(57)【要約】  レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の抗原マスは、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物を特定の種類の脂肪酸：多価不飽和Ｃ１８脂肪酸により補給することによって、バイオマスにおけるいかなる増加とも独立して顕著に増加され得る。これは、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）抗原産生における優位さを提供する。同様にこれは、より安全でかつより効果的な改良されたレプトスピラ症ワクチンの産生を可能とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の抗原マスを増加させる方法であって、前記レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物を多価不飽和Ｃ１８脂肪酸により補給する段階を含む前記の方法。
【請求項２】
該多価不飽和Ｃ１８脂肪酸が：リノール酸、アルファ‐リノレン酸およびガンマ‐リノレン酸から成る群より選択される一または複数である、請求項１の方法。
【請求項３】
少なくとも１５μｇの多価不飽和Ｃ１８脂肪酸／ｍｌが前記培養物に利用可能とされる条件下において、該方法がレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物を培養する段階を含む、請求項１または２の方法。
【請求項４】
前記レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物が増加した抗原マスを有する、請求項１〜３のいずれか一項の方法によって得ることが可能なレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物。
【請求項５】
レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）に対するワクチンにおける使用のための、請求項４のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物、または前記培養物の調製品。
【請求項６】
請求項４のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物、または前記培養物の調製品を含むレプトスピラ症に対するワクチン。
【請求項７】
レプトスピラ症に対するワクチンの製造のための、請求項４のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物、または前記培養物の調製品の使用。
【請求項８】
レプトスピラ症に対するワクチンを産生するための方法であって：
ａ．インビトロ系においてレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物を増殖し、
ｂ．前記レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物を多価不飽和Ｃ１８脂肪酸により補給し、
ｃ．前記補給されたレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物を不活性化しかつ収集し、および
ｄ．不活性化したレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物を薬剤的に許容可能な担体と混合する、
段階を含む前記の方法。
【請求項９】
段階ａ．とｂ．の間に、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の収集、貯蔵および／または精製を含む、追加の段階がある、請求項８の方法。
【請求項１０】
請求項１〜３、８または９のいずれか一項の方法のための、比較的に多価不飽和Ｃ１８脂肪酸に富んでいる化合物または組成物の使用。
【請求項１１】
比較的に多価不飽和Ｃ１８脂肪酸に富んでいる化合物または組成物が植物油である、請求項１０の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に微生物学の分野、および微生物のワクチンに関する。特に本発明は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の抗原マスを増加させる方法、該方法によって得られるレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）および当該レプトスピラのワクチンおよび使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属の細菌スピロヘータは、レプトスピラ科およびスピロヘータ門に属する。レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）は、細長く、薄くさらにらせん状形を有する、グラム陰性、好気性、運動性の細菌である。病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）は、多様な種類の動物およびヒトにおいて世界中で見出される；哺乳動物、例えば、げっ歯類、野生動物、家畜およびイヌは天然の保菌宿主である。該細菌は、レプトスピラ症、またはワイル病と呼ばれる疾病を引き起こす。該疾病は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）が‐感染および血流による輸送後に‐すべての内臓に侵入するとき、症状が現れ、軽度ないし重度、致死的にいたるまでの広い範囲の症状を示し得て、急性または慢性である。この変動性が、しばしば該疾病が誤診される理由である。主な症状は：熱、悪心および黄疸、脈肝炎に起因してもたらされる腎不全、肝不全または肺不全または心血管疾患である。レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）は、典型的に宿主の腎臓または生殖器官において生存し、この方法が人獣共通感染症も起こし得る水平伝播を引き起こし、それによってヒトが、動物の尿との接触または汚染された地表水により感染する。総説については、Ｐ．Ｌｅｖｅｔｔ，２０１１（Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒ．Ｒｅｖ．，ｖｏｌ．１４，ｐ．２９６）を参照されたい。レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）は自然界において極めて安定しており、水性条件下、雰囲気温度で数か月間、生存可能である。
【０００３】
レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の分類は、使用されている異なる系により混乱している：多年にわたって分類は、血清学的な識別に基づいていて、それによってすべての病原性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）は、菌種レプトスピラ・インターロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）（広義）の血清型として示されている。この系において血清型は、細菌の主免疫原：その外膜上のリポ多糖（ＬＰＳ）の血清学的試験によって識別される。現在２００以上の血清型が記載されており、それらは約２５の血清群にまとめられる。
【０００４】
しかしながらこの血清型判定による分類と直角に、分子生物学的性質、いわゆる：遺伝種（ｇｅｏｍｏｓｐｅｃｉｅｓ）に基づく遺伝子型判定の系が存在する。実際には、一つのレプトスピラ遺伝種が数個の血清型を含み得て、逆もまた同様である。本発明に関しては、血清型の血清学的分類を使用する。
【０００５】
いくつかのレプトスピラ血清型は、特定の宿主種にのみ感染するが、ほとんどの血清型は広い宿主範囲を有する。例えば：Ｌ．インターロガンス（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）（広義）血清型Ｈａｒｄｊｏはウシの感染に関連し、ブタにおいては血清型Ｔａｒａｓｓｏｖｉ、ＰｏｍｏｎａおよびＢｒａｔｉｓｌａｖａがほとんどの場合原因とみなされる。しかしながら、Ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、ＢｒａｔｉｓｌａｖａおよびＧｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ等の血清型は、ブタ、イヌおよびヒトに感染し得る。
【０００６】
宿主のレプトスピラ感染の検出は、種々の方法で可能である。最適基準は、いわゆる：顕微鏡下凝集試験（ＭＡＴ）による宿主血清における特異的抗体の血清学的検出である。この試験において、患者血清の段階希釈液が、特定の血清型の生きたレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）とインキュベートされる。血清中に特定の抗体が存在する場合、この抗体は試験細菌を凝集し、それは例えば、（暗視野）顕微鏡によって読み取られ得る。該試験は高度に特異的であり、ＭＡＴはまたレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）単離株の血清分類にとって決定的である。代わりの試験は、Ｅｌｉｓａ（酵素結合免疫吸着測定法）またはＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）である。
【０００７】
レプトスピラ症の治療は、抗生物質の投与によって治療的に成され得る。しかしながら、疾病はしばしば誤診されるので、ワクチンによる予防が好ましい。レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）に対する動物用またはヒト用の数種類のワクチンが研究されているが、しかし獣医学的ワクチンのみが広く市販されている。日常的にワクチン接種されている動物の種は、ブタ、ウシおよびイヌである。そのうえワクチン接種は、宿主の疾病を予防するため、ならびに人獣共通感染症の伝播を低減するために役立つ。
【０００８】
現在のレプトスピラ症ワクチンは、関連する血清型由来の菌株の不活化細菌細胞全体の懸濁液、いわゆるバクテリンに基づいている。これらのワクチンは、液性型の効果的な免疫を誘導し、それによって大多数の抗体がレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）を凝集し、それ故に中和することができる。細菌の免疫優勢な抗原は、ＬＰＳ、および特にＬＰＳのオリゴ糖部分のエピトープである。誘導される免疫は、主として血清型特異的であるが、例えば、同一の血清群内由来の関連血清型の間でいくらかの交差防御を有する。レプトスピラ症ワクチンの例は：Ｌ．インターロガンス（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）（広義）血清型Ｈａｒｄｊｏの菌株由来のバクテリンを含む、ウシ用のＬｅｐｔａｖｏｉｄ（登録商標）Ｈ（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）である。
【０００９】
しかしながら、大部分の野外状況では、二以上の血清群由来のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）が蔓延しているので、それ故に多数の市販レプトスピラ症ワクチンは、広い防御を提供する混合ワクチンである。例は、イヌ用ワクチン：Ｎｏｂｉｖａｃ（登録商標）Ｌｅｐｔｏ４（Ｍｅｒｃｋ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）であり、それはＬ．インターロガンス（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）（広義）血清群：Ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、ＩｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅおよびＰｏｍｏｎａの各々由来の菌株を含む。また、レプトスピラ症ワクチンは、しばしば他の細菌またはウイルスワクチン化合物と併用される。
【００１０】
今日、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）は、研究または診断目的用に日常的に増殖されているが、しかし主にワクチン製造用に増殖されている。レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）のインビトロでの増殖用の方法および手順は、５０年にわたり知られており、そのかなり単純な培養培地にとって重要な原料についても知られている。１９６０年代に、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）は、（インビトロでの増殖のために）その栄養および細胞成分に長鎖脂肪酸を要求することが立証された。また同様に、培養培地のタンパク質または炭水化物の（検出可能な）消費がないので、これらの長鎖脂肪酸が、唯一のエネルギーおよび炭素源として使用されることも立証された。それ故に、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）は、長鎖脂肪酸をデノボ合成することも短鎖脂肪酸を伸長することもできないので、これらの脂肪酸は培養培地によって供給される必要がある。これらの洞察は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）用半規定合成培養培地の発達に役立ち（Ｊｏｈｓｏｎ  ＆  Ｇａｒｙ  １９６３；Ｓｔａｌｈｅｉｍ  ＆  Ｗｉｌｓｏｎ  １９６４）、当該培地中において、従前の１０％（ｖ／ｖ）までの全（ウサギ）血清の使用は、アルブミン画分および規定脂肪酸源の組み合せによって代替された。これは、さらにレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）のインビトロでの小または大規模増殖用の標準培養培地：ＥｌｌｉｎｇｈａｕｓｅｎおよびＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈ（１９６５、Ａｍ．Ｊ．  ｏｆ  Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２６，ｐ．４５）により開発され、ＪｏｈｎｓｏｎおよびＨａｒｒｉｓ（１９６７、Ｊ．ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．９４，ｐ．２７）によって改変されたＥＭＪＨ培地として、今日もまだ使用されている合成培地に発展した。
【００１１】
ＥＭＪＨ培地は、必須ビタミン、塩およびミネラルは別にして、同様にポリソルベート８０  ０．１２５％（ｖ／ｖ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１％（ｗ／ｖ）を含む（Ｆａｉｎｅ，Ｓ．，１９９４，ｐ．３１２：「Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ａｎｄ  Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ（レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）およびレプトスピラ症）」，ｅｄ（編）．Ｓ．Ｆａｉｎｅ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，ＵＳＡ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）。
【００１２】
ポリソルベート８０は、その商品名の一つである：ツイーン（登録商標）８０（ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｉｎｃ）によって最も知られており、モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（ＣＡＳ番号９００５‐６５‐６）である。ポリソルベート８０は、医薬品、化粧品および食品において乳化剤および可溶化剤として広範に使用されている非イオン性界面活性剤である（Ｅ４３３）。ＥＭＪＨ培地においてはしかしながら、ポリソルベート８０は、都合のいいことには水溶性でありかつ細菌に対し低い毒性しか有さないので、細菌の長鎖脂肪酸源として役立つ。ポリソルベート８０の約７０％（ｖ／ｖ）の主成分はオレイン酸（Ｃ１８：１）であるが、しかし他の脂肪酸、主に：パルミチン酸（Ｃ１６：０）およびパルミトオレイン酸（Ｃ１６：１）も存在し、これはバッチおよび製造者による左右される。
【００１３】
ここにおいて：オレイン酸を：「Ｃ１８：１」とする等の脂肪酸の命名は、Ｃ：Ｄ表示法に従っており、当該表示法は、その主な特性：アシル鎖の炭素原子数（オレイン酸について：１８）、および二重（不飽和）結合数（オレイン酸について：１）によって脂肪酸を記載する周知の標準的な簡略標記法である。
【００１４】
レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）は、インビトロではタンパク質を消費しないので、ＥＭＪＨのアルブミン成分の主機能は、一方でそれらを生物学的に利用可能としつつ、可逆的にそれらを複合体に形成することによる、培養培地中の脂肪酸の解毒であると考えられる。
【００１５】
血清アルブミンは、浸透圧を与えることは別にして、種々の化合物、例えば、タンパク質、脂質、ビタミン、小分子等のための、血中の重要な輸送タンパク質である。
【００１６】
血清アルブミンに結合した脂質は、ジおよびトリグリセリド、およびコレステロールのエステルおよびリン脂質を含むが、しかしその大部分（＞９０％）は遊離脂肪酸の形態である；「遊離」とは：エステル化されていないことまたは共有結合的に結合していないことを意味する。アルブミンに結合したこれら遊離脂肪酸の中で、９０％以上はＣ１４〜Ｃ２０の範囲の中鎖‐および長鎖脂肪酸であり、主として：ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、パルミトオレイン酸（Ｃ１６：１）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）およびアラキドン酸（Ｃ２０：４）である。
【００１７】
アルブミンは、異なる親和性により、いくつかの結合部位でこれらの脂肪酸に可逆的に結合する。脂肪酸のどれだけが、およびどのタイプがドナー由来のアルブミン試料に結合するかは、生理学的に広い変動を有し、脂肪酸の鎖長および不飽和度等の化学的特徴に左右されるが、しかし同様にアルブミンのドナー由来の生物学的特徴、例えば：種、品種および性、ならびに栄養状態および活動状態等、にも左右される。
【００１８】
市販のＢＳＡが結合される脂肪酸の量および種類は、製造者によって使用される製造プロトコルに左右され、各バッチで変動する。
【００１９】
古典的なアルブミン調製品は、いわゆる：Ｃｏｈｎ画分Ｖアルブミン製品をもたらす、冷エタノール分画（Ｃｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９４６，Ｊ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．６８，ｐ４５９）によって得られた。それ以来、例えば、生化学および組織培養における使用のための、多種多様の血清アルブミンの種類および品質が市販されてきた。血清アルブミンの変動性に関する広範囲な総説が、Ｊａｎａｔｏｖａによってなされた（１９７４、Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．５，ｐ．１４９）。
【００２０】
実験条件下において、アルブミンの分子当たり１０個を超える脂肪酸が結合され得たが（Ｓｐｅｃｔｏｒ  ＆  Ｈｏａｋ，１９６９，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ３２，ｐ．２９７）、生理的にアルブミンは、アルブミンのモル当たり約０．３ないし３モルの間の脂肪酸を保有し得る（Ｈｅｎｎｉｇ  ＆  Ｗａｔｋｉｎｓ，１９８９，Ａｍ．Ｊ．ｏｆ  Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，ｖｏｌ．４９，ｐ．３０１）。
【００２１】
低含量の脂肪酸を有する、すなわち０．１モルの脂肪酸／１モルのアルブミン未満の市販の血清アルブミンもまた利用可能である；当該アルブミン製品は、種々の利用可能な技術、例えば、有機溶媒による抽出および／または活性炭への吸着等の一つを使用して、慎重に脱脂されている。しかしながら非常に低い脂質の負荷レベルを得るためには、非常に低いｐＨ値での積極的な抽出方法が必要とされ、当該方法はアルブミンの変性をもたらし得る。
【００２２】
産業規模の生物学的プロセスにおける使用のための大量の血清アルブミンは、実際上、食肉産業の副産物として、商業的にウシからのみ効率的に入手が可能である。
【００２３】
インビトロでの細胞増殖における使用のために適した種々の種類のＢＳＡの中で、いくつかが特定の細胞タイプについての使用に推奨される。一例はＢｏｖｏＬｅｐ（登録商標）ＢＳＡ（Ｂｏｖｏｇｅｎ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）であり、これは培養におけるレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の成長を促進するために推奨される；これは、いくつかの植物性脂肪酸により強化された標準的なＢＳＡである。
【００２４】
完全ＥＭＪＨ培養培地は、次に培養においてレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の増殖に重要であると知られる、すべての脂肪酸：パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）およびオレイン酸（Ｃ１８：１）を供給する（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｇａｒｙ，１９６３，前掲）。
【００２５】
このＥＭＪＨ培地は、Ｌ．インターロガンス（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）（広義）の関連する血清型のほとんどの増殖を可能とする。レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の工業的規模の増殖のための典型的な条件は、２８〜３０℃、ｐＯ２およびｐＨ制御下での撹拌装置を装備した標準的ファーメンター槽においてである。それにもかかわらず、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の増殖は、比較的に緩やかである：ビルレンスおよびインビトロでの増殖条件への適応レベルに依存して、１２ないし２４時間の間の世代時間が報告されている。結果として：高いバイオマスに達するために、増殖プロセスは、接種菌液密度に依存して比較的に長く、典型的には４〜７日を要し、十分な接種菌液を調製するために数回の前培養を要する。これが生産者のファーメンター能力に大きな負荷を提起する。同様に、この長期にわたる培養時間は、例えば、より短い倍加時間を有する細菌、酵母または糸状菌による汚染が発生する大きなリスクを提起する。
【００２６】
その結果として、インビトロでの培養におけるレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）抗原の生産のための改良された方法に対する必要性が存在する。
【００２７】
