(57)【要約】本発明の態様は、架橋共重合体ヒドロゲル組成物を含む。特定の実施形態に係る架橋共重合体ヒドロゲル組成物は、キトサンとポリエステルとの共重合体、及び加水分解性架橋剤を含む。ある特定の実施形態では、架橋ヒドロゲルは、フィブリノゲンをさらに含む。主題の発明はまた、一種または複数種の吸収された生理活性剤を含む架橋共重合体ヒドロゲルを有する組成物も記載する。本発明の架橋共重合体ヒドロゲルを調製及び使用するための方法も記載する。2016525374.tif 000027
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
キトサンとポリエステルとの共重合体；及び
架橋剤
を含む、架橋共重合体ヒドロゲル。
【請求項２】
前記ポリエステルがポリラクチドである、請求項１に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
【請求項３】
フィブリノゲンをさらに含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
【請求項４】
キトサン対前記ポリエステルの比が１：１から８：１の範囲である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
【請求項５】
一種または複数種の吸収された生理活性剤をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
【請求項６】
ＢＭＰ−２をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
【請求項７】
前記一種または複数種の吸収された生理活性剤を実質的に一次放出速度で持続放出するように構成されている、請求項５〜６のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
【請求項８】
架橋共重合体ヒドロゲルを作製するための方法であって、
キトサンを含む組成物を、ポリエステルを含む組成物と接触させて、キトサンと前記ポリエステルとの共重合体を生成すること；及び
キトサンと前記ポリエステルとの前記共重合体を、一種または複数種の架橋剤を含む組成物と接触させて、架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体を生成すること；
前記架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体を、架橋共重合体ヒドロゲルを生成するのに十分な架橋条件に供すること
を含む、前記方法。
【請求項９】
前記架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体をフィブリノゲンと接触させて、キトサン−ポリエステル−フィブリノゲンヒドロゲル前駆体組成物を生成すること；または
前記架橋共重合体ヒドロゲルをフィブリノゲンと接触させて、架橋キトサン−ポリエステル−フィブリノゲンヒドロゲルを生成すること
をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記架橋条件が、１００秒間以上の継続時間にわたるＵＶ照射で前記組成物を照射することを含む、請求項８〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記共重合体ヒドロゲル前駆体または前記架橋共重合体ヒドロゲルを生理活性剤と接触させることをさらに含む、請求項８〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
骨を再生させるための方法であって、
キトサンとポリエステルとの共重合体；
架橋剤；及び
ＢＭＰ−２
を含む架橋共重合体ヒドロゲルと骨を接触させること、並びに
ＢＭＰ−２を含む前記架橋共重合体ヒドロゲルを、骨を再生させるのに十分な様式で、前記骨と接触した状態に維持すること
を含む、前記方法。
【請求項１３】
前記架橋共重合体ヒドロゲルが、フィブリノゲンをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
キトサンとポリエステルとの共重合体；
架橋剤；及び
生理活性剤
を含む架橋共重合体ヒドロゲルと対象の鼓膜を接触させること、並びに
前記生理活性剤を含む前記架橋共重合体ヒドロゲルを、前記生理活性剤を前記鼓膜に送達するのに十分な様式で、前記鼓膜と接触した状態に維持すること
を含む、方法。
【請求項１５】
前記架橋共重合体ヒドロゲルが、フィブリノゲンをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援
本発明は、国防総省により授与された認可番号Ｗ８１ＸＷＨ−１０−１−０９６６の元で政府支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
緒言
ヒドロゲルは、相互侵入高分子網目構造を有する水膨潤性材料または水膨潤材料である。ヒドロゲルは、主にその水含有量が高く柔軟な性質（天然組織を模倣することができ、所望の生理学的部位での生理活性剤の放出を容易にすることができる）のために生体医学及び医薬用途において使用されている。ある特定の場合では、ヒドロゲルは、移植、組織接着及び整形処置、例えば、骨移植、半月板及び関節軟骨置換術ならびに椎間板内高周波減圧術（ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｎｕｃｌｅｏｐｌａｓｔｙ）を含む組織処置用途で使用されてきた。加えて、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に類似するヒドロゲル及び重合体は、成長因子の貯蔵及び制御放出を改善することができるＥＣＭのような化学的、構造的、物理化学的、機械的特性を保持するため、成長因子送達のために採用され得る。
【０００３】
それゆえ、生体組織工学用途及び薬物送達において使用することができるスカフォールドを開発する必要がある。これらのスカフォールドは、生体適合性（すなわち生体組織に対して非毒性であり、非免疫原性）であり、耐久性があり、細胞または薬物送達を可能にする所望の機械的特性（例えば、強度及び弾性）を有するべきである。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本発明の態様は、架橋共重合体ヒドロゲル組成物を含む。ある特定の実施形態に係る本発明の架橋共重合体ヒドロゲル組成物は、キトサンとポリエステルとの共重合体、及び加水分解性架橋剤を含む。ある特定の実施形態では、架橋ヒドロゲルは、フィブリノゲンをさらに含む。主題の発明はまた、一種または複数種の吸収された生理活性剤を含む架橋共重合体ヒドロゲルを有する組成物も記載する。本発明の架橋共重合体ヒドロゲルを調製及び使用するための方法も記載する。
【０００５】
実施形態では、架橋共重合体ヒドロゲルは、キトサンとポリエステルとの共重合体、及び加水分解性架橋剤を含む。いくつかの実施形態では、ポリエステルは、ポリ（開環環状エステル）（ｒｉｎｇ−ｏｐｅｎｅｄ  ｃｙｃｌｉｃ  ｅｓｔｅｒ）である。ある特定の例では、ポリエステルはポリラクチドである。従って、本発明の実施形態は、一種または複数種の加水分解性架橋剤を有する、キトサンとポリラクチドとの共重合体を含む架橋共重合体ヒドロゲルを含み得る。架橋キトサン−ポリラクチドヒドロゲルが有するキトサン対ポリラクチドの比は、１：１〜１０：１、例えば１：１〜８：１の範囲であり得、ある特定の例では、架橋キトサン−ポリラクチドヒドロゲルは、１：１のキトサン対ポリラクチドの比を有する。本発明の架橋共重合体ヒドロゲル中のキトサンの重量パーセントは１％〜９９％の範囲であり得、ポリエステルの重量パーセントも１％〜９９％の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、共重合体ヒドロゲルは、キトサン成分とポリエステル成分との間に一または複数のエステル及びアミド結合を含む。
【０００６】
本発明の架橋共重合体ヒドロゲルは、架橋剤も含む。いくつかの実施形態では、架橋剤は、生理的条件下で加水分解されるように構成される。いくつかの実施形態では、架橋剤は、メタクリレート架橋剤などのアクリレート架橋剤であり得る。ある特定の例では、架橋共重合体ヒドロゲルは、式
2016525374.tif 000003
（式中、
Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立して水素、アルキル及び置換アルキルから選択され；
Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立してＮ及びＯから選択され；かつ
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立してキトサン及びポリエステルから選択される）の架橋を含む。例えば、ある特定の実施形態では、Ｒａ及びＲｂはそれぞれメチルであり、Ｘ１及びＸ２はそれぞれＯであり、Ｒ１はポリエステルであり、Ｒ２はキトサンである。他の実施形態では、Ｒａ及びＲｂはそれぞれメチルであり、Ｘ１はＯであり、Ｘ２はＮであり、Ｒ１はポリエステルであり、Ｒ２はキトサンである。さらに他の実施形態では、Ｒａ及びＲｂはそれぞれメチルであり、Ｘ１及びＸ２はそれぞれＮであり、Ｒ１及びＲ２はキトサンである。
【０００７】
加水分解性架橋剤は、０．０５％〜１０％ｗ／ｗの範囲、例えば０．１％〜９％ｗ／ｗ、例えば０．５％〜８％ｗ／ｗ、例えば０．７５％〜７％ｗ／ｗ、例えば、１％〜５％ｗ／ｗの範囲の量で架橋共重合体ヒドロゲル中に存在し得る。主題のヒドロゲルを架橋するために採用されたプロトコルに応じて、架橋密度は変動し得る。ある特定の例では、ヒドロゲルは化学的架橋によって架橋される。そのため、架橋密度は、採用される化学的架橋剤の種類及び濃度に応じて変動し得る。あるいは、ヒドロゲルは光架橋されてもよく、架橋密度は、ヒドロゲル組成物と接触する電磁放射線の強さならびに照射期間に応じて変動し得る。本発明のいくつかの実施形態では、主題の架橋共重合体ヒドロゲルの架橋密度は、例えば１×１０−１５モル／ｃｍ３から１×１０−３モル／ｃｍ３の範囲であり得る。従って、架橋の量に応じて、主題のヒドロゲルの膨潤率は、例えば１〜３５の範囲で変動し得る。同様に、ヒドロゲルの圧縮弾性率は、例えば１ｋＰａ〜３５ｋＰａの範囲で変動し得る。
【０００８】
ある特定の実施形態では、本発明のヒドロゲルはフィブリノゲンをさらに含む。フィブリノゲンは、ヒドロゲルが架橋される前後でヒドロゲル組成物に組み込まれ得る。例えば、いくつかの例では、フィブリノゲンはヒドロゲル前駆体組成物に添加される。フィブリノゲンは、０．０５％〜５０％ｗ／ｗの範囲、例えば０．１％〜４５％ｗ／ｗ、例えば０．５％〜４０％ｗ／ｗ、例えば０．７５％〜３５％ｗ／ｗ、例えば１％〜３０％、例えば２％〜２０％、例えば５％〜１５％、例えば、１０％ｗ／ｗの範囲の量で架橋共重合体ヒドロゲル中に存在し得る。
【０００９】
主題の架橋共重合体ヒドロゲルが一種または複数種の吸収された生理活性剤を含む場合、ヒドロゲルはある特定の放出プロファイルを達成するように合成され得る。いくつかの実施形態では、本発明が提供する架橋共重合体ヒドロゲルは、一種または複数種の生理活性剤を生理的条件下にて実質的に０次放出速度で放出するように構成される。他の実施形態では、主題の架橋共重合体ヒドロゲルは、一種または複数種の生物学的製剤を生理的条件下にて実質的に一次放出速度で放出するように構成される。さらに他の実施形態では、主題の架橋共重合体ヒドロゲルは、一種または複数種の生理活性剤を生理的条件下にて実質的に二次放出速度で放出するように構成される。ある特定の実施形態では、主題の架橋共重合体ヒドロゲルは、１）一種または複数種の吸収された生理活性剤が、第一所定速度でヒドロゲルから放出される第一期間；及び２）一種または複数種の吸収された生理活性剤が、第二所定速度でヒドロゲルから放出される第二期間を含む放出プロファイルを有するように構成される。
【００１０】
本発明の態様は、主題の架橋共重合体ヒドロゲルを調製するための方法も含む。いくつかの実施形態では、本方法は、キトサンを含む組成物を、ポリエステルを含む組成物と接触させて、キトサンとポリエステルとの共重合体を生成すること、その後、該共重合体を、一種または複数種の加水分解性架橋剤を含む組成物と接触させて、架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体を生成することを含む。他の実施形態では、本方法は、キトサン及びフィブリノゲンを含む組成物を、ポリエステルを含む組成物と接触させて、キトサンとポリエステルとの共重合体を生成すること、その後、該共重合体を、一種または複数種の加水分解性架橋剤を含む組成物と接触させて、架橋性共重合体フィブリノゲンヒドロゲル前駆体組成物を生成することを含む。その後、該架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体を、共重合体ヒドロゲルを架橋するのに十分な様式で架橋条件に供して、キトサン−ポリエステル−フィブリノゲンヒドロゲルを生成する。ポリエステルがポリラクチドの場合、本方法は、キトサンを含む組成物を、ポリラクチドを含む組成物と接触させて、キトサンとポリラクチドとの共重合体を生成すること、その後、キトサン−ポリラクチド共重合体を、一種または複数種の加水分解性架橋剤を含む組成物と接触させて、架橋性キトサン−ポリラクチドヒドロゲル前駆体を生成することを含む。いくつかの実施形態では、キトサン−ポリラクチド共重合体は、キトサン及びポリラクチド重合体間の一または複数のエステル及びアミド結合を含む。次いで、架橋性キトサン−ポリラクチド共重合体ヒドロゲル前駆体を、キトサン−ポリラクチド共重合体ヒドロゲルを架橋するのに十分な様式で架橋条件に供する。主題の架橋共重合体ヒドロゲルが一種または複数種の吸収された生理活性剤をさらに含む実施形態では、本方法は、架橋共重合体ヒドロゲルを一種または複数種の生理活性剤を含む組成物と、該生理活性剤を該架橋共重合体ヒドロゲル内に封入するまたは吸収させるのに十分な様式で接触させることをさらに含んでよい。あるいは、一種または複数種の生理活性剤は、架橋共重合体ヒドロゲル内に、架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体が生理活性剤の存在下で架橋されて組み込まれた生理活性剤を有する架橋共重合体ヒドロゲルを生成する原位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）調製によって、組み込まれ得る。
【００１１】
本発明の態様は、主題の架橋共重合体ヒドロゲルを使用するための方法も含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の一または複数の架橋共重合体ヒドロゲルを標的部位へと投与することによって、一種または複数種の生理活性剤を送達するまたは対象の組織（または骨）の成長を促進するための方法を含む。ある特定の例では、一または複数の主題の架橋ヒドロゲルを対象の鼓膜に、鼓膜穿孔などの鼓膜における病状を処置するのに十分な様式で投与することを含む。従って、主題のヒドロゲルは実質的に細胞適合性であり、生理的条件下で非毒性副産物へと分解される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】キトサン、キトサン／ラクチド（Ｃｈ／ＬＡ）、及びキトサン／ラクチド／無水メタクリル酸（Ｃｈ／ＬＡ／ＭＡ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例を示す。
【図２】キトサン、キトサン／ラクチド（Ｃｈ／ＬＡ）、及びキトサン／ラクチド／無水メタクリル酸（Ｃｈ／ＬＡ／ＭＡ）のＦＴＩＲスペクトル例を示す。
【図３】３０秒のＵＶ照射によって作製された凍結乾燥されたキトサンヒドロゲル（ａ〜ｂ）；３００秒のＵＶ照射によって作製された凍結乾燥されたキトサンヒドロゲル（ｃ〜ｄ）；３０秒のＵＶ照射によって作製された凍結乾燥されたキトサン−ラクチド（１：１）ヒドロゲル（ｅ〜ｆ）；３００秒のＵＶ照射によって作製された凍結乾燥されたキトサン−ラクチド（１：１）ヒドロゲル（ｇ〜ｈ）の断面の走査型電子顕微鏡写真例を示す。試料を３７℃で１日間インキュベートし、１０ｋＶ電圧で行われる走査型電子顕微鏡（日立Ｓ−３４００Ｎ  ＶＰ  ＳＥＭ）下での検査の前に一晩凍結乾燥させた。（バー＝１００または２００μｍ）。
【図４】キトサンのラクチドに対する異なる比を有する架橋共重合体ヒドロゲルの圧縮弾性率の測定値の例を示す。架橋性共重合体前駆体溶液を６．９ｍＷ／ｃｍ２のＵＶ光に、（ａ）３０秒間；（ｂ）１２０秒間；（ｃ）３００秒間曝露した。一軸圧縮試験を、１０Ｎロードセルを備えたインストロン５９４４材料試験システムを使用して行った。圧縮弾性率は、応力−ひずみ曲線の直線での曲線近似から１０〜２０％のひずみ範囲について決定された。各値は平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。＊は、同一のＵＶ曝露時間の群間での有意差を示す（ｐ＜０．０５）。
【図５ａ】（ａ）ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中での、３７℃で１５日間にわたるヒドロゲルのインビトロ分解の例を示す。ヒドロゲルの分解プロファイルを、各時点でのヒドロゲルの湿重量残存率を測定することによって決定した。各値は平均±ＳＤ（ｎ＝４）を表す。
【図５ｂ】（ｂ）リゾチーム（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中での、３７℃で１５日間にわたるヒドロゲルのインビトロ分解の例を示す。ヒドロゲルの分解プロファイルを、各時点でのヒドロゲルの湿重量残存率を測定することによって決定した。各値は平均±ＳＤ（ｎ＝４）を表す。
【図６】１５日間のインキュベーションにわたる、キトサン−ラクチドヒドロゲルからのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のインビトロ累積放出プロファイルの例を示す。ＢＳＡをプレポリマー溶液へと直接添加して均質な溶液を形成し、次いで６．９ｍＷ／ｃｍ２のＵＶ光に（ａ）３０秒間；及び（ｂ）３００秒間曝露した。ヒドロゲルから放出されたＢＳＡの累積量を、経過時間に関して５６０ｎｍでのビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイによって決定した。各値は平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。
【図７ａ】Ｗ−２０−１７前骨芽細胞マウス骨髄間質細胞（ｐｒｅｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  ｍｏｕｓｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ）を使用した、ヒドロゲルの細胞毒性試験に関するデータを示す。（ａ）ＭＴＳアッセイを介したＷ−２０−１７の生存能。細胞を６０，０００個の細胞／ウェルの密度でウェルプレートの底に播種し、ヒドロゲルを、培養培地と共に上部チャンバーに配置した。１日間及び３日間インキュベートした後、生存細胞の数を定性的及び定量的に決定した（倍率＝１０倍）。各値は平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。＊は、１日間培養したものと比較した有意差を示す（ｐ＜０．０５）。
【図７ｂ】Ｗ−２０−１７前骨芽細胞マウス骨髄間質細胞を使用した、ヒドロゲルの細胞毒性試験に関するデータを示す。（ｂ）Ｗ−２０−１７の形態の顕微鏡写真。細胞を６０，０００個の細胞／ウェルの密度でウェルプレートの底に播種し、ヒドロゲルを、培養培地と共に上部チャンバーに配置した。１日間及び３日間インキュベートした後、生存細胞の数を定性的及び定量的に決定した（倍率＝１０倍）。
【図７ｃ】Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞を使用した、ヒドロゲルの細胞毒性試験に関するデータを示す。（ｃ）ＭＴＳアッセイを介したＣ２Ｃ１２の生存能。細胞を６０，０００個の細胞／ウェルの密度でウェルプレートの底に播種し、ヒドロゲルを、培養培地と共に上部チャンバーに配置した。１日間及び３日間インキュベートした後、生存細胞の数を定性的及び定量的に決定した（倍率＝１０倍）。各値は平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。＊は、１日間培養したものと比較した有意差を示す（ｐ＜０．０５）。
【図７ｄ】Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞を使用した、ヒドロゲルの細胞毒性試験に関するデータを示す。（ｄ）Ｃ２Ｃ１２の形態の顕微鏡写真。細胞を６０，０００個の細胞／ウェルの密度でウェルプレートの底に播種し、ヒドロゲルを、培養培地と共に上部チャンバーに配置した。１日間及び３日間インキュベートした後、生存細胞の数を定性的及び定量的に決定した（倍率＝１０倍）。
【図８ａ】ヒドロゲルから放出された骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）が、Ｗ−２０−１７細胞のＡＬＰ活性に及ぼす効果を示す。（ａ）Ｗ−２０−１７のＡＬＰ染色。細胞を２４ウェルのプレートに６０，０００個の細胞／ウェルの密度で播種し、５日間培養した（倍率＝１０倍）。
【図８ｂ】ヒドロゲルから放出された骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）が、Ｗ−２０−１７細胞のＡＬＰ活性に及ぼす効果を示す。（ｂ）Ｗ−２０−１７におけるＡＬＰの組織化学的半定量。細胞を２４ウェルのプレートに６０，０００個の細胞／ウェルの密度で播種し、５日間培養した（倍率＝１０倍）。各値は平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。＊は、群間の有意差を示す（ｐ＜０．０５）。
【図８ｃ】ヒドロゲルから放出された骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）が、Ｃ２Ｃ１２細胞のＡＬＰ活性に及ぼす効果を示す。（ｃ）Ｃ２Ｃ１２のＡＬＰ染色。細胞を２４ウェルのプレートに６０，０００個の細胞／ウェルの密度で播種し、５日間培養した（倍率＝１０倍）。
【図８ｄ】ヒドロゲルから放出された骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）が、Ｃ２Ｃ１２細胞のＡＬＰ活性に及ぼす効果を示す。（ｄ）Ｃ２Ｃ１２におけるＡＬＰの組織化学的半定量。細胞を２４ウェルのプレートに６０，０００個の細胞／ウェルの密度で播種し、５日間培養した（倍率＝１０倍）。各値は平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。＊は、群間の有意差を示す（ｐ＜０．０５）。
【図９ａ】ＢＭＰ−２が、（ａ）Ｗ−２０−１７細胞におけるカルシウム鉱質沈着に及ぼす効果を示す。細胞層内の鉱質の存在をアリザリンレッドＳ染色溶液で１０日目と２１日目に染色した。赤色領域及び小塊は、細胞層内のカルシウム鉱質についてのＡＲ−Ｓ陽性染色を実証する（倍率１０倍）。
【図９ｂ】ＢＭＰ−２が、（ｂ）Ｃ２Ｃ１２細胞におけるカルシウム鉱質沈着に及ぼす効果を示す。細胞層内の鉱質の存在をアリザリンレッドＳ染色溶液で１０日目と２１日目に染色した。赤色領域及び小塊は、細胞層内のカルシウム鉱質についてのＡＲ−Ｓ陽性染色を実証する（倍率１０倍）。
【図９ｃ】カルシウム鉱質の含有量を、１０日目と２１日目での（ｃ）Ｗ−２０−１７細胞の細胞層からのアリザリンレッドＳ染色抽出物から定量的に決定した。脱染アリザリンレッドＳ濃度を４０５ｎｍの吸光度で決定し、μｇ／ｍｌとして表した。各値は平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。＊は、同じ時点での群間の有意差を示す（ｐ＜０．０５）。＊＊は、１０日間培養したものと比較した有意差を示す（ｐ＜０．０５）。
【図９ｄ】カルシウム鉱質の含有量を、１０日目と２１日目での（ｄ）Ｃ２Ｃ１２細胞の細胞層からのアリザリンレッドＳ染色抽出物から定量的に決定した。脱染アリザリンレッドＳ濃度を４０５ｎｍの吸光度で決定し、μｇ／ｍｌとして表した。各値は平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。＊は、同じ時点での群間の有意差を示す（ｐ＜０．０５）。＊＊は、１０日間培養したものと比較した有意差を示す（ｐ＜０．０５）。
【図１０】本発明の特定の実施形態に従いキトサン−ラクチド共重合体ヒドロゲルを移植されたラット大腿骨部分欠損モデルを示す。図１０は、キトサン−ラクチドヒドロゲルを圧入した６ｍｍ重篤サイズのラット大腿骨欠損を示す。これは、特定の実施形態に従い、前もって製作された（ｐｒｅｆａｂｒｉｃａｔｅｄ）、ＢＭＰ−２を含むキトサン−ラクチドヒドロゲルが、インビボでラットの部分欠損に安定して組み込まれることができることを実証する。それゆえ、主題の架橋共重合体ヒドロゲルは、外科的圧入のために十分であるものを含む、任意のサイズ及び形状、質感（例えば、粘着性）、弾性、柔軟性に好適である。
【図１１】本発明の特定の実施形態に係る、キトサン−ラクチド共重合体ヒドロゲルを移植されたラット大腿骨部分欠損モデルの移植から２週間後及び４週間後のＸ線画像例を示す。
【図１２】図１２（ａ）は、本発明の特定の実施形態に係る、キトサン−ラクチド共重合体ヒドロゲルを移植されたラット大腿骨部分欠損モデルの移植から４週間後のマイクロコンピュータ断層撮影画像例を示す。（ｂ）は、骨の体積対移植されたキトサン−ラクチド共重合体ヒドロゲルのサイズを示す。
【図１３】本発明の特定の実施形態に係る、架橋共重合体ヒドロゲルを用いた心臓再生のためのヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）の送達を示す。
【図１４】本発明の特定の実施形態に係る、架橋共重合体ヒドロゲルを用いた心臓再生のためのヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）の送達を示す。インビボでの検討は、免疫応答性マウスを使用した細胞生存率（ＢＬＩ）を示した。マトリゲル対成長因子を含まない本発明の実施形態に係る架橋キトサン−ラクチド共重合体ヒドロゲルを群に含む。細胞数は、５×１０５個の細胞／試料であった。
【図１５】本発明の別の実施形態に係る、心臓再生のためのヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）の送達を示す。インビボでの検討は、免疫応答性マウスを使用した細胞生存率（ＢＬＩ）を示した。マトリゲル対成長因子を含まない本発明の特定の実施形態に係る架橋キトサン−ラクチド共重合体ヒドロゲル、成長因子ＢＭＰ−４を含む架橋キトサン−ラクチド共重合体ヒドロゲル、及びＥＧＦ−１を含む架橋キトサン−ラクチド共重合体ヒドロゲルを群に含む。細胞数は、５×１０５個の細胞／試料であった。
【図１６】本発明の特定の実施形態に係るソフト架橋共重合体ヒドロゲルにおけるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の毛細血管形成を示すインビトロでの検討を示す。
【図１７】本発明の特定の実施形態に係る、種々の圧縮弾性率の架橋共重合体ヒドロゲルにおける、ヒト臍帯静脈内皮細胞の毛細血管形成の速度に及ぼす分解効果のインビトロでの検討を示す。
【図１８】本発明の特定の実施形態に係る架橋共重合体ヒドロゲルにおける、ヒト臍帯静脈内皮細胞のネットワーク形成及び毛細血管形成に及ぼす分解のインビトロでの検討を示す。ヒドロゲルの分解は毛細血管形成及び退縮に影響した。
【図１９】本発明の特定の実施形態に係るヒト臍帯静脈内皮細胞におけるネットワーク形成に及ぼす架橋共重合体ヒドロゲルの効果のインビトロでの検討を示す。
【図２０】本発明の特定の実施形態に係る架橋共重合体ヒドロゲルにおけるヒト臍帯静脈内皮細胞の毛細血管形成の維持のインビトロでの検討を示す。
【図２１】本発明の特定の実施形態に係る架橋キトサン−ラクチド共重合体ヒドロゲルを使用した鼓膜穿孔（ＴＭＰ）の閉鎖を示す。
【図２２】架橋キトサン−ラクチドヒドロゲルを使用した鼓膜穿孔（ＴＭＰ）の閉鎖を示す。０日目及び９日目において対照試料で得られた結果を、本発明の実施形態に係る架橋キトサン−ラクチド共重合体ヒドロゲルで得られた結果と比較して示す。
【図２３】図２３ａは、キトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲル（点線円）の配置後の重篤サイズのラット大腿骨欠損のデジタル顕微鏡写真例を示す。図２３ｂは、キトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルを手術直後に移植された骨欠損の放射線画像例を示す。
【図２４】キトサン−ポリラクチドの前駆体溶液及びキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンのＦＴＩＲスペクトル例を示す。
【図２５】図２５ａ〜ｄは、試料を３７℃で１日間インキュベートし、５ｋＶ電圧で行われる走査型電子顕微鏡（ＦＥＩ  ＸＬ３０  Ｓｉｒｉｏｎ  ＳＥＭ）下での検査の前に一晩凍結乾燥した特定の実施形態に係る走査型電子顕微鏡写真例を示す。図２５ａは、キトサン−ポリラクチド共重合体ヒドロゲルについての断面の顕微鏡写真例を示す。図２５ｂは、キトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルについての断面の顕微鏡写真例を示す。図２５ｃは、キトサン−ポリラクチド共重合体ヒドロゲルの高倍率顕微鏡写真例を示す。図２５ｄは、キトサン−ポリラクチド−フィブリノゲン共重合体ヒドロゲルの高倍率顕微鏡写真例を示す。
【図２６】図２６ａ〜ｂは、一軸圧縮試験を、１０Ｎロードセルを備えたインストロン５９４４材料試験システムを使用して行った本発明の特定の実施形態に係るヒドロゲルの圧縮弾性率の棒グラフを示す。圧縮弾性率は応力−ひずみ曲線の直線での曲線近似から１０〜２０％のひずみ範囲について決定された。各値は平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。＊は、同一のＵＶ曝露時間の群間での有意差を示す（ｐ＜０．０５）。図２６ａは、キトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルの圧縮弾性率に及ぼす異なるＵＶ曝露時間の効果を示す。図２６ｂは、キトサン−ポリラクチドフィブリノゲンヒドロゲルの圧縮弾性率に及ぼすフィブリノゲンの効果を示す。
【図２７】図２７ａ〜ｄは、様々な時点でのヒドロゲルの湿潤残存率を測定することによって決定された特定の実施形態に係るヒドロゲルのインビトロ分解プロファイルを示す。各値は平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。図２７ａは、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）におけるヒドロゲルのインビトロ分解プロファイルを示す。図２７ｂは、ＰＢＳ（ｐＨ４）におけるヒドロゲルのインビトロ分解プロファイルを示す。図２７ｃは、リゾチームを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）におけるヒドロゲルのインビトロ分解プロファイルを示す。図２７ｄは、３７℃、２８日間でのコラゲナーゼＡ（１ｍｇ／ｍＬ）を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）におけるヒドロゲルのインビトロ分解プロファイルを示す。
【図２８】図２８ａ〜ｂは、４５０ｎｍでのＢＭＰ−２イムノアッセイによる４週間にわたる経過時間に関して決定された特定の実施形態に係るキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルからのＢＭＰ−２のインビトロ累積放出プロファイルを示す。ＢＭＰ−２の濃度は１０または１００ｎｇ／ｍＬであった。各値は平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。図２８ａは、累積放出量を示す。図２８ｂは、累積放出率（％）を示す。
【図２９ａ】特定の実施形態に係るＷ−２０−１７前骨芽細胞マウス骨髄間質細胞の存在下でのヒドロゲルの細胞毒性を図示する。細胞を３０，０００個の細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートの底に播種し、ヒドロゲルを、培養培地と共に上部チャンバーに配置した。１日間及び３日間インキュベートした後、生存細胞の数を定性的及び定量的に決定した（倍率＝１０倍）。各値は平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。＊は、１日間培養したものと比較した有意差を示す（ｐ＜０．０５）。図２９ａは、ＭＴＳアッセイを介したＷ−２０−１７の生存能を示す。
【図２９ｂ】特定の実施形態に係るＣ２Ｃ１２マウス筋芽細胞の存在下でのヒドロゲルの細胞毒性を図示する。細胞を３０，０００個の細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートの底に播種し、ヒドロゲルを、培養培地と共に上部チャンバーに配置した。１日間及び３日間インキュベートした後、生存細胞の数を定性的及び定量的に決定した（倍率＝１０倍）。各値は平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。＊は、１日間培養したものと比較した有意差を示す（ｐ＜０．０５）。図２９ｂは、ＭＴＳアッセイを介したＣ２Ｃ１２の生存能を示す。
【図２９ｃ】特定の実施形態に係るＷ−２０−１７前骨芽細胞マウス骨髄間質細胞の存在下でのヒドロゲルの細胞毒性を図示する。細胞を３０，０００個の細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートの底に播種し、ヒドロゲルを、培養培地と共に上部チャンバーに配置した。１日間及び３日間インキュベートした後、生存細胞の数を定性的及び定量的に決定した（倍率＝１０倍）。図２９ｃは、Ｗ−２０−１７の形態の顕微鏡写真を示す。
【図２９ｄ】特定の実施形態に係るＣ２Ｃ１２マウス筋芽細胞の存在下でのヒドロゲルの細胞毒性を図示する。細胞を３０，０００個の細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートの底に播種し、ヒドロゲルを、培養培地と共に上部チャンバーに配置した。１日間及び３日間インキュベートした後、生存細胞の数を定性的及び定量的に決定した（倍率＝１０倍）。図２９ｄは、Ｃ２Ｃ１２の形態の顕微鏡写真を示す。
【図３０】図３０ａ〜ｂは、特定の実施形態に係るキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルから放出されたＢＭＰ−２の用量がアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性の誘導に及ぼす効果を示す。異なる濃度のＢＭＰ−２（０、５０、１００、または５００ｎｇ／ｍｌ）をＣＬＦヒドロゲルへと添加した。ＡＬＰ活性を培養の７日目に決定し、ｄｓＤＮＡ含有量について正規化した。ＡＬＰ活性をｎｍｏｌ／ｎｇとして表す。各値は平均±ＳＤ（各群につきｎ＝３）を表す。＊は、各群の７日間培養したものと比較した有意差を示す（ｐ＜０．０５）。図３０ａは、キトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルから放出されたＢＭＰ−２の用量がＷ−２０−１７細胞におけるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性の誘導に及ぼす効果を示す。図３０ｂは、キトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルから放出されたＢＭＰ−２の用量がＣ２Ｃ１２細胞におけるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性の誘導に及ぼす影響を示す。
【図３１ａ】特定の実施形態に係るキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲン（ｆｉｒｂｉｎｏｇｅｎ）ヒドロゲルから放出されたＢＭＰ−２の用量がカルシウム鉱質沈着に及ぼす効果を示す。異なる濃度のＢＭＰ−２（０、５０、１００、または５００ｎｇ／ｍｌ）をＣＬＦヒドロゲルに添加した。細胞層内の鉱質の存在を、アリザリンレッドＳ（ＡＲ−Ｓ）染色溶液で１０日目及び２１日目に染色した。赤色領域及び小塊は、細胞層内のカルシウム鉱質についてのＡＲ−Ｓ陽性染色を実証する（倍率１０倍）。カルシウム鉱質の含有量をまた、１０日目と２１日目の細胞層からのアリザリンレッドＳ染色抽出物から定量的に決定した。脱染アリザリンレッドＳ濃度を４０５ｎｍの吸光度で決定し、μｇ／ｍｌとして表した。各値は平均±ＳＤ（各群につきｎ＝３）を表す。各値は平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。＊は、同じ時点での群間の有意差を示す（ｐ＜０．０５）。＊＊は、異なる時点での同一群間の有意差を示す（ｐ＜０．０５）。図３１ａは、キトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルから放出されたＢＭＰ−２の用量がＷ−２０−１７細胞におけるカルシウム鉱質沈着に及ぼす効果を示す。
【図３１ｂ】特定の実施形態に係るキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲン（ｆｉｒｂｉｎｏｇｅｎ）ヒドロゲルから放出されたＢＭＰ−２の用量がカルシウム鉱質沈着に及ぼす効果を示す。異なる濃度のＢＭＰ−２（０、５０、１００、または５００ｎｇ／ｍｌ）をＣＬＦヒドロゲルに添加した。細胞層内の鉱質の存在を、アリザリンレッドＳ（ＡＲ−Ｓ）染色溶液で１０日目及び２１日目に染色した。赤色領域及び小塊は、細胞層内のカルシウム鉱質についてのＡＲ−Ｓ陽性染色を実証する（倍率１０倍）。カルシウム鉱質の含有量をまた、１０日目と２１日目の細胞層からのアリザリンレッドＳ染色抽出物から定量的に決定した。脱染アリザリンレッドＳ濃度を４０５ｎｍの吸光度で決定し、μｇ／ｍｌとして表した。各値は平均±ＳＤ（各群につきｎ＝３）を表す。各値は平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。＊は、同じ時点での群間の有意差を示す（ｐ＜０．０５）。＊＊は、異なる時点での同一群間の有意差を示す（ｐ＜０．０５）。図３１ｂは、キトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルから放出されたＢＭＰ−２の用量がＣ２Ｃ１２細胞のカルシウム鉱質沈着に及ぼす効果を示す。
【図３２】第２週及び第４週でとられた、異なる濃度のＢＭＰ−２（０、０．５、１、２、または５μｇ）を含有する特定の実施形態に係るキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルを移植された骨欠損の放射線画像例を示す。
【図３３】図３３ａは、第４週での、異なる濃度のＢＭＰ−２（０、０．５、１、２、または５μｇ）を含有する特定の実施形態に係るキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルを移植された骨欠損のマイクロコンピュータ断層撮影画像例を示す。図３３ｂは、骨欠損内での再生された骨体積の定量を示し、ここで（＊）は０μｇのＢＭＰ−２を含む対照ＣＬＦヒドロゲル群と比較した有意差を示す（ｐ＜０．０５）。
【図３４】図３４ａ〜ｂは、異なる濃度のＢＭＰ−２（０、０．５、１、２、または５μｇ）を含有する特定の実施形態に係るキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルで処置されたラット重篤サイズ大腿骨欠損の組織学的解析を示す。骨欠損から組織学的断面を外科手術の４週間後にとり、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。図３４ａは、ヘマトキシリン・エオジンでの低倍率（１０倍）画像を示す。図３４ｂは、高倍率（２００倍）で、欠損部位での骨梁骨形成を示す。
【図３５】本発明の特定の実施形態に係る移植から４週間後の、吸収性コラーゲンスポンジ及び２μｇのＢＭＰ−２を含有するキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルの移植後の骨欠損の放射線画像を示す。
【図３６】本発明の特定の実施形態に係る移植から８週間後の、吸収性コラーゲンスポンジ及び２μｇのＢＭＰ−２を含有するキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルの移植後の骨欠損の放射線画像を示す。
【図３７】本発明の特定の実施形態に係る移植から１２週間後の、吸収性コラーゲンスポンジ及び２μｇのＢＭＰ−２を含有するキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルの移植後の骨欠損の放射線画像を示す。
【図３８】本発明の特定の実施形態に係る、第４週及び第１２週でマイクロＣＴによって決定された再生された骨密度の定量化を示す。
【図３９】本発明の特定の実施形態に係る、第４週及び第１２週でマイクロＣＴによって決定された再生された骨体積の定量化を示す。
【図４０】本発明の特定の実施形態に係る、破損までのトルク（ｔｏｒｑｕｅ  ｔｏ  ｆａｉｌｕｒｅ）によって測定された骨の機械的特性を図示する。
【図４１】特定の実施形態に係るキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルの聴性脳幹反応及び歪成分耳音響放射を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
