(57)【要約】  本発明は、ペプチドおよびペプチド組成物、ならびにそれによる体重の制御および肥満の処置の方法を提供する。
2016513645.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドであって、式中、
Ｘ１はＫ、ＨまたはＲであり、
Ｘ２はＨ、ＲまたはＫであり、
Ｘ３はＧ、ＡまたはＰであり、
Ｘ４はＬ、Ｒ、ＩまたはＶであり、
Ｘ５はＹ、ＦまたはＭであり、
Ｘ６はＮまたはＱであり、
Ｘ７はＬ、ＶまたはＩであり、
Ｘ８はＫ、ＲまたはＨであり、
Ｘ９はＱ、ＮまたはＳであり、
Ｘ１０はＣであり、
Ｘ１１はＫ、ＨまたはＲであり、
Ｘ１２はＭ、Ｆ、ＷまたはＹであり、
Ｘ１３はＳ、Ｔ、ＮまたはＱであり、
Ｘ１４はＬ、ＶまたはＩであり、
Ｘ１５はＮ、ＱまたはＳであり、
Ｘ１６はＧ、Ａ、ＳまたはＰであり、
Ｘ１７はＱ、Ｎ、ＳまたはＴであり、
Ｘ１８はＲ、ＫまたはＨである、単離されたペプチド。
【請求項２】
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドであって、式中、
Ｘ１はＫ、ＨまたはＲであり、
Ｘ２はＨ、ＲまたはＫであり、
Ｘ３はＧ、ＡまたはＰであり、
Ｘ４はＬ、Ｒ、ＩまたはＶであり、
Ｘ５はＹ、ＦまたはＭであり、
Ｘ６はＮまたはＱであり、
Ｘ７はＬ、ＶまたはＩであり、
Ｘ８はＫ、ＲまたはＨであり、
Ｘ９はＱ、ＮまたはＳであり、
Ｘ１０はＣであり、
Ｘ１１はＫ、ＨまたはＲであり、
Ｘ１２はＭ、Ｆ、ＷまたはＹであり、
Ｘ１３はＳ、Ｔ、ＮまたはＱである、単離されたペプチド。
【請求項３】
（ａ）アミノ酸配列ＫＨＧＬＹＮＬＫＱＣＫＭＳＬＮＧＱＲを有する単離されたペプチド；（ｂ）アミノ酸配列ＫＨＧＬＹＮＬＫＱＣＫＭＳＬＮＧＱＲを有するペプチドであって、位置１におけるＫがＲもしくはＨと置換され、位置２におけるＨがＲもしくはＫと置換され、位置８におけるＫがＲもしくはＨと置換され、位置１１におけるＫがＲもしくはＨと置換され、位置１８におけるＲがＫもしくはＨと置換され、またはそれらの任意の組合せである、ペプチド；または、ｃ）前記の（ａ）もしくは（ｂ）のいずれかの薬学的に許容される塩であって、前記ペプチドが完全長インスリン様成長因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ−２）ではない、ペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドが、そのＮ末端、そのＣ末端、またはそのＮ末端とＣ末端の両方に連結したポリアルキレングリコール部分をさらに含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の単離されたペプチド。
【請求項５】
前記ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
前記ＰＥＧが約１０，０００ｇ／ｍｏｌから約３０，０００ｇ／ｍｏｌまでの分子量を有する、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドが環化している、請求項１から３のいずれか１項に記載の単離されたペプチド。
【請求項８】
薬学的に許容される担体中に請求項１から７のいずれか１項に記載の単離されたペプチドを含む組成物。
【請求項９】
体重制御剤をさらに含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
対象において脂肪細胞分化を阻害するための方法であって、請求項１から７のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項８もしくは９に記載の組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１１】
対象において体重増加を阻害するための方法であって、請求項１から７のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項８もしくは９に記載の組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１２】
対象において脂肪量を低下させるための方法であって、請求項１から７のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項８もしくは９に記載の組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１３】
対象において肥満を処置するための方法であって、請求項１から４のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項５に記載の組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１４】
対象において体重を低下させるための方法であって、請求項１から４のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項５に記載の組成物の有効量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項１５】
対象において体重を制御するための方法であって、請求項１から７のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項８もしくは９に記載の組成物の有効量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項１６】
前記量が、前記対象において体重増加を低下させ、または体重減少を誘導するのに効果的である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記量が、前記対象の肥満度指数を低下させることにおいて効果的である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象が、少なくとも約２５ｋｇ／ｍ２の肥満度指数を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象が、少なくとも約３０ｋｇ／ｍ２の肥満度指数を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記投与が、少なくとも約１６週間または約２４週間の期間、継続される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象が少なくとも５％の体重減少を達成するか、または前記対象の肥満度指数が約２５ｋｇ／ｍ２未満まで低下するまで、前記投与が継続される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
対象において脂肪減少を誘導するための方法であって、請求項１から７に記載のペプチドまたは請求項８もしくは９に記載の組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２３】
前記対象がインスリン抵抗性を有する、請求項１０から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象がインスリン抵抗性を有さない、請求項１０から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１０から２４のいずれか１項に記載の方法を行うための薬物の調製における、請求項１から７のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項８から９のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項２６】
請求項１０から２４のいずれか１項に記載の方法を行うための、請求項１から７のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項８から９のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［優先権の言明］
本出願は、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）に基づき、２０１３年３月１２日に出願された米国特許出願第６１／７７７，７７３号および２０１３年９月１１日に出願された米国特許出願第６１／８７６，５９２号の利益を主張し、これらのそれぞれの全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
［政府援助の言明］
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により授与された認可番号ＡＧ０２３３１およびＡＲ０６１１６４に基づく政府援助でなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
［発明の分野］
本発明は、ペプチド、そのペプチドを含有する医薬製剤、ならびに体重の制御および肥満の処置におけるそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
インスリン様成長因子結合タンパク質−２（ＩＧＦＢＰ−２）は、ＩＧＦＢＰファミリーのメンバーである、３６，０００ダルトンのタンパク質である。６つの型の高親和性ＩＧＦ結合タンパク質がある。これらのタンパク質は、インスリン様成長因子ＩおよびＩＩと結合して輸送タンパク質として作用することに加えて、それらのＩＧＦに結合する能力とは無関係のいくつかの作用をもつことが知られている。
【０００５】
ＩＧＦＢＰ−２は、血清中で２番目に豊富な結合タンパク質である。それは、ヒトにおいて１００〜６００ｎｇ／ｍｌの間で変動する濃度で循環している。タンパク質濃度は、胎児期中および出生時において高く、小児期および青年期中、徐々に降下する。６０〜８０歳の間にわずかな上昇、およそ２５％の増加が生じる。ＩＧＦＢＰ−２の血清中濃度は、ホルモンおよび栄養素によって調節されている。空腹は、ＩＧＦＢＰ−２のかなりの増加を引き起こし、摂食（特に、タンパク質を摂食すること）は、濃度を正常へと回復させる。濃度はまた、インスリンまたは成長ホルモンの投与によっても抑制され、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）により増加する。これは、一つには、成長ホルモンおよびインスリンの抑制による可能性があり、それらのどちらもＩＧＦ−１を投与することにより抑制される。
【０００６】
本発明は、ＩＦＧＢＰ−２のペプチド、ならびに肥満の処置および体重の制御におけるそれらの使用方法を提供することにより当技術分野における以前の欠陥を克服する。
【発明の概要】
【０００７】
一態様において、本発明は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドであって、式中、
Ｘ１はＫ、ＨまたはＲであり、
Ｘ２はＨ、ＲまたはＫであり、
Ｘ３はＧ、ＡまたはＰであり、
Ｘ４はＬ、Ｒ、ＩまたはＶであり、
Ｘ５はＹ、ＦまたはＭであり、
Ｘ６はＮまたはＱであり、
Ｘ７はＬ、ＶまたはＩであり、
Ｘ８はＫ、ＲまたはＨであり、
Ｘ９はＱ、ＮまたはＳであり、
Ｘ１０はＣであり、
Ｘ１１はＫ、ＨまたはＲであり、
Ｘ１２はＭ、Ｆ、Ｗ、またはＹであり、
Ｘ１３はＳ、Ｔ、ＮまたはＱであり、
Ｘ１４はＬ、ＶまたはＩであり、
Ｘ１５はＮ、ＱまたはＳであり、
Ｘ１６はＧ、Ａ、ＳまたはＰであり、
Ｘ１７はＱ、Ｎ、ＳまたはＴであり、
Ｘ１８はＲ、ＫまたはＨである、単離されたペプチドを提供する。
【０００８】
さらなる態様において、本発明は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドであって、式中、
Ｘ１はＫ、ＨまたはＲであり、
Ｘ２はＨ、ＲまたはＫであり、
Ｘ３はＧ、ＡまたはＰであり、
Ｘ４はＬ、Ｒ、ＩまたはＶであり、
Ｘ５はＹ、ＦまたはＭであり、
Ｘ６はＮまたはＱであり、
Ｘ７はＬ、ＶまたはＩであり、
Ｘ８はＫ、ＲまたはＨであり、
Ｘ９はＱ、ＮまたはＳであり、
Ｘ１０はＣであり、
Ｘ１１はＫ、ＨまたはＲであり、
Ｘ１２はＭ、Ｆ、Ｗ、またはＹであり、
Ｘ１３はＳ、Ｔ、ＮまたはＱである、単離されたペプチドを提供する。
【０００９】
一態様において、本発明は、ａ）アミノ酸配列ＫＨＧＬＹＮＬＫＱＣＫＭＳＬＮＧＱＲを含むペプチド；ｂ）アミノ酸配列ＫＨＧＬＹＮＬＫＱＣＫＭＳＬＮＧＱＲを含むペプチドであって、任意の組合せで、位置１におけるＫがＲもしくはＨと置換され、位置２におけるＨがＲもしくはＫと置換され、位置８におけるＫがＲもしくはＨと置換され、位置１１におけるＫがＲもしくはＨと置換され、位置１８におけるＲがＫもしくはＨと置換される、ペプチド；またはｃ）上記の（ａ）もしくは（ｂ）のいずれかの薬学的に許容される塩であって、前記ペプチドが完全長インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ−２）ではない、ペプチドを提供する。
【００１０】
さらなる態様において、本発明のペプチドは、そのＮ末端、そのＣ末端、またはそのＮ末端とＣ末端の両方に（例えば、前記ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に含まれる反応性システイン残基を介して）連結したポリアルキレングリコール部分を含むことができる。
【００１１】
追加の態様において、本発明のペプチドは、薬学的に許容される担体を含む組成物において存在することができる。いくつかの態様において、前記組成物は、体重制御剤（ｗｅｉｇｈｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｇｅｎｔ）をさらに含むことができ、その体重制御剤は、食欲抑制剤、リパーゼ阻害剤、抗うつ剤、抗けいれん剤、抗前脂肪細胞分化因子、およびそれらの組合せであり得るが、それらに限定されない。
【００１２】
追加の実施形態において、本発明は、対象において脂肪細胞分化を阻害する方法であって、本発明のペプチドまたは組成物の有効量を前記対象に投与することを含む方法を提供する。
【００１３】
対象において体重増加を阻害する方法であって、本発明のペプチドまたは組成物の有効量を前記対象に投与することを含む方法もまた本明細書で提供される。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本発明は、対象において体重を低下させる方法であって、本発明のペプチドまたは組成物の有効量を前記対象に投与することを含む方法を提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、対象において体脂肪量を低下させる方法であって、本発明のペプチドまたは組成物の有効量を前記対象に投与することを含む方法を提供する。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、対象（例えば、体重を制御することを必要としている対象）において体重を制御するための方法であって、本発明の組成物またはペプチドを、体重を制御するのに有効な量で前記対象に投与することを含む方法を提供する。
【００１７】
加えて、本発明は、対象（例えば、肥満を処置することを必要としている対象）において肥満を処置する方法であって、本発明の組成物またはペプチドを、肥満を処置するのに有効な量で前記対象に投与することを含む方法を提供する。
【００１８】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載されている方法を行うための、および／または本明細書に記載されている方法を行うための薬物の調製のための、本明細書に記載されているペプチドまたは組成物の使用である。
【００１９】
本発明は、下記で、より詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ−１Ｂ】ＩＧＦＢＰ−２およびそれのヘパリン結合ドメインは、ＩＧＦＢＰ−２ヌルマウスから単離された前脂肪細胞の分化を阻害する。（Ａ）ＩＧＦＢＰ−２−／−マウス由来の初代前脂肪細胞を、本明細書に記載された手順に従って鼠径部脂肪パッドから単離した。コンフルエンスに達してから２日後、細胞を分化培地で処理した（ＤＭ、レーン１〜８）。その後、この培地にＨＢＤ１ペプチド（ＨＢＤ１、レーン２）；スクランブル化ＨＢＤ１ペプチド（ＨＢＤ１  Ｃｔｒｌ、レーン３）；ＨＢＤ２ペプチド（ＨＢＤ２、レーン４）；ＩＧＦＢＰ−５  Ｃ末端ＨＢＤペプチド（ＨＢＤ２  Ｃｔｒｌ、レーン５）；突然変異型ＨＢＤ１配列を含むＩＧＦＢＰ−２タンパク質（ＨＢＤ１突然変異体ＩＧＦＢＰ２、レーン６）；突然変異型ＨＢＤ２配列を含むＩＧＦＢＰ−２（ＨＢＤ２突然変異体ＩＧＦＢＰ２、レーン７）；または天然ＩＧＦＢＰ−２（ＷＴ  ＩＧＦＢＰ−２、レーン８）を追加した。細胞可溶化液を、抗アディポネクチン抗体、抗ａＰ２抗体、および抗ＰＰＡＲγ抗体、それぞれでイムノブロット（ＩＢ）した。負荷対照として、ブロットを抗β−アクチン抗体でイムノブロットした。３つの別個の実験からの結果の定量的分析を実施し、結果は、β−アクチン発現に対して表されている。各値は、平均値±ＳＥを表す。＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１は、２つの処理間の有意差を意味する。ｐ，ＮＳは、２つの処理間での有意差なしを示す。（Ｂ）ＩＧＦＢＰ−２−／−マウスから単離された前脂肪細胞を、分化培地（ＤＭ）、ＤＭ＋野生型ＩＧＦＢＰ−２（Ｗｔ  ＩＧＦＢＰ２）、またはＤＭ＋ＩＧＦ−Ｉ非結合性ＩＧＦＢＰ２（ＩＧＦ−Ｉ  ＮＢ  ＩＧＦＢＰ−２）のいずれかで処理した。細胞可溶化液を、抗アディポネクチン抗体、抗ａＰ２抗体、および抗ＰＰＡＲγ抗体、それぞれでイムノブロット（ＩＢ）した。負荷対照として、ブロットを抗β−アクチン抗体でイムノブロットした。
