(57)【要約】  本発明は、癌、乾癬、乾癬関節炎、若年多発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、多発性筋炎、皮膚筋炎およびサルコイドーシスからなるグループから選ばれる疾患の治療あるいは再発防止に使用される薬剤製造のための、メトトレキサート、トリメトレキサール、ペメトレキセド、あるいはそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選ばれるジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤の使用に関するもので、前記治療あるいは再発防止が、親油性スタチンと前記ジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤を、患者に同時に、別途にあるいは連続的に投与する。本発明は、また、ジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤と、親油性スタチンを、薬学的に許容できる媒体及び／あるいは賦形剤と共に配合した医薬組成物に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌、乾癬、乾癬関節炎、若年多発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、多発性筋炎、皮膚筋炎およびサルコイドーシスからなるグループから選ばれる疾患の治療あるいは再発防止に使用される薬剤製造のための、メトトレキサート、トリメトレキサール、ペメトレキセド、あるいはそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選ばれるジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤の使用であって、
前記治療あるいは再発防止が、親油性スタチンと前記ジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤を、患者に同時に、別途にあるいは連続的に投与するジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤の使用。
【請求項２】
癌、乾癬、乾癬関節炎、若年多発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、多発性筋炎、皮膚筋炎およびサルコイドーシスからなるグループから選ばれる疾患の治療あるいは再発防止に使用される薬剤製造のための、メトトレキサート、トリメトレキサール、ペメトレキセド、あるいはそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選ばれるジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤の使用であって、
前記薬剤が、親油性スタチンとの組合せ治療に使用されるジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤の使用。
【請求項３】
前記ジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤が、前記親油性スタチンと同時に投与される請求項１又は２に記載のジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤の使用。
【請求項４】
前記ジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤と前記親油性スタチンが、いずれの順序でも別個に、そして治療上有効間隔で投与される請求項１又は２に記載のジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤の使用。
【請求項５】
癌、乾癬、乾癬関節炎、若年多発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、多発性筋炎、皮膚筋炎およびサルコイドーシスからなるグループから選ばれる疾患の治療あるいは再発防止に使用される薬剤製造のための、メトトレキサート、トリメトレキサール、ペメトレキセド、あるいはそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選ばれるジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤と、親油性スタチンの使用。
【請求項６】
前記ジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤が、メトトレキサート、トリメトレキサール、ペメトレキセド、あるいはそれらの薬学的に許容される塩である請求項１乃至５のいずれか１項に記載のジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤の使用。
【請求項７】
前記ジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤が、１週から５週の間の頻度で投与され、前記親油性スタチンが１日から７日の間の頻度で投与される請求項１乃至６のいずれか１項に記載のジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤の使用。
【請求項８】
前記親油性スタチンが、シンバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎａ）、フルバスタチン（ｆｌｕｖａｓｔａｔｉｎａ）、アトルバスタチン（ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎａ）、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎａ）、あるいはそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選ばれる請求項１乃至７のいずれか１項に記載のジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤の使用。
【請求項９】
前記癌が、骨肉腫、破壊性絨毛腺腫、絨毛癌、胞状奇胎、急性リンパ性白血病、急性非リンパ性白血病、大細胞リンパ腫、高悪性度リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ肉腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、胸膜中皮腫、乳癌、卵巣癌、扁平上皮頭腫瘍、扁平上皮頸部腫瘍、小細胞肺癌、膀胱癌からなるグループから選ばれる請求項１乃至８のいずれか１項に記載のジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤の使用。
【請求項１０】
前記癌が急性リンパ性白血病であるとき、前記ジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤が、体表面に対し１〜３ｍｇ／ｍ２の量で投与され、前記親油性スタチンが、体表面に対し２０〜８０ｍｇ／ｍ２の量で投与される請求項９のジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤の使用。
【請求項１１】
前記癌が骨肉腫であるとき、前記ジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤が、体表面に対し１２〜１５ｍｇ／ｍ２の量で投与され、前記親油性スタチンが、体表面に対し２０〜８０ｍｇ／ｍ２の量で投与される請求項９のジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤の使用。
【請求項１２】
メトトレキサート、トリメトレキサール、ペメトレキセド、あるいはそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選ばれるジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤と、親油性スタチンを、賦形剤及び／又は薬学的に許容できる媒体と共に配合した医薬組成物。
【請求項１３】