詳細な説明
本発明の態様は、架橋共重合体ヒドロゲル組成物を含む。特定の実施形態に係る、本発明の架橋共重合体ヒドロゲル組成物は、キトサンとポリエステルとの共重合体、及び加水分解性架橋剤を含む。本発明のヒドロゲルは、キトサンとポリエステルとの共重合体、加水分解性架橋剤及び組み込まれたフィブリノゲンも含む。主題の発明は、一種または複数種の吸収された生理活性剤を含む架橋共重合体ヒドロゲルを有する組成物も記載する。本発明の架橋共重合体ヒドロゲルを調製及び使用するための方法も記載する。
【００１４】
本発明をより詳細に記載する前に、本発明は記載の特定の実施形態に、それ自体が当たり前に変動し得るために、限定されないことが理解されたい。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定され得るため、本明細書で使用される用語は単に特定の実施形態を説明することを目的とし、限定を意図しないことも理解されたい。
【００１５】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値と下限値との間にある値は、文脈が明らかに別段の指定する場合を除き、下限値の単位の１０分の１までの各中間値、及びその記述された範囲のその他のあらゆる記述された値又は中間値は、本発明の範囲内に包含されると理解される。これらのより小さな範囲の上限値と下限値は、記述された範囲内の全ての明示的に除外された限界値に従うことを条件として、独立して小さな範囲に含めることができるとされ、本発明にも包含される。記述された範囲が限界値の一方または両方を含む場合、これらに含まれた限界値のいずれかまたは両方を除く範囲もまた、本発明に包含される。
【００１６】
別段の定義がない限り、本明細書中で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法及び材料を、本発明の実施または試験においても使用することができるが、代表的な例示的方法及び材料を以下に記載する。
【００１７】
本明細書に引用される全ての刊行物及び特許は、あたかも個々の刊行物または特許がその参照により具体的にかつ個々に組み込まれることが示されるかのように、その参照により本明細書に組み入れられ、引用した刊行物に関連した方法及び／または材料を開示し説明するために、その参照により本明細書に組み込まれる。いかなる刊行物の引用も出願日前のその開示を目的としており、先行発明を理由として、本発明が、これらの刊行物に先行する権利を有しないことを認めると解釈すべきではない。さらに、提供される公開日が実際の公開日とは異なることがあり、これは個別に確認する必要があり得る。
【００１８】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される、単数形（「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」）は、文脈上明確に別途指示しない限り複数の言及を含むことに留意されたい。さらに特許請求の範囲は、任意の選択的要素を除外するために起草されている場合があることにさらに留意されたい。このように、この記載は、特許請求要素の記述もしくは、「否定」による限定の利用に関連して、「単独」、「のみ」などの排他的用語の使用の先行詞としての役割を果たすことを意図する。
【００１９】
この開示を読めば当業者に明らかであり得るように、本明細書に記載及び図示される個々の実施形態の各々は、個別の部品や機能を備えており、本発明の範囲もしくは趣旨から逸脱することなく、これは他のいくつかの実施形態の特徴と容易に分離でき、もしくはそれらと組み合わせることができる。いずれの記載された方法も、記載された事象の順序によって、もしくは論理的に可能な任意の他の順序によって、実施することができる。
【００２０】
上記に記載するように、本発明は架橋共重合体ヒドロゲル組成物を提供する。さらに記載する本発明の実施形態では、架橋剤、及び一種または複数種の吸収された生理活性剤を含む主題の架橋共重合体ヒドロゲルを有する組成物を有する架橋共重合体ヒドロゲルを、まず、より詳細に記載する。次に、主題の架橋共重合体ヒドロゲル及び架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体を調製及び使用するための方法を記載する。一または複数のまたは主題の架橋共重合体ヒドロゲルを含むキットも記載する。
【００２１】
架橋共重合体ヒドロゲル
上記に概説したように、本発明は架橋剤を有する架橋共重合体ヒドロゲルを提供する。用語「ヒドロゲル」は、溶媒（例えば、水）を吸収し、測定可能な溶解は起こさずに膨潤し、可逆的変形が可能な三次元ネットワークを維持する材料を指す、その通常の意味で用いられる。本明細書にいう「膨潤」とは、水分子がヒドロゲルの内部容積全体に拡散する際の、ヒドロゲル構造体の等方性の膨張を意味する。主題の架橋共重合体ヒドロゲルは疎水性成分及び親水性成分を含むが、当該ヒドロゲルは水に溶解しない。主題の架橋共重合体ヒドロゲルは親水性成分（すなわち、キトサン）及び疎水性成分（すなわち、ポリラクチドなどのポリエステル）の両方を含む。そのため、以下により詳細に説明するように、各成分の量、各成分の比または特定の成分の密度を変化させることにより、本発明の架橋共重合体ヒドロゲルの特性を所望通りに変えることができる。本明細書において、ヒドロゲルとの用語はその通常の意味で用いられ、脱水されたヒドロゲル及び水和した（例えば、溶媒で膨潤した）ヒドロゲルの両方を包含し得る。
【００２２】
本発明の架橋共重合体ヒドロゲルは、キトサン成分及びポリエステル成分を有する共重合体を含む。主題の架橋共重合体のキトサン成分とは、ランダムに分布するβ−（１−４）結合したＤ−グルコサミン及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンサッカライド単位からなる直鎖状多糖をいう。いくつかの実施形態において、キトサンマクロマーは、ポリエステル成分と共重合する前には、未修飾のキトサンを含む。用語「未修飾のキトサン」とは、化学構造を増強するためあるいはそれとは別に変化させるための如何なる方法での化学的な誘導または修飾もなされていないキトサンを指す、通常の意味で用いられる。従って、未修飾キトサンとは、硫酸化、アセチル化、グリコシル化、リン酸化、ポリマー連結（ポリエチレングリコールとの連結を含む）などによる、如何なる外来の残基を含むようにも修飾されていない、ランダムに分布するβ−（１−４）結合したＤ−グルコサミン及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンサッカライド単位からなる直鎖状多糖をいう。他の実施形態において、キトサンマクロマーは、ポリエステル成分との重合前には、キトサンの誘導体であってもよい。例えば、キトサンの誘導体としては、Ｎ−アルキルキトサン、アシル化キトサン、カルボキシメチルキトサン、リン酸化キトサン、Ｎ−（アミノアルキル）キトサン、スクシニルキトサン及びオクタノイルキトサンを挙げることができるが、これらに限定されない。従って、主題の架橋共重合体ヒドロゲルを製造するために用いられるキトサンとしては、式
2016525374.tif 000004
（式中、ＲＡ、ＲＢ、ＲＣ、及びＲＤのそれぞれは、独立に水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、及びシアノより選択され、
ｎは１〜５０００の整数であり、かつ
ｍは１〜５０００の整数である）
を有するオリゴマーを挙げることができる。
【００２３】
キトサン成分は、所望のヒドロゲルの特性（例えば、親水性、機械的特性、分解速度、タンパク質放出速度論）に応じて多様な分子量を有してもよく、０．５ｋＤａ以上、例えば１ｋＤａ以上、例えば１．５ｋＤａ以上、例えば２．５ｋＤａ以上、例えば５ｋＤａ以上、例えば７．５ｋＤａ以上、例えば１０ｋＤａ以上、例えば１２．５ｋＤａ以上、例えば１５ｋＤａ以上、例えば２０ｋＤａ以上、例えば、２５ｋＤａ以上であってよい。同様に、本発明のヒドロゲル中のキトサンの量は多様であり得る。例えば、キトサンは、主題の架橋共重合体ヒドロゲル中に１％〜９９％ｗ／ｗの範囲、例えば２％〜９５％ｗ／ｗ、例えば５％〜９０％ｗ／ｗ、例えば１０％〜９０％ｗ／ｗ、例えば１５％〜８５％ｗ／ｗ、例えば２０％〜８０％ｗ／ｗ、例えば２５％〜７５％ｗ／ｗ、例えば３０％〜７０％ｗ／ｗ、例えば、３５％〜６５％ｗ／ｗの範囲の量で存在してもよい。
【００２４】
本発明の架橋共重合体ヒドロゲル中の共重合体はポリエステル成分も含む。用語「ポリエステル」は、本明細書中で、その主鎖中にエステル官能基を含有するポリマーのカテゴリーを指す、その通常の意味で用いられる。対象とするポリエステルは、多くのポリエステルポリマーの中で特に、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリエチレンアジペート（ＰＥＡ）、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシバレレート）（ＰＨＢＶ）などの脂肪族ポリエステル、またはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリトリメチレンテレフタレート（ＰＴＴ）、ポリトリメチレンテレフタレート（ＰＴＴ）及びポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）などの芳香族ポリエステルであってよい。
【００２５】
ある実施形態において、本発明の架橋共重合体ヒドロゲル中のポリエステル成分はポリラクチドである。用語「ポリラクチド」は、本明細書中において、以下のスキームに図解するように、乳酸モノマーの縮合またはラクチドの（例えば、金属触媒による）触媒開環重合により形成される脂肪族ポリエステルを指す、その通常の意味で用いられる。
2016525374.tif 000005
【００２６】
上記ポリエステル成分は、例えば、ラジカル重合、光分解、酸化還元反応、電離放射線、電気分解又は他のプロトコルによるなどの、任意の利便なプロトコルによってキトサンと共重合させることができる。ある実施形態において、上記ポリエステル（例えば、ポリラクチド）は、以下により詳細に記載されるように、２−エチルヘキサン酸スズ（ＩＩ）及びトリエチルアミンを用いた反応によりキトサンと共重合される。上記ポリエステル成分は、反応条件、重合開始剤等に応じて、任意の利用可能な反応性残基で、共有結合によりキトサンに結合することができる。いくつかの場合において、本発明の架橋共重合体ヒドロゲルは、キトサンとポリエステルとの間に一または複数のアミド結合を含む。他の例においては、共重合体ヒドロゲルは、キトサンとポリエステルとの間に一または複数のエステル結合を含む。更に他の例においては、共重合体ヒドロゲルは、キトサンとポリエステルとの間に一または複数のアミド結合及び一または複数のエステル結合を含む。ポリエステル成分がポリラクチド（ＰＬＡ）であるいくつかの実施形態においては、上記共重合体は、式
2016525374.tif 000006
（式中、ｎは１〜５０００の整数であり、
ｍは1〜５０００の整数である）
の構造を含んでもよい。
【００２７】
他の実施形態において、上記キトサン−ポリラクチド共重合体は、式
2016525374.tif 000007
（式中、ｎは１〜５０００の整数であり、
ｍは１〜５０００の整数である）
の構造を含んでもよい。
【００２８】
更に他の実施形態において、上記キトサン−ポリラクチド共重合体は、式
2016525374.tif 000008
の構造を含んでもよい。
【００２９】
主題の架橋共重合体ヒドロゲル中の上記ポリエステル成分は、所望のヒドロゲルの特性（例えば、親水性、機械的特性、分解速度、生理活性剤放出速度論）に応じて多様な分子量を有してもよく、０．５ｋＤａ以上、例えば１ｋＤａ以上、例えば１．５ｋＤａ以上、例えば２．５ｋＤａ以上、例えば５ｋＤａ以上、例えば７．５ｋＤａ以上、例えば１０ｋＤａ以上、例えば１２．５ｋＤａ以上、例えば１５ｋＤａ以上、例えば２０ｋＤａ以上、例えば、２５ｋＤａ以上であってよい。同様に、本発明のヒドロゲル中のポリエステル（例えば、ポリラクチド）の量は多様であり得る。例えば、上記ポリエステルは、主題の架橋共重合体ヒドロゲル中に１％〜９９％ｗ／ｗの範囲、例えば２％〜９５％ｗ／ｗ、例えば５％〜９０％ｗ／ｗ、例えば１０％〜９０％ｗ／ｗ、例えば１５％〜８５％ｗ／ｗ、例えば２０％〜８０％ｗ／ｗ、例えば２５％〜７５％ｗ／ｗ、例えば３０％〜７０％ｗ／ｗ、例えば、３５％〜６５％ｗ／ｗの範囲の量で存在してもよい。
【００３０】
上記ポリエステル成分（例えば、ポリラクチド）は上記ヒドロゲルに対して疎水性を付与し、上記キトサン成分は親水性を付与し、それぞれの成分の比は、所望の物理化学及び活性薬剤放出速度論を得るために変えることができる。キトサン成分の生体適合性、タンパク質親和性及び分解性を、ポリエステル成分の制御可能な物性及び機械的特性と組み合わせて、所望の特性のバランスを有する架橋共重合体ヒドロゲルを生成することができる。キトサン成分のポリエステル成分に対する比を変えることにより、所望の物理化学及び活性薬剤放出速度論を有する架橋共重合体ヒドロゲルを得ることができる。以下により詳細に説明するように、キトサン成分及びポリエステル成分の比を変えることにより、調整可能な生体適合性、圧縮弾性率、膨潤率、分解性、細孔径及び活性薬剤放出速度論を容易に得ることができた。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態において、主題のヒドロゲル中におけるキトサン対ポリエステルの比は、いくつかの実施形態において、１０：１から９．５：１の間、９．５：１から９：１の間、９：１から８．５：１の間、８．５：１から８：１の間、８：１から７．５：１の間、７．５：１から７：１の間、７：１から６．５：１の間、６．５：１から６：１の間、６：１から５．５：１の間、５．５：１から５：１の間、５：１から４．５：１の間、４．５：１から４：１の間、４：１から３．５：１の間、３．５：１から３：１の間、３：１から２．５：１の間、２．５：１から２：１の間、２：１から１．５：１の間、１．５：１から１：１の間の範囲で、またはそれらの範囲で多様であり得る。例えば、キトサン成分対ポリエステル成分の質量比は、１０：１〜１：１の範囲、例えば８：１〜１：１、例えば５：１〜１：１、例えば４：１〜１：１、例えば、２：１〜１：１の範囲であってよい。ある例において、キトサン対ポリエステルの比は１：１である。
【００３２】
例えば、いくつかの実施形態において、上記ポリエステルはポリラクチドであり、キトサン成分対ポリラクチド成分の比は８：１であってよい。他の実施形態において、キトサン成分対ポリラクチド成分の比は４：１であってよい。更に他の実施形態において、キトサン成分対ポリラクチド成分の比は２：１であってよい。ある実施形態において、キトサン成分対ポリラクチド成分の比は１：１であってよい。
【００３３】
他の実施形態において、主題のヒドロゲル中のキトサン対ポリエステルの比は、いくつかの実施形態において、１：１から１：１．５の間、１：１．５から１：２の間、１：２から１：２．５の間、１：２．５から１：３の間、１：３から１：３．５の間、１：３．５から１：４の間、１：４から１：４．５の間、１：４．５から１：５の間、１：５から１：５．５の間、１：５．５から１：６の間、１：６から１：６．５の間、１：６．５から１：７の間、１：７から１：７．５の間、１：７．５から１：８の間、１：８から１：８．５の間、１：８．５から１：９の間、１：９から１：９．５の間、１：９．５から１：１０の間の範囲で、またはそれらの範囲で多様であり得る。例えば、キトサン対ポリエステルの比は、１：１〜１：１０の範囲、例えば１：１〜１：８、例えば１：１〜１：５、例えば１：１〜１：４、例えば、１：１〜１：２の範囲であってよい。
【００３４】
本発明により提供される架橋共重合体ヒドロゲルは１ｋＤａ以上、例えば２ｋＤａ以上、例えば３ｋＤａ以上、例えば５ｋＤａ以上、例えば１０ｋＤａ以上、例えば１５ｋＤａ以上、例えば２０ｋＤａ以上、例えば２５ｋＤａ以上、例えば３０ｋＤａ以上、例えば４０ｋＤａ以上、例えば５０ｋＤａ以上、例えば６０ｋＤａ以上、例えば、７５ｋＤａ以上であってよい。
【００３５】
ある実施形態において、本発明の共重合体ヒドロゲルは更にフィブリノゲンを含む。フィブリノゲンとの用語は、脊椎動物の血液中に一般的に存在する、ヘパリン結合ドメインを有する可溶性六量体血漿糖タンパク質を指す、その通常の意味で用いられる。主題のヒドロゲルに取り込まれるフィブリノゲンの量は多様であり得る。例えば、フィブリノゲンは、主題の架橋共重合体ヒドロゲル中に０．０５％〜５０％ｗ／ｗの範囲、例えば０．１％〜４５％ｗ／ｗ、例えば０．５％〜４０％ｗ／ｗ、例えば０．７５％〜３５％ｗ／ｗ、例えば１％〜３０％ｗ／ｗ、例えば２％〜２０％ｗ／ｗ、例えば５％〜１５％ｗ／ｗ、例えば、１０％ｗ／ｗの範囲の量で存在してもよい。
【００３６】
フィブリノゲンは、任意の利便なインビトロまたはインビボプロトコルにより主題の架橋共重合体ヒドロゲル中に導入することができる。以下により詳細に説明するように、フィブリノゲンは、架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体組成物に添加されてもよく、該架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体をフィブリノゲンの存在下で架橋し、架橋共重合体ヒドロゲル内にフィブリノゲンを封入してもよい。あるいは、既に架橋された共重合体ヒドロゲル（例えば、架橋キトサン−ポリラクチド共重合体ヒドロゲル）を、溶媒を用いてまたは無溶媒で、フィブリノゲンの存在下、所定の時間、例えば、１時間以上、５時間以上、１０時間以上、１２時間以上、２４時間以上、３日以上、例えば、１週間以上インキュベートし、架橋共重合体ヒドロゲルがフィブリノゲンを架橋マトリックス中に取り込むようにしてもよい。更になお、フィブリノゲンを、共重合体ヒドロゲルの基となる構成成分の混合物（すなわち、キトサン成分、ポリエステル成分、架橋剤）に直接添加し、ヒドロゲルの製造の各段階（すなわち、共重合及び架橋）を通して、フィブリノゲンが最終的な架橋共重合体ヒドロゲルの架橋マトリクス中に取り込まれるようにしてもよい。
【００３７】
主題のヒドロゲルがフィブリノゲンを含む場合、主題のヒドロゲル中におけるキトサン−ポリエステル共重合体対フィブリノゲンの比は、いくつかの実施形態において、１０：１から９．５：１の間、９．５：１から９：１の間、９：１から８．５：１の間、８．５：１から８：１の間、８：１から７．５：１の間、７．５：１から７：１の間、７：１から６．５：１の間、６．５：１から６：１の間、６：１から５．５：１の間、５．５：１から５：１の間、５：１から４．５：１の間、４．５：１から４：１の間、４：１から３．５：１の間、３．５：１から３：１の間、３：１から２．５：１の間、２．５：１から２：１の間、２：１から１．５：１の間、１．５：１から１：１の間の範囲で、またはそれらの範囲で多様であり得る。例えば、キトサン−ポリエステル共重合体対フィブリノゲンの比は１０：１〜１：１の範囲、例えば８：１〜１：１、例えば５：１〜１：１、例えば４：１〜１：１、例えば、２：１〜１：１の範囲であってよい。ある例において、キトサン−ポリエステル共重合体対フィブリノゲンの比は１：１である。他の実施形態において、キトサン−ポリエステル共重合体対フィブリノゲンの比は、いくつかの実施形態において、１：１から１：１．５の間、１：１．５から１：２の間、１：２から１：２．５の間、１：２．５から１：３の間、１：３から１：３．５の間、１：３．５から１：４の間、１：４から１：４．５の間、１：４．５から１：５の間、１：５から１：５．５の間、１：５．５から１：６の間、１：６から１：６．５の間、１：６．５から１：７の間、１：７から１：７．５の間、１：７．５から１：８の間、１：８から１：８．５の間、１：８．５から１：９の間、１：９から１：９．５の間、１：９．５から１：１０の間の範囲で、またはそれらの範囲で多様であり得る。例えば、キトサン−ポリエステル共重合体対フィブリノゲンの比は１：１〜１：１０の範囲、例えば１：１〜１：８、例えば１：１〜１：５、例えば１：１〜１：４、例えば、１：１〜１：２の範囲であってよい。
【００３８】
いくつかの実施形態において、フィブリノゲンは活性薬剤のヒドロゲル中への取り込みを向上させ、ヒドロゲル中に取り込まれるフィブリノゲンの量を変更して、所望の物理化学及び活性薬剤放出速度論を達成することができる。以下により詳細に説明するように、主題のヒドロゲル中のフィブリノゲンの量を変えることにより、調整可能な機械的特性、分解性、活性薬剤の取り込み及び活性薬剤放出速度論を容易に得ることができた。
【００３９】
上記に概観したように、架橋共重合体ヒドロゲルは一種または複数種の架橋剤を含む。用語「架橋」は、主題の架橋共重合体ヒドロゲルの骨格成分（すなわち、キトサン成分及びポリエステル成分）間の物理的相互作用（例えば、疎水性相互作用によるなどの、分子間相互作用または絡み合い）または化学的相互作用（例えば、共有結合）を指す、その通常の意味で用いられる。
【００４０】
以下により詳細に議論するように、架橋の型式及び程度はヒドロゲルの構造、機械的特性（例えば、圧縮弾性率）、活性薬剤放出速度論、膨潤（すなわち、溶媒吸収）並びに分解を変える。いくつかの実施形態において、主題の架橋共重合体ヒドロゲルの架橋剤は加水分解性である。生理的条件下における架橋の加水分解は、本発明のヒドロゲルをより容易に生分解させ、インビボでのプロトコルに用いることができる。同様に、架橋することにより、当該ヒドロゲルを注射可能及び／または移植可能となるように適応させることができ、膜、スポンジ、ゲル、固体足場、紡糸繊維、織物又は不織メッシュ、ナノ粒子、ミクロ粒子、またはその他の所望の構成の形状をとる、ある実施形態において用いることができる。
【００４１】
いくつかの実施形態において、主題の架橋共重合体ヒドロゲルは、加水分解性の一種または複数種の架橋を含み、生理的条件下（例えば、インビボ）における当該ヒドロゲルの分解を可能にする。一例において、上記加水分解性架橋剤はアクリレート架橋剤である。これらの実施形態において、上記アクリレート架橋剤としては、アクリレート、メタクリレート、アクリル酸エチル、アクリル酸ブチル、メタクリル酸ブチル、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート及びポリ（エチレングリコール）ジメタクリレートを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。いくつかの例において、上記アクリレート架橋剤はメタクリレート架橋剤である。
【００４２】
ある態様において、本発明の架橋共重合体ヒドロゲルは、一または複数の加水分解性のエステル結合または加水分解性のアミド結合を含む。いくつかの実施形態において、主題の架橋共重合体ヒドロゲルは、式
2016525374.tif 000009
（式中、
Ｒａ及びＲｂはそれぞれ独立に、水素、アルキル及び置換アルキルより選択され、例えば、Ｒａ及びＲｂはそれぞれ水素であり、またはＲａ及びＲｂはそれぞれアルキルであり、またはＲａ及びＲｂはそれぞれメチルであり、またはＲａはアルキルでありＲｂは水素であり、またはＲａはメチルでありＲｂは水素であり、
Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立にＮ及びＯより選択され、例えば、Ｘ１及びＸ２はＮであり、またはＸ１及びＸ２はＯであり、またはＸ１はＯでありＸ２はＮであり、またはＸ１はＮでありＸ２はＯであり、かつ
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、キトサン及びポリエステルより選択され、例えば、Ｒ１はキトサンでありＲ２はポリエステルであり、またはＲ１はポリエステルでありＲ２はキトサンであり、またはＲ１及びＲ２はキトサンであり、またはＲ１及びＲ２は両方共ポリエステルである）
の架橋を含む。
【００４３】
一例において、主題の架橋共重合体ヒドロゲルは、式
2016525374.tif 000010
（式中、Ｒａ及びＲｂはそれぞれメチルであり、
Ｘ１及びＸ２はＯであり、
Ｒ１はポリラクチドであり、かつ
Ｒ２はキトサンである）
の架橋を含む架橋キトサン−ポリラクチド共重合体ヒドロゲルである。
【００４４】
第２の例において、主題の架橋共重合体ヒドロゲルは、式
2016525374.tif 000011
（式中、Ｒａ及びＲｂはそれぞれメチルであり、
Ｘ１はＯであり、
Ｘ２はＮであり、
Ｒ１はポリラクチドであり、かつ
Ｒ２はキトサンである）
の架橋を含む架橋キトサン−ポリラクチド共重合体ヒドロゲルである。
【００４５】
第３の例において、主題の架橋共重合体ヒドロゲルは、式
2016525374.tif 000012
（式中、Ｒａ及びＲｂはそれぞれメチルであり、
Ｘ１及びＸ２はＮであり、かつ
Ｒ１及びＲ２はキトサンである）
の架橋を含む架橋キトサン−ポリラクチド共重合体ヒドロゲルである。
【００４６】
上記架橋剤は、所望のヒドロゲルの特性（例えば、機械的特性、圧縮弾性率、分解速度、タンパク質放出速度論）に応じて多様な分子量を有してもよく、０．１ｋＤａ以上、例えば０．２５ｋＤａ以上、例えば０．５ｋＤａ以上、例えば０．７５ｋＤａ以上、例えば１ｋＤａ以上、例えば１．２５ｋＤａ以上、例えば１．５ｋＤａ以上、例えば２ｋＤａ以上、例えば２．５ｋＤａ以上、例えば３ｋＤａ以上、例えば、５ｋＤａ以上であってよい。同様に、本発明のヒドロゲル中の架橋剤の量は多様であり得る。例えば、架橋剤は、主題の架橋共重合体ヒドロゲル中に０．０５％〜３５％ｗ／ｗの範囲、例えば０．１％〜３０％ｗ／ｗ、例えば０．５％〜２５％ｗ／ｗ、例えば０．７５％〜２０％ｗ／ｗ、例えば１％〜１５％ｗ／ｗ、例えば１．５％〜１２．５％ｗ／ｗ、例えば、２％〜１０％ｗ／ｗの範囲の量で存在してもよい。
【００４７】
以下により詳細に議論するように、主題のヒドロゲルは、化学的に開始される架橋、光開始架橋並びに熱、圧力またはｐＨの変化によって開始される架橋を始めとする（但し、これらに限定されない）任意の利便な架橋プロトコルにより架橋することができる。
【００４８】
ある例において、主題の架橋共重合体ヒドロゲルは光架橋される。用語「光架橋される」は、本明細書において、上記共重合体を有する複数の架橋剤の間の反応を開始または触媒するために電磁放射線を用いることを指す、その通常の意味で用いられる。上記放射線は、紫外線放射線、α−型放射線、β−型放射線、γ放射線、電子線放射線、及びＸ線放射線を始めとする任意且つ適宜の電磁放射線であってよいが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、２００〜８００ｎｍ（例えば、２００〜４００ｎｍ）の波長を有する放射線が、主題の共重合体ヒドロゲルを光架橋するために用いられる。所望の架橋を達成するために不足のない電磁エネルギーを与えるのに十分である限りにおいて、任意の利便な電磁放射線源を用いることができる。例えば、照射がＵＶ光による場合、共重合体ヒドロゲルは、水銀アークランプ、キセノンランプ、固体レーザー、ガスレーザーまたはその他の利便な放射線源（例えば、太陽光）からのＵＶ光への曝露によって架橋することができる。
【００４９】
いくつかの実施形態における光架橋は光開始剤を用いる。「光開始剤」とは、電磁放射線（例えば、ＵＶ）に曝露された際に、一種または複数種の反応種（ラジカル、カルベン、カチオン、アニオン等）を生成する化合物を意味する。例えば、上記光開始剤は、ＵＶ照射に応答して一種または複数種のラジカル種を生成する化合物であって、数ある光開始剤の中でも、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、過酸化ベンゾイル、２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）、２−メチル−１−（４−メチルチオ）フェニル−２−モルホリニル−１−プロパノン、２−ベンジル−２−（ジメチルアミノ）−４'−モルホリノブチロフェノン、フェニルビス（２，４，６−トリメチルベンゾイル）ホスフィンオキシド、１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン及び４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル−（２−ヒドロキシ−２−プロピル）ケトンなどの上記化合物であってよい。好適な光増感剤としてはまた、ベンゾフェノン及び置換ベンゾフェノン；並びにベンジルジメチルケタール、４−アクリロキシベンゾフェノン（ＡＢＰ）、１−ヒドロキシ−シクロヘキシルフェニルケトン、２，２−ジエトキシアセトフェノン及び２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセト−フェノンなどのアセトフェノン；２−メチル−２−ヒドロキシプロピオフェノンなどの置換α−ケタール；ベンゾインメチルエーテル及びベンゾインイソプロピルエーテルなどのベンゾインエーテル；アニソインメチルエーテルなどの置換ベンゾインエーテル；２−ナフタレンスルホニルクロリドなどの芳香族スルホニルクロリド；１−フェニル−１，２−プロパンジオン−２−（Ｏ−エトキシ−カルボニル）−オキシムなどの光活性オキシム；２−イソプロピルチオキサントン、２−クロロチオキサントン、２，４−ジメチルチオキサントン、２，４−ジクロロチオキサントン、及び２，４−ジエチルチオキサントンなどのアルキル及びハロゲン置換チオキサントンを始めとするチオキサントン；並びにアシルホスフィンオキシドなどの「水素引抜き」型の三重項増感剤が挙げられる。
【００５０】
いくつかの実施形態において、主題の架橋共重合体ヒドロゲルは、架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体組成物（すなわち、キトサンとポリエステルとの共重合体、該共重合体に共有結合した一種または複数種の架橋剤、及び以下により詳細に説明する光開始剤架橋剤）にＵＶ光を照射することにより光架橋される。上記ＵＶ光の強度は、所望の架橋密度及び用いる光開始剤の種類に応じて多様であってもよく、１ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば１．５ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば２ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば２．５ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば３ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば３．５ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば４ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば４．５ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば５ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば６ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば７ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば８ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば１０ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば１５ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば２０ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば、２５ｍＷ／ｃｍ２以上であってよい。
【００５１】
放射線の強度並びに所望の架橋共重合体ヒドロゲルの機械的及び物理化学的特性に応じて、任意且つ適宜の照射継続時間を用いることができる。例えば、いくつかの実施形態において、架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体組成物は、６ｍＷ／ｃｍ２から７ｍＷ／ｃｍ２の間の範囲の強度を有するＵＶ光を、１秒〜１０００秒の範囲、例えば１０秒〜９００秒、例えば３０秒〜８００秒、例えば４５秒〜７５０秒、例えば６０秒〜６００秒、例えば１２０秒〜４５０秒、例えば、２００秒〜３００秒の範囲の継続時間照射されてもよい。他の実施形態において、架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体組成物は、６ｍＷ／ｃｍ２から７ｍＷ／ｃｍ２の間の範囲の強度を有するＵＶ光を、３０秒以下、例えば２５秒以下、例えば２０秒以下の間照射されてもよく、例えば、ＵＶ光を１５秒以下の間照射されてもよい。更に他の実施形態において、架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体組成物は、６ｍＷ／ｃｍ２から７ｍＷ／ｃｍ２の間の範囲の強度を有するＵＶ光を、３０秒以上、例えば４５秒以上、例えば６０秒以上、例えば７５秒以上、例えば１００秒以上、例えば１２０秒以上、例えば１５０秒以上、例えば１８０秒以上、例えば２１０秒以上、例えば２４０秒以上、例えば２７０秒以上の間照射されてもよく、例えば、ＵＶ光を３００秒以上の間照射されてもよい。
【００５２】
より長い照射の継続時間により、主題の共重合体ヒドロゲルの架橋密度が増加する一方、より短い照射の継続時間により、架橋密度がより低くなる。より大きな膨潤率、より高い圧縮弾性率、より低い機械的強度、より高い圧縮弾性率及びより短い分解期間が所望されるいくつかの実施形態においては、架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体はより短い時間照射されてもよい。例えば、これらの実施形態においては、架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体組成物は、６ｍＷ／ｃｍ２から７ｍＷ／ｃｍ２の間の範囲の強度を有するＵＶ光を、３０秒以下、例えば２５秒以下、例えば２０秒以下の間照射されてもよく、例えば、ＵＶ光を１５秒以下の間照射されてもよい。より小さい膨潤率、より高い機械的強度、より低い圧縮弾性率またはより長い分解期間が所望される場合においては、架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体はより長い時間照射されてもよい。例えば、これらの実施形態においては、架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体は、６ｍＷ／ｃｍ２から７ｍＷ／ｃｍ２の間の範囲の強度を有するＵＶ光を、６０秒以上、例えば７５秒以上、例えば１００秒以上、例えば１２０秒以上、例えば１５０秒以上、例えば１８０秒以上、例えば２１０秒以上、例えば２４０秒以上、例えば２７０秒以上の間照射されてもよく、例えば、ＵＶ光を３００秒以上の間照射されてもよい。
【００５３】
他の実施形態において、主題のヒドロゲルの架橋は化学的に開始される。「化学的に開始される」とは、共重合体ヒドロゲルの架橋が、一種または複数種の反応種（ラジカル、カルベン、カチオン、アニオン等）を始めとする（但し、これらには限定されない）化学物質によって開始されることを意味する。例えば、好適な化学的開始剤としては、過酸化物、脂肪族アゾ化合物などのフリーラジカルを生成する開始剤、三フッ化ホウ素等の酸形成開始剤などの正荷電種を生成する開始剤、金属アミド、金属アルコキシド、金属水酸化物、金属シアニド、ホスフィン、アミン、並びにアルキルリチウム化合物、チーグラー触媒またはグリニヤール試薬等の有機金属化合物などの負荷電種を生成する開始剤を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。化学的架橋剤の量は、主題のヒドロゲル組成物を、（以下に説明する）所望の架橋密度まで架橋するのに十分な利便な量であってよい。
【００５４】
ある例において、主題の架橋共重合体ヒドロゲルは熱によって架橋される。熱架橋に関しては、熱的に活性化されるラジカル重合開始剤が用いられ、該開始剤は、重合に通常用いられる任意且つ公知のフリーラジカル生成開始剤とすることができる。例えば、好適な開始剤としては、主題の共重合体ヒドロゲルの約０．０１ｗｔ％〜１５ｗｔ％の範囲、例えば０．０５ｗｔ％〜１０ｗｔ％、例えば約０．１ｗｔ％〜約５ｗｔ％、例えば、約０．５ｗｔ％〜約４ｗｔ％の範囲の量などの、有機過酸化物及びアゾ化合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好適な有機過酸化物としては、ｔ−ブチルペルオキシド及び２，２−ビス（ｔ−ブチルペルオキシ）プロパンなどのジアルキルペルオキシド；ベンゾイルペルオキシド及びアセチルペルオキシドなどのジアシルペルオキシド；ｔ−ブチルペルベンゾエート及びｔ−ブチルペル−２−エチルヘキサノエートなどのペルエステル；ジセチルペルオキシジカーボネート及びジシクロヘキシルペルオキシジカーボネートなどのペルジカーボネート；シクロヘキサノンペルオキシド及びメチルエチルケトンペルオキシドなどのケトンペルオキシド；並びにクメンヒドロペルオキシド及びｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドなどのヒドロペルオキシドを挙げることができる。好適なアゾ化合物としては、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）及びアゾビス−（２，４−ジメチルバレロニトリル）を挙げることができる。主題の共重合体ヒドロゲルの架橋の化学的開始に関連して用いられる温度は、所望に応じて、５０℃〜２００℃の範囲、例えば６０℃〜１９０℃、例えば７５℃〜１８０℃、例えば８０℃〜１７０℃、例えば８５℃〜１６０℃、例えば９０℃〜１５５℃の範囲で、例えば、５０℃〜１００℃の範囲、例えば５０℃〜９０℃、例えば５０℃〜８５℃、例えば５０℃〜７５℃の範囲で、例えば、５０℃〜７０℃の範囲で多様であり得る。
【００５５】
主題の架橋共重合体ヒドロゲルの物理化学的特性（例えば、膨潤挙動）、機械的特性（例えば、圧縮弾性率）、分解速度並びに活性薬剤放出速度論は、存在する架橋の量を変えることによって調整することができる。例えば、架橋のパーセンテージは、例えば約２重量％〜約４５重量％、例えば約３重量％〜４０重量％、例えば４重量％〜３５重量％、例えば、約５重量％〜３０重量％を含む、約１重量％から約５０重量％の間で多様であり得る。例えば、架橋のパーセンテージを増加させることにより、主題の架橋共重合体ヒドロゲルの分解速度を低下させることができる。同様に、架橋のパーセンテージを増加させることにより、架橋共重合体ヒドロゲルの圧縮弾性率を高めることができる。更になお、架橋のパーセンテージを低下させることにより、主題の架橋共重合体ヒドロゲルの膨潤率を高めることができる。従って、所望の機械的及び物理化学的特性に応じて、主題の架橋共重合体ヒドロゲルは１×１０−１５モル／ｃｍ３〜１×１０−３モル／ｃｍ３の範囲、例えば１×１０−１４モル／ｃｍ３〜１×１０−３モル／ｃｍ３、例えば１×１０−１３モル／ｃｍ３〜１×１０−３モル／ｃｍ３、例えば１×１０−１２モル／ｃｍ３〜１×１０−３モル／ｃｍ３、例えば１×１０−１１モル／ｃｍ３〜１×１０−３モル／ｃｍ３、例えば１×１０−１０モル／ｃｍ３〜１×１０−３モル／ｃｍ３、例えば１×１０−９モル／ｃｍ３〜１×１０−３モル／ｃｍ３、例えば１×１０−８モル／ｃｍ３〜１×１０−３モル／ｃｍ３、例えば１×１０−１１モル／ｃｍ３〜１×１０−７モル／ｃｍ３、例えば、１×１０−６モル／ｃｍ３〜１×１０−３モル／ｃｍ３の範囲の架橋密度を有してもよい。
【００５６】
上述のように、主題の架橋共重合体ヒドロゲルの物理化学的及び機械的特性並びに活性薬剤放出速度論は、ヒドロゲルの構造に応じて多様であり得る。本発明の架橋共重合体はヒドロゲルであることから、主題の組成物は、生理的条件下（例えば、血液または血漿と接触している）で溶媒（例えば、水）を吸収し膨潤する。本明細書にいう用語「膨潤」とは、溶媒（例えば、水）分子がヒドロゲルの内部容積全体に拡散する際の、ヒドロゲル構造体の等方性（または異方性）の膨張を意味する。架橋共重合体ヒドロゲルの構造（例えば、キトサンのポリエステルに対する比、架橋密度）に応じて、膨潤率は多様であり得る。「膨潤率」とは、式
膨潤率＝（Ｗｓ−Ｗｄ）／Ｗｄ
（式中、Ｗｓは膨潤したヒドロゲルの重量であり、Ｗｄはヒドロゲルの乾燥重量である）によって決定される、溶媒吸収後のヒドロゲルの重量の、当該ヒドロゲルの乾燥重量に対する比を意味する。いくつかの実施形態において、主題の架橋共重合体ヒドロゲルの膨潤率は３〜３０の範囲、例えば４〜２７、例えば５〜２５、例えば６〜２０、例えば７〜１８、例えば８〜１７、例えば９〜１６の範囲であり、例えば、５〜１５の範囲の膨潤率である。
【００５７】
同様に、主題の架橋共重合体ヒドロゲルの圧縮弾性率は、当該ヒドロゲルの組成に応じて多様であり得る。圧縮弾性率とは、主題の架橋共重合体ヒドロゲルが軸方向の圧縮力に対する耐久力を意味し、当該材料が完全に損なわれる（例えば、潰れる）際に到達する一軸圧縮応力の値である。いくつかの実施形態において、主題の架橋共重合体ヒドロゲルの圧縮弾性率は１ｋＰａ〜３５ｋＰａの範囲、例えば２ｋＰａ〜３３ｋＰａ、例えば３ｋＰａ〜３０ｋＰａ、例えば４ｋＰａ〜２８ｋＰａ、例えば５ｋＰａ〜２５ｋＰａ、例えば６ｋＰａ〜２２ｋＰａ、例えば７ｋＰａ〜２０ｋＰａの範囲であり、例えば、１０ｋＰａ〜２０ｋＰａの範囲の圧縮弾性率である。
【００５８】
主題の架橋共重合体ヒドロゲルの細孔径もまた、当該ヒドロゲルの構造（例えば、架橋密度、フィブリノゲン含有量）に応じて多様であり得る。いくつかの実施形態において、主題の架橋共重合体ヒドロゲルの細孔径は、０．１ミクロン〜１０００ミクロンの範囲、例えば０．５ミクロン〜９００ミクロン、例えば１ミクロン〜８００ミクロン、例えば５ミクロン〜７５０ミクロン、例えば１０ミクロン〜６００ミクロン、例えば２５ミクロン〜５００ミクロン、例えば５０ミクロン〜４００ミクロン、例えば、１００ミクロン〜３００ミクロンの範囲である。
