は殺菌作用又は静菌作用を示す。
【００６６】
別の実施形態において、バリア形成組成物は以下の要件を満足する：
約0.01%≦C≦約0.4%；
約4.5%≦H≦約65%；かつ
0.0005%＜A
又は
約0%≦C≦約0.4%；
約55%≦H≦約65%；かつ
0.0005%＜A。
これらのパーセンテージは全て組成物全体における重量%を指す。
【００６７】
別の実施形態において、バリア形成組成物の湿潤剤は以下の要件を満足する：約0.07%≦H＜1%。この低湿潤剤の実施形態は、前記組成物の粘性を低減させる。
【００６８】
一実施形態において、バリア形成組成物はグリセリン又は1つ又は複数の同様の保湿物質を含む。一実施形態において、湿潤剤の濃度は、前記組成物全体の約0.07%重量%〜約10重量%の範囲、例えば約3%〜約8%、約0.35%〜約1%未満、又は約0.1%〜約0.5%未満であってよい。別の実施形態において、湿潤剤は、前記組成物全体の約2重量%〜約70重量%の範囲、例えば約4.5%〜約65%、約7%〜約35%、又は約15%〜約45%であってよい。グリセリンと同様の湿潤剤は一般にポリオールとして分類され得る。湿潤剤としては、例えばグリセリン、ソルビトール、キシリトール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物が挙げられる。一実施形態において、グリセリンは、ガムの非存在下で約55%〜約65%等の高濃度で使用可能である。
【００６９】
一実施形態において、前記組成物はガムを含む。ガムは、例えば多糖類、キサンタンガム、アラビアガム、又はグアーガムであってよい。一般に、このようなガムは、全体として負電荷を有する炭水化物ガムとして分類され得る。別の実施形態において、ガムは、例えばキサンタンガム、グアーガム、アラビアガム、トラガントガム、カラヤガム、ローカストビーンガム、イナゴマメガム、及びペクチンであってよい。これらのガムは一般に、全体として負電荷を有する炭水化物ガムとして分類され得る。一実施形態において、ガムは、全組成中の重量パーセントで約0.0001%〜約0.4%、例えば約0.0005%〜約0.25重量%存在してもよい。別の実施形態において、ガムは、全組成中の重量パーセントで約0.01%〜約0.4%、例えば約0.25%〜約0.35%、約0.05%〜約0.25%、又は約0.4重量%存在してもよい。
【００７０】
一実施形態において、バリア組成物は湿潤剤、抗菌剤、及び任意にガムを含み、ガムが存在する場合、ガムがバリア形成組成物全体の約0.0001重量%〜約0.4重量%の量で存在する。
【００７１】
一実施形態において、抗菌剤が前記組成物中に存在する。例えば、前記組成物は、1つ以上の抗ウイルス剤、又は抗真菌剤、又は抗細菌剤、又はこれらの組み合わせを含んでよい。また、そのような抗菌剤の効果は、静菌作用及び／又は殺菌作用を含む。
【００７２】
抗菌剤としては、例えばモノ第四級アンモニウム化合物（QAC、セトリミド、塩化ベンザルコニウム、塩化セタルコニウム、塩化セチルピリジニウム、ミリスタルコニウムクロリド、ポリサイド）、ビクオターナリ（biquaternaries）及びビスビグアニド（クロルヘキシジン、Barquat、ヒビテン）、ビグアニド、ポリマービグアニド、ポリヘキサメチレンビグアニド、バントシル、コスモシル、ジアミジン、塩素系及びヨウ素系化合物を含むハロゲン放出剤、銀及び銀の抗菌化合物、過酢酸（PAA）、スルファジアジン銀、フェノール類、ビスフェノール類、過酸化水素、ヘキサクロロフェン、それだけに限らないがクロロキシレノール（4-クロロ-3,5-ジメチルフェノール；p-クロロ-m-キシレノール）を含むハロフェノール等のカチオン性抗菌剤及びそれらの薬学的に許容される塩が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７３】
また、抗微生物剤は、殺菌性及び静菌性の両方を持ち、異なるクラスの抗菌剤、例えばテトラサイクリン、クロラムフェニコール、フシジン酸、フルオロキノロン、マクロライド系抗菌剤、オキサゾリジノン、キノロンカルボン酸及びナフチリドンカルボン酸、シトラール、トリメトプリム及びスルファメトキサゾール（単独及び組み合わせ）、アミノグリコシド、ポリミキシン、ペニシリン並びにこれらの誘導体であってよく、又はこれらを含むものであってもよい。また、抗菌剤は、例えば下記のクラスの抗真菌剤、すなわちアゾール類、ポリエン類、エキノカンジン類、及びピリミジン類も含むことができる。上記抗菌剤の任意の組み合わせも企図される。前述の抗菌剤の多くはカチオン種又はそれらの薬学的に許容される塩であり、一実施形態では、前記組成物中でカチオン性抗菌剤が利用される。一実施形態では、前記組成物は、二酸化塩素、又は反応剤を生成する二酸化塩素などの蒸気を放出する薬剤を含まない。
【００７４】
一実施形態において、抗菌剤は広域スペクトル抗菌剤である。一実施形態において、抗菌剤は水溶液に可溶である。一実施形態において、抗菌活性は病原体（細菌、ウイルス、又は真菌）の細胞膜に結合して細胞膜を破壊し、重要な細胞物質の損失、細胞の崩壊、及び死に至らせることで達成される。一実施形態において、抗菌剤は、抗接着性組成物などにおいて、選択的な細胞受容体ミミックを介して機能しない。一実施形態において、抗菌剤はナノエマルジョン活性を介して機能しない。一実施形態において、バリア形成組成物はエマルジョンではない。
【００７５】
一実施形態において、バリア形成組成物は、微生物の変異又は耐性発現を引き起こすことはない。これは、微生物に対する作用機序がバリアによるためであり、及び選ばれた抗菌剤によるためである。
【００７６】
抗菌剤は、例えば全組成中の重量%で約0.0005%〜5%、例えば約0.0025%〜約1%、約0.005%〜約0.006%、又は約0.0006%〜約0.003%の範囲の量で存在してもよい。別の実施形態において、抗菌剤は、例えば全組成中の重量%で約0.05%〜約0.1%、例えば約0.05%〜約0.06%又は約0.06%〜約0.1%の範囲の量で存在してもよい。一実施形態において、抗菌剤の量は、例えば使用される抗菌剤がより高い濃度でも溶解性の問題を引き起こさないとすれば、約5%以下、約3%以下、又は約1.5%以下である。
【００７７】
諸実施形態において、前記組成物は更に、例えばコポビドン及び他の潤滑剤、メチルパラベンやプロピルパラベン等のパラベン類、香味剤、安息香酸ナトリウム等の保存剤、リン酸一ナトリウムやリン酸二ナトリウム等の緩衝剤、甘味料、酸化エチレン硬化ヒマシ油、及びカルボキシメチルセルロースのような他の成分も含むことができる。これらの成分は、例えば全組成中の重量%で約0.01%〜約5%、例えば約0.1%〜約2%の範囲の量で含有されてもよい。別の実施形態において、該成分は、例えば約0.0001%〜約0.05%の範囲の量で含有されてもよい。緩衝剤（リン酸一ナトリウムやリン酸二ナトリウム等）も使用することができる。
【００７８】
一実施形態において、前記組成物は、疾患を治療する又は上気道疾患の症状などの疾患の症状を緩和する若しくは治療する追加の活性物質を、そのような物質が抗菌剤の有効性と対立しない限り含んでいてもよい。一実施形態において、バリア形成組成物で使用され得る活性物質は、遅延放出性又は持続放出性を有するものであるか、あるいは体表面上に長く存在するほど向上する有効性を有するものである。例示的な活性物質には、制酸剤、ビタミン、栄養補助活性剤、銀、酸化防止剤、感冒若しくはインフルエンザの対症療法、免疫刺激剤、又は上記の組み合わせが含まれる。
【００７９】
抗菌剤に加えて制酸活性剤を有する実施形態では、バリア形成組成物は、種々の疾患に起因し得る若しくは関連し得る酸逆流又は胃酸過多の治療のために使用される。例示的な制酸活性剤には、炭酸カルシウム及びマグネシウム、水酸化マグネシウム及びアルミニウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、及びC7H5BiO4並びにそれらの混合物が含まれる。
【００８０】
抗菌剤に加えて栄養補助活性剤を有する実施形態では、バリア形成組成物は種々の状態の治療のために使用される。例示的な栄養補助剤には、赤ブドウ製品由来のレスベラトロール、柑橘類、茶、ワイン、及びダークチョコレートのフラボノイド、ベリーに見られるアントシアニン、オオバコ種子殻などの可溶性食物繊維製品、ブロッコリー（スルフォラファン）、ゼンマイ（クサソテツ）、大豆若しくはクローバー（イソフラボノイド）、亜麻若しくはチアシード由来のアルファリノレン酸、魚油のオメガ3脂肪酸、チョウセンニンジン及びニンニク油などの植物及びハーブエキスが含まれる。
【００８１】
抗菌剤に加えて酸化防止剤を有する実施形態では、バリア形成組成物は種々の疾患の症状の治療又は緩和のために使用される。例示的な酸化防止剤には、チオール、カロチン、ユビキノール、アスコルビン酸、又はポリフェノールが含まれ、疎水性若しくは親水性のいずれかであってよい。
【００８２】
一実施形態では、抗菌剤に加えて感冒及びインフルエンザ薬剤がバリア形成組成物において活性薬剤であり、前記組成物は、感冒及びインフルエンザの症状の治療のために使用される。例示的な薬剤には、充血除去剤、抗下痢剤、制吐剤、及び抗ヒスタミン薬が含まれ、更なる詳細は本明細書に個別に記載されている。
【００８３】
抗菌剤に加えて免疫刺激活性剤を有する実施形態では、バリア形成組成物は、微生物負荷量を減少させることに加えて身体の免疫系を刺激し、それにより疾患の期間を減少させる及び／又は症状を緩和するために使用される。例示的な免疫刺激剤には、特異的及び非特異的免疫刺激剤、内因性免疫刺激剤、デオキシコール酸、マクロファージ刺激物質、合成免疫刺激剤、マクロカイン、イミキモド、レシキモド、並びに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子が含まれる。
【００８４】
抗菌剤に加えて抗下痢活性剤を有する実施形態では、バリア形成組成物は、下痢及び下痢に関する又は下痢を引き起こす疾患の治療のために使用される。例示的な抗下痢活性剤には、例えば、ジサリチル酸ビスマスのような抗炎症溶液、メチルセルロースのような増量剤、グアーガム又は植物繊維（ふすま、ステルクリア、イサゴール、メチルセルロースなどの吸収剤、オピオイド、及びロペラミド塩酸塩が含まれる。
【００８５】
抗菌剤に加えて制吐活性剤を有する実施形態では、バリア形成組成物は、吐き気及び吐き気を引き起こす又は吐き気に関する疾患の治療のために使用される。例示的な制吐活性剤には、例えば、オランザピン、5-HT3受容体アンタゴニスト、ドーパミンアンタゴニスト、ドラセトロン、NK1受容体アンタゴニスト、アプレピタント、ヒスタミンH1受容体アンタゴニスト、シクリジン、ジフェンヒドラミン、カンナビノイド、大麻、ドロナビノール、ベンゾジアゼピン、ミダゾラム、ロラゼパム、抗コリン薬、ヒヨスチン、ステロイド、デキサメタゾンが含まれる。
【００８６】
抗菌剤に加えて鎮痛活性剤を有する実施形態では、バリア形成組成物は、連鎖球菌性咽頭炎などの感染性疾患により引き起こされる若しくは感染性疾患に関連する口腔又は咽頭領域の痛みを減少させるために使用される。例示的な鎮痛剤には、プロピオン酸誘導体、ナプロキセン、イブプロフェン、酢酸誘導体、インドメタシン、エトドラク、エノール酸誘導体、フェナム酸誘導体、COX-2誘導体、アセトアミノフェン、スルホンアニリド、ジクロフェナク、カプサイシン、NSAIDs、イブプロフェン、トロラミンサリチル酸又はサリチル酸メチル、メンサシン及びゾストライクスが含まれる。
【００８７】
抗菌剤に加えて充血除去活性剤を有する実施形態では、バリア形成組成物は、過剰な粘液及び鼻閉を引き起こす又は鼻閉に関連する疾患の軽減のために使用される。例示的な充血除去剤には、プソイドエフェドリン、フェニレフリン、エフェドリン、レボメタンフェタミン、ナファゾリン、オキシメタゾリン、フェニルプロパノールアミン、プロピルヘキセドリン、シネフリン、及びテトラヒドロゾリンが含まれる。
【００８８】
抗菌剤に加えて鎮咳剤を有する実施形態では、バリア形成組成物は、咳及び咳を引き起こす又は咳に関連する疾患の軽減のために使用される。例示的な鎮咳剤には、鎮咳薬、デキストロメトルファン、コデイン、ノスカピン、ブロムヘキシン、アセチルシステイン、去痰剤、粘液溶解薬、及び蜂蜜が含まれる。
【００８９】
抗菌剤に加えて去痰剤を有する実施形態では、バリア形成組成物は、上気道呼吸器系の粘液及び粘液の原因となる又は粘液に関連する疾患の緩和のために使用される。前記組成物は、例えば鼻、口、又は咽頭粘膜に塗布されてよい。前記組成物は粘膜上に噴霧、回転塗布、あるいは分散され得る。例示的な去痰剤には、アセチルシステイン、アンブロキソール、及びグイネフェシンが含まれる。
【００９０】
抗菌剤に加えて抗ヒスタミン薬を有する実施形態では、バリア形成組成物は、上気道呼吸器系の粘液及び粘液の原因となる又は粘液に関連する疾患の緩和のために使用される。前記組成物は、例えば鼻、口、又は咽頭粘膜に、又は別の実施形態では目や耳に塗布されてよい。前記組成物は、粘膜上に噴霧、回転塗布、滴下、あるいは分散され得る。例示的な抗ヒスタミン薬には、アゼラスチン、ヒドロキシジン、デスロラタジン、シプロヘプタジン、エメダスチン、レボカバスチン、カルビノキサミン、レボセチリジン、フェキソフェナジン、ジフェンヒドラミン、ブロムフェニラミン、ロラタジン、クレマスチン、クロルフェニラミン及びセチリジンが含まれる。
【００９１】
精製水及び／又はアルコールは、前記組成物の希釈剤成分として使用可能である。一実施形態において、バリア形成組成物は、スプレーに適した自由流動性の液体である。これは、通常自由流動性ではなく、スプレーに適さないペースト又は練り歯磨きとは対照的である。加えて、一実施形態において、バリア組成物は、練り歯磨きに通常使われる研磨剤を含まない。
