(57)【要約】  本発明は、医学、具体的には免疫学及び消化器病学に関する。特に、本発明は、炎症性腸疾患といった炎症性疾患の治療のための治療的使用に対するプロバイオティクス細菌及びその抽出物に関する。活性成分としてフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆ（ＤＳＭ２６９４３）又は細胞外高分子マトリックス（ＥＰＭ）を含むその抽出物と、許容可能な担体と、賦形剤又は添加剤と、を含む組成物が提供される。また、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆから抽出されたＥＭＰを含む抗炎症組成物及び該組成物を調製する方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分としてフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆ（寄託番号ＤＳＭ２６９４３のもと２０１３年３月１日にＤＳＭＺに寄託された）と、許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤と、を含む医薬組成物、栄養補助組成物又は食品組成物。
【請求項２】
フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆ（ＤＳＭ２６９４３）の生細胞を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆ（ＤＳＭ２６９４３）の非生細胞を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
１又は２以上のプレバイオティクス、好ましくはオリゴ糖、より好ましくはフルクトオリゴ糖、ペクチン及び／又はインスリンをさらに含む、
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
１又は２以上のプロバイオティクス細菌、好ましくはビフィドバクテリウム、ラクトバチルス、ストレプトコッカス、サッカロマイセス及びこれらの混合物からなる群より選択される１又は２以上のプレバイオティクス細菌をさらに含む、
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
食品組成物、食品サプリメント又は栄養補助食品である、
ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
医薬組成物、好ましくは経口摂取可能な形態、好ましくはカプセル、マイクロカプセル、錠剤、顆粒、粉末、トローチ、ピル、懸濁液又はシロップの形態に製剤化れる、
ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
医薬品としての使用のためのフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆ（ＤＳＭ２６９４３）。
【請求項９】
哺乳動物である対象の消化管の炎症性疾患及び／又は微生物叢不均衡に関連する症状を治療又は予防する方法における使用のためのフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆ（ＤＳＭ２６９４３）。
【請求項１０】
前記対象は、ヒトである、
ことを特徴とする請求項９に記載のフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆ。
【請求項１１】
前記対象は、家畜又は農業動物である、
ことを特徴とする請求項９に記載のフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆ。
【請求項１２】
前記細菌が、治療上有効な量で、好ましくは約１０ｅｘｐ６ＣＦＵ／日から１０ｅｘｐ１１ＣＦＵ／日の量で、対象に投与されるように製剤化されている、
ことを特徴とする請求項８乃至１１のいずれか１項に記載の使用のためのフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆ。
【請求項１３】
前記消化管疾患は、炎症性腸疾患、クローン病、過敏性腸疾患、セリアック病、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、
ことを特徴とする請求項８乃至１２のいずれか１項に記載の使用のためのフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆ。
【請求項１４】
ａ）フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆ（ＤＳＭ２６９４３）の生細胞を収集すると共に、適切な緩衝液、好ましくはＰＢＳにおいて前記細胞を再懸濁する工程と、
ｂ）少なくとも３分間再懸濁された前記細胞をボルテックスして、細胞結合細胞外高分子マトリックス（ＥＰＭ）を前記緩衝液に溶解させる工程と、
ｃ）遠心分離により前記細胞をペレット化すると共に、上清を収集する工程と、
ｄ）約４倍量の氷冷したエタノールを前記上清に加えて、前記ＥＭＰを沈殿させる工程と、
ｅ）沈殿した前記ＥＰＭをエタノールで洗浄する工程と、
ｆ）任意で、その後凍結乾燥する工程と、
を含む、抗炎症組成物を生成する方法。
【請求項１５】
シンバイオティクス組成物であって、（ｉ）当該組成物の乾燥全重量に基づき少なくとも０．０５％の量のリボフラビン、リン酸リボフラビン又はその生理学的に許容可能な塩及び（ｉｉ）システイン、好ましくは当該組成物の乾燥全重量に基づき少なくとも０．０５％の量のシステイン、とともに製剤化されたフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆ（ＤＳＭ２６９４３）の生細胞を含むシンバイオティクス組成物。
【請求項１６】
インスリン又はインスリン−タイプ  フルクト−オリゴ糖、ペクチンを、好ましくは当該組成物の乾燥全重量に基づき２−１０％の量でさらに含む、
ことを特徴とする請求項１５に記載のシンバイオティクス組成物。
【請求項１７】
抗炎症組成物の生成のためのフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆ（ＤＳＭ２６９４３）の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、特に免疫学及び消化器病学に関する。具体的には、本発明は、炎症性腸疾患及び微生物相の不均衡に関連する疾患といった炎症性疾患の治療に対する治療的使用のためのプロバイオティクス細菌及びその抽出物に関する。本発明はまた、例えば、機能性食品、栄養補助組成物又は医薬組成物といった抗炎症性（プロバイオティクス）組成物、及びそれらを製造する方法、消化管におけるプロバイオティクスの生存を促進するためのアプローチを提供する。
【背景技術】
【０００２】
炎症性腸炎（ＩＢＤ）は、下痢、血便、腹痛及び体重減少により特徴付けられる消化管の慢性炎症疾患である。ＩＢＤは、慢性的であり、原因不明の炎症を再発する。ＩＢＤは、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）の、２つの主要な疾患コンディションを含む。ＵＣは主に、大腸又は結腸の粘膜層に影響を与える。一方、ＣＤは、小腸及び大腸の部位に関与し得る貫壁性の肉芽腫性炎症として規定される。ＵＣ及びＣＤは、遺伝的感受性宿主における腸微生物相に対する異常な炎症性Ｔ細胞応答により生じる。微生物相の多様性及び組成の劇的な変化は、ＵＣ及びＣＤに関連する（非特許文献１、非特許文献２）。ＩＢＤ患者の便の微生物相において、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）及びファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の系統の頻度の減少及びプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）及びアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の増加が観察されている（非特許文献３）。具体的には、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門のメンバーであり、健康なヒトの結腸において最も豊富な種の一つである）（非特許文献４）は、ＩＢＤ患者の微生物相において少数派である（非特許文献５）。活性化状態の疾患のＣＤ患者では、緩解状態の患者に比して、回腸生検からのフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の粘膜関連カウントも低い（非特許文献６）。
【０００３】
フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）は、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ（非特許文献６））及び樹状細胞における高い量のＩＬ−１０を誘導する能力のために抗炎症性細菌として報告されている。さらに、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の培養上清でＣａｃｏ−２細胞を処理すると、ＩＬ−１β誘導ＮＦ−κＢ活性化及びＩＬ−８の分泌が低減されることが報告されている。これは、培地に分泌された未同定の因子に帰する（非特許文献６）。さらに、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株Ａ２−１６５及びその培養上清を投与することで、マウスの２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）誘導大腸炎から保護されることが示されている（非特許文献６）。このモデルは、生じた粘膜炎症がＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１２の過剰な生成とのＴヘルパー１（Ｔｈ１）反応を介して生じるため、ＣＤと似ていると考えられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｅｋｓｉｋ，  Ｐ．，  Ｌ．  Ｒｉｇｏｔｔｉｅｒ−Ｇｏｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）．  “Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｆａｅｃａｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｌｏｎ．”  Ｇｕｔ  ５２（２）：  ２３７−２４２．
【非特許文献２】Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ，  Ｇ．  Ｔ．，  Ｋ．  Ｌ．  Ｂｌａｃｋｅｔｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）．  “Ｔｈｅ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．”  Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  １５（１３）：  １５２８−１５３６．
【非特許文献３】Ｆｒａｎｋ，  Ｄ．  Ｎ．，  Ａ．  Ｌ．  Ｓｔ  Ａｍａｎｄ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）．  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｍｂａｌａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．”  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０４（３４）：  １３７８０−１３７８５．
