(57)【要約】  本発明は一般に、ペグ化アプタマーなど、コンジュゲートオリゴヌクレオチドの医薬製剤に関するほか、これらを調製し使用する方法にも関する。医薬製剤は、様々な保管条件下で、所望の保存寿命の特徴を有する。約２から約３０℃における保存寿命が少なくとも約２４カ月間または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートの製剤ならびにそれらを調製および使用するための方法が提供される。特定の実施形態では、製剤は、ｐＨが約７以下であり、メチオニンを含有する。場合によって、製造工程時の低溶存酸素含量は、所望の保存寿命の特徴を改善するのに使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペグ化アプタマーおよび少なくとも１つの抗酸化剤を含む医薬製剤であって、ｐＨが約７以下であり、雰囲気レベルまたは低減レベルの溶存酸素を有し、保存寿命が少なくとも約２４カ月間または少なくとも約３６カ月間である医薬製剤。
【請求項２】
雰囲気レベルの溶存酸素を有する、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項３】
溶存酸素レベルが、約５から約１０ｐｐｍである、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項４】
低減レベルの溶存酸素を有する、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項５】
溶存酸素レベルが、約５ｐｐｍ未満である、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項６】
ペグ化アプタマーの濃度が、約１から約１００ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項７】
ペグ化アプタマーの濃度が、約２０から約３０ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項８】
ペグ化アプタマーの濃度が、約２４ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項９】
メチオニンが、約０．００１から約０．５０％ｗ／ｗ、約０．１０から約０．２５または約０．１０％ｗ／ｗで存在する、請求項１および６から８に記載の医薬製剤。
【請求項１０】
メチオニンが、約０．１０％ｗ／ｗで存在する、請求項９に記載の医薬製剤。
【請求項１１】
ペグ化アプタマーが、ペグニバコギンである、請求項１から１０に記載の医薬製剤。
【請求項１２】
ペグ化アプタマーが、ＲＢ５７１である、請求項１および６に記載の医薬製剤。
【請求項１３】
保存寿命が、約２℃から約８℃において決定される、請求項１から１２に記載の医薬製剤。
【請求項１４】
保存寿命が、約２５℃から約３０℃において決定される、請求項１から１２に記載の医薬製剤。
【請求項１５】
約２４ｍｇ／ｍＬのペグニバコギンおよび約０．１％のメチオニンを含む医薬製剤であって、ｐＨが約６．８であり、雰囲気レベルまたは低減レベルの溶存酸素を有し、保存寿命が少なくとも約２４カ月間または少なくとも約３６カ月間である、医薬製剤。
【請求項１６】
溶存酸素レベルが、雰囲気レベルである、請求項１５に記載の医薬製剤。
【請求項１７】
溶存酸素レベルが、約５から約１０ｐｐｍの間である、請求項１５に記載の医薬製剤。
【請求項１８】
溶存酸素レベルが、約５ｐｐｍ未満である、請求項１５に記載の医薬製剤。
【請求項１９】
保存寿命が、約２から約８℃において決定される、請求項１５から１８に記載の医薬製剤。
【請求項２０】
保存寿命が、約２５から約３０℃において決定される、請求項１５から１８に記載の医薬製剤。
【請求項２１】
医薬製剤を調製する方法であって、
（ｉ）メチオニンを含む水性溶媒を供給するステップ；（ｂ）ペグ化アプタマーを水性溶媒へと添加して、水性製剤を形成するステップ；（ｃ）水性製剤を濾過して、濾過された水性製剤を形成するステップ；（ｄ）保管容器を、濾過された水性製剤で充填するステップ；および（ｅ）保管容器を密封して、ｐＨが約７以下であり、雰囲気レベルまたは低減レベルの溶存酸素を有し、保存寿命が少なくとも約２４カ月間または少なくとも約３６カ月間である医薬製剤をもたらすステップを含む、方法。
【請求項２２】
（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）の前にｐＨを１回以上にわたり低減するステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
医薬製剤が、低減レベルの溶存酸素を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）の前に溶存酸素レベルが１回以上にわたり低減される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
溶存酸素レベルが、スパージング、不活性ガスパージングまたは真空脱気により低減される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
（ｅ）の前に溶存酸素レベルが、１回以上にわたるスパージングにより低減される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
溶存酸素レベルが、窒素を伴うスパージングにより低減される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
（ｅ）の前に、溶存酸素レベルが、窒素オーバーレイを添加することにより低減される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
溶存酸素レベルが、窒素でスパージングされた充填用アイソレーターを利用することにより低減される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
ペグ化アプタマーが、ペグニバコギンである、請求項２１から２９に記載の方法。
【請求項３１】
ペグ化アプタマーが、ＲＢ５７１である、請求項２１から２９に記載の方法。
【請求項３２】
保存寿命が、約２℃から約８℃において決定される、請求項２１から３１に記載の方法。
【請求項３３】
保存寿命が、約２５から約３０℃において決定される、請求項２１から３１に記載の方法。
【請求項３４】
医薬製剤を調製する方法であって、
（ｉ）水性溶媒を供給するステップ；（ｂ）ペグ化アプタマーおよびメチオニンを水性溶媒へと添加して、水性製剤を形成するステップ；（ｃ）水性製剤を濾過して、濾過された水性製剤を形成するステップ；（ｄ）保管容器を、濾過された水性製剤で充填するステップ；および（ｅ）保管容器を密封して、ｐＨが約７以下であり、雰囲気レベルまたは低減レベルの溶存酸素を有し、保存寿命が少なくとも約２４カ月間または少なくとも約３６カ月間である医薬製剤をもたらすステップを含む、方法。
【請求項３５】
ペグ化アプタマーが、固体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ペグ化アプタマーが、水溶液中にある、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
メチオニンが、ペグ化アプタマーの前に添加される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
メチオニンが、ペグ化アプタマーと同時に添加される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
メチオニンが、ペグ化アプタマーの後で添加される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）の前にｐＨを１回以上にわたり改変するステップをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
医薬製剤が、低減レベルの溶存酸素を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
溶存酸素レベルが、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）の前に１回以上にわたり低減される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
溶存酸素レベルが、スパージング、不活性ガスパージングまたは真空脱気により低減される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
（ｅ）の前に溶存酸素レベルが１回以上にわたるスパージングにより低減される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
溶存酸素レベルが、窒素を伴うスパージングにより低減される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
（ｅ）の前に、溶存酸素レベルが、窒素オーバーレイを添加することにより低減される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
溶存酸素レベルが、窒素でスパージングされた充填用アイソレーターを利用することにより低減される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
ペグ化アプタマーが、ペグニバコギンである、請求項３４から４７に記載の方法。
【請求項４９】
ペグ化アプタマーが、ＲＢ５７１である、請求項３４から４７に記載の方法。
【請求項５０】
保存寿命が、約２℃から約８℃において決定される、請求項３４から４９に記載の方法。
【請求項５１】
保存寿命が、約２５℃から約３０℃において決定される、請求項３４から４９に記載の方法。
【請求項５２】
治療有効量の、請求項１から２０のいずれかに記載の医薬製剤を投与することにより、それを必要とする宿主を処置する方法。
【請求項５３】
宿主が、抗凝固を必要とする、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
宿主が、手術手順を受けている、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
手術手順が、冠血行再建術手順である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
冠血行再建術手順が、ＣＡＢＧまたはＰＣＩである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
宿主が、構造的心疾患を患っている、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
構造的心疾患が、心臓弁膜症である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
手術手順が、経カテーテル大動脈弁置換術または移植術（ＴＡＶＲ／ＴＡＶＩ）である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
宿主が、血小板介在性障害を患っている、請求項５２に記載の方法。
【請求項６１】
血小板介在性障害が、糖尿病性網膜症、糖尿病性血管障害、アテローム性動脈硬化、虚血性脳卒中、および慢性腎不全から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
医薬製剤の投与が、宿主における微小血栓形成を低減または阻害する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
血小板介在性障害が、関節リウマチである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
医薬製剤が、約２４ｍｇ／ｍＬのペグニバコギンおよび約０．１％のメチオニンを含み、ｐＨが約６．８であり、雰囲気レベルまたは低減レベルの溶存酸素を有し、保存寿命が少なくとも約２４カ月間または少なくとも約３６カ月間である、請求項５３から５６に記載の方法。
【請求項６５】
溶存酸素レベルが、雰囲気レベルである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
溶存酸素レベルが、約５から約１０ｐｐｍの間である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
溶存酸素レベルが、約５ｐｐｍ未満へと低減される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
医薬製剤が、ＲＢ５７１を含む、請求項６０から６１および６３に記載の方法。
【請求項６９】
保存寿命が、約２から約８℃において決定される、請求項５２から６８のいずれかに記載の方法。
【請求項７０】
保存寿命が、約２５℃から約３０℃において決定される、請求項６２から５８に記載の医薬製剤。
【請求項７１】
医薬製剤が、静脈内投与される、請求項５２から６３のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
製剤が、ボーラス静脈内注射として投与される、請求項５２から６３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、それらの内容が参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、２０１２年１２月６日に出願された米国特許仮出願第６１／７３４，２７７号および２０１３年３月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／７９８，４６６号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は一般に、ペグ化アプタマーなど、コンジュゲートオリゴヌクレオチドの医薬製剤に関するほか、これらを調製し使用する方法にも関する。製剤は、様々な条件下で、所望の保存寿命の特徴を有する。
【背景技術】
【０００３】
オリゴヌクレオチド治療剤は、それらの構造、標的および作用機構により識別される、治療剤の有望なクラスを表す。現在のところ、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイムおよび干渉ＲＮＡを含む、クラス内の多数の薬剤が開発中である。
【０００４】
このクラス内の薬剤の治療プロファイルは、対象のオリゴヌクレオチドの、別の分子へのコンジュゲーションにより改善されることが多い。コンジュゲートは、例えば、ペプチドおよびタンパク質、炭水化物、抗体、酵素、ポリマー、薬物およびフルオロフォアを含む。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）へのコンジュゲーションは、例えば、オリゴヌクレオチド治療剤の薬物動態プロファイル、薬力学プロファイル、および免疫学的プロファイルを改善することが可能であり、これにより、その治療効果を増強しうる。分枝鎖状ＰＥＧによる抗ＶＥＧＦアプタマーであるペガプタニブ（Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標））は、ＦＤＡにより２００４年に加齢黄斑変性の処置について承認された。
【０００５】
その利益にもかかわらず、ＰＥＧは、自己酸化を受けやすいため、ＰＥＧへのコンジュゲーション（ペグ化として公知である。）は、オリゴヌクレオチド治療剤の保存寿命または効力に対して有害作用を及ぼしうる（Ｋｎｏｐ，Ｋ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２０１０、４９、６２８８−３０８；Ｈａｎ，Ｓ．ら、Ｐｏｌｙｍｅｒ、３８巻、２号、３１７−３３頁、１９９７）。酸化は、熱、光、または遷移金属により誘発される場合があり、酸素または他の酸化剤により伝搬される。酸化が進行すると、ＰＥＧは、クロマトグラフィーにより観察されうる、分子量の異なる類縁の物質のファミリーへと分解する（Ｙａｎｇら、Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．、３２（１９９６）、５３５−５４７；Ｈａｎら、Ｐｏｌｙｍｅｒ、３８（１９９７）、３１７−３２３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｎｏｐ，Ｋ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２０１０、４９、６２８８−３０８
【非特許文献２】Ｈａｎ，Ｓ．ら、Ｐｏｌｙｍｅｒ、３８巻、２号、３１７−３３頁、１９９７
【非特許文献３】Ｙａｎｇら、Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．、３２（１９９６）、５３５−５４７
【非特許文献４】Ｈａｎら、Ｐｏｌｙｍｅｒ、３８（１９９７）、３１７−３２３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ペグ化オリゴヌクレオチドを含む、コンジュゲートオリゴヌクレオチド治療剤の保存寿命を改善することが依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、ペグ化アプタマーなど、コンジュゲートオリゴヌクレオチドの医薬製剤に関するほか、これらを調製し使用する方法にも関する。医薬製剤は、様々な保管条件下における保存寿命が少なくとも約２４カ月間または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である。
【０００９】
一態様では、本発明は、ペグ化アプタマーおよびメチオニンを含む医薬製剤であって、ｐＨが約７以下であり、雰囲気レベルまたは低減レベルの溶存酸素を有し、様々な保管条件下における保存寿命が少なくとも約２４カ月間または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である製剤である。
【００１０】
ペグ化アプタマーの濃度は、変化しうる。特定の実施形態では、ペグ化アプタマーの濃度は、約１から約１００、約２０から約３０、または約２４ｍｇ／ｍＬである。
【００１１】
メチオニンの濃度は、変化しうる。特定の実施形態では、メチオニンは、約０．００１から約０．５０％ｗ／ｗ、約０．１０から約０．２５または約０．１０％ｗ／ｗで存在する。
【００１２】
医薬製剤中の溶存酸素レベルは、変化しうる。特定の実施形態では、溶存酸素レベルは、雰囲気レベルまたは約５から約１０ｐｐｍの間である。別の特定の実施形態では、溶存酸素レベルは、低減レベルまたは約５ｐｐｍ未満である。
【００１３】
本発明の医薬製剤は、様々な保管条件下における保存寿命が少なくとも約２４カ月間または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である点で有利である。製剤がその下に置かれる温度条件は、変化しうる。特定の実施形態では、温度は、約２℃から約８℃の間である。別の特定の実施形態では、温度は、約２５℃から約３０℃の間である。具体的な実施形態では、温度は、約２５℃である。
【００１４】
例示的な実施形態では、本発明は、約２０から約３０ｍｇ／ｍＬのペグニバコギンおよび約０．０２５から約０．５％ｗ／ｗのメチオニンを含む医薬製剤であって、ｐＨが約７以下であり、雰囲気レベルまたは低減レベルの溶存酸素を有し、様々な保管条件下における保存寿命が少なくとも約２４カ月間または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である製剤である。
【００１５】
別の例示的な実施形態では、本発明は、約２４ｍｇ／ｍＬのペグニバコギンおよび約０．１０％ｗ／ｗのメチオニンを含む医薬製剤であって、ｐＨが約７以下であり、または、より特定すれば、約６．８であり、雰囲気レベルまたは低減レベルの溶存酸素を有し、様々な保管条件下における保存寿命が少なくとも約２４カ月間または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である製剤である。
【００１６】
さらに別の例示的な実施形態では、本発明は、約２４ｍｇ／ｍＬのペグニバコギンおよび約０．１０％ｗ／ｗのメチオニンを含む医薬製剤であって、ｐＨが約６．８であり、溶存酸素レベルが約５から約１０ｐｐｍの間であり、約２℃から約８℃の間または約２５℃から約３０℃の間の温度における保存寿命が少なくとも約２４カ月間または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である製剤である。
【００１７】
第２の態様では、本発明は、医薬製剤を調製する方法である。一実施形態では、方法は、（ａ）メチオニンを含む水性溶媒を供給するステップ；（ｂ）ペグ化アプタマーを、水性溶媒へと添加して、水性製剤を形成するステップ；（ｃ）水性製剤を濾過して、濾過された水性製剤を形成するステップ；（ｄ）保管容器を、濾過された水性製剤で充填するステップ；および（ｅ）保管容器を密封して、ｐＨが約７以下であり、雰囲気レベルまたは低減レベルの溶存酸素を有し、様々な保管条件下における保存寿命が少なくとも約２４カ月間または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である医薬製剤をもたらすステップを含む。
【００１８】
ペグ化アプタマーは、水性溶媒へと、固体として添加することもでき、水溶液として添加することもでき、後者の場合、ペグ化アプタマーは溶解溶媒中にあらかじめ溶存している。
【００１９】
別の実施形態では、方法は、（ａ）水性溶媒を供給するステップ；（ｂ）ペグ化アプタマーおよびメチオニンを、水性溶媒へと添加して、水性製剤を形成するステップ；（ｃ）水性製剤を濾過して、濾過された水性製剤を形成するステップ；（ｄ）保管容器を、濾過された水性製剤で充填するステップ；および（ｅ）保管容器を密封して、ｐＨが約７以下であり、雰囲気レベルまたは低減レベルの溶存酸素を有し、様々な保管条件下における保存寿命が少なくとも約２４カ月間または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である医薬製剤をもたらすステップを含む。方法のこの実施形態に従い、メチオニンの水性溶媒へと添加のタイミングは、変化しうる。一実施形態では、メチオニンは、水性溶媒へと、ペグ化アプタマーと同時に添加される。別の実施形態では、メチオニンは、水性製剤へと、ペグ化アプタマーの後で添加される。
【００２０】
場合によって、方法は、１つ以上のさらなるステップをさらに含みうる。一実施形態では、方法は、溶媒、溶解溶媒、水性製剤、濾過された水性製剤またはこれらの組合せのうちの１つ以上のｐＨを、１回以上にわたり改変するステップをさらに含む。特定の実施形態では、ｐＨは、ｐＨ改変ステップの前に測定することもでき、および／またはｐＨ改変ステップの後で測定することもできる。
【００２１】
別の実施形態では、方法は、溶媒、水性製剤、濾過された水性製剤またはこれらの組合せのうちの１つ以上の溶存酸素レベルを、１回以上にわたり改変するステップをさらに含む。溶存酸素レベルは、例えば、窒素ガスまたは他の許容可能な医療用ガスを伴うスパージングにより低減されうる。特定の実施形態では、溶存酸素レベルは、溶存酸素改変ステップの前に測定することもでき、および／または溶存酸素レベル改変ステップの後で測定することもできる。
【００２２】
例示的な実施形態では、方法は、（ａ）メチオニンを含む水性溶媒を供給するステップ；（ｂ）ペグ化アプタマーを、水性溶媒へと添加して、水性製剤を形成するステップ；（ｃ）水性製剤を濾過して、濾過された水性製剤を形成するステップ；（ｄ）保管容器を、濾過された水性製剤で充填するステップ；および（ｅ）保管容器を密封して、ｐＨが約７以下であり、雰囲気レベルの溶存酸素を有し、約２℃から約８℃の間または約２５℃から約３０℃の間の温度が含まれるがこれらに限定されない、様々な保管条件下における保存寿命が少なくとも約２４カ月間または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である医薬製剤をもたらすステップを含む。
【００２３】
別の例示的な実施形態では、方法は、（ａ）水性溶媒を供給するステップ；（ｂ）ペグ化アプタマーおよびメチオニンを、水性溶媒へと添加して、水性製剤を形成するステップ；（ｃ）水性製剤を濾過して、濾過された水性製剤を形成するステップ；（ｄ）保管容器を、濾過された水性製剤で充填するステップ；および（ｅ）保管容器を密封して、ｐＨが約７以下であり、溶存酸素レベルが約５から約１０ｐｐｍであり、約２℃から約８℃の間または約２５℃から約３０℃の間の温度が含まれるがこれらに限定されない、様々な保管条件下における保存寿命が少なくとも約２４カ月間または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である医薬製剤をもたらすステップを含む。
【００２４】
好ましい実施形態では、本発明は、医薬製剤を調製する方法であって、（ａ）メチオニンを含む水性溶媒を供給するステップ；（ｂ）ペグニバコギンを、水性溶媒へと添加して、水性製剤を形成するステップ；（ｃ）水性製剤を濾過して、濾過された水性製剤を形成するステップ；（ｄ）保管容器を、濾過された水性製剤で充填するステップ；および（ｅ）保管容器を密封して、ｐＨが約７以下であり、雰囲気レベルの溶存酸素を有し、約２℃から約８℃の間または約２５℃から約３０℃の間の温度が含まれるがこれらに限定されない、様々な保管条件下における保存寿命が少なくとも約２４カ月間または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である医薬製剤をもたらすステップを含む方法である。
【００２５】
別の好ましい実施形態では、方法は、（ａ）水性溶媒を供給するステップ；（ｂ）ペグニバコギンおよびメチオニンを、水性溶媒へと添加して、水性製剤を形成するステップ；（ｃ）水性製剤を濾過して、濾過された水性製剤を形成するステップ；（ｄ）保管容器を、濾過された水性製剤で充填するステップ；および（ｅ）保管容器を密封して、ｐＨが約７以下であり、溶存酸素レベルが約５から約１０ｐｐｍであり、約２℃から約８℃の間または約２５℃から約３０℃の間の温度が含まれるがこれらに限定されない、様々な保管条件下における保存寿命が少なくとも約２４カ月間または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である医薬製剤をもたらすステップを含む。
【００２６】
第３の態様では、本発明は、治療有効量の、本発明の医薬製剤を投与することにより、それを必要とする宿主を処置する方法である。
【００２７】
特定の実施形態では、宿主は、抗凝固を必要とする。具体的な実施形態では、医薬製剤は、ペグニバコギンを含み、宿主は、ＣＡＢＧまたはＰＣＩなどの冠血行再建術手順を受けている。
【００２８】
別の特定の実施形態では、宿主は、血小板介在性障害を患っている。具体的な実施形態では、医薬製剤は、ＲＢ５７１を含み、宿主は、ＡＣＳ、関節リウマチまたは糖尿病性血管障害を患っている。
【００２９】
別の特定の実施形態では、宿主は、心臓弁膜症などの構造的心疾患を患っている。具体的な実施形態では、宿主は、経カテーテル大動脈弁置換術または移植術（ＴＡＶＲ／ＴＡＶＩ）を受けている。
【００３０】
一実施形態では、医薬製剤は、静脈内投与される。好ましい実施形態では、製剤は、ボーラス静脈内注射として投与される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】窒素パージングまたは空気パージングを伴い、５℃で１２カ月間にわたり保管された、ペグニバコギン製剤である０４０−１００−Ｒ１−Ｒ１７についての、ＡＸ−ＨＰＬＣクロマトグラムのオーバーレイを提示する図である。
【図２】窒素パージングまたは空気パージングを伴い、５℃で少なくとも２４カ月間にわたり保管された、ペグニバコギン製剤である０４０−１００−Ｒ１−Ｒ１７についての、ＡＸ−ＨＰＬＣクロマトグラムのオーバーレイを提示する図である。
【図３】５℃、２５℃および４０℃で１２カ月間にわたり保管された、２１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４のペグニバコギン注射液（０４０−１００Ｒ１２）についての、ＡＸ−ＨＰＬＣクロマトグラムのオーバーレイを提示する図である。
【図４】窒素パージングまたは空気パージングを伴い、５℃で１２カ月間にわたり保管された、ペグニバコギン製剤である０４０−１００−Ｒ１−Ｒ１７についての、ＩＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムのオーバーレイを提示する図である。
【図５】窒素パージングまたは空気パージングを伴い、５℃で２４カ月間にわたり保管された、ペグニバコギン製剤である０４０−１００−Ｒ１−Ｒ１７についての、ＩＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムのオーバーレイを提示する図である。
