(57)【要約】タンパク質製剤の凝集体含有量を減少させる組成物は、金属を実質的に欠く、金属親和性官能性を有する第１の表面結合リガンドを有する第１の基質と、第１の表面結合リガンドとは異なる追加の表面結合リガンドであって、金属親和性官能性の電荷とは逆ではない凝集体電荷を有する、追加の表面結合リガンドとを含み、任意で追加の表面結合リガンドが追加の基質に与えられ、それによって組成物が、第１の基質と追加の基質との混合物を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属を実質的に欠く、金属親和性官能性を有する第１の表面結合リガンドを含む第１の基質と、前記第１の表面結合リガンドとは異なる追加の表面結合リガンドであって、前記金属親和性官能性の電荷とは逆ではない凝集体電荷を有する、追加の表面結合リガンドとを含む、タンパク質製剤の凝集体含有量を減少させる組成物であって、任意で前記追加の表面結合リガンドが追加の基質に与えられ、それによって前記組成物が、前記第１の基質と前記追加の基質との混合物を含む、タンパク質製剤の凝集体含有量を減少させる組成物。
【請求項２】
前記第１の表面結合リガンド、前記追加の表面結合リガンド、または両方が多座金属キレート部分を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記追加の表面結合リガンドが金属親和性官能性を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記第１の表面結合リガンドが電気陰性の凝集体電荷を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記第１の基質が、前記第１の基質の凝集体電荷が電気陰性である場合、前記第１の基質に結合した追加の化学的部分を有する、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
前記第１の表面結合リガンドが電気陰性であり、イミノ二酢酸（２−（カルボキシメチルアミノ）酢酸）、エチレングリコール（アミノエチルエーテル）二酢酸、ニトリロ酢酸（２，２’，２’’−ニトリロ三酢酸）、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
前記第１の表面結合リガンドが、イミノ二酢酸（２−（カルボキシメチルアミノ）酢酸）である、請求項１記載の組成物。
【請求項８】
前記第１の表面結合リガンドが電気陽性の凝集体電荷を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項９】
前記第１の表面結合リガンドが、トリス（２−アミノエチル）アミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラアミン、またはデスフェリオキサミンである、請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
前記第１の表面結合リガンドが、トリス（２−アミノエチル）アミンである、請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
前記第１の基質が、前記第１の基質の凝集体電荷が変わらない場合、前記第１の基質に結合した追加の化学的部分を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
前記第１の基質または前記追加の基質の少なくとも１つが、前記第１の表面結合リガンドおよび前記追加の表面結合リガンドに加えてさらなる表面結合リガンドを含み、前記さらなる表面結合リガンドが、前記タンパク質製剤の成分との水素結合、疎水性相互作用、またはπ−π結合に関与する前記組成物の能力を高める、請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
前記第１の基質、前記追加の基質、または両方が、中性基、負荷電基、またはそれらの組み合わせと共に複数の負荷電金属キレート基を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１４】
前記第１の基質、および前記追加の基質、または両方が、中性基、正荷電基、またはそれらの組み合わせと共に複数の正荷電金属キレート基を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１５】
前記第１の表面結合リガンドと前記追加の表面結合リガンドとが、前記第１の基質に共有結合する、請求項１記載の組成物。
【請求項１６】
前記第１の表面結合リガンドが、前記第１の基質に共有結合し、前記追加の表面結合リガンドが前記任意の追加の基質に共有結合する、請求項１記載の組成物。
【請求項１７】
前記第１の基質、前記任意の追加の基質、または両方が複数の粒子を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１８】
前記複数の粒子が非多孔質である、請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
前記複数の粒子が多孔質である、請求項１７記載の組成物。
【請求項２０】
前記複数の粒子が、前記タンパク質製剤由来のタンパク質の進入を許容するのに十分な大きさの孔径を有する、請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
前記複数の粒子が、前記タンパク質製剤由来のタンパク質の進入を許容できないほど小さい孔径を有する、請求項１９記載の組成物。
【請求項２２】
平均孔径が約１０ｎｍ〜約１００ｎｍである、請求項１９記載の組成物。
【請求項２３】
平均孔径が約１０ｎｍ未満である、請求項１９記載の組成物。
【請求項２４】
平均孔径が約１００ｎｍ超である、請求項１９記載の組成物。
【請求項２５】
前記第１の基質、前記任意の追加の基質、または両方が、膜、またはモノリス、または繊維、または中空繊維を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項２６】
装置がクロマトグラフィー用に構成される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組成物を含む装置。
【請求項２７】
前記装置が、前記第１の基質、前記任意の追加の基質、または両方が充填されたクロマトグラフ装置である、請求項２６記載の装置。
【請求項２８】
前記装置の入口にある組成物が前記装置の出口にある組成物と異なる、請求項２６または２７の装置。
【請求項２９】
前記装置の構成要素の化学的表面が、前記装置の化学官能性に寄与しないように、実質的に不活性または十分に少ない表面積である、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３０】
