(57)【要約】  本発明は、組み換え酵母細胞、特に、トランスジェニック酵母細胞、であって、一以上の組み換えられた、特に異種の、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼ（ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ））およびホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）をコードする核酸配列を機能的に発現する組み換え酵母細胞に関連する。本発明は、組み換え化学合成微生物、特に真核微生物における、電子受容体としての二酸化炭素の使用に関連する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換え酵母細胞、特に、トランスジェニック酵母細胞、であって、
一以上の組み換えられた核酸配列、特に異種の、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼ（ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ））およびホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）をコードする核酸配列を機能的に発現する組み換え酵母細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の組み換え酵母細胞において、
前記酵母細胞は、一以上の原核生物の分子シャペロンをさらに備え、
前記シャペロンは、好ましくは、バクテリア由来であり、より好ましくはEscherichia coli(E.coli)由来である組み換え酵母細胞。
【請求項３】
請求項１または２に記載の組み換え酵母細胞において、
前記シャペロンは、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＧｒｏＥＬの機能的ホモローグおよびＧｒｏＥＳの機能的ホモローグからなる群から選択される組み換え酵母細胞。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載された組み換え酵母細胞において、
前記ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）は単一サブユニットのルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）である組み換え酵母細胞。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載された組み換え酵母細胞において、
前記ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）は、原核生物フォーム−ＩＩのルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）である組み換え酵母細胞。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載された組み換え酵母細胞において、
前記酵母細胞は、サッカロマイセス科（Saccharomyceraceae）、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・パストリアナス（Saccharomyces pastorianus）、サッカロマイセス・ベチカス（Saccharomyces beticus）、サッカロマイセス・フェルメンタチ（Saccharomyces fermentati）、サッカロマイセス・パラドクサス（Saccharomyces paradoxus）サッカロマイセス・ウバルム（Saccharomyces uvarum）、およびサッカロマイセス・バヤナス（Saccharomyces bayanus）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）例えば、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、シゾサッカロマイセス・ジャポニカス（Schizosaccharomyces japonicus）、シゾサッカロマイセス・オクトスポラス（Schizosaccharomyces octosporus）およびシゾサッカロマイセス・クリオフィラス（Schizosaccharomyces cryophilus）、トルラスポラ属（Torulaspora）、例えばトルラスポラ・デリュブルッキ（Torulaspora delbrueckii）、クリベロマイセス属、例えばクリベロマイセス・マルキシアナス（Kluyveromyces marxianus）、ピキア属（Pichia）例えばピキア・スティピティス（Pichia stipitis）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）またはピキア・アングスタ（pichia angusta）、ザイゴサッカロマイセス属（Zygosaccharomyces）、例えば、ザイゴサッカロマイセス・バイリー（Zygosaccharomyces bailii）、ブレタノマイセス属（Brettanomyces）例えばブレタノマイセス・インテルメディウス（Brettanomyces intermedius）、ブレタノマイセス・ブルキセレンシス（Brettanomyces bruxellensis）、ブレタノマイセス・アノマラス（Brettanomyces anomalus）、ブレタノマイセス・クステルシアナス（Brettanomyces custersianus）、ブレタノマイセス・ナアルデネンシス（Brettanomyces naardenensis）、ブレタノマイセス・ナナス（Brettanomyces nanus）、デッケラ・ブルキセレンシス（Dekkera bruxellensis）およびデッケラ・アノマラ（Dekkera anomala）、メチニコビア属（Metschnikowia）、イサチェンキア属（Issatchenkia）、例えばイサチェンキア・オリエンタリス（Issatchenkia orientalis）、クロエケラ属（Kloeckera）、例えばクロエケラ・アピクアラタ（Kloeckera apiculata）、アウレオバシジウム属（Aureobasidium）例えばアウレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）、からなる群から選択され、好ましくはサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の細胞である組み換え酵母細胞。
【請求項７】
請求項６に記載の組み換え酵母細胞において、
前記酵母細胞は、サッカロマイセス科（Saccharomyceraceae）の群から選択される組み換え酵母細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の組み換え酵母細胞において、
前記酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyceraceae）、サッカロマイセス・パストリアナス（Saccharomyces pastorianus）、サッカロマイセス・ベチカス（Saccharomyces beticus）、サッカロマイセス・フェルメンタチ（Saccharomyces fermentati）、サッカロマイセス・パラドクサス（Saccharomyces paradoxus）サッカロマイセス・ウバルム（Saccharomyces uvarum）、およびサッカロマイセス・バヤナス（Saccharomyces bayanus）からなる群から選択される組み換え酵母細胞。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の酵母細胞において、
前記ＰＲＫは、真核生物由来のＰＲＫである酵母細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の酵母細胞において、
前記ＰＲＫは、ナデシコ目（Caryophyllales）から選択された植物に由来する真核生物のＰＲＫであり、特にヒユ科（Amaranthaceae）、特にホウレンソウ属（Spinacia）由来である酵母細胞。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵母細胞において、
前記ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）は、リブロース−１，５−ビスリン酸依存的１４Ｃ−重炭酸塩（bicarbonate）の細胞抽出物による取り込みで定義される活性が、少なくとも1 nmol.min-1.(mg protein)（３０℃における値、例４で参照される方法により導出され得る）である酵母細胞。
【請求項１２】
異種ポリペプチドを酵母細胞において機能的に発現するための一以上のベクターであって、
前記ベクターは、ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）およびＰＲＫをコードする異種核酸配列を一以上備え、
前記ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）は炭素固定の活性を示すベクター。
【請求項１３】
アルコール、有機酸、またはアミノ酸を調製するための方法であって、
炭素源、特に炭水化物を、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の酵母細胞と共に発酵させ、これによりアルコール、有機酸、またはアミノ酸を形成する点を含み、
前記酵母細胞は反応培地に存在する、アルコール、有機酸、またはアミノ酸を調製するための方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載された方法において、
前記反応培地は二酸化炭素を含み、
前記反応培地における前記二酸化炭素の濃度は、二酸化炭素飽和濃度の少なくとも５％以上であり、特に少なくとも１０％以上であり、さらに少なくとも２０％以上である方法。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の方法において、
エタノールが形成される方法。
【請求項１６】
組み換え化学合成微生物、特に化学合成真核微生物における、電子受容体としての二酸化炭素の使用。
【請求項１７】
請求項１６に記載の使用において、
前記微生物は、
（天然において）独立栄養の生物由来のポリペプチドをコードする異種核酸配列を備え、
前記ポリペプチドは、炭酸脱水酵素、カルボキシラーゼ、オキシゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、イソメラーゼ、アルドラーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、ホスファターゼ、エピメラーゼ、キナーゼ、カルボキシキナーゼ、酸化還元酵素、アコニターゼ、フマラーゼ、レダクターゼ、ラクトナーゼ、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ、セドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼ、ホスホペントースイソメラーゼ、ホスホペントースエピメラーゼ、ホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リブロース５−リン酸イソメラーゼ、リブロース５−リン酸３−エピメラーゼ、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼ、乳酸脱水素酵素、リンゴ酸シンターゼ、イソクエン酸リアーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、グルコース−６−ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、イソクエン酸脱水素酵素、αケトグルタル酸脱水素酵素、スクシニルＣｏＡシンテターゼ、リンゴ酸脱水素酵素、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、キシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ、キシロースイソメラーゼ、イソプレノイドシンターゼ、キシロネートデヒドラターゼからなる群から選択され、かつ、
前記ポリペプチドのための第１の原核生物シャペロンをコードする異種核酸配列と、好ましくは、前記ポリペプチドのための第１のものとは異なる第２の原核生物シャペロンをコードする核酸配列とを備える使用。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載の使用において、
前記微生物は嫌気的条件下で有機酸を生産し、および／または
前記二酸化炭素は、ＮＡＤＨを電子供与体として用いる工程において、電子受容体として働く使用。
【請求項１９】
組み換え微生物、特に真核微生物であって、
化学合成（光栄養でない）条件下において、前記微生物が二酸化炭素を電子受容体として用いることを可能にする一以上の組み換え酵素を備え、
特に、請求項１６〜１８のいずれか一項で定義される組み換え微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所望の発酵生産物を生産可能な組み換え微生物と、微生物における異種ペプチドの機能的な発現と、上記の微生物が使用される発酵生産物を生産する方法とに関する。好ましい一実施形態において、その微生物は酵母である。さらに、本発明は微生物における二酸化炭素の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の発酵過程は、再生可能な炭水化物原料から広範囲の化合物を工業的に生産するのに利用されているが、利用できる化合物の範囲はますます広がっている。
【０００３】
特に、嫌気性の発酵過程では、補因子の対であるＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋の酸化還元平衡によって生産物の収量が大きく制約されてしまうことがある。この難題の顕著な例として、エタノール燃料をサッカロマイセス・セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae）により工業的に生産する際に、グリセロールが主な副産物として形成されることが挙げられる。これは、生合成反応により形成されたＮＡＤＨを再び酸化する必要があることによる直接的な結果である。
【０００４】
生命工学の分野において、サッカロマイセス・セレビシエによるエタノールの生産は、現在のところその量において、比類のない最大規模の発酵過程である。しかし、他のアルコール、カルボン酸、イソプレノイド、アミノ酸等のその他の様々な化合物が、現在、工業的な生命工学的過程で生産されている。
【０００５】
工業的な生命工学の分野において使用される、生物の発酵特性を遺伝子改変により改善するための様々なアプローチが提案されている。
【０００６】
ＷＯ２００８／０２８０１９は、少なくとも一つの異種の遺伝子配列を有する微生物を用いて発酵生産物を形成する方法に関する。該方法は、少なくとも一つの炭水化物を３−ホスホグリセリン酸塩（3-phosphoglycerate）に変換し、二酸化炭素を固定する複数のステップを含み、少なくとも一つの上記ステップは少なくとも一つの外来の酵素により触媒される。さらに、上記文献は少なくとも一つの糖類の発酵を通して発酵生産物を形成する微生物であって、該微生物は、ホスホペントースエピメラーゼ（phosphopentose epimerase）、ホスホリブロキナーゼ、およびリブロースビスリン酸カルボキシラーゼからなる群から選択された少なくとも一つの酵素をコードする少なくとも一つの異種の遺伝子配列を備える微生物に関連する。
【０００７】
