(57)【要約】  細胞膜電位が約−９０ｍＶである場合に細胞におけるＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害する化合物がここで提示される。好ましい化合物は、約−９０ｍＶの膜電位での１０μＭ以下のＩＣ50で、Ｔ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害する。好ましい化合物は、約−３０ｍＶ〜−６０ｍＶでのＴ型Ｃａ2+チャネル活性の阻害と比較して、１０：１以下の、約−９０ｍＶでＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害するための選択性を示す。細胞膜電位が約−９０ｍＶである場合に細胞におけるＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害する化合物を同定するための方法、およびかかる方法によって同定される化合物も提供される。
2016506248.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇ１／Ｓチェックポイントを通る細胞周期進行を阻害すること、細胞増殖性障害における細胞の増殖を阻害すること、および／または細胞増殖性障害の処置において放射線および／または化学療法薬の有効性を増強することにおける有用性に関して化合物を同定するための方法であって、前記方法が：
細胞の第１の細胞膜電位を約−７０ｍＶ〜約−１１０ｍＶの範囲にある電位で保持する場合に、前記化合物が前記細胞におけるＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害すると決定すること；および
前記決定に基づいて、Ｇ１／Ｓチェックポイントを通る細胞周期進行を阻害すること、細胞増殖性障害における細胞の増殖を阻害すること、および／または細胞増殖性障害の処置において放射線および／または化学療法薬の有効性を増強することにおける有用性に関して化合物を同定することを含む、化合物を同定するための方法。
【請求項２】
前記細胞の前記第１の細胞膜電位を約−８０ｍＶ〜約−１００ｍＶの範囲にある電位で保持する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞の前記第１の細胞膜電位を約−９０ｍＶの電位で保持する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞を前記第１の細胞膜電位で保持する場合に、前記Ｔ型カルシウムチャネル活性を阻害することにおける前記化合物のＩＣ50である第１のＩＣ50を決定することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記有用性に関して前記化合物を同定することが、前記第１のＩＣ50が約１０００μＭ以下であるという決定に基づく、任意の請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記有用性に関して前記化合物を同定することが、前記第１のＩＣ50が約１０μＭ以下であるという決定に基づく、任意の請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物の第２のＩＣ50を決定することをさらに含む方法であって、前記第２のＩＣ50が、細胞を約−３０ｍＶ〜約−６０ｍＶの範囲にある第２の細胞膜電位で保持する場合に、前記細胞における前記Ｔ型カルシウムチャネル活性を阻害することにおける前記化合物の前記ＩＣ50である、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第２の細胞膜電位が、約−３０ｍＶ〜約−５０ｍＶの範囲にある、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の細胞膜電位が、約−４０ｍＶである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のＩＣ50対前記第２のＩＣ50の比が、約２０：１以下、好ましくは約１０：１以下であるという決定に基づいて、前記有用性に関して化合物を同定することをさらに含む、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のＩＣ50対前記第２のＩＣ50の比が、約１：１以下、好ましくは約１：１０以下であるという決定に基づいて、前記有用性に関して化合物を同定することをさらに含む、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のＩＣ50対前記第２のＩＣ50の比が、約２０：１以下、好ましくは約１０：１以下であるという決定に基づいて、前記化合物が、神経によって媒介される副作用に関する減少した傾向を有することを同定することをさらに含む、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のＩＣ50対前記第２のＩＣ50の比が、約１：１以下、好ましくは約１：１０以下であるという決定に基づいて、前記化合物が、神経によって媒介される副作用に関する減少した傾向を有することを同定することをさらに含む、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞膜電位を、パッチクランプ技法を使用して制御する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
化合物がＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害する能力を、前記化合物が前記細胞中への成長因子刺激カルシウム流入を阻害する能力を決定することによって決定する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞中へのカルシウム流入を、カルシウム感受性マーカーを使用して、細胞内カルシウムのレベルの増加を測定することによって決定する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記カルシウム感受性マーカーが、カルシウム感受性蛍光色素である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ｇ１／Ｓチェックポイントを通る細胞周期進行を阻害することにおける有用性に関して前記化合物を同定することを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
細胞増殖性障害における細胞の増殖を阻害することにおける有用性に関して前記化合物を同定することを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞増殖性障害のための処置を必要としている対象の１つ以上の増殖細胞を使用して、前記方法を行う、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象に、前記細胞増殖性障害を処置するために有効量の前記化合物を投与することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
細胞増殖性障害の処置において放射線および／または化学療法薬の有効性を増強することにおける有用性に関して前記化合物を同定することを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記化合物を放射線および／または化学療法薬の投与に先立って投与する場合に、細胞増殖性障害の処置において前記放射線および／または化学療法薬の有効性を増強することにおける有用性に関して前記化合物を同定する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法を、前記細胞増殖性障害のための処置を必要としている対象の１つ以上の増殖細胞を使用して行う、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記対象に、前記細胞増殖性障害を処置するために有効量の放射線および／または化学療法薬と組み合わせた有効量の前記化合物を投与することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞増殖性障害を処置するための前記対象への放射線および／または化学療法薬の投与に先立って、前記化合物を投与することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記対象に、前記細胞増殖性障害を処置するために有効量の前記化学療法薬と組み合わせた有効量の前記化合物を投与することを含む、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記化学療法薬が、テモゾロミド、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、ブレオマイシン、カルボプラチン、シスプラチン、ダカルバジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イリノテカン、トポテカン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン；ビンデシンおよびマイトマイシンＣからなる群から選択される、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記化学療法薬がテモゾロミドである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記化学療法薬がカルボプラチンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記化学療法薬がゲムシタビンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞増殖性障害が癌である、請求項１〜１７または１９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記癌が、脳癌、乳癌、結腸癌、神経膠腫、グリア芽細胞腫、メラノーマ、卵巣癌および膵癌からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記癌が脳癌である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記癌が神経膠腫である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記癌が卵巣癌である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記癌が膵癌である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
約−９０ｍＶの細胞膜電位で細胞におけるＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害する化合物。
【請求項３９】
前記化合物が、約−９０ｍＶの細胞膜電位で約１０μＭ未満のＩＣ50でＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害する、請求項３８に記載の化合物。
【請求項４０】
約−３０ｍＶ〜−６０ｍＶの細胞膜電位でＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害するための前記化合物のＩＣ50と比較して、約−９０ｍＶの細胞膜電位でＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害するための前記化合物の前記ＩＣ50が、１０：１以下である、請求項３８または３９に記載の化合物。
【請求項４１】
前記化合物が細胞増殖を阻害する、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４２】
前記化合物が癌細胞増殖を阻害する、請求項４１に記載の化合物。
【請求項４３】
前記化合物が、神経細胞活性の阻害をほとんどまたは全く示さない、請求項３８〜４２のいずれかに記載の化合物。
【請求項４４】
約−９０ｍＶの細胞膜電位で細胞におけるＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害する化合物を同定するための方法であって、前記細胞膜電位を約−９０ｍＶで保持する場合に、化合物が細胞におけるＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害する能力を決定することを含む方法。
