(57)【要約】  本出願は、細胞毒性および／または低下した免疫原性を示す改質された毒素の組成物に関する。改質が少なくとも１つのＴ細胞エピトープの少なくとも１つのアミノ酸残基にある改質されたジフテリア毒素に由来するポリペプチド担毒体も提供される。別の態様は、改質されたジフテリア毒素と、細胞結合部分である非ジフテリア毒素フラグメントとを含む融合タンパク質に関する。別の態様は、悪性疾患または非悪性疾患を治療するための改質されたジフテリア毒素の使用に関する。改質されたジフテリア毒素または融合タンパク質を、１つ以上の薬剤とともに投与してもよい。
2016519651.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントであって、配列番号２、１４８または２００の全長配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、
（ｉ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１５；
（ｉｉ）配列番号２、１４８または２００アミノ酸残基９７〜１０５；
（ｉｉｉ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１０７〜１１５；
（ｉｖ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１１６〜１２４；
（ｖ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１２４〜１３２；
（ｖｉ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１４８〜１５６；および
（ｖｉｉ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基２９８〜３０６から選択される配列に少なくとも１つのアミノ酸改質を含む、少なくとも１つの改質されたＴ細胞エピトープコアを含み、
前記改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、細胞毒性であり、改質されていないジフテリア毒素と比較して、低下した免疫原性を示す、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメント。
【請求項２】
ジフテリア毒素またはそのフラグメントが、配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１５に改質を含み、
（ｉ）配列番号２、１４８または２００アミノ酸残基９７〜１０５；
（ｉｉ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１０７〜１１５；
（ｉｉｉ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１１６〜１２４；
（ｉｖ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１２４〜１３２；
（ｖ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１４８〜１５６；および
（ｖｉ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基２９８〜３０６から選択される配列に少なくとも１つのアミノ酸改質を含む、少なくとも１つの改質されたＴ細胞エピトープコアを含む、請求項１に記載の改質されたジフテリア毒素。
【請求項３】
配列番号２、１４８または２００の改質されたアミノ酸残基７〜１５をさらに含み、この配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基７〜１５が、少なくとも１つのアミノ酸改質を含む、請求項１に記載の改質されたジフテリア毒素。
【請求項４】
非ジフテリア毒素ポリペプチド由来の少なくとも１つの細胞結合リガンドをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の改質されたジフテリア毒素。
【請求項５】
前記細胞結合リガンドが、抗体またはその抗原結合性フラグメント、サイトカイン、ポリペプチド、ホルモン、成長因子、またはインスリンである、請求項４に記載の改質されたジフテリア毒素。
【請求項６】
サイトカインが、ＩＬ−２またはＩＬ−３である、請求項５に記載の改質されたジフテリア毒素。
【請求項７】
抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、遺伝子操作された抗体、またはグラフト化抗体である、請求項５に記載の改質されたジフテリア毒素。
【請求項８】
抗原結合性フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ’）２、ＳｃＦｖ、ａ（ＳｃＦｖ）２、一本鎖結合ポリペプチド、ＶＨまたはＶＬである、請求項５に記載の改質されたジフテリア毒素。
【請求項９】
改質されたジフテリア毒素は、Ｍ１５Ｄ、Ｍ１５Ｔ、Ｖ２９Ｓ、Ｖ２９Ｔ、Ｖ２９Ｎ、Ｖ２９Ｄ、Ｄ３０Ｅ、Ｓ３１Ｎ、Ｖ９７Ａ、Ｖ９７Ｄ、Ｖ９７Ｔ、Ｌ１０７Ａ、Ｌ１０７Ｎ、Ｌ１０７Ｔ、Ｔ１１２Ｇ、Ｔ１１２Ｄ、Ｔ１１２Ｅ、Ｅ１１３Ｄ、Ｌ１１５Ｔ、Ｌ１１５Ｎ、Ｌ１１５Ｄ、Ｍ１１６Ａ、Ｍ１１６Ｎ、Ｍ１１６Ｑ、Ｅ１１７Ｄ、Ｔ１２１Ｄ、Ｔ１２１Ｇ、Ｔ１２１Ｎ、Ｔ１２１Ｑ、Ｆ１２４Ｈ、Ｆ１２４Ａ、Ｆ１２４Ｋ、Ｉ１２５Ｈ、Ｒ１２７Ａ、Ｒ１２７Ｔ、Ｖ１４８Ａ、Ｖ１４８Ｔ、Ｉ２９０Ｔ、Ｄ２９１Ｅ、Ｄ２９１Ｋ、Ｓ２９２Ａ、Ｓ２９２Ｔ、Ｌ２９８Ａ、Ｌ２９８ＮおよびＳ３０６Ｇから選択される１つ以上の改質を含む、請求項１に記載の改質されたジフテリア毒素。
【請求項１０】
改質されたジフテリア毒素は、２つの改質を含み、Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｌ１０７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｌ１０７Ｎ；Ｍ１５Ｔ  Ｌ１０７Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｅ；Ｍ１５Ｔ  Ｅ１１３Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｌ１１５Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｌ１１５Ｎ；Ｍ１５Ｔ  Ｌ１１５Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｍ１１６Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｍ１１６Ｎ；Ｍ１５Ｔ  Ｍ１１６Ｑ；Ｍ１５Ｔ  Ｅ１１７Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１２１Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１２１Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１２１Ｎ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１２１Ｑ；Ｍ１５Ｔ  Ｆ１２４Ｈ；Ｍ１５Ｔ  Ｆ１２４Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｆ１２４Ｋ；Ｍ１５Ｔ  Ｉ１２５Ｈ；Ｍ１５Ｔ  Ｒ１２７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｒ１２７Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ１４８Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｌ２９８Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｌ２９８Ｎ；およびＭ１５Ｔ  Ｓ３０６Ｇから選択される、請求項１に記載の改質されたジフテリア毒素。
【請求項１１】
改質されたジフテリア毒素は、３つの改質を含み、Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｅ１１７Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｒ１２７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｒ１２７Ａ  Ｓ３０６Ｇ；およびＭ１５Ｔ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇから選択される、請求項１に記載の改質されたジフテリア毒素。
【請求項１２】
改質されたジフテリア毒素は、４つの改質を含み、Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｒ１２７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７Ａ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇから選択される、請求項１に記載の改質されたジフテリア毒素。
【請求項１３】
改質されたジフテリア毒素は、５つの改質を含み、Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇ；およびＭ１５Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇから選択される、請求項１に記載の改質されたジフテリア毒素。
【請求項１４】
改質されたジフテリア毒素は、６つの改質を含み、Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｓ３０６Ｇ；およびＭ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇから選択される、請求項１に記載の改質されたジフテリア毒素。
【請求項１５】
前記改質されたジフテリア毒素は、Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇを含む改質を含む、請求項１に記載の改質されたジフテリア毒素。
【請求項１６】
改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１５、配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基９７、配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１１２、配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１１７、配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１２７、配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１４８、または配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基３０６に１つ以上の改質を含む、請求項１に記載の改質されたジフテリア毒素。
【請求項１７】
改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、Ｍ１５Ｔ、Ｖ９７Ｔ、Ｔ１１２Ｄ、Ｅ１１７Ｄ、Ｒ１２７Ａ、Ｖ１４８Ｔ、Ｓ３０６Ｇ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の改質を含む、請求項１６に記載の改質されたジフテリア毒素。
【請求項１８】
配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１５での改質が、Ｍ１５Ｔである、請求項１６に記載の改質されたジフテリア毒素。
【請求項１９】
（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフに１つ以上のアミノ酸改質をさらに含み、改質されたジフテリア毒素は、改質されていないジフテリア毒素に匹敵する細胞毒性を有し、改質されていないジフテリア毒素と比較して、低下した免疫原性と内皮細胞に対する低下した結合性を示す、請求項１に記載の改質されたジフテリア毒素。
【請求項２０】
少なくとも１つのアミノ酸改質が、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフ内に作られ、位置（ｘ）での改質が、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、Ｇ、Ｌおよび表１からの改質されたアミノ酸または異常アミノ酸から選択されるアミノ酸残基による、ＶまたはＩの置換であり、位置Ｄ／Ｅでの改質が、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ｇ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｒおよび表１からの改質されたアミノ酸または異常アミノ酸から選択されるアミノ酸残基による、ＤまたはＥの置換であり、位置（ｙ）での改質が、Ｉ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｖおよび表１からの改質されたアミノ酸または異常アミノ酸から選択されるアミノ酸残基によるＳの置換であるか、またはこれらの組み合わせである、請求項１９に記載の改質されたジフテリア毒素。
【請求項２１】
改質されたジフテリア毒素は、Ｖ７Ｔ、Ｖ７Ｎ、Ｖ７Ｄ、Ｄ８Ｎ、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｔ、Ｓ９Ｇ、Ｖ２９Ｓ、Ｖ２９Ｎ、Ｖ２９Ｄ、Ｖ２９Ｔ、Ｄ３０Ｅ、Ｄ３０Ｎ、Ｓ３１Ｇ、Ｓ３１Ｎ、Ｉ２９０Ｎ、Ｉ２９０Ｔ、Ｄ２９１Ｅ、Ｄ２９１Ｋ、Ｓ２９２Ａ、Ｓ２９２ＧおよびＳ２９２Ｔから選択される１つ以上の改質を含む、請求項２０に記載の改質されたジフテリア毒素。
【請求項２２】
請求項１に記載の改質されたジフテリア毒素と、医薬的に許容され得る賦形剤または担体とを含む、組成物。
【請求項２３】
請求項４に記載の改質されたジフテリア毒素と、医薬的に許容され得る賦形剤または担体とを含む、組成物。
【請求項２４】
治療に有効な量の請求項２２または２３に記載の組成物を被検者に投与することを含む、被検者の血液がん、固形腫瘍または転移を治療するための方法。
【請求項２５】
固形腫瘍は、平滑筋腫、脳腫瘍、癌腫、基底細胞がん、奇形腫、網膜芽腫、脈絡膜悪性黒色腫、セミノーマ、肉腫、形質細胞腫、頭頸部腫瘍、肝臓腫瘍、腎臓腫瘍、腎細胞腫瘍、扁平上皮がん、子宮腫瘍、骨腫瘍、前立腺腫瘍、乳房腫瘍、膀胱腫瘍、膵臓腫瘍、子宮内膜腫瘍、扁平上皮がん、胃腫瘍、グリオーマ、結腸直腸腫瘍、精巣腫瘍、結腸腫瘍、直腸腫瘍、卵巣腫瘍、子宮頸管腫瘍、眼腫瘍、中枢神経系腫瘍、甲状腺腫瘍、肺腫瘍、リンパ腫、多発性骨髄腫、皮膚腫瘍、婦人科腫瘍、ホジキン病、小腸のがん、内分泌系のがん、中皮腫、尿道のがん、陰茎のがん、またはゴーリン症候群に関連する腫瘍である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）請求項２２に記載の組成物および（ｂ）血液がん、固形腫瘍または転移の標的細胞に結合するリガンドの少なくとも細胞結合ドメインを含む治療に有効な量の融合タンパク質を被検者に投与することを含む、被検者の血液がん、固形腫瘍または転移を治療するための方法。
【請求項２７】
細胞結合ドメインは、抗体またはその抗原結合性フラグメント、サイトカイン、ポリペプチド、ホルモン、成長因子またはインスリンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
サイトカインは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）またはインターロイキン−３（ＩＬ−３）である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、遺伝子操作された抗体、またはグラフト化抗体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
抗原結合性フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ’）２、ＳｃＦｖ、ａ（ＳｃＦｖ）２、一本鎖結合ポリペプチド、ＶＨまたはＶＬである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、ペプチドリンカーを介して細胞結合ドメインに融合する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
治療に有効な量の請求項２２または２３に記載の組成物を被検者に投与することを含む、被検者の非悪性疾患を治療するための方法。
【請求項３３】
前記非悪性疾患は、移植片対宿主疾患または乾癬である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
抗がん剤と、治療に有効な量の請求項２２または２３に記載の組成物とを被検者に投与することを含む、被検者の抗がん剤の活性を高めるための方法。
【請求項３５】
抗がん剤と、（ａ）請求項２２に記載の組成物および（ｂ）血液がん、固形腫瘍または転移の標的細胞に結合するリガンドの少なくとも細胞結合ドメインを含む治療に有効な量の融合タンパク質とを被検者に投与することを含む、被検者の抗がん剤の活性を高めるための方法。
【請求項３６】
抗がん剤と、治療に有効な量の請求項２２または２３に記載の組成物とを被検者に投与することを含む、被検者の血液がん、固形腫瘍または転移を治療するための方法。
【請求項３７】
抗がん剤と、（ａ）請求項２２に記載の組成物および（ｂ）血液がん、固形腫瘍または転移の標的細胞に結合するリガンドの少なくとも細胞結合ドメインを含む治療に有効な量の融合タンパク質とを被検者に投与することを含む、被検者の血液がん、固形腫瘍または転移を治療するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（相互参照）
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／７９９，９１０号の利益を請求し、この出願は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本出願は、米国特許第８，２５２，８９７号および米国特許第８，４７０，３１４号に関連し、それぞれ、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【０００３】
（配列表）
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照として本明細書に組み込まれる配列表を含む。このＡＳＣＩＩコピーは、２０１４年３月７日に作られ、３３０９４−７０３．６０３＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、大きさは１，２２９，５７６バイトである。
【背景技術】
【０００４】
治療用タンパク質の効能は、例えば、治療用タンパク質に対する望ましくない免疫反応によって制限されることがある。例えば、いくつかのマウスモノクローナル抗体は、多くのヒト疾患の設定において、治療薬として有望であることが示されているが、特定の症例では、顕著な程度のヒト抗−マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答の誘発に起因して、失敗している。モノクローナル抗体について、ＨＡＭＡ応答を減らすための試みにおいて、多くの技術が開発されてきた。得られた「ヒト化」抗体は、いくつかの症例では、依然として患者において免疫応答を誘発した。抗体に加え、ヒト由来の他の治療用タンパク質およびアミノ酸配列が、依然としてヒトにおいて免疫応答を誘発することがある。顕著な例としては、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子の治療への使用が挙げられる。
【０００５】
治療用タンパク質の持続的な抗体応答は、Ｔヘルパー細胞の増殖および活性化の刺激を必要とする。Ｔ細胞の刺激は、Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）の相互作用を必要とする。相互作用のコアに、ＡＰＣ表面のペプチドＭＨＣクラスＩＩ複合体と係合したＴ細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）がある。このペプチドは、抗原タンパク質の細胞内処理から誘導される。ＭＨＣクラスＩＩ分子の提示によってＴ細胞の活性化を刺激することができる、タンパク質抗原に由来するペプチド配列は、一般的に、「Ｔ細胞エピトープ」と呼ばれる。このようなＴ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有し、少なくとも原則的には、Ｔ細胞の応答を促進するためにＴＣＲと係合することによってこれらのＴ細胞を活性化させる、任意のアミノ酸残基配列である。多くのタンパク質について、Ｔヘルパー細胞エピトープによってＴヘルパーシグナル伝達が起こり、治療用タンパク質の非常に多種類の露出した表面の決定基であり得るものに対し、持続的な高アフィニティのクラススイッチした抗体応答が生じる場合がある。
【０００６】
ヒトＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲアロタイプの部分集合に結合する能力を有するポリペプチド配列を特定するためのコンピュータによるスレッディング手法が記載されている。これらの適用では、予想されるＴ細胞エピトープが、コンピュータによって特定され、その後、目的のタンパク質内の賢明なアミノ酸置換によって除去される。しかし、このスキームおよびエピトープ特定のための他のコンピュータに基づく手順を用い、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することができると予想されたペプチドが、あらゆる状況で、特に、この処理経路または他の現象に起因して、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞エピトープとして機能するとは限らないことがわかった。それに加え、Ｔ細胞エピトープの予測に対するコンピュータによる手法は、一般的に、ＤＰ制限またはＤＱ制限を有するエピトープを予測することができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本明細書で提供されるのは、改質された毒素、改質された毒素を含有する融合タンパク質、これらの組成物、改質された毒素およびその融合タンパク質を製造する方法、および改質された毒素を用いて疾患を治療する方法である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
特定の実施形態では、改質された毒素、改質された毒素を含有する融合タンパク質、これらの組成物、改質された毒素およびその融合タンパク質を製造する方法、および疾患を治療する方法は、少なくとも１つのＴ細胞エピトープ内に少なくとも１つのアミノ酸残基の改質を有する毒素を含み、この改質された毒素が、改質されていない毒素と比較して、低下した免疫原性を示す。特定の実施形態では、改質された毒素、改質された毒素を含有する融合タンパク質、これらの組成物、改質された毒素およびその融合タンパク質を製造する方法、および疾患を治療する方法は、少なくとも１つのＴ細胞エピトープ内に少なくとも１つのアミノ酸残基の改質を有する毒素を含み、この改質された毒素は、改質されていない毒素と比較して、細胞毒性である。特定の実施形態では、改質された毒素、改質された毒素を含有する融合タンパク質、これらの組成物、改質された毒素およびその融合タンパク質を製造する方法、および疾患を治療する方法は、少なくとも１つのＴ細胞エピトープ内に少なくとも１つのアミノ酸残基の改質を有する毒素を含み、この改質された毒素は、細胞毒性であり、改質されていない毒素と比較して、低下した免疫原性を示す。
【０００９】
配列番号２、１４８または２００に示されるようなアミノ酸を含むジフテリア毒素が本明細書で提供される。本明細書で提供されるのは、配列番号２、１４８または２００と約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含むジフテリア毒素である。
【００１０】
本明細書で提供されるのは、少なくとも１つのＴ細胞エピトープ内に少なくとも１つのアミノ酸残基の改質を含む改質されたジフテリア毒素であり、この改質された毒素は、改質されていない毒素と比較して、低下した免疫原性および／または細胞毒性を示す。ある実施形態では、Ｔ細胞エピトープは、配列番号１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６および１９９から選択されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。本明細書に開示される化合物の一実施形態では、改質されたジフテリア毒素の中の少なくとも１つのアミノ酸残基の改質は、配列番号１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６および１９９のエピトープコアの中で行われる。さらに別の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基の改質は、配列番号１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６および１９９のＮ末端、Ｃ末端、またはこれら両末端で行われる。なおさらなる実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基の改質は、配列番号１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６および１９９のエピトープコアと、Ｎ末端、Ｃ末端、またはこれら両末端で行われる。
【００１１】
特定の実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、（ｉ）配列番号２または２００のアミノ酸残基１５；（ｉｉ）配列番号２または２００のアミノ酸残基９７〜１０５；（ｉｉｉ）配列番号２または２００のアミノ酸残基１０７〜１１５；（ｉｖ）配列番号２または２００のアミノ酸残基１１６〜１２４；（ｖ）配列番号２または２００のアミノ酸残基１２４〜１３２；（ｖｉ）配列番号２または２００のアミノ酸残基１４８〜１５６；および（ｖｉｉ）配列番号２または２００のアミノ酸残基２９８〜３０６から選択される配列内に少なくとも１つのアミノ酸改質を含む、少なくとも１つの改質されたＴ細胞エピトープコアを含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも２つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも３つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも４つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも５つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも６つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも７つの改質を含む。
【００１２】
特定の実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、（ｉ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１５；（ｉｉ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基９７〜１０５；（ｉｉｉ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１０７〜１１５；（ｉｖ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１１６〜１２４；（ｖ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１２４〜１３２；（ｖｉ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１４８〜１５６；および（ｖｉｉ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基２９８〜３０６から選択される配列内に少なくとも１つのアミノ酸改質を含む、少なくとも１つの改質されたＴ細胞エピトープコアを含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも２つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも３つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも４つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも５つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも６つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも７つの改質を含む。
【００１３】
ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、配列番号２または２００のアミノ酸残基１５での改質と、（ｉ）配列番号２または２００のアミノ酸残基９７〜１０５；（ｉｉ）配列番号２または２００のアミノ酸残基１０７〜１１５；（ｉｉｉ）配列番号２または２００のアミノ酸残基１１６〜１２４；（ｉｖ）配列番号２または２００のアミノ酸残基１２４〜１３２；（ｖ）配列番号２または２００のアミノ酸残基１４８〜１５６；および（ｖｉ）配列番号２または２００のアミノ酸残基２９８〜３０６から選択される配列内の少なくとも１つのアミノ酸改質とを含む、少なくとも１つの改質されたＴ細胞エピトープコアを含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも２つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも３つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも４つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも５つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも６つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも７つの改質を含む。