【図６】温度およびｐＨの、１２カ月間にわたり保管されたペグニバコギン製剤の安定性に対する効果を、ＡＸ−ＨＰＬＣを介して裏付ける図である。
【図７】温度およびｐＨの、３６カ月間にわたり保管されたペグニバコギン製剤の安定性に対する効果を、ＡＸ−ＨＰＬＣを介して裏付ける図である。
【図８】温度およびｐＨの、１２カ月間にわたり保管された、抗酸化剤を含有するペグニバコギン製剤の安定性に対する効果を、ＡＸ−ＨＰＬＣを介して裏付ける図である。
【図９】温度およびｐＨの、３６カ月間にわたり保管された、抗酸化剤を含有するペグニバコギン製剤の安定性に対する効果を、ＡＸ−ＨＰＬＣを介して裏付ける図である。
【図１０】０．１％のメチオニンおよびｐＨの、４０℃におけるペグニバコギン注射液（ｐＨ６．５＝Ｒ２６、ｐＨ７．０＝Ｒ３１、ｐＨ７．４＝Ｒ３０、フェーズＩ／ＩＩ  Ｆｍｌ＝Ｒ２５）の安定性に対する効果を裏付ける図である。
【図１１Ａ】ｐＨの、４０℃で１０．５カ月間後における、０．１％ｗ／ｗのメチオニンを含有する製剤中のペグニバコギンの不純物プロファイルに対する効果を裏付ける図である。
【図１１Ｂ】ｐＨの、４０℃で１２カ月間後における、０．１％ｗ／ｗのメチオニンを含有する製剤中のペグニバコギンの不純物プロファイルに対する効果を裏付ける図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、オリゴヌクレオチドまたはペグ化アプタマーなどのコンジュゲートオリゴヌクレオチドの医薬製剤を対象とするほか、これらを調製し使用する方法も対象とする。本発明の医薬製剤は、多様な保管条件下で、所望の保存寿命を有する。特定の実施形態では、製剤は、様々な保管条件下における保存寿命が少なくとも２４カ月間または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である。
【００３３】
Ｉ．保存寿命
医薬品の保存寿命は一般に、製造後において、規格に従い保管される場合に、平均的な薬物特徴（例えば、効力、無菌性）が、承認された規格の範囲内に保持される期間であると考えられている。医薬品が市販されうる前に、製造元は一般に、保存寿命についての表示を、適切な規制機関、例えば、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）または欧州医薬品庁（ＥＭＥＡ）へと申請するように要求される。医薬品の真の保存寿命は通例知られていないので、当業者により理解される通り、薬物開発工程において実行される安定性研究に由来する、薬物特徴についてのアッセイ結果に基づいて推定されることが典型的である。保存寿命の改善は、著明な経済的利点をもたらす。
【００３４】
一実施形態では、保存寿命は、ペグ化アプタマーなどのオリゴヌクレオチド治療剤の生体活性の効力が、推奨される保管条件で保管された場合に、規格内に保持される、製造時からの期間を指す。
【００３５】
別の実施形態では、保存寿命は、ペグ化アプタマーの生体活性が、製造時に存在する生体活性の約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または１００％に保持される、製造時からの期間を指す。
【００３６】
別の実施形態では、保存寿命は、ペグ化アプタマーの生体活性が、製造時に存在する生体活性の約５０％から１５０％、約６０％から１４０％、約７０％から１３０％、約８０％から１２０％、約９０％から１１０％、約９５％から１０５％の間に保持される、製造時からの期間を指す。
【００３７】
別の実施形態では、保存寿命は、表示量に対するパーセントとの関連で記載される、投与量単位の一貫性を指す。一実施形態では、保存寿命は、表示量に対するパーセントが、約９０％から約１１０％、約９５％から約１０５％、または約９８％から約１０２％の間または約９９％から約１０１％に保持される、製造時からの期間を指す。
【００３８】
別の実施形態では、保存寿命は、ペグ化アプタマーの純度が、指定されたレベルを超える、製造時からの期間を指す。好ましい実施形態では、保存寿命は、純度パーセントが、約９０％、約９２％、約９４％、約９５％、約９９％、約９９．５％、または約９９．９％を超える、製造時からの期間を指す。
【００３９】
別の実施形態では、保存寿命は、総不純物含量が、指定されたレベルを下回るように保持される、製造時からの期間を指す。一実施形態では、保存寿命は、製剤中の総不純物含量が、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満または約０．５％未満である、製造時からの期間を指す。
【００４０】
製剤中の異なる種類の不純物の含量は、ＲＲＴ（相対保持時間：ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）の測定値に基づきうる。ＲＲＴが１．０１を超える不純物（ＲＲＴ≧１．０１である不純物）は、ＰＥＧの酸化分解物を表す。一実施形態では、保存寿命は、ＲＲＴ≧１．０１である不純物の含量が、約６％以下、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満に保持される、製造時からの期間を指す。ＲＲＴが１．１５に等しい不純物（ＲＲＴ＝１．１５である不純物）は、２０ｋＤａのアームのうちの１つの喪失を結果としてもたらす、分枝鎖状ＰＥＧのアーム間のリンカーの切断を表す。いかなる特殊な機構にも束縛されるわけではないが、ＲＲＴ＝１．１５である不純物の発生は、酸化工程（ペルオキシアニオンにより触媒される。）により加速化され、また、塩基性条件下でも加速化されると考えられる。一実施形態では、保存寿命は、ＲＲＴ＝１．１５である不純物の含量が、約２％以下、約１％未満、約０．５％未満または約０．１％未満に保持される、製造時からの期間を指す。
【００４１】
本発明の医薬製剤の保存寿命は、公知のコンジュゲートオリゴヌクレオチド治療剤の医薬製剤と比べて改善されており、特に、実施例１の医薬製剤と比べて改善されている。
【００４２】
一実施形態では、同じ保管条件（例えば、温度条件）下における保存寿命が、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％改善されており、または約５０％を超えて改善されている。
【００４３】
別の実施形態では、本発明の医薬製剤の保存寿命は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３８、約４０、約４２、約４４、約４６、約４８カ月間であり、または約４８カ月間を超える。
【００４４】
本発明の医薬製剤の改善された保存寿命は、例えば、保管温度を含む、様々な保管条件下において許容される。一実施形態では、医薬製剤は、冷凍条件下において、改善された保存寿命を有する。特定の実施形態では、医薬製剤は、約２℃から約８℃の温度において、改善された保存寿命を有する。
【００４５】
別の実施形態では、医薬製剤は、約８℃から約１２℃の間、約１２℃から約１８℃の間、約１８℃から約２４℃の間の温度において、改善された保存寿命を有する。
【００４６】
別の実施形態では、医薬製剤は、室温において、室温における出荷、輸送および保管を許容する、改善された保存寿命を有する。室温は、米国および欧州の大半において２５℃であると一般に考えられている、一般的な室内温度を指す。しかし、室温は、地域により変化しうる。特定の実施形態では、医薬製剤は、約２５℃から約３０℃、または約２５℃において、改善された保存寿命を有する。
【００４７】
別の実施形態では、医薬製剤は、約３０℃超において、改善された保存寿命を有する。
【００４８】
一実施形態では、医薬製剤の保存寿命は、冷凍条件下において、少なくとも約１２、約１４、約１６、約１８、約２０、約２２、約２４、約２６、約２８、約３０、約３２、約３４、約３６、約３８、約４０、約４２、約４４、約４６、約４８カ月間であり、または約４８カ月間を超える。
【００４９】
特定の実施形態では、医薬製剤の保存寿命は、約１℃から約１５℃の間、約１℃から約１０℃の間、約２℃から約８℃の間、または約５℃において、少なくとも約１２、約１４、約１６、約１８、約２０、約２２、約２４、約２６、約２８、約３０、約３２、約３４、約３６、約３８、約４０、約４２、約４４、約４６、約４８カ月間であり、または約４８カ月間を超える。
【００５０】
特定の実施形態では、医薬製剤の保存寿命は、約２℃から約８℃の間において、少なくとも約２４カ月間である。
【００５１】
別の特定の実施形態では、医薬製剤の保存寿命は、約２℃から約８℃の間において、少なくとも約３６カ月間である。
【００５２】
さらに別の特定の実施形態では、医薬製剤の保存寿命は、約２℃から約８℃の間において、少なくとも約４０カ月間である。
【００５３】
さらに別の特定の実施形態では、医薬製剤の保存寿命は、約２℃から約８℃の間において、少なくとも約４２カ月間である。
【００５４】
別の特定の実施形態では、医薬製剤の保存寿命は、約２℃から約８℃の間において、少なくとも約４６カ月間である。
【００５５】
別の実施形態では、医薬製剤の保存寿命は、約８℃から約２４℃の間において、少なくとも約１２、約１４、約１６、約１８、約２０、約２２、約２４、約２６、約２８、約３０、約３２、約３４または約３６カ月間である。
【００５６】
なおさらなる実施形態では、医薬製剤の保存寿命は、室温において、少なくとも約１２、約１４、約１６、約１８、約２０、約２２、約２４、約２６、約２８、約３０、約３２、約３４、約３６、約３８、約４０、約４２、約４４、約４６、約４８カ月間である。例えば、医薬製剤の保存寿命は、室温または約２５℃から３０℃の間もしくは約２５℃において、少なくとも約２４カ月間または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である。
【００５７】
具体的な実施形態では、製剤は、様々な保管条件下において、例えば、約２℃から約８℃の間、約８℃から約２４℃の間、もしくは約２５℃から約３０℃の間および／または室温において、少なくとも約２４から少なくとも約４８、少なくとも約２６から少なくとも約４４、少なくとも約２８から少なくとも約４２、少なくとも約３０から少なくとも約４０、少なくとも約３２から少なくとも約３８、または少なくとも約３６カ月間の保存寿命を許容する。
【００５８】
別の実施形態では、製剤の保存寿命は、冷凍条件下において、少なくとも約２４カ月間または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である。特定の実施形態では、製剤は、約２℃から約８℃において、改善された保存寿命を有する。
【００５９】
例示的な実施形態では、製剤の保存寿命は、約２℃から約８℃において、約５、約１０、約１５、約２０、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５または約１００％以上改善されている。
【００６０】
具体的な実施形態では、製剤は、２℃から約８℃において、および／または冷凍条件下において、少なくとも約２４から少なくとも約４８、少なくとも約２６から少なくとも約４４、少なくとも約２８から少なくとも約４２、少なくとも約３０から少なくとも約４０、少なくとも約３２から少なくとも約３８、または少なくとも約３６カ月間の保存寿命を許容する。
【００６１】
なおさらなる実施形態では、製剤は、約２５℃超において、少なくとも約２４カ月間または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間の保存寿命を許容する。
【００６２】
特定の実施形態では、製剤は、約３０℃超において、少なくとも約２４カ月間または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間の保存寿命を許容する。
【００６３】
特定の実施形態では、製剤は、約４０℃超において、少なくとも約２４カ月間または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間の保存寿命を許容する。
【００６４】
ＩＩ．オリゴヌクレオチド
本明細書で記載される医薬製剤は、オリゴヌクレオチドを伴う使用に適する。オリゴヌクレオチドは、典型的には約５０ヌクレオチドより短い長さの核酸ポリマーである。オリゴヌクレオチドは、研究目的、診断目的および治療目的に有用であることが公知である。
【００６５】
一実施形態では、本発明に従い製剤化されたオリゴヌクレオチドは、研究または診断法において有用である。すなわち、「医薬製剤」という用語は、本発明の使用を、治療法へと限定するとみなされるべきではない。
【００６６】
別の実施形態では、本発明に従い製剤化されたオリゴヌクレオチドは、治療用オリゴヌクレオチドである、すなわち、それを必要とする対象における疾患または障害の１つ以上の処置法において有用である。
【００６７】
オリゴヌクレオチド治療剤は、それらの構造、機能および作用方式により弁別される。構造的に、オリゴヌクレオチド治療剤は、サイズが約１０から約５０塩基対の範囲にわたる、一本鎖または二本鎖のＤＮＡポリマーまたはＲＮＡポリマーでありうる。本明細書でさらに記載される通り、核酸の構成要素および全体としてのオリゴヌクレオチドは、修飾される場合もあり、修飾されない場合もある。オリゴヌクレオチド治療剤の作用機構は、変化しうる。一般に、オリゴヌクレオチドは、相補的な核酸配列または三次元的立体配置をベースに、核酸配列、タンパク質または細胞表面受容体などの標的分子に結合することによりそれらの効果を及ぼす。このクラス内の分子は、例えば、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイム、デオキシリボザイム、干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、デコイオリゴヌクレオチドおよび免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む。本発明により想定されるオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の標準的な方法により、例えば、自動式ＤＮＡ合成器（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている自動式ＤＮＡ合成器など）の使用により合成されうる。
【００６８】
一実施形態では、本発明における使用に適するオリゴヌクレオチドは、約１０から約５０塩基対の長さである。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１０から約２０、約２０から約３０、約３０から約４０または約４０から約５０塩基対の長さである。
【００６９】
別の実施形態では、本発明における使用に適するオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。
【００７０】
本発明における使用に適するオリゴヌクレオチドは、修飾されない場合もあり、１カ所以上の修飾を含む場合もある。これらの修飾は、例えば、構成要素である核酸に対する修飾または全体としてのオリゴヌクレオチド分子に対する修飾を含みうる。このような改変は、例えば、インビボにおけるオリゴヌクレオチドの安定性を増大させるように、または分子の送達を増強もしくは媒介するように意図されている。
【００７１】
一実施形態では、本発明に従い製剤化されたオリゴヌクレオチドは、１カ所以上の修飾を含む。このような修飾は、核酸または全体としてのオリゴヌクレオチド分子に、例えば、さらなる電荷、極性、疎水性、水素結合、静電相互作用、および機能性をもたらしうる。
【００７２】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格に対する１カ所以上の修飾を含む。このような修飾は、２’位における糖修飾、５位におけるピリミジン修飾、８位におけるプリン修飾、環外アミンにおける修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモウラシルまたは５−ヨードウラシルの置換；骨格修飾、ホスホロチオエート修飾またはリン酸アルキル修飾、メチル化、イソシチジンおよびイソグアニジンなどのイソ塩基など、希少塩基対合の組合せを含むがこれらに限定されない。修飾はまた、キャッピングなどの３’改変および５’改変も含みうる。
【００７３】
オリゴヌクレオチドはまた、所望の生物学的特性を有する１つ以上の分子へのコンジュゲーションによっても改変されうる。このような分子は、限定を伴わずに述べると、ペプチドおよびタンパク質、炭水化物、抗体、酵素、ポリマー、薬物およびフルオロフォアを含みうる。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、コレステロール、ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロールなどの親油性化合物、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など、非免疫原性の高分子量化合物もしくはポリマー、またはポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）を含むがこれらに限定されない、その他水溶性の、医薬として許容されるポリマーおよびデキストラン、もしくはポリオキサゾリン（ＰＯＺ）などの多糖へとコンジュゲートされる。
【００７４】
ＰＥＧは、エチレンオキシド（ＥＯ）の、モノエチレングリコール（ＭＥＧ）またはジエチレングリコールとのさらなる反応により形成される。ＰＥＧの一般式は、Ｈ（ＯＣＨ２  ＣＨ２）ｎＯＨ［式中、ｎ＝Ｎ：反復エチレンオキシド基の平均数である。］である。他のポリマーと比較して、ＰＥＧの多分散性（Ｍ／Ｍ）は比較的狭く、低分子量ＰＥＧの１．０から高分子量ＰＥＧの１．１の範囲にある。ＰＥＧはまた、水性溶媒中および有機溶媒中のいずれにおいて可溶性でもある。ＰＥＧは、インビボにおいて、構造的変化を伴わずに速やかにクリアランスされ、この場合、クリアランスは、分子量に依存する。ＰＥＧの免疫原性は、高分子量であってもなおごく小さい。メトキシＰＥＧは、−ＯＨ  ｐｅｇと比較して安定性が改善されているので、医薬として使用されるＰＥＧの一般形は、ＣＨ３−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎである。
【００７５】
それらの平均分子量により表される多数のサイズのＰＥＧが存在する。ＰＥＧのサイズは、約５から約２００ｋＤの範囲にわたりうる。最大約３０ｋＤの直鎖状ＰＥＧが作製されうる。３０ｋＤを超えるＰＥＧでは、複数のＰＥＧが共に接合され（マルチアームＰＥＧまたは「分枝鎖状」ＰＥＧ）て、所望のサイズのＰＥＧをもたらす可能性がある。分枝鎖状「ｍＰＥＧ２」接合（アミノ酸を介して連結された２つのｍＰＥＧ）を伴う化合物の一般的合成については、Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、１９９５、６：６２−６９において記載されている。「分枝鎖状」ＰＥＧ、すなわち、一般的な反応性基へと連結された複数のＰＥＧまたはｍＰＥＧを含む化合物では、ＰＥＧまたはｍＰＥＧは、リシンなどのアミノ酸を介して共に連結される場合もあり、例えば、グリセリンを介して連結される場合もある。各ｍＰＥＧが約１０、約２０、または約３０ｋＤである分枝鎖状ＰＥＧでは、総質量は、約２０、約４０または約６０ｋＤであり、化合物は、その総質量により言及される（すなわち、４０ｋＤのｍＰＥＧ２は、２つの２０ｋＤ  ｍＰＥＧが連結されている。）。
【００７６】
ペグ化化合物を作製するときに試薬として使用されうる、総分子量４０ｋＤのＰＥＧは、例えば、
【００７７】
【化１】
2016506389.tif 000002
の構造である、［Ｎ２−（モノメトキシ２０Ｋポリエチレングリコールカルバモイル）−Ｎ６−（モノメトキシ２０Ｋポリエチレングリコールカルバモイル）］−リシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドを含む。
【００７８】
本発明の安定化化合物を調製するのに使用されうるさらなるＰＥＧ試薬は、一般式：
【００７９】
【化２】
2016506389.tif 000003
で、総分子量を４０ｋＤまたは６０ｋＤとする（式中、各ｍＰＥＧは、約２０または約３０ｋＤである。）、その他分枝鎖状ＰＥＧ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ）を含む。上記で記載した通り、分枝鎖状ＰＥＧは、アミノ酸など、任意の適切な試薬を介して連結される可能性があり、ある種の実施形態では、リシン残基またはグリシン残基を介して連結される。
【００８０】
総分子量４０ｋＤのＰＥＧはまた、一般式：
【００８１】
【化３】
2016506389.tif 000004
［式中、ｍＰＥＧは、約２０ｋＤまたは約３０ｋＤである。］の、非分枝鎖状ｍＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）も含みうる。具体的な実施形態では、反応性エステルは、−−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳである。
【００８２】
試薬はまた、日油株式会社（日本）製のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（商標）シリーズなど、グリセロールを介して連結された分枝鎖状ＰＥＧも含みうる。これらの試薬の、具体的で非限定的な例は、
【００８３】
【化４】
2016506389.tif 000005
である。
【００８４】
試薬はまた、一般式：
【００８５】
【化５】
2016506389.tif 000006
［式中、ｍＰＥＧは、１０から３０ｋＤの間である。］の、非分枝鎖状スクシンイミジルアルファ−メチルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＭＢ）も含みうる。亜実施形態では、反応性エステルは、−−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−−ＣＯ２−−ＮＨＳである。
【００８６】
ＰＥＧ試薬はまた、以下の構造
【００８７】
【化６】
2016506389.tif 000007
などの、ニトロフェニルカーボネートで連結されたＰＥＧも含みうる。
【００８８】
この構造の化合物は、例えば、Ｓｕｎｂｉｏ，Ｉｎｃから市販されている。ニトロフェニルカーボネートを含む化合物は、リンカーを含有する一級アミンへとコンジュゲートされうる。この反応では、Ｏ−ニトロフェニルは、構造［ｍＰＥＧ］ｎ−ＮＨ−−ＣＯ−−ＮＨ−リンカー−リガンドから脱離する脱離基として用いられる。
【００８９】
上記で記載された、チオールで修飾されたリンカーと共に使用されうる、チオール反応性基を伴うＰＥＧは、一般構造：
【００９０】
【化７】
2016506389.tif 000008
［式中、ｍＰＥＧは、約１０、約２０または約３０ｋＤである。］の化合物を含む。加えて、構造は、
【００９１】
【化８】
2016506389.tif 000009
［式中、各ｍＰＥＧは、約１０、約２０、または約３０ｋＤであり、総質量は、約２０、約４０、または約６０ｋＤである。］などの分枝鎖状でもありうる。上記で記載された、チオールで修飾されたリンカーと共に使用されうる、チオール反応性基を伴う分枝鎖状ＰＥＧは、分枝鎖状ＰＥＧの総分子量が約４０または６０ｋＤである化合物（化合物中、各ｍＰＥＧは、２０または３０ｋＤである。）を含む。ＰＥＧ試薬はまた、以下の構造：
【００９２】
【化９】
2016506389.tif 000010
でもありうる。ＰＥＧ−マレイミドは、標的化合物のチオールをペグ化し、標的化合物内のマレイミド環の二重結合は開裂して、チオールと接合される。反応速度はｐＨ依存的であり、一実施形態では、ｐＨ６から１０の間、またはｐＨ７から９の間または約ｐＨ８で実行される。
【００９３】
特定の実施形態では、本発明に従い製剤化されたオリゴヌクレオチドは、ＰＥＧへとコンジュゲートされ、すなわち、ペグ化オリゴヌクレオチドとなる。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、分子量が約１０ｋＤから約６０ｋＤ、約２０ｋＤ、約３０ｋＤ、約４０ｋＤ、約５０ｋＤまたは約６０ｋＤであるＰＥＧへとコンジュゲートされる。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、分子量が約４０ｋＤであるＰＥＧへとコンジュゲートされる。
【００９４】
一実施形態では、本発明に従い製剤化されたオリゴヌクレオチドは、単一のＰＥＧ分子と会合する。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２つ以上のＰＥＧ分子と会合する。
【００９５】
なおさらなる実施形態では、複数のＰＥＧ分子は、互いと接合されうる。この実施形態では、同じ標的または異なる標的に結合することが可能な１つ以上のオリゴヌクレオチドは、各ＰＥＧ分子と会合しうる。同じ標的に特異的な複数のオリゴヌクレオチドが、ＰＥＧへと接合される実施形態では、同じ標的の間の特異的相互作用を発生させるために、同じ標的を互いと近接させる可能性が存在する。異なる標的に特異的な複数のオリゴヌクレオチドが、ＰＥＧへと接合される実施形態では、標的の間の特異的相互作用を発生させるために、異なる標的を互いと近接させる可能性が存在する。
【００９６】
コンジュゲートされる分子は、対象のオリゴヌクレオチドと、共有結合的に結合される場合もあり、非共有結合的相互作用を介して会合する場合もある。一実施形態では、コンジュゲートされる分子は、オリゴヌクレオチドへと、共有結合的に接合される。共有結合的接合は、オリゴヌクレオチド上の多様な位置において、例えば、塩基上の環外アミノ基、ピリミジンヌクレオチドの５位、プリンヌクレオチドの８位、リン酸のヒドロキシル基、または５’末端もしくは３’末端におけるヒドロキシル基もしくは他の基において生じうる。一実施形態では、共有結合的接合は、オリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基または３’ヒドロキシル基への接合である。
【００９７】
親油性化合物分子または非免疫原性の高分子量化合物分子の、複合体の他の構成要素への接合は、直接的な接合の場合もあり、リンカーまたはスペーサーを利用する場合もある。当技術分野では、多様なリンカーおよび接合化学反応が公知である。下記では、いくつかの非限定的実施形態が提供される。一実施形態では、ヘキシルアミノリンカーを、合成されたオリゴヌクレオチドの５’端へと付加するのに、Ｃ６ヘキシルアミノリンカー、６−（トリフルオロアセトアミド）ヘキサノール（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイトなどのアミノリンカーが使用されうる。下記では、リンカーを、合成されたオリゴヌクレオチドへと付加するのに使用されうる他のリンカーであるホスホルアミダイトについて記載される：
以下の構造：
【００９８】
【化１０】
2016506389.tif 000011
のＴＦＡ−アミノＣ４  ＣＥＤホスホルアミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ；型番：ＣＬＰ−１４５３から入手可能である。）
【００９９】
以下の構造：
【０１００】
【化１１】
2016506389.tif 000012
の５’−アミノ修飾剤Ｃ３  ＴＦＡ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；型番：１０−１９２３−９０から入手可能である。）
【０１０１】
ＭＭＴアミノ修飾剤であるＣ６  ＣＥＤホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；型番：１０−１９０６から入手可能である。）
【０１０２】
【化１２】
2016506389.tif 000013
【０１０３】
以下の構造：
【０１０４】
【化１３】
2016506389.tif 000014
の５’−アミノ修飾剤５（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；型番：１０−１９０５−９０から入手可能である。）
以下の構造：
【０１０５】
【化１４】
2016506389.tif 000015
の５’−アミノ修飾剤Ｃ１２（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；型番：１０−１９１２−９０から入手可能である。）
【０１０６】
以下の構造：
【０１０７】
【化１５】
2016506389.tif 000016
の５’チオール修飾剤Ｃ６（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；型番：１０−１９２６−９０から入手可能である。）
