(57)【要約】  本明細書で提供されるのは、約２０％〜約７０％のＣ末端リジン含量、及び約１％〜約２０％のシアル酸含量を有する抗ＴＮＦα抗体（例えば、インフリキシマブ）等の抗体を産生する方法であって、少なくとも０．５μＭの亜鉛を含む培養培地において抗体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされた亜鉛応答性宿主細胞を培養する工程と、培養培地中の亜鉛の濃度を制御し、それによって抗体を産生する工程と、を含む、方法である。
2016512029.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
約２０％〜約７０％のＣ末端リジン含量と、
約１％〜約２０％のシアル酸含量と、を有する
抗体を産生する方法であって、
少なくとも０．５μＭの亜鉛を含む培養培地において前記抗体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされた亜鉛応答性宿主細胞を培養する工程と、
前記培養培地中の前記亜鉛の濃度を制御し、それによって前記抗体を産生する工程と、を含む、方法。
【請求項２】
前記抗体の前記Ｃ末端リジン含量が約４０％〜約７０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体の前記Ｃ末端リジン含量が約５５％〜約６５％である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体の前記Ｃ末端リジン含量が約６０％である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体の前記シアル酸含量が約３％〜約１４％である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、抗ＴＮＦα抗体、又はその抗原結合フラグメントであり、前記抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合フラグメントが（ｉ）Ａ２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７０４５）のヒトＴＮＦαへの結合を競合的に阻害し、（ｉｉ）結合定数（Ｋａ）として測定される少なくとも１×１０８リットル／モルの親和性でヒトＴＮＦαの中和エピトープと結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合フラグメントが、ヒト抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗ＴＮＦα抗体が、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合フラグメントが、免疫グロブリンクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又はＩｇＭのものである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合フラグメントが、ＩｇＧ１定常領域を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
ａ）軽鎖がＡ２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７０４５）の軽鎖の全ての抗原結合部を含む、
ｂ）重鎖がＡ２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７０４５）の重鎖の全ての抗原結合部を含む、又は
ｃ）軽鎖がＡ２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７０４５）の軽鎖の全ての抗原結合部を含み、かつ、重鎖がＡ２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７０４５）の重鎖の全ての抗原結合部を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号３及び配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、非−ヒト可変領域を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記非−ヒト可変領域が、配列番号２及び配列番号４からなる群から選択される核酸配列によってコードされるポリペプチドを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合フラグメントが、モノクローナル抗体ｃＡ２と同一のエピトープ特異性を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合フラグメントがモノクローナル抗体ｃＡ２である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記培養培地中の前記亜鉛の濃度が約０．６μＭ〜約６．５μＭの範囲内である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記培養培地中の前記亜鉛の濃度が約０．６μＭ〜約１．１μＭの範囲内である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記培養培地が、約２．５μＭ〜約３０μＭの濃度範囲内の総ＥＤＴＡを更に含み、前記方法が前記培養培地中の鉄を含まないＥＤＴＡの濃度を制御する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記培養培地が、約５μＭ〜約１６μＭの濃度範囲内の遊離ＥＤＴＡを更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体を回収する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記培養培地中の前記亜鉛応答性宿主細胞が１ｍＬあたり約１５０万細胞〜１ｍＬあたり約１１００万細胞の細胞密度に到達したとき、前記抗体が回収される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記培養培地中の前記亜鉛応答性宿主細胞が１ｍＬあたり約３００万細胞〜１ｍＬあたり約１１００万細胞の細胞密度に到達したとき、前記抗体が回収される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記亜鉛の濃度が、前記抗体が回収されるまで制御される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記亜鉛の濃度が、前期亜鉛応答性宿主細胞の指数増殖期中、制御される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記亜鉛の濃度を制御する工程が、前記培養培地中の前記亜鉛の濃度を監視する工程と、前記培養培地中の前記亜鉛の濃度が少なくとも０．５μＭであるように前記培養培地中の前記亜鉛の濃度を調整する工程と、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記培養培地中の前記亜鉛の濃度が約０．６μＭ〜約６．５μＭの範囲内である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体が、約５０％〜約９０％のガラクトース含量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体が、約４５％〜約８５％のガラクトース含量を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体が、約０．０５〜約０．２０の、ガラクトースに対するシアル酸の割合を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記亜鉛応答性宿主細胞が、ＳＰ２／０細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
培養培地中で抗体を生合成するプロセスにおいて約２０％〜約７０％のＣ末端リジン含量を有する抗体のＣ末端リジン含量を制御する方法であって、
前記抗体の生合成の間に前記培養培地中の亜鉛の濃度を監視する工程と、
前記抗体の生合成の間に前記培養培地中の亜鉛の濃度を調整する工程と、を含む方法。
【請求項３３】
培養培地中で抗体を生合成するプロセスにおいて約１％〜約２０％のシアル酸含量を有する抗体のシアル酸含量を制御する方法であって、
前記抗体の生合成の間に前記培養培地中の亜鉛の濃度を監視する工程と、
前記抗体の生合成の間に前記培養培地中の亜鉛の濃度を調整する工程と、を含む方法。
【請求項３４】
培養培地中で抗体を生合成するプロセスにおいて約５０％〜約９０％のガラクトース含量を有する抗体のガラクトース含量を制御する方法であって、
前記抗体の生合成の間に前記培養培地中の亜鉛の濃度を監視する工程と、
前記抗体の生合成の間に前記培養培地中の亜鉛の濃度を調整する工程と、を含む方法。
【請求項３５】
培養培地中で抗体を生合成するプロセスにおいて約０．０５〜約０．２０の、ガラクトースに対するシアル酸の割合を有する抗体のガラクトースに対するシアル酸の割合を制御する方法であって、
前記抗体の生合成の間に前記培養培地中の亜鉛の濃度を監視する工程と、
前記抗体の生合成の間に前記培養培地中の亜鉛の濃度を調整する工程と、を含む方法。
【請求項３６】
前記抗体が、抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗体が、抗ＴＮＦα抗体、又はその抗原結合フラグメントであり、前記抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合フラグメントが（ｉ）Ａ２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７０４５）のヒトＴＮＦαへの結合を競合的に阻害し、（ｉｉ）結合定数（Ｋａ）として測定される少なくとも１×１０８リットル／モルの親和性でヒトＴＮＦαの中和エピトープと結合する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体が、モノクローナル抗体ｃＡ２と同一のエピトープ特異性を有する、抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗体が、モノクローナル抗体ｃＡ２である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗体が、ＳＰ２／０細胞株によって生合成される、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
Ｃ末端リジン（ＣＴＬ）は、血流中にカルボキシペプチターゼを内在的に循環させることによってインフリキシマブを含む注射された抗体から急速に除去され（Ｃａｉ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｌｙｓｉｎｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ２  Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２０１１；１０８：４０４〜４１２）、したがって、製品の安全性及び有効性への影響があるとしてもごくわずかであると考えられる。しかしながら、ＣＴＬ残基を有する遺伝子組換えタンパク質中のＣＴＬ含量を、製造濃度及び製品均質性の基準として使用することができる。
【０００２】
ＣＴＬ含量と対比して、遺伝子組換えタンパク質中のシアル酸含量は、ヒトにおける生理学的重要性を有する数多くの現象と関連付けられてきた。例えば、エリトロポイエチン等の糖タンパク質中のシアル酸の存在は、循環半減期の長期化を促進する一方で、エリトロポイエチン中のシアル酸の欠如は、循環からのタンパク質の急速クリアランスにつながる。加えて、タンパク質中の増大したシアル酸含量は、ヒトにおけるタンパク質の免疫原性を調節し得る。製品の安全性及び有効性におけるシアル酸の重要性のため、シアル酸含量は、診療所で使用される範囲を反映した範囲内に維持されるべきである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、遺伝子組換えタンパク質中のＣＴＬ及びシアル酸含量、特にＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）（インフリキシマブ）又はＨＵＭＩＲＡ（登録商標）（アダリムマブ）等のヒトに投与される遺伝子組換えタンパク質に影響を及ぼすプロセス関連因子を理解及び制御する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書で開示されるのは、亜鉛濃度、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）濃度及び回収時期を含む培養条件を制御することにより、所望のＣ末端リジン（ＣＴＬ）含量、シアル酸含量、ガラクトース含量及び／又はガラクトースに対するシアル酸の割合を有する抗体、例えばモノクローナル抗体ｃＡ２（本明細書ではインフリキシマブとも呼ばれる）などの抗腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）抗体を産生する方法である。
【０００５】
本発明の一実施形態は、約２０％〜約７０％のＣ末端リジン含量、及び約１％〜約２０％のシアル酸含量を有する抗体を産生する方法であって、この方法は、少なくとも０．５μＭの亜鉛を含む培養培地において抗体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされた亜鉛応答性宿主細胞を培養する工程、及び培養培地中の亜鉛の濃度を制御し、それによって抗体を産生する工程を含む。一部の実施形態において、抗体のＣ末端リジン含量は、約４０％〜約７０％、例えば、約５５％〜約６５％、例えば、又は約６０％である。一部の実施形態において、抗体のシアル酸含量は、約３％〜約１４％である。一部の実施形態において、抗体は、約５０％〜約９０％、又は約４５％〜約８５％のガラクトース含量を有する。一部の実施形態において、抗体は、約０．０５〜約０．２０の、ガラクトースに対するシアル酸の割合を有する。
【０００６】
一部の実施形態において、抗体は、抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合フラグメントであり、その抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合フラグメントは、（ｉ）Ａ２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７０４５）のヒトＴＮＦαへの結合を競合的に阻害し、（ｉｉ）結合定数（Ｋａ）として測定される少なくとも１×１０８リットル／モルの親和性でヒトＴＮＦαの中和エピトープと結合する。抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、キメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体とすることができる。一部の実施形態において、抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合フラグメントは、免疫グロブリンクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又はＩｇＭとすることができ、一部の実施形態において、ＩｇＧ１の定常領域を含む。一部の実施形態において、抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖからなる群から選択される。
【０００７】
一部の実施形態において、抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト定常領域及び非ヒト可変領域、又はヒト定常領域及びヒト可変領域を含む。
【０００８】