【非特許文献４】Ｆｌｉｎｔ，  Ｈ．  Ｊ．，  Ｋ．  Ｐ．  Ｓｃｏｔｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）．  “Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｕｔ．”  Ｇｕｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ３（４）：  ２８９−３０６．
【非特許文献５】Ｓｏｋｏｌ，  Ｈ．，  Ｐ．  Ｓｅｋｓｉｋ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）．  “Ｌｏｗ  ｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  ｉｎ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ．”  Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ  １５（８）：  １１８３−１１８９．
【非特許文献６】Ｓｏｋｏｌ，  Ｈ．，  Ｂ．  Ｐｉｇｎｅｕｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）．  “Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  ｉｓ  ａｎ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｏｍｍｅｎｓａｌ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｒｏｈｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．”  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５（４３）：  １６７３１−１６７３６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、炎症性疾患の予防及び／又は治療における使用のためのさらなるフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株に対するニーズを認識した。彼らは特に、先行文献で用いられた株Ａ２−１６５（ＤＳＭＺ１７６７７）よりも効果的な株を同定することを目指した。さらなる目的は、抗炎症特性を有する細菌抽出物を提供することであった。そのためにも、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の異なる株及びその抽出物のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）腸炎マウスモデルにおける炎症を抑制する能力を評価した。
【０００６】
驚くべきことに、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆの生細胞及びそれから単離された細胞外高分子マトリックス（ＥＰＭ）が、強い免疫調節特性を有することが見出された。この株は、寄託番号ＤＳＭ２６９４３のもと本出願人により２０１３年３月１日にＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）に寄託された。株ＨＴＦ−Ｆは、過去に、健康なヒトドナーから得られたいくつかの新しい分離株の一つとして、Ｌｏｐｅｚ−Ｓｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）により報告された。１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列分析に基づき、それは系統グループＩＩに属することが見出された。しかしながら、株ＨＴＦ−Ｆの治療的使用については、本技術分野においていまだ報告又は示唆されておらず、ＩＢＤにおける強い抗炎症効果についても報告又は示唆されていなかった。
【０００７】
重要なことに、ＨＴＦ−Ｆの抗炎症効果は、株Ａ２−１６５よりも高いことが見出され、この一つの理由として、ＨＴＦ−ＦのＥＰＭの免疫調節特性が挙げられる。ＥＰＭの免疫調節効果は、抗原提示細胞におけるＩＬ−１２及びＩＬ−１０サイトカイン生成のＴＬＲ２依存的調節を少なくとも部分的に介して生じる。株ＨＴＦ−Ｆはまた、細胞内凝集を起こし、液体培養において高密度のバイオフィルムを形成することが観察されたが、株Ａ２−１６５では観察されなかった。理論に縛られることを望むものではないが、バイオフィルムは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細菌のコロニー形成にいくつかの利点を提供し得る。具体的には、ＥＰＭは、この細菌を酸化ストレスから保護し、ひいては、内部拡散を介して、主な酸素源である腸上皮の近傍に存在し得、それはＥＰＭを少なく生成する株よりも優れている。これは、結腸壁の近傍にブチレート及び他の抗炎症性生成物を運ぶ一助となる。すべてのこれらの特徴は、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆを、大腸炎及び他の炎症性腸疾患を治療するための強固なプロバイオティクスとする。このように、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆ及びそのＥＰＭは、ＩＢＤ及び関連する炎症性疾患のマネージメントにおける治療薬として有利に用いられる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって本発明の一実施態様において、活性成分としてフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆ又は細胞外高分子マトリックスを含むその抽出物と、許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤と、を含む組成物が提供される。該組成物は、例えば、医薬組成物、食品組成物又は栄養補助組成物である。また、医薬品としての使用のためのフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆ  ＤＳＭ２６９４３（本明細書において“ＨＴＦ−Ｆ”という）及び／又は細胞外高分子マトリックスを含むその抽出物が提供される。例えば、ＨＴＦ−Ｆ又は細胞外高分子マトリックスを含むＨＴＦ−Ｆの抽出物は、哺乳動物である対象の消化管の炎症性疾患を治療又は予防する方法において効果的に使用される。これは、マウス大腸炎モデルにおける臨床的パラメータの低減によって以下、本明細書において示される。
【０００９】
また、有効量のフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆ又はＥＰＭを含むその抽出物を投与することを含む、哺乳動物の消化管の炎症性疾患に関連する症状を治療又は予防する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ａ）嫌気性コンディション下でのＹＣＦＡＧ培地におけるフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆ及びＡ２−１６５の増殖及びバイオフィルム形成。ｉ）及びｉｉ）各々、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）Ａ２−１６５の振盪前後。ｉｉｉ）及びｉｖ）各々、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＨＴＦ−Ｆの振盪前後。ｂ）フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）Ａ２−１６５（左パネル）及びＨＴＦ−Ｆ（右パネル）のグラム染色。
【図２】透過型電子顕微鏡によるフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＨＴＦ−ＦのＥＰＭの検出。フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＨＴＦ−Ｆは、（ａ）より薄いがＳ．ｓｕｉｓ野生型株の莢膜多糖類（ＣＰＳ）に似ている広範かつ不規則な表層を有し（矢印、Ｓ．ｓｕｉｓ野生型株、ｂ左パネル）、ｂ）ＣＰＳ欠損変異株ではみられない（ｃｐｓ無しのＳ．ｓｕｉｓ、ｂ右パネル）。
【図３】フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＨＴＦ−ＦのＥＰＭのＴＬＲシグナリング特性。ＮＦκＢ活性は、ＴＬＲ２／１、ＴＬＲ２／６、ＴＬＲ５及びＴＬＲ４を発現するＨＥＫ２９３細胞株において発光レポーターを用いて測定され、相対値は、測定された値に対して中間コントロール値を減じて計算された。エラーバーはＳＥＭを表し、ｎ＝６である。
【図４】フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）Ａ２−１６５（３ドナー）、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＨＴＦ−Ｆ（３ドナー）、ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（５ドナー）、ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）＋ＥＰＭ（５ドナー）、ＥＰＭ（３ドナー）又は非刺激（５ドナー）とともに培養４８時間後のヒト未成熟樹状細胞（ｈＤＣ）におけるサイトカイン分泌及び表面マーカー発現。ａ）Ｌ−１０及びＩＬ−１２ｐ７０はｈＤＣの上清で測定された。エラーバーはＳＥＭを表し、＊は、ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）処理サンプルに比してｐ＜０．０５を示す。ｂ）ＣＤ８３＋  （左パネル）及びＣＤ８６＋  （右パネル）ｈＤＣの割合。エラーバーはＳＥＭを表し、＊＊は、ｐ＜０．０１を示し、ｎ．ｓ．は、コントロールに比して有意差がないことを示す。
【図５】定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定されたｈＤＣにおける相対的遺伝子発現レベル。ＲＮＡは、ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（黒色）、ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）＋ＥＰＭ（濃いグレー色）、ＥＰＭ（薄いグレー色）又は非刺激細胞（白色）とともに培養６時間及び２０時間後に、ｈＤＣから抽出され、ＩＬ−１２ｐ７０遺伝子の発現レベルが、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの発現レベルと比較して算出された。エラーバーはＳＥＭを表し、ｎ＝３であり、＊＊＊は、ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）処理サンプルに比してｐ＜０．００１を示す。
【図６】ＤＳＳ処理マウスのＤｉｓｅａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ  Ｓｃｏｒｅ（ＤＡＩ）、結腸のｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄａｍａｇｅ  ｓｃｏｒｅ及び臨床的評価。マウスに対して、非処理（白色）、ＤＳＳで８日間処理し、ＰＢＳを直腸内投与（黒色）、ＥＰＭを直腸内投与（青色）、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆを直腸内投与（赤色）又はフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株Ａ２−１６５を直腸内投与（緑色）した。ＤＡＩ、ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄａｍａｇｅ  ｓｃｏｒｅ及び結腸の長さは（各々、ａ、ｂ及びｃ）は、実験の最終に評価した。マウスの体重（ｄ）は、実験の間中測定され、体重の値は、ＤＳＳ投与前０日に測定された初期値の割合として表された。エラーバーはＳＥＭを表し、ｎ＝１０であり、＊は、ＤＳＳ＋ＰＢＳを投与したコントロール大腸炎マウスに比してｐ＜０．０５を示し、＊＊は、ＤＳＳ＋ＰＢＳを投与したコントロール大腸炎マウスに比してｐ＜０．０１を示し、＊＊＊は、ＤＳＳ＋ＰＢＳを投与したコントロール大腸炎マウスに比してｐ＜０．００１を示す。
