(57)【要約】  本発明は、インテインＣ断片のＣ末端に融合した、所望のタンパク質（ＰＯＩ）を含む第１の融合タンパク質と、インテインＮ断片及び精製タグを含む第２の融合タンパク質とを接触させて、第１の融合タンパク質と、第２の融合タンパク質との複合体を形成するステップと、インテインＣ断片からＰＯＩを切断するステップであって、タンパク質を複合体から遊離させるステップと、ＰＯＩを単離するステップとを含むＰＯＩを精製するための方法、組成物、使用及びキットを含む。本発明はまた、融合タンパク質及びベクターを含む。
2016504417.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望のタンパク質（ＰＯＩ）の精製方法であって、
インテインＣ断片のＣ末端に融合したＰＯＩを含む第１の融合タンパク質と、インテインＮ断片及び精製タグを含む第２の融合タンパク質とを接触させて、前記第１の融合タンパク質と、前記第２の融合タンパク質との複合体を形成するステップと、
前記インテインＣ断片から前記ＰＯＩを切断するステップであって、前記タンパク質を前記複合体から遊離させるステップと、
前記ＰＯＩを単離するステップと
を含む、前記方法。
【請求項２】
インテインがスプリットインテインである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
インテインが、ノストック・パンクチフォルメ（Nostoc punctiforme）の天然にスプリットしたインテインＤｎａＥである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
インテインが、シネコシスティス種のＳｓｐ、アファノティーキ・ハロフィチカのＡｈａ、アファニゾメノン・オバリスポラムのＡｏｖ、アナバエナ種のＡｓｐ、アナバエナ・バリアビリスのＡｖａ、シリンドロスペルモプシス・ラシボルスキイのＣｒａ（ＣＳ５０５）、シアノセイス（CyanotiIece）種のＣｓｐ（ＣＣＹＯｌｌＯ）、シアノセイス種のＣｓｐ（ＰＣＣ８８０１）、クロコスファエラ・ワトソニイのＣｗａ、ミクロシスチス・エルギノサのＭａｅｒ（ＮＩＥＳ８４３）、ミクロコレス・クソノプラステスのＭｃｈｔ（ＰＣＣ７４２０）−２、オシラトリア・リムネティカのＯｌｉ、シネココッカス・エロンガタスのＳｅｌ（ＰＣ７９４２）、シネココッカス種のＳｓｐ（ＰＣＣ７００２）、サーモシネココッカス・エロンガタス（Thernlosynechococcus elongates）のＴｅｌ、トリコデスミウム・エリスラエウムのＴｅｒ−３、及びサーモシネココッカス・ウルカヌス（Thernlosynechococcus vulcanus）のＴｖｕからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
インテインＣ断片が、変異していないインテインＣ断片と比較してＮ末端切断を著しく遅らせ、トランススプライシング能力を抑制し、Ｃ末端切断速度及び効率を増加させる変異を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
インテインが、天然にスプリットしたインテインＤｎａＥであり、Ｃ−インテイン断片が前記Ｃ−インテイン断片内にＡｓｐ１１８Ｇｌｙ変異を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
インテインＣ断片が、配列番号３７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
精製タグが、インテインＮ断片のＣ末端にあるインテインスプリット接合部に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
インテインＮ断片がＮ末端切断活性を消失させる変異を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
インテインＮ断片が、配列番号３９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
精製タグが、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、６×ヒスチジン、マルトース結合ドメイン（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される親和性タグである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
精製タグが、配列番号３８からなる群から選択される親和性タグである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
第２の融合タンパク質が、配列番号４、１０、２４及びそれらの組み合わせからなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
精製タグがエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
精製タグが、配列番号３８のアミノ酸配列を含む沈降タグである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
精製タグが沈降タグであり、かつ
方法が
複合体を沈降させるステップと、
前記複合体を洗浄するステップと、
前記複合体を可溶化するステップと、
インテイン切断を誘導するステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
複合体の沈降又は前記複合体の洗浄が、前記複合体と、１又は２以上の切断阻害剤とを接触させることを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
精製タグが親和性タグであり、かつ
方法が
複合体を前記親和性タグに結合することができる親和性樹脂に結合させるステップと、
切断ステップの前に前記複合体を洗浄緩衝液で洗浄するステップと、
インテイン切断を誘導するステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
複合体の結合又は前記複合体の洗浄が、前記複合体と、１又は２以上の切断阻害剤とを接触させることを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
インテイン切断の誘導が、複合体と、１又は２以上の還元剤又はキレート剤とを接触させることを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
インテイン切断の誘導が、複合体と、エチレングリコールアミノエチルエステル四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ジピコリン酸（ＤＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）からなる群から選択される１又は２以上のキレート剤とを接触させることを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
切断を誘導する前に複合体を第１の洗浄緩衝液でインキュベートするステップをさらに含み、前記洗浄緩衝液が切断を阻害し、及び／又はＺｎ２＋、Ｃｕ２、Ｍｇ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋及びＦｅ２＋からなる群から選択される切断阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
切断を誘導する前に複合体を第１の洗浄緩衝液で洗浄するステップをさらに含み、前記洗浄緩衝液がＣ末端切断反応を阻害する切断阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
Ｃ末端タンパク質切断の誘導が、硫黄誘導性Ｃ末端切断の誘導を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
Ｃ末端タンパク質切断の誘導が、ＤＴＴ、Ｚｎ２＋キレート剤、トリアルキルホスフィン（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、２−メルカプトエタノール、システイン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される切断誘導剤の存在下で硫黄誘導性Ｃ末端切断の誘導を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
Ｃ末端タンパク質切断の誘導が、キレート剤を使用した切断阻害剤をキレートすることによるインテイン切断の誘導を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
精製タグが親和性タグであり、かつ
方法が、複合体を親和性樹脂に結合させるステップをさらに含み、前記複合体からのＰＯＩの分離が、前記複合体が結合した前記親和性樹脂からＰＯＩを分離することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
精製タグが沈降タグであり、かつ
方法が
複合体を沈降させるステップであって、沈降した複合体を形成し、
前記複合体からのＰＯＩの分離が前記沈降した複合体の可溶化を含み、可溶化した複合体を形成するステップと、
前記可溶化した複合体から前記ＰＯＩを分離するステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
第２の融合タンパク質からインテインＣ断片を解離することによって前記第２の融合タンパク質を再生するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
ＰＯＩが、生理活性ペプチド、酵素、酵素阻害剤、酵素触媒部位、ＤＮＡ結合タンパク質、単離したタンパク質ドメイン、受容体のリガンド、受容体、成長因子、サイトカイン、構造タンパク質、抗体、抗体断片、エピトープ、エピトープ結合領域、抗原、アレルゲン及び所望のタンパク質配列の連続した又は重複した断片から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
精製タグが親和性タグであり、かつ
方法が
Ｃ末端タンパク質切断を誘導する前に複合体を親和性樹脂に結合させるステップと、
第２の融合タンパク質からインテインＣ断片を解離することによって前記親和性樹脂を再生するステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
第２の融合タンパク質からインテインＣ断片を解離することによって前記第２の融合タンパク質を再生するステップと、前記再生した第２の融合タンパク質と第１の融合タンパク質とを再度接触させるステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
精製タグが親和性タグであり、かつ第２の融合タンパク質が、キチンビーズ、ニッケル樹脂、アミロース樹脂、グルタチオン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される親和性樹脂に結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
精製タグが、第２の融合タンパク質の沈降を媒介する沈降タグであり、かつ複合体が沈降される、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
所望のタンパク質（ＰＯＩ）の精製方法であって、
前記ＰＯＩ及びインテインＣ断片を含む第１の融合タンパク質を提供するステップであって、前記ＰＯＩが前記インテインＣ断片のＣ末端に融合し、前記インテインが天然にスプリットしたインテインＤｎａＥであり、前記インテインＣ断片が前記インテインＣ断片内にＡｓｐ１１８Ｇｌｙ変異を有するステップと、
インテインＮ断片及び精製タグを含む第２の融合タンパク質を提供するステップであって、前記精製タグを前記インテインＮ断片のＣ末端にあるインテインスプリット接合部に挿入し、前記インテインＮ断片がＮ末端切断活性を消失させる変異を有するステップと、
結合緩衝液中で前記第１の融合タンパク質と、前記第２の融合タンパク質とを接触させるステップであって、前記第２の融合タンパク質が前記精製タグに結合する樹脂に付着し、前記精製タグが精製樹脂に特異的に結合することができ、前記第１の融合タンパク質と、前記第２の融合タンパク質との複合体が形成され、前記結合緩衝液が、前記ＰＯＩと前記インテインＣ断片との間の前記第１の融合タンパク質のＣ末端タンパク質切断を阻害するステップと、
前記ＰＯＩと前記インテインＣ断片との間の前記第１の融合タンパク質のＣ末端タンパク質切断を誘導し、それによって前記ＰＯＩを遊離させるステップと、
前記第１の融合タンパク質及び前記インテインＣ断片のＣ末端から前記ＰＯＩを分離するステップと
を含む、前記方法。
【請求項３６】
所望のタンパク質（ＰＯＩ）の精製方法であって、
ＰＯＩ及びインテインＣ断片を含む第１の融合タンパク質を提供するステップであって、前記ＰＯＩが前記インテインＣ断片のＣ末端に融合し、インテインが天然にスプリットしたインテインＤｎａＥであり、前記インテインＣ断片が前記インテインＣ断片内にＡｓｐ１１８Ｇｌｙ変異を有するステップと、
インテインＮ断片及び沈降タグを含む第２の融合タンパク質を提供するステップであって、前記沈降タグをインテインＮ断片のＣ末端であるインテインスプリット接合部に挿入し、前記インテインＮ断片がＮ末端切断活性を消失させる変異を有するステップと、
結合緩衝液中で前記第１の融合タンパク質と、前記第２の融合タンパク質とを接触させるステップであって、前記第１の融合タンパク質と、前記第２の融合タンパク質との複合体が形成され、前記結合緩衝液が、前記ＰＯＩと前記インテインＣ断片との間の第１の融合タンパク質のＣ末端タンパク質切断を阻害するステップと、
前記第１融合タンパク質と、前記第２融合タンパク質との複合体を沈降させるステップと、
低塩緩衝液中で前記複合体を可溶化するステップと、
前記ＰＯＩと前記インテインＣ断片との間の前記第１融合タンパク質のＣ末端タンパク質切断を誘導し、それによって前記ＰＯＩを遊離させるステップと、
前記第１の融合タンパク質と前記第２の融合タンパク質の前記複合体から２回目の沈降によって前記ＰＯＩを分離するステップと
を含む、前記方法。
【請求項３７】
所望のタンパク質（ＰＯＩ）及びインテインＣ断片を含む融合タンパク質であって、前記ＰＯＩが、前記インテインＣ断片のＣ末端に融合し、前記インテインが、天然にスプリットしたインテインＤｎａＥであり、前記インテインＣ断片が、前記インテインＣ断片内にＡｓｐ１１８Ｇｌｙ変異を有する、前記融合タンパク質。
【請求項３８】
配列番号３９を含む、請求項３７に記載の融合タンパク質。
【請求項３９】
ＰＯＩが、生理活性ペプチド、酵素、酵素阻害剤、酵素触媒部位、ＤＮＡ結合タンパク質、単離したタンパク質ドメイン、受容体のリガンド、受容体、成長因子、サイトカイン、抗体、抗体断片、エピトープ、エピトープ結合領域、抗原、アレルゲン及び所望のタンパク質配列の連続した又は重複した断片から選択される、請求項３７に記載の融合タンパク質。
【請求項４０】
インテインＮ断片及び精製タグを含む融合タンパク質であって、前記精製タグが、前記インテインＮ断片のＣ末端であるインテインスプリット接合部に位置し、前記インテインＮ断片が、Ｎ末端切断活性を消失させる変異を有する、前記融合タンパク質。
【請求項４１】
配列番号３９を含む、請求項４０に記載の融合タンパク質。
【請求項４２】
配列番号４、１０、２４又はそれらの組み合わせを含む、請求項４０に記載の融合タンパク質。
【請求項４３】
プロモーターに作動可能に結合したインテインＣ断片のＣ末端をコードする第１のＤＮＡエレメントを含むベクターであって、
前記インテインＣ断片が、変異していないインテインＣ断片と比較してＮ末端切断を抑制し、Ｃ末端切断を増加させる変異を有し、所望のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする第２のＤＮＡエレメントの前記インテインＣ断片の前記Ｃ末端への挿入を可能にするクローニング部位を有する前記ベクター。
【請求項４４】
インテインが、ノストック・パンクチフォルメの天然にスプリットしたインテインＤｎａＥであり、Ｃ−インテイン断片が前記Ｃ−インテイン断片内にＡｓｐ１１８Ｇｌｙ変異を有する、請求項４３に記載のベクター。
【請求項４５】
第１のＤＮＡエレメントが配列番号３７のアミノ酸配列をコードする、請求項４３に記載のベクター。
【請求項４６】
第１のＤＮＡエレメントが配列番号４０を含む、請求項４３に記載のベクター。
【請求項４７】
ＰＯＩが、生理活性ペプチド、酵素、酵素阻害剤、酵素触媒部位、ＤＮＡ結合タンパク質、単離したタンパク質ドメイン、受容体のリガンド、受容体、成長因子、サイトカイン、抗体、抗体断片、エピトープ、エピトープ結合領域、抗原、アレルゲン及び所望のタンパク質配列の連続した又は重複した断片から選択される、請求項４３に記載のベクター。
【請求項４８】
プロモーターに作動可能に結合したインテインＮ断片及び精製タグを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡエレメントを含むベクターであって、
前記精製タグが、前記インテインＮ断片のＣ末端であるインテインスプリット接合部に位置し、前記インテインＮ断片が、Ｎ末端切断活性を消失させる変異を有する、前記ベクター。
【請求項４９】
精製タグが親和性タグである、請求項４８に記載のベクター。
【請求項５０】
精製タグが沈降タグである、請求項４８に記載のベクター。
【請求項５１】
ＤＮＡエレメントが配列番号２３又は配列番号４１を含む、請求項４８に記載のベクター。
【請求項５２】
所望のタンパク質（ＰＯＩ）を単離するためのキットであって、
プロモーターに作動可能に結合したインテインＣ断片のＣ末端をコードする第１のＤＮＡエレメントを含む第１のベクターであって、前記インテインＣ断片が変異していないインテインＣ断片と比較してＮ末端切断を抑制し、Ｃ末端切断を増加させる変異を有し、前記第１のベクターがＰＯＩをコードする第２のＤＮＡエレメントの前記インテインＣ断片のＣ末端への挿入を可能にするクローニング部位を有する第１のベクターと、
プロモーターに作動可能に結合したインテインＮ断片及び精製タグを含む融合タンパク質をコードする第２のＤＮＡエレメントを含む第２のベクターであって、前記精製タグが、前記インテインＮ断片のＣ末端にあるインテインスプリット接合部に位置し、前記インテインＮ断片がＮ末端切断活性を消失させる変異を有する第２のベクター；又はインテインＮ断片及び前記インテインＮ断片のＣ末端にあるインテインスプリット接合部に位置する精製タグを含む融合タンパク質であって、前記インテインＮ断片が、Ｎ末端切断活性を消失させる変異を有する融合タンパク質と、
前記ＰＯＩをコードするＤＮＡエレメントを前記第１のベクターのクローニング部位に挿入するための指示書と、
前記ＰＯＩを単離するための指示書と
を含む、前記キット。
【請求項５３】
所望のタンパク質（ＰＯＩ）の精製方法であって、
インテインＣ断片のＣ末端に融合した前記ＰＯＩを含む第１の融合タンパク質と、インテインＮ断片及び精製タグを含む第２の融合タンパク質とを接触させて前記第１の融合タンパク質と前記第２の融合タンパク質との複合体を形成するステップであって、前記インテインＣ断片が変異していないインテインＣ断片と比較してＮ末端切断を著しく遅らせ、トランススプライシング能力を抑制し、Ｃ末端切断速度及び効率を増加させる変異を有するステップと、
前記インテインＣ断片から前記ＰＯＩを切断するステップであって、前記タンパク質を複合体から遊離させるステップと、
前記ＰＯＩを単離するステップと
を含む、前記方法。
【請求項５４】
インテインが、天然にスプリットしたインテインＤｎａＥであり、Ｃ−インテイン断片が前記Ｃ−インテイン断片内にＡｓｐ１１８Ｇｌｙ変異を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５５】
所望のタンパク質（ＰＯＩ）の精製方法であって、
前記ＰＯＩ及びインテインＣ断片を含む第１の融合タンパク質を提供するステップであって、前記ＰＯＩが、前記インテインＣ断片のＣ末端に融合し、インテインが天然にスプリットしたインテインＤｎａＥであり、前記インテインＣ断片は前記インテインＣ断片内にＡｓｐ１１８Ｇｌｙ変異を有するステップと、
インテインＮ断片及び精製タグを含む第２の融合タンパク質を提供するステップであって、前記インテインＮ断片が、Ｎ末端切断活性を消失させる変異を有するステップと、
結合緩衝液中で前記第１の融合タンパク質と、前記第２の融合タンパク質とを接触させるステップであって、前記第２の融合タンパク質が精製タグに結合する樹脂に付着し、前記精製タグが、精製樹脂に特異的に結合することができ、前記第１の融合タンパク質と、前記第２の融合タンパク質との複合体が形成され、前記結合緩衝液が、前記ＰＯＩと前記インテインＣ断片との間の前記第１の融合タンパク質のＣ末端タンパク質切断を阻害するステップと、
前記ＰＯＩと前記インテインＣ断片との間の前記第１の融合タンパク質のＣ末端タンパク質切断を誘導し、それによって前記ＰＯＩを遊離させるステップと、
前記第１の融合タンパク質及び前記インテインＣ断片のＣ末端から前記ＰＯＩを分離するステップと
を含む、前記方法。
【請求項５６】
所望のタンパク質（ＰＯＩ）及びインテインＣ断片を含む融合タンパク質であって、前記ＰＯＩが前記インテインＣ断片のＣ末端に融合し、前記インテインが天然にスプリットしたインテインＤｎａＥであり、前記インテインＣ断片が前記インテインＣ断片内にＡｓｐ１１８Ｇｌｙ変異を有する融合タンパク質。
【請求項５７】
所望のタンパク質（ＰＯＩ）を単離するためのキットであって、
プロモーターに作動可能に結合したインテインＣ断片のＣ末端をコードする第１のＤＮＡエレメントを含む第１のベクターであって、前記インテインＣ断片が前記インテインＣ断片内にＡｓｐ１１８Ｇｌｙ変異を有し、前記第１のベクターがＰＯＩをコードする第２のＤＮＡエレメントの前記インテインＣ断片のＣ末端への挿入を可能にするクローニング部位を有する第１のベクターと、
プロモーターに作動可能に結合したインテインＮ断片及び精製タグを含む融合タンパク質をコードする第２のＤＮＡエレメントを含む第２のベクター；又はインテインＮ断片及び精製タグを含む融合タンパク質と、
前記ＰＯＩをコードするＤＮＡエレメントを前記第１のベクターのクローニング部位に挿入するための指示書と、
前記ＰＯＩを単離するための指示書と
を含む、前記キット。
【請求項５８】
所望のタンパク質（ＰＯＩ）の精製方法であって、
インテインＣ断片のＣ末端に融合した前記ＰＯＩを含む第１の融合タンパク質と、インテインＮ断片及び精製タグを含む第２の融合タンパク質とを接触させて、前記第１の融合タンパク質と、前記第２の融合タンパク質との複合体を形成するステップであって、前記精製タグが、前記インテインＮ断片のＣ末端であるインテインスプリット接合部に位置するステップと、