一つの例において、異種のＰＲＫおよび異種のルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）遺伝子が組み込まれた酵母に言及されている。一つの実施形態において該酵母はエタノールの生産に用いられている。結果（図２４）には遺伝子操作のコントロール群と組み換えられた株に対する濃度が示されている。組み換えられた酵母とそれに対応するコントロール群とで顕著な差はほぼ見られない。生産物の収量と、糖への変換と、酵母の成長と、エタノールの蒸発速度に関しては、はっきりとした情報は無い。従って、結果からエタノールの収量の改善について結論付けることができないことは明らかである。
【０００８】
さらに、ＷＯ２００８／０２０８１９は、グリセロール副産物が形成される問題については記載がない。
【０００９】
酵母に基づくエタノール等の化合物の生産の化学量論に関係した主要な課題は、一般的に、ＮＡＤＨ依存的に並行して生産される物（特にグリセロール）が副産物としてかなりの量生成されることである。これは、とりわけ、嫌気的で酸素が制限される条件下、またはそれとは別に呼吸が制限されるか全くない条件下において顕著である。典型的な工業エタノール過程では、約４質量％に及ぶ糖原料がグリセロールに変換されると見積もられている（Nissen et al. Yeast 16 (2000) 463-474）。嫌気的生育における理想的な条件下では、グリセロールへの変換の度合はさらに高まり、約１０％にも及ぶ。
【００１０】
嫌気的条件下でのグリセロールの生産は、主に酸化還元代謝に関係している。サッカロマイセス・セレビシエの嫌気的生育の間、アルコール発酵を介して糖の異化が起こる。この過程において、解糖系のグリセルアルデヒド−３−リン酸の脱水素酵素反応により形成されたＮＡＤＨは、ピルビン酸の脱カルボキシル化の際に形成されたアセトアルデヒドをエタノールに変換する際に、ＮＡＤ＋依存性のアルコール脱水素酵素により再び酸化される。この酸化−中立異化反応路の固定された化学量論は、代謝のどこかでＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの正味の還元が起こると問題を引き起こす。嫌気的条件下では、サッカロマイセス・セレビシエにおけるＮＡＤＨの再酸化は、糖のグリセロールへの還元に大きく依存している。グリセロールの形成は、解糖系の中間体であるジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）のグリセロール−３−リン酸（グリセロール−３Ｐ）への還元により開始される。この反応は、ＮＡＤ＋依存的なグリセロール−３−リン酸脱水素酵素により触媒される。その後、この反応で形成されたグリセロール−３−リン酸はグリセロール−３−ホスファターゼにより加水分解されてグリセロールおよび無機リン酸塩が得られる。結果として、グリセロールはサッカロマイセス・セレビシエによる嫌気的エタノール生産中の主要な副産物となるが、糖からエタノールへの変換全体を減少させるため望ましくない。さらに、エタノール生産工場からの廃液にグリセロールが存在すると、排水処理を行うためのコストを強いられることにもなりかねない
【００１１】
ＷＯ２０１１／０１０９２３では、炭水化物を含む原料−とりわけリグノセルロース系バイオマス由来の炭水化物原料−からエタノールを生産する過程におけるＮＡＤＨに関連した副次的な生産物（グリセロール）の形成、グリセロール副生産物問題に取り組んでいる。上記文献では、ＮＡＤ＋依存性アセチル化アセトアルデヒド脱水素酵素（ＥＣ  １．２．１．１０）活性をコードした一または二以上の組み換え核酸配列を備え、ＮＡＤＨ依存的なグリセロール合成に必要な酵素活性が無いか、または、対応する野生型の酵母細胞と比較してＮＡＤＨ依存的なグリセロール合成の酵素活性が低い組み換え酵母細胞が提供されている。グリセロールの生産を本質的に消失させる点において効果を持つ細胞が記載されている。また、該細胞は酢酸塩を使用してＮＡＤＨを再酸化しており、もし酢酸塩を含む原料が使用された場合にはエタノールの収量は上がる可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ＷＯ２０１１／０１０９２３に記載された方法は有利であるが、他の方法が引き続き必要である。特に、ＮＡＤＨ依存性の副次的な生産物の合成を消失させるか、少なくとも減少させるための、酢酸塩やその他の有機電子受容分子が無くともエタノールのような有用な有機化合物を生産できる他の方法が必要である。酢酸塩（acetate）が存在しなくても、ＮＡＤＨ依存的な副次的な生産物の合成が減少し、高い収量が得られる微生物を提供することができれば特に望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の発明者らは、二酸化炭素を基質として用いて、従属栄養の、化学合成の微生物細胞、特に酵母細胞において組み換え酵素を機能的に発現し、ＮＡＤＨ依存的な副産物の合成を減少させるかまたは消失させることが可能であることに気付いた。
【００１４】
その結果、本発明は、組み換えられた化学合成従属栄養微生物、特に真核生物の微生物において、二酸化炭素を電子受容体として使用する点に関連する。本明細書において、化学合成の、（化学合成）従属栄養の、および独立栄養の微生物、ならびにその他の分類の微生物は組み換えを起こす前の微生物についていうものであり、本明細書においてこの微生物は宿主とも呼ぶ。例えば、本明細書で開示される組み換えにより、宿主の微生物は、元々（化学合成）従属栄養生物であり、独立栄養ではなかったものが、組み換え後に独立栄養となり得る。これは、本明細書で開示された点を適用することにより、その組み換え微生物は二酸化炭素を同化し、結果として（部分的な）（化学合成）独立栄養性を獲得することに起因する。
【００１５】
有利な点として、本発明者らは、従属栄養の工業用微生物の代謝を操作し二酸化炭素を補基質として取り込む方法であって、生産物の収量を改善し、および／または副生産物の形成を減少させるために用いることが可能な方法を発見した。
【００１６】
特に、発明者らは、真核生物の微生物、特に酵母細胞において２つの特定のグループ由来の少なくとも２つの組み換え酵素を機能的に発現させることによりＮＡＤＨ依存的な副産物の合成を減少させるか消失させることが可能であることを発見した。ここで、該酵素の一つは二酸化炭素が用いられる反応を触媒し、もう一方はＡＴＰを補因子として用いるものである。
【００１７】
また、本発明は、組み換えられた、特にトランスジェニックの、真核細胞の微生物、特に酵母細胞に関するものであり、前記微生物は一または複数の、組み換えられた、特に異種の、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）およびホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）をコードする核酸配列を機能的に発現する。
【００１８】
本発明による微生物は、ＲｕｂｉｓｃｏとＰＲＫとの存在下で、ＮＡＤＨ依存的な副産物（グリセロール）の形成が大幅に減少し、または実質的に完全に消失し、所望の生産物の生産を増加させることができる点で、特に有利である。これは、二酸化炭素がＮＡＤＨの電子受容体として働き、副産物（ＮＡＤＨのような）の生成反応に使用可能なＮＡＤＨが少なくなるからであると考えられる。
【００１９】
本発明は、さらに、有機化合物、特にアルコール、有機酸、またはアミノ酸を調製する方法に関するものであり、該方法は、炭素源、特に炭水化物またはその他の有機炭素源を微生物を用いて変換することにより有機化合物を形成することを含み、前記微生物として、本発明による微生物を用い、または、組み換えられた化学合成の若しくは化学合成従属栄養の微生物において二酸化炭素を電子受容体として用いる。
【００２０】
本発明は、さらに、異種のポリペプチドを酵母細胞内で機能的に発現させるためのベクターに関するものであり、該ベクターは、ＲｕｂｉｓｃｏおよびＰＲＫをコードする１つの異種の核酸配列を備え、該Ｒｕｂｉｓｃｏは炭素固定の活性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】例５におけるルビスコ活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書で用いられる、「１つの」の語は、その他の方法により特定されない限り、「少なくとも１つの」として定義される。
【００２３】
単数相の名詞（例えば、１つの化合物、１つの添加物、等）について言及する際は、その複数相の名詞も含まれるものとする。従って、例えば、「化合物」のように特定の部分について言及する際は、別途指定されない限り、「少なくとも１つの」その部分、例えば、「少なくとも１つの化合物」を意味する。
【００２４】
本明細書において、「または」の語は、「および／または」として解される。
【００２５】
いくつかの異性体が存在する化合物（例えば、ＤおよびＬの光学異性体）について言及する際は、原則としてその化合物の全ての光学異性体、ジアステレオマー、およびシス／トランス異性体であって、本発明の特定の方法に使用し得るものを含む。とりわけ、このような化合物に言及する際は、自然に存在する異性体を含むものとする。
【００２６】
明確性と簡潔な記載を目的とするため、本明細書において発明の特性は同一または別個の実施形態の一部として記載される。しかし、本発明の範囲は、記載された全て、またはいくつかの特性の組み合わせを有する実施形態を含み得るものとして認められる。この点に関して、熟練した読者には明らかであろうが、出願された請求項１の変異形は、この出願で記載されたその他の特性との組み合わせを含み得、特に従属項に開示された特性を含み得る。従属項は通常、発明の最も好ましい実施形態に関連している。
【００２７】
本明細書において「発酵」「発酵性の」等の語は標準的な意味で用いられている。すなわち、過程が嫌気的な条件下で実行されている、または実行された、ということを示す。本明細書において、嫌気的条件とは、酸素が全く無い条件か、または酵母細胞、特に酵母細胞により消費される酸素が実質的に無い、酸素消費量５ｍｍｏｌ／ｌ．ｈ未満、特に酸素消費量２．５ｍｍｏｌ／ｌ．ｈ未満、または１ｍｍｏｌ／ｌ．ｈ未満に対応する条件である。さらに好ましくは消費量０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである（すなわち、酸素消費量は不検出）。これは、通常、培養液中の溶存酸素の濃度が空気飽和度（air saturation）の５％未満、特に、溶存酸素の濃度が空気飽和度の１％未満、または空気飽和度の０．２％未満に対応する。
【００２８】
本明細書において「酵母」または「酵母細胞」の語は、単細胞の菌類の系統的に多様な群で、大半は子嚢菌門（Ascomycota）または担子菌門（Basidiomycota）に属するものを指す。出芽酵母（「真の酵母」）はサッカロマイセス目に分類されており、サッカロマイセス・セレビシエが最もよく知られた種である。
【００２９】
本明細書において用いられる「組み換え体（組み換え細胞）」または「組み換え微生物」の語は、組み換えＤＮＡ技術を用いた一または複数の遺伝的改変および／若しくはその他の変異導入技術の結果として得られた核酸を含む株（細胞）を指す。
特に、組み換え細胞は、対応する野生型細胞には存在しない核酸を含むことがあるが、その核酸は組み換えＤＮＡ技術を用いてその株（細胞）に導入されてもよい（トランスジェニック細胞）し、上記の野生型には存在しない核酸は一以上の変異の結果であってもよい。この変異は、上記の野生型に存在する（野生型ポリペプチドをコードする遺伝子のような）核酸配列を、−例えば組み換えＤＮＡ技術または紫外線放射のような−その他の変異技術を用いて導入したり、または、遺伝子の核酸配列を改変して（その核酸配列がコードする）ポリペプチド産物を細胞の他の部分に向かうようにして導入する。さらに、「組み換え（細胞）」の語は、特に、組み換えＤＮＡ技術を用いてＤＮＡ配列を取り除かれた株（細胞）に関連する。
【００３０】
本明細書で用いられる「トランスジェニック（酵母）細胞」の語は、その株（細胞）にとって自然発生的でない核酸を含み、該核酸は、組み換えＤＮＡ技術を用いてその株（細胞）に導入されたものである株（細胞）を指す（すなわち、組み換え細胞）。
【００３１】
タンパク質またはポリペプチドに関して本明細書で用いられる「変異した」の語は、野生型または自然発生的なタンパク質若しくはポリペプチド配列における、少なくとも一つのアミノ酸が、これらのアミノ酸をコードする核酸の変異を介して、異なるアミノ酸に置換されるか、または配列に挿入若しくは欠失が起こることを意味する。突然変異誘発は、当業者に周知の方法であり、例えば、サムブルック（Sambrook）らの著、モレキュラークローニング−研究室マニュアル、第２版１−３巻、１９８９年（Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2nd ed., Vol. 1-3(1989)）に記載されているような、ＰＣＲによる部位特異的な突然変異誘発か、またはオリゴヌクレオチドによる突然変異誘発が含まれる。遺伝子に関して本明細書で用いられる「変異した」の語は、その遺伝子の核酸配列若しくは調節配列の少なくとも一つのヌクレオチドが異なるヌクレオチドに置換されるか、または突然変異誘発を介し欠失し、結果として、質的若しくは量的に異なる機能をもつタンパク質配列の転写、またはその遺伝子のノックアウトがもたらされることを意味する。
【００３２】
本明細書において用いられる「遺伝子」の語は、核酸ポリメラーゼ、真核生物ではＲＮＡポリメラーゼＩＩの鋳型となる配列を含む核酸配列を指す。遺伝子はｍＲＮＡに転写され、その後、蛋白質に翻訳される。
【００３３】
本明細書で用いられる「核酸」という用語は、単鎖または二重鎖の形式の、デオキシリボ核酸またはリボ核酸のポリマー、すなわちポリヌクレオチドへの言及を含み、他に特に制限されなければ、自然発生的なヌクレオチド（例えばペプチド核酸）と類似した方法で単鎖の核酸にハイブリダイズする、天然のヌクレオチドの本質的な性質を持つ公知のアナローグを包含する。ポリヌクレオチドは、全長か、または野生型若しくは異種の構造若しくは調節遺伝子の部分列であり得る。他に特に指定の無い限り、この用語は、特定された配列だけでなくその相補配列への言及も含む。従って、本明細書においてこの用語により意図されているように、ＤＮＡまたはＲＮＡであって、安定性やその他の理由のため主鎖を修飾されたものも「ポリヌクレオチド」である。さらに、本明細書においてこの用語が使用されているように、ＤＮＡまたはＲＮＡで通常とは異なる塩基、二つだけ例を挙げれば、イノシンまたは、トリチル化した塩基のような修飾塩基を含むものはポリヌクレオチドである。もちろん、多くの役立つ目的に資するＤＮＡおよびＲＮＡへの多様な修飾が当業者に知られている。本明細書で採用するポリヌクレオチドの用語は、このような化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形式のポリヌクレオチドだけでなく、ウィルスおよび細胞のＤＮＡおよびＲＮＡの特性、とりわけ単純型および複雑型細胞（simple and complex cells）を含む。
【００３４】
本明細書で同じ意味に用いられる、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」の語は、アミノ酸残基のポリマーを指す。この語は、自然発生的なアミノ酸のポリマーだけでなく、アミノ酸のポリマーであって、一以上のアミノ酸残基が、対応する自然発生的なアミノ酸の人工的化学的なアナローグになっているものにも適用される。これらの自然発生的なアミノ酸のアナローグの本質的な性質は、タンパク質に導入されたとき、同じタンパク質であって全体が自然発生的なアミノ酸からなるものが誘発する抗体に特異的に反応することである。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」の語は、糖鎖付加、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のγカルボキシル化、水酸化およびＡＤＰリボシル化を含む修飾を包含し、またこれらの修飾に限定されない。
【００３５】
