(57)【要約】家禽類の胸筋重量を増加させるための方法が、本明細書に開示される。これらの方法は、卵内投与による組成物の送達を含み得る。本明細書に開示される方法は、線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２）またはインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）の送達などの、タンパク質の送達も包含する。本明細書に開示される方法は、胚及び食肉処理年齢のいずれの場合においても、家禽類の胸筋重量を増加させるために有効である。【選択図】図２Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
鳥類の筋肉量を増加させる方法であって、線維芽細胞成長因子−２及びインスリン様成長因子−１、ならびにそれらの変異体からなる群から選択されるタンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む組成物の卵内投与を含む、方法。
【請求項２】
前記タンパク質が、線維芽細胞成長因子−２である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質が、インスリン様成長因子−１である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質が、配列番号１〜４、またはそれらの変異体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
卵内投与される線維芽細胞成長因子−２の用量が、最大約５０ｎｇ／卵である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
卵内投与されるインスリン様成長因子−１の用量が、最大約２００ｎｇ／卵である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記投与が、約胚形成日０〜１８の間に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記投与が、約胚形成日０〜４の間に行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記投与が、約胚形成日０に行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記投与が、約胚形成日１（ＥＤ１）に行われる、いずれかの請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記投与が、約胚形成日２（ＥＤ２）に行われる、いずれかの請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記投与が、約胚形成日３（ＥＤ３）に行われる、いずれかの請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記投与が、約胚形成日４に行われる、いずれかの請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記投与が、インキュベーションの最終四半分に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記投与が、約胚形成日１８（ＥＤ１８）に行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項１６】
前記鳥類が、ニワトリ、シチメンチョウ、ホロホロチョウ、キジ、ウズラ、クジャク、アヒル、ガチョウ、ハト（ｐｉｇｅｏｎ）、ハト（ｄｏｖｅ）、及び走鳥類からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記鳥類が、ニワトリを含む、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年２月２２日出願の米国仮出願第６１／７６７，９６１号の優先権を主張し、本出願は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本出願の主題は、孵化前に卵に基質を送達することによって、家禽類における成績を改善する方法である。これは、孵化前及び孵化後の両方において、筋成長及び筋重量の増加をもたらす。
【背景技術】
【０００３】
現在、家禽類の成長成績を改善する必要性が存在し、これには、筋肉の形成速度及び筋肉量の増加、ならびにそれに伴う筋重量の増加が含まれる。家禽類及び他の食用動物における成績改善を達成するための環境に優しい手法を特定することが増々重視されていることに起因し、かかる方策が、ステロイドまたは他の化学的ホルモンの使用を伴わないことが望ましい。
【０００４】
家禽類において、衛星細胞は、筋細胞の前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）と見なされる。衛星細胞が活性化される生理学的状態下で、衛星細胞は増殖し、成熟筋細胞への分化を起こす（Ｋａｕｎｇ  ａｎｄ  Ｒｕｄｎｉｃｋｉ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ；１４（２）：８２−９１；２００８を参照されたい）。主に二段階あり、この段階の間に、家禽類の衛星細胞が、孵化前の（胚の）段階である増殖及び分化、ならびに孵化後に標的化され得る。したがって、家禽類における筋重量の増加を達成するために、好適な組成物を特定すること、ならびにその組成物の正確な適時及び投与経路を特定する必要性についてはまだ対処されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋａｕｎｇ  ａｎｄ  Ｒｕｄｎｉｃｋｉ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ；１４（２）：８２−９１；２００８
【発明の概要】
【０００６】
本発明の方法は、タンパク質の卵内投与が、孵化前及び孵化後のいずれの段階においても筋重量の著しい増加を引き起こすことを示す例を、驚くべきことに、かつ予想外に提供する。
【０００７】
本発明の一実施形態において、タンパク質の卵内投与を含む組成物の投与を含む、鳥類の筋重量を増加させる方法を提供する。本発明の１つ以上の実施形態において、タンパク質は、線維芽細胞成長因子及びインスリン様成長因子からなる群から選択されることを規定する。１つ以上の実施形態において、タンパク質は、線維芽細胞成長因子である。一実施形態において、タンパク質は、線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２）である。一実施形態において、タンパク質は、インスリン様成長因子である。一実施形態において、タンパク質は、インスリン様成長因子−１である。本発明の一実施形態において、タンパク質は、線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２）及びインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、またはそれらの変異体からなる群から選択されることを規定する。
【０００８】
本発明の１つ以上の実施形態において、タンパク質は、配列番号１〜４、またはそれらの変異体からなる群から選択されることを規定する。本発明の１つ以上の実施形態において、タンパク質が、配列番号１、またはそれらの変異体であることを規定する。本発明の１つ以上の実施形態において、タンパク質が、配列番号２、またはそれらの変異体であることを規定する。本発明の１つ以上の実施形態において、タンパク質が、配列番号３、またはそれらの変異体であることを規定する。本発明の１つ以上の実施形態において、タンパク質が、配列番号４、またはそれらの変異体であることを規定する。１つ以上の実施形態において、ペプチドが、組換えタンパク質である。
【０００９】
本発明の１つ以上の実施形態において、本方法は、卵内投与される線維芽細胞成長因子−２の用量が最大約１２０ｎｇ／卵であることを規定する。１つ以上の実施形態において、ＦＧＦ−２の用量は、約１０ｎｇ／卵〜６０ｎｇ／卵である。本発明の１つ以上の実施形態において、本方法は、インスリン様成長因子−１の用量が最大約２００ｎｇ／卵であることを規定する。
【００１０】
本発明の１つ以上の実施形態において、本方法は、鳥類が、ニワトリ、シチメンチョウ、ホロホロチョウ、キジ、ウズラ、クジャク、アヒル、ガチョウ、ハト（ｐｉｇｅｏｎ）、ハト（ｄｏｖｅ）、及び走鳥類からなる群から選択されることを規定する。一実施形態において、鳥類は、ニワトリを含む。
【００１１】
本発明の一実施形態において、本方法は、本発明の組成物の投与が卵内注入によることを規定する。一実施形態において、卵内注入は、卵殻を貫通し、処置物質を卵の内部に送達する装置によって実行される。一実施形態において、本方法は、投与方法が手動による卵内ワクチン接種であることを規定する。
【００１２】
１つ以上の実施形態において、本発明の方法は、約胚形成日０〜１８の間で投与される。一実施形態において、投与は、約胚形成日０〜４の間で行われる。１つ以上の実施形態において、投与は、約胚形成日０に行われる。１つ以上の実施形態において、投与は、約胚形成日１に行われる。１つ以上の実施形態において、投与は、約胚形成日２に行われる。１つ以上の実施形態において、投与は、約胚形成日３に行われる。一実施形態において、投与は、約胚形成日４に行われる。１つ以上の実施形態において、本発明の組成物の投与は、約胚形成日４〜胚形成日１８に行われる。一実施形態において、本発明の組成物の投与は、胚発生の最終四半分に行われる。１つ以上の実施形態において、組成物の投与は、約胚形成日１８に行われる。
【００１３】
一実施形態において、タンパク質は、延長された半減期を有する。１つ以上の実施形態において、タンパク質は、化学的に共有結合されている。１つ以上の実施形態において、タンパク質は、融合タンパク質である。一実施形態において、融合タンパク質は、Ｆｃ断片を含む。
【００１４】
本発明の一実施形態において、該タンパク質の投与は、少なくとも約２％の筋重量の増加を引き起こす。一実施形態において、タンパク質の投与は、食肉処理年齢における約２％〜１０％の筋重量を引き起こす。１つ以上の実施形態において、本発明の方法は、本発明のタンパク質の卵内投与が約３〜７％の筋重量の増加を引き起こすことを規定する。本発明の一実施形態において、本方法は、衛星細胞増殖の増加を引き起こす。一実施形態において、衛星細胞増殖の増加は、筋肉の過形成の増加を引き起こす。
【００１５】
本発明の１つ以上の実施形態において、本方法は、家禽類の筋成長を増加させるためのタンパク質を含む組成物の使用を提供し、本方法は、本発明の方法による投与を含む。
【００１６】
一実施形態において、本発明は、ＲＮＡレベルを測定することによる胸筋組織中のＭｙｏＤ、ミオゲニン、シンデカン、及びグリピカン−１などのタンパク質の転写レベルを測定することによって鳥類の増加した成長を決定する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａ及びＢ：ＰＢＳ（対照）による卵内注入と比較した、１２０ｎｇのＦＧＦ−２（ＶＨ）、２００ｎｇのＩＧＦ−１、及び４０ｎｇのＦＧＦ−２によるＥＤ４卵内注入後の、雄（Ａ）及び雌（Ｂ）の３５日目（肥育）の平均胸筋重量の要約のグラフ表示である。
【図１Ｂ】図１Ａ及びＢ：ＰＢＳ（対照）による卵内注入と比較した、１２０ｎｇのＦＧＦ−２（ＶＨ）、２００ｎｇのＩＧＦ−１、及び４０ｎｇのＦＧＦ−２によるＥＤ４卵内注入後の、雄（Ａ）及び雌（Ｂ）の３５日目（肥育）の平均胸筋重量の要約のグラフ表示である。
【図２Ａ】図２Ａ：５０ｎｇのＩＧＦ−１（低）、１００ｎｇのＩＧＦ−１（中）、及び２００ｎｇのＩＧＦ−１（高）、ならびにＰＢＳ（対照）によるＥＤ４卵内処置後の胚形成日１８（ＥＤ１８）に測定された大胸筋の主要重量の測定値のグラフ表示である。
【図２Ｂ】図２Ｂ：４０ｎｇのＦＧＦ−２及びＰＢＳ（対照）によるＥＤ４卵内処置後の胚形成日１８（ＥＤ１８）に測定された大胸筋の主要重量の測定のグラフ表示である。
【図３Ａ】図３Ａ：５０ｎｇのＩＧＦ−１（低）、１００ｎｇのＩＧＦ−１（中）、及び２００ｎｇのＩＧＦ−１（高）、及びＰＢＳ（対照）によるＥＤ４卵内処置後の胚形成日１８（ＥＤ１８）における体重のグラフ表示である。
