(57)【要約】  本明細書では、液体培養物中において上皮幹細胞及び上皮幹細胞を含む組織断片を培養する方法が提供される。【選択図】図１Ａ
2016512958.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）上皮幹細胞及び／又は（ｂ）上皮幹細胞を含む単離された上皮組織断片を液体培養する方法であって、上皮幹細胞及び／又は単離された組織断片を、（ｉ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤、（ｉｉ）分裂促進的増殖因子、（ｉｉｉ）Ｗｎｔアゴニスト、及び（ｉｖ）少なくとも約４％（ｗ／ｖ）の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を加えた、動物又はヒト細胞のための基礎培地を含む液体細胞培養物中において培養することを含む方法。
【請求項２】
陰窩を獲得する及び／又は増殖させる方法であって、上皮幹細胞及び／又は単離された組織断片を、（ｉ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤、（ｉｉ）分裂促進的増殖因子、（ｉｉｉ）Ｗｎｔアゴニスト、及び（ｉｖ）少なくとも約４％（ｗ／ｖ）の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を加えた、動物又はヒト細胞のための基礎培地を含む液体細胞培養物中において培養することを含む方法。
【請求項３】
ＢＭＰ阻害剤が、ノギン、ＤＡＮ、及び／又はケルベロス及びグレムリンを含むＤＡＮ様タンパク質である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＢＭＰ阻害剤がノギンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
液体細胞培養物中におけるＢＭＰ阻害剤の濃度が、約５〜約５００ｎｇ／ｍｌ（例えば、約５０〜約１００ｎｇ／ｍＬ）である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔ、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ（ＲＳＰＯ）、Ｎｏｒｒｉｎ、及び／又はＧＳＫ阻害剤である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＷｎｔアゴニストがＲＳＰＯである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
液体細胞培養物中におけるＷｎｔアゴニストの濃度が、約５００ｎｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍｌ（例えば、約５００〜約１５００ｎｇ／ｍＬ）である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
分裂促進的増殖因子が、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−アルファ（ＴＧＦ−α）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、及びケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
分裂促進的増殖因子がＥＧＦである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
液体細胞培養物中における分裂促進的増殖因子の濃度が、約５〜約５００ｎｇ／ｍｌ（例えば、約５〜約５０ｎｇ／ｍＬ）である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＥＣＭが増殖因子低減ＥＣＭである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＥＣＭがマトリゲルである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
液体細胞培養物中におけるＥＣＭの濃度が、約４％〜約１０％（ｗ／ｖ）である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
培地が更にＲｏｃｋ（Ｒｈｏ−キナーゼ）阻害剤を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
培地が更にＮｏｔｃｈアゴニストを含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
上皮幹細胞及び／又は上皮組織断片が、胃腸幹細胞及び／又は胃腸組織断片である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
胃腸幹細胞及び／又は胃腸組織断片が、小腸幹細胞及び／又は小腸組織断片である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法により獲得される陰窩。
【請求項２０】
薬物発見スクリーニング、毒性アッセイ、又は再生医学における、請求項１９に記載の陰窩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年２月２５日に出願された米国特許出願第６１／７６９０７６号の利益を主張し、参照によりその全体を援用される。
【０００２】
本明細書では、液体培養物中において上皮幹細胞及び上皮幹細胞を含む組織断片を培養する方法が提供される。
【背景技術】
【０００３】
小腸上皮は２〜５日毎に再生され、したがって最も修復性の高い哺乳動物組織である。位置及び循環動態に基づいて小腸には二種類の幹細胞が類型化されている。例えば、Barkeret al., Nature 449, 1003-1007 (2007); Sangiorgi, E. & Capecchi, M. R. Nature Genet. 40, 915-920 (2008); Li, L. & Clevers, H. Science 327, 542-545 (2010)を参照。循環の早い幹細胞は、Ｌｇｒ５、Ｃｄ１３３（Ｐｒｏｍ１としても知られる）及びＳｏｘ９を含むマーカーを発現し、腸全体に存在する。例えば、Zhu, L. et al., Nature 457, 603-607 (2009); Furuyama, K. et al., Nature Genet. 43, 34-41 (2011)を参照。陰窩底部柱状細胞（ＣＢＣ）としても知られるこれらの細長い細胞は、３日以内に陰窩及び繊毛に集まり、それらを支持するパネート細胞中に散在する。Sato, T. et al., Nature 469, 415-418 (2011); Cheng, H. & Leblond, C. P., Am. J. Anat. 141, 537-561 (1974)を参照。Ｂｍｉ１又はマウスＴｅｒｔ（ｍＴｅｒｔ）の豊かな発現を特徴とする循環の遅い幹細胞は、それよりも少ない細胞集団である。Sangiorgi, E. & Capecchi, M. R. Nature Genet. 40, 915-920 (2008)を参照。これらの細胞は、腸の近位領域から遠位領域へと漸減勾配を形成し、したがって結腸よりも十二指腸に多く存在する。少ないとはいえ、Ｂｍｉ１発現幹細胞は陰窩維持に重要である。
【０００４】
腸上皮幹細胞を含む初代上皮幹細胞を培養するための様々な培養系が文献に記載されている（Bjerknes and Cheng, Methods Enzymol 419, 337-83 (2006) and Sato and et al., Nature 459, 262-265 (2009)）。これまでの培養系は、初代上皮幹細胞を増殖するために固体細胞外マトリックスの使用に依存している。これまでの研究により、結腸又は腸管から単離された陰窩の基本的な陰窩−繊毛生理機能の保存及び上皮幹の多能性維持に、固体細胞外マトリックスが必要であることが示されている（例えば、国際公開第２０１０／０９０５１３号参照）。また、幹細胞を培養するためのＥＣＭの使用は、幹細胞の長期生存及び未分化幹細胞の存在の持続を増強することが示されている。これまでＥＣＭの非存在下において、幹細胞培養物を培養できない期間がもっと長く、未分化幹細胞の存在の持続は観察されなかった。加えて、ＥＣＭの存在により、ＥＣＭの非存在下では培養することができなかった三次元組織オルガノイドの培養が可能になった。しかしながら、培養系の固体の性質により、試験の種類、及び培養系を用いて調べることができる診断用化合物の種類にはサイズ的限界がある（例えば、大きな分子は固体マトリックス中に拡散させることができない）。更に、細胞及び高次構造は固体マトリックス中に埋め込まれるため、細胞及び高次構造の分析の容易性は低下する（例えば、分析のためには高次構造（例えば、オルガノイド）を固体マトリックスから切り離さなければならない）。上皮幹の生理構造を保存してその多能性を維持し且つオルガノイドの基本的生理機能を保存しながら、試験及び診断用化合物の種類と分析の容易性を増大させる、上皮幹細胞、特に腸上皮幹細胞のよりよい培養系が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書では、幹細胞を液体培養するための方法が提供される。特に、本明細書では、（ａ）上皮幹細胞及び／又は（ｂ）上皮幹細胞を含む単離された上皮組織断片を液体培養する方法であって、上皮幹細胞及び／又は単離された組織断片を、（ｉ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤、（ｉｉ）分裂促進増殖因子、（ｉｉｉ）Ｗｎｔアゴニスト、及び（ｉｖ）少なくとも約４％（ｗ／ｖ）の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を加えた、動物又はヒト細胞のための基礎培地を含む液体細胞培養物中においてインキュベートすることを含む方法が提供される。更に、本明細書では、陰窩を獲得する及び／又は増殖させる方法であって、上皮幹細胞及び／又は単離された組織断片を、（ｉ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤、（ｉｉ）分裂促進増殖因子、（ｉｉｉ）Ｗｎｔアゴニスト、及び（ｉｖ）少なくとも約４％（ｗ／ｖ）の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を加えた、動物又はヒト細胞のための基礎培地を含む液体細胞培養物中においてインキュベートすることを含む方法が提供される。
