(57)【要約】クリプトコッカス・フラベセンスの亜種の同定方法、および異なるクリプトコッカス・フラベセンス種による赤かび病の治療または抑制方法を開示する。特に、開示したリアルタイムＰＣＲ技術を用いて、２つの遺伝子型、遺伝子型Ａ型およびＢ型を同定した。遺伝子型Ａ型もしくはＢ型のいずれかであり、かつ赤かび病を抑制することが可能なものとして、以下のクリプトコッカス・フラベセンス株：Ｙ−７３７３、ＹＢ−６０１、ＹＢ−６０２、Ｙ−７３７７、Ｙ−７３７２、Ｙ−７３７５、Ｙ−７３７４、Ｙ−７３７６、ＹＢ−３２８、Ｙ−７３７９、およびＹＢ−７４４を同定した。【選択図】図２
2016512043.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
穀物用植物における赤かび病の抑制方法であって、
ａ）ｑＰＣＲおよび／または配列同一性によってクリプトコッカス・フラベセンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）株の遺伝子型を同定することと、
ｂ）１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量を前記植物の種子先端に塗布することと、
を含み、
前記１つ以上の微生物アンタゴニストは、工程ａ）で同定された遺伝子型Ａ型クリプトコッカス・フラベセンス株もしくは遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株であり、前記１つ以上の微生物アンタゴニストは、ＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７８で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス３ＣもしくはＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７９で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス４Ｃではない方法。
【請求項２】
クリプトコッカス・フラベセンス株の遺伝子型が、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により決定される請求項１に記載の方法であって、
ａ）表１のプライマー対（配列番号４５〜７２）と少なくとも９０％の配列同一性を共有する１つ以上のプライマー対を利用して抽出ゲノムＤＮＡのｑＰＣＲを行う工程と、ここで、配列同一性は、個々のフォワードプライマーもしくはリバースプライマーごとに決定され、
ｂ）クリプトコッカス・フラベセンス株を遺伝子型Ａ型もしくは遺伝子型Ｂ型として同定する工程と、ここで、
（１）ｑＰＣＲが、ｂｔｕｂ．１、ｂｔｕｂ．２、またはＥＦ１．２プライマーセットを用いた際に１７〜２１のＣｔ値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ  ｖａｌｕｅ）；ｈ２２．１、ｈ３０．２、またはｈ３１．１プライマーセットを用いた際に１８〜２０のＣｔ値；ｈ３１．２プライマーセットを用いた際に１７〜２０のＣｔ値；またはＩ２プライマーセットを用いた際に１２〜１５のＣｔ値をもたらす場合、前記クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ａ型として同定され；
（２）ｑＰＣＲが、ｂｔｕｂ．１プライマーセットを用いた際に３１〜３３のＣｔ値；ｂｔｕｂ．２プライマーセットを用いた際に３２〜３５のＣｔ値；ＥＦ１．２プライマーセットを用いた際に２４〜２６のＣｔ値；ｈ２２．１またはｈ３１．１プライマーセットを用いた際に２２〜２４のＣｔ値；ｈ３０．２プライマーセットを用いた際に２２〜２３のＣｔ値；ｈ３１．２プライマーセットを用いた際に３４〜３５のＣｔ値；またはＩ２プライマーセットを用いた際に１５〜１８のＣｔ値をもたらす場合、前記クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ｂ型として同定される、
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１つ以上の微生物アンタゴニストを１つ以上の穀草植物に塗布する前に、前記１つ以上の穀草植物から前記抽出ゲノムＤＮＡを回収する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
１つ以上の微生物アンタゴニストを１つ以上の穀草植物に塗布した後に、前記１つ以上の穀草植物から前記抽出ゲノムＤＮＡを回収する請求項２に記載の方法。
【請求項５】
クリプトコッカス・フラベセンスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養から前記抽出ゲノムＤＮＡを回収する請求項２に記載の方法。
【請求項６】
クリプトコッカス・フラベセンス株の遺伝子型が、配列同一性により決定される請求項１に記載の方法であって、
ａ）標的クリプトコッカス・フラベセンスの抽出ゲノムＤＮＡを配列決定する工程と、
ｂ）工程ａ）で決定された前記配列を他のクリプトコッカス・フラベセンス株の公知の相同配列と比較する工程と、
ｃ）クリプトコッカス・フラベセンス株を遺伝子型Ａ型もしくは遺伝子型Ｂ型として同定する工程と、ここで、
（１）前記標的クリプトコッカス・フラベセンスの抽出ゲノムＤＮＡの配列が、β−チューブリン遺伝子で配列番号１に１００％の配列同一性；キチンシンターゼ１遺伝子で配列番号２、３、４、５、または６に９５％〜１００％の配列同一性；ＥＦ１遺伝子で配列番号７、８、９、１０、または１１に９９％〜１００％の配列同一性；ｈｓｐ７０遺伝子で配列番号１２、１３、１４、１５、または１６に９９％〜１００％の配列同一性；またはｃｓ２２標的遺伝子座で配列番号８５、８６、８７、８８、または８９に９９％〜１００％の配列同一性を共有する場合、前記クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ａ型として同定され、
（２）前記標的クリプトコッカス・フラベセンスの抽出ゲノムＤＮＡの配列が、β−チューブリン遺伝子で配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３に９９％〜１００％の配列同一性；キチンシンターゼ１遺伝子で配列番号２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０に９７％〜１００％の配列同一性；ＥＦ１遺伝子で配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、または３７に９９％〜１００％の配列同一性；ｈｓｐ７０遺伝子で配列番号３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４に９９％〜１００％の配列同一性；またはｃｓ２２標的遺伝子座で配列番号９０に１００％の配列同一性を共有する場合、前記クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ｂ型として同定される、
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
１つ以上の微生物アンタゴニストを１つ以上の穀草植物に塗布する前に、前記１つ以上の穀草植物から前記抽出ゲノムＤＮＡを回収する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
１つ以上の微生物アンタゴニストを１つ以上の穀草植物に塗布した後に、前記１つ以上の穀草植物から前記抽出ゲノムＤＮＡを回収する請求項６に記載の方法。
【請求項９】
クリプトコッカス・フラベセンスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養から前記抽出ゲノムＤＮＡを回収する請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、遺伝子型Ａ型クリプトコッカス・フラベセンス株である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、Ｙ−７３７３；ＹＢ−６０１；ＹＢ−６０２；Ｙ−７３７７；Ｙ−７３７２；Ｙ−７３７５；Ｙ−７３７４；Ｙ−７３７６；ＹＢ−３２８；Ｙ−７３７９；およびＹＢ−７４４からなるクリプトコッカス・フラベセンス株からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、プロチオコナゾールに耐性を持つ請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、クリプトコッカス・フラベセンスＹ−７３７３である請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、クリプトコッカス・フラベセンスＹＢ−６０１である請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、クリプトコッカス・フラベセンスＹＢ−６０２である請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、クリプトコッカス・フラベセンスＹ−７３７７である請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、クリプトコッカス・フラベセンスＹ−７３７２である請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、クリプトコッカス・フラベセンスＹ−７３７５である請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、クリプトコッカス・フラベセンスＹ−７３７４である請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、クリプトコッカス・フラベセンスＹ−７３７６である請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、クリプトコッカス・フラベセンスＹＢ−３２８である請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、クリプトコッカス・フラベセンスＹ−７３７９である請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、クリプトコッカス・フラベセンスＹＢ−７４４である請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストを穀物用植物の種子先端に塗布することに加えて、ＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７８で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス３Ｃおよび／またはＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７９で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス４Ｃを前記穀物用植物に塗布する請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストを、成長のハード・ダフ・ステージ前に前記種子先端に塗布する請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストを、開花中に、前記種子先端に塗布する請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストを、開花前に、前記種子先端に塗布する請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記穀物用植物が小麦または大麦である請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記穀物用植物が小麦である請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも１つの微生物アンタゴニストの有効量が、対応する未処理対照におけるものに対して赤かび病のレベルを減少させるのに十分な量である請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量を穀物用植物の種子先端に塗布することが、前記穀物用植物上に前記１つ以上の微生物アンタゴニストを噴霧することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記噴霧方法が、スプリンクラー灌漑システムを介した噴霧；空中噴霧塗布；地上噴霧塗布からなる群から選択される請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量が、約１０５〜１０６ＣＦＵ／ｃｍ２の割合で塗布される約１０４〜１０９ＣＦＵ／ｍｌである請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量が、約２×１０６〜６×１０６ＣＦＵ／ｃｍ２の割合で塗布される約１．５×１０９ＣＦＵ／ｍｌである請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量が、約２×１０５ＣＦＵ／ｃｍ２の割合で塗布される約２．３×１０８ＣＦＵ／ｍｌである請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量が、約１０６ＣＦＵ／ｃｍ２の割合で約３×１０８ＣＦＵ／ｍｌである請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量を穀物用植物の種子先端に塗布することが、約５〜３５℃の温度で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量を穀物用植物の種子先端に塗布することが、約１５〜３０℃の温度で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストが、実質上生物学的に純粋である請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
２つ以上の微生物アンタゴニストを前記穀物用植物の種子先端に塗布する請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記２つ以上の微生物アンタゴニストを同時に塗布する請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記２つ以上の微生物アンタゴニストを別々に塗布する請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
少なくとも２つの微生物アンタゴニストが、遺伝子型Ａ型クリプトコッカス・フラベセンス株である請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも２つの微生物アンタゴニストが、遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株である請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
第１の微生物アンタゴニストが、遺伝子型Ａ型クリプトコッカス・フラベセンス株であり、第２の微生物アンタゴニストが、遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株である請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
少なくとも１つの微生物アンタゴニストが、遺伝子型Ａ型クリプトコッカス・フラベセンス株；および遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株からなる第１の群から選択され、少なくとも１つの微生物アンタゴニストが、ＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７８で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス３Ｃ；およびＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７９で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス４Ｃからなる第２の群から選択される請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
１つ以上の殺菌剤を前記穀物用植物に塗布することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
前記殺菌剤が、プロチオコナゾールである請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記１つ以上の殺菌剤を、前記１つ以上の微生物アンタゴニストの塗布前；前記１つ以上の微生物アンタゴニストの塗布と同時；および前記１つ以上の微生物アンタゴニストの塗布後からなる群から選択される時期に前記穀物用植物に塗布する請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
請求項１に記載の１つ以上の微生物アンタゴニストを含むキット。
【請求項５２】
表１のプライマー対（配列番号４５〜７２）と少なくとも９０％の配列同一性を共有する１つ以上のプライマー対を含むキットであって、
配列同一性は、個々のフォワードプライマーもしくはリバースプライマーごとに決定されるキット。
【請求項５３】
クリプトコッカス・フラベセンス株の遺伝子型の同定方法であって、
ａ）表１のプライマー対（配列番号４５〜７２）と少なくとも９０％の配列同一性を共有する１つ以上のプライマー対を利用して抽出ゲノムＤＮＡの定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行う工程と、ここで、配列同一性は、個々のフォワードプライマーもしくはリバースプライマーごとに決定され、
ｂ）クリプトコッカス・フラベセンス株を遺伝子型Ａ型もしくは遺伝子型Ｂ型として同定する工程と、ここで、
（１）ｑＰＣＲが、ｂｔｕｂ．１、ｂｔｕｂ．２、またはＥＦ１．２プライマーセットを用いた際に１７〜２１のＣｔ値；ｈ２２．１、ｈ３０．２、またはｈ３１．１プライマーセットを用いた際に１８〜２０のＣｔ値；ｈ３１．２プライマーセットを用いた際に１７〜２０のＣｔ値；またはＩ２プライマーセットを用いた際に１２〜１５のＣｔ値をもたらす場合、前記クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ａ型として同定され；
（２）ｑＰＣＲが、ｂｔｕｂ．１プライマーセットを用いた際に３１〜３３のＣｔ値；ｂｔｕｂ．２プライマーセットを用いた際に３２〜３５のＣｔ値；ＥＦ１．２プライマーセットを用いた際に２４〜２６のＣｔ値；ｈ２２．１またはｈ３１．１プライマーセットを用いた際に２２〜２４のＣｔ値；ｈ３０．２プライマーセットを用いた際に２２〜２３のＣｔ値；ｈ３１．２プライマーセットを用いた際に３４〜３５のＣｔ値；またはＩ２プライマーセットを用いた際に１５〜１８のＣｔ値をもたらす場合、前記クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ｂ型として同定される、
を含む方法。
【請求項５４】
１つ以上の微生物アンタゴニストを１つ以上の穀草植物に塗布する前に、前記１つ以上の穀草植物から前記抽出ゲノムＤＮＡを回収する請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
１つ以上の微生物アンタゴニストを１つ以上の穀草植物に塗布した後に、前記１つ以上の穀草植物から前記抽出ゲノムＤＮＡを回収する請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
クリプトコッカス・フラベセンスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養から前記抽出ゲノムＤＮＡを回収する請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
クリプトコッカス・フラベセンス株の遺伝子型の同定方法であって、
ａ）標的クリプトコッカス・フラベセンスの抽出ゲノムＤＮＡを配列決定する工程と、
ｂ）工程ａ）で決定された前記配列を他のクリプトコッカス・フラベセンス株の公知の相同配列と比較する工程と、
ｃ）クリプトコッカス・フラベセンス株を遺伝子型Ａ型もしくは遺伝子型Ｂ型として同定する工程と、ここで、
（１）前記標的クリプトコッカス・フラベセンスの抽出ゲノムＤＮＡの配列が、β−チューブリン遺伝子で配列番号１に１００％の配列同一性；キチンシンターゼ１遺伝子で配列番号２、３、４、５、または６に９５％〜１００％の配列同一性；ＥＦ１遺伝子で配列番号７、８、９、１０、または１１に９９％〜１００％の配列同一性；ｈｓｐ７０遺伝子で配列番号１２、１３、１４、１５、または１６に９９％〜１００％の配列同一性；またはｃｓ２２標的遺伝子座で配列番号８５、８６、８７、８８、または８９に９９％〜１００％の配列同一性を共有する場合、前記クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ａ型として同定され、
（２）前記標的クリプトコッカス・フラベセンスの抽出ゲノムＤＮＡの配列が、β−チューブリン遺伝子で配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３に９９％〜１００％の配列同一性；キチンシンターゼ１遺伝子で配列番号２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０に９７％〜１００％の配列同一性；ＥＦ１遺伝子で配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、または３７に９９％〜１００％の配列同一性；ｈｓｐ７０遺伝子で配列番号３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４に９９％〜１００％の配列同一性；またはｃｓ２２標的遺伝子座で配列番号９０に１００％の配列同一性を共有する場合、前記クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ｂ型として同定される、
を含む方法。
【請求項５８】
１つ以上の微生物アンタゴニストを１つ以上の穀草植物に塗布する前に、前記１つ以上の穀草植物から前記抽出ゲノムＤＮＡを回収する請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
１つ以上の微生物アンタゴニストを１つ以上の穀草植物に塗布した後に、前記１つ以上の穀草植物から前記抽出ゲノムＤＮＡを回収する請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
クリプトコッカス・フラベセンスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養から前記抽出ゲノムＤＮＡを回収する請求項５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明者ら：Ｂｒｉａｎ  Ｂ．ＭｃＳｐａｄｄｅｎ  Ｇａｒｄｅｎｅｒ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｐａｕｌ、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｊ．Ｂｏｅｈｍ、Ｘｉａｏｑｉｎｇ  Ｒｏｎｇ、およびＤａｖｉｄ  Ｓｃｈｉｓｌｅｒ
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／７８７，４５８号の優先権を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
配列リスト
【０００２】
本出願は、ＥＦＳ−ｗｅｂを通じて提出された配列リストを含み、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。２０１４年３月１２日に作成された「５３−５５８９０＿ＳＬ．ｔｘｔ」と命名されたＡＳＣＩＩコピーは、５３，３１１バイトサイズである。
【背景技術】
【０００３】
ＦＨＢとしても知られている赤かび病（ｈｅａｄ  ｓｃａｂ）は、小麦および大麦の深刻な病気であり、ジベレラ・ゼアエ（アナモルフ＝フザリウム・グラミネアラム）菌が主な原因である。この病気は、流行レベルに到達し得、世界中の湿潤および半湿潤の小麦産地全域にわたり、小麦および大麦に多大な損害をもたらす。この病気は、米国、カナダ、および中国において大規模な荒廃をもたらしている。湿潤および半湿潤地域において大量の小麦を生産し、ＦＨＢの大流行の影響を受けやすい世界の他の国々としては、インド、ロシア、フランス、ドイツ、およびイギリスが挙げられる。ＦＨＢは、１９９１年から２０１３年まで米国で失われた小麦のうちの凡そ５００百万ブッシェルの原因であった。この期間の経済的損失は、１３〜２６億ドルと推定されている。ＦＨＢの重要性は、第１０５回米国議会で認識され、ＦＨＢ研究に対して２６百万ドルの予算執行を許可した「Ｗｈｅａｔ  ａｎｄ  Ｂａｒｌｅｙ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｃｔ（小麦および大麦保護法）」を採択した。
【０００４】
ＦＨＢなどの植物病原菌を管理および防除するために多くの異なる戦略が用いられてきた。これらの病原菌の防除を補助するために化学農薬に依存することが多い。しかしながら、農業における化学物質の広範囲に及ぶ使用は、環境や人の健康への潜在的な悪影響により、社会的関心や監視が高まりつつある対象となっている。農薬耐性病原菌の発生を含む、農薬使用に関連する他の問題は、いくつかの市販農薬の段階的排除に至っている。さらに、化学農薬使用には厳しい規制、ならびに最も有害な化学物質を市場から排除することを目的とした政治的圧力が現在では存在している。その結果、いくつかの化学物質会社は、登録手続きやコストに関する懸念により新たな化学物質の開発や試験にますます消極的になってきている。代わりに、ＦＨＢに対する従来の耕作習慣が用いられている。これらのアプローチは、どれもＦＨＢの実質的かつ一貫した防除をもたらさない。残留物や高コストの化学物質殺菌剤、ならびに土壌浸食や土壌流出を予防するための低耕作もしくは保全耕作への要望が、これらの戦略の使用を阻んでいる。
【０００５】
ＦＨＢなどの植物病原性疾患を防除するための化学物質を用いない代替方法の開発が明らかに必要とされている。植物病原菌の生物学的防除は、植物の病気を管理するための実行可能な代替案としてますます見なされつつある。特に、植物ペストや病原性疾患の防除における生物学的活性剤の使用は、ペスト対策管理に合成化学物質を用いない公認の有機栽培者には特に重要になっている。
【０００６】
従って、本明細書では、クリプトコッカス・フラベセンス株を用いて穀物用植物のＦＨＢを抑制する方法が開示される。
【発明の概要】
【０００７】
クリプトコッカス・フラベセンスの亜種の同定方法、および異なるクリプトコッカス・フラベセンス種による赤かび病（ＦＨＢ）の治療または抑制方法を開示する。特に、開示したリアルタイムＰＣＲ技術を用いて、２つの遺伝子型、遺伝子型Ａ型およびＢ型を同定した。遺伝子型Ａ型もしくはＢ型のいずれか、および赤かび病を抑制することが可能なものとして、以下のクリプトコッカス・フラベセンス株：Ｙ−７３７３、ＹＢ−６０１、ＹＢ−６０２、Ｙ−７３７７、Ｙ−７３７２、Ｙ−７３７５、Ｙ−７３７４、Ｙ−７３７６、ＹＢ−３２８、Ｙ−７３７９、およびＹＢ−７４４を同定した。
【０００８】
本明細書に記載される特定の実施形態において、穀物用植物における赤かび病の抑制方法は、ａ）ｑＰＣＲおよび／または配列同一性によってクリプトコッカス・フラベセンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）株の遺伝子型を同定することと、ｂ）１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量を前記植物の種子先端に塗布することとを含み、ここで、１つ以上の微生物アンタゴニストは、工程ａ）で同定された遺伝子型Ａ型クリプトコッカス・フラベセンス株もしくは遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株であり、１つ以上の微生物アンタゴニストは、ＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７８で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス３ＣもしくはＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７９で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス４Ｃではない。
【０００９】
本明細書に記載される別の実施形態において、クリプトコッカス・フラベセンス株の遺伝子型は、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により決定され、本方法は、ａ）表１のプライマー対（配列番号４５〜７２）と少なくとも９０％の配列同一性を共有する１つ以上のプライマー対を利用して抽出ゲノムＤＮＡのｑＰＣＲを行う工程と、ここで、配列同一性は、個々のフォワードプライマーもしくはリバースプライマーごとに決定され、ｂ）クリプトコッカス・フラベセンス株を遺伝子型Ａ型もしくは遺伝子型Ｂ型として同定する工程と、ここで、（１）ｑＰＣＲが、ｂｔｕｂ．１、ｂｔｕｂ．２、またはＥＦ１．２プライマーセットを用いた際に１７〜２１のＣｔ値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ  ｖａｌｕｅ）；ｈ２２．１、ｈ３０．２、またはｈ３１．１プライマーセットを用いた際に１８〜２０のＣｔ値；ｈ３１．２プライマーセットを用いた際に１７〜２０のＣｔ値；またはＩ２プライマーセットを用いた際に１２〜１５のＣｔ値をもたらす場合、クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ａ型として同定され；（２）ｑＰＣＲが、ｂｔｕｂ．１プライマーセットを用いた際に３１〜３３のＣｔ値；ｂｔｕｂ．２プライマーセットを用いた際に３２〜３５のＣｔ値；ＥＦ１．２プライマーセットを用いた際に２４〜２６のＣｔ値；ｈ２２．１またはｈ３１．１プライマーセットを用いた際に２２〜２４のＣｔ値；ｈ３０．２プライマーセットを用いた際に２２〜２３のＣｔ値；ｈ３１．２プライマーセットを用いた際に３４〜３５のＣｔ値；またはＩ２プライマーセットを用いた際に１５〜１８のＣｔ値をもたらす場合、クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ｂ型として同定される、を含む。
【００１０】
本明細書に記載される別の実施形態において、クリプトコッカス・フラベセンス株の遺伝子型は、配列同一性により決定され、本方法は、ａ）標的クリプトコッカス・フラベセンスの抽出ゲノムＤＮＡを配列決定する工程と、ｂ）工程ａ）で決定された配列を他のクリプトコッカス・フラベセンス株の公知の相同配列と比較する工程と、ｃ）クリプトコッカス・フラベセンス株を遺伝子型Ａ型もしくは遺伝子型Ｂ型として同定する工程と、ここで、（１）標的クリプトコッカス・フラベセンスの抽出ゲノムＤＮＡの配列が、β−チューブリン遺伝子で配列番号１に１００％の配列同一性；キチンシンターゼ１遺伝子で配列番号２、３、４、５、または６に９５％〜１００％の配列同一性；ＥＦ１遺伝子で配列番号７、８、９、１０、または１１に９９％〜１００％の配列同一性；ｈｓｐ７０遺伝子で配列番号１２、１３、１４、１５、または１６に９９％〜１００％の配列同一性；またはｃｓ２２標的遺伝子座で配列番号８５、８６、８７、８８、または８９に９９％〜１００％の配列同一性を共有する場合、クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ａ型として同定され、（２）標的クリプトコッカス・フラベセンスの抽出ゲノムＤＮＡの配列が、β−チューブリン遺伝子で配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３に９９％〜１００％の配列同一性；キチンシンターゼ１遺伝子で配列番号２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０に９７％〜１００％の配列同一性；ＥＦ１遺伝子で配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、または３７に９９％〜１００％の配列同一性；ｈｓｐ７０遺伝子で配列番号３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４に９９％〜１００％の配列同一性；またはｃｓ２２標的遺伝子座で配列番号９０に１００％の配列同一性を共有する場合、クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ｂ型として同定される、を含む。
【００１１】
本明細書に記載される別の実施形態において、抽出ゲノムＤＮＡは、１つ以上の微生物アンタゴニストを１つ以上の穀草植物に塗布する前に、１つ以上の穀草植物から回収される。
【００１２】
本明細書に記載される別の実施形態において、抽出ゲノムＤＮＡは、１つ以上の微生物アンタゴニストを１つ以上の穀草植物に塗布した後に、１つ以上の穀草植物から回収される。
【００１３】
本明細書に記載される別の実施形態において、抽出ゲノムＤＮＡは、クリプトコッカス・フラベセンスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養から回収される。
【００１４】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つは、遺伝子型Ａ型クリプトコッカス・フラベセンス株である。
【００１５】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つは、遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株である。
【００１６】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つは、Ｙ−７３７３；ＹＢ−６０１；ＹＢ−６０２；Ｙ−７３７７；Ｙ−７３７２；Ｙ−７３７５；Ｙ−７３７４；Ｙ−７３７６；ＹＢ−３２８；Ｙ−７３７９；およびＹＢ−７４４からなるクリプトコッカス・フラベセンス株からなる群から選択される。
【００１７】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つは、プロチオコナゾールに耐性を持つ。