【図３Ｂ】図３Ｂ：４０ｎｇのＦＧＦ−２及びＰＢＳ（対照）によるＥＤ４卵内処置後の胚形成日１８（ＥＤ１８）における体重のグラフ表示である。
【図４Ａ】図４Ａ：５０ｎｇのＩＧＦ−１（低）、１００ｎｇのＩＧＦ−１（中）、及び２００ｎｇのＩＧＦ−１（高）、及びＰＢＳ（対照）によるＥＤ４卵内処置後の胚形成日１８（ＥＤ１８）における体重に対する大胸筋のパーセンテージのグラフ表示である。
【図４Ｂ】図４Ｂ：４０ｎｇのＦＧＦ−２及びＰＢＳ（対照）によるＥＤ４卵内処置後の胚形成日１８（ＥＤ１８）における体重に対する大胸筋のパーセンテージのグラフ表示である。
【図５】図５：異なる濃度（１０ｎｇ、２０ｎｇ、及び４０ｎｇ）のＦＧＦ−２によるＥＤ４における卵内処置後のＥＤ１８胸筋の遺伝子発現データのグラフ表示である。ミオゲニン転写の発現を測定し、ＲＮＡ抽出及びｑＰＣＲ分析後のＧＡＰＤＨ発現レベルと比較した。
【図６】図６：異なる濃度（１０ｎｇ、２０ｎｇ、及び４０ｎｇ）のＦＧＦ−２によるＥＤ４における卵内処置後のＥＤ１８胸筋の遺伝子発現データのグラフ表示である。グリピカン−１転写の発現を測定し、ＲＮＡ抽出及びｑＰＣＲ分析後のＧＡＰＤＨ発現レベルと比較した。
【図７】図７：異なる濃度（１０ｎｇ、２０ｎｇ、及び４０ｎｇ）のＦＧＦ−２によるＥＤ４における卵内処置後のＥＤ１８胸筋の遺伝子発現データのグラフ表示である。シンデカン−４転写の発現を測定し、ＲＮＡ抽出及びｑＰＣＲ分析後のＧＡＰＤＨ発現レベルと比較した。
【図８】図８：異なる濃度（１０ｎｇ、２０ｎｇ、及び４０ｎｇ）のＦＧＦ−２によるＥＤ４における卵内処置後のＥＤ１８胸筋の遺伝子発現データのグラフ表示である。ＭｙｏＤ転写の発現を測定し、ＲＮＡ抽出及びｑＰＣＲ分析後のＧＡＰＤＨ発現レベルと比較した。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
【表１】
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【００１９】
本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が、参照することにより組み込まれる。
【００２０】
以下の定義は、実施形態の記述中で使用される用語に適用され得る。以下の定義は、参照することにより本明細書に組み込まれる各個別の参考文献に含まれているいずれの矛盾した定義にも優先する。
【００２１】
本明細書で本発明の記述に使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のためであるに過ぎず、本発明を限定することを意図するものではない。
【００２２】
本発明を実施するための形態及び本特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に示さない限り、複数形も含むことが意図される。
【００２３】
用語「約」または「およそ」は、本明細書で使用される場合、別途示されない限り、測定可能な変数に関して使用されるとき、変数の指定された値、及び指定値の実験誤差以内（例えば、その意味に対して９５％の信頼区間以内）、または指定値の１０％以内のどちらか大きい方である変数の全値を意味する。
【００２４】
用語「気室」は、本明細書で使用される場合、別途示されない限り、卵の鈍端部における白身と殻との間の空の領域を意味する。
【００２５】
用語「アミノ酸」は、本明細書で使用される場合、別途示されない限り、天然及び合成アミノ酸、アミノ酸類似体、ならびに天然アミノ酸と同様の方法で機能するアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、ならびに後で修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、カルボキシグルタミン酸、及びオルト−ホスホセリンであるが、これらに限定されない。２０個の従来型アミノ酸、α及びα−二置換アミノなどの非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、ならびに他の非従来型アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）も、本発明のポリペプチドに好適な構成成分であり得る。非従来型アミノ酸の例として、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、オルト−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の類似のアミノ酸及びイミノ酸が挙げられる。
【００２６】
アミノ酸類似体とは、天然アミノ酸と同一の基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合する炭素を有する化合物を指す。代表的なアミノ酸類似体として、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、及びメチオニンメチルスルホニウムが挙げられる。かかる類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同一の基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様の方法で機能する化学化合物を指す。
【００２７】
アミノ酸は、本明細書において、それらの一般的に既知である３文字表記、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって、推奨される１文字表記のいずれかによって言及され得る。
【００２８】
用語「鳥類の」は、いずれの鳥類種の雄または雌も含むことが意図されるが、主として卵または食肉用に、商業用に育てられる家禽類を包含することが意図される。したがって、用語「鳥類の」は、特に雌のニワトリ、雄のニワトリ及び雄のカモ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、ならびにキジを包含することが意図される。
【００２９】
用語「胚」は、本明細書で使用される場合、別途示されない限り、受精卵内の多細胞性二倍体真核生物を意味する。用語「胚形成日」または「ＥＤ」は、本明細書で使用される場合、別途示されない限り、受精卵をインキュベーターに入れてからの日数を意味する。受精した鳥類の卵の産卵後、卵は、適切なインキュベート温度のインキュベーターに配置されると、卵内で発達が始まることが当業者には既知である。したがって、ＥＤ０は、卵が産卵後にインキュベーター内に配置された日と定義され、ＥＤ２１は、概してニワトリ胚の孵化の日と見なされる。用語「早期胚段階」は、本明細書で使用される場合、ＥＤ０に始まり、ＥＤ４の最後を終わりとする、最も早期の胚段階を記載するために使用されている。用語「後期胚段階」は、本明細書で使用される場合、胚のインキュベーションの最終四半分を記載するために使用されている。この段階は、約ＥＤ１８（胚形成日１８）前後として定義され得る。
【００３０】
用語「インキュベーションの最終四半分」は、本明細書で使用される場合、別途示されない限り、トリまたは家禽化されたトリの発達卵のインキュベーションの最終四半分を意味する。いくつかの実施形態において、インキュベーションの最終四半分は、ニワトリの場合、好ましくはインキュベーションの１５〜２０日目、及び最も好ましくはインキュベーションの１８または１９日目に行われる卵内投与を指す。シチメンチョウの場合、卵内投与は、好ましくはインキュベーションの２１〜２６日目に行われる。
【００３１】
用語「融合タンパク質」は、本明細書で使用される場合、融合タンパク質、特にＦｃ融合タンパク質を意味し、それは、別個のタンパク質に対して本来コードされる２つ以上の遺伝子を結合することを通して作製される。この融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質の各々から得られる官能性を含む単一のポリペプチドをもたらす。組換え融合タンパク質は、生物学的研究または治療において使用するために、組換えＤＮＡ技術によって人工的に作製される。ＩｇＧアイソタイプの抗体ＦｃドメインであるＦｃ系融合タンパク質は、異なるタンパク質に結合される。
【００３２】
用語「半減期」は、本明細書で使用される場合、別途示されない限り、タンパク質の半分の量が分解されるか、消滅するか、または個体群から除去されるかのいずれかにかかる時間を意味する。
【００３３】
用語「線維芽細胞成長因子」、「線維芽細胞成長因子−１」または「ＦＧＦ−１」、「線維芽細胞成長因子−２」または「ＦＧＦ−２」は、本明細書で使用される場合、別途示されない限り、血管新生、創傷治癒、及び胚発生において伴われる成長因子のファミリーに属するメンバーであるタンパク質を意味する。線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、ヘパリン結合性タンパク質であり、かつ細胞表面関連ヘパリン硫酸プロテオグリカンと相互作用があり、ＦＧＦ信号伝達のために必要であるとされている。発達プロセスにおけるＦＧＦの機能には、中胚葉誘導、前後パターン形成、肢発達、神経誘導及び神経発達、ならびに成熟組織／システム、血管新生、ケラチン組織、及び創傷治癒プロセスにおいてが含まれ得る。
【００３４】
用語「グリピカン」または「グリピカン−１」は、本明細書で使用される場合、別途示されない限り、ヘパリン硫酸プロテオグリカンと見なされるタンパク質のファミリーに属するタンパク質を意味する。グリピカンは、細胞の信号経路を修正し、細胞の増殖及び組織成長に寄与することができる。グリピカン−１の増加発現は、組織成長の増加を示す。
【００３５】
用語「肥育」は、本明細書で使用される場合、別途示されない限り、孵化から消費のためにトリを採取するまでの間の期間を意味する。用語「孵化直後」が、肥育の０日目を指すことが関連分野において既知である。用語「食肉処理年齢」は、本明細書で使用される場合、別途示されない限り、トリが採取される日を意味する。
【００３６】
用語「卵内投与」、または「卵内注入」は、本明細書で使用される場合、別途示されない限り、本明細書に記載される通り、卵の殻を貫入して組成物を導入するための任意の手段によって、胚を含有する鳥類の卵への本発明の組成物の注入を意味する。卵内の投与経路は、胚が卵中にある間、各胚に組成物の均一用量を送達する便利な方法を提供する。用語、卵内投与は、鳥類の卵に本発明の組成物を注入するのに使用される全ての多数の異なる投与手順を指し得る。当業者によく知られているように、卵内注入は、異なる技術及び試薬量を使用する種々の方法で行われ得る。本質的に、卵内注入は、卵殻を貫通し、処置物質を卵の内部に送達する装置または手動技術を使用する送達プロセスとして定義され得る。この投与は、例えば、各卵の内部の気室またはいずれの他の構造もが、キャンドリングによって位置確認され、ペンで印をつけられるなど、手動手順であり得る。定義として、キャンドリングは、卵内の胚の成長及び発達の領域を調査または位置確認するために使用される方法である。本方法は、卵の後方で明るい光源を使用して殻越しに詳細を示し、本方法がこのように呼称されるのは、使用される本来の光源がキャンドルであったためである。穴は、針を使用して、円によって印をつけた領域の真ん中に穴を穿孔され、指定の処置は、設けられた穴の中に本発明の組成物を滴下することによって、少量ではあるが可変容量を投与される。穴を次に接着剤によって封着し、卵をインキュベーター内に配置する。加えて、卵内投与は、卵殻を貫通し、処置物質を卵の内部に送達する任意の装置によって実行される方法を意味し得る。本発明の方法は、卵内注入の方法によって限定されない。注入は、手動で実行されてもよい。注入は、装置によって実行されてもよい。加えて、本発明の方法は、卵内への注入場所によって限定されない。例えば、早期胚段階で実行される卵内注入は、卵の気室中に投与されてもよいが、それに限定されない。後期胚段階、例えば、約胚形成日１８（ＥＤ１８）またはその前後に実行される卵内注入は、卵の羊膜中に投与されてもよいが、それに限定されない。
【００３７】