【０００６】
いずれの方法においても、いくつかの実施態様では、ＢＭＰ阻害剤が、ノギン、ＤＡＮ、及び／又はケルベロス及びグレムリンを含むＤＡＮ様タンパク質である。いくつかの実施態様では、ＢＭＰ阻害剤はノギンである。いくつかの実施態様では、液体細胞培養物中におけるＢＭＰ阻害剤の濃度は、約５〜約５００ｎｇ／ｍｌ（例えば、約５０〜約１００ｎｇ／ｍＬ）である。
【０００７】
いずれの方法においても、いくつかの実施態様では、Ｗｎｔアゴニストは、Ｗｎｔ、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ（ＲＳＰＯ）、Ｎｏｒｒｉｎ、及び／又はＧＳＫ阻害剤である。いくつかの実施態様では、ＷｎｔアゴニストはＲＳＰＯである。いくつかの実施態様では、ＷｎｔアゴニストはＲＳＰＯ１である。いくつかの実施態様では、ＷｎｔアゴニストはＲＳＰＯ２である。いくつかの実施態様では、ＷｎｔアゴニストはＲＳＰＯ３である。いくつかの実施態様では、ＷｎｔアゴニストはＲＳＰＯ４である。いくつかの実施態様では、液体細胞培養物中におけるＷｎｔアゴニストの濃度は、約５００ｎｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍｌ（例えば、約５００〜約１５００ｎｇ／ｍＬ）である。
【０００８】
いずれの方法においても、いくつかの実施態様では、分裂促進増殖因子は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−アルファ（ＴＧＦ−α）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、及びケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）である。いくつかの実施態様では、分裂促進増殖因子はＥＧＦである。いくつかの実施態様では、液体細胞培養物中における分裂促進増殖因子の濃度は、約５〜約５００ｎｇ／ｍｌ（例えば、約５〜約５０ｎｇ／ｍＬ）である。
【０００９】
いずれの方法においても、いくつかの実施態様では、ＥＣＭは増殖因子低減ＥＣＭである。いくつかの実施態様では、ＥＣＭはマトリゲルである。いくつかの実施態様では、液体細胞培養物中におけるＥＣＭの濃度は約４％〜約１０％（ｗ／ｖ）である。いずれの方法においても、いくつかの実施態様では、方法は、懸滴で培養することを含む。
【００１０】
いずれの方法においても、いくつかの実施態様では、培地はＲｏｃｋ（Ｒｈｏ−キナーゼ）阻害剤を更に含む。
【００１１】
いずれの方法においても、いくつかの実施態様では、培地はＮｏｔｃｈアゴニストを更に含む。
【００１２】
いずれの方法においても、いくつかの実施態様では、上皮幹細胞及び／又は上皮組織断片は、胃腸幹細胞及び／又は胃腸組織断片である。いくつかの実施態様では、胃腸幹細胞及び／又は胃腸組織断片は、小腸幹細胞及び／又は小腸組織断片である。
【００１３】
更に本明細書においては、本明細書において記載される方法により獲得可能な陰窩、及び薬物スクリーニング、毒性アッセイ、又は再生医療における陰窩の使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ａ：Ｌｇｒ５ＤＴＲＥＧＦＰマウスから得られたオルガノイドが、陰窩様構造内において膜ＧＦＰ（Ｌｇｒ５陽性幹細胞）及びリゾチーム染色（パネート細胞、矢印）を呈している。Ｂ：光学的断面である。
【図２】Ｌｇｒ５  ＤＴＲＥＧＦＰマウスから得られたオルガノイドが、ジフテリア毒素（ＤＴ）の存在下（Ｂ、Ｂ−１、Ｄ）又は非存在下（Ａ、Ａ−１、Ｃ）において１０日間培養された。陰窩様構造及びリゾチーム陽性細胞は、ＤＴ処理したオルガノイド内で保存される（Ｂ、Ｂ−１）。オルガノイドはＤＴの存在下において増殖を続けた（Ｄ）。
【図３】Ｌｇｒ５ＤＴＲＥＧＦＰマウスから得られたオルガノイドが、種々の濃度のマトリゲル中で培養された。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
Ｉ．定義
本明細書では、用語「ポリプチド」は、天然配列ポリペプチド、ポリペプチド変異体並びに天然配列ポリペプチド及びポリペプチド変異体の断片を指す（本明細書において更に定義づける）。本明細書に記載されるポリペプチドは、例えばヒト組織型から又は別の供給源からなど、様々な供給源から単離することができ、又は組換え又は合成法により調製することができる。
【００１６】
「天然配列ポリペプチド」は、天然由来の対応するポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００１７】
「ポリペプチド変異体」、又はその変形は、本明細書に開示される天然配列ポリペプチド配列のいずれかと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有すると本明細書で定義されるポリペプチド、通常は活性ポリペプチドを意味する。このようなポリペプチド変異体は、例えば、天然アミノ酸配列のＮ又はＣ末端において、一又は複数のアミノ酸残基が付加されている又は欠失しているポリペプチドを含む。通常、ポリペプチド変異体は、本明細書に開示される天然配列ポリペプチド配列と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する。通常、変異ポリペプチドの長さは、少なくとも約１０個のアミノ酸、或いは、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００個のアミノ酸かそれ以上である。場合により、変異体ポリペプチドは、天然ポリペプチド配列と比較して一以下の保存的なアミノ酸置換、或いは、天然ポリペプチド配列と比較して、約２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０以下の保存的なアミノ酸置換を有する。
【００１８】
「単離された」とは、その自然環境の成分から分離された、ポリペプチド、抗体、核酸などに言及するものである。抗体のいくつかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるとき、９５％又は９９％を上回る純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
【００１９】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定しないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００２０】
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のための配列比較は、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用する、当業者の技量の範囲にある種々の方法で達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。また、ＡＬＩＧＮ−２は、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であるか、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
【００２１】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、所与のアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対しての％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
１００  ×  分率Ｘ／Ｙ
ここで、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、そのプログラムのＡとＢとの配列比較において、完全一致を記録したアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したようにして得られる。
【００２２】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者であれば容易に決定することができ、通常はプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に基づく経験的計算である。通常、プローブが長いほど、適切なアニーリングに高い温度が必要であり、プローブが短い程温度は低くてよい。ハイブリダイゼーションは、通常、変性ＤＮＡの、相補鎖がその溶解温度未満の環境中に存在するときに再アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能配列との間の所望の相同性度が高い程、使用可能な相対温度が高くなる。結果として、相対温度が高い程反応条件のストリンジェンシーが高まる傾向があり、低い程その傾向が小さくなる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明については、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照されたい。
【００２３】
本明細書に定義される「ストリンジェントな条件」又は「高ストリンジェンシー条件」は、以下のように指定される。（１）洗浄に、低いイオン強度と高い温度、例えば、５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いること；（２）ハイブリダイゼーション中に、４２℃で、ホルムアミドのような変性剤、例えば、０．１％のウシ血清アルブミンを含む５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド／０．１％のフィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）を用いること；又は（３）５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波分解したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、及び１０％デキストラン硫酸塩を用いた４２℃の溶液中において一晩ハイブリダイズし、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中において４２℃で１０分間洗浄した後、５５℃でＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる高ストリンシー洗浄を１０分間行うこと。
