(57)【要約】  本発明は、グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を特性決定する方法であって、ａ）グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品のバッチを得る工程と；ｂ）所定量のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品で哺乳動物を免疫する工程と；ｃ）免疫後、所定時間に、工程ｂ）の哺乳動物由来の細胞培養物を調製する工程と；ｄ）工程ｃ）の培養物からの細胞を所定量の工程ａ）のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品とインキュベートする工程と；ｅ）ここに記載した少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定するか、またはここに記載した工程ｃ）の細胞の生物学的活性レベルを判定する工程を含み、それにより、工程ａ）のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を特性決定する、方法を提供する。【選択図】  図１
2016504039.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を特性決定する方法であって、
ａ）グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品のバッチを得る工程と；
ｂ）所定量のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品で哺乳動物を免疫する工程と；
ｃ）免疫後、所定時間に、工程ｂ）の前記哺乳動物由来の細胞培養物を調製する工程と；
ｄ）工程ｃ）の前記培養物からの細胞を、所定量の工程ａ）の前記グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品とインキュベートする工程と；
ｅ）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓのアクセッション番号ＧＳＥ４０５６６におけるグラチラマーアセテート医薬物質または医薬品によって制御される遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程；Ｅｃｍ１、Ｐｒｅｓ１、Ｐｄｌｉｍ４、Ｇｐｒ８３、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ２４、ＬＯＣ１０００４６６０８、Ｇｍ５９０、Ｇｐｒ１１４、Ｔｍｉｅ、Ｒａｓｇｒｐ１、Ｍｙｏ６、Ｐｆｋｐ、Ｕｓｐ１８、Ａｒｌ４ｃ、Ａｌｓ２ｃｌ、２８１０４１０Ｐ２２Ｒｉｋ、Ａｒｌ５ａ、Ｇｂｐ２、Ｒａｓｇｒｐ１、Ａｎｋｒｄ３７、Ｔｐｉ１、４９３０５８３Ｈ１４Ｒｉｋ、Ｉｆｉｔ３、ＬＯＣ６６７３７０、Ｋｌｈｄｃ１、Ｃｄ２４７、Ｉｇｆｂｐ４、Ｏａｓ２、Ｂｃｌ１１ｂ、Ｆｓｃｎ１、Ｃｔｓｇ、Ｍｐｏ、Ｐｒｔｎ３、Ｌｙｚｓ、Ｅｍｒ１、Ｃｈｉ３ｌ１、Ａｎｘａ３、Ｈｐ、Ｌｙｚ２、Ｌｙｚ、Ｆｅｒ１ｌ３、Ｓｉｒｐａ、Ｃｄ６３、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｌｅｃ４ｄ、ＥＧ４３３０１６、Ｓｔｆａ１、Ｃｈｉ３ｌ３  Ｎｇｐ、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｌｅｃｓｆ９、Ｓａａ３、５０３３４１４Ｋ０４Ｒｉｋ、Ｓｌｃ７ａ１１、Ｓｌｐｉ、Ｃｄ１４、Ｆｐｒ２、Ｆｃｇｒ３、Ｆ１０、Ｇｐｎｍｂ、Ｔｇｆｂｉ、Ｍｍｐ１４、Ｓｌｃ１１ａ１、Ｃ３、Ｇｐｒ８４、Ａｃｔａ２、Ｌｃｎ２、Ｈｍｏｘ１、Ｔｐｓａｂ１、Ｃｃｌ４、Ｉｌ２、Ｉｎｈｂａ、Ｃｘｃｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ２、Ｕｐｐ１、Ｇｐｒ１０９ａ、Ｇｐ３８、Ｉｌ１ｂ、Ｃｘｃｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｃｃｌ３、６７２０４１８Ｂ０１Ｒｉｋ、５８３０４９６Ｌ１１Ｒｉｋ、Ｃｄ８ｂ１、Ｆｃｇｒｔ、ＬＯＣ３８５６１５およびＳｃｍｌ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程；ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＧＡＴＡ３、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−ＤＭＢ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＧＲ２、ＩＬ２、ＩＬ１３、ＩＬ４、ＩＬ１８、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７Ｆ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６Ｒ、ＴＢＸ２１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＮＦ、ＦＯＸＰ３、ＩＬ１０ＲＢ、ＫＬＲＤ１、ＣＤ６９、ＬＴＢ、ＣＤ８３、ＰＲＦ１、ＣＡＭＫ２Ｄ、ＬＴＡ、ＦＳＣＮ１、ＴＬＲ７、ＣＳＦ２、ＣＣＲ７、ＦＡＳＬＧ、ＩＬ１Ａ、ＣＣＬ５、ＣＤ８Ｂ、ＣＸＣＬ１０、ＴＬＲ２、ＣＣＬ４、ＴＬＲ７、ＩＧＨＡ１、ＩＬ２４、ＳＯＣＳ１、ＯＡＳ１、ＪＡＫ１、ＰＴＰＮ２、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩ３５、ＳＴＡＴ２、ＢＣＬ２、ＭＶＤ、ＦＤＰＳ、ＳＱＬＥ、ＮＳＤＨＬ、ＤＨＣＲ２４、Ａｃａｔ２／Ａｃａｔ３、ＭＳＭＯ１、ＬＳＳ、ＣＹＰ５１Ａ１、ＮＦＫＢＩＥ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＰＰ３ＣＣ、ＣＤ３Ｄ、ＩＬ２ＲＢ、ＰＴＥＮ、ＣＤ３Ｇ、ＩＣＯＳ、ＣＡＭＫ２Ｄ、ＮＦＡＴ５、ＬＡＴ、ＩＴＫ、Ｈ２−Ｍ２、ＦＡＳＬＧ、ＬＩＦ、ＩＧＨＡ１、ＰＲＫＡＣＢ、ＳＧＫ１、ＭＡＰＫ１１、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＪＵＮ、ＦＫＢＰ５、ＡＤＲＢ２、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰＫ１２、ＰＯＵ２Ｆ１、ＳＭＡＲＣＡ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＴＧＦＢ３、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＤＨＣＲ２４、ＣＣＲ５、およびＣＸＣＬ９からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程；Ｆｏｘｐ３、Ｉｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｂ、Ｃ３、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｘｃｌ２、Ｃｘｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ３およびＣｄ１４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程；表８に示した遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程；表１０に示した遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程；ＦｏｘＰ３、ＧＰＲ８３、ＣＤ１４、ＴＬＲ２、ＩＦＮＧ、ＣＤ４０およびＩＬ１Ｂからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程；表１２に示した遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程；または、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージ細胞、単球細胞、間質細胞、多重系列前駆体細胞、樹状細胞、繊維芽細胞網状赤血球、繊維芽細胞および顆粒球からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子について遺伝子セットエンリッチメント解析を判定する工程と
を含み、
それにより、工程ａ）の前記グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を特性決定する、方法。
【請求項２】
グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を特性決定する方法であって、
ａ）グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品のバッチを得る工程と；
ｂ）所定量のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品で哺乳動物を免疫する工程と；
ｃ）免疫後、所定時間に、工程ｂ）の前記哺乳動物由来の細胞培養物を調製する工程と；
ｄ）工程ｃ）の前記培養物からの細胞を、所定量の工程ａ）の前記グラチラマーアセテート薬剤関連物質または医薬品とインキュベートする工程と；
ｅ）抗原提示細胞への免疫反応、エフェクターリンパ球の分化、Ｔリンパ球の抑制、Ｆｏｘｐ３ポジティブ制御性Ｔ細胞の活性化、単核白血球の広がり、Ｔリンパ球の増殖、リンパ球の広がり、ナイーブリンパ球の分化、炎症反応、免疫細胞の接着、細胞運動、細胞の遊走性、細胞の走化性、食細胞の細胞移動、単球の走化性、単球の細胞移動および発熱からなる群から選択される工程ｃ）の細胞の生物学的活性レベルを判定する工程と
を含み、
それにより、工程ａ）の前記グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を特性決定する、方法。
【請求項３】
グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を識別する方法であって、
ｉ）請求項１または請求項２の方法に従って２つ以上のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を特性決定し、それぞれの前記グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品の特性を得る工程と；
ｉｉ）工程ｉ）で得られた前記グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品の特性を比較する工程と
を含み、
それにより、前記グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を識別する、方法。
【請求項４】
前記哺乳動物がげっ歯動物である、請求項１〜３の何れか１項の方法。
【請求項５】
工程ｃ）の前記培養物が初代培養物である、請求項１〜４の何れか１項の方法。
【請求項６】
工程ａ）の前記グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品がグラチラマーアセテート医薬物質または医薬品である、請求項１〜５の何れか１項の方法。
【請求項７】
工程ａ）の前記グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品がグラチラマーアセテート医薬物質または医薬品以外のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品である、請求項１〜５の何れか１項の方法。
【請求項８】
工程ｂ）の前記グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品がグラチラマーアセテート医薬物質または医薬品である、請求項１〜７の何れか１項の方法。
【請求項９】
工程ｂ）の前記グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品がグラチラマーアセテート医薬物質または医薬品以外のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品である、請求項１〜７の何れか１項の方法。
【請求項１０】
工程ｂ）の前記グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品が工程ａ）と同一のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品である、請求項１〜７の何れか１項の方法。
【請求項１１】
工程ｂ）の前記グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品が工程ａ）のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品とは異なるグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品である、請求項１〜７の何れか１項の方法。
【請求項１２】
グラチラマーアセテート関連医薬物質を含む医薬品を生産する方法において、改良が、
ｉ）請求項１の方法に従って前記グラチラマーアセテート関連医薬物質を特性決定する工程であり、
ここで、工程ｅ）は、Ｅｃｍ１、Ｐｒｅｓ１、Ｐｄｌｉｍ４、Ｇｐｒ８３、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ２４、ＬＯＣ１０００４６６０８、Ｇｍ５９０、Ｇｐｒ１１４、Ｔｍｉｅ、Ｒａｓｇｒｐ１、Ｍｙｏ６、Ｐｆｋｐ、Ｕｓｐ１８、Ａｒｌ４ｃ、Ａｌｓ２ｃｌ、２８１０４１０Ｐ２２Ｒｉｋ、Ａｒｌ５ａ、Ｇｂｐ２、Ｒａｓｇｒｐ１、Ａｎｋｒｄ３７、Ｔｐｉ１、４９３０５８３Ｈ１４Ｒｉｋ、Ｉｆｉｔ３、ＬＯＣ６６７３７０、Ｋｌｈｄｃ１、Ｃｄ２４７、Ｉｇｆｂｐ４、Ｏａｓ２、Ｂｃｌ１１ｂ、Ｆｓｃｎ１、Ｃｔｓｇ、Ｍｐｏ、Ｐｒｔｎ３、Ｌｙｚｓ、Ｅｍｒ１、Ｃｈｉ３ｌ１、Ａｎｘａ３、Ｈｐ、Ｌｙｚ２、Ｌｙｚ、Ｆｅｒ１ｌ３、Ｓｉｒｐａ、Ｃｄ６３、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｌｅｃ４ｄ、ＥＧ４３３０１６、Ｓｔｆａ１、Ｃｈｉ３ｌ３  Ｎｇｐ、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｌｅｃｓｆ９、Ｓａａ３、５０３３４１４Ｋ０４Ｒｉｋ、Ｓｌｃ７ａ１１、Ｓｌｐｉ、Ｃｄ１４、Ｆｐｒ２、Ｆｃｇｒ３、Ｆ１０、Ｇｐｎｍｂ、Ｔｇｆｂｉ、Ｍｍｐ１４、Ｓｌｃ１１ａ１、Ｃ３、Ｇｐｒ８４、Ａｃｔａ２、Ｌｃｎ２、Ｈｍｏｘ１、Ｔｐｓａｂ１、Ｃｃｌ４、Ｉｌ２、Ｉｎｈｂａ、Ｃｘｃｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ２、Ｕｐｐ１、Ｇｐｒ１０９ａ、Ｇｐ３８、Ｉｌ１ｂ、Ｃｘｃｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｃｃｌ３、６７２０４１８Ｂ０１Ｒｉｋ、５８３０４９６Ｌ１１Ｒｉｋ、Ｃｄ８ｂ１、Ｆｃｇｒｔ、ＬＯＣ３８５６１５およびＳｃｍｌ４からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；表８に示した遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；表１０に示した遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；ＦｏｘＰ３、ＧＰＲ８３、ＣＤ１４、ＴＬＲ２、ＩＦＮＧ、ＣＤ４０およびＩＬ１Ｂからなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；表１２に示した遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；または、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージ細胞、単球細胞、間質細胞、多重系列前駆体細胞、樹状細胞、繊維芽細胞網状赤血球、繊維芽細胞および顆粒球からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子について遺伝子セットエンリッチメント解析を判定することを含む、工程と；
ｉｉ）Ｅｃｍ１、Ｐｒｅｓ１、Ｐｄｌｉｍ４、Ｇｐｒ８３、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ２４、ＬＯＣ１０００４６６０８、Ｇｍ５９０、Ｇｐｒ１１４、Ｔｍｉｅ、Ｒａｓｇｒｐ１、Ｍｙｏ６、Ｐｆｋｐ、Ｕｓｐ１８、Ａｒｌ４ｃ、Ａｌｓ２ｃｌ、２８１０４１０Ｐ２２Ｒｉｋ、Ａｒｌ５ａ、Ｇｂｐ２、Ｒａｓｇｒｐ１、Ａｎｋｒｄ３７、Ｔｐｉ１、４９３０５８３Ｈ１４Ｒｉｋ、Ｉｆｉｔ３、ＬＯＣ６６７３７０、Ｋｌｈｄｃ１、Ｃｄ２４７、Ｉｇｆｂｐ４、Ｏａｓ２  Ｂｃｌ１１ｂ、６７２０４１８Ｂ０１Ｒｉｋ、５８３０４９６Ｌ１１Ｒｉｋ、Ｃｄ８ｂ１、Ｆｃｇｒｔ、ＬＯＣ３８５６１５およびＳｃｍｌ４からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準と比較して低い場合、または、Ｆｓｃｎ１、Ｃｔｓｇ、Ｍｐｏ、Ｐｒｔｎ３、Ｌｙｚｓ、Ｅｍｒ１、Ｃｈｉ３ｌ１、Ａｎｘａ３、Ｈｐ、Ｌｙｚ２、Ｌｙｚ、Ｆｅｒ１ｌ３、Ｓｉｒｐａ、Ｃｄ６３、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｌｅｃ４ｄ、ＥＧ４３３０１６、Ｓｔｆａ１、Ｃｈｉ３ｌ３  Ｎｇｐ、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｌｅｃｓｆ９、Ｓａａ３、５０３３４１４Ｋ０４Ｒｉｋ、Ｓｌｃ７ａ１１、Ｓｌｐｉ、Ｃｄ１４、Ｆｐｒ２、Ｆｃｇｒ３、Ｆ１０、Ｇｐｎｍｂ、Ｔｇｆｂｉ、Ｍｍｐ１４、Ｓｌｃ１１ａ１、Ｃ３、Ｇｐｒ８４、Ａｃｔａ２、Ｌｃｎ２、Ｈｍｏｘ１、Ｔｐｓａｂ１、Ｃｃｌ４、Ｉｌ２、Ｉｎｈｂａ、Ｃｘｃｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ２、Ｕｐｐ１、Ｇｐｒ１０９ａ、Ｇｐ３８、Ｉｌ１ｂ、Ｃｘｃｌ２、Ｉｌ１ａ，およびＣｃｌ３からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準と比較して高い場合、医薬品中の含有物として許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質のバッチを処分する工程；表８に示した遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準の発現レベルと実質的に同一でない場合、医薬品中の含有物として許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質のバッチを処分する工程；表１０に示した遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準の発現レベルと実質的に同一でない場合、医薬品中の含有物として許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質のバッチを処分する工程；ＧＰＲ８３、ＩＦＮＧおよびＦｏｘｐ３からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが低い場合、または、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＴＬＲ２およびＩＬ１Ｂからなる群から選択される遺伝子の発現レベルが高い場合、医薬品中の含有物として許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質のバッチを処分する工程；ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞遺伝子として表１２で同定された遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが低い場合、または、マクロファージ遺伝子として表１２で同定された遺伝子および単球遺伝子として表１２で同定された遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが高い場合、医薬品中の含有物として許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質のバッチを処分する工程；あるいは、遺伝子セットエンリッチメント解析が、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される少なくとも１つの��胞型に関連した遺伝子についてダウンレギュレーションを示すか、もしくはアップレギュレーションの欠如を示す場合、または、遺伝子セットエンリッチメント解析が、マクロファージ細胞、単球細胞、間質細胞、多重系列前駆体細胞、樹状細胞、繊維芽細胞網状赤血球、繊維芽細胞および顆粒球からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子についてアップレギュレーションを示すか、ダウンレギュレーションの欠如を示す場合、医薬品中の含有物として許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質のバッチを処分する工程と
を含む、方法。
【請求項１３】
グラチラマーアセテート関連医薬物質を含む医薬品を生産する方法において、改良が、
ｉ）請求項１の方法に従って前記グラチラマーアセテート関連医薬物質を特性決定する工程であり、
ここで、工程ｅ）は、Ｆｏｘｐ３、Ｉｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｂ、Ｃ３、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｘｃｌ２、Ｃｘｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ３およびＣｄ１４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定することを含む、工程と；
ｉｉ）ＦｏｘＰ３の発現レベルが参考基準と比較して低い場合、または、Ｉｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｂ、Ｃ３、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｘｃｌ２、Ｃｘｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ３およびＣｄ１４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルが参考基準と比較して高い場合、医薬品中の含有物として許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質のバッチを処分する工程と
を含む、方法。
【請求項１４】
グラチラマーアセテート関連医薬物質を含む医薬品を生産する方法において、改良が、
ｉ）請求項２の方法に従ってグラチラマーアセテート関連医薬物質を特性決定する工程であり、
ここで、工程ｅ）は、抗原提示細胞への免疫反応、エフェクターリンパ球の分化、Ｔリンパ球の抑制、Ｆｏｘｐ３ポジティブ制御性Ｔ細胞の活性化、単核白血球の広がり、Ｔリンパ球の増殖、リンパ球の広がり、ナイーブリンパ球の分化、炎症反応、免疫細胞の接着、細胞運動、細胞の遊走性、細胞の走化性、食細胞の細胞移動、単球の走化性、単球の細胞移動および発熱からなる群から選択される工程ｃ）の細胞の生物学的活性レベルを判定することを含む、工程と；
ｉｉ）抗原提示細胞への免疫反応、エフェクターリンパ球の分化、Ｔリンパ球の抑制、およびＦｏｘｐ３ポジティブ制御性Ｔ細胞の活性化からなる群から選択される生物学的活性レベルが参考基準と比較して低い場合、または、単核白血球の広がり、Ｔリンパ球の増殖、リンパ球の広がり、ナイーブリンパ球の分化、炎症反応、免疫細胞の接着、細胞運動、細胞の遊走性、細胞の走化性、食細胞の細胞移動、単球の走化性、単球の細胞移動および発熱からなる群から選択される生物学的活性レベルが参考基準と比較して高い場合、医薬品中の含有物として許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質のバッチを処分する工程と
を含む、方法。
【請求項１５】
グラチラマーアセテート関連医薬物質を含む医薬品をリリースする方法において、改良が、
ｉ）請求項１の方法に従ってグラチラマーアセテート関連医薬品を特性決定する工程であり、
ここで、工程ｅ）は、Ｅｃｍ１、Ｐｒｅｓ１、Ｐｄｌｉｍ４、Ｇｐｒ８３、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ２４、ＬＯＣ１０００４６６０８、Ｇｍ５９０、Ｇｐｒ１１４、Ｔｍｉｅ、Ｒａｓｇｒｐ１、Ｍｙｏ６、Ｐｆｋｐ、Ｕｓｐ１８、Ａｒｌ４ｃ、Ａｌｓ２ｃｌ、２８１０４１０Ｐ２２Ｒｉｋ、Ａｒｌ５ａ、Ｇｂｐ２、Ｒａｓｇｒｐ１、Ａｎｋｒｄ３７、Ｔｐｉ１、４９３０５８３Ｈ１４Ｒｉｋ、Ｉｆｉｔ３、ＬＯＣ６６７３７０、Ｋｌｈｄｃ１、Ｃｄ２４７、Ｉｇｆｂｐ４、Ｏａｓ２、Ｂｃｌ１１ｂ、Ｆｓｃｎ１、Ｃｔｓｇ、Ｍｐｏ、Ｐｒｔｎ３、Ｌｙｚｓ、Ｅｍｒ１、Ｃｈｉ３ｌ１、Ａｎｘａ３、Ｈｐ、Ｌｙｚ２、Ｌｙｚ、Ｆｅｒ１ｌ３、Ｓｉｒｐａ、Ｃｄ６３、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｌｅｃ４ｄ、ＥＧ４３３０１６、Ｓｔｆａ１、Ｃｈｉ３ｌ３  Ｎｇｐ、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｌｅｃｓｆ９、Ｓａａ３、５０３３４１４Ｋ０４Ｒｉｋ、Ｓｌｃ７ａ１１、Ｓｌｐｉ、Ｃｄ１４、Ｆｐｒ２、Ｆｃｇｒ３、Ｆ１０、Ｇｐｎｍｂ、Ｔｇｆｂｉ、Ｍｍｐ１４、Ｓｌｃ１１ａ１、Ｃ３、Ｇｐｒ８４、Ａｃｔａ２、Ｌｃｎ２、Ｈｍｏｘ１、Ｔｐｓａｂ１、Ｃｃｌ４、Ｉｌ２、Ｉｎｈｂａ、Ｃｘｃｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ２、Ｕｐｐ１、Ｇｐｒ１０９ａ、Ｇｐ３８、Ｉｌ１ｂ、Ｃｘｃｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｃｃｌ３、６７２０４１８Ｂ０１Ｒｉｋ、５８３０４９６Ｌ１１Ｒｉｋ、Ｃｄ８ｂ１、Ｆｃｇｒｔ、ＬＯＣ３８５６１５およびＳｃｍｌ４からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；表８に示した遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；表１０に示した遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；ＦｏｘＰ３、ＧＰＲ８３、ＣＤ１４、ＴＬＲ２、ＩＦＮＧ、ＣＤ４０およびＩＬ１Ｂからなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；表１２に示した遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；または、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージ細胞、単球細胞、間質細胞、多重系列前駆体細胞、樹状細胞、繊維芽細胞網状赤血球、繊維芽細胞および顆粒球からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子について遺伝子セットエンリッチメント解析を判定することを含む、工程と；
ｉｉ）Ｅｃｍ１、Ｐｒｅｓ１、Ｐｄｌｉｍ４、Ｇｐｒ８３、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ２４、ＬＯＣ１０００４６６０８、Ｇｍ５９０、Ｇｐｒ１１４、Ｔｍｉｅ、Ｒａｓｇｒｐ１、Ｍｙｏ６、Ｐｆｋｐ、Ｕｓｐ１８、Ａｒｌ４ｃ、Ａｌｓ２ｃｌ、２８１０４１０Ｐ２２Ｒｉｋ、Ａｒｌ５ａ、Ｇｂｐ２、Ｒａｓｇｒｐ１、Ａｎｋｒｄ３７、Ｔｐｉ１、４９３０５８３Ｈ１４Ｒｉｋ、Ｉｆｉｔ３、ＬＯＣ６６７３７０、Ｋｌｈｄｃ１、Ｃｄ２４７、Ｉｇｆｂｐ４、Ｏａｓ２  Ｂｃｌ１１ｂ、６７２０４１８Ｂ０１Ｒｉｋ、５８３０４９６Ｌ１１Ｒｉｋ、Ｃｄ８ｂ１、Ｆｃｇｒｔ、ＬＯＣ３８５６１５およびＳｃｍｌ４からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準と比較して低い場合、または、Ｆｓｃｎ１、Ｃｔｓｇ、Ｍｐｏ、Ｐｒｔｎ３、Ｌｙｚｓ、Ｅｍｒ１、Ｃｈｉ３ｌ１、Ａｎｘａ３、Ｈｐ、Ｌｙｚ２、Ｌｙｚ、Ｆｅｒ１ｌ３、Ｓｉｒｐａ、Ｃｄ６３、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｌｅｃ４ｄ、ＥＧ４３３０１６、Ｓｔｆａ１、Ｃｈｉ３ｌ３  Ｎｇｐ、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｌｅｃｓｆ９、Ｓａａ３、５０３３４１４Ｋ０４Ｒｉｋ、Ｓｌｃ７ａ１１、Ｓｌｐｉ、Ｃｄ１４、Ｆｐｒ２、Ｆｃｇｒ３、Ｆ１０、Ｇｐｎｍｂ、Ｔｇｆｂｉ、Ｍｍｐ１４、Ｓｌｃ１１ａ１、Ｃ３、Ｇｐｒ８４、Ａｃｔａ２、Ｌｃｎ２、Ｈｍｏｘ１、Ｔｐｓａｂ１、Ｃｃｌ４、Ｉｌ２、Ｉｎｈｂａ、Ｃｘｃｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ２、Ｕｐｐ１、Ｇｐｒ１０９ａ、Ｇｐ３８、Ｉｌ１ｂ、Ｃｘｃｌ２、Ｉｌ１ａ、およびＣｃｌ３からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準と比較して高い場合、リリースについて許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬品のバッチを処分する工程；表８に示した遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準の発現レベルと実質的に同一でない場合、リリースについて許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬品のバッチを処分する工程；表１０に示した遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準の発現レベルと実質的に同一でない場合、リリースについて許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬品のバッチを処分する工程；ＧＰＲ８３、ＩＦＮＧおよびＦｏｘｐ３からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが低い場合、または、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＴＬＲ２およびＩＬ１Ｂからなる群から選択される遺伝子の発現レベルが高い場合、リリースについて許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬品のバッチを処分する工程；ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞遺伝子として表１２で同定された遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが低い場合、または、マクロファージ遺伝子として表１２で同定された遺伝子および単球遺伝子として表１２で同定された遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが高い場合、リリースについて許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬品のバッチを処分する工程；あるいは、遺伝子セットエンリッチメント解析が、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子についてダウンレギ��レーションを示すか、もしくはアップレギュレーションの欠如を示す場合、または、遺伝子セットエンリッチメント解析が、マクロファージ細胞、単球細胞、間質細胞、多重系列前駆体細胞、樹状細胞、繊維芽細胞網状赤血球、繊維芽細胞および顆粒球からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子についてアップレギュレーション示すか、もしくはダウンレギュレーションの欠如を示す場合、リリースについて許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬品のバッチを処分する工程と