【請求項４５】
パッチクランプ技法によって、前記細胞膜電位を約−９０ｍＶで保持する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
化合物が約−９０ｍＶの細胞膜電位で細胞におけるＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害する能力を、前記化合物が前記膜電位で前記細胞中への成長因子刺激カルシウム流入を防ぐ能力を決定することによって決定する、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞中へのカルシウム流入を、カルシウム感受性マーカーを使用して、細胞内カルシウムのレベルの増加を測定することによって決定する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記カルシウム感受性マーカーが、カルシウム感受性蛍光色素である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
請求項４４〜４８のいずれか１項に記載の方法によって同定される化合物。
【請求項５０】
癌細胞の増殖を阻害するための方法であって、有効量の請求項３８〜４３のいずれかに記載の化合物を投与することを含む、癌細胞の増殖を阻害するための方法。
【請求項５１】
前記化合物が、ミベフラジルまたはＴＨ−１１７７またはミベフラジルもしくはＴＨ−１１７７の薬学的に許容される塩である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記癌細胞が上皮癌細胞である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記癌細胞が癌幹細胞である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
対象における癌を処置するための方法であって、癌処置を必要としている対象に、有効量の請求項３８〜４３のいずれかに記載の化合物を投与することを含む、対象における癌を処置するための方法。
【請求項５５】
前記化合物が、ミベフラジルまたはＴＨ−１１７７またはミベフラジルもしくはＴＨ−１１７７の薬学的に許容される塩である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記癌が上皮起源の癌である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
癌の処置または予防のための医薬組成物であって、請求項３８〜４３のいずれか１項に記載の化合物を含む、癌の処置または予防のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１月１０日に提出された米国仮出願第６１／７５１，０３８号の利益を主張し、その開示全体が参照によってここに組み込まれている。
【０００２】
本開示は、治療的に有用な化合物、処置の方法、および治療的に有用な化合物を同定するための方法に関する。
【背景】
【０００３】
細胞周期の様々なポイントでのＣａ2+インフラックスは、進行に決定的であるが、詳細な役割およびＣａ2+がそこを通って作用する経路は大部分が分かりにくいままである。近年、１つのかかる経路、1、2すなわちＧ１／Ｓ移行または制限点を通っての通過を可能にすることにおけるＣａ2+インフラックスの役割；細胞周期進行における成長因子駆動、一方向性の工程の全貌を知ることが可能である。Ｇ１／Ｓ移行は、成長因子シグナル伝達および栄養素利用性を含めた多くの必須の細胞性入力からの情報を統合するのに役立つ。Ｇ１からＳ移行における多くの主要なタンパク質における遺伝的または後成的な変化は、細胞が分裂刺激とは独立して増殖することを可能にし得るので、この制限点は癌表現型に中心的である。3細胞周期キナーゼを標的として細胞周期におけるＧ１／Ｓおよび他の移行ポイントの調節不全を阻害することにかなりの努力が重ねられてきた。3しかしながら、Ｃａ2+インフラックスは、Ｇ１／Ｓ制限点を越えての成長因子駆動移行に関する経路の中心的な要素であり、おそらく制限からの解放に必須であるＣａ2+依存性プロセスの数のために、どの研究も、この事象からの後天性の独立を同定することができなかった。
【０００４】
カルシウムは、多くの細胞プロセスの決定的な制御因子であり、したがって、そのインフラックスは、厳しく制御されている。非常に一般的な用語では、この調節は、電気的または生化学的のいずれかとすることができる。電気的制御は、報告されたこれらの調節機構の最初のものであり、ＨｏｄｇｋｉｎおよびＨｕｘｌｅｙの先駆的研究において概説された（Ｈｕｘｌｅｙ  ａｎｄ  Ｈｏｄｇｋｉｎ，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１：４２４−５４４（１９５２））。この形の調節においては、Ｃａ2+チャネルが開かれて、Ｃａ2+を入れ、その後膜電位の変化に応答して閉じられる。この「ゲーティング」の詳細は、生化学的事象、例えばタンパク質キナーゼＡ4またはカルモジュリン5の活性化によって修飾され得るが、支配的な調節事象は、膜電位、最も注目すべきは活動電位の改変である。
【０００５】
細胞内カルシウム調節は、細胞周期移行およびアポトーシスを調節する複数のシグナル伝達経路の重要な要素である。癌細胞は、細胞周期を通って進行し、通常のカルシウム媒介チェックポイントをバイパスすることができ、これは、癌細胞が、細胞内カルシウムを調節するための代替の機構を発達させたことを示している。癌細胞がＴ型カルシウムチャネルを発現するという新しい証拠は、これらのチャネルがチェックポイント非依存性細胞周期進行および細胞増殖における役割を果たしていることを示唆している（Ｔａｙｌｏｒ  ＪＴら，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１４：４９８４−４９９１，２００８）。
【０００６】
膜電位は、細胞外部より高い濃度での、細胞内空間における正に荷電したイオン、例えばナトリウム、カリウムおよびカルシウムイオンの存在によって生み出される。細胞における膜電位は、典型的に−４０ｍＶ〜−８０ｍＶの範囲にある。電気的に興奮性の細胞、例えば神経細胞において、本質的に２つのレベルの膜電位：静止（非興奮）電位、およびより高い、閾電位がある。神経細胞において、静止電位は、約−７０ミリボルト（ｍＶ）であり、閾電位は、約−５５ｍＶである。神経細胞のシナプス刺激は、膜電位を脱分極させる（上昇させる）または過分極させる（低下させる）。活動電位は、細胞の電気的膜電位における一過性の「スパイク」である。活動電位は、閾値まで膜電位を至らせるために十分な脱分極が蓄積した場合に、トリガーされる。
【０００７】
全ての細胞は、膜電位を有するけれども、大部分の細胞は、活動電位を発生するための分子機構または細胞形状を有していない。にもかかわらず、全ての細胞は、プロセス、例えば分泌または細胞分裂を調節するためにサイトゾルのＣａ2+の増加を使用する。これらの細胞は、いわゆる容量性のＣａ2+流入における内部Ｃａ2+保管貯蔵所の枯渇によってＣａ2+インフラックスを開始すると考えられている。6しかしながら、この機構は、細胞分裂のプロセスにおいて有効ではない可能性があり、そうだとすると、それは癌生物学または療法に関連していない。7容量性の経路の構成要素の関与に関する複雑なモデルが導入されて、それらを細胞分裂に決定的に必要なＣａ2+インフラックスを調節することに結びつけたが、7細胞分裂におけるこの経路の役割は、不明確なままである。多くのイオンチャネルが、Ｃａ2+がそこを通り抜けてＧ１／Ｓ移行を可能にする分子経路として示唆されてきたが、8単一の経路が単に細胞系だけでなく、細胞系列において支配的であるというコンセンサスは達成されていない。
【０００８】
電気的に興奮性の細胞におけるＣａ2+チャネルの調節を報告する証拠が蓄積してきた。電気的に非興奮性の細胞におけるＣａ2+流入の調節の概略を述べる証拠もあるが、これは、細胞分裂およびＧ１／Ｓ境界を越えての通過に必要であるＣａ2+の流入を説明する見込みはない。そして、癌および幹細胞において発現されるＴ型Ｃａ2+チャネルがあるが、これらはボルテージ作動性である。癌細胞および幹細胞の大部分の型は、かかるボルテージ作動性チャネルを調節するために必要であると考えられている活動電位を有さないので、これらのチャネルの機能または調節の理解はほとんどない。
【概要】
【０００９】
本開示は、細胞膜電位が約−９０ｍＶである場合に細胞におけるＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害する化合物を提供する。好ましい化合物は、約−９０ｍＶの膜電位での１０μＭ以下のＩＣ50で、Ｔ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害する。好ましい化合物は、約−９０ｍＶの膜電位でのＴ型Ｃａ2+チャネル活性の阻害に選択的でもあり、約−３０〜−６０ｍＶでのＴ型Ｃａ2+チャネル活性の阻害と比較して、１０：１以下の、約−９０ｍＶでのＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害するための選択性を示す。かかる化合物は、細胞増殖を防ぐのに有用であり、神経細胞活性の阻害をほとんどまたは全く示さずに、癌および他の新生物性細胞の増殖を防ぐことができる。
【００１０】
本開示は、有効量の上記の細胞膜電位が約−９０ｍＶである場合に細胞におけるＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害する化合物を投与することによって、癌細胞の増殖を阻害するための方法をさらに提供する。癌細胞は、任意の癌細胞、例えば上皮癌細胞または癌幹細胞とすることができる。ある特定の態様において、投与する化合物は、ミベフラジルまたはＴＨ−１１７７である。
【００１１】
本開示は、癌処置を必要としている対象に、有効量の上記の細胞膜電位が約−９０ｍＶである場合に細胞におけるＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害する化合物を投与することによって、対象における癌を処置するための方法も提供する。癌は、任意の癌、例えば上皮癌とすることができる。ある特定の態様において、投与する化合物は、ミベフラジルまたはＴＨ−１１７７である。別の態様において、対象はヒトである。
【００１２】
ここで開示した化合物を少なくとも含有する癌の処置のための医薬組成物を、ここでさらに開示する。
【００１３】
本開示は、細胞膜電位が約−９０ｍＶである場合に細胞におけるＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害する化合物を同定する方法をさらに提供する。これらの方法は、細胞膜電位を約−９０ｍＶで保持する場合に、化合物が細胞におけるＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害する能力を決定することを含む。膜電位を、当技術分野で既知の技法、例えばパッチクランプ技法によって、約−９０ｍＶで保持することができる。細胞膜電位が約−９０ｍＶである場合に化合物が細胞におけるＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害する能力を、例えば、化合物が細胞中への成長因子刺激カルシウム流入を防ぐ能力を決定することによって、決定することができる。細胞中へのカルシウム流入を、細胞内カルシウムのレベルの増加を測定することによって、例えばカルシウム感受性蛍光色素の使用によって、決定することができる。
【００１４】
本開示は、Ｇ１／Ｓチェックポイントを通る細胞周期進行を阻害すること、細胞増殖性障害における細胞の増殖を阻害すること、および／または細胞増殖性障害の処置において放射線および／または化学療法薬の有効性を増強することにおける有用性に関して化合物を同定するための方法も提供する。方法は、細胞の第１の細胞膜電位を約−７０ｍＶ〜約−１１０ｍＶの範囲にある電位で保持する場合に、化合物が細胞におけるＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害すると決定すること；および、前記決定に基づいて、Ｇ１／Ｓチェックポイントを通る細胞周期進行を阻害すること、細胞増殖性障害の処置において細胞の増殖を阻害すること、および／または細胞増殖性障害の処置において放射線および／または化学療法薬の有効性を増強することにおける有用性に関して化合物を同定することを含む。
【００１５】