一部の実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、少なくとも１つのヒト軽鎖及び少なくとも１つのヒト重鎖を含む。一部の実施形態において、軽鎖は、Ａ２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７０４５）の軽鎖の全ての抗原結合部を含む。一部の実施形態において、重鎖は、Ａ２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７０４５）の重鎖の全ての抗原結合部を含む。更に他の実施形態において、軽鎖は、Ａ２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７０４５）の軽鎖の全ての抗原結合部を含み、重鎖は、Ａ２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７０４５）の重鎖の全ての抗原結合部を含む。
【０００９】
一部の実施形態において、抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１ヒト定常領域、及び配列番号３及び配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、又は配列番号２及び配列番号４からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、非−ヒト可変領域を含む。
【００１０】
一部の実施形態において、抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体ｃＡ２と同一であるエピトープ特異性を有し、一部の実施形態において、抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体ｃＡ２である。
【００１１】
一部の実施形態において、培養培地中の亜鉛の濃度は、約０．６μＭ〜約６．５μＭ、又は約０．６μＭ〜約１．１μＭの範囲内である。
【００１２】
一部の実施形態において、培養培地は、約２．５μＭ〜約３０μＭ、又は約５μＭ〜約１６μＭの濃度範囲内のＥＤＴＡを更に含み、方法は、培養培地中のＥＤＴＡの濃度を制御する工程を更に含む。
【００１３】
一部の実施形態において、方法は、例えば、培養培地中の亜鉛応答性宿主細胞が１ｍＬあたり約１５０万細胞〜１ｍＬあたり約１１００万細胞、又は１ｍＬあたり約３００万細胞〜１ｍＬあたり約１１００万細胞の細胞密度に到達したとき、抗体を回収する工程を更に含む。一部の実施形態において、亜鉛の濃度は、抗体が回収されるまで又は亜鉛応答性宿主細胞の指数増殖期の間、制御される。
【００１４】
本発明の一部の実施形態において、亜鉛の濃度を制御する工程は、培養培地中の亜鉛の濃度を監視する工程、及び培養培地中の亜鉛の濃度が少なくとも０．５μＭ又は約０．６μＭ〜約６．５μＭの範囲内であるように培養培地中の亜鉛の濃度を調整する工程を含む。
【００１５】
本発明の一部の実施形態において、亜鉛応答性宿主細胞は、ＳＰ２／０細胞である。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、培養培地中で抗体を生合成するプロセスにおいて約２０％〜約７０％のＣ末端リジン含量を有する抗体のＣ末端リジン含量を制御する方法であって、その方法は、抗体の生合成の間に培養培地中の亜鉛の濃度を監視する工程、及び抗体の生合成の間に培養培地中の亜鉛の濃度を調整する工程を含む。
【００１７】
本発明の更に別の実施形態は、培養培地中で抗体を生合成するプロセスにおいて約１％〜約２０％のシアル酸含量を有する抗体のシアル酸含量を制御する方法であって、その方法は、抗体の生合成の間に培養培地中の亜鉛の濃度を監視する工程、及び抗体の生合成の間に培養培地中の亜鉛の濃度を調整する工程を含む。
【００１８】
本発明の更に別の実施形態は、培養培地中で抗体を生合成するプロセスにおいて約５０％〜約９０％のガラクトース含量を有する抗体のガラクトース含量を制御する方法であって、その方法は、抗体の生合成の間に培養培地中の亜鉛の濃度を監視する工程、及び抗体の生合成の間に培養培地中の亜鉛の濃度を調整する工程を含む。
【００１９】
本発明の更に別の実施形態は、培養培地中で抗体を生合成するプロセスにおいて約０．０５〜約０．２０の、ガラクトースに対するシアル酸の割合を有する抗体のガラクトースに対するシアル酸の割合を制御する方法であって、その方法は、抗体の生合成の間に培養培地中の亜鉛の濃度を監視する工程、及び抗体の生合成の間に培養培地中の亜鉛の濃度を調整する工程を含む。
【００２０】
ＣＴＬ、シアル酸若しくはガラクトース含量、又はガラクトースに対するシアル酸の割合を制御する方法の一部の実施形態において、抗体は、抗ＴＮＦα抗体若しくはその抗原結合フラグメントであり、及び／又は抗体は、ＳＰ２／０細胞によって生合成される。
【００２１】
一実施形態では、抗体は、ＴＮＦのエピトープのアミノ酸を結合するｍＡｂであり、ハイブリドーマによって、又は組換え宿主によって産生される。一実施形態では、抗体は、Ａ２によって認識されるエピトープを認識するキメラ抗体である。別の実施形態では、抗体は、キメラＡ２（ｃＡ２）（即ち、インフリキシマブ）として表記されるキメラ抗体である。
【００２２】
抗ＴＮＦ抗体の特徴付け並びに作製及び使用の方法は、例えば、２００１年８月１日出願、２００７年７月３１日発行の米国特許第７，２５０，１６５号「ＴＮＦ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ」（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｈｅａｖｎｅｒら）、及び２００３年３月２１日出願の米国特許出願第１０／３９４，４７１号、米国特許出願公開第２００４／０１８５０４７（Ａ１）号「Ａｎｔｉ−ＴＮＦ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ」（Ｊｉｌｌ  Ｇｉｌｅｓ−Ｋｏｍａｒら）、及び２００４年２月６日出願、２００７年８月７日発行の米国特許第７，２５２，８２３号「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａ２−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＴＮＦα−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（Ｊｕｎｍｉｎｇ  Ｌｅら）（これらは全て、全体が参考として本明細書に組み込まれる）に開示され、詳細に説明される。
【００２３】
一部の実施形態において、抗体は、ｃ１３４Ａと呼ばれる細胞株によって産生されるマウスｍＡｂ  Ａ２、及びｃ１６８Ａと呼ばれる細胞株によって産生されるキメラ抗体ｃＡ２を含む。細胞株ｃ１３４Ａは、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｗｅｌｓｈ  ＆  ＭｃＫｅａｎ  Ｒｏａｄ，Ｓｐｒｉｎｇｈｏｕｓｅ，ＰＡ）に貯蔵されている。細胞株ｃ１６８Ａは、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２００  Ｇｒｅａｔ  Ｖａｌｌｅｙ  Ｐａｒｋｗａｙ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９３５５）、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ＢＶ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に貯蔵されている。
【００２４】
本明細書に開示の方法を使用して、例えば、ヒトにおける自己免疫疾患の治療に使用されるインフリキシマブ、つまりモノクローナル抗ＴＮＦα抗体を産生するために使用される製造プロセス等の、例えば商業的製造プロセスにおいてロットの均質性を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
前述は、以下の付属の図に示される本発明の例示的実施態様のより詳細な説明から明らかとなるであろう。
【００２６】
本特許又は出願書類は、少なくとも１枚のカラー印刷図面を収容している。カラー図面を備える、本特許又は特許出願公開の複製は、要請があれば、必要な手数料を支払うことにより、特許庁によって提供されるであろう。
【図１】インフリキシマブの試料の毛管等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）電気泳動図を示す。
【図２】ｃＩＥＦピーク１の割合に応じた逆相ペプチドマッピングからの脱リジン（Ｃ末端リジンの欠損％、略してｄｅｓ−Ｌｙｓ）の割合の適合線プロットであり、ＣＴＬ含量（ｄｅｓ−Ｌｙｓの割合として表現される）とピーク１の割合との間の相関を示す。
【図３】バイオリアクター期間に応じたＣＴＬ除去（ｄｅｓ−Ｌｙｓの割合として表現され、ピーク１のデータからｃＩＥＦ法を用いて計算される）のグラフであり、ＣＴＬ除去について様々なＺｎ＋２濃度の影響を示す。Ｙ軸：％  ｄｅｓｌ−Ｌｙｓ、Ｘ軸：バイオリアクター期間（日）。
【図４】バイオリアクター期間に応じ、ＷＡＸ法により判定されたシアル酸を含むインフリキシマブオリゴ糖の割合のグラフであり、シアル酸の割合について様々なＺｎ＋２濃度の影響を示す。Ｙ軸：％シアル酸、Ｘ軸：バイオリアクター期間（日）。
【図５】バイオリアクター期間に応じた生細胞密度のグラフであり、生細胞密度について様々なＺｎ＋２濃度の影響を示す。Ｙ軸：生細胞密度（百万生細胞／ｍＬ）、Ｘ軸：バイオリアクター期間（日）。
【図６】バイオリアクター期間に応じた生細胞の割合のグラフであり、培養物の生存性についてＺｎ＋２濃度の影響を示す。Ｙ軸：％生細胞、Ｘ軸：バイオリアクター期間（日）。
【図７】バイオリアクター期間に応じたインフリキシマブ濃度のグラフであり、インフリキシマブの濃度についてＺｎ＋２濃度の影響を示す。示されているｙ軸濃度ｍｇ／ｍＬは、誤植を含む。濃度は、ｍｇ／Ｌである。Ｙ軸：インフリキシマブ濃度（ｍｇ／Ｌ）、Ｘ軸：バイオリアクター期間（日）。
【図８Ａ】バイオリアクター期間に応じたＣＴＬ除去（ｄｅｓ−Ｌｙｓの割合として表現され、ピーク１のデータからｃＩＥＦ法を用いて計算される）のグラフであり、０．７６μＭのＺｎ＋２が存在するときのＣＴＬ除去について様々なＥＤＴＡ濃度の影響を示す（ラベル「Ｆｅ：５  Ｚｎ：１  ＥＤＴＡ：１０」に該当するバイオリアクター内のＺｎ＋２の初期濃度は、０．７６μＭではなく６．３μＭであり、０．７６μＭのＺｎ＋２の目標濃度は、１３日目から実験の終了まで実現された）。Ｙ軸：％  ｄｅｓｌ−Ｌｙｓ、Ｘ軸：バイオリアクター期間（日）。
【図８Ｂ】バイオリアクター期間に応じたＣＴＬ除去（ｄｅｓ−Ｌｙｓの割合として表現され、ピーク１のデータからｃＩＥＦ法を用いて計算される）のグラフであり、１．７μＭのＺｎ＋２が存在するときのＣＴＬ除去について様々なＥＤＴＡ濃度の影響を示す。Ｙ軸：％  ｄｅｓｌ−Ｌｙｓ、Ｘ軸：バイオリアクター期間（日）。
【図９Ａ】バイオリアクター期間に応じ、ＷＡＸ法により判定されたシアル酸を含むインフリキシマブオリゴ糖の割合のグラフであり、０．７６μＭのＺｎ＋２が存在するときのシアル酸の割合について様々なＥＤＴＡ濃度の影響を示す（ラベル「Ｆｅ：５  Ｚｎ：１  ＥＤＴＡ：１０」に該当するバイオリアクター内のＺｎ＋２の初期濃度は、０．７６μＭではなく６．３μＭであり、０．７６μＭのＺｎ＋２の目標濃度は、１３日目から実験の終了まで実現された）。Ｙ軸：％シアル酸、Ｘ軸：バイオリアクター期間（日）。
【図９Ｂ】バイオリアクター期間に応じ、ＷＡＸ法により判定されたシアル酸を含むインフリキシマブオリゴ糖の割合のグラフであり、１．７μＭのＺｎ＋２が存在するときのシアル酸含量について様々なＥＤＴＡ濃度の影響を示す。Ｙ軸：％シアル酸、Ｘ軸：バイオリアクター期間（日）。
【図９Ｃ】バイオリアクター期間に応じたＧ０Ｆ（ＷＡＸ成分１）の割合のグラフであり、０．７６μＭのＺｎ＋２が存在するときのガラクトシル化されていない種の割合について様々なＥＤＴＡ濃度の影響を示す（ラベル「Ｆｅ：５  Ｚｎ：１  ＥＤＴＡ：１０」に該当するバイオリアクター内のＺｎ＋２の初期濃度は、０．７６μＭではなく６．３μＭであり、０．７６μＭのＺｎ＋２の目標濃度は、１３日目から実験の終了まで実現された）。
【図９Ｄ】バイオリアクター期間に応じたＧ０Ｆ（ＷＡＸ成分１）の割合のグラフであり、１．７μＭのＺｎ＋２が存在するときのガラクトシル化されていない種の割合について様々なＥＤＴＡ濃度の影響を示す。
【図１０】バイオリアクター期間に応じた生細胞密度のグラフであり、０．７６μＭのＺｎ＋２又は１．７μＭのＺｎ＋２が存在するときの生細胞密度について様々なＥＤＴＡ濃度の影響を示す（ラベル「Ｆｅ：５  Ｚｎ：１  ＥＤＴＡ：１０」に該当するバイオリアクター内のＺｎ＋２の初期濃度は、０．７６μＭではなく６．３μＭであり、０．７６μＭのＺｎ＋２の目標濃度は、１３日目から実験の終了まで実現された）。Ｙ軸：生細胞密度（百万生細胞／ｍＬ）、Ｘ軸：バイオリアクター期間（日）。
【図１１Ａ】バイオリアクター期間に応じた生細胞の割合のグラフであり、０．７６μＭのＺｎ＋２又は１．７μＭのＺｎ＋２が存在するときの培養物の生存性について様々なＥＤＴＡ濃度の影響を示す（ラベル「Ｆｅ：５  Ｚｎ：１  ＥＤＴＡ：１０」に該当するバイオリアクター内のＺｎ＋２の初期濃度は、０．７６μＭではなく６．３μＭであり、０．７６μＭのＺｎ＋２の目標濃度は、１３日目から実験の終了まで実現された）。Ｙ軸：％生細胞、Ｘ軸：バイオリアクター期間（日）。
【図１１Ｂ】図１１Ａに示したグラフの０〜２５日目の拡大である。Ｙ軸：生細胞密度（百万生細胞／ｍＬ）、Ｘ軸：バイオリアクター期間（日）。
【図１２Ａ】バイオリアクター期間に応じたインフリキシマブ濃度のグラフであり、０．７６μＭのＺｎ＋２又は１．７μＭのＺｎ＋２が存在するときのインフリキシマブの濃度について様々なＥＤＴＡ濃度の影響を示す（ラベル「Ｆｅ：５  Ｚｎ：１  ＥＤＴＡ：１０」に該当するバイオリアクター内のＺｎ＋２の初期濃度は、０．７６μＭではなく６．３μＭであり、０．７６μＭのＺｎ＋２の目標濃度は、１３日目から実験の終了まで実現された）。示されているｙ軸濃度ｍｇ／ｍＬは、誤植を含む。濃度は、ｍｇ／Ｌである。Ｙ軸：インフリキシマブ濃度（ｍｇ／Ｌ）、Ｘ軸：バイオリアクター期間（日）。
【図１２Ｂ】図１２Ａに示したグラフの０〜２５日目の拡大である。示されているｙ軸濃度ｍｇ／ｍＬは、誤植を含む。濃度は、ｍｇ／Ｌである。Ｙ軸：インフリキシマブ濃度（ｍｇ／Ｌ）、Ｘ軸：バイオリアクター期間（日）。
【図１３Ａ】バイオリアクター期間に応じたＣＴＬ除去（ｄｅｓ−Ｌｙｓの割合として表現され、ピーク１のデータからｃＩＥＦ法を用いて計算される）のグラフであり、ＣＴＬ除去について様々なＥＤＴＡ濃度（μＭ）の影響を示す（結果は、２つの重複バイオリアクターの平均として表される）。Ｙ軸：％  ｄｅｓｌ−Ｌｙｓ、Ｘ軸：バイオリアクター期間（日）。
【図１３Ｂ】バイオリアクター期間に応じ、ＷＡＸ法により判定されたシアル酸を含むインフリキシマブオリゴ糖の割合のグラフであり、シアル酸含量について様々なＥＤＴＡ濃度（μＭ）の影響を示す（結果は、２つの重複バイオリアクターの平均として表される）。Ｙ軸：％シアル酸、Ｘ軸：バイオリアクター期間（日）。
【図１３Ｃ】バイオリアクター期間に応じた生細胞密度のグラフであり、生細胞密度について様々なＥＤＴＡ濃度（μＭ）の影響を示す。Ｙ軸：生細胞密度（百万生細胞／ｍＬ）、Ｘ軸：バイオリアクター期間（日）。
【図１３Ｄ】バイオリアクター期間に応じた生細胞の割合のグラフであり、培養物の生存性について様々なＥＤＴＡ濃度（μＭ）の影響を示す。Ｙ軸：％生細胞、Ｘ軸：バイオリアクター期間（日）。
【図１３Ｅ】バイオリアクター期間に応じたインフリキシマブ濃度のグラフであり、インフリキシマブの濃度について様々なＥＤＴＡ濃度（μＭ）の影響を示す。示されているｙ軸濃度ｍｇ／ｍＬは、誤植を含む。濃度は、ｍｇ／Ｌである。Ｙ軸：インフリキシマブ濃度（ｍｇ／Ｌ）、Ｘ軸：バイオリアクター期間（日）。
【図１３Ｆ】図１３Ｅに示したグラフの０〜２５日目の拡大である。示されているｙ軸濃度ｍｇ／ｍＬは、誤植を含む。濃度は、ｍｇ／Ｌである。Ｙ軸：インフリキシマブ濃度（ｍｇ／Ｌ）、Ｘ軸：バイオリアクター期間（日）。
【図１３Ｇ】バイオリアクター期間に応じたＧ０Ｆ（ＷＡＸ成分１）の割合のグラフであり、ガラクトースが欠損したインフリキシマブオリゴ糖の割合について様々なＥＤＴＡ濃度（μＭ）の影響を示す。Ｘ軸：バイオリアクター期間（日）。
【図１４Ａ】バイオリアクター期間に応じたＣＴＬ除去（ｄｅｓ−Ｌｙｓの割合として表現され、ピーク１のデータからｃＩＥＦ法を用いて計算される）のグラフであり、ＣＴＬ除去について様々なＥＤＴＡ濃度（μＭ）の影響を示す。Ｘ軸：バイオリアクター期間（日）。