５’−チオール修飾リンカーは、例えば、ＰＥＧ−マレイミド、ＰＥＧ−ビニルスルホン、ＰＥＧ−ヨードアセトアミドおよびＰＥＧ−オルトピリジルジスルフィドと共に使用される。
【０１０８】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、マレイミド官能基またはビニルスルホン官能基を介して、５’−チオールへと結合される。
【０１０９】
スペーサーは、例えば、グリコールスペーサーでありうる。
【０１１０】
本発明に従い製剤化されたオリゴヌクレオチドはまた、リポソーム内の封入によっても改変されうる。
【０１１１】
Ａ．アプタマー
一実施形態では、本発明に従い製剤化されたオリゴヌクレオチドは、アプタマーである。アプタマーは、高いアフィニティーおよび特異性で標的に結合する、短い（すなわち、典型的には、１２−８０ヌクレオチドの長さである。）一本鎖核酸ポリマーである。アプタマーの潜在的な標的は、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、低分子、ウイルスを含む可能性があり、なお全細胞も含みうる（Ｍｅｙｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、２０１１年巻（２０１１））。アプタマー−標的複合体の解離定数は、抗体の解離定数と同等であり、ピコモル範囲に達しうる。それらの結合特性に起因して、アプタマーは、診断適用および治療適用に有用なツールとなっている（Ｋｅｅｆｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、９巻、７号、５３７−５５０頁、２０１０；Ｂｏｕｃｈａｒｄら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、５０巻、２３７−２５７頁、２０１０）。
【０１１２】
特定の実施形態では、本発明に従い製剤化されたアプタマーは、標的タンパク質に結合する。
【０１１３】
核酸アプタマーは、試験管内人工進化（ＳＥＬＥＸ）工程を使用して単離される。この方法は、インビトロにおける、標的分子への高度に特異的結合を伴う核酸分子の進化を可能とする。ＳＥＬＥＸ法は、例えば、米国特許第７，０８７，７３５号、米国特許第５，４７５，０９６号および米国特許第５，２７０，１６３号において記載されている（また、ＷＯ９１／１９８１３も参照されたい。）。
【０１１４】
ＳＥＬＥＸ法は、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択ならびに結合、分別および増幅の段階的な反復を伴い、同じ一般的な選択スキームを使用して、結合アフィニティーおよび選択性についての事実上任意の所望の基準を達成する。ランダム化された配列のセグメントを含む混合物など、核酸の混合物から出発して、ＳＥＬＥＸ法は、混合物を、標的と、結合に好適な条件下において接触させるステップ、結合しなかった核酸を、標的分子に特異的に結合した核酸から分別するステップ、核酸−標的複合体を解離させるステップ、核酸−標的複合体から解離した核酸を増幅して、リガンドにより濃縮された核酸の混合物をもたらすステップを含み、次いで、標的分子に対して高度に特異的であり、高アフィニティーのアプタマーをもたらすのに所望な程度に多くのサイクルを介して、結合するステップ、分別するステップ、解離させるステップ、および増幅するステップを反復するステップを含む。
【０１１５】
基本的なＳＥＬＥＸ法は、多数の特殊な目的を達成するように改変されている。例えば、米国特許第５，７０７，７９６号は、ベントＤＮＡなど、特殊な構造特徴を伴う核酸分子を選択するための、ゲル電気泳動を伴うＳＥＬＥＸの使用について記載している。米国特許第５，７６３，１７７号は、標的分子への結合および／もしくは光架橋ならびに／または標的分子の光不活性化が可能な光反応性基を含有するアプタマーを選択するためのＳＥＬＥＸベースの方法について記載している。米国特許第５，５８０，７３７号は、近縁の分子の間を弁別することが可能な、高度に特異的なアプタマーを同定するための方法であって、カウンターＳＥＬＥＸと名付けられた方法について記載している。米国特許第５，５６７，５８８号および同第５，８６１，２５４号は、標的分子に対するアフィニティーが高いオリゴヌクレオチドおよび標的分子に対するアフィニティーが低いオリゴヌクレオチドの間の効率性の高い分別を達成する、ＳＥＬＥＸベースの方法について記載している。米国特許第５，４９６，９３８号は、ＳＥＬＥＸ工程を実施した後で、改善されたアプタマーを得るための方法について記載している。米国特許第５，７０５，３３７号は、リガンドをその標的へと共有結合的に連結するための方法について記載している。
【０１１６】
米国特許第５，６４８，２１４号では、溶液中の低分子ペプチドに対するアプタマーを同定する可能性が裏付けられた。ある種のレクチンに結合する高アフィニティーアプタマーの作製に関する米国特許第５，７８０，２２８号では、標的分子上の特異的部位へとターゲティングされたリガンドによるアフィニティー溶出を使用して、アプタマーを作製できることについて例示されている。米国特許第６，１２７，１１９号では、細胞型の群を含む、ある種の組織に対するアプタマーを調製する方法について記載されている。米国特許第６，６７３，５５３号では、ウシ腸ホスファターゼに対する、ある種の改変された高アフィニティーリガンドの作製について記載されている。米国特許第６，７１６，５８０号は、アプタマーを同定する自動式工程であって、ロボット操作器の使用を含む工程について記載している。
【０１１７】
その最も基本的な形態では、ＳＥＬＥＸ工程は、以下の一連のステップにより規定されうる。
【０１１８】
１）配列の異なる候補核酸の混合物が調製されるステップ。候補混合物は一般に、固定配列の領域（すなわち、同じ配列を同じ位置に含有する、候補混合物のメンバーの各々）およびランダム化配列の領域を含む。固定配列領域は、（ａ）下記で記載される増幅ステップの一助となり、（ｂ）標的へと結合することが公知の配列を模倣し、または（ｃ）候補混合物内の核酸の所与の構造的配置の濃度を増強するように選択される。ランダム化配列は、完全にランダム化される（すなわち、任意の位置において塩基を見い出す確率は、４分の１である。）場合もあり、部分的にだけランダム化される（例えば、任意の位置において塩基を見い出す確率は、０から１００パーセントの間の任意のレベルで選択されうる。）場合もある。
【０１１９】
２）候補混合物が、標的および候補混合物のメンバーの間の結合に好適な条件下において、選択された標的と接触するステップ。これらの状況下において、標的および候補混合物の核酸の間の相互作用は、標的および標的に対するアフィニティーが最も高い核酸の間で核酸−標的対を形成すると考えられうる。
【０１２０】
３）標的に対するアフィニティーが最も高い核酸が、標的に対するアフィニティーが低い核酸から分別されるステップ。候補混合物内に存在する、アフィニティーが最も高い核酸に対応する配列は、ごく少数だけ（および、おそらく、１つの核酸分子だけ）であるため、候補混合物内の著明量の核酸（約５−５０％）が、分別時に保持されるように、分別基準を設定することが一般に所望される。
【０１２１】
４）次いで、標的に対するアフィニティーが比較的高い核酸が濃縮された新たな候補混合物を創出するように、分別時に標的に対するアフィニティーが比較的高い核酸として選択された核酸が増幅されるステップ。
【０１２２】
５）上記の分別するステップおよび増幅するステップを反復することにより、新たに形成された候補混合物が含有する結合の弱い配列がますます少数となり、核酸の標的に対するアフィニティーの平均的な程度が一般に増大するステップ。その極限に達すると、ＳＥＬＥＸ工程は、元の候補混合物に由来する核酸であって、標的分子に対するアフィニティーが最も高い核酸を表す１つまたは少数の固有の核酸を含有する候補混合物をもたらす。
【０１２３】
一実施形態では、本発明における使用に適するアプタマーは、約１０から約５０ヌクレオチドまたは約１０から約１５、約１５から約２０、約２０から約２５、約２５から約３０、約３０から約３５、約３５から約４０、約４０から約４５または約４５から約５０ヌクレオチドを含む。
【０１２４】
既に記載された通り、本発明に従い製剤化されたアプタマーは、修飾される場合もあり、修飾されない場合もある。一実施形態では、アプタマーは、１カ所以上の修飾を含む。ＳＥＬＥＸ法は、インビボにおける改善された安定性または改善された送達特徴など、リガンドに改善された特徴を付与する修飾ヌクレオチドを含有する、高アフィニティーアプタマーの同定を包摂する。このような修飾の例は、リボース位置および／またはリン酸位置および／または塩基位置における化学的置換を含む。ピリミジンの５’位および２’位において化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドについて記載する米国特許第５，６６０，９８５号では、ＳＥＬＥＸにより同定された、修飾ヌクレオチドを含有するアプタマーについて記載されている。米国特許第５，５８０，７３７号は、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１つ以上のヌクレオチドを含有する特異的アプタマーについて記載している。米国特許第５，７５６，７０３号は、様々な２’−修飾されたピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドについて記載している。
【０１２５】
米国特許第５，６３７，４５９号および同第５，６８３，８６７号において記載されている通り、ＳＥＬＥＸ法は、選択されたオリゴヌクレオチドを、その他選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチドの機能的な単位と組み合わせるステップを包摂する。米国特許第５，６３７，４５９号は、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１つ以上のヌクレオチドを含有する高度に特異的なアプタマーについて記載している。米国特許第６，０１１，０２０号において記載されている通り、ＳＥＬＥＸ法は、選択されたアプタマーを、診断用複合体内または治療用複合体内の親油性または非免疫原性の高分子量化合物と組み合わせるステップをさらに包摂する。
【０１２６】
アプタマーが、ＳＥＬＥＸ法により誘導される場合、修飾は、ＳＥＬＥＸ前修飾の場合もあり、ＳＥＬＥＸ後修飾の場合もある。ＳＥＬＥＸ前修飾は、アプタマーに、その標的に対する特異性およびインビボにおける改善された安定性の両方をもたらしうる。２’−ＯＨ含有アプタマーに対して施されるＳＥＬＥＸ後修飾は、アプタマーの結合能に有害な影響を及ぼすことなく、インビボにおける改善された安定性を結果としてもたらしうる。一実施形態では、アプタマーの修飾は、分子の３’端における３’−３’反転ホスホジエステル連結およびヌクレオチドの一部または全部に対する２’フルオロ（２’−Ｆ）修飾および／または２’アミノ（２’−ＮＨ２）修飾および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）修飾を含む。
【０１２７】
一実施形態では、アプタマーは、インビボにおける増大した安定性など、所望の生物学的特性を付与する別の分子へとコンジュゲートされる。アプタマーへとコンジュゲートされる分子は、例えば、ペプチド、タンパク質、炭水化物、抗体、ハイブリダイゼーション誘発型架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発型切断剤、酵素、ポリマー、薬物、フルオロフォア、コレステロール、ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロールなどの親油性化合物、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など、非免疫原性の高分子量化合物もしくはポリマー、またはポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）を含むがこれらに限定されない、他の水溶性の、医薬として許容されるポリマー；デキストラン、もしくはポリオキサゾリンなどの多糖（ＰＯＺ）でありうる。
【０１２８】
特定の実施形態では、アプタマーは、ＰＥＧへとコンジュゲートされる、すなわち、ペグ化アプタマーとなる。ＩＩ節で記載された通り、当技術分野では、多数のＰＥＧが公知である。特定の実施形態では、アプタマーは、分子量が約２０ｋＤから約６０ｋＤ、約２０ｋＤ、約３０ｋＤ、約４０ｋＤ、約５０ｋＤまたは約６０ｋＤであるＰＥＧへとコンジュゲートされる。特定の実施形態では、アプタマーは、分子量が約４０ｋＤであるＰＥＧへとコンジュゲートされる。アプタマーは、単一のＰＥＧまたは複数のＰＥＧへとコンジュゲートされうる。
【０１２９】
ＩＩ節で記載された通り、アプタマーは、共有結合的結合を介して、または非共有結合的相互作用を介してコンジュゲートされうる。
【０１３０】
ＩＩ節で記載された通り、分子の、複合体の他の構成要素への接合は、直接なされる場合もあり、リンカーまたはスペーサーの利用によりなされる場合もある。
【０１３１】
特定の実施形態では、アプタマー−ＰＥＧ複合体は、ヘキシルアミノリンカーを利用する。米国特許出願公開第ＵＳ２０１２０２７７４１９号は、アプタマーの、ＰＥＧへの、リンカー部分を介するコンジュゲーションについて記載している。
【０１３２】
さらに他の実施形態では、アプタマーは、リポソーム内に封入される。
【０１３３】
アプタマーは、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善するように、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格において改変されうる。アプタマーは、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルチオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２α−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６イソペンテニルアデニン、ウラシルオキシ酢酸、ワイブトシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチルチオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシルオキシ酢酸（Ｖ）、５−メチルチオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎカルボキシプロピル）および２，６−ジアミノプリンを含むがこれらに限定されない群から選択される、少なくとも１つの修飾塩基を含みうる。
【０１３４】
アプタマーはまた、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシロース、およびヘキソースを含むがこれらに限定されない群から選択される、少なくとも１つの修飾糖部分も含みうる。アプタマーまたはモジュレーターは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタールまたはその類似体を含むがこれらに限定されない群から選択される、少なくとも１つの修飾リン酸骨格を含みうる。
【０１３５】
Ｂ．アプタマーのモジュレーター
一実施形態では、本発明に従い製剤化されたアプタマーは、アプタマーの一部に特異的に結合し、またはその活性を他の形でモジュレートすることが可能な、第２の薬剤（モジュレーター、調節因子、制御剤またはアンチドートとして様々に公知である。）により反転もしくは中和されうる結合活性を有するアプタマーである（Ｒｕｓｃｏｎｉら、２００４、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２２（１１）：１４２３−８；Ｒｕｓｃｏｎｉら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ、４１９（６９０２）：９０−４）。併せて、アプタマーおよびモジュレーターは、治療システムを構成する。
【０１３６】
本明細書で記載される通り、アプタマーは、非修飾アプタマーの場合もあり、修飾アプタマーの場合もある。モジュレーターは、オリゴヌクレオチドモジュレーターの場合もあり、低分子、ペプチド、オリゴ糖、例えば、アミノグリコシド、もしくはアプタマーに特異的に結合する可能性もあり、アプタマーの活性を他の形でモジュレートする可能性もある他の分子、またはこれらのうちのいずれかによるキメラ生成物もしくは融合生成物もしくは連結生成物など、非オリゴヌクレオチドモジュレーターの場合もある。
【０１３７】
一実施形態では、モジュレーターは、アプタマーの少なくとも一部と相補的であり、またはこれとハイブリダイズする配列を有する、オリゴヌクレオチドである。本明細書で教示される通り、オリゴヌクレオチドモジュレーターは、修飾される場合もあり、修飾されない場合もある。
【０１３８】
別の実施形態では、モジュレーターは、アプタマーの少なくとも一部と相補的であり、またはこれとハイブリダイズする配列を有する、リボザイム、ＤＮＡザイム、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸（ＭＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）またはシュードサイクリックオリゴヌクレオ塩基（ＰＣＯ）である。
【０１３９】
アプタマーは、適切な安定的二次構造の形成に依存する、活性の三次構造を保有する。したがって、本発明の相補的なオリゴヌクレオチドモジュレーターおよびアプタマーの間の二重鎖の形成の機構は、２つの短い直鎖状のオリゴリボヌクレオチドの間の二重鎖の形成の機構と同じであるが、このような相互作用をデザインするための規則およびこのような生成物の形成の反応速度のいずれも、分子内のアプタマー構造の影響を受ける。核形成の速度は、最終的な安定的二重鎖の形成に重要であり、このステップの速度は、オリゴヌクレオチドモジュレーターを、アプタマー内に存在する一本鎖ループおよび／または一本鎖３’テールもしくは一本鎖５’テールへとターゲティングすることにより大幅に増強される。分子間二重鎖の形成が生じるには、分子間二重鎖の形成の自由エネルギーが、ターゲティングされたアプタマー内の既存の分子内二重鎖の形成に関して好適でなければならない。
【０１４０】
モジュレーターは、高度の特異性および所望の程度のアフィニティーで特定のアプタマーに結合するようにデザインされうる。モジュレーターはまた、結合すると、アプタマーの構造が、活性の大きな形態または活性の小さな形態へと改変されるようにもデザインされうる。例えば、モジュレーターは、ターゲティングされたアプタマーに結合すると、アプタマーが、その標的分子にもはや結合しない、またはその標的分子により低いアフィニティーで結合するように、そのアプタマーの三次元構造が変化するよう、デザインされうる。
【０１４１】
代替的に、モジュレーターは、結合すると、アプタマーの、その標的分子に対するアフィニティーが増強されるように、アプタマーの三次元構造が変化するよう、デザインされうる。すなわち、モジュレーターは、結合すると、アプタマーがその標的分子に結合しうるように、アプタマー内で構造モチーフが作製されるよう、デザインされうる。
【０１４２】
本発明の代替的な実施形態では、モジュレーター自体がアプタマーである。この実施形態では第１に、所望の治療標的に結合するアプタマーが作り出される。第２のステップでは、本明細書で記載されるＳＥＬＥＸ工程または他の工程を使用して、第１のアプタマーに結合し、治療用アプタマーおよび標的の間の相互作用をモジュレートする第２のアプタマーが作り出される。一実施形態では、第２のアプタマーは、第１のアプタマーの効果を失活させる。
【０１４３】
他の代替的な実施形態では、ＰＮＡ、ＭＮＡ、ＬＮＡまたはＰＣＯおよびモジュレーターからなる群から選択される標的に結合するアプタマーは、アプタマーである。代替的に、ＰＮＡ、ＭＮＡ、ＬＮＡまたはＰＣＯおよびモジュレーターからなる群から選択される標的に結合するアプタマーは、ＰＮＡである。代替的に、ＰＮＡ、ＭＮＡ、ＬＮＡまたはＰＣＯおよびモジュレーターからなる群から選択される標的に結合するアプタマーは、ＭＮＡである。代替的に、ＰＮＡ、ＭＮＡ、ＬＮＡまたはＰＣＯおよびモジュレーターからなる群から選択される標的に結合するアプタマーは、ＬＮＡである。代替的に、ＰＮＡ、ＭＮＡ、ＬＮＡまたはＰＣＯおよびモジュレーターからなる群から選択される標的に結合するアプタマーは、ＰＣＯである。所望に応じて、自然発生の立体化学にあり、もしくは非自然発生の立体化学にあり、またはこれらの混合立体化学にある、これらのうちの何れかが使用されうる。例えば、好ましい実施形態では、アプタマーは、Ｄ立体配置であり、代替的な実施形態では、アプタマーは、Ｌ立体配置である。
【０１４４】
一実施形態では、モジュレーターは、ターゲティングされたアプタマー配列のうちの少なくとも一部と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドである。例えば、モジュレーターオリゴヌクレオチドは、ターゲティングされたアプタマーのうちの６−２５ヌクレオチド、典型的には、８−２０ヌクレオチド、より典型的には、１０−１５ヌクレオチドと相補的な配列を含みうる。モジュレーターオリゴヌクレオチドは、アプタマーのうちの６−２５連続ヌクレオチド、または８−２０または１０−１５連続ヌクレオチドと相補的であると有利である。モジュレーターオリゴヌクレオチドの長さは、ターゲティングされるアプタマーおよび求められる効果を考慮に入れて最適化されうる。典型的に、モジュレーターオリゴヌクレオチドは、５−８０ヌクレオチドの長さであり、より典型的には、１０−３０であり、最も典型的には、１５−２０ヌクレオチド（例えば、１５−１７）である。オリゴヌクレオチドは、Ｄ立体化学もしくはＬ立体化学、またはこれらの混合物を保有するヌクレオチドにより作製されうる。自然発生のヌクレオシドは、Ｄ立体配置にある。
【０１４５】
ターゲティングされたアプタマーに結合するオリゴヌクレオチドに最適な部位を決定するのに、多様な戦略が使用されうる。相補的なオリゴヌクレオチドが、アプタマーの近傍を「ウォーキング」する、経験的戦略が使用されうる。ウォーキング実験は、逐次的に実施される２つの実験を伴いうる。候補混合物のメンバーの各々が、対象のオリゴヌクレオチドモジュレーターに対応する固定核酸領域を有する、新たな候補混合物が作製されうる。各候補混合物のメンバーはまた、ランダム化配列の領域も含有する。この方法に従い、アプタマーの複数の結合性ドメインに結合しうる領域を含有する「拡張」アプタマーと呼ばれるものを同定することが可能である。この手法に従い、アプタマー上の約５ヌクレオチドが互い違いになった、約１５ヌクレオチドの長さの２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド）（例えば、アプタマーのうちのヌクレオチド１−１５、６−２０、１１−２５などと相補的なオリゴヌクレオチド）が使用されうる。アプタマーの三次構造の、ハイブリダイゼーションの効率に対する影響は、予測するのが困難でありうるため、経験的戦略は、特に効果的でありうる。異なるオリゴヌクレオチドが特異的アプタマーとハイブリダイズする能力を評価するのに、アプタマーの完全な結合を達成するのに要求される、モル過剰量のオリゴヌクレオチドに重点を置いた、当技術分野で公知のアッセイが使用されうる。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２００２／１６５５５を参照されたい。異なるオリゴヌクレオチドモジュレーターが、アプタマーの、その標的分子からの解離速度、またはアプタマーの、その標的分子との会合速度を増大させる能力はまた、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイを使用する、標準的な反応速度研究を実行することによっても決定されうる。オリゴヌクレオチドモジュレーターは、アプタマーおよびその標的分子の間の相互作用を、所望の様式で改変するのに、５−５０倍のモル過剰量以下のオリゴヌクレオチドが要求されるように選択されうる。
【０１４６】
代替的に、ターゲティングされたアプタマーは、オリゴヌクレオチドモジュレーターとの会合を促進するために、一本鎖テール（３’テールまたは５’テール）を含むように改変されうる。適切なテールは、１から２０ヌクレオチド、好ましくは、１−１０ヌクレオチド、より好ましくは、１−５ヌクレオチドを含むことが可能であり、最も好ましくは、３−５ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル配列などの修飾ヌクレオチド）を含みうる。一本鎖テールの付加が、アプタマーの活性構造を破壊しないことを検証するために、テール付加されたアプタマーは、結合およびバイオアッセイ（例えば、後続の実施例において記載されている。）において調べられうる。例えば、テール配列と１、３または５塩基対を形成しうる一連のオリゴヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド）がデザインされ、それらがテール付加されたアプタマー単独と会合する能力のほか、それらがアプタマーの、その標的分子からの解離速度、またはアプタマーの、その標的分子との会合速度を増大させる能力について調べられる可能性もある。効果は、二重鎖の形成に起因するものであり、非特異的効果に起因するものではないことを検証するのに、スクランブル配列対照が援用されうる。
【０１４７】
オリゴヌクレオチドモジュレーターは、アプタマーの少なくとも一部と相補的な配列を含む。しかし、絶対的相補性が要求されるわけではない。本明細書で言及される「アプタマーの少なくとも一部と相補的な」配列は、アプタマーとハイブリダイズすることが可能な程度に十分な相補性を有する配列を意味する。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存しうる。一般に、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが大型であるほど、標的アプタマーとの塩基ミスマッチは大きくなるが、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、安定的二重鎖（または、場合によって、安定的三重鎖）を含有し、やはりこれを形成する。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融解点を決定する標準的な手順の使用により、許容可能な程度のミスマッチを確認しうる。具体的な態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも５または少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５または１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドでありうる。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはこれらのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは一本鎖の改変形でありうる。
【０１４８】
モジュレーターは一般に、当業者により理解されており、ある種のアプタマーの具体的適用について記載する、本出願で引用される特許において記載されている通り、結合アッセイ、分子モデリング、または生物学的機能の改変を測定するインビボアッセイもしくはインビトロｉアッセイを介して同定されうる。本発明のモジュレーターを同定および選択するのに、標準的な結合アッセイが使用されうる。アプタマーおよび標的の間の相互作用の改変における調節因子の有効性を査定するインビボアッセイまたはインビトロアッセイは、処置される障害に特異的である。生物学的特性についての、多くの標準的なアッセイが周知であり、使用されうる。
【０１４９】
一実施形態では、モジュレーターは、１（１．０）マイクロモル（ｕＭ）未満、好ましくは０．１ｕＭ未満であり、より好ましくは０．０１ｕＭ未満のモジュレーター濃度で、溶液中のアプタマーに実質的に結合する能力を有する。「実質的に」は、標的の存在下におけるモジュレーションにより、標的の生物学的活性の少なくとも５０パーセントの低減が観察されることを意味し、本明細書では、５０％の低減のときのモジュレーター濃度は、ＩＣ５０値と称される。
【０１５０】