前記ジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤が、メトトレキサートあるいはその薬学的に許容される塩である請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
経口投与用である請求項１２又は１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
錠剤形状に処方されている請求項１２又は１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
静脈内、筋肉内、経皮、経直腸、腔内ルート、あるいは吸入投与用である請求項１２又は１３に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記ジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤が１ｍｇから１５ｇ、前記親油性スタチンが２０ｍｇから８０ｍｇでなる投薬ユニットに処方されている請求項１２乃至１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記親油性スタチンが、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロバスタチン、あるいはそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選ばれる請求項１２乃至１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
メトトレキサート、トリメトレキサール、ペメトレキセド、あるいはそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選ばれるジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤でなる第１医薬成分と、親油性スタチンでなる第２医薬成分と、癌、乾癬、乾癬関節炎、若年多発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、多発性筋炎、皮膚筋炎およびサルコイドーシスからなるグループから選ばれる疾患の治療あるいは再発防止に使用される組合せ治療を行う前記２つの医薬成分の使用説明書と、で構成されるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床医学、特に腫瘍と、乾癬や関節リウマチのような自己免疫疾患の分野に関するものである。特に、本発明は、メトトレキサートを親油性スタチンと組合せるこれらの疾病の改善された治療を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
メトトレキサート〔（２Ｓ）−２−［（４−｛［（２，４−ジアミノプテリジン−６−イル）メチル］（メチル）アミノ｝ベンゾイル）アミノ］ペンタンジオイック酸、ＣＡＳ番号５９−０５−２、ＭＴＸと略記する式Ｉ〕は、細胞周期のＳ期における核酸合成に有用な細胞内葉酸を抑え、タンパク質合成中にホモシステインのメチオニンへの転換を阻止する酵素であるジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を競争的に阻止することにより抗増殖及び抗炎症活性を持つ代謝拮抗物質である。
【０００３】
【化１】
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【０００４】
ＭＴＸは、骨肉腫のようなある種の腫瘍性疾患の治療を行う化学療法の最前線として使用されている。それは、多くの腫瘍性疾患に対して、腎臓機能が正常な患者では、高投与量（患者表面に対し３〜１２ｇ／ｍ２）で、過剰水分（患者の表面に対し３ｌ／ｍ２）およびアルカリ化で投与される。さらに、乾癬性関節炎や関節リウマチを含むいくつかの炎症性疾患の治療にも使用される。
【０００５】
しかしながら、この薬剤は、使用した患者の罹患死亡率を高める重大な厳しい副作用を生じることがある。ある場合には、葉酸で適切に救助がなされているにも拘わらずに患者の３分の１で化学療法を早々に中断することを強いられることがある。
【０００６】
ＭＴＸで治療された患者では、急性あるいは慢性脳障害を伴う骨髄抑制、粘膜炎及び神経毒性が記載されてきた。急性脳障害は、通常、患者の３〜１５％に、治療の開始後の５〜１４日に頭痛、吐き気、気力喪失、精神状態の変化、目のかすみ、失語症、片麻痺およびけいれんが発生する。これらの場合では、大多数の患者は、神経的症状が永続きしないようにＭＴＸ治療を再スタートするが、１０％〜５６％の患者は、再度の接触で再発を経験している。慢性脳障害は、徐々に進行し、神経的機能を永久に壊していく。
【０００７】
ＭＴＸを高投与量にすると、骨肉腫のある子供では生命に係る重大事となる。これらの場合では、ＭＴＸを止めるのが遅かったり、この薬剤との接触を続けると、ＭＴＸあるいはその代謝物質（１７−ヒドロキシ−メトトレキサート）の結晶が尿管中に沈着して起きる続発性腎臓障害により、あるいはこれらの管に対して薬剤の直接毒性によって顕著な毒性、特に急性腎臓障害に結びつくことがある。
【０００８】
そこで、これらの問題から、抗炎症性、免疫調節性および抗腫瘍活性を維持しつつ、ＭＴＸでの治療に伴う有害な副作用を減らすことができる治療法を見つけることが必要である。
【発明の概要】
【０００９】
発明者は、これらＤＨＦＲ阻止剤を用いた治療が示している癌および自己免疫疾患の治療に対して、親油性スタチンと、例えばメトトレキサート（ＭＴＸ）のようなジヒドロ葉酸還元（ＤＨＦＲ）酵素阻止剤とを組合せた使用は、相乗効果を生むことを見出した。以下に提示する実施例に示すように、油性スタチンをＭＴＸと組合せ治療で使用することは、ＭＴＸの抗腫瘍効果を高め、治療効果に影響を与えることなくＭＴＸの投与量を減らすことができる。この組合せ治療は、ＤＨＦＲ阻止剤が低濃度で接触するので、治療の効果に影響なく副作用を小さくすることができ、指示された治療がＤＨＦＲ阻止剤投与である疾患の患者、例えば癌あるいはある種の自己免疫疾患を持つ患者にとって非常に大きな利益となる。
【００１０】
そこで、本発明の第１の形態は、癌、乾癬、乾癬関節炎、若年多発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、多発性筋炎、皮膚筋炎およびサルコイドーシスからなるグループから選ばれる疾患の治療に、メトトレキサート、トリメトトレキサート、ペメトレキシド、あるいはそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選ばれるＤＨＦＲ酵素阻止薬剤を提供することである。ここで、前述の治療は、親油性スタチンとメトトレキサート、トリメトトレキサート、ペメトレキセドあるいはそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選ばれるジヒドロ葉酸還元（ＤＨＦＲ）酵素阻止剤を患者に同時に、別途にあるいは連続的に投与することである。この形態は、癌、乾癬、乾癬関節炎、若年多発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、多発性筋炎、皮膚筋炎およびサルコイドーシスからなるグループから選ばれる疾患の治療薬剤製造に、メトトレキサート、トリメトトレキサート、ペメトレキシドあるいはそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選ばれるジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤を使用することということができる。ここで、前述の治療は、親油性スタチンとＤＨＦＲ酵素阻止剤を患者に同時に、別途にあるいは連続的に投与することである。本発明は、さらに必要としている患者に、癌、乾癬、乾癬関節炎、若年多発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、多発性筋炎、皮膚筋炎およびサルコイドーシスからなるグループから選ばれる疾患の治療方法を提供する。ここで、前述の治療方法は、親油性スタチンと、メトトレキサート、トリメトトレキサート、ペメトレキセド、あるいはそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選ばれるジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤を患者に同時に、別途にあるいは連続的に投与することである。