本発明の１つ以上の態様の詳細を、添付の図面および以下の説明において述べる。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、成長因子受容体活性化Ｃａ2+を、Ｇ１／Ｓ制限点を越えての通過につながる生化学的カスケードと連結する経路の１つの概略図である。
【図２】図２は、Ｔ型Ｃａ2+チャネルの成長因子調節活性化に関する工程の図表示である。［Ｃａ2+］Iは、細胞内Ｃａ2+濃度であり、ψは、膜電位である。
【詳細な説明】
【００１７】
本開示において、明確にするために別個の態様の文脈で記載された本発明のある特定の特徴を、単一の態様における組合せで提供することもできることが理解されよう。逆に、簡潔にするために単一の態様の文脈で記載された本発明の様々な特徴を、別個にまたは任意の適したサブコンビネーションで提供することもできる。
【００１８】
本開示は、Ｔ型Ｃａ2+チャネルの阻害に関与する、癌および新生物性または増殖性疾患のための処置を提供する。本発明者らは、具体的には細胞膜電位が約−９０ｍＶである場合に、細胞におけるＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害することによる、Ｔ型Ｃａ2+チャネル活性の阻害が、新生物性障害の進行を防ぎ、癌を処置することができると決定した。
【００１９】
本発明は、特定の膜電位での応答性の阻害によるボルテージ作動性Ｔ型Ｃａ2+チャネルの阻害が、新生物性または癌細胞増殖の処置において有用であるという発見に関する。典型的な化学療法薬とは異なり、約−９０ｍＶの膜電位でＴ型Ｃａ2+チャネル活性を選択的に阻害するアンタゴニストは、免疫系機能に及ぼす制限された効果で、またはこの効果なく、癌細胞の増殖を防ぐことができる。したがって、かかるアンタゴニストの投与が、癌のための処置法としてここで提示される。
【００２０】
Ｔ型カルシウムチャネルを遮断する化合物は、（痛み、てんかんなどの処置において使用することができる）神経細胞様活性、（癌などの処置において使用することができる）抗増殖性活性、または時折の両方の活性のいずれかを示すことができる。Ｔ型カルシウムチャネルを遮断する化合物の挙動における差、例えば神経細胞におけるＴ型チャネルと増殖細胞におけるＴ型チャネルとの間のチャネルにおける潜在的な差（例えば、翻訳後修飾）を合理化するいくつかの可能性がある。他のものは、Ｔ型カルシウムチャネルでの抗増殖性化合物の活性が、偶発的であり、抗増殖の機構と無関係であること；抗増殖性機構は、全く異なる標的であることを示唆した。
【００２１】
本発明者らは、効果的な抗増殖性化合物が、細胞電位を−９０ｍＶで保持する場合に、約１０ｍＭ未満のＩＣ50値でＴ型チャネルを遮断することを発見した。電位が−４０ｍＶである場合にＴ型カルシウムチャネルを通してのカルシウム流入を高い効力で遮断する化合物は、神経細胞障害において効果的である。抗増殖性活性に関する選択性を実証する化合物は、好ましくは、−４０ｍＶ状態と比較して、−９０ｍＶ状態で＜１０のＩＣ50値を有する化合物である（すなわち、約−９０ｍＶでのＩＣ50値が、−４０ｍＶでのＩＣ50値の１０倍以下である）。
【００２２】
ミベフラジルは、−９０ｍＶ状態を優先的に遮断し、抗増殖性である。異なる骨格を有する他の抗増殖性化合物であるＴＴＬ−１１７０およびクロピモジド（chlopimozide）は、同様の選択性を示すものとしてここで同定された。抗増殖性活性を有さず、強力な神経細胞活性を示す他の化合物（例えば、ＴＴＡ−Ａ２およびＭＫ−８９９８）は、−４０ｍＶと比較して、−９０ｍＶでの減少した選択性を示す。したがって、本開示は、細胞膜電位が約−９０ｍＶである場合に細胞におけるＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害する化合物を同定する方法、および抗増殖性活性に関するこの実験プロトコールまたはその自明な拡張の使用を通して同定される任意の化合物を包含する。
【００２３】
「Ｔ型カルシウムチャネル」または「Ｔ型Ｃａ2+チャネル」は、ＣＡＣＮＡ１Ｇ遺伝子によってコードされるＣａｖ３．１、ＣＡＣＮＡ１Ｈ遺伝子によってコードされるＣａｖ３．２、またはＣＡＣＮＡ１Ｉ遺伝子によってコードされるＣａｖ３．３の型のＣａ2+選択的α１サブユニットを有する、またはこれらと同様の活性および／またはアミノ酸配列同一性を有する低ボルテージ活性化イオンチャネルである。１つの態様において、Ｔ型Ｃａ2+チャネルは、ＣＡＣＮＡ１Ｈ遺伝子によってコードされるα１サブユニットＣａｖ３．２を有する。
【００２４】
ここで使用する「阻害」は、活性の減少または予防を表す。
【００２５】
「アンタゴニスト」または「阻害剤」は、活性または機能を阻害する。例えば、化合物は、タンパク質発現を阻害する、減少させるもしくは排除すること、またはタンパク質活性を防ぐこと、または他のタンパク質とのタンパク質の相互作用を防ぐことによって、アンタゴニストまたは阻害剤として作用することができ、タンパク質媒介機能またはシグナル伝達の阻害を生じる。アンタゴニスト／阻害化合物の例は、Ｔ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害する、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ／ｓｉＲＮＡ、小分子、化学療法薬、ならびにその断片、誘導体および類似体を含む。１つの例において、化合物は、細胞膜電位が約−９０ｍＶである場合に、約１０μＭ未満の半数阻害濃度（half maximal inhibitory concentration）（ＩＣ50）でＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害する。別の例において、細胞膜電位が約−９０ｍＶである場合にＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害するための化合物の選択性は、細胞膜電位が約−３０〜−６０ｍＶである場合にＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害するための化合物の選択性と比較して、１：１０以下である。
【００２６】
本発明の例示的な化合物は、細胞膜電位が約−９０ｍＶである場合に、約１０μＭ未満の半数阻害濃度（ＩＣ50）で、Ｔ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害する。ＩＣ50は、生物活性を阻害することにおける化合物の有効性の測定値である。化合物のＩＣ50を決定するための方法は、当技術分野で既知であり、用量反応曲線を例えば使用した機能的アンタゴニストアッセイ、または化合物が標的分子から既知の結合パートナーを移動する能力を例えば測定する競合結合アッセイを含む。
【００２７】
本発明によって阻害することができるＴ型Ｃａ2+チャネルの活性は、細胞カルシウム取込み；細胞内カルシウムレベルの調節および／または媒介；細胞内ウインドウ電流（intracellular window current）の調節および／または媒介；カルシウム媒介シグナル伝達および／またはカルシウムシグナル伝達経路の調節；Ｇ１／Ｓ移行または制限点（Ｒ点）を通る通過を可能にすること；細胞周期進行を可能にすること；細胞成長および増殖、特に過剰なまたは不必要な増殖を開始するかつ／または維持すること；新形成および／または腫瘍成長を開始するかつ／または維持すること；ならびに血管形成および／または転移を開始するかつ／または維持することを含むが、これらに限定されない。
【００２８】
本発明者らは、細胞膜電位が約−９０ｍＶである場合の細胞におけるＴ型Ｃａ2+チャネル活性の阻害が、不必要な細胞増殖、例えば癌細胞増殖を優先的に阻害することができることを発見した。
【００２９】
ここで使用する、「約」および「およそ」という用語は、値が、その値を決定するために用いる方法に例えば基づく固有の変動、または自然発生の変動、例えば単一細胞において見出される静止または膜電位における変動、または異なる細胞間に見出される静止または膜電位における変動を含むことを示す。１つの非限定的な態様において、用語は、１０％以内、５％以内、１％以内、または０．５％以内であると定義される。同様に、「約−９０ｍＶ」の膜電位は、−８０ｍＶ〜−１００ｍＶの測定された範囲内、または−８５ｍＶ〜−９５ｍＶの範囲内、または−８９ｍＶ〜−９１ｍＶの範囲内の膜電位を含むことができる。別の例において、「約−３０〜−６０ｍＶ」の膜電位は、−２０ｍＶ〜−７０ｍＶの範囲内、または−２５ｍＶ〜−６５ｍＶの範囲内の膜電位を含むことができ、膜電位範囲、例えば約−３０ｍＶ〜−４０ｍＶ、約−３０ｍＶ〜−５０ｍＶ、約−３０ｍＶ〜−７０ｍＶ、約−４０ｍＶ〜−５０ｍＶ、約−４０ｍＶ〜−６０ｍＶ、約−４０ｍＶ〜−７０ｍＶ、約−５０ｍＶ〜−６０ｍＶ、および約−５０〜−７０ｍＶ、ならびに約−３０ｍＶ、約−４０ｍＶ、約−５０ｍＶ、および約−６０ｍＶも包含する。
【００３０】
「選択性」および「特異性」という用語は、ここで互換的に使用されて、別の状態または条件に対してある状態または条件での阻害に関する優先を表す。選択性または特異性は、絶対的であり得、ある状態または条件のみでの阻害、および異なる状態または条件での非阻害を示す。選択性または特異性は、相対的でもあり得、ある状態または条件（すなわち、ある膜電位での細胞または細胞型に関する）でのいくらかの阻害および別の状態または条件（すなわち、異なる膜電位での同じ細胞または細胞型に関する）でのいくらかの阻害も示す。
【００３１】
抗増殖性活性に関する選択性を実証する化合物は、約−４０ｍＶ状態と比較して、１０：１以下の−９０ｍＶ状態でのＩＣ50値を有する化合物として例証される、すなわち、約−９０ｍＶの膜電位での化合物のＩＣ50値が、−３０ｍＶ〜−６０ｍＶの膜電位での、または約−４０ｍＶでの同じ化合物のＩＣ50値の１０倍以下である。例えば、−８０ｍＶ〜−９０ｍＶの細胞膜電位でＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害するための化合物、例えばミベフラジルのＩＣ50は、およそ１μＭとすることができ、一方、細胞膜電位が約−３０ｍＶ〜−６０ｍＶである場合にＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害するための化合物、例えばミベフラジルのＩＣ50は、約０．１μＭ以上、例えば０．１５μＭ、０．２μＭ、０．２５μＭ、０．３μＭ、最大１．０μＭ以上とすることができる。
【００３２】
細胞の膜電位は、初期Ｇ１において約−３０ｍＶであるけれども、それは、後期Ｇ１において約−６０ｍＶに低下し、次いで、細胞がＧ１を出てＳ期に入るとき、約−９０ｍＶに急速に下落する。1Ｔ型カルシウムチャネルが開いてＧ１／Ｓ移行を可能にするのはこのポイントである。したがって、それらが約−３０ｍＶ〜−６０ｍＶである場合にチャネルを阻害することにおける高い効力を有するＴ型カルシウムチャネル遮断薬は、Ｓ期に入ることに及ぼす効果をほとんど有さないことになる。かかる化合物の例は、ＴＴＡ−Ａ２およびＭＫ−８９９８（Ｋｒａｕｓら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３３５：４０９−１７（２０１０）および米国特許第７，８７５，６３６号参照）である。これらの化合物は、Ｔ型カルシウムチャネルの阻害に関する高い効力を有するが、癌細胞の増殖に及ぼす効果をほとんどまたは全く有さない。したがって、Ｔ型カルシウムチャネルの高い効力の遮断は、それ自体は、癌の処置における臨床的有用性を予測しない。
【００３３】
ＴＴＡ−Ａ２およびＭＫ−８９９８での状況は、別のＴ型カルシウムチャネル遮断薬である、ミベフラジルの状況とは異なる。−９０ｍＶに対して約−３０ｍＶ〜−６０ｍＶでミベフラジルはチャネルを優先的に遮断するが、この優先性は、他の化合物に関する約１０００対１［Ｋｒａｕｓら，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３３５：４０９−１７（２０１０）］ではなく、約１０対１［Ｇｏｍｏｒａら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９２：９６−１０３（２０００）］である。この顕著な違いは、図において示されるように、ミベフラジルが癌細胞増殖を阻害する能力に反映されている。ミベフラジルのこの阻害作用は、それに、より強力な遮断薬ＭＫ−８９９８とは異なって、癌における臨床的有用性を有する潜在力を与える。
【００３４】
したがって、医薬品がＴ型チャネルを遮断する効力は、それ自体は、癌の処置における臨床的有用性を与えない。むしろ、約−９０ｍＶでＴ型カルシウムチャネルを遮断する能力は、決定的な特質である。さらに、約−３０ｍＶ〜−６０ｍＶでの高い効力の結合は無関係であり、医薬品の望まれない効果に寄与し得る。