【図７】非処理又はＤＳＳ処理マウスの下行結腸の組織学的断面図。ａ）大腸炎コントロール、ＰＢＳ−ＤＳＳ処理マウス（ダメージグレード３−３．５）、ｂ）ＨＴＦ−Ｆ−ＤＳＳ処理マウス（ダメージグレード１−２．４）、ｃ）は、Ａ２−１６５−ＤＳＳ処理マウス（ダメージグレード２−３．７）、ｄ）ＥＰＭ−ＤＳＳ処理マウス（ダメージグレード２．８−３．８）、ｅ）非処理マウス（ダメージグレード０）。
【図８】非処理のマウス（白色）又は８日間ＤＳＳで処理し、ＰＢＳ（黒色）、ＥＰＭ（青色）、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆ又はフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株Ａ２−１６５（各々、赤色においてＨＴＦ−Ｆ、緑色においてＡ２−１６５）を直腸内投与したマウスの腸管膜リンパ節（ＭＬＮ、左パネル）及び脾臓（右パネル）から単離したＦｏｘｐ３＋  ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合。
【図９】マウスのＢＭＤＣにおけるサイトカイン分泌。ａ）ＩＬ−１０及びＩＬ１２ｐ７０をラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）＋ＥＰＭ、ＥＰＭ及び非処理ＤＣとともに培養後にＢＭＤＣ上清において測定した。ｂ）抗ＴＬＲ２ブロッキング抗体（ａｎｔｉ−ＴＬＲ２  Ａｂ、濃いグレー色のバー）又はアイソタイプコントロール（アイソタイプＡｂ、薄いグレー色のバー）が培養の間含まれていたことを除き、ＩＬ−１０及びＩＬ１２ｐ７０をパネル（ａ）と同様のサンプルとともにＢＭＤＣ培養後に測定した。エラーバーはＳＥＭを表し、ｎ＝３であり、＊＊＊は、ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を投与したサンプルに比してｐ＜０．００１を示し、＊＊は、ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を投与したサンプルに比してｐ＜０．０１を示し、ｎ．ｓ．はラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を投与したサンプルと有意差がないことを示す。
【図１０】ＤＳＳ処理マウス由来の結腸培養物におけるサイトカイン分泌。マウスは、非処理又は８日間ＤＳＳ処理してＰＢＳ、ＥＰＭ、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆ又はＡ２−１６５を直腸内投与された。サイトカインは、マウスから単離した結腸切片の４８時間培養物の上清において測定された。エラーバーはＳＥＭを表し、ｎ＝５であり、＊は、ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、ｐ＜０．０１を示す。
【図１１】ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）＋ＥＰＭ、ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）＋非培養細菌培地由来の抽出物（コントロールＥＰＭ）、ＥＰＭ、非培養細菌培地由来の抽出物（コントロールＥＰＭ）又は非刺激（２ドナー）とともに４８時間培養した後の異なる２ドナー由来のヒト未成熟樹状細胞（ｈＤＣ）における１Ｌ−１２ｐ７０分泌。この効果は、非培養培地由来のコントロール抽出物を用いた場合では観察されなかった。ＥＰＭ抽出物、非培養培地由来のコントロール抽出物及び培地コントロールは、ＩＬ−１２分泌又は他のサイトカイン（図示せず）を誘導しなかった。これらの結果は、ＥＰＭの効果が非培養培地の成分によらないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明によれば、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株は、生細胞の形態であってもよい。あるいは、それらは、非生細胞の形態であってもよい。生細胞と非生細胞との混合物もまた、想定される。プロバイオティクス細菌の一般的な使用は、生細胞の形態である。しかしながら、それは、プロバイオティクス細菌により発現される、有効な因子を含む殺菌された培養物又は組成物といった非生細胞にまで拡張され得る。これは、熱により死滅させられた微生物、あるいは変えられたｐＨへの曝露又は高圧若しくはガンマ線照射への曝露により死滅させられた微生物を含み得る。細胞は、医薬品に組み込まれ得る。非生細菌では、生成物の調製は簡便であり、特に酸素感受性の観点から生細胞に比して保存要件の制限が少ない。
【００１２】
特定の態様において、生細菌又はＥＰＭは、例えば、直腸内送達というように、消化管に直接的に投与される。非生細菌の送達のための他のオプションは、腹膜内注射といった全身性の送達を含む、消化管非依存的経路を含む。本発明の好ましい態様にておいて、宿主細胞における炎症性反応を引き起こさない、１又は２以上の精製された細菌の抗炎症性成分が、例えば、経口投与、皮下投与又は局所投与される。
【００１３】
強い抗炎症効果の観点において、本発明は、望まない炎症性反応を含む種々の病態におけるその使用を見出す。炎症は、急性又は慢性に分類される。急性炎症は、有害な刺激に対する身体の初期の反応であり、血液から損傷を受けた組織への血漿及び白血球（特に顆粒球）の動きの増加により引き起こされる。一連の生化学的なイベントは、局所的な血管システム、免疫システム、及び損傷組織内の種々の細胞に関係する炎症反応を拡大させ、成熟させる。慢性炎症として知られる、長びく炎症は、炎症部位に存在する細胞の種類の進行的なシフトを引き起こし、同時の破壊及び炎症プロセスからの組織の回復により特徴付けられる。
【００１４】
一実施態様において、炎症性疾患は、炎症性の消化管疾患であり、好ましくは、炎症性腸疾患、クローン病、過敏性腸疾患、潰瘍性大腸炎、セリアック病、感染性大腸炎（例えば、ディフィシル菌により引き起こされた）、潰瘍性大腸炎、他の消化管関連疾患及びこれらの組み合わせからなる群より選択される。または、炎症性疾患は、炎症性自己免疫疾患であり、微生物叢不均衡及び低い程度の粘膜炎症が、糖尿病（タイプ１及び２）、喘息及びアトピー性疾患といった疾患の原因又は発病に関連する。
【００１５】
さらなる観点において、株ＨＴＦ−Ｆ及びそれを含む組成物は、消化管の微生物叢不均衡に関連するコンディション又は疾患を罹患しているか、増加する進展リスクを抱えているヒトにおける予防薬又は治療薬として用いられる。消化管微生物叢組成物は、メタボリックシンドローム（例えば、肥満、タイプ２糖尿病、冠動脈疾患及び非アルコール性脂肪性肝炎）のいくつかの特質に関連する。消化管の微生物叢は、消化管のバリア不均衡に関連するメカニズムを介してこれらの代謝性疾患を特徴付ける低い程度の炎症の発病に寄与することがエビデンスにより示唆される。近年、腸内分泌細胞及び内在性カンナビノイドシステムが、消化管の透過性及び代謝性の内毒素血を制御することが示されている。さらに、プレバイオティクス特性を有する消化されない炭水化物を用いる標的化栄養療法が、ヒトの介入試験についてはさらなる検討が必要であるが、これに関連する前臨床試験の結果をもたらすと期待されることが示されてきた。このように、本発明の組成物は、均衡のとれた消化管の微生物叢の確立又は維持のために有利に用いられる。さらに、ＨＴＦ−Ｆは、肥満及びタイプ２糖尿病に関連する治療標的として消化管の微生物叢を変化させるのに役立ち得る。
【００１６】
消化管の微生物叢及びエネルギーホメオスタシスと、炎症及び肥満関連疾患の発症におけるその役割と、の間の関連が、徐々にわかってきている。肥満の動物モデルでは、変化する微生物叢の組成は、食事からの増加するエネルギー取り入れ、脂肪組織及び肝臓における変化する脂肪酸代謝及び組成、消化管ペプチドＹＹ及びグルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）−１分泌の調節、リポ多糖類トール様受容体−４  ａｘｉｓの活性化、ＧＬＰ−２による腸バリアの完全性の調節といったいくつかのメカニズムを介して、宿主における肥満、インスリン抵抗及び糖尿病の進展につながる。
【００１７】
好ましい態様において、株ＨＴＦ−Ｆ又は抗炎症剤を含むその抽出物は、大腸又は結腸の粘膜層が受けた損傷を保護又は治療するために用いられる。
【００１８】
好ましくは、治療されるべき対象は、ヒトである。例えば、それは、潰瘍性大腸炎に罹患したことが分かってる、又は罹患の疑いのあるヒトである。しかしながら、本発明はまた、獣医学用薬においても適用可能である。例えば、家畜又は農業動物における治療的使用のためのフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆ又はその抽出物もまた提供される。
【００１９】
フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆ又はその抽出物は、好ましくは、対象における抗炎症性サイトカイン生成の増加及び／又は１又は２以上の前炎症性サイトカインの生成の減少を引き起こす。例えば、抗炎症性サイトカインは、ＩＬ−１０又はＴＧＦ−βである。一実施態様において、前炎症性サイトカインは、ＴＬＲ２シグナリングに依存し、好ましくは、前記サイトカインは、ＩＬ−１２ｐ７０である。
【００２０】
私たちはまた、望ましくない炎症活性の予防及び／又は治療のための抗炎症性生物学的治療剤の調製における使用に対するフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆ又はその抽出物を記載する。該株は、消化管から前炎症性の微生物を阻害及び排除することで作用し得る。
【００２１】
該細菌又は抽出物は、例えば、患者のタイプ、疾患の重症度及び投与ルートに依存して、治療上有効な量で、対象に投与されるよう製剤化される。典型的には、該細菌の治療上有効な量は、約１０ｅｘｐ６ＣＦＵ／日から１０ｅｘｐ１１ＣＦＵ／日、好ましくは、約１０ｅｘｐ７ＣＦＵ／日から１０ｅｘｐ１０ＣＦＵ／日である。
【００２２】
該細菌は、任意の適切な投与ルートで投与され得る。例えば、本発明の特定のフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株は、経口投与可能な形態で動物（ヒトを含む）に投与され得る。食品組成物又は栄養補助食品の場合、該細菌は単に、従来の食品アイテム又は食品サプリメントに組み込まれ得る。典型的な医薬製剤は、カプセル、マイクロカプセル、錠剤、顆粒、粉末、トローチ、ピル、坐薬、懸濁液及びシロップを含む。他の実施態様において、該組成物は、例えば直腸の坐薬又は浣腸剤といった、動物（ヒトを含む）への直腸投与のための形態である。適切な製剤が、従来の有機添加剤又は無機添加剤を用いて行われる通常の方法により調製され得る。医薬組成物における活性成分の量は、所望の治療効果を達成する濃度とし得る。
【００２３】
該組成物は、有益な態様において消化管の微生物叢の群生を変えるために、有益な細菌の増殖又は維持をサポートすることが知られている成分といった、有用なさらなる成分を含み得る。このような成分は“プロバイオティクス”と呼ばれる。公知のプロバイオティクスの典型的な例は、フルクトオリゴ糖及びインスリンといったオリゴ糖である。シンバイオティクスは、相乗的な形態においてプロバイオティクスとプレバイオティクスとを組み合わせた栄養補助的サプリメントに関する。