酵素分類（ＥＣ）を参照して酵素に言及する場合、その酵素分類は、国際生化学分子生物学連合の命名法委員会（ＮＢ−ＩＵＢＭＢ）の酵素命名法に基づいてその酵素が分類されている、またはおそらく分類されているであろう分類である。その命名法は、http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/で見られる。その他の、いまだ特定のクラスに分類されていない適当な酵素であるが、おそらくそのように分類されるだろうという意味のものもここでは含まれる。
【００３６】
本明細書において、遺伝子等のタンパク質または核酸配列が、登録番号（Accession Number）により参照されている場合は、他に特に指定の無い限り、この番号を用いて、www.ncbi.nlm.nih.gov/ （２００９年７月１３日の段階で参照可能）を介して、配列を有するタンパク質または核酸配列（遺伝子）が参照される。
【００３７】
本明細書において、ポリペプチドをコードするすべての核酸配列は、また、遺伝コードを参照することで、その核酸の全ての可能なサイレント変異体を表している。「保存的に改変された変異体」の語は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に対して、保存的に改変された変異体とは、遺伝コードの縮重により、同一の、または保存的に改変されたアミノ酸配列をコードする核酸を指す。「遺伝コードの縮重」の語は、ある１つのタンパク質に対し、非常に多くの数の機能的に同一の核酸がコードしている事実を指す。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵの全てはアミノ酸であるアラニンをコードする。従って、コドンによりアラニンが特定される位置では、そのコードされたポリペプチドを変化させない限り、そのコドンは上述の対応するいずれのコドンに変えられてもよい。このような核酸の変異が「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の一つの種類となっている。
【００３８】
本明細書で用いられるように、特定の配列（例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｘ）を有するポリペプチドの「機能的ホモローグ」（または、手短に言えば「ホモローグ」）の語は、上記の特定の配列を備えるポリペプチドに一以上のアミノ酸が、置換され、欠失され、付加され、および／または挿入されてなるポリペプチドが基質の変換に対し（質的に）同一の酵素の機能を有する場合、そのポリペプチドを指す。この機能は、酵母においてそのホモローグの発現をするための発現ベクターを含む、組み換え酵母細胞を備えるアッセイシステムの使用により試験することができる。ここで、上記の発現ベクターは、その酵母で機能するプロモーターに機能的に連結された異種の核酸配列を備え、上記の異種の核酸配列は相同のポリペプチドをコードし、アセチル補酵素Ａを酵母細胞の中でアセトアルデヒドに変換するその相同ポリペプチドの酵素活性が、試験の対象となっている。こうして上記の細胞で上記の変換が起こるかどうかが評価される。候補となるホモローグは、コンピュータによる（イン・シリコ）相同性分析を用いて同定することができる。このような分析の詳細な例がＷＯ２００９／０１３１５９の実施例２に記載されている。この分析から、当業者は、候補となるホモローグがどの程度適合するかを、知り得る。また、当業者は、選択的に、コドン（ペア）を最適化に際し、適当なアッセイ・システムを用いてこのような候補となるホモローグに必要とされる機能を試験することができる。適当なホモローグとは、特定のポリペプチドと比較して、５０％を超えるか、好ましくは６０％以上、特に少なくとも７０％、さらに特に少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列の類似性を有し、必要な酵素活性を有するポリペプチドを表す。核酸配列については、機能的ホモローグの語は、他の核酸配列と異なる核酸配列であって、遺伝コードの縮重により同一のポリペプチド配列をコードするものも含むものとする。
【００３９】
本明細書で定義される配列同一性とは、二以上のアミノ酸（ポリペプチドまたはタンパク質）配列または二以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列の間の関係であり、配列を比較することにより決定されるものである。通常、配列の同一性または類似性は、配列の全長にわたって比較される。当技術分野では、「同一性」は、アミノ酸、または、核酸配列の間での配列の関連性の度合を意味することもある。場合によっては、このような配列の列間での一致度により決定される。
【００４０】
一定の水準の類似性があれば、アミノ酸または核酸配列は相同であると言われる。２つの相同な配列は共通の進化の起源を示す。２つの相同な配列が近縁であるか遠縁であるかは「パーセント同一性（percent identity）」または「パーセント類似性（percent similarity）」により示され、それぞれ高い場合と低い場合とに対応する。議論はあるが、「パーセント同一性」または「パーセント類似性」、「相同性の水準」または「パーセント相同性（percent homology）」は、しばしば置き換え可能に用いられる。２つの配列の間の配列比較およびパーセント同一性の導出は数学的アルゴリズムを用いて得られる。当業者の察する事実としては、２つの配列をアラインし、その２つの配列の間の相同性を導出するためのいくつかの異なるコンピュータプログラムが利用可能である（Ｄ．サンコフ（Sankoff）、Ｊ．Ｂ．クラスカル（Kruskal）（編）「タイムワープ、列の編集、および高分子：配列比較の理論と実際」、１−４４ページに記載のＪ．Ｂ．クラスカル著（１９８３年）、「配列比較の概観」）２つのアミノ酸配列のパーセント同一性は２つの配列のアラインメントのためのニードルマン（Needleman）およびブンシュ（Wunsch）のアルゴリズムを用いて導出することができる（Needleman, S. B. and Wunsch, C.D.(1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453）。このアルゴリズムによりアミノ酸配列だけでなくヌクレオチド配列もアラインできる。ニードルマン−ブンシュ・アルゴリズムはコンピュータプログラムＮＥＥＤＬＥに実装されている。この発明の目的のために、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮＥＥＤＬＥプログラムが用いられた（バージョン２．８．０以上、EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite（２０００年）Rice, P. Longden, I. and Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) pp276-277, http://emboss.bioinformatics.nl/）。タンパク質配列に関しては、ＥＢＬＯＳＵＭ６２が置換行列（substitution matrix）として用いられた。ヌクレオチド配列には、ＥＤＮＡＦＵＬＬが用いられた。その他の行列も特定可能である。アミノ酸配列のアラインメントのために用いられる、任意に選択されるパラメータについては、ギャップ・オープン・ペナルティ（gap-open penalty）が１０で、ギャップ・伸長・ペナルティ（gap-extention penalty）が０．５である。当業者の理解するところでは、これらの全ての異なるパラメタは、わずかに異なる結果を産み出すが、２つの配列の全体としてのパーセント同一性は、異なるアルゴリズムを用いた時でも顕著に変化するわけではない。
【００４１】
グローバル相同性（Global Homology）の定義
相同性または同一性は、ギャップまたは伸長を含んだ、アラインされる領域全体にわたる、２つの配列の全長の同一の適合度の百分率である。２つのアラインされた配列の相同性または同一性は以下のように算出される：アラインメントにおいて対応する位置で、両方の配列が同一のアミノ酸を示している位置の数を、ギャップを含んだアラインメントの全長で割った値。本明細書で定義される同一性はＮＥＥＤＬＥから取得することができ、そして、プログラムの出力は「IDENTITY」とラベルされる。
【００４２】
最長の同一性（Longest Identity）の定義
２つのアラインされた配列の相同性または同一性は、以下のようにして算出される：アラインメントにおいて対応する位置で、両方の配列が同一のアミノ酸を示している位置の数を、アラインメントの全長からアラインメントにおけるギャップの総数を引いた数で割った値。本明細書において定義された同一性はＮＯＢＲＩＥＦオプションを用いてＮＥＥＤＬＥから得ることができるものであり、プログラムのアウトプットは「longest-identity」とラベルされる。
【００４３】
本明細書で開示されるヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変異体は、本明細書で特定し開示されるヌクレオチドまたはアミノ酸配列（例えば、配列表に記載のもの）と比較して、１個若しくは数個の置換、挿入および／または欠失を有するヌクレオチドまたはアミノ酸配列としても定義される。
【００４４】
任意であるが、アミノ酸の類似度を導出する際に、当業者はいわゆる、当業者に明らかなように、「保存的な」アミノ酸置換を考慮に入れることができる。保存的なアミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基による互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンである。脂肪族ヒドロキシル基を側鎖に有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニンである。アミドを含む側鎖を有するアミノ酸の群はアスパラギンおよびグルタミンである。芳香族側鎖を有するアミノ酸の群はフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンである。塩基性側鎖を有するアミノ酸の群はリシン、アルギニンおよびヒスチジンである。硫黄を含む側鎖を有するアミノ酸の群はシステインおよびメチオニンである。
好ましい保存的なアミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。
本明細書において開示されるアミノ酸配列の変異体は、開示された配列のうち、少なくとも１つの残基が取り除かれ、異なる残基がその場所に挿入されたものである。好ましくは、アミノ酸の変化は保存的なものである。それぞれの自然発生的なアミノ酸に対し、好ましい保存的な置換は以下のようである：アラニン（Ala）からセリン（ser）へ、アルギニン（Arg）からリシン（lys）へ、アスパラギン（Asn）からグルタミン（gln）またはヒスチジン(his)へ、アスパラギン酸（Asp）からグルタミン酸(glu)へ、システイン（Cys）からセリン（ser）またはアラニン(ala)へ、グルタミン（Gin）からアスパラギン(asn)へ、グルタミン酸（Glu)からアスパラギン酸（asp)へ、グリシン（Gly））からプロリン（pro）へ、ヒスチジン（His）からアスパラギン（asn）またはグルタミン（gin）へ、イソロイシン（Ile）からロイシン（leu）またはバリン（val）へ、ロイシン（Leu）からイソロイシン（ile）またはバリン（val）へ、リシン（Lys）からアルギニン（arg）、グルタミン（gln）またはグルタミン酸（glu）へ、メチオニン（Met）からロイシン（leu）またはイソロイシン（ile）へ、フェニルアラニン（Phe）からメチオニン（met）、ロイシン（leu）、またはチロシン（tyr）へ、セリン（Ser）からスレオニン（thr）へ、スレオニン（Thr）からセリン（ser）へ、トリプトファン（Trp）からチロシン（tyr）へ、チロシン（Tyr）からトリプトファン（trp）またはフェニルアラニン（phe）へ、そして、バリン（Val）からイソロイシン（ile）またはロイシン（leu）へ。
【００４５】
本発明のヌクレオチドの配列は、本明細書において開示される特定のヌクレオチド配列の一部と、それぞれ、中程度または好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズできるかにより定義され得る。本明細書におけるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、少なくとも約２５、好ましくは約５０ヌクレオチド、７５または１００そして最も好ましくは約２００かそれ以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列を、約１Ｍの塩を含む溶液、好ましくは６×ＳＳＣまたは同等のイオン強度を有する任意の溶液において約６５℃の温度でハイブリダイズさせ、約０．１Ｍか０．１Ｍ弱の塩、好ましくは０．２×ＳＳＣか同等のイオン強度を有する任意の溶液において６５℃で洗浄（wash）するものである。好ましくは、このハイブリダイゼーションはオーバーナイト（overnight）で実行される。すなわち、１０時間をかけ、好ましくは、洗浄液を少なくとも２回以上変え、少なくとも１時間以上の洗浄を行う。これらの条件では、通常、約９０％以上の配列同一性を有する配列間の特異的なハイブリダイゼーションが可能である。
【００４６】
本明細書で定義される中程度の条件とは、少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは約２００かそれ以上のヌクレオチドの核酸配列を、約１Ｍの塩を含む溶液、好ましくは６×ＳＳＣまたは同等のイオン強度を有する任意の溶液において約４５℃の温度でハイブリダイズさせ、約１Ｍの塩、好ましくは６×ＳＳＣか同等のイオン強度を有する任意の溶液において室温で洗浄するものである。好ましくは、このハイブリダイゼーションはオーバーナイトで実行される。すなわち、１０時間をかけ、好ましくは、洗浄液を少なくとも２回以上取り替え、少なくとも１時間以上の洗浄を行う。これらの条件では、通常、約５０％までの配列同一性を有する配列間の特異的なハイブリダイゼーションが可能である。当業者は、５０％から９０％に渡る同一性を有する配列を特異的に同定するため、これらのハイブリダイゼーション条件を変化させることができる。
【００４７】
「発現」とは、遺伝子を転写して構造ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）にし、その後タンパク質へと翻訳することである。
【００４８】
本明細書で用いられるように、核酸またはタンパク質に言及する際の「異種の」とは、核酸またはタンパク質が、外来の種に起源をもつか、もし同一の種に由来するならば、意図的な人為的介入により、組成および／または遺伝子座が野生型から実質的に改変されたものをいう。例えば、異種の構造遺伝子と機能的に連結されたプロモーターは、その構造遺伝子が由来する種と異なる種からのものであるか、もし同一の種からであれば、一方または両方がそれらの元々のものから実質的に改変されたものである。異種のタンパク質は外来の種に起源するかもしれないし、もし同一の種からであれば、意図的な人為的介入により元々のものから実質的に改変されたものである。
【００４９】
「異種発現」の語は、宿主細胞において異種の核酸を発現することを指す。酵母のような真核細胞の宿主細胞システムでの異種のタンパク質の発現は、当業者に周知の技術である。このような真核細胞のシステムでは、特定の活性を持つ酵素をコードする遺伝子の核酸配列を含むポリヌクレオチドが発現される。いくつかの実施形態では、酵素の発現のために、形質転換／トランスフェクションされた酵母細胞が発現システムとして採用され得る。酵母での異種タンパク質の発現は周知である。Ｆ．シャーマン（Sherman）ら著、酵母遺伝学における方法、コールドスプリングハーバー研究所（１９８２）は、酵母においてタンパク質の発現を可能にする様々な方法を記述しているよく知られた著作物である。２つの広く用いられている酵母は、サッカロマイセス・セレビシエおよびピキア・パストリス（Pichia pastoris）である。サッカロマイセスおよびピキアでの発現の、ベクター、菌株、およびプロトコルは当業者に知られており、商業的な供給者（例えば、インビトロジェン）から入手可能である。適したベクターは、通常、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたはアルコールオキシダーゼのものを含む、プロモーターのような発現をコントロールする配列と、および複製の起点および終点の配列等を所望により有する。