【図１４Ｂ】バイオリアクター期間に応じ、ＷＡＸ法により判定されたシアル酸を含むインフリキシマブオリゴ糖の割合のグラフであり、シアル酸含量について様々なＥＤＴＡ濃度（μＭ）の影響を示す。
【図１４Ｃ】バイオリアクター期間に応じた生細胞密度のグラフであり、生細胞密度について様々なＥＤＴＡ濃度（μＭ）の影響を示す。Ｙ軸：生細胞密度（百万生細胞／ｍＬ）、Ｘ軸：バイオリアクター期間（日）。
【図１４Ｄ】バイオリアクター期間に応じた生細胞の割合のグラフであり、培養物の生存性について様々なＥＤＴＡ濃度（μＭ）の影響を示す。Ｙ軸：％生細胞、Ｘ軸：バイオリアクター期間（日）。
【図１４Ｅ】バイオリアクター期間に応じたインフリキシマブ濃度のグラフであり、インフリキシマブの濃度について様々なＥＤＴＡ濃度（μＭ）の影響を示す。示されているｙ軸濃度ｍｇ／ｍＬは、誤植を含む。濃度は、ｍｇ／Ｌである。Ｙ軸：インフリキシマブ濃度（ｍｇ／Ｌ）、Ｘ軸：バイオリアクター期間（日）。
【図１４Ｆ】図１４Ｅに示したグラフの０〜２５日目の拡大である。示されているｙ軸濃度ｍｇ／ｍＬは、誤植を含む。濃度は、ｍｇ／Ｌである。Ｙ軸：インフリキシマブ濃度（ｍｇ／Ｌ）、Ｘ軸：バイオリアクター期間（日）。
【図１５】バイオリアクター期間に応じたＧ０Ｆ（ＷＡＸ成分１）の割合のグラフであり、ガラクトースが欠損したインフリキシマブオリゴ糖の割合について様々なＥＤＴＡ濃度（μＭ）の影響を示す。
【図１６】インフリキシマブの最も一般的な中性オリゴ糖、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆの生合成経路、並びに中性オリゴ糖からシアル酸付加形態への生合成経路を示す。
【図１７】Ｚｎ＋２濃度に応じたＣＴＬ除去（ピーク１のデータからｃＩＥＦ法を用いて計算される）のグラフであり、ＤＯＥ３及びＢＳＡ配合第１実験の２０日目でのＣＴＬ除去の割合を示す（青のデータポイント及び線は平均を表す）。
【図１８】Ｚｎ＋２濃度に応じたＣＴＬ除去（ピーク１のデータからｃＩＥＦ法を用いて計算される）のグラフであり、ＤＯＥ３実験の１３日目でのＣＴＬ除去の割合を示す。
【図１９】Ｚｎ＋２濃度に応じたシアル酸含量のグラフであり、ＤＯＥ３及びＢＳＡ配合第１実験の２０日目でのシアル酸の割合を示す（線は平均を表す）。
【図２０】Ｚｎ＋２濃度に応じたＷＡＸ成分１（ＧＯＦ）の割合のグラフであり、ＤＯＥ３及びＢＳＡ配合第１実験の２０日目でのガラクトースが欠損したインフリキシマブオリゴ糖の割合を示す。
【図２１】Ｚｎ＋２濃度に応じたガラクトースに対するシアル酸の割合の推定値（シアル酸率／（１００−ＷＡＸ成分１の割合）として推定される）のグラフであり、ＤＯＥ３及びＢＳＡ配合第１実験の２０日目でのガラクトースに対するシアル酸の割合の推定値を示す。
【図２２】ＥＤＴＡ濃度に応じたＣＴＬ除去（ピーク１のデータからｃＩＥＦ法を用いて計算される）のグラフであり、配合第１及び第２実験の３３〜３５日目で１．１〜１．２μＭのＺｎ＋２が存在するときのＣＴＬ除去率を示す。
【図２３】ＥＤＴＡ濃度に応じたシアル酸の割合のグラフであり、配合第１及び第２実験の３３〜３５日目で１．１〜１．２μＭのＺｎ＋２が存在するときのシアル酸率を示す。
【図２４】ＥＤＴＡ濃度に応じたＷＡＸ成分１の割合のグラフであり、配合第１及び第２実験の３３〜３５日目で１．１〜１．２μＭのＺｎ＋２が存在するときのガラクトースが欠損したインフリキシマブオリゴ糖の割合を示す。
【図２５】ＥＤＴＡ濃度に応じたガラクトースに対するシアル酸の割合の推定値（シアル酸率／（１００−ＷＡＸ成分１の割合）として推定される）のグラフであり、配合第１及び第２実験の３３〜３５日目で１．１〜１．２μＭのＺｎ＋２が存在するときのガラクトースに対するシアル酸の割合の推定値を示す。
【図２６】Ｇ０Ｆの割合（ＷＡＸ成分１から計算される）に応じたシアル酸の割合（ＷＡＸ成分５から計算される）のグラフであり、ＤＯＥ３及びＢＳＡ配合第１及び第２実験に関して、ガラクトースが欠損したインフリキシマブオリゴ糖の指標であるシアル酸とＷＡＸ成分１との割合の間で逆相関を示す。
【図２７Ａ】キメラＡ２抗体のキメラＨ（ｐＡ２ＨＧ１ａｐｇｐｔ）鎖及びＬ（ｐＡ２ＨｕＫａｐｇｐｔ）鎖の発現に用いられるプラスミドの概略図を提供する。
【図２７Ｂ】キメラＡ２抗体のキメラＨ（ｐＡ２ＨＧ１ａｐｇｐｔ）鎖及びＬ（ｐＡ２ＨｕＫａｐｇｐｔ）鎖の発現に用いられるプラスミドの概略図を提供する。
【図２８】配列番号１としてのヒトＴＮＦのアミノ酸配列である。
【図２９Ａ】クローン化されたｃＡ２軽鎖可変領域の核酸配列（配列番号２）及び対応するアミノ酸配列（配列番号３）である。
【図２９Ｂ】クローン化されたｃＡ２重鎖可変領域の核酸配列（配列番号４）及び対応するアミノ酸配列（配列番号５）である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の例示的実施形態の説明を続ける。
【００２８】
一実施形態は、約２０％〜約７０％のＣ末端リジン含量、及び約１％〜約２０％のシアル酸含量を有する抗体を産生する方法を提供し、少なくとも０．５μＭの亜鉛を含む培養培地において抗体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされた亜鉛応答性宿主細胞を培養する工程、及び培養培地中の亜鉛の濃度を制御し、それによって抗体を産生する工程を含む。
【００２９】
ＣＴＬ含量は、本明細書でＣ末端リジンを処理する重鎖の割合として表現され、次の等式を用いて計算することができる。ＣＴＬ含量（％）＝（ＣＴＬを処理する重鎖の数）／（重鎖総数）×１００。ＣＴＬ除去は、本明細書でＣ末端リジンが欠損した重鎖の割合（ｄｅｓ−Ｌｙｓ）として表現される。つまり、「８０％のｄｅｓ−Ｌｙｓ」は、２０％のＣＴＬ含量に等しい。本明細書に記載の方法の一部の実施形態において、抗体若しくは抗ＴＮＦα抗体、又はその抗原結合フラグメントのＣＴＬ含量は、約４０％〜約７０％、具体的には約５５％〜約６５％、及び更に具体的には約６０％である。
【００３０】
シアル酸含量は、本明細書でシアル酸を含有するオリゴ糖の割合として表現され、次の等式を用いて計算することができる。シアル酸含量（％）＝（シアル酸を含有するオリゴ糖の数）／（オリゴ糖総数）×１００。この等式は、オリゴ糖中のシアル酸残基の数に関係なく適用する。換言すれば、例えば、オリゴ糖中に１つ又は２つのシアル酸残基が存在するかどうかに関係なく、オリゴ糖は、シアル酸含量を計算する目的で１回だけカウントされる。本明細書に記載の方法の一部の実施形態において、抗体若しくは抗ＴＮＦα抗体、又はその抗原結合フラグメントのシアル酸含量は、約３％〜約１４％である。
【００３１】
ガラクトース含量は、本明細書でガラクトースを含有するオリゴ糖の割合として表現され、次の等式を用いて計算することができる。ガラクトース含量（％）＝（ガラクトースを含有するオリゴ糖の数）／（オリゴ糖総数）×１００。この等式は、オリゴ糖中のガラクトース単位の数に関係なく適用する。換言すれば、例えば、オリゴ糖中に１つ又は２つのガラクトース残基が存在するかどうかに関係なく、オリゴ糖は、ガラクトース含量を計算する目的で１回だけカウントされる。本明細書に記載の方法の一部の実施形態において、抗体若しくは抗ＴＮＦα抗体、又はその抗原結合フラグメントは、約５０％〜約９０％、及び具体的には約４５％〜約８５％のガラクトース含量を有する。
【００３２】
典型的には、インフリキシマブ等の抗体の両方の重鎖は、グリコシル化されている。しかしながら、幾つかの状況では、重鎖の一部は、アグリコシル化されたままである。例えば、一部の実施形態において、抗体分子の約９４％は、両方の鎖でグリコシル化され、抗体分子の約６％は、半グリコシル化され、抗体分子の約０．１％は、完全にアグリコシル化されている。
【００３３】
ガラクトースに対するシアル酸の割合は、インフリキシマブのオリゴ糖中のガラクトースに対するシアル酸のモル比から計算される。本明細書に記載の方法の一部の実施形態において、抗体若しくは抗ＴＮＦα抗体、又はその抗原結合フラグメントは、約０．０５〜約０．２０の、ガラクトースに対するシアル酸の割合を有する。
【００３４】
本明細書で使用される「亜鉛応答性宿主細胞」は、培養培地中の亜鉛濃度の変動に反応する宿主細胞を意味する。亜鉛濃度の変動に対する宿主細胞の反応性は、例えば、宿主細胞によって産生される抗体中のＣＴＬ含量、シアル酸含量、ガラクトース含量、及びガラクトースに対するシアル酸の割合について様々な亜鉛濃度の影響を測定することによって評価することができる。宿主細胞によって産生される抗体中のＣＴＬ含量、シアル酸含量、ガラクトース含量、及びガラクトースに対するシアル酸の割合を評価する方法は、実例に記述される。
【００３５】
本発明は、約０．５μＭを超える亜鉛の量を含む培養培地を提供する。一部の実施形態において、培養培地中の亜鉛の濃度は、約０．６μＭ〜約６．５μＭの範囲内、及び好ましくは、約０．６μＭ〜約１．１μＭの範囲内である。一部の実施形態において、培養培地中の亜鉛の量又は濃度は、亜鉛応答性宿主細胞に無害であり、例えば、特に培養の最初の２０〜２５日間に細胞生存性、細胞成長又は抗体産生を低減又は実質的に低減しない。
【００３６】
一部の実施形態において、培養培地は、約２．５μＭ〜約３０μＭの濃度範囲内、及び好ましくは約５μＭ〜約１６μＭの濃度範囲内のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（本明細書で「ＥＤＴＡ」又は「総ＥＤＴＡ」と呼ばれる）を更に含む。本明細書で使用される「鉄を含まないＥＤＴＡ」は、鉄（Ｆｅ＋３）にキレート化されていないＥＤＴＡを指す。鉄を含まないＥＤＴＡの量又は濃度（略して［ＥＤＴＡ−Ｆｅ＋３］）は、総ＥＤＴＡの量又は濃度からＦｅ＋３の量又は濃度を減算することによって計算することができる。イオンＦｅ＋３は、培養培地中の金属イオンのＥＤＴＡに対して最も高い親和性を有する。したがって、Ｆｅ＋３は、存在する場合、細胞培養培地中でＥＤＴＡを優先的に結合する。鉄を含まないＥＤＴＡの濃度は、培養培地中のＺｎ＋２及び他の金属イオンと結合可能なＥＤＴＡを表す。
【００３７】
本明細書に記載の一部の実施形態において、培養培地中のＥＤＴＡ及び／又は鉄を含まないＥＤＴＡの量又は濃度は、亜鉛応答性宿主細胞に無害であり、例えば、特に培養の最初の２０〜２５日間に細胞生存性、細胞成長又は抗体産生を低減又は実質的に低減しない。
【００３８】
本明細書で使用される「制御」は、確認及び／又は調整することを意味する。制御は、（直接又は間接的に）制御されている物質を感知／測定すること及び所望の結果に向かって補正するためにそれらの測定値を用いてフィードバックを提供することを含む。制御は、例えば、培養培地中の亜鉛及び／又はＥＤＴＡ及び／又は鉄を含まないＥＤＴＡの濃度を監視及び調整することを含む。典型的に、亜鉛及び／又はＥＤＴＡ及び／又は鉄を含まないＥＤＴＡの濃度は、培養期間中制御される。本明細書に記載される方法の一部の実施形態において、亜鉛及び／又はＥＤＴＡ及び／又は鉄を含まないＥＤＴＡの濃度は、亜鉛応答性宿主細胞の指数増殖期中、又は培養の最初の約１０〜２５日間制御される。
【００３９】
培養培地中の亜鉛及び／又はＥＤＴＡ及び／又は鉄を含まないＥＤＴＡの濃度は、例えば、培養培地中の亜鉛及び／又はＥＤＴＡ及び／又は鉄を含まないＥＤＴＡの濃度を監視すること、及び培養培地中の亜鉛及び／又はＥＤＴＡ及び／又は鉄を含まないＥＤＴＡの濃度を調整することによって制御することができる。したがって、本明細書に記載の方法の一部の実施形態において、亜鉛の濃度を制御する工程は、培養培地中の亜鉛の濃度を監視する工程、及び培養培地中の亜鉛の濃度が少なくとも０．５μＭ又は約０．６μＭ〜約６．５μＭであるように培養培地中の亜鉛の濃度を調整する工程を含む。
【００４０】
亜鉛及び／又はＥＤＴＡ及び／又は鉄を含まないＥＤＴＡの濃度を監視する方法は、当業者にとって周知である。例えば、亜鉛及び他の金属イオンの濃度は、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）によって測定されてもよい一方、濃度ＥＤＴＡは、ＨＰＬＣ法によって測定されてもよい。
【００４１】
本明細書で使用される「調整する」ことは、適切な状態に置く又は維持することを意味する。調整は、例えば、培養培地中の亜鉛及び／又はＥＤＴＡの濃度を維持すること、並びに、例えば、培養培地中の亜鉛及び／又はＥＤＴＡの濃度を必要に応じて調節することを含む。このようにして、亜鉛（例えば、無害な量の亜鉛）を、例えば、約５μＭ超の初期濃度で培養培地に含み、次に例えば、０．６μＭ〜約１．１μＭの濃度に調節することができる。調節は、例えば、指数増殖期から定常状態期への遷移と同時に又は直後に行うことができる。あるいは、亜鉛の濃度を、培養期間中、例えば、０．６μＭ〜約１．１μＭの濃度で維持することができる。
【００４２】
亜鉛及び／又はＥＤＴＡ及び／又は鉄を含まないＥＤＴＡの濃度の調整を、例えば、培養培地への亜鉛、鉄及び／若しくはＥＤＴＡの直接添加を通じて、亜鉛、鉄及び／若しくはＥＤＴＡを含有する原材料の配合を通じて、亜鉛、鉄及び／若しくはそのＥＤＴＡの濃度を調節するための原材料の処置を通じて、並びに／又は所望の濃度の亜鉛、鉄、及び／若しくはＥＤＴＡを得るために原材料の製造プロセスの修正を通じて、実現することができる。培養培地の成分を調整する方法は、当業者にとって周知である。
【００４３】
培養培地は、亜鉛及び／又はＥＤＴＡに加えて他の成分を含むことができる。好適な培養培地の選択は、当業者の知識の範囲内である。一部の実施形態において、培養培地は、無血清培地である。
【００４４】
例えばマウスＳＰ２／０細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、ＣＲＬ−１５８１）といったＳＰ２／０細胞等の哺乳類細胞を含む、抗体の産生への使用のための当該技術分野において周知の任意の宿主細胞を使用することができる。他の例示の宿主細胞は、ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）、ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６４６）、及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８０）マウス細胞株である。ヒト骨髄腫細胞株の一例は、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ  ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）である。他の有用な細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ））、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６１）、又はＤＧ４４などの、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来するものが挙げられる。細胞を、単細胞懸濁液中で又は付着依存性の方法で培養することができる。
【００４５】
フラスコ、ローラーボトル、及び例えば、撹拌タンクバイオリアクター等のバイオリアクターを含む、様々な培養システムが当該技術分野において周知である。培養培地は、培養培地を単一バッチで１度細胞に添加するバッチプロセスで、又は好ましくは、培養培地の小さなバッチが定期的に添加されるフェドバッチプロセスで添加することができる。宿主細胞を灌流培養で培養することもでき、これは、培養からの培養培地体積の連続的な除去、及び除去した体積と同程度の体積の新鮮培地との交換を伴う。一般に、灌流培養を操作して、バッチ培養より高い細胞密度を得ることができ、より長い期間維持することができる。灌流培養はまた、繰り返しの回収を可能にする。
【００４６】
抗体を産生する方法は、抗体を回収する工程を更に含む。一部の実施形態において、培養培地中の亜鉛応答性宿主細胞が１ｍＬあたり約１５０万細胞〜１ｍＬあたり約１１００万細胞、及び好ましくは１ｍＬあたり約３００万細胞〜１ｍＬあたり約１１００万細胞の細胞密度に到達したとき、抗体を回収することができる。抗体は、例えば、直接生成物捕獲（ＤＰＣ）によって回収することができる。本明細書に記載の方法の一部の実施形態において、亜鉛の濃度は、抗体が回収されるまで制御される。
【００４７】