を含む、方法。
【請求項１６】
グラチラマーアセテート関連医薬物質を含む医薬品をリリースする方法において、改良が、
ｉ）請求項１の方法に従ってグラチラマーアセテート関連医薬品を特性決定する工程であり、
ここで、工程ｅ）は、Ｆｏｘｐ３、Ｉｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｂ、Ｃ３、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｘｃｌ２、Ｃｘｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ３およびＣｄ１４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定することを含む、工程と；
ｉｉ）ＦｏｘＰ３の発現レベルが参考基準と比較して低い場合、または、Ｉｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｂ、Ｃ３、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｘｃｌ２、Ｃｘｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ３およびＣｄ１４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルが参考基準と比較して高い場合、リリースについて許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬品のバッチを処分する工程と
を含む、方法。
【請求項１７】
グラチラマーアセテート関連医薬物質を含む医薬品をリリースする方法において、改良が、
ｉ）請求項２の方法に従ってグラチラマーアセテート関連医薬品を特性決定する工程であり、
ここで、工程ｅ）は、抗原提示細胞への免疫反応、エフェクターリンパ球の分化、Ｔリンパ球の抑制、Ｆｏｘｐ３ポジティブ制御性Ｔ細胞の活性化、単核白血球の広がり、Ｔリンパ球の増殖、リンパ球の広がり、ナイーブリンパ球の分化、炎症反応、免疫細胞の接着、細胞運動、細胞の遊走性、細胞の走化性、食細胞の細胞移動、単球の走化性、単球の細胞移動および発熱からなる群から選択される工程ｃ）の細胞の生物学的活性レベルを判定することを含む、工程と；
ｉｉ）抗原提示細胞への免疫反応、エフェクターリンパ球の分化、Ｔリンパ球の抑制、およびＦｏｘｐ３ポジティブ制御性Ｔ細胞の活性化からなる群から選択される生物学的活性レベルが参考基準と比較して低い場合、または、単核白血球の広がり、Ｔリンパ球の増殖、リンパ球の広がり、ナイーブリンパ球の分化、炎症反応、免疫細胞の接着、細胞運動、細胞の遊走性、細胞の走化性、食細胞の細胞移動、単球の走化性、単球の細胞移動および発熱からなる群から選択される生物学的活性レベルが参考基準と比較して高い場合、リリースについて許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬品のバッチを処分する工程と
を含む、方法。
【請求項１８】
グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品の準最適活性を同定する方法であって、
ａ）グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品をげっ歯動物に投与する工程と；
ｂ）抗原提示細胞への免疫反応、エフェクターリンパ球の分化、Ｔリンパ球の抑制、Ｆｏｘｐ３ポジティブ制御性Ｔ細胞の活性化、単核白血球の広がり、Ｔリンパ球の増殖、リンパ球の広がり、ナイーブリンパ球の分化、炎症反応、免疫細胞の接着、細胞運動、細胞の遊走性、細胞の走化性、食細胞の細胞移動、単球の走化性、単球の細胞移動および発熱からなる群から選択されるげっ歯動物の生物学的活性レベルを判定する工程と；
ｃ）抗原提示細胞への免疫反応、エフェクターリンパ球の分化、Ｔリンパ球の抑制およびＦｏｘｐ３ポジティブ制御性Ｔ細胞の活性化からなる群から選択される生物学的活性レベルが参考基準と比較して低い場合、または、単核白血球の広がり、Ｔリンパ球の増殖、リンパ球の広がり、ナイーブリンパ球の分化、炎症反応、免疫細胞の接着、細胞運動、細胞の遊走性、細胞の走化性、食細胞の細胞移動、単球の走化性、単球の細胞移動および発熱からなる群から選択される生物学的活性レベルが参考基準と比較して高い場合、準最適活性を生じるものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を同定する工程と
を含み、
それにより、グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品の準最適活性を同定する、
方法。
【請求項１９】
グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品の準最適活性を同定する方法であって、
ａ）グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品をげっ歯動物に投与する工程と、
ｂ）Ｅｃｍ１、Ｐｒｅｓ１、Ｐｄｌｉｍ４、Ｇｐｒ８３、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ２４、ＬＯＣ１０００４６６０８、Ｇｍ５９０、Ｇｐｒ１１４、Ｔｍｉｅ、Ｒａｓｇｒｐ１、Ｍｙｏ６、Ｐｆｋｐ、Ｕｓｐ１８、Ａｒｌ４ｃ、Ａｌｓ２ｃｌ、２８１０４１０Ｐ２２Ｒｉｋ、Ａｒｌ５ａ、Ｇｂｐ２、Ｒａｓｇｒｐ１、Ａｎｋｒｄ３７、Ｔｐｉ１、４９３０５８３Ｈ１４Ｒｉｋ、Ｉｆｉｔ３、ＬＯＣ６６７３７０、Ｋｌｈｄｃ１、Ｃｄ２４７、Ｉｇｆｂｐ４、Ｏａｓ２、Ｂｃｌ１１ｂ、Ｆｓｃｎ１、Ｃｔｓｇ、Ｍｐｏ、Ｐｒｔｎ３、Ｌｙｚｓ、Ｅｍｒ１、Ｃｈｉ３ｌ１、Ａｎｘａ３、Ｈｐ、Ｌｙｚ２、Ｌｙｚ、Ｆｅｒ１ｌ３、Ｓｉｒｐａ、Ｃｄ６３、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｌｅｃ４ｄ、ＥＧ４３３０１６、Ｓｔｆａ１、Ｃｈｉ３ｌ３  Ｎｇｐ、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｌｅｃｓｆ９、Ｓａａ３、５０３３４１４Ｋ０４Ｒｉｋ、Ｓｌｃ７ａ１１、Ｓｌｐｉ、Ｃｄ１４、Ｆｐｒ２、Ｆｃｇｒ３、Ｆ１０、Ｇｐｎｍｂ、Ｔｇｆｂｉ、Ｍｍｐ１４、Ｓｌｃ１１ａ１、Ｃ３、Ｇｐｒ８４、Ａｃｔａ２、Ｌｃｎ２、Ｈｍｏｘ１、Ｔｐｓａｂ１、Ｃｃｌ４、Ｉｌ２、Ｉｎｈｂａ、Ｃｘｃｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ２、Ｕｐｐ１、Ｇｐｒ１０９ａ、Ｇｐ３８、Ｉｌ１ｂ、Ｃｘｃｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｃｃｌ３、６７２０４１８Ｂ０１Ｒｉｋ、５８３０４９６Ｌ１１Ｒｉｋ、Ｃｄ８ｂ１、Ｆｃｇｒｔ、ＬＯＣ３８５６１５およびＳｃｍｌ４からなる群から選択される１つ以上の遺伝子のげっ歯動物における発現レベルを判定する工程；表８に示した遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定する工程；表１０に示した遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定する工程；ＦｏｘＰ３、ＧＰＲ８３、ＣＤ１４、ＴＬＲ２、ＩＦＮＧ、ＣＤ４０およびＩＬ１Ｂからなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定する工程；表１２に示した遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定する工程；または、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージ細胞、単球細胞、間質細胞、多重系列前駆体細胞、樹状細胞、繊維芽細胞網状赤血球、繊維芽細胞および顆粒球からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子について遺伝子セットエンリッチメント解析を判定する工程と；
ｃ）Ｅｃｍ１、Ｐｒｅｓ１、Ｐｄｌｉｍ４、Ｇｐｒ８３、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ２４、ＬＯＣ１０００４６６０８、Ｇｍ５９０、Ｇｐｒ１１４、Ｔｍｉｅ、Ｒａｓｇｒｐ１、Ｍｙｏ６、Ｐｆｋｐ、Ｕｓｐ１８、Ａｒｌ４ｃ、Ａｌｓ２ｃｌ、２８１０４１０Ｐ２２Ｒｉｋ、Ａｒｌ５ａ、Ｇｂｐ２、Ｒａｓｇｒｐ１、Ａｎｋｒｄ３７、Ｔｐｉ１、４９３０５８３Ｈ１４Ｒｉｋ、Ｉｆｉｔ３、ＬＯＣ６６７３７０、Ｋｌｈｄｃ１、Ｃｄ２４７、Ｉｇｆｂｐ４、Ｏａｓ２  Ｂｃｌ１１ｂ、６７２０４１８Ｂ０１Ｒｉｋ、５８３０４９６Ｌ１１Ｒｉｋ、Ｃｄ８ｂ１、Ｆｃｇｒｔ、ＬＯＣ３８５６１５およびＳｃｍｌ４の群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準と比較して低い場合、または、Ｆｓｃｎ１、Ｃｔｓｇ、Ｍｐｏ、Ｐｒｔｎ３、Ｌｙｚｓ、Ｅｍｒ１、Ｃｈｉ３ｌ１、Ａｎｘａ３、Ｈｐ、Ｌｙｚ２、Ｌｙｚ、Ｆｅｒ１ｌ３、Ｓｉｒｐａ、Ｃｄ６３、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｌｅｃ４ｄ、ＥＧ４３３０１６、Ｓｔｆａ１、Ｃｈｉ３ｌ３  Ｎｇｐ、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｌｅｃｓｆ９、Ｓａａ３、５０３３４１４Ｋ０４Ｒｉｋ、Ｓｌｃ７ａ１１、Ｓｌｐｉ、Ｃｄ１４、Ｆｐｒ２、Ｆｃｇｒ３、Ｆ１０、Ｇｐｎｍｂ、Ｔｇｆｂｉ、Ｍｍｐ１４、Ｓｌｃ１１ａ１、Ｃ３、Ｇｐｒ８４、Ａｃｔａ２、Ｌｃｎ２、Ｈｍｏｘ１、Ｔｐｓａｂ１、Ｃｃｌ４、Ｉｌ２、Ｉｎｈｂａ、Ｃｘｃｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ２、Ｕｐｐ１、Ｇｐｒ１０９ａ、Ｇｐ３８、Ｉｌ１ｂ、Ｃｘｃｌ２、Ｉｌ１ａ、およびＣｃｌ３の群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準と比較して高い場合、準最適活性を生じるものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を同定する工程；表８に示した遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準の発現レベルと実質的に同一でない場合、準最適活性を生じるものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を同定する工程；表１０に示した遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準の発現レベルと実質的に同一でない場合、準最適活性を生じるものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を同定する工程；ＧＰＲ８３、ＩＦＮＧおよびＦｏｘｐ３からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが低い場合、または、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＴＬＲ２およびＩＬ１Ｂからなる群から選択される遺伝子の発現レベルが高い場合、準最適活性を生じるものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を同定する工程；ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞遺伝子として表１２で同定された遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが低い場合、または、マクロファージ遺伝子として表１２で同定された遺伝子および単球遺伝子として表１２で同定された遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが高い場合、準最適活性を生じるものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を同定する工程；あるいは、遺伝子セットエンリッチメント解析が、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子についてダウンレギュレーションを示すか、もしくはアッ��レギュレーションの欠如を示す場合、または、遺伝子セットエンリッチメント解析が、マクロファージ細胞、単球細胞、間質細胞、多重系列前駆体細胞、樹状細胞、繊維芽細胞網状赤血球、繊維芽細胞および顆粒球からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子についてアップレギュレーションを示すか、もしくはダウンレギュレーションの欠如を示す場合、準最適活性を生じるものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を同定する工程と
を含み、
それにより、前記グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品の準最適活性を同定する、方法。
【請求項２０】
前記発現レベルが血液で判定される、請求項１８〜１９の何れか１項の方法。
【請求項２１】
前記発現レベルがＰＢＭＣで判定される、請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記参考基準がグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品の投与前の発現レベルである、請求項１８〜１９の何れか１項の方法。
【請求項２３】
前記参考基準がグラチラマーアセテート医薬物質または医薬品の投与後の発現レベルである、請求項１８〜１９の何れか１項の方法。
【請求項２４】
前記げっ歯動物がマウスである、請求項４、請求項１８または請求項１９の方法。
【請求項２５】
前記マウスがメス（ＳＪＬ×ＢＡＬＢ／Ｃ）Ｆ１マウスである、請求項２４の方法。
【請求項２６】
前記マウスが約８週齢から約１２週齢である、請求項２４または請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記初代培養物が脾臓細胞の培養物である、請求項１または請求項２の方法。
【請求項２８】
前記初代培養物がリンパ節細胞の培養物である、請求項１または請求項２の方法。
【請求項２９】
前記脾臓細胞の初代培養物が免疫の約３日後に調製される、請求項２８の方法。
【請求項３０】
工程ｄ）の前記インキュベーションが約２４時間である、請求項１〜１４の何れか１項の方法。
【請求項３１】
前記グラチラマーアセテート関連医薬物質がグラチラモイドであり、または、前記グラチラマーアセテート関連医薬品がグラチラモイドを含む、請求項１〜３０の何れか１項の方法。
【請求項３２】
前記グラチラマーアセテート関連医薬物質がグラチラマーアセテート医薬物質以外のグラチラモイドであり、または、前記グラチラマーアセテート関連医薬品がグラチラマーアセテート医薬物質以外のグラチラモイドを含む、請求項１〜３０の何れか１項の方法。
【請求項３３】
Ｅｃｍ１、Ｐｒｅｓ１、Ｐｄｌｉｍ４、Ｇｐｒ８３、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ２４、ＬＯＣ１０００４６６０８、Ｇｍ５９０、Ｇｐｒ１１４、Ｔｍｉｅ、Ｒａｓｇｒｐ１、Ｍｙｏ６、Ｐｆｋｐ、Ｕｓｐ１８、Ａｒｌ４ｃ、Ａｌｓ２ｃｌ、２８１０４１０Ｐ２２Ｒｉｋ、Ａｒｌ５ａ、Ｇｂｐ２、Ｒａｓｇｒｐ１、Ａｎｋｒｄ３７、Ｔｐｉ１、４９３０５８３Ｈ１４Ｒｉｋ、Ｉｆｉｔ３、ＬＯＣ６６７３７０、Ｋｌｈｄｃ１、Ｃｄ２４７、Ｉｇｆｂｐ４、Ｏａｓ２、Ｂｃｌ１１ｂ、Ｆｓｃｎ１、Ｃｔｓｇ、Ｍｐｏ、Ｐｒｔｎ３、Ｌｙｚｓ、Ｅｍｒ１、Ｃｈｉ３ｌ１、Ａｎｘａ３、Ｈｐ、Ｌｙｚ２、Ｌｙｚ、Ｆｅｒ１ｌ３、Ｓｉｒｐａ、Ｃｄ６３、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｌｅｃ４ｄ、ＥＧ４３３０１６、Ｓｔｆａ１、Ｃｈｉ３ｌ３  Ｎｇｐ、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｌｅｃｓｆ９、Ｓａａ３、５０３３４１４Ｋ０４Ｒｉｋ、Ｓｌｃ７ａ１１、Ｓｌｐｉ、Ｃｄ１４、Ｆｐｒ２、Ｆｃｇｒ３、Ｆ１０、Ｇｐｎｍｂ、Ｔｇｆｂｉ、Ｍｍｐ１４、Ｓｌｃ１１ａ１、Ｃ３、Ｇｐｒ８４、Ａｃｔａ２、Ｌｃｎ２、Ｈｍｏｘ１、Ｔｐｓａｂ１、Ｃｃｌ４、Ｉｌ２、Ｉｎｈｂａ、Ｃｘｃｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ２、Ｕｐｐ１、Ｇｐｒ１０９ａ、Ｇｐ３８、Ｉｌ１ｂ、Ｃｘｃｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｃｃｌ３、６７２０４１８Ｂ０１Ｒｉｋ、５８３０４９６Ｌ１１Ｒｉｋ、Ｃｄ８ｂ１、Ｆｃｇｒｔ、ＬＯＣ３８５６１５およびＳｃｍｌ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程を含む、請求項１、１２、１５または１９の何れか１項の方法。
【請求項３４】
Ｆｏｘｐ３、Ｉｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｂ、Ｃ３、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｘｃｌ２、Ｃｘｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ３およびＣｄ１４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項３５】
Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓアクセッション番号ＧＳＥ４０５６６におけるグラチラマーアセテート医薬物質または医薬品によって制御される遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項３６】
ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＧＡＴＡ３、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−ＤＭＢ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＧＲ２、ＩＬ２、ＩＬ１３、ＩＬ４、ＩＬ１８、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７Ｆ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６Ｒ、ＴＢＸ２１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＮＦ、ＦＯＸＰ３、ＩＬ１０ＲＢ、ＫＬＲＤ１、ＣＤ６９、ＬＴＢ、ＣＤ８３、ＰＲＦ１、ＣＡＭＫ２Ｄ、ＬＴＡ、ＦＳＣＮ１、ＴＬＲ７、ＣＳＦ２、ＣＣＲ７、ＦＡＳＬＧ、ＩＬ１Ａ、ＣＣＬ５、ＣＤ８Ｂ、ＣＸＣＬ１０、ＴＬＲ２、ＣＣＬ４、ＴＬＲ７、ＩＧＨＡ１、ＩＬ２４、ＳＯＣＳ１、ＯＡＳ１、ＪＡＫ１、ＰＴＰＮ２、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩ３５、ＳＴＡＴ２、ＢＣＬ２、ＭＶＤ、ＦＤＰＳ、ＳＱＬＥ、ＮＳＤＨＬ、ＤＨＣＲ２４、Ａｃａｔ２／Ａｃａｔ３、ＭＳＭＯ１、ＬＳＳ、ＣＹＰ５１Ａ１、ＮＦＫＢＩＥ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＰＰ３ＣＣ、ＣＤ３Ｄ、ＩＬ２ＲＢ、ＰＴＥＮ、ＣＤ３Ｇ、ＩＣＯＳ、ＣＡＭＫ２Ｄ、ＮＦＡＴ５、ＬＡＴ、ＩＴＫ、Ｈ２−Ｍ２、ＦＡＳＬＧ、ＬＩＦ、ＩＧＨＡ１、ＰＲＫＡＣＢ、ＳＧＫ１、ＭＡＰＫ１１、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＪＵＮ、ＦＫＢＰ５、ＡＤＲＢ２、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰＫ１２、ＰＯＵ２Ｆ１、ＳＭＡＲＣＡ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＴＧＦＢ３、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＤＨＣＲ２４、ＣＣＲ５、およびＣＸＣＬ９からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項３７】
表８に示した遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程を含む、請求項１、１２、１５または１９の何れか１項の方法。
【請求項３８】
表１０に示した遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程を含む、請求項１、１２、１５または１９の何れか１項の方法。
【請求項３９】
ＦｏｘＰ３、ＧＰＲ８３、ＣＤ１４、ＴＬＲ２、ＩＦＮＧ、ＣＤ４０およびＩＬ１Ｂからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程を含む、請求項１、１２、１５または１９の何れか１項の方法。
【請求項４０】
表１２に示した遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程を含む、請求項１、１２、１５または１９の何れか１項の方法。
【請求項４１】
ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージ細胞、単球細胞、間質細胞、多重系列前駆体細胞、樹状細胞、繊維芽細胞網状赤血球、繊維芽細胞および顆粒球からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子についての遺伝子セットエンリッチメント解析を判定する工程を含む、請求項１、１２、１５または１９の何れか１項の方法。
【請求項４２】
遺伝子セットエンリッチメント解析を判定する工程が、表１１に示したランクリストファイルの１つ以上に存在する遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを評価する工程を含む、請求項４１の方法。
【請求項４３】
前記参考基準が培養基である、請求項１２〜１７の何れか１項の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本出願は、２０１３年５月３日に出願された米国仮出願第６１／８１９，４８１号、および２０１３年１月４日に出願された同第６１／７４９，２２８号の利益を主張するものであり、そのそれぞれの内容はすべて、参照によりここに組み込まれるものとする。
【０００２】
本出願の全体にわたって、様々な刊行物が括弧内の識別数字によって参考文献として載せられている。これらの参考文献の全目録は、実施例の後に確認することができる。これらの刊行物の開示は、本発明が関係する技術の状況をより完全に説明するために、それらの全体が本出願の中に参照により組み込まれるものとする。
【０００３】
多発性硬化症（ＭＳ）は、再発−寛解型（ＲＲ）または進行型の何れかの経過を伴う中枢神経系（ＣＮＳ）の慢性で衰弱性の自己免疫疾患であって、神経学的悪化（neurologic deterioration）および障害をもたらす。初診時では、ＲＲＭＳはこの疾患の最も一般的な形態（１）であり、これは神経学的機能障害（再発）の予測不可能な急性発症と、その後の不定性回復および臨床的安定期を特徴とする。大多数のＲＲＭＳ患者は、最終的には、重複型再発（superimposed relapses）があるかまたはそれがない二次進行性（ＳＰ）疾患を発症する。約１５％の患者は、最初から患者の神経機能の持続的悪化が発症する；この形態は、一次進行性（ＰＰ）ＭＳと呼ばれる。クリニカリ−・アイソレイテッド・シンドローム（Clinically Isolated Syndrome）または「ＣＩＳ」）を経験した患者、およびその後のＭｃＤｏｎａｌｄの基準による磁気共鳴画像（ＭＲＩ）走査の際に病変播種を示す患者もまた、再発性ＭＳに罹患しているものと見なされる（２）。
【０００４】
ＭＳは、罹患率が世界中で大幅に異なり、若年成人層における慢性神経学的障害の最も一般的な原因である（３、４）。Ａｎｄｅｒｓｏｎらは、１９９０年に米国には医師がＭＳと診断した患者が約３５０，０００人いると推定した（人口１００，０００人当たり約１４０人）（５）。世界では約２５０万人が罹患していると推定される（６）。一般に、ＭＳの罹患率および発症率は世界的に増加傾向にあったが、この傾向の理由は十分に理解されていない（５）。
【０００５】
現在の治療的アプローチは、ｉ）対症療法、ｉｉ）コルチコステロイドによる急性再発の処置、およびｉｉｉ）疾患の経過を変えることを目的とした処置からなっている。現在認可されている治療法は、疾患の炎症プロセスを標的としている。それらのほとんどは免疫調節剤として作用すると考えられているが、それらの作用機序は完全には解明されていない。免疫抑制剤または細胞障害剤もまた、従来の治療法が不十分であった後に一部の患者で使用されている。いくつかの医薬品がＲＲ−ＭＳの処置に効果的なものとして承認され、臨床的に確認されている；例えば、ベタステロン（BETASERON）（登録商標）、アボネックス（AVONEX）（登録商標）およびレビフ（REBIF）（登録商標）などがそれに含まれるが、これらはサイトカインインターフェロンベータ（ＩＦＮＢ）の誘導体であって、ＭＳにおけるその作用機序は一般に免疫調節作用に起因し、炎症誘発性反応に拮抗し、サプレッサー細胞を誘導する（７）。ＭＳ処置用の他の承認済み医薬品としては、ミトキサントロン（Mitoxantrone）およびナタリズマブ（Natalizumab）が挙げられる。
【０００６】
コパキソン（Copaxone）（登録商標）（Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．）は、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）および臨床的に孤発した症候群（ＣＩＳ）の罹患患者の処置で承認されたグラチラマーアセテート医薬品である（８）。コパキソン（登録商標）の活性物質であるグラチラマーアセテート医薬物質（ＧＡ）はポリペプチドの複合混合物であり、グラチラモイド（glatiramoid）クラスの第１のメンバーである；すなわち、規定のモル比で４種類の天然アミノ酸：Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−リシンおよびＬ−チロシンから構築されている様々なサイズの合成ポリペプチドの複合混合物である（９）。
【０００７】
ＧＡは、慢性炎症性疾患および神経変性疾患の様々な動物モデルにおいて抗炎症効果および神経保護効果を誘導し（１０〜１４）、長期処置した後のＭＳ患者における再発の低減と神経学的障害の遅延において安全かつ有効であることが示されている（１５）。
【０００８】
ＧＡ治療活性の根底にある機序は完全には解明されないが、免疫細胞に対するＧＡ活性は十分に示されている。ＧＡは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）内の脳炎誘発性エピトープの改変ペプチドリガンド（ＡＰＬ）として作用するよう考えられており（１６）、体液および細胞レベルでＭＢＰと交差反応性を示す（１７〜２３）。ＧＡポリペプチド混合物の特有の抗原配列は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）のＭＨＣクラスＩＩ分子への結合およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）への提示に関してミエリン抗原と競合し、アネルギーの誘導または自己反応性ＭＢＰ−反応性Ｔ細胞の欠損およびＧＡ−反応性Ｔ細胞の増殖をもたらす。コパキソン処置の開始時に、ＭＳ患者由来のＧＡ−反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞株は、炎症誘発性ヘルパーＴ細胞１型（Ｔｈ１）および抗炎症性Ｔｈ２サイトカインの両方を分泌するが（２１、２４）、コパキソンへの継続的暴露により、ＧＡ−反応性Ｔ細胞からＴｈ２表現型へのシフトが誘導される（２１、２３、２５−２８）。
【０００９】
コパキソンはまた、ＭＳ患者で機能的に損傷されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞の数および抑制能力をも増加させる（２９〜３１）。さらに、処置によってＡＰＣ機能の抗原非特異性モジュレーションがもたらされる。コパキソン処置は、インターロイキン（ＩＬ）−１０およびトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）の増加と、ＩＬ−１２および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の産生の低下を特徴とする、抗炎症性ＩＩ型単球の発達を促進する（３２）。
【００１０】