【００５０】
本明細書で用いられるように、「プロモーター」は（構造）遺伝子の転写を誘導するＤＮＡ配列である。典型的には、プロモーターは遺伝子の５′末端領域にあり、（構造）遺伝子の転写開始地点に近接した位置にある。プロモーター配列は、恒常的、誘導可能、または抑制可能である。もしプロモーターが誘導可能なプロモーターであれば、転写速度は誘導剤に応じて上昇する。
【００５１】
本明細書で用いられるように、「ベクター」の語は、常染色体の発現ベクターおよび染色体に組み込むのに用いられる組込みベクターを含む。
【００５２】
「発現ベクター」の語は、線状または環状のＤＮＡ分子であって、関心のあるポリペプチドをコードする断片を、その転写を提供する追加的な核酸断片のコントロール下に（すなわち機能するようにそれに連結されて）備えるものを指す。このような追加断片は、プロモーターやターミネーター配列を含んでいてもよく、また、一以上の複製開始点、一以上の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等を選択的に含んでいてもよい。発現ベクターは一般的にプラスミド若しくはＤＮＡに由来し、または両方の要素を含んでもよい。特に発現ベクターは、５′から３′の方向に、機能するように連結された以下の核酸配列を備える。（ａ）酵母で認識される転写及び翻訳の開始領域、（ｂ）関心のあるポリペプチドをコードする配列、（ｃ）酵母で認識される転写および翻訳が終結する領域。「プラスミド」とは、自律的に複製する染色体外のＤＮＡであって、微生物のゲノムに組み込まれず、通常、環状である特性を持つものを指す。
【００５３】
「組込みベクター」とは、線状または環状のＤＮＡ分子であって、微生物のゲノムに導入され得るもので、関心のあるポリペプチドをコードする遺伝子を安定的に保持するものである。組込みベクターは、一般的に、関心のあるポリペプチドをコードする遺伝子配列を、その転写を提供する追加の核酸断片のコントロール下に（すなわち機能するようにそれに連結されて）備える、一以上の断片を含む。このような追加の核酸断片は、プロモーターおよびターミネーター配列を含み、また、その関心のある遺伝子を、通常、相同組み換えのプロセスにより、標的とする細胞のゲノムへ取り込ませるための、一以上の断片を含む。典型的には、組込みベクターは標的細胞に移行するものであるが、その生物では機能しないレプリコンを含んでいてもよい。関心のある遺伝子を含む断片の組み込みは、その断片に適切なマーカーが含まれている場合に選択することができる。
【００５４】
「宿主細胞」とは、ベクターを含み、ベクターの複製および／または発現を支持する細胞を意味する。宿主細胞は、E.  coliのような原核細胞か、酵母、昆虫、両生類、または哺乳類の細胞のような真核細胞である。好ましくは、宿主細胞は放線菌目の真核細胞である。
【００５５】
本明細書において用いられる、「形質転換」および「形質転換を起こす」とは、宿主細胞への異種のポリヌクレオチドの挿入を指し、その挿入に用いられる方法、例えば直接取り込み、形質導入、ｆ−メイティング（f-mating）、または電気穿孔法を問わず、いずれでもよい。外部から導入されたポリヌクレオチドは、例えばプラスミドのように組み込まれないベクターとして維持されてもよく、または、宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。
【００５６】
微生物は、サッカロマイセス科（Saccharomyceraceae）、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・パストリアナス（Saccharomyces pastorianus）、サッカロマイセス・ベチカス（Saccharomyces beticus）、サッカロマイセス・フェルメンタチ（Saccharomyces fermentati）、サッカロマイセス・パラドクサス（Saccharomyces paradoxus）サッカロマイセス・ウバルム（Saccharomyces uvarum）、およびサッカロマイセス・バヤナス（Saccharomyces bayanus）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）、例えば、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、シゾサッカロマイセス・ジャポニカス（Schizosaccharomyces japonicus）、シゾサッカロマイセス・オクトスポラス（Schizosaccharomyces octosporus）およびシゾサッカロマイセス・クリオフィラス（Schizosaccharomyces cryophilus）、トルラスポラ属（Torulaspora）、例えばトルラスポラ・デリュブルッキ（Torulaspora delbrueckii）、クリベロマイセス属、例えばクリベロマイセス・マルキシアナス（Kluyveromyces marxianus）、ピキア属（Pichia）例えばピキア・スティピティス（Pichia stipitis）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）またはピキア・アングスタ（pichia angusta）、ザイゴサッカロマイセス属（Zygosaccharomyces）、例えば、ザイゴサッカロマイセス・バイリー（Zygosaccharomyces bailii）、ブレタノマイセス属（Brettanomyces）例えばブレタノマイセス・インテルメディウス（Brettanomyces intermedius）、ブレタノマイセス・ブルキセレンシス（Brettanomyces bruxellensis）、ブレタノマイセス・アノマラス（Brettanomyces anomalus）、ブレタノマイセス・クステルシアナス（Brettanomyces custersianus）、ブレタノマイセス・ナアルデネンシス（Brettanomyces naardenensis）、ブレタノマイセス・ナナス（Brettanomyces nanus）、デッケラ・ブルキセレンシス（Dekkera bruxellensis）およびデッケラ・アノマラ（Dekkera anomala）、メチニコビア属（Metschnikowia）、イサチェンキア属（Issatchenkia）、例えばイサチェンキア・オリエンタリス（Issatchenkia orientalis）、クロエケラ属（Kloeckera）、例えばクロエケラ・アピクラタ（Kloeckera apiculata）、アウレオバシジウム属（Aureobasidium）例えばアウレオバシディウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）、からなる群から選択されることが好ましい。
【００５７】
非常に好ましい一実施形態では、微生物は、サッカロマイセス科の群から選択される酵母細胞である。特に、良い結果がサッカロマイセス・セレビシエの細胞で得られている。本発明によるこのような細胞をアルコール（エタノール）の調製方法に用いることで、ＲｕｂｉｓｃｏおよびＰＲＫが無い類似の細胞と比較して、ＮＡＤＨ依存性副産物の形成（グリセロール）を約９０％減少させ、所望の生産物（エタノール）の収量を約１０％増加させることが可能なことが見出された。
【００５８】
Ｒｕｂｉｓｃｏは、原則的に、真核生物および原核生物のＲｕｂｉｓｃｏから選択することができる。
【００５９】
Ｒｕｂｉｓｃｏは、非光栄養生物から得られたものであることが好ましい。特に、Ｒｕｂｉｓｃｏは化学合成無機独立栄養生物から得ることができる。
【００６０】
良い結果は細菌のＲｕｂｉｓｃｏにより得られている。好ましくは、細菌のＲｕｂｉｓｃｏはチオバシルス属（Thiobacillus）、特に化学合成無機独立栄養生物であるチオバシルス・デニトリフィカンス（Thiobacillus denitrif icons）を起源とするものである。
【００６１】
Ｒｕｂｉｓｃｏは単一サブユニットのＲｕｂｉｓｃｏまたは複数のサブユニットを有するＲｕｂｉｓｃｏであり得る。特に、良い結果が単一のサブユニットのＲｕｂｉｓｃｏから得られている。
【００６２】
特に、良い結果がフォームＩＩ（Form II）のＲｕｂｉｓｃｏ、特にＣｂｂＭにおいて得られている。
【００６３】
配列ＩＤ、番号２では本発明に従う、特に好ましいＲｕｂｉｓｃｏの配列を示す。これは、チオバシルス・デニトリフィカンス（Thiobacillus denitrif icons）からのｃｂｂＭ遺伝子にコードされている。このＲｕｂｉｓｃｏの他の好ましい態様は、このＲｕｂｉｓｃｏの機能的なホモローグであり、特に好ましいのは、このような機能的ホモローグであって、配列ＩＤ、番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有する配列を備えるものである。適した野生型Ｒｕｂｉｓｃｏポリペプチドは表１に与えられる。
【００６４】
【表１】
2016511639.tif 000002
【００６５】
本発明では、Ｒｕｂｉｓｃｏは微生物において、少なくとも、関心のある化合物を調製するための工業的過程での使用の間機能的に発現される。
【００６６】
ここに、本発明で形質転換された（組み換えられた）宿主細胞において、活性型で十分な水準の、酵素活性が発現される尤度を高めるために、これらの酵素をコードするヌクレオチド配列だけでなく、Ｒｕｂｉｓｃｏ酵素およびその他の本発明における酵素（以下を参照）はそのコドンの使用量を当該宿主細胞におけるものに適合して最適化することが好ましい。ある酵素をコードするヌクレオチド配列の、宿主細胞のコドンの使用量への適合度は、コドン適合指数（codon adaptation index (CAI)）として表現することができある。本明細書では、コドン適合指数は、ある遺伝子のコドンの使用量に対する、特定の宿主細胞または生物に高発現される遺伝子のコドンの使用量の相対的な適合度を測定することで定義される。それぞれのコドンの相対的な適合度（ｗ）は、同一のアミノ酸に対するコドンで最も豊富なものの使用量に対する、それぞれのコドンの使用量の比である。ＣＡＩ指数はこれらの相対的な適合度の値の幾何平均として定義される。非同義コドンおよび終止コドン（遺伝コードによる）は除外される。ＣＡＩ値は０から１の値を取り、高い程、最も豊富なコドンが高い割合をもっていることを示す（Sharp and Li, 1987, Nucleic Acids Research 15: 1281-1295を参照。さらに、Jansen et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31(8):2242-51を参照）。適合されたヌクレオチド配列は、少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８または０．９のＣＡＩを有することが好ましい。例えばＳ．セレビシエ細胞のような、問題となっている菌類の宿主細胞での発現において、コドンが最適化された配列が最も好ましい。
【００６７】
好ましくは、機能的に発現されたＲｕｂｉｓｃｏは、細胞抽出物によるリブロース−１，５−ビスリン酸依存的１４Ｃ重炭酸塩取り込みにより定義される活性が、少なくとも１nmol.min-1.(mg protein)-1、特に少なくとも２nmol.min-1.(mg protein)-1の活性、さらに特に少なくとも４nmol.min-1.(mg protein)-1の活性をもつ。この活性の上限は重大なものではない。実際のところは、活性は約２００nmol.min-1.(mg protein)-1以下、特に２５nmol.min-1.(mg protein)-1以下、さらに特に１５nmol.min-1.(mg protein)-1以下、例えば約１０nmol.min-1.(mg protein)-1以下である。本明細書でＲｕｂｉｓｃｏの活性について言及する際は、特に３０℃における活性を意味する。このＲｕｂｉｓｃｏの活性を導出するためのアッセイの条件は、以下の実施例に記載されている（実施例４）。
【００６８】
本発明により機能的に発現されたホスホリブロキナーゼ（PRK, (EC 2.7.1.19)）はこの化学反応を触媒する。
【化１】
2016511639.tif 000003
【００６９】
従って、この酵素の２つの基質はＡＴＰとＤ−リブロース５−リン酸であり、そしてこの酵素の２つの生産物はＡＤＰとＤ−リブロース１，５−ビスリン酸である。
【００７０】
ＰＲＫはトランスフェラーゼのファミリーに属し、特に、アルコール基を受容体としてリン含有基を転移する（ホスホトランスフェラーゼ）ものである。この酵素のクラスの系統名は、ＡＴＰ：Ｄ−リブロース−５−リン酸１−ホスホトランスフェラーゼである。その他の慣用名にはホスホペントキナーゼ、リブロース−５−リン酸キナーゼ、ホスホペントキナーゼ、ホスホリブロキナーゼ（リン酸化）、５−ホスホリブロースキナーゼ、リブロースリン酸キナーゼＰＫＫ、ＰＲｕＫ、およびＰＲＫが含まれる。この酵素は炭素固定に関与する。
【００７１】
ＲＰＫは原核生物由来でも真核生物由来でもよい。真核生物由来のＰＲＫで良い結果が得られている。好ましくは、ナデシコ目（Caryophyllales）から選択された植物に由来する真核生物のＰＲＫであり、特にヒユ科（Amaranthaceae）、さらに特にホウレンソウ属（Spinacia）由来のものが好ましい。
【００７２】
ホウレンソウ属由来のＰＲＫの好適な代替物として、ホウレンソウ属由来のＰＲＫの機能的ホモローグが存在していてもよく、特に、配列ＩＤ番号４と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性をもつ配列を備える機能的ホモローグが存在していてもよい。表２に適切な天然のＰＲＫポリペプチドを示す。
【００７３】
【表２】
2016511639.tif 000004
【００７４】
有利な一実施形態では、組み換え微生物は、一以上の異種の原核生物または真核生物の分子シャペロンをコードする核酸配列をさらに含む。この分子シャペロンは、発現された際、上記微生物における酵素、特に少なくともＲｕｂｉｓｃｏおよびＰＲＫのうちの一つと機能的に相互作用することができる。
【００７５】
シャペロニンは、他のタンパク質が適切に折りたたみ（フォールディング）するために好ましい条件を提供し、それにより凝集を防ぐタンパク質である。新しく作成されたタンパク質は、通常、アミノ酸の線状の鎖から三次元の形式に折りたたまれなければならない。シャペロニンは、分子シャペロンと呼ばれる、タンパク質のフォールディングを助ける広汎な分子群に属する。蛋白質を折りたたむためのエネルギーはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）により供給される。本明細書において有用なシャペロンに関する総説記事は、２００１年にイエベネス（Yebenes）により書かれたものがある”Chaperonins: two rings for folding”; Hugo Yebenes et al. Trends in Biochemical Sciences, August 2011, Vol. 36, No.8。
【００７６】
好適な一実施形態において、一または複数のシャペロンはバクテリア由来であり、好ましくはエシェリキア属由来であり、特に好ましくはＥ．ｃｏｌｉ由来のＥ．ｃｏｌｉＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥｓであり、特に本発明による微生物にコードされることが好ましい。その他の好適なシャペロンはサッカロマイセス属由来のシャペロンであり、特にサッカロマイセス・セレビシエのＨｓｐ１０およびＨｓｐ６０である。もしシャペロンが元々天然でミトコンドリアのようなオルガネラに発現される場合（例えばサッカロマイセス・セレビシエのＨｓｐ６０およびＨｓｐ１０）、例えばそのシャペロニンの野生型のシグナル配列を改変することにより、細胞質への移動を可能にすることができる。
