(57)【要約】  核酸の検出に関し、特に多重核酸の同時検出のための方法および組成物に関するが、これらに限定されない技術を本明細書に提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の核酸を検出する方法であって、
１）核酸を含むサンプルを消光状態のプライマーと接触させることと、
２）ａ）前記プライマーが前記核酸とハイブリッド形成するか、または
ｂ）前記プライマーが前記核酸とハイブリッド形成し、かつ前記プライマーがアンプリコン中に組み込まれる場合、
検出可能状態の前記プライマーからのシグナルを検出することと
を含み、
前記核酸がＢＲＡＦ遺伝子またはＢＲＡＦ遺伝子の一部を含み、前記シグナルが検出されるとき、前記核酸が前記サンプル中で検出される、方法。
【請求項２】
消光状態のプライマーが二重鎖重複領域を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
シグナルが蛍光である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
プライマーがフルオロフォアを含み、前記プライマーが消光状態のとき、前記フルオロフォアがクエンチャーによって消光される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
フルオロフォアが、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５およびＣｙ５．５からなる群から選択され、クエンチャーが、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２およびＢＨＱ−３からなる群から選択される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
消光状態のプライマーがポリメラーゼによって核酸鎖に組み込まれる請求項１に記載の方法。
【請求項７】
消光状態のプライマーが、
ａ）フルオロフォアおよびクエンチャーを含む１つのオリゴヌクレオチドからなるか、または
ｂ）フルオロフォアを含む第１のオリゴヌクレオチドと、クエンチャーを含む第２のオリゴヌクレオチドとからなり、前記第１のオリゴヌクレオチドが前記第２のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する、
請求項１に記載の方法。
【請求項８】
アンプリコンが検出可能状態のプライマーを含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
プライマーがステムループプライマーまたは二重鎖直鎖状プライマーである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
プライマーが、アミノ酸置換Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋおよび／またはＶ６００Ｄを含むＢ−Ｒａｆタンパク質をコードするＢＲＡＦにおける変異を検出するための対立遺伝子特異的プライマーである請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ポリメラーゼおよびヌクレオチドを用いて、消光状態のハイブリッド形成したプライマーを伸長させることをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ポリメラーゼ連鎖反応を実施することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ポリメラーゼ連鎖反応がリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
３）核酸を含むサンプルを消光状態の第２のプライマーと接触させることと、
４）ａ）前記第２のプライマーが前記核酸とハイブリッド形成するか、または
ｂ）前記第２のプライマーが前記核酸とハイブリッド形成し、かつ前記第２のプライマーがアンプリコンに組み込まれる場合、
検出可能状態の前記第２のプライマーからの第２のシグナルを検出することと
をさらに含み、
前記第２のシグナルが検出されるとき、前記核酸が前記サンプル中で検出される、
請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
サンプル中の核酸を検出する方法であって、
１）核酸を含むサンプルを、プライマーおよび
ａ）消光状態のプローブまたは
ｂ）基底状態のプローブ
と接触させることと、
２）前記プローブが、前記プライマーを含む前記核酸の相補体とハイブリッド形成する場合、前記プライマーからのシグナルを検出することと
を含み、
前記シグナルが検出されるとき、前記核酸が前記サンプル中で検出される、方法。
【請求項１６】
消光状態のプローブが二重鎖重複領域を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
シグナルが蛍光である請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
プローブがフルオロフォアを含み、前記プローブが消光状態のとき、前記フルオロフォアがクエンチャーによって消光される請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
フルオロフォアが、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５およびＣｙ５．５からなる群から選択され、クエンチャーが、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２およびＢＨＱ−３からなる群から選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
プライマーが、プローブのフルオロフォアと適合する蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アクセプターである第２のフルオロフォアを含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
消光状態のプローブが、
ａ）フルオロフォアおよびクエンチャーを含む１つのオリゴヌクレオチドからなるか、または
ｂ）フルオロフォアを含む第１のオリゴヌクレオチドと、クエンチャーを含む第２のオリゴヌクレオチドとからなり、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第２のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する、
請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
核酸の相補体がプライマーを含み、プローブが前記核酸の相補体とハイブリッド形成する請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
プローブがステムループプローブまたは二重鎖直鎖状プローブである請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
プライマーが、アミノ酸置換Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋ、および／またはＶ６００Ｄを含むＢ−Ｒａｆタンパク質をコードするＢＲＡＦにおける変異を検出するための対立遺伝子特異的プライマーである請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
ポリメラーゼおよびヌクレオチドを用いてプライマーを伸長させることをさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
ポリメラーゼ連鎖反応を実施することをさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
ポリメラーゼ連鎖反応がリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
３）核酸を含むサンプルを第２のプライマーと接触させることと、
４）プローブが前記第２のプライマーを含む前記核酸の相補体とハイブリッド形成する場合、前記第２のプライマーからのシグナルを検出することと
をさらに含み、
第２のシグナルが検出されるとき、前記核酸が前記サンプル中で検出される、
請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
ａ）検出可能プライマーとハイブリッド形成した核酸であって、前記検出可能プライマーがフルオロフォアおよびクエンチャーを含む核酸、
ｂ）検出可能プライマーを含む核酸であって、前記検出可能プライマーがフルオロフォアおよびクエンチャーを含む核酸、
ｃ）検出可能プライマーとハイブリッド形成した核酸であって、前記検出可能プライマーがフルオロフォアと、クエンチャーを含むクエンチャーオリゴヌクレオチドとを含む核酸、
ｄ）検出可能プライマーを含む核酸であって、前記検出可能プライマーがフルオロフォアと、クエンチャーを含むクエンチャーオリゴヌクレオチドとを含む核酸、
ｅ）プライマーを含み、かつプローブとハイブリッド形成した核酸であって、前記プローブが第１のフルオロフォアおよびクエンチャーを含み、前記プライマーが第２のフルオロフォアを含み、前記第１のフルオロフォアおよび前記第２のフルオロフォアがＦＲＥＴ対である核酸、
または
ｆ）プライマーを含み、かつプローブとハイブリッド形成した核酸であって、前記プローブが第１のフルオロフォアを含み、前記プライマーが第２のフルオロフォアを含み、前記第１のフルオロフォアおよび前記第２のフルオロフォアがＦＲＥＴ対であり、クエンチャーを含むクエンチャーオリゴヌクレオチドを含む核酸、
の１つを含む組成物であって、
前記核酸がＢＲＡＦ遺伝子またはＢＲＡＦ遺伝子の一部を含む、
組成物。
【請求項３０】
組成物が反応混合物である請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
ポリメラーゼをさらに含む請求項２９に記載の組成物。
【請求項３２】
ヌクレオチドをさらに含む請求項２９に記載の組成物。
【請求項３３】
フルオロフォアが、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、およびＣｙ５．５からなる群から選択され、クエンチャーが、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、およびＢＨＱ−３からなる群から選択される請求項２９に記載の組成物。
【請求項３４】
ｇ）第２の検出可能プライマーとハイブリッド形成した第２の核酸であって、前記第２の検出可能プライマーが、第２のフルオロフォアと、クエンチャーもしくは第２のクエンチャーとを含む第２の核酸、
ｈ）第２の検出可能プライマーを含む第２の核酸であって、前記第２の検出可能プライマーが、第２のフルオロフォアと、前記クエンチャーもしくは第２のクエンチャーとを含む第２の核酸、
ｉ）第２の検出可能プライマーとハイブリッド形成した第２の核酸であって、前記第２の検出可能プライマーが第２のフルオロフォアを含む第２の核酸、
ｊ）第２の検出可能プライマーを含む第２の核酸であって、前記第２の検出可能プライマーが第２のフルオロフォアを含む第２の核酸、
ｋ）第２のプライマーを含み、かつプローブとハイブリッド形成した第２の核酸であって、前記プローブが第１のフルオロフォアおよびクエンチャーを含み、前記第２のプライマーが第３のフルオロフォアを含み、前記第１のフルオロフォアおよび前記第３フルオロフォアがＦＲＥＴ対である第２の核酸、
または、
ｌ）第２のプライマーを含み、かつ前記プローブとハイブリッド形成した第２の核酸であって、前記プローブが前記第１のフルオロフォアを含み、前記第２のプライマーが第３のフルオロフォアを含み、前記第１のフルオロフォアおよび前記第３のフルオロフォアがＦＲＥＴ対である第２の核酸
をさらに含み、
前記第２の核酸がＢＲＡＦ遺伝子またはＢＲＡＦ遺伝子の一部を含む、
請求項２９に記載の組成物。
【請求項３５】
クエンチャーもしくは第２のクエンチャーを含む第２のクエンチャーオリゴヌクレオチドをさらに含む請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
１つ以上のＢＲＡＦ対立遺伝子を検出するための、請求項２９から３５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３７】
１つ以上のＢＲＡＦ一塩基多型を検出するための、請求項２９から３５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３８】
同一サンプル中の複数のＢＲＡＦ対立遺伝子を多重アッセイで検出するための、請求項２９から３５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３９】
ＢＲＡＦ対立遺伝子を検出するためのキットであって、
１）１つ以上のＢＲＡＦ対立遺伝子を検出するための検出試薬であって、
ａ）フルオロフォアおよびクエンチャーを含むステムループプライマー、
ｂ）フルオロフォアおよび相補的クエンチングオリゴヌクレオチドを含む対立遺伝子特異的一本鎖プライマーを含む二重鎖直鎖状プライマー、
ｃ）フルオロフォアおよび相補的オリゴヌクレオチドを含む対立遺伝子特異的一本鎖プライマーを含む二重鎖直鎖状プライマー、
ｄ）フルオロフォアと、第２のフルオロフォアおよびクエンチャーオリゴヌクレオチドを含むプローブ鎖を含む二重鎖プローブとを含む対立遺伝子特異的プライマー、
ｅ）フルオロフォアと、第２のフルオロフォアを含むプローブ鎖を含む二重鎖プローブとを含む対立遺伝子特異的プライマー、
ｆ）フルオロフォアと、第２のフルオロフォアを含む一本鎖プローブとを含む対立遺伝子特異的プライマー、
または
ｇ）フルオロフォアと、第２のフルオロフォアおよびクエンチャーを含むステムループプローブとを含む対立遺伝子特異的プライマー、
の１つを含む前記検出試薬と、
２）ＢＲＡＦ遺伝子またはＢＲＡＦ遺伝子の一部を含むコントロール核酸と
を含むキット。
【請求項４０】
２）第２のＢＲＡＦ対立遺伝子を検出するための第２の検出試薬であって、
ａ）第２のフルオロフォアと、クエンチャーもしくは第２のクエンチャーとを含む第２のステムループプライマー、
ｂ）第２のフルオロフォアと、相補的クエンチングオリゴヌクレオチドもしくは第２の相補的クエンチングオリゴヌクレオチドとを含む第２の対立遺伝子特異的一本鎖プライマーを含む第２の二重鎖直鎖状プライマー、
または
ｃ）第３のフルオロフォアを含む第２の対立遺伝子特異的プライマー
を含む前記検出試薬をさらに含む、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
請求項４０の（ｃ）に記載のキットであって、
ｉ）第４のフルオロフォアおよびクエンチャーオリゴヌクレオチドを含む第２のプローブ鎖を含む第２の二重鎖プローブ、
ｉｉ）第４のフルオロフォアおよび第２のクエンチャーオリゴヌクレオチドを含む第２のプローブ鎖を含む第２の二重鎖プローブ、
ｉｉｉ）第４のフルオロフォアおよびクエンチャーを含む第２のステムループプローブ、
ｉｖ）第４のフルオロフォアおよび第２のクエンチャーを含む第２のステムループプローブ、
または、
ｖ）第４のフルオロフォアを含む第２の一本鎖プローブ、
をさらに含むキット。
【請求項４２】
フルオロフォアおよび第２のフルオロフォアがＦＲＥＴ対であるか、または第３のフルオロフォアと前記第２のフルオロフォアがＦＲＥＴ対であるか、または前記第３のフルオロフォアおよび第４のフルオロフォアがＦＲＥＴ対である請求項３９から４１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４３】
ＢＲＡＦ対立遺伝子が、アミノ酸置換Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋ、および／またはＶ６００Ｄを含むＢ−Ｒａｆタンパク質をコードする請求項３９から４１のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１５日出願に出願された米国仮特許出願第６１／７９２，２０２号の優先権を主張するものであり、この全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、核酸検出に関し、特に、多重核酸の同時検出のための方法および組成物に関するが、これらに限定されない技術を提供する。
【背景技術】
【０００３】
一塩基多型（ＳＮＰ）の検出は、ヒト遺伝学、癌診断法、薬理遺伝学、および微生物ジェノタイピング等の生物医学分野で利用される。通常、多くの従来技術は、特異的ＳＮＰテンプレートを効率的に伸長させるが、野生型テンプレートまたは他の非標的ＳＮＰ配列を伸長しない配列を有するようにデザインされている対立遺伝子特異的プライマーを用いてＳＮＰを検出する。これらの特異性の結果、このような対立遺伝子特異的プライマーは、他の技術、例えば、対立遺伝子特異的プローブ等と比較して、ＳＮＰ検出用として好まれることが多い。しかしながら、増幅産物の検出は、コンセンサス配列に結合するプローブに基づいているか、または個体のＳＮＰ等の小さなヌクレオチド変異間を区別するのに十分な能力を有していない技術に基づいているかのどちらかであるので、対立遺伝子特異的プライマーを使用するＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲ法は、この多重化能力に限界がある。
【０００４】
一部の従来のソリューションは、プライマーの３’末端にＳＮＰ検出ヌクレオチドを含む対立遺伝子特異的プライマーおよびプライマー特異的ハイブリダイゼーション標識を使用する（米国特許第６，７９４，１３３号）。しかし、この技術は、固相技術に依存しており、リアルタイムＰＣＲのためのこの技術の有用性を損なうプライマー特異性に問題がある。他の従来のハプロタイプソリューションは、プライマーの３’末端にＳＮＰ検出ヌクレオチドを含む対立遺伝子特異的プライマーを用いる多重検出を提供するが、ＳＮＰの検出は、大きさによって達成され、リアルタイムＰＣＲ蛍光シグナルによって達成されるのではない（国際特許公報番号ＷＯ  ２００８１４３３６７）。結局、一部の現存している従来技術は、多重解析用ユニバーサルプライマー配列を使用するが、検出は電気泳動法によって実施され、多重リアルタイムＰＣＲは提供されていない（米国特許第６，２０７，３７２号、および同第５，８８２，８５６号）。従って、生物医学分野において、対立遺伝子特異的プライマーを用いた多重ＳＮＰの多重化ＰＣＲ検出が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第６，７９４，１３３号明細書
【特許文献２】国際公開第２００８／１４３３６７号
【特許文献３】米国特許第６，２０７，３７２号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８８２，８５６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本明細書は、対立遺伝子特異的プライマーを使用した、核酸配列の多重化検出に関する技術を提供する。例えば、方法の実施形態は、１つの検出反応（例えば、１つのＰＣＲ、例えば、１つのリアルタイムＰＣＲ）における多重ＳＮＰの同時検出を提供する。一部の実施形態では、本技術は、多重対立遺伝子特異的プライミング検出（Ｍａｓｐ）およびＦＲＥＴ媒介多重対立遺伝子特異的プライミング検出（Ｆ−Ｍａｓｐ）として本明細書に参照される。
【０００７】
一部の実施形態では、および一部の用途で利用される技術として、Ｆ−Ｍａｓｐは、一部の実施形態において、所望であれば、本技術にさらなる特異性を提供するプローブをＦ−Ｍａｓｐが使用することで、Ｍａｓｐと比較して１つ以上の利点を提供する。例えば、Ｆ−Ｍａｓｐは、非特異的シグナル、例えば、非特異的プライミング、プライマー二量体の形成、および／または同じもしくは類似の標的配列（例えば、偽遺伝子）を含む非標的領域の存在から、一部のアッセイ干渉を減少、または排除する。
【０００８】