発明の概要
免疫細胞内でＧＡによってモジュレートされる機能経路をさらに特性決定するために、ハイスループット遺伝子発現解析を使用した。この技術により、何千もの遺伝子の検査を容易にし、広範囲の生物学的機能を同定することができる。マイクロアレイ遺伝子発現解析は、ＧＡを、またはＧＡ−Ｎａｔｃｏ（Ｇｌａｔｉｍｅｒ（登録商標）、Ｎａｔｃｏ  Ｐｈａｒｍａ，Ｌｔｄ．、ハイデラバード、インド）と呼ばれている異形体を用い、エクスビボで再活性化させたＧＡ−プライム型マウス脾臓細胞を使用して行われた。ＧＡまたはＧＡ−Ｎａｔｃｏによって誘導される遺伝子の転写変化は、ＧＡ活性の既知の機序と関連している可能性のある機能経路に関して評価した。この高感度ハイスループット遺伝子発現解析は、ＧＡの作用様式、および別の方法では検出が困難な各種グラチラモイド間の差を解明する。
【００１１】
本発明は、グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を特性決定する方法であって、
ａ）グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品のバッチを得る工程と；
ｂ）所定量のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品で哺乳動物を免疫する工程と；
ｃ）免疫後、所定時間に、工程ｂ）の哺乳動物由来の細胞培養物を調製する工程と；
ｄ）工程ｃ）の培養物からの細胞を所定量の工程ａ）のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品とインキュベートする工程と；
ｅ）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓのアクセッション番号ＧＳＥ４０５６６におけるグラチラマーアセテート参考基準またはグラチラマーアセテート医薬物質または医薬品によって制御される遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程；Ｅｃｍ１、Ｐｒｅｓ１、Ｐｄｌｉｍ４、Ｇｐｒ８３、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ２４、ＬＯＣ１０００４６６０８、Ｇｍ５９０、Ｇｐｒ１１４、Ｔｍｉｅ、Ｒａｓｇｒｐ１、Ｍｙｏ６、Ｐｆｋｐ、Ｕｓｐ１８、Ａｒｌ４ｃ、Ａｌｓ２ｃｌ、２８１０４１０Ｐ２２Ｒｉｋ、Ａｒｌ５ａ、Ｇｂｐ２、Ｒａｓｇｒｐ１、Ａｎｋｒｄ３７、Ｔｐｉ１、４９３０５８３Ｈ１４Ｒｉｋ、Ｉｆｉｔ３、ＬＯＣ６６７３７０、Ｋｌｈｄｃ１、Ｃｄ２４７、Ｉｇｆｂｐ４、Ｏａｓ２、Ｂｃｌ１１ｂ、Ｆｓｃｎ１、Ｃｔｓｇ、Ｍｐｏ、Ｐｒｔｎ３、Ｌｙｚｓ、Ｅｍｒ１、Ｃｈｉ３ｌ１、Ａｎｘａ３、Ｈｐ、Ｌｙｚ２、Ｌｙｚ、Ｆｅｒ１ｌ３、Ｓｉｒｐａ、Ｃｄ６３、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｌｅｃ４ｄ、ＥＧ４３３０１６、Ｓｔｆａ１、Ｃｈｉ３ｌ３  Ｎｇｐ、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｌｅｃｓｆ９、Ｓａａ３、５０３３４１４Ｋ０４Ｒｉｋ、Ｓｌｃ７ａ１１、Ｓｌｐｉ、Ｃｄ１４、Ｆｐｒ２、Ｆｃｇｒ３、Ｆ１０、Ｇｐｎｍｂ、Ｔｇｆｂｉ、Ｍｍｐ１４、Ｓｌｃ１１ａ１、Ｃ３、Ｇｐｒ８４、Ａｃｔａ２、Ｌｃｎ２、Ｈｍｏｘ１、Ｔｐｓａｂ１、Ｃｃｌ４、Ｉｌ２、Ｉｎｈｂａ、Ｃｘｃｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ２、Ｕｐｐ１、Ｇｐｒ１０９ａ、Ｇｐ３８、Ｉｌ１ｂ、Ｃｘｃｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｃｃｌ３、６７２０４１８Ｂ０１Ｒｉｋ、５８３０４９６Ｌ１１Ｒｉｋ、Ｃｄ８ｂ１、Ｆｃｇｒｔ、ＬＯＣ３８５６１５およびＳｃｍｌ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程；ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＧＡＴＡ３、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−ＤＭＢ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＧＲ２、ＩＬ２、ＩＬ１３、ＩＬ４、ＩＬ１８、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７Ｆ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６Ｒ、ＴＢＸ２１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＮＦ、ＦＯＸＰ３、ＩＬ１０ＲＢ、ＫＬＲＤ１、ＣＤ６９、ＬＴＢ、ＣＤ８３、ＰＲＦ１、ＣＡＭＫ２Ｄ、ＬＴＡ、ＦＳＣＮ１、ＴＬＲ７、ＣＳＦ２、ＣＣＲ７、ＦＡＳＬＧ、ＩＬ１Ａ、ＣＣＬ５、ＣＤ８Ｂ、ＣＸＣＬ１０、ＴＬＲ２、ＣＣＬ４、ＴＬＲ７、ＩＧＨＡ１、ＩＬ２４、ＳＯＣＳ１、ＯＡＳ１、ＪＡＫ１、ＰＴＰＮ２、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩ３５、ＳＴＡＴ２、ＢＣＬ２、ＭＶＤ、ＦＤＰＳ、ＳＱＬＥ、ＮＳＤＨＬ、ＤＨＣＲ２４、Ａｃａｔ２／Ａｃａｔ３、ＭＳＭＯ１、ＬＳＳ、ＣＹＰ５１Ａ１、ＮＦＫＢＩＥ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＰＰ３ＣＣ、ＣＤ３Ｄ、ＩＬ２ＲＢ、ＰＴＥＮ、ＣＤ３Ｇ、ＩＣＯＳ、ＣＡＭＫ２Ｄ、ＮＦＡＴ５、ＬＡＴ、ＩＴＫ、Ｈ２−Ｍ２、ＦＡＳＬＧ、ＬＩＦ、ＩＧＨＡ１、ＰＲＫＡＣＢ、ＳＧＫ１、ＭＡＰＫ１１、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＪＵＮ、ＦＫＢＰ５、ＡＤＲＢ２、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰＫ１２、ＰＯＵ２Ｆ１、ＳＭＡＲＣＡ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＴＧＦＢ３、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＤＨＣＲ２４、ＣＣＲ５、およびＣＸＣＬ９からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程；Ｆｏｘｐ３、Ｉｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｂ、Ｃ３、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｘｃｌ２、Ｃｘｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ３およびＣｄ１４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程；表８に示した遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程；表１０に示した遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程；ＦｏｘＰ３、ＧＰＲ８３、ＣＤ１４、ＴＬＲ２、ＩＦＮＧ、ＣＤ４０およびＩＬ１Ｂからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程；表１２に示した遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程；または、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージ細胞、単球細胞、間質細胞、多重系列前駆体細胞（multi-lineage progenitor cell）、樹状細胞、繊維芽細胞網状赤血球、繊維芽細胞および顆粒球からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子について遺伝子セットエンリッチメント解析を判定する工程と
を含み、
それにより、工程ａ）のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を特性決定する、
方法を提供する。
【００１２】
また本発明は、グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を特性決定する方法であって、
ａ）グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品のバッチを得る工程と；
ｂ）所定量のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品で哺乳動物を免疫する工程と；
ｃ）免疫後、所定時間に、工程ｂ）の哺乳動物由来の細胞培養物を調製する工程と；
ｄ）工程ｃ）の培養物からの細胞を所定量の工程ａ）のグラチラマーアセテート薬剤関連物質または医薬品とインキュベートする工程と；
ｅ）抗原提示細胞への免疫反応、エフェクターリンパ球の分化、Ｔリンパ球の抑制、Ｆｏｘｐ３ポジティブ制御性Ｔ細胞の活性化、単核白血球の広がり、Ｔリンパ球の増殖、リンパ球の広がり、ナイーブリンパ球の分化、炎症反応、免疫細胞の接着、細胞運動、細胞の遊走性、細胞の走化性、食細胞の細胞移動、単球の走化性、単球の細胞移動および発熱からなる群から選択される工程ｃ）の細胞の生物学的活性レベルを判定する工程と
を含み、
それにより、工程ａ）のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を特性決定する、
方法を提供する。
【００１３】
また本発明は、グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を識別する方法であって、
ｉ）本発明の方法に従って２つ以上のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を特性決定し、それぞれのグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品の特性を得る工程と；
ｉｉ）工程ｉ）で得られたグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品の特性を比較する工程と
を含み、
それにより、グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を識別する、
方法を提供する。
【００１４】
また本発明は、グラチラマーアセテート関連医薬物質を含む医薬品を生産する方法であって、改良が、
ｉ）本発明の方法に従ってグラチラマーアセテート関連医薬物質を特性決定する工程であり、
ここで、工程ｅ）は、Ｅｃｍ１、Ｐｒｅｓ１、Ｐｄｌｉｍ４、Ｇｐｒ８３、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ２４、ＬＯＣ１０００４６６０８、Ｇｍ５９０、Ｇｐｒ１１４、Ｔｍｉｅ、Ｒａｓｇｒｐ１、Ｍｙｏ６、Ｐｆｋｐ、Ｕｓｐ１８、Ａｒｌ４ｃ、Ａｌｓ２ｃｌ、２８１０４１０Ｐ２２Ｒｉｋ、Ａｒｌ５ａ、Ｇｂｐ２、Ｒａｓｇｒｐ１、Ａｎｋｒｄ３７、Ｔｐｉ１、４９３０５８３Ｈ１４Ｒｉｋ、Ｉｆｉｔ３、ＬＯＣ６６７３７０、Ｋｌｈｄｃ１、Ｃｄ２４７、Ｉｇｆｂｐ４、Ｏａｓ２、Ｂｃｌ１１ｂ、Ｆｓｃｎ１、Ｃｔｓｇ、Ｍｐｏ、Ｐｒｔｎ３、Ｌｙｚｓ、Ｅｍｒ１、Ｃｈｉ３ｌ１、Ａｎｘａ３、Ｈｐ、Ｌｙｚ２、Ｌｙｚ、Ｆｅｒ１ｌ３、Ｓｉｒｐａ、Ｃｄ６３、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｌｅｃ４ｄ、ＥＧ４３３０１６、Ｓｔｆａ１、Ｃｈｉ３ｌ３  Ｎｇｐ、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｌｅｃｓｆ９、Ｓａａ３、５０３３４１４Ｋ０４Ｒｉｋ、Ｓｌｃ７ａ１１、Ｓｌｐｉ、Ｃｄ１４、Ｆｐｒ２、Ｆｃｇｒ３、Ｆ１０、Ｇｐｎｍｂ、Ｔｇｆｂｉ、Ｍｍｐ１４、Ｓｌｃ１１ａ１、Ｃ３、Ｇｐｒ８４、Ａｃｔａ２、Ｌｃｎ２、Ｈｍｏｘ１、Ｔｐｓａｂ１、Ｃｃｌ４、Ｉｌ２、Ｉｎｈｂａ、Ｃｘｃｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ２、Ｕｐｐ１、Ｇｐｒ１０９ａ、Ｇｐ３８、Ｉｌ１ｂ、Ｃｘｃｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｃｃｌ３、６７２０４１８Ｂ０１Ｒｉｋ、５８３０４９６Ｌ１１Ｒｉｋ、Ｃｄ８ｂ１、Ｆｃｇｒｔ、ＬＯＣ３８５６１５およびＳｃｍｌ４からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；表８に示した遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；表１０に示した遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；ＦｏｘＰ３、ＧＰＲ８３、ＣＤ１４、ＴＬＲ２、ＩＦＮＧ、ＣＤ４０およびＩＬ１Ｂからなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；表１２に示した遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；または、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージ細胞、単球細胞、間質細胞、多重系列前駆体細胞、樹状細胞、繊維芽細胞網状赤血球、繊維芽細胞および顆粒球からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子について遺伝子セットエンリッチメント解析を判定することを含む、工程と；
ｉｉ）Ｅｃｍ１、Ｐｒｅｓ１、Ｐｄｌｉｍ４、Ｇｐｒ８３、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ２４、ＬＯＣ１０００４６６０８、Ｇｍ５９０、Ｇｐｒ１１４、Ｔｍｉｅ、Ｒａｓｇｒｐ１、Ｍｙｏ６、Ｐｆｋｐ、Ｕｓｐ１８、Ａｒｌ４ｃ、Ａｌｓ２ｃｌ、２８１０４１０Ｐ２２Ｒｉｋ、Ａｒｌ５ａ、Ｇｂｐ２、Ｒａｓｇｒｐ１、Ａｎｋｒｄ３７、Ｔｐｉ１、４９３０５８３Ｈ１４Ｒｉｋ、Ｉｆｉｔ３、ＬＯＣ６６７３７０、Ｋｌｈｄｃ１、Ｃｄ２４７、Ｉｇｆｂｐ４、Ｏａｓ２  Ｂｃｌ１１ｂ、６７２０４１８Ｂ０１Ｒｉｋ、５８３０４９６Ｌ１１Ｒｉｋ、Ｃｄ８ｂ１、Ｆｃｇｒｔ、ＬＯＣ３８５６１５およびＳｃｍｌ４からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準と比較して低い場合、または、Ｆｓｃｎ１、Ｃｔｓｇ、Ｍｐｏ、Ｐｒｔｎ３、Ｌｙｚｓ、Ｅｍｒ１、Ｃｈｉ３ｌ１、Ａｎｘａ３、Ｈｐ、Ｌｙｚ２、Ｌｙｚ、Ｆｅｒ１ｌ３、Ｓｉｒｐａ、Ｃｄ６３、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｌｅｃ４ｄ、ＥＧ４３３０１６、Ｓｔｆａ１、Ｃｈｉ３ｌ３  Ｎｇｐ、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｌｅｃｓｆ９、Ｓａａ３、５０３３４１４Ｋ０４Ｒｉｋ、Ｓｌｃ７ａ１１、Ｓｌｐｉ、Ｃｄ１４、Ｆｐｒ２、Ｆｃｇｒ３、Ｆ１０、Ｇｐｎｍｂ、Ｔｇｆｂｉ、Ｍｍｐ１４、Ｓｌｃ１１ａ１、Ｃ３、Ｇｐｒ８４、Ａｃｔａ２、Ｌｃｎ２、Ｈｍｏｘ１、Ｔｐｓａｂ１、Ｃｃｌ４、Ｉｌ２、Ｉｎｈｂａ、Ｃｘｃｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ２、Ｕｐｐ１、Ｇｐｒ１０９ａ、Ｇｐ３８、Ｉｌ１ｂ、Ｃｘｃｌ２、Ｉｌ１ａ，およびＣｃｌ３からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準と比較して高い場合、医薬品中の含有物として許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質のバッチを処分する工程；表８に示した遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準の発現レベルと実質的に同一でない場合、医薬品中の含有物として許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質のバッチを処分する工程；表１０に示した遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準の発現レベルと実質的に同一でない場合、医薬品中の含有物として許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質のバッチを処分する工程；ＧＰＲ８３、ＩＦＮＧおよびＦｏｘｐ３からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが低い場合、または、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＴＬＲ２およびＩＬ１Ｂからなる群から選択される遺伝子の発現レベルが高い場合、医薬品中の含有物として許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質のバッチを処分する工程；ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞遺伝子として表１２で同定された遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが低い場合、または、マクロファージ遺伝子として表１２で同定された遺伝子および単球遺伝子として表１２で同定された遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが高い場合、医薬品中の含有物として許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質のバッチを処分する工程；あるいは、遺伝子セットエンリッチメント解析が、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される少なくとも１つの��胞型に関連した遺伝子についてダウンレギュレーションを示すか、もしくはアップレギュレーションの欠如を示す場合、または、遺伝子セットエンリッチメント解析が、マクロファージ細胞、単球細胞、間質細胞、多重系列前駆体細胞、樹状細胞、繊維芽細胞網状赤血球、繊維芽細胞および顆粒球からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子についてアップレギュレーションを示すか、ダウンレギュレーションの欠如を示す場合、医薬品中の含有物として許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質のバッチを処分する工程と
を含む、方法を提供する。
【００１５】
また本発明は、グラチラマーアセテート関連医薬物質を含む医薬品を生産する方法であって、改良が、
ｉ）本発明の方法に従ってグラチラマーアセテート関連医薬物質を特性決定する工程であり、
ここで、工程ｅ）は、Ｆｏｘｐ３、Ｉｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｂ、Ｃ３、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｘｃｌ２、Ｃｘｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ３およびＣｄ１４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定することを含む、工程と；
ｉｉ）ＦｏｘＰ３の発現レベルが参考基準と比較して低い場合、または、Ｉｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｂ、Ｃ３、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｘｃｌ２、Ｃｘｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ３およびＣｄ１４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルが参考基準と比較して高い場合、医薬品中の含有物として許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質のバッチを処分する工程と
を含む、方法を提供する。
【００１６】
本方法はまた、グラチラマーアセテート関連医薬物質を含む医薬品を生産する方法であって、改良が、
ｉ）本発明の方法に従ってグラチラマーアセテート関連医薬物質を特性決定する工程であり、
ここで、工程ｅ）は、抗原提示細胞への免疫反応、エフェクターリンパ球の分化、Ｔリンパ球の抑制、Ｆｏｘｐ３ポジティブ制御性Ｔ細胞の活性化、単核白血球の広がり、Ｔリンパ球の増殖、リンパ球の広がり、ナイーブリンパ球の分化、炎症反応、免疫細胞の接着、細胞運動、細胞の遊走性、細胞の走化性、食細胞の細胞移動、単球の走化性、単球の細胞移動および発熱からなる群から選択される工程ｃ）の細胞の生物学的活性レベルを判定することを含む、工程と；
ｉｉ）抗原提示細胞への免疫反応、エフェクターリンパ球の分化、Ｔリンパ球の抑制、およびＦｏｘｐ３ポジティブ制御性Ｔ細胞の活性化からなる群から選択される生物学的活性レベルが参考基準と比較して低い場合、または、単核白血球の広がり、Ｔリンパ球の増殖、リンパ球の広がり、ナイーブリンパ球の分化、炎症反応、免疫細胞の接着、細胞運動、細胞の遊走性、細胞の走化性、食細胞の細胞移動、単球の走化性、単球の細胞移動および発熱からなる群から選択される生物学的活性レベルが参考基準と比較して高い場合、医薬品中の含有物として許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質のバッチを処分する工程と
を含む、方法を提供する。
【００１７】
また本発明は、グラチラマーアセテート関連医薬物質を含む医薬品をリリースする方法であって、改良が、
ｉ）本発明の方法に従ってグラチラマーアセテート関連医薬品を特性決定する工程であり、
ここで、工程ｅ）は、Ｅｃｍ１、Ｐｒｅｓ１、Ｐｄｌｉｍ４、Ｇｐｒ８３、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ２４、ＬＯＣ１０００４６６０８、Ｇｍ５９０、Ｇｐｒ１１４、Ｔｍｉｅ、Ｒａｓｇｒｐ１、Ｍｙｏ６、Ｐｆｋｐ、Ｕｓｐ１８、Ａｒｌ４ｃ、Ａｌｓ２ｃｌ、２８１０４１０Ｐ２２Ｒｉｋ、Ａｒｌ５ａ、Ｇｂｐ２、Ｒａｓｇｒｐ１、Ａｎｋｒｄ３７、Ｔｐｉ１、４９３０５８３Ｈ１４Ｒｉｋ、Ｉｆｉｔ３、ＬＯＣ６６７３７０、Ｋｌｈｄｃ１、Ｃｄ２４７、Ｉｇｆｂｐ４、Ｏａｓ２、Ｂｃｌ１１ｂ、Ｆｓｃｎ１、Ｃｔｓｇ、Ｍｐｏ、Ｐｒｔｎ３、Ｌｙｚｓ、Ｅｍｒ１、Ｃｈｉ３ｌ１、Ａｎｘａ３、Ｈｐ、Ｌｙｚ２、Ｌｙｚ、Ｆｅｒ１ｌ３、Ｓｉｒｐａ、Ｃｄ６３、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｌｅｃ４ｄ、ＥＧ４３３０１６、Ｓｔｆａ１、Ｃｈｉ３ｌ３  Ｎｇｐ、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｌｅｃｓｆ９、Ｓａａ３、５０３３４１４Ｋ０４Ｒｉｋ、Ｓｌｃ７ａ１１、Ｓｌｐｉ、Ｃｄ１４、Ｆｐｒ２、Ｆｃｇｒ３、Ｆ１０、Ｇｐｎｍｂ、Ｔｇｆｂｉ、Ｍｍｐ１４、Ｓｌｃ１１ａ１、Ｃ３、Ｇｐｒ８４、Ａｃｔａ２、Ｌｃｎ２、Ｈｍｏｘ１、Ｔｐｓａｂ１、Ｃｃｌ４、Ｉｌ２、Ｉｎｈｂａ、Ｃｘｃｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ２、Ｕｐｐ１、Ｇｐｒ１０９ａ、Ｇｐ３８、Ｉｌ１ｂ、Ｃｘｃｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｃｃｌ３、６７２０４１８Ｂ０１Ｒｉｋ、５８３０４９６Ｌ１１Ｒｉｋ、Ｃｄ８ｂ１、Ｆｃｇｒｔ、ＬＯＣ３８５６１５およびＳｃｍｌ４からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；表８に示した遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；表１０に示した遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；ＦｏｘＰ３、ＧＰＲ８３、ＣＤ１４、ＴＬＲ２、ＩＦＮＧ、ＣＤ４０およびＩＬ１Ｂからなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；表１２に示した遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；または、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージ細胞、単球細胞、間質細胞、多重系列前駆体細胞、樹状細胞、繊維芽細胞網状赤血球、繊維芽細胞および顆粒球からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子について遺伝子セットエンリッチメント解析を判定することを含む、工程と；
ｉｉ）Ｅｃｍ１、Ｐｒｅｓ１、Ｐｄｌｉｍ４、Ｇｐｒ８３、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ２４、ＬＯＣ１０００４６６０８、Ｇｍ５９０、Ｇｐｒ１１４、Ｔｍｉｅ、Ｒａｓｇｒｐ１、Ｍｙｏ６、Ｐｆｋｐ、Ｕｓｐ１８、Ａｒｌ４ｃ、Ａｌｓ２ｃｌ、２８１０４１０Ｐ２２Ｒｉｋ、Ａｒｌ５ａ、Ｇｂｐ２、Ｒａｓｇｒｐ１、Ａｎｋｒｄ３７、Ｔｐｉ１、４９３０５８３Ｈ１４Ｒｉｋ、Ｉｆｉｔ３、ＬＯＣ６６７３７０、Ｋｌｈｄｃ１、Ｃｄ２４７、Ｉｇｆｂｐ４、Ｏａｓ２  Ｂｃｌ１１ｂ、６７２０４１８Ｂ０１Ｒｉｋ、５８３０４９６Ｌ１１Ｒｉｋ、Ｃｄ８ｂ１、Ｆｃｇｒｔ、ＬＯＣ３８５６１５およびＳｃｍｌ４からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準と比較して低い場合、または、Ｆｓｃｎ１、Ｃｔｓｇ、Ｍｐｏ、Ｐｒｔｎ３、Ｌｙｚｓ、Ｅｍｒ１、Ｃｈｉ３ｌ１、Ａｎｘａ３、Ｈｐ、Ｌｙｚ２、Ｌｙｚ、Ｆｅｒ１ｌ３、Ｓｉｒｐａ、Ｃｄ６３、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｌｅｃ４ｄ、ＥＧ４３３０１６、Ｓｔｆａ１、Ｃｈｉ３ｌ３  Ｎｇｐ、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｌｅｃｓｆ９、Ｓａａ３、５０３３４１４Ｋ０４Ｒｉｋ、Ｓｌｃ７ａ１１、Ｓｌｐｉ、Ｃｄ１４、Ｆｐｒ２、Ｆｃｇｒ３、Ｆ１０、Ｇｐｎｍｂ、Ｔｇｆｂｉ、Ｍｍｐ１４、Ｓｌｃ１１ａ１、Ｃ３、Ｇｐｒ８４、Ａｃｔａ２、Ｌｃｎ２、Ｈｍｏｘ１、Ｔｐｓａｂ１、Ｃｃｌ４、Ｉｌ２、Ｉｎｈｂａ、Ｃｘｃｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ２、Ｕｐｐ１、Ｇｐｒ１０９ａ、Ｇｐ３８、Ｉｌ１ｂ、Ｃｘｃｌ２、Ｉｌ１ａ、およびＣｃｌ３からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準と比較して高い場合、リリースについて許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬品のバッチを処分する工程；表８に示した遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準の発現レベルと実質的に同一でない場合、リリースについて許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬品のバッチを処分する工程；表１０に示した遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準の発現レベルと実質的に同一でない場合、リリースについて許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬品のバッチを処分する工程；ＧＰＲ８３、ＩＦＮＧおよびＦｏｘｐ３からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが低い場合、または、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＴＬＲ２およびＩＬ１Ｂからなる群から選択される遺伝子の発現レベルが高い場合、リリースについて許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬品のバッチを処分する工程；ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞遺伝子として表１２で同定された遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが低い場合、または、マクロファージ遺伝子として表１２で同定された遺伝子および単球遺伝子として表１２で同定された遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが高い場合、リリースについて許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬品のバッチを処分する工程；あるいは、遺伝子セットエンリッチメント解析が、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子についてダウンレギ��レーションを示すか、もしくはアップレギュレーションの欠如を示す場合、または、遺伝子セットエンリッチメント解析が、マクロファージ細胞、単球細胞、間質細胞、多重系列前駆体細胞、樹状細胞、繊維芽細胞網状赤血球、繊維芽細胞および顆粒球からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子についてアップレギュレーション示すか、もしくはダウンレギュレーションの欠如を示す場合、リリースについて許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬品のバッチを処分する工程と
を含む、方法を提供する。
【００１８】
また本発明は、グラチラマーアセテート関連医薬物質を含む医薬品をリリースする方法であって、改良が、
ｉ）本発明の方法に従ってグラチラマーアセテート関連医薬品を特性決定する工程であり、
ここで、工程ｅ）は、Ｆｏｘｐ３、Ｉｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｂ、Ｃ３、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｘｃｌ２、Ｃｘｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ３およびＣｄ１４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定することを含む、工程と；