用語「インスリン様成長因子」、「インスリン様成長因子−１」、または「ＩＧＦ−１」は、本明細書で使用される場合、別途示されない限り、インシュリンに類似した高い配列を有するタンパク質を意味する。ＩＧＦは、細胞の複雑システムの一部であり、それらの生理環境と交信するために使用される。ＩＧＦ−１は、３個の分子内ジスルフィド架橋と共に、単鎖内で７０個のアミノ酸からなる。ＩＧＦ−１は、１７，０６６ダルトンの分子量を有する。その主な作用は、多くの組織中で多くの種類の細胞上に表れる「ＩＧＦ１Ｒ」と省略される、インスリン様成長因子１受容体である、特定の受容体に結合することによって媒介される。受容体チロシンキナーゼである、ＩＧＦ１Ｒに結合することは、細胞内信号送信を開始することであり、ＩＧＦ−１は、ＡＫＴ信号経路の最も強力な天然活性剤の１つであり、細胞成長及び増殖の刺激物質、ならびにプログラム細胞死の強力な阻害剤である。ＩＧＦ−１は、有効な成長ホルモン（ＧＨ）の主な媒介物である。インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）及び他のチロシンキナーゼ成長因子受容体は、複数の経路を通して、信号を送る。
【００３８】
用語「筋肉量」または「筋成長」は、本明細書で使用される場合、別途示されない限り、筋重量の増加を意味する。これは、過形成及び肥大の２つの期間に分けられ得る。用語「過形成」は、本明細書で使用される場合、特定の刺激に対する生理的（正常）反応と見なされ、過形成成長の細胞は、正常な調節制御の機序にかけられたままである。本発明の範囲において、過形成は、筋細胞または線維の数の増加として定義される。用語「肥大」は、組織の構成成分の細胞の増大に起因し、組織の量が増加することである。肥大は、細胞がほぼ同じサイズのままではあるが数の上で増加する過形成とは区別されるべきである。
【００３９】
本発明の方法は、過形成の反応、または実際の筋肉の数の増加を驚くべきことに、かつ予想外に示す。これは、肥大筋肉量の増加に対して観察されてきたものと比較される。過形成は、血液供給における平行増加を可能にしない肥大と比較して、血液供給において平行増加を可能にする。現在まで、家禽業界は、市場取引年齢のトリにおいて、筋壊死の問題を有する乏しい血管供給を引き起こしてきた肥大プロセスを通して迅速な増量に注力してきた。本発明の方法は、筋壊死の問題がない、筋肉への良好な血管供給に基づく、過去にないレベルの過形成を驚くべきことに、かつ予想外に示す。
【００４０】
用語「ミオゲニン」は、本明細書で使用される場合、骨格筋の発達及び矯正の統一に伴われる、筋肉の特定の転写因子である。存在するミオゲニンの量の増加は、骨格筋の発達の増加を示す。
【００４１】
用語「ＭｙｏＤ」は、本明細書で使用される場合、筋分化を調節する重要な役割を有する、タンパク質として定義される。ＭｙｏＤは、筋原性調節因子として既知であるタンパク質のファミリーに属する。これらのベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス転写因子は、筋原性分化において連続的に作用する。ＭｙｏＤは、筋原性の運命決定の最も早期の目印のうちの１つである。ＭｙｏＤは、休止期の衛星細胞中ではなく、活性期の衛星細胞中で発現される。
【００４２】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」などは、よく知られており、当該技術分野において交換可能に的に使用され、ポリマーの長さに関係なく、アミド結合（ペプチド結合としても既知である）によって直鎖状に連鎖されるアミノ酸のポリマーを指す。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質は、ポリペプチドの定義内に含まれる。この用語はまた、発現後のポリペプチドの変異を特定しないか、または除外しない、例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基などの共有結合を含むポリペプチドが用語、ポリペプチドによって明白に包含されるが、これらに限定されない。また、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、非天然アミノ、無関係な生体システム中でのみ自然発生するアミノ酸、哺乳類システムからの修飾アミノ酸、などを含む）、置換連鎖を含むポリペプチド、ならびに天然及び非天然の両方である当該技術分野において既知である他の変異を含有するポリペプチドも定義内に含まれる。
【００４３】
「薬学的に許容される」は、本明細書で使用される場合、別途示されない限り、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などが無く、対象とする組織と接触して使用するのに好適であり、合理的な利益とリスクの比率の釣り合いが取れており、それらの目的とする使用に有効である、物質を指す。
【００４４】
用語「ポリヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド分子」は、本明細書で使用される場合、別途示されない限り、鎖内で共有結合的に結合されるヌクレオチドモノマーからなる有機ポリマー分子を意味する。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）及びＲＮＡ（リボ核酸）は、特徴的な生物学上の機能を含むポリヌクレオチドの例である。
【００４５】
用語「家禽類」は、本明細書で使用される場合、別途示されない限り、基本的に食肉及び卵のために飼育される家禽化された野鶏を意味する。本用語は、キジ目、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ホロホロチョウ、キジ、ウズラ、及びクジャク、ならびにガンカモ目（遊泳トリ）、例えば、アヒル及びガチョウのトリを含む。本用語は、ハト（ｐｉｇｅｏｎ）、ハト（ｄｏｖｅ）、及び走鳥類（ダチョウも含まれるが、これに限定されない）も指す。用語「家禽類」、「トリ」、及び「鳥類」は、本明細書において交換可能に使用される。
【００４６】
ニワトリに関して、それらは主に２つの群、産卵のために飼育されるもの（「産卵ニワトリ」）と食肉生産のために飼育されるもの（「ブロイラーニワトリ」）とに分けられ得る。ブロイラーニワトリは、開示される発明の方法の好ましい標的である。ブロイラーニワトリは、特に、効率的な食肉生産のために大規模に飼育され、概して産卵用の雌のニワトリまたは従前の二つの目的のための種よりも非常に早く成長する。それらは、極めて早い速度で成長し、高い供給会話速度、及び比較的低い活動性を示す。それらは、わずか５週間で４〜５パウンド（処理済）の食肉処理の重量に達し得ることが多い。この期間は、「肥育」期間と呼ばれる。ニワトリの種に関して、本発明の方法は、全種への適用性を有する。商業用のトリには多くの異なる種がある。より人気の高いブロイラーニワトリの種は、コブ及びロスという種であるが、これらに限定されない。コブは、フランスのブレス若鶏種のアメリカの変種であり、１９８０年代後半に現れ始めた。コブ種のトリは典型的に、３５日（５週間）の肥育期間を有する。ロス種は、ニュージーランド原産であり、スコットランドのロスとアメリカのコブとの間の異種交配によるものである。ロス種のトリは典型的に、４２日（６週間）の肥育期間を有する。しかし、本発明の方法は、処置されるトリの種、及びいずれの種の卵によっても制限されることはなく、商業用またはそれ以外にも使用され得る。
【００４７】
本発明の一実施形態は、タンパク質を含む組成物の卵内投与を提供する方法である。ニワトリ胚の卵内での成長周期は、およそ２１日である。２１日周期の間の何時においても、本発明の方法は実施される可能性がある。本発明の方法は、０もしくは約０（胚形成日０、もしくはＥＤ０）、インキュベーションの最終四半分、またはインキュベーションのＥＤ１８もしくは約ＥＤ１８（胚形成日１８）の間に行われる可能性がある。本発明の方法は、ＥＤ０〜ＥＤ４の間もしくは約ＥＤ０〜ＥＤ４の間、またはＥＤ０もしくは約ＥＤ０、またはＥＤ４もしくは約ＥＤ４にも実施される可能性がある。
【００４８】
用語「組換えタンパク質」または「組換え」は、本明細書で使用される場合、別途示されない限り、所望のタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ構築物によって形質転換される細胞から得られるタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを意味し、かつ当業者によく知られる、それらを生成するために使用される技術を意味する。
【００４９】
用語「衛星細胞」は、本明細書で使用される場合、骨格筋細胞に対する前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）、または前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）であり、衛星細胞または分化骨格筋細胞を生じさせることができる。それらは、新たな筋繊維を生成するか、それらの元の筋繊維に追加の筋核を提供するか、または休止状態に戻るための潜在力を有する。より具体的には、活性化すると、衛星細胞は、細胞周期に再進入して増殖し、筋芽細胞に分化し得る。
【００５０】
用語「食肉処理年齢」は、本明細書で使用される場合、別途示されない限り、家禽種が消費のために屠殺される年齢を意味する。
【００５１】
用語「シンデカン」は、本明細書で使用される場合、共受容体、特に、Ｇタンパク質結合受容体として作用すると考えられる単一の膜貫通型ドメインタンパク質である。これらのコアタンパク質は、３〜５個のヘパラン硫酸及びコンドロイチン硫酸鎖を保持し、これは、線維芽細胞成長因子、血管内皮の成長因子、形質転換成長因子−ベータ、フィブロネクチン、及び抗トロンビン−１を含む、多種多様なリガンドとの相互作用を可能にする。
【００５２】
用語「治療有効量」は、本明細書で使用される場合、別途示されない限り、所望の明白な有効性をもたらすために必要な量を意味する。筋肉の場合、治療有効量は、実証できるほどの筋重量の増加を示すために必要な量であるであろう。
【００５３】
用語「変異体」は、本明細書で使用される場合、アミノ酸配列において７０％を超えて、８０％を超えて、８５％を超えて、９０％を超えて、９５％を超えて、または９７％を超えて、または９８％を超えて、ペプチドの特性を本質的に減じることはなく、本来のポリペプチドと、等しいポリペプチドを包含する特定のポリペプチドに関して定義されるペプチドである。例えば、かかる変異体は、遺伝子欠失、挿入、及び／または置換を含む、自然的変異または遺伝子工学の結果であり得る。
【００５４】
ポリペプチドのアミノ酸配列の固有性は、Ｂｅｓｔｆｉｔ、ＦＡＳＴＡ、またはＢＬＡＳＴ（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８（１９９０）、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１３２：１８５−２１９（２０００）、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）を参照されたい）などの既知であるコンピュータープログラムを従来的に使用して決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラムを使用して、特定の配列が、例えば、参照のアミノ酸配列に９５％等しいかどうかを決定するとき、パラメータは、同一性のパーセンテージが参照のアミノ酸配列の完全な長さにわたって計算されるように、及び相同性における差が参照の配列中でアミノ酸残基の総数の最大５％まで許容されるように、設定される。この、ポリペプチド間の同一性のパーセンテージを決定する前述の方法は、本明細書に開示される全てのタンパク質、断片、またはそれらの変異体に適用可能である。
【００５５】
用語「獣医学的に許容できる担体」、または「担体」は、本明細書で使用される場合、別途示されない限り、確実な医学的判定の範囲内において、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などが無く、対象とする動物と接触して使用するのに好適であり、合理的な利益とリスクの比率の釣り合いが取れており、それらの目的とする使用に有効である、物質を意味する。
【００５６】