【００２４】
「中程度にストリンジェントな条件」は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989によって記載されているように指定することができ、上述したものよりストリンジェンシーの低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度にストリンジェントな条件の例は、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０ｍｇ／ｍｌの変性せん断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中において３７℃で一晩インキュベートした後、約３７〜５０℃の１×ＳＳＣでフィルタを洗浄することである。当業者であれば、プローブ長などの要因に適合させるために必要な温度、イオン強度などの調節方法を認識するであろう。
【００２５】
「組織試料」又は「組織断片」は、被験体又は個体の組織から得られた類似の細胞の集合を意味する。組織試料又は組織断片の供給源は、新鮮な、冷凍の、及び／又は保存された器官、組織試料、生検、及び／又は吸引物由来の固体組織；血液又は血漿のような何らかの血液成分；脳脊髄液、羊水、腹水、又は間質液のような体液；被験体の妊娠又は発育の任意の時期に由来する細胞とすることができる。組織試料又は組織断片は、初代若しくは培養細胞又は細胞株でもよい。任意選択的に、組織試料又は組織断片は疾患組織／器官から得られる。組織試料は、本質的に組織と自然に混在しない化合物、例えば、防腐剤、抗凝血剤、緩衝剤、定着剤、栄養剤、抗生物質などを含む場合がある。
【００２６】
本明細書で使用される「基準試料」、「基準細胞」、「基準組織」、「コントロール試料」、「コントロール細胞」、又は「コントロール組織」は、比較を目的として使用される試料、細胞、組織、標準、又はレベルを指す。一実施態様では、基準試料、基準細胞、基準組織、コントロール試料、コントロール細胞、又はコントロール組織は、同じ被験体又は個体の身体（例えば、組織又は細胞）の健常な及び／又は非疾患性の部分から得られる。例えば、健常な及び／又は非疾患性の細胞又は組織は、疾患細胞又は組織に隣接している（例えば、腫瘍に隣接する細胞又は組織）。別の実施態様では、基準試料は同じ被験体又は個体の身体の未処理組織及び／又は細胞から得られる。また別の実施態様では、基準試料、基準細胞、基準組織、コントロール試料、コントロール細胞、又はコントロール組織は、被験体又は個体ではない個体の身体（例えば、組織又は細胞）の、健常な及び／又は非疾患性の部分から得られる。さらに別の実施態様では、基準試料、基準細胞、基準組織、コントロール試料、コントロール細胞、又はコントロール組織は、被験体又は個体ではない個体の身体の未処理組織及び／又は細胞から得られる。
【００２７】
本明細書で用いられる用語「実質的に同じ」は、当業者が、二つの値の間の差異が、その値（例えばＫｄ値又は阻害）によって測定される生物学的特性という文脈において、殆ど又は全く生物学的及び／又は統計学的有意性を持たないと考慮するために、二つの数値間の類似性が十分に高いことを指す。このような二つの値の間の差異は、基準／比較値に応じて、例えば約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、及び／又は約１０％未満である。
【００２８】
本明細書で用いられる表現「実質的に異なる」は、当業者が、二つの値の間の差異が、その値（例えばＫｄ値又は阻害）によって測定される生物学的特性という文脈において、統計学的有意性を持つと考慮するために、二つの数値間の差異が十分に大きいことを指す。前記二つの値の間の差異は、参照／比較分子の値に応じて、例えば約１０％より大きい、約２０％より大きい、約３０％より大きい、４０％より大きい、及び／又は約５０％より大きい。
【００２９】
薬剤の「有効量」とは、所望の治療的又は予防的結果を達成するために必要な用量及び期間において効な量を指す。
【００３０】
「患者」、「個体」、又は「被験体」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、並びにげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特定の実施態様において、患者、個体又は被検体はヒトである。
【００３１】
「低減する又は阻害する」とは、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の全体的減少を引き起こす能力を意味する。低減する又は阻害するとは、治療する疾患の症状、転移の存在又は大きさ、又は原発腫瘍の大きさに言及することができる。
【００３２】
当業者によって理解されるように、本明細書において値又はパラメータ「について」という場合、その値又はパラメータ自体を対象とする実施態様を含む（記載する）。例えば、「Ｘについて」との記載には「Ｘ」の記載が含まれる。
【００３３】
本明細書に記載される本発明の態様及び実施態様は、態様及び実施態様「からなる」及び／又は「から本質的になる」ことを含む。本明細書で使用されるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に指示がない限り、複数への言及を含む。
【００３４】
ＩＩ．方法及び使用
本明細書では、幹細胞を液体培養するための方法が提供される。本明細書では、未分化表現型及び自己保全能力を保持する幹細胞の存在を保存しながら、上皮幹細胞、及び上皮幹細胞を含む小腸、結腸、胃及び膵臓由来の単離された断片を液体中において培養する方法が提供される。例えば、本明細書に記載される方法により培養された単離された陰窩は、繊毛様上皮が並ぶ中央内腔を含む、陰窩−繊毛オルガノイドへと発達する。得られたオルガノイドは、複数回の陰窩分裂事象を生じる。驚くべきことに、本明細書に提供される方法は、低レベルの細胞外マトリックスの存在下での液体培養物において、単一の、単離された上皮幹細胞が陰窩−繊毛オルガノイドへ成長することを可能にする。胃の幽門部由来の単離された胃断片は、腸陰窩オルガノイドとしてふるまった。即ち、単位の開放上部はシールされ、内腔はアポトーシス細胞で満たされ、オルガノイドには連続的な発芽事象が生じた（腺分裂によく似た）と同時に、低レベルの細胞外マトリックス中の中央内腔においてそれらの極性は維持された。
【００３５】
特に、本明細書では、（ａ）上皮幹細胞及び／又は（ｂ）上皮幹細胞を含む単離された上皮組織断片を液体培養する方法であって、上皮幹細胞及び／又は単離された組織断片を、（ｉ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤、（ｉｉ）分裂促進増殖因子、（ｉｉｉ）Ｗｎｔアゴニスト、及び（ｉｖ）少なくとも約４％（ｗ／ｖ）の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を加えた、動物又はヒト細胞のための基礎培地を含む液体細胞培養物中において培養することを含む方法が提供される。更に、本明細書では、陰窩を獲得する及び／又は増殖させる方法であって、上皮幹細胞及び／又は単離された組織断片を、（ｉ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤、（ｉｉ）分裂促進増殖因子、（ｉｉｉ）Ｗｎｔアゴニスト、及び（ｉｖ）少なくとも約４％（ｗ／ｖ）の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を加えた、動物又はヒト細胞のための基礎培地を含む液体細胞培養物中において培養することを含む方法が提供される。
【００３６】
幹細胞は、動物成体の多数の器官に見られるもので、未分化の表現型を保持しており、それらの子孫は関連の組織中に存在するすべての系統へと分化することができ、それらは生涯にわたって自己保全能を保持し、且つ傷ついた幹細胞が特定の位置、即ち幹細胞ニッチに存在した後で関連の組織を再生することができ、これは、幹細胞集団の維持のための細胞間接触及びシグナルを供給する。
【００３７】
上皮幹細胞は、上皮を構成する個別の細胞型を形成することができる。皮膚又は腸といったいくつかの上皮の細胞代謝回転は速く、これは存在する幹細胞が連続的に増殖していなければならないことを示す。肝臓又は膵臓といった他の上皮の代謝回転は、通常の状態では極めて遅い。陰窩は、十二指腸と、空腸、回腸、及び結腸を含む小腸及び大腸、及び胃の幽門部から、当業者に既知の手順により単離することができる。例えば、陰窩は、基底膜及び間質細胞型とのカルシウム依存性及びマグネシウム依存性の相互作用から細胞を解放するキレート剤と共になされた、単離された組織のインキュベーションにより単離することができる。組織の洗浄後、上皮細胞層を、ガラススライドを用いて粘膜下層から掻き取ってすり潰す。この後、トリプシン、更に好ましくはＥＤＴＡ及び／又はＥＧＴＡ中でのインキュベーションと、陰窩からの、例えば濾過及び／又は遠心分離工程を用いた未消化組織断片及び単独細胞の分離とを行う。コラゲナーゼ及び／又はディスパーゼＩといった他のタンパク質分解酵素を、トリプシンの代わりに使用することができる。同様の方法が、膵臓及び胃の断片を単離するために使用される。
【００３８】
上皮組織から幹細胞を単離する方法は、当該技術分野で既知である。いくつかの実施態様では、方法は、大きなＧプロテイン共役受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーに属するＬｇｒ５及び／又はＬｇｒ６を表面上に発現する幹細胞を単離することを含む。いくつかの実施態様では、方法は、上皮組織から細胞懸濁液を調製すること、細胞懸濁液にＬｇｒ５及び／又は６結合化合物を接触させること、Ｌｇｒ５及び／又は６結合化合物を単離すること、及び結合化合物から幹細胞を単離することを含む。いくつかの実施態様では、上皮幹細胞を含む単一細胞の懸濁液は、単離された陰窩から機械的に生成される。