【図２】ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−２突然変異体、または異なるヘパリン結合ドメインを含有するペプチドに曝されたＩＧＦＢＰ−２−／−前脂肪細胞のオイルレッドＯ染色。ＩＧＦＢＰ−２−／−マウス由来の初代前脂肪細胞を、標準培地中で培養した。それらがコンフルエンスに達してから２日後、分化培地（ＤＭ）単独か、またはＩＧＦＢＰ−２  ＨＢＤ１配列を含有するペプチド（ＨＢＤ１）、スクランブル化ＨＢＤ１配列を含有するペプチド（ＨＢＤ１  Ｃｔｒｌ）、置換型ＨＢＤ１配列を含有するＩＧＦＢＰ−２の突然変異型（ＨＢＤ１  ＭＰ）、野生型ウシＩＧＦＢＰ−２（ＷＴ  ＩＧＦＢＰ−２）、ＩＧＦＢＰ−２  ＨＢＤ２配列を含有するペプチド（ＨＢＤ２）、ＩＧＦＢＰ−５  Ｃ末端ＨＢＤ配列を含有するペプチド（ＨＢＤ２  Ｃｔｒｌ）、もしくは置換型ＨＢＤ２配列を含有するＩＧＦＢＰ−２の突然変異型（ＨＢＤ２  ＭＰ）を加えたこの培地かのいずれかで、細胞を処理した。４８時間後、培地を、０．５ｍＭインスリンを加えた標準培地に交換した。さらに４８時間後、培地を標準培地に交換した。培養物を、本明細書における手順に従ってオイルレッドＯで染色した。結果を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量化し、全面積（ピクセル）で割られたオイルレッドＯ陽性の面積（ピクセル）として表した。＊＊＊ｐ＜０．００１は、２つの処理間の有意差を示す。ｐ，ＮＳは、２つの処理間での有意差なしを示す。３つの独立した実験の代表的な画像が示されている。
【図３Ａ−３Ｃ】ＩＧＦＢＰ−２のヘパリン結合ドメインは、ＩＧＦＢＰ−２−／−マウスにおいて体重増加を抑制するが、グルコース代謝および食物摂取量に影響しない。ＩＧＦＢＰ−２−／−マウスを、ＩＧＦＢＰ−２  ＨＢＤ１配列を含有するペグ化合成ペプチド（ＰｅｇＨＢＤ１、ｎ＝８）、ＩＧＦＢＰ−２  ＨＢＤ２配列（ＰｅｇＨＢＤ２、ｎ＝１０）、またはペグ化合成対照ペプチド（ＰｅｇＣｔｒｌ、ｎ＝１８）のいずれかで、本明細書に記載された手順に従って、１２週間、処置した。野生型マウス（Ｗｔ、ｎ＝８）にリン酸緩衝食塩水を注射した。（Ａ）週１回の時点でのマウスの平均体重増加を各群について計算した。（Ｂ）１日の平均飼料摂取量を各群について計算した。（Ｃ）経口グルコース負荷試験を、全ての群のマウスにおいて、１２週間の処置後、本明細書に記載された手順に従って実施した。各バーの値は平均値±ＳＥを表す。異なる文字は、２つの処置間の有意差を表す。
【図４Ａ−４Ｂ】ＩＧＦＢＰ−２のヘパリン結合ドメインは、ＩＧＦＢＰ−２−／−マウスにおいて、体脂肪量増加を抑制し、除脂肪体重の減少を防ぐ。ＩＧＦＢＰ−２−／−マウスを、図３の説明に記載されているように処置した。各群からの体脂肪量および除脂肪体重を、Ｅｃｈｏ−ＭＲＩスキャニングを用いて、０週間目および１２週間目、それぞれにおいて分析した。各群における０週間目と１２週間目の間での総脂肪量または非脂肪量の変化は、体重に占めるパーセンテージとして表された脂肪量または非脂肪量の変化として提示されている（Ａ、Ｂ）。各バーの値は平均値±ＳＥを表す。＊ｐ＜０．０５は、２つの処置間の有意差を示す。
【図５Ａ−５Ｃ】ＩＧＦＢＰ−２のヘパリン結合ドメインは、ＩＧＦＢＰ−２−／−マウスにおいて、鼠径部脂肪および内臓脂肪形成を抑制する。ＩＧＦＢＰ−２−／−マウスを、図３の説明に記載されているように処置した。屠殺時に、各マウスの肝臓および心臓を収集し、重量を測定した（Ａ）。鼠径部脂肪および内臓脂肪を、本明細書に記載された手順に従って解剖し、重量を測定した。結果は、体重に占めるパーセンテージとして表された鼠径部脂肪量または内臓脂肪量として示されている（Ｂ、Ｃ）。各バーの値は平均値±ＳＥを表す。＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１は、２つの処置間の有意差を示す。ｐ，ＮＳは、２つの処置間での有意差なしを示す。
【図６Ａ−６Ｃ】ＩＧＦＢＰ−２のヘパリン結合ドメインは、ＩＧＦＢＰ−２−／−マウスにおいて、脂肪パッドトリグリセリド含有量および血清中アディポネクチンレベルを減少させるが、ＨＢＤ２は血清中レプチンを刺激する。ＩＧＦＢＰ−２−／−マウスを、図３の説明に記載されているように処置した。１２週間目の終わりに、各マウスから、それらが屠殺される前に、血液を収集した。（Ａ）右鼠径部脂肪パッド中のトリグリセリドレベルを、本明細書に記載された手順に従って測定した。血清中アディポネクチンレベル（Ｂ）およびレプチンレベル（Ｃ）を製造会社の使用説明書に従って測定した。各バーの値は平均値±ＳＥとして表されている。＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１は、２つの処置間の有意差を示す。
【図７】ＩＧＦＢＰ−２−／−マウス由来の初代前脂肪細胞を、標準培地中で培養した。（Ａ）それらがコンフルエンスに達してから２日後、分化培地（ＤＭ）単独か、または野生型ＩＧＦＢＰ−２（Ｗｔ  ＩＧＦＢＰ２）、マウスＩＧＦＢＰ−２  ＨＢＤ１配列を含有するペプチド（ｍＨＢＤ１）、およびヒトＩＧＦＢＰ−２  ＨＢＤ１配列を含有するペプチド（ｈＨＢＤ１）を加えたこの培地のいずれかで細胞を処置した。細胞可溶化液を、抗アディポネクチン抗体でイムノブロット（ＩＢ）した。負荷対照として、ブロットを抗β−アクチン抗体でイムノブロットした。（Ｂ）分化培地（ＤＭ）単独でか、またはＨＢＤ１ペプチド（ＨＢＤ１）、ＨＢＤ２ペプチド（ＨＢＤ２）、ＩＧＦ−Ｉ（１００ｎｇ／ｍｌ、ＤＭ＋ＩＧＦ−Ｉ）、ＩＧＦ−Ｉ＋ＨＢＤ１（ＤＭ＋Ｉ＋ＨＢＤ１）、ＩＧＦ−Ｉ＋ＨＢＤ２（ＤＭ＋Ｉ＋ＨＢＤ２）、および野生型ＩＧＦＢＰ−２（Ｗｔ  ＩＧＦＢＰ２）を加えたこの培地のいずれかで細胞を処置した。細胞可溶化液を、抗アディポネクチン抗体、抗ａＰ２抗体、および抗ＰＰＡＲγ抗体、それぞれでイムノブロット（ＩＢ）した。負荷対照として、ブロットを抗β−アクチン抗体でイムノブロットした。
【図８】卵巣切除した（ＯＶＸ）マウスの４週間のＨＢＤ−２処置後、体重および総脂肪量は有意に減少している。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、下記で、より詳細に説明される。この説明は、本発明が実行される可能性がある全ての異なる方法の、または本発明に加えられる可能性がある全ての特徴の詳細な目録であることを意図するものではない。例えば、一実施形態に関して例証された特徴は、他の実施形態へ組み込まれてもよいし、特定の実施形態に関して例証された特徴が、その実施形態から削除されてもよい。加えて、本発明から逸脱しない、本明細書に示唆された様々な実施形態への多数のバリエーションおよび付加は、本開示を鑑みれば、当業者には明らかだろう。したがって、以下の特定化は、本発明のいくつかの特定の実施形態を例証することを意図され、それらの全ての順列、組合せ、およびバリエーションを余すところなく特定化することを意図するものではない。
【００２２】
本明細書に引用された全ての特許、特許公開、および非特許文書の開示は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【００２３】
本発明は、脂肪細胞分化を阻害する、ＩＧＢＰ−２タンパク質内に含有されるペプチドの予想外の発見に基づいている。そのようなペプチドは、体重の制御および肥満の処置において治療的用途をもつ。本発明は、ＩＧＦＢＰ−２のペプチド（例えば、ヘパリン結合ドメイン２（ＨＢＤ２））により肥満を処置する方法、体重制御の方法、および脂肪形成を阻害する方法において用いることができる。
【００２４】
したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドであって、式中、
Ｘ１はＫ、ＨまたはＲであり、
Ｘ２はＨ、ＲまたはＫであり、
Ｘ３はＧ、ＡまたはＰであり、
Ｘ４はＬ、Ｒ、ＩまたはＶであり、
Ｘ５はＹ、ＦまたはＭであり、
Ｘ６はＮまたはＱであり、
Ｘ７はＬ、ＶまたはＩであり、
Ｘ８はＫ、ＲまたはＨであり、
Ｘ９はＱ、ＮまたはＳであり、
Ｘ１０はＣであり、
Ｘ１１はＫ、ＨまたはＲであり、
Ｘ１２はＭ、Ｆ、ＷまたはＹであり、
Ｘ１３はＳ、Ｔ、ＮまたはＱであり、
Ｘ１４はＬ、ＶまたはＩであり、
Ｘ１５はＮ、ＱまたはＳであり、
Ｘ１６はＧ、Ａ、ＳまたはＰであり、
Ｘ１７はＱ、Ｎ、ＳまたはＴであり、
Ｘ１８はＲ、ＫまたはＨである、単離されたペプチドを提供する。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドであって、式中、
Ｘ１はＫ、ＨまたはＲであり、
Ｘ２はＨ、ＲまたはＫであり、
Ｘ３はＧ、ＡまたはＰであり、
Ｘ４はＬ、Ｒ、ＩまたはＶであり、
Ｘ５はＹ、ＦまたはＭであり、
Ｘ６はＮまたはＱであり、
Ｘ７はＬ、ＶまたはＩであり、
Ｘ８はＫ、ＲまたはＨであり、
Ｘ９はＱ、ＮまたはＳであり、
Ｘ１０はＣであり、
Ｘ１１はＫ、ＨまたはＲであり、
Ｘ１２はＭ、Ｆ、ＷまたはＹであり、
Ｘ１３はＳ、Ｔ、ＮまたはＱである、単離されたペプチドを提供する。
【００２６】
したがって、本発明は、Ｘ１からＸ１８までと定義される１８個のアミノ酸（すなわち、１８マーのペプチド）を含み得、それから本質的になり得、またはそれからなり得るペプチドを提供し、Ｘ１からＸ１７までと定義される１７個のアミノ酸（すなわち、１７マーのペプチド）を含み得、それから本質的になり得、またはそれからなり得るペプチドを提供し、Ｘ１からＸ１６までと定義される１６個のアミノ酸（すなわち、１６マーのペプチド）を含み得、それから本質的になり得、またはそれからなり得るペプチドを提供し、Ｘ１からＸ１５までと定義される１５個のアミノ酸（すなわち、１５マーのペプチド）を含み得、それから本質的になり得、またはそれからなり得るペプチドを提供し、Ｘ１からＸ１４までと定義される１４個のアミノ酸（すなわち、１４マーのペプチド）を含み得、それから本質的になり得、またはそれからなり得るペプチドを提供し、Ｘ１からＸ１３までと定義される１３個のアミノ酸（すなわち、１３マーのペプチド）を含み得、それから本質的になり得、またはそれからなり得るペプチドを提供し、およびＸ１からＸ１２までと定義される１２個のアミノ酸（すなわち、１２マーのペプチド）を含み得、それから本質的になり得、またはそれからなり得るペプチドを提供する。
【００２７】
本発明はまた、ａ）アミノ酸配列ＫＨＧＬＹＮＬＫＱＣＫＭＳＬＮＧＱＲを含み、それから本質的になり、またはそれからなるペプチド；ｂ）アミノ酸配列ＫＨＧＬＹＮＬＫＱＣＫＭＳＬＮＧＱＲを含むペプチドであって、任意の組合せで、位置１におけるＫがＲもしくはＨと置換され、位置２におけるＨがＲもしくはＫと置換され、位置８におけるＫがＲもしくはＨと置換され、位置１１におけるＫがＲもしくはＨと置換され、位置１８におけるＲがＫもしくはＨと置換される、ペプチド；またはｃ）上記の（ａ）もしくは（ｂ）のいずれかの薬学的に許容される塩であって、前記ペプチドが完全長インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ−２）ではない、ペプチドを提供する。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本発明のペプチドは、そのＮ末端、そのＣ末端、またはそのＮ末端とＣ末端の両方に連結したポリアルキレングリコール部分を含むことができる。いくつかの実施形態において、ポリアルキレングリコール部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、約１０，０００ｇ／ｍｏｌから約３０，０００ｇ／ｍｏｌまでの分子量を有し得る。
【００２９】
いくつかの実施形態において、単離されたペプチドは、そのペプチドを安定化するために、当業界で公知のような非天然アミノ酸を含むことができる。いくつかの実施形態において、単離されたペプチドは、そのペプチドの血漿中滞留時間を増加させる（例えば、半減期を延ばす）ために、当業界で公知の方法に従って修飾することができる。例えば、ＰｏｌｌａｒｏおよびＨｅｉｎｉｓ「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｔｏ  ｐｒｏｌｏｎｇ  ｐｌａｓｍａ  ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ  ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｒｕｇｓ」Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ  １：３１９〜３２４（２０１０）（その全内容は参照により本明細書に組み入れられている）を参照されたい。
【００３０】
薬学的に許容される担体中に本発明の単離されたペプチドを含む組成物（例えば、医薬製剤）もまた本明細書において提供される。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本発明のペプチドまたは組成物を対象に投与する方法は、そのペプチドまたは組成物の投与の前、後、および／またはそれと同時に体重制御剤を対象に投与することをさらに含むことができる。本発明の体重制御剤の非限定的な例には、当業界で公知のように、食欲抑制剤、リパーゼ阻害剤、抗うつ剤、抗けいれん剤、抗前脂肪細胞分化因子、およびそれらの任意の組合せが挙げられる。
【００３２】
本発明のペプチドおよび組成物を用いる方法もまた本明細書において提供される。したがって、本発明は、対象（例えば、体重の制御および／または肥満の処置を必要としている対象）において体重の制御および／または肥満の処置のための方法であって、本発明のペプチドおよび／または組成物を、体重の制御および／または肥満の処置に有効な量で前記対象に投与することを含む方法を提供する。
【００３３】
対象において体重の制御および／または肥満の処置のための方法のいくつかの実施形態において、ペプチドまたはそのペプチドを含む組成物は、１つもしくは複数の体重制御剤と共同的に、ならびに／または、１つもしくは複数の体重制御剤の投与の前および／もしくは後に、対象に投与することができる。
【００３４】
対象において体重増加を阻害する方法であって、本発明のペプチドまたは組成物の有効量を前記対象に投与することを含む方法もまた本明細書において提供される。
【００３５】
加えて、対象において脂肪形成を阻害する方法であって、本発明のペプチドまたは組成物の有効量を前記対象に投与することを含む方法が本明細書において提供される。
【００３６】
対象において体重を低下させる方法であって、本発明のペプチドまたは組成物の有効量を前記対象に投与することを含む方法が本明細書においてさらに提供される。
【００３７】
さらに、本発明は、対象において脂肪量を低下させる方法であって、本発明のペプチドまたは組成物の有効量を前記対象に投与することを含む方法を提供する。
【００３８】
加えて、対象において肥満を処置する方法であって、本発明のペプチドまたは組成物の有効量を前記対象に投与することを含む方法が本明細書において提供される。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態において、対象はインスリン抵抗性をもち、本発明のいくつかの実施形態において、対象はインスリン抵抗性をもたない。
【００４０】
本発明の方法において、本発明のペプチドおよび／または組成物の量は、前記対象において体重増加を低下させ、もしくは体重減少を誘導するのに有効な量、および／または前記対象の肥満度指数を低下させるのに有効な量である。
【００４１】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、対象は、少なくとも約２５ｋｇ／ｍ２の肥満度指数を有し得、いくつかの実施形態において、対象は、少なくとも約３０ｋｇ／ｍ２の肥満度指数を有し得る。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態において、ペプチドおよび／または組成物は、少なくとも約１６週間または約２４週間の期間、投与することができる。
【００４３】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ペプチドおよび／または組成物は、前記対象が、少なくとも５％の体重減少を達成するまで、または前記対象の肥満度指数が約２５ｋｇ／ｍ２未満まで低下するまで、投与することができる。
【００４４】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ペプチドおよび／または組成物は、前記対象において脂肪減少を誘導するのに有効である量で、および／または前記対象において脂肪細胞分化を阻害する（例えば、脂肪細胞前駆体の成熟脂肪細胞への分化を阻害する）のに有効である量で投与される。したがって、追加の実施形態において、本発明は、対象において脂肪細胞分化を阻害する方法であって、本発明のペプチドまたは組成物の有効量を前記対象に投与することを含む方法を提供する。
【００４５】
本発明のさらなる態様は、本発明の方法を行うための薬物の調製における本発明のペプチドおよび／または組成物の使用を含む。
【００４６】