【００１１】
親油性スタチンは、水に僅かに溶解する。本発明のある実施形態では、ＭＴＸと組合せて使用される親油性スタチンは、シンバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎａ）〔ＣＡＳ番号：７９９０２−６３−９，式ＩＩ〕あるいはその薬学的塩である。別のある実施形態では、親油性スタチンは、アトルバスタチン（ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎａ）〔ＣＡＳ番号：１３４５２３−００−５，式Ｖ〕あるいはその薬学的塩である。別のある実施形態では、親油性スタチンは、フルバスタチン（ｆｌｕｖａｓｔａｔｉｎａ）〔ＣＡＳ番号：９３９５７−５４−１，式ＩＶ〕あるいはその薬学的塩である。別のある実施形態では、親油性スタチンは、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎａ）〔ＣＡＳ番号：７５３３０−７５−５，式ＩＩＩ〕あるいはその薬学的塩である。
【００１２】
【化２】
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【００１３】
さらに、本発明は、親油性スタチンとの組合せ治療において、ＭＴＸの治療代替物として使用でき、ＭＴＸと同じあるいは非常に類似した作用機構をもつＭＴＸ類似物あるいは誘導体の使用を提供する。これらには、トリメトレキサール〔５−メチル−６−［（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノメチル］キナゾリン−２，４−ジアミン、式ＶＩの化合物〕およびペメトレキシド〔（２Ｓ）−２−｛［４−［２−（２−アミノ−４−オキソ−１，７−ジヒドロピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）エチル］ベンゾイル］アミノ｝ペンタンジオイックアシド、式ＶＩＩの化合物〕などのジヒドロ葉酸還元酵素の薬学的阻止剤がある。この分野のエキスパートには明らかなように、これらＭＴＸの等価物、類似物および誘導体は、親油性スタチンと相互作用がし易く、親油性スタチンによりその効果が高められ、それ故、親油性スタチンとの組合せ治療で同じ利点を示すことがわかる。
【００１４】
【化３】
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【００１５】
どのようなＤＨＦＲ阻止剤あるいは親油性スタチンの薬学的に許容できる塩も、本発明の目的に使用することができる。用語“薬学的に許容できる塩”は、無毒の薬学的に許容できる塩基から製造できる塩を意味する。これらの塩に関して、治療目的に使用されたときに薬学的に許容できなければならないということ以外制限はない。
【００１６】
本発明の組合せ治療の化合物の薬学的に許容できる塩類は、従来技術で公知の方法で製造できる。例えば、酸性部位あるいは塩基部位を含む親合成物から、化学操作で従来からの方法で製造できる。これらの塩類は、例えば、これら化合物の遊離酸あるいは塩基を、水あるいは有機溶剤あるいはそれらの混合物の存在下で、化学量的に充分な量の酸あるいは薬学的に受理可能な塩と反応させて製造できる。塩類を塩基性親合成物から製造するとき、これらの塩類は、有機酸あるいは無機酸を含む無毒な薬学的に許容できる酸から製造される。これらの酸は、例えば、酢酸、ベンゾスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマール酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩化水素酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデリン酸、メタンスルホン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸、および類似物である。
【００１７】
本発明は、また、組合せ治療での使用に、結晶形状の化合物、溶媒和していない化合物あるいは溶液（例えば、水和物）になっている化合物も包含する。溶媒和する方法は、従来技術で知られている。
【００１８】
本発明は、また、ＤＨＦＲ阻止剤あるいは親油性スタチンのプロドラッグの使用を提供する。“プロドラッグ”は、不活性（あるいは低活性）形態で投与され、投与の後に患者の正常な代謝プロセスの結果として、相当する薬学的に活性成分に変換される物質と理解される。特に、用語プロドラッグは、許容できる生理学的に加水分解できるエステル類である。
【００１９】
用語“許容できる生理学的に加水分解できるエステル類”は、ヒドロキシグループがエステル化され、生理学的条件で加水分解されて、投与された量で生理学的に耐えられる酸を生じるエステルである。これらのエステルの例としては、ＭＴＸあるいは親油性スタチンの酢酸塩および安息香酸塩がある。
【００２０】
本発明は、また、リポソーム、グリセロール、アルブミン、ジグリセライドのような物質、フェニルアラニンまたはプロリンのようなアミノ酸、あるいはアルギニン−グリシン−アスパラギンのようなペプチド、あるいは“ヘアピン”ペプチドと接合（ｃｏｎｊｕｇａｄｏ）形態になったＤＨＦＲ阻止剤の投与を提供する。これらの物質との接合薬剤はその生物学的利用能を増加できる。
【００２１】
ある実施形態では、本発明の組合せ治療におけるＤＨＦＲ阻止剤は、ＭＴＸである。別の実施形態では、本発明の組合せ治療は、ＭＴＸとシンバスタチンで行われる。
【００２２】
本発明の組合せ治療は、治療目的のみならず、癌または自己免疫疾患に対する過去の治療に充分応えていた患者に対する再発（あるいは、ぶりかえし（ｒｅｃａｉｄａｓ））を防止する目的で用いることができる追加的な利点を提供する。
【００２３】
さらに、本発明の別の様態は、癌、乾癬、乾癬関節炎、若年多発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、多発性筋炎、皮膚筋炎およびサルコイドーシスからなるグループから選ばれる疾患の再発防止に使用するための、メトトレキサート、トリメトレキサールおよびペメトレキシド、あるいはそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選ばれるＤＨＦＲ阻止剤を提供する。ここで、前述の治療は、親油性スタチンとＤＨＦＲ阻止剤を患者に同時に、別途にあるいは連続的に投与することである。この様態は、癌、乾癬、乾癬関節炎、若年多発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、多発性筋炎、皮膚筋炎およびサルコイドーシスからなるグループから選ばれる疾患の再発を防止する薬剤の製造のために、メトトレキサート、トリメトレキサール、ペメトレキシド、あるいはそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選ばれるジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤の使用ということができる。ここで、前述の治療あるいは防止は、親油性スタチンとジヒドロ葉酸還元酵素ＤＨＦＲ阻止剤を患者に同時に、別途にあるいは連続的に投与することである。本発明は、また、必要としている患者に、癌、乾癬、乾癬関節炎、若年多発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、多発性筋炎、皮膚筋炎およびサルコイドーシスからなるグループから選ばれる疾患の再発防止方法を提供する。ここで、前述の治療方法は、親油性スタチンと、メトトレキサート、トリメトレキサールおよびペメトレキシド、あるいはそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選ばれるジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤を、患者に同時に、別途にあるいは連続的に投与することからなっている。
【００２４】