例示的な実施形態では、本発明に従い製剤化されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、それらの内容が参照により組み込まれる、米国特許第７，３１２，３２５号、同第７，８１２，００１号、同第７，７４１，３０７号、同第７，７７６，８３６号、同第７，８５８，５９１号、同第７，３００，９２２号、同第７，３０４，０４１号、同第７，７２３，３１５号、同第７，５３１，５２４号および米国特許公開ＵＳ−２００９−２００９００４８１９３、ＵＳ−２０１０−０３１１８２０およびＵＳ２０１２−００９５０８５において開示されている、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む。
【０１５１】
Ｃ．ペグニバコギン
特定の実施形態では、本発明に従い製剤化されたオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＲＢ００６（配列番号１）としてもまた公知のペグニバコギンである。ペグニバコギンは、ＵＳ−２００９−２００９００４８１９３および本明細書で引用される他の特許公開において記載されているアプタマーベースの抗凝固系である、ＲＥＧ１の薬物成分である。
【０１５２】
構造的に、ＲＢ００６は、３１ヌクレオチドの長さの修飾ＲＮＡアプタマーであり、２’−フルオロ糖含有残基および２’−Ｏ−メチル糖含有残基の存在により、エンドヌクレアーゼ分解に対して安定化されており、３’反転デオキシチミジンキャップにより、エクソヌクレアーゼ分解に対して安定化されている。アプタマーの核酸部分は、ヘキシルアミノリンカーを介して、分子量が４０ｋＤであるＰＥＧへとコンジュゲートされている。ペグニバコギン自体の分子量は、約５０ｋＤである（すなわち、４０ｋＤのＰＥＧを加えた３１ヌクレオチド）。
【０１５３】
機能的に、ＲＢ００６は、凝固因子ＩＸａに高いアフィニティーおよび特異性で結合する、直接的ＦＩＸａ阻害剤である（Ｒｕｓｃｏｎｉら、２００４、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２２（１１）：１４２３−８；Ｒｕｓｃｏｎｉら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ、４１９（６９０２）：９０−４；また、ＷＯ０５／１０６０４２および米国特許第７，７２３，３１５号も参照されたい。）。ＲＢ００６は、ＦＶＩＩＩａ／ＦＩＸａに触媒されるＦＸからＦＸａへの転換を遮断することにより、抗凝固効果を誘発する。ＲＢ００６の半減期は、そのヌクレアーゼに対して安定化された骨格およびＰＥＧ成分に起因して長い。静脈内送達される場合、その半減期は、約９６時間である。皮下送達される場合、その半減期は、約７日間を超える。
【０１５４】
一実施形態では、ペグニバコギンの活性は、ＲＢ００７（配列番号２）としてもまた公知のアニバメルセンによりモジュレートされる。アニバメルセンは、ＲＢ００６の一部と相補的な、１５ヌクレオチドの長さの、２’−Ｏ−メチルＲＮＡオリゴヌクレオチドである。２’−Ｏ−メチル修飾は、モジュレーターに、それが、ＲＢ００６へと向かい、これに結合することを可能とするのに十分な、インビボにおける安定性をもたらす、中程度のヌクレアーゼ耐性を付与するが、インビボにおける存続の延長は支援しない。
【０１５５】
Ｄ．ＲＢ５７１
特定の実施形態では、本発明に従い製剤化されたオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＲＢ５７１（配列番号３）として公知である。ＲＢ５７１は、米国特許第８，３１８，９２３号および本明細書で引用される他の特許公開において記載されている、アプタマーベースの抗血小板薬理学系である、ＲＥＧ３の薬物成分である。
【０１５６】
一実施形態では、ＲＢ５７１は、５’から３’方向に、第１のステム領域、第１のループ領域、第２のステム領域、第２のループ領域、第３のループ領域、第３のステム領域および第４のループ領域を含む二次構造を含む。別の実施形態では、ＲＢ５７１は、５’から３’方向に、第１のステム領域、第１のループ領域、第２のステム領域、第２のループ領域、第３のループ領域、第３のステム領域および第４のループ領域から本質的になる。
【０１５７】
構造的に、ＲＢ５７１は、２９ヌクレオチドの長さの修飾ＲＮＡアプタマーであり、２’−フルオロ糖含有残基および２’−Ｏ−メチル糖含有残基の存在により、エンドヌクレアーゼ分解に対して安定化されており、３’反転デオキシチミジンキャップにより、エクソヌクレアーゼ分解に対して安定化されている。アプタマーの核酸部分は、ヘキシルアミノリンカーを介して、分子量が４０ｋＤであるＰＥＧへとコンジュゲートされている。ＲＢ５７１自体の分子量は、約５０ｋＤである（すなわち、４０ｋＤのＰＥＧを加えた２９ヌクレオチド）。
【０１５８】
機能的に、ＲＢ５７１は、糖タンパク質ＶＩに高いアフィニティーおよび特異性で結合する（米国特許第８，３１８，９２３号）。いかなる特定の機構にも限定されるわけではないが、ＲＢ５７１は、血小板の接着および凝集において鍵となる役割を果たす、血小板細胞の表面上の糖タンパク質ＶＩに結合することにより、抗血小板効果を誘発すると考えられる。ＲＢ５７１の半減期は、そのヌクレアーゼに対して安定化された骨格およびＰＥＧ成分に起因して、非修飾オリゴヌクレオチドより長い。
【０１５９】
一実施形態では、ＲＢ５７１の活性は、ＲＢ５１５（配列番号４）によりモジュレートされる。ＲＢ５１５は、ＲＢ５７１の一部と相補的な、１２ヌクレオチドの長さの、２’−Ｏ−メチルＲＮＡオリゴヌクレオチドである。２’−Ｏ−メチル修飾は、モジュレーターに、それが、ＲＢ５７１へと向かい、これに結合することを可能とするのに十分な、インビボにおける安定性をもたらす、中程度のヌクレアーゼ耐性を付与するが、インビボにおける存続の延長は支援しない。
【０１６０】
ＲＢ５７１
（ＰＥＧ４０ＫＧＬ２−ＮＯＦ）（Ｃ６Ｌ）ｍＧｍＧｍＡｍＧｍＧＡｆＣＧ（ｓ）Ｇ（ｓ）ｍＣｍＧ（６ＧＬＹ）ｍＣｍＧｆＣｆＣｆＵｍＧｍＧｆＣｍＡｆＵｍＡｍＡｍＧｍＣｍＣｍＵｍＣｍＣｉＴ（配列番号３）
【０１６１】
ＲＢ５１５
ｍＵｍＵｍＡｍＵｍＧｍＣｍＣｍＡｍＧｍＧｍＣｍＧ（配列番号４）
［配列中、配列の略号は、以下を反映する：ｒＧ＝２’リボＧ；ｒＡ＝２’リボＡ；ｍＧ＝２’−Ｏ−メチルＧ；ｍＡ＝２’−Ｏ−メチルＡ；ｍＣ＝２’−Ｏ−メチルＣ；ｍＵ＝２’−Ｏ−メチルＵ；ｆＣ＝２’−フルオロＣ；ｆＵ＝２’−フルオロＵ；Ｇ＝２’−デオキシＧ；Ａ＝２’−デオキシＡ；ｉＴ＝反転デオキシチミジン；（ｓ）−ホスホロチオエート連結；（Ｃ６Ｌ）＝ヘキシルアミノリンカー；（６ＧＬＹ）＝ヘキサエチレングリコールリンカー（９−Ｏ−ジメトキシトリチル−トリエチレングリコール、１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイトを使用して組み込まれた。）；（ＰＥＧ４０ＫＧＬ２−ＮＯＦ）＝４０ｋＤａの分枝鎖状ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＧＳ２生成物）；（６ＦＡＭ）：６−カルボキシフルオレセイン］
【０１６２】
ＩＩＩ．抗酸化剤
一実施形態では、本発明の医薬製剤は、オリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートオリゴヌクレオチドおよび１つ以上の抗酸化剤を含む。これらのオリゴヌクレオチド製剤における使用のための抗酸化剤は、酸化可能な基質の濃度と比較して低い濃度で存在する場合に、その基質の酸化を著明に遅延させ、または防止する物質を含む。抗酸化剤は、酸化を完全には防止せず、単離において提供しうる利益は無視しうることが周知である。
【０１６３】
抗酸化剤は、それらの作用機構に従い、一次抗酸化剤または鎖切断型抗酸化剤および二次抗酸化剤または防止型抗酸化剤に広く群分けされうる。一次抗酸化剤は、フリーラジカルアクセプター／スカベンジャーとして作用し、自己酸化の開始ステップを遅延させ、もしくは阻害し、または自己酸化の伝搬ステップを中断させる。鎖切断剤またはフリーラジカル分離剤として作用する一次抗酸化剤の大半は、様々な環置換を伴うモノヒドロキシフェノールまたはポリヒドロキシフェノールである。
【０１６４】
特定の実施形態では、抗酸化剤は、一次抗酸化剤である。
【０１６５】
二次抗酸化剤または防止型抗酸化剤は、フリーラジカルを安定的分子へと転換しないので、一次抗酸化剤とは異なる。そうではなくて、二次抗酸化剤は、酸化促進剤または触媒である金属イオンのキレート剤として作用し、水素を一次抗酸化剤へと供与し、ヒドロペルオキシドを非ラジカル種へと分解し、一重項酸素を失活させ、紫外放射線を吸収し、または酸素スカベンジャーとして作用する。二次抗酸化剤は、一次抗酸化剤の抗酸化活性を増強することが多い。
【０１６６】
特定の実施形態では、抗酸化剤は、二次抗酸化剤である。
【０１６７】
金属のキレート化により二次抗酸化剤活性を呈示する化合物は、例えば、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸および酒石酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびリン酸誘導体（例えば、ポリリン酸およびフィチン酸）を含む。オリゴヌクレオチド製剤内に存在しうるキレート化剤の、その他非限定的な例は、ジカルボキシメチルグルタミン酸、エチレンジアミン二コハク酸（ＥＤＤＳ）、ジエチレントリアミンペンタ（リン酸メチレン）の七ナトリウム塩（ＤＴＰＭＰ．Ｎａ７）、リンゴ酸、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、シュウ酸、リン酸、極性アミノ酸（例えば、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、リシン、およびオルニチン）、シデロフォア（例えば、デスフェリオキサミンＢ）、コハク酸およびこれらの組合せを含む。
【０１６８】
特定の実施形態では、抗酸化剤は、キレート剤である。
【０１６９】
酸素スカベンジングにより二次抗酸化剤活性を呈示する化合物および還元剤は、例えば、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、エリソルビン酸、エリソルビン酸ナトリウムおよび亜硫酸ナトリウムを含む。
【０１７０】
一重項酸素クェンチングにより二次抗酸化剤活性を呈示する化合物は、例えば、カロテノイド（例えば、ｂ−カロテン、リコペンおよびルテイン）を含む。
【０１７１】
一実施形態では、抗酸化剤は、還元剤である。
【０１７２】
特定の実施形態では、還元剤は、フリーラジカルをスカベンジングするアミノ酸である。別の実施形態では、フリーラジカルをスカベンジングするアミノ酸は、ヒスチジン、システイン、トリプトファン、またはメチオニンである。抗酸化剤は、例えば、チオール（システイン、グルタチオン、チオグリセロールを含むがこれらに限定されない。）またはチオエーテル（メチオニン、Ｄ−メチオニン、Ｌ−メチオニン、Ｄ−エチオニン、Ｌ−エチオニン、３−メチルチオ−１，２−プロパンジオール、メチル−３−（メチルチオ）プロピオネート、２−（エチルチオ）エチルアミン、２−（メチルチオ）−エタノール、ブチオニン、Ｓ−メチル−Ｌ−システイン、Ｓ−メチル−Ｄ−システイン、Ｄ−メチオニノールおよびＬ−メチオニノール、ジアリルスルフィドおよびメチルチオエタンを含むがこれらに限定されない。）から選択されうる。ＷＯ９７／１４４３０は、親水性チオエーテルの、タンパク質およびペプチドによる水性製剤の保管安定性を延長する抗酸化剤としての使用について開示している。
【０１７３】
別の実施形態では、抗酸化剤は、鎖ターミネーターである。モノチオグリセロールは、オリゴヌクレオチド製剤内に存在しうる鎖ターミネーターの非限定的な一例を提示する。
【０１７４】
特定の実施形態では、抗酸化剤は、メチオニンである。
【０１７５】
別の特定の実施形態では、抗酸化剤は、アスコルビン酸ではない。
【０１７６】
本発明の医薬製剤における使用のための、その他適切な抗酸化剤は、限定を伴わずに述べると、アセトン−亜硫酸水素ナトリウム、パルミチン酸アスコルビル、亜硫酸水素ナトリウム、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、システイン、システインＨＣｌ、亜ジチオン酸ナトリウム、ゲンチジン酸、ゲンチジン酸エタノールアミド、グルタミン酸一ナトリウム、亜リン酸、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、ピロ亜硫酸カリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、亜硫酸ナトリウム、およびチオグリコール酸ナトリウムを含む。
【０１７７】
ＩＶ．他の構成要素
本発明の医薬製剤は、１つ以上のさらなる構成要素を含有しうる。このようなさらなる成分は、当然ながら、本発明の医薬製剤の全体的な安定性に有害な影響を及ぼすべきではない。
【０１７８】
一実施形態では、医薬製剤は、等張剤を含有する。当技術分野では、等張剤が周知であり、例えば、マンニトール、ＮａＣｌ、グルコースおよびスクロースを含む。
【０１７９】
本発明の医薬製剤は、１つ以上の緩衝剤、例えば、１つ以上の、医薬として許容される緩衝剤を含みうる。「緩衝剤」は、希釈時または酸もしくはアルカリの添加時におけるｐＨの変化に抵抗するのに使用される化合物を意味することが意図される。このような化合物は、例を目的として、限定を伴わずに述べると、酢酸、酢酸ナトリウム、アジピン酸、安息香酸、安息香酸ナトリウム、クエン酸、マレイン酸、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、乳酸、酒石酸、グリシン、メタリン酸カリウム、リン酸カリウム、一塩基性酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酒石酸ナトリウムならびに無水クエン酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム二水和物ならびに当業者に公知の他の化合物を含む。下記でさらに論じられる通り、製剤はまた、溶存酸素も含みうる。溶存酸素は、それ自体で製剤へと添加されるものではなく、除去されない限りにおいて、天然で存在する。
【０１８０】
Ｖ．製剤
本発明の医薬製剤は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含有し、場合によって、少なくとも１つの抗酸化剤を含有する、水性製剤であることが好ましい。
【０１８１】
水（例えば、注射用水またはＷＦＩ）は、好ましい溶媒であるが、水および１つ以上の他の水混和性溶媒（複数可）の混合物を含む他の溶媒も利用されうる。
【０１８２】
好ましい実施形態では、本発明の医薬製剤は、水の、医薬として許容されるアルコールなど、その他医薬として許容される溶媒との混合物を含む、水または他の溶媒を利用する医薬製剤である。
【０１８３】
溶液中のオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートオリゴヌクレオチド（例えば、ペグ化アプタマー）の濃度は、変化しうる。一実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲート（例えば、ペグ化アプタマー）の濃度は、約１ｍｇ／ｍＬから約５００ｍｇ／ｍＬである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲート（例えば、ペグ化アプタマー）の濃度は、約１ｍｇ／ｍＬから約３００ｍｇ／ｍＬである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲート（例えば、ペグ化アプタマー）の濃度は、約１ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲート（例えば、ペグ化アプタマー）の濃度は、約１ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬである。
【０１８４】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲート（例えば、ペグ化アプタマー）の濃度は、約１から約１０、約１０から約２０、約２０から約３０、約３０から約４０、約５０から約６０、約７０から約８０、約９０から約１００、約１００から約１１０、約１１０から約１２０、約１２０から約１３０、約１３０から約１４０、約１４０から約１５０、約１５０から約１６０、約１６０から約１７０、約１７０から約１８０、約１８０から約１９０、約１９０から約２００、約２００から約２１０、約２１０から約２２０、約２２０から約２３０、約２３０から約２４０、約２４０から約２５０、約２５０から約２６０、約２６０から約２７０、約２７０から約２８０、約２８０から約２９０、約２９０から約３００ｍｇ／ｍＬである。
【０１８５】
具体的な実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲート（例えば、ペグ化アプタマー）の濃度は、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９または約３０ｍｇ／ｍＬである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートの濃度は、約２４ｍｇ／ｍＬである。
【０１８６】
特定の実施形態では、コンジュゲートオリゴヌクレオチドは、ペグ化アプタマーであり、その溶液中の濃度は、約１から約１００、約１０から約５０、約１０から約３０、約２０から約３０であり、より特定すれば、約２０から約２２、約２２から約２４、約２４から約２６、約２６から約３０または約３０ｍｇ／ｍＬである。
【０１８７】
具体的な実施形態では、ペグ化アプタマーは、ペグニバコギンであり、その溶液中の濃度は、約２０から約３０、約２０から約２２、約２２から約２４、約２４から約２６、約２６から約２８、約２８から約３０であり、またはより具体的には、約２４ｍｇ／ｍＬである。
【０１８８】
具体的な実施形態では、ペグ化アプタマーは、ＲＢ５７１であり、その溶液中の濃度は、約１から約３００、約１から約１００、約１０から約５０、約１０から約３０、約２０から約４０、約１０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬまたは約４０ｍｇ／ｍＬである。
【０１８９】
製剤は、本明細書で論じられるさらなる構成要素を含有しうる。存在する場合、等張剤の濃度は、変化しうる。等張剤は、製剤に体液と同じ浸透圧を付与する量で使用されうる。所望の効果を達成するのに必要な正確量は、製剤中のオリゴヌクレオチド治療剤の濃度など、当業者が精通している因子に依存しうる。
【０１９０】
例えば、等張剤の濃度は、例えば、約０．０１％から１０％（ｗ／ｖ）または約０．１から約１００ｍｇ／ｍＬ、例えば、約０．５から約７ｍｇ／ｍＬ、例えば、約１から約５ｍｇ／ｍＬでありうる。
【０１９１】
特定の実施形態では、マンニトールは、約０．５％から約７．５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは約４．０％から約５．５％（ｗ／ｖ）、例えば、約５．０％（ｗ／ｖ）または約５から約７５ｍｇ／ｍＬ、例えば、約４０から約５５ｍｇ／ｍＬの量で存在する。
【０１９２】
別の特定の実施形態では、ＮａＣｌは、約０．０５％から約１．２％（ｗ／ｖ）、より好ましくは約０．０８％から約１％（ｗ／ｖ）、例えば、約０．９％（ｗ／ｖ）の量または約０．５から約１２ｍｇ／ｍＬ、例えば、約８から約１０ｍｇ／ｍＬ、例えば、約３．６ｍｇ／ｍＬの量で存在する。
【０１９３】
存在する場合、緩衝剤の濃度は、変化しうる。一実施形態では、濃度は、約５０ｍＭから約８０ｍＭ、約５５ｍＭから約７５ｍＭ、または約６０ｍＭから約７０ｍＭである。別の実施形態では、濃度は、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭまたは約１００ｍＭである。特定の実施形態では、緩衝剤の濃度は、約６６ｍＭである。
【０１９４】
Ａ．ｐＨの改変または低減
一実施形態では、本発明の医薬製剤は、当技術分野で公知のオリゴヌクレオチドコンジュゲートの製剤と比べて、ｐＨが改変されている（例えば、低減されている。）。
【０１９５】
一実施形態では、医薬製剤のｐＨは、約７以下である。特定の実施形態では、製剤のｐＨは、約７．０から６．５の間または約６．５から６．０の間である。別の特定の実施形態では、製剤のｐＨは、約７．０、約６．９、約６．８、約６．７、約６．６、約６．５、約６．４、約６．３、約６．２、約６．１または約６．０である。
【０１９６】
特定の実施形態では、医薬製剤のｐＨは、約６．８以下である。別の特定の実施形態では、医薬製剤のｐＨは、約６．８である。
【０１９７】
一実施形態では、本発明は、コンジュゲートオリゴヌクレオチド（例えば、コンジュゲートアプタマー）を含み、ｐＨが約７以下である医薬製剤である。
【０１９８】
好ましい実施形態では、本発明は、ペグニバコギンを含み、ｐＨが約７．０以下であり、より特定すれば、約６．８である医薬製剤である。
【０１９９】
別の好ましい実施形態では、本発明は、ＲＢ５７１を含み、ｐＨが約７．０以下である医薬製剤である。
【０２００】
例示的な実施形態では、本発明は、ペグニバコギンを含み、ｐＨが約７．０以下であり、より特定すれば、約６．８であり、様々な保管条件下における保存寿命が少なくとも約２４カ月間または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である医薬製剤である。例えば、保管条件は、温度により変化することが可能であり、限定を伴わずに述べると、約２℃から約８℃、約８℃から約２４℃または約２５℃から約３０℃の温度範囲を含む。
【０２０１】
本発明の他の実施形態では、製剤のｐＨは、改変または低減されない。一実施形態では、ｐＨは、約７を超える。一実施形態では、ｐＨは、約７．４以上である。
【０２０２】
Ｂ．溶存酸素レベル
本発明の医薬製剤の溶存酸素レベル（ＤＯ２）は、雰囲気レベルの場合もあり、改変レベル（例えば、低減レベル）の場合もある。
【０２０３】
一実施形態では、溶存酸素レベルは、雰囲気レベルである。溶存酸素を低減する処理を伴わなければ、溶存酸素レベルは、約５から約１０ｐｐｍの間である。一実施形態では、溶存酸素レベルは、約８から約１０ｐｐｍの間である。別の実施形態では、溶存酸素レベルは、約１０ｐｐｍである。
【０２０４】
特定の実施形態では、本発明は、ペグニバコギンを含み、雰囲気レベルの溶存酸素を有し、または、より特定すれば、約５から約１０ｐｐｍの間の溶存酸素を有する医薬製剤である。
【０２０５】
別の実施形態では、本発明の製剤は、改変（例えば、低減）レベルの溶存酸素を有する。溶存酸素レベルは、当技術分野で公知の任意の適切な方法により、所望のレベルへと改変（例えば、低減）されうる。例えば、溶存酸素レベルは、本明細書でさらに記載され、または当業者が精通している、不活性ガスパージングにより低減されうる。
【０２０６】
医薬製剤の改変レベルまたは低減レベルの溶存酸素は、例えば、約５．０から約４．５の間、約４．５から約４．０の間、約４．０から約３．５の間、約３．５から約３．０の間、約３．０から約２．５の間、約２．５から約２．０の間、約２．０から約１．５ｐｐｍの間、約１．０ｐｐｍから約０．５ｐｐｍの間、約０．５ｐｐｍから約０．１ｐｐｍの間、約０．１ｐｐｍから約０ｐｐｍの間でありうる。特定の実施形態では、溶存酸素レベルは、約２．０、約１．９、約１．８、約１．７、約１．６、約１．５、約１．４、約１．３、約１．２、約１．１、約１．０、約０．９、約０．８、約０．７、約０．６、約０．５、約０．４、約０．３、約０．２、約０．１ｐｐｍ未満であり、または約０ｐｐｍである。特定の実施形態では、溶存酸素レベルは、約０ｐｐｍまたはｐｐｍ以下である。
【０２０７】
特定の実施形態では、医薬製剤の溶存酸素レベルは、約５ｐｐｍ未満である。別の特定の実施形態では、溶存酸素レベルは、約４ｐｐｍ未満である。別の特定の実施形態では、溶存酸素レベルは、約３ｐｐｍ未満である。別の特定の実施形態では、溶存酸素レベルは、約２ｐｐｍ未満である。別の特定の実施形態では、溶存酸素レベルは、約１ｐｐｍ未満である。
【０２０８】
一実施形態では、本発明は、ペグ化アプタマーなどのコンジュゲートオリゴヌクレオチドを含み、溶存酸素レベルが約５ｐｐｍ未満、約４ｐｐｍ、約３ｐｐｍ、約２ｐｐｍまたは約１ｐｐｍである医薬製剤である。
【０２０９】
一実施形態では、本発明は、ペグニバコギンを含み、溶存酸素レベルが約５ｐｐｍ、約４ｐｐｍ、約３ｐｐｍ、約２ｐｐｍ、約１ｐｐｍ未満または約０ｐｐｍである医薬製剤である。
【０２１０】
一実施形態では、本発明は、ＲＢ５７１を含み、溶存酸素レベルが約５ｐｐｍ、約４ｐｐｍ、約３ｐｐｍ、約２ｐｐｍ、約１ｐｐｍ未満または約０ｐｐｍである医薬製剤である。
【０２１１】
Ｃ．ｐＨ／溶存酸素の低減
本発明の医薬製剤は、ｐＨが低減されており、雰囲気レベルの溶存酸素または、代替的に、改変レベルもしくは低減レベルの溶存酸素を有しうる。
【０２１２】
一実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲート（例えば、ペグ化アプタマー）を含み、ｐＨが低減されており、雰囲気レベルの溶存酸素を有する医薬製剤である。
【０２１３】
特定の実施形態では、医薬製剤は、ペグ化アプタマーを含み、この場合、製剤は、ｐＨが約７以下であり、または、より具体的には、約６．８であり、溶存酸素レベルが約５から約１０ｐｐｍの間である。
【０２１４】
好ましい実施形態では、本発明の医薬製剤は、ペグニバコギンを含み、この場合、製剤は、ｐＨが約７以下であり、または、より具体的には、約６．８であり、雰囲気レベルの溶存酸素を有し、または、より特定すれば、溶存酸素レベルが約５から約１０ｐｐｍの間である。この例示的な製剤は、例えば、約２℃から約８℃の間、約８℃から約２４℃の間、または約２５℃から約３０℃の間の保管温度を含む、多様な保管条件下における保存寿命が少なくとも約２４カ月間または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である。
【０２１５】
好ましい実施形態では、本発明の医薬製剤は、ＲＢ５７１を含み、この場合、製剤は、ｐＨが約７以下であり、または、より具体的には、約６．８であり、雰囲気レベルの溶存酸素を有し、または、より特定すれば、溶存酸素レベルが約５から約１０ｐｐｍの間である。この例示的な製剤は、例えば、約２℃から約８℃の間、約８℃から約２４℃の間、または約２５℃から約３０℃の間の保管温度を含む、多様な保管条件下における保存寿命が少なくとも約２４カ月間または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である。
【０２１６】
別の実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲート、例えば、ペグ化アプタマーを含み、ｐＨが低減されており、低減レベルの溶存酸素を有する医薬製剤である。
【０２１７】
特定の実施形態では、医薬製剤は、ペグ化アプタマーを含み、ｐＨが約７以下であり、溶存酸素レベルが約５ｐｐｍ未満または約２ｐｐｍである。
【０２１８】
さらなる特定の実施形態では、医薬製剤は、ペグ化アプタマーを含み、ｐＨが約６．８以下であり、溶存酸素レベルが約５ｐｐｍまたは約２ｐｐｍ以下である。
【０２１９】
さらに別の特定の実施形態では、医薬製剤は、ペグ化アプタマーを含み、ｐＨが約７以下であり、溶存酸素レベルが約１ｐｐｍ以下である。
【０２２０】
具体的な実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲート、例えば、ペグ化アプタマーを含み、ｐＨが約７以下であり、溶存酸素含量が約５ｐｐｍ未満であり、例えば、約２℃から約８℃、約８℃から約２４℃または約２５℃から約３０℃の温度で保管した場合を含む、様々な条件下における保存寿命が少なくとも約２４カ月間または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である医薬製剤である。
【０２２１】
具体的な実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲート、例えば、ペグ化アプタマーを含み、ｐＨが約７以下であり、溶存酸素含量が約２ｐｐｍ以下であり、約２℃から約８℃における保存寿命が少なくとも約２４カ月間または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である医薬製剤である。
【０２２２】
Ｄ．抗酸化剤
ある種の実施形態では、本発明の医薬製剤は、ペグ化オリゴヌクレオチドまたはペグ化アプタマーなどのオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートオリゴヌクレオチド、および少なくとも１つの抗酸化剤を含む。
【０２２３】