【００２４】
前述の抗炎症効果に必要とされるフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）細菌は、酸素に非常に感受性が高く、数分以上の大気への曝露により生存することができなくなる。結果として、生きたフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）を含むプロバイオティクス組成物は、治療的適用が期待されるにもかかわらず、これまで記載されてこなかった。
【００２５】
本発明の特定の観点は、リボフラビン、リン酸リボフラビン又はその生理学的に許容可能な塩及びシステインと混合されたフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆの生細胞を含むシンバイオティクス組成物に関する。この混合物は、製造、保存及び／又は消費の間、大気への曝露に対するこれらの細菌の驚くべき良好な保護を与えることが見出された。例えば、それは、少なくとも２４時間、大気への曝露に耐えることができ、少なくとも２時間、擬似消化液中で安定である。また、本発明によるシンバイオティクス製剤は、例えば、ミルク又はヨーグルト飲料といった食用製品と混合された場合、少なくとも２時間、安定であり得る。好ましくは、リボフラビンが用いられる。
【００２６】
リボフラビン、リン酸リボフラビン又はその生理学的に許容可能な塩は、組成物の乾燥全重量に基づき、少なくとも０．０５％、好ましくは少なくとも１％、より好ましくは少なくとも２％の量で存在する。例えば、それは、組成物の乾燥全重量に基づき、０．０５〜１０％、好ましくは１〜１０％、より好ましくは２〜１０％又は０．０５〜０．２５％含み得る。システインは、組成物の乾燥全重量に基づき、好ましくは少なくとも０．０５％の量で存在する。システインの量は、２％までが適切である。例えば、組成物は、組成物の乾燥全重量に基づき、０．１〜１．５％、０．５〜１％又は０．０５〜０．２％のシステインを含み得る。
【００２７】
組成物はさらに、１又は２以上のプレバイオティクス、好ましくはオリゴ等、より好ましくはフルクトオリゴ糖、ペクチン及び／又はイヌリン又はイヌリン−タイプ  フルクトオリゴ等を、好ましくは、組成物の乾燥全重量に基づき、２−１０％の量で含み得る。他の適切な成分は、好ましくは組成物の乾燥全重量に基づき、４０−６５％の量の充填剤を含む。
【００２８】
当然、組成物は、さらなるプレバイオティクス及び／又はプロバイオティクスを含む、さらなる有用な成分を含み得る。有用なプロバイオティクス細菌は、好ましくは、乳酸菌、ビフィズス菌又はそれらの混合物からなる群より選択される。プロバイオティクス細菌は、確立されたプロバイオティクス特性を有するいかなる乳酸菌又はビフィズス菌であってもよい。例えば、それらはまた、ビフィズス菌腸微生物叢の発達を促進させることができる。場合によっては、それらは、酸素からフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）を保護するのを助けることができる。適切な付加的なプロバイオティクスは、ビフィズス菌、乳酸菌、ストレプトコッカス及びサッカロミケス又はそれらの混合物からなる群より選択され得、具体的には、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉ及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ又はそれらの混合物からなる群より選択され得、好ましくは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  （ＮＣＣ５３３；  ＣＮＣＭ  １−１２２５）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  （ＮＣＣ４９０；  ＣＮＣＭ  １−２１７０）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  （ＮＣＣ２７０５；  ＣＮＣＭ  １−２６１８）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ  （２８１８；  ＣＮＣＭ  １−３４４６），  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  （ＮＣＣ２４６１；  ＣＮＣＭ  １−２１１６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＧ  （ＡＴＣＣ５３１０３）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  （ＮＣＣ４００７；  ＣＧＭＣＣ  １．３７２４）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ  ＳＦ  ６８  （ＮＣＩＭＢ１０４１５）及びそれらの混合物からなる群より選択され得る。一実施態様において、さらなるプロバイオティクスは、抗炎症分子の送達媒体として機能する非病原性の食品グレードの組み換え体の細菌である、食品グレードの細菌を含む。国際公開公報２０１１／０８６１７２号を参照のこと、その特許の全体を本明細書に参考として組み込む。有用な増殖基質は、セロビオース及びラクツロースを含む。製剤は、マルトデキストラン又はプルランといった充填剤及び増量剤を含み得る。一実施態様において、組成物は、株ＨＴＦ−Ｆを含む嫌気性細菌の集合を含む。これらの嫌気性細菌は、糖、アミノ酸、酢酸塩及びリボフラビンのようなビタミンといった必須栄養素をＨＴＦ−Ｆに与え、その増殖を早め、促進する。例えば、ビフィズス菌及びクロストリジウムの群ＩＶ及びＸＩＶａのメンバーは、株ＨＴＦ−Ｆと組み合わせて適切に用いら��る。
【００２９】
他の特定の観点において、本発明は、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆから抽出された細胞外高分子マトリックスを含む組成物、及び治療におけるその使用、具体的には抗炎症剤としての使用を提供する。抗炎症抽出物を生成する方法も提供される。一実施態様において、該方法は、ａ）フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆの生細胞を収集すると共に、適切な緩衝液、好ましくはＰＢＳにおいて該細胞を再懸濁する工程と、ｂ）好ましくは少なくとも３分間再懸濁された前記細胞をボルテックスして、前記細胞結合細胞外高分子マトリックス（ＥＰＭ）を前記緩衝液に溶解させる工程と、ｃ）遠心分離により前記細胞をペレット化すると共に、上清を収集する工程と、ｄ）約４倍量の氷冷したエタノールを前記上清に加えて、ＥＭＰを沈殿させる工程と、ｅ）沈殿したＥＰＭをエタノールで洗浄する工程と、ｆ）任意で、その後凍結乾燥する工程と、を含む。（凍結乾燥された）沈殿物は、使用前に適切なキャリアーにおいて所望の濃度で再構成され得る。例えば、それは、ＰＢＳといった生理食塩水に溶解される。
【００３０】
本発明の抽出物は、少なくとも１つの免疫調節サイトカインの生成を調整することができる。一実施態様において、それは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのシステムにおいて、抗炎症性サイトカイン生成の増加及び／又は１若しくは２以上の前炎症性サイトカイン生成の減少を引き起こす。例えば、抽出物は、任意でラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）で刺激された、ヒト単球由来樹状細胞（ＨＭＤＣ）又は骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験される。他のアッセイは、ヒト血液又は結腸培養物由来の末梢血単核球を用いたものを含み、例えば、サイトカイン生成は、ＤＳＳ処理マウスから得られた培養された結腸切片において測定され得る。
【００３１】
一実施態様において、抽出物は、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の生成を増加させる。他の実施態様において、抽出物は、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７及び／又はＩＦＮ−γのような、１又は２以上の前炎症性サイトカインの生成を低減させる。例えばＩＬ−１２ｐ７０といった前炎症性サイトカインの減少は、ＴＬＲ２シグナリングに依存し得る。好ましい態様において、抽出物は、抗炎症性サイトカインの生成を引き起こし、前炎症性サイトカインを低減させる。
【００３２】
フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆ又はＥＰＭを含むその抗炎症性抽出物を投与することを含む、哺乳動物である対象の消化管の炎症性疾患に関連する症状を治療又は抑制する方法もまた、提供される。消化管疾患は、炎症性腸疾患、クローン病、過敏性腸疾患、セリアック病、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎及びこれらの組み合わせからなる群より選択される。好ましくは、治療されるべき対象は、ヒトである。フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆは、治療上有効な量で（典型的には、細菌の治療上有効な量は、約１０ｅｘｐ６ＣＦＵ／日から１０ｅｘｐ１１ＣＦＵ／日である）、対象に投与される。特定の実施態様において、細菌は、前述のシンバイオティクス組成物の一部として投与され、それは、リボフラビン、リン酸リボフラビン又はその生理学的に許容可能な塩及びシステインとともに製剤化されたフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆｅａｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆの生細胞を含む。
【実施例】
【００３３】
（材料及び方法）
【００３４】
（動物）
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、通常のコンディションで飼育した。２月齢雌マウスをこれらの試験に使用し、それらの体重を実験の前後で測定した。動物実験は、ｔｈｅ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｚｅｃｈ  Ｒｅｐｕｂｌｉｃ）で承認された。
【００３５】
（細菌株及び培養コンディション）
フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆ及びＡ２−１６５については本明細書以にで記載され（Ｂａｒｃｅｎｉｌｌａ，  Ｐｒｙｄｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００；  Ｄｕｎｃａｎ  ２００２；  Ｌｏｐｅｚ−Ｓｉｌｅｓ，  Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２）、嫌気性コンディション下、イースト抽出物、カシトン、脂肪酸及びグルコース培地（ＹＣＦＡＧ、Ｌｏｐｅｚ−Ｓｉｌｅｓ，  Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２において記載される）において３７℃で維持された。株ＨＴＦ−Ｆは、寄託番号ＤＳＭ２６９４３のもと、２０１３年３月１日にＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）に寄託された。
【００３６】