【００５９】
いくつかの実施形態において、主題の架橋共重合体ヒドロゲルは生分解性であり（すなわち、分解して無毒の構成成分を生成する）、生理的条件下での本発明の共重合体ヒドロゲルの分解速度は、構造及び組成（例えば、キトサンのラクチドに対する比、架橋密度、フィブリノゲン含有量）に応じて多様であり得る。いくつかの実施形態において、主題の架橋共重合体ヒドロゲルは、生理的条件下（例えば、インビボ）で、所定の期間にわたって、例えば０．５日以上、例えば１日以上、例えば２日以上、例えば５日以上、例えば７日以上、例えば１０日以上、例えば１４日以上、例えば２１日以上、例えば２８日以上、例えば７０日以上、例えば、１００日以上にわたって分解するように構造的に設計される。他の実施形態において、本発明の架橋共重合体ヒドロゲルは、生理的条件に曝露される際に、所定の速度で、例えば実質的にゼロ次分解速度、例えば実質的に一次分解速度、例えば、実質的に二次分解速度で分解するように構成される。
【００６０】
いくつかの実施形態において、本発明の態様は、主題の架橋共重合体ヒドロゲル内に吸着または吸収された一種または複数種の生理活性剤を更に含み、ここで、該架橋共重合体ヒドロゲルは、主題の架橋共重合体ヒドロゲルを移植すること、移植片を該架橋共重合体ヒドロゲルで被覆すること、該架橋共重合体ヒドロゲルを摂取することなどにより、上記一種または複数種の生理活性剤を投与部位に送達するように構成される。（例えば、骨移植、血管移植）。
【００６１】
本発明の実施形態に係る好適な生理活性剤としては、多くの種類の生理活性剤の中でも、インターフェロン；インターロイキン；エリスロポエチン；顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）；幹細胞因子（ＳＣＩ：）；レプチン（ＯＢタンパク質）；インターフェロン（α、β、γ）；バンコマイシン、ゲンタマイシン、シプロフロキサシン、アモキシシリン、乳酸菌、セフォタキシム、レボフロキサシン、セフェピム、メベンダゾール、アンピシリン、乳酸菌、クロキサシリン、ノルフロキサシン、チニダゾール、セフポドキシム、プロキセチル、アジスロマイシン、ガチフロキサシン、ロキシスロマイシン、セファロスポリンなどの抗生物質；抗血栓剤；アスピリン；チクロピジン；スルフィンピラゾン；ヘパリン；ワルファリン；成長因子；分化因子；肝細胞刺激因子；形質細胞腫増殖因子；グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；神経栄養因子３（ＮＴ３）；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）；形質転換成長因子（ＴＧＦ）；血小板形質転換成長因子；乳成長因子；内皮成長因子；内皮細胞由来成長因子（ＥＣＤＧＦ）；α−内皮成長因子；β−内皮成長因子；神経栄養成長因子；神経成長因子（ＮＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；４−１ＢＢレセプター（４−ＩＢＢＲ）；ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）；アルテミン（ＧＦＲα３−ＲＥＴのリガンド）；ＢＣＡ−Ｉ（Ｂ細胞誘因性ケモカイン）；Ｂリンパ球化学誘引物質（ＢＬＣ）；Ｂ細胞成熟タンパク質（ＢＣＭＡ）；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）などの骨成長因子；骨由来成長因子；トロンボポエチン；巨核球由来増殖因子（ＭＤＧＦ）；ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；ニューロトロフィン４（ＮＴ４）；顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）；マクロファージコロニー刺激因子（ｍＣＳＦ）；骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）；ＢＲＡＫ；Ｃ−ＩＯ；カルジオトロフィン１（ＣＴ１）；ＣＣＲ８；抗炎症剤：パラセタモール、サルサレート、ジフルニサル、メフェナム酸、ジクロフェナク、ピロキシカム、ケトプロフェン、ジピロン、アセチルサリチル酸；アリトレチノイン、アルトレタミン、アナストロゾール、アザチオプリン、ビカルタミド、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、エキセメスタン、ビンクリスチン、ビノレルビンなどの抗がん剤；ホルモン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）、プロラクチン、黄体刺激性ホルモン（ＬＴＨ）、乳腺刺激ホルモン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、メラニン濃縮ホルモン（ＭＣＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨｂ）、成長ホルモン（ＨＧＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨｂ）；ハロペリドール；インドメタシン；ドキソルビシン；エピルビシン；アムホテリシンＢ；タキソール；シクロホスファミド；シスプラチン；メトトレキサート；ピレン；アンホテリシンＢ；抗ジスキネジア剤；アルツハイマーワクチン；抗パーキンソン剤；イオン；エデト酸；栄養素；グルココルチコイド；ヘパリン；抗凝血剤；抗ウイルス剤；抗ＨＩＶ剤；ポリアミン；ヒスタミン及びその誘導体；シスチンアミン（ｃｙｓｔｉｎｅａｍｉｎｅ）及びその誘導体；ジフェンヒドラミン及び誘導体；オルフェナドリン及びその誘導体；ムスカリン性アンタゴニスト；フェノキシベンザミン及びその誘導体；タンパク質Ａ；ストレプトアビジン；アミノ酸；β−ガラクトシダーゼ；メチレンブルー；プロテインキナーゼ；β−アミロイド；リポ多糖類；真核生物の開始因子４Ｇ；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；腫瘍壊死因子結合タンパク質（ＴＮＦ−ｂｐ）；インターロイキン−１（〜１８）受容体アンタゴニスト（ＩＬ−Ｉｒａ）；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；新規赤血球生成刺激タンパク質（ＮＥＳＰ）；トロンボポエチン；組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）；ウロキナーゼ；ストレプトキナーゼ；カリクレイン；インスリン；ステロイド；アセトアミノフェン；鎮痛剤；抗腫瘍製剤；抗がん製剤；抗増殖製剤またはアポトーシス促進製剤を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
いくつかの実施形態において、上記一種または複数種の吸収された生理活性剤は、走化性物質、細胞付着媒介物質、インテグリン結合配列、上皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、ヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン関連ペプチド、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、転写因子、増殖分化因子（ＧＤＦ）、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ８、組換えヒト成長因子、軟骨由来形態形成タンパク質（ＣＤＭＰ）、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２及びＣＤＭＰ−３からなる群より選択される化合物である。ある例において、主題の親水性−疎水性架橋共重合体ヒドロゲルは、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）を含む。更に他の例において、主題のヒドロゲルは、ヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）を含む。ある実施形態において、上記生理活性剤は、ヘパリン結合内皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）ではない。
【００６３】
本発明のキトサン−ポリエステルヒドロゲル及びキトサン−ポリエステル−フィブリノゲンヒドロゲルに取り込まれる生理活性剤の量は、送達の継続期間、適用部位並びに治療を受ける疾病に依存することとなる。いくつかの実施形態において、主題のヒドロゲルに取り込まれる生理活性剤の量は、０．０００１μｇ以上、例えば０．００１μｇ以上、例えば０．０１μｇ以上、例えば０．１μｇ以上、例えば１μｇ以上、例えば１０μｇ以上、例えば２５μｇ以上、例えば５０μｇ以上、例えば１００μｇ以上、例えば５００μｇ以上、例えば１０００μｇ以上、例えば５０００μｇ以上、例えば、１０，０００μｇ以上である。上記生理活性剤が液体としてヒドロゲル中に取り込まれる場合、生理活性剤の濃度は、０．０００１μｇ／ｍＬ以上、例えば０．００１μｇ／ｍＬ以上、例えば０．０１μｇ／ｍＬ以上、例えば０．１μｇ／ｍＬ以上、例えば０．５μｇ／ｍＬ以上、例えば１μｇ／ｍＬ以上、例えば２μｇ／ｍＬ以上、例えば５μｇ／ｍＬ以上、例えば１０μｇ／ｍＬ以上、例えば２５μｇ／ｍＬ以上、例えば５０μｇ／ｍＬ以上、例えば１００μｇ／ｍＬ以上、例えば５００μｇ／ｍＬ以上、例えば１０００μｇ／ｍＬ以上、例えば５０００μｇ／ｍＬ以上、例えば、１０，０００μｇ／ｍＬ以上であってよい。
【００６４】
本発明のキトサン−ポリエステルヒドロゲル及びキトサン−ポリエステル−フィブリノゲンヒドロゲルがＢＭＰ−２を含む場合、主題のヒドロゲル中に取り込まれるＢＭＰ−２の量は、送達の継続期間、治療を受ける疾病及び適用部位に依存して多様であり得、例えば０．０００１μｇ以上、例えば０．００１μｇ以上、例えば０．０１μｇ以上、例えば０．１μｇ以上、例えば１μｇ以上、例えば１０μｇ以上、例えば２５μｇ以上、例えば５０μｇ以上、例えば１００μｇ以上、例えば５００μｇ以上、例えば１０００μｇ以上、例えば５０００μｇ以上、例えば、１０，０００μｇ以上である。例えば、ＢＭＰ−２は、０．０００１μｇ／ｍＬ以上の濃度で、例えば０．００１μｇ／ｍＬ以上、例えば０．０１μｇ／ｍＬ以上、例えば０．１μｇ／ｍＬ以上、例えば０．５μｇ／ｍＬ以上、例えば１μｇ／ｍＬ以上、例えば２μｇ／ｍＬ以上、例えば５μｇ／ｍＬ以上、例えば１０μｇ／ｍＬ以上、例えば２５μｇ／ｍＬ以上、例えば５０μｇ／ｍＬ以上、例えば１００μｇ／ｍＬ以上、例えば５００μｇ／ｍＬ以上、例えば１０００μｇ／ｍＬ以上、例えば５０００μｇ／ｍＬ以上、例えば、１０，０００μｇ／ｍＬ以上の濃度で主題のヒドロゲル中に取り込まれていてよい。ある実施形態において、ＢＭＰ−２は１μｇ〜１０μｇの範囲、例えば１．５μｇ〜９．５μｇ、例えば２μｇ〜９μｇ、例えば３μｇ〜８μｇ、例えば、４μｇ〜７μｇの範囲の量で、主題のヒドロゲル中に取り込まれる。
【００６５】
上記一種または複数種の生理活性剤は、任意の利便なインビトロまたはインビボでのプロトコルにより、主題の架橋共重合体ヒドロゲル中に導入することができる。以下により詳細に説明するように、上記一種または複数種の生理活性剤を架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体組成物に添加し、上記一種または複数種の生理活性剤の存在下で該架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体を架橋し、該生理活性剤を架橋共重合体ヒドロゲル内に封入してもよい。あるいは、既に架橋された共重合体ヒドロゲル（例えば、架橋キトサン−ポリラクチド共重合体ヒドロゲル）を、溶媒を用いてまたは無溶媒で、上記一種または複数種の生理活性剤の存在下、所定の時間、例えば、１時間以上、５時間以上、１０時間以上、１２時間以上、２４時間以上、３日以上、例えば、１週間以上インキュベートし、架橋共重合体ヒドロゲルが上記一種または複数種の生理活性剤を架橋マトリックス中に取り込むようにしてもよい。更になお、上記一種または複数種の生理活性剤を、共重合体ヒドロゲルの基となる構成成分の混合物（すなわち、キトサン成分、ポリエステル成分、架橋剤）に直接添加し、ヒドロゲルの製造の各段階（すなわち、共重合及び架橋）を通して、上記一種または複数種の生理活性剤が最終的な架橋共重合体ヒドロゲルの架橋マトリクス中に取り込まれるようにしてもよい。
【００６６】
用いられる特定の架橋共重合体ヒドロゲルの構造（例えば、キトサンのラクチドに対する比、架橋密度、フィブリノゲン含有量等）に応じて、上記一種または複数種の生理活性剤の架橋共重合体ヒドロゲルマトリクスからの放出は多様であり得る。例えば、本発明の架橋共重合体ヒドロゲルは、上記一種または複数種の生理活性剤を持続的に放出するまたはパルス状に放出するように構成されてもよい。
【００６７】
「持続放出（持続的に放出する）」とは、上記架橋共重合体ヒドロゲルが、該架橋共重合体ヒドロゲルが投与部位（例えば、骨移植片）と接触した状態に維持される全ての時間、例えば１日以上にわたって、例えば２日以上、例えば５日以上、例えば１０日以上、例えば１５日以上、例えば３０日以上、例えば、１００日以上にわたって、一定且つ連続的に上記一種または複数種の生理活性剤を送達するように構築されている（例えば、キトサンのポリエステル（ポリラクチド）に対する比、架橋密度）ことを意味する。例えば、ある例において、上記生理活性剤はＢＭＰ−２であり、キトサン−ラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルは、当該生物学的高分子を、７日間以上の期間、例えば１４日間以上、例えば２１日間以上、例えば、２８日間以上、持続的に放出するように構成されてもよい。
【００６８】
他の例において、本発明の架橋共重合体ヒドロゲルは、上記一種または複数種の生理活性剤をパルス状に放出するように構成される。「パルス状の放出（パルス状に放出する）」とは、架橋共重合体ヒドロゲルが、上記一種または複数種の生理活性剤を投与部位中に、漸増的に（例えば、不連続の時間に）、例えば１時間毎に、例えば２時間毎に、例えば５時間毎に、例えば１２時間毎に、例えば２４時間毎に、例えば３６時間毎に、例えば４８時間毎に、例えば７２時間毎に、例えば９６時間毎に、例えば１２０時間毎に、例えば１４４時間毎に、例えば、１６８時間毎に放出するように構成されることを意味する。
【００６９】
他の例において、主題の架橋共重合体ヒドロゲルは、あるパーセンテージの当該主題の共重合体ヒドロゲルが分解した後に、上記一種または複数種の生理活性剤を送達するように構成される。例えば、投与部位において、１０％の主題の共重合体ヒドロゲルの架橋が分解した後毎に、例えば１５％の主題の共重合体ヒドロゲルの架橋が分解した後毎に、例えば２０％の主題の共重合体ヒドロゲルの架橋が分解した後毎に、例えば２５％の主題の共重合体ヒドロゲルの架橋が分解した後毎に、例えば３０％の主題の共重合体ヒドロゲルの架橋が分解した後毎に、例えば、３３％の主題の共重合体ヒドロゲルの架橋が分解した後毎に、ある量の一種または複数種の生理活性剤が送達されてもよい。
【００７０】
更に他の例において、本発明の架橋共重合体ヒドロゲルは、（疼痛を急速に低減するなどのために）投与部位への接触に際して直ちに、例えば５０％以上、例えば６０％以上、例えば７０％以上、例えば、９０％以上の一種または複数種の生理活性剤が、投与部位への接触に際して直ちに放出されることを含む、多量の上記一種または複数種の生理活性剤を放出するように構成されてもよい。更に他の例において、本発明の架橋共重合体ヒドロゲルは、所定の速度で、例えば実質的にゼロ次放出速度で、例えば実質的に一次放出速度で、または実質的に二次放出速度で、一種または複数種の生理活性剤を放出するように構成されてもよい。
【００７１】
ある実施形態において、本発明の架橋共重合体ヒドロゲルは、生理活性剤の放出プロファイルであって、
当該生理活性剤が、架橋共重合体ヒドロゲルから第１の所定の速度で放出される第１の期間と、
当該生理活性剤が、架橋共重合体ヒドロゲルから第２の所定の速度で放出される第２の期間と
を含む、上記放出プロファイルを与えるように構成される。
【００７２】
例えば、これらの実施形態において、上記第１の期間は、当該共重合体ヒドロゲルの投与時間から０．５時間〜７２時間の範囲の期間、例えば１時間〜６０時間、例えば２時間〜４８時間、例えば３時間〜３６時間、例えば４時間〜３０時間、例えば、上記投与時間から５時間〜２４時間の範囲の期間であってよい。上記第２の期間は、当該共重合体ヒドロゲルの投与時間から０．５時間〜３３６時間の範囲の期間、例えば１時間〜３１２時間、例えば２時間〜２８８時間、例えば３時間〜２６４時間、例えば４時間〜２４０時間、例えば５時間〜２１６時間、例えば、上記投与時間から６時間〜１９２時間の範囲の期間であってよい。
【００７３】
上記放出プロファイルの間のそれぞれの期間における放出速度は、当該架橋共重合体ヒドロゲルの構築のされ方（例えば、キトサンのラクチドに対する比、架橋密度、フィブリノゲン含有量）に応じて多様であり得る。いくつかの実施形態において、第１の所定の速度は、実質的にゼロ次放出速度であってよい。他の実施形態において、第１の所定の速度は、実質的に一次放出速度であってよい。更に他の実施形態において、第１の所定の速度は、実質的に二次放出速度であってよい。同様に、第２の所定の速度は、実質的にゼロ次放出速度、実質的に一次放出速度または実質的に二次放出速度であってよい。
【００７４】
ある実施形態において、上記架橋共重合体ヒドロゲルの放出プロファイルは、実質的に一次放出速度を有する第１の期間、及びそれに続く実質的にゼロ次放出速度を有する第２の期間を含む。他の実施形態において、上記放出プロファイルは、実質的に二次放出速度を有する第１の期間、及びそれに続く実質的に一次放出速度を有する第２の期間を含む。更に他の実施形態において、上記放出プロファイルは、実質的に二次放出速度を有する第１の期間、及びそれに続く実質的にゼロ次放出速度を有する第２の期間を含む。
【００７５】
これらの実施形態において、それぞれの期間に放出される生理活性剤の量は多様であり得る。いくつかの例において、架橋共重合体ヒドロゲルは、第１の期間に、生理活性剤の全量の１０％から７５％の間の量、例えば生理活性剤の全量の１５％から７０％の間の量、例えば生理活性剤の全量の２０％から６０％の間の量、例えば生理活性剤の全量の２５％から５０％の間の量、例えば、第１の期間に、生理活性剤の全量の３０％から３５％の間の量を放出するように構成される。これらの例において、架橋共重合体ヒドロゲルは、第２の期間に、生理活性剤の全量の１０％から７５％の間の量、例えば生理活性剤の全量の１５％から７０％の間の量、例えば生理活性剤の全量の２０％から６０％の間の量、例えば生理活性剤の全量の２５％から５０％の間の量、例えば、第２の期間に、生理活性剤の全量の３０％から３５％の間の量を放出するように構成される。
【００７６】
複数の生理活性剤が送達される場合、各生理活性剤の量（すなわち、質量）は、０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲、例えば０．０１ｍｇ〜５００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜２５０ｍｇ、例えば０．５ｍｇ〜１００ｍｇ、例えば１ｍｇ〜５０ｍｇ、例えば、１ｍｇ〜１０ｍｇの範囲で多様であり得る。従って、本発明の組成物中において、第１の生理活性剤対他の（すなわち、第２のまたはそれ以上の）生理活性剤の質量比は多様であってもよく、いくつかの例において、１：１から１：２．５の間、１：２．５から１：５の間、１：５から１：１０の間、１：１０から１：２５の間、１：２５から１：５０の間、１：５０から１：１００の間、１：１００から１：１５０の間、１：１５０から１：２００の間、１：２００から１：２５０の間、１：２５０から１：５００の間、１：５００から１：１０００の間、またはそれらの範囲の範囲であってよい。例えば、第１の生理活性剤対他の（すなわち、第２のまたはそれ以上の）生理活性剤の質量比は、１：１から１：１０、１：５から１：２５、１：１０から１：５０、１：２５から１：１００、１：５０から１：５００、または１：１００から１：１０００の間の範囲であってよい。
【００７７】
対象の適用部位及び生理学に応じて、対象に投与するための、主題の架橋共重合体ヒドロゲル中に取り込まれる生理活性剤の量は多様であり得る。いくつかの例において、上記生理活性剤の量は、０．００１ｍｇ〜５００ｍｇの範囲、例えば０．００５ｍｇ〜４００ｍｇ、例えば０．０１ｍｇ〜３００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜２００ｍｇ、例えば１ｍｇ〜１００ｍｇ、例えば２ｍｇ〜９０ｍｇ、例えば３ｍｇ〜８０ｍｇ、例えば４ｍｇ〜７０ｍｇ、例えば、５ｍｇ〜５０ｍｇの範囲であってよい。あるいは、対象に投与するための、主題の架橋共重合体ヒドロゲル中に取り込まれる生理活性剤の量は、（当該生理活性剤が溶媒中に存在する場合）例えば約０．００１〜１０００μＭ、例えば約０．００５〜５００μＭ、例えば約０．０１〜１００μＭ、例えば約０．５〜５０μＭ、例えば、１〜２５ｍＭの範囲であってよい濃度とすることができる。従って、当該生理活性剤の効能並びに所望の効果に応じて、主題の架橋共重合体ヒドロゲルによって送達される生理活性剤の濃度は、０．０１μＭ〜５００μＭの範囲、例えば０．１μＭ〜２５０μＭ、例えば０．１μＭ〜１００μＭ、例えば０．１μＭ〜７５μＭ、例えば０．１μＭ〜５０μＭ、例えば０．１μＭ〜２５μＭ、例えば０．１μＭ〜１０μＭ、例えば、０．１μＭ〜１μＭの範囲であってよい。
【００７８】
いくつかの実施形態において、本発明のキトサン−ポリエステルヒドロゲル及びキトサン−ポリエステル−フィブリノゲンヒドロゲルは、所定の用量の生理活性剤（例えば、ＢＭＰ−２）を送達するように構成されてもよい。用語「所定の用量」とは、キトサン−ポリエステルヒドロゲル及びキトサン−ポリエステル−フィブリノゲンヒドロゲルから送達される生理活性剤の所望の量を意味する。例えば、キトサン−ポリエステルヒドロゲル及びキトサン−ポリエステル−フィブリノゲンヒドロゲルは、５μｇ／ｈｒ以上、例えば１０μｇ／ｈｒ以上、例えば２０μｇ／ｈｒ以上、例えば２５μｇ／ｈｒ以上、例えば３０μｇ／ｈｒ以上、例えば３５μｇ／ｈｒ以上、例えば４５μｇ／ｈｒ以上、例えば５０μｇ／ｈｒ以上、例えば、６０μｇ／ｈｒ以上の所定の生理活性剤用量を送達するのに十分な様式で構成されてもよい。ある実施形態において、キトサン−ポリエステルヒドロゲル及びキトサン−ポリエステル−フィブリノゲンヒドロゲルは、２０〜７５μｇ／ｈｒの範囲、例えば２１〜７０μｇ／ｈｒ、例えば２２〜６５μｇ／ｈｒ、例えば２３〜６０μｇ／ｈｒ、例えば２４〜５５μｇ／ｈｒ、例えば２５〜５０μｇ／ｈｒ、例えば、２８〜４８μｇ／ｈｒの範囲の所定の生理活性剤用量を送達するのに十分な様式で構成されてもよい。
【００７９】
例えば、キトサン−ポリエステルヒドロゲルまたはキトサン−ポリエステル−フィブリノゲンヒドロゲルのサイズに応じて、主題のヒドロゲルによる生理活性剤の送達は多様であり得、例えば０．５μｇ／ｃｍ２／ｈｒ以上、例えば０．６μｇ／ｃｍ２／ｈｒ以上、例えば０．６５μｇ／ｃｍ２／ｈｒ以上、例えば０．７５μｇ／ｃｍ２／ｈｒ以上、例えば０．９μｇ／ｃｍ２／ｈｒ以上、例えば１．０μｇ／ｃｍ２／ｈｒ以上、例えば１．５μｇ／ｃｍ２／ｈｒ以上、例えば１．７５μｇ／ｃｍ２／ｈｒ以上、例えば、ピーク流量２．０μｇ／ｃｍ２／ｈｒ以上である。
【００８０】
本発明のキトサン−ポリエステルヒドロゲル及びキトサン−ポリエステル−フィブリノゲンヒドロゲルはまた、所定の投与期間（例えば、４週間以上）にわたって、生理活性剤を実質的に線形の速度で送達するように構成されてもよい。「実質的に線形に」とは、ヒドロゲルから放出される生理活性剤の累積量が、実質的に一定の速度（すなわち、一次速度論で定義される）で増加することを意味する。従って、累積的に送達される生理活性剤の速度の変化は、任意の所与の時間において、１０％以下の増減、例えば８％以下、例えば７％以下、例えば６％以下、例えば５％以下、例えば３％以下、例えば２．５％以下、例えば２％以下、例えば、１％以下の増減である。
【００８１】
他の実施形態において、利用するヒドロゲルのサイズに応じて、キトサン−ポリエステルヒドロゲル及びキトサン−ポリエステル−フィブリノゲンヒドロゲルは、長期にわたって、５μｇ／ｃｍ２以上の平均累積量の生理活性剤を送達するように構成されてもよい。用語「累積量」とは、キトサン−ポリエステルヒドロゲル及びキトサン−ポリエステル−フィブリノゲンヒドロゲルによって送達される生理活性剤の合計量を意味する。これらの実施形態において、本発明のキトサン−ポリエステルヒドロゲル及びキトサン−ポリエステル−フィブリノゲンヒドロゲルは、２５μｇ／ｃｍ２以上、例えば５０μｇ／ｃｍ２以上、例えば４週間の送達期間にわたって７５μｇ／ｃｍ２以上、例えば１００μｇ／ｃｍ２以上、例えば１２５μｇ／ｃｍ２以上、例えば１５０μｇ／ｃｍ２以上、例えば、所定の送達期間にわたって２００μｇ／ｃｍ２の、平均累積量の生理活性剤を送達するように構成されてもよい。
【００８２】
更に他の実施形態において、キトサン−ポリエステルヒドロゲル及びキトサン−ポリエステル−フィブリノゲンヒドロゲルは、例えば、全生理活性剤曝露量によりまたは平均の１日当たりの曝露量により特徴付けられるなどの、目標用量の生理活性剤を送達するように構成されてもよい。目標用量との用語は、対象に送達される生理活性剤の量を意味し、ヒドロゲルの物理化学的特性（例えば、膨潤挙動、架橋密度）、機械的特性（例えば、圧縮弾性率）、分解速度、並びに適用部位に応じて多様であり得る。例えば、主題のヒドロゲルによって送達される生理活性剤の目標用量は、０．０１ｍｇ／日以上、例えば０．０４ｍｇ／日以上、例えば４週間の投与期間にわたって０．５ｍｇ／日以上、例えば１．０ｍｇ／日以上、例えば２ｍｇ／日以上、例えば５ｍｇ／日以上、例えば、４週間の投与期間にわたって１０ｍｇ／日であってよい。
【００８３】
従って、主題の架橋共重合体ヒドロゲルを用いて送達される生理活性剤の用量は、１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲、例えば１日当たり０．０１ｍｇ／ｋｇ〜４００ｍｇ／ｋｇ、例えば１日当たり０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、例えば１日当たり０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば１日当たり０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、例えば１日当たり０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ、例えば、１日当たり０．０２ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇの範囲で多様であり得る。他の実施形態において、上記用量は、所望通りの投与プロトコルに応じて、１日当たり０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇを４回（ＱＩＤ）、例えば０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇＱＩＤ、例えば０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇＱＩＤ、例えば０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇＱＩＤ、例えば０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．２ｍｇ／ｋｇＱＩＤの範囲であってよい。他の実施形態において、上記用量は、１日当たり０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇを３回（ＴＩＤ）、例えば０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇＴＩＤ、例えば０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇＴＩＤ、例えば、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．２ｍｇ／ｋｇＴＩＤの範囲であってよい。更に他の実施形態において、上記用量は、１日当たり０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇを２回（ＢＩＤ）、例えば０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇＢＩＤ、例えば０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇＢＩＤ、例えば、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．２ｍｇ／ｋｇＢＩＤの範囲であってよい。
【００８４】
架橋共重合体ヒドロゲルの調製方法
上記に概説したように、主題の発明は、架橋剤を有する架橋共重合体ヒドロゲルを提供する。本発明の態様はまた、主題の架橋共重合体ヒドロゲルの調製方法も包含する。ある実施形態において、本発明の架橋共重合体ヒドロゲルの調製方法は、キトサンとポリラクチドなどのポリエステルとの共重合体、及び該共重合体に共有結合した架橋剤を含む架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体組成物を生成する第１のプロセスと、その後の、上記架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体組成物を架橋してキトサン−ポリエステル共重合体ヒドロゲルを生成する第２のプロセスとを特徴とし得る。他の実施形態において、本発明の架橋共重合体ヒドロゲルの調製方法は、キトサンと、フィブリノゲンと、ポリラクチドなどのポリエステルと、架橋剤とを含む架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体組成物を生成する第１のプロセス、並びにその後の、上記架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体組成物を架橋してキトサン−ポリエステル−フィブリノゲン共重合体ヒドロゲルを生成する第２のプロセスを特徴とし得る。
【００８５】
ある実施形態において、方法は、１）キトサンを含む組成物を、ポリエステルを含む組成物と接触させて、キトサンとポリエステルとの共重合体を生成するステップと、２）上記キトサンとポリエステルとの共重合体を、一種または複数種の架橋剤を含む組成物と接触させて、架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体を生成するステップと、３）上記架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体を、架橋共重合体ヒドロゲルを生成するのに十分な架橋条件に供するステップとを含む。他の実施形態において、方法は、１）キトサンを含む組成物を、フィブリノゲン及びポリエステルの組成物と接触させて、キトサン−ポリエステル−フィブリノゲン組成物を生成するステップと、２）上記キトサン−ポリエステル−フィブリノゲン組成物を、一種または複数種の架橋剤を含む組成物と接触させて、架橋性キトサン−ポリエステル−フィブリノゲン前駆体組成物を生成するステップと、３）上記架橋性キトサン−ポリエステル−フィブリノゲン前駆体組成物を、架橋キトサン−ポリエステル−フィブリノゲンポリマーヒドロゲルを生成するのに十分な架橋条件に供するステップとを含む。
【００８６】
上記に詳細に議論したように、主題の共重合体のキトサン成分とは、ランダムに分布したβ−（１−４）結合したＤ−グルコサミン及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンサッカライド単位からなる直鎖状多糖をいう。いくつかの実施形態において、キトサンは未修飾キトサンを含む。他の実施形態において、キトサンはキトサンの誘導体であってもよい。従って、上記架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体を製造するために用いられるキトサンは、式
2016525374.tif 000013
（式中、ＲＡ、ＲＢ、ＲＣ、及びＲＤのそれぞれは独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アシル、置換アシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アミノアシル、置換アミノアシル、アミノ、置換アミノ、アシルアミノ、置換アシルアミノ、及びシアノより選択され、
ｎは１〜５０００の整数であり、かつ
ｍは１〜５０００の整数である）
を有するオリゴマーを含み得る。
【００８７】
キトサンは、所望の最終的な架橋共重合体ヒドロゲルの特性に応じて多様な分子量を有してもよく、０．５ｋＤａ以上、例えば１ｋＤａ以上、例えば１．５ｋＤａ以上、例えば２．５ｋＤａ以上、例えば５ｋＤａ以上、例えば７．５ｋＤａ以上、例えば１０ｋＤａ以上、例えば１２．５ｋＤａ以上、例えば１５ｋＤａ以上、例えば２０ｋＤａ以上、例えば、２５ｋＤａ以上であってよい。同様に、キトサンの量は多様であり得る。例えば、キトサンは、主題の架橋共重合体ヒドロゲル前駆体中に、１％〜９９％ｗ／ｗの範囲、例えば２％〜９５％ｗ／ｗ、例えば５％〜９０％ｗ／ｗ、例えば１０％〜９０％ｗ／ｗ、例えば１５％〜８５％ｗ／ｗ、例えば２０％〜８０％ｗ／ｗ、例えば２５％〜７５％ｗ／ｗ、例えば３０％〜７０％ｗ／ｗ、例えば、３５％〜６５％ｗ／ｗの範囲の量で存在してもよい。
【００８８】
上記に議論したように、「ポリエステル」成分は、その主鎖中にエステル官能基を含有するポリマーのカテゴリー中の任意のポリマーであってよい。対象とするポリエステルは、多くのポリエステルポリマーの中で特に、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリエチレンアジペート（ＰＥＡ）、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシバレレート）（ＰＨＢＶ）などの脂肪族ポリエステル、またはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリトリメチレンテレフタレート（ＰＴＴ）、ポリトリメチレンテレフタレート（ＰＴＴ）及びポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）などの芳香族ポリエステルであってよい。
【００８９】
ある実施形態において、上記ポリエステルはポリラクチドである。用語「ポリラクチド」は、本明細書中において、乳酸モノマーの縮合またはラクチドの（例えば、金属触媒による）触媒開環重合により形成される脂肪族ポリエステルを指す、その通常の意味で用いられる。
【００９０】
上記ポリエステルは、例えば、ラジカル重合、光分解、酸化還元反応、電離放射線、電気分解又は他のプロトコルによるなどの、任意の利便なプロトコルによってキトサンと共重合させることができる。ある実施形態において、上記ポリエステルは、以下に説明するように、２−エチルヘキサン酸スズ（ＩＩ）及びトリエチルアミンを用いた反応によりキトサンと共重合する。上記ポリエステルは、反応条件、重合開始剤等に応じて、任意の利用可能な反応性残基で、キトサンと共有結合を形成することができる。いくつかの例において、本発明の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体は、キトサンとポリエステルとの間に一または複数のアミド結合を含む。他の例において、架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体は、キトサンとポリエステルとの間に一または複数のエステル結合を含む。更に他の例において、架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体は、キトサンとポリエステルとの間に一または複数のアミド結合及び一または複数のエステル結合を含む。ポリエステル成分がポリラクチド（ＰＬＡ）であるいくつかの実施形態において、主題の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体中のキトサン−ポリラクチド共重合体は、式
2016525374.tif 000014
（式中、ｎは１〜５０００の整数であり、かつ
ｍは1〜５０００の整数である）
の構造を含んでもよい。
【００９１】
他の実施形態において、主題の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体中のキトサン−ポリラクチド共重合体は、式
2016525374.tif 000015
（式中、ｎは１〜５０００の整数であり、かつ
ｍは１〜５０００の整数である）
の構造を含んでもよい。
【００９２】
主題の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体中のキトサン−ポリラクチド共重合体は、式
2016525374.tif 000016
の構造を含んでもよい。
【００９３】
上記ポリエステルは、所望の最終的な架橋共重合体ヒドロゲルの特性に応じて多様な分子量を有してもよく、０．５ｋＤａ以上、例えば１ｋＤａ以上、例えば１．５ｋＤａ以上、例えば２．５ｋＤａ以上、例えば５ｋＤａ以上、例えば７．５ｋＤａ以上、例えば１０ｋＤａ以上、例えば１２．５ｋＤａ以上、例えば１５ｋＤａ以上、例えば２０ｋＤａ以上、例えば、２５ｋＤａ以上であってよい。同様に、上記ポリエステル（例えば、ポリラクチド）は、１％〜９９％ｗ／ｗの範囲、例えば２％〜９５％ｗ／ｗ、例えば５％〜９０％ｗ／ｗ、例えば１０％〜９０％ｗ／ｗ、例えば１５％〜８５％ｗ／ｗ、例えば２０％〜８０％ｗ／ｗ、例えば２５％〜７５％ｗ／ｗ、例えば３０％〜７０％ｗ／ｗ、例えば、３５％〜６５％ｗ／ｗの範囲の量で存在してもよい。
【００９４】
いくつかの実施形態において、上記架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体中のキトサン対ポリエステルの比は、いくつかの実施形態において、１０：１から９．５：１の間、９．５：１から９：１の間、９：１から８．５：１の間、８．５：１から８：１の間、８：１から７．５：１の間、７．５：１から７：１の間、７：１から６．５：１の間、６．５：１から６：１の間、６：１から５．５：１の間、５．５：１から５：１の間、５：１から４．５：１の間、４．５：１から４：１の間、４：１から３．５：１の間、３．５：１から３：１の間、３：１から２．５：１の間、２．５：１から２：１の間、２：１から１．５：１の間、１．５：１から１：１の間の範囲で、またはそれらの範囲で多様であり得る。例えば、キトサン対ポリエステルの比は、１０：１〜１：１の範囲、例えば８：１〜１：１、例えば５：１〜１：１、例えば４：１〜１：１、例えば、２：１〜１：１の範囲であってよい。ある例において、キトサン対ポリエステルの比は１：１である。例えば、いくつかの実施形態において、上記ポリエステルはポリラクチドであり、キトサン対ポリラクチドの比は８：１であってよい。他の実施形態において、キトサン対ポリラクチドの比は４：１であってよい。更に他の実施形態において、キトサン対ポリラクチドの比は２：１であってよい。ある実施形態において、キトサン対ポリラクチドの比は１：１であってよい。
【００９５】
他の実施形態において、本発明の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体中のキトサン対ポリエステルの比は、いくつかの実施形態において、１：１から１：１．５の間、１：１．５から１：２の間、１：２から１：２．５の間、１：２．５から１：３の間、１：３から１：３．５の間、１：３．５から１：４の間、１：４から１：４．５の間、１：４．５から１：５の間、１：５から１：５．５の間、１：５．５から１：６の間、１：６から１：６．５の間、１：６．５から１：７の間、１：７から１：７．５の間、１：７．５から１：８の間、１：８から１：８．５の間、１：８．５から１：９の間、１：９から１：９．５の間、１：９．５から１：１０の間の範囲で、またはそれらの範囲で多様であり得る。例えば、キトサン対ポリエステルの比は、１：１〜１：１０の範囲、例えば１：１〜１：８、例えば１：１〜１：５、例えば１：１〜１：４、例えば、１：１〜１：２の範囲であってよい。
【００９６】
本発明により提供される架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体は、１ｋＤａ以上、例えば２ｋＤａ以上、例えば３ｋＤａ以上、例えば５ｋＤａ以上、例えば１０ｋＤａ以上、例えば１５ｋＤａ以上、例えば２０ｋＤａ以上、例えば２５ｋＤａ以上、例えば３０ｋＤａ以上、例えば４０ｋＤａ以上、例えば５０ｋＤａ以上、例えば６０ｋＤａ以上、例えば、７５ｋＤａ以上であってよい。
【００９７】
ある実施形態において、方法は、フィブリノゲンを上記ヒドロゲル中へ取り込んで、キトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルなどのキトサン−ポリエステル−フィブリノゲンヒドロゲルを生成すること含む。所望の物理化学的特性、機械的特性、分解性及び活性薬剤放出速度論に応じて、本発明のヒドロゲルに取り込まれるフィブリノゲンの量は多様であり得る。例えば、フィブリノゲンは、０．０５％〜５０％ｗ／ｗの範囲、例えば０．１％〜４５％ｗ／ｗ、例えば０．５％〜４０％ｗ／ｗ、例えば０．７５％〜３５％ｗ／ｗ、例えば１％〜３０％、例えば２％〜２０％、例えば５％〜１５％、例えば、１０％ｗ／ｗの範囲の量で取り込まれてもよい。