以下の記述は、本発明の本実施形態を実践する上で、当業者を補助するために提供される。たとえそうであっても、本明細書で議論される実施形態中の修正及び変更が、本発明の発見の真意または範囲から逸脱することなく、当業者によって行われるため、本記述は、本発明を過度に限定すると解釈されるべきではない。
【００５７】
現在、家禽類の成長成績を改善する必要性が存在し、これには、筋肉の形成速度及び筋肉量の増加、ならびにそれに伴う筋重量の増加が含まれる。本発明の方法は、過形成反応、または実筋肉の増加を示す。過形成は、血液供給における平行増加を可能にしない肥大と比較して、血液供給において平行増加を可能にする。現在まで、家禽業界は、市場取引年齢のトリにおいて、筋壊死の問題を有する乏しい血管供給を引き起こしてきた肥大プロセスを通して迅速な増量に注力してきた。本発明の方法は、過去にないレベルの過形成を驚くべきことに、かつ予想外に示し、筋壊死の問題がない筋肉への良好な血管供給に基づく。
【００５８】
先に定義されたように、衛星細胞は、骨格筋特異的異種性ステムまたは前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）である。それらは、サブラミナー局在、筋電位、及び自己再生能力を特徴とする。衛星細胞が活性化される生理学的状態下で、衛星細胞は増殖し、成熟筋細胞への分化を起こす（Ｋａｕｎｇ  ａｎｄ  Ｒｕｄｎｉｃｋｉ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ；１４（２）：８２−９１；２００８）を参照されたい）。多くの従前の調査は、筋重量の増加をもたらし、それゆえ、成績の改善と見なされるであろう衛星細胞の刺激作用を示そうとしてきた。例えば、孵化前または孵化後のいずれかにおけるステロイドの投与は、衛星細胞の刺激作用及び後に続く、筋肉量の増加を引き起こさなかった。Ｈｅｎｒｙ  ａｎｄ  Ｂｕｒｋｅ（Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉ．；７８：１００６−１０１３，１９９９）は、テストステロンが卵内に投与されたとき、胸重量において明白な有効性を見なかった。Ｋｅｒａｌａｐｕｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉ．；８９：１４９７−１５０１，２０１０）は、Ｌ−カルニチンが卵内に投与されたとき、成績または食肉収量の増加を見なかった。加えて、ステロイドの使用は、概して人間の食物連鎖に入る動物を処理する環境に優しい手段としては見なされない。
【００５９】
Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉ．；６２：８１１−８１５，１９８３）は、甲状腺活性ヨウ素化カゼインが、孵化後に送達されたとき、胸重量の増加を見なかった。Ｖａｓｉｌａｔｏｓ−Ｙｏｕｎｋｅｎ（ＰｏｕｌｔｒｙＳｃｉ；７８：７５９−７６８，１９９９）は、成長ホルモンが、孵化後に投与されたとき、鳥類の筋成長の誘発を見なかった。Ｎｅｉｔｈｅｒ  Ｈｕｙｂｒｅｃｈｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉ；７１：１８１−１８７，１９９２）も、Ｔｉｘｉｅｒ−Ｂｏｉｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ；１３３：１０１−１１０，１９９２）も、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）が、孵化後に投与されたとき、体重増量の増加を見なかった。Ｓｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；３０（４）：５１５−５２１，１９９０）は、卵内にＩＧＦ−１を投与したとき、総体重及び他のパラメータにおける著しく明白な影響を見ることはなく、外因性ＩＧＦ−１の投与は、ニワトリ胚のさらなる成長を促進しなかったと結論付けた。
【００６０】
本発明の方法は、例えば、胚形成日０（ＥＤ０）から胚形成日４（ＥＤ４）を通して、または胚形成日１８（ＥＤ１８）において、線維芽細胞成長因子−２またはインスリン様成長因子−１などの、ペプチドの投与を提供し、筋幹細胞（衛星細胞）を促進して、それらの細胞の数を増殖及び増加させる。本発明の方法が、驚くべき、かつ予想外な家禽類における成績改善、特に、過形成による筋肉量の増加を提供することを本明細書で例証される。
【００６１】
組成物
本発明の一実施形態は、種々の種類の化合物を使用して、家禽類の成績を改善し筋重量を増加することを包含する。特定の実施形態において、本発明は、タンパク質を用いる方法を包含し得る。これらのタンパク質は、本発明の方法に従って使用される。かかる例として、例えば、種類１及び２に限定されないがインスリン様成長因子（ＩＧＦ）、例えば、種類１及び２に限定されないが線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、成長ホルモン（ＧＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、及び甲状腺刺激ホルモン放出因子（ＴＲＦ）などが挙げられるが、これらに限定されるべきではない。それらはまた、合成的に、または組換えて生産され得る。例えば、配列番号１は、本発明の方法において使用され得る、ヒトＦＧＦ−２の成熟形態のアミノ酸配列を開示する。配列番号２は、本発明の方法において使用され得る、ヒトＩＧＦ−１の成熟形態のアミノ酸配列を開示する。配列番号３は、本発明の方法において使用され得る、ニワトリＦＧＦ−２の成熟形態のアミノ酸配列を開示する。配列番号４は、本発明の方法において使用され得る、ニワトリＩＧＦ−１の成熟形態のアミノ酸配列を開示する。本発明は、配列番号１〜４のうちのいずれか１つの変異体を提供する。
【００６２】
本発明の方法において使用される組成物は、１つ以上の獣医学的に、または薬学的に許容される担体（複数可）を含み得、全て、交換可能に的に使用される。かかる担体は、制限なく、水、生理食塩水、緩衝生理食塩水、リン酸緩衝液、アルコール／水性溶液、乳濁液、または懸濁液を含む。さらに、エタノール、ポリオール、及び好適なそれらの混合物、植物性油、ならびに注入可能有機エステルが含まれる。緩衝液及びｐＨ調整剤も用いられてもよい。緩衝液は、制限なく、有機酸または塩基から調製される塩を含む。代表的な緩衝液は、制限なく、例えば、クエン酸塩、アスコルビン酸、グルコン酸、ヒスチジン−Ｈｅｌ、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、フタル酸、トリス、トリエチルアミン塩酸塩、またはリン酸緩衝液などのクエン酸の塩など、有機酸塩を含む。非経口の担体は、塩化ナトリウム溶液、リンガーのブドウ糖、ブドウ糖、トレハロース、ショ糖、乳酸加リンガー、または不揮発性油を含み得る。静脈内担体は、リンガーのブドウ糖などに基づくもののような、流動性の及び栄養性の補液、電解質補液を含み得る。例えば、抗菌性、抗酸化剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、不活性ガスなどの、防腐剤及び他の添加剤も、薬学的担体中に提供されてもよい。本発明は、担体の選択によって限定されない。これらの薬学的に許容される、適切なｐＨ、等張性、安定性、及び他の従来の特徴を有する、上記の構成成分からの組成物の調製は、当業者内で行われる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ｅｄ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，ｐｕｂ．，２０００、及びＴｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｓ．Ｒ．Ｃ．Ｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＰｈＡ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２００３などの本文を参照されたい。これは、任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、アジュバント、安定剤、希釈剤、防腐剤、抗菌性及び抗真菌薬、等張剤、吸着遅延剤などを含み得る。希釈剤は、水、生理食塩水、ブドウ糖、エタノール、グリセロールなどを含み得る。等張剤は、当業者に既知である他のものの中でも、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール、及び乳糖を含み得る。安定剤は、当業者に既知であるものの中でも、アルブミンを含む。防腐剤は、当業者に既知であるものの中でも、マーサイアレイト、クロロクレゾールを含む。
【００６３】
本明細書に記載される活性化合物は、それ自体の薬学的配合物として、または薬学的に許容されるそれらの塩の形態で、投与及び調製されてもよい。例えば、アセテートアジピン酸、アルギン酸、アスパラギン酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸、重硫酸、酪酸、クエン酸、樟脳酸、樟脳スルホン酸、シクロペンタンプロピオン酸、ジグルコン酸、ドデシルスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプタン酸、グリセロリン酸ヘミ硫酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、塩酸塩、臭化水素酸、ヨウ化水素酸塩、２ヒドロキシエタンスルホン酸、乳酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、ニコチン酸、シュウ酸、パモ酸、ペクチン酸、過硫酸、３−フェニルプロピオン酸（３−ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）、ピクリン酸、ピバリン酸、プロピオン酸、コハク酸、酒石酸、チアシアン酸トシレート、及びウンデカン酸の酸付加塩であるが、これらに限定されない。塩基塩は、アンモニウム塩、ナトリウム及びカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム及びマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ジシクロヘキシルアミン塩などの有機塩基との塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ならびに例えばアルギニン、リジンなどの、しかしこれらに限定されないアミノ酸との塩を含む。
【００６４】
本発明の標的、送達の方法、用量
用語「卵内」は、本明細書で使用される場合、孵化前の卵内に包含される鳥類を指す。本発明は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、及びキジの卵を含む、任意の種類の鳥類の卵で実践されてもよいが、これらに限定されない。しかし、鳥類の卵の種類に基づいて、卵内のインキュベーション時間は、変化する。
【００６５】
参照として、産卵される鳥類の卵は、いずれの胚発達も未だ見られない段階である、不活性段階と見なされる。この段階は、ＥＤ０と呼ばれ、ＥＤ０とみなされる全ては０〜２１日のこの段階に入れられ得る。ＥＤ０における卵は、熱が胚の発達を開始させる、およそカ氏９９度でインキュベーター内に配置される。卵は、成熟し、孵化の準備が整った発達した胚ができる時点である、胚形成日１８までインキュベートされる。卵は、次に、卵が孵化してニワトリになる時点であるそれから３日後まで、つまり最長ＥＤ２１まで孵化トレーに置かれる。その後、これらのニワトリを、それらが処理される時点である、市場取引年齢まで飼育する。コブ種では孵化後の３５日間、またはロス種では孵化後の４２日間は、肥育期間と見なされ、それよりも早期であれば、家禽業界にとっては望ましくないと見なされる。
【００６６】
用語「卵内投与」は、本明細書で使用される場合、鳥類の卵殻を通して本発明の組成物を送る、特に卵殻を貫通し、卵の内部に処置を送達させる手段を指す。注入の部位は、羊膜によって画定され、本部位は、羊水及び胚自体、卵黄嚢内、卵白内、または気室内を含む、部域内であり得る。本発明の実践において、気室中への注入が好ましい。注入の機序は、重要ではないが、処置が、過度に孵化の速度を減ずることがないように、方法が、胚の組織及び器官、または胚を取り囲む胚外の膜に過度に損傷を与えないことが好ましい。