前記インテインＣ断片から前記ＰＯＩを切断するステップであって、前記タンパク質を前記複合体から遊離させるステップと、
前記ＰＯＩを単離するステップと
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に、タンパク質精製及びタンパク質切断の分野に関する。
【０００２】
連邦政府資金援助研究の声明
本発明は、米国空軍／空軍科学研究所提供のＦＡ９５５０−１２−１−０３３０及び全米科学財団提供の１１５０４７８によって米国政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の範囲を限定することなく、インテイン媒介によるタンパク質の精製に関連する本発明の背景を記載する。
【０００４】
米国特許出願第２００６／０１４１５７０号明細書（２００５年１１月１６日出願）は、生成物タンパク質ドメイン、インテイン及び少なくとも１種の凝集体タンパク質ドメインを含む融合タンパク質であって、この凝集体タンパク質ドメインがポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の顆粒に特異的に関与することができるタンパク質を含み、宿主細胞において発現させることによって実施した、組換えタンパク質の精製について開示している。
【０００５】
欧州特許出願第１１１７６９３Ｂ１号明細書（１９９９年９月３０日出願）は、インテインに融合した標的タンパク質を第１のステップでチオール試薬によって選択的に切断し、標的タンパク質のカルボキシ末端チオエステルを形成し、インテインから標的タンパク質を遊離させる、半合成融合タンパク質を産生するためのインビトロでの方法について開示している。その後のステップにおいて、アミノ末端にシステインを有する所望の合成タンパク質又はペプチドを標的タンパク質に連結する。ＤＴＴなどの標準的チオール試薬又は無臭のＭＥＳＮＡなどの連結用に最適化したチオール試薬を第１のステップにおいて使用することができる。この方法は、標的タンパク質をインテインに結合させるチオエステル結合に所望のペプチドを直接連結させると言われている。この方法のインビボでの変法は、細胞毒性タンパク質の産生を可能にすると言われており、インテリンに融合した不活性な切断型タンパク質をインビボに導入し、次にこの融合生成物を選択的に切断し、細胞毒性タンパク質の本来の活性を復活させるために、合成タンパク質又はペプチドをその後標的タンパク質のカルボキシ末端チオエステルに連結する。
【０００６】
欧州特許出願第１１５１１１７Ａ４号明細書（２００５年８月１０日出願）は、インテイン、例えば、メタノバクテリウム・サーモトロフィーカム（Methanobacterium thermotrophicum）のＲＩＲ１インテインを利用する、発現タンパク質の連結方法を開示している。インテインのＣ末端アスパラギン又はＮ末端システインのいずれかがアラニンに置換したＭｔｈのＲＩＲ１インテインの構築物は、２以上の発現タンパク質の融合で使用するために、指定のＮ末端、例えば、システインを有するタンパク質の単離を容易にすることができる。この方法は、Ｃ末端チオエステルをタグ付けした標的タンパク質及び改変ＭｔｈのＲＩＲ１インテインなどのインテインを介して指定のＮ末端を有する第２の標的タンパク質を生成するステップと、これらのタンパク質を連結するステップとを含む。環式の、又は重合したタンパク質を産生するために類似の方法を提供する。Ｃ末端又はＮ末端それぞれを切断するために操作した改変インテイン及びこれらの改変インテインをコードするＤＮＡ及びプラスミドも提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願第２００６／０１４１５７０号明細書
【特許文献２】欧州特許出願第１１１７６９３Ｂ１号明細書
【特許文献３】欧州特許出願第１１５１１１７Ａ４号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、インテインＣ断片のＣ末端に融合した、所望のタンパク質（ＰＯＩ；protein of interest）を含む第１の融合タンパク質と、インテインＮ断片及び精製タグを含む第２の融合タンパク質とを接触させて、第１の融合タンパク質と、第２の融合タンパク質との複合体を形成するステップと、インテインＣ断片からＰＯＩを切断するステップであって、タンパク質を複合体から遊離させるステップと、ＰＯＩを単離するステップとを含む、ＰＯＩの精製方法を含む。特定の態様では、インテインは、スプリットインテイン、ノストック・パンクチフォルメ（Nostoc punctiforme）の天然にスプリットしたインテインＤｎａＥであり、及び／又はシネコシスティス（Synechocystis）種のＳｓｐ、アファノティーキ・ハロフィチカ（Aphanothece halophytica）のＡｈａ、アファニゾメノン・オバリスポラム（Aphanizomenon ovalisporum）のＡｏｖ、アナバエナ（Anabaena）種のＡｓｐ、アナバエナ・バリアビリス（Anabaena variabilis）のＡｖａ、シリンドロスペルモプシス・ラシボルスキイ（Cylindrospermopsis raciborskii）のＣｒａ（ＣＳ５０５）、シアノセイス（CyanotiIece）種のＣｓｐ（ＣＣＹＯｌｌＯ）、シアノセイス（Cyanothece）種のＣｓｐ（ＰＣＣ８８０１）、クロコスファエラ・ワトソニイ（Crocosphaera watsonii）のＣｗａ、ミクロシスチス・エルギノサ（Microcystis aeruginosa）のＭａｅｒ（ＮＩＥＳ８４３）、ミクロコレス・クソノプラステス（Microcoleus chthonoplastes）のＭｃｈｔ（ＰＣＣ７４２０）−２、オシラトリア・リムネティカ（Oscillatoria limnetica）のＯｌｉ、シネココッカス・エロンガタス（Synechococcus elongates）のＳｅｌ（ＰＣ７９４２）、シネココッカス（Synechococcus）種のＳｓｐ（ＰＣＣ７００２）、サーモシネココッカス・エロンガタス（Thernlosynechococcus elongates）のＴｅｌ、トリコデスミウム・エリスラエウム（Trichodesmium erythraeum）のＴｅｒ−３及びサーモシネココッカス・ウルカヌス（Thernlosynechococcus vulcanus）のＴｖｕからなる群から選択される。特定の態様では、インテインＣ断片は、変異していない（non-mutated）インテインＣ断片と比較してＮ末端切断を著しく遅らせ、トランススプライシング能力を抑制し、Ｃ末端切断速度及び効率を増加させる変異（mutation）を有し、Ｃ−インテイン断片は、Ｃ−インテイン断片内にＡｓｐ１１８Ｇｌｙ変異を有し、及び／又はインテインＣ断片は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、精製タグは、インテインＮ断片のＣ末端にあるインテインスプリット接合部に位置し、インテインＮ断片はＮ末端切断活性を消失させる変異を有し、及び／又はインテインＮ断片は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、精製タグは、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、６×ヒスチジン、マルトース結合ドメイン（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される親和性タグである。特定の態様では、精製タグは、配列番号３８からなる群から選択される親和性タグであり、並びに／又は第２の融合タンパク質は、配列番号４、１０、２４及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の態様では、精製タグは、エラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）であり、及び／又は精製タグは、配列番号３８のアミノ酸配���を含む沈降タグ（precipitation tag）である。特定の態様では、精製タグは、沈降タグであり、この方法はさらに、複合体を沈降させるステップと、複合体を洗浄するステップと、複合体を可溶化するステップと、インテイン切断を導入するステップとを含み、特定の態様では、複合体の沈降及び複合体の洗浄は、１又は２以上の切断阻害剤の存在下で実行する。特定の態様では、精製タグは親和性タグであり、この方法はさらに、複合体を親和性タグに結合することができる親和性樹脂に結合させるステップと、切断ステップの前に複合体を洗浄緩衝液で洗浄するステップと、インテイン切断を誘導するステップとを含む。特定の態様では、複合体の結合及び複合体の洗浄は、１又は２以上の切断阻害剤の存在下で実行する。特定の態様では、インテイン切断の誘導は、還元剤又はキレート剤によって実行する。特定の態様では、インテイン切断の誘導は、複合体とエチレングリコールアミノエチルエステル（ethyleneglycolaminoethylester）四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ジピコリン酸（ＤＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）からなる群から選択される１又は２以上のキレート剤とを接触させることを含む。特定の態様では、方法はさらに、切断を誘導する前に複合体を第１の洗浄緩衝液でインキュベートするステップであって、この洗浄緩衝液が切断を阻害し、及び／又はＺｎ２＋、Ｃｕ２、Ｍｇ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋及びＦｅ２＋からなる群から選択される切断阻害剤を含むステップ；並びに／又は切断を誘導する前に複合体を第１の洗浄緩衝液で洗浄するステップであって、この洗浄緩衝液がＣ末端切断反応を阻害する切断阻害剤を含むステップを含む。特定の態様では、Ｃ末端タンパク質切断は、硫黄誘導性Ｃ末端切断の誘導、ＤＴＴ、Ｚｎ２＋キレート剤、トリアルキルホスフィン（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、２−メルカプトエタノール、システイン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される切断誘導剤の存在下での硫黄誘導性Ｃ末端切断の誘導を含むＣ末端タンパク質切断の誘導、キレート剤を使用した切断阻害剤のキレートによるインテイン切断の誘導を含むＣ末端タンパク質切断の誘導を含む。特定の態様では、精製タグが親和性タグの場合、この方法はさらに、複合体を親和性樹脂に結合させるステップを含み、複合体からのＰＯＩの分離は複合体が結合した親和性樹脂からＰＯＩを分離することを含み、及び／又は精製タグが沈降タグの場合、この方法はさらに、複合体を沈降させるステップであって、沈降した複合体を形成し、複合体からのＰＯＩの分離が沈降した複合体の可溶化を含み、可溶化した複合体が形成されるステップと、可溶化した複合体からＰＯＩを分離するステップとを含む。特定の態様では、この方法はさらに、第２の融合タンパク質からインテインＣ断片を解離することによって第２の融合タンパク質を再生するステップを含む。特定の態様では、ＰＯＩは生理活性ペプチド、酵素、酵素阻害剤、酵素触媒部位、ＤＮＡ結合タンパク質、単離したタンパク質ドメイン、受容体のリガンド、受容体、成長因子、サイトカイン、構造タンパク質、抗体、抗体断片、エピトープ、エピトープ結合領域、抗原、アレルゲン及び所望のタンパク質配列の連続した又は重複した断片から選択される。特定の態様では、精製タグは親和性タグであり、この方法はさらに、Ｃ末端タンパク質切断を誘導する前に複合体を親和性樹脂に結合させ第２の融合タンパク質からインテインＣ断片を解離することによって親和性樹脂を再生するステップを含む。特定の態様では、この方法はさらに、第２の融合タンパク質からインテインＣ断片を解離することによって第２の融合タンパク質を再生するステップと、再生した第２の融合タンパク質と第１の融合タンパク質とを再度接触させるステップとを含む。特定の態様では、精製タグが親和性タグの場合、第２の融合タンパク質はキチンビーズ、ニッケル樹脂、アミロース樹脂、グルタチオン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される親和性樹脂に結合させ、精製タグが第２の融合タンパク質の沈降を媒介する沈降タグの場合、複合体を沈降させる。
【０００９】
本発明は、所望のタンパク質（ＰＯＩ）及びインテインＣ断片を含む第１の融合タンパク質を提供するステップであって、ＰＯＩがインテインＣ断片のＣ末端に融合し、インテインが天然にスプリットしたインテインＤｎａＥであり、インテインＣ断片がインテインＣ断片内にＡｓｐ１１８Ｇｌｙ変異を有するステップと、インテインＮ断片及び精製タグを含む第２の融合タンパク質を提供するステップであって、精製タグをインテインＮ断片のＣ末端のインテインスプリット接合部に挿入し、インテインＮ断片がＮ末端切断活性を消失させる変異を有するステップと、結合緩衝液中で第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質とを接触させるステップであって、第２の融合タンパク質が精製タグに結合する樹脂に結合し、精製タグが精製樹脂に特異的に結合することができ、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質の複合体が形成され、結合緩衝液がＰＯＩとインテインＣ断片の間の第１の融合タンパク質のＣ末端タンパク質切断を阻害するステップと、ＰＯＩとインテインＣ断片との間の第１の融合タンパク質のＣ末端タンパク質切断を誘導し、それによってＰＯＩを遊離させるステップと、第１の融合タンパク質及びインテインＣ断片のＣ末端からＰＯＩを分離するステップとを含む、ＰＯＩの精製方法の実施形態を含む。
【００１０】
本発明はまた、所望のタンパク質（ＰＯＩ）及びインテインＣ断片を含む第１の融合タンパク質を提供するステップであって、ＰＯＩがインテインＣ断片のＣ末端に融合し、インテインが天然にスプリットしたインテインＤｎａＥであり、インテインＣ断片がインテインＣ断片内にＡｓｐ１１８Ｇｌｙ変異を有するステップと、インテインＮ断片及び沈降タグを含む第２の融合タンパク質を提供するステップであって、沈降タグをインテインＮ断片のＣ末端にあるインテインスプリット接合部に挿入し、インテインＮ断片がＮ末端切断活性を消失させる変異を有するステップと、結合緩衝液中で第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質とを接触させるステップであって、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質の複合体が形成され、結合緩衝液がＰＯＩとインテインＣ断片の間の第１の融合タンパク質のＣ末端タンパク質切断を阻害するステップと、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質の複合体を沈降させるステップと、複合体を低塩緩衝液中で可溶化するステップと、ＰＯＩとインテインＣ断片の間の第１の融合タンパク質のＣ末端タンパク質切断を誘導し、それによってＰＯＩを遊離させるステップと、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質の複合体から２回目の沈降によってＰＯＩを分離するステップとを含む、ＰＯＩの精製方法の実施形態を含む。
【００１１】
本発明は、所望のタンパク質（ＰＯＩ）及びインテインＣ断片を含み、ＰＯＩがインテインＣ断片のＣ末端に融合し、インテインが天然にスプリットしたインテインＤｎａＥであり、インテインＣ断片がインテインＣ断片内にＡｓｐ１１８Ｇｌｙ変異を有する融合タンパク質の実施形態を含む。特定の態様では、融合タンパク質は配列番号３７を含む。特定の態様では、ＰＯＩは生理活性ペプチド、酵素、酵素阻害剤、酵素触媒部位、ＤＮＡ結合タンパク質、単離したタンパク質ドメイン、受容体のリガンド、受容体、成長因子、サイトカイン、抗体、抗体断片、エピトープ、エピトープ結合領域、抗原、アレルゲン及び所望のタンパク質配列の連続した又は重複した断片から選択される。
【００１２】
本発明は、インテインＮ断片及び精製タグを含み、精製タグがインテインＮ断片のＣ末端にあるインテインスプリット接合部に位置し、インテインＮ断片がＮ末端切断活性を消失させる変異を有する融合タンパク質の実施形態を含む。特定の態様では、融合タンパク質は配列番号１０、２４、配列番号２１、２２、配列番号４、配列番号２３又はそれらの組み合わせを含む。
【００１３】
本発明は、プロモーターに作動可能に結合したインテインＣ断片のＣ末端をコードする第１のＤＮＡエレメントを含むベクターであって、インテインＣ断片が変異していないインテインＣ断片と比較してＮ末端切断を抑制し、Ｃ末端切断を増加させる変異を有し、ベクターが所望のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする第２のＤＮＡエレメントのインテインＣ断片のＣ末端への挿入を可能にするクローニング部位を有するベクターの実施形態を含む。特定の態様では、インテインは、ノストック・パンクチフォルメの天然にスプリットしたインテインＤｎａＥであり、Ｃ−インテイン断片はＣ−インテイン断片内にＡｓｐ１１８Ｇｌｙ変異を有する。特定の態様では、第１のＤＮＡエレメントは配列番号３７のアミノ酸配列をコードし、及び／又は第１のＤＮＡエレメントは配列番号４０を含む。特定の態様では、ＰＯＩは生理活性ペプチド、酵素、酵素阻害剤、酵素触媒部位、ＤＮＡ結合タンパク質、単離したタンパク質ドメイン、受容体のリガンド、受容体、成長因子、サイトカイン、抗体、抗体断片、エピトープ、エピトープ結合領域、抗原、アレルゲン及び所望のタンパク質配列の連続した又は重複した断片から選択される。
【００１４】
本発明は、プロモーターに作動可能に結合したインテインＮ断片及び精製タグを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡエレメントを含むベクターであって、精製タグがインテインＮ断片のＣ末端にあるインテインスプリット接合部に位置し、インテインＮ断片がＮ末端切断活性を消失させる変異を有するベクターの実施形態を含む。特定の態様では、精製タグは、親和性タグであり、及び／又は精製タグは、沈降タグである。特定の態様では、ＤＮＡエレメントは配列番号２３又は配列番号４１を含む。
【００１５】
本発明は、プロモーターに作動可能に結合したインテインＣ断片のＣ末端をコードする第１のＤＮＡエレメントを含む第１のベクターであって、インテインＣ断片が変異していないインテインＣ断片と比較してＮ末端切断を抑制し、Ｃ末端切断を増加させる変異を有し、第１のベクターが所望のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする第２のＤＮＡエレメントのインテインＣ断片のＣ末端への挿入を可能にするクローニング部位を有する第１のベクターと、プロモーターに作動可能に結合したインテインＮ断片及び精製タグを含む融合タンパク質をコードする第２のＤＮＡエレメントを含む第２のベクターであって、精製タグがインテインＮ断片のＣ末端にあるインテインスプリット接合部に位置し、インテインＮ断片がＮ末端切断活性を消失させる変異を有する第２のベクター；又はインテインＮ断片及びインテインＮ断片のＣ末端にあるインテインスプリット接合部に位置する精製タグを含む融合タンパク質であって、インテインＮ断片がＮ末端切断活性を消失させる変異を有する融合タンパク質と、ＰＯＩをコードするＤＮＡエレメントを第１のベクターのクローニング部位に挿入するための指示書と、ＰＯＩを単離するための指示書とを含む、ＰＯＩを単離するためのキットの実施形態を含む。
【００１６】
本発明は、インテインＣ断片のＣ末端に融合した所望のタンパク質（ＰＯＩ）を含む第１の融合タンパク質とインテインＮ断片及び精製タグを含む第２の融合タンパク質とを接触させて第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質の複合体を形成するステップであって、インテインＣ断片が変異していないインテインＣ断片と比較してＮ末端切断を著しく遅らせ、トランススプライシング能力を抑制し、Ｃ末端切断速度及び効率を増加させる変異を有するステップと；インテインＣ断片からＰＯＩを切断するステップであって、タンパク質を複合体から遊離させるステップと、ＰＯＩを単離するステップとを含む、ＰＯＩの精製方法の実施形態を含む。特定の態様では、インテインは、天然にスプリットしたインテインＤｎａＥであり、Ｃ−インテイン断片はＣ−インテイン断片内にＡｓｐ１１８Ｇｌｙ変異を有する。
【００１７】
本発明は、所望のタンパク質（ＰＯＩ）及びインテインＣ断片を含む第１の融合タンパク質を提供するステップであって、ＰＯＩがインテインＣ断片のＣ末端に融合し、インテインは天然にスプリットしたインテインＤｎａＥであり、インテインＣ断片がインテインＣ断片内にＡｓｐ１１８Ｇｌｙ変異を有するステップと、インテインＮ断片及び精製タグを含む第２の融合タンパク質を提供するステップであって、インテインＮ断片がＮ末端切断活性を消失させる変異を有するステップと、結合緩衝液中で第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質とを接触させるステップであって、第２の融合タンパク質が精製タグに結合する樹脂に結合し、精製タグが精製樹脂に特異的に結合することができ、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質の複合体が形成され、結合緩衝液がＰＯＩとインテインＣ断片の間の第１の融合タンパク質のＣ末端タンパク質切断を阻害するステップと、ＰＯＩとインテインＣ断片の間の第１の融合タンパク質のＣ末端タンパク質切断を誘導し、それによってＰＯＩを遊離させるステップと、第１の融合タンパク質及びインテインＣ断片のＣ末端からＰＯＩを分離するステップとを含む、ＰＯＩの精製方法の実施形態を含む。
【００１８】
本発明は、所望のタンパク質（ＰＯＩ）及びインテインＣ断片を含む融合タンパク質であって、ＰＯＩがインテインＣ断片のＣ末端に融合し、インテインが天然にスプリットしたインテインＤｎａＥであり、インテインＣ断片がインテインＣ断片内にＡｓｐ１１８Ｇｌｙ変異を有する融合タンパク質の実施形態を含む。
【００１９】
本発明は、プロモーターに作動可能に結合したインテインＣ断片のＣ末端をコードする第１のＤＮＡエレメントを含む第１のベクターであって、インテインＣ断片がインテインＣ断片内にＡｓｐ１１８Ｇｌｙ変異を有し、第１のベクターが所望のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする第２のＤＮＡエレメントのインテインＣ断片のＣ末端への挿入を可能にするクローニング部位を有する第１のベクターと、プロモーターに作動可能に結合したインテインＮ断片及び精製タグを含む融合タンパク質をコードする第２のＤＮＡエレメントを含む第２のベクター；又はインテインＮ断片及び精製タグを含む融合タンパク質と、ＰＯＩをコードするＤＮＡエレメントを第１のベクターのクローニング部位に挿入するための指示書と、ＰＯＩを単離するための指示書とを含む、ＰＯＩを単離するためのキットの実施形態を含む。