【００１４】
ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１５での改質と、（ｉ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基９７〜１０５；（ｉｉ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１０７〜１１５；（ｉｉｉ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１１６〜１２４；（ｉｖ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１２４〜１３２；（ｖ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１４８〜１５６；および（ｖｉ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基２９８〜３０６から選択される配列内の少なくとも１つのアミノ酸改質とを含む、少なくとも１つの改質されたＴ細胞エピトープコアを含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも２つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも３つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも４つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも５つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも６つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも７つの改質を含む。
【００１５】
ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、（ｉ）配列番号２または２００のアミノ酸残基１５；（ｉｉ）配列番号２または２００のアミノ酸残基９７；（ｉｉｉ）配列番号２または２００のアミノ酸残基１１２；（ｉｖ）配列番号２または２００のアミノ酸残基１１７；（ｖ）配列番号２または２００のアミノ酸残基１２７；（ｖｉ）配列番号２または２００のアミノ酸残基１４８；および（ｖｉｉ）配列番号２または２００のアミノ酸残基３０６から選択される配列内に少なくとも１つのアミノ酸改質を含む、少なくとも１つの改質されたＴ細胞エピトープコアを含む。
【００１６】
ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、（ｉ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１５；（ｉｉ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基９７；（ｉｉｉ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１１２；（ｉｖ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１１７；（ｖ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１２７；（ｖｉ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１４８；および（ｖｉｉ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基３０６から選択される配列内に少なくとも１つのアミノ酸改質を含む、少なくとも１つの改質されたＴ細胞エピトープコアを含む。
【００１７】
ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、配列番号２または２００のアミノ酸残基１５での改質と、（ｉ）配列番号２または２００のアミノ酸残基９７；（ｉｉ）配列番号２または２００のアミノ酸残基１１２；（ｉｉｉ）配列番号２または２００のアミノ酸残基１１７；（ｉｖ）配列番号２または２００のアミノ酸残基１２７；（ｖ）配列番号２または２００のアミノ酸残基１４８；および（ｖｉ）配列番号２または２００のアミノ酸残基３０６から選択される配列内の少なくとも１つのアミノ酸改質とを含む、少なくとも１つの改質されたＴ細胞エピトープコアを含む。
【００１８】
ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１５での改質と、（ｉ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基９７；（ｉｉ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１１２；（ｉｉｉ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１１７；（ｉｖ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１２７；（ｖ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１４８；および（ｖｉ）配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基３０６から選択される配列内の少なくとも１つのアミノ酸改質とを含む、少なくとも１つの改質されたＴ細胞エピトープコアを含む。
【００１９】
ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素は、１つ以上の改質を含有する。改質としては、限定されないが、Ｍ１５Ｄ、Ｍ１５Ｔ、Ｖ２９Ｓ、Ｖ２９Ｔ、Ｖ２９Ｎ、Ｖ２９Ｄ、Ｄ３０Ｅ、Ｓ３１Ｎ、Ｖ９７Ａ、Ｖ９７Ｄ、Ｖ９７Ｔ、Ｌ１０７Ａ、Ｌ１０７Ｎ、Ｌ１０７Ｔ、Ｔ１１２Ｇ、Ｔ１１２Ｄ、Ｔ１１２Ｅ、Ｅ１１３Ｄ、Ｌ１１５Ｔ、Ｌ１１５Ｎ、Ｌ１１５Ｄ、Ｍ１１６Ａ、Ｍ１１６Ｎ、Ｍ１１６Ｑ、Ｅ１１７Ｄ、Ｔ１２１Ｄ、Ｔ１２１Ｇ、Ｔ１２１Ｎ、Ｔ１２１Ｑ、Ｆ１２４Ｈ、Ｆ１２４Ａ、Ｆ１２４Ｋ、Ｉ１２５Ｈ、Ｒ１２７Ａ、Ｒ１２７Ｔ、Ｖ１４８Ａ、Ｖ１４８Ｔ、Ｉ２９０Ｔ、Ｄ２９１Ｅ、Ｄ２９１Ｋ、Ｓ２９２Ａ、Ｓ２９２Ｔ、Ｌ２９８Ａ、Ｌ２９８ＮおよびＳ３０６Ｇが挙げられる。一実施形態では、改質されたジフテリア毒素は、Ｍ１５Ｔを含有する。一実施形態では、改質されたジフテリア毒素は、Ｖ９７Ｔを含有する。一実施形態では、改質されたジフテリア毒素は、Ｔ１１２Ｄを含有する。一実施形態では、改質されたジフテリア毒素は、Ｅ１１７Ｄを含有する。一実施形態では、改質されたジフテリア毒素は、Ｒ１２７Ａを含有する。一実施形態では、改質されたジフテリア毒素は、Ｖ１４８Ｔを含有する。一実施形態では、改質されたジフテリア毒素は、Ｓ３０６Ｇを含有する。
【００２０】
ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素は、２つの改質を含有する。改質としては、限定されないが、Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｌ１０７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｌ１０７Ｎ；Ｍ１５Ｔ  Ｌ１０７Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｅ；Ｍ１５Ｔ  Ｅ１１３Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｌ１１５Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｌ１１５Ｎ；Ｍ１５Ｔ  Ｌ１１５Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｍ１１６Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｍ１１６Ｎ；Ｍ１５Ｔ  Ｍ１１６Ｑ；Ｍ１５Ｔ  Ｅ１１７Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１２１Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１２１Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１２１Ｎ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１２１Ｑ；Ｍ１５Ｔ  Ｆ１２４Ｈ；Ｍ１５Ｔ  Ｆ１２４Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｆ１２４Ｋ；Ｍ１５Ｔ  Ｉ１２５Ｈ；Ｍ１５Ｔ  Ｒ１２７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｒ１２７Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ１４８Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｌ２９８Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｌ２９８Ｎ；およびＭ１５Ｔ  Ｓ３０６Ｇが挙げられる。一実施形態では、改質されたジフテリア毒素は、Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔを含有する。一実施形態では、改質されたジフテリア毒素は、Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄを含有する。一実施形態では、改質されたジフテリア毒素は、Ｍ１５Ｔ  Ｅ１１７Ｄを含有する。一実施形態では、改質されたジフテリア毒素は、Ｍ１５Ｔ  Ｒ１２７Ａを含有する。一実施形態では、改質されたジフテリア毒素は、Ｍ１５Ｔ  Ｖ１４８Ｔを含有する。一実施形態では、改質されたジフテリア毒素は、Ｍ１５Ｔ  Ｓ３０６Ｇを含有する。
【００２１】
ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素は、３つの改質を含有する。改質としては、限定されないが、Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｅ１１７Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｒ１２７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｒ１２７Ａ  Ｓ３０６Ｇ；およびＭ１５Ｔ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇが挙げられる。
【００２２】
ある実施形態では、ジフテリア毒素改変体は、４つの改質を含有する。改質としては、限定されないが、Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｒ１２７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７Ａ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇ；およびＭ１５Ｔ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇが挙げられる。
【００２３】
ある実施形態では、ジフテリア毒素改変体は、５つの改質を含む。改質としては、限定されないが、Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇ；およびＭ１５Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇが挙げられる。
【００２４】
ある実施形態では、ジフテリア毒素改変体は、６つの改質を含有する。改質としては、限定されないが、Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｓ３０６Ｇ；およびＭ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇが挙げられる。
【００２５】
ある実施形態では、ジフテリア毒素改変体は、７つの改質を含有する。改質としては、限定されないが、Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇが挙げられる。
【００２６】
ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、（ｉ）配列番号２または２００のＭ１５Ｔ；（ｉｉ）配列番号２または２００のＶ９７Ｔ；（ｉｉｉ）配列番号２または２００のＴ１１２Ｄ；（ｉｖ）配列番号２または２００のＥ１１７Ｄ；（ｖ）配列番号２または２００のＲ１２７Ａ；（ｖｉ）配列番号２または２００のＶ１４８Ｔ；および（ｖｉｉ）配列番号２または２００のＳ３０６Ｇから選択される配列内に少なくとも１つのアミノ酸改質を含む、少なくとも１つの改質されたＴ細胞エピトープコアを含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも２つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも３つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも４つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも５つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも６つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも７つの改質を含む。
【００２７】
ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、配列番号２または２００のＭ１５Ｔの改質と、（ｉ）配列番号２または２００のＶ９７Ｔ；（ｉｉ）配列番号２または２００のＴ１１２Ｄ；（ｉｉｉ）配列番号２または２００のＥ１１７Ｄ；（ｉｖ）配列番号２または２００のＲ１２７Ａ；（ｖ）配列番号２または２００のＶ１４８Ｔ；および（ｖｉ）配列番号２または２００のＳ３０６Ｇから選択される配列内の少なくとも１つのアミノ酸改質とを含む、少なくとも１つの改質されたＴ細胞エピトープコアを含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも２つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも３つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも４つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも５つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも６つの改質を含む。ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、少なくとも７つの改質を含む。
【００２８】
ある実施形態では、改質されたジフテリア毒素またはそのフラグメントは、Ｍ１５Ｔ、Ｖ９７Ｔ、Ｔ１１２Ｄ、Ｅ１１７Ｄ、Ｒ１２７Ａ、Ｖ１４８Ｔ、Ｓ３０６Ｇ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の改質を含む。
【００２９】
本明細書で提供されるのは、Ｔ細胞エピトープ１内に変異を単独で含有するか、またはＴ細胞エピトープ２〜７内の１つ以上の変異と組み合わせて含有する、改質されたジフテリア毒素分子である。一実施形態では、ジフテリア毒素分子は、Ｔ細胞エピトープ１および２内で改質される。一実施形態では、ジフテリア毒素分子は、Ｔ細胞エピトープ１および３内で改質される。一実施形態では、ジフテリア毒素分子は、Ｔ細胞エピトープ１および４内で改質される。一実施形態では、ジフテリア毒素分子は、Ｔ細胞エピトープ１および５内で改質される。一実施形態では、ジフテリア毒素分子は、Ｔ細胞エピトープ１および６内で改質される。一実施形態では、ジフテリア毒素分子は、Ｔ細胞エピトープ１および７内で改質される。
【００３０】
さらに本明細書で提供されるのは、Ｔ細胞エピトープ１内に変異を含有する改質されたジフテリア毒素分子である。一実施形態では、ジフテリア毒素分子は、アミノ酸残基１５で、ＴまたはＤによるＭの置換で改質される。
【００３１】
さらに本明細書で提供されるのは、Ｔ細胞エピトープ２内に変異を単独で含有するか、またはＴ細胞エピトープ１および／または３〜７内の１つ以上の変異と組み合わせて含有する、改質されたジフテリア毒素分子である。一実施形態では、ジフテリア毒素分子は、アミノ酸残基９７で、ＴによるＶの置換で改質される。
【００３２】
さらに本明細書で提供されるのは、Ｔ細胞エピトープ３内に変異を単独で含有するか、またはＴ細胞エピトープ１、２および／または４〜７内の１つ以上の変異と組み合わせて含有する、改質されたジフテリア毒素分子である。一実施形態では、ジフテリア毒素分子は、アミノ酸残基１１２で、ＤによるＴの置換で改質される。
【００３３】
さらに本明細書で提供されるのは、Ｔ細胞エピトープ４内に変異を単独で含有するか、またはＴ細胞エピトープ１〜３および／または５〜７内の１つ以上の変異と組み合わせて含有する、改質されたジフテリア毒素分子である。一実施形態では、ジフテリア毒素分子は、アミノ酸残基１１７で、ＤによるＥの置換で改質される。
【００３４】
さらに本明細書で提供されるのは、Ｔ細胞エピトープ５内に変異を単独で含有するか、またはＴ細胞エピトープ１〜４、６および／または７内の１つ以上の変異と組み合わせて含有する、改質されたジフテリア毒素分子である。一実施形態では、ジフテリア毒素分子は、アミノ酸残基１２７で、ＡによるＲの置換で改質される。
【００３５】
さらに本明細書で提供されるのは、Ｔ細胞エピトープ６内に変異を単独で含有するか、またはＴ細胞エピトープ１〜５および／または７内の１つ以上の変異と組み合わせて含有する、改質されたジフテリア毒素分子である。一実施形態では、ジフテリア毒素分子は、アミノ酸残基１４８で、ＴによるＶの置換で改質される。
【００３６】
さらに本明細書で提供されるのは、Ｔ細胞エピトープ７内に変異を単独で含有するか、またはＴ細胞エピトープ１〜６内の１つ以上の変異と組み合わせて含有する、改質されたジフテリア毒素分子である。一実施形態では、ジフテリア毒素分子は、アミノ酸残基３０６で、ＧによるＳの置換で改質される。
【００３７】
別の態様では、さらに本明細書で提供されるのは、Ｔ細胞エピトープ１、２および７内に変異を含有する改質されたジフテリア毒素分子である。さらに別の態様では、本明細書で提供されるのは、Ｔ細胞エピトープ１、２および６内に変異を含有する改質されたＤＴ分子である。さらに別の態様では、本明細書で提供されるのは、Ｔ細胞エピトープ１、２および５内に変異を含有する改質されたＤＴ分子である。さらに別の態様では、本明細書で提供されるのは、Ｔ細胞エピトープ１、２および４内に変異を含有する改質されたＤＴ分子である。さらに別の態様では、本明細書で提供されるのは、Ｔ細胞エピトープ１、２および３内に変異を含有する改質されたＤＴ分子である。
【００３８】
本明細書で提供されるのは、ジフテリア毒素と非ジフテリア毒素ポリペプチドに由来するリガンドの少なくとも１つの細胞結合ドメインとを含む毒素を含有する融合物を含む、改質された毒素である。一実施形態では、非ジフテリア毒素ポリペプチドに由来する細胞結合ドメインは、細胞結合リガンドである。本明細書に開示する化合物の別の実施形態では、改質された毒素は、非毒素ポリペプチドが細胞結合リガンドであり、限定されないが、抗体またはその抗原結合フラグメント、サイトカイン、ポリペプチド、ホルモン、成長因子、またはインスリンが挙げられる、融合毒素である。
【００３９】
一実施形態では、改質された毒素は、細胞結合ドメインが抗体またはその抗原結合フラグメントである融合毒素である。抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、遺伝子操作された抗体、またはグラフト化抗体であってもよい。抗原結合フラグメントは、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ２、一本鎖結合ポリペプチド、ＶＨまたはＶＬであってもよい。さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｂ細胞表面分子、例えば、Ｂ細胞表面分子ＣＤ１９またはＣＤ２２に結合する。これに代えて、抗体またはその抗原結合フラグメントは、卵巣受容体ＭＩＳＩＩＲ（ミュラー管抑制因子ＩＩ型受容体）に結合する。
【００４０】
非ジフテリア毒素ポリペプチドは、限定されないが、抗体またはその抗原結合フラグメント、ＥＧＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＮＦα、ＩＮＦγ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、Ｅｐｈｒｉｎ、ＢＦＧＦおよびＴＧＦを含んでいてもよい。一実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−２である。一実施形態では、抗体は、ＨＥＲ２またはＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体に対する抗体である。一実施形態では、抗体は、トラスツズマブである。
【００４１】
特定の実施形態では、本明細書で提供されるのは、少なくとも１つのＴ細胞エピトープ内に少なくとも１つのアミノ酸残基の改質を有する改質された毒素であり、この毒素は、ジフテリア融合毒素である。さらに提供されるのは、少なくとも１つのＴ細胞エピトープ内に少なくとも１つのアミノ酸残基の改質を有する改質された毒素であり、この毒素は、ジフテリア毒素と、少なくとも１つの非ジフテリア毒素ポリペプチドに由来する細胞結合ドメインとを含む、ジフテリア融合毒素である。さらに提供されるのは、少なくとも１つのＴ細胞エピトープ内に少なくとも１つのアミノ酸残基の改質を有する改質された毒素であり、この毒素は、ジフテリア毒素と、少なくとも１つの非ジフテリア毒素ポリペプチドに由来する細胞結合ドメインとを含み、非ジフテリア毒素ポリペプチドがＩＬ−２である、ジフテリア融合毒素である。さらに提供されるのは、少なくとも１つのＴ細胞エピトープ内に少なくとも１つのアミノ酸残基の改質を有する改質された毒素であり、この毒素は、ジフテリア毒素と、少なくとも１つの非ジフテリア毒素ポリペプチドに由来する細胞結合ドメインとを含み、非ジフテリア毒素ポリペプチドがＨＥＲ２受容体に対する抗体である、ジフテリア融合毒素である。
【００４２】
本明細書で提供されるのは、低下した免疫原性および内皮細胞に対する低下した結合性を有する改質されたジフテリア毒素を含む組成物であり、この改質されたジフテリア毒素は、１つ以上のアミノ酸改質を有する配列番号２、１４８または２００に引用されるようなアミノ酸配列を含み、配列番号１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６および１９９から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＴ細胞エピトープが改質され、少なくとも１つのアミノ酸改質が、配列番号２、１４８または２００の残基７〜９、２９〜３１および２９０〜２９２から選択される領域中の（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフ内で行われ、この改質されたジフテリア毒素は、改質されていないジフテリア毒素に匹敵する細胞毒性を有し、位置（ｘ）での改質は、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、Ｇ、Ｌおよび表１からの改変されたアミノ酸または異常アミノ酸から選択されるアミノ酸残基による、ＶまたはＩの置換であり、および／または位置Ｄ／Ｅでの改質が、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ｇ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｒおよび表１からの改変されたアミノ酸または異常アミノ酸から選択されるアミノ酸残基による、ＤまたはＥの置換であり、および／または位置（ｙ）での改質が、Ｉ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｖおよび表１からの改変されたアミノ酸または異常アミノ酸から選択されるアミノ酸残基によるＳの置換である。
【００４３】
ほんの一例として、改質されていないジフテリア毒素は、例えば、配列番号２、１４８または２００のアミノ酸配列を有していてもよい。
【００４４】
改質されたジフテリア毒素を含む組成物は、改質されていないジフテリア毒素と比較して、低下した免疫原性（改変されたＴ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープ）およびヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対する低下した結合活性を示す（有する）。このような組成物は、さらに、限定されないが、抗体またはその抗原結合性フラグメント、ＥＧＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＮＦα、ＩＮＦγ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、Ｅｐｈｉｒｉｎ、ＢＦＧＦおよびＴＧＦを含む非ジフテリア毒素ポリペプチドを含んでいてもよい。非ジフテリア毒素ポリペプチドは、このようなポリペプチドのフラグメント、例えば、その細胞結合部分であってもよい。一実施形態では、非ジフテリア毒素ポリペプチドは、ＩＬ−２またはその細胞結合部分である。一実施形態では、非ジフテリア毒素ポリペプチドは、ＨＥＲ２受容体またはその細胞結合部分に対する抗体である。
【００４５】
本明細書で提供されるのは、（ｉ）ジフテリア毒素内の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを同定し、（ｉｉ）（ｉ）で同定された少なくとも１つのＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改質するプロセスによって製造され、この改質されたジフテリア毒素が、改質されていない毒素と比較して、低下した免疫原性を示す、改質されたジフテリア毒素である。
【００４６】
さらに本明細書で提供されるのは、（ｉ）配列番号２、１４８または２００のジフテリア毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを同定することと、（ｉｉ）（ｉ）で同定された少なくとも１つのＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改質することと、（ｉｉｉ）配列番号２、１４８または２００の残基７〜９、２９〜３１および２９０〜２９２からなる群から選択される領域内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改質し、この改質されたジフテリア毒素が、改質されていない毒素と比較して、低下した免疫原性および内皮細胞に対する低下した結合性を示すことと、（ｉｖ）改質されたジフテリア毒素の改質されたアミノ酸配列を分析し、少なくとも１つのＴ細胞エピトープまたは少なくとも１つのＶＬＳモチーフが改質されていることを確認することと、（ｖ）改質されていない毒素と比較して、低下した免疫原性および内皮細胞に対する低下した結合性を示す改質されたジフテリア毒素を選択することとを含む、改質されていない毒素と比較して、低下した免疫原性および内皮細胞に対する低下した結合性を示す改質されたジフテリア毒素を選択する方法である。
【００４７】
本明細書で提供されるのは、（ｉ）配列番号２、１４８または２００のジフテリア毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを同定することと、（ｉｉ）（ｉ）で同定された少なくとも１つのＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改質することとを含む、改質されていない毒素と比較して、低下した免疫原性を示す改質されたジフテリア毒素を製造する方法である。
【００４８】
さらに本明細書で提供されるのは、（ｉ）配列番号２、１４８または２００のジフテリア毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを同定することと、（ｉｉ）（ｉ）で同定された少なくとも１つのＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改質することと、（ｉｉｉ）配列番号２、１４８または２００の残基７〜９、２９〜３１および２９０〜２９２からなる群から選択される領域内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改質し、この改質されたジフテリア毒素が、改質されていない毒素と比較して、低下した免疫原性および内皮細胞に対する低下した結合性を示すことを含む、改質されていない毒素と比較して、低下した免疫原性および内皮細胞に対する低下した結合性を示す改質されたジフテリア毒素を製造する方法である。
【００４９】
さらに本明細書で提供されるのは、（ｉ）配列番号２、１４８または２００のジフテリア毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを同定することと、（ｉｉ）（ｉ）で同定された少なくとも１つのＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改質することと、（ｉｉｉ）配列番号２または２００の残基７〜９、２９〜３１および２９０〜２９２からなる群から選択される領域内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改質することと、（ｉｖ）改質されたジフテリア毒素の改質されたアミノ酸配列を分析し、Ｔ細胞エピトープの改質によってＶＬＳモチーフが生成するかどうかを同定することと、（ｖ）（ｉｖ）で同定されるＶＬＳモチーフを改質することとを含み、この改質されたジフテリア毒素は、改質されていない毒素と比較して、低下した免疫原性および内皮細胞に対する低下した結合性を示す、改質されていない毒素と比較して、低下した免疫原性および内皮細胞に対する低下した結合性を示す改質されたジフテリア毒素を製造する方法である。
【００５０】
