(57)【要約】  本発明は、カロテノイド（ルテインなど）、一価不飽和及び多価不飽和脂肪酸（パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸など）、クロロフィル色素（クロロフィルＡ及びＢなど）、並びにビタミン（ビタミンＢ９及びＢ１２など）から成る群から、個別又は一緒に、選択される酸化感受性代謝物、より具体的にはカロテノイドを含有する微細藻類のバイオマスを安定化する方法に関し、前記方法は、従属栄養条件下での前記バイオマスの発酵を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルテインなどのカロテノイド、パルミトレイン酸、オレイン酸若しくはリノール酸などの一価不飽和及び多価不飽和脂肪酸、クロロフィルＡ及びＢなどのクロロフィル色素、並びにビタミンＢ９及びＢ１２などのビタミンから成る群から、単独で若しくは組み合わせて、選択される酸化感受性代謝物、より具体的にはカロテノイドを安定化又は貯蔵するための方法であって、以下：
−  栄養因子が不足した培養段階を含む従属栄養条件下で微細藻類のバイオマスを発酵させるステップと、
−  前記酸化感受性代謝物が安定化された前記乾燥バイオマスを貯蔵するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記微細藻類が、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類の群から選択され、より具体的にはクロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、前記乾燥バイオマスに外因性抗酸化剤又は安定剤を添加するステップを含まないことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記不足栄養因子が、炭素含有供給源であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
従属栄養下での前記微細藻類のバイオマスの生産方法が、以下：
・第１ステップのバッチ式発酵と、
・第２ステップのフェドバッチ式発酵であって、前記炭素含有供給源が、前記微細藻類により完全に消費されたら、前記微細藻類によるその消費速度を下回る速度で、前記炭素含有供給源の連続的供給を行うステップを含むフェドバッチ式発酵と
を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記不足栄養因子が、グルコースであることと、前記グルコースを１ｇ／ｌ／ｈ超、好ましくは１〜５ｇ／ｌ／ｈ、より具体的には２〜４ｇ／ｌ／ｈの速度で培養物に添加することとを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記不足培養段階の持続時間が、少なくとも１時間、好ましくは少なくとも１０時間、より好ましくは少なくとも２０時間、特に３０〜６０時間であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記貯蔵ステップが、室温で少なくとも１２、１８又は２４ヵ月持続することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記酸化感受性代謝物が、ルテインであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
酸化感受性代謝物を安定化することを目的とする、栄養因子が不足した培養段階を含む従属栄養条件下で産生された微細藻類のバイオマスの使用。
【請求項１１】
前記微細藻類が、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類の群から選択され、より具体的にはクロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）であることを特徴とする、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記不足栄養因子が、前記炭素含有供給源である、請求項１０又は１１に記載の使用。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法により得られるクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類、より具体的にはクロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）のバイオマスであって、前記乾燥バイオマスへ外因性抗酸化剤又は安定剤を添加することなく、室温で少なくとも１２、１８又は２４ヵ月の貯蔵後に、バイオマス１ｋｇ当たり少なくとも１ｇのルテインを含有することを特徴とするバイオマス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細藻類、より具体的には、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類により産生される酸化感受性代謝物を安定化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最もよく知られている酸化感受性代謝物としては、例えば、カロテノイドがある。