生成物の収集時、つまり回収時の細胞齢を制御することによって、ＣＴＬ及びシアル酸含量を更により正確に制御することができる。したがって、本明細書に記載の方法の一部の実施形態において、抗体は、指数増殖期から定常状態期への遷移と同時に又は直後に回収される。他の実施形態において、抗体は、培養成長の定常状態期間に回収される。一部の実施形態において、抗体は、例えば、１０〜２５日目、１５〜２０日目、又は２０日目前後に等、培養の最初の２５日以内に回収される。他の実施形態において、抗体は、培養の最初の２５日後に回収される。
【００４８】
本明細書で更に提供されるのは、培養培地中で抗体を生合成するプロセスにおいて約２０％〜約７０％のＣ末端リジン含量を有する抗体のＣ末端リジン含量を制御する方法であって、その方法は、抗体の生合成の間に培養培地中の亜鉛の濃度を監視する工程、及び抗体の生合成の間に培養培地中の亜鉛の濃度を調整する工程を含む。
【００４９】
本明細書で更に提供されるのは、培養培地中で抗体を生合成するプロセスにおいて約１％〜約２０％のシアル酸含量を有する抗体のシアル酸含量を制御する方法であって、その方法は、抗体の生合成の間に培養培地中の亜鉛の濃度を監視する工程、及び抗体の生合成の間に培養培地中の亜鉛の濃度を調整する工程を含む。
【００５０】
本明細書で更に提供されるのは、培養培地中で抗体を生合成するプロセスにおいて約５０％〜約９０％のガラクトース含量を有する抗体のガラクトース含量を制御する方法であって、その方法は、抗体の生合成の間に培養培地中の亜鉛の濃度を監視する工程、及び抗体の生合成の間に培養培地中の亜鉛の濃度を調整する工程を含む。
【００５１】
本明細書で更に提供されるのは、培養培地中で抗体を生合成するプロセスにおいて約０．０５〜約０．２０の、ガラクトースに対するシアル酸の割合を有する抗体のガラクトースに対するシアル酸の割合を制御する方法であって、その方法は、抗体の生合成の間に培養培地中の亜鉛の濃度を監視する工程、及び抗体の生合成の間に培養培地中の亜鉛の濃度を調整する工程を含む。
【００５２】
ＣＴＬ、シアル酸若しくはガラクトース含量、又はガラクトースに対するシアル酸の割合を制御する方法の一部の実施形態において、抗体は、抗ＴＮＦα抗体若しくはその抗原結合フラグメントであり、及び／又は抗体は、ＳＰ２／０細胞若しくはＣＨＯ細胞によって生合成される。
【００５３】
抗体及びそのフラグメント
本明細書で使用されるとき、「抗体」は、抗体全体及び任意の抗原結合フラグメント又はその単鎖を含む。
【００５４】
抗体は、重鎖定常領域（Ｈｃ）、重鎖可変領域（Ｈｖ）、軽鎖可変領域（Ｌｖ）及び軽鎖定常領域（Ｌｃ）の少なくとも１つを含むことができ、ポリクローナルＡｂ、モノクローナルＡｂ、フラグメント及び／又はその領域は、抗原の一部を結合し、抗原の少なくとも１つの生物活性を阻害及び／又は中和する重鎖可変領域（Ｈｖ）又は軽鎖可変領域（Ｌｖ）の少なくとも１つを含む。
【００５５】
抗体又は抗原結合フラグメントは、少なくとも１つのヒト相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）又は少なくとも１つの重鎖可変領域の変異体及び少なくとも１つのヒト相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）又は少なくとも１つの軽鎖可変領域の変異体を含む抗原結合領域を含むことができる。かかる抗体は、組換えＤＮＡ技術の従来技術を使用して抗体をコードする（即ち、１つ以上の）核酸分子を調製し、発現させることによって、又は任意の他の適切な方法を使用することによって、従来技術を使用して抗体の様々な部分（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク）を一緒に化学的に連結させることにより調製できる。
【００５６】
抗体は、霊長類、哺乳類、マウス、キメラ、ヒト化、又はヒトにすることができる。抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラ抗体、マウス抗体、ヒト抗体又はそれらの任意の部分の少なくとも１つを含むことができ、少なくとも１つの抗原結合フラグメント又は免疫グロブリン可変領域の領域を有する。
【００５７】
キメラ抗体は、マウスｍＡｂ由来の可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有するもの等、分子の異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。例えば、これらは、通常１つの種からの可変ドメイン、及び別の種からの残部である、少なくとも１つの別個のドメインを保持することができ、例えば、マウス−ヒトキメラ抗体等がある。それらは主に、適用時の免疫原性を低減させるため、及び産生時の生産量を増加させるために使用され、例えば、マウスｍＡｂがハイブリドーマからより高い生産量を有するが、ヒトにおいてより高い免疫原性を有する場合、ヒト／マウスキメラｍＡｂが使用されるキメラ抗体及びその産生の方法は、当該技術分野において周知である（Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３２７３〜３２７７（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１〜６８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８〜２７０（１９８５）；及びＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））。これらの文献は参照としてその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５８】
本明細書で使用するとき、用語「キメラ抗体」は、一価、二価、又は多価の免疫グロブリンを含む。一価のキメラ抗体は、ジスルフィド架橋によってキメラＬ鎖と結合したキメラＨ鎖によって形成される二量体（ＨＬ）である。二価のキメラ抗体は、少なくとも１つのジスルフィド架橋によって結合した２つのＨＬ二量体によって形成される四量体（Ｈ２Ｌ２）である。多価のキメラ抗体はまた、例えば、（例えば、ＩｇＭのＨ鎖又はμ鎖から）凝集するＣＨ領域を使用することによって、産生することもできる。
【００５９】
「ヒト化」抗体（ＣＤＲ移植抗体としても周知である）は、異種の供給源（通常げっ歯類）からのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の免疫原性を低減させる、かつエフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞障害、補体活性化、及び／又はＣ１ｑ結合）を向上するためのプロセスによって産生される。一般にヒト化抗体は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類又は他の哺乳類等（ただしこれらに限定されない）ヒト以外の供給源からの１つ以上のアミノ酸残基を有する。遺伝子操作を受けたｍＡｂは、分子生物学技術を用いて遺伝子操作することができる。げっ歯類の相補的決定領域（ＣＤＲ）のヒトフレームワークへの単純なＣＤＲ移植は、多くの場合、元のｍＡｂの結合親和性及び／又は特異性を失う結果になる。抗体をヒト化するために、ヒト化抗体の設計は、ＣＤＲの残基における保存的アミノ酸置換、げっ歯類ｍＡｂからヒトフレームワーク領域への残基の復帰置換（復帰突然変異）等の変化を含むこともできる。非ヒト抗体又はヒト抗体を遺伝子操作又はヒト化するための方法は、当該技術分野において周知である。
【００６０】
本明細書で使用する用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する又は密接にマッチする可変領域及び定常領域を有する抗体を含む。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列にコードされていないアミノ酸残基を含んでもよい（例えば、インビトロにおけるランダム若しくは部位特異的突然変異誘発により、又はインビボにおける体細胞突然変異により導入された突然変異）を含んでもよい。したがって、本明細書で使用するとき、用語「ヒト抗体」は、実質的にタンパク質の全ての部分（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク、ＣＬ、ＣＨドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ヒンジ、（ＶＬ、ＶＨ））が実質的にヒト生殖細胞系抗体と類似である抗体を指す。
【００６１】
本明細書で使用するとき、用語「ヒト抗体」はまた、実質的にタンパク質の全ての部分（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク、ＣＬ、ＣＨドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ヒンジ（ＶＬ、ＶＨ））が軽微な配列の変化又は変異だけで実質的にヒトにおいて非免疫原性である抗体も指す。同様に、霊長類（サル、ヒヒ、チンパンジー等）、げっ歯類（マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター等）及び他の哺乳類を指定された抗体は、かかる種、亜属、属、亜科、及び科の特異的抗体を示す。ヒト抗体は、機能的に再構成されたヒト免疫グロブリン（例えば、重鎖及び／又は軽鎖）遺伝子を発現する能力をもつ非ヒト動物又は原核若しくは真核細胞により産生され得る。その上、ヒト抗体が単鎖抗体である場合、天然のヒト抗体では見出されないリンカーペプチドを含み得る。例えば、Ｆｖは、重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域を接続する２〜約８個のグリシン又はその他のアミノ酸残基などのリンカーペプチドを含み得る。このようなリンカーペプチドはヒト由来のものと見なされる。
【００６２】
抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤ及びその任意のサブクラスを含む任意の免疫グロブリンクラスであってよい。本明細書で使用するとき、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされている抗体クラス（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧｌ）を指す。ヒトでは、５種類の重鎖アイソタイプ及び２種類の軽鎖アイソタイプが存在する。重鎖については、ＩｇＡ１及び２；ＩｇＤ；ＩｇＧ１、２、３、及び４；ＩｇＥ；並びにＩｇＭが、重鎖のアイソタイプである。κ及びλは、軽鎖のアイソタイプである。ある実施形態では、重鎖は、ＩｇＧクラス重鎖である。他の実施形態では、重鎖は、ＩｇＭクラス重鎖である。ある実施形態では、重鎖は、少なくとも約８個のＪ領域のアミノ酸を更に含む。
【００６３】
抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、抗体に対する抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体であり得、可溶性又は結合形態、及びフラグメント、領域又はその誘導体、に分類することができ、酵素的切断、ペプチド合成又は組換え技術等（ただしこれらに限定されない）任意の既知の技術によって提供される。かかる抗体は、抗原受容体への抗原の結合を阻害する抗原（例えば、ＴＮＦ）の部分を結合し得る。
【００６４】
ポリクローナル抗体は、抗原で免疫化された動物の血清に由来する抗体分子の不均一な集団である。
【００６５】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、抗原に特異的な抗体の実質的に均質の集団を含み、モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープの単一結合特異性を示す。
【００６６】
ｍＡｂは、当業者に既知の方法により得ることができる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７（１９７５）、米国特許第４，３７６，１１０号、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９８７，１９９２）、及びＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）を参照されたい。これらの文献の内容は、参照として本明細書に全体が組み込まれる。
【００６７】
抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体は、一般に抗体の抗原結合部位と結合する固有の決定基を認識する抗体である。抗Ｉｄ抗体はまた、更に別の動物で免疫応答を誘発させる「免疫原」として使用されてもよく、いわゆる抗−抗Ｉｄ抗体を産生する。抗−抗Ｉｄは、抗Ｉｄを誘発させる元のｍＡｂとエピトープが同一であってもよい。したがって、ｍＡｂのイディオタイプ決定基に対する抗体を使用することによって、同じ特異性の抗体を発現する他のクローンを同定することが可能である。
【００６８】
抗体フラグメントとして、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖが挙げられる。これらのフラグメントは、無傷の抗体のＦｃフラグメントが欠損し、循環からより急速にクリアするので、無傷の抗体より非特異的組織結合を少なくすることができる（Ｗａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６〜３２５（１９８３））。これらのフラグメントは、例えば、（Ｆａｂフラグメントを産生する）パパイン又は（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生する）ペプシンのような酵素を用いたタンパク質分解開裂によって等、当該技術分野において周知の方法を用いて無傷の抗体から産生される。
【００６９】
本明細書で使用される場合、用語「抗原結合フラグメント」は、抗原と相互作用し、抗原についての特異性及び親和性を抗体に付与するアミノ酸残基を含有する抗体分子の部分を指す。「抗原」は、分子又は付加的に、動物にその抗原のエピトープと結合可能な抗体の産生を誘発させることができる抗体によって結合し得る分子の部分である。抗原は、１つ又は複数のエピトープを有することができる。抗体領域は、抗原結合残基の適切なコンフォメーションを維持するのに必要な「フレームワーク」アミノ酸残基を含む。
【００７０】
「抗原結合フラグメント」又はその部分は、例えば、単鎖抗体及びそのフラグメントを含む。抗原結合フラグメントの例として、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ、ドメインからなる一価フラグメント、（ｉｉ）ヒンジ領域にてジスルフィド架橋により結合された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ、ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨ及びＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖で発現するｄＡｂフラグメント、並びに（ｖｉ）１つ以上の単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。このような断片は、当該技術分野において既知であるような、及び／又は本明細書に記載のような、酵素的切断、合成又は組換え技術により生成できる。一部の実施形態において、フラグメントは、重鎖の定常、連結、多様性若しくは可変領域、又は軽鎖の定常、連結、若しくは可変領域等の抗体鎖の１つ以上の部分を含むことができる。
【００７１】
抗原結合領域は、例えば、マウス起源等の非ヒトのものであり得る。一部の実施形態において、抗原結合領域は、ウサギ又はラット若しくはハムスター等のげっ歯類に由来し得る。
【００７２】
キメラ抗体の抗原結合フラグメントは、ヒト抗原に特異的な非ヒト抗体に由来し得る。一部の実施形態において、そのようなキメラ抗体をコードするＤＮＡの供給源は、抗体を産生する細胞株、好ましくは通常ハイブリドーマとして周知であるハイブリッド細胞株を含む。一実施形態では、ハイブリドーマは、Ａ２ハイブリドーマ細胞株である。
【００７３】
