(57)【要約】  本発明は、一つには、シトクロムＰ４５０ ２Ｃ８活性又は発現の阻害剤、又はｓＥＨ活性又は発現の促進剤の治療有効量を対象に投与することを含んでなる、対象における網膜の血管障害を治療又は予防する方法、対象における血管新生を治療又は予防する方法、及び対象における新血管新生を治療又は予防する方法を特徴としている。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトクロムＰ４５０ ２Ｃ８（ＣＹＰ２Ｃ８）活性又は発現の阻害剤の治療有効量を対象に投与すること、それによって網膜の血管障害を治療又は予防することを含んでなる、対象における網膜の血管障害を治療又は予防する方法。
【請求項２】
ＣＹＰ２Ｃ８活性又は発現の阻害剤の治療有効量を対象に投与すること、それによって血管形成を治療又は予防することを含んでなる、対象における血管形成を治療又は予防する方法。
【請求項３】
ＣＹＰ２Ｃ８活性又は発現の阻害剤の治療有効量を対象に投与すること、それによって新血管形成を治療又は予防することを含んでなる、対象における新血管形成を治療又は予防する方法。
【請求項４】
可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）活性又は発現の促進剤の治療有効量を対象にすること、それによって網膜の血管障害を治療又は予防することを含んでなる、対象における網膜の血管障害を治療又は予防する方法。
【請求項５】
モンテルカスト又はフェノフィブラートの治療医有効量を対象に投与すること、それによって対象の網膜の血管障害、血管形成及び／又は新血管形成を治療又は予防することを含んでなる、対象における網膜の血管障害、血管形成及び／又は新血管形成を治療又は予防する方法。
【請求項６】
網膜の血管障害が、網膜症、滲出性加齢黄斑変性症（ＡＲＭＤ）、及び血管閉塞よりなる群から選ばれる、請求項１、４又は５に記載の方法。
【請求項７】
網膜症が、糖尿病網膜症及び未熟児の網膜症（ＲＯＰ）から選ばれる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ｓＥＨ活性又は発現の促進剤の治療有効量を対象に投与すること、それによって血管形成を治療又は予防することを含んでなる、対象における血管形成を治療又は予防する方法。
【請求項９】
ｓＥＨ活性又は発現の促進剤の治療有効量を対象にすること、それによって新血管形成を治療又は予防することを含んでなる、対象における新血管形成を治療又は予防する方法。
【請求項１０】
対象が網膜の血管障害があると或いは網膜の血管障害に罹りやすいと確認されている、請求項１〜９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
網膜の血管障害が、網膜症、滲出性加齢黄斑変性症（ＡＲＭＤ）、及び血管閉塞よりなる群から選ばれる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
対象が未熟児性網膜症の危険性がある早産児である、請求項１〜９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
モンテルカスト、フェノフィブラート及び／又はＣＹＰ２Ｃ８の阻害剤が、ＣＹＰ２Ｃ８タンパク質の活性を減少するか又は組織内のＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の発現を減少する、請求項１〜９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ｓＥＨの促進剤がｓＥＨタンパク質の活性を増大するか又は組織内のｓＥＨ遺伝子の発現を増大する、請求項１〜９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
モンテルカスト、フェノフィブラート、ＣＹＰ２Ｃ８活性の阻害剤及び／又はｓＥＨ活性或いは発現の促進剤を眼組織に投与する、請求項１〜８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
網膜症が、糖尿病網膜症、未熟児の網膜症、及び湿潤性加齢黄斑変性症よりなる群から選ばれる、請求項１〜１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
対象がポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）強化食を食べている、請求項１〜１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＰＵＦＡ強化食が、ω３−ＰＵＦＡ又はω−６ＰＵＦＡに富んでいる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＹＰ２Ｊ２の阻害剤を対象に投与することをさらに含んでいる、請求項１〜１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＣＹＰ２Ｊ２の阻害剤が、テルミサルタン、フルナリジン、アモジアキン、ニカルジピン、ミベフラジル、ノルフロキサシン、ニフェジピン、ニモジピン、ベンズブロマロン及びハロペリドールよりなる群から選ばれる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
モンテルカスト又はフェノフィブラート、及び使用説明書を含んでなる、対象における網膜の血管障害を治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦支援研究に基づく発明に対する権利の声明）
本研究は国立衛生研究所（ＮＩＨ）の以下の補助金の支援、５ＲＯ１ＥＹ０１７０１７を受けた。政府は本発明に対してある特定の権利を有している。
【０００２】
（関連出願）
本出願は、２０１３年１０月２５日に出願され、「網膜の血管障害を治療又は予防する方法」と題する、米国仮特許出願第６１／８９５，８５１号の優先権及び米国特許法第１１９（ｅ）条（３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ））による利益を主張する。前記特許出願の全内容は参照により本明細書に取り込まれている。
【背景技術】
【０００３】
糖尿病網膜症、滲出性加齢黄斑変性症（ＡＲＭＤ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）及び血管閉塞を含んでいる網膜の血管障害は、視力障害及び失明の主な原因である。この疾患群は、病的な眼の新血管形成を阻止又は修正するのに役立つ新規な治療法を特定することを目的とする集中的な研究の焦点である。例えば、ＡＲＭＤは６５歳以上の何百万人ものアメリカ人に発症し、そしてその１０〜１５％に脈絡膜（網膜下）血管新生の直接的な影響として視力障害を引き起こす。６５歳未満のアメリカ人の視力障害の主な原因は糖尿病であり、何百万人もの米国民が糖尿病であって、多くが、主に網膜新血管形成の結果、この疾患による眼の合併症を患っている。レーザー光凝固術は、高リスク糖尿病患者の一部で重篤な視力障害の予防に効果的であるが、網膜症の全体的な１０年発生率には実質的な変化はない。ＡＲＭＤ又は眼ヒストプラストマ症のような炎症性眼疾患に起因している脈絡膜血管新生の患者に対しては、殆ど例外なく、光凝固術は視力障害には無効である。
【０００４】
加齢黄斑変性症及び糖尿病網膜症は先進工業国において視力障害の主な原因であって異常な網膜新血管形成の結果として起こる。網膜はニューロン、グリア、及び血管成分の明確に定義された層から成っているので、血管増殖又は浮腫に見られるそれらの比較的小さい障害が視覚機能の著しい損失を引き起こす。網膜色素変性（ＲＰ）のような遺伝的な網膜変性も、細動脈狭窄及び血管萎縮のような、血管異常と関連している。血管新生を促進及び阻害する特定の因子において進展がある一方で、眼の血管障害を特異的に治療するために現在利用できる治療法はない。
【０００５】
網膜の遺伝的な変性は、３５００人のうちの１人に悪影響を与え、進行性夜盲症、視野欠損、視神経萎縮、細動脈減衰、血管透過性の変化、及び全盲に進行することが多い中心部視力低下によって特徴づけられる。これらの網膜変性疾患の進行を遅延又は止める効果的な治療は未だ存在しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、網膜症を含む、網膜の血管障害を治療又は予防する方法が当該技術分野において必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
失明の主な原因である、病的血管新生を伴う網膜症は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）及びリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）によって産生される抗血管形成代謝物を介して食餌性ω３−ポリ不飽和脂肪酸（ω３ＰＵＦＡｓ）によって抑制される。また、網膜症における役割が未だ知られていない、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）エポキシゲナーゼ（ＣＹＰ２Ｃ８）はＰＵＦＡを代謝してエポキシドを産生し、これは可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）によって不活性化されてトランス−ジヒドロジオールを形成する。本発明は、一つには、ω３ＰＵＦＡのＣＹＰ２Ｃ８／ｓＥＨ代謝が、増大したω３ＰＵＦＡ：ジオールの比に対応して、酸素誘発網膜症（ＯＩＲ）における新血管形成を制御するという新知見に基づいている。ＣＹＰ２Ｃ８の阻害は網膜症の治療に対する新たな標的を示している。
【０００８】
従って、第一の態様において、本発明は、シトクロムＰ４５０ ２Ｃ８（ＣＹＰ２Ｃ８）活性又は発現の阻害剤の治療有効量を対象に投与することによって、網膜の血管障害を治療又は予防することを含んでなる、対象における網膜の血管障害を治療又は予防する方法を特徴としている。
【０００９】
別の態様では、本発明は、ＣＹＰ２Ｃ８活性又は発現の阻害剤の治療有効量を対象に投与することによって、血管新生を治療又は予防することを含んでなる、対象における血管新生を治療又は予防する方法を特徴としている。
【００１０】
さらに別の態様では、本発明は、ＣＹＰ２Ｃ８活性又は発現の阻害剤の治療有効量を対象に投与することによって、新血管形成を治療又は予防することを含んでなる、対象における新血管形成を治療又は予防する方法を特徴としている。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）活性又は発現の促進剤の治療有効量を対象に投与することによって、網膜の血管障害を治療又は予防することを含んでなる、対象における網膜の血管障害を治療又は予防する方法を特徴としている。
【００１２】
追加の態様では、本発明は、網膜の血管障害、血管新生及び／又は新血管形成の治療又は予防が対象において達成できるように、モンテルカスト（ｍｏｎｔｅｌｕｋａｓｔ）又はフェノフィブラート（ｆｅｎｏｆｉｂｒａｔｅ）の治療有効量を対象に投与することを含んでいる、対象における網膜の血管障害、血管新生及び／又は新血管形成を治療又は予防する方法を提供する。
【００１３】
上記態様の一実施態様では、網膜の血管障害は、網膜症、滲出性加齢黄斑変性症（ＡＲＭＤ）、及び血管閉塞からなる群から選ばれる。さらなる実施態様では、網膜症は糖尿病網膜症及び未熟児網膜症（ＲＯＰ）から選ばれる。
【００１４】
別の態様では、本発明は、ｓＥＨ活性又は発現の促進剤の治療有効量を対象に投与することによって、血管新生を治療又は予防することを含んでなる、対象における血管新生を治療又は予防する方法を特徴としている。
【００１５】
さらに別の態様では、本発明は、ｓＥＨ活性又は発現の促進剤の治療有効量を対象に投与することによって、新血管形成を治療又は予防することを含んでなる、対象における新血管形成を治療又は予防する方法を特徴としている。
【００１６】
上記態様の一実施態様では、対象は、網膜の血管障害に罹っている、或いは網膜の血管障害に罹る傾向があると確認されている。関連する実施態様では、網膜の血管障害は、網膜症、滲出性加齢黄斑変性症（ＡＲＭＤ）、及び血管閉塞からなる群から選ばれる。
【００１７】
上記態様の別の実施態様では、対象は未熟児網膜症の危険性がある未熟児である。
【００１８】
上記態様の一実施態様では、モンテルカスト、フェノフィブラート及び／又はＣＹＰ２Ｃ８の阻害剤はＣＹＰ２Ｃ８タンパク質の活性を減少するか或いは組織内のＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の発現を減少する。上記態様の別の実施態様では、ｓＥＨの促進剤はｓＥＨタンパク質の活性を増大するか或いは組織内のｓＥＨ遺伝子の発現を増大する。さらなる実施態様では、モンテルカスト、フェノフィブラート、ＣＹＰ２Ｃ８活性の阻害剤及び／又はｓＥＨ活性或いは発現の促進剤は眼組織に投与される。
【００１９】
上記態様の一実施態様では、網膜症は糖尿病網膜症、未熟児の網膜症及び滲出性加齢黄斑変性症よりなる群から選ばれる。
【００２０】
上記態様の別のさらなる実施態様では、対象はポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）強化食を食べている。関連する実施態様では、ＰＵＦＡ強化食はω３−ＰＵＦＡ食又はω−６ＰＵＦＡ食である。
【００２１】
追加の実施態様では、本発明の方法はさらに、ＣＹＰ２Ｊ２阻害剤の対象への投与を含んでいる。任意に、ＣＹＰ２Ｊ２阻害剤は、テルミサルタン（Ｔｅｌｍｉｓａｒｔａｎ）、フルナリジン（Ｆｌｕｎａｒｉｚｉｎｅ）、アモジアキン（Ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）、ニカルジピン（Ｎｉｃａｒｄｉｐｉｎｅ）、ミベフラジル（Ｍｉｂｅｆｒａｄｉｌ）、ノルフロキサシン（Ｎｏｒｆｌｏｘａｃｉｎ）、ニフェジピン（Ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ）、ニモジピン（Ｎｉｍｏｄｉｐｉｎｅ）、ベンズブロマロン（Ｂｅｎｚｂｒｏｍａｒｏｎｅ）又はハロペリドール（Ｈａｌｏｐｅｒｉｄｏｌ）である。
【００２２】