本明細書に提供するこの技術は、１つの均一な増幅反応からの多重ＳＮＰまたは多重遺伝子型の検出、同定、および／または報告を可能にする。このため、本技術は、情報を臨床医および患者により効率的に提供し、アッセイワークフローを向上させ、必要な技術を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一部の実施形態では、この技術は、サンプル中の核酸（例えば、ＢＲＡＦ遺伝子またはＢＲＡＦ遺伝子の一部を含む核酸、例えば、ＢＲＡＦ変異を含む核酸、例えば、アミノ酸置換を含むＢ−Ｒａｆタンパク質をコードするＢＲＡＦ変異を含む核酸、例えば、Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋ、および／またはＶ６００Ｄであるアミノ酸置換を含むＢ−Ｒａｆタンパク質をコードするＢＲＡＦ変異を含む核酸）を検出する方法を提供し、方法は、核酸を含むサンプルを消光状態のプライマーと接触させること、ならびにプライマーが核酸とハイブリッド形成し、増幅産物を生成する場合、検出可能状態のプライマーからのシグナルを検出することを含んでおり、シグナルが検出されるとき、核酸がサンプル中で検出される。一部の実施形態では、消光状態のプライマーは二重鎖重複領域を含む。一部の実施形態では、シグナルは蛍光である。一部の実施形態では、プライマーはフルオロフォアを含み、フルオロフォアは、プライマーが消光状態のとき、クエンチャーによって消光される。本技術は、オリゴヌクレオチドに連結した蛍光部分、クエンチャー部分、およびＦＲＥＴ対に限定されない。例えば、一部の実施形態では、フルオロフォアが、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、またはＣｙ５．５であり、クエンチャーが、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、またはＢＨＱ−３である方法を提供する。
【００１０】
一部の実施形態では、検出可能状態のプライマーは、核酸とハイブリッド形成し、一部の実施形態では、消光状態のプライマーは、ポリメラーゼによって核酸鎖に組み込まれる。一部の実施形態では、消光状態のプライマーは、ポリメラーゼによって核酸鎖に組み込まれ、プライマーは、二重鎖重複領域を保持する。さらにまた、一部の実施形態では、プライマーは、二重鎖重複領域の喪失と同時に、例えば、二重鎖重複領域を置換する相補鎖の合成と同時に、検出可能な状態になる。
【００１１】
本技術によるプライマーは、幾つかの形態で提供される。例えば、一部の実施形態では、消光状態のプライマーは、フルオロフォアおよびクエンチャーを含む１つのオリゴヌクレオチドからなる。一部の実施形態では、消光状態のプライマーは、フルオロフォアを含む第１のオリゴヌクレオチドと、クエンチャーを含む第２のオリゴヌクレオチドとからなり、第１のオリゴヌクレオチドが、第２のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する。一部の実施形態では、基底状態のプライマーは、フルオロフォアを含む第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドとからなり、第１のオリゴヌクレオチドが、第２のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する。
【００１２】
一部の実施形態では、本技術のプライマーは、ポリメラーゼ（例えば、ＰＣＲの間に）または他の合成工程によって核酸に組み込まれる。一部の実施形態では、組み込まれるプライマーは、検出可能状態、消光状態、または基底状態である。従って、一部の実施形態では、アンプリコンは検出可能状態のプライマーを含む。本技術によるプライマーは、幾つかの形態で提供される。例えば、一部の実施形態では、プライマーは、ステムループプライマーまたは二重鎖直鎖状プライマーである。一部の実施形態では、プライマーは、対立遺伝子特異的プライマーである。
【００１３】
一部の実施形態では、本技術は、ポリメラーゼおよびヌクレオチドを用いて検出可能状態のプライマーを伸長させることをさらに含む。また、一部の実施形態では、本技術は、ポリメラーゼ連鎖反応を実施することをさらに含む。例えば、一部の実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応はリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応である。
【００１４】
一部の実施形態では、方法は、例えば、複数の対立遺伝子、ＳＮＰ、遺伝子および変異等、複数の核酸（例えば、ＢＲＡＦ遺伝子またはＢＲＡＦ遺伝子の一部を含む複数の核酸、例えば、ＢＲＡＦ変異を含む核酸、例えば、アミノ酸置換を含むＢ−Ｒａｆタンパク質をコードするＢＲＡＦ変異を含む核酸、例えば、Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋおよび／またはＶ６００Ｄであるアミノ酸置換を含むＢ−Ｒａｆタンパク質をコードするＢＲＡＦ変異を含む核酸）を検出するための多重化方法である。従って、一部の実施形態では、方法は、第２の核酸を含むサンプルを、消光状態の第２のプライマーと接触させること、および第２のプライマーが第２の核酸とハイブリッド形成し、増幅産物を生成する場合、検出可能状態の第２のプライマーからの第２のシグナルを検出することを含み、第２のシグナルが検出されるとき、第２の核酸がサンプル中で検出される。
【００１５】
一部の実施形態では、本技術は、プライマーおよびプローブの使用を含む。例えば、一部の実施形態では、サンプル中の核酸を検出する方法が提供される。この方法は、核酸を含むサンプルを、消光状態または基底状態のプライマーおよびプローブと接触させること、ならびにプローブが核酸とハイブリッド形成する場合、プライマーからのシグナルを検出することを含み、シグナルが検出されるとき、核酸がサンプル中で検出される。一部の実施形態では、プローブは二重鎖重複領域を含む。一部の実施形態では、シグナルは蛍光である。一部の実施形態では、プローブは、フルオロフォア（例えば、蛍光共鳴エネルギー移動ドナー）を含み、プライマーは、フルオロフォア（例えば、蛍光共鳴エネルギー移動アクセプター）を含む。
【００１６】
本技術によるプローブは、幾つかの形態で提供される。例えば、一部の実施形態では、消光状態のプローブは、フルオロフォアおよびクエンチャーを含む１つのオリゴヌクレオチドからなる。一部の実施形態では、消光状態のプローブは、フルオロフォアを含む第１のオリゴヌクレオチドと、クエンチャーを含む第２のオリゴヌクレオチドとからなり、第１のオリゴヌクレオチドが、第２のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する。一部の実施形態では、基底状態のプローブは、フルオロフォアを含む第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドとからなり、第１のオリゴヌクレオチドが、第２のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する。一部の実施形態では、プローブは、ポリメラーゼによる伸長のための基質を提供しない（例えば、ポリメラーゼがプローブにヌクレオチドを付加することができない）ように、修飾されている（例えば、プローブの３’末端で）。一部の実施形態では、プローブは、本明細書に記載のステムループプローブまたは二重鎖直鎖状プローブである。この技術は、対立遺伝子、ＳＮＰ、変異等の検出に利用され、また、一部の実施形態では、プライマーは、対立遺伝子特異的プライマーである。
【００１７】
一部の実施形態では、プローブが消光状態のとき、プローブのフルオロフォアはクエンチャーによって消光される。本技術は、本技術のオリゴヌクレオチドに連結したフルオロフォアおよびクエンチャーに限定されない。例えば、一部の実施形態では、フルオロフォアは、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、またはＣｙ５．５であり、クエンチャーはＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２またはＢＨＱ−３である。一部の実施形態では、プライマーは、プローブの蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ドナーであるフルオロフォアと適合する蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アクセプターである、第２のフルオロフォアを含む。
【００１８】
一部の実施形態では、方法は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の実施におけるように、ポリメラーゼおよびヌクレオチドを用いてプライマーを伸長させることを含む。一部の実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応である。
【００１９】
一部の実施形態では、方法は、例えば、複数の対立遺伝子、ＳＮＰ、遺伝子および変異等、複数の核酸（例えば、ＢＲＡＦ遺伝子またはＢＲＡＦ遺伝子の一部を含む複数の核酸、例えば、ＢＲＡＦ変異を含む核酸、例えば、アミノ酸置換を含むＢ−Ｒａｆタンパク質をコードするＢＲＡＦ変異を含む核酸、例えば、Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋおよび／またはＶ６００Ｄであるアミノ酸置換を含むＢ−Ｒａｆタンパク質をコードするＢＲＡＦ変異を含む核酸）を検出するための多重化方法である。ＦＲＥＴの使用を含む一部の実施形態では、同じドナー部分は、２つ（以上）の異なるアクセプター部分と共に使用され、また、一部の実施形態では、２つ（以上）の異なるドナー部分は、２つ（以上）のアクセプター部分と共に使用される。従って、一部の実施形態では、方法は、第２の核酸を含むサンプルを、第２のプライマーと接触させること、およびプローブが第２の核酸とハイブリッド形成する場合、第２のプライマーからの第２のシグナルを検出することをさらに含み、第２のシグナルが検出されるとき、第２の核酸がサンプル中で検出される。
【００２０】
本技術は、１つ以上の対立遺伝子、ＳＮＰ、遺伝子、変異等の検出に利用される組成物の実施形態を提供する。一部の実施形態は、以下、即ち、
・検出可能プライマーとハイブリッド形成した核酸であって、検出可能プライマーがフルオロフォアおよびクエンチャーを含む核酸、
・検出可能プライマーを含む核酸であって、検出可能プライマーがフルオロフォアおよびクエンチャーを含む核酸、
・検出可能プライマーとハイブリッド形成した核酸であって、検出可能プライマーがフルオロフォアと、クエンチャーを含むクエンチャーオリゴヌクレオチドとを含む核酸、
・検出可能プライマーを含む核酸であって、検出可能プライマーがフルオロフォアと、クエンチャーを含むクエンチャーオリゴヌクレオチドとを含む核酸、
・プライマーを含み、かつプローブとハイブリッド形成した核酸であって、プローブが第１のフルオロフォアおよびクエンチャーを含み、プライマーが第２のフルオロフォアを含み、第１のフルオロフォアおよび第２のフルオロフォアがＦＲＥＴ対である核酸、または
・プライマーを含み、かつプローブとハイブリッド形成した核酸であって、プローブが第１のフルオロフォアを含み、プライマーが第２のフルオロフォアを含み、第１のフルオロフォアおよび第２のフルオロフォアがＦＲＥＴ対であり、クエンチャーを含むクエンチャーオリゴヌクレオチドを含む核酸、
の１つを含む組成物を提供する。
【００２１】
一部の実施形態では、組成物は反応混合物である。一部の実施形態では、組成物はポリメラーゼおよび／またはヌクレオチドをさらに含む（例えば、リアルタイムＰＣＲ等のＰＣＲにおいて）。一部の実施形態では、フルオロフォアは、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、またはＣｙ５．５であり、クエンチャーは、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、またはＢＨＱ−３である。一部の実施形態は、複数のフルオロフォアおよび／または複数のクエンチャーを含む。
【００２２】
一部の実施形態は、本明細書で提供されるプローブとプライマー、例えば、多重プライマー（例えば、対立遺伝子特異的プライマー）の組合せを使用して、２つ以上の対立遺伝子、ＳＮＰ、変異、および遺伝子等の多重検出を提供する。従って、一部の実施形態では、２つ（以上）の対立遺伝子、ＳＮＰ、変異、遺伝子等の多重検出のための組成物、方法、システム、およびキットを提供する。これらの実施形態は、本明細書に記載の２つ以上のプライマー（例えば、２つ以上の対立遺伝子特異的プライマー）の使用に関し、各プライマーは、別々に検出可能なフルオロフォアを用いて標識化されている。これらの実施形態では、２つ以上のプライマーに関連したクエンチャーは、同じクエンチャーであっても良く、または、２つ以上のプライマーに関連したクエンチャーは、２つ以上の異なるクエンチャーであっても良い。プローブおよび／またはプローブの使用を含む実施形態では、２つ以上のプライマーに関連したプローブは、同じプローブであっても良く、または、２つ以上のプライマーに関連したプローブは、２つ以上の異なるプローブであっても良い。従って、多重アッセイに使用するプローブは、同じ配列を含んでいてもよく、または、多重アッセイに使用するプローブは、２つ以上の異なる（例えば、同じ標的配列とハイブリッド形成するか、または２つ以上の異なる標的配列とハイブリッド形成する）配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、プローブがハイブリッド形成する２つ以上の異なる配列は、１つのヌクレオチドだけが異なっていてもよい。クエンチャーを含むプローブの実施形態については、２つ以上の異なるプローブは、それぞれ同じクエンチャーを含んでいてもよく、または、クエンチャーを含む２つ以上の異なるプローブは、それぞれ２つ以上の異なるクエンチャーを含んでいてもよい。一部の実施形態では、２つ以上のプライマーを多重検出に使用し、および１つのプローブを２つ以上のプライマーの検出に使用する。一部の実施形態では、２つ以上のプライマーを多重検出に使用し、および２つ以上のプローブを２つ以上のプライマーの検出に使用する。
【００２３】
一部の実施形態は、プローブ上のドナーフルオロフォアと２つ以上のプライマー上の２つ以上のアクセプターフルオロフォアとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（例えば、Ｆ−Ｍａｓｐ）に関連している。これらの実施形態では、同一のプローブドナーフルオロフォアを、２つ以上のプライマーアクセプターフルオロフォアと共に使用する。従って、アッセイには少なくとも３つのフルオロフォア（例えば、２つ以上の各プライマーフルオロフォアとＦＲＥＴ対を形成する、第１のプライマー上のアクセプターフルオロフォア、第２のプライマー上の異なるアクセプターフルオロフォア、およびプローブ上のドナーフルオロフォア）がある。一部の実施形態では、２つ以上の異なるプローブを、２つ以上のプライマーのためにそれぞれ使用する。これらの実施形態では、２つ以上の異なるプローブのドナーフルオロフォアは、２つ以上のプライマーのアクセプターフルオロフォアと共に使用する。従って、アッセイには少なくとも４つのフルオロフォア（例えば、第１のプライマー上のアクセプターフルオロフォア、第２のプライマー上の異なるアクセプターフルオロフォア、第１のプライマーに関連したプローブ上のドナーフルオロフォア、および第２のプライマーに関連したプローブ上の異なるドナーフルオロフォア）がある。各関連プライマープローブ対のフルオロフォア、プライマー、およびプローブは、ＦＲＥＴ対である。一部の実施形態では、ハイブリッド形成していないプローブは、二重鎖重複領域を含み、一部の実施形態では、ハイブリッド形成していないプローブは、クエンチャーを含む（例えば、プローブは、基底状態にある。）。
【００２４】
従って、一部の実施形態（例えば多重実施形態）では、組成物は、以下の１つをさらに含む。即ち、
・第２の検出可能プライマーとハイブリッド形成した第２の核酸であって、第２の検出可能プライマーが、第２のフルオロフォアと、クエンチャーもしくは第２のクエンチャーとを含む第２の核酸、
・第２の検出可能プライマーを含む第２の核酸であって、第２の検出可能プライマーが第２のフルオロフォアと、クエンチャーもしくは第２のクエンチャーとを含む第２の核酸、
・第２の検出可能プライマーとハイブリッド形成した第２の核酸であって、第２の検出可能プライマーが第２のフルオロフォアを含む第２の核酸、
・第２の検出可能プライマーを含む第２の核酸であって、第２の検出可能プライマーが第２のフルオロフォアを含む第２の核酸、
・第２のプライマーを含み、かつプローブとハイブリッド形成する第２の核酸であって、プローブが、第１のフルオロフォアおよびクエンチャーを含み、第２のプライマーが、第３のフルオロフォアを含み、第１のフルオロフォアおよび第３のフルオロフォアとがＦＲＥＴ対である第２の核酸、または、
・第２のプライマーを含み、かつプローブとハイブリッド形成する第２の核酸であって、プローブが第１のフルオロフォアを含み、第２のプライマーが第３のフルオロフォアを含み、第１のフルオロフォアと第３のフルオロフォアとがＦＲＥＴ対である第２の核酸。
【００２５】
クエンチャーオリゴヌクレオチドを含む一部の実施形態では、クエンチャーオリゴヌクレオチドは、クエンチャーもしくは第２のクエンチャーを含む第２のクエンチャーオリゴヌクレオチドである。関連する実施形態は、多重アッセイで同一サンプル中の１つ以上の対立遺伝子を検出するため、１つ以上の一塩基多型を検出するため、および／または複数の対立遺伝子を検出するために、本明細書で提供される組成物の使用を提供する。
【００２６】
さらに、実施形態は、検出試薬（例えば、核酸（例えば、ＢＲＡＦ遺伝子またはＢＲＡＦ遺伝子の一部を含む核酸、例えば、ＢＲＡＦ変異を含む核酸、例えば、アミノ酸置換を含むＢ−Ｒａｆタンパク質をコードするＢＲＡＦ変異を含む核酸、例えば、Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋおよび／またはＶ６００Ｄであるアミノ酸置換を含むＢ−Ｒａｆタンパク質をコードするＢＲＡＦ変異を含む核酸）の検出のための）を含むキットを提供し、検出試薬が、以下の１つを含む。即ち、
・フルオロフォアおよびクエンチャーを含むステムループプライマー、
・フルオロフォアおよび相補的クエンチングオリゴヌクレオチドを含む対立遺伝子特異的一本鎖プライマーを含む二重鎖直鎖状プライマー、
・フルオロフォアおよび相補的オリゴヌクレオチドを含む対立遺伝子特異的一本鎖プライマーを含む二重鎖直鎖状プライマー、
・フルオロフォアと、第２のフルオロフォアおよびクエンチャーオリゴヌクレオチドを含むプローブ鎖を含む二重鎖プローブとを含む対立遺伝子特異的プライマー、
・フルオロフォアと、第２のフルオロフォアを含むプローブ鎖を含む二重鎖プローブとを含む対立遺伝子特異的プライマー、または
・フルオロフォアと、第２のフルオロフォアおよびクエンチャーを含むステムループプローブとを含む対立遺伝子特異的プライマー。
【００２７】
一部の実施形態では、キットはコントロール核酸をさらに含む。
【００２８】
一部の実施形態では、キットは、複数の対立遺伝子、ＳＮＰ、遺伝子、変異等の多重検出を提供する。従って、一部の実施形態では、キットは、第２の検出試薬をさらに含み、第２の検出試薬は、以下の１つを含む。即ち、
・第２のフルオロフォアと、クエンチャーもしくは第２のクエンチャーとを含む第２のステムループプライマー、
・第２のフルオロフォアと、相補的クエンチングオリゴヌクレオチドもしくは第２の相補的クエンチングオリゴヌクレオチドとを含む第２の対立遺伝子特異的一本鎖プライマーを含む第２の二重鎖直鎖状プライマー、または
・第３のフルオロフォアを含む第２の対立遺伝子特異的プライマー。
【００２９】
一部の実施形態では、キットは、以下、即ち、
・第４のフルオロフォアおよびクエンチャーオリゴヌクレオチドを含む第２のプローブ鎖を含む第２の二重鎖プローブ、
・第４のフルオロフォアおよび第２のクエンチャーオリゴヌクレオチドを含む第２のプローブ鎖を含む第２の二重鎖プローブ、
・第４のフルオロフォアおよびクエンチャーを含む第２のステムループプローブ、または