【００９２】
一実施形態において、前記組成物は、本質的にガムと、湿潤剤と、抗菌剤とからなり、該組成物のバリア又は抗菌作用に影響を与えない防腐剤、香味剤、又は他の薬剤のみを含む。本明細書で使用される「本質的に〜からなる（”consists essentially of”又は” consisting essentially of”）」とは、典型的に適応される意味を持ち、特定の材料並びに該組成物の基本的及び新規の特性（複数含む）に物質的に影響を与えないものを意味する。
【００９３】
一実施形態において、前記組成物は、歯及び／又は歯肉に対して作用する、例えば研磨剤（練り歯磨きに使われるようなもの）、歯のホワイトニング剤又は減感剤等の薬剤を含まない。一実施形態において、前記組成物はセロオリゴ糖類も含まない。一実施形態において、抗菌剤は、多価アルコールの脂肪酸エーテル若しくは脂肪酸エステル又はそれらのアルコキシル化誘導体などの脂質を含まない。一実施形態において、前記組成物は、持続放出剤、アレルギー緩和化合物、アゼラスチン、シリコンベース油、精油、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール及び硝酸カリウムのうちの1つ又は複数を含まない。一実施形態において、前記組成物は、例えば揮発性アルコールなどの揮発性有機化合物を含まない。一実施形態において、前記組成物は界面活性剤又は起泡剤を含まない。誤解を避けるために、上記のどの記載についても全ての実施形態がこれらの化合物を含まないことを意味するものと解釈すべきではない。
【００９４】
一実施形態において、バリア形成組成物の製造方法は、炭水化物ガムと、湿潤剤と、抗菌剤とを混合して加熱するステップを含む。一実施形態において、加熱するステップを、混合時間を延長することに置き換えられる。他の成分もまた、単回又は複数回の混合ステップで混合される。バリア形成組成物の全成分は一度に混合され、約6ヶ月以上安定であるような、約1年間〜約3年間、又は約1.3〜約2年間安定であるような、安定した保存期間を持つ該組成物を生成する。これは、使用前に短時間で別々に加えなければならない活性成分又は溶液から分離する活性成分を有する組成物とは対照的である。したがって一実施形態において、バリア形成組成物は、使用する際、活性化するために他の組成物と混合させる必要のない、安定した単一構成の組成物である。一実施形態において、バリア形成組成物は、単一相であり、エマルションではない。
【００９５】
一実施形態において、前記組成物は液体であり、気泡性はない。
【００９６】
上記記述のように、一実施形態において、前記組成物は、スプレーに適しており、したがってその粘度もまたスプレーに適している。一実施形態において、前記組成物は、500cps未満の粘度、例えば約490 cps〜約10 cps、又は約400 cps〜約15 cpsの粘度を有する。別の実施形態において、前記組成物は、約16 cps〜約20 cpsの粘度、例えば約17 cps〜約19 cpsの粘度を有する。
【００９７】
一実施形態において、前記組成物は、実質的に自由流動性であり、凝集塊を実質的に含まない。一実施形態において、実質的に自由流動性であり、凝集塊を実質的に含まないことは、140 U.S.メッシュ（0.10 mm孔径）に前記組成物を通すことで判断され、前記組成物の95〜100%、例えば96%〜99.9%は30秒後に通過する。
【００９８】
一実施形態において、前記組成物はヒトに無毒であり、ここで少なくとも前記組成物の一部、例えば、一日当たり約1mL〜一日当たり約30mL、一日当たり約2mL〜一日当たり約8mL、一日当たり約2.5mL〜一日当たり約7.5mLは、食用に摂取されても安全で無毒である。前記組成物はまた、不燃性である。
【００９９】
理論に縛られるものではないが、バリア形成組成物は親水性でないため、バリア形成組成物が粘膜表面に付着し当該表面を覆うよう、より大きな親和性を有することが可能となる。さらに、一実施形態では、非親水性組成物に埋め込まれる抗菌剤により、処理済みの表面における抗菌活性の持続が可能となる。一実施形態において、バリア形成組成物は、それ自体両親媒性であるか両親媒性成分を有する。
【０１００】
親水性の一つの尺度は、水中クロマトグラフィーによって判定されるRf（relative front）値である。一実施形態において、前記組成物の水中でのRf値は、0〜約0.25、例えば約0.0001〜約0.15、又は約0.03〜約0.1である。
【０１０１】
一実施形態において、前記組成物のpHは、約4〜約8、約5〜約7、又は約6〜約7.5である。別の実施形態において、前記組成物のpHは、約5.5〜約8であり、塩化セチルピリジニウム等の抗菌剤が最も有効である。
【０１０２】
一般に、微生物に対するバリア及び抗菌剤を提供する二重作用機序により、in vitro、模擬in vivoの両方を特徴とする長期持続効果がもたらされる。in vivo例を以下に示す。in vivoの例では、バリア形成組成物が少なくとも6時間殺菌効果（殺菌又は静菌）を有することが示された。バリア特性自体は模擬in vivo試験（人工のヒト粘膜EHOMを対象とする）で検査され、バリア自体の持続時間が約6時間超、例えば約8時間超、約6時間〜約16時間、約24時間又はそれより長い時間に大幅に延長されることが示された。また、in vitro試験では、抗菌効果が、約2時間超、約6時間超、また検査した微生物に応じて、8時間超、約6時間〜約16時間、及び約24時間又はそれより長い時間に大幅に延長されることが示された。
【０１０３】
事後抗菌効果（post antimicrobial effect：PAE）は、抗菌剤への限定的な曝露後に持続する微生物の増殖を抑制することと定義される。PAEが長くなるほど微生物の増殖の持続的な阻止が可能となるので抗菌剤にとって有利と考えられ、PAEが長い作用物質はPAEが短い作用物質よりも低頻度の投与を必要とし得るため、投与計画に影響を及ぼす可能性がある。
【０１０４】
本明細書に開示する方法及び組成物の諸実施形態において、粘膜に適用したときの該組成物のPAEは、例えば約6時間以上、約6時間〜約16時間、又は約16時間〜24時間持続するPAEを有する。
【０１０５】
後述の実施例に示すように、本発明のバリア形成組成物は、多岐にわたる代表的な真菌、細菌及びウイルスの通過を（捕捉により）遮断し、また広範囲の微生物（ウイルス、細菌、及び真菌）を殺すことが証明されている。ウイルスが最小の感染性微生物のうちの1つであり、また、バリア形成組成物はウイルスを遮断する機械的バリアを形成するので、バリア形成組成物は、ウイルスだけでなく広範な細菌及び真菌を含めたより大型の微生物に対しても有効な処理となることが予想される。
【０１０６】
いくつかの実験を実施して、哺乳動物を対象として前記組成物の安全性及び操作ヒト口腔粘膜（EHOM）モデル上に保護バリアを形成するスプレー製剤の能力を評価した。実験証拠から、本発明の組成物が組織上にバリアを形成し、このバリアが組織中への微生物の侵入を防止することが示された。
【実施例】
【０１０７】
臨床試験の実施例では、微生物負荷量の減少、疾患の予防、並びに症状の期間、重症度、及び頻度の減少を対プラセボで示す。
（実験例1）
＜ヒト歯肉上皮細胞及び線維芽細胞の培養物＞
【０１０８】
正常ヒト歯肉細胞（上皮細胞及び線維芽細胞）をScienCell研究所（米国カリフォルニア州カールスバッド）から入手した。線維芽細胞は、胎児ウシ血清（FBS；Gibco社（カナダオンタリオ州バーリントン）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DME；Invitrogen Life Technologies社（カナダオンタリオ州バーリントン））にて最終濃度10%まで培養した。上皮細胞は、5μg/mLのヒトトランスフェリン、2nMの3,3',5'‐トリヨード‐L‐チロニンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（DME）／Ham’s F12（3：1）（DMEH）にて培養した。
【０１０９】
0.4μg/mLのヒドロコルチゾン、10ng/mLの上皮増殖因子、ペニシリン及びストレプトマイシン、並びに10%FBS（最終濃度）を添加したダルベッコ改変イーグル（DME）／Ham's F12（3:1）（DMEH）培地にて培養した。この培地を上皮細胞については1日1回、線維芽細胞については週に3回取り替えた。培養物が90%コンフルエントに達したときに、0.05%トリプシン‐0.1%エチレンジアミン四酢酸（EDTA）溶液を使用して細胞をフラスコから剥離し、これを2回洗浄し、DMEM（上皮細胞の場合）又はDMEH添加培地（線維芽細胞の場合）の中に再懸濁させた。
（実験例2）
＜操作ヒト口腔粘膜（EHOM）組織＞
【０１１０】
EHOMモデルは、正常なヒト口腔粘膜で見られるものと同様の複雑な三次元空間細胞構成を形成するのに用いた歯肉線維芽細胞及び実験例1の上皮細胞を使用して作製した。固有層は、I型コラーゲン（Gibco-Invitrogen社（カナダオンタリオ州バーリントン））を歯肉線維芽細胞と混合して製造し、10%FBS添加培地で4日間培養した。次いで、この固有層に歯肉上皮細胞を播種してEHOMを得た。固有層の全表面が上皮細胞で覆われるまで、組織標本を浸漬条件下で増殖させた。重層上皮を生成するために、EHOMを、更に4日間気液界面まで上昇させて、上皮の別の層への組織化を促進させた。
【０１１１】
粘膜固有層は、上皮下にあって上皮と共に粘膜を構成する緩結合組織の薄い層である。図2は、バリア形成組成物で覆われた粘膜内の位置を矢印で示したEHOMの粘膜組織図である。
（実験例3〜9）
【０１１２】
バリア形成組成物の各例は、50mLの遠心管に下記の成分を添加し、ボルテックスすることによって「自由流動」濃度として、作製した。各組成物の成分及びそれらの近似量を表Iに記載する（表I中の値は全組成中の重量%である）。
【０１１３】
【表１】
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【０１１４】
下記の結果から、防腐剤がバリア形成及び抗菌活性に不必要であることが分かった。
（実験例10〜26）
【０１１５】
粘膜表面上での前記組成物の安全性を実証するために、実験例10〜26を実施した。先行米国特許公報第2012/0270909号明細書及び本願が優先権の利益を主張する仮出願は、この情報を含む。
（実験例27及び28）
＜バリア形成組成物が、粘膜組織を通過する微生物に対するEHOMの機械的バリア機能に影響を及ぼすか否かの判定＞
【０１１６】
実験例27及び28では、2つのアプローチを使用して、対照例が、粘膜組織を通過する微生物を遮断し、固有の抗菌効果も有するかどうかを判定した。パススルーチャンバ内とEHOM表面上の増殖を、寒天培地内の増殖評価によって評価した。
【０１１７】
実験例27では、実験例2のEHOMを、実験例4の1%及び5%希釈液（無血清培地にて希釈）に入れて2分間接触させた。次いで、組織を無血清培地で2回洗浄した後、体積300μLの1×106カンジダ菌細胞を重層させた。次いで、組織を空気‐液体培養プレート上に置き、37℃の5%CO2湿潤雰囲気下で24時間インキュベートした。次に、EHOM（ベントラルチャンバ）下の培養培地を回収してサブロー寒天プレート上に播種し、微生物が組織を貫通して下記の培養培地に達しているかどうかを確認した。EHOM表面からも培養物を回収し、サブロー寒天プレート上に播種した。このプロセスを図３に図示する。
【０１１８】
実験例28では、実験例4の組成物の1%及び5%希釈物で2分間処理した実験例2のEHOMを24時間にわたってカンジダ菌体で覆い、サブローデキストロース寒天プレート上に裏返して置き、所定位置に5分間放置した。次いで、EHOMを除去し、プレートを30℃で24時間インキュベートした後、微生物の増殖を肉眼で確認し写真を撮影した。各実験を5回ずつ繰り返して同様の結果を得た。
【０１１９】
図4は、EHOM面（パネルC及びD）の培養物、及び底部（ベントラル）チャンバ（パネルA及びB）のパススルー液の培養物の結果を示す。パネルA及びCは実験例4の1%希釈液で処理したEHOMであり、パネルB及びDは実験例4の5%希釈液で処理したEHOMSである。これらのデータから、実験例4の組成物によって形成されるバリアは、微生物によるEHOM組織の貫通を防止するが固有の抗菌効果を有さないことが示された。
（実験例29及び30）
【０１２０】
実験例29及び30は、EHOMをS. mutansに感染させた点を除いて、実験例27及び28の繰り返しである。バリア形成組成物によりS. mutans微生物がバリアを通過することを防止するバリアが形成されるが抗菌効果を有さないことを示す、同様の結果が得られた。
（実験例31及び32）
＜バリア形成組成物が微生物侵入に対抗するEHOMの機械的バリア機能に影響を与えるか否かの判定＞
【０１２１】
実験例32では、実験例2のEHOM組織セットを実験例4のバリア形成組成物で処理した後、C. albicansで重層した。対照例31では、対照セットにC. albicansで重層する前のバリア形成組成物による処理を行わなかった。各接触時間の経過直後に各EHOMから生検をそれぞれ採取し、パラホルムアルデヒド溶液で固定し、パラフィンに包埋した。薄切片（4μm）をエオシンヘマトキシリンで染色した。光学顕微鏡を使用して切片の観察を行い、組織内の微生物細胞の浸潤／浸透を分析した。顕微鏡観察後、各条件の代表的な写真を撮影し提示した。この実験を3回繰り返し同様の結果を得た。実験例3による処理でも同様の結果が得られた（データは示さず）。
【０１２２】
図5は、EHOM組織の微生物侵入に対するバリア形成組成物の影響を示している。パネル（A）は未処理の対照例31の代表的な写真であり、パネル（B）は処理済み実験例32の写真である。矢印は未処理の対照例31における侵入菌糸を示す。