【０００３】
カロテノイドは、一般にオレンジ色又は黄色の色素であり、非常に多種の生存生物に広く存在する。これらは、脂溶性であるため、概して、生物により容易に同化される。
【０００４】
カロテノイドは、脂肪族又は脂環式構造を有するイソプレン単位の重合から形成されるテルペノイドの化学クラスに属する。一般に、これらは、脂質の代謝経路に類似した代謝経路をたどると想定されている。
【０００５】
カロテノイドは、全ての緑色植物によって、及び多くの真菌、細菌（シアノバクテリア（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）を含む）によって、並びに全ての微細藻類によって合成される。
【０００６】
カロテノイドは、動物によりその食物から吸収される。
【０００７】
カロテノイドは、顕著な抗酸化特性を有するため、癌及びその他のヒトの疾患の予防のために研究されている。
【０００８】
さらに、抗酸化物質は、その役割を果たすためにそれ自体が容易に酸化可能でなければならないことは当業者にはよく知れられており、従って、カロテノイドを酸化に対して特に感受性にするのは、その抗酸化特性に他ならない。
【０００９】
カロテノイドの代表例としては、α−カロテン、β−カロテン及びリコペンがある。
【００１０】
リコペン及びβ−カロテンは、一般に、遊離した非結合形態で存在し、植物細胞の葉緑体の中に含まれる。
【００１１】
キサントフィルは、酸素原子の添加によりカロテンから得られる黄色の分子である（アルコール、ケトン、エポキシ及びその他の基）。これらは、カロテノイドクラスに属する。
【００１２】
キサントフィルは、いくつかの黄色又はオレンジ色の果物及び野菜、例えば、桃、マンゴー、パパイヤ、プラム、スカッシュ及びオレンジに豊富に存在する。
【００１３】
これらはまた、特に、黄色、オレンジ色若しくは赤色の特定の花の花弁、及び藻類、例えば、褐藻類（Ｐｈａｅｏｐｈｙｃｅａｅ）において、植物細胞の葉緑体又は有色体にも存在し、そこで、クロロフィルをマスクする。
【００１４】
キサントフィルは、中でも、眼の健康に寄与する抗酸化物質である。
【００１５】
キサントフィルの例としては、ルテイン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼア
キサンチン、クリプトキサンチンなどがある。
【００１６】
食料品中で、又は補助食品として消費される場合、カロテノイドの遊離形態は、良好な吸収を可能にする。
【００１７】
ルテインは、式：４［１８−（４−ヒドロキシ−２，６，６−トリメチルシクロヘキス−１−エン−１−イル）−３，７，１２，１６−テトラメチルオクタデカ−１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７−ノナエン−１−イル］−３，５，５−トリメチルシクロヘキス−２−エン−１−オールのキサントフィル色素であり、眼の黄斑及び網膜の中心部に高濃度で存在する。
【００１８】
そこで、ルテインは、眼の水晶体及び黄斑に対する損傷を防ぐための光の紫外線波長のフィルタリングにおいて重要な役割を有する。
【００１９】
さらに、ルテインは、光誘導性フリーラジカルからの、多価不飽和脂肪酸に富んだ黄斑の保護も行う抗酸化特性を有する。
【００２０】
ルテインは、身体により産生することができないため、食事で補給しなければならない。
【００２１】
そのため、ルテインは、加齢黄斑変性（又はＡＲＭＤ）、白内障、及び網膜色素変性による視力喪失を予防及び／又は治療するために、補助食品にますます多く使用されている。
【００２２】
ムリエロプシス属（Ｍｕｒｉｅｌｌｏｐｓｉｓ）種、セネデスムス・アルメリエンシス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ａｌｍｅｒｉｅｎｓｉｓ）、クロレラ・ゾフィジエンシス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）及びクロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）のタイプの微細藻類が、ルテインの供給源候補として既に提案されている。
【００２３】
規定の観点から、ルテインは、食用系統の果物及び野菜、並びに草、ムラサキウマゴヤシ（ａｌｆａｌｆａ）及びアフリカンマリーゴールド（Ｔａｇｅｔｅｓ  ｅｒｅｃｔａ：千寿菊）から溶媒抽出により得られる。
【００２４】
また、様々な量のカロテンが存在し得る。
【００２５】
ルテインは、由来する植物材料中に天然に存在する脂肪性物質及びワックスを含むこともある。
【００２６】
それらを抽出するために認可されているのは次の溶媒だけである：メタノール、エタノール、プロパノール−２、ヘキサン、アセトン、メチルエチルケトン及び二酸化炭素。