「エピトープ」という用語は、抗体に対する特異的結合が可能なタンパク質決定因子を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸又は糖側鎖等の分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特定の三次元構造特性並びに特定の電荷特性を有する。「エピトープ」は、１つ以上のＡｂの抗原結合領域にて抗体によって認識及び結合することができる任意の分子の部分であり得る。「阻害及び／又は中和エピトープ」によって意図されるのは、抗体によって結合されるとき、インビボ、インビトロ、又はインサイチュの、より好ましくはインビボの、例えば、ＴＮＦ受容体へのＴＮＦの結合等、エピトープを含有する分子又は生物の生物活性の損失をもたらすエピトープである。
【００７４】
抗体は、例えば、単離、組換え及び／又は合成抗体であり得る。
【００７５】
本明細書で使用する「組換え抗体」は、組換え手段によって調整、発現、作製、又は単離される全ての抗体を含む。用語「組換え宿主細胞」（又は単純に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入された細胞を指す。組換え宿主細胞として、例えば、ＣＨＯ細胞株、又はマウス骨髄腫ＳＰ２／０由来の細胞株が挙げられる。マウス又はキメラマウス−ヒト若しくはヒト−ヒト抗体等の組換え抗体は、周知の技術を用いて産生され得る。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８７，１９９２，１９９３）、及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい。その全体の内容は参照として本明細書に組み込まれる。
【００７６】
同じ又は異なる可変領域結合特異性のキメラＨ鎖及びＬ鎖を有する抗体、フラグメント、又は誘導体は、周知の方法工程に従った、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（上記）、Ｈａｒｌｏｗ（下記）、及びＣｏｌｌｉｇａｎ（下記）に従った、例えば個別ポリペプチド鎖の適切な結合によって調整され得、これらの文献の内容は、参照として本明細書に全体が組み込まれる。
【００７７】
このアプローチによって、キメラＨ鎖（又はそれらの誘導体）を発現する宿主は、キメラＬ鎖（又はそれらの誘導体）を発現する宿主から別個に培養され、免疫グロブリン鎖は、別個に回収され、次に結合される。あるいは、宿主は共培養され得、鎖は培養培地中で自発的に結合でき、次に集合した免疫グロブリン、フラグメント又は誘導体の回収が続く。
【００７８】
ハイブリッド細胞は、非ヒト抗ｈＴＮＦα抗体産生細胞、典型的には天然若しくは組換えヒトＴＮＦ、又はヒトＴＮＦαタンパク質配列のペプチドフラグメントのどちらかに対して免疫化された動物の脾臓細胞、の融合によって形成される。あるいは、非ヒト抗ＴＮＦα抗体産生細胞は、ＴＮＦで免疫化された動物の血液、脾臓、リンパ節又は他の組織から得られるＢリンパ球であり得る。
【００７９】
第２の融合パートナーは、不死化機能を提供するものであり、リンパ芽球様細胞又は形質細胞腫若しくは骨髄腫細胞であり得、これは、それ自体抗体産生細胞でなく悪性である。一部の実施形態において、融合パートナー細胞は、ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）と省略されるハイブリドーマＳＰ２／０−Ａｇ１４、及び骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ９）、又はその誘導体を含む。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（下記）、Ｈａｒｌｏｗ（下記）、及びＣｏｌｌｉｇａｎ（下記）を参照されたい。これらの文献の内容は、参照として本明細書に全体が組み込まれる。
【００８０】
本明細書で使用するとき、「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に有しない抗体を指すことが意図される。ヒト抗原のエピトープと特異的に結合する単離抗体は、しかしながら、他の関連する抗原に倒して交差反応性を有する場合がある。更に、単離抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まない場合もある。
【００８１】
競合阻害によってｍＡｂの特異性及び親和性を決定する方法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）、及びＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９〜６０１（１９８３）に見つけることができ、これらの文献は全体にわたり本明細書に参照により組み込まれる。
【００８２】
一部の実施形態において、抗体は、生物活性抗体であり得る。生物活性抗体は、ネイティブ（非合成）、内因性又は関連する、及び既知の抗体のものの、少なくとも２０％、３０％、又は４０％、及び好ましくは少なくとも５０％、６０％、又は７０％、及び最も好ましくは少なくとも８０％、９０％又は９５％〜１００％の比活性を有する。酵素活性及び基質特異性のアッセイ及び定量測定の方法は、当業者にとって周知である。
【００８３】
抗ＴＮＦα抗体
一部の実施形態において、本明細書に記載の方法によって産生された抗体は、抗腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）抗体である。本明細書で使用されるとき、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、特に明記しない限り、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）を指すために互換的に使用される。同様に、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）抗体及び抗腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）及び抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）抗体は、特に明記しない限り、互換的に使用される。
【００８４】
ＴＮＦαは、１７ｋＤのタンパク質サブユニットの可溶性ホモ三量体である（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：６９５１〜６９５４（１９８７））。ＴＮＦの膜結合型２６ｋＤ前駆体型もまた存在する（Ｋｒｉｅｇｌｅｒｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５３：４５〜５３（１９８８））。ＴＮＦに関して、Ｂｅｕｔｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２０：５８４（１９８６），Ｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：６３０（１９８６）、及びＬｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５６：２３４を参照されたい。Ｐｅｎｎｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７２４〜７２９（１９８４）に従った完全なヒトＴＮＦαの一次配列を図２８に示す（配列番号１）。
【００８５】
ＴＮＦαは、組織の損傷につながる炎症誘発性作用を引き起こす場合がある。腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）は、細菌性、ウイルス性若しくは寄生虫性の感染症、慢性の炎症性疾病、自己免疫疾患、悪性腫瘍、及び／又は神経変性病等（ただしこれらに限定されない）の多数の病態を媒介する又はこれらの病態に関係する。したがって、一部の実施形態において、抗体は、ＴＮＦに対する中和及び／又は阻害活性を有する。
【００８６】
一部の実施形態において、抗体は、高親和性ヒト−マウスキメラ抗ＴＮＦ抗体、及びフラグメント又はその領域であり、インビボでヒトＴＮＦαに対して強力な阻害及び／又は中和活性を有する。かかる抗体及びキメラ抗体は、精製された組換えｈＴＮＦα（配列番号１）又はそのペプチドフラグメントを用いた免疫化によって生成されたものを含み得る。
【００８７】
一部の実施形態において、抗体及びフラグメントは、ＴＮＦαに特異的に結合する。一部の実施形態において、それらはまた、インビトロ、インサイチュ及び／又はインビトロのＴＮＦのＲＮＡ、ＤＮＡ又はタンパク合成、ＴＮＦ放出、ＴＮＦ受容体シグナリング、膜型ＴＮＦ開裂、ＴＮＦ活性、ＴＮＦ産生及び／又は合成を低減、ブロック、抑制、干渉、防止及び／又は阻害することもできる。
【００８８】
一部の実施形態において、抗体は、ｃＡ２である。キメラ抗体ｃＡ２は、Ａ２と呼ばれる高親和性中和マウス抗ヒトＴＮＦα  ＩｇＧ１抗体の抗原結合可変領域及びヒトＩｇＧ１のκ免疫グロブリンの定常領域からなる。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、同種の抗体のエフェクター機能を改善し、循環血清半減期を増加させ、抗体の免疫原性を減少させる。キメラ抗体ｃＡ２の結合活性及びエピトープの特異性は、マウス抗体Ａ２の可変領域に由来する。特定の実施形態において、マウス抗体Ａ２の可変領域をコードする核酸の供給源は、Ａ２ハイブリドーマ細胞株である。
【００８９】
一実施形態では、マウスモノクローナル抗体Ａ２は、ｃ１３４Ａと呼ばれる細胞株によって産生される。一実施形態では、キメラ抗体ｃＡ２は、ｃ１６８Ａと呼ばれる細胞株によって産生される。
【００９０】
一部の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、ｃＡ２の重鎖ＣＤＲ３及び／又はｃＡ２の軽鎖ＣＤＲ３の少なくとも１つを含み得る。特定の実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、ｃＡ２の対応のＣＤＲ１、２及び／又は３のアミノ酸配列を有する少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ（即ち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３）の少なくとも一部分を含む抗原結合領域を有することができる。別の実施形態において、抗体又は抗原結合部分又は変異体は、ｃＡ２の対応のＣＤＲ１、２及び／又は３のアミノ酸配列を有する少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ（即ち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３）の少なくとも一部分を含む抗原結合領域を有することができる。一実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントの３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲは、本明細書に記載のような、ｍＡｂ−Ａ２又はｃＡ２のうちの少なくとも１つの対応するＣＤＲのアミノ酸配列を有する。
【００９１】
キメラＡ２の結合活性及びエピトープの特異性は、マウスＡ２の可変領域に由来する。固相ＥＬＩＳＡにおいて、ＴＮＦの交差競合が、キメラとマウスＡ２との間で観察され、ｃＡ２及びマウスＡ２について同一のエピトープ特異性を示した。ＴＮＦ−αのｃＡ２の特異性は、リンホトキシン（ＴＮＦ−β）の細胞毒性効果を中和できないことによって確認された。キメラＡ２は、天然及び組換え両方のヒトＴＮＦの細胞毒性効果を用量依存的に中和する。ｃＡ２及び組換えヒトＴＮＦの結合アッセイから、ｃＡ２の親和定数は、１．８×ｌ０９Ｍ１と計算された。
【００９２】
ＴＮＦ中和化合物のＴＮＦ中和活性を判定するために使用することができるスクリーニング法は、インビトロ又はインビボアッセイを含むことができる。かかるインビトロアッセイは、ラジオイムノアッセイ等のＴＮＦ細胞毒性アッセイを含むことができ、これは単離又は組換え型のチンパンジー又はヒトＴＮＦ等のＴＮＦとの接触による細胞死の減少を判定し、ＴＮＦ中和化合物の同時存在は、細胞死の程度又は比率を低減させる。細胞死は、細胞死率を５０％減にするＴＮＦ中和化合物の濃度を表すＩＤ５０値を用いて判定することができる。例えば、ｍＡｂのＡ２及びｃＡ２は、１４〜２０ｍｇ／ｍＬ等の約１７ｍｇ／ｍＬ＋／−３ｍｇ／ｍＬ、又はその中の任意の範囲若しくは値のＩＤ５０を有することが分かった。
【００９３】
一部の実施形態において、抗体は、インビボでの抗ＴＮＦαマウスｍＡｂ−Ａ２、キメラｍＡｂ−ｃＡ２、又はＡ２及び／若しくはｃＡ２と実質的に同じ特定の結合特性、例えば、エピトープ特異性等を有する抗体のヒトＴＮＦαとの結合を競合的に阻害することができる。
【００９４】
抗体並びにフラグメント及びその領域によって認識されるエピトープは、次のＴＮＦのアミノ酸配列のいずれか又は両方のうち少なくとも１つのアミノ酸を含む５つ以上のアミノ酸を含むことができ、それらは、抗ＴＮＦ活性、ＴＮＦ抗体若しくはそのフラグメントによって認識される、及び／又はこれらと結合するＴＮＦのトポグラフィー又は三次元のエピトープを提供する。
【００９５】
【表１】
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【００９６】
一部の実施形態において、抗ＴＮＦ抗体の抗体、フラグメント、及び領域は、（配列番号１の）ｈＴＮＦαのアミノ酸残基８７〜１０８又は残基５９〜８０及び８７〜１０８の両方からの少なくとも１つのアミノ酸を含む５つのアミノ酸を含むエピトープを認識する。一部の実施形態において、抗ＴＮＦ抗体の抗体、フラグメント、及び領域は、（配列番号１の）ｈＴＮＦαのアミノ酸１１〜１３、３７〜４２、４９〜５７又は１５５〜１５７のうち少なくとも１つからのエピトープを認識しない。（Ｅｃｋ  ａｎｄ  Ｓｐｒａｎｇ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（２９）：１７５９５〜１７６０５（１９８９）によって発表された推定的受容体結合箇所）。
【００９７】
一実施形態では、抗体は、２本の軽鎖及び２本の重鎖を含む抗ｈＴＮＦキメラ抗体であって、それらの鎖のそれぞれは、ヒト定常領域の少なくとも一部分及びヒトＴＮＦに対する特異性を有する非ヒト由来の可変（Ｖ）領域の少なくとも一部分を含み、前記抗体がヒトＴＮＦの阻害及び／又は中和エピトープに高い親和性で結合する。
【００９８】
一実施形態では、抗体は、異常なＴＮＦ産生に関連した状態に苦しんでいる疑いのある患者又は動物においてＴＮＦを検出する診断方法で使用されるものである。一部の実施形態において、ＴＮＦ抗体は、細菌性、ウイルス性若しくは寄生虫性の感染症、慢性の炎症性疾病、自己免疫疾患、悪性腫瘍、及び／又は神経変性病等（ただしこれらに限定されない）のＴＮＦに関係する症状又は病態を軽減するために使用される。
【００９９】
ヒトＴＮＦα又はＴＮＦβに特異的なｍＡｂを産生するマウスハイブリドーマは、ＳＰ２／０、及び精製されたｈＴＮＦα、組換えｈＴＮＦα、天然又は合成ＴＮＦペプチドに対して免疫化されたマウスからの脾臓細胞等のマウス融合パートナー細胞の融合によって形成され、（配列番号１の）ＴＮＦの残基５９〜８０、及び８７〜１０８から選択される５つ以上のアミノ酸又はＴＮＦを含む他の生物製剤を含むペプチドを含む。マウスを免疫化するために、様々な異なる従来のプロトコルに従うことができる。例えば、マウスは、ＴＮＦの一次免疫及びブースト免疫を受容することができる。
【０１００】
本明細書に記載の抗体は、広範囲にわたる親和性（ＫＤ）でヒトＴＮＦを結合することができる。一実施形態では、少なくとも１つのヒトｍＡｂは、所望によりヒトＴＮＦを高い親和性で結合することができる。例えば、ヒトｍＡｂは、ヒトＴＮＦを約１０−７Ｍ以下、例えば０．１〜９．９（又はその中の任意の範囲若しくは値）Ｘ１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２、１０−１３又はその中の任意の範囲若しくは値等（ただしこれらに限定されない）のＫＤで結合することができる。
【０１０１】