【００３９】
いくつかの実施態様では、Ｌｇｒ５及び／又は６結合化合物は、抗体、例えばＬｇｒ５又はＬｇｒ６の細胞外ドメインを特異的に認識して結合するモノクローナル抗体、例えばマウス及びラットのモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体を含む。このような抗体を使用して、Ｌｇｒ５及び／又はＬｇｒ６発現幹細胞は、例えば磁気ビーズを援用して又は蛍光活性化細胞分類により単離することができる。いくつかの実施態様では、上皮幹細胞は、陰窩、胃又は膵臓の断片から単離される。例えば、上皮幹細胞は、腸から単離された陰窩から単離される。いくつかの実施態様では、上皮幹細胞は、十二指腸、空調、及び回腸を含む小腸、膵臓又は胃から単離される。
【００４０】
いずれの方法においても、いくつかの実施態様では、上皮幹細胞及び／又は上皮組織断片は、胃腸幹細胞及び／又は胃腸組織断片である。いくつかの実施態様では、胃腸幹細胞及び／又は胃腸組織断片は、小腸幹細胞及び／又は小腸組織断片である。
【００４１】
細胞のニッチは、部分的には、幹細胞と周囲細胞、及びニッチ内の細胞によって生成される細胞外マトリックス（ＥＣＭ）によって決定される。いくつかの実施態様では、単離された陰窩又は上皮幹細胞はＥＣＭに付着させる。ＥＣＭは、様々な多糖類、水、エラスチン、及び糖タンパク質からなり、糖タンパク質は、コラーゲン、エンタクチン（ナイドジェン）、フィブロネクチン、及びラミニンを含む。ＥＣＭは、接続組織細胞により分泌される。複数の異なる種類のＥＣＭが既知であり、それには異なる種類の糖タンパク質及び／又は糖タンパク質の異なる組み合わせを含む異なる組成物が含まれる。ＥＣＭは、例えば繊維芽細胞といったＥＣＭ生成細胞を容器内で生成した後、これらの細胞を除去し、単離された陰窩又は上皮幹細胞を加えることにより提供される。細胞外マトリックス生成細胞の例は、主にコラーゲン及びプロテオグリカンを生成する軟骨細胞、主にＩＶ型コラーゲン、ラミニン、間質性プロコラーゲンを生成する繊維芽細胞、並びに主にコラーゲン（Ｉ、ＩＩＩ、及びＶ型）、コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、及びテネイシンＣを生成する結腸筋繊維芽細胞である。代替的に、ＥＣＭは市販のものが提供される。市販の細胞外マトリックスの例は、細胞外マトリックスタンパク質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＭａｔｒｉｇｅｌTM（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。
【００４２】
いくつかの実施態様では、ＥＣＭは、二つの異なる種類のコラーゲン又は一つのコラーゲン及びラミニンといった少なくとも二つの別個の糖タンパク質を含む。ＥＣＭは、合成ハイドロゲル細胞外マトリックス又は天然に存在するＥＣＭとすることができる。最も好ましいＥＣＭは、ＭａｔｒｉｇｅｌTM（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって提供されるもので、ラミニン、エンタクチン、及びコラーゲンＩＶを含んでいる。
【００４３】
いずれの方法においても、いくつかの実施態様では、ＥＣＭは増殖因子低減ＥＣＭである。いくつかの実施態様では、ＥＣＭはマトリゲルである。
【００４４】
いずれの方法においても、いくつかの実施態様では、ＥＣＭの濃度は、液体細胞培養物中約４％〜約１０％、約４％〜約５％、及び／又は約４％〜約１５％（ｗ／ｖ）のいずれかである。いくつかの実施態様では、ＥＣＭの濃度は、約４％、５％、６％、７％、８％、９％、及び／又は１０％のいずれかを上回っており、且つ約２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、及び／又は１０％のいずれかを下回っている。いくつかの実施態様では、ＥＣＭの濃度は、約４％、５％、６％、７％、８％、９％、及び／又は１０％のいずれかである。
【００４５】
本明細書に記載される方法において使用される細胞培地は、あらゆる細胞培地を含むことができる。いくつかの実施態様では、細胞培地は、炭酸塩ベースのバッファーでｐＨ７．４（例えば、７．２〜７．６又は７．２以上７．６以下）にバッファーリングされた限定合成培地であり、細胞は、５％〜１０％のＣＯ２、又は５％以上１０％以下のＣＯ２、好ましくは５％のＣＯ２を含む雰囲気下で培養される。いくつかの実施態様では、細胞培地は、グルタミン、インスリン、ペニシリン／ストレプトマイシン及びトランスフェリンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２及びＲＰＭＩ１６４０から選択される。いくつかの実施態様では、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＡｄｖａｎｃｅｄ  ＲＰＭＩが使用される。このような培地は血清を加えない培養物のために最適化されており、既にインスリンを含んでいる。この場合、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＡｄｖａｎｃｅｄ  ＲＰＭＩ培地には、好ましくはグルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンが補充される。いくつかの実施態様では、細胞培地には、精製された、天然の、半合成の、及び／又は合成の増殖因子が補充され、ウシ胎児血清又はウシ胎子血清といった非限定成分が含まれない。例えば、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｎ−アセチルシステイン（Ｓｉｇｍａ）及びＮ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）といった補充物は、いくつかの細胞の増殖を刺激するもので、培地に更に加えることができる。
【００４６】
いくつかの実施態様では、基本培地はＢＭＰ阻害剤を含む。ＢＭＰは二量体のリガンドとして、二つの異なる受容体セリン／トレオニンキナーゼ、Ｉ型及びＩＩ型受容体からなる受容体複合体に結合する。ＩＩ型受容体はＩ型受容体をリン酸化し、その結果この受容体キナーゼの活性化を引き起こす。Ｉ型受容体は、続いて特異的受容体基質（ＳＭＡＤ）をリン酸化し、その結果転写活性につながるシグナル伝達経路をもたらす。
【００４７】
いくつかの実施態様では、ＢＭＰ阻害剤は、ＢＭＰ分子に結合し、例えばＢＭＰ分子のＢＭＰ受容体への結合を防止又は阻害することにより、ＢＭＰ活性が中和された複合体を形成する薬剤である。代替的には、阻害剤は、アンタゴニスト又はリバースアゴニストとして作用する薬剤である。この種の阻害剤は、ＢＭＰ受容体と結合し、受容体に対するＢＭＰの結合を防止する。前記薬剤の一例は、ＢＭＰ受容体に結合し、抗体結合受容体に対するＢＭＰの結合を防止する抗体である。
【００４８】
複数のクラスの天然のＢＭＰ結合タンパク質が既知であり、これには、ノギン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、コーディン及びコーディンドメインを含むコーディン様タンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｔｅｍｓ）、フォリスタチン及びフォリスタチンドメインを含むフォリスタチン関連タンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｔｅｍｓ）、ＤＡＮ及びＤＡＮシステインノットドメインを含むＤＡＮ様タンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｔｅｍｓ）、スクレロスチン／ＳＯＳＴ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｔｅｍｓ）、デコリン（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｔｅｍｓ）、及びアルファ−２マクログロブリン（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｔｅｍｓ）が含まれる。いくつかの実施態様では、ＢＭＰ阻害剤は、ノギン、ＤＡＮ、及びケルベロス及びグレムリンを含むＤＡＮ様タンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｔｅｍｓ）から選択される。いくつかの実施態様では、ＢＭＰ阻害剤はノギンである。いくつかの実施態様では、拡散性タンパク質は、様々な程度の親和性でＢＭＰリガンドに結合して、シグナル伝達受容体に対するＢＭＰリガンドの到達を阻害することができる。これらＢＭＰ阻害剤のいずれかを基本培地に添加することにより、添加しない場合には培養の約２〜３週間後に生じる幹細胞の損失が防止される。
【００４９】
いくつかの実施態様では、ＢＭＰ阻害剤は、細胞中のＢＭＰ依存性活性を、阻害剤の非存在下におけるＢＭＰ活性のレベルの、９０％以下、８０％以下、７０％以下、５０％以下、３０％以下、１０％以下、又は０％に抑制する。いくつかの実施態様では、ＢＭＰ活性は、例えばZilberberg et al , 2007 BMC Cell Biol 8:41に例示されているように、ＢＭＰの転写活性を測定することにより決定することができる。
【００５０】
いくつかの実施態様では、ＢＭＰ阻害剤の液体セル中の濃度は、約５〜５００ｎｇ／ｍＬ、５〜２５０ｎｇ／ｍＬ、２５〜１５０ｎｇ／ｍＬ、及び５０〜１００ｎｇ／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施態様では、基本細胞培養物中のＢＭＰ阻害剤の濃度は、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌのいずれかである。いくつかの実施態様では、ＢＭＰ阻害剤の濃度は約１００ｎｇ／ｍｌである。幹細胞の培養中、ＢＭＰ阻害剤は、好ましくは二日毎に培地に添加され、培地は好ましくは四日ごとに取り替えられる。いくつかの実施態様では、ＢＭＰ阻害剤はノギンである。
【００５１】