本発明の別の態様は、モンテルカスト又はフェノフィブラート、及び使用説明書を含んでいる、対象における網膜の血管障害の治療のための医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、ＣＹＰ２Ｃ８同族体、ｓＥＨ及びそれらの産物のＯＩＲに対する酸素正常状態における網膜発現の比を示す。  （Ａ）アラキドン酸（ＡＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）のＣＹＰ２Ｃ８及びｓＥＨ代謝物の略図。  （Ｂ）ＣＹＰ２Ｃ（緑）、Ｆ４／８０（紫）、イソレクチン（赤）及びＤＡＰＩ（青）で染色した生後（Ｐ）１７日の酸素正常状態及びＯＩＲの網膜フラットマウントの三次元再構成共焦点画像。スケールバー：１００μｍ。  （Ｃ）酸素正常状態網膜の静脈を横切る各層の共焦点画像。  （Ｄ）ＯＩＲ網膜のフラットマウントにおけるＣＹＰ２Ｃ及びＦ４／８０（矢印）の共局在化。  （Ｅ）ｓＥＨが新生血管網内に（矢印）、そして神経節細胞（ＧＣＬ）内及び内顆粒層（ＩＮＬ）に発現されることを示すイソレクチン（赤）、ｓＥＨ（緑）及びＤＡＰＩ（青）による網膜断面の染色。スケールバー：１００μｍ。  （Ｆ）ＣＹＰ２Ｃ陽性白血球を指す（矢印）血液塗抹標本。スケールバー：２０μｍ。  （Ｇ）血液及び灌流したか或いは灌流していない網膜におけるＣＹＰ２ＣのｍＲＮＡレベル。  （Ｈ）ＯＩＲ中の網膜におけるＣＹＰ２Ｃ及びｓＥＨのｍＲＮＡ発現（ｎ＝６）。  （Ｉ）正常状態網膜（Ｎ）対ＯＩＲ網膜（Ｏ）におけるＣＹＰ２Ｃ及びｓＥＨのタンパク質発現。  （Ｊ）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳオキシリピッド分析による、ジオールに対する対応するＡＡ、ＤＨＡ及びＥＰＡエポキシドの比率（ｎ＝４〜６／群）（ボンフェローニ事後テストを用いる双方向ＡＮＯＶＡ試験後解析、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図２】図２は、ω３ＰＵＦＡ給餌はＴｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８−Ｔｇマウス及びＴｉｅ２−ｓＥＨ−ＴｇマウスにおいてＯＩＲの新血管形成を修正することを示す。  （Ａ）Ｔｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８−Ｔｇマウス対野生型同腹仔コントロール（ＷＴ）のＯＩＲ血管新生領域（ｎ＝１１〜１３／群）。  （Ｂ）Ｔｉｅ２−ｓＥＨ−Ｔｇ対ＷＴのＯＩＲ血管新生領域（ｎ＝１４〜１９／群）。  （Ｃ）全身ｓＥＨ欠損（ｓＥＨ−／−）のＯＩＲ血管新生領域（ｎ＝８〜１５／群）。スケールバー：５００μｍ。  （Ｄ）ＷＴと比較したＴｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８−Ｔｇ及びＴｉｅ２−ｓＥＨ−ＴｇのＯＩＲにおけるＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦ−ＣのＲＴ−ＰＣＲ（ｔ−検定、ｎ．ｓ．有意差なし、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図３】図３は、Ｔｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８−Ｔｇ及びＴｉｅ２−ｓＥＨ−Ｔｇがω３ＰＵＦＡ摂食マウスにおいて対応するエポキシドレベルを変えることを示す。  （Ａ）１４，１５−ＥＥＴ、１９，２０−ＥＤＰ及び１７，１８−ＥＥＱのＴｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８−Ｔｇマウスの血漿レベル（ｎ＝４〜６／群）。  （Ｂ）１４，１５−ＥＥＴ、１９，２０−ＥＤＰ及び１７，１８−ＥＥＱのＴｉｅ２−ｓＥＨ−Ｔｇマウスの血漿レベル（ｎ＝４〜６／群）。  （Ｃ）１４，１５−ＥＥＴ：１４，１５−ＤＨＥＴ、１９，２０−ＥＤＰ：ＤｉＨＤＰＡ、及び１７，１８−ＥＥＱ：１７，１８−ＤＨＥＴに関するＴｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８−Ｔｇ対ＷＴにおけるレチナール比（ｎ＝４〜６／群）。  （Ｄ）１９，２０−ＥＤＰ：ＤｉＨＤＰＡ及び１７，１８−ＥＥＱ：１７，１８−ＤＨＥＴに関するＴｉｅ２−ｓＥＨ−Ｔｇ対ＷＴにおけるレチナール比（ｎ＝４〜６／群）（ｔ−検定、ｎ．ｓ．有意差なし、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図４】図４は、ＤＨＡ及びＡＡ或いはエポキシド代謝物で処置したＴｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８−Ｔｇ及びＴｉｅ２−ｓＥＨ−Ｔｇを用いる大動脈輪発芽を示す。  （Ａ）ＡＡ（３０μＭ）又はＤＨＡ（３０μＭ）が誘発したＷＴとＴｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８−Ｔｇマウスの大動脈輪発芽（ｎ＝３〜７／群）。  （Ｂ）１７，１８−ＥＤＰ、１９，２０−ＥＥＱ及び１４，１５−ＥＥＴで処置したＴｉｅ２−ｓＥＨ−Ｔｇ及びｓＥＨ−／−からの大動脈輪発芽（ｎ＝４〜８／群）。スケールバー：５０μｍ（ｔ−検定、ｎ．ｓ．有意差なし、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図５】図５は、ω６ＰＵＦＡ食を用いると、Ｔｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８−ＴｇはＷＴと比べてＯＩＲ新血管形成を誘発し（９．４５８±０．３４２５対８．２９１±０．３９７６）、Ｔｉｅ２−ｓＥＨ−Ｔｇ及びｓＥＨ−／−では差がなかったことを示す。
【図６】図６は、血漿１４，１５−ＥＥＴ及び網膜の１４，１５−ＥＥＴ：１４，１５−ＤＨＥＴ比は、増大した新血管形成と一致して、ＷＴと比べてＴｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８−Ｔｇで増大した（Ａ〜Ｄ）。１４，１５−ＥＥＴで処置すると、Ｔｉｅ２−ｓＥＨ−Ｔｇ、ｓＥＨ−／−及びＷＴにおいて大動脈輪発芽は類似していた（Ｅ）。
【図７】図７は、低用量（１０ｍｇ／ｋｇ／日・強制経口投与（ＧＶ））及び高用量（１００ｍｇ／ｋｇ・ＧＶ）両方のフェノフィブラートは正常食のＪＡＸ（ＷＴ）マウスにおいて新血管形成を減少したことを示す。
【図８】図８は、低用量（１０ｍｇ／ｋｇ／日・強制経口投与（ＧＶ））及び高用量（１００ｍｇ／ｋｇ・ＧＶ）両方のフェノフィブラートは正常食のＰＰＡＲα欠損マウスにおいて新血管形成を減少したことを示し、観察された結果はＰＰＡＲα非依存性であったことを示唆している。
【図９】図９は、低用量のフェノフィブラートは、ＷＴ及びＣｙｐ２Ｃ８過剰発現遺伝子組み換えマウスの両方において、ω３とω６の何れのＬＣＰＵＦＡ強化食で飼育しても新血管形成を減少したことを示す。
【図１０】図１０は、フェノフィブリン酸（ＦＡ、フェノフィブラートの活性代謝物）が、ＷＴ及びＣｙｐ２Ｃ８Ｔｇ両マウスからの大動脈輪の発芽を阻害したことを示す。この阻害は１９，２０−ＥＤＰによって回復した。
【図１１】図１１は、フェノフィブリン酸（ＦＡ）が、ＷＴ及びＣｙｐ２Ｃ８Ｔｇ両マウスからの大動脈輪の発芽を抑制したことを示す。この阻害はＤＨＡによって回復しなかった。
【図１２】図１２は、ＦＡが、ＷＴ及びＣｙｐ２Ｃ８Ｔｇ両マウスの大動脈輪の発芽を抑制し、これはＰＰＡＲα阻害剤ＧＷ６４７１によって回復できなかったことを示す。
【図１３】図１３は、ＦＡが、ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）の小管形成を阻害して、この効果は１９，２０−ＥＤＰによって部分的に回復したことが観察されたことを示す。
【図１４】図１４は、定量化して棒状グラフで表した、図１３に示したような結果を示す。
【図１５】図１５は、ｗ３ＬＣＰＵＦＡが、ＦＡによるＨＲＭＥＣの小管形成の阻害を回復できなかったことを示す。
【図１６】図１６は、定量化して棒状グラフで表した、図１５に示したような結果を示す。
【図１７】図１７は、フェノフィブラートが、ＨＲＭＥＣの小管形成を阻害することが確認されたこと、ＰＰＡＲα阻害剤ＧＷ６４７１が試験され、ＨＲＭＥＣの小管形成に対して観察されたフェノフィブラートの効果に影響を与えないことが見出され、フェノフィブラートがＰＰＡＲα非依存的に小管形成を阻害することが確認されたこと示す。
【図１８】図１８は、定量化して棒状グラフで表した、図１７に示したような結果を示す。
【図１９】図１９は、１９，２０−ＥＤＰ及び１７，１８−ＥＥＱ（ＥＰＡ及びＣＹＰ２Ｃ８の下流化合物）が、ＦＡによるＨＲＭＥＣ遊走の阻害を部分的に回復することが確認されたことを示す。
【図２０】図２０は、ｗ３ＬＣＰＵＦＡがＦＡによるＨＲＭＥＣ遊走の阻害を回復できないことが確認されたことを示す。
【図２１】図２１は、ＰＰＡＲα阻害剤ＧＷ６４７１が試験され、ＨＲＭＥＣ遊走に対して観察されたフェノフィブラートの効果に対して影響を与えないことが見いだされ、ＨＲＭＥＣ遊走のＦＡによる阻害が、ＰＰＡＲα−非依存性であることが観察されたことを示す。
【図２２】図２２は、ω３及びω６経路内のフェノフィブラート／ＦＡの見極められた作用点を示す。
【図２３】図２３は、モンテルカストが通常食のＪＡＸ（ＷＴ）マウスにおいて新血管形成を減少させたことを示す。
【図２４】図２４は、ＣＹＰ２Ｃ８を過剰に発現しているマウス（Ｃｙｐ２Ｃ８遺伝子組み換えマウス、「Ｃｙｐ２Ｃ８Ｔｇ」）にモンテルカストを投与することの影響を示す。
【図２５】図２５は、ＨＲＭＥＣの小管形成に対するモンテルカストの影響を示す。
【図２６】図２６は、ＨＲＭＥＣの小管形成を評価したときに、モンテルカストが、フェノフィブラートについて観察されたものとも類似している、明確な用量反応曲線を表すことを示す。
【図２７】図２７は、明確な用量反応曲線にも示されるように、ＨＲＭＥＣの小管形成がモンテルカストによって阻害されたことを明示している。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（定義）
以下の用語はもっぱら本発明の理解に役立つように提供されている。これらの定義は当業者によって理解されているより狭い範囲を有していると解釈してはならない。
【００２５】
本開示において、「からなる」、「含んでいる」、「含有している」及び「有している」などは、米国特許法においてそれらのものと見做している意味を有することができて、「包含する」、「包含している」などを意味し得る。「本質的に〜からなる」、「本質的になる」などは、米国特許法においてそれらのものと見做している意味を有することができて、この用語には制約がなく、列挙されているものの基本的な或いは新規な特徴が列挙されているものを上回るものの存在によって変えられない限り、列挙されているものを上回るものの存在を可能とするが、先行技術を除外する。
【００２６】
この明細書及び添付されている特許請求の範囲で用いられているような、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容が明確に述べていない限り、複数への参照を含んでいる。
【００２７】
本明細書で用いられている用語「網膜の血管障害」は、眼内の血管に影響を及ぼす眼疾患の範囲を指すように意図されている。網膜の血管障害の例は、これに限定されないが、網膜症、滲出性加齢黄斑変性症（ＡＲＭＤ）、及び血管閉塞を包含する。
【００２８】
用語「網膜症」は、眼の網膜への持続的或いは急性の障害を指すように意図されている。網膜症の種類は糖尿病網膜症及び未熟児の網膜症（ＲＯＰ）を包含する。
【００２９】
用語「シトクロムＰ４５０」は、有機物質の酸化を触媒する酵素の大きくて多様な集団を指すように意図されている。ＣＹＰをコードする遺伝子、及び酵素それ自体は、遺伝子ファミリーを示す数字、サブファミリーを指す大文字、及び個々の遺伝子についての数字が続いている、略語ＣＹＰで指定されている。「シトクロムＰ４５０ ２Ｃ８（ＣＹＰ２Ｃ８）」は、体内の生体異物の代謝に関わるシトクロムＰ４５０混合機能酸化酵素系のメンバーを指すように意図されている。
【００３０】
用語「血管形成」は、それによって既存の血管から新らしい血管が形成される生理的な過程を指すように意図されている。
【００３１】
用語「新血管形成」は、眼の中の小さくて、異常で、漏出性の血管の発育を指すように意図されている。
【００３２】
用語「可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）」は、ヒトにおいてＥＰＨＸ２遺伝子によってコードされる二機能性酵素を指すように意図されている。ｓＥＨはエポキシドヒドロラーゼファミリーのメンバーである。細胞質ゾル及びペルオキシソームの両方で見つけられた、この酵素は特異的なエポキシドと結合してそれらを対応するジオールに変換する。
【００３３】
用語「ポリ不飽和脂肪（ＰＵＦＡ）」は、その炭化水素の尾部がポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）（脂肪酸は１個以上の炭素−炭素二重結合を有している）を構成しているトリグリセリドを指すように意図されている。ω３−ＰＵＦＡは、ＡＬＡ（植物油から見つけられた）、ＥＰＡ、及びＤＨＡ（共に水産油脂から見つけられることが多い）と呼ばれる三つの脂肪群であるオメガ−３脂肪酸（ω−３脂肪酸又はｎ−３脂肪酸と呼ばれる）を指す。
【００３４】
本明細書で用いられる用語「対象」は、動物、特にヒトだけではなくその他の哺乳動物を含んでいる。
【００３５】
本明細書で用いられる用語「治療すること」又は「予防すること」は治療効果及び／又は予防効果を達成することを含んでいる。治療効果とは、治療している基礎疾患の根絶又は軽減を意味する。また、治療効果は、対象が未だに基礎疾患を患っているにもかかわらず、基礎疾患に関連している１つ又はそれ以上の生理的症状を患者に改善が観察されるように根絶又は軽減することによって達成される。予防効果に関しては、組成物を特定の疾患を発症する危険性がある対象に、又はこの疾患の診断が未だなされていなくとも、疾患の１つ又はそれ以上の生理的症状を示している対象に、組成物を投与できる。組成物は生理的症状又は基礎疾患の発症を予防するために対象に投与できる。