【００２０】
本発明は、インテインＣ断片のＣ末端に融合した所望のタンパク質（ＰＯＩ）を含む第１の融合タンパク質とインテインＮ断片及び精製タグを含む第２の融合タンパク質とを接触させて第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質の複合体を形成するステップであって、精製タグがＮ断片のＣ末端にあるインテインスプリット接合部に位置するステップと、インテインＣ断片からＰＯＩを切断するステップであって、タンパク質を複合体から遊離させるステップと、ＰＯＩを単離するステップとを含む、ＰＯＩの精製方法の実施形態を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
本発明の特徴及び利点をより完全に理解するために、添付した図面に沿って本発明の詳細な説明をここに記載する。
【図１】様々な連続したインテイン及びスプリットインテインについて明らかに報告されている半減期に関する表である。ａ）ＳｓｐＤａｎＥ及びスプリットＳｓｐＤｎａＢの半減期は、参考文献で報告された擬一次ｋｏｂｓから算出した。ｂ）Ｎ末端切断後のＳｓｐＤｎａＥ  Ｃ末端切断速度；ｃ）連続したインテイン；２：Waugh, D.S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. Protein Expr. Purif. 80, 283-293 （2011）。３：Malakhov, M.P. et al. SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins. J Struct. Funct. Genomics 5, 75-86 （2004）。４：Mathys, S. et al. Characterization of a self-splicing mini-intein and its conversion into autocatalytic N- and C-terminal cleavage elements: facile production of protein building blocks for protein ligation. Gene 231, 1-13 （1999）。５：Lew, B.M., Mills, K.V. & Paulus, H. Characteristics of protein splicing in trans mediated by a semisynthetic split intein. Biopolymers 51, 355-362 （1999）。７：Southworth, M.W., Amaya, K., Evans, T.C., Xu, M.Q. & Perler, F.B. Purification of proteins fused to either the amino or carboxy terminus of the Mycobacterium xenopi gyrase A intein. BioTechniques 27, 110-114, 116, 118-120 （1999）；８：Li, Y.F. Self-cleaving fusion tags for recombinant protein production. Biotechnology Letters 33, 869-881 （2011）。
【図２Ａ−２Ｂ】ＤＴＴ５又は５０ｍＭの非存在下又は存在下における２２℃でのＣ−ＧＦＰ（１）とＣＢＤ−ＮｐｕＮ（２）（図２Ａ）又はＣＢＤ−ＮＣ１Ａ（４）（図２Ｂ）との反応を示した図である（１２％アクリルアミド）。ＣＢＤ−ＧＦＰは、トランススプライシング生成物であり、ＧＦＰは切断されたＣ−エクステインである。「＋」は不純物を示す。
【図３】使用した様々な融合タンパク質構築物のリストを示した図である。構築物には、特徴づけを目的とした操作されたインテイン対並びに試料精製のために使用した所望のタンパク質が含まれる。
【図４】野生型ＮｐｕＤｎａＥ  インテインのトランススプライシング活性が硫黄依存性であることを示した図である。ＳＤＳ−ゲル（１２％アクリルアミド）で視覚化したＤＴＴ２ｍＭの非存在下又は存在下における２２℃でのＣＢＤ−Ｎ（２）とＣ−ＧＦＰ（１）との反応。ＣＢＤ−ＧＦＰはトランススプライシング生成物である。ＧＦＰは切断されたＣ−エクステインである。Ｃ、Ｎは切断されたインテインである。微量の切断されたＮ−エクステインＣＢＤは、低濃度のためＳＤＳ−ゲルで視覚化することはできないが、ウェスタンブロットによって検出することができる（データは示していない）。「＋」は未同定のバンドを示す。
【図５Ａ−５Ｃ】機構を示した図である。図５Ａは、インテインのトランススプライシング機構を示す。図５Ｂは、異なるインテイン反応から得られた生成物を示す。最後のアスパラギン及び第１のシステインがアラニンに変異することによって、ほとんどのインテインＮ及びＣ末端それぞれが切断される。図５Ｃは、ＮｐｕＤｎａＥインテイン（赤、ｐｄｂ：２ｋｅｑ）とミニ−ＭｔｕＲｅｃＡインテイン（黄、ｐｄｂ：２ＩＭＺ）の構造アラインメントを示す。Ｎｐｕ  ＤｎａＥ及びミニ−ＭｔｕＲｅｃＡインテインの保存された触媒残基をそれぞれ、緑色及び茶色で強調する。
【図６】Ｓｓｐ及びＮｐｕのＤｎａＥインテイン並びにミニ−ＭｔｕＲｅｃＡインテインの配列アラインメントを示した図である。｜｜：ＤｎａＥインテインのＩＮ及びＩＣの切断点。図５Ｃ及び図２１で示した活性部位残基は赤で強調する。Ａｓｎ１１８残基は赤紫で強調する。数字はＮｐｕＤｎａＥ残基（配列番号６７〜６９）に対応する。
【図７Ａ−７Ｃ】変異体Ｃ＊の触媒活性を示した図である。還元剤ＤＴＴ（図７Ａ）又はＴＣＥＰ（図７Ｂ）の非存在下又は存在下における２２℃でのＣＢＤ−Ｎ（２）とＣ＊−ＧＦＰ（４）との反応。２Ｎ：ＣＢＤ−Ｎ（２）の二量体複合体。二量体は、より高濃度のβ−メルカプトエタノールで処理し、より長時間煮沸した試料では消失する。ＧＦＰは切断されたＣ−エクステインであり、Ｃ＊は切断されたＣ−インテインである。Ｎは切断されたＮ−インテインである。切断されたＮ−エクステインＣＢＤは、ＳＤＳ−ゲル上では視覚化することはできないが、ＤＴＴと共にインキュベートした試料をウェスタンブロットすると検出することができる（データは示していない）。「＋」は未同定のバンドを示す。図７Ｃは様々な温度でのＣ末端切断によるＣ＊−ＧＦＰの消失の時間経過を示す。エラーバーは、３回の独立した実験の標準偏差を表す。
【図８】ＣＢＤ−ＮＣ１ＡによるＣ＊−ＧＦＰの触媒活性を示した図である。ＤＴＴの非存在下又は存在下における２２℃でのＣ＊−ＧＦＰ（３）とＣＢＤ−ＮｐｕＮＣ１Ａ（４）との反応。ＧＦＰは切断されたＣ−エクステインであり、ＮｐｕＣ＊は切断されたＣ−インテインである。「＋」は不純物を示す。
【図９Ａ−９Ｂ】操作したインテイン対の模式図である。図９Ａは、現在のインテイン系又はタグ除去の設計対従来の系又は設計の比較を示す。図９Ｂは、インテイン会合前後の融合タンパク質を表したものである。インテインＮ断片（黄）及びＣ断片（茶）は、ＮｐｕＤｎａＥのＮＭＲ構造（ＰＤＢコード：２ｋｅｑ）から製作した。
【図１０Ａ−１０Ｄ】操作したインテイン系のＣ末端切断反応速度の特徴を示した図である。図１０Ａ及び１０Ｂはそれぞれ、濃度測定分析を使用して定量した、ＤＴＴ５０ｍＭを含有するｐＨ８緩衝液中において２２℃及び６℃で実施したＮＣ１Ａ−ＣＢＤ（構築物１）とＣ＊−ＰＴＤＨ（構築物３）（連続線）との反応のＳＤＳ−ゲル（１２％アクリルアミド）を示す。切断されたＣ＊は４ｋＤａで、ゲルで視覚化することはできない。図１０Ｃは、濃度測定分析を使用して定量した、ＤＴＴ５０ｍＭを含有するｐＨ８緩衝液中における２２℃でＮＣ１Ａ−ＣＢＤを使用した野生型インテインＣ−ＰＴＤＨのＣ末端切断反応速度を示す。図１０Ｄは様々な温度でのＣ末端切断によるＣ／Ｃ＊−ＰＴＤＨの消失の時間経過を示す。最初の５分間の時間経過を差し込み図で示す。エラーバーは、２回の独立した試験の標準偏差を表す。
【図１１Ａ−１１Ｂ】異なる条件下でのＣ末端切断反応速度を示した図である。図１１Ａは、異なる緩衝条件下で、２２℃で実施したＮＣ１Ａ−ＣＢＤ（構築物１２）とＣ＊−ＰＴＤＨ（構築物６）との反応のＳＤＳ−ゲルを示す。「＋」は不純物を示す。図１１Ｂは、異なる条件下で計算したＣ末端切断パーセントを示す。エラーバーは、２回の独立した実験の標準偏差を表す。
【図１２】Ｃ末端切断の＋１残基の効果を示した図である。ｐＨ８及び２２℃でのＮＣ１Ａ−ＣＢＤとＣ＊−Ｘ−ＧＦＰとの反応のＳＤＳゲル。Ｃ＊−Ｘ−ＧＦＰの算出したＣ末端切断パーセントをそれぞれのレーンの下に示す。上部の大文字は、＋１位でのアミノ酸置換を表す。２回の独立した実験による切断反応全ての標準偏差は、７％未満である。
【図１３】ＳＩＲＰ（タグの付いていないタンパク質のスプリットインテイン媒介による超高速精製）と称する開発方法を使用したタンパク質精製を示した図である。図１３は、キチン媒介によるクロマトグラフィー精製法の概略図である。Ｃ＊−ＰＯＩの溶解物を、ＮＣ１Ａ−ＣＢＤを予め結合させたカラムにＺｎＣｌ２  ０．５ｍＭの存在下で通過させる。洗浄後、ＤＴＴを添加することによってインテインＣ末端切断反応を誘導し、精製したＰＯＩをフロースルー中に集めることができる。その後、カラムは、ｐＨ１１．４緩衝液で洗浄し、インテイン複合体を解離させることによって再生する。
【図１４Ａ−１４Ｂ】ＳＩＲＰ方法の下で、ＮＣ１Ａ−ＣＢＤ−キチン樹脂を使用したＰＴＤＨ（図１４Ａ）及びＧＦＰ（図１４Ｂ）の精製を示した図である。ＰＴＤＨ（左）及びＧＦＰ（右）の精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーン１、Ｃ＊−ＰＴＤＨ／ＧＦＰを含有する溶解物の可溶性画分；レーン２、可溶性溶解物のフロースルー；レーン３、溶解物を添加し、ＺｎＣｌ２  ０．５ｍＭを含有する緩衝液で洗浄した後のキチン樹脂；レーン４、ｐＨ１１．４緩衝液におけるＣ＊−ＰＴＤＨ／ＧＦＰの溶出；レーン５、切断緩衝液中で２２℃で３０分間インキュベートしたキチン樹脂；レーン６、切断緩衝液中で６℃で３時間インキュベートしたキチン樹脂；レーン７、切断緩衝液中で２２℃で３０分間インキュベートした後のフロースルー；レーン８、６℃で３時間インキュベートした後のフロースルー；レーン９、標的タンパク質溶出後のキチン樹脂。
【図１５】精製後キチン結合ＮＣ１Ａ−ＣＢＤを再生することができることを示した図である。再生したカラムを使用したＰＴＤＨの精製中に収集した試料のＳＤＳ−ゲル、レーン１、切断前のキチン樹脂；レーン２、切断緩衝液中で２２℃で３０分間インキュベートしたキチン樹脂；レーン３、精製したＰＴＤＨを含有するフロースルー。切断されたＣ＊は４ｋＤａで、ゲルで視覚化することはできない。
【図１６】タンパク質精製法の２つの実施形態の概略図である。方法１：カラムを使わない方法。方法２：クロマトグラフィーをベースにした方法。印は溶解物中に存在する大腸菌（E.coli）の細胞性タンパク質を表す。
【図１７Ａ−１７Ｃ】操作したＮｐｕ＊インテインを使用したＰＴＤＨ、ＤｓＲｅｄ及びＧＦＰの精製を示した図である。図１７Ａは、ＥＬＰの可逆的沈降法によるＰＴＤＨの精製中に収集した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミド）分析を示す。レーン１、予備精製したＥＬＰ−Ｎ（５）；レーン２、Ｃ＊−ＰＴＤＨ（３）を含有する可溶性溶解物；レーン３、レーン１及び２の試料の混合物；レーン４、ＥＬＰ複合体の沈降後の上清；レーン５及び６、それぞれ２２℃でのインテイン反応のｔ＝０及び３ｈでのＥＬＰ−Ｎ及びＣ＊−ＰＴＤＨの混合物；レーン７、３ｈインテイン反応後のＥＬＰ沈降；レーン８及び９、それぞれ、３及び２０ｈインテイン反応後の硫酸アンモニウム沈降後の精製したＰＴＤＨを含有する上清。同等量のタンパク質を各レーンに添加した。黒い矢印は切断されていないＣ＊−ＰＴＤＨを示す。図１７Ｂは、ＥＬＰの可逆的沈降によるＤｓＲｅｄ精製の経過によって得られた画像を示す。図１７Ｃは、キチンカラムによるＧＦＰの精製中に収集した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％アクリルアミド）分析を示す。レーン１及び２、それぞれＣＢＤ−Ｎ（２）及びＣ＊−ＧＦＰ（３）を含有する可溶性溶解物；レーン３、ＣＢＤ−Ｎ（２）結合後にキチンビーズから得られた試料；レーン４、Ｃ＊−ＧＦＰ（４）結合直後にキチンビーズから得られた試料；レーン５、インテイン反応３時間後の試料；レーン６、ＧＦＰ溶出後にキチンビーズから得られた試料；レーン７、精製したＧＦＰを含有する溶出液。レーン１及び２以外は、同等量のタンパク質を各レーンに添加した。
【図１８Ａ−１８Ｂ】ＥＬＰの可逆的沈降及び自己切断Ｃ＊を使用した組換えタンパク質のさらなる試料精製を示した図である。レーン１、予備精製したＥＬＰ−Ｎ；レーン２、Ｃ＊−ＰＯＩを含有する可溶性溶解物；レーン３、レーン１及び２の試料の混合物；レーン４、ＥＬＰ複合体の沈降後の上清；レーン５及び６、それぞれインテイン反応開始時及び３時間後のＥＬＰ−ＮとＣ＊−ＰＯＩとの混合物；レーン７、インテイン切断反応３時間後のＥＬＰ沈降物；レーン８及び９、それぞれ、インテイン切断反応時間３及び２０時間での硫酸アンモニウム沈降後の精製したＰＯＩを含有する上清。同等量のタンパク質を各レーンに添加した。黒い矢印は切断されていないＣ＊−ＰＯＩ（Ａ）ＤｓＲｅｄ、（Ｂ）β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、（Ｃ）クロラムフェニカルアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、（Ｄ）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、（Ｅ）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を示す。
【図１９】ＥＬＰ沈降によるタンパク質精製及び定量を示した図である。ａ：２２℃でのインテイン反応時間；ｂ：精製収率は、湿潤大腸菌ペレット２５ｍｇから決定した。ｃ：パーセント回収率は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの濃度測定分析を使用して推定した。ｄ：３時間インテイン反応時間で精製したタンパク質を使用した。β−ガラクトシダーゼ１単位は、２２℃で１分当たりＯＮＰＧ  １．０μｍｏｌｅを加水分解するために必要なタンパク質の量と定義する。ＤＴＴはＰＴＤＨ及びＣＡＴ反応の生成物の吸収に干渉し、これらのタンパク質の正確な活性アッセイを妨害する。ＭＢＰの活性は、定量的にのみ分析した。ｅ：ＮＤ、測定せず。ｆ：括弧内の数字は、活性アッセイをベースにしたパーセント回収率を表す。
【図２０】図２１におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに添加した試料に対する活性アッセイをベースにして計算したＥＬＰプルダウン効率及び精製収率を示した図である。ａ：プルダウン効率＝（レーン２活性−レーン４活性）／レーン２活性×１００％。ｂ：収率（３時間）＝レーン８活性／レーン２活性×１００％。ｃ：収率（２０時間）＝レーン９活性／レーン２活性×１００％。
【図２１Ａ−２１Ｂ】Ｃ末端切断に必要な電荷リレーに関与する残基を示した図である。図２１Ａは、Ｃ末端アスパラギン環化を担う電荷リレーの第１のステップの模式である。ＳｓｐＤｎａＥ（オレンジ色）及びＮｐｕＤｎａＥ（黒）における対応する残基を示す。図２１Ｂは、ＳｓｐＤｎａＥ（オレンジ色、ｐｄｂ：１ｚｄ７）及びＮｐｕＤｎａＥ（基本色、ｐｄｂ：２ｋｅｑ）における電荷リレー残基の構造アラインメントを示す。Ａｓｎ１３７はＮｐｕＤｎａＥにおいてＡｓｐ１１７と水素結合を形成し、電荷リレーへの関与にあまり適さなくなる。
【図２２】Ｃ＊−ＧＦＰ（３）とＣＢＤ−ＮｐｕＮ（１）の反応を様々な温度でＤＴＴ５ｍＭでインキュベートしたことを示した図である。反応は、試料をＳＤＳ試料緩衝液と混合し、５分間煮沸することによって停止した。
【図２３】適切なＤｎａＥインテイン並びにそれらの由来し得る属、種及び株を挙げた図である。
【図２４】Ｎ−インテイン並びにＣ−インテインアミノ酸配列（配列番号７０〜８７）を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の様々な実施形態の作製及び使用を以下に詳細に論じるが、本発明は、多種多様な具体的な状況において実施することができる多くの応用可能な本発明の概念を提供するものであることを理解されたい。本明細書で記載した具体的な実施形態は、本発明を作製し、使用するための具体的な方法を例示するのみであり、本発明の範囲を限定しない。
【００２３】
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。本明細書で定義した用語は、本発明に関連する分野の当業者によって通常理解されている意味を有する。「１つの（ａ）」、「１つの（an）」及び「その（the）」などの用語は、単数の実体のみを意味するだけではなく、具体的な実施例を例示のために使用することができるその一般型を含む。本明細書の専門用語は、本発明の特定の実施形態を説明するために使用されているが、それらの使用は、特許請求の範囲で概説されている場合を除いて、本発明を限定しない。
【００２４】
用語「遺伝子」とは、機能的タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードする単位を意味するために使用される。当業者によって理解されるように、この機能的用語には、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列又はそれらの断片若しくは組み合わせ、並びに、ヒトの手によって改変することができるものを含む遺伝子産物のいずれもが含まれる。精製された遺伝子、核酸、タンパク質などは、通常関連する少なくとも１種の混入核酸又はタンパク質から同定され、分離されたとき、これらの実体を意味するために使用される。
【００２５】
本明細書で使用したように、用語「ベクター」とは、１つの細胞から別の細胞へＤＮＡ断片を移す核酸分子に関して使用する。ベクターはさらに、特定の配列を増やすために設計されたベクター、又は特定の配列に作動可能に結合したプロモーターを含む発現ベクター、又はこのようなプロモーターの導入を引き起こすように設計されたベクターと定義することができる。ベクターは、宿主細胞染色体と独立した状態で存在していてもよく、又は宿主細胞染色体に組み込まれていてもよい。
【００２６】
用語「宿主細胞」とは、古細菌、原核細胞又は真核細胞を問わず、核酸セグメント又は改変されたセグメントを含有するように操作された細胞を意味する。したがって、操作された、又は組換えられた細胞は、人の手によって組換えられた導入遺伝子を含有しない、天然に生じる細胞と区別することができる。
【００２７】
核酸又はポリペプチド配列に関して、用語「改変された」又は「改変」又は「変更した」とは、挿入、欠失、置換、関連のある、若しくは関連のない配列との融合などの変化、人の手によって生じ得る変化、又は多型、対立遺伝子及びその他の構造型などの天然に生じ得る変化を含むことを意味する。改変には、所与のハイブリダイゼーションプローブを使用したハイブリダイゼーション特性が異なるゲノムＤＮＡ及びＲＮＡ配列が包含される。ポリヌクレオチド配列又はそれらの断片の改変には、機能を増加、減少させるか、又は機能に全く影響を及ぼさないものが含まれる。ポリペプチドの改変とは、アミノ酸誘導体若しくはコンジュゲート、又は翻訳後修飾などの組換えＤＮＡ操作、化学的若しくは生化学的修飾によって変化したものを意味する。
【００２８】
用語「制御配列」とは、特定の宿主生物において、作動可能に結合したコーディング配列の発現のために必要なＤＮＡ配列を意味する。原核細胞に適した制御配列は、例えば、プロモーター、場合によってオペレーター配列、リボソーム結合部位及び転写ターミネーターを含む。細胞培養物が成長し、成熟する間、例えば、対数期中に、増殖阻害量未満のレベルでＦａｂ’ポリペプチド合成を抑制する、強く調節された誘導プロモーターを使用することができる。
【００２９】
別の核酸配列と機能的に関係がある場合、核酸は「作動可能に結合」している。例えば、ポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現させる場合、プレ配列若しくは分泌リーダー用のＤＮＡをポリペプチドのＤＮＡに作動可能に結合させ、配列の転写を達成する場合、プロモーター又はエンハンサーをコーディング配列に作動可能に結合させ、又は翻訳を容易にするために配置する場合、リボソーム結合部位をコーディング配列に作動可能に結合させる。一般的に、「作動可能に結合した」とは、結合したＤＮＡ配列は連続しており、分泌リーダーの場合、同じリーディングフレーム内に連続していることを意味する。エンハンサーは、連続している必要はない。結合は、便利な制限部位でのライゲーションによって実現する。このような部位が存在しないならば、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを従来の実施にしたがって使用する。
【００３０】
「外因性」要素とは、本明細書では、細胞にとって外来の核酸配列であるか、又は細胞にとってホモログであるが、その要素が通常見いだされない宿主細胞核酸内の位置にあることを意味するものと定義される。
【００３１】
本明細書で使用したように、「細胞」及び「細胞培養物」という表現は同義に使用され、このような名称には全て後代が含まれる。したがって、「形質転換体」及び「形質転換した細胞」という語には、初代対象細胞及び継代の回数に関係なく、それらから得られた培養物が含まれる。計画的又は偶発的な変異があるため、後代は全て、ＤＮＡ内容物が正確に一致していないこともあることを理解されたい。元々の形質転換細胞でスクリーニングされたのと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体後代が含まれる。様々な呼び方は、前後関係から明らかだろう。
【００３２】
「プラスミド」は、大文字及び／又は数字の前後の小文字ｐによって指定される。本明細書の開始プラスミドは市販されており、制限なく公的に入手可能であるか、又は公表された手法にしたがってこのような入手可能なプラスミドから構築することができる。さらに、その他の同等のプラスミドは、当業界では公知で、当業者には明らかであろう。
【００３３】
