(57)【要約】  ７種のヒトＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインに特異的に結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、種々の炎症性／自己免疫性疾患、例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、尋常性乾癬、および掌蹠膿疱症、ならびにがん、例えば腎がんまたは卵巣がんを治療するために有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＧｒｏ−アルファ、Ｇｒｏ−ベータ、Ｇｒｏ−ガンマ、ＥＮＡ−７８、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−２、およびＩＬ−８を中和する抗体。
【請求項２】
前記抗体は、以下のアミノ酸：Ａｒｇ６、Ｉｌｅ１０、Ａｒｇ３５、Ｉｌｅ４０においてＩＬ−８（配列番号２７）に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体は、Ｌｅｕ４９においてＩＬ−８（配列番号２７）にさらに結合する、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む軽鎖であって、前記ＬＣＶＲが、ＬＣＤＲ１（ＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＨ（配列番号７））、ＬＣＤＲ２（ＹＴＳＲＳＶＳ（配列番号８））、およびＬＣＤＲ３（ＧＱＮＮＥＷＰＥＶ（配列番号９））を含む、前記軽鎖と、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む重鎖であって、前記ＨＣＶＲが、ＨＣＤＲ１（ＧＹＥＦＴＳＹＷＩＨ（配列番号１０））、ＨＣＤＲ２（ＮＩＳＰＮＳＧＳＡＮＹＮＥＫＦＫＳ（配列番号１１））、およびＨＣＤＲ３（ＥＧＰＹＳＹＹＰＳＲＸａａＹＹＧＳＤＬ（配列番号２０））（配列中、ＸａａはＥまたはＱである）を含む、前記重鎖とを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列は、配列番号４または１６でありかつ前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列は、配列番号２または配列番号１４である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が軽鎖および重鎖を含み、前記軽鎖のアミノ酸は配列番号３または１５であり、かつ前記重鎖のアミノ酸は配列番号１または１３である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
ヒトＧｒｏ−アルファ、Ｇｒｏ−ベータ、Ｇｒｏ−ガンマ、ＥＮＡ−７８、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−２、およびＩＬ−８に結合する抗体であって、前記抗体は、軽鎖および重鎖を含み、前記軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含みかつ前記重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含みかつ前記ＨＣＶＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む（ここで、ＬＣＤＲ１は、ＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＨ（配列番号７）であり、ＬＣＤＲ２は、ＹＴＳＲＳＶＳ（配列番号８）であり、ＬＣＤＲ３は、ＧＱＮＮＥＷＰＥＶ（配列番号９）であり、ＨＣＤＲ１は、ＧＹＥＦＴＳＹＷＩＨ（配列番号１０）であり、ＨＣＤＲ２は、ＮＩＳＰＮＳＧＳＡＮＹＮＥＫＦＫＳ（配列番号１１）であり、かつＨＣＤＲ３は、ＥＧＰＹＳＹＹＰＳＲＸａａＹＹＧＳＤＬ（配列番号２０）（配列中、Ｘａａは、ＥまたはＱ）である）、抗体。
【請求項８】
前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列は、配列番号２または配列番号１４である、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列は、配列番号４または１６である、請求項７に記載の抗体。
【請求項１０】
前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列は、配列番号２でありかつ前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列は、配列番号４である、請求項７に記載の抗体。
【請求項１１】
前記重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１でありかつ前記軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号３である、請求項７に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する２本の重鎖および配列番号３のアミノ酸配列を有する２本の軽鎖を含む、請求項７に記載の抗体。
【請求項１３】
配列番号１または１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド配列を含み、かつ配列番号３または１５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子。
【請求項１４】
請求項１３に記載のＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体を発現する能力を有する、細胞。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体を産生するプロセスであって、請求項１４に記載の哺乳動物細胞を前記抗体が発現するような条件下で培養するステップと、前記発現した抗体を回収するステップとを含む、プロセス。
【請求項１６】
請求項１５に記載のプロセスによって産生される、抗体。
【請求項１７】
患者における潰瘍性大腸炎、腎がん、または卵巣がんを治療する方法であって、請求項１〜１２および１６のいずれか一項に記載の抗体の治療的有効量を前記患者に投与するステップを含む、方法。
【請求項１８】
療法における使用のための、請求項１〜１２および１６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
潰瘍性大腸炎、腎がん、または卵巣がんの治療における使用のための、請求項１〜１２および１６のいずれか一項に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインに対する抗体、および病因がＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインによって媒介される疾患を治療することにおけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカイン（ケモカインファミリーのメンバーは全て、それらのＣＸＣモチーフのすぐ隣にＥ−Ｌ−Ｒアミノ酸モチーフを持つためそう呼ばれる）は、炎症および血管新生の部位への好中球の遊走を含めた、種々の発症機序において重要な役割を果たす。好中球は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、尋常性乾癬および掌蹠膿疱症などの、いくつかの急性および慢性炎症性／自己免疫性疾患の病因に寄与する。ＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインは、腫瘍発生および腫瘍転移においても決定的な役割を果たす。これらのケモカインは、腫瘍において高度に発現される。腫瘍環境内で、ＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインは、種々の経路、例えば血管新生、腫瘍部位における内皮細胞および白血球の動員および浸潤、ならびに腫瘍細胞の増殖および残存に関与する。
【０００３】
ケモカインは、４つのサブファミリー、ＣＸＣ、ＣＣ、（Ｘ）Ｃ、およびＣＸ３Ｃに分類される。ＣＸＣケモカインにおいては、１個のアミノ酸が、最初の２個のシステインを隔てている（「ＣＸＣモチーフ」）。ＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインは、ＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインに特異的に結合するＧタンパク質共役７回膜貫通ドメイン型受容体である、ＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２ケモカイン受容体のリガンドである。７種のヒトＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインは、ヒトＧｒｏ−アルファ（別名ＣＸＣＬ１）、ヒトＧｒｏ−ベータ（別名ＣＸＣＬ２）、ヒトＧｒｏ−ガンマ（別名ＣＸＣＬ３）、ヒトＥＮＡ−７８（別名ＣＸＣＬ５）、ヒトＧＣＰ−２（別名ＣＸＣＬ６）、ヒトＮＡＰ−２（別名ＣＸＣＬ７）、およびヒトＩＬ−８（別名ＣＸＣＬ８）である。全てのＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインが、ＣＸＣＲ２受容体に結合し、さらに、一部のＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインは、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２受容体の両方に結合し（すなわち、ＣＸＣＬ６およびＣＸＣＬ８）、それらの全てが活性化経路における冗長性に寄与する。
【０００４】
個々のＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインに結合する抗体は、以前より説明されている。ＣＸＣＬ８（ＩＬ−８）に対する２種のモノクローナル抗体は、早期臨床試験において炎症性疾患における有効性を評価されている（非特許文献１、非特許文献２）。さらに、特許文献１は、ヒトＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）、ヒトＧｒｏ−アルファ（ＣＸＣＬ１）、ヒトＧｒｏ−ベータ（ＣＸＣＬ２）、ヒトＧｒｏ−ガンマ（ＣＸＣＬ３）、およびヒトＥＮＡ−７８（ＣＸＣＬ５）に結合する抗体を開示している。しかしながら、その開示は、抗体がＧＣＰ−２（ＣＸＣＬ６）と強く結合し、かつＮＡＰ−２（ＣＸＣＬ７）との結合に関しては無変化（ｓｉｌｅｎｔ）であることを実証していない。