追加の態様は、本発明の方法を行うための本発明のペプチドおよび／または組成物の使用である。
【００４７】
いくつかの実施形態において、対象は肥満または過体重である。いくつかの実施形態において、対象は肥満または過体重ではない。
【００４８】
本発明の任意の特定の活性化合物の治療的有効量または用量は、化合物ごと、および患者ごとに異なり、とりわけ、達成されるべき効果もしくは結果、患者の状態、および／または送達経路に依存する。いくつかの実施形態において、約０．００１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、１μｇ／ｋｇ）、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、もしくは１．０ｍｇ／ｋｇから約３０、４０、もしくは５０ｍｇ／ｋｇまで（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０ｍｇ／ｋｇ）またはそれ以上の用量が用いられ得る。
【００４９】
本発明の化合物または組成物の投与は、任意の適切な経路によってもよく、それには、クモ膜下腔内注射、皮下、皮膚、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内注射、経鼻、口腔内、舌下、吸入により、インプラント中、マトリックス中、ゲル中、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。
【００５０】
Ａ．定義
本明細書で用いられる場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、または「その（ｔｈｅ）」は、１つ、または１つより多いことを意味する場合がある。例えば、「１つの（ａ）」細胞は、単一細胞または多数の細胞を意味する場合がある。
【００５１】
また本明細書で用いられる場合、「および／または」は、関連の列挙された項目の１つまたは複数のありとあらゆる可能な組合せを指し、かつ包含し、加えて、選択的に解釈される（「または（ｏｒ）」）場合には組合せを欠く。
【００５２】
本明細書で用いられる場合、投与量（例えば、脂肪酸の量）などの測定可能な値を指す時の用語「約」は、特定された量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、またはさらに±０．１％の変動を包含することを意図される。
【００５３】
本明細書で用いられる場合、移行句「から本質的になる」（および文法上の変化形）は、列挙された材料またはステップ、「および特許請求された発明の基本的かつ新規な特性に実質的に影響しない材料またはステップ」を包含すると解釈されるものとする。したがって、本明細書で用いられる場合、用語「から本質的になること」は、「を含む」と同等として解釈されないものとする。
【００５４】
本明細書で用いられる場合、「対象」は、体重制御または肥満の処置が必要であり、または望まれる任意の動物を含む。本発明の対象は、体重制御または肥満の処置を必要としている対象であり得、したがって、いくつかの実施形態において、本発明の方法の対象は、肥満もしくは過体重であり得、および／または肥満もしくは過体重になりやすくあり得る。いくつかの実施形態において、本発明の対象は、体重制御を望む対象、または体重制御が望まれる対象であり得、そのような対象は、肥満または過体重であってもなくてもよい。いくつかの実施形態において、本発明の対象は、哺乳類対象であり得、それはヒト対象であり得る。本発明の対象は、男性または女性であり得、任意の人種または民族性であってもよく、それには、カフカス人、アフリカ系アメリカ人、アフリカ人、アジア人、スペイン系人、インド人などが挙げられるが、それらに限定されない。対象は、任意の年齢であってもよく、それには、生まれたばかりの新生児、生後２８日未満の新生児、幼児、小児、青年、成人、および老人が挙げられる。対象にはまた、獣医学として、または医薬品開発を目的とした、動物対象、特にイヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ブタ、齧歯類（例えば、ラットおよびマウス）、ウサギ、霊長類（非ヒト霊長類を含む）などの哺乳類対象が挙げられ得る。
【００５５】
用語「処置する」、「処置すること」、または「の処置」（およびそれらの文法上の変化形）とは、対象の状態の重症度が低下し、少なくとも部分的に改善し、もしくは寛解すること、および／または少なくとも１つの臨床症状のある程度の軽減、緩和、もしくは減少が達成されること、および／または疾患もしくは障害の進行の遅延があることを意味する。
【００５６】
本明細書で用いられる場合、「処置する」、「処置すること」、または「処置」はまた、疾患または障害をもつ対象に利益を与える任意の型の行動または投与を指し、その利益には、患者の状態の改善（例えば、１つまたは複数の症状の低減または寛解）、治癒などが挙げられる。
【００５７】
本明細書で用いられる場合、「処置有効」量は、対象を（本明細書で定義されているように）処置するのに十分である量である。ある程度の利益が対象に与えられる限り、治療効果が、必ずしも完全または治癒的である必要はないことを当業者は認識しているだろう。
【００５８】
本明細書で用いられる場合、用語「治療的有効量」および「有効量」は、他に指示がない限り、同じ意味であり、処置されことになっている状態、疾患、もしくは障害を改善し、および／または所望の利益もしくは目標（例えば、体重の制御）を達成するのに十分である、本発明の化合物、ペプチド、または組成物の量を意味する。治療的有効量、加えて、剤形、投与経路、および投薬頻度を含む、本発明の対象への本発明の化合物の有効な投与に関連した他の因子の決定は、処置され、または取り組まれることになっている対象および状態、特定の対象における状態の重症度、用いられることになっている特定の化合物、用いられることになっている特定の投与経路、投薬の頻度、ならびに用いられることになっている特定の製剤を含む、遭遇する条件の詳細に依存し得る。本発明の対象についての治療的に有効な処置計画の決定は、医学または獣医学分野の当業者レベルの範囲内である。臨床用途において、有効量は、米国食品医薬品局または相当する外国の機関により推奨される量であり得る。単一の剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置されることになっている対象および特定の投与様式に依存して異なる。
【００５９】
用語「予防する」、「予防すること」、または「の予防」（およびそれらの文法上の変化形）は、本発明の方法を行わない場合に起こるだろうことと比べての、対象における疾患、障害、および／もしくは臨床症状の発生および／もしくは進行の予防および／もしくは遅延、ならびに／または疾患、障害、および／もしくは臨床症状の発生および／もしくは進行の重症度の低下を指す。代表的な実施形態において、用語「予防する」、「予防すること」、または「の予防」（およびそれらの文法上の変化形）は、臨床疾患の他の徴候の有無にかかわらず、対象におけるウイルス血症の発生および／または進行の予防および／または遅延を指す。予防は、完全、例えば、疾患、障害、および／または臨床症状の全くの欠如であり得る。予防はまた、対象における疾患、障害、および／もしくは臨床症状の出現率、ならびに／または発生および／もしくは進行の重症度が、本発明の方法を行わない場合に起こるだろうものより低いような、部分的であり得る。
【００６０】
本明細書で用いられる場合、「予防有効」量は、対象において疾患、障害、および／または臨床症状を（本明細書で定義されているように）予防するのに十分である量である。ある程度の利益が対象に与えられる限り、予防のレベルが、必ずしも完全である必要はないことを当業者は認識しているだろう。
【００６１】
本明細書で用いられる場合、「共同的に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）投与すること」または「同時に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）投与する」は、２つ以上の化合物または組成物が複合効果を生じるのに十分な程度、時間的に接近して投与されることを意味する（すなわち、「共同的に」は「同時に」であってもよく、またはそれは、互いの前後の短い時間内に、例えば逐次的に、起こる２つ以上の事象であってもよい。）。同時投与または共同的な投与は、投与前に化合物を混合することにより、または同じ時点であるが、異なる解剖学的部位に化合物を投与することにより、および／または異なる投与経路を用いることにより、行われてもよい。
【００６２】
本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容される」は、化合物または組成物が、疾患の重症度および処置の必要性を考慮して過度に有害な副作用なしに、本明細書に記載された処置を達成するのに対象への投与に適していることを意味する。
【００６３】
本明細書で用いられる場合、「体重制御剤」は、任意の体重制御剤を含み、それには、当業界で公知のような、抗前脂肪細胞分化因子；シブトラミン、フェンテルミン、ジエチルプロピオン、フェンジメトラジンなどの食欲抑制剤；オルリスタットなどのリパーゼ阻害剤；ブプロピオンなどの抗うつ剤；トピラメート、ゾニサミド、およびメトホルミンなどの抗けいれん剤が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６４】
本明細書で用いられる場合、「ポリアルキレンオキシド」は知られており（例えば、米国特許第７，４６２，６８７号参照）、それには、ポリ（エチレングリコール）、すなわち「ＰＥＧ」が挙げられる。追加の例は、ＳまたはＮなどのヘテロ原子を含有してもよく、典型的には、Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−ＮＲＣＨ２ＣＨ２２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＲ−、および−ＳＨＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ−などの直鎖ポリアルキレンオキシドであり、ここで上記式中、ＲはＨまたは低級アルキル（好ましくはメチル）であり、ｘは、分子について約１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、または１００，０００ダルトンまたはそれ以上の総数平均分子量をもたらすかまたは生じる整数である。
【００６５】
本明細書で用いられる場合、「類似体」は、その親化合物の生理学的活性を有するペプチド、および天然に存在する親ペプチドのアミノ酸配列とは異なる１個または複数（例えば、２個、３個、４個、５個、または６個、またはそれ以上）のアミノ酸を含むペプチドである。そのような類似体は、好ましくは、親ペプチドの生理学的活性の少なくとも約７０％を有する。そのような異なるアミノ酸は、付加、置換、欠失、またはそれらの組合せであってもよく、それには、非天然の側鎖基の付加およびバックボーンリンクが挙げられる。ペプチドの、その類似体を作製する修飾は、知られている。例えば、米国特許第７，３２３，５４３号参照；米国特許第７，４８２，１７１号、第７，４５９，１５２号、および第７，３９３，９１９号も参照されたい。
【００６６】
Ｂ．活性化合物
本明細書で用いられる場合、アミノ酸の一文字コードは以下である：Ａ（Ａｌａ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｋ（Ｌｙｓ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｍ（Ｍｅｔ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｐ（Ｐｒｏ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｗ（Ｔｒｐ）、およびＹ（Ｔｙｒ））。
【００６７】
ヒトインスリン様成長因子結合タンパク質−２（ＩＧＦＢＰ−２）のアミノ酸配列が下記に示されている。ペプチドＫＨＧＬＹＮＬＫＱＣＫＭＳＬＮＧＱＲは、下記の配列において太字で示されている。
【００６８】
【表１】
2016513645.tif 000003
【００６９】
本発明の活性化合物の非限定的な例には、アミノ酸配列ＫＨＧＬＹＮＬＫＱＣＫＭＳＬＮＧＱＲを含むか、それから本質的になるか、もしくはそれからなるペプチドが挙げられ、アミノ酸配列ＫＨＧＲＹＮＬＫＱＣＫＭＳＬＮＧＱＲを含むか、それから本質的になるか、もしくはそれからなるペプチドが挙げられ、およびアミノ酸配列ＫＨＧＬＹＮＬＫＱＣＫＭＳＬＮＧＱＲを含むか、それから本質的になるか、もしくはそれからなるペプチド（このペプチドに示された１８個のアミノ酸は、Ｎ末端からＣ末端まで連続して１〜１８の番号が付けられている）であって、任意の組合せで、位置１におけるＫがＲもしくはＨと置換され、位置２におけるＨがＲもしくはＫと置換され、位置８におけるＫがＲもしくはＨと置換され、位置１１におけるＫがＲもしくはＨと置換され、位置１８におけるＲがＫもしくはＨと置換される、ペプチド、または上記で示されたペプチドのいずれかのプロドラッグ、類似体、および／もしくは薬学的に許容される塩が挙げられる。本発明のペプチドは、完全長インスリン様成長因子結合タンパク質−２（ＩＧＦＢＰ−２）ではない。
【００７０】
本発明のペプチドにおけるアミノ酸は、ＤまたはＬの立体配置であり得る。例えば、全てＤの立体配置であるか、全てＬの立体配置であるか、任意の組合せでいくつかのＤおよびいくつかのＬの立体配置であり得る。
【００７１】
本発明の活性化合物の非限定的な例には、本発明のペプチド、その類似体、そのいずれかのプロドラッグ、またはそのいずれかの薬学的に許容される塩が挙げられる。
【００７２】
本発明の化合物の追加の例には、最初の１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ末端アミノ酸が欠失しており、および／または最初の１個、２個、３個、もしくは４個のＣ末端アミノ酸が欠失している、前述の化合物のいずれか、または全てが挙げられる。
【００７３】
本発明の化合物の追加の例には、前述の化合物に連結した、任意の型の１個、２個、３個、４個、もしくは５個の付加のカルボキシ末端アミノ酸および／または任意の型のＮ末端アミノ酸を有する、前述の化合物のいずれかまたは全てが挙げられる。
【００７４】
本発明の化合物の追加の例には、前述の化合物のＮ末端かもしくはＣ末端のいずれか、またはＮ末端とＣ末端の両方に連結した、１０，０００〜３０，０００の分子量のポリ（エチレングリコール）（すなわち、「ＰＥＧ」）部分を有する、前述の化合物のいずれかまたは全てが挙げられる。
【００７５】
「ポリアルキレングリコール」は、限定されるわけではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ならびにポリブチレングリコール（ＰＢＧ）、加えて、ＰＥＧ、ＰＰＧ、およびＰＢＧの任意の組合せでのコポリマーを含む、直鎖状または分岐型ポリアルキレングリコールポリマーを意味し、ポリアルキレングリコールのモノアルキルエーテルを含む。したがって、本発明の様々な実施形態において、本発明の組成物におけるポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、およびそれらの任意の組合せであり得るが、それらに限定されない。
【００７６】
ある特定の実施形態において、組成物のポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコール、すなわち、「ＰＥＧ」である。用語「ＰＥＧサブユニット」は、単一のポリエチレングリコール単位、すなわち、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−を指す。
【００７７】
いくつかの実施形態において、ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）は、多分散せず、単分散し、実質的に単分散し、純粋に単分散し、または実質的に純粋に単分散し得る。
【００７８】
「単分散した」は、混合物における化合物の約１００パーセントが同じ分子量をもつ、化合物の混合物を記載するために用いられる。
【００７９】
「実質的に単分散した」は、混合物における化合物の少なくとも約９５パーセントが同じ分子量をもつ、化合物の混合物を記載するために用いられる。
【００８０】
「純粋に単分散した」は、混合物における化合物の約１００パーセントが同じ分子量をもち、かつ同じ分子構造をもつ、化合物の混合物を記載するために用いられる。したがって、純粋に単分散した混合物は、単分散した混合物であるが、単分散した混合物は、必ずしも純粋に単分散した混合物であるとは限らない。
【００８１】
「実質的に純粋に単分散した」は、混合物における化合物の少なくとも約９５パーセントが同じ分子量をもち、かつ同じ分子構造をもつ、化合物の混合物を記載するために用いられる。したがって、実質的に純粋に単分散した混合物は、実質的に単分散した混合物であるが、実質的に単分散した混合物は、必ずしも実質的に純粋に単分散した混合物であるとは限らない。
【００８２】