抗原に対する抗体の親和性又は結合活性は、任意の好適な方法を用いて実験的に決定することができる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）、Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）、及び本明細書に記載の方法を参照されたい）。特定の抗体抗原相互作用の測定される親和性は、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ）下で測定される場合に異なり得る。したがって、親和性及び他の抗原結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋａ、Ｋｄ）の測定は、好ましくは、抗体及び抗原の標準化溶液、及び本明細書で記載される緩衝剤等の標準化緩衝剤を用いて行われる。
【０１０２】
抗ＴＮＦ抗体は、定義されたアミノ酸配列を有する重鎖又は軽鎖可変領域のうち少なくとも１つを含むことができる。例えば、一実施形態では、抗ＴＮＦ抗体は、任意追加的に配列番号３のアミノ酸配列を有する、少なくとも１つの軽鎖可変領域、及び／又は任意追加的に配列番号５のアミノ酸配列を有する、少なくとも１つの重鎖可変領域のうち少なくとも１つを含む。ヒトＴＮＦと結合し、定義された重鎖又は軽鎖可変領域を含む抗体は、当該技術分野において周知の及び／又は本明細書に記載の、ファージディスプレイ（Ｋａｔｓｕｂｅ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ，１（５）：８６３〜８６８（１９９８））又はトランスジェニック動物を使用する方法等の好適な方法を用いて調整され得る。一実施形態では、抗ＴＮＦ抗体は、Ｋａｂａｔにより示された配列番号３のアミノ酸残基２４〜３４、５０〜５６及び８９〜９７にそれぞれ対応する軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、並びに配列番号５のアミノ酸残基３１〜３５、５０〜６８及び１０１〜１０９にそれぞれ対応する重鎖ＣＤＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む。
【０１０３】
抗ＴＮＦ抗体は、所望により更に、配列番号３及び５のうち少なくとも１つの、隣接アミノ酸の７０〜１００％の少なくとも１つのポリペプチドを含んでもよい。
【０１０４】
一部の実施形態において、免疫グロブリン鎖又はその一部（例えば、可変領域）のアミノ酸配列は、配列番号３及び５の少なくとも１つの対応する鎖と約７０〜１００％の同一性（例えば、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、又はこの中の任意の範囲若しくは値）を有する。例えば、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を、配列番号８の配列と比較することができるか、又は重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号７と比較することができる。好ましくは、７０〜１００％のアミノ酸同一性（すなわち、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、又はこの中の任意の範囲若しくは値）は、当該技術分野において既知であるような、適切なコンピュータアルゴリズムを用いて決定される。
【０１０５】
代表的な重鎖及び軽鎖可変領域の配列は、配列番号３及び５に示される。抗体は、抗体から任意の数の隣接アミノ酸残基を含み得、その数は、抗ＴＮＦ抗体における隣接残基数の１０〜１００％からなる整数の群から選択される。任意で、隣接アミノ酸のこの部分配列は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、又はそれ以上のアミノ酸長であるか、又はその中の任意の範囲若しくは値である。更に、かかる部分列の数は、少なくとも２、３、４、又は５等の、１〜２０からなる群から選択される任意の整数であり得る。
【０１０６】
抗体はまた、ＴＮＦイムノアッセイ及びＴＮＦ媒介性病理学の療法の両方に対して、高親和性及び／又は強力なインビボのＴＮＦ阻害及び／又は中和抗体、フラグメント又はその領域も含む。かかる抗体、フラグメント、又は領域は、好ましくは、ｈＴＮＦαに対し、少なくとも１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１（例えば、ｌ０８−Ｉ０１０Ｍ−１、５×１０８Ｍ−１、８×１０８Ｍ−１、２×１０９Ｍ−１、４×１０９Ｍ−１、６×１０９Ｍ−１、８×１０９Ｍ−１等）、又はその中の任意の範囲又は値の、Ｋａとして表現される親和性を有する。
【０１０７】
ＴＮＦ抗体はまた、高い親和性のマウス及びキメラ抗体、並びにフラグメント、領域並びにＴＮＦ誘導ＩＬ−６の分泌をブロックする強力なインビボのＴＮＦα阻害及び／又は中和活性を有する誘導体を含む。一部の実施形態において、ヒト治療用の抗体は、高い親和性のマウス及びキメラ抗ＴＮＦα抗体、並びにフラグメント、領域及びその誘導体を含み、これらは、ＴＮＦ誘導プロコアグラント活性をブロックし、ＥＬＡＭ−Ｉ及びＩＣＡＭ−Ｉ等の細胞接着分子のＴＮＦ誘発発現をブロックすること、並びにインビボ、インサイチュ、及びインビトロのＴＮＦ細胞分裂活性をブロックすることを含む。
【０１０８】
モノクローナル抗ＴＮＦ抗体の追加の例は、当該技術分野において説明される（例えば、米国特許第５，２３１，０２４号、Ｍｏｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２（３）：１６２〜１６９（１９９０）、米国特許出願第０７／９４３，８５２号（１９９２年９月１１日出願）、Ｒａｔｈｊｅｎらによる国際公開第９１／０２０７８号（１９９１年２月２１日公開）、Ｒｕｂｉｎらによる欧州特許第０  ２１８  ８６８号（１９８７年４月２２日公開）、Ｙｏｎｅらによる、欧州特許第０  ２８８  ０８８号（１９８８年１０月２６日）、Ｌｉａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１３７：８４７〜８５４（１９８６）、Ｍｅａｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ６３０５〜３１１（１９８７）、Ｆｅｎｄｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ６：３５９〜３６９（１９８７）、Ｂｒｉｎｇｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ６：４８９〜５０７（１９８７）、及びＨｉｒａｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．９６：５７〜６２（１９８７）を参照されたい。これらの文献は全体的に参照として本明細書に組み込まれる）。
【０１０９】
後述の実施例の結果は、多数の重要な発見を実証する。
【０１１０】
ＣＴＬ除去を、細胞外Ｚｎ＋２の制御によって最大濃度未満に制御することができる。例えば、後述のＳＭＦ−１０．１実験、ＤＯＥ３実験、ＢＳＡ配合実験第１、及びＢＳＡ配合実験第２における実験群によって実証されるように、Ｚｎ＋２の細胞外濃度を≦１．２μＭの値に制御することによってＣＴＬ含量を範囲内（例えば、４０〜７０％）に制御することができる。その上、ＤＯＥ３実験で実証されるように、ＣＴＬ含量のより高い範囲への制御は、最大６．３μＭのより高いＺｎ＋２濃度で可能である。
【０１１１】
更に、ＤＯＥ３実験、ＢＳＡ配合実験第１、及びＢＳＡ配合実験第２における実験群によって実証されるように、細胞外Ｚｎ＋２濃度の範囲内で、細胞外［ＥＤＴＡ］又は［ＥＤＴＡ−Ｆｅ＋３］を制御することによって、ＣＴＬ含量を更に制御することができる。
【０１１２】
加えて、シアル酸含量を、細胞外Ｚｎ＋２の制御によって最大濃度未満に制御することができる。例えば、ＤＯＥ３実験、ＢＳＡ配合実験第１、及びＢＳＡ配合実験第２における実験群によって実証されるように、Ｚｎ＋２の細胞外濃度を≦１．２μＭの値に制御することによってシアル酸を範囲内（例えば、４〜１３％）に制御することができる。更に、ＤＯＥ３実験で実証されるように、シアル酸含量のより高い範囲への制御は、最大６．３μＭのより高いＺｎ＋２濃度で可能である。
【０１１３】
その上、ＤＯＥ３実験、ＢＳＡ配合実験第１、及びＢＳＡ配合実験第２で実証されるように、細胞外Ｚｎ＋２濃度の範囲内で、細胞外［ＥＤＴＡ］又は［ＥＤＴＡ−Ｆｅ＋３］を制御することによって、シアル酸含量を更に制御することができる。
【０１１４】
更に、ＳＦＭ−１０．３実験及びＤＯＥ３実験で実証されるように、Ｚｎ＋２の細胞外濃度を制御することによって、抗体産生もまた制御することができる。
【０１１５】
シアル酸付加、ＣＴＬ除去及び抗体産生の制御を実現するためのＺｎ＋２、Ｆｅ＋３及びＥＤＴＡの濃度の制御は、次のいずれかを単独又は組み合わせで含む、様々な手段を介して実現することができる。１）Ｚｎ＋２、Ｆｅ＋３及びＥＤＴＡの培養培地への直接添加、２）Ｚｎ＋２、Ｆｅ＋３若しくはＥＤＴＡを成分として有する原材料の配合による、３）Ｚｎ＋２、Ｆｅ＋３若しくはＥＤＴＡの濃度を調節するための原材料の処置による、並びに／又は４）所望の濃度のＺｎ＋２、Ｆｅ＋３、及び／若しくはＥＤＴＡを得るために複合原材料の製造プロセスの修正による。
【０１１６】
実例
材料及び方法
本明細書に記載の実験は、制御された３Ｌ  Ａｐｐｌｉｋｏｎ（登録商標）バイオリアクターで、市販のインフリキシマブの経過の代表的な結果を提供するように実証された動作条件を用いて実行された。
【０１１７】
指定した日に、プロテインＡカラムを用いた直接生成物捕獲（ＤＰＣ）によってインフリキシマブを精製した。次に毛管等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）又はＷＡＸアッセイによって特性化された。プロテインＡカラムを用いたＤＰＣによって精製されたインフリキシマブを、本明細書では「ＤＰＣ試料」又は「ＤＰＣ溶出液」と呼ぶ。
【実施例】
【０１１８】
実施例１−ｃＩＥＦ法
ｃＩＥＦを使用してインフリキシマブオリゴ糖のＣＴＬ含量を計算した。インフリキシマブ予備配合バルク（ＰＦＢ）の分析で顕在化する電荷不均一性の３つの原因が存在する。（１）ＣＴＬ変異性、（２）シアル酸含量、及び（３）脱アミドである。初期、中期、及び後期の市販のバイオリアクター試料からの典型的なインフリキシマブ溶出液は、約３０％〜８０％のインフリキシマブの重鎖からのＣＴＬ除去を呈し、ＰＦＢ中の平均ＣＴＬ除去は約４０％〜６０％である。軽鎖ＣＴＬは、除去の対象ではない。ＣＴＬ除去は、初期バイオリアクター試料ではより低くなる傾向にあり、中期及び後期バイオリアクター試料では増加する。初期及び後期のバイオリアクター試料からの典型的なインフリキシマブ溶出液は、ＩｇＧオリゴ糖の約３％〜１４％のシアル酸含量を呈する。シアル酸付加は、初期バイオリアクター試料では典型的にはより低く、中期及び後期バイオリアクター試料ではより高い。逆相ペプチドマッピングは、重鎖及び軽鎖上のインフリキシマブのいくつかの脱アミド部位で一貫した低レベルの脱アミノを明らかにする。
【０１１９】
この電荷不均一性は通常、ｃＩＥＦ電気泳動図において４〜６個のピークをもたらす。ピーク１は、過剰電荷を含有しないインフリキシマブに相当し、即ち、このピーク又はバンドは、両法のＣ末端リジンを含有し、シアル酸、及び脱アミドを含有しない。第２、第３、第４、第５及び第６のピーク又はバンドは、ＣＴＬ除去、シアル酸付加及び脱アミドの組み合わせにより、それぞれ１、２、３、４及び５個の過剰電荷を含有する。
【０１２０】
図１は、インフリキシマブの試料のｃＩＥＦ電気泳動図であり、ピーク１〜６に対するｐＩ値を示す。
【０１２１】
比較的高いレベルのＣＴＬ除去、低レベルのシアル酸付加、及び脱アミドの一貫性により、ピーク１の相対的割合は、ＣＴＬ除去と相関が高かった。図２は、ピーク１の割合に応じた脱リジン（ｄｅｓ−Ｌｙｓ）の割合の適合線プロットであり、実験条件の範囲にわたるＣＴＬ含量（ｄｅｓ−Ｌｙｓの割合として表現される）とピーク１の割合との間の相関を示す。図２に表された相関は、ｄｅｓ−Ｌｙｓの割合をペプチドマッピングによって決定し、ピーク１の割合をｃＩＥＦによって決定したインフリキシマブ試料から作製した。
【０１２２】
ＣＴＬ含量は、本明細書でＣ末端リジンを処理する重鎖の割合として表現され、次の等式を用いて計算することができる。ＣＴＬ含量（％）＝（ＣＴＬを処理する重鎖の数）／（重鎖総数）×１００。ＣＴＬ除去は、本明細書でＣ末端リジンが欠損した重鎖の割合（ｄｅｓ−Ｌｙｓ）として表現される。つまり、「８０％のｄｅｓ−Ｌｙｓ」は、２０％のＣＴＬ含量に等しい。脱リジンの割合と（ｃＩＥＦによって測定された）ピーク１の割合との間の相関は、ＣＴＬ除去、シアル酸付加、及び脱アミドの典型的な割合を呈するインフリキシマブ試料についても成り立つ。この相関は、したがって、以下により本明細書に記載の実験に適用される。（１）ＷＡＸによるシアル酸付加は、これらの実験からの多数のＤＰＣ試料について決定され、その結果は、シアル酸が早期バイオリアクター試料で３％〜後期バイオリアクター試料で約１４％の典型的な範囲内に残った（即ち、シアル酸の割合は、図１の相関を生成するために使用されたデータの範囲内に残った）ことを示し、（２）図１の相関を生成するために使用された実験試料の場合と同様に脱アミドの割合が低いまま一貫したと仮定するのが道理的である。
【０１２３】
これらの実験においてＣＴＬ除去は、３０〜６０％の典型的な値からより高い値の範囲に及んだ。これらの条件下で、ＣＴＬ除去は、ピーク１の割合の優勢な決定基であり続ける。
【０１２４】
実施例２−ＷＡＸアッセイ
ＷＡＸアッセイを使用してインフリキシマブオリゴ糖のシアル酸含量及びガラクトース含量を決定した。このアッセイでは、Ｎ−結合オリゴ糖は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いたＩｇＧから放出され、次にアントラニル酸及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムの溶液を用いて誘導体化される。試料は、０．４５−ｍｉｃｒｏｎ  ｎｙｌｏｎ  ＡＣＲＯＤＩＳＣ（登録商標）フィルターを用いて精製され、蛍光検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣで分析される。ピーク同一性は、市販のＮ−グリカンスタンダードを用いて解決される。
【０１２５】
本明細書に記載のＷＡＸアッセイにおいて、成分５Ａは、シアル酸を含有するインフリキシマブオリゴ糖の割合である。成分１は、ガラクトースが欠損したインフリキシマブオリゴ糖の割合と相関が高い。したがって、（１００−成分１の割合）は、ガラクトースを含有するインフリキシマブオリゴ糖の割合の合理的推定値を表す。
【０１２６】
インフリキシマブの重鎖において、１つのアスパラギン（Ａｓｎ）残基は、オリゴ糖でグリコシル化され、これは、例えば、１つ又は２つのガラクトース残基及び１つ又は２つのシアル酸残基を含有することができる。インフリキシマブのガラクトース含量は、本明細書でガラクトースを含有するオリゴ糖の割合として表現され、次の等式を用いて計算することができる。ガラクトース含量（％）＝（ガラクトースを含有するオリゴ糖の数）／（オリゴ糖総数）×１００。この等式は、オリゴ糖中のガラクトース単位の数に関係なく適用する。換言すれば、例えば、オリゴ糖中に１つ又は２つのガラクトース残基が存在するかどうかに関係なく、オリゴ糖は、ガラクトース含量を計算する目的で１回だけカウントされる。
【０１２７】
インフリキシマブのシアル酸含量は、本明細書でシアル酸を含有するオリゴ糖の割合として表現され、次の等式を用いて計算することができる。シアル酸含量（％）＝（シアル酸を含有するオリゴ糖の数）／（オリゴ糖総数）×１００。この等式は、オリゴ糖中のシアル酸残基の数に関係なく適用する。換言すれば、例えば、オリゴ糖中に１つ又は２つのシアル酸残基が存在するかどうかに関係なく、オリゴ糖は、シアル酸含量を計算する目的で１回だけカウントされる。
【０１２８】
典型的には、インフリキシマブの両方の重鎖は、グリコシル化されている。しかしながら、幾つかの状況では、重鎖の一部は、アグリコシル化されたままである。例えば、一部の実施形態において、インフリキシマブ分子の約９４％は、両方の鎖でグリコシル化され、インフリキシマブ分子の約６％は、半グリコシル化され、インフリキシマブ分子の約０．１％は、完全にアグリコシル化されている。
【０１２９】