【００３６】
（略語及び頭字語）
ＰＵＦＡ−ポリ不飽和脂肪酸；ＣＯＸ−シクロオキシゲナーゼ；ＬＯＸ−リポキシゲナーゼ；ＣＹＰ−シトクロムＰ４５０；ｓＥＨ−可溶性エポキシドヒドロラーゼ；ＯＩＲ−酸素誘発網膜症；ＤＨＡ−ドコサヘキサエン酸；ＥＰＡ−エイコサペンタエン酸；ＡＡ−アラキドン酸；ＥＣ−内皮細胞；ＶＥＧＦ−血管内皮増殖因子；ＥＥＴ−エポキシエイコサトリエン酸；ＥＤＰ−エポキシドコサペンタエン酸；ＥＥＱ−エポキシエイコサテトラエン酸；ＤＨＥＴ−ジヒドロキシエイコサトリエン酸；ＤｉＨＤＰＡ−ジヒドロキシドコサペンタエン酸。
【００３７】
（発明の詳細な説明）
ω３ＰＵＦＡ強化食が酸素誘発網膜症（ＯＩＲ）において新血管形成を抑制することはすでに立証されている。ＯＩＲイヌにおけるω３ＰＵＦＡの抗血管新生効果は主にＣＯＸ及びＬＯＸの代謝物に由来している。これらの研究に基づいて、未熟児用の完全静脈栄養へのω３ＰＵＦＡの添加が、網膜症の阻止を助けるための臨床試験中にある。新たに確認された、あまり特徴付けされていないＣＹＰ経路が、ω６ＰＵＦＡアラキドン酸（ＡＡ）を代謝して血管新生誘発代謝物エポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴ）を生ずることが最近見出されたが、網膜症におけるω３ＰＵＦＡ由来のＣＹＰ及びｓＥＨ代謝物の役割は知られていない。
【００３８】
網膜症におけるω３ＰＵＦＡ由来ＣＹＰ代謝物の役割を理解することは完全静脈栄養にω３ＰＵＦＡを添加することの意味を知るために極めて重要である。本明細書に記載されているものはＣｙｐ２Ｃ８由来の新規なω３ＰＵＦＡエポキシド代謝物であって、これは新血管形成を促進する。これらの結果は、ＣＯＸ及びＬＯＸによるω３ＰＵＦＡ代謝物は網膜症において新血管形成を阻害するとはいえ、ＣＹＰ２Ｃ８によるω３ＰＵＦＡ代謝物は疾患を促進し、その阻害はいずれも必須食餌脂肪酸であるω３ＰＵＦＡとω６ＰＵＦＡからの血管新生促進代謝物の生産を減少又は阻止するので、ＣＹＰ２Ｃ８の阻害は、網膜症治療の新規で興味深い標的を提供するかもしれない。
【００３９】
シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）は生命体の全ての領域で見出されるヘムタンパク質の大きくて多様なスパーファミリーである。これらは酵素反応において基質として大量の外因性及び内因性化合物の両方を用いる。通常これらは、Ｐ４５０含有系と呼ばれる、他成分の電子移動連鎖の一部を形成する。シトクロムＰ４５０ ２Ｃ８混合機能オキシダーゼ系のメンバーである、シトクロムＰ４５０２Ｃ８（略語ＣＹＰ２Ｃ８）は体内で生体異物の代謝に関わっている。
【００４０】
本明細書に記載したように、本発明はシトクロムＰ４５０２Ｃ８（ＣＹＰ２Ｃ８）活性又は発現の阻害剤を含んでいる。本発明は可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）活性又は発現の活性化剤、作動薬及び／又は促進剤も含んでいる。
【００４１】
ある特定の実施態様では、ＣＹＰ２Ｃ８の阻害剤はＣＹＰ２Ｃ８タンパク質の活性を減少するか又は細胞又は組織中のＣＹＰ２Ｃ８遺伝子の発現を減少する。別の実施態様では、ｓＥＨの促進剤はｓＥＨタンパク質の活性を増大するか又は細胞又は組織中のｓＥＨ遺伝子の発現を増大する。
【００４２】
本発明は阻害剤のタイプによって限定してはならない。典型的なＣＹＰ２Ｃ８の阻害剤又はｓＥＨの促進剤は、これに限定されないが、抗体、ペプチド、ｓｉＲＮＡのような抑制性核酸、アプタマー、及び小有機分子を包含する。通常、「小有機分子」は一般に医薬品に用いられている有機分子の大きさに匹敵する大きさの分子を指す。通常、この用語は有機生体高分子（例えば、タンパク質、核酸など）を除外する。小有機分子は殆どの場合最大約５０００Ｄａまで、ある実施態様では、最大約２０００Ｄａまで、或いは別の実施態様では、最大約１０００Ｄａまで大きさの幅がある。ある特定の実施態様では、ＣＹＰ２Ｃ８活性又は発現の典型的な阻害剤はフェノフィブラート、ゲムフィブロジル（ｇｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌ）、トリメトプリム（ｔｒｉｍｅｔｈｏｐｒｉｍ）、チアゾリジンジオン（ｔｈｉａｚｏｒｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ）、モンテルカスト及びケルセチン（ｑｕｅｌｃｅｔｉｎ）を包含する。例として、フェノフィブラートとモンテルカストの化学構造はそれぞれ
【００４３】
【化１】
2016539098.tif 000003
【００４４】
である。
【００４５】
ＣＹＰ２Ｃ８活性又は発現の追加の例示的な阻害剤は、カンデサルタンシレキセチル（Ｃａｎｄｅｓａｒｔａｎ ｃｉｌｅｘｅｔｉｌ）、ザフィルルカスト（Ｚａｆｉｒｌｕｋａｓｔ）、クロトリマゾ−ル（Ｃｌｏｔｒｉｍａｚｏｌｅ）、フェロジピン（Ｆｅｌｏｄｉｐｉｎｅ）、モメタゾンフロ酸エステル（Ｍｏｍｅｔａｓｏｎｅ  ｆｕｒｏａｔｅ）、サルメテロール（Ｓａｌｍｅｔｅｒｏｌ）、ラロキシフェン（Ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、リトナビル（Ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）、レボチロキシン（Ｌｅｖｏｔｈｙｒｏｘｉｎｅ）、タモキシフェン（Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、ロラタジン（Ｌｏｒａｔａｄｉｎｅ）、オキシブチニン（Ｏｘｙｂｕｔｙｎｉｎ）、メドロキシプロゲステロン（Ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、シンバスタチン（Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）、ケトコナゾール（Ｋｅｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ）、エチニルエストラジオール（Ｅｔｈｉｎｙｌ  ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）、スピロノラクトン（Ｓｐｉｒｏｎｏｌａｃｔｏｎｅ）、ロバスタチン（Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、ニフェジピン（Ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ）、イルベサルタン（Ｉｒｂｅｓａｒｔａｎ）、クロピトグレル（Ｃｌｏｐｉｄｏｇｒｅｌ）、アムロジピン（Ａｍｌｏｄｉｐｉｎｅ）、グリブリド（Ｇｌｙｂｕｒｉｄｅ）、ロシグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、セフロキシムアキセチル（Ｃｅｆｕｒｏｘｉｍｅ  ａｘｅｔｉｌ）、テルフェナジン（Ｔｅｒｆｅｎａｄｉｎｅ）、ピオグリタゾン（Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｚｏｎｅ）、ラベプラゾール（Ｒａｂｅｐｒａｚｏｌｅ）、トラニルシプロミン（Ｔｒａｎｙｌｃｙｐｒｏｍｉｎｅ）、ミダゾラム（Ｍｉｄａｚｏｌａｍ）、ニスタチン（Ｎｙｓｔａｔｉｎ）、ロサルタン（Ｌｏｓａｒｔａｎ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、エキセメスタン（Ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）、バルデコキシブ（Ｖａｌｄｅｃｏｘｉｂ）、フルバスタチン（Ｆｌｕｖａｓｔａｔｉｎ）、セレコキシブ（Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）、カルベジロール（Ｃａｒｖｅｄｉｌｏｌ）、トリアムシノロン（Ｔｒｉａｍｃｉｎｏｌｏｎｅ）、エストラジオール（Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）、ネファゾドン（Ｎｅｆａｚｏｄｏｎｅ）、メチルプレドニゾロン（Ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、セルトラリン（Ｓｅｒｔｒａｌｉｎｅ）及びカンデサルタン（Ｃａｎｄｅｓａｒｔａｎ）を包含する（Walsky et al. J. Clin. Phramacol. 45: 68-78 を参照されたい）。
【００４６】
ＣＹＰ２Ｃ８又はｓＥＨの活性又は発現は通常のアッセイ、例えば、免疫組織化学的染色、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット分析、発光分析、質量分析、高速液体クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析及びリアルタイム（ＲＴ）ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを用い当業者によって容易に確認することができる。無傷細胞におけるシトクロムＰ４５０活性をスクリーニングするための蛍光ベースのアッセイは記述されている（Donato et al. Drug Metab Dispos. 2004 Jul;32(7):699-706、参照によりその全てが本明細書に取り込まれている）。発光シトクロムＰ４５０アッセイは、例えば、ＰＲＯＭＥＧＡから購入できる。
【００４７】
ある実施態様では、ＣＹＰ２Ｃ８の阻害剤又はｓＥＨの促進剤は、網膜の血管障害の症状を平均で少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９０％超減少するか、或いは網膜の血管障害の症状を実質的に除去する治療効果を十分に発揮する量で存在する。
【００４８】
ある実施態様では、ＣＹＰ２Ｃ８の阻害剤又はｓＥＨの促進剤は、網膜の症状、例えば、糖尿病網膜症を平均で少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９０％超減少するか、或いは網膜の症状を実質的に除去する治療効果を十分に発揮する量で存在する。
【００４９】
ある実施態様では、ＣＹＰ２Ｃ８の阻害剤又はｓＥＨの促進剤は、対象における網膜の変性を平均で少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９０％超縮小するか、或いは網膜の変性を実質的に除去するのに十分な量で存在する。
【００５０】
ある実施態様では、ＣＹＰ２Ｃ８の阻害剤又はｓＥＨの促進剤は、対象の治療されている眼における血管閉塞を平均で少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９０％超減少するか、或いは網膜浮腫を実質的に除去するのに十分な量で存在する。
【００５１】
さらに別の実施態様では、ＣＹＰ２Ｃ８の阻害剤又はｓＥＨの促進剤は、対象の治療されている眼における血管形成を平均で少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９０％超減少するか、或いは血管形成を実質的に除去するのに十分な量で存在する。
【００５２】
ある実施態様では、ＣＹＰ２Ｃ８の阻害剤又はｓＥＨの促進剤は、対象の治療されている眼における網膜の新血管形成を平均で少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９０％超減少するか、或いは網膜の新血管形成を実質的に除去するのに十分な量で存在する。
【００５３】
ある実施態様では、ＣＹＰ２Ｃ８の阻害剤又はｓＥＨの促進剤は、対象の治療されている眼の視力低下を平均で少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９０％超遅延するか、或いはさらなる視力低下を実質的に除去するのに十分な量で存在する。
【００５４】
ある実施態様では、ＣＹＰ２Ｃ８の阻害剤又はｓＥＨの促進剤は、対象の網膜に対する非増殖性損傷を平均で少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９０％超制限するか、あるいは網膜に対する非増殖性損傷を実質的に除去するのに十分な量で存在する。
【００５５】
ある実施態様では、ＣＹＰ２Ｃ８の阻害剤又はｓＥＨの促進剤は、対象の網膜に対する増殖性損傷を平均で少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９０％超遅らすか、あるいは網膜に対するさらなる増殖性損傷を実質的に除去するのに十分な量で存在する。
【００５６】
本発明の化合物は市販されているか、又は当業者に周知の方法で製造するか、或いは本明細書に取り込まれている引例に記載されていて、１つ又はそれ以上の多形体を生じる多様な条件における結晶化又は沈殿法を含む、多種の方法で精製できる。
【００５７】
（治療方法）
シトクロムＰ４５０ ２Ｃ８（ＣＹＰ２Ｃ８）活性又は発現の阻害剤の治療有効量を対象に投与することを含んでいる、対象における網膜の血管障害を治療又は予防する方法、対象における血管形成を治療又は予防する方法、及び対象における新血管形成を治療又は予防する方法が本発明に含まれている。可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）活性又は発現の促進剤の治療有効量を対象に投与することを含んでいる、対象における網膜の血管障害を治療又は予防する方法も本発明に含まれている。
【００５８】
本明細書で用いられる用語「対象」は動物、特にヒト並びにその他の哺乳動物を包含している。ある特定の実施態様では、対象は未熟児網膜症の危険性がある未熟児である。別の実施態様では、対象は糖尿病を患っている。別の実施態様では、対象は網膜の血管障害に罹りやすいと認定されている。
【００５９】
ある特定の実施態様では、本発明は、シトクロムＰ４５０ ２Ｃ８（ＣＹＰ２Ｃ８）活性又は発現の阻害剤の治療有効量、又は可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）活性又は発現の促進剤の治療有効量を対処に投与することによって、網膜症を治療又は予防することを含んでいる、対象における網膜の血管障害を治療又は予防する方法を特徴としている。
【００６０】