制限酵素消化からのＤＮＡの所与の断片の「回収」又は「単離」とは、電気泳動によるポリアクリルアミド若しくはアガロースゲルでの消化物の分離、公知の分子量のマーカーＤＮＡ断片に対するその移動度の比較による所望の断片の同定、所望の断片を含有するゲル部分を取り出し、及びＤＮＡからのゲルの分離を意味する。この手法は一般的に公知である。例えば、Lawn et al. （Nucleic Acids Res. 1981. 9:6103-6114）及びGoeddel et al. （Nucleic Acids Res. 1980. 8:4057）を参照のこと。
【００３４】
細胞からのＤＮＡの「調製」とは、宿主細胞の培養物からのプラスミドＤＮＡの単離を意味する。ＤＮＡ調製に通常使用される方法は、Sambrook et al., （Molecular Cloning: A Laboratory Manual New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）の1.25〜1.33項に記載された大規模及び小規模のプラスミド調製である。ＤＮＡ調製物は、当業界で周知の方法によって精製する（Sambrook et al.,上記の1.40節を参照のこと）。
【００３５】
本明細書で使用したように、用語「タンパク質−タンパク質複合体」又は「タンパク質複合体」とは、１つ以上のタンパク質の会合を意味する。複合体のタンパク質は、限定はしないが、機能的、立体化学的、構造的、生化学的若しくは静電気的会合を含む様々な手段又は手段の任意の組み合わせによっても会合することができる。この用語には、任意の数のタンパク質の会合も包含することを意図する。
【００３６】
本明細書で使用したように、用語「タンパク質」、「ポリペプチド」又は「ペプチド」とは、ペプチド結合によって結合したアミノ酸を含む化合物を意味し、同義に使用される。
【００３７】
本明細書で使用したような用語「所望のタンパク質」とは、本発明の方法及び構築物を使用して単離又は精製することが所望されるタンパク質、その機能及び／又は発現を意味する。本発明は、原核生物にせよ真核生物にせよ、任意の生物の任意の遺伝子によって発現した任意のタンパク質の単離及び／又は精製に関して有用であり得る。
【００３８】
ヌクレオチドに関して、用語「基本的に配列番号（＃）に記載の配列（a sequence essentially as set forth in SEQ ID NO. (#)）」、「に類似の（a sequence similar to）」、「ヌクレオチド配列（nucleotide sequence）」及び類似の用語は、本明細書において配列番号１として同定した配列のいかなる分にも実質的に対応する配列を意味する。これらの用語は、合成的に、並びに天然に得られる分子を意味し、例えば、核酸配列によるハイブリダイゼーション、又は活性の全体又は一部をコードする能力に関して、生物学的、免疫学的、実験的又はその他に機能的に同等な活性を保有する配列を含む。もちろん、これらの用語は、その直線的順番によって指定されるこのような配列の情報を含むことを意味する。
【００３９】
用語「相同性」とは、２つの核酸が相補的である範囲を意味する。部分的又は完全な相同性であってもよい。部分的に相補的な配列とは、完全に相補的な配列が標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害する配列であり、機能用語「実質的に相同な」を使用して表現される。ハイブリダイゼーションの程度又は範囲は、ハイブリダイゼーション又はその他のアッセイ（競合ＰＣＲアッセイ）などを使用して調べることができ、当業者に公知なように、ストリンジェンシーが低くても特異的に相互作用することを含むことを意味する。
【００４０】
標的配列に対して完全に相補的な配列のハイブリダイゼーションの阻害はまた、低ストリンジェンシー条件下で、固体支持体を含むハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザン又はノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を使用して調べることができる。低ストリンジェンシー条件とは、２つの配列が互いに結合し、まだ特異的（すなわち、選択的）であることを同定するために使用することができる。非特異的結合がないことは、部分的な相補性さえも欠如している（例えば、約３０％同一性を下回る）第２の標的を使用することによって試験することができる。非特異的結合がなければ、プローブは第２の非相補的標的にハイブリダイズせず、元々の相互作用が選択であることが見いだされる。低ストリンジェンシー条件は一般的に、５×ＳＳＰＥ（ＮａＣｌ  ４３．８ｇ／ｌ、ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ  ６．９ｇ／ｌ及びＥＤＴＡ  １．８５ｇ／ｌ、ｐＨ７．４）、０．１％ＳＤＳ、５×デンハート試薬（５０×デンハートは、５００ｍｌ当たりFicoll（Type 400、Pharmacia社）５ｇ、ＢＳＡ（画分Ｖ；Sigma社）５ｇ及び変性鮭精子ＤＮＡ１００マイクログラム／ｍｌ）からなる溶液中における摂氏４２度での結合又はハイブリダイゼーションと同等の条件であり、長さ約５００ヌクレオチドのプローブを使用するときは、その後摂氏４２度で５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ含む溶液で洗浄する。低ストリンジェンシー条件を実現するために数多くの同等の条件を使用することができることは当業界では公知である。ストリンジェンシーのレベルに影響を及ぼす要素には、プローブの長さ及び性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）並びに標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成、溶液中に存在するか、又は固定されているかなど）並びに塩及びその他の成分（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコール）の濃度が含まれる。同様に、ハイブリダイゼーション溶液は、上記の条件と異なるが同等の低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションの条件を作製するために変化させることができる。さらに、高ストリンジェンシーの条件下（例えば、ハイブリダイゼーション温度の上昇及び／又は洗浄ステップの増加、ホルムアミドの包含など）でハイブリダイゼーションを促進する条件は当業界で公知である。
【００４１】
本発明者等は、短時間でタグの付いていないタンパク質を精製するために、操作されたスプリットインテインの使用を可能にする超高速法（ＳＩＲＰ）を開発した。特定の実施形態では、この技術は、小規模利用においてタグの付いていないタンパク質を精製するための強力な新規方法を提供する。特定の実施形態では、低コストのキチンビーズを使用する。その他の実施形態では、ＣＢＤの親和性支持体として低コストのＣＢＤ結合アモルファスセルロースマトリクスを使用する。これによって、このインテイン媒介による方法の利用は、大規模なタンパク質精製用の親和性をベースにしたステップとして魅力的となる。その他の実施形態では、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）の沈降を使用する。
【００４２】
いくつかの実施形態には、図２３及び図２４に掲示したインテインが含まれる。
【００４３】
本発明者等は、組換えタンパク質の精製において、タグの迅速で効率的な除去は重要な問題であることを認識している。ノストック・パンクチフォルメの天然のスプリットＤｎａＥインテインの操作されたＣ末端切断を使用して、本発明者等は、１時間未満で大腸菌溶解物からのタグの付いていない組換えタンパク質の精製を可能にするタグの付いていないタンパク質のスプリットインテインによる超高速精製（ＳＩＲＰ）を開発した。
【００４４】
本発明者等は、親和性タグが組換えタンパク質の精製を簡単にし、現代のバイオテクノロジーには極めて重要であることを認識している。しかし、今のところ親和性タグを除去する簡単で低コストな方法はないので、タグの除去に必要なプロテアーゼに余分な時間及び高いコストがかかるため、大規模な工業プロセスにおいては親和性タグの有用性が大きく損なわれる。タグ除去に使用されるほとんどのプロテアーゼは、特異性が低いか又は活性が低く、切断後に標的タンパク質の特定のアミノ酸を遊離させる。最近発見されたＳＵＭＯ−プロテアーゼは、高い特異性及び効率の両方を示している（２２℃で２０分以内に９０％超完了）。しかし、ＳＵＭＯ−プロテアーゼ（Life Technologies社）を使用して組換えタンパク質１ｇを切断するコストは６７３，０００ドルで、ほとんどの適用において使用することができない。
【００４５】
本発明者等は、酸性（ｐＨ６）又は還元環境においてＮ／Ｃ末端切断反応を行うために操作されたインテインを使用した、プロテアーゼを用いないタンパク質精製方法が開発されたことを認識している。インテインは、ペプチド結合を介して関連するＮ−及びＣ−エクステインを結合させるスプライシング反応を触媒するタンパク質である。インテインは、酸性（ｐＨ６）又は還元環境においてＮ又はＣ末端で切断反応を１回実施するように操作することができ、これらの操作されたインテインは、タンパク質精製への適用において刺激応答性タグを除去するために利用することができる。しかし、これらのタンパク質精製の適用において使用した操作されたインテインは、常に非効率的で、顕著な切断／タグ除去を実現するためには少なくとも一晩インキュベートすることが必要である（図１）。また、これらの系では、インビボにおいて切断が不完全で、標的タンパク質が遊離する。したがって、作用が遅いインテインを使用しなければ、標的タンパク質を発現させる条件はしばしば、インビボにおけるインテイン切断を最小限に抑えるために最適化させる必要がある。場合によっては、発現条件を最適化した後でも、不完全なタンパク質切断がまだかなり標的タンパク質収率に影響を及ぼす。本発明者等は、インビボにおいてインテインによる不完全な切断を誘導する可能性がなく、ずっと短い時間で切断／タグ除去反応を実施する、したがって、経済的で、広範に使用しやすい、タグの付いていない組換えタンパク質を精製するためのインテインによるシステムを作り出した。
【００４６】
特定の実施形態では、本発明者等は、２つのペプチド鎖：Ｎ末端インテイン（ＩＮ）とＣ末端インテイン（ＩＣ）の間でその触媒残基がスプリットするスプリットインテインを使用して、インビボにおける標的タンパク質切断を防ぐ溶液を認識している。スプリットインテインは、２つの断片が会合したときにのみ活性を有する。シネコシスティス（Synethocystis）種（Ｓｓｐ）の人工的にスプリットしたＤｎａＢインテイン使用した２つのタンパク質精製系を開発した。１つでは、人工的なスプリットＳ１  ＤｎａＢインテインは１１−アミノ酸Ｎ−インテイン（ＩＮ）及び１４４−アミノ酸Ｃ−インテイン（ＩＣ）からなる。標的タンパク質をＩＣに融合させ、タグ除去はＩＮペプチドを付加することによって実現する。Ｎ−エクステインは全く存在しないので、野生型触媒残基は維持される。十分な切断を実現するために、４０対１モル比でＩＮ対ＩＣが融合した標的タンパク質が必要である。ＩＮのサイズが小さいにも関わらず、ペプチド合成はコストが高いので、大規模プロセスにおいてこの系は利用することはできない。異なるスプリット接合部を備えた同じＳｓｐＤｎａＢインテインを使用する類似の親和性をベースにした精製系も開発した。この系では、Ｎ及びＣ末端の適切な触媒残基の変異を、それぞれＣ及びＮ末端切断を実現するために使用する。しかし、野生型ＳｓｐＤｎａＢの反応速度は比較的速いにも関わらず（図１）、変異体インテインは、反応速度が遅く、十分なＣ末端切断を実現するために室温でインキュベーション時間を延長する必要がある（１６時間）。インキュベーション時間が長いため、この系の有用さは限られる。
【００４７】
特定の実施形態では、本発明者等は、人工的なスプリットインテインを使用するにはさらに２つの制限があること：人工的スプリットインテインは、（１）一部にはスプリット断片間の親和性が低いため、連続したものよりも活性が低く、（２）単独で発現させた場合、凝集体を形成する傾向が高いことを認識している。本発明者等は、Ｓｓｐ及びＮｐｕのＤｎａＥなどの天然のスプリットインテインは活性が高く、可溶性で、２つのスプリット断片間で非常に高い親和性を表すことを認識している。２つの天然のスプリットＤｎａＥインテインはいずれも、タンパク質精製に使用されたことはない。ＤｎａＥのＩＮの高度に曝露された疎水性表面（Ｎｐｕ及びＳｓｐそれぞれのＤｎａＥの１０２及び１２３アミノ酸）は、Ｎ−エクステインの折り畳みに干渉する傾向があり、いくつかの融合タンパク質が誤って折り畳まれ、不溶性凝集体が形成される原因となり、一般的な精製タグとしてのＮ断片の有用さが限定される。本発明者等は、そのサイズが小さく（Ｎｐｕ及びＳｓｐの両方とも３６アミノ酸）、標的タンパク質の溶解性にあまり干渉しないにも関わらず、ＤｎａＥのＣ断片はまた、Ｃ及びＮ末端切断反応と密接に共役しているので、精製タグとして適していないことを認識している。天然のスプリットＤｎａＥインテインでは、Ｃ末端切断は、Ｎ末端切断後にのみ生じることができ、最初のＣｙｓをＡｌａに変異させると、Ｃ末端切断活性を干渉することなくＮ末端切断を正常に妨害し、Ｃ末端切断も消失させる（図２Ｂ）。
【００４８】
特定の実施形態のために、本発明者等は、Ｎ末端を切断することなくＣ末端を切断するために、ミニ−ＭｔｕＲｅｃＡインテインに対する配列アラインメントをベースにして、１個の変異、Ａｓｐ１１８を導入することによってＮｐｕＤｎａＥ（Ｎｐｕ＊と称する）を操作した。Ｎｐｕ＊は、２２℃で反応３時間以内に、約８０％のＣ末端切断収率を実現する。比較として、同程度のＣ末端切断を実現するためには、ＳｃｅＶｍａ１及びＳｓｐＤｎａＢインテイン（IMPACT Manual社）を使用するＩＭＰＡＣＴ系（New England Biolab社）では２３℃で約１６時間かかる。Ｎｐｕ＊を使用して、本発明者等はさらに、２つのタンパク質精製法を開発し、短時間以内（４時間未満）に高収率（大腸菌培養物１リットル当たり最高８４ｍｇ）で電気泳動的に純粋に複数の標的タンパク質を精製し、これらの技術の有用さ及び大規模な産業的タンパク質精製のための可能性を示唆した。
【００４９】
本発明者等は、Ｎ末端切断の非存在下で迅速なＣ末端切断を触媒することができるＤｎａＥインテインの操作を開示する。特定の実施形態では、以前に操作したＣ末端切断インテインミニ−ＭｔｕＲｅｃＡとの配列アラインメントをベースにして、ノストック・パンクチフォルメＰＣＣ７３１０２のＤｎａＥインテイン（ＮｐｕＤｎａＥ）に１変異、Ａｓｐ１１８Ｇｌｙを導入した。この変異は、トランススプライシン活性を抑制し、Ｎ末端切断を遅らせ、Ｃ末端切断効率を著しく上昇させることができた。分子モデリングによって、ＮｐｕＤｎａＥにおいて、Ａｓｐ１１８は最後から２番目のＡｓｎと水素結合を形成し、Ｎ末端切断前の自然発生的な環化を妨害することが示唆される。Ａｓｐ１１８をＧｌｙに変異させると、この制限がなくなり、その後、Ｎ末端切断非存在下でＣ末端切断が導かれる。Ｇｌｙ１１８  ＮｐｕＤｎａＥ変異体は、迅速な硫黄依存性（又は硫黄誘導性）Ｃ末端切断反応速度を示し、室温で３時間以内に８０％が完了する。様々な実施形態において、本発明者等はこの新たに操作したインテインを使用して、除去可能な精製タグとして、エラスチン様ペプチドを利用するカラムを使わないタンパク質精製法及びキチン結合タンパク質を利用するクロマトグラフィーをベースにしたタンパク質精製法の両方を開発した。特定の実施形態では、電気泳動的な純度で、収率が大腸菌培養物１リットル当たり最高８４ｍｇで、標的タンパク質を迅速に精製する。
【００５０】
特定の実施形態では、インテインのインビトロにおける活性を分析するために、ＮｐｕＤｎａＥのＩＮ又はＩＣ（Ｎ又はＣ）を含有する様々な融合タンパク質を図３に例示したように生成した。タンパク質精製タグとして応用するために、インテイン活性は外部刺激によって調節されることが重要である。理論上では、インテイン反応はいかなるチオール試薬も必要としないが、ＮｐｕＤｎａＥインテイン内には、分子内ジスルフィド結合を形成することができ、酸化還元トラップを形成することによってインテイン反応を妨害し得る不対システイン残基がいくつかある。本発明者等は、ＮｐｕＤｎａＥ活性が硫黄依存性であるかどうかを測定した。精製したＣＢＤ−Ｎ（構築物２）は、ＤＴＴ２ｍＭの非存在下又は存在下で、同濃度のＣ−ＧＦＰ（構築物１）と混合した。トランススプライシング生成物ＣＢＤ−ＧＦＰは、ＤＴＴを含有する反応においてのみ存在したので、スプリットＮｐｕＤｎａＥインテインは硫黄依存性であることが確認された（図４）。トランススプライシング反応は、３０分後にほぼ完了する。微量の切断されたＮ及びＣエクステインはまた、視覚化することができ、ＤＴＴ濃度５０ｍＭで実施した反応では若干目立っている（図２Ａ）。ＤＴＴは、直鎖状又は分岐状中間体のチオエステル結合への求核攻撃を開始することができ（それぞれ図５Ａ、ステップ１及び２）、Ｎ末端切断を引き起こす。本発明者等は、ＳｓｐＤｎａＥインテインでは、ＤＴＴ５０ｍＭが存在するとタンパク質トランススプライシングがほぼ完全にブロックされ、Ｎ末端切断及びその後のＣ末端切断の反応が遮断されることが見いだされたことを認識している。ＤＴＴ５０ｍＭでも、ＮｐｕＤｎａＥインテインにおいて認められた一定限度の量のＮ末端切断は、直鎖状／分岐状中間体のトランススプライシング生成物への変換がＤＴＴによる求核攻撃と有効に競合するならば、極めて迅速なトランススプライシング反応速度によるものであり得る。
【００５１】
特定の実施形態では、最初のＣｙｓがＡｌａに置換した変異体Ｎ、ＣＢＤ−ＮＣ１Ａ（構築物４）は、ＤＴＴ５０ｍＭでもトランススプライシング活性を示さず、Ｃ末端切断活性は無視でき（図２Ｂ）、Ｃ末端切断反応はＤｎａＥインテインにおいてＮ末端切断と密接に共役しているという以前の発見と一致した。本発明者等は、この特有の特性が、Ｃ末端タンパク質精製適用に野生型ＤｎａＥインテインを使用することの妨げとなることを認識している。
【００５２】
Ｃ末端を切断するＮｐｕ  ＤｎａＥの合理的設計：いくつかの例外はあるが、ほとんどのインテインスプライシング反応は、４つの協調性の高い求核置換を含む（図５Ａ）。最初のステップは、インテインの最初の残基、システイン（Ｃｙｓ１）又はセリンが前のペプチドカルボニルを攻撃し、直鎖状（チオ）エステルを形成するＮ−Ｘアシルシフト（Ｘ：Ｃ又はＳ）を含む。第２のステップにおいて、Ｃ−エクステインの第１の残基、システイン（Ｃｙｓ＋１）、セリン又はトレオニンは、この（チオ）エステルカルボニルを攻撃し、Ｎエクステインを切断し、１つはインテインに属し、他方はＮエクステインに属する２つのＮ末端を備えた分岐状中間体を形成する。この状況で、エクステインは一緒に結合するが、まだインテインＣ末端に結合している。次に、この分岐状中間体は、インテインの最後のアスパラギン残基が関与するトランスアミド化反応によってインテインから切断される（ステップ３）。最終ステップにおいて、遊離のエクステインは、自然発生的なＸ−Ｎアシルシフトを受け、ペプチド結合への（チオ）エステルを復帰させ、スプライスしたタンパク質生成物を形成する。
【００５３】
ほとんどのインテインにおいて、Ｎ及びＣ末端での反応は独立しており、したがって１末端での反応を消失させる触媒残基の変異は、その他の末端での切断反応を引き起こす（図１及び５Ｂ）。しかし、Ｎ及びＣ末端切断反応が密接に共役しているため、従来の方法は、Ｃ末端切断ＤｎａＥインテインの操作に使用することはできない。Ｃ末端切断インテイン、ミニ−ＭｔｕＲｅｃＡは、定向進化を使用して操作した。単一の変異、Ｄ４２２Ｇが、Ｃ末端切断活性の上昇及びＮ末端切断の抑制を担うことが発見された。ＮｐｕＤｎａＥ及びミニ−ＭｔｕＲｅｃＡインテインのアラインメントによって、配列レベルの高い相同性（図６）及び構造レベルでもより高い相同性（図５Ｃ）が明らかになった。Ａｓｐ４２２（ＮｐｕＤｎａＥのＡｓｐ１１８）を含む触媒残基のほとんどは、ＮｐｕＤｎａＥとミニ−ＭｔｕＲｅｃＡインテインの間で保存されている（図６）。本発明者等は、変異Ｄ１１８ＧがＮｐｕＤｎａＥインテインにＣ末端切断活性を付与できることを認識している。
【００５４】
Ａｓｐ１１８Ｇｌｙ変異を有するＮｐｕ  ＤｎａＥインテインの活性：Ｄ１１８Ｇ変異の効果を試験するために、部位特異的変異誘発を介してアミノ酸置換をＣ−ＧＦＰに導入し、Ｃ＊−ＧＦＰ（構築物３）を形成した。野生型ＮｐｕＤｎａＥと同様に、変異体Ｎｐｕ＊の活性も硫黄依存性である。Ｄ１１８Ｇ変異は、トランススプライシング反応を完全に消失させ、還元条件下で迅速なＣ末端切断を誘導した（図７Ａ）。自然発生的なＣ末端切断は、Ｃ＊−ＧＦＰを単独で、又はＤＴＴと共に室温でインキュベートすると、２０時間後でも認められず、Ｃ末端切断活性はＮ依存性であることが確かめられた。反応を低ＤＴＴ濃度で実施した場合、遊離のＮ−エクステインはほとんど認められず、高ＤＴＴ濃度（５０ｍＭ）での反応では遊離Ｎエクステインは非常に限定された量のみ認められ、このＤ１１８Ｇ変異は基本的に第１のＮ−Ｘアシルシフトを消失させ、Ｎ末端切断とは独立したＣ末端切断反応を誘導することが示唆された。Ｎｐｕ＊がＮ末端切断の非存在下でＣ末端切断を行うことができることをさらに確認するために、本発明者等は、ジスルフィド結合を破壊することはできるが、チオエステル結合は破壊しないトリアルキルホスフィン（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフォン、ＴＣＥＰ）の存在下で反応を実施した。ＴＣＥＰはまた、Ｎ末端切断が全くなくてもＣ末端切断反応を誘導するので（図７Ｂ）、Ｎｐｕ＊ではＮ及びＣ末端切断活性が共役していないことが示唆された。本発明者等はまた、ＣＢＤ−ＮＣ１Ａ（構築物４）と混合したときのＣ＊−ＧＦＰの活性を測定した。還元条件下で同様の速度のＣ末端切断が認められた。しかし、ＤＴＴの非存在下でも迅速なＣ末端切断が認められ、制御可能なタンパク質精製タグとして使用するためには不適切となった（図８）。Ｃｙｓ１及びＣｙｓ＋１は、非常に接近しているので、２つのインテイン断片の会合のすぐ側にジスルフィド結合を形成することができ、インテイン反応をさらに妨害し、還元剤によるＣ末端切断開始の制御を可能にする。本発明者等はまた、様々な温度でＮｐｕ＊のＣ末端切断反応速度を測定した（図７Ｃ）。最高の切断速度が３７℃で得られ、約８０％の切断がちょうど１時間で実現した。同じ８０％切断を実現するため、室温（２２℃）でインキュベートした試料では３時間、１６℃では４．５時間が必要だった。８５％を上回るＣ末端切断が４℃で２０時間後に得られた。この切断速度は、類似の切断効率を実現するために２３℃で約１６時間のインキュベーションを必要とするＩＭＰＡＣＴ系（New England Biolab社）で現在使用されているＳｓｐＤｎａＢ及びＳｃｅＶｍａ１インテインの速度よりも著しく速い。Ｎが過剰に存在すると、より速い切断速度を実現することが可能であり得る。一緒に考え合わせると、これらの結果は、タンパク質精製の自己切断タグとしてのＮｐｕ＊の有用性を示唆している。
【００５５】