当該技術分野における文献は、インビトロでの培養におけるレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の増殖を改良するためのいくつかの試みを記載している。ＥＭＪＨ培地のいくつかの改変は、血清を再導入し、またはさらなるポリソルベート、および／または加水分解物を添加したものであった。しかしながら当該の強化ＥＭＪＨ培地は、大規模なレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）のインビトロでの増殖においては一般的に使用されず、しかし診断において、臨床検体からの最も要求の厳しいレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の低い含量でさえも検出し増殖するために、典型的には半流動培地として使用される。
【００２８】
典型的にレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）は、不活化レプトスピラ症ワクチンを調製するためにインビトロで増殖される。増殖期の後、一般的に下流加工工程は、バクテリンを生産するために、最終培養産物の不活性化によって開始する。不活性化は、いくつかの方法、通常は化学的不活性化、例えばホルマリン、チオメルサール、ベータプロピオラクトン（ＢＰＬ）またはベータ‐エタノールアミン（ＢＥＡ）等によって実施され得る。次の段階は、不活性化された培養物を、例えば遠心分離または濾過によってしばしば濃縮し、精製することである。生じた抗原調製品は、次にワクチンに製剤化される。
【００２９】
バイオマスに基づいて不活化レプトスピラ症ワクチンを製剤化することは、常法であり、それによって動物の一用量が、一定数の細胞、典型的には個々の血清型の約１０^９細胞／用量を含むように作成される。しかしながら、（化学的な）不活性化が細菌細胞に損傷を与えるので、この細胞数は、製剤化された最終製品に基づいては成され得ない。それ故に細胞数は、その不活性化の前に全細胞（生菌および死菌）を計数することによって、最終培養物から決定される。この細胞数により、どれだけの用量／ｍｌが製剤化後に最終製品に割り当てられ得るか計算される。製品の市場への出荷のための品質管理チェックとして、最終ワクチンの免疫学的有効性（ｅｆｆｉｃａｃｙ）（別名、効力（ｐｏｔｅｎｃｙ））が検証される。規制当局により現在要求されるバッチ効力試験は、ハムスターにおけるワクチン接種および攻撃感染を用いるインビボでの試験においてである（欧州薬局方モノグラフ０４４７、イヌ用レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）ワクチン）。
【００３０】
レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）ワクチン用のインビトロでの効力試験法が知られている（Ｒｕｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ｖｏｌ．２０，ｐ．２５９）。この試験法は、血清型特異的抗体および標準品を使用して、血清学的試験法によって、最終ワクチンの抗原マスを定量することに基づいている。レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）バクテリンの抗原マスと免疫学的効力の間の相互関係は周知であるが、レプトスピラ症ワクチンの製剤化は、いまだにバイオマス／用量に基づいている。
【００３１】
バイオマスに基づくレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）バクテリンワクチンの調製の結果は、当該ワクチンがＬＰＳのようには免疫化にほとんど寄与せず、それどころか局所および／または全身の有害なワクチン接種反応をもたらし得る、タンパク質および細菌の他の成分のある量を含むというものである。この問題は、数種のレプトスピラの抗原を組み合わせるワクチンの場合に悪化する。レプトスピラ症ワクチンの安全性を改良するための試みにおいて、下流加工工程における追加の精製段階が一般的に適用される。有害なワクチン接種反応の恐れはまた、ヒトの使用のためのバクテリンを含むレプトスピラ症ワクチンが、今日一般的に市販されていないことの主な理由でもある。
【００３２】
起こりうるワクチン接種反応を克服するために、いくつかのグループが、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養用の適応培地を適用することによって、（混合）レプトスピラ症ワクチンの非防御および培地由来のワクチン成分の重荷を低減することを試みた。しかしながら、これらの培地は、さらにレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）増殖を支持するために要求される必須長鎖脂肪酸をなお供給しなければならない。この事が、これらの脂肪酸の固有の毒性に対処するための解決法を要求したのは、現在のところ、これらの脂肪酸が血清またはＢＳＡによって提供される等の多量のタンパク質によって解毒され得なかったからである。一つのアプローチ法は、ポリソルベートそれ自体を、イオン交換によってまたはポリビニルピロリドンまたは活性炭による抽出によって、解毒することであった（Ｂｅｙ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９７８，Ｉｎｆ．＆  Ｉｍｍ．，ｖｏｌ．１９，ｐ．５６２）。別のアプローチ法がＷＯ  ２００６／１１３６０１に記載されており、そこで脂肪酸の毒性は、無タンパク質培養培地を、繰り返し少量のポリソルベートにより補給することによって、いわゆる、制御された準最大な増殖速度におけるバイオマスの増加に基づく、流加培養法によって制限される。今日まで、無タンパク質で培養されたレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）に基づく商業的なレプトスピラ症ワクチンは市販されておらず、伝統的なワクチンは未だに下流加工工程の精製に頼っている。
【００３３】
それにもかかわらず、これらの先行技術の研究のどれも、産生されたレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の抗原マスおよび／または免疫原性に関する、培養培地に対する、または増殖条件に対する変更のいかなる効果も報告しなかった。それ故にこれらのすべては、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）バイオマスの産生のための本質的に別の方法である。
【００３４】
それ故に本発明の目的は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）抗原マスの生産の改良を提供すること、およびそこから生じる改良されたワクチンを提供することである。
【００３５】
驚いたことに、この目的が期待できること、ならびに先行技術の不利な点が、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の培養物を特定の長鎖不飽和脂肪酸：多価不飽和Ｃ１８脂肪酸により補給することによって克服され得ること、が見出だされた。これは、バイオマスにおける３倍までのいかなる増加をも超える、抗原マスの迅速でかつ強力な増加をもたらす。
【００３６】
この発見は、いくつかの有利な利用法、例えば、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）に対する改良されたワクチンの生産のために使用され得る、増加した抗原マスを有するレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の産生等への道を開く。抗原量の増加がバイオマスの増加を超えることが見出だされたので、補給されたレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物を補給されなかった培養物と比較すると、それ故に一定の細菌細胞当たりの正味の抗原量の増加が存在する。
【００３７】
当該増加された抗原マスを有するレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）は、減少した量の他の細菌成分および培養物由来成分を有し、先行技術のワクチンと同じ抗原含量を有するワクチンを調製するために、今や使用され得る。これは、下流プロセシングにとって、およびワクチンの副作用のレベルにとって好ましい。代わりに：増加した抗原マスを有するワクチンは、非特異的成分に関し従前と同じレベルで今や適用され得る。ワクチン接種される標的の安全性にとって好ましいのは別にして、当業者にとってこれらすべての改良がまた、高度に経済的観点に関連することは明らかであろう。
【００３８】
さらに、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸を補給されたレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物は、今や従来よりも数日早く先行技術の抗原マスレベルに達する。それ故に培養時間が今や大幅に短縮され得るので、当該培養物は、今やより迅速に、より経済的に、ならびに汚染の機会が少なくて生産され得る。代わりに：もし多価不飽和Ｃ１８脂肪酸を補給されたレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物が、従来と同様に最大のバイオマスまで増殖することが許されるならば、今や増加された量の抗原を収集することができる。
【００３９】
本発明は、現在のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の増殖および抗原産生用の現在の培養培地の改良、ならびに最適（半‐）合成培地の合理的な設計を可能とする。
【００４０】
レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物を多価不飽和Ｃ１８脂肪酸により補給するために、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸が純粋であるかまたは富んでいる化合物および／または組成物が使用され得る；経済的な例は植物油である。
【００４１】
さらに、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）において、バイオマス産生のためのプロセスおよびＬＰＳ抗原の産生のためのプロセスは、大いに分離していると思われるので、分離したプロセス設計が今や考えられ、そこでは初期の段階において、高含量のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）バイオマスが産生され、分離した後の段階において、それらを多価不飽和Ｃ１８脂肪酸により補給することによってＬＰＳ抗原が産生されるように誘導される。これら二段階の分離は、次に両プロセスにとって、それらの異なる関連パラメータ、例えば、培養時間、培養温度、等に関して分離して最適化されることを可能とする。これはまた、例えば、中間の貯蔵、収集および／または精製を可能とすることによって、いくつかの物流上および設計上の優位さも提供する。
【００４２】
このすべては、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸が先行技術において、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）増殖条件に関連してほとんど述べられていないので、全く予想されていなかった：Ｓｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９６９，Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．８，ｐ．１０１）は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）がリノール酸（Ｃ１８：２）を培養培地から細胞膜脂質に取り込むことを記載した。Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７０，Ｉｎｆ．＆Ｉｍｍ．，ｖｏｌ．２，ｐ．２８６）は、リノール酸がレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物を増殖するために使用されたＢＳＡに存在した脂肪酸のリストの一つであったと報告したが、しかし具体的な含量を与えなかった。ほとんどどの刊行物も、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養に関連してリノレン酸（Ｃ１８：３）について述べておらず、しかもその利益については皆無である。結局、先行技術のいかなる記事も、その潜在的な毒性を除いて、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸がレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）との特別な関連にあることを全く述べていない。リノール酸またはリノレン酸は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）抗原、特にＬＰＳ抗原の産生について特別の関連があるとは決して述べられなかったかまたは決して示唆されなかった。
【００４３】
それどころか、当該分野における先行技術の総意は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）に関連する脂肪酸はパルミチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸であり、しかもこれらはすべてポリソルベート８０によって標準的な培養培地中に豊富に供給されているというものである。このように、「適切な（ａｄｅｑｕａｔｅ）」量のＬＰＳ抗原を有するレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）が長年にわたり生産されてきて、どの試みも、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）バイオマス単位当たりのＬＰＳ抗原量を改良することを記述または示唆してこなかった。また、そうしようとする意欲も存在しなかったのは、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）ワクチンがバイオマスに基づいて日常的に製剤化され、それ故に培養物中のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細胞数を最大化することが、常に当該技術分野における主な焦点であり、それらの抗原マスではなかったからである。
【００４４】
なぜレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）が、そのＬＰＳ抗原の産生のために不飽和Ｃ１８脂肪酸を要求するのか、またはどのようにして不飽和Ｃ１８脂肪酸が、ＬＰＳ分子（の一部）を産生するためにレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）によって使用されるのかは、知られていない。
【００４５】
発明者らは、これらの知見を説明し得る理論またはモデルによって縛られることを欲するものではないが、発明者らは今、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）における細菌の増殖を対象とする生物学的プロセス、およびＬＰＳの産生を対象とする生物学的プロセスが、異なる栄養を要求する部分的に別々の酵素系に頼っているのかもしれないと推測している。これは、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸による補給がまたバイオマスのいくらかの増加を生じ得るという事実とは別である。
【００４６】
発明者らはさらに、現在使用されているＥＭＪＨ等の標準的なレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養培地が、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）抗原の十分な産生のために最適下限である量の多価不飽和Ｃ１８脂肪酸しか含んでいないと推測している；これは、当該培地がレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）バイオマスの形成のために必要とされる豊富な脂肪酸を供給すると言う事実には依存しない。結果として、これらの先行技術のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養培地において、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸は迅速に枯渇され、抗原産生は、その後最大細胞数に達するかなり前に停止する。これが、ＬＰＳ抗原を産生するレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の一部の能力しかこれまで使用されてこなかった原因である。
【００４７】
それ故に一態様において、本発明は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の抗原マスを増加するための方法を提供し、該方法は前記のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物を多価不飽和Ｃ１８脂肪酸により補給する段階を含む。
【００４８】
本発明に関する「抗原マス（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｍａｓｓ）」とは、一定数のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細胞のＬＰＳ抗原量であり、それはＥｌｉｓａ等の血清学的アッセイで測定され得る。本明細書において特定の抗原マスと表現されるのは：一定数のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細胞のＬＰＳ上の免疫優性な防御抗原エピトープの量であり、１×１０^９レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細胞当たりのレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）ＬＰＳ抗原の血清学的単位数として表現される。
【００４９】
レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細胞は、生菌または死菌の全対の細胞が不活性化の前に通常の手順に従って計数される；これが本発明の「バイオマス」として理解されるものである。
【００５０】
従って本発明にとって、本発明の方法を適用する結果として、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細胞当たりの抗原量が増加する場合に、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の抗原マスは増加する。
【００５１】
これは、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）を増殖することによる、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）抗原を産生するための先行技術の方法における効果とは反対である；該方法はレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）バイオマスを増加することに集中していたが、しかし細胞当たりの抗原量を改良しなかった。結果として、バイオマスが増加しかつ抗原量が増加しない場合、それは抗原量／バイオマス単位の比率の減少を引き起こす。
【００５２】
抗原マスは、当該技術分野において周知の用語であり、典型的には測定される抗原：本明細書ではレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）ＬＰＳに特異的である抗体を使用する、Ｅｌｉｓａ等の血清学的分析法を使用して測定される。試料中に検出される抗原量は、その時、任意単位数で表現され、ここでこれらの単位は、例えば、１０００単位を含むと設定されている標準試料中の抗原量を参照して定義される。結果として、抗原量スコアの絶対値は任意であり、それが適用される個別の試験、および抗体および使用された標準試料に左右されるからである。しかしながら重要であるのは、同じ標準試料に対する同じ条件下で試験した試料スコア間の相対的な差である。これは、例えば、測定された抗原量における差として表現され得るか（例えば、２５０対５００抗原単位／ｍｌ）、または便宜上パーセンテージとして表現され得る。二つの試料間の差の当該パーセンテージは、同じ試料が、異なる抗体または異なる（が適切な）標準試料により分析されるときに、同様にあてはまるであろう。
【００５３】
本発明における使用のために抗原量を決定するための好ましい試験法は、Ｅｌｉｓａであり、該Ｅｌｉｓａは特定のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群または血清型のＬＰＳ抗原に特異的である抗体を使用する。当該抗体は、ＭＡＴにおいてレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）を凝集し得る。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体であり、試料は希釈して使用し得るように十分に高力価である。
【００５４】
当業者に長年にわたり周知されてきた、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）用の抗原量分析を実施するためのプロトコルおよび材料は、一般的に利用可能であり、本明細書で詳細に記載および例示される。例えば、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ，ＵＳＡ）またはＣＮＣＭ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）等の公的生物資源センターは、ほとんどの血清型のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属の細菌を提供することができ、ならびに血清型特異的かつ凝集性モノクローナル抗体、またはそのモノクローナルを発現するマウスハイブリドーマ細胞系を提供することができる（１９８９、Ｊ．ｏｆ  Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１３５，ｐ．７３）。
【００５５】
代わりに、当該材料は、標準的な方法を使用して日常的に内製で産生し得る：細菌を、感染したヒトまたは動物から獲得し得て（適正なバイオセイフティー対策を適用の下）、これらを通常の技術を使用して特性化し得る；抗原を、日常的な技術を使用してレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）を増殖することによって産生し得る；同様に血清型特異的抗体を、実験動物の免疫化によって獲得し得て、ならびにモノクローナル抗体を産生する方法は周知である。当業者は、これらの抗体の特異性および力価を、周知のＭＡＴを実施することによって容易に測定し得る。
【００５６】
同様に、いくつかの公的研究所および国際機関が、例えば、試験法開発のために、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌、‐抗原、および特異的抗体の標準試料を提供する。例えば、王立熱帯研究所（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）であり、ここは、ＷＨＯ、ＦＡＯおよびＯＩＥにとってレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）に関する標準センターである。同様に、ＵＳＤＡ（Ａｍｅｓ，ＩＡ，ＵＳＡ）は、主要なレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清型の標準的な基準バクテリンを提供し、ならびに抗原量（能力）ＥＬＩＳＡを設定し実施するために、関係者をプロトコルおよび材料により支える。