・第４のフルオロフォアおよび第２のクエンチャーを含む第２のステムループプローブ
などのプローブを含む。
【００３０】
一部の実施形態では、第２の対立遺伝子特異的プライマーを含むキットは、第２のフルオロフォアおよびクエンチャーオリゴヌクレオチドを含むプローブ鎖を含む二重鎖プローブも（例えば、第１の対立遺伝子特異的プライマーと共に使用するプローブも）含む。一部の実施形態では、第２の対立遺伝子特異的プライマーを含むキットは、第２のフルオロフォアを含むプローブ鎖を含む二重鎖プローブも（例えば、第１の対立遺伝子特異的プライマーと共に使用するプローブも）含む。
【００３１】
一部の実施形態では、上述のように、プローブは全て、プライマーの各アクセプターフルオロフォアのフルオロフォアとＦＲＥＴ対を形成する同じドナーフルオロフォアを含む。一部の実施形態では、異なるプライマープローブ対は、異なるアクセプタードナーＦＲＥＴ対を使用する。このため、一部の実施形態では、フルオロフォアおよび第２のフルオロフォアがＦＲＥＴ対であるか、第３のフルオロフォアおよび第２のフルオロフォアがＦＲＥＴ対であるか、または、第３のフルオロフォアおよび第４のフルオロフォアがＦＲＥＴ対である。
【００３２】
従って、本明細書は、サンプル中の核酸を検出する方法の実施形態を提供し、方法は、核酸を含むサンプルを消光状態のプライマーと接触させること、およびプライマーが核酸とハイブリッド形成する場合、またはプライマーが核酸とハイブリッド形成し、かつプライマーがアンプリコンに組み込まれる場合、検出可能状態のプライマーからのシグナルを検出することを含み、核酸がＢＲＡＦ遺伝子またはＢＲＡＦ遺伝子の一部を含み、およびシグナルが検出されるとき、核酸がサンプル中で検出される。一部の実施形態では、消光状態のプライマーは二重鎖重複領域を含む。一部の実施形態では、シグナルは蛍光である。一部の実施形態では、プライマーはフルオロフォアを含み、プライマーが消光状態のとき、フルオロフォアは、クエンチャーによって消光される。一部の実施形態では、フルオロフォアは、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、またはＣｙ５．５であり、クエンチャーはＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、またはＢＨＱ−３である。一部の実施形態では、消光状態のプライマーは、ポリメラーゼによって核酸鎖に組み込まれる。
【００３３】
さらに、一部の実施形態では、消光状態のプライマーは、フルオロフォアおよびクエンチャーを含む１つのオリゴヌクレオチドからなるか、または、フルオロフォアを含む第１のオリゴヌクレオチドと、クエンチャーを含む第２のオリゴヌクレオチドとからなり、第１のオリゴヌクレオチドが、第２のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する。
【００３４】
一部の実施形態では、アンプリコンは、検出可能状態のプライマーを含む。一部の実施形態では、プライマーは、ステムループプライマーまたは二重鎖直鎖状プライマーである。
【００３５】
一部の実施形態では、プライマーは、ＢＲＡＦにおける変異を検出するための対立遺伝子特異的プライマーであり、例えば、プライマーは、アミノ酸置換を含むＢ−Ｒａｆタンパク質をコードするＢＲＡＦにおける変異を検出するための対立遺伝子特異的プライマーであり、例えば、プライマーは、Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋおよび／またはＶ６００Ｄであるアミノ酸置換を含むＢ−Ｒａｆタンパク質をコードするＢＲＡＦにおける変異を検出するための対立遺伝子特異的プライマーである。
【００３６】
一部の実施形態では、方法は、ポリメラーゼおよびヌクレオチドを用いて、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、例えば、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を実施することによって、消光状態のハイブリッド形成したプライマーを伸長させることをさらに含む。
【００３７】
一部の実施形態では、方法は、核酸を含むサンプルを、消光状態の第２のプライマーと接触させること、および第２のプライマーが核酸とハイブリッド形成する場合、または第２のプライマーが核酸とハイブリッド形成し、かつ第２のプライマーがアンプリコンに組み込まれる場合、検出可能状態の第２のプライマーからの第２のシグナルを検出することをさらに含み、第２のシグナルが検出されるとき、核酸がサンプル中で検出される。
【００３８】
一部の実施形態は、サンプル中の核酸を検出する方法を提供し、方法は、核酸を含むサンプルを、プライマーおよび消光状態のプローブ、または基底状態のプローブと接触させること、およびプローブがプライマーを含む核酸の相補体とハイブリッド形成する場合、プライマーからのシグナルを検出することを含み、シグナルが検出されるとき、核酸がサンプル中で検出される。一部の実施形態では、消光状態のプローブは、二重鎖重複領域を含む。一部の実施形態では、シグナルは蛍光である。一部の実施形態では、プローブは、フルオロフォアを含み、プローブが消光状態のとき、フルオロフォアは、クエンチャーによって消光される。一部の実施形態では、フルオロフォアは、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５およびＣｙ５．５からなる群から選択され、クエンチャーは、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２およびＢＨＱ−３からなる群から選択される。一部の実施形態では、プライマーは、プローブのフルオロフォアと適合する蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アクセプターである、第２のフルオロフォアを含む。
【００３９】
一部の実施形態では、消光状態のプローブは、フルオロフォアおよびクエンチャーを含む１つのオリゴヌクレオチドからなるか、または、フルオロフォアを含む第１のオリゴヌクレオチドと、クエンチャーを含む第２のオリゴヌクレオチドとからなり、第１のオリゴヌクレオチドが、第２のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成するものと規定する。
【００４０】
一部の実施形態では、核酸の相補体はプライマーを含み、プローブは核酸の相補体とハイブリッド形成する。一部の実施形態では、プローブは、ステムループプローブまたは二重鎖直鎖状プローブである。
【００４１】
一部の実施形態では、プライマーは、ＢＲＡＦにおける変異を検出するための対立遺伝子特異的プライマーであり、例えば、プライマーは、アミノ酸置換を含むＢ−Ｒａｆタンパク質をコードするＢＲＡＦにおける変異を検出するための対立遺伝子特異的プライマーであり、例えば、プライマーは、Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋおよび／またはＶ６００Ｄであるアミノ酸置換を含むＢ−Ｒａｆタンパク質をコードするＢＲＡＦにおける変異を検出するための対立遺伝子特異的プライマーである。
【００４２】
一部の実施形態では、方法は、ポリメラーゼおよびヌクレオチドを用いて、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、例えば、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を実施することによって、ハイブリッド形成した消光状態のプライマーを伸長させることをさらに含む。
【００４３】
一部の実施形態では、方法は、核酸を含むサンプルを、第２のプライマーと接触させることと、プローブが、第２のプライマーを含む核酸の相補体とハイブリッド形成する場合、第２のプライマーからのシグナルを検出することとをさらに含み、第２のシグナルが検出されるとき、核酸がサンプル中で検出される。
【００４４】
さらなる実施形態は、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、および以下の、検出可能プライマーとハイブリッド形成した核酸（例えば、ＢＲＡＦ遺伝子またはＢＲＡＦ遺伝子の一部を含む核酸）であって、検出可能プライマーが、フルオロフォアおよびクエンチャーを含む核酸、検出可能プライマーを含む核酸（例えば、ＢＲＡＦ遺伝子またはＢＲＡＦ遺伝子の一部を含む核酸）であって、検出可能プライマーが、フルオロフォアおよびクエンチャーを含む核酸、検出可能プライマーとハイブリッド形成した核酸（例えば、ＢＲＡＦ遺伝子またはＢＲＡＦ遺伝子の一部を含む核酸）であって、検出可能プライマーがフルオロフォアと、クエンチャーを含むクエンチャーオリゴヌクレオチドとを含む核酸、検出可能プライマーを含む核酸（例えば、ＢＲＡＦ遺伝子またはＢＲＡＦ遺伝子の一部を含む核酸）であって、検出可能プライマーがフルオロフォアと、クエンチャーを含むクエンチャーオリゴヌクレオチドとを含む核酸、プライマーを含み、かつプローブとハイブリッド形成した核酸（例えばＢＲＡＦ遺伝子またはＢＲＡＦ遺伝子の一部を含む核酸）であって、プローブが第１のフルオロフォアおよびクエンチャーを含み、プライマーが第２のフルオロフォアを含み、第１のフルオロフォアおよび第２のフルオロフォアがＦＲＥＴ対である核酸、または、プライマーを含み、かつプローブとハイブリッド形成した核酸（例えば、ＢＲＡＦ遺伝子またはＢＲＡＦ遺伝子の一部を含む核酸）であって、プローブが第１のフルオロフォアを含み、プライマーが第２のフルオロフォアを含み、第１のフルオロフォアおよび第２のフルオロフォアがＦＲＥＴ対であり、クエンチャーを含むクエンチャーオリゴヌクレオチドを含む核酸、の１つを含む組成物（例えば、反応混合物）を提供する。実施形態は、フルオロフォアが、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、またはＣｙ５．５であり、クエンチャーがＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、またはＢＨＱ−３であると規定する。
【００４５】
実施形態は、第２の検出可能プライマーとハイブリッド形成した第２の核酸（例えば、ＢＲＡＦ遺伝子またはＢＲＡＦ遺伝子の一部を含む核酸）であって、第２の検出可能プライマーが、第２のフルオロフォアとクエンチャーもしくは第２のクエンチャーとを含む第２の核酸、第２の検出可能プライマーを含む第２の核酸（例えば、ＢＲＡＦ遺伝子またはＢＲＡＦ遺伝子の一部を含む核酸）であって、第２の検出可能プライマーが、第２のフルオロフォアとクエンチャーもしくは第２のクエンチャーとを含む第２の核酸、第２の検出可能プライマーとハイブリッド形成した第２の核酸（例えば、ＢＲＡＦ遺伝子またはＢＲＡＦ遺伝子の一部を含む核酸）であって、第２の検出可能プライマーが第２のフルオロフォアを含む第２の核酸、第２の検出可能プライマーを含む第２の核酸（例えば、ＢＲＡＦ遺伝子またはＢＲＡＦ遺伝子の一部を含む核酸）であって、第２の検出可能プライマーが第２のフルオロフォアを含む核酸、第２のプライマーを含み、かつプローブとハイブリッド形成した第２の核酸（例えば、ＢＲＡＦ遺伝子またはＢＲＡＦ遺伝子の一部を含む核酸）であって、プローブが第１のフルオロフォアおよびクエンチャーを含み、第２のプライマーが第３のフルオロフォアを含み、第１のフルオロフォアおよび第３のフルオロフォアがＦＲＥＴ対である第２の核酸、または、第２のプライマーを含み、かつプローブとハイブリッド形成した第２の核酸（例えば、ＢＲＡＦ遺伝子またはＢＲＡＦ遺伝子の一部を含む核酸）であって、プローブが第１のフルオロフォアを含み、第２のプライマーが第３のフルオロフォアを含み、第１のフルオロフォアおよび第３のフルオロフォアがＦＲＥＴ対である第２の核酸をさらに含む組成物を提供する。一部の実施形態は、組成物がクエンチャーもしくは第２のクエンチャーを含む第２のクエンチャーオリゴヌクレオチドを含むと規定する。
【００４６】
この技術は、例えば、多重アッセイにおいて同一サンプル中の、１つ以上のＢＲＡＦ対立遺伝子を検出するため、１つ以上のＢＲＡＦ一塩基多型を検出するため、および複数のＢＲＡＦ対立遺伝子を検出するために利用される。
【００４７】
従って、実施形態は、ＢＲＡＦ対立遺伝子を検出するためのキットを提供する。例えば、キットの実施形態は、１つ以上のＢＲＡＦ対立遺伝子を検出するための検出試薬（検出試薬は、以下の、フルオロフォアおよびクエンチャーを含むステムループプライマー、フルオロフォアおよび相補的クエンチングオリゴヌクレオチドを含む対立遺伝子特異的一本鎖プライマーを含む二重鎖直鎖状プライマー、フルオロフォアおよび相補的オリゴヌクレオチドを含む対立遺伝子特異的一本鎖プライマーを含む二重鎖直鎖状プライマー、フルオロフォアと、第２のフルオロフォアおよびクエンチャーオリゴヌクレオチドを含むプローブ鎖を含む二重鎖プローブとを含む対立遺伝子特異的プライマー、フルオロフォアと、第２のフルオロフォアを含むプローブ鎖を含む二重鎖プローブとを含む対立遺伝子特異的プライマー、フルオロフォアと、第２のフルオロフォアを含む一本鎖プローブとを含む対立遺伝子特異的プライマー、または、フルオロフォアと、第２のフルオロフォアおよびクエンチャーを含むステムループプローブとを含む対立遺伝子特異的プライマーの１つを含む)、ならびにＢＲＡＦ遺伝子またはＢＲＡＦ遺伝子の一部を含むコントロール核酸を含む。
【００４８】
一部の実施形態では、キットは、第２のＢＲＡＦ対立遺伝子を検出するための第２の検出試薬をさらに含み、第２の検出試薬は、第２のフルオロフォアと、クエンチャーもしくは第２のクエンチャーとを含む第２のステムループプライマー、第２のフルオロフォアと、相補的クエンチングオリゴヌクレオチドもしくは第２の相補的クエンチングオリゴヌクレオチドとを含む第２の対立遺伝子特異的一本鎖プライマーを含む第２の二重鎖直鎖状プライマー、または、第３のフルオロフォアを含む第２の対立遺伝子特異的プライマーを含む。
【００４９】
キットの一部の実施形態は、第４のフルオロフォアおよびクエンチャーオリゴヌクレオチドを含む第２のプローブ鎖を含む第２の二重鎖プローブ、第４のフルオロフォアおよび第２のクエンチャーオリゴヌクレオチドを含む第２のプローブ鎖を含む第２の二重鎖プローブ、第４のフルオロフォアおよびクエンチャーを含む第２のステムループプローブ、第４のフルオロフォアおよび第２のクエンチャーを含む第２のステムループプローブ、または、第４のフルオロフォアを含む第２の一本鎖プローブをさらに含む。実施形態は、２つ以上のフルオロフォア（例えば、フルオロフォア、第２のフルオロフォア、第３のフルオロフォア、第４のフルオロフォア等）がＦＲＥＴ対である、例えば、フルオロフォアおよび第２のフルオロフォアがＦＲＥＴ対である、第３のフルオロフォアおよび第２のフルオロフォアがＦＲＥＴ対である、または、第３のフルオロフォアおよび第４のフルオロフォアがＦＲＥＴ対であると規定する。キットは、ＢＲＡＦ対立遺伝子、例えば、アミノ酸置換を含むＢ−Ｒａｆタンパク質をコードするＢＲＡＦ対立遺伝子、例えば、Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋおよび／またはＶ６００Ｄであるアミノ酸置換を含むＢ−Ｒａｆタンパク質をコードするＢＲＡＦ対立遺伝子を検出するための検出試薬を提供する。
【００５０】
さらに、方法の実施形態は、サンプル中の核酸（例えば、ＢＲＡＦ核酸）を検出するために、例えば、核酸を含むサンプルを、消光状態の（例えば、プライマーが二重鎖重複領域を含み、および／またはプライマーが消光状態（例えば、プライマーがフルオロフォアおよびクエンチャーを含む１つのオリゴヌクレオチドからなる（例えば、プライマーがステムループプライマーである。）か、または、プライマーが、フルオロフォアを含む第１のオリゴヌクレオチドと、クエンチャーを含む第２のオリゴヌクレオチドとからなり、第１のオリゴヌクレオチドが、第２のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する（例えば、プライマーが二重鎖直鎖状プライマーである。））のとき、フルオロフォアがクエンチャー（例えば、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、およびＢＨＱ−３）によって消光される）プライマー（例えば、対立遺伝子特異的プライマー（例えば、アミノ酸置換Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋおよび／またはＶ６００Ｄを含むＢ−Ｒａｆタンパク質をコードするＢＲＡＦ変異のための対立遺伝子特異的プライマー）、例えば、フルオロフォア（例えば、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、およびＣｙ５．５）を含むプライマー）；プライマー（例えば、対立遺伝子特異的プライマー（例えば、Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋおよび／またはＶ６００Ｄアミノ酸置換を含むＢ−Ｒａｆタンパク質をコードするＢＲＡＦ変異のための対立遺伝子特異的プライマー））と消光状態の（例えば、プローブが、二重鎖重複領域を含み、および／またはプローブが消光状態（例えば、プローブがフルオロフォアおよびクエンチャーを含む１つのオリゴヌクレオチドからなる（例えば、プローブがステムループプローブである。）か、または、プローブが、フルオロフォアを含む第１のオリゴヌクレオチドと、クエンチャーを含む第２のオリゴヌクレオチドとからなり、第１のオリゴヌクレオチドが、第２のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する（例えば、プローブが二重鎖直鎖状プローブである。））のとき、フルオロフォアがクエンチャー（例えば、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、およびＢＨＱ−３）によって消光される）プローブ（例えば、フルオロフォア（例えば、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、およびＣｙ５．５）を含むプローブ）；またはプライマー（例えば、対立遺伝子特異的プライマー（例えば、Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋおよび／またはＶ６００Ｄアミノ酸置換を含むＢ−Ｒａｆタンパク質をコードするＢＲＡＦ変異のための対立遺伝子特異的プライマー）、例えば、フルオロフォア（例えばＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、およびＣｙ５．５）およびプローブ（例えば、基底状態のフルオロフォア（例えば、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、およびＣｙ５．５）を含むプローブ）を含むプライマー）と接触させること、および次いで、プライマーが核酸とハイブリッド形成する場合、検出可能状態のプライマーからシグナル（例えば蛍光シグナル）を検出すること、プライマーが核酸とハイブリッド形成し、およびプライマーがアンプリコンに組み込まれる（例えば、消光状態のプライマーがポリメラーゼによって核酸鎖に組み込まれる）場合、検出可能状態のプライマーからシグナル（例えば蛍光シグナル）を検出すること、またはプローブがプライマーを含む核酸の相補体とハイブリッド形成する（例えば、プライマーが、フルオロフォアを含むプローブのフルオロフォアと適合する蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アクセプターであるフルオロフォアを含む）場合、プライマーからシグナル（例えば、蛍光シグナル）を検出すること、および一部の実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応）を実施することを含む方法であって、核酸がＢＲＡＦ遺伝子またはＢＲＡＦ遺伝子の一部を含み、およびシグナルが検出されるとき核酸がサンプル中で検出される方法を提供する。
【００５１】
