(57)【要約】本発明は、抗体アクセプターフレームワーク、及び良好に適合させた抗体アクセプターフレームワークを使用して非ヒト抗体（例えばウサギ抗体）をグラフトする方法に関する。本発明の方法によって生成された抗体は、多様な診断用適用及び治療用適用に有用である。第１の態様において、本発明は、ジスルフィド架橋がＣＤＲ中に存在するかどうかに非依存的に、異なる結合特異性の多様な抗体からの（特にウサギ抗体からの）ＣＤＲのためのアクセプターとして特に適切な特定のヒト抗体の重鎖可変領域（いわゆる「ａ７２」ＶＨフレームワーク配列）を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１を含むヒト重鎖アクセプターフレームワーク。
【請求項２】
位置１２、１０３、及び／または１４４（Ａｈｏナンバリング）でアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のヒト重鎖アクセプターフレームワーク。
【請求項３】
前記置換が、
（ａ）位置１２でのセリン（Ｓ）；
（ｂ）位置１０３でのセリン（Ｓ）もしくはスレオニン（Ｔ）；及び／または
（ｃ）位置１４４でのセリン（Ｓ）もしくはスレオニン（Ｔ）
である、請求項２に記載のヒト重鎖アクセプターフレームワーク。
【請求項４】
請求項１に記載のアクセプターフレームワークをコードする単離核酸。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸を含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項７】
所望される抗原に特異的であり、
（ａ）ウサギ目の動物免疫結合物の可変軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖アクセプターフレームワーク；及び
（ｂ）ウサギ目の動物免疫結合物の可変重鎖ＣＤＲを含む請求項１に記載のヒト重鎖アクセプターフレームワーク
を含む、免疫結合物。
【請求項８】
前記軽鎖アクセプターフレームワークが配列番号：２と少なくとも８５％の同一性を有する、請求項７に記載の免疫結合物。
【請求項９】
可変軽鎖フレームワーク及び重鎖アクセプターフレームワークを連結するリンカー配列をさらに含み、前記リンカー配列が配列番号：４である、請求項７に記載の免疫結合物。
【請求項１０】
抗原結合に関与するドナーフレームワーク残基をさらに含む、請求項７に記載の免疫結合物。
【請求項１１】
前記免疫結合物が、ｓｃＦｖ抗体、全長免疫グロブリンまたはＦａｂ断片である、請求項７に記載の免疫結合物。
【請求項１２】
ウサギ免疫結合物をヒト化する方法であって、前記方法は：
（ａ）ドナーウサギ免疫結合物からのＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２及びＣＤＲ  Ｈ３配列からなる群のうちの少なくとも１つの重鎖ＣＤＲを請求項１に記載のヒト重鎖アクセプターフレームワークの中へグラフトすることと；
（ｂ）ドナーウサギ免疫結合物からのＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２及びＣＤＲ  Ｌ３配列からなる群のうちの少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを配列番号：２と少なくとも８５％の同一性を有するヒト軽鎖アクセプターフレームワークの中へグラフトすることと
を含む、方法。
【請求項１３】
前記ヒト重鎖アクセプターフレームワーク及び前記ヒト軽鎖フレームワークのうちの１つまたは両方中のフレームワーク残基を、前記ドナーウサギ免疫結合物のフレームワーク残基により置換することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記重鎖アクセプターフレームワークが重鎖アミノ位置１２、１０３及び１４４（ＡＨｏナンバリング）のうちの１つまたは複数で置換を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
位置１２及び１０３及び１４４のうちの１つまたは複数での前記置換が、
（ａ）位置１２でのセリン（Ｓ）；
（ｂ）位置１０３でのスレオニン（Ｔ）；及び
（ｃ）位置１４４でのスレオニン（Ｔ）
からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載の方法に従ってヒト化された免疫結合物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
モノクローナル抗体、それらのコンジュゲート及び誘導体は、治療用薬剤及び診断用薬剤として商業上非常に重要である。非ヒト抗体は、通常単一の低用量の注射に続いて、患者において強い免疫反応を誘発する（Ｓｃｈｒｏｆｆ，１９８５  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４５：８７９−８５，Ｓｈａｗｌｅｒ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９８５  １３５：１５３０−５；Ｄｉｌｌｍａｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  １９９４  ９：１７−２８）。したがって、例えば遺伝子導入マウスまたはファージディスプレイを使用して完全ヒト抗体を作製する技術に加えて、マウス及び他のげっ歯類抗体の免疫原性を減少させる複数の方法が開発された。キメラ抗体が操作され、それはヒト定常領域とげっ歯類可変領域を組み合わせたものであり（例えばＢｏｕｌｉａｎｎｅ  Ｎａｔｕｒｅ  １９８４  ３１２：６４３−６）、免疫原性問題を大幅に減少させる（例えばＬｏＢｕｇｌｉｏ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １９８９  ８６：４２２０−４；Ｃｌａｒｋ，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ２０００  ２１：３９７−４０２）。ヒト化抗体も操作され、その場合、可変領域それ自体のげっ歯類配列はヒト配列に可能な限り近いが少なくとももとのＣＤＲを維持するように操作されるか、またはげっ歯類抗体からのＣＤＲはヒト抗体のフレームワークの中へグラフトされる（例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ  １９８８  ３３２：３２３−７；ＵＳ５，６９３，７６１）。ウサギポリクローナル抗体は、生物学的アッセイ（ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット等）のために広く使用される。ポリクローナルウサギ抗体は、通常はるかに高い親和性に起因してポリクローナルげっ歯類抗体よりもしばしば好まれる。さらに、しばしばウサギは、マウスにおいて免疫抗原性の低い抗原及び／またはファージディスプレイにおいて使用された場合に良好な結合物を生じない抗原に対して良好な抗体反応を誘発することができる。ウサギ抗体のこれらの周知の長所に起因して、治療用抗体の探索及び開発において使用されることが理想的だろう。これが一般的には行われない理由は、主にモノクローナルウサギ抗体の生成における技術的な難題のためである。ミエローマ様の腫瘍がウサギにおいて知られていないので、モノクローナル抗体を生成する従来のハイブリドーマ技術はウサギ抗体に適用可能ではない。ウサギ抗体発現細胞のための融合細胞株パートナーの提供に関する先駆的研究は、Ｋｎｉｇｈｔ及び共同研究者（Ｓｐｉｅｋｅｒ−Ｐｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １９９５，９２：９３４８−５２）によって行われ、改善された融合パートナー細胞株は、２００５年にＰｙｔｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（例えば米国特許第７４２９４８７号を参照）によって記述された。しかしながら、基本的には対応するノウハウが単一の研究グループによって優先されるので、この技術は幅広く広まらない。ＲＴ−ＰＣＲ経由で選択される抗体発現細胞からの抗体のクローニングを含むモノクローナル抗体の生成のための代替方法は、文献中で記載されているが、ウサギ抗体について成功したとは報告されていない。
【０００２】
ウサギ抗体は、マウス抗体と同様に、ヒト治療法のために使用されれば強い免疫応答を誘発すると予想され、したがってウサギ抗体は臨床的に使用する前にヒト化する必要がある。しかしながら、ヒト化げっ歯類抗体の作製に使用される方法は、ウサギ抗体とマウス抗体との間及びそれぞれウサギ抗体とヒト抗体との間の構造的な差異に起因して、ウサギ抗体については容易に推定することができない。例えば、軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）は、大抵の場合ヒト抗体またはマウス抗体からの従来公知のＣＤＲＬ３よりもはるかに長い。
【０００３】
先行技術中で記載されるウサギ抗体ヒト化アプローチは少数あるが、それは非ヒトドナーのＣＤＲがヒトアクセプター抗体上に移植される古典的なグラフトアプローチではない。ＷＯ０４／０１６７４０はいわゆる「表面再建（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」戦略を記述する。「表面再建」戦略の目標は、よりヒト様になるように、非ヒトフレームワークの溶媒接近可能な残基をリモデルすることである。ＷＯ０４／０１６７４０中で記載されるように、ウサギ抗体のための類似のヒト化技法は、当技術分野において公知である。ＷＯ０８／１４４７５７及びＷＯ０５／０１６９５０の両方は、ウサギモノクローナル抗体をヒト化する方法を開示し、それは、類似のヒト抗体のアミノ酸配列に対する親のウサギ抗体のアミノ酸配列の比較を含む。続いて、親ウサギ抗体のアミノ酸配列は、そのフレームワーク領域が類似のヒト抗体の同等のフレームワーク領域に配列でより類似するように変更される。良好な結合能力を獲得するために、各々の免疫結合物のためにについて労力を要する開発努力を個別に行なう必要がある。
【０００４】
上述のアプローチの可能性のある問題は、ヒトフレームワークが使用されないが、ウサギフレームワークをよりヒト様になるように操作するということである。かかるアプローチは、タンパク質のコア中に埋没するアミノ酸ストレッチが免疫原性Ｔ細胞エピトープをまだ含み得るというリスクをもたらす。
【０００５】