【０００５】
しかしながら、７種全てのヒトＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインと結合して中和することができる抗体は、まだ開示されていない。１つまたは幾つかのヒトＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインを標的にすることは、他のＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインのための多数の生物学的機能を引き出す機会を残している。７種全てのＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインを中和することは、ＣＸＣＲ１＋またはＣＸＣＲ２＋細胞の炎症の部位へ遊走する能力に影響を与える可能性がありかつ血管新生を阻害する可能性がある。ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２受容体活性化経路における有意な冗長性を考慮すると、特異性および高親和性を有して７種全てのヒトＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインに結合する抗体の必要性が依然としてある。７種全てのヒトＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインを中和する抗体は、必要がある。物理的に安定な抗体も必要がある。したがって７種全てのヒトＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインと結合して中和することができ、かつ物理的に安定な隔膜特異的な抗体を提供することが、望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００８／１３０９６９号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊ  Ｌｅｕｋ  Ｂｉｏｌ  ６６、４０１〜４１０頁
【非特許文献２】Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８１、６６９〜６７９頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ヒトＧｒｏ−アルファ、Ｇｒｏ−ベータ、Ｇｒｏ−ガンマ、ＥＮＡ−７８、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−２、およびＩＬ−８を中和する抗体を提供する。本発明は、ヒトＧｒｏ−アルファ、Ｇｒｏ−ベータ、Ｇｒｏ−ガンマ、ＥＮＡ−７８、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−２、およびＩＬ−８を中和する抗体であって、以下のアミノ酸、Ａｒｇ６、Ｉｌｅ１０、Ａｌａ３５、Ｉｌｅ４０におけるＩＬ−８（配列番号２７）に結合する抗体も提供する。本発明は、ヒトＧｒｏ−アルファ、Ｇｒｏ−ベータ、Ｇｒｏ−ガンマ、ＥＮＡ−７８、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−２、およびＩＬ−８を中和する抗体であって、以下のアミノ酸、Ａｒｇ６、Ｉｌｅ１０、Ａｌａ３５、Ｉｌｅ４０、およびＬｅｕ４９におけるＩＬ−８（配列番号２７）に結合する抗体をさらに提供する。
【０００９】
本発明は、軽鎖および重鎖を含む抗体であって、軽鎖が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含みかつ重鎖が、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、ＬＣＶＲが、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含みかつＨＣＶＲが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む（ここで、ＬＣＤＲ１は、ＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＨ（配列番号７）、ＬＣＤＲ２は、ＹＴＳＲＳＶＳ（配列番号８）、ＬＣＤＲ３は、ＧＱＮＮＥＷＰＥＶ（配列番号９）、ＨＣＤＲ１は、ＧＹＥＦＴＳＹＷＩＨ（配列番号１０）、ＨＣＤＲ２は、ＮＩＳＰＮＳＧＳＡＮＹＮＥＫＦＫＳ（配列番号１１）、およびＨＣＤＲ３は、ＥＧＰＹＳＹＹＰＳＲＸａａＹＹＧＳＤＬ（配列番号２０）（配列中、Ｘａａは、ＥまたはＱ）である）抗体を提供する。
【００１０】
本発明は、別の態様においてＨＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号２または配列番号１４である抗体を提供する。本発明は、ＬＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号４または配列番号１６である抗体をさらに提供する。
【００１１】
本発明は、重鎖のアミノ酸配列が、配列番号１または１３である抗体を提供する。本発明は、軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号３または１５である抗体も提供する。
【００１２】
本発明は、配列番号１または１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド配列を含み、かつ配列番号３または１５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子も提供する。
【００１３】
本発明は、細胞が、配列番号１または１３のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号３または１５のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体を発現する能力を有する、上述のＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を提供する。機能的免疫グロブリンを発現する能力を有することが知られている哺乳動物の宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、およびＮＳ０細胞が含まれる。本発明において使用するための好ましい宿主細胞は、ＮＳ０細胞である。
【００１４】
本発明は、抗体が発現するような条件下で上述の哺乳動物細胞を培養すること、および発現した抗体を回収することを含む、アミノ酸配列が配列番号３または１５である軽鎖およびアミノ酸配列が配列番号１または１３である重鎖を含む抗体を産生するためのプロセスをさらに提供する。
【００１５】
本発明は、それを必要とする患者に治療的有効量の本発明の抗体を投与することを含む、潰瘍性大腸炎、腎がん、または卵巣がんを治療する方法を提供する。
【００１６】
本発明は、療法において使用するための本発明の抗体をさらに提供する。さらには、本発明は、潰瘍性大腸炎、腎がん、または卵巣がんの治療において使用するための本発明の抗体を提供する。加えて、本発明は、潰瘍性大腸炎、腎がん、または卵巣がんの治療のための薬物の製造における本発明の抗体の使用を提供する。
【００１７】
本発明は、本発明の抗体および１種または複数の医薬的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書で使用する場合、「ヒトＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカイン」と言う語は、Ｅ−Ｌ−Ｒモチーフを有しかつＣＸＣＲ１および／またはＣＸＣＲ２受容体に結合する７種の既知のＣＸＣケモカインを指すことが意図される。ヒトＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインは、ヒトＧｒｏ−アルファ（別名ＣＸＣＬ１）（配列番号２１）、ヒトＧｒｏ−ベータ（別名ＣＸＣＬ２）（配列番号２２）、ヒトＧｒｏ−ガンマ（別名ＣＸＣＬ３）（配列番号２３）、ヒトＥＮＡ−７８（別名ＣＸＣＬ５）（配列番号２４）、ヒトＧＣＰ−２（別名ＣＸＣＬ６）（配列番号２５）、ヒトＮＡＰ−２（別名ＣＸＣＬ７）（配列番号２６）、およびヒトＩＬ−８（別名ＣＸＣＬ８）（配列番号２７）である。集合的に、７種全てのヒトＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインは、本明細書において「ヒトｐａｎ−ＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカイン」と呼ばれる。
【００１９】
「抗体」と言う語は、本明細書で使用する場合、ジスルフィド結合によって相互に連結された、４個のポリペプチド鎖である２個の重（Ｈ）鎖および２個の軽（Ｌ）鎖を含むモノクローナル免疫グロブリン分子を指すことが意図される。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３個のドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および軽鎖定常領域、ＣＬからなる。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変性の領域、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、散在したより一定に保たれた領域にさらに細分され得る。それぞれのＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、アミノ末端からカルボキシ末端へ以下の順序、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４に配列した、３個のＣＤＲおよび４個のＦＲから構成される。ＨＣＶＲにおけるＣＤＲ領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３と呼ばれる。ＬＣＶＲにおけるＣＤＲ領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３と呼ばれる。ＣＤＲは、抗原との特異的な相互作用を形成する残基の大部分を含有する。現在は配列描写に用いられる抗体のためのＣＤＲ割当ての３種の体系がある。ＫａｂａｔのＣＤＲ定義（Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、ベセスダ、メリーランド州（１９９１））は、抗体配列可変性に基づく。ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ定義（Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９６、９０１〜９１７（１９８７）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、「Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２７３、９２７〜９４８（１９９７））は、抗体の３次元構造およびＣＤＲループの位相幾何学に基づく。ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ定義は、ＨＣＤＲ１およびＨＣＤＲ２を除いてＫａｂａｔのＣＤＲ定義と一致する。本発明の目的のためには、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの定義の混成を、ＣＤＲを定義するために用いる。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ領域におけるアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔの番号付け規則に従う。「抗体」と言う語は、これに限定されないが、アシル化およびグリコシル化を含めた、抗体への任意の細胞の翻訳後修飾を包含することがさらに理解される。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「中和抗体」と言う語は、ＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインに結合することが、そのケモカインによって誘導される生物活性の阻害をもたらす抗体を指すことが意図される。このＥＬＲ＋  ケモカイン誘導性生物活性の阻害は、当技術分野において既知のいくつかの標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアッセイの１つまたは複数によって評価してよい（実施例を参照）。本発明の抗体の活性に関して本明細書で使用する場合「阻害する」または「中和する」という語は、１種または複数のＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインによって誘導される生物活性の進行、強度、または重症度を弱める、軽減する、または中断させる能力を意味することがさらに理解される。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「隔膜特異的な抗体」と言う語は、７種全てのヒトＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインに高親和性で（例えば、約５ｘ１０−１１Ｍから約１ｘ１０−９Ｍの範囲の結合親和力（ＫＤ）で）結合する抗体を包含することが意図される。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「患者」は、ヒトＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインのレベルの低下またはヒトＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインによって誘導される生理活性の低下から恩恵を受けるであろう疾患、障害、または状態を有する哺乳動物、好ましくはヒトを指す。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「治療」または「治療すること」は、本明細書に開示される障害の進行を遅らせる、制御する、または停止することが有り得る全てのプロセスを指すことが意図されるが、全ての障害症状の全体的な解消は必ずしも示さない。治療には、患者、特にヒトにおける疾患または状態の治療のための本発明の抗体の投与が含まれる。
【００２４】
本発明の抗体は、ヒトｐａｎ−ＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインと高親和性で結合する。例えば、本抗体は、全長ＩｇＧ４抗体として発現した場合に、表面プラズモン共鳴によって測定されるような、約５ｘ１０−１１Ｍから約１ｘ１０−９Ｍ、例えば約１．０ｘ１０−１０Ｍから約８．６ｘ１０−１０Ｍの範囲の結合親和力（ＫＤ）で７種全てのヒトＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインに結合する。本発明の抗体は、ヒトｐａｎ−ＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインに特異性を有して結合する場合、他のＣＸＣケモカイン、例えばストロマ細胞由来因子１アルファ（ＳＤＦ−１α、別名ＣＸＣＬ１２）とは特異的に結合しないことをさらに特徴とする。
【００２５】
一実施形態において、本発明の抗体は、重鎖可変領域が、以下のアミノ酸配列：ＨＣＤＲ１（配列番号１０）、ＨＣＤＲ２（配列番号１１）、およびＨＣＤＲ３（配列番号１２）を有するＣＤＲ領域を含み、かつ軽鎖可変領域が、以下のアミノ酸配列：ＬＣＤＲ１（配列番号７）、ＬＣＤＲ２（配列番号８）およびＬＣＤＲ３（配列番号９）を有するＣＤＲ領域を含む、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有していてよい。
【００２６】
別の実施形態において、本発明の抗体は、重鎖可変領域が、以下のアミノ酸配列：ＨＣＤＲ１（配列番号１０）、ＨＣＤＲ２（配列番号１１）、およびＨＣＤＲ３（配列番号１９）を有するＣＤＲ領域を含み、かつ軽鎖可変領域が、以下のアミノ酸配列：ＬＣＤＲ１（配列番号７）、ＬＣＤＲ２（配列番号８）およびＬＣＤＲ３（配列番号９）を有するＣＤＲ領域を含む、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有していてよい。
【００２７】
さらなる実施形態において、本発明の抗体は、配列番号２または１４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号４または１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含んでいてよい。
【００２８】
さらに一層の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１または１３のアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号３または１５のアミノ酸配列を有する軽鎖を含んでいてよい。
【００２９】
好ましくは、抗体は、２個の同一の軽鎖および２個の同一の重鎖を含む。好ましくは、配列番号３に示されるようなアミノ酸配列を有する軽鎖は、配列番号６に示されるポリヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。好ましくは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列を有する重鎖は、配列番号５に示されるポリヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。好ましくは、配列番号１５に示されるような軽鎖アミノ酸配列は、配列番号１８に示されるポリヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。好ましくは、配列番号１３に示されるような重鎖アミノ酸配列は、配列番号１７に示されるポリヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。
【００３０】
本発明の最も好ましい実施形態は、配列番号１のアミノ酸配列を有する２個の同一の重鎖、および配列番号３のアミノ酸配列を有する２個の同一の軽鎖を含む抗体である。
【００３１】
本発明の抗体は、患者への投与に適した医薬組成物に組み込んでよい。典型的には医薬組成物は、本発明の抗体および医薬的に許容可能な担体を含む。本明細書で使用する場合、「医薬的に許容可能な担体」には、生理学的に適合性である任意および全ての溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤、ならびに同類のものが含まれる。医薬的に許容可能な担体は、抗体の有効期間または有効性を向上する少量の補助物質をさらに含んでいてよい。
【００３２】
本発明の組成物は、種々の形態であってよい。好ましい形態は、投与および療法適用の意図される様式に依存する。典型的な好ましい組成物は、ヒトの受動免疫のために用いられる物に類似した組成物などの、注射可能なまたは注入可能な溶液の形態である。好ましい投与の様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内）である。一実施形態において、抗体は、腹腔内または皮下注射によって投与される。しかしながら、当業者によって理解されるであろうように、投与の経路および／または様式は、所望の結果によって変わるであろう。
【００３３】
補助的活性化合物も、医薬組成物に組み込んでよい。特定の実施形態において、本発明の抗体は、ＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカイン活性が有害である障害を治療するために有用な１種または複数の追加の療法剤と共製剤化（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）および／または同時投与される。例えば、本発明の抗体は、１種または複数の化学療法剤（例えば、スニチニブまたはシスプラチン）と共製剤化および／または同時投与してよい。
【００３４】
本発明の医薬組成物は、「治療的有効量」の本発明の抗体を含んでいてよい。「治療的有効量」は、所望の療法の結果を達成するための、投薬量においてのおよび必要な期間についての、有効な量を指す。抗体の治療的有効量は、個体の疾患の状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の反応を引き出す抗体の能力などの因子に従って変わり得る。治療的有効量は、治療的に有益な効果が、抗体のいかなる毒性または有害作用にも上回る量でもある。
【００３５】
投薬計画は、最適な所望の反応（例えば、治療反応）を提供するように調節してよい。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、いくつかの分割された用量を経時的に投与してもよく、あるいは治療的状況の緊急性による必要があれば用量を釣り合うように減少または増加してもよい。