さらに本明細書で提供されるのは、（ｉ）配列番号２、１４８または２００のジフテリア毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを同定することと、（ｉｉ）（ｉ）で同定された少なくとも１つのＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改質することと、（ｉｉｉ）配列番号２、１４８または２００の残基７〜９、２９〜３１および２９０〜２９２からなる群から選択される領域内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改質することと、（ｉｖ）改質されたジフテリア毒素の改質されたアミノ酸配列を分析し、ＶＬＳモチーフの改質によってＴ細胞エピトープが生成するかどうかを同定することと、（ｖ）（ｉｖ）で同定されるＴ細胞エピトープを改質することとを含み、この改質されたジフテリア毒素は、改質されていない毒素と比較して、低下した免疫原性および内皮細胞に対する低下した結合性を示す、改質されていない毒素と比較して、低下した免疫原性および内皮細胞に対する低下した結合性を示す改質されたジフテリア毒素を製造する方法である。
【００５１】
改質されていない毒素と比較して、低下した免疫原性および内皮細胞に対する低下した結合性を示す改質されたジフテリア毒素は、限定されないが、Ｖ７Ｎ  Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇの改質を有する改質されたジフテリア毒素が挙げられる。
【００５２】
本明細書で提供されるのは、（ｉ）ジフテリア毒素ワクチンで免疫化された被検者に由来する血清サンプルを得て、この血清が、前記ジフテリア毒素ワクチンに対する抗体を含み；（ｉｉ）前記血清と、１つ以上の改質されたジフテリア毒素とを接触させ、前記改質されたジフテリア毒素に対する前記抗体の結合によって複合体を生成し；（ｉｉｉ）前記複合体の存在または非存在を検出し、複合体が検出される場合、改質されたジフテリア毒素は、少なくとも１つのＢ細胞エピトープを欠いておらず、複合体のレベルの減少が検出される場合、改質されたジフテリア毒素は、少なくとも１つのＢ細胞エピトープを欠き；（ｉｖ）少なくとも１つのＢ細胞エピトープを欠く改質されたジフテリア毒素を選択することを含む、少なくとも１つのＢ細胞エピトープを欠く改質されたジフテリア毒素を選択する方法である。
【００５３】
本出願は、ある改質が行われ、その後、１つ以上の次の改質が行われるような、段階的または逐次的な様式で改質されたタンパク質を作成することができることも想定する。このような逐次的または段階的な改質は、このプロセスを行う１つの様式および本明細書に記載され、特許請求の範囲で請求される、改質されたタンパク質を産生する１つの様式を表す。
【００５４】
本明細書で提供されるのは、改質された毒素と、医薬的に許容され得る担体または賦形剤とを含む医薬組成物である。
【００５５】
本明細書で提供されるのは、治療に有効な量の本明細書に記載の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の悪性疾患または非悪性疾患、例えば、ＧＶＨＤを治療する方法である。
【００５６】
悪性疾患は、血液がんであってもよい。例示的な非限定的な血液がんとしては、限定されないが、急性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、再発／難治Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、再発／難治Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、脂肪織炎Ｔ細胞リンパ腫、節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫の鼻型、慢性リンパ性白血病、固形腫瘍およびヒトＴ細胞リンパ好性ウイルス１型に関連する急性Ｔ細胞白血病／リンパ腫が挙げられる。
【００５７】
悪性疾患は、固形腫瘍であってもよい。悪性疾患は、転移であってもよい。例示的な固形腫瘍としては、限定されないが、平滑筋腫、脳腫瘍（例えば、悪性、前悪性または良性の脳腫瘍、例えば、神経膠芽腫、星状細胞腫、髄膜腫、髄芽腫または末梢性神経外胚葉性腫瘍）、癌腫（例えば、胆嚢癌、気管支癌、基底細胞癌、腺がん、扁平上皮がん、小細胞癌腫、大細胞未分化がん、腺腫、嚢腺腫など）、基底細胞癌、奇形腫、網膜芽腫、脈絡膜悪性黒色腫、セミノーマ、肉腫（例えば、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、頭蓋咽頭腫、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、平滑筋肉腫、Ａｓｋｉｎ腫瘍、リンパ肉腫、神経肉腫、カポジ肉腫、皮膚線維肉腫、血管肉腫など）、形質細胞腫、頭頸部腫瘍（例えば、口腔、喉頭、上咽頭、食道など）、肝臓腫瘍、腎臓腫瘍、腎細胞腫瘍、扁平上皮がん、子宮腫瘍、骨腫瘍、前立腺腫瘍、限定されないが、Ｈｅｒ２および／またはＥＲおよび／またはＰＲの乳房腫瘍を含む、乳房腫瘍、膀胱腫瘍、膵臓腫瘍、子宮内膜腫瘍、扁平上皮がん、胃腫瘍、グリオーマ、結腸直腸腫瘍、精巣腫瘍、結腸腫瘍、直腸腫瘍、卵巣腫瘍、子宮頸管腫瘍、眼腫瘍、中枢神経系腫瘍（例えば、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸索（ｓｐｉｎａｌ  ａｘｉｓ）腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫など）、甲状腺腫瘍、肺腫瘍（例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）または小細胞肺がん）、リンパ腫（例えば、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、非皮膚末梢Ｔ細胞リンパ腫、ヒトＴ細胞リンパ好性ウイルス（ＨＴＬＶ）に関連するリンパ腫、例えば、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、成人Ｔ細胞白血病リンパ腫、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）、慢性または肝細胞癌腫など）、多発性骨髄腫、皮膚腫瘍（例えば、基底細胞癌腫、扁平上皮がん、黒色腫、例えば、悪性黒色腫、皮膚黒色腫または眼内黒色腫、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞がんまたはカポジ肉腫）、婦人科腫瘍（例えば、子宮肉腫、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がんなど）、ホジキン病、小腸のがん、内分泌系のがん（例えば、甲状腺、副甲状腺または副腎のがんなど）、中皮腫、尿道のがん、陰茎のがん、ゴーリン症候群に関連する腫瘍（例えば、髄芽腫、髄膜腫など）、未知の由来の腫瘍；またはこれらに対する転移が挙げられる。
【００５８】
非悪性疾患としては、例えば、ＧＶＨＤ、ＧＶＨＤおよび乾癬が挙げられる。
【００５９】
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質を投与することによる、抗がん剤（例えば、ＲＮＡによってトランスフェクションされたＤＣ、抗−ＣＬＴＡ４抗体、ＭＩＳＩＩＲ  ｓｃＦｖｓなど）の活性を高める方法である。一実施形態では、ＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質が投与され、その後、抗がん剤が投与される。ある非限定的な例では、抗がん剤の少なくとも４日前に、ＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質が投与される。
【００６０】
さらに本明細書で提供されるのは、抗がん剤（例えば、ＲＮＡによってトランスフェクションされたＤＣ、抗−ＣＬＴＡ４抗体、ＭＩＳＩＩＲ  ｓｃＦｖなど）および本明細書に記載されるＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質を投与することによってＴｒｅｇを減らすか、またはなくすことによる、転移がんを治療する方法である。転移腫瘍としては、例えば、転移腎細胞がん、転移前立腺がん、転移卵巣がんおよび転移肺がんが挙げられる。一実施形態では、ＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質が投与され、その後、抗がん剤が投与される。ある非限定的な例では、抗がん剤の少なくとも４日前に、ＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質が投与される。
【００６１】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、抗がん剤（例えば、ＲＮＡによってトランスフェクションされたＤＣ、抗−ＣＬＴＡ４抗体、ＭＩＳＩＩＲ  ｓｃＦｖなど）および本明細書に記載されるＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質を投与することによってＴｒｅｇを減らすか、またはなくすことによる、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍または黒色腫を治療する方法である。一実施形態では、ＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質が投与され、その後、抗がん剤が投与される。ある非限定的な例では、抗がん剤の少なくとも４日前に、ＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質が投与される。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】野生型ＤＴおよびネガティブコントロールと比較した、ＶＬＳモチーフで改質された種々のＤＴ毒素の最大溶解率％を与える。構築物は、以下のとおりである。ｐＡＮＧ１９＝Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｎ  Ｉ２９０Ｎ；ｐＡＮＧ２０＝Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｎ  Ｓ２９２Ａ；ｐＡＮＧ２１＝Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｎ  Ｓ２９２Ｔ；ｐＡＮＧ２２＝Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｓ２９２Ａ；ｐＡＮＧ２３＝Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｉ２９０Ｔ；ｐＡＮＧ２４＝Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｉ２９０Ｎ；およびｐＡＮＧ  ２５＝Ｖ７Ｎ。
【図２】野生型ＤＴおよびネガティブコントロール（Ｈｉｓ溶出バッファー）と比較した、ＶＬＳモチーフで改質された種々のＤＴ毒素の最大溶解率％を与える。構築物は、以下のとおりである。ｐＡＮＧ２３−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｉ２９０Ｔ；ｐＡＮＧ２４−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｉ２９０Ｎ；ｐＡＮＧ３３−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ；ｐＡＮＧ３５−Ｖ７Ｎ  Ｄ３０Ｅ  Ｉ２９０Ｔ；ｐＡＮＧ４６−Ｖ７Ｎ  Ｄ３０Ｅ  Ｉ２９０Ｎ；ｐＡＮＧ４７−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｄ２９１Ｋ；およびｐＡＮＧ４８−Ｖ７Ｎ  Ｄ３０Ｅ  Ｄ２９１Ｋ。
【図３】野生型ＤＴおよびネガティブコントロール（Ｈｉｓ溶出バッファー）と比較した、ＶＬＳモチーフで改質された種々のＤＴ毒素の最大溶解率％を与える。構築物は、以下のとおりである。ｐＡＮＧ２３−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｉ２９０Ｔ；ｐＡＮＧ２４−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｉ２９０Ｎ；ｐＡＮＧ３３−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ；ｐＡＮＧ３５−Ｖ７Ｎ  Ｄ３０Ｅ  Ｉ２９０Ｔ；ｐＡＮＧ４６−Ｖ７Ｎ  Ｄ３０Ｅ  Ｉ２９０Ｎ；ｐＡＮＧ４７−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｄ２９１Ｋ；およびｐＡＮＧ４８−Ｖ７Ｎ  Ｄ３０Ｅ  Ｄ２９１Ｋ。
【図４】野生型ＤＴと比較した、ＶＬＳモチーフで改質された種々のＤＴ毒素の最大溶解率％を与える。構築物は、以下のとおりである。ｐＡＮＧ２３−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｉ２９０Ｔ；ｐＡＮＧ３３−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ；ｐＡＮＧ３５−Ｖ７Ｎ  Ｄ３０Ｅ  Ｉ２９０Ｔ；ｐＡＮＧ３６−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｓ  Ｉ２９０Ｔ；およびｐＡＮＧ３７−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｄ  Ｉ２９０Ｔ。
【図５】野生型ＤＴと比較した、ＶＬＳモチーフで改質された種々のＤＴ毒素の最大溶解率％を与える。構築物は、以下のとおりである。ｐＡＮＧ２３−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｉ２９０Ｔ；ｐＡＮＧ２５−Ｖ７Ｎ；ｐＡＮＧ３５−Ｖ７Ｎ  Ｄ３０Ｅ  Ｉ２９０Ｔ；ｐＡＮＧ４７−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｄ２９１Ｋ；およびｐＡＮＧ４８−Ｖ７Ｎ  Ｄ３０Ｅ  Ｄ２９１Ｋ。
【図６】野生型ＤＴと比較した、ＶＬＳモチーフで改質された種々のＤＴ毒素の最大溶解率％を与える。構築物は、以下のとおりである。ｐＡＮＧ２３−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｉ２９０Ｔ；ｐＡＮＧ２５−Ｖ７Ｎ；ｐＡＮＧ３５−Ｖ７Ｎ  Ｄ３０Ｅ  Ｉ２９０Ｔ；ｐＡＮＧ４７−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｄ２９１Ｋ；およびｐＡＮＧ４８−Ｖ７Ｎ  Ｄ３０Ｅ  Ｄ２９１Ｋ。
【図７】野生型ＤＴと比較した、Ｔ細胞エピトープで改質された種々のＤＴ毒素の最大溶解率％を与える。構築物は、以下のとおりである。ｐＡＮＧ５０−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ａ；ｐＡＮＧ５１−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ；ｐＡＮＧ５３−Ｖ７Ｎ  Ｌ１０７Ａ；ｐＡＮＧ５４−Ｖ７Ｎ  Ｌ１０７Ｎ；およびｐＡＮＧ５５−Ｖ７Ｎ  Ｍ１１６Ａ。
【図８】野生型ＤＴと比較した、Ｔ細胞エピトープで改質された種々のＤＴ毒素の最大溶解率％を与える。構築物は、以下のとおりである。ｐＡＮＧ５６−Ｖ７Ｎ  Ｍ１１６Ｎ；ｐＡＮＧ５７−Ｖ７Ｎ  Ｍ１１６Ｑ；ｐＡＮＧ６０−Ｖ７Ｎ  Ｌ２９８Ａ；ｐＡＮＧ６１−Ｖ７Ｎ  Ｌ２９８Ｎ。
【図９】野生型ＤＴと比較した、Ｔ細胞エピトープで改質された種々のＤＴ毒素の最大溶解率％を与える。構築物は、以下のとおりである。ｐＡＮＧ５０−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ａ；ｐＡＮＧ５１−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ；ｐＡＮＧ５２−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｄ；ｐＡＮＧ５８−Ｖ７Ｎ  Ｖ１４８Ａ；およびｐＡＮＧ５９−Ｖ７Ｎ  Ｖ１４８Ｔ。
【図１０】野生型ＤＴおよびＨｉｓ溶出バッファーと比較した、Ｔ細胞エピトープで改質された種々のＤＴ毒素の最大溶解率％を与える。構築物は、以下のとおりである。ｐＡＮＧ５１−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ；ｐＡＮＧ６０−Ｖ７Ｎ  Ｌ２９８Ａ；ｐＡＮＧ７０−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ２９８Ａ；およびｐＡＮＧ７１−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ２９８Ｎ。
【図１１】野生型ＤＴおよびＨｉｓ溶出バッファーと比較した、Ｔ細胞エピトープで改質された種々のＤＴ毒素の最大溶解率％を与える。構築物は、以下のとおりである。ｐＡＮＧ５１−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ；ｐＡＮＧ６０−Ｖ７Ｎ  Ｌ２９８Ａ；ｐＡＮＧ７０−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ２９８Ａ；およびｐＡＮＧ７１−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ２９８Ｎ。
【図１２】野生型ＤＴと比較した、Ｔ細胞エピトープで改質された種々のＤＴ毒素の最大溶解率％を与える。構築物は、以下のとおりである。ｐＡＮＧ７２−Ｖ７Ｎ  Ｉ１２５Ｈ；ｐＡＮＧ７３−Ｖ７Ｎ  １２７Ａ；ｐＡＮＧ７４−Ｖ７Ｎ  Ｒ１２７Ｔ；ｐＡＮＧ７８−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７Ａ；およびｐＡＮＧ７９−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７Ｔ。
【図１３】野生型ＤＴと比較した、Ｔ細胞エピトープで改質された種々のＤＴ毒素の最大溶解率％を与える。構築物は、以下のとおりである。ｐＡＮＧ７３−Ｖ７Ｎ  １２７Ａ；ｐＡＮＧ７４−Ｖ７Ｎ  Ｒ１２７Ｔ；ｐＡＮＧ７８−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７Ａ；およびｐＡＮＧ７９−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７Ｔ。
【図１４】６つの改質を含むＤＴ毒素が活性であることを示すＩＶＴＴアッセイを与える。構築物は、以下のとおりである。
【表１】
2016519651.tif 000003
【図１５】７つの改質を含むＤＴ毒素が活性であることを示すＩＶＴＴアッセイを与える。構築物は、以下のとおりである。
【表２】
2016519651.tif 000004
【図１６】ＨＵＶＥＣ細胞に対する、直接標識されたＤＴΔＲ、ＶＬＳ変異体およびコントロールの直接的な結合を示す。
【図１７】例示的なＶＬＳ結合アッセイを示す。コントロールおよび試験サンプルについて、Ｏｎｔａｋ、野生型ＤＴΔＲおよびＶＬＳ変異体のＡｌｅｘａ−４８８接合対のＦＡＣＳプロットを与える。
【図１８】図１７に示した分散データのグラフを与える。
【図１９】ＤＴ−ＩＬ２融合タンパク質の改変体の細胞毒性試験を示す。このデータは、ＤＴ  Ｍ１５Ｔ，Ｓ３０６Ｇ−ＩＬ２が、ＤＴ野生型−ＩＬ２に匹敵する顕著な細胞毒性を示したことを示す。ＤＴ  Ｍ１５Ｔ，Ｓ３０６Ｇ−ＩＬ２は、ＤＴ  Ｍ１５Ｄ，Ｓ３０６Ｇ−ＩＬ２およびＤＴ  Ｆ１３Ｄ，Ｓ３０６Ｇ−ＩＬ２よりも予測できないほど優れた細胞毒性を示した。ＤＴ−ＩＬ２の濃度は、左から右に以下のとおりである。１．  １０００ｎｇ／ｍｌ（１６．６ｎＭ）；２．  ５００ｎｇ／ｍｌ（８．３２ｎＭ）；３．  ２５０ｎｇ／ｍｌ（４．１６ｎＭ）；４．  １２５ｎｇ／ｍｌ（２．０８ｎＭ）；５．  ６２．５ｎｇ／ｍｌ（１．０４ｎＭ）；６．  ３１．３ｎｇ／ｍｌ（０．５２ｎＭ）。
【図２０】ＨＥＲ２ネガティブ細胞におけるＤＴ−ハーセプチンＳｃＦｖ融合タンパク質の改変体の細胞毒性試験を示す。このデータは、試験したタンパク質が、予想されるように、いずれもＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（ＨＥＲ２ネガティブ）において細胞毒性を示さなかったことを示す（ネガティブコントロール）。ＤＴ−ハーセプチンＳｃＦｖの濃度は、左から右に以下のとおりである。１．  ２５００ｎｇ／ｍｌ（３４．６ｎＭ）；２．  １２５０ｎｇ／ｍｌ（１７．３ｎＭ）；３．  ６２５ｎｇ／ｍｌ（８．６５ｎＭ）；４．  ３１３ｎｇ／ｍｌ（４．３３ｎＭ）；５．  １５６ｎｇ／ｍｌ（２．１６ｎＭ）；６．  ７８．１ｎｇ／ｍｌ（１．０８ｎＭ）；７．  ３９．１ｎｇ／ｍｌ（５４１ｐＭ）；８．  １９．５ｎｇ／ｍｌ（２７０ｐＭ）；９．  ９．８ｎｇ／ｍｌ（１３６ｐＭ）；１０．  ４．９ｎｇ／ｍｌ（６７．８ｐＭ）；１１．  ２．４ｎｇ／ｍｌ（３３．２ｐＭ）；１２．  １．２ｎｇ／ｍｌ（１６．６ｐＭ）；１３．  ０．６１ｎｇ／ｍｌ（８．４４ｐＭ）；１４．  ０．３１ｎｇ／ｍｌ（４．２９ｐＭ）；１５．  ０．１５ｎｇ／ｍｌ（２．０８ｐＭ）；１６．  ０．０７６ｎｇ／ｍｌ（１．０５ｐＭ）；１７．  ０．０３８ｎｇ／ｍｌ（５２６ｆＭ）；１８．  ０．０１９ｎｇ／ｍｌ（２６３ｆＭ）。
【図２１】ＨＥＲ２ポジティブ細胞におけるＤＴ−ハーセプチンＳｃＦｖ融合タンパク質の改変体の細胞毒性試験を示す。このデータは、ＤＴ  Ｍ１５Ｔ，Ｓ３０６Ｇ−ＨＥＲが、ＤＴ野生型−ＨＥＲに匹敵する顕著な細胞毒性を示したことを示す。ＤＴ−ハーセプチンＳｃＦｖの濃度は、左から右に以下のとおりである。１．  ２５００ｎｇ／ｍｌ（３４．６ｎＭ）；２．  １２５０ｎｇ／ｍｌ（１７．３ｎＭ）；３．  ６２５ｎｇ／ｍｌ（８．６５ｎＭ）；４．  ３１３ｎｇ／ｍｌ（４．３３ｎＭ）；５．  １５６ｎｇ／ｍｌ（２．１６ｎＭ）；６．  ７８．１ｎｇ／ｍｌ（１．０８ｎＭ）；７．  ３９．１ｎｇ／ｍｌ（５４１ｐＭ）；８．  １９．５ｎｇ／ｍｌ（２７０ｐＭ）；９．  ９．８ｎｇ／ｍｌ（１３６ｐＭ）；１０．  ４．９ｎｇ／ｍｌ（６７．８ｐＭ）；１１．  ２．４ｎｇ／ｍｌ（３３．２ｐＭ）；１２．  １．２ｎｇ／ｍｌ（１６．６ｐＭ）；１３．  ０．６１ｎｇ／ｍｌ（８．４４ｐＭ）；１４．  ０．３１ｎｇ／ｍｌ（４．２９ｐＭ）；１５．  ０．１５ｎｇ／ｍｌ（２．０８ｐＭ）；１６．  ０．０７６ｎｇ／ｍｌ（１．０５ｐＭ）；１７．  ０．０３８ｎｇ／ｍｌ（５２６ｆＭ）；１８．  ０．０１９ｎｇ／ｍｌ（２６３ｆＭ）。
【図２２】ＨＥＲ２ポジティブ細胞におけるＤＴ−ハーセプチンＳｃＦｖ融合タンパク質の改変体の細胞毒性試験を示す。このデータは、ＤｉＤＴ−ＨＥＲ（ＤＴ  Ｍ１５Ｔ，Ｓ３０６Ｇ−ＨＥＲ）が、ＤＴ野生型−ＨＥＲに匹敵する顕著な細胞毒性を示したことを示す。ＤＴ−ハーセプチンＳｃＦｖの濃度は、左から右に以下のとおりである。１．  ２５００ｎｇ／ｍｌ（３４．６ｎＭ）；２．  １２５０ｎｇ／ｍｌ（１７．３ｎＭ）；３．  ６２５ｎｇ／ｍｌ（８．６５ｎＭ）；４．  ３１３ｎｇ／ｍｌ（４．３３ｎＭ）；５．  １５６ｎｇ／ｍｌ（２．１６ｎＭ）；６．  ７８．１ｎｇ／ｍｌ（１．０８ｎＭ）；７．  ３９．１ｎｇ／ｍｌ（５４１ｐＭ）；８．  １９．５ｎｇ／ｍｌ（２７０ｐＭ）；９．  ９．８ｎｇ／ｍｌ（１３５ｐＭ）；１０．  ４．９ｎｇ／ｍｌ（６７．６ｐＭ）；１１．  ２．４ｎｇ／ｍｌ（３３．８ｐＭ）；１２．  １．２ｎｇ／ｍｌ（１６．９ｐＭ）；１３．  ０．６１ｎｇ／ｍｌ（８．４５ｐＭ）；１４．  ０．３１ｎｇ／ｍｌ（４．２２ｐＭ）；１５．  ０．１５ｎｇ／ｍｌ（２．１１ｐＭ）；１６．  ０．０７６ｎｇ／ｍｌ（１．０６ｐＭ）；１７．  ０．０３８ｎｇ／ｍｌ（５２８ｆＭ）；１８．  ０．０１９ｎｇ／ｍｌ（２６４ｆＭ）；１９．  ０．００９５ｎｇ／ｍｌ（１３２ｆＭ）；２０．  ０．００４８ｎｇ／ｍｌ（６６ｆＭ）；２１．  ０．００２４ｎｇ／ｍｌ（３３ｆＭ）；２２．  ０．００１２ｎｇ／ｍｌ（１６ｆＭ）；２３．  ０．０００６ｎｇ／ｍｌ（８．２ｆＭ）；２４．  ０．０００３ｎｇ／ｍｌ（４．１ｆＭ）。ＥＴ１０１Ｈは、左に示される最も高い１２種類の濃度で使用された（２５００ｎｇ／ｍｌ〜１．２ｎｇ／ｍｌ）。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
本明細書で述べられるすべての刊行物および特許明細書は、それぞれ個々の刊行物または特許明細書が、具体的かつ独立して参考として組み込まれるように示されるのと同じ程度まで、参考として組み込まれる。
【００６４】
製剤または処理パラメータは変動し得るため、本明細書は、特定の製剤および処理パラメータに限定されないことを理解すべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記述することを目的としており、限定することを意図したものではないことも理解すべきである。さらに、本明細書に記載した方法および材料と類似または等価の多くの方法および材料を本発明の実施に使用することができることも理解されたい。
【００６５】
本明細書に従って、当該技術分野の技術に含まれる従来の分子生物学、細菌学および組み換えＤＮＡ技術を使用してもよい。このような技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ［Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｒ．Ｍ．編集（１９９４）］；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ［Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ編集（１９９４））］；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ［Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｊ．Ｅ．編集（１９９４）］；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編集  １９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集（１９８５）］；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集（１９８４）］；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編集（１９８６）］；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」［ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４）を参照。それぞれ、本明細書にその全体が具体的に参考として組み込まれる。
【００６６】
［Ｉ．Ｔ細胞エピトープを同定する方法］
合成ペプチドと組み合わせて組み換えＭＨＣ分子の可溶性複合体を活用する技術が用いられるようになっている。これらの試薬および手順を使用し、ヒトまたは実験動物被検者由来の末梢血サンプルから、特定のＭＨＣ−ペプチド複合体に結合する能力を有するＴ細胞クローンの存在を同定してもよいが、多種多様なＭＨＣアロタイプに対し、可能性がある複数のエピトープをスクリーニングするのには適合しない。
【００６７】
Ｔ細胞活性化の生物学的アッセイは、依然として、試験ペプチド／タンパク質配列が免疫応答を誘起する能力の尺度を与える最良の実施選択肢である。この種の手法の例としては、細菌タンパク質スタフィロキナーゼへのＴ細胞増殖アッセイの使用、次いで、Ｔ細胞株を刺激するための合成ペプチドを用いたエピトープマッピングを含む。同様に、破傷風毒素タンパク質の合成ペプチドを用いたＴ細胞増殖アッセイによって、この毒素の免疫優性エピトープ領域の定義がなされた。一実施形態では、試験タンパク質中のＴ細胞エピトープは、ヒト免疫細胞の単離されたサブセットを用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでその分化を促進し、目的の合成ペプチド存在下、細胞を培養し、培養したＴ細胞中の誘発された増殖を測定することによって決定されてもよい。他の技術を使用してもよく、両方の場合に、この方法が、細菌サブチリシンの中のＴ細胞エピトープの検出に適用される。このような技術は、細胞単離技術と、望ましい免疫細胞サブセット（樹状細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびまたはＣＤ８＋Ｔ細胞）を得るために複数のサイトカインを追加した細胞培養の注意深い適用を伴う。
【００６８】
治療目標の複数のタンパク質のためのＭＨＣクラスＩＩリガンドを定義するために、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ技術を利用してもよい。しかし、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで免疫原性ペプチドの提示を導くタンパク質分解処理および他の生理学的工程を必要とするという理由のために、コンピュータに基づくスキームによって定義可能なペプチドの全レパートリーの部分集合が、最終的な生物学的関連性を有する場合がある。従って、ｅｘ  ｖｉｖｏでのヒトＴ細胞活性化アッセイを使用し、毒素のタンパク質配列内で、Ｔ細胞活性化を補助する能力を有することにより、このタンパク質の免疫原性の問題に最も生物学的に関連する領域を同定してもよい。本明細書で使用する場合、「Ｔ細胞エピトープ」は、ＭＨＣクラスＩＩに結合する能力を有し、Ｔ細胞を刺激する能力を有し、および／またはＭＨＣクラスＩＩとの複合体で（必ずしも測定可能な活性化をしなくても）Ｔ細胞に結合する能力も有するアミノ酸配列を指す。
【００６９】