今日まで、本出願人は、最先端技術のグラフトアプローチの適用によってヒト化されたウサギ抗体を同定していない。これは、ウサギＣＤＲがヒトＣＤＲまたはげっ歯類ＣＤＲとはかなり異なり得るという事実によって説明されるだろう。当技術分野において公知であるように、多くのウサギＶＨ鎖はマウス及びヒトのカウンターパートと比較して余剰のペアのシステインを有する。ｃｙｓ２２とｃｙｓ９２との間に形成される保存されたジスルフィド架橋に加えて、ｃｙｓ２１−ｃｙｓ７９架橋、そしていくつかのウサギ鎖においてＣＤＲ  Ｈ１の最後の残基とＣＤＲ  Ｈ２の第１の残基との間に形成されるＣＤＲ間Ｓ−Ｓ架橋もある。その他に、ペアのシステイン残基は、多くの場合ＣＤＲ−Ｌ３中で見出される。さらに、多くのウサギ抗体ＣＤＲはいかなる従来公知の標準構造にも属さない。特に、ＣＤＲ−Ｌ３は、大抵の場合ヒトまたはマウスのカウンターパートのＣＤＲ−Ｌ３よりもはるかに長い。
【０００６】
したがって、ヒトフレームワークの中への非ヒトＣＤＲ抗体のグラフトは、タンパク質工学の主要な課題である。自然に進化したフレームワークから異なる人為的に選択されたヒトフレームワークへの抗原結合ループの移行は、天然のループのコンフォメーションが抗原結合のために保持されるように、実行されなくてはならない。多くの場合、抗原結合親和性は、ループグラフト後に大幅に減少するかまたは消失する。抗原結合ループのグラフトにおける慎重に選択されたヒトフレームワークの使用は、ヒト化分子における結合親和性を保持する可能性を最大化する（Ｒｏｇｕｚｋａ  ｅｔ  ａｌ  １９９６）。文献で入手可能な多くのグラフト実験はＣＤＲグラフトのための大まかな指針を提供するが、パターンを一般化することは可能ではない。典型的な問題は、ＣＤＲループのグラフト後に特異性、安定性または生産可能性を失うことである。
【０００７】
したがって、治療用薬剤及び診断用薬剤としての使用のためのウサギ抗体を確実かつ迅速にヒト化する改善された方法について緊急の必要性がある。さらに、確実にウサギ抗体をヒト化し、薬剤様の生物物理的特性を備えた機能的な抗体及び／または抗体断片を提供する、ヒトアクセプターフレームワークのための必要性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００４／０１６７４０号
【特許文献２】国際公開第２００８／１４４７５７号
【特許文献２】国際公開第２００５／０１６９５０号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
品質管理（ＱＣ）アッセイ（ＷＯ０１４８０１７及びＡｕｆ  ｄｅｒ  Ｍａｕｒ  ｅｔ  ａｌ（２００１），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５０８，ｐ．４０７−４１２中で開示されるような）によって同定された高度に可溶性及び安定性のあるヒト抗体フレームワークが、他の非ヒト動物種からのＣＤＲ（例えばウサギＣＤＲ）の順応のために特に好適であることが意外にも見出された。したがって、第１の態様において、本発明は、ジスルフィド架橋がＣＤＲ中に存在するかどうかに非依存的に、異なる結合特異性の多様な抗体からの（特にウサギ抗体からの）ＣＤＲのためのアクセプターとして特に適切な特定のヒト抗体の重鎖可変領域（いわゆる「ａ７２」ＶＨフレームワーク配列）を提供する。
【００１０】
この高度に適合性のある可変的な鎖フレームワークの中へのウサギＣＤＲのグラフトによって一貫かつ確実に生成されるヒト化免疫結合物は、ドナーＣＤＲが由来するウサギ抗体の空間的方向性を保持する。したがって、ドナー免疫結合物の構造的に関連する位置をアクセプターフレームワークの中へ導入する必要はない。これらの長所に起因して、結合能力の至適化がほとんどないかまたはないウサギ抗体のハイスループットヒト化を達成することができる。
【００１１】
したがって、別の態様において、本発明は、ウサギ及び他の非ヒトＣＤＲを本明細書において開示されるヒト抗体フレームワーク配列の可溶性及び安定性のある軽鎖及び／または重鎖の中へグラフトし、それによって優れた生物物理的特性を備えたヒト化抗体を生成する方法を提供する。特に、本発明の方法によって生成された免疫結合物は優れた機能的特性（可溶性及び安定性等）を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ウサギモノクローナル抗体からの抗原結合部位を高度に可溶性及び安定性のあるヒト抗体フレームワークの中へグラフトするための本明細書において使用されるＣＤＲ  Ｈ１の定義を図示する。
【図２】Ｋａｂａｔのデータベースから抽出されたウサギ抗体配列の分析により、典型的には可変重鎖のＣＤＲ３はそのマウスカウンターパートよりも３アミノ酸長いことが確認される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
本発明をより容易に理解するために、特定の用語を以下の通り定義する。追加の定義は「発明の概要」を通して説明される。
【００１４】
「抗体」という用語は抗体全体及び任意の抗原結合断片を指す。「抗原結合ポリペプチド」及び「免疫結合物」という用語は本明細書において同時に使用される。「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む、任意で糖鎖付加されるタンパク質またはその抗原結合部分を指す。各々の重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨと本明細書において省略される）及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）からなる。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬと本明細書において省略される）及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は１つのドメイン（ＣＬ）からなる。ＶＨ及びＶＬの領域は、より保存された領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と称される）が散在する超可変性の領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される）へとさらに細分することができる。各々のＶＨ及びＶＬは、以下の順序、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端までアレンジされる３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
【００１５】
抗体の「抗原結合部分」（または単純に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えばＴＮＦ）に特異的に結合する能力を保持する、１つまたは複数の抗体の断片を指す。全長抗体の断片によって抗体の抗原結合機能を実行することができることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから成る一価断片）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を含む二価断片）；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１のドメインから成るＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単腕のＶＬ及びＶＨのドメインから成るＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインから成る、単一ドメインまたはｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）または（ｖｉｉ）合成リンカーによって任意で連結することができる２つ以上の単離されたＣＤＲの組み合わせが含まれる。さらに、Ｆｖ断片（ＶＬ及びＶＨ）の２つのドメインは分離した遺伝子によってコードされるが、ＶＬ及びＶＨの領域がペアになって一価分子を形成する単一タンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えばＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３）を参照）として作製されることを可能にする合成リンカーによって、組換え法を使用して、連結することができる。かかる単一の鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含されることが意図される。これらの抗体断片は当業者に公知の従来の技法を使用して得られ、断片はインタクトな抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組み換えＤＮＡ技法またはインタクトな免疫グロブリンの酵素切断もしくは化学切断によって生産することができる。抗体は、異なるアイソタイプ、例えばＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体であり得る。
【００１６】
「免疫結合物」という用語は、免疫結合物が標的の抗原を特異的に認識するように、抗体の抗原結合部位のすべてまたは一部（例えば重鎖及び／または軽鎖の可変ドメインのすべてまたは一部）を含有する分子を指す。免疫結合物の非限定的例には、全長免疫グロブリン分子及びｓｃＦｖに加えて、（ｉ）Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから成る一価断片）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を含む二価断片）；（ｉｉｉ）Ｆａｂ’断片（本質的にはヒンジ領域の一部を備えたＦａｂ）（ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｐａｕｌ  ｅｄ．，３．ｓｕｐ．ｒｄ  ｅｄ．１９９３））を参照）；（ｉｖ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片；（ｖ）抗体の単腕のＶＬ及びＶＨのドメインから成るＦｖ断片、（ｖｉ）単一ドメイン抗体（ＶＨまたはＶＬドメインから成るＤａｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）、ラクダ科からの抗体（Ｃａｍｅｌｉｄ）（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）及びＤｕｍｏｕｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１：５００−５１５（２００２）を参照）、またはサメ抗体（例えばサメＩｇ−ＮＡＲナノボディ（登録商標））等）；及び（ｖｉｉ）ナノボディ（単一の可変ドメインを含有する重鎖可変領域及び２つの定常ドメイン）を含むが、これらに限定されない抗体断片が含まれる。