ガラクトースに対するシアル酸の割合は、インフリキシマブのオリゴ糖中のガラクトースに対するシアル酸のモル比から計算される。
【０１３０】
実施例３−回収物保持試験
無細胞インフリキシマブ回収物を長時間保持した２つの試験を実施した。これらの試験の目的は、ＣＴＬ除去が細胞外で発生し得る（即ち、分泌後）かどうかを理解するためであった。
【０１３１】
シアル酸が、分泌の前に細胞内で糖タンパク質に付加されることは周知である。しかしながら、分泌された組換え糖タンパク質からのシアル酸の細胞外除去は、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞培養物について報告されている。ＣＨＯ細胞について、シアリダーゼは、溶解した細胞から細胞外培地の中に放出される。つまり、これらの回収物保持試験の第２の目的は、インフリキシマブの経過に関して無細胞回収物においてシアル酸の細胞外除去が存在するかどうかを明確にすることであった。
【０１３２】
製造規模バイオリアクターからの回収物を用いた回収物保持試験は、様々な条件下の回収物の保持（２〜１４℃で３０日間の清澄化した、無細胞回収物保持、２〜８℃で１４日間の清澄化しない回収物保持）及び様々なバイオリアクターの経年数がインフリキシマブのｃＩＥＦゲル特性に全く影響しないことを実証した。
【０１３３】
これらの結果を強化するために、別の回収物保持試験を実施した。インフリキシマブ無細胞回収物を２つのバイオリアクターから採取した。各バイオリアクターに対し、回収物の一部をプロテインＡクロマトグラフィーによって直ちに精製してＤＰＣ溶出液を製造した。ＤＰＣ溶出液に対する処理の前に、回収物の他の部分を１０〜１４℃の温度（典型的な保管温度）で７日間保管した。保持中の回収物の温度を冷蔵庫内のプローブで監視し、手動調整によって制御した。４つのＤＰＣ溶出液試料を次にｃＩＥＦによって、回収物中のＣＴＬ又はシアル酸除去を示す電荷分布変化の何らかの証拠について分析した。
【０１３４】
この保持試験は、直ちに作製された回収物から、又はプロテインＡの精製の前に１０〜１２℃の温度で７日間保持した回収物から、ＤＰＣ溶出液のｃＩＥＦパターンに有意差がないことを明らかにした。
【０１３５】
回収物保持試験は、インフリキシマブの重鎖からのＣＴＬの除去が、細胞内で発生する可能性があることを実証した。同様に、インフリキシマブオリゴ糖のシアル酸含量は、細胞内で決定される。
【０１３６】
実施例４−ＳＦＭ−１０．１実験
用語ＳＦＭ−１０．１は、ＢＳＡ及びＣＭ２（パートＢ）液（亜鉛含有インスリンを含む）を欠いているインフリキシマブＳＦＭ−１０培地に相当する。ＳＦＭ−１０．１実験の目的は、インフリキシマブの産生に対するＺｎ＋２添加の影響を精査することであった。
【０１３７】
４つの実験条件は、硫酸亜鉛七水和物を添加したＳＦＭ−１０．１培地を表し、これを、最終培地濃度に０．２５、０．５、１．０又は２．０μＭのＺｎ＋２を追加する量で追加した。各実験におけるＺｎ＋２全濃度は、この添加の合計プラスＰＲＩＭＡＴＯＮＥ（登録商標）（Ｋｅｒｒｙ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｆｌａｖｏｕｒｓ（Ｂｅｌｏｉｔ，ＷＩ）から入手可能）由来のＺｎ＋２であり、これは０．４９μＭ（金属分析に基づいて）であると判定された。したがって、これらの４つのバイオリアクターにおける亜鉛全濃度は、０．７４、１．０、１．５及び２．５μＭと合理的に推定される。これらのバイオリアクターにおけるＦｅ＋３濃度は、使用したロットのＰＲＩＭＡＴＯＮＥ（登録商標）の金属分析に基づいて５．８μＭであった。ＥＤＴＡ濃度は、トランスフェリンから由来した２μＭであると推定される。ＥＤＴＡは、Ｆｅ＋３に対して、Ｚｎ＋２及び他の二価のカチオンに対するよりも一層強い親和性を有する。したがって、［ＥＤＴＡ−Ｆｅ＋３］の計算は、Ｚｎ＋２をキレート化することができるＥＤＴＡの濃度を表し得る。したがって、この実験の第１セットにおいて、細胞外のＺｎ２＋を結合することができる遊離ＥＤＴＡが存在しないことが期待できる。
【０１３８】
【表２】
2016512029.tif 000004
【０１３９】
図３は、バイオリアクター期間に応じたＣＴＬ除去（ｄｅｓ−Ｌｙｓの割合として表現され、ピーク１のデータからｃＩＥＦ法を用いて計算される）のグラフであり、ＣＴＬ除去について様々なＺｎ＋２濃度の影響を示す。Ｚｎ＋２全濃度が約１．５及び２．５μＭのバイオリアクターは、全ての時点で７０％〜８０％のＣＴＬ除去を示した。全ての時点（早期、中期及び後期バイオリアクター試料）のＣＴＬ除去が高いため、バイオリアクター期間に応じて電荷分布に変化はない。Ｚｎ＋２濃度が１．０μＭのバイオリアクターは、試験の早期に６０％のＣＴＬ除去を呈し、中期及び後期の試料点で約７０％の除去を示した。Ｚｎ＋２濃度が約０．７４μＭのバイオリアクターは、バイオリアクター期間に応じて増加するＣＴＬ除去を示した。
【０１４０】
図４は、バイオリアクター期間に応じ、ＷＡＸ法により判定されたシアル酸を含むインフリキシマブオリゴ糖の割合のグラフであり、シアル酸の割合について様々なＺｎ＋２濃度の影響を示す。図４は、この実験でＺｎ＋２濃度に応じたシアル酸付加に明確な傾向がなかったことを示す。
【０１４１】
このように影響がないことは、ＳＦＭ−１０．１培地においてシアル酸含量の細胞外Ｚｎ＋２濃度に対する真の不感性を表すかどうか、少数のバイオリアクターが与えられた実験ノイズの反映であるかどうか、又は実験実施を含む手順の問題である恐れがあったのかどうかは、不明である。
【０１４２】
図５〜７は、それぞれ時間に応じた生細胞密度、培養物生存性、及びインフリキシマブ濃度のグラフであり、ＳＦＭ−１０．１実験における様々なＺｎ＋２の濃度の影響を示す。約１５〜２０日目に標的細胞密度に到達する前の期間中の結果は、これが全てのバイオリアクターが一貫して操作されている期間を表すことを最もよく明らかにする。標的細胞密度に到達後、細胞は、標的細胞濃度を維持するように意図して毎日培養から除去され、この除去手順の変化は、細胞密度、培養物生存性、及び抗体濃度の変動を引き起こす場合がある。
【０１４３】
ＳＦＭ−１０．１実験において、０．７４μＭのＺｎ＋２を用いたバイオリアクターは、標的細胞密度に到達する前に、１．５及び２．５μＭのＺｎ＋２を含有するバイオリアクターより低い細胞成長率、より低い培養物生存性、及びより低い抗体濃度を有する。１．０μＭのＺｎ＋２を用いたバイオリアクターは、各事例で０．７４μＭを用いたバイオリアクターと１．５又は２．５μＭのＺｎ＋２を用いたバイオリアクターとの間の中間の性能を示した。
【０１４４】
この実験の条件は、ＳＰ２／０細胞によるＺｎ＋２蓄積に有利であった。［ＥＤＴＡ−Ｆｅ＋３］は、０未満であり、全てのＥＤＴＡがＦｅ＋３にキレート化され、細胞外培地でＺｎ＋２をキレート化できないことを示す。更に、別の可能なキレート剤であるＢＳＡは、培地に存在しなかった。
【０１４５】
Ｚｎ＋２蓄積に対するこれらの有利な条件にもかかわらず、実験結果は、特に培養の最初の２０日間の、ＣＴＬ除去、初期細胞成長、培養物生存性、及び抗体濃度、に対する０．７４及び１．０μＭの細胞外Ｚｎ＋２濃度の影響を示す。結果は、この実験条件下でシアル酸付加に対するＺｎ＋２の明確な影響を示さない。
【０１４６】
特定の理論に束縛されることを望むわけではないが、これらの結果は、次の仮説と一致する。
・ＳＰ２／０細胞は、細胞内のＺｎ＋２を蓄積して、Ｚｎ＋２補因子要求性を有する酵素と関連する細胞内プロセスを支持する必要がある。これは、ＣＴＬ除去、細胞成長、細胞分裂、及び抗体産生の原因である酵素を含む。
・約０．７４〜１．０μＭのＺｎ＋２濃度は、産生バイオリアクタープロセスの初期の間、これらのＺｎ＋２要求細胞内プロセスを十分に供給する十分な細胞外Ｚｎ＋２を提供しない。
・その影響は、培養の最初の２０日間で最も著しい。これは、１細胞あたりの細胞内Ｚｎ＋２の量が細胞分裂のために連続的に減少される期間である。即ち、細胞が分裂するたびに、蓄積されたＺｎ＋２が娘細胞間で分割される。０．７４〜１．０μＭの細胞外Ｚｎ＋２において、Ｚｎ＋２の細胞取り込みは、細胞倍増のためにＺｎ＋２の細胞還元と同じレベルを保持することができない。このように、細胞は、Ｚｎ＋２が不十分であり、非最適の細胞成長、培養物生存性及び抗体産生能力を呈する。
・約２０日目の後、細胞は、灌流培養の標的細胞密度に近付き、細胞分裂が遅くなる。以後、細胞分裂が遅くなるため細胞内Ｚｎ＋２還元と細胞取り込みの比率は、経時的に増加する細胞ごとのＺｎ＋２蓄積を確保するのに十分である。これらの条件下で２０日目の後、細胞は、Ｚｎ＋２の細胞内貯蔵を徐々に増やす。
・０．７４μＭのＺｎ＋２を用いたバイオリアクターについて、バイオリアクター期間に応じたＺｎ＋２蓄積のパターンは、バイオリアクター期間に応じたｃＩＥＦパターンで観察された変化の原因である。即ち、ＣＴＬ除去は、細胞内酵素カルボキシペプチダーゼが、要求されたＺｎ＋２補因子の最も不足する培養中の時点である２０日目で最小限である。細胞分裂が遅くなった後で２０日目の後、Ｚｎ＋２蓄積が増加するためＣＴＬ除去は増加し、カルボキシペプチダーゼの作用の増加につながる。
【０１４７】
１．５μＭ及び２．５μＭのＺｎ＋２を用いた実験群について、細胞外Ｚｎ＋２濃度は、細胞酵素が培養中の任意の時点でＺｎ＋２不足を経験しないほど十分に高い。このように、ＣＴＬ除去は、２０日目〜６０日目で高い率である。同様に、細胞成長、培養物生存性及び抗体産生は、培養日に応じて高い率で進む。
【０１４８】
実施例５−ＤＯＥ３実験
ＳＦＭ−１０．１実験で生成された先行にならい、ＣＴＬ除去、シアル酸付加、細胞成長、培養物生存性及び抗体産生に対する細胞外のＺｎ＋２、ＥＤＴＡ、及びＦｅ＋３の濃度の影響を精査するために、市販のインフリキシマブＳＦＭ−１０培地を用いてより詳細な実験を実行した。
【０１４９】
Ｚｎ＋２のＥＤＴＡへの細胞外結合は、仮定的にＺｎ＋２の細胞内蓄積を阻害し得ると推論された。細胞外Ｆｅ＋３は、Ｚｎ＋２よりもＥＤＴＡへの一層高い結合親和性を有するので、Ｚｎ＋２の細胞内蓄積を決定する鍵となる要因は、［ＥＤＴＡ−Ｆｅ＋３］であり得ることが推論された。
【０１５０】
ＤＯＥ３実験では、１２個のバイオリアクターを有した。この実験の培地は、市販のＳＦＭ−１０培地であった。ＰＲＩＭＡＴＯＮＥ（登録商標）、インスリン、トランスフェリン及びＢＳＡの選択されたロットが、０．７６μＭのＺｎ＋２、５．９μＭのＥＤＴＡ、及び０．９μＭのＦｅ＋３の基礎レベルを作製した。実験条件のマトリックスを、表２に示したようにＺｎ＋２、ＥＤＴＡ、及び／又はＦｅ＋３の添加によって作製した。
【０１５１】
【表３】
2016512029.tif 000005
ａバイオリアクター群は、Ｆｅ＋３、Ｚｎ＋２及びＥＤＴＡのおおよその濃度（単位μＭ）によって指定される。
ｂバイオリアクター「Ｆｅ：５  Ｚｎ：１  ＥＤＴＡ：１０」（Ｍ１２ＣＯＯ３）は、実験プロトコルにおいて大きなずれがあった。１３日目より前、培地のＺｎ＋２濃度は６．３μＭであった。１３日目に、培地を０．７６μＭの目標値に調整した。即ち、このバイオリアクターは、細胞培養の早期における非常に高いＺｎ＋２濃度の対象であった。
【０１５２】
ＤＯＥ３実験において、Ｚｎ＋２の全濃度は、０．７６〜１．７μＭの範囲に及び、Ｆｅ＋３濃度は、０．９０〜５．４μＭの範囲に及び、ＥＤＴＡ濃度は、５．９〜２６．８μＭの範囲に及び、［ＥＤＴＡ−Ｆｅ＋３］は、０．５３〜２３．６μＭの範囲に及んだ。
【０１５３】
ＤＯＥ３実験結果の分析において、Ｚｎ＋２の影響は、細胞外［ＥＤＴＡ］及び［ＥＤＴＡ−Ｆｅ＋３］の影響より優勢であった。したがって、次の結果の提示において、各バイオリアクターの［Ｚｎ＋２］に応じてＤＯＥ３実験結果をグループ化するのが合理的であり、６個のバイオリアクターが０．７６μＭの［Ｚｎ＋２］の対象であり、６個のバイオリアクターが１．７μＭの［Ｚｎ＋２］の対象であった。
【０１５４】
図８Ａは、バイオリアクター期間に応じたＣＴＬ除去（ｄｅｓ−Ｌｙｓの割合として表現され、ピーク１のデータからｃＩＥＦ法を用いて計算される）のグラフであり、０．７６μＭのＺｎ＋２が存在するときのＣＴＬ除去について様々なＥＤＴＡ濃度の影響を示す（ラベル「Ｆｅ：５  Ｚｎ：１  ＥＤＴＡ：１０」に該当するバイオリアクター内のＺｎ＋２の初期濃度は、０．７６μＭではなく６．３μＭであり、０．７６μＭのＺｎ＋２の目標濃度は、１３日目から実験の終了まで実現された）。図８Ｂは、バイオリアクター期間に応じたＣＴＬ除去（ｄｅｓ−Ｌｙｓの割合として表現され、ピーク１のデータからｃＩＥＦ法を用いて計算される）のグラフであり、１．７μＭのＺｎ＋２が存在するときのＣＴＬ除去について様々なＥＤＴＡ濃度の影響を示す。ＳＦＭ−１０．１実験等の場合、ＤＯＥ３実験からのバイオリアクターは、ＣＴＬ除去とＺｎ＋２濃度との割合の間で強い相関を示した。
【０１５５】
０．７６μＭのＺｎ＋２を用いたバイオリアクターは、１．７μＭのＺｎ＋２を用いたバイオリアクターよりも有意に低いＣＴＬ除去率を示した。より高いＺｎ＋２濃度を用いたバイオリアクターは、培養の早期、中間期、及び後期で６０〜７５％のＣＴＬ除去を示した。より低いＺｎ＋２の濃度を用いたバイオリアクターは、１０〜２０日目で４０％のＣＴＬ除去を示し、ＣＴＬ除去は、培養日に応じて徐々に上がり、培養の最後に６０％のＣＴＬ除去に近付いた。これらの結果は、ＳＦＭ−１０．１実験で観察されたＺｎ＋２濃度の影響と一致する。
【０１５６】
前述のとおり、「Ｆｅ：５、Ｚｎ：１、ＥＤＴＡ：１０」とラベル付されたバイオリアクターは、１３日目より前に６．３μＭの非常に高いＺｎ＋２濃度を経験し、これは培養の早期で８０％のＣＴＬ除去に相関し、最高のＣＴＬ除去はこの試験で達成した。このバイオリアクターにおけるＣＴＬ除去の割合は、１３日目に０．７６μＭのＺｎ＋２に対する培地濃度の補正に従って徐々に下がった。１日あたり約０．７培養容積の灌流量を用いると、産生バイオリアクター内のＺｎ＋２濃度は、１０日以内に０．７６μＭに下がったであろう。更に、ＣＴＬ除去の割合は、このバイオリアクターにおいて、０．７６μＭのＺｎ＋２での姉妹バイオリアクター内よりも一層高いままであった。即ち、細胞は、過去のＺｎ＋２曝露を「記憶する」機序を有するようである。
【０１５７】
特定の理論に束縛されることを望むわけではないが、この細胞の「記憶」が細胞の内部でＺｎ＋２の蓄積に関連すると仮定される。この蓄積されたＺｎ＋２は、細胞外Ｚｎ＋２濃度の急激な低下によって逆転することができない。細胞ごとに蓄積されたＺｎ＋２は、蓄積されたＺｎ＋２が娘細胞間で分割されるその後の細胞分裂によってのみ低減できるようである。ＤＯＥ３実験の条件下では、細胞分裂の範囲は、細胞が約１５〜２０日目に標的細胞密度に到達した後に限定された。
【０１５８】
１０及び１３日目でのバイオリアクター「Ｆｅ：５、Ｚｎ：１、ＥＤＴＡ：１０」のＣＴＬ除去は、約８０％であり、１．７μＭのＺｎ＋２でのバイオリアクターに関するより高い。これは、ＤＯＥ３実験の実験条件下では、１．７μＭのＺｎ＋２は、細胞のＺｎ＋２の要求を満たすのに十分ではないことを示唆する。
【０１５９】
上述のように、ＤＯＥ３実験の結果は、Ｚｎ＋２濃度と強く相関した。しかしながら、所与のＺｎ＋２濃度での結果内で、ＣＴＬ除去に対するＥＤＴＡ（又はＥＤＴＡ−Ｆｅ＋３）の影響の証拠が存在する。０．７μＭのＺｎ＋２を用いたバイオリアクターの中では、１３、２０、及び２８日目で最も低いＣＴＬ除去を用いた２つのバイオリアクターが最も高い［ＥＤＴＡ］及び［ＥＤＴＡ−Ｆｅ＋３］（バイオリアクター「Ｆｅ：１  Ｚｎ：１  ＥＤＴＡ：２５」及び「Ｆｅ：５  Ｚｎ：１  ＥＤＴＡ：２８」）を有した（図８Ａ）。逆に、最も低い［ＥＤＴＡ］及び［ＥＤＴＡ−Ｆｅ＋３］を用いたバイオリアクターは、最も高いＣＴＬ除去（「Ｆｅ：１  Ｚｎ：１  ＥＤＴＡ：６」）を有した。
【０１６０】
同様に、１．７μＭのＺｎ＋２を用いたバイオリアクターの中では、１３、２０、及び２８日目で最も低いＣＴＬ除去を用いたバイオリアクターが最も高い［ＥＤＴＡ］及び［ＥＤＴＡ−Ｆｅ＋３］（「Ｆｅ：３  Ｚｎ：２  ＥＤＴＡ：２７」）を有した（図８Ｂ）。
【０１６１】
図９Ａ及び９Ｂは、ＤＯＥ３実験では［Ｚｎ＋２］に応じてシアル酸含量に有意差があることを示す。１０〜２０日目で、１．７μＭのＺｎ＋２を用いたバイオリアクター（図９Ｂ）において、０．７６μＭでのバイオリアクター（図９Ａ）内よりも有意に高いシアル酸含量が存在する。「後期」バイオリアクター試料について、シアル酸含量の差は小さくなるが、０．７６μＭのＺｎ＋２よりも１．７μＭのＺｎ＋２で高いままである。
【０１６２】