（実験例33〜40）
【０１２３】
上記のEHOMモデルも使用して、実験例5〜7のバリア形成能を評価した。バリア形成能は、（a）口腔内細菌（S. mutans）及び真菌（Candida albicans）がヒト口腔粘膜に侵入／浸透するのを防止すること、及び（b）宿主細胞を損傷しないことである（細胞毒性アッセイ）。
【０１２４】
実験例33〜40は表IIIに従って調製した。
【０１２５】
【表２】
2016504381.tif 000004
【０１２６】
実験例33〜40では、実験例27及び28の手順に従って前処置及びインキュベーションを行った後、（1）フロースルー培地を下部チャンバから回収し、（2）サブローデキストロース寒天ペトリ皿の表面に裏返して置き24時間インキュベートした。実験例27及び28において記載したように、回収したフロースルー培地を寒天培地プレート上に広げて24時間インキュベートした。表IIIには、裏返した各実験例の培養物上の微生物の増殖を示す各実験例の写真を掲載した参照図番号も示してある。
【０１２７】
図6及び7は、カンジダとストレプトコッカスの両方が実験例5〜6の組成物で処理したEHOMの表面上で増殖できたことを示している。対照的に、図8に示すように、実験例36又は40のEHOMの下部チャンバから収集した「フロースルー」培地、すなわち実験例7の組成物で処理した培地では、微生物の増殖は観察されなかった。このことは、実験例7の組成物でEHOMを処理しても、粘膜組織の表面への損傷が起こらず、処理したEHOMに生物が浸透できなかったことを示す。実験例5及び6の組成物で処理したEHOMでも同様の結果が得られた（データは示さず）。これらのデータは、グリセリン及びキサンタンガムの組合せが粘膜組織上に保護バリアを形成することができることを示している。
（実験例41〜47）
＜検査製剤は毒性がなく細胞／組織を損傷させない＞
【０１２８】
実験例41〜47では、EHOMモデルを使用して組成物の毒性を評価した。実験例41〜47は表IVに従って調製した。
【０１２９】
【表３】
2016504381.tif 000005
【０１３０】
実験例27及び28の手順に従って前処理及びインキュベーションを行った後、実施例41〜48のEHOM組織から培養上清を回収しLDH活性の測定に使用した。
【０１３１】
図9に示すように、実験例41〜48では、製剤が保存剤を含む又は含まない塩化セチルピリジニウムを含有するかどうか、またCandida albicans又はS. mutansのいずれかに感染したかどうかに関わらず、LDHレベルの有意な増加は観察されなかった。これらのデータから、実験例のバリア形成組成物の非毒性効果が示され、これらの製剤が宿主粘膜組織の完全性を維持することも示された。
【０１３２】
データは平均±SDである。未処理組織と処理済み組織との間に有意な差は認められなかった。
【０１３３】
まとめると、上記のデータから、実験例の組成物がヒトの粘膜組織を貫通して侵入する微生物を防止することが可能な効果的かつ安全なバリアを提示することが示された。
（実験例48〜61）
【０１３４】
バリア形成組成物の前臨床評価から、該組成物が多くの細菌及び酵母に対して有効であることが示された。S. salivarius、P. gingivalis、S. pyogenes、S. pneumonia、Fusobacterium nucleatum、S. mutans、S. aureus、Y. enterocolitica、S. oralis、S. mitis、C. albicans、C. krusei、C. tropicalis、及びC. glabrataを含む、患者から得た複数の臨床分離株に対して、実験例7のバリア形成組成物の抗菌活性を評価した。実験例7のバリア形成組成物の活性は、臨床及び検査標準協会（CLSI）の文書番号M07-A8、M11-A7及びM27-A3に記載されている標準法を使用して最小発育阻止濃度（MIC）を判定することにより評価した。
【０１３５】
いくつかのタイプの好気性又は嫌気性細菌（1×104細胞/mL）の標準化接種材料を、比較例として、実験例7の段階希釈溶液（0.1%又は1μg/mLのCPC含有）又は2%グルコン酸クロルヘキシジン（CHX、20μg/mL）でインキュベートした。細胞を試験薬剤の存在下又は非存在下（増殖制御）で24時間増殖させた。各作用物質のMICは（無薬物対照と比較して）100%の発育阻止を誘発した濃度として定義した。
【０１３６】
同様の微量希釈ベースのCLSI法（M27-A2）を使用して、アルビカンス及び非アルビカンスのカンジダ種に対する実験例7の活性を評価した。
【０１３７】
【表４】
2016504381.tif 000006
【０１３８】
バリア形成組成物は、MRSA、Acinetobacter baumannii、Streptococcus sanguis、S. gordonii、及びAggregatibacter actinomycetemcomitansに対して強力な抗菌活性を有することも判明した。
【０１３９】
表Vから分かるように、実験例7の組成物は、多くの好気性及び嫌気性細菌、並びに真菌に対して強力な活性を示した。
【０１４０】
S. oralis及びS. mitisに対する例7のバリア形成組成物のMICは、他の生物に比べて著しく上昇した（500μg/mL）。S. oralis及びS. mitisが口腔の正常な片利共生生物であることは興味深い。一般に使用される抗菌クロルヘキシジン（2%溶液）の活性も同様の方法により判定した。表Vは、種々の微生物に対する比較例として、実験例7のバリア形成組成物及びクロルヘキシジン（2%溶液）のMICを示す。
【０１４１】
まとめると、これらの結果から、実験例7が一般に口腔から単離された病原性細菌や真菌に対して強力な活性を有することが実証された。この活性はクロルヘキシジンで観察されるものよりも強力であった。
【０１４２】
実験例10及び11のバリア形成組成物についても類似の活性プロフィルが観察された。
（実験例62）
【０１４３】
更なる比較として、公表されているデータから、試験したバリア形成組成物は、CPC単独比較で（すなわち、本明細書に開示するバリア製剤による組成物中ではなく）優れた又は少なくとも同等のMICを有することが示されている（Frank-Albert Pitten and Axel Kramer, "Efficacy of Cetylpyridinium Chloride Used as Oropharyngeal Antiseptic," Arzneim.Forsch./Drug Res.51 (II), pp588-595 (2001)参照。当該文献の内容を参照により本明細書に援用する）。データは試験微生物に応じて変動するが、例えばS. mutansに対するCPC（単独）のMICは5.0μg/mL〜6.25μg/mLであり、この値は実験例53で報告された1.95μg/mLよりも効果が小さくなる。このことは、CPCが製剤中の他の賦形剤と混合したときにその活性を失うリスクを有することに照らして、予想外の結果であった。詳しくはDepartment of Health and Human Services (Food and Drug Administration) (1994) Oral Health Care Drug Products for Over-the-Counter Human Use; Tentative Final Monograph for Oral Antiseptic Drug Products. Proposed Rules (21 CFR Part 356, Docket No. 81N-033A, RIN 0905-AA06). Federal Register 59:6084-124を参照されたい。
（実験例63〜69）
＜in vitroにおけるバリア形成組成物の抗菌活性持続時間：ポスト抗菌効果（PAE）判定＞
【０１４４】
いくつかの微生物に対する実験例8のPAEを実験例63〜68で評価した。対照例69も準備した。いくつかの微生物を実験例8に（MICと等しい濃度で）1分間曝露した後、残留製剤を除去するために3回洗浄した。次いで、処理した細胞を37℃でインキュベートした寒天培地プレート上に広げ、細胞の再増殖に要した時間を測定した。PAEは、未処理対照例69と比較して、発育阻止率（%）が実験例63〜68によって維持された時間（hour）として表した。
【０１４５】
図10に示すように、実験例8は、試験した生物（S. aureus、S. pneumonia、S. gordonii、S. sanguis、S. salivarius、及びS. mitis）に応じて4時間〜24時間の間のPAEを示した。実験例8と同様の活性をカンジダに対して観察した（データは示さず）。他の実験例のバリア形成組成物は微生物に対して同様のPAEを示した。
（実験例70）
【０１４６】
CPC含量を0.7%に低下させた同様の比較例と比較した、実験例7のS. mutansに対するバリア形成組成物のPAE試験から、実験例7のPAEは、比較実験例70の6時間に対して24時間であることが示された。したがって、実験例7が比較実験例70より長い時間抗菌活性を示し、CPC含量の追加が抗菌活性に対して単なる相加効果以上のものを発揮することが証明された。
（実験例71〜76）
【０１４７】
走査型電子顕微鏡を使用してS. sanguis（実験例71）、S. oralis（実験例72）及びC. albicans（実験例73）の実験例3の組成物による処理が細胞完全性を損なうことが示された。
【０１４８】
実験例71〜73では、細胞を、実験例3の存在下で24時間増殖させた。次に、細胞を、洗浄して残留製剤を除去し、一連のアルコール溶液（10%〜100%（v/v））に通して脱水し、SEM分析用に加工した。対照例74〜76は、実験例3の存在下で増殖させなかった点で、実験例71〜73と異なる。
【０１４９】
SEM写真から、健康で無傷の細胞（図11A、図11C、図11E）であることが証明された未処理の対照例74〜76とは異なり、実験例3のバリア形成組成物に曝露した微生物が変形し、崩壊し、細胞質物質の漏出の明らかな証拠となる細胞の完全性の全面的な破壊が示された（図11B、図11D、図11F）。
（実験例77〜79）
【０１５０】
バイオフィルムは実験例77〜79における特定の感染症の前駆体であることから、バリア形成組成物が細菌及び酵母菌によるバイオフィルムの形成を防止することができるかどうかを判定する実験を行った。バイオフィルムはin vitroモデルを使用して形成した。in vitroモデルの詳細は、Chandra et al. "In vitro Growth and Analysis of Candida Biofilms" Nature Protocols 3(12):1909-1924 (2008)を参照されたい。
【０１５１】
実験例77〜79では、標準的なバイオフィルムモデルを利用して、実験例3のバリア形成組成物が、細菌及び真菌バイオフィルムに対して活性を示すかどうかを判定した。実験例77〜79では、3種類の微生物（C. albicans、S. oralis、S. salivarius）を基板上に90分間接着させて接着相にバイオフィルムを形成させた。次に、付着細菌を含むディスクを、濃度50%の実験例3（適切な培地で1:1希釈）で15分間、30分間又は60分間インキュベートした。インキュベーション後、バイオフィルムを、剥離し、培養培地上に広げ、インキュベートし、コロニー形成単位（CFU）を判定した。リン酸緩衝生理食塩水（PBS（1:1））で希釈した培地を対照として使用した。表VIは0分（対照）、15分、30分及び60分の時点のデータを示す。
【０１５２】
【表５】
2016504381.tif 000007
【０１５３】
実験例77〜79に関するデータは、図12にも阻止率対増殖制御のグラフとして示されている。これらの結果から、実験例3のバリア形成組成物が、S. salivarius、S. oralis又はC. albicansによって形成されるバイオフィルムに対して0.2%のMICで細菌及び真菌微生物を阻害することが示された。
（実験例80及び81）
【０１５４】
実験例80において、本発明者らは、C. albicansの初期段階のバイオフィルムを実験例3に1分間曝露した際の影響を評価した結果、1分程度の短時間の曝露であってもバイオフィルム形成を阻害することができることが分かった（図13）。実験例81は未処理の対照試料とした。
（実験例80及び81）
＜バリア形成組成物による成熟バイオフィルムの処理能力＞
【０１５５】
バリア形成組成物がバイオフィルムを処理することができるかどうかを判定するために、本発明者らは、完全に形成された成熟バイオフィルムに対するバリア形成組成物の活性を評価した。バイオフィルムを成熟期まで成長させ、その後実験例7に2時間又は4時間曝露し、その結果得られたCFUを判定した。未処理の細胞と比較して微生物CFUを少なくとも2 log reductionだけ減少させる組成物は、微生物バイオフィルムに対して有効であると考えられる。
【０１５６】
表VIIに示すように、実験例7への曝露によりC. albicans及びS. oralisによって形成されたバイオフィルムが完全に除去され、S. salivariusによって形成されたバイオフィルムのCFUが未処理対照と比較して3.4 log reductionだけ減少した（log CFUは、それぞれ3.95対7.36）。
【０１５７】
【表６】
2016504381.tif 000008
【０１５８】
要約すると、上記の結果は、実験例7が、細菌及び真菌によって形成されるバイオフィルムに対して強力な活性を有することを示している。