ｉｉ）ＦｏｘＰ３の発現レベルが参考基準と比較して低い場合、または、Ｉｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｂ、Ｃ３、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｘｃｌ２、Ｃｘｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ３およびＣｄ１４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルが参考基準と比較して高い場合、リリースについて許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬品のバッチを処分する工程と
を含む、方法を提供する。
【００１９】
また本発明は、グラチラマーアセテート関連医薬物質を含む医薬品をリリースする方法であって、改良が、
ｉ）本発明の方法に従ってグラチラマーアセテート関連医薬品を特性決定する工程であり、
ここで、工程ｅ）は、抗原提示細胞への免疫反応、エフェクターリンパ球の分化、Ｔリンパ球の抑制、Ｆｏｘｐ３ポジティブ制御性Ｔ細胞の活性化、単核白血球の広がり、Ｔリンパ球の増殖、リンパ球の広がり、ナイーブリンパ球の分化、炎症反応、免疫細胞の接着、細胞運動、細胞の遊走性、細胞の走化性、食細胞の細胞移動、単球の走化性、単球の細胞移動および発熱からなる群から選択される工程ｃ）の細胞の生物学的活性レベルを判定することを含む、工程と；
ｉｉ）抗原提示細胞への免疫反応、エフェクターリンパ球の分化、Ｔリンパ球の抑制、およびＦｏｘｐ３ポジティブ制御性Ｔ細胞の活性化からなる群から選択される生物学的活性レベルが参考基準と比較して低い場合、または、単核白血球の広がり、Ｔリンパ球の増殖、リンパ球の広がり、ナイーブリンパ球の分化、炎症反応、免疫細胞の接着、細胞運動、細胞の遊走性、細胞の走化性、食細胞の細胞移動、単球の走化性、単球の細胞移動および発熱からなる群から選択される生物学的活性レベルが参考基準と比較して高い場合、リリースについて許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬品のバッチを処分する工程と
を含む、方法を提供する。
【００２０】
本発明はまた、グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品の準最適活性を同定する方法であって、
ａ）グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品をげっ歯動物に投与する工程と；
ｂ）抗原提示細胞への免疫反応、エフェクターリンパ球の分化、Ｔリンパ球の抑制、Ｆｏｘｐ３ポジティブ制御性Ｔ細胞の活性化、単核白血球の広がり、Ｔリンパ球の増殖、リンパ球の広がり、ナイーブリンパ球の分化、炎症反応、免疫細胞の接着、細胞運動、細胞の遊走性、細胞の走化性、食細胞の細胞移動、単球の走化性、単球の細胞移動および発熱からなる群から選択されるげっ歯動物の生物学的活性レベルを判定する工程と；
ｃ）抗原提示細胞への免疫反応、エフェクターリンパ球の分化、Ｔリンパ球の抑制およびＦｏｘｐ３ポジティブ制御性Ｔ細胞の活性化からなる群から選択される生物学的活性レベルが参考基準と比較して低い場合、または、単核白血球の広がり、Ｔリンパ球の増殖、リンパ球の広がり、ナイーブリンパ球の分化、炎症反応、免疫細胞の接着、細胞運動、細胞の遊走性、細胞の走化性、食細胞の細胞移動、単球の走化性、単球の細胞移動および発熱からなる群から選択される生物学的活性レベルが参考基準と比較して高い場合、準最適活性を生じるものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を同定する工程と
を含み、
それにより、グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品の準最適活性を同定する、
方法を提供する。
【００２１】
また本発明は、グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品の準最適活性を同定する方法であって、
ａ）グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品をげっ歯動物に投与する工程と、
ｂ）Ｅｃｍ１、Ｐｒｅｓ１、Ｐｄｌｉｍ４、Ｇｐｒ８３、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ２４、ＬＯＣ１０００４６６０８、Ｇｍ５９０、Ｇｐｒ１１４、Ｔｍｉｅ、Ｒａｓｇｒｐ１、Ｍｙｏ６、Ｐｆｋｐ、Ｕｓｐ１８、Ａｒｌ４ｃ、Ａｌｓ２ｃｌ、２８１０４１０Ｐ２２Ｒｉｋ、Ａｒｌ５ａ、Ｇｂｐ２、Ｒａｓｇｒｐ１、Ａｎｋｒｄ３７、Ｔｐｉ１、４９３０５８３Ｈ１４Ｒｉｋ、Ｉｆｉｔ３、ＬＯＣ６６７３７０、Ｋｌｈｄｃ１、Ｃｄ２４７、Ｉｇｆｂｐ４、Ｏａｓ２、Ｂｃｌ１１ｂ、Ｆｓｃｎ１、Ｃｔｓｇ、Ｍｐｏ、Ｐｒｔｎ３、Ｌｙｚｓ、Ｅｍｒ１、Ｃｈｉ３ｌ１、Ａｎｘａ３、Ｈｐ、Ｌｙｚ２、Ｌｙｚ、Ｆｅｒ１ｌ３、Ｓｉｒｐａ、Ｃｄ６３、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｌｅｃ４ｄ、ＥＧ４３３０１６、Ｓｔｆａ１、Ｃｈｉ３ｌ３  Ｎｇｐ、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｌｅｃｓｆ９、Ｓａａ３、５０３３４１４Ｋ０４Ｒｉｋ、Ｓｌｃ７ａ１１、Ｓｌｐｉ、Ｃｄ１４、Ｆｐｒ２、Ｆｃｇｒ３、Ｆ１０、Ｇｐｎｍｂ、Ｔｇｆｂｉ、Ｍｍｐ１４、Ｓｌｃ１１ａ１、Ｃ３、Ｇｐｒ８４、Ａｃｔａ２、Ｌｃｎ２、Ｈｍｏｘ１、Ｔｐｓａｂ１、Ｃｃｌ４、Ｉｌ２、Ｉｎｈｂａ、Ｃｘｃｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ２、Ｕｐｐ１、Ｇｐｒ１０９ａ、Ｇｐ３８、Ｉｌ１ｂ、Ｃｘｃｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｃｃｌ３、６７２０４１８Ｂ０１Ｒｉｋ、５８３０４９６Ｌ１１Ｒｉｋ、Ｃｄ８ｂ１、Ｆｃｇｒｔ、ＬＯＣ３８５６１５およびＳｃｍｌ４からなる群から選択される１つ以上の遺伝子のげっ歯動物における発現レベルを判定する工程；表８に示した遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定する工程；表１０に示した遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定する工程；ＦｏｘＰ３、ＧＰＲ８３、ＣＤ１４、ＴＬＲ２、ＩＦＮＧ、ＣＤ４０およびＩＬ１Ｂからなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定する工程；表１２に示した遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定する工程；または、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージ細胞、単球細胞、間質細胞、多重系列前駆体細胞、樹状細胞、繊維芽細胞網状赤血球、繊維芽細胞および顆粒球からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子について遺伝子セットエンリッチメント解析を判定する工程と；
ｃ）Ｅｃｍ１、Ｐｒｅｓ１、Ｐｄｌｉｍ４、Ｇｐｒ８３、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ２４、ＬＯＣ１０００４６６０８、Ｇｍ５９０、Ｇｐｒ１１４、Ｔｍｉｅ、Ｒａｓｇｒｐ１、Ｍｙｏ６、Ｐｆｋｐ、Ｕｓｐ１８、Ａｒｌ４ｃ、Ａｌｓ２ｃｌ、２８１０４１０Ｐ２２Ｒｉｋ、Ａｒｌ５ａ、Ｇｂｐ２、Ｒａｓｇｒｐ１、Ａｎｋｒｄ３７、Ｔｐｉ１、４９３０５８３Ｈ１４Ｒｉｋ、Ｉｆｉｔ３、ＬＯＣ６６７３７０、Ｋｌｈｄｃ１、Ｃｄ２４７、Ｉｇｆｂｐ４、Ｏａｓ２  Ｂｃｌ１１ｂ、６７２０４１８Ｂ０１Ｒｉｋ、５８３０４９６Ｌ１１Ｒｉｋ、Ｃｄ８ｂ１、Ｆｃｇｒｔ、ＬＯＣ３８５６１５およびＳｃｍｌ４の群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準と比較して低い場合、または、Ｆｓｃｎ１、Ｃｔｓｇ、Ｍｐｏ、Ｐｒｔｎ３、Ｌｙｚｓ、Ｅｍｒ１、Ｃｈｉ３ｌ１、Ａｎｘａ３、Ｈｐ、Ｌｙｚ２、Ｌｙｚ、Ｆｅｒ１ｌ３、Ｓｉｒｐａ、Ｃｄ６３、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｌｅｃ４ｄ、ＥＧ４３３０１６、Ｓｔｆａ１、Ｃｈｉ３ｌ３  Ｎｇｐ、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｌｅｃｓｆ９、Ｓａａ３、５０３３４１４Ｋ０４Ｒｉｋ、Ｓｌｃ７ａ１１、Ｓｌｐｉ、Ｃｄ１４、Ｆｐｒ２、Ｆｃｇｒ３、Ｆ１０、Ｇｐｎｍｂ、Ｔｇｆｂｉ、Ｍｍｐ１４、Ｓｌｃ１１ａ１、Ｃ３、Ｇｐｒ８４、Ａｃｔａ２、Ｌｃｎ２、Ｈｍｏｘ１、Ｔｐｓａｂ１、Ｃｃｌ４、Ｉｌ２、Ｉｎｈｂａ、Ｃｘｃｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ２、Ｕｐｐ１、Ｇｐｒ１０９ａ、Ｇｐ３８、Ｉｌ１ｂ、Ｃｘｃｌ２、Ｉｌ１ａ、およびＣｃｌ３の群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準と比較して高い場合、準最適活性を生じるものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を同定する工程；表８に示した遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準の発現レベルと実質的に同一でない場合、準最適活性を生じるものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を同定する工程；表１０に示した遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準の発現レベルと実質的に同一でない場合、準最適活性を生じるものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を同定する工程；ＧＰＲ８３、ＩＦＮＧおよびＦｏｘｐ３からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが低い場合、または、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＴＬＲ２およびＩＬ１Ｂからなる群から選択される遺伝子の発現レベルが高い場合、準最適活性を生じるものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を同定する工程；ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞遺伝子として表１２で同定された遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが低い場合、または、マクロファージ遺伝子として表１２で同定された遺伝子および単球遺伝子として表１２で同定された遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが高い場合、準最適活性を生じるものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を同定する工程；あるいは、遺伝子セットエンリッチメント解析が、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子についてダウンレギュレーションを示すか、もしくはアッ��レギュレーションの欠如を示す場合、または、遺伝子セットエンリッチメント解析が、マクロファージ細胞、単球細胞、間質細胞、多重系列前駆体細胞、樹状細胞、繊維芽細胞網状赤血球、繊維芽細胞および顆粒球からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子についてアップレギュレーションを示すか、もしくはダウンレギュレーションの欠如を示す場合、準最適活性を生じるものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を同定する工程と
を含み、
それにより、グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品の準最適活性を同定する、
方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】活性化基によって着色された、変位値を正規化したバッチ補正済みシグナルのＰＣＡ。
【図２】ＦＤＲ調整ｐ値が０．０５未満であり、ＧＡと培養基の再活性化サンプル間の倍差が１．３以上である、１４７４個の遺伝子の遺伝子的階層クラスター解析（gene-wise hierarchical clustering）。遺伝子と遺伝子記号は欄に記載されており、サンプルタイプによって並べられたサンプルは、縦列に記載されている。
【図３】ＦＤＲ調整ｐ値が０．０５未満であり、ＧＡ−ＲＳと８つのＧＡ−Ｎａｔｃｏサンプルの間の倍差が１．３以上である、９８個の遺伝子の遺伝子的階層クラスター解析。遺伝子と遺伝子記号は縦列に記載されており、サンプルタイプによって並べられたサンプルは、欄に記載されている。これらの９８個の遺伝子についての培養基サンプルおよびＧＡ−ＤＰサンプルの発現レベルは同様に示されている。
【図４】ＧＡの生物学的影響は、他のグラチラモイドよりも一定性が有意に高い。活性化によって誘導された変動を有するプローブのうち、４倍よりも高いプローブは、ＧＡ活性化サンプルと比較した場合に他のグラチラモイド活性化サンプルにおいてＦ検定による有意な変動があった（Ａ）。そのプローブについて参考基準によって誘導される最大および最小の発現レベル間の範囲内にない発現レベルを有するサンプルのパーセンテージとして許容を定義し、プローブの数がこれを満たしていない任意の所定の許容閾値に対し、この閾値を他のグラチラモイドとＧＡの両方について示した（Ｂ）。このことは、ほとんどすべてのケースにおいて、多くのプローブが、他のグラチラモイドによって誘導された後に許容を満たしていないことを示唆している。それぞれの個別の他のグラチラモイドバッチについて、比較用のＧＡと参考基準の間の変動における差のあるプローブのパーセンテージ（緑色の破線）と一緒に、ＧＡまたはＧＡ参考基準の何れかと比較した場合に変動に有意な差のあるプローブのパーセンテージをＣにプロットした。それぞれの場合、他のグラチラモイドのバッチは、変動に大きな差を有する。
【図５】所定強度でＧＡにおいてはより狭い範囲の変動係数（ＣＶ）を示し、他のグラチラモイドにおいてはより広い範囲のＣＶを示している、他のグラチラモイド（黒色）およびＧＡ（赤色）によって活性化された場合のそれぞれのプローブに関する強度関数としてのＣＶのプロット。
【図６】ＧＡは、Ｔｒｅｇを他のグラチラモイドよりも効果的に誘導する。（Ａ）ＧＡは、他のグラチラモイドよりも有意に高いＦｏｘＰ３の発現を誘導する。ＦｏｘＰ３はＴｒｅｇの重要なマーカーである。（Ｂ）別の重要なＴｒｅｇマーカーＧｐｒ８３も同様のパターンの発現を示す。（Ｃ）ＦｏｘＰ３とＧｐｒ８３の両方は、分散プロットで示したとおり同一サンプルで低く、他のグラチラモイドは一部の患者において強いＴｒｅｇ応答を誘導しないということをさらに強調する。（Ｄ）ＦｏｘＰ３誘導の差のさらなる証拠として、ＧＳＥＡ解析では、他のグラチラモイド活性化サンプルよりもＧＡ活性化サンプルにおいてＦｏｘＰ３標的遺伝子のアップレギュレーションが有意に強いことがわかった。（Ｅ）ＧＳＥＡ解析はまた、他のグラチラモイドの場合よりもＧＡにおいて高発現の遺伝子のうちＴｒｅｇ特異的遺伝子の有意なエンリッチメントを確認した。ＮＳ＝有意差なし。
【図７】図６Ｄ〜Ｅで報告したＦｏｘＰ３およびＴｒｅｇのＧＳＥＡ解析に関するＧＳＥＡエンリッチメントプロット。
【図８】ＧＡおよび他のグラチラモイドの生物学的影響における細胞型に特異的な差。ヒートマップは、ＧＡ活性化サンプルおよび他のグラチラモイド活性化サンプルにおける特定遺伝子の相対的発現を示す。Ｔｒｅｇセクション内のそれぞれの行は、Ｔｒｅｇに対して細胞型特異性スコアが高い遺伝子を表わし、一方、マクロファージおよび単球のセクション中のそれぞれの行は、それぞれのそれらの細胞型に対して細胞型特異性スコアが高い遺伝子を表わす。関連の遺伝子のリストは、補助情報として掲載している。まとめると、ＧＡは、他のグラチラモイドよりもＴｒｅｇ関連遺伝子の高発現を誘導し、一方、他のグラチラモイドは、ＧＡよりもマクロファージおよび単球の関連遺伝子の高発現を誘導する。
【図９】他のグラチラモイドと比較してＧＡおよび参照において低発現レベルを示す、ＣＤ１４およびＴＬＲ２のボックスプロット。これは、図１０Ａのカーネル密度プロットによって示した差を可視化する追加の方法である。
【図１０】他のグラチラモイドの単球に対する影響は、ＧＡの影響とは異なり得る。（Ａ）ウィルコクソン順位和検定によって判定し、平滑ヒストグラムになぞらえることができるカーネル密度プロットとして示した場合、他のグラチラモイドは、ＣＤ１４およびＴＬＲ２の有意により高い発現を誘導する。（Ｂ）ＣＤ１４およびＴＬＲ２の発現は、両方とも同一（ほとんどが他のグラチラモイド）サンプルにおいて異常に高い。（Ｃ）ＦｏｘＰ３発現は、ＣＤ１４発現が異常に高いサンプルで異常に低く、このことは、他のグラチラモイドの単球に対する影響の差がそのＴｒｅｇに対する影響の差と関係し得ることを示唆しており、単球がＧＡ誘導ＦｏｘＰ３発現で機能することを示唆している文献と一致する。（Ｄ）ＦｏｘＰ３発現は、ＩＬ１Ｂ発現が異常に高いサンプルで異常に低く、このことは、他のグラチラモイドの単球に対する影響の差がＬＰＳ活性化単球とＴ細胞接触活性化単球の間の差と関係し得ることを示唆しており、ＩＬ１Ｂ産生に対して反対の影響を有していることは既に文献に記載されている。（Ｅ）ＧＳＥＡ解析では、ＧＡの場合よりも他のグラチラモイドにおいて高発現を有する遺伝子のうち単球およびマクロファージ−特異的遺伝子の有意なエンリッチメントが確認された。ＮＳ＝有意差なし。
【図１１】異常に低いＦｏｘＰ３発現と同じ他のグラチラモイドサンプルも、ＩＦＮＧの２つの異なるプローブにより異常に低いＩＦＮＧ発現を有することを示す分散プロット。分散プロットは、ＩＦＮＧの２つの異なるプローブについて、ＧＡおよび参考基準は、他のグラチラモイドよりも大幅にＩＦＮＧをアップレギュレートしたことを説明している。
【図１２】この遺伝子が、ウィルコクソン順位和検定による判定と一致し、また文献とも一致している、ＧＡ活性化サンプルの場合よりも他のグラチラモイド活性化サンプルにおいて高発現を有している事実を示唆しているＣＤ４０のカーネル密度プロット。
【図１３】ＩＬ１Ｂが単球によって主として発現されるという仮説を支持する、ＣＤ１４とＩＬ１Ｂの間の高相関を説明する分散プロット。
【図１４】培養基よりも他のグラチラモイドにおいて高発現を有する遺伝子は、ＣＤ１６ｄｉｍ単球に特異的な遺伝子にエンリッチされるが、培養基よりもＧＡにおいて高発現を有する遺伝子は、ＣＤ１６＋単球に特異的な遺伝子にエンリッチされることを表わすＧＳＥＡ解析。
【図１５】画期的医薬品を他のグラチラモイドと比較する方法のフローチャート、およびＧＡと他のグラチラモイドの間の重要な差のモデル。（Ａ）ＧＡの免疫学的影響を他のグラチラモイドの影響と比較するための遺伝子発現データを解析する方法の概説。処理の後、直接的な差は、多重パラメトリック法、ノンパラメトリック法、ならびにＡＮＯＶＡ系パターン解析、および変動解析によって同定される。これらの方法によって同定される遺伝子は、様々なエンリッチメント系の方法を使用して解析され、追加の方法によって検証される仮説が得られる。（Ｂ）本発明者らの試験から得られる重要な仮説は、ＧＡと比較して他のグラチラモイドの生物学的影響において不均一性が大きいこと、また、ＧＡはＦｏｘＰ３発現をより効果的にアップレギュレートし、許容−誘導Ｔｒｅｇを促進するが、他のグラチラモイドは、許容を低減し得る骨髄系細胞、例えば単球およびマクロファージなどをアップレギュレートするように思われるという事実と関係している。これらの知見を考慮すると、ＧＡは、他のグラチラモイドよりも有害な細胞傷害性細胞を効果的に抑制し得ると仮定するのが妥当であり、この仮説はさらなる調査が当然必要である。
【図１６】変動を比較する許容方法の図。ＧＡおよび他のグラチラモイドで活性化した後の遺伝子の発現を、参考基準によって誘導される最大および最小の発現レベルによって定義される許容範囲内の後部のサンプルのパーセンテージを判定して評価する（Ｇｐｒ８３に関するレッドボックスの頂部および底部、ＦｏｘＰ３に関するレッドボックスの左側および右側）。
【発明の詳細な説明】
【００２３】
発明の態様
本発明は、グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を特性決定する方法であって、
ａ）グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品のバッチを得る工程と；
ｂ）所定量のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品で哺乳動物を免疫する工程と；
ｃ）免疫後、所定時間に、工程ｂ）の哺乳動物由来の細胞培養物を調製する工程と；
ｄ）工程ｃ）の培養物からの細胞を、所定量の工程ａ）のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品とインキュベートする工程と；
ｅ）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓのアクセッション番号ＧＳＥ４０５６６におけるグラチラマーアセテート参考基準またはグラチラマーアセテート医薬物質または医薬品によって制御される遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程；Ｅｃｍ１、Ｐｒｅｓ１、Ｐｄｌｉｍ４、Ｇｐｒ８３、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ２４、ＬＯＣ１０００４６６０８、Ｇｍ５９０、Ｇｐｒ１１４、Ｔｍｉｅ、Ｒａｓｇｒｐ１、Ｍｙｏ６、Ｐｆｋｐ、Ｕｓｐ１８、Ａｒｌ４ｃ、Ａｌｓ２ｃｌ、２８１０４１０Ｐ２２Ｒｉｋ、Ａｒｌ５ａ、Ｇｂｐ２、Ｒａｓｇｒｐ１、Ａｎｋｒｄ３７、Ｔｐｉ１、４９３０５８３Ｈ１４Ｒｉｋ、Ｉｆｉｔ３、ＬＯＣ６６７３７０、Ｋｌｈｄｃ１、Ｃｄ２４７、Ｉｇｆｂｐ４、Ｏａｓ２、Ｂｃｌ１１ｂ、Ｆｓｃｎ１、Ｃｔｓｇ、Ｍｐｏ、Ｐｒｔｎ３、Ｌｙｚｓ、Ｅｍｒ１、Ｃｈｉ３ｌ１、Ａｎｘａ３、Ｈｐ、Ｌｙｚ２、Ｌｙｚ、Ｆｅｒ１ｌ３、Ｓｉｒｐａ、Ｃｄ６３、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｌｅｃ４ｄ、ＥＧ４３３０１６、Ｓｔｆａ１、Ｃｈｉ３ｌ３  Ｎｇｐ、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｌｅｃｓｆ９、Ｓａａ３、５０３３４１４Ｋ０４Ｒｉｋ、Ｓｌｃ７ａ１１、Ｓｌｐｉ、Ｃｄ１４、Ｆｐｒ２、Ｆｃｇｒ３、Ｆ１０、Ｇｐｎｍｂ、Ｔｇｆｂｉ、Ｍｍｐ１４、Ｓｌｃ１１ａ１、Ｃ３、Ｇｐｒ８４、Ａｃｔａ２、Ｌｃｎ２、Ｈｍｏｘ１、Ｔｐｓａｂ１、Ｃｃｌ４、Ｉｌ２、Ｉｎｈｂａ、Ｃｘｃｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ２、Ｕｐｐ１、Ｇｐｒ１０９ａ、Ｇｐ３８、Ｉｌ１ｂ、Ｃｘｃｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｃｃｌ３、６７２０４１８Ｂ０１Ｒｉｋ、５８３０４９６Ｌ１１Ｒｉｋ、Ｃｄ８ｂ１、Ｆｃｇｒｔ、ＬＯＣ３８５６１５およびＳｃｍｌ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程；ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＧＡＴＡ３、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−ＤＭＢ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＧＲ２、ＩＬ２、ＩＬ１３、ＩＬ４、ＩＬ１８、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７Ｆ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６Ｒ、ＴＢＸ２１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＮＦ、ＦＯＸＰ３、ＩＬ１０ＲＢ、ＫＬＲＤ１、ＣＤ６９、ＬＴＢ、ＣＤ８３、ＰＲＦ１、ＣＡＭＫ２Ｄ、ＬＴＡ、ＦＳＣＮ１、ＴＬＲ７、ＣＳＦ２、ＣＣＲ７、ＦＡＳＬＧ、ＩＬ１Ａ、ＣＣＬ５、ＣＤ８Ｂ、ＣＸＣＬ１０、ＴＬＲ２、ＣＣＬ４、ＴＬＲ７、ＩＧＨＡ１、ＩＬ２４、ＳＯＣＳ１、ＯＡＳ１、ＪＡＫ１、ＰＴＰＮ２、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩ３５、ＳＴＡＴ２、ＢＣＬ２、ＭＶＤ、ＦＤＰＳ、ＳＱＬＥ、ＮＳＤＨＬ、ＤＨＣＲ２４、Ａｃａｔ２／Ａｃａｔ３、ＭＳＭＯ１、ＬＳＳ、ＣＹＰ５１Ａ１、ＮＦＫＢＩＥ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＰＰ３ＣＣ、ＣＤ３Ｄ、ＩＬ２ＲＢ、ＰＴＥＮ、ＣＤ３Ｇ、ＩＣＯＳ、ＣＡＭＫ２Ｄ、ＮＦＡＴ５、ＬＡＴ、ＩＴＫ、Ｈ２−Ｍ２、ＦＡＳＬＧ、ＬＩＦ、ＩＧＨＡ１、ＰＲＫＡＣＢ、ＳＧＫ１、ＭＡＰＫ１１、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＪＵＮ、ＦＫＢＰ５、ＡＤＲＢ２、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰＫ１２、ＰＯＵ２Ｆ１、ＳＭＡＲＣＡ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＴＧＦＢ３、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＤＨＣＲ２４、ＣＣＲ５、およびＣＸＣＬ９からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程；Ｆｏｘｐ３、Ｉｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｂ、Ｃ３、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｘｃｌ２、Ｃｘｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ３およびＣｄ１４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程；表８に示した遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程；表１０に示した遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程；ＦｏｘＰ３、ＧＰＲ８３、ＣＤ１４、ＴＬＲ２、ＩＦＮＧ、ＣＤ４０およびＩＬ１Ｂからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程；表１２に示した遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程；または、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージ細胞、単球細胞、間質細胞、多重系列前駆体細胞、樹状細胞、繊維芽細胞網状赤血球、繊維芽細胞および顆粒球からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子について遺伝子セットエンリッチメント解析を判定する工程と
を含み、
それにより、工程ａ）のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を特性決定する、
方法を提供する。
【００２４】
また本発明は、グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を特性決定する方法であって、
ａ）グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品のバッチを得る工程と；
ｂ）所定量のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品で哺乳動物を免疫する工程と；
ｃ）免疫後、所定時間に、工程ｂ）の哺乳動物由来の細胞培養物を調製する工程と；
ｄ）工程ｃ）の培養物からの細胞を、所定量の工程ａ）のグラチラマーアセテート薬剤関連物質または医薬品とインキュベートする工程と；
ｅ）抗原提示細胞への免疫反応、エフェクターリンパ球の分化、Ｔリンパ球の抑制、Ｆｏｘｐ３ポジティブ制御性Ｔ細胞の活性化、単核白血球の広がり、Ｔリンパ球の増殖、リンパ球の広がり、ナイーブリンパ球の分化、炎症反応、免疫細胞の接着、細胞運動、細胞の遊走性、細胞の走化性、食細胞の細胞移動、単球の走化性、単球の細胞移動および発熱からなる群から選択される工程ｃ）の細胞の生物学的活性レベルを判定する工程と
を含み、
それにより、工程ａ）のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を特性決定する、
方法を提供する。
【００２５】
また本発明は、グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を識別する方法であって、
ｉ）本発明の方法に従って２つ以上のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を特性決定し、それぞれのグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品の特性を得る工程と；
ｉｉ）工程ｉ）で得られたグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品の特性を比較する工程と
を含み、
それにより、グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を識別する、
方法を提供する。
【００２６】
本発明の１つ以上の態様において、哺乳動物はげっ歯動物である。
【００２７】
本発明の１つ以上の態様において、工程ｃ）の培養物は初代培養物である。
【００２８】
本発明の１つ以上の態様において、工程ａ）のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品はグラチラマーアセテート医薬物質または医薬品である。