【００１８】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つは、クリプトコッカス・フラベセンスＹ−７３７３である。
【００１９】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つは、クリプトコッカス・フラベセンスＹＢ−６０１である。
【００２０】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つは、クリプトコッカス・フラベセンスＹＢ−６０２である。
【００２１】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つは、クリプトコッカス・フラベセンスＹ−７３７７である。
【００２２】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つは、クリプトコッカス・フラベセンスＹ−７３７２である。
【００２３】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つは、クリプトコッカス・フラベセンスＹ−７３７５である。
【００２４】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つは、クリプトコッカス・フラベセンスＹ−７３７４である。
【００２５】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つは、クリプトコッカス・フラベセンスＹ−７３７６である。
【００２６】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つは、クリプトコッカス・フラベセンスＹＢ−３２８である。
【００２７】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つは、クリプトコッカス・フラベセンスＹ−７３７９である。
【００２８】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つは、クリプトコッカス・フラベセンスＹＢ−７４４である。
【００２９】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の微生物アンタゴニストを穀物用植物の種子先端に塗布することに加えて、ＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７８で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス３Ｃおよび／またはＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７９で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス４Ｃを穀物用植物に塗布する。
【００３０】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の微生物アンタゴニストを、成長のハード・ダフ・ステージ前に種子先端に塗布する。
【００３１】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の微生物アンタゴニストを、開花中に、種子先端に塗布する。
【００３２】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の微生物アンタゴニストを、開花前に、種子先端に塗布する。
【００３３】
本明細書に記載される別の実施形態において、穀物用植物は小麦または大麦である。
【００３４】
本明細書に記載される別の実施形態において、穀物用植物は小麦である。
【００３５】
本明細書に記載される別の実施形態において、少なくとも１つの微生物アンタゴニストの有効量は、対応する未処理対照におけるものに対して赤かび病のレベルを減少させるのに十分な量である。
【００３６】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量を穀物用植物の種子先端に塗布することは、穀物用植物上に１つ以上の微生物アンタゴニストを噴霧することを含む。
【００３７】
本明細書に記載される別の実施形態において、噴霧方法は、スプリンクラー灌漑システムを介した噴霧；空中噴霧塗布；地上噴霧塗布からなる群から選択される。
【００３８】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量は、約１０５〜１０６ＣＦＵ／ｃｍ２の割合で塗布される約１０４〜１０９ＣＦＵ／ｍｌである。
【００３９】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量は、約２×１０６〜６×１０６ＣＦＵ／ｃｍ２の割合で塗布される約１．５×１０９ＣＦＵ／ｍｌである。
【００４０】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量は、約２×１０５ＣＦＵ／ｃｍ２の割合で塗布される約２．３×１０８ＣＦＵ／ｍｌである。
【００４１】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量は、約１０６ＣＦＵ／ｃｍ２の割合で約３×１０８ＣＦＵ／ｍｌである。
【００４２】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量を穀物用植物の種子先端に塗布することは、約５〜３５℃の温度で行われる。
【００４３】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量を穀物用植物の種子先端に塗布することは、約１５〜３０℃の温度で行われる。
【００４４】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の微生物アンタゴニストは、実質上生物学的に純粋である。
【００４５】
本明細書に記載される別の実施形態において、２つ以上の微生物アンタゴニストを穀物用植物の種子先端に塗布する。
【００４６】
本明細書に記載される別の実施形態において、２つ以上の微生物アンタゴニストを同時に塗布する。
【００４７】
本明細書に記載される別の実施形態において、２つ以上の微生物アンタゴニストを別々に塗布する。
【００４８】
本明細書に記載される別の実施形態において、少なくとも２つの微生物アンタゴニストは、遺伝子型Ａ型クリプトコッカス・フラベセンス株である。
【００４９】
本明細書に記載される別の実施形態において、少なくとも２つの微生物アンタゴニストは、遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株である。
【００５０】
本明細書に記載される別の実施形態において、第１の微生物アンタゴニストは、遺伝子型Ａ型クリプトコッカス・フラベセンス株であり、第２の微生物アンタゴニストは、遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株である。
【００５１】
本明細書に記載される別の実施形態において、少なくとも１つの微生物アンタゴニストは、遺伝子型Ａ型クリプトコッカス・フラベセンス株；および遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株からなる第１の群から選択され、少なくとも１つの微生物アンタゴニストは、ＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７８で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス３Ｃ；およびＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７９で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス４Ｃからなる第２の群から選択される。
【００５２】
本明細書に記載される別の実施形態において、穀物用植物における赤かび病の抑制方法は、１つ以上の殺菌剤を穀物用植物に塗布することをさらに含む。
【００５３】
本明細書に記載される別の実施形態において、殺菌剤は、プロチオコナゾールである。
【００５４】
本明細書に記載される別の実施形態において、１つ以上の殺菌剤を、１つ以上の微生物アンタゴニストの塗布前；１つ以上の微生物アンタゴニストの塗布と同時；および１つ以上の微生物アンタゴニストの塗布後からなる群から選択される時期に穀物用植物に塗布する。
【００５５】
本明細書に記載される特定の実施形態において、本明細書に開示された１つ以上の微生物アンタゴニストを含むキットである。
【００５６】
本明細書に記載される特定の実施形態において、表１のプライマー対（配列番号４５〜７２）と少なくとも９０％の配列同一性を共有する１つ以上のプライマー対を含むキットであり、配列同一性は、個々のフォワードプライマーもしくはリバースプライマーごとに決定される。
【００５７】
本明細書に記載される特定の実施形態において、クリプトコッカス・フラベセンス株の遺伝子型の同定方法は、ａ）表１のプライマー対（配列番号４５〜７２）と少なくとも９０％の配列同一性を共有する１つ以上のプライマー対を利用して抽出ゲノムＤＮＡの定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行う工程と、ここで、配列同一性は、個々のフォワードプライマーもしくはリバースプライマーごとに決定され、ｂ）クリプトコッカス・フラベセンス株を遺伝子型Ａ型もしくは遺伝子型Ｂ型として同定する工程と、ここで、（１）ｑＰＣＲが、ｂｔｕｂ．１、ｂｔｕｂ．２、またはＥＦ１．２プライマーセットを用いた際に１７〜２１のＣｔ値；ｈ２２．１、ｈ３０．２、またはｈ３１．１プライマーセットを用いた際に１８〜２０のＣｔ値；ｈ３１．２プライマーセットを用いた際に１７〜２０のＣｔ値；またはＩ２プライマーセットを用いた際に１２〜１５のＣｔ値をもたらす場合、クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ａ型として同定され；（２）ｑＰＣＲが、ｂｔｕｂ．１プライマーセットを用いた際に３１〜３３のＣｔ値；ｂｔｕｂ．２プライマーセットを用いた際に３２〜３５のＣｔ値；ＥＦ１．２プライマーセットを用いた際に２４〜２６のＣｔ値；ｈ２２．１またはｈ３１．１プライマーセットを用いた際に２２〜２４のＣｔ値；ｈ３０．２プライマーセットを用いた際に２２〜２３のＣｔ値；ｈ３１．２プライマーセットを用いた際に３４〜３５のＣｔ値；またはＩ２プライマーセットを用いた際に１５〜１８のＣｔ値をもたらす場合、クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ｂ型として同定される、を含む。
【００５８】
本明細書に記載される特定の実施形態において、クリプトコッカス・フラベセンス株の遺伝子型の同定方法は、ａ）標的クリプトコッカス・フラベセンスの抽出ゲノムＤＮＡを配列決定する工程と、ｂ）工程ａ）で決定された前記配列を他のクリプトコッカス・フラベセンス株の公知の相同配列と比較する工程と、ｃ）クリプトコッカス・フラベセンス株を遺伝子型Ａ型もしくは遺伝子型Ｂ型として同定する工程と、ここで、（１）標的クリプトコッカス・フラベセンスの抽出ゲノムＤＮＡの配列が、β−チューブリン遺伝子で配列番号１に１００％の配列同一性；キチンシンターゼ１遺伝子で配列番号２、３、４、５、または６に９５％〜１００％の配列同一性；ＥＦ１遺伝子で配列番号７、８、９、１０、または１１に９９％〜１００％の配列同一性；ｈｓｐ７０遺伝子で配列番号１２、１３、１４、１５、または１６に９９％〜１００％の配列同一性；またはｃｓ２２標的遺伝子座で配列番号８５、８６、８７、８８、または８９に９９％〜１００％の配列同一性を共有する場合、クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ａ型として同定され、（２）標的クリプトコッカス・フラベセンスの抽出ゲノムＤＮＡの配列が、β−チューブリン遺伝子で配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３に９９％〜１００％の配列同一性；キチンシンターゼ１遺伝子で配列番号２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０に９７％〜１００％の配列同一性；ＥＦ１遺伝子で配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、または３７に９９％〜１００％の配列同一性；ｈｓｐ７０遺伝子で配列番号３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４に９９％〜１００％の配列同一性；またはｃｓ２２標的遺伝子座で配列番号９０に１００％の配列同一性を共有する場合、クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ｂ型として同定される、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｆは、クリプトコッカス・フラベセンス株間の遺伝的類似性を示す。内部転写スペーサー（Ａ）のＤＮＡ配列およびβ−チューブリン、キチンシンターゼ１、伸長因子１、および熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（Ｂ）が連結したＤＮＡ配列を示す。クリプトコックス・ネオフォルマンスＪＥＣ２１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ１０７３４１〜ＡＥ１０７３５６）における相同領域を外群として用いた。分類群間の系統発生関係は、Ｔａｍｕｒａ−Ｎｅｉモデルを用いて計算した距離から近隣結合法により推測した。＞６０％のブートストラップ値（１，０００複製）を分岐の隣に示す。スケールバーは、部位あたりの塩基置換数を示す。クリプトコッカス・フラベセンス株を２つの群に分け、β−チューブリン（Ｃ）、キチンシンターゼ１（Ｄ）、伸長因子１（Ｅ）、および熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（Ｆ）のＤＮＡ配列によって個々に示す。分類群間の系統発生関係は、一般時間逆転モデルを最尤法により推測した。＞６０％のブートストラップ値（１，０００複製）を分岐の隣に示す。スケールバーは、部位あたりの塩基置換数を示す。異なる区分線パターンを用いて、３Ｃ型株（均質ダッシュ）と非３Ｃ型株（代替ダッシュ）とを区別した。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｆは、クリプトコッカス・フラベセンス株間の遺伝的類似性を示す。内部転写スペーサー（Ａ）のＤＮＡ配列およびβ−チューブリン、キチンシンターゼ１、伸長因子１、および熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（Ｂ）が連結したＤＮＡ配列を示す。クリプトコックス・ネオフォルマンスＪＥＣ２１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ１０７３４１〜ＡＥ１０７３５６）における相同領域を外群として用いた。分類群間の系統発生関係は、Ｔａｍｕｒａ−Ｎｅｉモデルを用いて計算した距離から近隣結合法により推測した。＞６０％のブートストラップ値（１，０００複製）を分岐の隣に示す。スケールバーは、部位あたりの塩基置換数を示す。クリプトコッカス・フラベセンス株を２つの群に分け、β−チューブリン（Ｃ）、キチンシンターゼ１（Ｄ）、伸長因子１（Ｅ）、および熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（Ｆ）のＤＮＡ配列によって個々に示す。分類群間の系統発生関係は、一般時間逆転モデルを最尤法により推測した。＞６０％のブートストラップ値（１，０００複製）を分岐の隣に示す。スケールバーは、部位あたりの塩基置換数を示す。異なる区分線パターンを用いて、３Ｃ型株（均質ダッシュ）と非３Ｃ型株（代替ダッシュ）とを区別した。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｆは、クリプトコッカス・フラベセンス株間の遺伝的類似性を示す。内部転写スペーサー（Ａ）のＤＮＡ配列およびβ−チューブリン、キチンシンターゼ１、伸長因子１、および熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（Ｂ）が連結したＤＮＡ配列を示す。クリプトコックス・ネオフォルマンスＪＥＣ２１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ１０７３４１〜ＡＥ１０７３５６）における相同領域を外群として用いた。分類群間の系統発生関係は、Ｔａｍｕｒａ−Ｎｅｉモデルを用いて計算した距離から近隣結合法により推測した。＞６０％のブートストラップ値（１，０００複製）を分岐の隣に示す。スケールバーは、部位あたりの塩基置換数を示す。クリプトコッカス・フラベセンス株を２つの群に分け、β−チューブリン（Ｃ）、キチンシンターゼ１（Ｄ）、伸長因子１（Ｅ）、および熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（Ｆ）のＤＮＡ配列によって個々に示す。分類群間の系統発生関係は、一般時間逆転モデルを最尤法により推測した。＞６０％のブートストラップ値（１，０００複製）を分岐の隣に示す。スケールバーは、部位あたりの塩基置換数を示す。異なる区分線パターンを用いて、３Ｃ型株（均質ダッシュ）と非３Ｃ型株（代替ダッシュ）とを区別した。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｆは、クリプトコッカス・フラベセンス株間の遺伝的類似性を示す。内部転写スペーサー（Ａ）のＤＮＡ配列およびβ−チューブリン、キチンシンターゼ１、伸長因子１、および熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（Ｂ）が連結したＤＮＡ配列を示す。クリプトコックス・ネオフォルマンスＪＥＣ２１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ１０７３４１〜ＡＥ１０７３５６）における相同領域を外群として用いた。分類群間の系統発生関係は、Ｔａｍｕｒａ−Ｎｅｉモデルを用いて計算した距離から近隣結合法により推測した。＞６０％のブートストラップ値（１，０００複製）を分岐の隣に示す。スケールバーは、部位あたりの塩基置換数を示す。クリプトコッカス・フラベセンス株を２つの群に分け、β−チューブリン（Ｃ）、キチンシンターゼ１（Ｄ）、伸長因子１（Ｅ）、および熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（Ｆ）のＤＮＡ配列によって個々に示す。分類群間の系統発生関係は、一般時間逆転モデルを最尤法により推測した。＞６０％のブートストラップ値（１，０００複製）を分岐の隣に示す。スケールバーは、部位あたりの塩基置換数を示す。異なる区分線パターンを用いて、３Ｃ型株（均質ダッシュ）と非３Ｃ型株（代替ダッシュ）とを区別した。
【図１Ｅ】図１Ａ〜１Ｆは、クリプトコッカス・フラベセンス株間の遺伝的類似性を示す。内部転写スペーサー（Ａ）のＤＮＡ配列およびβ−チューブリン、キチンシンターゼ１、伸長因子１、および熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（Ｂ）が連結したＤＮＡ配列を示す。クリプトコックス・ネオフォルマンスＪＥＣ２１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ１０７３４１〜ＡＥ１０７３５６）における相同領域を外群として用いた。分類群間の系統発生関係は、Ｔａｍｕｒａ−Ｎｅｉモデルを用いて計算した距離から近隣結合法により推測した。＞６０％のブートストラップ値（１，０００複製）を分岐の隣に示す。スケールバーは、部位あたりの塩基置換数を示す。クリプトコッカス・フラベセンス株を２つの群に分け、β−チューブリン（Ｃ）、キチンシンターゼ１（Ｄ）、伸長因子１（Ｅ）、および熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（Ｆ）のＤＮＡ配列によって個々に示す。分類群間の系統発生関係は、一般時間逆転モデルを最尤法により推測した。＞６０％のブートストラップ値（１，０００複製）を分岐の隣に示す。スケールバーは、部位あたりの塩基置換数を示す。異なる区分線パターンを用いて、３Ｃ型株（均質ダッシュ）と非３Ｃ型株（代替ダッシュ）とを区別した。
【図１Ｆ】図１Ａ〜１Ｆは、クリプトコッカス・フラベセンス株間の遺伝的類似性を示す。内部転写スペーサー（Ａ）のＤＮＡ配列およびβ−チューブリン、キチンシンターゼ１、伸長因子１、および熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（Ｂ）が連結したＤＮＡ配列を示す。クリプトコックス・ネオフォルマンスＪＥＣ２１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ１０７３４１〜ＡＥ１０７３５６）における相同領域を外群として用いた。分類群間の系統発生関係は、Ｔａｍｕｒａ−Ｎｅｉモデルを用いて計算した距離から近隣結合法により推測した。＞６０％のブートストラップ値（１，０００複製）を分岐の隣に示す。スケールバーは、部位あたりの塩基置換数を示す。クリプトコッカス・フラベセンス株を２つの群に分け、β−チューブリン（Ｃ）、キチンシンターゼ１（Ｄ）、伸長因子１（Ｅ）、および熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（Ｆ）のＤＮＡ配列によって個々に示す。分類群間の系統発生関係は、一般時間逆転モデルを最尤法により推測した。＞６０％のブートストラップ値（１，０００複製）を分岐の隣に示す。スケールバーは、部位あたりの塩基置換数を示す。異なる区分線パターンを用いて、３Ｃ型株（均質ダッシュ）と非３Ｃ型株（代替ダッシュ）とを区別した。
【図２】推定ｈｓｐ７０遺伝子を標的にするクリプトコッカス・フラベセンス特異的ｑＰＣＲアッセイの感度および特異性を示す。試験サンプルには、３ＣゲノムＤＮＡの１０倍連続希釈液、他のクリプトコッカス・フラベセンス株の反応単位で２．５ｎｇのゲノムＤＮＡ、テンプレートフリーＰＣＲ水、ならびに２つのフィールドサンプル（＊）が含まれた。フィールドサンプルのテンプレートは、それぞれ、接種後４４日目の３Ｃ接種した小麦先端（「ｗ／３Ｃ」）および接種した日の非接種先端（「ｗ／ｏ３Ｃ」）からの１：２０希釈ＤＮＡ抽出物である。標的アンプリコンは、１５０ｂｐサイズであり、矢印で示した。閾値サイクル数（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ）は、蛍光シグナルが増幅後に閾値を下回った場合、「Ｎ／Ａ」（該当なし）とマークした。８７．０℃または８７．５℃（標準系列の溶融温度）のピークが検出されない場合、溶融温度を「−」と示した。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｊは、ｑＰＣＲ増幅曲線である。内部転写スペーサー（ＩＴＳ）領域、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ７０）、ベータチューブリン（ｂｔｕｂ）、伸長因子１（ＥＦ１）、およびキチンシンターゼ５と同様な配列を内部に含むコンティグを同定し、株特異性プライマーの成長のための標的として選択した。図３Ａはｂｔｕｂ．１；図３Ｂはｂｔｕｂ．２；図３ＣはＥＦ１．１；図３ＤはＥＦ１．２；図３Ｅはｈ２２．１；図３Ｆはｈ３０．２；図３Ｇはｈ３１．１；図３Ｈはｈ３１．２；図３Ｉは５Ｉ；および図３ＪはＩ２である。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｊは、ｑＰＣＲ増幅曲線である。内部転写スペーサー（ＩＴＳ）領域、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ７０）、ベータチューブリン（ｂｔｕｂ）、伸長因子１（ＥＦ１）、およびキチンシンターゼ５と同様な配列を内部に含むコンティグを同定し、株特異性プライマーの成長のための標的として選択した。図３Ａはｂｔｕｂ．１；図３Ｂはｂｔｕｂ．２；図３ＣはＥＦ１．１；図３ＤはＥＦ１．２；図３Ｅはｈ２２．１；図３Ｆはｈ３０．２；図３Ｇはｈ３１．１；図３Ｈはｈ３１．２；図３Ｉは５Ｉ；および図３ＪはＩ２である。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｊは、ｑＰＣＲ増幅曲線である。内部転写スペーサー（ＩＴＳ）領域、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ７０）、ベータチューブリン（ｂｔｕｂ）、伸長因子１（ＥＦ１）、およびキチンシンターゼ５と同様な配列を内部に含むコンティグを同定し、株特異性プライマーの成長のための標的として選択した。図３Ａはｂｔｕｂ．１；図３Ｂはｂｔｕｂ．２；図３ＣはＥＦ１．１；図３ＤはＥＦ１．２；図３Ｅはｈ２２．１；図３Ｆはｈ３０．２；図３Ｇはｈ３１．１；図３Ｈはｈ３１．２；図３Ｉは５Ｉ；および図３ＪはＩ２である。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｊは、ｑＰＣＲ増幅曲線である。内部転写スペーサー（ＩＴＳ）領域、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ７０）、ベータチューブリン（ｂｔｕｂ）、伸長因子１（ＥＦ１）、およびキチンシンターゼ５と同様な配列を内部に含むコンティグを同定し、株特異性プライマーの成長のための標的として選択した。図３Ａはｂｔｕｂ．１；図３Ｂはｂｔｕｂ．２；図３ＣはＥＦ１．１；図３ＤはＥＦ１．２；図３Ｅはｈ２２．１；図３Ｆはｈ３０．２；図３Ｇはｈ３１．１；図３Ｈはｈ３１．２；図３Ｉは５Ｉ；および図３ＪはＩ２である。
【図３Ｅ】図３Ａ〜３Ｊは、ｑＰＣＲ増幅曲線である。内部転写スペーサー（ＩＴＳ）領域、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ７０）、ベータチューブリン（ｂｔｕｂ）、伸長因子１（ＥＦ１）、およびキチンシンターゼ５と同様な配列を内部に含むコンティグを同定し、株特異性プライマーの成長のための標的として選択した。図３Ａはｂｔｕｂ．１；図３Ｂはｂｔｕｂ．２；図３ＣはＥＦ１．１；図３ＤはＥＦ１．２；図３Ｅはｈ２２．１；図３Ｆはｈ３０．２；図３Ｇはｈ３１．１；図３Ｈはｈ３１．２；図３Ｉは５Ｉ；および図３ＪはＩ２である。
【図３Ｆ】図３Ａ〜３Ｊは、ｑＰＣＲ増幅曲線である。内部転写スペーサー（ＩＴＳ）領域、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ７０）、ベータチューブリン（ｂｔｕｂ）、伸長因子１（ＥＦ１）、およびキチンシンターゼ５と同様な配列を内部に含むコンティグを同定し、株特異性プライマーの成長のための標的として選択した。図３Ａはｂｔｕｂ．１；図３Ｂはｂｔｕｂ．２；図３ＣはＥＦ１．１；図３ＤはＥＦ１．２；図３Ｅはｈ２２．１；図３Ｆはｈ３０．２；図３Ｇはｈ３１．１；図３Ｈはｈ３１．２；図３Ｉは５Ｉ；および図３ＪはＩ２である。
【図３Ｇ】図３Ａ〜３Ｊは、ｑＰＣＲ増幅曲線である。内部転写スペーサー（ＩＴＳ）領域、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ７０）、ベータチューブリン（ｂｔｕｂ）、伸長因子１（ＥＦ１）、およびキチンシンターゼ５と同様な配列を内部に含むコンティグを同定し、株特異性プライマーの成長のための標的として選択した。図３Ａはｂｔｕｂ．１；図３Ｂはｂｔｕｂ．２；図３ＣはＥＦ１．１；図３ＤはＥＦ１．２；図３Ｅはｈ２２．１；図３Ｆはｈ３０．２；図３Ｇはｈ３１．１；図３Ｈはｈ３１．２；図３Ｉは５Ｉ；および図３ＪはＩ２である。
【図３Ｈ】図３Ａ〜３Ｊは、ｑＰＣＲ増幅曲線である。内部転写スペーサー（ＩＴＳ）領域、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ７０）、ベータチューブリン（ｂｔｕｂ）、伸長因子１（ＥＦ１）、およびキチンシンターゼ５と同様な配列を内部に含むコンティグを同定し、株特異性プライマーの成長のための標的として選択した。図３Ａはｂｔｕｂ．１；図３Ｂはｂｔｕｂ．２；図３ＣはＥＦ１．１；図３ＤはＥＦ１．２；図３Ｅはｈ２２．１；図３Ｆはｈ３０．２；図３Ｇはｈ３１．１；図３Ｈはｈ３１．２；図３Ｉは５Ｉ；および図３ＪはＩ２である。
【図３Ｉ】図３Ａ〜３Ｊは、ｑＰＣＲ増幅曲線である。内部転写スペーサー（ＩＴＳ）領域、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ７０）、ベータチューブリン（ｂｔｕｂ）、伸長因子１（ＥＦ１）、およびキチンシンターゼ５と同様な配列を内部に含むコンティグを同定し、株特異性プライマーの成長のための標的として選択した。図３Ａはｂｔｕｂ．１；図３Ｂはｂｔｕｂ．２；図３ＣはＥＦ１．１；図３ＤはＥＦ１．２；図３Ｅはｈ２２．１；図３Ｆはｈ３０．２；図３Ｇはｈ３１．１；図３Ｈはｈ３１．２；図３Ｉは５Ｉ；および図３ＪはＩ２である。
【図３Ｊ】図３Ａ〜３Ｊは、ｑＰＣＲ増幅曲線である。内部転写スペーサー（ＩＴＳ）領域、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ７０）、ベータチューブリン（ｂｔｕｂ）、伸長因子１（ＥＦ１）、およびキチンシンターゼ５と同様な配列を内部に含むコンティグを同定し、株特異性プライマーの成長のための標的として選択した。図３Ａはｂｔｕｂ．１；図３Ｂはｂｔｕｂ．２；図３ＣはＥＦ１．１；図３ＤはＥＦ１．２；図３Ｅはｈ２２．１；図３Ｆはｈ３０．２；図３Ｇはｈ３１．１；図３Ｈはｈ３１．２；図３Ｉは５Ｉ；および図３ＪはＩ２である。
【図４】クリプトコッカス・フラベセンスの２つの別個の遺伝子型の生物防除効果を示す。より効果的な遺伝子型である遺伝子型Ａ型には、以前に特許取得した株ＯＨ  １８２．９（３Ｃ）、ならびにＵＳＤＡ分離株Ｙ−７３７３、ＹＢ−６０１、およびＹＢ−６０２が挙げられる。遺伝子型Ｂ型には、ＵＳＤＡ分離株Ｙ−７３７２、ＹＢ−３２８、およびＹＢ−７４４が挙げられる。５回の独立した実験にわたって組み合わせた平均疾患重症度値を示す。全部で２２７個、１５８個、および６９個の先端を、それぞれ、遺伝子型Ａ型、遺伝子型Ｂ型、および陰性対照（ｎｃ）と評価した。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。
【図５】フィールド１におけるクリプトコッカス・フラベセンス株３Ｃの検出のためのフィールドマップおよび主要サンプリングスキームである。小麦栽培領域の各６．１ｍ縞間で０．６ｍ幅の休閑歩道領域（二重実線で示す）を除いた４２．７ｍ×６１．０ｍ（最大矩形）のフィールド全体にわたって小麦（ホープウェル品種）を植えた。小麦の開花中に、６．１ｍ×６．１ｍの３つの領域に３Ｃを噴霧し、マップ中に「ｉ＿１」、「ｉ＿２」、および「ｉ＿３」として標識した網掛け領域で示した。２０１１年夏に、マップにおいてローマ数字（小麦栽培領域の内側）および短い太線（歩道に隣接する小麦栽培領域の境界に沿って）でおおよそ示された場所の各々から１つの小麦先端を刈り取ることで、３０．５ｍ×４２．７ｍの矩形（実線の５×７正方格子からなる）内でサンプリングを行った。各固有のローマ数字は、接種領域の最近点に同等の距離を持つサンプリング場所の１つの群を示す。各群の平均距離は、Ｉで０ｍ、ＩＩで１．６０ｍ、ＩＩＩで４．６４ｍ、ＩＶで７．３８ｍ、Ｖで１２．３７ｍ、ＶＩで１４．７２ｍ、ＶＩＩで１８．１２ｍであった。接種後０日目、１日目、１０日目、２６日目、および４４日目に、群Ｉ〜群Ｖの場所からサンプルを収集した。群Ｖ、ＶＩ、およびＶＩＩは、接種後４４日目にのみサンプリングした。境界場所（短い太線で示す）は、接種後１０日目にのみサンプリングした。
【図６】接種した小麦先端の３Ｃの個体群動態を示すグラフである。１平方センチメートル当たり２×１０６〜６×１０６細胞の割合で３Ｃ接種懸濁液を小麦に噴霧した。接種後５つの時点で３つの接種領域（サンプリング場所の詳細については図５を参照）から収集した小麦先端サンプル（ｎ＝５〜９）を比較した。同一文字（ａ、ｂ）を共有しない群の個体群中央値は、テューキー検定（Ｐ≦０．０５）に基づいて有意に異なっていた。Ｙ軸上の「ＤＬ」は、この実験の理論的検出限界を表す。所与の時点での３Ｃ検出で陰性だったサンプル数は、区画の底部に四角い箱で示した。
【図７Ａ】小麦畑における３Ｃ様クリプトコッカス・フラベセンスの経時的な存在度ならびに接種点に対する距離。図７Ａでは、接種点からの距離（メートル）の直尺に沿って母数レベルの閾値を超えたサンプルの平均の割合を示す。図７Ｂでは、計測された全ての距離（ローマ数字で示す距離群は図Ｓ１を参照されたい）で全てのコロニー形成レベル（着色バー）に対して陽性と判定されたサンプルの割合を示す。追加のサンプリングおよび距離Ｖ〜ＶＩＩは４４ＤＰＩでのみ提供しつつ、接種後（ＤＰＩ）０日目〜２６日目に距離Ｉ〜ＩＶからサンプルを採取したことに留意されたい。各時点での各場所群からのサンプルサイズは、距離群Ｉではｎ＝５〜９（サンプル採取日に依る）、距離群ＩＩではｎ＝１８〜２０、距離群ＩＩＩではｎ＝８〜１０、距離群ＩＶではｎ＝４〜６、距離群Ｖではｎ＝１６、距離群ＶＩではｎ＝８、および距離群ＶＩＩではｎ＝４であった。この実験の理論的検出限界は、小麦先端１グラム当たり２．７×１０３個の標的遺伝子コピーであった。
【図７Ｂ】小麦畑における３Ｃ様クリプトコッカス・フラベセンスの経時的な存在度ならびに接種点に対する距離。図７Ａでは、接種点からの距離（メートル）の直尺に沿って母数レベルの閾値を超えたサンプルの平均の割合を示す。図７Ｂでは、計測された全ての距離（ローマ数字で示す距離群は図Ｓ１を参照されたい）で全てのコロニー形成レベル（着色バー）に対して陽性と判定されたサンプルの割合を示す。追加のサンプリングおよび距離Ｖ〜ＶＩＩは４４ＤＰＩでのみ提供しつつ、接種後（ＤＰＩ）０日目〜２６日目に距離Ｉ〜ＩＶからサンプルを採取したことに留意されたい。各時点での各場所群からのサンプルサイズは、距離群Ｉではｎ＝５〜９（サンプル採取日に依る）、距離群ＩＩではｎ＝１８〜２０、距離群ＩＩＩではｎ＝８〜１０、距離群ＩＶではｎ＝４〜６、距離群Ｖではｎ＝１６、距離群ＶＩではｎ＝８、および距離群ＶＩＩではｎ＝４であった。この実験の理論的検出限界は、小麦先端１グラム当たり２．７×１０３個の標的遺伝子コピーであった。
【図８】フィールドの接種領域における３Ｃの越冬持続性を示す。３つの接種領域の収穫後の残留物は、２０１２年の１月下旬および３月下旬にサンプリングした。土壌、生えている雑草、および茶色に腐敗している植物材料の複合サンプル（Ｃ）と、腐敗していない小麦の茎のサンプル（Ｗ）とを各接種領域の中心の周りの半径約１ｍの円の中から収集した。Ｙ軸上の「ＤＬ」は、この実験の理論的検出限界を表す。各サンプル型および各時点での３Ｃ検出で陰性だったサンプル数は、区画の底部に四角い箱で示した。統計分析は、図８に存在する全てのデータポイントをランク付けした形式で、１月からのサンプルと３月からのサンプルとで別々に行った。文字の前の同一番号を共有するが同一文字は共有しない群（ｎ＝２１）の個体群中央値は、テューキー検定（Ｐ≦０．０５）に基づいて有意に異なっていた。