【００９８】
フィブリノゲンは、任意の利便なインビトロまたはインビボプロトコルにより主題の架橋共重合体ヒドロゲル中に導入することができる。いくつかの実施形態において、フィブリノゲンは、上記架橋性キトサン−ポリエステル（例えば、キトサン−ポリラクチド）共重合体ヒドロゲル前駆体組成物に添加されてもよく、該架橋性キトサン−ポリエステル共重合体ヒドロゲル前駆体をフィブリノゲンの存在下で架橋し、架橋キトサン−ポリエステル共重合体ヒドロゲル内にフィブリノゲンを封入し、キトサン−ポリエステル−フィブリノゲンヒドロゲルを生成してもよい。あるいは、既に架橋されたキトサン−ポリエステル共重合体ヒドロゲル（例えば、架橋キトサン−ポリラクチド共重合体ヒドロゲル）を、溶媒を用いてまたは無溶媒で、フィブリノゲンの存在下、所定の時間、例えば、１時間以上、５時間以上、１０時間以上、１２時間以上、２４時間以上、３日以上、例えば、１週間以上インキュベートし、架橋共重合体ヒドロゲルがフィブリノゲンを架橋マトリックス中に取り込むようにしてもよい。更になお、フィブリノゲンを、共重合体ヒドロゲルの基となる構成成分の混合物（すなわち、キトサン成分、ポリラクチド成分、メタクリレート架橋剤）に直接添加し、ヒドロゲルの製造の各段階（すなわち、共重合及び架橋）を通して、フィブリノゲンが最終的な架橋キトサン−ポリエステル−フィブリノゲン共重合体ヒドロゲルの架橋マトリクス中に取り込まれるようにしてもよい。
【００９９】
主題のヒドロゲルがフィブリノゲンを含む場合、方法は、主題のヒドロゲル中におけるキトサン−ポリエステル共重合体対フィブリノゲンの比が１０：１から９．５：１の間、９．５：１から９：１の間、９：１から８．５：１の間、８．５：１から８：１の間、８：１から７．５：１の間、７．５：１から７：１の間、７：１から６．５：１の間、６．５：１から６：１の間、６：１から５．５：１の間、５．５：１から５：１の間、５：１から４．５：１の間、４．５：１から４：１の間、４：１から３．５：１の間、３．５：１から３：１の間、３：１から２．５：１の間、２．５：１から２：１の間、２：１から１．５：１の間、１．５：１から１：１の間の範囲、またはそれらの範囲となるような量で、フィブリノゲンを取り込むことを含んでもよい。例えば、方法は、キトサン−ポリエステル共重合体対フィブリノゲンの比が１０：１〜１：１の範囲、例えば８：１〜１：１、例えば５：１〜１：１、例えば４：１〜１：１、例えば、２：１〜１：１の範囲となるような量で、フィブリノゲンを取り込むことを含んでもよい。ある例において、方法は、キトサン−ポリエステル共重合体対フィブリノゲンの比が１：１となるような量で、フィブリノゲンを取り込むことを含んでもよい。他の実施形態において、方法は、キトサン−ポリエステル共重合体対フィブリノゲンの比が１：１から１：１．５の間、１：１．５から１：２の間、１：２から１：２．５の間、１：２．５から１：３の間、１：３から１：３．５の間、１：３．５から１：４の間、１：４から１：４．５の間、１：４．５から１：５の間、１：５から１：５．５の間、１：５．５から１：６の間、１：６から１：６．５の間、１：６．５から１：７の間、１：７から１：７．５の間、１：７．５から１：８の間、１：８から１：８．５の間、１：８．５から１：９の間、１：９から１：９．５の間、１：９．５から１：１０の間の範囲、またはそれらの範囲となるような量で、フィブリノゲンを取り込むことを含んでもよい。例えば、キトサン−ポリエステル対フィブリノゲンの比は、１：１〜１：１０の範囲、例えば１：１〜１：８、例えば１：１〜１：５、例えば１：１〜１：４、例えば、１：１〜１：２の範囲であってよい。
【０１００】
上記に概説したように、主題の架橋性ヒドロゲル前駆体はまた、上記共重合体に共有結合した架橋剤も含む。いくつかの実施形態において、主題の架橋性ヒドロゲル前駆体は、加水分解性である一種または複数種の架橋剤を含み、生理的条件下（例えば、インビボ）で分解することができる架橋の生成を可能にする。一例において、上記加水分解性架橋剤はアクリレート架橋剤である。これらの実施形態において、上記アクリレート架橋剤としては、アクリレート、メタクリレート、アクリル酸エチル、アクリル酸ブチル、メタクリル酸ブチル、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート及びポリ（エチレングリコール）ジメタクリレートが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの例において、上記アクリレート架橋剤はメタクリレート架橋剤である。
【０１０１】
ある態様において、主題の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体は、キトサン及び／または上記ポリエステルとの一以上のエステルまたはアミド結合を有する、一種又は複数種の加水分解性の架橋剤を含む。いくつかの実施形態において、主題の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体は、式
2016525374.tif 000017
（式中、
Ｒｃは水素、アルキルまたは置換アルキルであり、
Ｘ３はＮまたはＯであり、かつ
Ｒ３はキトサンまたは上記ポリエステルである）
の架橋剤を含む。
【０１０２】
一例において、主題の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体は、式
2016525374.tif 000018
（式中、
Ｒｃは水素であり、
Ｘ３はＯであり、かつ
Ｒ３は上記ポリエステルである）
を有する、上記共重合体に共有結合した架橋剤を含む。
【０１０３】
第２の例において、主題の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体は、式
2016525374.tif 000019
（式中、
Ｒｃはメチルであり、
Ｘ３はＯであり、かつ
Ｒ３は上記ポリエステルである）
を有する、上記共重合体に共有結合した架橋剤を含む。
【０１０４】
第３の例において、主題の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体は、式
2016525374.tif 000020
（式中、
Ｒｃは水素であり、
Ｘ３はＯであり、かつ
Ｒ３はキトサンである）
を有する、上記共重合体に共有結合した架橋剤を含む。
【０１０５】
第４の例において、主題の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体は、式
2016525374.tif 000021
（式中、
Ｒｃはメチルであり、
Ｘ３はＯであり、かつ
Ｒ３はキトサンである）
を有する、上記共重合体に共有結合した架橋剤を含む。
【０１０６】
上記架橋剤は、所望の最終的な架橋共重合体ヒドロゲルの特性に応じて多様な分子量を有してもよく、０．１ｋＤａ以上、例えば０．２５ｋＤａ以上、例えば０．５ｋＤａ以上、例えば０．７５ｋＤａ以上、例えば１ｋＤａ以上、例えば１．２５ｋＤａ以上、例えば１．５ｋＤａ以上、例えば２ｋＤａ以上、例えば２．５ｋＤａ以上、例えば３ｋＤａ以上、例えば、５ｋＤａ以上であってよい。同様に、架橋剤の量は多様であり得る。例えば、架橋剤は、０．０５％〜３５％ｗ／ｗの範囲、例えば０．１％〜３０％ｗ／ｗ、例えば０．５％〜２５％ｗ／ｗ、例えば０．７５％〜２０％ｗ／ｗ、例えば１％〜１５％ｗ／ｗ、例えば１．５％〜１２．５％ｗ／ｗ、例えば、２％〜１０％ｗ／ｗの範囲の量で存在してもよい。
【０１０７】
上記架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体を調製した後、方法は、上記架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体を架橋してキトサン−ポリエステル共重合体ヒドロゲルを生成する第２のプロセスを更に含む。一実施形態において、方法は、キトサン−ポリエステル（例えば、キトサン−ポリラクチド）架橋性ヒドロゲル前駆体組成物を架橋して、架橋キトサン−ポリエステル共重合体ヒドロゲルを生成することを含む。別の実施形態において、方法は、キトサン−ポリエステル−フィブリノゲン（例えば、キトサン−ポリラクチド−フィブリノゲン）架橋性ヒドロゲル前駆体組成物を架橋して、架橋キトサン−ポリエステル−フィブリノゲンヒドロゲルを生成することを含む。
【０１０８】
主題のヒドロゲルは、化学的に開始される架橋、光開始架橋並びに熱、圧力またはｐＨの変化によって開始される架橋を始めとする（但し、これらに限定されない）任意の利便な架橋プロトコルにより架橋することができる。
【０１０９】
ある例において、主題の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体は光架橋される。上記に議論したように、「光架橋される」は、上記共重合体を有する複数の架橋剤の間の反応を開始または触媒するために電磁放射線を用いることを意味する。上記放射線は、紫外線放射線、α−型放射線、β−型、γ放射線、電子線放射線、及びＸ線放射線を始めとする（但し、これらに限定されない）任意且つ適宜の電磁放射線であってよい。いくつかの実施形態において、２００〜８００ｎｍ（例えば、２００〜４００ｎｍ）の波長を有する放射線が用いられる。所望の架橋を達成するために不足のない電磁エネルギーを与えるのに十分である限りにおいて、任意の利便な電磁放射線源を用いることができる。例えば、照射がＵＶ光による場合、共重合体ヒドロゲルは、水銀アークランプ、キセノンランプ、固体レーザー、ガスレーザーまたはその他の利便な放射線源（例えば、太陽光）からのＵＶ光への曝露によって架橋することができる。
【０１１０】
いくつかの実施形態における光架橋は光開始剤を用いてもよい。例えば、上記光開始剤は、ＵＶ照射に応答して一種または複数種のラジカル種を生成する化合物であり、数ある光開始剤の中でも、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、過酸化ベンゾイル、２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）、２−メチル−１−（４−メチルチオ）フェニル−２−モルホリニル−１−プロパノン、２−ベンジル−２−（ジメチルアミノ）−４'−モルホリノブチロフェノン、フェニルビス（２，４，６−トリメチルベンゾイル）ホスフィンオキシド、１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン及び４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル−（２−ヒドロキシ−２−プロピル）ケトンなどの上記化合物であってよい。好適な光増感剤としてはまた、ベンゾフェノン及び置換ベンゾフェノン；並びにベンジルジメチルケタール、４−アクリロキシベンゾフェノン（ＡＢＰ）、１−ヒドロキシ−シクロヘキシルフェニルケトン、２，２−ジエトキシアセトフェノン及び２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセト−フェノンなどのアセトフェノン；２−メチル−２−ヒドロキシプロピオフェノンなどの置換α−ケタール；ベンゾインメチルエーテル及びベンゾインイソプロピルエーテルなどのベンゾインエーテル；アニソインメチルエーテルなどの置換ベンゾインエーテル；２−ナフタレンスルホニルクロリドなどの芳香族スルホニルクロリド；１−フェニル−１，２−プロパンジオン−２−（Ｏ−エトキシ−カルボニル）−オキシムなどの光活性オキシム；２−イソプロピルチオキサントン、２−クロロチオキサントン、２，４−ジメチルチオキサントン、２，４−ジクロロチオキサントン及び２，４−ジエチルチオキサントンなどのアルキル及びハロゲン置換チオキサントンを始めとするチオキサントン；並びにアシルホスフィンオキシドなどの「水素引抜き」型の三重項増感剤が挙げられる。
【０１１１】
ある実施形態において、上記方法は、主題の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体にＵＶ光を照射することを含む。上記ＵＶ光の強度は所望の架橋密度及び用いる光開始剤の種類に応じて多様であり得、１ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば、１．５ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば、２ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば、２．５ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば、３ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば、３．５ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば、４ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば、４．５ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば、５ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば、６ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば、７ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば、８ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば、１０ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば、１５ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば、２０ｍＷ／ｃｍ２以上、例えば、２５ｍＷ／ｃｍ２以上であってよい。
【０１１２】
放射線の強度並びに所望の最終的な架橋共重合体ヒドロゲルの機械的及び物理化学的特性に応じて、任意且つ適宜の照射継続時間を用いることができる。例えば、いくつかの実施形態において、架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体は、６ｍＷ／ｃｍ２から７ｍＷ／ｃｍ２の間の範囲の強度を有するＵＶ光を、１秒〜１０００秒の範囲、例えば、１０秒〜９００秒、例えば、３０秒〜８００秒、例えば、４５秒〜７５０秒、例えば、６０秒〜６００秒、例えば、１２０秒〜４５０秒、例えば、２００秒〜３００秒の範囲の継続時間照射されてもよい。他の実施形態において、架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体は、６ｍＷ／ｃｍ２から７ｍＷ／ｃｍ２の間の範囲の強度を有するＵＶ光を、２５秒以下など、２０秒以下などの、またＵＶ光を１５秒以下の間照射することを含む、３０秒以下の間照射されてもよい。更に他の実施形態において、架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体は、６ｍＷ／ｃｍ２から７ｍＷ／ｃｍ２の間の範囲の強度を有するＵＶ光を、３０秒以上、例えば、４５秒以上、例えば、６０秒以上、例えば、７５秒以上、例えば、１００秒以上、例えば、１２０秒以上、例えば、１５０秒以上、例えば、１８０秒以上、例えば、２１０秒以上、例えば、２４０秒以上、例えば、２７０秒以上、例えば、３００秒以上照射されてもよい。
【０１１３】
他の実施形態において、主題のヒドロゲルの架橋は化学的に開始される。「化学的に開始される」とは、共重合体ヒドロゲルの架橋が、一種または複数種の反応種（ラジカル、カルベン、カチオン、アニオン等）を始めとする（但し、これらには限定されない）化学物質によって開始されることを意味する。例えば、好適な化学的開始剤としては、過酸化物、脂肪族アゾ化合物などのフリーラジカルを生成する開始剤、三フッ化ホウ素等の酸形成開始剤などの正荷電種を生成する開始剤、金属アミド、金属アルコキシド、金属水酸化物、金属シアニド、ホスフィン、アミン、並びにアルキルリチウム化合物、チーグラー触媒またはグリニヤール試薬等の有機金属化合物などの負荷電種を生成する開始剤を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。化学的架橋剤の量は、主題のヒドロゲル組成物を、（以下に説明する）所望の架橋密度まで架橋するのに十分な利便な量であってよい。例えば、化学的開始剤の量は、主題の共重合体ヒドロゲルの約０．０１ｗｔ％〜１５ｗｔ％の範囲、例えば、０．０５ｗｔ％〜１０ｗｔ％、例えば、約０．１ｗｔ％〜約５ｗｔ％、例えば、約０．５ｗｔ％〜約４ｗｔ％、例えば、０．０５ｗｔ％〜１ｗｔ％の範囲であってよい。
【０１１４】
ある例において、主題の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体は熱的に（すなわち、化学的に）架橋される。熱的架橋には、熱的に活性化されるラジカル重合開始剤が用いられ、該開始剤は、重合に通常用いられる任意且つ公知のフリーラジカル生成開始剤とすることができる。例えば、好適な開始剤としては、主題の共重合体ヒドロゲルの約０．０１ｗｔ％〜１５ｗｔ％の範囲の量、例えば、０．０５ｗｔ％〜１０ｗｔ％、例えば、約０．１ｗｔ％〜約５ｗｔ％、例えば、約０．５ｗｔ％〜約４ｗｔ％の範囲の量などの、有機過酸化物及びアゾ化合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好適な有機過酸化物としては、ｔ−ブチルペルオキシド及び２，２−ビス（ｔ−ブチルペルオキシ）プロパンなどのジアルキルペルオキシド；ベンゾイルペルオキシド及びアセチルペルオキシドなどのジアシルペルオキシド；ｔ−ブチルペルベンゾエート及びｔ−ブチルペル−２−エチルヘキサノエートなどのペルエステル；ジセチルペルオキシジカーボネート及びジシクロヘキシルペルオキシジカーボネートなどのペルジカーボネート；シクロヘキサノンペルオキシド及びメチルエチルケトンペルオキシドなどのケトンペルオキシド；並びにクメンヒドロペルオキシド及びｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドなどのヒドロペルオキシドを挙げることができる。好適なアゾ化合物としては、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）及びアゾビス−（２，４−ジメチルバレロニトリル）を挙げることができる。化学的開始に関連して用いられる温度は、所望に応じて、５０℃〜２００℃の範囲、例えば、６０℃〜１９０℃、例えば、７５℃〜１８０℃、例えば、８０℃〜１７０℃、例えば、８５℃〜１６０℃、例えば、９０℃〜１５５℃、例えば、１００℃〜１５０℃の範囲で多様であり得る。
【０１１５】
本発明の方法の実施において、キトサン、上記ポリエステル、架橋剤、キトサンと上記ポリエステルとの共重合体、架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体及び最終的な架橋共重合体ヒドロゲルの特性は、任意の段階で特徴付けることができる。特徴付けとの用語は、キトサン、上記ポリエステル、架橋剤、キトサンと上記ポリエステルとの共重合体、架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体及び最終的な架橋共重合体ヒドロゲルの一または複数の特性及び／または成分の分析を指すために用いられる。特徴付けとしては、組成（キトサンの上記ポリエステルに対する比、架橋密度）、ｐＨ、物性（例えば、膨潤率、圧縮弾性率）、含有量アッセイ（ＡＰＩ）、分光分析特性及び不純物組成（微量金属、関連物質等）の測定を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。本発明の組成物の分析方法としては、数ある分析プロトコルの中でも、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー質量分析、核磁気共鳴分光分析（ＮＭＲ）、フーリエ変換赤外分光分析（ＦＴ−ＩＲ）、ＵＶ−可視光分光分析を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、方法は、主題の架橋共重合体ヒドロゲルの調製方法の全体にわたって、キトサンと上記ポリエステルとの共重合体、架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体及び最終的な架橋共重合体ヒドロゲルのそれぞれの反応を監視することを含む。いくつかの実施形態において、監視としては、各組成物を監視するための検出器を用いることなどにより、リアルタイムデータ（例えば、ＮＭＲスペクトル、ＦＴ−ＩＲスペクトル）を収集することが挙げられる。他の実施形態において、監視としては、１分毎、５分毎、１０分毎、３０分毎、６０分毎などの規則的な間隔で、または何等かの他の間隔で、各組成物を特徴付けることが挙げられる。更に他の実施形態において、方法は、各ステップが完了したときに各組成物を特徴付けることが挙げられる。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、本発明の方法はまた、特徴付けられた組成物の特性を評価することも含む。「評価すること」とは、ヒトが（単独で、または、最初にヒトの指示下で設定されたコンピュータ自動化プロセスを用いる場合には、コンピュータの支援を受けてのいずれかで）、測定された組成物を評価し、且つ当該組成物が処理の次のステップへと進んでいくことに適しているかまたは適していないかを判定することを意味する。測定された組成物が適していると評価した場合には、各組成物は、それ以上何も調整なしに次のステップへと進むことができる。換言すると、これらの実施形態の方法は、測定された組成物を評価して、何らかの所望の調整（例えば、キトサンのポリエステルに対する比、架橋密度等）があるかを識別するステップを含む。
【０１１８】
一種又は複数種の生理活性剤を送達するための架橋共重合体ヒドロゲルの使用方法
上記に概説したように、本発明の態様はまた、一種又は複数種の生理活性剤を対象に送達するための、主題の架橋共重合体ヒドロゲルの使用方法も包含する。従って、一種又は複数種の生理活性剤を有する架橋共重合体ヒドロゲル組成物が、対象に対して、目標位置において、対象に当該生理活性剤を送達するに十分な様式で投与されてもよい。架橋共重合体ヒドロゲル組成物は、例えば、骨の内部または表面上、皮下、筋肉組織内部または表面上、関節内部または表面上、骨格腔内、一または複数の歯の内部または表面上に、更には、例えば、腕、脚、臀部、腹部、背中、頸部、陰嚢、膣、顔、耳の後ろの皮膚上などの局所的に、口腔内に、並びに舌下に移植することにより、任意の所望の目標位置に適用することができる。同様に、主題の架橋共重合体ヒドロゲルはまた、上述の投与部位に移植される、骨移植片またはデバイス（ステント、ドラッグデリバリーデバイス）などの移植片を（一層または多層として）被覆するために用いられてもよい。従って、ある実施形態に係る態様は、生理活性剤を対象に送達するように構成された主題の架橋共重合体ヒドロゲル内部に吸着または吸収された一種又は複数種の生理活性剤を含む。他の実施形態において、主題の架橋共重合体ヒドロゲルは、鼓膜における鼓膜の穿孔の修復におけるなどの、膜修復構造として用いることもできる。
【０１１９】
本発明の実施形態に係る好適な生理活性剤としては、多くの種類の生理活性剤の中でも、インターフェロン；インターロイキン；エリスロポエチン；顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）；幹細胞因子（ＳＣＩ：）；レプチン（ＯＢタンパク質）；インターフェロン（α、β、γ）；シプロフロキサシン、アモキシシリン、乳酸菌、セフォタキシム、レボフロキサシン、セフェピム、メベンダゾール、アンピシリン、乳酸菌、クロキサシリン、ノルフロキサシン、チニダゾール、セフポドキシム、プロキセチル、アジスロマイシン、ガチフロキサシン、ロキシスロマイシン、セファロスポリンなどの抗生物質；抗血栓剤；アスピリン；チクロピジン；スルフィンピラゾン；ヘパリン；ワルファリン；成長因子；分化因子；肝細胞刺激因子；形質細胞腫増殖因子；グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；神経栄養因子３（ＮＴ３）；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）；形質転換成長因子（ＴＧＦ）；血小板形質転換成長因子；乳成長因子；内皮成長因子；内皮細胞由来成長因子（ＥＣＤＧＦ）；α−内皮成長因子；β−内皮成長因子；神経栄養成長因子；神経成長因子（ＮＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；４−１ＢＢレセプター（４−ＩＢＢＲ）；ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）；アルテミン（ＧＦＲα３−ＲＥＴのリガンド）；ＢＣＡ−Ｉ（Ｂ細胞誘因性ケモカイン）；Ｂリンパ球化学誘引物質（ＢＬＣ）；Ｂ細胞成熟タンパク質（ＢＣＭＡ）；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）などの骨成長因子；骨由来成長因子；トロンボポエチン；巨核球由来増殖因子（ＭＤＧＦ）；ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；ニューロトロフィン４（ＮＴ４）；顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）；マクロファージコロニー刺激因子（ｍＣＳＦ）；骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）；ＢＲＡＫ；Ｃ−ＩＯ；カルジオトロフィン１（ＣＴ１）；ＣＣＲ８；抗炎症剤：パラセタモール、サルサレート、ジフルニサル、メフェナム酸、ジクロフェナク、ピロキシカム、ケトプロフェン、ジピロン、アセチルサリチル酸；アリトレチノイン、アルトレタミン、アナストロゾール、アザチオプリン、ビカルタミド、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、エキセメスタン、ビンクリスチン、ビノレルビンなどの抗がん剤；ホルモン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）、プロラクチン、黄体刺激性ホルモン（ＬＴＨ）、乳腺刺激ホルモン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、メラニン濃縮ホルモン（ＭＣＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨｂ）、成長ホルモン（ＨＧＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨｂ）；ハロペリドール；インドメタシン；ドキソルビシン；エピルビシン；アムホテリシンＢ；タキソール；シクロホスファミド；シスプラチン；メトトレキサート；ピレン；アンホテリシンＢ；抗ジスキネジア剤；アルツハイマーワクチン；抗パーキンソン剤；イオン；エデト酸；栄養素；グルココルチコイド；ヘパリン；抗凝血剤；抗ウイルス剤；抗ＨＩＶ剤；ポリアミン；ヒスタミン及びその誘導体；シスチンアミン及びその誘導体；ジフェンヒドラミン及び誘導体；オルフェナドリン及びその誘導体；ムスカリン性アンタゴニスト；フェノキシベンザミン及びその誘導体；タンパク質Ａ；ストレプトアビジン；アミノ酸；β−ガラクトシダーゼ；メチレンブルー；プロテインキナーゼ；β−アミロイド；リポ多糖類；真核生物の開始因子４Ｇ；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；腫瘍壊死因子結合タンパク質（ＴＮＦ−ｂｐ）；インターロイキン１（〜１８）受容体アンタゴニスト（ＩＬ−Ｉｒａ）；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；新規赤血球生成刺激タンパク質（ＮＥＳＰ）；トロンボポエチン；組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）；ウロキナーゼ；ストレプトキナーゼ；カリクレイン；インスリン；ステロイド；アセトアミノフェン；鎮痛剤；抗腫瘍製剤；抗がん製剤；抗増殖製剤またはアポトーシス促進製剤を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、上記一種または複数種の吸収された生理活性剤は、走化性物質、細胞付着媒介物質、インテグリン結合配列、上皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、ヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン関連ペプチド、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、転写因子、増殖分化因子（ＧＤＦ）、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ８、組換えヒト成長因子、軟骨由来形態形成タンパク質（ＣＤＭＰ）、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２及びＣＤＭＰ−３からなる群より選択される化合物である。ある例において、主題の架橋共重合体ヒドロゲルは骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）を含む。更に他の例において、主題のヒドロゲルはヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）を含む。ある実施形態において、上記生理活性剤はヘパリン結合内皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）ではない。
【０１２１】
本発明のキトサン−ポリエステルヒドロゲル及びキトサン−ポリエステル−フィブリノゲンヒドロゲルに取り込まれる生理活性剤の量は、送達の継続期間、適用部位並びに治療を受ける疾病に依存することとなる。いくつかの実施形態において、主題のヒドロゲルに取り込まれる生理活性剤の量は、０．０００１μｇ以上、例えば、０．００１μｇ以上、例えば、０．０１μｇ以上、例えば、０．１μｇ以上、例えば、１μｇ以上、例えば、１０μｇ以上、例えば、２５μｇ以上、例えば、５０μｇ以上、例えば、１００μｇ以上、例えば、５００μｇ以上、例えば、１０００μｇ以上、例えば、５０００μｇ以上、例えば、１０，０００μｇ以上である。上記生理活性剤が液体としてヒドロゲル中に取り込まれる場合、生理活性剤の濃度は、０．０００１μｇ／ｍＬ以上、例えば、０．００１μｇ／ｍＬ以上、例えば、０．０１μｇ／ｍＬ以上、例えば、０．１μｇ／ｍＬ以上、例えば、０．５μｇ／ｍＬ以上、例えば、１μｇ／ｍＬ以上、例えば、２μｇ／ｍＬ以上、例えば、５μｇ／ｍＬ以上、例えば、１０μｇ／ｍＬ以上、例えば、２５μｇ／ｍＬ以上、例えば、５０μｇ／ｍＬ以上、例えば、１００μｇ／ｍＬ以上、例えば、５００μｇ／ｍＬ以上、例えば、１０００μｇ／ｍＬ以上、例えば、５０００μｇ／ｍＬ以上、例えば、１０，０００μｇ／ｍＬ以上であってよい。
【０１２２】
本発明のキトサン−ポリエステルヒドロゲル及びキトサン−ポリエステル−フィブリノゲンヒドロゲルがＢＭＰ−２を含む場合、主題のヒドロゲル中に取り込まれるＢＭＰ−２の量は、送達の継続期間、治療を受ける疾病及び適用部位に依存して多様であり得、例えば、０．０００１μｇ以上、例えば、０．００１μｇ以上、例えば、０．０１μｇ以上、例えば、０．１μｇ以上、例えば、１μｇ以上、例えば、１０μｇ以上、例えば、２５μｇ以上、例えば、５０μｇ以上、例えば、１００μｇ以上、例えば、５００μｇ以上、例えば、１０００μｇ以上、例えば、５０００μｇ以上、例えば、１０，０００μｇ以上である。例えば、ＢＭＰ−２は、０．０００１μｇ／ｍＬ以上の濃度、例えば、０．００１μｇ／ｍＬ以上、例えば、０．０１μｇ／ｍＬ以上、例えば、０．１μｇ／ｍＬ以上、例えば、０．５μｇ／ｍＬ以上、例えば、１μｇ／ｍＬ以上、例えば、２μｇ／ｍＬ以上、例えば、５μｇ／ｍＬ以上、例えば、１０μｇ／ｍＬ以上、例えば、２５μｇ／ｍＬ以上、例えば、５０μｇ／ｍＬ以上、例えば、１００μｇ／ｍＬ以上、例えば、５００μｇ／ｍＬ以上、例えば、１０００μｇ／ｍＬ以上、例えば、５０００μｇ／ｍＬ以上、例えば、１０，０００μｇ／ｍＬ以上の濃度で、主題のヒドロゲル中に取り込まれていてよい。ある実施形態において、ＢＭＰ−２は、１μｇ〜１０μｇの範囲、例えば、１．５μｇ〜９．５μｇ、例えば、２μｇ〜９μｇ、例えば、３μｇ〜８μｇ、例えば、４μｇ〜７μｇの範囲の量で、主題のヒドロゲル中に取り込まれる。
【０１２３】
ある実施形態において、方法は、主題の架橋共重合体ヒドロゲルを、骨再生、心臓組織再生または血管形成のためなどの細胞の送達、並びに血管新生のために用いることを包含し得る。
【０１２４】
本発明の方法の説明において、用語「対象」とは、上記架橋共重合体ヒドロゲルが適用され、接触した状態に維持される人または生物を意味する。従って、本発明の対象としては、哺乳類、例えば、ヒト並びに他の霊長類、例としてチンパンジー及び他の類人猿並びにサル種、を挙げることができるが、これらに限定はされず、ある実施形態において対象はヒトである。
【０１２５】
本発明の方法の実施において、一種又は複数種の生理活性剤を有する（上記に詳述した）主題の架橋共重合体ヒドロゲルの一種又は複数種が、（対象自身または治療提供者のいずれかにより）目標部位に配置され、対象に対して当該生理活性剤を送達するのに十分な期間、対象と接触した状態に維持される。
【０１２６】
上述のように、用いられる特定の架橋共重合体ヒドロゲルの構造（例えば、キトサンのラクチドに対する比、架橋密度、フィブリノゲン含有量等）に応じて、上記生理活性剤の架橋共重合体ヒドロゲルマトリクスからの放出は多様であり得る。例えば、架橋共重合体ヒドロゲルは、主題の架橋共重合体ヒドロゲルが対象（例えば、骨、鼓膜）と接触した状態に維持される全ての期間、例えば、１日以上にわたって、例えば、２日以上、例えば、５日以上、例えば、１０日以上、例えば、１５日以上、例えば、３０日以上、例えば、１００日以上にわたって、一定且つ連続的に送達するように、一種または複数種の生理活性剤の持続放出に向けて構成されてもよい。他の例において、本発明の架橋共重合体ヒドロゲルは、例えば、１時間毎に、例えば、２時間毎に、例えば、５時間毎に、例えば、１２時間毎に、例えば、２４時間毎に、例えば、３６時間毎に、例えば、４８時間毎に、例えば、７２時間毎に、例えば、９６時間毎に、例えば、１２０時間毎に、例えば、１４４時間毎に、例えば、１６８時間毎に、漸増的に放出するように、一種または複数種の生理活性剤のパルス状放出に向けて構成されてもよい。他の例において、主題の架橋共重合体ヒドロゲルは、あるパーセンテージの当該主題の共重合体ヒドロゲルが分解した後に、一種または複数種の生理活性剤を送達するように構成される。例えば、１０％の主題の共重合体ヒドロゲルの架橋が分解した後毎に、例えば、１５％の主題の共重合体ヒドロゲルの架橋が分解した後毎に、例えば、２０％の主題の共重合体ヒドロゲルの架橋が分解した後毎に、例えば、２５％の主題の共重合体ヒドロゲルの架橋が分解した後毎に、例えば、３０％の主題の共重合体ヒドロゲルの架橋が分解した後毎に、例えば、３３％の主題の共重合体ヒドロゲルの架橋が分解した後毎に、ある量の生理活性剤が放出されてもよい。更に他の例において、架橋共重合体ヒドロゲルは、（疼痛を急速に低減するなどのために）投与部位への接触に際して直ちに、例えば、５０％以上、例えば、６０％以上、例えば、７０％以上、例えば、９０％以上の一種または複数種の生理活性剤が、投与部位への接触に際して直ちに放出されることを含む、多量の上記生理活性剤を送達するように構成されてもよい。更に他の例において、本発明の架橋共重合体ヒドロゲルは、実質的にゼロ次放出速度でなど、実質的に一次放出速度でなど、または実質的に二次放出速度での所定の速度で、一種または複数種の生理活性剤を放出するように構成されてもよい。
【０１２７】
ある実施形態において、本発明の架橋共重合体ヒドロゲルは、一種又は複数種の生理活性剤の放出プロファイルであって、
当該生理活性剤が、当該架橋共重合体ヒドロゲルから第１の所定の速度で放出される第１の期間と、
当該生理活性剤が、当該架橋共重合体ヒドロゲルから第２の所定の速度で放出される第２の期間と
を含む、上記放出プロファイルを与えるように構成される。
【０１２８】
例えば、これらの実施形態において、上記第１の期間は、当該共重合体ヒドロゲルの投与時間から０．５時間〜７２時間の範囲の期間、例えば、１時間〜６０時間、例えば、２時間〜４８時間、例えば、３時間〜３６時間、例えば、４時間〜３０時間、例えば、上記投与時間から５時間〜２４時間の範囲の期間であってよい。上記第２の期間は、当該共重合体ヒドロゲルの投与時間から０．５時間〜３３６時間の範囲の期間、例えば、１時間〜３１２時間、例えば、２時間〜２８８時間、例えば、３時間〜２６４時間、例えば、４時間〜２４０時間、例えば、５時間〜２１６時間、例えば、上記投与時間から６時間〜１９２時間の範囲の期間であってよい。
【０１２９】
それぞれの期間における放出速度は、当該架橋共重合体ヒドロゲルの構造（例えば、キトサンのラクチドに対する比、架橋密度）に応じて多様であり得る。いくつかの実施形態において、上記第１の所定の速度は、実質的にゼロ次放出速度であってよい。他の実施形態において、第１の所定の速度は、実質的に一次放出速度であってよい。更に他の実施形態において、第１の所定の速度は、実質的に二次放出速度であってよい。同様に、第２の所定の速度は、実質的にゼロ次放出速度、実質的に一次放出速度または実質的に二次放出速度であってよい。
【０１３０】
ある実施形態において、主題の架橋共重合体ヒドロゲルの放出プロファイルは、実質的に一次放出速度を有する第１の期間、及びそれに続く実質的にゼロ次放出速度を有する第２の期間を含む。他の実施形態において、上記放出プロファイルは、実質的に二次放出速度を有する第１の期間、及びそれに続く実質的に一次放出速度を有する第２の期間を含む。更に他の実施形態において、上記放出プロファイルは、実質的に二次放出速度を有する第１の期間、及びそれに続く実質的にゼロ次放出速度を有する第２の期間を含む。
【０１３１】
これらの実施形態において、それぞれの期間に放出される生理活性剤の量は多様であり得る。いくつかの例において、主題の架橋共重合体ヒドロゲルは、第１の期間に、生理活性剤の全量の１０％から７５％、例えば、生理活性剤の全量の１５％から７０％、例えば、生理活性剤の全量の２０％から６０％、例えば、生理活性剤の全量の２５％から５０％、例えば、生理活性剤の全量の３０％から３５％を放出するように構成される。これらの例において、主題の架橋共重合体ヒドロゲルは、第２の期間に、生理活性剤の全量の１０％から７５％、例えば、生理活性剤の全量の１５％から７０％、例えば、生理活性剤の全量の２０％から６０％、例えば、生理活性剤の全量の２５％から５０％、例えば、生理活性剤の全量の３０％から３５％を放出するように構成されてもよい。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、一種又は複数種の生理活性剤を有する架橋共重合体ヒドロゲルの投与は、一又は複数の投与期間を含む。「投与期間」とは、生理活性剤を有する一種又は複数種の主題の架橋共重合体ヒドロゲルを、対象に接触させて適用及び維持することの単一の投与の継続期間を意味する。換言すれば、投与期間は、架橋共重合体ヒドロゲルを対象の目標位置に適用することで開始し、積極的にヒドロゲルを取り出すことによる、あるいは目標部位におけるヒドロゲルの完全な分解による、架橋共重合体ヒドロゲルの対象との接触からの除去で終了する。従って、投与期間とは、一種又は複数種の生理活性剤が対象に対して送達されている時間であり、約０．５時間以上、例えば、約１時間以上、例えば、約２時間以上、例えば、約４時間以上、例えば、約１２時間以上、例えば、約２４時間以上、例えば、約２日以上、例えば、約７日以上、例えば、１４日以上、例えば、２８日以上、例えば、７０日以上、例えば、１００日以上継続してよい。治療レジメンとしては、所望に応じて、一又は複数の投与期間、例えば、２以上の投与期間、例えば、５以上の投与期間、例えば、１０以上の投与期間を挙げることができる。
【０１３３】
ある実施形態において、本発明の方法はまた、対象への上記生理活性剤の送達を監視することを包含する。いくつかの実施形態において、生理活性剤の送達は、架橋共重合体ヒドロゲルが対象と接触した状態に維持されている時間全体にわたり、リアルタイムでデータを収集することなどにより、監視されてもよい。他の例において、生理活性剤の送達は、架橋共重合体ヒドロゲルを対象と接触した状態に維持している間、規則的な間隔でデータ収集すること、例えば、０．２５時間毎に、０．５時間毎に、１時間毎に、２時間毎に、４時間毎に、１２時間毎に、２４時間毎に、例えば、７２時間毎に、または他の何らかの間隔で、データを収集することによって監視される。更に他の実施形態において、生理活性剤の送達は、架橋共重合体ヒドロゲルを対象と接触した状態に維持している間、架橋共重合体ヒドロゲルの対象への投与後、特定のタイムスケジュールに従ってデータを収集することによって監視される。例えば、生理活性剤の送達は、（生理活性剤を有する）架橋共重合体ヒドロゲルの対象への投与後６時間、例えば、１２時間、例えば、２４時間、例えば、３、例えば、７日、例えば、１４日、例えば、（生理活性剤を有する）架橋共重合体ヒドロゲルの対象への投与後３０日に監視してもよい。
【０１３４】