一部の実施形態では、この技術は、核酸を含むサンプルを、複数のプライマー（例えば、複数の対立遺伝子特異的プライマー（例えば、Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋおよび／またはＶ６００Ｄアミノ酸置換を含むＢ−Ｒａｆタンパク質をコードする１つ以上のＢＲＡＦ変異のための複数の対立遺伝子特異的プライマー）、例えば、消光状態の（例えば、各プライマーが、二重鎖重複領域を含み、および／または各プライマーが消光状態（例えば、プライマーがフルオロフォアおよびクエンチャーを含む１つのオリゴヌクレオチドからなる（例えば、プライマーはステムループプライマーである。）または、プライマーが、フルオロフォアを含む第１のオリゴヌクレオチドと、クエンチャーを含む第２のオリゴヌクレオチドとからなり、第１のオリゴヌクレオチドが、第２のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する（例えば、プライマーは二重鎖の直鎖状プライマーである。））のとき、各プライマーのフルオロフォアがクエンチャー（例えば、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、およびＢＨＱ−３）によって消光される）フルオロフォア（例えばＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、およびＣｙ５．５）をそれぞれ含む複数のプライマー）；複数のプライマー（例えば、複数の対立遺伝子特異的プライマー、（例えば、アミノ酸置換Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋおよび／またはＶ６００Ｄを含むＢ−Ｒａｆタンパク質をコードする１つ以上のＢＲＡＦ変異のための複数の対立遺伝子特異的プライマー））およびプローブ（例えば、消光状態の（例えば、プローブが二本鎖重複領域を含み、および／またはプローブが消光状態（例えば、プローブがフルオロフォアおよびクエンチャーを含む１つのオリゴヌクレオチドからなる（例えば、プローブはステムループプローブである。）か、または、プローブが、フルオロフォアを含む第１のオリゴヌクレオチドと、クエンチャーを含む第２のオリゴヌクレオチドとからなり、第１のオリゴヌクレオチドが、第２のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する（例えば、プローブは二本鎖の直鎖状プローブである。））のとき、フルオロフォアがクエンチャー（例えば、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、およびＢＨＱ−３）によって消光される））フルオロフォア（例えば、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、およびＣｙ５．５）を含むプローブ）；または複数のプライマー（例えば、複数の対立遺伝子特異的プライマー（例えば、Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋおよび／またはＶ６００Ｄアミノ酸置換を含むＢ−Ｒａｆタンパク質をコードする１つ以上のＢＲＡＦ変異のための複数の対立遺伝子特異的プライマー）、例えば、各プライマーが基底状態のフルオロフォア（例えば、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、およびＣｙ５．５）およびプローブ（例えば、フルオロフォア（例えば、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、およびＣｙ５．５）を含むプローブ）を含む。）と接触させること；および次いで、１つ以上のプライマーが核酸とハイブリッド形成する場合、検出可能状態の複数のプライマーの１つ以上のプライマーから１つ以上のシグナル（例えば、１つ以上の蛍光シグナル）を検出すること、１つ以上のプライマーが核酸とハイブリッド形成し、および１つ以上のプライマーがアンプリコンに組み込まれる（例えば、消光状態のプライマーがポリメラーゼによって核酸鎖に組み込まれる）場合、検出可能状態の複数のプライマーの１つ以上のプライマーから１つ以上のシグナル（例えば、１つ以上の蛍光シグナル）を検出すること、または、プローブが複数のプライマーの１つのプライマーを含む核酸の相補体とハイブリッド形成する（例えば、各プライマーが、フルオロフォアを含むプローブのフルオロフォアと適合する蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アクセプターであるフルオロフォアを含む）場合、１つ以上のプライマーから１つ以上のシグナル（例えば１つ以上の蛍光シグナル）を検出すること、および一部の実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応）を実施することを含む方法であって、核酸がＢＲＡＦ遺伝子またはＢＲＡＦ遺伝子の一部を含み、シグナルが検出されるとき核酸がサンプル中に検出される方法を提供する。
【００５２】
実施形態は、ＢＲＡＦ対立遺伝子を検出するためのキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、１つ以上のＢＲＡＦ対立遺伝子（例えば、Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋおよび／またはＶ６００Ｄであるアミノ酸置換を含むＢ−Ｒａｆタンパク質をコードする変異を含む）を検出するための検出試薬、例えば、フルオロフォアおよびクエンチャーを含むステムループプライマー、フルオロフォアおよび相補的クエンチングオリゴヌクレオチドを含む対立遺伝子特異的一本鎖プライマーを含む二重鎖直鎖状プライマー、フルオロフォアおよび相補的オリゴヌクレオチドを含む対立遺伝子特異的一本鎖プライマーを含む二重鎖直鎖状プライマー、フルオロフォア、ならびに第２のフルオロフォアおよびクエンチャーオリゴヌクレオチドを含むプローブ鎖を含む二重鎖プローブを含む対立遺伝子特異的プライマー、フルオロフォア、および第２のフルオロフォアを含むプローブ鎖を含む二重鎖プローブを含む対立遺伝子特異的プライマー、フルオロフォア、および第２のフルオロフォアを含む一本鎖プローブを含む対立遺伝子特異的プライマー、または、フルオロフォア、ならびに第２のフルオロフォアおよびクエンチャーを含むステムループプローブを含む対立遺伝子特異的プライマー；場合により、第２のＢＲＡＦ対立遺伝子を検出するための第２の検出試薬であって、第２の検出試薬が、第２のフルオロフォアおよびクエンチャーもしくは第２のクエンチャーを含む第２のステムループプライマー、第２のフルオロフォアおよび相補的クエンチングオリゴヌクレオチドもしくは第２の相補的クエンチングオリゴヌクレオチドを含む第２の対立遺伝子特異的一本鎖プライマーを含む第２の二重鎖直鎖状プライマー、または、第３のフルオロフォアを含む第２の対立遺伝子特異的プライマー、（および場合により、第４のフルオロフォアおよびクエンチャーオリゴヌクレオチドを含む第２のプローブ鎖を含む第２の二重鎖プローブ、第４のフルオロフォア、および第２のクエンチャーオリゴヌクレオチドを含む第２のプローブ鎖を含む第２の二重鎖プローブ、第４のフルオロフォアおよびクエンチャーを含む第２のステムループプローブ、第４のフルオロフォアおよび第２のクエンチャーを含む第２のステムループプローブ、および／または、第４のフルオロフォアを含む第２の一本鎖プローブ）を含み；ならびにＢＲＡＦ遺伝子、もしくはＢＲＡＦ遺伝子の一部由来のヌクレオチド配列を含むコントロール核酸を含む。一部の実施形態では、本明細書に提供するキットは、ＦＲＥＴ対である２つのフルオロフォアを含む（例えば、フルオロフォア、第２のフルオロフォア、第３のフルオロフォア、および第４のフルオロフォアの任意の２つ（以上）が、ＦＲＥＴ対である。）。
【００５３】
さらなる実施形態は、本明細書に含まれる教示に基づいた関連技術分野の当業者には明らかであろう。
【００５４】
以下の図面に関しては、本技術のこれらの、およびこの他の特徴、態様、および利点がより良く理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本技術の一実施形態を示す。
【図２】本技術の一実施形態を示す。
【図３】本技術の一実施形態を使用して実施した実験の概略図を示す。
【図４】本技術の一実施形態を使用して実施した実験の概略図を示す。
【図５】本技術の一実施形態の試験中に回収したリアルタイムＰＣＲデータのプロットである。
【図６】ＢＲＡＦ変異核酸を検出する技術の一実施形態で実施したリアルタイムＰＣＲ実験から得たデータのプロットである。
【図７】ＢＲＡＦ変異核酸を検出する技術の一実施形態で実施したリアルタイムＰＣＲ実験から得たデータのプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
図面は必ずしも縮尺通りに描かれておらず、また、図面中の物体も、必ずしも互いの関係における縮尺で描かれていないことが理解されるであろう。図面は、本明細書に開示する装置、システム、および方法の、様々な実施形態に対する明瞭さおよび理解をもたらすように意図した描写である。可能であればいつでも、同一の参照番号が、同一、または類似部分を指すように、図面全体を通して使用されている。さらに、図面は、いかなる点においても本教示の範囲を制限するよう意図されていないことが理解されるであろう。
【００５７】
本明細書は、核酸検出に関し、特に、多重核酸（例えば多重ＳＮＰ等の多重対立遺伝子）の同時検出のための方法および組成物に関する技術を提供するが、これらに限定されるものではない。通常、本技術は、以下に、より詳細に記載したようなフルオロフォアおよびクエンチャーで標識したプライマーおよびプローブを利用する。一部の実施形態では、本明細書に提供する技術は、１つの均一な増幅反応由来の多重ＳＮＰまたは遺伝子型の検出、同定、および／または報告を可能にする。
【００５８】
本明細書に用いるセクションの見出しは、組織化の目的のためのだけにあり、いかなる点においても記載の主題を限定するものと解釈されるべきではない。
【００５９】
様々な実施形態のこの詳細な記述には、説明のために、開示した実施形態の理解の徹底を期して多数の具体的な詳細が述べられている。しかしながら、当業者は、これらの様々な実施形態が、これらの具体的な詳細を用いて実行しても用いずに実行してもよいことを理解するであろう。他の例では、構造および装置はブロック図形で示している。さらに、当業者は、方法が示され実施されている具体的順序は例示として示されていること、ならびにかかる順序を変更しても、本明細書に開示された様々な実施形態の精神および範囲内にあることが企図されていることを容易に理解することができる。
【００６０】
本出願で引用した文献および同様の資料（特許、特許出願、記事、書籍、論文およびインターネットウェブページを含むがこれらに限定されない。）は全て、あらゆる目的のためにこの全体が参照により明示的に組み込まれる。他に定義されない限り、本明細書で使用する全ての専門用語および科学技術用語は、本明細書に記載した様々な実施形態が属する分野の当業者によって共通に理解されるのと同じ意味を有する。組み込まれた引用文献中の用語の定義が、本教示に示す定義と異なるように思われる場合には、本教示に示す定義が優先するものとする。
【００６１】
定義
本技術の理解を容易にするために、幾つかの用語および語句を以下に定義する。さらなる定義は、詳細な記述全体を通して述べられている。
【００６２】
以下の用語は、明細書および請求項の全体を通して、文脈に明確な別段の指示がない限り、本明細書に明示的に関連する意味に解釈する。本明細書で使用する語句「１つの実施形態では」は、同一の実施形態を指す場合もあるが必ずしもそうではない。さらに、本明細書で使用する語句「別の実施形態では」は、異なる実施形態を指す場合もあるが、必ずしもそうではない。従って、以下に述べるように、本発明の様々な実施形態は、本発明の範囲または精神から逸脱することなく容易に組み合わせ得る。
【００６３】
さらに、本明細書で使用する用語「または」は、包括的な「または」の機能語であり、文脈に明確な別段の指示がない限り、用語「および／または」と同義である。用語「に基づく」は、文脈に明確な別段の指示がない限り、排他的ではなく、記載されていないさらなる要素に基づくことを許容するものである。さらに、本明細書を通して、「１つの」および「この」の意味は、複数の参照を含む。「に」という意味は、「中に」および「上に」を含む。
【００６４】
本明細書で使用する「多形配列」は、変異可能な任意のヌクレオチド配列を指し、「対立遺伝子」は、このような１つの変異を指す。好ましくは、このような変異は、生物の集団において共通であり、メンデル様式で遺伝する。このような対立遺伝子は、関連した表現型を有している場合も、有していない場合もある。用語「一塩基多型」（または「ＳＮＰ」）は「多形配列」の１種であり、ヌクレオチドの１つだけの配列変異によって特徴づけられる。用語「ハプロタイプ」は、個体由来の単一染色体上の遺伝子座にある１つ以上（好ましくは、少なくとも２つの多型部位）の多型部位で見られるヌクレオチドの５’から３’の配列を指す。用語「遺伝子型」は、個体における１対の相同染色体上の遺伝子座にある１つ以上の多型部位で見られるヌクレオチド対の５’から３’の配列を指す。用語「ヌクレオチド変異」は、配列の他の点では類似している連続ＤＮＡセグメントの中で特定の位置にあるＤＮＡ配列のヌクレオチド遺伝子多型を指す。このような連続ＤＮＡセグメントは、染色体の遺伝子または任意の他の部分を含む。ヌクレオチド変異の例には、欠失、挿入、および置換がある。
【００６５】
用語「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド」または「核酸」は、２つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなる分子を指し、好ましくは３より多く、通常１０より多い。正確なサイズは多くの因子によって決まり、因子はオリゴヌクレオチドの最終機能または用途によって決まる。オリゴヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、またはこれらの組合せを含む任意の方法で生成されてもよい。
【００６６】
本明細書で使用する用語「プライマー」は、オリゴヌクレオチドを指し、核酸鎖（テンプレート）に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下、例えば、ヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼ等の重合用薬剤の存在下に、適切な温度およびｐＨで置かれたとき、合成の開始ポイントとして作用することが可能である。一部の実施形態では、プライマーは一本鎖であり、また、一部の実施形態では、プライマーは部分的にまたは完全に二重鎖である。一部の実施形態では、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。
【００６７】
一部の実施形態では、プライマーは、幾つかの代替立体配座または代替立体状態で存在し、この一部は二重鎖重複領域および／または一本鎖領域を含む。一部の実施形態では、ハイブリッド形成した二重鎖重複領域の一本鎖成分は、分離（「融解」）して一本鎖プライマーを形成する。一部の実施形態では、プライマーは、検出可能標識（例えば、フルオロフォア）を含む。一部の実施形態では、プライマーは、消光状態（例えば、フルオロフォアが、例えば、クエンチャー部分によって、消光されており、プライマーは「消光プライマー」である。）および検出可能（非消光）状態（例えば、フルオロフォアが非消光状態であり、プライマーが「検出可能プライマー」である。）を取ることができ、さらに、一部の実施形態では、プライマーは、消光状態（本明細書で使用する「消光プライマー」）から検出可能状態（本明細書で使用する「検出可能プライマー」）に転換することができ、また、プライマーは、検出可能状態から消光状態に転換することができる。例えば、一部の実施形態では、プライマー集団は、２つの状態（例えば、互いに平衡状態にある、消光状態と検出可能状態）を含む。プライマーの化学的および／または物理的環境の変化は、消光状態のプライマー集団および検出可能状態のプライマー集団が逆になるように、消光状態から検出可能状態への転換および検出可能状態から消光状態への転換の熱力学的現象および／または動態を変更し得る。
【００６８】
プライマーは天然のｄＮＭＰ（例えば、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰ、およびｄＴＭＰ）、修飾ヌクレオチド、または非天然ヌクレオチドを含むことができる。プライマーはリボヌクレオチドも含むことができる。例えば、この技術に使用するプライマーは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｅｇｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６−５６８）、ホスホロチオネートＤＮＡ、ホスホロジチオエートＤＮＡ、ホスホラミデートＤＮＡ、アミド連結ＤＮＡ、ＭＭＩ連結ＤＮＡ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、アルファ−ＤＮＡ、およびメチルホスホネートＤＮＡ等のバックボーン修飾を有するヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、２’−フルオロＲＮＡ、２’−アミノＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキルＤＮＡ、２’−Ｏ−アリルＤＮＡ、２’−Ｏ−アルキニルＤＮＡ、ヘキソースＤＮＡ、ピラノシルＲＮＡ、およびアンヒドロヘキシトールＤＮＡ等の糖修飾を有するヌクレオチド、およびＣ−５置換ピリミジン（フルオロ−、ブロモ−、クロロ−、ヨード−、メチル−、エチル−、ビニル−、ホルミル−、エチニル−、プロピニル−、アルキニル−、チアゾリル−、イミダゾリル−、およびピリジル−を含む置換基）、Ｃ−７置換基（フルオロ−、ブロモ−、クロロ−、ヨード−、メチル−、エチル−、ビニル−、ホルミル−、アルキニル−、アルケニル−、チアゾリル−、イミダゾリル−、およびピリジル−を含む置換基）を有する７−デアザプリン、イノシン、およびジアミノプリン等の塩基修飾を有するヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００６９】
プライマーは、重合のための薬剤の存在下で伸長産物の合成を刺激するのに十分な長さである。プライマーの正確な長さは、プライマーの温度、用途、および供給源を含む多くの因子によって決まることとなる。本明細書で使用する用語「アニーリング」または「プライミング」は、テンプレート核酸に対するオリゴデオキシヌクレオチドまたは核酸の付加を指し、これにより、付加によって、ポリメラーゼが、ヌクレオチドを、テンプレート核酸またはこの一部と相補的な核酸分子に重合することが可能となる。本明細書で使用する用語「ハイブリッド形成」は、相補的一本鎖核酸から二重鎖核酸を形成することを指す。用語「アニーリング」と「ハイブリッド形成」との間に意図された区別はなく、これらの用語は交換可能に使用されることとなる。プライマー配列は、テンプレートとハイブリッド形成することができ、プライマーとして機能することができる限り、一部のミスマッチを含んでもよい。用語「実質的に相補的な」は、アニールされたプライマーが、ポリメラーゼによって伸長されてテンプレートの相補的コピーを形成することができるような、指定のアニーリング条件またはストリンジェントな条件下で、プライマーがテンプレート核酸配列と選択的にハイブリッド形成するのに十分相補的であることを示すために本明細書で使用する。
【００７０】
本明細書で使用する用語「プローブ」は、精製された制限消化物に天然に生じるか、または、合成して、組換えで、もしくはＰＣＲ増幅によって生成され、目的の、別のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリッド形成することができるオリゴヌクレオチド（即ち、ヌクレオチドの配列）を指す。プローブは一本鎖であってもよく、または二重鎖であってもよい。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定、および単離に有用である。
【００７１】