【００５７】
さもなければ、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）抗原量試験法の開発および／または日常的実行を、多数の（商業的）診断サービル研究所の一つに外部委託し得る。
【００５８】
多価不飽和Ｃ１８脂肪酸を補給されなかった、その他は同一の条件下において、同一または同様のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の抗原量と比較するときに、より高い抗原量が多価不飽和１８脂肪酸を補給されたレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物に見出されるならば、本発明にとって「抗原マスを増加すること」は、本発明の方法によって達成されていた。抗原マスにおける２０％の増加を、当業者に周知の日常的な技術を使用して、有意差をもって既に検出し得る。
【００５９】
それ故に本発明の方法の好ましい実施形態において、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の抗原マスの増加は、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸による補給をうけなかった同様のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の抗原マスと比較して、少なくとも２０％である。
【００６０】
より好ましくは抗原マスの増加は、好ましさの順に少なくとも２５、２８、３０、３５、４０、４５、５０、６３、７７、９０、１００、１２１、１５０、１７５、１８４または少なくとも２００％である。
【００６１】
本発明にとって、「同様のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物」とは、生物学的用語において、比較されているレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の培養物と高度に匹敵する、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の培養物を表す。例えば、これは、同じ単離株、菌株または血清型由来のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の、この比較を行うための使用を示し得る。
【００６２】
本発明の方法の適用後に、発明者らによって観察された、同様であるが非補給の培養物と比較して異なるレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群についての単位バイオマス当たりの抗原マスの増加（同様の非補給培養物と比較しての）の例は：Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅについての増加：１６４％、Ｓｅｊｒｏｅ（血清型Ｈａｒｄｊｏ）について：１８４％、Ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａについて：６３％、Ｔａｒａｓｓｏｖｉについて：１４１％、Ｐｏｍｏｎａについて：７３％、Ｃａｎｉｃｏｌａについて：１１８％およびＡｕｓｔｒａｌｉｓ（血清型Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）について：６２％であった。詳細を実施例および図に提供する。効果の差は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群に特異的、または血清型から使用された特異的な菌株材料に関連するのかもしれない。それにもかかわらず、これらのすべての増加は、高度に経済性に関係する。
【００６３】
例えば、培養、補給、または使用するレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の条件の適応によって、本発明の方法における多価不飽和Ｃ１８脂肪酸による補給から生じる、抗原マスの増加を最適化することは、十分に当業者の日常的になし得ることである。
【００６４】
この洞察が、特定の多価不飽和Ｃ１８脂肪酸による補給によって、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の血清群、血清型、型または菌株の抗原マス／バイオマスの比率における最大の相対増加を獲得するために、異なる血清群由来のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の培養物のさらなる最適化を可能とする。
【００６５】
それ故に本発明の方法の好ましい実施例において：
‐レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの培養物にとって、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸は、リノレン酸（Ｃ１８：３）であり、好ましくはアルファ‐リノレン酸（アルファＣ１８：３）であり、
‐レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｃａｎｉｃｏｌａの培養物にとって、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸はリノレン酸であり、
‐レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｐｏｍｏｎａにとって、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸はガンマ‐リノレン酸（ガンマＣ１８：３）であり、および／または
‐レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｓｅｊｒｏｅ（血清型Ｈａｒｄｊｏ）にとって、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸はリノール酸（Ｃ１８：２）であり、
ここで該脂肪酸は、本明細書で定義する通り該脂肪酸の誘導体の形態、または該脂肪酸に比較的富んだ化合物または組成物の形態で、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物に同様に供給し得る。
【００６６】
原則的に上で定義したどの多価不飽和Ｃ１８脂肪酸も、本発明の方法において使用され得て、一般的に同じ効果を提供した。さらに：発明者らは、異なる種類の多価不飽和Ｃ１８脂肪酸が、組み合わされた補給において同様に培養物に供給され得ることを見出したが、ここで抗原マスの増加に関するその効果は累積的であった。
【００６７】
このことは、本明細書で、例えば、血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ由来のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）について例証されるが、ここでリノール酸およびアルファ‐リノレン酸の各々の５０μｇ／ｍｌの併用による補給は、リノール酸またはアルファ‐リノレン酸の１００μｇ／ｍｌによる培養物の補給からの抗原マスにおける別々の相対的な増加の算術平均と極めて近い、抗原マスにおける増加を生み出した。
【００６８】
本発明の方法のための多価不飽和Ｃ１８脂肪酸の併用補給は、脂肪酸（またはその誘導体、または比較的に該脂肪酸に富む化合物または組成物）の混合物により補給することによって、または同時、連続または時間的により分離した別々の補給として成し得る。
【００６９】
従って一の実施形態において、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸は、二種以上の多価不飽和Ｃ１８脂肪酸を天然に含む組成物を使用することによって、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物に補給される。例は、植物（種子）油、例えばナタネ油またはアマニ油であり、それらは比較的にＣ１８：２およびアルファＣ１８：３に富んでおり、または麻実油であり、それは比較的にＣ１８：２、アルファＣ１８：３およびガンマＣ１８：３に富んでいる。
【００７０】
「レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）」とは、一般的にスピロヘータという名の細菌の分類学的な属由来の細菌を表す。これには、同様にそれから、例えば、亜種、菌株、単離株、遺伝子型、血清型、血清群、変異株または亜型、等に多少なりとも細分類されたレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）が含まれる。当該レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）は、それらの分類学的な科のメンバーを特徴づける特性、例えば、ゲノム的な、物理的な、電子顕微鏡的なおよび生化学的な特性、等ならびに生物学的特性、例えば、生理学的、免疫学的または病原体的な挙動、等を共有する。血清学的分類とは別に、他の決定法は、当該分野において周知の通り、ヌクレオチド配列決定法またはＰＣＲ法に基づかれ得る。
【００７１】
当業者にとって、本発明の主題である細菌の属が現在のところレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）と命名されている一方で、新たな識見が新しいまたは異なる分類学上のグループへの再分類をもたらすので、これが変更を受け得る分類学上の分類であることは、明らかである。しかしながら、これは関連する微生物またはその特徴づける特性を変えず、その科学名または分類だけを変えるので、当該再分類された微生物は、本発明の範囲内にとどまる。
【００７２】
本発明の方法における使用のための好ましいレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）は、一または複数の動物種またはヒトに対し病原性であるレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）である；より好ましくは、Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ（ｓｅｎｓｕ  ｌａｔｏ（広義））Ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉｓ、Ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｐｏｍｏｎａ、Ｔａｒａｓｓｏｖｉ、ＳｅｊｒｏｅおよびＡｕｔｕｍｎａｌｉｓから選択される少なくとも一つの血清型である。
【００７３】
より一層好ましいのは、Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ（ｓｅｎｓｕ  ｌａｔｏ（広義））Ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｐｏｒｔｌａｎｄｖｅｒｅ、Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、ＣｏｐｅｎｈａｇｅｎｉＢｒａｔｉｓｌａｖａ、Ａｕｓｔｒａｌｉｓ、Ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｄａｄａｓ、Ｐｏｍｏｎａ、Ｔａｒａｓｓｏｖｉ、Ｇａｔｕｎｉ、Ｈａｒｄｊｏ、ＳａｘｋｏｅｂｉｎｇおよびＡｕｔｕｍｎａｌｉｓから選択される少なくとも一つの血清型である。
【００７４】
本発明にとって「培養物（ｃｕｌｔｕｒｅ）」とは：レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属の細菌を含んでいる組成物である。本発明のためのレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物中の細菌は、種々の密度または状態：インタクトまたは非インタクト、生菌または死菌、（部分的）破裂または不活化、等であり得る。細菌は、例えば、増殖、休止または休眠等のどの細胞周期相でもあり得る。培養物は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）が直近に接種された、初期、中期、後期の指数または対数増殖期である、増殖している培養物であり得る。または培養物は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）が誘導期または回収または保存培養物である、休止期または定常期の培養物であり得る。
【００７５】
レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属の細菌を含む組成物は、液体、固体または半固体、凍結、または凍結乾燥であり得る。組成物は、培養培地または保存培地であり得て、ならびに安定剤または他の薬剤的に許容可能な添加物または担体を含み得る。特に当該培養物は、細胞懸濁液を含む。
【００７６】
好ましい実施形態において、本発明の方法における使用のための培養物は、液体形態であるのは、当該形態がレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）による多価不飽和Ｃ１８脂肪酸の摂取を促進するからである。
【００７７】
本発明にとって本明細書で用いる場合、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）および「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」等の変化形）とは、当該要素または組み合せが明示的に列挙されていないとしても、この用語が使用される本出願の部分、段落、請求項、等によってカバーされるかまたは含まれる、本発明のために考えうるすべての要素、および任意の可能な組み合せへの言及である；当該要素または組み合せのいかなる排除へ言及ではない。結果として、任意の本出願の部分、段落、請求項、等はまた、用語「含んでいる（または変化形）」が「から成る（ｃｏｎｓｉｔ  ｏｆ）」、「から成っている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「本質的にから成る（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」等の用語によって置き換えられる、一または複数の実施形態とも関連する。
【００７８】
本発明にとって、「補給している（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）」は：不足を補うために、またはあるものを強化または拡張するために添加することという普通の意味を有する（出典：Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｈｅｒｉｔｇｅ  ｄｉｃｔｏｎａｒｙ（アメリカンヘリテージ辞典），ｅｄ（編）．Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  Ｍｉｆｌｉｎ  Ｃｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＵＳＡ）。
【００７９】
本発明の方法において多価不飽和Ｃ１８脂肪酸の補給が適用される方法は、前記の方法の効果が：抗原マスの相対的な増加に達し得る限り、原則として制限されない。従って本発明の方法にとって、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸の補給は、現存するレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物への１回の、反復のまたは連続する添加によって成され得る。その代わりに、本発明の方法におけるレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の補給は、本発明のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の培養を確立するときに、一定濃度の多価不飽和Ｃ１８脂肪酸を供給することによって成し得る。例えば、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物が接種され増殖される予定である培養培地中に、またはレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物が維持または処理されている、洗浄‐、貯蔵‐または培養培地中に、一定濃度の多価不飽和Ｃ１８脂肪酸を提供することによってである。
【００８０】
同様に、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸による補給は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏ
ｓｐｉｒａ）の生活環の異なる時点、例えば、活発に増殖している培養物の初期、中期または後期、または貯蔵試料中、等において、ならびに細菌細胞の異なる密度で成し得る。
【００８１】
多価不飽和Ｃ１８脂肪酸は、異なる形態であり得て、ならびに異なる方法で補給され得る。これらの条件の変動および最適化のための選択肢は、本明細書に記載され例示されるが、十分に当業者の日常的な能力の範囲内である。
【００８２】
好ましい実施形態において、本発明の方法のための補給は、増殖するレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物に多価不飽和Ｃ１８脂肪酸を添加することによって、かつ経時的に徐々に添加することによってなされる。
【００８３】
本発明にとって「多価不飽和Ｃ１８脂肪酸」とは、脂肪酸である化学化合物、またはその誘導体、なおまた混合物または複合体中の多価不飽和Ｃ１８脂肪酸、または多価不飽和Ｃ１８脂肪酸に比較的に富んでいる化合物または組成物を表す。化合物または組成物は、もしそれが多価不飽和Ｃ１８脂肪酸をその総脂肪酸量の少なくとも約５％の量で含んでいるならば、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸に「比較的に富んで」いる。好ましくは、好ましい順で、その総脂肪酸量の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０％である。
【００８４】
脂肪酸含量の測定、ならびに個別の脂肪酸の相対含量への分化は、例えば抽出およびガスクロマトグラフィーによって、当業者によって日常的に成され得る。本発明の方法における使用のために、比較的に多価不飽和Ｃ１８脂肪酸に富んでいる化合物および組成物の例を、以下に記載する。
【００８５】
用語「多価不飽和Ｃ１８脂肪酸」は、１８個のＣ原子を含む炭化水素鎖を有し、該炭化水素鎖が二以上の二重（不飽和）結合を含む脂肪酸に関して、普通の意味で使用される。
【００８６】
当該技術分野において知られているのは、共役多価不飽和Ｃ１８脂肪酸であり、それは乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）等の細菌よって、反芻動物の反芻胃において産生される（それ故に吸収されない）。
【００８７】
好ましい実施形態において、本発明における使用のための多価不飽和Ｃ１８脂肪酸は非共役である。
【００８８】
より好ましい実施形態において、本発明における使用のための多価不飽和Ｃ１８脂肪酸は、メチレン中断型ポリエンであり、非分岐であり、および／またはシクロアルカン環に結合していない。
【００８９】
より一層好ましい実施形態において、本発明における使用のための多価不飽和Ｃ１８脂肪酸は、オメガ３‐またはオメガ６多価不飽和Ｃ１８脂肪酸である。
【００９０】
より一層好ましい実施形態において、本発明における使用のための多価不飽和Ｃ１８脂肪酸は、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３およびＣ１８：４から成る群より選択される一または複数である。
【００９１】
最も好ましい実施形態において、本発明における使用のための多価不飽和Ｃ１８脂肪酸は：リノール酸、アルファ‐リノレン酸、ガンマ‐リノレン酸またはステアリドン酸から成る群から選択される一または複数である。
【００９２】
「リノール酸」は、学名：９，１２‐オクタデカジエン酸およびＣＡＳ番号：６０‐３３‐３を有する、Ｃ１８：２、ｎ‐６、デルタ９、１２脂肪酸である。好ましくはその二重結合の双方は、シス型である。
【００９３】
リノレン酸は、二つの異性体：アルファ‐リノレン酸およびガンマ‐リノレン酸を有するＣ１８：３脂肪酸である。
【００９４】
「アルファ‐リノレン酸」は、学名：９，１２，５‐オクタデカトリエン酸およびＣＡＳ番号：４６３‐４０‐１を有する、Ｃ１８：３、ｎ‐３、デルタ９，１２，１５脂肪酸である。好ましくはそのすべての二重結合は、シス型である。
【００９５】
「ガンマ‐リノレン酸」は、学名：６，９，１２‐オクタデカトリエン酸およびＣＡＳ番号：５０６‐２６‐３を有する、Ｃ１８：３、ｎ‐６、デルタ６，９，１２脂肪酸である。好ましくはそのすべての二重結合は、シス型である。
【００９６】
「ステアリドン酸」は、学名：６，９，１２，５‐オクタデカテトラエン酸およびＣＡＳ番号：２０２９０‐７５‐９を有する、Ｃ１８：４、ｎ‐３、デルタ６，９，１２，１５脂肪酸である。ステアリドン酸はまた、モロクチン酸としても知られる。好ましくはそのすべての二重結合は、シス型である。
【００９７】
多価不飽和Ｃ１８脂肪酸は、天然または合成起源であり得て、単離状態またはさまざまな純度であり得る。また多価不飽和Ｃ１８脂肪酸は、他の化学基に結合、共役またはエステル化され得る。多価不飽和Ｃ１８脂肪酸がレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物に生物学的に利用可能であり、ならびに本発明の方法の効果が得られる限り、これらのすべての形態は許容可能である。好ましくは、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物に対しあまり毒性がなく、ならびに水性培養物の状態で使用し得る形態である。
【００９８】
当業者は、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸、誘導体、または多価不飽和Ｃ１８脂肪酸を含む化合物または組成物が、本発明の方法において使用し得るか、または毒性が高すぎるかまたは不都合であるかを、本明細書に記載の詳細および実施例によって容易に決定し得る。例えば、該脂肪酸、誘導体、化合物または組成物を代表的な小規模のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の発酵において試験し、ならびに一定数の細胞のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）ＬＰＳ抗原量を測定し、その量を化合物または組成物を含む多価不飽和Ｃ１８脂肪酸により補給されなかった同様のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物由来の細胞の抗原量と比較することによって決定し得る。
【００９９】
本発明における使用のための、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸、誘導体、化合物および組成物の例は：生化学製品の主な供給業者から種々の純度で入手可能な多価不飽和Ｃ１８脂肪酸である。また多価不飽和Ｃ１８脂肪酸は、担体分子、例えば、タンパク質またはタンパク質複合体（例えば、血清またはアルブミン、酵素（アシル‐ＣｏＡ））等に結合または複合されており、またはグリセリンまたはコレステロールにエステル化されており、またはリポタンパク質、リン脂質（リン酸との結合）または糖脂質またはリポ多糖（糖鎖との結合）としてである。また多価不飽和Ｃ１８脂肪酸は、他の脂肪酸組成物における遊離酸の微量成分として存在し得る。代わりに、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸は、例えば植物（種子）油等の多価不飽和Ｃ１８脂肪酸に比較的富んだ化合物または組成物に含まれ得る。