上記に議論したように、本発明の態様はまた、一種又は複数種のヒドロゲルを対象に適用することにより、対象を治療することも包含する。いくつかの実施形態において、方法は、対象にヒドロゲルを適用し、対象を治療するのに十分な様式で、該ヒドロゲルを対象と接触した状態に維持することを含む。上記に議論したように、本発明のヒドロゲルは、骨、心臓、肝臓、腎臓、膀胱、口腔内及び舌下などの口の中、並びに鼻、喉及び耳の中を始めとする（但し、これらに限定されない）、治療を必要とする任意且つ適宜の適用部位に適用することができる。ある実施形態において、一種又は複数種のヒドロゲルが鼓膜に適用される。他の実施形態において、一種又は複数種のヒドロゲルが骨に適用される。更に他の実施形態において、一種又は複数種のヒドロゲルが心臓に適用される。
【０１３５】
上記に議論したように、本発明のヒドロゲルは、持続放出を通じるなどして、一種又は複数種の生理活性剤を送達するように構成されてもよい。本発明のヒドロゲルが一種又は複数種の生理活性剤を送達するように構成される場合、方法は、対象に一種又は複数種のヒドロゲルを適用し、対象に当該生理活性剤を送達するのに十分な様式で、該ヒドロゲルを対象と接触した状態に維持することを含む。いくつかの例において、上記生理活性剤としては、ＢＭＰ−２などの成長因子及び幹細胞が挙げられる。これらの例において、方法は、対象に一種又は複数種の当該生理活性剤を含むヒドロゲルを適用し、対象に当該生理活性剤を送達するのに十分な様式で、該ヒドロゲルを対象と接触した状態に維持することを含む。例えば、取り込まれたＢＭＰ−２などの成長因子及び幹細胞を有するキトサン−ポリエステルヒドロゲルまたはキトサン−ポリエステル−フィブリノゲンヒドロゲルが、対象の骨、鼓膜または心臓に適用され、上記生理活性剤を対象に送達するのに十分な様式で、骨、鼓膜または心臓と接触した状態で維持されてもよい。
【０１３６】
一例において、方法は、ＢＭＰ−２を含むヒドロゲル（例えば、キトサン−ポリラクチド、キトサン−ポリラクチド−フィブリノゲン）を対象の骨の少なくとも一部に接触させ、ＢＭＰ−２を含む該ヒドロゲルを、ＢＭＰ−２を対象の骨に送達するのに十分な様式で、対象の骨と接触した状態に維持することを含む。いくつかの実施形態において、主題の方法は、主題のヒドロゲルが存在しない場合の骨の再生と比較して、骨の再生を５％以上、例えば、１０％以上、例えば、２５％以上、例えば、５０％以上、例えば、７５％以上、例えば、９０％以上向上させることなどにより、骨を十分に再生させる。
【０１３７】
別の例において、方法は、生理活性剤を含むヒドロゲル（例えば、キトサン−ポリラクチド、キトサン−ポリラクチド−フィブリノゲン）を対象の鼓膜の少なくとも一部に接触させ、当該生理活性剤を含む当該ヒドロゲルを、当該生理活性剤を対象の鼓膜に送達するのに十分な様式で、対象の鼓膜と接触した状態に維持することを含む。
【０１３８】
更に別の例において、方法は、成長因子及び幹細胞を含む共重合体ヒドロゲル（例えば、キトサン−ポリラクチド、キトサン−ポリラクチド−フィブリノゲン）を対象の心臓の少なくとも一部に接触させ、成長因子及び幹細胞を含む当該ヒドロゲルを、幹細胞を対象の心臓に送達するのに十分な様式で、対象の心臓と接触した状態に維持することを含む。
【０１３９】
ある実施形態において、方法は、一種又は複数種のヒドロゲルを適用し、該ヒドロゲルを、所定の用量の生理活性剤（例えば、ＢＭＰ−２または幹細胞）を適用部位に送達するのに十分な様式で、対象と接触した状態に維持することを含む。例えば、上記ヒドロゲルは、適用部位に接触し、５μｇ／ｈｒ以上、例えば、１０μｇ／ｈｒ以上、例えば、２０μｇ／ｈｒ以上、例えば、２５μｇ／ｈｒ以上、例えば、３０μｇ／ｈｒ以上、例えば、３５μｇ／ｈｒ以上、例えば、４５μｇ／ｈｒ以上、例えば、５０μｇ／ｈｒ以上、例えば、６０μｇ／ｈｒ以上の、所定の生理活性剤（例えば、ＢＭＰ−２または幹細胞）の用量を送達するのに十分な様式で、該適用部位と接触した状態に維持されてもよい。ある実施形態において、上記ヒドロゲルは、適用部位と接触し、１〜７５μｇ／ｈｒの範囲、例えば、２〜７０μｇ／ｈｒ、例えば、５〜６５μｇ／ｈｒ、例えば、１０〜６０μｇ／ｈｒ、例えば、１５〜５５μｇ／ｈｒ以上、例えば、２０〜５０ｎｇ／ｈｒ、例えば、２５〜４５μｇ／ｈｒの範囲の、所定の生理活性剤（例えば、ＢＭＰ−２または幹細胞）の用量を送達するのに十分な様式で、該適用部位と接触した状態に維持されてもよい。
【０１４０】
他の実施形態において、方法は、一種又は複数種の主題のヒドロゲルを適用し、生理活性剤（例えば、ＢＭＰ−２または幹細胞）を対象の適用部位に、０．５ｎｇ／ｃｍ２／ｈｒ以上の速度、例えば、０．６ｎｇ／ｃｍ２／ｈｒ以上、例えば、０．６５ｎｇ／ｃｍ２／ｈｒ以上、例えば、０．７５ｎｇ／ｃｍ２／ｈｒ、例えば、０．９ｎｇ／ｃｍ２／ｈｒ、例えば、１．０ｎｇ／ｃｍ２／ｈｒ以上、例えば、１．５ｎｇ／ｃｍ２／ｈｒ以上、例えば、１．７５ｎｇ／ｃｍ２／ｈｒ以上の速度で、例えば、２．０ｎｇ／ｃｍ２／ｈｒ以上のピーク流量で送達するのに十分な様式で、該ヒドロゲルを対象と接触した状態に維持することを含む。
【０１４１】
方法はまた、一種又は複数種のヒドロゲルを適用し、該ヒドロゲルを、長期間にわたって、５ｎｇ／ｃｍ２以上の平均累積量の生理活性剤を送達するのに十分な様式で、対象と接触した状態に維持することも含む。これらの実施形態において、本発明のキトサン−ポリラクチドヒドロゲル及びキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルは、２５ｎｇ／ｃｍ２以上、例えば、５０ｎｇ／ｃｍ２以上、例えば、４週間の送達期間にわたって７５ｎｇ／ｃｍ２以上、例えば、１００ｎｇ／ｃｍ２以上、例えば、１２５ｎｇ／ｃｍ２以上、例えば、１５０ｎｇ／ｃｍ２以上、例えば、所定の送達期間にわたって２００ｎｇ／ｃｍ２の、平均累積量の生理活性剤（例えば、ＢＭＰ−２または幹細胞）を送達するように構成されてもよい。
【０１４２】
更に他の実施形態において、方法は、一種又は複数種のヒドロゲルを適用し、該ヒドロゲルを、例えば、全生理活性剤（例えば、ＢＭＰ−２または幹細胞）曝露量によって、または平均の１日当たりの生理活性剤曝露量によって特徴付けられる目標用量の生理活性剤を送達するのに十分な様式で、対象と接触した状態に維持することを含む。例えば、主題の方法により送達される生理活性剤の上記目標用量は、０．０１ｍｇ／日以上、例えば、０．０４ｍｇ／日以上、例えば、４週間の投与期間にわたって０．５ｍｇ／日以上、例えば、１．０ｍｇ／日以上、例えば、２ｍｇ／日以上、例えば、５ｍｇ／日以上、例えば、４週間の投与期間にわたって１０ｍｇ／日であってよい。
【０１４３】
キット
キットもまた提供され、ここでキットは、一種又は複数種の、例えば複数の、上述の主題の架橋共重合体ヒドロゲルを少なくとも備える。ある実施形態において、ある量の一種又は複数種の生理活性剤を主題の架橋共重合体ヒドロゲルとの組み合わせで有する組成物が、パッケージ化されたキットとして提供されてもよい。
【０１４４】
キットは、投与のための器具（例えば、シリンジ）または主題の架橋共重合体ヒドロゲルを適用する前に投与部位を洗うための流体などの、主題の方法を実施するための他の構成要素を更に備えていてもよい。キットはまた、ガーゼパッド又は目的部位を洗浄するためのその他の器具などを備えていてもよく、これらは主題の方法の実施において用いることができる。
【０１４５】
更に、キットはまた、主題の架橋共重合体ヒドロゲルの使用方法に関する指示書を備えていてもよく、ここで該指示書は、治療レジメンを実行するための、当該架橋共重合体ヒドロゲルの投与方法、投与スケジュール、及び記録保管のためのデバイスに関する情報を備えていてもよい。上記指示書は、適宜の記録媒体上に記録される。例えば、指示書は、紙面またはプラスチック等の基材上に印刷されていてもよい。従って、指示書は、添付文書としてキット中に、キットまたはその構成要素（すなわち、包装または個別包装を伴う）等の容器のラベル中にあってもよい。他の実施形態において、指示書は、例えばＣＤ−ＲＯＭ、フロッピーディスク等の適宜のコンピュータ可読の保存媒体上に存在する、電子保存データファイルとして存在する。更に他の実施形態において、実際の指示書はキット中には存在せず、例えばインターネットを介した、遠隔のソースより指示書を入手する手段が提供される。この実施形態の例は、指示書が閲覧可能である及び／または指示書をダウンロードすることができるウェブアドレスを備えるキットである。指示書と同様に、指示書を入手するための手順を適宜の基材上に記録してもよい。
【０１４６】
有用性
本開示に係る架橋共重合体ヒドロゲル及び該架橋共重合体ヒドロゲルの使用方法は、生体適合性の、無害の且つ生分解性の組成物を用いて、対象が、活性薬剤の送達から恩恵を受ける、または対象における構造体（例えば、骨、鼓膜、靭帯、軟骨）を修復することとなる任意の用途に用いられる。同様に、本発明の架橋共重合体ヒドロゲルはまた、生理活性剤が、生理活性剤の部位特異的な送達を安定化させるまたは提供するために用いることができる、調整可能な、生体適合性の且つ生分解性の送達ビヒクルから恩恵を受ける任意の用途に用いられる。
【０１４７】
ある例において、架橋共重合体ヒドロゲルは、投与部位への送達がヒドロゲルなどの生体適合性の送達ビヒクルを用いて行うことができる場合に、病気を治療するために用いられる、成長因子（例えば、骨移植片用の骨成長因子）、医薬または他の活性薬剤の送達に用いられる。治療とは、少なくとも対象を悩ます疾病に伴う症状の改善が達成されることを意味し、但し、改善は、例えば、治療を受けている疾病に伴う症状などのパラメータの大きさが少なくとも低下することを指す、広い意味で用いられる。従って、治療はまた、病理学的疾病、または少なくともそれに伴う症状が完全に抑制され、例えば、起こることが防止され、または停止、例えば終息し、対象が当該疾病、又は少なくとも当該疾病の特徴である症状に悩むことがないようになることも含む。
【０１４８】
実験
キトサン−ポリラクチドヒドロゲル
キトサン、ラクチド及び無水メタクリル酸をベースとする架橋共重合体ヒドロゲルを合成し、その化学構造、分解速度、圧縮弾性率、及びタンパク質放出速度論を調べた。上記ヒドロゲルの細胞毒性、並びにＷ−２０−１７前骨芽細胞マウス骨髄間質細胞及びＣ２Ｃ１２マウス筋芽細胞を用いた、骨芽細胞分化及び石灰化に対する該ヒドロゲルの骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）の送達効果も評価した。ＮＭＲ及びＦＴＩＲを用いて、主題の架橋共重合体ヒドロゲルを特徴付けた。いくつかの実施形態において、親水性のキトサン連鎖へのラクチド疎水性部分の付加により、上記共重合体ヒドロゲルの膨潤性、柔軟性、及び分解速度が増加した。キトサン／ラクチド比と比較して、より長いＵＶ露光時間によるより多くの架橋が、圧縮弾性率の増加及びタンパク質放出速度論の減速を示す、ヒドロゲルに対する更なる効果を生み出した。上記ヒドロゲルは、その組成及びＵＶ架橋にもかかわらず細胞毒性はなかった。より低架橋の共重合体ヒドロゲルにおいて、Ｗ−２０−１７及びＣ２Ｃ１２両細胞のより高いＡＬＰ活性が観測された。石灰化もまたＢＭＰ−２の放出によって向上した。
【０１４９】
材料及び方法
材料
キトサン（≧３１０ｋＤａ、脱アセチル化度７５％以上）及び無水メタクリル酸はシグマ−アルドリッチ社（ミズーリ州セントルイス）より購入した。Ｄ，Ｌ−ラクチドはＯｒｔｅｃ社（サウスカロライナ州ピエモント）より購入した。ヒト骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）はメドトロニック社（ミネソタ州ミネアポリス）より入手した。他の全ての化学品は試薬グレードであり、受け入れた状態のまま用いた。ＵＶ光源（オムニキュアＳ２０００）はルーメン・ダイナミクス・グループ社（カナダ国オンタリオ）より購入した。
【０１５０】
架橋共重合体ヒドロゲルの合成
粉末状キトサンを０．７５％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液中で室温にて一晩撹拌することにより、１％（ｗ／ｖ）キトサン溶液を調製した。該キトサン溶液中の不溶粒子をろ過により除去した。粉末状のＤ，Ｌ−ラクチドを８０℃でＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）中に溶解させることにより、乳酸水溶液を調製した。キトサンに対して異なる質量比を有するラクチドを調製した（８：１、４：１、または１：１）。上記キトサンとラクチドとの混合物を、磁気攪拌機を用いて８０℃で１時間撹拌した。２−エチルヘキサン酸スズ（ＩＩ）及びトリエチルアミン（ＴＥＡ）を滴下により添加した。該混合物を、窒素雰囲気中、８０℃で２０時間、磁気攪拌機で撹拌しながら反応させた。該混合物を、透析チューブ（分子量カットオフ：１４，０００）を用いて、蒸留水中で１日間透析した。上記透析した混合物中に、２．５％（ｗ／ｖ）の無水メタクリル酸を滴下により添加し、６０℃で８時間反応を継続させた。該混合物を、透析チューブ（分子量カットオフ：１４，０００）を用いて、蒸留水中で７日間透析した。次に、得られた溶液を２〜３日凍結乾燥し、使用するまで−２０℃で保存した。光架橋性ヒドロゲルの生成のために、上記凍結乾燥した試料を蒸留水中２％（ｗ／ｖ）溶液として再構成した。光開始剤（イルガキュア２９５９、チバ・ケミカルズ社）を７０℃で蒸留水に完全に溶解させた。該光開始剤溶液を、０．２２μｍのフィルタを通す細菌ろ過器でろ過し、その後上記プレポリマー溶液に添加して、最終濃度０．５％（ｗ／ｖ）とした。次に、上記プレポリマー溶液を６．９ｍＷ／ｃｍ２のＵＶ光に露光させ、光架橋によってフリーラジカル重合させた。以下のスキーム１に示すように、異なる質量比及び異なるＵＶ露光時間でＤ，Ｌ−ラクチドをキトサンと反応させることによって、キトサン−ラクチドヒドロゲルを調製した。
スキーム１
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【０１５１】
架橋共重合体ヒドロゲルの特徴付け
プロトン核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）分光分析
キトサン、キトサン／ラクチド（Ｃｈ／ＬＡ）、及びキトサン／ラクチド／無水メタクリル酸（Ｃｈ／ＬＡ／ＭＡ）の構造の特徴付けを、ＮＭＲ分光分析によって行った。ＮＭＲ測定用に、試料をＣＤ３ＣＯＯＤ中に溶解させて調製し、バリアン・イノーバ−３００分光分析機上で１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを得た。全ての共鳴シグナルに関する化学シフトを百万分率（ｐｐｍ）で報告した。
【０１５２】
フーリエ変換赤外分光分析（ＦＴＩＲ）スペクトル
キトサン、Ｃｈ／ＬＡ、及びＣｈ／ＬＡ／ＭＡを含むプレポリマー溶液の化学構造を調べるために、解析ソフトウェアを有するＰＣと組み合わせたブルカー・ベルテックス７０  ＦＴＩＲ分光分析機を用いてＦＴＩＲスペクトルを得た。試料を、ＩＲレーザービーム中のホルダーに直接入れた。全てのスペクトルを透過モード（４０回走査、８００〜４０００ｃｍ−１）で記録した。
【０１５３】
走査型電子顕微鏡分析（ＳＥＭ）
未修飾キトサンヒドロゲルをキトサン−ラクチドヒドロゲルと比較することにより、ヒドロゲルの内部ミクロ構造を検討した。ヒドロゲルの形態上の変化に対するＵＶ架橋時間の影響もまた観測した。キトサンのラクチドに対する異なる質量比及び異なるＵＶ架橋時間でヒドロゲル試料を調製した。これらをＰＢＳ（ｐＨ７．４）中３７℃で１時間インキュベートし、一晩凍結乾燥した（フリーゾーン、ラブコンコ社）。試料を金でスパッタコートし、１０ｋＶの電圧で運転する走査型電子顕微鏡（日立Ｓ−３４００Ｎ  ＶＰ  ＳＥＭ）下で試験した。
【０１５４】
機械的試験
キトサンへのラクチドの導入及びＵＶ架橋時間のヒドロゲルの機械的特性に対する影響を判定するために、１０Ｎのロードセル（インターフェース社、アリゾナ州スコッツデール）を備えるインストロン５９４４材料試験システム（インストロン社、マサチューセッツ州ノーウッド）を用いて、一軸圧縮試験を実施した。プレポリマー溶液をピペットでテフロン製の円筒形の型内にとり、６．９ｍＷ／ｃｍ２のＵＶ光に露光させた。試料の直径（約６ｍｍ）及び厚さ（約３ｍｍ）を、デジタル式のノギス及び材料試験システムの位置の読みを用いてそれぞれ測定した。各試験の前に、約２ｍＮの予備負荷を印加した。次に、上部圧盤を１％ひずみ／秒の速度で最大ひずみ３０％まで降下させた。荷重及び変位データを１００Ｈｚで記録した。各ひずみ範囲における応力−ひずみ曲線の直線での曲線近似から、１０〜２０％のひずみ範囲に対して圧縮弾性率を測定した。全ての試験はＰＢＳ溶液中、室温で行った。
【０１５５】
インビトロでの分解特性
キトサンのラクチドに対する異なる比及び異なるＵＶ露光時間に応じて、ヒドロゲルのインビトロ分解を検討した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）及びリゾチーム含有ＰＢＳの両方における、ヒドロゲルの湿重量残存率を測定することにより、ヒドロゲルの膨潤挙動または分解プロファイルを判定した。インビトロでの分解過程を促進するために、血清中に存在する生理的濃度よりもより高い濃度のリゾチームを用いた（１．５μｇ／ｍｌ）。ヒドロゲルを、表面の濡れを除去して秤量した（Ｗ０）。次に、当該ヒドロゲルを３７℃で、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中または１００μｇ／ｍｌリゾチーム／ＰＢＳ溶液中に入れた。１５日の期間にわたる所定の時点で、１日おきに試料を取り出して再度秤量を行った（Ｗ１）。湿重量残存率を次のように算出した。
湿重量残存率（％）＝Ｗ１／Ｗ０×１００％
【０１５６】
インビトロでの放出の検討
上記ヒドロゲルからのタンパク質の放出速度論を検討するために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をモデルタンパク質として用いた（８２μｇ／ｍｌ）。この検討では、キトサンのラクチドに対する異なる比及び異なるＵＶ架橋時間に応じた、ヒドロゲルからのＢＳＡの放出速度論を評価した。ＢＳＡをプレポリマー溶液と混合して均一な溶液を形成させ、次いで実験の前に４℃に一晩保持した。その後、上記混合物をピペットでテフロン製の円筒形の型内にとり、６．９ｍＷ／ｃｍ２のＵＶ光に露光させた。直径６ｍｍ及び厚さ３ｍｍを有するヒドロゲルを調製した。各試料を、３ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を収容する容器内に入れ、３７℃で１５日間インキュベートした。所定の時点で５００μｌの放出媒体の部分試料を採取し、同量の新しいＰＢＳ（ｐＨ７．４）を各容器に添加した。採取した画分において、ヒドロゲルからのＢＳＡの累積放出量を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ社、イリノイ州ロックフォード）によって、時間の関数として測定した。５６０ｎｍにおいてマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ５０）を用いて各試料の光学密度を測定した。
【０１５７】
インビトロでの生理活性
細胞培養
２種の異なる細胞株、Ｗ−２０−１７前骨芽細胞マウス骨髄間質細胞及びＣ２Ｃ１２マウス筋芽細胞をＡＴＣＣ（バージニア州マナサス）より購入した。これらの細胞を、１０％のＦＢＳ、１％の抗生剤／抗カビ剤混合物、５ｍｌのＬ−グルタミン（２００ｍＭ）、及びピルビン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ培地中で増殖及び保持した。上記細胞を、５％ＣＯ２を供給する培養器中、３７℃で培養した。培地を３日毎に交換した。
【０１５８】
ヒドロゲルの細胞毒性
本検討においては、ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ（商標）コントロール細胞培養インサートを介した間接培養を用い、細胞培養培地を通じたゲルの細胞毒性を評価した。上記インサートは、基底膜マトリクスの薄層を有する０.４５ミクロンの細孔径のＰＥＴ膜を含有し、該膜は細胞が該膜を通して移動することを防止し、且つ培地のみが該ＰＥＴ膜を通して移動できるようにする。上記細胞を６０，０００細胞／ウェルの密度でウェルプレートの底部に播種し、ヒドロゲルを培地と共に上部チャンバーに入れた。１日間及び３日間のインキュベーションの後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎアッセイを用い、その製造者の指示に従って生存細胞数を測定した。上記アッセイの前に、ツァイスＡｘｉｏｖｅｒｔ  ２００顕微鏡（カールツァイス・マイクロイメージング社、ニューヨーク州ソーンウッド）を用いて細胞形態を観察した。細胞の光学顕微鏡写真を画像処理ソフトウェア（ツァイス社、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ）を用いて処理した。
【０１５９】
細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性に対する異なるＵＶ露光時間の影響
ＢＭＰ−２放出に対するＵＶ露光時間の影響を調べるために、異なるＵＶ露光時間（３０秒及び３００秒）によって作製したヒドロゲルを含むＤＭＥＭ培地中で細胞を培養した。本検討では、２種の異なる細胞株を使用した。ＡＳＴＭ  Ｆ２１３１規格の下では、Ｗ−２０−１７細胞株を用いて、インビトロでＢＭＰ−２の活性が評価されている。Ｃ２Ｃ１２細胞株は、ＢＭＰ−２による処理後に、分化経路において筋芽細胞から骨芽細胞へ転じることから、該細胞株も選択した。細胞を６０，０００細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種し、５日間インキュベートした。２種の対照群はヒドロゲルを含まなかった。陰性対照群においては、ＢＭＰ−２を含まないＤＭＥＭ中で細胞をインキュベートした。陽性対照群においては、１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２を第１日に培地に添加したが、第３日に培地を交換した後にはＢＭＰ−２を補充しなかった。実験群においては、ＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加したヒドロゲルを、第１日に同一のウェルプレートに入れた。陽性対照群は、ＢＭＰ−２の爆発的な放出効果に対して設計した。実験ゲル群は、ＢＭＰ−２の持続的な放出効果に対して設計した。５日間インキュベートした後、培地を細胞培養物から除去し、細胞層をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で一度洗浄した。ＡＬＰ活性を、シグマ−アルドリッチ  アルカリホスファターゼキットを用い、その製造者の指示書（シグマ−アルドリッチ社、ミズーリ州セントルイス）に従って検出した。ＡＬＰの組織化学的な半定量的画像を、ツァイスＡｘｉｏｖｅｒｔ  ２００顕微鏡（カールツァイス・マイクロイメージング社、ニューヨーク州ソーンウッド）を用いて得た。染色の定量化は、アドビ・フォトショップ７．０（アドビ・システムズ社、カリフォルニア州サンノゼ）を用いて行った。画像ヒストグラムツールを用いて平均のピクセル強度を測定した。
【０１６０】
カルシウム石灰化に対するアリザリンレッドＳ染色
細胞層内のカルシウム鉱質含有量を、アリザリンレッドＳ染色（ＡＲ−Ｓ）によって定性的及び定量的に測定した。細胞を３０，０００細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種し、ＤＭＥＭ中で１日インキュベートし、次いで培地を、１０％のＦＢＳ、１０ｍＭのβ−グリセロリン酸、１０ｎＭのデキサメタゾン、及び５０ｍｇ／ｍｌのアスコルビン酸を含有する骨形成培地に変更した。２．７．３で説明したように、２種の対照群はヒドロゲルを含まなかった。陰性対照群においては、ＢＭＰ−２を含まない骨形成培地中で細胞をインキュベートした。陽性対照群においては、１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２を第１日に骨形成培地に添加したが、第３日に培地を交換した後にはＢＭＰ−２を補充しなかった。実験群においては、異なるＵＶ露光時間（３０秒及び３００秒）によって作製したヒドロゲルにＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加し、これを第１日に同一のウェルプレートに入れた。陽性対照群は、ＢＭＰ−２の爆発的な放出効果に対して設計した。実験ゲル群は、ＢＭＰ−２の持続的な放出効果に対して設計した。各時点（１０日及び２１日のインキュベーション）で、細胞層をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、４℃の氷冷５０％エタノールで３０分間固定化した。蒸留水で洗浄した後、上記細胞層を室温で乾燥させ、１ｍｌの１％アリザリンレッドＳ（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加することにより、室温で４５分間染色した。次に、上記細胞層を蒸留水で５回洗浄し乾燥させた。染色した細胞層を、ツァイスＡｘｉｏｖｅｒｔ  ２００顕微鏡（カールツァイス・マイクロイメージング社、ニューヨーク州ソーンウッド）を用いて写真撮影した。１０％酢酸とメタノールとの混合物を含有する抽出溶媒を用いた、室温で３０分間の脱染操作により、定量的なカルシウム鉱質含有量を測定した。次いで、アリザリンレッドＳ抽出分の２００μｌの分割液を、９６ウェルのアッセイプレートに添加した。試料及び標準試料のアリザリンレッドＳの濃度を、４０５ｎｍの吸光度において測定し、μｇ／ｍｌで表した。
【０１６１】
統計的解析
全てのデータは平均値±標準偏差で表される。有意差は一方向ＡＮＯＶＡ検定によって解析した。群及び任意の時間における実験時点における差異は、ｐ＜０．０５の場合に有意であると見なした。
【０１６２】
結果
キトサン−ラクチドヒドロゲルの特徴付け
プロトン核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）分光分析
図１はキトサン、Ｃｈ／ＬＡ、及びＣｈ／ＬＡ／ＭＡの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。試料に由来する、キトサン、乳酸、及び無水メタクリル酸セグメントに関連する特性ピークは、文献に報告されたデータに従って帰属を行った。キトサンは、グルコサミン環中のＨ−３、Ｈ−４、Ｈ−５、及び２Ｈ−６によるδ３．２６〜３．８９のマルチプレット、並びに、キトサンのＮ−アセチルグルコサミン単位のＨ−２に帰属されるδ１．８０、２．００、及び２．２１のシグナルを示した。Ｃｈ／ＬＡの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、キトサンに比較して、キトサンのシグナルを示すだけでなく、ポリラクチド分枝及びその連鎖中の繰り返し単位の末端メチンプロトンにそれぞれ帰属されるδ４．３０〜４．５３及びδ５．２３の新たなピークも有していた。δ１．４８〜１．５９及びδ１．３１のシグナルは、末端基に位置するポリラクチドのメチルプロトンに帰属された。上記結果から、Ｃｈ／ＬＡはポリラクチド側鎖を含有することが明らかとなった。Ｃｈ／ＬＡ／ＭＡに関するスペクトルは、Ｃｈ／ＬＡにおいて帰属されたシグナルに加えて、新たな、メタクリル酸基のビニルプロトン（Ｃ＝ＣＨ２）に帰属されるδ６．２３及びδ５．７４のシグナル、並びにメタクリル酸基のメチルプロトン（ＣＨ３）によるδ１．９７のシングレットの存在を示した。δ１．８７〜２．３１のピークは、キトサンの未修飾領域上のアセチル基、及びメタクリル化されたキトサンのメタクリルアミドペンダントのメチレン炭素に相当した。キトサンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、ラクチドによる修飾（Ｃｈ／ＬＡ）及び無水メタクリル酸による修飾（Ｃｈ／ＬＡ／ＭＡ）後のキトサンのスペクトルと比較すると、これらの新たなスペクトルは、エステル化及びアミド化の結果を示した。
【０１６３】
フーリエ変換赤外分光分析（ＦＴＩＲ）スペクトル
プレポリマー溶液の構造変化を、ＦＴＩＲスペクトル（図２）によっても確認した。キトサン（Ｃｈ）のスペクトルは、１６２２ｃｍ−１のアミドＩのＣ＝Ｏ伸縮振動、１５４０、１５５６、及び１５６８ｃｍ−１のアミドＩＩのＮ−Ｈ変角振動、並びに１２６１ｃｍ−１のアミン基のＣ−Ｎ変角振動に帰属される、いくつかの特性ピークを示した。１０７２ｃｍ−１及び１０２２ｃｍ−１のＣ−Ｏ−Ｃ変角振動を表すピークが観測された。１３７３及び１４０５ｃｍ−１のピークは、ＣＨ３の対称な変角振動の特性吸収であった。１７３３、１７４４、及び１８１８ｃｍ−１の吸収は、キトサン骨格中のＮ−アセチル基のＣ＝Ｏ伸縮振動に帰属され、当該キトサンが完全には脱アセチル化されていないことを示した。
【０１６４】
１６２２ｃｍ−１のアミドＩの強度は、ＬＡ修飾（Ｃｈ／ＬＡ）の後に、キトサンのＩＲスペクトルと比較して増加した。アミドＩＩのＮ−Ｈ変角振動に帰属されるピークは変化し、且つ１５３７及び１５７７ｃｍ−１へと変位し、このことは反応後に、共重合体（Ｃｈ／ＬＡ）中においてアミド基の量が増加したことを示した。Ｃ＝Ｏ伸縮振動に帰属される１７３３、１７７４、及び１８１８ｃｍ−１のピークは、キトサン中のＮ−アセチル基及びキトサンとラクチドとを連結するエステルに由来するピークの重なり合いのために増加した。この証拠は、ラクチドのカルボニル基もまたキトサンの水酸基と相互作用することを示している。
【０１６５】
Ｃｈ／ＬＡが無水メタクリル酸と反応してＣｈ／ＬＡ／ＭＡを生成した際に、アミドＩのピーク（１６１６ｃｍ−１）並びにアミドＩＩ（１５３９、１５７１、及び１５７９ｃｍ−１）の強度の増加がアミド化の増加を示した。更に、Ｃ＝Ｃ伸縮振動に帰属される１６００〜１６４７ｃｍ−１の範囲の吸収ピークは、アミドＩ由来のピークと重なり合った。１７３５、１７７６、及び１８１８ｃｍ−１のピークの増加は、キトサン中のＮ−アセチル基及びキトサンと無水メタクリル酸とを連結するエステルに起因するＣ＝Ｏ伸縮振動に帰属された。このことは、無水メタクリル酸とキトサン−ラクチドとの間の反応を証明した。
【０１６６】
ＳＥＭ観察
図３は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、３７℃で１日のインキュベーション後の、凍結乾燥したヒドロゲルの断面領域のＳＥＭ顕微鏡写真を示す。全てのヒドロゲルは高度に多孔質であったが、断面全体にわたって、試料間で異なる形態を示した。キトサン単独（図３ａ〜３ｄ）は、キトサンのラクチドとの組み合わせ（図３ｅ〜３ｈ）と比較して、より小さい細孔径を有する多孔質構造を示した。ＵＶ３０秒露光によって作製したＣｈ／ＬＡ（１：１）は、ヒドロゲルの４組の群の中で最も大きな細孔径を示し（図３ｅ及び３ｆ）、ＰＢＳ中１日のインキュベーション後により高い膨潤挙動を示した。同様に、ＵＶ露光時間を増加させると（図３ｇ及び３ｈ）、Ｃｈ／ＬＡ（１：１）の細孔径は、３０秒の照射におけるＣｈ／ＬＡ（１：１）の細孔径よりもより小さくなった。プレポリマー溶液に対するＵＶ露光をより長くすると、より架橋したネットワークが生成するように思われる。ＳＥＭ像は、これらの構造的な特性が、ヒドロゲルの組成及び露光時間による架橋密度に伴って変化することを実証した。
【０１６７】
機械的試験
キトサンのラクチドに対する異なる比及び異なるＵＶ架橋時間に応じて、ヒドロゲルの機械的特性を検討した（図４）。その結果は、キトサンのラクチドに対する比を増加させるのに伴って、ヒドロゲルの圧縮弾性率が増加することを示した。３０秒のＵＶ光照射において、キトサン単独は、キトサンとラクチドとの組み合わせよりもより高い圧縮弾性率を示した（ｐ＜０．０５）。Ｃｈ／ＬＡ（８：１）とＣｈ／ＬＡ（１：１）との間にも圧縮弾性率の差異があった（ｐ＝０．０３９）。全ての群について、ヒドロゲルの圧縮弾性率は、ＵＶ架橋時間を増加させるに伴って増加した。キトサン単独では、３０秒、１２０秒、及び３００秒のＵＶ露光時間において、それぞれ５±０．６８、２１．６±２．０４、及び３５．２±５．１ｋＰａの圧縮弾性率を有していた。Ｃｈ／ＬＡ（８：１）は、３０秒、１２０秒、及び３００秒において、それぞれ４±０．３８、２２．４±４．１、及び３３．２±２．６１ｋＰａの圧縮弾性率を示した。Ｃｈ／ＬＡ（４：１）は、３０秒、１２０秒、及び３００秒において、それぞれ１．９±１．１１、１４±３．２３、及び１６．９±３．１５ｋＰａの圧縮弾性率を有していた。Ｃｈ／ＬＡ（１：１）もまた、３０秒における１．３±０．４８ｋＰａから３００秒における１５．２±０．８６ｋＰａへと圧縮弾性率を増加させた。このことは、ＵＶ架橋時間をより長くすることで架橋度が増加し、ヒドロゲルのミクロ構造が強化される結果となることを示した。ヒドロゲルの圧縮弾性率は、ヒドロゲルネットワーク中のラクチドの量に反比例した。ラクチドの比をより高くすると、他に比較してより低いヒドロゲルの圧縮弾性率が示された。この結果は、機械的強度はキトサンのラクチドに対する比及びＵＶ照射による架橋密度に依存することを示した。キトサンのラクチドに対するより高い比及びより長い露光時間により、ヒドロゲルの剛性が高くなった。
【０１６８】
ヒドロゲルのインビトロでの分解特性
異なる比及び異なるＵＶ露光時間のヒドロゲルの分解挙動に対する影響を理解するために、図５に示すように、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でのヒドロゲルの湿重量残存率を調べた。上記ゲルを、リゾチーム（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中においても試験した。ＰＢＳ中での、３０秒のＵＶ露光時間におけるＣｈ／ＬＡ（１：１）の湿重量残存率は、同一のＵＶ露光時間において、他の群と比較して増加した（ｐ＜０．０５）。他の群は、全てのＵＶ露光時間において、２０％未満の湿重量残存率の低下を示し、当該ヒドロゲルの形状は、ＰＢＳ中での１５日のインキュベーションの間十分に維持された。ＵＶ露光時間を増加させるに伴って、Ｃｈ／ＬＡ（１：１）の湿重量残存率もまた緩やかに低下し、他と比較して類似の傾向を示した。この結果は、より大きなラクチド部分を有するヒドロゲル及びより短いＵＶ露光時間は、より多い量の水の吸収を誘導し、より大きな膨潤度をもたらすことを示した。
【０１６９】
１００μｇ／ｍｌのリゾチームを含有するＰＢＳ中においては、３０秒のＵＶ露光時間において、全ての群におけるヒドロゲルの湿重量残存率が時間と共に減少し、３日以内に完全に分解する結果となった。ヒドロゲルの湿重量の減少は、ＵＶ露光時間を増加させるに伴って低下した。１２０秒のＵＶ露光時間では、Ｃｈ／ＬＡ（１：１）の湿重量残存率は、３日のインキュベーションの間未変化のままであった。Ｃｈ／ＬＡ（１：１）は第９日までに完全に分解した。他の群も湿重量の有意な減少を示したが（ｐ＜０．０５）、これらは、１５日間で、Ｃｈ／ＬＡ（８：１）及びＣｈ／ＬＡ（４：１）に関しては概ね１４％、キトサン単独に関しては２３％残存した。３００秒のＵＶ露光時間では、全ての群が時間と共に有意な重量減少を示したが、これらは、１５日間で、Ｃｈ／ＬＡ（１：１）に関する概ね３８％とキトサン単独に関する５３％の間で残存した。キトサンのラクチドに対するより高い比、及びより長いＵＶ露光時間により、湿重量残存率が著しく減少し、分解速度が減速した。
【０１７０】
インビトロでの放出の検討
キトサンのラクチドに対する異なる比及び異なるＵＶ架橋時間が、インビトロで、取り込まれたタンパク質の放出速度に影響を与えるかを検討した。放出の検討に対するモデルタンパク質としてＢＳＡを用い、該タンパク質のパーセントで表した累積放出率を時間の関数として測定した（図６）。その結果は、３０秒及び３００秒のＵＶ照射の両方で、全てのヒドロゲルからの初期の爆発的なタンパク質の放出、及びそれに続く持続放出を示した。３０秒のＵＶ露光に関しては、全ての群が、１日での全体量の５３〜５８％の爆発的な放出、及びそれに続く、１５日間のインキュベーションにわたる全体量の８１〜９１％の緩やかな放出を示した。対照的に、３００秒のＵＶ露光に関しては、ヒドロゲルのＢＳＡ放出プロファイルは、１日での全体量の３１〜３３％の初期の爆発的なタンパク質の放出を生じ、初期の爆発的なタンパク質の放出は低減された結果となった。その後、１５日間にわたる、全体量の６５〜７４％の適度且つ持続的な放出があった。この検討は、同一のＵＶ露光時間における、キトサンのラクチドに対する異なる比を有するヒドロゲルからのＢＳＡの放出プロファイルは類似する一方、より長いＵＶ露光によるより高い架橋度は、初期の爆発的な放出を低減させ、１５日間のインキュベーションにわたるＢＳＡの放出期間を延長することを実証した。
【０１７１】
ヒドロゲルの細胞毒性
Ｗ−２０−１７及びＣ２Ｃ１２細胞に対する上記ヒドロゲルの細胞毒性をＭＴＳアッセイにより調べ（図７ａ及び７ｃ）、３日のインキュベーションの間、細胞形態を観察した（図７ｂ及び７ｄ）。３日間の培養後、Ｗ−２０−１７及びＣ２Ｃ１２細胞の代謝活性の有意な増加があり（Ｐ＜０．０５）、このことは細胞が生存可能であること及びヒドロゲルの存在下で増殖していることを示した。顕微鏡画像は、ＭＴＳアッセイと一致して、全ての群における細胞が、３日の培養の間に増殖したことを示した。結果は、ポリマーの組成及びＵＶ架橋にかかわらず、上記ヒドロゲルは細胞毒性がないことを実証した。
【０１７２】
ＢＭＰ−２に応答したＡＬＰ活性
上記ヒドロゲルから放出されるＢＭＰ−２の生理活性を調べるために、細胞のＡＬＰ比活性を測定した。第１日にＷ−２０−１７及びＣ２Ｃ１２細胞をＢＭＰ−２で処理し、第５日に該細胞のＡＬＰ活性を測定した。図８ａ及び８ｂは、異なる条件でのＷ−２０−１７のＡＬＰ活性を示す。５日間以内の細胞培養で、全ての群において、陰性対照と比較して、ＢＭＰ−２処理によってＡＬＰ活性が相当に増加した（Ｐ＜０．０５）。ヒドロゲル（ＵＶ３０秒）を介してＢＭＰ−２で処理したＷ−２０−１７は、陽性対照と比較して、より高いＡＬＰ活性を示した（ｐ＜０．０５）。
【０１７３】
図８ｃ及び８ｄに示すように、Ｃ２Ｃ１２もまた、他の群と比較して、陰性対照においてより低いＡＬＰ活性を示した（ｐ＜０．０５）。ヒドロゲル（ＵＶ３０秒）を介してＢＭＰ−２で処理したＣ２Ｃ１２は、５日の細胞培養の間、最も高いＡＬＰ活性を示し、該活性は、陽性対照及びヒドロゲル（ＵＶ３００秒）の活性よりも大きかった。但し、陽性対照とヒドロゲル（ＵＶ３００秒）との間には有意差はなかった。上記結果は、上記光架橋性ヒドロゲルを介したＢＭＰ−２の継続的な供給が、Ｗ−２０−１７及びＣ２Ｃ１２の骨芽細胞分化に影響を与えることを示した。
【０１７４】
アリザリンレッドＳにより染色された石灰化
Ｗ−２０−１７及びＣ２Ｃ１２細胞における石灰化並びに小結節の形成に対するＢＭＰ−２処理の効果を、アリザリンレッドＳ染色によって評価した。図９ａ及び９ｃは、第１０日及び第２１日におけるＷ−２０−１７及びＣ２Ｃ１２のカルシウム鉱質沈着の染色画像を示し、図９ｂ及び９ｄはその解析結果を示す。Ｗ−２０−１７の培養において、陰性対照は、第１０日においては明確なアリザリンレッド染色を示さず、第２１日において、少数の石灰化した骨小結節を伴う極僅かな染色を示した（図９ａ）。しかし、ＢＭＰ−２の存在下では、陽性対照及びヒドロゲルにより処理した培養物の両方において、アリザリンレッド染色が顕著であった（図９ａ）。骨形成培地と組み合わせたＢＭＰ−２によるＷ−２０−１７の処理は、カルシウム石灰化及び小結節の形成の刺激に繋がった。図９ｃの解析結果は、図９ａの目視での観察と一致した。ＢＭＰ−２を伴う培養物において、第１０日と比較して第２１日には、アリザリンレッドＳ染色が増加した（ｐ＜０．０５）。陽性対照及びヒドロゲル（ＵＶ３０秒）で処理した培養物の両方において、第２１日にカルシウムの蓄積が最も高くなった。
【０１７５】
Ｃ２Ｃ１２培養物においては（図９ｂ及び９ｄ）、第１０日と比較して第２１日に、全ての群のカルシウム石灰化が増加した（ｐ＜０．０５）。対照群においてカルシウム沈着は経時的に増加したが、陰性対照と陽性対照との間に有意差はなかった。第２１日に、ヒドロゲル群において、対照群と比較してカルシウム鉱質含有量の有意な増加が観測された（ｐ＜０．０５）。ヒドロゲル（ＵＶ３００秒）で処理した培養物において、第２１日に最も高いカルシウムの蓄積が観測された。細胞の石灰化の定量的な測定により、ヒドロゲルを介してＣ２Ｃ１２細胞へ継続的に補充されるＢＭＰ−２は、カルシウム沈着の水準を向上させることが実証された。
【０１７６】
考察
キトサン−ラクチド共重合体ヒドロゲルを、キトサンにＤ，Ｌ−ラクチドを添加し、続いてメタクリル化して光架橋性共重合体ネットワークを形成することによって合成した。キトサン、Ｃｈ／ＬＡ、及びＣｈ／ＬＡ／ＭＡの化学的及び構造的変化を１Ｈ−ＮＭＲ及びＦＴＩＲスペクトルによって特徴付けた。ラクチドのカルボニル基はキトサンの水酸基及びアミン基と相互作用する。無水メタクリル酸もまた、エステル化及びアミド化によってキトサン−ラクチドと反応した。従って、親水性のキトサン骨格への疎水性のラクチド側鎖の導入、並びにメタクリレートの組み込みは、共重合体ネットワーク及び相互作用機構を制御し、当該共重合体の物理化学的特性の操作を可能にすることとなる。
【０１７７】
次に、ＳＥＭによって観察された構造的変化は、異なるヒドロゲルの組成及びＵＶ照射によって誘導される異なる架橋密度に起因していた。ラクチド成分をより少なくする及びＵＶ放射時間をより長くすると、キトサン−ＰＬＡヒドロゲルにおいて、相対的に、ネットワークがより緻密になり、表面テクスチャがより密になり、且つ細孔径がより小さくなった。ヒドロゲルの機械的挙動は、多孔質ネットワーク構造の特徴と一致した。ＵＶ放射時間にかかわらず、ラクチドの量を増加させると、ヒドロゲルの圧縮弾性率が低下した。これは、架橋間のポリラクチド連鎖分枝がキトサンの結晶構造を壊したことによる。キトサンのラクチドに対する比にかかわらず、ＵＶ放射をより長くすると、ヒドロゲルの弾性率がより大きくなった。これは、ＵＶ放射によるより大きな架橋度に起因する。
【０１７８】