いずれの方法においても、いくつかの実施態様では、Ｗｎｔアゴニストが基本培地に添加される。Ｗｎｔシグナル伝達経路は、Ｗｎｔタンパク質がＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体のファミリーメンバーの細胞表面受容体に結合するときに起こる一連の事象により規定される。これにより、アキシン、ＧＳＫ−３、及びタンパク質ＡＰＣを含むタンパク質の複合体を阻害するディシブルドファミリータンパク質が活性化され、細胞内β−カテニンが分解される。その結果得られる濃縮核β−カテニンは、ＴＣＦ／ＬＥＦファミリー転写因子による転写を増強する。いくつかの実施態様では、Ｗｎｔアゴニストは、細胞内のＴＣＦ／ＬＥＦ媒介性転写を活性化する薬剤とすることができる。したがって、Ｗｎｔアゴニストは、Ｗｎｔファミリータンパク質のすべてを含むＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体ファミリーメンバーに結合して活性化させる真性のＷｎｔアゴニスト、細胞内β−カテニン分解の阻害剤、及びＴＣＦ／ＬＥＦの活性化因子から選択される。
【００５２】
Ｗｎｔアゴニストは分泌性糖タンパク質を含み、これには、限定されないが、Ｗｎｔ−１／Ｉｎｔ−１、Ｗｎｔ−２／Ｉｒｐ（例えば、ＩｎＭ関連Ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｗｎｔ−２ｂ／１３、Ｗｎｔ−３／Ｉｎｔ−４、Ｗｎｔ−３ａ（例えば、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｔｅｍｓ）、Ｗｎｔ−４、Ｗｎｔ−５ａ、Ｗｎｔ−５ｂ、Ｗｎｔ−６（例えば、Kirikoshi H et al. (2001) Biochem Biophys Res Com 283:798-805）、Ｗｎｔ−７ａ（例えば、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｔｅｍｓ）、Ｗｎｔ−７ｂ、Ｗｎｔ−８ａ／８ｄ、Ｗｎｔ−８ｂ、Ｗｎｔ−９ａ／１４、Ｗｎｔ−９ｂ／１４ｂ／１５、Ｗｎｔ−１０ａ、Ｗｎｔ−１０ｂ／１２、ＷｎＭ１、及び／又はＷｎｔ−１６が含まれる。ヒトＷｎｔタンパク質の総説は、「ＴＨＥ  ＷＮＴ  ＦＡＭＩＬＹ  ＯＦ  ＳＥＣＲＥＴＥＤ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ」（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社カタログ、２００４）に提供されている。いくつかの実施態様では、Ｗｎｔアゴニストは、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１−４、Ｎｏｒｒｉｎ、及び／又はＧＳＫ阻害剤である。
【００５３】
いくつかの実施態様では、ＷｎｔアゴニストはＲ−ｓｐｏｄｉｎポリペプチドである。分泌タンパク質のＲ−ｓｐｏｎｄｉｎファミリーは、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化及び調節に関与しており、４つのメンバー（Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１（例えば、ＮＵ２０６、Ｎｕｖｅｌｏ、Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ２（例えば、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｔｅｍｓ）、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ３、及びＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ−４）を含む。
【００５４】
いくつかの実施態様では、ＷｎｔアゴニストはＮｏｒｒｉｎ（Ｎｏｍｅ疾患タンパク質又はＮＤＰとも呼ばれる）（例えば、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｔｅｍｓ））であり、これは、高い親和性でＦｒｉｚｚｌｅｄ−４受容体に結合してＷｎｔシグナル伝達経路の活性化を誘導するという点でＷｎｔタンパク質のように機能する分泌調節タンパク質である（Kestutis Planutis et al. (2007) BMC Cell Biol 8:12）。Ｗｎｔシグナル伝達経路の小分子アゴニストは、アミノピリミジン誘導体であり、最近同定されたもので、やはりＷｎｔアゴニストとして含まれることを明示する（Lin et al. (2005) Angew Chem Int Ed Engl 44:1987-90）。
【００５５】
いくつかの実施態様では、ＷｎｔアゴニストはＧＳＫ阻害剤である。ＧＳＫ阻害剤の例には、限定されないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、例えば、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、リチウム（例えば、Ｓｉｇｍａ）、ケンパウロン（Ｂｉｏｍｏｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Leost et al. (2000) Eur J Biochem 267, 5983-5994）、６−ブロモインジルビン−３０−アセトキシム（Meyer et al. (2003) Chem Biol 10, 1255-1266）、ＳＢ２１６７６３及びＳＢ４１５２８６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、並びにＧＳＫ−３のアキシンとの相互作用を防止するＦＲＡＴ−ファミリーメンバー及びＦＲＡＴ由来ペプチド（Meijer et al. (2004) Trends in Pharma. Sci. 25, 471-480）が含まれる。これらはここで参照することにより本明細書に包含される。ＧＳＫ−３阻害のレベルを決定するための方法及びアッセイは、当業者には既知であり、例えば、Liao et al. (2004) Endocrinology, 145(6) 2941-9に記載の方法及びアッセイを含む。
【００５６】
いくつかの実施態様では、Ｗｎｔアゴニストは、細胞中のＷｎｔ活性を、分子の非存在下におけるＷｎｔ活性のレベルの、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％刺激する。当業者には既知であるように、Ｗｎｔ活性は、Ｗｎｔの転写活性を、例えばｐＴＯＰＦＬＡＳＨ及びｐＦＯＰＦＬＡＳＨ  Ｔｃｆルシフェラーゼレポーターコンストラクト（Korinek et al. (1997) Science 275 1784-1787）により測定することによって決定することができる。
【００５７】
いくつかの実施態様では、Ｗｎｔアゴニストの濃度は、液体細胞培養物中、約５００ｎｇ／ｍＬ〜５μｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍＬ〜５μｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ〜約１．５μｇ／ｍＬのいずれか（例えば、約５００〜約１５００ｎｇ／ｍＬ）である。いくつかの実施態様では、Ｗｎｔアゴニストは、濃度少なくとも約５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、７５０ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、１２５０ｎｇ／ｍＬ、及び／又は１５００ｎｇ／ｍＬのいずれかで基本培地に添加される。いくつかの実施態様では、Ｗｎｔアゴニストの濃度は約５００ｎｇ／ｍｌである。幹細胞の培養期間中、Ｗｎｔアゴニストは、好ましくは、二日毎に培地に添加され、培地は、好ましくは、四日毎に取り替えられる。いくつかの実施態様では、ＷｎｔアゴニストはＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１を含む、又はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１からなる。いくつかの実施態様では、ＷｎｔアゴニストはＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２を含む、又はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ２からなる。いくつかの実施態様では、ＷｎｔアゴニストはＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ３を含む、又はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ３からなる。いくつかの実施態様では、ＷｎｔアゴニストはＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ４を含む、又はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ４からなる。
【００５８】
いくつかの実施態様では、Ｗｎｔアゴニストは、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ、Ｗｎｔ−３ａ及びＷｎｔ−６からなる群より選択される。いくつかの実施態様では、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ及びＷｎｔ−３ａの両方がＷｎｔアゴニストとして使用される。いくつかの実施態様では、濃度は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎについては約５００ｎｇ／ｍｌであり、Ｗｎｔ３ａについては約１００ｎｇ／ｍｌである。
【００５９】
いくつかの実施態様では、基本培地は分裂促進増殖因子である。マイトジェン増殖因子の例には、限定されないが、上皮増殖因子（ＥＧＦ、例えば、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α、例えば、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、塩基性繊維芽増殖因子（ｂＦＧＦ、例えば、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、及びケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）が含まれる。ＥＧＦは、様々な培養外胚葉及び中胚葉細胞の強力な分裂促進因子であり、インビボ及びインビトロでの特定の細胞の分化と、細胞培養物中における一部の繊維芽細胞の分化に対する大きな効果を有している。ＥＧＦ前駆体は、タンパク質分解により切断されて、細胞を刺激する５３アミノ酸ペプチドホルモンを生成する膜結合分子として存在する。