【０１００】
脂肪酸は、水性培地において通常は溶解性が乏しいので、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸、または誘導体、また多価不飽和Ｃ１８脂肪酸に比較的に富んでいる化合物または組成物は、それが生物利用可能であるようにするためまたは維持するために、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物へのその補給を促進する調製品に作成し得る。例えば、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸は、物理的に分散、または化学的に乳化、または溶媒と混合され得る。それは、セルロース、シクロデキストリンまたはコレステロール等の担体と、または上記の通りＢＳＡまたは血清を使用することによって担体と組み合わせ得る；その代りに、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸は、例えば、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）またはＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）（Ｓｐｅｃｔｏｒ  ＆  Ｈｏａｋ、前掲）等の粒状吸着剤により移行し得る。
【０１０１】
本発明の方法において、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸によりレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の培養物を補給するための有利な方法は、高含量の多価不飽和Ｃ１８脂肪酸を含むように作成されたＢＳＡにより該培養物を補給することである。
【０１０２】
それ故に本発明の方法の好ましい実施形態において、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸は、ＢＳＡとの複合体の形態で補給される。
【０１０３】
多価不飽和Ｃ１８脂肪酸は、単純なコ‐インキュベーションによって、ＢＳＡが多価不飽和Ｃ１８脂肪酸により飽和されるまで、ＢＳＡに負荷され得る。ＢＳＡへの脂肪酸の結合は、当該技術分野において知られている通り、温度およびｐＨ依存性であり、例えば、Ｓｐｅｃｔｏｒ  ＆  Ｈｏａｋ（前掲）、およびＡｓｈｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２５０，ｐ．２３３３）に記載されている。多価不飽和Ｃ１８脂肪酸のＢＳＡへの負荷レベルは、下記の通りガスクロマトグラフィーによって適宜分析され得る。どれほどの多価不飽和Ｃ１８脂肪酸がＢＳＡによって吸収され得るかは、ＢＳＡの種類および品質、ならびに既に結合した脂肪酸量に依存する。もし多価不飽和Ｃ１８脂肪酸を最大限に負荷することが望まれるならば、ＢＳＡを最初に抽出によって脱脂し、それからもっぱら多価不飽和Ｃ１８脂肪酸で再負荷し得る。（追加の）多価不飽和Ｃ１８脂肪酸により負荷されたＢＳＡが、既に培養培地において使用されているＢＳＡまたは血清の代わりに、または追加して、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物において使用し得る。
【０１０４】
発明者らは、本発明の方法のための効率的な補給が、その脂肪酸の少なくとも約１０％を多価不飽和Ｃ１８脂肪酸として含むように作成された、ＢＳＡを使用することによって可能であることを見出した。
【０１０５】
それ故に本発明の方法のための、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸を補給するための好ましい組成物は、その遊離脂肪酸の少なくとも約１０％を多価不飽和Ｃ１８脂肪酸として含む；好ましくはその遊離脂肪酸の少なくとも好ましい順に、１２、１５、１８、２０、２１、２３、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０、９５または９９％（ｗ／ｗ）を含む、ＢＳＡ調製品である。
【０１０６】
当業者は、ＢＳＡ調製品を使用して本発明の方法に従って、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物を多価不飽和Ｃ１８脂肪酸により補給するとき、これが培養物のタンパク質の負荷を、従ってそれから産生されるワクチンの負荷を増加し得ることを、理解するであろう。これは、ワクチン接種の副作用のレベルに影響を及ぼすかもしれない。当該培養物は、それ故に過剰なタンパク質を取り除くための精製段階を必要とするかもしれない。しかしながら、当該精製はしばしば適用されているので、それ故にＢＳＡまたは血清との複合体での多価不飽和Ｃ１８脂肪酸の補給は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の抗原マスを増加するための高度に効率的な方法である。
【０１０７】
多価不飽和Ｃ１８脂肪酸（‐調製品）は、種々の方法、例えばパルスとして、または経時的により緩やかに、本発明の方法に従ってレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物に補給され得る。パルス補給は、例えば、すべての多価不飽和Ｃ１８脂肪酸を約１時間以内に補給することであろうが、これは培養が静置である場合に最も適切であろう。レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の増殖にとって、最も適切な補給は、緩やかな補給であり、それはすべての多価不飽和Ｃ１８脂肪酸を約１ないし約６時間の期間に添加することを意味するであろう。増殖している培養物への流加補給は、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸（‐調製品）という餌をほとんどの培養期間の間与えることを意味するであろう。
【０１０８】
本発明の方法の好ましい実施形態において、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の増殖している培養物は、緩やかにまたは流加方式で補給される。
【０１０９】
本発明の方法において、抗原マスの相対的な増加を達成するために、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物に補給されるべき多価不飽和Ｃ１８脂肪酸の量は、原則として実際的、経済的および生物学的視点から実行可能なことによってのみ制限される。例えば、実際的な考慮事項には、培養物を増殖するファーメンターを、安全な作業およびその無菌性を損ない得るので、補給を添加するために何度も開放してはならないということがある。これに反して、補給されるべき培養物が、最終培養物または貯蔵培養物等の活発に増殖していない培養物であるとき、培養物を過剰増殖させる汚染のリスクは非常に低い。経済的な考慮事項は、例えば、大量の純粋な多価不飽和Ｃ１８脂肪酸、または特別な多価不飽和Ｃ１８脂肪酸‐の併用製品を補給するための材料費である。生物学的考慮事項は、脂肪酸が生きた細胞にとって毒であり得ることであるが、それは静置培養にとって大した問題ではない。それ故に大量の多価不飽和Ｃ１８脂肪酸が、増殖している培養物に短時間に補給されるべき時は、例えば、上記の通り毒性を低下させるために複合体の多価不飽和Ｃ１８脂肪酸を与えることによって、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）に対する脂肪酸の毒性を軽減するまたは防止するように注意が払わなければならない。その代わりに、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸は、経時的に緩やかに補給され得る。
【０１１０】
考慮されるべきさらなるパラメータは、それぞれの特定の場合の条件：レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の量、状態および種類、ならびに培養時間、温度、ｐＨ、等である。本明細書の詳細および実施例に関して、本発明の方法に関連して多価不飽和Ｃ１８脂肪酸がレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物に補給される量および方法を変更しおよび最適化することは、当業者の手が届くところである。
【０１１１】
培養物中のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）は、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸をできるだけ速く消費するように思われる。参照されたいが、例えば、図２、３および１３、１４は、リノール酸およびリノレン酸が、パルミチン酸およびオレイン酸とは対照的に、非常に急速に消費され、抗原マスに変換されることを説明する。これは、当該培養物中で産生される抗原マスの総量が、培養の間の培養物に利用可能である累積的な多価不飽和Ｃ１８脂肪酸の総量の結果であることを意味する。本発明にとって、培養物に補給される多価不飽和Ｃ１８脂肪酸の量に関する指標は、それ故に、あたかも多価不飽和Ｃ１８脂肪酸が一つの時点において利用可能であったかのように、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の増殖または培養の間に利用可能であった、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸の総量を表す。該量は、培養物の総容量に基づく濃度として表現される。該濃度は、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸が含まれていた混合物の形態または用量と無関係であり、該濃度にはすべての培地成分によってなされる添加が含まれる。
【０１１２】
その結果として、当業者は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物に供給された多価不飽和Ｃ１８脂肪酸のこの総濃度を測定することが、しばしば実際には可能でないことを理解するであろう。一方では、当該濃度が、経時的におよび異なる成分からなされた、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸貢献物由来の累積的数であるからである。他方では、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物が、当該濃度の一部を試料採取時の前に既に摂取し、処理してしまっているだろうからである。
【０１１３】
例えば、発明者らは、わずか約５μｇ／ｍｌしか利用可能でなかった培養物と比較して、２５μｇのリノール酸が培養物ｍｌ当たりに利用可能になされるように、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の培養物を本発明の方法に従ってリノール酸により補給したときに、抗原マスの顕著な増加が獲得され得ることを証明した。
【０１１４】
標準的なＥＭＪＨ培養培地は、ごく少量のＣ１８：３しか含まないが、同じことがリノレン酸に対して当てはまる。それ故に原則としてレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物へのいかなる量のＣ１８：３の補給も、その抗原マス／バイオマス比率にとってすでに有益であろう。実用的には、約５μｇ／ｍｌから始まる量のＣ１８：３が添加され得る。
【０１１５】
利用可能な多価不飽和Ｃ１８脂肪酸のより高い含量において、抗原マスはより増加した。試験した利用可能な最も高いレベル、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物における３００μｇ／ｍｌを超える多価不飽和Ｃ１８脂肪酸において、多少の毒性がいくつかの血清型に対して注目された。しかしながら、この影響は純粋な多価不飽和Ｃ１８脂肪酸の調製品を使用したとき見られたので、上記の通り複合体中での多価不飽和Ｃ１８脂肪酸の適切な解毒によって打ち勝ち得る。
【０１１６】
それ故に一実施形態において、本発明は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の抗原マスを増加させるための方法を提供し、ここで該方法は、
少なくともリノール酸１５μｇ／ｍｌ、および／または少なくともリノレン酸５μｇ／ｍｌが前記の培養物に利用可能となされた条件下において、前記のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物を培養する段階を含む。
【０１１７】
下記の通り、種々の多価不飽和Ｃ１８脂肪酸‐上に定義した通り‐の補給はまた、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物において累積的効果を与えながら、併用され得る。結果として、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物に利用可能となされている多価不飽和Ｃ１８脂肪酸の総量は、従って併用される種々の多価不飽和Ｃ１８脂肪酸の合計量に基づき得る。
【０１１８】
それ故に本発明の方法の好ましい実施形態において、該方法は、少なくとも１５μｇの多価不飽和Ｃ１８脂肪酸が前記の培養物に利用可能となされた条件下において、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物を培養する段階を含む。より好ましくは、好ましい順に少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３５、３７、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または少なくとも１００μｇの多価不飽和Ｃ１８脂肪酸／ｍｌが、前記の培養物に利用可能になされていた。
【０１１９】
本発明の方法のさらに好ましい実施形態において、該方法は、約１５と１０００μｇの間の多価不飽和Ｃ１８脂肪酸／ｍｌが前記の培養物に利用可能となされた条件下において、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物を培養する段階を含む。より好ましくは、好ましい順に、約２０と５００μｇ／ｍｌの間、約２０と３００μｇ／ｍｌの間、または約２５と２５０μｇの間の多価不飽和Ｃ１８脂肪酸／ｍｌが前記の培養物に利用可能となされていた。
【０１２０】
一実施形態において、本発明は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の抗原マスを増加させる方法を提供し、該方法は、少なくとも１５μｇの多価不飽和Ｃ１８脂肪酸が前記の培養物に利用可能となされた条件下において、前記のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物を多価不飽和Ｃ１８脂肪酸により補給する段階を含み；ここでレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）は、Ｌ．インターロガンス（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ（ｓｅｎｓｕ  ｌａｔｏ）（広義））Ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉｓ、Ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｐｏｍｏｎａ、Ｔａｒａｓｓｏｖｉ、ＳｅｊｒｏｅおよびＡｕｔｕｍｎａｌｉｓから選択される少なくとも一つの血清群であり；およびここで前記のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の抗原マスの増加は、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸によって補給されなかった同様のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の抗原マスと比較して、少なくとも２０％である。
【０１２１】
さらなる態様において、本発明は、本発明の方法によって獲得可能なレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物を提供し、ここで前記のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物は、増加した抗原マスを有する。
【０１２２】
本発明の当該レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物は、該レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物が、本発明の方法における多価不飽和Ｃ１８脂肪酸による補給から生じる顕著に増加された抗原マスを有することにおいて、先行技術のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物と異なる。増加された抗原マスは、記載の通り容易に検出可能であり定量可能であり：上記の通り２０％以上の抗原マスの増加が重要であり検出可能である。
【０１２３】
抗原マスの増加は、上記の本発明の方法において多価不飽和Ｃ１８脂肪酸により補給しなかった以外は、同様の条件下における同様のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の抗原マスと比較してである。
【０１２４】
それ故に本発明のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物は、前記のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の抗原マスが、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸により補給されなかった、同様のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の抗原マスと比較して少なくとも２０％増加されることを特徴とする。
【０１２５】
より好ましくは本発明のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物は、前記のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の抗原マスが、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸により補給されなかった、同様のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の抗原マスと比較して、好ましい順に少なくとも２２、２４、２５、２８、３０、３５、４０、４５、５０、６３、７７、９０、１００、１２１、１５０、１７５、１８４または少なくとも２００％増加されることを特徴とする。
【０１２６】
本発明のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物は、記載の本発明の方法、例えば、増殖期‐、または定常期の培養物または収集した培養物のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）を、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸、誘導体または多価不飽和Ｃ１８脂肪酸に比較的富んでいる化合物または組成物により補給することによって得られる。これは、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）に対するワクチンにおける、いくつかの有利な有用性を有する。
【０１２７】
さらなる態様において本発明は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）に対するワクチンにおける使用のための、本発明のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物、または前記の培養物の調製品に関する。
【０１２８】
好ましくは、本発明のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）に対するワクチンにおける使用のためのレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物は、本発明の不活化したレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の形態である。
【０１２９】
本発明にとって、本発明のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の「調製品」は、当該培養物のフラグメント、例えば、本発明のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物由来の抽出物、超音波処理物、または濾過物、またはサブユニット、例えば、ＬＰＳを含む外層膜の一部、精製ＬＰＳ、または前記のＬＰＳの一部、等であり得る。
【０１３０】
それ故にさらなる態様において、本発明は、本発明のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物、または前記の培養物の調製品を含むレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）に対するワクチンを提供する。
【０１３１】
本発明の「ワクチン」は、本発明のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の（調製品の）免疫学的有効量、および薬剤的に許容可能な担体を含む医薬組成物である。ワクチンは、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）に対する有効な免疫応答を誘導する。
【０１３２】
「薬剤的に許容可能な担体」は、それが投与される標的の健康に（重篤な）有害な影響を引き起こすことなく、医薬活性化合物の効果的な投与において援助することを意図する。薬剤的に許容可能な担体は、例えば、滅菌水または滅菌生理食塩水であり得る。より複雑な形態において担体は、例えば、安定剤または保存料等のさらなる添加物を含み得る緩衝液であり得る。
【０１３３】
本発明のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）に対するワクチンのレプトスピラの成分は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）感染、またはレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）感染で引き起こされるレプトスピラ症の臨床徴候の強度を予防、改善または低減するための助けとなる、標的のヒトまたは動物における免疫応答を誘導する。これは、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）に起因する病変および影響、またはそれに対する標的の反応に起因する数または重症度の低減をもたらすレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）によるコロニー形成または感染率の減少の結果であり得る。さらに、これはレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の（尿）排泄の低減、およびそれによる環境への拡散を低減するであろうし、それは人獣共通感染症の機会を低減する。
【０１３４】