【００１７】
「単一鎖抗体」、「単一鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」という用語は、リンカーによって接続された抗体重鎖可変ドメイン（または領域；ＶＨ）及び抗体軽鎖可変ドメイン（または領域；ＶＬ）を含む分子を指す。かかるｓｃＦｖ分子は、以下の一般構造、ＮＨ２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨまたはＮＨ２−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＯＯＨを有することができる。適切な最先端技術のリンカーは反復ＧＧＧＧＳアミノ酸配列またはそのバリアントから成る。本発明の好ましい実施形態において、配列番号：８中で記載されるアミノ酸配列の（ＧＧＧＧＳ）４リンカーが使用されるが、１〜３の反復のバリアントも可能である（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８）。本発明のために使用することができる他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：７２５−７３１、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：９４−１０６、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３０５５−３０６１、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：４１−５６及びＲｏｏｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌによって記述される。
【００１８】
本明細書において使用されるとき、「機能的特性」という用語は、例えば、ポリペプチドの製造特性または治療有効性を改善するために、改善（例えば従来のポリペプチドと比較して）が、当業者に所望される及び／または有利であるポリペプチド（例えば免疫結合物）の特性である。一実施形態において、機能的特性は安定性（例えば熱安定性）である。別の実施形態において、機能的特性は可溶性（例えば細胞条件下で）である。さらに別の実施形態において、機能的特性は凝集挙動である。さらになお別の実施形態において、機能的特性はタンパク質発現（例えば原核生物細胞中の）である。さらに別の実施形態において、機能的特性は製造プロセスにおける封入体可溶化に続く再折畳み挙動である。特定の実施形態において、機能的特性は抗原結合親和性における改善ではない。別の好ましい実施形態において、１つまたは複数の機能的特性の改善は免疫結合物の結合親和性に対する実質的効果を有していない。
【００１９】
「ＣＤＲ」という用語は、主に抗原結合に寄与する抗体の可変ドメイン内の６つの超可変領域のうちの１つを指す。６つのＣＤＲについての最も一般的には使用される定義の１つは、Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２によって提供された。本明細書において使用される時、ＫａｂａｔのＣＤＲの定義は、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、ＣＤＲ  Ｌ３またはＬ１、Ｌ２、Ｌ３）に加えて、重鎖可変ドメインのＣＤＲ２及びＣＤＲ３（ＣＤＲ  Ｈ２、ＣＤＲ  Ｈ３またはＨ２、Ｈ３）についてだけ適用される。しかしながら本明細書において使用される時、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１（ＣＤＲ  Ｈ１またはＨ１）は、位置２６で開始し位置３６の前に終了する残基位置（Ｋａｂａｔのナンバリング）によって定義される。この定義は、基本的にＫａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａによって異なって定義されるようなＣＤＲ  Ｈ１の融合である（図示については図１も参照）。
【００２０】
本明細書において使用される時、「抗体フレームワーク」という用語は、この可変ドメインの抗原結合ループ（ＣＤＲ）のためにスキャフォールドとして役立つ可変ドメイン（ＶＬまたはＶＨのいずれか）の一部を指す。基本的には、それはＣＤＲなしの可変ドメインである。
【００２１】
「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原上の部位（例えばＴＮＦ分子上の特異的部位）を指す。エピトープは典型的には独特の空間的なコンフォメーションで少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５の連続または非連続のアミノ酸を含む。例えばＥｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照されたい。
【００２２】
「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」及び「特異的に結合する」という用語は、既定の抗原上のエピトープへの抗体の結合を指す。典型的には、抗体は、およそ１０−７Ｍ未満（およそ１０−８Ｍ、１０−９Ｍもしくは１０−１０Ｍ未満またはさらに低い等）の親和性（ＫＤ）で結合する。
【００２３】
「ＫＤ」または「Ｋｄ」という用語は特定の抗体−抗原相互作用の持続的な解離平衡を指す。典型的には、本発明の抗体は、例えばＢＩＡＣＯＲＥ装置において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して決定されるように、およそ１０−７Ｍ未満（およそ１０−８Ｍ、１０−９Ｍもしくは１０−１０Ｍ未満またはさらに低い等）の解離平衡定数（ＫＤ）でＴＮＦに結合する。
【００２４】
本明細書において使用されるとき、「核酸分子」という用語はＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を指す。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。別の核酸配列と機能的関係へと配置される場合、核酸は「作動可能に連結される」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーが配列の転写に影響するならば、コード配列に作動可能に連結される。
【００２５】
「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。一実施形態において、ベクターは「プラスミド」であり、追加のＤＮＡセグメントをライゲーションできる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の実施形態において、ベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムの中へライゲーションできる。本明細書において開示されるベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自律複製が可能であり得るか（例えば細菌複製起点を有する細菌ベクター、及びエピソーム哺乳類ベクター）、または宿主細胞の中への導入に際して宿主細胞のゲノムの中へ組み込むことができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）。
【００２６】
「宿主細胞」という用語は、発現ベクターが導入される細胞を指す。宿主細胞には、細菌細胞、微生物細胞、植物細胞または動物細胞、好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣株）細胞またはＮＳ0細胞が含まれる。
【００２７】
「ウサギ目の動物」という用語は、科Ｌｅｐｏｒｉｄａｅ（例えば野ウサギ及びウサギ）及びＯｃｈｏｔｏｎｉｄａｅ（ナキウサギ）を含む分類学上の目Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａのメンバーを指す。最も好ましい実施形態において、ウサギ目の動物はウサギである。本明細書において使用される時、「ウサギ」という用語はＬｅｐｏｒｉｄａｅ科に属する動物を指す。
【００２８】
本明細書において使用されるとき、「同一性」は、２つのポリペプチド、分子または核酸の間の配列マッチングを指す。２つの比較される配列の両方中の位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占められる場合（例えば各々の２つのポリペプチド中の位置がリジンによって占められるならば）、その時それぞれの分子はその位置で同一である。２つの配列の間の「パーセンテージ同一性」は、２つの配列の最適なアライメントのために導入される必要のあるギャップの数及び各々のギャップの長さを考慮に入れて、配列が共有する同一の位置の数の関数である。一般的に、２つの配列がアライメントされる場合に最大の同一性を与えるように比較される。かかるアライメントは、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップウェイト及び１、２、３、４、５または６の長さウェイトを使用して、例えばＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰのプログラムの中へ組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））アルゴリズムの方法を使用して提供することができる。
【００２９】
特別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される同じ意味を有する。本発明の実践または試験において、本明細書において記述されたものに類似または同等の方法及び材料を使用することができるが、適切な方法及び材料が下記に述べられる。矛盾する事例において、定義を含む本明細書が優先されるだろう。加えて、材料、方法、及び例は、単に説明的なものであり、限定を意図したものではない。