【００６０】
いくつかの実施態様では、分裂促進増殖因子は、５〜５００ｎｇ／ｍｌ又は５以上５００ｎｇ／ｍｌ以下の濃度で基本培地に添加される。いくつかの実施態様では、濃度は、約５、１０、２０、２５、３０、４０、４５、又は５０ｎｇ／ｍＬ以上、約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、又は１００ｎｇ／ｍＬ以下である。いくつかの実施態様では、分裂促進増殖因子の濃度は約５０以上約１００ｎｇ／ｍｌ以下である。いくつかの実施態様では、濃度は約５０ｎｇ／ｍｌである。いくつかの実施態様では、分裂促進増殖因子はＥＧＦである。いくつかの実施態様では、分裂促進増殖因子はｂＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ１０又はＦＧＦ７）である。いくつかの実施態様では、ＦＧＦ７及び／又はＦＧＦ１０が使用される。ＦＧＦ７もＫＧＦ（ケラチノサイト増殖因子）として知られている。何らかの実施態様では、例えば、ＥＧＦとＫＧＦ、又はＥＧＦとＢＤＮＦといった分裂促進増殖因子の組合せが基本培地に添加される。いくつかの実施態様では、例えば、ＥＧＦとＫＧＦ、又はＥＧＦとＦＧＦ１０といった分裂促進増殖因子の組合せが、基本培地に添加される。複数の分裂促進増殖因子、例えばＦＧＦ７とＦＧＦ１０が使用される場合も、分裂促進増殖因子の濃度は上述の通りであり、分裂促進増殖因子の走濃度を指す。いくつかの実施態様では、幹細胞の培養期間中、分裂促進増殖因子は二日毎に培地に添加され、培地は四日毎に取り替えられる。を指す。いくつかの実施態様では、幹細胞の培養期間中、分裂促進増殖因子は二日毎に培地に添加され、培地は四日毎に取り替えられる。ｂＦＧＦファミリーのいずれのメンバーを使用してもよい。
【００６１】
いくつかの実施態様では、培地はＲｏｃｋ（Ｒｈｏ−キナーゼ）阻害剤を含む。Ｒｏｃｋ阻害剤の添加により、特に単独幹細胞の培養時にアノイキスが防止されることが分かった。Ｒｏｃｋ阻害剤は、好ましくは、（Ｒ）−（＋）−トランス−４−（  ｌ−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩一水和物（Ｙ−２７６３２、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、５−（  ｌ  ，４−ジアセパン−ｌ−イルスルホニル）イソキノリン（ファスジル又はＨＡ１０７７、例えば、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、及び（Ｓ）−（＋）−２−メチル−ｌ−［（４−メチル−５−イソキノリニル）スルホニル］−ヘキサヒドロ−ｌ  Ｈ−ｌ，４−ジアゼピン二塩酸塩（Ｈ−１  １５２、例えば、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｈｉｅｎｃｅ）から選択される。Ｒｈｏ−キナーゼ阻害剤、例えば、Ｙ−２７６３２は、幹細胞培養の最初の七日間の間、二日ごとに培地に添加される。いくつかの実施態様では、Ｙ２７６３２の濃度は１０ＤＭである。
【００６２】
いくつかの実施態様では、培地はＮｏｔｃｈアゴニストを含む。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、細胞運命決定において、並びに細胞の生存及び増殖において、重要な役割を果たすことが示されている。Ｎｏｔｃｈ受容体タンパク質は、限定しないが、Ｄｅｌｔａ１、Ｊａｇｇｅｄ１及び２、並びにＤｅｌｔａ様１、Ｄｅｌｔａ様３、Ｄｅｌｔａ様４を含む、複数の表面結合又は分泌リガンドと相互作用することができる。リガンド結合時、Ｎｏｔｃｈ受容体は、ＡＤＡＭプロテアーゼファミリーのメンバーに関与する一連の切断事象、並びにγセクレターゼペニシリンにより調節された膜内切断によって活性化される。結果として、Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメインが核へ転位置し、そこで転写により下流の遺伝子を活性化する。いくつかの実施態様では、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、Ｊａｇｇｅｄ１及びＤｅｌｔａ１、又はその活性断片若しくは誘導体から選択される。いくつかの実施態様では、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、配列ＣＤＤＹＹＹＧＦＧＣＮＫＦＣＲＰＲを含むＤＳＬペプチドである（Dontu et al., 2004. Breast がん Res 6:R605-R615）。ＤＳＬペプチド（ＡＮＡ  ｓｐｅｃ）は、好ましくは、約１０μＭ〜約１００ｎＭ、又は１０μＭ以上約１００ｎＭ以下の濃度で使用される。Ｎｏｔｃｈアゴニストの添加は、特に培養の最初の一週間の間、培養効率を２〜３倍上昇させる。いくつかの実施態様では、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、幹細胞培養の最初の七日の間、二日毎に培地に添加される。
【００６３】
いくつかの実施態様では、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、細胞内のＮｏｔｃｈ活性を、分子の非存在下におけるＮｏｔｃｈ活性のレベルの少なくとも約１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、９０％、及び／又は１００％のいずれかだけ刺激する。いくつかの実施態様では、Ｎｏｔｃｈ活性は、Ｎｏｔｃｈの転写活性を、例えば文献（Hsieh et al. ( 1996) Cell. Biol. 16:952-959）に記載の４ｘｗｔＣＢＦｌ−ルシフェラーゼレポーターコンストラクトによって測定することにより決定することができる。
【００６４】
いずれの方法も、いくつかの実施態様では、懸滴で培養することを含む。いくつかの実施態様では、方法は、従来式の懸滴で培養することを含む。いくつかの実施態様では、方法は、中空球懸滴で培養することを含む（Lee et al. Tissue Engineering 15(00) (2009)）。いずれの方法も、いくつかの実施態様では、スキャフォールドフリー環境で培養することを含む。いくつかの実施態様では、方法は、懸滴プレートで培養することを含む（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０３０６１２２号及び／又はＥＰ２３４２３１７に記載されており、これら文献は参照によりその全体が本明細書に包含される）。
【００６５】
いくつかの実施態様では、上皮幹細胞は、膵臓、胃、腸、及び／又は結腸の上皮幹細胞である。いくつかの実施態様では、上皮幹細胞は、小腸の上皮幹細胞である。いくつかの実施態様では、上皮幹細胞は、胚性幹細胞を含まない。いくつかの実施態様では、上皮幹細胞は、成体の幹細胞を含む。いくつかの実施態様では、小腸、結腸、及び胃由来の単独保存上皮幹細胞は、これらの三次元オルガノイドを液体培養物中において生じさせることができる。
【００６６】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の液体培養法は、すべての分化細胞型が存在する繊毛様上皮ドメインを同時に生成しながら、単独の陰窩に複数の陰窩分裂事象が起こる長期培養条件の確立を可能にする。いくつかの実施態様では、培養された陰窩には、培養物に入れられた後で劇的な形態変化が生じる。いくつかの実施態様では、新しく単離された陰窩の上部開口は塞がれ、この領域は徐々に外側へと膨らんでアポトーシス細胞で満たされ、絨毛先端においてアポトーシス細胞がちぎれるようになる。いくつかの実施態様では、陰窩領域は、陰窩分裂を思わせるプロセスである、さらなる陰窩を生じる連続的出芽事象を生じることが発見された。いくつかの実施態様では、陰窩様拡張は、増殖細胞、パネート細胞、腸細胞及び杯細胞を含むすべての分化上皮細胞型を含む。いくつかの実施態様では、筋繊維芽細胞又は他の非上皮細胞は、いずれの段階においてもオルガノイド中において検出不能である。
【００６７】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の液体培養法は、オルガノイドを生み出す出芽陰窩構造の拡大を可能にし、このオルガノイドは、繊毛様上皮が並び、アポトーシス細胞体で満たされた中央の内腔を囲む＞４０の陰窩様構造を含む。いくつかの実施態様では、陰窩−繊毛オルガノイドは、繊毛様上皮の並ぶ中央内腔を含む。いくつかの実施態様では、内腔は、連続した時間間隔で開口し、その中身を培地中に放出する。いくつかの実施態様では、液体培養法は、少なくとも七か月、少なくとも八か月、少なくとも九か月、少なくとも十か月の培養期間を可能にする。いくつかの実施態様では、オルガノイドは、その基本的特性を失うことなく、少なくとも６か月間培養物中に継代培養及び維持することができる。いくつかの実施態様では、継代培養は、オルガノイドの手作業による断片化を伴う及び／又は必要とする。
【００６８】
したがって、一態様では、本発明は、本明細書に記載の培地中において上皮幹細胞又は単離された陰窩を培養することにより得られた、繊毛様上皮の並ぶ中央内腔を含む陰窩−繊毛オルガノイド、及び／又は本明細書に記載の方法を用いて獲得可能な陰窩−繊毛オルガノイドを提供する。いくつかの実施態様では、オルガノイドは胃のオルガノイドである。
【００６９】