ＹＣＦＡ培地は、カシトン（１．０ｇ）、イースト抽出物（０．２５ｇ）、ＮａＨＣＯ３（０．４ｇ）、システイン（０．１ｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（０．０４５ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（０．０４５ｇ）、ＮａＣｌ（０．０９ｇ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（０．０９ｇ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．００９ｇ）、ＣａＣｌ２（０．００９ｇ）、レサズリン（０．１ｍｇ）、ヘミン（１ｍｇ）、ビオチン（１μｇ）、コバラミン（１μｇ）、ｐ−アミノ安息香酸（３μｇ）、葉酸（５μｇ）及びピリドキサミン（１５μｇ）からなる。加えて、以下の短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）が含まれる（最終濃度）：アセテート（３３ｍＭ）；プロピオネート（９ｍＭ）；イソブチレート、イソバレレート及びバレレート（各々１ｍＭ）。システインを煮騰後に培地に加え、Ｈｕｎｇａｔｅチューブに、ＣＯ２で該チューブをフラッシュしながら分配した。オートクレーブ後、チアミン及びリボフラビンのフィルター滅菌溶液を加え、各々０．０５μｇ／ｍＬの最終濃度とする。
【００３７】
ＥＰＭ生成のために、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株を、ＹＣＡＧ培養液中で培養する。ＹＣＡＧ培養液は、ＹＣＦＡＧ培地と同じ組成を有するが、アセテート以外、すべての短鎖脂肪酸は除かれている。ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＷＣＦＳ１を、３７℃で、ｄｅＭａｎ，Ｒｏｇｏｓａ  Ｓｈａｒｐｅ培地（ＭＲＳ、Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）において、安定相まで一晩培養した。細菌を１５分間、３０００ｇ、４℃で、遠心分離により収集し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２０％グリセロールを含むＰＢＳに再懸濁し、使用前に−８０℃で保存した。ＢＭＤＣアッセイのために、３７℃でＭＲＳ中で増殖させたラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＷＣＦＳ１を、前述の通り、１％ホルムアルデヒド−ＰＢＳで不活性化した（Ｓｃｈａｂｕｓｓｏｖａ，  Ｈｕｆｎａｇｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２）。細菌を蛍光  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）又は位相差顕微鏡法によって定量した。嫌気性細菌に対して用いられたすべての緩衝液及び培養液は、３０分間、窒素非含有の酸素でフラッシングすることにより酸素を除去した。
【００３８】
（フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）細胞外高分子マトリックスの単離及び染色）
ＥＰＭに結合した細胞を、過去の記載の通り抽出した（Ｒｉｃｃｉａｒｄｉ，  Ｐａｒｅｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８）。２５０ｍＬのフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の２４時間培養物を、１５分間、３３００ｇで遠心分離することにより回収し、ＰＢＳで洗浄後、遠心分離を行った。前洗浄細胞ペレットを５分間ボルテックスすることで８ｍＬのＰＢＳに懸濁し、細胞結合ＥＰＭを溶解させた。細胞をその後、１０分間（４℃）、１８４００ｇで遠心分離することで、ペレット化した。上清をその後、注意深く収集し、４倍量の氷冷した無水エタノールを加え、ＥＰＭを沈殿させた。３０分間、３３００ｇで遠心分離後、ＥＰＭ沈殿ペレットを７０％エタノールで洗浄し、その後、凍結乾燥させ、−２０℃で保存した。さらなる実験のために、凍結乾燥させたＥＰＭフラクションを所望の濃度でＰＢＳに溶解させた。ＥＰＭを、グラム染色後、目視して、細菌のコンタミネーションがないことを確認した。ＴＬＲアッセイ（次のセクションにて記載）は、ＥＰＭがＭＡＭＰｓの混入がないことを示した。
【００３９】
（ＴＬＲシグナリングアッセイ）
ＴＬＲアッセイを、安定してヒトＴＬＲ２／６、ＴＬＲ２／１、ＴＬＲ４又はＴＬＲ５を発現し（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、フランス）、ＮＦ−κＢプロモーターのコントロールのもとルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミド（ｐＮｉＦＴＹ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）でトランスフェクトされたヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）を用いて行った。異なるＴＬＲ及びｐＮｉＦＴＹを発現するＨＥＫ２９３細胞を、ＥＰＭ（１．２％  ｖ／ｖ）、ＴＬＲアゴニスト、ＴＬＲ２／６に対するＰａｍ２ＣＳＫ４（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）、ＴＬＲ２／１に対するＰａｍ３ＣＳＫ４（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）、ＴＬＲ５に対するフラジェリン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）及びＴＬＲ４に対するＬＰＳ又はコントロールとして培地単独で培養した。培養６時間後、培地をＢｒｉｇｈｔ  ｇｌｏｗ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で置換し、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて発光を測定した。ネガティブコントロールとして、ＴＬＲを発現しないがｐＮｉＦＴＹを発現するＨＥＫ２９３細胞を同コンディションにおいて試験し、該ＨＥＫ２９３細胞はルシフェラーゼ活性を示さなかった。ＴＬＲレポーター細胞株に対する感受性の限界は、各々の精製されたアゴニストに対する用量範囲を用いた独立した実験において決定された。これらのレポーター細胞株に対する検出限界は、以下の通り決定された：Ｐａｍ２ＣＳＫ４（ＴＬＲ２）では２ｎｇ／ｍｌ、フラジェリン（ＴＬＲ５）では８ｎｇ／ｍｌ及びＬＰＳ（ＴＬＲ４）では５０ｐｇ／ｍｌ；これより低い濃度で存在するＭＡＭＰｓは、私たちのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでは免疫細胞を活性化せず、期待されるように、ＥＰＭはｈＤＣ又はマウスＢＭＤＣを活性化しなかった（図４及び図９）。
【００４０】
（ヒトＤＣアッセイ）
この試験は、Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認され、ヘルシンキ宣言の原則に従い行われた。血液ドナー由来のバフィーコートをナイメーヘン（オランダ）のＳａｎｑｕｉｎ  Ｂｌｏｏｄ  ｂａｎｋから得た。記入済みのインフォームドコンセントを、サンプル収集前に得た。ＥＰＭの免疫調節特性を、表面マーカーの発現及びフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）Ａ２−１６５とヒト単球由来ＤＣ（ｈＤＣ）（３ドナー由来のｈＤＣ）、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＨＴＦ−Ｆ（３ドナー由来のｈＤＣ）、ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（５ドナー由来のｈＤＣ）、ＥＰＭ（３ドナー由来のｈＤＣ）又はＥＰＭと一緒のラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（５ドナー由来のｈＤＣ）の培養後の上清において分泌されたサイトカインを測定することで検討した。細菌は、細菌：ＤＣ比１０：１、ＥＰＭ１．２％ｖ／ｖで用いられた。単核球を、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ密度勾配（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｄｉｅｇｅｍ  Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて、その使用説明書に従い、健康なドナーのバフィーコートから単離した。遠心分離後、単核球を収集し、単球を磁気マイクロビーズでコーティングされたＣＤ−１４特異的抗体（Ｍｉｌｔｅｎｔｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、ライデン、オランダ）を用いてＣＤ１４＋細胞のポジティブセレクションにより単離した。ＣＤ１４＋細胞を、ＩＬ−４及び顆粒球−マクロファージ  コロニー刺激因子（ＧＭＣＦＳ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）の存在下、完全培地で６日間培養し、未成熟単球由来ＤＣに分化させた。６日目、２４ウェルプレートにおいて細胞を１０６細胞／ウェルで播種し、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）（１、２％ｖ／ｖ）から単離したＥＰＭの存在下若しくは非存在下又は非処理で、ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（細菌：ＤＣ、１０：１）で処理した。共培養４８時間後、サイトカイン測定のために上清を収集した。
【００４１】
培養期間及び刺激の間、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を加えたＲｏｓｅｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０培養培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＤＣを培養し、細胞増殖は観察されなかった。６日目及び８日目に、ＣＤ１４＋細胞の活性及び成熟状態をＣＤ８３及びＣＤ８６表面発現を測定することで評価し、細胞生存率をアネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いて測定した。細胞を、ＣＤ８３、ＣＤ８６、それらのアイソタイプに合致したコントロールに特異的な蛍光物質コンジュゲートモノクローナル抗体及びアネキシンＶ及びＰＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ブレダ、オランダ）で染色し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ、ＢＤ）で分析した。ＣＤ８６及びＣＤ８３は未成熟又は非処理ＤＣで低レベルで発現しており、刺激後に高度に発現した。６日目及び８日目に、細胞の生存率は、６０−８０％であった（図示せず）。
【００４２】
（ＲＮＡ単離及びリアルタイムｑＰＣＲ）
トータルＲＮＡをＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、フェンロ、オランダ）を用いて、その使用説明書に従いｈＤＣから単離した。ｃＤＮＡ合成を、５００ｎｇの単離したトータルＲＮＡ及びＱ−ｓｃｒｉｐｔ（Ｑｕａｎｔａ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて、その使用説明書に従い行った。ｃＤＮＡを、ヌクレアーゼ非含有水において最終容量１００μＬに希釈し、さらなる使用まで−２０℃で保存した。プライマーとして、ＩＬ−１０（ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＧＴＧＡＴＧＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＡＧＡ−３’、ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＣＡＣＧＧＣＣＴＴＧＣＴＣＴＴＧＴＴＴＴ−３’）、ＩＬ−１２ｐ４０（ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＣＴＣＴＧＧＣＡＡＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣ−３’、ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＧＣＴＴＡＧＡＡＣＣＴＣＧＣＣＴＣＣＴＴ−３’）、ＩＬ−１β（ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＣＴＴＧＴＴＣ−３’、ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＣＧＧＡＧＡＴＴＣＧＴＡ−３’）、ＴＮＦ−ａｌｐｈａ（ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−  ＣＴＧＣＴＧＣＡＣＴＴＴＧＧＡＧＴＧＡＴ−３’、ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＡＧＡＴＧＡＴＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧＧＧ−３’）及び参照遺伝子ＧＡＰＤＨ  （ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧ−３’、ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＧＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴ−３’）及びβ−アクチン（ｆｏｒｗａｒｄ  ５’−ＴＴＧＣＧＴＴＡＣＡＣＣＣＴＴＴＣＴＴＧ−３’、ｒｅｖｅｒｓｅ  ５’−ＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＴＴＣＣＡＧＴＴＴ−３’）を、ＰＲＩＭＥＲ３ソフトウェア（Ｒｏｚｅｎ  ａｎｄ  Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ，  ２０００）を用いてデザインした。定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を、ＧｏＴａｑ  ｑＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行い、簡潔には、５μＬ  ｃＤＮＡ（２０×希釈）、フォーワード及びリバースプライマー（各々３００ｎＭ）を７μＬ  ｑＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒｍｉｘに加え、脱塩水を加えて最終容量１４μＬにした。ｑＰＣＲ反応（９５℃で２分間、９５℃で１５秒を４０サイクル、６０℃で６０秒）を、Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ  ６０００  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｃｙｃｌｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）により行った。生データをＲｏｔｏｒ−ｇｅｎｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖ５．０の比較定量法を用いて分析し、相対的な遺伝子発現レベルを標的遺伝子対参照遺伝子の比として決定し、Ｐｆａｆｆｌ（Ｐｆａｆｆｌ  ２００１）により記載されたΔＣｔ法に従い、以下の方程式：比＝（Ｅｔａｒｇｅｔ）Ｃｔｔａｒｇｅｔ（コントール−サンプル）／（Ｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）Ｃｔｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（コントロール−サンプル）を用いて算出した。式中、Ｅは増幅効率であり、Ｃｔは予め決められた閾値を超えるシグナルに必要とされるＰＣＲサイクルの数である。二重内在参照遺伝子（ＧＡＰＤＨ及びβ−アクチン）は、すべてのｑＰＣＲ実験において組み込まれ、結果は、以下の各遺伝子への標準化と同様であった。各サンプルに対して、逆転写酵素で処理されてないコントールが含まれ、バックグラウンドレベルを超える増幅は観察されなかった。各実行における各遺伝子に��して非鋳型コントールは含まれておらず、バックグラウンドレベルを超える増幅は観察されなかった。増幅の特異性を、融点及び各々の融解曲線の特性を調べることで確認した。各テンプレートの生成物を、シーケンスにより少なくとも一度チェックした。
【００４３】
（マウスＢＭＤＣアッセイ）
ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のマウスＢＭＤＣを、先に記載されたように（Ｌｕｔｚ，  Ｋｕｋｕｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９）調製した。簡潔には、大腿骨及び脛骨から単離した骨髄細胞を、細菌用ペトリ皿で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン及び２０ｎｇ／ｍＬマウスｒＧＭ−ＣＳＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に２×１０５細胞／ｍＬで播種した。新鮮培地を３日目及び６日目に加え、培養８日目にはＢＭＤＣが使用された。ＢＭＤＣ（１０６細胞／ｍＬ）を、２０時間のラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ＥＰＭ又はラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ＥＰＭ又はＥＰＭと一緒のラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）による刺激前、３７℃で１時間、１０μｇ／ｍＬの濃度で、抗ＴＬＲ２抗体（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、米国）又はコントールアイソタイプ抗体ＩｇＧ２ａ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）とともに培養した。ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を細菌：ＤＣ比１０：１、ＥＰＭ  １．２％ｖ／ｖで使用した。刺激されたＢＭＤＣの培養上清を使用まで−２０℃で保存した。細胞表面マーカー分析のために、培養後にＢＭＤＣ収集し、抗マウスＦＩＴＣ−コンジュゲートＣＤ１１ｃ、ＡＰＣ−コンジュゲートＭＨＣＩＩ及びＰＥ−コンジュゲートＣＤ４０、ＣＤ８０又はＣＤ８６モノクローナル抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）で、４℃で３０分間染色する前に、５分間氷上で抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）とともに予め培養した。サンプルデータを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国）で得て、ＦｌｏｗＪｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ７．６．２（ＴｒｅｅＳｔａｒ、米国）で分析した。
【００４４】
（サイトカイン分析）
ｈＤＣ培養上清におけるサイトカイン濃度を、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｂｅａｄ  ａｒｒａｙｓ（ＢＤ）及びｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ、ＢＤ）を用いて決定した。ｈＤＣ試験において、検出限界は以下の通りである：ＩＬ−１β  ７．２  ｐｇ／ｍＬ、ＩＬ−１０  ３．３ｐｇ／ｍＬ、ＴＮＦ  ３．７ｐｇ／ｍＬ及びＩＬ−１２ｐ７０  １．９ｐｇ／ｍＬ。マウスＩＬ−１０を、Ｒｅａｄｙ−Ｓｅｔ−Ｇｏ！  ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）を用いて、その使用説明書に従い酵素免疫定量（ＥＬＩＳＡ）によって培養上清において評価した。ＩＬ−１２ｐ７０のレベルを、合致した抗体ペア（ｍａｔｃｈｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐａｉｒｓ）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、米国）で測定した。
【００４５】
（細菌又はＥＰＭの直腸内投与及び急性潰瘍性結腸炎の誘導）
治療グループの１０マウス及びその各々の治療を表１に示す。グループ２、３、４及び５のマウスには、１週間、不断で２．５％ＤＳＳ（分子量４０ｋＤａ；ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、オハイオ、米国）を含む飲用水を与えた。非処理コントールグループ１のマウスには、飲用水のみを与えた。グループ３及び４のマウスは、１日量２〜３×１０９ＣＦＵのフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＨＴＦ−Ｆ及びＡ２−１６５を、各々、１００μＬのＰＢＳ中で、ＤＳＳ曝露の前１０日間及びＤＳＳ処理の８日間の間、（チューブを介して）直腸内投与した。グループ５のマウスには、１日量５０μｇのＥＰＭを、１００μＬのＰＢＳ中で、ＤＳＳ曝露の前１０日間及びＤＳＳ処理の８日間の間、直腸内投与した。結腸炎コントールグループのマウスには、１００μＬのＰＢＳを直腸内投与した。以下の臨床的症状を測定又は評価した：便の硬さ、直腸脱、直腸出血及び屠殺後の結腸の長さ。下行性結腸について、ミエロペルオキシダーゼアッセイ、ｍＲＮＡの単離、組織学的評価及び腸管切片培養を行った。
【００４６】
【表１】
2016511272.tif 000002
【００４７】
（Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）
Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ（ＤＡＩ）（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｏｏｐｅｒ，  Ｍｕｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．  １９９３）に従い測定）は、体重減少、便の硬さ及び出血を３で割った混合スコアである。急性の臨床的症状は、下痢及び／又は肉眼的血便である。スコアは、表２で説明される。
【００４８】
【表２】
2016511272.tif 000003
【００４９】
＊正常便：良好な形状のペレット、軟便：ペースト状であり半形成状の便、肛門に付着していない、下痢：液体状の便であり、肛門に付着している。
【００５０】
（結腸ダメージの組織学的評価）
結腸組織を３０分間、カルノア液で固定し、９６％エタノールに移し、パラフィン包埋した。５ｍｍのパラフィン包埋切片を切り出し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）並びにアルシアンブルーで染色し、ムチン生成のためにＮｕｃｌｅａｒＦａｓｔＲｅｄ  （Ｖｅｃｔｏｒ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）で後染色した。サンプルを、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｃａｍｅｄｉａ  ＤＰ  ７０  デジタルカメラを備えるＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ  ４０  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを用いて観察し、画像をＯｌｙｍｐｕｓ  ＤＰソフトを用いて分析した。個々の結腸切片における表面上皮のダメージ、陰窩変形及びムチン生成の程度を、Ｃｏｏｐｅｒら（Ｃｏｏｐｅｒ、Ｍｕｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．  １９９３）に従い評価した。