【００２９】
本発明の１つ以上の態様において、工程ａ）のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品はグラチラマーアセテート医薬物質または医薬品以外のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品である。
【００３０】
本発明の１つ以上の態様において、工程ｂ）のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品はグラチラマーアセテート医薬物質または医薬品である。
【００３１】
本発明の１つ以上の態様において、工程ｂ）のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品はグラチラマーアセテート医薬物質または医薬品以外のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品である。
【００３２】
本発明の１つ以上の態様において、工程ｂ）のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品は工程ａ）と同一のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品である。
【００３３】
本発明の１つ以上の態様において、工程ｂ）のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品は工程ａ）のグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品とは異なるグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品である。
【００３４】
また本発明は、グラチラマーアセテート関連医薬物質を含む医薬品を生産する方法であって、改良が、
ｉ）本発明の方法に従ってグラチラマーアセテート関連医薬物質を特性決定する工程であり、
ここで、工程ｅ）は、Ｅｃｍ１、Ｐｒｅｓ１、Ｐｄｌｉｍ４、Ｇｐｒ８３、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ２４、ＬＯＣ１０００４６６０８、Ｇｍ５９０、Ｇｐｒ１１４、Ｔｍｉｅ、Ｒａｓｇｒｐ１、Ｍｙｏ６、Ｐｆｋｐ、Ｕｓｐ１８、Ａｒｌ４ｃ、Ａｌｓ２ｃｌ、２８１０４１０Ｐ２２Ｒｉｋ、Ａｒｌ５ａ、Ｇｂｐ２、Ｒａｓｇｒｐ１、Ａｎｋｒｄ３７、Ｔｐｉ１、４９３０５８３Ｈ１４Ｒｉｋ、Ｉｆｉｔ３、ＬＯＣ６６７３７０、Ｋｌｈｄｃ１、Ｃｄ２４７、Ｉｇｆｂｐ４、Ｏａｓ２、Ｂｃｌ１１ｂ、Ｆｓｃｎ１、Ｃｔｓｇ、Ｍｐｏ、Ｐｒｔｎ３、Ｌｙｚｓ、Ｅｍｒ１、Ｃｈｉ３ｌ１、Ａｎｘａ３、Ｈｐ、Ｌｙｚ２、Ｌｙｚ、Ｆｅｒ１ｌ３、Ｓｉｒｐａ、Ｃｄ６３、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｌｅｃ４ｄ、ＥＧ４３３０１６、Ｓｔｆａ１、Ｃｈｉ３ｌ３  Ｎｇｐ、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｌｅｃｓｆ９、Ｓａａ３、５０３３４１４Ｋ０４Ｒｉｋ、Ｓｌｃ７ａ１１、Ｓｌｐｉ、Ｃｄ１４、Ｆｐｒ２、Ｆｃｇｒ３、Ｆ１０、Ｇｐｎｍｂ、Ｔｇｆｂｉ、Ｍｍｐ１４、Ｓｌｃ１１ａ１、Ｃ３、Ｇｐｒ８４、Ａｃｔａ２、Ｌｃｎ２、Ｈｍｏｘ１、Ｔｐｓａｂ１、Ｃｃｌ４、Ｉｌ２、Ｉｎｈｂａ、Ｃｘｃｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ２、Ｕｐｐ１、Ｇｐｒ１０９ａ、Ｇｐ３８、Ｉｌ１ｂ、Ｃｘｃｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｃｃｌ３、６７２０４１８Ｂ０１Ｒｉｋ、５８３０４９６Ｌ１１Ｒｉｋ、Ｃｄ８ｂ１、Ｆｃｇｒｔ、ＬＯＣ３８５６１５およびＳｃｍｌ４からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；表８に示した遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；表１０に示した遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；ＦｏｘＰ３、ＧＰＲ８３、ＣＤ１４、ＴＬＲ２、ＩＦＮＧ、ＣＤ４０およびＩＬ１Ｂからなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；表１２に示した遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；または、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージ細胞、単球細胞、間質細胞、多重系列前駆体細胞、樹状細胞、繊維芽細胞網状赤血球、繊維芽細胞および顆粒球からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子について遺伝子セットエンリッチメント解析を判定することを含む、工程と；
ｉｉ）Ｅｃｍ１、Ｐｒｅｓ１、Ｐｄｌｉｍ４、Ｇｐｒ８３、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ２４、ＬＯＣ１０００４６６０８、Ｇｍ５９０、Ｇｐｒ１１４、Ｔｍｉｅ、Ｒａｓｇｒｐ１、Ｍｙｏ６、Ｐｆｋｐ、Ｕｓｐ１８、Ａｒｌ４ｃ、Ａｌｓ２ｃｌ、２８１０４１０Ｐ２２Ｒｉｋ、Ａｒｌ５ａ、Ｇｂｐ２、Ｒａｓｇｒｐ１、Ａｎｋｒｄ３７、Ｔｐｉ１、４９３０５８３Ｈ１４Ｒｉｋ、Ｉｆｉｔ３、ＬＯＣ６６７３７０、Ｋｌｈｄｃ１、Ｃｄ２４７、Ｉｇｆｂｐ４、Ｏａｓ２  Ｂｃｌ１１ｂ、６７２０４１８Ｂ０１Ｒｉｋ、５８３０４９６Ｌ１１Ｒｉｋ、Ｃｄ８ｂ１、Ｆｃｇｒｔ、ＬＯＣ３８５６１５およびＳｃｍｌ４からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準と比較して低い場合、または、Ｆｓｃｎ１、Ｃｔｓｇ、Ｍｐｏ、Ｐｒｔｎ３、Ｌｙｚｓ、Ｅｍｒ１、Ｃｈｉ３ｌ１、Ａｎｘａ３、Ｈｐ、Ｌｙｚ２、Ｌｙｚ、Ｆｅｒ１ｌ３、Ｓｉｒｐａ、Ｃｄ６３、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｌｅｃ４ｄ、ＥＧ４３３０１６、Ｓｔｆａ１、Ｃｈｉ３ｌ３  Ｎｇｐ、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｌｅｃｓｆ９、Ｓａａ３、５０３３４１４Ｋ０４Ｒｉｋ、Ｓｌｃ７ａ１１、Ｓｌｐｉ、Ｃｄ１４、Ｆｐｒ２、Ｆｃｇｒ３、Ｆ１０、Ｇｐｎｍｂ、Ｔｇｆｂｉ、Ｍｍｐ１４、Ｓｌｃ１１ａ１、Ｃ３、Ｇｐｒ８４、Ａｃｔａ２、Ｌｃｎ２、Ｈｍｏｘ１、Ｔｐｓａｂ１、Ｃｃｌ４、Ｉｌ２、Ｉｎｈｂａ、Ｃｘｃｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ２、Ｕｐｐ１、Ｇｐｒ１０９ａ、Ｇｐ３８、Ｉｌ１ｂ、Ｃｘｃｌ２、Ｉｌ１ａ，およびＣｃｌ３からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準と比較して高い場合、医薬品中の含有物として許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質のバッチを処分する工程；表８に示した遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準の発現レベルと実質的に同一でない場合、医薬品中の含有物として許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質のバッチを処分する工程；表１０に示した遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準の発現レベルと実質的に同一でない場合、医薬品中の含有物として許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質のバッチを処分する工程；ＧＰＲ８３、ＩＦＮＧおよびＦｏｘｐ３からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが低い場合、または、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＴＬＲ２およびＩＬ１Ｂからなる群から選択される遺伝子の発現レベルが高い場合、医薬品中の含有物として許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質のバッチを処分する工程；ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞遺伝子として表１２で同定された遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが低い場合、または、マクロファージ遺伝子として表１２で同定された遺伝子および単球遺伝子として表１２で同定された遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが高い場合、医薬品中の含有物として許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質のバッチを処分する工程；あるいは、遺伝子セットエンリッチメント解析が、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される少なくとも１つの��胞型に関連した遺伝子についてダウンレギュレーションを示すか、もしくはアップレギュレーションの欠如を示す場合、または、遺伝子セットエンリッチメント解析が、マクロファージ細胞、単球細胞、間質細胞、多重系列前駆体細胞、樹状細胞、繊維芽細胞網状赤血球、繊維芽細胞および顆粒球からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子についてアップレギュレーションを示すか、ダウンレギュレーションの欠如を示す場合、医薬品中の含有物として許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質のバッチを処分する工程と
を含む、方法を提供する。
【００３５】
また本発明は、グラチラマーアセテート関連医薬物質を含む医薬品を生産する方法であって、改良が、
ｉ）本発明の方法に従ってグラチラマーアセテート関連医薬物質を特性決定する工程であり、
ここで、工程ｅ）は、Ｆｏｘｐ３、Ｉｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｂ、Ｃ３、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｘｃｌ２、Ｃｘｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ３およびＣｄ１４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定することを含む、工程と；
ｉｉ）ＦｏｘＰ３の発現レベルが参考基準と比較して低い場合、または、Ｉｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｂ、Ｃ３、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｘｃｌ２、Ｃｘｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ３およびＣｄ１４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルが参考基準と比較して高い場合、医薬品中の含有物として許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質のバッチを処分する工程と
を含む、方法を提供する。
【００３６】
本発明はまた、グラチラマーアセテート関連医薬物質を含む医薬品を生産する方法であって、改良が、
ｉ）本発明の方法に従ってグラチラマーアセテート関連医薬物質を特性決定する工程であり、
ここで、工程ｅ）は、抗原提示細胞への免疫反応、エフェクターリンパ球の分化、Ｔリンパ球の抑制、Ｆｏｘｐ３ポジティブ制御性Ｔ細胞の活性化、単核白血球の広がり、Ｔリンパ球の増殖、リンパ球の広がり、ナイーブリンパ球の分化、炎症反応、免疫細胞の接着、細胞運動、細胞の遊走性、細胞の走化性、食細胞の細胞移動、単球の走化性、単球の細胞移動および発熱からなる群から選択される工程ｃ）の細胞の生物学的活性レベルを判定することを含む、工程と；
ｉｉ）抗原提示細胞への免疫反応、エフェクターリンパ球の分化、Ｔリンパ球の抑制、およびＦｏｘｐ３ポジティブ制御性Ｔ細胞の活性化からなる群から選択される生物学的活性レベルが参考基準と比較して低い場合、または、単核白血球の広がり、Ｔリンパ球の増殖、リンパ球の広がり、ナイーブリンパ球の分化、炎症反応、免疫細胞の接着、細胞運動、細胞の遊走性、細胞の走化性、食細胞の細胞移動、単球の走化性、単球の細胞移動および発熱からなる群から選択される生物学的活性レベルが参考基準と比較して高い場合、医薬品中の含有物として許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質のバッチを処分する工程と
を含む、方法を提供する。
【００３７】
また本発明は、グラチラマーアセテート関連医薬物質を含む医薬品をリリースする方法であって、改良が、
ｉ）本発明の方法に従ってグラチラマーアセテート関連医薬品を特性決定する工程であり、
ここで、工程ｅ）は、Ｅｃｍ１、Ｐｒｅｓ１、Ｐｄｌｉｍ４、Ｇｐｒ８３、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ２４、ＬＯＣ１０００４６６０８、Ｇｍ５９０、Ｇｐｒ１１４、Ｔｍｉｅ、Ｒａｓｇｒｐ１、Ｍｙｏ６、Ｐｆｋｐ、Ｕｓｐ１８、Ａｒｌ４ｃ、Ａｌｓ２ｃｌ、２８１０４１０Ｐ２２Ｒｉｋ、Ａｒｌ５ａ、Ｇｂｐ２、Ｒａｓｇｒｐ１、Ａｎｋｒｄ３７、Ｔｐｉ１、４９３０５８３Ｈ１４Ｒｉｋ、Ｉｆｉｔ３、ＬＯＣ６６７３７０、Ｋｌｈｄｃ１、Ｃｄ２４７、Ｉｇｆｂｐ４、Ｏａｓ２、Ｂｃｌ１１ｂ、Ｆｓｃｎ１、Ｃｔｓｇ、Ｍｐｏ、Ｐｒｔｎ３、Ｌｙｚｓ、Ｅｍｒ１、Ｃｈｉ３ｌ１、Ａｎｘａ３、Ｈｐ、Ｌｙｚ２、Ｌｙｚ、Ｆｅｒ１ｌ３、Ｓｉｒｐａ、Ｃｄ６３、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｌｅｃ４ｄ、ＥＧ４３３０１６、Ｓｔｆａ１、Ｃｈｉ３ｌ３  Ｎｇｐ、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｌｅｃｓｆ９、Ｓａａ３、５０３３４１４Ｋ０４Ｒｉｋ、Ｓｌｃ７ａ１１、Ｓｌｐｉ、Ｃｄ１４、Ｆｐｒ２、Ｆｃｇｒ３、Ｆ１０、Ｇｐｎｍｂ、Ｔｇｆｂｉ、Ｍｍｐ１４、Ｓｌｃ１１ａ１、Ｃ３、Ｇｐｒ８４、Ａｃｔａ２、Ｌｃｎ２、Ｈｍｏｘ１、Ｔｐｓａｂ１、Ｃｃｌ４、Ｉｌ２、Ｉｎｈｂａ、Ｃｘｃｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ２、Ｕｐｐ１、Ｇｐｒ１０９ａ、Ｇｐ３８、Ｉｌ１ｂ、Ｃｘｃｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｃｃｌ３、６７２０４１８Ｂ０１Ｒｉｋ、５８３０４９６Ｌ１１Ｒｉｋ、Ｃｄ８ｂ１、Ｆｃｇｒｔ、ＬＯＣ３８５６１５およびＳｃｍｌ４からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；表８に示した遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；表１０に示した遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；ＦｏｘＰ３、ＧＰＲ８３、ＣＤ１４、ＴＬＲ２、ＩＦＮＧ、ＣＤ４０およびＩＬ１Ｂからなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；表１２に示した遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定すること；または、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージ細胞、単球細胞、間質細胞、多重系列前駆体細胞、樹状細胞、繊維芽細胞網状赤血球、繊維芽細胞および顆粒球からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子について遺伝子セットエンリッチメント解析を判定することを含む、工程と；
ｉｉ）Ｅｃｍ１、Ｐｒｅｓ１、Ｐｄｌｉｍ４、Ｇｐｒ８３、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ２４、ＬＯＣ１０００４６６０８、Ｇｍ５９０、Ｇｐｒ１１４、Ｔｍｉｅ、Ｒａｓｇｒｐ１、Ｍｙｏ６、Ｐｆｋｐ、Ｕｓｐ１８、Ａｒｌ４ｃ、Ａｌｓ２ｃｌ、２８１０４１０Ｐ２２Ｒｉｋ、Ａｒｌ５ａ、Ｇｂｐ２、Ｒａｓｇｒｐ１、Ａｎｋｒｄ３７、Ｔｐｉ１、４９３０５８３Ｈ１４Ｒｉｋ、Ｉｆｉｔ３、ＬＯＣ６６７３７０、Ｋｌｈｄｃ１、Ｃｄ２４７、Ｉｇｆｂｐ４、Ｏａｓ２  Ｂｃｌ１１ｂ、６７２０４１８Ｂ０１Ｒｉｋ、５８３０４９６Ｌ１１Ｒｉｋ、Ｃｄ８ｂ１、Ｆｃｇｒｔ、ＬＯＣ３８５６１５およびＳｃｍｌ４からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準と比較して低い場合、または、Ｆｓｃｎ１、Ｃｔｓｇ、Ｍｐｏ、Ｐｒｔｎ３、Ｌｙｚｓ、Ｅｍｒ１、Ｃｈｉ３ｌ１、Ａｎｘａ３、Ｈｐ、Ｌｙｚ２、Ｌｙｚ、Ｆｅｒ１ｌ３、Ｓｉｒｐａ、Ｃｄ６３、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｌｅｃ４ｄ、ＥＧ４３３０１６、Ｓｔｆａ１、Ｃｈｉ３ｌ３  Ｎｇｐ、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｌｅｃｓｆ９、Ｓａａ３、５０３３４１４Ｋ０４Ｒｉｋ、Ｓｌｃ７ａ１１、Ｓｌｐｉ、Ｃｄ１４、Ｆｐｒ２、Ｆｃｇｒ３、Ｆ１０、Ｇｐｎｍｂ、Ｔｇｆｂｉ、Ｍｍｐ１４、Ｓｌｃ１１ａ１、Ｃ３、Ｇｐｒ８４、Ａｃｔａ２、Ｌｃｎ２、Ｈｍｏｘ１、Ｔｐｓａｂ１、Ｃｃｌ４、Ｉｌ２、Ｉｎｈｂａ、Ｃｘｃｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ２、Ｕｐｐ１、Ｇｐｒ１０９ａ、Ｇｐ３８、Ｉｌ１ｂ、Ｃｘｃｌ２、Ｉｌ１ａ、およびＣｃｌ３からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準と比較して高い場合、リリースについて許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬品のバッチを処分する工程；表８に示した遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準の発現レベルと実質的に同一でない場合、リリースについて許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬品のバッチを処分する工程；表１０に示した遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準の発現レベルと実質的に同一でない場合、リリースについて許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬品のバッチを処分する工程；ＧＰＲ８３、ＩＦＮＧおよびＦｏｘｐ３からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが低い場合、または、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＴＬＲ２およびＩＬ１Ｂからなる群から選択される遺伝子の発現レベルが高い場合、リリースについて許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬品のバッチを処分する工程；ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞遺伝子として表１２で同定された遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが低い場合、または、マクロファージ遺伝子として表１２で同定された遺伝子および単球遺伝子として表１２で同定された遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが高い場合、リリースについて許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬品のバッチを処分する工程；あるいは、遺伝子セットエンリッチメント解析が、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子についてダウンレギ��レーションを示すか、もしくはアップレギュレーションの欠如を示す場合、または、遺伝子セットエンリッチメント解析が、マクロファージ細胞、単球細胞、間質細胞、多重系列前駆体細胞、樹状細胞、繊維芽細胞網状赤血球、繊維芽細胞および顆粒球からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子についてアップレギュレーションを示すか、もしくはダウンレギュレーションの欠如を示す場合、リリースについて許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬品のバッチを処分する工程と
を含む、方法を提供する。
【００３８】
また本発明は、グラチラマーアセテート関連医薬物質を含む医薬品をリリースする方法であって、改良が、
ｉ）本発明の方法に従ってグラチラマーアセテート関連医薬品を特性決定する工程であり、
ここで、工程ｅ）は、Ｆｏｘｐ３、Ｉｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｂ、Ｃ３、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｘｃｌ２、Ｃｘｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ３およびＣｄ１４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定することを含む、工程と；
ｉｉ）ＦｏｘＰ３の発現レベルが参考基準と比較して低い場合、または、Ｉｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｂ、Ｃ３、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｘｃｌ２、Ｃｘｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ３およびＣｄ１４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルが参考基準と比較して高い場合、リリースについて許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬品のバッチを処分する工程と
を含む、方法を提供する。
【００３９】
また本発明は、グラチラマーアセテート関連医薬物質を含む医薬品をリリースする方法であって、改良が、
ｉ）本発明の方法に従ってグラチラマーアセテート関連医薬品を特性決定する工程であり、
ここで、工程ｅ）は、抗原提示細胞への免疫反応、エフェクターリンパ球の分化、Ｔリンパ球の抑制、Ｆｏｘｐ３ポジティブ制御性Ｔ細胞の活性化、単核白血球の広がり、Ｔリンパ球の増殖、リンパ球の広がり、ナイーブリンパ球の分化、炎症反応、免疫細胞の接着、細胞運動、細胞の遊走性、細胞の走化性、食細胞の細胞移動、単球の走化性、単球の細胞移動および発熱からなる群から選択される工程ｃ）の細胞の生物学的活性レベルを判定することを含む、工程と；
ｉｉ）抗原提示細胞への免疫反応、エフェクターリンパ球の分化、Ｔリンパ球の抑制、およびＦｏｘｐ３ポジティブ制御性Ｔ細胞の活性化からなる群から選択される生物学的活性レベルが参考基準と比較して低い場合、または、単核白血球の広がり、Ｔリンパ球の増殖、リンパ球の広がり、ナイーブリンパ球の分化、炎症反応、免疫細胞の接着、細胞運動、細胞の遊走性、細胞の走化性、食細胞の細胞移動、単球の走化性、単球の細胞移動および発熱からなる群から選択される生物学的活性レベルが参考基準と比較して高い場合、リリースについて許容できないものとしてグラチラマーアセテート関連医薬品のバッチを処分する工程と
を含む、方法を提供する。
【００４０】
本発明はまた、グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品の準最適活性を同定する方法であって、
ａ）グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品をげっ歯動物に投与する工程と；
ｂ）抗原提示細胞への免疫反応、エフェクターリンパ球の分化、Ｔリンパ球の抑制、Ｆｏｘｐ３ポジティブ制御性Ｔ細胞の活性化、単核白血球の広がり、Ｔリンパ球の増殖、リンパ球の広がり、ナイーブリンパ球の分化、炎症反応、免疫細胞の接着、細胞運動、細胞の遊走性、細胞の走化性、食細胞の細胞移動、単球の走化性、単球の細胞移動および発熱からなる群から選択されるげっ歯動物の生物学的活性レベルを判定する工程と；
ｃ）抗原提示細胞への免疫反応、エフェクターリンパ球の分化、Ｔリンパ球の抑制およびＦｏｘｐ３ポジティブ制御性Ｔ細胞の活性化からなる群から選択される生物学的活性レベルが参考基準と比較して低い場合、または、単核白血球の広がり、Ｔリンパ球の増殖、リンパ球の広がり、ナイーブリンパ球の分化、炎症反応、免疫細胞の接着、細胞運動、細胞の遊走性、細胞の走化性、食細胞の細胞移動、単球の走化性、単球の細胞移動および発熱からなる群から選択される生物学的活性レベルが参考基準と比較して高い場合、準最適活性を生じるものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を同定する工程と
を含み、
それにより、グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品の準最適活性を同定する、
方法を提供する。
【００４１】
また本発明は、グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品の準最適活性を同定する方法であって、
ａ）グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品をげっ歯動物に投与する工程と、
ｂ）Ｅｃｍ１、Ｐｒｅｓ１、Ｐｄｌｉｍ４、Ｇｐｒ８３、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ２４、ＬＯＣ１０００４６６０８、Ｇｍ５９０、Ｇｐｒ１１４、Ｔｍｉｅ、Ｒａｓｇｒｐ１、Ｍｙｏ６、Ｐｆｋｐ、Ｕｓｐ１８、Ａｒｌ４ｃ、Ａｌｓ２ｃｌ、２８１０４１０Ｐ２２Ｒｉｋ、Ａｒｌ５ａ、Ｇｂｐ２、Ｒａｓｇｒｐ１、Ａｎｋｒｄ３７、Ｔｐｉ１、４９３０５８３Ｈ１４Ｒｉｋ、Ｉｆｉｔ３、ＬＯＣ６６７３７０、Ｋｌｈｄｃ１、Ｃｄ２４７、Ｉｇｆｂｐ４、Ｏａｓ２、Ｂｃｌ１１ｂ、Ｆｓｃｎ１、Ｃｔｓｇ、Ｍｐｏ、Ｐｒｔｎ３、Ｌｙｚｓ、Ｅｍｒ１、Ｃｈｉ３ｌ１、Ａｎｘａ３、Ｈｐ、Ｌｙｚ２、Ｌｙｚ、Ｆｅｒ１ｌ３、Ｓｉｒｐａ、Ｃｄ６３、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｌｅｃ４ｄ、ＥＧ４３３０１６、Ｓｔｆａ１、Ｃｈｉ３ｌ３  Ｎｇｐ、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｌｅｃｓｆ９、Ｓａａ３、５０３３４１４Ｋ０４Ｒｉｋ、Ｓｌｃ７ａ１１、Ｓｌｐｉ、Ｃｄ１４、Ｆｐｒ２、Ｆｃｇｒ３、Ｆ１０、Ｇｐｎｍｂ、Ｔｇｆｂｉ、Ｍｍｐ１４、Ｓｌｃ１１ａ１、Ｃ３、Ｇｐｒ８４、Ａｃｔａ２、Ｌｃｎ２、Ｈｍｏｘ１、Ｔｐｓａｂ１、Ｃｃｌ４、Ｉｌ２、Ｉｎｈｂａ、Ｃｘｃｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ２、Ｕｐｐ１、Ｇｐｒ１０９ａ、Ｇｐ３８、Ｉｌ１ｂ、Ｃｘｃｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｃｃｌ３、６７２０４１８Ｂ０１Ｒｉｋ、５８３０４９６Ｌ１１Ｒｉｋ、Ｃｄ８ｂ１、Ｆｃｇｒｔ、ＬＯＣ３８５６１５およびＳｃｍｌ４からなる群から選択される１つ以上の遺伝子のげっ歯動物における発現レベルを判定する工程；表８に示した遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定する工程；表１０に示した遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定する工程；ＦｏｘＰ３、ＧＰＲ８３、ＣＤ１４、ＴＬＲ２、ＩＦＮＧ、ＣＤ４０およびＩＬ１Ｂからなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定する工程；表１２に示した遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルを判定する工程；または、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージ細胞、単球細胞、間質細胞、多重系列前駆体細胞、樹状細胞、繊維芽細胞網状赤血球、繊維芽細胞および顆粒球からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子について遺伝子セットエンリッチメント解析を判定する工程と；