【００６７】
別の実施形態において、本発明の方法は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ及びキジ、または任意の他の家禽化された野鶏を含むがこれらに限定されない、任意の鳥類を対象として実施され得る。
【００６８】
本発明の方法によって処置される卵は、本明細書に定義される通り、インキュベーションの最初のまたは最終四半分中に卵内注入の方法によって処置される。本発明の一実施形態において、卵は、胚形成日０（ＥＤ０）〜胚形成日１８（ＥＤ１８）の間に処置される。一実施形態において、卵は、早期発達中、好ましくは約ＥＤ０〜ＥＤ４の間に処置される。一実施形態において、卵は、ＥＤ０または約ＥＤ０に処置される。一実施形態において、卵は、ＥＤ１または約ＥＤ１に処置される。一実施形態において、卵は、ＥＤ２または約ＥＤ２に処置される。一実施形態において、卵は、ＥＤ３または約ＥＤ３に処置される。一実施形態において、卵は、ＥＤ４または約ＥＤ４に処置される。一実施形態において、卵は、インキュベーションの最終四半分に処置される。一実施形態において、卵は、ＥＤ１８または約ＥＤ１８（胚形成日１８）に処置される。しかし、述べたように、これらの列挙されるインキュベーション時間は、ニワトリの卵のための時間である。他の鳥類の卵のインキュベーション時間は、変化する。当業者は、この事実を認識し、適宜調整することができよう。
【００６９】
概して、本発明の方法において使用される組成物のための適切な「有効量」または用量の選択は、用いられる組成物（複数可）の固有性に基づいてもよい。組成物中の追加の構成成分の存在も、組成物の用量及び量に影響を及ぼし得る。かかる選択、及び有効量の上方調整または下方調整は、当業者内で適切に行われる。著しく有害な副作用無しに、対象物において所望の有効性を誘発するために必要とされる組成物の量は、これらの要因に応じて変化する。好適な用量は、当業者によって容易に決定される。
【００７０】
組換え技術
本発明の方法の一実施形態において、組成物は、組換えタンパク質を含んでもよい。かかる組換えタンパク質は、タンパク質をコードするベクター及び異種挿入物から生成される可能性がある。いくつかの実施形態における異種挿入物は、本発明のアミノ酸配列をコードする１つ以上の核酸配列、例えば、配列番号１〜４、またはそれらの変異体を含む。挿入物は、例えば、当該技術分野において既知である合成のプロモーターなどの異種プロモーターを任意選択的に含んでもよい。あるいは、宿主ベクターのプロモーターは、挿入物の発現にわたり転写制御を発揮し得る。プロモーター（ベクターの選択に応じて、ネイティブまたは異種であってもよい）の好適な非限定的な例は、Ｈ６ワクシニアプロモーター、Ｉ３Ｌワクシニアプロモーター、４２Ｋポックスウイルスプロモーター、７．５Ｋワクシニアプロモーター、及びＰｉワクシニアプロモーターである。
【００７１】
本発明の方法において用いられる組成物のヌクレオチド配列をクローン化及び発現させるために使用され得る、複数の既知である方法または技術がある。例えば、配列は、制限断片として分離され得、クローニング及び／または発現ベクターにクローン化され得る。配列は、増幅、ならびにクローニング及び／または発現ベクターにクローン化されるＰＣＲでもあり得るか、またはそれらは、これらの２つの方法の組み合わせによってクローン化され得る。当該技術分野において既知である標準的な分子生物学技術は、具体的に記載されないが、概して、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎｅｔ  ａｌ（ｅｄｓ）Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌｓ．１−４  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）に記載される通りに従われ得、米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号、及び同第５，２７２，０５７号に記載される方法論に従われ得る。ポリマー鎖反応（ＰＣＲ）は、概して、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載される通りに実施される。
【００７２】
本発明の方法は、ベクター及び宿主細胞を含む、原核性及び真核性発現系の使用を包含し得、これは、本発明のヌクレオチド配列によって発現される、切断及び完全な長さの形態である両方の組換えポリペプチドを発現させるために使用されてもよい。種々の宿主発現ベクター系は、本発明の方法において用いられるポリペプチドを発現させるために用いられてもよい。かかる宿主発現系は、目的のコード配列がクローン化され、後に精製されてもよい、媒体をも表す。本発明は、適切なベクターまたはヌクレオチド配列によって形質転換または遺伝子導入されるとき、本発明のコードされるポリペプチド遺伝子生成物を発現し得る、宿主細胞をさらに提供する。かかる宿主細胞は、コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターによって形質転換される細菌（例えば、大腸菌、枯草菌、コリネバクテリウム）などの微生物；遺伝子生成物コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターによって形質転換される酵母（例えば、サッカロミセス、ピキア）；コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）によって感染される昆虫細胞システム；コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）によって感染されるか、もしくは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）によって形質転換される植物細胞システム；または哺乳類細胞（例えば、メタロチオネインプロモーター）のゲノムもしくは哺乳類ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）から得られるプロモーターを含有する組換え発現構築物を持つ哺乳類細胞システム（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）を含むが、これらに限定されない。
【００７３】
本発明の方法において用いられ得るベクターは、細菌性プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素、哺乳類ウイルス、哺乳類染色体、及びコスミド及びファージミドを含むがこれらに限定されない、プラスミド及びバクテリオファージ遺伝子要素から得られるものなどの、それらの組み合わせから得られることができるが、これらに限定されない。
【００７４】
本発明の方法において用いられ得るベクターは、ポリペプチドの発現のために使用され得る。概して、本発明のベクターは、発現されるポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドに動作可能に連鎖されるシス作用調節部域を含む。調節部域は、恒常的または誘導可能であってもよい。適切なトランス作用因子は、宿主中への導入に際し、インビトロ翻訳システムによる宿主、補足ベクター、またはベクター自体によって供給される。
【００７５】
本発明の方法において用いられ得るベクターは、ポリペプチドが、抗生物質耐性、制限部位、リボソーム結合部位、翻訳エンハンサー（転写後のｍＲＮＡ安定性のためのステムーループ構造の形成が可能である配列）、終止コドンが欠如するアミノ酸をコードする配列、及び細菌性コートタンパク質をコードする配列を与える遺伝子をコードし得る、複製配列の起点、１つ以上のプロモーター、抗生物質耐性遺伝子、リーダーまたは信号ペプチド配列、種々のタグ配列、スタッファー配列を含むが、これらに限定されない、発現または表示ベクター中に典型的に含まれる任意の要素を含み得る。
【００７６】
本発明の方法において使用するためのペプチドの分離を促進するために、融合ポリペプチドは作製され得、ペプチドまたはそれらの特有の断片は異種ポリペプチドに連鎖され、それは、アフィニティークロマトグラフィによる分離を可能にする。好ましくは、融合ポリペプチドは、当業者に既知である発現系のうちの１つを使用して作製される。例えば、ペプチドまたはそれらの特有の断片をコードするポリヌクレオチドは、それの５′または３′のいずれかの末端において、異種ポリペプチドをコードする核酸に連鎖される。核酸は、融合ポリペプチドの生成を可能にするために適当なコドン読み枠中に連鎖され、アミノ及び／またはペプチドまたはそれらの部分のカルボキシ終端が、融合ポリペプチドとして抗原の単純化された回収を可能にする異種ポリペプチドに融合される。融合ポリペプチドは、精製中に、抗原が分解されることも防ぐ。いくつかの事例において、精製後に、異種ポリペプチドを除去することが望ましい場合がある。したがって、融合ポリペプチドが、ペプチドと異種ポリペプチドとの間の連鎖部分において切断部位を含むことも企図される。切断部位は、その部位においてアミノ酸配列特有の酵素によって切断されるアミノ酸配列からなる。企図されるかかる切断部位の例として、エンテロキナーゼによって切断されるエンテロキナーゼ切断部位、因子Ｘａによって切断される因子Ｘａ切断部位、及びＧＥＮＥＮＡＳＥ（ＧＥＮＥＮＡＳＥは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓの商標である）によって切断されるＧＥＮＥＮＡＳＥ切断部位が挙げられる。
【００７７】
ペプチドまたはそれらの特定の断片を生成するための原核生物発現系の例は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子融合システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）である。融合タンパク質を生成するための別の方法は、ポリヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列である、抗原をコードするｃＤＮＡとインフレームを連鎖させる方法である。該タグは、金属アフィニティークロマトグラフィ、好ましくはニッケルアフィニティークロマトグラフィによる融合ポリペプチドの精製を可能にする。Ｘｐｒｅｓｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）は、ポリヒスチジン−ポリペプチド融合タンパク質を作製及び分離するために利用可能な商業用キットの例である。
【００７８】
また、ｐＭＡＬ融合及び精製システム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）は、融合ポリペプチドを作製するための手段の別の例であり、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）は、ペプチドまたはそれらの特有の断片に融合される。ＭＢＰは、アミロースアフィニティークロマトグラフィによる融合ポリペプチドの分離を促進する。
【００７９】
かかる融合を発生させるための他の融合パートナー及び方法は、容易に利用可能であり、当業者に既知である。該融合物は、本発明の方法において使用される組成物としてそれらの全体が使用され得るか、またはそれらは、ペプチドと異種ポリペプチドとの間の連鎖部分において切断され得る。
【００８０】
あるいは、融合タンパク質は、本発明の方法において使用されるペプチドまたはそれらの特有の断片の半減期を伸長するための役割を果たし得る。好適な融合タンパク質の例として、抗体または抗体のＦｃ部分を含むそれらの断片が挙げられる。アルブミンも、トランスフェリンがし得るように、本発明の方法において用いられる組成物の半減期を伸長するための融合パートナーとしての役割を果たし得る。他のタンパク質は、本発明の方法において用いられる組成物の半減期を伸長するための融合パートナーとして用いられることができ、それらは、当業者に既知である。
【００８１】