前記装置の構成要素の化学的表面が、前記装置の効果的使用を妨げないようにするために、（１）構造的完全性を生じること、（２）前記装置を通る液体の流れを方向づけること、および（３）タンパク質製剤中の不溶性物質を物理的に遮断、捕捉、または取り込むことのうちの１つまたは２つ以上を可能にするように構成される、請求項２９記載の装置。
【請求項３１】
前記装置が多孔質膜を備え、前記多孔質膜が、第１の表面結合リガンドまたは第２の表面結合リガンドが結合する第１の基質である、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３２】
第１の基質、任意の追加の基質、または両方が、中実、または多孔質壁中空の繊維を含む、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３３】
第１の基質、任意の追加の基質、または両方が、透過性チョップド繊維マットを含む、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３４】
第１の基質、任意の追加の基質、または両方が、規則正しい巻繊維構造、織繊維構造、または不織繊維構造を含む、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３５】
第１の基質、任意の追加の基質、または両方が、透過性チョップド繊維マットと規則正しい巻繊維構造、織繊維構造、または不織繊維構造との組み合わせを含む、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３６】
前記装置が多孔質細網繊維を含み、前記多孔質細網繊維が中空多孔質壁繊維または非多孔質繊維であり、前記多孔質細網繊維が、第１の表面結合リガンドおよび第２の表面結合リガンドが結合する第１の基質である、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３７】
前記装置が、多孔質膜間、またはモノリス間にはさまれた多孔質粒子または非多孔質粒子を含む、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３８】
多孔質粒子または非多孔質粒子が、第１の表面結合リガンドまたは第２の表面結合リガンドのうちの一方が結合する第１の基質であり、膜またはモノリスが、前記第１の表面結合リガンドと第２の表面結合リガンドのうちの他方が結合する追加の基質である、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項３９】
前記装置が、織繊維フィルター間もしくは非晶質繊維フィルター間にはさまれた、または繊維性マトリクス内に埋め込まれた多孔質または非多孔質粒子を含む、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項４０】
粒子が、第１の表面結合リガンドまたは第２の表面結合リガンドのうちの一方が結合する第１の基質または任意の追加の基質を含み、繊維フィルターが、前記第１の表面結合リガンドまたは前記第２の表面結合リガンドのうちの他方が結合する前記第１の基質または前記任意の追加の基質を含む、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項４１】
前記装置が織フリットまたは結晶性フリット間にはさまれた多孔質または非多孔質粒子を含む、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項４２】
多孔質または非多孔質粒子が、第１の表面結合リガンドまたは第２の表面結合リガンドのうちの一方が結合する第１の基質であり、織フリットまたは結晶性フリットが、前記第１の表面結合リガンドおよび前記第２の表面結合リガンドのうちの他方が結合する任意の追加の基質である、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項４３】
前記装置が、細網高分子網目に埋め込まれた多孔質または非多孔質粒子を含む、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項４４】
第１の表面結合リガンド、第２の表面結合リガンド、または両方が、ヒドロゲル物質を含む、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の明示
本出願は、２０１３年２月６日に出願された米国特許出願第６１／７６１，６５３号の優先権を主張し、その全体は本明細書に参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、タンパク質、特に抗体の精製用物質に関する。本発明は特に凝集体の含有量を減少させるための物質に関し、凝集体は特にヌクレオソーム、ヒストン、およびＤＮＡなどの宿主細胞クロマチン残遺物を含むものである。
【０００３】
宿主細胞由来の汚染物質と体外細胞培養法によって生成された組換えタンパク質との間に、非天然ヘテロ凝集体が自然発生的に形成することが示されている（非特許文献１〜５）。これらのヘテロ凝集体は、２つの点で非天然と見なすことができる：１）構成汚染物質は、しばしば、生きている非ヒト宿主細胞によって分泌される、または非ヒト宿主細胞が死んで溶解するときに培地に放出される非ヒト起源のものである。生きているヒトには、そのような非ヒト汚染物質は存在しない。２）構成汚染物質は、死細胞の構成要素がすぐに排泄されるヒトの生体内系と比較して、高濃度に蓄積する。したがって、組換え産物を、生体系では通常生じない濃度で、高度に強く相互に作用する汚染物質に触れさせる。一方、高発現レベルの組換えタンパク質が、さまざまな組成の望ましくないヘテロ凝集体の形成を支持しながら、これらの非ヒト汚染物質との非特異的会合のためにそれらを適切な基質にする。
【０００４】
ヘテロ凝集体の汚染タンパク質含有量は、汚染タンパク質の直接標的によってある程度対処され（非特許文献１および４）、同時に汚染タンパク質を招いている該当するＤＮＡ成分を標的にすることによって間接的に対処されてきた（非特許文献２および５）。抗体凝集体レベルの低減は、いくつかの錯体が解離されるときに示された（非特許文献１、３、および５）。抗体と汚染物質との錯体のレベルを低減するアニオン交換体の能力が開示されている（非特許文献２および４）が、ヘテロ凝集体を十分に除去できたアニオン交換処理は示されていない。また、サイズ排除、カチオン交換、および疎水性相互作用クロマトグラフィーが、ヘテロ凝集体を減少させる試みにおいて使用されたが、これらの技術はアニオン交換より概して劣っていた（非特許文献４）。
【０００５】