略語：ＥＬＰ、エラスチン様ペプチド；ＣＢＤキチン結合ドメイン；ＰＯＩ、所望のタンパク質；Ｍｔｕ、マイコバクテリウム・チュバーキュロシス；Ｎｐｕ、ノストック・パンクチフォルメ；ＩＮ／ＩＣ、スプリットインテインＮ／Ｃ断片；Ｎ／Ｃ、ＮｐｕＤｎａＥ  Ｎ／Ｃ断片；ＩＰＴＧ、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド；ＳＤＳ、ドデシル硫酸ナトリウム。
【００５６】
ＳＩＲＰで使用したＣ末端切断反応速度及び効率を得るために、本発明者等はインテインスプリット接合部（インテインＮ断片のＣ末端）にタンパク質精製タグを再配置し、標的タンパク質をＣ断片のＣ末端に融合させた。この系は、極端に迅速な硫黄誘導性Ｃ末端切断を示し、２２℃及び６℃の両方で３０秒以内に約５０％が完了した。これは、今までにインテインについて報告された最速のＣ末端切断活性である。反応速度は最初の１分後に減速するように見えたが、８５％を超える切断の完了が、２２℃では３０分以内に、６℃では３時間以内に実現する。超高速切断反応速度は、精製タグをインテインスプリット接合部に配置し、したがって、Ｎ−とＣ−エクステインの間の重要な相互反応の立体的障害の可能性を回避することによって可能になる。操作されたスプリットインテインのＣ末端切断効率は、Ｃ−エクステインの最初の残基が何であるかによって影響を受けず（プロリンは例外であることが見いだされた）、ＳＩＲＰによって精製タグを完全に除去し、天然のＮ末端を備えたタンパク質を精製することが可能であった。Ｃ末端切断反応は、非還元条件下で二価Ｚｎ２＋によって効果的に阻害することができる。重要なことに、インテインＮ及びＣ断片の会合は可逆的なので、タンパク質を捉えるカラム結合インテインＮ断片を何回も使用するために再生することが可能で、タンパク質精製のコストをさらに低減する。ＳＩＲＰ技術は、タグの付いていないタンパク質及びペプチドを精製するための有用な手段を提供するはずである。
【００５７】
ノストック・パンクチフォルメの天然のスプリットＤｎａＥ（ＮｐｕＤｎａＥ）は、非常に高いトランススプライシング活性を有し、構成断片が別々の宿主で発現するので、不完全なインビボにおけるインテイン切断は生じない。本発明者等は、点変異、Ａｓｐ１１８ＧｌｙをＣ−インテイン断片（Ｃ）に導入して変異体Ｃ＊を生成することによって、硫黄誘導性Ｃ末端切断を実施するためにＮｐｕＤｎａＥを操作した。特定の実施形態では、Ｎ−インテイン断片の第１の残基（Ｎ）をＡｌａに変異させて（ＮＣ１Ａ）、いかなるＮ末端切断活性も完全に消失させ、親和性タグ、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）をＮＣ１ＡのＣ末端に付加して構築物ＮＣ１Ａ−ＣＢＤ（構築物１２）を生成した。この構築物は、Ｎ−エクステインとして１個のＭｅｔを含有し、親和性タグをＮ−エクステインとして用い、Ｃ−エクステインによる立体的障害によって切断活性を干渉することができるタンパク質精製用に使用される従来のインテイン系とは対照的である（図９Ａ）。所望のタンパク質（ＰＯＩ）は、Ｃ＊のＣ末端に結合させた。
【００５８】
本発明者等は、図３に挙げたような操作したインテイン対を含有する様々な融合タンパク質を作製した。Ｃ末端切断反応速度を測定するために、球状タンパク質ホスファイト脱水素酵素（ＰＴＤＨ）に融合したＣ＊を含むＣ＊−ＰＴＤＨ（構築物６）を、ＮＣ１Ａ−ＣＢＤ（構築物１２）と１：１モル比でＤＴＴ５０ｍＭの存在下で混合した。２２℃及び６℃の両方で、３０秒以内にＣ＊−ＰＴＤＨからＰＴＤＨ約５０％が切断した（図１０、Ａ及びＢ）。３０秒は、正確に測定できる最も早い時点なので、このような切断を実現するために必要な時間はさらに短い可能性がある。対照的に、Ｃ末端切断インテイン、ｇｐ４１−１Ｃ１Ａで報告された最も速い時間は３７℃でのｔ１／２５分である。反応速度は、最初の１分で減速するが、８５％を上回るＣ末端切断が２２℃で３０分以内、６℃で３時間以内に実現する（図１０Ｄ）。この迅速な切断速度は、おそらく１）野生型ＮｐｕＤｎａＥの高い活性、２）インテインＣ断片における変異Ａｓｐ１１８Ｇｌｙ、及び３）ＰＯＩで干渉される可能性があるＮ−エクステインの排除によるものだろう。興味深いことに、野生型Ｃの切断に使用できないＣＢＤ−ＮＣ１Ａ（構築物４）とは異なり、ＮＣ１Ａ−ＣＢＤはまた、会合時に野生型Ｃの著しいＣ末端切断を誘導することができ、２２℃で３時間で約３０％が切断される（図１０Ｄ、２Ｂ）。これらのデータは、ＳｓｐＤｎａＥインテインでも認められるように、Ｎ末端切断がＮｐｕＤｎａＥインテインで見られるまでＣ末端切断が厳しく制限されるのは、少なくとも部分的にはＮ−エクステインの存在によるものであることをさらに実証している。
【００５９】
ＮＣ１Ａ−ＣＢＤはまた、還元条件下よりもずっと遅い速度ではあるが、非還元条件下でＣ＊−ＰＴＤＨの迅速なＣ末端切断を誘導する（図１１Ｂ、Ｚｎ２＋  ０ｍＭ）。ＤＤＴの非存在でも、中性及び酸性ｐＨの両方で３０分以内に５０％を上回るＣ＊−ＰＴＤＨが切断される。この基本レベルの切断はおそらく、Ｃｙｓ＋１とジスルフィド結合を形成することができインテイン反応を阻害するＣｙｓ１が存在しないためであろう。本発明者等は、操作したＮｐｕＤｎａＥ構築物のＣ末端切断を阻害するＺｎ２＋の能力を試験した。図１１Ａに示したように、ＺｎＣｌ２（０．５ｍＭ）は、非還元条件下で効果的にＣ末端切断反応を阻害するが、ＤＴＴの存在下ではほとんど阻害効果を有さない。阻害は、ｐＨ６でより強力で、２２℃で３時間インキュベートした後のインテイン切断はたったの約１０％である。これらの結果は、Ｚｎ２＋及びＤＴＴはそれぞれ、Ｃ末端切断の停止及び開始の効果的なスイッチとして使用することができることを実証している。Ｚｎ２＋濃度がより高いと、より効率よくＣ末端切断反応を阻害することができ、長時間の洗浄ステップ中の生成物の損失を防ぐために役立つ。本発明者等は、１ｍＭ以上の濃度のＺｎ２＋イオンがいくつかの細胞性タンパク質を沈降させることがあり、したがって細胞溶解物中で直接使用すべきではないことを認識している。ＳｓｐＤｎａＥの結晶構造によると、Ｚｎ２＋は、Ａｓｐ１４０、Ｈｉｓ４８（ＮｐｕＤｎａＥのＡｓｐ１１８、Ｈｉｓ４８と同等である）及びＣｙｓ＋１１６に配位する。しかし、Ｃ＊においてＡｓｐ１１８がＧｌｙに変異すると、Ｎ末端切断の非存在下においてＣ末端切断活性が付与される。したがって、本発明者等は、ＮｐｕＤｎａＥにＺｎ２＋結合のための別の部位があることを認識している。本発明者等はまた、その他のイオン／分子が切断阻害剤を構成し、非還元条件下でＺｎ２＋より効果的にＣ末端切断を阻害することができることを認識している。
【００６０】
特定の実施形態では、非天然のアミノ酸は全て、標的タンパク質から完全に除去することが望ましい。インテイントランススプライシング反応のために、＋１位のシステインはトランスエステル化及びＳ／Ｏ−Ｎアシルシフト反応を完了するために必要である。しかし、Ｃｙｓ＋１は、Ｃ末端切断に関与するアスパラギン環化反応には必要ない。本発明者等は、Ｃ−エクステインの第１の残基（Ｘ）が小さい、大きい、疎水性、極性、陽性及び陰性に荷電した側鎖のアミノ酸の代表として５個の異なるアミノ酸、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ及びＰｒｏと置換した様々なＣ＊−Ｘ−ＧＦＰ融合タンパク質（図３、構築物１４〜１８）を設計した。Ｐｒｏ＋１以外、生じたその他の置換は全て、室温で３０分後にＣ末端切断を完了し（図１２）、＋１位にＣｙｓを含有する元のＣ＊構築物で認められたものと同程度の切断プロファイルであった（図１０）。
【００６１】
特定の実施形態は、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）を含み、操作したインテイン対の有用性を示すために、本発明者等はキチン結合ドメイン（ＣＢＤ）をベースにしたタンパク質精製法を設計し（図１３）、キチン親和性クロマトグラフィーによって２つのタンパク質を精製した（図１４Ａ及び１４Ｂ）。キチン樹脂１ｍＬ当たり高純度のＰＴＤＨが１４ｍｇ、ＧＦＰが１８ｍｇも得られた。ＮＣ１Ａ−ＣＢＤへのＣ＊−ＰＴＤＨ及びＣ＊−ＧＦＰの結合のモル比は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で測定すると、それぞれ０．３５及び０．９２である。結合能の差はおそらく、二量体であるＰＴＤＨのサイズが球状単一ドメインＧＦＰと比較して大きいためであろう。親和性樹脂に固定したときの両タンパク質のインテインＣ末端切断効率は、溶液中で認められたものと同程度で、２２℃で３０分及び６℃で３時間で８０％超が切断する（図１４、レーン５、６）。Ｃ＊−ＧＦＰ試料中に少量の切断ＧＦＰが存在する（図１４Ｂ、レーン３）。これは主に、細胞溶解中のタンパク質分解切断及びＧＦＰとキチン樹脂の非特異的相互作用によるものである。ｐＨ１１．４緩衝液で選択的に未切断Ｃ＊−ＰＴＤＨ／ＧＦＰがキチン結合ＮＣ１Ａ−ＣＢＤから溶出するので、Ｃ＊とＮＣ１Ａの会合は可逆的で（図１４、レーン４）、Ｃ＊とＮＣ１Ａの間の高い親和性が静電気的相互作用によって大体決定されることを実証している。
【００６２】
特定の実施形態では、ＮＣ１Ａを含む融合タンパク質を再利用する。キチン結合ＮＣ１Ａ−ＣＢＤの再利用性を示すために、本発明者等は同じキチンカラムを４回使用して、ＰＴＤＨの精製を繰り返した（図１５）。切断したＰＴＤＨの溶出後、及びＣ＊−ＰＴＤＨを含有する新鮮な溶解物を添加する前に、切断したＣ＊をカラム上のＮＣ１Ａ−ＣＢＤから除去するために、キチン樹脂をｐＨ１１．４緩衝液で徹底的に洗浄した。精製したＰＴＤＨの収率は、４回のサイクル全てにおいて同程度で、ＮＣ１Ａ−ＣＢＤ−キチン親和性マトリクスは複数回使用サイクルのための再生能力があることが確認された。切断したＣ＊は、完全長Ｃ＊−ＰＴＤＨよりも容易にｐＨ１１．４緩衝液中でＮＣ１Ａ−ＣＢＤから解離することができるのは明らかである。
【００６３】
本発明者等は、タンパク質溶出のための切断誘導剤としてＤＴＴを使用することが、特定の適用、例えば、３次元及び４次元構造のために表面に曝露したジスルフィド結合を利用するタンパク質にとっては望ましくないことを認識している。本発明者等は、基本的な切断を抑制し、ＰＯＩを遊離させるＺｎ２＋イオンをキレートすることができるならば、ＥＤＴＡをＣ末端切断の誘導剤として使用できることを認識している（図１１Ｂ、ＤＴＴ及びＺｎ２＋  ０ｍＭ）。
【実施例１】
【００６４】
可逆的沈降及びキチン樹脂によるタンパク質精製：タンパク質精製におけるＮｐｕ＊の有用性を示すために、本発明者等は、タンパク質精製法の様々な実施形態を開発した（図１６）。特定の実施形態には、エラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）の可逆的沈降と制御可能なＮｐｕ＊のＣ末端切断を組み合わせる方法が含まれる（図１６、方法１）。可動性リンカーＥＬＰ−Ｎ（構築物５）を介してＮをエラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）のＣ末端に結合させ、変異体Ｃ＊を様々な試料標的タンパク質のＮ末端に融合させたＣ＊−ＰＯＩ（構築物３、６〜１０）。非還元条件下で、Ｎ及びＣ＊は切断しなくても互いに非共有的に相互反応し、ＰＯＩとＥＬＰを物理的に会合させる。硫酸アンモニウムの添加は、ＥＬＰの相分離を誘発し、ＥＬＰ及び会合したＰＯＩの凝集を引き起こす。上清中の細胞性タンパク質を除去した後、この沈降物を次に低塩還元緩衝液中で溶解し、相転移を逆転させ、インテインのＣ末端切断を誘導する。切断すると、ＰＯＩはＥＬＰ−インテイン複合体から遊離し、２回目の硫酸アンモニウム沈降及び遠心によって選択的に除去され、溶液中に高純度のＰＯＩを生じさせる。
【００６５】
球状タンパク質ホスファイト脱水素酵素（ＰＴＤＨ）の精製例を図１７Ａに示す。インテイン自己切断反応による収率は、２２℃で３時間及び２０時間でそれぞれ大腸菌培養物１リットル当たり精製ＰＴＤＨ  ４９．８及び５９．３ｍｇであった。さらなる様々なサイズ及び多量体のタンパク質５種類（構築物３、７〜１０）の精製を図１８Ａ〜１８Ｅに示す。ＤｓＲｅｄ（構築物７）の精製方法は、視覚検査によって都合よくモニターすることができる（図１７Ｂ）。可溶性溶解物からの標的タンパク質精製収率及び回収パーセントを図１９にまとめて示す。試験したタンパク質全てについて高純度が得られた。驚くことではないが、ＥＬＰの引き下げ効率及びインテイン切断反応速度は、標的タンパク質によって影響を受ける（図２０）。単量体及び多量体タンパク質はいずれも、この方法によって効率よく精製することができる。ほとんどの場合、インテイン自己切断反応は、基本的に４時間で完了し、全手順が完了する時間は従来のクロマトグラフィーによるタンパク質精製法と同程度である。
【実施例２】
【００６６】
クロマトグラフィーをベースにした方法は、相変わらず組換えタンパク質精製の柱であるので、本発明者等はまた、操作したインテインの用途をさらに拡大するために親和性をベースにした精製法を使用する実施形態を開発した。この方法では、ＥＬＰをキチン結合ドメイン（ＣＢＤ）に置き換え、精製は、キチンビーズへの結合によって実行する（図１６、方法２）。ＧＦＰの精製例を図１７Ｃに示す。精製したＧＦＰの収率は、１００μｌキチンカラムでは約２ｍｇであった。キチンビーズの結合能力は、マルトース結合タンパク質で報告されたものよりもずっと高いようである（０．２ｍｇ／キチンビーズ１００μＬ、New England Biolabs社 website）。確かな理由は分からないが、部分的にはマルトース結合タンパク質と比較してＮのサイズがずっと小さいためであろう。
【００６７】
特定の実施形態は、Ｎ末端を切断することなく迅速なＣ末端切断反応を実施することができる操作されたスプリットＮｐｕＤｎａＥインテインを含む。スプリットＮｐｕＤｎａＥインテインは、今日同定されている最も活性のあるインテインの１つである（図１）。しかし、ＮｐｕＤｎａＥの迅速な反応速度及び高い溶解性にも関わらず、Ｃ末端アスパラギン環化がＮ末端のアシルシフトに依存するため、タンパク質精製などの多くの適用においてＤｎａＥインテインを使用することはできない。インテイントランススプライシングを導く複数のステップの触媒経路が緊密に協調しているが、この一連の反応に関与する正確な機構は分からないままである。インテインＮ／Ｃ末端切断は、スプライス接合部における切断速度の増加又は別のステップの反応速度の減少から生じ得る。本発明者等は、ミニ−ＭｔｕＲｅｃＡインテインにおける単一の変異、Ｄ４２２Ｇがトランススプライシング活性を消失させ、Ｃ末端切断活性を著しく上昇させることができることを認識している。Ａｓｐ４２２はインテイン活性部位内の保存されたブロックＦ領域（Ｃ２モチーフとも称する）にあり、スプリットＮｐｕＤｎａＥ及びＳｓｐＤｎａＥインテインを含む様々な種の全インテイン中で７５％保存されている（図６）。このブロックＦアスパラギン酸は、インテイン反応の第１及び第２のステップの両方に必須であることが以前に示されたことがある（図５Ａ）。ＳｓｐＤｎａＥを含む複数のインテインの結晶構造は、このアスパラギン酸がＮ末端Ｃｙｓ１のオキシアニオンと水素結合を形成することを示しており、第１のステップＮ−Ｘアシルシフトのためにこの残基は配置されるようである。さらに、その他のインテインの量子力学シミュレーション及び構造の研究によって、このアスパラギン酸はまた、Ｃｙｓ＋１のチオール基を脱プロトン化し、求核攻撃を開始して分岐状中間体を形成させることができることを示唆している。ミニ−ＭｔｕＲｅｃＡにおいてこのＡｓｐ４２２が変異すると、Ｎ末端切断反応及び分岐状中間体の形成が著しく遅くなる。ＮＭＲ構造では、この位置にはＡｌａが含まれていたが、ＮｐｕＤｎａＥインテインのＮＭＲ構造は、Ａｓｐ１１８（ミニ−ＭｔｕＲｅｃＡのＡｓｐ４２２と同等）が第１の残基のオキシアニオンとの水素結合距離内にあることを示した。対応するアスパラギン酸がＧｌｙに変化したＮｐｕ＊は、ＤＴＴ５０ｍＭでも非常に限られたＮ末端切断を示し（図７Ａ）、この変異はおそらくまた、第１のステップＮ−Ｘアシルシフト及び分岐状中間体の形成をブロックすることを示唆している。
【００６８】
ミニ−ＭｔｕＲｅｃＡインテインではＣ及びＮ末端切断反応は共役しておらず、したがって、インテイン反応の第１及び第２のステップの遅れは、Ｃ末端切断生成物が上昇する原因となる。しかし、ＤｎａＥインテインでは、Ｃ及びＮ末端切断反応は強く共役している。Ｃ１Ａを有する変異体ＤｎａＥインテインはほとんど又は全くＣ末端切断を示さないので、最初の２つのステップを阻害しても、Ｃ末端切断生成物の上昇は直接に導かれない。ＮｐｕＤｎａＥインテインにおいてＤ１１８ＧがどのようにＣ末端切断を誘導するのかを理解するために、本発明者等はＮｐｕＤｎａＥの溶液構造をその最も近似したホモログＳｓｐＤｎａＥの結晶構造と比較した。ＳｓｐＤｎａＥインテインにおいて、Ｃ末端アスパラギンの環化は、Ｃ末端スプライシング接合部の近くのＨｉｓ１４７、Ａｓｎ１５９、Ａｒｇ７３及び水分子が関与する電荷リレー過程によって媒介される（図２１Ａ）。水分子は、Ａｓｎ１５９及びＨｉｓ１４７のＮδ原子とＬｅｕ１４３の主鎖窒素の水素結合距離内にあり、プロトンをＡｓｎ１５９からＨｉｓ１４７に移す（図２１Ａ）。脱プロトン化したＡｓｎ１５９  Ｎδは、そのカルボニル炭素原子に求核攻撃を開始し、Ｃ末端インテイン−エクステイン結合の切断を引き起こす。同じ機構は、類似の位置に水分子を含有するＳｓｐＤｎａＢ及びミニ−ＭｔｕＲｅｃＡにおけるアスパラギン環化に関与する。ＮｐｕＤｎａＥのＮＭＲ構造は、Ａｓｐ１１８がＡｓｎ１３７のＮδと水素結合を形成することができ、電荷リレーに都合が悪くなり、したがって、Ｃ末端切断を阻害することを示している（図２１Ｂ）。いくつかの研究において、Ｃｙｓ＋１のチオール基の水素によってＡｓｐ１１８をプロトン化することが必要であることが示された分岐状中間体の形成は、Ａｓｎ１３７とＡｓｐ１１８のＨ結合相互作用を分断し、電荷リレーにおいてＡｓｎ１３７を関与させ、Ｃ末端切断を導かせる。分岐状中間体の形成によって、Ｃ末端アスパラギン環化反応を加速するインテイン構造のわずかな変化が引き起こされる。Ａｓｐ１１８をより小さなＧｌｙに変異させると、Ｈ結合相互反応が排除され、構造変化を必要とすることなく電荷リレーにおいてＡｓｎ１３７を自由に関与させることができ、脱共役Ｃ末端切断が導かれる。したがって、インテイン反応の最初の２つのステップの阻害に加えて、Ｄ１１８Ｇはまた、Ｎｐｕ＊におけるアスパラギン環化を加速することができ、迅速なＣ末端切断を導く。図２２は、Ｃ＊−ＧＦＰ（３）とＣＢＤ−ＮｐｕＮ（１）の反応を様々な温度でＤＴＴ５ｍＭでインキュベートしたことを示す。反応は、試料をＳＤＳ試料緩衝液と混合し、５分間煮沸することによって停止した。
【００６９】
Ｎｐｕ＊の切断反応速度は、野生型インテイントランススプライシング反応よりもわずかに遅い（図１）。これは、Ａｓｐ１１８側鎖の非存在下ではＡｓｎ１３７の配置が不完全であるためであろう。それにも関わらず、室温で３時間以内に約８０％のＣ末端切断を実現することができ、この変異体インテインはタンパク質精製におけるタグ除去に有益となる。Ｎｐｕ＊を使用して、本発明者等は、カラムを使わないタンパク質精製方法及びクロマトグラフィーをベースにしたタンパク質精製方法を、それぞれＮ−エクステインをＥＬＰ及びＣＢＤに置換することによって開発し、様々なサイズ及び多量体の状態の様々な標的タンパク質を高純度及び高収率で迅速に精製すること（４時間未満）を示した（図１９、１７Ａ及び１８Ａ〜１８Ｅ）。しかし、インテイン切断を誘発するために還元剤を使用するので、この方法は天然に生じるジスルフィド結合を含有するタンパク質の精製では試験しなかった。第１の方法では、ＥＬＰを使用することによって、コストの高いカラムの必要性がなくなり、大規模な産業的タンパク質精製において、その使用が容易になるはずである。第２の方法では、ｈｉｓタグなどのその他の精製タグをＣＢＤの位置に使用して、親和性精製を媒介することができることが便利である。
【００７０】
特定の実施形態では、標的タンパク質は精製後にＮ末端にトリペプチドＣＦＮを含有する（図３）。構築物６〜１０に存在するＡＳは、ＮｈｅＩ部位に対応し、クローニングを容易にするために導入された。Ｃｙｓ＋１は、おそらくＣｙｓ１とのジスルフィド結合によって、非還元条件下でインテインを不活性にするために重要である。Ｐｈｅ＋２及びＡｓｎ＋３の機能は知られていないが、野生型ＮｐｕＤｎａＥにおけるトランススプライシング活性で既に報告されたように、これらの残基はおそらくＮｐｕ＊Ｃ末端切断活性において重要な役割を果たさないだろう。Ｃ末端切断効率は、すぐ近くのエクステイン残基に依存するだけでなく、標的タンパク質にも依存する（図２０）。このばらつきはＣ＊とＮの会合における様々な標的タンパク質による立体的障害によるもので、これらの２つの断片の親和性並びにインテイン触媒効率の両方に影響を及ぼす可能性がある。
【００７１】
特定の実施形態では、本発明者等は合理的な設計によってＮｐｕＤｎａＥインテインを操作した。このインテインは、Ｎ末端切断とは独立した迅速なＣ末端切断反応速度を示す。本発明者等は、タンパク質精製におけるこの操作されたインテインの応用を示した。変異体ＮｐｕＤｎａＥインテインをベースにした精製方法を人工的なスプリットＤｎａＢインテインによるその他の精製方法と比較すると、本発明で開示した方法によって、小さなペプチドの依存性がなくなり、さらにより迅速な切断速度が実現する。したがって、本発明で開示した方法は、大規模なタンパク質精製への応用において有用である。
【実施例３】
【００７２】
ＳＩＲＰによる精製例（図１４）：キチン樹脂１５０μＬを含有する使い捨てカラムに緩衝液Ａ（ＮａＣｌ  ０．５Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １０ｍＭ、ｐＨ８．０）に溶かしたＮＣ１Ａ−ＣＢＤを含有する可溶性溶解物を添加し、１０カラム体積（ＣＶ）の緩衝液Ｂ（ＮａＣｌ  ０．５Ｍ、ＮａＰＯｉ  ５０ｍＭ、ｐＨ６．０）で４回洗浄した。全添加及び洗浄ステップは、バッチ相で実施した。最後の洗浄にはＺｎＣｌ２  ０．５ｍＭを補給した。溶解物を同じキチン樹脂に添加する直前に、同濃度のＺｎＣｌ２を緩衝液Ｂに溶かしたＣ＊−ＰＴＤＨ／ＧＦＰの可溶性溶解物に添加した。その後、カラムをＺｎＣｌ２（０．５ｍＭ）を含む１０ＣＶの緩衝液Ｂで洗浄し、最後にＤＴＴ  ５０ｍＭを含有する４ＣＶの緩衝液Ａで室温で３０分間又は６℃で３時間インキュベートした。精製したＰＴＤＨ及びＧＦＰをフロースルーに収集した。フロースルー中の微量のＮＣ１Ａ−ＣＢＤは、新鮮なキチンカラムに通過させることによって除去することができる。ＮＣ１Ａ−ＣＢＤ−キチン親和性マトリクスを再生するために、使用した樹脂を緩衝液Ｃ（ＮａＣｌ  １．５Ｍ、Ｎａ２ＨＰＯ４  ５０ｍＭ／ＮａＯＨ、ｐＨ１１．４、ＺｎＣｌ２  ０．５ｍＭ）で徹底的に洗浄して、結合したＣ＊を遊離させた。再生したカラムは保存緩衝液（ＮａＣｌ  ０．５Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １０ｍＭ、ＥＤＴＡ  １ｍＭ、０．１５％ＮａＮ３、ｐＨ８．０）で４℃で約１週間、活性をあまり損失することなく保存することができる。