【００３０】
本発明の様々な態様を以下のサブセクション中でさらに詳細に記載する。様々な実施形態、優先性及び範囲が随意に組み合わせられることが理解される。さらに、特異的実施形態に応じて、選択された定義、実施形態または範囲を適用しなくてもよい。
【００３１】
特別に明示されないならば、アミノ酸位置はＡＨｏナンバリングスキームに従って示される。ＡＨｏナンバリングシステムは、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，Ａ．ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（２００１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０中でさらに記載されている。あるいは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）中でさらに記載されるようなＫａｂａｔナンバリングシステムを使用することができる。抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域中のアミノ酸残基位置の同定に使用される、２つの異なるナンバリングシステムについての換算表は、Ａ．Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９（２００１）６５７−６７０中で提供される。
【００３２】
第１の態様において、本発明は、ウサギ目の動物種（例えばウサギ）からのＣＤＲのグラフトのためのヒトアクセプターフレームワーク配列を提供する。ヒト一本鎖ＶＨフレームワークａ７２（配列番号：１）は、意外にもウサギ抗体の抗原結合部位と基本的には非常に適合性のあることが見出された。したがって、ａ７２  ＶＨは、ウサギループのグラフトに由来した安定性のあるヒト化ｓｃＦｖ抗体断片の構築に適切なスキャフォールドを表わす。
【００３３】
したがって、一態様において、本発明は、配列番号：１と少なくとも７０％の同一性を有するＶＨ配列を含む免疫結合物アクセプターフレームワークを提供する。
【００３４】
前記配列は他の適切な可変軽鎖と組み合わせることができる。好ましい可変軽鎖は、ＷＯ０３／０９７６９７中で開示されＫＩ２７と表記される配列番号：２、またはＷＯ０３／０９７６９７中で開示されるような他のＶＬ配列である。
【００３５】
好ましい実施形態において、可変重鎖フレームワークはリンカー経由で可変軽鎖フレームワークに連結される。リンカーは、任意の適切なリンカー、例えば配列ＧＧＧＧＳ（配列番号：５）の１〜４の反復を含むリンカー、好ましくは（ＧＧＧＧＳ）４ペプチド（配列番号：４）、またはＡｌｆｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：７２５−７３１中で開示されるようなリンカーであり得る。
【００３６】
したがって、本発明は、
（ｉ）配列番号：１と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖フレームワーク；及び／または
（ｉｉ）配列番号：２と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖フレームワーク
を含む、免疫結合物アクセプターフレームワークを提供する。
【００３７】
より好ましい実施形態において、本発明は、配列番号：３と少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の同一性を備えた配列を有する免疫結合物を提供する。
【００３８】
フレームワークは実質的には任意のウサギＣＤＲと適合性がある。異なるウサギＣＤＲを含有しても、ウサギ野生型一本鎖とは異なって良好に発現され良好に生産され、もとのドナーウサギ抗体の親和性をほとんど完全に保持する。
【００３９】
本明細書において記載されるような免疫結合物アクセプターフレームワークは、重鎖フレームワーク中の好ましくは位置１２、１０３及び１４４（ＡＨｏナンバリング）で、可溶性を促進する置換を含むことができる。好ましくは、疎水性アミノ酸はより親水性のアミノ酸によって置換される。親水性アミノ酸は、例えばアルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）及びスレオニン（Ｔ）である。より好ましくは、重鎖フレームワークは、（ａ）位置１２でのセリン（Ｓ）；（ｂ）位置１０３でのセリン（Ｓ）もしくはスレオニン（Ｔ）及び／または（ｃ）位置１４４でのセリン（Ｓ）もしくはスレオニン（Ｔ）を含む。
【００４０】
さらに、安定性を促進するアミノ酸は、可変軽鎖フレームワークの１つまたは複数の位置１、３、４、１０、４７、５７、９１及び１０３（ＡＨｏナンバリング）で存在し得る。より好ましくは、可変軽鎖フレームワークは、位置１でのグルタミン酸（Ｅ）、位置３でのバリン（Ｖ）、位置４でのロイシン（Ｌ）、位置１０でのセリン（Ｓ）；位置４７でのアルギニン（Ｒ）、位置５７でのセリン（Ｓ）、位置９１でのフェニルアラニン（Ｆ）及び／または位置１０３でのバリン（Ｖ）を含む。
【００４１】
グルタミン（Ｑ）は脱アミノ化（ｄｅｓａｍｉｎａｔｉｏｎ）の傾向があるので、別の好ましい実施形態において、ＶＨは位置１４１でのグリシン（Ｇ）を含む。この置換は、タンパク質の長期保存を改善し得る。
【００４２】
例えば、本明細書において開示されるアクセプターフレームワークを使用して、非ヒトＣＤＲが由来する非ヒト抗体の結合特性を保持するヒト抗体またはヒト化抗体を生成することができる。したがって、好ましい実施形態において、本発明は、ドナー免疫結合物、好ましくは哺乳類免疫結合物、より好ましくはウサギ目の動物免疫結合物、及び最も好ましくはウサギからの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ならびに／または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をさらに含む、本明細書において開示されるような免疫結合物アクセプターフレームワークを包含する。したがって、一実施形態において、本発明は、
（ｉ）ウサギ目の動物の可変軽鎖ＣＤＲ；及び
（ｉｉ）配列番号：１と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％及び最も好ましくは１００％の同一性を有するヒト可変重鎖フレームワーク
を含む、所望される抗原に特異的な免疫結合物を提供する。
【００４３】
好ましくは、ウサギ目の動物はウサギである。より好ましくは、免疫結合物は、ドナー免疫結合物からの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。
【００４４】
当技術分野において公知であるように、多くのウサギＶＨ鎖はマウス及びヒトのカウンターパートと比較して余剰のペアのシステインを有する。ｃｙｓ２２とｃｙｓ９２との間に形成される保存されたジスルフィド架橋に加えて、ｃｙｓ２１−ｃｙｓ７９架橋、そしていくつかのウサギ鎖においてＣＤＲ  Ｈ１の最後の残基とＣＤＲ  Ｈ２の第１の残基との間に形成されるＣＤＲ間Ｓ−Ｓ架橋もある。その他に、ＣＤＲ−Ｌ３中のペアのシステイン残基は多くの場合見出される。その他に、多くのウサギ抗体ＣＤＲは任意の従来公知の標準構造に属さない。特にＣＤＲ−Ｌ３は、大抵の場合ヒトまたはマウスのカウンターパートのＣＤＲ−Ｌ３よりもはるかに長い。
【００４５】
先に述べたように、本明細書において開示されるフレームワーク上への非ヒトＣＤＲのグラフトは、ＣＤＲが適切なコンフォメーションで提示される分子をもたらす。必要ならば、免疫結合物の親和性は、非ヒトドナー免疫結合物の抗原と相互作用するフレームワーク残基のグラフトによって改善することができる。これらの位置は、例えば、
（ｉ）それぞれの生殖系列先祖配列を同定すること、または代わりに、高度に相同なフレームワーク配列の事例においてコンセンサス配列を使用すること；
（ｉｉ）生殖系列先祖配列または工程（ｉ）のコンセンサス配列とドナー可変ドメイン配列の配列アラインメントを生成すること；及び
（ｉｉｉ）異なる残基を同定すること
によって同定することができる。
【００４６】
分子の表面上の異なる残基は、多くの事例において、インビボの親和性生成プロセスの間に変異して、おそらく抗原に対する親和性を生成する。
【００４７】
別の態様において、本発明は、本明細書において記述される免疫結合物アクセプターフレームワークを含む免疫結合物を提供する。前記免疫結合物は、例えばｓｃＦｖ抗体、全長免疫グロブリン、Ｆａｂ断片、Ｄａｂまたはナノボディであり得る。
【００４８】
好ましい実施形態において、免疫結合物は、１つまたは複数の分子、例えば治療用薬剤（細胞毒性剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子または他のシグナリング分子等）、イメージング剤、または第２のタンパク質（転写活性化因子またはＤＮＡ結合性のドメイン等）に付加される。
【００４９】
本明細書において開示されるような免疫結合物は、例えば診断用適用、治療用適用、標的の検証または遺伝子療法において使用することができる。
【００５０】
本発明は、本明細書において開示される免疫結合物アクセプターフレームワークまたは本明細書において開示されるような免疫結合物（複数可）をコードする単離核酸をさらに提供する。
【００５１】
別の実施形態において、本明細書において開示される核酸を含むベクターが提供される。
【００５２】
本明細書において開示されるような核酸またはベクターは例えば遺伝子療法において使用することができる。
【００５３】
本発明は、本明細書において開示されるベクター及び／または核酸を含む宿主細胞をさらに包含する。
【００５４】
さらに、組成物は、本明細書において開示されるような免疫結合物アクセプターフレームワーク、本明細書において開示されるような免疫結合物、本明細書において開示されるような単離核酸、または本明細書において開示されるようなベクターを含んで提供される。
【００５５】
本明細書において開示される配列は以下の通りである（Ｘ残基はＣＤＲ挿入部位であり、少なくとも３〜５０までのアミノ酸を含有する）。
【００５６】
配列番号：１：可変重鎖フレームワークａ７２
ＥＶＱＬＶＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＧＶＳ（Ｘ）ｎ＝３−５０ＷＩＲＱＨＰＶＫＧＬＥＷＩＧ（Ｘ）ｎ＝３−５０  ＲＬＴＩＳＶＤＴＳＫＴＱＶＳＬＮＬＲＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（Ｘ）ｎ＝３−５０  ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