一部の実施形態では、核酸（例えば、プライマーおよびプローブ）は、デオキシイノシン、イノシン、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、２−アザ−２’−デオキシイノシン、２’−Ｏ−Ｍｅイノシン、２’−Ｆイノシン、デオキシ３−ニトロピロール、３−ニトロピロール、２’−Ｏ−Ｍｅ３−ニトロピロール、２’−Ｆ３−ニトロピロール、１−（２’−デオキシ−ベータ−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、デオキシ５−ニトロインドール、５−ニトロインドール、２’−Ｏ−Ｍｅ５−ニトロインドール、２’−Ｆ５−ニトロインドール、デオキシ４−ニトロベンゾイミダゾール、４−ニトロベンゾイミダゾール、デオキシ４−アミノベンゾイミダゾール、４−アミノベンゾイミダゾール、デオキシネブラリン、２’−Ｆネブラリン、２’−Ｆ４−ニトロベンゾイミダゾール、ＰＮＡ−５−イントロインドール（ｉｎｔｒｏｉｎｄｏｌｅ）、ＰＮＡ−ネブラリン、ＰＮＡ−イノシン、ＰＮＡ−４−ニトロベンゾイミダゾール、ＰＮＡ−３−ニトロピロール、モルホリノ−５−ニトロインドール、モルホリノ−ネブラリン、モルホリノ−イノシン、モルホリノ−４−ニトロベンゾイミダゾール、モルホリノ−３−ニトロピロール、ホスホラミデート−５−ニトロインドール、ホスホラミデート−ネブラリン、ホスホラミデート−イノシン、ホスホラミデート−４−ニトロベンゾイミダゾール、ホスホラミデート−３−ニトロピロール、２’−Ｏ−メトキシエチルイノシン、２’−Ｏ−メトキシエチルネブラリン、２’−Ｏ−メトキシエチル５−ニトロインドール、２’−Ｏ−メトキシエチル４−ニトロ−ベンゾイミダゾール、２’−Ｏ−メトキシエチル３−ニトロピロール、およびこれらの組合せ等の、ユニバーサル塩基または修飾塩基を含む。
【００７２】
以下の用語は、２つ以上のポリヌクレオチド間の配列関係を述べるために使用する。即ち、「参照配列」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、および「実質的な同一性」である。「参照配列」は、配列比較のための基準として使用する定義済み配列であり、参照配列は、例えば、配列表に示される完全長のｃＤＮＡ配列のセグメントのように、より大きな配列のサブセットであってもよく、または、完全な遺伝子配列を含んでもよい。通常、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチド長であり、しばしば、少なくとも２５ヌクレオチド長であり、多くの場合、少なくとも５０ヌクレオチド長である。２つのポリヌクレオチドは、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似している配列（即ち、完全なポリヌクレオチド配列の一部）をそれぞれ含んでいてもよく、また、（２）２つのポリヌクレオチド間で異なる配列をさらに含んでいてもよいので、２つ（以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的に、「比較ウインドウ」で、２つのポリヌクレオチドの配列比較によって実施し、配列類似性の局部領域を同定し、比較する。本明細書で使用する「比較ウインドウ」は、少なくとも２０の連続ヌクレオチドの位置の概念セグメントを指し、ポリヌクレオチド配列は、少なくとも２０の連続ヌクレオチドの参照配列と比較されてもよく、また、比較ウインドウのポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適アライメントのための参照配列（付加または欠失を含まない。）と比較して、２０パーセント以下の付加または欠失（即ち、ギャップ）を含んでいてもよい。比較ウインドウをアラインするための配列の最適アライメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ［Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）］の局地的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ［Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）］の相同性アライメントのアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ［Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４（１９８８）］の類似法のための検索によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）をコンピューターによって実行しても、または検査によって行ってもよく、様々な方法によって生成された最も良好なアライメント（即ち、比較ウインドウで相同性のパーセンテージが最も高い結果になる。）を選択する。用語「配列同一性」は、比較ウインドウで、２つのポリヌクレオチド配列が同一である（即ち、ヌクレオチドごとの単位で）ことを意味する。用語「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウインドウに最適にアラインした２つの配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両方の配列に生じる位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較ウインドウ中（即ち、ウインドウサイズ）の位置の総数で除し、およびこの結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算する。本明細書で使用する用語「実質的同一性」は、ポリヌクレオチド配列の特性を表し、この特性において、ポリヌクレオチドは、少なくとも２０ヌクレオチド位置、しばしば少なくとも２５から５０ヌクレオチド位置の比較ウインドウの参照配列と比較して、少なくとも８５パーセントの配列同一性、好ましくは、少なくとも９０から９５パーセントの配列同一性、より一般的には、少なくとも９９パーセントの配列同一性を有する配列を含み、この配列において、配列同一性のパーセンテージは、比較ウインドウの参照配列の全部で２０パーセント以下の欠失または付加を含み得るポリヌクレオチド配列と参照配列を比較することによって計算する。参照配列は、例えば、本発明で特許請求する組成物の完全長配列のセグメントのように、より大きな配列のサブセットであってもよい。
【００７３】
用語「実質的に相同な」は、ｃＤＮＡまたはゲノミッククローン等の二重鎖核酸配列に関して使用する場合、上述のように低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーの条件下で、二重鎖核酸配列のどちらか、または両方の鎖とハイブリッド形成することができる任意のプローブを指す。
【００７４】
用語「実質的に相同な」は、一本鎖核酸配列に関して使用する場合、上述のように低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーの条件下で、一本鎖核酸配列をハイブリッド形成することができる（つまり、一本鎖核酸配列の相補体である。）任意のプローブを指す。
【００７５】
本明細書で使用する用語「相補的な」または「相補性」は、塩基対合則によって関連づけられたポリヌクレオチド（例えば、ヌクレオチドの配列）に関して使用する。例えば、配列５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’は、配列３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’と相補的である。相補性は、「部分的」であってもよく、部分的である場合、核酸塩基の一部のみが、塩基対合則に従って一致している。または、核酸間に「完全」または「全」相補性があってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強さに重大な影響を有する。これは、ハイブリダイゼーションに依存する検査法だけでなく、増幅反応においても極めて重要である。本明細書で使用する、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、または核酸の「相補体」は、塩基対合則により、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、または核酸と完全にまたは部分的に相補的であるオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、または核酸を指す。
【００７６】
本明細書で使用する用語「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリッド形成する」は、相補的な核酸の対合に関して使用する。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強さ（例えば、核酸間の関連性の強さ）は、核酸間の相補の程度、関連する条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）、および核酸内のＧ：Ｃ比率のような因子によって影響を受ける。自身の構造内に相補的核酸の対合を含む単一分子は、「自己ハイブリッド形成している」と言う。核酸ハイブリダイゼーションに対する広範囲にわたる手引きは、参照により組み込まれるＴｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，ｐａｒｔ  Ｉ，ｃｈａｐｔｅｒ  ２，「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９９３）に見られ得る。
【００７７】
生体高分子（例えば、核酸）の「配列」は、生体高分子のモノマー単位（例えば、ヌクレオチド等）の順序および同一性を指す。核酸の配列（例えば、塩基配列）は、典型的に、５’から３’方向に読み取られる。
【００７８】
用語「検出する」、「検出すること」、または「検出」は、サンプル中の１つ以上の標的（例えば、核酸、アンプリコン等）の存在（ｅｘｉｓｔｅｎｃｅまたはｐｒｅｓｅｎｃｅ）を決定する行為を指す。
【００７９】
用語「野生型」は、遺伝子に関して使用した場合、天然の供給源から単離された遺伝子の特徴を有する遺伝子を指す。用語「野生型」は、遺伝子産物に関して使用した場合、天然の供給源から単離された遺伝子産物の特徴を有する遺伝子産物を指す。用語「天然の」は、物に適用される場合、物が自然界に見られることができるという事実を指す。例えば、自然界にある供給源から単離することができ、および実験室で人によって意図的に修飾されていない生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列は、天然である。野生型遺伝子は、集団において最も頻繁に観察され、従って「通常の」または「野生型の」遺伝子形態と恣意的に称される遺伝子であることが多い。対照的に、用語「修飾された」または「変異の」は、遺伝子または遺伝子産物に関して使用した場合、野生型遺伝子または野生型遺伝子産物と比較した場合、配列および／または機能特性の修飾（即ち、変更された特徴）を表す遺伝子または遺伝子産物をそれぞれ指す。天然の変異体は単離することができるということに留意されたい。また、天然の変異体は、野生型遺伝子または野生型遺伝子産物と比較した場合、変更された特徴を有しているという事実によって同定する。
【００８０】
本明細書で使用する核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）の「増幅」は、核酸配列の混合物内の特定の核酸配列の濃度を増加することを指す。「アンプリコン」は、増幅される標的核酸配列である。一部の実施形態では、増幅は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法に従って実施する。プライマーアニーリング、プライマー伸長、および変性によってＤＮＡ分子を増幅させるための工程は、当業者に周知である。適切なアニーリングまたはハイブリダイゼーション条件は日常的に決定する。温度、成分濃度、ハイブリダイゼーションおよび洗浄時間、緩衝液成分、ならびにこれらのｐＨおよびイオン強度等の条件は、プライマーおよび標的ヌクレオチド配列の、長さおよびＧＣ含量を含む様々な因子により変動する。ハイブリダイゼーションのための詳細な条件は、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）およびＭ．Ｌ．Ｍ．  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９９）に見られ得る。一部の実施形態では、シグナルを、ＰＣＲ（例えば、「リアルタイムＰＣＲ」）の間に連続的または多重の離散時間点で監視し、また、一部の実施形態では、ＰＣＲが完了した後（「エンドポイントＰＣＲ」ということもある。）、シグナルを監視する。リアルタイムＰＣＲ用のデータは、ＰＣＲサイクルの関数として蛍光レポーター部分の監視強度としてしばしば報告されている。
【００８１】
ｍＲＮＡを出発物質として用いる場合、逆転写ステップは、アニーリングステップを実施する前に有用であり、逆転写ステップの詳細は、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）およびＮｏｏｎａｎ，Ｋ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０３６６）に見られる。逆転写については、ｍＲＮＡのポリＡテイルとハイブリッド形成可能なオリゴヌクレオチドｄＴプライマーが、しばしば使用される。オリゴヌクレオチドｄＴプライマーは、ｄＴＭＰを含み、ｄＴプライマーがプライマーとして機能することができる限り、ｄＴＭＰの１つ以上が他のｄＮＭＰと置き換わっていてもよい。逆転写は、ＲＮＡ分解酵素Ｈ活性を有する逆転写酵素を用いて実施される。ＲＮＡ分解酵素Ｈ活性を有する酵素を使用する場合、個別のＲＮＡ分解酵素Ｈ消化ステップは、反応条件を慎重に選択することにより省かれることが多い。
【００８２】
様々なＤＮＡポリメラーゼを、本方法の伸長ステップで使用することができ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの「クレノウ」断片、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、およびバクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼを含む。好ましくは、ポリメラーゼは、様々なバクテリア種から得られる、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｉｓ  ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｅｒａｌｉｓ、およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）等の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。重合反応が行われているとき、一部の実施形態は、反応槽でのこのような超過量の反応に必要な成分を提供する。伸長反応の成分に関する超過量は、この成分の濃度によって、所望の伸長を達成する能力が実質的に制限されないような、それぞれの成分の量を指す。必要な量のＭｇ２＋、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ等の補助因子を、所望の伸長の程度を維持するのに十分な量で、反応混合物に供給することが望ましい。
【００８３】
用語「サンプル」は、サンプルの最も広い意味で使用する。１つの意味では、動物細胞または組織を指すことができる。別の意味では、生物サンプルおよび環境サンプルだけでなく、任意の供給源から得た検体または培養物を含むことを意味する。生体サンプルは、植物または動物（ヒトを含む）から得てもよく、流体、固体、組織、および気体を包含してもよい。環境サンプルは、表面物質、土壤、水、および産業サンプル等の環境材料を含む。これらの標本は、本発明に適用可能なサンプルタイプを制限するものとして解釈されるべきではない。任意の核酸サンプルを、本技術の実行に使用されてもよく、真核、原核、およびウイルス核酸を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、標的核酸は、患者から単離したゲノムＤＮＡのサンプルを表す。このＤＮＡは、任意の細胞供給源または体液から得てもよい。診療に利用可能な細胞供給源の非限定的例には、血球、バッカル細胞、頚膣部細胞、尿由来上皮細胞、胎児細胞、または生検によって得た組織中に存在する任意の細胞が挙げられる。体液には、感染または炎症部位の血液、尿、脳脊髄液、精液、組織滲出液が挙げられる。核酸は、当技術分野に標準的な多数の方法のいずれかを使用して、細胞供給源または体液から抽出される。核酸を抽出するために使用する特定の方法は供給源の性質に依存することが理解されよう。
【００８４】
本明細書で使用する「多重の」は、単一サンプル中の多重核酸標的を同時に検出または同定することを指す。
【００８５】
実施形態
本明細書における開示は、ある種の例証された実施形態を参照するが、これらの実施形態は例示として示されており、限定として示されているのではないことが理解されるべきである。
【００８６】
多重対立遺伝子特異的プライミング検出（Ｍａｓｐ）
Ｍａｓｐ技術は、以下の基本概念と関連している（図１参照）。各対立遺伝子特異的プライマーは、プライマーに特異的な固有のフルオロフォアを含む。標的の非存在下では、プライマー上のフルオロフォアは、遊離プライマーによって形成されたステムループ構造または部分的な二重鎖構造のために、クエンチャーによって消光される（例えば、あらゆる目的でこの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｕａｎｇ（２００７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３５：ｅ１０１を参照のこと）。標的の存在下では、プライマーは標的と結合して伸長され、この結果、クエンチャーからのフルオロフォアの分離、および蛍光シグナルの産出をもたらす。
【００８７】
一部の手法では、対立遺伝子特異的プライマー部分は、標的配列に相補的ではない。例えば、対立遺伝子特異的プライマーは、テイル領域等の非相補的領域を有していてもよく、または、ステムループプライマーは、例えば、ループ領域において、標的と非相補的であってもよい。または、プライマーの二重鎖重複領域は、テンプレート中の標的配列またはテンプレート中の標的配列の相補配列と完全にまたは部分的に非相補的であってもよい。これらのタイプのプライマーに関連した一部の実施形態では、クエンチャーからのフルオロフォアの分離は、ハイブリダイゼーションの結果ではなく、クエンチャーからのフルオロフォアの分離は、プライマーを介して標的領域の反対側に逆プライマーが伸長することに起因する。対立遺伝子特異的標識プライマーが伸長された後、逆プライマーは、対立遺伝子特異的標識プライマーの伸長によって生成されたテンプレート上に伸長される。この伸長は、プライマーに相補的な鎖の合成をもたらし、およびこの際、ポリメラーゼが二重鎖重複領域を通って移動するとき、クエンチャーからフルオロフォアを分離する（例えば、重複は融解される。）。従って、二重鎖直鎖状プライマーデザインの場合には、クエンチングオリゴヌクレオチドを置換し、または、一本鎖ステムループデザインの場合には、伸長される配列とループ配列とのハイブリダイゼーションによって、フルオロフォア標識からクエンチャー標識を分離させるのは、逆プライマーから伸長される鎖である。従って、一部の実施形態では、フルオロフォアとクエンチャーの分離は、ハイブリダイゼーションと伸長の組合せによって生じる。
【００８８】
ステムループプライマーおよび部分的二重鎖プライマー構造のデザインは、伸長プライマーと非伸長プライマーとの間のシグナルを識別し、非特異的プライミングを最小限にするかまたは除去することに備えている。本技術は、当業者の通常の技術範囲内であるアッセイデザインにおいて、適切な変更を用いた逆プライマーに適用可能であるのと同様に、フォワードプライマーにも適用可能である。このため、「プライマー」、「対立遺伝子特異的プライマー」、および／または「フォワードプライマー」に関連した用語および概念は、逆プライマーに適用可能である。本技術に基づいたアッセイは、一部の実施形態ではリアルタイムＰＣＲアッセイにおいて実行され、また、一部の実施形態では、エンドポイントＰＣＲアッセイにおいて実行される。