現今の医療行為によれば、ＭＴＸのようなＤＨＦＲ阻止剤の使用と投与のこの副次的効果は、病状が緩和されているか、あるいは過去の治療によって消えた患者に使用するまで意図していないと考える。例えばＭＴＸを、低濃度で、より大きな治療効果で使用できるので、本発明のこの組合せ治療は、ＭＴＸの投与が効く例えば癌などの疾患の過去の治療で効果をみた患者に、再発を避けるために使用できる。この意味で、発明者が親油性スタチンによるＤＨＦＲ阻止剤への効果向上が、ＭＴＸ投与量が患者体表面に対し１〜３ｍｇ／ｍ２の特に低濃度関連してくることが見出されたことは重要である。
【００２５】
本発明の組合せ治療から利益のある疾患は、ＭＴＸのようなＤＨＦＲ阻止剤の投与が指示される疾患、特に癌およびいくつかの自己免疫疾患がある。特定の形態で、本発明の組合せ治療は、骨肉腫、破壊性絨毛腺腫、絨毛癌、胞状奇胎、急性リンパ性白血病、急性非リンパ性白血病、大細胞リンパ腫、高悪性度リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ肉腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、胸膜中皮腫、乳癌、卵巣癌、扁平上皮頭腫瘍、扁平上皮頸部腫瘍、小細胞肺癌、膀胱癌からなるグループから選ばれる癌の治療に使用できる。別の特定の形態で、本発明の組合せ治療は、骨肉腫の治療に対してである。別の特定の形態で、癌が、リンパ性白血病である。
【００２６】
ＤＨＦＲ阻止剤と親油性スタチンを含む本発明の組合せ治療から利益がある別のグループの疾患は、いくつかの自己免疫疾患、特に乾癬、乾癬関節炎、若年多発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、多発性筋炎、皮膚筋炎およびサルコイドーシスである。
【００２７】
この分野のエキスパートにとって明らかであろうように、本発明の組合せ治療は、ＤＨＦＲ阻止剤と親油性スタチンである活性成分が、単一成分で使用される場合のみならず、２つの異なる成分が同時に、あるいは治療上有効な範囲内で如何なる順序で互いに別々に投与して使用した場合にも効果がある。さらに、この分野のエキスパートは、ＤＨＦＲ阻止剤投与で利益がある疾患の治療あるいは再発防止の目的で、専門医によって、ＤＨＦＲ阻止剤を親油性スタチンと一緒にしての組合せ治療で使用するように処方される、あるいはその逆が理解できよう。
【００２８】
それ故に、本発明の１つの様態は、癌、乾癬、乾癬関節炎、若年多発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、多発性筋炎、皮膚筋炎およびサルコイドーシスからなるグループから選ばれる疾患の治療に使用するために、親油性スタチンとの組合せ治療に使用されるメトトレキサート、トリメトトレキサート、ペメトレキセド、あるいはそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選ばれるＤＨＦＲ酵素阻止剤に関するものである。この様態は、癌、乾癬、乾癬関節炎、若年多発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、多発性筋炎、皮膚筋炎およびサルコイドーシスからなるグループから選ばれる疾患の治療薬製造のために、メトトレキサート、トリメトレキサールおよびペメトレキシド、あるいはそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選ばれるジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤の使用と言うことができる。ここで、前述の治療薬は、親油性スタチンとの組合せ治療に使用されるものである。本発明は、さらに必要としている患者における、癌、乾癬、乾癬関節炎、若年多発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、多発性筋炎、皮膚筋炎およびサルコイドーシスからなるグループから選ばれる疾患の治療方法ということができる。ここで、前述の治療方法は、メトトレキサート、トリメトトレキサート、ペメトレキセド、あるいはそれらの薬学的に許容される塩をからなるグループから選ばれるジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤を、親油性スタチンと一緒にした組合せ治療で患者に投与することである。
【００２９】
本発明の別の様態は、親油性スタチンとの組合せ治療で使用したとき癌の再発防止に使用されるＤＨＦＲ阻止剤に関するものであり、ＤＨＦＲ阻止剤が、メトトレキサート、トリメトトレキサート、ペメトレキセド、あるいはそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選ばれる。この様態は、癌、乾癬、乾癬関節炎、若年多発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、多発性筋炎、皮膚筋炎およびサルコイドーシスからなるグループから選ばれる疾患の再発を防止する薬剤製造のためのＭＴＸ、プロドラッグ、あるいはそれらの薬学的に許容できる塩の使用と言うことができる。ここで、この薬剤は、親油性スタチンとの組合せ治療に使用される。本発明は、また、必要としている患者における、癌、乾癬、乾癬関節炎、若年多発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、多発性筋炎、皮膚筋炎およびサルコイドーシスからなるグループから選ばれる疾患の再発防止方法に関するものである。ここで、前述のこの治療方法は、メトトレキサート、トリメトトレキサート、ペメトレキセド、あるいはそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選ばれるジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤を、親油性スタチンとの組合せ治療で患者に投与することである。
【００３０】
さらに、本発明は、癌、乾癬、乾癬関節炎、若年多発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、多発性筋炎、皮膚筋炎およびサルコイドーシスからなるグループから選ばれる疾患の治療に使用されるための、メトトレキサート、トリメトトレキサート、ペメトレキセド、あるいはそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選ばれるＤＨＦＲ阻止剤と、親油性スタチンを提供する。この様態は、癌、乾癬、乾癬関節炎、若年多発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、多発性筋炎、皮膚筋炎およびサルコイドーシスからなるグループから選ばれる疾患を治療する薬剤製造のために、メトトレキサート、トリメトトレキサート、ペメトレキセド、あるいはそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選ばれるＤＨＦＲ阻止剤と、親油性スタチンの使用ということができる。本発明は、また、必要としている患者における、癌、乾癬、乾癬関節炎、若年多発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、多発性筋炎、皮膚筋炎およびサルコイドーシスからなるグループから選ばれる疾患の治療方法を提供するものである。ここで、前述のこの方法は、メトトレキサート、トリメトトレキサート、ペメトレキセド、あるいはそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選ばれるＤＨＦＲ阻止剤と、親油性スタチンを患者に投与することである。
【００３１】