本明細書に開示する方法によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されたヒトＴ細胞における増殖応答を誘起する能力について、合成ペプチドを試験する。Ｔ細胞は、よく知られた手段によって全血サンプルから容易に得ることができる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の層内に存在する。さらに、ＰＢＭＣ調製物は、生理学的比率のＴ細胞および抗原提示細胞を含み、従って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで代替免疫反応を行うための良好な材料源である。このようなアッセイの操作において、２．０に近づくか、または２．０を超える刺激指数は、増殖が誘発されたことの有用な指標である。しかし、刺激指数は、毒素によって異なる場合があり、それぞれの毒素および対応するペプチドライブラリーのベースラインを参照して確立されるだろう。このような試験の一例において、刺激指数（ＳＩ）は、慣習的には、試験ペプチドに対して測定された増殖スコア（例えば、３Ｈ−チミジン組み込みを用いた場合、１分あたりの放射能の計測数）を、試験ペプチドと接触していない細胞で測定されたスコアで割ることによって誘導されてもよい。応答を誘発しないペプチドは、ＳＩ＝１．０を与える場合があるが、０．８〜１．２の範囲のＳＩ値も、顕著とはいえない場合がある。記録されたスコアの信頼性を確保するために、多くの技術的手順によって、このようなアッセイの操作を構築することができる。典型的には、すべての決定は、少なくとも３回ずつ行われ、平均スコアを計算してもよい。計算されたＳＩが２．０を超える場合、その３回分の個々のスコアについて、はずれたデータであることの証拠があるか調べてもよい。試験ペプチドを、少なくとも２種類の異なる濃度で細胞と接触させ、その濃度は、典型的には、最低でも２倍の濃度差があるだろう。このような濃度範囲は、このアッセイに対して速度の変動幅を相殺し、例えば、７日後のような単一の時間点での決定が行われるときに有用であろう。いくつかのアッセイにおいて、複数の時間点での一連の決定を行ってもよく、これらも、最低で２種類の異なる濃度で与えられたペプチド免疫原を用いて行われてもよい。同様に、ＰＭＢＣドナーサンプルの大部分が応答性であると予想される場合に、コントロールペプチドを含め、それぞれのアッセイプレートに含まれていてもよい。インフルエンザヘマグルチニンペプチド３０７〜３０９の配列ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡ（配列番号２０１）；およびクラミジアＨＳＰ６０ペプチド配列ＫＶＶＤＱＩＫＫＩＳＫＰＶＱＨ（配列番号２０２）は、このようなアッセイで使用すべきコントロールペプチドの例である。これに代えて、またはこれに加え、アッセイは、強力な全タンパク質抗原（例えば、Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ由来のヘモシアニン）を使用することもでき、この抗原に対し、すべてのＰＢＭＣサンプルは、２．０より顕著に大きなＳＩを示すことが予想されるだろう。このような使用のための他のコントロール抗原は、当該技術分野でよく知られているだろう。
【００７０】
本明細書に開示される方法は、可能性のあるＭＨＣアロタイプの広いスペクトルと関係がある毒素のエピトープマップを与えることができる。このマップは、タンパク質がＴ細胞によって働く免疫応答を誘起する能力が、投与されると思われる患者の大部分に対して失われていてもよく、または、少なくとも改善していてもよいような、改質されたタンパク質の設計または選択を可能にするのに十分に代表的であろう。改善は、改質されていないタンパク質と比較した免疫応答の低下（すなわち、低下した免疫原性）を指してもよい（例えば、約１．５分の１、約２分の１、約５分の１、約１０分の１、約２０分の１、約５０分の１、約１００分の１、約２００分の１、約５００分の１、またはもっと、またはこれらの間の任意の範囲）。これに代えて、低下した免疫原性を有するタンパク質または毒素は、改質されていないタンパク質と比較して、免疫応答を誘発する能力の低下率を指していてもよい（例えば、約１％低下、約２％低下、約３％低下、約４％低下、約５％低下、約１０％低下、約２０％低下、約５０％を超えて低下、約１００％低下、およびこれらの間の任意の範囲）。従って、スクリーニングプロセスの実施において、ナイーブドナー由来のＴ細胞から誘導されるＰＢＭＣを、十分な免疫学的多様性を有するドナープールから集め、ヒトの集団において現存するＭＨＣクラスＩＩレパートリー（ＨＬＡ−ＤＲ）の少なくとも９０％より大きいサンプルを得る。ナイーブＴ細胞の応答が、所与の合成ペプチドについて検出される場合、このペプチドを、実際に、単離中に複数のドナーから誘導されたＰＢＭＣ調製物と接触させる。ドナーの数（または「ドナープール」の大きさ）は、現実的な目的のために、２０人を下回らない血縁関係でない個人であると考えられ、ドナープールのすべてのサンプルは、そのＭＨＣクラスＩＩハプロタイプに従ってあらかじめ選択されてもよい。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「ナイーブドナー」という用語は、環境的に、ワクチン接種によって、または、例えば輸血のような他の手段によって、以前に毒素にさらされていない被検者を指す。
【００７２】
特定の国の個人は、日常的に毒素に対してワクチン接種されているか、または、環境的な外因性の毒素源および毒素様タンパク質（例えば、ジフテリア毒素）にさらされていることを注記しておく。このような個人では、上述のＳＩスコアの増加によって測定されるようなリコール応答の可能性がある。
【００７３】
Ｔ細胞エピトープについてスクリーニングするとき、Ｔ細胞は、治療的なタンパク質を今までに投与されていない多数の異なる健康なドナーに由来する末梢血サンプルから与えられてもよい。必要な場合、従来のアッセイ（例えば、１つ以上のポリペプチドの有無を同定するために抗体を使用するＥＬＩＳＡ）を用い、特定のポリペプチドの存在について、患者の血液サンプルを試験することができる。このアッセイを、当該技術分野で知られている従来の手順を用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されたＰＢＭＣを用いて行い、ＰＢＭＣと、目的のタンパク質の合成ペプチド種の代表例（すなわち、ライブラリー）とを接触させることを含む。適切なインキュベーション期間の後、ペプチドによって誘発されたＴ細胞の活性化（例えば、細胞増殖）を測定することを含む。測定は、任意の適切な手段によって行われてもよく、例えば、Ｈ３−チミジン組み込みを用いて行われてもよく、それによって、細胞材料内のＨ３の蓄積は、実験室の装置を用いて簡単に測定される。ＰＢＭＣサンプルと合成ペプチドのそれぞれの組み合わせの細胞増殖度を、ペプチド処理をしていないサンプルにおいてみられる細胞増殖度に対して調べることができる。予測される増殖効果が存在する１つ以上のペプチドで処理した後にみられる増殖応答を参照してもよい。この観点で、既知の広いＭＨＣ制限を有し、特に、ＤＰまたはＤＱのアイソタイプに対するＭＨＣ制限を有するペプチドエピトープを有するペプチドを使用することが有利であるが、本発明は、このような制限されたペプチドの使用に限定されない。このようなペプチドは、例えば、インフルエンザヘマグルチニンおよびクラミジアＨＳＰ６０について上に記載されている。
【００７４】
非限定的な一例では、ジフテリア毒素（ＤＴ）のためのＴ細胞エピトープをマッピングし、その後、本明細書に記載される方法を用いて改質する。ＤＴのためのエピトープマップのアセンブリを容易にするために、合成ペプチドのライブラリを作成する。それぞれのペプチドは、１５アミノ酸残基長であり、それぞれが、１２アミノ酸残基によってそのシリーズの次のペプチドと重複しており、すなわち、そのシリーズのそれぞれの連続したペプチドが、その分析に対してアミノ酸がさらに３ずつ加えられている。この様式で、任意の所与の隣接したペプチド対は、連続した配列の１８アミノ酸をマッピングした。ナイーブＴ細胞アッセイを用いたＤＴのためのＴ細胞マップを定義するための１つの方法を実施例７に示す。毒素のＴ細胞マップを定義するための方法によって同定されたそれぞれのペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩに結合する能力を有し、このアッセイシステムで検出可能な爆発的増殖の出現を誘起するのに十分なアフィニティを有する少なくとも１つの同種ＴＣＲに係合する能力を有することが示唆される。
【００７５】
［ＩＩ．毒素を改質する方法］
本明細書に記載される毒素分子は、組み換え方法の使用を含む任意のいくつかの様式で調製することができる。本明細書で提供されるタンパク質配列および情報を使用し、アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を推論することができる。このことは、例えば、コンピュータソフトウエアツール、例えば、ＤＮＡｓｔａｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｓｕｉｔｅ［ＤＮＡｓｔａｒ  Ｉｎｃ、マディソン、ウィスコンシン、ＵＳＡ］または類似のものを用いて達成することができる。このポリペプチドをコードする任意のこのようなポリヌクレオチド、または顕著なホモログ、改変体、トランケーション体、伸長、またはさらなる改質も本発明で想定される。
【００７６】
本明細書で提供されるのは、毒素のＴ細胞エピトープをマッピング（同定）し、改質された配列がＴヘルパーの応答誘発を（部分的または完全に）低下させるようにエピトープを改質する方法である。改質としては、同様の変化を行うために、改質されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン内で行われるアミノ酸の置換、欠失または挿入が挙げられる。アミノ酸残基をコードするコドンは、当該技術分野でよく知られている。目標配列の直接的な変異導入を達成するために、組み換えＤＮＡ方法を使用することができ、多くのこのような技術が、利用可能であり、本明細書に記載され、例えば上述のように当該技術分野で記載されている。一般的に、部位特異的な変異導入の技術がよく知られている。簡単にいうと、オリゴヌクレオチドの直接的なＰＣＲ変異導入のための一本鎖テンプレートを産生するバクテリオファージベクターを使用する。ファージベクター（例えば、Ｍ１３）が市販されており、その使用は、一般的に、当該技術分野でよく知られている。同様に、二本鎖プラスミドも、日常的に部位特異的変異導入に使用されており、ファージからプラスミドへと目的のポリヌクレオチドを移す工程が省かれる。望ましい変異された配列を生じる合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用し、このテンプレートから、改質された（望ましくは、変異）ＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成を直接行うことができ、ヘテロ二本鎖ＤＮＡを使用し、望ましいクローンの成長選択および同定のために、適格なＥ．ｃｏｌｉを形質転換する。これに代えて、プライマー対をアニーリングし、二本鎖ベクターの２個の別個の鎖にし、ＰＣＲ反応において望ましい変異を有する対応する両方の相補鎖を同時に合成してもよい。
【００７７】
一実施形態では、プラスミドＤＮＡテンプレートを用いたＱｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ部位特異的変異導入方法を使用してもよい。挿入物の挿入標的遺伝子を含有するプラスミドテンプレートのＰＣＲ増幅は、望ましい変異を含有する２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて達成される。ベクターの反対側の鎖にそれぞれ相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを、変異導入グレードのＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼによる温度変化の繰り返し中に伸長させる。オリゴヌクレオチドプライマーを組み込むと、互い違いに配列されたニックを含有する変異されたプラスミドが生成する。増幅された非メチル化産物をＤｐｎ  Ｉで処理し、メチル化された親ＤＮＡテンプレートを消化し、変異を含有する新しく合成されたＤＮＡを選択する。ほとんどのＥ．ｃｏｌｉ株から単離されるＤＮＡが、ｄａｍメチル化されているため、Ｄｐｎ  Ｉ消化を受けやすく、この消化は、メチル化されたＤＮＡおよびヘミメチル化されたＤＮＡに特異的である。この反応生成物でＥ．ｃｏｌｉの高効率株を形質転換し、望ましい改質を含有するプラスミドを得る。アミノ酸改質をポリペプチドに導入するさらなる方法は、当該技術分野でよく知られており、本明細書にも使用することができる。
【００７８】
タンパク質に適切な改質は、特定の残基または残基の組み合わせのアミノ酸置換を含んでいてもよい。Ｔ細胞エピトープの脱離のために、アミノ酸置換は、Ｔ細胞エピトープの活性を減らすか、またはなくすと予想されるアミノ酸配列内の適切な点またはアミノ酸残基で行われる。実際に、適切な点またはアミノ酸残基は、好ましくは、ＭＨＣクラスＩＩの結合溝の中に作られるポケットの１つの中のアミノ酸残基の結合と同等である。このような改質は、ペプチドのいわゆる「Ｐ１」位置または「Ｐ１アンカー」位置にあるクレフトの第１のポケットの中の結合を改変するだろう。ペプチドのＰ１アンカー残基とＭＨＣクラスＩＩ結合溝の第１のポケットとの間の結合相互作用の質は、全ペプチドに対する全体的な結合アフィニティの主要な決定因子であると認識される。この位置でのアミノ酸配列の適切な置換によって、一般的に、そのポケットの中に簡単には収容されないアミノ酸残基が組み込まれるだろう（例えば、もっと親水性が高い残基に置換）。ＭＨＣ結合クレフト内の他のポケット領域中の結合と同等の位置にあるペプチドのアミノ酸残基も、本発明の範囲内であると考えられ、この範囲に含まれる。
【００７９】
所与の潜在的なＴ細胞エピトープ内の１つのアミノ酸改質が、１つ以上のＴ細胞エピトープが脱離し得る１つの経路を表すと理解されたい。１つのエピトープ内の改質の組み合わせを想定してもよく、個々に定義されるエピトープが互いに重複していることも適切な場合がある。さらに、アミノ酸改質（所与のエピトープ内に１つ、または１つのエピトープ内に組み合わせて）は、ＭＨＣクラスＩＩ結合溝に対する「ポケット残基」と同等の位置ではなく、アミノ酸配列内の任意の点で行われてもよい。改質は、当該技術分野で知られており、本明細書に記載されるｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ技術を用いて作られる同一の構造または構造的方法を参照しておこなわれてもよく、ポリペプチドの既知の構造的特徴に基づいていてもよい。改変体分子の構造または生体活性を回復させるための変化（改質）が想定されてもよい。このような互助的変化および変化は、ポリペプチドに由来する特定のアミノ酸残基の欠失または付加（挿入）を含んでいてもよい。さらに、分子の構造を改変し、および／または生体活性を下げ、さらに、Ｔ細胞エピトープを脱離させることによって、分子の免疫原性を下げる改変が行われてもよい。あらゆる種類の改質が本発明で想定される。
【００８０】
タンパク質分子からエピトープを除去するさらなる手段は、本明細書に参考として完全に組み込まれるＷＯ  ０２／０６９２３２号に記載されるスキームに従って開発されたｉｎ  ｓｉｌｉｃｏツールと共に本明細書に概説したようなナイーブＴ細胞活性化アッセイスキームの使用に関する。このソフトウエアは、ポリペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ結合相互作用のレベルでの抗原提示のプロセスをシミュレーションし、所与のポリペプチド配列の結合スコアを与える。このようなスコアは、その集合において現存する、多くの優勢なＭＨＣクラスＩＩアロタイプについて決定される。このスキームで任意のポリペプチド配列を試験することができ、ポリペプチドがＭＨＣクラスＩＩ結合溝と相互作用する能力について、アミノ酸の置換、付加または欠失の結果を予測することができる。その結果、ＭＨＣクラスＩＩと相互作用することができ、それによって、免疫原性Ｔ細胞エピトープとして機能する、少ない数のアミノ酸を含む新しい配列組成物を設計することができる。任意の所与の１つのドナーサンプルを用いた生物学的アッセイが、最大で４種類のＤＲアロタイプに対する結合を評価することができる場合、このｉｎ  ｓｉｌｉｃｏプロセスは、４０種類を超えるアロタイプを用いた同じポリペプチド配列を同時に試験することができる。実際に、この手法は、複数のＭＨＣアロタイプと相互作用する能力が改変された新しい配列改変体の設計に向けることができる。当業者には明らかだと思われるが、複数の代替的な置換のセットは、望ましくないエピトープを除去するという目的を達成することまで到達することができた。しかし、得られる配列は、本明細書に開示する特定の組み合わせと非常に相同性であると認識され、従って、本出願の範囲に含まれる。
【００８１】
エピトープマッピングおよび場合によりＴ細胞活性化の生物学的アッセイを用いる再試験と合わせて、ＭＨＣクラスＩＩリガンドを同定し、ＭＨＣクラスＩＩリガンドを欠く配列アナログを設計するためのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏツールを用いる組み合わせ手法は、本出願のさらなる方法および実施形態である。この実施形態の一般的な方法は、以下の工程を含む。
（ｉ）Ｔ細胞を活性化することができるエピトープ領域を同定するための、目的のタンパク質配列を全体的に包含するナイーブＴ細胞活性化アッセイおよび合成ペプチドの使用；
（ｉｉ）ペプチドリガンドと１つ以上のＭＨＣアロタイプとの結合をシミュレーションし、工程（ｉ）で同定されたエピトープ領域を分析し、それによって、エピトープ領域内のＭＨＣクラスＩＩリガンドを同定するコンピュータスキームの使用；
（ｉｉｉ）ペプチドリガンドと１つ以上のＭＨＣアロタイプとの結合をシミュレーションし、もはやＭＨＣクラスＩＩに結合しないか、もっと少ない数のＭＨＣアロタイプに対して低下したアフィニティで結合するエピトープ領域内に包含されるＭＨＣリガンドの配列アナログを同定するコンピュータスキームの使用、場合により、
（ｉｖ）目的のタンパク質内の同定されたエピトープ領域を完全に包含するか、または全体的に包含し、野生型（親）配列と並行してナイーブＴ細胞活性化アッセイにおいて配列アナログを試験する、ナイーブＴ細胞活性化アッセイおよび合成ペプチドの使用。
【００８２】
一実施形態では、改質されていない毒素と比較して、低下した免疫原性を示す改質された毒素を製造する方法は、毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを同定することと、少なくとも１つの同定されたＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改質することとを含む。
【００８３】
別の実施形態では、改質されていない毒素と比較して、低下した免疫原性を示す改質された毒素は、毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを同定し、少なくとも１つの同定されたＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改質するプロセスによって作られる。
【００８４】
さらに別の実施形態では、改質されていない毒素と比較して、低下した免疫原性を示す改質された毒素を選択する方法は、毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを同定することと、少なくとも１つの同定されたＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改質することと、改質されていない毒素と比較して、低下した免疫原性を示す改質された毒素を選択することとを含む。
【００８５】
（ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ）
さらに本明細書で提供されるのは、１つ以上のＴ細胞エピトープ内に少なくとも１つの改質を有するか、または含有するＤＴ改質体である。本明細書に記載され、さらに実施例９に記載される方法によって、７つのＴ細胞エピトープがＤＴ内で同定されている。この７つのＴ細胞エピトープは、配列番号１８１、１８４、１８７、１９０、１９３、１９６および１９９に示されるようなジフテリア毒素のアミノ酸配列を含む。本明細書に記載されるように、配列番号１８１は、配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１〜２７に対応し、配列番号１８４は、配列番号２のアミノ酸残基８５〜１１７に対応し、配列番号１８７は、配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基９５〜１２７に対応し、配列番号１９０は、配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１０４〜１３６に対応し、配列番号１９３は、配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１１２〜１４４に対応し、配列番号１９６は、配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基１３６〜１６８に対応し、配列番号１９９は、配列番号２、１４８または２００のアミノ酸残基２８６〜３１８に対応する。これらのエピトープは、さらに、エピトープのＭＨＣクラスＩＩ結合のために最も望ましい結合レジスターであるコア９量体アミノ酸配列（９量体結合レジスター）および隣接するアミノ酸残基を含む。このコア９量体結合レジスターは、主要なエピトープであると考えられるが、９量体結合レジスターの外側に位置する残基は、ＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用し、ペプチド／ＭＨＣクラスＩＩ複合体の安定性を補助することが示されている。この７つの同定されたＤＴ  Ｔ細胞エピトープのコア９量体結合レジスターは、配列番号１６１、１６４、１６７、１６９、１７３、１７５および１７８のアミノ酸配列を有する。
【００８６】
本明細書に記載されるＴ細胞エピトープは、さらに、エピトープの領域によって特性決定することができる。このような領域は、エピトープコア、Ｎ末端およびＣ末端を含む。本明細書で使用する場合、「エピトープコア」は、Ｔ細胞エピトープのコア９量体アミノ酸配列を指す。エピトープコアは、さらに、Ｎ末端および／またはＣ末端のコア９量体アミノ酸配列に隣接する０個、１個、２個または３個のアミノ酸残基を含んでいてもよい。従って、エピトープコアは、特定の実施形態では、約９アミノ酸から約１５アミノ酸までの範囲の長さであってもよい。
【００８７】
本明細書で使用する場合、「Ｎ末端」は、エピトープコアのＮ末端に隣接するアミノ酸を指し、エピトープコアのＮ末端に隣接し、上流の少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個のアミノ酸を含む。
【００８８】
本明細書で使用する場合、「Ｃ末端」は、エピトープコアのＣ末端に隣接するアミノ酸を指し、エピトープコアのＣ末端に隣接し、下流の少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個のアミノ酸を含む。
【００８９】
ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ１は、ＶＤＳＳＫＳＦＶＭ（配列番号１６１）として示されるアミノ酸配列を有する９量体ペプチドを含む。本明細書に記載されるように、Ｔ細胞エピトープの脱離は、エピトープコアの０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個または１５個のアミノ酸を改質することによって、および／またはエピトープコアのＮ末端および／またはＣ末端に隣接する０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個またはもっと多いアミノ酸残基を改質することによって達成することができる。
【００９０】
非限定的な一例において、本明細書で提供されるのは、配列番号１８１として示されるアミノ酸配列を有するＤＴ  Ｔ細胞エピトープ１のエピトープコア内に１つ以上のアミノ酸改質を有し、このアミノ酸改質が、挿入、欠失または置換によるものである、ジフテリア毒素である。ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ１のコアエピトープは、配列番号１８１として示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基７〜１５、６〜１６、５〜１７、４〜１８またはこれらの任意の組み合わせを含んでいてもよい。さらに本明細書で提供されるのは、配列番号１８１として示されるアミノ酸配列を有するＤＴ  Ｔ細胞エピトープ１のＮ末端および／またはＣ末端に１つ以上のアミノ酸改質を有するジフテリア毒素である。ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ１のＮ末端は、配列番号１８１として示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜６、１〜５、１〜４、１〜３またはこれらの任意の組み合わせを含む。ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ１のＣ末端は、配列番号１８１として示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１６〜２４、１７〜２５、１８〜２６、１９〜２７またはこれらの任意の組み合わせを含む。さらに、本明細書で提供されるのは、配列番号１８１のエピトープコアと、配列番号１８１のＮ末端および／Ｃ末端の中に１つ以上のアミノ酸改質を有する、改質されたジフテリア毒素である。非限定的な一例では、同定されたＴ細胞エピトープを改質および／または脱離するために、エピトープコアのＰ１バリン残基を任意のアミノ酸残基で置き換えることができる。一実施形態では、同定されたＴ細胞エピトープを改質および／または脱離するために、エピトープコアのＰ１バリン残基を、極性アミノ酸残基を用い、残基の極性部分がＤＴ分子の表面に露出し、疎水性領域が埋もれるように置き換えることができる。例示的な極性アミノ酸残基としては、限定されないが、ヒスチジン（Ｈ）、グリシン（Ｇ）、リジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸／アスパルテート（Ｄ）、グルタミン酸／グルタメート（Ｅ）およびグルタミン（Ｑ）が挙げられる。一実施形態では、本明細書に提供される改質は、Ｍ１５Ｔである。これらの改質を、以下に記載する他のエピトープに適用することができることが理解されるだろう。
【００９１】
ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ２は、ＶＤＮＡＥＴＩＫＫ（配列番号１６４）として示されるアミノ酸配列を有する９量体ペプチドを含む。このＴ細胞エピトープの脱離は、エピトープコアの０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個のアミノ酸を改質することによって、および／またはそのＮ末端および／またはＣ末端の０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個またはもっと多いアミノ酸残基を改質することによって達成することができる。ある非限定的な例では、本明細書で提供されるのは、配列番号１８４のエピトープコア内に１つ以上のアミノ酸改質を有し、このアミノ酸改質が、挿入、欠失または置換によるものである、ジフテリア毒素である。ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ２のコアエピトープは、配列番号１８４として示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１３〜２１、１２〜２２、１１〜２３、１０〜２４またはこれらの任意の組み合わせを含む。本明細書で提供されるのは、配列番号１８４として示されるようなアミノ酸配列を有するＤＴ  Ｔ細胞エピトープ２のＮ末端および／またはＣ末端内に１つ以上のアミノ酸改質を有するジフテリア毒素である。ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ２のＮ末端は、配列番号１８４として示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜９、２〜１０、３〜１１、４〜１２またはこれらの任意の組み合わせを含む。ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ２のＣ末端は、配列番号１８４として示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２２〜３０、２３〜３１、２４〜３２、２５〜３３またはこれらの任意の組み合わせを含む。さらに、本明細書で提供されるのは、配列番号１８４のエピトープコアと、Ｎ末端および／またはＣ末端の中に１つ以上のアミノ酸改質を有する、改質されたジフテリア毒素である。非限定的な一例では、同定されたＴ細胞エピトープを改質および／または脱離するために、コア９量体のＰ１バリン残基を任意のアミノ酸残基で置き換えることができる。一実施形態では、本明細書に提供される改質は、Ｖ９７Ｔである。
【００９２】
ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ３は、ＬＧＬＳＬＴＥＰＬ（配列番号１６７）として示されるアミノ酸配列を有する９量体ペプチドを含む。このＴ細胞エピトープの脱離は、エピトープコアの０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個のアミノ酸を改質することによって、および／またはそのＮ末端および／またはＣ末端の０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個またはもっと多いアミノ酸残基を改質することによって達成することができる。ある非限定的な例では、本明細書で提供されるのは、配列番号１８７のエピトープコア内に１つ以上のアミノ酸改質を有し、このアミノ酸改質が、挿入、欠失または置換によるものである、ジフテリア毒素である。ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ３のコアエピトープは、配列番号１８７として示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１３〜２１、１２〜２２、１１〜２３、１０〜２４またはこれらの任意の組み合わせを含んでいてもよい。さらに本明細書で提供されるのは、配列番号１８７に示されるアミノ酸配列を有するＤＴ  Ｔ細胞エピトープ３のＮ末端および／またはＣ末端内に１つ以上のアミノ酸改質を有するジフテリア毒素である。ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ３のＮ末端は、配列番号１８７に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜９、２〜１０、３〜１１、４〜１２またはこれらの任意の組み合わせを含む。ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ３のＣ末端は、配列番号１８７に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２２〜３０、２３〜３１、２４〜３２、２５〜３３またはこれらの任意の組み合わせを含む。さらに、本明細書で提供されるのは、配列番号１８７のエピトープコアと、Ｎ末端および／またはＣ末端の中に１つ以上のアミノ酸改質を有する、改質されたジフテリア毒素である。非限定的な一例において、同定されたＴ細胞エピトープを改質および／または脱離するために、コア９量体のＰ１リジン残基を、極性アミノ酸残基を用い、残基の極性部分がＤＴ分子の表面に露出し、疎水性領域が埋もれるように置き換えることができる。さらに別の非限定的な例において、同定されたＴ細胞エピトープを改質および／または脱離するために、コア９量体の位置Ｐ６のトレオニンおよび／またはＰ７のグルタミン酸を任意のアミノ酸で置換してもよい。一実施形態では、本明細書に提供される改質は、Ｔ１１２Ｄである。