【００２７】
いくつかの商業的ルテイン製剤は、「５％又は１０％のルテイン」として販売されている。これらの製剤は、実際には、ルテインを安定化するために５〜１５％の割合で不活性安定剤に添加された精製ルテイン（エステル化又は遊離）である。
【００２８】
ルテインは、光及び酸化に感受性であるため、涼しく乾燥した場所において、光及び酸素に対して耐性の密閉容器中で貯蔵しなければならない。これらの予防措置にもかかわらず、これらの化合物の安定性は保証されない。
【００２９】
さらに、これらの貯蔵及び取扱い条件は、決して容易ではない。
【００３０】
ルテインは、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）などの特定の微細藻類中に高い割合で存在する。従って、より多くの量のルテインを有利に取得する生産方法を開発すると共に、こうした分子の脆弱性に固有の損失を埋め合わせるために、この微生物供給源を選択することが好ましい。
【００３１】
さらに、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類は、前述したカロテノイドの他に、全ての必須アミノ酸、飽和及び不飽和脂肪酸、多量のビタミン、ミネラル及び微量元素、並びにクロロフィルのような貴重な成分を含む独特の多様な成分を高濃度で含有する。
【００３２】
微細藻類はまた、タンパク質及び他の必須栄養素に富んだ魅力的な食物源候補でもあり、いったん乾燥すると、通常、約４５％のタンパク質、２０％の脂肪性物質、２０％の炭水化物、５％の繊維及び１０％のミネラル及びビタミンを呈示する。
【００３３】
しかし、カロテノイドと同様に、不飽和脂肪酸は、不飽和度が増すに従い、酸化に対する感受性はさらに高くなる。従って、多価不飽和リノール酸は、オレイン及びパルミトレインタイプのモノ（一価）不飽和酸より酸化に対して感受性が高い。
【００３４】
同じことはクロロフィル色素にも当てはまり、光酸化に対するその感受性は、当業者には周知である。
【００３５】
このように、クロロフィルの可溶性塩は、キサンチンより１０００倍超高く、レスベラトロール（ブドウ、クワなどのある種の果物に存在するスチルベンクラスのポリフェノール）より２０倍高い抗酸化活性を有することがわかっている。
【００３６】
従って、クロロフィル補助食品は、液状形態で、錠剤として又はカプセルとして市販されている。クロロフィルは、粉末形態の緑色野菜調合物に含まれていることが多い。
【００３７】
ビタミンに関して、水溶性のビタミンＢ群（例えば、ビタミンＢ９又はビタミンＢ１２）は、天然では壊れやすい（光、熱及び酸化に感受性である）。
【００３８】
生存生物の生化学における抗酸化物質としてのビタミンＡ、Ｃ及びＥの重要性は、文献にも多く記載されている。
【００３９】
ゆえに、これら栄養素全ての耐性を高めるためには、「外部攻撃因子」、すなわち光及び酸素からこれらを保護する必要がある。
【００４０】
ところで、これらの化合物を調製するための従来の方法は、その基本的生物媒体からの抽出／精製の後、密閉容器に封入することによって実施されている。
【００４１】
そのため、不活性雰囲気下での抗酸化添加剤及び貯蔵条件が推奨される。しかし、こうした技術は、実施するのに複雑かつ高価であるとこと以外に、あまり有効ではなく、しかも栄養及び健康の見地からも完全に満足できるものではない。
【００４２】
これに代わる技術的解決案が、特に米国特許第２００５／０１８６２９８号明細書に提示されており、これは、カロテノイドを産生する微細藻類のバイオマス中でカロテノイドを安定化することから成る。
【００４３】
この場合、より具体的には、アスタキサンチンを産生するヘモトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍｏｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）のバイオマスを安定化することが重要である。
【００４４】
しかし、この技術的解決案は、以下のことを推奨する：
−  乾燥バイオマスを生産し（通常、光合成条件−光及びＣＯ２の存在下での増殖−で実施されるが、従属栄養−同化性炭素含有供給源の存在下、暗所での発酵−でも生産することができる）、次に、
−  このバイオマスを、トコフェロールタイプの少なくとも２種の抗酸化剤の混合物と組み合わせる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００４５】
従って、本発明の基礎となる課題は、抗酸化剤又は安定剤などの化学薬品の添加を必要とせずに、単純な方法によって、酸化感受性代謝物、より具体的には、微細藻類、特に、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類により産生されるものを安定化する別の方法を提案することである。
【００４６】
従来の技術で知られる方法より有効な方法を開発する目的で、本出願人は、自身の研究を実施して、従属栄養での微細藻類の生産のためにこれら技術を改変することにより、この目的を達成することに成功した。