【００３５】
したがって、細胞膜電位が約−９０ｍＶである場合に細胞におけるＴ型Ｃａ2+チャネル活性を選択的に阻害する化合物は、不必要な細胞増殖を阻害することができる一方で、化合物、例えばＴＴＡ−Ａ２およびＭＫ−８９９８と比較して、神経細胞活性に及ぼす効果をほとんどまたは全く有さない。加えて、細胞膜電位が約−９０ｍＶである場合に細胞におけるＴ型Ｃａ2+チャネル活性を選択的に阻害する化合物は、癌細胞増殖を処置することができる一方で、他の化学療法化合物と比較して、免疫細胞機能に及ぼす最小の効果を有する。
【００３６】
Ｔ型Ｃａ2+チャネルは、小さい膜脱分極によって活性化および不活性化され、遅い非活性化速度を示す。したがって、これらのチャネルは、低膜電位で脱分極電流を保有することができ、活性化と低または静止膜電位での定常状態不活性化との間のボルテージ重複内に起こる、細胞「ウインドウ」電流を媒介する（Ｔｓｉｅｎ  ＲＷら  ｉｎ  Ｌｏｗ−ｖｏｌｔａｇｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ−ｔｙｐｅ  Ｃａ2+  ｃｈａｎｎｅｌｓ，Ｃｈｅｓｔｅｒ：Ａｄｉｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ，ｐｐ．１−３９４，１９９８；Ｃｒｕｎｅｌｌｉ  Ｖら，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５６２：１２１−１２９，２００５）。Ｔ型Ｃａ2+チャネルは、ウインドウ電流を非刺激または静止膜電位で維持することができ、それによって、不活性化されていないチャネルの部分によって保有された持続性の内向きカルシウム電流を可能にする（Ｂｅａｎ  ＢＰ，ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ  ＳＩ，Ｎｅｕｒｏｎ  ２０：８２５−８２８，１９９８）。ウインドウ電流の媒介は、非刺激または静止細胞条件下で、電気的に発火している細胞、例えば神経細胞におけるのと、非興奮性の組織におけるのとの両方で、Ｔ型Ｃａ2+チャネルが細胞内カルシウムレベルを調節することを可能にする。
【００３７】
全てのボルテージ作動性イオンチャネルと同じように、Ｔ型Ｃａ2+チャネルは、閉じている、開いているおよび不活性化されているの３つの主要な状態を有する。25単純な用語では、特定のシークエンスにおけるボルテージ作動性チャネル周期：閉じている、開いている、不活性化されている；閉じている、開いている、不活性化されている；など。ボルテージ作動性チャネルにおいて予想されるように、これらの様々な状態は、膜電位における実験的に課された変化によって誘導することができる。これらの実験的システムにおいて、Ｔ型Ｃａ2+チャネルは、癌細胞の静止膜電位（−６０ｍＶ）で大部分が不活性化されており、大部分が閉じており、Ｃａ2+活性化Ｋ+チャネルの活性化によって引き起こされる過分極された電位（約−９０ｍＶ）で、開くことができる。
【００３８】
Ｇ１／Ｓ移行を可能にする普遍的なＣａ2+流入経路に関する現在までの最も有力な証拠は、骨髄由来ではない細胞におけるボルテージ作動性Ｔ型Ｃａ2+に関して提示された。2、9、10１９９２年の癌細胞におけるＴ型Ｃａ2+チャネルの最初の説明以来、11癌細胞におけるＴ型Ｃａ2+チャネルの物理的および機能的発現に関する証拠は増してきた。12しかし、活動電位を発生しない細胞、例えば癌細胞におけるボルテージ作動性Ｃａ2+チャネルに関する中心的役割の示唆は、懐疑を招いた。
【００３９】
Ｔ型Ｃａ2+チャネル関与に関する証拠は、いくつかの研究ラインに由来する。第１に、干渉ＲＮＡ標的Ｔ型Ｃａ2+チャネルの取込みによる細胞系におけるＴ型Ｃａ2+チャネルの操作は、Ｇ１／Ｓ境界を越えての通過を阻害することによって、これらの細胞の増殖を遮断するまたは遅くする。13、14逆に、Ｔ型Ｃａ2+チャネル発現の上方調節は、増殖の速度を増加させる。15加えて、不同性の化学的分類からの薬理的阻害剤は、Ｔ型Ｃａ2+チャネルを阻害し、Ｇ１／Ｓ境界を越えての通過を阻害することによって、癌細胞の増殖を一致して遮断する。16加えて、Ｔ型Ｃａ2+チャネルアイソフォームＣａｖ３．２（カルシウムチャネル、ボルテージ依存性、Ｔ型、アルファ１Ｈサブユニット）に関するｍＲＮＡおよび／またはそのδ２５スプライスバリアントが、いろいろな癌細胞型において見出された。16、17さらに、Ｃａｖ３．２メッセージおよび薬物感受性の存在または非存在の１：１の一致がある。17
Ｔ型Ｃａ2+チャネルは、チャネルが開いてカルシウムを入れ、膜電位の変化に応答して、特に膜を横断した活動電位における改変に応答して閉じるという点で、「電気的に調節された」または「活動電位調節」活性を有する。例えば、Ｔ型Ｃａ2+チャネルは、約−３０ｍＶ〜−６０ｍＶの静止膜電位で大部分が不活性化されているが、約−９０ｍＶの過分極した電位での、カルシウム活性化カルモジュリン（ＣａＭ）によるか、またはカルモジュリン活性化タンパク質、例えばＣａＭＫＩＩによるかのいずれかで、閉じ、開くことができる。
【００４０】
Ｔ型Ｃａ2+チャネルは、成長因子シグナル伝達に従って、チャネルが開いてカルシウムを入れるという点で「成長因子調節」活性を有する。例えば、成長因子、例えば、これらに限定されないが、インスリン様成長因子、上皮成長因子、神経成長因子、トランスフォーミング成長因子および血小板由来成長因子による成長因子受容体の活性化は、Ｔ型Ｃａ2+チャネルを不活性化から閉じて開くことができる状態に変化させるシグナル伝達カスケードを開始する。この機構は、Ｃａ2+を細胞内Ｃａ2+貯蔵プール、例えば小胞体から放出する任意の薬剤、例えばタプシガルジンによっても開始することができる。
【００４１】
したがって、Ｔ型Ｃａ2+チャネルは、電気的に調節された機構と成長因子調節機構の両方によって調節される。例えば、成長因子結合は、ＥＲにおいてのように、Ｔ型Ｃａ2+チャネルを不活性化から閉じて開くことができる状態に変化させる膜電位の変化につながる。Ｔ型Ｃａ2+チャネル状態のユニークな低ボルテージ感受性−高ボルテージ活性化Ｌ、Ｎ、Ｐ、ＲおよびＱ型Ｃａ2+チャネルとは明確に異なる−は、成長因子誘発増殖中に誘発されるボルテージ調節によって正確にプロファイルされる。したがって、癌および幹細胞のＧ１／Ｓ移行中の、静止状態膜電位および成長因子に媒介され、活性化に誘発された過分極電位は、Ｔ型Ｃａ2+チャネルのボルテージ依存性状態と正確に適合する。
【００４２】
Ｔ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害する例示的な化合物は、ＷＯ００／０５９８８２において開示されており、その内容は、参照によってその全体がここに組み込まれている。
【００４３】
特定の態様において、Ｔ型Ｃａ2+チャネル活性の阻害剤は、ＴＨ−１１７７であり、ＷＯ００／５９８８２に開示された構造を有する。
【化１】
2016506248.tif 000003
【００４４】
追加のＴ型Ｃａ2+チャネル活性阻害剤の例は、ミベフラジル、ベプリジル、クレンチアゼム、ジルチアゼム、フェンジリン、ガロパミル、プレニラミン、セモチアジル、テロジリン、ベラパミル、アムロジピン、アラニジピン、バルニジピン、ベニジピン、シルニジピン、エホニジピン、エルゴジピン、フェロジピン、イスラジピン、ラシジピン、レルカニジピン、マニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、シンナリジン、フルナリジン、リドフラジン、ロメリジン、ベンシクラン、エタフェノン、ファントファロン、およびペルヘキシリン（perhexyline）を含むが、これらに限定されない。好ましい例において、成長因子調節Ｔ型Ｃａ2+チャネル活性阻害剤は、ミベフラジルまたはＴＨ−１１７７である。
【００４５】
化合物、例えばミベフラジルまたはＴＨ−１１７７は、細胞膜電位が約−９０ｍＶである場合に、Ｔ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害する。同様に、ミベフラジルまたはＴＨ−１１７７によって占められる部位に結合する薬剤は、細胞膜電位が約−９０ｍＶである場合に、細胞におけるＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害することができる。
【００４６】
本開示は、細胞膜電位が約−９０ｍＶである場合に細胞におけるＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害する化合物を同定する方法をさらに提供する。かかる化合物は、標準的な電気生理学的方法、例えばパッチクランプを使用して、細胞におけるＴ型Ｃａ2+チャネル活性の阻害を測定することによって、または細胞が、マイトジェン、例えば成長因子によって刺激される場合に、医薬品がその細胞、例えば癌細胞中へのカルシウム流入を遮断する能力を測定することによって同定することができる。かかる方法は、例えば、Ｄｅｎｓｍｏｒｅら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３１２：１６１−１６４（１９９２）；Ｈａｖｅｒｓｔｉｃｋら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ４：１７３−１８４（１９９３）；およびＧｏｍｏｒａら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９２：９６−１０３（２０００）において開示されており、その内容は、参照によって組み込まれている。カルシウム流入は、方法、例えばＣａ2+感受性蛍光色素の細胞内保持によって決定することができる。
【００４７】
したがって、本開示は、細胞膜電位が約−９０ｍＶである場合に化合物が細胞におけるＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害する能力を決定することによって、抗増殖性活性および／または癌を処置する能力を有する化合物を同定するための方法を包含する。本開示は、ここで開示した方法によって同定される化合物をさらに包含する。
【００４８】
ここで使用する、「新生物性」細胞または「癌」細胞は、周辺組織に侵入する制御されていない増殖および潜在力を示す異常な細胞を意味する。
【００４９】
ここで使用する、「癌幹細胞」という用語は、高度に増殖性の癌細胞の前駆体であり得る、または前駆体の元となり得る細胞を表す。癌幹細胞は、免疫不全の哺乳類、例えばマウスにおいて腫瘍を形成する、および免疫不全の哺乳類、例えばマウスにおけるその後の累代移植時に腫瘍を形成するその能力によって実証されるように腫瘍を再成長させる能力を有する。
【００５０】
ここで開示した化合物は、新生物性または癌細胞の増殖、分化または発達を阻害することができる。新生物、腫瘍、転移、白血病または制御されていない細胞成長によって特徴づけられる任意の疾患もしくは障害を含むが、これらに限定されない、癌または新生物性疾患を、それを必要としている対象に、治療有効量のここで開示したＴ型Ｃａ2+チャネル活性の阻害剤を投与することによって、防ぎ、処置し、かつ／または管理することができる。
【００５１】
任意の型の癌を、本発明に従って、防ぎ、処置し、かつ／または管理することができる。本発明に従って、防ぎ、処置し、かつ／または管理することができる癌の非限定的な例は、上皮起源の癌、例えば乳癌、基底細胞癌腫、腺癌、消化器癌、口唇癌、口腔癌、食道癌、小腸癌および胃癌、結腸癌、肝癌、膀胱癌、膵癌、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌、乳癌および皮膚癌、例えば扁平上皮および基底細胞癌(basal cell cancer）、前立腺癌、腎細胞癌、ならびに身体全体の上皮細胞に影響する他の既知の癌を含む。
【００５２】
ここで提供する処置の方法および組成物は、幹細胞、例えば癌幹細胞の増殖を阻害するのにさらに有用である。
【００５３】
Ｇ１／Ｓ移行におけるＴ型Ｃａ2+チャネルの重要な役割は、癌細胞増殖に限定されない。胚幹細胞は、Ｇ１／Ｓ移行で増加するＣａｖ３．２に関するメッセージも含有し、Ｃａｖ３．２の薬理的阻害剤は、それらの増殖を遮断し、Ｃａｖ３．２に向けられた干渉ＲＮＡは、アルカリホスファターゼおよびＯｃｔ３／４発現を減少させ、これは、初期幹細胞を特徴づける。18そのまま受け取ると、これらのデータは、Ｃａｖ３．２の発現が、幹細胞における細胞周期進行に決定的であることを示している。胚幹細胞に関するデータは、Ｔ型Ｃａ2+チャネルレベルが、それらの未分化状態を維持することに関与していることを加えて示唆している。17しかしながら、ホモ接合Ｃａｖ３．２ノックアウトマウスが、異常な冠動脈機能および著しく低い出生時体重のみを通常呈するようになることも示された。18