別の実施態様では、本発明は、シトクロムＰ４５０ ２Ｃ８（ＣＹＰ２Ｃ８）活性又は発現の阻害剤の治療有効量、又は可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）活性又は発現の促進剤の治療有効量を対象に投与することによって、血管形成を治療又は予防することを含んでいる、対象における血管形成を治療又は予防する方法を特徴としている。
【００６１】
さらに別の実施態様では、本発明は、シトクロムＰ４５０ ２Ｃ８（ＣＹＰ２Ｃ８）活性又は発現の阻害剤の治療有効量、又は可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）活性又は発現の促進剤の治療有効量を対象に投与することによって、新血管形成を治療又は予防することを含んでいる、対象における新血管形成を治療又は予防する方法を特徴としている。
【００６２】
シトクロムＰ４５０ ２Ｃ８（ＣＹＰ２Ｃ８）活性又は発現の阻害剤による予防又は治療に適している症状及び疾患はこれに限定されないが、異常な血管又は細胞増殖が生じているものを包含する。ある特定の実施態様では、この疾患又は症状はここで網膜の血管疾患である。例えば、網膜の血管疾患は、網膜症、滲出性加齢黄斑変性症（ＡＲＭＤ）、及び血管閉塞であってよい。網膜症は眼の網膜に対する持続性又は急性損傷に起因している。継続的な炎症及び血管再構築は患者が疾患の程度を十分に自覚していない長期にわたって生じる。しばしば、網膜症は糖尿病又は高血圧症に見られる全身疾患の眼症状発現である。特定の実施態様では、網膜症は糖尿病網膜症及び未熟児網膜症（ＲＯＰ）から選ばれる。
【００６３】
未熟児網膜症（ＲＯＰ）は未熟児に生じる。通常、網膜は、妊娠満期には完全に血管が新生されている。未熟児では、出産時に網膜は不完全な血管新生のままである。通常の方法に引き継がれるのではなく、未熟児の網膜における脈管形成は崩壊する。異常で新しい増殖性血管は血管が新生された網膜と血管のない網膜の接点で成長する。これらの異常な新しい血管は網膜から硝子体へ成長して、網膜の出血及び牽引性剥離をもたらす。血管のない周辺部網膜のレーザー切断が適時に十分な方法で提供された場合には新血管形成の進行を止めることができるが、それにも関わらず何人かの未熟児は網膜剥離を進展し続ける。新生児のＲＯＰ関連網膜剥離を治療する手術手技は、小さい眼サイズ及び極めて堅固な新生児の硝子体網膜の剥離のような独特な問題によって、現時点では成功が限られている。
【００６４】
糖尿病網膜症は労働年齢の成人において失明の主な原因である。糖尿病患者においては、網膜の毛細血管閉塞が生じ、虚血性網膜の領域を作り出す。網膜の虚血は、視神経乳頭又は網膜後部から眼球赤道までの他の場所に前から存在している網膜小静脈を起源とした新血管増殖を引き起こす刺激としての機能を果たす。増殖性糖尿病網膜症（ＰＤＲ）における重篤な視力障害は、硝子体出血及び牽引性剥離に起因している。また、レーザー治療（虚血領域への全網膜光凝固）は、この疾患における新血管増殖の進展を止めるが、それは適時に極めて強烈な方法で提供された場合だけである。一部の糖尿病患者は、眼科診療を受けていないために、或いは適切なレーザー治療にもかかわらず、ＰＤＲに続いて重篤な視力低下となる。硝子体切除手術は、この疾患における重篤な視力低下を減少できるが完全に除去できない。
【００６５】
加齢黄斑変性症は、６５歳を超えた人々の重篤な視力低下の主な原因である。新血管形成が網膜血管系から発生して硝子体腔に広がるＲＯＰ及びＰＤＲとは対照的に、ＡＭＤは脈絡膜血管系に起因して網膜下腔に広がる新血管形成と関連している。脈絡膜新血管形成は、中心視野に関与している網膜の領域である黄斑に生じるので、ＡＭＤ患者において重篤な視力低下の原因となる。脈絡膜新血管形成を引き起こす要因は解明されていない。脈絡膜新血管形成のレーザー切断は、選ばれた患者の視力を安定化する。しかしながら、新血管ＡＭＤ患者のたった１０〜１５％が、最新の基準に従ってレーザー光凝固に適していると判断される損傷を有している。
【００６６】
未熟児の網膜症、増殖性糖尿病網膜症、及び血管新生加齢黄斑変性症は、新血管形成に続いて視力低下を引き起こしうる眼疾患のうちの３つにすぎない。他のものは鎌状赤血球網膜症、網膜静脈閉塞、及び幾つかの眼の炎症性疾患を包含する。しかしながら、これらは眼の新血管形成に起因する視力低下の非常に小さい部分を占めている。
【００６７】
網膜症は、酸素誘導性の血管損失マウスの眼にモデル化され、これは低酸素誘導網膜症を引き起こして、網膜血管の損失、損傷後の血管再生及び病的血管新生の評価を可能にする。
【００６８】
非増殖性糖尿病網膜症（ＮＰＤＲ）は、最初に、網膜毛細血管の変性、嚢状毛細血管微細動脈瘤の形成、周皮細胞欠乏毛細血管、及び毛細血管の閉鎖及び閉塞によって特徴付けられる正常な微小血管構築の異常を示す。作用機序は、白血球及び血小板による血管腔の閉塞に続いて周辺細胞及び内皮細胞両方の最終的な死を導く、糖尿病が誘発する血管の炎症を含んでいる。炎症過程による白血球の細胞壁への誘引及び接着は白血球の一時的な内皮細胞への吸着（白血球滞留）を引き起こし、細胞障害性因子を放出して、内皮細胞を傷つけるか又は破壊する。損傷した内皮表面は血小板接着、凝集、微小血栓形成、血管閉塞及び虚血を引き起こす。内皮損傷の別の帰結は、増大した血管透過性を引き起こす血液網膜関門（ＢＲＢ）の変化である。これは蛍光眼底血管造影中のフルオレセイン漏出又は光干渉断層法（ＯＣＴ）によって測定される網膜肥厚によって明らかである。この漏出の結果は臨床的に有意な黄斑浮腫及び網膜肥厚の一因となる網膜へのリポタンパク質の蓄積（硬性白斑）である。この過程が続くと、網膜の神経節細胞が失われて視力低下又は失明を引き起こす。内皮細胞中の血管系の変化、周辺細胞の破壊、及び毛細血管の閉塞がもたらした破壊した自己調節能及び減少した血流は、ＤＲ進行のマーカーであって、網膜虚血の発生を引き起こし、これがより重篤な、ＤＲの増殖性ステージへの進行を可能にする。
【００６９】
増殖性ＤＲは、網膜の視神経乳頭又はその他の場所の網膜虚血が引き起こした新血管形成又は血管形成を包含する。この新しい血管系は硝子体液の出血及び随伴する収縮性繊維組織から網膜剥離を引き起こす。
【００７０】
この糖尿病網膜症の進行の間の任意の時点で、黄斑浮腫又は糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）が進行して、視力機能に重大な影響を及ぼす。この関連疾患の進行は網膜血管漏出によって予測されて、失明の危険性を減らすために光凝固治療につながる。糖尿網膜症患者の大部分がこの疾患にも罹っているので、これは関連する臨床的に介入すべき標的である。これら全ての損傷又は変性障害は、機能障害又は視力の完全な喪失をもたらして、治療的な介入の標的を提供する。効率的な治療の選択肢は、現在のところ入手できない。レーザー光凝固は眼の様々な領域にレーザー光を投与することを含んでいて、新血管形成に関連している多くの疾患の治療に用いられている。特に、新血管形成は一般に散乱又は汎網膜光凝固で治療される。しかしながら、レーザー治療は治療した領域に対応した永久盲点を引き起こすかもしれない。レーザー治療は持続的な又は再発性の出血を引き起こし、網膜剥離の危険性を増大し、或いは新血管形成又は線維症も引き起こすかもしれない。眼に関連する疾患に関するその他の選択肢は、温熱療法、硝子体切除、光力学治療、放射線治療、手術、例えば、過剰な眼組織の切除などを包含する。しかしながら、殆どの場合、全ての利用可能な治療選択肢は、限られた治療効果を有し、反復治療を必要とし、費用のかかる処置であり、そして／又は危険な副作用と関連している。
【００７１】
多くの種類の網膜症は、多くの場合、新血管形成又は血管の過剰生育に起因して増殖性である。血管形成は、特に黄斑が影響を受けているときに、失明又は重篤な視力低下をもたらす。ある希なケースでは、網膜症は網膜色素変性症のような遺伝性疾患に起因しているだろう。眼の糖尿病合併症と関連しているその他の治療的な介入では、硝子体切除術が用いられる。グルココルチコイドステロイドであるデキサメタゾンは、非糖尿病患者に比べて糖尿病患者において増進する手術後炎症を減少するのに有用であることが示されている。従って、本発明の方法をデキサメタゾンと併用して実施することが望ましい。
【００７２】
例えば、ＣＹＰ２Ｊ２の阻害剤と共にＣＹＰ２Ｃ８の阻害剤（例えば、モンテルカスト、フェノフィブラート又は別のもの）を投与することを含んでいる併用治療も考えられる。ＣＹＰ２Ｊ２の例は、テルミサルタン、フルナリジン、アモジアキン、ニカルジピン、ミベフラジル、ノルフロキサシン、ニフェジピン、ニモジピン、ベンズブロマロン、ハロペリドール、メトプロロール（Ｍｅｔｏｐｔｏｌｏｌ）、トリアムシノロン、ペルフェナジン（Ｐｅｒｐｈｅｎａｚｉｎ）、ベプリジル（Ｂｅｐｒｉｄｉｌ）、クロザピン（Ｃｌｏｚａｐｉｎｅ）、セルトラリン、チクロピジン（Ｔｉｃｒｏｐｉｄｉｎｅ）、ベラパミル（Ｖｅｒａｐａｍｉｌ）、クロロプロマジン（Ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ）及びセフトリアキソン（Ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅ）を含んでいる（Ren et al. Drug Metab. Dispos. 41: 60-71 を参照されたい）。
【００７３】
眼の糖尿病性合併症と関連している別の治療的な介入は、光力学療法を閉塞又は漏出を改善するために利用できるが、これは糖尿病患者において過剰な炎症を引き起こしうる。レーザー光凝固治療を閉塞又は漏出を改善するために利用できるが、これは糖尿病患者において過剰な炎症を引き起こしうる。従って、シトクロムＰ４５０ ２Ｃ８（ＣＹＰ２Ｃ８）活性又は発現の阻害剤の治療有効量を光力学療法と併用して用いることが望ましい。本発明のシトクロムＰ４５０ ２Ｃ８（ＣＹＰ２Ｃ８）活性又は発現の阻害剤の治療有効量をこの療法の前に投与できる。
【００７４】
ＤＭＥの人は、視力低下の原因となることが多い白内障発生の危険性が高い。糖尿病患者は白内障手術に続く前眼部及び後眼部両方の合併症の危険性が高い。これらのうち最も著名なものは、血管新生緑内障に進展するような虹彩の新血管形成である。その他の前記合併症は、新たに移植した眼内レンズ（ＩＯＬ）の表面上に沈殿物を有する色素分散、前眼部における繊維性浸出液又は膜の形成（炎症由来）を包含する。本発明のある実施態様では、ＤＭＥ患者の眼における白内障手術に続く前眼部又は後眼部合併症を減らすことは、シトクロムＰ４５０ ２Ｃ８（ＣＹＰ２Ｃ８）活性又は発現の阻害剤を、それを必要としている対象に投与することによって達成される。ある実施態様では、健常人と比べて白内障発生の危険性が高いＤＭＥ患者にシトクロムＰ４５０ ２Ｃ８（ＣＹＰ２Ｃ８）活性又は発現の阻害剤を予防的に投与し、それによって白内障の発生を減少又は予防するために方法が提供される。
【００７５】
本発明の方法によって、例えば、シトクロムＰ４５０ ２Ｃ８（ＣＹＰ２Ｃ８）活性又は発現の阻害剤の治療有効量を対象に投与することによって、治療できるそのような他の疾患又は障害は、血管形成又は新血管形成によって特徴付けられる疾患を包含する。例えば、細胞増殖の阻害がこれらの又はその他の疾患の治療における望ましいゴールである、眼及び乾癬を含んでいる増殖性疾患、アテローム性動脈硬化及び関節リウマチのような細胞の増殖を特徴としている各種の炎症性疾患である。ある特定の例では、血管形成及び増殖の両方を予防することは、例えば、固形癌の治療に有効であろう。ここでは増殖異常細胞及びそれによって誘発される改善された腫瘍血管系の両方が本発明の治療薬による阻害の標的である。いずれにしても、増殖を促進又は阻害するための治療は、局所的には特定の期間で有効であるが全身的には無効であって、増殖調節治療を適切に適用しなければならない。本発明は、特定の効果を達成するために、罹患した組織及び臓器へのこのような化合物の局所的送達を包含している。
【００７６】
本発明に従って治療できる癌、腫瘍、悪性腫瘍、新生物、及びその他の増殖異常疾患の制限のない例は、骨髄性及びリンパ性白血病のような白血病、リンパ腫、骨髄増殖性疾患、及び、これに限定されないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィリムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫のような、固形癌を包含する。
【００７７】
上記のように、糖尿病網膜症の結果としての眼の硝子体液での血管新生は失明の主因であって、このような血管新生の阻害が望ましい。血管新生が望ましくないその他の疾患は、ある特定の慢性炎症性疾患、特に炎症性の関節及び皮膚疾患を包含するが、増殖反応が生じてそれが病気の一部又は全ての原因となるその他の炎症性疾患も包含する。例えば、乾癬は、皮膚乳頭における顕著な表皮過形成及び新血管形成によって特徴付けられる一般的な炎症性皮膚疾患である。成長因子の結果と思われる、平滑筋細胞の増殖は、幾つかの例を挙げると、心筋虚血、狭心症、心筋梗塞、及び脳卒中の原因である、アテローム性動脈硬化症におけるマクロ血管系の狭窄及び閉塞の要因である。末梢血管障害及び閉塞性動脈硬化症は炎症性成分を含んでいる。
【００７８】
本発明の幾つかの実施態様では、対象はポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）強化食、及びとりわけω３−ＰＵＦＡ強化食を食べている。ポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）はその骨格に一つ以上の二重結合を含んでいる脂肪酸である。ポリ不飽和脂肪酸はそれらの化学構造、オメガ−３、オメガ−６及びオメガ−９によって幾つかのグループに分類される。典型的なオメガ−３脂肪酸は、これに限定されないが、ヘキサデカトリエン酸（ＨＴＡ）、アルファ−リノレン酸（ＡＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサトリエン酸（ＥＴＥ）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、ティムドン酸）、へネイコサペンタエン酸（ＨＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、クルパノドン酸）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、セルボン酸）、テトラコサペンタエン酸、及びテトラコサヘキサエン酸（ニシン酸）を包含する。典型的なオメガ−６脂肪酸は、これに限定されないが、リノール酸、ガンマ−リノール酸（ＧＬＡ）、エイコサジエン酸、ジホモ−ガンマ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）、アラキドン酸（ＡＡ）、ドコサジエン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸（オズボンド酸）、テトラコサテトラエン酸及びテトラコサペンタエン酸を包含する。典型的なオメガ−９脂肪酸は、これに限定されないが、オレイン酸、エイコサエン酸、ミード酸、エルカ酸及びネルボン酸を包含する。