【００８９】
ＦＲＥＴ媒介多重対立遺伝子特異的プライミング検出（Ｆ−Ｍａｓｐ）
Ｆ−Ｍａｓｐ技術は、以下の基本概念（図２）と関連している。各対立遺伝子特異的プライマーは、プライマーに特異的な固有のＦＲＥＴアクセプターフルオロフォアを含む。標的の非存在下では、プライミングは生じず、またＦＲＥＴアクセプターは蛍光を発しない。さらに、増幅がないためアンプリコンが生成されていないので、ＦＲＥＴドナープローブは、アンプリコンに結合しない。一部の実施形態では、プローブ上のドナーフルオロフォアは、遊離したプローブによって形成されたステムループ構造または部分的二重鎖構造のためにクエンチャーによって消光される（例えば、あらゆる目的でこの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｕａｎｇ（２００７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３５：ｅ１０１を参照のこと）。または、プローブは、ドナーフルオロフォアを含む一本鎖プローブである（例えば、クエンチャーを含まない。）。このような実施形態では、励起エネルギーがフルオロフォアを励起していないとき、フルオロフォアは基底状態である（例えば、フルオロフォアは適切な励起波長の光源、干渉（例えば、レーザー）源等によって励起されていない。）。
【００９０】
標的の存在下で、プライマーはハイブリッド形成し、伸長され、また、プローブは、プライマーを含む伸長鎖と結合する。結合の結果、ドナーとアクセプターとが引き合わされて（例えば、ＦＲＥＴ結合に必要な距離内に）、ＦＲＥＴが、プローブ上のドナーとプライマー上のアクセプターとの間に生じ、およびアクセプターは、蛍光を発してシグナルを生成することとなる。本技術は、当業者の通常の技術範囲内であるアッセイデザインにおいて、適切な変更を用いた逆プライマーに適用可能であるのと同様に、フォワードプライマーにも適用可能である。この技術に基づいたアッセイは、一部の実施形態ではリアルタイムＰＣＲアッセイにおいて実行され、また、一部の実施形態では、エンドポイントＰＣＲアッセイにおいて実行される。さらに、実施形態は、ＦＲＥＴ対のドナーとアクセプターとが交換される（例えば、ドナーフルオロフォアがプライマー上に存在し、またアクセプターフルオロフォアがプローブ上に存在するような）技術と同等の技術も提供する。
【００９１】
対立遺伝子特異的ＰＣＲマーカー
「対立遺伝子特異的ＰＣＲ」は、ヌクレオチドが１つ以上異なる対立遺伝子を、増幅産物に基づいて識別することができるＰＣＲの一用途である（Ｕｇｏｚｚｏｌｉ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：４２−４８）。本技術は、１つの対立遺伝子（標的対立遺伝子）が別の対立遺伝子（非標的対立遺伝子）よりも優先的に増幅できるようにする特異的ミスマッチを、３’末端またはこの近傍に有するプライマーを利用する（Ｕｇｏｚｚｏｌｉ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，ｓｕｐｒａ；Ｃｈａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ２：１４−２０）。この工程は、例えば、連鎖地図構築のための、一塩基多型（ＳＮＰ）に基づいたマーカーを生成する可能性を提供し、および全部がこれらのマーカーからなる稠密マップを構築するための優れたオプションを意味する。対立遺伝子特異的ＰＣＲは、様々な遺伝性疾患に関連した点変異を検出しようとする試み（Ｕｇｏｚｚｏｌｉ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，ｓｕｐｒａ；Ｗｅｎｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：２４１−２４４；Ｃｈａｎｇ（１９９７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２：５２０−５２７）を含む、１つ以上の変異ヌクレオチド配列の有無を増幅によって検出しようとする試み（例えば、欧州特許出願第８９３０２３３１．７号、同公開第０３３２４３５号参照）において、すでに使用されている。
【００９２】
ステムループプライマー
本技術の一部の実施形態は、対立遺伝子特異的ステムループプライマーを使用する。ステムループプライマーは、フルオロフォアをこの一末端またはこの近傍に、およびクエンチャーをもう一つの末端またはこの近傍に含むオリゴヌクレオチドである（例えば、フルオロフォアが、オリゴヌクレオチドの５’末端またはこの近傍にあり、およびクエンチャーが、オリゴヌクレオチドの３’末端、またはこの近傍にあるか、またはクエンチャーがオリゴヌクレオチドの５’末端またはこの近傍にあり、およびクエンチャーがオリゴヌクレオチドの３’末端またはこの近傍にある。）。ステムループ構造が形成されていて、およびプライマーが標的と結合しないときフルオロフォアが消光されるように、ならびにポリメラーゼによってプライマーが伸長する（例えば、ＰＣＲにおける）ためのプライミングサイト（例えば、３’ヒドロキシル）を３’末端が提供するように、３’末端のクエンチャーまたはフルオロフォアは、ヌクレオチドの１つに結合する。本明細書に提供されたステムループプライマーは標的部位に結合し、プライミングサイトを提供するが、プローブはプライミングサイトを提供せずに標的に結合するようにデザインされているという点で、本ステムループプライマー技術は、分子ビーコンなどのステムループプローブとは異なる。一部の概念は類似しているが、核酸合成のプライミングにおけるステムループプライマーの機能は、ステムループプローブとは異なる（例えば、３’部分（フルオロフォアまたはクエンチャー）の位置等）ステムループプライマーの特徴と関連している。
【００９３】
一部の実施形態では、ステムループプライマーは、変異（例えば、ＳＮＰ、挿入、欠失、塩基変更等）または野生型配列等の、検出したい配列を含む標的配列に相補的である。
【００９４】
例えば、一部の実施形態では、ステムループプライマーは、約１８から５０長のヌクレオチドであり、３つの領域を含む。即ち、約４から１０ヌクレオチドの５’ステム形成領域、１０から３０ヌクレオチドを含む中央ループ領域、および約４から１０ヌクレオチドを含む、３’ステム形成領域である。ループ領域は、標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡと相補的な配列を含み、ループ領域自体とまたはステムループプライマーの他の領域と対をなさず、５’ステム形成領域の配列と３’ステム形成領域の配列とは、互いに相補的であり、プライマーが標的核酸と結合しないとき、二重鎖「ステム」構造を形成する。
【００９５】
３’ステム形成領域および５’ステム形成領域は、本技術の様々な実施形態で、標的配列との相補性の程度が様々である（例えば、３’ステム形成領域および／または５’ステム形成領域は、標的配列と相補性を有していない、３’ステム形成領域および／または５’ステム形成領域は、標的配列と完全な相補性を有している、３’ステム形成領域および／または５’ステム形成領域は、標的配列と中位の相補性を有している、例えば、３’ステム形成領域および／または５’ステム形成領域は、標的配列と比較して、１つ以上のミスマッチまたはギャップ（例えば、挿入または欠失（例えば、バルジを形成する）、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つのミスマッチを有しているか、または、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の標的配列相補性を有している。）。
【００９６】
３’ステム形成領域および５’ステム形成領域は、標的配列と同程度の相補性を有する必要はないが、標的配列と同程度の相補性を有していてもよい。このため、一部の実施形態では、３’ステム形成領域および５’ステム形成領域は、標的配列と同程度の相補性を有し、また、一部の実施形態では、３’ステム形成領域および５’ステム形成領域は、標的配列と程度が異なる相補性を有する。さらに、５’ステム形成領域および３’ステム形成領域は、本技術に適切である任意の程度の相補性を有していてもよい（例えば、５’ステム形成領域の配列と３’ステム形成領域の配列とが、互いに完全に相補的であるか、または互いに比較して１つ以上のミスマッチもしくはギャップ（例えば、挿入または欠失（例えば、バルジを形成する））を含む。）。ステム重複は、完全に相補的な５’ステム形成領域および３’ステム形成領域、または１つ以上のミスマッチもしくはギャップを有する５’ステム形成領域および３’ステム形成領域からできていてもよい。
【００９７】
ステムループプライマーの一末端（例えば、５’末端または３’末端）で、蛍光色素が共有結合する。もう１つの末端（例えば、３’端または５’端）では、非蛍光性クエンチャー色素が共有結合する。ステムループプライマーが閉ループ立体配座にあるとき、クエンチャーはフルオロフォアの近傍にあり、クエンチャーは、蛍光発光が監視されている１つ以上の波長のフルオロフォアの蛍光発光を消光する（例えば、極小化し、減少させ、および／または除去する。）。
【００９８】
検出したい核酸とステムループプライマーとのハイブリダイゼーションをもたらすために、検出したい核酸がステムループプライマーの配列と十分に相補的である場合、ステムループプライマーは、直線化し（例えば、閉ループ立体配座から開裂し）、標的配列とハイブリッド形成する。例えば、一部の実施形態では、標的核酸で形成された重複はより熱力学的に安定しているので、例えば、標的核酸で形成された重複はより多くの塩基対を含んでいるので、標的核酸と直線化されたステムループプライマーとの間に形成された二重鎖は、ステムの３’ステム形成領域と５’ステム形成領域とによって形成されたステム重複よりも安定している。この直鎖状立体配座では、フルオロフォアとクエンチャーとが分離されており、プライマーは、適切な反応条件下でポリメラーゼによって伸長することができる状態である。フルオロフォアがクエンチャーから分離されるとき、フルオロフォアは蛍光を発し、問い合わせを受けると（例えば、励起波長で光子を吸収し、１つ以上の監視発光波長で光子を発すると）シグナルを生成する。発光はハイブリダイゼーションと関連しており、従って試験サンプル中の標的核酸の存在を知らせる。一部の実施形態では、蛍光は、この方法によって生成された蛍光標識アンプリコ中で特異的に検出され、また、一部の実施形態では、サンプルの共通蛍光が、検出される。
【００９９】
２つ以上の標的核酸（例えば、２つ以上の対立遺伝子、ＳＮＰ等）を検出するために、本技術を多重アッセイに使用するとき、２つ以上の対立遺伝子特異的ステムループプライマーを使用する。２つ以上の対立遺伝子特異的ステムループプライマーは、２つ以上の異なる（例えば、異なる発光スペクトルにより、および／または２つの波長で発光を監視することにより検出可能である）フルオロフォアを含み、および２つ以上の標的核酸に特異的（例えば、相補的）配列を含む。２つ以上の対立遺伝子特異的ステムループプライマーは、同一のクエンチャーを含んでいてもよいし、または異なるクエンチャーを含んでいてもよい。２つ以上の対立遺伝子特異的ステムループプライマーは、同一の相補的３’および５’ステム形成領域を含んでいてもよいし、または異なる相補的３’および５’ステム形成領域を含んでいてもよい。一部の実施形態では、各対立遺伝子特異的ステムループプライマーは、異なる標的核酸に特異的であり、また、一部の実施形態では、各対立遺伝子特異的ステムループプライマーは、標的核酸の異なる群（例えば、２つ以上の標的核酸を含む群）に特異的である。例証となる非限定的例示として、一部の実施形態では、４つの異なる対立遺伝子Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤが４つの異なる対立遺伝子特異的ステムループプライマーによって検出されてもよく、または、一部の実施形態では、対立遺伝子ＡおよびＢが１つの対立遺伝子特異的ステムループプライマーによって検出されてもよく、ならびに、対立遺伝子ＣおよびＤが別の対立遺伝子特異的ステムループプライマーによって検出されてもよい。
【０１００】
二重鎖直鎖状プライマー
本技術の一部の実施形態は、対立遺伝子特異的二重鎖直鎖状プライマーを使用する。対立遺伝子特異的二重鎖直鎖状プライマーは、２つの鎖を含む。即ち、対立遺伝子特異的（一本鎖）プライマーおよび相補的クエンチングオリゴヌクレオチドである。対立遺伝子特異的プライマーは、従来のプライマーに類似した長さ（例えば、１５から５０ヌクレオチド）を有し、共有結合で連結したフルオロフォアを含む。フルオロフォアは、対立遺伝子特異的プライマーの任意のヌクレオチドに共有結合で連結されるが、典型的に、対立遺伝子特異的プライマーの５’末端、またはこの近傍にある。クエンチングオリゴヌクレオチドは、典型的に、対立遺伝子特異的プライマー（例えば、１０から２０ヌクレオチド）より短いが、より長くてもよい（例えば、対立遺伝子特異的プライマーと同じか、またはこれより長い長さを含む、２０ヌクレオチド以上）。クエンチングオリゴヌクレオチドは、共有結合で連結したクエンチャーを含む。クエンチャーは、クエンチャーオリゴヌクレオチドの任意のヌクレオチドに共有結合で連結されるが、典型的に、クエンチャーオリゴヌクレオチドの３’末端、またはこの近傍にある。重複が対立遺伝子特異的プライマーおよびクエンチャーオリゴヌクレオチドによって形成されるとき、クエンチャーはフルオロフォアの近傍にあり、クエンチャーは、蛍光発光が監視されている１つ以上の波長のフルオロフォアの蛍光発光を消光する（例えば、極小化し、減少させ、および／または除去する。）。
【０１０１】
重複は、対立遺伝子特異的プライマーおよびクエンチャーオリゴヌクレオチドの短い方の長さまでの、任意の長さであってもよい。対立遺伝子特異的プライマーおよびクエンチャーオリゴヌクレオチドは、本技術に適切である任意の程度の相補性を有していてもよい（例えば、対立遺伝子特異的プライマー配列およびクエンチャーオリゴヌクレオチド配列が、互いに完全に相補的であるか、または互いと比較して１つ以上のミスマッチもしくはギャップ（例えば、挿入または欠失（例えば、バルジを形成する））を含む。）。重複は、完全に相補的な対立遺伝子特異的プライマーおよびクエンチャーオリゴヌクレオチド、または１つ以上のミスマッチもしくはギャップを有する対立遺伝子特異的プライマーおよびクエンチャーオリゴヌクレオチドからできていてもよい。
【０１０２】
一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーは、標的に相補的でない、および／またはクエンチャーオリゴヌクレオチドに相補的でないテイル領域を含む。一部の実施形態では、クエンチャーオリゴヌクレオチドは、標的に相補的でない、および／または対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドに相補的でないテイル領域を含む。例えば、一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーとクエンチャーオリゴヌクレオチドとの間の相補性の程度、ならびに／または対立遺伝子特異的プライマーと標的との間の相補性の程度は、対応する二重鎖重複領域と、対立遺伝子特異的プライマーと標的とによって形成されたハイブリッドの融解温度、ならびに／または対応する二重鎖重複領域と、対立遺伝子特異的プライマーと標的とによって形成されたハイブリッドの対応する融解温度を調節するようにデザインされている。
【０１０３】
対立遺伝子特異的プライマーは、本技術の様々な実施形態において、標的配列との相補性の程度は様々である（例えば、対立遺伝子特異的プライマーが、標的配列と完全な相補性を有しているか、または標的配列と比較して１つ以上のミスマッチまたはギャップ（例えば、挿入または欠失（例えば、バルジを形成する））を有する。）。標的核酸（例えば、ＳＮＰ等の対立遺伝子の特異的検出のための一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーは、標的核酸と完全に相補的である。）。
【０１０４】
蛍光色素は、対立遺伝子特異的プライマーに共有結合する。非蛍光性クエンチャー色素は、クエンチャーオリゴヌクレオチドに共有結合する。対立遺伝子特異的プライマーとクエンチャーオリゴヌクレオチドとが重複を形成するとき（例えば、標的の非存在下で）、クエンチャーはフルオロフォアの近傍にあり、クエンチャーは、蛍光発光が監視されている１つ以上の波長のフルオロフォアの蛍光発光を消光する（例えば、極小化し、減少させ、および／または除去する。）。
【０１０５】
検出したい核酸と対立遺伝子特異的プライマーとのハイブリダイゼーションをもたらすために、検出したい核酸（例えば、標的核酸）が対立遺伝子特異的プライマーの配列と十分に相補的な場合、対立遺伝子特異的プライマーはクエンチャーオリゴヌクレオチドから分離し（例えば、対立遺伝子特異的プライマーとクエンチャーオリゴヌクレオチドとから形成された重複が融解し）、対立遺伝子特異的プライマーは標的配列とハイブリッド形成する。例えば、一部の実施形態では、標的核酸で形成された重複はより熱力学的に安定しているので、例えば、標的核酸で形成された重複はより多くの塩基対を含んでいるので、標的核酸と対立遺伝子特異的プライマーとの間に形成された重複は、対立遺伝子特異的プライマーおよびクエンチャーオリゴヌクレオチドから形成された重複より安定している。この立体配座では、フルオロフォアとクエンチャーとが分離されており、対立遺伝子特異的プライマーは、適切な反応条件下でポリメラーゼによって伸長することができる状態にある。
【０１０６】
一部の手法では、対立遺伝子特異的プライマー部分は、標的配列に相補的ではない。例えば、対立遺伝子特異的プライマーは、テイル領域等の非相補的領域を含んでいてもよい。または、プライマーの二重鎖重複領域は、テンプレート中の標的配列またはテンプレート中の標的配列の相補配列と完全にまたは部分的に非相補的であってもよい。これらのタイプのプライマーに関連した一部の実施形態では、クエンチャーからのフルオロフォアの分離は、ハイブリダイゼーションの結果ではなく、クエンチャーからのフルオロフォアの分離は、組み込まれたプライマーを介して標的領域の反対側に逆プライマーが伸長することに起因する。対立遺伝子特異的標識プライマーが伸長した後、逆プライマーは、対立遺伝子特異的標識プライマーの伸長によって生成したテンプレート上に伸長する。この伸長は、プライマーに相補的な鎖を合成することとなり、この際、ポリメラーゼが二重鎖重複領域を通って移動するとき、ポリメラーゼはクエンチャーからフルオロフォアを分離する（例えば、重複は融解される。）。従って、二重鎖直鎖状プライマーのクエンチングオリゴヌクレオチドを置換するのは、逆プライマーから伸長される鎖である。従って、一部の実施形態では、フルオロフォアとクエンチャーとの分離は、ハイブリダイゼーションと伸長との組合せに起因する。
【０１０７】
フルオロフォアがクエンチャーから分離されるとき、フルオロフォアは蛍光を発し、問い合わせを受けると（例えば、励起波長で光子を吸収し、１つ以上の監視発光波長で光子を発すると）シグナルを生成する。発光はハイブリダイゼーションと関連しており、従って試験サンプル中の標的核酸の存在を知らせる。一部の実施形態では、蛍光は、この方法によって生成された蛍光標識アンプリコン中で特異的に検出され、また、一部の実施形態では、サンプルの共通蛍光が、検出される。
【０１０８】