別の様態で、本発明は、癌、乾癬、乾癬関節炎、若年多発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、多発性筋炎、皮膚筋炎およびサルコイドーシスからなるグループから選ばれる疾患の再発防止に使用するための、メトトレキサート、トリメトトレキサート、ペメトレキセド、あるいはそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選ばれるＤＨＦＲ阻止剤と、親油性スタチンを提供する。この様態は、癌、乾癬、乾癬の関節炎、若年性多発性関節炎、慢性関節リウマチ、クローン病、多発性筋炎、皮膚筋炎およびサルコイドーシスから成るグループから選ばれる疾病の再発を防止する薬剤製造のために、メトトレキサート、トリメトトレキサート、ペメトレキセド、あるいはそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選ばれるＤＨＦＲ阻止剤と、親油性スタチンの使用ということができる。本発明は、また、必要としている患者における、癌、乾癬、乾癬関節炎、若年多発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、多発性筋炎、皮膚筋炎およびサルコイドーシスからなるグループから選ばれる疾患の再発を防止する方法を提供するものである。ここで、この方法は、メトトレキサート、トリメトトレキサート、ペメトレキセド、あるいはそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選ばれるＤＨＦＲ阻止剤と、親油性スタチンを患者に投与することである。
【００３２】
本発明は、ＤＨＦＲ阻止剤と親油性スタチンを同時に投与する組合せ治療を意図している。本発明は、また、ＤＨＦＲ阻止剤と親油性スタチンを、治療上効果のある範囲で如何なる順序でも別々に投与することを意図している。この治療上効果のある範囲は、対象とする疾患に大きく変わり、その目的が治療なのか再発防止なのかにも依るが、親油性スタチンとの組合せにより、患者に投与されるＤＨＦＲ阻止剤の量が従来の治療より遥かに少ないという事実が常に考慮に入れられる。
【００３３】
本発明の組合せ治療で使用されるＤＨＦＲ阻止剤がＭＴＸであるとき、この薬剤の投与量は、患者の表面に対し０．５ｍｇ／ｍ２から２０ｇ／ｍ２であり、親油性スタチンの投与量は、１０から１００ｍｇであることができる。凡その投与量は、患者の疾病に依り、また治療の目的が治療なのか再発防止なのかに依る。それ故、急性リンパ性白血病治療には、ＭＴＸの投与量が、患者の表面に対し１ｍｇ／ｍ２から３ｍｇ／ｍ２である。骨肉腫の治療には、ＭＴＸは、患者の表面に対し１２ｍｇ／ｍ２から１５ｍｇ／ｍ２で投与される。両方の場合で、親油性スタチンを４０ｍｇから８０ｍｇの初期高投与量とし、１０ｍｇから３０ｍｇ、例えば２０ｍｇで維持することが可能である。骨肉腫の再発防止には、ＭＴＸを患者の表面に対し３〜２０ｍｇ／ｍ２、親油性スタチンを２０ｍｇで投与することができる。同様に、投与方法は、問題の疾患に依り、またその目的が疾患の治療なのかあるいは再発防止なのかにも依る。一般に、本発明の組合せ治療では、ＭＴＸを、１週から５週の頻度で投与し、親油性スタチンを１日から７日の頻度で投与する。例えば、組合せ治療の目的が急性リンパ性白血病の治療であるとき、ＭＴＸ量を、４〜６週間にわたって、患者の表面に対し１〜３ｍｇ／ｍ２で投与することができる。例えば、組合せ治療の目的が骨肉腫の治療であるとき、ＭＴＸを１４日毎に患者の表面に対し１２〜１５ｍｇ／ｍ２の量で投与することができる。両方の場合で、親油性スタチンを４０ｍｇから８０ｍｇの初期高投与量とし、１０ｍｇから３０ｍｇ、例えば２０ｍｇで維持することができる。例えば、本発明の治療の目的が、骨肉腫の再発防止であるとき、ＭＴＸを患者の表面に対し３〜２０ｍｇ／ｍ２、親油性スタチンを毎週２０ｍｇの量で投与することができる。
【００３４】
既に述べたように、本発明の組合せ治療の意味でのＭＴＸと親油性スタチンは、同時に、連続的にあるいは別途に投与することができる。投与が同時である場合には、薬剤を同じ医薬組成物の一部とすることができ、あるいは、それぞれの薬剤を異なった医薬組成物の一部とすることができる。
【００３５】
本発明の様態は、メトトレキサート、トリメトレキサールおよびペメトレキセドからなるグループから選ばれるジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤と、親油性スタチンを、賦形剤及び／あるいは薬学的に許容できる媒体と共に配合した医薬組成物を提供する。この組成物は、上述した疾患の治療或いは再発防止のための本発明の組み合わせ治療における使用のために有用である。
【００３６】
表現“賦形剤及び／あるいは薬学的に許容できる媒体”は、物質、組成物あるいは薬学的に許容できる媒体を意味している。それぞれの成分は、医薬組成物中の他の成分と共存できるという意味で薬学的に許容できるものでなければならない。さらに、これらは、過度の毒性、刺激症状、アレルギー反応、免疫性、あるいは起こり得る利益／危険比率からくる他の問題あるいは合併症を発生することなく、ヒト及び動物の組織と器官に接触して使用するに適していなければならない。
【００３７】
ある実施形態で、本発明における親油性スタチンは、メトトレキサート、トリメトレキサールおよびペメトレキセドからなるグループ、あるいはそれの薬学的に許容できる塩から選ばれる。別のある実施形態で、ＤＨＦＲ阻止剤は、ＭＴＸである。ある実施形態で、組成物はＭＴＸとシンバスタチンを含んでいる。
【００３８】
本発明の組成物は、経口投与する投薬ユニットに配合することができる。ある実施形態では、この経口投与する投薬ユニットは、錠剤、丸薬、パステル、トローチ、カプセル、溶液、懸濁液、ゲルあるいはゼリーである。別の実施形態では、本発明の組成物は、静脈内、筋肉内、経皮、経直腸、腔内ルートによって、あるいは吸入による投与を目的にした投薬ユニットに配合される。
【００３９】
ある実施形態では、前述した疾患の治療のための本発明の組成物の投与方法は、その投薬ユニット中のＤＨＦＲ阻止剤と親油性スタチンの含有量に依っている。本発明の組成物の投与方法を決める際には、組合せ治療の推奨投与量を考慮に入れなければならない。
【００４０】
本発明の組合せ治療で使用されるＤＨＦＲ阻止剤と親油性スタチンの投与が、順番にあるいは別個であるとき、それぞれの薬剤は、異なる組成物に配合され、上述の疾患の治療あるいは再発防止に適した投与をするための指示書を添えたキットにして投与される。
【００４１】
同様に、本発明の別の実例では、メトトレキサート、トリメトトレキサート、ペメトレキセド、あるいはそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選ばれるジヒドロ葉酸還元酵素阻止剤でなる第１医薬成分と、親油性スタチンでなる第２医薬成分と、及び癌、乾癬、乾癬関節炎、若年多発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、多発性筋炎、皮膚筋炎およびサルコイドーシスからなるグループの治療あるいは再発防止を組合せ治療で行う２つの医薬成分の指示書で構成されるキットを提供する。
【００４２】
ある実施形態では、本発明のキット中の親油性スタチンは、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン及びそれらの薬学的に許容される塩からなるグループから選択される。ある実施形態では、このスタチンがシンバスタチンである。別の実施形態では、ＤＨＦＲ阻止剤がＭＴＸである。
【００４３】
本発明のキット中のそれぞれの活性成分は、ＤＨＦＲ阻止剤と親油性スタチンであり、経口投与の投薬ユニットに配合できる。ある実施形態では、経口投与の投薬ユニットが、錠剤、丸薬、パステル、トローチ、カプセル、溶液、懸濁液、ゲルあるいはゼリーである。別の実施形態では、本発明のキット中のそれぞれの活性成分が、静脈内、筋肉内、経皮、経直腸、腔内ルート、あるいは吸入による投与を目的にした投薬ユニットに配合される。
【００４４】
ある実施形態は、ＭＴＸの０．５ｍｇから２０ｇが賦形剤と薬学的に許容できる媒体と共に投薬ユニットに配合された組成物中のＭＴＸと、親油性スタチンの１０ｍｇから１００ｍｇが賦形剤と薬学的に許容できる媒体と共に投薬ユニットに配合された組成物中の親油性スタチンと、前述した疾患の１つの治療あるいは再発防止のための組合せ治療での両医薬成分を投与するに必要な指示書とからなるキットを提供する。ある実施形態では、ＭＴＸの投薬ユニットは、ＭＴＸを１ｍｇから３ｇ含んでいる。別の実施形態では、ＭＴＸの投薬ユニットは、ＭＴＸを１２ｍｇから１５ｍｇ含んでいる。両方の場合で、親油性スタチンの投薬ユニットは、４０ｍｇから８０ｍｇの初期高投与量、あるいは１０ｍｇから３０ｍｇ、例えば２０ｍｇの維持投与量でなっている。組合せ治療で組成物を投与するための指示書は、その他事項中に、ＭＴＸと親油性スタチンを同時に投与する、あるいはこれらを治療上有効な範囲内で別個に投与すると記載することができる。この指示書は、また、投与される投薬ユニット及びそれぞれが投与される時間間隔を特定した組合せ治療の投与方法を記載することができる。投与量と時間間隔は、このキットが、患者の疾患治療なのか再発防止なのかに依って変わる。本発明の組成物の投与方法を決めるには、本発明の組合せ治療のために上記した推奨投与量を考慮に入れなければならない。