図９Ａ及び９Ｂはまた、上述した細胞の「Ｚｎ＋２記憶」の証拠である。バイオリアクター「Ｆｅ：５、Ｚｎ：１、ＥＤＴＡ：１０」では、シアル酸含量は、このバイオリアクターの最も早い時点で非常に高く、バイオリアクターの全てにおいて細胞外Ｚｎ＋２濃度が約２０日目まで同じであったという事実にもかかわらず、培養期間にわたって０．７６μＭのＺｎ＋２を有するその姉妹バイオリアクターより一層高いままであった。
【０１６３】
１０及び１３日目でのバイオリアクター「Ｆｅ：５、Ｚｎ：１、ＥＤＴＡ：１０」のシアル酸含量は、約８０％であり、１．７μＭのＺｎ＋２を有するバイオリアクターに関するより有意に高い。これは、ＤＯＥ３実験の実験条件下では、１．７μＭのＺｎ＋２は、細胞のＺｎ＋２の要求を満たしてシアル酸付加を支持するのに十分ではないことを示唆する。
【０１６４】
上述のように、ＤＯＥ３実験の結果は、Ｚｎ＋２濃度と強く相関した。しかしながら、所与のＺｎ＋２濃度での結果内で、シアル酸付加に対する［ＥＤＴＡ］（又は［ＥＤＴＡ−Ｆｅ＋３］）の影響の証拠が存在する。図９Ａは、０．７μＭのＺｎ＋２を用いたバイオリアクターの中で、３８日目では［ＥＤＴＡ］が減少するとシアル酸含量が増加することを示す。図９Ｂは、２０及び３８日目では、［ＥＤＴＡ］が減少するとシアル酸含量が増加することを示す。
【０１６５】
ＤＯＥ３実験では、０．７６μＭのＺｎ＋２を用いた５つのバイオリアクターは、１．７μＭのＺｎ＋２（図１０）を有した６つのバイオリアクターよりも（標的細胞密度に到達する前の）最初の２０日間に一層低い細胞成長速度を有した。前述のとおり、「Ｆｅ：５、Ｚｎ：１、ＥＤＴＡ：１０」とラベル付けされたバイオリアクターは、１３日目より前に６．３μＭの非常に高いＺｎ＋２濃度を経験した。このバイオリアクターは、２０日目より前の期間で１．７μＭのＺｎ＋２を用いたバイオリアクターと合致した細胞成長行動を示した。これらのデータは、１．７μＭの細胞外Ｚｎ＋２濃度がその細胞の細胞分裂のためのＺｎ＋２の細胞内要求を満たすのに十分であることを示唆する。
【０１６６】
図１１Ａ及び１１Ｂは、０．７６μＭのＺｎ＋２を用いた５つのバイオリアクターの培養物生存性が最初の３０日間で１．７μＭのＺｎ＋２を用いた６つのバイオリアクターの培養物生存性よりも低かったことを示す。特に、「Ｆｅ：５、Ｚｎ：１、ＥＤＴＡ：１０」とラベル付けされたバイオリアクターは、１０及び１３日目で高い培養物生存性を示したが、次にＺｎ＋２濃度を補正した後すぐに元に戻って０．７６μＭのＺｎ＋２濃度を用いたその姉妹バイオリアクターと合致した。これは、培養物生存性が細胞内部のＺｎ＋２貯蔵ではなく、細胞外Ｚｎ＋２の瞬間的な濃度に関連するという仮説を支持する。
【０１６７】
図１２Ａ及び１２Ｂは、０．７６μＭのＺｎ＋２を用いた５つのバイオリアクターの抗体濃度が最初の２０日間で１．７μＭのＺｎ＋２を用いた６つのバイオリアクターよりも低かったことを示す。「Ｆｅ：５、Ｚｎ：１、ＥＤＴＡ：１０」とラベル付けされたバイオリアクターは、１．７μＭのＺｎ＋２でのバイオリアクターに匹敵する抗体濃度を示し、細胞外Ｚｎ＋２の瞬間的な値よりもむしろ蓄積されたＺｎ＋２に関連するという仮説を支持した。
【０１６８】
図１０、１１Ａ、１１Ｂ、１２Ａ及び１２Ｂは、ＤＯＥ３結果において［ＥＤＴＡ］と、生細胞密度、培養物生存性及び抗体濃度との間に明確な相関がないことを示す。
【０１６９】
ＤＯＥ３実験は、様々な［Ｚｎ＋２］、［ＥＤＴＡ］、及び［ＥＤＴＡ−Ｆｅ＋３］を含んだ。例えば、［ＥＤＴＡ−Ｆｅ＋３］は、０．５〜２３μＭの範囲に及んだ。しかしながら、これらの実験の結果における支配的要因は、０．７６μＭ〜１．７μＭ（及びバイオリアクター「Ｆｅ：５、Ｚｎ：１、ＥＤＴＡ：１０」での初期の６．３μＭ）の範囲に及ぶＺｎ＋２の細胞外濃度であった。１．７μＭの細胞外Ｚｎ＋２を用いたバイオリアクターは、０．７６μＭの細胞外Ｚｎ＋２を用いたバイオリアクターよりも有意に高いＣＴＬ除去、シアル酸含量、初期細胞成長、初期培養物生存性、及び初期抗体産生を有した（図８Ａ、８Ｂ、９Ａ、９Ｂ、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１２Ａ及び１２Ｂ）。
【０１７０】
所与のＺｎ＋２濃度におけるバイオリアクター内で、ＣＴＬ除去及びシアル酸付加に対する［ＥＤＴＡ］（又は［ＥＤＴＡ−Ｆｅ＋３］）の２次影響のいくつかの証拠が存在した（図８Ａ、８Ｂ、９Ａ及び９Ｂ）。この結果は、細胞成長、培養物生存性及び抗体産生に対する［ＥＤＴＡ］の影響の証拠を提供しなかった（図１０、１１Ａ、１１Ｂ、１２Ａ及び１２Ｂ）。［ＥＤＴＡ］の影響は、次の節で議論されるＢＳＡ配合実験＃１及び＃２でより十分に調べられた。
【０１７１】
バイオリアクター「Ｆｅ：５、Ｚｎ：１、ＥＤＴＡ：１０」は、１３日目より前に６．３μＭの非常に高いＺｎ＋２濃度を経験し、次に０．７６μＭの標的Ｚｎ＋２濃度に戻った。このバイオリアクターは、１．７μＭのＺｎ＋２を用いたバイオリアクターと同等の初期細胞成長（図１０）、培養物生存性（図１１Ａ及び１１Ｂ）及び抗体産生能力（図１２Ａ及び１２Ｂ）を示した。しかしながら、このバイオリアクターは、１．７μＭのＺｎ＋２でのバイオリアクターより大きな初期ＣＴＬ除去及びシアル酸含量を示した。このバイオリアクターは、ＣＴＬ除去、シアル酸含量、細胞密度及び抗体産生のための細胞外Ｚｎ＋２濃度の補正をはるかに越えた初期の高いＺｎ＋２濃度に対する「記憶」を示した（図８Ａ、８Ｂ、９Ａ、９Ｂ、１０、１２Ａ及び１２Ｂ）。しかしながら、このバイオリアクターは、培養物生存性の記憶を示さなかった、即ち、細胞外Ｚｎ＋２濃度が６．３μＭから０．７６μＭに落ちるとすぐに培養物生存性は補正した（図１１Ａ及び１１Ｂ）。
【０１７２】
図９Ｃ及び９Ｄは、バイオリアクター期間に応じたＧ０Ｆ（ＷＡＸ成分１）の割合のグラフであり、０．７６μＭのＺｎ＋２及び１．７μＭのＺｎ＋２が存在するときのガラクトシル化されていない種の割合について様々なＥＤＴＡ濃度の影響を示す。
【０１７３】
ＤＯＥ３実験の結果は、ＳＦＭ−１０．１実験について前に表現した仮説と一致する。更なる仮説も明らかになる。
・ＣＴＬ除去、シアル酸付加、細胞成長及び抗体の発現は、現在のＺｎ＋２の細胞外濃度よりむしろ細胞内Ｚｎ＋２の蓄積された量に関連する。蓄積されたＺｎ＋２の貯蔵は、直近の細胞外濃度ではなくて細胞外Ｚｎ＋２の過去の履歴に基づいている。これは、過去の細胞外Ｚｎ＋２に関する「細胞記憶」の基本である。
・培養物生存性は、現在のＺｎ＋２の細胞外濃度に関連する。
【０１７４】
この実験の条件下では、１．７μＭのＺｎ＋２の細胞外濃度は、細胞のＺｎ＋２の要求を満たして細胞成長及び抗体の発現に関連する酵素活性を支持するのに十分であった。しかしながら、１．７μＭのＺｎ＋２は、細胞のＺｎ＋２の要求を満たしてＣＴＬ除去又はシアル酸付加を支持するのに十分ではなかった。これらの仮説は、バイオリアクター「Ｆｅ：５、Ｚｎ：１、ＥＤＴＡ：１０」の結果によって支持され、これは１３日目より前に６．３μＭのＺｎ＋２濃度を有した。
【０１７５】
実施例６−ＢＳＡ配合実験第１及び第２
これらの２つの実験は、ＳＦＭ−１０培地を使用した。各実験において、同じロットのＰＲＩＭＡＴＯＮＥ（登録商標）及びインスリンを使用し、Ｚｎ＋２及びＦｅ＋３の一定濃度を確保した。ＢＳＡ配合実験第１及び第２では、Ｚｎ＋２濃度はそれぞれ１．１及び１．２μＭであった。
【０１７６】
各実験では、高及び低濃度のＥＤＴＡを含有するＢＳＡのロットは特定され、次に混合されて様々なバイオリアクター内のＥＤＴＡ濃度を作製した。ＢＳＡ配合実験第１は、４つのＥＤＴＡ濃度での重複バイオリアクターによる、８個のバイオリアクターを使用した。ＢＳＡ配合実験第１で重複バイオリアクターは、「Ａ」及び「Ｂ」とラベル付けされる。ＢＳＡ配合実験第２は、それぞれ異なるＥＤＴＡ濃度を用いる８個のバイオリアクターを使用した。表３及び４は、ＢＳＡ配合実験第１及び第２におけるバイオリアクター内のＺｎ＋２、Ｆｅ＋３、ＥＤＴＡ及びＥＤＴＡ−Ｆｅ濃度を列挙している。
【０１７７】
【表４】
2016512029.tif 000006
ａバイオリアクター群は、ＥＤＴＡのおおよその濃度（単位μＭ）によって指定される。
【０１７８】
【表５】
2016512029.tif 000007
ａバイオリアクター群は、ＥＤＴＡのおおよその濃度（単位μＭ）によって指定される。
【０１７９】
両方のＢＳＡ配合実験で、より高いＥＤＴＡ濃度を用いたバイオリアクターは、より少ないＣＴＬ除去を経験し、逆もまた同様に、より低いＥＤＴＡ濃度を用いたバイオリアクターは、増加したＣＴＬ除去を経験した。その影響は、各実験において３５日目で最も明白であり、後の培養日に減少した（図１３Ａ及び１４Ａ）。
【０１８０】
両方のＢＳＡ配合実験で、より高いＥＤＴＡ濃度を用いたバイオリアクターは、より低いシアル酸含量を経験し、逆もまた同様に、より低いＥＤＴＡ濃度を用いたバイオリアクターは、より高いシアル酸含量を経験した。その影響は、早期、中間期、及び後期のバイオリアクター試料で維持された（図１３Ｂ及び１４Ｂ）。
【０１８１】
両方のＢＳＡ配合実験で、より高いＥＤＴＡ及びより低いＥＤＴＡ濃度を用いたバイオリアクターは、同等の細胞成長（図１３Ｃ及び１４Ｃ）及び同等の培養物生存性（図１３Ｄ及び１４Ｄ）を示した。
【０１８２】
ＥＤＴＡ濃度の軽微な影響は、ＢＳＡ配合実験における抗体産生に記載した。ＢＳＡ配合実験第１では、高いＥＤＴＡ及び低いＥＤＴＡを用いたバイオリアクターは、標的細胞密度に達する前に同等の抗体産生を有する。標的細胞密度に到達した直後の期間中（約１５日目〜２５日目）より高いＥＤＴＡを用いたバイオリアクターは、低いＥＤＴＡを用いたバイオリアクターより低い抗体発現を有する（図１３Ｅ及び１３Ｆ）。ＢＳＡ配合実験第２では、抗体産生の減少は、１０日目から始まる２つの最も高い［ＥＤＴＡ］で記述され、最も低い［ＥＤＴＡ］を用いたバイオリアクターは、約１５日目でより高い抗体産生を示した（図１４Ｅ及び１４Ｆ）。しかしながら、抗体産生に対する［ＥＤＴＡ］の影響は、ＤＯＥ３実験では観察されなかった（図１２Ｂ）。
【０１８３】
約１．１〜１．２μＭの細胞外Ｚｎ＋２を用いたバイオリアクターについて、ＢＳＡ配合実験は、ＥＤＴＡ濃度がＣＴＬ除去及びシアル酸付加に対する有意な影響を有し得ることを実証した。加えて、１０日目〜２５日目の期間中に抗体産生に対するＥＤＴＡ濃度の軽微な影響が存在することがあるが、この影響はＤＯＥ３実験で明白ではなかった。これらのＺｎ＋２濃度で、ＥＤＴＡは、細胞成長又は培養物生存性に対する認識できる影響を有さなかった。
【０１８４】
Ｆｅ＋３の濃度がＢＳＡ配合実験のバイオリアクター内で一定であったため、［ＥＤＴＡ］に対する上述の相関は、［ＥＤＴＡ−Ｆｅ＋３］と同等にあてはまる。
【０１８５】
両方のＢＳＡ配合実験で、減少するＥＤＴＡ濃度は、非ガラクトース化オリゴ糖の割合の減少につながることが示された（図１３Ｇ及び１５）。したがって、ＥＤＴＡの濃度の減少は、より多いガラクトース及びより多いシアル酸含量の両方につながる。
【０１８６】
特定の理論に束縛されることを望むわけではないが、ＢＳＡ配合実験からのデータは、次の仮説を支持する。
・ＥＤＴＡ（又は［ＥＤＴＡ−Ｆｅ＋３］）は、細胞によるＺｎ＋２取り込みの速度に影響を与えることがある。この影響は、Ｚｎ＋２の細胞外濃度が低く、細胞がＺｎ＋２要求を有する酵素の単体に細胞内Ｚｎ＋２不足を経験しているときに、最も明らかなようである。
・細胞は、Ｚｎ＋２の貯蔵及び分配のための精巧な細胞内システムを有し、Ｚｎ＋２制限の期間中ではＺｎ＋２配分の優先順位が存在する。Ｚｎ＋２制限の条件下では、細胞は、細胞分裂のためにＺｎ＋２を要求する細胞内プロセスを優先するだろう。このように、ＢＳＡ配合実験第１及び第２では、この試験の条件下で細胞が細胞分裂のための十分なＺｎ＋２を有したので細胞成長に対するＥＤＴＡの影響はなかった。同様に、この実験の条件下でＥＤＴＡによって抗体発現に及ぼす影響は少なかった。ＣＴＬ除去及びシアル酸付加を支持するＺｎ＋２の細胞内配分は、細胞成長のためのＺｎ＋２の配分より低い細胞内優先順位を有する。このように、ＥＤＴＡが細胞成長に影響を及ぼさない条件下で、ＣＴＬ除去及びシアル酸付加に対するＥＤＴＡの有意な影響が存在することがある。
【０１８７】
インフリキシマブバイオリアクターは、フェドバッチ培養に似た方法で最初の１５〜２０日間に操作される。即ち、細胞は低い初期細胞密度に植え付けられ、次の１５〜２０日間に細胞成長及び抗体発現を支持する新鮮な培地を連続的に供給される。したがって、本明細書に記載の実験結果は、フェドバッチ培養及び潅流培養に等しく適用される。
【０１８８】
実施例７−ＤＯＥ３実験並びにＢＳＡ配合第１及び第２実験の更なる分析
ＤＯＥ３及びＢＳＡ配合実験は、同じ小規模バイオリアクターモデルを用いて全て同じ実験室で実施され、試料は同じアッセイ群によって分析された。したがって、ＤＯＥ３並びにＢＳＡ配合第１及び第２実験の結果を互いに比較することが可能であるはずである。
【０１８９】
ＤＯＥ３実験及びＢＳＡ配合第１実験では、試料は、２０日目に採取され、ｃＩＥＦ及びＷＡＸアッセイによって分析された。図１７、１９、２０及び２１は、共にプロットされたＤＯＥ３実験及びＢＳＡ配合第１実験からの２０日目のデータを示す。図１７、１９及び２０に示す結果は、前の分析を支持する、即ち、そのＣＴＬ除去は増加する［Ｚｎ＋２］によって増加し、シアル酸含量は増加する［Ｚｎ＋２］によって増加し、非ガラクトシルオリゴ糖の割合は増加する［Ｚｎ＋２］によって減少する。これらの後半２つの結果は、図１６に示すようにガラクトース付加及びシアル酸付加の酵素反応の促進と一致する。
【０１９０】
図２１は、ガラクトースに対するシアル酸の割合が増加する［Ｚｎ＋２］によって増加することを示す。
【０１９１】
図２６は、Ｇ０Ｆの割合（ＷＡＸ成分１の優勢な非ガラクトシル成分）に応じたシアル酸の割合（ＷＡＸ成分５）のグラフであり、ＤＯＥ３及びＢＳＡ配合第１及び第２実験に関して、シアル酸の割合と非ガラクトシルオリゴ糖との間で逆相関を示す。図２６は、ガラクトース付加及びシアル酸付加がＤＯＥ３並びにＢＳＡ配合第１及び第２実験で連結される傾向があり、ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼによって触媒される反応の連結と一致することを示す。換言すれば、これら２つのグリコシル化反応を高める因子は、シアル酸を含有するオリゴ糖により多くのＧ０Ｆを向かわせる。
【０１９２】
ＢＳＡ配合第１及び第２実験の両方は、３３〜３５日目に採取された試料を含んだ。図２２〜２５は、ＢＳＡ配合第１及び第２実験からの３３〜３５日目のデータを示す。図２２〜２５は、より低いＥＤＴＡ濃度において、より高いＣＴＬ除去、より高いシアル酸含量、より低い非ガラクシルオリゴ糖の割合、及びより高いガラクトースに対するシアル酸の割合が存在することを示す。
【０１９３】
本明細書で引用する全ての特許、公開特許、及び引用文献による教示はその全体が参照により組み込まれる。
【０１９４】
本発明は、その例示的実施形態を参照にして具体的に示され、記載されてきたが、当業者らは、添付の特許請求に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細における様々な変更をこれに加えることができることを理解する。
【図１】
2016512029.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2016512029.tif 000014
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2016512029.tif 000016
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
2016512029.tif 000029
【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2016512029.tif 000044
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
2016512029.tif 000051
【図２７Ｂ】
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【図２８】
2016512029.tif 000053
【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【配列表】
2016512029000001.app
【国際調査報告】
2016512029.tif 000056