まとめると、細胞周期進行および胚細胞自己再生に通常必要なＣａｖ３．２の機能は、その非存在下で別のＣａ2+インフラックス機構によって引き継がれ得ることが明白である。３つのＴ型Ｃａ2+アイソフォーム（Ｃａｖ３．１、３．２および３．３）間の調節性および生物物理学的類似性を考慮に入れると、Ｃａｖ３．２の正常機能が２つの他のアイソフォームの１つによって促進され得ると推測することは合理的である。既知の薬理的Ｔ型Ｃａ2+アンタゴニストは、３つのアイソフォームの間で著しく分化せず19、これは、同じ薬物に対する抵抗性を発達させる年月の間、Ｔ型Ｃａ2+遮断薬（その１Ｃ30で）の連続的な存在下で成長した癌細胞の無能を説明し得る（Ｄ．Ｍ．Ｈａｖｅｒｓｔｉｃｋ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｇｉｎｉａ、未発表の知見）。
【００５４】
ここで使用する、「対象」および「患者」という用語は、互換的に使用され、動物、好ましくは哺乳類、例えば非霊長類（例えば、雌ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）および霊長類（例えば、サルおよびヒト）、最も好ましくはヒトを表す。
【００５５】
ここで使用する、「処置」は、処置される個体または細胞の疾患経過を改変するための試みにおける臨床的介入を表し、予防のためまたは臨床病理の経過中のいずれかに行うことができる。処置の治療効果は、限定することなく、疾患の発生または再発を防ぐこと、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の縮小、疾患進行の速度を減少させること、疾患状態の寛解または緩和、および緩解または改善された予後を含む。例えば、癌患者の処置は、腫瘍サイズの減少、新生物性または悪性細胞の排除または減少、転移の予防、またはその腫瘍が退行した患者における再発の予防であってもよい。
【００５６】
ここで使用する、「治療有効量」および「有効量」という用語は、互換的に使用され、癌幹細胞または癌およびその１つ以上の症状の発達、再発、または発症の予防を生じ、別の療法の予防効果を増強するかまたは改善し、癌の重症度および期間を減少させ、癌の１つ以上の症状を寛解させ、癌の進行を防ぎ、癌の退行を引き起こし、かつ／または追加の抗癌処置の治療効果を増強または改善するのに十分な本発明の組成物の量を表す。
【００５７】
治療有効量を、疾患の進行を緩和する、寛解する、安定化する、転換させるもしくは遅くする、またはさもなければ疾患の病理学的結果を減少させる、または疾患の症状を減少させるのに十分な１つ以上の用量で患者に投与することができる。寛解または減少は、永久的である必要はないが、少なくとも１時間、少なくとも１日、または少なくとも１週間以上の範囲の期間であってもよい。有効量は、ケースバイケースで医師によって一般的に決定され、当業者のスキルの範囲内である。有効量を達成するための適切な投薬量を決定する場合、いくつかの因子を典型的に考慮に入れる。これらの因子は、患者の年齢、性別および体重、処置される条件、条件の厳しさ、ならびに投与の経路、剤形およびレジメンおよび望ましい結果を含む。
【００５８】
例えば、有効量のＴ型Ｃａ2+チャネル活性の阻害剤は、１日当たり０．０００１〜１０ｍｇ／体重ｋｇであってもよい。投薬量範囲は、単回または複数回投与で投与してもよく、一般的に患者当たり１日当たり約０．５ｍｇ〜１．０ｇとなる。１つの態様において、投薬量範囲は、患者当たり１日当たり約０．５ｍｇ〜２００ｍｇ；別の態様において、患者当たり１日当たり約１ｍｇ〜１００ｍｇ；および別の態様において、患者当たり１日当たり約１ｍｇ〜５０ｍｇ；さらに別の態様において、患者当たり１日当たり約１０ｍｇ〜２０ｍｇとなる。本発明の医薬組成物は、固形投与製剤（solid dosage formulation）で提供してもよく、これは例えば約０．５ｍｇ〜５００ｍｇの活性成分を含むか、または約１ｍｇ〜２５０ｍｇの活性成分を含む。医薬組成物は、約１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇまたは２５０ｍｇの活性成分を含む固形投与製剤で提供してもよい。化合物を、１日当たり１〜４回、例えば１日当たり１回または２回のレジメンで投与してもよい。
【００５９】
本発明のある特定の態様において、治療有効量は、いったんそれを投与すると、以下の結果の１つ、２つまたは３つ以上を達成するのに効果的な量である：（１）新生物性細胞集団の減少または排除；（２）癌細胞集団の減少または排除；（３）腫瘍または新生物の成長または増殖の減少；（４）腫瘍の形成における障害；（５）原発、局所および／または転移癌の根絶、除去、または制御；（６）死亡率の減少；（７）無病、無再発、無進行、および／または全生存、期間、または率の増加；（８）応答率、応答の耐久性、または応答するもしくは緩解にある患者の数の増加；（９）腫瘍のサイズが維持され、増加しない、または１０％未満、もしくは５％未満、もしくは４％未満、もしくは２％未満増加する、（１０）緩解にある患者の数の増加、（１１）緩解の長さまたは期間の増加、（１２）癌の再発率の減少、（１３）癌の再発までの時間の増加、（１４）癌関連症状および／またはクオリティ・オブ・ライフの寛解および（１５）癌細胞の薬物耐性の減少。
【００６０】
いくつかの態様において、電気的に調節されたＴ型Ｃａ2+チャネル活性の阻害剤の量またはレジメンは、塊状腫瘍サイズの減少および癌幹細胞集団の減少を生じる。ある特定の態様において、塊状腫瘍サイズの減少；塊状腫瘍サイズの減少および薬物耐性癌幹細胞を含めた癌幹細胞集団の減少；または塊状腫瘍サイズの減少、癌幹細胞集団の減少および癌細胞集団の減少は、定期的にモニターされる。したがって、１つの例において、本発明は、対象において癌を防ぐ、処置するかつ／または管理する方法であって、（ａ）それを必要としている対象に、有効量の電気的に調節されたＴ型Ｃａ2+チャネル活性の阻害剤の１つ以上の用量を投与することを含む方法を提供する。特定の例において、阻害剤は、ＣＡＣＮＡ１Ｈを阻害する。
【００６１】
細胞に関してここで互換的に使用する、「増殖」および「成長」という用語は、細胞分裂、急速なおよび反復される細胞繁殖、細胞周期、ならびに細胞成長、特に制御されていない細胞成長による、同じ型の細胞の数の増加を表す。「発達」は、より小さい、より単純な、または良性の形からより大きい、より複雑な、または新生物性の形への進行を表す。例えば、腫瘍は、小さい腫瘤からより大きい腫瘤に発達し得る。癌幹細胞発達は、非癌細胞状態から癌細胞状態への進行、または非新生物性組織形成から新生物性または腫瘍形成への進行を表すことができる。
【００６２】
「細胞増殖性障害」は、細胞が非定型的に加速された速度で身体によって作製される障害を意味する。細胞増殖性障害は、癌を含むことができる。癌の非限定的な例は、膀胱癌、脳癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、消化器癌、尿生殖器癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、皮膚癌および精巣癌を含む。
【００６３】
とりわけ、ここで記載した化合物、組成物、および方法によって処置されてもよい癌は、以下のものを含むが、これらに限定されない：（１）以下を含む乳癌、例えば、ＥＲ+乳癌、ＥＲ-乳癌、ＨＥＲ２-乳癌、ＨＥＲ２+乳癌、間質性腫瘍、例えば線維腺腫、葉状腫瘍および肉腫ならびに上皮性腫瘍、例えば大管乳頭腫（large duct papilloma）；上皮内乳管癌（パジェット病を含む）および上皮内小葉癌を含めた上皮内（非侵襲的）癌、ならびに侵襲的腺管癌、侵襲的小葉癌、髄様癌、膠様（粘液性）癌、管状癌、および侵襲的乳頭癌を含むが、これらに限定されない、侵襲的（浸潤性）癌を含む乳房の癌；および種々の悪性新生物。乳癌の別の例は、ルミナルＡ、ルミナルＢ、ベーサルＡ、ベーサルＢ、ならびにエストロゲン受容体陰性（ＥＲ-）、プロゲステロン受容体陰性、およびＨＥＲ２陰性（ＨＥＲ２-）である三種陰性乳癌を含むことができる。いくつかの態様において、乳癌は、ハイリスクオンコタイプスコアを有し得る；（２）以下を含む噴門癌、例えば、肉腫、例えば、血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、および脂肪肉腫；粘液腫；横紋筋腫；線維腫；脂肪腫および奇形腫；（３）以下を含む肺癌、例えば、気管支原性癌、例えば、扁平上皮、未分化小細胞、未分化大細胞、および腺癌；肺胞および細気管支癌；気管支腺腫；肉腫；リンパ腫；軟骨性過誤腫；および中皮腫；（４）以下を含む消化器癌、例えば、食道の癌、例えば、扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、およびリンパ腫；胃の癌、例えば、癌腫、リンパ腫、および平滑筋肉腫；膵臓の癌、例えば、導管腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、およびビポーマ；小腸の癌、例えば、腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管種、脂肪腫、神経線維腫、および線維腫；大腸の癌、例えば、腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、および平滑筋腫；（５）以下を含む尿生殖路癌、例えば、腎臓の癌、例えば、腺癌、ウィルムス腫瘍（腎芽腫）、リンパ腫、および白血病；膀胱および尿道の癌、例えば、扁平上皮癌、移行上皮癌、および腺癌；前立腺の癌、例えば、腺癌、および肉腫；精巣の癌、例えば、精上皮腫、奇形腫、胚性癌、奇形癌、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、および脂肪腫；（６）以下を含む肝癌、例えば、ヘパトーマ、例えば、肝細胞癌；胆管細胞癌；肝芽腫；血管肉腫；肝細胞腺腫；および血管種；（７）以下を含む骨癌、例えば、骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫  脊索腫、オステオクロンドローマ（osteochrondroma）（骨軟骨腫）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫（chondromyxofibroma）、類骨腫および巨細胞腫瘍；（８）以下を含む神経系癌、例えば、頭蓋の癌、例えば、骨腫、血管種、肉芽腫、黄色腫、および変形性骨炎；髄膜の癌、例えば、髄膜腫、髄膜肉腫、および神経膠腫症；脳の癌、例えば、星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫（松果体腫）、多形グリア芽細胞腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、網膜芽細胞腫、および先天性腫瘍；および脊髄の癌、例えば、神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、および肉腫；（９）以下��含む婦人科癌、例えば、子宮の癌、例えば、子宮内膜癌；子宮頸部の癌、例えば、子宮頸癌、および前腫瘍（pre tumor）子宮頸部異形成；卵巣の癌、例えば、漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、未分類の癌、顆粒莢膜細胞腫（granulosa thecal cell tumor）、セルトリ・ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、および悪性奇形腫を含めた卵巣癌；外陰部の癌、例えば、扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、およびメラノーマ；腟の癌、例えば、明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫、および胎児性横紋筋肉腫；およびファロピウス管の癌、例えば、癌腫；（１０）以下を含む血液癌、例えば、血液の癌、例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、および骨髄異形成症候群、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（悪性リンパ腫）およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症；（１１）以下を含む皮膚癌、例えば、悪性メラノーマ、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、非定型異形成母斑（moles dysplastic nevi）、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、および乾癬等；（１２）以下を含む副腎癌、例えば、神経芽細胞腫；（１３）以下を含む膵癌、例えば、腺癌（Ｍ８１４０／３）、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝様癌、膠様癌、未分化癌、および破骨細胞様巨細胞を有する未分化癌等の膵外分泌癌；および膵外分泌腫瘍。