（実験例85〜86）
＜バリア形成組成物はウイルスに対しても活性がある＞
【０１５９】
呼吸器系ウイルス（インフルエンザウイルスH1N1、株2009/H1N1/infA）やヒト免疫不全ウイルス（HIV）等のウイルスに対するバリア形成組成物の活性を測定した。
【０１６０】
バリア形成組成物はインフルエンザAの感染性を阻害する。
【０１６１】
インフルエンザウイルスの感染性に対するバリア形成組成物の影響を評価するために、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（MDCK）細胞を感染前に37℃で≧90%コンフルエントまで増殖させた。MDCK細胞は、インフルエンザウイルスが関与するアッセイのために日常的に使用されている。
【０１６２】
実験例85では、細胞単層を実験例7のバリア形成組成物に曝露した。対照例86では、細胞層をOptiMEM（+P/S、+Lglu）組織培養培地に異なる時間曝露した：（1）T1：30分間曝露、（2）T2：1時間曝露、（3）T3：2時間曝露。次に、製剤を除去し、細胞単層をインフルエンザウイルスに感染させた（感染多重度（MOI）=0.1）。未処理の細胞又は曝露直後（T0）に感染した細胞をベースライン対照として使用した。次いで、感染した細胞を遠心分離し、増殖培地500μLに再懸濁し、32.5℃で48時間インキュベートした。また、免疫蛍光顕微鏡（FITC標識抗インフルエンザ抗体を使用）を使用して、哺乳動物細胞に対するインフルエンザウイルスの感染能に対する実験例7のバリア形成組成物の影響も評価した。
【０１６３】
図14は、インフルエンザに感染したMDCK細胞（実験例85）（パネルA及びC）及び対照例86（パネルB及びD）の細胞変性効果に対する実験例7の影響を示す。画像は下記から取得した。位相コントラスト（A〜B）、及び免疫蛍光顕微鏡（C〜D）：特定の細胞変性効果（CPE）は製剤で処理した細胞では認められなかった。未処理細胞は、局所的な円形化（focal rounding）や退行性変化を含む典型的なCPEを呈した。
【０１６４】
これらのデータから、細胞単層を実験例7に30分間、1時間又は2時間曝露してもコンフルエントかつ健常（実験例85）のままであることが示された。対照的に、未処理の細胞及び感染直前（T0）に処理した細胞（対照例86）では、実質的な細胞変性効果が示された。図14のパネルCに示されるように、実験例86の未処理細胞では蛍光が示されたが（図14、パネルD）、実験例85のバリア形成組成物で処理した細胞では蛍光が観察されなかった。
【０１６５】
実験例85及び86に対応する更なる蛍光顕微鏡像を図15に示す。
（実験例87及び88）
＜定量PCRを使用したウイルス負荷に対するバリア形成組成物の活性＞
【０１６６】
図16は、定量PCRにより判定した、感染した処理済み細胞（実験例87）及び未処理細胞（実験例88）におけるインフルエンザウイルスレベルを示す。実験例87では細胞を実験例7で処理し、対照例88では細胞を未処理のままとした。その後上清を回収してウイルスの有無を分析した。
【０１６７】
実験例87及び88と同様のアッセイから細胞培養上清を回収し、QIAampウイルスRNAキット（QIAGEN社（カリフォルニア州バレンシア））を使用して核酸抽出した。Random Hexamer Primers（Invitrogen社（カリフォルニア州カールズバッド））を使用して各試料のcDNAライブラリーを作成した。逆転写反応は、製造業者（Invitrogen社（カリフォルニア州カールズバッド））の仕様によるM-MLV RTを使用して実施した。定量分析は、StepOne Plus Taqman Real Time PCR（Applied Biosystems社（ニュージャージー州ブランチバーグ））上で、TaqMan Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems社（ニュージャージー州ブランチバーグ））、cDNA試料2μL、及びプライマー／プローブを使用してインフルエンザマトリックス遺伝子を標的として実施した。参照標準は、従来のRT-PCR、精製ゲル（QIAquick、Qiagen社（カリフォルニア州バレンシア））によって増幅されたH1N1マトリックス遺伝子及びヒトRNAse PのcDNA断片を使用して調製し、分光光度計（Beckman Coulter社（カリフォルニア州ブレア）を使用して定量した。
【０１６８】
図16及び表IVに示すように、実験例7で30分間又は60分間処理した実験例87の細胞は、感染後48時間で検出可能なインフルエンザを有さなかった。さらに、実験例7で2時間処理した結果、未処理対照又は感染直前に処理したもの（実験例88）と比較して、ウイルス負荷量が1/6に減少した。
【０１６９】
【表７】
2016504381.tif 000009
（実験例89〜91）
＜バリア形成組成物は、インフルエンザウイルスに対する直接的な抗ウイルス効果を有する＞
【０１７０】
バリア形成組成物がインフルエンザウイルスに対する直接的な抗ウイルス活性を有するかどうかを判定するために、本発明者らは、ウイルスアフリカミドリザル腎臓（CV-1）細胞（90%コンフルエントまで24ウェルプレート内で増殖させた）を実験例7で前処理したインフルエンザに感染させた。CV-1細胞は、診断及びウイルス研究のために日常的に使用される高感受性基材である。
【０１７１】
実験例89〜91では、標準化された量のインフルエンザウイルス（0.1 MOI）を室温で5分間、（1）実験例7（実験例89を形成するため）、（2）対照例6、CPCなし防腐剤あり化合物（実験例90を形成するため）、（3）対照例5のプラセボ単独（CPC及び保存剤なしの化合物）（実験例91を形成するため）で前処理した。5分間のインキュベーション後に、ウイルス／薬物混合物をOptiMEM（+P/S、+Lglu）で追加的な同体積分だけ希釈して、該処理組成物を希薄にした。
【０１７２】
実験例89〜91では、上記で説明したようにCV-1細胞を調製した。次いで、実験例89〜91で処理済みの及び未処理のウイルスを上記のように細胞に接種した。
【０１７３】
インフルエンザウイルス負荷量は上述のようにリアルタイムPCRによって判定した。図17に示すデータから、抗菌剤CPC（実験例89）を含有する実験例7のバリア形成組成物で前処理したインフルエンザウイルスについて、バリア形成組成物及び／又は防腐剤を含むがCPCを含まないもの（実験例90及び91）と比較して、ウイルス負荷量の有意な減少が示された。実験例7によるウイルスの前処理は、CPCを含まない製剤と比較して、ウイルスコピーの有意な減少を示した。
【０１７４】
これらの結果は、実験例7のバリア形成組成物が実験例5及び6に固有ではないインフルエンザウイルスに対する直接的な抗ウイルス活性を有することを証明している。
（実験例92及び93）
【０１７５】
実験例92及び93では、インフルエンザA（2009/H1N1/infA）の感染を阻害するバリア形成組成物の能力を試験した。アフリカミドリザル腎臓（CV-1）細胞を90%コンフルエントまで24ウェルプレート中で増殖させた。次に、実験例7のバリア形成組成物を実験例92の細胞（20%の実験例7、80%のOptiMem、ワーキングCPC濃度0.02%）に塗布した。各時点は対照例93（形成組成物の塗布なし。100% OptiMem）と一致する。バリア形成組成物を表面上に30分間滞留させた後、細胞単層から除去した。細胞を無菌optiMEM（+PfS、+Lglu）で2回十分に洗浄した。インフルエンザをMOI=0.1にてT0からT＋6時間まで30分間隔で接種した。感染後、細胞を2200rpmで30分間、500μLのoptiMEM（+P/S、+Lglu、2μg/mLのトリプシン（sigma-Aldrich社（ミズーリ州セントルイス））で遠心分離した。感染細胞を32.5℃で96時間、5%CO2にて増殖させた。インフルエンザウイルス負荷量はリアルタイムPCRによって判定した。
【０１７６】
図18に示すように、グリセリン‐キサンタンガム製剤による宿主単層の前処理により、未処理の対照と比較して最大84.93%ウイルス感染が阻害された。バリア形成組成物の除去にもかかわらず宿主細胞中でウイルス感染の阻害が観察されたという事実は、バリア形成組成物により、ウイルス侵入を少なくとも6時間防止する保護バリアが宿主細胞に形成されたことを示している。
【０１７７】
図1は、感染の阻害に対処する可能な機序として参照することができる。
（実験例94及び96）
＜バリア形成組成物はHIVに対して活性を示す＞
【０１７８】
実験例94〜96では、バリア形成組成物がHIVに対する活性を有するかどうかを判定した。宿主MT哺乳動物細胞をRPMI／10%FBS／PS中15,000細胞／ウェルの密度で96ウェル丸底プレートに播種した。翌日（2日目）、ウイルスを対照例5（実験例94を形成）、対照例6（実験例95を形成）、又は実験例7（実験例96を形成）で5分間前処理して細胞に添加した。製剤への曝露から24時間後にMT（マカク）哺乳動物細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄し、新鮮な培地に取り替えた。1日目、2日目、5日目、6日目、7日目及び9日目に処理後の上清（10μL）を回収し、逆転写酵素（RT）活性によりウイルス負荷量を測定した。図19は、9日間に及ぶ各実験例72〜74のmL当たりのウイルスコピーのグラフを示す。
【０１７９】
図示の結果は、実験例96中の実験例7が、処理後の全ての監視時点において抗HIV活性を呈したことを示している。
【０１８０】
実験例94及び95におけるCPC及び／又は保存剤なしの対照例5又は対照例6が、最も小さい抗HIV活性を示した。
【０１８１】
要約すると、我々の調査結果から、CPCを含むバリア形成組成物の実験例7が、HIVに対する長時間持続する抗ウイルス活性を示すことが証明された。
（実験例97）
【０１８２】
代表的な生物ウイルス病変は、様々な粘膜組織における重要な感染症である。実験例97では、バリア形成組成物が一般的な口腔エプスタインバールウイルス（EBV）に対する活性を示すかどうかを判定するための実験を行った。ウェスタンブロッティングを使用して、実験例8のバリア形成組成物による溶菌ウイルスタンパク質EAD（ウイルス複製の阻害を示す）の分解能を評価した。
【０１８３】
実験例97では、EBVに感染した胃上皮細胞を実験例8の異なる希釈物（1:16、1:32、1:64）に曝露し、特異的抗体を使用してEADタンパク質の存在を検出した。細胞性β‐アクチンの存在を上皮細胞の完全性の指標とした。図20に示すように、実験例8の1:64希釈液は、細胞性アクチンに影響を及ぼすことなくEADを分解した。これらの結果は、実験例8が、ウイルス複製を固有に阻害し、したがって有効な抗ウイルスであり、ウイルス感染の防止に有用であることを証明している。
（実験例98〜100）
＜抗菌バリア対市販洗口製品の持続時間＞
【０１８４】
バリア形成組成物が抗菌活性を維持可能な持続時間を判定するために、細菌及び真菌を、ウェル中の実験例7のバリア形成組成物で処理した実験例2のEHOMと、同等の市販品で処理した実験例2のEHOMとに2分間曝露した。細菌及び真菌微生物を、未処理の対照EHOM（実験例98）及び処理済みのEHOM（実験例99及び比較例100）の上に重層した。次に、残留（フロースルー）溶液をウェル底（EHOMモデルの下部チャンバ）から取り出し、寒天培地プレート上に広げた。図3は、この試験法を更に明確化するものである。これらのプレートを37℃でインキュベートし、24時間後の増殖微生物細胞数（コロニー形成単位；CFU）を計数した。
【０１８５】
対照例98では未処理のEHOMを試験した。実験例99では、S. mitis細菌を上記のようにバリア形成組成物に重層した。実験例100は、細菌をS. mitis細菌に対する市販のLISTERINE（エタノール（26.9%）、メントール、チモール、サリチル酸メチル及びオイカリプトールを含む）の活性を示す比較例である。結果を表IXに示す。
【０１８６】
【表８】
2016504381.tif 000010
（実験例101〜103）
【０１８７】
実験例101〜103では、Candida albicans細菌を上記のようなバリア形成組成物で試験したこと以外は、実験例98〜100と同じ手順を実施した。結果を表Xに示す。実験例103は市販のLISTERINEの活性を示す比較例である。
【０１８８】
【表９】
2016504381.tif 000011
【０１８９】
これらのデータは更に、実験例7のバリア形成組成物が最大24時間を含む活性を維持することを示している。まとめると、これらの結果は、LISTERINEとは異なり、実験例7のバリア形成組成物が、最大24時間EHOM組織に無傷のバリアを維持し続けたことを示している。
（実験例104〜153）
【０１９０】
微生物の通過を防止するのに有効なバリアを形成することが可能なグリセリン及びキサンタンガムの濃度の更なる例を識別するために、in vitroフィルターインサートベースバリアモデルを使用して様々な濃度のガムキサンタンガム及び保湿剤グリセリン（5%〜95%のグリセリン、0.005%〜0.5%のキサンタンガム）を単独で及び組み合わせて試験した。図27は、実験例104〜153に使用される一般的な試験法を示す。
【０１９１】