細胞内部位に標的化される化合物の生物学的利用率は、投与および分布のために十分に極性でありながらも、なお細胞の非極性脂質二重層を介して分散するのに十分に非極性であるという必要条件によって決まる（Ｂｅｇｌｅｙ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ＆Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４８：１３６〜１４６（１９９６））。細胞膜を横切っての合成化合物の送達のためのストラテジーは、産業と大学の両方の研究者によって調査されてきた（Ｒ．Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：２８〜２９（２０００））。正荷電の陽イオン性ペプチドは、受容体または特定の輸送機構とは無関係に、細胞膜を横断することが知られている（Ｓｃｈｗａｒｚｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５６９〜１５７２（１９９９）；Ｈｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６１：４７４〜４７７（２００１）；Ｍｏｒｒｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９：１１７３〜１１７６（２００１）；Ｐｏｏｇａら、ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １２：６７〜７７（１９９８）；Ｄｅｒｏｓｓｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７１：１８１８８〜１８１９３（１９９６）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：１３９７〜１４０５（  ２００１）；ＥｌｌｉｏｔｔおよびＯ’Ｈａｒｅ、Ｃｅｌｌ  ８８：２２３〜２３３（１９９７）；Ｄｅｒｅｒら、ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １６：１３２〜１３３（２００２）；Ｗｉｌｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０：ｅ５９（２００２）；Ｒｏｔｈｂａｒｄら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５：３６１２〜３６１８（２００２）；Ｃｈｅｎら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８：１１２３〜１１２９（２００１）；Ｗｅｎｄｅｒら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９７：１３００３〜１３００８（２０００））。輸送には、塩基性アミノ酸（アルギニンおよびリジン）を含有する、高荷電の短いペプチド（約１０〜２０個のアミノ酸）であり、かつ水素結合を形成する能力を有するタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）が関与している。ＰＴＤの細胞膜を横断する能力も濃度依存性である。
【００８３】
核酸、ペプチド、およびさらに大きいタンパク質のこれらのＰＴＤへの付着は、それらの全ての細胞膜を横切っての高効率様式での形質導入を可能にする（ＳｃｈｗａｒｚｅおよびＤｏｗｄｙ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２１：４５〜４８（２０００））。潜在的なＤＮＡ結合タンパク質であるという共通の特性を共有する以下の３つのＰＴＤが記載されている：ＨＩＶ−ＴＡＴ、ＶＰ２２、およびアンテナペディア（Ｓｃｈｗａｒｚｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５６９〜１５７２（１９９９）；Ｄｅｒｏｓｓｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７１：１８１８８〜１８１９３（１９９６）；ＥｌｌｉｏｔｔおよびＯ’Ｈａｒｅ、Ｃｅｌｌ  ８８：２２３〜２３３（１９９７））。
【００８４】
ＨＩＶゲノムのＨＩＶ−ＴＡＴ（転写のトランス活性化因子（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）、「ＴＡＴ」）由来のＰＴＤ（例えば、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ））は、付着したペプチド、大きいタンパク質、および核酸を、脳を含む事実上全ての細胞膜を横切って非受容体媒介性形式で移動させる能力を有する（Ｓｃｈｗａｒｚｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５６９〜１５７２（１９９９）；Ｃａｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２２：５４２３〜５４３１（２００２）；Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０６：７３５〜７３９（２００２）；Ｎａｇａｈａｒａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：１４４９〜１４５２（１９９８））。付着したタンパク質は、細胞の内部に入るとすぐに、活性立体構造にリフォールディングされ、生物学的に活性である。ＧｒｅｅｎおよびＬｏｗｅｎｓｔｅｉｎにより１９８８年に最初に記載された完全長ＴＡＴタンパク質は、ＨＩＶウイルスによりコードされる８６個のアミノ酸タンパク質である（Ｆａｗｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：６６４〜６６８（１９９４）；ＦｒａｎｋｅｌおよびＰａｂｏ、Ｃｅｌｌ  ５５：１１８９〜１１９３（１９８８）；ＧｒｅｅｎおよびＬｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ、Ｃｅｌｌ  ５５：１１７９〜１１８８（１９８８））。より具体的には、通常膜を横断しないペプチドにコンジュゲートした、ＴＡＴ配列の１１個のアミノ酸、アルギニンリッチかつリジンリッチな部分、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲは、細胞膜を横切って形質導入し、生物活性のある融合タンパク質を組織へ送達することができる。さらに、ＴＡＴ融合タンパク質が２週間、マウスへ注射された場合、神経学的な問題または系の有害ストレスの全体的な徴候はなかった。以前、ＴＡＴ融合タンパク質は、ミトコンドリア機能に影響する活性融合タンパク質を送達する能力があることが示されたが、どちらの場合においても、融合タンパク質はミトコンドリアによってプロセシングされなかった（Ｃａｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２２：５４２３〜５４３１（２００２）；Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０６：７３５〜７３９（２００２））。
【００８５】
いくつかの実施形態において、本発明のペプチドは環化している。ペプチドの環化は、当業界で周知である（例えば、米国特許第４，１０２，８７７号、米国特許公開第２００８／００９７０７９号参照（それぞれの全内容は参照により本明細書に組み入れられている））。１つの非限定的な例として、ペプチドは、固体支持体（例えば、樹脂）上で環化することができる。ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ、ＰｙＢｏｐ／ＤＩＥＡ、ＰｙＣｌｏｃｋ／ＤＩＥＡなどの様々な環化試薬を用いることができる。頭−尾のペプチドは、固体支持体上で作製することができる。ある適切なポイントでのＣ末端の脱保護は、脱保護化Ｎ末端とのアミド結合形成により樹脂上での環化を可能にする。いったん環化が起こったならば、ペプチドは、酸分解により樹脂から切断され、精製される。環化ペプチドの固相合成のためのストラテジーは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、またはＬｙｓ側鎖を通しての付着に限定されない。システインは、それの側鎖上に非常に反応性が高いスルフヒドリル基を有する。１個のシステイン由来のイオウ原子が、そのタンパク質の異なる部分における第２のシステイン由来の別のイオウ原子と単共有結合を形成する場合、ジスルフィド架橋が生じる。これらの架橋は、タンパク質、特に細胞から分泌されたタンパク質を安定化させるのに役立つ。Ｓ−アセトミドメチル（Ａｃｍ）を用いる修飾システインは、ジスルフィド結合の形成をブロックするが、システインおよびタンパク質の最初の一次構造を保存するために用いることができる。
【００８６】
Ｃ．医薬製剤
上記の活性化合物は、知られた技術に従って、薬学的担体中に、投与のために製剤化されてもよい。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第９版、１９９５）参照されたい。本発明による医薬製剤の製造において、活性化合物（その生理学的に許容される塩を含む）は、典型的には、とりわけ、許容される担体と、混合される。担体は、当然のことながら、製剤中の任意の他の成分に適合するという意味において許容されなければならず、かつ患者に有害であってはならない。担体は、固体または液体、または両方であり得、好ましくは、０．０１重量％または０．５重量％から９５重量％または９９重量％までの活性化合物を含有し得る、単位用量製剤、例えば、錠剤として化合物と製剤化される。１つまたは複数の活性化合物が、本発明の製剤中に組み入れられてもよく、その製剤は、任意で１つまたは複数の副成分を含む、構成要素を混合することを含む薬学のよく知られた技術のいずれかによって調製され得る。
【００８７】
さらに、本発明による組成物の塩、担体、賦形剤、または希釈剤などの「薬学的に許容される」構成要素は、（ｉ）それが、本発明の組成物と、その組成物をその意図された目的に適さないようにすることなく組み合わせることができる点において、組成物の他の成分と適合し、かつ（ｉｉ）過度の有害な副作用（例えば、毒性、刺激作用、およびアレルギー反応）なしに、本明細書に提供されているような対象に用いるのに適している構成要素である。副作用は、それらのリスクが、組成物によって与えられる利益を上回る場合、「過度」である。薬学的に許容される構成要素の非限定的な例には、リン酸緩衝食塩水、水、油／水の乳濁液、マイクロエマルジョン、および様々な型の湿潤剤などの標準的な薬学的担体のいずれかが挙げられる。
【００８８】
本発明の製剤には、経口、直腸、局所的、頬側（例えば、舌下）、膣、非経口（例えば、皮下、筋肉内、皮内、または静脈内）、局所的（すなわち、気道表面を含む、皮膚表面と粘膜表面の両方）、および経皮の投与に適したものが挙げられるが、任意の所定の場合において最も適切な経路は、処置されることになっている状態の性質および重症度、ならびに用いられることになっている特定の活性化合物の性質に依存する。
【００８９】
経口投与に適した製剤は、それぞれがあらかじめ決められた量の活性化合物を含有するカプセル、カシェ剤、ロゼンジ、もしくは錠剤などの個別の単位として；粉末もしくは顆粒として；水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として；または水中油もしくは油中水の乳濁液として提供され得る。そのような製剤は、活性化合物と適切な担体（上記で述べられたような１つまたは複数の副成分を含有してもよい）を会合させるステップを含む、薬学の任意の適切な方法により調製され得る。一般的に、本発明の製剤は、活性化合物を液体または微粉化固体担体または両方と均一かつ密に混合し、その後、必要ならば、その結果生じた混合物を形作ることにより調製される。例えば、錠剤は、活性化合物を、任意で１つまたは複数の副成分と共に含有する粉末または顆粒を圧縮または成形することにより調製され得る。圧縮錠は、任意で結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、および／または表面活性剤／分散剤と混合された、粉末または顆粒などの自由流動の形での化合物を適切な機械において圧縮することにより調製され得る。成形錠剤は、不活性液体結合剤で湿った粉末化合物を適切な機械において成形することにより作製され得る。
【００９０】
頬側（舌下）投与に適した製剤には、風味付け基剤（通常、スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントゴム）中に活性化合物を含むロゼンジ、ならびにゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアゴムなどの不活性基剤中に化合物を含む香錠が挙げられる。
【００９１】
非経口投与に適した本発明の製剤は、活性化合物の無菌水性および非水性注射液を含み、その調製物は、好ましくは、対象とするレシピエントの血液と等張性である。これらの調製物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を対象とするレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有してもよい。水性および非水性無菌懸濁液は、懸濁剤および増粘剤を含んでもよい。製剤は、単位用量または複数用量の容器、例えば、密封アンプルおよびバイアルにおいて提供されてもよく、使用直前に無菌液体担体、例えば、食塩水または注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存されてもよい。即時用注射液および懸濁液は、前に記載された種類の無菌粉末、顆粒、および錠剤から調製されてもよい。例えば、本発明の一態様において、密封容器における単位剤形での、活性化合物またはその塩を含む注射可能で安定な無菌組成物が提供される。化合物または塩は、適切な薬学的に許容される担体と再構成されて、対象への注射に適した液体組成物を形成することができる凍結乾燥物の形で提供される。単位剤形は、典型的には、約１０ｍｇから約１０グラムまでの化合物または塩を含む。化合物または塩は、実質的に不水溶性である場合、生理学的に許容される十分な量の乳化剤を、水性担体中の化合物または塩を乳化するために十分な量で用いられてもよい。１つのそのような有用な乳化剤はホスファチジルコリンである。
【００９２】
直腸投与に適した製剤は、好ましくは、単位用量坐剤として提供される。これらは、活性化合物を１つまたは複数の通常の固体担体、例えば、カカオバターと混合し、その後、その結果生じた混合物を形作ることにより調製され得る。
【００９３】
皮膚への局所適用に適した製剤は、好ましくは、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、または油の形をとる。用いられ得る担体には、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮賦活剤、およびそれらのうちの２つ以上の組合せが挙げられる。
【００９４】
経皮投与に適した製剤は、長時間、レシピエントの表皮との密接な接触を保つのに適応した個別のパッチとして提供され得る。経皮投与に適した製剤はまた、イオン泳動により送達され得（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３（６）：３１８（１９８６）参照）、典型的には、活性化合物の任意で緩衝化した水溶液の形をとる。適切な製剤は、クエン酸緩衝液もしくはｂｉｓ−ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６）またはエタノール／水を含み、０．１Ｍから０．２Ｍまでの活性成分を含有する。
【００９５】
さらに、本発明は、本明細書に開示された化合物およびその塩のリポソーム製剤を提供する。リポソーム懸濁液を形成するためのテクノロジーは当業界で周知である。化合物またはその塩が水溶性塩である場合、通常のリポソームテクノロジーを用いて、それは脂質ベシクルへ取り込まれ得る。そのような場合、化合物または塩の水溶性のせいで、化合物または塩は、リポソームの親水性の中央またはコア内に実質的に同調するだろう。用いられる脂質層は、任意の通常の組成であってもよく、コレステロールを含有してもよいし、コレステロールを含まなくてもよい。関心対象となる化合物または塩が不水溶性である場合、この場合もやはり、通常のリポソーム形成テクノロジーを用いて、塩は、リポソームの構造を形成する疎水性脂質二重層内に同調し得る。いずれの場合においても、作製されるリポソームを、標準超音波処理およびホモジナイゼーション技術の使用によるように、サイズを低下させてもよい。
【００９６】
もちろん、本明細書に開示された化合物またはその塩を含有するリポソーム製剤は、水などの薬学的に許容される担体と再構成されて、リポソーム懸濁液を再生し得る凍結乾燥物を生じるように凍結乾燥されてもよい。
【００９７】
水性基剤乳濁液などの他の医薬組成物は、本明細書に開示された不水溶性化合物またはその塩から調製され得る。そのような場合、組成物は、所望の量の化合物またはその塩を乳化するための十分な量の薬学的に許容される乳化剤を含有する。具体的には、有用な乳化剤には、ホスファチジルコリンおよびレシチンが挙げられる。
【００９８】