【００７７】
真核生物において、タンパク質Ｈｓｐ６０とＨｓｐ１０とは、それぞれＧｒｏＥＬとＧｒｏＥＳとに構造的および機能的にほぼ同一である。従って、真核生物由来のＨｓｐ６０およびＨｓｐ１０はＲｕｂｉｓｃｏのシャペロンとして働き得ることが期待される。以下の論文を参照：Zeilstra-Ryalls J, Fayet O, Georgopoulos C (1991) “The universally conserved GroE (Hsp60) chaperonins” Annu Rev Microbiol. 45: 301-25. doi:10.1146/annurev.mi.45.100191.001505. PMID 1683763、および、Horwich AL, Fenton WA, Chapman E, Farr GW (2007) “Two Families of Chaperonin: Physiology and Mechanism” Annu Rev Cell Dev Biol. 23: 115-45. doi:10.1146/annurev.cellbio.23.090506.123555.PMID 17489689。
【００７８】
特に、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳの両方の異種シャペロンを含む組み換え酵母細胞により良い結果が得られている。
【００７９】
ＧｒｏＥＬの好適な代替物として、ＧｒｏＥＬの機能的ホモローグ、よい。特に、配列ＩＤ番号１０と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性をもつ配列を備える機能的ホモローグが存在していてもよい。
【００８０】
表３に、配列ＩＤ番号１０に相同性を持つ、適切な天然のシャペロンのポリペプチドを示す。
【００８１】
【表３】
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【００８２】
ＧｒｏＥＳの好適な代替物として、ＧｒｏＥＳの機能的ホモローグ、特に、配列ＩＤ番号１２と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性をもつ配列を備える機能的ホモローグが存在していてもよい。
【００８３】
表４に、配列ＩＤ番号１２に相同性を持つ、適切な天然のシャペロンのポリペプチドを示す。
【００８４】
【表４】
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【００８５】
一実施形態において、宿主での発現のため、同一の生物の属または種由来の、表３からの１０ｋＤａシャペロンと、適合する表４からの６０ｋＤａシャペロンとが組み合わせられる。
【００８６】
例えば、>gi|189189366|ref|XP_001931022.1|:71-168 １０ｋＤａシャペロニン（10 kDa chaperonin） [コムギ黄斑病菌（Pyrenophora tritici-repentis）]が、適合する、>gi|189190432|ref|XP_001931555.1|熱ショックタンパク質６０、ミトコンドリア前駆体（heat shock protein 60, mitochondrial precursor） [コムギ黄斑病菌（Pyrenophora tritici-repentis） Pt-1C-BFP]と一緒に発現される。
【００８７】
表３および４からの、同一の生物資源から同様に生成された、他の全ての組み合わせが当業者により発現可能である。
【００８８】
さらに、表３からのある生物のシャペロンと、表４からの他の生物からのシャペロンを組み合わせてもよいし、ＧｒｏＥＳと表３からのシャペロンを組み合わせてもよいし、または、ＧｒｏＥＬを表４からのシャペロンと組み合わせてもよい。
【００８９】
以上のように、本発明は、さらに、微生物を用いて炭素源を変換して有機化合物を形成することを含む有機化合物の調製方法に関する。この方法は、好気的、酸素制限下、または嫌気的条件下で実行され得る。
【００９０】
本発明は特に、対応する参考株での生産と比較して、ＮＡＤＨ依存的な副産物、特にグリセロールの形成が、１００％に至るまで、９９％に至るまで、または９０％に至るまで減少させることができる。そのＮＡＤＨ依存的副産物の形成は、対応する参考株と比較して好ましくは１０％以上、特に少なくとも２０％、さらに特に少なくとも５０％減少させることができる。ＮＡＤＨ依存的副産物の生産は、好ましくは１０−１００％、特に２０−９５％、さらに特に５０−９０％減少させることができる。
【００９１】
Ｒｕｂｉｓｃｏ、ＣＯ２（およびその他の基質）からの有機化合物の形成を触媒することができるその他の酵素、またはＣＯ２の電子受容体としての機能を触媒するその他の酵素が用いられる好適な方法において、その反応媒体における二酸化炭素濃度は、その反応条件の二酸化炭素飽和濃度の、少なくとも５％であり、特に上記二酸化炭素飽和濃度の少なくとも１０％であり、さらに特に上記二酸化炭素飽和濃度の少なくとも２０％である。この点は、生産物の収量に関して特に有利である。その反応媒体は二酸化炭素濃度が過飽和、飽和、飽和濃度を下回る濃度のいずれでもよい。特定の一実施形態においては、その二酸化炭素の濃度はその飽和濃度の７５％以下、特に上記飽和濃度の５０％以下、さらに特に、その二酸化炭素濃度の２５％以下であってもよい。
【００９２】
特定の一実施形態においては、二酸化炭素、またはその一部は、微生物によりその場（in  situ）で形成される。所望により、上記方法は、通常、ＣＯ２またはＣＯ２を含む混合ガス、例えばＣＯ２／窒素の混合物を給気することにより、外部のＣＯ２をその反応系に加えるステップをさらに含む。もしその場（in situ）で十分なＣＯ２が形成されないか、ＣＯ２が全く形成されない場合、望ましい濃度の範囲にＣＯ２を（増加させるか）維持するために、外部のＣＯ２の付加が特に用いられる。
【００９３】
流体におけるＣＯ２濃度の導出は、当業者の通常の技術の範囲内である。実用上、酵母の培養の上方の気相（実用上、もしその媒体がガスのパージをされている場合には、その排気ガスである）におけるＣＯ２濃度は、日常的に導出される。これは、RosemountNGA200000ガス分析器（ローズマウント・アナリティカル社、オービル、アメリカ合衆国）のような商業的なガス分析器を用いて日常的に測定され得る。液相における濃度（飽和濃度に対して相対的な）は気体において測定された値、その方法の実際の条件下でのＣＯ２飽和濃度およびヘンリー定数から算出することができる。これらのパラメータはハンドブックで取得可能か、または日常的に導出され得る。
【００９４】
炭素源としては、原則的に、微生物が基質として用いることができるいかなる炭素源を用いてもよい。特に、有機炭素源は、炭水化物および脂質（脂肪酸を含む）からなる群から選択され、使用され得る。適した炭水化物には、単糖類、二糖類、および加水分解された多糖類（例えば、加水分解されたデンプンやリグノセルロース系加水分解物）が含まれる。カルボン酸もあるが、酢酸のようなカルボン酸を、炭素源として含む必要は無い。
【００９５】
本発明の特に有利な点は、グリセロール３−リン酸ホスホヒドロラーゼの阻害および／またはグリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をコードすることによる細胞のゲノムへの干渉の必要が無く、例えば野生型の酵母細胞と比べて、エタノールの収量の改善と、グリセロールの生産の減少とが実現することである。
【００９６】
また、特定の一実施形態において、本発明に従う酵母細胞は、グリセロール３−リン酸ホスホヒドロラーゼおよび／またはグリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をコードする一以上の内在性の核酸配列の欠失または破壊を含む。
【００９７】
本明細書では、細胞内で、ＮＡＤＨ依存的なグリセロール合成に必要な酵素活性を減少させるか、または欠損させる。この酵素活性の減少または欠損は、ＮＡＤ依存的グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性（ＧＰＤ）をコードする一以上の遺伝子、または、グリセロールリン酸ホスファターゼ活性（ＧＰＰ）をコードする一以上の遺伝子を改変することにより得られる。これにより、野生型と比べて、その酵素の発現量が顕著に少なくなるか、またはその遺伝子がコードするポリペプチドの活性が減少する。
【００９８】
このような改変は、一般に知られている生命工学技術を用いて実行することができ、特に、ＧＰＤおよび／またはＧＰＰがコードする構造遺伝子のプロモーター領域またはコーディング領域の、一以上のノックアウト変異または部位特異的変異を含んでいてもよい。他の方法では、グリセロール生産に欠陥がある酵母の株は、ランダムな突然変異を誘発し、次いでＧＰＤおよび／またはＧＰＰの活性が減少または欠損した株を選択することにより得ることができる。Ｓ・セレビシエのＧＰＤ１、ＧＰＤ２、ＧＰＰ１およびＧＰＰ２遺伝子は、ＷＯ２０１１／０１０９２３に示されており、その出願の配列ＩＤ番号２４−２７に開示されている。この出願の内容、ＧＰＤおよび／またはＧＰＰに関連する内容は、本明細書において参照される。
【００９９】
以下の実施例に示されるように、本発明は、特に、アルコール、特にエタノールの生産のための過程において有利であることが見出された。しかしながら、天然の状態ではＣＯ２を電子受容体として用いない微生物でＣＯ２を電子受容体として用いることが可能であるという洞察から、有機分子、特に比較的低分子量の有機分子、特に１０００ｇ／ｍｏｌより小さい分子量の有機分子の生産のためのその他の生命工学的過程にとっても工業的に有益であることが期待される。以下の項目は、本発明の、電子受容体としての二酸化炭素の使用の好適な実施形態として、述べたものである。
【０１００】
１．非光栄養の真核微生物である、組み換え化学合成微生物での、電子受容体としての二酸化炭素の使用。
【０１０１】
２．組み換え化学合成微生物における二酸化炭素の電子受容体としての使用であって、前記微生物は嫌気的条件下で有機化合物を生産する。
【０１０２】
３．項目１．または２．に従う使用において、前記二酸化炭素が電子受容体として働く過程で、ＮＡＤＨが電子の供与体となる。
【０１０３】
５．これまでのいずれかの項目に従う使用において、前記微生物は、ＡＴＰおよび／またはＮＡＤＨを過剰生産する過程で有機化合物を生産する。
【０１０４】
６．これまでのいずれかの項目に従う使用において、前記微生物は、（天然の）自家栄養の生物由来のポリペプチドをコードする異種の核酸配列を備える。
【０１０５】
７．項目６．に従う使用において、前記微生物は、前記ポリペプチドのための第１の原核生物シャペロンをコードする異種の核酸配列と、好ましくは前記ポリペプチドのための、前記第１のものとは異なる、第２の原核生物シャペロンをコードする核酸配列を備える。
【０１０６】
８．項目７．に従う使用において、前記シャペロンはＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳである。
【０１０７】
９．これまでのいずれかの項目に従う使用において、前記微生物は、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、フェノール、ポリフェノール）、リボソームペプチド（riboomal peptides）、抗生物質（例えば、ペニシリン）、バイオディーゼル（bio-diesel）、アルキン、アルカン、イソプレノイド、エステル、カルボン酸（例えば、コハク酸、クエン酸、アジピン酸、乳酸）、アミノ酸、ポリケチド、脂質、および炭水化物からなる群から選択された有機化合物を生産する。
【０１０８】
１０．これまでのいずれかの項目に従う使用において、前記微生物は、炭酸脱水酵素、カルボキシラーゼ、オキシゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、イソメラーゼ、アルドラーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、ホスファターゼ、エピメラーゼ、キナーゼ、カルボキシキナーゼ、酸化還元酵素、アコニターゼ、フマラーゼ、レダクターゼ、ラクトナーゼ、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ、セドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼ、ホスホペントースイソメラーゼ、ホスホペントースエピメラーゼ、ホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リブロース５−リン酸イソメラーゼ、リブロース５−リン酸３−エピメラーゼ、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼ、乳酸脱水素酵素、リンゴ酸シンターゼ、イソクエン酸リアーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、グルコース−６−ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、イソクエン酸脱水素酵素、αケトグルタル酸脱水素酵素、スクシニルＣｏＡシンテターゼ、リンゴ酸脱水素酵素、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、キシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ、キシロースイソメラーゼ、イソプレノイドシンターゼ、キシロネートデヒドラターゼからなる群から選択されたポリペプチドを機能的に発現する異種の核酸配列を備える。
【０１０９】
１１．項目１０．に従う使用において、前記微生物は、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）を機能的に発現する異種の核酸配列および／またはホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）を機能的に発現する異種の核酸配列を備える。
【０１１０】
１２．これまでのいずれかの項目に従う使用において、前記微生物は、サッカロマイセス科、ペニシリウム属、ヤロウィア属、アスペルギルス属からなる群から選択される。
【０１１１】
１３．これまでのいずれかの項目に従う使用において、前記二酸化炭素は、グリセロールのような、ＮＡＤ＋依存的な副産物またはＮＡＤＨ依存的な副産物の生成を減少させるための電子受容体として、他のアルコールまたはカルボン酸のようなその他の有機化合物を調製する過程において用いられる。
【０１１２】
１４．組み換え微生物、特に、化学合成（非光栄養の）条件下において前記微生物に電子受容体として二酸化炭素を使用させ得る真核微生物であって、前記微生物は、好ましくは、これまでの項目で定義されたものである。
【０１１３】
１５．項目１４に従う微生物において、前記微生物は過剰なＡＴＰおよび／またはＮＡＤＨの生産を行う過程において有機化合物の生産のための酵素系を有する。
【０１１４】
関心のある有機化合物の生産は、関心のあるその有機化合物の生産に有用であることが知られている生物で行い得るが、前記生物は、二酸化炭素をその生物において電子受容体として使用することが可能なように遺伝的に改変されている。
【０１１５】
本発明は、様々な工業的に重要な有機化合物の生産に関して興味深いものと期待される。しかし、特に、本発明に従う方法又は使用は、アルコール、特にエタノール、ｎ−ブタノール、および２，３−ブタンジオールからなる群から選択されたアルコールの生産、または有機酸／カルボン酸塩、特にＬ−乳酸塩（L-lactate）、３−ヒドロキシプロピオン酸塩（3-hydroxypropionate）、Ｄ−リンゴ酸塩（D-malate）、Ｌ−リンゴ酸塩（L-malate）、コハク酸エステル塩（succinate）、クエン酸塩（citrate）、ピルビン酸塩（pyruvate）およびイタコン酸塩（itaconate）からなる群から選択されたカルボン酸塩（carboxylate）の生産に有利と考えられる。