【図９】収穫直前の小麦先端および収穫後の脱穀粒における３Ｃ個体群を示す。各タイプのサンプル１つを、６カ所の接種区画および６カ所の非接種区画の各々から異なる時点で無作為に収集した。Ｙ軸上の「ＤＬ」は、この実験の理論的検出限界を表す。時点−処理の各組み合わせでの３Ｃ検出で陰性だったサンプル数は、区画の底部に四角い箱で示した。この図で示す統計分析は、図９に存在する全てのデータポイントをランク付けした形式で、異なるサンプル型および異なる時点で別々に行った。文字の前の同一番号を共有するが同一文字は共有しない個体群グループ（ｎ＝６）の中央値は、テューキー検定（Ｐ≦０．０５）に基づいて有意に異なっていた。
【図１０Ａ】図１０Ａおよび１０Ｂは、コロニー形成単位（ＣＦＵ）（Ａ）およびｑＰＣＲとの相関関係（Ｂ）による収穫後の脱穀粒における３Ｃ個体群の培養物に基づく定量化を示す。ＣＦＵ定量化は、収穫後１５５日目の穀粒サンプルで行った。（Ａ）では、同一文字を共有しないＣＦＵ個体群グループ（ｎ＝６）は、テューキー検定（Ｐ＝０．００４）に基づいて有意に異なっていた。（Ｂ）では、ｑＰＣＲにおける３Ｃ検出を非接種サンプルは示さなかったため、接種サンプルのみに回帰を行った（図９）。Ｘ軸上の「ＤＬ」は、この実験におけるｑＰＣＲの理論的検出限界を表す。
【図１０Ｂ】図１０Ａおよび１０Ｂは、コロニー形成単位（ＣＦＵ）（Ａ）およびｑＰＣＲとの相関関係（Ｂ）による収穫後の脱穀粒における３Ｃ個体群の培養物に基づく定量化を示す。ＣＦＵ定量化は、収穫後１５５日目の穀粒サンプルで行った。（Ａ）では、同一文字を共有しないＣＦＵ個体群グループ（ｎ＝６）は、テューキー検定（Ｐ＝０．００４）に基づいて有意に異なっていた。（Ｂ）では、ｑＰＣＲにおける３Ｃ検出を非接種サンプルは示さなかったため、接種サンプルのみに回帰を行った（図９）。Ｘ軸上の「ＤＬ」は、この実験におけるｑＰＣＲの理論的検出限界を表す。
【図１１】ｍｕｌｔｉ−ｌｏｃｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｙｐｉｎｇ（ＭＬＳＴ）法を用いて検出したクリプトコッカス・フラベセンス株間の遺伝子型変異である。遺伝子であるβ−チューブリン、キチンシンターゼ１、伸長因子１、および熱ショックタンパク質７０ｋＤａから得られた連結ＤＮＡ配列に基づくＭＬＳＴ分析は、表２に示すプライマーにより増幅された。分類群間の系統発生関係は、一般時間逆転モデルを最尤法により推測した。＞６０％のブートストラップ値（１，０００複製）を分岐の隣に示す。スケールバーは、部位あたりの塩基置換数を示す。
【図１２Ａ】生物学的検定法を用いて検出したクリプトコッカス・フラベセンス株間の表現型変異である。初期の時点（図１２Ａ）および後期の時点（図１２Ｂ）での炭素源利用および薬剤感受性パターンのクラスター分析である。検定における２つの独立したランを株ごとに行った。２つのラン間のアッセイ条件の変動により、ランＩにおけるインキュベーション７日目および１２日目からのデータは、それぞれ、ランＩＩにおけるインキュベーション１０日目および１５日目からのデータとほぼ等しかった。相関係数距離およびウォード連結法を用いたクラスター変数分析をＯＤ５９５測定値で行った。異なる群の各々は、同一株（＊）の２つの複製間の最小値よりも大きい類似率により定義された。異なる区分線パターンを用いて、遺伝子型Ａ型（均質ダッシュ）と遺伝子型Ｂ型（代替ダッシュ）とを区別した。
【図１２Ｂ】生物学的検定法を用いて検出したクリプトコッカス・フラベセンス株間の表現型変異である。初期の時点（図１２Ａ）および後期の時点（図１２Ｂ）での炭素源利用および薬剤感受性パターンのクラスター分析である。検定における２つの独立したランを株ごとに行った。２つのラン間のアッセイ条件の変動により、ランＩにおけるインキュベーション７日目および１２日目からのデータは、それぞれ、ランＩＩにおけるインキュベーション１０日目および１５日目からのデータとほぼ等しかった。相関係数距離およびウォード連結法を用いたクラスター変数分析をＯＤ５９５測定値で行った。異なる群の各々は、同一株（＊）の２つの複製間の最小値よりも大きい類似率により定義された。異なる区分線パターンを用いて、遺伝子型Ａ型（均質ダッシュ）と遺伝子型Ｂ型（代替ダッシュ）とを区別した。
【図１３】クリプトコッカス・フラベセンスの２つの別個の遺伝子型の生物防除効果を示す。評価した株は、３Ｃ、Ｙ−７３７３、ＹＢ−６０１、およびＹＢ−６０２（遺伝子型Ａ型）、ならびにＹ−７３７２、ＹＢ−３２８、およびＹＢ−７４４（遺伝子型Ｂ型）であった。接種後２つの時点でデータを収集し、この分析のための５回の独立した実験からデータをプールした。全部で６９個、２２７個、１５８個、および６９個の先端を、それぞれ、陰性対照（ＮＣ）、遺伝子型Ａ型、および遺伝子型Ｂ型の処理サンプルとして評価した。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。
【図１４Ａ】クリプトコッカス・フラベセンス株を一貫して２つの群に分け、図１４Ａにβ−チューブリン、図１４Ｂにキチンシンターゼ１、図１４Ｃに伸長因子１、図１４Ｄに熱ショックタンパク質７０ｋＤａ、および図１４Ｅにキチンシンターゼ５プラス下流匿名領域のＤＮＡ配列によって個々に示す。全ての遺伝子型Ａ型株は、同一クレード（上位）であったが、遺伝子型Ｂ型株は、他のクレード（下位）であった。分類群間の系統発生関係は、一般時間逆転モデルを最尤法により推測した。＞６０％のブートストラップ値（１，０００複製）を分岐の隣に示す。スケールバーは、部位あたりの塩基置換数を示す。
【図１４Ｂ】クリプトコッカス・フラベセンス株を一貫して２つの群に分け、図１４Ａにβ−チューブリン、図１４Ｂにキチンシンターゼ１、図１４Ｃに伸長因子１、図１４Ｄに熱ショックタンパク質７０ｋＤａ、および図１４Ｅにキチンシンターゼ５プラス下流匿名領域のＤＮＡ配列によって個々に示す。全ての遺伝子型Ａ型株は、同一クレード（上位）であったが、遺伝子型Ｂ型株は、他のクレード（下位）であった。分類群間の系統発生関係は、一般時間逆転モデルを最尤法により推測した。＞６０％のブートストラップ値（１，０００複製）を分岐の隣に示す。スケールバーは、部位あたりの塩基置換数を示す。
【図１４Ｃ】クリプトコッカス・フラベセンス株を一貫して２つの群に分け、図１４Ａにβ−チューブリン、図１４Ｂにキチンシンターゼ１、図１４Ｃに伸長因子１、図１４Ｄに熱ショックタンパク質７０ｋＤａ、および図１４Ｅにキチンシンターゼ５プラス下流匿名領域のＤＮＡ配列によって個々に示す。全ての遺伝子型Ａ型株は、同一クレード（上位）であったが、遺伝子型Ｂ型株は、他のクレード（下位）であった。分類群間の系統発生関係は、一般時間逆転モデルを最尤法により推測した。＞６０％のブートストラップ値（１，０００複製）を分岐の隣に示す。スケールバーは、部位あたりの塩基置換数を示す。
【図１４Ｄ】クリプトコッカス・フラベセンス株を一貫して２つの群に分け、図１４Ａにβ−チューブリン、図１４Ｂにキチンシンターゼ１、図１４Ｃに伸長因子１、図１４Ｄに熱ショックタンパク質７０ｋＤａ、および図１４Ｅにキチンシンターゼ５プラス下流匿名領域のＤＮＡ配列によって個々に示す。全ての遺伝子型Ａ型株は、同一クレード（上位）であったが、遺伝子型Ｂ型株は、他のクレード（下位）であった。分類群間の系統発生関係は、一般時間逆転モデルを最尤法により推測した。＞６０％のブートストラップ値（１，０００複製）を分岐の隣に示す。スケールバーは、部位あたりの塩基置換数を示す。
【図１４Ｅ】クリプトコッカス・フラベセンス株を一貫して２つの群に分け、図１４Ａにβ−チューブリン、図１４Ｂにキチンシンターゼ１、図１４Ｃに伸長因子１、図１４Ｄに熱ショックタンパク質７０ｋＤａ、および図１４Ｅにキチンシンターゼ５プラス下流匿名領域のＤＮＡ配列によって個々に示す。全ての遺伝子型Ａ型株は、同一クレード（上位）であったが、遺伝子型Ｂ型株は、他のクレード（下位）であった。分類群間の系統発生関係は、一般時間逆転モデルを最尤法により推測した。＞６０％のブートストラップ値（１，０００複製）を分岐の隣に示す。スケールバーは、部位あたりの塩基置換数を示す。
【図１５】フィールドにおける接種した小麦先端の３Ｃ様クリプトコッカス・フラベセンスの個体群動態である。１平方センチメートル当たり２×１０６〜６×１０６細胞の割合で３Ｃ接種懸濁液を小麦に噴霧した。接種後５つの時点で３つの接種領域（サンプリング場所の詳細については図Ｓ１を参照）から先端サンプル（サンプル採取日によって、ｎ＝５〜９）を収集した。図１５に存在するランク付けされたデータでテューキー検定を行い、同一文字（ａ、ｂ）を共有しない群の個体群中央値は、有意に異なっていた（Ｐ≦０．０５）。Ｙ軸上の「ＤＬ」は、この実験の理論的検出限界を表す。任意の測定時点での３Ｃ検出で陰性だったサンプルは１つだけであり、区画の底部に四角い箱で示した。
【図１６】接種区画における３Ｃ様クリプトコッカス・フラベセンスの越冬持続性を示す。３つの接種領域の収穫後の残留物は、２０１２年の１月下旬および３月下旬にサンプリングした。土壌、生えている雑草、および茶色に腐敗している植物材料の複合サンプル（Ｃ）と、残った小麦の茎のサンプル（Ｗ）とを各接種領域の中心の周りの半径約１ｍの円の中から収集した。Ｙ軸上の「ＤＬ」は、この実験の理論的検出限界を表す。各サンプル型および各時点での検出で陰性だったサンプル数は、区画の底部に四角い箱で示した。統計分析は、図１６に存在する全てのデータポイントをランク付けした形式で、１月からのサンプルと３月からのサンプルとで別々に行った。文字の前の同一番号を共有するが同一文字は共有しない群（ｎ＝２１）の個体群中央値は、ランク変換データのテューキー検定（Ｐ≦０．０５）に基づいて有意に異なっていた。
【図１７】収穫前および収穫後の小麦先端および穀粒における３Ｃ様クリプトコッカス・フラベセンスの検出を示す。各タイプのサンプル１つを、６カ所の接種区画および６カ所の非接種区画の各々から異なる時点で無作為に収集した。Ｙ軸上の「ＤＬ」は、この実験の理論的検出限界を表す。時点−処理の各組み合わせでの検出で陰性だったサンプル数は、区画の底部に四角い箱で示した。この図で示す統計分析は、異なるサンプル型および異なる時点で別々に行った。文字の前の同一番号を共有するが同一文字は共有しない個体群グループ（ｎ＝６）の中央値は、ランク変換データのテューキー検定（Ｐ≦０．０５）に基づいて有意に異なっていた。
【図１８】３Ｃおよび他の６つのクリプトコッカス・フラベセンス株からのｑＰＣＲアンプリコンの配列アラインメントである。コンセンサス配列は、アラインメントの上部である。プライマー結合であるｈ３１．２＿Ｆ（１〜２２ｂｐ）およびｈ３１．２＿Ｒ（１２９〜１５０ｂｐ）と、Ａｕｇｕｓｔｕｓによりエクソン（３９〜１５０ｂｐ）として予測された領域とを示す。図１８は、出現順序でそれぞれ、配列番号９１〜９２、９２、９２、９３〜９４、９４〜９６、９６、９６、９６〜９７、９７、９７〜９９、９９、９９、９９〜１００、１００、および１００を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本開示を通じて、種々の刊行物、特許および公開された特許明細書が参照されている。本発明が属する技術分野の状況をより完全に説明するために、これらの刊行物の開示、特許および公開された特許明細書は、参照により本開示中に援用される。
【００６１】
本明細書に記載される全ての刊行物は、該刊行物が引用するものと関連して方法および／または材料を開示し記載するために、参照により本明細書に援用される。本明細書に引用される刊行物は、本出願の出願日の前のそれらの開示に対してのみ引用される。ここにおける何も、先行発明に基づいてかかる刊行物に先行する権利がないことを自認したと解されるものではない。さらに、本明細書で提供される公開日は、実際の公開日とは異なっていてもよく、個別の検証が必要とされ得る。
【００６２】
これらの方法および試薬は変化し得るので、本組成物および方法は、他に規定されていない限りにおいて特定の合成方法に限定されず、または、他に規定されていない限りにおいて特定の試薬に限定されないことが理解されるべきである。本明細書において用いられている用語法は、特定の態様を説明することのみを目的とし、限定的であることは意図されていないこともまた理解されるべきである。さらに、別段の記載がない限りにおいて、本明細書に記載のいずれかの方法は、そのステップが特定の順番で実施される必要性があると解釈されることは如何様にも意図されていない。従って、ステップがたどるべき順番が方法の請求項に実際に記載されていない場合、もしくは特許請求の範囲または明細書において、ステップは特定の順番に限定されていると方法の請求項が特定的に規定していない場合、どのような観点においても、順番が推定されていることは如何様にも意図されていない。これは、ステップまたは作業フローの順序に関する論理性、文法上の構成もしくは句読法から導かれる平易な意味、または、明細書中に記載されている態様の数またはタイプを含む解釈のための可能性のある明示的ではないいずれかの根拠に適用される。
【００６３】
１．定義
【００６４】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられているところ、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈中において明らかに相反して記載されていない限り、複数の参照対象を含む。それ故、例えば、「クリプトコッカス・フラベセンス株」、「量」、または「植物」への参照は、２つ以上のこのようなクリプトコッカス・フラベセンス株、量、または植物などの混合物を含む。
【００６５】
範囲は、本明細書において、１つの特定の値（「約」）から、および／または、他の特定の値（「約」）までとして表記されることが可能である。このような範囲が表記されている場合、さらなる態様は、１つの特定の値から、および／または、他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表記されている場合、先行詞「約」を用いることにより、特定の値がさらなる態様を形成することが理解されるであろう。範囲の各々の端点は、他の端点との関係において、および、他の端点とは独立して、共に重要であることもまた理解されるであろう。多数の値が本明細書に開示されており、値の各々はまた、本明細書において、その値自体に追加して特定の値の「約」として開示されていることもまた理解される。例えば、値「１０」が開示されている場合、「約１０」もまた開示されている。２つの特定の単位間の各単位もまた開示されていることもまた理解される。例えば、１０〜１５の範囲が開示されている場合、１１、１２、１３、および、１４もまた開示されている。
【００６６】
本明細書で使用される「穀物」という用語は、ＦＨＢの影響を受けやすい任意の穀物用植物種を指すものである。小麦や大麦はこの病気が大きな経済問題となる２つの作物ではあるが、ＦＨＢの影響を受けやすいと報告されている穀物としては、限定されないが、小麦、大麦、米、オート麦、スペルト小麦、およびライ小麦が挙げられる。これらの穀物のいずれも本明細書に記載される方法を用いてＦＨＢを治療することができる。
【００６７】
「微生物アンタゴニスト」という用語は、穀物用植物などの植物における病原菌もしくは病原性疾患の進行を予防する、抑制する、治療する、または防除する微生物を指すものである。微生物アンタゴニストは、果実および他の収穫可能な部分を含む植物における収穫前または収穫後の病気の予防、抑制、治療、または防除をもたらすことができる。例えば、微生物アンタゴニストを用いて、ＦＨＢを治療してもよい。微生物アンタゴニスト活性は、種々のメカニズムにより達成してもよい。場合によっては、微生物アンタゴニストは、例えば、ＦＨＢなどの植物病原菌に拮抗してもよい。アンタゴニスト自体は、バクテリア、菌、または他の型の微生物であってもよい。例えば、微生物アンタゴニストは、未処理対照のＦＨＢ阻害度を統計的に有意なレベルで超えるＦＨＢ阻害度を示す。
【００６８】
「抑制する」または「抑制している」という用語は、軽減または阻害を指すものである。例えば、「赤かび病を抑制している」とは、赤かび病に起因する病気のレベルを軽減していることを指すものである。赤かび病を「抑制している」ことは、赤かび病を「治療している」ことと交換可能である。治療することは、病気、病態、または疾患を治す、改善する、安定させる、または予防する意図を指すものである。それ故、用語は、病気を予防すること、阻害すること、抑制すること、または緩和することを含むいずれの治療も包含する。
【００６９】
本明細書で使用される、「有効量」および「に有効な量」という用語は、所望の結果を達成するかまたは望ましくない病態に効果があるのに十分な組成物の量を指すものである。例えば、有効量は、対応する未処理対照のものと比べて赤かび病のレベルを軽減することができる。有効量は、望ましくない効果をもたらすことなく所望の結果を達成するのに十分な量である。開示された方法の一態様において、有効量は、限定されないが、治療すべき穀物用植物の種類、投与量、投与経路、治療期間、および併用されるいずれの組成物または微生物アンタゴニストなどの因子に応じて変化し得る。
【００７０】
本明細書で使用される、ポリヌクレオチド配列に適用されるような、「同一性パーセント」という用語は、分子進化・系統学的解析（ＭＥＧＡ）ソフトウェア（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、Ｔｅｍｐｅ、ＡＺ）で用いられるＣｌｕｓｔａｌＷおよびＭｕｓｃｌｅアルゴリズムなどの標準化アルゴリズムを用いて並べた、少なくとも２つの配列間の残留物マッチの割合を指すものである。他のアラインメントツール、例えば、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴプログラムスーツ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（例えば、ｂｌａｓｔ、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ヌクレオチドｂｌａｓｔ、およびタンパク質ｂｌａｓｔ）などを用いて同一性パーセントを決定してもよい。
【００７１】
同一性パーセントは、例えば特定の配列番号によって定義されるような全定義配列の長さに渡って測定してもよいし、あるいは、より短い長さに渡って、例えば、より長い定義配列から取った断片、例えば、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７０、少なくとも１００、または少なくとも２００の連続するヌクレオチドの断片の長さに渡って測定してもよい。このような長さは例示のみであり、表、図面、または配列リストにおいて本明細書に示される配列により支持されるいかなる断片長を用いて、同一性パーセントを測定することが可能な長さを説明するのに使用可能であると理解される。
【００７２】
本明細書で使用される、「ホモログ」および「相同な」という用語は、配列を説明するために用いる場合、別の変異体である配列を指すものであり、ここで、２つの配列は進化的に関係している。本開示において、特定の遺伝子を参照する場合、用語は、かかる遺伝子またはタンパク質のホモログおよびオルソログ、変異体、誘導体、ならびに突然変異体を包含することを意味する。本発明は、開示したポリヌクレオチドのいずれかの完全配列を用いた実施形態に限らず、構造、配列、機能により関連するかもしくは指名されたポリヌクレオチドからいかようにも誘導されるあらゆる変異体を包含する。例えば、本発明は、遺伝子：β−チューブリン、キチンシンターゼ１、伸長因子１、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ、およびｃｓ２２（キチンシンターゼ５プラス下流匿名領域）のクリプトコッカス・フラベセンスの全株のうち、例えば、少なくとも８５％の一次核酸配列同一性を有するポリヌクレオチドを包含する。
【００７３】
「変異体」とは、参照ポリヌクレオチドとは異なるが、本質的な特性を保持するポリヌクレオチドを指すものである。ポリヌクレオチドの通常の変異体は、別の参照ポリヌクレオチドと核酸配列が異なる。一般に、差は限られているため、参照ポリヌクレオチドおよび変異体の配列は全体的に極めて類似しており、多くの領域において同一である。変異体および参照ポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾（置換、付加、および／または欠失）により核酸配列が異なる。変異体は、天然に存在するものでも、天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレオチド変異体は、例えば、元のポリヌクレオチドの全長にわたって少なくとも９９％、９５％、９０％、または少なくとも８５％の配列同一性パーセントを有し得る。変異体は、変異体であり、化学的または生化学的に修飾され得、かつ、１つ以上のアミノヌクレオチド置換、付加、および／または欠失を有し得るポリヌクレオチドの誘導体であってもよい。変異体は、変異体であるポリヌクレオチドを持つ機能的に重要な特定モチーフを共有してもよい。
【００７４】
本明細書で使用される、「閾値サイクル（Ｃｔ）」という用語は、ｑＰＣＲ増幅曲線と閾値ラインとの間の交点を指すものである。閾値ラインは、一般に、バックグラウンド蛍光の標準偏差の１０倍である。閾値ラインを上回る第１のサイクルは、Ｃｔと定義される。テンプレート濃度のある範囲内で、Ｃｔ値は反応開始時に存在するテンプレートコピー数に比例しており、テンプレートを定量化する最初の機会を反映する。本明細書に開示されたプライマー−プローブ配列のミスマッチは、ＤＮＡ増幅の効率に変化をもたらす。一般に、ミスマッチ数が増すと、ｑＰＣＲ効率が低下する。これらのｑＰＣＲ効率（およびその基礎となるプライマー−プローブミスマッチ）が変化することにより、本明細書に開示された遺伝子型Ａ型クリプトコッカス・フラベセンスと遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンスとを区別することができる。
【００７５】
２．クリプトコッカス・フラベセンス遺伝子型の同定方法
【００７６】
クリプトコッカス・フラベセンスの特定の遺伝子型を同定する方法を提供する。例えば、遺伝子型Ａ型および遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株は、開示された定量ＰＣＲまたは配列同一性の方法を用いて同定してもよい。クリプトコッカスは、酵母菌として培養下で成長する菌属である。クリプトコッカスの１種であるクリプトコッカス・フラベセンスは、被包性の酵母菌である。クリプトコッカス・フラベセンスは、ＦＨＢの生物学的防除剤であり、耐乾燥性が改善していることが実証されている。異なる遺伝子型のクリプトコッカス・フラベセンスは、ＦＨＢなどの病気を異なる効率で治療することができる。従って、クリプトコッカス・フラベセンス遺伝子型を区別する方法を開発することは有利となり得る。
【００７７】
定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）とも呼ばれるリアルタイムＰＣＲを用いて、異なる種もしくは遺伝子型のクリプトコッカス・フラベセンスを同定することができる。ｑＰＣＲアッセイは、標的株だけを培養し、かつ、標的株の抗生物質耐性に基づいた従来の検出方法よりも早く、安価で、かつ信頼性が高い。プライマーおよびアッセイ条件は、３Ｃに遺伝的に同様で、かつ、同様の生物防除表現型を発現するクリプトコッカス・フラベセンスの環境株を単離するのに容易に適合させてもよい。さらに、追加のプライマーセットは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＵＧ０１０００００１〜ＣＡＵＧ０１０００７１２により提供されるゲノム配列を用いて定義してもよい。例えば、クリプトコッカス・フラベセンス遺伝子型Ａ型もしくは遺伝子型Ｂ型株は、微生物から得られたＤＮＡにｑＰＣＲを行うことで同定してもよい。ｑＰＣＲは、株ごとにＣｔ値をもたらす。ｑＰＣＲ中に用いたプライマーセットに応じて、Ｃｔ値は、特定のクリプトコッカス・フラベセンス遺伝子型を示すことができる。以下に説明するものは、遺伝子型Ａ型および遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株を示すｑＰＣＲプライマーおよびＣｔ値の例である。
【００７８】
クリプトコッカス・フラベセンス遺伝子型を同定する別の方法は、特定の遺伝子の配列同一性を決定することを含む。例えば、β−チューブリン、キチンシンターゼ１、伸長因子１、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ、およびｃｓ２２（キチンシンターゼ５プラス下流匿名領域）遺伝子配列のうちの１つ以上の配列同一性を決定し、決定された配列を公知の遺伝子型Ａ型および遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株における相同遺伝子配列と比較することを用いて、試験対象株の遺伝子型を同定することができる。β−チューブリン、キチンシンターゼ１、伸長因子１、熱ショックタンパク質７０、およびｃｓ２２（キチンシンターゼ５プラス下流匿名領域）の多座位配列分析を用いて、同様に、クリプトコッカス・フラベセンス株を２つの別個の群もしくは遺伝子型に分類することもできる。内部転写スペーサー（ＩＴＳ）領域などのクリプトコッカス・フラベセンスＤＮＡのいくつかの領域は、全てのクリプトコッカス・フラベセンス株が同一のＩＴＳ配列であるため、クリプトコッカス・フラベセンス亜種を区別するのに用いることができない。遺伝子型Ａ型および遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株を決定するのに用いられる配列同一性の例を以下に説明する。
【００７９】
本明細書に記載されるように、ｑＰＣＲ中に決定されたＣｔ値または配列同一性を用いて、クリプトコッカス・フラベセンスの遺伝子型を区別してもよい。これらの株は、開示された方法で用いてもよい。同定方法には、試験対象ＤＮＡを回収する初期工程が含まれ得る。例えば、ゲノムＤＮＡは、微生物から抽出されてもよく、または穀物用植物種子先端を収集し、これらの先端から単離されたＤＮＡであってもよい。ＤＮＡが得られると、公知のクリプトコッカス・フラベセンス株と比較した際に配列同一性を決定するために、本明細書で同定されたプライマーおよびプローブを用いてｑＰＣＲを行ってもよく、あるいは公知の配列決定技術を用いてＤＮＡの配列を決定してもよい。
【００８０】
いくつかの態様において、クリプトコッカス・フラベセンスの遺伝子型を同定する方法には、複数のプライマーセットでｑＰＣＲを行うことが含まれる。本方法には、複数の遺伝子で配列同一性を比較することも含まれ得る。場合によっては、同定方法をｑＰＣＲ技術および配列同一性技術の両方に組み込んで、遺伝子型Ａ型もしくは遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株を同定してもよい。例えば、特定のプライマーセットを用いたｑＰＣＲを微生物から単離されたＤＮＡで行い、単離されたＤＮＡの特定の遺伝子の配列同一性を公知の遺伝子型Ａ型および遺伝子型Ｂ型株のものと比較することを行ってもよい。従って、ｑＰＣＲおよび配列同一性の結果を組み合わせることにより、クリプトコッカス・フラベセンス遺伝子型の同一性をもたらすことができる。
【００８１】
本明細書で同定されたものに加えてクリプトコッカス・フラベセンスの株を、本明細書に記載されるプライマーおよび配列同一性を用いて、当業者により同定し回収することができる。
【００８２】
開示された方法には、本明細書に記載されるクリプトコッカス・フラベセンス株ならびに本明細書に記載されるクリプトコッカス・フラベセンス株を含む組成物の使用が含まれ得る。
【００８３】
ｉ．遺伝子型Ａ型
【００８４】
クリプトコッカス・フラベセンス遺伝子型Ａ型株を開示された方法に用いることができる。遺伝子型Ａ型株の例としては、ＯＨ  １８２．９（３Ｃ）、Ｙ−７３７３、Ｙ７３７７、ＹＢ６０１、およびＹＢ−６０２が挙げられる。
【００８５】
遺伝子型Ａ型株は、ｑＰＣＲにより検出することができる。一態様において、ｂｔｕｂ．１、ｂｔｕｂ．２、ｈ３１．２、ＥＦ１．２、ｈ２２．１、ｈ３０．２、ｈ３１．１、およびＩ２から選択された１つ以上のプライマーセットで増幅を行う（表１および図３を参照されたい）。遺伝子型Ａ型株は、ｂｔｕｂ．１、ｂｔｕｂ．２、またはＥＦ１．２プライマーセットを用いた際に１７〜２１のＣｔ値を有し得る。遺伝子型Ａ型株は、ｈ２２．１、ｈ３０．２、またはｈ３１．１プライマーセットを用いた際に１８〜２０のＣｔ値を有し得る。遺伝子型Ａ型株は、ｈ３１．２プライマーセットを用いた際に１７〜２０のＣｔ値を有し得る。遺伝子型Ａ型株は、Ｉ２プライマーセットを用いた際に１２〜１５のＣｔ値を有し得る。
【００８６】
本明細書に記載される方法で用いられる遺伝子型Ａ型株は、決定されたポリヌクレオチド配列を他の遺伝子型Ａ型株の公知の相同配列と比較することによって同定することもできる。例えば、これらの遺伝子に対して開示された配列と比較したβ−チューブリン、キチンシンターゼ１、伸長因子１、熱ショックタンパク質７０、およびｃｓ２２（キチンシンターゼ５プラス下流匿名領域）のうちの１つ以上の遺伝子配列の同一性パーセントを用いて、遺伝子型Ａ型株を同定することができる。以下に開示されている配列同一性を共有するこれらの株は、遺伝子型Ａ型株と見なされる。
【００８７】
ａ．β−チューブリン遺伝子配列
【００８８】
遺伝子型Ａ型株は、β−チューブリン遺伝子の株のうち１００％の配列同一性を共有する。従って、配列番号１に１００％の同一性を有するこれらのクリプトコッカス・フラベセンス株は、遺伝子型Ａ型株として分類することができる。
【００８９】
ｂ．キチンシンターゼ１遺伝子配列
【００９０】
遺伝子型Ａ型株は、キチンシンターゼ１遺伝子で９５％〜１００％の配列同一性を共有することができる。一態様において、遺伝子型Ａ型株は、キチンシンターゼ１遺伝子で少なくとも９５．２％の配列同一性を共有する。従って、配列番号２、３、４、５、または６に９５％〜１００％の配列同一性を有するクリプトコッカス・フラベセンス株は、遺伝子型Ａ型株として分類することができる。
【００９１】
ｃ．伸長因子１（ＥＦ１）遺伝子配列
【００９２】
遺伝子型Ａ型株は、ＥＦ１遺伝子で９９％〜１００％の配列同一性を共有することができる。一態様において、遺伝子型Ａ型株は、ＥＦ１遺伝子で少なくとも９９．７％の配列同一性を共有する。配列番号７、８、９、１０、または１１に９９％〜１００％の配列同一性を有するクリプトコッカス・フラベセンス株は、遺伝子型Ａ型株として分類することができる。
【００９３】
ｄ．熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ｈｓｐ７０）遺伝子配列
【００９４】
遺伝子型Ａ型株は、ｈｓｐ７０遺伝子で９９％〜１００％の配列同一性を共有することができる。一態様において、遺伝子型Ａ型株は、ｈｓｐ７０遺伝子で少なくとも９９％の配列同一性を共有する。配列番号１２、１３、１４、１５、または１６に９９％〜１００％の配列同一性を有するクリプトコッカス・フラベセンス株は、遺伝子型Ａ型株として分類することができる。
【００９５】
ｅ．ｃｓ２２（キチンシンターゼ５プラス下流匿名領域）標的遺伝子座配列
【００９６】
遺伝子型Ａ型株は、ｃｓ２２標的遺伝子座で９９％〜１００％の配列同一性を共有することができる。一態様において、遺伝子型Ａ型株は、ｃｓ２２標的遺伝子座で少なくとも９９％の配列同一性を共有する。配列番号８５、８６、８７、８８、または８９に９９％〜１００％の配列同一性を有するクリプトコッカス・フラベセンス株は、遺伝子型Ａ型株として分類することができる。
【００９７】
ｉｉ．遺伝子型Ｂ型
【００９８】
クリプトコッカス・フラベセンス遺伝子型Ｂ型株もしくは非３Ｃ株を開示された方法に用いることができる。遺伝子型Ｂ型株の例としては、Ｙ−７３７２、Ｙ−７３７４、Ｙ−７３７５、Ｙ−７３７６、Ｙ−７３７９、ＹＢ−３２８、およびＹＢ−７４４が挙げられる。
【００９９】
遺伝子型Ｂ型株は、ｑＰＣＲにより検出することができる。一態様において、ｂｔｕｂ．１、ｂｔｕｂ．２、ｈ３１．２、ＥＦ１．２、ｈ２２．１、ｈ３０．２、ｈ３１．１、およびＩ２から選択された１つ以上のプライマーセットで増幅を行う（表１および図３を参照されたい）。遺伝子型Ｂ型株は、ｂｔｕｂ．１プライマーセットを用いた際に３１〜３３のＣｔ値を有し得る。遺伝子型Ｂ型株は、ｂｔｕｂ．２プライマーセットを用いた際に３２〜３５のＣｔ値を有し得る。遺伝子型Ｂ型株は、ＥＦ１．２プライマーセットを用いた際に２４〜２６のＣｔ値を有し得る。遺伝子型Ｂ型株は、ｈ２２．１またはｈ３１．１プライマーセットを用いた際に２２〜２４のＣｔ値を有し得る。遺伝子型Ｂ型株は、ｈ３０．２プライマーセットを用いた際に２２〜２３のＣｔ値を有し得る。遺伝子型Ｂ型株は、ｈ３１．２プライマーセットを用いた際に３４〜３５のＣｔ値を有し得る。遺伝子型Ｂ型株は、Ｉ２プライマーセットを用いた際に１５〜１８よりも大きいＣｔ値を有し得る。
【０１００】
本明細書に記載される方法で用いられる遺伝子型Ｂ型株は、決定されたポリヌクレオチド配列を他の遺伝子型Ｂ型株の公知の相同配列と比較することによって同定することもできる。例えば、これらの遺伝子に対して開示された配列と比較したβ−チューブリン、キチンシンターゼ１、伸長因子１、熱ショックタンパク質７０、およびｃｓ２２（キチンシンターゼ５プラス下流匿名領域）のうちの１つ以上の遺伝子配列の同一性パーセントを用いて、遺伝子型Ｂ型株を同定することができる。以下に開示されている配列同一性を共有するこれらの株は、遺伝子型Ｂ型株と見なされる。
【０１０１】
ａ．β−チューブリン遺伝子配列
【０１０２】
遺伝子型Ｂ型株は、β−チューブリン遺伝子で９９％〜１００％の配列同一性を共有することができる。一態様において、遺伝子型Ｂ型株は、β−チューブリン遺伝子で少なくとも９９．６％の配列同一性を共有する。配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３に９９％〜１００％の配列同一性を有するクリプトコッカス・フラベセンス株は、遺伝子型Ｂ型株として分類することができる。
【０１０３】
ｂ．キチンシンターゼ１遺伝子配列
【０１０４】
遺伝子型Ｂ型株は、キチンシンターゼ１遺伝子で９８％〜１００％の配列同一性を共有することができる。一態様において、遺伝子型Ｂ型株は、キチンシンターゼ１遺伝子で少なくとも９８．８％の配列同一性を共有する。配列番号２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０に９７％〜１００％の配列同一性を有するクリプトコッカス・フラベセンス株は、遺伝子型Ｂ型株として分類することができる。
【０１０５】
ｃ．伸長因子１遺伝子配列
【０１０６】
遺伝子型Ｂ型株は、ＥＦ１遺伝子で９９％〜１００％の配列同一性を共有することができる。一態様において、遺伝子型Ｂ型株は、ＥＦ１遺伝子で９９．７％の配列同一性を共有する。配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、または３７に９９％〜１００％の配列同一性を有するクリプトコッカス・フラベセンス株は、遺伝子型Ｂ型株として分類することができる。