ｃ）Ｅｃｍ１、Ｐｒｅｓ１、Ｐｄｌｉｍ４、Ｇｐｒ８３、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ２４、ＬＯＣ１０００４６６０８、Ｇｍ５９０、Ｇｐｒ１１４、Ｔｍｉｅ、Ｒａｓｇｒｐ１、Ｍｙｏ６、Ｐｆｋｐ、Ｕｓｐ１８、Ａｒｌ４ｃ、Ａｌｓ２ｃｌ、２８１０４１０Ｐ２２Ｒｉｋ、Ａｒｌ５ａ、Ｇｂｐ２、Ｒａｓｇｒｐ１、Ａｎｋｒｄ３７、Ｔｐｉ１、４９３０５８３Ｈ１４Ｒｉｋ、Ｉｆｉｔ３、ＬＯＣ６６７３７０、Ｋｌｈｄｃ１、Ｃｄ２４７、Ｉｇｆｂｐ４、Ｏａｓ２  Ｂｃｌ１１ｂ、６７２０４１８Ｂ０１Ｒｉｋ、５８３０４９６Ｌ１１Ｒｉｋ、Ｃｄ８ｂ１、Ｆｃｇｒｔ、ＬＯＣ３８５６１５およびＳｃｍｌ４の群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準と比較して低い場合、または、Ｆｓｃｎ１、Ｃｔｓｇ、Ｍｐｏ、Ｐｒｔｎ３、Ｌｙｚｓ、Ｅｍｒ１、Ｃｈｉ３ｌ１、Ａｎｘａ３、Ｈｐ、Ｌｙｚ２、Ｌｙｚ、Ｆｅｒ１ｌ３、Ｓｉｒｐａ、Ｃｄ６３、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｌｅｃ４ｄ、ＥＧ４３３０１６、Ｓｔｆａ１、Ｃｈｉ３ｌ３  Ｎｇｐ、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｌｅｃｓｆ９、Ｓａａ３、５０３３４１４Ｋ０４Ｒｉｋ、Ｓｌｃ７ａ１１、Ｓｌｐｉ、Ｃｄ１４、Ｆｐｒ２、Ｆｃｇｒ３、Ｆ１０、Ｇｐｎｍｂ、Ｔｇｆｂｉ、Ｍｍｐ１４、Ｓｌｃ１１ａ１、Ｃ３、Ｇｐｒ８４、Ａｃｔａ２、Ｌｃｎ２、Ｈｍｏｘ１、Ｔｐｓａｂ１、Ｃｃｌ４、Ｉｌ２、Ｉｎｈｂａ、Ｃｘｃｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ２、Ｕｐｐ１、Ｇｐｒ１０９ａ、Ｇｐ３８、Ｉｌ１ｂ、Ｃｘｃｌ２、Ｉｌ１ａ、およびＣｃｌ３の群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準と比較して高い場合、準最適活性を生じるものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を同定する工程；表８に示した遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準の発現レベルと実質的に同一でない場合、準最適活性を生じるものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を同定する工程；表１０に示した遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが参考基準の発現レベルと実質的に同一でない場合、準最適活性を生じるものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を同定する工程；ＧＰＲ８３、ＩＦＮＧおよびＦｏｘｐ３からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが低い場合、または、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＴＬＲ２およびＩＬ１Ｂからなる群から選択される遺伝子の発現レベルが高い場合、準最適活性を生じるものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を同定する工程；ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞遺伝子として表１２で同定された遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが低い場合、または、マクロファージ遺伝子として表１２で同定された遺伝子および単球遺伝子として表１２で同定された遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現レベルが高い場合、準最適活性を生じるものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を同定する工程；あるいは、遺伝子セットエンリッチメント解析が、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子についてダウンレギュレーションを示すか、もしくはアッ��レギュレーションの欠如を示す場合、または、遺伝子セットエンリッチメント解析が、マクロファージ細胞、単球細胞、間質細胞、多重系列前駆体細胞、樹状細胞、繊維芽細胞網状赤血球、繊維芽細胞および顆粒球からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子についてアップレギュレーションを示すか、もしくはダウンレギュレーションの欠如を示す場合、準最適活性を生じるものとしてグラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品を同定する工程と
を含み、
それにより、グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品の準最適活性を同定する、
方法を提供する。
【００４２】
本発明の１つ以上の態様において、発現レベルは血液で判定される。
【００４３】
本発明の１つ以上の態様において、発現レベルはＰＢＭＣで判定される。
【００４４】
本発明の１つ以上の態様において、参考基準は、グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品の投与前の発現レベルである。
【００４５】
本発明の１つ以上の態様において、参考基準は、グラチラマーアセテート医薬物質または医薬品の投与後の発現レベルである。
【００４６】
本発明の１つ以上の態様において、げっ歯動物はマウスである。
【００４７】
本発明の１つ以上の態様において、マウスはメス（ＳＪＬ×ＢＡＬＢ／Ｃ）Ｆ１マウスである。
【００４８】
本発明の１つ以上の態様において、マウスは約８週齢から約１２週齢である。
【００４９】
本発明の１つ以上の態様において、初代培養物は脾臓細胞の培養物である。
【００５０】
本発明の１つ以上の態様において、初代培養物はリンパ節細胞の培養物である。
【００５１】
本発明の１つ以上の態様において、脾臓細胞の初代培養物は免疫の約３日後に調製される。
【００５２】
本発明の１つ以上の態様において、工程ｄ）のインキュベーションは約２４時間である。
【００５３】
本発明の１つ以上の態様において、グラチラマーアセテート関連医薬物質はグラチラモイドであり、または、グラチラマーアセテート関連医薬品はグラチラモイドを含む。
【００５４】
本発明の１つ以上の態様において、グラチラマーアセテート関連医薬物質はグラチラマーアセテート医薬物質以外のグラチラモイドであり、または、グラチラマーアセテート関連医薬品はグラチラマーアセテート医薬物質以外のグラチラモイドを含む。
【００５５】
本発明の１つ以上の態様において、方法は、Ｅｃｍ１、Ｐｒｅｓ１、Ｐｄｌｉｍ４、Ｇｐｒ８３、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ２４、ＬＯＣ１０００４６６０８、Ｇｍ５９０、Ｇｐｒ１１４、Ｔｍｉｅ、Ｒａｓｇｒｐ１、Ｍｙｏ６、Ｐｆｋｐ、Ｕｓｐ１８、Ａｒｌ４ｃ、Ａｌｓ２ｃｌ、２８１０４１０Ｐ２２Ｒｉｋ、Ａｒｌ５ａ、Ｇｂｐ２、Ｒａｓｇｒｐ１、Ａｎｋｒｄ３７、Ｔｐｉ１、４９３０５８３Ｈ１４Ｒｉｋ、Ｉｆｉｔ３、ＬＯＣ６６７３７０、Ｋｌｈｄｃ１、Ｃｄ２４７、Ｉｇｆｂｐ４、Ｏａｓ２、Ｂｃｌ１１ｂ、Ｆｓｃｎ１、Ｃｔｓｇ、Ｍｐｏ、Ｐｒｔｎ３、Ｌｙｚｓ、Ｅｍｒ１、Ｃｈｉ３ｌ１、Ａｎｘａ３、Ｈｐ、Ｌｙｚ２、Ｌｙｚ、Ｆｅｒ１ｌ３、Ｓｉｒｐａ、Ｃｄ６３、Ｃｌｅｃ４ｎ、Ｃｌｅｃ４ｄ、ＥＧ４３３０１６、Ｓｔｆａ１、Ｃｈｉ３ｌ３  Ｎｇｐ、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｌｅｃｓｆ９、Ｓａａ３、５０３３４１４Ｋ０４Ｒｉｋ、Ｓｌｃ７ａ１１、Ｓｌｐｉ、Ｃｄ１４、Ｆｐｒ２、Ｆｃｇｒ３、Ｆ１０、Ｇｐｎｍｂ、Ｔｇｆｂｉ、Ｍｍｐ１４、Ｓｌｃ１１ａ１、Ｃ３、Ｇｐｒ８４、Ａｃｔａ２、Ｌｃｎ２、Ｈｍｏｘ１、Ｔｐｓａｂ１、Ｃｃｌ４、Ｉｌ２、Ｉｎｈｂａ、Ｃｘｃｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ２、Ｕｐｐ１、Ｇｐｒ１０９ａ、Ｇｐ３８、Ｉｌ１ｂ、Ｃｘｃｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｃｃｌ３、６７２０４１８Ｂ０１Ｒｉｋ、５８３０４９６Ｌ１１Ｒｉｋ、Ｃｄ８ｂ１、Ｆｃｇｒｔ、ＬＯＣ３８５６１５およびＳｃｍｌ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程を含む。
【００５６】
本発明の１つ以上の態様において、方法は、Ｆｏｘｐ３、Ｉｌ２、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｂ、Ｃ３、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｃｘｃｌ２、Ｃｘｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ３およびＣｄ１４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程を含む。
【００５７】
本発明の１つ以上の態様において、方法は、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓアクセッション番号ＧＳＥ４０５６６におけるグラチラマーアセテート医薬物質または医薬品によって制御される遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程を含む。
【００５８】
本発明の１つ以上の態様において、方法は、ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＧＡＴＡ３、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−ＤＭＢ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＧＲ２、ＩＬ２、ＩＬ１３、ＩＬ４、ＩＬ１８、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７Ｆ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６Ｒ、ＴＢＸ２１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＮＦ、ＦＯＸＰ３、ＩＬ１０ＲＢ、ＫＬＲＤ１、ＣＤ６９、ＬＴＢ、ＣＤ８３、ＰＲＦ１、ＣＡＭＫ２Ｄ、ＬＴＡ、ＦＳＣＮ１、ＴＬＲ７、ＣＳＦ２、ＣＣＲ７、ＦＡＳＬＧ、ＩＬ１Ａ、ＣＣＬ５、ＣＤ８Ｂ、ＣＸＣＬ１０、ＴＬＲ２、ＣＣＬ４、ＴＬＲ７、ＩＧＨＡ１、ＩＬ２４、ＳＯＣＳ１、ＯＡＳ１、ＪＡＫ１、ＰＴＰＮ２、ＩＦＩＴＭ１、ＩＦＩ３５、ＳＴＡＴ２、ＢＣＬ２、ＭＶＤ、ＦＤＰＳ、ＳＱＬＥ、ＮＳＤＨＬ、ＤＨＣＲ２４、Ａｃａｔ２／Ａｃａｔ３、ＭＳＭＯ１、ＬＳＳ、ＣＹＰ５１Ａ１、ＮＦＫＢＩＥ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＰＰ３ＣＣ、ＣＤ３Ｄ、ＩＬ２ＲＢ、ＰＴＥＮ、ＣＤ３Ｇ、ＩＣＯＳ、ＣＡＭＫ２Ｄ、ＮＦＡＴ５、ＬＡＴ、ＩＴＫ、Ｈ２−Ｍ２、ＦＡＳＬＧ、ＬＩＦ、ＩＧＨＡ１、ＰＲＫＡＣＢ、ＳＧＫ１、ＭＡＰＫ１１、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＪＵＮ、ＦＫＢＰ５、ＡＤＲＢ２、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰＫ１２、ＰＯＵ２Ｆ１、ＳＭＡＲＣＡ２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＴＧＦＢ３、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＤＨＣＲ２４、ＣＣＲ５、およびＣＸＣＬ９からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程を含む。
【００５９】
本発明の１つ以上の態様において、方法は、表８に示した遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程を含む。
【００６０】
本発明の１つ以上の態様において、方法は、表１０に示した遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程を含む。
【００６１】
本発明の１つ以上の態様において、方法は、ＦｏｘＰ３、ＧＰＲ８３、ＣＤ１４、ＴＬＲ２、ＩＦＮＧ、ＣＤ４０およびＩＬ１Ｂからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程を含む。
【００６２】
本発明の１つ以上の態様において、方法は、表１２に示した遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを判定する工程を含む。
【００６３】
本発明の１つ以上の態様において、方法は、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージ細胞、単球細胞、間質細胞、多重系列前駆体細胞、樹状細胞、繊維芽細胞網状赤血球、繊維芽細胞および顆粒球からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型に関連した遺伝子についての遺伝子セットエンリッチメント解析を判定する工程を含む。
【００６４】
本発明の１つ以上の態様において、遺伝子セットエンリッチメント解析を判定する工程は、表１１に示したランクリストファイルの１つ以上に存在する遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを評価する工程を含む。
【００６５】
本発明の１つ以上の態様において、参考基準は培養基である。
【００６６】
定義
ここで使用される場合、「ナイーブ対象」とは、いかなる多発性硬化症薬によっても処置されていない対象である。
【００６７】
ここで使用される場合、「グラチラモイドナイーブ対象」とは、いかなるグラチラモイド薬によっても処置されていない対象である。グラチラモイドナイーブ対象は、他の多発性硬化症薬によって処置されていてもよい。
【００６８】
ここで使用される場合、「対象の血液で」とは、対象の血液に由来するＰＢＭＣ、リンパ球、単球、マクロファージ、好塩基球、樹状細胞または他の細胞を意味する。
【００６９】
ここで使用される場合、「参考基準」とは、１つ以上の変数に関して、参考基準とは異なる別のサンプルまたは値についての比較点となるサンプルまたは値である。対象への特定について、「参照標準」は、健全と定義された状態の定義された群を特徴付ける値または値の範囲である。例えば、参照標準は、健全な対象または多発性硬化症に罹患している対象を特性決定することができ、対象が多発性硬化症に罹患している場合、対象はナイーブであり得るか、またはグラチラマーアセテート医薬物質を服用した可能性がある。
【００７０】
ここで使用される場合、用語「グラチラマーアセテート関連医薬物質」（ＧＡＲＤＳ）は、抗原提示においてＭＨＣクラスＩＩでミエリン塩基性タンパク質と競合し得るすべてのポリペプチドを含むものとする。グラチラマーアセテート関連物質としては、所定の配列を有するポリペプチド、ならびに、４種のアミノ酸、グルタミン酸（Ｅ）、アラニン（Ａ）、リシン（Ｋ）およびチロシン（Ｙ）から；アミノ酸Ｙ、Ｅ、ＡおよびＫのうちの何れか３種、すなわち、ＹＡＫ、ＹＥＫ、ＹＥＡもしくはＥＡＫから；またはアミノ酸Ｙ、Ｅ、ＡおよびＫのうちの３種と第４のアミノ酸から構築されるポリペプチドの混合物が挙げられる。グラチラマーアセテート関連物質の例は、米国特許第６，５１４，９３８  Ａ１号、同第７，２９９，１７２  Ｂ２号、同第７，５６０，１００号および同第７，６５５，２２１  Ｂ２号、および米国特許出願公報第ＵＳ  ２００９−０１９１１７３  Ａ１号に開示されており、これらの開示は、それらの全体が参照によりここに組み込まれるものとする。グラチラマーアセテート関連物質としては、グラチラモイドおよびグラチラマーアセテート医薬物質が挙げられる。
【００７１】
ここで使用される場合、「グラチラマーアセテート関連医薬品」（ＧＡＲＤＰ）は、グラチラマーアセテート関連医薬物質を含有する。
【００７２】
ここで使用される場合、「グラチラマーアセテート関連医薬物質または医薬品」は、グラチラマーアセテート関連医薬物質またはグラチラマーアセテート関連医薬品である。
【００７３】
ここで使用される場合、「グラチラモイド」は、合成タンパク質の複合混合物、および４種の天然アミノ酸：Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−リシンおよびＬ−チロシンから所定のモル比で構築される様々なサイズのポリペプチドである。グラチラモイドの例としては、グラチラマーアセテート医薬物質（例えば、Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標））、ならびに、Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）以外のグラチラモイド、例えばＧＡ−Ｎａｔｃｏが挙げられる。
【００７４】
ここで使用される場合、「グラチラマーアセテート医薬物質」（ＧＡＤＳ）はＴｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｌｔｄ．によって生産されているグラチラマーアセテートであり、グラチラマーアセテート医薬品中の活性成分である。
【００７５】
ここで使用される場合、「グラチラマーアセテート医薬品」（ＧＡＰＤ）は４種の天然アミノ酸：Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシンおよびＬ−リシンをそれぞれ０．１４１、０．４２７、０．０９５および０．３３８の平均モル分率で含有し、平均分子量が５，０００〜９，０００ダルトンである、合成ポリペプチドの酢酸塩からなる、Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｌｔｄ．によって生産されているグラチラマーアセテート医薬物質を含有する（８）。グラチラマーアセテート医薬品、ならびにグラチラマーアセテート医薬物質は、例１および例２に従って試験した場合、図２に示す応答をもたらす。Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）はグラチラマーアセテート医薬品である。
【００７６】
ここで使用される場合、「グラチラマーアセテート医薬物質または医薬品」は、グラチラマーアセテート医薬物質またはグラチラマーアセテート医薬品である。
【００７７】
ここで使用される場合、「グラチラマーアセテート参考基準」は、グラチラマーアセテート医薬品中で確認された医薬物質であるか、またはそれを含有している。グラチラマーアセテート参考基準の例としては、例２のグラチラマーアセテート参考基準が挙げられる。
【００７８】
ここで使用される場合、「準最適活性」は、消極的応答（negative response）を意味するか、またはＴｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｌｔｄ．によって生産されているグラチラマーアセテート医薬物質またはグラチラマーアセテート医薬品に対する応答よりも低い応答を意味する。
【００７９】
ここで使用される場合、医薬品の「リリース」とは、消費者に対し製品が利用可能になることを意味する。
【００８０】
ここで使用される場合、明示した数に関する「約」とは、明示した値の＋１０パーセントから−１０パーセントの範囲を包含する。したがって、例えば、約１００ｍｇは９０〜１１０ｍｇの範囲を含み、したがってまた、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９および１１０ｍｇを含む。したがって、約１００ｍｇは、一態様において、１００ｍｇを含む。
【００８１】
パラメーター範囲が提供される場合、その範囲内のすべての整数、それらの１０分の１、およびそれらの１００分の１もまた本発明によって提供されるものと理解されたい。例えば、「０．２〜５ｍｇ」は、０．３ｍｇ以下の０．２ｍｇ、０．２１ｍｇ、０．２２ｍｇ、０．２３ｍｇ等、０．４ｍｇ以下の０．３１ｍｇ、０．３２ｍｇ、０．３３ｍｇ等、５．０ｍｇ以下の０．５ｍｇ、０．６ｍｇ等の表示である。
【００８２】
ここに記載されている様々な要素のすべての組合せは、本発明の範囲内である。
【００８３】
本発明は、この後の実験の詳細な記載によってより一層理解されるが、当業者は、詳述した特定の実験がこの後の請求項でより完全に開示されている本発明の単なる例証であるということを容易に認識する。
【００８４】
［実施例］
実験の詳細
方法
マウス
すべての実験手順は、研究における動物の使用に関して容認されている倫理基準に適合し、Ｔｅｖａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されている実験動物ガイドラインの管理および使用に関する委員会（Committee for the Care and Use of Experimental Animals guidelines）に従った。これらの実験については、本発明者らは、８〜１２週間齢のメス（Ｂａｌｂ／ｃ×ＳＪＬ）Ｆ１マウス（Ｈａｒｌａｎ、Ｉｓｒａｅｌ）を購入した。
【００８５】
マウス脾臓細胞培養物の調製
すべての実験手順は、研究における動物の使用に関して容認されている倫理基準に適合し、Ｔｅｖａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されている実験動物ガイドラインの管理および使用に関する委員会に従った。ＧＡ反応性Ｔ細胞を刺激誘導するため、８匹のメスのマウス、８〜１２週齢のＦ１雑種（ＳＪＬ×ＢＡＬＢ／Ｃ）（Ｈａｒｌａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｓｒａｅｌ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、Ｉｓｒａｅｌから購入）にＰＢＳ中のＧＡ参考基準（ＧＡ−ＲＳ）の２．５ｍｇ／ｍＬ溶液の１００μＬを注射した。（マウス１匹当たり２５０μｇのＧＡ−ＲＳ）。ＧＡ−ＲＳ（Ｔｅｖａ）は、標準バッチとして定められ、すべてのコパキソン（登録商標）バッチの品質管理（ＱＣ）リリース試験における基準として使用されている、選定されたＧＡ医薬物質バッチである。マウスは、免疫処置後、３日間個別に換気ケージで飼育し、マウスを屠殺し、それらの脾臓を無菌的に摘出し、ＲＰＭＩ１６４０中で氷上に置いた。単一細胞懸濁液を調製した。
【００８６】
赤血球溶解後、脾臓細胞を取り出し、Ｌ−グルタミン２ｍＭ（１％ｖ／ｖ）、ＭＥＭ  ２ｍＭ（１％ｖ／ｖ）、ピルビン酸ナトリウム１ｍＭ（１％ｖ／ｖ）、抗生物質／抗カビ剤溶液（０．２％ｖ／ｖ）および２−メルカプトエタノール（０．１％ｖ／ｖ）を補充した、規定の細胞培養基（ＤＣＣＭ１）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、Ｉｓｒａｅｌ）（９６．７％ｖ／ｖ）中で１０×１０6細胞／ｍＬの最終濃度に再懸濁した。
【００８７】
インビトロにおける細胞活性化
脾臓細胞は、次の何れかで処置した：Ａ）ＧＡ、Ｔｅｖａによって製造されたＧＡ参考基準（ＧＡ−ＲＳ；２２のサンプル）およびＧＡ医薬品（ＧＡ−ＤＰ、３０のバッチから得た３４のサンプル）を含んでいるもの；ならびに、Ｔｅｖａ以外の会社によって製造された他のグラチラモイドの５つの異なるバッチから得た１１のサンプルを含んでいるＧＡ−Ｎａｔｃｏ。
【００８８】
アクチベータ水溶液サンプル、マンニトール（Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）中の非活性賦形剤）、および培養基を、９６ウェル組織培養プレートに加えた（１サンプル当たり３ウェル）。脾臓細胞（１２５μＬ  １０×１０6ＳＰＬ細胞／ｍＬ懸濁液）をアクチベータ溶液に加え、３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、ＲＮＡ安定化溶液（ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）溶液、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で希釈し、４℃で保存した。
【００８９】
ＲＮＡ単離およびマイクロアレイ発現プロファイリング
活性化した脾臓細胞由来の全ＲＮＡの抽出は、ＰｅｒｆｅｃｔＰｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ＣＥＫＫ  ｋｉｔ  ５０（５Ｐｒｉｍｅ  ＧｍｂＨ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、メーカーの使用説明書に従って実施した。ＲＮＡの品質は、２６０／２８０ｎｍの吸光度比およびゲル電気泳動（Ｅｘｐｅｒｉｏｎ（商標）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によって評価した。サンプルから抽出した全ＲＮＡは、４５，２００個を超える転写物を含有するＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｏｕｓｅ  ＷＧ−６＿Ｖ２マイクロアレイチップにハイブリダイズさせた。
【００９０】
マイクロアレイハイブリダイゼーション、アレイスキャン法、および最初の前処理は、ＢｉｏＲａｐ（Ｔｅｃｈｎｉｏｎ、Ｈａｉｆａ、Ｉｓｒａｅｌ）によって実施した。８つの独立したマイクロアレイ実験を実施し、それぞれの実験は、１つ以上の培養基およびＧＡサンプルを、様々なＧＡ関連材料および他のグラチラモイド、サンプルと共に含んでいた。
【００９１】
データ解析
最初のビーズレベルデータ前処理は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＳｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して実施した。続くバイオインフォマティクス解析は、Ｎｅｇｅｖ，  Ｌｔｄ．（ＮＩＢＮ，  Ｂｅｅｒ−Ｓｈｅｖａ，  Ｉｓｒａｅｌ）のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのバイオインフォマティクスコア施設で行った。遺伝子レベルシグナルに対するビーズレベルデータのとりまとめは、中央絶対偏差（ＭＡＤ）３よりも大きい外れ値を除いた後、Ｒパッケージ「ｂｅａｄａｒｒａｙ」（４５）を使用して実施した。サンプル間の分値正規化は、Ｐａｒｔｅｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｕｉｔｅ  （Ｐａｒｔｅｋ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を使用して実施し、続いて、実験のバッチ効果の補正（すなわち、ＲＮＡ抽出とアレイ処理の日付の違いに関連したもの）は、Ｐａｒｔｅｋ  Ｂａｔｃｈ  Ｒｅｍｏｖｅｒ（商標）ツールを使用して実施した。その結果、サンプルの少なくとも１つにおいて発現シグナルが（ｌｏｇ２スケールで）６を超える３４，６６６個の発現遺伝子をさらなる解析のために保持した。達成されたシグナルの主成分解析（ＰＣＡ）を図１に示す。
【００９２】
特異的に発現された遺伝子の同定に関する統計的検定
３４，６６６個の発現遺伝子を次の試験に供した：（１）ＧＡ（すなわちＧＡ−ＲＳおよびＧＡ−ＤＰ）と培養基を比較するｔ検定；（２）ＧＡ−Ｎａｔｃｏと培養基を比較するｔ検定；および（３）３つのサンプル群：ＧＡ−ＲＳ、ＧＡ−ＤＰおよびＧＡ−Ｎａｔｃｏを比較する一元配置分散解析試験。この試験は２回実施した：１１個のＧＡ−Ｎａｔｃｏサンプルすべてについては１回、ＧＡ−Ｎａｔｃｏサンプルの８個だけは１回であった。それぞれの一元配置分散解析試験には、２対の比較（「差異」）：ＧＡ−ＤＰ対ＧＡ−ＲＳおよびＧＡ−Ｎａｔｃｏ対ＧＡ−ＲＳが含まれていた。倍差値は、線形目盛で示した。
【００９３】
階層クラスター解析
階層クラスター解析は、サンプル全体のそれぞれの遺伝子の平均シグナルがゼロと等しく、標準偏差が１と等しくなるようにデータを正規化した後、Ｅｘｐａｎｄｅｒ（４６）で実施した。
【００９４】
マイクロアレイデータの共有
マイクロアレイデータは、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ）にアクセッション番号ＧＳＥ４０５６６で集積された。
【００９５】
機能遺伝子の発現解析
グラチラモイドにより脾臓細胞において誘導される遺伝子関連の主要生物学的機序を同定するため、遺伝子機能アノテーション、エンリッチメント、および経路解析をＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  （ＩＰＡ）Ｓｕｉｔｅ（ｗｗｗ．ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ．ｃｏｍ）により実施した。プログラムは、様々な実験プラットフォームおよび一次文献情報源からのデータを統合し、分子の相互作用、細胞の表現型および疾患プロセスに対する洞察を提供し、次いで、遺伝子転写変化の下流の生物学的効果を予測する。ＩＰＡウェブソフトウェアも調節遺伝子および転写因子の機能的なネットワークの再構築に使用した。それぞれのプロセスに関する有意スコア（フィッシャーの右側直接確率検定を使用し、ｐ値として表わされる）は、ＩＰＡデータベースに保存されているすべての機能性／経路アノテーションにおいてこれらの遺伝子の総数に関するネットワークまたは経路に関与する遺伝子転写産物の数として計算される。すべてのｐ値は、ｐ＝０．０５のカットオフで、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ  ＦＤＲ法を使用する複数の試験の補正に適用された。
【００９６】
例１
ＧＡおよびＧＡ−Ｎａｔｃｏによって制御される遺伝子の同定
マウスをＧＡ参考基準（ＲＳ）で免疫し、３日後に脾臓を摘出し、細胞を抽出した。培養した脾臓細胞を、２４時間、培養基、マンニトールまたはグラチラモイドの何れか（ＧＡ−ＲＳ、ＧＡ−ＤＰまたはＧＡ−Ｎａｔｃｏ）でエクスビボにて再活性化した。ＲＮＡを抽出し、完全遺伝子発現解析を実施した。
【００９７】
マイクロアレイ解析
正規化された遺伝子発現シグナルの主成分解析（ＰＣＡ）は、２つの主要なクラスターを示した。１つのクラスターにおいては培養基およびマンニトールのサンプルであり、別のクラスターにおいてはグラチラモイド（ＧＡ−ＲＳ、ＧＡ−ＤＰおよびＧＡ  Ｎａｔｃｏ）であった（図１）。
【００９８】
合計１４７４個の遺伝子が、ＧＡ（すなわち、ＧＡ参考基準のＧＡ−ＲＳおよびＧＡ医薬品のＧＡ−ＤＰ）によってアップレギュレートまたはダウンレギュレートされ（ＦＤＲ調整ｐ値＜０．０５）、培養基処置サンプルと比較した倍差は１．３以上であった（図２）。ＧＡ−ＲＳにより、またＧＡ−ＤＰにより活性化された細胞の遺伝子発現レベルは、統計的には判別不可能であった。ＧＡ−Ｎａｔｃｏと培養基の間の比較により、アップレギュレートまたはダウンレギュレートされた１８９４個の遺伝子が示され（ＦＤＲ調整ｐ値＜０．０５、倍差は１．３以上）、１２７１個の遺伝子がＧＡおよびＧＡ−Ｎａｔｃｏの両方のシグネチャーに共通であった。ＧＡ−ＮａｔｃｏサンプルをＧＡ−ＲＳサンプルと直接比較した場合、７５個の遺伝子が有意に異なる発現を有していた（ＦＤＲ調整ｐ値＜０．０５）。遺伝子発現パターンは、１１のＧＡ−Ｎａｔｃｏサンプル（５つのバッチから取得したもの）内では一貫性はなく、３つのサンプル（２バッチ）と８つのサンプル（３バッチ）の２つの個別のクラスターに分かれる。ＧＡ−ＲＳサンプルと８つのＧＡ−Ｎａｔｃｏサンプルの遺伝子発現パターンを比較した場合、９８子の遺伝子でＦＤＲ調整ｐ値が０．０５未満であり、倍差は１．３以上であった（図３）。
【００９９】
例２