【００５１】
（実施例１）
フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆの表現型特性及び細胞外高分子マトリックスの精製
【００５２】
フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−Ｆ及びＡ２−１６５は固形寒天上でムコイド様のコロニーを形成するが、株ＨＴＦ−Ｆのみが液体培養においてムコイドバイオフィルムを形成する（図１ａ）。この表現型は通常、細胞外多糖及び細胞内凝集タンパク質の生成に関与する（Ｆｌｅｍｍｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｎｇｅｎｄｅｒ  ２０１０）。株ＨＴＦ−ＦのＥＰＭは、グラム染色で示され（図１ｂ）、拡散し（ｄｉｆｆｕｓｅ）かつ不規則な表面層として透過型電子顕微鏡において観察され（図２ａ、矢印）、それは、豚レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）の莢膜多糖（ＣＰＳ）と似ている（図２ｂ、（Ｍｅｉｊｅｒｉｎｋ，  Ｆｅｒｒａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２）。
【００５３】
株ＨＴＦ−Ｆにより生成されたＥＰＭに結合した細胞を単離し、濃縮し、ろ過して、予想される細菌の汚染物質を除去した。ＥＰＭの収率は、約２．５×１０１１細菌から１．２ｍｇ／ｍＬであった。ヒトＴＬＲ２、ＴＬＲ２／６、ＴＬＲ４及びＴＬＲ５に対するルシフェラーゼに基づくＴＬＲシグナリングアッセイにより、微生物分子パターン（Ｍｉｃｒｏｂｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎｓ）（ＭＡＭＰｓ）がｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫細胞の活性化に影響を与える量で存在しないことが示された（図３）。このことは、ｈＤＣとインキュベーションした後にＥＰＭが活性化又はサイトカイン分泌を引き起こさなかった事実により確認された（図４ｂ）。
【００５４】
（実施例２）
フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株ＨＴＦ−ＦのＥＰＭは、ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）活性化ｈＤＣにおける前炎症性ＩＬ−１２ｐ７０の転写及び生成を減少させる。
【００５５】
フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）Ａ２−１６５、ＨＴＦ−Ｆ及びＥＰＭの免疫調節特性を、ヒト単球由来のＤＣ（ｈＤＣ）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。ＤＣは、粘膜部位での天然のＴ細胞を作り、免疫応答を起こす能力を有する最も重要な抗原提示細胞の一つなのでＤＣが選択された。
【００５６】
フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株Ａ２−１６５及びＨＴＦ−ＦとともにｈＤＣを培養することで、ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（図４ａ）又は他のラクトバチルス（図示せず）に比して、大量のＩＬ−１０及び少量のＩＬ−１２ｐ７０が誘導された。株ＨＴＦ−ＦとともにｈＤＣを培養した後に生成されたＩＬ−１０の量は、株Ａ２−１６５のものよりも低かった（図４ａ）しかしながら、差異は顕著ではなかった。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの保護効果は、より複雑で、付加的な要素、具体的には株の生存率及び複製に依存的であるかもしれない。
【００５７】
ＥＰＭ単独では、非処理ｈＤＣに比して、活性化又は成熟マーカーの発現及びサイトカインの発現に影響を与えず（図４ｂ）、ＴＬＲシグナリング活性の欠落が確認された（図３）。したがって、ＥＰＭをｈＤＣにおいてラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）と組み合わせて、サイトカイン生成を調節するか調査した。ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）との組み合わせにおいて、ＥＰＭは、前炎症性ＩＬ−１２ｐ７０の分泌を減少させたが、ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）によって誘発されたＩＬ−１０、ＩＬ−１β又はＴＮＦ−αに影響を与えなかった（図４ａ、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αについては図示せず）。これは、共刺激分子ＣＤ８３及びＣＤ８６の測定により示されたようなｈＤＣの成熟及び活性化に対するＥＰＭの影響に起因しなかった（図４ｂ）。このように、ＥＰＭは、ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）といった炎症性刺激因子に免疫調節的な影響を与える（図４ｂ、図５及び図１１に示される）。
【００５８】
低減されたＩＬ−１２ｐ７０の分泌が転写調節に起因するか調べるために、定量的ＲＴ−ＰＣＲを、ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ＥＰＭと組み合わされたラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ＥＰＭ単独又は非刺激ｈＤＣと共に培養後、６時間及び２０時間に、ｈＤＣから抽出されたＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αのｍＲＮＡに対して行った。ＥＰＭの添加は、ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）で刺激されたｈＤＣにおけるＩＬ−１β、ＴＮＦ−α又はＩＬ−１０の転写に顕著な影響を与えなかったが、２０時間で約２分の１に、ＩＬ−１２の転写レベルを顕著に減少させた（図５）。
【００５９】
（実施例３）
フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）及び株ＨＴＦ−ＦのＥＰＭは、ＤＳＳ−大腸炎の臨床的症状を低減させる。
【００６０】
フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株Ａ２−１６５、ＨＴＦ−Ｆ及びＥＰＭの潜在的な保護的効果を、ＤＳＳ誘発大腸炎モデルのマウスを用いて評価した。ＤＳＳ曝露前に１０日間、マウスに細菌又はＥＰＭを直腸内投与し、継続的に毎日、ＤＳＳを飲用水に含ませて８日間にわたって投与し、大腸炎を誘発させた。大腸炎の重症度を、Ｄｉｓｅａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ  Ｓｃｏｒｅ（ＤＡＩ）、結腸のｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄａｍａｇｅ  ｓｃｏｒｅ、体重及び結腸の長さを測定することで、各群の個々のマウスに対して評価した。ＤＳＳ処理後のＤＡＩ及びｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｌｏｎ  ｄａｍａｇｅ  ｓｃｏｒｅを、Ｃｏｏｐｅｒらのスケール（０−４）に従って評価した（Ｃｏｏｐｅｒ，  Ｍｕｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．  １９９３）。
【００６１】
フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株Ａ２−１６５、ＨＴＦ−Ｆ及びＥＰＭの投与により、スコアは非処理マウスよりも高かったが、ＤＡＩは、ＰＢＳを直腸内投与され、飲用水においてＤＳＳを投与された大腸炎コントロールマウスに比して顕著に減少していた（図６ａ）。
【００６２】
ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｌｏｎ ｄａｍａｇｅ  ｓｃｏｒｅは、非処理マウスにおいてグレード０であった（図６ｂ及び図７ａ）。フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＨＴＦ−Ｆの投与により、大腸炎コントロールマウスに比してｃｏｌｏｎ ｄａｍａｇｅ  ｓｃｏｒｅが顕著に減少した（各々、グレード１．６５及び３．２、図６ｂ、図７ｃ及び図７ｂ）。一方、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）Ａ２−１６５及びＥＰＭの投与では、大腸炎コントロールマウスに比してｃｏｌｏｎ ｄａｍａｇｅ  ｓｃｏｒｅに顕著な影響を与えなかった（各々、グレード２．８及び３．３、図６ｂ、図７ｄ及び図７ｅ）。
【００６３】
結腸の長さは、非処理マウスに比してすべてのＤＳＳ処理群において低減したが、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＨＴＦ−Ｆの投与群では大腸炎コントロールマウスに比して結腸が顕著に長くなり（図６ｃ））、大腸炎の重症度の低減が示唆された。
【００６４】
ＤＳＳ処理の期間中、マウスの体重を測定し、処理前の体重と比較した。非処理マウスでは、体重は、５日目から８日目に約５％増加した（図６ｄ）。しかしながら、大腸炎コントロールマウスでは、体重は、５日目から８日目に約５％減少した。フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＨＴＦ−Ｆ、Ａ２−１６５又はＥＰＭの投与マウスでは、大腸炎コントロールマウスに比して、体重減少が１日遅れた。フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＨＴＦ−Ｆ、Ａ２−１６５及びＥＰＭの投与マウスでは、６日目から８日目の体重減少は、２％と４％との間であり、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＨＴＦ−Ｆ及びＥＰＭでは、体重減少は、大腸炎コントロール群よりも少なかった（図６ｄ）。
【００６５】
総合すると、この実施例によって、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）株Ａ２−１６５、バイオフィルム形成株ＨＴＦ−Ｆは、株ＨＴＦ−Ｆから単離されたＥＰＭと同様に、ＤＳＳ誘発大腸炎の臨床的症状を低減させることが示された。重要なことに、株ＨＴＦ−Ｆは、炎症を抑えることにおいて株Ａ２−１６５よりも効果的であり、他の処理に比してｃｏｌｏｎ ｄａｍａｇｅ  ｓｃｏｒｅ及び結腸の長さに顕著な効果を有していた（図６）。精製されたＥＰＭ単独投与では、ＤＡＩが低減され、それが株ＨＴＦ−Ｆの保護的効果に寄与し、Ａ２−１６５に比べて株ＨＴＦ−Ｆで見られたより強い保護の原因となっている可能性があることが示唆された。
【００６６】
（実施例４）
ＤＳＳ処理マウスの腸管膜リンパ節及び脾臓におけるＦｏｘｐ３発現へのフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）及びＥＰＭの効果
【００６７】