【００９３】
ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ４は、ＭＥＱＶＧＴＥＥＦ（配列番号１６９）として示されるアミノ酸配列を有する９量体ペプチドを含む。このＴ細胞エピトープの脱離は、エピトープコアの０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個のアミノ酸を改質することによって、および／またはそのＮ末端および／またはＣ末端の０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個またはもっと多いアミノ酸残基を改質することによって達成することができる。ある非限定的な例では、本明細書で提供されるのは、配列番号１９０のエピトープコア内に１つ以上のアミノ酸改質を有し、このアミノ酸改質が、挿入、欠失または置換によるものである、ジフテリア毒素である。ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ４のコアエピトープは、配列番号１９０として示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１３〜２１、１２〜２２、１１〜２３、１０〜２４またはこれらの任意の組み合わせを含んでいてもよい。さらに本明細書で提供されるのは、配列番号１９０として示されるアミノ酸配列を有するＤＴ  Ｔ細胞エピトープ４のＮ末端および／またはＣ末端内に１つ以上のアミノ酸改質を有するジフテリア毒素である。ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ４のＮ末端は、配列番号１９０として示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜９、２〜１０、３〜１１、４〜１２またはこれらの任意の組み合わせを含む。ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ４のＣ末端は、配列番号１９０として示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２２〜３０、２３〜３１、２４〜３２、２５〜３３またはこれらの任意の組み合わせを含む。さらに、本明細書で提供されるのは、配列番号１９０のエピトープコアと、Ｎ末端および／またはＣ末端の中に１つ以上のアミノ酸改質を有する、改質されたジフテリア毒素である。ある非限定的な例では、同定されたＴ細胞エピトープを改質および／または脱離するために、コア９量体のＰ６トレオニンおよび／またはＰ７グルタミン酸残基を任意のアミノ酸残基で置き換えることができる。一実施形態では、本明細書に提供される改質は、Ｅ１１７Ｄである。
【００９４】
ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ５は、ＦＩＫＲＦＧＤＧＡ（配列番号１７３）として示されるアミノ酸配列を有する９量体ペプチドを含む。Ｔ細胞エピトープの脱離は、エピトープコアの０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個のアミノ酸を改質することによって、および／またはそのＮ末端および／またはＣ末端の０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個またはもっと多いアミノ酸残基を改質することによって達成することができる。ある非限定的な例では、本明細書で提供されるのは、配列番号１９３のエピトープコア内に１つ以上のアミノ酸改質を有し、このアミノ酸改質が、挿入、欠失または置換によるものである、ジフテリア毒素である。ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ５のコアエピトープは、配列番号１９３として示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１３〜２１、１２〜２２、１１〜２３、１０〜２４またはこれらの任意の組み合わせを含んでいてもよい。さらに本明細書で提供されるのは、配列番号１９３に示されるアミノ酸配列を有するＤＴ  Ｔ細胞エピトープ５のＮ末端および／またはＣ末端内に１つ以上のアミノ酸改質を有するジフテリア毒素である。ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ５のＮ末端は、配列番号１９３として示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜９、２〜１０、３〜１１、４〜１２またはこれらの任意の組み合わせを含む。ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ５のＣ末端は、配列番号１９３として示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２２〜３０、２３〜３１、２４〜３２、２５〜３３またはこれらの任意の組み合わせを含む。さらに、本明細書で提供されるのは、配列番号１９３のエピトープコアと、Ｎ末端および／またはＣ末端の中に１つ以上のアミノ酸改質を有する、改質されたジフテリア毒素である。非限定的な一例において、同定されたＴ細胞エピトープを改質および／または脱離するために、コア９量体のＰ４アルギニン残基、Ｐ６グリシン残基、Ｐ７アスパラギン酸残基、および／またはＰ９アラニン残基、またはこれらの任意の組み合わせを置き換えることができる。一実施形態では、本明細書に提供される改質は、Ｒ１２７Ａである。
【００９５】
ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ６は、ＶＥＹＩＮＮＷＥＱ（配列番号１７５）として示されるアミノ酸配列を有する９量体ペプチドを含む。このＴ細胞エピトープの脱離は、エピトープコアの０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個のアミノ酸を改質することによって、および／またはそのＮ末端および／またはＣ末端の０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個またはもっと多いアミノ酸残基を改質することによって達成することができる。ある非限定的な例では、本明細書で提供されるのは、配列番号１９６のエピトープコア内に１つ以上のアミノ酸改質を有し、このアミノ酸改質が、挿入、欠失または置換によるものである、ジフテリア毒素である。ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ６のコアエピトープは、配列番号１９６として示されるアミノ酸配列を有するアミノ酸残基１３〜２１、１２〜２２、１１〜２３、１０〜２４またはこれらの任意の組み合わせを含んでいてもよい。さらに本明細書で提供されるのは、配列番号１９６として示されるアミノ酸配列を有するＤＴ  Ｔ細胞エピトープ６のＮ末端および／またはＣ末端内に１つ以上のアミノ酸改質を有するジフテリア毒素である。ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ６のＮ末端は、配列番号１９６として示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜９、２〜１０、３〜１１、４〜１２またはこれらの任意の組み合わせを含む。ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ６のＣ末端は、配列番号１９６として示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２２〜３０、２３〜３１、２４〜３２、２５〜３３またはこれらの任意の組み合わせを含む。さらに、本明細書で提供されるのは、配列番号１９６のエピトープコアと、Ｎ末端および／またはＣ末端の中に１つ以上のアミノ酸改質を有する、改質されたジフテリア毒素である。非限定的な一例において、同定されたＴ細胞エピトープを改質および／または脱離するためにコア９量体のＰ１バリンを、極性アミノ酸残基を用い、残基の極性部分が表面に露出し、疎水性領域が埋もれるように置き換えることができる。一実施形態では、本明細書に提供される改質は、Ｖ１４８Ｔである。
【００９６】
ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ７は、ＬＥＫＴＴＡＡＬＳ（配列番号１７８）として示されるアミノ酸配列を有する９量体ペプチドを含む。このＴ細胞エピトープの脱離は、エピトープコアの０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個のアミノ酸を改質することによって、および／またはそのＮ末端および／またはＣ末端の０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個またはもっと多いアミノ酸残基を改質することによって達成することができる。ある非限定的な例では、本明細書で提供されるのは、配列番号１９９のエピトープコア内に１つ以上のアミノ酸改質を有し、このアミノ酸改質が、挿入、欠失または置換によるものである、ジフテリア毒素である。ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ７のコアエピトープは、配列番号１９９として示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１３〜２１、１２〜２２、１１〜２３、１０〜２４またはこれらの任意の組み合わせを含んでいてもよい。さらに本明細書で提供されるのは、配列番号１９９として示されるようなアミノ酸配列を有するＤＴ  Ｔ細胞エピトープ７のＮ末端および／またはＣ末端内に１つ以上のアミノ酸改質を有するジフテリア毒素である。ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ７のＮ末端は、配列番号１９９として示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜９、２〜１０、３〜１１、４〜１２またはこれらの任意の組み合わせを含む。ＤＴ  Ｔ細胞エピトープ７のＣ末端は、配列番号１９９として示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２２〜３０、２３〜３１、２４〜３２、２５〜３３またはこれらの任意の組み合わせを含む。さらに、本明細書で提供されるのは、配列番号１９９のエピトープコアと、Ｎ末端および／またはＣ末端の中に１つ以上のアミノ酸改質を有する、改質されたジフテリア毒素である。一実施形態では、同定されたＴ細胞エピトープを改質および／または脱離するために、コア９量体のＰ１ロイシンを任意のアミノ酸で置き換えることができる。一実施形態では、本明細書に提供される改質は、Ｓ３０６Ｇである。
【００９７】
一実施形態では、改質されたジフテリア毒素は、１つ以上の改質を含む。改質としては、限定されないが、Ｖ７Ｓ、Ｖ７Ｔ、Ｖ７Ｎ、Ｖ７Ｄ、Ｄ８Ｅ、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｔ、Ｍ１５Ｔ、Ｖ２９Ｓ、Ｖ２９Ｔ、Ｖ２９Ｎ、Ｖ２９Ｄ、Ｄ３０Ｅ、Ｓ３１Ｎ、Ｖ９７Ａ、Ｖ９７Ｄ、Ｖ９７Ｔ、Ｌ１０７Ａ、Ｌ１０７Ｎ、Ｌ１０７Ｔ、Ｔ１１２Ｇ、Ｔ１１２Ｄ、Ｔ１１２Ｅ、Ｅ１１３Ｄ、Ｌ１１５Ｔ、Ｌ１１５Ｎ、Ｌ１１５Ｄ、Ｍ１１６Ａ、Ｍ１１６Ｎ、Ｍ１１６Ｑ、Ｅ１１７Ｄ、Ｔ１２１Ｄ、Ｔ１２１Ｇ、Ｔ１２１Ｎ、Ｔ１２１Ｑ、Ｆ１２４Ｈ、Ｆ１２４Ａ、Ｆ１２４Ｋ、Ｉ１２５Ｈ、Ｒ１２７Ａ、Ｒ１２７Ｔ、Ｖ１４８Ａ、Ｖ１４８Ｔ、Ｉ２９０Ｔ、Ｄ２９１Ｅ、Ｓ２９２Ａ、Ｓ２９２Ｔ、Ｌ２９８Ａ、Ｌ２９８Ｎ、Ｓ３０６Ｇが挙げられる。
【００９８】
一実施形態では、改質されたジフテリア毒素は、２つの改質を含む。改質としては、限定されないが、Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｌ１０７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｌ１０７Ｎ；Ｍ１５Ｔ  Ｌ１０７Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｅ；Ｍ１５Ｔ  Ｅ１１３Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｌ１１５Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｌ１１５Ｎ；Ｍ１５Ｔ  Ｌ１１５Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｍ１１６Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｍ１１６Ｎ；Ｍ１５Ｔ  Ｍ１１６Ｑ；Ｍ１５Ｔ  Ｅ１１７Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１２１Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１２１Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１２１Ｎ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１２１Ｑ；Ｍ１５Ｔ  Ｆ１２４Ｈ；Ｍ１５Ｔ  Ｆ１２４Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｆ１２４Ｋ；Ｍ１５Ｔ  Ｉ１２５Ｈ；Ｍ１５Ｔ  Ｒ１２７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｒ１２７Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ１４８Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｌ２９８Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｌ２９８Ｎ；Ｍ１５Ｔ  Ｓ３０６Ｇ；Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｎ；Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ；Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｄ；Ｖ７Ｔ  Ｖ２９Ｎ；Ｖ７Ｔ  Ｖ２９Ｔ；Ｖ７Ｔ  Ｖ２９Ｄ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ａ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｄ；Ｖ７Ｎ  Ｌ１０７Ａ；Ｖ７Ｎ  Ｌ１０７Ｎ；Ｖ７Ｎ  Ｔ１１２Ｇ；Ｖ７Ｎ  Ｔ１１２Ｄ；Ｖ７Ｎ  Ｔ１１２Ｅ；Ｖ７Ｎ  Ｌ１１５Ｔ；Ｖ７Ｎ  Ｌ１１５Ｎ；Ｖ７Ｎ  Ｌ１１５Ｄ；Ｖ７Ｎ  Ｍ１１６Ａ；Ｖ７Ｎ  Ｍ１１６Ｎ；Ｖ７Ｎ  Ｍ１１６Ｑ；Ｖ７Ｎ  Ｔ１２１Ｄ；Ｖ７Ｎ  Ｔ１２１Ｇ；Ｖ７Ｎ  Ｔ１２１Ｎ；Ｖ７Ｎ  Ｔ１２１Ｑ；Ｖ７Ｎ  Ｆ１２４Ｈ；Ｖ７Ｎ  Ｉ１２５Ｈ；Ｖ７Ｎ  Ｒ１２７Ａ；Ｖ７Ｎ  Ｒ１２７Ｔ；Ｖ７Ｎ  Ｖ１４８Ａ；Ｖ７Ｎ  Ｖ１４８Ｔ；Ｖ７Ｎ  Ｌ２９８Ａ；およびＶ７Ｎ  Ｌ２９８Ｎが挙げられる。
【００９９】
一実施形態では、改質されたジフテリア毒素は、３つの改質を含む。改質としては、限定されないが、Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｅ１１７Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｒ１２７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｒ１２７Ａ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇ  ；Ｖ７Ｄ  Ｌ１０７Ａ  Ｆ１２４Ｈ；Ｖ７Ｄ  Ｌ１０７Ｎ  Ｆ１２４Ｈ；Ｖ７Ｎ  Ｌ１０７Ａ  Ｆ１２４Ｈ；Ｖ７Ｎ  Ｌ１０７Ｎ  Ｆ１２４Ｈ；Ｖ７Ｔ  Ｌ１０７Ａ  Ｆ１２４Ｈ；Ｖ７Ｎ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１３Ｄ；Ｖ７Ｔ  Ｌ１０７Ｎ  Ｆ１２４Ｈ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ１０７Ａ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ１０７Ｎ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７Ａ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７Ｔ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｖ１４８Ｔ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ２９８Ａ；およびＶ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ２９８Ｎが挙げられる。
【０１００】
一実施形態では、ジフテリア毒素改質体は、４つの改質を含む。改質としては、限定されないが、Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｒ１２７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７Ａ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇ；Ｖ７Ｄ  Ｖ９７Ｄ  Ｌ１０７Ｎ  Ｆ１２４Ｈ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｄ  Ｌ１０７Ｎ  Ｆ１２４Ｈ；Ｖ７Ｔ  Ｖ９７Ａ  Ｌ１０７Ｎ  Ｆ１２４Ｈ；Ｖ７Ｔ  Ｖ９７Ｄ  Ｌ１０７Ｎ  Ｆ１２４Ｈ；Ｖ７Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ１０７Ｎ  Ｆ１２４Ｈ；Ｖ７Ｄ  Ｖ９７Ａ  Ｌ１０７Ｎ  Ｆ１２４Ｈ；Ｖ７Ｄ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ１０７Ｎ  Ｆ１２４Ｈ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ａ  Ｌ１０７Ｎ  Ｆ１２４Ｈ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ａ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ｑ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ｎ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｄ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ａ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｄ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ｑ、Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｄ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ｎ、Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７Ａ  Ｌ２９８Ａ、Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７Ａ  Ｌ２９８Ｎ、Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７Ｔ  Ｌ２９８Ａ、Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７Ｔ  Ｌ２９８ＮおよびＶ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ１０７Ｎ  Ｆ１２４Ｈが挙げられる。
【０１０１】
一実施形態では、ジフテリア毒素改質体は、５つの改質を含む。改質としては、限定されないが、Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇ；およびＭ１５Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇが挙げられる。
【０１０２】
一実施形態では、ジフテリア毒素改質体は、６つの改質を含む。改質としては、限定されないが、Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇ；Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｓ３０６Ｇ；およびＭ１５Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６ＧＶ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ａ  Ｆ１２４Ｈ  Ｖ１４８Ａ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ｑ  Ｆ１２４Ｈ  Ｖ１４８Ａ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ｎ  Ｆ１２４Ｈ  Ｖ１４８Ａ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｄ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ａ  Ｆ１２４Ｈ  Ｖ１４８Ｔ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｄ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ｑ  Ｆ１２４Ｈ  Ｖ１４８Ｔ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｄ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ｎ  Ｆ１２４Ｈ  Ｖ１４８Ｔ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ａ  Ｆ１２４Ｈ  Ｖ１４８Ｔ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ｑ  Ｆ１２４Ｈ  Ｖ１４８Ｔ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ｎ  Ｆ１２４Ｈ  Ｖ１４８Ｔ；Ｖ７Ｔ  Ｖ９７Ｄ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ａ  Ｆ１２４Ｈ  Ｖ１４８Ｔ；Ｖ７Ｔ  Ｖ９７Ｄ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ｑ  Ｆ１２４Ｈ  Ｖ１４８Ｔ；およびＶ７Ｔ  Ｖ９７Ｄ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ｎ  Ｆ１２４Ｈ  Ｖ１４８Ｔが挙げられる。
【０１０３】
一実施形態では、ジフテリア毒素改質体は、７つの改質を含む。改質としては、限定されないが、Ｍ１５Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｔ１１２Ｄ  Ｅ１１７Ｄ  Ｒ１２７Ａ  Ｖ１４８Ｔ  Ｓ３０６Ｇ；Ｖ７Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ｎ  Ｆ１２４Ｈ  Ｖ１４８Ａ  Ｌ２９８Ａ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｄ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ｑ  Ｆ１２４Ｈ  Ｖ１４８Ｔ  Ｌ２９８Ａ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｄ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ｎ  Ｆ１２４Ｈ  Ｖ１４８Ｔ  Ｌ２９８Ａ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ｎ  Ｆ１２４Ｈ  Ｖ１４８Ｔ  Ｌ２９８Ａ；Ｖ７Ｔ  Ｖ９７Ｄ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ａ  Ｆ１２４Ｈ  Ｖ１４８Ｔ  Ｌ２９８Ａ；Ｖ７Ｔ  Ｖ９７Ｄ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ｎ  Ｆ１２４Ｈ  Ｖ１４８Ｔ  Ｌ２９８Ａ；Ｖ７Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ｎ  Ｆ１２４Ｈ  Ｖ１４８Ａ  Ｌ２９８Ｎ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｄ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ｑ  Ｆ１２４Ｈ  Ｖ１４８Ｔ  Ｌ２９８Ｎ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｄ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ｎ  Ｆ１２４Ｈ  Ｖ１４８Ｔ  Ｌ２９８Ｎ；Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ｎ  Ｆ１２４Ｈ  Ｖ１４８Ｔ  Ｌ２９８Ｎ；Ｖ７Ｔ  Ｖ９７Ｄ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ａ  Ｆ１２４Ｈ  Ｖ１４８Ｔ  Ｌ２９８Ｎ；およびＶ７Ｔ  Ｖ９７Ｄ  Ｌ１０７Ｎ  Ｍ１１６Ｎ  Ｆ１２４Ｈ  Ｖ１４８Ｔ  Ｌ２９８Ｎが挙げられる。
【０１０４】
上述の例および実施形態に加え、１つ以上のＴ細胞エピトープ内に１つ以上のアミノ酸改質を含む、改質されたジフテリア毒素が本明細書で想定される。ある非限定的な例では、本明細書で提供されるのは、少なくとも１つのＴ細胞エピトープ内に少なくとも１つの改質を有するジフテリア毒素である。別の非限定的な例において、本明細書で提供されるのは、上述のＴ細胞エピトープ１、２、３、４、５、６または７内に少なくとも１つのアミノ酸改質を有するジフテリア毒素である。さらなる非限定的な例としては、１個より多いＴ細胞エピトープに１つより多いアミノ酸改質を有するジフテリア毒素が挙げられる。任意の数の上述のＤＴ  Ｔ細胞エピトープでのアミノ酸改質の任意の組み合わせが、本発明で想定される。
【０１０５】
本明細書で提供されるのは、Ｔ細胞エピトープ１内に変異を単独で含有するか、またはＴ細胞エピトープ２〜７内の１つ以上の変異と組み合わせて含有する、改質されたＤＴ分子である。一実施形態では、ＤＴ分子は、Ｔ細胞エピトープ１および２内で改質される。一実施形態では、ＤＴ分子は、Ｔ細胞エピトープ１および３内で改質される。一実施形態では、ＤＴ分子は、Ｔ細胞エピトープ１および４内で改質される。一実施形態では、ＤＴ分子は、Ｔ細胞エピトープ１および５内で改質される。一実施形態では、ＤＴ分子は、Ｔ細胞エピトープ１および６内で改質される。一実施形態では、ＤＴ分子は、Ｔ細胞エピトープ１および７内で改質される。
【０１０６】
さらに本明細書で提供されるのは、Ｔ細胞エピトープ１内に変異を含有する、改質されたＤＴ分子である。一実施形態では、ＤＴ分子は、アミノ酸残基７で、Ｎ、ＡまたはＴによるＶの置換で改質される。
【０１０７】
さらに本明細書で提供されるのは、Ｔ細胞エピトープ２内に変異を単独で含有するか、またはＴ細胞エピトープ１および／または３〜７内の１つ以上の変異と組み合わせて含有する、改質されたＤＴ分子である。一実施形態では、ＤＴ分子は、アミノ酸残基９７で、ＴによるＶの置換で改質される。
【０１０８】
さらに本明細書で提供されるのは、Ｔ細胞エピトープ３内に変異を単独で含有するか、またはＴ細胞エピトープ１、２および／または４〜７内の１つ以上の変異と組み合わせて含有する、改質されたＤＴ分子である。
【０１０９】
さらに本明細書で提供されるのは、Ｔ細胞エピトープ４内に変異を単独で含有するか、またはＴ細胞エピトープ１〜３および／または５〜７内の１つ以上の変異と組み合わせて含有する、改質されたＤＴ分子である。
【０１１０】
さらに本明細書で提供されるのは、Ｔ細胞エピトープ５内に変異を単独で含有するか、またはＴ細胞エピトープ１〜４、６および／または７内の１つ以上の変異と組み合わせて含有する、改質されたＤＴ分子である。一実施形態では、Ｔ細胞エピトープ改質体は、Ｖ７Ｎを含む二重変異体およびＶ７ＮおよびＮ９７Ｔを含む三重変異体として構築される。構築物は、Ｔ細胞エピトープ５の改変体が構築され、ｐ２  ＴＣＲ接触残基Ｉ１２５およびｐ４  ＭＨＣアンカー残基Ｒ１２７を標的とするように製造されてもよい。このような変異の非限定的な例としては、限定されないが、Ｖ７Ｎ  Ｉ１２５Ｈ、Ｖ７Ｎ  Ｒ１２７Ａ、Ｖ７Ｎ  Ｒ１２７Ｔ、Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７ＡおよびＶ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７Ｔが挙げられる。
【０１１１】
さらに本明細書で提供されるのは、Ｔ細胞エピトープ６内に変異を単独で含有するか、またはＴ細胞エピトープ１〜５および／または７内の１つ以上の変異と組み合わせて含有する、改質されたＤＴ分子である。一実施形態では、ＤＴ分子は、アミノ酸残基１４８で、ＴによるＶの置換で改質される。
【０１１２】
さらに本明細書で提供されるのは、Ｔ細胞エピトープ７内に変異を単独で含有するか、またはＴ細胞エピトープ１〜６内の１つ以上の変異と組み合わせて含有する、改質されたＤＴ分子である。一実施形態では、ＤＴ分子は、アミノ酸残基２９８で、ＡまたはＮによるＬの置換で改質される。