活性化合物に加えて、医薬組成物は、ｐＨ調整添加剤などの他の添加剤を含有してもよい。特に、有用なｐＨ調整剤には、塩化水素酸などの酸、塩基、または乳酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウムなどの緩衝剤が挙げられる。さらに、組成物は、抗微生物保存剤（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓ）を含有してもよい。有用な抗微生物保存剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、およびベンジルアルコールが挙げられる。抗微生物保存剤は、典型的には、製剤が、複数回投薬用として設計されたバイアル中に入れられる場合に用いられる。もちろん、示されているように、本発明の医薬組成物は、当業界で周知の技術を用いて凍結乾燥されてもよい。
【００９９】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明のペプチドまたは化合物は、皮下投与のために水溶液中に存在する。いくつかの実施形態において、ペプチドまたは化合物は、再構成されて、皮下に投与される凍結乾燥粉末として提供される。
【０１００】
以下の非限定的な例で本発明を例証する。
【実施例１】
【０１０１】
材料および方法
イモビロンＰ膜を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）から購入した。１リットルあたり４，５００ｍｇのグルコース（２５ｍＭ）、ストレプトマイシン、およびペニシリンを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を、Ｇｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から購入した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をコンジュゲートしたマウス抗ウサギ抗体およびヤギ抗マウス抗体を、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）から購入した。ＩＧＦＢＰ−２抗血清を、以前に記載されているように（Ｃｏｈｉｃｋ  ＷＳ、Ｃｌｅｍｍｏｎｓ  ＤＲ、１９９１）調製した。全ての他の試薬を、他に指定のない限り、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。
【０１０２】
合成ペプチドの作製およびペプチドペグ化
マウスＩＧＦＢＰ−２の、リンカーに位置したヘパリン結合ドメインを含有する合成ペプチド（ＫＨＬＳＬＥＥＰＫＫＬＲＰ）（ＨＢＤ１ペプチドと呼ぶ）を調製した。スクランブルされたＨＢＤ１（ＣＫＰＬＲＬＳＫＥＥＨＰＬＫ）（ＨＢＤ１対照ペプチドと呼ぶ）を調製した。ヒトＩＧＦＢＰ−２のＣ末端ヘパリン結合ドメインを含有するペプチド（ＫＨＧＬＹＮＬＫＱＣＫＭＳＬＮＧＱＲ）（ＨＢＤ２ペプチドと呼ぶ）も調製した。ＩＧＦＢＰ−５のＣ末端ヘパリン結合ドメインを含有するペプチド（ＲＫＧＦＹＫＲＫＱＣＫＰＳＲＧＲＫＲ）（ＨＢＤ２対照ペプチドと呼ぶ）を調製した。ペプチドは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  ＣａｒｏｌｉｎａのＣｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ校のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにより合成された。純度および配列を、質量分析法により確認した。
【０１０３】
以下に、マウスＩＧＦＢＰ−２アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース受入番号ＡＡＢ６０７０９）を示す。
【０１０４】
【表２】
2016513645.tif 000004
【０１０５】
以下に、ヒトＩＧＦＢＰ−５アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース受入番号ＮＰ＿０００５９０）を示す。
【０１０６】
【表３】
2016513645.tif 000005
【０１０７】
以下に、ヒトＩＧＦＢＰ−２アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース受入番号ＡＡＢ２２３０８）を示す。
【０１０８】
【表４】
2016513645.tif 000006
【０１０９】
Ｃ末端にシステインが付加されたＨＢＤ１、ＨＢＤ２、およびＨＢＤ１対照ペプチドを合成し、その後、以下のようにペグ化した：１０ｍｇのペプチドを、４．０ｍｌの０．０５Ｍ  ＮａＰＯ４（ｐＨ７．０）において３８０μｇのメトキシＰＥＧマレイミド（２００００ｋＤａ）（１：３モル比のペプチド対ＰＥＧ）（ＪｅｎＫｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｌｌｅｎ、ＴＸ）と混合した。４℃での一晩のインキュベーション後、システインを１７ｍＭの最終濃度まで加え、未処理の部位をブロックした。非ペグ化ペプチドおよびシステインを除去するために、混合物を、Ｚｅｂｒａ  Ｄｅｓａｌｔスピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて、製造会社の使用説明書に従って、脱塩した。ペグ化を、クーマシー染色を用いてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により検証した。
【０１１０】
ｐＬｅｎｔｉ−ＩＧＦＢＰ−２野生型（ＷＴ）および２つのＨＢＤ突然変異体の作製
マウスＩＧＦＢＰ−２  ｃＤＮＡを、マウスｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から、マウスＩＧＦＢＰ−２のヌクレオチド８９〜１１０に対応する５’プライマー配列（５’−ＡＴＧＣＴＧＣＣＧＡＧＡＴＴＧＧＧＣＧＧＣＣ−３’）、およびヌクレオチド９８１〜１００３に相補的な３’プライマー配列（５’−ＧＧＧＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＡＡＧＴＧＴＧＣＡＧ−３’）を用いて増幅した。正しい配列が増幅されていることを確認するためのＤＮＡシーケンシング後、ＰＣＲ産物を、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターへサブクローニングし、その後、ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ反応を用いて、製造会社の使用説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に従い、ｐＬｅｎｔｉ６−Ｖ５  ＤＥＳＴ発現ベクターへ移した。
【０１１１】
ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターへ挿入された野生型ＩＧＦＢＰ−２を、置換突然変異体を作製するための鋳型として用いた。２つのＩＧＦＢＰ−２突然変異体は、配列ＫＨＬＳＬＥＥＰＫＫＬＲＰを含有するマウスＩＧＦＢＰ−２のＨＢＤ１ドメイン、および配列ＫＨＧＲＹＮＬＫＱＣＫＭＳＬＮＧＱＲを含有するマウスＩＧＦＢＰ−２のＨＢＤ２ドメイン内のアミノ酸の置換を組み込んだ。太字で強調された置換は以下の通りであった：それぞれ、
【化１】
2016513645.tif 000007
（ＨＢＤ１突然変異体と呼ぶ）、および
【化２】
2016513645.tif 000008
（ＨＢＤ２突然変異体と呼ぶ）。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）によるＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キットを用いて、（下記の太字で示された）これらの置換をコードするために必要とされる塩基変化を組み込んだ。
【０１１２】
ＨＢＤ１突然変異体構築物を作製するために、以下のプライマーを用いた。
【化３】
2016513645.tif 000009
ＨＢＤ２突然変異体構築物を作製するために、２ラウンドのＰＣＲを実施した。以下のプライマーを第１ラウンドのＰＣＲに用いた。
【化４】
2016513645.tif 000010
正しい配列が存在することを確認した後、第１ラウンドのＰＣＲ産物を鋳型として用いて、第２ラウンドのＰＣＲを実施した。以下のプライマーを第２ラウンドのＰＣＲに用いた。
【化５】
2016513645.tif 000011
【０１１３】
配列分析に基づいた正しいクローンの選択後、２つの突然変異型のＩＧＦＢＰ−２をコードするｃＤＮＡを、製造会社の使用説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に従いＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ反応を用いて、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターからｐＬｅｎｔｉ６−Ｖ５  ＤＥＳＴベクターへ移した。
【０１１４】
ウイルスストックの調製
それぞれの個々のｐＬｅｎｔｉ構築物のために、２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いてウイルスストックを作製した。細胞を、トランスフェクションの前日、成長培地（１０％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌでのストレプトマイシン、および１００Ｕ／ｍｌでのペニシリンを含むＤＭＥＭ−Ｈ）中、７５ｃｍ２プレートあたり５×１０６個で蒔いた。トランスフェクションの日、培地を、抗生物質と血清を含まない５ｍｌのＯｐｔｉ変法イーグル培地Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と交換した。各トランスフェクションのためのＤＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００複合体を、製造会社のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に従って調製した。次の日、ＤＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００複合体を含有する培地を除去し、成長培地と交換した。トランスフェクションから４８〜７２時間後、ウイルス含有上清を回収し、４℃で１５分間、３０００ｒｐｍで遠心分離して、細胞片をペレット化した。上清を濾過し、１ｍｌのアリコートとして−８０℃で保存した。
【０１１５】
野生型および２つのＨＢＤ突然変異型ＩＧＦＢＰ−２の精製
構築物を、以前に記載された手順（Ｇｏｃｋｅｒｍａｎ  Ａ、１９９５）を用いることによりＣＨＯ−Ｋ１細胞において発現させた。無血清α−ＭＥＭ中、４８時間、維持された、ＷＴ  ＩＧＦＢＰ２またはＨＢＤ１突然変異体またはＨＢＤ２突然変異体を発現するコンフルエントなＣＨＯ−Ｋ１細胞から条件培地を収集した。発現したタンパク質を、以前に記載された手順（Ｓｈｅｎら、２０１３）に従って精製した。
【０１１６】
初代前脂肪細胞の細胞培養
初代前脂肪細胞を、週齢６週間のＩＧＦＢＰ−２−／−マウスの精巣上体の脂肪パッドから単離した。以前に記載された方法（Ｂｏｎｅｙ，ＣＭら、１９９４）を用いて、細胞を培養した。脂肪パッドの重量を計り、組織を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍおよび１．５％ＢＳＡ）中、３７℃で４５分間、同体積（Ｗ／Ｖ）のコラゲナーゼＡ型（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）で消化した。完全な消化後、前脂肪細胞を、５００ｘｇで５分間の遠心分離により間質血管細胞から分離した。ペレット化細胞を、３０ｍＭグルコースを含有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で洗浄し、１００μｍのメッシュフィルター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に通した。その後、６ウェルプレート内に１．２〜１．５×１０４細胞／ｍｌの密度で、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、および１０％ウシ胎児血清を追加した３０ｍＭグルコースを含有するＤＭＥＭ（以後、標準培地と呼ぶ）中、細胞を蒔いた。培養物は、それらがコンフルエンスに達するまで、２日ごとに培地を交換された。その後、コンフルエントから２日後の細胞を、分化培地（０．５ｍＭ  ＩＢＭＸ、１μＭデキサメタゾン、および５μｇ／ｍＬインスリンを含有する無血清ＤＭＥＭ）に曝露し、２日間、インキュベートした。この培地に加えられる実験的処理は、野生型ＩＧＦＢＰ−２（３μｇ／ｍｌ）、ＨＢＤ１ペプチド（６μｇ／ｍｌ）、ＨＢＤ１対照ペプチド（６μｇ／ｍｌ）、ＨＢＤ２ペプチド（６μｇ／ｍｌ）、ＨＢＤ２対照ペプチド（６μｇ／ｍｌ）、ＨＢＤ１突然変異体ＩＧＦＢＰ−２（３μｇ／ｍｌ）、またはＨＢＤ２突然変異体ＩＧＦＢＰ−２（３μｇ／ｍｌ）のいずれかを含んだ。５μｇ／ｍｌインスリンを追加した標準培地中、さらに２日間、培養物を維持した。その後、インスリンを含まない新鮮な標準培地中、さらに２日間、培養物を保持した。
【０１１７】
オイルレッドＯ染色
処理後、細胞をＰＢＳで２回、すすぎ、１０％ホルマリンで室温で３０分間、固定した。蒸留水での２回のすすぎ後、１００％プロピレングリコール（Ｐｏｌｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂａｙ  Ｓｈｏｒｅ、ＮＹ）を加え、５分間、インキュベートした。オイルレッドＯ溶液（Ｐｏｌｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂａｙ  Ｓｈｏｒｅ、ＮＹ）を加える前に、プロピレングリコールを除去した。培養物を６０℃で１０分間、インキュベートした。オイルレッドＯ溶液を除去し、培養物を、８０％プロピレングリコールと５分間、インキュベートした。インキュベーション後、培養物を、水道水で２回、すすいだ。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８１倒立顕微鏡を用いて画像を撮った。
【０１１８】
免疫沈降およびイムノブロッティング
分化した脂肪細胞を、氷冷溶解緩衝液中に溶解した（Ｘｉら、２００８）。１４，０００ｘｇで１０分間の遠心分離後、可溶化したタンパク質を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ方法（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）により定量化した。等しいタンパク質量の可溶化液を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に負荷し、タンパク質を分離し、その後、イモビロンフィルターへ移し、適切な抗体を用いるイムノブロッティングにより可視化した。用いられる一次抗体希釈度は、抗アディポネクチン抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ、Ｇｏｌｄｅｎ、ＣＯ）について１：１０００、抗ＰＰＡＲγ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）について１：５００、抗ａｐ２抗体（ＰｒｏＳｃｉ  Ｉｎｃ．、Ｐｏｗａｙ、ＣＡ）について１：２０００、抗β−アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）について１：５０００であった。免疫複合体を、高感度化学発光（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて可視化した。
【０１１９】
マウス
Ｉｇｆｂｐ２−／−マウスと呼ばれるＢ６．１２９−Ｉｇｆｂｐ２ｔｍ１Ｊｅｐの作製は、以前に記載されている（ＤｅＭａｍｂｒｏら、２００８；Ｄａｎｎｏら、１９９２）。マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドへ少なくとも１０世代、戻し交配した。交配対は、Ｍａｉｎｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＥ）から提供された。Ｉｇｆｂｐ２＋／＋マウスはＣ５７ＢＬ／６Ｊ対照であった。全てのインビボおよびエクスビボの実験的研究を、雄マウスを用いて実施した。動物研究プロトコールは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  ＣａｒｏｌｉｎａのＣｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ校のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより審査され、承認された。マウスを、４つの処置群の１つに割り当てた。１）Ｐｅｇ  ＨＢＤ１ペプチド：Ｉｇｆｂｐ２−／−マウスに、０．１ｍＬ  ＰＢＳ中の５０μｇのペグ化ＨＢＤ１ペプチドを投与した（ｎ＝９）；２）Ｐｅｇ  ＨＢＤ２ペプチド：Ｉｇｆｂｐ２−／−マウスに、０．１ｍＬ  ＰＢＳ中の５０μｇのペグ化ＨＢＤ２ペプチドを投与した（ｎ＝１０）；３）対照ペプチド：Ｉｇｆｂｐ２−／−マウスに、０．１ｍＬ  ＰＢＳ中の５０μｇのＨＢＤ１対照ペプチドを与えた（ｎ＝１８）；４）ＷＴ：Ｉｇｆｂｐ２＋／＋マウスに、０．１ｍＬのＰＢＳを与えた（ｎ＝９）。全ての注射を、週齢１０週間から２２週間まで、腹腔内に３回、投与した。全てのマウスは、１８．６％タンパク質、６．２％脂肪、および３．５％粗繊維を含有する２０１８  Ｔｅｋｌａｄ  ｇｌｏｂａｌ  ｒｏｄｅｎｔ  ｄｉｅｔ（Ｈａｒｌａｎ、Ｄｕｂｌｉｎ、ＶＡ）への自由なアクセスが提供された。マウスの摂食量および体重を毎週、決定した。