【００７９】
本発明の幾つかの実施態様では、シトクロムＰ４５０ ２Ｃ８（ＣＹＰ２Ｃ８）活性又は発現の阻害剤又は可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）活性又は発現の促進剤の治療有効量を用いる治療方法に診断検査が含まれる。一実施態様では、糖尿病網膜症に対する診断検査を実施して疾患の診断がなされた後に、本明細書に記載されているようなシトクロムＰ４５０ ２Ｃ８（ＣＹＰ２Ｃ８）活性又は発現の阻害剤又は可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）活性又は発現の促進剤を対象に投与する。本発明のある実施態様では、診断検査は対象の眼を画像化して又は対象の眼の生体試料を分析して行われる。
【００８０】
（投与）
本発明の実施態様の幾つかでは、治療薬、例えば、シトクロムＰ４５０ ２Ｃ８（ＣＹＰ２Ｃ８）活性又は発現の阻害剤の治療有効量、又は可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）活性又は発現の促進剤の治療有効量は、局所に、経口で、眼周囲に、眼球内に、注射によって、経鼻的に、エアゾールを用いて、挿入によって、埋め込みデバイスによって、或いは滴下して投与される。本発明の別の実施態様では、治療薬を、脂肪滴、洗浄液、霧状液、ゲル、軟膏、エアゾール、スプレー、重合体ミクロ又はナノ粒子、溶液、懸濁液、固体、生分解性マトリックス、粉末、結晶、泡又はリポソームである担体賦形剤の中に入れて投与する。本発明の実施態様の幾つかでは、当該治療薬の治療有効量を局所又は全身送達によって当該対象の眼に送達する。本発明の実施態様の幾つかでは、注射投与は眼内に又は眼周囲に行う。本発明のある実施態様では、投与は当該化合物のゲル、クリーム、粉末、泡剤、結晶、リポソーム、スプレー、重合体ミクロ又はナノスフェア、又は液体懸濁剤形態の眼内滴下剤を投与することによって達成される。ある実施態様では、重合体ミクロ又はナノスフェアが、眼内又は眼周囲注射又は移植によって治療薬を送達するために用いられる。
【００８１】
実施態様の幾つかでは、治療薬の治療有効量が局所又は全身送達によって対象の眼に送達される。
【００８２】
本発明の実施態様の幾つかでは、治療薬を、脂肪滴、洗浄液、霧状液、ゲル、軟膏、エアゾール、スプレー、重合体ミクロ又はナノ粒子、溶液、懸濁液、固体、生分解性マトリックス、粉末、結晶、泡又はリポソームである担体賦形剤の中に入れてで投与する。本発明の実施態様の幾つかでは、局所投与は、ポンプ−カテーテルシステム、挿入、連続又は選択的放出デバイス、生体吸収性移植片、連続又は持続性放出製剤、及びコンタクトレンズよりなる群から選ばれるデバイスを介する、当該化合物の当該眼への点滴を含んでいる。本発明の実施態様の幾つかでは、注射投与は眼内に、硝子体内に、眼周囲に、皮下に、結膜下に、眼球後に、又は前房内に行われる。徐放性製剤も本発明の実施態様の幾つかに提供される。本発明のある実施態様では、本発明の化合物プロドラッグとして製剤化されている。本発明のある実施態様では、治療薬の製剤は保存料を含んでいない。本発明のある実施態様では、治療薬の製剤は少なくとも１つの保存料を含んでいる。本発明のある実施態様では、治療薬の製剤は増粘剤を含んでいる。本発明の別の実施態様では、治療薬の製剤はミクロ又はナノ粒子を用いている。
【００８３】
化合物は、熟練した臨床医によって効果があると決定された眼内又は網膜濃度をもたらすのに十分な量、例えば、約１×１０−８〜約１×１０−１モル／リットルの眼内又は網膜濃度をもたらすのに十分な量で対象に投与される。本発明のある実施態様では、化合物は少なくとも１年に１回投与される。本発明の別の実施態様では、化合物は少なくとも１日に１回投与される。本発明の別の実施態様では、化合物は少なくとも１週間に１回投与される。本発明の別の実施態様では、化合物は少なくとも１ケ月に１回投与される。
【００８４】
ＣＹＰ２Ｃ８及び／又はその他のＣＹＰに対する阻害剤の対象へ投与する典型的な用量は、これに限定されないが、以下のものを含む。１〜２０ｍｇ／ｋｇ／日、２〜１５ｍｇ／ｋｇ／日、５〜１２ｍｇ／ｋｇ／日、１０ｍｇ／ｋｇ／日、１〜５００ｍｇ／ｋｇ／日、２〜２５０ｍｇ／ｋｇ／日、５〜１５０ｍｇ／ｋｇ／日、２０〜１２５ｍｇ／ｋｇ／日、５０〜１２０ｍｇ／ｋｇ／日、１００ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも１０ｕｇ／ｋｇ／日、少なくとも１００ｕｇ／ｋｇ／日、少なくとも２５０ｕｇ／ｋｇ／日、少なくとも５００ｕｇ／ｋｇ／日、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも２ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも５ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも５０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも７５ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも１００ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも２００ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも５００ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも１ｇ／ｋｇ／日、並びに５００ｍｇ／ｋｇ／日未満、２００ｍｇ／ｋｇ／日未満、１００ｍｇ／ｋｇ／日未満、５０ｍｇ／ｋｇ／日未満、２０ｍｇ／ｋｇ／日未満、１０ｍｇ／ｋｇ／日未満、５ｍｇ／ｋｇ／日、２ｍｇ／ｋｇ／日未満、１ｍｇ／ｋｇ／日未満、５００ｕｇ／ｋｇ／日未満、及び５００ｕｇ／ｋｇ／日未満である治療有効量。
【００８５】
本発明のある実施態様では、第二治療薬は、シトクロムＰ４５０ ２Ｃ８（ＣＹＰ２Ｃ８）活性又は発現の阻害剤の治療有効量或いは可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）活性又は発現の促進剤の治療有効量を投与する前に、併用して、同時に、又はその後に投与される。ある実施態様では、第二治療薬は、抗酸化剤、抗炎症薬、抗菌薬、ステロイド、プロテインキナーゼＣ阻害剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、抗血管新生薬、補体阻害薬、ＣＹＰ２Ｊ２阻害剤及び抗アポトーシス薬よりなる群から選ばれる。本発明のある実施態様では、第二治療薬は抗体又は抗体断片である。
【００８６】
この後の代表的な実施例は発明を説明するのに役立つことを意図していて、本発明の範囲を限定することを意図しておらず、そのように理解してはならない。実際、本明細書に示して記載したものに加えて、本発明の多様な変更及びそれらの多くのさらなる実施態様は、以下の実施例及び本明細書で引用した科学及び特許文献への参照を含んでいる、本文書の全内容から当業者に明らかとなるだろう。これらの引用文献の内容が技術水準を説明するのに役立つように参照により本明細書に取り込まれていることをさらに理解されたい。
【実施例】
【００８７】
本明細書に記載されているものはＣＹＰ２Ｃ８由来の新規ω３ＰＵＦＡ代謝物であって、これは新血管形成を促進する。これらの結果は、ω３ＰＵＦＡ強化食は全体としては網膜内の新血管形成を阻害するが、ＣＹＰ２Ｃ８を阻害することが、どちらも必須の食事由来の酸であるω３ＰＵＦＡ及びω６ＰＵＦＡに由来する血管新生促進代謝物の産生を阻害できるので、ＣＹＰ２Ｃ８の阻害は網膜症治療に対して新規で魅力的な標的を提供できる。
【００８８】
本明細書に記載されている結果は、部分的に、ＣＹＰ２Ｃ８由来のω３ＰＵＦＡ代謝物１４，１５−ＥＤＰの血管新生促進的役割、及び可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）の血管新生阻害的役割が、本明細書で最初に明らかにされたように、エポキシゲナーゼ経路を介する１４，１５−ＥＤＰの分解を増大することによって主に達成されることを明らかにしている。本明細書に記載されている結果は、網膜症における血管形成に影響を及ぼす活性代謝物の産生と分解の両方を考慮することの重要性を明らかにしている。本明細書に記載されている結果は、ＣＹＰ２Ｃ８が、ω６ＰＵＦＡ（１４，１５−ＥＥＴ）及びω３ＰＵＦＡ（１４，１５−ＥＤＰ）の両方からの血管新生促進網膜症促進代謝物を産生することも明らかにし、これは網膜症治療−ＣＹＰ２Ｃ８の阻害のための興味深い治療標的を示す。さらに、本明細書に記載されている結果は、網膜において、血液循環に由来するＣＹＰ２Ｃ８陽性細胞及び代謝物が、血管新生促進１４，１５−ＥＤＰ（及び１４，１５−ＥＥＴ）の増大したレベルを引き起こしていることを示した。ＣＹＰ２Ｃ８の起源である白血球は、以前に決して示されていなかった。
【００８９】
網膜症における病的な新血管形成は失明の主な原因である。効果的な治療を見いだすことが重要である。オメガ−３ポリ不飽和脂肪酸（ω３ＰＵＦＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）は、動物及び臨床試験１、２において、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）及びリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）の活性代謝物を介して網膜症の進展を予防する２、３。シトクロムＰ４５０ｓ（ＣＹＰｓ）もω３ＰＵＦＡ及びω６ＰＵＦＡの両方をエポキシドに代謝し、これはさらに可溶性エポキシドヒドロラーゼによって加水分解されて活性が低いトランス−ジヒドロジオール（ジオール）を形成するので、ＰＵＦＡエポキシドの生物学的作用を減退させる（図１Ａ）４、５。従って、活性代謝物を生成する酵素（ＣＹＰ２Ｃ）及びそれらを分解する酵素（ｓＥＨ）の両方の役割を解明すること、及びそれらの網膜症に対する影響を理解することが重要である。
【００９０】
ヒトにおける優性エポキシゲナーゼであるＣＹＰ２Ｃ８は、網膜症の進展における重要な因子である低酸素症によって誘発される６。ｓＥＨは心臓血管疾患に関わっていて８、ＥＣｓで発現される７ので、血管新生を直接制御できる。
【００９１】
アラキドン酸（ＡＡ）からＣＹＰ２Ｃ８によって合成されたω６ＰＵＦＡ由来エポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴｓ）は血管形成を促進する１０にもかかわらず、ＣＹＰ２Ｃ８からのω３ＰＵＦＡ由来エポキシ代謝物であるＤＨＡ由来エポキシドコサペンタエン酸（ＥＤＰｓ）、及びＥＰＡ由来エポキシエイコサテトラエン酸（ＥＥＱｓ）の網膜症への血管形成効果は知られていない。しかしながら、両者は強力な血管拡張及び心臓保護作用を示し１１、ＥＤＰは腫瘍においてＥＣの遊走及び血管新生を抑制することが示唆された１２。
【００９２】
本明細書に記載された実験において、ＯＩＲにおけるＣＹＰ２Ｃ８及びそのω３ＰＵＦＡ代謝物の役割を、内皮細胞（ＥＣ）及び単球／マクロファージに特異的なＣＹＰ２Ｃ８とｓＥＨを過剰発現するマウス（Ｔｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８−Ｔｇ、Ｔｉｅ２−ｓＥＨ−Ｔｇ）、並びにｓＥＨ欠損生殖系（ｓＥＨ−／−）及びω３ＰＵＦＡ強化食を食べているそれらの野生型（ＷＴ）同腹仔を用いて検討した。ω６ＰＵＦＡ由来のＣＹＰ２Ｃ８及びｓＥＨ代謝物も試験した。
【００９３】
実施例１．酸素正常状態（ｎｏｒｍｏｘｉａ）と酸素誘発網膜症（ＯＩＲ）におけるＣＹＰ２Ｃ、ｓＥＨ及びそれらの代謝物の発現
マウスのＣＹＰ２Ｃ８同族体（ＣＹＰ２Ｃ）陽性細胞が、酸素正常状態の網膜の血管腔内（図１Ｂ及びＣ）及びＰ１７のＯＩＲ網膜の血管外で見出され、それらは漏洩血管からの単球／マクロファージの遊走と一致した（図１Ｂ）。Ｆ４／８０−陽性マクロファージもＯＩＲにおいてＣＹＰ２Ｃを発現することが確認された（図１Ｄ）。病的な血管新生及び神経組織がＯＩＲにおいてｓＥＨを発現することが確認された（図１Ｅ）。ＣＹＰ２Ｃ−陽性白血球がＷＴ酸素正常状態マウス由来の血液細胞内に検出された（図１Ｆ）。ＣＹＰ２ＣのｍＲＮＡレベルは全血中で最も高く、そして灌流網膜に対して灌流していないものでは劇的に高いことが確認されて、正常な網膜のＣＹＰ２Ｃは血液細胞に由来していることが示唆された（図１Ｇ）。
【００９４】
ＣＹＰ２ＣはＯＩＲ中に網膜に誘発される（ｍＲＮＡとタンパク質の両方）のに対して、ｓＥＨは抑制されたことを確認した（ｐ＜０．０５；図１Ｈ及びＩ）。増大する血管漏出に伴うＣＹＰ２Ｃを発現するマクロファージの補充は、ＯＩＲの網膜において増大したＣＹＰ２Ｃの一因となり得る。Ｐ１４（正常食）における正常酸素状態に対するＯＩＲでは、網膜のＤＨＡとＡＡのエポキシド：ジオール比は、増大したＣＹＰ２Ｃと減少したｓＥＨレベルと一致して、２倍以上増大した（１４，１５−ＥＥＴ：１４，１５−ＤＨＥＴ（ｐ＝０．００７３）及び１９，２０−ＥＤＰ：１９，２０−ＤｉＨＤＰＡ（ｐ＝０．０１７））（図１Ｊ）。
【００９５】
実施例２．Ｔｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８−Ｔｇ、Ｔｉｅ２−ｓＥＨ−Ｔｇ及びｓＥＨ−／−マウスを用いるω３ＰＵＦＡ食の網膜症及びＶＥＧＦ発現に及ぼす影響