抗体と安定した会合を形成する汚染物質の特定のソースは必ずしもわかっていない（例えば非特許文献１を参照）。いくつかの試みは、他の考えられる汚染物質の特定のソースにほとんど注意を払わないでＤＮＡ汚染物質に焦点を合わせている（非特許文献４および５）。抗体製剤における宿主汚染物質と凝集体との会合を示すいくつかの成果は、クロマチン異化産物を含む汚染物質に特に焦点を合わせている（非特許文献２および３）。これらの例において、凝集は、ヒストンおよびＤＮＡなどのクロマチン異化産物用の抗体の免疫特異性によって直接、媒介されてもよい。クロマチン異化産物は、非特異的相互作用によって、抗体との安定した錯体も形成できることが示された。したがって、クロマチン異化産物を含まない抗原の既知の免疫特異性を有するモノクローナル抗体が、死んだ宿主細胞の核由来のヌクレオソーム、ヒストン、およびＤＮＡとさまざまな種類の高度に安定した凝集体を形成することができる（非特許文献６）。クロマチン異化産物は高分子量（ＨＭＷ）凝集体の中で代表するものであることが特に示された。ＨＭＷ凝集体は、治療効果を無効にする抗体の形成を促すのにかかわっていることが疑われるため、特に懸念される。ＨＭＷ凝集体は、小さい複数の目的の抗体より大きいサイズの凝集体と通常定義される。例えば、２つの抗体の会合はＨＭＷ凝集体とは見なされず、４つの抗体もＨＭＷ凝集体と見なされない。しかしながら、例えば約８〜約１０またはそれ以上の抗体に相当する、はるかに大きいサイズの凝集体は、通常、ＨＭＷ凝集体に分類されてもよい。
【０００６】
ヘテロ凝集体を解離することが期待され得る因子で抗体製剤を処理することは、一般に効果的でないことがわかっている。例えば、高濃度の尿素、塩、またはその２つの組み合わせは、ＩｇＭ汚染物質ヘテロ凝集体を実質的に解離しない（非特許文献４）。プロテインＧの親和性クロマトグラフィーとともに尿素、塩、およびＥＤＴＡを組み合わせた溶出前洗浄を行ったように（非特許文献３）、尿素、アルコール、および界面活性剤の溶出前洗浄とともにプロテインＡの親和性クロマトグラフィーを行うことが、洗浄なしの場合より効果的にヘテロ凝集体レベルを低減することが示された（非特許文献１）。尿素の溶出前洗浄とともにアニオン交換クロマトグラフィーを行うことは、尿素洗浄なしの場合より効果的にヘテロ凝集体を減少させることが示された（非特許文献４）。カチオン交換クロマトグラフィーもまた、溶出前ＥＤＴＡ洗浄とともに行うことで、ＥＤＴＡ洗浄なしの場合より効果的にヘテロ凝集体を減少させることが示された（非特許文献４）。最後に、尿素および／または塩の溶出前洗浄とともに行ったヒドロキシアパタイトもまた、そのような洗浄なしの場合より効果的にヘテロ凝集体を減少させた（非特許文献５）。これらの観察結果にもかかわらず、概して、クロマトグラフィーカラムに結合した抗体の溶出前洗浄における解離因子の使用が中程度に成功している。
【０００７】
固定化ＴＲＥＮ（トリス（２−アミノエチル）アミン）は公知で、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を行う目的で市販され、固定化ＴＲＥＮが最初に金属イオンで負荷され、ＴＲＥＮが会合した金属イオンと接触させることによって生体分子が捕捉され、その後、標的生体分子を金属イオンから解離することによって回収される。ＴＲＥＮ以外のＩＭＡＣリガンド、例えばイミノ二酢酸（ＩＤＡ）およびニトリロ酢酸（ＮＴＡ）も公知であり、ＩＭＡＣを行う目的で市販され、そのリガンドは最初に金属イオンで負荷され、そのリガンドが会合した金属イオンと接触させることによって生体分子が捕捉され、その後、標的生体分子を金属イオンから解離することによって回収される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｈｕｋｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇｒ．（２００８）２４：１１１５−１１２１
【非特許文献２】Ｌｕｈｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ（２００９）８７７：１５４３−１５５２
【非特許文献３】Ｍｅｃｈｅｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ（２０１１）８７９：２５８３−２５９４
【非特許文献４】Ｇａｇｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，（２０１１）１２１８：２４０５−２４１２
【非特許文献５】Ｇａｇｎｏｎ，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｊ．（２０１０）９（４）：１４−２４
【非特許文献６】Ｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ  １９１（２０１３）３３−４０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
いくつかの態様において、本明細書で開示された実施形態は、タンパク質製剤の凝集体含有量を減少させる組成物に関し、その組成物は、金属（金属イオン）を実質的に欠く、金属親和性官能性を有する第１の表面結合リガンドを含む第１の基質と、第１の表面結合リガンドとは異なる追加の表面結合リガンドであって、金属親和性官能性の電荷とは逆ではない凝集体電荷を有する、追加の表面結合リガンドとを含み、任意で追加の表面結合リガンドが追加の基質に与えられ、それによって組成物が、第１の基質と追加の基質との混合物を含む。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
負の正味電荷を有する金属親和性リガンドを有する固体物質と、負の正味電荷を有するか正味電荷を全く有さない少なくとも１つの追加のリガンドを含む本明細書で開示された組成物、あるいは正の正味電荷を有する金属親和性リガンドを有する固体物質と、正の正味電荷を有するか正味電荷を全く有さない少なくとも１つの追加のリガンドを含む本明細書で開示された組成物が、タンパク質製剤中の高分子量（ＨＭＷ）凝集体およびより小さいサイズの凝集体の含有量を実質的に減少させる能力を有することが、驚くべきことに判明した。本発明の特定の実施形態は、タンパク質製剤に加えられ得る多価イオンや抗ウイルス化合物などの因子を除去する付加的な能力を有する。
【００１１】
特定の実施形態において、本発明は、それぞれ反対の電荷でないリガンドが同じ表面、または異なる表面、またはその両方の混合物に存在し得る装置を提供する。そのようなリガンドは、限定されないが、疎水性、π−π結合、水素結合、および金属親和性を含む、付加的な化学官能性を有してもよいし、または組み合わされてもよい。固体表面は、複数の構造タイプの組み合わせを含む、構造上、粒子状、繊維状、多孔質膜状、またはモノリシックであってもよい。いくつかの実施形態において、反対の電荷ではないそれぞれのリガンドは、上述の構造タイプのいずれかを含む１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の別々の表面に存在してもよい。複数の表面が使用されると、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の官能性が、表面ごとに任意の数のリガンドによって与えられてもよい。単一のリガンドが、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の官能性を与えることもできる。例として、単一のリガンドは、２つの官能性を与えることができ、例えば、金属親和性と水素結合官能性、または金属親和性と疎水性官能性、または金属親和性とπ−π結合官能性などである。同様に、単一リガンドは、３つの官能性を与えてもよく、例えば金属親和性と疎水性官能性とπ−π結合官能性などである。当業者は、任意の所望のタイプおよび数の官能性を組み合わせられることや、任意の数のリガンドおよびそれらのリガンドを有する任意の数の表面の間でそれらを分配できることを認識している。