【０１０７】
ｄ．熱ショックタンパク質７０ｋＤａ遺伝子配列
【０１０８】
遺伝子型Ｂ型株は、ｈｓｐ７０遺伝子で９９％〜１００％の配列同一性を共有することができる。一態様において、遺伝子型Ｂ型株は、ｈｓｐ７０遺伝子で９９．１％の配列同一性を共有する。配列番号３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４に９９％〜１００％の配列同一性を有するクリプトコッカス・フラベセンス株は、遺伝子型Ｂ型株として分類することができる。
【０１０９】
ｅ．ｃｓ２２（キチンシンターゼ５プラス下流匿名領域）遺伝子配列
【０１１０】
遺伝子型Ｂ型株は、ｃｓ２２標的遺伝子座での株のうち１００％の配列同一性を共有する。従って、配列番号９０に１００％の同一性を有するこれらのクリプトコッカス・フラベセンス株は、遺伝子型Ｂ型株として分類することができる。
【０１１１】
ｉｉｉ．クリプトコッカス・フラベセンスとして菌の同定
【０１１２】
菌は、決定されたポリヌクレオチド配列を他のクリプトコッカス・フラベセンス株の公知の相同配列と比較することによって、クリプトコッカス・フラベセンスの株として同定することができる。例えば、これらの遺伝子に対して開示された配列と比較したβ−チューブリン、キチンシンターゼ１、伸長因子１、熱ショックタンパク質７０、およびｃｓ２２（キチンシンターゼ５プラス下流匿名領域）のうちの１つ以上の遺伝子配列の同一性パーセントを用いて、クリプトコッカス・フラベセンスの種として菌を同定することができる。
【０１１３】
ａ．β−チューブリン遺伝子配列
【０１１４】
クリプトコッカス・フラベセンス株は、β−チューブリン遺伝子で９５％〜１００％の配列同一性を共有することができる。一態様において、クリプトコッカス・フラベセンス株は、β−チューブリン遺伝子で少なくとも９５．１％の配列同一性を共有する。
【０１１５】
ｂ．キチンシンターゼ１遺伝子配列
【０１１６】
クリプトコッカス・フラベセンス株は、キチンシンターゼ１遺伝子で８９％〜１００％の配列同一性を共有することができる。一態様において、クリプトコッカス・フラベセンス株は、キチンシンターゼ１遺伝子で少なくとも９５．５％の配列同一性を共有する。
【０１１７】
ｃ．伸長因子１遺伝子配列
【０１１８】
クリプトコッカス・フラベセンス株は、伸長因子１遺伝子で９４％〜１００％の配列同一性を共有することができる。一態様において、クリプトコッカス・フラベセンス株は、伸長因子１遺伝子で少なくとも９４．１％の配列同一性を共有する。
【０１１９】
ｄ．熱ショックタンパク質７０ｋＤａ遺伝子配列
【０１２０】
クリプトコッカス・フラベセンス株は、熱ショックタンパク質７０遺伝子で９３％〜１００％の配列同一性を共有することができる。一態様において、クリプトコッカス・フラベセンス株は、熱ショックタンパク質７０遺伝子で少なくとも９３．７％の配列同一性を共有する。
【０１２１】
ｅ．ｃｓ２２（キチンシンターゼ５プラス下流匿名領域）遺伝子配列
【０１２２】
クリプトコッカス・フラベセンス株は、ｃｓ２２標的遺伝子座で７９％〜１００％の配列同一性を共有することができる。一態様において、クリプトコッカス・フラベセンス株は、ｃｓ２２標的遺伝子座で少なくとも７９．４％の配列同一性を共有する。
【０１２３】
ｆ．クリプトコッカス・フラベセンスの株として菌の同定
【０１２４】
遺伝子β−チューブリン、キチンシンターゼ１、伸長因子１、熱ショックタンパク質７０、およびｃｓ２２の連結にわたって、クリプトコッカス・フラベセンス株は、少なくとも８９．８％の配列同一性を共有する。従って、これら５つの遺伝子のうち少なくとも８９．８％の配列同一性を共有する菌は、クリプトコッカス・フラベセンスの種として同定することができる。
【０１２５】
３．穀物用植物における赤かび病の抑制方法
【０１２６】
少なくとも１つの微生物アンタゴニストの有効量を前記植物の種子先端に塗布することによる穀物用植物におけるＦＨＢの抑制方法を提供する。微生物アンタゴニストは、遺伝子型Ａ型クリプトコッカス・フラベセンス株もしくは遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株であってもよく、クリプトコッカス・フラベセンスの株は、ＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７８で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス３ＣもしくはＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７９で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス４Ｃではない。
【０１２７】
本方法の一態様において、遺伝子型Ａ型クリプトコッカス・フラベセンス株を用いて、少なくとも１つの遺伝子型Ａ型クリプトコッカス・フラベセンス株の有効量を穀物用植物の種子先端に塗布することによって穀物用植物におけるＦＨＢを抑制することができる。本明細書に記載される遺伝子型Ａ型クリプトコッカス・フラベセンス株のいずれかを用いてもよい。例えば、遺伝子型Ａ型クリプトコッカス・フラベセンス株には、Ｙ−７３７３、Ｙ７３７７、ＹＢ６０１、およびＹＢ−６０２を含み得る。
【０１２８】
本方法の一態様において、遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株を用いて、少なくとも１つの遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株の有効量を穀物用植物の種子先端に塗布することによって穀物用植物におけるＦＨＢを抑制することができる。本明細書に記載される遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株のいずれかを用いてもよい。例えば、遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株には、Ｙ−７３７２、Ｙ−７３７４、Ｙ−７３７５、Ｙ−７３７６、Ｙ−７３７９、ＹＢ−３２８、およびＹＢ−７４４を含み得る。
【０１２９】
開示された方法は、クリプトコッカス・フラベセンスの有効量を穀物用植物に塗布することを伴う。クリプトコッカス・フラベセンスの有効量は、対応する未処理対照におけるものに対してＦＨＢのレベルを減少させる量であってもよい。クリプトコッカス・フラベセンスの有効量は、１０４〜１０９ＣＦＵ／ｍｌであってもよい。例えば、１０７〜１０８ＣＦＵ／ｍｌのクリプトコッカス・フラベセンスレベルを用いてもよい。場合によっては、５×１０９ＣＦＵ／ｍｌを２０ｇａｌ／エーカーで塗布してもよい。開示された方法の一態様において、未処理対照におけるＦＨＢレベルは予め決定されている。
【０１３０】
Ａ．赤かび病（ＦＨＢ）
【０１３１】
ＦＨＢとしても知られている赤かび病（ｈｅａｄ  ｓｃａｂ）は、小麦および大麦などの穀物用植物の深刻な病気であり、ジベレラ・ゼアエ（アナモルフ＝フザリウム・グラミネアラム）菌が主な原因である。フザリウム・グラミネアラムは、開花の頃から先端成長のソフト・ダフ・ステージを通じて穀物用植物の先端（頭花、種子先端、または穂）に主に感染する。フザリウム・グラミネアラムの発芽分生子または子嚢胞子は、葯および関連組織を貫通し、宿主の感染およびＦＨＢの症状の発現を始める。
【０１３２】
フザリウム・グラミネアラムによる種子の感染により、種子発芽、苗木の活力ならびに植物出現が減少する［Ｂｅｃｈｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍ．６２：１９１−１９７］。フザリウム・グラミネアラムによる小麦穀粒の感染により、穀物収率が減少し、穀粒品質に影響を及ぼす［Ｃｌｅａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）  Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．７０：１０５７−１０６９］。穀物収率損失を引き起こすことに加えて、フザリウム・グラミネアラムは、穀物品質［Ｃａｒｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ：ｔｈｅ  ｃｏｓｔ  ｏｆ  ａｃｈｉｅｖｉｎｇ  ｆｏｏｄ  ｓｅｃｕｒｉｔｙ  ａｎｄ  ｆｏｏｄ  ｑｕａｌｉｔｙ，  ＡＰＳ  Ｎｅｔ：Ｆｅａｔｕｒｅ  ｓｔｏｒｙ  Ａｕｇｕｓｔ，２００１］および動物衛生［Ｍａｒａｓａｓ，１９９１，Ｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｆｕｓａｒｉａ，ｉｎ：Ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ  ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆｏｏｄｓ，Ｊ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｒ．Ｓ．Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ；Ｂｅａｒｄａｌｌ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，１９９４，Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ｗｉｔｈ  ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ  ａｓ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｃａｕｓｅｓ，ｉｎ  Ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  Ｇｒａｉｎ：  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｏｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  Ａｆｌａｔｏｘｉｎ（ＭＩＬＬＥＲ，Ｊ．Ｄ．＆  ＴＲＥＮＨＯＬＭ，Ｈ．Ｌ．，Ｅｄｓ．）．Ｅａｇａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，Ｍｉｎｎ．，ｐｐ．３８７−３９］に悪影響を及ぼす可能性があるエストロゲン性ゼラレノン毒素（Ｆ−２）（Ｈｅｓｓｅｌｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｆｕｎｇｉ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ  Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａｚｅａｅ，ａｎｄ  ｚｅａｒａｌｅｎｏｎｅ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｗｈｅａｔ．Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ，７０，１４−１８）およびトリコテセン系デオキシニバレノール（ＤＯＮ，ｖｏｍｉｔｏｘｉｎ）（Ｓｎｉｊｄｅｒｓ，１９９０，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅａｄ  ｂｌｉｇｈｔ  ａｎｄ  ｍｙｃｏｔｏｘｉｎ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｈｅａｔ，ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，９６，１８７−１９８）などのマイコトキシンを産生する可能性がある。従って、ＦＨＢを治療するための強いニーズがある。
【０１３３】
ＦＨＢの一般的な治療は、プロチオコナゾール殺菌剤の塗布を含む。プロチオコナゾールにより、穀物収率を増し、小麦穀粒におけるＤＯＮを軽減することができる。しかしながら、プロチオコナゾールなどの殺菌剤の使用は、環境への懸念や殺菌剤で処理された産物を消費するヒトまたは動物に起こり得る副作用によりますます受け入れられなくなっている。新規のＦＨＢ治療は最終的にはプロチオコナゾールに取って代わり得るが、新規の治療をプロチオコナゾール治療と併用し得る可能性も存在する。従って、開示したＦＨＢに対する微生物アンタゴニストは、プロチオコナゾール耐性であってもよい。
【０１３４】
Ｂ．微生物アンタゴニスト
【０１３５】
開示された方法は、クリプトコッカス・フラベセンスの株である微生物アンタゴニストの使用を含む。開示された微生物アンタゴニストを含有する組成物も開示する。クリプトコッカス・フラベセンスＯＨ  １８２．９（ａｋａ  ３Ｃ）を用いて穀物におけるＦＨＢを軽減することができるが、クリプトコッカス・フラベセンスＯＨ  １８２．９（ａｋａ  ３Ｃ）は、低濃度のプロチオコナゾール殺菌剤にも敏感である。この感度により、プロチオコナゾールで処理されるかもしくはプロチオコナゾールでも処理されるフィールドのＦＨＢに対してクリプトコッカス・フラベセンスの塗布が制限されてきた。親３Ｃよりもプロチオコナゾールに有意に大きな耐性を示す変異体、突然変異体、または他のクリプトコッカス・フラベセンス株を開示された方法で用いてもよい。プロチオコナゾール耐性株は、クリプトコッカス・フラベセンス３Ｃ親株よりもＦＨＢに対して高い有効性を示し得る。
【０１３６】
本明細書に記載される方法で有用な微生物アンタゴニストは、限定されないが、クリプトコッカス・フラベセンス（Ｙ−７３７３）、クリプトコッカス・フラベセンス（ＹＢ−６０１）、クリプトコッカス・フラベセンス（ＹＢ−６０２）、クリプトコッカス・フラベセンス（Ｙ−７３７７）、クリプトコッカス・フラベセンス（Ｙ−７３７２）、クリプトコッカス・フラベセンス（Ｙ−７３７５）、クリプトコッカス・フラベセンス（Ｙ−７３７４）、クリプトコッカス・フラベセンス（Ｙ−７３７６）、クリプトコッカス・フラベセンス（ＹＢ−３２８）、クリプトコッカス・フラベセンス（Ｙ−７３７９）、またはクリプトコッカス・フラベセンス（ＹＢ−７４４）であってもよい。クリプトコッカス・フラベセンス株の他の例は、米国特許第８，２４１，８８９号に記載のものであってもよい。これらの特許に記載の株を開示された方法で用いてＦＨＢを治療することができる。
【０１３７】
穀物用植物におけるＦＨＢの抑制に用いられるクリプトコッカス・フラベセンス株は、遺伝子型Ａ型もしくは遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株であってもよい。従って、開示された方法で使用される微生物アンタゴニストは、上述のｑＰＣＲおよび配列同一性の同定方法を用いて同定されたクリプトコッカス・フラベセンス株を含み得る。
【０１３８】
いくつかの態様において、微生物アンタゴニストは、遺伝子型Ａ型クリプトコッカス・フラベセンス株もしくは遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株からなる群から選択されるクリプトコッカス・フラベセンスの株である実質的に純粋な微生物であってもよく、ここで、クリプトコッカス・フラベセンスの株は、ＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７８で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス３ＣもしくはＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７９で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス４Ｃではない。
【０１３９】
Ｃ．穀物用植物
【０１４０】
穀物用植物は、食用種子、果実、または穀粒を生産する任意の種子もしくは植物を含み、限定されないが、オート麦、ライ麦、小麦、米、トウモロコシ、モロコシ、およびキビが挙げられる。小麦、大麦、オート麦、スペルト小麦、およびライ小麦は、ＦＨＢの影響を受けやすいことが知られているため、開示された方法で治療することができる。穀物用植物はヒトおよび家畜の両方で毎日消費されるため、これらの植物がＦＨＢなどの有害物質で使用できない程度にまで汚染されないようにすることは重要である。ＦＨＢなどの作用物質の成長もしくは悪影響を予防する、阻害する、または抑制する方法は、穀物用植物の健全な成長またはライフサイクルを促進する方法であると考えられる。
【０１４１】
Ｄ．微生物アンタゴニストの投与
【０１４２】
微生物アンタゴニストは、種々の因子に応じて投与してもよい。投与は、限定されないが、穀物用植物の成長の段階、天候、穀物用植物にすでに存在する微生物アンタゴニストの量、および投与方法などの因子に応じて変化し得る。
【０１４３】
ｉ．穀物用植物の成長の段階
【０１４４】
微生物アンタゴニストの種子先端への塗布は、穀物成長におけるブート・ステージ後およびハード・ダフ・ステージ前のいかなるときにおいても起こり得る。穀物先端は、開花の始まり（開花期）から核種成長のソフト・ダフ・ステージを通じて、フザリウム・グラミネアラムにより感染の影響を受けやすい。それ故、生物学的防除剤を塗布する１つの時期は、開花直前の時期から、遅くとも核種成長のソフト・ダフ・ステージまでである。開花以前の先端へのアンタゴニストの塗布により、小麦先端が感染症を起こしやすくなるのに先立って、アンタゴニストが小麦の先端部にコロニーを作ることが可能になる。加えて、コロニーを作るために、かつ小さい花から現れる葯を守るために、アンタゴニストの位置は良い位置に設定されるだろう。もし、開花開始後、しかし成長のハード・ダフ・ステージ前に塗布すれば、アンタゴニストはまだ有効であろう。しかしながら、長時間の遅延が、細胞製剤や塗布の方法によっては治療効果を減少する場合がある。従って、微生物アンタゴニストの塗布は、成長のハード・ダフ・ステージ前、開花中、または開花前に行うことができる。
【０１４５】
ｉｉ．天候
【０１４６】
塗布してもよいクリプトコッカス・フラベセンスの温度は変化し得る。微生物アンタゴニストは、約５℃〜約３５℃の範囲の温度で効果的であり得る。開示された方法の一態様において、微生物アンタゴニストは、１５℃〜３０℃の範囲の温度で塗布される。
【０１４７】
風または雨は、微生物アンタゴニストの投与にも役割を果たし得る。例えば、強風条件または雨により、穀物用植物に残る微生物アンタゴニストは少なくなってしまう。風または雨により微生物アンタゴニストのいくらかまたは全てが穀物用植物に残らないようになると、治療効果は最小限になるかまたはなくなってしまう場合がある。
【０１４８】
ｉｉｉ．穀物用植物の微生物アンタゴニストの存在
【０１４９】
微生物アンタゴニストの投与は、微生物アンタゴニストが植物にすでにどのくらいの量で存在しているかどうかにも依存する。従って、本方法の一態様において、穀物用植物を最初に試験することは、クリプトコッカス・フラベセンスなどのいずれの微生物アンタゴニストが存在するかどうか決定するために役立つ。クリプトコッカス・フラベセンスが存在する場合、量を決定することは有益であり得る。クリプトコッカス・フラベセンスが存在するが、有効量と見なされる量ではない場合、より多くのクリプトコッカス・フラベセンスを作物に塗布することが必要な場合がある。有効量が作物にすでに存在する場合、より多くのクリプトコッカス・フラベセンスでの治療を遅らせてもよい。
【０１５０】
ｉｖ．投与方法
【０１５１】
クリプトコッカス・フラベセンス株の穀物用植物への塗布は変化し得る。一態様において、微生物アンタゴニストは、植物上に噴霧してもよい。噴霧は、スプリンクラー灌漑システムまたは空中もしくは地上塗布具を介して行ってもよい。微生物アンタゴニストの投与は、限定されないが、アンタゴニストを受ける領域のサイズや天候などの因子に応じて変化し得る。当業者であれば、微生物アンタゴニストを穀物用植物にどのように塗布するか分かるであろう。
【０１５２】
Ｅ．併用療法
【０１５３】
ＦＨＢは、併用療法を用いて抑制することができる。開示された方法は、クリプトコッカス・フラベセンス株の組み合わせを塗布することを含み得る。組み合わせは、２つ以上の遺伝子型Ａ型株、２つ以上の遺伝子型Ｂ型株、または１つ以上の遺伝子型Ａ型および遺伝子型Ｂ型株の混合物を含み得る。
【０１５４】
開示された方法のいくつかの態様において、微生物アンタゴニストは、遺伝子型Ａ型もしくは遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株を、ＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７８で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス３ＣまたはＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７９で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス４Ｃと組み合わせたものを含み得る。それ故、一態様において、クリプトコッカス・フラベセンス株の少なくとも１つは、クリプトコッカス・フラベセンス３Ｃまたはクリプトコッカス・フラベセンス４Ｃであり、少なくとも１つの株は、クリプトコッカス・フラベセンス３Ｃまたはクリプトコッカス・フラベセンス４Ｃではない。
【０１５５】
併用療法は、プロチオコナゾールなどの殺菌剤ならびにクリプトコッカス・フラベセンス株で治療することも含み得る。開示されたクリプトコッカス・フラベセンス株のいずれも併用療法で用いてもよい。治療の順序は変えてもよい。一例として、穀物用植物は最初にプロチオコナゾールで処理した後、１つ以上のクリプトコッカス・フラベセンス株で処理する。一例として、プロチオコナゾールとクリプトコッカス・フラベセンス株を同時に塗布する。さらに別の例として、クリプトコッカス・フラベセンスで処理した後にプロチオコナゾールを塗布する。
【０１５６】
ある態様において、穀物用植物は第１のクリプトコッカス・フラベセンス株で処理した後、１つ以上の追加のクリプトコッカス・フラベセンス株で処理する。一態様において、第１のクリプトコッカス・フラベセンス株を追加のクリプトコッカス・フラベセンス株と同時に塗布する。別の態様において、第１のクリプトコッカス・フラベセンス株を塗布した後に、１つ以上の追加のクリプトコッカス・フラベセンス株を１回以上塗布する。
【０１５７】
４．穀物用植物におけるクリプトコッカス・フラベセンスの存在を決定する方法
【０１５８】
穀物用植物におけるクリプトコッカス・フラベセンス、特に、遺伝子型Ａ型もしくは遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株の存在を決定する方法を提供する。開示されたｑＰＣＲ方法またはプライマーのいずれかを用いて、遺伝子型Ａ型もしくは遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株の存在を同定することができる。例えば、ｑＰＣＲは、フィールドにおいて穀物用植物から採取したサンプルで行ってもよい。特定のクリプトコッカス・フラベセンス遺伝子型を同定するために開発されたものと同じＣｔ値分析を用いて、遺伝子型Ａ型もしくは遺伝子型Ｂ型株の存在を決定してもよい。
【０１５９】
一態様において、少なくとも１つの遺伝子型Ａ型株と少なくとも１つの遺伝子型Ｂ型株とが各々存在する。穀物用植物に遺伝子型Ｂ型株のみが存在すると決定された場合、遺伝子型Ａ型株を穀物用植物に投与してもよい。もちろん、クリプトコッカス・フラベセンス株のみの存在が、どのような治療が穀物用植物に必要なのかを決定するのに関わる唯一の因子ではない。クリプトコッカス・フラベセンスの量も役割を果たし得る。それ故、有効量のクリプトコッカス・フラベセンスが存在しない場合、遺伝子型Ａ型もしくは遺伝子型Ｂ型株を投与する必要があり得る。
【０１６０】
遺伝子型Ａ型もしくは遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株の存在は、公知の遺伝子型Ａ型もしくはＢ型クリプトコッカス・フラベセンス株の遺伝子配列と比較した、サンプルにおける１つ以上の特定の遺伝子の配列同一性を用いることに関する本明細書に記載される方法に基づいて決定してもよい。
【０１６１】
遺伝子型Ａ型もしくは遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株の存在を決定する方法は、開示された微生物アンタゴニストの１つを投与する前もしくは後に行ってもよい。本方法の一態様において、クリプトコッカス・フラベセンス株の存在は、微生物アンタゴニストの投与前および投与後の両方にて決定されてもよい。
【０１６２】
従って、本方法を用いて、穀物用植物における微生物アンタゴニストの存在を確認することができる。本方法の一態様において、遺伝子型Ａ型クリプトコッカス・フラベセンス株の存在を決定した後、より多くの遺伝子型Ａ型株を投与してもよいし、あるいは遺伝子型Ｂ型株を投与してもよい。場合によっては、クリプトコッカス・フラベセンス遺伝子型の組み合わせを投与してもよい。
【０１６３】
クリプトコッカス・フラベセンスの存在を決定するかまたは確認する方法は、穀物用植物種子先端サンプルを収集することを含み得る。サンプルを収集することは、個人、またはフィールドで使用される機械もしくは装置で行ってもよい。サンプルを収集すると、穀物用植物からＤＮＡを採取し、本明細書に記載されるｑＰＣＲまたは配列決定を行うことにより、公知のクリプトコッカス・フラベセンス遺伝子型に対するＣｔ値または配列同一性を用いて、遺伝子型Ａ型もしくは遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株の存在を決定することができる。
【０１６４】
クリプトコッカス・フラベセンスの特定の株および遺伝子型は、他の株よりもＦＨＢの治療により有益な効果を有するため、穀物用植物におけるクリプトコッカス・フラベセンスの存在を決定する、特に、クリプトコッカス・フラベセンスの遺伝子型を決定する必要がある。
【０１６５】
本方法の一態様において、プロチオコナゾールなどの殺菌剤の存在を決定する。プロチオコナゾールが存在すると決定される場合、クリプトコッカス・フラベセンスのプロチオコナゾール耐性株を用いて穀物用植物を治療することが必要な場合もある。
【０１６６】
実施例
【０１６７】
以下の実施例は、本明細書に特許請求される化合物、組成物、および方法がどのように使用され、評価されるかの完全なる開示および説明を当業者に提供するために記載し、本発明の純粋に例示的なことを目的とし、本発明者らがその発明としてみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、開示された具体的な態様に数多くの変更を加えることができ、発明の精神および範囲を逸脱することなく同様もしくは類似した結果が得られることを理解すべきである。特に指示しない限り、部は重量部であり、温度は摂氏度℃であるかまたは周囲温度であり、圧力は大気圧または大気圧に近い圧力である。
【０１６８】
実施例１：クリプトコッカス・フラベセンスの別個の２つの亜集団：遺伝子型Ａ型および遺伝子型Ｂ型
【０１６９】
材料および方法
【０１７０】
定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）。各ｑＰＣＲ反応は、２．５μｌのテンプレートＤＮＡ、０．４ｐｍｏｌ／μｌの各プライマー（フォワードプライマーｈ３１．２＿Ｆ：５’−ＣＧＴＣＡＧＣＧＴＧＴＴＧＣＣＡＣＴＴＣＧＴ−３’（配列番号６７）；リバースプライマーｈ３１．２Ｒ：５’−ＧＣＴＧＣＴＧＴＣＴＴＧＣＧＧＴＣＧＣＴＴＡ−３’（配列番号６８））、１２．５μｌのｉＱ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州）、および容量の残りとしてテンプレートフリーＰＣＲ水からなる全容量２５μｌを有した。また、テンプレートフリーＰＣＲ水を陰性対照のテンプレートとして用いた。熱サイクルプログラムをｉＣｙｃｌｅｒで実行し、ｉＱ（商標）５検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）により蛍光データを収集した。増幅は２段階であり、９５℃で３分間増幅した後、９５℃で１５秒および７２℃で１分間の４０サイクルで増幅した。その後、０．５℃の増分で５５℃〜９５℃、かつ、各温度で１０秒の滞在時間で融解曲線を得た。ｉＱ（商標）５  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いてｑＰＣＲの生データを分析した。
【０１７１】
結果
【０１７２】
特定のｑＰＣＲプライマーを用いて、クリプトコッカス・フラベセンス株を２つの遺伝子型Ａ型およびＢ型のサブタイプに分類することができる。クリプトコッカス・フラベセンス株を試験するために設計されたプライマーを表１に示す。６つの異なるクリプトコッカス・フラベセンス株に対して試験した１２個のセットのうち、ＥＦ１．１と５Ｉとは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのいかなる変異についても区別できなかった。しかしながら、プライマーセットであるｂｔｕｂ．１、ｂｔｕｂ．２、およびｈ３１．２は、Ｃｔ値の１１〜１４の差により、２つの異なる遺伝子型を区別した。プライマーセットであるＥＦ１．２、ｈ２２．１、ｈ３０．２、ｈ３１．１、およびＩ２も、Ｃｔ値の１〜３の差により、２つの異なる遺伝子型を区別した。
【表１−１】
2016512043.tif 000003
【表１−２】
2016512043.tif 000004
【表１−３】
2016512043.tif 000005
【表１−４】
2016512043.tif 000006
【表１−５】
2016512043.tif 000007
【０１７３】
表１からのプライマーを用いたｑＰＣＲの増幅曲線を図３Ａ〜３Ｊに示す。これらの曲線は、異なる遺伝子型ごとに表示されたＣｔ値の差を示す。
【表２−１】
2016512043.tif 000008
【表２−２】
2016512043.tif 000009
【表２−３】
2016512043.tif 000010
【０１７４】
多座位配列タイピング分析（ＭＬＳＴ）に用いたプライマーおよび標的遺伝子座をそれぞれ、表２および表３に示す。クリプトコッカス・フラベセンス分離株は全て、株３Ｃに同一でかつクリプトコッカス・ネオフォルマンス（図１Ａ）とは異なるＩＴＳ配列（ｒＲＮＡ遺伝子のＩＴＳ１＋２領域をカバー）を持つことが分かった。β−チューブリン、キチンシンターゼ、熱ショックタンパク質７０、および伸長因子１遺伝子のＭＬＳＴにより、クリプトコッカス・フラベセンスの２つの別個の遺伝子型が示された（図１Ｂ）。ＭＬＳＴを用いた株間の同一性パーセントを表３に示す。
【０１７５】
クリプトコッカス・フラベセンスの２つの別個の遺伝子型は、本明細書に記載されるプライマーセットを用いて同定してもよい。遺伝子型Ａ型は、株ＯＨ  １８２．９（３Ｃ）ならびに分離株Ｙ−７２７３、ＹＢ−６０１、およびＹＢ−６０２の型により定義され、これらはいずれも、ｑＰＣＲアッセイにより容易に検出される（図２）。遺伝子型Ｂ型は、分離株Ｙ−７２７２、ＹＢ−３２８、およびＹＢ−７４４により定義され、これらはいずれも、本明細書に記載されるｑＰＣＲアッセイを用いたおおよそ３４サイクル後にのみ検出することができる（図２）。ｑＰＣＲアッセイの実施中に試験した追加のプライマーセットも、株間で同じ遺伝子型差異が現れた。全体として、ＵＳＤＡ収集における分離株間のクリプトコッカス・フラベセンスの２つの系統発生的に異なる系統が、これらのデータにより明確に示される。
【表３】
2016512043.tif 000011
【０１７６】
ｑＰＣＲアッセイの感度および特異性を決定した。ｑＰＣＲアッセイで用いたプライマー対ｈ３１．２は、受託番号ＣＡＵＧ０１０００００１〜ＣＡＵＧ０１０００７１２により同定された３Ｃのゲノム配列から同定された熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（Ｈｓｐ７０）推定遺伝子の一部を増幅するために設計された。標的領域は、１５０ｂｐであり、エクソン−イントロン結合を含んでいた。選択されたｑＰＣＲ反応の産物を電気泳動ゲルにかけ、縞模様を示した（図２）。３Ｃの１５０−ｂｐ標的領域は、クリアバンドを生じた。標準系列の標的バンドは、１×１０−５〜１×１０−７ｎｇ／μｌでは目に見えるバンドは無かったが、テンプレート濃度１〜１×１０−４ｎｇ／μｌでは暗さを軽減する勾配が表示された。理論的検出限界は、テンプレート（１反応当たり１コピーの標的遺伝子に等価）において３ＣゲノムＤＮＡが０．８×１０−５ｎｇ／μｌであったため、３ＣゲノムＤＮＡのテンプレート濃度が１×１０−５ｎｇ／μｌ未満の場合にクリアバンドが観測されなかったのは妥当である。
【０１７７】
１５０ｂｐの期待標的領域よりも僅かに＞２００ｂｐのより軽いバンドも存在した（図２）。このより軽いバンドは、プライマーに配列類似性を持つが完全には一致しない３Ｃゲノムの別の領域であり得る。テンプレートとして３ＣゲノムＤＮＡまたはＰＣＲ水を用いた反応において、この非特異的バンドと標的１５０−ｂｐバンドとが共起および共欠損（図２）することにより、非特異的バンドが３Ｃ以外の微生物からの汚染バンドである可能性が除外された。標的領域の実際の開始量は、この非特異的バンドによるｑＰＣＲ出力として実証されたものよりも僅かに低い場合がある。しかしながら、閾値サイクル（Ｃｔ）値が３５．０である反応においてこのバンドは１５０−ｂｐバンドよりも不鮮明であるため、系統誤差は最小限にすべきである（図２）。回帰式によれば、Ｃｔ値は、理論的検出限界と同等な、テンプレートにおいて２．２３×１０−５ｎｇ／μｌの３ＣゲノムＤＮＡ、または、小麦先端組織１グラム当たり７．４３×１０３個の標的遺伝子コピーと等価である。従って、非特異的バンドは、ｑＰＣＲアッセイの定量化に有意に干渉すべきではない。
【０１７８】
クリプトコッカス・フラベセンス種内でのアッセイの特異性を試験するため、３Ｃ以外の６つのクリプトコッカス・フラベセンス株の１ｎｇ／μｌゲノムＤＮＡテンプレートでもｑＰＣＲを実行した（図２）。株Ｙ−７３７２、ＹＢ−３２８、およびＹＢ−７４４は、同じテンプレート濃度で３ＣゲノムＤＮＡよりも遥かに高いＣｔ値を示した。３Ｃと最初の３つの株との約１５のＣｔ差（開始量においておおよそ３×１０４倍の差に等しい）は、３Ｃをそれらとよく区別することができる。しかしながら、株Ｙ−７３７３、ＹＢ−６０１、およびＹＢ−６０２は、３Ｃに相当するＣｔ値を示したため、このアッセイでは３Ｃを区別することはできない。
【０１７９】
実施例２：赤かび病を防除するためのクリプトコッカス・フラベセンスの２つの遺伝子型の有効性レベルの違い
【０１８０】