【００５７】
配列番号：２：可変軽鎖フレームワークＫＩ２７
ＥＩＶＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＩＩＴＣ（Ｘ）ｎ＝３−５０  ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（Ｘ）ｎ＝３−５０  ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＡＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣ（Ｘ）ｎ＝３−５０  ＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬＧ
【００５８】
配列番号：３：フレームワーク配列
ＥＩＶＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＩＩＴＣ（Ｘ）ｎ＝３−５０  ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（Ｘ）ｎ＝３−５０  ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＡＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣ（Ｘ）ｎ＝３−５０ＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＧＶＳ（Ｘ）ｎ＝３−５０ＷＩＲＱＨＰＶＫＧＬＥＷＩＧ（Ｘ）ｎ＝３−５０  ＲＬＴＩＳＶＤＴＳＫＴＱＶＳＬＮＬＲＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（Ｘ）ｎ＝３−５０  ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
【００５９】
配列番号：４：リンカー
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
【００６０】
別の態様において、本発明は、安定性及び可溶性のある抗体フレームワークの上へ非ヒトドナー抗体のＣＤＲをグラフトすることによって、非ヒト抗体のヒト化のための方法を提供する。特に好ましい実施形態において、ＣＤＲはウサギ抗体から生じ、フレームワークは上記のものである。
【００６１】
米国特許第５，２２５，５３９号中でＷｉｎｔｅｒ及びＷＯ９００７８６１Ａ１中でＱｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（それらの全体は参照として本明細書に援用される）によって、ヒトアクセプターフレームワークの中へＣＤＲをグラフトする一般的な方法が開示されている。ウサギモノクローナル抗体からのＣＤＲを選択されたフレームワークの上へグラフトするための一般的な戦略はＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．及びＱｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．の戦略に関連するが、特定の鍵となる点で異なる。特に、本発明の方法は、本明細書において開示されるようなヒト抗体フレームワークがヒトまたは非ヒトのドナー抗体のためのアクセプターとして特に適切であるという点で、当技術分野において公知の典型的なＷｉｎｔｅｒ及びＱｕｅｅｎ方法論とは異なる。したがって、Ｗｉｎｔｅｒ及びＱｕｅｅｎの一般的な方法とは異なり、本発明のヒト化方法のために使用されたフレームワーク配列は、必ずしもドナーＣＤＲが由来する非ヒト（例えばウサギ）抗体の配列に最大の配列類似性を示すフレームワーク配列ではない。加えて、ＣＤＲコンフォメーションを支持するためにドナー配列からフレームワーク残基をグラフトすることは要求されない。多くとも、フレームワーク中に位置する抗原結合アミノ酸または体細胞超変異の間に起こった他の変異を導入することができる。
【００６２】
高い可溶性及び安定性を備えたヒト化したウサギ由来抗体を生成するグラフト方法の特定の詳細について下記に述べる。
【００６３】
本発明の方法の例示的な実施形態において、ＣＤＲドナー抗体のアミノ酸配列を最初に同定し、配列を従来の配列アラインメントツール（例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム及びＢｌｏｓｓｕｍマトリックス）を使用してアライメントさせる。ギャップの導入及び残基位置の命名は従来の抗体ナンバリングシステムを使用して行うことができる。例えば、免疫グロブリン可変ドメインのためのＡＨｏナンバリングシステムを使用することができる。抗体中の残基のナンバリングのために最も広く採用される基準であるので、Ｋａｂａｔのナンバリングスキームも適用することができる。Ｋａｂａｔのナンバリングは、例えばＳＵＢＩＭプログラムを使用して割り当てることができる。このプログラムは、Ｋａｂａｔ及び共同研究者（Ｄｅｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ  １９９５）によって確立されたシステムに従って抗体配列の可変領域を分析し配列をナンバリングする。フレームワーク及びＣＤＲの領域の定義は、配列可変性に基づき最も一般的に使用されるＫａｂａｔの定義に従って、一般的には行われる。しかしながら、ＣＤＲ−Ｈ１については、表記は、好ましくはＫａｂａｔの定義、抗体と抗原との間の接触の３次元の複合体構造のサブセットの分析によって生成された平均接触データ（ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、及び構造的ループ領域の位置に基づくＣｈｏｔｉａの定義の組み合わせである（図１も参照）。抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域中のアミノ酸残基位置の同定に使用される、２つの異なるナンバリングシステムについての換算表は、Ａ．Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９（２００１）６５７−６７０中で提供される。Ｋａｂａｔのナンバリングシステムは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）中にさらに記載されている。ＡＨｏナンバリングシステムは、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，Ａ．ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（２００１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０中でさらに記載されている。
【００６４】
ウサギモノクローナル抗体の可変ドメインは、例えばヒト抗体レパートリーの分析に基づいた配列分析アルゴリズム及び分類方法のＥＸＣＥＬ実装を使用して、例えば対応するヒトサブグループへと分類することができる（Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．Ｆｅｂ  １１；２９６（１）：５７−８６）。
【００６５】
ＣＤＲコンフォメーションをドナー抗原結合領域に割り当てることができ、続いて異なる正準構造の維持に要求される残基位置も同定することができる。ウサギ抗体の６つの抗体超可変領域のうちの５つについてのＣＤＲ正準構造（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１及びＨ２）はＣｈｏｔｈｉａ（１９８９）の定義を使用して決定される。
【００６６】
本発明の抗体をさらに至適化して、促進された機能的特性（例えば促進された可溶性及び／または安定性）を示すことができる。特定の実施形態において、本発明の抗体は、２００８年３月１２日に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００１９５８号、発明の名称「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（参照として本明細書に援用される）中で開示された「機能的なコンセンサス」方法論に従って至適化される。
【００６７】
置換のための例示的なフレームワーク残基位置及び例示的なフレームワーク置換は、２００８年６月２５日に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＣＨ２００８／０００２８５号、発明の名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａｎｄ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」、及び２００８年６月２５日に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＣＨ２００８／０００２８４号、発明の名称「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」中で記載される。
【００６８】
他の実施形態において、本発明の免疫結合物は、２００８年６月２５日に出願された米国仮出願第６１／０７５，６９２号、発明の名称「Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｅｒｓ」中で記載される、安定性促進変異のうちの１つまたは複数を含む。特定の好ましい実施形態において、免疫結合物は、１２、１０３及び１４４（従来のＡＨｏナンバリング）からなる重鎖アミノ酸位置の群から選択されるアミノ酸位置での可溶性促進変異を含む。１つの好ましい実施形態において、免疫結合物は、（ａ）重鎖アミノ酸位置１２でのセリン（Ｓ）；（ｂ）重鎖アミノ酸位置１０３でのセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）；及び（ｃ）重鎖アミノ酸位置１４４でのセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）からなる群から選択される１つまたは複数の置換を含む。別の実施形態において、免疫結合物は、以下の置換、（ａ）重鎖アミノ酸位置１２でのセリン（Ｓ）；（ｂ）重鎖アミノ酸位置１０３でのセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）；及び（ｃ）重鎖アミノ酸位置１４４でのセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）を含む。