本発明の方法において用いられるポリペプチドを融合パートナーと融合する方法は、架橋または生物結合体化としても既知である化学結合を含み得る。架橋方法の標的は、第一級アミン、カルボキシル、スルフヒドリル、及びカルボニルのタンパク質官能基を含む。好適な架橋剤の例として、スベリン酸ジサクシンイミジル（ＤＤＳ）及び（スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる。本発明の方法において用いられるポリペプチドはまた、遺伝子的結合の手段によって融合パートナーに結合され得る。これは、本来２つの別個のタンパク質をコードする２つの別個の遺伝子が、結合されるとき、起こる。この融合遺伝子の翻訳は、融合またはキメラタンパク質として既知である単一のポリペプチドをもたらす。化学的または遺伝子的結合によって融合タンパク質を作製する方法は、容易に当業者に既知であり、本明細書に具体的に開示されるものに限定されるべきではない。
【００８２】
全体的に、本発明は、基質を用いた処置のＥＤ０〜ＥＤ４及び胚のインキュベーション時点の約最終四半分を示し、市場取引年齢のトリにおいて、驚くべきかつ予想外の成績向上をもたらす方法を提供する。これらの驚くべき結果は、家禽業界の商業価値のために用いられ得る。加えて、本方法は、胸筋の増加と同時に脚筋の増加が、歩行問題及び関連問題を有さないより頑健及びより健康なトリをもたらすことをさらに提供する。本明細書で例証される全体的な筋重量の増量は、従来、家禽業界において見られることがなかった増加を示す。
【実施例】
【００８３】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示され、かつ裏付けられる。しかし、これらの実施例は、本発明の範囲をさらに限定するものと決して見なされるべきではない。反対に、当業者は、本発明の真意及び／または特許請求の範囲から逸脱することなく、他の実施形態、修正、及び本発明の同等物が存在することを容易に理解されよう。
【００８４】
実施例
実施例１：３５日目ブロイラーニワトリの成績において、卵内に与えられたＦＧＦ−２またはＩＧＦ−１の有効性
この調査の目的は、胚形成日４（ＥＤ４）における気室中への線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２）またはインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）の卵内投与後の３５日目胸重量及び体重を評価することであった。
【００８５】
卵内段階：
この調査は、４つの処置群、Ｔ０１（ＰＢＳ対照、最大４０羽のトリが収容された）、Ｔ０２（高い用量ＩＧＦ、最大４０羽のトリが収容された）、Ｔ０３（高い用量のＦＧＦ−２、最大４０羽のトリが収容された）、及びＴ０４（極めて高い用量のＦＧＦ−２、最大３０羽のトリが収容された）を含んだ。表１を参照されたい。
【００８６】
【表２】
2016511768.tif 000004
【００８７】
処置を、以下の手順を使用してＥＤ４に卵内投与した。
【００８８】
１．各卵の気室をキャンドリングにより位置確認し、ペンで印をつけた。
【００８９】
２．１８Ｇの針を使用して、円によって印をつけた領域の真ん中に穴を穿孔した。
【００９０】
３．指定の処置を、中心に挿入された１８Ｇの１／４インチ針またはプラスチックのピペットチップを備えるＧｉｌｍａｎのピペットを使用して、設けられた穴の中に滴下することによって約１００μＬ容量を投与した。
【００９１】
４．設けられた穴を、接着ガンからの熱接着剤を用いて封着した。
【００９２】
５．卵を、インキュベーターに戻した。
【００９３】
全ての卵を、商業用インキュベーターに置いた。指定の処置を、胚形成日（ＥＤ４）に各卵の気室中に投与した。処置の投与に続いて、卵を、無作為の方法で、インキュベーター内で指定の平面及びレベルに戻した。ＥＤ１８に、卵をキャンドリングし、生存可能な卵を指定の孵化バスケットに移した。
【００９４】
ＥＤ１８に、各処置群から各３０個の卵を集めた。大胸筋胸筋を、抽出した。胸筋重量を、卵毎に記録した。
【００９５】
肥育段階：
孵化（０日目）において、全ての残存する生存可能なニワトリの体重を個別に計量し、首にタグを付けて、全てのトリを単一の平飼い鶏舎内で混合した。トリは、調査中にわたり、適宜飼料及び水を摂取することができた。
【００９６】
観察は、通常の群れ状態、照明、水、飼料、換気、及び予期しない事象が起こる状態で１日２回実行された。全ての死該及び間引かれたトリの体重を計量し、トリの性別及び死因を決定するために検死した。
【００９７】
７日目、１４日目、２８日目、及び３５日目に、個別にトリの体重を記録した。３５日目の個別の体重の収集に続いて、全ての生存するトリを安楽死させ、骨無し、皮無しの左胸の半分を除去して、重量を計量した。全ての胸重量を記録した。性別も決定し、トリ毎に記録した。
【００９８】
分析
分析に対する一次変数は、胸重量及び平均日増量であった。分析に対する二次変数は、死骸体重、死骸体重の生体重に対する比率、及び胸重量の死骸体重に対する比率を含む。体重のデータを、繰り返される測定のための混合線型モデルを使用して統計学的に分析した。モデルは、処置、調査日、及び処置と調査日との相互作用に対する固定効果を含んだ。変量効果は、処置中の動物及び残余誤差内を含んだ。調査期間（０〜１４、２８〜３４、及び０〜３４）の体重及び平均日増量に対する処置最小二乗平均（ＬＳ平均）を、体重に対する繰り返される測定モデルから算定した。最小二乗平均の標準誤差を算定し、９０％の信頼区間を構築した。３５日目体重及び死骸データ（胸重量、死骸体重、胸重量の死骸体重に対する比率、死骸体重の生体重に対する比率）を、混合線型モデルを使用して分析した。モデルは、性別、処置、及び性別と処置との相互作用に対する固定効果、ならびに残余誤差に対する変量効果を含有した。最小二乗平均を、処置平均の算定として使用した。最小二乗平均の標準誤差を算定し、９０％の信頼区間を構築した。
【００９９】
結果：
３５日目の最小二乗平均体重は、Ｔ０１〜Ｔ０４に対してそれぞれ、２０９７．８ｇ、２１３６．３ｇ、２２２２．７ｇ、及び２０９２．５ｇであった。３５日目大胸筋重量の分析は、表２に示される。
【０１００】
【表３】
2016511768.tif 000005
【０１０１】
この調査は、ＩＧＦ及びＦＧＦ−２の卵内投与を評価した。処置を、ＥＤ４に気室中に卵内投与した。胚発生のこの段階でのこの経路によるＩＧＦ（２００ｎｇ）の投与は、３５日目の胸筋重量において７．０％の増加をもたらした。同一条件下での低用量のＦＧＦ−２（４０ｎｇ）の投与は、３５日目の胸筋重量において７．２％の増加をもたらした。しかし、３倍の用量のＦＧＦ−２（１２０ｎｇ）の投与は、３５日目胸筋重量において１．１％の減少をもたらした。したがって、ＥＤ４に卵の気室中へ卵内投与された２００ｎｇのＩＧＦまたは４０ｎｇのＦＧＦ−２は、生理食塩水対照群と比較して、３５日目の総胸筋重量において≧７．０％の増加をもたらした。
【０１０２】
実施例２：筋発達及びＥＤ１８胚胸筋重量における、卵内に与えられたＦＧＦ−２またはＩＧＦの有効性
この調査の目的は、筋発達及びＥＤ１８胚胸筋重量における、ＥＤ４に卵内に与えられたヒトＦＧＦ−２またはＩＧＦ−１の有効性を評価することであった。
【０１０３】
この調査は、５つの処置群：Ｔ０１（ＰＢＳ対照）、Ｔ０２（２００ｎｇＩＧＦ）、Ｔ０３（１００ｎｇＩＧＦ）、Ｔ０４（５０ｎｇＩＧＦ）、及びＴ０５（４０ｎｇＦＧＦ）を含む。下記の表３を参照されたい。
【０１０４】
【表４】
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【０１０５】
処置（表３）を、以下の手順を使用して、ＥＤ４に卵内投与した。
【０１０６】
１．各卵の気室をキャンドリングにより位置確認し、ペンで印をつけた。
【０１０７】
２．１８Ｇの針を使用して、円によって印をつけた領域の真ん中に穴を穿孔した。
【０１０８】
３．指定の処置を、中心に挿入された１８Ｇの１／４インチ針またはプラスチックのピペットチップを備えるＧｉｌｍａｎのピペットを使用して、設けられた穴の中に滴下することによって約１００μＬ容量を投与した。
【０１０９】
４．設けられた穴を、接着ガンからの熱接着剤を用いて封着した。
【０１１０】
５．卵をインキュベーターに戻した。
【０１１１】
全ての卵を、商業用インキュベーターに置いた。指定の処置をＥＤ４に各卵の気室中に投与した。処置の投与に続いて、卵を、無作為の方法で、インキュベーター内で指定の平面及びレベルに戻した。ＥＤ１８に、各処置群から最大３０個の卵を除去した。体重を記録し、大胸筋を採取した。胸筋重量を、卵毎に記録した。
【０１１２】
分析
分析の一次変数は胸重量であった。胸重量データを、混合線型モデルを使用して統計学的に分析した。モデルは、処置に対する固定効果、及び残余誤差に対する変量効果を含有した。最小二乗平均を、処置平均の算定として使用した。最小二乗平均の標準誤差を算定し、９０％の信頼区間を構築した。先験的対比を使用して、Ｆｉｓｈｅｒの保護つきＬＳＤを使用した処置差異を査定したが、処置の有効性が有意であることが条件であった。処置差異を、１０％の有意水準（Ｐ＜０．１０）で査定した。
【０１１３】
結果
ＥＤ１８の胸筋重量の分析は、表４に示される。先験的対比は、表５に示される。
【０１１４】
【表５】
2016511768.tif 000007
【０１１５】
【表６】
2016511768.tif 000008
【０１１６】
ＥＤ１８のＬＳ平均胸筋重量は、Ｔ０１〜Ｔ０５に対してそれぞれ、０．１９、０．２４、０．２５、０．２５、及び０．２４ｇであった。全てのＩＧＦ（Ｔ０２〜Ｔ０４）及びＦＧＦ（Ｔ０５）の用量群は、生理食塩水対照群（Ｔ０１）と比較して、著しくより高いＥＤ１８胸筋重量を有した。加えて、１００ｎｇ（Ｔ０３）のＩＧＦでは、４０ｎｇ（Ｔ０５）のＦＧＦと比較して、著しくより高いＥＤ１８胸筋重量を有した。ＩＧＦの群の中ではＥＤ１８胸筋重量において著しい差異はなかった。
【０１１７】
ＥＤ４に気室中へ卵内投与された５０〜２００ｎｇ／卵のＩＧＦは、ＥＤ１８の胸筋量において２８〜３３％の増加をもたらした。ＥＤ４に気室中へ卵内投与された４０ｎｇ／卵のＦＧＦは、ＥＤ１８の胸筋量において２４％の増加をもたらした。
【０１１８】
実施例３：筋発達及びＥＤ１８胚胸筋重量における、ＥＤ４に卵内に与えられたＦＧＦ−２の有効性
この調査の目的は、遺伝子の発現上昇及び筋肉の過形成における、ＥＤ４に卵内投与されたヒトＦＧＦ−２の有効性を評価することであった。
【０１１９】
この調査は、４つの処置群：Ｔ０１（ペニシリン−ストレプトマイシンを有するＰＢＳ対照）、Ｔ０２（ＦＧＦ−２、１０ｎｇ）、Ｔ０３（ＦＧＦ−２、２０ｎｇ）、及びＴ０４（ＦＧＦ−２、４０ｎｇ）を含む。
【０１２０】
【表７】
2016511768.tif 000009
【０１２１】
処置を、以下の手順を使用してＥＤ４に卵内投与した。
【０１２２】
１．各卵の気室をキャンドリングにより位置確認し、ペンで印をつけた。
【０１２３】
２．１８Ｇの針を使用して、円によって印をつけた領域の真ん中に穴を穿孔した。
【０１２４】
３．指定の処置を、中心に挿入された１８Ｇの１／４インチ針またはプラスチックのピペットチップを備えるＧｉｌｍａｎのピペットを使用して、設けられた穴の中に滴下することによって約１００μＬ容量を投与した。
【０１２５】
４．設けられた穴を、接着ガンからの熱接着剤を用いて封着した。
【０１２６】
５．卵を、インキュベーターに戻した。
【０１２７】
全ての卵を、商業用インキュベーターに置いた。指定の処置をＥＤ４に各卵の気室中に投与した。処置の投与に続いて、卵を、インキュベーター内で指定の平らかつレベルに戻した。ＥＤ１８に、各処置群から最大３０個の卵を除去した。体重を記録し、大胸筋を採取した。胸筋重量を卵毎に記録し、胸組織を病理組織学及びゲノム分析のために採取した。
【０１２８】
インキュベーター内の２つの平面上の卵に、一方方向処置構造を用いて、完全な無作為的な仕様に従って処置を供した。
【０１２９】
関連変数測定体重及びＥＤ１８胸筋
ＥＤ１８に、各処置群から各最大３０個の卵を集めた。胚体重を個別に記録し、次に大胸筋を抽出した。各胚の大胸筋の左胸筋の重量を計量し、記録した。
【０１３０】
遺伝子分析
ＲＮＡを、胸筋組織から抽出した。ＲＮＡ試料を、グリピカン−１及びミオゲニン遺伝子発現についてｑＰＣＲによって分析した。プライマーは、表７に列挙される。
【０１３１】
【表８】