【００４７】
従属栄養で緑藻類、より具体的には、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の緑藻類を培養することは、ルテインなどの対象代謝物が豊富なバイオマスを調製するための一般的方法において知られている。
【００４８】
従って、１９６０年代以降、照明下の栄養要求性条件でさらに従来通りに培養した同じ微細藻類で得られるより、はるかに高収率で色素を得ることができると想定されている。
【００４９】
とりわけ、前述したように、この従属栄養生産方法の選択は、可能な限り高いルテイン含量を生産することにより、酸化的分解によりそれらの損失を補償することを目的とする。
【００５０】
雑誌：Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２３，ｐｐ  １２３３−１２３８に２００７年に発表された論文において、Ｗｕらは、ルテインの生産を最適化するように、バッチ式及びフェドバッチ式の従属栄養発酵培養によりルテインの生産をそのようにモデル化した。
【００５１】
しかし、出願人が知る限り、従来技術の文献のいずれも、対象代謝物を安定化するためのベクターとして、従属栄養条件下で生産されるバイオマス自体を使用することは記載又は示唆していない。
【００５２】
それどころか、この結果を達成するために、抗酸化剤を添加することが推奨されている。
【課題を解決するための手段】
【００５３】
従って、本発明は、ルテインなどのカロテノイド、パルミトレイン酸、オレイン酸若しくはリノール酸などの一価飽和及び多価飽和脂肪酸、クロロフィルＡ及びＢなどのクロロフィル色素、並びにビタミンＢ９及びＢ１２などのビタミンから成る群から、単独で若し
くは組み合わせて、選択される酸化感受性代謝物、より具体的にはカロテノイドを安定化又は貯蔵するための方法に関し、前記方法は、以下：
−  栄養因子が不足した培養段階を含む従属栄養条件下で微細藻類のバイオマスを発酵させるステップと、
−  酸化感受性代謝物が安定化された乾燥バイオマスを貯蔵するステップと
を含む。
【００５４】
「代謝物を安定化する」とは、１年を超える期間にわたる貯蔵後の対象代謝物の品質を保証することを意味し、これは、特に、酸化的分解に対する代謝物の保護に表れる。特に、貯蔵は、非不活性雰囲気下、室温で実施することができる。貯蔵ステップは、好ましくは室温で、少なくとも１２、１８又は２４時間持続する。
【００５５】
クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類により産生される「対象酸化感受性代謝物」とは、ルテインなどのカロテノイド、パルミトレイン酸、オレイン酸及びリノール酸などの一価不飽和及び多価不飽和脂肪酸、クロロフィルＡ及びＢなどのクロロフィル色素、並びにビタミンＢ９及びとりわけＢ１２などのビタミンから成る群から選択される化合物、より具体的にはカロテノイドを意味する。
【００５６】
「栄養因子が不足した」培養段階とは、微細藻類の栄養因子の少なくとも１つが、その正常な生育を可能にするのに不十分な量で供給される培養段階を意味する。「不十分な量」は、当該栄養因子の供給がゼロであると理解されないことに留意すべきである。これにより、その後、この栄養不足段階は、細胞の代謝を完全に阻害することなく、それを緩徐化（制限）する。
【００５７】
培養は、例えば、微細藻類が、制限のない場合に達成することができる消費速度を下回る速度で、栄養因子の１つが培地に供給されるような条件で実施する。
【００５８】
これはまた、微細藻類が当該栄養因子を供給と同時に消費するため、培地中の残留栄養因子の非存在としても表れる。
【００５９】
好ましくは、栄養因子は、炭素含有供給源、より具体的にはグルコースである。
【００６０】
このように、本発明は、その極端な酸化感受性が当業者には周知である、カロテノイドなどの代謝物を安定化する上で特に好適である。
【００６１】
従って、本発明のより具体的な状況において、カロテノイドの安定化は、微細藻類により産生される他の代謝物の安定化も保証し、前記代謝物は、酸化による分解を被りやすい。
【００６２】
とりわけ、酸化感受性代謝物は、バイオマスに含まれる微細藻類の細胞中に貯蔵される。
【００６３】
本発明の方法では、酸化感受性代謝物を保存する目的で、外因性抗酸化剤又は安定剤を添加する必要がなくなる。従って、好ましいことに、本方法は、前記乾燥バイオマスに外因性抗酸化剤又は安定剤を添加するステップを含まない。
【００６４】
従って、本発明は、保証される含量の対象代謝物（色素など）を含む天然バイオマスを提供する。
【００６５】
ここで、微細藻類のバイオマスとは、微細藻類、より具体的には、クロレラ・ソロキニ
アナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）などのクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類を意味する。極めて具体的な実施形態では、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）の株は、株ＵＴＥＸ  １６６３−Ｔｈｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆ  Ｔｅｘａｓ，Ａｕｓｔｉｎ−ＵＳＡである。
【００６６】
より具体的には、本明細書に記載する実施例において、安定化しようとする対象代謝物は、ルテインを含む全カロテノイド、クロロフィル及びビタミンである。好ましい実施形態では、安定化しようとする対象代謝物は、ルテインである。
【００６７】
従属栄養で培養する場合、微細藻類により天然に産生されないビタミンＢ１２は、培地に添加し、後に同化させる。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
本発明の好ましい実施形態では、微細藻類により産生される対象の酸化的分解−感受性代謝物の安定化に関して、最適な効率を保証する特定の従属栄養培養の条件で発酵を実施する。
【００６９】
従って、本方法は、第１ステップのバイオマス増殖、及び第２ステップの栄養因子が不足した培養を用いて、従属栄養条件下で微細藻類のバイオマスを発酵させることを含む。
【００７０】
バイオマスの生産は、従って、以下を含む：
・第１ステップのバッチ式発酵、
・第２ステップのフェドバッチ式発酵であって、炭素含有供給源が、微細藻類により完全に消費されたら、制限のない場合に微細藻類が達成し得る消費速度を下回る速度で、前記炭素含有供給源の連続的供給を行うステップを含むフェドバッチ式発酵。
【００７１】
本出願人は、厳密な意味でのバイオマスの生産ステップの前に、第１ステップの前培養（バッチ式発酵により）を実施することを推奨し、これによって、厳密な意味での生産発酵槽への播種に必要な量の微細藻類のバイオマスの生産を可能にする。
【００７２】
例えば、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）などのクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の株を培養しようとする場合、この第１ステップの前培養の後、以下に記載する実施例に示すように、５０〜６０の値の細胞密度（通常、６００ｎｍでの光学密度により測定する）が得られる。
【００７３】
微細藻類のバイオマスの生産に関して、従って、本方法は、例えば、前培養ステップで使用したものと同じ培地を用いた第１ステップのバッチ式発酵を含む。
【００７４】
微細藻類による炭素含有供給源の完全な消費があれば（ここで、培地中の残留グルコース＝０ｇ／ｌ）、前記炭素含有供給源が、微細藻類による消費速度を下回る速度で連続的に添加される。好ましい実施形態では、不足栄養因子はグルコースである。
【００７５】
クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）によるルテインの生産を最適化するために（Ｗｕらによる論文、前掲）、高グルコース濃度によってルテインの増加及び生産が阻害されれば、クロレラ・ピレノイドーサ（Ｃ．ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）によるルテインの生産の場合、５〜２４ｇ／ｌの最低グルコース濃度を選択することが推奨されると一般に想定されているところ、本出願人は、前記のようにして技術的推定を克服した。
【００７６】
従って、本発明に従って推奨される培養条件は、ルテインの生産を最適化するための従
来技術で一般に想定されているものと相いれない。
【００７７】
クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）の場合、本出願人は、残留グルコースを０ｇ／ｌに維持しながら、グルコースを１ｇ／ｌ／ｈ超で添加することを推奨する。例えば、グルコース供給速度は、１〜５ｇ／ｌ／ｈ、より具体的には２〜４ｇ／ｌ／ｈであってよい。この速度は、培地中の残留グルコースが０ｇ／ｌとなるように選択する。この速度は、制限がない場合のグルコース消費速度に基づいて決定してよい。従って、グルコース供給速度は、制限がない場合の上記グルコース消費速度の９０、８０、７０、６０又は５０％であってよい。
【００７８】
この速度は、従って、フェドバッチ操作の開始時には約２ｇ／ｌ／ｈに設定し、培養の終了時には４ｇ／ｌ／ｈまで増加することができる。
【００７９】
不足栄養因子の供給速度は、細胞増殖を非ゼロ速度に維持しながら、細胞増殖速度を低下又は緩徐化するように、選択するのが好ましい。特に、増殖速度を、グルコース制限がない場合の増殖速度と比較して１０〜６０％、特に、グルコース制限がない場合の増殖速度と比較して１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０又は５５％低下させることが提案される。好ましくは、増殖速度は、１５〜５５％低下させる。
【００８０】