【００６９】
特定の好ましい実施形態において、免疫結合物は、ＡＨｏナンバリングシステムに従う軽鎖可変領域の位置１、３、４、１０、４７、５７、９１及び１０３のうちの少なくとも１つ中の軽鎖アクセプターフレームワークのフレームワーク残基で、安定性促進変異を含む。好ましい実施形態において、軽鎖アクセプターフレームワークは、（ａ）位置１でのグルタミン酸（Ｅ）、（ｂ）位置３でのバリン（Ｖ）、（ｃ）位置４でのロイシン（Ｌ）；（ｄ）位置１０でのセリン（Ｓ）；（ｅ）位置４７でのアルギニン（Ｒ）；（ｅ）位置５７でのセリン（Ｓ）；（ｆ）位置９１でのフェニルアラニン（Ｆ）；及び（ｇ）位置１０３でのバリン（Ｖ）からなる群から選択される１つまたは複数の置換を含む。
【００７０】
上述のような変異を含むヒト化抗体を生産する多様な利用可能な方法のうちのいずれかを使用することができる。
【００７１】
したがって、本発明は、本明細書において記述された方法に従ってヒト化された免疫結合物を提供する。
【００７２】
特定の好ましい実施形態において、前記免疫結合物の標的抗原はＶＥＧＦまたはＴＮＦαである。
【００７３】
本発明中で記載されるポリペプチドまたは本発明の方法によって生成されるポリペプチドは、例えば当技術分野において公知の技法を使用して合成することができる。あるいは、所望される可変領域をコードする核酸分子は合成することができ、ポリペプチドは組換え法によって生産される。
【００７４】
例えば、一旦ヒト化可変領域の配列が決められたならば、その可変領域またはそれを含むポリペプチドは分子生物学の技術分野における周知の技法によって作製することができる。より具体的には、組み換えＤＮＡ技法を使用して、核酸配列（例えば所望される可変領域（例えば修飾された重鎖または軽鎖；その可変ドメイン、またはその他の抗原結合断片）をコードするＤＮＡ配列）による宿主細胞の形質転換によって、広範囲のポリペプチドを生産することができる。
【００７５】
一実施形態において、少なくともＶＨまたはＶＬをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されるプロモーターを含む発現ベクターを調製することができる。必要であるかまたは所望されるならば、相補的な可変ドメインをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されるプロモーターを含む第２の発現ベクターを調製することができる（すなわち、親発現ベクターがＶＨをコードする場合、第２の発現ベクターはＶＬをコードし、その逆も成立する）。次いで細胞株（例えば不死化哺乳類細胞株）を、１つまたは両方の発現ベクターで形質転換し、キメラ可変ドメインまたはキメラ抗体の発現を可能にする条件下で培養することができる（例えばＮｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ．ａｌ．に帰属する国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ８５／００３９２号を参照されたい）。
【００７６】
一実施形態において、ドナーＣＤＲ及びアクセプターＦＲのアミノ酸配列を含む可変領域を作製することができ、次いで変化を核酸分子の中へ導入してＣＤＲアミノ酸置換を達成する。
【００７７】
ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントをコードする核酸分子の作製のための例示的な当技術分野で認められている方法には、部位特異的（またはオリゴヌクレオチド媒介性）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、及びポリペプチドをコードする先に調製されたＤＮＡのカセット式変異誘発による調製が含まれるが、これらに限定されない。
【００７８】
部位特異的変異誘発は置換バリアントを調製する好ましい方法である。この技法は当技術分野において周知である（例えばＣａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３（１９８５）、Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８（１９８７）を参照されたい）。簡潔には、ＤＮＡの部位特異的変異誘発の実行において、親ＤＮＡは、所望される変異をコードするオリゴヌクレオチドをかかる親ＤＮＡの単一ストランドへ最初にハイブリダイズすることによって変更される。ハイブリダイゼーション後に、ＤＮＡポリメラーゼを使用し、プライマーとしてハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドを使用し、テンプレートとして親ＤＮＡの単一ストランドを使用して、第２のストランド全体を合成する。したがって、所望される変異をコードするオリゴヌクレオチドが、生じた二本鎖ＤＮＡ中に取り込まれる。
【００７９】
ＰＣＲ変異誘発もポリペプチドのアミノ酸配列バリアントの作製に好適である。ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１７７−１８３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０）；ａｎｄ  Ｖａｌｌｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７２３−７３３（１９８９）中のＨｉｇｕｃｈｉを参照されたい。簡潔には、少量のテンプレートＤＮＡがＰＣＲにおける出発材料として使用される場合、テンプレートＤＮＡ中の対応する領域とわずかに配列で異なるプライマーを使用して、プライマーがテンプレートとは異なる位置でのみテンプレート配列と異なる比較的大量の特異的ＤＮＡ断片を生成することができる。
【００８０】
バリアントを調製する別の方法（カセット式変異誘発）はＷｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３（１９８５）によって記述された技法に基づく。出発材料は変異させるＤＮＡを含むプラスミド（または他のベクター）である。変異させる親ＤＮＡ中のコドン（複数可）を同定する。同定された変異部位（複数可）の各サイド上にユニークな制限酵素部位がなくてはならない。かかる制限部位が存在しないならば、ポリペプチドをコードするＤＮＡ中の適切な位置でそれらを導入する上述のオリゴヌクレオチド媒介性変異誘発方法を使用して、それらを生成することができる。プラスミドＤＮＡをこれらの部位で切断して直線化する。制限部位の間のＤＮＡの配列をコードするが所望される変異（複数可）を含有する二本鎖オリゴヌクレオチドを、標準的な手順（オリゴヌクレオチドの２つのストランドを別々に合成し、次いで標準的な技法を使用してともにハイブリダイズする）を使用して合成する。この二本鎖オリゴヌクレオチドはカセットと称される。このカセットは線状化プラスミドの末端と適合性のある５’末端及び３’末端を有するようにデザインされ、その結果プラスミドへ直接ライゲーションすることができる。このプラスミドはここで変異させたＤＮＡ配列を含有する。
【００８１】
本発明の方法によって生成された可変領域をリモデルしさらに変更して、さらに抗原結合を増加させることができる。したがって、追加の工程（例えば親和性成熟が含まれる）は上記の工程に先行または後続し得る。加えて、経験的な結合データはさらなる至適化のために使用することができる。
【００８２】
アミノ酸置換の他に、本発明は、変更されたエフェクター機能を備えたＦｃ領域バリアントを生成するために、例えばＦｃ領域アミノ酸配列への他の修飾を企図する。例えば、ＦｃＲに結合を減少または促進するために、Ｆｃ領域の１つまたは複数のアミノ酸残基を削除することができる。一実施形態において、Ｆｃ領域残基のうちの１つまたは複数はかかるＦｃ領域バリアントを生成するために修飾することができる。一般的に、１〜約１０のＦｃ領域残基は本発明のこの実施形態に従って削除されるだろう。１つまたは複数アミノ酸欠失を含む本明細書におけるＦｃ領域は、好ましくは出発のＦｃ領域またはヒトＦｃ領域の天然の配列の少なくとも約８０％及び好ましくは少なくとも約９０％及び最も好ましくは少なくとも約９５％を保持するだろう。
【００８３】
一実施形態において、本発明中で記載されるポリペプチドまたは本発明の方法によって生成されるポリペプチド（例えばヒト化Ｉｇ可変領域及び／またはヒト化Ｉｇ可変領域を含むポリペプチド）は、組換え法によって生産することができる。例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、組換え発現のために好適な発現ベクター中に挿入することができる。ポリペプチドが抗体である場合、追加の軽鎖及び重鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチド（任意で定常領域に連結される）は、同じまたは異なる発現ベクターの中へ挿入することができる。親和性タグ配列（例えばＨｉｓ（６）タグ）を、後続の精製を促進するためにポリペプチド配列内に任意で付加または含み得る。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を保証する発現ベクター中の制御配列へ作動可能に連結される。発現制御配列には、プロモーター（例えば天然に結び付いたプロモーターまたは異種プロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメント及び転写終結配列が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションすることができるベクターにおける真核生物プロモーターシステムである。一旦、ベクターが適切な宿主の中へ取り込まれたならば、宿主はヌクレオチド配列の高レベル発現ならびにポリペプチドの収集及び精製のために好適な条件下で維持される。
【００８４】
これらの発現ベクターは、典型的には、エピソームとしてまたは宿主染色体ＤＮＡの組込み部分として宿主生物中で複製可能である。一般的には、発現ベクターは選択マーカー（例えばアンピシリン抵抗性、ハイグロマイシン抵抗性、テトラサイクリン耐性またはネオマイシン抵抗性）を含有して、所望されるＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にする（例えば米国特許第４，７０４，３６２号を参照）。