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【０１３２】
増幅及び検出を、Ｍｘ３０００Ｐシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及びＲＴ2ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって実施した。個別転写レベルを、ＧＡＰＤＨの転写レベルに正規化した。
【０１３３】
結果：遺伝子発現
ＭｙｏＤ、シンデカン４、ミオゲニン、及びグリピカン−１の遺伝子発現データは、図５〜８に示される。これらのデータは、定量的実時間ＰＣＲによって測定される転写の遺伝子発現レベルを示す。各棒は、「Ｃ」、「Ｌ」、「Ｍ」、及び「Ｈ」の処置群からの３つまたは４つの胚の等しいＲＮＡ量を有するプールした試料を表す。ｑＲＴ−ＰＣＲに使用されたプライマーは、表７に列挙される。ＲＮＡの定量及びプール情報は、表８に示される。
【０１３４】
【表９−１】
2016511768.tif 000011
【０１３５】
【表９−２】
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【０１３６】
結果
ＥＤ４に気室中へ卵内投与された１０〜４０ｎｇのＦＧＦ−２は、対照群と比較して、ＥＤ１８の胸筋重量において最大２６％の増加をもたらした。体重のパーセンテージとしても胸筋は、著しく増加した。ＥＤ１８の体重は、ＥＤ４におけるＦＧＦ−２の卵内投与の影響を受けなかった。胸重量における形態的な増加は、１．５〜２倍近く上昇したグリピカン−１及びミオゲニンなどの、生体指標によって実証された。
【０１３７】
ＥＤ１８胚に対する平均体重は、Ｔ０１〜Ｔ０４に対してそれぞれ、２８．９９ｇ、２９．１３ｇ、２８．９８ｇ、及び２８．６８ｇであった。ＥＤ１８の平均左胸筋重量は、Ｔ０１〜Ｔ０４に対してそれぞれ、０．１９５ｇ、０．２３３ｇ、０．２４７ｇ、及び０．２４８ｇであった。全てのＦＧＦ−２の処置群（Ｔ０２〜Ｔ０４）は、Ｔ０１の対照群と比較して、著しくより重い胸筋を有した。大胸筋（左筋肉×２）によって表された体重のパーセンテージは、Ｔ０１〜Ｔ０４に対してそれぞれ、１．３４、１．６１、１．７０、及び１．７３％であった。胸筋は、対照群（Ｔ０１）と比較して、全てのＦＧＦ−２の用量群（Ｔ０２〜Ｔ０４）に対するＥＤ１８における体重が著しくより高いことを表した。ＭｙｏＤ及びグリピカン−１遺伝子を上昇させた。
【０１３８】
胸筋組織の増加の有利性に加えて、胚体重、及びより具体的には筋重量の全体的な増加は、ウイルスワクチンの製造費削減に深い意味を有するであろう。筋肉及び線維芽細胞が、互いに関連しあっているため、胚毎の増加した筋肉の採取は、増加した線維芽細胞の採取を意味するであろう。卵毎の線維芽細胞が多いほど、ウイルスワクチンの生成物の線維芽細胞中で成長するウイルスを成長させるために必要とされる卵がより少ないことを意味するであろう。
【０１３９】
この実施例は、それぞれの転写のＲＮＡレベルを測定し、ＧＡＰＤＨなどの既知であるハウスキーピング遺伝子との比較によって、胸筋組織中のＭｙｏＤ、ミオゲニン、シンデカン、及びグリピカン−１などのタンパク質の転写レベルを測定することによって鳥類の増加した成長を決定する方法を示す。
【０１４０】
この実施例は、改善された血管供給、及びそれにより市場取引年齢のトリ（孵化後５週間）における筋壊死を引き起こすことがない、生体指標によって測定することによりＥＤ１８胚における過形成の筋繊維を測定する方法をさらに提供する。
【０１４１】
実施例４：標準商業用成長条件下での、雄及び雌コブ５００のブロイラーニワトリの３３日目における、ＥＤ０及びＥＤ４に卵内投与されたＩＧＦ−１及びＦＧＦ−２の評価
この調査の目的は、３用量レベルでＥＤ０またはＥＤ４においてＩＧＦ−１及びＦＧＦ−２を卵内投与された、孵化後３３日目の雄及び雌ブロイラーニワトリの健康成績における標準商業用成長条件の影響を評価することであった。評価は、体重増量、飼料要求、及びプロセス歩留まりを含む。
【０１４２】
ブロイラーニワトリが典型的に飼育される条件を最も良好に模倣する、標準商業用成長条件は、特に米国南部の全域において使用された。
【０１４３】
【表１０】
2016511768.tif 000013
【０１４４】
処置を、以下の手順を使用してＥＤ０またはＥＤ４に卵内投与した。
【０１４５】
１．各卵の気室をキャンドリングにより位置確認し、ペンで印をつけた。
【０１４６】
２．１８Ｇの針を使用して、円によって印をつけた領域の真ん中に穴を穿孔した。
【０１４７】
３．指定の処置を、中心に挿入された１８Ｇの１／４インチ針またはプラスチックのピペットチップを備えるＧｉｌｍａｎのピペットを使用して、設けられた穴の中に滴下することによって約１００μＬ容量を投与した。
【０１４８】
４．設けられた穴を、接着ガンからの熱接着剤を用いて封着した。
【０１４９】
５．卵をインキュベーターに戻した。
【０１５０】
この調査において、孵化段階の間中、処置を、一方方向処置構造を用いて、完全な無作為的な仕様に従って、インキュベータートレー及びカラムに供した。
【０１５１】
孵化日（０日目）において、ニワトリを性別分別し、全体区画因子としての性別、及び補助区画因子としての処置による分割区画仕様に従って、肥育段階用の鶏舎及び処置に割り振った。全体区画仕様を、一方方向処置構造を有する仕様に完全に無作為化した。総数１０羽のトリを、処理のために各鶏舎から選択した。処置群及び性別内において、トリを、手順を定位置で使用するその群に指定された鶏舎に無作為に割り当てた。ニワトリを、１日目のワクチン接種（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓワクチンを、噴霧キャビネットを使用して投与した）後、配置した。トリの密度、温度、照明、飼料供給機、及び水の空間を、全ての処置群において同様にした。
【０１５２】
全てのトリは、単一の共通の初生雛、育雛、及び成鶏用の基礎飼料ダイエットを受けた。飼料を、調査中にわたって（予定された処理時間のおよそ１２時間前まで）、適宜提供した。全てのトリは、単一の共通の初生雛、育雛、及び成鶏用の基礎飼料ダイエットを受けた。１日目から調査終了まで鶏舎に追加及び鶏舎から除去された飼料を計量し、記録した。水を、調査中にわたって、適宜提供した。
【０１５３】
７日目に、全ての処置のための全ての鶏舎を調整した。各鶏舎の中に含めるトリの総数を、全ての処置及び全ての鶏舎の中で健康で利用可能なトリ（明らかに劣等または病気のトリを可能な限り除去した）の最多数に基づいて決定した。全ての除去されたトリを、計量し、各鶏舎に対する死亡率シートに記録した。
【０１５４】
トリを、鶏舎毎に、およそ１、７、１４、２１、２８日目、及び調査終了日（３３日目）に計量した。各鶏舎に残存する飼料を、およそ７、１４、２１、２８日目、及び調査終了日（３３日目）に計量し、記録した。１〜７、１〜１４、１〜２１、１〜２８、及び１〜３３日間の飼料摂取量を計算した。飼料を、初生雛から育雛への１４日目、及び育雛から成鶏への２８日目に変更した。
【０１５５】
鶏舎単位、各測定日のトリの平均重量を要約した。各測定期間の鶏舎に対する総飼料消費を生存するトリの総重量で割って、平均飼料要求を計算した。鶏舎中の総飼料消費を、生存するトリの総重量、及び死亡またはその鶏舎から除去されたトリの重量で割って、調整飼料要求を計算した。
【０１５６】
３３日目において、およそ１，５６０羽のトリ（無作為化計画によって決定された無作為の１０羽のトリ／鶏舎）に、個別にタグを付け、２日間のうちに処理して、最終体重を測定した。トリを、標準業界の各手順の通りに処理して、胸肉及び骨付きももを、除去し、計量して、記録した。処理された各トリの２つの骨付きももを、収集した。トリ個別に収集された処理データは、生体重、温死骸体重、胸重量、浅胸筋重量、ささみ（深胸筋）重量、及び骨付きもも重量を含んだ。
【０１５７】
分析に対する一次変数は、胸重量、平均日増量、及び飼料要求であった。３３日目体重及び死骸データ（温死骸体重、胸重量）を、混合線型モデルを使用して統計学的に分析した。モデルは、性別、処置、及び性別と処置との相互作用に対する固定効果を含んだ。変量効果は、性別内のブロック、性別の範囲内のブロックと処置との相互作用（鶏舎期間）、及び誤差を含んだ。飼料摂取量（１〜３３日目）、飼料要求（１〜３３日目）、及び平均日増量（１〜３３日目）を、混合線型モデルを使用して分析した。モデルは、性別、処置、及び性別と処置との相互作用に対する固定効果を含有した。変量効果は、性別内のブロック及び誤差を含んだ。最小二乗平均を、処置平均の算定として使用した。最小二乗平均の標準誤差を算定し、９０％の信頼区間を構築した。処置差異を、１０％の有意水準（Ｐ＜０．１０）で査定した。
【０１５８】
処置群毎の６つの鶏舎は、０．１０の有意水準で未処置群よりも処置される群に対して、胸重量において４％の改善を示す少なくとも８８％の体力、飼料要求において４％の改善を示す少なくとも９０％の体力、平均日増量における４％の改善のための少なくとも９０％の体力を求められた。
【０１５９】
結果
トリの健康及び死亡率は、商業用ブロイラーニワトリ生産にとっては予想された範囲内であった。異常な有効性は観察されなかった。
【０１６０】
深胸筋重量の分析は、表１０に示される。総胸重量（浅胸筋肉及び深胸筋肉）の分析は、表１１に示される。骨付きももの重量の分析は、表１２に示される。
【０１６１】
【表１１−１】
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【０１６２】
【表１１−２】
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【０１６３】
【表１２−１】
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【０１６４】
【表１２−２】
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【０１６５】
【表１３−１】
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【０１６６】
【表１３−２】
2016511768.tif 000019
【０１６７】
雌ドリにおいて、ＥＤ０に投与された１０ｎｇのＦＧＦ−２は、総胸筋（４．５％）及び深胸筋（５．９％）の著しい増加をもたらした。深胸筋における著しい増加は、ＥＤ０における４０ｎｇのＦＧＦ−２（５．１％）、ＥＤ０における２００ｎｇのＩＧＦ−１（５．９％）、及びＥＤ４における１００ｎｇのＩＧＦ−１（６．５％）の投与後の雌ドリにおいても観察された。
【０１６８】
雄ドリにおいて、ＥＤ０に投与された５０ｎｇのＩＧＦ−１は、総胸筋重量、深筋の重量、及び骨付きもも重量の著しい増加をもたらした（各々、６．８％の増加）。深胸筋（５．８％）及び骨付きもも（４．９％）における著しい増加は、ＥＤ４における１０ｎｇのＦＧＦ−２の投与後の雄ドリにもおいても観察された。雄ドリへＥＤ０に投与された１００ｎｇのＩＧＦ−１は、深胸筋（６．２％）及び骨付きもも重量（５．６％）の著しい増加をもたらした。雄の骨付きもも重量における著しい増加は、ＥＤ０における１０ｎｇのＦＧＦ−２（４．４％）、ＥＤ０における４０ｎｇのＦＧＦ−２（４．６％）、ＥＤ４における２０ｎｇのＦＧＦ−２（６．５％）、ＥＤ０における１００ｎｇのＩＧＦ−１（５．６％）、及びＥＤ４における１００ｎｇのＩＧＦ−１（４．２％）の投与後にも観察された。
【０１６９】
結論として、性別混合に対する全体的な体重は、対照群と比較して、数値的にプラスの増減率を有した。１０ｎｇのＦＧＦ−２、及びＥＤ０、及び５０ｎｇのＩＧＦ−１の投与は、対照群に勝って、筋肉量において最も高い増加を生じさせた。
【０１７０】
加えて、胸筋の増加と同時に脚筋の増加は、歩行問題を有さない、より頑健及びより健康なトリをもたらす。これは、大きなトリが飼料供給機周辺を動き回って、飼料を取得することも可能にし、それにより病気及び飢えを防ぐ。この方法において、大きいトリ程、著しい健康効果を有する。
【０１７１】
筋肉の増加に対する追加の利点は、トリが、５週間未満で生産目標の筋重量に達し、例えば、４週間までに生産目標の筋重量に達するため、労働者の住宅、飼料、及び水の経費削減につながる。
【０１７２】