【００１２】
特定の実施形態において、装置は、適用される試料と反対の電荷でないそれぞれのリガンドとの接触が実質的に同時であるように構成されてもよい。いくつかのそのような実施形態において、複数の表面が使用される場合、それらは均質に混合されてもよいし、あるいは勾配混合物のようであってもよい。
【００１３】
他の実施形態において、装置は、適用される試料と反対の電荷でないそれぞれのリガンドとの接触が順次的であるように構成されてもよい。いくつかのそのような実施形態において、順次的な接触は、複数の表面の使用によって促進されてもよく、そのような複数の表面は空間的に分離していてもよい。他のそのような実施形態において、順次的な接触は、まず試料を１つの表面に接触させ、その後、他の表面に接触させることによって促進されてもよい。他のそのような実施形態において、順次的な接触は、空間的および時間的分離の両方によって促進されてもよい。
【００１４】
本発明は、特定の実施形態において、抗体製剤中の凝集体濃度の減少を含むタンパク質の精製のための組成物および装置を提供する。特定の実施形態において、タンパク質製剤の凝集体含有量を減少させる組成物は、組成物が金属親和性官能性を有する第１の表面結合リガンドおよび第１の表面結合リガンドの金属親和性官能性の電荷と反対でない凝集体電荷を有する少なくとも１つの追加の表面結合リガンドを含む場合に供給される。
【００１５】
特定の実施形態において、第１の表面結合リガンドおよび追加の表面結合リガンドは、基質にそれぞれ共有結合する。第１の表面結合リガンドおよび追加の表面結合リガンドは、同じ基質にそれぞれ共有結合してもよい。他の実施形態において、第１の表面結合リガンドおよび追加の表面結合リガンドは、異なる基質にそれぞれ共有結合してもよい。基質は粒子であってもよく、特定の実施形態において、粒子は多孔質または非多孔質であってもよい。特定の実施形態において、基質はタンパク質製剤中のタンパク質の進入を許容するのに十分な大きさの孔を有する多孔質粒子である。他の実施形態において、孔はタンパク質製剤のタンパク質の進入を許容できないほど小さい。特定の実施形態において、基質は、平均孔径が約１０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１０ｎｍ未満、または約１００ｎｍ超である多孔質粒子である。特定の実施形態において、基質は、膜、モノリス、または中実、または多孔質壁中空の繊維である。特定の実施形態において、第１の表面結合リガンドが結合する基質は、追加の表面結合リガンドが結合する基質とは異なる種類のものである。例えば、一方の基質は粒子で、他方の基質は、モノリス、膜、または繊維、多孔質壁中空の繊維、それらの複数または複合構成物であってもよい。
【００１６】
特定の実施形態において、第１の表面結合リガンドと追加の表面結合リガンドは異なる。特定の実施形態において、第１の表面結合リガンドは多座金属キレート部分である。特定の実施形態において、第１の表面結合リガンドは、電気陰性の凝集体電荷を有する。他の実施形態において、第１の表面結合リガンドは、電気陽性の凝集体電荷を有する。特定の実施形態において、追加の表面結合リガンドは金属親和性官能性を有する。特定のそのような実施形態においては、追加の表面結合リガンドは多座金属キレート部分である。
【００１７】
特定の実施形態において、第１の表面結合リガンドは電気陽性であり、その表面は、その表面の凝集体電荷が電気陽性であれば、その表面に結合した追加の化学的部分を有する。いくつかのそのような実施形態において、１つまたは２つ以上の追加の化学的部分は、凝集体電荷が正であり続ける限り、反対の（負の）電荷を有することができる。他のそのような実施形態において、第１の表面結合リガンドは電気陰性であり、その表面は、その表面の凝集体電荷が電気陰性であれば、その表面に結合した追加の化学的部分を有する。いくつかのそのような実施形態において、１つまたは２つ以上の追加の化学的部分は、凝集体電荷が負であり続ける限り、反対の（正の）電荷を有することができる。特定の実施形態において、少なくとも１つの基質は、第１の表面結合リガンドまたは追加の表面結合リガンドに加えて１つまたは２つ以上の化学的部分を有し、そのような追加の化学的部分は、タンパク質製剤のタンパク質との水素結合、疎水性相互作用、金属親和性、またはπ−π結合に関与する組成物の能力を高める。
【００１８】
特定の実施形態において、第１の表面結合リガンドは電気陰性であり、イミノ二酢酸（２−（カルボキシメチルアミノ）酢酸）（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール（アミノエチルエーテル）二酢酸（ＥＧＴＡ）、ニトリロ酢酸（２，２’，２’’−ニトリロ三酢酸）（ＮＴＡ）、アスパラギン酸、またはグルタミン酸である。特定の実施形態において、第１の表面結合リガンドは電気陽性であり、トリス（２−アミノエチル）アミンまたはデスフェリオキサミンである。
【００１９】
特定の実施形態において、前述の実施形態で記載された表面に結合した化学的部分は、物理的表面の合成中に、代替的にポリマーの構造に直接組み込まれてもよい。
【００２０】
特定の実施形態において、本発明は、本発明の組成物を含む、クロマトグラフィー用に構成された装置を提供する。特定の実施形態において、装置は、第１の表面結合リガンドおよび追加の表面結合リガンドが結合する基質を含むハウジングからなる。特定の実施形態において、装置は１つまたは２つ以上の多孔質膜を含み、そのような膜の少なくとも１つは、第１の表面結合リガンドおよび追加の表面結合リガンドが結合する基質である。特定の実施形態において、膜は多孔質壁中空の繊維状である。特定の実施形態において、装置は多孔質細網の配列の繊維を含み、そのような繊維は、第１の表面結合リガンドおよび追加の表面結合リガンドが結合する基質である。
【００２１】