ＤＳＳ誘発大腸炎の低減におけるＦｏｘｐ３＋  Ｔ制御細胞（Ｔｒｅｇｓ）の潜在的な役割を調査するために、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によって、細胞内Ｆｏｘｐ３を発現する腸管膜リンパ節（ＭＬＮｓ）及び脾臓から単離したＣＤ４＋Ｔ細胞の数を測定した。ＤＳＳ処理は、非処理マウスに比して、ＭＬＮｓ又は脾臓におけるＦｏｘｐ３＋  ＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルに顕著な影響を与えなかった。フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の投与はまた、非処理マウスに比してＦｏｘｐ３＋  ＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルに影響を与えなかった。しかしながら、ＥＰＭの投与は、ＭＬＮｓにおけるＦｏｘｐ３＋  ＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルに小さいながらも顕著な増加を引き起こしたが、脾臓では引き起こさなかった（図８）。
【００６８】
（実施例５）
ＥＰＭの免疫調節効果は、ＴＬＲ依存的である。
【００６９】
ｈＤＣによるＩＬ−１２ｐ７０生成に対するＥＰＭの抗炎症性効果がＤＳＳ誘発大腸炎において観察された保護的効果に寄与するのかを調べるために、ＥＰＭ存在下及び非存在下でラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）で刺激されたマウス骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を行った。ｈＤＣを用いて見られたように、ＥＰＭの存在により、ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）で刺激されたマウスＢＭＤＣによって前炎症性ＩＬ−１２ｐ７０の分泌が低減された。とりわけ、ＥＰＭはまた、ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）で刺激されたＢＭＤＣにおけるＩＬ−１０の生成を増加させ、それは、ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）で刺激されたｈＤＣよりもかなり高いレベルですでに誘発されていた。これらの効果は、ＥＰＭ単独によるサイトカイン分泌の誘導に起因するものではなかった（図９ａ）。さらに、ＥＰＭの免疫調節効果が、ＴＬＲ２阻止抗体又はアッセイにおける同じアイソタイプの無関係な抗体を含むことによりＴＬＲ２シグナリングに依存するのかについて調べた。ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）刺激ＢＭＤＣによるＩＬ−１２ｐ７０及びＩＬ−１０生成に対するＥＰＭの効果は、ＴＬＲ２阻止抗体の存在下で阻害されたが、アイソタイプ抗体の存在下では阻害されなかった。ＥＰＭそれ自体ではＴＬＲ２シグナリングを誘導しなかったので（図３）、ＩＬ−１２ｐ７０の転写の低減及びＩＬ−１０の生成の増加を引き起こすメカニズムは、ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）によるＴＬＲ２シグナリングに依存していた（図９（ｂ））。
【００７０】
以前、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）Ａ２−１６５及びその上清を、大腸炎の誘導前及びその期間、毎日、胃内投与することにより、マウスの２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）大腸炎を低減することが示された（Ｓｏｋｏｌ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。Ｓｏｋｏｌ  ｅｔ  ａｌの試験では、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）Ａ２−１６５又はその上清で処理したマウスの結腸は、大腸炎コントロール群に比して、ＩＬ−１２ｐ７０の量が低減しており、ＩＬ−１０の量が増加していた。これは、マウスＢＭＤＣ、ｈＤＣ（図４）及びヒトＢＭＤＣと一緒のフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）Ａ２−１６５のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養によって、相対的に多い量のＩＬ−１０が誘導されたことと一致していた（Ｓｏｋｏｌ，Ｐｉｇｎｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。ＩＬ−１０は、腸のホメオスタシスの維持の根本となるものである（Ｇｅｕｋｉｎｇ，  Ｃａｈｅｎｚｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１；  Ｖｅｅｎｂｅｒｇｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｓｏｍ  ２０１２）。それは、基底膜において、ＤＣにより、また、Ｆｏｘｐ３＋及びＦｏｘｐ３−Ｔ細胞により分泌される。ＤＣによるＩＬ−１０の分泌は、腸の炎症の間、機能的Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇｓの維持に重要である（Ｍｕｒａｉ，  Ｔｕｒｏｖｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９）。ＩＬ−１０はまた、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１２といった前炎症性サイトカインの生成を阻害する。さらに、ＩＬ−１０は、ＩＬ−２３生成を抑制することにより移行細菌への前炎症性反応を制御する役割を果たすことが示された（Ｍａｎｕｚａｋ，  Ｄｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２）。それにもかかわらず、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）Ａ２−１６５と培養されたＤＣによって、及び株ＨＴＦ−Ｆと培養されたＤＣによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されたＩＬ−１０における違いは、Ａ２−１６５とＩＬ−１０との間で顕著な量の違いを作り出さなかったため、ＨＴＦ−Ｆで見られたより良好な保護を説明できなかった。
【００７１】
フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）により結腸で生成されたブチレートはまた、実験的な大腸炎モデルで観察される抗炎症効果に寄与し得る。近年、酪酸ナトリウムの経口投与により、実験的なＵＣの炎症が低減されたことが示されたからである（Ｖｉｅｉｒａ，  Ｌｅｏｎｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２）。微生物生成のブチレートは、結腸の健康に重要であり、上皮細胞に対するエネルギー源としての使用ための大腸癌の抑制において重要であり、酸化ストレス及び炎症の調節因子として重要であると考えられている（Ｈａｍｅｒ，  Ｊｏｎｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）。さらに、ブチレート浣腸剤が、ＵＣの治療に効果的であることが報告されている（Ｈａｍｅｒ，  Ｊｏｎｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０）。
【００７２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより、ＥＰＭの抗炎症メカニズムがＭＡＭＰｓのコンタミネーション又はＤＣの活性化によらないことが示された。しかしながら、ＥＰＭがｈＤＣに炎症性刺激因子としてラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）とともに加えられた場合、それは、ラクトバチルスプランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）単独に比して、ＩＬ−１２ｐ７０の生成を低減させ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αの生成に影響を与えなかった（図４）。ＥＰＭの同様の効果は、マウスＢＭＤＣによるＩＬ−１２ｐ７０の生成において見られたが（図９）、ｈＤＣとは対照的に、ＩＬ−１０は顕著に増加した。ＩＬ−１２ｐ７０生成におけるＥＰＭの効果は、転写レベルで生じ（図５）、細胞シグナリングにおけるＥＰＭの関与が示唆された。このメカニズムは、ＥＰＭそれ自体はレポーターアッセイにおけるＴＬＲ２シグナリングを引き起こさず、又は合成ＴＬＲ２アゴニストの場合のようにｈＤＣ又はマウスＢＭＤＣを活性化しないが、ＴＬＲ２シグナリングに依存的であった。該メカニズムは、ＥＰＭにおける炭水化物構造のＣ−タイプレクチン受容体との相互作用に関与し得、そのいくつかは、ＴＬＲアゴニストに応答したサイトカイン生成を調節することが知られている。ＤＳＳ大腸炎モデルにおいて、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ではなくＥＰＭの投与によって、ＭＬＮｓにおけるＦｏｘｐ３＋Ｔ細胞の数が増加した。
【００７３】
（実施例６）
フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＨＴＦ−Ｆは、結腸培養物からＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７の分泌を減少させる。
【００７４】
事前に重量を測定した結腸の断片を、４８時間、２４ウェルの平底プレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）で、３７℃、５％ＣＯ２及び９５％空気中、１０％ウシ血清アルブミンを加えたＲＰＭＩ培地で培養した。培養上清を、ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ  ＭＡＰ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ／Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｐａｎｅｌ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）によりサイトカイン含量の分析のために説明書に従って収集し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）で分析した。
【００７５】
ＤＳＳ処理によって、非処理コントロールに比して、結腸培養物におけるサイトカイン分泌が顕著に増加した。図１０に示されるように、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＨＴＦ−Ｆ及びＥＰＭの胃内投与により、ＩＦＮ−γ分泌の低減が引き起こされ、フィーカリバクテリウム・パラウスニッチィー（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＨＴＦ−Ｆによって、ＰＢＳ投与に比して、ＩＬ−１７分泌の低減が引き起こされた。
【００７６】
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【図１】
2016511272.tif 000004
【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図７ｅ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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