【００７３】
化学物質及び株：化学物質は全て試薬等級で、特に記載していない限り、Sigma-Aldrich社（St. Louis, MO）又はVWR International社（Radnor, PA）から購入した。大腸菌ＤＨ５α（Invitrogen社、Grand Island、NY）は、組換えＤＮＡクローニング及び操作のために使用した。大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）（Novagen社、Madison、WI）は、組換えタンパク質の発現のために使用した。ＯＮＰＧは、Research Products International Corp.社（Mount Prospect、IL）から購入した。キチンビーズは、New England Biolabs社（Ipswich、MA）から購入した。
【００７４】
プラスミド構築：特定の実施形態のアミノ酸配列、構造及びそれらの番号の概要を図３に示す。
【００７５】
Ｃ−ＧＦＰ（構築物１）を作製するために、プライマーNpuC_F_NdeI及びOXP-NC-G-Revを使用してプラスミドKanR-IntRBS-NpuNC-CFN9からＮｐｕＣ遺伝子を増幅し、重複伸長ＰＣＲによってGFP pet26-GFPのＮ末端にプライマーOXP-GFP-NC-FWD及びXhoI_GFP_Rを用いて結合し、pET-26b(+)（Novagen社、Madison、WI）のNdeIとXhoI部位の間にクローニングした。部位特異的変異誘発を使用して変異Ｄ１１８Ｇを導入して、プライマーNpuCD17G-F及びNpuCD17G-RによってＣ＊−ＧＦＰ（３）を作製した。
【００７６】
ＣＢＤ−Ｎ（２）を作製するために、ＮｐｕＮはまた、プライマーHindIII-Link-Npu F及びNpuN_R_XhoIを使用してプラスミドKanR-IntRBS-NpuNC-CFN9から増幅し、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）に結合し、重複伸長ＰＣＲによってプライマーNdeI-CBD-F及びHindIII-CBD-Rを用いてpTWIN1（New England BioLabs社）から増幅し、pET-26b(+)（Novagen社、Madison、WI）のNdeIとXhoI部位の間に挿入した。ＣＢＤ−ＮｐｕＮＣ１Ａ（４）は、プライマーNheI-C1A-F及びNpuN_R_XhoIを使用して部位特異的変異誘発によって作製した。
【００７７】
ＥＬＰ−Ｎ（５）は、ＮｐｕＮ（アミノ酸１〜１０２）をプラスミドpET-EI:MBP10のEcoRIとHindIII部位の間に挿入することによって構築した。ＮｐｕＮは、最初にプライマーHindIII-リンク-Npu F及びHindIII-6H-NupN-Rを使用して増幅し、次いで制限部位及び可動性リンカーを含めるためにプライマーEcorI-リンカー-NpuN F及びHindIII-6H-NupN-Rを用いて再度増幅した。
【００７８】
Ｃ＊−ＤｓＲｅｄ（７）は、pET-26b(+)（Novagen社、Madison、WI）のNdeIとXhoI部位の間にクローニングした。ＮｐｕＣ＊は、プライマーNpuC_F_NdeI及びNheI-NpuC CFN-Rを用いてＣ＊−ＧＦＰから増幅した。ＤｓＲｅｄは、プライマーHindII-L-DsRed-fwd及びXhoI_DsRed_Rを用いてpTY24プラスミド（NCRR、YRS、Seattle、WA）から増幅した。NheI酵素の消化によって生成物をＮｐｕＣ＊に結合させ、短いリンカーペプチドＣＦＮＡＳを生じた。標準ＣＦＮ配列とは別に、「ＡＳ」ジペプチドは、NheI制限部位に対応し、その後のクローニングを容易にするために含めた。
【００７９】
Ｃ＊−ＰＴＤＨ（６）をクローニングするために、リン酸脱水素酵素「ＰＴＤＨ」をプライマーNheI-PTDH-F及びXhoI-PTDH12x-Rを用いてプラスミドPTDH12xA176R-pet15b11から増幅し、NheI及びXhoIで消化したＮｐｕＣ＊−ＤｓＲｅｄ（７）に挿入した。プラスミド構築物Ｃ＊−β＿Ｇａｌ（８）、Ｃ＊−ＣＡＴ（９）及びＣ＊−ＭＢＰ（１０）は、同じ方法で適切なプライマーを用いてNheIとXhoI部位の間に挿入することによって合成した。β−ガラクトシダーゼ遺伝子は、プラスミドpET-E-I:β−ガラクトシダーゼから増幅した。同様に、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）遺伝子は、プラスミドpET-E-I:CAT及びpET-E-MBP（David Wood教授から恵与された）それぞれから増幅した。
【００８０】
タンパク質発現及び精製：大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）は適切な発現プラスミドを用いて形質転換し、テトラサイクリン５μｇ／ｍＬ及びアンピシリン１００μｇ／ｍＬ（図３、構築物５）又はテトラサイクリン５μｇ／ｍＬ及びカナマイシン５０μｇ／ｍＬ（その他の全構築物）を含有する寒天プレートに播種した。翌日、１個のコロニーを採取し、５ｍＬのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス中でＯＤ６００約０．６まで増殖させた。培養物を、同じ抗生物質を含有する１ＬのＬＢブロスに移し、ＯＤ６００が約０．６になるまで３７℃で増殖させた。タンパク質発現は、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．２ｍＭ）を添加することによって１８℃で１４時間誘導した。発現後、細胞を４℃で６０００×ｇで１５分間遠心することによって収集し、使用するまで−８０℃で保存した。
【００８１】
ＣＢＤ−Ｎ／ＮＣ１Ａ（図３、構築物２、４）を精製するために、細胞ペレットを緩衝液Ａ（ＮａＣｌ  ０．５Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １０ｍＭ、ｐＨ８．０）に湿潤ペレット１グラム当たり１０ｍＬで再懸濁し、超音波処理によって破壊した（QSonica Misonix 200、Ａｍｐ１０、１６〜２０Ｗ、１秒パルス６秒休止を１分間）。可溶性溶解物を４℃で１６，０００×ｇで２０分間遠心した後収集し、５−ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラム（GE Healthcare Life Sciences社、Piscataway、NJ）に通過させ、洗浄緩衝液（ＮａＣｌ  ０．５Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １０ｍＭ、イミダゾール４５ｍＭ、ｐＨ８）で洗浄し、イミダゾール１５０ｍＭを含有する緩衝液Ａで溶出した。
【００８２】
タンパク質Ｃ／Ｃ＊−ＧＦＰ（図３、構築物１、３）は、類似の方法であるが、タンパク質分解を最小限に抑えるために緩衝液Ｂ（ＮａＣｌ  ０．５Ｍ、ＮａＰＯｉ  ５０ｍＭ、ｐＨ６．０、１×プロテアーゼ阻害剤又はカクテル（Roche Applied Science社、Indianapolis、IN））を用いて精製した。精製したタンパク質は、緩衝液Ａに緩衝液交換し、１０ｋＤａ限外濾過スピンカラム（Amicon Ultra、Millipore社、Billerica、MA）によって濃縮した。
【００８３】
方法１を使用した精製例では（図１６）、全細胞ペレットを緩衝液Ａに再懸濁した。方法２を使用した精製例では、全細胞ペレットをカラム緩衝液（ＮａＣｌ  １Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １０ｍＭ、ｐＨ８）に再懸濁して標的タンパク質のキチン樹脂への結合を増加させた。
【００８４】
インテイン反応速度の特徴：インテインを特徴づける実験は全て、緩衝液Ａで希釈した精製タンパク質を使用して、指示した量の還元剤を用いて指定した温度で実施した。反応は全て、各インテイン断片２０μＭを含有した。反応開始後様々な時点で試料を採取し、特に記載がなければ２×ＳＤＳ試料緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ０．５Ｍ、ｐＨ６．８、２０％グリセロール、１０％ｗ／ｖＳＤＳ、０．１％ｗ／ｖブロモフェノールブルー、２％β−メルカプトエタノール）と混合し、９５℃で５分間インキュベートし、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して分析した。ゲルはクーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色した。０分時点に対応する試料については、精製したＣ／Ｃ＊−ＧＦＰ（構築物１及び３）タンパク質をまずβ−メルカプトエタノールの非存在下で２×ＳＤＳ試料と混合し、９５℃で３分間インキュベートした。ＣＢＤ−Ｎ／ＮＣ１Ａ（図３、構築物２及び４）及びβ−メルカプトエタノールをその後混合物に添加した。混合物全体を９５℃でさらに３分間インキュベートしてタンパク質を不活性化した。反応物及び生成物に対応するバンド強度は、Quantity Oneソフトウェア（BioRad社、Hercules、CA）においてTrace Quantity moduleを使用して定量した。
【００８５】
エラスチン様ペプチドの可逆的沈降によるタンパク質精製：この実施形態では、ＥＬＰ−Ｎ（図３、構築物５）を硫酸アンモニウム沈降１回によって予備精製してＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの解読を容易にしたが、このステップでタンパク質精製の効率は改善しないことが見いだされた。ＥＬＰ−Ｎ及びＣ＊−ＰＯＩの清澄にした細胞溶解物（図３、構築物３、６〜１０）を徹底的に混合し、室温で１０分間インキュベートし、Ｃ＊とＮを会合させた（図１７Ａ、レーン３）。硫酸アンモニウム（最終濃度０．４Ｍ）を混合物に添加して、ＥＬＰ複合体の沈降を誘導した。ＥＬＰに非共有結合した標的タンパク質を含有するペレットを緩衝液Ａに再懸濁した（図１７Ａ、レーン５）。インテイン反応は、ＤＴＴ（５０ｍＭ）を添加することによって開始し、室温で３又は２０時間実施した。Ｃ末端切断を誘導するためにより低いＤＴＴ濃度を使用することができる（図７）。反応の終了時に、硫酸アンモニウム（０．４Ｍ）を混合物に添加して、ＥＬＰ−Ｎ／Ｃ＊複合体を沈降させた。この沈降物は、遠心によって除去した。上清は、高度に精製された標的タンパク質を含有した（図１７Ａ、レーン８、９）。
【００８６】
キチン樹脂によるタンパク質精製：キチンビーズのスラリーを最初にＣＢＤ−Ｎの溶解物（図３、構築物２）と共に室温で１０分間インキュベートし、混入するタンパク質全てを除去するためにカラム緩衝液で集中的に洗浄し（図１７Ｃ、レーン３）、次にＣ＊−ＧＦＰを含有する溶解物を添加した（図３、構築物３）。洗浄後、ＤＴＴ（５ｍＭ）を混合物に添加してＣ末端切断を誘導した。反応は、室温で３時間反応すると基本的に完了し（図１７Ｃ、レーン５）、精製したＧＦＰはフロースルーに収集した（図１７Ｃ、レーン７）。ＣＢＤ−Ｎ並びに微量の未反応Ｃ＊−ＧＦＰが相変わらずキチンビーズに結合していた（図１７Ｃ、レーン６）。切断したＣ＊は、非常にサイズが小さいので（４ｋＤａ）ゲル上で視覚化することができないが、Ｎとの相互作用によってカラムに残存することが推定された。
【００８７】
分子モデリング：ミニ−ＭｔｕＲｅｃＡ（ｐｄｂ：２ＩＭＺ）、ＮｐｕＤｎａＥ（ｐｄｂ：２ＫＥＱ）及びＳｓｐＤｎａＥ（ｐｄｂ：１ＺＤ７）の構造はVisual Molecular Dynamics（ＶＭＤ）を使用して視覚化し、ＶＭＤにおいてMultiSeq moduleを使用して整列させた。水素結合の相互作用はＶＭＤによって同定した。ＮｐｕＤｎａＥのＮＭＲ構造には、２０の異なる溶液構造が含まれる。明瞭にするために、ＳｓｐＤｎａＥとＮｐｕＤｎａＥの構造＃７のアラインメントのみを図５Ｃに示す。
【００８８】
温度依存性反応速度：異なる温度でのＣ＊−ＧＦＰのＣ末端切断反応の半減期を測定するためにLab Fitソフトウェアパッケージ（Campina Grande社、Paraiba、Brazil）を使用して、図７Ｃの全データ点に最も合致する傾向線を作成した。５０％切断に対応する時間は、近似曲線に基づいて推定した。
【００８９】
様々な温度でのＣ＊−ＧＦＰ切断の推定半減期：
温度          半減期
４℃          ２４３分
１６℃        ７０分
２２℃        ５５分
３７℃        １６分
【００９０】
精製タンパク質含量の定量：標的タンパク質精製収率は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Coomassie Plus Bradford Assay Reagent、Pierce Biotechnology社、Rockford、IL）を使用して精製した試料の濃度を測定することによって定量した。パーセント回収率を推定するために、可溶性溶解物及び精製タンパク質を同じＳＤＳ−ＰＡＧＥに添加し、SimplyBlue SafeStain（Life Technology社、Carlsbad、CA）で染色し、標的タンパク質に対応するバンド強度はQuantity Oneソフトウェア（BioRad社、Hercules、CA）においてTrace Quantity moduleを使用して測定した。
【００９１】
ＥＬＰ−Ｎの予備精製：硫酸アンモニウム（０．４Ｍ）を可溶性溶解物に添加し、ＥＬＰ−Ｎ相分離を誘導した。混合物を室温で約３分間インキュベートし、１４，０００×ｇで１０分間遠心した。得られたペレットを元の体積の３分の１の緩衝液Ａに再懸濁した。低強度水浴超音波装置（Ultrasonic Cleaner、GB928）を使用して（５分）、ＥＬＰ−Ｎの再懸濁を支援した。
【００９２】
試料タンパク質活性の測定：精製ＰＴＤＨの活性は、Mayer et alによって記載されたようにＮＢＴアッセイによって確認した。ＤＴＴは高濃度でＮＢＴ反応を干渉するので、精製タンパク質中におけるＤＴＴ濃度は、測定前に３０ｋＤａカットオフスピンカラム（Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit、Millipore社、Billerica、MA）を使用して緩衝液交換によって約５μＭに低減させた。
【００９３】
ＭＢＰの活性は、アミロース樹脂（New England Biolabs社、Ipswich、MA）に結合させることによって確認した。アミロースビーズ（２５μＬ）は室温で１０分間精製タンパク質（５００μＬ）と共にインキュベートして、緩衝液Ａ  ５００μＬで２回洗浄して、緩衝液Ａ  ５００μＬに再懸濁した。この懸濁液１０μＬを２×ＳＤＳ添加緩衝液１０μＬと混合し、９５℃で３分間煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＭＢＰタンパク質は、アミロースビース懸濁液中では視覚化できるが、洗浄緩衝液中では視覚化できなかった。
【００９４】
タンパク質ＧＦＰ及びＤｓＲｅｄは、非蛍光タンパク質ＣＡＴに対する蛍光測定によってアッセイした。精製したＧＦＰ又はＤｓＲｅｄは、２倍に希釈し、９６ウェルプレート（１５０μＬ／ウェル）に移した。蛍光強度は、蛍光光度計SpectraMax Gemini EM（Molecular Devices社、Sunnyvale、CA）を使用して、励起/放射波長４８５／５３８ｎｍ（ＧＦＰ）又は５４４／５９０ｎｍ（ＤｓＲｅｄ）で測定した。対照タンパク質ＣＡＴは、両アッセイにおいてバックグラウンド値を生じた。
【００９５】
β−ガラクトシダーゼ活性は、ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を４２０ｎｍに吸収のあるｏ−ニトロフェノールに加水分解することによって測定した。精製したβ−ガラクトシダーゼはＺ緩衝液（Ｎａ２ＨＰＯ４  ０．０６Ｍ、ＮａＨ２ＰＯ４  ０．０４Ｍ、ＫＣｌ  ０．０１Ｍ、ＭｇＳＯ４  ０．００１Ｍ及び０．２７％  ２−メルカプトエタノール）で１０００倍に希釈した。希釈したタンパク質（３０μＬ）をＺ緩衝液（２００μＬ）及びＯＮＰＧ（７０μＬ、リン酸カリウム緩衝液１００ｍＭ  ｐＨ７  １ｍＬ当たり４ｍｇ）と混合し、２２℃で１５又は３０分間インキュベートした。反応終了時に、停止緩衝液（Ｎａ２ＣＯ３  １Ｍ）５００μＬを添加し、４２０ｎｍでの吸収はBiomate3分光光度計（Thermo Electron Corporation社）で測定した。
【００９６】
β-ガラクトシダーゼの酵素単位を推定するために、以下の式を使用した：
【００９７】
【数１】
2016504417.tif 000003
【００９８】
８ｘ１０５ナノリットルは反応の体積である；４５００Ｍ−１ｃｍ−１は、ｏ−ニトロフェノールの吸光係数であり、１−ｃｍは光路の長さである。β−ガラクトシダーゼ１単位は、２２℃で１分当たりＯＮＰＧ  １マイクロモルを加水分解するために必要な酵素の量と定義する。
【００９９】
【数２】
2016504417.tif 000004
2016504417.tif 000005
【０１００】
β−ガラクトシダーゼの試料回収を推定するために、精製したβ−ガラクトシダーゼをＺ緩衝液で１０００倍に希釈することによって類似の活性アッセイ法を９６ウェルプレートで実施した。希釈したタンパク質（５０μＬ）をＺ緩衝液（５０μＬ）及びＯＮＰＧ溶液１０μｌと混合した。４２０ｎｍの吸収は、SpectraMax 340PC384吸光度マイクロプレートリーダー（Molecular Devices社、Sunnyvale、CA）を使用して２０分間インキュベーションした後に測定した。
【０１０１】
本明細書で記載したいかなる実施形態も本発明のいかなる方法、キット、試薬又は組成物に関して実施することができ、逆の場合も同じであると考えられる。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を実現するために使用することができる。
【０１０２】
本明細書で記載した特定の実施形態は例示のために示されており、本発明を限定するものではないことを理解されたい。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な実施形態で使用することができる。当業者であれば、本明細書で記載した特定の方法には数多くの同等物があることを認識するか、又は所定の実験のみを使用して確認することができるであろう。このような同等物は、本発明の範囲内であると考えられ、特許請求の範囲によってカバーされている。
【０１０３】
本明細書で言及した出版物及び特許出願は全て、本発明が関係する業界の当業者のレベルの指標となる。出版物及び特許出願は全て、それぞれ個々の出版物又は特許出願が参考として組み込まれることが具体的かつ個々に示されるのと同程度に、本明細書に参考として組み込まれる。
【０１０４】
特許請求の範囲及び／又は明細書において「含む（comprising）」という用語と併用したとき、「１つの（a）」又は「１つの（an）」という語の使用は、「１つ（one）」を意味することができるが、「１又は２以上（one or more）」、「少なくとも１つの（at least one）」及び「１又は１より多い（one or more than one）」の意味とも合致する。特許請求の範囲における「又は」という用語は、開示が選択肢のみ及び「及び／又は」を意味する定義を支持していても、選択肢のみを意味しているか、又は選択肢が互いに排他的であることが明示的に示されていなければ、「及び／又は」を意味するために使用される。本明細書全体にわたって、「約」という用語は、値の測定に使用されたデバイス、方法に本来備わっている誤差の変動、又は研究対象間に存在する変動が値に含まれることを示すために用いられる。
【０１０５】
本明細書及び特許請求の範囲で使用したように、「含む（comprising）」（及び「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」などを含む（comprising）の任意の形態）、「有する（having）」（及び「有する（have）」及び「有する（has）」などを有する（having）の任意の形態）、「含む（including）」（及び「含む（includes）」及び「含む（include）」などを含む（including）の任意の形態）又は「含有する（containing）」（及び「含有する（contains）」及び「含有する（contain）」などを含有する（containing）の任意の形態）の用語は包括的又は非限定的であり、さらに、列挙されていない付加的な要素又は方法ステップを排除しない。本明細書で使用したように、「から本質的になる（consisting essentially of）」という表現は、指定の材料又はステップ及び請求した発明の基本的及び新規特性に実質的に影響を及ぼさないものに請求の範囲を限定する。本明細書で使用したように、「からなる（consisting of）」という表現は、例えば、要素又は限定に通常関連する不純物以外の、請求の範囲で指定していないいかなる要素、ステップ又は成分も排除する。
【０１０６】
本明細書で使用したように、用語「又はそれらの組み合わせ（or combinations thereof）」とは、用語の前に挙げた事項の順列及び組み合わせ全てを意味する。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ又はそれらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ又はＡＢＣの少なくとも１つを含むことを意図しており、特定の文脈において順番が重要ならば、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ又はＣＡＢも含むことを意図する。この例に続いて、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどの１又は２以上の事項又は用語の反復を含有する組み合わせも明らかに含まれる。当業者であれば、文脈から明らかでない限り、通常、いかなる組み合わせにおいても事項又は用語の数には制限がないことを理解するだろう。特定の実施形態では、本発明はまた、移行句「から本質的になる（consisting essentially of）」又は「からなる（consisting of）」も使用することができる方法及び組成物を含むことができる。
【０１０７】
本明細書で使用したように、限定はしないが、「約（about）」、「実質的（substantial）」又は「実質的に（substantially）」などの近似を示す用語は、そのような変更が絶対的又は完全である必要はないと思われるが、当業者が提示したような条件を指定することが正当であると考えるのにほぼ十分なときの条件を意味する。記載の変動可能な範囲は、変化がどのような大きさで起こり得るかに左右され、改変された特徴が改変していない特徴の必要な特性及び能力をまだ備えていることを当業者がまだ認識できる範囲である。一般的に、まだ考察は行っていないが、「約（about）」などの近似の語句によって修飾された本明細書の数値は、提示された値から少なくとも±１、２、３、４、５、６、７、１０、１２又は１５％変化していてもよい。