ω３ＰＵＦＡ食中の、Ｔｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８−Ｔｇ（ＣＹＰ２Ｃ８過剰発現）マウスはＷＴよりより多くのＯＩＲ−新血管形成を進展させた（全網膜面積の７．６０±０．２９対６．４０±０．３３％、ｐ＝０．０１４）（図２Ａ）。これに対して、Ｔｉｅ２−ｓＥＨ−Ｔｇ網膜はＷＴに対してより少ない新血管形成を進展させた（４．６７±０．３４対６．５９±０．３８％、ｐ＝０．００２７；図２Ｂ）。恐らくＯＩＲにおいて既に確立している低いｓＥＨ発現レベルを反映して（図１Ｆ）、ｓＥＨの生殖系欠損（ｓＥＨ−／−）はＷＴと比べて、新血管形成にさらに影響を及ぼさなかった（７．３９±０．３４対７．３５±０．３２％、ｐ＝０．９５；図２Ｃ）。
【００９６】
ω３ＰＵＦＡ食餌を用いると、Ｔｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８−Ｔｇ ＯＩＲマウスはＷＴより２．６倍多くＶＥＧＦ−Ａを発現した（ｐ＝０.０１１）のに対して、Ｔｉｅ２−ｓＥＨ−Ｔｇは５７％少なくＶＥＧＦ−Ａを発現した（ｐ＝０．０３０）。ＶＥＧＦ−Ｃレベルに有意な差は検出されなかった（図２Ｄ及びＥ）。
【００９７】
実施例３．ＯＩＲにおいてω３ＰＵＦＡ食餌を用いると、血漿のエポキシレベル及び網膜のエポキシド：ジオール比を、Ｔｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８−Ｔｇは増大したのに対して、Ｔｉｅ２−ｓＥＨ−Ｔｇは減少した
ＯＩＲにおいて、ω３ＰＵＦＡ食のＴｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８−Ｔｇマウスは、ＷＴと比べて、６０％多い１９，２０−ＥＤＰ（ｐ＝０．０２９）及び４７％多い１７，１８−ＥＥＱ（ｐ＝０．０３０）を有していると評価された。このようなサンプルにおいて１９，２０−ＥＤＰの濃度は１７，１８−ＥＥＱより３０倍高かった（図３Ａ）。Ｔｉｅ２−ｓＥＨ−Ｔｇマウスにおいて、１９，２０−ＥＤＰ及び１７，１８−ＥＥＱのレベルは３４％（ｐ＝０．０３４）及び２４％（ｐ＝０．０１６）減少した。１４，１５−ＥＥＴレベルは１６％減少した（ｐ＝０．０２９；図３Ｂ）。
【００９８】
ＯＩＲにおいて、ω３ＰＵＦＡ食のＴｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８−Ｔｇの網膜はＷＴより５２％高い１９，２０−ＥＤＰ：ＤｉＨＤＰＡ比を有し（ｐ＝０．０４５）、１７，１８−ＥＥＱ：１７，１８−ＤＨＥＴ比は変わらなかった（図３Ｃ）。ω３ＰＵＦＡ食のＴｉｅ２−ｓＥＨ−Ｔｇの網膜において１９，２０−ＥＤＰ：ＤｉＨＤＰＡ比は５８％減少し（ｐ＝０．０２８）、１７，１８−ＥＥＱ：１７，１８−ＤＨＥＴ比は変わらなかった。１４，１５−ＥＥＴ：１４，１５−ＤＨＥＴ比は６０％減少した（ｐ０．０４３；図３Ｄ）。
【００９９】
実施例４．Ｔｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８−Ｔｇ大動脈輪起因の血管発芽はＡＡ又はＤＨＡと共に増大して、Ｔｉｅ２−ｓＥＨ−Ｔｇでの出芽は１９，２０−ＥＤＰによって阻害される
血管新生に対するＣＹＰ２Ｃ８由来の血管新生促進効果及びω３ＰＵＦＡ代謝物で処理したｓＥＨの抗血管新生効果を大動脈輪発芽アッセイで確認した。３０μＭのＡＡ（対３０μＭのＤＨＡ）はＷＴにおいて大動脈発芽を促進し（ｐ＝０．０１）、これはＴｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８−Ｔｇにおいて消失した。ＷＴに対してＴｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８−ＴｇはＤＨＡ処置による発芽を増大した（ｐ＝０．４３；図４Ａ）。ＷＴに対して１９，２０−ＥＤＰで処置したＴｉｅ２−ｓＥＨ−Ｔｇ大動脈輪からの５０％少ない発芽とは（ｐ＜０．０１；図４Ｂ）対照的に、１７，１８−ＥＥＱで処置したＷＴ、Ｔｉｅ２−ｓＥＨ−Ｔｇ及びｓＥＨ−／−の大動脈輪発芽の間に差はなかった。これらの結果はＴｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８−Ｔｇがω３ＰＵＦＡと一体になって血管新生を促進したことを裏付けて、Ｔｉｅ２−ｓＥＨ−Ｔｇにおける減少した新血管形成は、過剰発現したｓＥＨによる１９，２０−ＥＤＰの加速された分解に直接起因していることを示唆した。
【０１００】
実施例５．ＯＩＲにおいて、ω６ＰＵＦＡ食はＴｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８−Ｔｇマウスにおける新血管形成を増大した
ω６ＰＵＦＡ食によって、Ｔｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８−ＴｇはＷＴと比べてＯＩＲ−新血管形成を誘発した（９．４５８±０．３４２５対８．２９１±０．３９７９、ｐ＝０．０３２）。対照的に、Ｔｉｅ２−ｓＥＨ−Ｔｇ又はｓＥＨ−／−では差が見いだされなかった（図５）。血漿の１４，１５−ＥＥＴレベル及び網膜の１４，１５−ＥＥＴ：１４，１５−ＤＨＥＴ比は、増大した新血管形成と一致して、ＷＴと比べてＴｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８−Ｔｇにおいて増大した（図６Ａ〜Ｄ）。１４，１５−ＥＥＴ処置による大動脈輪発芽はＴｉｅ２−ｓＥＨ−Ｔｇ、ｓＥＨ−／−及びＷＴマウスで観察されたものと同様であった（図６Ｅ）。
【０１０１】
実施例６．治療的に有効なＣＹＰ２Ｃ８阻害剤としてのフェノフィブラートの同定
フェノフィブラートは、以前はペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アルファ（ＰＰＡＲα）の活性化を介して脂質レベルを減少するコレステロール低下剤として記載されていた。具体的には、ＰＰＡＲαは活性リポプロテインリパーゼを活性化し、アポプロテインＣＩＩＩを減少して、増大した脂肪分解及び血漿からトリグリセリド高含有粒子の除去をもたらすと記載されている（Staels et al. Circulation 98: 2088-93)。網膜の血管障害の治療薬としてのフェノフィブラートの有効性及びメカニズムを試験するために、フェノフィブラートを以下に詳細に述べるように、マウスに強制経口投与（ＧＶ）して、酸素誘発網膜症（これはＣｙｐ２Ｃ８Ｔｇマウスで増大している）における新血管形成（ＮＶ）の、Ｃｙｐ２Ｃ８活性の阻害を介する、抑制剤としてフェノフィブラートの同定をもたらした。
【０１０２】
図７に示したように、正常食を食べているＪＡＸマウス（ＷＴ）に強制経口投与（ＧＶ）によってフェノフィブラートを投与すると、統計的に有意なように新血管形成が減少していることが観察された。特に、フェノフィブラートの低い濃度（１０ｍｇ／ｋｇ／日ＧＶ）及び高い濃度（１００ｍｇ／ｋｇ／日ＧＶ）の両方がこのようなマウスにおける新血管形成（ＮＶ）の有意な減少を生じたことが観察された。ＰＰＡＲαに関連する効果がフェノフィブラートの高用量においてのみ誘発されると期待していたので、低用量フェノフィブラートの新血管形成に対する効果は意外であって、新血管形成におけるフェノフィブラートに対してＰＰＡＲα非依存性の作用機作を暗示した。
【０１０３】
フェノフィブラートの少なくとも幾つかの効果が実際にＰＰＡＲα非依存性であったか否かを確認するために、フェノフィブラートを投与したＰＰＡＲα欠損マウスにおいて新血管形成の阻害を評価した。図８に示すように、ＪＡＸ（ＷＴ）マウスで観察されたものと同様な結果がＰＰＡＲα欠損マウスにおいて観察された。具体的には、フェノフィブラートの低レベル（１０ｍｇ／ｋｇ／日ＧＶ）及び高レベル（１００ｍｇ／ｋｇ／日ＧＶ）の両方が正常食のＰＰＡＲα欠損マウスにおいて新血管形成（ＮＶ）の有意な減少を生じたことが観察された。従って、ＮＶを阻害するフェノフィブラートの観察された効果はＰＰＡＲα非依存性であることが確認された。
【０１０４】
フェノフィブラートがＮＶを減少するためにＣＹＰ２Ｃ８の調節を介して作用しているのか否かを試験するために、ＣＹＰ２Ｃ８を過剰に発現しているマウス（Ｃｙｐ２Ｃ８遺伝子組み換えマウス、「Ｃｙｐ２Ｃ８Ｔｇ」）にフェノフィブラートを投与することの影響を試験した。図９に示したように、低用量のフェノフィブラート（１０ｍｇ／ｋｇ／日ＧＶ）を投与したマウスで観察されたＮＶが減少した範囲の大きさは、対応するＷＴマウスにおいて観察された減少した大きさと比べて、ＣＹＰ２Ｃ８を過剰に発現しているマウスにおいて増強された。同様な結果（ＣＹＰ２Ｃ８を過剰に発現しているマウスにおいてＮＶの阻害が増強される）がω３（ｎ３）又はω６（ｎ６）を食べているマウスに対しても観察され、ω３及びω６経路の両方がＣＹＰ２Ｃ８依存性の結果に関連していたことを示唆している。
【０１０５】
フェノフィブラートに関して観察された効果のメカニズムを大動脈輪発芽アッセイでさらに試験した。図１０に示したように、フェノフィブリン酸（ＦＡ、フェノフィブラートの活性代謝物）はＷＴ及びＣｙｐ２Ｃ８Ｔｇマウスの両方に由来する大動脈輪の発芽を阻害することが観察された。この結果がＦＡによるＣｙｐ２Ｃ８の阻害に起因していることと一致して、１９，２０−ＥＤＰ（以下の図２２に示したように、ＤＨＡのＣＹＰ２Ｃ８の代謝後産物）によってこの阻害が部分的に回復した。実際に、図１１に示したように、この大動脈輪発芽のＦＡ阻害の回復が、１９，２０−ＥＤＰではなく、ＤＨＡを投与したときに観察され、ＣＹＰ２Ｃ８阻害剤としてのＦＡの作用によって阻害されたＮＶ／大動脈輪生育過程におけるＣＹＰ２Ｃ８の代謝後産物の関与−及びＣｙｐ２Ｃ８酵素の阻害を示唆していた。
【０１０６】
さらに、図１２に示したように、ＷＴ及びＣｙｐ２Ｃ８ＴＧマウスの両方において大動脈輪発芽を阻害するＦＡ作用の効果を、ＰＰＡＲα阻害剤であるＧＷ６４７１を試験して、大動脈輪発芽に対する観察されたＦＡの効果への影響がないことを見出したときに、ＰＰＡＲα非依存性として確認した。
【０１０７】
フェノフィブラートの新血管形成（ＮＶ）を減少する効果及び大動脈輪発芽を減少する効果を確認して、次にヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を小管形成に対する効果の対応系列について試験した。図１３に示したように、ＦＡがＨＲＭＥＣ小管形成を阻害して、この効果は、上記図１０においてＦＡ及び大動脈輪アッセイについて記載されているように、１９，２０−ＥＤＰによって部分的に回復することが観察された。これらの結果を定量化して棒グラフとして図１４に示す。ここで、１９，２０−ＥＤＰ（ＣＹＰ２Ｃ８のオメガ３代謝物）は、ＦＡによるＨＲＭＥＣの小管形成の阻害を部分的に回復する。図１５に示したように、ＤＨＡと同種のものがフェノフィブラートについて観察された大動脈輪発芽効果を回復できないことが確認され、ＣＹＰ２Ｃ８の上流の他の化合物、ｗ３ＬＣＰＵＦＡが、ＦＡによるＨＲＭＥＣ小管形成の阻害を回復できないことが見出された。図１６に、このような実験の結果を定量化して棒グラフ形式で示した。
【０１０８】
図１７及び１８に示したように、ＰＰＡＲα阻害剤ＧＷ６４７１を試験して、ＨＲＭＥＣ小管形成に対する観察されたフェノフィブラートの効果に影響を及ぼさないことが見出されたときに、フェノフィブラートはＰＰＡＲα非依存である方法でＨＲＭＥＣ小管形成を阻害することが確認された。
【０１０９】
ＣＹＰ２Ｃ８酵素の上流化合物（ＤＨＡ、ＥＰＡ、ｗ３ＬＣＰＵＦＡ）と対照的に、ＣＹＰ２Ｃ８酵素の下流化合物は少なくとも部分的に回復する特性を有しているかの確認が継続された。図１９において、１９，２０ＥＤＰ及び１７，１８ＥＥＱ（ＥＰＡ及びＣＹＰ２Ｃ８の下流化合物−図２２を参照されたい）は、ＦＡによるＨＲＭＥＣ遊走の阻害を部分的に回復することが確認された。図２０において、ｗ３ＬＣＰＵＦＡはＦＡによるＨＲＭＥＣ遊走の阻害を回復できないことが確認された。図２１において、ＰＰＡＲα阻害剤ＧＷ６４７１を試験してＨＲＭＥＣ遊走に対する観察されたフェノフィブラートの効果に影響を及ぼさないことが見出されたときに、ＨＲＭＥＣ遊走のＦＡ阻害はＰＰＡＲα非依存性であることが観察された。図２２はω３及びω６経路内のフェノフィブラート／ＦＡの推定作用部位を示す。
【０１１０】
実施例７．治療的に有効なＣＹＰ２Ｃ８阻害剤としてのモンテルカストの同定
モンテルカストは、対象の喘息の維持療法に、そして季節性アレルギーの症状を軽減するために既に用いられているロイコトリエン受容体拮抗薬（ＬＴＲＡ）である（Lipkowitz et al. The Encyclopedia of Allergies (2nd ed.)）。モンテルカストは口から服用するための錠剤、チュアブル錠、及び顆粒になり、通常食事と共に又は食事なしで１日１回服用する。モンテルカストは当初ＣｙｓＬＴ１拮抗薬と認識されており、肺及び気管支内でシステイニルロイコトリエン受容体ＣｙｓＬＴ１に対するロイコトリエンＤ４（及び第２リガンドＬＴＣ４及びＬＴＥ４）の作用をそれに結合することによって阻害する。理論に縛られることを望むものではないが、これは気管支収縮を減少するか、さもなければロイコトリエンに起因して、より少ない炎症をもたらすと考えられる。
【０１１１】
この実施例において、モンテルカストは、上記フェノフィブラートに関して観察されたものと類似した効果を有して、ＣＹＰ２Ｃ８の阻害剤として働くことが新たに確認された。具体的には、図２３に示したように、正常食を摂っているＪＡＸマウス（ＷＴ）にモンテルカストを投与すると、新血管形成が統計学的に有意であるように減少していることが観察された。
【０１１２】
図２４に示したように、ＣＹＰ２Ｃ８の調節によって生じるモンテルカストのＮＶを減少する作用を、ＣＹＰ２Ｃ８を過剰発現しているマウス（Ｃｙｐ２Ｃ８遺伝子組み換えマウス、「Ｃｙｐ２Ｃ８Ｔｇ」）にモンテルカストを投与することの影響を試験して確認した。上記フェノフィブラートのように、モンテルカストを投与された（１０ｍｇ／ｋｇ／日、ＧＶ）マウスで観察された新血管形成（ＮＶ）の減少規模の大きさは、対応するＷＴマウスで観察された減少の大きさと比べると、ＣＹＰ２Ｃ８を過剰発現したマウスで増大した。同様な結果（ＮＶの阻害がＣＹＰ２Ｃ８を過剰発現しているマウスで増大している）が、ω３（ｎ３）又はω６（ｎ６）を摂食しているマウスに関して観察され、ω３とω６の両経路がモンテルカストに関するこれらのＣＹＰ２Ｃ８に依存的な結果に関与していることを示唆している。