特定の実施形態において、装置は、多孔質膜間、またはモノリス間、またはフリット間にはさまれた多孔質または非多孔質粒子を含む。特定のそのような実施形態において、粒子は、第１の表面結合リガンドか追加の表面結合リガンドのうちの一方が結合する基質である。特定の実施形態において、第１の表面結合リガンドおよび追加の表面結合リガンドはまた、膜またはモノリスに結合してもよい。特定の実施形態において、装置は、織繊維フィルター間もしくは非晶質繊維フィルター間にはさまれた多孔質または非多孔質粒子を含む。特定のそのような実施形態において、粒子は、第１の表面結合リガンドか追加の表面結合リガンドのうちの一方が結合する基質であり、繊維フィルターは実質的に不活性である。他の実施形態において、繊維フィルターはまた、１つまたは２つ以上の表面結合リガンドを有してもよい。特定の実施形態において、装置は、織フリット間または結晶性フリット間にはさまれ多孔質または非多孔質粒子を含み、フリットは実質的に不活性である。特定の実施形態において、フリットは１つまたは２つ以上の表面結合リガンドを有してもよい。特定の実施形態において、装置は、細網高分子網目に埋め込まれた多孔質または非多孔質粒子を含む。特定のそのような実施形態において、粒子は、第１の表面結合リガンドまたは第２の表面結合リガンドのうちの一方が結合する基質であり、細網高分子網目は実質的に不活性である。特定の実施形態において、細網高分子網目はまた、１つまたは２つ以上の表面結合リガンドを有する。特定の実施形態において、装置は、第１の表面結合リガンドが結合する基質と追加の表面結合リガンドが結合する基質の両方が粒子であり、粒子が膜間、モノリス間、細網高分子網目間、織繊維フィルター間または非晶質繊維フィルター間、結晶性フリット間、またはそれらの組み合わせの間に押し込められる場合を提供する。
【００２２】
特定の実施形態において、装置の１つまたは２つ以上の構成要素の化学的表面は、装置の化学官能性にほとんど寄与しないように、比較的不活性または比較的少ない表面積であってもよい。特定のそのような実施形態において、比較的不活性または比較的少ない表面積の化学的表面は、装置の効果的使用を妨げないようにするために、構造的完全性を生じるように、または装置を通る液体の流れを方向づけるように、またはタンパク質製剤中の不溶性物質を物理的に遮断、捕捉、または取り込むように構成される。
【００２３】
いくつかの実施形態において、第１の表面結合リガンドと追加のリガンドの比は、約１：９９〜約９９：１の範囲であってもよい。当業者は、ほとんど任意の比が特定の適用に適切であり得ることを認識するであろう。実用上、いくつかの実施形態において、第１の表面と第２の表面の比を最適化することは、第１の構成要素と第２の構成要素の衡平な１：１の比を使用し、この開始点から比を変えることによって比を系統的に最適化することから始めてもよい。
【００２４】
リガンドが複数のタイプの物質上に存在するいくつかの実施形態において、それぞれの物質の比および分布はさまざまな特徴のものであってもよい。当業者は、ほとんど任意の比および／または分布が特定の適用に適切であり得ることを認識するであろう。
【００２５】
本発明が理解しやすくなるように用語を定義する。付加的な定義は詳細な説明中に記載する。
【００２６】
「凝集体」とは、生理的条件で安定し、広範囲のｐＨおよび電気伝導率の条件下で安定し得る、２つまたは３つ以上の分子の会合物のことを指す。凝集体は、タンパク質、核酸、または脂質などの少なくとも１つの生体分子、および他の分子または金属イオンをしばしば含む。その会合物は化学的相互作用の任意の種類または任意の組み合わせによって生じ得る。抗体の凝集体は２つのカテゴリーに分類することができる。「ホモ凝集体」は、２つまたは３つ以上の安定した会合物のことを指す。「ヘテロ凝集体」とは、１つまたは２つ以上の抗体分子と１つまたは２つ以上の非抗体分子との安定した会合物のことを指す。非抗体成分は、ヌクレオチド、エンドトキシン、金属イオン、タンパク質、脂質、または細胞培地成分からなる群からの１つまたは２つ以上の物質から構成され得る。
【００２７】
「抗体」とは、免疫グロブリン、複合体、またはそれらの断片状の形態を指す。その語は、限定されないが、ヒトまたは他の哺乳類細胞株由来のクラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含んでもよく、それらにはヒト化、ヒト、単鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、変異型、移植、およびインビトロ生成抗体などの天然型または遺伝的に修飾された形態を含む。「抗体」はまた、限定されないが、免疫グロブリン部分を含有する融合タンパク質を含む複合体形態を含んでもよい。「抗体」はまた、抗原結合機能を保持しているかどうかは関係なく、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、Ｆｃ、および他の組成などの抗体断片を含んでもよい。
【００２８】
「エンドトキシン」とは、溶解時に細胞から放出されるグラム陰性菌の外膜に存在する毒性熱安定性リポ多糖物質のことを指す。エンドトキシンは、リン酸残基およびカルボキシル残基の高い含有量のためにほぼ酸性の可能性があり、脂質Ａ領域の脂肪酸含有量のために高度な疎水性を有する可能性がある。エンドトキシンは水素結合の幅広い機会を与えることができる。
【００２９】
「基質」または「固体物質」とは、性質上、粒子状、結晶質、重合体、繊維状、多孔質中空の繊維状、モノリシック、または膜質の不溶性有機または無機固体のことを指す。それは、非多孔質または多孔質粒子、多孔質膜、多孔質フィルター、または多孔質モノリスから構成されてもよい。粒子状の場合、粒子はほぼ球状または球状でなくてもよく、１００ｎｍ未満〜１００ミクロン超の範囲の大きさであってもよい。多孔質粒子の平均孔径は、１０ｎｍ未満（ミクロ多孔質）〜１００ｎｍ超（マクロ多孔質）の範囲にわたってもよい。膜における平均孔径は、１００ｎｍ未満〜１ミクロン超の範囲にわたってよい。膜またはモノリスにおける平均チャネルサイズは、１ミクロン未満〜１０ミクロン超の範囲にわたってもよい。固体物質はさらに、例えば、粒子が細網マトリクスに埋め込まれた、または膜間にはさまれた、またはその両方である複合構成物から構成されてもよい。
【００３０】
「金属親和性官能性」とは、金属イオンを好ましくは１：１に結合する、表面上に固定化され得る化学的部分の能力のことを指す。そのような化学的部分は、金属イオンと配位結合を形成する能力を有し得、特定のそのような化学的部分は、性質上、二座または多座であってもよい。この能力を有する電気陰性の化学的部分の非限定的な例は、イミノ二酢酸（２−（カルボキシメチルアミノ）酢酸）、ジエチルアミントリアミン五酢酸、ニトリロ酢酸（２，２’，２’’−ニトリロ三酢酸）を含む。この能力を有する電気陽性の化合物の例は、限定されないが、トリス（２−アミノエチル）アミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラアミン、およびデスフェリオキサミンを含む。
【００３１】