【００６４】
癌は、転移性であってもよいかまたは転移性でなくてもよい固形腫瘍であってもよい。癌は、白血病におけるように、散在した組織としても起こり得る。したがって、ここで提供する「腫瘍細胞」という用語は、上記の同定された障害の任意の１つによって傷害された細胞を含む。
【００６５】
細胞増殖性障害は、新生児における血管腫症、二次性進行型多発性硬化症、慢性進行型骨髄ミエロデジェネレイティブ疾患（chronic progressive myelodegenerative disease）、神経線維腫症、神経節神経腫症、ケロイド形成、骨パジェット病、乳房線維嚢胞症、子宮筋腫、ペーロニー病、デュピュイトラン病、レステノシス（restenoisis）、および硬変を含むが、これらに限定されない、非癌性増殖性障害も含むことができる。
【００６６】
ここで使用する「化学療法薬」という用語は、細胞増殖性障害の処置において、細胞の成長または増殖を止めるまたは阻害するために使用することができる薬剤を表す。適した化学療法薬の例は、アバレリックス、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アナストロゾール、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アザシチジン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾンビ（bortezombi）、ボルテゾミブ、静脈内ブスルファン（busulfan intravenous）、経口ブスルファン（busulfan oral）、カルステロン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セツキシマブ、クロランブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダルテパリンナトリウム、ダサチニブ、ダウノルビシン、デシタビン、デニロイキン、デニロイキンディフチトクス、デキスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エクリズマブ、エピルビシン、エルロチニブ、エストラムスチン、リン酸エトポシド、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガマイシン、酢酸ゴセレリン、酢酸ヒストレリン、イブリツモマブチウキセタン、イダルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、インターフェロンアルファ２ａ、イリノテカン、トシル酸ラパチニブ、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリン、酢酸ロイプロリド、レバミソール、ロムスチン、メクロレタミン（meclorethamine）、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトキサレン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、フェンプロピオン酸ナンドロロン、ネララビン、ノフェツモマブ（nofetumomab）、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、パニツムマブ、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペメトレキセド二ナトリウム、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、プロカルバジン、キナクリン、ラスブリカーゼ、リツキシマブ、ルクソリチニブ、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、スニチニブ、マレイン酸スニチニブ、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ボリノスタット、およびゾレドロネートのいずれかを含む。
【００６７】
Ｔ型Ｃａ2+チャネル駆動Ｇ１／Ｓ移行の生化学的活性化。本開示は、図１において図示した、最初の成長因子活性化からＧ１／Ｓ制限の解放までの工程の以下のシークエンスを提案する。成長因子受容体（ＧＦＲ）活性化は、ホスホリパーゼＣの活性化を通して、サイトゾルのイノシトール三リン酸（ＩＰ３）濃度を増加させる。次いで、ＩＰ３は、小胞体上のＩＰ３受容体との相互作用を通して、Ｃａ2+を内部貯蔵プールから放出する。生じたサイトゾルのＣａ2+濃度のわずかな増加は、図１において概略を述べたように、Ｔ型Ｃａ2+チャネルを通るＣａ2+インフラックスによって生じる遙かに大きい増加をトリガーする。経路において必要な事象は、Ｃａ2+結合Ｓ１００に関与し、これは次にｐ５３に結合し、これを不活性化し、したがってｐ２１の活性化を減少させる。活性化したｐ２１はＣＤＫ２を不活性化するので、ｐ２１活性の減少は、ＣＤＫ２がＧ１／Ｓ移行を駆動するのを可能にする。
【００６８】
電気的に非興奮性の細胞における細胞分裂につながる事象。細胞分裂につながる成長因子受容体活性化をフォローする事象に関するモデルが提示された。このモデルにおいて、その内部貯蔵所から放出されたＣａ2+は、内部貯蔵所が「空であること」によって二次的にトリガーされるＣａ2+流入ではなく、明白にＣａ2+依存性のプロセスによって、Ｃａ2+流入を活性化する。17単純に、保管貯蔵所から放出されたＣａ2+は、カルモジュリンを活性化し、これは次に細胞分裂につながるＣａ2+インフラックスを活性化する。
【００６９】
癌細胞の膜電位は、−３０ｍＶ〜−６０ｍＶであることが報告されている。しかしながら膜電位がヒト乳癌株における細胞周期における位置の関数として測定された場合、初期Ｇ１において約−３０ｍＶであり、後期Ｇ１およびＳにおいて約−６０ｍＶに低下することが示され（Ｏｕａｄｉｄ−Ａｈｉｄｏｕｃｈら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８７：Ｃ１２５−３４（２００４））、これは、文献において報告された癌細胞において測定された膜電位の可変性を説明し得る。成長因子活性化は、イノシトール三リン酸を作製し、これは内部保管貯蔵所からＣａ2+を放出する。20細胞内Ｃａ2+のこの増加の第１の作用の１つは、Ｃａ2+活性化Ｋ+チャネルの活性化および開口であることができる。21生じたＫ+の流出は、後期Ｇ１における約−６０ｍＶの値から、カリウムに関する平衡電位である約−９０ｍＶの過分極された値までの膜電位の一過性の減少を自然に生じることになる。
【００７０】
興味深いことに、Ｋ+チャネル遮断薬は、サイトゾルのＣａ2+の成長因子刺激増加を阻害し、Ｔ型Ｃａ2+チャネル阻害剤と機能的に同一の作用である、癌細胞系および間葉系幹細胞におけるＧ１／Ｓ境界を越えての通過を阻害することによって細胞増殖を遮断することが示された22-24。かかる研究において使用されたＫ+チャネル遮断薬が非特異的である一方で、Ｋ+チャネル、またはＫ+チャネル活性と関連している過分極が、Ｃａ2+チャネル機能に及ぼす効果を有するかまたはサイトゾルのＣａ2+を増加させ、これが細胞分裂につながることは予想外である。広く引用されている見解は、Ｋ+チャネル機能によって媒介される過分極が、Ｃａ2+流入に関する電気化学的駆動力を増加させるのに役立つというものである。表面的には、これは明確に真実である。しかしながら、０の膜電位でのＣａ2+流入に関して１０，０００倍の濃度勾配があり、血漿膜電位を過分極させるために必要な代謝負荷と、Ｃａ2+流入に関する駆動力を増加させることにおける過分極の一般的に仮定された役割を有する厳重に制御されたＣａ2+流入を有する必要性とを調和させることは困難である。したがって、Ｋ+チャネルの活性化およびカリウムの平衡電位に向かう付随する膜電位の下落を、Ｃａ2+に関する駆動力を増加させる機能としてここで開示する。
【００７１】
議論の余地があるが、それにもかかわらず広く普及した仮説によれば、悪性腫瘍は、いわゆる癌幹細胞の可変的な比率からなる（Ｌａｔｈｉａ  ＪＤら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｖ．７：２２７−３７（２０１１））。これらの細胞は、放射線および化学療法に対して比較的耐性があると報告されており、癌再発を説明し得る。癌幹細胞は、胚幹細胞と類似していると考えられており、幹細胞の両方の型の生物学的な知識は新規な治療方針を明らかにし得る。興味深いことに、Ｃａｖ３．２（Ｕｎｉｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｈｓ．４５９６４２）および２型小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネル（Ｕｎｉｇｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｈｓ．９８２８０）は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎによって決定されたように、胚様体において最も高く発現しその後低下する、著しく類似した妊娠初期同時発現パターンを有する。この妊娠初期発現パターンは、Ｃａｖ３．１またはＣａｖ３．３では見られず、他のカルシウム活性化カリウムチャネルでも見られない。この同時発現パターンは、胚幹細胞におけるＣａｖ３．２の機能発現18および以下に記載したモデルと一貫しており、癌処置への新しい医学的手法を明らかにするのを助け得る。
【００７２】
増殖を可能にする成長因子調節Ｃａ2+インフラックスに関するモデル。これらの情報は、明瞭で単純なモデル（図２）に総合することができる：
１．静止膜電位で、Ｔ型チャネルは、不活性化され、開くことはできない。
【００７３】
２．成長因子受容体が活性化される。
【００７４】
３．これが、イノシトール三リン酸の作製を引き起こす。
【００７５】
４．イノシトール三リン酸は、内部貯蔵プールからＣａ2+を放出する。
【００７６】
５．この放出されたＣａ2+は、構成的に結合したカルモジュリンを介してＣａ2+活性化Ｋ+チャネルを開く。
【００７７】
６．生じた過分極は、Ｔ型チャネルの不活性化を減少させる。
【００７８】
７．ここでＴ型チャネルは閉じており、したがって、開かれることができる。
【００７９】
８．Ｃａ2+活性化カルモジュリンは、カルモジュリンキナーゼによるＴ型チャネルリン酸化をおそらく介して、Ｔ型チャネルに拡散し、これを開く。
【００８０】
９．Ｃａ2+活性化Ｓ１００アイソフォームは、ｐ２１のｐ５３除去活性化を不活性化し、これはＣＤＫ２を放出して、Ｓ期への進行を促進する。
【００８１】
これらの工程を、以下のようにさらに記載する。経路の第１のアームにおいて、Ｃａ2+活性化Ｋ+チャネルとのＣａＭの構成的な結合は5、25、サイトゾルのＣａ2+の増加に応答したそれらの急速な開口を可能にする。Ｃａ2+／ＣａＭ複合体の拡散に関する必要性およびＣａＭＫＩＩの関与に関する可能性のある要求は、経路の第２のアームを遅くすることになり、Ｔ型Ｃａ2+チャネルを介したＣａ2+流入のＣａＭ依存性活性化が後に続く、過分極の時間的な順序づけをおそらく提供する。
【００８２】
この経路が治療効果に関して攻撃され得る様々なポイントの中で、脆弱な標的は、Ｔ型Ｃａ2+チャネル自体である。この脆弱性に関する１つの理由は、Ｔ型Ｃａ2+チャネルアイソフォームの限定された数である。例えば、成長因子は、遮断されたものをバイパスするために動員され得る多数の関連タンパク質からなる。３つのＴ型Ｃａ2+チャネルタンパク質のみがあり、全ては入手可能な薬理的阻害剤19に対してほぼ等しく感受性であるので、代替のメンバーの動員は、無益である。
【００８３】