【０１１３】
ＨＲＭＥＣ小管形成に対するモンテルカストの効果がフェノフィブラートについて観察されたものとも類似している結果とともに、明確な用量反応曲線を示したことを図２５及び図２６が明らかにしたのに対して、図２７では、ＨＲＭＥＣ遊走が、明確な用量反応曲線を示すように、モンテルカストによって阻害されたことが観察された。従って、モンテルカストは試験した全てのアッセイにおいてフェノフィブラートと同様な効果を示し、モンテルカスト及びフェノフィブラートの両方がＣＹＰ２Ｃ８の治療に有効な阻害剤であったことを示唆している。
【０１１４】
追加のモンテルカスト試験において、上記のフェノフィブラートにおいて実施したものと類似している、大動脈輪アッセイも実施した。
【０１１５】
網膜症を治療する新規な手法を見出すことが重要である。ω３ＰＵＦＡ食は、概して、ＯＩＲにおいて、ＣＯＸ及びＬＯＸの抗血管形成代謝物を介して新血管形成を減少する。（Ｔｉｅ２に由来する）ＣＹＰ２Ｃ８の過剰発現が、ω３ＰＵＦＡ食の新血管形成を血漿ＤＨＡ由来の１９，２０−ＥＤＰ及び網膜の１９，２０−ＥＤＰ：ＤｉＨＤＰＡ比を増大して、最初に促進するという点で、ω３ＰＵＦＡの介在する網膜症におけるＣＹＰ２Ｃ８とｓＥＨの新規な役割が本明細書に記載されている。ＥＰＡ由来のＥＥＱ濃度は３０倍低い。ω３ＰＵＦＡ食を伴う、Ｔｉｅ２由来のｓＥＨ過剰発現は、血漿１９，２０−ＥＤＰ及び網膜の１９，２０−ＥＤＰ：ＤｉＨＤＰＡ比を減少させるばかりではなく、血管新生を促進するＡＡ由来の１４，１５−ＥＥＴのレベル及び網膜の１４，１５−ＥＥＴ：１４，１５−ＤＨＥＴ比も減少させることにより、新血管形成を減少する。野生型マウスでは、ＣＹＰ２Ｃ８が（最初にマクロファージと白血球で）誘発され、ｓＥＨがＯＩＲで減少し、１９，２０−ＥＤＰのレベルが増大する。
【０１１６】
最近の研究が、ＥＤＰがＶＥＧＦ−Ａに影響を与えずにＶＥＧＦ−Ｃを抑制することによってＥＣの遊走及び腫瘍の血管新生を阻害することを見出した１２。網膜において、増大したＶＥＧＦ−Ａが見出されたが、ω３ＰＵＦＡ食のＴｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８−ＴｇにＶＥＧＦ−Ｃ発現の変化は見られず、Ｔｉｅ２−ｓＥＨ−Ｔｇにおいて減少したＶＥＧＦ−Ａの発現が見出されて、それらのＯＩＲで観察された血管新生表現型と一致した。これらの結果はＡＡ、ＤＨＡ及びＥＰＡ代謝物並びに代謝酵素の間の複雑なクロストークを示唆している。ＣＹＰ２Ｃの過剰発現はＣＯＸ−２を誘発して１４、１４，１５−ＥＥＴの安定化は５−ＬＯＸの発現１５、全ての影響がある活性ＰＵＦＡ代謝物レベルを減少できる。さらに、１９，２０−ＥＤＰは、ＣＹＰ２Ｃ８及びｓＥＨの組織特異的発現に応じて異なった血管形成機能を有しているかもしれない。ＣＹＰ２Ｃ８を発現している心筋細胞は、心臓虚血／再灌流後の回復を促進する。しかしながら、ＣＹＰ２Ｃ８を発現しているＥＣは回復を遅らせる７。ＯＩＲの網膜では、白血球由来のＥＥＴは、白血球−ＥＣ接着を誘発して１６、Ｃｙｐ２Ｃ−陽性単球／マクロファージの浸潤を引き起こすことができる。ＣＯＸ、ＬＯＸ、及びＣＹＰ経路間の相互作用及び代謝物に関するさらなる検討が必要とされている。この結果は、新血管形成、大動脈弓生育並びにＨＲＭＥＣ微小管の形成及び遊走アッセイなどの、（他の疾患及び障害の中で特に）網膜症に対する治療的な影響を反映しているアッセイにおいて、Ｃｙｐ２Ｃ８阻害化合物であるモンテルカスト及びフェノフィブラートの能力を用い、そして観察して実証したように、Ｃｙｐ２Ｃ８の阻害がω３ＰＵＦＡ及びω６ＰＵＦＡ代謝物が誘発する網膜症を予防することを示唆している。
【０１１７】
方法
本明細書に記載されている実施例は、これに限定されないが、以下の方法を実施した。
【０１１８】
酸素誘発虚血性網膜症（ＯＩＲ）；ＰＵＦＡ食の治療介入；大動脈輪アッセイ
ＯＩＲのマウスモデルは記載されている１３。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを免疫組織化学、リアルタイムＰＣＲ、ウェスタンブロット、血液塗抹検査及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳオキシリピッド分析で分析した。Ｃｙｐ及びｓＥＨ突然変異マウスの母親にω３ＰＵＦＡ又はω６ＰＵＦＡ強化食を与え、次いで網膜血漿及び大動脈輪発芽をアッセイした。
【０１１９】
動物
全ての研究は、眼科及び視力研究における動物の使用（Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research）に関する視力及び眼科研究協会（Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO)）の声明を忠実に守っていて、ボストン小児病院動物愛護及び利用委員会（Children's Hospital Boston Animal Care and Use Committee）の承認を得た。内皮及び循環細胞に特異的なＣＹＰ２Ｃ８を（Ｔｉｅプロモーター主導で）過剰に発現する遺伝子組み換えマウス（Ｔｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８Ｔｇ）、内皮及び循環細胞に特異的なｓＥＨを（Ｔｉｅ２プロモーター主導で）過剰に発現する遺伝子組み換えマウス（Ｔｉｅ２−ｓＥＨＴｇ）、全身性ｓＥＨ欠損マウス（ｓＥＨ−／−）は Dr. Darryl C. Zeldin （ＮＩＨ／ＮＩＥＨＳ）から贈与され、野生型対照Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウス（保存番号０００６６４；Jackson Laboratory）がこの研究で用いられた。Ｔｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８Ｔｇの体重は６．６５±０．１７ｇ（平均値±標準誤差）であって、野生型同腹仔対照の体重は６．５０±０．０５ｇであった。Ｔｉｅ２−ｓＥＨＴｇの体重は６．８５±０．６２ｇであって、野生型同腹仔対照の体重は６．１０±０．６１ｇであった。ｓＥＨ−／−の体重は６．５０±０．１９ｇであって、野生型同腹仔対照の体重は６．８５±０．１５ｇであった。
【０１２０】
酸素誘発網膜症
酸素誘発網膜症のマウスモデルは既に記載されている（Smith et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 35: 101-111）。血管減少を誘発するために、出生後７日目（Ｐ７）からＰ１２まで７５％の酸素に暴露した。高酸素暴露による網膜中心血管閉塞は、新血管形成を引き起こす過剰な血管形成応答をもたらす。血管新生応答が最大になるＰ１７にアバーティン（Ａｖｅｒｔｉｎ、Sigma）の致死量をマウスに腹腔内投与した。
【０１２１】
免疫組織化学
野生型の酸素正常状態マウスと高酸素Ｐ１７マウスから摘出した眼球を４％のパラホルムアルデヒドに室温で１時間固定した。ホールマウントな免疫染色のために、網膜を摘出して、ＰＢＳ中の１％トリトンＸ−１００（Sigma、カタログ  Ｔ−８７８７）で２時間室温にて透過処理して、ウサギ抗マウスＣＹＰ２Ｃ（Abcam、カタログ ａｂ２２５９６、１：１００希釈）、ラット抗マウスＦ４／８０（Abcam、カタログ ａｂ６６４０、１：１００希釈）及びイソレクチンＢ４で、上記のように染色した。網膜の断面免疫染色のために、１時間固定後にレンズを取り除いた。眼杯を３０％のスクロース中、４℃で培養して、最適切断組織（Ｏｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｉｓｓｕｅ（ＯＣＴ））培地中に埋め込んだ。厚さが１０μｍの切片をＶｉｓｔａＶｉｓｉｏｎ Ｈｉｓｔｏｂｏｎｄ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｓｌｉｄｅ（VWR、カタログ１６００４−４０６）の上で切り取って、ＰＢＳ中で０．１％のトリトンＸ−１００及び５％のヒツジ血清でブロックした。切片をイソレクチンＢ４及び第一抗体ヒツジ抗マウスｓＥＨ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−２２３４４、１：２００希釈）、次いで第二抗体で染色した。網膜を４０倍の対物レンズ及び２倍のズームを用いるライカＳＰ２共焦点ライカで可視化した。ホールマウントに関しては、多数の化学断片を０．１６ミクロン間隔で採取し、編集してＶｅｌｏｃｉｔｙソフトウェアを用いてＹＺ平面の三次元画像を再構築した。
【０１２２】
ＲＮＡ単離及びｃＤＮＡ調製
数時点にそれぞれが異腹仔由来の６匹のマウスの網膜から全ＲＮＡを抽出し、生物学的変動を減らすためにＲＮＡをプールした（ｎ＝６）。各時点からの網膜を乳鉢と乳棒で溶解してＱｕｉａＳｈｅｒｄｄｅｒカラム（Qiagen、カタログ ７９６５６）で濾過した。次いで、ＲＮｅａｓｙ  Ｋｉｔ（Qiagen、カタログ ７４１０４）を用いて製造会社の使用説明書のようにＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡを作り出すために、１μｇの全ＲＮＡをＤＮａｓｅＩ（Qiagen、カタログ ７９２５４）で処理して夾雑ゲノムＤＮＡを取り除き、次いで無作為のヘキサマー、及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（Life Tecｈnologies Corp., カタログ１８０８０−０４４）用いて逆転写した。全ｃＤＮＡをアリコートして−８０℃で保存した。
【０１２３】
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
Ｃｙｐ２ｃ５５（Ｆ：５’−ＡＡＴＧＡＴＣＴＧＧＧＧＧＴＧＡＴＴＴＴＣＡＧ−３’、Ｒ：５’−ＧＣＧＡＴＣＣＴＣＧＡＴＧＣＴＣＣＴＣ−３’）、ｓＥＨ（Ｆ：５’−ＡＴＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣ−３’、Ｒ：５’−ＣＴＧＧＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＧＧＡＴＣＴ−３’）及び不変制御遺伝子シクロフィリンＡ（Ｆ：５’−ＡＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＡＧＡ−３’、Ｒ：５’−ＴＧＣＣＧＧＡＧＴＣＧＡＣＡＡＴＧＡＴ−３’）を標的にするＰＣＲプライマーを Ｈａｒｖａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ Ｂａｎｋ 及び ＮＣＢＩ Ｐｒｉｍｅｒ Ｂｌａｓｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ を用いて設計した。遺伝子発現の定量分析をＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ ミックスキット（Kapa BioSystems、カタログＫＫ４６０２）と共にＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて作り出した。ΔｃＴ法を用いてシクロスポリンＡに関して遺伝子発現を計算した。
【０１２４】
ウエスタンブロットタンパク質分析
酸素正常状態及び高酸素状態の野生型マウスを生後日（Ｐ）７、１２、１４及び１７に屠殺した。網膜を採取し、細胞溶解緩衝液（Cell Signalling、カタログ９８０３）中、プロテアーゼ阻害剤（１：１０００希釈）で均質化して超音波処理した。サンプルをＰｉｅｒｃｅ（登録商標） ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ThermoScientific、カタログ２３２５５）を用いて標準化した。５０μｇの網膜溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに搭載してそれらの分子量によって分離して、ＰＶＤＦ膜に移した。保護した後、一次抗体ヒツジ抗マウスｓＥＨ（Santa Cruz、カタログ２２３４４）又はウサギ抗マウスＣＹＰ２Ｃ（Abcam、カタログａｂ２２５９６）と５％ＢＳＡ中４℃で一晩培養した。西洋わさびペルオキシダーゼが結合したウサギ抗ヒツジ及びロバ抗ウサギＩｇＧ（１：１００００希釈）との二次培養を室温で１時間続けた。化学発光シグナルをＥＣＬを加えた基質を用いて作り出してＫＯＤＡＫフィルムで捕獲した。ＩｍａｇｅＪ １．４６ｒ（ＮＩＨ）ソフトウェアを用いて濃度測定を行った。
【０１２５】
食餌介入
食餌性実験に関して、それぞれＲＯＰＵＦＡ、ＡＲＡＳＣＯ及びＤＨＡＳＣＯという商品名のポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、アラキドン酸（ＡＡ）及びドコサヘキサエン酸サプリメントは、DSM Nutritional Products（dsmnutritionalproducts.com）から入手でき、Research Diets Incorporated (researchdiets.com/)で齧歯動物の餌に取り込まれた。食餌は長期にわたってそして酸素暴露に対して安定であった。出産すると、母獣は２％のω６−ＰＵＦＡ（ＡＡ）を含みω３−ＰＵＦＡ（ＤＨＡ及びＥＰＡ）を含まないか、或いは２％のω３−ＰＵＦＡを含みω６−ＰＵＦＡを含まない、サフラワーオイルを１０％（Ｗ／Ｗ）とともに規定の齧歯動物食を摂食した。
【０１２６】
網膜血管閉塞及び新血管形成の定量