培養基と比較してＧＡにより差次的に発現される遺伝子の機能解析
ＧＡサンプルによる活性化の後にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた１４７４個の遺伝子の機能解析からは、特に、最も顕著に影響を受けた生物学的機能は、Ｔリンパ球およびＢリンパ球をはじめとする免疫細胞の増殖および活性化の強化、ＡＰＣの刺激および免疫反応、およびエフェクターＴリンパ球の分化に関連したものであったことが示唆された（表１）。同時に、細胞傷害性Ｔリンパ球の量に関連する機能、および血液形成前駆細胞の発達に関連する機能はダウンレギュレートされた。
【表１】
2016504039.tif 000003
【０１００】
ＧＡおよびそれらの対応する遺伝子によって改変された遺伝子転写産物に関連する有意な標準経路は、表２で確認することができる。このリストにおいて、Ｔヘルパー細胞分化は最も有意な標準経路であり（ｐ＝４．９７Ｅ−１６）、この経路の転写活性化（表３）はＧＡ免疫調節活性の前述の機序と一致している。ＧＡは、前炎症性サイトカイン、例えば、ＩＦＮγ、ＩＬ−２をコードしている遺伝子の発現を促進することによって、またＴＢＸ２１転写因子の発現を増加させることによってＴｈ１細胞活性化を誘導した（表３）。さらに、両方ともＴＨ−１７経路と関係するＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆは、ＧＡサンプルにおいて過剰発現された。Ｔｈ２表現型への分化は、抗炎症サイトカイン、例えばＩＬ−４およびＩＬ−１３などをコードしている遺伝子の刺激、ならびに、ＩＬ−４ＲおよびＩＬ−４産生を刺激する転写因子のＧＡＴＡファミリー（ＧＡＴＡ３）の過剰発現によって明白であった（表３）。ＩＬ１８Ｒ発現は、Ｔｈ２表現型にも一致しているＧＡによってダウンレギュレートされた（３３）。これらの知見は、ＧＡ処置の開始時に、ＣＤ４＋Ｔ細胞株が炎症誘発性Ｔｈ１サイトカインおよび抗炎症性Ｔｈ２サイトカインの両方を分泌すること（２１および２４）、また、ＧＡへの継続的な暴露がＴｈ１型サイトカインプロファイルからＴｈ２型プロファイルへのシフトを誘導すること（２１、２３、２７、２８）を示す、ＧＡ処置したＭＳ患者からの証拠と一致している。その点に関して、本発明者らの遺伝子発現解析は、ＧＡによって免疫細胞を初期活性化した後に起こる主要な現象、すなわち、Ｔｈ１およびＴｈ２の両経路の活性化をキャプチャーする。制御性Ｔ細胞の維持に必要な重要な転写因子であるＦＯＸＰ３は、ＧＡサンプルにおいて過剰発現され、これは、ＧＡは、ＲＲＭＳ患者におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ制御性細胞の数および機能を増加させるという知見と一致している（３０、３１、３４）。
【表２】
2016504039.tif 000004
【表３】
2016504039.tif 000005
【０１０１】
例３
ＧＡ−Ｎａｔｃｏ対培養基によって差次的に発現される遺伝子の機能解析
ＧＡ−Ｎａｔｃｏバッチ対培養基機能解析は、ＧＡシグネチャーの場合と同様に、最も有意に影響を受けた生物学的機能は、リンパ球（ｐ＝６．４８Ｅ−３５）、免疫細胞（ｐ＝２．７０Ｅ−３５）、Ｂ細胞（ｐ＝２．７４Ｅ−１５）、および造血細胞株（ｐ＝２．０２Ｅ−１０）の増殖；リンパ球（６．０３Ｅ−２５）、食細胞（５．９５Ｅ−０７）、および単球（ｐ＝２．２５Ｅ−２４）の活性化；ならびにＡＰＣ（ｐ＝２．８８Ｅ−６）およびマクロファージ（ｐ＝１．８７Ｅ−０６）の増殖に関連していることを示唆した。
【０１０２】
ＧＡと同様に、Ｔヘルパー細胞分化は、培養基と比較して、ＧＡ−Ｎａｔｃｏの遺伝子転写産物プロファイルに関する最も有意な標準経路であった（ｐ＝１．３７Ｅ−１５）。ＧＡ−Ｎａｔｃｏの転写産物のシグネチャーは、明らかな例外を除いて、ＧＡに関して示したものと同じくこの経路内の機序を有するものと考えられた。ＦｏｘＰ３は、ＧＡ−Ｎａｔｃｏによって活性化された脾臓細胞において過剰発現されなかったが、このことは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３  ＴｒｅｇのアップレギュレートがＧＡとは異なり得ることを示唆している。
【０１０３】
ＧＡとＧＡ−Ｎａｔｃｏの間の遺伝子発現シグネチャーの他の重要な機能性の差を表４に示す。ＧＡによる誘導は、ＡＰＣの免疫応答の活性化、およびＴ細胞を同時抑制とともにエフェクターＴ細胞の分化と関係する機能に関連した遺伝子転写産物のアップレギュレーションにより特性決定された。ＧＡ−Ｎａｔｃｏによって改変された生物学的機能は、Ｔリンパ球増殖ならびにリンパ球および単球の広がりと関連していた。これらの知見は、ＧＡ−Ｎａｔｃｏが、ＡＰＣを活性化する能力の低下、エフェクターＴ細胞の不適切な分化およびＴ細胞の抑制の低減に関連している可能性があることを示唆している。さらに、ＧＡ−Ｎａｔｃｏには、Ｔ細胞の増殖ならびにリンパ球および単球の広がりの増加によって示されたように、多くの炎症誘発性特性があった。
【表４】
2016504039.tif 000006
【０１０４】
例４
ＧＡ−ＮａｔｃｏとＧＡ−ＲＳを識別する９８個の遺伝子の機能解析
記載のように、８つのＧＡ−ＮａｔｃｏサンプルとＧＡ−ＲＳの直接比較を９８個の遺伝子で明らかにし、倍差は１．３以上であった。これらの遺伝子は、免疫応答、炎症反応、免疫細胞の接着および様々な細胞遊走の刺激ならびに移動機序の機能上のプロセス活性化の強化に関連していた（表５）。炎症反応機能において、炎症は、ＩＬ２、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、Ｃ３、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の過剰発現をはじめとする、３０個の異なる転写産物のうち２０個が活性炎症反応と一致する方向で発現されたことを考えると、ＧＡ−Ｎａｔｃｏサンプルにおいて増加することが予測された（ｐ＝８．６７Ｅ−１９）。同様に、細胞移動の増加についての予測も、３９個の転写産物のうち２９個（ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３  ＣＣＬ４を含む）がＧＡ−Ｎａｔｃｏサンプルにおいて過剰発現されたことから予測される（ｐ＝９．５５Ｅ−１５）。興味深いことに、発熱の高いリスクに関連する炎症反応遺伝子のネットワーク（ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ａ、ＣＣＬ４、ＣＣＬ３、ＣＤ１４を含む）も同様に過剰発現された。
【表５】
2016504039.tif 000007
【０１０５】
考察−例１〜４
グラチラマーアセテート医薬物質（ＧＡ、Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標））は４種類のアミノ酸で構成されているポリマーの混合物であるが、これは再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）およびクリニカリ−・アイソレイテッド・シンドローム（ＣＩＳ、clinically isolated syndrome）を処置するための認可医薬品である。ＧＡは、優性の炎症誘発性表現型（Ｔｈ１／Ｔｈ１７）から抗炎症性表現型（Ｔｈ２／Ｔｒｅｇ）にＴ細胞バランスをシフトする、ＧＡ特異的Ｔ細胞を誘導することによってその活性を媒介する。ＧＡが免疫細胞にその活性を及ぼす機能上の経路をさらに特性決定するため、本発明者らは、ＧＡ刺激脾臓細胞に対して遺伝子発現プロファイリングを使用した。マウスをＧＡで免疫し、３日後、脾臓細胞を回収し、エクスビボにおいてＧＡで再活性化した。遺伝子発現プロファイルおよび経路解析を再活性化脾臓細胞で評価したところ、ＧＡによって有意にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた合計１４７４個の遺伝子が示された。ＧＡによって誘導された主な機能上の経路は次のとおりであった：増殖ならびにＴリンパ球およびＢリンパ球を含む免疫細胞の活性化、抗原提示細胞の刺激、ならびにエフェクターＴリンパ球の分化の増加。Ｔヘルパー細胞分化は、ＧＡによって改変された遺伝子転写産物に関連する最も顕著な標準経路であった。こうした発現パターンは、他のグラチラモイドが細胞活性化に使用された場合には認められなかった。このＧＡ誘導経路は、ＭＳ患者におけるＧＡ活性の既知の機序と一致し、この医薬品の特有の治療効果をさらに支持する。
【０１０６】
本発明者らはさらに、ＧＡ治療活性の根本的な機序を調査し、密接に関連するグラチラモイド、ＧＡ−ＮａｔｃｏがＧＡと同様の遺伝子発現パターンを誘導するかどうかを評価することを目的とした。マウスをＧＡ−ＲＳで免疫し、続いて、切除された脾臓細胞をＧＡまたはＧＡ−Ｎａｔｃｏによるエクスビボでの活性化に暴露した。ＧＡによって誘導される最も顕著な転写上の変化は、以下によって特性決定される、Ｔ細胞活性化および分化と関連があった：ａ）炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症サイトカインの混合物のアップレギュレート、ｂ）ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３制御性Ｔ細胞のアップレギュレート、ならびにｃ）Ｔリンパ球の抑制。これらの知見は、短期のＧＡ処置を行った後にＭＳ患者から得たＣＤ４＋Ｔ細胞株が炎症誘発性Ｔｈ１（ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ）と抗炎症性Ｔｈ２（ＩＬ−４およびＩＬ−５）サイトカインを両方とも分泌するが（１４、２８）、ＧＡへの長期間の暴露は、原発性Ｔｈ１型サイトカインプロファイルからＴｈ２型プロファイルへの明瞭なシフトをもたらす（２３、２７、３２、３６〜４０）ことを示唆している以前の刊行物と一致している。ＧＡ処置はまた、ＦＯＸＰ３発現の活性化によってＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の形成を誘導すること（４１）、また、ＭＳ患者におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ３１＋制御性Ｔ細胞の数と抑制能力を増加させること（３０、３１）も示した。さらに、ＧＡで処置した脾臓細胞の遺伝子発現プロファイルがＴ細胞抑制の誘導に機能的に関連しているという本発明者らの知見は、ＭＳ患者において認められたＧＡ効果、すなわち、ＣＤ８＋Ｔ細胞のサプレッサー活性の増大（４２）とＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ２８−サプレッサーＴ細胞のレベルの増加（４３）と一致していた。
【０１０７】
ＧＡはまた、再活性化した脾臓細胞におけるＡＰＣ関連遺伝子の活性化を誘導した。実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルにおける試験は、ＧＡ処置がＡＰＣ類、例えば抗炎症性ＩＩ型単球などの発達を活性化し促進する（３２）ことを示した。これらの細胞は、Ｔｈ２細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞へのＴ細胞分化を促進することが可能であり、ＧＡの作用機序にとって重要であると考えられる（３２）。
【０１０８】
ＧＡによって誘導される特定遺伝子発現パターンは、別の試験において、３か月間、毎日ＧＡ処置を行った前後のＲＲＭＳ患者由来の新鮮な単離ＰＢＭＣを使用して調査した（４４）。この試験において、ＧＡ処置は、４８０個の遺伝子の差次的発現を誘導した。これらの遺伝子のうちの一部は、細胞増殖および免疫応答の機序と関連があり、本発明者らの知見と一致する知見であった。しかし、この試験で示された他の遺伝子は、抗原活性化アポトーシス、接着機序およびＭＨＣクラスＩ抗原提示との関連があった（４４）。遺伝子発現パターンでの試験間のばらつきは、プロトコル、例えば、細胞の起原（ヒトＰＢＭＣｖｓ．マウス脾臓細胞）、ＧＡへのインビボにおける暴露の期間（３か月ｖｓ数日）およびＲＲＭＳ  ＰＢＭＣ試験におけるエクスビボ再活性化フェーズの非存在などの差に起因し得る。
【０１０９】
ＧＡ−ＤＰサンプルによるＧＡ初回抗原刺激を受けた脾臓細胞のエクスビボ活性化からは、ＧＡ−ＲＳサンプルにより活性化した脾臓細胞と比較した場合、統計的に判別不可能な遺伝子発現プロファイルが得られた。対照的に、１１のＧＡ−Ｎａｔｃｏサンプルの遺伝子発現パターンは７５個の遺伝子で異なっており、２つの異なる転写産物プロファイルが得られ、３つのサンプルからなるものと、もう１つが８つのサンプルからなるものであった。これらの８つのＧＡ−Ｎａｔｃｏサンプルによる脾臓細胞の活性化は、ＧＡにより活性化された脾臓細胞と比較して、９８個の遺伝子の発現において有意差を示した。
【０１１０】
ＧＡと比較した場合、８つのＧＡ−Ｎａｔｃｏサンプルは、適切なＴ細胞分化；ＡＰＣの活性化、Ｔ細胞抑制、およびＦＯＸＰ３ポジティブ制御性Ｔ細胞の活性化と関連する転写変化の欠如と一致する遺伝子発現シグネチャーを有していた。さらに、ＧＡＮａｔｃｏおよびＧＡ−ＲＳによって誘導される遺伝子発現プロファイル間の差は、炎症反応の顕著な活性化および炎症細胞接着機序の亢進と関連していた。
【０１１１】
この試験においては、マウスをＧＡ−ＲＳで免疫し、ＧＡとＧＡ−Ｎａｔｃｏの間の転写の差は、ＧＡ初回抗原刺激を受けた脾臓細胞の再活性化フェーズにおいてのみ判定した；したがって、これらの結果は、ＧＡとＧＡ−Ｎａｔｃｏの間のすべての潜在的な差を反映していない場合がある。
【０１１２】
例５
例としてグラチラマーアセテート（ＧＡ）および他のグラチラミド（ｇｌａｔｉｒａｍｉｄ）（ＰＧ）を使用し、本発明者らは、示差的発現遺伝子のリストを超えたコンピュータによる方法の完全な一式を開発しようと、２種類の医薬品の免疫学的影響を厳密に比較するために転写プロファイルを使用して試みた。本発明者らは、（１）それぞれの医薬品バッチについてそれらの転写シグネチャーを測定した場合に２種類の医薬品の変動を比較すること；（２）それぞれの医薬品によってモジュレートされる細胞型の構成を特性決定すること；（３）誘導し抑制する遺伝子のコンテクスト、ならびに、モジュレートする免疫細胞型および臨床結果に結びつく可能性における２種類の医薬品の免疫調節挙動を特性決定および説明することに注目した。
【０１１３】
例６
変動解析：ＧＡはＰＧよりも安定性が有意に高い
異なる製造プロセスによって生産される医薬品を比較する際、それらが生物学的影響において等しく安定しているかどうかを評価することが重要である。本発明者らは、ＰＧの生物学的影響がＧＡと同様に安定しているかどうかの問題に対処するため、関連のすべてのプローブに対して全体的な変動における差を検討しようと試みた。活性化によって特異的に誘導された変動のあるプローブとして（実験的ノイズ、例えば、培養基にのみ暴露させたサンプルで確認された変動などとは対照的に）関連プローブを定義する場合、本発明者らは、ＧＡの場合よりも、ＰＧにおいてはプローブが４倍を超える有意に高い変動を有することを確認した（図４Ａおよび表６）。
【表６−１】
2016504039.tif 000008
【表６−２】
2016504039.tif 000009
【表６−３】
2016504039.tif 000010
【表６−４】
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【表６−５】
2016504039.tif 000012
【０１１４】
変動を試験する第２の方法として、本発明者らは、各々のプローブに関する許容範囲（すなわち、ＧＡ参考基準によって誘導される最小発現および最大発現の間）を決定した。本発明者らは、ＧＡとＰＧの両方についてこの許容範囲内のサンプルのパーセンテージを決定した。本発明者らは、この範囲を有するサンプルの最大許容パーセンテージを許容閾値として定義し、任意の所定の許容閾値について、ＰＧはほとんど常に、ＧＡよりも多くの許容範囲外のプローブを有していることを確認した（図４Ｂ）。例えば、ＰＧについては１５８個のプローブが、参考基準により定義された範囲内のサンプルの７５％の許容を満たしていなかったが、ＧＡについては同一の許容を満たしていないのはわずかに１０個のプローブだけであった。最も不良のＰＧプローブは許容内に５／２２のサンプルを有していたが（２２．７％）、最も不良のＧＡプローブは許容内に４３／６８のサンプルを有していた（６３％）。
【０１１５】
変動を試験する第３の方法として、本発明者らは、各々のＰＧバッチについて、ＰＧバッチと参考基準の間で、またＰＧバッチとＧＡの間で、Ｆ検定により差次的に変動し得るプローブのパーセンテージを計算した。次いで、本発明者らは、これらの値を、参考基準とＧＡの間の差次的に変動し得るプローブの数値と比較し、両方を参考基準と比較した場合、各々のＰＧバッチはＧＡよりも変動が高いことがわかった（図４Ｃ）。
【０１１６】
最後に、本発明者らは、強度の関数として、ＧＡおよびＰＧにおけるすべてのプローブに対して変動係数（ＣＶ）を試験し、所定の強度で、ＰＧよりも、ＧＡで示されるＣＶ値の範囲がはるかに狭いことがわかった（図５）。
【０１１７】
変動の差を確認するだけでなく、これらの差の潜在的な生物学的影響を調査することも重要である。したがって、本発明者らは、各々のプローブについて、ＰＧでの変動とＧＡでの変動の比を計算した。ＰＧでの変動とＧＡでのその変動の比によって最も高いとランク化されたプローブは、許容誘導性の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の重要なマーカーである、ＦＯＸＰ３についてであった（ＩＬＭＮ＿２６３５１３２、比率４．１７、表７）。ＰＧでの変動とＧＡでの変動の比の２番目に高い比を有するプローブは、確立されたＴｒｅｇマーカーでもある（４７）、ＧＰＲ８３についてであった（ＩＬＭＮ＿２７０７９４１、比率４．１４）。
【表７−１】
2016504039.tif 000013
【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【０１１８】
例７
重要免疫系遺伝子に対する影響の比較：ＧＡは、ＴｒｅｇマーカーＦｏｘＰ３およびＧｐｒ８３をＰＧよりも効果的に誘導する。
【０１１９】
異なる医薬品への応答における特定の遺伝子の差次的発現を系統的に試験するため、本発明者らは、パラメトリック試験とノンパラメトリック試験の両方を含む複数の方法を用いた。ＧＡはＦＯＸＰ３発現をＰＧよりもより安定して誘導しただけでなく、ＧＡはまた以下の４種のパラメトリック法によって判定されたように有意に高い発現を誘導した：ＡＮＯＶＡ（ｐ＜１．３７×１０−３に調整）、バックグラウンド除去したＬＩＭＭＡ（ｐ＜６．１４×１０−４に調整）、シグナル対ノイズ（ｐ＜１．３４×１０−２に調整）とｔ−検定（ｐ＜２．１２×１０−２に調整）を使用する比較マーカー選択、およびノンパラメトリックなウィルコクソン順位和検定（ｐ＜４．６２×１０−２に調整）（図６Ａ、表８）。
【０１２０】
ＧＰＲ８３に同じ方法を用い、本発明者らは、ＧＡがＰＧよりも有意に高い発現レベルを誘導したことを確認した：ＡＮＯＶＡ（ｐ＜４．７５×１０−８に調整）、バックグラウンド除去したＬＩＭＭＡ（ｐ＜８．６７×１０−１０に調整）、シグナル対ノイズ（ｐ＜１．３４×１０−２に調整）とｔ−検定（ｐ＜１．４９×１０−２に調整）を使用する比較マーカー選択、およびノンパラメトリックなウィルコクソン順位和検定（ｐ＜３．４５×１０−４に調整、図２Ｂ）。ＧＰＲ８３はまた、ＰＧと比較した場合、ＧＡからの倍差によりトップ２０のプローブにある（表８）。
【表８−１】
2016504039.tif 000017
【表８−２】
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【表８−３】
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【表８−４】
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【表８−５】
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【表８−６】
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【表８−７】
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【表８−８】
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【表８−９】
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【表８−１０】
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【表８−１１】
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【表８−１２】
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【表８−１３】
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【表８−１４】
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【表８−１５】
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【表８−１６】
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【表８−１７】
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【表８−１８】
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【表８−１９】
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【表８−２０】
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【表８−２１】
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【０１２１】
ＦＯＸＰ３とＧＰＲ８３は両方ともＴｒｅｇｓと関連しており（４７）、両方ともＰＧよりもＧＡによって誘導される、より安定し有意に高い発現を有するので、本発明者らは、ＰＧサンプルの同一サブセットが低レベルの両遺伝子を誘導するかどうか、または、ＦＯＸＰ３が一部のＰＧサンプルにおいて低く、かつＧＰＲ８３が他のＰＧサンプルにおいて低いかどうかを、サンプル毎を基本に判定しようと試みた。本発明者らは、さらに、ＦＯＸＰ３において低かったのと同じＰＧサンプルがＧＰＲ８３において低いことを確認した（図６Ｃ）。
【０１２２】
さらに、異なる医薬品に応じて差次的に発現した遺伝子が転写因子（例えばＦＯＸＰ３）である場合、本発明者らは、転写因子の標的であることが知られている遺伝子の発現を調べることによる観察をさらに試験することができる。この場合、本発明者らは、ＦｏｘＰ３に下流の遺伝子が、ＰＧと比較して、ＧＡによってアップレギュレートされた後に活性化されるかどうかを判定しようと試みた。
【０１２３】
遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）（４８）によって、本発明者らは、ＦｏｘＰ３標的遺伝子が、培養基と比較してＰＧサンプルでよりも有意な程度にまで（ＦＤＲ−調整  ｑ＝０．０３６、図６Ｄおよび図７Ａ）、培養基と比較してＧＡサンプルでエンリッチであった（ＦＤＲ−調整  ｑ＝０．００８）ことを見出した。
【０１２４】
ノンパラメトリックなウィルコクソン順位和検定による、ＰＧよりもＧＡによって誘導される有意に高い発現を有する遺伝子のリストに関して、本発明者らはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＳｉｇＤＢ）を利用し（４８）、ＦｏｘＰ３によって結合される遺伝子の同一リストが著しくエンリッチされたことを判定した（ｐ＜１．５９ｘ１０−８に調整、表９）。
【表９−１】
2016504039.tif 000038
【表９−２】
2016504039.tif 000039
【表９−３】
2016504039.tif 000040
【表９−４】
2016504039.tif 000041
【表９−５】
2016504039.tif 000042
【０１２５】
例８
重要免疫系細胞型における潜在的効果に関連する影響の比較：ＧＡは、ＰＧよりも効果的にＴｒｅｇｓを誘導する
本発明者らは、遺伝子発現データを使用して、２つの異なる医薬品がどのように免疫系細胞に差次的に影響を及ぼすかを系統的に判定しようとした。本発明者らは、まず、ＡＮＯＶＡ系パターン解析法を利用して、培養基と比較してＰＧによってのみ有意にダウンレギュレートされ、培養基と比較してＧＡまたはＧＡ参考基準によってはダウンレギュレートされない遺伝子のリストを同定した（表１０、方法）。次いで、本発明者らは、新規な手法によって免疫系細胞型エンリッチメントについてこのリストを試験した（方法）。ＰＧによってのみダウンレギュレートされた遺伝子は、Ｔｒｅｇｓをはじめとする様々なＴ細胞に特異的な遺伝子でエンリッチされている（表１１）。この同じ手法から、培養基と比較してＧＡおよびＧＡ参考基準によって有意にアップレギュレートされたが、培養基と比較してＰＧによってアップレギュレートされなかった遺伝子は（表１０）、再び、最もエンリッチされた細胞型としてＴｒｅｇｓをはじめとするＴ細胞を産生した（表１１）。最後に、４つのパラメトリック法によって判定した場合、ＰＧよりもＧＡによって活性化されたサンプルで有意に高発現する遺伝子は（表８）、再度、ＴｒｅｇｓをはじめとするＴ細胞をエンリッチした（表１１）。
【表１０−１】
2016504039.tif 000043
【表１０−２】
2016504039.tif 000044
【表１０−３】
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【表１０−４】
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【表１０−５】
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【表１０−６】
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【表１０−７】
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【表１０−８】
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【表１０−９】
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【表１０−１０】
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【表１０−１１】
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【表１０−１２】
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【表１０−１３】
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【表１０−１４】
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【表１０−１５】
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【表１０−１６】
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【表１０−１７】
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【表１０−１８】
2016504039.tif 000060
【表１０−１９】
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【表１０−２０】
2016504039.tif 000062
【表１０−２１】
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【表１０−２２】
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【表１０−２３】
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【表１０−２４】
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【表１０−２５】
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【表１０−２６】
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【表１０−２７】
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【表１０−２８】
2016504039.tif 000070
【表１０−２９】
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【表１０−３０】
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【表１０−３１】
2016504039.tif 000073
【０１２６】
特異的免疫系細胞に対する各々の医薬品の影響についてさらに考察するため、本発明者らは、Ｔｒｅｇｓに対して高い細胞型特異性を有する遺伝子のリストを作成し、ＧＳＥＡを利用して、２つの医薬品間で差次的発現される遺伝子のランク化リストのトップでこれらのＴｒｅｇ特異的遺伝子が過剰発現される範囲を判定した。本発明者らは、これらのＴｒｅｇ特異的遺伝子が、ＰＧ活性化サンプルよりもＧＡ活性化サンプルにおいて高発現するランク化リストのトップで過剰発現されることを確認した（ＦＤＲ−調整  ｑ＝０．００、図６Ｅ）。
【０１２７】
まとめると、これらの知見は、ＧＡがＰＧよりもＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇｓをより安定的に、高レベルまでアップレギュレートすることを強調するものである。この知見は、有効性に影響をあたえる。
【０１２８】
例９
重要免疫系細胞型に対する潜在的な安全性に関する影響の比較：ＰＧは、ＧＡよりも大幅に骨髄系細胞をアップレギュレートし得る