何が本発明のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）に対するワクチンの免疫学的有効量を規定するかは、使用されるワクチンの所望の効果および特定の性質、およびワクチンが適用される標的に依存する。本質的に液性免疫応答によって機能するバクテリンに基づくレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）ワクチンに対して、特定の抗原マスと標的中におけるワクチンの免疫防御力の間の相関関係が良く知られている。それ故に有効量の決定は、例えば、ワクチン接種後の免疫応答をモニターすることによって、または攻撃感染後に、例えば、疾病の臨床徴候、血清学的パラメータをモニターすることによって、または病原菌を再単離することによって、ならびにこれらを未接種の動物に観察される応答と比較することによって、十分に日常的な実務家の技術の範囲にある。
【０１３５】
好ましい実施形態において、本発明のワクチンは、例えば、分解し易い成分を保護するために、および／またはワクチンのシェルフライフを高めるために、安定剤をさらに含む。一般的に当該安定剤は、高分子量の大分子、例えば、脂質、炭水化物またはタンパク質；例えば、粉乳、ゼラチン、血清アルブミン、ソルビトール、トレハロース、スペルミジン、デキストランまたはポリビニルピロリドン、およびアルカリ金属リン酸塩等の緩衝液、等である。
【０１３６】
安定剤は、好ましくは動物起源の化合物を含まないか、または：ＷＯ  ２００６／０９４，９７４に開示される通り化学的に定義される。
【０１３７】
同様に、チメロサール、フェノール性化合物および／またはゲンタマイシン等の保存料が添加され得る。
【０１３８】
ワクチン学における一般的な技術および手順は、当該技術分野において周知であり、例えば、薬局方等の政府規制において、ならびに「Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ（獣医学のワクチン学）」（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ（編）．，１９９７，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＩＳＢＮ：０４４４８１９６８１）および「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ（レミントン：薬学の科学と実践）」（２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ，ＵＳＡ，ＩＳＢＮ：６８３３０６４７２）等の周知のハンドブックに記載されている。
【０１３９】
本発明のワクチンに対する標的の被験者は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）感染に感受性であるヒトまたは多種多様な動物である。好ましい標的は：ヒト、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジおよびシカから選択される一または複数である。原則として標的は、健康または病気であり得て、しかもレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の存在に関して、またはレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）に対する抗体に関して正または負であり得る。同様に標的は、ワクチン接種に感受性のあるいかなる年齢でもあり得る。しかしながら、健康で感染していない標的にワクチン接種すること、およびいかなる圃場感染をも防ぐためにできるだけ早くワクチン接種することが明らかに好ましい。
【０１４０】
本発明のワクチンは、効果的な初回抗原刺激として役立ち得て、それはその後追加免疫接種に引き継がれ、増幅される。
【０１４１】
本発明のワクチンは、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）感染の確立および進行の双方、または病気の臨床徴候を防ぐので、予防的処置にも治療的処置にも等しく使用され得る。
【０１４２】
標的に対する本発明のワクチンの適用計画は、単回投与または反復投与であり得て、投与量および製剤に適合するように、ならびに免疫学的に有効である量で、同時にまたは連続的に投与され得る。
【０１４３】
本発明のワクチン投与のプロトコルは、理想的には標的が必要とし得る既存の他のワクチンの既存の接種計画と統合される。
【０１４４】
本発明のワクチンは、好ましくは年１回の単回投与として適用される。
【０１４５】
本発明のワクチンは、本発明の培養物由来のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、またはその調製品の、用量当たり１ｘ１０^６と１ｘ１０^１０の間；好ましくは用量当たり１ｘ１０^７と５ｘ１０^９の間の細菌細胞量を含み得る。
【０１４６】
本発明のワクチンは、標的に適う容量で投与され得て、例えば、容量で約０．１と１０ｍｌの間であり得る。好ましくは、一用量は約０．２５と３ｍｌの間である。
【０１４７】
本発明のワクチンは、当該技術分野で既知の方法に従って標的に投与され得る。例えば、皮膚の中へのまたは皮膚を貫く注射の任意の経路、例えば：筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内、粘膜下または皮下による非経口適用としてである。実行可能な代わりの適用経路は、局所適用、吸入または食餌性経路である。
【０１４８】
好ましい適用経路は、筋肉内または皮下注射によってである。最適の適用経路が、使用される具体的なワクチン製剤、および標的の個々の特性に依存するであろうことは言うまでもない。
【０１４９】
本発明のワクチンをさらに最適化することは、十分に当業者の手が届くところである。一般的にこれには、ワクチンが十分な免疫応答を提供するために、ワクチンの効果の微調整細が関与する。これは、ワクチン用量を適応させることによって、またはワクチンの他の形態または製剤で使用することによって、またはワクチンの他の成分（例えば、安定剤またはアジュバント）を適応させることによって、または異なる経路による適用によって、成され得る。
【０１５０】
ワクチンは、他の化合物、例えば、アジュバント、追加の抗原、サイトカイン、等をさらに含み得る。もう一つの方法として、本発明のワクチンは、医薬成分、例えば、抗生物質、ホルモンまたは抗炎症薬と有利に併用され得る。
【０１５１】
好ましい実施形態において、本発明のワクチンは、それがアジュバントを含むことによって特徴づけられる。
【０１５２】
「アジュバント」は、周知のワクチン成分であり、一般的にそれは、標的の免疫応答を非特異的に刺激する物質である。様々なアジュバントが当該技術分野において知られている。アジュバントの例は、完全フロイントおよび不完全フロイントアジュバント、ビタミンＥ、アルミニウム組成物、非イオン性ブロック重合体および硫酸デキストラン等のポリアミン、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）およびピランである。
【０１５３】
さらに、ペプチド類、例えば、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシン等がしばしばアジュバントとして使用され、ならびにミネラルオイル、例えば、Ｂａｙｏｌ（登録商標）またはＭａｒｋｏｌ（登録商標）、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）または軽パラフィンオイル、植物油または併用製品、例えば、Ｓｅｐｐｉｃ（登録商標）社のＩＳＡ（登録商標）、またはＤｉｌｕｖａｃＦｏｒｔｅ（登録商標））が有利に使用され得る。エマルジョンは、油中水型（ｗ／ｏ）、水中油型（ｏ／ｗ）、水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）、二重オイルエマルジョン（ＤＯＥ）、等であり得る。
【０１５４】
本発明のワクチンのための好ましいアジュバントは、水酸化アルミニウムまたはサポニン、例えば：Ｑｕｉｌ  Ａ（登録商標）、またはＱ‐ｖａｃ（登録商標）等である。サポニンおよびワクチン成分は、ＩＳＣＯＭ（登録商標）（ＥＰ  １０９．９４２、ＥＰ  １８０．５６４、ＥＰ  ２４２．３８０）に組み込まれ得る。
【０１５５】
言うまでもないが、アジュバント化する、ビヒクル化合物または希釈剤を添加する、ワクチンを乳化するまたは安定化する他の方法も、本発明の範囲内である。
【０１５６】
本発明のワクチンは、他の抗原と共に混合ワクチンに有利に組み込まれ得る。
【０１５７】
それ故により好ましい実施形態において、本発明のワクチンは、それが追加の免疫活性成分を含むことで特徴づけられる。
【０１５８】
「追加の免疫活性成分」は、抗原、免疫亢進物質および／またはワクチンであり得て、それらのいずれもアジュバントを含み得る。追加の免疫活性成分は、抗原の形態である場合、ヒトまたは獣医学的に重要ないかなる抗原成分からも成りたち得る。好ましくは追加の免疫活性成分は、標的に対し病原性であるさらなる微生物に基づくか、または由来する。それは、例えば、生体分子または合成分子、例えば、タンパク質、炭水化物、リポ多糖、タンパク質性の抗原をコードする核酸、等を含み得る。また、当該核酸、または当該核酸を含むキャリアー・生きた組換え微生物を含む宿主は、該核酸または追加の免疫活性成分を送達するための一つの方法であり得る。代わりに、それは、分画または殺菌された微生物、例えば、寄生生物、細菌またはウイルス等を含み得る。
【０１５９】
追加の免疫活性成分はまた、免疫亢進物質、例えば、ケモカイン、または免疫刺激性核酸、例えば、ＣｐＧモチーフでもあり得る。代わりに、本発明のワクチンは、それ自体が一つのワクチンに添加され得る。
【０１６０】
本発明の混合ワクチンの有利な有用性は、それがレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）に対する免疫応答を誘導するだけでなく、また標的の他の病原菌にたいしても誘導し、一方でワクチン接種のために標的の単回処理だけが必要とされ、そのために標的への不快感、ならびに時間および労働費が低減される。
【０１６１】
当該追加の免疫活性成分の例は、原則として、本発明のレプトスピラ症に対するワクチンにとっての標的でもある、標的のワクチン接種を受け入れられる、すべてのウイルス、細菌および寄生性病原体である。
【０１６２】
例えば、ブタ用：ブタサーコウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタパルボウイルス、ブタコレラウイルス、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトコッカス属菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃ．）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｅｃ．）、クロストリジウム属菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄａｉ  ｓｐｅｃ．）、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ属菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｅｃ．）、ヘモフィルス属菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｅｃ．）、エリシペロスリクス属菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｓｐｅ．）、ボルデテラ属菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐｅｃ．）、等。
【０１６３】
ウシ用：ネオスポラ属菌（Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｓｐｅｃ．）、ディクチオカウルス属菌（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ  ｓｐｅｃ．）、クリプトスオポリジウム属菌（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｅｃ．）、オステルタギア属菌（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ  ｓｐｅｃ．）、ウシロタウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス、ウシコロナウイルス、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス（ウシヘルペスウイルス）、ウシパラミクソウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、ブルータングウイルス、パスツレラ・ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｒｕｒｅｌｌａ  ｈｅａｍｏｌｙｔｉｃａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｅｃ．）、スタフィロコッカス属菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃ．）、マイコバクテリウム属菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃ．）：、ブルセラ属菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｅｃ．）、クロストリジウム属菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｓｐｅｃ．）、マンヘニア属菌（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐｅｃ．）、ヘモフィルス属菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｅｃ．）、フソバクテリウム属菌（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｕ  ｓｐｅｃ．）、等。
【０１６４】
ヒツジまたはヤギ用：トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、小反芻獣症ウイルス、ブルータングウイルス、シュマレンベルクウイルス、マイコバクテリウム属菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅ．）、ブルセラ属菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｅｃ．）、クロストリジウム属菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｓｐｅ．）、コクシエラ属菌（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｓｐｅｃ．）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、クラミジア属菌（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｅｃ．）、クロストリジウム属菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｓｐｅｃ．）、パスツレラ属菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｅｃ．）、マンヘミア属菌（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐｅｃ．）、等。
【０１６５】
イヌまたはネコ用：エーリキア・カニス（ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ）、ドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ−ｃｏｍｐｌｅｘ）、ネオスポラ・カニナム（Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｃａｎｉｎｕｍ）、イヌパルボウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス１型または２型、イヌ肝炎ウイルス、イヌコロナウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ネコカリシウイルス、ネコヘルペスウイルス、ネコ汎血球減少症ウイルス、クロストリジウム属菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｕ  ｓｐｅ．）、ヘパトゾーン属菌（Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ  ｓｐｅｃ．）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、クラミジア属菌（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｅｃ．）、およびバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）属菌またはタイレリア（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ）属菌。
【０１６６】
ヒト用：マラリア原虫属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、トキソプラズマ属（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、水痘帯状疱疹ウイルス、ＨＩＶ、ヒトパピローマウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、肝炎ウイルス種、インフルエンザウイルス、ヘモフィルス属菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｅｃ．）、ストレプトコッカス属菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃ．）、コリネバクテリウム属菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃ．）、ボルデテラ属菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐｅｃ．）、ナイセリア属菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｅｃ．）、およびクロストリジウム属菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｅ．）。
【０１６７】
別の実施形態において、本発明の混合ワクチンは、Ｌ．インターロガンス（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）の二以上の血清群由来のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）を含み得る。例えば、イヌ標的用は：Ｌ．インターロガンス（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ（ｓｅｎｓｕ  ｌａｔｏ（広義）））血清群ＣａｎｉｃｏｌａおよびＩｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａ；または：Ｌ．インターロガンス（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ（ｓｅｎｓｕ  ｌａｔｏ（広義）））血清群Ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、ＡｕｓｔｒａｌｉｓおよびＧｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａである。これらのうち一または複数は、本発明のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物（由来）であり得て；好ましくはすべてが、本発明のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物（由来）である。
【０１６８】
本発明の混合ワクチンのさらに好ましい実施形態において、混合ワクチンは（追加の免疫活性成分は別にして）、Ｌ．インターロガンス（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）の二以上の血清群に相当する一または複数のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）を含む。例えば、ブタの標的に対する混合ワクチンは：Ｌ．インターロガンス（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）（広義）血清群Ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉｓ、Ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、ＰｏｍｏｎａおよびＴａｒａｓｓｏｖｉ、ならびにブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）およびブタパルボウイルス、を含み得る。本混合ワクチンにおいて、一または複数のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）は、本発明のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物であり得る；好ましくはすべてが本発明のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物である。
【０１６９】
実用的およびプロセス制御の理由から、当該混合ワクチンにおける各々のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）抗原を、本発明の分離した培養物において産生することが有益である。これは、その時に各々がその特別な最適な条件により産生され得るからである。次に別のワクチン抗原が調製され、その時初めて異なるレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）抗原が混合され得る。
【０１７０】
さらなる態様において、本発明は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）に対するワクチン製造のための、本発明のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物、または前記のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の調製品の使用に関する。
【０１７１】
本発明のワクチンの「製造」は、当業者に周知の方法によって実施される。当該製造は、一般的に本発明のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物、またはその調製品の薬剤的に混合可能な賦形剤との混合および製剤化、その後に適切なサイズの容器への割り当てが続く段階を含む。該製造プロセスの種々の段階は、適切な試験によって、例えば、抗原の品質および量については免疫学的試験によって；無菌性および外来病原体の存在については微生物学的試験によって；および最終的にワクチンの効力および安全性を決定するためにはインビトロおよびインビボでの試験によって、モニターされる必要があり得る。これらのすべては、当業者に周知である。
【０１７２】
本発明のワクチンは、ヒトまたは動物標的への投与に適する、ならびに所望の投与経路および所望の効果に調和する形態に製造され得る。