脆弱性の別のポイントは、このタンパク質の制限された分布から生じ、このタンパク質は、胚幹細胞において通常発現され、成体において通常分裂しない細胞において発現されないが、傷害または発癌性の刺激に応答して再発現される。この再び現れる増殖は、病理学的刺激への標準的な応答である、創傷治癒に応答して分裂する線維芽細胞における再発現と同じくらい比較的単純な、26または通常の刺激に対するかなり病理的な応答であり得る、固形癌におけるのと同じくらい複雑である何かから生じ得る。加えて、Ｔ型チャネルアンタゴニストは、これらの細胞の増殖または分化に及ぼす効果を有さず、Ｃａｖ３．２の発現は骨髄由来の細胞系において観察されないので、骨髄由来細胞は異なるＣａ2+流入経路を利用するように見える。これに関する分子基盤は理解されていないが、これは活発な研究の源である。これらの特質により、Ｔ型Ｃａ2+チャネルの阻害剤は、免疫細胞増殖に及ぼす減少した効果を有するかまたは効果を有さない一方で、癌細胞の増殖を阻害する癌化学療法薬の新しいユニークなカテゴリーの非常に魅力的な候補になる。
【００８４】
単独療法として、Ｔ型カルシウムチャネル遮断薬は、ヒト疾患の多くの動物モデルにおいて観察されるように、癌細胞増殖を遅くし、インビボでの腫瘍成長を減少させる。27、28ミベフラジルは、Ｒｏｃｈｅによって販売されていた高血圧およびアンギナの処置のためのＴ型Ｃａ2+チャネル遮断薬である（Ｃｌｏｚｅｌら，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｖ．９：４−１７（１９９１））。それは、ほぼ１００万人の患者によって使用された後、ミベフラジルのＣＹＰ  ４５０  ３Ａ４の阻害によって引き起こされる望ましくない薬物・薬物相互作用を有することが発見されたとき、市場から回収された（Ｐｏ  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，Ｌａｎｃｅｔ．３５１：１８２９−３０（１９９８））。これは別として、ミベフラジルは、著しく十分に耐用性があり、その薬効分類のメンバーに関してさえも副作用がなかった（Ｋｏｂｒｉｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．８０：４０Ｃ−４６Ｃ（１９９７））。これは、Ｔ型Ｃａ2+チャネル遮断薬の副作用が、最大でも適度であり、多くの癌化学療法薬物によって一般的に引き起こされるものよりも著しく優れていることになることを示唆している。部分的にはこの理由で、細胞周期および癌幹細胞標的細胞分裂停止剤としてのＴ型Ｃａ2+チャネル遮断の使用は、活発に探求されている。
【００８５】
しかしながら、かかる薬剤の潜在的な臨床的有用性に関する別の可能性がある。大部分の従来の細胞毒性薬剤は、細胞周期の特定の時期、通常ＤＮＡ合成中に作用する。癌細胞をＧ１／Ｓ制限点で「並ばせ」、次いでＳ期に放出するなら、従来の細胞毒は、癌細胞を殺すのにより効率的になったであろう。これは、ヒトグリア芽細胞腫のマウスのモデルにおける場合であるように見える（Ｋｅｉｒら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．１１１（２）：９７−１０２（２０１３））。このモデルにおいて、マウスに、Ｃａ2+インフラックスを遮断し、Ｇ１／Ｓ制限点での細胞周期を通る進行を停止させるためのミベフラジルの７日コースを処置し、次いでミベフラジルの最後の用量後３０分で、テモゾロミドの５日コースを開始した。このレジメンは、テモゾロミドの細胞毒性効果を著しく増加させ、薬物耐性癌細胞系のテモゾロミドへの感受性を回復させた。多形グリア芽細胞腫（glioblastome multiforme）におけるこの戦略を使用したＩＮＤが２０１２年初期に始まり、正常で健康なボランティアにおけるミベフラジルの漸増用量のフェーズ１研究が進行中であり、患者における治験が２０１２年の春にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）’ｓ  Ａｄｕｌｔ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍによって開始された。方法の別の詳細は、ＷＯ２０１０／１４１８４２において提供されており、これは参照によってここに組み込まれている。
【００８６】
いくつかの態様において、本開示は、Ｇ１／Ｓチェックポイントを通る細胞周期進行を阻害すること、細胞増殖性障害における細胞の増殖を阻害することおよび／または細胞増殖性障害の処置において放射線および／または化学療法薬の有効性を増強することにおける有用性に関して化合物を同定するための方法を提供する。方法は、細胞の第１の細胞膜電位を約−７０ｍＶ〜約−１１０ｍＶの範囲にある電位で保持する場合に、化合物が細胞におけるＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害すると決定すること；および、前記決定に基づいて、Ｇ１／Ｓチェックポイントを通る細胞周期進行を阻害すること、細胞増殖性障害の処置において細胞の増殖を阻害することおよび／または細胞増殖性障害の処置において放射線および／または化学療法薬の有効性を増強することにおける有用性に関して化合物を同定することを含む。いくつかの態様において、膜電位は、約−８０ｍＶ〜約−１００ｍＶの測定された範囲内、または約８５ｍＶ〜約−９５ｍＶの範囲内、または約−８９ｍＶ〜約−９１ｍＶの範囲内の膜電位を含むことができる。いくつかの態様において、膜電位は、約９０ｍＶである。いくつかの態様において、細胞は、ここで記載したＴ型カルシウムチャネル亜型の１つ以上を発現することができる。いくつかの態様において、細胞を、ここで記載したカルシウムチャネル亜型の型の１つ以上を組換えで発現するように操作することができる。
【００８７】
いくつかの態様において、方法は、細胞を第１の細胞膜電位で保持する場合に、Ｔ型カルシウムチャネル活性を阻害することにおける化合物のＩＣ50である第１のＩＣ50を決定することを含むことができる。化合物を、第１のＩＣ50が約１００００μＭ以下、約１０００μＭ以下、約１０００μＭ以下、約１００μＭ以下、約１０μＭ以下、約１μＭ以下、または約１００ｎＭ以下であるという決定に基づいて、有用性に関して有用であると同定することができる。
【００８８】
いくつかの態様において、方法は、第２のＩＣ50が、細胞を約−３０ｍＶ〜約−６０ｍＶの範囲にある第２の細胞膜電位で保持する場合に、細胞におけるＴ型カルシウムチャネル活性を阻害することにおける化合物のＩＣ50である、化合物の第２のＩＣ50を決定することを含むことができる。第２の膜電位は、第１の膜電位よりも大きい（すなわち、負の値が小さい）。様々な態様において、第２の膜電位は、約−２０ｍＶ〜約−７０ｍＶ、約−２５ｍＶ〜約−６５ｍＶ、約−３０ｍＶ〜約−４０ｍＶ、約−３０ｍＶ〜約−５０ｍＶ、約−３０ｍＶ〜約−７０ｍＶ、約−４０ｍＶ〜約−５０ｍＶ、約−４０ｍＶ〜約−６０ｍＶ、約−４０ｍＶ〜約−７０ｍＶ、約−５０ｍＶ〜約−６０ｍＶ、約−５０〜約−７０ｍＶの範囲内、および約−３０ｍＶ、約−４０ｍＶ、約−５０ｍＶ、または約−６０ｍＶとすることができる。
【００８９】
いくつかの態様において、異なる膜電位での測定を、同じ細胞または細胞の群を使用して行う。いくつかの態様において、異なる膜電位での測定を、異なる細胞または細胞の群を使用して行う。使用する細胞は、好ましくは同じ細胞型のものである。例えば細胞は、クローン、同じ細胞系由来の細胞または細胞増殖性障害のための処置を必要としている単一の対象由来の増殖細胞とすることができる。
【００９０】
いくつかの態様において、方法は、第１のＩＣ50対第２のＩＣ50の比が、約２０：１以下、約１０：１以下、約５：１以下、約２：１以下、約１：１以下、約１：２以下、約１：５以下、約１：１０以下、または約１：１００以下であるという決定に基づいて、有用性に関して有用であると化合物を同定することを含むことができる。方法は、第１のＩＣ50対第２のＩＣ50の比が、約２０：１以下、約１０：１以下、約５：１以下、約２：１以下、約１：１以下、約１：２以下、約１：５以下、約１：１０以下、または約１：１００以下であるという決定に基づいて、神経によって媒介される副作用に関する減少したまたは低い傾向を有すると化合物を同定することも含むことができる。神経に基づく副作用の例は、不安、注意欠陥、認知障害、混乱、痙攣、抑うつ、眩暈、幻覚、精神病、鎮静、興奮などを含むことができる。
【００９１】
いくつかの態様において、細胞膜電位を、パッチクランプ技法を使用して制御することができる。いくつかの態様において、細胞膜電位を、ここで記載したまたは当技術分野で既知の任意の他の技法を使用して制御することができる。
【００９２】
いくつかの態様において、化合物がＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害する能力を、化合物が細胞中への成長因子刺激カルシウム流入を阻害する能力を決定することによって決定する。いくつかの態様において、化合物がＴ型Ｃａ2+チャネル活性を阻害する能力は、ここで記載したまたは当技術分野で既知の任意の他の技法を使用して決定する。
【００９３】
いくつかの態様において、細胞中へのカルシウム流入を、カルシウム感受性マーカー、例えばカルシウム感受性蛍光色素を使用して、細胞内カルシウムのレベルの増加を測定することによって決定する。いくつかの態様において、細胞中へのカルシウム流入を、ここで記載したまたは当技術分野で既知の任意の他の技法を使用して決定する。
【００９４】
いくつかの態様において、方法は、Ｇ１／Ｓチェックポイントを通る細胞周期進行を阻害することにおける有用性に関して化合物を同定することを含む。
【００９５】
いくつかの態様において、方法は、細胞増殖性障害における細胞の増殖を阻害することにおける有用性に関して化合物を同定することを含む。細胞増殖性障害は、ここで同定される癌性または非癌性増殖性障害の任意の１つ以上を含めた、癌性または非癌性増殖性障害とすることができる。細胞増殖性障害は、その増殖細胞がＴ型カルシウムチャネルを発現する障害とすることができる。細胞増殖性障害は、その増殖細胞がここで記載したＴ型カルシウムチャネルの任意のアイソフォームを発現する障害とすることができる。
【００９６】
いくつかの態様において、方法は、化合物を放射線および／または化学療法薬の投与に先立って投与する場合に、細胞増殖性障害の処置において放射線および／または化学療法薬の有効性を増強するための化合物を同定することを含む。細胞増殖性障害は、ここで同定される癌性または非癌性増殖性障害の任意の１つ以上を含めた、癌性または非癌性増殖性障害とすることができる。細胞増殖性障害は、その増殖細胞がＴ型カルシウムチャネルを発現する障害とすることができる。化学療法薬は、ここで同定される化学療法薬のいずれか、またはその任意の組合せとすることができる。
【００９７】
いくつかの態様において、使用する細胞が、増殖性障害のための処置を必要としている対象の１つ以上の増殖細胞を含む方法を行うことができ、この方法は細胞増殖性障害の処置において細胞増殖性障害の処置ならびに／または放射線および／もしくは化学療法薬の有効性を増強することにおける使用に有用であると化合物を同定することができる。いくつかの態様において、化合物を、放射線および／または化学療法薬の投与に先立って投与する。この方法を使用して、対象の処置に有用である化合物を同定することができる。細胞増殖性障害は、ここで同定される癌性または非癌性増殖性障害の任意の１つ以上を含めた、癌性または非癌性増殖性障害とすることができる。細胞増殖性障害は、その増殖細胞がＴ型カルシウムチャネルを発現する障害とすることができる。化学療法薬は、ここで同定される化学療法薬のいずれか、またはその任意の組合せとすることができる。
【００９８】
いくつかの態様において、方法は、対象に、細胞増殖性障害を処置するために有効量の化合物を投与することを含む。いくつかの態様において、方法は、対象に、細胞増殖性障害を処置するために有効量の放射線および／または化学療法薬と組み合わせた有効量の化合物を投与することを含む。いくつかの態様において、化合物を、放射線および／または化学療法薬の投与に先立って、対象に投与する。細胞増殖性障害は、ここで同定される癌性または非癌性増殖性障害の任意の１つ以上を含めた、癌性または非癌性増殖性障害とすることができる。細胞増殖性障害は、その増殖細胞がＴ型カルシウムチャネルを発現する障害とすることができる。化学療法薬は、ここで同定される化学療法薬のいずれか、またはその任意の組合せとすることができる。
【００９９】
いくつかの態様において、化学療法薬は、テモゾロミド、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、ブレオマイシン、カルボプラチン、シスプラチン、ダカルバジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イリノテカン、トポテカン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン；ビンデシンおよびマイトマイシンＣからなる群から選択される。いくつかの態様において、化学療法薬は、テモゾロミドである。いくつかの態様において、化学療法薬は、カルボプラチンである。いくつかの態様において、化学療法薬は、ゲムシタビンである。