ハイスループットを目的として、陰窩−繊毛オルガノイドは、例えば、９６ウェルプレート又は３８４ウェルプレートといったマルチウェルプレート内で培養される。分子のライブラリーが、オルガノイドに影響する分子を同定するために使用される。好ましいライブラリーには、抗体断片のライブラリー、ペプチドファージディスプレイライブラリー、ペプチドライブラリー（例えば、ＬＯＰＡＰTM、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、脂質のライブラリー（ＢｉｏＭｏｌ）、合成化合物のライブラリー（例えば、ＬＯＰ  ＡＣTM、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）又は天然化合物のライブラリー（Ｓｐｅｃｓ、ＴｉｍＴｅｃ）が含まれる。これら遺伝子ライブラリーには、ｃＤＮＡライブラリー、アンチセンスライブラリー、及びｓｉＲＮＡ又はその他ノンコーディングＲＮＡライブラリーが含まれる。好ましくは、細胞は、複数の濃度の試験剤に特定の期間曝される。培養物は、暴露期間の最後に評価される。用語「影響する（ａｆｆｅｃｔｉｎｇ）」は細胞内のあらゆる変化を網羅し、そのような変化には、限定されないが、増殖、形態変化、及び細胞死の低減、又は消失が含まれる。陰窩−繊毛、胃又は膵臓のオルガノイドは、上皮癌細胞を特異的に標的化するが、陰窩−繊毛、胃又は膵臓のオルガノイドを標的化しない薬剤を同定するために使用することができる。
【００７０】
陰窩−繊毛オルガノイドは更に、新規薬物候補又は既知の若しくは新規の栄養補助食品の毒性アッセイにおいて、Ｃａｃｏ−２細胞といった細胞株の使用に取って代わることができる。
【００７１】
更に、陰窩−繊毛オルガノイドは、現在のところ適切な組織培養又は動物モデルを欠くノロウイルスのような病原体を培養するために使用することができる。
【００７２】
いくつかの実施態様では、遺伝子療法は更に、損傷又は疾病組織の補修を目的とする方法に使用することができる。例えば、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡのような遺伝子情報を幹細胞に送達するために、アデノウイルス又はレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルを使用することができる。当業者であれば、遺伝子療法において標的化された特定の遺伝子を置換又は修復することができる。例えば、正常な遺伝子をゲノム内部の非特異的位置に挿入して非機能性遺伝子を置き換えることができる。別の例では、相同的組換えにより、異常な遺伝子配列を正常な遺伝子配列で置き換えることができる。或いは、選択的復帰突然変異が、遺伝子をその正常機能に復帰させることができる。さらなる例は、特定の遺伝子の調節（遺伝子をオン又はオフにする程度）を変更することである。好ましくは、幹細胞は、遺伝子療法的アプローチによりエクスビボで処理された後、治療を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに移される。
【００７３】
一部では、本明細書において提供されるポリペプチドのアミノ酸配列変異体（例えば、ＢＭＰ阻害剤、Ｗｎｔアゴニストなど）が考慮される。例えば、抗体及び／又は結合ポリペプチドの、結合親和性及び／又は他の生物学的特性を向上させることが望ましい。抗体及び／又は結合ポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、抗体及び／又は結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列中に適当な修飾を導入することにより、又はペプチド合成により、調製される。このような修飾は、例えば、抗体及び／又は結合ポリペプチドのアミノ酸配列内部での残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトに到達させるために作成されうる。
【００７４】
特定の実施態様では、一又は複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体及び／又は結合ポリペプチド変異体が提供される。置換突然変異の対象となる部位は、ＨＶＲ及びＦＲを含む。保存的置換は、表１の「望ましい置換」という見出しの列に示されている。より実質的な変更が、表１の「例示的置換」という見出しの列に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体及び／又は結合ポリペプチドに導入することができ、その生成物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
【００７５】
2016512958.tif 000003
【００７６】
アミノ酸は共通の側鎖特性に従ってグループ化することができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
【００７７】
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスと交換することを必要とするであろう。
【００７８】
一つの置換変異体の型は、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体など）の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的には、さらなる研究のために選択された変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性に修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の上昇、免疫原性の低下）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に生成され得る。簡潔に言えば、一又は複数のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【００７９】
変更（例えば、置換）は、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲで行うことができる。このような変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で（例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照）、及び／又は抗原に接する残基で行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬは結合親和性について試験される。二次ライブラリーから構築し選択し直すことによる親和性成熟が、例えばHoogenboom et al. in Methods in 分子 Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発）のいずれかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーは、所望の親和性を持つ抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するするも別の方法は、複数のＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されたＨＶＲ指向のアプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、又はモデリングを用いて、特異的に同定されうる。ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的にされる。
【００８０】
特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、 そのような変更が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限りにおいて、一以上のＨＶＲ内で生じうる。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的変更（例えば本明細書において提供される保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。このような変更は、例えば、ＨＶＲ内の残基に接する抗原の外側で生じる。上記変異体ＶＨ又はＶＬ配列の特定の実施態様では、各ＨＶＲは不変であるか、又は一つ、二つ、若しくは三つを超えないアミノ酸置換を含む。
【００８１】
突然変異誘発の標的とすることができる抗体及び／又は結合ポリペプチドの残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham及びWells (1989) Science, 244:1081-1085に記載のように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又はグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）により置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入されうる。代わりに、又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされる又は排除される。変異体は、それらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされる。
【００８２】
アミノ酸配列挿入は、 一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、 並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合（例えばＡＤＥＰＴの場合）、又は抗体の血清半減期を延ばすポリペプチドへの融合を含む。
【００８３】
本明細書において引用されたすべての特許及び文献は、参照によりその全体が本明細書に包含される。
【実施例】
【００８４】
以下は本発明の方法及び組成物の実施例である。上記に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施されうる。
【００８５】
実施例１−液体培養物中におけるオルガノイド増殖
様々な器官の組織断片由来のオルガノイド培養物の増殖を実証した。後述は、オルガノイドの生物学の理解を目的とした下流でのアプリケーションの実行可能性を最大化しながら、幹細胞を含む組織断片（例えば、小腸）からのオルガノイド増殖を可能にするための技術的記述である。
【００８６】
物質及び方法
マウス
週齢６〜１２のＣＤ−１非近交系マウスを陰窩単離に使用した。
【００８７】
陰窩単離