遺伝子型Ａ型および遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンスの小麦のＦＨＢを抑制する能力は、５回の別々の温室バイオアッセイで評価した。クリプトコッカス・フラベセンス株による予防接種に起因する疾病重症度の軽減は、５回の独立した試験のうち４回で観測された。これらの試験のうちの２回で、観測されたパターンは、インキュベーション後１６日目で統計的に有意であった（Ｋ−Ｗ検定によるＰ＜０．１０）。全体で、遺伝子型Ａ型株は、５回の試験のうち３回で遺伝子型Ｂ型株よりも大きな生物防除活性を示した。
【０１８１】
クリプトコッカス・フラベセンスの接種による疾病重症度の著しい軽減は、接種してから１０日目および１６日目に観測された（それぞれＫ−Ｗ検定によるＰ＝０．１１および０．０３；図４）。最も有意には、遺伝子型Ａ型は、インキュベーション後１６日目で陰性対照に対して疾病重症度を軽減させた（Ｐ＜０．１０）。遺伝子型Ｂ型も疾病重症度を軽減させたように見えたが、パターンは統計的に有意ではなかった。グループとして、遺伝子型Ａ型は、接種後１０日目（陰性対照２３％に対して１６％）と１６日目（陰性対照６４％に対して４６％）に病気の平均重症度を軽減させた。遺伝子型Ｂ型は、病気の平均重症度（１０日目と１６日目で、それぞれ１７％および５１％）を軽減させたが、遺伝子型Ａ型のように劇的ではなかった。これらのデータは、クリプトコッカス・フラベセンスの両方の遺伝子型がＦＨＢを防除する機能を有し、これらのうち、遺伝子型Ａ型は遺伝子型Ｂ型よりもＦＨＢの防除により効果的であることを示すものである。
【０１８２】
実施例３：赤かび病に対して生物学的防除活性を持つクリプトコッカス・フラベセンス株の環境モニタリング
【０１８３】
材料および方法
【０１８４】
株。クリプトコッカス・フラベセンス株ＯＨ  １８２．９（３Ｃ）をＮｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＮＲＲＬ）からＮＲＲＬ受託番号Ｙ−３０２１６で入手した。他の６つのクリプトコッカス・フラベセンス株も、ＮＲＲＬからそれぞれ、受託番号Ｙ−７３７２、Ｙ−７３７３、ＹＢ−３２８、ＹＢ−６０１、ＹＢ−６０２、およびＹＢ−７４４で入手した。全ての株は、長期保存用に−８０℃でグリセロールストックとして維持した。
【０１８５】
フィールドの確立と３Ｃ塗布。本研究の実験は、オハイオ州ウースター最北端のスナイダー農場で軟質赤色冬小麦（トリチカム・アエスチバムＬ．）を植えた２つのフィールドで行った。第１のフィールド（以下、フィールド１と呼ばれる）には、２０１０年１０月１１日にホープウェル品種を植えた。フィールド１のレイアウトを図５に示す。第２のフィールド（以下、フィールド２と呼ばれる）には、２０１１年１０月６日にフリーダム品種を植えた。フィールド２の小麦は、１．５ｍ幅および０．６ｍ長さの空間を持つ、区画１つ当たり４．６ｍ×１．７ｍの１４×７区画を含む８５ｍ×１６ｍの矩形領域に植えた。図２および図６〜９に示すデータは、それぞれ、フィールド１および２から収集した。
【０１８６】
ＳＤＣＬ培地で産生された３Ｃの対数増殖期細胞は、８０ＬのＳＤＣＬ培地を充填したＢブラウンＤ−１００発酵槽での産生用の５％種子接種物として機能した。発酵槽は、２０Ｌ／分の通気、およびツインラシュトン羽根車により提供される２００回転／分の攪拌で２５℃にて作動させた。接種してから１８時間後に、発酵槽の温度を１５℃に下げ、細胞に収穫前に２４時間低温ショックを与えた。Ｓｈａｒｐｌｅｓ  １２−Ｖ管型ボール遠心分離機を用いてペースト状に濃縮して細胞を収穫した。その後、細胞ペーストをＰＯ４弱緩衝液におおよそ２×１０９ＣＦＵ／ｍｌの濃度で懸濁させ、ストックとして−２０℃で凍結させた。フィールド接種物は、１．５Ｌのストック（１０℃で一晩予備解凍）を１．５Ｌの無菌２回蒸留水と１０．８ｍｌの１０％ツイーン８０と混合させることで、塗布直前に準備した。小麦の開花中（初期の穂ばらみ期１０．５；２０１１年５月２９日）、６．１ｍ×６．１ｍ（図Ｓ１の区画ｉ＿１、ｉ＿２、およびｉ＿３）の３つの領域に、おおよそ１．５×１０９細胞／ｍｌの３Ｃ接種物を１平方センチメートル当たり２×１０６〜６×１０６細胞の速度で噴霧した。
【０１８７】
フィールド２に対する３Ｃ接種物の産生方法は、Ｓｃｈｉｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ、２００２）に記載のものと同様であった。簡単に言えば、３Ｃ（開始ＯＤはＡ６２０で０．１０）を接種した２００ｍｌのＳＤＣＬ培地を含有する５００−ｍｌフラスコを２５℃にて２５０回転／分で２４時間インキュベートした。その後、これらの培養物を用いて、１．２５ＬのＳＤＣＬ培地を含有する３−ＬのＦｅｒｎｂａｃｈフラスコにＯＤ０．１０に播種した。培養を２５℃にて２５０回転／分で４８時間インキュベートした。次いで、２．３×１０８ＣＦＵ／ｍｌのコロニー形成ブロスを無菌容器に移し、氷上のフィールドに搬送し、フィールドに１平方センチメートル当たり４．４×１０５ＣＦＵの速度で２４時間以内に塗布した。塗布は、小麦の開花中（初期の穂ばらみ期１０．５；２０１２年５月２９日）に行った。本研究用のサンプリングは１２区画で行い、そのうちの６カ所には３Ｃのみを噴霧し、別の６カ所にはいずれの微生物も噴霧しなかった。フィールドの他のいくつかの区画にも３Ｃを噴霧したが、他の微生物も噴霧した。異なる治療の区画場所は、フィールドにわたって無作為に設計した。
【０１８８】
サンプル収集。小麦先端サンプルは、先端下１〜２ｃｍの茎を刈り、各先端を個々のサンプル袋に密封することで収集した。サンプル収集中、各先端には、それの収集に用いた袋の内側からのみ触れ、刈り込みハサミは、二次汚染を予防するために７５％水性エタノールで殺菌した。２０１１年夏に、３Ｃの噴霧塗布直後（接種後０日目）、ならびに接種後２４時間（１日目）、１０日目、２６日目、４４日目（サンプリング場所の詳細については図５を参照されたい）にフィールド１から先端を収集した。２０１２年夏に、収穫の１１日前および１日前にフィールド２から先端を収集し、ここで、２つの先端は、１２区画の各々における２つのランダムな場所から、各時点でそれぞれ収集した。
【０１８９】
２０１２年の１月下旬および３月下旬に、収穫後の残留物サンプルをフィールド１の３カ所の接種領域から収集した。７つの異なる場所で、各接種領域の中心の周りの半径約１ｍの円の中からサンプリングした。各時点で、２種類のサンプルを各場所で収集し：土壌、生えている雑草、および茶色に腐敗している植物材料の組み合わせを１つの複合サンプルとして収集し、腐敗していない小麦の茎を他のサンプルとして収集した。穀粒は、２０１２年６月２６日にフィールド２の全体として１２区画の各区画から収穫した。各区画の全穀粒は、１つの紙袋に６ｃｍより薄い層として室温で暗所下に保存した。おおよそ１０ｇの１つのサブサンプルは、ＤＮＡ抽出のために挽き砕く直前に、それぞれ、収穫後１４日目、６４日目、および１５５日目に各区画の全穀粒から収集した。
【０１９０】
サンプル取り扱い、ＤＮＡ抽出、およびテンプレート調製。３Ｃおよび他の６つのクリプトコッカス・フラベセンス株のゲノムＤＮＡは、製造元の指示に従って、ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ（登録商標）ＤＮＡ単離キット（ＭＯ  ＢＩＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，米国カリフォルニア州）を用いて１／５トリプシン大豆寒天上で成長させた２日経った培養物から抽出した。これらの元のＤＮＡ抽出物を、Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国デラウェア州）の測定値に基づいて、２０倍以上の特定濃度に希釈し、ｑＰＣＲ用のテンプレートを調製した。
【０１９１】
小麦先端および茎のサンプルは、サンプリング後１時間以内にラボに戻し、−８０℃で保存した。穀粒サンプルをフィールドから持ち帰った後、室温で保存した。これらの小麦サンプルをＤＮＡ抽出直前に液体窒素中で挽き砕いた。複合残留物サンプルをラボへ持ち帰った後、１０℃で保存し、その後、サンプルを挽き砕くことなく、２４時間以内にサンプルからＤＮＡ抽出を直接行った。全てのＤＮＡは、製造元の指示に従って、おおよそ０．３グラムの各サンプルからＰｏｗｅｒＳｏｉｌ（登録商標）ＤＮＡ単離キットを用いて抽出し、サンプル１つ当たりのＤＮＡ抽出物は１００μｌの収量であった。小麦先端および穀粒サンプルのＤＮＡ濃度はｑＰＣＲデータ解釈を妨げるほど非常に高かった（新鮮組織からの豊富な小麦ＤＮＡにより）ため、元のＤＮＡ抽出物の１：２０希釈物をこれら全てのサンプルのテンプレートとして用いた。非希釈ＤＮＡ抽出物は、フィールド１からの収穫後の残留物サンプルのテンプレートとして用いた。
【０１９２】
定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）。ｑＰＣＲは実施例１に記載のように行った。
【０１９３】
培養物に基づく定量化。収穫後１５５日目のフィールド２からの穀粒サンプルを、希釈平板法を用いて３Ｃ個体群について定量化した。１２袋（それぞれ、１２区画、６カ所の接種および６カ所の非接種）の各々からの１±０．０１ｇの穀粒を、滅菌スプーンを用いて１５ｍｌの容量を持つ滅菌ポリプロピレン管に移した。１０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、および０．０４％のツイーン８０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州）を含有する２ｍｌの滅菌水溶液を各管に加えた。管を２０秒間攪拌し、室温にて２００回転／分で１０分間振った後、再び２０秒間攪拌した。得られた懸濁液２００μｌとそれらの１０倍希釈物および１００倍希釈物とを、１ｐｐｍ  Ｐｒｏｓａｒｏ（登録商標）殺菌剤（Ｂａｙｅｒ  ＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅ  ＬＰ、米国ノースカロライナ州）、５０ｐｐｍストレプトマイシン、５０ｐｐｍカナマイシン、および５０ｐｐｍリファンピシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で補正した１／５強度トリプシン大豆寒天の各プレート上に広げた。３Ｃ個体群は、２５℃でのインキュベーション５日後に、プレート上に酵母菌様形態のコロニー形成単位（ＣＦＵ）として列挙された。
【０１９４】
データ処理および分析。テンプレート中の３ＣゲノムＤＮＡの１、１×１０−１、１×１０−２…１×１０−７ｎｇ／μｌの標準系列を３通りで実行し、回帰式Ｙ＝５．７９２−０．２９８４Ｘを得た。この式を用いて、テンプレート中の３ＣゲノムＤＮＡ濃度の等価として、フィールドサンプルのＣｔ値（Ｘ）からそれらの対数開始量値（Ｙ）を算出した。開始量の単位は、「テンプレート中の３ＣゲノムＤＮＡのｎｇ／μｌ」から「サンプル１グラム当たりの標的遺伝子コピー数」に変換した。単位換算は、以下の２つの前提に基づいた：（ｉ）ゲノム当たりの標的遺伝子が１コピーであり、３Ｃ（受託番号ＣＡＵＧ０１０００００１〜ＣＡＵＧ０１０００７１２）のゲノムに対する遺伝子ならびにｈ３１．２プライマーのＢＬＡＳＴ検索と、全ゲノムの範囲に対する各コンティグの配列決定とで支持されていた；（ｉｉ）３Ｃのゲノムサイズは、配偶子当たり約０．０２ｐｇ（クリプトコッカス・ガッティおよびクリプトコックス・ネオフォルマンスのゲノムサイズに基づいて推定）であった（Ｋｕｌｌｍａｎ，Ｂ．，Ｔａｍｍ，Ｈ．＆  Ｋｕｌｌｍａｎ，Ｋ．２００５．Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｉｚｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｂｉ．ｅｅ／ｆｕｎｇａｌ−ｇｅｎｏｍｅｓｉｚｅを参照されたい）。従って、１ｎｇの３ＣゲノムＤＮＡは、５×１０４コピーの標的遺伝子に等しく、相互に、１コピーの標的遺伝子は、２×１０−５ｎｇの３ＣゲノムＤＮＡに等しいと見なされた。この研究では、各反応は、２．５μｌテンプレートで開始され、これは、０．３グラムサンプルから得られた全１００μｌのＤＮＡ抽出物に属していた。従って、１ｎｇ／μｌの３ＣゲノムＤＮＡは、小麦先端および穀粒サンプル（テンプレートとして元のＤＮＡ抽出物の１：２０希釈物）のサンプル１グラム当たり３．３×１０８（１０８．５）コピーの標的遺伝子、およびフィールド１からの収穫後の残留物サンプル（テンプレートとして非希釈ＤＮＡ抽出物）のサンプル１グラム当たり１．７×１０７（１０７．２）コピーに等しいと見なされた。
【０１９５】
いずれか任意のＰＣＲ反応に対する理論的検出限界は、反応当たり１コピーの標的遺伝子であると見なされた。単位変換に対する上記２つの前提と、本研究において各反応が２．５μｌのテンプレートで開始されたこととを考えると、本研究の理論的検出限界は、２．５μｌ当たり２×１０−５ｎｇの３ＣゲノムＤＮＡであり、テンプレート中の３ＣゲノムＤＮＡ８×１０−６ｎｇ／μｌと等しかった。全１００μｌのＤＮＡ抽出物が０．３グラムサンプルから得られたフィールドサンプルにおいて、理論的検出限界は、小麦先端および穀粒サンプルの小麦先端組織１グラム当たり２．７×１０３（１０３．４）コピーの標的遺伝子、およびフィールド１からの収穫後の残留物サンプルのサンプル１グラム当たり１．３×１０２（１０２．１）コピーであった。
【０１９６】
ｑＰＣＲデータの分析において、８７．０℃または８７．５℃（標準系列の溶融温度）の単一ピークがｉＱ（商標）５検出システムにより認識された唯一のピークであるサンプルのみが、３Ｃの検出において陽性と見なされた。８７．０℃または８７．５℃のピークを示さないサンプルは、３Ｃは検出されないと見なされ、それらの閾値サイクル（Ｃｔ）値は、統計分析で４１と見なされた。８７．０℃または８７．５℃のピークおよび他のピークを示すサンプルは、３Ｃの検出を示したが、非特異的ピークの干渉により定量化は十分に正確ではないため、さらなる分析用にトリミングした。いくつかの統計異常値もトリミングした。各実験において、トリミングしたデータポイントは、指定のない限り、全データポイントの７％を超えることはなかった。α＝０．０５の一般線形モデルを用いた分散分析を、ソフトウェアＭｉｎｉｔａｂ  １６（Ｍｉｎｉｔａｂ  Ｉｎｃ．、米国ペンシルベニア州）を用いてランク付けした形式のＣｔ値で行った。
【０１９７】
結果
【０１９８】
人工的に接種した領域における３Ｃ個体群の動態
【０１９９】
小麦先端組織１グラム当たりの標的遺伝子コピー数により表される、小麦先端の３Ｃの個体群密度は、３Ｃを人工的に接種した領域において経時的に変動した（図６）。接種後（ＤＰＩ）１日目のサンプルは、１０ＤＰＩ時および１０ＤＰＩ後のものよりも有意に低い３Ｃ個体群密度を示した。３Ｃ個体群密度は、人工接種直後のその日のうちに減少した後、１ＤＰＩ〜１０ＤＰＩの間に増加するという明らかな傾向があった。これは、小麦先端に塗布した３ＣのＤＮＡが人工接種後に一部劣化したが、生き残った３Ｃ細胞も小麦先端で増殖し始めた結果、３Ｃ個体群の成長が後でもたらされたことを示している。１０〜２６〜４４ＤＰＩでは３Ｃ個体群密度が徐々に増加するという僅かな傾向があったが、増加は、１〜１０ＤＰＩのものよりも少なかった。これは、季節後半においても３Ｃ個体群はまだ成長しているが、成長率は減少したことを示している。これはおそらく、微生物による３Ｃのコロニー形成ニッチとして非老化性小麦先端組織の飽和、および／または、季節後半に３Ｃのコロニー形成機能が低下した小麦の老化によるものである。
【０２００】
大部分のサンプルの３Ｃ個体群密度は、接種直後（０ＤＰＩ）には小麦先端組織１グラム当たり１０５．５〜１０６．０コピーの標的遺伝子であったが、１日後には１０４．５〜１０５．５に減少し、季節の終わりには１０６．０〜１０６．５に徐々に増加した。接種率が１平方センチメートル当たり１０６．３〜１０６．８細胞であり、かつ、小麦先端の横断面がおおよそ１平方センチメートルであったことを考えると、３Ｃ個体群密度は、成長期中のフィールドの接種率未満であるが該接種率に相当するレベルで維持された。
【０２０１】
フィールドの非接種領域への３Ｃの拡散
【０２０２】
３Ｃ個体群密度は接種領域からの距離が増すにつれて減少し、非接種領域の３Ｃ個体群密度は１〜４４ＤＰＩに経時的に増加した傾向があった（図７Ａおよび図７Ｂ）。これは、３Ｃが人工的に接種した領域から非接種領域へと無秩序ではなく確率的に経時的に拡散したことを示している。成長期の終わりまでに（４４ＤＰＩ）、非接種領域からの大部分のサンプルは、小麦先端１グラム当たり３．３×１０３〜３．３×１０５の標的遺伝子コピーとして検出された。
【０２０３】
１ＤＰＩでの全非接種サンプルは３Ｃの検出を示さなかった一方、０ＤＰＩでの非接種領域におけるいくつかのサンプルは、小麦先端１グラム当たり３．３×１０２〜３．３×１０３の標的遺伝子コピーとして検出された。しかしながら、これらいくつかの０−ＤＰＩサンプルは単に理論的検出限界（小麦先端１グラム当たり２．７×１０３の標的遺伝子コピー）あたりであったため、これは、３Ｃ個体群密度が１ＤＰＩよりも０ＤＰＩに非接種領域において高かったという強い証拠と見なすべきではない。
【０２０４】
サンプル収集活動の３Ｃ拡散への効果
【０２０５】
フィールド全体を歩いたサンプル収集者が３Ｃの拡散に寄与したかどうか試験するため、１０ＤＰＩにフィールド１の小麦栽培領域の境界で追加の小麦先端サンプルを収集した。サンプル収集者は小麦栽培領域間の休閑歩道に沿って歩いたため、人工的に接種した領域から非接種領域に３Ｃを持ちこんだ可能性があった。サンプル収集活動が３Ｃ拡散に寄与した場合、歩道に隣接する小麦栽培領域の境界での小麦先端は、小麦栽培領域の内側奥深くのものよりも高い３Ｃ個体群密度を示すべきであるとの仮説を立てた。サンプル収集者は、接種領域からサンプルを収集した後、その側からフィールドを出るよう求められていたため、この仮説に対するサンプルは、フィールドの東側（サンプリング場所の詳細については図５を参照）から収集した。この実験用にランク付けされたデータにテューキー検定を実行した。ローマ数字ＩＩ（場所群ＩＩ）で示した場所の内側近くの１２個の境界場所（１つの場所当たり２つのサンプル；１つのデータポイントは非特異的な増幅によりトリミングした）から収集した２３個のサンプルを場所群ＩＩの７個のサンプルと比較した（Ｐ＝１．００）。場所群ＩＩＩの近くの１２個の境界場所（１つの場所当たり１つのサンプル；２つのデータポイントは非特異的な増幅によりトリミングした）から収集した１０個のサンプルを場所群ＩＩＩの５個のサンプルと比較した（Ｐ＝０．７８）。従って、小麦栽培領域の境界および内側からの小麦先端の３Ｃ個体群密度間には有意差はなく、これは、サンプル収集活動がこのフィールドにおける３Ｃの拡散に有意に寄与していなかったことを示している。
【０２０６】
卓越風向の３Ｃ拡散への効果
【０２０７】
卓越風向（西から東）が３Ｃ拡散のパターンに影響を与えたか試験するため、フィールド１の西側と東側からの小麦先端サンプルを比較した。異なる場所群（場所群の詳細については図５を参照）および／または異なる時点でのサンプルを別々に比較した。卓越風が３Ｃ拡散に重要な役割を果たしたのであれば、フィールドの東側からのサンプルは、西側からのものよりも高い３Ｃ個体群密度を示すべきであるとの仮説を立てた。実際に、３Ｃ個体群密度の微分パターンは、異なる場所群およびサンプリング時点にわたり一貫しておらず、フィールドのどちらの側にも明らかな傾向は無かった。これは、卓越風向が３Ｃ拡散のパターンに有意な影響を及ぼさなかったことを示している。
【０２０８】
３Ｃの越冬持続性
【０２０９】
３Ｃが冬を越してフィールドで持続できるか試験するため、フィールド１の３つの接種領域における収穫後の残留物を冬から２０１２年の春先にかけてサンプリングした。収穫して６〜９カ月後まで３Ｃは接種領域で検出できたことをデータは示した（図８）。異なる接種領域（データ不図示）における同型のサンプル間での有意差は無かったため、３つの接種領域からのデータポイントをサンプル型間の比較用に組み合わせた。腐敗していない小麦の茎サンプルは、土壌、生えている雑草、および腐敗している植物材料（大部分は１０２．５〜１０３．５）の複合サンプルよりも重量１グラム当たりの３Ｃ個体群（大部分は１０４〜１０５）が有意に高いレベルを示した（図８）。越冬残留物の３Ｃ個体群密度は、成長期の終わり頃には小麦先端のものよりも低く、その大部分は、４４ＤＰＩでサンプル１グラム当たり１０６標的遺伝子コピーを上回った。
【０２１０】
収穫時期および保存中の３Ｃ個体群レベル
【０２１１】
収穫時期の小麦の３Ｃ個体群の動態を試験するため、収穫時期の異なる時点で別のフィールド（フィールド２）から追加の小麦先端および穀粒サンプルを収集した。穀粒の３Ｃ個体群レベルを保存期間の後に再び試験した。接種サンプルは、一般に、異なる時点で両方のサンプル型において非接種サンプルよりも高い３Ｃ検出を示した（図９）。先端および脱穀粒を含む、接種区画からのサンプルのほとんどは、１グラム当たり１０３．５よりも高く、最大で１０６．７の標的遺伝子コピーの検出を示した。小麦先端の３Ｃ個体群密度は、接種および非接種区画の両方において収穫１１日前から収穫１日前では増加する傾向があった。非接種区画から収集したサンプルにおいて、３Ｃ個体群密度は、収穫１日前の先端（大部分は、１グラム当たり１０４．０〜１０４．５の標的遺伝子コピー）よりも収穫１４日後の脱穀粒（大部分は、１グラム当たり約１０３．５の標的遺伝子コピー）で有意に低かった（テューキー検定によるＰ＝０．０３７）。接種サンプルは、かかる差の傾向を示したが、有意ではなかった（テューキー検定によるＰ＝０．２２）。収穫後１４日目から６４日目の保存中のもので収穫後１５５日目のものでは接種および非接種区画の両方からの脱穀粒の３Ｃ個体群レベルは徐々に減少する傾向があった（図９）。
【０２１２】
ｑＰＣＲと比較した穀粒の３Ｃの培養物に基づく定量化
【０２１３】
ｑＰＣＲアッセイにより検出されたＤＮＡ分子が生存３Ｃ細胞をいかに良く表すのかを調べるため、収穫後１５５日目に３Ｃ個体群を脱穀粒のコロニー形成単位（ＣＦＵ）で定量化した。ｑＰＣＲ結果と一致して、３ＣのＣＦＵレベルは、非接種サンプルよりも接種サンプルで有意に高かった（図１０Ａ）。穀粒１グラム当たり１．３×１０３（１０３．１）単位よりも低い個体群レベルが、培養物に基づく方法（図１０Ａ）により検出されたが、ｑＰＣＲ（図９）では検出されなかった。３ＣのＣＦＵのＬｏｇ１０値と、接種サンプル用のｑＰＣＲにより与えられた標的遺伝子コピー数のＬｏｇ１０値との間には強い線形相関があった（図１０Ｂ）。ｑＰＣＲにより推定された個体群レベルは、ＣＦＵにより推定されたものよりも低い傾向があったが、２つの方法により与えられた大きさは同様であった。
【０２１４】
糸状菌もＣＦＵ定量化プレートで観測された。主要なコロニーは、ＩＴＳ領域により一般的な腐生菌であるアルテルナリア・アルテルナータおよびクラドスポリウム・クラドスポリオイデスとして同定された。個体群レベルは、ほとんどのプレート上の主要な糸状菌の両方において穀粒１グラム当たり１０３ＣＦＵ未満であり、３Ｃの定量化に大きく干渉しなかった。
【０２１５】
考察
【０２１６】
ｑＰＣＲアッセイの効果
【０２１７】
ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙのｑＰＣＲアッセイは、屋外栽培の小麦および残留物における３Ｃ拡散および持続性を監視するために開発された。このアッセイにより、３Ｃコロニー形成用に陽性対陰性と推定される小麦先端サンプル間において明確な差を持つ３Ｃの検出が可能になった（図５、最も右側の２レーン）。本研究で試験したサンプル型の各々において意味ある差の結果を与えたため、多数のサンプル型に合理的に適用してもよい。
【０２１８】
本アッセイの感度は、他の関連ｑＰＣＲアッセイと比較した際に良好である。小麦の菌類病原体を検出するためにｑＰＣＲを用いた過去の研究では、反応当たり１０１の遺伝子コピーおよび１０４の遺伝子コピーもしくは小麦組織１グラム当たり１〜１０３ｎｇのゲノムＤＮＡの大きさで最小検出を示し、これはアッセイにおけるもの（反応当たり１２．５の遺伝子コピーかつ１０３〜１０４の遺伝子コピー、もしくは小麦組織１グラム当たり０．０１〜０．１ｎｇのゲノムＤＮＡ）に相当もしくはそれよりも高かった（図１、図３Ｂ、および図４）。
【０２１９】
小麦先端の３Ｃコロニー形成は、以前はコロニー形成単位（ＣＦＵ）で定量化されていた（Ｓｃｈｉｓｌｅｒ  ２００９、２０１０  Ｎａｔ．ＦＨＢ  Ｆｏｒｕｍ  Ｐｒｏｃ．を参照されたい）。１平方センチメートル当たり約１０６ＣＦＵの速度でおおよそ３×１０８ＣＦＵ／ｍｌの３Ｃ接種物を塗布することで、接種１６時間後に１０１〜１０２ＣＦＵ／ｇの包頴組織および接種２５６〜２８０時間後に１０５〜１０６のＣＦＵが得られた。３ＣのＣＦＵレベルは、本研究において接種１６時間後の塗布率と比較して１０４〜１０５の大きさで減少した。これに対し、本研究における接種後１日では３ＣのＤＮＡ密度はおおよそ１０倍しか減少しなかった。この劇的な差は、本研究で１ＤＰＩに検出された３Ｃ  ＤＮＡのほとんどが非生存細胞に属していたかもしくは溶解細胞からすでに放出されていたことによる可能性がある。しかしながら、３ＣのＣＦＵレベルは、本研究の１０日後の塗布率と同様なレベルに増加し、これは本研究においても同様である。これは、１０ＤＰＩに検出された３Ｃ  ＤＮＡのほとんどが生存細胞に属していたことを示している。
【０２２０】
開示されたアッセイは、クリプトコッカス・フラベセンス種内において特定レベルの菌株間特異性を示し、３Ｃ以外の６つの株は、増幅効率に基づいて２つの遺伝子型群に分化した（図５）。他の３つの株は３Ｃと同様の増幅効率を示したが、フィールドにおける他のクリプトコッカス・フラベセンス株の在来個体群が本研究における３Ｃ個体群の定量化に干渉した可能性はわずかでなければならない。第１に、０および１ＤＰＩのほとんど全ての非接種サンプルは標的増幅の検出を示さなかったが、接種サンプルは明確な検出を示した（図７）。著しい干渉があった場合、これらの非接種サンプルが、より高い増幅の検出レベルを示したのかもしれない。第２に、検出レベルは、一般に、接種区画からの距離が増すにつれて減少した（図７）。著しい干渉があった場合、検出レベルは、一般に、フィールドにわたって同じかもしくはより無作為でなければならない。
【０２２１】
フィールドにわたる３Ｃ個体群動態
【０２２２】
微生物個体群は、成長の死滅期に到達すると死滅することがよく知られている。培養物に基づく方法を用いた植物付着細菌の個体群動態についてのいくつかの研究では、実験期間の後半で宿主植物の花または葉の細菌個体群の減少が観測された。個体群の定量化に対してＴａｑｍａｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙのｑＰＣＲを用いた研究では、３つのフザリウム属種の全個体群が、夏の収穫の６カ月後に春小麦の切り株の残留物で有意に死滅した。ＣＦＵに基づく定量化を用いた小麦の３Ｃコロニー形成の過去の研究では、２００９年のランにおける小麦開花および接種後の１８４時間と２５６〜２８０時間の間で３Ｃ個体群のわずかな死滅が観測されたが、２０１０年のランでは観測されなかった。これに対し、開示した研究では、０〜１ＤＰＩの小麦先端を除いて、同じ型のサンプルの３Ｃ個体群における経時的な著しい死滅は観測されなかった（図６、図８、図９）。これは、著しい死滅が観測されない場合に経時的に生き残ることが可能な３Ｃ細胞か、細胞はもはや生存していないが大部分が無傷のままの３Ｃ  ＤＮＡかのいずれかによるであろう。
【０２２３】
本研究の小麦畑にわたる３Ｃ拡散パターンは、小麦のいくつかの真菌性疾患の拡散に似ている。これらの状況において、同じ時点で、微生物個体群は人工的に接種した領域（ソース）からソース近くの非接種領域（シンク）で急速に減少したが、特に初期の時点では、シンクにわたり距離が離れるにつれて穏やかに減少した。この研究では、シンク内の同じ距離の３Ｃ個体群は経時的に明らかに増加し（図７）、これは、感受性および抵抗性品種の混合物における小麦病原菌よりも感受性品種の純群落における小麦病原菌の拡散パターンにより近い。このことは、小麦が３Ｃに対する適合性宿主であることを示している。これは、３Ｃが効果的に小麦先端にコロニー形成することができるという事実と一致しており（（Ｓｃｈｉｓｌｅｒら、２００９年の全米赤かび病フォーラム予稿集、フロリダ州オーランド、Ｐ８０−８４、２００９；Ｓｃｈｉｓｌｅｒ  ＤＡら、２０１０年の全米赤かび病フォーラム予稿集、ウィスコンシン州ミルウォーキー、ｐ９８−１０２、２０１０）、開示されたアッセイはこのパターンをうまく実証するために十分ロバストである。
【０２２４】
ｑＰＣＲアッセイの適用
【０２２５】
このアッセイを用いて、バイオ農薬としての３Ｃの環境動態およびリスク評価を行い、かつ、３Ｃに基づくバイオ農薬の調合を最適にするために３Ｃ個体群動態における共同耕作地の非生物および生物の関心因子の効果を研究することができる。このアッセイを用いて、あるミクロ環境下における３Ｃ個体群動態と赤かび病に対する３Ｃの生物防除効果との関連性を調べることもできる。これにより、バイオ農薬として３Ｃを開発し易くなり、３Ｃ塗布の頻度やタイミングに指針を提供する。３ＣのｑＰＣＲ個体群定量化と培養物に基づく個体群定量化との相関に関する研究により、ｑＰＣＲアッセイの結果をより良く解釈することができる。さらに、このアッセイの標的遺伝子と、多数のクリプトコッカス・フラベセンス株の他の保存遺伝子との配列を決定し、異なる研究目的に役立つために異なるレベルの特異性を持つ関連ｑＰＣＲアッセイを開発することができる。
【０２２６】
実施例４．小麦の赤かび病に対する生物防除剤であるクリプトコッカス・フラベセンスの遺伝子型および表現型の特性化
【０２２７】
材料および方法
【０２２８】
株。クリプトコッカス・フラベセンス株ＯＨ  １８２．９＿３Ｃ（３Ｃ）をＮＣＡＵＲ研究所のＡＲＳ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから受託番号ＮＲＲＬ  Ｙ−５０３７８で入手した。他の１２のクリプトコッカス・フラベセンス株も、ＡＲＳ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎからそれぞれ、受託番号Ｙ−１４０１Ｔ（＝ＣＢＳ  ９４２Ｔ）、Ｙ−７３７２、Ｙ−７３７３、Ｙ−７３７４、Ｙ−７３７５、Ｙ−７３７６、Ｙ−７３７７、Ｙ−７３７９、ＹＢ−３２８、ＹＢ−６０１、ＹＢ−６０２、およびＹＢ−７４４で入手した。株単離の情報を表４にまとめる。全ての株は、長期保存用に−８０℃でグリセロールストックとして維持した。
【０２２９】
ＭＬＳＴ遺伝子座の同定およびプライマーの選択。ＭＬＳＴの標的遺伝子は、ＮＣＢＩヌクレオチドコレクション（ｎｒ／ｎｔ）データベースに対するｂｌａｓｔｎおよびｂｌａｓｔｘ検索を通じて、３Ｃドラフトゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＵＧ０１０００００１〜ＣＡＵＧ０１０００７１２）から同定された。エクソンおよびイントロンの境界は、Ａｕｇｕｓｔｕｓ予測およびクリプトコックス・ネオフォルマンスＪＥＣ２１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ１０７３４１〜ＡＥ１０７３５６）へのアラインメントを通じて定義した。ＭＬＳＴに用いたプライマーは、ソフトウェアＰｒｉｍｅｒ３を用いて設計した（表５）。
【０２３０】
ＤＮＡ単離、ＰＣＲ、および配列決定。３Ｃおよび他の１２のクリプトコッカス・フラベセンス株のゲノムＤＮＡは、製造元の指示に従って、ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ（登録商標）ＤＮＡ単離キット（ＭＯ  ＢＩＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，米国カリフォルニア州）を用いて１／５トリプシン大豆寒天上で成長させた２日経った培養物から抽出した。各ＰＣＲ反応は、クリプトコッカス・フラベセンス株の２．５μｌゲノムＤＮＡ、各プライマー（１００μＭ）の０．２μｌ溶液、４つのデオキシヌクレオシド三燐酸（各々２ｍＭ、１：１：１：１の比率で混合）の２．５μｌ混合物、１．８μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．３μｌのＧｏＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）、５μｌの５Ｘ無色ＧｏＴａｑ（登録商標）Ｆｌｅｘ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国ウィスコンシン州）、および容量の残りとしてＤＮＡフリーＰＣＲ水からなる全容量２５μｌを有した。７分間９５℃、１分間９４℃および２分間７２℃を３３サイクル、その後８分間７２℃の熱サイクルプログラムをＰｅｌｔｉｅｒサーマルサイクラーＰＴＣ−２００で実行した（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、米国マサチューセッツ州）。増幅産物の二本鎖の配列をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｔｈｅ  Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（米国オハイオ州ウースター）で決定した。ソフトウェアＧｅｎｅｉｏｕｓ６．１．５（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓにより作成）を用いて配列を編集し、連結させた。大部分の処理配列は高品質であり、塩基の９５％以上がＰｈｒｅｄ品質スコアで＞４０であった。僅かな低品質の塩基は手作業で調べ、系統発生分析の精度を損なわずに十分な信頼性で塩基コールした。
【表４】
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【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【０２３１】
系統発生分析。処理配列を整列させ、ＣｌｕｓｔａｌＷ２を用いて配列同一性を算出した。ＭＥＧＡ５における一般時間逆転モデルによる最尤法を用いて系統ツリーを生成した。１，０００複製のブーストラップ検定を行い、コンセンサスツリーの信頼性を決定した。異なるツリー構築法を用いる効果を評価するため、ＭＥＧＡ５の近隣結合法およびＭｒＢａｙｅｓ  ｖ３．２．０のベイズ推論を用いて関連する全てのアラインメントについてもツリーを生成し、最尤法によるものに相当するツリー樹形が得られた。
【０２３２】