「電気陽性表面」とは、正電荷が多数を占める基質または固体物質の表面のことを指す。表面の電気陽性度は、化学基によってもたらされてもよく、化学基は限定されないが、アミノ、エチレンジアミノ、ジエチルアミノエチル、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミンのような弱アニオン交換基、第四級アミノ基などの強アニオン交換基、ポリリジン、ポリアルギニンまたはトリス（２−アミノエチル）アミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラアミン、ＰＡＭＡＭデンドリマー（エチレンジアミン核）などの弱交換体と強交換体の結合体、またはそれらの組み合わせを含む。正荷電表面に混合した化学的性質を生じさせる第２の官能性は、負荷電基または正荷電基、疎水性基、π−π結合基、水素結合基、または金属キレート基から構成されてもよい。第２の官能性は、製造物質、または粒子が合成されるまたは意図的な設計によって粒子が存在する、製造方法の偶発性の副産物として電気陽性表面に存在し得る。第２の官能性の濃度は、粒子の１ｍＬにつき１ミリ当量未満〜１ｍＬにつき１００ミリ当量超の範囲にわたってもよい。
【００３２】
「電気陰性表面」とは、負電荷が多数を占める基質または固体物質の表面のことを指す。表面の電気陰性度は、化学基によってもたらされてもよく、化学基は限定されないが、カルボキシル、アミノカルボキシル（イミノ二酢酸またはニトリロ酢酸）、もしくはホスホリルなどのいわゆる弱カチオン交換体、またはスルホ基など（例えば、スルホ、スルホメチル、スルホエチル、スルホプロピル）の強交換体を含む。負荷電表面に混合した化学的性質を生じさせる第２の官能性は、負荷電基または正荷電基、疎水性基、π−π結合基、水素結合基、または金属キレート基から構成されてもよい。第２の官能性は、粒子が合成されるまたは意図的な設計によって粒子が存在する、製造方法の偶発性の副産物として電気陰性表面に存在し得る。第２の官能性の濃度は、粒子の１ｍＬにつき１ミリ当量未満〜１ｍＬにつき１００ミリ当量超の範囲にわたってもよい。
【００３３】
「ポリヌクレオチド」とは、鎖において共有結合された複数のヌクレオチドモノマーからなるバイオポリマーのことを指す。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）は、ポリヌクレオチドの例である。ポリヌクレオチドは水素結合を形成する傾向が高い可能性がある。
【００３４】
「タンパク質」とは、炭素、水素、酸素、窒素、および通常は硫黄を含む複合有機高分子の群のいずれかのことをいい、ペプチド結合によってつながれたアミノ酸の１つまたは２つ以上の鎖から主に構成される。タンパク質は天然起源または組換え起源のものであってもよい。タンパク質は、例えばグリコシル化、ペグ化、または他の化学的部分との接合によって非アミノ酸部分を用いて修飾されてもよい。タンパク質の例としては、限定されないが、抗体、凝固因子、酵素、およびペプチドホルモンを含む。
【００３５】
「タンパク質製剤」とは、目的のタンパク質を含む任意の水溶液またはほぼ水溶液のことを指し、例えば、細胞を含む細胞培養収集物、（実質的に）無細胞の細胞培養上清、または精製段階の目的のタンパク質を含む溶液である。
【００３６】
「ウイルス」または「ビリオン」とは、超微細で（直径約２０〜３００ｎｍ）、代謝的に不活性な感染病原体のことを指し、生きている宿主、主にバクテリア、植物、および動物の細胞内でのみ複製し、それらはＲＮＡまたはＤＮＡコアと、タンパク質膜と、より複雑な種類では周囲膜とからなる。
【００３７】
特定の実施形態において、本発明の実施に用いられる固体物質は、限定されないが例えば、クロマトグラフィーの実施に通常使用される多孔質微粒子などの天然起源または合成起源の不溶性粒子を含んでもよい。そのような粒子は、限定されないが例えば抗体などのタンパク質の拡散性の進入を許容する大きい孔を具体化してもよいし、または、例えば塩、糖、およびヘテロ凝集体の解離因子などの小さい化学種の拡散性の進入は許容するが、抗体などのタンパク質の進入は許容できない小さい孔を具体化してもよい。あるいは固体物質は、非多孔質粒子、膜またはモノリス、多孔質壁中空の繊維などの繊維、多孔質膜、および／または上記要素の組み合わせを用いる複合構成物を含んでもよい。
【００３８】
電気陽性基はいわゆる強アニオン交換基および／またはいわゆる弱アニオン交換基を含んでもよい。強アニオン交換体の語は、第四級アミンなどの官能基を含み、ｐＨ１２超のｐＫａｓを具体化する。弱アニオン交換体の語は、ジエチルアミノエチルおよびエチレンジアミンなどの官能基を指すことが理解され、それは１２未満のｐＫａｓを具体化する。弱アニオン交換または強弱アニオン交換の混合の電気陽性基が含まれてもよい。金属配位能を有する、そのような混合された強弱アニオン交換基の非限定的な例は、トリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＲＥＮ）で、表面上に固定化され、第一級アミノ基、第二級アミノ基、および第三級アミノ基を含んでもよい。いくつかのそのような実施形態において、表面上にすでに固定化されたＴＲＥＮは、ＴＲＥＮ基の追加の層をすでに固定化されたＴＲＥＮ基に結合する目的で二次的な化学修飾を受けてもよく、それによって表面からさらに延びるＴＲＥＮデンドリマーを生成する。いくつかのそのような実施形態において、ＴＲＥＮ基の別の層がＴＲＥＮ基の第２の層に加えられ、３つの層のＴＲＥＮデンドリマーを形成するなどしてもよい。
【００３９】
電気陰性基はいわゆる強カチオン交換基またはいわゆる弱カチオン交換基を含んでもよい。強カチオン交換体の語は、３未満のｐＫａｓを有する部分を含む硫酸塩またはスルホを含むことが理解される。弱カチオン交換体の語は、３超のｐＫａｓを有するカルボキシ基および／またはホスホ基を含む部分を含むことが理解される。２つのカルボキシ基とアミノ基の組み合わせなどの（中性ｐＨで）双極性の電気陰性が支配的な基が含まれてもよい。そのような基の非限定的な例は、特に、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、エチレングリコール（アミノエチルエーテル）二酢酸（ＥＧＴＡ）、およびニトリロ酢酸（ＮＴＡ）基を含む。
【００４０】
電気陽性または電気陰性物質の表面はまた脂肪族性質および／または芳香族性質の疎水性基を取り込み、芳香族性質の方がいわゆるπ−π結合に関与する能力のために好ましい場合がある。混合された化学的性質が単一の複合化学基、単一の種類の表面、異なる表面の異なる性質の別個の化学基、またはそれらの組み合わせに存在してもよい。１つまたは２つ以上の電気陰性金属親和性基および／または１つまたは２つ以上の電気陽性金属親和性基が同時に使用されてもよく、それらは具体化される物理的形態に関して異なってもよい。異なる個別の性質の化学官能性が、特定の試料組成物のニーズにカスタマイズされたさまざまな比で使用されてもよい。例えば、清澄化された細胞培養上清の処理を目的とした組み合わせは、過剰な電気陽性表面を含む場合があり、エタクリジン、メチレンブルー、セチルトリメチルアンモニウム、クロルヘキシジン、またはポリエチレンイミンなどの可溶性因子で処理済みの上清の処理を目的とした組み合わせは過剰な電気陰性表面を含む場合がある。
【００４１】