【０１１６】
エタノールの生産については、本明細書で上述した、ＰＲＫおよびＲｕｂｉｓｃｏを含む酵母細胞の記載と、実施例とに詳細が示されている。エタノールとその他のアルコールは、好ましくは発酵過程により生産される。
【０１１７】
例えばクエン酸のような、いくつかの有機酸（カルボン酸塩）の生産には、好気的な工程が有用である。クエン酸の生産には、例えば、クロコウジカビ（Aspergillus niger）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）またはその他の公知のクエン酸を生産する生物を用いることができる。
【０１１８】
嫌気的に生産されることが好ましい有機酸の例は乳酸である。様々な乳酸を生産するバクテリアの株および乳酸を生産するように操作された酵母の株は一般的に当業者に公知である。
【実施例】
【０１１９】
例１．発現ベクトルの構築
Spinacia oleracea（ホウレンソウ）（ＥＭＢＬ登録番号：X07654.1）由来のホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）のｃＤＮＡをPhusion Hot-startポリメラーゼ（Finnzymes社, Landsmeer,オランダ）と、オリゴヌクレオチドXbaI_prk-FW2およびRV1_XhoI_prk（表５）とを用いてＰＣＲで増幅し、pCR(R)-Blunt II-TOPO(R)（Life Technologies Europe BV社, Bleiswijk, オランダ）に結合させた。
【０１２０】
【表５】
2016511639.tif 000016
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【０１２１】
XbaIおよびXhoIによる切断の後、ＰＲＫを含むフラグメントはpTEF424に結合させた。TEF1pはその後、プラスミドpSH45からのGAL1pに、XbaIおよびSacI切断／結合により置き換えられ、プラスミドpUDE046が作成された（表６参照）。
【０１２２】
【表６】
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【０１２３】
KpnI部位とSacI部位とに挟まれた、チオバチルス・デニトリフィカンス（T.denitrificans）からのＲｕｂｉｓｃｏフォームII遺伝子cbbMは、GeneArt（Life Technologies Europe BV社）でコドン最適化し合成され、pPCR-Scriptに結合され、そのプラスミドはBamHIとSacIとにより切断された。そのcbbMを含むフラグメントは、BamHIおよびSacIにより切断されたベクターpGPD_426に結合されプラスミドpBTWW002が作られた。そのcbbM発現カセットはpRS416にKpnIおよびSacIを用いて移転され、pUDC098が得られた。
【０１２４】
T.denitrificans由来の特定のＲｕｂｉｓｃｏフォームIIシャペロンの発現ベクトルcbbQ2およびcbbO2と、E.coli由来のgroELおよびgroESシャペロンとがコドン最適化された。発現カセットは、そのコドン最適化遺伝子を挟み、酵母の定常的プロモーターとターミネーターとを含んでいる。そのカセットは、サッカロマイセスゲノム欠失プロジェクト（Saccharomyces Genome Deletion Project）で用いられたランダムに組み合わせたバーコード配列により得られるユニークな６０ｂｐ領域とEcoRV部位（GeneArt）に挟まれている。発現カセットは、SfiIクローニング部位を用いてプラスミドpMK-RQ（GeneArt）挿入され、pUB230（PGI1dp-cbbQ2-TEF2t）、pUD231 (PGK1p-cbbO2-ADH1t), pUD232(TEF1p-groEL-ACT1t)、および pUDE233 (TPI1p-groES-PGI1t)（表６）が得られた。組み換えクローニングのためにその６０ｂｐ領域を取り込むため、発現カセットTDH3p-cbbM-CYC1t は、Phusion Hot-Start Polymerase (Finnzymes社)とプライマーHR-cbbM-FW-65およびHR-cbbM-RV-65とを用いてプラスミドpBTWW002からＰＣＲにより増幅された。
【０１２５】
例２．株の構築、単離および維持
用いたすべてのサッカロマイセス・セレビシエの株（表７）はＣＥＮ．ＰＫファミリーに属している。全ての株は２％ｗ／ｖグルコース合成培地で育成され、必要な場合には指数関数的段階を終えるまで150 mg L-1 ウラシルが補完され、その後無菌グリセロールがおよそ３０％ｖ／ｖまで加えられ、そして１ｍｌのアリコートで−８０℃に保存された。
【０１２６】
【表７】
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【０１２７】
インビボ（in vivo）での形質転換関連組み換え（transformation associated recombination）により、ＲｕｂｉｓｃｏフォームIIのccbMおよび４つのシャペロンcbbQ2, cbbO2, groELおよびgroESが共発現された株IMC014が構築された。２００fmolのそれぞれの発現カセットは、100fmolのKpnI/SacIで線状化されたpRS416主鎖とプールされ、最終的な体積は５０μｌとなってCEN.PK 113-5Dにおいて酢酸リチウム法により形質転換された（Gietz, et al., Yeast Transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG Method in Yeast Protocol, Humana press, 2006）。細胞は合成培地で選択された。pUDC075のフラグメントの正しいアセンブリは、形質転換細胞のコロニーに対して相同組み換えに用いられた領域（表５）の増幅を可能にするプライマーを用いたマルチプレックスＰＣＲと、単離したプラスミドをE.coli DH5αに再形質転換した後の制限酵素分析とにより実行された。PUDC075は次世代シークエンシング（Illumina社,San Diego, California,USA）により配列決定（100br ペアエンド・リード（reads paird-end） 50Mb）され、Velvet (Zerbino, et al., Velvet: Algorithms for De Novo Short Read Assembly Using De Bruijn Graphs, Genome Research, 2008)によりアセンブリされた。アセンブリされた配列は、いずれのアセンブルされた発現カセットにおいても変異を含まなかった。それぞれccbM/ccbQ2/ccbO2およびccbM/groEL/groESを発現するIMC034およびIMC035の株は、同じインビボのアセンブリ方法に以下の改変を施したものを用いて構築された。プラスミドpUDC099およびpUDC100を構築するため、１２０ｂｐのcbbO2-pRSリンカーおよびcbbM-GroELリンカーが、それぞれアセンブリを完了するために用いられ（表５）、それぞれの相補的な１２０ｂｐのオリゴヌクレオチド１００fmolが形質転換に加えられた。そのcbbM遺伝子を唯一発現するIMC033株はCEN.PK113-5DをpUDC098と形質転換することにより構築された。
【０１２８】
ＰＲＫ、ccbM、ccbQ2、ccbO2、GroEL、GroESを共発現するIMU033株を構築するため、中間体の株IMI229が、ＰＲＫ、４つのシャペロン、およびKlLEU2 (Guldener, et al., A second set of loxP marker cassettes for Cre-mediated multiple gene knockouts in budding yeast, Nucleic Acids Research, 2002)がCEN.PK102-3Aにおいて、CAN1 遺伝子座にインビボ相同組込みにより組み込まれ構築された。発現カセットは、Phusion Hot-Start Polymerase (Finnzymes社, Thermo Fisher Scientific Inc. Massachusetts, U.S.A.)と対応するオリゴヌクレオチドとＤＮＡテンプレート（表５）とを用いてＰＣＲ増幅された。最後に、IMI229株は、ＲｕｂｉｓｃｏフォームIIのccbMと２つのE.coliシャペロンgroELおよびgroESとを保持するpUDC100により形質転換された。
【０１２９】
IMI232株はCEN.PK102-3AをKlLEU2カセットで形質転換することで構築された。IMI232は最後にプラスミドp426GPDにより形質転換され、原栄養に戻り参考株IMU032が得られる。
【０１３０】
例３．ケモスタットおよびバッチ実験の実験準備
嫌気的なケモスタット培養は本質的に文献の通りに行われた（Basso, et al., Engineering topology and kinetics of sucrose metabolism in Saccharomyces cerevisiaefor improved ethanol yield, Metabolic Engineering 13:694-703, 2011）。ただし、炭素源としては12.5 g l-1グルコースおよび12.5 g l-1ガラクトースを用い、示された箇所では供給ガス（sparging gas）として純窒素を10% CO2/90% N2に置き換えた。急冷（rapid quenching）後に残存したグルコースおよびガラクトースの濃度が、グルコース（Boehringer社, Mannheim, ドイツ）およびＤ−ガラクトース（Megazyme社, Bray, アイルランド）の商業的な酵素アッセイにより導出された（Mashego, et al., Critical evaluation of sampling techniques for residual glucose determination in carbon-limited chemostat culture of Saccharomyces cerevisiae, Biotechnology and Bioengineering 83:395-399, 2003）。嫌気的なバイオリアクターバッチ培養は、本質的に文献に記載の通りに育成された（Guadalupe Medina, et al., Elimination of glycerol production in anaerobic cultures of a Saccharomyces cerevisiae strain engineered to use acetic acid as an electron acceptor. Applied and Environmental Microbiology76:190-195, 2010）。但し、20 g L-1ガラクトースと10% CO2および90% N2からなる供給ガスを用いた。バッチと、ケモスタットおよびバッチ培養との、バイオマスおよび代謝産物の濃度は、グラダループらの報告（Guadalupe Medina, et al., Elimination of glycerol production in anaerobic cultures of a Saccharomyces cerevisiae strain engineered to use acetic acid as an electron acceptor. Appl. Environ. Microbiol. 76, 190-195, 2010）に記載のように導出された。エタノールの流量および収量、エタノールの蒸発量の計算では、本研究のバイオリアクター内の構成における一次の蒸発速度定数0.008 h-1と、本研究で用いられた条件の下に修正された。
【０１３１】
例４．ホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）およびＲｕｂｉｓｃｏの酵素アッセイ
ホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）の活性の分析のための細胞抽出物が、以前の報告（Abbott, et al., Catalase Overexpression reduces lactic acid-induced oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae, Applied and Environmental Microbiology 75:2320-2325, 2009）と同様に調製された。ＰＲＫの活性は、共役分光学的定量法（coupled spectrophotometric assay）により３０℃で測定された（MacElroy, et al., Properties of Phosphoribulokinase from Thiobacillus neapolitanus, Journal of Bacteriology 112:532-538, 1972）。反応速度は、加えられた細胞抽出物の量に比例した。タンパク質の濃度は、ウシ血清アルブミンを基準としてローリー法（Lowry, et al., Protein measurement with the Folin phenol reagent, The Journal of Biological Chemistry193:265-275, 1951）により導出された。
【０１３２】
Ｒｕｂｉｓｃｏの活性の分析のための細胞抽出物が、Abbott, et al., Catalase Overexpression reduces lactic acid-induced oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae, Appl Environ. Microbiol. 75:2320-2325, 2009に、２点の変更点を加えて同様に調製された。２点の変更点とは、20 mMのMgCl2・6H2O、5 mMのDTT、5 mMのNaHCO3を含んだTris-HCl (1 mM, pH 8.2) を超音波処理バッファとして用いた点と、Tris-HCl (100 mM, pH 8.2)、 20 mMのMgCl2・6H2Oと5 mMのDTTを凍結バッファとして用いた点である。Ｒｕｂｉｓｃｏの活性は、文献に記載（Beudeker, et al., Relations between d-ribulose-1,5-biphosphate carboxylase, carboxysomes and CO2 fixing capacity in the obligate chemolithotroph Thiobacillus neapolitanus grown under different limitations in the chemostat, Archives of Microbiology 124:185-189, 1980）のように、１４ＣＯ２の固定の測定（PerkinElmer社, Groningen, オランダ）および、Ultima GoldTM シンチレーションカクテル（scintillation cocktail）（PerkinElmer社, Groningen, オランダ）を用いて、放射能のカウントを、TRI-CARB(R) 2700TR Series 液体シンチレーションカウンタ（liquid scintillation counter）（PerkinElmer社, Groningen, オランダ）で測定することにより導出された。タンパク質の濃度は、50 mM Tris-HCl (pH 8.2)にウシ血清アルブミン溶解させた標準溶液を基準としてローリー法（Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., & Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265-275, 1951）により導出された。