例えば、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）の株の場合、本出願人は、少なくとも０．０４ｈ−１、例えば、０．０６ｈ−１〜０．０９ｈ−１の増殖率μを可能にするグルコース供給速度を選択することを推奨する。
【００８１】
従って、栄養因子の供給速度は、少なくとも０．０４ｈ−１、例えば、０．０６ｈ−１〜０．０９ｈ−１の細胞増殖率μを可能にするように選択する。
【００８２】
栄養因子、特にグルコースが不足した培養段階の持続時間は、少なくとも１時間、好ましくは少なくとも１０時間、より好ましくは少なくとも２０時間、特に３０〜６０時間である。
【００８３】
要望される量（例えば、３０〜８０ｇ／ｌ）のバイオマスに達したら、発酵を停止する（グルコースの供給を停止する）。
【００８４】
光合成条件で生産されるバイオマスと比較して、従属栄養条件下での発酵により得られるバイオマス中のカロテノイド（ルテイン）、ビタミン（Ｂ９、及びとりわけＢ１２）並びに全脂肪酸の変化を試験する目的で、安定性試験（１４ヵ月及び２３ヵ月）を実施した。
【００８５】
実施例に示すように、バイオマスを本発明の好ましい方法に従う従属栄養条件下で調製した場合、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）により産生された代謝物の安定性は、はるかに優れている。
【００８６】
従って、例えば、光バイオリアクターで得られるバイオマスは、１４ヵ月の貯蔵後にそのルテイン含量のほぼ８０％を喪失したが、従属栄養条件下で調製したバイオマスのそれは、不変であった。
【００８７】
また、本発明は、酸化感受性代謝物を安定化することを目的とする、栄養因子が不足した培養段階を含む従属栄養条件下で産生された微細藻類のバイオマスの使用にも関する。好ましくは、微細藻類は、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類の群から選択され、より具体的にはクロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａ
ｎａ）である。好ましくは、制限栄養因子は、炭素含有供給源、より具体的にはグルコースである。
【００８８】
本発明は、さらに、本発明の方法により得られるクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の微細藻類、より具体的にはクロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）のバイオマスにも関し、これは、前記乾燥バイオマスへ外因性抗酸化剤又は安定剤を添加することなく、室温で少なくとも１２、１８又は２４ヵ月の貯蔵後に、バイオマス１ｋｇ当たり少なくとも１ｇのルテインを含有することを特徴とする。
【００８９】
本発明は、以下に記載する実施例からより明瞭に理解されよう。尚、これらの実施例は、例示的であり、非限定的であることを意図する。
【実施例】
【００９０】
実施例１．本発明の好ましい実施形態に従う従属栄養条件下で培養するクロレラ・ソロキニアナ（Ｃ．Ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）のバイオマスの調製
段階１．前培養
前培養により、株の再活性化及び生産発酵槽の接種を実施する。
【００９１】
これは、三角フラスコ中で実施し、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）の株（株ＵＴＥＸ  １６６３−Ｔｈｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ，ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ，Ａｕｓｔｉｎ−ＵＳＡ）の冷凍チューブと、以下の表１に示す組成の培地６００ｍｌから開始する。
【００９２】
【表１】
2016514470.tif 000002
【００９３】
８Ｎ  ＮａＯＨを添加することにより、滅菌前にｐＨを７に調節する。
【００９４】
インキュベーションは、１１０ｒｐｍで７２時間撹拌（ＩＮＦＯＲＳ  Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ撹拌器）しながら、２８±１℃で実施する。
【００９５】
各三角フラスコのインキュベーションの終了時に得られるバイオマスの最終濃度を、６００ｎｍでのＯＤの測定から、約５０〜６０に位置する。
【００９６】
段階２．生産
発酵を実施するためのパラメータを以下の表２に示す。
【００９７】
【表２】
2016514470.tif 000003
【００９８】
ステップ１：バッチ式発酵
バッチ式用の培地は、前培養のもの（表１）と同一であるが、酵母エキスを含まず、尿素の代わりにＮＨ４Ｃｌを用いる（以下の表３）。
【００９９】
【表３】
2016514470.tif 000004
【０１００】
ステップ２．フェドバッチ式発酵
ビタミンＢ１２も、０．４７μｇ／ｌ（培地）の速度でバッチ段階において導入し、約