直径3μm〜8μmの細孔サイズのフィルターインサートを使用して、それぞれ細菌（Streptococcus salivarius）及び真菌（Candida albicans）の通過を試験した。グリセリン若しくはキサンタンガム又はそれらの組合せ（100μLアリコート）をフィルターの表面上に重層してバリアを形成させた。フィルターの直径は24mmであった。したがって、フィルター上の膜の厚さは約0.01mmであり、この値は口内に処置有効量だけ塗布されたときの組成物膜の厚さの範囲内の値と類似する。次に、細菌又は真菌のいずれかの5×104細胞をフィルターインサート内の形成バリア上に塗布した。次に、本発明者らはこれらのフィルターインサートを6ウェルプレート内の寒天培地（真菌についてはブレインハートインフュージョン（BHI）培地、細菌についてはサブローデキストロース（SD）培地）の表面上に置いた。各プレートをフィルターインサートと共に37℃で24時間、一晩インキュベートした。
【０１９２】
各プレートにつき、寒天培地及びフィルターインサート中の細菌又は真菌の増殖（コロニー形成単位）の有無を観察した。フィルターインサート中だけでなく寒天培地中でも微生物の増殖が見られたことから、微生物の通過を防ぐ効果的なバリアがフィルター上に形成されたことが証明された。逆に、フィルターインサート周囲の寒天培地中で増殖が見られた場合は、試験作用物質が、効果的なバリアを形成することができず生物によるフィルターの通過を許したことを示唆している。
【０１９３】
表XIに示す結果は、グリセリンが単独で試験した場合に55%以上の濃度でバリアを形成することができることを示している。対照的に、キサンタンガムのみの場合は、どの試験濃度でも（0.005%〜0.4%）バリアは形成されなかった。しかしながら、0.01%のキサンタンガムと組み合わせた場合は、グリセリン濃度7%、45%、55%及び65%でバリアの形成が観察された。さらに、0.4%キサンタンガムと、グリセリン濃度7%、15%、25%、35%、45%、55%及び65%の組合せでもバリアが形成された。したがって、in vitroフィルターインサートベースモデルにおいて、微生物の通過を防止するバリアを形成し得るグリセリンとキサンタンガムの特定の組合せが特定された。
【０１９４】
【表１０】
2016504381.tif 000012
【０１９５】
フィルターインサート上に形成された実験例104〜153の組成物によって保持される微生物細胞は、バリアによって捕捉され生存可能であることが分かり、したがって、形成されたバリアは、抗菌剤を含まない場合は固有の抗菌性を有さないことが証明された。換言すると、バリア内に保持された微生物は活性を維持しており、例えば、微生物が摩耗によってバリアから解放され又はバリアが完全性を失った場合には、感染への脅威を与えるおそれがある。
【０１９６】
注目すべきは、有効な抗菌剤を加えると、より低いグリセリン濃度及び／又はキサンタンガム濃度で有効なバリア又は被膜を形成することができることである。これは、抗菌剤とバリアとが相まって有害な細菌を阻止及び／又は殺滅するからである。
（実験例154〜160）
【０１９７】
粘膜表面上での組成物の安全性を実証するために、実験例154〜160を実施した。米国特許公報第2012/0270909号明細書及び本願が優先権の利益を主張する仮出願は、この情報を含む。
（実験例161）
＜グリセリン‐キサンタンガム製剤がヒト口腔粘膜上に被膜を形成する＞
【０１９８】
グリセリン‐キサンタンガム製剤がヒト口腔粘膜上に被膜を形成できるかどうかを判定するために、本発明者らは、ゲンチアナバイオレット（GV）をマーカー色素として用いて、実験例7の製剤を添加した。添加した産物（750μL）をヒトボランティアの口腔に噴霧した。塗布後、口腔内染色の有無を観察し、デジタルカメラを使用して画像を撮影した。図21に示すように、この製剤は両頬と舌の背側／腹側面とを染色した。
（実験例162及び163）
＜バリア形成組成物への微生物の曝露が細胞増殖を阻害する経時的顕微鏡検査法＞
【０１９９】
バリア形成組成物が微生物に対する活性を示す阻害活性及び持続時間を判定するために、未処理の細菌及び真菌と比較して、バリア形成組成物に曝露した細胞について経時的分析を実施した。
【０２００】
実験例162では、S. mutans菌体を実験例7に1分間曝露し、洗浄して残留物質を除去し、新鮮な増殖培地を収容したペトリ皿内で増殖させた。37℃での生物の増殖を6時間観察し、顕微鏡に接続したカメラを使用して6時間のインキュベーション期間中20分毎に顕微鏡写真を撮影した。
【０２０１】
対象実験例163では、未処理の細胞に同じ手順を実施した。
【０２０２】
図22に示すように、細胞が6時間以内にコンフルエントに達した未処理の細菌とは対照的に、実験例7のバリア形成組成物で処理した微生物は、曝露後の同期間中に再増殖しなかった。同様に、実験例7のバリア形成組成物にカンジダ細胞を曝露した場合は、インキュベーション期間中の増殖が完全に阻害された（データは示さず）。
【０２０３】
さらに、これらの結果からバリア形成組成物が長期の抗菌活性を有することが確認された。
（実験例164〜166）
＜in vivo試験：バリア形成組成物（実験例7）はヒトにおける口腔微生物負荷量を低減する：短期活性及び長期活性＞
＜短期活性＞
【０２０４】
口腔微生物の微生物負荷に対する単回塗布の効果を評価することにより、実験例7の活性持続時間を健康な個体で測定した。実験例164〜166では、（年齢18歳以上の健康な口）3人の健常者のインフォームドコンセントを得て、各自の両頬に実験例7の組成物の単回塗布を依頼した。単回塗布は体積0.25mLずつを3噴霧と定義した。次に、これらの人間からベースライン（前処置）、処置後1時間経過後、処置後2時間経過後及び処置後6時間経過後のスワブを採取した。これらのスワブを好気性又は嫌気性生物に特異的な寒天培地プレート上で培養し、37℃で24〜28時間インキュベートし、CFU数を計数した。微生物負荷に対する実験例7の影響（CFU）を判定し、ベースライン（0分）のCFUを基準にして各露光後時点の阻害率を計算した。
【０２０５】
得られた結果から、実験例7の塗布により最大6時間にわたる微生物負荷量の一貫した低下が確認された（代表的な被験者のCFUを示す図23A参照）。バリア形成組成物による処置によって口腔内微生物負荷量が69%〜96%低下した（代表的な被験者の微生物負荷量の減少を示す図23B参照）。
（実験例167〜169）
【０２０６】
口腔微生物に対する5日間にわたるバリア形成組成物の活性を評価した。実験例167-169では、3人の健常者を登録し、実験例7の単回用量（3回噴霧の合計：0.75mL）を1日3回（目安として午前9時、正午及び午後3時の3回）塗布する処置を5日間（典型的な週5日制）続けることを依頼した。ベースライン（1日目の塗布前）及び5日間の試験期間における各日の終わりに、被験者からスワブを採取した。収集したスワブを寒天培地プレート上で培養し、37℃の5%CO2湿潤雰囲気下で24〜28時間インキュベートし、CFUの数を計数した。
【０２０７】
微生物負荷に対する実験例7のバリア形成組成物の影響を（3名の被験者のメジアンCFUとして）判定し、各露光後時点の阻害率をベースライン（0分）CFUを基準として計算した。図24は、これらの結果をCFU対時間（図24A）、及び微生物負荷量の減少対時間（図24B）を示すグラフである。実験例167〜169は、5日間の実験例7の塗布が、5日間の試験期間中一貫した微生物負荷量の低下をもたらしたことを証明する（図24A）。実験例7のバリア形成組成物による処置により、研究参加者の口腔内の微生物負荷量中央値が65%〜88%減少した（図24B）。
（実験例170〜198）
【０２０８】
臨床試験では、29人の健常者をインフォームドコンセント後に登録した。ベースライン情報（年齢、性別、民族及び登録日）を記録した。口の構内検査を実施し、口（頬）の内側を無菌培養スワブで消毒した。ベースラインの口腔スワブ試料を培養して試験前の細菌負荷を判定した。実験例170〜198では、29人の参加者各自に実験例7のバリア形成組成物を含むスプレーボトルを渡し、それを各自の口の内側に総体積0.75mL噴霧し、その後30秒間口内で攪拌してから飲み込むよう指示した。ほぼ同数の参加者で構成される2つのグループについて検査を行った。一方のグループは、実験例のバリア形成組成物を2時間毎に1日3回5日間（典型的な週間労働日数）にわたって使用した。他方のグループは、実験例のバリア形成組成物を2時間毎に1日4回5日間（典型的な週間労働日数）にわたって使用した。これら2つのグループで大きな差は認められなかった。1日目、2日目、3日目及び5日目の終わり（バリア形成組成物の初回投与時点から8時間後）にスワブを回収し、好気性及び嫌気性細菌に特異的な培地上で培養した。データは好気性と嫌気性に分けて微生物数：合計で表した。図25は総微生物負荷量のグラフであり、合計を処理直前と処理5日目の好気性及び嫌気性のカウントに分けて示す。図26は、代表的な3人の研究参加者から得た口腔試料中の5日間にわたる微生物負荷量のグラフを示す。
【０２０９】
全体として、in vivo試験から、これらの生物レベルの低下によって測定されるように、バリア形成組成物が短期と長期の両方の持続期間にわたって口腔微生物に対する抗菌活性を有することが示された。
【０２１０】
これらのデータは、バリア形成組成物による処理が全体の好気性微生物及び嫌気性生物について5日間にわたる口腔微生物負荷量の減少をもたらしたことを示した。
（実験例199〜205）
＜微生物侵入を防止するためのバリアを形成する追加的な保湿剤の識別＞
【０２１１】
例199では、インビトロフィルタ挿入ベースモデル（図27参照）を使用して様々な濃度の様々な保湿剤を試験した。
【０２１２】
実験例3〜8で使用した混合手順に基づいて、6種の組成物を表12に従って調製した。
【０２１３】
【表１１】
2016504381.tif 000013
【０２１４】
次に、100μLの実験例199〜205をフィルターインサート（細菌と真菌の両方を通過させる孔サイズ：直径0.8μm）に入れて層を形成させた。次に、生物を、試験用液により形成した層に重層した。次いで、試験溶液の層及び微生物を含むフィルターインサートを寒天培地プレートの表面上に置き、37℃で24時間インキュベートした。インキュベーション期間経過後、寒天培地プレートについて、フィルターインサート上及び寒天培地内の発育の有無を評価した。フィルターインサート上では発育が確認されたが寒天培地内では発育が確認されなかったことから、試験溶液が微生物の通過を防止するバリアを形成したことが示された。対照的に、フィルターインサート及び寒天培地内で微生物の発育が確認された場合は、そのようなバリアが形成されなかったことを示す。
【０２１５】
得られた結果から、試験保湿剤（単独又は組合せ）を含むキサンタンガムベースの各溶液が、土台の寒天培地まで微生物が通過することを防止する無傷のバリアをフィルターインサート上に形成したことが示された。
（実験例206〜213）
＜キサンタンガムの溶解限度の判定＞
【０２１６】
キサンタンガムの溶解度を判定するために、キサンタンガムを様々な濃度で水と混合し、塊の有無及び混合物の自由流動を監視することにより溶解度を観察した。表XIIIは結果及び濃度を示す。
【０２１７】
【表１２】
2016504381.tif 000014
【０２１８】
本発明者らは、0.4%で混合した場合にキサンタンガムが自由流動性溶液（表XIII）を形成することを発見した。対照的に、0.45%又は0.5%のキサンタンガムを含有する混合物は、粘性流体を形成するが小塊を含んでいた。塊の程度はキサンタンガムの濃度の上昇（0.6%及び0.7%）と共に増加した。濃度≧0.8%では、キサンタンガム混合物はゼリー様の粘稠度を有し自由流動のない広範囲の塊を含んでいた。
（実験例214）
＜バリア形成組成物中のカチオン性CPCとバリア形成組成物中の中性抗菌剤との比較＞
【０２１９】
実験例214では、CPCの代わりに中性剤シトラールを使用した点を除いて、実験例7の製剤を調製した。CPC（0.1%）又はシトラール（0.5%）を含有する製剤の連鎖球菌に対する抗菌活性を確認した。これらの研究を行うために実験例48〜61において上記で説明したアッセイを使用した。
【０２２０】
得られた結果から、シトラールを含有する製剤が抗菌活性（MIC=12.5%）を示すことが示された。しかしながら、シトラールを含有する製剤の活性はCPC（MIC=0.098%）を含有する製剤より大幅に低い。
（実験例215）
＜疎水性の物理化学的試験及び比較＞
【０２２１】
実験例215では、薄層クロマトグラフィー分析を使用して実験例7と疎水性組成物の疎水性を比較した。疎水性組成物の成分は表XIVに示すとおりである。
【０２２２】
【表１３】
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【０２２３】
10μLの実験例7及び疎水性組成物を予め用意したTLCプレート上に（下端から2cmの距離まで）堆積させた。スポットを5分間空気乾燥し、各プレートを、溶媒として水を含有するTLCクロマトグラフィージャーに入れた。溶媒前線がプレート上端に達するまでTLCシステムを実行した。プレートを取り出して溶媒及び試料前線をマークした。これら2つのサンプルの相対前面（RF）の値を式Iによって計算した。
式I：
RF＝スポットの移動距離／溶媒前面の距離
【０２２４】
得られた結果から、疎水性組成物及び実験例7のRf値がそれぞれ0.33及び0であり、これによって疎水性組成物の水混和性が高いことが示された。対照的に、実験例7は水性溶媒中でどのような移動性も示さず、これによって本製剤が疎水性であること又は親水性でないことが証明された。
（実験例216）
【０２２５】
下記の表XVに記載の各種成分を水中で混合し溶液として、バリア形成組成物を調製した。米国ホメオパシー薬局方に基づき5倍量のオイカリプトール成分も含めたが試験結果には影響を及ぼさず、この場合も本例の組成物が追加成分と協働して作用することが証明された。以下、「%」は全て重量%を示す。
【０２２６】
【表１４】
2016504381.tif 000016
（実験例217〜219）