上記ヒドロゲルの膨潤挙動及び分解プロファイルを、同一の試料の変化を経時的に調べることができる湿重量残存率を調べることによって特徴付けた。我々の検討では、キトサンのラクチドに対する異なる比は、ヒドロゲルの膨潤、収縮、及び酵素分解に影響を与えた。ヒドロゲルネットワークはＣ＝Ｃ重合によるアルキル連鎖によって結合及び維持されている。ヒドロゲルが、Ｃｈ／ＬＡ（１：１）のように、キトサン主鎖に沿ってより多くのポリラクチド連鎖分枝を含有する場合には、ヒドロゲル連鎖の移動度及び間隔が増加する。結果的に、これによりヒドロゲルがその格子のサイズを拡大し、より多量の水を吸収且つ保持することができることとなる。このことにより、ＵＶ３０秒におけるＣｈ／ＬＡ（１：１）のＰＢＳ中での、他の群と比較して異なる膨潤挙動が説明できる。結果として、より多くの量の水がヒドロゲルネットワークの加水分解に対する感受性を増加させ、グラフト化したポリラクチドのアミド結合及びエステル結合を切断し得る。カチオン性の天然生物ポリマーであるキトサンは、水系加水分解に加えて、キトサナーゼまたはリゾチームにより酵素的に分解することができる。キトサナーゼは哺乳動物には存在しないが、リゾチームは存在し、ヒト体内でのキトサンの分解を担う。キトサン中のＮ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）単位部分がキトサンの酵素的加水分解に寄与する。リゾチーム非存在下での分解速度と比較して、リゾチーム／ＰＢＳ溶液は、ヒドロゲルの分解速度を加速した。但し、実証したように、ヒドロゲルの酵素分解速度は、ヒドロゲル中のラクチドの量及び架橋度によって調整可能であった。
【０１７９】
上記ヒドロゲルのこれらの特性は、拡散、膨潤、及び分解による薬物放出速度論において重要である。例えば、ヒドロゲルの膨潤は、ポリマーネットワークの細孔を開くことによって薬物の拡散を加速することができる。ポリマーの表面侵食及び全体の分解はポリマー連鎖及びネットワークを破壊することとなり、また薬物の放出を加速することもできる。我々のインビトロでの放出の検討においては、モデルタンパク質であるＢＳＡをポリマー溶液中に組み込み、ＵＶ照射後に直接ヒドロゲルネットワーク内に取り込む。ＵＶ３０秒及びＵＶ３００秒による、両方のヒドロゲル中へのＢＳＡの取り込みによって、ＢＳＡの初期の爆発的な放出及びそれに続く持続放出を含む、２段階プロファイルが誘導された。前者は、ヒドロゲル表面に吸収されたタンパク質の迅速な放出と、溶解したタンパク質の拡散を加速するヒドロゲルの膨潤との組み合わせの効果に起因する。後者は、ヒドロゲルの分解速度と、水素結合、静電的相互作用、双極子−双極子相互作用、及び疎水性相互作用を始めとするタンパク質とヒドロゲルとの間の分子間相互作用との組み合わせの効果によって制御される。より長いＵＶ照射によるより高い架橋度によって、キトサン−ラクチド比にかかわらず、初期の爆発的な放出が低減され、より高い割合の、ヒドロゲル内に添加されたＢＳＡが保持された。
【０１８０】
更に、ヒドロゲルの細胞毒性を検討し、また、ＢＭＰ−２を送達して骨芽細胞の分化及び石灰化を誘導するために、上記ヒドロゲルを用いた。２種の細胞株をモデルとして用いた。すなわち、Ｗ−２０−１７細胞及びＣ２Ｃ１２細胞である。Ｗ−２０−１７細胞株は、インビトロでのＢＭＰ−２の生物学的ＡＬＰ活性に関するＡＳＴＭ  Ｆ１２３１の標準試験に用いられていることから選択した。いくつかの検討が、ＢＭＰ−２が、Ｗ−２０−１７細胞中で、用量依存的な様式で、骨芽細胞の表現型に関連するいくつかのマーカーの発現を誘導したことを実証した。Ｃ２Ｃ１２細胞株は、骨に隣接する軟組織から生じ、骨形成分化転換によって骨形成系列に再プログラム化することができる細胞株であり、これを使用した。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞は、ＢＭＰ−２の処理に応答して、容易に骨の遺伝子プログラムを取り入れる。本検討では、第５日において、より軽度に架橋したヒドロゲル（ＵＶ３０秒）の存在下では、より高度に架橋したヒドロゲル（ＵＶ３００秒）と比較して、Ｗ−２０−１７及びＣ２Ｃ１２細胞の両方で、より大きなＡＬＰ活性を観測した。ヒドロゲル（ＵＶ３０秒）は、上記期間内においてより多くのＢＭＰ−２を放出した。Ｗ−２０−１７及びＣ２Ｃ１２細胞は、陽性対照と比較して、ヒドロゲル（ＵＶ３０秒）を介した持続的なＢＭＰ−２処理に応答して、より高いＡＬＰ活性を発現した（ｐ＜０．０５）。
【０１８１】
石灰化の検討において、ＢＭＰ−２を含有する培地（陽性対照）及びヒドロゲル（ＵＶ３０秒）は、Ｗ−２０−１７細胞において、より高いアリザリンレッドＳ染色及び小結節の形成をもたらした。ヒドロゲル（ＵＶ３００秒）は、陰性対照（ＢＭＰ−２を含まない培地）と比較して、初期の期間にはＷ−２０−１７の石灰化を向上させなかったが、後期においては向上させた。上記結果は、ＢＭＰ−２の爆発的な放出が、Ｗ−２０−１７のカルシウム石灰化を向上させることを示した。とりわけ、Ｃ２Ｃ１２細胞は、ヒドロゲル（ＵＶ３００秒）で処理した培養物において、ヒドロゲル（ＵＶ３０秒）を含む他の群と比較して、より高いカルシウムの蓄積を生じた（ｐ＜０．０５）。これは、ヒドロゲル（ＵＶ３００秒）が、ヒドロゲル（ＵＶ３０秒）よりも、後期においてより緩やかに且つより多くのＢＭＰ−２を放出したであろうことによる。
【実施例】
【０１８２】
以下の実施例は説明のために提示するものであって、限定のためのもではない。詳細には、以下の実施例は、本発明を実施するための具体的な実施形態の例である。実施例は説明のみを目的とし、本発明の範囲を限定することは決して意図されない。用いる数字（例えば、量、温度等）に関して精度を確保する努力を行ってきたが、何がしかの実験誤差及び偏差は、当然のことながら許容されるべきである。
【０１８３】
架橋キトサン−ラクチド共重合体ヒドロゲルを有するラット大腿骨部分欠損モデル
図１０は、キトサン−ラクチドヒドロゲルを圧入した、６ｍｍの重篤サイズのラット大腿骨欠損を示す。これは、ある実施形態によれば、予め作製したＢＭＰ−２を含むキトサン−ラクチドヒドロゲルを、インビボにおいて、ラットの部分欠損中に安定的に適合させることができることを実証する。従って、主題の架橋共重合体ヒドロゲルは、任意のサイズ及び形状、テクスチャ（例えば、粘着性である）に対して適合し、外科的な圧入を満たすことを含めて、弾性があり、柔軟である。
【０１８４】
図１１は、ある実施形態に係る、移植したキトサン−ラクチド共重合体ヒドロゲルを有するラット大腿骨部分欠損モデルの、移植第２週及び第４週におけるＸ線画像の例を示す。ヒドロゲル中に添加したＢＭＰ−２の異なる用量の、骨形成に対する効果を評価した。当該画像は、キトサン−ラクチドヒドロゲルのアライメント及び安定性、並びに高用量のＢＭＰ−２群と対照群との間の骨形成の明確な差異を示す。
【０１８５】
図１２（ａ）は、ある実施形態に係る、移植したキトサン−ラクチド共重合体ヒドロゲルを有するラット大腿骨部分欠損モデルの、移植第４週におけるマイクロコンピュータ断層撮影画像の例を示す。ヒドロゲル中に添加したＢＭＰ−２の異なる用量の、骨形成に対する効果を評価した。図１２（ｂ）は、骨体積対移植したキトサン−ラクチド共重合体ヒドロゲルのサイズを示す。
【０１８６】
心臓再生のためのヒト羊膜間葉細胞（ｈＡＭＳＣ）の送達
図１３は、ある実施形態に係る架橋共重合体ヒドロゲルを用いた、心臓再生のためのヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）の送達を示す。上記図は、インビトロでの２週間の培養にわたる、キトサン−ラクチドヒドロゲルの表面上でのｈＡＭＳＣの生存可能性、増殖、及び移動を図解する。当該画像は、生／死細胞アッセイによる、第１日及び第５日における、ヒドロゲル上で培養した細胞の形態、並びにＦ−アクチン／ＤＡＰＩ染色による、培養第２週における、上記表面上の細胞の代表的な共焦点画像を示す。
【０１８７】
図１４は、本発明のある実施形態に係る架橋共重合体ヒドロゲルを用いた、心臓再生のためのヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）の送達を示す。該インビボでの検討は、免疫応答性マウスを用いた細胞生存率（ＢＬＩ）を示した。群は、マトリゲル対成長因子を含まない、本発明のある実施形態に係る架橋キトサン−ラクチド共重合体ヒドロゲルを含んでいた。細胞数は５×１０５細胞／試料であった。数値は、架橋キトサン−ラクチド共重合体ヒドロゲル中のヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）の生存率が、マトリゲル中の生存率よりも、少なくとも僅かにより良好であったことを示す。生存可能な細胞の数は移植後１０日以降減少した。
【０１８８】
図１５は、別の実施形態に係る、心臓再生のためのヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）の送達を示す。該インビボでの検討は、免疫応答性マウスを用いた細胞生存率（ＢＬＩ）を示した。群は、マトリゲル対成長因子を含まない、本発明のある実施形態に係る架橋キトサン−ラクチド共重合体ヒドロゲル、成長因子ＢＭＰ−４を含む架橋キトサン−ラクチド共重合体ヒドロゲル、及びＥＧＦ−１を含む架橋キトサン−ラクチド共重合体ヒドロゲルを含んでいた。細胞数は５×１０５細胞／試料であった。
【０１８９】
血管新生のためのインビトロでのヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の培養
図１６は、ある実施形態に係る、柔軟な架橋共重合体ヒドロゲル中での、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の毛細血管形成を示すインビトロでの検討を示す。
【０１９０】
図１７は、ある実施形態に係る、種々の圧縮弾性率の架橋共重合体ヒドロゲル中での、ヒト臍帯静脈内皮細胞の毛細血管形成の速度に対する分解の効果の、インビトロでの検討を示す。
【０１９１】
図１８は、ある実施形態に係る架橋共重合体ヒドロゲル中での、ヒト臍帯静脈内皮細胞のネットワーク形成及び毛細血管形成に対する分解の、インビトロでの検討を示す。ヒドロゲルの分解は、毛細血管形成及び退縮に影響を与えた。
【０１９２】
図１９は、ある実施形態に係る組織培養フラスコと比較した、ヒト臍帯静脈内皮細胞のネットワーク形成に対する架橋共重合体ヒドロゲルの効果の、インビトロでの検討を示す。図１９は、ＥＣＭ様構造に類似のヒドロゲルの、血管網形成及び血管新生に対する効果を示す。
【０１９３】
図２０は、ある実施形態に係る架橋共重合体ヒドロゲル中での、ヒト臍帯静脈内皮細胞の毛細血管形成の維持の、インビトロでの検討を示す。上記図は、インビトロでの、予め血管新生化したＨＵＶＥＣ凝集体を生み出し、その構造及び機能を維持するための作製方法を示す。
【０１９４】
架橋キトサン−ラクチド共重合体ヒドロゲルを用いた鼓膜穿孔（ＴＭＰ）の閉鎖
図２１は、ある実施形態に係る架橋キトサン−ラクチド共重合体ヒドロゲルを用いた、鼓膜穿孔（ＴＭＰ）の閉鎖を示す。当該架橋キトサン−ラクチド共重合体ヒドロゲルを膜穿孔部位に配置した。図２１は、主題の架橋共重合体ヒドロゲルが治癒を高め、且つ１ヶ月または２ヶ月以内に分解することを実証する。続いて、主題の架橋共重合体ヒドロゲルが僅かな細胞毒性を示すあるいは細胞毒性を示さないことを判定し、並びに、聴力検査を行い、当該ヒドロゲルの分解速度を調べることにより、治癒過程を評価した。
【０１９５】
図２２は、架橋キトサン−ラクチドヒドロゲルを用いた鼓膜穿孔（ＴＭＰ）の閉鎖を示す。図２２は、第０日及び第９日における対照試料を用いて得られた結果を、架橋キトサン−ラクチド共重合体ヒドロゲルを用いて得られた結果と比較して示す。鼓膜穿孔は、両群において一部が閉鎖されていた。上記架橋共重合体ヒドロゲルは、効果的に分解したことを示した。分解すると聴力が回復する。
【０１９６】
キトサン−ポリエステル−フィブリノゲンヒドロゲル
光架橋性キトサン−ポリエステル−フィブリノゲン（ＣＬＦ）ヒドロゲルを開発し、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）含有ＣＬＦヒドロゲルの、インビトロ及びインビボでの骨形成に対する効能を評価した。ＣＬＦヒドロゲルを合成し、その化学構造、分解速度、圧縮弾性率、及びインビトロでのＢＭＰ−２放出速度論に関して特徴付けた。Ｗ−２０−１７前骨芽細胞マウス骨髄間質細胞及びＣ２Ｃ１２マウス筋芽細胞を用いた、インビトロでの、ＢＭＰ−２を含有するＣＬＦヒドロゲル（０、５０、１００、及び５００ｎｇ／ｍｌ）の生理活性を特徴付けた。ＢＭＰ−２含有ＣＬＦゲル（０、０．５、１、２、及び５μｇ）の骨形成に対する効果を、ラット重篤サイズ部分骨欠損を用いて４週間評価した。ＦＴＩＲスペクトル及びＳＥＭ画像は、キトサン−ラクチド共重合体中へのフィブリノゲンの付加による化学的及び構造的変化を示した。フィブリノゲン分子の組み込みにより、ヒドロゲルの圧縮弾性率が増加し、酵素的加水分解の速度が低下した。インビトロでのＢＭＰ−２放出の検討において、ＢＭＰ−２の濃度にかかわらず、４週間にわたり、ＣＬＦヒドロゲルからの初期の爆発的放出及びそれに続く持続放出が見られた。ＢＭＰ−２用量にかかわらず、全ての群の細胞がヒドロゲルの存在下で生存可能であり、このことは、当該ヒドロゲルは細胞毒性がないことを示した。細胞のアルカリリン酸活性及び石灰化は、ＢＭＰ−２を含有するＣＬＦヒドロゲルに対する用量依存性を示した。放射線撮影、マイクロコンピュータ断層撮影、及び組織学的検査により、ＢＭＰ−２を含有するＣＬＦヒドロゲルは、用量依存的な様式で、新骨形成を促進し欠損の治癒を加速することが確認された。
【０１９７】
ＢＭＰ−２の送達用担体としての光架橋性キトサン−ラクチド−フィブリノゲン（ＣＬＦ）ヒドロゲルを合成し、該ヒドロゲルは、ＢＭＰ−２を含有するＣＬＦヒドロゲルの、インビトロ及びインビボでの骨形成に対する送達効果を評価した。ある実施形態において、フィブリノゲンは、ヘパリン結合ドメインを含有し、ＢＭＰ−２のヒドロゲルに対する結合親和性を向上させることが判った。上記ＣＬＦヒドロゲルは、調整可能な機械的特性、加水分解による分解性のアミド及びエステル結合、及び優れたタンパク質結合親和性を示した。上記架橋ヒドロゲルネットワークは、紫外（ＵＶ）光の照射に基づくラジカル重合により形成される。膨潤性、剛性、及び分解性などのＣＬＦヒドロゲルの特性に対する調整は、キトサンのラクチドに対する比及びＵＶ露光時間による架橋密度を変えることによって実証される。数週間にわたるＢＭＰ−２の持続放出のためのＣＬＦヒドロゲルもまた示す。
【０１９８】
材料及び方法
材料
キトサン（≧３１０ｋＤａ、脱アセチル化度７５％以上）及び無水メタクリル酸はシグマ−アルドリッチ社（ミズーリ州セントルイス）より購入した。Ｄ，Ｌ−ラクチドはＯｒｔｅｃ社（サウスカロライナ州ピエモント）より購入した。ヒトフィブリノゲンはエンザイム・リサーチ・ラボズ社（インディアナ州サウスベンド）より入手した。ヒト骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）は、メドトロニック社（ミネソタ州ミネアポリス）より入手した。他の全ての化学品は試薬グレードであり、受け入れた状態のまま用いた。ＵＶ光源（オムニキュアＳ２０００）はルーメン・ダイナミクス・グループ社（カナダ国オンタリオ）より購入した。
【０１９９】
キトサン−ラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルの合成
粉末状キトサンを０．７５％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液中で室温にて一晩撹拌することにより、１％（ｗ／ｖ）キトサン溶液を調製した。該キトサン溶液中の不溶粒子をろ過により除去した。粉末状のＤ，Ｌ−ラクチドを８０℃でＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）中に溶解させることにより、乳酸水溶液を調製した。キトサン対ラクチドの質量比は８：１であった。上記キトサンとラクチドとの混合物を、磁気攪拌機を用いて８０℃で１時間撹拌した。２−エチルヘキサン酸スズ（ＩＩ）及びトリエチルアミン（ＴＥＡ）を滴下により添加した。該混合物を、窒素雰囲気中、８０℃で２０時間、磁気攪拌機で撹拌しながら反応させた。該混合物を、透析チューブ（分子量カットオフ：１４，０００）を用いて、蒸留水中で１日間透析した。上記透析した混合物中に、２．５％（ｗ／ｖ）の無水メタクリル酸を滴下により添加し、６０℃で８時間反応を継続させた。該混合物を、透析チューブ（分子量カットオフ：１４，０００）を用いて、蒸留水中で７日間透析した。次に、得られた溶液を２〜３日凍結乾燥し、使用まで−２０℃で保存した。ＣＬＦヒドロゲルの生成のために、上記凍結乾燥した試料を、蒸留水中２．５％（ｗ／ｖ）溶液として再構成した。上記プレポリマー溶液をフィブリノゲン（３．６ｍｇ／ｍｌ）と４℃で一晩混合した。光開始剤（イルガキュア２９５９、チバ・ケミカルズ社）を７０℃で蒸留水に完全に溶解させた。該光開始剤溶液を、０．２２μｍのフィルタを通す細菌ろ過器でろ過し、その後上記プレポリマー溶液に添加して、最終濃度０．５％（ｗ／ｖ）とした。次に、上記プレポリマー溶液を６．９ｍＷ／ｃｍ２のＵＶ光に露光させ、光架橋によってフリーラジカル重合させた。
【０２００】
キトサン−ラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルの特徴付け
フーリエ変換赤外分光分析（ＦＴＩＲ）スペクトル
ＣＬ及びＣＬＦを含むプレポリマー溶液の化学構造を調べるために、解析ソフトウェアを有するＰＣと組み合わされたブルカー・ベルテックス７０  ＦＴＩＲ分光分析機を用いてＦＴＩＲスペクトルを得た。試料を、ＩＲレーザービーム中のホルダーに直接入れた。全てのスペクトルを透過モード（４０回走査、８００〜４０００ｃｍ−１）で記録した。
【０２０１】
走査型電子顕微鏡分析（ＳＥＭ）
ＣＬ及びＣＬＦヒドロゲルの内部ミクロ構造をＳＥＭにより検討した。ＣＬヒドロゲルの形態上の変化に対するフィブリノゲンの影響を観察した。ヒドロゲル試料をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中３７℃で１時間インキュベートし、一晩凍結乾燥した（フリーゾーン、ラブコンコ社）。試料を金でスパッタコートし、１０ｋＶの電圧で運転する走査型電子顕微鏡（日立Ｓ−３４００Ｎ  ＶＰ  ＳＥＭ）下で試験した。
【０２０２】
機械的試験
ＣＬ及びＣＬＦヒドロゲルの機械的特性を測定するために、１０Ｎのロードセル（インターフェース社、アリゾナ州スコッツデール）を備えるインストロン５９４４材料試験システム（インストロン社、マサチューセッツ州ノーウッド）を用いて一軸圧縮試験を実施した。プレポリマー溶液をピペットでテフロン製の円筒形の型内にとり、６．９ｍＷ／ｃｍ２のＵＶ光に２００秒間露光させた。試料の直径（約６ｍｍ）及び厚さ（約３ｍｍ）を、デジタル式のノギス及び材料試験システムの位置の読みを用いてそれぞれ測定した。各試験の前に、約２ｍＮの予備負荷を印加した。次に、上部圧盤を１％ひずみ／秒の速度で最大ひずみ３０％まで降下させた。荷重及び変位データを１００Ｈｚで記録した。応力−ひずみ曲線の直線での曲線近似から、１０〜２０％のひずみ範囲に対して圧縮弾性率を測定した。全ての試験はＰＢＳ溶液中、室温で行った。
【０２０３】
インビトロでの分解特性
異なるｐＨ及び酵素活性に応じてＣＬヒドロゲルをＣＬＦと比較することによって、上記ヒドロゲルのインビトロでの分解挙動を検討した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液中におけるヒドロゲルの湿潤残存率を測定することにより、ヒドロゲルの膨潤挙動または分解プロファイルを判定した。ヒドロゲルを、表面の濡れを除去して秤量した（Ｗ０）。次に、当該ヒドロゲルを３７℃で、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、ＰＢＳ（ｐＨ４）、１００μｇ／ｍｌリゾチーム含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、または１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に入れた。４週間の期間にわたる所定の時点で、試料を取り出して再度秤量を行った（Ｗ１）。湿重量残存率を次のように算出した。
湿重量残存率（％）＝Ｗ１／Ｗ０×１００％
【０２０４】
インビトロでのＢＭＰ−２放出の検討
上記ＣＬＦヒドロゲルからのＢＭＰ−２の放出速度論を検討するために、２種の異なる濃度のＢＭＰ−２を直接ＣＬＦヒドロゲル配合処方中に添加した（１０ｎｇ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌ）。簡単に説明すると、ＢＭＰ−２をプレポリマー溶液に混合して均一な溶液を形成し、次に該溶液を一晩、実験の前まで４℃に維持した。その後、該混合物をピペットでテフロン製の円筒形の型内にとり、６．９ｍＷ／ｃｍ２のＵＶ光に露光させた。６ｍｍの直径及び３ｍｍの厚さを有するヒドロゲルを調製した。各試料を、１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を収容する容器内に入れ、３７℃で２８日間インキュベートした。所定の時点で１５０μｌの放出媒体の部分試料を採取し、同量の新しいＰＢＳ（ｐＨ７．４）を各容器に添加した。採取した画分における、ＣＬＦヒドロゲルから放出されたＢＭＰ−２の累積量及びパーセンテージを、ＢＭＰ−２  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムス社、ミネソタ州）によって、時間の関数として測定した。５４０ｎｍの補正設定したマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ５０）を用いて、４５０ｎｍにおいて各ウェルの光学密度を測定した。
【０２０５】
インビトロでの生理活性
細胞培養
２種の異なる細胞株、Ｗ−２０−１７前骨芽細胞マウス骨髄間質細胞及びＣ２Ｃ１２マウス筋芽細胞をＡＴＣＣ（バージニア州マナサス）より購入した。これらの細胞を、１０％のＦＢＳ、１％の抗生剤／抗カビ剤混合物、５ｍｌのＬ−グルタミン（２００ｍＭ）、及びピルビン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ培地中で増殖及び保持した。上記細胞を、５％ＣＯ２を供給する培養器中、３７℃で培養した。培地を３日毎に交換した。
【０２０６】
ヒドロゲルの細胞毒性
上記ＣＬＦヒドロゲルの細胞毒性を、間接細胞培養によって定量的に調べた。上記ヒドロゲルに、異なる濃度のＢＭＰ−２（０、５０、１００、または５００ｎｇ／ｍｌ）を上述のようにして添加し、細胞培養インサート（ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ（商標）コントロール細胞培養インサート）中に入れた。２種の異なる細胞株（Ｗ−２０−１７及びＣ２Ｃ１２）を用いた。上記細胞を３０，０００細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートの底部に播種し、上記ヒドロゲルを培地と共に上部チャンバーに入れた。１日間及び３日間のインキュベーションの後、ＭＴＳアッセイを用い、その製造者の指示に従って生存細胞数を定量的に測定した。マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ５０）を用いて、４９０ｎｍにおける吸光度を記録した。上記アッセイの前に、ツァイスＡｘｉｏｖｅｒｔ  ２００顕微鏡（カールツァイス・マイクロイメージング社、ニューヨーク州ソーンウッド）を用いて細胞形態を定性的に観測した。細胞の顕微鏡写真を画像処理ソフトウェア（ツァイス社、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ）を用いて処理した。
【０２０７】
細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性に対するＢＭＰ−２の用量の影響
異なる濃度のＢＭＰ−２のＡＬＰの存在に対する影響を検討するために、上記ＣＬＦヒドロゲルを含むＤＭＥＭ培地中でＷ−２０−１７及びＣ２Ｃ１２細胞株を培養した。細胞を６０，０００細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートの底部に播種した。ＢＭＰ−２（０、５０、１００、または５００ｎｇ／ｍｌ）を添加したヒドロゲルをインサート中に入れ、上記２４ウェルプレート中に添加した。７日間のインキュベーションの後、細胞層をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、次に１ｍｌの０．２％トリトンＸ−１００を用い、−８０℃での３０分間の凍結及び直後の３７℃での１５分間の融解からなる３回の凍結−融解サイクルにより溶解した。上記ヒドロゲルから放出されたＢＭＰ−２に対する細胞の応答を、ＡＬＰ活性により及び二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）により測定した。簡単に説明すると、５０μｌの細胞溶解液の分割液を採取し、９６ウェルアッセイプレート中の５０μｌの作業用反応剤に添加した。上記作業用反応剤は等量（１：１：１）の１．５Ｍの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（シグマ社）、２０ｍＭのｐ−ニトロフェニルフォスフェート（シグマ社）、及び１ｍＭの塩化マグネシウムを含有していた。次に、上記試料を３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、氷浴上で１００μｌの１Ｎの水酸化ナトリウムによって反応を停止させた。ＡＬＰ活性を、ｐ−ニトロフェノール標準原液（シグマ社）から作成した検量線を用いて、吸光度から測定した。吸光度は、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ５０）を用いて、４９２ｎｍで測定した。ｄｓＤＮＡに関しては、５０μｌの細胞溶解液の分割液を９６ウェルアッセイプレート中に添加した。各ウェルに各５０μｌの１：２００希釈ピコグリーン（インビロトジェン社）を添加し、暗所にて５分間インキュベートした。バイオテックＦＬｘ８００プレートリーダーを用いて、アッセイプレートを、４８５ｎｍの励起及び５２８ｎｍの発光において読み取った。提供されたｄｓＤＮＡ標準試料により作成した検量線を用いて、ｄｓＤＮＡ含有量を算出した。次に、ｄｓＤＮＡに対して標準化することによって、細胞のＡＬＰ比活性を算出した。ＡＬＰ活性はｎｍｏｌ／ｎｇで表した。
【０２０８】
カルシウム石灰化分析のためのアリザリンレッドＳ染色
細胞層内のカルシウム鉱質含有量を、アリザリンレッドＳ染色（ＡＲ−Ｓ）によって定性的及び定量的に測定した。細胞を３０，０００細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種し、ＤＭＥＭ中で１日インキュベートし、次いで培地を、１０％のＦＢＳ、１０ｍＭのβ−グリセロリン酸、１０ｎＭのデキサメタゾン、及び５０ｍｇ／ｍｌのアスコルビン酸を含有する骨形成培地に変更した。上記ヒドロゲルに異なる濃度のＢＭＰ−２（０、５０、１００、または５００ｎｇ／ｍｌ）を添加した。ＢＭＰ−２を添加したヒドロゲルをインサート中に入れ、上記ウェルプレート中に添加した。各時点の終わりに（１０日及び２１日のインキュベーション）、細胞層をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、４℃の氷冷５０％エタノールで３０分間固定化した。蒸留水で洗浄した後、上記細胞層を室温で完全に乾燥させ、１ｍｌの１％アリザリンレッドＳ（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加することにより、室温で４５分間染色した。次に、上記細胞層を蒸留水で５回洗浄し、完全に乾燥させた。染色した細胞層を、ツァイスＡｘｉｏｖｅｒｔ  ２００顕微鏡（カールツァイス・マイクロイメージング社、ニューヨーク州ソーンウッド）を用いて写真撮影した。１０％酢酸とメタノールとの混合物を含有する抽出溶媒を用いた、室温で３０分間の脱染操作により、定量的なカルシウム鉱質含有量を測定した。次いで、アリザリンレッドＳ抽出分の２００μｌの分割液を、９６ウェルのアッセイプレートに添加した。上記試料及び標準試料のアリザリンレッドＳの濃度を、４０５ｎｍの吸光度において測定し（ＴＥＣＡＮ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ５０）、μｇ／ｍｌで表した。
【０２０９】
インビボでの検討
動物及び外科的処置
全ての動物実験は、施設内動物管理及び使用に関する委員会の承認を受けたプロトコルに従って実施した。ＣＬＦゲル中に含まれる、増加する用量のＢＭＰ−２（０μｇ、０．５μｇ、１μｇ、２μｇ、及び５μｇ）を用いた５つの実験群を設けた。簡単に説明すると、３０頭の成獣、雄のスプラーグ−ドーリーラットの右大腿骨に、一側性の重篤サイズ、６ｍｍの部分欠損をつくり出した。該ラットの体重は３５４〜３８２グラムの範囲であった（ハーラン・ラボラトリーズ社）。右後肢を剃毛し、無菌状態での外科的処置の準備をした。切開を、大腿骨骨幹に沿って縦に行い、骨に到達させた。大腿骨が露出したところで、ポリアセチルプレート（長さ２７ｍｍ×幅４ｍｍ×厚さ４ｍｍ）を大腿骨側面に固定し、６本のバイコルチカル（ｂｉｃｏｒｔｉｃａｌ）の、ネジを切った針金で、所定の位置に保持した。次いで、大腿骨の中央骨幹領域のために、往復動鋸を用いて骨の６ｍｍの部分を除去し、骨切断術を行った。創傷部を灌注し、乾燥させた。次に、ＣＬＦゲルを欠損部に留置した（図２３a）。続いて、創傷部を縫合糸及びステープルで閉鎖した。術後、当該動物をケージ内で制約なく活動させた。当該動物は術後４週間生存し、その後安楽死させた。次いで、右大腿骨をプレートに固定したまま回収した。それぞれの大腿骨の周辺の軟組織を除去したが、欠損部位を乱さないように注意を払った。上記大腿骨を１０％中性緩衝ホルマリン中に保存した。
【０２１０】
Ｘ線撮影
ファキシトロンＸ線システム（ファキシトロンＸ線社［モデル：ＭＸ−２０］、アリゾナ州ツーソン、時間１５秒、３５ｋＶ）を用いて、二次元放射線撮像を行った。Ｘ線撮像は、術後すぐにはプレート及び針金が適正な位置であることを確認するために（図２３ｂ）、そして第０週〜第４週では骨の生長を評価するために用いた。
【０２１１】
マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）分析
４週で、スカイスキャン・マイクロＣＴ（スカイスキャン、モデル：１０７６、ブルカー・バイオスピン社、マサチューセッツ州ビレリカ）を用いて、試料をエクスビボ・マイクロＣＴスキャンにかけた。該マイクロＣＴは、１００ｋＶの電源電圧、１００μＡの電源電流、及び解像度８．７７ミクロンに設定した。ＮＲｅｃｏｎソフトウェア（ブルカー・バイオスピン社、マサチューセッツ州ビレリカ）を用いて画像を再構成した。着目した範囲（ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＲＯＩ）は、６ｍｍの欠損部全体を含んでいた。閾値を８７６ｍｇ／ｃｍ３（０〜２５５のスケールに対して７３に相当）に設定して、全ての試料にわたって石灰化した組織を定義した。ＣＴＡｎソフトウェア（スカイスキャン）を用いて画像を解析した。
【０２１２】
組織学的染色
移植４週時におけるμＣＴ分析の後に、上記大腿骨部分欠損試験片を取り出し、組織学的染色を行った。１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）を用いて試料を固定化し、１０％エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）中で脱灰し、段階的なエタノール溶液（７０％〜１００％）中で脱水し、パラフィン中に包埋した。試料の連続した切片（厚さ４μｍ）をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色した。
【０２１３】
統計的解析
全てのデータは平均値±標準偏差で表される。一連のデータ中の著しい異常値の存在は、グラブス検定（グラフパッド・ソフトウェア社、カリフォルニア州ラホヤ）によって識別した。有意差は、一方向ＡＮＯＶＡ検定、順位に基づくクラスカル−ワリスＡＮＯＶＡ検定またはカテゴリーデータに対するフィッシャーの正確確率検定（シグマプロット１２．０、シスタット・ソフトウェア社、カリフォルニア州サンノゼ）によって解析した。群における差異及び任意の時間での実験時点における差異は、ｐ＜０．０５の場合に有意であると見なした。
【０２１４】
結果
ＣＬＦヒドロゲルの特徴付け
ＦＴＩＲスペクトル
フィブリノゲンの組み込み後の化学構造の変化を、ＦＴＩＲスペクトルによって確認した（図２４）。ＣＬのスペクトルは、１６２０ｃｍ−１におけるアミドＩのＣ＝Ｏ伸縮振動、１５４８及び１５８９ｃｍ−１におけるアミドＩＩのＮ−Ｈ変角振動、並びに１２６１ｃｍ−１におけるアミン基のＣ−Ｎ変角振動に帰属される、キトサン及びラクチドの両方の特性ピークを示した。キトサンのＣ−Ｏ−Ｃ変角振動を表す１０３１ｃｍ−１及び１０７４ｃｍ−１のピークが観測された。１３７９、１４０９、及び１４６０ｃｍ−１のピークは、ＣＨ３の対称な変角振動の特性吸収である。１７４１、１７８４、及び１８２０ｃｍ−１の吸収は、恐らく、キトサン中のＮ−アセチル基及びキトサンとラクチドとを連結するエステルに由来するピークの重なり合いに起因するＣ＝Ｏ伸縮振動に帰属される。
【０２１５】
ＣＬのＩＲスペクトルと比較して、ＣＬＦ中のアミドＩの強度が、フィブリノゲンの組み込み後に１６３１ｃｍ−１において増加した。これは、元々のフィブリノゲンにおける主要なスペクトル上の特徴である。アミドＩＩのＮ−Ｈ変角振動に帰属されるピークもまた増大し、且つ１５８９ｃｍ−１から１５４８ｃｍ−１へと変位し、このことは共重合体中のアミド基の量が増加したことを示した。側鎖のカップリング、及びフィブリノゲンの共重合体の構造中の水酸基またはアミノ基との水素結合に帰属されるアミドＩＩＩの複合吸収が１３３０ｃｍ−１に観測された。１４０９ｃｍ−１のＣＨ３モードのＣＬＦシグナル強度が、フィブリノゲン分子と共に、アミノ酸の含有量の増加に起因して増加した。この証拠は、フィブリノゲンがキトサン−ラクチド共重合体と反応することができることを示唆する。
【０２１６】
ＳＥＭ観察
図２５は、凍結乾燥したＣＬ及びＣＬＦヒドロゲルに関する断面の代表的なＳＥＭ画像を示す。全てのヒドロゲルが、断面全体にわたって、均一且つ微細孔性の構造を示した。上記ＣＬヒドロゲル（図２５ａ及び２５ｃ）は、キトサン及びラクチドの組み合わせによって形成された比較的に滑らか且つ平坦な表面を示した。図２５ｂ及び２５ｄは、ＣＬＦヒドロゲルの表面上のタンパク質の凝集を示す。このタンパク質分子の凝集は、キトサン−ラクチド共重合体の水酸基及びアミノ基とフィブリノゲン分子との間の分子間水素結合の形成に起因する。
【０２１７】
機械的試験
上記ＣＬＦヒドロゲルの圧縮弾性率に対するＵＶ露光時間の影響を測定した（図２６ａ）。ＣＬＦヒドロゲルの圧縮弾性率はＵＶ架橋時間の増加に伴って増加した。ＣＬＦヒドロゲルは、５０秒、１００秒、１５０秒、２００秒、２５０秒及び３００秒のＵＶ露光時間において、それぞれ４．４±１．２、１４．４±２．０、１５．７±０．９、２９．９±０．７、２９．２±１．５、及び３１．７±０．９ｋＰａの圧縮弾性率を有していた。２００秒と３００秒との間になお有意差はあるが、２００秒のＵＶ露光で殆どＣＬＦヒドロゲルの最大強度に到達するように思われた。３００秒のＵＶ照射でのヒドロゲルにおいて、２０〜３０％のひずみ範囲に対して何らかの構造的な破損が観測され、より長いＵＶ露光時間においては、ヒドロゲルの柔軟性が低下し剛性が上昇することを示したことは特記事項である。更に、２００秒のＵＶ露光時間でのＣＬＦヒドロゲルの平均圧縮弾性率（図２６ｂ）は２９．９±０．７ｋＰａであり、ＣＬヒドロゲルの弾性率２２．７±１．７ｋＰａよりも有意に大きい（ｐ＜０．０５）。上記結果は、フィブリノゲン分子の添加がヒドロゲルの圧縮弾性率を増加させることを示した。
【０２１８】
インビトロでの分解特性
異なるｐＨ及び酵素活性の分解挙動に対する影響を理解するために、ＣＬ及びＣＬＦヒドロゲルの湿潤残存率を、該ヒドロゲルをＰＢＳ（ｐＨ７．４）、ＰＢＳ（ｐＨ４）、１００μｇ／ｍｌのリゾチームを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）、または１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＡを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、３７℃でインキュベートした後に調べた（図２７）。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）媒体中においては、４週間のインキュベーションに対して、ＣＬヒドロゲルの湿重量残存率はＣＬＦヒドロゲルの湿重量残存率と同様であった。４週間のインキュベーション後に、両ヒドロゲルの形状は十分に維持され、湿重量残存率は、それぞれＣＬに関しては８３．８２％、ＣＬＦ関しては８３．６２％へと緩やかに低下した。ＰＢＳ（ｐＨ４）媒体中においては、両ヒドロゲルは、１日のインキュベーション後に有意な湿重量残存率の増加を示し（ｐ＜０．０５）、酸性条件はより多量の水の吸収を誘導することを示した。１００μｇ／ｍｌのリゾチームを含有するＰＢＳ溶液においては、ＣＬ及びＣＬＦヒドロゲルの湿重量残存率は、リゾチームに制御される加水分解に起因して経時的にかなり低下し、ＣＬに関しては１１日、ＣＬＦに関しては１３日のインキュベーション後にそれぞれ完全に分解するに至った。但し、ＣＬＦの分解速度はＣＬの分解速度よりも有意に遅く（ｐ＜０．０５）、キトサン−ラクチド共重合体中へのフィブリノゲンの組み込みは、キトサン分子のグリコシド結合の、酵素に制御される加水分解的な開裂を抑制することを示唆した。１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＡを含有するＰＢＳ溶液においては、１日のインキュベーション後に、湿重量残存率が、ＣＬに関しては７８．４％、ＣＬＦに関しては７８．９％に有意に低下し（ｐ＜０．０５）、その後４週間のインキュベーションにわたって緩やかに低下した。上記の結果は、キトサン−ラクチドヒドロゲルの膨潤及び分解挙動が、ｐＨ及び酵素活性に影響を受けることを実証した。
【０２１９】
インビトロでのＢＭＰ−２の放出の検討
インビトロでのＣＬＦヒドロゲルからのＢＭＰ−２の放出挙動は、時間の関数としてのＢＭＰ−２の累積量及びパーセンテージによって解釈した。図２８ａ及び２８ｂは、ＣＬＦヒドロゲルからのＢＭＰ−２の累積放出を示す。より高い濃度（１００ｎｇ／ｍｌ）のＢＭＰ−２を含有するＣＬＦヒドロゲルは、より低い濃度（１０ｎｇ／ｍｌ）を含有するゲルと比較して、４週の間、有意により多くの量を放出した。より高い濃度（１００ｎｇ／ｍｌ）のＢＭＰ−２を含有するＣＬＦヒドロゲルは、４週間のインキュベーションにわたって、１日で全量の２４％の初期の爆発的放出及びそれに続く全量の７１％の緩やかな放出を示した。同様に、より低い濃度（１０ｎｇ／ｍｌ）のＢＭＰ−２を含有するＣＬＦヒドロゲルは、４週間のインキュベーションにわたって、１日で全量の３５％の初期の爆発的放出及び全量の６０％の持続放出を示した。但し、より高い量またはより低い量のＢＭＰ−２を有するヒドロゲルに関する、パーセンテージによる放出プロファイルに有意差はなかった。上記結果は、タンパク質の濃度にかかわらず、ＣＬＦヒドロゲルからのＢＭＰ−２の初期の爆発的放出の後に持続放出が続くことを実証した。
【０２２０】
インビトロでの生理活性
ＣＬＦヒドロゲルの細胞毒性
Ｗ−２０−１７及びＣ２Ｃ１２細胞を用いたヒドロゲルの細胞毒性をＭＴＳアッセイにより調べ、３日のインキュベーションの間、細胞形態の変化を顕微鏡により観察した。図２９に示すように、３日間の培養後、Ｗ−２０−１７及びＣ２Ｃ１２細胞の代謝活性の有意な増加があった（Ｐ＜０．０５）。細胞は、第１日よりも第３日に、有意により高い代謝活性を示し、より高度にコンフルエントであり（ｐ＜０．０５）、当該ヒドロゲルの無毒性を示した。但し、３日のインキュベーションの間に、群間に有意差はなかった。上記結果は、ＢＭＰ−２の異なる濃度は、細胞の成長及び増殖に有意には影響しないことを実証した。ＭＴＳアッセイと一致して、顕微鏡画像は、全ての群の細胞が、３日の培養の間に有意に増殖したことを示し（図２９ｃ及び２９ｄ）、ＢＭＰ−２の組み込みにかかわらず、細胞が当該ヒドロゲルの存在下で生存可能であることを示唆する。
【０２２１】
ＢＭＰ−２に応答したＡＬＰの産生
骨芽細胞分化に対するＢＭＰ−２の効果を検討するために、ＡＬＰ比活性を、骨芽細胞系列の初期の指標として評価した。Ｗ−２０−１７及びＣ２Ｃ１２細胞を、異なる濃度のＢＭＰ−２を含有するＣＬＦヒドロゲルと共に培養し、第７日に、ＡＬＰ量を試料当たりのｄｓＤＮＡ含有量に対して標準化することにより、該細胞のＡＬＰ比活性を測定した。図３０ａは、異なる濃度のＢＭＰ−２で処理したＷ−２０−１７のＡＬＰ比活性を示す。種々のＢＭＰ−２の濃度の間で、ＡＬＰ比活性の有意差が観測された。７日の細胞培養において、ＣＬＦを介してＢＭＰ−２によって処理したＷ−２０−１７は、ヒドロゲルのみ（０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２）と比較して、有意により高いＡＬＰ活性を示した（ｐ＜０．０５）。Ｗ−２０−１７のＡＬＰ比活性は、濃度依存的な様式で、ＢＭＰ−２を添加したＣＬＦヒドロゲルによって有意に増加した（ｐ＜０．０５）。図３０ｂに示すように、Ｃ２Ｃ１２細胞における最も高いＡＬＰ発現もまた、７日の細胞培養の間に、５００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２を含有するＣＬＦヒドロゲルにおいて見られた。Ｃ２Ｃ１２は、ＢＭＰ−２を含有しない群において最も低いＡＬＰ発現を示した（ｐ＜０．０５）。但し、５０ｎｇ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２を含有するヒドロゲルの間に有意差はなかった。Ｗ−２０−１７及びＣ２Ｃ１２細胞の両方が、より高濃度のＢＭＰ−２に応答して、有意により高いＡＬＰ活性を発現した。