金属のキレート化により二次抗酸化剤活性を呈示する化合物は、例えば、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸および酒石酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＮＡ）およびリン酸誘導体（例えば、ポリリン酸およびフィチン酸）を含む。オリゴヌクレオチド製剤内に存在しうるキレート化剤の、その他非限定的な例は、ジカルボキシメチルグルタミン酸、エチレンジアミン二コハク酸（ＡＤＤＳ）、ジエチレントリアミンペンタ（リン酸メチレン）の七ナトリウム塩（ＤＴＰＭＰ．Ｎａ７）、リンゴ酸、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、シュウ酸、リン酸、極性アミノ酸（例えば、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、リシン、およびオルニチン）、シデロフォア（例えば、デスフェリオキサミンＢ）、コハク酸およびこれらの組合せを含む。
【０２２４】
特定の実施形態では、抗酸化剤は、キレート剤である。
【０２２５】
酸素スカベンジングにより二次抗酸化剤活性を呈示する化合物および還元剤は、例えば、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、エリソルビン酸、エリソルビン酸ナトリウムおよび亜硫酸ナトリウムを含む。
【０２２６】
一重項酸素クェンチングにより二次抗酸化剤活性を呈示する化合物は、例えば、カロテノイド（例えば、ｂ−カロテン、リコペンおよびルテイン）を含む。
【０２２７】
一実施形態では、抗酸化剤は、還元剤である。
【０２２８】
特定の実施形態では、還元剤は、フリーラジカルをスカベンジングするアミノ酸である。別の実施形態では、フリーラジカルをスカベンジングするアミノ酸は、ヒスチジン、システイン、トリプトファン、またはメチオニンである。抗酸化剤は、例えば、チオール（システイン、グルタチオン、チオグリセロールを含むがこれらに限定されない。）またはチオエーテル（メチオニン、Ｄ−メチオニン、Ｌ−メチオニン、Ｄ−エチオニン、Ｌ−エチオニン、３−メチルチオ−１，２−プロパンジオール、メチル−３−（メチルチオ）プロピオネート、２−（エチルチオ）エチルアミン、２−（メチルチオ）−エタノール、ブチオニン、Ｓ−メチル−Ｌ−システイン、Ｓ−メチル−Ｄ−システイン、Ｄ−メチオニノールおよびＬ−メチオニノール、ジアリルスルフィドおよびメチルチオエタンを含むがこれらに限定されない。）から選択されうる。ＷＯ９７／１４４３０は、親水性チオエーテルの、タンパク質およびペプチドによる水性製剤の保管安定性を延長する抗酸化剤としての使用について開示している。
【０２２９】
別の実施形態では、抗酸化剤は、鎖ターミネーターである。モノチオグリセロールは、オリゴヌクレオチド製剤内に存在しうる鎖ターミネーターの非限定的な一例を提示する。
【０２３０】
特定の実施形態では、抗酸化剤は、メチオニンである。
【０２３１】
別の特定の実施形態では、抗酸化剤は、アスコルビン酸ではない。
【０２３２】
他の適切な抗酸化剤は、限定を伴わずに述べると、アセトン−亜硫酸水素ナトリウム、パルミチン酸アスコルビル、亜硫酸水素ナトリウム、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、システイン、システインＨＣｌ、亜ジチオン酸ナトリウム、ゲンチジン酸、ゲンチジン酸エタノールアミド、グルタミン酸一ナトリウム、亜リン酸、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、ピロ亜硫酸カリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、亜硫酸ナトリウム、およびチオグリコール酸ナトリウムを含む。
【０２３３】
特定の実施形態では、本発明は、コンジュゲートオリゴヌクレオチドおよび少なくとも１つの抗酸化剤を含み、例えば、約２℃から約８℃、約８℃から約２４℃または約２５℃から約３０℃で保管した場合を含む、様々な保管条件下における保存寿命が少なくとも約２４カ月間または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である医薬製剤である。
【０２３４】
少なくとも１つの抗酸化剤の濃度は、変化しうる。特定の実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートオリゴヌクレオチド（例えば、ペグ化アプタマー）および約０．１０から約０．１５、約０．１５から約０．２０、約０．２０から約０．２５、約０．３０から約０．３５、約０．４０から約０．４５、または約０．４５から約０．５０％ｗ／ｗの抗酸化剤を含む医薬製剤である。
【０２３５】
抗酸化剤の濃度は、０．１％ｗ／ｗ未満でありうる。特定の実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートオリゴヌクレオチドおよび約０．０１から約０．１、約０．１０から約０．１５、約０．１５から約０．２０、約０．２０から約０．２５、約０．３０から約０．３５、約０．４０から約０．４５、または約０．４５から約０．５０％ｗ／ｗの抗酸化剤を含む医薬製剤である。
【０２３６】
特定の実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートオリゴヌクレオチドおよび約０．００１から約０．１、約０．１０から約０．１５、約０．１５から約０．２０、約０．２０から約０．２５、約０．３０から約０．３５、約０．４０から約０．４５、または約０．４５から約０．５０％ｗ／ｗの還元剤を含む医薬製剤である。
【０２３７】
さらなる特定の実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートオリゴヌクレオチド（例えば、ペグ化アプタマー）および約０．００１から約０．１、約０．１０から約０．１５、約０．１５から約０．２０、約０．２０から約０．２５、約０．３０から約０．３５、約０．４０から約０．４５、または約０．４５から約０．５０％ｗ／ｗのメチオニンを含む医薬製剤である。
【０２３８】
さらに別の特定の実施形態では、本発明は、約１から約１００ｍｇ／ｍＬのオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートオリゴヌクレオチド（例えば、ペグ化アプタマー）および約０．００１から約０．１、約０．１０から約０．１５、約０．１５から約０．２０、約０．２０から約０．２５、約０．３０から約０．３５、約０．４０から約０．４５、または約０．４５から約０．５０％ｗ／ｗのメチオニンを含む医薬製剤である。
【０２３９】
例示的な実施形態では、本発明は、約１から約１００ｍｇ／ｍＬのペグニバコギンおよび約０．００１から約０．１０、約０．１０から約０．１５、約０．１５から約０．２０、約０．２０から約０．２５、約０．３０から約０．３５、約０．４０から約０．４５、または約０．４５から約０．５０％ｗ／ｗのメチオニンを含む医薬製剤である。
【０２４０】
別の例示的な実施形態では、本発明は、約２０から約３０ｍｇ／ｍＬのペグニバコギンおよび約０．００１から約０．１０、約０．１０から約０．１５、約０．１５から約０．２０、約０．２０から約０．２５、約０．３０から約０．３５、約０．４０から約０．４５、または約０．４５から約０．５０％ｗ／ｗのメチオニンを含む医薬製剤である。
【０２４１】
なおさらなる具体的な実施形態では、本発明は、約２４ｍｇ／ｍＬのペグニバコギンおよび約０．００１から約０．１０、約０．１０から約０．１５、約０．１５から約０．２０、約０．２０から約０．２５、約０．３０から約０．３５、約０．４０から約０．４５、または約０．４５から約０．５０％ｗ／ｗのメチオニンを含む医薬製剤である。
【０２４２】
好ましい実施形態では、本発明は、約２４ｍｇ／ｍＬのペグニバコギンおよび約０．１０％ｗ／ｗのメチオニンを含む医薬製剤である。
【０２４３】
なおさらなる具体的な実施形態では、本発明は、約２４ｍｇ／ｍＬのＲＢ５７１および約０．００１から約０．１０、約０．１０から約０．１５、約０．１５から約０．２０、約０．２０から約０．２５、約０．３０から約０．３５、約０．４０から約０．４５、または約０．４５から約０．５０％ｗ／ｗのメチオニンを含む医薬製剤である。
【０２４４】
好ましい実施形態では、本発明は、約２４ｍｇ／ｍＬのＲＢ５７１および約０．１０％ｗ／ｗのメチオニンを含む医薬製剤である。
【０２４５】
Ｅ．抗酸化剤を含有し、ｐＨが改変もしくは低減されており、および／または雰囲気の溶存酸素レベルもしくは改変溶存酸素レベルを含有する製剤
ある種の実施形態では、医薬製剤は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲート（例えば、ペグ化アプタマー）および少なくとも１つの抗酸化剤（例えば、メチオニン）を含み、この場合、製剤は、ｐＨが改変もしくは低減されており、および／または雰囲気の溶存酸素レベルもしくは改変（例えば、低減）溶存酸素レベルを有する。
【０２４６】
一実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートオリゴヌクレオチド（例えば、ペグ化アプタマー）および少なくとも１つの抗酸化剤（例えば、メチオニン）を含み、ｐＨが改変または低減されている医薬製剤である。
【０２４７】
別の実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートオリゴヌクレオチド（例えば、ペグ化アプタマー）および少なくとも１つの抗酸化剤（例えば、メチオニン）を含み、雰囲気の溶存酸素レベルもしくは改変溶存酸素レベルもしくは低減溶存酸素レベル、例えば、約５ｐｐｍ未満の溶存酸素レベルを有する医薬製剤である。
【０２４８】
さらに別の実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートオリゴヌクレオチド（例えば、ペグ化アプタマー）を含み、ｐＨが約７以下であり、および／または雰囲気の溶存酸素レベルもしくは改変レベルもしくは低減レベルの溶存酸素、例えば、約５ｐｐｍ未満の溶存酸素を有する医薬製剤である。
【０２４９】
特定の実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートオリゴヌクレオチド（例えば、ペグ化アプタマー）および約０．１０から約０．１５、約０．１５から約０．２０、約０．２０から約０．２５、約０．３０から約０．３５、約０．４０から約０．４５、または約０．４５から約０．５０％ｗ／ｗの少なくとも１つの抗酸化剤（例えば、メチオニン）を含み、ｐＨが約７以下であり、および／または雰囲気の溶存酸素レベルもしくは低減された溶存酸素レベルを有し、低減溶存酸素レベルが約５ｐｐｍ未満、約４ｐｐｍ、約３ｐｐｍ  約２ｐｐｍ、約２．０から約１．５ｐｐｍの間、約１．０ｐｐｍから約０．５ｐｐｍの間、約０．５ｐｐｍから約０．１ｐｐｍの間、約０．１ｐｐｍから約０ｐｐｍの間である医薬製剤である。
【０２５０】
別の特定の実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートオリゴヌクレオチド（例えば、ペグ化アプタマー）および約０．００１から約０．１、約０．００５から約０．０５、約０．０１から約０．０５％ｗ／ｗまたは約０．００１、０．０１、０．０２５、０．０５または０．１％ｗ／ｗの少なくとも１つの抗酸化剤（例えば、メチオニン）を含み、ｐＨが約７以下であり、および／または雰囲気の溶存酸素レベルもしくは低減された溶存酸素レベルを有し、低減溶存酸素レベルが約５．０、約３．０、約２．０、約１．９、約１．８、約１．７、約１．６、約１．５、約１．４、約１．３、約１．２、約１．１、約１．０、約０．９、約０．８、約０．７、約０．６、約０．５、約０．４、約０．３、約０．２、約０．１ｐｐｍ未満もしくは約０ｐｐｍである医薬製剤である。
【０２５１】
さらなる特定の実施形態では、本発明は、コンジュゲートアプタマー（例えば、ペグ化アプタマー）および約０．００１から約０．１、約０．００５から約０．０５、約０．０１から約０．０５％ｗｔ／ｗｔまたは約０．００１、０．０１、０．０２５、０．０５または０．１％ｗ／ｗの少なくとも１つの抗酸化剤（例えば、メチオニン）を含み、ｐＨが約７以下であり、および／または雰囲気の溶存酸素レベルもしくは低減された溶存酸素レベルを有し、低減溶存酸素レベルが約５．０、約４．０、約３．０、約２．０、約１．９、約１．８、約１．７、約１．６、約１．５、約１．４、約１．３、約１．２、約１．１、約１．０、約０．９、約０．８、約０．７、約０．６、約０．５、約０．４、約０．３、約０．２、約０．１ｐｐｍ未満もしくは約０ｐｐｍである医薬製剤である。
【０２５２】
別の特定の実施形態では、本発明は、ペグニバコギンおよび約０．００１から約０．１、約０．００５から約０．０５、約０．０１から約０．０５％ｗ／ｗもしくは約０．００１、０．０１、０．０２５、０．０５または０．１％ｗｔ．／ｗｔ．の少なくとも１つの抗酸化剤（例えば、メチオニン）を含み、ｐＨが約７．０以下であり、および／または雰囲気の溶存酸素レベルもしくは低減された溶存酸素レベルを有し、低減溶存酸素レベルが約５．０、約４．０、約３．０、約２．０、約１．９、約１．８、約１．７、約１．６、約１．５、約１．４、約１．３、約１．２、約１．１、約１．０、約０．９、約０．８、約０．７、約０．６、約０．５、約０．４、約０．３、約０．２、約０．１ｐｐｍ未満もしくは約０ｐｐｍである医薬製剤である。
【０２５３】
さらに別の特定の実施形態では、本発明は、ペグニバコギンおよび約０．００１から約０．１、約０．００５から約０．０５、約０．０１から約０．０５％ｗ／ｗまたは約０．００１、０．０１、０．０２５、０．０５または０．１％ｗｔ．／ｗｔ．の少なくとも１つの抗酸化剤（例えば、メチオニン）を含み、ｐＨが約７．０以下であり、雰囲気の溶存酸素レベル、または、より特定すれば、約５から約１０ｐｐｍの溶存酸素レベルを有する医薬製剤である。
【０２５４】
例示的な実施形態では、本発明は、約１から約１００ｍｇ／ｍＬ、または、より特定すれば、約２０から約３０ｍｇ／ｍＬのペグニバコギンおよび約０．００１から約０．１、約０．００５から約０．０５、約０．０１から約０．０５％ｗ／ｗまたは約０．００１、０．０１、０．０２５、０．０５または０．１％ｗｔ．／ｗｔ．のメチオニンを含み、ｐＨが約７．０以下であり、雰囲気の溶存酸素レベル、または、より特定すれば、約５から約１０ｐｐｍの溶存酸素レベルを有する医薬製剤である。
【０２５５】
別の例示的な実施形態では、本発明は、約１から約１００ｍｇ／ｍＬ、または、より特定すれば、約２０から約３０ｍｇ／ｍＬのペグニバコギンおよび約０．００１から約０．１、約０．００５から約０．０５、約０．０１から約０．０５％ｗ／ｗまたは約０．００１、０．０１、０．０２５、０．０５または０．１％ｗｔ．／ｗｔ．のメチオニンを含み、ｐＨが約７．０以下であり、低減された溶存酸素レベル、または、より特定すれば、約５．０、約４．０、約３．０、約２．０、約２．０、約１．９、約１．８、約１．７、約１．６、約１．５、約１．４、約１．３、約１．２、約１．１、約１．０、約０．９、約０．８、約０．７、約０．６、約０．５、約０．４、約０．３、約０．２、約０．１ｐｐｍ未満もしくは約０ｐｐｍの溶存酸素レベルを有する医薬製剤である。
【０２５６】
具体的な実施形態では、本発明は、約２４ｍｇ／ｍＬのペグニバコギンおよび約０．０２５から約０．１％ｗ／ｗのメチオニンを含み、ｐＨが約７．０以下であり、雰囲気の溶存酸素レベルまたは低減された溶存酸素レベルを有し、低減溶存酸素レベルが約５．０ｐｐｍ未満である医薬製剤である。
【０２５７】
好ましい実施形態では、本発明は、医薬製剤である。好ましい実施形態では、本発明は、約２４ｍｇ／ｍＬのペグニバコギンおよび約０．１％ｗ／ｗのメチオニンを含み、ｐＨが約７．０以下であり、または、より具体的には、約６．８であり、雰囲気の溶存酸素レベル、または、より特定すれば、約５から約１０ｐｐｍの間の溶存酸素レベルを有する医薬製剤である。
【０２５８】
別の好ましい実施形態では、本発明は、医薬製剤である。好ましい実施形態では、本発明は、約２４ｍｇ／ｍＬのペグニバコギンおよび約０．１％ｗ／ｗのメチオニンを含み、ｐＨが約７．０以下であり、または、より特定すれば、約６．８であり、溶存酸素レベルが雰囲気レベルまたは約５から約１０ｐｐｍの間であり、例えば、約２℃から約８℃、約８℃から約２４℃または約２５℃から約３０℃の温度を含む、様々な保管条件下における保存寿命が少なくとも約２４カ月間であり、好ましくは、少なくとも約３６カ月間である医薬製剤である。
【０２５９】
なおさらなる好ましい実施形態では、本発明は、医薬製剤である。好ましい実施形態では、本発明は、約２４ｍｇ／ｍＬのペグニバコギンおよび約０．１％ｗ／ｗのメチオニンを含み、ｐＨが約７．０以下であり、または、より特定すれば、約６．８であり、溶存酸素レベルが雰囲気レベルまたは約５から約１０ｐｐｍの間であり、約２℃から約８℃、約８℃から約２４℃または約２５℃から約３０℃の温度における保管を含むがこれらに限定されない、様々な保管条件下における保存寿命が、当技術分野で公知のコンジュゲートオリゴヌクレオチド製剤または実施例１において開示される製剤と比べて、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、または約７５％以上改善された医薬製剤である。
【０２６０】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、約２４ｍｇ／ｍＬのペグニバコギンおよび約０．１％ｗ／ｗのメチオニンを含み、ｐＨが約７．０以下であり、または、より特定すれば、約６．８であり、低減された溶存酸素レベルを有し、より特定すれば、約５．０、約４．０、約３．０、約２．０、約１．０ｐｐｍ未満または約０ｐｐｍの溶存酸素レベルを有し、約２℃から約８℃、約８℃から約２４℃または約２５℃から約３０℃の温度における保管を含むがこれらに限定されない、様々な保管条件下における保存寿命が少なくとも約２４カ月間であり、または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である医薬製剤である。
【０２６１】
さらなる好ましい実施形態では、本発明は、約２４ｍｇ／ｍＬのペグニバコギンおよび約０．１％ｗ／ｗのメチオニンを含み、ｐＨが約７．０以下であり、または、より特定すれば、約６．８であり、低減された溶存酸素レベルを有し、より特定すれば、約５．０、約４．０、約３．０、約２．０、約１．０ｐｐｍ未満または約０ｐｐｍの溶存酸素レベルを有し、約２℃から約８℃、約８℃から約２４℃または約２５℃から約３０℃の温度における保管を含むがこれらに限定されない、様々な保管条件下における保存寿命が、実施例１の製剤または当技術分野で公知のオリゴヌクレオチド製剤と比べて、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、または約７５％以上改善された医薬製剤である。
【０２６２】
別の特定の実施形態では、本発明は、ＲＢ５７１および約０．００１から約０．１、約０．００５から約０．０５、約０．０１から約０．０５％ｗ／ｗまたは約０．００１、０．０１、０．０２５、０．０５または０．１％ｗｔ．／ｗｔ．の少なくとも１つの抗酸化剤（例えば、メチオニン）を含み、ｐＨが約７．０以下であり、および／または雰囲気の溶存酸素レベルもしくは低減された溶存酸素レベルを有し、低減溶存酸素レベルが約５．０、約４．０、約３．０、約２．０、約１．９、約１．８、約１．７、約１．６、約１．５、約１．４、約１．３、約１．２、約１．１、約１．０、約０．９、約０．８、約０．７、約０．６、約０．５、約０．４、約０．３、約０．２、約０．１ｐｐｍ未満もしくは約０ｐｐｍである医薬製剤である。
【０２６３】
さらに別の特定の実施形態では、本発明は、ＲＢ５７１および約０．００１から約０．１、約０．００５から約０．０５、約０．０１から約０．０５％ｗ／ｗまたは約０．００１、０．０１、０．０２５、０．０５または０．１％ｗｔ．／ｗｔ．の少なくとも１つの抗酸化剤（例えば、メチオニン）を含み、ｐＨが約７．０以下であり、雰囲気の溶存酸素レベル、または、より特定すれば、約５から約１０ｐｐｍの間の溶存酸素レベルを有する医薬製剤である。
【０２６４】
例示的な実施形態では、本発明は、約１から約１００ｍｇ／ｍＬ、または、より特定すれば、約２０から約３０ｍｇ／ｍＬのＲＢ５７１および約０．００１から約０．１、約０．００５から約０．０５、約０．０１から約０．０５％ｗ／ｗまたは約０．００１、０．０１、０．０２５、０．０５または０．１％ｗｔ．／ｗｔ．のメチオニンを含み、ｐＨが約７．０以下であり、雰囲気の溶存酸素レベル、または、より特定すれば、約５から約１０ｐｐｍの溶存酸素レベルを有する医薬製剤である。
【０２６５】
別の例示的な実施形態では、本発明は、約１から約１００ｍｇ／ｍＬ、または、より特定すれば、約２０から約３０ｍｇ／ｍＬのＲＢ５７１および約０．００１から約０．１、約０．００５から約０．０５、約０．０１から約０．０５％ｗ／ｗまたは約０．００１、０．０１、０．０２５、０．０５または０．１％ｗｔ．／ｗｔ．のメチオニンを含み、ｐＨが約７．０以下であり、低減された溶存酸素レベル、または、より特定すれば、約５．０、約４．０、約３．０、約２．０、約２．０、約１．９、約１．８、約１．７、約１．６、約１．５、約１．４、約１．３、約１．２、約１．１、約１．０、約０．９、約０．８、約０．７、約０．６、約０．５、約０．４、約０．３、約０．２、約０．１ｐｐｍ未満もしくは約０ｐｐｍの溶存酸素レベルを有する医薬製剤である。
【０２６６】
具体的な実施形態では、本発明は、約２４ｍｇ／ｍＬのＲＢ５７１および約０．０２５から約０．１％ｗ／ｗのメチオニンを含み、ｐＨが約７．０以下であり、雰囲気の溶存酸素レベルまたは低減された溶存酸素レベルを有し、低減溶存酸素レベルが約５．０ｐｐｍ未満である医薬製剤である。
【０２６７】
好ましい実施形態では、本発明は、医薬製剤である。好ましい実施形態では、本発明は、約２４ｍｇ／ｍＬのＲＢ５７１および約０．１％ｗ／ｗのメチオニンを含み、ｐＨが約７．０以下であり、または、より具体的には、約６．８であり、雰囲気の溶存酸素レベル、または、より特定すれば、約５から約１０ｐｐｍの間の溶存酸素レベルを有する医薬製剤である。
【０２６８】
別の好ましい実施形態では、本発明は、医薬製剤である。好ましい実施形態では、本発明は、約２４ｍｇ／ｍＬのＲＢ５７１および約０．１％ｗ／ｗのメチオニンを含み、ｐＨが約７．０以下であり、または、より特定すれば、約６．８であり、溶存酸素レベルが雰囲気レベルまたは約５から約１０ｐｐｍの間であり、例えば、約２℃から約８℃、約８℃から約２４℃または約２５℃から約３０℃の温度を含む、様々な保管条件下における保存寿命が少なくとも約２４カ月間であり、好ましくは、少なくとも約３６カ月間である医薬製剤である。
【０２６９】
なおさらなる好ましい実施形態では、本発明は、医薬製剤である。好ましい実施形態では、本発明は、約２４ｍｇ／ｍＬのＲＢ５７１および約０．１％ｗ／ｗのメチオニンを含み、ｐＨが約７．０以下であり、または、より特定すれば、約６．８であり、溶存酸素レベルが雰囲気レベルまたは約５から約１０ｐｐｍの間であり、約２℃から約８℃、約８℃から約２４℃または約２５℃から約３０℃の温度における保管を含むがこれらに限定されない、様々な保管条件下における保存寿命が、当技術分野で公知のコンジュゲートオリゴヌクレオチド製剤または実施例１において開示される製剤と比べて、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、または約７５％以上改善された医薬製剤である。
【０２７０】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、約２４ｍｇ／ｍＬのＲＢ５７１および約０．１％ｗ／ｗのメチオニンを含み、ｐＨが約７．０以下であり、または、より特定すれば、約６．８であり、低減された溶存酸素レベルを有し、より特定すれば、約５．０、約４．０、約３．０、約２．０、約１．０ｐｐｍ未満または約０ｐｐｍの溶存酸素レベルを有し、約２℃から約８℃、約８℃から約２４℃または約２５℃から約３０℃の温度における保管を含むがこれらに限定されない、様々な保管条件下における保存寿命が、少なくとも約２４カ月間であり、好ましくは、少なくとも約３６カ月間である医薬製剤である。
【０２７１】
さらなる好ましい実施形態では、本発明は、約２４ｍｇ／ｍＬのＲＢ５７１および約０．１％ｗ／ｗのメチオニンを含み、ｐＨが約７．０以下であり、または、より特定すれば、約６．８であり、低減された溶存酸素レベルを有し、より特定すれば、約５．０、約４．０、約３．０、約２．０、約１．０ｐｐｍ未満または約０ｐｐｍの溶存酸素レベルを有し、約２℃から約８℃、約８℃から約２４℃または約２５℃から約３０℃の温度における保管を含むがこれらに限定されない、様々な保管条件下における保存寿命が、実施例１の製剤または当技術分野で公知のオリゴヌクレオチド製剤と比べて、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、または約７５％以上改善された医薬製剤である。
【０２７２】
ＶＩ．調製法
本発明は、本発明の医薬製剤を調製するための方法を含む。
【０２７３】
一方法に従い、水性溶媒（または第１の水溶液）が提供される。水性溶媒は、例えば、浸透圧調整された緩衝液でありうる。ある種の実施形態では、提供される水性溶媒は、メチオニンを含有する。下記でさらに論じられる通り、水性溶媒の溶存酸素含量および／またはｐＨは、場合によって、改変されうる。
【０２７４】
この第１の方法に従い、オリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートがあらかじめ溶解した第２の水溶液の形態でもたらされる。第２の水溶液は、例えば、調製された緩衝液でありうる。水溶液中のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートの濃度は、必要に応じて、さらに溶液を添加することにより調整されうる。
【０２７５】
この第１の方法に従い、水性溶媒および第２の水溶液は、水性製剤を形成するように混合される。第１の溶液および第２の溶液は独立に、本明細書で記載される他の賦形剤および薬剤を含みうる。
【０２７６】
第２の調製法に従い、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、固体として、水性溶媒へと直接（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートを、溶解溶媒中に溶解させることにより、第２の水溶液をあらかじめ形成することなく）添加され、これにより、水性製剤を形成する。第２の方法の特定の実施形態では、水性溶媒（第１の溶液）は、メチオニンを含有する。メチオニンは、オリゴヌクレオチドと同時に、水性溶媒へと添加される場合もあり、水性製剤へと添加される、すなわち、オリゴヌクレオチドが水性溶媒へと添加された後で添加される場合もある。下記でさらに記載される通り、場合によって、水性溶媒および／または水性製剤のｐＨまたは溶存酸素レベルは、改変されうる。
【０２７７】
場合によって、緩衝液は、第１の溶液もしくは第２の溶液および／または水性製剤へと添加されうる。
【０２７８】
第１の実施形態では、本発明は、医薬製剤を調製する方法であって、（ａ）水性溶媒を供給するステップ；（ｂ）オリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートオリゴヌクレオチド（例えば、ペグ化アプタマー）を、水性溶媒へと添加して、水性製剤を形成するステップ；（ｃ）水性製剤を濾過して、濾過された水性製剤を形成するステップ；（ｄ）保管容器を、濾過された水性製剤で充填するステップ；および（ｅ）保管容器を密封して、ｐＨが約７以下であり、雰囲気の溶存酸素レベル、または、より特定すれば、約５から約１０ｐｐｍの溶存酸素レベルを有する医薬製剤をもたらすステップを含む方法である。
【０２７９】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、例えば、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートを、溶解溶媒へと添加することにより調製された水溶液の形態で、水性溶媒へと添加される。
【０２８０】
別の特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、固体の形態で、水性溶媒へと添加される。
【０２８１】
方法のこの第１の実施形態によりもたらされた医薬製剤は様々な保管条件下において、所望の保存寿命を有する。例えば、方法のこの第１の実施形態により調製された医薬製剤は、例えば、約２℃から約８℃、約８℃から約２４℃または約２５℃から約３０℃の温度における保管を含みうる様々な保管条件下において、少なくとも２４カ月間または少なくとも３６カ月間の保存寿命をもたらして有利である。
【０２８２】