【００８５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、本発明のポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ配列）のクローン化のために特に有用な１つの原核生物宿主である。使用のために好適な他の微生物宿主には桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓ等）及び他の腸内細菌科（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種、Ｓｅｒｒａｔｉａ種及び様々なＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種等）が含まれる。
【００８６】
他の微生物（酵母等）も発現のために有用である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ及びＰｉｃｈｉａは、所望に応じて発現制御配列（例えばプロモーター）、複製起点、終止配列及び同種のものを有する適切なベクターがある、例示的な酵母宿主である。典型的なプロモーターには３−ホスホグリセレートキナーゼ及び他の解糖系酵素のものが含まれる。誘導可能な酵母プロモーターには、とりわけ、アルコール脱水素酵素、イソシトクロムＣ、ならびにメタノール、マルトース及びガラクトース利用に関与する酵素からのプロモーターが含まれる。
【００８７】
本発明の範囲内で大腸菌及び出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は好ましい宿主細胞である。
【００８８】
微生物に加えて、哺乳類組織培養も使用して本発明のポリペプチド（例えば免疫グロブリンまたはその断片をコードするポリヌクレオチド）を発現及び生産することができる。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）を参照されたい。異種タンパク質（例えばインタクトな免疫グロブリン）を分泌することができる多数の適切な宿主細胞株が当技術分野において開発されているので、真核細胞は実際に好ましく、ＣＨＯ細胞株、様々なＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ミエローマ細胞株、形質転換されたＢ細胞及びハイブリドーマが含まれる。これらの細胞のための発現ベクターは、発現制御配列（複製起点、プロモーター及びエンハンサー等）（Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））及び必要なプロセッシング情報部位（リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写ターミネーター配列等）を含み得る。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス及び同種のものに由来するプロモーターである。Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照されたい。
【００８９】
対象となるポリヌクレオチド配列（例えば重鎖及び軽鎖のコード配列ならびに発現制御配列）を含有するベクターは、周知の方法（それは細胞宿主のタイプに依存して変動する）によって宿主細胞の中へ移行させることができる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは原核生物細胞のために一般的には利用されるが、リン酸カルシウム処理、電気穿孔、リポフェクション、微粒子銃またはウイルスベースのトランスフェクションを他の細胞宿主のために使用することができる（一般的にはＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，１９８９を参照されたい）。哺乳類細胞を形質転換するために使用される他の方法は、ポリブレン、原形質融合、リポソーム、電気穿孔及び顕微注入の使用を含む（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．前出、を参照されたい）。遺伝子導入動物の生産のために、導入遺伝子を受精卵母細胞の中へ顕微注射することができるか、または胚性幹細胞のゲノムの中へ取り込み、かかる細胞の核を除核卵母細胞の中へ移行させることができる。
【００９０】
被験体ポリペプチドも、遺伝子導入動物のゲノムの中への導入及び後続する発現（例えば遺伝子導入動物の乳汁中の）のために導入遺伝子中に取り込むことができる（例えばＤｅｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．５，７４１，９５７；Ｒｏｓｅｎ  ５，３０４，４８９；及びＭｅａｄｅ  ５，８４９，９９２を参照されたい）。適切な導入遺伝子には、乳腺腺特異的遺伝子（カゼインまたはβラクトグロブリン等）からのプロモーター及びエンハンサーとの作動可能な連結における軽鎖及び／または重鎖のためのコード配列が含まれる。
【００９１】
ポリペプチドは単一ベクターまたは２つのベクターを使用して発現することができる。例えば、抗体の重鎖及び軽鎖は分離した発現ベクター上にクローン化され、細胞の中へ共トランスフェクションすることができる。
【００９２】
一実施形態において、シグナル配列を使用して本発明のポリペプチドの発現を促進することができる。
【００９３】
一旦発現されたならば、ポリペプチドは、硫安分画、アフィニティーカラム（例えばプロテインＡまたはプロテインＧ）、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動及び同種のものが含まれる、当該技術分野の標準的な手順に従って精製することができる（一般的にはＳｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，（１９８２）を参照されたい）。
【００９４】
ヒト化Ｉｇ可変領域またはそれらを含むポリペプチドのいずれかは、培養中の宿主細胞または細胞株によって発現することができる。それらは細胞中でインビボでも発現させることができる。変更された抗体を生産するように形質転換（例えばトランスフェクション）された細胞株は、不死化哺乳類細胞株（リンパ系起源のもの（例えばミエローマ、ハイブリドーマ、トリオーマまたはクアドローマ細胞株）等）であり得る。細胞株には、ウイルス（例えばエプスタインバーウイルス）による形質転換によって不死化された正常リンパ球様細胞（Ｂ細胞等）も含まれ得る。
【００９５】
典型的にはポリペプチドの生産に使用される細胞株は哺乳類細胞株であるが、他の源（細菌及び酵母等）からの細胞株も使用することができる。特に、大腸菌由来細菌株を使用することができる（特に例えばファージディスプレイ）。
【００９６】
いくつかの不死化リンパ球様細胞株（ミエローマ細胞株等）は正常状態において単離されたＩｇの軽鎖または重鎖を分泌する。かかる細胞株が本発明のプロセスの間に調製された変更された抗体を発現するベクターにより形質転換されて、正常に分泌された鎖が以前に調製されたベクターによってコードされたＩｇ鎖の可変ドメインに対して相補的ならば、プロセスの残りの工程を実行することは必要ではないだろう。
【００９７】
不死化細胞株が分泌しないかまたは相補的な鎖を分泌しなければ、細胞の中へ適切な相補的な鎖またはその断片をコードするベクターを導入することが必要だろう。
【００９８】
不死化細胞株が相補的な軽鎖または重鎖を分泌する事例において、例えばベクターにより適切な細菌細胞を形質転換し、次いで不死化細胞株と細菌細胞を縮合することによって（例えばスフェロプラスト融合によって）、形質転換された細胞株を生産することができる。あるいは、ＤＮＡは電気穿孔によって不死化細胞株の中へ直接導入することができる。
【００９９】
一実施形態において、本発明において記載されるようなヒト化Ｉｇ可変領域または本発明の方法によって生成されるヒト化Ｉｇ可変領域は、任意の抗体の抗原結合断片中に存在し得る。断片は組換えにより生産し操作することができるか、合成することができるか、またはタンパク質分解酵素による抗体の消化によって生産することができる。例えば、断片はＦａｂ断片であり得、パパインによる消化は、鎖間（すなわちＶＨ−ＶＨ）ジスルフィド結合（それは２つの重鎖をつなぐ）の前の領域で抗体を分解する。これは、軽鎖ならびに重鎖のＶＨ及びＣＨ１のドメインを含有する２つの同一の断片の形成を生じる。あるいは、断片はＦ（ａｂ’）２断片であり得る。これらの断片はペプシン（それは鎖間ジスルフィド結合の後の重鎖を切断する）による抗体の消化によって生成することができ、両方の抗原結合部位を含有する断片を生じる。さらに別の代替案は「単一鎖」抗体を使用することである。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片は多様な手法で構築することができる。例えば、ＶＨのＣ末はＶＬのＮ−末に連結することができる。典型的には、リンカー（例えば（ＧＧＧＧＳ）４；配列番号：４）はＶＨとＶＬとの間に設置される。しかしながら、鎖が連結され得る順序は逆にすることができ、検出または精製を促進するタグ（例えば、Ｍｙｃ−タグ、Ｈｉｓ−タグまたはＦＬＡＧ−タグ）を含むことができる（これらのようなタグは任意の抗体または本発明の抗体断片へ添付することができ、それらの使用はｓｃＦｖに限定されない）。したがって、及び以下で指摘されるように、タグ付加抗体は本発明の範囲内である。代替の実施形態において、本明細書において記述される抗体または本明細書において記述される方法によって生成される抗体は、重鎖二量体または軽鎖二量体であり得る。なおさらに、抗体の軽鎖もしくは重鎖またはその部分（例えば単一ドメイン抗体（ＤＡｂ））を使用することができる。
【０１００】
別の実施形態において、本発明において記載されるようなヒト化Ｉｇ可変領域または本発明の方法によって生成されるヒト化Ｉｇ可変領域は、単一鎖抗体（ＳｃＦｖ）またはミニボディ中に存在する（例えば米国特許第５，８３７，８２１号またはＷＯ９４／０９８１７Ａ１を参照されたい）。ミニボディは、各々がＳｃＦｖ分子を含む２つのポリペプチド鎖から構成された二量体の分子である（１つまたは複数の抗原結合部位を含む単一ポリペプチド、例えば接続ペプチド経由でＣＨ３ドメインへ融合したＶＨドメインへ柔軟なリンカーによって連結されたＶＬドメイン）。ＳｃＦｖ分子は、ＶＨ−リンカー−ＶＬの方向性またはＶＬ−リンカー−ＶＨの方向性で構築することができる。抗原結合部位を作り上げるＶＬドメイン及びＶＨドメインを連結する柔軟なヒンジは、好ましくは約１０〜約５０アミノ酸残基を含む。この目的のための例示的な接続ペプチドは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３である（Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）．ＰＮＡＳ，８５：５８７９）。他の接続ペプチドは当技術分野において公知である。