【０１２０】
体組成および血清中アディポカイン測定
体脂肪および除脂肪筋肉量を、無麻酔の動物において脂肪量および非脂肪量を測定する技術である、磁気共鳴画像分析（ＥｃｈｏＭＲＩ−１００、Ｅｃｈｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）により処置の０週間目および１２週間目に測定した（Ｋｅｌｌｙ  ＳＡら、２０１０）。１２週間の処置の完了後、マウスを屠殺した。血液を、心穿刺により収集し、３５００ｒｐｍ×１５分間での遠心分離前の４時間、そのままにしておいた。血清を吸引し、分析まで−２０℃で保存した。腹部鼠径部脂肪パッドおよび内臓脂肪パッドを、定義された解剖学的ランドマークに従って各動物から注意深く解剖した。胸郭の下部と大腿上方との間の全ての皮下脂肪は、腹部皮下鼠径部脂肪とみなされ、胃の小弯から始まり、Ｓ字結腸で終わる腸間膜に沿って見出される全ての脂肪は内臓脂肪とみなされた。脂肪貯蔵部位を、重量測定の前に拭き取って乾燥させた。右鼠径部脂肪パッドを切り離して解剖し、この組織のトリグリセリド含有量を、以前に記載されているように（Ｄａｎｎｏ  Ｈ、Ｋｉｍｕｒａ  Ｓ  １９９２）、比色分析（Ｐｏｉｎｔｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｎｔｏｎ、ＭＩ）により決定した。血清中アディポネクチンおよびレプチンを、ＥＬＩＳＡにより、製造会社の使用説明書（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）に従って測定した。
【０１２１】
グルコース負荷試験
グルコース負荷試験を、６時間の断食後、実施した。経口グルコース負荷試験について、マウスに２０％グルコース（２．５ｇ／ｋｇ体重）を経口胃管栄養により与え、ベースライン、胃管栄養から１５分後、３０分後、６０分後、９０分後、および１２０分後にグルコースの決定（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｎｔｏｕｒ  Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）のために血液を尾静脈から採取した。
【０１２２】
統計学的解析
全てのデータは、平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として表されている。結果を、インビトロアッセイから得られたデータについてスチューデントｔ検定、またはインビボアッセイから得られたデータについて、ＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニ事後多重比較検定を用いて統計学的有意差について解析した。統計学的有意性をｐ＜０．０５に設定した。
【０１２３】
ＩＧＦＢＰ−２、ならびにそれの固有の、およびＣ末端のヘパリン結合ドメインを含有するペプチドは、初代ＩＧＦＢＰ−２−／−マウス前脂肪細胞の分化を阻害する
ヘパリン結合ドメインのそれぞれの脂肪生成への効果を調べるために、ＩＧＦＢＰ−２のリンカー領域に位置するＨＢＤ配列（ＨＢＤ１）またはＣ末端領域に位置するＨＢＤ配列（ＨＢＤ２）（図１Ａ）を含有するペプチドを合成し、ＩＧＦＢＰ−２ヌルマウスから単離された前脂肪細胞の培養物とインキュベートした。結果は、３つの分化マーカー、アディポネクチン、ａＰ２、およびＰＰＡＲγの抑制により示されているように、天然ＩＧＦＢＰ−２は成熟脂肪細胞への前脂肪細胞分化を阻害すること（図１Ｂ、レーン８）を示した。ＨＢＤ１配列を含有するペプチドは、アディポネクチン（例えば、６６±１０％低下、ｐ＜０．０１）、ａＰ２（例えば、５１±２％低下、ｐ＜０．０１）、およびＰＰＡＲγ（例えば、４７±９％低下、ｐ＜０．０５）の発現を阻害した（図１Ｂ、レーン２対レーン１）。しかしながら、スクランブル化ＨＢＤ１配列を含有するペプチドは、効果を生じなかった（図１Ｂ、レーン３対レーン１）。興味深いことに、ＨＢＤ２を含有するペプチドは、アディポネクチンおよびａＰ２の発現を完全に阻害し、ＰＰＡＲγ発現は、分化培地のみに曝された細胞と比較して低下した（６７±７％（ｐ＜０．０１））（図１Ｂ、レーン４対レーン１）。ＩＧＦＢＰ−５配列の相同領域を含有するペプチドは対照としての役割を果たし、それはそれらの効果に影響しなかった（図１Ｂ、レーン５対レーン１）。
【０１２４】
これらの結果を確認するために、ＨＢＤ１またはＨＢＰ２ドメインのいずれかにおける荷電残基が中性残基に変化しているＩＧＦＢＰ−２突然変異体を調製し、発現させた。変化したＨＢＤ１配列を含有するが、無傷ＨＢＤ２配列を含有するＩＧＦＢＰ−２突然変異体は、野生型ＩＧＦＢＰ−２（図１Ｂ、レーン６対レーン８）およびＨＢＤ２配列を含有するペプチド（図１Ｂ、レーン６対レーン４）と同様に分化マーカー発現を阻害した。対照的に、変化したＨＢＤ２残基を含有するが、無傷ＨＢＤ１配列を含有するＩＧＦＢＰ−２突然変異体は、前脂肪細胞分化を防ぐことに効果が有意に少なかった（図１Ｂ、レーン７対レーン２）。分化した脂肪細胞を形成する能力を、オイルレッドＯ染色を用いて決定した場合、同様の結果が得られた（図２）。これらの結果は、天然ＩＧＦＢＰ−２、ＨＢＤ１突然変異体、およびＨＢＤ２ペプチドが脂肪生成の最も強力な阻害剤であり、ＨＢＤ１ペプチドおよびＨＢＤ２突然変異体は活性がより低かったことを実証している。総合すれば、結果は、ＩＧＦＢＰ−２の前脂肪細胞の分化への阻害効果は、主に、それのＨＢＤ２ドメインを介して媒介されることを強く示唆している。
【０１２５】
ＩＧＦＢＰ−２のヘパリン結合ドメインがＩＧＦＢＰ−２−／−マウスにおいて体重増加を減少させる
ＩＧＦＢＰ−２  ＨＢＤの体重増加および脂肪量への効果をインビボで調べるために、ＨＢＤ配列を含有するペプチドをＩＧＦＢＰ−２−／−マウスに投与した。両方の対照ペプチドがインビボで、前脂肪細胞分化へ類似した効果を生じたので、スクランブル化ＨＢＤ１ペプチドだけを対照として用いた。インビボで、ペプチドの半減期を延ばし、かつそれらのタンパク質分解に対する抵抗性を増加させるために、全ての３つのペプチドをペグ化した。週５回、３週間、腹腔内（ＩＰ）注射により投与された５０μｇのＨＢＤ１ペプチドは、ＩＧＦＢＰ−２−／−雄マウスにおいて骨成長を促進するのに効果的であったことが示されている（１７）。このプロトコールを、より長期の研究、および５０μｇの各ペプチドの３回／週、１２週間の（ＩＰ）注射に適応するように改変した。同年齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｗｔ）雄マウスを、溶媒で処置し、ペプチド処置を受けた３群のマウスと比較した。この動物研究は多数のＩＧＦＢＰ−２−／−マウスを必要とするため、実験を２つの時期に分けた。第１時期において、ＨＢＤ１および対照ペプチド処置、加えて野生型対照マウスを研究した。第２時期において、ＨＢＤ２および対照ペプチドの効果を決定した。各時期における各群のマウスの体重および年齢は、処置の開始時点で類似しており、全てのマウスの体重を、研究中、毎週、計った。対照ペプチドを受けたＩＧＦＢＰ−２−／−マウスは、対照野生型マウスと比較して、１２週間中、体重増加がより多かった（図３Ａ）。研究の区間の間、ＨＢＤ１またはＨＢＤ２ペプチドで処置されたＩＧＦＢＰ−２−／−マウスは、対照ペプチドで処置されたＩＧＦＢＰ−２−／−マウスと比較して、８週間の処置後、体重増加が有意により少なかった。この差は、１２週間の処置後、対照ペプチド処置マウスと比較して、ＨＢＤ処置マウスにおいて持続し、その差は有意のままであった（図３Ａ）。加えて、１０週間の処置後、体重増加は、ＨＢＤ１ペプチドを受けたマウスと比較して、ＨＢＤ２ペプチドを受けたマウスにおいて有意に少なかった（図３Ａ）。重要なことには、研究中、野生型対照マウスにおける体重の増加は、ＨＢＤ１かまたはＨＢＤ２のいずれかでそれぞれ処置されたＩＧＦＢＰ−２−／−マウスと類似した（図３Ａ）。体重増加における違いが異なる食物摂取量により引き起こされた可能性を排除するために、摂食量を毎週、測定した。結果により、全ての処置の間で有意差はないことが示された（図３Ｂ）。加えて、経口グルコース負荷試験は、異なる処置の間でグルコース代謝において有意差が検出されなかったことを示した（図３Ｃ）。
【０１２６】
ＩＧＦＢＰ−２のヘパリン結合ドメインは、ＩＧＦＢＰ−２−／−マウスにおいて、体脂肪量蓄積を阻害し、血清中アディポカインホルモン濃度を変化させる
体組成における変化を調べるために、全てのマウスに研究の開始時点および終了時点にＭＲＩを実施した。脂肪量の変化を、体重に占めるパーセンテージとしての脂肪の変化として表した。結果により、対照ペプチド処置と比較して、両方のＨＢＤペプチドが研究の１２週間にわたって体脂肪量増加の減少を生じたが、ＨＢＤ２処置だけが統計学的差（例えば、４８±９％低下、ｐ＜０．０５）に達したことが示された（図４Ａ）。加えて、研究中、対照ペプチドで処置されたＩＧＦＢＰ−２−／−マウスは、激しい非脂肪量減少を経験した（例えば、７．２±１．０％低下）。両方のＨＢＤペプチドは、この変化の程度を有意に阻止したが、ＨＢＤ２ペプチドがより強力であった（例えば、ＨＢＤ１について４．１±１．１％低下、ｐ＜０．０５；ＨＢＤ２について２．１±０．８％低下）（図４Ｂ）。
【０１２７】
脂肪量への効果を確認するために、１２週間の処置の完了後、マウスを屠殺し、２つの体脂肪区画の重量を測定した。結果により、異なる処置の間で肝臓および心臓の重量において有意差はないことが示され（図５Ａ）、そのことにより、臓器重量変化が、ＨＢＤペプチド処置に応答して起こる体重変化に寄与する可能性が排除された。脂肪区画分析により、対照ペプチドを与えられたＩＧＦＢＰ−２−／−マウスは、全ての群の間で、鼠径部脂肪および内臓脂肪のパーセンテージが最も大きいことが示された。ＨＢＤ２配列を含有するペプチドは、対照ペプチドで処置されたＩＧＦＢＰ−２−／−マウスと比較して、鼠径部脂肪パッド重量を有意に阻害し（例えば、３２±７％低下、ｐ＜０．０１）、一方、ＨＢＤ１配列を含有するペプチドは効果を生じなかった（図５Ｂ）。内臓脂肪重量は、ＨＢＤ１またはＨＢＤ２ペプチドのどちらで処置されたマウスにおいても有意に低下したが、ＨＢＤ２配列を含有するペプチドがより効果的であった（例えば、４４±７％対２４±５％低下、ｐ＜０．０５）（図５Ｃ）。興味深いことに、両方の脂肪区画の重量が体重に占めるパーセンテージとして表される場合、ＨＢＤ２ペプチドで処置されたＩＧＦＢＰ−２−／−マウスにおける結果は、野生型マウスと類似した（図５Ｂ〜Ｃ）。鼠径部脂肪パッド中のトリグリセリド含有量の分析により、ＨＢＤ１またはＨＢＤ２ペプチドのどちらで処置されたＩＧＦＢＰ−２−／−マウスにおいてもそれは有意に低下したが、ＨＢＤ２がより効果的であった（例えば、３７±９％対２２±２％低下、ｐ＜０．０５）ことが示された（図６Ａ）。血清中アディポネクチン平均レベルは、対照ペプチド（例えば、３６±４％、ｐ＜０．０１）またはＨＢＤ１ペプチド（例えば、２４±５％低下、ｐ＜０．０５）で処置されたマウスのどちらと比較しても、ＨＢＤ２ペプチドで処置されたＩＧＦＢＰ−２−／−マウスにおいて有意に低かった（図６Ｂ）。加えて、ＨＢＤ２ペプチドでの処置は、対照ペプチド処置マウスと比較して、血清中レプチンレベルを有意に増加させたが（例えば、５７±９％増加、ｐ＜０．０１）、ＨＢＤ１ペプチドは効果を生じなかった（図６Ｃ）。総合すると、これらの結果は、ＨＢＤ１とＨＢＤ２ペプチドの両方が、脂肪生成を阻害することができるが、ＨＢＤ２ペプチドがより強力な阻害剤であることを明らかに示唆している。
【０１２８】
マウスペプチドＫＨＧＲＹＮＬＫＱＣＫＭＳＬＮＧＱＲのヒトペプチドＫＨＧＬＹＮＬＫＱＣＫＭＳＬＮＧＱＲとの比較
本明細書に記載されているように、前脂肪細胞をマウスから調製し、培養して成長させた。記載されているように、それぞれのマウスおよびヒトペプチドを細胞に加え、細胞を溶解し、可溶化液をＳＤＳゲル上に流した。アディポネクチンについてのイムノブロッティングを、記載されているように行った。各ペプチドの３つの濃度、０．７、２．０、および６．０μｇ／ｍｌを比較した。結果は、％抑制平均値±ＳＥ（Ｎ＝３）として表され、以下の通りであった。
【０１２９】
【表５】
2016513645.tif 000012
【０１３０】
これらの結果は、ヒトおよびマウスペプチドが、それらの脂肪細胞分化を阻害する能力において等効力であることを示している。
【実施例２】
【０１３１】
インスリン様成長因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ−２）過剰発現は、高脂肪摂食に対する抵抗性を与え、インビトロでの前脂肪細胞の分化を阻害する。しかしながら、ＩＧＦＢＰ−２の投与がインビボで脂肪生成を調節することができるかどうか、およびこの応答を媒介するドメインは定義されていない。ＩＧＦＢＰ−２は、２つのヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）を含有し、それらは、ＩＧＦＢＰ２のリンカー領域（ＨＢＤ１）およびＣ末端領域（ＨＢＤ２）に位置する。これらのドメインの相対的重要性を決定するために、本明細書に記載された研究に、合成ペプチド、加えて突然変異誘発を用いた。ＨＢＤ１とＨＢＤ２ペプチドのどちらも、前脂肪細胞分化を阻害したが、ＨＢＤ２ペプチドがより効果的であった。ＨＢＤ１またはＨＢＤ２領域における荷電残基の選択的置換は、その完全長タンパク質の細胞分化を阻害する能力を減弱したが、ＨＢＤ２突然変異体が、最も大きい低下を生じた。インビボでそれらの活性を決定するために、各ペプチドのペグ化型を、ＩＧＦＢＰ−２−／−マウスに１２週間、投与した。ＭＲＩスキャニングにより、ＨＢＤ２ペプチドのみが、総脂肪量の増加を有意に低下させることが示された（４８±９％、ｐ＜０．０５）。鼠径部脂肪（３２±７％、ｐ＜０．０１）および内臓脂肪（４４±７％、ｐ＜０．０１）の両方は、ＨＢＤ２により有意に減少したが、ＨＢＤ１は、内臓脂肪蓄積だけを低下させた（２４±５％、ｐ＜０．０５）。ＨＢＤ２ペプチドは、トリグリセリド含有量および血清中アディポネクチンを低下させるのにより効果的なペプチドであったが、ＨＢＤ２ペプチドだけが、血清中レプチンを増加させた。これらの所見は、ＩＧＦＢＰ２のＨＢＤ２ドメインが、それの脂肪生成を阻害する能力の原因となる主要な領域であること、およびこの領域を包含するペプチドが、天然ＩＧＦＢＰ−２に匹敵する活性を有することを実証している。
【０１３２】
インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）および−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）の生物学的利用能は、リガンド輸送および生物学的利用能を調節する高親和性ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）により調整される。ＩＧＦＢＰ−２は、ヒト循環において２番目に豊富なＩＧＦＢＰであり、脂肪生成中、白色前脂肪細胞により分泌されるＩＧＦＢＰの主要な型である。それが、動物から単離された非不死化前脂肪細胞の分化を直接的に阻害するかどうか、およびこの効果を媒介するＩＧＦＢＰ−２内の特定のドメインは決定されていない。ＩＧＦＢＰファミリーのメンバーは、６７％〜７０％構造相同性を示すが、個々の結合タンパク質の生理学的効果の多くは異なる。６つの型のＩＧＦＢＰの間で最も大きい相同性は、Ｎ末端およびＣ末端領域に含有される。Ｎ末端領域は、主要なＩＧＦ−Ｉ結合部位を含有し、一方、Ｃ末端領域は、ＩＧＦ−Ｉ結合を促進し、かつ、ファミリーのいくつかのメンバーの細胞外マトリックスに結合する能力の原因である。ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）は、ＩＧＦＢＰ−２、−３、および−５のＣ末端領域で同定されているが、ＲＧＤ配列は、ＩＧＦＢＰ−１、および−２に存在する。Ｃ末端ＨＢＤ（以下、ＨＢＤ２と呼ぶ）に加えて、ＩＧＦＢＰ−２は、リンカー領域内に位置する固有のＨＢＤ（以下、ＨＢＤ１と呼ぶ）を含有する（図１Ａ）。機能研究により、ＩＧＦＢＰ−３および−５内のＣ末端ＨＢＤが、細胞外マトリックスタンパク質に結合することができるが（ＩＧＦ依存性と非依存性の両方の作用を媒介すると提唱されている）、ＲＧＤ配列は、ＩＧＦＢＰ−１およびＩＧＦＢＰ−２のα５β１インテグリンへの結合に関与することが示されており、これが細胞遊走を媒介する。ＨＢＤ１配列を含有する合成ペプチドは、ＩＧＦＢＰ−２−／−マウスにおいて、骨芽細胞増殖を刺激し、海綿骨量を増加させ、骨吸収を低下させた。しかしながら、脂肪生成を変化させることにおけるＨＢＤ１およびＨＢＤ２の役割は決定されていない。したがって、本研究は、ＩＧＦＢＰ−２が前脂肪細胞分化を阻害することができるかどうかを決定するため、およびこの効果を調節することにおけるＨＢＤ１と２ドメインの相対的重要性を定義するために企てられた。同様に、これらの配列を含有するペプチドが脂肪量獲得を阻害することができるかどうかを決定するために、インビボ研究を実施した。
【０１３３】