【０１１３】
別の態様では、さらに本明細書で提供されるのは、Ｔ細胞エピトープ１、２および７内に変異を含有する、改質されたＤＴ分子である。さらに別の態様では、さらに本明細書で提供されるのは、Ｔ細胞エピトープ１、２および６内に変異を含有する、改質されたＤＴ分子である。
【０１１４】
２つのＴ細胞エピトープが改質されたＤＴ分子の構築物としては、限定されないが、Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ａ、Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ、Ｖ７Ｎ  Ｌ９７Ｄ、Ｖ７Ｎ  Ｌ１０７Ａ、Ｖ７Ｎ  Ｌ１０７Ｎ、Ｖ７Ｎ  Ｍ１１６Ａ、Ｖ７Ｎ  Ｍ１１６Ｎ、Ｖ７Ｎ  Ｍ１１６Ｑ、Ｖ７Ｎ  Ｖ１４８Ａ、Ｖ７Ｎ  Ｖ１４８Ｔ、Ｖ７Ｎ  Ｌ２９８ＡおよびＶ７Ｎ  Ｌ２９８Ｎが挙げられる。構築物は、３つのアミノ酸置換を行うことによって改質された、改質されたＤＴ分子も含む。例えば、３つのＴ細胞エピトープで改質されたＤＴ分子の構築物としては、限定されないが、Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ２９８ＡおよびＶ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ２９８Ｎが挙げられる。
【０１１５】
（ＤＴ  Ｔ細胞エピトープおよびアロタイプの頻度）
抗原内でみられる個々のエピトープは、特異的なＭＨＣクラスＩＩアロタイプによって優先的に提示することができ、同様に、同じ抗原内の他の特異的なエピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子上でまったく提示されなくてもよい。特定のエピトープと、特異的なＭＨＣクラスＩＩ分子とのこのような会合は、個人のＭＨＣクラスＩＩアロタイプに依存することが示された。Ｔ細胞エピトープを除去するためにＤＴを改質するとき、特定のエピトープと特異的なアロタイプとの会合を検討することもできる。このような検討によって、特異的なアロタイプに対して（例えば、特定のＭＨＣクラスＩＩアロタイプを有する被検者の特異的な集合に対して）非常に特異的なＤＴ分子の改質を可能にすることができる。１以上の被検者のＭＨＣクラスＩＩアロタイプは、当該技術分野で知られているジェノタイピング方法によって簡単に決定することができ、これによって、このアロタイプに合わせた毒素の改質を検討するために、ＤＴ  Ｔ細胞エピトープと所与のアロタイプとの会合を簡単に同定することができる。ＤＴ  Ｔ細胞エピトープとＭＨＣクラスＩＩアロタイプとの会合の同定は、実施例９および表５に示される。本明細書で想定されるのは、毒素の所与のエピトープについて同定されたＭＨＣクラスＩＩの会合に合うようなＴ細胞エピトープの改質を有する、改質された毒素である。
【０１１６】
本明細書の教示に基づき、本明細書に記載される他の毒素にこれらの方法を適用することができる。例えば、ＭＨＣの会合およびＴ細胞エピトープについて分析された毒素のアミノ酸配列を簡単に使用することができる。それに加えて、本明細書全体に記載され、以下の実施例に記載される方法を用い、ＭＨＣの会合について分析されていない毒素を分析し、試験することもできる。
【０１１７】
［ＩＩＩ．Ｂ細胞エピトープのスクリーニング］
本明細書に開示されるようなＴ細胞エピトープの同定および改変に加え、Ｂ細胞エピトープを同定および改変すると、さらに、毒素の免疫原性を下げることができる。血清学的な方法、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの方法、または両方法の組み合わせを使用し、毒素または改質された毒素の中のＢ細胞エピトープを同定することができる。血清学的な方法は、被検者が免疫原性分子（タンパク質、ペプチドおよびポリペプチドを含む）に対する抗体を生成する能力を使用する。毒素または改質された毒素が、例えば、ワクチン接種のために集団にすでに投与されたものである場合、その被検者で発生する抗体応答を使用し、Ｂ細胞エピトープのための毒素または改質された毒素をスクリーニングすることができる。非限定的な一例では、本明細書に開示されるように改質されたＴ細胞エピトープを有する毒素（例えば、ジフテリア毒素）をさらにスクリーニングし、Ｂ細胞エピトープを同定することができる。改質された毒素の配列に基づくペプチドライブラリーを合成することができ、毒素をワクチン接種され、毒素に対する抗体を含有するドナー由来の血清について、ペプチドライブラリーのペプチドに結合する能力を調べることができる。限定されないが、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよびウェスタンブロッティングを含む種々の技術およびアッセイは、当該技術分野でよく知られており、これを使用し、毒素をワクチン接種されたドナーの血清に由来する抗体に結合する１つ以上のペプチドを同定することができる。ドナー血清中の抗体に結合するこれらの１つ以上のペプチドは、毒素配列内のＢ細胞エピトープを表す。改質された毒素のＢ細胞エピトープを同定した後、このＢ細胞エピトープに対応するアミノ酸残基を改質してもよく、ドナー血清に対し、改質された毒素を再びスクリーニングしてもよい。このプロセスを複数回行い、改質された毒素の免疫毒性をさらに下げることができる。本発明のＴ細胞エピトープの同定について示されるように、既知のＢ細胞エピトープデータベースおよび推定タンパク質モデリングプログラムを利用するｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの方法を使用し、毒素または改質された毒素の中のＢ細胞エピトープを同定することができる。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの方法によってこのようなエピトープが同定され、改質されると、本明細書に記載されるようなワクチン接種されたドナー血清に対し、改質された毒素をスクリーニングすることができる。このｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでのＢ細胞エピトープスクリーニング方法を単独で使用してもよく、または毒素内のＢ細胞エピトープを同定し、改質するためのペプチドライブラリーＢ細胞エピトープスクリーニングと組み合わせて使用してもよい。場合により、Ｂ細胞エピトープスクリーニングの前および／または後に、改質された毒素をスクリーニングしてもよい。本明細書でさらに想定されるのは、Ｂ細胞エピトープの改質中に生成し得る任意のＴ細胞エピトープの存在についての改質された毒素のＢ細胞エピトープのスクリーニングである。
【０１１８】
本明細書に記載される本発明の適用は、毒素で免疫化された少なくとも１被検者に由来する血清サンプルを得て、この血清が、前記毒素に対する抗体を含むことと、前記血清と、１つ以上の改質された毒素とを接触させ、前記改質された毒素に対する前記抗体の結合によって複合体を生成することと、前記複合体の存在または非存在を検出し、複合体が検出される場合、改質された毒素は、少なくとも１つのＢ細胞エピトープを欠いておらず、複合体のレベルの減少が検出される場合、改質された毒素は、少なくとも１つのＢ細胞エピトープを欠くことと、少なくとも１つのＢ細胞エピトープを欠く改質された毒素を選択することと、を含む、少なくとも１つのＢ細胞エピトープを欠く改質された毒素を選択する方法である。非限定的な実施形態では、複合体のレベルの減少は、改質されていない毒素を用いて観察されるレベルよりも、例えば、約１．５分の１、約２分の１、約５分の１、約１０分の１、約２０分の１、約５０分の１、約１００分の１、約２００分の１、または約５００分の１であってもよい。
【０１１９】
［ＩＶ．血管漏出症候群］
細胞損傷、特に、内皮細胞損傷は、毒素（例えば、ヘビに噛まれることによる毒素）、または敗血症ショックを引き起こす分子、または治療薬剤（例えば、免疫毒素またはインターロイキン）によって生じるか否かにかかわらず、依然として患者にとって問題である。
【０１２０】
ＶＬＳは、細菌性敗血症の最中に観察されることが多く、ＩＬ−２および種々の他のサイトカインが関与している場合がある。ＶＬＳの基礎となる機構は不明確であり、内皮細胞（ＥＣ）で開始される次々と起こる事象が関与し、炎症カスケードおよびサイトカインが関与すると考えられる。ＶＬＳは、血管内皮細胞（ＥＣ）に対する損傷、流体およびタンパク質の溢出を含む複雑な因果関係を有し、腸管浮腫、体重増加を生じ、その最も重篤な形態である腎損傷、失語症および肺浮腫を生じる。血管漏出症候群（ＶＬＳ）は、あらゆる免疫毒素を伴う大きな問題があり、そのため、ヒトにおいて、サイトカイン、例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）、ＴＮＦおよびアデノウイルスベクターにおいて今までに試験されている。
【０１２１】
残基Ｌ７４、Ｄ７５、Ｖ７６に改質された配列を含有するリシン毒素Ａ鎖に由来する抗体が結合したペプチドは、減少していることが示された。従って、毒素（例えば、ジフテリア毒素）の（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）配列および／または１つ以上のフランキング残基の１つ以上のアミノ酸の欠失または変異が、これらの配列を含む毒素分子がＥＣ損傷を誘発する能力を下げ得るか、または防ぎ得ることが想定される。このような薬剤がＥＣ損傷を起こす活性を減らすか、またはなくす、少なくとも１つの変異されたモチーフおよび／または１つ以上のフランキング残基を含む１つ以上のポリペプチドを作成することができると予想される。
【０１２２】
本明細書で以下に記載されるのは、ポリペプチド内の（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）配列または（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔ配列が変異され、このような配列がそれぞれ除去されたか、または改変されたことに基づき、ＶＬＳを促進する能力が低下した組成物、およびその使用方法である。従って、ＥＣ損傷を起こす活性が低下したポリペプチドを製造するため、ＶＬＳを促進する能力が低下したポリペプチドを製造するための本明細書に記載されるすべての方法を適用し得ることが理解されるだろう。すべてのこのような方法、このような方法によって同定され、または製造された組成物およびその等価物は、本発明に包含される。
【０１２３】
特定の態様では、本出願は、限定されないが、悪性疾患、例えば、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、再発／難治Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、再発／難治Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、脂肪織炎Ｔ細胞リンパ腫、節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫の鼻型、慢性リンパ性白血病およびヒトＴ細胞リンパ好性ウイルス１に関連する急性Ｔ細胞白血病／リンパ腫；非悪性疾患、例えば、移植片対宿主疾患および乾癬、およびこのような疾患進行中の内皮細胞に対する損傷（すなわち、ＶＬＳ）を含む疾患を治療するための医薬を製造するための、改質されていない毒素組成物の配列に対し、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）および／または（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔが除去または改変された配列の少なくとも１つのアミノ酸を有する、改質された毒素組成物の使用を提供する。
【０１２４】
副作用としての血管漏出症候群（ＶＬＳ）を減らすか、またはなくすことは、タンパク質治療、特に、タンパク質治療の免疫毒素および融合毒素サブクラスの「リスクベネフィット比」を高め得るため、顕著な利点を表すだろう。細胞毒素および固有の標的ドメイン（免疫毒素の場合には細胞結合ドメイン）で構成される一本鎖分子である融合タンパク質を開発する能力があれば、自己免疫性疾患、例えば、関節リウマチ、乾癬および移植拒絶ならびに他の非悪性の医学的徴候の治療薬剤の開発を促進することができる。ＤＡＢ３８９ＩＬ−２（ＯＮＴＡＫ（登録商標））は、現在、ＦＤＡで唯一承認されているタンパク質融合毒素であり、ＤＴ担毒体およびサイトカインＩＬ−２を使用し、ＩＬ−２受容体を生じる細胞を標的とし、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）の治療について承認されている。ＯＮＴＡＫ（登録商標）は、デニロイキンジフチトクス、ＤＡＢ３８９−ＩＬ−２、またはＯｎｚａｒとさまざまに呼ばれる。その構造は、順に、メチオニン残基、ネイティブＤＴの残基１〜３８６、ネイティブＤＴの残基４８４〜４８５、ＩＬ−２の残基２〜１３３で構成されている（配列番号１４８）。従って、全長ＯＮＴＡＫ（登録商標）は、５２１個のアミノ酸を含有する。ＯＮＴＡＫ（登録商標）のＮ末端にメチオニン残基が付加されている結果として、ジフテリアの配列の番号は、ＯＮＴＡＫ（登録商標）の配列の番号の登録と１つずつずれていることを注記しておくべきである。
【０１２５】
免疫毒素、融合毒素および化学コンジュゲートを開発するときに、多くの他の担毒体（最も顕著なのは、リシン毒素およびシュードモナス外毒素Ａ）が使用されてきた。しかし、これらの分子は、臨床試験を首尾良く終了することができず、すべてが顕著な副作用としてＶＬＳを示す。従って、ジフテリア毒素について本明細書に記載される改質は、他の毒素、例えば、リシンおよびシュードモナス外毒素Ａについても推定することができる。
【０１２６】
特定の実施形態では、（ｘ）Ｄ（ｙ）モチーフおよび／または（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔモチーフまたはそのフランキング配列の１つ以上に基づいて改質された毒素または化合物を使用し、ｉｎ  ｖｉｖｏでＶＬＳを阻害することができる。従って、（ｘ）Ｄ（ｙ）配列またはフランキング配列が影響を受けるこのような変異によって、ポリペプチドがＶＬＳを誘発する能力またはこれらの配列に関連する他の能力を改変することができることが想定される。非限定的な一例では、ジフテリア毒素は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＶＬＳを阻害するように改質される。
【０１２７】
ＶＬＳを誘発する能力を低下させた毒素または化合物を製造するために、１つ以上の（すべてまで、また、すべてを含む）残った（ｘ）Ｄ（ｙ）配列および／または（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列が、ポリペプチド表面に露出するのを少なくすることが想定される。例えば、ポリペプチドの露出していない部分に少なくとも部分的に配置されているか、または分子表面に完全または部分的に露出しないように他の方法で隠されている（ｘ）Ｄ（ｙ）配列および／または（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列が、ＶＬＳを促進または誘発する細胞、受容体または他の分子とほとんど相互作用しないことが想定される。従って、ＶＬＳを誘発または促進する能力が低下した毒素または分子を製造するために、ポリペプチドの一次構造から（ｘ）Ｄ（ｙ）配列および／または（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列が完全に脱離することは必要ではない場合がある。しかし、ＶＬＳを誘発または促進する能力が最小の組成物を製造するために、すべての（ｘ）Ｄ（ｙ）配列および／または（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列の除去が想定される。
【０１２８】
ある変異が、（ｘ）Ｄ（ｙ）モチーフおよび／または（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔモチーフがほとんど露出していないポリペプチドを製造しそうであるかを決定するために、限定されないが、Ｘ線結晶学、ＮＭＲまたはコンピュータモデリングのような当業者には知られている方法によって決定されるように、変異した配列と、変異していないポリペプチドの二次構造および三次構造の配列とを比較することによって、移動されるか、または付加される（ｘ）Ｄ（ｙ）配列および／または（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列の推定位置を決定することができる。種々のポリペプチド構造のコンピュータモデルも、文献またはコンピュータデータベースから入手可能である。非限定的な例では、Ｅｎｔｒｅｚデータベースウェブサイト（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／）を使用し、変異導入のための標的配列および領域を特定することができる。Ｅｎｔｒｅｚデータベースは、わかっている場合には、同定されるアミノ酸配列の三次元構造のデータベースと相互にリンクしている。このような分子モデルを使用し、ポリペプチドの中で、ポリペプチドの内側に埋め込まれている同様の配列よりも外来分子と接触するように露出している（ｘ）Ｄ（ｙ）配列、（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列および／またはフランキング配列を同定することができる。外来分子と接触するように露出している（ｘ）Ｄ（ｙ）配列、（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列および／またはフランキング配列は、ＶＬＳおよびこれらの配列に関連する他の毒性の影響を促進するか、または減らすことへの寄与度が高いと思われ、そのため、変異導入の主な標的となるべきである。変異したポリペプチドまたは野生型ポリペプチドの構造は、当業者には知られているように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのアッセイで使用する前に、Ｘ線結晶学またはＮＭＲによって直接決定することができる。
【０１２９】
（ｘ）Ｄ（ｙ）配列および／または（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列を含むアミノ酸配列が、ポリペプチド内で改変されたら、本明細書に記載されるいずれかの技術、または当業者が知っているいずれかの技術を用い、少なくとも１つの毒性の影響を誘発または促進する能力の変化をアッセイすることができる。
【０１３０】
本明細書で使用する場合、（ｘ）Ｄ（ｙ）配列または（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列を含むアミノ酸配列の「改変する」、「改変された」、「改変すること」および「改変」は、当業者に知られているように、ポリペプチド内の（ｘ）Ｄ（ｙ）配列および／または（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列を含むアミノ酸配列の化学修飾、および限定されないが、挿入、欠失、トランケーションまたは置換を含む、このようなアミノ酸配列の任意の変異を含んでいてもよい。このような変化は、（ｘ）Ｄ（ｙ）配列および／または（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列を含む１つ以上のアミノ酸配列の少なくとも１つの毒性の影響（すなわち、ＶＬＳ、ＥＣ損傷を促進する能力など）を改変するか、または改質し（減らし）てもよい。本明細書で使用する場合、（ｘ）Ｄ（ｙ）配列および／または（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列を含むアミノ酸配列は、（ｘ）Ｄ（ｙ）および／または（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔのトリペプチド配列またはクアトラペプチド（ｑｕａｔｒａ−ｐｅｐｔｉｄｅ）配列に対し、少なくとも１つのフランキング配列のＣ末端および／またはＮ末端を含んでいてもよい。このような「改変」は、変異したポリペプチドを産生するように発現する合成されたポリペプチドまたは核酸配列において行うことができる。
【０１３１】
一態様では、（ｘ）Ｄ（ｙ）配列および／または（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列を含有するアミノ酸配列の改変は、アミノ酸配列の除去によるものである。本明細書で使用する場合、（ｘ）Ｄ（ｙ）配列および／または（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列を含有するアミノ酸配列を「除去する」、「除去された」、「除去すること」または「除去」は、（ｘ）Ｄ（ｙ）および／または（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔのトリペプチド配列またはクアトラペプチド配列、および／または少なくとも１つのネイティブフランキング配列存在下で脱離する主なアミノ酸配列の変異を指す。「除去される」または「欠く」という用語は、相互に置き換え可能に用いられる。
【０１３２】
本出願の一態様は、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対する低下した結合を有するジフテリア毒素（ＤＴ）の遺伝子的に改質されたポリペプチドに関する。これらの改質されたポリペプチドは、本明細書で以下、改質されたＤＴ、改質されたＤＴポリペプチドまたはＤＴ改変体と呼ばれる。本出願は、ＤＴポリペプチドの（ｘ）Ｄ（ｙ）モチーフ内に、すなわち、ネイティブＤＴ配列（配列番号１）の残基６〜８（ＶＤＳ）、残基２８〜３０（ＶＤＳ）および残基２８９〜２９１（ＩＤＳ）、または配列番号２、１４８または２００の残基７〜９（ＶＤＳ）、残基２９〜３１（ＶＤＳ）および残基２９０〜２９２（ＩＤＳ）に１つ以上の変化を有する改質されたＤＴを提供する。（ｘ）Ｄ（ｙ）モチーフは、「ＶＬＳモチーフ」と呼ばれるため、１つ以上の改質された（ｘ）Ｄ（ｙ）モチーフを有する改質されたＤＴポリペプチドは、「ＶＬＳ改質されたＤＴポリペプチド」と呼ぶことができる。
【０１３３】
本出願の一態様は、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対する低下した結合性を有する、毒素（例えば、ジフテリア毒素（ＤＴ））の遺伝子的に改質されたポリペプチドを提供する。これらの改質された毒素は、本明細書で以下、改質された毒素と呼ばれる。本出願は、毒素のポリペプチドの（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフ内に１つ以上の変化を有する、改質された毒素を提供する。例えば、ＤＴ内に見出される（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフは、ネイティブＤＴ配列（配列番号１）の残基６〜８（ＶＤＳ）、残基２８〜３０（ＶＤＳ）および残基２８９〜２９１（ＩＤＳ）、または配列番号２、１４８または２００の残基７〜９（ＶＤＳ）、残基２９〜３１（ＶＤＳ）、および残基２９０〜２９２（ＩＤＳ）に生じる。（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフは、「ＶＬＳモチーフ」と呼ばれるため、１つ以上の改質された（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフを有する改質された毒素のポリペプチドは、「ＶＬＳ改質された毒素のポリペプチド」と呼ばれることがある。
【０１３４】
ＶＬＳを誘発し、アポトーシスおよび他の影響を誘発するような（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフおよび（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔモチーフの同定を用い、ＶＬＳ阻害剤分子の新しいファミリーの作成によって、これらの分子に最大限の有益な効果を発揮させることができる。例えば、本明細書に開示される組成物および方法を用い、毒素治療薬剤の毒性を下げると、もっと多くの患者集団を治療するか、またはもっと進行した疾患（例えば、がん）を治療することができるだろう。特定の実施形態では、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフおよび／または（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔモチーフまたはそのフランキング配列に由来する改質されたタンパク質または融合タンパク質を使用し、ｉｎ  ｖｉｖｏでＶＬＳまたは他の活性を阻害してもよい。
【０１３５】
（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）配列および／または（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔ配列を欠くペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を製造するために、保存されたアスパラギン酸（Ｄ）または保存されたグルタミン酸（Ｅ）を欠失させるか、または変異させてもよく、アスパラギン酸またはグルタミン酸を別のアミノ酸で置換してもよく、またはその位置または隣接する位置に１つ以上のアミノ酸を挿入してもよい。本明細書で想定される改質としては、欠失または変異といった事象の結果として、アラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）、グリシン（Ｇ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）および表１からの改変されたアミノ酸または異常アミノ酸から選択されるアミノ酸残基を用いた、配列内の（Ｄ）残基または（Ｅ）残基の置換が挙げられる。
【０１３６】
これに代えて、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）配列および／または（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔ配列を欠くペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を製造するために、保存されたアスパラギン酸（Ｄ）を欠失させるか、または変異させてもよく、アスパラギン酸を別のアミノ酸で置換してもよく、またはその位置または隣接する位置に１つ以上のアミノ酸を挿入してもよい。本明細書で想定される改質としては、欠失または変異といった事象の結果として、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）および表１からの改変されたアミノ酸または異常アミノ酸から選択されるアミノ酸残基による、配列内の（Ｄ）残基の置換が挙げられる。
【表３】
2016519651.tif 000005
【０１３７】
一実施形態では、（ｘ）残基を、欠失させるか、置換するか、または１つ以上のアミノ酸の挿入によって移動させ、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）配列および／または（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔ配列を除去することができる。本明細書で想定される改質としては、欠失または変異といった事象の結果として、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）および表１からの改変されたアミノ酸または異常アミノ酸から選択されるアミノ酸残基による、配列内の（ｘ）残基の置換が挙げられる。
【０１３８】
これに代えて、（ｘ）残基を、欠失させるか、置換するか、または１つ以上のアミノ酸の挿入によって移動させ、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）配列および／または（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔ配列を除去することができる。本明細書で想定される改質としては、欠失または変異といった事象の結果として、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）および表１からの改変されたアミノ酸または異常アミノ酸から選択されるアミノ酸残基による、配列内の（ｘ）残基の置換が挙げられる。例えば、記載されるようなＶアミノ酸残基またはＩアミノ酸残基を、このような任意のアミノ酸残基で置き換える。
【０１３９】
一実施形態では、（ｙ）残基を、欠失させるか、置換するか、または１つ以上のアミノ酸の挿入によって移動させ、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）配列および／または（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔ配列を除去することができる。欠失または変異といった事象の結果として、配列内の（ｙ）残基と置き換えてもよいアミノ酸は、例えば、イソロイシン（Ｉ）；フェニルアラニン（Ｆ）；システイン／シスチン（Ｃ）；メチオニン（Ｍ）；アラニン（Ａ）；グリシン（Ｇ）；トレオニン（Ｔ）；トリプトファン（Ｗ）；チロシン（Ｙ）；プロリン（Ｐ）；ヒスチジン（Ｈ）；グルタミン酸（Ｅ）；グルタミン（Ｑ）；アスパラギン酸（Ｄ）；アスパラギン（Ｎ）；リジン（Ｋ）；およびアルギニン（Ｒ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、セリン（Ｓ）であり、さらに、限定されないが、表１に示されるものを含む。
【０１４０】
これに代えて、（ｙ）残基を、欠失させるか、置換するか、または１つ以上のアミノ酸の挿入によって移動させ、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）配列および／または（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔ配列を除去することができる。欠失または変異といった事象の結果として、配列内の（ｙ）残基と置き換えてもよいアミノ酸は、例えば、イソロイシン（Ｉ）；フェニルアラニン（Ｆ）；システイン／シスチン（Ｃ）；メチオニン（Ｍ）；アラニン（Ａ）；グリシン（Ｇ）；トレオニン（Ｔ）；トリプトファン（Ｗ）；チロシン（Ｙ）；プロリン（Ｐ）；ヒスチジン（Ｈ）；グルタミン酸（Ｅ）；グルタミン（Ｑ）；アスパラギン酸（Ｄ）；アスパラギン（Ｎ）；リジン（Ｋ）；およびアルギニン（Ｒ）であり、さらに、限定されないが、表１に示されるものを含む。
【０１４１】