【０１３３】
例５．細胞抽出物の、Ｒｕｂｉｓｃｏの活性と、ＰＲＫの活性
S. cerevisiaeにおけるＲｕｂｉｓｃｏの異種シャペロンの必要性を研究するため、フォームIIのＲｕｂｉｓｃｏをコードするT. denitrificansからのcbbM遺伝子をコドン最適化して動原体ベクター（centromeric vector）から発現させた。発現は、該ベクター単独および、コドン最適化されたE.coli groEL/groESおよび／またはT. denitrificansの cbbO2/cbbQ2遺伝子の発現カセットと組み合わせて行われた。酵母の細胞抽出物による、リブロース−１，５−ビスリン酸依存的ＣＯ２固定の分析から、E. coli GroEL/GroESの共発現の際、T. denitrificansのＲｕｂｉｓｃｏの酵母での機能的発現が示された。Ｒｕｂｉｓｃｏの活性は0.2 nmol.min-1.(mg protein)-1未満から6 nmol.min-1.(mg protein)-1を超える値へと増加した。これらの実験の結果は図１に可視化した。図１には、単独で、（IMC033）または、E.coliシャペロンGroEL/GroES（IMC035）、T. denitrificansシャペロンCbbO2/CbbQ2[20](IMC034)若しくは４つ全てのシャペロン（IMC014）と組み合わせてT. denitrificansのＲｕｂｉｓｃｏフォームIICbbMを発現させた際のS. cerevisiaeの細胞抽出物におけるリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）の活性を示している。異種発現された遺伝子は、酵母での発現のためコドン最適化され、単一の動原体ベクターから発現された。バイオマスの試料は、窒素を供給され20 g l-1のグルコースを含む合成培地上の嫌気的なバッチ培養（pH5.0, 30℃）から採取された。野生型参考株と、cbbM、およびcbbM-cbbQ2-cbbO2を発現するＳ．セレビシエ株において、細胞抽出物の14CO2固定として測定されたＲｕｂｉｓｃｏの活性は、その酵素アッセイの検出限界を下回る値であった(0.2 nmol CO2 min-1 mg protin-1)。
【０１３４】
CbbO2/cbbQ2の共発現は、Ｒｕｂｉｓｃｏの活性の、顕著な、さらなる増加という結果にはならなかった。GroEL/GroESによる、S.cerevisiaeでのＲｕｂｉｓｃｏの発現へのポジティブな効果は、このアプローチの代謝工学への可能性を表している。特に、真核生物の細胞質において原核生物の酵素を発現させる必要がある際に有用である。
【０１３５】
ガラクトース誘導性GAL1プロモーターの制御下で、Spinach oleraceaのＰＲＫ遺伝子が、E.coliのgroEL/groESと、T.denitrificansのcbbO2/cbbQ2と共にS.cerevisiaeのゲノムのCAN1遺伝子座に組み込まれた。これは、T. denitrificansのＲｕｂｉｓｃｏの動原体発現カセットをさらに保持する、S.cerevisiaeのIMU033株の細胞抽出物において高いＰＲＫ活性を引き起こした。この遺伝子操作された酵母の株が、ＲｕｂｉｓｃｏおよびＰＲＫの発現の生理学的影響を定量的に分析するために用いられた。
【０１３６】
【表８】
2016511639.tif 000022
【０１３７】
表８は、ホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）およびＲｕｂｉｓｃｏを発現しているS.cerevisiaeの株でのエタノールの対糖収率の増加を示す。ＰＲＫおよびＲｕｂｉｓｃｏを発現しているS.cerevisiaeのIMU033と、同系（isogenic）の参考株IMU032との生理学的分析が、嫌気的なケモスタット培養で希釈率が0.05 h-1で、12.5 g l-1のグルコースと12.5 g l-1のガラクトースを炭素源として追加された合成培地（ｐＨ５）を用いて行われた。ＣＯ２濃度の影響を評価するため、ケモスタット培養は、純窒素ガスまたは１０％ＣＯ２および９０％窒素の混合気を注入して行われた。
【０１３８】
結果は、独立に繰り返された重複ケモスタット実験のデータの、平均±平均偏差で表される。データのペアは同一の添字（a,a, b,b,等）でラベルされ、標準ｔ検定(p<0.02)をもって統計的に有意の差があるとした。
【０１３９】
ＣＯ２が供給された、炭素制限ケモスタット培養において、ＰＲＫの共発現なしでＲｕｂｉｓｃｏと４つのシャペロンとを発現した場合（IMC014株）には、グリセロールの収量(0.13 mol mol-1)は、参考株IMU032 (0.12 mol mol-1)と比較して、減少しなかった。従って、グリセロールの生産を減少させるためには、ホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）遺伝子がS.cerevisiaeの機能的経路に必要であるということが示唆された。ガラクトースで生育された（galactoce-grown）S.cerevisiaeの嫌気的バッチ培養での、成長、基質消費、および生産物形成に対する、ＰＲＫおよびＲｕｂｉｓｃｏの発現の生理学的影響も調べられ、同系の参考株と比較された。生育条件は、T = 30 °C、 pH 5.0で、注入ガスに10% CO2 を含むものであった。２つの重複した実験が独立して行われ、その生育動態パラメータ（growth kinetic parameter）の差は５％未満であった。ＰＲＫおよびＲｕｂｉｓｃｏが機能的に発現された酵母細胞では、これらの酵素を欠く酵母細胞と比較し、エタノールの対ガラクトース収率は８％高く、グリセロールの生産は６０％減少した。この差は統計的に有意である（標準t検定(p値<0.02)）。遺伝子操作された株IMU033（表７）の細胞抽出物におけるホスホリブロキナーゼおよびＲｕｂｓｃｏの活性により、CO2を電子受容体として使用することが可能にになっている。参考株IMU032（表８）に対する株IMU033のエタノール収量およびグリセロール収量から、嫌気的発酵における、エタノール生産の増加が可能であることが示されている。
【０１４０】
配列
配列ＩＤ番号１（SEQUENCE ID NO 1）:
ＲｕｂｉｓｃｏのcbbM遺伝子（Rubisco cbbM gene）（Thiobacillus denitrificans 由来のcbbM遺伝子に基づいて合成- pBTWW002、コドン最適化 由来（Source）: Hernandez et al 1996, GenBank ID: L37437.2)
ATGGATCAATCTGCAAGATATGCTGACTTGTCTTTAAAGGAAGAAGATTTGATTAAAGGTGGTAGACATATTTTGGTTGCTTACAAAATGAAACCAAAATCTGGTTATGGTTATTTGGAAGCTGCTGCTCATTTTGCTGCTGAATCTTCTACAGGTACAAATGTTGAAGTTTCTACTACAGATGATTTTACAAAAGGTGTTGATGCTTTAGTTTACTACATCGATGAAGCTTCAGAAGATATGAGAATTGCTTATCCATTGGAATTATTCGACAGAAATGTTACTGACGGAAGATTCATGTTAGTTTCTTTTTTGACTTTGGCTATTGGTAACAATCAAGGAATGGGAGATATAGAACATGCAAAAATGATAGATTTTTACGTTCCAGAAAGATGTATTCAAATGTTTGATGGTCCAGCTACAGATATTTCTAATTTGTGGAGAATTTTGGGTAGACCAGTAGTTAATGGTGGTTATATTGCTGGTACTATTATTAAGCCAAAATTGGGTTTAAGACCAGAACCATTTGCTAAAGCTGCTTATCAATTTTGGTTGGGTGGAGATTTTATCAAGAATGACGAACCACAAGGTAATCAAGTTTTTTGTCCATTGAAAAAAGTTTTGCCATTGGTTTACGATGCTATGAAAAGAGCACAAGATGATACTGGTCAAGCAAAATTGTTTTCTATGAATATTACTGCAGACGATCATTATGAAATGTGTGCAAGAGCTGATTATGCTTTGGAAGTTTTCGGTCCAGATGCAGATAAATTGGCTTTTTTGGTAGATGGTTACGTTGGAGGTCCAGGAATGGTTACTACTGCTAGAAGGCAATATCCTGGTCAATATTTGCATTATCATAGAGCAGGTCACGGTGCTGTTACTTCTCCATCTGCTAAAAGAGGTTATACTGCTTTTGTTTTGGCTAAAATGTCTAGATTGCAAGGCGCTTCAGGTATTCATGTTGGTACTATGGGTTATGGAAAAATGGAAGGAGAAGGCGACGATAAGATTATTGCTTATATGATAGAAAGGGACGAATGTCAAGGTCCAGTTTATTTTCAAAAATGGTACGGTATGAAACCAACTACTCCAATTATCTCCGGAGGAATGAATGCTTTGAGATTGCCTGGTTTTTTCGAAAATTTGGGTCATGGTAACGTTATTAATACTGCAGGTGGTGGTTCTTACGGTCATATTGATTCTCCTGCTGCTGGTGCTATTTCTTTGAGACAATCTTACGAATGTTGGAAACAAGGTGCAGATCCAATTGAATTTGCTAAGGAACATAAGGAATTTGCAAGAGCTTTTGAATCTTTTCCAAAAGATGCTGATAAGTTATTTCCAGGATGGAGAGAAAAATTGGGAGTTCATTCTTAA
【０１４１】
配列ＩＤ番号２（SEQUENCE ID NO 2）:
Thiobacillus denitrificans由来のcbbM遺伝子の翻訳されたタンパク質配列
MDQSARYADLSLKEEDLIKGGRHILVAYKMKPKSGYGYLEAAAHFAAESSTGTNVEVSTTDDFTKGVDALVYYIDEASEDMRIAYPLELFDRNVTDGRFMLVSFLTLAIGNNQGMGDIEHAKMIDFYVPERCIQMFDGPATDISNLWRILGRPVVNGGYIAGTIIKPKLGLRPEPFAKAAYQFWLGGDFIKNDEPQGNQVFCPLKKVLPLVYDAMKRAQDDTGQAKLFSMNITADDHYEMCARADYALEVFGPDADKLAFLVDGYVGGPGMVTTARRQYPGQYLHYHRAGHGAVTSPSAKRGYTAFVLAKMSRLQGASGIHVGTMGYGKMEGEGDDKIIAYMIERDECQGPVYFQKWYGMKPTTPIISGGMNALRLPGFFENLGHGNVINTAGGGSYGHIDSPAAGAISLRQSYECWKQGADPIEFAKEHKEFARAFESFPKDADKLFPGWREKLGVHS
【０１４２】
配列ＩＤ番号３（SEQUENCE ID NO 3）:
Spinacea oleracea  由来のprk遺伝子- pBTWW001、リストリクションとライゲーションによりプラスミドを構築。由来: Milanez and Mural 1988, GenBank ID: M21338.1 
ATGTCACAACAACAAACAATTGTGATTGGTTTAGCAGCAGATTCAGGTTGTGGTAAGAGTACATTCATGAGGAGGTTAACAAGTGTTTTCGGTGGCGCGGCCGAGCCACCAAAGGGTGGTAACCCAGATTCAAACACATTGATTAGTGACACTACTACTGTTATCTGTTTGGATGATTTTCATTCCCTTGATAGAAATGGCAGGAAAGTGGAAAAAGTTACTGCTTTAGACCCAAAAGCTAATGATTTTGATCTTATGTATGAACAAGTTAAGGCTTTGAAAGAAGGTAAAGCTGTTGATAAACCTATTTATAATCATGTTTCTGGTTTGTTGGACCCTCCTGAGCTTATTCAACCTCCTAAGATCTTGGTCATTGAAGGGTTACACCCCATGTATGACGCACGTGTGAGGGAATTGCTAGACTTCAGCATCTACTTGGACATTAGCAATGAAGTTAAATTTGCCTGGAAAATTCAGAGAGACATGAAAGAAAGAGGACACAGTCTTGAAAGCATCAAAGCCAGTATTGAATCCAGAAAGCCAGATTTTGATGCTTACATTGACCCACAAAAGCAGCATGCTGATGTAGTGATTGAAGTATTGCCAACTGAACTCATTCCTGATGATGATGAAGGCAAAGTGTTGAGAGTAAGGATGATTCAGAAAGAAGGAGTCAAGTTTTTCAACCCAGTTTACTTGTTTGATGAAGGATCTACCATTTCATGGATTCCATGTGGTAGAAAATTAACATGTTCTTACCCTGGTATCAAATTTTCCTATGGCCCAGACACCTTCTATGGCAACGAGGTGACAGTAGTAGAGATGGATGGGATGTTTGACAGATTAGACGAACTAATCTACGTCGAAAGCCATTTGAGCAATCTATCAACCAAGTTTTATGGTGAAGTCACTCAACAAATGTTGAAGCACCAAAATTTCCCAGGAAGCAACAATGGAACTGGTTTCTTCCAAACCATAATTGGATTGAAGATCAGAGACTTGTTCGAGCAGCTCGTTGCTAGCAGGTCTACAGCAACTGCAACAGCTGCTAAAGCCTAG
【０１４３】
配列ＩＤ番号４（SEQUENCE ID NO 4）:
Spinacea oleracea由来のprk遺伝子の翻訳されたタンパク質配列
MSQQQTIVIGLAADSGCGKSTFMRRLTSVFGGAAEPPKGGNPDSNTLISDTTTVICLDDFHSLDRNGRKVEKVTALDPKANDFDLMYEQVKALKEGKAVDKPIYNHVSGLLDPPELIQPPKILVIEGLHPMYDARVRELLDFSIYLDISNEVKFAWKIQRDMKERGHSLESIKASIESRKPDFDAYIDPQKQHADVVIEVLPTELIPDDDEGKVLRVRMIQKEGVKFFNPVYLFDEGSTISWIPCGRKLTCSYPGIKFSYGPDTFYGNEVTVVEMDGMFDRLDELIYVESHLSNLSTKFYGEVTQQMLKHQNFPGSNNGTGFFQTIIGLKIRDLFEQLVASRSTATATAAKA
【０１４４】
配列ＩＤ番号５（SEQUENCE ID NO 5）:
cbbQ2 遺伝子 (Thiobacillus denitrificans 由来のcbbQ2遺伝子に基づいて合成-コドン最適化、オリジナルの配列はBeller et al 2006から入手, GenBank Gene ID: 3672366, Protein ID: AAZ98590.1)。
ATGACTACTAACAAGGAACAATACAAGGTTCACCAAGAACCATACTACCAAGCTCAAGGTAGAGAAGTTCAATTGTACGAAGCTGCTTACAGAAACAGATTGCCAGTTATGGTTAAGGGTCCAACTGGTTGTGGTAAGTCTAGATTCGTTGAATACATGGCTTGGAAGTTGAACAAGCCATTGATCACTGTTGCTTGTAACGAAGACATGACTGCTTCTGACTTGGTTGGTAGATACTTGTTGGAAGCTAACGGTACTAGATGGTTGGACGGTCCATTGACTACTGCTGCTAGAATCGGTGCTATCTGTTACTTGGACGAAGTTGTTGAAGCTAGACAAGACACTACTGTTGTTATCCACCCATTGACTGACCACAGAAGAACTTTGCCATTGGACAAGAAGGGTGAATTGATCGAAGCTCACCCAGACTTCCAATTGGTTATCTCTTACAACCCAGGTTACCAATCTTTGATGAAGGACTTGAAGCAATCTACTAAGCAAAGATTCGCTGCTTTCGACTTCGACTACCCAGACGCTGCTTTGGAAACTACTATCTTGGCTAGAGAAACTGGTTTGGACGAAACTACTGCTGGTAGATTGGTTAAGATCGGTGGTGTTGCTAGAAACTTGAAGGGTCACGGTTTGGACGAAGGTATCTCTACTAGATTGTTGGTTTACGCTGCTACTTTGATGAAGGACGGTGTTGACGCTGGTGACGCTTGTAGAATGGCTTTGGTTAGACCAATCACTGACGACGCTGACATCAGAGAAACTTTGGACCACGCTATCGACGCTACTTTCGCTTAA