場合によって、方法は、１つ以上のさらなるステップを伴う。一実施形態では、方法は、溶媒（溶解溶媒を含む）、水性製剤または濾過された水性製剤のｐＨを改変または低減するステップをさらに伴う。当技術分野では、溶液のｐＨを改変する方法が公知であり、溶液の生理学的に適合性の特徴を保存するのに適切な方法が使用される。組成物のｐＨは、例えば、緩衝剤、例えば、医薬として許容される緩衝剤を使用して改変されうる。上記で指し示された緩衝剤は、例を目的として、限定を伴わずに述べると、酢酸、酢酸ナトリウム、アジピン酸、安息香酸、安息香酸ナトリウム、クエン酸、マレイン酸、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、乳酸、酒石酸、グリシン、メタリン酸カリウム、リン酸カリウム、一塩基性酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酒石酸ナトリウムならびに無水クエン酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム二水和物ならびに当業者に公知の他の化合物を含む。リン酸緩衝液は、例えば、リン酸ナトリウム緩衝液および二塩基性リン酸ナトリウム二水和物緩衝液を含む。特定の実施形態では、ｐＨは、ＨＣｌ、ＮａＯＨならびに／または他の酸および塩基を使用して改変される。
【０２８３】
ｐＨは、方法の間において、１回以上にわたり改変されうる。特定の実施形態では、溶媒（溶解溶媒を含む）、水性製剤および／または濾過された水性製剤のうちの１つ以上のｐＨが改変される。
【０２８４】
特定の実施形態では、ｐＨは、ステップ（ａ）−（ｄ）のうちの１つ以上の前、これらの間および／またはこれらの後において改変される。特定の実施形態では、ｐＨは、オリゴヌクレオチドおよび緩衝液が、任意の濾過または後続の加工処理の前に併せて混合された後で改変される。
【０２８５】
場合によって、ｐＨは、当技術分野で公知の方法を使用する任意のｐＨ調整ステップの前、この間、および／またはこの後で測定されうる。
【０２８６】
第２の実施形態では、本発明の方法は、溶媒（溶解溶媒を含む）、水性製剤または濾過された水性製剤またはこれらの組合せの溶存酸素含量を改変するステップをさらに含む。溶存酸素レベルは、所望のレベルに達するまで、改変または低減されうる。当業者には、溶液中の溶存酸素レベルを改変するための方法が公知である。例えば、溶存酸素は、窒素ガスパージングなどの不活性ガスパージング手順により溶液から除去される場合もあり、真空脱気により溶液から除去される場合もある。
【０２８７】
特定の実施形態では、溶存酸素レベルは、窒素ガスパージングにより低減される。
【０２８８】
水性製剤および／または構成要素、例えば、バルク緩衝液は、１回または１回以上にわたりパージされうる。例えば、水溶液は、濾過の直前にパージされる場合もあり、および／または持続的な充填時を含む充填時にパージされる場合もある。また、ヘッドスペースも、パージされうる。特定の実施形態では、溶存酸素レベルはステップ（ａ）−（ｄ）のうちの１つ以上の前、これらの間において改変または低減される。一実施形態では、溶存酸素レベルは、作製バッチ内の全てのバイアルの標的溶存酸素レベルが実質的に同じとなるように制御される。一実施形態では、作製バッチの全てのバイアルの溶存酸素は、約２ｐｐｍ未満、約３−５ｐｐｍ、約４−６ｐｐｍ、約６−８ｐｐｍ、または約８−１０ｐｐｍである。溶存酸素は、バルク緩衝液、ヘッドスペース、濾過ラインをパージすることにより低減または制御されうる。溶存酸素はまた、バイアルの充填環境内およびバイアルのキャッピング環境内の溶存酸素を制御することによっても低減または制御されうる。
【０２８９】
特定の実施形態では、水性溶媒の溶存酸素レベルは、（ａ）において供給された後で改変される。
【０２９０】
別の特定の実施形態では、溶解溶媒の溶存酸素レベルは、水性製剤を形成する第２の水溶液が供給される前に、または水性製剤を形成する第２の水溶液が供給された後で改変される。
【０２９１】
さらに別の特定の実施形態では、水性製剤の溶存酸素レベルは、濾過の前に、濾過の間に、また濾過の後で改変される。
【０２９２】
なおさらなる実施形態では、濾過された水性製剤の溶存酸素レベルは、充填の前に、充填の間に、また充填の後で改変される。特定の実施形態では、濾過された水性製剤の溶存酸素レベルは、充填時に、オーバーレイを介して、および／または窒素でスパージングされた充填用アイソレーターを援用することにより改変される。
【０２９３】
特定の実施形態では、水性製剤は、濾過の直前に窒素ガスでパージされ、これに続いて、ヘッドスペースのパージングが施される。
【０２９４】
溶存酸素の測定値は、実施例２において概括される方法を含む、当業者が精通する方法により得られうる。
【０２９５】
この第２の実施形態に従い、本発明は、医薬製剤を調製する方法であって、（ａ）水性溶媒を供給するステップ；（ｂ）オリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートオリゴヌクレオチド（例えば、ペグ化アプタマー）を、水性溶媒へと添加して、水性製剤を形成するステップ；（ｃ）水性製剤を濾過して、濾過された水性製剤を形成するステップ；（ｄ）保管容器を、濾過された水性製剤で充填するステップ；および（ｅ）保管容器を密封して、低減された溶存酸素レベル、より特定すれば、約５ｐｐｍ、約４ｐｐｍ、約３ｐｐｍ、約２ｐｐｍ、約１ｐｐｍ未満または約０ｐｐｍの溶存酸素レベルを有する医薬製剤をもたらすステップを含む方法である。
【０２９６】
場合によって、方法の第２の実施形態は、例えば、第１の実施形態に関して上記で記載されたｐＨの改変を含む、１つ以上のさらなるステップを伴う。
【０２９７】
方法のこの第２の実施形態によりもたらされた医薬製剤は、様々な条件下において、所望の保存寿命を有する。例えば、方法のこの第１の実施形態により調製された医薬製剤は、例えば、約２℃から約８℃、約８℃から約２４℃または約２５℃から約３０℃の温度における保管を含みうる、様々な保管条件下において、少なくとも約２４カ月間または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間の保存寿命をもたらして有利である。
【０２９８】
第３の実施形態では、本発明は、医薬製剤を調製する方法であって、（ａ）少なくとも１つの抗酸化剤を含む水性溶媒を供給するステップ；（ｂ）オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲート（例えば、ペグ化アプタマーなどのペグ化オリゴヌクレオチド）を、水性溶媒へと添加して、水性製剤を形成するステップ；（ｃ）水性製剤を濾過して、濾過された水性製剤を形成するステップ；（ｄ）保管容器を、濾過された水性製剤で充填するステップ；および（ｅ）保管容器を密封するステップを含む方法である。
【０２９９】
一実施形態では、抗酸化剤は、還元剤である。
【０３００】
特定の実施形態では、抗酸化剤は、メチオニンである。
【０３０１】
第４の実施形態では、本発明は、医薬製剤を調製する方法であって、（ａ）水性溶媒を供給するステップ；（ｂ）オリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートオリゴヌクレオチドおよび少なくとも１つの抗酸化剤を、水性溶媒へと添加して、水性製剤を形成するステップ；（ｃ）水性製剤を濾過して、濾過された水性製剤を形成するステップ；（ｄ）保管容器を、濾過された水性製剤で充填するステップ；ならびに（ｅ）保管容器を密封して、約２℃から約８℃における保存寿命が少なくとも約２４カ月間、または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である医薬製剤をもたらすステップを含む方法である。
【０３０２】
特定の実施形態では、抗酸化剤は、還元剤である。
【０３０３】
別の特定の実施形態では、抗酸化剤は、メチオニンである。
【０３０４】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートオリゴヌクレオチドおよび少なくとも１つの抗酸化剤は、水性溶媒へと同時に添加される。
【０３０５】
別の特定の実施形態では、少なくとも１つの抗酸化剤は、水性製剤へと添加される、すなわち、オリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートオリゴヌクレオチドが水性溶媒へと添加された後で添加される。
【０３０６】
方法のこの第３のおよび第４の実施形態によりもたらされた医薬製剤は、様々な保管条件下において、所望の保存寿命を有する。例えば、方法のこの第１の実施形態により調製された医薬製剤は、例えば、約２℃から約８℃、約８℃から約２４℃または約２５℃から約３０℃の温度における保管を含みうる、様々な保管条件下において、少なくとも約２４カ月間または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間の保存寿命をもたらして有利である。
【０３０７】
第５の実施形態では、本発明は、医薬製剤を調製する方法であって、（ａ）水性溶媒および少なくとも１つの抗酸化剤（例えば、メチオニン）を供給するステップ；（ｂ）オリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートオリゴヌクレオチドを、水性溶媒へと添加して、水性製剤を形成するステップ；（ｃ）水性製剤を濾過して、濾過された水性製剤を形成するステップ；（ｄ）保管容器を、濾過された水性製剤で充填するステップ；ならびに（ｅ）保管容器を密封して、ｐＨが約７以下であり、および／または低減された溶存酸素含量を有する医薬製剤をもたらすステップを含む方法である。
【０３０８】
特定の実施形態では、溶存酸素含量は、スパージングまたは他の適切な方法により、１回以上にわたり低減される。医薬製剤の技術分野では、組成物をスパージングする方法が公知であり、本明細書で記載される製剤は、窒素などであるがこれらに限定されない、許容可能な医療用ガスでスパージングされうる。当業者には、その他許容可能な医療用ガスが公知である。製剤は、製造時における緩衝液のスパージング、または保管および／もしくは出荷のために、バイアルを充填および密封する前における液体のスパージングなど、製造工程の適切な時点においてスパージングされうる。製剤は、製造工程を通して持続的にスパージングされる場合もあり、酸素レベルを作製および保管に適するレベルに保つように、必要に応じて間欠的にスパージングされる場合もある。スパージングはまた、充填中のオーバーレイまたはブランケットに使用される場合もあり、充填ラインを格納する、窒素が充填されたアイソレーター内で使用される場合もある。一実施形態では、スパージングは、充填ステップを通してバイアル内の溶存酸素レベルを一定に維持するのに使用される。別の実施形態では、バイアルは、バイアルが開封されるまで、実質的に同じ溶存酸素レベルを維持するのに十分な程度に密封される。
【０３０９】
場合によって、第１の実施形態および第２の実施形態に関して上記で記載された通り、方法は、１回以上にわたりｐＨを調整するステップをさらに含む。
【０３１０】
方法のこの第６の実施形態によりもたらされる医薬製剤は、様々な保管条件下において、所望の保存寿命を有する。例えば、方法のこの第１の実施形態により調製された医薬製剤は、例えば、約２℃から約８℃、約８℃から約２４℃または約２５℃から約３０℃の温度における保管を含みうる、様々な保管条件下において、少なくとも２４カ月間または少なくとも３６カ月間の保存寿命をもたらして有利である。
【０３１１】
方法のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、変化しうる。方法の一実施形態では、オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ペグ化アプタマーである。
【０３１２】
例示的な実施形態では、本発明は、医薬製剤を調製する方法であって、（ａ）水性溶媒を供給するステップ；（ｂ）ペグ化アプタマーおよび少なくとも１つの抗酸化剤を、水性溶媒へと添加して、水性製剤を形成するステップ；（ｃ）水性製剤を濾過して、濾過された水性製剤を形成するステップ；（ｄ）保管容器を、濾過された水性製剤で充填するステップ；ならびに（ｅ）保管容器を密封して、ｐＨが約７以下であり、雰囲気の溶存酸素含量または低減された溶存酸素含量（例えば、約５ｐｐｍ未満）を有し、例えば、約２℃から約８℃、約８℃から約２４℃または約２４℃から約３０℃における保管を含む、様々な保管条件下における保存寿命が少なくとも約２４または少なくとも約３６カ月間である医薬製剤をもたらすステップを含む方法である。
【０３１３】
別の例示的な実施形態では、本発明は、医薬製剤を調製する方法であって、（ａ）少なくとも１つの抗酸化剤を含む水性溶媒を供給するステップ；（ｂ）オリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートオリゴヌクレオチドおよび少なくとも１つの抗酸化剤を、水性溶媒へと添加して、水性製剤を形成するステップ；（ｃ）水性製剤を濾過して、濾過された水性製剤を形成するステップ；（ｄ）保管容器を、濾過された水性製剤で充填するステップ；ならびに（ｅ）保管容器を密封して、ｐＨが約７以下であり、雰囲気の溶存酸素含量または低減された溶存酸素含量（例えば、約５ｐｐｍ未満）を有し、例えば、約２℃から約８℃、約８℃から約２４℃または約２４℃から約３０℃における保管を含む、様々な保管条件下における保存寿命が少なくとも約２４または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である医薬製剤をもたらすステップを含む方法である。
【０３１４】
具体的な実施形態では、オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ペグニバコギンである。
【０３１５】
例示的な実施形態では、本発明は、医薬製剤を調製する方法であって、（ａ）水性溶媒を供給するステップ；（ｂ）ペグニバコギンおよび少なくとも１つの抗酸化剤（例えば、メチオニン）を、水性溶媒へと添加して、水性製剤を形成するステップであり、ペグニバコギンは、水性溶媒へと、固体として添加される場合もあり、水溶液の形態で添加される場合もあり、抗酸化剤は、ペグニバコギンの前に添加される場合もあり、ペグニバコギンの後で添加される場合もあるステップ；（ｃ）水性製剤を濾過して、濾過された水性製剤を形成するステップ；（ｄ）保管容器を、濾過された水性製剤で充填するステップ；ならびに（ｅ）保管容器を密封して、ｐＨが約７以下であり、雰囲気の溶存酸素含量または低減された溶存酸素含量（例えば、約５ｐｐｍ未満）を有し、例えば、約２℃から約８℃、約８℃から約２４℃または約２４℃から約３０℃における保管を含む、様々な保管条件下における保存寿命が少なくとも約２４または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である医薬製剤をもたらすステップを含む方法である。
【０３１６】
別の例示的な実施形態では、本発明は、医薬製剤を調製する方法であって、（ａ）少なくとも１つの抗酸化剤を含む水性溶媒を供給するステップ（例えば、メチオニン）；（ｂ）ペグニバコギンを、水性溶媒へと添加して、水性製剤を形成するステップであり、ペグニバコギンは、水性溶媒へと、固体として添加される場合もあり、水溶液の形態で添加される場合もあり、抗酸化剤は、ペグニバコギンの前に添加される場合もあり、ペグニバコギンの後で添加される場合もあるステップ；（ｃ）水性製剤を濾過して、濾過された水性製剤を形成するステップ；（ｄ）保管容器を、濾過された水性製剤で充填するステップ；および（ｅ）保管容器を密封して、ｐＨが約７以下であり、雰囲気の溶存酸素含量または低減された溶存酸素含量（例えば、約５ｐｐｍ未満）を有し、例えば、約２℃から約８℃、約８℃から約２４℃または約２４℃から約３０℃における保管を含む、様々な保管条件下における保存寿命が少なくとも約２４または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である医薬製剤をもたらすステップを含む方法である。
【０３１７】
具体的な実施形態では、オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＲＢ５７１である。
【０３１８】
例示的な実施形態では、本発明は、医薬製剤を調製する方法であって、（ａ）水性溶媒を供給するステップ；（ｂ）ＲＢ５７１および少なくとも１つの抗酸化剤（例えば、メチオニン）を、水性溶媒へと添加して、水性製剤を形成するステップであり、ＲＢ５７１は、水性溶媒へと、固体として添加される場合もあり、水溶液の形態で添加される場合もあり、抗酸化剤は、ＲＢ５７１の前に添加される場合もあり、ＲＢ５７１の後で添加される場合もあるステップ；（ｃ）水性製剤を濾過して、濾過された水性製剤を形成するステップ；（ｄ）保管容器を、濾過された水性製剤で充填するステップ；ならびに（ｅ）保管容器を密封して、ｐＨが約７以下であり、雰囲気の溶存酸素含量または低減された溶存酸素含量（例えば、約５ｐｐｍ未満）を有し、例えば、約２℃から約８℃、約８℃から約２４℃または約２４℃から約３０℃における保管を含む、様々な保管条件下における保存寿命が少なくとも約２４または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である医薬製剤をもたらすステップを含む方法である。
【０３１９】
別の例示的な実施形態では、本発明は、医薬製剤を調製する方法であって、（ａ）少なくとも１つの抗酸化剤（例えば、メチオニン）を含む水性溶媒を供給するステップ；（ｂ）ＲＢ５７１を、水性溶媒へと添加して、水性製剤を形成するステップであり、ＲＢ５７１は、水性溶媒へと、固体として添加される場合もあり、水溶液の形態で添加される場合もあり、抗酸化剤は、ＲＢ５７１の前に添加される場合もあり、ＲＢ５７１の後で添加される場合もあるステップ；（ｃ）水性製剤を濾過して、濾過された水性製剤を形成するステップ；（ｄ）保管容器を、濾過された水性製剤で充填するステップ；および（ｅ）保管容器を密封して、ｐＨが約７以下であり、雰囲気の溶存酸素含量または低減された溶存酸素含量（例えば、約５ｐｐｍ未満）を有し、例えば、約２℃から約８℃、約８℃から約２４℃または約２４℃から約３０℃における保管を含む、様々な保管条件下における保存寿命が少なくとも約２４または、より好ましくは、少なくとも約３６カ月間である医薬製剤をもたらすステップを含む方法である。
【０３２０】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートの量もまた、変化しうる。方法の一実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートの濃度は、約１から約１００、約２０から約３０または約２４ｍｇ／ｍＬである。
【０３２１】
存在する場合、抗酸化剤の量もまた、変化しうる。方法の一実施形態では、抗酸化剤の量は、約０．００１から約１．０％ｗ／ｗ、または約０．０１から約０．５％ｗ／ｗである。具体的な実施形態では、抗酸化剤は、メチオニンであり、約０．００１から約１．０％％ｗ／ｗ、約０．０１から約０．５％ｗ／ｗ、約０．５から約０．２％ｗ／ｗ、または約０．１％ｗ／ｗで存在する。
【０３２２】
保管容器を、水性製剤で充填する前に、１つ以上のさらなるステップが施されうる。例えば、製剤は、適量の等張剤を使用して等張性とされうる。また、充填の前に、ｐＨおよび／またはオリゴヌクレオチド含量も決定されうる。ｐＨは、上記で記載された通りに決定されうる。オリゴヌクレオチド含量は、当業者に公知の方法に従い、例えば、ペグニバコギン含量に関して実施例１で記載された通りに決定されうる。
【０３２３】
本発明の医薬製剤は、典型的に、非経口製剤用に使用される容器を含む、製薬業界で一般に使用される容器であって、プラスチック容器または標準的なＵＳＰ／ＥＰ  Ｉ型ホウケイ酸ガラス容器などのガラス容器を含みうる容器内に保管されうる。例えば、使用される容器は、シリンジまたはバイアルでありうる。
【０３２４】
一実施形態では、バイアルは、窒素パージシステムを使用して、窒素パージ下で密封される。窒素パージシステムは、パッケージングシステムに、いくつかの異なる様式で、大きな利益をもたらしうる。１つの様式は、容器が、キャッピングされ、または他の形で密封される直前に、酸素を容器のヘッドスペースから除去することを介する。ヘッドスペース内の酸素を窒素ガスで置きかえることにより、パッケージングされる生成物は、いくつかの利点を得る。ボトルが窒素パージシステムを通過するとき、窒素ガスの噴射が、容器の開口部へと施される。次いで、容器は、速やかに、キャッピング機へと送り込まれて、密封され、ヘッドスペースは、酸素ではなく、窒素で満たされる。別の実施形態では、容器は、窒素を含有するアイソレーター内で充填されて、ヘッドスペースを、酸素ではなく、窒素で満たすように充填する。
【０３２５】
一実施形態では、保管容器は、止栓およびオーバーシールを有するバイアルである。特定の実施形態では、バイアルは、６ｍＬのガラスバイアルである。止栓は、オリゴヌクレオチドのほか、製剤の他の構成要素に適合性の止栓、例えば、ゴム止栓でありうる。非限定的例は、あらかじめ滅菌処理され、シリコン処理された、グレーの４４３２／５０ブチルゴム止栓およびＴｅｆｌｏｎ（登録商標）でコーティングされたグレーの４４３２／５０ブチルゴム止栓を含む。オーバーシールは、変化する場合があり、例えば、アルミニウムキャップおよび青色プラスチックのＦｌｉｐ−Ｏｆｆ（登録商標）開封明示オーバーシールから構築された、標準的なＦｌｉｐ−Ｏｆｆ（登録商標）オーバーシールを含む。
【０３２６】
一実施形態では、本発明は、本発明の医薬製剤を含有する容器を含む製品である。適切な容器は、上記で論じられている。
【０３２７】
本発明による水性製剤は、キットで提供されうる。
【０３２８】
ＶＩＩ．投与法および使用法
本発明の医薬製剤は、それを必要とする宿主へと投与される。宿主は、例えば、哺乳動物であり、より具体的には、ヒトでありうる。場合によって、医薬製剤は、使用前に希釈されうる（例えば、生理食塩液または滅菌注射用水を使用して）。
【０３２９】
一実施形態では、本発明は、それを必要とする宿主を処置するための方法であって、宿主へと、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲート（例えば、ペグ化アプタマー）およびメチオニンなど、１つ以上の還元剤を含むがこれらに限定されない少なくとも１つの抗酸化剤を含む医薬製剤を投与するステップを含む方法である。
【０３３０】
別の実施形態では、本発明は、それを必要とする宿主を処置するための方法であって、宿主へと、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲート（例えば、ペグ化アプタマー）を含み、ｐＨが約７以下である医薬製剤を投与するステップを含む方法である。
【０３３１】
特定の実施形態では、本発明は、それを必要とする宿主を処置するための方法であって、宿主へと、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲート（例えば、ペグ化アプタマー）を含み、ｐＨが約６．８である医薬製剤を投与するステップを含む方法である。
【０３３２】
さらなる実施形態では、本発明は、それを必要とする宿主を処置するための方法であって、宿主へと、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含み、雰囲気の溶存酸素レベルまたは低減された溶存酸素レベルを有し、低減溶存酸素レベルが約５ｐｐｍ未満である医薬製剤を投与するステップを含む方法である。
【０３３３】
なおさらなる実施形態では、本発明は、それを必要とする宿主を処置するための方法であって、宿主へと、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含み、ｐＨが約７以下であり、雰囲気の溶存酸素レベルまたは低減された溶存酸素レベルを有し、低減溶存酸素レベルが約５ｐｐｍ未満である医薬製剤を投与するステップを含む方法である。
【０３３４】
なおさらなる実施形態では、本発明は、それを必要とする宿主を処置するための方法であって、宿主へと、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートおよび少なくとも１つの抗酸化剤（例えば、メチオニンなどの還元剤）を含み、ｐＨが約７以下であり、または、より好ましくは、約６．８である医薬製剤を投与するステップを含む方法である。
【０３３５】
別の実施形態では、本発明は、それを必要とする宿主を処置するための方法であって、宿主へと、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートおよび少なくとも１つの抗酸化剤（例えば、メチオニンなどの還元剤）を含み、雰囲気の溶存酸素レベルまたは低減された溶存酸素レベルを有し、低減溶存酸素レベルが約５ｐｐｍ未満である医薬製剤を投与するステップを含む方法である。
【０３３６】
さらに別の実施形態では、本発明は、それを必要とする宿主を処置するための方法であって、宿主へと、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートおよび少なくとも１つの抗酸化剤（例えば、メチオニンなどの還元剤）を含み、ｐＨが約７以下であり、より好ましくは、約６．８であり、雰囲気の溶存酸素レベルまたは約５から約１０ｐｐｍの間の溶存酸素レベルを有する医薬製剤を投与するステップを含む方法である。
【０３３７】
好ましい実施形態では、本発明は、それを必要とする宿主を処置するための方法であって、宿主へと、ペグニバコギンおよびメチオニンを含み、ｐＨが約７以下であり、より好ましくは、約６．８であり、雰囲気の溶存酸素レベルまたは約５から約１０ｐｐｍの間の溶存酸素レベルを有する医薬製剤を投与するステップを含む方法である。
【０３３８】
好ましい実施形態では、本発明は、それを必要とする宿主を処置するための方法であって、宿主へと、ＲＢ５７１およびメチオニンを含み、ｐＨが約７以下であり、より好ましくは、約６．８であり、雰囲気の溶存酸素レベルまたは約５から約１０ｐｐｍの間の溶存酸素レベルを有する医薬製剤を投与するステップを含む方法である。
【０３３９】
場合によって、本発明の医薬製剤の投与に続いて、モジュレーターが、宿主へと投与される。
【０３４０】
宿主は、宿主に影響を及ぼす疾患または障害の結果として、処置を必要としうる。疾患または障害は、感染性の性格の場合もあり、非感染性の性格の場合もある。代表的な非感染性疾患および非感染性障害は、心血管疾患、がん、炎症性疾患および神経障害を含む。
【０３４１】
一実施形態では、宿主は、抗凝固を必要とする。特定の実施形態では、宿主は、不安定狭心症または心筋梗塞などの急性冠症候群を患っている。別の特定の実施形態では、宿主は、冠血行再建術手順を受けている。手順は、例えば、冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）術または経皮的冠動脈インターベンション（ＰＣＩ）でありうる。
【０３４２】
とりわけ、本発明の製剤は、ＣＡＢＧ術またはＰＣＩを受けている宿主において、アンチドート可逆性抗凝固剤として使用され、急性冠症候群を患う患者における使用のためのアンチドート可逆性抗凝固剤として使用され、抗凝固治療または抗血栓性治療のためのアンチドート可逆性薬剤を援用することが有利な、その他適応のための抗凝固剤として使用される可能性がある。本発明の医薬製剤が使用されうる障害および手順は、腸骨血管、頸動脈、上腕血管、大動脈、腎血管、腸間膜血管、大腿血管、膝窩血管、脛骨血管、および腹膜血管と関連する手順；深部静脈血栓症の防止または処置；整形外科術後における肺塞栓症またはがんを伴う患者における肺塞栓症の防止または処置；心房細動の防止；血栓性脳卒中の防止；ならびに血液透析および膜型人工肺を含むがこれらに限定されない、血液の体外循環を要求する適応を含む、末梢血管移植手順を含むがこれらに限定されない。本発明の製剤が使用されうる潜在的な障害および手順のさらなる例は、心肺バイパスにおける心内手術を受けている患者；心内凝血塊形成または末梢塞栓を伴う患者；および他の凝固亢進状態にある患者を含むがこれらに限定されない。本発明の製剤はまた、不動患者におけるＤＶＴおよび肺塞栓の防止ならびに静脈内留置カテーテルおよび動脈ラインまたは静脈ラインの開存性の維持にも有用でありうる。
【０３４３】
一実施形態では、宿主は、心臓弁膜症などの構造的心疾患を患っており、本発明は、経カテーテル大動脈弁置換術または移植術（ＴＡＶＲ／ＴＡＶＩ）を受けている宿主において、アンチドート可逆性抗凝固剤として使用されうる。
【０３４４】