【０２２２】
アリザリンレッドＳにより染色された石灰化
Ｗ−２０−１７及びＣ２Ｃ１２細胞における石灰化及び小結節の形成に対するＢＭＰ−２の用量効果を、１％のアリザリンレッドＳを用いた染色によって検討した。脱染操作により、カルシウム鉱質含有量の定量的な水準を測定した。Ｗ−２０−１７の培養物において（図３１ａ）、ＢＭＰ−２を含まないＣＬＦヒドロゲルは、２１日間で明確なアリザリンレッドＳ染色を示さず、Ｗ−２０−１７細胞は、２１日間でＢＭＰ−２の補充なしには石灰化した表現型へは分化しないことを示唆した。しかし、ＢＭＰ−２の存在下では、ＢＭＰ−２を含有するＣＬＦヒドロゲルによって処理した培養物において、用量及び時間依存的な様式で、有意なアリザリンレッドＳ染色が明らかであった（ｐ＜０．０５）。第２１日において、最も高いカルシウムの蓄積は、５００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２を含有するＣＬＦヒドロゲルによって処理した培養物において生じた。
【０２２３】
Ｃ２Ｃ１２培養物において（図３１ｂ）、第２１日での全群におけるカルシウム鉱質形成が、第１０日と比較して有意に増加した（ｐ＜０．０５）。ＢＭＰ−２を含まないＣＬＦヒドロゲルにおいては、カルシウムの沈着は経時的な様式で増加したが、第２１日において、細胞層と共に形成した、少数の石灰化した骨小結節を伴う極僅かな染色であった。最大のカルシウムの蓄積は、第２１日において、５００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２を含有するヒドロゲルによって処理した培養物において観測された。
【０２２４】
インビボでの検討
Ｘ線画像
３０頭全てのラットは本検討の全期間生存した。図３２は第２週及び第４週における代表的なＸ線画像を示す。欠損部間の骨のブリッジングは、０μｇのＢＭＰ−２  ＣＬＦヒドロゲル群における大腿骨のいずれにおいても明確ではなく、０．５μｇのＢＭＰ−２群における大腿骨の１例のみにおいて明確であった。０μｇ及び０．５μｇの群と比較して、１μｇ、２μｇ及び５μｇの群においては、ブリッジングの速度増加の傾向があった（各群において４例のブリッジした大腿骨）（それぞれｐ＝０．０６及びｐ＝０．２４）。
【０２２５】
マイクロＣＴスキャン及び解析
図１１は、代表的なマイクロＣＴスキャン（図３３ａ）及び解析（図３３ｂ）を示す。試料のマイクロＣＴ解析により、ＣＬＦヒドロゲル中のＢＭＰ−２の量の増加に対する骨体積（ＢＶ）の増加を伴う用量応答が実証された。再生したＢＶは、５μｇのＢＭＰ−２用量において、ＢＭＰ−２なしの群と比較して有意により大きいことが見出された（ｐ＜０．０５）。最も大きい骨体積の増加の幅は、ＣＬＦヒドロゲル中における０．５μｇから１μｇ（５２％増加）のＢＭＰ−２、及び１μｇから２μｇ（３５％増加）のＢＭＰ−２の増加に対して見られた。
【０２２６】
組織学的染色
ＢＭＰ媒介骨形成を更に検討するために、術後４週で試料の縦断面の組織学的画像を撮影した。図３４は、重篤サイズの骨欠損における、骨芽細胞、新たに沈着した骨マトリクス中に包埋された骨細胞、多核性破骨細胞様細胞、及び血管を含む、ＢＭＰ−２を含有するＣＬＦヒドロゲルによって誘導された強固な新しい骨形成を示す。当該ＣＬＦヒドロゲルは部分的に分解していたが、欠損部内及びその周辺でなお検出することができた。
【０２２７】
ＣＬＦヒドロゲル単独の群は、多量の細胞の浸潤を示したが、新たな骨形成は極僅かしか示さなかった。僅かな新たに形成された骨は、元々の骨の部分の端部に近接した箇所に観察された（図３４ａ）。しかし、広範な新たな骨形成が、長骨の皮層殻に対応する、ＢＭＰ−２を含有するＣＬＦヒドロゲルの周辺に明確に観察され、ＢＭＰ−２の用量の増加に伴って、長手方向の骨の間隙をブリッジし始めており、これは放射線画像及びμＣＴの結果と一致した。より詳細には、ＣＬＦヒドロゲル（０．５μｇのＢＭＰ−２）において、Ｈ＆Ｅ染色によって、欠損を超えて延びる、部分の端部のキャッピングを伴う骨構造体が明らかになった。ＣＬＦヒドロゲル群（０．５μｇのＢＭＰ−２）における骨梁骨の大きさは、骨欠損部のブリッジングのないＣＬＦヒドロゲル単独における骨梁骨の大きさよりもやや大きい。一方、漸増量のＢＭＰ−２（１、２、及び５μｇ）を有するＣＬＦヒドロゲルを移植した欠損においては、骨のブリッジ及び新たに形成された骨髄細胞型で充填された骨梁骨構造体を含む、より顕著な骨形成が観察された。図３４ｂに示すように、より高い倍率では、骨細胞が新たな骨に包埋され、骨芽細胞が、欠損領域内側の新たな骨の表面に沿って並んでいた。
【０２２８】
考察
本検討においては、ＢＭＰ−２の送達のためのヒドロゲルを合成し、特徴付けし、重篤サイズのラット大腿骨欠損の修復におけるその有効性に関して評価した。上記ＣＬＦヒドロゲルは、キトサン上にＤ，Ｌ−ラクチドを反応させ、続いてフィブリノゲンを組み込むことにより合成した。ＣＬＦヒドロゲルのプレポリマー溶液は、ＵＶ光の照射によるラジカル重合により、光架橋性共重合体のネットワークを形成する。上記ヒドロゲル系においては、親水性のキトサン骨格分子及び疎水性のポリラクチド側鎖が、疎水性成分及び親水性成分の両方を有する共重合体ネットワークを形成し、当該ヒドロゲルに柔軟性を付与した。上記ＣＬＦヒドロゲル系はまた、プレポリマー溶液に組み込まれた成長因子結合リガンドであるフィブリノゲンを含んでいた。あるヒドロゲルにおいては、フィブリノゲンのヘパリン結合ドメインが、ＢＭＰ−２を始めとする広範囲の成長因子に結合することができ、合成マトリックス内に組み込まれた場合には、潜在的に組織修復を促進する。
【０２２９】
本検討においては、ＦＴＩＲスペクトル及びＳＥＭ画像によって化学的及び構造的変化を観察した。上記ＣＬヒドロゲルは、ラクチドのカルボニル基と、キトサンの水酸基及びアミン基との間の相互作用により形成された。フィブリノゲンの添加により、ＣＬＦヒドロゲルの表面上に均質なタンパク質の凝集が観察され、これは、フィブリノゲンの残基と、ＣＬ共重合体中の水酸基またはアミノ基との間の相互作用から生じた。その結果、上記化学的及び構造的特性の変化が、機械的特性、分解挙動、及びＢＭＰ−２放出速度論に影響を与えた。ＣＬＦヒドロゲルの圧縮弾性率により、より長いＵＶ露光時間が、架橋度の増加に起因して、ヒドロゲルの微小構造を強化することが示唆された。フィブリノゲン分子の添加はまた、キトサン−ラクチド共重合体の水酸基及びアミノ基とフィブリノゲン分子との間の分子間水素結合の効果に起因して、共重合体ネットワークの弾性を増加させた。
【０２３０】
ＣＬ及びＣＬＦヒドロゲルの両方の膨潤挙動及び分解プロファイルは、ｐＨ及び酵素活性の影響を受けた。我々は、生理学的条件及び生じたばかりの骨折外傷条件を模倣するために、中性及び酸性のｐＨを用いた。酸性条件は、中性ｐＨ環境と比較して、両方のヒドロゲルの有意な膨潤挙動をもたらした。これは、酸性条件が、ヒドロゲル連鎖の移動度を増加させたことによる。結果として、ヒドロゲルはその水を吸収する能力を増加させた。また、リゾチームの加水分解反応によって、ＣＬ及びＣＬＦヒドロゲルの両方の相当な経時的重量損失が生じることが見出された。但し、ＣＬ及びＣＬＦヒドロゲルの間には、分解速度に有意差があった（ｐ＜０．０５）。理論に拘束されるものではないが、分子間水素結合を介したＣＬＦヒドロゲルの表面上でのタンパク質の凝集が、キトサン連鎖上のＮ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）単位へのリゾチームの結合を阻害し、リゾチームが触媒する反応を減速させ、それによってＣＬＦヒドロゲルにおける酵素的加水分解の速度をＣＬヒドロゲルと比較して低下させることが仮定された。また、ＰＢＳへのコラゲナーゼの添加により、１日のインキュベーションで、ＣＬヒドロゲル及びＣＬＦヒドロゲルの重量が有意に減少したが、全体としての分解速度は、リゾチームを含有する培地に比較して有意により緩やかであった。
【０２３１】
骨形成に対するＢＭＰ−２の用量効果を検討するために、異なる用量のＢＭＰ−２をＣＬＦヒドロゲル中に組み込み、インビトロでＢＭＰ−２の放出速度論を調べた。我々のインビトロでの放出の検討により、ＢＭＰ−２の濃度にかかわらず、初期のＣＬＦのヒドロゲルからのＢＭＰ−２の爆発的な放出及びそれに続く持続放出が実証された。初期の爆発的な放出は、ヒドロゲルの表面に吸収されたＢＭＰ−２の速やかな放出及び膨潤による拡散に主として起因する。上記持続放出は、当該タンパク質とヒドロゲルとの間の分子間相互作用、並びに分解挙動によって制御される。
【０２３２】
細胞生存性の結果は、Ｗ−２０−１７及びＣ２Ｃ１２細胞の両方が、ＢＭＰ−２用量にかかわらず、上記ヒドロゲルの存在下で生存可能であることを実証し、当該ヒドロゲルの非細胞毒性を示した。骨芽細胞分化及び石灰化に対するＢＭＰ−２の用量効果も検討した。第７日に、最も高い用量（５００ｎｇ／ｍｌ）のＢＭＰ−２を含有するＣＬＦヒドロゲルの存在下で、Ｗ−２０−１７及びＣ２Ｃ１２細胞の両方のより高いＡＬＰ活性が観測された。理論に拘束されるものではないが、ＢＭＰ−２（５００ｎｇ／ｍｌ）を有するＣＬＦヒドロゲルは、当該期間において、他のヒドロゲルよりもより多量のＢＭＰ−２を放出したことが仮定される。同様に、ＢＭＰ−２を含有するＣＬＦヒドロゲルによって処理した培養物において、Ｗ−２０−１７及びＣ２Ｃ１２細胞の両方において、用量及び時間依存的な様式での、有意により多い量の石灰化及び小結節形成が明らかであった（ｐ＜０．０５）。
【０２３３】
上記インビボでの結果はまた、ＣＬＦヒドロゲル中に添加されたＢＭＰ−２が、新骨形成を増進し、用量依存的な様式で骨欠損の治癒を加速することも実証している。ＣＬＦヒドロゲルへの高用量（１、２、及び５μｇ）のＢＭＰ−２の添加は、ＣＬＦヒドロゲル単独または低濃度のＢＭＰ−２（０．５μｇ）を含有するＣＬＦヒドロゲルよりも、相当に多くの骨形成を誘発し、これは、欠損部位への良好且つ効果的なＢＭＰ−２のＣＬＦヒドロゲル媒介性送達を示している。事実、５μｇの用量のＢＭＰ−２において再生された骨体積は、ＣＬＦヒドロゲル単独を用いて再生された骨体積よりも有意により大きかった。用いたＢＭＰ−２用量の範囲において、炎症反応並びに異常な骨構造及び細胞型を誘導する有害な副作用は観察されなかった。
【０２３４】
架橋キトサン−ラクチド−フィブリノゲン共重合体ヒドロゲルを有するラット大腿骨部分欠損モデル
（１００秒及び２００秒のＵＶ光架橋露光時間の）キトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルを、吸収性コラーゲンスポンジと比較した。群当たり合計１４頭の動物を用い、移植後４、８及び１２週に、大腿骨の二次元放射線画像（ファキシトロンＭＸ−２０デジタル、ファキシトロンＸ線社、イリノイ州ウィーリング）を撮影し、骨再生及び欠損のブリッジングを定性的に評価した。移植の４週間後に、４頭の動物の画像（Ｘ線）を撮影し、屠殺して組織学的検査を行った。定量的な骨形成の評価のために、移植後４、８及び１２週にインビボマイクロＣＴを行った。１２週にねじり試験及び組織学的検査を実施した。
【０２３５】
移植後２及び４週目に大腿骨の二次元放射線画像を撮影し、定性的に骨再生及び欠損のブリッジングを評価した。図３５は、移植後４週での、２μｇのＢＭＰ−２を含有する吸収性コラーゲンスポンジ及びキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルの、移植後の骨欠損の放射線画像を示す。ブリッジングする骨の割合は、吸収性コラーゲンスポンジに関しては２５％、１００秒のＵＶ露光により生成させた架橋密度を有するキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルに関しては５０％、２００秒のＵＶ露光により生成させた架橋密度を有するキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルに関しては７５％であった。
【０２３６】
図３６は、移植後８週での、２μｇのＢＭＰ−２を含有する吸収性コラーゲンスポンジ及びキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルの移植後の骨欠損の放射線画像を示す。ブリッジングする骨の割合は、吸収性コラーゲンスポンジに関しては５０％、１００秒のＵＶ露光により生成させた架橋密度を有するキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルに関しては９０％、２００秒のＵＶ露光により生成させた架橋密度を有するキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルに関しては８０％であった。
【０２３７】
図３７は、移植後１２週での、２μｇのＢＭＰ−２を含有する吸収性コラーゲンスポンジ及びキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルの移植後の骨欠損のＸ線画像を示す。ブリッジングする骨の割合は、吸収性コラーゲンスポンジに関しては５０％、１００秒のＵＶ露光により生成させた架橋密度を有するキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルに関しては９０％、２００秒のＵＶ露光により生成させた架橋密度を有するキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルに関しては８０％であった。
【０２３８】
図３８は、第４週及び第１２週における、マイクロＣＴによって測定した再生骨密度の定量化を示す。各群は、第４週と比較して第１２週でより高密度である（ｐ＜０．００１）。但し、第１２週において、２００秒のＵＶ露光により生成させた架橋密度を有するキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルに関する再生骨密度は、吸収性コラーゲンスポンジによる処理に関する再生骨密度よりも大幅に大きかった。
【０２３９】
図３９は、第４週及び第１２週における、マイクロＣＴによって測定した再生骨体積の定量化を示す。各群は、第４週と比較して第１２週でより大きな骨の充填量を有する（ｐ＜０．００１）。
【０２４０】
図４０は、破損に至るトルク（Ｎｍｍ）によって測定される骨の機械的特性を図解する。本検討は、ＢＭＰ−２を含有するキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルが、吸収性コラーゲンスポンジと比較して有意に骨の治癒の速度を増加させることを実証する。特に、主題のキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルによって、再生骨密度及び再生骨体積の両方の有意により高い速度が容易に得られた。主題のキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルは、より良好な外科的処置用継手材を与え、該ヒドロゲルは吸収性コラーゲンスポンジよりもより緩やかに分解し、これにより、骨の治癒速度を高める成長因子のより制御され且つ効果的な放出が提供された。また、ねじり試験によって測定される、主題のキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルによって提供される再生骨の機械的特性は同様であり、このことは、主題のキトサン−ポリラクチド−フィブリノゲンヒドロゲルが、骨治癒の質を犠牲にすることなく、大幅に早い骨の治癒を容易にすることを示した。
【０２４１】
図４１は、マウスの鼓膜に主題のキトサン−ポリエステル−フィブリノゲンヒドロゲルを注入した後に測定した、聴性脳幹反応及びひずみ成分耳音響放射閾値を図解する。片側の耳に上記ポリマーを充填する一方、反対側の耳には注入を行わなかった（対照）。９頭のマウスにおいて両側の鼓膜に外科的に穿孔を行った６０日後に、聴性脳幹反応（ＡＢＲ）及びひずみ成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）閾値を測定した。鼓膜が自然治癒する上記時間までに、両側の耳の間の聴覚閾値に差はなかった（図４１）。これらの結果は、上記ヒドロゲルが非耳毒性であることを示す。
【０２４２】
添付の特許請求の範囲にもかかわらず、本明細書に記載された開示は、以下の各項によっても規定される。
【０２４３】
１．キトサンとポリエステルとの共重合体と、
架橋剤と
を含む架橋共重合体ヒドロゲル。
２．上記ポリエステルがポリラクチドである、第１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
３．上記架橋剤が加水分解性のアクリレート架橋剤を含む、第１項または第２項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
４．上記アクリレート架橋剤が、アクリレート、メタクリレート、アクリル酸エチル、アクリル酸ブチル、メタクリル酸ブチル、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート及びポリ（エチレングリコール）ジメタクリレートからなる群より選択される化合物である、第１〜第３項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
５．上記アクリレート架橋剤がメタクリレート架橋剤である、第１〜第３項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
６．上記架橋剤が式
2016525374.tif 000023
（式中、
Ｒａ及びＲｂがそれぞれ独立に、水素、アルキル及び置換アルキルより選択され、
Ｘ１及びＸ２がそれぞれ独立にＮ及びＯより選択され、かつ
Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立に、キトサン及び上記ポリエステルより選択される）
の加水分解性の架橋を含む、第１〜第３項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
７．Ｒａ及びＲｂがそれぞれ水素である、第６項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
８．Ｒａ及びＲｂがそれぞれアルキルである、第６項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
９．Ｒａ及びＲｂがそれぞれメチルである、第８項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１０．Ｒａがアルキルであり、かつＲｂが水素である、第６項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１１．Ｒａがメチルである、第１０項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１２．Ｒ１がキトサンであり、かつＲ２が上記ポリエステルである、第６項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１３．Ｒ１及びＲ２がキトサンである、第６項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１４．Ｒ１及びＲ２が上記ポリエステルである、第６項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１５．Ｘ１及びＸ２がＮである、第６項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１６．Ｘ１及びＸ２がＯである、第６項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１７．Ｘ１がＯであり、かつＸ２がＮである、第６項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１８．Ｒａ及びＲｂがそれぞれメチルであり、
Ｘ１及びＸ２がＯであり、
Ｒ１が上記ポリエステルであり、かつ
Ｒ２がキトサンである、
第６項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１９．Ｒａ及びＲｂがそれぞれメチルであり、
Ｘ１がＯであり、
Ｘ２がＮであり、
Ｒ１が上記ポリエステルであり、かつ
Ｒ２がキトサンである、
第６項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
２０．Ｒａ及びＲｂがそれぞれメチルであり、
Ｘ１及びＸ２がＮであり、かつ
Ｒ１及びＲ２がキトサンである、
第６項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
２１．キトサンと上記ポリエステルとの間にエステル結合を含む、第１〜第２０項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
２２．キトサンと上記ポリエステルとの間にアミド結合を含む、第１〜第２０項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
２３．キトサン対上記ポリエステルの比が１：１〜１０：１の範囲である、第１〜第２０項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
２４．キトサン対上記ポリエステルの比が１：１〜８：１の範囲である、第１〜第２０項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
２５．キトサン対上記ポリエステルの比が１：１である、第１〜第２０項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
２６．１％〜９９％ｗ／ｗのキトサンを含む、第１〜第２５項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
２７．５ｋＤａ以上の分子量を有するキトサンを含む、第１〜第２５項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
２８．１％〜９９％ｗ／ｗの上記ポリエステルを含む、第１〜第２５項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
２９．５ｋＤａ以上の分子量を有するポリラクチドを含む、第１〜第２５項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
３０．０．０５％〜１０％ｗ／ｗの架橋剤を含む、第１〜第２５項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
３１．光架橋された、化学的に架橋されたまたは熱的に架橋された、第１〜第２０項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
３２．３０秒間以下のＵＶ照射により光架橋された、第３１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
３３．１００秒間以上のＵＶ照射により光架橋された、第３１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
３４．１×１０−１５モル／ｃｍ３から１×１０−３モル／ｃｍ３の間の範囲の架橋密度を含む、第１〜第３３項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
３５．１から３５の間の範囲の膨潤率を含む、第１〜第３４項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
３６．５から２５の間の範囲の膨潤率を含む、第１〜第３４項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
３７．１ｋＰａ〜３５ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を含む、第１〜第３４項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
３８．５ｋＰａ〜２５ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を含む、第３７項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
３９．細胞適合性である、第１〜第３４項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
４０．一種または複数種の吸収された生理活性剤を更に含む、第１〜第３４項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
４１．上記一種または複数種の吸収された生理活性剤が、走化性物質、細胞付着媒介物質、インテグリン結合配列、上皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン関連ペプチド、ヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、転写因子、増殖分化因子（ＧＤＦ）、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ８、組換えヒト成長因子、軟骨由来形態形成タンパク質（ＣＤＭＰ）、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２及びＣＤＭＰ−３からなる群より選択される化合物である、第４０項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
４２．上記一種または複数種の吸収された生理活性剤が骨形成タンパク質である、第４１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
４３．上記骨形成タンパク質がＢＭＰ−２である、第４２項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
４４．架橋共重合体ヒドロゲルであって、
上記一種または複数種の吸収された生理活性剤が、当該ヒドロゲルから第１の所定の速度で放出される第１の期間と、
上記一種または複数種の吸収された生理活性剤が、当該ヒドロゲルから第２の所定の速度で放出される第２の期間と
を含む上記一種または複数種の吸収された生理活性剤の放出プロファイルを与えるように構成されている、第４０項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
４５．第１の期間の継続期間が０．５時間〜７２時間の範囲である、第４４項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
４６．第２の期間の継続期間が０．５時間〜３３６時間の範囲である、第４４項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
４７．第１の期間の間に生理活性剤の全量の１０％から７５％の間の量を放出するように構成されている、第４４項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
４８．第１の期間の間に生理活性剤の全量の３０％から３５％の間の量を放出するように構成されている、第４７項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
４９．第２の期間の間に生理活性剤の全量の１０％から７５％の間の量を放出するように構成されている、第４４項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
５０．上記一種または複数種の吸収された生理活性剤を、実質的にゼロ次放出速度で放出するように構成されている、第４０項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
５１．上記一種または複数種の吸収された生理活性剤を、実質的に一次放出速度で放出するように構成されている、第４０項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
５２．生理的条件下で、１５日以上で分解するように構成されている、第１〜第４０項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
５３．生理的条件下で、実質的にゼロ次分解速度で分解するように構成されている、第１〜第４０項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
５４．０．１ミクロン〜２００ミクロンの範囲のサイズを有する細孔を含む、第１〜第４０項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
５５．０．１ミクロン〜５ミクロンの範囲のサイズを有する細孔を含む、第１〜第４０項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
５６．２５ｋＤａ以下の分子量を有する、第１〜第５５項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
５７．上記ポリエステルがポリ（開環環状エステル）である、第１〜第５６項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
５８．上記ポリエステルがポリラクチドである、第１〜第５６項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
５９．  キトサンを含む組成物を、ポリエステルを含む組成物と接触させて、キトサンと上記ポリエステルとの共重合体を生成することと、
キトサンと上記ポリエステルとの上記共重合体を、一種または複数種の架橋剤を含む組成物と接触させて、架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体を生成することと、
上記架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体を、架橋共重合体ヒドロゲルを生成するのに十分な架橋条件に供することと
を含む、架橋共重合体ヒドロゲルの作製方法。
６０．上記ポリエステルがポリラクチドである、第５９項に記載の方法。
６１．上記架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体が光架橋される、化学的に架橋されるまたは熱的に架橋される、第５９項に記載の方法。
６２．上記架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体が、３０秒間以下の継続時間にわたるＵＶ照射によって光架橋される、第６１項に記載の方法。
６３．上記架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体が、１００秒間以上の継続時間にわたるＵＶ照射によって光架橋される、第６１項に記載の方法。
６４．上記架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体が化学的に架橋される、第５９項に記載の方法。
６５．上記架橋剤が加水分解性アクリレート架橋剤を含む、第５９項に記載の方法。
６６．上記アクリレート架橋剤が、アクリレート、メタクリレート、アクリル酸エチル、アクリル酸ブチル、メタクリル酸ブチル、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート及びポリ（エチレングリコール）ジメタクリレートからなる群より選択される化合物である、第６５項に記載の方法。
６７．上記アクリレート架橋剤がメタクリレート架橋剤である、第６６項に記載の方法。
６８．キトサンと上記ポリエステルとの間にエステル結合を形成することを含む、第５９項に記載の方法。
６９．キトサン対上記ポリエステルの比が１：１〜１０：１の範囲である、第５９項に記載の方法。
７０．キトサン対上記ポリエステルの比が１：１〜８：１の範囲である、第６９項に記載の方法。
７１．キトサン対上記ポリエステルの比が１：１である、第６９項に記載の方法。
７２．上記架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体が、１×１０−１２モル／ｃｍ３から１×１０−５モル／ｃｍ３の間の範囲の架橋密度を与えるのに十分な様式で架橋される、第５７項に記載の方法。
７３．上記架橋共重合体ヒドロゲルが１から３５の間の範囲の膨潤率を含む、第５９項に記載の方法。
７４．上記架橋共重合体ヒドロゲルが５から２５の間の範囲の膨潤率を含む、第７３項に記載の方法。
７５．上記架橋共重合体ヒドロゲルが１ｋＰａ〜３５ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を含む、第５９項に記載の方法。
７６．上記架橋共重合体ヒドロゲルが５ｋＰａ〜２５ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を含む、第７５項に記載の方法。
７７．上記架橋共重合体ヒドロゲルを一種または複数種の生理活性剤と接触させることを更に含む、第５９項に記載の方法。
７８．上記一種または複数種の生理活性剤が、走化性物質、細胞付着媒介物質、インテグリン結合配列、上皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、ヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン関連ペプチド、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、転写因子、増殖分化因子（ＧＤＦ）、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ８、組換えヒト成長因子、軟骨由来形態形成タンパク質（ＣＤＭＰ）、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２及びＣＤＭＰ−３からなる群より選択される化合物である、第７７項に記載の方法。
７９．上記一種または複数種の生理活性剤が、骨形成タンパク質またはヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）である、第７８項に記載の方法。
８０．上記骨形成タンパク質がＢＭＰ−２である、第７９項に記載の方法。
８１．上記架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体が、０．１ミクロン〜２００ミクロンの範囲のサイズを有する細孔を与えるのに十分な様式で架橋される、第５９項に記載の方法。
８２．上記架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体が、０．１ミクロン〜５ミクロンの範囲のサイズを有する細孔を与えるのに十分な様式で架橋される、第５９項に記載の方法。
８３．キトサンと上記ポリエステルとの間にアミド結合を形成することを含む、第６０項に記載の方法。
８４．上記ポリエステルがポリラクチドである、第５９〜第８３項のいずれか１項に記載の方法。
８５．  キトサンとポリエステルとの共重合体と、
上記共重合体に共有結合した架橋剤と
を含む、架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
８６．上記ポリエステルがポリラクチドである、第８５項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
８７．架橋剤を更に含む、第８５項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
８８．上記架橋剤がラジカル開始剤である、第８７項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
８９．上記ラジカル開始剤が光開始剤である、第８７項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
９０．上記光開始剤が４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル−（２−ヒドロキシ−２−プロピル）ケトンである、第８９項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
９１．上記架橋剤が加水分解性のアクリレート架橋剤を含む、第８５項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
９２．上記アクリレート架橋剤が、アクリレート、メタクリレート、アクリル酸エチル、アクリル酸ブチル、メタクリル酸ブチル、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート及びポリ（エチレングリコール）ジメタクリレートからなる群より選択される化合物である、第９１項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
９３．上記アクリレート架橋剤がメタクリレート架橋剤である、第９２項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
９４．上記架橋剤が式
2016525374.tif 000024
（式中、
Ｒｃが水素、アルキル及び置換アルキルより選択され、
Ｘ３がＮ及びＯより選択され、かつ
Ｒ３がキトサン及び上記ポリエステルより選択される）
の架橋剤を含む、第８５項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
９５．Ｒｃが水素である、第９４項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
９６．Ｒｃがアルキルである、第９４項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
９７．Ｒ３がキトサンである、第９４項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
９８．Ｒ３が上記ポリエステルである、第９４項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
９９．Ｘ３がＮである、第９４項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
１００．Ｘ３がＯである、第９４項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
１０１．Ｒｃが水素であり、
Ｘ３がＯであり、かつ
Ｒ３が上記ポリエステルである、
第９４項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
１０２．Ｒｃがメチルであり、
Ｘ３がＯであり、かつ
Ｒ３が上記ポリエステルである、
第９４項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
１０３．Ｒｃが水素であり、
Ｘ３がＯであり、かつ
Ｒ３がキトサンである、
第９４項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
１０４．Ｒｃがメチルであり、
Ｘ３がＯであり、かつ
Ｒ３がキトサンである、
第９４r項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
１０５．上記共重合体がキトサンと上記ポリエステルとの間にエステル結合を含む、第８５項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
１０６．上記共重合体がキトサンと上記ポリエステルとの間にアミド結合を含む、第８５項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
１０７．キトサン対上記ポリエステルの比が１：１〜１０：１の範囲である、第８５項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
１０８．キトサン対上記ポリエステルの比が１：１〜８：１の範囲である、第８５項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
１０９．キトサン対上記ポリエステルの比が１：１である、第１０８項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
１１０．キトサンと上記ポリエステルとの上記共重合体が１％〜９９％ｗ／ｗのキトサンを含む、第８５項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
１１１．キトサンと上記ポリエステルとの上記共重合体が５ｋＤａ以上の分子量を有するキトサンを含む、第８５項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
１１２．キトサンと上記ポリエステルとの上記共重合体が１％〜９９％ｗ／ｗの上記ポリエステルを含む、第８５項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
１１３．キトサンと上記ポリエステルとの上記共重合体が５ｋＤａ以上の分子量を有するポリエステルを含む、第８５項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
１１４．上記架橋剤が０．０５％〜１０％ｗ／ｗの量で存在する、第８５項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
１１５．一種または複数種の吸収された生理活性剤を更に含む、第８５〜第１１４項のいずれか１項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