【０１４５】
配列ＩＤ番号６（SEQUENCE ID NO 6）:
Thiobacillus denitrificans由来のcbbQ2遺伝子の翻訳されたタンパク質配列。
MTTNKEQYKVHQEPYYQAQGREVQLYEAAYRNRLPVMVKGPTGCGKSRFVEYMAWKLNKPLITVACNEDMTASDLVGRYLLEANGTRWLDGPLTTAARIGAICYLDEVVEARQDTTVVIHPLTDHRRTLPLDKKGELIEAHPDFQLVISYNPGYQSLMKDLKQSTKQRFAAFDFDYPDAALETTILARETGLDETTAGRLVKIGGVARNLKGHGLDEGISTRLLVYAATLMKDGVDAGDACRMALVRPITDDADIRETLDHAIDATFA
【０１４６】
配列ＩＤ番号７（SEQUENCE ID NO 7）:
cbbO2遺伝子(Thiobacillus denitrificans 由来のcbbO2遺伝子に基づいて合成-コドン最適化、オリジナル配列は、Beller et al 2006から入手, GenBank Gene ID: 3672365, Protein ID: YP_316394.1。
ATGGCTGCTTACTGGAAGGCTTTGGACACTAGATTCGCTCAAGTTGAAGAAGTTTTCGACGACTGTATGGCTGAAGCTTTGACTGTTTTGTCTGCTGAAGGTGTTGCTGCTTACTTGGAAGCTGGTAGAGTTATCGGTAAGTTGGGTAGAGGTGTTGAACCAATGTTGGCTTTCTTGGAAGAATGGCCATCTACTGCTCAAGCTGTTGGTGAAGCTGCTTTGCCAATGGTTATGGCTTTGATCCAAAGAATGCAAAAGTCTCCAAACGGTAAGGCTATCGCTCCATTCTTGCAAACTTTGGCTCCAGTTGCTAGAAGATTGCAATCTGCTGAACAATTGCAACACTACGTTGACGTTACTTTGGACTTCATGACTAGAACTACTGGTTCTATCCACGGTCACCACACTACTTTCCCATCTCCAGGTTTGCCAGAATTCTTCGCTCAAGCTCCAAACTTGTTGAACCAATTGACTTTGGCTGGTTTGAGAAACTGGGTTGAATACGGTATCAGAAACTACGGTACTCACCCAGAAAGACAACAAGACTACTTCTCTTTGCAATCTGCTGACGCTAGAGCTGTTTTGCAAAGAGAAAGACACGGTACTTTGTTGGTTGACGTTGAAAGAAAGTTGGACTTGTACTTGAGAGGTTTGTGGCAAGACCACGACCACTTGGTTCCATACTCTACTGCTTTCGACGAAATCAGAAAGCCAGTTCCATACTACGACAAGTTGGGTATGAGATTGCCAGACGTTTACGACGACTTGGTTTTGCCATGTCCAGCTGGTAGAGGTGGTGCTGGTGGTGAAGACGTTTTGGTTTCTGGTTTGGACAGATACAGAGCTACTTTGGCTCACATGGTTGGTCACAGAAGATGGTCTGAAGCTCAAATCGCTGACAACTGGTCTCCATTCCAAAGAATGGCTGTTGAATTCTTCGAAGACTGTAGAGTTGAAACTTTGTTGATGAGAGAATACCCAGGTTTGGCTAGAATCTTCAGAGCTTTGCACCCAAAGCCAGTTGAAGCTGCTTGTGACGGTGAAACTACTTCTTGTTTGAGACACAGATTGGCTATGTTGTCTAGAGCTTTCATCGACCCAGACCACGGTTACGCTGCTCCAGTTTTGAACGACTTCGTTGCTAGATTCCACGCTAGATTGGCTGACGGTACTTCTTCTACTTCTGAAATGGCTGACTTGGCTTTGTCTTACGTTGCTAAGACTAGAAGACCATCTGACCAATTCGCTAAGGTTCACTTCGACGACACTGTTGTTGACTACAGAGACGACAACAGACAATTGTGGAAGTTCATCGAAGAAGGTGACGAAGAAGAAGCTTTCGACGCTAAGAGAAAGATCGAACCAGGTGAAGAAATCCAAGGTTTGCCACCAAGACACTACCCAGAATGGGACTACACTTCTCAAACTTACAGACCAGACTGGGTTTCTGTTTACGAAGGTTTGCACAGATCTGGTAACGCTGGTGACATCGACAGATTGTTGGCTAAGCACGCTGCTTTGGCTAAGAGATTGAAGAAGATGTTGGACTTGTTGAAGCCACAAGACAAGGTTAGAGTTAGATACCAAGAAGAAGGTTCTGAATTGGACTTGGACGTTGCTATCAGATCTTTGATCGACTTCAAGGGTGGTGCTACTCCAGACCCAAGAATCAACATGTCTCACAGATCTGACGGTAGAGACATCGCTGTTATGTTGTTGTTGGACTTGTCTGAATCTTTGAACGAAAAGGCTGCTGGTGCTGGTCAAACTATCTTGGAATTGTCTCAAGAAGCTGTTTCTTTGTTGGCTTGGTCTATCGAAAAGTTGGGTGACCCATTCGCTATCGCTGGTTTCCACTCTAACACTAGACACGACGTTAGATACTTCCACATCAAGGGTTACTCTGAAAGATGGAACGACGACGTTAAGGCTAGATTGGCTGCTATGGAAGCTGGTTACTCTACTAGAATGGGTGCTGCTATGAGACACGCTGCTCACTACTTGTCTGCTAGACCAGCTGACAAGAAGTTGATGTTGATCTTGACTGACGGTAGACCATCTGACGTTGACGCTGCTGACGAAAGATTGTTGGTTGAAGACGCTAGACAAGCTGTTAAGGAATTGGACAGACAAGGTATCTTCGCTTACTGTATCTCTTTGGACGCTCAATTGAAGGCTGGTGCTGACGACTACGTTGCTGAAATCTTCGGTAGACAATACACTGTTATCGACAGAGTTGAAAGATTGCCAGAAAGATTGCCAGAATTGTTCATGGCTTTGACTAAGTAA
【０１４７】
配列ＩＤ番号８（SEQUENCE ID NO: 8）
Thiobacillus denitrificans由来のcbbO2遺伝子の翻訳されたタンパク質配列。
MAAYWKALDTRFAQVEEVFDDCMAEALTVLSAEGVAAYLEAGRVIGKLGRGVEPMLAFLEEWPSTAQAVGEAALPMVMALIQRMQKSPNGKAIAPFLQTLAPVARRLQSAEQLQHYVDVTLDFMTRTTGSIHGHHTTFPSPGLPEFFAQAPNLLNQLTLAGLRNWVEYGIRNYGTHPERQQDYFSLQSADARAVLQRERHGTLLVDVERKLDLYLRGLWQDHDHLVPYSTAFDEIRKPVPYYDKLGMRLPDVYDDLVLPCPAGRGGAGGEDVLVSGLDRYRATLAHMVGHRRWSEAQIADNWSPFQRMAVEFFEDCRVETLLMREYPGLARIFRALHPKPVEAACDGETTSCLRHRLAMLSRAFIDPDHGYAAPVLNDFVARFHARLADGTSSTSEMADLALSYVAKTRRPSDQFAKVHFDDTVVDYRDDNRQLWKFIEEGDEEEAFDAKRKIEPGEEIQGLPPRHYPEWDYTSQTYRPDWVSVYEGLHRSGNAGDIDRLLAKHAALAKRLKKMLDLLKPQDKVRVRYQEEGSELDLDVAIRSLIDFKGGATPDPRINMSHRSDGRDIAVMLLLDLSESLNEKAAGAGQTILELSQEAVSLLAWSIEKLGDPFAIAGFHSNTRHDVRYFHIKGYSERWNDDVKARLAAMEAGYSTRMGAAMRHAAHYLSARPADKKLMLILTDGRPSDVDAADERLLVEDARQAVKELDRQGIFAYCISLDAQLKAGADDYVAEIFGRQYTVIDRVERLPERLPELFMALTK
【０１４８】
配列ＩＤ番号９（SEQUENCE ID NO: 9）
GroEL 遺伝子 (E. coli由来のGroEL に基づき合成-コドン最適化、オリジナルの配列はDurfee et al 2008から入手, Gene ID: 6061450, Protein ID: YP_001732912.1。
ATGGCTGCTAAGGACGTTAAGTTCGGTAACGACGCTAGAGTTAAGATGTTGAGAGGTGTTAACGTTTTGGCTGACGCTGTTAAGGTTACTTTGGGTCCAAAGGGTAGAAACGTTGTTTTGGACAAGTCTTTCGGTGCTCCAACTATCACTAAGGACGGTGTTTCTGTTGCTAGAGAAATCGAATTGGAAGACAAGTTCGAAAACATGGGTGCTCAAATGGTTAAGGAAGTTGCTTCTAAGGCTAACGACGCTGCTGGTGACGGTACTACTACTGCTACTGTTTTGGCTCAAGCTATCATCACTGAAGGTTTGAAGGCTGTTGCTGCTGGTATGAACCCAATGGACTTGAAGAGAGGTATCGACAAGGCTGTTACTGCTGCTGTTGAAGAATTGAAGGCTTTGTCTGTTCCATGTTCTGACTCTAAGGCTATCGCTCAAGTTGGTACTATCTCTGCTAACTCTGACGAAACTGTTGGTAAGTTGATCGCTGAAGCTATGGACAAGGTTGGTAAGGAAGGTGTTATCACTGTTGAAGACGGTACTGGTTTGCAAGACGAATTGGACGTTGTTGAAGGTATGCAATTCGACAGAGGTTACTTGTCTCCATACTTCATCAACAAGCCAGAAACTGGTGCTGTTGAATTGGAATCTCCATTCATCTTGTTGGCTGACAAGAAGATCTCTAACATCAGAGAAATGTTGCCAGTTTTGGAAGCTGTTGCTAAGGCTGGTAAGCCATTGTTGATCATCGCTGAAGACGTTGAAGGTGAAGCTTTGGCTACTTTGGTTGTTAACACTATGAGAGGTATCGTTAAGGTTGCTGCTGTTAAGGCTCCAGGTTTCGGTGACAGAAGAAAGGCTATGTTGCAAGACATCGCTACTTTGACTGGTGGTACTGTTATCTCTGAAGAAATCGGTATGGAATTGGAAAAGGCTACTTTGGAAGACTTGGGTCAAGCTAAGAGAGTTGTTATCAACAAGGACACTACTACTATCATCGACGGTGTTGGTGAAGAAGCTGCTATCCAAGGTAGAGTTGCTCAAATCAGACAACAAATCGAAGAAGCTACTTCTGACTACGACAGAGAAAAGTTGCAAGAAAGAGTTGCTAAGTTGGCTGGTGGTGTTGCTGTTATCAAGGTTGGTGCTGCTACTGAAGTTGAAATGAAGGAAAAGAAGGCTAGAGTTGAAGACGCTTTGCACGCTACTAGAGCTGCTGTTGAAGAAGGTGTTGTTGCTGGTGGTGGTGTTGCTTTGATCAGAGTTGCTTCTAAGTTGGCTGACTTGAGAGGTCAAAACGAAGACCAAAACGTTGGTATCAAGGTTGCTTTGAGAGCTATGGAAGCTCCATTGAGACAAATCGTTTTGAACTGTGGTGAAGAACCATCTGTTGTTGCTAACACTGTTAAGGGTGGTGACGGTAACTACGGTTACAACGCTGCTACTGAAGAATACGGTAACATGATCGACATGGGTATCTTGGACCCAACTAAGGTTACTAGATCTGCTTTGCAATACGCTGCTTCTGTTGCTGGTTTGATGATCACTACTGAATGTATGGTTACTGACTTGCCAAAGAACGACGCTGCTGACTTGGGTGCTGCTGGTGGTATGGGTGGTATGGGTGGTATGGGTGGTATGATGTAA
【０１４９】
配列ＩＤ番号１０（SEQUENCE ID NO: 10）
E. coli由来のGroEL遺伝子の翻訳されたタンパク質配列。
MAAKDVKFGNDARVKMLRGVNVLADAVKVTLGPKGRNVVLDKSFGAPTITKDGVSVAREIELEDKFENMGAQMVKEVASKANDAAGDGTTTATVLAQAIITEGLKAVAAGMNPMDLKRGIDKAVTAAVEELKALSVPCSDSKAIAQVGTISANSDETVGKLIAEAMDKVGKEGVITVEDGTGLQDELDVVEGMQFDRGYLSPYFINKPETGAVELESPFILLADKKISNIREMLPVLEAVAKAGKPLLIIAEDVEGEALATLVVNTMRGIVKVAAVKAPGFGDRRKAMLQDIATLTGGTVISEEIGMELEKATLEDLGQAKRVVINKDTTTIIDGVGEEAAIQGRVAQIRQQIEEATSDYDREKLQERVAKLAGGVAVIKVGAATEVEMKEKKARVEDALHATRAAVEEGVVAGGGVALIRVASKLADLRGQNEDQNVGIKVALRAMEAPLRQIVLNCGEEPSVVANTVKGGDGNYGYNAATEEYGNMIDMGILDPTKVTRSALQYAASVAGLMITTECMVTDLPKNDAADLGAAGGMGGMGGMGGMM
【０１５０】
配列ＩＤ番号１１（SEQUENCE ID NO: 11）
GroES 遺伝子(E. coli 由来の合成GroES E. coli - コドン最適化、オリジナル配列は、Durfee et al 2008から入手, Gene ID: 6061370, Protein ID: YP_001732911.1)。
ATGAACATCAGACCATTGCACGACAGAGTTATCGTTAAGAGAAAGGAAGTTGAAACTAAGTCTGCTGGTGGTATCGTTTTGACTGGTTCTGCTGCTGCTAAGTCTACTAGAGGTGAAGTTTTGGCTGTTGGTAACGGTAGAATCTTGGAAAACGGTGAAGTTAAGCCATTGGACGTTAAGGTTGGTGACATCGTTATCTTCAACGACGGTTACGGTGTTAAGTCTGAAAAGATCGACAACGAAGAAGTTTTGATCATGTCTGAATCTGACATCTTGGCTATCGTTGAAGCTTAA
【０１５１】
配列ＩＤ番号１２（SEQUENCE ID NO: 12）
E. coli由来のGroES遺伝子の翻訳されたタンパク質配列。
MNIRPLHDRVIVKRKEVETKSAGGIVLTGSAAAKSTRGEVLAVGNGRILENGEVKPLDVKVGDIVIFNDGYGVKSEKIDNEEVLIMSESDILAIVEA
【図１】
2016511639.tif 000023
【国際調査報告】
2016511639.tif 000024
2016511639.tif 000025
2016511639.tif 000026
2016511639.tif 000027
2016511639.tif 000028