十二指腸、空腸、及び回腸を含む小腸を、個体プレーティング実験のために単一のマウスから回収した。小腸に冷ＰＢＳを一度流し、長手方向に開いた。細胞スクレーパーを用いて繊毛構造を除去し、よって陰窩構造を希釈標準溶液に暴露した。次いで腸を約５ｍｍ片に刻み、冷たいキレート化バッファー（５．６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、９６．２ｍＭ  ＮａＣｌ、１．６ｍＭ  ＫＣｌ、４３．４ｍＭ  サッカロース、５４．９  Ｄ−ソルビトール）＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＤＬ−ジチオトレイトール中において３０分間氷上でインキュベートした。キレート化ＥＤＴＡ−ＤＴＴバッファーを除去し、組織断片を、１０−ｍＬのピペットを用いて冷たいキレート化バッファー中に勢いよく再懸濁した。溶液中における遊離陰窩の出現を、解剖顕微鏡を用いてモニタした。キレート化ＥＤＴＡ−ＤＴＴバッファー中でのインキュベーション工程及び再懸濁を、遊離陰窩の濃度が１μＬあたり陰窩１０個となるまで、通常は３サイクルにわたり、繰り返した。陰窩を含む上清を１５ｍＬの円錐管に収集し、３分間１５０〜２００ｇでペレットにとり、冷キレート化バッファーを用いて洗浄した。
【００８８】
プレーティング及び培養
キレート化バッファー中で洗浄した後、陰窩を再びペレットに取り、１μＬあたり陰窩５個の濃度で増殖培地（下記参照）に再懸濁した。次いで陰窩を、ＧｒａｖｉｔｙＰＬＵＳ  ９６ウェル懸滴プレート（ｉｎＳｐｈｅｒｏ）に１ウェルあたり４０μＬ（陰窩２００個）で蒔いた。１０ｍＬのＰＢＳをプレートの底に加えてエバポレーションを防止し、プレートを加湿インキュベーター内において３７℃、５％ＣＯ２、及び大気酸素で培養した。２日毎に、各ウェルから培地の半分を除去して新しい培地で置き換え、常に増殖に必要な因子源を確保した。
【００８９】
増殖及び分化アッセイ
培養の１０日後、プレートを、ＧｒａｖｉｔｙＰＬＵＳレシーバープレート（ＩｎＳｐｈｅｒｏ）に連結し、１５０〜２００ｇで３分間遠心分離した。培地を、多チャネルピペットを用いて除去し、オルガノイドを増殖培地＋１０μＭのＥｄＵ中において３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、オルガノイドを４％のパラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中において１５分間室温で固定した。オルガノイドを、ＰＢＳ＋３％のＢＳＡ中において２回洗浄し、次いでＰＢＳ＋０．５％のＴｒｉｏｎ  Ｘ−１００中において室温で２０分間透過処理した。透過後、オルガノイドを、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ  ＥｄＵ反応カクテル中においてインキュベートし、製造元の手順（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って処理した。オルガノイドを、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｒｉｏｎ  Ｘ−１００を用いて２回洗浄し、１：３０００のウサギ抗ヒトリゾチーム初代抗体中において一晩４℃でインキュベートした。翌日、オルガノイドを、ＰＢＳ＋０．１％のＴｒｉｏｎ  Ｘ−１００を用いて２回洗浄し、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ４８８二次内で１時間室温でインキュベートし、ＰＢＳ＋０．１％のＴｒｉｏｎ  Ｘ−１００で２回洗浄し、延長金マウント培地に載せ、Ｌｅｉｃａ  ＳＰＥ共焦点顕微鏡上で画像化した。
【００９０】
増殖培地
ペニシリン／ストレプトマイシン、１×Ｎ２（Ｇｉｂｃｏ）、１×Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭ  Ｎ−アセチルシステイン、マウスＥＧＦ  １０〜５０ｎｇ／ｍＬ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、マウスノギン５０〜１００ｎｇ／ｍＬ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、ｈＲＳＰＯ３  １μｇ／ｍＬ、及び０〜５％増殖因子低減マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を補充した改良型ＤＭＥＭ／Ｆ１２。
【００９１】
結果
一貫したオルガノイドの増殖が、５％のマトリゲルで、上記方法を用いて観察された。主要なオルガノイド体から発芽した陰窩様構造内のＧＦＰ染色の存在及び位置は、インビボでの陰窩基部におけるＬｇｒ５発現の局在性と一致していた（図１）。加えて、オルガノイドの陰窩様構造内のリゾチーム染色が観察され、これはこの調製が、腸の特殊化細胞を能動的に分化するオルガノイドをもたらすことを示すものである（図１）。
【００９２】
実施例２−腸オルガノイド中のＬｇｒ５陽性幹細胞のアブレーション
これまでの研究により、マウス腸内のＬｇｒ５陽性幹細胞のアブレーションは、正常な腸形態と、分化した細胞の正常な分布及び数とをもたらすことが示されている（Tian et al 2011）。液体培養されたオルガノイドが、インビボの腸組織の機能的及び形態的特性を模倣するかどうかを決定するために、Ｌｇｒ５陽性幹細胞のアブレーションを、以下のようにして、液体培養されたオルガノイド中で行った。
【００９３】
材料及び方法
マウス
最初にTian et al., 2011により特徴付けされたＬｇｒ５ＤＴＲＥＧＦＰ／＋マウスを、上述のような陰窩の単離に使用した。これらのマウスは、ＥＧＦＰカセットを利用するＬｇｒ５発現のレポーターの役割を有し、Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ  Ｔｏｘｉｎ（ＤＴ）の投与によるＬｇｒ５陽性幹細胞のアブレーションを可能にする。
【００９４】
Ｌｇｒ５陽性幹細胞のアブレーション
陰窩を３〜７日間増殖させてオルガノイドの存在について目視検査したＬｇｒ５陽性幹細胞アブレーションの場合を例外として、陰窩の単離、プレーティング、及び培養を上述のように実行した。次いでオルガノイドを、１０ｎｇ／ｍＬのＤｉｐｔｈｅｒｉａ  Ｔｏｘｉｎ（ＤＴ）を含む培地で処理した。ＤＴを含む培地、コントロールオルガノイドのためのＤＴを含まない培地を、１０日間の間、二日毎に取り替えた。
【００９５】
オルガノイド染色
次いで処理済みのコントロールオルガノイドを回収し、Ｌｇｒ５幹細胞アブレーションの効果をモニタするためにＧＦＰについて染色した。同時に、オルガノイドをリゾチームについて共染色し、分化したパネート細胞を同定した。オルガノイドを、ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｒｉｏｎ  Ｘ−１００で２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中において室温で１５分間固定した。オルガノイドを、ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｒｉｏｎ  Ｘ−１００中で３回洗浄し、タンパク質を含まないブロック（Ｄａｋｏ）で１時間ブロックした。オルガノイドを、ニワトリ抗ＧＦＰ（１：２０００）及びウサギ抗ヒトリゾチーム（１：２０００）抗体と共に一晩４℃でインキュベートした。翌日、オルガノイドを、ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｒｉｏｎ  Ｘ−１００で３回洗浄し、抗ニワトリＩｇＧ  Ｃｙ３（）及び抗ウサギＡｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ４８８二次内で１時間室温でインキュベートし、ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｒｉｏｎ  Ｘ−１００で２回洗浄し、延長金マウント培地に載せ、Ｌｅｉｃａ  ＳＰＥ共焦点顕微鏡上で画像化した。
【００９６】
結果
ＤＴ存在下でのＬｇｒ５ＤＴＲＥＧＦＰ／＋  オルガノイドの長期インキュベーションは、Ｌｇｒ５発現細胞のアブレーションにより、すべてのＬｇｒ５依存性ＧＦＰ発現を欠くオルガノイドの正常な出現をもたらした（図２ｂ）。これらのオルガノイドはリゾチーム染色に陽性であり、分化がＬｇｒ５陽性細胞の非存在下で起こったもので（グリーンの染色、図２ｂ、ｂ’及びｄ）、強い増殖を示した（赤色の染色、図２ｄ）ことが示唆された。
【００９７】
まとめると、単一の腸幹細胞は、固体細胞外マトリックスを含むその環境からの位置的な合図とは関係なく作用可能であること、及びそれが正常な腸を思わせるような、拡張を続ける自己組織化上皮構造を生成できることが示された。液体培養法を含む上記培養系は、幹細胞主導の陰窩−繊毛生物学の研究を単純化するであろう。
【００９８】
実施例３−腸オルガノイド増殖のためのＥＣＭ（マトリゲル）の必要性
腸オルガノイド増殖に対するマトリゲルの必要性を決定するため、増殖培地中に異なる濃度のマトリゲルを用いる懸滴法を使用してオルガノイドを増殖させた。
【００９９】
マウス、オルガノイド調製物、及びオルガノイド染色
ＷＴ  ＣＤ−１マウスをこれらの実験に使用した。陰窩の単離、プレーティング、及び培養を上記のように、但しオルガノイドを０％、１％、２％、３％、４％、及び５％のマトリゲルの存在下において増殖させて、実行した。オルガノイドを含むプレートを、陰窩の播種後７日目に目視により検査した。オルガノイドを、染色し、上記のように画像化した。
【０１００】
結果
図３は、増殖培地においてマトリゲルの濃度を低下させながら陰窩を播種した結果を示している。５％及び４％のマトリゲル（それぞれａ及びｂ）は一貫して大きなオルガノイドを生成した。それよりも低濃度のマトリゲルは、オルガノイドの強い増殖をサポートせず（ｃ及びｄ）、１％及び０％のマトリゲルはまったく増殖を示さなかった（データは示さない）。
【図１】
2016512958.tif 000004
【図２】
2016512958.tif 000005
【図３】
2016512958.tif 000006
【国際調査報告】
2016512958.tif 000007
2016512958.tif 000008
2016512958.tif 000009