【００３６】
投薬量値は、緩和される状態の種類および重症度によって変わり得る。任意の特定の対象について、固有の投与計画は、個々の必要性および組成物の投与を管理または監督する人物の専門的な判断に従って経時的に調節すべきであることがさらに理解される。
【００３７】
ヒトＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインへの本発明の抗体の特異的な結合および中和は、前記抗体が、ヒトＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカイン生理活性の阻害から恩恵を受ける疾患および障害のための療法として用いられることを可能にする。７種全てのヒトＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインに結合して中和するそれらの能力を考えると、本発明の抗体は、単一のヒトＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインを標的とする単独療法および複数のヒトＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインを標的とする併用療法に勝る利点を提供する。
【００３８】
一実施形態において、本発明は、潰瘍性大腸炎またはがん、例えば腎がんもしくは卵巣がんを治療するための方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、潰瘍性大腸炎またはがん、例えば腎がんもしくは卵巣がんの治療において使用するための抗体を提供する。
【００３９】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに例示される。
【実施例】
【００４０】
抗体の発現および産生
本発明の抗体は、以下の通りに発現させて精製してよい。配列番号５（配列番号１の重鎖ポリペプチドをコードする）および配列番号６（配列番号３の軽鎖ポリペプチドをコードする）のＤＮＡ配列を含有する発現ベクターを、ＮＳ０細胞をトランスフェクトするために用いる。本発現ベクターから生じる抗体は、「抗体１」である。
【００４１】
さらに、配列番号１７（配列番号１３の重鎖ポリペプチドをコードする）および配列番号１８（配列番号１５の軽鎖ポリペプチドをコードする）のＤＮＡ配列を含有する発現ベクターを、ＮＳ０細胞をトランスフェクトするために用いる。本発現ベクターから生じる抗体は、「抗体２」である。
【００４２】
抗体１または抗体２のいずれかについて、トランスフェクトしたプールを低密度でプレート化して安定発現細胞のクローン性に近い増殖（ｃｌｏｓｅ−ｔｏ−ｃｌｏｎａｌ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）を可能にさせる。マスターウェルを、抗体発現についてスクリーニングし次いで産生に用いるために血清を含まない、懸濁培養液中で拡大する。抗体がその中へ分泌された、浄化した培地を、適合した緩衝液、例えばリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で平衡化したプロテインＡまたはＧカラムに適用する。カラムを洗って非特異的な結合成分を除去する。結合した抗体を、ｐＨグラジエント（例えば０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．８から０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ２．５）によって溶離する。抗体画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出し次いでプールする。さらなる精製は、意図する使用法に応じて、任意である。抗体は、一般的な技術を用いて濃縮および／または除菌ろ過してよい。可溶性凝集体およびマルチマーは、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含めた、一般的な技術によって有効に除去してよい。これらのクロマトグラフィーステップ後の抗体の純度は、９９％より高くてよい。産生物は、−７０℃で直ちに凍結するかまたは凍結乾燥してよい。
【００４３】
ヒトＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインへの結合親和力
Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００計器およびＢｉａｃｏｒｅ  ２０００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１を、表面プラズモン共鳴分析のために用いる。ＣＭ５チップを、製造業者のＥＤＣ／ＮＨＳアミンカップリング法を用いて調製する。簡単に言えば、ＥＤＣ／ＮＨＳの１：１混合物を１０μＬ／分で７分間注入することによって４個全てのフローセルの表面を活性化する。プロテインＡを、１０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ４．５緩衝液で１００μｇ／ｍＬに希釈して、１０μＬ／分の流速で７分間注入によって固定化して４個全てのフローセル上に約１０，０００ＲＵを達成する。未反応の部位は、１０μＬ／分でエタノールアミンの７分間注入でブロックする。１０μＬ／分で３０秒間のグリシン（ｐＨ１．５）の２つの注入を、任意の非共有結合したタンパク質を除去するために用いる。ランニング緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ＋である。
【００４４】
抗体１または抗体２を、ランニング緩衝液で２μｇ／ｍＬに希釈して、フローセル（Ｆｃ）中に約４００〜６００ＲＵを捕捉する。リガンドを、ランニング緩衝液で１００μｇ／ｍＬから５０ｎＭに希釈し次いでランニング緩衝液で３．１２５ｎＭまで２倍段階希釈する。それぞれのリガンド濃度の重複注入を、１００μＬ／分で１５０秒間注入してその後に解離段階が続く。解離段階は、全てのリガンドについて１８００秒である。全てのフローセルに１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）を５０μＬ／分で６０秒間注入することにより再生を行う。参照を引いたデータを、Ｆｃ２−Ｆｃ１、Ｆｃ３−Ｆｃ１、およびＦｃ４−Ｆｃ１として収集する。測定値は、２５℃で取得する。それぞれのリガンドについてｏｎ−ｒａｔｅ（ｋｏｎ）およびｏｆｆ−ｒａｔｅ（ｋｏｆｆ）を、「１：１（物質移動）結合」結合モデルを用いて評価する。親和力（ＫＤ）は、関係式：ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎに従って結合反応速度から計算する。
【００４５】
ヒトＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインは、抗体１および抗体２との濃度依存性の結合反応を生じる。表１および表２は、抗体１および抗体２についてのｋｏｎ、ｋｏｆｆ、およびＫＤ値の概要を示す。これらの結果は、抗体１および抗体２が、７種全てのヒトＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインに高親和性で結合することを実証する。
【表１】
2016512026.tif 000002
【表２】
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【００４６】
物理的安定性評価
タンパク質凝集および自己会合は、免疫反応を誘発することなどの、不要な影響を潜在的に悪化させ得るので抗体において望ましくない特性である。したがって、抗体を単量体状態に維持することは、非常に望ましい。凝集体高分子量パーセント（％ＨＭＷ）は、タンパク質凝集および自己会合の指標である。より高い凝集体％ＨＭＷは、タンパク質凝集／自己会合の増加および物理的不安定性の増加を示す。抗体１および抗体２の物理的安定性は、以下の通りに測定する。
【００４７】
抗体を、４℃で一晩１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６＋／−１５０ｍＭＮａＣｌ中に透析する。翌朝、試料を５０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、０．２ミクロンフィルターを通してろ過し、次いで０．０２％の最終濃度までＴｗｅｅｎ−８０を加える。それぞれの試料を、２５℃で所定の時間インキュベーションする。可溶性凝集体形成後に、ＴＳＫ３０００ＳＷＸＬ、寸法３０ｃｍｘ０．７８ｃｍの５ミクロンカラムを用いて分析的ＳＥＣを行う。移動相は、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７、１７５ｍＭ  ＮａＣｌ、流速０．５ｍＬ／分である。試料を、１μＬ注入として適用し２８０ｎｍで観測して凝集体％ＨＭＷの増加を測定する（表３）。
【００４８】
５０ｍｇ／ｍＬの配合物を、２５℃で１週間および４週間インキュベーションしてストレス条件下の長期的安定性を評価する。デルタ凝集体％ＨＭＷを、１週または４週時点における％ＨＭＷから（表３において「初期」と指定されている）時間ゼロにおける凝集体％ＨＭＷを引くことにより決定する。１週および４週後、抗体１および抗体２の両方とも１％未満のデルタ％ＨＭＷを実証し、従って良好な物理的安定性を実証した。
【表３】
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【００４９】
抗体１に関する抗体エピトープマッピング
抗体１に関するエピトープを特徴づけるためにウエスタンブロット分析、抗体のいくつかのＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインとの共結晶化、ならびに結合および中和に関する突然変異解析を含めた、複数の手法に取り組む。
【００５０】
ウエスタンブロット分析