ＯＩＲの眼を摘出して４％のパラホルムアルデヒドに４℃で１時間固定した。網膜を乖離して、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４で蛍光標識したＧｒｉｆｆｏｎｉａ Ｂａｎｄｅｒｅｉｒａｅａ Ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ Ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４ (Molecular Probes、カタログ Ｉ２１４１３、１：１００希釈)を用いて１ｍＭのＣａＣｌ２を含むＰＢＳ中２３℃で一晩染色した。洗浄の２時間後、網膜をＳｌｏｗＦａｄｅ  Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Invitrogen、カタログ Ｓ２８２８）中に上向きに埋め込まれた光受容体を備えたＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ／Ｐｌｕｓ顕微鏡スライド（Fisher カタログ １２−５５０−１５）上にホールマウントした。網膜新血管形成を定量するために、ホールマウントした網膜それぞれの２０画像を５倍の倍率でＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ．Ｚ１顕微鏡上で得て、１つの画像を形成するためにＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ４．６．３．０ソフトウェアと結合した。既に記載されているように（Stahl et al. Angiogenesis 12: 297-301）、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて血管閉塞を定量して、新血管形成をＩｍａｇｅＪ１．４６ｒ（ＮＩＨ）ソフトウェア上のＳＷＩＦＴ＿ＮＶで分析した。
【０１２７】
生体外大動脈輪移植片からの大血管発芽
Ｔｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８−Ｔｇ、Ｔｉｅ２−ｓＥＨ−Ｔｇ、ｓＥＨ−／−マウス及び同腹の野生型マウスを麻酔して、温かいＰＢＳで心臓内灌流を行った。大動脈を解体して取り除き、厚さ１ｍｍの輪に切断して２４ウェルの組織培養プレート中で３０μＬの増殖因子減少Ｍａｒｔｒｉｇｅｌ（登録商標、BD Biosciences、カタログ ３５４２３０）内に埋め込んだ。次いで処置の前に、増殖因子Ｂｏｏｓｔで活性化した５００μＬのＣＳＣ完全培地（Cell System、カタログ ４２０−５００）をそれぞれのウェルに添加して５％のＣＯ２と３７℃で４８時間培養した。培地は雑菌の混入を防ぐために５単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（GIBCO、カタログ１５１４２）を含有していた。
【０１２８】
ＤＨＡ（Cyaman Chemical、カタログ９０３１０、３０μＭ）及びＡＡ（Cyaman Chemical、カタログ９００１０、３０μＭ）を、Ｔｉｅ２−ＣＹＰ２Ｃ８Ｔｇ及び野生型同腹仔対照由来大動脈輪の播種の４８時間後に培養培地に投入した。１７（１８）−ＥｐＥＴＥ（ＥＥＱ）（Cyaman Chemical、カタログ５０８６１、１μＭ）、１９（２０）−ＥｐＤＰＥ（ＥＤＰ）（Cyaman Chemical、カタログ１０１７５、１μＭ）及び１４，１５−ＥＥ−８（Ｚ）−Ｅ（ＥＥＴ）（Cyaman Chemical、カタログ１００１０４８６、１μＭ）を、Ｔｉｅ２−ｓＥＨＴｇ、ｓＥＨ−／−及びそれらの野生型同腹仔対照由来大動脈輪の播種の４８時間後に培養培地に投与した。全群で４８時間毎に培地を交換した。Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ．Ｚ１顕微鏡を用いて、播種後１６８時間後（処置後１２０時間後）に個々の移植片の位相差写真を撮った。大血管発芽の領域をコンピュータソフトウェアＩｍａｇｅＪ１．４６ｒ（National Institute of Health）で定量化した。血管発芽を定量化するための半自動マクロプラグインは筆者から入手できる。
【０１２９】
統計分析
全ての棒グラフに関するデータは別段の指示がない限り、平均値±標準誤差で表した。サンプルが正常に分散していたので、群間の比較を両側対応のないスチューデントｔ−検定又は分散分析（ＡＶＯＶＡ）それに続く平均値間を比較するための事後検定補正（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）の何れかで行った。ｐ＜０．０５は統計的に有意であると考えられる。
【０１３０】
（参照による取り込み）
本明細書に開示された全ての特許、公開された特許出願及びその他の参考文献はその全てが参照により明確に本明細書に取り込まれている。
【０１３１】
（均等）
当業者は本明細書に記載されている発明の具体的な態様の多くの均等物を認識できるか或いは、通常の実験のみを用いて確認できる。このような均等物は以下の特許請求の範囲に含まれるように意図されている。
【０１３２】
本明細書における可変物の定義の何れかにおいて、要素のリストの列挙は任意の単一要素として、又は挙げられている任意の要素の組み合わせ（又はサブコンビネーション）としての可変物の定義を包含している。本明細書における実施態様の列挙は何れかの単一実施態様として、或いは他の何れかの実施態様又はその部分との組み合わせとしての実施態様を包含している。
【０１３３】
（参考文献）
1.  Hellstrom A, Smith LE, Dammann O. Retinopathy of prematurity. Lancet. Jun 14 2013.
2.  Connor KM, SanGiovanni JP, Lofqvist C, Aderman CM, Chen J, Higuchi A, Hong S, Pravda EA, Majchrzak S, Carper D, Hellstrom A, Kang JX, Chew EY, Salem N, Jr., Serhan CN, Smith LE. Increased dietary intake of omega-3-polyunsaturated fatty acids reduces pathological retinal angiogenesis. Nat Med. Jul 2007;13(7):868-873.
3.  Sapieha P, Stahl A, Chen J, Seaward MR, Willett KL, Krah NM, Dennison RJ, Connor KM, Aderman CM, Liclican E, Carughi A, Perelman D, Kanaoka Y, Sangiovanni JP, Gronert K, Smith LE. 5-Lipoxygenase metabolite 4-HDHA is a mediator of the antiangiogenic effect of omega-3 polyunsaturated fatty acids. Science translational medicine. Feb 9 2011;3(69):69ra12.
4.  Arnold C, Konkel A, Fischer R, Schunck WH. Cytochrome P450-dependent metabolism of omega-6 and omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids. Pharmacol Rep. May-Jun 2010;62(3):536-547.
5.  Panigrahy D, Greene ER, Pozzi A, Wang DW, Zeldin DC. EET signaling in cancer. Cancer metastasis reviews. Dec 2011;30(3-4):525-540.
6.  Michaelis UR, Fisslthaler B, Barbosa-Sicard E, Falck JR, Fleming I, Busse R. Cytochrome P450 epoxygenases 2C8 and 2C9 are implicated in hypoxia-induced endothelial cell migration and angiogenesis. Journal of cell science. Dec 1 2005;118(Pt 23):5489-5498.
7.  Edin ML, Wang Z, Bradbury JA, Graves JP, Lih FB, DeGraff LM, Foley JF, Torphy R, Ronnekleiv OK, Tomer KB, Lee CR, Zeldin DC. Endothelial expression of human cytochrome P450 epoxygenase CYP2C8 increases susceptibility to ischemia-reperfusion injury in isolated mouse heart. FASEB J. Oct 2011;25(10):3436-3447.
8.  Imig JD, Hammock BD. Soluble epoxide hydrolase as a therapeutic target for cardiovascular diseases. Nat Rev Drug Discov. Oct 2009;8(10):794-805.
9.  Zhang W, Koerner IP, Noppens R, Grafe M, Tsai HJ, Morisseau C, Luria A, Hammock BD, Falck JR, Alkayed NJ. Soluble epoxide hydrolase: a novel therapeutic target in stroke. Journal of cerebral blood flow and metabolism : official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. Dec 2007;27(12):1931-1940.
10.  Imig JD. Epoxides and soluble epoxide hydrolase in cardiovascular physiology. Physiol Rev. Jan 2012;92(1):101-130.
11.  Konkel A, Schunck WH. Role of cytochrome P450 enzymes in the bioactivation of polyunsaturated fatty acids. Biochim Biophys Acta. Jan 2011;1814(1):210-222.
12.  Zhang G, Panigrahy D, Mahakian LM, Yang J, Liu JY, Stephen Lee KS, Wettersten HI, Ulu A, Hu X, Tam S, Hwang SH, Ingham ES, Kieran MW, Weiss RH, Ferrara KW, Hammock BD. Epoxy metabolites of docosahexaenoic acid (DHA) inhibit angiogenesis, tumor growth, and metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. Apr 3 2013.
13.  Smith LE, Wesolowski E, McLellan A, Kostyk SK, D'Amato R, Sullivan R, D'Amore PA. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. Jan 1994;35(1):101-111.
14.  Michaelis UR, Falck JR, Schmidt R, Busse R, Fleming I. Cytochrome P4502C9-derived epoxyeicosatrienoic acids induce the expression of cyclooxygenase-2 in endothelial cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. Feb 2005;25(2):321-326.
15.  Revermann M, Mieth A, Popescu L, Paulke A, Wurglics M, Pellowska M, Fischer AS, Steri R, Maier TJ, Schermuly RT, Geisslinger G, Schubert-Zsilavecz M, Brandes RP, Steinhilber D. A pirinixic acid derivative (LP105) inhibits murine 5-lipoxygenase activity and attenuates vascular remodelling in a murine model of aortic aneurysm. Br J Pharmacol. Aug 2011;163(8):1721-1732.
16.  Liu X, Zhu P, Freedman BD. Multiple eicosanoid-activated nonselective cation channels regulate B-lymphocyte adhesion to integrin ligands. Am J Physiol Cell Physiol. Mar 2006;290(3):C873-882.
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図２Ａ】
2016539098.tif 000014
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
2016539098.tif 000021
【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2016539098.tif 000029
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７】
2016539098.tif 000033
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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