生化学アッセイ。炭素源利用および化学物質過敏症のプロファイルを、Ｂｉｏｌｏｇ  ＧＥＮ  ＩＩＩマイクロプレート（ＢＩＯＬＯＧ，Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州）を用いて生成した。１／５トリプシン大豆寒天上で成長させて２日経ったクリプトコッカス・フラベセンスコロニーを１２０μｌの無菌２回蒸留水に懸濁させた。細胞懸濁液の光学密度は、ＥＬｘ８００ユニバーサルマイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＴＥＫ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．、米国バーモント州）を用いて５９５ｎｍで測定した。水中４０〜１００μｌの細胞懸濁液を、１０ｍｌ接種溶液ＩＦ−Ａ（ＢＩＯＬＯＧ、Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州）に加え、ボルテックスでよく混合した。ＩＦ−Ａ（３×１０５〜４×１０５細胞）中に懸濁させた１００μｌの細胞を、Ｂｉｏｌｏｇ  Ｇｅｎ  ＩＩＩマイクロプレートの各ウェルに加えた。アッセイプレートを暗所下で室温（２３〜２５℃）にてインキュベートした。クリプトコッカス・フラベセンス成長および細胞呼吸を表す、アッセイウェルの色の変化は、インキュベーション後にＥＬｘ８００ユニバーサルマイクロプレートリーダーによりＯＤ５９５として測定した。２つの実験を設定した。１２個の株（３Ｃ、Ｙ−７３７２、Ｙ−７３７３、Ｙ−７３７４、Ｙ−７３７５、Ｙ−７３７６、Ｙ−７３７７、Ｙ−７３７９、ＹＢ−３２８、ＹＢ−６０１、ＹＢ−６０２、およびＹＢ−７４４）を実験１で用い、４つの株（Ｙ−１４０１Ｔ、３Ｃ、Ｙ−７３７２、およびＹＢ−６０１）を実験２で用いた。
【０２３３】
Ｍｉｎｉｔａｂ  １５（Ｍｉｎｉｔａｂ  Ｉｎｃ．、米国ペンシルベニア州）のＯＤ５９５データで統計分析を行った。相関係数距離およびＡｖｅｒａｇｅ法、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ法、ＭｃＱｕｉｔｔｙ法、Ｓｉｎｇｌｅ法、およびＷａｒｄ法を含む種々のＬｉｎｋａｇｅ法を用いて、全体として全てのアッセイウェルからのデータについてクラスター変数分析を行った。株間の実際の表現型差に対するｒｕｎ−ｔｏ−ｒｕｎ変動による不正確さを避けるため、同じ株の２つの独立したラン間の最小ペアワイズ類似性の割合を、１つの異なる群を形成する株間の低い類似性閾値として用いた。個々のアッセイウェルのデータで分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行い、Ｆ検定での有意差を定義するためのα値０．０１、０．０３、または０．１を持つ一般線形モデルを用いて異なる群を比較した。実験１では、ランＩのインキュベーション７日目とランＩＩのインキュベーション１０日目のデータ（短いインキュベーションと呼ばれる）を組み合わせ、ランＩの１２日目とランＩＩの１５日目のデータ（長いインキュベーションと呼ばれる）を組み合わせてＡＮＯＶＡを行った。実験２では、両方のランの同じインキュベーション日数のデータを組み合わせてＡＮＯＶＡを行った。
【０２３４】
生物防除アッセイ。フザリウム・グラミネアラム単離物Ｚ−３６３９の大分生子を、２５℃で７日間、１２時間／日の蛍光灯の状況下で浄化したＶ８ジュース寒天（ＣＶ８寒天）上で作製した。コロニー形成したプレートをＰＯ４弱緩衝液で満たし、病原菌の分生子懸濁液を得た。Ｙ−７３７４、Ｙ−７３７５、Ｙ−７３７６、Ｙ−７３７７、Ｙ−７３７９以外の全てのクリプトコッカス・フラベセンス株のバイオマスを１／５強度トリプシン大豆ブロス寒天（ＴＳＢＡ／５）のプレート上で開始した。２８℃で２４時間インキュベーション後、細胞を用いて、２５０ｍｌ三角フラスコ（ＯＤ＝０．１０、Ａ６２０）中の半規定完全液体培地（ＳＤＣＬ）５０ｍｌに接種した。シェーカーインキュベーター（２５０ｒｐｍ、２５℃、２４時間）でフラスコをインキュベートし、４８時間インキュベーション後に接種物培養物として用いた培養物（２５０ｍｌフラスコ中５０ｍｌのＳＤＣＬ、ＯＤ＝０．１０、Ａ６２０）を接種するために、細胞を対数増殖で生成した。
【０２３５】
株の有効性を決定するための各実験を、夜間は１７〜２０℃、日中は２５〜２８℃の範囲の温度で温度と湿度が調節された温室で行った。自然光を高圧ナトリウム灯で１４時間／日補った。各実験単位は、直径１９ｃｍのプラスチック鉢で育てられた硬質赤色春小麦品種基準の２つの植物からなった。各鉢は、空気流で低温殺菌された（６０℃で３０分間）ポッティングミックス（Ｔｅｒｒａ−ｌｉｔｅ  Ｒｅｄｉ−ｅａｒｔｈ  ｍｉｘ、Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）を含み、植物は、温室ベンチに移す前に７〜８週間、成長室（２５℃、１４時間光周期、６００ｕｍｏｌ／［ｍ２／ｓ］）で栽培した。１週間後、さらにその１週間後に、鉢に１．２５ｇ／Ｌのピーターズ２０−２０−２０（Ｇｒａｃｅ−Ｓｉｅｒｒａ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カリフォルニア州ミルピタス）と０．０７９ｇ／Ｌの  鉄キレート（Ｓｐｒｉｎｔ３３０、Ｂｅｃｋｅｒ  Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ，Ｉｎｃ．、アイオワ州エームズ）とを含有する溶液５０ｍｌを施肥した。植物を温室に移してからおよそ１週間後に、最終濃度０．０３６％のツイーン８０（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス）を含有するＰＯ４緩衝液中２５％の収穫したてのクリプトコッカス・フラベセンス細胞（〜５×１０７ＣＦＵ／ｍｌ）を噴霧することで開花期の小麦先端に接種した。各実験では、株ごとに５０ｍＬの接種物を用いて、全部で１２〜１５個の先端を表す６つの植物に接種した。その後直ちに、０．０３６％ツイーン８０含有ＰＯ４緩衝液中のフザリウム・グラミネアラム（３×１０４分生子／ｍｌ）の分生子懸濁液１２ｍＬを噴霧することで先端に抗原投与した。小麦先端には、まず、ＰＯ４緩衝液／ツイーン８０溶液を接種し、次に、病原菌のみの対照として機能するＰＯ４緩衝液／ツイーン８０中のフザリウム・グラミネアラム分生子のみを接種した。接種していない小麦の鉢を用いて、治療中に病原菌接種物が拡散しないようにした。接種された植物に蒸留水を軽く吹き付け、温室ベンチに移す前に３日間、夜間は１７〜２０℃、日中は２５〜２８℃のプラスチック湿度室でインキュベートした。治療は完全無作為化法で行った。赤かび病の重症度は、接種後１０日目と１６日目に０〜１００％縮尺を用いて視覚的に推定した。全ての温室実験は５回行った。Ｍｉｎｉｔａｂ  ｖ．１５を用いたクラスカル・ワリス検定によりデータを分析した。
【０２３６】
受託番号。ＭＬＳＴ分析で用いた配列は、受託番号ＫＣ６７９２３８〜ＫＣ６７９２９７およびＫＦ１７１１０６〜ＫＦ１７１１２２としてＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪデータベースに寄託されていた。
【０２３７】
結果
【０２３８】
クリプトコッカス・フラベセンスの２つの別個の遺伝子型のエビデンス
【０２３９】
６つの遺伝子座である、ｒＤＮＡ−ＩＴＳ、タンパク質をコード化する４つの遺伝子の部分配列、およびｃｓ２２の配列を決定し、整列させて、クリプトコッカス・フラベセンス株間の系統発生関係を推測した（表５）。これらの遺伝子座は、３Ｃのドラフトゲノム中の６つの異なる足場からであり、かつ、それらのホモログはそれぞれクリプトコックス・ネオフォルマンスＪＥＣ２１の６つの異なる染色体（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ１０７３４１〜ＡＥ１０７３５６）上に位置するため、おそらく非連鎖であった。１３個全ての株のｒＤＮＡ−ＩＴＳ配列は１００％同一であった。他の５つの遺伝子座は種内に分岐が現れ（従って、可変遺伝子座と呼ばれる）、ブートストラップ値１００（図１１）により支持された２つのクレード（遺伝子型Ａ型およびＢ型）が得られた。タンパク質をコード化する４つの遺伝子において、アラインメントにおける同一部位の割合は、各遺伝子型内で９５．８％〜１００％、２つの遺伝子型間では８９．５％〜９５．１％の範囲であり、キチンシンターゼ１遺伝子座およびβ−チューブリン遺伝子座は、それぞれ、最も高い分枝レベルと最も低い分枝レベルとを示した（表６）。遺伝子座ｃｓ２２は、３Ｃのドラフトゲノムから同定された、クリプトコックス・ネオフォルマンスＪＥＣ２１（８３ｂｐ）のキチンシンターゼ５遺伝子プラス下流匿名領域（７２４ｂｐ）の末端エクソンに対するホモログの３’末端である。Ａｕｇｕｓｔｕｓにより匿名領域内に妥当なコード配列が予測されず、かつ、ＮＣＢＩヌクレオチドコレクション（ｎｒ／ｎｔ）に対して不連続なｍｅｇａｂｌａｓｔもしくはｂｌａｓｔｘ検索のどちらも匿名領域に対してヒットしなかったため、匿名領域はおそらく遺伝子間である。ｃｓ２２での２つの遺伝子型間の配列差は、部分的には、匿名部分における３６−ｂｐ挿入（遺伝子型Ａ型における）もしくは欠失（遺伝子型Ｂ型における）により、タンパク質をコード化する４つの遺伝子（表６）間の配列差よりもはるかに低かった。ｃｓ２２での各遺伝子型内の配列差は、タンパク質をコード化する４つの遺伝子（表６）と比較して、低い代わりに中程度から大きいものであった。
【０２４０】
遺伝子型の分割は、５つ全ての可変遺伝子座にわたって一貫していた（図１４）。各遺伝子型には２〜６つの株があり、５つの遺伝子座の各々において互いに１００％のペアワイズ同一性を示した。さらに、全ての対応する配列は、以下の群：（ｉ）３Ｃ、Ｙ−１４０１Ｔ、およびＹ−７３７３；（ｉｉ）ＹＢ−６０１およびＹＢ−６０２；（ｉｉｉ）Ｙ−７３７２、Ｙ−７３７４、Ｙ−７３７５、および（ｉｖ）ＹＢ−７３７９およびＹＢ−７４４の各々内で１００％同一であった。各遺伝子座に対する最小ペアワイズ同一性は、アラインメントにおける同一部位の割合と同じかもしくは非常によく似ていた。Ｙ−７３７７は、３つの遺伝子座であるキチンシンターゼ１、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ、およびｃｓ２２に対して９５．８％、９９．０％、および９９．３％のペアワイズ同一性により、遺伝子型Ａ型株の残りの部分からの分岐であった（図１４Ｂ、１４Ｄ、および１４Ｅ；表６）。
【表６】
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【０２４１】
クリプトコッカス・フラベセンス株の生化学的特性のＴａｘｏｍｅｔｒｉｃ分析
【０２４２】
Ｂｉｏｌｏｇ  ＧＥＮ  ＩＩＩ基質に応じて多くの類似性を共有しているが、１２個のクリプトコッカス・フラベセンス株（Ｙ−１４０１Ｔを含まない）は、インキュベーション時間に応じて３つの測定可能に異なる群に分割することができた（図１２）。全ての分離株に共通するものは、７１個の評価した炭素化合物（表７、１行目）のうち３１個の同化は良好であり、他の２２個（表７、２行目）の同化は不足であった。さらに、１２個全ての株は、２３種類のうちの１８種類の化学ストレス（表７、１行目）に耐性であり、テトラゾリウムバイオレットに対して感受性があった。７つ全ての遺伝子型Ｂ型の株は、短期および長期インキュベーション（それぞれ図２Ａおよび２Ｂ）の後、遺伝子型Ａ型５株から異なる群を形成した。長期インキュベーションの終わりに、このグループ分けの基本は、１１個の炭素源の利用および３つの化合物に対する感度の差からくると判明した（表７、３行目）。
【表７−１】
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【表７−２】
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【０２４３】
遺伝子型Ａ型株は、インキュベーション時間に応じて異なるサブグループパターンを示した（図１２Ａ対図１２Ｂ）。ＹＢ−６０１およびＹＢ−６０２は、短いインキュベーション後に他の１０個全ての株とはかなり異なっていたが（図１２Ａ）、長いインキュベーション後には残りの遺伝子型Ａ型株と一緒にクラスタ化した（図１２Ｂ）。この食違いの寄与因子の１つは、おそらく、ＹＢ−６０１およびＹＢ−６０２によるいくつかの炭素源（例えば、ツイーン４０、Ｌ−アラニン、Ｄ−トレハロース、およびＬ−リンゴ酸）の独自の利用パターンである。これら４つのアッセイウェルのＯＤ５９５は、短いインキュベーション後には残りの遺伝子型Ａ型株（Ｆ検定のＰ＜０．０１）よりもＹＢ−６０１およびＹＢ−６０２が有意に低かったが、長いインキュベーション後には遺伝子型Ａ型の２つのサブグループ間は有意に異なっていなかった（Ｆ検定のＰ＞０．１）。これにより、ＹＢ−６０１およびＹＢ−６０２はこれらの炭素源を穏やかに同化させた結果、他の遺伝子型Ａ型株と比較して成長が遅れたことが示された。この表現型の差は、伸長因子１の系統発生における３つの遺伝子型Ａ型株からのＹＢ−６０１およびＹＢ−６０２の分枝と一致していた（図１４Ｃ）。長いインキュベーション後に、Ｙ−７３７３およびＹ−７３７７は、閾値よりも僅かに低い類似性により、３Ｃ、ＹＢ−６０１、およびＹＢ−６０２から表現型的に異なる群を形成した（図１２Ｂ）。これは、キチンシンターゼ１、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ、およびｃｓ２２の遺伝子座で他の３つの株からのＹ−７３７７の分枝と部分的に一致している（図１４Ｂ、１４Ｄ、および１４Ｅ）。クラスター分析においてＷａｒｄ法以外のＬｉｎｋａｇｅ法（Ａｖｅｒａｇｅ法、ＭｃＱｕｉｔｔｙ法、Ｓｉｎｇｌｅ法、およびＣｏｍｐｌｅｔｅ法）を用いることで、異なる樹形や類似性の大きさが得られた。しかしながら、上記のクラスタリングパターンは、Ｌｉｎｋａｇｅ法に関係なく常に実証された。
【０２４４】
次の分析では、基準株Ｙ−１４０１Ｔは、インキュベーション時間に関係なく３Ｃ、ＹＢ−６０１（両方とも遺伝子型Ａ型）、およびＹ−７３７２（遺伝子型Ｂ型）とは異なる生化学的特性を示した（データ不図示）。この差異は、おそらく、他の３つの株よりもＹ−１４０１Ｔの成長が遅いことに起因し、７１個の炭素源利用アッセイのうち２７個、２３個の化学物質過敏症アッセイのうち１６個が統計的に有意であった（表７、４行目）。唯一の例外は、Ｙ−１４０１Ｔが、１９日間のインキュベーションの終わりまでに他の株よりも僅かに良好にクエン酸を利用したことであった（Ｆ検定のＰ＝０．０８６）。各個々のランにおいて、３ＣとＹ−７３７２は、インキュベーション後５日目にＹＢ−６０１とは異なるクラスターを形成したが、３ＣとＹＢ−６０１は、インキュベーション後１９日目にＹ−７３７２とは異なるクラスターを形成した。これらのパターンは、２つのランと一致していた（図１２Ａおよび１２Ｂ）。しかしながら、基準株を用いたその後のアッセイにおけるｒｕｎ−ｔｏ−ｒｕｎ変動は非常に高かったため、そのようなパターンは、両方のランからのデータを一緒に見た際には観測されなかった。
【０２４５】
赤かび病（ＦＨＢ）を抑制するためのクリプトコッカス・フラベセンスの２つの遺伝子型の生物防除効果
【０２４６】
２つの遺伝子型からの代表的な株を、５回の別々の温室バイオアッセイで小麦のＦＨＢ抑制について評価した。クリプトコッカス・フラベセンス分離株による予防接種に起因するＦＨＢ疾病重症度の軽減は、５回の独立した試験のうち４回で観測された。これら４回の試験のうち２回で、観測された病気の軽減は、インキュベーション後１６日目で統計的に有意であった（クラスカル・ワリス検定によるＰ＜０．１０）。全体で、遺伝子型Ａ型分離株は、５回の独立した試験のうち３回で遺伝子型Ｂ型分離株よりも大きな生物防除活性を示したが、かかる試験に特有な疾患スコアの変異が高いことから、個々のラン結果は統計的に有意ではなかった。しかしながら、試験した全ての株について考えると、クリプトコッカス・フラベセンスの接種による疾病重症度の著しい軽減は、接種してから１０日目および１６日目に観測された（それぞれクラスカル・ワリス検定によるＰ＝０．１１および０．０３；図１３）。さらに、サブグループとして、遺伝子型Ａ型分離株は、温室試験でのインキュベーション後１６日目で陰性対照に対して疾病重症度を軽減させた（クラスカル・ワリス検定によるＰ＜０．１０）。しかし、遺伝子型Ｂ型分離株も疾病重症度を平均して軽減させたように見えたが、図１３に示す傾向は、クリプトコッカス・フラベセンスのそのサブグループでは統計的に有意ではなかった。グループとして、遺伝子型Ａ型は、平均のＦＨＢ疾病重症度を接種後１０日目に１６％（陰性対照２３％に対して）と１６日目に４６％（陰性対照６４％に対して）軽減させた。同様に、それほどではないにせよ、遺伝子型Ｂ型は、１０日目と１６日目に、病気の平均重症度をそれぞれ１７％および５１％軽減させた。これらのデータは、クリプトコッカス・フラベセンスの分離株が、全体として、赤かび病を防除する機能を有し、この研究で同定された２つの群のうち、遺伝子型Ａ型は遺伝子型Ｂ型よりもＦＨＢの防除により効果的であることを示すものである。
【０２４７】
考察
【０２４８】
この例では、クリプトコッカス・フラベセンス多様性の最初の詳細な特性化を提供し、種の公的に入手可能な分離株の大部分内において遺伝子型かつ表現型的に区別可能なサブグループの発生について実証する。これまでは、クリプトコッカス・フラベセンスの唯一入手可能な配列は、基準株Ｙ−１４０１Ｔ（＝ＣＢＳ  ９４２Ｔ）のリボソームＤＮＡおよび内部転写スペーサーと、他のいくつかの株であった。ヒト病原性クリプトコックス・ネオフォルマンスおよび生物防除菌であるトリコデルマ・ハルジアナムのｒＤＮＡ−ＩＴＳ遺伝子座での種内多様性に対し、本研究で得られた全てのクリプトコッカス・フラベセンスｒＤＮＡ−ＩＴＳ配列は、Ｙ−１４０１Ｔの公開配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０３５０４６）と１００％同一であった。ＩＴＳ領域においてＹ−１４０１Ｔと９９．０％の配列同一性を持つ株はクリプトコッカス・フラベセンスとして同定されていたため、本研究における他の１２個全ての株は、一般的に、ＩＴＳ遺伝子型のみに基づいてクリプトコッカス・フラベセンスとしても分類されるであろう。しかしながら、この群は、ＭＬＳＴに基づいて２つの別個の遺伝子型に分けることができ（図１１）、使用した５つの増幅配列のうちの３つにおいて１０％を超える配列分岐であった（表６）。表現型的に、全ての遺伝子型Ａ型株は、ｒｕｎ−ｔｏ−ｒｕｎ変動に関係なく遺伝子型Ｂ型株とは異なる群を形成した（図１２）。これは、遺伝子型がクリプトコッカス・フラベセンスの生化学的特性を示すことを実証するものである。植物病理学者に最も関連する、クリプトコッカス・フラベセンスの両方の遺伝子型はＦＨＢに対する生物防除効果を示した（図１３）。これは、種が全体として著しい生物防除ポテンシャルを持つことを示す。さらに、遺伝子型Ａ型（その株３Ｃは基準株である）は、５回の独立した温室実験からのデータを組み合わせた際に、遺伝子型Ｂ型よりも僅かに良かった。
【０２４９】
５つの可変ＭＬＳＴ遺伝子座により示された遺伝子型の分割は、クリプトコッカス・フラベセンスの定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイの実施中に観測された結果と一致していた（実施例５を参照）。実施例５では、本研究のＭＬＳＴで用いた同一熱ショックタンパク質７０ｋＤａ遺伝子座内の１５０−ｂｐ領域を標的にした。ｑＰＣＲアッセイにより、プライマー結合領域における配列差から得られた閾値サイクルの差に基づいて、試験したクリプトコッカス・フラベセンス株を２つの群、３Ｃ様および非３Ｃ様に分化させた。実際には、３Ｃ様株は遺伝子型Ａ型に属し、非３Ｃ様は遺伝子型Ｂ型に属する。遺伝子型Ａ型内で、５つの可変ＭＬＳＴ遺伝子座でＹ−１４０１Ｔが３ＣおよびＹ−７３７３に１００％同一であることは、Ｙ−１４０１Ｔが、日本では何十年も前に単離されているが、米国にてより最近に単離された２つの株と密接に関連していることを示す。それ故、その種は、１０年の時間スケールで遺伝的に安定であると思われる。
【０２５０】
炭素源の利用結果は、過去の研究と本研究とのほとんどの時間で一致していた（表７、５行目）。唯一の僅かな不一致はグリセロールであった。これまでの結果は、Ｙ−１４０１Ｔもしくは変数に対して陰性であった。しかしながら、本研究では１３株全ての利用に対して陽性もしくは陽性に近かった（最も長いインキュベーション後、Ｙ−１４０１ＴのＯＤ５９５＝０．５８９、他の１２個の株のＯＤ５９５＞０．７）。Ｙ−１４０１Ｔはほとんどの遺伝子型Ａ型株から最小限の遺伝的多様性を示したが、その生物学的アッセイの結果は、一般的に成長が不良であることにより大きく異なっていた。このパターンが地理的／生息地の差もしくは長年にわたる株の二次培養／保存から得られたかどうかは不明である。炭素源利用はこれまで赤かび病（ＦＨＢ）に対する生物防除剤の回復力に関連しており、微生物による酒石酸の利用により、ＦＨＢの損害を軽減する能力の方に正にバイアスされていた。酒石酸は、ＯＨ  １８２．９（３Ｃの前駆細胞）によって利用されてもよいが、本研究で用いた生物学的検定法には含まれない。
【０２５１】
いくつかの株はこれまで接合試験に基づいて２つの接合型と指定されており、接合応答には、接合管の形成、および株ペアの混合培養における融合管からの菌糸成長が含まれた。反対の接合型の株は（研究室内で）交配することができるが、同じ接合型の株は交配することができない。この研究では、Ｙ−７３７２、Ｙ−７３７４、Ｙ−７３７５、Ｙ−７３７６、およびＹ−７３７９は接合型αと指定されたが；Ｙ−７３７３およびＹ−７３７７は接合型ａと指定された。５つ全てのα株は遺伝子型Ｂ型として示されたが、両方のａ株は本研究のＭＬＳＴにより遺伝子型Ａ型として示された。２つの接合型間の遺伝的多様性により、環境において研究した株間における最小限の有性組換えが示された。同じＭＬＳＴ遺伝子型の株が本研究の同じ接合型に属していたという事実は、クリプトコックス・ネオフォルマンス変種グルビにおける過去のＭＬＳＴ研究と一致しており、４０以上のＭＬＳＴ型と２つの接合型だけ同定された。それ故、クリプトコッカス種内において、異なる接合型の株は、他の保存遺伝子座で異なる遺伝子型になる傾向がある。
【０２５２】
新規の生物防除分離株の発見を助け、かつ、生物防除剤の地理的分布を研究するために遺伝子マーカーが使用されている。本研究で開発されたＭＬＳＴマーカーを用いて、新しくかつ新規のリプトコッカス・フラベセンス生物防除剤を同定してもよい。この種の自然の範囲および多様性を包括的に特性化するために種々の地理的場所で小麦畑から追加のクリプトコッカス・フラベセンス株を回収する際に、ＭＬＳＴ分析を追加のクリプトコッカス・フラベセンス株に行うこともできる。雑種子孫が親よりも優れた生物学的特質を示す雑種強勢が、より高い収穫率および耐病性などの改善性能を持つ種間雑種を作成するために植物育種で利用されている。相性の良い接合型のクリプトコッカス・フラベセンス分離株を交配させることで、ＦＨＢに対する雑種子孫の生物防除効果が増したかどうかを調べることができる。生物学的プレートに示す炭素源利用および耐薬品性パターンを用いて、潜在的な生物防除剤としてクリプトコッカス・フラベセンスの選択的な回復力を助けるクリプトコッカス・フラベセンス特異性培地を開発してもよい。
【０２５３】
実施例５。小麦に塗布した生物防除酵母であるクリプトコッカス・フラベセンスのフィールド拡散および持続性を監視するための定量ＰＣＲアッセイ
【０２５４】
材料および方法
【０２５５】
株。クリプトコッカス・フラベセンス株ＯＨ  １８２．９＿３Ｃ（３Ｃ）をＮＣＡＵＲ研究所のＡＲＳ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから受託番号ＮＲＲＬ  Ｙ−５０３７８で入手した。他の６つのクリプトコッカス・フラベセンス株も、ＮＲＲＬからそれぞれ、受託番号Ｙ−７３７２、Ｙ−７３７３、ＹＢ−３２８、ＹＢ−６０１、ＹＢ−６０２、およびＹＢ−７４４で入手した。全ての株は、長期保存用に−８０℃でグリセロールストックとして維持した。
【０２５６】
フィールドの確立と３Ｃ塗布。本研究の実験は、オハイオ州ウースター最北端のスナイダー農場で軟質赤色冬小麦（トリチカム・アエスチバムＬ．）を植えた２つのフィールドで行った。第１のフィールド（以下、フィールド１と呼ぶ）には、２０１０年１０月１１日にホープウェル品種を植えた。フィールド１のレイアウトを図５に示す。第２のフィールド（以下、フィールド２と呼ぶ）には、２０１１年１０月６日にフリーダム品種を植えた。フィールド２の小麦は、１．５ｍ幅および０．６ｍ長の空間を持つ、区画１つ当たり４．６ｍ×１．７ｍで１４×７区画を含む８５ｍ×１６ｍの矩形領域に植えた。フザリウム・グラミネアラムによりコロニー形成されたコーン穀粒を、開花のおよそ３週間前にフィールド２にわたって均等にばらまいた。図７、図１５、および図１６に示すデータはフィールド１から収集したもの、図１７に示すデータはフィールド２から収集したものである。
【０２５７】
接種物産生。ＳＤＣＬ培地で産生された３Ｃの対数増殖期細胞は、８０ＬのＳＤＣＬ培地を充填したＢブラウンＤ−１００発酵槽での産生用の５％種子接種物として機能した。発酵槽は、２０Ｌ／分の通気、およびツインラシュトン羽根車により提供される２００回転／分の攪拌で２５℃にて作動させた。接種してから１８時間後に、発酵槽の温度を１５℃に下げ、細胞に収穫前２４時間低温ショックを与えた。Ｓｈａｒｐｌｅｓ  １２−Ｖ管型ボール遠心分離機を用いてペーストに濃縮して細胞を収穫した。その後、細胞ペーストをＰＯ４弱緩衝液におおよそ２×１０９ＣＦＵ／ｍｌの濃度で懸濁させ、ストックとして−２０℃で凍結させた。フィールド接種物は、１．５Ｌのストック（１０℃で一晩予備解凍）を１．５Ｌの無菌２回蒸留水と１０．８ｍｌの１０％ツイーン８０と混合させることで、塗布直前に準備した。小麦の開花中（初期の穂ばらみ期１０．５；２０１１年５月２９日）、６．１ｍ×６．１ｍ（図５の区画ｉ＿１、ｉ＿２、およびｉ＿３）の３つの領域に、３Ｃ接種物を、１平方センチメートル当たり２×１０６〜６×１０６細胞の速度でおおよそ１．５×１０９細胞／ｍｌの霧として噴霧した。
【０２５８】
フィールド２に対する３Ｃ接種物を産生するために、３Ｃ（開始ＯＤはＡ６２０で０．１０）を接種した２００ｍｌのＳＤＣＬ培地を含有する５００−ｍｌフラスコを２５℃にて２５０回転／分で２４時間インキュベートした。その後、これらの培養物を用いて、１．２５ＬのＳＤＣＬ培地を含有する３リットルのＦｅｒｎｂａｃｈフラスコにＯＤ０．１０に播種した。培養物を２５℃にて２５０回転／分で４８時間インキュベートした。次いで、２．３×１０８ＣＦＵ／ｍｌのコロニー形成ブロスを無菌容器に移し、氷上のフィールドに搬送し、フィールドに１平方センチメートル当たり４．４×１０５ＣＦＵの速度で２４時間以内に塗布した。塗布は、小麦の開花中（初期の穂ばらみ期１０．５；２０１２年５月２９日）に行った。本研究用のサンプリングは１２区画で行い、そのうちの６つには３Ｃのみを噴霧し、別の６つにはいずれの微生物も噴霧しなかった。異なる治療の区画場所は、フィールドにわたって無作為に選んだ。
【０２５９】
サンプル収集。小麦先端サンプルは、先端下１〜２ｃｍの茎を刈り、各先端を個々のサンプル袋に密封することで収集した。サンプル収集中、各先端には、それの収集に用いた袋に内側からのみ触れ、刈り込みハサミは、二次汚染を予防するためにクリップ間に７５％水性エタノールで殺菌した。２０１１年夏に、３Ｃの噴霧塗布後１時間以内（接種後０日目）、ならびに接種後２４時間（１日目）、１０日目、２６日目、４４日目（サンプリング場所の詳細については図５を参照されたい）にフィールド１から先端を収集した。２０１２年６月２６日に、収穫の１１日前および１日前にフィールド２から先端を収集し、ここで、１つの先端は、各時点で１２区画の各々から収集した。
【０２６０】
２０１２年の１月下旬および３月下旬に、収穫後の残留物サンプルをフィールド１の３つの接種領域から収集した。７つの異なる場所で、各接種領域の中心の周りの半径約１ｍの円の中からサンプリングした。各時点で、２種類のサンプルを各場所で収集し：土壌、生えている雑草、および茶色に腐敗している植物材料の組み合わせを１つの複合サンプルとして収集し、腐敗していない小麦の茎を他のサンプルとして収集した。
【０２６１】
穀粒は、２０１２年６月２６日にフィールド２全体としての１２区画の各区画から収穫した。各区画の全穀粒は、１つの紙袋に６ｃｍより薄い層として室温で暗所下に保存した。おおよそ１０ｇの１つのサブサンプルは、ＤＮＡ抽出のために挽き砕く直前に、それぞれ、収穫後１４日目、６４日目、および１５５日目に各区画の全穀粒から収集した。
【０２６２】
サンプル取り扱い、ＤＮＡ抽出、およびテンプレート調製。３Ｃおよび他の６つのクリプトコッカス・フラベセンス株のゲノムＤＮＡは、製造元の指示に従って、ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ（登録商標）ＤＮＡ単離キット（ＭＯ  ＢＩＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，米国カリフォルニア州）を用いて１／５トリプシン大豆寒天上で成長させた２日経った培養物から抽出した。これらの元のＤＮＡ抽出物を、Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国デラウェア州）の測定値に基づいて、２０倍以上の特定濃度に希釈し、ｑＰＣＲ用のテンプレートを調製した。
【０２６３】
小麦先端および茎のサンプルは、サンプリング後１時間以内にラボに戻し、−８０℃で保存した。小麦（穀粒を含む）サンプルをＤＮＡ抽出直前に液体窒素中で挽き砕いた。複合残留物サンプルをラボに持ち帰った後、１０℃で保存し、その後、サンプルを液体窒素中で挽き砕くことなく、２４時間以内にサンプルからＤＮＡ抽出を直接行った。全てのＤＮＡは、製造元の指示に従って、おおよそ０．３グラムの各サンプルからＰｏｗｅｒＳｏｉｌ（登録商標）ＤＮＡ単離キットを用いて抽出し、サンプル１つ当たりのＤＮＡ抽出物は１００μｌの収量であった。小麦先端および穀粒サンプルのＤＮＡ濃度はｑＰＣＲデータ解釈を妨げるほど非常に高かった（新鮮組織からの豊富な小麦ＤＮＡにより）ため、元のＤＮＡ抽出物の１：２０希釈物および１：１０希釈物を、それぞれ、フィールド１および２からのサンプルのテンプレートとして用いた。非希釈ＤＮＡ抽出物は、フィールド１からの収穫後の残留物サンプルのテンプレートとして用いた。
【０２６４】
定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）。３Ｃのドラフトゲノム配列（ＥＭＢＬ受託番号ＣＡＵＧ０１０００００１〜ＣＡＵＧ０１０００７１２）に基づいて、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェアを用いてｑＰＣＲプライマーを設計した。３Ｃおよび他の６つのクリプトコッカス・フラベセンス株の１ｎｇ／μｌゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、特異性のｑＰＣＲ試験を、７つの推定保存領域を標的にする１４対のプライマーについて行った。７つの領域は推定では、ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２、および、以下のタンパク質をコードする遺伝子：β−チューブリン、キチンシンターゼ５、伸長因子１、および３つの７０ｋＤａ熱ショックタンパク質の部分領域であった。１４対のプライマーのうち、プライマー対ｈ３１．２は、３ＣといずれかのＹ−７３７２、ＹＢ−３２８、およびＹＢ−７４４との間の閾値サイクル値において最も大きな差を示したため、以下に記載のｑＰＣＲアッセイに用いるために選ばれた。各ｑＰＣＲ反応は、２．５μｌのテンプレートＤＮＡ、０．４ｐｍｏｌ／μｌの各プライマー（フォワードプライマーｈ３１．２＿Ｆ：５’−ＣＧＴＣＡＧＣＧＴＧＴＴＧＣＣＡＣＴＴＣＧＴ−３’（配列番号６７）；リバースプライマーｈ３１．２Ｒ：５’−ＧＣＴＧＣＴＧＴＣＴＴＧＣＧＧＴＣＧＣＴＴＡ−３’（配列番号６８））、１２．５μｌのｉＱ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州）、および容量の残りとしてＤＮＡフリーＰＣＲ水からなる全容量２５μｌを有した。また、ＤＮＡフリーＰＣＲ水を陰性対照のテンプレートとして用いた。熱サイクルプログラムをｉＣｙｃｌｅｒで実行し、ｉＱ（商標）５検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）により蛍光データを収集した。増幅は２段階であり、９５℃で３分間増幅した後、９５℃で１５秒および７２℃で１分間を４０サイクルで増幅した。その後、０．５℃の増分で５５℃〜９５℃、かつ、各温度で１０秒の滞在時間で融解曲線を得た。ｉＱ（商標）５  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いてｑＰＣＲの蛍光データを分析した。
【０２６５】
データ処理および分析。テンプレート中の３ＣゲノムＤＮＡの１、１×１０−１、１×１０−２…１×１０−７ｎｇ／μｌの標準系列を３通りで実行し、回帰式Ｙ＝５．７９２−０．２９８４Ｘ（Ｒ２＝０．９９１）を得た。この式を用いて、テンプレート中の３ＣゲノムＤＮＡ濃度の等価として、フィールドサンプルのＣｔ値（Ｘ）およびそれらの対数開始量値（Ｙ）から算出した。開始量の単位は、「テンプレート中の３ＣゲノムＤＮＡのｎｇ／μｌ」から「サンプル１グラム当たりの標的遺伝子コピー数」に変換した。単位換算は、以下の２つの前提に基づいた：（ｉ）ゲノム当たりの標的遺伝子が１コピーであり、３Ｃのドラフトゲノムに対する遺伝子ならびにｈ３１．２プライマーのＢＬＡＳＴ検索と、全ゲノム（データ不図示）の範囲に対する各足場の配列決定の範囲とで支持されている；（ｉｉ）３Ｃのゲノムサイズは、１倍体ゲノム当たり約０．０２ｐｇ（クリプトコッカス・ガッティおよびクリプトコックス・ネオフォルマンスのゲノムサイズに基づいて推定）であった（Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｉｚｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）。従って、１ｎｇの３ＣゲノムＤＮＡは、５×１０４コピーの標的遺伝子に等しく、相互に、１コピーの標的遺伝子は、２×１０−５ｎｇの３ＣゲノムＤＮＡに等しいと見なされた。この研究では、各反応は、２．５μｌテンプレートで開始され、これは、０．３グラムサンプルから得られた全１００μｌのＤＮＡ抽出物に属していた。従って、１ｎｇ／μｌの３ＣゲノムＤＮＡは、小麦先端または穀粒サンプル（それぞれ、テンプレートとして元のＤＮＡ抽出物の１：２０または１：１０希釈物）のサンプル１グラム当たり３．３×１０８（１０８．５）または１．７×１０８（１０８．２）コピーの標的遺伝子、およびフィールド１からの収穫後の残留物サンプル（テンプレートとして非希釈ＤＮＡ抽出物）のサンプル１グラム当たり１．７×１０７（１０７．２）コピーに等しいと見なされた。
【０２６６】
いずれか任意のＰＣＲ反応に対する理論的検出限界は、反応当たり１コピーの標的遺伝子であると見なされた。単位変換に対する上記２つの前提と、本研究において各反応は２．５μｌのテンプレートで開始されたこととを考えると、本研究の理論的検出限界は、２．５μｌ当たり２×１０−５ｎｇの３ＣゲノムＤＮＡであり、テンプレート中の３ＣゲノムＤＮＡ８×１０−６ｎｇ／μｌと等しかった。全１００μｌのＤＮＡ抽出物が０．３グラムサンプルから得られたフィールドサンプルにおいて、理論的検出限界は、小麦先端または穀粒サンプルのサンプル１グラム当たり２．７×１０３（１０３．４）または１．３×１０３（１０３．１）コピーの標的遺伝子（それぞれ、テンプレートとして元のＤＮＡ抽出物の１：２０または１：１０希釈物）、およびフィールド１からの収穫後の残留物サンプルのサンプル１グラム当たり１．３×１０２（１０２．１）コピーであった。
【０２６７】