合成ペプチドの作製およびペプチドペグ化。マウスＩＧＦＢＰ−２のＨＢＤ１ドメイン（ＣＫＨＬＳＬＥＥＰＫＫＬＲＰ）、スクランブル化ＨＢＤ１ペプチド（ＣＫＰＬＲＬＳＫＥＥＨＰＬＫ）（ＨＢＤ１対照ペプチド）、ヒトＩＧＦＢＰ−２のＨＢＤ２ドメイン（ＣＫＨＧＬＹＮＬＫＱＣＫＭＳＬＮＧＱＲ）、およびＩＧＢＰ−５のＣ末端ＨＢＤ（ＲＫＧＦＹＫＲＫＱＣＫＰＳＲＧＲＫＲ）（ＨＢＤ２対照ペプチド）を含有する合成ペプチドを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  ＣａｒｏｌｉｎａのＣｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ校のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにより合成された。Ｎ末端システインを含有しないＨＢＤ１および２ペプチドもまた調製された。純度および配列同一性を、質量分析法により確認した。ＨＢＤ１、ＨＢＤ２、およびＨＢＤ１対照ペプチド（それぞれ、Ｎ末端システインを含有した）を、本明細書に記載された手順に従ってペグ化した。
【０１３４】
ｐＬｅｎｔｉ−ＩＧＦＢＰ−２野生型（ＷＴ）、２つのＨＢＤ突然変異体、および非ＩＧＦ−Ｉ結合性突然変異体の作製。ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から増幅された野生型マウスＩＧＦＢＰ−２を、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターへ挿入し、置換突然変異体を作製するための鋳型として用いた。２つのＩＧＦＢＰ−２突然変異体は、配列１８８ＫＨＬＳＬＥＥＰＫＫＬＲ１９９を含有するＨＢＤ１ドメイン内と配列２４３ＫＨＧＬＹＮＬＫＱＣＫＭＳＬＮＧＱＲ２６０を含有するＩＧＦＢＰ−２のＨＢＤ２ドメイン内にアミノ酸の置換を組み込んだ。置換は太字で強調され、それぞれ以下：
【化６】
2016513645.tif 000013
（ＨＢＤ１突然変異体）および
【化７】
2016513645.tif 000014
（ＨＢＤ２突然変異体）の通りであった。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いて、これらの置換をコードするために必要とされる塩基変化を組み込んだ。ＩＧＦＢＰ−２の非ＩＧＦ−Ｉ結合性突然変異体を、以前に記載されているように調製した。
【０１３５】
ＩＧＦＢＰ−２の野生型、非ＩＧＦ−Ｉ結合性突然変異型、および２つのＨＢＤ突然変異型の精製。構築物をＣＨＯ−Ｋ１細胞に発現させた。無血清α−ＭＥＭ中に４８時間、維持された、ＷＴ  ＩＧＦＢＰ２または非ＩＧＦ−Ｉ結合性突然変異体、またはＨＢＤ１突然変異体、またはＨＢＤ２突然変異体を発現するコンフルエントなＣＨＯ−Ｋ１細胞から条件培地を収集した。発現したタンパク質を精製した。非ＩＧＦ−Ｉ結合性ＩＧＦＢＰ−２のＩＧＦ−Ｉ結合能力を決定するために、ＩＧＦ−Ｉ結合アッセイを実施した。
【０１３６】
初代前脂肪細胞の細胞培養。前脂肪細胞を、ＩＧＦＢＰ−２−／−マウスの精巣上体脂肪パッドから単離した。培養物は、それらがコンフルエンスに達するまで２日ごとに培地交換された。コンフルエントから２日後、細胞を分化培地（０．５ｍＭ  ＩＢＭＸ、１μＭデキサメタゾン、および５μｇ／ｍＬインスリンを含有する無血清ＤＭＥＭ）に曝し、２日間、インキュベートした。この培地に加えられる実験的処理は、野生型ＩＧＦＢＰ−２（３μｇ／ｍｌ）、ＨＢＤ１ペプチド（６μｇ／ｍｌ）、ＨＢＤ１対照ペプチド（６μｇ／ｍｌ）、ＨＢＤ２ペプチド（６μｇ／ｍｌ）、ＨＢＤ２対照ペプチド（６μｇ／ｍｌ）、ＨＢＤ１突然変異体ＩＧＦＢＰ２（３μｇ／ｍｌ）、ＨＢＤ２突然変異体ＩＧＦＢＰ−２（３μｇ／ｍｌ）、または非ＩＧＦ−Ｉ結合性突然変異体ＩＧＦＢＰ−２（３μｇ／ｍｌ）のいずれかを含んだ。インスリン（５μｇ／ｍｌ）を追加した標準培地中にさらに２日間、培養物を維持した。その後、インスリンを含まない新鮮な標準培地中にさらに２日間、培養物を保持した。
【０１３７】
オイルレッドＯ染色。細胞をＰＢＳですすぎ、その後、１０％ホルマリンで３０分間、固定した。１００％プロピレングリコール（Ｐｏｌｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂａｙ  Ｓｈｏｒｅ、ＮＹ）を加え、５分間、インキュベートし、培養物を、オイルレッドＯ（Ｐｏｌｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂａｙ  Ｓｈｏｒｅ、ＮＹ）と共に６０℃で１０分間、その後、８０％プロピレングリコールと共に５分間、インキュベートした。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８１倒立顕微鏡を用いて画像を撮り、結果を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ、バージョン１．４５Ｓ）を用いて定量化した。
【０１３８】
免疫沈降およびイムノブロッティング。分化した脂肪細胞を、氷冷溶解緩衝液中に溶解し、可溶化したタンパク質を定量化した（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）。等しいタンパク質量の可溶化液を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に負荷し、タンパク質を分離し、その後、イモビロンフィルターへ移し、抗アディポネクチン抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ、Ｇｏｌｄｅｎ、ＣＯ）について１：１０００、抗ＰＰＡＲγ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）について１：５００、抗ａｐ２抗体（ＰｒｏＳｃｉ  Ｉｎｃ．、Ｐｏｗａｙ、ＣＡ）について１：２０００、および抗β−アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）について１：５０００を用いるイムノブロッティングにより可視化した。免疫複合体を、高感度化学発光（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて可視化した。
【０１３９】
マウス。マウスＢ６．１２９−Ｉｇｆｂｐ２ｔｍ１Ｊｅｐ（Ｉｇｆｂｐ２−／−マウスと呼ぶ）を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドへ少なくとも１０世代、戻し交配した。Ｉｇｆｂｐ２＋／＋マウスはＣ５７ＢＬ／６Ｊ対照であった。全てのインビボおよびエクスビボの実験的研究を、雄マウスを用いて実施した。マウスを、以下の３つの処置群の１つに割り当てた：１）Ｐｅｇ  ＨＢＤ１ペプチド（Ｎ＝８）；２）Ｐｅｇ  ＨＢＤ２ペプチド（Ｎ＝１０）；３）対照ペプチド（Ｎ＝１８）。Ｉｇｆｂｐ２−／−マウスに、０．１ｍＬ  ＰＢＳ中の５０μｇの各ペグ化ペプチドを投与した。０．１ｍＬのＰＢＳを与えられたＩｇｆｂｐ２＋／＋マウス（Ｎ＝８）は対照としての役割を果たした（ＷＴ）。全ての注射を、週齢１０週間から２２週間まで、３回、ＩＰ投与した。全てのマウスは、１８．６％タンパク質、６．２％脂肪、および３．５％粗繊維を含有する２０１８  Ｔｅｋｌａｄ  ｇｌｏｂａｌ  ｒｏｄｅｎｔ  ｄｉｅｔ（Ｈａｒｌａｎ、Ｄｕｂｌｉｎ、ＶＡ）への自由なアクセスが提供された。マウスの摂食量および体重を毎週、決定した。
【０１４０】
体組成および血清中アディポカイン測定。体脂肪量および非脂肪量を、無麻酔の動物を用いて、磁気共鳴画像分析（ＥｃｈｏＭＲＩ−１００、Ｅｃｈｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）により処置の０週間目および１２週間目に測定した。１２週間の処置後、マウスを屠殺し、血液を、心穿刺により収集し、３５００ｒｐｍ×１５分間で遠心分離した。血清を−２０℃で保存した。腹部の鼠径部脂肪パッドおよび内臓脂肪パッドを、定義された解剖学的ランドマークに従って各動物から解剖した。胸郭と大腿上方との間の皮下脂肪を皮下鼠径部脂肪と名付け、一方、胃の小弯からＳ字結腸までの全ての脂肪を内臓脂肪と名付けた。脂肪貯蔵部位を、重量測定の前に、ブロッティング乾燥した。右鼠径部脂肪パッドを切り離して解剖し、この組織のトリグリセリド含有量を、比色分析（Ｐｏｉｎｔｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｎｔｏｎ、ＭＩ）により決定した。血清中アディポネクチンおよびレプチンを、ＥＬＩＳＡにより、製造会社の使用説明書（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）に従って測定した。
【０１４１】
グルコース負荷試験。経口グルコース負荷試験について、４時間の断食後、マウスに２０％グルコース（２．５ｇ／ｋｇ体重）を経口胃管栄養により与え、ベースライン、１５分後、３０分後、６０分後、９０分後、および１２０分後に血液を尾静脈から採取した（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｎｔｏｕｒ  Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）。
【０１４２】
統計学的解析。全てのデータは、平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として表されている。結果を、インビトロアッセイから得られたデータについてスチューデントｔ検定、またはインビボアッセイから得られたデータについてＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニ事後多重比較検定を用いて統計学的有意差について解析した。加えて、適切な場合、反復測定ＡＮＯＶＡを用いた。統計学的有意性をｐ＜０．０５に設定した。
【０１４３】
試薬。イモビロンＰ膜を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）から購入した。ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ストレプトマイシン、およびペニシリンを、Ｇｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から購入した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をコンジュゲートしたマウス抗ウサギ抗体およびヤギ抗マウス抗体を、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）から購入した。全ての他の試薬を、他に指定のない限り、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。
【０１４４】
ペプチドペグ化。ＨＢＤ１、ＨＢＤ２、およびＨＢＤ１対照ペプチド（それぞれ、Ｎ末端システインを含有する）を以下のようにペグ化した：１０ｍｇのペプチドを、４．０ｍｌの０．０５Ｍ  ＮａＰＯ４（ｐＨ７．０）において３８０μｇのメトキシＰＥＧマレイミド（２００００ｋＤａ）（１：３モル比のペプチド対ＰＥＧ）（ＪｅｎＫｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｌｌｅｎ、ＴＸ）と４℃で１４時間、混合した。システイン（１７ｍＭ）を、未処理の部位をブロックするために加えた。混合物を、Ｚｅｂｒａ  Ｄｅｓａｌｔスピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて、製造会社の使用説明書に従って、脱塩した。ペグ化を、クーマシー染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により検証した。Ｎ末端システインを含有するペグ化ペプチドを、Ｎ末端システインを含有しない非ペグ化ペプチドと比較した場合、等モル濃度が、前脂肪細胞分化へ類似した効果を生じた。種の違いの可能性を排除するために、合成マウスＨＢＤ１ペプチドをヒトＨＢＤ１ペプチドと比較した。これらのペプチドもまた、前脂肪細胞分化を阻害することにおいて等価であった。ヒトＨＢＤ１配列は、ウシＩＧＦＢＰ−２において同一である。無傷マウスＨＢＤ２配列は、ＨＢＤ１突然変異体タンパク質に含有され、それの生物活性は、ヒトＨＢＤ２ペプチドおよびウシ野生型タンパク質と類似している。
【０１４５】
ウイルスストックの調製。各ｐＬｅｎｔｉ構築物のために、ウイルスストックを、２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて作製した。細胞を、トランスフェクションの前日、成長培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）中、７５ｃｍ２プレートあたり５×１０６個で蒔いた。トランスフェクションの日、培地を、抗生物質と血清を含まない５ｍｌのＯｐｔｉ変法イーグル培地Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と交換した。各トランスフェクションのためのＤＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００複合体を、製造会社のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に従って調製した。１４時間後、培地を成長培地と交換した。トランスフェクションから４８〜７２時間後、ウイルス含有上清を回収し、４℃で１５分間、３０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を濾過し、１ｍｌのアリコートとして−８０℃で保存した。
【０１４６】
ｐＬｅｎｔｉ−ＩＧＦＢＰ−２野生型（ＷＴ）、２つのＨＢＤ突然変異体の作製。ＨＢＤ１突然変異体構築物を作製するために、以下のプライマー：
【化８】
2016513645.tif 000015
を用いた。ＨＢＤ２突然変異体構築物を作製するために、２ラウンドのＰＣＲを実施した。第１ラウンドＰＣＲについて以下のプライマー：
【化９】
2016513645.tif 000016
を用いた。配列確認後、第１ラウンドＰＣＲ産物を、第２ラウンドＰＣＲを実施するための鋳型として用いた。第２ラウンドのＰＣＲについて以下のプライマー：
【化１０】
2016513645.tif 000017
を用いた。ＩＧＦＢＰ−２の２つの突然変異型をコードするｃＤＮＡを、ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ反応を用いて、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターからｐＬｅｎｔｉ６−Ｖ５  ＤＥＳＴベクターへ移した。
【０１４７】
初代前脂肪細胞の単離。ＩＧＦＢＰ２−／−マウスから得られた精巣上体脂肪パッドの重量を計り、その組織を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍおよび１．５％ＢＳＡ）中、３７℃で４５分間、同体積（Ｗ／Ｖ）のコラゲナーゼＡ型（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）で消化した。前脂肪細胞を、５００ｘｇで５分間の遠心分離により間質血管細胞から分離した。ペレット化細胞を、３０ｍＭグルコースを含有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で洗浄し、１００μｍのメッシュフィルター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に通し、その後、６ウェルプレート内に１．２〜１．５×１０４細胞／ｍｌの密度で、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、および１０％ウシ胎児血清を追加した３０ｍＭグルコースを含有するＤＭＥＭ中に蒔いた。
【０１４８】
脂肪細胞面積測定。性腺周囲脂肪組織の試料を、１０％ホルマリンにおいて固定し、パラフィン内に包埋した。各試料から複数の切片を得て、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ６１顕微鏡を用いて、各切片のデジタル画像を取得し、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（１．４５Ｓ）を用いて、試料アイデンティティについて知らされていない研究者により切片あたり少なくとも２００細胞について細胞面積を手作業でトレースした。各脂肪貯蔵部位からの４つの切片を分析して、マウス（群あたりｎ＝６マウス）あたりの平均細胞面積を引き出した。
【０１４９】