ＨＵＶＥＣ結合部位および／または（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフの物理的領域、三次元空間または近傍に位置する他の残基を変異させるか、または改変し、ＶＬＳを抑止するか、減らすか、またはなくしてもよい。フランキング領域内の変異の標的とされるアミノ酸としては、ネイティブ毒素のタンパク質の表面または表面付近にあるアミノ酸が挙げられる。改変によって、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフ領域にある帯電した残基を除去するか、または置換してもよく、タンパク質表面の特定の領域内の電荷を打ち消すか、または逆にしてもよい。改変によって、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）配列またはタンパク質の活性部位の物理的領域、空間または近傍にあるアミノ酸の大きさおよび／または親水性の性質を変えてもよい。例えば、ＬＤＶは、α４β１インテグリン受容体に対する結合を担うフィブロネクチンのＣＳ１ドメインの最小限の活性部位を構成する。しかし、フィブロネクチン（ＦＮ）は、ＨＵＶＥＣに損傷を与えない。その代わりに、ＦＮは、ＨＵＶＥＣがＲＴＡによって媒介される損傷を受けないように保護する。ＲＴＡとは異なり、ＦＮは、トレオニンの代わりに、Ｃ末端にＬＤＶ−フランキングにプロリンを有する。ジスインテグリンにおいて、残基フランキングＲＧＤは、リガンド結合において役割を果たす。ＬＤＶまたはホモログを含有する分子が血管壁統合性を促進する能力（例えば、ＦＮ）と破壊する能力（例えば、ＤＴ）の差は、その配向、またはＬＤＶモチーフの相互作用（例えば、結合）の利用可能性によって変わり、従って、フランキング配列に基づいて変わると思われる。従って、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）配列の１つ以上のフランキング残基における変化によって、ある分子がＶＬＳを促進する能力が高まったり、または低下したりする場合がある。さらに、他のタンパク質（例えば、受容体）と相互作用するようにタンパク質の外側表面に（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）配列が露出する変化によって、ＶＬＳを促進する活性が高まり、一方、ほとんど露出していない配座では、ＶＬＳを促進する活性は低下するだろう。
【０１４２】
（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）配列および／または（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔ配列のＮ末端またはＣ末端のフランキング配列内の少なくとも１つの変異、化学修飾、移動または他の改変によって、ＶＬＳを促進する能力が低下したタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドも生成するだろう。好ましくは、このような変異または改変は、活性部位に影響を与えない１つ以上の残基で起こるだろう。他の実施形態では、変異または改変は、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）トリペプチド配列に対し、約１、約２、約３、約４、約５、約６またはもっと多いＮ末端および／またはＣ末端の１つ以上の残基で起こるだろう。他の態様では、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）トリペプチドに隣接しない１つ以上の残基が、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフの機能を担う場合もある。このような残基は、本明細書に記載されるように、また、当業者には知られているように、三次元モデルでのトリペプチド配列に対する近さによって同定されてもよく、フランキング配列の一部として改変が想定される。１つ以上の「野生型」フランキング残基が、改変され、除去され、移動され、化学修飾されるなどしている限り、このような改変は、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）配列および（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔ配列を改変するために上述のいずれかを含んでいてもよい。改変は、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）配列および（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔ配列の約５Å以内、約１０Å以内、約１５Å以内、または約２０Å以内で行われてもよい。
【０１４３】
このようなアミノ酸改質について、融合タンパク質という観点で、ＤＴの触媒ドメインを効果的に標的細胞に運び、インタクトなＶＬＳモチーフを再構築しない能力をアッセイすることができる。本明細書で提供されるのは、ＶＬＳを誘発する能力が低下した、改質されたジフテリア毒素であり、残りの（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）配列および／または（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔ配列は、可能ならば、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの表面への露出が少なくなる。
【０１４４】
非限定的な一例では、ジフテリア毒素の露出していない部分に少なくとも部分的に配置されているか、または分子表面に完全または部分的に露出しないように他の方法で隠されている（ｘ）Ｄ（ｙ）配列および／または（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列が、ＶＬＳを促進または誘発する細胞、受容体または他の分子とほとんど相互作用しないことが想定される。従って、ＶＬＳを誘発または促進する能力が低下した毒素または分子を製造するために、ジフテリア毒素の一次構造から（ｘ）Ｄ（ｙ）配列および／または（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列が完全に脱離することは必要ではないことが想定される。しかし、一実施形態では、ＶＬＳを誘発または促進する能力が最小の組成物を製造するために、すべての（ｘ）Ｄ（ｙ）配列および／または（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列が除去される。
【０１４５】
ある変異が、（ｘ）Ｄ（ｙ）モチーフおよび／または（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔモチーフがほとんど露出していない改質された毒素を製造しそうであるかを決定するために、限定されないが、Ｘ線結晶学、ＮＭＲまたはコンピュータモデリングのような当業者には知られている方法によって決定されるように、変異した配列と、変異していない毒素の二次構造および三次構造の配列とを比較することによって、移動されるか、または付加される（ｘ）Ｄ（ｙ）配列および／または（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列の推定位置を決定することができる。種々のポリペプチド構造のコンピュータモデルも、文献またはコンピュータデータベースから入手可能である。非限定的な例では、Ｅｎｔｒｅｚデータベースのワールドワイドウェブサイト（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／）を使用し、変異導入のための標的配列および領域を毒定することができる。Ｅｎｔｒｅｚデータベースは、わかっている場合には、同定されるアミノ酸配列の三次元構造のデータベースと相互にリンクしている。このような分子モデルを使用し、ジフテリア毒素の中で、そのポリペプチドの内側またはポリペプチドに埋め込まれている同様の配列よりも外来分子（例えば、受容体）と接触するように露出している（ｘ）Ｄ（ｙ）配列、（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列および／またはフランキング配列を同定することができる。外来分子と接触するように露出している（ｘ）Ｄ（ｙ）配列、（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列および／またはフランキング配列は、ＶＬＳおよびこれらの配列に関連する毒性の影響を促進するか、または減らすことへの寄与度が高いと思われ、そのため、変異導入の主な標的となるべきであることが推定される。特定の実施形態では、少なくとも１つの（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔおよび／またはフランキング配列を付加することが望ましい場合、外来分子と接触するように露出しているタンパク質の領域は、このような配列を付加するための部位として好ましい。変異した毒素または野生型毒素の構造は、当業者には知られているように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのアッセイで使用する前に、Ｘ線結晶学またはＮＭＲによって直接決定することができる。
【０１４６】
（ｘ）Ｄ（ｙ）配列および／または（ｘ）Ｄ（ｙ）Ｔ配列を含むアミノ酸配列が、毒素内で改変されたら、本明細書に記載されるいずれかの技術、または当業者が知っているいずれかの技術を用い、少なくとも１つの毒性の影響を誘発または促進する能力の変化をアッセイすることができる。アミノ酸配列を改変する（変化させる）方法は、以下にもっと詳細に記載され、当該技術分野で知られている。
【０１４７】
改質（変化）は、これらの領域内でネイティブ配列またはすでに改質された配列の改変が可能であるが、毒素または担毒体の細胞毒性を損なわない、アミノ酸の置換、挿入または欠失である。これらの改質は、内皮細胞との相互作用を媒介することを担うＶＤＳ／ＩＤＳ配列を再生することを含まないだろう。従って、このような非ネイティブ組み換え配列は、毒素の固有のドメインの本来の機能を維持しつつ、血管内皮細胞と相互作用する能力を顕著に下げた新しいシリーズの異性体を含む。
【０１４８】
一実施形態では、本発明のＤＴ改変体は、ＤＴ分子のいずれかの（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフ内に、すなわち、配列番号１の残基６〜８（ＶＤＳ）、残基２８〜３０（ＶＤＳ）および残基２８９〜２９１（ＩＤＳ）に少なくとも１つの改質を含有し、ＶＬＳに関連するモチーフが脱離し、それによって、この症候群に一般的に関連する臨床的に有害な影響が減る。しかし、本出願の改質されたＤＴは、タンパク質融合毒素に組み込まれたとき、標的とする真核細胞のサイトゾルに触媒ドメインを運ぶのを促進する能力という点で、ＤＴ３８７と同様に効果的であり、効率的である。ＤＴ３８７（配列番号２）は、触媒ドメインと転移ドメインを含むネイティブＤＴタンパク質のアミノ酸残基１〜３８６を含み、Ｎ末端にメチオニンが付加された、トランケーションされたＤＴタンパク質である。ＤＴ３８９（配列番号２００）は、順に、メチオニン残基、ネイティブＤＴの残基１〜３８６、ネイティブＤＴの残基４８４〜４８５を含む、トランケーションされたＤＴタンパク質である。ＤＴ３８９ＩＬ２（配列番号１４８）は、順に、メチオニン残基、ネイティブＤＴの残基１〜３８６、ネイティブＤＴの残基４８４〜４８５、ＩＬ−２を含む、トランケーションされたＤＴタンパク質である。一実施形態では、本発明のＤＴ改変体は、ＤＴ分子のいずれかの（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフ内に、すなわち、配列番号２、１４８または２００の残基７〜９（ＶＤＳ）、残基２９〜３１（ＶＤＳ）および残基２９０〜２９２（ＩＤＳ）に少なくとも１つの改質を含有し、ＶＬＳに関連するモチーフが脱離し、それによって、この症候群に一般的に関連する臨床的に有害な影響が減る。
【０１４９】
ほんの一例として、改質されていないジフテリア毒素は、例えば、配列番号２、１４８または２００のアミノ酸配列を有していてもよい。さらに、改質されていないジフテリア毒素は、ＯＮＴＡＫ（登録商標）および／または他のタンパク質または分子に接続したジフテリア毒素と呼ぶことができる。例えば、ＯＮＴＡＫ（登録商標）（ＤＡＢ３８９ＩＬ２）は、配列番号１４８のアミノ酸配列を有していてもよい。
【０１５０】
一実施形態では、改質されていないジフテリア毒素に匹敵する細胞毒性を有する（示す）改質されたジフテリア毒素は、改質されていないジフテリア毒素と実質的に同様の細胞毒性を有する（示す）、改質されたジフテリア毒素を指す。
【０１５１】
別の実施形態では、改質されていないジフテリア毒素に匹敵する細胞毒性を有する（示す）改質されたジフテリア毒素は、改質されていないジフテリア毒素と比較して、細胞毒性が少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％多い、改質されたジフテリア毒素を指す。別の実施形態では、改質されたジフテリア毒素（またはその融合物）の細胞毒性は、改質されていないジフテリア毒素（またはその融合物）と比較して、約１．５倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、またはもっと高くてもよい（またはこの間の任意の整数）。上述の副作用の減少または変化をアッセイするための方法は、当該技術分野で知られており、本明細書に記載されるとおりである。
【０１５２】
別の実施形態では、改質されていないジフテリア毒素に匹敵する細胞毒性を有する（示す）改質されたジフテリア毒素は、改質されていないジフテリア毒素と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％少ない細胞毒性を有する（示す）、改質されたジフテリア毒素を指す。改質されたジフテリア毒素（またはその融合物）の細胞毒性は、改質されていないジフテリア毒素（またはその融合物）と比較して、約１．５倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、またはもっと低くてもよい（またはこの間の任意の整数）。上述の副作用の減少または変化をアッセイするための方法は、当該技術分野で知られており、本明細書に記載されるとおりである。
【０１５３】
Ｅ．ｃｏｌｉで作られる精製されたＤＡＢ３８９ＩＬ−２は、一般的に、ＩＣ５０が５×１０−１１Ｍ〜１×１０−１２Ｍである。従って、別の実施形態では、改質されていないジフテリア毒素に匹敵する細胞毒性を有する改質されたジフテリア毒素は、ＩＣ５０が約５×１０−１１Ｍ〜約１×１０−１２Ｍ、約１×１０−１０Ｍ〜約５×ｌ０−１１Ｍ、約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１０Ｍ、約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−９Ｍ、または約１×１０−７Ｍ〜１×１０−８Ｍである改質されたジフテリア毒素を指す。改質された毒素は、改質されていないジフテリア毒素またはＯＮＴＡＫよりも大きな細胞毒性を有していてもよく、改質されていないジフテリア毒素またはＯＮＴＡＫ（登録商標）と比較した、改質されたジフテリア毒素の細胞毒性は、実施例で以下に記載するような細胞毒性アッセイで試験することができる。
【０１５４】
さらなる実施形態では、改質されたジフテリア毒素（またはその融合物）は、改質されていないジフテリア毒素（またはその融合物）またはＯＮＴＡＫ（登録商標）に匹敵する治療効能を有するだろう。疾患または状態の治療に加え、治療効能としては、治療薬（例えば、ＯＮＴＡＫ（登録商標）または改質されたジフテリア毒素またはその融合物）の投与に起因する副作用および治療される疾患に関連する副作用の低下が挙げられるだろう。副作用としては、例えば、薬物有害事象（ＡＤＥ）および毒性、例えば、毛細血管漏出症候群、脱水症状、低血圧、熱、低アルブミン血症、皮膚障害、胸部痛、血管脆弱化、疲労、過敏症、心筋虚血、尿路感染症、血圧低下、関節硬直、筋肉痛、手根管症候群、意識消失、呼吸困難、剥脱性皮膚炎、紅斑および全身発疹、過敏症の１つ以上が挙げられる。改質されていないジフテリア毒素（またはその融合物）と比較して、改質されたジフテリア毒素（またはその融合物）における１つ以上の薬物有害事象（ＡＤＥ）／毒性の低下は、約１．５分の１、約２分の１、約３分の１、約４分の１、約５分の１、約６分の１、約７分の１、約８分の１、約９分の１、約１０分の１、約１５分の１、約２０分の１、約３０分の１、約４０分の１、約５０分の１、またはもっと大きくてもよい（またはこの間の任意の整数）。上述の副作用の低下または変化をアッセイするための方法は、当該技術分野で知られており、本明細書に記載されるとおりである。
【０１５５】
低下した副作用および／または毒性に加え、低下した細胞毒性を有するジフテリア毒素によって、治療の特異性を上げることができる。細胞内に移行するＯＮＴＡＫ（登録商標）分子の数は、細胞死の可能性に影響を与えるだろう。一実施形態では、本明細書に記載されるジフテリア毒素の細胞毒性の低下によって、標的細胞を殺すのにもっと多くのジフテリア毒素が必要な場合がある。別の実施形態では、本明細書に記載されるジフテリア毒素の細胞毒性の低下によって、標的細胞を殺すのにもっと多くのジフテリア毒素が必要とならない場合もあり、このような実施形態では、低下した細胞毒性を示す改質されたジフテリア毒素は、標的細胞を殺し、誘発する副作用が少ないという点でなお有効であろう。
【０１５６】
ジフテリア毒素−ＩＬ２融合タンパク質（例えば、ＯＮＴＡＫ（登録商標））は、標的細胞に入るために、高アフィニティＩＬ−２受容体を利用する。表面に高レベルのＩＬ−２受容体を有する細胞は、多くのジフテリア毒素が内部に移行し、もっと迅速に殺されるだろう。
【０１５７】
腫瘍細胞は、一般的に、高レベルの高アフィニティＩＬ−２受容体を発現し、望ましい治療標的である。従って、低下した細胞毒性を示すジフテリア毒素を投与すると、高レベルのＩＬ−２受容体を有する細胞（望ましい標的）をもっと特異的に殺し、低レベルのＩＬ−２受容体を有する細胞を殺すのが減り、そのため、治療または処置の特異性が高まるだろう。
【０１５８】
（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフ内の改質に加え、改質されたＤＴは、トランケーションされた分子が細胞結合ドメインと融合したときに、トランケーションされた分子が、細胞に移動し、標的細胞を殺す能力を保持している限り、さらに、配列番号２、１４８または２００の１〜３０アミノ酸、１〜１０アミノ酸、または１〜３アミノ酸の欠失または置換を含んでいてもよい。
【０１５９】
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、少なくとも１つのアミノ酸改質を有する配列番号２、１４８または２００に示されるようなアミノ酸配列を有し、少なくとも１つのアミノ酸改質が、例えば、配列番号２、１４８または２００の残基７〜９、２９〜３１および２９０〜２９２の領域の（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフ内に作られ、改質されていないジフテリア毒素に匹敵する細胞毒性を有する、改質されたジフテリア毒素である。一実施形態では、位置（ｘ）での改質は、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、Ｇ、Ｌおよび表１からの改質されたアミノ酸または異常アミノ酸による、ＶまたはＩの置換である。一実施形態では、位置Ｄでの改質は、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ｇ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｒおよび表１からの改質されたアミノ酸または異常アミノ酸によるＤの置換である。一実施形態では、位置（ｙ）での改質は、Ｉ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｖおよび表１からの改質されたアミノ酸または異常アミノ酸による置換である。
【０１６０】
これに代えて、別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、１つ以上のアミノ酸改質を有し、少なくとも１つのアミノ酸改質が、配列番号２、１４８または２００の残基７〜９、２９〜３１および２９０〜２９２からなる群から選択される領域の（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフ内に作られ、改質されていないジフテリア毒素に匹敵する細胞毒性を有する、改質されたジフテリア毒素である。一実施形態では、位置（ｘ）での改質は、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒおよび表１からの改質されたアミノ酸または異常アミノ酸による、ＶまたはＩの置換である。別の実施形態では、位置Ｄ／Ｅでの改質は、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｒおよび表１からの改質されたアミノ酸または異常アミノ酸によるＤ／Ｅの置換である。一実施形態では、位置（ｙ）での改質は、Ｉ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｖおよび表１からの改質されたアミノ酸または異常アミノ酸による置換である。
【０１６１】
一実施形態では、改質されたジフテリア毒素は、１つ以上の改質を含む。このような改質されたジフテリア毒素は、例えば、Ｖ７Ｔ、Ｖ７Ｎ、Ｖ７Ｄ、Ｄ８Ｎ、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｔ、Ｓ９Ｇ、Ｖ２９Ｓ、Ｖ２９Ｎ、Ｖ２９Ｄ、Ｖ２９Ｔ、Ｄ３０Ｅ、Ｄ３０Ｎ、Ｓ３１Ｇ、Ｓ３１Ｎ、Ｉ２９０Ｎ、Ｉ２９０Ｔ、Ｄ２９１Ｅ、Ｄ２９１Ｋ、Ｓ２９２Ａ、Ｓ２９２ＧおよびＳ２９２Ｔのような変異を含んでいてもよい。
【０１６２】
一実施形態では、改質されたジフテリア毒素は、２つの改質を含む。このような改質されたジフテリア毒素は、例えば、Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｎ；Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ；Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｄ；Ｖ７Ｔ  Ｖ２９Ｎ；Ｖ７Ｔ  Ｖ２９Ｔ；およびＶ７Ｔ  Ｖ２９Ｄのような変異の組み合わせを含んでいてもよい。
【０１６３】
一実施形態では、改質されたジフテリア毒素は、３つの改質を含む。このような改質されたジフテリア毒素は、例えば、Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｎ  Ｉ２９０Ｎ；Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｎ  Ｉ２９０Ｔ；Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｎ  Ｓ２９２Ａ；Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｎ  Ｓ２９２Ｔ；Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｉ２９０Ｎ；Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｉ２９０Ｔ；Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｓ２９２Ａ；Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｓ２９２Ｔ；Ｖ７Ｔ  Ｖ２９Ｔ  Ｉ２９０Ｔ；Ｖ７Ｎ  Ｄ３０Ｅ  Ｉ２９０Ｔ；Ｖ７Ｎ  Ｄ３０Ｅ  Ｉ２９０Ｎ、Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｄ２９１Ｋ；Ｖ７Ｎ  Ｄ３０Ｅ  Ｄ２９１Ｋ；Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｓ  Ｉ２９０Ｔ；Ｖ７Ｔ  Ｖ２９Ｔ  Ｓ２９２Ａ；Ｖ７Ｔ  Ｖ２９Ｔ  Ｓ２９２Ｔ；およびＶ７Ｎ  Ｖ２９Ｄ  Ｉ２９０Ｔのような変異の組み合わせを含んでいてもよい。
【０１６４】
本明細書に記載される方法を用い、アミノ酸残基を連続的に改質し、それぞれの改質の後に、前に改質されていないジフテリア毒素または前に改質されたジフテリア毒素の活性と比較することによって、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または約２０までの改質を１つ以上の（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフ内に含有する改質されたジフテリア毒素を作ることができる。これに代えて、本明細書に記載される方法を用い、２つ以上のアミノ酸残基を同時に改質し、前に改質されていないジフテリア毒素の活性と比較することによって、１つより多い改質を含有する改質されたジフテリア毒素を作ることができる。改質された毒素について、当該技術分野で知られているアッセイおよび限定されないが、細胞毒性アッセイおよびＡＤＰリボシル化アッセイを含む本明細書に記載されるアッセイを用い、活性を試験することができる。
【０１６５】
発現した毒素−変異体および毒素−融合タンパク質について、その機能活性を試験することができる。種々の毒素の活性を試験する方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、ＤＴ−変異体およびＤＴ−融合タンパク質のＶＬＳに与える影響は、実施例２に記載するように、ＨＵＶＥＣで試験することができる。ＤＴ改変体またはＤＴ−融合タンパク質のリボシルトランスフェラーゼ活性は、実施例３に記載されるリボシルトランスフェラーゼアッセイによって試験することができる。ＤＴ改変体またはＤＴ−融合タンパク質の細胞毒性は、実施例４に記載されるように試験することができる。これらのリガンドを用いてＶＬＳ改質されたＤＴ融合毒素は、がんまたは特異的な結合が存在する細胞種の他の疾患を治療するのに有用である。
【０１６６】
［Ｖ．Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープおよびＶＬＳモチーフを含む毒素の改質］
本明細書に記載されるようなＴ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープの改質によって免疫原性を低下させるための方法、およびＶＬＳモチーフの改質によって血管漏出症候群を減らすための方法に加え、毒素および改質された毒素が両方とも改質を含み、低下した免疫原性（Ｔ細胞、Ｂ細胞、または両者）および血管漏出症候群を引き起こす能力の低下（すなわち、内皮細胞および血管内皮細胞に対する低下した結合性、および本明細書に記載されるような内皮細胞の接合の破壊および血管漏出症候群の他の徴候の減少）を示すポリペプチドを製造することができる。
【０１６７】
Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、ＶＬＳモチーフ、およびこれらの組み合わせ内に改質を有する毒素（例えば、ジフテリア毒素）を製造するために、それぞれの種類の改質について行われるアミノ酸残基の改質は、他の改質を考慮しつつ考えられる。非限定的な一例では、Ｔ細胞エピトープおよびＶＬＳモチーフ両方の改質が望ましい。Ｔ細胞エピトープおよびＶＬＳモチーフの両方を改質するとき、毒素の中の少なくとも１つのＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つのアミノ酸の改質は、ＶＬＳモチーフを生成すべきではない。同様に、毒素の中の少なくとも１つのＶＬＳモチーフ内の少なくとも１つのアミノ酸の改質は、Ｔ細胞エピトープを生成すべきではない。さらに、Ｔ細胞エピトープおよびＶＬＳモチーフの改質は、以前に改質されたＴ細胞またはＶＬＳモチーフを再び導入すべきではない。さらに、このようなポリペプチドの改質は、Ｂ細胞エピトープの改質も考慮することができ、所望な場合、Ｔ細胞エピトープおよびＶＬＳモチーフを生成すべきではなく、また、再導入すべきでもない。
【０１６８】
毒素の細胞毒性に影響を与える改質も行うことができる。例えば、１つ以上の改質が、Ｔ細胞エピトープ、ＶＬＳモチーフおよび／またはＢ細胞エピトープの１つ以上について行われ、改質された毒素の細胞毒性が、改質されていない毒素の細胞毒性より小さい場合、１つ以上の改質が、細胞毒性を改質されていない毒素に匹敵するレベルまで、または有効なレベルまで回復させることができることが、本発明で想定される。
【０１６９】
ジフテリア毒素（Ｔ）の膜挿入ドメイン（転移ドメイン）は、触媒（Ｃ）ドメインを細胞のサイトゾルに運ぶことに関与する両親媒性領域を含む。非限定的な一例では、両親媒性領域の１つ以上のアミノ酸残基を、その領域のらせん構造を保持する１つ以上の異なるアミノ酸残基と置き換えることで、細胞毒性を維持することができる。両親媒性領域内の帯電したアミノ酸残基および疎水性のアミノ酸残基の組成および分布と、その改質を考慮することも、本発明で想定される。帯電したアミノ残基の例としては、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓが挙げられ、疎水性アミノ酸としては、限定されないが、アラニンおよびフェニルアラニンが挙げられる。
【０１７０】
本明細書に記載されるＡＤＰをリボシル化するタンパク質ファミリーの触媒ドメインの結合クレフトの改質は、細胞毒性にも影響を与えることがある。非限定的な一例では、ジフテリア毒素のＣドメインのＦ／Ｙ−Ｘ−Ｓ−Ｔ−Ｘモチーフ内の１つ以上のアミノ酸残基の改質は、ポリペプチドの細胞毒性に影響を与えることがある。この領域内の１つ以上のアミノ酸残基を、触媒ドメインを保持する１つ以上の異なるアミノ酸残基と置き換えることで、細胞毒性を維持することができる。ＡＤＰをリボシル化するタンパク質ファミリー（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ）の関連するメンバーと比較すると、ドメイン（例えば、ジフテリア毒素のＣドメイン）のアミノ酸残基の改質および組成に対するさらなる手引きを与えることができる。このような改質も本発明で想定される。
【０１７１】