ＡＮＯＶＡ系パターン解析を使用して（方法）、本発明者らは、培養基と比較してＰＧによってのみ有意にアップレギュレートされるが、培養基と比較してＧＡまたはＧＡ参考基準によってはアップレギュレートされない遺伝子のリストを同定した（表１１）。細胞型エンリッチメントによって、様々な間質細胞、マクロファージおよび単球が得られた（表１１）。同様に、培養基と比較してＧＡおよびＧＡ参考基準によって有意にダウンレギュレートされるが、培養基と比較してＰＧによってはダウンレギュレートされない遺伝子（表１０）は、マクロファージ、単球および顆粒球を大幅にエンリッチした（表１１）。最後に、４つの異なるパラメトリック法による、ＧＡによって活性化されたサンプルよりもＰＧによって活性化されたサンプルにおいて有意に高発現する遺伝子（表８）は、主として、マクロファージおよび単球をエンリッチした（表１１）。
【表１１−１】
2016504039.tif 000074
【表１１−２】
2016504039.tif 000075
【表１１−３】
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【表１１−４】
2016504039.tif 000077
【０１２９】
ＧＡとＰＧの間で差次的発現される遺伝子の細胞型特異性を説明するため、本発明者らは、ＰＧによって活性化されたサンプルと比較して、ＧＡによって活性化されたサンプルにおいてＴｒｅｇ特異的遺伝子、マクロファージ特異的遺伝子および単球特異的遺伝子の相対的発現を示す差次的発現した遺伝子のヒートマップを作成した（図８および表１２）。本発明者らの知見と一致して、ＰＧは、マクロファージおよび単球関連遺伝子をアップレギュレートするが、ＧＡは、Ｔｒｅｇｓをはじめとする、Ｔ細胞関連遺伝子をアップレギュレートするように思われる。
【表１２−１】
2016504039.tif 000078
【表１２−２】
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【表１２−３】
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【表１２−４】
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【表１２−５】
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【表１２−６】
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【表１２−７】
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【０１３０】
ＧＡとＰＧの間の異なる細胞型活性化をさらに調査するため、本発明者らは、ノンパラメトリックなウィルコクソン順位和検定を利用し、ＧＡからよりもＰＧから有意に高く発現する遺伝子を判定し、ＭＳｉｇＤＢを使用してエンリッチメントを実施した（方法）。ＴＬＲシグナル経路は有意にエンリッチされた（ｐ＜１．２７×１０−６に調整、表９）。オーバーラップ遺伝子のうち、ウィルコクソンにより有意であって、この経路に存在するのはＣＤ１４、単球マーカーおよびＴＬＲ２であった。カーネル密度プロット（図１０Ａ）は平滑化ヒストグラムにたとえることができるが、これは、これらの２つの遺伝子に関するＰＧとＧＡの間の発現の差を示している。これらの２つの遺伝子に関するボックスプロットは、図９で確認することができる。
【０１３１】
ＣＤ１４とＴＬＲ２の両方が同一細胞型（単球）に関連していると仮定し、本発明者らは、同一ＰＧサンプルがＣＤ１４とＴＬＲ２の両方の非常に高い発現を有することを確認した（図１０Ｂ）。
【０１３２】
例１０
観察された差異の根底にある機序の調査：なぜＰＧはＧＡほど効果的にＴｒｅｇｓをアップレギュレートしないのか？
単球は、ＧＡがＴｒｅｇｓを誘導する機序において機能している可能性があるので（４９）、本発明者らは、個々のサンプルにおけるＦＯＸＰ３およびＣＤ１４の発現を比較することを試みた。ＦＯＸＰ３が低いＰＧサンプルもまた、高ＣＤ１４を有している（図１０Ｃ）。これは、単球に対する差次的影響が、ＧＡおよびＰＧがＴｒｅｇｓに差次的に影響することによる１つの機序であり得ることを示唆している。
【０１３３】
ＧＡとＰＧが差次的にＴｒｅｇｓに影響を及ぼし得る別の機序は、これについては、ＦＯＸＰ３発現を誘導すること（５０）、ＧＡ誘導ＦＯＸＰ３発現に必要であることが知られている、インターフェロンγが関与している（５１）。ＩＦＮＧは、ＰＧと比較して、ＧＡによって大幅にアップレギュレートされる：ＩＦＮＧに関するプローブは、ＧＡからの高発現についての倍差によって＃１および＃３を付したプローブである（表８および図１１）。実際、ＦＯＸＰ３において異常に低いそれらのＰＧサンプルはまた、ＩＦＮＧにおいても異常に低い（図１１）。
【０１３４】
例１１
観察された差の根底にある機序の調査：なぜＰＧは単球をアップレギュレートするのか？
ＧＡは単球のＣＤ４０発現レベルを下げることが知られており（４９）、これは、ＣＤ４０が、ＧＡによる活性化後の発現がＰＧによる活性化後よりも有意に低い遺伝子のリスト中にある（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ、方法）（図１２）という本発明者らの知見と一致している。ＧＡはＴ細胞接触対ＬＰＳによって刺激される単球に様々な影響を及ぼす：前者の場合、ＧＡは単球ＩＬ１Ｂ産生の低下をもたらし、一方、後者の場合、ＧＡはその増加をもたらす（５２）。これは、ＰＧからの高発現を有する遺伝子におけるＭＳｉｇＤＢエンリッチメント（方法）の実施により（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ、方法）ＬＰＳ応答経路において有意なエンリッチメントが生じることからも明白であった（ｐ＜４．９６×１０−６に調整、表９）。さらに、本発明者らは、ＦＯＸＰ３が低レベルのそれらのＰＧサンプルが高レベルのＩＬ１Ｂを有することも示す（図１０Ｄ）。ＧＳＥＡ解析は、単球とマクロファージに特異的な遺伝子が、ＧＡよりもＰＧで高発現であるそれらの遺伝子の中で有意にエンリッチされたことを示した（図９Ｅ）。ＩＬ１Ｂはまた、それがＣＤ１４と高度に相関しているので、単球と関連していると考えられる（図１３）。最後に、ＩＬ１Ｂレベルは、ＡＮＯＶＡ（ｐ＜０．０４３に調整）とバックグラウンド除去のＬＩＭＭＡ（ｐ＜０．０３７に調整）の両方で、ＧＡよりもＰＧにおいて有意に高い（表８）。
【０１３５】
ＧＡとＰＧが単球の様々な亜型に影響を及ぼしているかどうかを判定するため、本発明者らは、ヒトＣＤ１６＋およびＣＤ１６ｄｉｍ単球を試験する文献からの遺伝子リストを使用し（５３）、ＧＳＥＡ解析を実施した。本発明者らは、培養基に対しＰＧによってアップレギュレートされた遺伝子のうち、ＣＤ１６ｄｉｍ単球に有意なエンリッチメントがあった（ＦＤＲ  ｑ＝０．１３２、ここで有意性閾値は０．２５である）ことを確認した。培養基に対しＧＡによってアップレギュレートされた遺伝子のうち、ＣＤ１６＋単球に有意なエンリッチメントがあった（ＦＤＲ  ｑ＝０．０５２、ここで有意性閾値は０．２５である）（図１４）。
【０１３６】
方法−例５〜１１
実験計画、データ収集、および前処理
実験計画、データ収集および前処理工程は、既に記載されている（１５）。簡単に説明すると、（Ｂａｌｂ／ｃ×ＳＪＬ）Ｆ１マウスにＧＡ参考基準を注射し、ＧＡ応答性Ｔ細胞を誘導した。３日後、マウスを屠殺し、それらの脾臓細胞を単離し、これらの脾臓細胞を２４時間アクチベータ溶液と混合した。アクチベータ溶液は、複数バッチのＧＡ、ならびにグラチラマーアセテート参考基準、および複数バッチのＰＧ（Ｇｌａｔｉｍｅｒ，  Ｎａｔｃｏ  Ｐｈａｒｍａ，  Ｌｔｄ．，  Ｈｙｄｅｒａｂａｄ，  Ｉｎｄｉａ）を含む。次いで、ＲＮＡを抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＷＧ−６＿Ｖ２チップを使用するマイクロアレイによって遺伝子発現を特性決定した。画像処理、ビーズ当たりのシグナル強度の定量、およびバックグラウンドシグナルの補正には、ＩｌｌｕｍｉｎａのＢｅａｄＳｔｕｄｉｏソフトウェアを利用した。マイクロアレイデータは、アクセッション番号ＧＳＥ４０５６６で、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓに集積した。
【０１３７】
データ処理工程
本発明者らは、Ｒの「ｐｒｅｐｒｏｃｅｓｓＣｏｒｅ」パッケージによって、４６，５４７個のプローブ全体にわたり、２１４のサンプルすべてに関する抽出データを変位値正規化した（２９）。次いで、本発明者らは、ＲのＳＶＡパッケージにおいて実行されるＣｏｍＢａｔ（３０）でバッチ変動を修正した（６２）。各々のマイクロアレイチップの記号はバッチ標識を提供していた；バッチは全部で１８であった。処置用の標識（すなわち、医薬品、参考基準…）は共変量として添加した。
【０１３８】
変動解析法
活性化によって特異的に誘導される変動（実験ノイズとは対照的に）を有するプローブを同定するため、本発明者らは、培養基よりもＧＡまたはＰＧの何れかで活性化した場合に有意に変動し得るプローブを同定しようと試みた。Ｆ検定を使用して、本発明者らは、各々のプローブについてＧＡを培養基と比較し、ＰＧを培養基と比較した。次いで、本発明者らは、処置の何れかが培養基よりも高い変動に達するプローブのセットを取得した（ユニオン、少なくとも１つの経路を通過）。プローブ単独のそれらのセットに関して、本発明者らは、Ｆ−検定を利用してＧＡからＰＧの変動を比較し、プローブ間の差異の有意性を測定した。
【０１３９】
方法変動を評価する許容方法：
大規模な生産方法の目的は、小規模生産された製品と同じ品質の製品を大量に生産することである。ＧＡとＰＧの方法の均質性を評価するため、本発明者らは比較の基準を求めた。この比較の基準は、培養基と比較した参考基準の絶対倍差によりトップ１０００のプローブをまず同定することにより構築した（表１３）。リストは、培養基と比較してアップレギュレートおよびダウンレギュレートされたプローブを含む。プローブは、参考基準によりアップレギュレートされたものは６．００以上の平均参考基準発現を有する必要があり、参考基準によりダウンレギュレートされたものが６．００以上の平均培養基発現を有する必要があるように選別された。このことは、リストの１０００のプローブがともに参考基準によりも有意に影響が及ぼされ、しかも十分に発現されて、発現の低いプローブに関連するノイズを確実に回避させた。
【表１３−１】
2016504039.tif 000085
【表１３−２】
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【表１３−３】
2016504039.tif 000087
【表１３−４】
2016504039.tif 000088
【表１３−５】
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【表１３−６】
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【表１３−７】
2016504039.tif 000091
【表１３−８】
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【表１３−９】
2016504039.tif 000093
【表１３−１０】
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【表１３−１１】
2016504039.tif 000095
【表１３−１２】
2016504039.tif 000096
【表１３−１３】
2016504039.tif 000097
【表１３−１４】
2016504039.tif 000098
【表１３−１５】
2016504039.tif 000099
【表１３−１６】
2016504039.tif 000100
【表１３−１７】
2016504039.tif 000101
【表１３−１８】
2016504039.tif 000102
【表１３−１９】
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【表１３−２０】
2016504039.tif 000104
【０１４０】
１０００のそれぞれのプローブについて、任意の参考基準サンプルによって観察される最大および最小の発現を記録した。参考基準に対して観察された最大発現と最小発現の間の範囲は、各々のプローブに関して認められ得る許容範囲として有用であった。次いで、本発明者らは、認められ得る許容範囲内にある発現を有するＧＡおよびＰＧに関するサンプルの数を数え、その結果を１０００のすべてのプローブについて範囲内のサンプルの割合に変換した。次いで、これらのパーセンテージをＰＧとＧＡについて個別に最小から最大までソートし、１〜１０００の整数に対してプロットした。最終結果は、どれだけ多くのプローブが、各々のプローブに関して認められ得る許容範囲内にあるために必要とされるサンプルの数に対し、所定の方法の仕様を満たすことができないかということを何れかの医薬品に対して判定することができるプロットであった。この方法の視覚的な表現は図１６で確認することができるが、これは、ＧＡとＰＧの両方に関するＧｐｒ８３ｖｓ．ＦｏｘＰ３の分散プロットを示す。両プロットにおける赤色の正方形は、両プローブに関する最大および最小の参考基準発現によって定義される、認められ得る許容範囲である。５つのプローブはＧＡに関する認められ得る許容範囲から外れるが、一方、１２のプローブはＰＧに関する範囲から外れている。
【０１４１】
分散比法
ＰＧサンプルとＧＡサンプルでの変動における相対的差異を測定するため、本発明者らは、処置の各々のセット（ＧＡおよびＰＧ）に関する母分散の不偏推定値として標本分散を利用した。簡単に説明すると、本発明者らは、イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）マイクロアレイ中の各々のプローブについて、ＰＧサンプルでの分散値をＧＡサンプルでの分散値で除算した比を計算した。この測定は、処置間の各々のプローブでの分散値の直観的比較を提供し、この比はＦ−検定によって計算される基礎統計である（６３）。次いで、本発明者らは、１以上の比（ＧＡと比較してＰＧで変動が高い）から１未満まで（ＰＧと比較してＧＡで変動が高い）プローブをソートした。
【０１４２】
時間プロットに対する変動解析
ＰＧおよびＧＡで処理したサンプルの変動を解析および比較するため、本発明者らは、発現が高く（ランクによる最も高い発現のトップ１０％）変動係数の高い（ＣＶ、ランクによる最も高いＣＶのトップ１０％）ものまでプローブのリストを限定した。組み合わせた基準によって、ともに発現が高く（平均ｌｏｇ２強度＞＝９）変動が高い（平均ＣＶ＞＝２％）３１５個のプローブのセットが得られた。
【０１４３】
任意の２つのカテゴリー／バッチ間の距離を測定するため、本発明者らは、これらのカテゴリー間でＰ＜０．０５にＦＤＲ−調整されたＦ−検定により示差的に変動し得るプローブの数を簡単に数え、各々のプローブに関する平均を使用して技術的な重複をまとめ、技術的変動の影響を最小限にした（６４）。本発明者らは、各々のＰＧバッチと参考基準（ＲＳ）およびＧＡの間の示差的に変動し得るプローブの数をプロットした。本発明者らはまた、比較するための緑色の水平なラインでＧＡとＲＳの間の示差的に変動し得る（合計３１５個のうちの）プローブのパーセントに注目した。
【０１４４】
変動係数プロット
プローブ強度とプローブ変動の関係を測定するため、本発明者らは、正規化／バッチ補正後に、各々のプローブのｌｏｇ２強度を計算した（技術的反復を平均して、技術的問題により発生した変動よりもむしろ生物学的変動に焦点をあてる（６４））。本発明者らはまた、その平均ｌｏｇ２強度で各々のプローブの標準偏差を除算することによって、ＣＶと表示した変動係数を計算した。次いで、本発明者らは、Ｘ軸上のプローブのｌｏｇ２強度とＹ軸上のＣＶを使用して、すべてのプローブに関する関係をプロットした。プロットは、強度の高いプローブの低ＣＶに対するバイアス、およびその逆を示す。このバイアスにもかかわらず、本発明者らは、なおも、クラスとして、ＰＧ処理サンプルは、２つの処理と培養基の間で変動の高いプローブの数に基づきＧＡ処理サンプルと比較して（Ｆ−検定により測定した場合）総括的に有意に高い変動を示すと考える。
【０１４５】
複数のパラメトリック検定（ＡＮＯＶＡ、バックグラウンド除去のＬＩＭＭＡ、ＳＮＲによる比較マーカー選択およびｔ−検定）を使用する示差的発現遺伝子の同定
ＰＧとＧＡの間の示差的発現プローブを見出すため、本発明者らは、プローブレベルで様々な統計的検定を利用し、異なる方法全体の結果を統合した。まず、本発明者らは、各々のプローブに分散解析法（ＡＮＯＶＡ）を使用して、処理間の差次的発現の統計的有意差を計算し（６５）、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇの偽発見率（False Discovery Rate）（ＦＤＲ）補正法を使用して多重仮説検定について調節した（６６）。次に、本発明者らは、マイクロアレイのための線形モデル（ＬＩＭＭＡ）データ解析（６７、６８）Ｒパッケージ、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒフレームワーク部分（６９）を利用してＰＧおよびＧＡのサンプルを比較し、培養基からの固定効果について調節する線形モデルに適合させた（効果＝（ＧＡ−ＰＧ）−（ＰＧ−培養基））。線形モデルの係数は、改良ｔ−検定を使用して有意性に関して試験し（標準偏差を考慮）、各々のプローブに関するｐ値はＦＤＲを使用して調整した（６６）。同時に、本発明者らは、ＧｅｎｅＰａｔｔｅｒｎ（７０）で実施される比較マーカー選択を使用し、ＰＧとＧＡの間のプローブを直接比較した。本発明者らは、このフレームワーク内で２つの個別の技術；従来のｔ−検定およびシグナル対ノイズ比検定（Signal-to-Noise Ratio test）（ＳＮＲ）を適用した。これらの２つのそれぞれの検定について、本発明者らはＦＤＲにより公称ｐ値を調整した。記載した４つのすべての検定について、本発明者らは、０．０５以下の調整閾値を使用した。
【０１４６】
ノンパラメトリック／ウィルコクソン
ＰＧおよびＧＡのサンプルにおけるプローブ発現分布の自然変動のため、本発明者らは、ノンパラメトリック手法によって差異を同定しようと試みた。これに関し、本発明者らは、各々のプローブについて、Ｒ（Ｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．１５．１（２０１２−０６−２２））で実施されるウィルコクソン順位和検定（７１）を使用した。
【０１４７】
公称ｐ値はＦＤＲ調整し、０．０５以下であるプローブのみを検討した。
【０１４８】
ＦｏｘＰ３標的遺伝子リストによるＧＳＥＡ
ＦｏｘＰ３転写因子の下流遺伝子が２つの処置によってどのようにモジュレートされたかを検討するため、本発明者らは、ＣｈＩＰ（クロマチン免疫沈降法）によりＦｏｘＰ３結合部位を有し、ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞と比較して示差的発現される遺伝子を含むヒト胸腺および末梢から単離されたＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞由来のＺｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（７２）により構築された遺伝子セットを利用した。ヒトからマウスへのオルソロジーマッピングは、マウスゲノムデータベース（７３）が提供するマップを使用して実施した。次いで、本発明者らは、遺伝子セットエンリッチメントアルゴリズム（ＧＳＥＡ）（４８）を使用して、培養基と比較してＧＡで、および培養基と比較してＰＧでアップレギュレートされた遺伝子のＦｏｘＰ３標的のエンリッチメントを測定した。簡単に説明すると、ＧＳＥＡは、インプットとして遺伝子セット（この場合、ＦｏｘＰ３標的のセット）と発現マトリックス（ＰＧもしくはＧＡまたは未処置／培養基の何れかで処置されたサンプルのセット）を入力し、次いで、各々のクラス／処置に関する発現マトリックスにおけるそれらの発現に基づいて遺伝子をランク化する。次いで、ＧＳＥＡは、各々の処置に対して過剰出現した各々の遺伝子セットがどの程度の発現の極値（高発現または低発現）であるかに基づいて、各々の遺伝子セットのエンリッチメントスコアを計算する。
【０１４９】
ＡＮＯＶＡ系パターン同定法：
本発明者らは、ＡＮＯＶＡ系パターン同定法と呼ばれる技術を使用して、実験条件全体の発現の特異的パターンと一致するプローブを同定しようと試みた。
【０１５０】
例えば、目的のパターンの１つは、プローブがＰＧによってのみ有意に影響を受ける場合であった。このパターンにおいて、所定のプローブの発現は、ＧＡ、参考基準、または培養基により処置された細胞中で統計的に異ならないものとする。統計用語において、このパターンにマッチするプローブは、ＰＧとＧＡの間を比較するためのｐ値（ｐＧＡ−ＰＧ）、ＰＧと参考基準のｐ値（ｐＰＧ−参考基準）、およびＰＧと培養基のｐ値（ｐＰＧ−培養基）が０．０５未満でなければならず、ＧＡと培養基の間を比較するためのｐ値（ｐＧＡ−培養基）、ＧＡと参考基準のｐ値（ｐＧＡ−参考基準）、および参考基準と培養基のｐ値（ｐ参考基準−培養基）は０．０５を超えなければならない。
【０１５１】
一般的な方法で解析を行うため、本発明者らは、ＭＡＴＬＡＢでＡＮＯＶＡ１関数を使用して、すべてのプローブについて４つのすべての条件のペア比較を行うのに必要な６つのｐ値を計算した。次いで、本発明者らは、所望のパターンとマッチするプローブのセットを同定した。上記の例において、プローブは、それらの６つのペアの比較ｐ値が次のパターン（ｐＧＡ−ＰＧ＜０．０５、ｐＰＧ−参考基準＜０．０５、ｐＰＧ−培養基＜０．０５、ｐＧＡ−培養基＞０．０５、ｐＧＡ−参考基準＞０．０５、ｐ参考基準−培養基＞０．０５）とマッチした場合に、ＰＧによってのみ影響を受けるものと同定された。
【０１５２】
細胞型エンリッチメント
遺伝子セットにおいて細胞型特異性を測定するため、本発明者らは、Ｂｅｎｉｔａらのエンリッチメントツール（７４）を利用し、ＩＭＭＧＥＮ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ）における各々の細胞型に各々の遺伝子を関連づける特異性スコアを計算した（７５）。次いで、本発明者らは超幾何検定を利用し、各々の細胞型にわたって遺伝子セットに関する合計特異性スコアの有意性を計算した。最後に、本発明者らは、多重仮説検定に関するＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇの偽発見率（False Discovery Rate）（ＦＤＲ）補正法を使用して、超幾何学的エンリッチメントによる各々のｐ値アウトプットを調整した（６６）。
【０１５３】
ＭＳｉｇＤＢによる機能エンリッチメント
遺伝子リストの機能的有意性を評価するため（テストセット）、本発明者らは、ＭＳｉｇＤＢ（１７）のデータベースのバージョン３．１を参照セットとして使用した。本発明者らは、標準の超幾何学的エンリッチメント検定を、本発明者らのテストセットからの少なくとも３つの遺伝子が参照セットに存在する追加の判定基準とともに実施した。次いで、本発明者らは、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正手順を適用し、０．０５の有意閾値を使用した。
【０１５４】
考察−例５〜１１
本発明者らは、画期的な新薬の免疫学的影響をＰＧの影響と比較するための一連の計算方法を開発した。
【０１５５】
方法の第１のセットは、特定遺伝子の発現におけるサンプルの変動を比較することを含む。本発明者らは、ある医薬品が非常に安定しており、他方が非常に変動性である特定遺伝子を同定する、分散比解析を含む広範囲の計算方法を適用した。本発明者らは、Ｆ−検定を使用して個々の遺伝子に関する変動を直接比較し、強度の関数として変動係数をプロットして変動とプローブ強度の関係を判定し、バッチ全体の変動を調査した。本発明者らはまた、化学／方法工学からの原理を使用して新規方法を開発し、参考基準によって定義される許容範囲を使用して変動を判定した。
【０１５６】
これらの方法により、ＰＧがＧＡ参考基準またはＧＡの何れかよりも有意に変動し得る生物学的影響を有することを示唆するマルチプルラインの証拠が得られた。例えば、様々なＧＡバッチは非常に安定的であり、ＧＡ参考基準に類似していることがわかった。逆に、より多くのプローブは、様々なＰＧバッチで刺激した後の発現において高い変動を有する。この変動性自体は、製品のバッチ間変動が患者に有害的に出現する可能性があることから、医師および規制当局間における懸念の原因である。可能性の１つは、患者がＰＧの特定のバッチからの効果を受けることはできるが、その後のバッチからは受けることができず、可能性のある最大の効果を患者が受けることが妨げられることである。より懸念される別の可能性は、変動が、有害事象を引き起こすＰＧの特定のバッチの原因になり得ることである。ＰＧの不均一性により、こうした有害事象は断続的となる可能性があり、したがって、検出、モニター、報告が困難である。
【０１５７】
方法の次のセットは、２種類の医薬品の間で異なる免疫学的影響を同定することを含んでいた。本発明者らは、様々な方法（多重パラメトリック検定、ノンパラメトリック検定、およびＡＮＯＶＡ系パターンマッチング法）を使用して示差的発現遺伝子を同定した。次いで、本発明者らは、特定の免疫細胞型に特異的な遺伝子におけるエンリッチメントを判定する新規に開発した方法を使用して、これらの示差的な発現遺伝子の免疫学的関連を調査した。本発明者らはさらに、細胞型特定遺伝子および転写因子標的遺伝子のリストに対して、ＭＳｉｇＤＢ（１７）およびＧＳＥＡ（１７）による超幾何学的エンリッチメントを含む確立方法を使用して、得られた仮説を調査した。
【０１５８】
これらの方法から、ＰＧよりもＧＡによってより有意にアップレギュレートされる特定遺伝子および免疫細胞型が同定された。この場合、これらは、ＧＡがＰＧよりもＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇｓをより安定して、より効果的にアップレギュレートすることを示唆する強力な証拠である。本発明者らは、ＦｏｘＰ３自体の発現、ＦｏｘＰ３の下流遺伝子、他の既知のＴｒｅｇマーカー、およびＴｒｅｇ特定遺伝子が、ＰＧと比べ、ＧＡによる活性化からすべてエンリッチされることを明らかにした。Ｔｒｅｇへの生物学的影響におけるこの顕著な差は、医師および規制当局に必ず注目される。ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇが有害なミエリン反応性Ｔ細胞（５４）を抑制することによりＭＳの患者において有益な許容を誘導することは十分に確立されており、したがって、変動が高く低下したＴｒｅｇの誘導は、Ｔｒｅｇに対するコパキソンの影響を示し（５１）、ＭＳ患者における臨床反応にＴｒｅｇを結びつけている（５５）最新の知見を示したＰＧの潜在的な効果に関する問題を特に提起する。またこれらの方法から、ＧＡよりもＰＧによってより有意にアップレギュレートされる特定遺伝子および免疫細胞型が同定された。この場合、ＰＧは、ＧＡよりも骨髄系細胞、例えば単球およびマクロファージなどに対して有意に高い影響を及ぼした。ＧＡよりもＰＧで有意に高い発現のある遺伝子は、重要な単球マーカー、例えばＣＤ１４などを含み、マクロファージおよび単球細胞型がエンリッチされ、関連経路、例えばＴＬＲシグナル伝達などでエンリッチされる。単球がＭＳにおける神経炎症に「著しく寄与している」こと（５６）を特に考慮し、またＧＡの作用機序の１つが単球に対するその影響を含んでいるという最近の報告（５２）を考慮すると、単球−特定遺伝子のより強力なアップレギュレートは、医師および規制当局によるさらなる調査の根拠となる。
【０１５９】
単球に対するＰＧの影響に起因する潜在的な安全上の懸念は、ＰＧによる活性化後の遺伝子発現パターンがＣＤ１６ｄｉｍ単球の遺伝子発現パターンにより密接に類似しているが、ＧＡ活性化後の発現パターン化はＣＤ１６＋単球に関連した遺伝子発現パターンにより密接に類似しているという本発明者らのＧＳＥＡ解析の知見により高まった。これは、コパキソンがＣＤ１６＋単球に確実に影響を及ぼしていることを示す文献情報と一致しており（５７）、ＰＧが好むＣＤ１６ｄｉｍ単球は様々な生物学的役割を果たすことが知られているので、特に安全上の観点から懸念されている。
【０１６０】
単球に対する影響の差はまた、ＧＡ処置した単球がＦｏｘＰ３発現をアップレギュレートすることが知られていることから、Ｔｒｅｇアップレギュレートにおいて観察された差を説明するのに役立ち得る（４９）。ＧＡは、（ＩＬ１Ｂ産生の低下をもたらす）Ｔ細胞接触によって刺激された単球とは反対に（５２）、（ＩＬ１Ｂ産生の増加をもたらす）ＬＰＳによって刺激された単球に対して逆の影響を及ぼした。ＩＬ１Ｂのレベルが著しく高い同一ＰＧサンプルもまた、ＦｏｘＰ３が著しく低い。ＰＧはまた、ＬＰＳ応答経路においてアップレギュレートを示す。まとめると、これらの知見は、意図的であるか汚染による、ＰＧの一部の成分は、単球におけるＬＰＳ応答経路を誘発し、ＩＬ１Ｂの過剰産生およびＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの著しく低い誘導をもたらす可能性があることを示唆している。この可能性は、安全性に関するさらなる調査の根拠となる。
【０１６１】
マウスにおける任意の遺伝子発現研究に対する明らかな警告の１つは、健全なマウスモデルとヒトＭＳ患者の間の本質的な違いにある。さらに、ＧＡとＰＧの生物学的影響に明確な差がある。これにさらに対処するための工程の１つは、示差的影響遺伝子を、ＭＳに罹患しているヒトでのコパキソン応答に関連のあることが知られているマーカーおよび方法（２７、２８）と結び付けることにある。
【０１６２】
これらの試験において、本発明者らは、画期的新薬をＰＧと比較する計算方法の広範囲で適用可能なセットを開発しようと試みた（図１５Ａ）。本発明者らは、ＧＡと比較してＰＧによる活性化後に遺伝子発現で高い変動があること、またＴｒｅｇおよび単球をはじめとする重要な生物学的プロセスへの影響における有意差を見出した（図１５Ｂ）。これらの差は、ＭＳ患者への安全で有効な治療法を探索する医師および規制当局に対して問題を提起し、ＰＧとＧＡとの比較に適切な安全性と最終時点での効果を使用し、臨床研究が支持されることを示唆するものである。より一般には、ここに記載されているデータ解析法は、２つの類似治療法の免疫学的影響を比較する様々な状況で利用し、患者にとって最良と考えられる医薬品を確実に投与させることができる。
【０１６３】
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【図１】
2016504039.tif 000105
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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