抗体１が直線状または立体構造エピトープに結合可能かどうかを判定するために、還元および非還元条件を用いてウエスタンブロット分析を実行する。タンパク質の電気泳動を、プレキャストＮｕＰＡＧＥ（登録商標）  ４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを用いて実行する。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）  ＭＥＳ  ＳＤＳランニング緩衝液を、ミニセルの内側（２００ｍＬ）および外側（少なくとも６００ｍＬ）チャンバーの両方に加える。ヒトＣＸＣＬ８の段階希釈（１レーンにつき４００ｎｇ、１００ｎｇ、または２５ｎｇ）を、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）  ＬＤＳ  ４Ｘ  Ｓａｍｐｌｅ  ＢｕｆｆｅｒでＮｕＰＡＧＥ（登録商標）  １０Ｘ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ有りまたは無しで作成する。試料を、９５℃で２分間加熱する。投入体積は、試料についてはレーン当り１０μＬ、およびＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄマーカーについてはレーン当り５μＬである。ゲルを、２００Ｖで３５分間室温で流す。
【００５１】
タンパク質を、ｉＢｌｏｔ（登録商標）  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｔａｃｋ、Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、Ｍｉｎｉを備えたｉＢｌｏｔ（登録商標）  Ｄｒｙ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いるＰＶＤＦに移動する。膜を、ブロッキング溶液（リン酸緩衝食塩水中３％の脱脂乳）中で室温で１時間ブロックする。抗体１を、１μｇ／ｍＬの最終濃度までブロッキング溶液に加え次いで室温で２時間インキュベーションする。最初のインキュベーションに続いて、抗体／ブロック溶液を除去し、膜を洗浄緩衝液（リン酸緩衝食塩水＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）中で１５分間３回洗う。膜を、次いでＨＲＰ結合ロバ抗−ヒトＦｃに特異的なＩｇＧ二次抗体（ブロッキング溶液中０．１μｇ／ｍＬ）と共に室温で１時間インキュベーションする。二次抗体の除去後、膜を洗浄緩衝液で１０分間４回洗う。膜を次いでＳｔａｂｌｅ  Ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ＳｏｌｕｔｉｏｎおよびＬｕｍｉｎｏｌ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）の希釈標準溶液で５分間インキュベーションする。膜を、ＣＬ−Ｘ  Ｐｏｓｕｒｅ（商標）  Ｆｉｌｍを備えたＸ線用フィルムカセット内のプラスチックの膜保護具内に３０秒間置く。フィルムを、Ｋｏｎｉｃａ  ＳＲＸ−１０１システムを用いて現像する。
【００５２】
非還元条件下では、４００ｎｇのＣＸＣＬ８濃度において、２つの帯が約１７ｋＤａおよび約１０ｋＤａで現れた。１００ｎｇのＣＸＣＬ８濃度において、１つの帯が約１０ｋＤａで現れた。２５ｎｇのＣＸＣＬ８濃度において、帯は現れなかった。還元条件下では、試験した濃度のいずれにおいても帯は現れなかった。
【００５３】
この結果は、抗体１が、非還元の、変性したヒトＣＸＣＬ８には結合可能であるが、還元の、変性したヒトＣＸＣＬ８には結合できないことを実証した。したがって、ＣＸＣＬ８における２個のジスルフィド結合は、抗体エピトープを維持するために必要である。これらの結果は、抗体１について立体構造エピトープを実証する。
【００５４】
結晶構造分析
抗体１の完全結合表面を測定するためにヒトＣＸＣＬ８、ならびにカニクイザルＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、およびＣＸＣＬ７に関してＦａｂ／抗原複合体の結晶構造を取得する。野生型切断ヒトＣＸＣＬ８  １−６６、ヒトＣＸＣＬ８点突然変異体、およびカニクイザルＣＸＣＬ７は、全てＮ末端Ｈｉｓ−ＳＵＭＯタグを有するＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させる。これらのタンパク質をリフォールディングし、タグを切断し、タンパク質を標準的な精製技術によって精製する。カニクイザルＣＸＣＬ２およびＣＸＣＬ３は、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞において発現させ標準的な精製技術によって精製する。ジスルフィド結合の形成は、トリプシン消化物およびマスフィンガープリント分析によって確認し、活性は、好中球走化性アッセイによって確認する。抗体１のＦａｂは、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞において発現させ標準的な精製技術によって精製する。Ｆａｂ／抗原複合体を、わずかな過剰モルの抗原をＦａｂに加えることにより形成し、続いてサイズ排除クロマトグラフィー精製により過剰な遊離抗原を除去する。複合体を結晶化し、Ｂｕｓｔｅｒ  ２．９．５（Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｈａｓｉｎｇ  Ｌｔｄ．）を用いて結晶構造を分子置換により溶解する。
【００５５】
これらの結晶構造は、抗体１のエピトープがＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインのＮ末端を含むことを確認したが、これらは、ＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインのＦａｂとβ１−β２ループとの間およびβ２ストランドとβ３ストランドとの間の接触も示した。結晶構造は、結晶構造が重ね合わせ可能であったので、抗体がＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインの折りたたみを特異的に認識することも実証する。非常に多くの水素結合およびファンデルワールス相互作用も観察された。最も注目すべきは、ＥＬＲモチーフの保存されたＲ６側鎖は、残基Ｗ３３、Ｙ１０２、およびＹ１１０におけるＦａｂ重鎖、ならびに残基Ｗ９４におけるＦａｂ軽鎖によって形成された深い結合ポケットに位置した。野生型切断ヒトＣＸＣＬ８ケモカインも、残基Ｅ９９におけるＦａｂ重鎖およびＮ９１主鎖カルボニルにおけるＦａｂ軽鎖の両方と水素結合する。他の観察された水素結合は、野生型切断ヒトＣＸＣＬ８ケモカインのＬ５主鎖カルボニルとＦａｂ軽鎖Ｗ９４主鎖アミドとの間、野生型切断ヒトＣＸＣＬ８ケモカインのＩ１０主鎖カルボニルとＦａｂ重鎖Ｓ５２側鎖との間、野生型切断ヒトＣＸＣＬ８ケモカインのＫ１１側鎖とＦａｂ重鎖Ｔ３０およびＳ３１側鎖との間、野生型切断ヒトＣＸＣＬ８ケモカインのＨ３３側鎖とＦａｂ軽鎖Ｗ９４主鎖カルボニルとの間、Ａ３５主鎖アミドとＦａｂ重鎖Ｎ５９側鎖との間、ならびに野生型切断ヒトＣＸＣＬ８ケモカインのＣ５０主鎖アミドとＦａｂ重鎖Ｙ１０４主鎖カルボニルとの間であった。さらには、野生型切断ヒトＣＸＣＬ８ケモカインのＮ末端残基５から１３は、Ｎ末端がＦａｂ重鎖ＣＤＲ２とＣＤＲ３との間の溝に位置するのでＦａｂとの非常に多くの接触を作っていた。加えて、Ｆａｂ重鎖ＣＤＲ３ループは、この溝から遠くへ伸びて野生型切断ヒトＣＸＣＬ８ケモカインのβ２ストランド上の非Ｎ末端残基Ｉ４０、ならびにβ３ストランド上の残基Ｇｌｕ４８、Ｌｅｕ４９、およびＣｙｓ５０と交わっていた。最後に、野生型切断ヒトＣＸＣＬ８ケモカインにおけるβ１−β２ループの残基３３〜３６は、Ｆａｂ重鎖ＣＤＲ２に逆らって塊になっている。
【００５６】
突然変異分析
抗体１  Ｆａｂと野生型ヒトＣＸＣＬ８との間のいくつかの重要な接触を結晶構造において観察してヒトＣＸＣＬ８点突然変異体の結合反応速度調査およびＵ９３７−ｈｕＣＸＣＲ２蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）中和によってさらに試験する。これらの重要な接触を調査するために、いくつかの点突然変異体（Ｒ６Ａ、Ｉ１０Ａ、Ａ３５Ｐ、Ｉ４０Ａ、およびＬ４９Ａ）を、ヒトＣＸＣＬ８配列（配列番号２７）に基づいて作成する。野生型、Ｒ６Ａ、Ｉ１０Ａ、Ａ３５Ｐ、Ｉ４０Ａ、およびＬ４９ＡヒトＣＸＣＬ８点突然変異体を、標準技術に従って発現し、リフォールディングして、精製する。ジスルフィド結合の形成は、トリプシン消化物およびマスフィンガープリント分析によって確認し、活性は、好中球走化性アッセイによって確認する。
【００５７】
結合反応速度を、上述のようにＢｉａｃｏｒｅ  ２０００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１を備えたＢｉａｃｏｒｅ  ２０００計器上で試験する。野生型および突然変異体ヒトＣＸＣＬ８を、生物活性についておよび抗体１による中和についてＵ９３７−ｈｕＣＸＣＲ２アッセイを用いて試験する。Ｕ９３７−ｈｕＣＸＣＲ２は、ヒトＣＸＣＲ２の発現のためにレトロウイルスで形質導入した単核球細胞株である。
【００５８】
ＣＸＣＬ８突然変異体を、Ｖ字底９６−ウェルポリプロピレンプレートのウェルにおいて０．２％ＢＳＡを含有するＡｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒで段階希釈する。リガンド濃度は、最終アッセイ濃度の３倍（最終アッセイ濃度は３００から０．００５１ｎＭの範囲）である。細胞プレートおよびリガンドプレートを、５０μＬのリガンドを細胞プレートのウェルに移すようにプログラムした蛍光イメージングプレートリーダー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）（ＦＬＩＰＲ−３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）に装填する。蛍光は、１秒置きに９０秒間記録する。蛍光の変化［デルタ相対蛍光単位（ＤＲＦＵ）、Ｍａｘ  ＲＦＵ−Ｍｉｎ  ＲＦＵ］は、１０から９０の像から計算する。ＤＲＦＵ対ｌｏｇ（リガンド濃度）をプロットしてＥＣ５０値をＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて非線形回帰により決定する。アッセイは、３個のアッセイプレートにおいて３重に重複して実行する。
【００５９】