【０１００】
いくつかの態様において、癌は、脳癌、乳癌、結腸癌、神経膠腫、グリア芽細胞腫、メラノーマ、卵巣癌および膵癌からなる群から選択される。いくつかの態様において、癌は、脳癌である。いくつかの態様において、癌は、神経膠腫である。いくつかの態様において、癌は、卵巣癌である。いくつかの態様において、癌は、膵癌である。
【０１０１】
本発明を様々な態様および技法を参照して記載した。しかしながら、本発明の精神および範囲内のままでありながら多くの変更および修正を加えることができることが理解されるべきである。過度な実験に頼ることなく、ここで広く開示したように、ここで具体的に記載したもの以外の組成物、方法、デバイス、デバイス要素、材料、手順および技法を適用して、本発明を実施することができることは当業者に明らかであろう。ここで記載した組成物、方法、デバイス、デバイス要素、材料、手順および技法の全ての技術的に既知の機能的同等物は、本発明によって包含されることが意図されている。範囲が開示されるときはいつでも、全てのサブレンジおよび個々の値が包含される。本発明は、限定のためではなく例または例示のために与えられた、明細書において例証した全てのものを含めた、開示した態様によって限定されるべきではない。本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定されなければならない。
【０１０２】
ここで引用した全ての参考文献は、参照によってその全体がここに組み込まれる。
【０１０３】
参考文献
1. Rustandi RR, Baldisseri DM, Weber DJ. Structure of the negative regulatory domain of p53 bound to S100B (betabeta). Nat. Struct. Biol., 2000; 7: 570-4.
2. Lu F, Chen H, Zhou C, et al. T-type Ca2+ channel expression in human esophageal carcinomas: a functional role in proliferation. Cell Calcium, 2008; 43: 49-58.
3. Lapenna S, Giordano A. Cell cycle kinases as therapeutic targets for cancer. Nat. Rev. Drug Discov. 2009;8:547-66.
4. Trautwein W, Hescheler J. Regulation of cardiac L-type calcium channels by phosphorylation and G proteins. Annu. Rev. Physiol., 1990; 52: 257-74.
5. Saimi Y, Kung C. Ion channel regulation by calmodulin binding, FEBS Lett., 1994; 350: 155-8.
6. Putney JW, Jr. A model for receptor-regulated calcium entry. Cell Calcium, 1986; 7: 1-12.
7. Smyth JT, Putney JW. Regulation of store-operated calcium entry during cell division. Biochem. Soc. Trans., 2012; 40: 119-23.
8. Cahalan MD. STIMulating store-operated Ca(2+) entry. Nat. Cell. Biol., 2009; 11: 669-77.
9. Harper JV, McLatchie L, Perez-Reyes E, Cribbs LL, Shattock MJ, Brooks G. T-type calcium channel expression is necessary for G I-S progression in vascular smooth muscle. Circulation 2000; 102: 11-48.
10.Li W, Zhang SL, Wang N, Zhang BB, Li M. Blockade of T-Type Ca(2+) channels inhibits human ovarian cancer cell proliferation. Cancer Invest., 2011, 29(5): 339-46.
11.Densmore JJ, Szabo G, Gray LS. A voltage-gated calcium channel is linked to the antigen receptor in Jurkat T lymphocytes. FEBS Lett. 1992; 312: 161-4.
12.Santoni G, Santoni M, Nabissi M. Functional role of T-type calcium channels in tumour growth and progression: Prospective in cancer therapy. Br. J. Pharmacol., 2012, 166(4): 1244-6.
13.Mulgrew CJ, Cove-Smith A, McLatchie LM, Brooks G, Shattock MJ, Hendry BM. Inhibition of human mesangial cell proliferation by targeting T-type calcium channels. Nephron Exp. Nephrol., 2009; 113: e77-88.
14.Rodman DM, Reese K, Harral J, et al. Low-voltage-activated (T-type) calcium channels control proliferation of human pulmonary artery myocytes. Circ. Res., 2005; 96: 864-72.
15.Brooks G, Harper JV, Bates SE, et al. Over expression of the voltage-gated T-type calcium channel induces vascular smooth muscle cell proliferation. Circulation, 1999; 100: 1-209.
16.Taylor JT, Zeng XB, Pottle JE, et al. Calcium signaling and T-type calcium channels in cancer cell cycling. World J. Gastroenterol., 2008; 14: 4984-91.
17.Gray LS, Perez-Reyes E, Gamorra JC, et al. The role of voltage gated T-type Ca2+ channel isoforms in mediating "capacitative" C;+ entry in cancer cells. Cell Calcium, 2004; 36: 489-97.
18.Rodriguez-Gomez JA, Levitsky KL, Lopez-Bameo J. T-type Ca2+ channels in mouse embryonic stem cells: modulation during cell cycle and contribution to self renewal. Am. J. Physiol. Cell. Physiol., 2012; 302: C494-504.
19.Heady TN, Gomora JC, Macdonald TL, Perez-Reyes E. Molecular pharmacology of T-type Ca2+ channels. Jpn. J. Pharmacol., 2001; 85: 339-50.
20.Exton JH. Regulation of phosphoinositide phospholipases by hormones, neurotransmitters, and other agonists linked to G proteins. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 1996; 36: 481-509.
21.Wonderlin WF, Strobl JS. Potassium channels, proliferation and G1 progression. J. Membr. Biol., 1996; 154: 91-107.
22.Chandy, KC, Wulff, H, Beeton C, Pennington M, Gutman GA, Cahalan MD. K(+) channels as targets for specific immunomodulation. Trends Pharmacol. Sci., 2004; 25: 280-9.
23.Strobl JS, Wonderlin WF, Flynn DC. Mitogenic signal transduction in human breast cancer cells. Gen. Pharmacol., 1995; 26: 1643-9.
24.Tao R, Lau CP, Tse HF, Li GR. Regulation of cell proliferation by intermediate conductance Ca2+-activated potassium and volume-sensitive chloride channels in mouse mesenchymal stem cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol., 2008;295:CI409-16.
25.Levitan IB. It is calmodulin after all! Mediator of the calcium modulation of multiple ion channels. Neuron 1999; 22: 645-8.
26.Estacion M, Mordan LJ. Expression of voltage-gated calcium channels correlates with PDGF-stimulated calcium influx and depends upon cell density in C3H 10T1I2 mouse fibroblasts. Cell Calcium, 1993; 14: 161-71.
27.Haverstick DM, Heady TN, Macdonald TL, Gray LS. Inhibition of human prostate cancer proliferation in vitro and in a mouse model by a compound synthesized to block Ca2+ entry. Cancer Res. 2000; 60: 1002-8.
28.Panner A, Wurster RD. T-type calcium channels and tumor proliferation. Cell Calcium 2006; 40: 253-9.
29.Giles TD. Hypertension and pathologic cardiovascular remodeling: a potential therapeutic role for T-type calcium antagonists. Clin. Ther., 1997; 19 Suppl. A: 27-38.
【図１】
2016506248.tif 000004
【図２】
2016506248.tif 000005
【国際調査報告】
2016506248.tif 000006
2016506248.tif 000007