【００４５】
この指示書は、また、組合せ治療を使用して治療される疾患を記載することができる。ある実施形態では、キットは、癌の治療を対象としている。別の実施形態では、キットは、癌の治療がされていた患者での再発防止を対象としている。ある実施形態では、癌は、骨肉腫、破壊性絨毛腺腫、絨毛癌、胞状奇胎、急性リンパ性白血病、急性非リンパ性白血病、大細胞リンパ腫、高悪性度リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ肉腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、胸膜中皮腫、乳癌、卵巣癌、扁平上皮頭腫瘍、扁平上皮頸部腫瘍、小細胞肺癌、膀胱癌からなるグループから選ばれる。特別の特定の形態で、癌は骨肉腫である。ある実施形態では、キットは、自己免疫疾患の治療を対象としている。ある特定の実施形態では、自己免疫疾患が、乾癬、乾癬関節炎、若年多発性関節炎、関節リウマチ、クローン病、多発性筋炎、皮膚筋炎およびサルコイドーシスである。
【００４６】
記述および請求項を通して、単語“含む”及びその変形は、他の技術的特性、添加物、成分あるいはステップを排除するものではない。さらに単語“なる”は、“からなる”の意味を包含している。この分野のエキスパートにとっては、本発明の他の目的、利点および特性は、一部はこの記述から、一部は本発明の実施から出てくる。以下の実施例および図面は、説明として提供したものであり、本発明に制限を加えることを意図していない。さらに、本発明は、ここに記載した特定の好ましい実施形態の可能な組合せ全てを包含している。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ＭＴＸとシンバスタチンを含む組合せ治療のＨＯＳ細胞に及ぼす細胞毒性効果を示すグラフである。スルホローダミンＢ試験により、シンバスタチン量を次善の０．５μＭに固定してＭＴＸとの組合せ（グラフＡ：黒棒、グラフＢ：黒丸）、あるいはシンバスタチンなしでＭＴＸ量を４８時間で最大濃度１００ｎＭに迄増加させただけ（グラフＡ：白棒、グラフＢ：白丸）で評価した。測定は３回行い、データは、平均値±標準偏差評価で表す。Ｙ−軸は生存割合をパーセントで表し、Ｘ−軸はＭＴＸの濃度である。
【図２】ＨＯＳ細胞の生存率を示す表で、シンバスタチンなし（縦列：Ａ）、０．５μＭ濃度のシンバスタチンで処理したシンバスタチンあり（縦列：Ｂ）、及び両者の差異（縦列：Ｃ）である。左側の縦列は、用いたＭＴＸ量である。
【図３】ＭＴＸとシンバスタチンを含む組合せ処理したＨＯＳ細胞に及ぼす細胞毒性効果を示すグラフである。スルホローダミンＢ試験により、シンバスタチン量を次善の１μＭに固定してのＭＴＸとの組合せ（グラフＡ：黒棒、グラフＢ：黒丸）、あるいは４８時間シンバスタチンなしでＭＴＸ量を最大濃度１００ｎＭに迄上げて（グラフＡ：白棒、グラフＢ：白丸）評価した。測定は、３回行い、データは、平均値±標準偏差で表している。Ｙ−軸は生存割合をパーセントで表し、Ｘ−軸はＭＴＸ濃度を表している。
【図４】シンバスタチンなしの処理（１）、シンバスタチンを１μＭ濃度迄ありで処理（２）したＨＯＳ細胞生存率、及び両処理間の差異（３）をまとめたグラフ（Ａ）および表（Ｂ）である。左側の縦列は、使用したＭＴＸ量を表している。
【図５】シンバスタチン０．５μＭ濃度（１）と１μＭ濃度（２）で処理したＨＯＳ細胞生存率、及び両処理間の差異（３）をまとめたグラフ（Ａ）と表（Ｂ）である。左側の縦列は、使用したＭＴＸ量を表している。
【図６】７２時間（Ｘ−軸）にわたって、シンバスタチン０．５μＭ（２）、メトトレキサート５０ｎＭ（３）、あるいは両方（４）で処理した骨肉腫細胞（ＨＯＳ）の増殖能力を、コントロール細胞（１）と比較して評価したグラフである。この効果は、トリパンブルーを用いた染色技術で、ノイバウエルチャンバ（Ｎｅｕｂａｕｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒ）内の細胞（生存及び非生存）の総数（Ｙ−軸）を数えて評価した。測定を３回行い、データを平均値±標準偏差で表している。
【図７】７２時間（Ｘ−軸）にわたり、シンバスタチン０．５μＭ（２）で処理、メトトレキサート５０ｎＭ（３）で処理、あるいは両方で処理（４）された骨肉腫細胞（ＨＯＳ）の細胞死誘導を、コントロール細胞（１）と比較して評価したグラフである。効果は、トリパンブルーを用いた染色技術で、ノイバウエルチャンバ内の生存していない細胞の総数（Ｙ−軸）を数えて評価した。測定を３回行い、データを平均値±標準偏差で表している。
【図８】４８時間（パネル：Ａ）及び７２時間（パネル：Ｂ）にわたって、シンバスタチン０．５μＭ（２）、メトトレキサート５０ｎＭ（３）、あるいは両方（４）で処理した骨肉腫細胞（ＨＯＳ）における形態変化を、コントロール細胞（１）と比較して示す図である。ＭＴＸ（３）は、大きくなり、２つの核（直線矢）をもった細胞さえも生じ、ＳＶ（２）は円形の細胞（破線矢）を生じ、両薬剤（４）ではその両方の効果を生じていることが見られる。
【図９】４８時間（Ｘ−軸）にわたって、シンバスタチン１μＭ（２）、メトトレキサート１００ｎＭ（３）、あるいは両方（４）で処理した骨肉腫細胞（ＨＯＳ）の総数変化あるいは死んだ細胞の数の変化を、コントロール細胞（１）と比較して示すグラフである。効果は、トリパンブルーでの染色技術を用い、ノイバウエルチャンバ内の細胞の総数（グラフＡのＹ−軸）及びトリパンブルー陽性細胞の総数（グラフＢのＹ−軸）を数えて評価した。測定を３回行い、データを平均値±標準偏差で表している。
【図１０】７２時間（Ｘ−軸）にわたって、シンバスタチン０．５μＭ（２）、メトトレキサート５０ｎＭ（３）、あるいは両方（４）で処理した骨肉腫細胞（ＨＯＳ）の総数変化を、コントロール細胞（１）と比較して示すグラフである。効果は、トリパンブルーでの染色技術を用い、ノイバウエルチャンバ内の細胞の総数（グラフＡのＹ−軸）及びトリパンブルー陽性細胞の総数（グラフＢのＹ−軸）を数えて評価した。測定を３回行い、データを平均値±標準偏差で表している。
【図１１】ＭＴＸの量を増やして２４時間処理したＨＯＳ細胞の細胞周期変化を示すグラフである。Ｇ１．１＝コントロール（全ての図で、コントロールは０ｎＭを意味する）；２＝１０ｎＭ；３＝５０ｎＭ；４＝１００ｎＭ；５＝２００ｎＭ。Ｓ期での減少及びＧ２／Ｍ期での細胞数の減少、引き続くＧ１期での上昇に注意してほしい。
【図１２】（Ａ）ＭＴＸの量を増やして２４時間処理したＨＯＳ細胞の細胞周期変化を示すグラフである。Ｘ軸は、ＭＴＸ濃度を示す：１＝コントロール；２＝１０ｎＭ；３＝５０ｎＭ；４＝１００ｎＭ；５＝２００ｎＭ。（Ｂ）前述のＭＴＸ濃度で、周期の各期での絶対値。（Ｃ）周期の各期で得られた値のコントロールと比較した差異パーセント。ａ＝１０ｎＭ対コントロール；ｂ＝５０ｎＭ対コントロール；ｃ＝１００ｎＭ対コントロール；ｄ＝２００ｎＭ対コントロール。Ｓ期は、コントロールと比較して９．３８％と３５．４６％の間で減少する。Ｇ２／Ｍ期は、コントロールと比較して６．３０％と５５．４６％の間で減少するが、Ｇ１期の細胞は、コントロールと比較して１．８９％と４２．００％の間でその数を増している。
【図１３】ＳＶの量を増やして２４時間処理したＨＯＳ細胞の細胞周期変化を示すグラフである。１＝コントロール；２＝０．２μＭ；３＝０．５μＭ；４＝１μＭ；５＝２μＭ；６＝５μＭ；７＝１０μＭ。Ｓ期の減少、及びＧ１期での細胞数の減少、引き続くＧ２／Ｍ期での上昇が顕著である。
【図１４】（Ａ）ＳＶの量を増やして２４時間処理したＨＯＳ細胞の細胞周期変化を示すグラフである。Ｘ−軸は、ＳＶ濃度を示す：１＝コントロール；２＝０．２μＭ；３＝０．５μＭ；４＝１μＭ；５＝２μＭ；６＝５μＭ；７＝１０μＭ。（Ｂ）前述のＳＶ濃度で、周期の各期の絶対値。（Ｃ）周期の各期で得られた値のコントロールと比較した差異パーセント。ａ＝０．２μＭ対コントロール；ｂ＝０．５μＭ対コントロール；ｃ＝１μＭ対コントロール；ｄ＝２μＭ対コントロール；ｅ＝５μＭ対コントロール；ｆ＝１０μＭ対コントロール。Ｓ期は，コントロールと比較して０．４１％と２２．５３％の間で減少する。Ｇ１期は７．８５％と４８．２８％の間で減少する。Ｇ２／Ｍ期の細胞は、コントロールと比較して９．３２％と９７．６５％の間でその数を増加している。