２つ以上の標的核酸（例えば、２つ以上の対立遺伝子、ＳＮＰ等）を検出するために、本技術を多重アッセイに使用するとき、２つ以上の対立遺伝子特異的二重鎖直鎖状プライマーを使用する。２つ以上の対立遺伝子特異的二重鎖直鎖状プライマーは、２つ以上の異なる（例えば、異なる発光スペクトルにより、および／または２つの波長で発光を監視することにより検出可能である）フルオロフォアを含み、および２つ以上の標的核酸に特異的（例えば、相補的）配列を含む。２つ以上の対立遺伝子特異的二重鎖直鎖状プライマーは、同一のクエンチャーを含んでいてもよいし、または異なるクエンチャーを含んでいてもよい。２つ以上の対立遺伝子特異的二重鎖直鎖状プライマーは、同一の相補的な二重鎖形成領域を含んでいてもよく、または、異なる相補的な二重鎖形成領域を含んでもよい。一部の実施形態では、各対立遺伝子特異的二重鎖直鎖状プライマーは、異なる標的核酸に特異的であり、また、一部の実施形態では、各対立遺伝子特異的二重鎖直鎖状プライマーは、標的核酸の異なる群（例えば、２つ以上の標的核酸を含む群）に特異的である。例証となる非限定的例示として、一部の実施形態において、４つの異なる対立遺伝子Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤが４つの異なる対立遺伝子特異的二重鎖直鎖状プライマーによって検出されてもよく、または、一部の実施形態では、対立遺伝子ＡおよびＢが１つの対立遺伝子特異的二重鎖直鎖状プライマーによって検出されてもよく、ならびに対立遺伝子ＣおよびＤが別の対立遺伝子特異的二重鎖直鎖状プライマーによって検出されてもよい。
【０１０９】
Ｆ−Ｍａｓｐ
一部の実施形態、例えば、ＦＲＥＴ媒介多重対立遺伝子特異的プライミング検出（Ｆ−Ｍａｓｐ）では、対立遺伝子特異的プライマーおよび二重鎖プローブを使用する。一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーおよび一本鎖プローブを使用する。対立遺伝子特異的プライマーは、蛍光標識（例えば、アクセプターフルオロフォア）を含む。標識は、対立遺伝子特異的プライマーに共有結合で結合される。標識は、対立遺伝子特異的プライマーの任意のヌクレオチドに連結し、典型的に、対立遺伝子特異的プライマーの３’末端近傍にある。
【０１１０】
対立遺伝子特異的プライマーは、従来のプライマーに類似した長さ（例えば、１５から５０ヌクレオチド）を有しており、共有結合で連結したフルオロフォアを含む。フルオロフォアは、対立遺伝子特異的プライマーの任意のヌクレオチドに共有結合で連結されるが、典型的に、対立遺伝子特異的プライマーの３’末端、またはこの近傍にある。対立遺伝子特異的プライマーは、本技術の様々な実施形態において、標的配列との相補性の程度は様々である（例えば、対立遺伝子特異的プライマーが、標的配列と完全な相補性を有しているか、または標的配列と比較して１つ以上のミスマッチまたはギャップ（例えば、挿入または欠失（例えば、バルジを形成する））を有する。）。標的核酸（例えば、ＳＮＰ等の対立遺伝子）の特異的検出のための一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーは、標的核酸と完全に相補的である。
【０１１１】
一本鎖プローブは、プローブ鎖を１つ含む。プローブ鎖は、従来のプローブ（例えば、１５から１００以上のヌクレオチド）に類似した長さを有しており、共有結合で連結したフルオロフォア（例えば、ドナーフルオロフォア）を含む。フルオロフォアは、プローブ鎖の任意のヌクレオチドに共有結合で連結されるが、典型的に、プローブ鎖の３’末端またはこの近傍にある。このような実施形態では、励起エネルギーがフルオロフォアを励起していないとき、フルオロフォアおよび／またはプローブは、「基底」状態にある（例えば、フルオロフォアは、適切な励起波長の光源、干渉（例えば、レーザー）源等によって励起されていない。）。この状態では、フルオロフォアもＦＲＥＴ対のアクセプターにエネルギーを移動せず、従って、シグナルは検出されない。
【０１１２】
二重鎖プローブは、鎖を２つ含む。即ち、プローブ鎖および相補的クエンチングオリゴヌクレオチドである（例えば、あらゆる目的でこの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｕａｎｇ（２００７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３５：ｅ１０１を参照のこと）。プローブ鎖は、従来のプローブに類似した長さ（例えば、１５から１００以上のヌクレオチド）を有しており、および共有結合で連結したフルオロフォア（例えば、ドナーフルオロフォア）を含む。フルオロフォアは、プローブ鎖の任意のヌクレオチドに共有結合で連結されるが、典型的に、プローブ鎖の３’末端またはこの近傍にある。クエンチングオリゴヌクレオチドは典型的に、プローブ鎖より短い（例えば、１０から２０ヌクレオチド）が、プローブ鎖より長くてもよい（例えば、プローブ鎖と同じかまたはプローブ鎖より長い長さを含む、２０ヌクレオチド以上）。クエンチングオリゴヌクレオチドは、共有結合で連結したクエンチャーを含む。クエンチャーは、クエンチャーオリゴヌクレオチドの任意のヌクレオチドに共有結合で連結されるが、典型的に、クエンチャーオリゴヌクレオチドの３’末端またはこの近傍にある。重複がプローブ鎖およびクエンチャーオリゴヌクレオチドによって形成されるとき、クエンチャーはフルオロフォアの近傍にあり、クエンチャーは、フルオロフォアが発光する１つ以上の波長で、フルオロフォアの蛍光発光を消光する（例えば、極小化し、減少させ、および／または除去する。）。
【０１１３】
重複は、プローブ鎖およびクエンチャーオリゴヌクレオチドの短い方の長さまでの、任意の長さであってもよい。プローブ鎖およびクエンチャーオリゴヌクレオチドは、本技術に適切である任意の程度の相補性を有していてもよい（例えば、プローブ鎖の配列とクエンチャーオリゴヌクレオチドの配列とが、互いに完全に相補的であるか、または互いと比較して１つ以上のミスマッチもしくはギャップ（例えば、挿入または欠失（例えば、バルジを形成する））を含む。）。重複は、完全に相補的なプローブ鎖およびクエンチャーオリゴヌクレオチド、または１つ以上のミスマッチもしくはギャップを有するプローブ鎖およびクエンチャーオリゴヌクレオチドからできていてもよい。
【０１１４】
プローブ鎖は、本技術の様々な実施形態において、標的配列との相補性の程度は様々である（例えば、プローブ鎖は、標的配列と完全な相補性を有しているか、または標的配列と比較して１つ以上のミスマッチもしくはギャップを有している（例えば、挿入または欠失（例えば、バルジを形成する））を有する。）。プローブ鎖が、対立遺伝子特異的プライマーに結合する配列に隣接の、または近傍の配列にわたって標的核酸と完全に相補的であることが好ましい。
【０１１５】
クエンチャーオリゴヌクレオチドを含むプローブの実施形態については、プローブ鎖と標的核酸とのハイブリダイゼーションをもたらすために、検出したい核酸（例えば、標的核酸）が、プローブ鎖の配列と十分に相補的である場合、プローブ鎖はクエンチャーオリゴヌクレオチドから分離し（例えば、プローブ鎖とクエンチャーオリゴヌクレオチドとから形成された重複が融解し）、プローブ鎖は標的配列とハイブリッド形成する。例えば、一部の実施形態では、標的核酸で形成された重複は、より熱力学的に安定しているので、例えば、標的核酸で形成された重複がより多くの塩基対を含んでいるので、標的核酸とプローブ鎖との間に形成された重複は、プローブ鎖とクエンチャーオリゴヌクレオチドとから形成された重複より安定している。この立体配座では、フルオロフォアとクエンチャーとが分離されており、フルオロフォアは、例えば、アクセプターフルオロフォアを励起するために発光することができる。一部の実施形態では、プローブは、伸長することができないようにデザインされており、例えば、３’末端（３’ヒドロキシル）は遮断されているか、またはそうでなければ、ポリメラーゼによる（例えば、プローブの３’末端にヌクレオチドを付加することによる）伸長を阻止される。
【０１１６】
一本鎖である（例えば、クエンチャーヌクレオチドを含まない）プローブの実施形態については、プローブ鎖と標的核酸とのハイブリダイゼーションをもたらすために、検出したい核酸（例えば、標的核酸）がプローブ鎖の配列と十分に相補的な場合、プローブ鎖は標的配列とハイブリッド形成する。この立体配座では、およびフルオロフォアはアクセプターフルオロフォアを励起することができる。一部の実施形態では、プローブは、伸長できないようにデザインされており、例えば、３’末端（３’ヒドロキシル）は遮断されているか、またはそうでなければ、ポリメラーゼによる（例えば、プローブの３’末端にヌクレオチドを付加することによる）伸長を阻止される。
【０１１７】
対立遺伝子特異的プライマーの蛍光標識とプローブ鎖の蛍光標識とは、ＦＲＥＴ対を形成する。ＦＲＥＴ対は、１つのフルオロフォアがドナーフルオロフォアであり、もう１つのフルオロフォアがアクセプターフルオロフォアである、発光および励起特性を有する２つのフルオロフォアを含む。最初、電子励起状態のドナーフルオロフォアが、非放射性双極子−双極子結合を介してアクセプターフルオロフォアにエネルギーを移動する。ドナーフルオロフォアの発光スペクトルは、アクセプターフルオロフォアの励起スペクトルとある程度まで重なる。移動効率は、ドナーとアクセプターとの間の距離、ドナー発光スペクトルとアクセプター吸収スペクトルとのスペクトルの重なり、およびドナー発光双極子モーメントとアクセプター吸収双極子モーメントとの相対配向に依存する。特に、エネルギーの移動効率は、ドナーとアクセプターとの間の距離の６乗に反比例する。このため、アクセプターとドナーとが極めてわずかな距離（例えば、約１から１０ｎｍの距離）だけ離れているとき、検出可能なエネルギー移動が生じる。
【０１１８】
１）対立遺伝子特異的プライマーがポリメラーゼによってアンプリコン鎖に組み込まれるとき、および２）プローブ鎖がフルオロフォアを含むアンプリコン鎖に結合するとき、ＦＲＥＴが生じる。アンプリコンがフルオロフォアを含む対立遺伝子特異的プライマーから生成されるので、アンプリコンとプローブ鎖との結合によって、対立遺伝子特異的プライマーのフルオロフォアは、プローブ鎖のフルオロフォアのエネルギー移動が生じるのに適切な距離内に配置される。このため、アクセプターフルオロフォアの発光は（例えば、１つ以上の波長で発光を監視することによって）検出可能となり、サンプル中に標的核酸が存在するというシグナルを送る。一部の実施形態では、対立遺伝子特異的プライマーの組み込み時のシグナルの検出、およびプローブ鎖の結合を含むＦ−Ｍａｓｐ技術は、Ｍａｓｐの実施態様に比べてより敏感なおよび／またはより特異的な技術を提供する。
【０１１９】
本技術を２つ以上の標的核酸（例えば、２つ以上の対立遺伝子、ＳＮＰ等）を検出するために多重アッセイに使用するとき、２つ以上の対立遺伝子特異的プライマーを使用する。２つ以上の対立遺伝子特異的プライマーは２つ以上の異なるフルオロフォア（例えば、異なる発光スペクトルにより、および／または２つの波長で発光を監視することにより検出可能であるアクセプターフルオロフォア）を含み、および２つ以上の標的核酸に特異的な（例えば、相補的）配列を含む。一部の実施形態では、同一のプローブ鎖が、２つ以上の標的核酸を検出するために使用され、また、一部の実施形態では、異なるプローブ鎖が、２つ以上の標的核酸を検出するために使用される。プローブ鎖の組成（例えば、長さ、配列等）は、対立遺伝子特異的プライマーが結合する標的部位に隣接の、または近傍の標的核酸の配列に依存する。プローブ鎖のフルオロフォア（例えば、ドナーフルオロフォア）は、同じであってもよく、または異なっていてもよい。プローブ鎖のフルオロフォア（例えば、ドナーフルオロフォア）は、２つ以上の対立遺伝子特異的プライマーに結合する２つの異なるフルオロフォアのためのドナーとして作用する。一部の実施形態では、各対立遺伝子特異的プライマーは、異なる標的核酸に特異的であり、また、一部の実施形態では、各対立遺伝子特異的プライマーは、標的核酸の異なる群（例えば、２つ以上の標的核酸を含む群）に対して特異的である。例証となる非限定的例示として、一部の実施形態では、４つの異なる対立遺伝子Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤが４つの異なる対立遺伝子特異的プライマーによって検出されてもよく、または、一部の実施形態では、対立遺伝子ＡおよびＢが１つの対立遺伝子特異的プライマーによって検出されてもよく、ならびに対立遺伝子ＣおよびＤが別の対立遺伝子特異的プライマーによって検出されてもよい。
【０１２０】
分子ビーコンＦ−Ｍａｓｐ
Ｆ−Ｍａｓｐ技術の一部の実施形態では、二重鎖プローブの代わりに分子ビーコンプローブを使用する（例えば、あらゆる目的でこの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０３；Ｄｒａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ａｐｐｌ．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．５８：２６９Ａを参照のこと）。このため、本技術は、用語「二重鎖プローブ」が、本明細書に記載され、当業者によって理解されるようなＦ−Ｍａｓｐ技術における用語「分子ビーコンプローブ」と置き換わっている実施形態を含む。
【０１２１】
分子ビーコンプローブは、この１末端またはこの近傍のフルオロフォア、および別の１末端またはこの近傍のクエンチャーを含むオリゴヌクレオチドである。例えば、フルオロフォアが、オリゴヌクレオチドの５’末端もしくはこの近傍にあり、およびクエンチャーが、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくはこの近傍にあるか、または、クエンチャーが、オリゴヌクレオチドの５’末端もしくはこの近傍にあり、およびクエンチャーが、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくはこの近傍にある。ステムループ構造が形成され、およびプローブが標的に結合しないとき、フルオロフォアを消光するように、３’末端にあるクエンチャーまたはフルオロフォアをヌクレオチドの１つに結合する。
【０１２２】
例えば、一部の実施形態では、分子ビーコンプローブは、約１８から５０ヌクレオチド長であり、３つの領域を含む。即ち、約４から１０ヌクレオチドの５’ステム形成領域、１０から３０ヌクレオチドを含む中央ループ領域、および約４から１０ヌクレオチドを含む３’ステム形成領域である。ループ領域は、標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡと相補的な配列を含み、ループ領域自体または分子ビーコンプローブの他の領域と対をなさず、５’ステム形成領域の配列と３’ステム形成領域の配列とは、分子ビーコンプローブが標的核酸に結合しないとき、二重鎖「ステム」構造を形成するのに互いに十分に相補的である。
【０１２３】
３’ステム形成領域および５’ステム形成領域は、本技術の様々な実施形態において、標的配列との相補性の程度は様々である（例えば、３’ステム形成領域および／または５’ステム形成領域は、標的配列との相補性を有していない、３’ステム形成領域および／または５’ステム形成領域は、標的配列と完全な相補性を有している、３’ステム形成領域および／または５’ステム形成領域は、標的配列との中位の相補性を有している、例えば、３’ステム形成領域および／または５’ステム形成領域は、標的配列と比較して、１つ以上のミスマッチまたはギャップ（例えば、挿入または欠失（例えば、バルジを形成する）、例えば１つ、２つ、３つ、４つ、５つのミスマッチを有しているか、または、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の標的配列相補性を有している。）。
【０１２４】
３’ステム形成領域および５’ステム形成領域は、標的配列と同程度の相補性を有する必要はないが、標的配列と同程度の相補性を有していてもよい。このため、一部の実施形態では、３’ステム形成領域および５’ステム形成領域は標的配列と同程度の相補性を有し、また、一部の実施形態では、３’ステム形成領域および５’ステム形成領域は、標的配列と程度が異なる相補性を有する。さらに、５’ステム形成領域および３’ステム形成領域は、本技術に適切である任意の程度の相補性を有していてもよい（例えば、５’ステム形成領域の配列と３’ステム形成領域の配列とが、互いに完全に相補的か、または互いと比較して１つ以上のミスマッチもしくはギャップ（例えば、挿入または欠失（例えば、バルジを形成する））を含む。）。ステム重複は、完全に相補的な５’ステム形成領域および３’ステム形成領域、または１つ以上のミスマッチもしくはギャップを有する５’ステム形成領域および３’ステム形成領域から形成してもよい。
【０１２５】
分子ビーコンプローブの一末端（例えば、５’末端または３’末端）で、蛍光色素が共有結合する。もう１つの末端（例えば３’末端または５’末端）では、非蛍光性クエンチャー色素が共有結合する。分子ビーコンプローブが閉ループ立体配座にあるとき、クエンチャーはフルオロフォアの近傍にあり、クエンチャーは、フルオロフォア（例えば、ドナーフルオロフォア）の蛍光発光を消光する（例えば、極小化し、減少させ、および／または除去する。）。
【０１２６】
検出したい核酸と分子ビーコンプローブとのハイブリダイゼーションをもたらすために、検出したい核酸が分子ビーコンプローブの配列と十分に相補的である場合、分子ビーコンプローブは直線化し（例えば、閉ループ立体配座から開裂し）、標的配列とハイブリッド形成する。例えば、一部の実施形態では、標的核酸で形成された重複はより熱力学的に安定しているので、例えば、標的核酸で形成された重複はより多くの塩基対を含んでいるので、標的核酸と、直線化された分子ビーコンプローブとの間に形成された二重鎖は、ステムの３’ステム形成領域と５’ステム形成領域とによって形成されたステム重複よりも安定している。この直鎖状立体配座では、フルオロフォアとクエンチャーとが分離されており、２つのフルオロフォアがエネルギー移動に適切な距離内（例えば、約１から１０ｎｍ）にあるとき、分子ビーコンプローブは、対立遺伝子特異的プライマーに連結したアクセプターフルオロフォアを励起する状態にある。
【０１２７】
分子ビーコンプローブの実施形態は、二重鎖プローブを使用する本明細書に記載の実施形態と同様に、多重標的核酸の多重検出に利用される。本技術を、２つ以上の標的核酸（例えば、２つ以上の対立遺伝子、ＳＮＰ等）を検出する多重アッセイに使用するとき、２つ以上の対立遺伝子特異的プライマーを使用する。２つ以上の対立遺伝子特異的プライマーは２つ以上の異なるフルオロフォア（例えば、異なる発光スペクトルにより、および／または２つの波長で発光を監視することにより検出可能であるアクセプターフルオロフォア）を含み、２つ以上の標的核酸のための特異的（例えば、相補的）配列を含む。一部の実施形態では、同一の分子ビーコンプローブを使用して２つ以上の標的核酸を検出し、また、一部の実施形態では、異なる分子ビーコンプローブを使用して２つ以上の標的核酸を検出する。分子ビーコンプローブの組成（例えば、長さ、配列等）は、対立遺伝子特異的プライマーが結合する標的部位に隣接の、または近傍の標的核酸の配列に依存する。分子ビーコンプローブのフルオロフォア（例えば、ドナーフルオロフォア）は、同じであっても異なっていてもよい。分子ビーコンプローブのフルオロフォア（例えばドナーフルオロフォア）は、２つ以上の対立遺伝子特異的プライマーに結合する２つの異なるフルオロフォアのドナーとして作用する。一部の実施形態では、各対立遺伝子特異的プライマーは、異なる標的核酸に特異的であり、また、一部の実施形態では、各対立遺伝子特異的プライマーは、標的核酸の異なる群（例えば、２つ以上の標的核酸を含む群）に特異的である。例証となる非限定的例示として、一部の実施形態では、４つの異なる対立遺伝子Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤが４つの異なる対立遺伝子特異的プライマーによって検出されてもよく、または、一部の実施形態では、対立遺伝子ＡおよびＢが１つの対立遺伝子特異的プライマーによって検出されてもよく、ならびに対立遺伝子ＣおよびＤが別の対立遺伝子特異的プライマーによって検出されてもよい。
【０１２８】
蛍光部分