【０１７３】
周知のワクチン形態は、標的への所望の適用方法に依存して、例えば：液剤、ゲル剤、軟膏剤、粉剤、錠剤またはカプセルである。好ましくは本発明のワクチンは、注射用液体、例えば：懸濁液、溶液、分散剤またはエマルジョン、等として製剤化される。通常、当該ワクチンは無菌的に調製される。
【０１７４】
一実施形態において、本発明のワクチンは、不活性化された本発明のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物に基づく。当該のバクテリンに基づく不活化ワクチンは、周知の技術を使用して今や本発明用に製造され得る。
【０１７５】
それ故にさらなる態様において、本発明は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）に対するワクチンを生産するための方法を提供し、前記の方法は：
ａ．インビトロ系においてレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物を増殖し、
ｂ．前記のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物を多価不飽和Ｃ１８脂肪酸により補給し、
ｃ．前記の補給レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物を不活性化し収集し、および
ｄ．不活化レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物を薬剤的に許容可能な担体と混合する、
段階を含む。
【０１７６】
該方法は、レプトスピラ症ワクチンの増殖、不活性化および製剤化に関する周知の手順に従って実施される。収集は、先行技術におけるよりも収集の時点を選択するためのより多くの選択肢がある以外には、先行技術におけると同様に実施される：先行技術の場合、抗原マスのレベルが要求されるのに、収集は今や以前よりも早期に成され得る。
【０１７７】
代わりに、最大限の抗原マスが望まれる場合には、従前実施されていた通り培養物は、最初にその最大のバイオマスまで増殖され得て、培養物が本発明の方法において多価不飽和Ｃ１８脂肪酸により補給されるときになって初めて、顕著に多い抗原量が産生される。
【０１７８】
用語「増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ）」とはレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌を多数の細胞分裂サイクルを繰り返し行い得るように、およびそのように誘導するという通常の意味を有する。本発明にとっての増殖は、「成長（ｇｒｏｗｉｎｇ）」、「培養（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）」または「増幅（ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ）」等の、細胞数および細胞サイズの増加を表す同様の用語の意味を包含する。増殖期は、接種によりはじまり、これは順番に菌株選択、前処理および／またはさらに前増殖により始まる。
【０１７９】
「インビトロ系」とは、制御された人工的な条件下における、人体または動物体の外側でのレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌の計画的な増殖の周知の方法である。これには、典型的にはケモスタットまたはファーメンター、ならびに（半）合成培養培地を用いる。日常的に、重要ないくつかの発酵パラメータがモニターされ、適切な場合に調整され、しかもこれは自動化さえされ得る。いかなる規模におけるインビトロでの細菌細胞増殖系のための技術、材料および装置も、周知であり、生命科学産業の多数の民間供給業者から容易に入手可能である。
【０１８０】
本発明のワクチンを製造するための方法の好ましい実施形態において、プロセスが非連続的に作業され得る介在段階が導入される。介在段階は、増殖段階および補給段階の間に導入され、最初の段階において増殖されたレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の収集、貯蔵および／または精製に関連する。
【０１８１】
それ故に好ましい実施形態において、本発明のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）に対するワクチンを生産するための方法は、第一の段階と第二の段階の間に、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の収集、貯蔵および／または精製を含む、追加の段階を含む。
【０１８２】
この介在段階は、本発明の方法の増殖期および補給期の別個の実施および最適化を可能とする。介在段階は、本法の更なる段階におけるその効果的な使用を可能とするように、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物の生存能または生化学的完全性を維持する方法で、実施される。例えば、収集は、例えば、遠心分離またはダイアフィルトレーションによって行われ得る。収集の結果として、レプトスピラはより濃縮された形態となり得る。保存は、水性環境下において約２ないし約３０℃の間の温度で実施され得る。精製は、例えば、その後の段階に対し最適条件を提供するために、増殖培地の回復または置換を含み得る。これらの各々の操作は、別箇に、統合してまたは連続して、ならびにいかなる論理的順序でも行われ得る。
【０１８３】
本発明の方法において、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物は、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸により補給される。しかしながら、超高純度化学品としての多価不飽和Ｃ１８脂肪酸は、例えば、いくつかの獣医用ワクチンに適用される等、薄利の製品の生産における大規模な使用にとって、余りにも高価であり得る。それ故にこれらの方法における使用のための多価不飽和Ｃ１８脂肪酸は、上で定義した通り、誘導体または多価不飽和Ｃ１８脂肪酸に比較的に富んでいる化合物または組成物、等の異なる形態または純度で補給され得る。
【０１８４】
それ故にさらなる態様において、本発明は、本発明の方法のための、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸に比較的に富んでいる化合物または組成物の使用に関する。
【０１８５】
当業者は、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸に比較的に富んでいる化合物および組成物を試験しうるだけでなく、さらに本発明の方法におけるそれらの使用を最適化し得る。
【０１８６】
本発明の方法における使用のための多価不飽和Ｃ１８脂肪酸の非常に経済的な供給源は、植物油であり、何故ならばこれらの油のいくつかが、非常に高いレベルの多価不飽和Ｃ１８脂肪酸を含むことが良く知られており、それらが経済的な価格であり、本発明の方法における使用のために許容可能である品質および純度で利用可能であるからである。
【０１８７】
それ故に本発明の使用の好ましい実施形態において、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸に比較的に富んでいる化合物または組成物は、植物油である。
【０１８８】
「植物油」は、植物の一部由来、ほとんどの場合、果実および種子：ベリー類、エンドウ類、豆類、穀類およびナッツ類等由来；あるいは：葉、茎、花、花芽、根またはテンサイ由来である。植物油は、その植物源材料から圧縮、抽出、等によって単離され得る；植物油を獲得し精製するための方法は、古来知られてきた。
【０１８９】
リノール酸に比較的に富んでいる植物油の例を、表１に記載する。示した値は、総脂肪酸含量の％（ｗ／ｗ）であり、ならびにおおよその平均であり、植物品種および使用される抽出プロセスにより変動しかつ依存し得る。参考文献：Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（米国農務省），Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（標準的基準としての国立栄養データベース），ｒｅｌｅａｓｅ（発行）２４，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１１。
【０１９０】
2016504028.tif 000002
表１  
（１）これらの油類の慣用名において、油は種子から得られるが、種子は特定されていない。
【０１９１】
（２）これは、高オレイン酸であるこの油の変異体を考慮していない。
【０１９２】
（３）ナタネ油の変異体はＣａｎｏｌａ（登録商標）油であり、それは低減されたエルカ酸含量を有する。
【０１９３】
（４）亜麻仁（Ｌｉｎｓｅｅｄ）はまた：亜麻の種子（ｆｌａｘ  ｓｅｅｄ）として知られる。
【０１９４】
同様に、より外来性の非食料品の植物（種子）油がリノール酸に比較的に富んでいる；例えば、：ピラカンサ（Ｆｉｒｅｔｈｏｒｎ）の種子由来の油：総脂肪酸の７０％（ｗ／ｗ）；オレゴングレープ（Ｏｒｅｇｏｎ  ｇｒａｐｅ）：５２％；ならびにサルサパリラ（Ｓａｒｓａｐａｒｉｌｌａ）：５１％（Ｓ．Ｏｅｚｇｕｅｌ‐Ｙｕｅｃｅｌ  ２００５，Ｊ．Ａ．Ｏ．Ｃ．Ｓ，ｖｏｌ．８２，ｐ．８９３）。
【０１９５】
アルファリノレン酸の周知の供給源は：チアセージ（Ｓｈｉａ  ｓａｇｅ）、キーウィフルーツ、シソ属（Ｐｅｒｉｌｌａ）、亜麻（Ｆｌａｘ）、大麻、コケモモ（Ｌｉｎｇｏｎｂｅｒｒｙ）、ニガー（Ｎｉｇｅｒ）、ゴム、カメリナ（Ｃａｍｅｌｉｎａ）、スベリヒユ（Ｐｕｒｓｌａｎｅ）、シーバックソーン（Ｓｅａ  ｂｕｃｋｔｈｏｒｎｅ）およびナタネ（Ｒａｐｅｓｅｅｄ）、由来の種子油である。
【０１９６】
ガンマリノレン酸の周知の供給源は：マツヨイグサ、ルリジサ（Ｂｏｒａｇｅ）、クロスグリ（Ｂｌａｃｋｃｕｒｒａｎｔ）、ベニバナ（Ｓａｆｆｌｏｗｅｒ）およびアサ（Ｈｅｍｐ）、由来の種子油である。
【０１９７】
ステアリドン酸の周知の供給源は：アサ（Ｈｅｍｐ）、クロスグリ（Ｂｌａｃｋｃｕｒｒａｎｔ）、ムラサキ（Ｃｏｒｎ  ｇｒｏｍｗｅｌｌ）およびシャゼンムラサキ属（Ｅｃｈｉｕｍ）、由来の種子油である。
【０１９８】
それ故に本発明にとって、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸として、総脂肪酸の少なくとも２５％（ｗ／ｗ）を有する植物油が好ましく、より好ましくは多価不飽和Ｃ１８脂肪酸として、総脂肪酸の好ましい順に少なくとも３０、４０、５０、６０、７０または少なくとも７５％（ｗ／ｗ）を有する植物油である。
【０１９９】
本発明のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物はまた、診断方法においても有利に使用しうる。例は、被験試料中のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の特異的抗体または抗原の検出のための診断試験における使用である。例えば、本発明のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）培養物由来の調製品は、プレートまたは担体上に被覆され得て、すなわち抗原検出として使用され得る。代わりに、調製品は、高い抗原マスを有する標準的な基準抗原として使用され得る。
【０２００】
本発明は、今や以下の非限定的な実施例を参照してさらに記載される。
【０２０１】
実施例
１．  全般的な材料および方法
１．１  レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の増殖
１．１．１  細菌株、培地および前増殖（ｐｒｅ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）  
Ｌ．インターロガンス（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）の菌株の作業用の種菌をＥＭＪＨ培地に接種し、２９℃で３ないし５日間培養した。もし必要であれば、５回連続の前培養の継代を実施することができて、その際前培養を次の継代に移す基準として十分な増殖（濁度）を肉眼的に検査した。
【０２０２】
備考：生きたレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）を扱うときは、適切なバイオセキュリティーおよび封じ込め措置を適用しなければならない。
【０２０３】
１．１．２  主醗酵
全実験を、作業体積が０．５、２または２０Ｌの、コンピュータ制御のファーメンター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）中で行ったが、それぞれを０．５、１または１０Ｌの濾過滅菌したＥＭＪＨ培地により充填した。標準ＥＭＪＨ培地は、ＢＳＡ１％（ｗ／ｖ）およびポリソルベート８０  ０．１２５％（ｗ／ｖ）を含んだ。培地のｐＨは、最初は７．４±０．１であった。ファーメンターを、０日において２〜４ｘ１０^７細胞／ｍｌの接種密度を与えるように、５％（ｖ／ｖ）の血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの前培養（継代５回）により接種した。レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）バイオマスの最終収量は、発酵を停止したとき培養の５ないし６日目において、典型的には約１〜２ｘ１０^９細胞／ｍｌであった。
【０２０４】
すべての醗酵実験の間、温度を約２９℃に制御した。培地をヘッドスペースの気流により通気し、設定ｐＯ２濃度を維持するために、溶存酸素（ｐＯ２）濃度を撹拌速度の自動変化によって制御した。温度、ｐＨおよびｐＯ２濃度をオンラインで制御したが、ｐＨおよび起泡は制御しなかった。
【０２０５】
比較実験において、４基までのファーメンターを平衡して稼働したが、同じ培地およびレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の接種菌液により開始した。そのとき通常は、一つのファーメンターが標準ＥＭＪＨ培地を含み対照として役立ち、一方で他のファーメンター中では多価不飽和Ｃ１８脂肪酸の種々の補給を実施した。
【０２０６】
１．１．３  リノール酸による補給
無水アルコール（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ）中の１０％（ｖ／ｖ）ストックとして、純粋なリノール酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、純度＞９９％）により補給を行った。代わりに、高レベルのリノレン酸により作成されたＢＳＡ（高ＬＡ  ＢＳＡ）を使用することによって、リノレン酸を補給した。ＥＭＪＨ培地中の標準的なＢＳＡを代替するために、またはＥＭＪＨ培地中のＢＳＡに添加するために、高ＬＡ  ＢＳＡを使用したが、その場合それは滅菌水中の２５％（ｗ／ｖ）ストック溶液として添加した。高ＬＡ  ＢＳＡまたは純粋なリノール酸／エタノールの補給剤を、ファーメンターの培養物が所望の総リノール酸を受け取るまで、０．１〜０．２ｍｌ／時間で４時間の過程にわたりファーメンターに供給した。リノール酸の、総量における５ないし４２５μｇ／ｍｌの間の、種々の総利用可能レベルを試験した。レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）のファーメンターの培養物を、異なる細胞密度、すなわち初期‐、中期‐、後期培養において補給した。典型的な中期の細胞密度は、約５ｘ１０^８細胞／ｍｌであり、主培養の２日の間に達せられた。エタノールストック中の純粋なリノール酸由来のリノール酸による補給の際に、時々わずかなｐＨの低下が認められたが、ＮａＯＨを適用することによって修正した。
【０２０７】
１．１．４  試料採取およびオフライン分析
培養培地中の総細胞数（血球計算盤による）；抗原マス（抗原量（検出）Ｅｌｉｓａによる）；不活化細胞；および脂肪酸型のプロファイリングおよび脂肪酸型の相対含量（ガスクロマトグラフィーによる）の分析のために、試料５ｍｌを毎日ファーメンターから直接無菌的に取り出した。
【０２０８】
試料を、０．１または０．２％のＢＰＬにより、２９℃で１６〜２４時間不活性化した。不活化レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）を２４時間以内に抗原（検出）Ｅｌｉｓａにおいて試験した。
【０２０９】
１．２  抗原（検出）Ｅｌｉｓａ
レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）ＬＰＳ抗原の抗原マスを、血清群または血清型特異的、凝集性、マウスモノクローナル抗体（ｍｏａｂｓ）のセットに基づく抗原（検出）Ｅｌｉｓａにおいて測定したが、当該抗体は：ＷＨＯ／ＦＡＯ／ＯＩＥ  ａｎｄ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ（レプトスピラ症に関する基準・研究のＷＨＯ／ＦＡＯ／ＯＩＥおよび国の基準・研究共同センター），Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｒｏｙａｌ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（王立熱帯研究所生物医学部門），Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手した。使用したｍｏａｂｓを表２に記載した。参考として：Ｒ．Ａ．Ｈａｒｔｓｋｅｅｒｌ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  ｌａｂｏａｔｏｒｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ（レプトスピラ症診断のための実験方法に関する国際課程），４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（第４版），１  Ａｐｒｉｌ  ２００４．Ｒｏｙａｌ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（国立熱帯研究所），Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）を参照されたい。
【０２１０】
Ｅｌｉｓａを捕捉アッセイとして準備し、被覆および検出用に同じｍｏａｂを使用した。
【０２１１】
2016504028.tif 000003
１．２．１  被覆のためのモノクローナル抗体の調製
抗原（検出）Ｅｌｉｓａにおける使用のためのｍｏａｂは、腹水または細胞培養物由来であり得た。双方の型を、標準的な非クロマトグラフィー法によって使用前に精製した。つまり：アルブミンおよび他の非‐ＩｇＧタンパク質を、カプリル酸により沈殿させた。次にＩｇＧ画分を硫酸アンモニウムにより沈殿させた。この方法により、陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製されるＩｇＧと同等の純度を有する、ＩｇＧの８０％以上を単離することが可能であった。
【０２１２】
代わりにｍｏａｂを、プロテインＧカラムクロマトグラフィーによって精製し得た。
【０２１３】
１．２．２  標識モノクローナル抗体の調製
抗原（検出）Ｅｌｉｓａのホースラディッシュペルオキダーゼ（ＨＲＰ）‐ＩｇＧのために、標準的手順を使用して、標識体をｍｏａｂから調製した。基本的に反応は、アルデヒド基を形成するＨＲＰ酵素による炭水化物残基の過ヨウ素酸酸化を含み、その後アルデヒド基はモノクローナルＩｇＧ分子上の遊離アミノ基と反応した。
【０２１４】
１．２．３  抗原量標準試料の調製
標準試料を、抗原（検出）Ｅｌｉｓａによって試験された各々のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）株に対して調製した。標準は、不活化細胞由来の一価のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）抗原のバッチである。これは、慣用技術を使用して、本質的に上記の通りレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の特定の菌株をＥＭＪＨ培地にいて増殖することによって、および以前述べた通り不活性化することによって調製される。次に標準を、約１ｘ１０^９細胞／ｍｌ含むように、濃縮および／または希釈する。任意の抗原単位数、例えば：１０００単位／ｍｌを試料に添付した。標準品が補充を必要としたとき、同じ標準品のその後の調製品は、置き換える前に古い標準品と一緒に数回比較し滴定した。
【０２１５】
１．３  脂肪酸分析
脂肪酸組成および含量を、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細胞、培養培地成分の試料、および完全ＥＭＪＨ培養培地試料によって、周知の手順に従って分析した。脂肪酸の抽出を、Ｂｌｉｇｈ  ＆  Ｄｙｅｒ（１９５９，Ｃａｎ．Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，ｖｏｌ．３７，ｐ．９１１）およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ＆  Ｓｍｉｔｈ（１９６４，Ｊ．ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．５，ｐ．６００）によって公表された通りに行った。要するに：純粋な完全培養培地、またはレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細胞（０．５ｍｌ当たり１ｘ１０^９と１ｘ１０１^０の間；細胞をＢＰＬで不活性化した）、または１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ水希釈試料の水希釈試料を含む、０．５ｍｌの試料を分析した。この０．５ｍｌを、メタノール１ｍｌおよびクロロホルム２ｍｌにより３分間混合することによって抽出した。水０．５ｍｌを別に添加し、３０秒間混合し、試料を１，０００×ｇ、２〜８℃で１０分間遠心分離した。２ｍｌのクロロホルム（下）相をガラス製バイアルに移し、クロロホルムをＮ２ガス気流下で蒸散した。乾燥脂質をＢＦ３メタノール溶液の０．６ｍｌに再溶解し、９５℃で１５分間加熱して、脂肪酸をメチル化した。次に水０．３ｍｌおよびヘキサン０．３ｍｌを添加し、これを振盪により混合し、その後ヘキサン（上）相を、抽出物中の脂肪酸のプロファイルおよび相対含量の分析のために、標準的なガスクロマトグラフィー装置に移行した。内部標準として、既知濃度のＣ２１：０脂肪酸（ヘンイコシル酸）の試料を使用した。通常、試料を繰り返し測定し、試料をガラス容器の中で調整し測定した。
【０２１６】
２．先行技術の増殖条件の比較
比較例として、標準的な先行技術の条件下（従って無補給）でのレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)の回分培養における抗原マスの形成を分析した。血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅのレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)を、ポリソルベート８０（Ｃｒｏｄａ）および標準的な市販ＢＳＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含む、標準的なＥＭＪＨ培地において培養した。数回の前培養後に、主ファーメンターの培養液に接種し、５ないし６日間培養した。血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅのレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)にとって、これらの増殖条件において得られる抗原マスは、培養が定常期であったときの３〜５日の平均として、通常１×１０^９細胞当たり５００ないし７００（血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの）抗原単位の間であった。