【図１５】（Ａ）ＳＶとＭＴＸの組合せで２４時間処理したＨＯＳ細胞の細胞周期変化を示すグラフである。Ｘ−軸は、薬剤の濃度を示す：１＝コントロール；２＝ＳＶ１μＭ；３＝ＭＴＸ５０ｎＭ；４＝ＳＶ１μＭ＋ＭＴＸ５０ｎＭ；（Ｂ）前述の濃度で、周期の各期での絶対値。（Ｃ）周期の各期で得られた値のコントロールと比較した差異パーセント。ａ＝ＳＶ１μＭ対コントロール；ｂ＝ＭＴＸ５０ｎＭ対コントロール；ｃ＝両薬剤対コントロール。Ｓ期は、コントロールと比較して４．１０％と１２．１０％の間で減少する。Ｇ１期は、ＳＶで１９．６０％だけ減少するが、ＭＴＸと組合せたとき、コントロールと比較して１５．１１％増加する。Ｇ２／Ｍ期での細胞は、ＳＶ単独で処理したとき、その数を４０．９２％だけ増加させるが、ＭＴＸと組合せたとき、コントロールと比較して３３．９０％だけ減少する。
【図１６】ＭＴＸで４８時間処理したＨＯＳ細胞のＳｕｂ−Ｇ０ピークのグラフである。１＝コントロール；２＝ＭＴＸ１０ｎＭ；３＝ＭＴＸ２０ｎＭ；４＝ＭＴＸ５０ｎＭ；５＝ＭＴＸ１００ｎＭ；６＝ＭＴＸ２００ｎＭ。ＭＴＸが２０ｎＭで、Ｇ１−Ｇ２／Ｍ域の形状、及びＳｕｂＧ０ピーク（３）の始まりに顕著な変化が見られ、アポトーシスによる細胞死を示している。
【図１７】ＭＴＸの量を増やして４８時間処理したＨＯＳ細胞のＳｕｂ−Ｇ０ピークの変化を示すグラフである。Ｘ−軸は、ＭＴＸ濃度を示す：１＝コントロール；２＝１０ｎＭ；３＝２０ｎＭ；４＝５０ｎＭ；５＝１００ｎＭ；６＝２００ｎＭ。（Ｂ）前述のＭＴＸ濃度で、それぞれの域の絶対値。（Ｃ）各域で得られた値のコントロールと比較した増加あるいは減少。ａ＝１０ｎＭ対コントロール；ｂ＝２０ｎＭ対コントロール；ｃ＝５０ｎＭ対コントロール；ｄ＝１００ｎＭ対コントロール；そしてｅ＝２００ｎＭ対コントロール。最も顕著な結果は、ＭＴＸ５０ｎＭ以上のＳｕｂＧ０期で定量された細胞数の著しい増加である。
【図１８】ＳＶで４８時間処理したＨＯＳ細胞のＳｕｂ−Ｇ０ピークの変化を示すグラフである。１＝コントロール；２＝ＳＶ０．２μＭ；３＝ＳＶ０．５μＭ；４＝ＳＶ１．０μＭ；５＝ＳＶ２．０μＭ；６＝ＳＶ５．０μＭ；及び７＝ＳＶ１０μＭ。ＳＶ濃度を最高で１０μＭとして、ＳＶが０．２μＭ以下の濃度（２）で、Ｇ１−Ｇ２／Ｍ域の大きな形状変化とＳｕｂＧ０ピークの出現があり、アポトーシスによる細胞死を示している。
【図１９】ＳＶの量を増やして４８時間処理したＨＯＳ細胞のＳｕｂ−Ｇ０ピークの変化、及びＧ１−Ｇ２／Ｍ域の変化を示すグラフである。Ｘ−軸は、ＳＶ濃度を示す：１＝コントロール；２＝０．２μＭ；３＝０．５μＭ；４＝１．０μＭ；５＝２．０μＭ；６＝５．０μＭ；７＝１０μＭ。（Ｂ）前述のＳＶ濃度で検討した各域の絶対値。（Ｃ）各域で得られた値のコントロールと比較しての増加あるいは減少。１＝０．２μＭ対コントロール；ｂ＝０．５μＭ対コントロール；ｃ＝１．０μＭ対コントロール；ｄ＝２．０μＭ対コントロール；ｅ＝５．０μＭ対コントロール；ｆ＝１０μＭ対コントロール。ＳＶ０．２μＭ以上の量で、ＳｕｂＧ０期で定量された細胞数に顕著な増加がある。
【図２０】（Ａ）ＳＶとＭＴＸの組合せで４８時間処理したＨＯＳ細胞のＳｕｂＧ０ピークの変化、およびＧ１−Ｇ２／Ｍ域の変化を示すヒストグラムである。１＝コントロール；２＝ＭＴＸ３０ｎＭ；３＝ＳＶ０．５μＭ；４＝ＭＴＸ３０ｎＭ＋ＳＶ０．５μＭ。
【図２１】（Ａ）ＳＶとＭＴＸの組合せで４８時間処理したＨＯＳ細胞のＳｕｂＧ０ピークの変化、及びＧ１−Ｇ２／Ｍ域の変化を示すグラフである。１＝コントロール；２＝ＭＴＸ３０ｎＭ；３＝ＳＶ０．５μＭ；４＝ＭＴＸ３０ｎＭ＋ＳＶ０．５μＭ；（Ｂ）前述のそれぞれの濃度でのＳｕｂＧ０ピーク、及びＧ１−Ｇ２／Ｍ域の絶対値。（Ｃ）各領域で得られた値のコントロールと比較しての増加あるいは減少。ａ＝コントロール；ｂ＝ＳＶ０．５μＭ対コントロール；ｃ＝両方対コントロール。両方の処理を組み合わせたとき、ＳｕｂＧ０ピーク（細胞死）の細胞数が６倍に迄顕著な増加がある。
【図２２】ＤＮＡラダー技術を用いた、２４時間（Ａ）および３６時間（Ｂ）後のＨＯＳ細胞の細胞アポトーシスの変化を示すグラフである。１＝コントロール；２＝ＳＶ０．５μＭ；３＝ＭＴＸ５０ｎＭ；４＝ＭＴＸ５０ｎＭ＋ＳＶ０．５μＭ。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００４８】
以下の実施例は、請求項に挙げた本発明をよりよく説明するためのものであり、本発明の範囲を制限すると解釈すべきでない。特定の材料を述べているが、これは純粋に説明のためであり、本発明を制限するものではない。この技術のエキスパートにとっては、創造的能力を働かせずに、また本発明の範囲から逸脱することなしに、等価な手段あるいは薬剤を開発することができよう。
【００４９】
〔実施例１：骨肉腫細胞株の培養〕
ラット骨肉腫細胞株ＵＭＲ−１０６およびヒト骨肉腫細胞株ＨＯＳを、ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養する。ヒトの骨肉腫細胞株ＭＧ−６３を、ＤＭＥＮ培地で培養する。全ての培地は、ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）１０％、グルタミン２ｍＭ、ペニシリン１００ユニット／ｍＬ、およびストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを添加する。全ての細胞株の保持条件は、３７℃で、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中である。腫瘍株は、ＡＴＣＣ〔アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）〕から入手し、推奨された条件で培養する。
【００５０】
〔実施例２：細胞生存試験〕
骨肉腫細胞株は、ＭＴＸを１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０および１００ｎＭ、およびシンバスタチンを０．５μＭと１．０μＭで培養する。細胞生存は、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）試験を用いて定量する。スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）試験は、ＳＲＢのトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で固定した塩基アミノ酸への静電気的結合に基づく分光光度定量の非放射性比色試験である。
【００５１】
【化４】
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【００５２】
このため、ＵＭＲ−１０６、ＨＯＳおよびＭＧ−６３の腫瘍細胞株を、９６ウェルのプレート上にＦＢＳ１０％を加えた培地２００μＬ中、５×１０３細胞／ウェルの密度で、２４、４８あるいは７２時間培養する。実験が終ってから、培地をデカンテーションによって除く。冷却したＴＣＡ１０％〔１００％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ・１００ｍＬ＋エリックス（Ｅｌｉｘ）水・９００ｍＬ、２〜５℃〕を加えた後、細胞を４℃で３０分間培養して、細胞をウェルの底に完全に固定する。次いで、ＴＣＡをデカンテーションによって除き、ウェルを冷流水で４度洗い、全ウェルを等しく洗う。次いで、プレートをひっくり返し、翌日迄数層の吸着紙上に逆さに置いて水を全て除く。１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）酢酸中に０．４％（ｗｔ／ｖｏｌ）としたスルホローダミンＢ溶液〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｓ−９０１２、室温でＳＲＢ４ｇ＋１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）酢酸１Ｌ〕４０μＬを、室温で光が直接あたらないようにして（ＳＲＢは光に敏感である）加える。プレートを、室温にて３０分間培養する。次いで、色素をデカンテーションし、１％酢酸（ｖｏｌ／ｖｏｌ、酢酸１００ｍＬ＋エリックス水１０Ｌ）で少なくとも４回洗って、細胞に結合していないトレースの色素を除く。暗所で、プレートを多層吸着紙に激しくぶつけて残酢酸を全て除く。次に、１０ｍＭ−ＴＲＩＳ：ＢＡＳＥ（ｐＨ：１０．５、１００ｍＭＴＲＩＳ：ＢＡＳＥ・１００ｍＬ＋エリックス水・９００ｍＬ）１５０μＬを加え、室温に１０分間放置して、色素を完全になくす。最後に、マルチプレートデュアルリーダー（ｍｕｌｔｉ−ｐｌａｔｅ  Ｄｕａｌ  Ｒｅａｄｅｒ）を用いて、４９２ｎｍ（ＳＲＢのピーク吸光度）及び６２０ｎｍ（プレート中の容積、汚れあるいは欠陥での小さな変化によって起きる妨害をなくすため）で測定を行う。測定前に、プレートを激しく振るのが必要である。