【０２２７】
本例のバリア形成組成物は、アレルギーを誘発するカビを殺滅するのに有効であることも示された。ポリスチレンプラスチック表面にてMIC試験を行った。
【０２２８】
実験例217では、実験例216のバリア形成組成物を検査してStachybotrys MRL 9740に対するMICを判定した。実験例7の組成物のMICは0.06μg/mLであった。
【０２２９】
実験例218では、実験例216のバリア形成組成物を検査してAspergillus fumigatus 18748に対するMICを判定した。実験例7の組成物のMICは0.49μg/mLであった。
【０２３０】
実験例219では、実験例216のバリア形成組成物を検査してCladosporiumに対するMICを判定した。実験例7の組成物のMICは0.39μg/mLであった。
【０２３１】
Stachybotrys及びAspergillus fumigatusはカビを発生させる有機物であるので、これらの実験例は更に、バリア形成組成物を表面に塗布してカビの増殖又は変色を防止又はそれらに対処する実施形態もサポートする。
（実験例219〜224）
【０２３２】
実験例219〜224では、シリコーンエラストマーディスク表面上でMRSAバイオフィルムに対するバリア形成組成物の影響を評価した。
【０２３３】
実験例219〜221では、直径1cm の3枚のシリコーンエラストマーディスクに実験例7のバリア形成組成物0.25mLを予め噴霧し、60分間37℃でインキュベートした。実験例222〜224では、シリコーンエラストマーディスクを当量のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で60分間処理することにより対照例とし、37℃でインキュベートした。
【０２３４】
実験例219〜224の前処理したディスクをそれぞれ4mLのMRSA懸濁液（1×107細胞/mL）に浸漬し、37℃で90分間インキュベートした（「接着段階」）。次いで、接着細胞を含むディスクを取り出し、4mLのブレインハートインフュージョン（BHI）を含むウェルに移した。これらのウェルをロッカーに置き37℃で24時間インキュベートした。BHI寒天培地における定量培養によりディスク上のバイオフィルム形成評価を行った。スキャナを使用して各ウェルのスキャン画像を記録した。
【０２３５】
表XVIに示されるように、実施例7のバリア形成組成物による前処理を行った場合はディスク表面上にバイオフィルムが形成されなかった。図28は、MRSAにより、PBS処理ディスク（A, C, E）及び実施例7で処理したディスク（B, D, F）上に形成されるバイオフィルム内のコロニー数（colony burden）の画像を示す。
【０２３６】
【表１５】
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（実験例225〜246）
【０２３７】
実験例7のバリア形成組成物を検査して数株のBordetella pertussisに対する有効性を判定した。実験例225〜235では、実施例7のバリア形成組成物をRegan-Lowe Charcoal Agar BBL #297883プレートに入れ、64μg/mLの水希釈液として寒天ベースアッセイを行った。対照例236〜246は、実施例7のバリア形成組成物を含まない寒天プレートとした。実験例225〜246では、それぞれ細胞数5×104（50μL）のBordetella pertussisを試験面にスポットし、各プレートを37℃で24時間インキュベートした。表XVIIに示されるように、対照例236〜246では密集増殖が観察されたが、実験例236〜246では増殖が認められなかった。表中「4+」は顕著な増殖を示す。
【０２３８】
【表１６】
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（実験例247〜252）
【０２３９】
実施例7の（様々な希釈濃度の）バリア形成組成物につき、ライノウイルスのATCC VR-1200株に対する抗ウイルス活性を評価した。
【０２４０】
ヒト肝細胞癌（HUH-7）細胞を、10%熱不活性化ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を加えた24ウェルプレート中で調製し、L-グルタミン（Lglu）及びペニシリン／ストレプトマイシン（P/S）（特に明記しない限り、全てGibco社（ニューヨーク州）製の試薬）を補充した。全ての培養細胞をCO2濃度5%、37℃の条件下で90%〜100%コンフルエンスまで増殖させた後、感染前に一度OptiMEM （+ P/S + Lglu）にて洗浄した。
【０２４１】
実験例247〜251では、実験例7の組成物を、0.005%、0.01%、0.015%、0.02%、及び0.05%のCPC作用濃度に対する諸種の濃度（OptiMEM（+ P/ S、+ Lglu）400μL中の希釈濃度5%、10%、15%、20%、50%）で細胞単層に塗布し、それぞれ接種前に1時間滞留させた。対照例252では、400μLのOptiMEM（+ P/S、+ Lglu）を細胞に塗布し、接種前に1時間滞留させた。
【０２４２】
次いで、実験例7の希釈液又は対照のOptiMEMから細胞単層を取り出してライノウイルスを塗布し、感染多重度（MOI）を0.1とした。細胞をウイルスとともに32.5℃で1時間インキュベートした。この後、接種材料を除去し、500μLのOptiMEM + P/S + Lgluを細胞上に置いた。次いで、CO2濃度5%、32.5℃の条件下で細胞を増殖させた。5日間のインキュベーション後、細胞培養上清をライノウイルス負荷の定量化のために収集した。
【０２４３】
実験例247〜251の細胞培養上清のライノウイルス力価は、リアルタイムPCRによって測定した。対照例252と比較して、実験例251ではライノウイルス負荷量の有意な減少が示され、実施例7の50%の濃度であった。表XVIIIを参照。
【０２４４】
【表１７】
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（実験例253及び254）
【０２４５】
実験例253は、OptiMEM（+ P/S、+ Lglu）500μL中50%である実施例7の希釈懸濁液（CPC濃度0.05）で調製した。対照例254は、実験例7（500μLのOptiMEM（+ P/S、+ Lglu））を含まない対照溶液として調製した。実験例253及び254を実験例246〜252で開示した細胞に塗布した。前処理の時間間隔は次のとおり定義した：T-1＝感染1時間前、T-30＝感染30分前、T-0＝感染直前。
【０２４６】
次いで、実験例253の懸濁液及び実験例254の対照溶液から細胞単層を取り出した。処理した細胞単層にライノウイルス粒子を感染多重度（MOI）0.1で塗布した。細胞をウイルスと共に32.5℃で1時間インキュベートした。この後、接種材料を除去し、500μLのOptiMEM + P/S + Lgluを細胞上に置いた。次いで、CO2濃度5%、32.5℃の条件下で細胞を5日間増殖させた。実験例253及び254で処理した各細胞を毎日観察し、細胞変性効果の有無を確認した。5日間のインキュベーション後、細胞培養上清を免疫蛍光及びライノウイルス負荷量の定量化のために収集した。
【０２４７】
図29は、実験例253で処理した細胞の写真を示す。図29（a）はT-1（1時間前）、図29（c）はT-30（30分前）、図29（b）はT-0（直前）である。これらの写真ではいずれも細胞変性効果は確認されず、プレート一面に健康な細胞が増殖した。一方、図29（d）に示されるように、実験例254の未処理の対照細胞では、巣状円形化(focal rounding)、解離、及び細胞死が確認された。細胞変性効果の判定として、巣状円形化の進行、細胞サイズの拡大又は縮小、合胞体形成、多核巨細胞の発達、及び解離を判定した。
【０２４８】
免疫蛍光測定を以下のように行った。ウイルスに感染した細胞単層及び非感染対照を滅菌PBSで洗浄した。これらの細胞を、トリプシン処理し、スライド上のウェル上にスポットし、アセトンで固定した。各スライドを、FITC標識モノクローナル抗体を利用したDFAにより試験した。Light Diagnostics Pan-Enterovirus Detection Kit（Millipore社）を使用して間接免疫蛍光アッセイを行った。この検出キットは、ライノウイルス感染細胞との交差反応性を示すことでよく知られている。全ての抗体滞留ステップを37℃で1時間行った。最終洗浄後、各細胞の蛍光の有無を488nmの波長で評価した。
【０２４９】
図30は、実験例253で前処理した細胞の免疫蛍光写真を示す。図30（d）はT-1（1時間前）、図30（b）はT-30（30分前）、図30（c）はT-0（直前）である。実施例253で処理した細胞は1時間30分にわたって免疫蛍光を示さなかった。実験例253で処理したT-0（直前）の細胞は、わずかな蛍光を示した。一方、未処理の対照例254は、顕著な免疫蛍光を示し、重度のウイルス感染が示唆された（図30（a）参照）。
【０２５０】
サンプルのウイルス負荷量を下記のように定量した。細胞培養上清を回収し、−80℃で保存した。核酸はQIAamp Viral RNA Kit（QIAGEN社（カリフォルニア州バレンシア）を使用して抽出した。Random Hexamer Primers（Invitrogen社（カリフォルニア州カールズバッド））を使用して各試料のcDNAライブラリーを作成した。逆転写反応は、製造業者（Invitrogen社（カリフォルニア州カールズバッド））の仕様によるM-MLV RTを使用して実施した。定量分析は、StepOne Plus Taqman Real Time PCR（Applied Biosystems社（ニュージャージー州ブランチバーグ））上で、TaqMan Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems社（ニュージャージー州ブランチバーグ））、cDNAサンプル2μL、及びプライマー／プローブを使用してライノウイルスポリプロテイン遺伝子を標的として実施した。参照標準は、従来のRT-PCR 、精製ゲル（QIAquick、Qiagen社（カリフォルニア州バレンシア））によって増幅されたアンプリコンを使用して調製し、分光光度計（Beckman Coulter社（カリフォルニア州ブレア）を使用して定量した。結果を表XIXに示す。
【０２５１】
【表１８】
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【０２５２】
感染5日後、T-1（1時間前）、T-30（30分前）、又はT-0（直前）のいずれの時点でもライノウイルスの増幅は認められなかった。未処理の（対照）細胞では、顕著な増幅（>108コピー/mL）が示され、ウイルス感染が示唆された。
（実験例255）
＜塩化セチルピリジニウム組成物は無生物表面で抗菌活性を示す＞
【０２５３】
実験例255では、塩化セチルピリジニウム系スプレー消毒剤のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）に対する活性を評価した。組成物でプレコーティングした表面の抗菌効果を分析し、水洗浄が活性維持に与える影響を分析した。
【０２５４】
一実施形態において、塩化セチルピリジニウムを含むバリア形成組成物は、水洗浄した後にも、ステンレススチール表面上で相当量の殺菌作用又は静菌作用、例えば少なくとも約35%〜約50%、又は約15%〜約40%などの殺菌作用又は静菌作用を水洗浄した後に保持した。
【０２５５】
テストCPC組成物は、以下の配合率を有する：93%〜97%水、0.5〜1% CPC抗菌剤、0.5〜1%グリセリン、及びクレモフォールRH-40、コポビドン、パラベン、および安息香酸ナトリウムなどの防腐剤を含み、それらのどれも約1%の量を超えて存在していない、組成物の残部。
【０２５６】
テストCPC組成物の活性（CPCsd）は、ステンレススチール担体を、MRSA懸濁液（1 x 108細胞）に15分間、37℃で浸漬させることにより評価しました。次いで過剰な液体を排出し、担体にCPCsd（0.5 mL用量）を30秒間スプレーし、空気乾燥させ、ブレインハートインフュージョン培地（BHI）で一晩インキュベートした。培地のアリコートは、その後定量的に培養した。
【０２５７】
プレコート担体への効果を測定するために、ディスクにCPCsd（0.50 mL用量）をスプレーし、2〜4分間空気乾燥させ、MRSAと共に15分間、37℃でインキュベートした。過剰な液体を排出し、担体をBHIで一晩インキュベートした後に定量培養した。
【０２５８】
結果は、CPCsdが汚染担体上のMRSAの増殖を阻害したことを示した（CFUカウント＝0）。これはまだ2.54 x 108のCFUカウントを有する対照試料とは対照であった。その上、CPCsdでのプレコーティングは、担体の細菌汚染を防止した（CFU＝0）。これは3.5 x 108のCFUカウントを有する対照試料とは対照である。
【０２５９】
塩化ベンザルコニウム及びエタノールを含む市販の消毒剤をコンパレーター（Bkc- EtOH）として使用し、同様に試験した。コンパレーターも類似の抗菌活性を示した。
【０２６０】
持続的な殺菌活性に対する水洗浄の影響を、ミリQでプレコート担体を洗浄し（プレコート担体を2 mLミリQオートクレーブ水に移し、2〜3秒で取り出す）、次いでMRSAに15分間曝露して調べ、約16〜24時間、37℃でのインキュベーションの後にコロニー形成単位数（CFUs）を測定した。塩化ベンザルコニウム及びエタノールを含む市販の消毒剤をコンパレーター（Bkc-EtOH）として使用し、同様に試験した。消毒剤を含まない細胞及びリン酸緩衝生理食塩水処理をした細胞を対照試料として使用した。