ｑＰＣＲの融解曲線分析において、８７．０℃または８７．５℃の単一ピークは、標準系列（１〜１０−４ｎｇ／μｌの３ＣゲノムＤＮＡ）における濃縮テンプレート用のｉＱ（商標）５検出システムにより報告された唯一のピークであった。従って、フィールドサンプルにおいて、８７．０℃または８７．５℃の単一ピークが報告された唯一のピークであるサンプルのみが、３Ｃの検出において陽性と見なされた。８７．０℃または８７．５℃のピークを示さないサンプルは、３Ｃの検出なしと見なされ、それらのＣｔ値は、統計分析で４１と見なされた。８７．０℃または８７．５℃のピークおよび他のピークを示すサンプルは、３Ｃの検出を示したが、非特異的ピークの干渉により定量化は十分に正確ではないため、さらなる分析用にトリミングした。いくつかの統計異常値もトリミングした。各実験において、トリミングしたデータポイントは、指定のない限り、全データポイントの７％を超えることはなかった。α＝０．０５の一般線形モデルを用いた分散分析を、ソフトウェアＭｉｎｉｔａｂ  １６（Ｍｉｎｉｔａｂ  Ｉｎｃ．、米国ペンシルベニア州）を用いてランク付けした形式のＣｔ値で行った。
【０２６８】
結果
【０２６９】
アッセイの感度および特異性
【０２７０】
ｑＰＣＲアッセイで用いたプライマー対ｈ３１．２は、３Ｃのドラフトゲノム配列から同定された推定熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ｈｓｐ７０）遺伝子の一部を増幅するために設計された。プライマーｈ３１．２Ｆは、推定イントロン領域に結合し、プライマーｈ３１．２Ｒは、推定エクソン領域に結合する（図１８）。標的領域は１５０ｂｐであり、１つの推定エクソン−イントロン結合を含む。ｑＰＣＲアッセイの増幅効率は、９８％〜１０９％の範囲であった。選択されたｑＰＣＲ反応の閾値サイクル（Ｃｔ）値および溶融温度を表８に示す。標準系列は、１〜１×１０−４ｎｇ／μｌのテンプレート濃度でＣｔ値が増える勾配を示したが、１×１０−６もしくは１×１０−７ｎｇ／μｌでは検出されなかった。１×１０−５ｎｇ／μｌの３つの複製のうち、１つは検出を示したが、他の２つは検出を示さなかった。理論的検出限界は、テンプレート（１反応当たり１コピーの標的遺伝子に等価）において０．８×１０−５ｎｇ／μｌの３ＣゲノムＤＮＡであったため、３ＣゲノムＤＮＡのテンプレート濃度が１×１０−５ｎｇ／μｌ未満の場合に一貫した検出がなかったのは妥当である。標的ＤＮＡのピペット量の誤差は、標的濃度が１反応当たり１コピーに近い場合に非常に大きいため、３５．１（１×１０−５ｎｇ／μｌでの標準複製のＣｔ）を超えるＣｔによる任意の検出事象は、定量的ではなく定性的のみと見なすべきである。
【０２７１】
クリプトコッカス・フラベセンス種内のアッセイの特異性を試験するため、３Ｃ以外の他の６つのクリプトコッカス・フラベセンス株の１ｎｇ／μｌゲノムＤＮＡテンプレートでもｑＰＣＲを実行した（表８）。株Ｙ−７３７２、ＹＢ−３２８、およびＹＢ−７４４の配列は、各プライマー結合部位での２つの塩基対により３Ｃとは異なる（図１８）。これら３つの株は、同じテンプレート濃度で３ＣゲノムＤＮＡよりも遥かに高いＣｔ値を示した。３Ｃと上述の３つの株との約１５のＣｔ差（開始量においておおよそ３×１０４倍の差に等しい）は、３Ｃをそれらとよく区別することができる。これに対し、株Ｙ−７３７３、ＹＢ−６０１、およびＹＢ−６０２は、全アンプリコンにわたり３Ｃに１００％の配列同一性を示した（図１８）。これら３つの株は、１４個全てのプライマー対の３Ｃに相当するＣｔ値を示したため、アッセイプライマー対ｈ３１．２（表８）または他の１３個いずれかの試験プライマー対により３Ｃと区別することはできなかった。従って、アッセイが定量化するものは、３Ｃのみの個体群の代わりに、３ＣならびにＹ−７３７３、ＹＢ−６０１、およびＹＢ−６０２を含む３Ｃ様クリプトコッカス・フラベセンスの個体群である。
【０２７２】
３Ｃを接種した領域における３Ｃ様クリプトコッカス・フラベセンス個体群の動態
【０２７３】
小麦先端組織１グラム当たりの標的遺伝子コピー数により表される、小麦先端の３Ｃ様クリプトコッカス・フラベセンスの個体群密度は、３Ｃを接種した領域において経時的に変動した（図１５）。接種後（ＤＰＩ）１日目のサンプルは、１０ＤＰＩ時および１０ＤＰＩ後のものよりも有意に低い３Ｃ個体群密度を示した。これは、３Ｃ細胞が１〜１０ＤＰＩに小麦先端で増殖することで、個体群成長のｑＰＣＲ検出がもたらされたことを示している。０〜１ＤＰＩおよび１０〜４４ＤＰＩに個体群が変化する傾向があったが、α＝０．０５に基づいて統計的に有意ではなかった。
【表８】
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【０２７４】
大部分のサンプルの３Ｃ様クリプトコッカス・フラベセンス個体群は、接種直後（０ＤＰＩ）には小麦先端組織１グラム当たり１０５．５〜１０６．０コピーの標的遺伝子であったが、１ＤＰＩでは１０４．５〜１０５．５であった。その後、個体群は、季節の終わりには１０６．０〜１０６．５に増加した。接種率が１平方センチメートル当たり１０６．３〜１０６．８の３Ｃ細胞であり、かつ、小麦先端の横断面がおおよそ１平方センチメートルであったことを考えると、ｑＰＣＲ−検出した個体群は、成長期中の接種率よりも僅かに低いが該接種率に相当するレベルで維持された。
【０２７５】
フィールドの非接種領域への３Ｃの拡散
【０２７６】
３Ｃ様個体群は、接種領域からの距離が増すにつれて減少し、生物防除効果を示すのに必要な最小限の個体群密度あたりで、閾値（小麦先端１グラム当たり３．３×１０４の遺伝子コピー）を上回るサンプルの割合で示される傾向があった（図７Ａ）。この傾向は、異なる個体群レベルのサンプルが全体の一部分として示される場合にも実証されている（図７Ｂ）。さらに、非接種領域における個体群が１〜４４ＤＰＩに経時的に増加する傾向が観測された（図７Ａおよび図７Ｂ）。これは、３Ｃが接種領域から非接種領域へと確率的に経時的に拡散したことを示している。成長期の最後のサンプリング（４４ＤＰＩ）までに、非接種領域からの大部分のサンプルは、ｈｓｐ７０マーカーの小麦先端１グラム当たり３．３×１０３〜３．３×１０５の標的遺伝子コピーとして検出された。
【０２７７】
０ＤＰＩに非接種領域において３Ｃ様クリプトコッカス・フラベセンスに陽性のサンプルがいくつかあった（すなわち、３６個のうち５つ）。しかしながら、検出レベルは、小麦先端１グラム当たりで３．３×１０２〜３．３×１０３の標的遺伝子コピーであり、アッセイの検出限界あたりの量であった。１ＤＰＩでの非接種サンプルはどれも（すなわち、３５個のうち０）、３Ｃ様個体群に陽性とならなかった。これらのデータにより、天然クリプトコッカス・フラベセンスによる小麦先端のコロニー形成は、一般に低頻度であり、起こったとしても、１小麦先端当たり１０４の遺伝子コピーには決して到達しなかったことが示される。それ故、この実験におけるｑＰＣＲ検出個体群の大部分は、３Ｃ接種から生じたものと解釈され、これが、上述の距離的および時間的な個体群動態が３Ｃの拡散パターンを反映している理由である。
【０２７８】
サンプル収集活動の３Ｃ拡散への効果
【０２７９】
フィールド全体を歩いたサンプル収集者が３Ｃの明らかな拡散に寄与したかどうか試験するため、１０ＤＰＩにフィールド１の小麦栽培領域の境界で追加の小麦先端サンプルを収集した。サンプル収集者は小麦栽培領域間の休閑歩道に沿って歩いたため、接種領域から非接種領域に３Ｃを持ちこんだ可能性があった。サンプル収集活動が３Ｃ拡散に寄与した場合、歩道に隣接する小麦栽培領域の境界での小麦先端は、小麦栽培領域の内側奥深くのものよりも高い３Ｃ個体群密度を示すべきであるとの仮説を立てた。サンプル収集者は、接種領域からサンプルを収集した後、その側からフィールドを出るよう求められていたため、この仮説に対するサンプルは、フィールドの東側（サンプリング場所の詳細については図５を参照）から収集した。小麦栽培領域の境界および内側からの小麦先端の個体群密度間には有意差はなく（ｎ＞７、Ｐ＞０．７８）、これは、サンプル収集活動がこの実験における３Ｃの拡散に有意に寄与していなかったことを示している。
【０２８０】
卓越風向の３Ｃ拡散への効果
【０２８１】
卓越風向（西から東）が３Ｃ拡散の明白なパターンに影響を与えたか試験するため、フィールド１の西側と東側からの小麦先端サンプルを比較した。異なる場所群（場所群の詳細については図５を参照）および／または異なる時点でのサンプルを別々に比較した。卓越風が３Ｃ拡散に重要な役割を果たしたのであれば、フィールドの東側からのサンプルは、西側からのものよりも高い３Ｃ個体群密度を示すべきであるとの仮説を立てた。３Ｃ個体群密度の微分パターンは、異なる場所群およびサンプリング時点にわたり一貫しておらず、フィールドのどちらの側にも明らかな傾向は無かった。これは、卓越風向がこの実験における３Ｃ拡散のパターンに有意な影響を及ぼさなかったことを示している。これは、３Ｃが、風で分散した胞子の公知の産生をしない酵母菌であるという事実と一致しているため、風のみで容易に分散されないのかもしれない。３Ｃは風の吹く雨でより良く分散されるが、降雨事象は卓越風向と相関していない。
【０２８２】
３Ｃ様クリプトコッカス・フラベセンスの越冬持続性
【０２８３】
３Ｃ様クリプトコッカス・フラベセンスが冬を越してフィールドで持続できるか試験するため、フィールド１の３つの接種領域を冬から２０１２年の春先にかけてサンプリングした。収穫して６〜９カ月後まで個体群は接種領域で検出できたことをデータは示した（図１６）。異なる接種領域における同型のサンプル間での有意差は無かったため、３つの接種領域からのデータポイントをサンプル型間の比較用に組み合わせた。腐敗していない小麦の茎サンプルは、土壌、生えている雑草、および腐敗している植物材料（大部分は１０２．５〜１０３．５）の複合サンプルよりも重量１グラム当たりの個体群（大部分は１０４〜１０５）が有意に高いレベルを示した（図１６）。越冬残留物の個体群は、成長期の終わり頃には小麦先端のものよりも低く、その大部分は、４４ＤＰＩでサンプル１グラム当たり１０６標的遺伝子コピーを上回った。
【０２８４】
収穫時期および保存中の３Ｃ様クリプトコッカス・フラベセンスの個体群レベル
【０２８５】
収穫時期の異なる時点で別のフィールド（フィールド２）から追加の小麦先端および穀粒サンプルを収集した。穀粒の個体群レベルを保存期間の後にｑＰＣＲにより繰り返し測定した。接種サンプルは、一般に、異なる時点で両方のサンプル型において非接種サンプルよりも高い個体群を示した（図１７）。先端および脱穀粒を含む、接種区画からのサンプルのほとんどは、１グラム当たり１０３．５よりも高く、最大で１０６．７の標的遺伝子コピーの検出を示した。小麦先端の個体群は、接種および非接種区画の両方において収穫１１日前から収穫１日前に増加する傾向があった。非接種区画から収集したサンプルにおいて、個体群は、収穫１日前の先端（大部分は、１グラム当たり１０４．０〜１０４．５の標的遺伝子コピー）よりも収穫１４日後の脱穀粒（大部分は、１グラム当たり約１０３．５の標的遺伝子コピー）で有意に低かった（テューキー検定によるＰ＝０．０３７）。接種サンプルは、かかる差の傾向を示したが、有意ではなかった（テューキー検定によるＰ＝０．２２）。収穫後１４日目から６４日目の保存中から収穫後１５５日目に接種および非接種区画の両方から脱穀粒の個体群が徐々に減少する傾向があった（図１７）。
【０２８６】
考察
【０２８７】
この例では、屋外栽培の小麦、より広範には、環境における３Ｃ様クリプトコッカス・フラベセンスの拡散および持続性を監視するために開発されたｑＰＣＲアッセイについて説明する。このアッセイにより、接種および非接種の小麦先端サンプル間において明確な差を持つ検出が可能になった（表８、最後の２列）。本研究で試験したサンプル型の各々において意味ある差の結果を与えたため、多数のサンプル型に合理的に適用することができる。本アッセイの感度は、他の関連ｑＰＣＲアッセイに相当した。小麦の菌類病原体を検出するためにｑＰＣＲを用いた過去の研究では、反応当たり１０１の遺伝子コピーおよび１０４の遺伝子コピーもしくは小麦組織１グラム当たり１〜１０３ｎｇのゲノムＤＮＡの大きさで最小検出を示し、これは本アッセイにおけるもの（反応当たり１２．５の遺伝子コピー、１０３〜１０４の遺伝子コピー、もしくは小麦組織１グラム当たり０．０１〜０．１ｎｇのゲノムＤＮＡ）に相当した（表８、図７Ｂ、および図１６）。本ｑＰＣＲアッセイは、３Ｃの培養物に基づく定量化ほど感度が良いわけではなく、小麦組織１グラム当たり１０〜１００個の細胞を検出できた。しかしながら、このｑＰＣＲアッセイは、菌株間特異性を有するが、培養物に基づく定量化では、形態に基づいてクリプトコッカス・フラベセンスの亜種間を区別できないという点において、前者は後者よりも優れている。また、ｑＰＣＲアッセイにより、保存中の細胞の死滅により個体群を低く見積もることなく、定量化する前にサンプルを長期保存することができる。
【０２８８】
ｑＰＣＲアッセイにより、他の３つの株よりも４つの３Ｃ様クリプトコッカス・フラベセンス株（３Ｃ、Ｙ−７３７３、ＹＢ−６０１、およびＹＢ−６０２）に種間特異性が示された（表８）。３Ｃ様株間では閾値サイクル（Ｃｔ）値もしくは溶融温度のいずれでもさらなる区別をすることができず、これは、３Ｃ様株間の高い配列類似性によるものである。３Ｃと３つの３Ｃ様株との配列差は、本研究でのプライマー設計に用いた７つ全ての領域を含む９つの保存領域にわたって、全部で５５００ｂｐを超えるＤＮＡ（推定では〜２０００ｂｐの非コード配列を含む）のうち実際には０〜１ｂｐであった。プライマー結合部位での１つの塩基対による不一致は、試験したプライマーの１つに対して〜１．５のＣｔ差しか生じなかったため、これらの保存領域からの増幅を介して３Ｃ様クリプトコッカス・フラベセンス間を区別することはほとんど不可能である。「３Ｃに対してのみ」の特異性を達成するために、さらなる可変領域を標的にするプライマーを設計することは可能かもしれない。しかしながら、可変領域におけるより高い自然突然変異率は、プライマー結合部位に変異がある３Ｃ子孫を検出する能力を失わせる可能性があるため、そのような戦略は感度を犠牲にする場合がある。さらに、いくつかの３Ｃ様株が近接過去において３Ｃと同じ個体群から生じたかもしれず、単に別々の単離事象により異なる株として命名された可能性を除外することはできない。赤かび病に対する生物防除効果は、３Ｃと他の３Ｃ様株間で有意に異なることはなかった。従って、３Ｃ単離物に対してさらなる特異性を得るためにアッセイをさらに洗練させることは大した実用的価値をもたらさない。
【０２８９】
過去の研究では、１平方センチメートル当たり約１０６ＣＦＵの速度でおおよそ３×１０８ＣＦＵ／ｍｌの３Ｃ接種物を塗布することで、接種１６時間後に１０１〜１０２ＣＦＵ／ｇの包頴組織および接種２５６〜２８０時間後に１０５〜１０６のＣＦＵが得られたことが実証されている。本研究において、株３Ｃの株ＣＦＵは、接種１６時間後の塗布率と比較して１０４〜１０５の大きさで減少した。これに対し、本研究における接種後１日目で３ＣのＤＮＡ個体群はおおよそ１０倍しか減少しなかった（図１５）。この劇的な差は、本研究にて１ＤＰＩで検出された３Ｃ  ＤＮＡのほとんどが非生存細胞に属していたかもしくは溶解細胞からすでに放出されていたことによる。しかしながら、３ＣのＣＦＵレベルは、過去の研究において１０日後の塗布率と同様なレベルに増加したが、これは本研究においても同様である。これは、本研究にて１０ＤＰＩで検出された３Ｃ  ＤＮＡのほとんどが生存細胞に属していたことを示している。
【０２９０】
他の小麦関連の真核生物について過去に開発されたｑＰＣＲアッセイでは、種間特異性が示された。本アッセイは、クリプトコッカス・フラベセンス種内において特定レベルの菌株間特異性を示した。すなわち、クリプトコッカス・フラベセンスの他の６つの分離株のアッセイにより、ＤＮＡテンプレートの標準量の増幅効率に基づいて種が２つの遺伝子型群を包含したことが示された（表８）。全ての３Ｃ様分離株は同様の増幅効率を示したが、３Ｃの近親者の在来個体群の検出は、本研究では最小限であった。その理由は、０および１ＤＰＩでのほとんど全ての非接種サンプルにわたって検出事象はまったく示されなかったが、接種サンプルは全てはっきりした検出を示したためである（図７）。著しい干渉があった場合、これらの非接種サンプルは、高頻度かつより高レベルの増幅検出を示したであろう。第２に、検出レベルは、一般に、接種区画からの距離が増すにつれて減少した（図７）。著しい干渉があった場合、検出レベルは、一般に、フィールドにわたって同じかもしくはより無作為であったであろう。これらのデータにより、３Ｃ様クリプトコッカス・フラベセンスの在来個体群は、開花から収穫の間では小麦先端で比較的まれであることが示される。
【０２９１】
培養物に基づく方法を用いた植物付着細菌の個体群動態についてのいくつかの研究では、実験期間の後半で宿主植物の花または葉の細菌個体群の減少が観測された。個体群の定量化に対してｑＰＣＲを用いた研究では、３つのフザリウム属種の全個体群が、夏の収穫の６カ月後に春小麦の切り株の残留物で有意に死滅した。ＣＦＵに基づく定量化を用いた小麦の３Ｃコロニー形成の過去の研究では、２００９年のランにおける小麦開花および接種後の１８４時間と２５６〜２８０時間の間で３Ｃ個体群のわずかな死滅が観測されたが、２０１０年のランでは観測されなかった。本研究では、０〜１ＤＰＩの小麦先端（図１５）および保存中の脱穀粒（図１６）において個体群が減少する傾向が示された。本研究での３Ｃ様クリプトコッカス・フラベセンスの死滅（その大部分は３Ｃであった）は、過去の研究の観測と一致している。これは、３Ｃが長期の増殖を通じて生態学的均衡または食品安全に脅威を与えないことを示している。
【０２９２】
本研究の小麦畑にわたる３Ｃ拡散パターンは、小麦のいくつかの菌類病原体について過去に報告されたものと似ている。かかる研究では、所与の各時点で、微生物個体群は人工的に接種した領域（ソース）からソース近くの非接種領域（シンク）で急速に減少したが、特に初期の時点では、シンクにわたり距離が離れるにつれて穏やかに減少した。この研究では、シンク内の同じ距離の３Ｃ個体群は経時的に明らかに増加し（図７）、これは、感受性および抵抗性品種の混合物における小麦病原菌よりも感受性品種の純群落における小麦病原菌の拡散パターンにより近い。これは、小麦が３Ｃに対する適合性宿主であることを示しており、これは、３Ｃが効果的に小麦先端にコロニー形成することができるという事実と一致している。本アッセイはこのパターンをうまく実証するために十分ロバストである。
【０２９３】
過去の研究では、小麦病原菌の定量化のためのｑＰＣＲアッセイは、疾病重症度を評価し、病気の発症を監視し、予測するために使用されてきた。本ｑＰＣＲアッセイは、バイオ農薬として３Ｃ様クリプトコッカス・フラベセンスの環境動態を決定するために使用することができる。すなわち、３Ｃ様クリプトコッカス・フラベセンスの拡散および持続性は、多様な成長期にわたって様々な地理的場所で小麦生産システムを通じて調べることができる。本ｑＰＣＲアッセイを用いて、３Ｃに基づくバイオ農薬の調合を最適にするために３Ｃ個体群動態における共同耕作地の非生物および生物の関心因子の効果を研究することもできる。さらに、本ｑＰＣＲアッセイを用いて、様々な条件下で３Ｃ個体群動態と赤かび病に対する３Ｃの生物防除効果との関連性を調べることもできる。
【０２９４】
実施例６。塗布の非限定例
【０２９５】
クリプトコッカス・フラベセンスの１つ以上の株、１つ以上の微生物アンタゴニスト、組成物、または本明細書に記載されるプライマー対の群は、キットの形態で提供してもよい。いくつかの実施形態において、キットは、クリプトコッカス・フラベセンスの１つ以上の株、微生物アンタゴニスト、または植物、最も好ましくは、穀物用植物の種子先端に塗布するための組成物を提供する。
【０２９６】
他の実施形態において、キットは、β−チューブリン、キチンシンターゼ１、ＥＦ１、および／またはｈｓｐ７０を特に増幅するために設計されたプライマー対の群を提供する。キットは、限定されないが、ｄＮＴＰ、反応緩衝液、Ｔａｑポリメラーゼ、およびＲＮＡｓｅ−ｆｒｅｅ水を含む１つ以上の必要なＰＣＲ試薬を充填した１つ以上の容器も提供する。かかる容器（単数または複数）と任意に関連付けられるものは、プライマー対および関連試薬の群の製造、使用または販売を規制する政府当局により定められた形式の通知であり、そのような通知は、研究用の製造、使用または販売の当局による承認を反映する。
【０２９７】
キットは、供給されたクリプトコッカス・フラベセンス株、微生物アンタゴニスト、および塗布用組成物を調製するための適切な指示も含み得る。指示としては、調製されたクリプトコッカス・フラベセンス株、微生物アンタゴニスト、および組成物の適切な塗布技術および塗布濃度をさらに説明する。プライマー対の群がキットに含まれる場合、キットは、キットに含まれるプライマー対を用いてクリプトコッカス・フラベセンス株の遺伝子型を決定するためにｑＰＣＲを調製し、実行し、分析するための適切な指示を含み得る。指示は、任意の適切なフォーマットをとることができ、限定されないが、印刷物、ビデオテープ、コンピュータ可読ディスク、または光ディスクが挙げられる。
【０２９８】
様々な好ましい実施形態を参照しながら本発明について説明してきたが、本発明の本質的な範囲を逸脱することなく、種々の変更がなされ得、等価物がその要素を置換し得ることが、当業者に理解されるべきである。さらに、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、ある特定の状況または材料を本発明の教示に適合させるために、多様な修正を行い得る。
【０２９９】
従って、本発明は、この発明を実施するために考えられた本明細書に開示された特定の実施形態には限定されず、本発明は、特許請求の範囲の範囲内に含まれるあらゆる実施形態を含むことが、意図される。
【０３００】
明細書および例は、以下の特許請求の範囲によって示される本発明の真の範囲および精神と共に、例示のみとして考慮されるべきことが意図される。
【図１Ａ】
2016512043.tif 000021
【図１Ｂ】
2016512043.tif 000022
【図１Ｃ】
2016512043.tif 000023
【図１Ｄ】
2016512043.tif 000024
【図１Ｅ】
2016512043.tif 000025
【図１Ｆ】
2016512043.tif 000026
【図２】
2016512043.tif 000027
【図３Ａ】
2016512043.tif 000028
【図３Ｂ】
2016512043.tif 000029
【図３Ｃ】
2016512043.tif 000030
【図３Ｄ】
2016512043.tif 000031
【図３Ｅ】
2016512043.tif 000032
【図３Ｆ】
2016512043.tif 000033
【図３Ｇ】
2016512043.tif 000034
【図３Ｈ】
2016512043.tif 000035
【図３Ｉ】
2016512043.tif 000036
【図３Ｊ】
2016512043.tif 000037
【図４】
2016512043.tif 000038
【図５】
2016512043.tif 000039
【図６】
2016512043.tif 000040
【図７Ａ】
2016512043.tif 000041
【図７Ｂ】
2016512043.tif 000042
【図８】
2016512043.tif 000043
【図９】
2016512043.tif 000044
【図１０Ａ】
2016512043.tif 000045
【図１０Ｂ】
2016512043.tif 000046
【図１１】
2016512043.tif 000047
【図１２Ａ】
2016512043.tif 000048
【図１２Ｂ】
2016512043.tif 000049
【図１３】
2016512043.tif 000050
【図１４Ａ】
2016512043.tif 000051
【図１４Ｂ】
2016512043.tif 000052
【図１４Ｃ】
2016512043.tif 000053
【図１４Ｄ】
2016512043.tif 000054
【図１４Ｅ】
2016512043.tif 000055
【図１５】
2016512043.tif 000056
【図１６】
2016512043.tif 000057
【図１７】
2016512043.tif 000058
【図１８】
2016512043.tif 000059
【配列表】
2016512043000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年12月15日(2015.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
穀物用植物における赤かび病の抑制方法であって、
ａ）穀物用植物から回収されたサンプル中のクリプトコッカス・フラベセンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）株の遺伝子型を同定することと、
ｂ）工程ａ）の結果に基づいて穀物用植物に、１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量を塗布し、それにより、赤かび病を抑制することと、
を含み、
前記１つ以上の微生物アンタゴニストは、遺伝子型Ａ型クリプトコッカス・フラベセンス株もしくは遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株であり、前記１つ以上の微生物アンタゴニストは、ＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７８で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス３ＣもしくはＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７９で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス４Ｃではない方法。
【請求項２】
クリプトコッカス・フラベセンス株の遺伝子型が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または配列同一性によって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
クリプトコッカス・フラベセンス株の遺伝子型が、１つ以上のプライマー対を利用するＰＣＲを行うことによって決定され、ここで、前記プライマー対は、配列番号４５および４６；配列番号４７および４８；配列番号４９および５０；配列番号５１および５２；配列番号５３および５４；配列番号５５および５６；配列番号５７および５８；配列番号５９および６０；配列番号６１および６２；配列番号６３および６４；配列番号６５および６６；配列番号６７および６８；配列番号６９および７０；または配列番号７１および７２に少なくとも９０％の配列同一性を含み、それにより、クリプトコッカス・フラベセンス株が決定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
１つ以上の微生物アンタゴニストを１つ以上の穀草植物に塗布する前に、１つ以上の穀草植物から前記サンプルを回収する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
１つ以上の微生物アンタゴニストを１つ以上の穀草植物に塗布した後に、１つ以上の穀草植物から前記サンプルを回収する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
クリプトコッカス・フラベセンス株の遺伝子型が、配列同一性により決定される請求項２に記載の方法であって、
ａ．標的クリプトコッカス・フラベセンスの抽出ゲノムＤＮＡを配列決定する工程と、
ｂ．工程ａ）で決定された前記配列を他のクリプトコッカス・フラベセンス株の公知の相同配列と比較する工程と、
ｃ．クリプトコッカス・フラベセンス株を同定する工程と、
を含む請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、Ｙ−７３７３；ＹＢ−６０１；ＹＢ−６０２；Ｙ−７３７７；Ｙ−７３７２；Ｙ−７３７５；Ｙ−７３７４；Ｙ−７３７６；ＹＢ−３２８；Ｙ−７３７９；およびＹＢ−７４４からなるクリプトコッカス・フラベセンス株の群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、プロチオコナゾールに耐性を持つ請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストを穀物用植物の種子先端に塗布することに加えて、ＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７８で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス３ＣおよびＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７９で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス４Ｃを前記穀物用植物に塗布する請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストを、成長のハード・ダフ・ステージ前に前記種子先端に塗布する請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストを、開花中に、前記種子先端に塗布する請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストを、開花前に、前記種子先端に塗布する請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記穀物用植物が小麦または大麦である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つの微生物アンタゴニストの有効量が、対応する未処理対照におけるものに対して赤かび病のレベルを減少させるのに十分な量である請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量を穀物用植物の種子先端に塗布することが、前記穀物用植物上に前記１つ以上の微生物アンタゴニストを噴霧することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記噴霧方法が、スプリンクラー灌漑システムを介した噴霧；空中噴霧塗布；地上噴霧塗布からなる群から選択される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量が、約１０５〜１０６ＣＦＵ／ｃｍ２の割合で塗布される約１０４〜１０９ＣＦＵ／ｍｌである請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量が、約２×１０６〜６×１０６ＣＦＵ／ｃｍ２の割合で塗布される約１．５×１０９ＣＦＵ／ｍｌである請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量が、約２×１０５ＣＦＵ／ｃｍ２の割合で塗布される約２．３×１０８ＣＦＵ／ｍｌである請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量が、約１０６ＣＦＵ／ｃｍ２の割合で塗布される約３×１０８ＣＦＵ／ｍｌである請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量を穀物用植物の種子先端に塗布することが、約５〜３５℃の温度で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量を穀物用植物の種子先端に塗布することが、約１５〜３０℃の温度で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つ以上の微生物アンタゴニストが、実質上生物学的に純粋である請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
２つ以上の微生物アンタゴニストを前記穀物用植物の種子先端に塗布する請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記２つ以上の微生物アンタゴニストを同時に塗布する請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記２つ以上の微生物アンタゴニストを別々に塗布する請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも２つの微生物アンタゴニストが、遺伝子型Ａ型クリプトコッカス・フラベセンス株である請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも２つの微生物アンタゴニストが、遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株である請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
第１の微生物アンタゴニストが、遺伝子型Ａ型クリプトコッカス・フラベセンス株であり、第２の微生物アンタゴニストが、遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株である請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも１つの微生物アンタゴニストが、遺伝子型Ａ型クリプトコッカス・フラベセンス株；および遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株からなる第１の群から選択され、少なくとも１つの微生物アンタゴニストが、ＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７８で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス３Ｃ；およびＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７９で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス４Ｃからなる第２の群から選択される請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
１つ以上の殺菌剤を前記穀物用植物に塗布することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記殺菌剤が、プロチオコナゾールである請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記１つ以上の殺菌剤を、前記１つ以上の微生物アンタゴニストの塗布前；前記１つ以上の微生物アンタゴニストの塗布と同時；および前記１つ以上の微生物アンタゴニストの塗布後からなる群から選択される時期に前記穀物用植物に塗布する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