【０２１７】
レプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)抗原の当該バッチを内製のインビトロでの効力試験において試験したとき、必要とされる最小限の効力レベルに達しえなかった。
【０２１８】
この問題は、ＥＭＪＨ培地中で、レプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)培養のために特に推奨された市販ＢＳＡ：ＢｏｖｏＬｅｐ（登録商標）ＢＳＡ（Ｂｏｖｏｇｅｎ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用することによっては解決されなかった。次いでこれを、同じ製造者製の標準的な汎用ＢＳＡであるＢｏｖｏＳｔａｒ（登録商標）で試験し、次いで、以前使用したＢＳＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で試験した。結果を表３に示す。「ｎａ」は：該当なしを示す。
【０２１９】
興味深いことには、宣伝通りにＢｏｖｏＬｅｐ（登録商標）は、レプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)のバイオマスを増加させたが、しかしその抗原マスに関しては顕著な効果を有さなかった。これは、今日までのレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)増殖に対する古典的なアプローチ法：バイオマスレベルに対する集中を象徴する。
【０２２０】
2016504028.tif 000004
３．多価不飽和Ｃ１８脂肪酸の効果
３．１リノール酸
より多くのリノール酸（Ｃ１８：２）がレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)培養物に利用可能とされたときのみ、抗原マスが増加した。
【０２２１】
標準的なＥＭＪＨ培地は、上の試験および記載の通り、約５μｇ／ｍｌのリノール酸を提供することが見出だされた（表３を参照されたい）。標準的な１％のＢＳＡは、ガスクロマトグラフィーの検出限界に近い１μｇ／ｍｌ未満のリノール酸しか供給しなかったので、これは、主に０．１２５％のポリソルベート８０に由来した。
【０２２２】
この点においてポリソルベート８０は、薬局方が定義するように、リノール酸をその脂肪酸の最大限１８％まで含むことが許される。しかしながら実際には、はるかに少なく典型的には１．５％未満しか保有しないことが見出だされた。一つの普通の種類のポリソルベート８０（種類：植物グレード、販売元：Ｃｒｏｄａ，Ｆｒａｎｃｅ）に基づき、発明者らは、数年にわたる４８バッチ由来のリノール酸含量を比較し、リノール酸の平均含量が総脂肪酸の約０．３％（ｗ／ｗ）であることを見出した。ポリソルベート８０が基本的に脂肪酸から構成されると仮定すれば、ＥＭＪＨ培地において使用される０．１２５％のポリソルベート８０は、約４μｇ／ｍｌのリノール酸を培地に供給する。
【０２２３】
増加された量のリノール酸を含むＢＳＡを作成した。ＥＭＪＨ培地におけるこの高ＬＡ  ＢＳＡの１％での使用は、レプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)培養物に約２１μｇ／ｍｌのリノール酸を供給した；ポリソルベートの寄与により、当該培養培地はレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)のファーメンターの培養物に２５μｇ／ｍｌのリノール酸を供給した。この利用可能なリノール酸量の増加は、レプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)抗原の産生を、１６３６抗原単位／１×１０^９細胞（３〜５日目の平均）へと強力に増加させた。
【０２２４】
次のように発明者らは、発明者らの発見の有用性を証明した：５μｇ／ｍｌの代わりに２５のリノール酸によりレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)培養物を補給したとき、レプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)培養物の抗原マスは、１２４％増加させることができた。
【０２２５】
図１および２は、ＥＭＪＨ培地で高ＬＡ  ＢＳＡを使用するリノール酸補給により増殖しているレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)培養物からの毎日の試料の分析結果を表す。図１においてバイオマス（左の縦軸）は、増殖の全六日にわたり安定した増加を示した。抗原量（右の縦軸）は、培養培地において標準的なＢＳＡを使用して得られたよりも高いレベルに達した。それにも関わらず抗原マスは、三日目以降はあまり増加しなかった。図２は、これについてリノール酸の関連性を明確に証明する、この培養物由来の培地の脂肪酸プロファイルにおける、理由を示す；結果は総脂肪酸の％（ｗ／ｗ）である。Ｃ１６：０（パルミチン酸）、Ｃ１８：０（ステアリン酸）およびＣ１８：１（リノール酸）のレベルは左の縦軸、一方でＣ１８：２（リノール酸）のレベルは右の縦軸に関係づけられることに留意されたい。
【０２２６】
図２は、ポリソルベート８０由来のＣ１８：１が総脂肪酸量の大部分となる、培養の過程にわたる培養培地において本質的に変化しなかった、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０およびＣ１８：１の脂肪酸量を示す。しかしながら、Ｃ１８：２のレベルは、最初の３日にわたり急激に降下し、３〜５日目には検出限界（０．３％以下）未満である。リノール酸の枯渇は、図１に示す通り抗原産生における増加の減少と一致する。
【０２２７】
３．２リノレン酸
リノレン酸（Ｃ１８：３）のアイソフォーム：アルファ‐またはガンマ‐のどちらも、ＢＳＡまたはポリソルベート８０のバッチにおいて、ガスクロマトグラフィーの検出限界（脂肪酸約０．６μｇ／ｍＬｇ／ｍｌ）を超えて検出され得なかった。従って標準的な完全ＥＭＪＨ培養培地は、意味あるいかなる量のＣ１８：３も含まない。結果として、レプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)培養物へのリノレン酸の補給を試験した実験において、培養物で利用されたリノレン酸のすべては、基本的に別個の添加によって培養物に補給されたリノレン酸に由来した。
【０２２８】
４．レプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)培養物へのリール酸のさらなる補給
もしリノール酸をさらに補給するならば、抗原マスはさらに増加するであろう。
【０２２９】
上記と同様の培養物においてリノール酸を、エタノールに希釈した純粋なリノール酸により、２日目、指数増殖中期において補給した。培養物において１００μｇ／ｍｌのリノール酸を供給するリノール酸量を添加した。図３の脂肪酸プロファイリングが示す通り、最初の急速な減少および２日目の補給から生じる明確な急上昇の後に、リノール酸レベルは、培養の継続につれて再度着実に減少した。Ｃ１６：０およびＣ１８：１脂肪酸のレベルを内部標準として分析したが、これらは予想通り大部分変化しなかった。
【０２３０】
血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ由来のレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)に対する本実験において産生された抗原マスは、１７６７抗原単位／１×１０^９細胞（３〜５日の平均）であった。
【０２３１】
５．異なる補給条件による比較培養
以前の実施例での同じ装置のより精巧な実験において、血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ由来のレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)と比較してのファーメンター培養を並列して行ったが、ここでリノール酸（Ｃ１８：２）補給の異なる条件を比較した。リノール酸補給の効果を強調するために、ＥＭＪＨ培地において標準的なＢＳＡを使用した。いくつかのファーメンターにおいてリノール酸を、エタノール中の純粋形態で、または高ＬＡ  ＢＳＡの溶液の添加によるＢＳＡの複合体として、指数増殖中期に補給した。
【０２３２】
補給したリノール酸量は、５０、７５および１５０μｇ／ｍｌであった。表４はまた、培養物に利用できる総リノール酸量を記載する。
【０２３３】
全ファーメンターについて、細胞および培地の試料を毎日採取し、分析した。結果を図４および５、および下の表４に示す。抗原量は、培養物の３〜５日に対する平均に基づく。同様に、異なる補給に対する抗原マスにおける相対増加を、標準的なＢＳＡを有する非補給培養物に対するパーセンテージとして表した。用語「非補給」とは、ＥＭＪＨ中で標準的なＢＳＡを用いた培養物を表す。
【０２３４】
2016504028.tif 000005
表４、および対応する図４（バイオマス）および５（抗原量）のグラフから明らかな通り、培養物をリノール酸により補給すると、非補給培養においては観察されない、レプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)における抗原マスの急激かつ顕著な増加がある。リノール酸の補給に際してバイオマスにおけるある程度の増加が生ずるが、しかし抗原マスにおける増加は、それを顕著に上回っている。抗原マスにおける増加は、培養物が１５０μｇ／ｍｌにより補給されるとき、７５μｇ／ｍｌによる補給と比較して若干高い。しかしながら、リノール酸を純粋形態で補給したとき、またはＢＳＡとの複合体として補給したときの間に大きな差はなかった。おそらく、これは抗原マスの増加と毒性の間のトレードオフ（取引）である。
【０２３５】
さらなる好ましい効果が、図５より推定され得る：増加された抗原マスが、リノール酸の補給により今や非常に迅速に達し得る。例えば、図５は、リノール酸の補給により高い抗原マスが、補給から数時間以内に達せられることを示す。
【０２３６】
同様に、最終的に得られた最大抗原マスレベルを比較するとき、補給培養物を以前と同じ期間培養する場合、そのときはかなり増加された量の抗原マスを得ることができるであろう。
【０２３７】
６．異なる血清群のレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)におけるリノール酸の補給効果の比較
次の研究において、リノール酸（Ｃ１８：２）による補給の際の抗原マスにおける増加は、レプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)における一般的な現象であることが確認された。いくつかの実験において、いくつかの血清群由来のレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)株の培養物を、以前と同様の装置のファーメンターにおいてかつ同様の補給により増殖した：ＥＭＪＨ培地においては、標準的ＢＳＡまたは高ＬＡ  ＢＳＡによる補給である；いくつかの培養物を、エタノール中の純リノール酸由来の１００μｇ／ｍｌのリノール酸によりさらに補給した。バイオマスおよび抗原量の分析結果を、図６〜７（Ｓｅｊｒｏｅ）、および８〜９（Ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）に示し、表５に要約する。
【０２３８】
血清群Ｓｅｊｒｏｅ（血清型Ｈａｒｄｊｏ）由来のレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)にとって、高ＬＡ  ＢＳＡ培養培地の１００μｇ／ｍｌのリノール酸による補給は、目覚ましい１８４％の抗原マスの増加をもたらした。補給後にバイオマスのいくらかの増加が観察されたが、抗原量における増加は、はるかに高かった。ファーメンターを６日間稼働し、これらの実験のスコアを培養の５および６日にわたり平均した。
【０２３９】
血清群Ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｓａに対し、スコアを培養の４および５日にわたり平均した。リノール酸による補給の結果として生じた６３％の増加が、抗原マスにおいて観察された。
【０２４０】
同様に血清群Ａｕｓｔｒａｌｉｓ（血清型Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）に対し、４５％の抗原マスにおける増加が観察された；ここで補給には低ＬＡ  ＢＳＡを使用した。
【０２４１】
2016504028.tif 000006
６．１．レプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)血清群Ｔａｒａｓｓｏｖｉの補給
上の実施例６に記載の補給と同様の補給において、標準的なＢＳＡを含むＥＭＪＨ培地におけるレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)血清群Ｔａｒａｓｓｏｖｉの培養物のバイオマスおよび抗原マスへの異なる量のＣ１８：２脂肪酸による補給の効果を試験した。結果を、図１１および１２に示す。
【０２４２】
３００μｇ／ｍｌのＣ１８：２による補給が本培養に対して毒性のあることが判明したのに対して、１００または２００μｇ／ｍｌのＣ１８：２による補給は、抗原マスにおいてバイオマス単位当たり強力な増加：非補給の対照の培養物と比較してそれぞれ６７％、９９％を生じさせた。
【０２４３】
７．最大補給レベル
一つの研究において、リノール酸（Ｃ１８：２）補給の最大レベルを検討した：血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ由来のレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)を、高ＬＡ  ＢＳＡを含むＥＭＪＨにおいて培養し、リノール酸エタノール中の純リノール酸由来の追加のリノール酸１００、２００または４００μｇ／ｍｌにより補給した。結果より、４００μｇ／ｍｌの添加は、補給後に細胞数が急激に減少したので、細菌に対し毒性を誘発したことが明らかであった。それ故に、同様に高レベルのリノール酸、ただしリノール酸により飽和しておいたＢＳＡとの複合体でのリノール酸由来を補給することによって、この実験を繰り返すであろう。１００μｇ／ｍｌ補給群の刺激効果は、前に観察された通りであったが、一方で２００μｇ／ｍｌ群は、１００μｇ／ｍｌ群の抗原マスの増加と比較して、やや少ない増加であった。
【０２４４】
従って、これらの条件において純粋なリノール酸による補給は、２５ないし２５０μｇ／ｍｌの間のリノール酸がレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)の培養物に利用できるとき、最適であると思われる。
【０２４５】
８．補給時点
更なる実験において、レプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)培養物の補給の時点の妥当性を究明した。血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅのレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)を使用して試験した補給時点は、初期‐、中期‐および後期指数増殖期であった。標準的なＢＳＡを含むＥＭＪＨ培地を、エタノール中の純リノール酸１００μｇ／ｍｌにより補給した。これらの培養物に利用できる総リノール酸量は、それ故に１０５μｇ／ｍｌであった。
【０２４６】
結果を表６および図１０に示した。図１０が明示する通り、補給の２，４および８時間後に既に急激な上昇を伴って、抗原マスにおける激しい増加が、レプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)培養物のすべての期間において誘導され得る。この時間の尺度ゆえに、増加という結果は、主に生化学的プロセスに起因し、増殖にはあまり起因しない。
【０２４７】
産生される抗原の量が、補給をより遅く行うときにより少ないと見える事実は、リノール酸補給がバイオマスに関して有するやや正の効果に由来する。これは、抗原マスを標準細胞量当たりで表すとき、平均化される。表６を参照されたい。
【０２４８】
2016504028.tif 000007
さらなる時点：収集後、洗浄後および濃縮後、における補給試験を継続して検討している。終期の培養物の培養は、培地の回復調製を必要とするかもしれない；終期の培養物の補給が最も好ましいと推定されるにしても、その段階において細胞は多数であり、未だ抗原マスの形成が可能だからである。さらにこの段階において、補給リノール酸の任意の残存毒性が細胞の増殖能を妨げるかどうかは、増殖能がもはや要求されないので、あまり関係しない。
【０２４９】
９．補給レプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)培養物から調製されたワクチンの改良された免疫能の究明
リノール酸により補給したレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)培養物を、上記の通り産生した。これらを、当該技術分野において周知の通り、不活性化、アジュバント化したレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)ワクチンに製剤化し、薬局方モノグラフに規定される通りインビボでの実験において試験する。血清応答、攻撃感染防御およびワクチン接種の副反応のレベルの影響をモニターする。
【０２５０】
レプトスピラ症ワクチンに対して、抗原マスと免疫防御能の相互関係が周知であるので、従前よりも高い抗原マスを有するバクテリンワクチンはまた、より高いレベルの免疫防御を誘導し得ることを、確信を持って予測し得る。
【０２５１】
同様に、レプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)バクテリンワクチンのタンパク質負荷は、ワクチン接種の副作用の原因作用として明確に関係しているので、レプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)バクテリンワクチンが、副作用を誘発することは少ないが、同等または改良された免疫化を誘導することも予測し得る。
【０２５２】
１０  リノレン酸によるレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)培養物の補給
アルファ‐またはガンマ‐リノール酸（Ｃ１８：３）によるレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)培養物の補給を、基本的にリノール酸（Ｃ１８：２）による補給に対し上記した通り行った。実施例が、他に優って多価不飽和Ｃ１８脂肪酸の一形態に対する特別の好みを示す、特別のレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)であった以外は、結果はまた大部分は同等である。
【０２５３】
単位バイオマス当たりの抗原マスを、レプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)の培養物が定常期にあった日々にわたり、また同様の方法で計算した；典型的にこれは接種の３‐４‐５日後においてであり、時折およびある血清群に対しては、培養の４‐５‐６日後であった。以前の通り、Ｅｌｉｓａによる平均抗原マススコアを、１×１０^９細胞当たりで計算した（前‐不活性化）。抗原マスにおける相対増加を、補給を受けなかった対照培養物と比較して計算した。対照培養物の平均抗原マス／１×１０^９細胞を、０％増加と設定した。
【０２５４】
Ｃ１８：３によるレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)培養物の補給に関する全実験において、標準的なＢＳＡ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）およびポリソルベート８０（Ｃｒｏｄａ）を使用してＥＭＪＨを調製した。述べた通り、当該ＥＭＪＨ培地それ自身、無視できる量のＣ１８：３を含んでいた。
【０２５５】
アルファ‐およびガンマＣ１８：３の双方は、純粋な化学品（＞９８％）を購入した。補給直前に、培養物に添加される予定であったＣ１８：３量に依存して、Ｃ１８：３を無水エタノール中で１０％ないし２０％（ｖ／ｖ）に希釈した。このエタノール希釈液を、４時間の期間にわたり分割して、５回分の添加によりレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)培養物に添加した。
【０２５６】
１０．１  レプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)培養物におけるリノレン酸の消費
実施例４および図１〜３においてＣ１８：２に対し記載することに即して、補給の有無によるＣ１８：３の消費を検討した。ＥＭＪＨ培地におけるレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの培養物に対する結果を、図１３および１４に示す。これらの培養物の標準的なバイオマスの増殖は、図１に示した増殖と類似した。
【０２５７】
図１３は、非補給培養物中の主な脂肪酸の相対量のプロファイルを示す：Ｃ１６：０およびＣ１８：１、これらは左側の縦軸に対して示すが、培養物が増殖しているときでさえ、比較的に一定のままである。Ｃ１８：２およびＣ１８：３の量は右側の縦軸に対し示す：３日目に、Ｃ１８：２のレベルは既に消尽されて、Ｃ１８：３‐アルファは着実に低下し、５日目から消尽される。
【０２５８】
図１４は同様のプロファイルを示すが、しかし２００μｇ／ｍｌアルファＣ１８：３により接種３日後に補給した培養物に関するものである。この図においてすべての脂肪酸相対量を、左側の縦軸に基づいて示す。図に示すように、アルファＣ１８：３の補給は、試料採取時点の３．３日におけるＣ１８：３の明確に検出可能なレベルをもたらす。その後の日々に、この量は着実に消費され、再度５日において消尽される。抗原マスの相当する増加を、図１６、１８および２０に示す。
【０２５９】
１０．２  異なる量のＣ１８：３の補給の効果
実施例５、および図４および５においてＣ１８：２に対し記載するものとの比較で、ＥＭＪＨ培地中のレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの培養物を、異なる量のＣ１８：３、アルファ‐リノレン酸（アルファＣ１８：３）またはガンマ‐リノレン酸（ガンマＣ１８：３）、により補給した。結果を図１５〜２０に示す。
【０２６０】
これらのすべての結果において明らかな通り：リノレン酸による補給は、レプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)培養物における、バイオマス単位当たりの抗原マスにおける正味の増加を生じながら、バイオマスの増加を遥かに超える抗原マスの増加を誘発する。
【０２６１】
図１５および１６は、１００、２００、３００または４００μｇ／ｍｌのアルファＣ１８：３による補給の、バイオマスおよび抗原マスに関する効果を示す。３００または４００μｇ／ｍｌの補給は、明らかに培養に関し毒性のある効果を有した。他の量については、１００μｇ／ｍｌのアルファＣ１８：３は、２００μｇ／ｍｌのアルファＣ１８：３：８１％よりも、抗原マスにおけるやや良好な増加：１２２％を与えた。
【０２６２】
図１７および１８は、２００、３００または４００μｇ／ｍｌのガンマＣ１８：３による補給の、バイオマスおよび抗原マスに関する効果を示す。４００μｇ／ｍｌの量だけが毒性を示したので、明らかにガンマＣ１８：３は、アルファＣ１８：３よりもＩｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ培養物によってより許容された。