特定の実施形態において、本発明は、電気陰性および／または電気的中性の粒子と組み合わさった電気陰性金属親和性官能性を有する粒子を提供することができ、それらは混合されてもよく、さらに中性物質と混合され、および／または中性物質によって囲まれ、中性物質に埋め込まれ、あるいは電気陰性の物質によって囲まれ、または電気陰性の物質に埋め込まれてもよい。
【００４２】
特定の実施形態において、本発明は、電気陽性および／または電気的中性の粒子と組み合わさった電気陽性金属親和性官能性を有する粒子を提供することができ、それらは混合されてもよく、さらに中性物質と混合され、および／または中性物質によって囲まれ、中性物質に埋め込まれ、あるいは電気陽性の物質によって囲まれ、または電気陽性の物質に埋め込まれてもよい。
【００４３】
特定の実施形態において、本発明は、電気陰性または電気的中性の金属親和性官能性を有する粒子と組み合わさった電気陰性金属親和性官能性を有する粒子を提供することができ、それらは混合されてもよく、さらに中性物質と混合され、および／または中性物質によって囲まれ、中性物質に埋め込まれ、あるいは電気陰性および／または電気陽性の物質によって囲まれ、または電気陰性および／または電気陽性の物質に埋め込まれてもよい。
【００４４】
特定の実施形態において、本発明は、限定されないが、疎水性相互作用、π−π結合、水素結合、および金属親和性に関与する能力を含む付加的な化学官能性を具体化できる電気陰性および／または電気的中性の表面を提供することができる。特定の実施形態において、本発明は、混合され、中性物質によって囲まれた、１種または２種以上の電気陰性粒子および１種または２種以上の電気的中性の粒子を提供することができる。
【００４５】
特定の実施形態において、粒子は異なるサイズおよび／または異なる多孔度を有してもよい。
【００４６】
特定の実施形態において、本発明は、限定されないが、膜、繊維、およびモノリスを含む他の物理的形態の逆に荷電されていない物質と混合および／または物質に囲まれ得る粒子を提供することができる。
【００４７】
特定の実施形態において、１つまたは２つ以上の基質の第１の官能性および追加の官能性の異なる割合は、異なる組成のタンパク質製剤のニーズに合うように選択されてもよい。
【００４８】
本発明が、タンパク質製剤中のホモ凝集体およびヘテロ凝集体の含有量を減少させるのに有用なことに加えて、特定の実施形態においては、タンパク質製剤から宿主細胞タンパク質、ポリヌクレオチド、エンドトキシン、およびウイルスを実質的に減少させるのに有用であり得ることは、当業者には明らかであろう。主要な官能性が、例えば、疎水性および水素結合などの付加的な官能性によって達成される場合、本発明はまた、細胞培地成分、再現性よく目標を達成する下流の精製方法の能力を制限する添加物の含有量を減少させることができる。また、本発明の特定の実施形態は比較的粗製の供給物の流れに加えられるとき、実質的な価値を有し得るが、それにもかかわらず、特定の実施形態においては、実質的に精製される試料に加えられるときに重要な価値を与え得ることも当業者には明らかであろう。
【００４９】
特定の実施形態において、本発明は、使用後に固体物質が洗浄され、リサイクルされ得るように、組成物または装置を提供してもよい。他の実施形態においては、それらは単回使用用に構成されてもよい。
【００５０】
本発明の付加的な目的および利点を、以下にいくつか記載し、いくつかはその記述から明らかであり、あるいは本発明の実施によって知ることができる。本発明の目的および利点は、請求項に記載された要素および組み合わせによって実現され、達成される。
【００５１】
上述の概要と以下の詳細な説明の両方は、単なる例および説明であり、請求項のように本発明を制限するものではない。
【実施例】
【００５２】
実施例１
ＨＥＲ２抗原に特異的な約１ｇ／ＬのＩｇＧモノクローナル抗体を含む１Ｌの細胞培養収集物を、１％アラントインで処理した。電気伝導性は約１３ｍＳ／ｃｍであり、ｐＨは約６．８であった。添加物は沈降を促進する効果があった。固体物質は、濾過によって除去し、透明な抗体を含む濾液を残した。抗体回収率は９９％であった。Ｂｉｏ  ＷｏｒｋｓのＴＲＥＮ  ｈｉ−ｓｕｂ２０ｍＬ、アガロース多孔質粒子ベースの電気陽性金属親和性物質をカラム（１．６×１０ｃｍ）に充填し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０に平衡化した。清澄化した濾液を、２００ｃｍ／時の線流速でカラム内を通過させた。最初の収集物は２０％超の凝集体を含み、特に少なくとも１０％のいわゆる高分子量凝集体を含む。処理された試料は、高分子量凝集体を０．０５％未満含み、凝集体全てでは４％未満を含んだ。蛍光色素分析によって測定されたＤＮＡは、９８％超減少していたが、ｑＰＣＲは、減少が実際は９９．９９９％超であったことを示した。ヒストンタンパク質は少なくとも９８％減少し、Ｃｙｇｎｕｓ  ＥＬＩＳＡによって測定された全体的な宿主タンパク質レベルは６２％減少していた。抗体回収率は９９％であった。
【００５３】
実施例２
ＴＲＥＮと疎水性電気陽性粒子状物質のＤｏｗｅｘ  ＡＧ１ｘ２の１：１の混合物の代わりにＴＲＥＮを代用すること以外は、実施例１の手順を繰り返した。全ての結果は、抗体回収率が９５％に減少したことや分析サイズ排除クロマトグラフィーが、実施例１の後に明らかな２つの強い疎水性の汚染物質が除去されたこと以外は、名目上同じであった。
【００５４】
実施例３
細胞含有収集物を、１％アラントインに加えて０．０５％オクタン酸を用いて処理したこと以外は、実施例２の手順を繰り返した。宿主タンパク質の汚染は７０％超減少し、抗体回収率は９０％まで減少した。オクタン酸は処理された試料中で検出できず、固体物質に結合していることを示しているように見えた。凝集体は３％未満に減少した。ＤＮＡおよびヒストン含有量は９９％減少した。
【００５５】
実施例４
２０ｍＳ／ｃｍの電気伝導率を与える濃度までＮａＣｌを細胞含有収集物に加え、ｐＨを６．０に調整した以外は、ＩｇＭモノクローナル抗体を用いて実施例２の手順を繰り返した。未処理の収集物の凝集体含有量は３０％超であった。カラムを５０ｍＭのＭＥＳ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０に平衡化した。全ての高分子量凝集体とともに９９％のＤＮＡおよびヒストンを除去した。全凝集体含有量は約２％に減少した。抗体回収率はわずか８４％であった。全ての宿主タンパク質は６７％減少した。実験は、電気伝導率２０ｍＳ／ｃｍを達成するために加えられた濃度より高い、塩化ナトリウムの５０ｍＭの増加量の添加に対応する、電気伝導率２５ｍＳ／ｃｍでずっと繰り返した。抗体回収率は９８％に増加し、他の全ての測定値は同じままであった。実験は４０ｍＳ／ｃｍの電気伝導率で繰り返した。宿主タンパク質の減少は約４７％に減少したが、他の全ての性能測定値は変わらなかった。
【００５６】
実施例５