１つ以上のプライマー対を含むキットであって、前記プライマー対が、配列番号４５および４６;配列番号４７および４８;配列番号４９および５０;配列番号５１および５２;配列番号５３および５４;配列番号５５および５６;配列番号５７および５８;配列番号５９および６０;配列番号６１および６２;配列番号６３および６４;配列番号６５および６６;配列番号６７および６８;配列番号６９および７０;または配列番号７１および７２に少なくとも９０％の配列同一性を含む、キット。
【請求項３５】
クリプトコッカス・フラベセンス株の遺伝子型の同定方法であって、
１つ以上のプライマー対を利用してＰＣＲを行う工程であって、前記プライマー対が、配列番号４５および４６;配列番号４７および４８;配列番号４９および５０;配列番号５１および５２;配列番号５３および５４;配列番号５５および５６;配列番号５７および５８;配列番号５９および６０;配列番号６１および６２;配列番号６３および６４;配列番号６５および６６;配列番号６７および６８;配列番号６９および７０;または配列番号７１および７２に少なくとも９０％の配列同一性を含む、方法。
【請求項３６】
クリプトコッカス・フラベセンス株の遺伝子型の同定方法であって、
ａ．標的クリプトコッカス・フラベセンスの抽出ゲノムＤＮＡを配列決定する工程と、
ｂ．工程ａ）で決定された前記配列を他のクリプトコッカス・フラベセンス株の公知の相同配列と比較する工程と、
ｃ．クリプトコッカス・フラベセンス株を遺伝子型Ａ型もしくは遺伝子型Ｂ型として同定する工程と、
を含む方法。
【請求項３７】
前記ＰＣＲが定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＰＣＲがポリメラーゼの使用を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＰＣＲが熱サイクルを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４０】
ｑＰＣＲが、配列番号４５および４６、配列番号４７および４８または配列番号５５および５６に少なくとも９０％の配列同一性を含む１つ以上のプライマー対を用いた際に１７〜２１のＣｔ値；配列番号５７および５８、配列番号６５および６６、配列番号６７および６８に少なくとも９０％の配列同一性を含む１つ以上のプライマー対を用いた際に１８〜２０のＣｔ値；配列番号６９および７０に少なくとも９０％の配列同一性を含むプライマー対を用いた際に１７〜２０のＣｔ値；または配列番号７３および７４に少なくとも９０％の配列同一性を含むプライマー対を用いた際に１２〜１５のＣｔ値をもたらす場合、前記クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ａ型として同定される、請求項３に記載の方法。
【請求項４１】
ｑＰＣＲが、配列番号４５および４６に少なくとも９０％の配列同一性を含むプライマー対を用いた際に３１〜３３のＣｔ値；配列番号４７および４８に少なくとも９０％の配列同一性を含むプライマー対を用いた際に３２〜３５のＣｔ値；配列番号５５および５６に少なくとも９０％の配列同一性を含むプライマー対を用いた際に２４〜２６のＣｔ値；配列番号５７および５８または配列番号６７および６８に少なくとも９０％の配列同一性を含む１つ以上のプライマー対を用いた際に２２〜２４のＣｔ値；配列番号６５および６６に少なくとも９０％の配列同一性を含むプライマー対を用いた際に２２〜２３のＣｔ値；配列番号６９および７０に少なくとも９０％の配列同一性を含むプライマー対を用いた際に３４〜３５のＣｔ値；または配列番号７３および７４に少なくとも９０％の配列同一性を含むプライマー対を用いた際に１５〜１８のＣｔ値をもたらす場合、前記クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ｂ型として同定される、請求項３に記載の方法。
【請求項４２】
前記標的クリプトコッカス・フラベセンスの抽出ゲノムＤＮＡの配列が、β−チューブリン遺伝子で配列番号１に１００％の配列同一性；キチンシンターゼ１遺伝子で配列番号２、３、４、５、または６に９５％〜１００％の配列同一性；ＥＦ１遺伝子で配列番号７、８、９、１０、または１１に９９％〜１００％の配列同一性；ｈｓｐ７０遺伝子で配列番号１２、１３、１４、１５、または１６に９９％〜１００％の配列同一性；またはｃｓ２２標的遺伝子座で配列番号８５、８６、８７、８８、または８９に９９％〜１００％の配列同一性を共有する場合、前記クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ａ型として同定される、請求項６に記載の方法。
【請求項４３】
前記標的クリプトコッカス・フラベセンスの抽出ゲノムＤＮＡの配列が、β−チューブリン遺伝子で配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３に９９％〜１００％の配列同一性；キチンシンターゼ１遺伝子で配列番号２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０に９７％〜１００％の配列同一性；ＥＦ１遺伝子で配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、または３７に９９％〜１００％の配列同一性；ｈｓｐ７０遺伝子で配列番号３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４に９９％〜１００％の配列同一性；またはｃｓ２２標的遺伝子座で配列番号９０に１００％の配列同一性を共有する場合、前記クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ｂ型として同定される、請求項６に記載の方法。
【請求項４４】
赤かび病を治療する方法であって、前記方法は、
ａ）１つ以上の微生物アンタゴニストを穀物用植物に塗布することであって、ここで、前記微生物アンタゴニストが、遺伝子型Ａ型のクリプトコッカス・フラベセンス株または遺伝子型Ｂ型のクリプトコッカス・フラベセンス株を含み、ここで、前記１つ以上の微生物アンタゴニストが、ＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０７３８で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス３Ｃでも、ＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７９で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス４Ｃでもないことと、
ｂ）１つ以上の殺菌剤を前記植物に塗布することと
を含む、方法。
【請求項４５】
１つの殺菌剤がプロチオコナゾールである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記１つ以上の殺菌剤を、前記１つ以上の微生物アンタゴニストの塗布前；前記１つ以上の微生物アンタゴニストの塗布と同時；および前記１つ以上の微生物アンタゴニストの塗布後からなる群から選択される時期に前記穀物用植物に塗布する請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
配列同一性は、個々のフォワードプライマーもしくはリバースプライマーごとに決定される請求項３４に記載のキット。
【請求項４８】
前記キットがまた、１つ以上の殺菌剤を含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項４９】
前記殺菌剤がプロチオコナゾールである、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
前記キットが、増幅成分をさらに含む、請求項４８に記載のキット。
【請求項５１】
前記増幅成分がヌクレオチド、ポリメラーゼ、反応緩衝液、または他の反応試薬のうちの１つ以上を含む、請求項５０に記載のキット。
【請求項５２】
ｑＰＣＲが、配列番号４５および４６、配列番号４７および４８または配列番号５５および５６に少なくとも９０％の配列同一性を含む１つ以上のプライマー対を用いた際に１７〜２１のＣｔ値；配列番号５７および５８、配列番号６５および６６、または配列番号６７および６８に少なくとも９０％の配列同一性を含む１つ以上のプライマー対を用いた際に１８〜２０のＣｔ値；配列番号６９および７０に少なくとも９０％の配列同一性を含むプライマー対を用いた際に１７〜２０のＣｔ値；または配列番号７３および７４に少なくとも９０％の配列同一性を含むプライマー対を用いた際に１２〜１５のＣｔ値をもたらす場合、前記クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ａ型として同定される、請求項３５に記載の方法。
【請求項５３】
ｑＰＣＲが、配列番号４５および４６に少なくとも９０％の配列同一性を含むプライマー対を用いた際に３１〜３３のＣｔ値；配列番号４７および４８に少なくとも９０％の配列同一性を含むプライマー対を用いた際に３２〜３５のＣｔ値；配列番号５５および５６に少なくとも９０％の配列同一性を含むプライマー対を用いた際に２４〜２６のＣｔ値；配列番号５７および５８または配列番号６７および６８に少なくとも９０％の配列同一性を含む１つ以上のプライマー対を用いた際に２２〜２４のＣｔ値；配列番号６５および６６に少なくとも９０％の配列同一性を含むプライマー対を用いた際に２２〜２３のＣｔ値；配列番号６９および７０に少なくとも９０％の配列同一性を含むプライマー対を用いた際に３４〜３５のＣｔ値；または配列番号７３および７４に少なくとも９０％の配列同一性を含むプライマー対を用いた際に１５〜１８のＣｔ値をもたらす場合、前記クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ｂ型として同定される、請求項３５に記載の方法。
【請求項５４】
前記標的クリプトコッカス・フラベセンスの抽出ゲノムＤＮＡの配列が、β−チューブリン遺伝子で配列番号１に１００％の配列同一性；キチンシンターゼ１遺伝子で配列番号２、３、４、５、または６に９５％〜１００％の配列同一性；ＥＦ１遺伝子で配列番号７、８、９、１０、または１１に９９％〜１００％の配列同一性；ｈｓｐ７０遺伝子で配列番号１２、１３、１４、１５、または１６に９９％〜１００％の配列同一性；またはｃｓ２２標的遺伝子座で配列番号８５、８６、８７、８８、または８９に９９％〜１００％の配列同一性を共有する場合、前記クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ａ型として同定される、請求項３６に記載の方法。
【請求項５５】
前記標的クリプトコッカス・フラベセンスの抽出ゲノムＤＮＡの配列が、β−チューブリン遺伝子で配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３に９９％〜１００％の配列同一性；キチンシンターゼ１遺伝子で配列番号２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０に９７％〜１００％の配列同一性；ＥＦ１遺伝子で配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、または３７に９９％〜１００％の配列同一性；ｈｓｐ７０遺伝子で配列番号３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４に９９％〜１００％の配列同一性；またはｃｓ２２標的遺伝子座で配列番号９０に１００％の配列同一性を共有する場合、前記クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ｂ型として同定される、請求項３６に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
本明細書に記載される特定の実施形態において、クリプトコッカス・フラベセンス株の遺伝子型の同定方法は、ａ）標的クリプトコッカス・フラベセンスの抽出ゲノムＤＮＡを配列決定する工程と、ｂ）工程ａ）で決定された前記配列を他のクリプトコッカス・フラベセンス株の公知の相同配列と比較する工程と、ｃ）クリプトコッカス・フラベセンス株を遺伝子型Ａ型もしくは遺伝子型Ｂ型として同定する工程と、ここで、（１）標的クリプトコッカス・フラベセンスの抽出ゲノムＤＮＡの配列が、β−チューブリン遺伝子で配列番号１に１００％の配列同一性；キチンシンターゼ１遺伝子で配列番号２、３、４、５、または６に９５％〜１００％の配列同一性；ＥＦ１遺伝子で配列番号７、８、９、１０、または１１に９９％〜１００％の配列同一性；ｈｓｐ７０遺伝子で配列番号１２、１３、１４、１５、または１６に９９％〜１００％の配列同一性；またはｃｓ２２標的遺伝子座で配列番号８５、８６、８７、８８、または８９に９９％〜１００％の配列同一性を共有する場合、クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ａ型として同定され、（２）標的クリプトコッカス・フラベセンスの抽出ゲノムＤＮＡの配列が、β−チューブリン遺伝子で配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３に９９％〜１００％の配列同一性；キチンシンターゼ１遺伝子で配列番号２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０に９７％〜１００％の配列同一性；ＥＦ１遺伝子で配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、または３７に９９％〜１００％の配列同一性；ｈｓｐ７０遺伝子で配列番号３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４に９９％〜１００％の配列同一性；またはｃｓ２２標的遺伝子座で配列番号９０に１００％の配列同一性を共有する場合、クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ｂ型として同定される、を含む。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
穀物用植物における赤かび病の抑制方法であって、
ａ）ｑＰＣＲおよび／または配列同一性によってクリプトコッカス・フラベセンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）株の遺伝子型を同定することと、
ｂ）１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量を前記植物の種子先端に塗布することと、
を含み、
前記１つ以上の微生物アンタゴニストは、工程ａ）で同定された遺伝子型Ａ型クリプトコッカス・フラベセンス株もしくは遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株であり、前記１つ以上の微生物アンタゴニストは、ＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７８で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス３ＣもしくはＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７９で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス４Ｃではない方法。
（項目２）
クリプトコッカス・フラベセンス株の遺伝子型が、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により決定される項目１に記載の方法であって、
ａ）表１のプライマー対（配列番号４５〜７２）と少なくとも９０％の配列同一性を共有する１つ以上のプライマー対を利用して抽出ゲノムＤＮＡのｑＰＣＲを行う工程と、ここで、配列同一性は、個々のフォワードプライマーもしくはリバースプライマーごとに決定され、
ｂ）クリプトコッカス・フラベセンス株を遺伝子型Ａ型もしくは遺伝子型Ｂ型として同定する工程と、ここで、
（１）ｑＰＣＲが、ｂｔｕｂ．１、ｂｔｕｂ．２、またはＥＦ１．２プライマーセットを用いた際に１７〜２１のＣｔ値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ  ｖａｌｕｅ）；ｈ２２．１、ｈ３０．２、またはｈ３１．１プライマーセットを用いた際に１８〜２０のＣｔ値；ｈ３１．２プライマーセットを用いた際に１７〜２０のＣｔ値；またはＩ２プライマーセットを用いた際に１２〜１５のＣｔ値をもたらす場合、前記クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ａ型として同定され；
（２）ｑＰＣＲが、ｂｔｕｂ．１プライマーセットを用いた際に３１〜３３のＣｔ値；ｂｔｕｂ．２プライマーセットを用いた際に３２〜３５のＣｔ値；ＥＦ１．２プライマーセットを用いた際に２４〜２６のＣｔ値；ｈ２２．１またはｈ３１．１プライマーセットを用いた際に２２〜２４のＣｔ値；ｈ３０．２プライマーセットを用いた際に２２〜２３のＣｔ値；ｈ３１．２プライマーセットを用いた際に３４〜３５のＣｔ値；またはＩ２プライマーセットを用いた際に１５〜１８のＣｔ値をもたらす場合、前記クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ｂ型として同定される、
を含む項目１に記載の方法。
（項目３）
１つ以上の微生物アンタゴニストを１つ以上の穀草植物に塗布する前に、前記１つ以上の穀草植物から前記抽出ゲノムＤＮＡを回収する項目２に記載の方法。
（項目４）
１つ以上の微生物アンタゴニストを１つ以上の穀草植物に塗布した後に、前記１つ以上の穀草植物から前記抽出ゲノムＤＮＡを回収する項目２に記載の方法。
（項目５）
クリプトコッカス・フラベセンスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養から前記抽出ゲノムＤＮＡを回収する項目２に記載の方法。
（項目６）
クリプトコッカス・フラベセンス株の遺伝子型が、配列同一性により決定される項目１に記載の方法であって、
ａ）標的クリプトコッカス・フラベセンスの抽出ゲノムＤＮＡを配列決定する工程と、
ｂ）工程ａ）で決定された前記配列を他のクリプトコッカス・フラベセンス株の公知の相同配列と比較する工程と、
ｃ）クリプトコッカス・フラベセンス株を遺伝子型Ａ型もしくは遺伝子型Ｂ型として同定する工程と、ここで、
（１）前記標的クリプトコッカス・フラベセンスの抽出ゲノムＤＮＡの配列が、β−チューブリン遺伝子で配列番号１に１００％の配列同一性；キチンシンターゼ１遺伝子で配列番号２、３、４、５、または６に９５％〜１００％の配列同一性；ＥＦ１遺伝子で配列番号７、８、９、１０、または１１に９９％〜１００％の配列同一性；ｈｓｐ７０遺伝子で配列番号１２、１３、１４、１５、または１６に９９％〜１００％の配列同一性；またはｃｓ２２標的遺伝子座で配列番号８５、８６、８７、８８、または８９に９９％〜１００％の配列同一性を共有する場合、前記クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ａ型として同定され、
（２）前記標的クリプトコッカス・フラベセンスの抽出ゲノムＤＮＡの配列が、β−チューブリン遺伝子で配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３に９９％〜１００％の配列同一性；キチンシンターゼ１遺伝子で配列番号２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０に９７％〜１００％の配列同一性；ＥＦ１遺伝子で配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、または３７に９９％〜１００％の配列同一性；ｈｓｐ７０遺伝子で配列番号３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４に９９％〜１００％の配列同一性；またはｃｓ２２標的遺伝子座で配列番号９０に１００％の配列同一性を共有する場合、前記クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ｂ型として同定される、
を含む項目１に記載の方法。
（項目７）
１つ以上の微生物アンタゴニストを１つ以上の穀草植物に塗布する前に、前記１つ以上の穀草植物から前記抽出ゲノムＤＮＡを回収する項目６に記載の方法。
（項目８）
１つ以上の微生物アンタゴニストを１つ以上の穀草植物に塗布した後に、前記１つ以上の穀草植物から前記抽出ゲノムＤＮＡを回収する項目６に記載の方法。
（項目９）
クリプトコッカス・フラベセンスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養から前記抽出ゲノムＤＮＡを回収する項目６に記載の方法。
（項目１０）
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、遺伝子型Ａ型クリプトコッカス・フラベセンス株である項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株である項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、Ｙ−７３７３；ＹＢ−６０１；ＹＢ−６０２；Ｙ−７３７７；Ｙ−７３７２；Ｙ−７３７５；Ｙ−７３７４；Ｙ−７３７６；ＹＢ−３２８；Ｙ−７３７９；およびＹＢ−７４４からなるクリプトコッカス・フラベセンス株からなる群から選択される項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、プロチオコナゾールに耐性を持つ項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、クリプトコッカス・フラベセンスＹ−７３７３である項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、クリプトコッカス・フラベセンスＹＢ−６０１である項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、クリプトコッカス・フラベセンスＹＢ−６０２である項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、クリプトコッカス・フラベセンスＹ−７３７７である項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、クリプトコッカス・フラベセンスＹ−７３７２である項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、クリプトコッカス・フラベセンスＹ−７３７５である項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、クリプトコッカス・フラベセンスＹ−７３７４である項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、クリプトコッカス・フラベセンスＹ−７３７６である項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、クリプトコッカス・フラベセンスＹＢ−３２８である項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、クリプトコッカス・フラベセンスＹ−７３７９である項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの少なくとも１つが、クリプトコッカス・フラベセンスＹＢ−７４４である項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記１つ以上の微生物アンタゴニストを穀物用植物の種子先端に塗布することに加えて、ＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７８で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス３Ｃおよび／またはＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７９で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス４Ｃを前記穀物用植物に塗布する項目１に記載の方法。
（項目２６）
前記１つ以上の微生物アンタゴニストを、成長のハード・ダフ・ステージ前に前記種子先端に塗布する項目１に記載の方法。
（項目２７）
前記１つ以上の微生物アンタゴニストを、開花中に、前記種子先端に塗布する項目１に記載の方法。
（項目２８）
前記１つ以上の微生物アンタゴニストを、開花前に、前記種子先端に塗布する項目１に記載の方法。
（項目２９）
前記穀物用植物が小麦または大麦である項目１に記載の方法。
（項目３０）
前記穀物用植物が小麦である項目１に記載の方法。
（項目３１）
少なくとも１つの微生物アンタゴニストの有効量が、対応する未処理対照におけるものに対して赤かび病のレベルを減少させるのに十分な量である項目１に記載の方法。
（項目３２）
１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量を穀物用植物の種子先端に塗布することが、前記穀物用植物上に前記１つ以上の微生物アンタゴニストを噴霧することを含む項目１に記載の方法。
（項目３３）
前記噴霧方法が、スプリンクラー灌漑システムを介した噴霧；空中噴霧塗布；地上噴霧塗布からなる群から選択される項目２９に記載の方法。
（項目３４）
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量が、約１０５〜１０６ＣＦＵ／ｃｍ２の割合で塗布される約１０４〜１０９ＣＦＵ／ｍｌである項目１に記載の方法。
（項目３５）
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量が、約２×１０６〜６×１０６ＣＦＵ／ｃｍ２の割合で塗布される約１．５×１０９ＣＦＵ／ｍｌである項目３１に記載の方法。
（項目３６）
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量が、約２×１０５ＣＦＵ／ｃｍ２の割合で塗布される約２．３×１０８ＣＦＵ／ｍｌである項目３１に記載の方法。
（項目３７）
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量が、約１０６ＣＦＵ／ｃｍ２の割合で約３×１０８ＣＦＵ／ｍｌである項目３１に記載の方法。
（項目３８）
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量を穀物用植物の種子先端に塗布することが、約５〜３５℃の温度で行われる項目１に記載の方法。
（項目３９）
前記１つ以上の微生物アンタゴニストの有効量を穀物用植物の種子先端に塗布することが、約１５〜３０℃の温度で行われる項目１に記載の方法。
（項目４０）
前記１つ以上の微生物アンタゴニストが、実質上生物学的に純粋である項目１に記載の方法。
（項目４１）
２つ以上の微生物アンタゴニストを前記穀物用植物の種子先端に塗布する項目１に記載の方法。
（項目４２）
前記２つ以上の微生物アンタゴニストを同時に塗布する項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記２つ以上の微生物アンタゴニストを別々に塗布する項目４１に記載の方法。
（項目４４）
少なくとも２つの微生物アンタゴニストが、遺伝子型Ａ型クリプトコッカス・フラベセンス株である項目４１に記載の方法。
（項目４５）
少なくとも２つの微生物アンタゴニストが、遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株である項目４１に記載の方法。
（項目４６）
第１の微生物アンタゴニストが、遺伝子型Ａ型クリプトコッカス・フラベセンス株であり、第２の微生物アンタゴニストが、遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株である項目４１に記載の方法。
（項目４７）
少なくとも１つの微生物アンタゴニストが、遺伝子型Ａ型クリプトコッカス・フラベセンス株；および遺伝子型Ｂ型クリプトコッカス・フラベセンス株からなる第１の群から選択され、少なくとも１つの微生物アンタゴニストが、ＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７８で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス３Ｃ；およびＮＲＲＬ受託番号Ｙ−５０３７９で寄託されたクリプトコッカス・フラベセンス４Ｃからなる第２の群から選択される項目４１に記載の方法。
（項目４８）
１つ以上の殺菌剤を前記穀物用植物に塗布することをさらに含む項目１に記載の方法。
（項目４９）
前記殺菌剤が、プロチオコナゾールである項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記１つ以上の殺菌剤を、前記１つ以上の微生物アンタゴニストの塗布前；前記１つ以上の微生物アンタゴニストの塗布と同時；および前記１つ以上の微生物アンタゴニストの塗布後からなる群から選択される時期に前記穀物用植物に塗布する項目４８に記載の方法。
（項目５１）
項目１に記載の１つ以上の微生物アンタゴニストを含むキット。
（項目５２）
表１のプライマー対（配列番号４５〜７２）と少なくとも９０％の配列同一性を共有する１つ以上のプライマー対を含むキットであって、
配列同一性は、個々のフォワードプライマーもしくはリバースプライマーごとに決定されるキット。
（項目５３）
クリプトコッカス・フラベセンス株の遺伝子型の同定方法であって、
ａ）表１のプライマー対（配列番号４５〜７２）と少なくとも９０％の配列同一性を共有する１つ以上のプライマー対を利用して抽出ゲノムＤＮＡの定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行う工程と、ここで、配列同一性は、個々のフォワードプライマーもしくはリバースプライマーごとに決定され、
ｂ）クリプトコッカス・フラベセンス株を遺伝子型Ａ型もしくは遺伝子型Ｂ型として同定する工程と、ここで、
（１）ｑＰＣＲが、ｂｔｕｂ．１、ｂｔｕｂ．２、またはＥＦ１．２プライマーセットを用いた際に１７〜２１のＣｔ値；ｈ２２．１、ｈ３０．２、またはｈ３１．１プライマーセットを用いた際に１８〜２０のＣｔ値；ｈ３１．２プライマーセットを用いた際に１７〜２０のＣｔ値；またはＩ２プライマーセットを用いた際に１２〜１５のＣｔ値をもたらす場合、前記クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ａ型として同定され；
（２）ｑＰＣＲが、ｂｔｕｂ．１プライマーセットを用いた際に３１〜３３のＣｔ値；ｂｔｕｂ．２プライマーセットを用いた際に３２〜３５のＣｔ値；ＥＦ１．２プライマーセットを用いた際に２４〜２６のＣｔ値；ｈ２２．１またはｈ３１．１プライマーセットを用いた際に２２〜２４のＣｔ値；ｈ３０．２プライマーセットを用いた際に２２〜２３のＣｔ値；ｈ３１．２プライマーセットを用いた際に３４〜３５のＣｔ値；またはＩ２プライマーセットを用いた際に１５〜１８のＣｔ値をもたらす場合、前記クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ｂ型として同定される、
を含む方法。
（項目５４）
１つ以上の微生物アンタゴニストを１つ以上の穀草植物に塗布する前に、前記１つ以上の穀草植物から前記抽出ゲノムＤＮＡを回収する項目５３に記載の方法。
（項目５５）
１つ以上の微生物アンタゴニストを１つ以上の穀草植物に塗布した後に、前記１つ以上の穀草植物から前記抽出ゲノムＤＮＡを回収する項目５３に記載の方法。
（項目５６）
クリプトコッカス・フラベセンスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養から前記抽出ゲノムＤＮＡを回収する項目５３に記載の方法。
（項目５７）
クリプトコッカス・フラベセンス株の遺伝子型の同定方法であって、
ａ）標的クリプトコッカス・フラベセンスの抽出ゲノムＤＮＡを配列決定する工程と、
ｂ）工程ａ）で決定された前記配列を他のクリプトコッカス・フラベセンス株の公知の相同配列と比較する工程と、
ｃ）クリプトコッカス・フラベセンス株を遺伝子型Ａ型もしくは遺伝子型Ｂ型として同定する工程と、ここで、
（１）前記標的クリプトコッカス・フラベセンスの抽出ゲノムＤＮＡの配列が、β−チューブリン遺伝子で配列番号１に１００％の配列同一性；キチンシンターゼ１遺伝子で配列番号２、３、４、５、または６に９５％〜１００％の配列同一性；ＥＦ１遺伝子で配列番号７、８、９、１０、または１１に９９％〜１００％の配列同一性；ｈｓｐ７０遺伝子で配列番号１２、１３、１４、１５、または１６に９９％〜１００％の配列同一性；またはｃｓ２２標的遺伝子座で配列番号８５、８６、８７、８８、または８９に９９％〜１００％の配列同一性を共有する場合、前記クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ａ型として同定され、
（２）前記標的クリプトコッカス・フラベセンスの抽出ゲノムＤＮＡの配列が、β−チューブリン遺伝子で配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３に９９％〜１００％の配列同一性；キチンシンターゼ１遺伝子で配列番号２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０に９７％〜１００％の配列同一性；ＥＦ１遺伝子で配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、または３７に９９％〜１００％の配列同一性；ｈｓｐ７０遺伝子で配列番号３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４に９９％〜１００％の配列同一性；またはｃｓ２２標的遺伝子座で配列番号９０に１００％の配列同一性を共有する場合、前記クリプトコッカス・フラベセンス株は遺伝子型Ｂ型として同定される、
を含む方法。
（項目５８）
１つ以上の微生物アンタゴニストを１つ以上の穀草植物に塗布する前に、前記１つ以上の穀草植物から前記抽出ゲノムＤＮＡを回収する項目５７に記載の方法。
（項目５９）
１つ以上の微生物アンタゴニストを１つ以上の穀草植物に塗布した後に、前記１つ以上の穀草植物から前記抽出ゲノムＤＮＡを回収する項目５７に記載の方法。
（項目６０）
クリプトコッカス・フラベセンスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養から前記抽出ゲノムＤＮＡを回収する項目５７に記載の方法。
【国際調査報告】
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