【０２６３】
２００μｇ／ｍｌのガンマＣ１８：３による補給は、３００μｇ／ｍｌのガンマＣ１３：３による補給よりも抗原マスにおいてやや低い増加：１１４％対１５３％を与えた。
【０２６４】
図１９および２０は、等量のアルファ‐またはガンマＣ１８：３の、ＥＭＪＨ培地におけるレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)血清型Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの培養物の、バイオマスおよび抗原マスに対する効果の比較を示す。１００μｇ／ｍｌのアルファＣ１８：３による補給は、相対抗原マスにおいて、１００μｇ／ｍｌのガンマＣ１８：３が誘発したよりも大きな増加：１２２％対１７０％を誘発した。
【０２６５】
このことは、血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅレプトスピラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ)のアルファ異性体Ｃ１８：３に対する嗜好性を示す。
【０２６６】
１０．３  他のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群のＣ１８：３補給の効果
実施例６、および図６〜９および１１〜１２においてＣ１８：２に対し記載するものとの比較で、リノレン酸による補給による抗原マスに関する効果を、Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ以外の血清群のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）についても試験した。血清群Ａｕｓｔｒａｌｉｓ（血清型Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）、Ｔａｒａｓｓｏｖｉ、Ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、ＰｏｍｏｎａまたはＣａｎｉｃｏｌａの特定の培養物において、１００または２００μｇ／ｍｌのアルファＣ１８：３、または１００μｇ／ｍｌのガンマＣ１８：３による補給によって試験した。結果を、図２１〜３２、および表７および８に示す。
【０２６７】
2016504028.tif 000008
血清群Ａｕｓｔｒａｌｉｓ、ＴａｒａｓｓｏｖｉおよびＧｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａのレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）は、一般的にＣ１８：３のどちらの異性体にも強い嗜好性を有さないことが特筆された。しかしながら血清群Ｐｏｍｏｎａは、強い嗜好性、つまりガンマＣ１８：３に対する嗜好性を有した；その抗原マス産生は、アルファＣ１８：３が補給されたとき、対照培養物さえよりも少なかった。
【０２６８】
Ｃｏｎｉｃｏｌａは、抗原マスにおける相対増加を示す前に、高含量の脂肪酸を要求するように（それぞれに対し：許容可能であった）思われたので、血清群Ｃａｎｉｃｏｌａのレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）（菌株  ２８０５０３）を、若干量のアルファ‐およびガンマＣ１８：３により試験した。結果を、図２９〜３２、および表８に示す。
【０２６９】
2016504028.tif 000009
１０．４  Ｃ１８：３の最大補給レベル
実施例７においてＣ１８：２に対し記載するものとの比較で、補給されるＣ１８：３の量の効果は、実際問題としてそのレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）にたいする細胞毒性によって制限されるようにみえる。血清群Ｃａｎｉｃｏｌａは、いくぶん高いレベルのＣ１８：３補給を許容するように思われたが、他のほとんどの血清群は、Ｃ１８：３の２００μｇ／ｍｌ以上で細胞毒性を示した。Ｃ１８：３のアルファ‐またはガンマ異性体由来の細胞毒性に関して、明確な差異は認められなかった。
【０２７０】
１０．５  Ｃ１８：３の補給時点
実施例８、および図１０おいてＣ１８：２に対し記載するものとの比較で、ＥＭＪＨ培地のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの培養物の補給の効果を、アルファ‐またはガンマＣ１８：３により培養の異なる時点において試験した。結果を図３３〜３６に示す。
【０２７１】
図３３および３４は、アルファＣ１８：３による、１、５または８×１０^８細胞／ｍｌにおける補給の結果を示す。認められた抗原マスの相対増加は：それぞれ１６３、１６４および１４０％であった。
【０２７２】
図３５および３６は、ガンマＣ１８：３による、２、５または８×１０^８細胞／ｍｌにおける補給の結果を示す。認められた抗原マスの相対増加は：それぞれ７１、８１および１６２％であった。
【０２７３】
結果として、Ｃ１８：３による補給のタイミングの効果は、補給の時の細胞濃度の関数としてそれほど重要ではないと思われる。低い培地細胞濃度で適用したとき、アルファＣ１８：３による補給は抗原マスの最も高い増加を与えたが、一方で高い細胞濃度で適用したときに、ガンマＣ１８：３は最も高い増加を与えた。
【０２７４】
１０．６  異なる多価不飽和Ｃ１８脂肪酸の併用補給
驚いたことに、多価不飽和Ｃ１８脂肪酸はまた、補給において併用され得て、それから累積的な効果を引き起こすことが認められた。これを、ＥＭＪＨ培地中のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの培養物に関して試験したが、当該培地を、１００μｇ／ｍｌのＣ１８：２により、または１００μｇ／ｍｌのアルファＣ１８：３により、または５０μｇ／ｍｌのＣ１８：２および５０μｇ／ｍｌのアルファＣ１８：３の併用により補給した。併用の脂肪酸を、４時間の過程にわたる５回の添加において、別々の１０％エタノール希釈液として、二つの脂肪酸を実用的に同時に添加することによって、培養物に供給した。
【０２７５】
得られた相対抗原マスの増加は：それぞれ７７％、１４４％および１１８％であった。結果を図３７および３８に示す。
【０２７６】
驚くべきことに、Ｃ１８：２とＣ１８：３の併用による補給によって得られた抗原マスの増加は、個々の補給の相対増加の算術平均（１１１％）に極めて近い、
抗原マスの相対増加のレベル（１１８％）を引き起こした。
【図面の簡単な説明】
【０２７７】
【図１】高ＬＡ  ＢＳＡを含むが、それ以上は補給されなかったＥＭＪＨ培地中の血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ由来のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の培養物に関する、経時的なバイオマスおよび抗原Ｅｌｉｓａの結果。
【図２】図１に示す培養物の培養培地における脂肪酸プロファイルの分析結果。
【図３】高ＬＡ  ＢＳＡを含むＥＭＪＨ中での血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ由来のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の培養物由来の培養培地の脂肪酸プロファイルであり、ここで培養物を２日目に、５×１０^８細胞／ｍｌの細胞密度において１００μｇ／ｍｌのリノール酸により補給した。
【図４】標準的なＢＳＡを含むＥＭＪＨ培地中で増殖された、血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ由来のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の異なる培養物からの、それぞれバイオマスおよび抗原量の測定結果；対照培養物として補給しないか、またはリノール酸により補給した：一つはエタノール中の純リノール酸由来のリノール酸７５μｇ／ｍｌにより補給；一つは同様にエタノール中の純リノール酸由来の１５０μｇ／ｍｌにより補給、ならびに一つはＢＳＡ複合リノール酸としてのリノール酸５０μｇ／ｍｌにより補給した。
【図５】標準的なＢＳＡを含むＥＭＪＨ培地中で増殖された、血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ由来のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の異なる培養物からの、それぞれバイオマスおよび抗原量の測定結果；対照培養物として補給しないか、またはリノール酸により補給した：一つはエタノール中の純リノール酸由来のリノール酸７５μｇ／ｍｌにより補給；一つは同様にエタノール中の純リノール酸由来の１５０μｇ／ｍｌにより補給、ならびに一つはＢＳＡ複合リノール酸としてのリノール酸５０μｇ／ｍｌにより補給した。
【図６】高ＬＡ  ＢＳＡを含むＥＭＪＨ培地中で増殖された、血清群Ｓｅｊｒｏｅ（血清型Ｈａｒｄｊｏ）由来のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の異なる培養物からの、それぞれバイオマスおよび抗原量の測定結果；培養物を、対照培養物として補給しないか、またはエタノール中の純リノール酸由来の１００μｇ／ｍｌのリノール酸により補給した。
【図７】高ＬＡ  ＢＳＡを含むＥＭＪＨ培地中で増殖された、血清群Ｓｅｊｒｏｅ（血清型Ｈａｒｄｊｏ）由来のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の異なる培養物からの、それぞれバイオマスおよび抗原量の測定結果；培養物を、対照培養物として補給しないか、またはエタノール中の純リノール酸由来の１００μｇ／ｍｌのリノール酸により補給した。
【図８】高ＬＡ  ＢＳＡを含むＥＭＪＨ培地中で増殖された、血清群Ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ由来のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の異なる培養物からの、それぞれバイオマスおよび抗原量の測定結果；培養物を、対照培養物として補給しないか、またはエタノール中の純リノール酸由来の１００μｇ／ｍｌのリノール酸により補給した。
【図９】高ＬＡ  ＢＳＡを含むＥＭＪＨ培地中で増殖された、血清群Ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ由来のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の異なる培養物からの、それぞれバイオマスおよび抗原量の測定結果；培養物を、対照培養物として補給しないか、またはエタノール中の純リノール酸由来の１００μｇ／ｍｌのリノール酸により補給した。
【図１０】レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の培養物を、異なる増殖段階において補給する時の、抗原マスにおける増加への効果。血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ由来のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）を標準的なＥＭＪＨ培地中で培養し、初期、中期または後期において、１００μｇ／ｍｌのリノール酸により補給した。初期の試料採取は、補給の２、４および８時間後であった。
【図１１】標準的なＥＭＪＨ培地中の、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｔａｒａｓｓｏｖｉの培養物のバイオマスおよび抗原マスに関する、異なる量のリノール酸による補給の効果。
【図１２】標準的なＥＭＪＨ培地中の、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｔａｒａｓｓｏｖｉの培養物のバイオマスおよび抗原マスに関する、異なる量のリノール酸による補給の効果。
【図１３】ＥＭＪＨ培地中のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの、培養物における相対脂肪酸含量の経時的なプロファイル。非補給培養物；注：Ｃ１８：２およびＣ１８：３レベルを右側の縦軸に対して示す。
【図１４】ＥＭＪＨ培地中のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの、培養物における相対脂肪酸含量の経時的なプロファイル。２００μｇ／ｍｌのアルファＣ１８：３により補給した培養物。
【図１５】ＥＭＪＨ培地中のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの培養物のバイオマスおよび抗原マスに関する、異なる量のアルファ‐またはガンマＣ１８：３による補給の効果。
【図１６】ＥＭＪＨ培地中のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの培養物のバイオマスおよび抗原マスに関する、異なる量のアルファ‐またはガンマＣ１８：３による補給の効果。
【図１７】ＥＭＪＨ培地中のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの培養物のバイオマスおよび抗原マスに関する、異なる量のアルファ‐またはガンマＣ１８：３による補給の効果。
【図１８】ＥＭＪＨ培地中のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの培養物のバイオマスおよび抗原マスに関する、異なる量のアルファ‐またはガンマＣ１８：３による補給の効果。
【図１９】ＥＭＪＨ培地中のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの培養物のバイオマスおよび抗原マスに関する、異なる量のアルファ‐またはガンマＣ１８：３による補給の効果。
【図２０】ＥＭＪＨ培地中のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの培養物のバイオマスおよび抗原マスに関する、異なる量のアルファ‐またはガンマＣ１８：３による補給の効果。
【図２１】ＥＭＪＨ培地中の異なる血清群由来のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の培養物のバイオマスおよび抗原マスに関する、異なる量のアルファ‐またはガンマＣ１８：３による補給の効果。レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ａｕｓｔｒａｌｉｓ（血清型Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）の培養物。
【図２２】ＥＭＪＨ培地中の異なる血清群由来のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の培養物のバイオマスおよび抗原マスに関する、異なる量のアルファ‐またはガンマＣ１８：３による補給の効果。レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ａｕｓｔｒａｌｉｓ（血清型Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）の培養物。
【図２３】ＥＭＪＨ培地中の異なる血清群由来のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の培養物のバイオマスおよび抗原マスに関する、異なる量のアルファ‐またはガンマＣ１８：３による補給の効果。レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｔａｒａｓｓｏｖｉの培養物。
【図２４】ＥＭＪＨ培地中の異なる血清群由来のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の培養物のバイオマスおよび抗原マスに関する、異なる量のアルファ‐またはガンマＣ１８：３による補給の効果。レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｔａｒａｓｓｏｖｉの培養物。
【図２５】ＥＭＪＨ培地中の異なる血清群由来のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の培養物のバイオマスおよび抗原マスに関する、異なる量のアルファ‐またはガンマＣ１８：３による補給の効果。レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａの培養物。
【図２６】ＥＭＪＨ培地中の異なる血清群由来のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の培養物のバイオマスおよび抗原マスに関する、異なる量のアルファ‐またはガンマＣ１８：３による補給の効果。レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａの培養物。
【図２７】ＥＭＪＨ培地中の異なる血清群由来のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の培養物のバイオマスおよび抗原マスに関する、異なる量のアルファ‐またはガンマＣ１８：３による補給の効果。レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｐｍｏｎａの培養物。
【図２８】ＥＭＪＨ培地中の異なる血清群由来のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の培養物のバイオマスおよび抗原マスに関する、異なる量のアルファ‐またはガンマＣ１８：３による補給の効果。レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｐｍｏｎａの培養物。
【図２９】ＥＭＪＨ培地中の異なる血清群由来のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の培養物のバイオマスおよび抗原マスに関する、異なる量のアルファ‐またはガンマＣ１８：３による補給の効果。レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｃａｎｉｃｏｌａの培養物。
【図３０】ＥＭＪＨ培地中の異なる血清群由来のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の培養物のバイオマスおよび抗原マスに関する、異なる量のアルファ‐またはガンマＣ１８：３による補給の効果。レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｃａｎｉｃｏｌａの培養物。
【図３１】ＥＭＪＨ培地中の異なる血清群由来のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の培養物のバイオマスおよび抗原マスに関する、異なる量のアルファ‐またはガンマＣ１８：３による補給の効果。レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｃａｎｉｃｏｌａの培養物。
【図３２】ＥＭＪＨ培地中の異なる血清群由来のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の培養物のバイオマスおよび抗原マスに関する、異なる量のアルファ‐またはガンマＣ１８：３による補給の効果。レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｃａｎｉｃｏｌａの培養物。
【図３３】ＥＭＪＨ培地中のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの培養物の、培養の異なる時点におけるアルファ‐またはガンマＣ１８：３による補給の効果。
【図３４】ＥＭＪＨ培地中のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの培養物の、培養の異なる時点におけるアルファ‐またはガンマＣ１８：３による補給の効果。
【図３５】ＥＭＪＨ培地中のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの培養物の、培養の異なる時点におけるアルファ‐またはガンマＣ１８：３による補給の効果。
【図３６】ＥＭＪＨ培地中のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの培養物の、培養の異なる時点におけるアルファ‐またはガンマＣ１８：３による補給の効果。
【図３７】ＥＭＪＨ培地中のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの培養物のバイオマスおよび抗原マスに関する、異なる多価不飽和Ｃ１８脂肪酸による分離補給対併用補給の効果の比較。
【図３８】ＥＭＪＨ培地中のレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）血清群Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅの培養物のバイオマスおよび抗原マスに関する、異なる多価不飽和Ｃ１８脂肪酸による分離補給対併用補給の効果の比較。
【図１】
2016504028.tif 000010
【図２】
2016504028.tif 000011
【図３】
2016504028.tif 000012
【図４】
2016504028.tif 000013
【図５】
2016504028.tif 000014
【図６】
2016504028.tif 000015
【図７】
2016504028.tif 000016
【図８】
2016504028.tif 000017
【図９】
2016504028.tif 000018
【図１０】
2016504028.tif 000019
【図１１】
2016504028.tif 000020
【図１２】
2016504028.tif 000021
【図１３】
2016504028.tif 000022
【図１４】
2016504028.tif 000023
【図１５】
2016504028.tif 000024
【図１６】
2016504028.tif 000025
【図１７】
2016504028.tif 000026
【図１８】
2016504028.tif 000027
【図１９】
2016504028.tif 000028
【図２０】
2016504028.tif 000029
【図２１】
2016504028.tif 000030
【図２２】
2016504028.tif 000031
【図２３】
2016504028.tif 000032
【図２４】
2016504028.tif 000033
【図２５】
2016504028.tif 000034
【図２６】
2016504028.tif 000035
【図２７】
2016504028.tif 000036
【図２８】
2016504028.tif 000037
【図２９】
2016504028.tif 000038
【図３０】
2016504028.tif 000039
【図３１】
2016504028.tif 000040
【図３２】
2016504028.tif 000041
【図３３】
2016504028.tif 000042
【図３４】
2016504028.tif 000043
【図３５】
2016504028.tif 000044
【図３６】
2016504028.tif 000045
【図３７】
2016504028.tif 000046
【図３８】
2016504028.tif 000047
【国際調査報告】
2016504028.tif 000048
2016504028.tif 000049
2016504028.tif 000050