【０１０１】
単一鎖抗体を作製する方法は当技術分野において周知である（例えばＨｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｇｅｎｅ，７７：５１；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３；Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０１１７；Ｍｉｌｅｎｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５１：６３６３；Ｔａｋｋｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：８３７）。ミニボディは、当技術分野において記述された方法を使用して、ＳｃＦｖ成分及び接続ペプチド−ＣＨ３成分を構築することによって作製することができる（例えば米国特許５，８３７，８２１またはＷＯ  ９４／０９８１７Ａ１を参照されたい）。これらの成分を制限断片として分離したプラスミドから単離し、次いで適切なベクターの中へライゲーションし、再クローン化することができる。適切なアセンブリーは制限消化及びＤＮＡ配列分析によって検証することができる。一実施形態において、本発明のミニボディは接続ペプチドを含む。一実施形態において、接続ペプチドはＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー、例えばＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧ（配列番号：６）を含む。
【０１０２】
別の実施形態において、四価ミニボディを構築することができる。２つのＳｃＦｖ分子が例えばアミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）４Ｇ３ＡＳ（配列番号：７）を有する柔軟なリンカーを使用して連結されること以外は、四価ミニボディはミニボディと同じ様式で構築することができる。
【０１０３】
別の実施形態において、本発明において記載されるようなヒト化可変領域または本発明の方法によって生成されるヒト化可変領域は、ダイアボディ中に存在し得る。ダイアボディはｓｃＦｖ分子に類似するが、同じポリペプチド鎖上のＶＬドメインとＶＨドメインが相互作用することができないように、通常両方の可変ドメインを接続する短い（１０未満及び好ましくは１〜５）アミノ酸残基リンカーを有する。その代りに、１つポリペプチド鎖のＶＬドメイン及びＶＨドメインは、第２のポリペプチド鎖上のＶＨ及びＶＬドメインと（それぞれ）相互作用する（ＷＯ０２／０２７８１）。
【０１０４】
別の実施形態において、本発明のヒト化可変領域は、ＦｃＲ結合部分へ作動可能に連結された抗体の免疫反応性断片または部分（例えばｓｃＦｖ分子、ミニボディ、四価ミニボディまたはダイアボディ）中に存在し得る。例示的な実施形態において、ＦｃＲ結合部分は完全なＦｃ領域である。
【０１０５】
好ましくは、本明細書において記述されるヒト化方法は、抗原についての親和性がドナー抗体に比較して実質的に変化しないＩｇ可変領域を生じる。
【０１０６】
一実施形態において、本発明の可変ドメインを含むポリペプチドは、約１０５Ｍ−１、１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１または１０１２Ｍ−１（これらの値の親和性中間値が含まれる）の会合定数Ｋａを超える（またはそれに等しい）結合親和性で抗原へ結合する。
【０１０７】
親和性、結合活性、及び／または特異性は多様な手法で測定することができる。一般的に、及び親和性が定義または測定される正確な様式にかかわらず、本発明の方法が作製された抗体（複数可）に対する臨床適用の任意の態様において上回る抗体を生成する場合、本発明の方法は抗体親和性を改善する（例えば、それが作製された抗体（複数可）よりも低用量で、低頻度で、またはより便利な投与経路によって、修飾された抗体を投与することができる場合、本発明の方法は効果的または成功したと判断される）。
【０１０８】
より具体的には、抗体とそれが結合する抗原との間の親和性は、様々なアッセイ（例えばＥＬＩＳＡアッセイ、ＢｉａＣｏｒｅアッセイまたはＫｉｎＥｘＡ（商標）３０００アッセイ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ、ＩＤ）から入手可能）が含まれる）によって測定することができる。簡潔には、セファロースビーズは、抗原（本発明の方法において使用される抗原は、対象となる任意の抗原（例えば癌抗原；細胞表面タンパク質または分泌タンパク質；病原体の抗原（例えば細菌性抗原またはウイルス性抗原（例えばＨＩＶ抗原、インフルエンザ抗原または肝炎抗原））またはアレルゲン）であり得る）により、共有結的な付加によってコーティングされる。試験される抗体の希釈を調製し、各々の希釈をプレート上の指定のウェルへ添加する。次いで検出抗体（例えばヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート）、続いて色素形成性基質（例えばＨＲＰ）を各々のウェルに添加する。次いでプレートを４５０ｎＭでＥＬＩＳＡプレートリーダーで読み取り、ＥＣ５０値を計算する（ここで記述された方法が一般的には適用可能であることは理解されるが、それらは任意の特定の抗原または抗原のクラスを結合する抗体の生産に限定されない）。
【０１０９】
当業者は、必ずしも親和性の決定がただ一つの図から判断するように単純だとは限らないということを認識するだろう。抗体に２つの腕があるので、それらの見かけ上の親和性は可変領域と抗原との間の内因的な親和性（これは結合活性に起因すると考えられる）よりも通常はるかに高い。内因的な親和性はｓｃＦｖまたはＦａｂ断片を使用して測定することができる。
【０１１０】
別の態様において、本発明は、治療用部分（細胞毒素、薬剤（例えば免疫抑制剤）または放射性毒素等）へコンジュゲートされたヒト化ウサギ抗体またはその断片を特色とする。かかるコンジュゲートは「免疫コンジュゲート」と本明細書において称される。
【０１１１】
本発明の抗体コンジュゲートを使用して与えられた生物学的応答を修飾することができ、薬剤部分は古典的な化学療法剤に限定されると解釈されるべきでない。例えば、薬剤部分は所望される生物学的活性を保持するタンパク質またはポリペプチドであり得る。かかるタンパク質には、例えば酵素的に活性な毒素またはその活性断片（アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素またはジフテリア毒素等）；タンパク質（腫瘍壊死因子またはインターフェロン−γ等）；または生物応答修飾因子（例えばリンホカイン、インターロイキン１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン６（「ＩＬ−６」）、顆粒細胞マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）または他の増殖因子等）が含まれ得る。
【０１１２】
かかる治療用部分を抗体へコンジュゲートするための技法は周知であり、例えばＡｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，”Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；”Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）、及びＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）を参照されたい。
【０１１３】
一態様において、本発明は疾患の治療のためのヒト化ウサギ抗体を含む薬学的製剤を提供する。「薬学的製剤」という用語は、抗体または抗体誘導体の生物学的活性が明白に効果的であり、それは製剤が投与される被験体に対して毒性のある追加成分を含有しないことを可能にするような形態である調製物を指す。「薬学的に許容される」賦形剤（賦形剤、添加剤）は、用いられた活性成分の効果的な用量を提供するように被験体哺乳類へ正当に投与することができるものである。
【０１１４】
均等物
本発明の多数の修飾及び代替の実施形態は、前述の記述を考慮して当業者に明らかであろう。したがって、この記述は例示のみと解釈されるべきであり、当業者に本発明の実行のための最良の形態を教示する目的のためである。構造の詳細は本発明の趣旨から逸脱せずに実質的に変動することができ、添付の請求項の範囲内で生じてくるすべての修飾物の独占使用が保有される。本発明は、添付の請求項及び法律が適用可能なルールによって必要とされる程度のみに限定されることが意図される。
【０１１５】
本出願中で引用されるすべての文献及び類似の材料（特許、特許出願、物品、本、論文、学位論文、ウェブページ、図及び／または付属書類が、かかる文献及び類似の材料のフォーマットにかかわらず含まれる）は、それらの全体が参照として明示的に援用される。援用された文献及び類似の材料のうちの１つまたは複数が、本出願（定義された用語、用語使用、記述された技法または同種のものが含まれる）とは異なるかまたは矛盾する場合、本出願が優先する。
【図１】
2016506752.tif 000002
【図２】
2016506752.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成27年8月21日(2015.8.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2016506752000001.app
【国際調査報告】
2016506752.tif 000004
2016506752.tif 000005
2016506752.tif 000006
2016506752.tif 000007
2016506752.tif 000008
2016506752.tif 000009