【０１０８】
本明細書で開示し、請求した組成物及び／又は方法は全て、本開示に関して不適切な実験を行うことなく作製し、実行することができる。本発明の組成物及び方法は好ましい実施形態を用いて記載してきたが、当業者であれば、本発明の概念、精神及び範囲を逸脱することなく、本明細書で記載した組成物及び／又は方法及びステップ又は方法のステップの順番に変更を加えることができることを理解するだろう。添付の特許請求の範囲に定義したように、当業者に明らかなこのような類似の置換及び改変は全て、本発明の精神、範囲及び概念内にあると見なされる。
【０１０９】
使用した配列の表
構築物１
Ｃ−ＧＦＰ：
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGACATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAATTGTTTCAATGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGTTACTCGAGCACCACCACCACCACCAC（配列番号１）
翻訳されたＣ−ＧＦＰ：
MIKIATRKYLGKQNVYDIGVERDHNFALKNGFIASNCFNVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELLEHHHHHH（配列番号２）
構築物２
ＣＢＤ−Ｎ
ATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGACAAATCCTGGTGTATCCGCTTGGCAGGTCAACACAGCTTATACTGCGGGACAATTGGTCACATATAACGGCAAGACGTATAAATGTTTGCAGCCCCACACCTCCTTGGCAGGATGGGAACCATCCAACGTTCCTGCCTTGTGGCAGCTTCAAGAAGCTTGTGGAGGCGGAGGGAGCGGAGGCGGAGGGAGCGCTAGCTGTTTAAGCTATGAAACGGAAATATTGACAGTAGAATATGGATTATTACCGATTGGTAAAATTGTAGAAAAGCGCATCGAATGTACTGTTTATAGCGTTGATAATAATGGAAATATTTATACACAACCTGTAGCACAATGGCACGATCGCGGAGAACAAGAGGTGTTTGAGTATTGTTTGGAAGATGGTTCATTGATTCGGGCAACAAAAGACCATAAGTTTATGACTGTTGATGGTCAAATGTTGCCAATTGATGAAATATTTGAACGTGAATTGGATTTGATGCGGGTTGATAATTTGCCGAATCTCGAGCACCACCACCACCACCAC（配列番号３）
翻訳されたＣＢＤ−Ｎ：
MKIEEGKLTNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQEACGGGGSGGGGSASCLSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNLPNLEHHHHHH（配列番号４）
構築物３
Ｃ＊−ＧＦＰ：
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGGCATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAATTGTTTCAATGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGTTACTCGAGCACCACCACCACCACCAC（配列番号５）
翻訳されたＣ＊−ＧＦＰ：
MIKIATRKYLGKQNVYGIGVERDHNFALKNGFIASNCFNVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELLEHHHHHH（配列番号６）
構築物４
ＣＢＤ−ＮＣ１Ａ
ATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGACAAATCCTGGTGTATCCGCTTGGCAGGTCAACACAGCTTATACTGCGGGACAATTGGTCACATATAACGGCAAGACGTATAAATGTTTGCAGCCCCACACCTCCTTGGCAGGATGGGAACCATCCAACGTTCCTGCCTTGTGGCAGCTTCAAGAAGCTTGTGGAGGCGGAGGGAGCGGAGGCGGAGGGAGCGCTAGCGCCTTAAGCTATGAAACGGAAATATTGACAGTAGAATATGGATTATTACCGATTGGTAAAATTGTAGAAAAGCGCATCGAATGTACTGTTTATAGCGTTGATAATAATGGAAATATTTATACACAACCTGTAGCACAATGGCACGATCGCGGAGAACAAGAGGTGTTTGAGTATTGTTTGGAAGATGGTTCATTGATTCGGGCAACAAAAGACCATAAGTTTATGACTGTTGATGGTCAAATGTTGCCAATTGATGAAATATTTGAACGTGAATTGGATTTGATGCGGGTTGATAATTTGCCGAATCTCGAGCACCACCACCACCACCAC（配列番号７）
翻訳されたＣＢＤ−ＮＣ１Ａ：
MKIEEGKLTNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQEACGGGGSGGGGSASALSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNLPNLEHHHHHH（配列番号８）
構築物５
ＥＬＰ−Ｎ
ATGGGCCACGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGGGCTGGTGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAACAACCTCGGGATCGAGGGAAGGATTTCAGAATTCGGAGGCGGAGGGAGCGGAGGCGGAGGGAGCGCTAGCTGTTTAAGCTATGAAACGGAAATATTGACAGTAGAATATGGATTATTACCGATTGGTAAAATTGTAGAAAAGCGCATCGAATGTACTGTTTATAGCGTTGATAATAATGGAAATATTTATACACAACCTGTAGCACAATGGCACGATCGCGGAGAACAAGAGGTGTTTGAGTATTGTTTGGAAGATGGTTCATTGATTCGGGCAACAAAAGACCATAAGTTTATGACTGTTGATGGTCAAATGTTGCCAATTGATGAAATATTTGAACGTGAATTGGATTTGATGCGGGTTGATAATTTGCCGAATCTCGAGCACCACCACCACCACCAC（配列番号９）
翻訳されたＥＬＰ−Ｎ：
MGHGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGGLVSSNNNNNNNNNNLGIEGRISEFGGGGSGGGGSASCLSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNLPNLEHHHHHH（配列番号１０）
構築物６
Ｃ＊−ＰＴＤＨ：
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGGCATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAATTGTTTCAATGCTAGCATGCTGCCGAAACTCGTTATAACTCACCGAGTACACGAAGAGATCCTGCAACTGCTGGCGCCACATTGCGAGCTGATAACCAACCAGACCGACAGCACGCTGACGCGCGAGGAAATTCTGCGCCGCTGTCGCGATGCTCAGGCGATGATGGCGTTCATGCCCGATCGGGTCGATGCAGACTTTCTTCAAGCCTGCCCTGAGCTGCGTGTAATCGGCTGCGCGCTCAAGGGCTTCGACAATTTCGATGTGGACGCCTGTACTGCCCGCGGGGTCTGGCTGACCTTCGTGCCTGATCTGTTGACGGTCCCGACTGCCGAGCTGGCGATCGGACTGGCGGTGGGGCTGGGGCGGCATCTGCGGGCAGCAGATGCGTTCGTCCGCTCTGGCAAGTTCCGGGGCTGGCAACCACGGTTCTACGGCACGGGGCTGGATAACGCTACGGTCGGCTTCCTTGGCATGGGCGCCATCGGACTGGCCATGGCTGATCGCTTGCAGGGATGGGGCGCGACCCTGCAGTACCACGCGCGGAAGGCTCTGGATACACAAACCGAGCAACGGCTCGGCCTGCGCCAGGTGGCGTGCAGCGAACTCTTCGCCAGCTCGGACTTCATCCTGCTGGCGCTTCCCTTGAATGCCGATACCCTGCATCTGGTCAACGCCGAGCTGCTTGCCCTCGTACGGCCGGGCGCTCTGCTTGTAAACCCCTGTCGTGGCTCGGTAGTGGATGAAGCCGCCGTGCTCGCGGCGCTTGAGCGAGGCCAGCTCGGCGGGTATGCGGCGGATGTATTCGAAATGGAAGACTGGGCTCGCGCGGACCGGCCGCAGCAGATCGATCCTGCGCTGCTCGCGCATCCGAATACGCTGTTCACTCCGCACATAGGGTCGGCAGTGCGCGCGGTGCGCCTGGAGATTGAACGTTGTGCAGCGCAGAACATCCTCCAGGCATTGGCAGGTGAGCGCCCAATCAACGCTGTGAACCGTCTGCCCAAGGCCAATCCTGCCGCAGACCTCGAGCACCACCACCACCACCAC（配列番号１１）
翻訳されたＣ＊−ＰＴＤＨ：
MIKIATRKYLGKQNVYGIGVERDHNFALKNGFIASNCFNASMLPKLVITHRVHEEILQLLAPHCELITNQTDSTLTREEILRRCRDAQAMMAFMPDRVDADFLQACPELRVIGCALKGFDNFDVDACTARGVWLTFVPDLLTVPTAELAIGLAVGLGRHLRAADAFVRSGKFRGWQPRFYGTGLDNATVGFLGMGAIGLAMADRLQGWGATLQYHARKALDTQTEQRLGLRQVACSELFASSDFILLALPLNADTLHLVNAELLALVRPGALLVNPCRGSVVDEAAVLAALERGQLGGYAADVFEMEDWARADRPQQIDPALLAHPNTLFTPHIGSAVRAVRLEIERCAAQNILQALAGERPINAVNRLPKANPAADLEHHHHHH（配列番号１２）
構築物７
Ｃ＊−ＤｓＲｅｄ
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGGCATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAATTGTTTCAATGCTAGCGCCTCCTCCGAGGACGTCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCCCAGTTCCAGTACGGCTCCAAGGTGTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACAAGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCTCCTTCATCTACAAGGTGAAGTTCATCGGCGTGAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACTATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCCCGCGACGGCGTGCTGAAGGGCGAGATCCACAAGGCCCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACCTGGTGGAGTTCAAGTCCATCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCTACTACTACGTGGACTCCAAGCTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAGCAGTACGAGCGCGCCGAGGGCCGCCACCACCTGTTCCTGCTCGAGCACCACCACCACCACCAC（配列番号１３）
翻訳されたＣ＊−ＤｓＲｅｄ：
MIKIATRKYLGKQNVYGIGVERDHNFALKNGFIASNCFNASASSEDVIKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKVYVKHPADIPDYKKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGSFIYKVKFIGVNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERLYPRDGVLKGEIHKALKLKDGGHYLVEFKSIYMAKKPVQLPGYYYVDSKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHHLFLLEHHHHHH（配列番号１４）
構築物８
Ｃ＊−β−Ｇａｌ
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGGCATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAATTGTTTCAATGCTAGCATGACCATGATTACGGATTCACTCGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCTTCCTGAGGCCGATACTGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCCCATCTACACCAACGTGACCTATCCCATTACGGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAATGTTGATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTGATGGCGTTAACTCGGCGTTTCATCTGTGGTGCAACGGGCGCTGGGTCGGTTACGGCCAGGACAGTCGTTTGCCGTCTGAATTTGACCTGAGCGCATTTTTACGCGCCGGAGAAAACCGCCTCGCGGTGATGGTGCTGCGCTGGAGTGACGGCAGTTATCTGGAAGATCAGGATATGTGGCGGATGAGCGGCATTTTCCGTGACGTCTCGTTGCTGCATAAACCGACTACACAAATCAGCGATTTCCATGTTGCCACTCGCTTTAATGATGATTTCAGCCGCGCTGTACTGGAGGCTGAAGTTCAGATGTGCGGCGAGTTGCGTGACTACCTACGGGTAACAGTTTCTTTATGGCAGGGTGAAACGCAGGTCGCCAGCGGCACCGCGCCTTTCGGCGGTGAAATTATCGATGAGCGTGGTGGTTATGCCGATCGCGTCACACTACGTCTGAACGTCGAAAACCCGAAACTGTGGAGCGCCGAAATCCCGAATCTCTATCGTGCGGTGGTTGAACTGCACACCGCCGACGGCACGCTGATTGAAGCAGAAGCCTGCGATGTCGGTTTCCGCGAGGTGCGGATTGAAAATGGTCTGCTGCTGCTGAACGGCAAGCCGTTGCTGATTCGAGGCGTTAACCGTCACGAGCATCATCCTCTGCATGGTCAGGTCATGGATGAGCAGACGATGGTGCAGGATATCCTGCTGATGAAGCAGAACAACTTTAACGCCGTGCGCTGTTCGCATTATCCGAACCATCCGCTGTGGTACACGCTGTGCGACCGCTACGGCCTGTATGTGGTGGATGAAGCCAATATTGAAACCCACGGCATGGTGCCAATGAATCGTCTGACCGATGATCCGCGCTGGCTACCGGCGATGAGCGAACGCGTAACGCGAATGGTGCAGCGCGATCGTAATCACCCGAGTGTGATCATCTGGTCGCTGGGGAATGAATCAGGCCACGGCGCTAATCACGACGCGCTGTATCGCTGGATCAAATCTGTCGATCCTTCCCGCCCGGTGCAGTATGAAGGCGGCGGAGCCGACACCACGGCCACCGATATTATTTGCCCGATGTACGCGCGCGTGGATGAAGACCAGCCCTTCCCGGCTGTGCCGAAATGGTCCATCAAAAAATGGCTTTCGCTACCTGGAGAGACGCGCCCGCTGATCCTTTGCGAATACGCCCACGCGATGGGTAACAGTCTTGGCGGTTTCGCTAAATACTGGCAGGCGTTTCGTCAGTATCCCCGTTTACAGGGCGGCTTCGTCTGGGACTGGGTGGATCAGTCGCTGATTAAATATGATGAAAACGGCAACCCGTGGTCGGCTTACGGCGGTGATTTTGGCGATACGCCGAACGATCGCCAGTTCTGTATGAACGGTCTGGTCTTTGCCGACCGCACGCCGCATCCAGCGCTGACGGAAGCAAAACACCAGCAGCAGTTTTTCCAGTTCCGTTTATCCGGGCAAACCATCGAAGTGACCAGCGAATACCTGTTCCGTCATAGCGATAACGAGCTCCTGCACTGGATGGTGGCGCTGGATGGTAAGCCGCTGGCAAGCGGTGAAGTGCCTCTGGATGTCGCTCCACAAGGTAAACAGTTGATTGAACTGCCTGAACTACCGCAGCCGGAGAGCGCCGGGCAACTCTGGCTCACAGTACGCGTAGTGCAACCGAACGCGACCGCATGGTCAGAAGCCGGGCACATCAGCGCCTGGCAGCAGTGGCGTCTGGCGGAAAACCTCAGTGTGACGCTCCCCGCCGCGTCCCACGCCATCCCGCATCTGACCACCAGCGAAATGGATTTTTGCATCGAGCTGGGTAATAAGCGTTGGCAATTTAACCGCCAGTCAGGCTTTCTTTCACAGATGTGGATTGGCGATAAAAAACAACTGCTGACGCCGCTGCGCGATCAGTTCACCCGTGCACCGCTGGATAACGACATTGGCGTAAGTGAAGCGACCCGCATTGACCCTAACGCCTGGGTCGAACGCTGGAAGGCGGCGGGCCATTACCAGGCCGAAGCAGCGTTGTTGCAGTGCACGGCAGATACACTTGCTGATGCGGTGCTGATTACGACCGCTCACGCGTGGCAGCATCAGGGGAAAACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGGATTGATGGTAGTGGTCAAATGGCGATTACCGTTGATGTTGAAGTGGCGAGCGATACACCGCATCCGGCGCGGATTGGCCTGAACTGCCAGCTGGCGCAGGTAGCAGAGCGGGTAAACTGGCTCGGATTAGGGCCGCAAGAAAACTATCCCGACCGCCTTACTGCCGCCTGTTTTGACCGCTGGGATCTGCCATTGTCAGACATGTATACCCCGTACGTCTTCCCGAGCGAAAACGGTCTGCGCTGCGGGACGCGCGAATTGAATTATGGCCCACACCAGTGGCGCGGCGACTTCCAGTTCAACATCAGCCGCTACAGTCAACAGCAACTGATGGAAACCAGCCATCGCCATCTGCTGCACGCGGAAGAAGGCACATGGCTGAATATCGACGGTTTCCATATGGGGATTGGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCGTCAGTATCGGCGGAATTCCAGCTGAGCGCCGGTCGCTACCATTACCAGTTGGTCTGGTGTCAAAAACTCGAGCACCACCACCACCACCAC（配列番号１５）
翻訳されたＣ＊−β−Ｇａｌ：
MIKIATRKYLGKQNVYGIGVERDHNFALKNGFIASNCFNASMTMITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDRPSQQLRSLNGEWRFAWFPAPEAVPESWLECDLPEADTVVVPSNWQMHGYDAPIYTNVTYPITVNPPFVPTENPTGCYSLTFNVDESWLQEGQTRIIFDGVNSAFHLWCNGRWVGYGQDSRLPSEFDLSAFLRAGENRLAVMVLRWSDGSYLEDQDMWRMSGIFRDVSLLHKPTTQISDFHVATRFNDDFSRAVLEAEVQMCGELRDYLRVTVSLWQGETQVASGTAPFGGEIIDERGGYADRVTLRLNVENPKLWSAEIPNLYRAVVELHTADGTLIEAEACDVGFREVRIENGLLLLNGKPLLIRGVNRHEHHPLHGQVMDEQTMVQDILLMKQNNFNAVRCSHYPNHPLWYTLCDRYGLYVVDEANIETHGMVPMNRLTDDPRWLPAMSERVTRMVQRDRNHPSVIIWSLGNESGHGANHDALYRWIKSVDPSRPVQYEGGGADTTATDIICPMYARVDEDQPFPAVPKWSIKKWLSLPGETRPLILCEYAHAMGNSLGGFAKYWQAFRQYPRLQGGFVWDWVDQSLIKYDENGNPWSAYGGDFGDTPNDRQFCMNGLVFADRTPHPALTEAKHQQQFFQFRLSGQTIEVTSEYLFRHSDNELLHWMVALDGKPLASGEVPLDVAPQGKQLIELPELPQPESAGQLWLTVRVVQPNATAWSEAGHISAWQQWRLAENLSVTLPAASHAIPHLTTSEMDFCIELGNKRWQFNRQSGFLSQMWIGDKKQLLTPLRDQFTRAPLDNDIGVSEATRIDPNAWVERWKAAGHYQAEAALLQCTADTLADAVLITTAHAWQHQGKTLFISRKTYRIDGSGQMAITVDVEVASDTPHPARIGLNCQLAQVAERVNWLGLGPQENYPDRLTAACFDRWDLPLSDMYTPYVFPSENGLRCGTRELNYGPHQWRGDFQFNISRYSQQQLMETSHRHLLHAEEGTWLNIDGFHMGIGGDDSWSPSVSAEFQLSAGRYHYQLVWCQKLEHHHHHH（配列番号１６）