一部の実施形態では、記載した本技術で使用したオリゴヌクレオチド（例えば、ステムループプライマー、対立遺伝子特異的プライマー、二重鎖直鎖状プライマー、および／または分子ビーコン）は、蛍光部分（例えば、有機色素）を含む。様々な蛍光部分が当技術分野で公知である。蛍光部分として使用してもよい化合物の例には、キサンテン、アントラセン、シアニン、ポルフィリンおよびクマリン色素が挙げられるがこれらに限定されない。本技術で利用するキサンテン色素の例には、フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、５−または６−カルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、５−または６−カルボキシ−４’５’２’４’５’７ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５’または６’−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２，’７’−ジメトキシフルオロセイン（ＪＯＥ）、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン（ＺＯＥ）、ロードール、ローダミン、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、４，７−ｄｌｃｈｌｏｒｏｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌローダミン（ＤＴＡＭＲＡ）、ローダミンＸ（ＲＯＸ）、およびテキサスレッドが挙げられるが、これらに限定されない。本発明で利用してもよいシアニン色素の例にはＣｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、およびＣｙ７．５が挙げられるが、これらに限定されない。本技術で利用する他の蛍光部分および／または蛍光色素にはエネルギー移動色素、複合色素、および蛍光シグナルを示す他の芳香族化合物が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、蛍光部分は量子ドットを含む。
【０１２９】
このため、本技術によれば、利用する例示的なフルオロフォアおよび色素は、蛍光色素の蛍光を消光する蛍光色素または分子を含むがこれらに限定されない。蛍光色素は、Ｃｙ５、ジクロロ［Ｒ１１０］、ジクロロ［Ｒ６Ｇ］、ジクロロ［ＴＡＭＲＡ］、またはジクロロ［ＲＯＸ］等を含むｄ−ローダミンアクセプター色素、フルオレセイン、６−ＦＡＭ、または５−ＦＡＭ等を含むフルオレセインドナー色素；アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー、プロフラビン、ｐＨ７等を含むアクリジン；２−メチルベンゾオキサゾール、ｐ−ジメチルアミノベンゾアートエチル、フェノール、ピロール、ベンゼン、またはトルエン等を含む芳香族炭化水素；オーラミンＯ、クリスタルバイオレット、クリスタルバイオレット、グリセロール、またはマラカイトグリーン等を含むアリールメチン色素；７−メトキシクマリン−４−酢酸、クマリン１、クマリン３０、クマリン３１４、クマリン３４３、またはクマリン６等を含むクマリン色素；１，１’−ジエチル−２，２’−シアニンヨウ化物、クリプトシアニン、インドカルボシアニン（Ｃ３）色素、インドカルボシアニン（Ｃ５）色素、インドトリカルボシアニン（Ｃ７）色素、オキサカルボシアニン（Ｃ３）色素、オキサジカルボシアニン（Ｃ５）色素、オキサトリカルボシアニン（Ｃ７）色素、ピナシアノールヨージド、ステイン−オール、チアカルボシアニン（Ｃ３）色素、エタノール、チアカルボシアニン（Ｃ３）色素、ｎ−プロパノール、チアジカルボシアニン（Ｃ５）色素、またはチアトリカルボシアニン（Ｃ７）色素等を含むシアニン色素；Ｎ，Ｎ’−ジフルオロボリル−１，９−ジメチル−５−（４−ヨードフェニル）−ジピリン、Ｎ，Ｎ’−ジフルオロボリル−１，９−ジメチル−５−［（４−（２−トリメチルシリルエチニル、またはＮ，Ｎ’−ジフルオロボリル−１，９−ジメチル−５−フェニルジピリン等を含むジピリン色素、；４−（ジシアノメチレン）−２−メチル−６−（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−４Ｈ−ピラン（ＤＣＭ）、アセトニトリル、４−（ジシアノメチレン）−２−メチル−６−（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−４Ｈ−ピラン（ＤＣＭ）、メタノール、４−ジメチルアミノ−４’−ニトロスチルベン、またはメロシアニン５４０等を含むメロシアニン；４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ジメチルスルホキシド、７−ベンジルアミノ−４−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール、ダンシルグリシン、ダンシルグリシン、ジオキサン、ヘキスト３３２５８、ＤＭＦ、ヘキスト３３２５８、ルシファーイエローＣＨ、ピロキシカム、キニーネ硫酸塩、キニーネ硫酸塩、またはスクアリリウム色素ＩＩＩ等を含む種々雑多な色素；２，５−ジフェニルオキサゾール（ＰＰＯ）、ビフェニル、ＰＯＰＯＰ、ｐ−クアテルフェニル、またはｐ−ターフェニル等を含むオリゴフェニレン類；クレシルバイオレット過塩素酸塩、ナイルブルー、メタノール、ナイルレッド、エタノール、オキサジン１、またはオキサジン１７０等を含むオキサジン；９，１０−ビス（フェニルエチニル）アントラセン、９，１０−ジフェニルアントラセン、アントラセン、ナフタレン、ペリレン、ピレン等を含む多環式芳香族炭化水素；１，２−ジフェニルアセチレン、１，４−ジフェニルブタジエン、１，４−ジフェニルブタジイン、１，６−ジフェニルヘキサトリエン、ベータ−カロテン、スチルベン等を含むポリエン／ポリイン；アントラキノン、アゾベンゼン、ベンゾキノン、フェロセン、リボフラビン、トリス（２，２’−ｂｉｐｙｒｉｄｙｐｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ））、テトラピロール、ビリルビン、クロロフィルａ、ジエチルエーテル、クロロフィルａ、メタノール、クロロフィルｂ、プロトンを２個付加した（ｄｉｐｒｏｔｏｎａｔｅｄ）−テトラフェニルポルフィリン、ヘマチン、マグネシウムオクタエチルポルフィリン、マグネシウムオクタエチルポルフィリン（ＭｇＯＥＰ）、マグネシウムフタロシアニン（ＭｇＰｃ）、ＰｒＯＨ、マグネシウムフタロシアニン（ＭｇＰｃ）、ピリジン、マグネシウムテトラメシチルポルフィリン（ＭｇＴＭＰ）、マグネシウムテトラフェニルポルフィリン（ＭｇＴＰＰ）、オクタエチルポルフィリン、フタロシアニン（Ｐｃ）、ポルフィン、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、テトラ−ｔ−ブチルアザポルフィン、テトラ−ｔ−ブチルナフタロシアニン、テトラキス（２，６−ジクロロフェニル）ポルフィリン、テトラキス（ｏ−アミノフェニル）ポルフィリン、テトラメシチルポルフィリン（ＴＭＰ）、テトラフェニルポルフィリン（ＴＰＰ）、ビタミンＢ１２、亜鉛オクタエチルポルフィリン（ＺｎＯＥＰ）、亜鉛フタロシアニン（ＺｎＰｃ）、ピリジン、亜鉛テトラメシチルポルフィリン（ＺｎＴＭＰ）、亜鉛テトラメシチルポルフィリンラジカルカチオン、または亜鉛テトラフェニルポルフィリン（ＺｎＴＰＰ）等を含む酸化還元活性型発色団；エオシンＹ、フルオレセイン、塩基性エタノール、フルオレセイン、エタノール、ローダミン１２３、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローズベンガル、またはスルホロダミン１０１等を含むキサンテン；またはこれらの混合物もしくは組合せ、もしくはこれらの合成誘導体を含むがこれらに限定されない。
【０１３０】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、光子の発光なしで励起がドナー分子からアクセプター分子まで移動する、２つの色素分子の電子励起状態間の距離依存性相互作用である。一部の実施形態では、記載した本技術で使用するオリゴヌクレオチド（例えば、ステムループプライマー、対立遺伝子特異的プライマー、二重鎖直鎖状プライマー、および／または分子ビーコン）は、ＦＲＥＴに使用するのに適切な部分（例えば、ＦＲＥＴ対（例えば、ＦＲＥＴドナーまたはＦＲＥＴアクセプター）のメンバー）を含む。一部の適切なＦＲＥＴ対を表１に示す。
【０１３１】
【表１】
2016512041.tif 000002
【０１３２】
クエンチャー
一部の実施形態では、記載した本技術で使用するオリゴヌクレオチド（例えば、ステムループプライマー、対立遺伝子特異的プライマー、二重鎖直鎖状プライマー、および／または分子ビーコン）は、クエンチャー部分を含む。様々なクエンチャー部分が当技術分野で公知である。例えば、一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ブラックホールクエンチャー（例えば、ＢＨＱ−０、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３）、ダブシル、アイオワブラッククエンチャー（Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）（例えば、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＦＱ、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＲＱ）、Ｅｃｌｉｐｓｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒであるクエンチャーを含む。
【０１３３】
一部の実施形態では、ＢＨＱ−１は、約５００から６００ｎｍの発光波長を有する蛍光部分と共に使用する。一部の実施形態では、ＢＨＱ−２は、約５５０から６７５ｎｍの発光波長を有する蛍光部分と共に使用する。一部の実施形態では、ＦＲＥＴ対は、クエンチングをもたらすフルオロフォアクエンチャー対である。
【０１３４】
一部の例示的なフルオロフォアクエンチャー対には、ＦＡＭおよびＢＨＱ−１、ＴＥＴおよびＢＨＱ−１、ＪＯＥおよびＢＨＱ−１、ＨＥＸおよびＢＨＱ−１、Ｃｙ３およびＢＨＱ−２、ＴＡＭＲＡおよびＢＨＱ−２、ＲＯＸおよびＢＨＱ−２、Ｃｙ５およびＢＨＱ−３、Ｃｙ５．５およびＢＨＱ−３、ＦＡＭおよびＢＨＱ−１、ＴＥＴおよびＢＨＱ−１、ＪＯＥおよび３’ＢＨＱ−１、ＨＥＸおよびＢＨＱ−１、Ｃｙ３およびＢＨＱ−２、ＴＡＭＲＡおよびＢＨＱ−２、ＲＯＸおよびＢＨＱ−２、Ｃｙ５およびＢＨＱ−３、Ｃｙ５．５およびＢＨＱ−３、またはＢｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｎｏｖａｔｏ，Ｃａｌｉｆ．等の他の民間企業から入手可能な同様のフルオロフォアクエンチャー対が挙げられる。
【０１３５】
キット
本明細書に記載した１つ以上の組成物を含むキットも本明細書に提供する。一部の実施形態では、キットを、本明細書に提供した方法の１つ以上の実施に利用する。一部の実施形態では、方法は、本明細書に記載の方法および組成物を使用するための一連の指示に記載しており、キットにおいて提供する。組成物は、１つ以上の容器（例えば、ボトル、バイアル、アンプル、および試験管等）で提供し、および使用する準備ができている形態（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ  ｆｏｒｍａｔ）であってもよく、または、復元し得る形態（例えば、水を添加する凍結乾燥形態。水はキットに付属していてもユーザが用意してもよい。）であってもよい。キットは、本明細書に記載したフルオロフォアと共に使用するための１つ以上の光学フィルターを含んでいてもよい。一部の実施形態では、キットはコントロールを含む。コントロールの例は、ポジティブコントロール、例えば、キットの組成物および／または方法の使用の対象である１つ以上の標的配列を含む核酸、およびネガティブコントロール、例えば、キットの組成物および／または方法の使用の対象である１つ以上の標的配列を含まない核酸である。一部の実施形態では、コントロールは、野生型対立遺伝子である配列を含む核酸および／または野生型の配列と比較して変異している１つ以上の配列を含む（例えば、１つ以上の変異対立遺伝子、ＳＮＰ等を含む）核酸であると規定する。ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲに関する実施形態では、キットは、ポリメラーゼ、緩衝液、１つ以上のヌクレオチド（ｄＮＴＰ、例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴｐ、および／またはこの類似体または誘導体）および他の試薬を含んでいてもよい。一部のキットの実施形態は、予め調剤されており、多重形態、例えば、ランしたい試験数に応じて９６−ウェルプレート、３８４−ウェルプレート、１５３６−ウェルプレート、またはより多くのまたはより少ないウェルから成るプレートなどのマルチウェルプレートで使用する準備ができている、本技術による組成物を提供する。一部の実施形態では、サンプルを、使用する準備ができているプレートに添加し、プレートをサーマルサイクルにかけることによってアッセイ（例えば、ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲ）を実施する。
【０１３６】
本技術の実施形態をさらに理解し、以下の関連する例示に記載する。
【実施例】
【０１３７】
［実施例１］
ＢＲＡＦ変異の多重検出
本技術の実施形態の開発中に、ＢＲＡＦ変異を検出するアッセイにおいて、データを回収した。ＢＲＡＦはＢ−Ｒａｆと呼ばれるタンパク質を作るヒトの遺伝子である。この遺伝子は、セリン／トレオニンタンパク質キナーゼファミリー中の癌原遺伝子であり、非ホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、悪性黒色腫、乳頭甲状腺癌、非小細胞肺癌、および肺腺癌などのヒトの癌中にアミノ酸置換を含むことが示されている。さらに、Ｂ−Ｒａｆにおける一部の他の置換は先天性欠損をもたらす。
【０１３８】
ヒトの癌に関連したＢＲＡＦ遺伝子の３０を超える変異が同定されている。９０％の事例で、ＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１５中のヌクレオチド１７９９で、チミンがアデニンと置換されている。これは、ヒト癌で見られる活性化セグメント中のコドン６００でグルタミン酸（Ｅ）により置換されているバリン（Ｖ）（今やＶ６００Ｅと称す。）を導く。この変異は、乳頭甲状腺癌、結腸直腸癌、メラノーマおよび非小細胞肺癌で広く観察されている。ＢＲＡＦにおける他の変異は、コドン６００でバリンに代わるリジン（Ｋ）およびアスパラギン酸（Ｄ）の置換をもたらし、それぞれＶ６００ＫおよびＶ６００Ｄ変異と表される。
【０１３９】
これらの癌を引き起こすＢ−Ｒａｆタンパク質に関連した核酸を検出するために、Ｂ−Ｒａｆタンパク質におけるＶ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋ、およびＶ６００Ｄの置換をもたらすＢＲＡＦ中の変異を検出する本技術による対立遺伝子特異的プライマーをデザインした。リアルタイムＰＣＲは、３つの対立遺伝子特異的フォワードプライマー（ＡＳ−ＦＰ）を、１つの共通逆プライマー（ＲＰ）と共に使用した。３つの対立遺伝子特異的プライマーを、異なるフルオロフォアでそれぞれ標識化し、１つのＰＣＲを使用して多重アッセイでＢＲＡＦの３つの変異型を検出した。従って、ＳＮＰ変異は、３つの異なる蛍光チャネルの蛍光発光を監視することにより識別する。ＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１３の一部を増幅するように方向づけたプライマーを、内部の内因性コントロールとしてデザインした。例えば、図３を参照のこと。
【０１４０】
特に、３つの対立遺伝子特異的プライマーは、本明細書に記載した二重鎖プライマーであった。二重鎖プライマーは、フルオロフォアを含むプライマー鎖とクエンチャーを含むクエンチャー鎖とからなっていた。プライマーが二重鎖重複領域を含む（例えば、ハイブリッド形成していない状態、および重複が融解される前の組み込まれた状態の）とき、プライマーフルオロフォアは消光されており、プライマーは検出可能ではない。例えば、図４を参照のこと。図４において、星形の要素はフルオロフォアであり、また、「Ｑ」はクエンチャーである。
【０１４１】
ＢＲＡＦ変異核酸の既知量を有するように、試験サンプルを混合した。特に、サンプルは、０．５％、１％、５％、２５％、および５０％などの濃度で、野生型ＢＲＡＦ核酸および変異核酸を含んでいた。対立遺伝子特異的プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを実施して、野生型核酸のバックグラウンドにおいてこれらのレベルで変異核酸を検出した。
【０１４２】
１セットの実験からデータを回収して、二重鎖対立遺伝子特異的プライマーの特異性および感受性を検証した。Ｖ６００Ｅを検出するための二重鎖対立遺伝子特異的プライマーの特異性および感受性を検証するための非多重実験の結果を、図５に示す。蛍光シグナルを、サイクル数の関数としてプロットする。プロットによって示すように、変異対立遺伝子特異的プライマーによる変異核酸の検出は、野生型ＢＲＡＦが変異対立遺伝子特異的プライマーによって検出されるよりも早いサイクルで生じる。検出サイクル数は、サンプル中に存在する変異核酸の量に依存する。このため、５０％のＶ６００Ｅ  ＢＲＡＦからなるサンプルは、０．５％のＢＲＡＦからなるサンプルよりも早いサイクルで検出され、また、両方とも野生型ＢＲＡＦが検出されるよりも早いサイクルで検出される。挿入図は、内部ポジティブコントロールＰＣＲから得たシグナルを示す。
【０１４３】
第２セットの実験は、細胞内ＤＮＡ中のＶ６００ＥおよびＶ６００Ｋの多重検出から得たデータを回収するように方向づけた。１０ｎｇの全インプット細胞内ＤＮＡからなるサンプルを、本明細書に提供した本技術の実施形態によってアッセイした。反応混合物は、Ｖ６００Ｅ対立遺伝子特異的プライマー、Ｖ６００Ｋ対立遺伝子特異的プライマー、野生型ＢＲＡＦ  ＤＮＡ、および以下、即ち、０．５％のＶ６００Ｅ変異ＤＮＡ、５０％のＶ６００Ｅ  ＤＮＡ、１％のＶ６００Ｋ  ＤＮＡ、または５０％のＶ６００Ｋ  ＤＮＡの１つを含んでいた。リアルタイムＰＣＲデータを回収し、図６にプロットした。図６において、Ｙ軸は、試験サンプルと内部の内因性コントロールとの間の蛍光シグナルにおける相違（ｄＣｔ）をサイクル数の関数として示す。図６に示すように、Ｖ６００Ｅ変異ＤＮＡおよびＶ６００Ｋ変異ＤＮＡの両方とも、サンプル中に１％以下存在するとき、検出される。特に、変異体が野生型に関連して検出されるサイクルにおいて、データは統計的有意差を示す。Ｖ６００Ｅ変異体は、０．５％存在するとき、ｄＣｔが１３．３０で検出され、５０％存在するとき、ｄＣｔが５．３５で検出され、一方、野生型は、ｄＣｔが１８．８０で検出された。同様に、Ｖ６００Ｋ変異体は、１％存在するとき、ｄＣｔが９．３３で検出され、５０％で存在するとき、ｄＣｔが３．８５で検出され、一方、野生型は、ｄＣｔが２０．７７で検出された。
【０１４４】
同様の実験を、合成ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプルから抽出した１０ｎｇの全ＤＮＡを使用して実施した。図７は、この実験から得たデータを示す。データは、サンプル中に０．５％存在するとき、ＦＦＰＥサンプルから抽出したＶ６００Ｅ変異核酸の検出を示す。Ｖ６００Ｅ変異核酸は、ｄＣｔが１０．０６で検出され、野生型ＢＲＡＦ核酸は、ｄＣｔが１１．５９で検出された。
【０１４５】
上記の明細書において述べた刊行物および特許は全て、あらゆる目的でこの全体が参照により本明細書に組み込まれる。記載した本技術の組成物、方法および使用の様々な変更および変形は、記載した本技術の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかであろう。本技術は特異的、例示的な実施形態に関して記載しているが、特許請求される本発明は、このような具体的な実施形態に過度に制限されるべきでないことを理解されたい。実際には、当業者にとって明白である、本発明を実施するために記載した様式の様々な変更は、以下の請求項の範囲内であるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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