オクタン酸の代わりに０．０２５％エタクリジンを代用し、金属親和性リガンドイミノ二酢酸（Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）およびスチレンジビニルベンゼン粒子（Ｃｈｅｌｅｘ  １００，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を１：１の混合で有するアクリレートベースの多孔質粒子を充填したカラムを使用すること以外は、実施例３の手順を繰り返した。処理された試料は黄色を含まず、一方、クロマトグラフィー培地は強い黄色で、エタクリジンの除去を示した。ＤＮＡ、ヒストン、ヌクレオソームは９９％減少し、抗体回収率は９９％であった。高分子量凝集体を完全に除去し、全ての凝集体は２％未満に減少した。分析ＳＥＣはまた、強い疎水性汚染物質の除去を示した。全ての宿主タンパク質汚染は６３％減少した。
【００５７】
実施例６
負荷電疎水性相互作用粒子（Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  Ｔ−ｂｕｔｙｌ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を、ＰｒｏｆｉｎｉｔｙおよびＣｈｅｌｅｘとともに１：１：１の比で混合して含むこと以外は、実施例５の手順を繰り返した。処理された試料は黄色を含まず、一方、クロマトグラフィー培地は強い黄色で、エタクリジンの除去を示した。ＤＮＡ、ヒストン、ヌクレオソームは９９％減少し、抗体回収率は９９％であった。高分子量凝集体を完全に除去し、全ての凝集体は２％未満に減少した。分析ＳＥＣはまた強い疎水性汚染物質の除去を示した。全ての宿主タンパク質汚染は６４％減少した。
【００５８】
実施例７
実施例２の処理に対して、遠心分離および精密濾過によって清澄化した収集物を比較して、固定化プロテインＡ（ｒＡＦ  プロテインＡ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍ，Ｔｏｓｏｈ）に関する動的結合実験を行った。精密濾過された物質の動的結合能力は２８ｍｇ／ｍＬであった。実施例３の物質の動的結合能力は３５ｍｇ／ｍＬであった。プロテインＡの精製後の精密濾過された物質の宿主タンパク質含有量は７９２ｐｐｍであった。実施例３で処理された物質の宿主タンパク質含有量は１ｐｐｍ未満であった。
【００５９】
実施例８
試料を２倍の水で希釈し、５０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液をｐＨ８．０に改質することによって、使用ｐＨを８．０に上げ、細胞培養上清の電気伝導率を４．７に減少させること以外は、実施例２の手順を使用した。全体的な宿主タンパク質の減少は８３％まで上昇したが、凝集体除去は、実施例２よりも約５０％効果が低かった。
【００６０】
実施例９
粒子の全体的な割合を２％から５％に増加させること以外は、実施例２の手順を使用した。結果は、抗体回収率が８４％まで減少したこと以外は、名目上変わらなかった。次の実験において、全体の粒子の割合が２％で、Ｄｏｗｅｘ  ＡＧｌｘ２によって表される割合は２５％、１２．５％のそれぞれに減少したが、抗体回収率は９７％と９８％にそれぞれ上昇した。疎水性汚染物質の除去は、減少したＤｏｗｅｘレベルで依然と有効であった。他の全ての結果は、名目上、実施例２と同等であった。
【００６１】
実施例１０
Ｄｏｗｅｘ  ＡＧｌｘ２をＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑに置き換えること以外は、実施例２の手順を繰り返した。ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑは、残留するエタクリジンをより効果的に除去した。その他の点では結果は類似していた。
【００６２】
実施例１１
カプリル酸を０．４％まで増加させ、使用ｐＨを５．２まで減少させ、ＴＲＥＮ粒子を添加する前に２時間インキュベートし、その後、固体を除去する前に４時間インキュベートすること以外は、実施例３の手順を繰り返した。凝集体含有量は０．１％未満に減少した。宿主タンパク質は９９．９％減少した。
【００６３】
実施例１２
使用ｐＨ５．６以外は、実施例１２の物質および手順をＩｇＭモノクローナル抗体を含む細胞培養収集物に適用した。凝集体は、非凝集抗体と比較して最初の２２％から０．１％未満に減少した。宿主タンパク質は９８％超減少した。
【００６４】
上述の実施例が、粒子、モノリス、膜、および繊維上の化学基、ならびに負荷電基と正荷電キレート剤、負荷電キレート剤と正荷電キレート剤、負荷電キレート剤と正荷電基、および疎水性相互作用リガンドなどの他の化学反応性と組み合わさった両方の組み合わせを使用することは当業者には明らかであろう。本発明の異なる明白な極めて重要な特徴であるが、ＩｇＧおよびＩｇＭの抗体に関するこれらの多様な実施例にかかわらず、さらに多くのそのような組み合わせが考えられること、および上述のものと同様の利点を生むことが予測できる場合、抗体以外の多くの種類のタンパク質に適用され得ることは、さらに明らかであろう。
【００６５】
本発明は、所望のレベルの精製を達成するために、さまざまな精製方法と組み合わされてもよい。例として、限定されないが、プロテインＡなどの抗体の精製に一般的に使用される他の方法、他のタイプの親和性クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、固定化金属親和性クロマトグラフィー、およびさらなる混合モードクロマトグラフィー法を含む。さまざまな方法の適切な条件を考案し、特定の抗体の必要な精製を達成するためにそれらを本発明と統合することは、当業者の範囲内である。
【００６６】
本明細書の全ての引用文献は、それぞれの個別の文献または特許または特許出願が、全ての目的のためにその全体を参照することによって組み込まれるように具体的に個別に示されるのと同じ程度まで、その全体を全ての目的のために参照することによって組み込まれる。参照によって組み込まれる文献および特許または特許出願が、本明細書に含まれる開示と矛盾するという点で、本明細書は、いかなるそのような矛盾するものに取って代わり、および／または優先されることが意図される。
【００６７】
本明細書および請求項で使用される要素、クロマトグラフィー条件などの量を表す全ての数は、全ての例において、「約」の語で修飾されると理解されるものとする。したがって、反対に示されない限り、本明細書および添付の請求項に記載の数値パラメーターは、本発明によって得られることが求められる所望の成績によって変わり得る近似値である。
【００６８】
本発明の多くの修正および変形が、当業者には明らかであるように、その精神および範囲から逸脱しないでなされ得る。本明細書に記載された具体的な実施形態は、単なる例として示され、それはいかなる点においても限定を意図しない。本明細書および実施例は例示としてのみ見なされることが意図され、本発明の正確な範囲および精神は以下の請求項によって示される。
【国際調査報告】
2016513245.tif 000002
2016513245.tif 000003
2016513245.tif 000004