構築物９
Ｃ＊−ＣＡＴ
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGGCATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAATTGTTTCAATGCTAGCATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTTCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTCTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGCTCGAGCACCACCACCACCACCAC（配列番号１７）
翻訳されたＣ＊−ＣＡＴ：
MIKIATRKYLGKQNVYGIGVERDHNFALKNGFIASNCFNASMEKKITGYTTVDISQWHRKEHFEAFQSVAQCTYNQTVQLDITAFLKTVKKNKHKFYPAFIHILARLMNAHPEFRMAMKDGELVIWDSVHPCYTVFHEQTETFSSLWSEYHDDFRQFLHIYSQDVACYGENLAYFPKGFIENMFFVSANPWVSFTSFDLNVANMDNFFAPVFTMGKYYTQGDKVLMPLAIQVHHAVCDGFHVGRMLNELQQYCDEWQGGALEHHHHHH（配列番号１８）
構築物１０
Ｃ＊−ＭＢＰ
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGGCATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAATTGTTTCAATGCTAGCATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCCACCATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAGACTAATTCGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAACAACCTCGGGATCGAGGGAAGGGGACTCGAGCACCACCACCACCACCAC（配列番号１９）
翻訳されたＣ＊−ＭＢＰ：
MIKIATRKYLGKQNVYGIGVERDHNFALKNGFIASNCFNASMKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGIEGRGLEHHHHHH（配列番号２０）
構築物１１
Ｎ−ＣＢＤ：
ATGTGTTTAAGCTATGAAACGGAAATATTGACAGTAGAATATGGATTATTACCGATTGGTAAAATTGTAGAAAAGCGCATCGAATGTACTGTTTATAGCGTTGATAATAATGGAAATATTTATACACAACCTGTAGCACAATGGCACGATCGCGGAGAACAAGAGGTGTTTGAGTATTGTTTGGAAGATGGTTCATTGATTCGGGCAACAAAAGACCATAAGTTTATGACTGTTGATGGTCAAATGTTGCCAATTGATGAAATATTTGAACGTGAATTGGATTTGATGCGGGTTGATAATTTGCCGAATAAGCTTGGAGGCGGAGGGAGCGGAGGCGGAGGGAGCGCTAGCATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGACAAATCCTGGTGTATCCGCTTGGCAGGTCAACACAGCTTATACTGCGGGACAATTGGTCACATATAACGGCAAGACGTATAAATGTTTGCAGCCCCACACCTCCTTGGCAGGATGGGAACCATCCAACGTTCCTGCCTTGTGGCAGCTTCAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA（配列番号２１）
翻訳されたＮ−ＣＢＤ：
MCLSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNLPNKLGGGGSGGGGSASMKIEEGKLTNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQLEHHHHHH（配列番号２２）
構築物１２
ＮＣ１Ａ−ＣＢＤ：
ATGGCTTTAAGCTATGAAACGGAAATATTGACAGTAGAATATGGATTATTACCGATTGGTAAAATTGTAGAAAAGCGCATCGAATGTACTGTTTATAGCGTTGATAATAATGGAAATATTTATACACAACCTGTAGCACAATGGCACGATCGCGGAGAACAAGAGGTGTTTGAGTATTGTTTGGAAGATGGTTCATTGATTCGGGCAACAAAAGACCATAAGTTTATGACTGTTGATGGTCAAATGTTGCCAATTGATGAAATATTTGAACGTGAATTGGATTTGATGCGGGTTGATAATTTGCCGAATAAGCTTGGAGGCGGAGGGAGCGGAGGCGGAGGGAGCGCTAGCATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGACAAATCCTGGTGTATCCGCTTGGCAGGTCAACACAGCTTATACTGCGGGACAATTGGTCACATATAACGGCAAGACGTATAAATGTTTGCAGCCCCACACCTCCTTGGCAGGATGGGAACCATCCAACGTTCCTGCCTTGTGGCAGCTTCAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA（配列番号２３）
翻訳されたＮＣ１Ａ−ＣＢＤ：
MALSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNLPNKLGGGGSGGGGSASMKIEEGKLTNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQLEHHHHHH（配列番号２４）
構築物１３
Ｃ−ＰＴＤＨ：
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGACATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAATTGTTTCAATGCTAGCATGCTGCCGAAACTCGTTATAACTCACCGAGTACACGAAGAGATCCTGCAACTGCTGGCGCCACATTGCGAGCTGATAACCAACCAGACCGACAGCACGCTGACGCGCGAGGAAATTCTGCGCCGCTGTCGCGATGCTCAGGCGATGATGGCGTTCATGCCCGATCGGGTCGATGCAGACTTTCTTCAAGCCTGCCCTGAGCTGCGTGTAATCGGCTGCGCGCTCAAGGGCTTCGACAATTTCGATGTGGACGCCTGTACTGCCCGCGGGGTCTGGCTGACCTTCGTGCCTGATCTGTTGACGGTCCCGACTGCCGAGCTGGCGATCGGACTGGCGGTGGGGCTGGGGCGGCATCTGCGGGCAGCAGATGCGTTCGTCCGCTCTGGCAAGTTCCGGGGCTGGCAACCACGGTTCTACGGCACGGGGCTGGATAACGCTACGGTCGGCTTCCTTGGCATGGGCGCCATCGGACTGGCCATGGCTGATCGCTTGCAGGGATGGGGCGCGACCCTGCAGTACCACGCGCGGAAGGCTCTGGATACACAAACCGAGCAACGGCTCGGCCTGCGCCAGGTGGCGTGCAGCGAACTCTTCGCCAGCTCGGACTTCATCCTGCTGGCGCTTCCCTTGAATGCCGATACCCTGCATCTGGTCAACGCCGAGCTGCTTGCCCTCGTACGGCCGGGCGCTCTGCTTGTAAACCCCTGTCGTGGCTCGGTAGTGGATGAAGCCGCCGTGCTCGCGGCGCTTGAGCGAGGCCAGCTCGGCGGGTATGCGGCGGATGTATTCGAAATGGAAGACTGGGCTCGCGCGGACCGGCCGCAGCAGATCGATCCTGCGCTGCTCGCGCATCCGAATACGCTGTTCACTCCGCACATAGGGTCGGCAGTGCGCGCGGTGCGCCTGGAGATTGAACGTTGTGCAGCGCAGAACATCCTCCAGGCATTGGCAGGTGAGCGCCCAATCAACGCTGTGAACCGTCTGCCCAAGGCCAATCCTGCCGCAGACCTCGAGCACCACCACCACCACCAC（配列番号２５）
翻訳されたＣ−ＰＴＤＨ：
MIKIATRKYLGKQNVYDIGVERDHNFALKNGFIASNCFNASMLPKLVITHRVHEEILQLLAPHCELITNQTDSTLTREEILRRCRDAQAMMAFMPDRVDADFLQACPELRVIGCALKGFDNFDVDACTARGVWLTFVPDLLTVPTAELAIGLAVGLGRHLRAADAFVRSGKFRGWQPRFYGTGLDNATVGFLGMGAIGLAMADRLQGWGATLQYHARKALDTQTEQRLGLRQVACSELFASSDFILLALPLNADTLHLVNAELLALVRPGALLVNPCRGSVVDEAAVLAALERGQLGGYAADVFEMEDWARADRPQQIDPALLAHPNTLFTPHIGSAVRAVRLEIERCAAQNILQALAGERPINAVNRLPKANPAADLEHHHHHH（配列番号２６）
構築物１４
Ｃ＊−Ａ−ＧＦＰ：
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGGCATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAATGCGTTCAATGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGTTACTCGAGCACCACCACCACCACCAC（配列番号２７）
翻訳されたＣ＊−Ａ−ＧＦＰ：
MIKIATRKYLGKQNVYGIGVERDHNFALKNGFIASNAFNVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELLEHHHHHH（配列番号２８）
構築物１５
Ｃ＊−Ｄ−ＧＦＰ：
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGGCATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAATGATTTCAATGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGTTACTCGAGCACCACCACCACCACCAC（配列番号２９）
翻訳されたＣ＊−Ｄ−ＧＦＰ：
MIKIATRKYLGKQNVYGIGVERDHNFALKNGFIASNDFNVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELLEHHH
HHH（配列番号３０）
構築物16
Ｃ＊−Ｌ−ＧＦＰ：
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGGCATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAATCTGTTCAATGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGTTACTCGAGCACCACCACCACCACCAC（配列番号３１）
翻訳されたＣ＊−Ｌ−ＧＦＰ：
MIKIATRKYLGKQNVYGIGVERDHNFALKNGFIASNLFNVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELLEHHHHHH（配列番号３２）
構築物１７
Ｃ＊−Ｐ−ＧＦＰ：
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGGCATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAATCCGTTCAATGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGTTACTCGAGCACCACCACCACCACCAC（配列番号３３）
翻訳されたＣ＊−Ｐ−ＧＦＰ：
MIKIATRKYLGKQNVYGIGVERDHNFALKNGFIASNPFNVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELLEHHHHHH（配列番号３４）
構築物１８
Ｃ＊−Ｒ−ＧＦＰ：
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGGCATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAATCGTTTCAATGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGTTACTCGAGCACCACCACCACCACCAC（配列番号３５）
翻訳されたＣ＊−Ｒ−ＧＦＰ：
MIKIATRKYLGKQNVYGIGVERDHNFALKNGFIASNRFNVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELLEHHHHHH（配列番号３６）
翻訳されたＣ＊−：
MIKIATRKYLGKQNVYGIGVERDHNFALKNGFIASN（配列番号３７）
ＥＬＰのアミノ酸配列：
MGHGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGGLVSSNNNNNNNNNNLGIEGRISEF（配列番号３８）
インテインＮ断片のアミノ酸配列：
ALSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNLPN（配列番号３９）
Ｃ＊−ＤＮＡ：
ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATGGCATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCATAGCTTCTAAT
（配列番号４０）
ＥＬＰ−インテインＮ断片：
ATGGGCCACGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGCGTGGGTGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGCAGGTGTTCCTGGTGTAGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTGCCGGGTGTTGGTGTACCAGGTGGCGGTGTTCCGGGTGCAGGCGTTCCGGGTGGCGGTGTGCCGGGCGGGCTGGTGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAACAACCTCGGGATCGAGGGAAGGATTTCAGAATTCGGAGGCGGAGGGAGCGGAGGCGGAGGGAGCGCTAGCTGTTTAAGCTATGAAACGGAAATATTGACAGTAGAATATGGATTATTACCGATTGGTAAAATTGTAGAAAAGCGCATCGAATGTACTGTTTATAGCGTTGATAATAATGGAAATATTTATACACAACCTGTAGCACAATGGCACGATCGCGGAGAACAAGAGGTGTTTGAGTATTGTTTGGAAGATGGTTCATTGATTCGGGCAACAAAAGACCATAAGTTTATGACTGTTGATGGTCAAATGTTGCCAATTGATGAAATATTTGAACGTGAATTGGATTTGATGCGGGTTGATAATTTGCCGAATCTCGAGCACCACCACCACCACCAC（配列番号４１）。
翻訳されたＥＬＰ−インテインＮ断片：
MGHGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGVGVPGVGVPGVGVPGGGVPGAGVPGGGVPGGLVSSNNNNNNNNNNLGIEGRISEFGGGGSGGGGSASCLSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNLPNLEHHHHHH（配列番号４２）
本研究で使用したプライマー：
NPUC_F_NDEI 104：
TTAGAAGGCATATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGG（配列番号４３）。
OXP-NC-G-REV：
CCTCGCCCTTGCTCACATTGAAACAATTAGAAGCTATGAAGCCAT（配列番号４４）。
OXP-GFP-NC-FWD：
ATAGCTTCTAATTGTTTCAATGTGAGCAAGGGCGAGG（配列番号４５）。
XHOI_GFP_R：
TAAAATCTCGAGTAACTCGTCCATGCCGAGAG（配列番号４６）。
NPUCD17G-F：
GGCAAACAAAATGTCTATGGCATTGGAGTT（配列番号４７）。
NPUCD17G-R：
GTCGCGCTCAACTCCAATGCCATAGACATT（配列番号４８）。
HINDIII-LINK-NPU F：
CCTGGAAGCTTGTGGAGGCGGAGGGAGCGGAGGCGGAGGGAGCGCTAGCTGTTTAAGCTATGAAACGGAAATATTGAC（配列番号４９）。
NPUN_R_XHOI：
ATATAGCTCGAGATTCGGCAAATTATCAACCCG（配列番号５０）。
NDEI-CBD-F：
TAATTTAACATATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGACAAATCCT（配列番号５１）。
HINDIII-CBD-R：
AAGATTAAAGCTTCTTGAAGCTGCCACAAGGCA（配列番号５２）。
NHEI-C1A-F：
AATTAAGCTAGCGCCTTAAGCTATGAAACGGAAATATTGACA（配列番号５３）。
ECORI-LINKER-NPUN F：
AATATGGGAATTCGGAGGCGGAGGGAGCGG（配列番号５４）。
HINDIII-6H-NUPN- R：
GTACATTAAGCTTAGCAGCCGGATCTCAGT（配列番号５５）。
NHEI-NPUC CFN-R：
ATTCGCGCTAGCATTGAAACAATTAGAAGCTATGAAGCC（配列番号５６）。
XHOI_DSRED_R：
TAAAATCTCGAGCAGGAACAGGTGGTGGC（配列番号５７）。
HINDII-L-DSRED-FWD：
TTCAATAAGCTTGGAGGCGGAGGGAGCGGAGGCGGAGGGAGCGCTAGCGCCTCCTCCGAGGACG（配列番号５８）。
NHEI-PTDH-F：
ATTTAACGCTAGCATGCTGCCGAAACTCGTTATAACTC（配列番号５９）。
XHOI-PTDH12X-R：
AGTTTAGCTCGAGGTCTGCGGCAGGATTGG（配列番号６０）。
NHEI-LACZ-F：
ATTTCAATGCTAGCATGACCATGATTACGGATTCACT（配列番号６１）。
XHOI-LACZ-R：
TGATAATCTCGAGTTTTTGACACCAGACCAACTG（配列番号６２）。
NHEI-CAT-F：
GTTTCAATGCTAGCATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATAT（配列番号６３）。
XHOI-CAT-R：
TAATAATTAACTCGAGCGCCCCGCCCTGCCAC（配列番号６４）。
NHEI-MBP-F：
GTTTCAATGCTAGCATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCT（配列番号６５）。
XHOI-MBP-R：
AAGTTATACTCGAGTCCCCTTCCCTCGATCC（配列番号６６）。
【図１】
2016504417.tif 000006
【図２】
2016504417.tif 000007
【図３】
2016504417.tif 000008
【図４】
2016504417.tif 000009
【図５Ａ】
2016504417.tif 000010
【図５Ｂ−Ｃ】
2016504417.tif 000011
【図６】
2016504417.tif 000012
【図７】
2016504417.tif 000013
【図８】
2016504417.tif 000014
【図９】
2016504417.tif 000015
【図１０】
2016504417.tif 000016
【図１１】
2016504417.tif 000017
【図１２】
2016504417.tif 000018
【図１３】
2016504417.tif 000019
【図１４】
2016504417.tif 000020
【図１５】
2016504417.tif 000021
【図１６】
2016504417.tif 000022
【図１７】
2016504417.tif 000023
【図１８】
2016504417.tif 000024
【図１９】
2016504417.tif 000025
【図２０】
2016504417.tif 000026
【図２１】
2016504417.tif 000027
【図２２】
2016504417.tif 000028
【図２３】
2016504417.tif 000029
【図２４Ａ】
2016504417.tif 000030
【図２４Ｂ】
2016504417.tif 000031
【国際調査報告】
2016504417.tif 000032
2016504417.tif 000033
2016504417.tif 000034
2016504417.tif 000035
2016504417.tif 000036