１１６．上記一種または複数種の吸収された生理活性剤が、走化性物質、細胞付着媒介物質、インテグリン結合配列、上皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、ヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン関連ペプチド、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、転写因子、増殖分化因子（ＧＤＦ）、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ８、組換えヒト成長因子、軟骨由来形態形成タンパク質（ＣＤＭＰ）、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２及びＣＤＭＰ−３からなる群より選択される化合物である、第１１５項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
１１７．上記一種または複数種の吸収された生理活性剤が骨形成タンパク質またはヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）である、第１１５項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
１１８．上記骨形成タンパク質がＢＭＰ−２である、第１１７項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
１１９．１２．５ｋＤａ以下の分子量を有する、第８５〜第１１８項のいずれか１項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
１２０．上記ポリエステルがポリラクチドである、第８５〜第１１９項のいずれか１項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
１２１．キトサンとポリエステルとの共重合体と、
フィブリノゲンと、
架橋剤と
を含む架橋共重合体ヒドロゲル。
１２２．上記ポリエステルがポリラクチドである、第１２１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１２３．上記架橋剤が加水分解性のアクリレート架橋剤を含む、第１２１項または第１２２項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１２４．上記アクリレート架橋剤が、アクリレート、メタクリレート、アクリル酸エチル、アクリル酸ブチル、メタクリル酸ブチル、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート及びポリ（エチレングリコール）ジメタクリレートからなる群より選択される化合物である、第１２１〜第１２３項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１２５．上記アクリレート架橋剤がメタクリレート架橋剤である、第１２１〜第１２３項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１２６．上記架橋剤が式
2016525374.tif 000025
（式中、
Ｒａ及びＲｂがそれぞれ独立に、水素、アルキル及び置換アルキルより選択され、
Ｘ１及びＸ２がそれぞれ独立にＮ及びＯより選択され、かつ
Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立に、キトサン及び上記ポリエステルより選択される）
の加水分解性の架橋を含む、第１２１〜第１２３項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１２７．Ｒａ及びＲｂがそれぞれ水素である、第１２６項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１２８．Ｒａ及びＲｂがそれぞれアルキルである、第１２６項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１２９．Ｒａ及びＲｂがそれぞれメチルである、第１２８項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１３０．Ｒａがアルキルであり、かつＲｂが水素である、第１２６項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１３１．Ｒａがメチルである、第１３０項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１３２．Ｒ１がキトサンであり、かつＲ２が上記ポリエステルである、第１３１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１３３．Ｒ１及びＲ２がキトサンである、第１２６項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１３４．Ｒ１及びＲ２が上記ポリエステルである、第１２６項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１３５．Ｘ１及びＸ２がＮである、第１２６項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１３６．Ｘ１及びＸ２がＯである、第１２６項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１３７．Ｘ１がＯであり、かつＸ２がＮである、第１２６項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１３８．Ｒａ及びＲｂがそれぞれメチルであり、
Ｘ１及びＸ２がＯであり、
Ｒ１が上記ポリエステルであり、かつ
Ｒ２がキトサンである、
第１２６項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１３９．Ｒａ及びＲｂがそれぞれメチルであり、
Ｘ１がＯであり、
Ｘ２がＮであり、
Ｒ１が上記ポリエステルであり、かつ
Ｒ２がキトサンである、
第１２６項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１４０．Ｒａ及びＲｂがそれぞれメチルであり、
Ｘ１及びＸ２がＮであり、かつ
Ｒ１及びＲ２がキトサンである、
第１２６項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１４１．キトサンと上記ポリエステルとの間にエステル結合を含む、第１２１〜第１４０項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１４２．キトサンと上記ポリエステルとの間にアミド結合を含む、第１２１〜第１４０項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１４３．キトサン対上記ポリエステルの比が１：１〜１０：１の範囲である、第１２１〜第１４０項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１４４．キトサン対上記ポリエステルの比が１：１〜８：１の範囲である、第１２１〜第１４０項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１４５．キトサン対上記ポリエステルの比が１：１である、第１２１〜第１４０項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１４６．１％〜９９％ｗ／ｗのキトサンを含む、第１２１〜第１４５項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１４７．５ｋＤａ以上の分子量を有するキトサンを含む、第１２１〜第１４５項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１４８．１％〜９９％ｗ／ｗの上記ポリエステルを含む、第１２１〜第１４５項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１４９．５ｋＤａ以上の分子量を有するポリラクチドを含む、第１２１〜第１４５項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１５０．０．０５％〜１０％ｗ／ｗの架橋剤を含む、第１２１〜第１４５項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１５１．光架橋された、化学的に架橋されたまたは熱的に架橋された、第１２１〜第１４５項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１５２．１００秒間以上のＵＶ照射により光架橋された、第１５１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１５３．１２０秒間以上のＵＶ照射により光架橋された、第１５１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１５４．１×１０−１５モル／ｃｍ３から１×１０−３モル／ｃｍ３の間の範囲の架橋密度を含む、第１２１〜第１５３項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１５５．１から３５の間の範囲の膨潤率を含む、第１２１〜第１５４項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１５６．５から２５の間の範囲の膨潤率を含む、第１２１〜第１５４項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１５７．１ｋＰａ〜３５ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を含む、第１２１〜第１５４項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１５８．５ｋＰａ〜２５ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を含む、第１５７項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１５９．細胞適合性である、第１２１〜第１５４項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１６０．一種または複数種の吸収された生理活性剤を更に含む、第１２１〜第１５９項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１６１．上記一種または複数種の吸収された生理活性剤が、走化性物質、細胞付着媒介物質、インテグリン結合配列、上皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、ヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン関連ペプチド、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、転写因子、増殖分化因子（ＧＤＦ）、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ８、組換えヒト成長因子、軟骨由来形態形成タンパク質（ＣＤＭＰ）、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２及びＣＤＭＰ−３からなる群より選択される化合物である、第１６０項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１６２．上記一種または複数種の吸収された生理活性剤が骨形成タンパク質またはヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）である、第１６０項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１６３．上記骨形成タンパク質がＢＭＰ−２である、第１６２項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１６４．架橋共重合体ヒドロゲルであって、
上記一種または複数種の吸収された生理活性剤が、当該ヒドロゲルから第１の所定の速度で放出される第１の期間と、
上記一種または複数種の吸収された生理活性剤が、当該ヒドロゲルから第２の所定の速度で放出される第２の期間と
を含む上記一種または複数種の吸収された生理活性剤の放出プロファイルを与えるように構成されている、第１２１〜第１６３項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１６５．第１の期間の継続期間が０．５時間〜７２時間の範囲である、第１６４項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１６６．第２の期間の継続期間が０．５時間〜３３６時間の範囲である、第１６５項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１６７．第１の期間の間に生理活性剤の全量の１０％から７５％の間の量を放出するように構成されている、第１６５項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１６８．第１の期間の間に生理活性剤の全量の３０％から３５％の間の量を放出するように構成されている、第１６７項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１６９．第２の期間の間に生理活性剤の全量の１０％から７５％の間の量を放出するように構成されている、第１６７項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１７０．上記一種または複数種の吸収された生理活性剤を、実質的にゼロ次放出速度で放出するように構成されている、第１６５項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１７１．上記一種または複数種の吸収された生理活性剤を、実質的に一次放出速度で放出するように構成されている、第１６５項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１７２．生理的条件下で、１５日以上で分解するように構成されている、第１２１〜第１７１項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１７３．生理的条件下で、実質的にゼロ次分解速度で分解するように構成されている、第１２１〜第１７１項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１７４．０．１ミクロン〜２００ミクロンの範囲のサイズを有する細孔を含む、第１２１〜第１７１項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１７５．０．１ミクロン〜５ミクロンの範囲のサイズを有する細孔を含む、第１２１〜第１７１項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１７６．２５ｋＤａ以下の分子量を有する、第１２１〜第１７５項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１７７．上記ポリエステルがポリ（開環環状エステル）である、第１２１〜第１７５項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１７８．上記ポリエステルがポリラクチドである、第１２１〜第１７７項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲル。
１７９．キトサンを含む組成物を、ポリエステルを含む組成物及びフィブリノゲンを含む組成物と接触させて、キトサン、ポリエステル及びフィブリノゲンを含む組成物を生成することと、
上記キトサン、ポリエステル及びフィブリノゲンを含む組成物を、一種または複数種の架橋剤を含む組成物と接触させて、架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体を生成することと、
上記架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体を、架橋キトサン−ポリエステル−フィブリノゲンヒドロゲルを生成するのに十分な架橋条件に供することと
を含む、架橋共重合体ヒドロゲルの作製方法。
１８０．上記ポリエステルがポリラクチドである、第１７９項に記載の方法。
１８１．上記架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体が光架橋される、化学的に架橋されるまたは熱的に架橋される、第１７９項に記載の方法。
１８２．上記架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体が、３０秒間以下の継続時間にわたるＵＶ照射によって光架橋される、第１８１項に記載の方法。
１８３．上記架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体が、１００秒間以上の継続時間にわたるＵＶ照射によって光架橋される、第１８１項に記載の方法。
１８４．上記架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体が化学的に架橋される、第１７９項に記載の方法。
１８５．上記架橋剤が加水分解性アクリレート架橋剤を含む、第１７９項に記載の方法。
１８６．上記アクリレート架橋剤が、アクリレート、メタクリレート、アクリル酸エチル、アクリル酸ブチル、メタクリル酸ブチル、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート及びポリ（エチレングリコール）ジメタクリレートからなる群より選択される化合物である、第１８５項に記載の方法。
１８７．上記アクリレート架橋剤がメタクリレート架橋剤である、第１８６項に記載の方法。
１８８．キトサンと上記ポリエステルとの間にエステル結合を形成することを含む、第１７９項に記載の方法。
１８９．キトサン対上記ポリエステルの比が１：１〜１０：１の範囲である、第１７９項に記載の方法。
１９０．キトサン対上記ポリエステルの比が１：１〜８：１の範囲である、第１８０項に記載の方法。
１９１．キトサン対上記ポリエステルの比が１：１である、第１８９項に記載の方法。
１９２．上記架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体が、１×１０−１２モル／ｃｍ３から１×１０−５モル／ｃｍ３の間の範囲の架橋密度を与えるのに十分な様式で架橋される、第１７９項に記載の方法。
１９３．上記架橋共重合体ヒドロゲルが１から３５の間の範囲の膨潤率を含む、第１７９項に記載の方法。
１９４．上記架橋共重合体ヒドロゲルが５から２５の間の範囲の膨潤率を含む、第１９３項に記載の方法。
１９５．上記架橋共重合体ヒドロゲルが１ｋＰａ〜３５ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を含む、第１７９項に記載の方法。
１９６．上記架橋共重合体ヒドロゲルが５ｋＰａ〜２５ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を含む、第１９５項に記載の方法。
１９７．上記架橋共重合体ヒドロゲルを一種または複数種の生理活性剤と接触させることを更に含む、第１７９〜第１９６項のいずれか１項に記載の方法。
１９８．上記一種または複数種の生理活性剤が、走化性物質、細胞付着媒介物質、インテグリン結合配列、上皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、ヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン関連ペプチド、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、転写因子、増殖分化因子（ＧＤＦ）、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ８、組換えヒト成長因子、軟骨由来形態形成タンパク質（ＣＤＭＰ）、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２及びＣＤＭＰ−３からなる群より選択される化合物である、第１９７項に記載の方法。
１９９．上記一種または複数種の生理活性剤が、骨形成タンパク質またはヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）である、第１９８項に記載の方法。
２００．上記骨形成タンパク質がＢＭＰ−２である、第１９９項に記載の方法。
２０１．上記架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体が、０．１ミクロン〜２００ミクロンの範囲のサイズを有する細孔を与えるのに十分な様式で架橋される、第１７９項に記載の方法。
２０２．上記架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体が、０．１ミクロン〜５ミクロンの範囲のサイズを有する細孔を与えるのに十分な様式で架橋される、第１７９項に記載の方法。
２０３．キトサンと上記ポリエステルとの間にアミド結合を形成することを含む、第１８０項に記載の方法。
２０４．上記ポリエステルがポリラクチドである、第１７９〜第２０３項のいずれか１項に記載の方法。
２０５．キトサンとポリエステルとの共重合体と、
フィブリノゲンと、
上記共重合体に共有結合した架橋剤と
を含む、架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２０６．上記ポリエステルがポリラクチドである、第２０５項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２０７．架橋剤を更に含む、第２０５項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２０８．上記架橋剤がラジカル開始剤である、第２０７項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２０９．上記ラジカル開始剤が光開始剤である、第２０７項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２１０．上記光開始剤が４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル−（２−ヒドロキシ−２−プロピル）ケトンである、第２０９項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２１１．上記架橋剤が加水分解性のアクリレート架橋剤を含む、第２０５項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２１２．上記アクリレート架橋剤が、アクリレート、メタクリレート、アクリル酸エチル、アクリル酸ブチル、メタクリル酸ブチル、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート及びポリ（エチレングリコール）ジメタクリレートからなる群より選択される化合物である、第２１１項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２１３．上記アクリレート架橋剤がメタクリレート架橋剤である、第２１２項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２１４．上記架橋剤が式
2016525374.tif 000026
（式中、
Ｒｃが水素、アルキル及び置換アルキルより選択され、
Ｘ３がＮ及びＯより選択され、かつ
Ｒ３がキトサン及び上記ポリエステルより選択される）
の架橋剤を含む、第２０５項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２１５.Ｒｃが水素である、第２１４項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２１６．Ｒｃがアルキルである、第２１４項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２１７．Ｒ３がキトサンである、第２１４項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２１８．Ｒ３が上記ポリエステルである、第２１４項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２１９．Ｘ３がＮである、第２１４項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２２０．Ｘ３がＯである、第２１４項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２２１．Ｒｃが水素であり、
Ｘ３がＯであり、かつ
Ｒ３が上記ポリエステルである、
第２１４項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２２２．Ｒｃがメチルであり、
Ｘ３がＯであり、かつ
Ｒ３が上記ポリエステルである、
第２１４項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２２３．Ｒｃが水素であり、
Ｘ３がＯであり、かつ
Ｒ３がキトサンである、
第２１４項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２２４．  Ｒｃがメチルであり、
Ｘ３がＯであり、かつ
Ｒ３がキトサンである、
第２１４項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２２５．上記共重合体がキトサンと上記ポリエステルとの間にエステル結合を含む、第２０５項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２２６．上記共重合体がキトサンと上記ポリエステルとの間にアミド結合を含む、第２０５項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２２７．キトサン対上記ポリエステルの比が１：１〜１０：１の範囲である、第２０５〜第２２６項のいずれか１項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２２８．キトサン対上記ポリエステルの比が１：１〜８：１の範囲である、第２０５〜第２２６項のいずれか１項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２２９．キトサン対上記ポリエステルの比が１：１である、第２０５〜第２２６項のいずれか１項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２３０．キトサンと上記ポリエステルとの上記共重合体が１％〜９９％ｗ／ｗのキトサンを含む、第２０５〜第２２６項のいずれか１項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２３１．キトサンと上記ポリエステルとの上記共重合体が５ｋＤａ以上の分子量を有するキトサンを含む、第２０５〜第２２６項のいずれか１項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２３２．キトサンと上記ポリエステルとの上記共重合体が１％〜９９％ｗ／ｗの上記ポリエステルを含む、第２０５〜第２２６項のいずれか１項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２３３．キトサンと上記ポリエステルとの上記共重合体が５ｋＤａ以上の分子量を有するポリエステルを含む、第２０５〜第２２６項のいずれか１項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２３４．上記架橋剤が０．０５％〜１０％ｗ／ｗの量で存在する、第２０５〜第２２６項のいずれか１項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２３５．一種または複数種の吸収された生理活性剤を更に含む、第２０５〜第２２６項のいずれか１項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２３６．上記一種または複数種の吸収された生理活性剤が、走化性物質、細胞付着媒介物質、インテグリン結合配列、上皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、ヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン関連ペプチド、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、転写因子、増殖分化因子（ＧＤＦ）、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ８、組換えヒト成長因子、軟骨由来形態形成タンパク質（ＣＤＭＰ）、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２及びＣＤＭＰ−３からなる群より選択される化合物である、第２３５項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２３７．上記一種または複数種の吸収された生理活性剤が骨形成タンパク質またはヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）である、第２３５項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２３８．上記骨形成タンパク質がＢＭＰ−２である、第２３７項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２３９．１２．５ｋＤａ以下の分子量を有する、第２０５〜第２２６項のいずれか１項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２４０．上記ポリエステルがポリラクチドである、第２０５〜第２２６項のいずれか１項に記載の架橋性共重合体ヒドロゲル前駆体。
２４１．第１〜第２４０項のいずれか１項に記載の架橋共重合体ヒドロゲルと、
一種または複数種の生理活性剤と
を備えるキット。
２４２．上記一種または複数種の生理活性剤が、走化性物質、細胞付着媒介物質、インテグリン結合配列、上皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、ヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン関連ペプチド、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、転写因子、増殖分化因子（ＧＤＦ）、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ８、組換えヒト成長因子、軟骨由来形態形成タンパク質（ＣＤＭＰ）、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２及びＣＤＭＰ−３からなる群より選択される化合物である、第２４１項に記載のキット。
２４３．上記一種または複数種の生理活性剤が骨形成タンパク質またはヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）である、第２４２項に記載のキット。
２４４．上記骨形成タンパク質がＢＭＰ−２である、第８７項に記載のキット。
２４５．対象または対象由来の試料を、第１〜第５８項、第８５〜第１７８項及び第２０５〜第２４０項のいずれか１項に記載の配合物と接触させることと、
上記配合物を、上記対象を治療するのに十分な様式で、上記対象と接触した状態に維持することと
を含む方法。
２４６．上記対象が耳の疾病を有している、第２４５項に記載の方法。
２４７．上記対象が骨再生を必要としている、第２４５項に記載の方法。
２４８．上記対象が心臓組織再生を必要としている、第２４５項に記載の方法。
２４９．一種または複数種の生理活性剤が、走化性物質、細胞付着媒介物質、インテグリン結合配列、上皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、ヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン関連ペプチド、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、転写因子、増殖分化因子（ＧＤＦ）、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ８、組換えヒト成長因子、軟骨由来形態形成タンパク質（ＣＤＭＰ）、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２及びＣＤＭＰ−３からなる群より選択される化合物である、第２４５〜第２４８項のいずれか１項に記載の方法。
２５０．上記一種または複数種の生理活性剤が骨形成タンパク質またはヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）である、第２４９項に記載の方法。
【０２４４】
２５１．対象の鼓膜を、第１〜第５８項、第８５〜第１７８項及び第２０５〜第２４０項のいずれか１項に記載の配合物と接触させることと、
上記配合物を、上記対象の鼓膜を治療するのに十分な様式で、上記鼓膜と接触した状態に維持することと
を含む方法。
２５２．骨を、第１〜第５８項、第８５〜第１７８項及び第２０５〜第２４０項のいずれか１項に記載の配合物と接触させることと、
上記配合物を、骨を再生させるのに十分な様式で、上記骨と接触した状態に維持することと
を含む、骨の再生方法。
２５３．上記配合物がＢＭＰ−２を更に含む、第２５２項に記載の方法。
２５４．心臓組織を、第１〜第５８項、第８５〜第１７８項及び第２０５〜第２４０項のいずれか１項に記載の配合物と接触させることと、
上記配合物を、心臓組織を再生させるのに十分な様式で、上記心臓組織と接触した状態に維持することと
を含む、心臓組織の再生方法。
２５５．上記配合物がヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）を更に含む、第２５４項に記載の方法。
２５６．対象の鼓膜を、架橋共重合体ヒドロゲルと接触させることであって、該架橋共重合体ヒドロゲルが、
キトサンとポリエステルとの共重合体と、
架橋剤と、
生理活性剤と
を含む、上記接触させることと、
生理活性剤を含む上記架橋共重合体ヒドロゲルを、上記生理活性剤を上記対象の鼓膜に送達するのに十分な様式で、上記鼓膜と接触した状態に維持することと
を含む方法。
２５７．上記架橋共重合体ヒドロゲルがフィブリノゲンを更に含む、第２５６項に記載の方法。
２５８．生理活性剤を含む上記架橋共重合体ヒドロゲルが、上記鼓膜と接触した状態で１週間以上維持される、第２５６項または第２５７項に記載の方法。
２５９．骨を、架橋共重合体ヒドロゲルと接触させることであって、該架橋共重合体ヒドロゲルが、
キトサンとポリエステルとの共重合体と、
架橋剤と、
ＢＭＰ−２と
を含む、上記接触させることと、
ＢＭＰ−２を含む上記架橋共重合体ヒドロゲルを、骨を再生させるのに十分な様式で、上記骨と接触した状態に維持することと
を含む、骨の再生方法。
２６０．上記架橋共重合体ヒドロゲルがフィブリノゲンを更に含む、第２５９項に記載の方法。
２６１．生理活性剤を含む上記架橋共重合体ヒドロゲルが、上記骨と接触した状態で１週間以上維持される、第２５９項または第２６０項に記載の方法。
２６４．心臓組織を、架橋共重合体ヒドロゲルと接触させることであって、該架橋共重合体ヒドロゲルが、
キトサンとポリエステルとの共重合体と、
架橋剤と、
生理活性剤と
を含む、上記接触させることと、
生理活性剤を含む上記架橋共重合体ヒドロゲルを、上記心臓組織を再生させるのに十分な様式で、上記心臓組織と接触した状態に維持することと
を含む、心臓組織の再生方法。
２６５．上記架橋共重合体ヒドロゲルがフィブリノゲンを更に含む、第２６４項に記載の方法。
２６６．生理活性剤を含む上記架橋共重合体ヒドロゲルが、上記心臓組織と接触した状態で１週間以上維持される、第２６４項または第２６５項に記載の方法。
２６７．上記生理活性剤がヒト羊膜間葉幹細胞（ｈＡＭＳＣ）である、第２６４〜第２６６項のいずれか１項に記載の方法。
【０２４５】
上述の本発明は、説明のためのいくつかの詳細及び理解の明確化のための例について記載してきたが、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲より逸脱することなく、特定の変更及び修正が本発明に対してなされ得ることは、本発明の教示に照らせば、当業者にとって容易に明らかである。
【０２４６】
従って、前述は単に本発明の原理を説明するものである。当業者は、本明細書に明示的に記載されていないまたは示されてはいないが、本発明の原理を具体化し、且つ本発明の趣旨及び範囲に含まれる様々なアレンジを案出することができることが理解されよう。更に、本明細書に述べられる全ての例及び条件を表す用語は、原則として、読者が、本発明の原理及び本技術を進歩させるために本発明者によって与えられた概念を理解する上での支援とすることが意図され、具体的に述べられたかかる例及び条件へ限定することなく理解されるべきである。更に、原理、態様、及び本発明の実施形態、並びにそれらの具体的な例を述べた全ての記載は、構造面及び機能面でのそれらの等価物を包含することが意図される。加えて、かかる等価物は、現在知られている等価物及び将来開発される等価物、すなわち、構造にかかわらず同様の機能を果たす、任意の開発される要素を包含することが意図される。従って、本発明の範囲は、本明細書に示されるまたは記載される代表的な実施形態に限定されることを意図しない。そうではなく、本発明の範囲及び趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。
【図１】
2016525374.tif 000028
【図２】
2016525374.tif 000029
【図３】
2016525374.tif 000030
【図４】
2016525374.tif 000031
【図５ａ】
2016525374.tif 000032
【図５ｂ】
2016525374.tif 000033
【図６】
2016525374.tif 000034
【図７ａ】
2016525374.tif 000035
【図７ｂ】
2016525374.tif 000036
【図７ｃ】
2016525374.tif 000037
【図７ｄ】
2016525374.tif 000038
【図８ａ】
2016525374.tif 000039
【図８ｂ】
2016525374.tif 000040
【図８ｃ】
2016525374.tif 000041
【図８ｄ】
2016525374.tif 000042
【図９ａ】
2016525374.tif 000043
【図９ｂ】
2016525374.tif 000044
【図９ｃ】
2016525374.tif 000045
【図９ｄ】
2016525374.tif 000046
【図１０】
2016525374.tif 000047
【図１１】
2016525374.tif 000048
【図１２】
2016525374.tif 000049
【図１３】
2016525374.tif 000050
【図１４】
2016525374.tif 000051
【図１５】
2016525374.tif 000052
【図１６】
2016525374.tif 000053
【図１７】
2016525374.tif 000054
【図１８】
2016525374.tif 000055
【図１９】
2016525374.tif 000056
【図２０】
2016525374.tif 000057
【図２１】
2016525374.tif 000058
【図２２】
2016525374.tif 000059
【図２３】
2016525374.tif 000060
【図２４】
2016525374.tif 000061
【図２５】
2016525374.tif 000062
【図２６】
2016525374.tif 000063
【図２７】
2016525374.tif 000064
【図２８】
2016525374.tif 000065
【図２９ａ】
2016525374.tif 000066
【図２９ｂ】
2016525374.tif 000067
【図２９ｃ】
2016525374.tif 000068
【図２９ｄ】
2016525374.tif 000069
【図３０】
2016525374.tif 000070
【図３１ａ】
2016525374.tif 000071
【図３１ｂ】
2016525374.tif 000072
【図３２】
2016525374.tif 000073
【図３３】
2016525374.tif 000074
【図３４】
2016525374.tif 000075
【図３５】
2016525374.tif 000076
【図３６】
2016525374.tif 000077
【図３７】
2016525374.tif 000078
【図３８】
2016525374.tif 000079
【図３９】
2016525374.tif 000080
【図４０】
2016525374.tif 000081
【図４１】
2016525374.tif 000082
【国際調査報告】
2016525374.tif 000083
2016525374.tif 000084