抗体１を、０．２％ＢＳＡを含有するＡｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒで段階希釈する。抗体濃度は、最終アッセイ濃度の３倍（最終濃度は１０から０．０１９５μｇ／ｍｌの範囲）である。野生型ヒトＣＸＣＬ８およびＣＸＣＬ８突然変異体の原液を、Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ＋０．２％ＢＳＡで２４０ｎＭ（８ｎＭの最終アッセイ濃度ｘ３０）で調製する。２０μＬのリガンドを、Ｖ字底９６−ウェルポリプロピレンプレートのウェル内で１８０μＬの抗体１と混合する。リガンドおよび抗体を、室温で３０分間インキュベーションする。細胞プレートおよびリガンド−抗体プレートを、５０μＬのリガンド−抗体を細胞プレートのウェルに移すようにプログラムした蛍光イメージングプレートリーダー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）（ＦＬＩＰＲ−３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）に装填する。蛍光は、１秒置きに９０秒間記録する。蛍光の変化（ＤＲＦＵ）を、１０から９０の像から計算する。ＤＲＦＵ対ｌｏｇ（抗体濃度）をプロットしてＩＣ５０値をＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて非線形回帰により決定する。アッセイは、３個のアッセイプレートにおいて３重に重複して実行する。
【００６０】
結合反応速度、生物活性、および中和結果を、表４に概説する。測定値は、２５℃で取得する。それぞれのリガンドについてｏｎ−ｒａｔｅ（ｋｏｎ）およびｏｆｆ−ｒａｔｅ（ｋｏｆｆ）を、「１：１（物質移動）結合」結合モデルを用いて評価する。親和力（ＫＤ）は、関係式：ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎに従って結合反応速度から計算する。
【００６１】
突然変異のいくつかは、受容体（ＥＣ５０）に対する活性がノックアウトされ、したがって、中和について試験することはできなかった。Ａ３５Ｐ突然変異は、受容体に対する完全な活性を有するにもかかわらず中和活性が完全に無効化されていることが留意される。これらの結果は、抗体結合に肝要なＣＸＣＬ８抗原の結合界面内の重要な接触（Ｒ６、Ｉ１０、Ａ３５、Ｉ４０、およびＬ４９）を強調する。
【表４】
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【００６２】
概して、抗体１に関するエピトープマッピング分析は、抗原の結合界面がＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインのＮ末端（アミノ酸５〜１３）、β１−β２ループ（アミノ酸３３〜３６）、ならびにβ２およびβ３ストランド（アミノ酸４０、４８〜５０）を含むことを実証した。抗体結合に肝要なこの界面内の重要な接触には、ＣＸＣＬ８（配列番号２７）におけるアミノ酸Ｒ６、Ｉ１０、Ａ３５、Ｉ４０、およびＬ４９が含まれる。
【００６３】
中和アッセイ
ヒトＣＸＣＲ２−トランスフェクトＨＭＥＣ細胞を用いたヒトＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの中和
ＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインの全てがＣＸＣＲ２受容体に結合し得るので、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ調査のためにＣＸＣＲ２発現細胞を選択した。ＨＭＥＣ−ｈｕＣＸＣＲ２は、ヒトＣＸＣＲ２受容体の発現のためにレトロウイルスで形質導入した不死化ヒト内皮細胞株である。ヒトＣＸＣＲ２発現ＨＭＥＣ細胞は、ヒト、カニクイザル、ラット、およびマウスＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインに反応して細胞内Ｃａ２＋流入を誘導することができる。細胞内Ｃａ２＋流入は、蛍光イメージングプレートリーダー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍａｇｉｎｅ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）（ＦＬＩＰＲ）によって検出され得る。ケモカイン中和はしたがって、これらのケモカインによって誘導される細胞内Ｃａ２＋流入も中和するべきである。
【００６４】
ＨＭＥＣ−ｈｕＣＸＣＲ２を、３７℃で５％ＣＯ２中１０％ウシ胎児血清、２ｘＧｌｕｔａＭａｘ、１ｘ非必須アミノ酸、１μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン、１０ｎｇ／ｍＬのヒト上皮成長因子、および０．４μｇ／ｍＬのピューロマイシンを添加したＭＣＤＢ  ３１培地内に保持する。培養物を、サブコンフルエント（ｓｕｂ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）な密度（５０〜８０％コンフルエント）に維持した。細胞を、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓで採取し、細胞密度を、完全培養培地中３ｘ１０５細胞／ｍＬに調節して、１００μＬの細胞懸濁液を、黒色透明底アッセイプレートのウェルに播種する。細胞プレートを、室温で３０分間インキュベーションして細胞をウェルの底に沈降させた後にプレートを、３７℃で５％ＣＯ２中で一晩インキュベーションする。それぞれのアッセイプレートについて、Ｆｌｕｏ−４ＮＷ試薬の１個のバイアルの内容物を、１０ｍＬのＡｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒおよび１００μＬのプロベネシド中に懸濁させて１ｘＦｌｕｏ−４ＮＷ試薬を作成する。インキュベーション後、培養培地を吸引して１００μＬの１ｘＦｌｕｏ−４ＮＷ溶液をアッセイプレートのそれぞれのウェルに加える。プレートを、３７℃で３０分間その後さらに室温で３０分間インキュベーションして光から保護する。抗体１を、０．２％ＢＳＡを含有するＡｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒで段階希釈する。抗体濃度は、３ｘ最終アッセイ濃度（最終濃度は１０〜０．０１９５μｇ／ｍＬの範囲）である。リガンドの原液を、Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ＋０．２％ＢＳＡで３００ｎＭ（１０ｎＭの最終アッセイ濃度ｘ３０）で調製する。２０μＬのリガンドを、Ｖ字底９６−ウェルポリプロピレンプレートのウェル内で１８０μＬの抗体と混合する。リガンドおよび抗体を、室温で３０分間インキュベーションする。細胞プレートおよびリガンド−抗体プレートを、５０μＬのリガンド−抗体を細胞プレートのウェルに移すようにプログラムした蛍光イメージングプレートリーダー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍａｇｉｎｅ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）（ＦＬＩＰＲ−３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）に装填する。蛍光は、９０秒間毎秒記録する。蛍光の変化（ＤＲＦＵ）を、１０から９０の像から計算する。ＤＲＦＵ対ｌｏｇ（抗体濃度）をプロットしてＩＣ５０値をＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて非線形回帰により決定する。アッセイは、３個のアッセイプレート上で３重に重複して実行する。データを、反復試験の平均として表わす。
【００６５】
表５に結果を概説する。これらの結果は、抗体１が、７種全てのヒトＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインを中和することができたことを実証する。ＩＣ５０値は、抗体のμｇ／ｍＬとして表わされる（標準偏差は括弧内）。ＣＸＣＬ８の７２アミノ酸および７７アミノ酸形態の両方を用いた。データは、２〜５反復試験の平均である。
【表５】
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【００６６】
初期段階のヒト好中球を用いたヒトＣＸＣＬ８またはＣＸＣＬ１誘導走化性のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの中和
ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２の両方を天然に発現している細胞における抗体１の中和活性を測定するためにヒト好中球を用いる走化性アッセイを選択した。健常人からの末梢血を、２個の１０ｍＬナトリウムヘパリンチューブに引き込む。好中球を単離するために、５ｍＬの血液を、４個の１５ｍＬチューブ中で５ｍＬのポリモルホプレップ上に層化する。チューブを、４７０ｘｇ、１８℃で３０分間遠心分離する。血漿および最上部の細胞帯（単核細胞）は、取り出して破棄する。第２の帯（好中球）は、４個のチューブからプールして等体積のＰＢＳを加える。チューブを、４００ｘｇ、１８℃で１０分間遠心分離する。ペレットを、１２ｍＬのＰＢＳで洗い、前のように遠心分離して、１１ｍＬのＨＢＳＳ／ＢＳＡ（７．５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、ＨＢＳＳ）でペレットを再懸濁させる。６０ｘ１０６個の細胞を、１２ｍＬのＨＢＳＳ／ＢＳＡおよび５μＭのＣＭＦＤＡに懸濁させて３７℃で３０分間インキュベーションする。インキュベーション後、チューブを遠心分離して細胞をペレット化し、１２ｍＬのＨＢＳＳ／ＢＳＡで１回洗い、次いで細胞を１２ｍＬのＨＢＳＳ／ＢＳＡに再懸濁させる（５ｘ１０６細胞／ｍＬ）。
【００６７】
抗体１およびアイソタイプ対照（ヒトＩｇＧ４抗体）を、ＨＢＳＳ／ＢＳＡ（希釈剤１）を用いて１４９５ｎＭに希釈し次いでＨＢＳＳ／ＢＳＡで１：５に段階希釈する。ＣＸＣＬ８は、ＨＢＳＳ／ＢＳＡで２０ｎＭに希釈する。ＣＸＣＬ１は、ＨＢＳＳ／ＢＳＡで１０．１ｎＭに希釈する。
【００６８】
７０μＬの抗体１またはＨＢＳＳ／ＢＳＡを、７０μＬのＣＸＣＬ８溶液またはＣＸＣＬ１溶液のいずれかと混合して室温で約３０分間インキュベーションする。３０μＬの混合物を、３重に重複したＣｈｅｍｏＴｘプレートの下方のチャンバーウェルに分注する。ＨＢＳＳ／ＢＳＡのみを含有するウェル（ケモカインまたは抗体を含まない）は、バックグラウンド信号を示すであろう。ＣｈｅｍｏＴｘフィルターを下方のチャンバー上に置いて５０μＬ（２５０，０００細胞）をそれぞれのウェルの上に分注する。ＣｈｅｍｏＴｘプレートを、３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベーションする。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで天面からすすいでＣｈｅｍｏＴｘフィルターを除去する。蛍光は、底部検出器のみを用いて（Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ３  １４２０計数器）４８５／５３５を示す。バックグラウンドウェル（ＨＢＳＳ／ＢＳＡのみ）の平均蛍光を、試験ウェル蛍光から引き、平均および標準偏差をＥｘｃｅｌにおいて計算する。