実施例５：肥育時の雄及び雌コブ５００ブロイラーニワトリにおける、ＥＤ１８に卵内投与されたＩＧＦ−１またはＦＧＦ−２の評価。
【０１７３】
【表１４】
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【０１７４】
表１３による処置は、以下の手順を使用して、ＥＤ１８に卵内投与される。
【０１７５】
１．各卵へ注入するための適切な構造、好ましくはＥＤ１８の羊膜は、位置確認される。
【０１７６】
２．印をつけた領域の真ん中に穴を穿孔する。
【０１７７】
３．指定の処置を、量は変化する可能性があるが、設けられた穴の中に滴下することによって約１００μＬを投与する。
【０１７８】
４．設けられた穴を、接着ガンからの熱接着剤を用いて封着する。
【０１７９】
５．卵をインキュベーターに戻す。
【０１８０】
卵内投与注入は、手動、または卵殻を貫通し得、処置物質を卵の内部に送達し得る装置を使用することによって実行される可能性がある。
【０１８１】
トリは、敷き藁を寝床として使用するコンクリート床の鶏舎中で環境制御された設備内部に収容される。トリは、孵化場でＭａｒｅｋｓワクチン接種を受けない。Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ（ＮＣＢ）ワクチンを、ニワトリが孵化すると直後に噴霧キャビネットを使用して投与する。他のワクチン接種または処置（表１３に示される以外）を、調査中に投与することはない。
【０１８２】
水及び飼料を、調査中にわたって、適宜提供する。ニワトの飼料供給トレーを、ほぼ最初の４日間、各鶏舎に配置する。全てのトリは、単一の共通した初生雛、育雛、及び成鶏用の基礎飼料ダイエットを受ける。それらを、孵化直後（０日目）に、単一の共通の初生雛用の基礎飼料ダイエットに配置する。全てのダイエットの変化は、全ての鶏舎に対して、同一の時間に行われる。０日目から調査終了まで鶏舎に追加及び鶏舎から除去された飼料を計量し、記録する。試験設備、鶏舎、及びトリは、通常の群れ状態、照明、水、飼料、換気、及び予期しない事象が起こる状態で少なくとも１日２回観察される。異常状態または異常行動が、１日２回の観察のいずれにおいても指摘された場合、それらは文書に記録される。
【０１８３】
各鶏舎内に残ったトリ及び飼料を、７日目に開始して週単位で鶏舎毎に計量し、記録する。鶏舎に入れた飼料の量の重量から、トリを計量する時点での、飼料供給器に残っている飼料の量を差し引くことによって、各体重測定期間の各鶏舎の飼料の摂取量を決定する。鶏舎単位、各測定日のトリの平均重量を、要約する。各測定期間の鶏舎に対する総飼料消費を生存するトリの総重量で割って、平均飼料要求を計算する。鶏舎中の総飼料消費を、生存するトリの総重量、及び死亡またはその鶏舎から除去されたトリの重量で割って、調整飼料要求を計算する。
【０１８４】
選択された孵卵器のトレー及びスタックを、無作為化計画に従って、処置に割り振る。処置を、一方方向処置構造を有する、完全に無作為化された仕様に従って孵卵器トレー及びスタックに割り当てる。各処置を、１３０個の卵を各々含有する１０個のトレーに割り当て、各処置の総合計の卵が１３００個となる。調査のこの段階での処置に対する実験単位は、トレーとスタックとの組み合わせである。
【０１８５】
肥育段階中、ニワトリを、無作為化計画に従って、処置及び鶏舎に割り振る。孵化日（０日目）において、ニワトリを、全体区画因子としての性別、及び補助区画因子としての処置による分割区画仕様に従って、性別分別し、鶏舎及び処置に割り振った。ブロックを、検死日までに性別及び処置の均衡を保つように、検死日に無作為に割り当てる。
【０１８６】
分析に対する一次変数は、胸重量、平均日増量、及び飼料要求となる。死骸データ（最後の生体重、温死骸体重、死骸構成要素、及び構成要素の温死骸体重に対する比率）を、混合線型モデルを使用して分析する。モデルは、性別、処置、検視日、及びこれらの有効性の全ての相互作用に対する固定効果を含有する。変量効果は、ブロック、ブロックと性別との相互作用、ブロックと処置との相互作用、ブロックと性別と処置との相互作用（鶏舎期間）、及び残余を含む。
【０１８７】
体重のデータを、繰り返される測定のための混合線型モデルを使用して分析する。モデルは、性別、処置、検視日、及びこれらの有効性の全ての相互作用に対する固定効果を含む。変量効果は、ブロック、ブロックと性別との相互作用、ブロックと処置との相互作用、ブロックと性別と処置との相互作用、及び残余を含む。調査期間及び週毎の期間に対する平均日増量を、体量用の統計学的モデルを使用して各処置群毎に算定する。
【０１８８】
飼料摂取量（０〜３５日目）、飼料要求（０〜３５日目）を、混合線型モデルを使用して分析する。モデルは、性別、処置、及び性別と処置との相互作用に対する固定効果を含有する。変量効果は、ブロック、ブロックと性別との相互作用、ブロックと処置との相互作用、ブロックと性別と処置との相互作用、及び残余を含む。
【０１８９】
最小二乗平均を、上記のモデルに対する処置平均の算定として使用する。最小二乗平均の標準誤差を算定し、９０％の信頼区間を構築する。先験的対比を使用して、処置差異を査定するが、処置に関連する有効性のうちの少なくとも１つが有意であることが条件である。目的の比較は、Ｔ０１対全ての他の処置を含む（性別に関連した処置の著しい有効性がある場合、繰り返される測定モデルに対する時点及び性別の範囲内において）。処置差異を、１０％の有意水準（Ｐ＜０．１０）で査定する。
【０１９０】
トリを、安楽死させ、計量、及び記録する。胸肉及び骨付きももを除去し、計量、及び記録する。生体重、温死骸体重、温骨無し、皮無し胸、浅胸筋及びささみ（深胸筋）、ならびに温骨付きもも重量を含む処理データを、トリ個別に収集する。
【０１９１】
実施例６：ＥＤ１８胚胸筋重量における、卵内投与されたニワトリ線維芽細胞成長因子の有効性。
【０１９２】
この調査は、ｈＦＧＦ−２と比較した、Ｅ１８の胸筋重量におけるニワトリ線維芽細胞成長因子（ｃＦＧＦ：配列番号３）の有効性を調査するために考案された。この調査は、対照群に対して、ＥＤ０において卵内投与される高用量及び低用量のｃＦＧＦ及びヒトＦＧＦ（ｈＦＧＦ２）を比較する。投与方法は、ＥＤ０に直接的に卵内の気室上で行われる。
【０１９３】
媒体対照は、２０ｍＭのクエン酸塩緩衝液ｐＨ６＋ショ糖＋ＥＤＴＡ＋メチオニン＋Ｔｗｅｅｎ−８０を含む。コブ及びロス種の両方の卵を、この調査において使用した。
【０１９４】
【表１５】
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【０１９５】
ＥＤ１８に、各対照及び処置群の全ての生存可能な卵を安楽死させ、大胸筋を抽出して、計量した。筋肉を組織学のために収集し、筋肉遺伝子生体指標のためにＲＮＡを抽出した。
【０１９６】
データを以下の通り分析し、胸重量を混合線型モデルを使用して分析した。モデルは、処置の固定効果、及び残余誤差に対する変量効果を含有した。最小二乗平均を、処置平均の算定として使用した。最小二乗平均の標準誤差を算定し、９０％の信頼区間、及び構築した。先験的対比を使用して、Ｆｉｓｈｅｒの保護つきＬＳＤを使用した処置差異を査定したが、処置の有効性が有意であることが条件であった。処置差異を、１０％の有意水準（Ｐ＜０．１０）で査定した。
【０１９７】
【表１６】
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【０１９８】
要約：
この調査は、コブ及びロスのトリの血統が、両方ともにニワトリＦＧＦによって胚形成日１８において胸筋の著しい増加を示すことを示した。用量に関連する有効性が、指摘された。
【０１９９】
実施例７：３５日ブロイラーニワトリ胸筋重量における、卵内に与えられたニワトリＦＧＦ−２の有効性
この調査は、市場取引年齢に成熟したトリ（コブ５００種）の胸筋重量におけるニワトリ線維芽細胞成長因子（ｃＦＧＦ：配列番号３）の有効性を調査するために考案された。この調査は、ＥＤ０において卵の気室に卵内投与された高用量及び低用量を比較した。
【０２００】
【表１７】
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【０２０１】
収集データ
・設備及びトリの日々の観察、日々の設備の温度
・０日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、及び３５日目のトリ個別の体重
・処理日：体重及び胸肉重量
・死亡：性別、体重、及び推定死因
・除去されたトリ：間引き理由、性別、及び体重
全ての除去されたトリ及び死亡したトリを計量し、死因のために検死して、性別を決定した。
【０２０２】
データ分析：
分析に対する一次変数は、胸重量及び平均日増量であった。分析に対する二次変数は、死骸体重、死骸体重の生体重に対する比率、及び胸重量の死骸体重に対する比率を含む。
【０２０３】
体重のデータを、繰り返される測定のための混合線型モデルを使用して分析した。モデルは、処置、調査日、及び処置と調査日との相互作用に対する固定効果を含んだ。変量効果は、処置中の動物及び残余誤差内を含んだ。
【０２０４】
調査期間（０〜１４、２８〜３４、及び０〜３４）の体重及び平均日増量に対する処置最小二乗平均を、体重に対する繰り返される測定モデルから算定した。最小二乗平均の標準誤差を算定し、９０％の信頼区間を構築した。
【０２０５】
３５日目体重及び死骸データ（胸重量、死骸体重、胸重量の死骸体重に対する比率、死骸体重の生体重に対する比率）を、混合線型モデルを使用して分析した。モデルは、性別、処置、及び性別と処置との相互作用に対する固定効果、ならびに残余誤差に対する変量効果を含有する。最小二乗平均を、処置平均の算定として使用した。最小二乗平均の標準誤差を算定し、９０％の信頼区間を構築した。
【０２０６】
先験的対比を使用して、Ｆｉｓｈｅｒの保護つきＬＳＤを使用した処置差異を査定するが、処置に関連する有効性のうちの少なくとも１つが有意であることが条件である。処置差異を、１０％の有意水準（Ｐ＜０．１０）で査定した。
【０２０７】
【表１８】
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【０２０８】
要約
胸筋重量
雄において、対照群に勝って胸筋収率の９％の増加があり、雌においては、この増加は４．６％であった。この調査は、コブ血統のトリにおける以前の調査の結果を確証する。
【０２０９】
遺伝子発現データ
３５日齢におけるコブ肥育に対する遺伝子発現は、ロスのトリの筋肉の成長パターンに関して、差異を示す。コブ種のトリは、ＭｙｏＤ発現によって示されるように、筋細胞においてより低度の増殖を有する。雄において、分化は、高レベルのミオゲニン（ＭＧＮ）によって示されるように高い。ミオゲニンは、分化の目印である。これは、雌においてはより低度となる。確かに、処置群における筋重量の増加は、ミオゲニンのこれらのデータによって裏付けされる。ＭＲＦ４が、線維形成のためのみに発現されると従来から考えられているが、最近の証拠は増殖の役割を示すことから、ＭＲＦ４は興味深い。雄において、組み合わされたデータは、ＦＧＦ処置は３５日目における決定を増加させたが、線維形成には影響しないことを示した。しかし、雌において、処置群のＭＲＦ４における増加は、いくつかの成熟線維発達を示す可能性がある。
【０２１０】
筋組織
これらの化合物による処置の結果は、胸の形態的構造を改善する。個々の線維は、筋周囲及び筋内膜の間隔の増加が明らかとなる。筋内膜及び筋周囲の間隔は、対照群で観察されるような線維の変性を防ぐために必要である。毛細血管床は、これらの結合組織層内で位置確認され、１つの機能は、筋繊維の損傷から乳酸の蓄積を除去することである。また、これらの空間は、組織の水和に伴う結合組織分子を含有する。特に処置によって観察された変化は、食肉の質を向上させるはずである著しい改善である。また、３５日目における筋重量収率の増加は、著しく、雄においてほとんど９％であった。
【図１Ａ】
2016511768.tif 000025
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
2016511768.tif 000033
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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