【００５３】
細胞生存試験の結果を、図１〜５に示す。この結果は、ＭＴＸとシンバスタチンを共投与したとき、シンバスタチンがＭＴＸの有効投与量を下げることを示している。この効果は、ＭＴＸが０ｎＭと３０ｎＭの間の低濃度で特に関連している。
【００５４】
〔実施例３：細胞生存率試験〕
ＨＯＳ細胞を、３７℃、９５％湿度および５％ＣＯ２の雰囲気下、５〜１０％の熱不活性化ウシ胎児血清とＬ−グルタミン２ｍＭを加えた培地で培養する。この細胞を、シンバスタチン０．５μＭとＭＴＸ・５０ｎＭで、２４、４８および７２時間処理する。細胞をトリプシン処理で集める。これは、最初に培地を吸引し、その後、ＰＢＳ（無菌）２〜３ｍＬで細胞を洗い、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（無菌）０．５〜１ｍＬを加え、３７℃で５分間培養し、新しい培地５ｍＬで細胞を集め、得られた懸濁液を新しい無菌の１５ｍＬチューブに入れる、ことからなっている。細胞の生存率測定には、トリパンブルー色素を使用する。トリパンブルーは、コロイドで、細胞膜を破って細胞内に入る。それ故、明瞭にブルーに染まったイメージで現れる細胞は、生きていないと考えられる。測定には、トリパンブルー色素５０μＬと細胞懸濁液５０μＬを混合して１．５ｍＬチューブに入れる。この混合物を均質にし、その１０μＬをノイバウアーチャバに入れる。全細胞および生きていない細胞（完全にブルーに染まる）を数える。
【００５５】
細胞生存率試験の結果を、図６、７、８、９および１０で見ることができる。
【００５６】
これらの実験から、シンバスタチンは細胞死誘導に大きな効果があると結論することができる。すなわち、メトトレキサートは、専ら細胞増殖を遅くするに作用し、両方の治療がなされると、この増殖がかなり遅くなり、両方の治療が別途に投与されたときに較べて細胞死が増える。
【００５７】
〔実施例４：アポトーシスの検出〕
アポトーシスの検出および定量を、ＤＮＡ断片化試験、及びアネキシン−Ｖ／ヨウ化プロピジウム染色を用いた流動細胞分析法により行う。
【００５８】
〔４．１：ＤＮＡ断片化試験（ラダーＤＮＡ）〕
ＵＭＲ−１０６腫瘍細胞株を、６ウェルのプレート上、２×１０５細胞／ウェルの密度で２日間か３日間培養する。次に、細胞培養を、シンバスタチン０．５μＭおよびＭＴＸ５０ｎＭで２４時間および４８時間培養する。マイクロ遠心分離チューブ中の個々の実験状態にある細胞を得た後、これら細胞を、トリス／ＨＣｌ（ｐＨ：８．０）１０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ、トリトンＸ−１００・０．２％を含むバッファー２００μＬ中に溶解させ、ヘリウス・インストゥルメント（Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）社のバイオヒュージ・シュトラトス（Ｂｉｏｆｕｇｅ  Ｓｔｒａｔｏｓ）マイクロ遠心分離機中、１２，０００ｘｇで２０分間遠心分離する。サンプルを、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）（シグマ）と３７℃で１時間、およびプロテナーゼＫ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ）（シグマ）と３７℃で１時間培養して、ＲＮＡ含有量を最終濃度５ｍｇ／ｍＬに減らす。フェノールを主成分に何回も洗浄した後、２倍量の無水エタノールを用い、−２０℃で少なくとも１２時間置いてサンプルを析出させる。サンプルを、１２，０００ｘｇで再度遠心分離する、この実験条件は、トリス／ＨＣｌ（ｐＨ：８．０）１０ｍＭ、ＥＤＴＡ（ｐＨ：８．０）１ｍＭを含むＴＥバッファー５０μＬを加えるために、７０％エタノールで洗浄する。サンプルを、１％アガロースゲルで分析する。１２３ｂｐのＤＮＡ含有量は、臭化エチジウムで染色し、ＵＶ光システム〔バイオ・イメージング・システム−シンジーン（Ｂｉｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ−Ｓｙｎｇｅｎｅ）〕を使用して視覚化する。濃度測定分析は、ウインドゥズ・パブリック・ドメイン・ソフトウェアのシオン・イメージング・ベータ４．０２（Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ  Ｂｅｔａ  ４．０２）を用いて行う。
【００５９】
ＤＮＡ断片化試験の結果を、図２２に示す。細胞がＳＶとＭＴＸで処理されると、アポトーシス応答が大きくなっていることに注意。
【００６０】
〔４．２：アネキシン−Ｖ／ヨウ化プロピジウムを用いる流動細胞分析法〕
アネキシンＶ−ＦＩＴＣアポトーシス検出キット〔参照番号：５５６５４７，ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、商品名〕を用い、アポトーシス条件下の細胞を検出及び定量する。細胞を、６ウェルあるプレート上に接種し、３日間置く。その後、シンバスタチン０．５μＭとＭＴＸ５０ｎＭで２４時間および４８時間処理する。その後、フルオレッセインイソチオシアネートと結合したアネキシン（アネキシンＶ−ＦＩＴＣ）４μＬとヨウ化プロピジウム１０μＬを含有する結合バッファー１００μＬで、暗所、室温で１５分間培養する。この細胞を、同じ結合バッファー４００μＬに懸濁させ、暗所に保管する。溶液を、ＦＡＣＳ・カリバー・フロー・サイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）〔ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、サンホセ、カルフォルニア〕及びセル・クェスト・ソフトウェア〔ベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）〕を用いて分析する。これらの条件の下で、アポトーシスプロセスとネクローシスプロセスを区別し、細胞生存率を差し引くため、それぞれの結果を、次式で計算する。
％細胞＝アネキシンＶ−ＦＩＴＣ＋ＰＩ−／ＰＩ−
ここで、ＰＩ−は、生存していると考えられる細胞（アネキシンＶ−ＦＩＴＣ−ＰＩ−）とアポトーシス状態で見出された細胞（アネキシンＶ−ＦＩＴＣ＋ＰＩ−）の合計である。
【００６１】
流動細胞分析法を用いたアポトーシス試験の結果を、図１６〜２２に示す。この結果は、２つの薬剤の組合せが、それぞれ別々に投与されたときより、大きな細胞死を引き起こすことを示している。
【００６２】
〔実施例５：細胞周期の分析〕
細胞周期分布の変化を分析するために、細胞を、アネキシン−Ｖ色素を用いたと同じ条件で接種及び処理する。処理された細胞と処理していない細胞を、ＮＰ−４０を１％溶解させ、さらにＰＩ（ヨウ化プロピジウム）５０μｇ／ｍＬを加えたＰＢＳに、３×１０５細胞／サンプルの密度で再度懸濁する。実験条件それぞれの分析および定量は、室温の暗所に１５分間培養の後、アネキシン−Ｖ染色でのアポトーシス実験に用いたと同じ方法で行う（ＦＡＣＳ・カリバー・フロー・サイトメトリー及びセル・クェスト・ソフトウェア）。
【００６３】
細胞周期の分布変化の検討結果を、図１１〜１５に示す。この結果から、ＭＴＸは本質的に周期をＧ１期で停止させ、ＳＶは周期をＧ２／Ｍ期で停止させており、この２つの組合せは、周期を両方の期で止めてＤＮＡ合成の著しい減少となる。それ故に、この組合せは、細胞が細胞周期をコントロールできなくなるのを抑えていることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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