４００μｇ／１００ｇの乾燥バイオマスの値でバイオマス中に貯蔵されるように添加する。
【０１０１】
フェドバッチ段階では、培地中の残留含量がゼロになるように、株が可能にする消費の速度を下回る速度でのグルコースの連続的供給と一緒に、完全培地の供給を提供する。
【０１０２】
このグルコース供給の速度は、「フェドバッチ」の開始時で約２ｇ／ＬＡｌ／ｈ（ＡＩ＝播種後）であり、培養の終了時には４ｇ／ＬＡｌ／ｈまで上昇し得る。このステップでの増殖率μは、０．０７〜０．０８ｈ−１である。
【０１０３】
供給溶液中のグルコース濃度は、４００〜８００ｇ／Ｌの範囲であってよい。
【０１０４】
塩は、連続的に、個別に又はグルコースと混合して供給する。
【０１０５】
最初の添加は、バッチが終わった直後に実施しなければならないが、株の増殖の阻害を防止するために、塩は一度に供給してはならない。
【０１０６】
以下の表４は、グルコース１００ｇ当たりの塩の必要量を示す。
【０１０７】
【表４】
2016514470.tif 000005
【０１０８】
グルコースの供給は、細胞密度が８０ｇ／ｌに達したら停止する。これにより、培養が停止する。
【０１０９】
バイオマスを粉砕して乾物量＞９５％にする。
【０１１０】
実施例２．クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）により産生された酸化感受性代謝物の室温安定性の試験
従属栄養（発酵による）又は独立栄養（光バイオリアクター）で得られたバイオマスから抽出したカロテノイド、ルテイン、ビタミンＢ９、及びより具体的にはビタミンＢ１２の含量の変化を調べる目的で、安定性試験を室温で１４〜２３か月の期間にわたり実施した。
【０１１１】
この試験は、これら酸化感受性代謝物の安定性に対するクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の培養方法の効果を明らかにする。
【０１１２】
次の２つのバイオマスを比較する：
−  実施例１の条件に従い産生された第１バイオマス、
−  従来の条件（Ｐｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｒｅｈｍ  Ｈ．−Ｊ．，Ｒｅｅｄ  Ｇ．（編），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０，第２版，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，１０５−１３６）下、光バイオリアクター（ＰＢＲ４０００など）中で産生された第２バイオマス。
【０１１３】
これら２つの操作条件で産生された、ＤＭ（乾物量）９５％超の１００ｇのバイオマスについて測定を実施した。
【０１１４】
全カロテノイド及びルテインの含量の変化（ＨＰＬＣにより実施した測定）
【０１１５】
【表５】
2016514470.tif 000006
【０１１６】
全カロテノイドの安定性は、従属栄養で得られたバイオマス中の方が高い。
【０１１７】
ルテインについても同じ傾向が認められ、発酵させたバイオマスは、分解からルテインをより良好に保護する。
【０１１８】
ビタミンの含量の変化（方法：ＡＯＡＣ９５２．２０−Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ１２に従い実施したアッセイ）
従属栄養下の培地により供給されると、ビタミンＢ１２は、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）のバイオマスにより十分に同化され、この場合、その含量は、乾物量１００ｇ当たり約３６３μｇである。
【０１１９】
【表６】
2016514470.tif 000007
【０１２０】
ビタミンＢ１２の安定性は、これらケースの両方で、試験全体を通して認められる。値は、従属栄養で産生されたバイオマスについては３００μｇ／１００ｇの付近、独立栄養
で産生されたバイオマスについては１０５μｇ／１４００ｇの付近で変化した。
【０１２１】
クロロフィルの含量の変化（分光光度法により測定）
【０１２２】
【表７】
2016514470.tif 000008
【０１２３】
クロロフィルＢの含量は、両方の操作条件で安定したままであるが、これは、クロロフィルＡの含量については当てはまらず、発酵により産生されたバイオマス中の方がはるかに優れて安定化している。
【０１２４】
結論として、微細藻類により産生される代謝物は、発酵により産生されるバイオマス中で、より安定している（これらが感受性である酸化的分解に対するその優れた保護を表している）。
【０１２５】
この現象は、ルテイン含量についてさらに顕著であり、ルテイン含量は、発酵バイオマス中の方が明らかに優れて安定している（これに対し、独立栄養で産生されたバイオマス中では、８０％超が分解されている）。
【国際調査報告】
2016514470.tif 000009
2016514470.tif 000010
2016514470.tif 000011
2016514470.tif 000012