【０２６１】
水洗浄後、及び16〜24時間後、CPCsd処理した担体はまだ33%の細菌数減少を示し、10%の減少であるコンパレーター処理した担体とは対照であった（図31）。したがって、試験組成物CPCsdは、コンパレーターより3倍高い活性を水洗浄後に維持することができた。
（実験例256）
【０２６２】
実験例256では、1日3回口腔内にスプレーしたバリア形成組成物を、プラセボと比較して評価する臨床試験を行なった。
【０２６３】
50mLの遠心チューブに下記の成分を添加して、ボルテックスにより「自由流動」濃度として、バリア形成組成物（試験組成物）を作製した。該組成物の成分及びおおよその量を、表Iに記載した（表Iの値は組成物全体の重量パーセントである）：
【０２６４】
【表１９】
2016504381.tif 000021
【０２６５】
プラセボとして機能させるために、風味付けした無抗菌性の組成物を得た。
【０２６６】
臨床試験を、以下を第一に立証するために実施した：アクティブ製品（試験組成物）は急性上気道疾患（URI）の（1）頻度、（2）重症度及び／又は（3）期間を減少させるか。この研究の第二の目的は、（1）安全性、忍容性、受容性、及び試験組成物の遵守、（2）URIsによる長期欠勤及び医療訪問への試験組成物の影響、（3）中咽頭の細菌及び真菌微生物叢に対する試験組成物の影響、並びに（4）過去のインフルエンザワクチン接種状況が研究成果に与える影響、を評価することである。
【０２６７】
開発したバリア形成塩化セチルピリジニウム（CPC）系経口スプレーの安全性と有効性を試験するために、無作為化した二重盲検のプラセボ対照パイロット臨床試験を実施した。100人の健康な男女を均等な割合（それぞれ50人）で無作為に「アクティブグループ」（試験組成物を服用する）又は「プラセボグループ」に振り分けた。両グループの参加者に、試験組成物又はプラセボを口腔内に1日3回のスプレー投与（1回スプレー当たり0.25 mLsを3回スプレー）を両グループとも75日間行うよう指示した。子ども、妊婦、囚人又はその他の脆弱な個体は登録しなかった。登録参加者は治験訪問のために、登録時（ベースライン）と、その後毎月の追跡調査訪問で3回と、そして最終訪問のために治療終了後2週間以内にクリニックを訪問した。このプログラムに参加した100人のうち、94人が治験を完了した。4人（プラセボグループの1人、アクティブグループの3人）が「3つの訪問」を完了しなかった。
【０２６８】
表XXIは、治験参加者の人口統計学データをまとめている。治験参加者の年齢は、両グループにおいて18〜43歳にわたり、平均年齢はプラセボグループで24.86 ± 6.47歳、アクティブグループで25.14 ± 6.73歳であり、有意差は認められなかった（P =0.68）。性別分布も2つの治験グループにおいて同様であり、プラセボグループでは男性24人と女性20人（それぞれ54.5%と45.5%）、アクティブグループでは男性24人と女性26人（それぞれ48%と52%）であった。治験期間（登録日から3回目の追跡調査訪問までの日数）は、プラセボグループで72.8 ± 2.9日、アクティブグループで71.8 ± 2.8日であった。
【０２６９】
治験完了者のうち、44人はプラセボグループ、50人はアクティブグループであった。人口学的特性（年齢、性別分布）、治験期間、及び調査完了の割合において、2つのグループ間で有意差はなかった。治験参加者の人口統計学データを、表XXIに記載する。
【０２７０】
【表２０】
2016504381.tif 000022
【０２７１】
年齢、性別、インフルエンザワクチン接種状況、及び症状緩和のために服用した薬も記録した。治験期間及び完了した治験調査数は、日記から入手可能な情報を要約するために使用された。
【０２７２】
5つの方法を使用して参加者を検査した。（1）副作用だけでなく症状及び重症度を記録するために参加者が記入を指示された日記調査。（2）仕事やその他の責務の欠勤記録。（3）URIの症状が発現した際のクリニックの「往診」であり、その間にPCR分析を行いURIウイルスの有無を確認した。（4）中間訪問時（治験期間の最初の訪問時と更に3回の訪問時）に行う細菌（口腔連鎖球菌、A群連鎖球菌）及び真菌培養。（5）投与期間終了の2週間後の訪問。参加者はまた、治験ガイドラインの遵守を報告した。
【０２７３】
この治験で、合計5945個の調査が完了された（プラセボグループで2849個、アクティブグループで3096個）。さらに、完了した調査割合（治験期間で割った完了した調査数）は両グループで同様であった；プラセボグループ及びアクティブグループでそれぞれ89.1 ± 15.6%及び86.3 ± 20.6%。
【０２７４】
急性上気道感染症（URI）を、以下の症状のいずれか3つの組み合わせとして定義した：発熱（＞37.8℃）、乾性咳嗽、咽頭痛、鼻漏（鼻水）、鼻閉（鼻づまり）、及び倦怠感（通常いい気分ではない）。これら症状のそれぞれは、個別にURIに関連する事象（URE）と考えられているる。本明細書で使用される場合、3UREsという用語は3つ同時のURE症状の報告に基づくURIを意味する。（このように定義されたURIは、以下で使用されるように、慢性URI発症と同じものではない。慢性URI発症は臨床及び実験室試験により確認される。）
【０２７５】
研究電子データ収集（REDCap）手段を、臨床試験に固有の臨床データを収集、保存、普及するためのツールとして使用した（Harris et al. 2009 J. Biomed. Informal 42(2):377-381）。電子日記はREDCapシステムを使用して作成され、そして参加者はこれらの電子日記を使用して自分の症状を記録し、治験関連のアンケートに取り組んだ。データ分析を、治験デザインに記載の一次及び二次目的に取り組むために行った。URIの頻度を、以下に基づいて評価した：（1）治験参加者が少なくとも3つのURI関連症状を持つ場合のクリニックへの訪問；これらの発症（往診）を、さらに治験スタッフにより臨床的に、また細菌、真菌及びウイルスの存在を評価するために口腔及び鼻腔スワブを採取することにより微生物学的に、確認した；（2）治療終了後2週間以内に治験看護師が治験参加者に行った面談（これらの報告された症状を、「治療後往診」として分類した）、並びに（3）治験参加者が電子手段によって仕上げた、少なくとも3つの症状の存在を説明している日々の日記の分析。
【０２７６】
URI関連症状の重症度を、少なくとも3つの症状を持つ治験参加者の日記の内容に基づいて5段階評価で採点した（0 = なし、1 = わずか（「悪くない」）、2 =軽度（「少し悪い」）、3 = 中等度（「かなり悪い」）、4 = 重度（「非常に悪い」）。治験参加者（少なくとも3つの症状を持つ）の自己報告の日記の評価により、URI関連症状の期間の判定を行い、症状が少なくとも2日連続で見られた発生率を明らかにした。
【０２７７】
URIの各症状を別々に調査した。各エンドポイントについて、事象があった延べ日数を記録した。その後、アクティブ及びプラセボグループのそれぞれで、事象があった延べ日数を、人-時間追跡調査の75日当たり（被験者当たりの治験期間に関連する）で記録した。次に、ロジスティック回帰モデルを構築した。その日の事象に対して、エンドポイントが「はい／いいえ」となるように、データを日単位で取った。データには完了した調査のものが毎日含まれている。エンドポイントを各処置グループについて評価した（プラセボ対活性製剤）。この治験では各個人のための複数の毎日の観測があったので（名目上、被験者ごとに75個の反復測定があるが、被験者ごとに異なる）、通常のロジスティック回帰モデルは不適切であったが、これは被験体内での日々の観測は相関すると予想されるためである。したがって、回帰モデルを適合させるために一般化推定方程式（GEE）を使用した。被験者の今日の事象状況は、昨日（及び明日）のその状況と相関するが、複数日前（又は複数日後）のものと、ましてや1日のラグ（リード）で説明されるものとはそれほど相関しないと予想されるため、自己回帰相関構造（lag=l）を選択した。各グループの事象の生の数値データは、75日間の公称の治験期間に合わせて調整した。
【０２７８】
医療訪問（被験者がURI症状のために毎日救急科、救急ケアセンター、若しくは診療所に行ったかどうかの指標）又は欠勤（被験者が毎日学校や仕事を欠席したか、若しくは学校や仕事が予定されていたら欠席していたかどうかの指標）も個々の症状分析と同様に分析した。説明変数として治療グループとワクチン接種状況とを多重ロジスティック回帰モデルに適応させることにより、ワクチン接種状況が研究成果に与える影響を評価した。上記のように、被験者ごとの複数の観測を考慮するためにGEEを使用した。
（結果）
【０２７９】
以下に示す結果は、治験の一次及び二次目的を反映し、、次のことを説明するセクションで表わされる：（1）慢性URI発症頻度（「往診）より）、（2）治験終了後2週間以内の「治療後往診」におけるURIsの頻度、（3）電子日記の内容に基づくURI事象の頻度及び重症度、（4）URI関連症状の期間、（5）安全性、忍容性、受容性、及び試験薬剤の遵守、（6）長期欠勤及び医療訪問（診療所、救急科、及び救急ケアセンターへの訪問）、（7）口腔微生物負荷への効果、（8）過去のインフルエンザワクチン接種状況が治験成果に与える影響。
＜１．慢性URIsの頻度＞
【０２８０】
登録した94人のうち、6人の参加者が、URI症状の発現に関連する口腔および鼻腔スワブの収集のために、クリニックを訪れた。慢性URI発症（臨床評価及び／又は実験室試験により判断）が見られる参加者のうち、4人はプラセボグループに属し、2人はアクティブグループに属しており、プラセボグループと比べてアクティブグループでは55%の減少を示した。これらの個人から収集した口腔及び鼻腔スワブにかけたPCR分析では、3人の参加者に3種の呼吸器系ウイルス（インフルエンザ、コロナウイルス、又はライノウイルス）が存在すると示され、それらは全員プラセボグループに属しており（表XXII）、ウイルス感染があると実証された。「往診」のために来たアクティブグループの2人からは、ウイルスは検出されなかった。
【０２８１】
【表２１】
2016504381.tif 000023
【０２８２】
その上、慢性URI発症が見られる6人から得た口腔スワブの細菌培養分析では、微生物負荷量中央値（log CFU好気性）は、プラセボグループに比べてアクティブグループにおいて低い傾向にあったことが示された（図32、P＞0.05）。
＜２．治療後往診でのURIsの頻度＞
【０２８３】
6人が、治療完了後の調査（活性製剤の投与を終了した2週間以内）でURI関連事象（UREs）を報告したことが判明した。これら6人のうち、4人はプラセボグループで2人はアクティブグループであり、プラセボグループと比べてアクティブグループではUREsの頻度が55%減少したことが示された（表XXIII、P = 0.28）。
【０２８４】
【表２２】
2016504381.tif 000024
＜３．日記内容に基づくURI関連事象の頻度及び重症度＞
【０２８５】
日々の日記に治験参加者により報告された症状の分析では、少なくとも3つのURI関連事象（3UREs）の合計64個の発症が20人に見られたことが示された（表XXIV）。これら3UREsのうち、37個はプラセボグループで発症し（11人）、一方27個はアクティブグループで発症した（9人）。これは、プラセボグループと比べてアクティブグループでは3UREsを患う個人が28%減少したことと、プラセボグループと比べてアクティブグループでは全3UREsが36%減少したことを示す。
【０２８６】
【表２３】
2016504381.tif 000025
【０２８７】
3UREsの重症度の分析では、発熱はプラセボグループのみで報告されたこと（10.8%）、咳及び咽頭痛の重症度は、プラセボグループに比べてアクティブグループで大幅に減少したことが示された（それぞれP = 0.062及び＜0.001）。その上、3UREsを患う個人における症状のカイ二乗分析では、プラセボグループにおける咳の相対リスク（RR）はアクティブグループの人の3倍であり（P＜0.001）、一方で咽頭痛のRRはアクティブグループの人の1.6倍である（表XXV、P = 0.008）ことが示された。
【０２８８】
【表２４】
2016504381.tif 000026
【０２８９】
分析はまた、75人日当たりの咳、咽頭痛、又は鼻水の事象の数は、プラセボグループと比較して、アクティブグループに低い傾向にあったことを示す（表XXVI）。この分析はまた、アクティブグループは咳、咽頭痛、又は鼻漏は少ないが（オッズ比、OR＜l）、鼻づまり又は倦怠感が少ないということではなかった（OR＞l）。
【０２９０】
【表２５】
2016504381.tif 000027
【０２９１】
3UREsの確率も、ロジスティック回帰モデル（上述の）を用いてプラセボグループ及びアクティブグループで推定した。図33に示すように、治験50日後にアクティブグループの信頼帯はプラセボグループの信頼帯（の上）を通過した。この分析はまた、治験25、50、及び75日目の時点で、プラセボグループに比べてアクティブ治療薬は保護効果があることを示した（それぞれP = 0.79、0.26、及び0.19）。この分析は、URIに対する保護は製剤使用の時間の経過と共に増加することを示した（ベースラインを反映した、治療は開始されていなかった1日目（前処置）からのデータ）。
＜４．URI関連症状の期間＞
【０２９２】