ＩＧＦＢＰ−２およびＨＢＤ１またはＨＢＤ２ペプチドはＩＧＦＢＰ２−／−前脂肪細胞の分化を阻害する。ＨＢＤのそれぞれの脂質生成への効果を調べるために、ＨＢＤ１またはＨＢＤ２配列を含有するペプチドを、ＩＧＦＢＰ−２ヌルマウスから単離された前脂肪細胞の培養物とインキュベートした。３つの分化マーカー、アディポネクチン、ａＰ２、およびＰＰＡＲγの抑制により示されているように、天然ＩＧＦＢＰ−２は、前脂肪細胞の成熟脂肪細胞への分化を阻害した（図１Ａ、レーン８）。ＨＢＤ１ペプチドは、アディポネクチン（例えば、６６±１０％低下、ｐ＜０．０１）、ａＰ２（例えば、５１±２％低下、ｐ＜０．０１）、およびＰＰＡＲγ（例えば、４７±９％低下、ｐ＜０．０５）の発現を有意に阻害した（図１Ａ、レーン２対レーン１）。対照ＨＢＤ１ペプチドは、効果を生じなかった（図１Ａ、レーン３対レーン１）。興味深いことに、ＨＢＤ２ペプチドは、アディポネクチンおよびａＰ２の発現を完全に阻害し、ＰＰＡＲγ発現は低下した（６７±７％（ｐ＜０．０１））（図１Ａ、レーン４対レーン１）。ＩＧＦＢＰ−５の相同領域を含有するペプチドはそれらの発現を変化させなかった（図１Ａ、レーン５対レーン１）。ＨＢＤ１またはＨＢＤ２ドメインのいずれかにおける荷電残基が中性残基に変化しているＩＧＦＢＰ−２突然変異体を試験した。変化したＨＢＤ１配列を含有するＩＧＦＢＰ−２突然変異体は、野生型ＩＧＦＢＰ−２と同様に分化マーカー発現を阻害した（図１Ａ、レーン６対レーン８）。対照的に、変化したＨＢＤ２残基を含有するが、無傷ＨＢＤ１配列を含有するＩＧＦＢＰ−２突然変異体は、前脂肪細胞分化を阻止することにおける効果が有意に少なかった（図１Ａ、レーン７対レーン６）。分化した脂肪細胞を形成する能力を決定した場合、同様の結果が得られた（図２）。加えて、ＩＧＦ−Ｉ結合能力が１／５０００を下回る低下を示すＩＧＦＢＰ−２の非ＩＧＦ−Ｉ結合性突然変異型を利用した。結果は、この突然変異体が前脂肪細胞の分化へ阻害効果を生じないことを示した（図１Ｂ）。これらの結果は、天然ＩＧＦＢＰ−２、ＨＢＤ１突然変異体、およびＨＢＤ２ペプチドが脂肪生成の最も強力な阻害剤であり、一方、ＨＢＤ１ペプチドおよびＨＢＤ２突然変異体は活性がより低かったことを実証している。総合すれば、結果は、ＩＧＦＢＰ−２の前脂肪細胞の分化への阻害効果は、主に、それのＨＢＤ２ドメインを介して媒介され、それのＩＧＦ−Ｉ結合能力の存在も必要とすることを強く示唆している。
【０１５０】
ＨＢＤ１およびＨＢＤ２ペプチドはＩＧＦＢＰ２−／−マウスにおいて体重増加を減少させる。ＩＧＦＢＰ−２  ＨＢＤの体重増加および脂肪量への効果をインビボで調べるために、各ＨＢＤ配列を含有するペプチドをＩＧＦＢＰ−２−／−マウスに投与した。両方の対照ペプチドがインビトロで、前脂肪細胞分化へ類似した効果を生じたので、スクランブル化ＨＢＤ１ペプチドだけを対照として用いた。インビボで、ペプチドの半減期を延ばし、かつそれらのタンパク質分解に対する抵抗性を増加させるために、全ての３つのペプチドをペグ化した。週５回、３週間、腹腔内（ＩＰ）注射により投与された５０μｇのＨＢＤ１ペプチドは、ＩＧＦＢＰ−２−／−雄マウスにおいて骨成長を促進したことが以前に示されている。その以前のプロトコールを改変し、５０μｇの各ペプチドを３回／週、１２週間、（ＩＰ）注射した。同年齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｗｔ）雄マウスを、溶媒で処置し、ペプチド処置を受けた３群のマウスと比較した。
【０１５１】
この動物研究は多数のＩＧＦＢＰ−２−／−マウスを必要とするため、実験を２つの時期に分けた。第１時期において、ＨＢＤ１および対照ペプチド処置、加えて野生型対照マウスを研究した。第２時期において、ＨＢＤ２および対照ペプチドの効果を決定した。各時期における各群のマウスの体重および年齢は、処置の開始時点で類似していた。結果により、対照ペプチドを受けたＩＧＦＢＰ−２−／−マウスは、対照野生型マウスと比較して、１２週間中、体重増加がより多いことが示された（図３Ａ）。研究の区間の間、ＨＢＤ１またはＨＢＤ２ペプチドで処置されたＩＧＦＢＰ−２−／−マウスは、対照ペプチドで処置されたマウスと比較して、８週間の処置後、体重増加が有意により少なかった。この差は、ＨＢＤ処置されたマウスにおいて持続し、１２週間の処置後、その差は有意のままであった（図３Ａ）。加えて、１０週間後、体重増加は、ＨＢＤ１ペプチドを受けたマウスと比較して、ＨＢＤ２ペプチドを受けたマウスにおいて有意により少なかった（図３Ａ）。重要なことには、野生型対照マウスにおける体重の増加は、ＨＢＤ１かまたはＨＢＤ２のいずれかでそれぞれ処置されたＩＧＦＢＰ−２−／−マウスと類似した（図３Ａ）。体重増加における違いが食物摂取量の差によって引き起こされた可能性を排除するために、摂食量を毎週、測定した。結果により、全ての処置の間で有意差はないことが示された（図３Ｂ）。加えて、経口グルコース負荷試験は、異なる処置の間で有意差がないことを示した（図３Ｃ）。
【０１５２】
ＩＧＦＢＰ−２のヘパリン結合ドメインは、体脂肪量蓄積を阻害し、血清中アディポカインホルモン濃度を変化させる。体組成における変化を調べるために、全てのマウスに研究の開始時点および終了時点にＭＲＩを実施した。１２週間の処置後、両方のＨＢＤペプチドが、対照ペプチド処置と比較して、脂肪量増加を低下させたが、ＨＢＤ２だけが統計学的差に達した（例えば、０．５８±０．１２ｇ増加対１．１９±０．３５ｇ増加、ｐ＜０．０５）（表１）。脂肪量の変化が、体重に占めるパーセンテージとして表された脂肪の変化として表された場合、同じ結果が得られた。ＨＢＤ２ペプチドだけが、研究の区間に渡って体脂肪量増加の有意な減少を生じた（例えば、対照と比較して４８±９％低下、ｐ＜０．０５）（図４Ａ）。ＨＢＤ２ペプチド処置はまた、対照ペプチドと比較して、非脂肪量の有意な保存を伴った（例えば、非脂肪量増加：３．１０±０．５７ｇ対１．８５±０．４９ｇ、ｐ＜０．０５）（表１）。非脂肪量変化が、体重に占めるパーセンテージとして表された場合、結果は、対照ペプチドで処置されたＩＧＦＢＰ−２−／−マウスが、いずれかのＨＢＤペプチドで処置されたマウスと比較して、相対的により大きい非脂肪量変化を体験したが（例えば、７．２±１．０％相対的低下）、ＨＢＤ２ペプチドがより効果的であった（例えば、ＨＢＤ１について４．１±１．１％相対的低下、ＨＢＤ２について２．１±０．８％相対的低下、ｐ＜０．０５）ことを示した（図４Ｂ）。
【０１５３】
脂肪量への効果を確認するために、１２週間の処置の完了後、マウスを屠殺し、２つの体脂肪区画の重量を測定した。結果により、異なる処置の間で肝臓および心臓の重量において有意差はないことが示され（図５Ａ）、そのことにより、臓器重量変化が、処置に関連した体重変化に寄与する可能性が排除された。脂肪区画分析により、対照ペプチドを与えられたＩＧＦＢＰ−２−／−マウスは、全ての群の間で、最も高い鼠径部脂肪含有量および内臓脂肪含有量を有することが示された。ＨＢＤ２ペプチドは、対照ペプチドで処置されたＩＧＦＢＰ−２−／−マウスと比較して、鼠径部脂肪パッド重量を有意に低下させたが（例えば、０．２３±０．０２ｇ対０．３４±０．０３ｇ、ｐ＜０．０５）、ＨＢＤ１ペプチドは効果を生じなかった（表２）。体重に占めるパーセンテージとして表された鼠径部脂肪パッドを処置の間で比較した場合、類似した結果が得られた（例えば、対照ペプチドと比較した場合、ＨＢＤ２処置に関して３２±７％差、ｐ＜０．０１）（図５Ｂ）。
【０１５４】
絶対的内臓脂肪重量は、対照ペプチド処置と比較して、ＨＢＤ１またはＨＢＤ２ペプチドのどちらで処置されたマウスにおいても有意に低下したが、ＨＢＤ２ペプチドがより効果的であった（例えば、ＨＢＤ２についての０．２５±０．０２ｇおよびＨＢＤ１についての０．３４±０．０１ｇ対、対照についての０．４６±０．０４ｇ、ｐ＜０．０５）（表２）。変化が体重に占めるパーセンテージとして表された場合、類似した結果が検出された（例えば、ＨＢＤ２と対照の間での４４±７％の差、ＨＢＤ１と対照の間での２４±５％の差、ｐ＜０．０５）（図５Ｃ）。興味深いことに、両方の脂肪区画の重量が体重に占めるパーセンテージとして表された場合、ＨＢＤ２ペプチドで処置されたＩＧＦＢＰ−２−／−マウスにおける結果は、野生型マウスと類似した（図５Ｂ〜Ｃ）。脂肪細胞サイズを処置の間で比較した場合、有意差は検出されなかった（例えば、対照ペプチド、ＨＢＤ１、ＨＢＤ２、および野生型、それぞれについて、１２３９９±１４０８、１２４０６±７４８、１１９６７±７１６、および１２４２２±８３１ピクセル／細胞。ｐ、Ｎ．Ｓ．（非有意））。鼠径部脂肪パッド中のトリグリセリド含有量の分析により、ＨＢＤ１またはＨＢＤ２ペプチドのどちらで処置されたＩＧＦＢＰ−２−／−マウスにおいてもそれは有意に低下したが、ＨＢＤ２がより効果的であった（例えば、３７±９％対２２±２％低下、ｐ＜０．０５）ことが示された（図６Ａ）。加えて、野生型マウスにおけるトリグリセリド含有量は、対照ペプチドで処置されたＩＧＦＢＰ−２−／−マウスのそれより有意に低かった（例えば、３１±５％低い、ｐ＜０．０１）（図６Ａ）。血清中アディポネクチン平均レベルは、対照ペプチド（例えば、３６±４％、ｐ＜０．０１）またはＨＢＤ１ペプチド（例えば、２４±５％低下、ｐ＜０．０５）で処置されたマウスのどちらと比較しても、ＨＢＤ２ペプチド処置に関して有意に低かった（図６Ｂ）。ＨＢＤ２ペプチドでの処置は、対照ペプチド処置マウスと比較して、血清中レプチンレベルを有意に増加させたが（例えば、５７±９％増加、ｐ＜０．０１）、ＨＢＤ１ペプチドは効果を生じなかった（図６Ｃ）。野生型マウスにおける血清中レプチンレベルもまた、対照ペプチド処置ＩＧＦＢＰ−２−／−マウスのそれより高かった（図６Ｃ）。総合すると、これらの結果は、ＨＢＤ１とＨＢＤ２ペプチドの両方が、脂肪生成を阻害することができるが、ＨＢＤ２ペプチドがより強力な阻害剤であることを実証している。
【０１５５】
上記のように、ＩＧＦＢＰ−２がインビボで脂肪生成を変化させることができるかどうかを決定するために、合成ペプチドを用いた。ＩＧＦＢＰ−２は、複雑なジスルフィド結合パターンを有し、それゆえに、哺乳類細胞における発現が必要とされ、これらの動物を処置することができるのに十分な材料を得ることが困難であろう。したがって、２つのＨＢＤに由来した配列を含有する合成ペプチドが、前脂肪細胞分化を阻害する能力を保持するかどうかを決定するために研究を行った。
【０１５６】
本明細書で報告された研究は、インビトロで、ＨＢＤ１領域における荷電残基の突然変異誘発が、結果として、ＩＧＦＢＰ−２の前脂肪細胞分化を阻害する能力の喪失を生じ、この領域を含有するペプチドが、結果として、脂肪量獲得の３１％阻害を生じたことを実証している。対照的に、Ｃ末端ヘパリン結合ドメイン内の配列を含有するペプチドは、前脂肪細胞分化のより強力な阻害剤であり、その領域内の荷電残基がアラニンと置換されたＩＧＦＢＰ−２突然変異体は、分化を阻害する能力が低下した。ＨＢＤ２ペプチドは、前脂肪細胞分化を阻害することにおいて、ＨＢＤ１ペプチドより１．８倍、強力であった。
【０１５７】
これらの所見は、ＩＧＦＢＰ−２−／−マウスにおけるインビボ研究において確認された。ＨＢＤ２ペプチドの投与は、対照ペプチドを受けたマウスと比較して、１２週間の期間に渡って、脂肪量の増加を有意に阻害した。ＨＢＤ１ペプチドもまた有意な効果を生じたが、ＨＢＤ２ペプチドに対する応答が有意により大きかった。ＨＢＤ２ペプチドはインビボでそれの優れた効力を保持すること、および両方のペプチドが天然ＩＧＦＢＰ−２の代用物として利用し得ることが結論づけられた。処置は、食物摂取量への有意な効果を生じなかったが、研究は、観察される小さな差（例えば、８％）を検出するのに十分な力はなかった。ペプチドがエネルギー消費を増加させる可能性があるが、これは測定されなかった。この区間に渡る脂肪量の変化は、グルコース耐性の変化を生じなかった。
【０１５８】
ＨＢＤペプチドが、ＩＧＦ−Ｉ作用をアンタゴナイズすることにより前脂肪細胞分化を阻害する可能性を排除するために、分化培地において各ペプチドの存在下でＩＧＦ−Ｉを加える実験を行った。分化培地は、ＩＧＦ−Ｉ受容体を活性化するのに十分である１０−６Ｍインスリンを含有するため、ＩＧＦ−Ｉを加えることは、細胞分化に追加の効果を生じず、したがって、ＨＢＤペプチドの追加の効果は直接、検出することができなかった。ＩＧＦＢＰ−２またはＨＢＤペプチドはインスリンを結合することができないため、ＩＧＦＢＰ−２またはＨＢＤペプチドは、ＩＧＦ−Ｉまたはインスリンのこの受容体への結合を阻止することにより前脂肪細胞分化を阻害するのではないと結論づけられた。
【０１５９】
要約すれば、本明細書に記載された研究は、インビトロおよびインビボで、ＩＧＦＢＰ−２の両方のヘパリン結合ドメインが、前脂肪細胞分化を阻害するある程度の能力をもつが、Ｃ末端ＨＢＤが、有意に、より強力であることを実証している。このドメインの効果は、そのペプチドの１２週間の投与が、脂肪量蓄積を、野生型マウスにおいて測定される比率と類似した比率に制限するようなことであった。これは、このドメインが、脂肪生成を制限することにおけるタンパク質全体の効果の多くを模倣することができることを示唆している。ＩＧＦＢＰ−２レベルは、ヒトにおいて脂肪症およびインスリン抵抗性の発生と相関しているため、これらの所見は、このペプチドが、インスリン抵抗性を媒介することにおける脂肪症の役割を研究するための薬理学的ツールとしてだけでなく、有望な処置モダリティーとして有用である可能性があることを示している。
【実施例３】
【０１６０】
ＨＢＤ−２ペプチドが脂肪減少を誘導するかどうかを決定するために、ＨＢＤ−２ペプチドを、遺伝的に正常で、卵巣切除したマウスに投与する実験を行った。この実験の目的は、そのペプチドが、卵巣切除したマウスにおいて脂肪量を変化させることができるかどうかを決定することであった。エストロゲン欠乏マウスは、卵巣の除去後、脂肪量を増すことが知られている。遺伝子操作されていない動物モデルにおいてそのペプチドは試験されていなかったため、かつそれが既存の脂肪量を低下させることができるかどうかを決定するために、脂肪量が前に獲得されている状態においてそれは試験されていなかったため、この実験を行った。実験設計は以下の通りであった。
【０１６１】
各処置群において８匹のマウスがあった。Ｃ５７Ｂ６正常マウスは、週齢８週間に卵巣切除を受けた。その後、それらを、標準固形飼料食餌（６％脂肪）で３週間、維持した。その時点で、それらを、週２日で４週間の２．５ｍｇ／ｋｇの活性ペプチドの皮下注射で処置した。そのペプチドは、本明細書に記載されたペグ化ＨＢＤ−２ペプチドである。
【０１６２】
同様に卵巣切除を受けている第２処置群を、同じアミノ酸であるが、スクランブルされた順序でアミノ酸を含有する対照ペプチドの同一の濃度で処置した。第３群は、切開が行われ、その後、閉じられて、卵巣が除去されないシャム手術を受けた。比較のために、ＩＧＦＢＰ−２遺伝子が欠失しているマウスの応答を、同じ様式で処置した。
【０１６３】
８匹のマウスが受け、正常な動物について記載されているように、活性ペプチドで４週間、処置された。８匹の追加のマウスが対照ペプチドを受け、８匹のマウスがシャム手順を受けた。動物の体重を毎週、計った。４週間後、それらは、体組成を決定するためにＭＲＩ分析を受けた。非脂肪量および脂肪量の両方を定量化し、全体重に占めるパーセントとしてのパーセント脂肪を数学的に決定した。
【０１６４】
結果は、対照の、卵巣切除を受けている遺伝的に正常な動物において、そのペプチドが脂肪量を低下させることを実証した。卵巣切除した動物は、シャム手術の動物における２．８３ｇから６．３ｇへ（ｐ＜０．００１）の脂肪量の非常に有意な増加を示した。活性ペプチドの投与は、脂肪量を６．３２ｇから４．０ｇへ（ｐ＜０．００７）低下させた。これらのデータは表３に示されている。全体重もまた、２５．８７ｇから２３．０ｇへ（ｐ＜０．０１）有意に低下した。これは、シャム動物における２２．８ｇに匹敵する。ＩＧＦＢＰ−２遺伝子が欠失している卵巣切除を受けた動物は、類似した変化を示した。具体的には、対照ペプチドで処置された動物は、５．３７ｇの脂肪を有したが、シャム動物は、２．９ｇを有した（ｐ＜０．０３５）。ＨＢＤ−２ペプチドの投与は、結果として、対照ペプチド処置された動物と比較して、３．８５ｇの脂肪量を生じた（ｐ＜０．００１）。対照ペプチドと比較した場合の、活性ペプチドを受けた遺伝的に正常な動物における脂肪の変化を比較した結果は、図８に示されている。要約すれば、結果は、エストロゲンの欠乏の結果として脂肪量が増加している遺伝的に正常な動物へのＨＢＤ−２ペプチドの投与が、脂肪量において有意な低下を引き起こすことを実証している。これは、過剰な脂肪蓄積を有する正常な個体において効果的である可能性が高いことを示している。
【０１６５】
本明細書に引用された全ての特許、特許公開、および非特許文書の開示は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【０１６６】
【表６】
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【０１６７】
【表７】
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【０１６８】
【表８】
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【０１６９】
処置群は、ＨＢＤペプチド（ＨＢＤ  ｐｅｐｔ）、対照ペプチド（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｐｅｐｔ）、およびシャムである。シャム動物は、それらの卵巣を除去されなかったが、その他の２つの群は除去された。マウスは２つの異なる遺伝子型を有する。＋／＋は対照マウスであり、−／−マウスはＩＧＦＢＰ−２ノックアウトマウスである。
【図１Ａ−１】
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【図１Ａ−２】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ．３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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