オリゴヌクレオチドコンジュゲートがペグニバコギンの場合、用量の範囲は、適応に依存し、抗凝固など、所望の生理学的効果をもたらすのに十分な、有効量のＲＢ００６である。例えば、ＲＢ００６の用量は、ヒトにおいて、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇでありうる。ある種の適応では、用量範囲は、約０．５ｍｇ／ｋｇから約９ｍｇ／ｋｇ、約０．７５ｍｇ／ｋｇから約８ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇから約７ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇから約６．０ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇから約５．０ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇから約４．０ｍｇ／ｋｇである。特定の実施形態では、ＲＢ００６の用量は、約１．０ｍｇ／ｋｇである。ある種の適応では、薬物成分は、手順の開存性を維持するのに必要な用量で投与される。ある種の適応では、ＲＢ００６は、中和性アンチドートの後続の投与を伴わずに単独で投与される。
【０３４５】
ＲＥＧ１のアンチドート成分であるＲＢ００７の対応する用量は、ＲＢ００６を中和または部分的に中和するのに要求される治療有効量であり、投与されたＲＢ００６の量に依存する。一般に、治療有効量は、凝固モジュレーティング量または炎症モジュレーティング量を含むがこれらに限定されない、核酸リガンドの効果に対する測定可能なモジュレーションをもたらすのに十分なアンチドートの量である。アンチドート用量は、アンチドート：薬物重量比（アンチドートｍｇ：薬物ｍｇ）で、約０．１：１から約２０：１、約０．２５：１から約１５：１、約０．５：１から約１２：１、約０．７５から約１０：１、約１：１から約９：１、約１．５：１から約８：１、約２：１から約７．５：１、約２．５：１から約６：１、約３：１から約５：１の範囲にわたりうる。特定の実施形態では、アンチドート用量は、約０．５：１．０である。
【０３４６】
一実施形態では、本発明は、アプタマー抗凝固系の投与法であって、１）宿主の体格指数（ＢＭＩ）を測定するステップ；２）所望の薬力学応答を同定するステップ；および３）１ＢＭＩ当たりの用量の、薬力学応答に照らした比較に基づいて、所望の薬力学応答を達成する用量のペグ化アプタマーの医薬製剤を、宿主へと投与するステップを含む投与法を含む。ある種の実施形態では、アプタマーに対するアンチドートが、続いて宿主へと投与され、この場合、アンチドートの用量は、あらかじめ投与されたアプタマーの用量との比に基づき、アプタマー活性の所望の低減について調整されて施される。ある種の場合、このアンチドートの用量は、アプタマーの投与後の時間に基づいて調整される。ある種の場合、アプタマーが２４時間を超えた以前に投与されていれば、アプタマーに対するアンチドートの比は２分の１である。
【０３４７】
ある種の実施形態では、最高レベルの抗凝固効果が所望される。これらの場合、アプタマーは、４ｍｇ／ＢＭＩ以上のレベルで施されうる。他の場合、約７５％の最高レベルの抗凝固が所望される。これらの場合、約０．７５−１．５ｍｇ／ＢＭＩの間の用量が、宿主へと施される。他の場合、約５０％の最高レベルの抗凝固が所望される。これらの場合、約０．２５−０．５ｍｇ／ＢＭＩの用量が施される。
【０３４８】
ある種の一般的実施形態では、使用される抗凝固剤の投与量は、０．１から１０ｍｇ／ＢＭＩの間である。別の実施形態では、投与量は、０．２から８ｍｇ／ＢＭＩの間、または０．２から６ｍｇ／ＢＭＩの間、０．２から５ｍｇ／ＢＭＩの間、０．２から４ｍｇ／ＢＭＩの間、０．２から３ｍｇ／ＢＭＩの間、０．２から２ｍｇ／ＢＭＩの間、または０．２から１ｍｇ／ＢＭＩの間である。いくつかの実施形態では、抗凝固剤の用量は、約０．１ｍｇ／ＢＭＩ、または約０．２ｍｇ／ＢＭＩ、または約０．５ｍｇ／ＢＭＩ、または約０．７５ｍｇ／ＢＭＩ、または約１ｍｇ／ＢＭＩ、または約２ｍｇ／ＢＭＩ、または約３ｍｇ／ＢＭＩ、または約４ｍｇ／ＢＭＩ、または約５ｍｇ／ＢＭＩ、または約６ｍｇ／ＢＭＩ、または約７ｍｇ／ＢＭＩ、または約８ｍｇ／ＢＭＩ、または約９ｍｇ／ＢＭＩ、または約１０ｍｇ／ＢＭＩである。
【０３４９】
別の実施形態では、本発明は、アプタマー抗凝固系の改善された投与法であって、１）宿主の体重を測定するステップ；２）所望の薬力学応答を同定するステップ；および３）宿主の体重１キログラム当たりの用量の、薬力学応答に照らした比較に基づいて、所望の薬力学応答を達成する用量のアプタマー抗凝固剤を、宿主へと投与するステップを含む、改善された投与法を提供する。ある種の実施形態では、アプタマーに対するアンチドートが、続いて宿主へと投与され、この場合、アンチドートの用量は、あらかじめ投与されたアプタマーの用量との比に基づき、アプタマー活性の所望の低減について調整されて施される。ある種の場合、このアンチドートの用量は、アプタマーの投与後の時間に基づいて調整される。ある種の場合、アプタマーが２４時間を超えた以前に投与されていれば、アプタマーに対するアンチドートの比は２分の１である。
【０３５０】
ある種の実施形態では、最高レベルの抗凝固効果が所望される。これらの場合、アプタマーは、≧０．７５ｍｇ／ｋｇ以上のレベルで施されうる。他の場合、約７５％の最高レベルの抗凝固が所望される。これらの場合、０．４から０．６ｍｇ／ｋｇの間の用量が、宿主へと施される。他の場合、約５０％の最高レベルの抗凝固が所望される。これらの場合、約０．２−０．３ｍｇ／ｋｇの用量が施される。
【０３５１】
ある種の一般的実施形態では、使用される用量は、０．１から２ｍｇ／ｋｇの間、０．１から１．８ｍｇ／ｋｇの間、０．１から１．６ｍｇ／ｋｇの間、０．１から１．５ｍｇ／ｋｇの間、０．１から１．４ｍｇ／ｋｇの間、０．１から１．３ｍｇ／ｋｇの間、０．１から１．２ｍｇ／ｋｇの間、０．１から１．１ｍｇ／ｋｇの間、０．１から１．０ｍｇ／ｋｇの間、０．１から０．９ｍｇ／ｋｇの間、０．１から０．８ｍｇ／ｋｇの間、０．１から０．７ｍｇ／ｋｇの間、０．１から０．６ｍｇ／ｋｇの間、０．１から０．５ｍｇ／ｋｇの間、０．１から０．４ｍｇ／ｋｇの間、０．１から０．３ｍｇ／ｋｇの間、または０．１から０．２ｍｇ／ｋｇの間である。他の実施形態では、用量は、１から２０ｍｇ／ｋｇの間、１から１８ｍｇ／ｋｇの間、１から１５ｍｇ／ｋｇの間、２から１５ｍｇ／ｋｇの間、３から１５ｍｇ／ｋｇの間、４から１５ｍｇ／ｋｇの間、５から２０ｍｇ／ｋｇの間、５から１５ｍｇ／ｋｇの間、もしくは１から１０ｍｇ／ｋｇの間、または５から１０ｍｇ／ｋｇの間であり、または約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、もしくは約１０ｍｇ／ｋｇである。主要な実施形態では、アプタマー抗凝固系は、アプタマー抗凝固剤およびオリゴヌクレオチドアンチドートを含むＲＥＧ１系である。ある種の非限定的実施形態では、アプタマーは、ＲＢ００６（配列番号１）であり、アンチドートは、ＲＢ００７（配列番号２）である。一実施形態では、薬力学応答は、ａＰＴＴ（血漿または全血）または活性化凝固時間（ＡＣＴ）などの凝固アッセイにより測定され、絶対値、ベースラインの基準と比べて、またはこれに照らして標準化された効果、効果パーセント、変化パーセント、規定された時間にわたる、時間で重みづけされた平均または曲線下面積として報告されうる。
【０３５２】
好ましい実施形態では、本発明は、それを必要とする宿主を処置するための方法であって、宿主へと、ペグニバコギンおよびメチオニンを含み、ｐＨが約７以下であり、より好ましくは、約６．８であり、雰囲気の溶存酸素レベルまたは約５から約１０ｐｐｍの間の溶存酸素レベルを有し、ペグニバコギンの用量が１ｍｇ／ｋｇである医薬製剤を投与するステップを含む方法である。
【０３５３】
薬力学応答のレベルは、特定の適用に所望の任意のレベルでありうる。例えば、患者の血栓性事象に対する危険性が低いある種の場合、低レベルの応答が所望されうる。特定の場合、飽和量の抗凝固剤、特に、ＲＢ００６など、ＦＩＸａに対するアプタマーを使用することにより、凝固因子の阻害を最大化することは所望されず、特に、ＦＩＸまたはＦＩＸａの阻害を最大化することは所望されない可能性がある。患者の血栓性事象に対する危険性が高く、または患者が血栓性挿間を有する他の場合、高レベルの応答が所望されうる。このような場合、飽和量の抗凝固剤、特に、ＲＢ００６など、ＦＩＸａに対するアプタマーを使用することにより、凝固因子の阻害を最大化し、特に、ＦＩＸまたはＦＩＸａの阻害を最大化することが所望されうる。
【０３５４】
本発明の素材の、哺乳動物宿主への好ましい投与方式は、非経口投与方式、静脈内投与方式または皮下投与方式である。
【０３５５】
一実施形態では、オリゴヌクレオチド治療剤は、静脈内送達により施される。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド治療剤は、ボーラスの静脈内注入により施される。
【０３５６】
本明細書で記載される手順は、抗凝固剤およびアンチドートの両方の段階的な送達を可能として、化合物のうちの一方または両方の、所望のレベルの標的の阻害および反転への滴定を可能とする。
【０３５７】
別の実施形態では、糖尿病と一般に関連する血小板介在性障害など、多様な血小板介在性障害を処置するのに、ＲＢ５７１など、ＧＰＶＩアプタマーリガンドおよび対応するアンチドートであるＲＢ５１５の製剤が使用されうる。一実施形態では、糖尿病を患う対象を処置する方法であって、ＧＰＶＩリガンドの投与を含む方法が提供される。危険性の高い糖尿病性患者をＧＰＶＩリガンドで処置することにより、これらの患者における糖尿病関連障害を低減または防止することができる。これらの障害は、糖尿病性網膜症、糖尿病性血管障害、アテローム性動脈硬化、虚血性脳卒中、および慢性腎不全を含むがこれらに限定されない。ＧＰＶＩリガンドによる糖尿病患者の処置はまた、これらの患者における微小血栓形成も低減または阻害しうる。
【０３５８】
また、関節リウマチ（ＲＡ）または他の炎症性関節炎障害などの血小板介在性炎症性障害を患う対象を処置するための方法も提供される。近年の研究は、ＲＡおよび炎症性関節炎の他の形態を患う患者が、関節液中の血小板微粒子レベルを上昇させていることを示している（Ｂｏｉｌａｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１０、３２７：５８０−５８３）。血小板微粒子は、炎症促進性であり、周囲の細胞（例えば、滑膜線維芽細胞）からの炎症性応答を誘発する。例えば、ＩＶ型コラーゲンの、ＧＰＶＩへの結合は、ＩＬ−１およびＩＬ−８の放出を結果としてもたらす。
【０３５９】
ＧＰＶＩリガンド製剤はまた、強皮症または全身性硬化症を患う対象を処置するのにも使用されうる。強皮症は、コラーゲンの過剰産生と関連する、筋肉および関節における腫脹（炎症）をもたらす自己免疫応答として生じると考えられる。細小血管損傷は、全身性硬化症または強皮症に関与する主要な病原性過程のうちの１つである。全身性硬化症患者において進行中の細小血管損傷の結果としての、血小板Ｉ型コラーゲン受容体およびＩＩＩ型コラーゲン受容体（ＧＰＶＩ）の、露出された内皮下間質内のそのそれぞれのリガンドとの相互作用は、炎症促進性メディエーターの放出を伴う血小板の活性化および凝集を結果としてもたらし、血管損傷および炎症に寄与する（Ｃｈｉａｎｇら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、２００６、１１７：２９９−３０６）。全身性硬化症では、血管病変は、動脈内膜の増殖ならびに内皮細胞および基底膜の損耗を伴う細動脈および毛細血管の閉塞をもたらす、単核細胞浸潤を伴う細動脈−毛細血管間の血管周囲炎により特徴づけられる。内皮細胞もしくは基底膜またはこれらの両方への損傷の反復的パターンは、全身性硬化症の特徴である。加えて、これらの事象は、体内組織内のコラーゲンの過剰産生および蓄積により駆動され、全身における広範にわたる組織の硬化および瘢痕化をもたらす。したがって、ＧＰＶＩリガンドの使用は、コラーゲンレベルの上昇および血小板介在性細小血管損傷の増大と関連する強皮症または全身性硬化症など、疾患の治療的緩和をもたらしうる。本明細書では、治療有効量のＧＰＶＩリガンドを投与することにより、強皮症を患う対象を処置する方法が提示される。
【０３６０】
本明細書で開示されるＧＰＶＩリガンド製剤はまた、がんを伴うと診断された対象を処置するのにも使用されうる。近年の研究は、ＧＰＶＩが、腫瘍の転移を媒介することを示唆する（例えば、Ｊａｉｎら、Ｊ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、２００９、７：１７１３−１７１７を参照されたい。）。インビボ実験による転移アッセイを使用して、Ｊａｉｎらは、ＧＰＶＩノックアウトマウスが、野生型対照マウスと比較して、腫瘍の転移の著明な減少を呈示したことを示している。したがって、一実施形態では、原発性がん性腫瘍を有すると診断された対象における転移を阻害し、低減し、または防止するための方法であって、対象が治療有効量のＧＰＶＩリガンドを投与される方法が提供される。
【０３６１】
ＧＰＶＩ核酸リガンド製剤はまた、抗血小板治療を要求する障害または処置レジメにおける使用のための、モジュレート可能な抗血小板剤としても提供される。ある種の実施形態では、処置は、外科的介入である。使用法は、ＧＰＶＩ核酸リガンドを、それを必要とする宿主へと投与するステップを含むことが可能であり、この場合、宿主は、冠血管系、脳血管系または末梢血管系の閉塞性血栓性疾患または閉塞性血栓性障害を患っており、またはこれらを患う危険性がある。
【０３６２】
一実施形態では、ＧＰＶＩリガンドは、血小板活性化の誘発を阻害する。他の実施形態では、ＧＰＶＩリガンドは、血小板活性化および結果として生じる血小板の炎症促進性応答を阻害する。他の実施形態では、ＧＰＶＩリガンドは、血小板の接着を阻害する。他の実施形態では、ＧＰＶＩリガンドは、血小板凝集を阻害する。なおさらなる実施形態では、ＧＰＶＩリガンドは、トロンビンの産生を阻害する。
【０３６３】
一実施形態では、宿主は、冠血管系、脳血管系および末梢血管系の閉塞性血栓性疾患を有し、またはこれらを有する危険性がある。ある種の他の実施形態では、宿主は、外科的介入を受ける準備をしており、もしくはこれを受けており、または宿主を閉塞性血栓性事象の危険性に置く外科的介入を受けている。他の実施形態では、宿主は、血液透析を可能とするように、血管移植を受けており、これは、血管および血小板の間の相互作用に起因する閉塞の危険性がある。
【０３６４】
ある種の実施形態では、血管事象、特に、血栓性事象または血栓塞栓性事象を処置する方法またはこの形成を防止する方法であって、本発明のＧＰＶＩ核酸リガンドを、それを必要とする宿主へと投与するステップを含む方法が提供される。
【０３６５】
一実施形態では、ＧＰＶＩ核酸リガンド製剤は、長期間にわたり施される。この場合、救急状況では、例えば、処置が、頭蓋内出血または消化管内出血を含む出血をもたらすときは、ＧＰＶＩリガンドモジュレーターだけが使用されうる。別の実施形態では、ＧＰＶＩ核酸リガンド処置を受けた患者に救急手術が要求される場合、モジュレーターが投与される。別の実施形態では、モジュレーターは、ＧＰＶＩ核酸リガンドの濃度を制御し、これにより、処置の持続時間および強度を制御するように投与される。別の実施形態では、ＧＰＶＩ核酸リガンド製剤は、心肺バイパス手順における血小板麻酔剤として施される。別の実施形態では、ＧＰＶＩ核酸リガンド製剤は、経口抗血小板薬からの移行期間または経口抗血小板薬への移行期間をもたらすように投与され、モジュレーターは、経口抗血小板剤の治療レベルが確立されたら、ＧＰＶＩ核酸リガンドを反転するのに使用される。
【０３６６】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチド治療剤は、静脈内送達により施され、モジュレーターは、静脈内送達により施される。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド治療剤およびモジュレーターのいずれも、ボーラスの静脈内注入により施される。
【０３６７】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチド治療剤およびモジュレーターは、異なる投与方式により施される。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド治療剤は、皮下投与され、モジュレーターは、静脈内投与される。
【０３６８】
アプタマーに対するアンチドートの比は、アプタマーに対する阻害の所望のレベルに基づいて調整される。アンチドート用量は、アプタマーの用量と相関しさえすればよく、加えて、宿主に関する因子に基づいて調整される必要はないことが判明した。一実施形態では、アプタマーのアンチドートに対する比は、１：１である。他の実施形態では、アプタマーのアンチドートに対する比は、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１以上など、約１：１を超える。これらの比はまた、アプタマーに対するアンチドート比に基づいても計算される場合もあり、例えば、約０．９：１または約０．９：１、０．８：１または約０．８：１、０．７：１または約０．７：１、０．６：１または約０．６：１、０．５：１または約０．５：１、０．４５：１または約０．４５：１、０．４：１または約０．４：１、０．３５：１または約０．３５：１、０．３：１または約０．３：１、０．２５：１または約０．２５：１、約０．２：１または約０．２：１、０．１５：１または約０．１５：１、０．１：１または約０．１：１または約０．００５：１以下など、０．１：１未満など、約１：１未満でありうる。いくつかの実施形態では、比は、約０．５：１から約０．１：１の間、または約０．５：１から約０．２：１の間、または約０．５：１から約０．３：１の間である。他の実施形態では、比は、約１：１から約５：１の間、または約１：１から約１０：１の間、または約１：１から約２０：１の間である。
【０３６９】
いくつかの実施形態では、アプタマー活性の部分的反転だけが生じる。例えば、いくつかの実施形態では、アプタマー活性は、約９０％、または約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％以下など、約９０％未満反転される。アプタマーに対するアンチドートの比は、重量対重量ベースで比較することにより計算される場合もあり、モルベースで比較することにより計算される場合もある。
【０３７０】
好ましい実施形態では、本発明は、抗凝固を必要とする宿主を処置するための方法であって、ペグニバコギンおよびメチオニンを含み、ｐＨが約７以下であり、より好ましくは、約６．８であり、雰囲気の溶存酸素レベルまたは約５から約１０ｐｐｍの間の溶存酸素レベルを有する医薬製剤を宿主へと投与するステップを含む方法である。
【０３７１】
本明細書で参照される全ての特許および特許公開は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３７２】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するために使用されるものであり、限定的であると考えられるべきではない。
【実施例】
【０３７３】
［実施例１］  注射液ペグニバコギン原薬の製剤化
注射用のペグニバコギン（ＲＢ００６）（「ペグニバコギン注射液」または「注射液ペグニバコギン」）は、以下の通りに、ＧＭＰ条件下で無菌的に製造された。ｐＨ７．４の製剤緩衝液は、リン酸ナトリウム緩衝液により調製され、２９０±３０ｍＯｓｍ／Ｋｇの標的オスモル濃度をもたらすように、適量の塩化ナトリウムを使用して、等張性とされた。次いで、製剤は、０．２２ｕｍのフィルターを介して濾過された。ＲＢ００６は、２１ｍｇ／ｍＬの名目濃度を達成するように、製剤緩衝液へと添加された。バルク医薬品溶液の製剤化の間、溶液は、Ｎ２ガスでパージされた。バルク溶液が調製され、アッセイ値がｐＨ、オスモル濃度およびＲＢ００６含量についての工程内規格を満たした後、生成物は、無菌的に濾過され、あらかじめ滅菌処理された部材内に充填された。
【０３７４】
容器施栓のためのバイアル、止栓およびオーバーシールは、ペグニバコギン注射液の中性ｐＨに基づき、標準的な市販部材から選択された。全てのバッチに利用されるガラスバイアルは、処理済のＩ型ホウケイ酸ガラスであり、６ｍＬのバイアルは、ヘッドスペースを低減するように作製された。施栓は、あらかじめ滅菌処理され、シリコン処理された、グレーの４４３２／５０ブチルゴム止栓によりなされた。アルミニウムキャップおよび青色プラスチックのＦｌｉｐ−Ｏｆｆ（登録商標）開封明示オーバーシールから構築された、標準的なＦｌｉｐ−Ｏｆｆ（登録商標）オーバーシールが利用された。
【０３７５】
以下では、ペグニバコギンの例示的な製剤が提示される。
【０３７６】
【表１】
2016506389.tif 000017
【０３７７】
合計で、７つのバッチが作製され、２−８℃で最長３６カ月間の保管条件において、２５℃で少なくとも６カ月間にわたる加速化された保管についての安定性データが収集された。バルク医薬品溶液中で測定された（実施例２で記載される通りに測定された）溶存酸素（ＤＯ２）レベルは、バルク医薬品溶液中で測定される、１．７から４．７ｐｐｍの範囲内に収まった。
【０３７８】
［実施例２］  解析法
【０３７９】
Ａ．ＵＶアッセイ
製剤開発時におけるアッセイ測定は、希釈された（０．１ｍｇ／ｍＬ）製剤試料の、２５９ｎｍにおける吸光度を測定する、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＵＶ分光光度計を使用して実施された。２５９ｎｍにおける吸光度を、ＲＢ００６濃度（ｍｇ／ｍＬ）へと変換するのに、あらかじめ決定された減衰係数およびＡＰＩについての純度補正が使用された。
【０３８０】
Ｂ．アニオン交換（ＡＸ−ＨＰＬＣ）による純度
トリスアセトニトリル緩衝液中で増大させるＮａＣｌの塩勾配を使用する、ペグニバコギンのアニオン交換（ＡＸ−ＨＰＬＣ：ａｎｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）は、Ｄｉｏｎｅｘ  ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ−１００（４．０×２５０ｍｍ）カラムを使用して実施された。ＵＶの検出は、２０μＬの注入容量、１．２ｍＬ／分の流量および２０分間の試行時間を使用して、２５９ｎｍにおいて達成される。
【０３８１】
方法は、ペグニバコギンに特異的であり、ペグニバコギン、近縁物質、未知の不純物および分解物の間で弁別されうる。方法は、合成により調製された、複数のＮ＋１誘導体およびＮ−１誘導体、分解生成物および分子量を２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、および６０ｋＤａとするペグ化ペグニバコギン種を分解することが示されている。
【０３８２】
ペグニバコギンのＡＰＩロット番号：Ｒ０１ＡＺ０８００１またはＲ０１ＡＺ０８００２は、ＨＰＬＣ解析についての対照として利用された。データ表中で言及される場合、溶存酸素は、希釈およびＨＰＬＣ解析のために試料を回収する前に、安定性試料から測定された。製剤は、ＡＸ−ＨＰＬＣに従うペグニバコギンの純度解析のために、ＰＢＳ中で約０．１ｍｇ／ｍＬへと２００倍に希釈された。
【０３８３】
Ｃ．イオン対合ＨＰＬＣによる純度解析
イオン対合ＨＰＬＣ（ＩＰ−ＨＰＬＣ）は、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ３００  Ｃ４カラム（４．６×１００ｍｍ、３．５μｍ）を使用して実施された。検出は、２５９ｎｍにおけるＵＶを介する。方法は、ＱＣ−ＦＰＭ−０２０４と同等である。
【０３８４】
Ｄ．メチオニンアッセイ
ＨＰＬＣは、Ｗａｔｅｒｓ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ２．１×５０ｍｍ  １．７μｍカラムを使用して、３５℃、１μＬの注入量で実施され、３分間の検出にわたる勾配溶出は、２１０ｎｍにおけるＵＶを介する。方法は、低減され、酸化されたメチオニンを検出することが可能である。
【０３８５】
Ｅ．活性アッセイ
このアッセイは、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ  Ｓｔａｒｔ  ４手動型凝固計、被験基質としてのプールされた正常ヒト血漿（例えば、ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＭＤＡ  Ｖｅｒｉｆｙ  １血漿）およびＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＭＤＡ  ＡｕｔｏａＰＴＴ試薬を使用して実施された。ペグニバコギンは、希釈され、被験血漿へと添加され、次いで、ａＰＴＴ試薬が添加され、血漿が凝固するのに要求される時間が測定された。被験ペグニバコギンの濃度範囲にわたり、ペグニバコギンは、十分に規定された飽和用量反応曲線をもたらした。
【０３８６】
Ｆ．溶存酸素の測定値
溶存酸素の測定値は、販売元の指示書に従い、外部データロガーへと接続され、１４０μｍのシリカ光ファイバー酸素マイクロセンサー（ＰｒｅＳｅｎｓ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  ＧｍｂＨ、Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ  Ｍｉｃｒｏｎ  ＴＸ３、Ｊｏｓｅｆ−Ｅｎｇｅｒｔ−Ｓｔｒ．１１、Ｄ−９３０５３  Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ、２００６）を装備された、Ｍｉｃｒｏｘ  ＴＸ３酸素計を使用して得られた。酸素マイクロセンサーは、検出限界を２０ｐｐｂとする、０から２２．５ｐｐｍの範囲で測定することが可能である。精度は、１００％の空気飽和では、±１％であり、１％の空気飽和では、±０．１％である。センサーは、調製されたばかりの較正標準物質を使用して較正された。
【０３８７】
［実施例３］  ペグニバコギン注射液についての強制分解研究
酸化ストレス条件をシミュレートする１％のＨ２Ｏ２の存在下において実行される強制分解研究は、ＲＢ００６の著明なクロマトグラフィーテーリングと共に、メインピークのピーク面積の低減を裏付けた。３．６Ｍルクス時間（ＩＣＨ  Ｑ１Ｂによる推奨の３倍）の曝露を伴う、シミュレートされたＵＶストレスの後で、同様の結果が得られた。メインピーク面積の減少および両側における広がりは、不純物量の約５％の増大を結果としてもたらしたので、ペグニバコギンはまた、６０℃で１６時間へと露出される場合に観察された通り、熱ストレスも受けやすかった。分解は、ＰＥＧの分解に起因する分子量の減少と符合した。
【０３８８】
過酸化物の存在下では、面積の低減（対照に対して９４．４６％面積対９８．１６％面積）およびメインピークの前側におけるピークの広がりにより証拠立てられる通り、まずＰＥＧ部分に酸化損傷が生じた後、オリゴヌクレオチド部分に対する損傷が生じたと推定された。
【０３８９】
ＵＶストレス（３６０万ルクス時間）または熱ストレス（２４時間、６０℃、光から保護された）の存在下で、クロマトグラムは、酸化ストレスを受けた試料と同様の、メインピークの広がりを伴うパターンを示したが、予測される通り、はるかに遅い速度においてであった。
【０３９０】
［実施例４］  製剤開発：研究１
【０３９１】
Ａ．緩衝液の調製
ｐＨ６．０、６．５、７．０および７．４のリン酸緩衝液は、滅菌注射用水を使用して、６６ｍＭのリン酸濃度（臨床用製剤と同等の）で、フィルター処理された窒素ガスでパージされ、次いで、０．２ミクロンのＰＶＤＦ  Ｄｕｒａｐｏｒｅフィルターを介して個別に濾過されて調製された。バルク緩衝液は、製剤の製造時となるまで、ヘッドスペース内に任意選択の窒素ガスオーバーレイを伴って保管された。
【０３９２】
Ｂ．要因計画製剤
表１に示される通り、１１の異なる製剤デザインを通して、以下の変数：ペグニバコギン濃度、ｐＨ、メチオニン、およびＥＤＴＡが探索された。加えて、表２に示される通り、追補製剤において、モノチオグリセロールの使用、３つの異なる止栓種類、２つのバイアル種類および溶存酸素レベルが査定された。
【０３９３】
【表２】
2016506389.tif 000018
【０３９４】
【表３】
2016506389.tif 000019
【０３９５】
Ｃ．製剤の調製
塩化ナトリウムなどの製剤賦形剤および様々な抗酸化剤が秤量され、あらかじめ洗浄され、オートクレーブ処理され、ラベル付けされたジャー内で、所定量の指定緩衝液へと添加され、これと混合された。バルク溶液の窒素パージングは、製造を通して、可能な工程で実行された。ペグニバコギン含量についての工程内アッセイは、２５９ｎｍにおけるＵＶ吸光度を測定し、使用されるペグニバコギンのＡＰＩロットの純度についての以下の計算補正を使用することにより決定された。
【０３９６】
【数１】
2016506389.tif 000020
工程内アッセイ値が許容可能であれば、ｐＨおよびオスモル濃度が記録された。アッセイ値が大きすぎれば、以下の式に従い、標的値まで希釈するために添加するように要求される緩衝液の量が計算された。
【０３９７】