症状の期間は、少なくとも2日間連続で3UREsを報告した個人で評価した。この分析は、そのような個人がプラセボグループで8人、アクティブグループで7人いたことを示した。表XXVIIに示すように、発熱は、プラセボグループの2人の異なる個体においてのみ報告され、二日間続いた。プラセボグループにおける咳、咽頭痛又は鼻水の期間の中央値は、各症状で2.5日、一方アクティブグループにおけるこれらの症状の期間の中央値は、それぞれ0、1、又は2日であった。鼻づまりと倦怠感期間の中央値は、両治験グループで2日間であった。全ての非発熱症状の最大期間は、プラセボグループでは5〜9日、一方アクティブグループではこの期間は低かった（3〜5日）（咳ではP = 0.019、他の全ての比較ではP＞
0.05）。
【０２９３】
【表２６】
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＜５．安全性、忍容性、受容性、及び遵守＞
【０２９４】
安全性、忍容性、受容性、及び遵守を、経口試験、非自発的及び自発的に報告された有害事象（AEs）、治験終了時点の受容性調査、並びに自己申告のスプレー使用により評価した。
【０２９５】
経口試験：治験プロトコルの一部として、経口試験を全ての試験参加者に実施した。登録した94人のうち異常な経口試験が報告されたのは4人で、そのうち3人はプラセボグループ（2人の参加者が咬頬癖、及び1人の参加者が唇粘膜損傷）であり、1人はアクティブグループ（登録時に扁桃腺肥大、その後の訪問や治験終了時では見られなかった）であった。これらの経口事象のいずれも、治験薬に関連していなかった。
【０２９６】
有害事象：合計9つの有害事象（AEs）がこの治験（75日の期間）で報告され、そのうち5つはプラセボグループ、一方4つはアクティブグループで生じた（表8）。AEsのいずれも、治験薬に関連すると考えられなかった。
【０２９７】
【表２７】
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【０２９８】
受容性：治験終了時にアクティブ生成物の受容性に関する質問で出口アンケートを完了するように、参加者に求めた。結果は、多数が、組成物の味、香りを気に入り、製品の使用を継続する意欲を示すという、好ましいものであった。
【０２９９】
遵守：治験ガイドラインの遵守を、薬剤使用（1日に3回スプレー）の自己申告により評価した。分析では、記載の通りプラセボグループで日々に≧85%及びアクティブグループで≧86.9%使用されていたことが示された（表9）。これらの結果は、治験参加者は、高い割合で治験プロトコル及び治験薬の塗布を遵守していたことを示す。
【０３００】
【表２８】
2016504381.tif 000030
＜６．長期欠勤及び医療訪問＞
【０３０１】
合計5945個の調査がこの治験で完了された（プラセボグループで2849個及びアクティブグループで3096個）。61個の調査で医療の問題が空白のままであったので、データは5884個の調査（プラセボグループで2841個及びアクティブグループで3043個）にのみ使用できる。3UREsを患う個人のうち、2つの医療訪問（クリニック以外の医者への訪問）があり、どちらもプラセボグループであって、そして9つの長期欠勤のエピソードがあり、そのうちの5つ（13.5%）はプラセボグループ、4つ（14.8%）はアクティブグループであった。これらの結果は、医療訪問はプラセボグループでのみ発生し、一方長期欠勤は2つの治療群間で大きな違いはなかったことを示した。
＜７．口腔微生物負荷への効果＞
【０３０２】
微生物学データの評価は、好気性及び嫌気性細菌の数により測定されるように、口腔微生物（細菌）負荷量が、プラセボグループに比べてアクティブグループで低い傾向にあることを明らかにした（P > 0.05、2つのグループ間の全ての比較について）。別々の訪問時にわたる、3UREsを患う個人の口腔微生物分布のさらなる分析では、一般的にlog CFUsの中央値は、特に2回目と3回目の訪問（図34のボックスプロットを参照）で、プラセボグループよりもアクティブグループで低い傾向があった。パネルは、（A）好気性細菌及び（B）の嫌気性細菌のCFUsのlog数を表す。円は外れ値を表す。
【０３０３】
次に、log CFUsの中央値を、別々の訪問時で、3UREsを患う個人について比較し（図35）、アクティブグループにおける微生物負荷量は、ベースラインから最後の治験訪問時まで減少し続けたことがわかった（訪問3、図35）。これとは対照的に、プラセボグループにおける微生物負荷量は、同じ治験訪問の間に増加し続けた。興味深いことに、治験訪問時のプラセボとアクティブグループ間の差は、訪問1の0.02から訪問3の0.51へ増加した（訪問3では22倍の差）。
【０３０４】
加えて、1つのサブグループ（男性、25〜34歳）は、4つ全ての治験訪問でアクティブグループはプラセボグループよりも低い細菌負荷量を持っており、訪問1では差が統計的に有意であることがわかった（P=0.028）。
【０３０５】
口腔スワブの真菌特有寒天培地での培養は、登録した治験参加者の全ての試験スワブサンプルで真菌増殖を示さなかった。
【０３０６】
定期の治験訪問で治験参加者から収集した口腔スワブをPCR分析にかけた。定期の治験訪問（ベースライン、訪問1、訪問2、及び訪問3）で参加者から収集した口腔スワブの分析では、プラセボグループの1人からのエンテロウイルスの存在を除き、呼吸器系ウイルスは検出されなかった。往診のために訪れた3人から、3つのウイルスが検出された（上記の通り）。
＜８．ワクチン接種状況の影響＞
【０３０７】
登録した94人のうち、41人が過去にインフルエンザワクチンを接種したと報告し、そのうち17人（38.6%）はプラセボグループであり、一方24人（48%）はアクティブグループであった。多変量ロジスティック回帰分析では、ワクチン接種状況はUREs（P=0.15）に有意な影響を与えなかったことが明らかになった。これらの結果は、ワクチン接種状態が2つの治療群間でUREsに影響を与えなかったということを示した。
【０３０８】
この臨床試験の結果では、（1）慢性URI発症の頻度及び治療後往診は、プラセボグループと比べてアクティブグループで55%の減少を示し、（2）UREsの頻度及び重症度（日記内容に基づく）はアクティブグループで減少し、発熱がプラセボグループのみで報告され、咳及び咽頭痛はアクティブグループでは統計的に大幅に少なく、（3）URI関連の咳及び咽頭痛の期間の中央値は、アクティブグループ（それぞれ0日及び1日）と比べてプラセボグループ（ともに2.5日）で高く、（4）製剤は安全で、忍容性があり、登録した参加者の間で受容性が高く、（5）活性薬剤及び治験プロトコルの遵守は高く、（6）医療訪問はプラセボグループでのみ発生し、一方長期欠勤は2つの治療群間で大きな違いはなく、（7）口腔微生物負荷量はプラセボグループと比べてアクティブグループで減少し、並びに（8）過去のインフルエンザワクチン接種状態が治験成果に与える影響はなかったことが示された。
（結果の概要）
＜予防（1）慢性URIsの頻度及び治療後往診、並びに（2）日記内容に基づく＞
【０３０９】
登録した94人のうち、6人の参加者が、URI症状の発現（慢性URIs発症）に関連する口腔および鼻腔スワブの収集のために、クリニックを訪れた。慢性URI発症の6人のうち、4人はプラセボグループに属し、2人はアクティブグループに属しており、アクティブグループでは55%のURIの減少を示し、これは往診時の看護師や医師による症状の評価にのみ基づいている（プラセボグループのより少数の人が試験を完了したため、パーセンテージは50%よりも高い。）
【０３１０】
往診の間にこれらの個人から収集した口腔及び鼻腔スワブにかけたPCR分析では、3人の参加者に3種の呼吸器系ウイルス（インフルエンザ、コロナウイルス、又はライノウイルス）が存在すると示され；それらは全員プラセボグループに属していた。「往診」のために来たアクティブグループの2人からは、ウイルスは検出されなかった。さらに、治験終了後2週間以内の治療後往診の頻度は、アクティブグループではプラセボグループと比べて55%減少した（それぞれN = 4及び2）
（症状の期間及び重症度）
【０３１１】
治験参加者の日々の日記の分析では、「URI事象」（UREs）の頻度及び重症度（日記内容に基づく）はアクティブグループで減少し、発熱がプラセボグループのみで報告されたことも明らかになった。咳及び咽頭痛の症状の頻度及び重症度の減少は、2つのグループ間で統計的に有意であった（P ≦ 0.008）。URI関連の咳及び咽頭痛の期間の中央値は、プラセボグループ（ともに2.5日）がアクティブグループ（それぞれ0日及び1日、それぞれP = 0.019及び0.102）と比べてで高いことも明らかになった。
（安全性／副作用）
【０３１２】
さらにこの結果では、試験組成物は安全で、忍容性があり、登録した参加者の間で受容性が高く、活性薬剤及び治験プロトコルの遵守は高いことが示された。
（治験ガイドラインの遵守）
【０３１３】
報告された治験ガイドラインの遵守は高かった。
（医療訪問及び長期欠勤への影響）
【０３１４】
医療訪問（被験者がURI症状のために毎日救急科、救急ケアセンター、若しくは診療所に行ったかどうかの指標）又は欠勤（被験者が毎日学校や仕事を欠席したか、若しくは学校や仕事が予定されていたら欠席していたかどうかの指標）はプラセボグループでのみ発生し、一方長期欠勤は2つのグループで違いはなかった。
（微生物負荷量の減少）
【０３１５】
微生物分析では、口腔微生物負荷量はプラセボグループと比べてアクティブグループで減少したことが明らかになった。
（インフルエンザワクチンは治験に対し影響しない）
【０３１６】
最後に、過去のインフルエンザワクチン接種状態が治験成果に与える影響はなかった。
【０３１７】
結論として、この臨床試験では、試験製剤は登録した治験参加者をURIsから保護したこと、またURIに対する保護は製剤使用の時間の経過と共に増加すること、が実証された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2016504381.tif 000033
【図４（Ａ）】
2016504381.tif 000034
【図４（Ｂ）】
2016504381.tif 000035
【図４（Ｃ）】
2016504381.tif 000036
【図４（Ｄ）】
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【図５（Ａ）】
2016504381.tif 000038
【図５（Ｂ）】
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【図６（Ａ）】
2016504381.tif 000040
【図６（Ｂ）】
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【図６（Ｃ）】
2016504381.tif 000042
【図６（Ｄ）】
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【図７（Ａ）】
2016504381.tif 000044
【図７（Ｂ）】
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【図７（Ｃ）】
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【図７（Ｄ）】
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【図８（Ａ）】
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【図８（Ｂ）】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2016504381.tif 000053
【図１３】
2016504381.tif 000054
【図１４（Ａ）】
2016504381.tif 000055
【図１４（Ｂ）】
2016504381.tif 000056
【図１４（Ｃ）】
2016504381.tif 000057
【図１４（Ｄ）】
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【図１５】
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【図１６】
2016504381.tif 000060
【図１７】
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【図１８】
2016504381.tif 000062
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
2016504381.tif 000071
【図２８】
2016504381.tif 000072
【図２９（Ａ）】
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【図２９（Ｂ）】
2016504381.tif 000074
【図２９（Ｃ）】
2016504381.tif 000075
【図２９（Ｄ）】
2016504381.tif 000076
【図３０（Ａ）】
2016504381.tif 000077
【図３０（Ｂ）】
2016504381.tif 000078
【図３０（Ｃ）】
2016504381.tif 000079
【図３０（Ｄ）】
2016504381.tif 000080
【図３１】
2016504381.tif 000081
【図３２】
2016504381.tif 000082
【図３３】
2016504381.tif 000083
【図３４】
2016504381.tif 000084
【図３５】
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【国際調査報告】
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