【００６９】
５ｎＭのＣＸＣＬ８濃度において、抗体１（ＭＷ  １５０，０００ｋＤａ）のＩＣ５０は、２６．４（±０．２３６）ｎＭであった。１０ｎＭのＣＸＣＬ８濃度において、抗体１のＩＣ５０は、４３．７（±０．０８６）ｎＭであった。５ｎＭのＣＸＣＬ１濃度において、抗体１のＩＣ５０は、１８．５（±０．１５８）ｎＭであった。２０ｎＭのＣＸＣＬ１濃度において、抗体１のＩＣ５０は、４０．３（±０．１１２）ｎＭであった。ＣＸＣＬ１およびＣＸＣＬ８の全ての試験した濃度において、アイソタイプ対照抗体は、走化性に影響しなかった。データは、走化活性はアイソタイプ対照抗体による影響を受けなかったが抗体１は用量依存的にヒトＣＸＣＬ８またはＣＸＣＬ１の走化活性をブロックし得ることを示す。
【００７０】
マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの急性ＤＳＳ大腸炎モデル
デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）は、最も一般的に用いられる潰瘍性大腸炎（ＵＣ）のモデルである。本モデルにおいて、ＤＳＳは、飲料水に加えられてＵＣに類似する急性疾患を誘導する化学性刺激物である。ＤＳＳ大腸炎の急性期は、粘膜および粘膜下組織への好中球の漸増、および増加したＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインの発現によって特徴付けられる。しかしながら、ＤＳＳへの慢性暴露は、激しい消化管損傷および有意な体重減少を引き起こし、大腸炎モデルにおいては適さない。本モデルの急性の性質に対応するために、抗体１を、その好中球の漸増および大腸炎の発症を阻害する能力を試験するために予防的方法で用いる。本モデルにおいて留意すべきは、マウスＣＸＣＬ５（ＬＩＸ）タンパク質が、結腸組織（Ｋｗｏｎ  ２００５）において有意に増加するが、抗体１はこのマウスケモカインを中和しないことである。
【００７１】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス、８〜１０週齢、重量１８〜２２ｇ、を取得する。血液を、心臓穿刺によって収集して分析しベースラインを定める。大腸炎を誘導するために、マウスは、飲料水において２．５％ＤＳＳ（ＭＷ＝３６，０００〜５０，０００）を５日間（１〜５日目）、その後に続いてＤＳＳを含まない水（急性炎症を反映する）を６日間受ける。対照健常マウスは、水のみを受ける（「ＤＳＳ無し」群）。ＤＳＳを受けているマウスは、０、２、４、および８日目に皮下注射によってヒトＩｇＧ４対照抗体（２５ｍｇ／ｋｇ）または抗体１（２５ｍｇ／ｋｇ）を投薬する。体重を、毎日記録する。それぞれの処置のために用いたマウスの数は、９匹である（健常「ＤＳＳ無し」群において用いられる５匹の健常マウスを除く）。本調査は、４重に実行する。
【００７２】
表６に示すように、ヒトＩｇＧ４対照抗体を受けたＤＳＳマウスは、５日目から８日目の間に劇的に体重減少した。大腸炎の誘導前および疾患の急性期の間に抗体１を受けたＤＳＳマウスは、ヒトＩｇＧ４対照抗体で処置したＤＳＳマウスの５日目から８日目の間の体重減少よりも少ない体重減少を示した（８日目におけるＩｇＧ４対照の初期体重８５．３％に対して抗体１の初期体重９４．０％）。これらの結果は、抗体１の全身投与がＤＳＳ誘導大腸炎における体重減少を効果的に軽減したことを実証し、抗体１がある種のマウスＥＬＲ＋  ＣＸＣケモカインの活性を中和して結腸への好中球漸増を減少するという結論を裏付ける。
【表６】
2016512026.tif 000007
【００７３】
７８６−Ｏ腎明細胞異種移植モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの中和
７８６−Ｏ腎細胞腫（ＲＣＣ）細胞を、マトリゲルと１：１で混合して無胸腺ヌード雌マウスの右脾腹の皮下に１注射当り３．０ｘ１０６細胞で移植する。１００ｍｍ３に達した腫瘍体積を有する７８６−Ｏ異種移植担持マウスに、対照で処置したマウス（ＩｇＧ４および１０％ビヒクル）のようなスニチニブ処理下でもマウスの腫瘍成長が進行し始めるまで連続的な投与計画下で１０ｍｇ／ｋｇのスニチニブを１日２回強制経口投与した。スニチニブ療法中に腫瘍成長が進行していたマウスを、無作為に２つの群に分けた。一方の群は、スニチニブを１０ｍｇ／ｋｇで１日２回に加えて対照ＩｇＧ４抗体を２０ｍｇ／ｋｇで週１回受ける。もう一方の群は、スニチニブ（ｓｕｎｉｎｉｔｉｂ）を１０ｍｇ／ｋｇで１日２回に加えて抗体１を２０ｍｇ／ｋｇで週１回受ける。平均腫瘍体積（括弧内は標準誤差）を、表７に示す。スニチニブ処置への抗体１の追加は、腫瘍成長を経時的に有意に減少し（ｐ＜０．０００１）、抗体１がスニチニブ処置に対して明細胞ＲＣＣ腫瘍を再感作したことを示した。
【表７】
2016512026.tif 000008
【００７４】
ＳＫＯＶ３−Ｌｕｃ卵巣がん異種移植モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの中和
ＳＫＯＶ３−Ｌｕｃは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現するヒト卵巣がん細胞株である。ＳＫＯＶ３−Ｌｕｃ細胞は、しばしばｉｎ  ｖｉｖｏで用いられてヒト卵巣腺がん腫瘍成長を確立する。
【００７５】
ＳＫＯＶ３−Ｌｕｃ卵巣がん細胞を、マトリゲルと１：１で混合して無胸腺ヌード雌マウスの右脾腹の皮下に１注射当り３．０ｘ１０６細胞で移植する。マウスを、異種移植片が平均腫瘍体積２００ｍｍ３に成長した後の腫瘍体積に従ってベースライン時に４つの群に無作為化した。マウスは、対照ＩｇＧ４抗体（２．５ｍｇ／ｋｇ  週１回）、シスプラチン（２．５ｍｇ／ｋｇ  週１回）、抗体１（２０ｍｇ／ｋｇ  週１回）、またはシスプラチン（２．５ｍｇ．ｋｇ  週１回）と抗体１（２０ｍｇ／ｋｇ  週１回）との組み合わせのいずれかを腹腔内注入により受けた。腫瘍成長を表８に示す。シスプラチン単剤療法は、アイソタイプ対照と比較して統計的に有意な腫瘍成長阻害を示さなかった。しかしながら、シスプラチンと抗体１との組み合わせは、アイソタイプ対照およびシスプラチン単剤療法と比較して統計的に有意な腫瘍成長阻害（ｐ≦０．００１）を示し、抗体１がＳＫＯＶ３−Ｌｕｃ卵巣がん異種移植モデルにおける化学療法を相乗効果的に増強することを示した。
【表８】
2016512026.tif 000009
【００７６】
配列表
抗体１重鎖アミノ酸配列：配列番号１
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＥＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＮＩＳＰＮＳＧＳＡＮＹＮＥＫＦＫＳＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＰＹＳＹＹＰＳＲＥＹＹＧＳＤＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
抗体１重鎖可変領域：配列番号２
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＥＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＮＩＳＰＮＳＧＳＡＮＹＮＥＫＦＫＳＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＰＹＳＹＹＰＳＲＥＹＹＧＳＤＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
抗体１軽鎖アミノ酸配列：配列番号３
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＴＳＲＳＶＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＧＱＮＮＥＷＰＥＶＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
抗体１軽鎖可変領域：配列番号４
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＴＳＲＳＶＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＧＱＮＮＥＷＰＥＶＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
抗体１重鎖ＤＮＡ配列：配列番号５
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＡＴＣＴＧＧＣＴＡＣＧＡＧＴＴＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡＡＴＡＴＴＴＣＴＣＣＴＡＡＴＡＧＴＧＧＴＡＧＴＧＣＴＡＡＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＴＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＧＧＧＣＣＣＴＴＡＣＡＧＴＴＡＴＴＡＴＣＣＧＡＧＴＡＧＧＧＡＧＴＡＣＴＡＴＧＧＣＴＣＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＣＣＴＡＧＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴ
抗体１軽鎖ＤＮＡ配列：配列番号６
ＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＡＡＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＡＣＣＴＡＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＴＡＴＡＣＴＴＣＣＣＧＧＴＣＣＧＴＣＴＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＡＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＡＣＡＧＡＡＴＡＡＣＧＡＧＴＧＧＣＣＴＧＡＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ
抗体１／抗体２ＬＣＤＲ１：配列番号７
ＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＨ
抗体１／抗体２ＬＣＤＲ２：配列番号８
ＹＴＳＲＳＶＳ
抗体１／抗体２ＬＣＤＲ３：配列番号９
ＧＱＮＮＥＷＰＥＶ
抗体１／抗体２ＨＣＤＲ１：配列番号１０
ＧＹＥＦＴＳＹＷＩＨ
抗体１／抗体２ＨＣＤＲ２：配列番号１１
ＮＩＳＰＮＳＧＳＡＮＹＮＥＫＦＫＳ
抗体１ＨＣＤＲ３：配列番号１２
ＥＧＰＹＳＹＹＰＳＲＥＹＹＧＳＤＬ
抗体２重鎖アミノ酸配列：配列番号１３
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＥＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＮＩＳＰＮＳＧＳＡＮＹＮＥＫＦＫＳＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＰＹＳＹＹＰＳＲＱＹＹＧＳＤＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
抗体２重鎖可変領域：配列番号１４
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＥＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＮＩＳＰＮＳＧＳＡＮＹＮＥＫＦＫＳＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＰＹＳＹＹＰＳＲＱＹＹＧＳＤＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
抗体２軽鎖アミノ酸配列：配列番号１５
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＴＳＲＳＶＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＧＱＮＮＥＷＰＥＶＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
抗体２軽鎖可変領域：配列番号１６
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＴＳＲＳＶＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＧＱＮＮＥＷＰＥＶＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
抗体２重鎖ＤＮＡ配列：配列番号１７
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＡＴＣＴＧＧＣＴＡＣＧＡＧＴＴＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡＡＴＡＴＴＴＣＴＣＣＴＡＡＴＡＧＴＧＧＴＡＧＴＧＣＴＡＡＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＴＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＧＧＧＣＣＣＴＴＡＣＡＧＴＴＡＴＴＡＴＣＣＧＡＧＴＡＧＧＣＡＧＴＡＣＴＡＴＧＧＣＴＣＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＣＣＴＡＧＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴ
抗体２軽鎖ＤＮＡ配列：配列番号１８
ＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＡＡＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＡＣＣＴＡＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＴＡＴＡＣＴＴＣＣＣＧＧＴＣＣＧＴＣＴＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＡＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＡＣＡＧＡＡＴＡＡＣＧＡＧＴＧＧＣＣＴＧＡＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ
抗体２ＨＣＤＲ３：配列番号１９
ＥＧＰＹＳＹＹＰＳＲＱＹＹＧＳＤＬ
ＨＣＤＲ３コンセンサス配列：配列番号２０
ＥＧＰＹＳＹＹＰＳＲＸａａＹＹＧＳＤＬ
（配列中、ＸａａはＥまたはＱである）
ヒトＧｒｏ−アルファ（ＣＸＣＬ１）：配列番号２１
ＡＳＶＡＴＥＬＲＣＱＣＬＱＴＬＱＧＩＨＰＫＮＩＱＳＶＮＶＫＳＰＧＰＨＣＡＱＴＥＶＩＡＴＬＫＮＧＲＫＡＣＬＮＰＡＳＰＩＶＫＫＩＩＥＫＭＬＮＳＤＫＳＮ
ヒトＧｒｏ−ベータ（ＣＸＣＬ２）：配列番号２２
ＡＰＬＡＴＥＬＲＣＱＣＬＱＴＬＱＧＩＨＬＫＮＩＱＳＶＫＶＫＳＰＧＰＨＣＡＱＴＥＶＩＡＴＬＫＮＧＱＫＡＣＬＮＰＡＳＰＭＶＫＫＩＩＥＫＭＬＫＮＧＫＳＮ
ヒトＧｒｏ−ガンマ（ＣＸＣＬ３）：配列番号２３
ＡＳＶＶＴＥＬＲＣＱＣＬＱＴＬＱＧＩＨＬＫＮＩＱＳＶＮＶＲＳＰＧＰＨＣＡＱＴＥＶＩＡＴＬＫＮＧＫＫＡＣＬＮＰＡＳＰＭＶＱＫＩＩＥＫＩＬＮＫＧＳＴＮ
ヒトＥＮＡ−７８（ＣＸＣＬ５）：配列番号２４
ＡＡＶＬＲＥＬＲＣＶＣＬＱＴＴＱＧＶＨＰＫＭＩＳＮＬＱＶＦＡＩＧＰＱＣＳＫＶＥＶＶＡＳＬＫＮＧＫＥＩＣＬＤＰＥＡＰＦＬＫＫＶＩＱＫＩＬＤＧＧＮＫＥＮ
ヒトＧＣＰ−２（ＣＸＣＬ６）：配列番号２５
ＶＳＡＶＬＴＥＬＲＣＴＣＬＲＶＴＬＲＶＮＰＫＴＩＧＫＬＱＶＦＰＡＧＰＱＣＳＫＶＥＶＶＡＳＬＫＮＧＫＱＶＣＬＤＰＥＡＰＦＬＫＫＶＩＱＫＩＬＤＳＧＮＫＫＮ
ヒトＮＡＰ−２（ＣＸＣＬ７）：配列番号２６
ＡＥＬＲＣＭＣＩＫＴＴＳＧＩＨＰＫＮＩＱＳＬＥＶＩＧＫＧＴＨＣＮＱＶＥＶＩＡＴＬＫＤＧＲＫＩＣＬＤＰＤＡＰＲＩＫＫＩＶＱＫＫＬＡＧＤＥＳＡＤ
ヒトＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）：配列番号２７
ＳＡＫＥＬＲＣＱＣＩＫＴＹＳＫＰＦＨＰＫＦＩＫＥＬＲＶＩＥＳＧＰＨＣＡＮＴＥＩＩＶＫＬＳＤＧＲＥＬＣＬＤＰＫＥＮＷＶＱＲＶＶＥＫＦＬＫＲＡＥＮＳ
【配列表】
2016512026000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年9月11日(2015.9.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＧｒｏ−アルファ、Ｇｒｏ−ベータ、Ｇｒｏ−ガンマ、ＥＮＡ−７８、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−２、およびＩＬ−８に結合する抗体であって、前記抗体は、軽鎖および重鎖を含み、前記軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含みかつ前記重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含みかつ前記ＨＣＶＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む（ここで、ＬＣＤＲ１は、ＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＨ（配列番号７）であり、ＬＣＤＲ２は、ＹＴＳＲＳＶＳ（配列番号８）であり、ＬＣＤＲ３は、ＧＱＮＮＥＷＰＥＶ（配列番号９）であり、ＨＣＤＲ１は、ＧＹＥＦＴＳＹＷＩＨ（配列番号１０）であり、ＨＣＤＲ２は、ＮＩＳＰＮＳＧＳＡＮＹＮＥＫＦＫＳ（配列番号１１）であり、かつＨＣＤＲ３は、ＥＧＰＹＳＹＹＰＳＲＸａａＹＹＧＳＤＬ（配列番号２０）（配列中、Ｘａａは、ＥまたはＱ）である）、抗体。
【請求項２】
前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列は、配列番号２または配列番号１４である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列は、配列番号４または１６である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列は、配列番号２でありかつ前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列は、配列番号４である、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１でありかつ前記軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号３である、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する２本の重鎖および配列番号３のアミノ酸配列を有する２本の軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
配列番号１または１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド配列を含み、かつ配列番号３または１５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子。
【請求項８】
請求項１３に記載のＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体を発現する能力を有する、細胞。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体を産生するプロセスであって、請求項８に記載の哺乳動物細胞を前記抗体が発現するような条件下で培養するステップと、前記発現した抗体を回収するステップとを含む、プロセス。
【請求項１０】
請求項９に記載のプロセスによって産生される、抗体。
【請求項１１】
患者における潰瘍性大腸炎、腎がん、または卵巣がんを治療する方法であって、請求項１〜６および１０のいずれか一項に記載の抗体の治療的有効量を前記患者に投与するステップを含む、方法。
【請求項１２】
療法における使用のための、請求項１〜６および１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
潰瘍性大腸炎、腎がん、または卵巣がんの治療における使用のための、請求項１〜６および１０のいずれか一項に記載の抗体。
【国際調査報告】
2016512026.tif 000010
2016512026.tif 000011
2016512026.tif 000012
2016512026.tif 000013