溶液の正味重量（ｇ）×［（アッセイ−標的）／標的］＝十分量まで添加する緩衝液の量
【０３９８】
最終的なアッセイ決定の後、バルク溶液は、窒素ガスで約１０分間にわたりパージされ、ヘッドスペースは、少なくともさらに５分間にわたりパージされた。時間は、窒素ガスによる同様なレベルのパージングを得るように、異なるバッチサイズに応じて調整される場合がある。溶液は、０．２μｍのシリンジフィルターを介して、滅菌処理された充填用の受容ジャーへと濾過された。いずれの研究でも、濾過された製剤バルクは、窒素ガスによる充填時にパージされた。バルクをパージする間、各空バイアルは、あらかじめフィルター処理された窒素ガスでパージされた後、充填、窒素オーバーレイ、止栓の挿入およびアルミニウムのフリップオフオーバーシールの圧着を施した。この工程が発生させた溶存酸素は、≦２ｐｐｍの標的値であった。研究１では、各製剤からの、少数の、充填された、窒素でパージされたバイアルが開栓され、溶存酸素を雰囲気条件へと戻すように、６０ｍＬの空気でパージされた。次いで、空気でパージされたバイアルは、再止栓され、新たな圧着を加えられた。この工程が発生させた溶存酸素は、標的値の約１０ｐｐｍであり、これは、雰囲気の溶存酸素レベルと符合した。研究２では、バイアルを充填し止栓する前の、バルクの直接的な空気パージにより、本明細書で記載される、約１０ｐｐｍの溶存酸素標的値が達成された。次いで、完成されたバイアルは、ラベル付けされ、温度を制御された安定性チャンバー内で倒立させて保管された。
【０３９９】
Ｄ．安定性プロトコール
研究１による１７の製剤の、充填され、止栓され、キャッピングされたバイアルは、温度を制御された安定性チャンバー内で倒立させて保管され、表３で概括される通りに調べられた。
【０４００】
【表４】
2016506389.tif 000021
【０４０１】
［実施例５］  安定性データ：研究１
【０４０２】
Ａ．安定性研究のデザイン
実施例４で記載される通りに作製された１１の製剤は、以下の４つの異なる条件：（１）５℃（＜２ｐｐｍの溶存酸素）；（２）５℃（約１０ｐｐｍの溶存酸素）；（３）２５℃（＜２ｐｐｍの溶存酸素）；および（４）４０℃（＜２ｐｐｍの溶存酸素）の下において、安定性について研究された。表４では、３つの施設地点を伴う、４因子、２レベルの一部実施要因デザイン（合計１１の試行）が提示される。
【０４０３】
【表５】
2016506389.tif 000022
【０４０４】
Ｂ．１２カ月後における０４０−１００−Ｒ１−Ｒ１７についての、ＡＸ−ＨＰＬＣによる安定性データのオーバーレイ
図１では、５℃で１２カ月間にわたる保管についての、ＡＸ−ＨＰＬＣクロマトグラムのオーバーレイが提示される。クロマトグラムは、窒素でパージされた製剤（上）では、酸化の徴候を事実上示さなかったが、空気でパージされた試料（下）の多くでは、酸化分解の明確な証拠を示した。特に、試行７および８（抗酸化剤を伴わない）ならびに試行１２−１７に由来する試料は、メインピーク面積の低減および著明なテーリングを示した。
【０４０５】
Ｃ．１２カ月後における、０４０−１００−Ｒ１−１２についての、ＡＸ−ＨＰＬＣによる純度データ
表５では、１２カ月間にわたる保管の後、０４０−１００−Ｒ１−１２についてのＡＸ−ＨＰＬＣ解析に由来する、メチオニン濃度の昇順に群分けされた、対応する純度データが提示される。
【０４０６】
【表６】
2016506389.tif 000023
【０４０７】
５℃で１２カ月間にわたり保管された、窒素でパージされた（平均ＤＯ２を約０．５８ｐｐｍとする）試料についてのＡＸ−ＨＰＬＣによる純度結果は、ペグニバコギン濃度（２１−３０ｍｇ／ｍＬ）、メチオニン濃度（０−０．５％ｗ／ｗ）、ｐＨ（６−７）、およびＥＤＴＡ濃度（０−０．１％ｗ／ｗ）の範囲にわたり、対照標準物質（９４％の純度）からのそれほど著明ではない変化を裏付けた。製剤が、窒素によりパージされ、５℃で保管された場合、５℃で１２カ月後における純度データから、所与の任意のパラメータの、ペグニバコギン製剤の安定性に対する影響を識別することは困難である。
【０４０８】
空気によりパージされ（ＤＯ２を約８−１０ｐｐｍとする）、５℃で保管された製剤について、純度が低下することが観察された。ＡＸ−ＨＰＬＣによる純度は、Ｎ２でパージされた試料と比較して、メチオニンを含有する試料では約１％低下し、メチオニンを伴わない試料ではより著明に低下した。メチオニンまたはＥＤＴＡを表さない、空気でパージされた試料番号８、７、および１２（表５において太字で強調されている）の比較は、これらの製剤中のペグニバコギンの安定性は、ｐＨ依存的であり、ｐＨが低下すると安定性が増大する：ｐＨ６（８８．８０％）＞＞＞ｐＨ７．０（６８．３９％）＞＞ｐＨ７．４（５１．８％）であることを裏付けた。０．１％のＥＤＴＡだけを含有する、空気でパージされた試料番号１１（９３．８４％）および３（９３．９０％）は、０．２５％または０．５％のメチオニンを含有する試料とほぼ同等な安定性（いずれも約９５％）を裏付けた。このＥＤＴＡの効果は、５℃から２５℃の間の温度条件において明らかである。
【０４０９】
Ｄ．１２カ月後における、０４０−１００−Ｒ１２−１７についての、ＡＸ−ＨＰＬＣによる純度データ
この製剤群では、異なる容器施栓部材、モノチオグリセロール、およびｐＨの条件下におけるペグニバコギンの安定性を比較し、結果は表６に示される。
【０４１０】
【表７】
2016506389.tif 000024
【０４１１】
純度データは、５℃で保管され、窒素でパージされた場合、１２カ月後における製剤間で安定性の差違は感知されないことを裏付けた。モノチオグリセロール（製剤０４０−１００−Ｒ１３中に１％）は、ｐＨ６の１つの製剤だけに限定された、５℃で空気によりパージされる条件下で、有効ではなく、ある程度有害であることが示された。
【０４１２】
最良の安定性が測定された試料は、明らかに、ｐＨが低く、溶存酸素が少ない試料であり、ＦｌｕｒｏＴｅｃ（登録商標）でコーティングされた止栓を含む試料（窒素でパージされたのか、空気でパージされたのかに関わらず）であった。空気でパージされたバイアル（約１０ｐｐｍ）の５℃における保管の場合、ＦｌｕｒｏＴｅｃでコーティングされた止栓の効能は、Ｔｅｆｌｏｎでコーティングされた止栓の効能を凌駕した。
【０４１３】
Ｅ．２４カ月後における０４０−１００−Ｒ１−Ｒ１７についての、ＡＸ−ＨＰＬＣによる安定性データのオーバーレイ
図２では、５℃で２４カ月間にわたる保管についての、ＡＸ−ＨＰＬＣクロマトグラムのオーバーレイが提示される。２４カ月後におけるクロマトグラムは、窒素でパージされた製剤では、酸化の徴候を事実上示さなかった（上および中）ことは、製造時に十分な窒素パージが援用されれば、これらの条件下における２年間の保存寿命はたやすく達成可能であることを裏付ける。予測される通り、雰囲気の溶存酸素レベルを表す、空気でパージされた試料（下）は、大半の被験試料中の、広範にわたる酸化を裏付けた。中央部のグラフは、Ｒ０１ＡＺ０７００１Ｎ基準物質の、製剤Ｒ２（２１ｍｇ／ｍＬ、０．５％のメチオニン、ｐＨ７）、Ｒ９（３０ｍｇ／ｍＬ、０．５％のメチオニン、ｐＨ６．０）、Ｒ８（２１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．０）、Ｒ７（３０ｍｇ／ｍＬのｐＨ７．０）、およびＲ１２（２１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４）との比較を強調する。
【０４１４】
Ｆ．２４カ月後における、０４０−１００−Ｒ１−１２についての、ＡＸ−ＨＰＬＣによる純度データ
表７では、２４カ月間にわたる保管の後における、０４０−１００−Ｒ１−１２についての、ＡＸ−ＨＰＬＣによる純度データが提示される。
【０４１５】
【表８】
2016506389.tif 000025
【０４１６】
５℃で保管され、窒素でパージされた２４カ月後の試料は、抗酸化剤を含有しない製剤である０４０−１００−Ｒ７およびＲ８であってもなお、ほとんど分解が見られないことを裏付け、これは、１２カ月間にわたる保管後において得られたデータと符合する。５℃／空気でパージされ、または２５℃／窒素でパージされた、メチオニンおよび／またはＥＤＴＡを含有する製剤は、９２％という、最新のＡＸ−ＨＰＬＣによる純度規格内に保持された。これらの条件下で純度規格を下回った製剤は、抗酸化剤を伴わない製剤である０４０−１００−Ｒ７およびＲ８だけであった。５℃／加速条件において空気でパージされた、製剤０４０−１００−７（ｐＨ７）および製剤Ｒ８（ｐＨ６）の比較は、ｐＨが６という低値の製剤が、良好な安定性を一貫して裏付けることを示した。
【０４１７】
Ｇ．２４カ月後における、０４０−１００−Ｒ１２−１７についての、ＡＸ−ＨＰＬＣによる純度データ
表８では、２４カ月間にわたる保管の後における、０４０−１００−Ｒ１２−１７についての、ＡＸ−ＨＰＬＣによる純度データが提示される。上記で示された通り、この製剤群では、異なる容器施栓部材、モノチオグリセロール、およびｐＨの条件下におけるペグニバコギンの安定性を比較した。
【０４１８】
【表９】
2016506389.tif 000026
【０４１９】
純度データは、５℃で保管され、窒素でパージされた場合、２４カ月後における製剤間で安定性の差違は感知されないことを裏付け、これは、１２カ月後のデータと符合する。
【０４２０】
Ｈ．１２カ月後における０４０−１００−Ｒ１２についての、ＡＸ−ＨＰＬＣによる安定性データのオーバーレイ
図３では、様々な条件での１２カ月間にわたる保管の後における、製剤０４０−１００−Ｒ１２（ｐＨ７．４の臨床対照）についての代表的なＡＸ−ＨＰＬＣクロマトグラムのオーバーレイが提示される。濾過およびバイアルへの充填の前に、バルク溶液中の溶存酸素を２ｐｐｍ未満へと低減することの利益は、窒素パージを伴い加工処理された、５℃で１２カ月間にわたり保管された試料、および窒素パージを伴わずに加工処理された、５℃で１２カ月間にわたり保管された試料についてのＡＸ−ＨＰＬＣ解析の結果を比較することによりたやすく観察される。窒素パージを伴わずに加工処理されたが、５℃で保管された試料についてのクロマトグラムは、後期溶出ピークまたは共溶出ピークの高度化と共に、純度の低減（５１．８％）およびメインピーク面積の広がりを裏付けた。このクロマトグラフィー挙動は、本報告の前出で論じられた、１％のＨ２Ｏ２を使用する強制分解研究において観察されたＰＥＧの酸化分解と符合する。２５℃で保管された製剤の窒素パージングが、５℃における保管とほぼ同等な安定性をもたらしたのに対し、窒素パージングは、４０℃で保管されたペグニバコギン製剤に対して、同程度に効果的ではなかった。
【０４２１】
Ｉ．１２および２４カ月後における、０４０−１００−Ｒ１−１７についての、ＩＰ−ＨＰＬＣによる安定性データ
図４および５では、同じ製剤の、それぞれ、１２および２４カ月間にわたる、５℃における保管試料についての、ＩＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムのオーバーレイが提示される。全ての窒素でパージされた試料における安定性の増強に関して、ＩＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムもまた、ＡＸ−ＨＰＬＣ解析と同様の傾向を示すが、空気でパージされた試料の多くでは、酸化損傷が明らかである。
【０４２２】
３６カ月後において、５℃でＮ２によりパージされた製剤の全ては、純度規格内にあり、不純物規格内にあった。５℃で空気によりパージされた製剤である、Ｒ１からＲ６、Ｒ７からＲ１０およびＲ１５は、規格を満たしたが、残りの製剤では分解が明らかであった。２５℃でＮ２によりパージされる条件では、製剤Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４からＲ６、Ｒ９からＲ１１、Ｒ１３およびＲ１５だけが規格を満たした。対象の製剤であるＲ２およびＲ９は、５℃でＮ２によりパージされる条件、５℃で空気によりパージされる条件、および２５℃でＮ２によりパージされる条件において３６カ月間にわたり保管された場合、最新のＩＰ−ＨＰＬＣ規格を満たした。
【０４２３】
Ｊ．３６カ月後における、ＡＸ−ＨＰＬＣによる安定性データ
表９および表１０では、３６カ月後の時点についての、ＡＸ−ＨＰＬＣによる純度の測定値および溶存酸素の測定値が提示される。１つ以上の不純物測定値が規格外にある製剤についての純度値は、データ表中の脚注により指示されている。５℃でＮ２によりパージされる保管条件における３６カ月後、以下の８つの製剤：Ｒ１−Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、およびＲ１１が、ＡＸ−ＨＰＬＣによる純度および不純物についての規格内に保持された。これらの製剤のうちの全てが、Ｒ７（３０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．０）を例外として、メチオニンおよび／またはＥＤＴＡを含む。依然として規格内にある製剤のうち、Ｒ１−Ｒ４が最も安定的である。議論に最も関与性の製剤は、フェーズ３の臨床用製剤を包括する濃度およびｐＨ値を伴い、ＥＤＴＡを伴わないが、メチオニンを含有する製剤である。これらの製剤は、Ｒ２（２１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．０、０．５％のメチオニン）およびＲ９（３０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．０、０．５％のメチオニン）である。Ｒ２は、５℃でＮ２によりパージされる条件、５℃で空気によりパージされる条件、および２５℃でＮ２によりパージされる条件において３６カ月間にわたり保管された場合、安定性が良好であり、最新のＡＸ−ＨＰＬＣ規格を満たす。Ｒ９は、５℃でＮ２によりパージされる条件についてのＡＸ−ＨＰＬＣ規格を満たし（ＲＲＴ≧１．０１の面積和が≦６．０面積％であり、＞５．５面積％の個別の不純物が存在しない場合という限界の近傍ではあるが。）、２５℃でＮ２によりパージされる条件についてのＡＸ−ＨＰＬＣ規格を満たすが、５℃で空気によりパージされる条件では、この同じ規格を満たさなかったことは驚くべきことではない。
【０４２４】
【表１０】
2016506389.tif 000027
【０４２５】
【表１１】
2016506389.tif 000028
【０４２６】
まとめると、これらのデータは、Ｎ２により十分にパージされた場合、フェーズ３のために選択された製剤化条件が、５℃または２５℃で少なくとも３６カ月間にわたる保存寿命をもたらすべきことを示唆する。メチオニンまたはＥＤＴＡの存在は、溶存酸素レベルに関わらず、５℃または２５℃における十分な保存寿命を達成するのに極めて重要であるが、溶存酸素が少ないほど、安定性は増強され、予測保存寿命は長くなる。
【０４２７】
図６および７は、それぞれ、１２および３６カ月間にわたる、抗酸化剤の非存在下における、温度および空気（溶存酸素を約１０ｐｐｍとする）の、ＲＢ００６製剤の純度に対する不安定化効果を裏付ける。この不安定化は、ｐＨ依存的であり、これにより、ｐＨが低下するのに応じて安定性は増大した。このｐＨ効果は、５℃／空気によりパージされる条件下（１２および３６カ月後）において最もよく観察可能であったが、２５℃／窒素でパージされる条件下（３６カ月後）では、それほどよく観察可能ではなかった。ｐＨ７．４の製剤の純度の増大は異例の結果であると考えられたので、このｐＨ効果はまた、１２カ月後の時点においても明らかであった。
【０４２８】
ＥＤＴＡまたはメチオニンの存在下の１２カ月後（図８）および３６カ月後（図９）において、安定性の差違はほとんど見られず、５℃における保管条件では、安定性は、ｐＨおよび溶存酸素に依存しなかった。
【０４２９】
メチオニン含量は、メチオニンを含有する製剤（Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ１０）において測定された。全ての条件での３６カ月後におけるメチオニン含量は、方法の解析的なばらつき内にある初期値と符合した。メチオニン含量が比較的不変であったことは、雰囲気の溶存酸素レベルと同等である、空気でパージされた場合でもなお、製剤中に十分な過剰量のメチオニンが存在することを示唆する。研究１の製剤中のメチオニンは、０．２５％ｗ／ｗから０．５％ｗ／ｗで存在するが、雰囲気の溶存Ｏ２での製剤は、０．１％ｗ／ｗで確立された。
【０４３０】
［実施例６］  オリゴヌクレオチド結合活性
実施例４で査定された濃度、ｐＨおよび保管条件にわたる、メチオニンを伴うペグニバコギン注射液製剤、メチオニンを伴わないペグニバコギン注射液製剤のほか、対照としての臨床用バッチである００６ＡＴ１１０９ＣＰＳに由来する試料が、抗凝固活性について査定された。
【０４３１】
ペグニバコギンの抗凝固活性は、オリゴヌクレオチドの一次配列、二次構造および三次構造に依存し、原薬の放出および医薬品の放出のいずれにも使用される、標準的なａＰＴＴ血漿ベースのアッセイを使用して測定された。
【０４３２】
表１１では、それぞれの製剤試料と比較して、基準物質（ロット番号：Ｒ０１ＡＺ０４００４Ｎ）について作成されたａＰＴＴ用量反応曲線から計算された結果が提示される。
【０４３３】
【表１２】
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【０４３４】
ペグニバコギンについての生体活性アッセイを使用して、上述の３つの安定性条件での３６カ月間にわたる保管後における、製剤Ｒ２およびＲ９の安定性試料が、各製剤の、調製されたばかりの対照と共に解析された。いずれの製剤についても、全ての条件において、対照と好適に比較された、生体活性アッセイの結果（表１１）は、全ての製剤が、３つの保管条件での３６カ月間にわたる保管を通して、それらの完全な抗凝固活性を保持したことを裏付ける。完全な抗凝固活性の保持は、ペグニバコギンのオリゴヌクレオチド部分の完全性が、これらの保管条件において維持されたことを確認する。
【０４３５】
［実施例７］  製剤開発：研究２
【０４３６】
Ａ．実験デザイン
２群の製剤が調製された。第１群の製剤は、異なるｐＨおよび溶存酸素レベルにおける容器施栓系の効果を査定することが意図された。第２群の製剤は、同じ容器施栓系を使用して、異なる濃度におけるメチオニンの効果を査定するようにデザインされた。
【０４３７】
群１は、２つの製剤：ｐＨ７．４で緩衝液された製剤ＡおよびｐＨ６．５で緩衝液された製剤Ｂを含んだ。２つの製剤は、バルクで調製され、濾過され、容器施栓系へと充填され、表１２および１３に従う指定の標的ＤＯ２で加工処理された。
【０４３８】
【表１３】
2016506389.tif 000030
【０４３９】
【表１４】
2016506389.tif 000031
【０４４０】
研究２の製剤試料である群１Ａおよび１Ｂは、倒立させて保管された。
【０４４１】
第２群の製剤は、表１４で概括される通りに調製された。
【０４４２】
【表１５】
2016506389.tif 000032
【０４４３】
Ｂ．安定性プロトコール
群２は、倒立させて保管された。この群には、短期間の研究において様々な製剤の差別化を容易とするように、５０℃の条件が付加された。
【０４４４】
表１５および１６では、それぞれ、群１の２つの製剤および群２の製剤のための安定性プロトコールが示される。
【０４４５】
【表１６】
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【０４４６】
【表１７】
2016506389.tif 000034
【０４４７】
３および６カ月後の時点の安定性データが作成された。
【０４４８】
異なる容器施栓構成の効果を比較するようにデザインされ、ｐＨ６．５対７．４、Ｎ２によるパージ対空気によるパージの条件下で保管され、５℃および２５℃で１２および２４カ月間にわたり、または４０℃で１０．５カ月間（９カ月後における中止に置きかえた）および１２カ月間にわたり保管された、研究２の製剤に由来する安定性試料についての解析が提示される。さらに興味深いことに、０．１％のメチオニン対０．２５％のメチオニンを含有し、ｐＨ６．５対７．４で、Ｎ２によるパージ対空気によるパージを受け、非処理ガラス内で保管され、４０℃で１０．５および１２カ月間、ならびに５℃で２４カ月間にわたり保管された補助製剤（Ｒ２５−Ｒ３１）が再検討された。安定性試料は、ＡＸ−ＨＰＬＣによる純度および不純物、溶存酸素、および関与性の場合は、メチオニン含量について解析された。
【０４４９】
［実施例８］  安定性データ
【０４５０】
Ａ．３カ月後における、０４０−１２５  Ｒ２５−３１についての、ＡＸ−ＨＰＬＣによる安定性データ
表１７では、４０℃および５０℃で３カ月間にわたる保管の後における、ＡＸ−ＨＰＬＣによるペグニバコギンの純度解析、メチオニン％および溶存酸素含量が提示される。
【０４５１】
【表１８】
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【０４５２】
これらの条件下での３カ月後、弁別的変化が観察可能なのは、５０℃だけに限られた。とりわけ、実施例５の結果から、抗酸化剤または窒素パージの非存在下における、低ｐＨの、ペグニバコギンの安定性の改善に対する効果が注目された。本実施例では、この傾向が一般に、ペグニバコギン製剤についてのＡＸ−ＨＰＬＣ解析において注目されるが、これによれば、異なるｐＨ値、６．５、７．０および７．４、５０℃で、０．１％のメチオニンを含有する２１ｍｇ／ｍＬの製剤の純度値は、７７．１％、８１．３３％、および６９．５％である。
【０４５３】
これらのストレスをかけられた研究条件下において、観察された分解ピークのＲＲＴは、３’切断物、５’切断物、およびＲＢ００５＋２０ｋＤのＰＥＧ生成物についてのピークと符合した。これらの分解物は、ＡＸ−ＨＰＬＣ解析においてテールとして観察された分解物とは異なり、これらの分解物は、ＰＥＧの酸化の結果ではないことが注目される。メインピーク純度との関連における以下の安定性のランク順位：ｐＨ７（８１．３３％）＞ｐＨ６．５（７７．１％）＞ｐＨ７．４（６９．５％）により、ペグニバコギン製剤は、ｐＨ７において最も安定的であると考えられた。ｐＨ効果は、ＲＲＴ≦０．９９に相当するピークの分解バンドの面積和については比較的フラットであるが、ＰＥＧの酸化分解に関する分解物を表すＲＲＴ≧１．０１に相当する分解の面積和は、ｐＨ７．４において急激に増大する。
【０４５４】
また、製剤中のメチオニン含量が、窒素でパージされたかどうかに関わらず、４０℃／７５％ＲＨで３カ月間にわたり保管された試料中で比較的不変で保持され、窒素でパージされた場合、５０℃において比較的不変で保持されたことも注目に値する。空気でパージされ、５０℃で３カ月間にわたり保管された試料では、０．２５％のおよび０．１％のメチオニンを含有する試料中のメチオニン含量が、約１６％および３５％低下した。
【０４５５】
Ｂ．６カ月後における、０４０−１２５  Ｒ２５−３１についての、ＡＸ−ＨＰＬＣによる安定性データ
６カ月後の時点では、４０℃／７５％ＲＨ（表１８）試料だけが査定された。
【０４５６】
【表１９】
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【０４５７】
メチオニンを含有し、ｐＨが低減された製剤は、試料の溶存酸素レベルが低いのか高いのかに関わらず、４０℃の加速化研究条件で、６カ月後において、既存の製剤と比較して保護的である。明らかに、酸素の低減は、ｐＨ６．５で、ストレスをかけた条件下における、メチオニンを含有する製剤の安定性を改善した。酸素の低減を伴わずに、ストレスをかけた条件下では、メチオニン酸化の証拠が認められ、５０℃の高度にストレスをかけた条件下では、メチオニン消費の証拠が認められることに注目することは重要である。
【０４５８】
低減レベルのメチオニン、すなわち、０．１％メチオニンは、効果的であることが示された。表１７において示される通り、０．１％のメチオニンの存在を伴う、５０℃の高温では、３カ月後におけるペグニバコギンの安定性が、４３．４％から６９．４５％へと改善されていることは、メチオニンの保護的効果を裏付ける。
【０４５９】
Ｃ．１２カ月後における、０４０−１２５  Ｒ２５−３１についての、ＡＸ−ＨＰＬＣによる安定性データ
表１９および表２０では、４０℃で１０．５および１２カ月間にわたる保管後における、メチオニンを含有する加速化試料製剤（Ｒ２６−Ｒ３１）および対照製剤（Ｒ２５）について、ＡＸ−ＨＰＬＣによる純度値、メチオニン％、および溶存酸素の測定値が提示される。最良の安定性である、約９２％の純度は、ｐＨ６．５で、メチオニンをそれぞれ、０．１および０．２５％で伴って製剤化された、Ｒ２６試料およびＲ２７試料について観察された。やや低い約９１％の純度は、ｐＨ７．０および０．１％ｗ／ｗのメチオニンを伴う製剤Ｒ３１について得られた。図１０では、０．１％ｗ／ｗのメチオニンの添加およびｐＨの、４０℃における医薬品中のペグニバコギンの安定性に対する全体的な効果が描示される。提示されるデータは、０．１％ｗ／ｗのメチオニンの添加が、６．５から７．４のｐＨ範囲にわたり、４０℃／７５％ＲＨで最長１２カ月間にわたる加速化条件で保管した場合における、医薬品中のペグニバコギンの安定性を著明に改善したことを示す。図１１Ａおよび図１１Ｂでは、０．１％ｗ／ｗのメチオニンを含有する製剤についての、４０℃で１０．５および１２カ月後における、ｐＨの、不純物の形成に対する効果の比較が示される。いずれの時点においても、ｐＨの効果は、６．５から７．０のｐＨ範囲にわたり、ＲＲＴ≦０．９９の面積和およびＲＲＴ≧１．０１の面積和のいずれについても同等であったが、ＲＲＴ≧１．０１に相当する分解の面積和は、ｐＨ７．４において急激に増大し、５０℃で３カ月後において観察された関係と全く同様であった。ＲＲＴが１．１５のピーク（ＲＢ００５＋２０ｋＤａのＰＥＧ）については、僅少なｐＨ効果が観察され、塩基によるストレスを受けた試料と符合した。メチオニン含量が、４０℃／７５％で最長１２カ月間にわたり保管された試料について、比較的不変で保持されたことは、０．１％ｗ／ｗのメチオニン濃度でもなお、十分な過剰量のメチオニンが製剤中に存在したことを示唆する。
【０４６０】
【表２０】
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【０４６１】
【表２１】
2016506389.tif 000038
【０４６２】
この加速化データは、５℃での３年間にわたる安定性について、著明なさらなる信頼性をもたらし、おそらく、２５℃または３０℃での３年間にわたる安定性がたやすく達成可能であることが予測される。
【０４６３】
Ｄ．ＡＸ−ＨＰＬＣによる純度−最長２４カ月間にわたる５℃での保管状態
表２１では、５℃の条件で２４カ月間にわたり保管された、メチオニンを含有する試料（Ｒ２６−Ｒ３１）および対照製剤（Ｒ２５）について、ＡＸ−ＨＰＬＣによる純度値、メチオニン％、および溶存酸素の測定値が示される。５℃の条件で保管された試料についての解析は、２４カ月後のこれらの製剤についてスケジュールされた唯一の解析であった。この群内の全ての製剤が、純度の測定値を約９４−９６面積％とする良好な安定性を裏付けたことは、対照ＡＰＩ（純度は、約９５面積％である。）と比較して、事実上同一な不純物プロファイルを裏付ける。このデータは、最低限で要求される２４カ月間の保存寿命（であるが、おそらく３６カ月間以上の保存寿命も達成される。）をもたらすための、ペグニバコギン製剤中の抗酸化剤に対する必要を強く支持する。さらに、データは、雰囲気ＤＯ２の存在下においてもなお、メチオニンは、５℃において、ペグニバコギンの分解からの保護をもたらし、これにより、製剤の酸化ストレス条件に対する頑健性を、既存の製剤と比較して大幅に改善することを明らかに裏付ける。
【０４６４】
【表２２】
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【０４６５】
［実施例９］  アスコルビン酸製剤
ＡＸ−ＨＰＬＣにより測定される通り、アスコルビン酸の抗酸化剤としての使用が、製剤の純度に対して有害な影響を及ぼしたことは、驚くべきことである。アスコルビン酸の非存在下では、純度は、９１．７８％と測定されたが、アスコルビン酸の存在下では、純度は、７２．０６％であった。これらの結果は、表２２にまとめられる。
【０４６６】
【表２３】
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【０４６７】
前出の記載を読めば、当業者には、ある種の改変および改善が想到する。本明細書では、簡略および可読性のために、このような改変および改善が全て抹消されているが、本明細書で記載される一般的な発明の構想の範囲内に適正に収まることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2016506389.tif 000049
【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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