本明細書で提供されるのは、低下した免疫原性、ＶＬＳに与える影響の低下（すなわち、低下した内皮細胞結合性）、およびこれらの組み合わせを有する、改質された毒素を製造する方法である。さらに、低下した免疫原性、ＶＬＳに与える影響の低下、およびこれらの組み合わせを有する、改質された毒素を選択する方法も、本明細書に記載される本発明で想定される。Ｔ細胞エピトープおよびＶＬＳエピトープ内で改質された例示的な構築物としては、限定されないが、Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｎ  １２９０Ｎ  Ｆ１２４Ｈ  Ｌ１０７Ａ；Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｎ  Ｓ２９２Ａ  Ｆ１２４Ｈ  ＬＩ  ０７  Ａ；Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｎ  Ｓ２９２Ｔ  Ｆ１２４Ｈ  ＬＩ  ０７  Ａ；Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  １２９０Ｎ  Ｆ１２４Ｈ  ＬＩ  ０７  Ａ；Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  １２９０Ｔ  Ｆ１２４Ｈ  ＬＩ  ０７  Ａ；Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｓ２９２Ｔ  Ｆ１２４Ｈ  ＬＩ  ０７  Ａ；Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｓ２９２Ａ  Ｆ１２４Ｈ  ＬＩ  ０７  Ａ；Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｎ  １２９０Ｎ  Ｆ１２４Ｈ  Ｌ１０７Ｎ；Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｎ  Ｓ２８２Ａ  Ｆ１２４Ｈ  Ｌ１０７Ｎ；Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｎ  Ｓ２９２Ｔ  Ｆ１２４Ｈ  Ｌ１０７Ｎ；Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  １２９０Ｎ  Ｆ１２４Ｈ  Ｌ１０７Ｎ；Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  １２９０Ｔ  Ｆ１２４Ｈ  Ｌ１０７Ｎ；およびＶ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｓ２９２Ａ  Ｆ１２４Ｈ  Ｌ１０７Ｎが挙げられる。
【０１７２】
一実施形態では、毒素は、Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、ＶＬＳモチーフ、およびこれらの組み合わせのために改質され、改質された毒素のアミノ酸配列を、その後、Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、またはＶＬＳモチーフの生成または再導入について調べる。Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、ＶＬＳモチーフ、またはこれらの組み合わせが生成するか、または再導入されることがわかった場合、そのアミノ酸残基は、Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、ＶＬＳモチーフ、またはこれらの組み合わせを新たに生成または再導入することなく、このＴ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、ＶＬＳモチーフ、またはこれらの組み合わせを除去するようにさらに改質される。
【０１７３】
別の実施形態では、毒素の中のＴ細胞エピトープをまず同定し、改質し、その後、毒素の中のＶＬＳモチーフを同定し、改質する。次いで、改質された毒素について、Ｔ細胞エピトープの生成または再導入を調べ、任意のこのようなＴ細胞エピトープは、ＶＬＳモチーフを生成または再導入することなく改質される。さらに別の実施形態では、毒素の中のＶＬＳモチーフをまず同定し、改質し、その後、毒素の中のＴ細胞エピトープを同定し、改質する。
【０１７４】
本明細書に記載される本発明の適用は、低下した免疫原性、ＶＬＳに与える影響の低下（すなわち、低下した内皮細胞結合性）およびこれらの組み合わせを示す改質された毒素を製造する方法も提供する。さらに、低下した免疫原性、ＶＬＳに与える影響の低下、およびこれらの組み合わせを有する、改質された毒素を選択する方法も、本明細書に記載される本発明で想定される。このような特徴について、改質された毒素を試験する方法は、当該技術分野で知られており、例えば、本明細書に提供される実施例に記載される。一実施形態では、改質されていない毒素と比較して、低下した免疫原性およびＶＬＳに与える影響の低下を示す改質された毒素を製造する方法は、毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを同定することと、少なくとも１つの同定されたＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改質することと、毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１つのＶＬＳモチーフを同定することと、少なくとも１つの同定されたＶＬＳモチーフ内の少なくとも１つのアミノ酸を改質することとを含む。
【０１７５】
別の実施形態では、改質されていない毒素と比較して、低下した免疫原性およびＶＬＳに与える影響の低下を示す改質された毒素は、毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを同定し、少なくとも１つの同定されたＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改質し、毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１つのＶＬＳモチーフを同定し、少なくとも１つの同定されたＶＬＳモチーフ内の少なくとも１つのアミノ酸を改質するプロセスによって作られる。
【０１７６】
さらに別の実施形態では、改質されていない毒素と比較して、低下した免疫原性およびＶＬＳに与える影響の低下を示す改質された毒素を選択する方法は、毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを同定することと、少なくとも１つの同定されたＴ細胞エピトープ内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改質することと、毒素のアミノ酸配列内の少なくとも１つのＶＬＳモチーフを同定することと、少なくとも１つの同定されたＶＬＳモチーフ内の少なくとも１つのアミノ酸を改質することと、改質されていない毒素と比較して、低下した免疫原性を示す改質された毒素を選択することと、を含む。
【０１７７】
［ＶＩ．毒素］
本明細書で使用する場合、「毒素」という用語は、任意の抗細胞薬剤を指し、限定されないが、細胞毒素および／または抗細胞薬剤の任意の組み合わせが挙げられる。特定の態様では、毒素は、例えば、植物毒素、真菌毒素、細菌毒素、リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）またはこれらの組み合わせである。毒素としては、限定されないが、アブリンＡ鎖、ジフテリア毒素（ＤＴ）Ａ鎖、シュードモナス外毒素、ＲＴＡ、志賀毒素Ａ鎖、志賀様毒素、ゲロニン、モモルジン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、トリコサンチン、毒麦、および当該技術分野で知られている種々の他の毒素が挙げられる。毒素は、本明細書で使用する場合、具体的に、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）、ヒルジンおよびブーガイニンタンパク質（ｂｏｕｇａｉｎｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は除外される。
【０１７８】
ジフテリア毒素は、コレラ毒素、シュードモナス外毒素Ａ、百日咳毒素およびクロスチリジウムＣ３様毒素のような毒素をさらに含む、モノ−ＡＤＰリボシル化毒素ファミリーのメンバーである。このファミリーのメンバーは、多くの同様のタンパク質ドメインおよびモチーフを含有し、特に、毒素の触媒部位を含有する。例えば、このファミリーの多くのメンバーの触媒部位は、これら毒素の触媒機能にとって重要なグルタミン酸残基を含有することが知られている。このファミリーのメンバーは、ＤＴおよび例示的な毒素を用い、本明細書に記載される発明の範囲内であることが想定される。ＤＴは、触媒ドメイン；膜貫通ドメイン；および受容体結合ドメインの３つのドメインで構成される。ネイティブＤＴの核酸およびアミノ酸配列は、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄら、ＰＮＡＳ（１９８３）８０：６８５３〜６８５７によって記載される。ネイティブＤＴは、ヘパリン結合性の上皮成長因子様受容体を発現する細胞を標的とする（Ｎａｇｌｉｓｈら、Ｃｅｌｌ、６９：１０５１〜１０６１（１９９２））。第一世代の標的とされた毒素は、まず、例えば、ＤＴまたは細胞結合性がないＤＴ変異体（例えば、ＣＲＭ４５）といった毒素の新規標的リガンドを化学的に架橋することによって開発された。特定の種類の受容体を生じる細胞の上の受容体にＤＴ担毒体を向かわせるネイティブ細胞結合ドメインまたは架橋したリガンドは、インタクトな触媒ドメインおよび転移ドメインを有していなければならない。これらのドメインは、受容体が内部に移行した後に、標的とする細胞の送達および中毒にとって重要である。毒素、毒素コンジュゲートまたは融合毒素が細胞表面の受容体に結合したら、細胞は、細胞内小胞を介し、毒素が結合した受容体を内部に移行させる。この小胞が処理されるにつれ、小胞は酸性化し、ＤＴ担毒体の転移ドメインが構造的な再編成を受けるにつれて、毒素の９回膜貫通セグメントが細胞内小胞の膜に挿入される。この事象は、毒素の触媒ドメインが通り抜ける生産的な孔の生成の引き金となる。ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を有する転移ドメインおよび触媒ドメインが標的細胞のサイトゾルに放出されると、毒の翻訳が自由に行われるようになり、それにより、細胞死が起こる（ｖａｎｄｅｒＳｐｅｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１４５：８９〜９９、Ｈｕｍａｎａ  ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．、（２０００）にまとめられている）。
【０１７９】
１０を超えないＤＴ分子がサイトゾルに入ると、細胞を殺すだろう（しかし、多くの場合、入っていくプロセスが非効率的であるため、細胞表面にはこの何倍もが結合しなければならない）。この並外れた有効性は、最初は、このような毒は強すぎて制御できないと危惧されていた。しかし、毒素（例えば、ＤＴ）は、単に細胞結合ドメインまたはサブユニットを除去するか、または改質することによって、（標的細胞に向かう場合を除き）無毒化することができる。次いで、（細胞結合ドメインを欠く）毒素の残りの部分が、毒性部分を標的細胞に向かわせるリガンド（例えば、細胞結合ドメインを含有するポリペプチドまたはその部分）に接続する。望ましくない交差反応性を欠く細胞結合ドメインを含有するポリペプチドまたはその部分を選択することによって、融合タンパク質は、ほとんどの従来の抗がん薬よりも安全であり、非特異的な細胞毒性の影響が少なくなる。ＤＴのような毒素の他の主要な魅力は、これらがタンパク質合成の阻害剤であるため、分裂している細胞と同様に効果的に休止細胞を殺すことである。従って、治療時に細胞周期にない腫瘍細胞または感染した細胞が、融合タンパク質の細胞毒性の影響から逃れられない。
【０１８０】
ＤＴのような毒素は、２つのジスルフィドが結合した鎖（Ａ鎖およびＢ鎖）を含有することが多い。Ｂ鎖は、細胞結合領域および転移領域を有し、サイトゾル内の酸細胞内コンパートメントの膜を通るＡ鎖の挿入を促進する。その後、Ａ鎖は、転移の後に細胞を殺す。ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用のために、リガンドと毒素は、血流および組織を通過する間は安定なまま維持され、毒性部分をサイトゾルに放出することができるように標的細胞の中で不安定になるような様式で接続する。
【０１８１】
しかし、薬理学的見地から、適切な生体応答を与えることができる最小の分子を使用することが望ましいだろう。従って、十分な抗細胞応答性を与え得るもっと小さなＡ鎖ペプチドまたは他の毒素を使用することも望ましいだろう。
【０１８２】
本明細書に記載されるようなジフテリア毒素は、配列番号２、１４８または２００に示されるようなアミノ酸を含む。さらに、ジフテリアの改変体は、その生体活性を保持しつつ、核酸配列内の核酸残基の挿入、欠失、および／または置換を含有することが知られている。ジフテリア毒素の改変体は、ジフテリア毒素の核酸が変異していると特性決定されており（Ｈｏｌｍｅｓ、Ｒ．Ｋ．、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１８１（Ｓｕｐｐ．１）：Ｓ１５６−Ｓ１６７（２０００））、従って、ジフテリア毒素は、異なる核酸および／またはアミノ酸配列を含んでいてもよい。核酸残基の挿入、欠失、および／または置換が、アミノ酸配列にも影響を与えることがある。しかし、遺伝子コードの冗長性に起因して、すべての核酸残基の変化が、タンパク質のアミノ酸残基のレベルを変えるわけではない。ジフテリア毒素の核酸および／またはアミノ酸の変異（すなわち、挿入、欠失、および／または置換）も、ジフテリア毒素の定義の中に含まれ、本発明で想定される。本明細書で使用する場合、ジフテリア毒素は、配列番号２、１４８または２００に示されるようなアミノ酸を含み、さらに、配列番号２、１４８または２００と約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸を含むジフテリア毒素を含む。ＤＴのＣ末端のトランケーションを行うこともでき、例えば、ＤＴ３８９のＤＴ３８７の約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、または約５０のアミノ酸残基の欠失を含む。例えば、本明細書で使用する場合、ジフテリア毒素は、配列番号２または１４９のアミノ酸残基１〜３８２に示されるアミノ酸配列を含み、さらに、配列番号２または１４９のアミノ酸残基１〜３８２と約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含むジフテリア毒素を含む。ジフテリア毒素の改変体は、改質されていてもよく、本明細書に記載されるいずれかの方法を用い、その機能を試験してもよいことが理解されるだろう。
【０１８３】
一態様では、本明細書で使用される毒素は、毒素（例えば、ジフテリア毒素）と、少なくとも１つの細胞結合ドメインを含有する非毒素ポリペプチドとの融合タンパク質を想定する。非限定的な一例では、ジフテリア毒素またはそのフラグメントは、インターロイキン２（ＩＬ−２）の細胞結合ドメインに融合することによって、融合毒素を生成する。本明細書にさらに詳細に記載されるように、融合タンパク質毒素は、リンカーポリペプチドとコンジュゲートも含んでいてもよい。このような毒素も、本明細書に開示される発明の方法によって改質された毒素も想定している。
【０１８４】
一実施形態では、毒素は、改質された毒素を含む融合タンパク質であり、毒素の結合ドメインが、非毒性ポリペプチドの結合ドメインと置き換わっている。別の実施形態では、毒素は、改質されたジフテリア毒素と非毒素ポリペプチドとを含む融合タンパク質である。別の実施形態では、毒素は、ジフテリア毒素とＩＬ−２とを含む融合タンパク質である。
【０１８５】
ジフテリア毒素を、頻繁に例示的な毒素として記載しているが、本明細書に記載される本発明の方法を、上述のいずれかの毒素に適用することができることは理解されるだろう。
【０１８６】
［ＶＩＩ．融合タンパク質］
本発明は、改質された毒素の融合タンパク質も提供する。改質された毒素のポリペプチドは、例えば、非毒素ポリペプチドに融合していてもよい。一実施形態では、非毒素ポリペプチドは、細胞特異的な結合リガンドである。本発明で使用される特異的な結合リガンドは、リガンド全体、またはリガンドの全結合ドメインを含むリガンドの一部、または結合ドメインの有効な部分を含んでいてもよい。リガンド分子の結合ドメインのすべてまたはほとんどを含むことが最も望ましい。非限定的な一例では、ＤＴ融合タンパク質は、ＤＴに関連するポリペプチド（例えば、本明細書に記載される改質されたＤＴ）と、互いにフレーム内で融合した非ＤＴポリペプチドとを含有する。ＤＴに関連するポリペプチドは、低下した免疫原性または改質されたＴ細胞エピトープ、ヒト血管内皮細胞に対する低下した結合活性、またはこれらの組み合わせを有するＤＴ改変体のすべてまたは一部に対応する。一実施形態では、ＤＴ融合タンパク質は、本明細書に示されるようないずれかの配列番号に引用される改質されたＤＴ配列の少なくとも一部を含む。別の実施形態では、ＤＴ融合タンパク質は、少なくとも１つのＴ細胞エピトープ改質を含む。さらなる実施形態では、ＤＴ融合タンパク質は、少なくとも１つのＴ細胞エピトープ改質と、本明細書に示されるような１つ以上の配列番号で示される少なくとも１つの改質とを含む。さらなる実施形態では、ＤＴ融合タンパク質は、少なくとも１つのＴ細胞エピトープ改質と、本明細書に示されるような１つ以上の配列番号で示される少なくとも１つの改質と、少なくとも１つのＢ細胞エピトープ改質とを含む。
【０１８７】
本明細書に開示される化合物の一実施形態では、改質された毒素は、非ジフテリア毒素のポリペプチドが細胞結合リガンドである融合毒素である。さらなる実施形態では、細胞結合リガンドは、抗体またはその抗原結合フラグメント、サイトカイン、ポリペプチド、ホルモン、成長因子、またはインスリンである。さらに別の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−２である。
【０１８８】
別の実施形態では、改質された毒素は、細胞結合ドメインが抗体またはその抗原結合フラグメントである融合毒素である。抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、遺伝子操作された抗体、またはグラフト化抗体であってもよい。抗原結合フラグメントは、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ２（鎖の２つのｓｃＦｖ分子の頭部と尾部のタンデム結合）、一本鎖結合ポリペプチド、ＶＨまたはＶＬであってもよい。抗原結合フラグメントを製造する方法は、当該技術分野で知られており、本発明に組み込まれる。有用な抗体としては、標的細胞膜または腫瘍に関連する抗原の表面に発現する受容体または他の部分に特異的に結合するものが挙げられる。
【０１８９】
「特異的に結合する」とは、結合剤が、無関係の抗原に結合するよりも高いアフィニティで標的細胞の抗原に結合することを意味する。好ましくは、このようなアフィニティは、無関係の抗原に対する結合剤のアフィニティよりも少なくとも約１０倍大きく、少なくとも約１００倍大きく、または少なくとも約１０００倍大きい。「免疫反応性」および「特異的に結合する」という用語は、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。特定の実施形態では、抗腫瘍抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ２など）は、腫瘍細胞の表面決定基を認識し、受容体が媒介するエンドサイトーシスによって、この細胞の内部に移行するものである。さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｂ細胞表面分子に結合し、例えば、Ｂ細胞表面分子は、ＣＤ１９またはＣＤ２２である。これに代えて、抗体またはその抗原結合フラグメントは、卵巣受容体ＭＩＳＩＩＲ（ミュラー管抑制因子ＩＩ型受容体）に結合する。
【０１９０】
細胞特異的な結合リガンドとしては、限定されないが、ポリペプチドホルモン、例えば、α−ＭＳＨの結合ドメインを用いて作られ、メラニン細胞に選択的に結合することができ、黒色腫の治療に有用な改良されたｔ−ＭＳＨキメラ毒素を構築することができるものを挙げることができる。使用可能な他の特異的な結合リガンドとしては、インスリン、ソマトスタチンおよび顆粒球コロニー刺激因子が挙げられる。細胞特異的な結合ドメインを有する他の有用なポリペプチドリガンドは、卵胞刺激ホルモン（卵巣細胞に特異的）、黄体形成ホルモン（卵巣細胞に特異的）、甲状腺刺激ホルモン（甲状腺細胞に特異的）、バソプレシン（子宮細胞、膀胱および腸の細胞に特異的）、プロラクチン（乳房細胞に特異的）および成長ホルモン（特定の骨細胞に特異的）である。使用可能な特異的な結合リガンドとしては、サイトカインが挙げられ、限定されないが、ＩＬ−１（インターロイキンＩ）、ＩＬ−２、ＩＬ−３（これもインターロイキンＩＩＩ）、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、β−インターフェロン、α−インターフェロン（ＩＮＦ−α）、ＩＮＦ−γ、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、ＭＥＴＨ−１、ＭＥＴＨ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＳＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β、Ｆｌｔ３および細胞成長因子を含む。ＩＬ−２は、活性化されたＴ細胞が寄与する全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のようなアレルギー反応および自己免疫性疾患における役割に起因して、特に重要である。Ｂ細胞成長因子を用いて製造される毒素の融合タンパク質を、過敏反応および臓器拒絶に関与するＢ細胞成長因子受容体を生じつつ増殖するＢ細胞を殺す免疫抑制試薬として使用することができる。他のサイトカインとしては、サブスタンスＰ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦが挙げられる。これらのリガンドを用いて改質された融合毒素は、がんまたは特異的な結合が存在する細胞種の他の疾患の治療に有用である。
【０１９１】
ＩＬ−２では、残基１９〜２１（配列番号３または５８８）のＬＤＬ配列（「ＶＬＳ」モチーフ）は、αらせん内に位置し、部分的に露出もしている。ＬＤＬモチーフ内のＡｓｐ−２０からＬｙｓへの変異によって、ＩＬ−２受容体のβ鎖に対するＩＬ−２の結合がなくなり、その後の細胞増殖がなくなる。ＩＬ−２は、血管内皮がｉｎ  ｖｉｔｒｏでアルブミンを透過する能力を直接的に高め、この効果を抗−ＩＬ−２受容体モノクローナル抗体によって阻害することができることが報告されている。ＩＬ−２内のＬＤＬ配列は、ＨＵＶＥＣに損傷を与える。ＩＬ−２のＬＤＬ内のＡｓｐ−２０は、受容体の結合および機能活性に関与する。従って、特定の実施形態では、ＶＬＳをなくすか、または減らすためのＩＬ−２の（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）配列および／またはフランキング配列での変異は、Ａｓｐ−２０についても保存されるべきであり、または、ＩＬ−２の生体活性を低下させてもよいことも想定される。一実施形態では、ＩＬ２のＡｓｐ−２０をトレオニン（Ｔ）に変異させる。別の実施形態では、ＩＬ２のＡｓｐ−２０をリジン（Ｋ）に変異させる。別の実施形態では、ＩＬ２のＡｓｐ−２０をアスパラギン（Ｎ）に変異させる。
【０１９２】
別の実施形態では、ＩＬ−２は、ＶＬＳモチーフの外側で変異させてもよい。改質は、ＩＬ−２の２２〜５８の１つ以上の位置で行われてもよい。例えば、ＩＬ−２は、３８、３９、４２または５５の１つ以上の位置で改質されてもよい。改質の非限定的な例としては、限定されないが、Ｎ８Ｒ、Ｒ３８Ｇ、Ｒ３８Ｗ、Ｒ３８Ｇ、Ｒ３８Ｙ、Ｍ３９Ｖ、Ｍ３９Ｌ、Ｆ４２ＫおよびＨ５５Ｙが挙げられる。改質は、例えば、Ｋ８、Ｑ１３、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｌ２５、Ｎ２６、Ｎ３１、Ｒ３８、Ｌ４０、Ｐ４２、Ｋ４３、Ｍ４６、Ｋ４８、Ｋ４９、Ｔ５１、Ｈ７９、Ｌ８０、Ｒ８１、Ｄ８４、Ｎ８８、Ｖ９１、１９２、Ｅ９５、Ｄ１０９、Ｅ１１０、Ａ１１２、Ｔ１１３、Ｖ１１５、Ｅ１１６、Ｎ１１９、Ｒ１２０、１１２２、Ｔ１２３、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｓ１３０およびＴ１３１のような１つ以上の位置で行われてもよい。改質の非限定的な例としては、限定されないが、Ｎ８８Ｒ、Ｌ８５Ｔ、Ｉ８６Ｔ、Ｆ４２Ｙ、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｅ１５Ａ、Ｅ１５Ｒ、Ｌ１９Ａ、Ｌ１９Ｒ、Ｎ３０Ｅ、Ｋ３２Ｅ、Ｎ３３Ｄ、Ｐ３４Ｇ、Ｔ３７Ｉ、Ｍ３９Ｑ、Ｆ４２Ｙ、Ｆ４４Ｙ、Ｆ４２Ａ、Ｆ４４Ａ、Ｐ４７Ｇ、Ｔ５１Ｉ、Ｅ５２Ｋ、Ｌ５３Ｎ、Ｌ５６Ｍ、Ｌ５６Ｇ、Ｌ５６Ｎ、Ｑ５７Ｅ、Ｎ１１９Ａ、Ｎ１１９Ｒ、Ｆ４２Ａ  Ｌ１９Ａ、Ｌ１９Ａ  Ｎ１１９Ａ、Ｔ５１ＡおよびＴ５１Ｐが挙げられる。改質は、細胞結合ドメインのカルボキシ末端からの欠失も含む。例えば、ＤＴのカルボキシ末端の残基１２４〜１２６が欠失する。別の例では、残基１２４が欠失する。別の例では、残基１２７〜１２９が欠失する。
【０１９３】
多くの細胞特異的なリガンドについて、それぞれのこのようなリガンド内で、結合ドメインが位置する領域が現在は知られている。さらに、固相ポリペプチド合成の進化によって、この技術の当業者は、リガンドの種々のフラグメントを合成し、ＥＬＩＳＡアッセイのような当該技術分野で知られている従来の技術を用いて標識される細胞種に対する結合能力を試験することによって、任意のこのようなリガンドの結合ドメインを実際に決定することができる。従って、本発明のキメラ遺伝子の融合毒素は、リガンド全体を含む必要はなく、望ましい細胞結合能力を示すリガンドのフラグメントのみを含んでいればよい。同様に、少量の配列変動を有するリガンドのアナログまたはその細胞結合領域を合成し、細胞に結合する能力について試験し、本発明のハイブリッド分子に組み込むことができる。細胞結合ポリペプチドのアミノ酸配列について、１つ以上のＶＬＳモチーフ、Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、またはこれらの組み合わせを分析し、本明細書に記載される考え方に従って改質することができる。
【０１９４】
一態様では、本発明の毒素−融合タンパク質は、標準的な組み換えＤＮＡ技術によって製造される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来の技術に従って、例えば、ライゲーションのための平滑末端または突出末端、適切な末端を与えるための制限酵素による消化、適切な場合には付着末端の埋め込み、望ましくない接続を避けるためのアルカリホスファターゼ処理および酵素によるライゲーションを使用することによって、一緒にライゲーションする。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来の技術によって合成することができる。これに代えて、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続的な遺伝子フラグメントの間に相補性の突出物を生じるアンカープライマーを用いて行うことができ、その後、アニーリングし、再増幅させ、キメラ遺伝子配列を作成することができる。
【０１９５】
融合タンパク質の適切な配座的な折り畳みのために必要な場合、ペプチドリンカー配列を使用し、毒素に関連するポリペプチドを、非毒素ポリペプチド要素から、それぞれのポリペプチドが確実に二次構造および三次構造に折り畳まれるのに十分な距離だけ離すことができる。このようなペプチドリンカー配列を、当該技術分野でよく知られている標準的な技術を用い、融合タンパク質に組み込むことができ、以下の因子に基づいて選択することができる。（１）柔軟に伸長される構造に合わせる能力；（２）毒素に関連するポリペプチドの機能性エピトープと非毒素ポリペプチドとの相互作用を可能にする二次構造に適合する能力がないこと；および（３）ポリペプチドの機能性エピトープと反応し得る疎水性残基または帯電した残基がないこと。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒの残基を含有する。他の中性に近いアミノ酸、例えば、ＴｈｒおよびＡｌａもリンカー配列に使用することができる。リンカーとして有用に使用することができるアミノ酸配列としては、限定されないが、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ、４０：３９〜４６、１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：８２５８〜８２６２、１９８６、米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されるものが挙げられる。リンカー配列は、一般的に、１〜約５０アミノ酸長であってもよい。毒素に関連するポリペプチドおよび非毒素ポリペプチドが、非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有し、これを使用して機能性ドメインを分離し、立体的な干渉を避けることができる場合には、リンカー配列は必要ではない場合もある。
【０１９６】
化学架橋または化学コンジュゲーションによって、反応生成物を表す種々の分子種が得られ、典型的には、これらの生成物のほんの一部が触媒的または生物学的に活性である。生物学的に活性であるために、反応生成物は、担毒体の触媒ドメインおよび転移ドメインの本来の構造および活性を妨害しない様式でコンジュゲーションされなければならない。不活性な種から、活性な種またはきわめて活性な種を決断することは、反応生成物が、例えば、大きさ、電荷密度および相対的な疎水性を含む類似した生物物理学的特徴を有することが多いため、常に実行可能というわけではない。化学的に架橋した毒素からの大量の純粋な臨床グレードの活性生成物の単離は、臨床試験およびその後の医療市場への導入のための医薬品グレードの製品の製造にとって、典型的には経済的な理由で実行可能ではないことは注目すべきことである。この問題を回避するために、ネイティブＤＴの受容体結合ドメインを、メラニン細胞刺激ホルモンと遺伝子的に置き換えた遺伝子的にＤＴ由来のタンパク質融合毒素を、代替的な受容体標的ドメインとして作成した。この手法を、代替的な標的リガンドとしてヒトＩＬ−２とともに使用し、ＩＬ−２受容体の高アフィニティ形態を発現する細胞にのみ特異的に細胞毒性があるＤＡＢ４８６ＩＬ−２を作成した。ＤＡＢ４８６ＩＬ−２のその後の研究は、分子のＤＴ部分から９７アミノ酸をトランケーションすると、もっと安定で、もっと細胞毒性が高い態様のＩＬ−２受容体を標的とする毒素ＤＡＢ３８９ＩＬ−２が得られることを示した。元々の構築物（４８６形態）は、まだネイティブＤＴ細胞の結合ドメインの一部を有していた。ＤＡＢ３８９の態様は、ＤＴのＣドメインおよびＴドメインを含み、この融合タンパク質のＤＴ部分は、Ｔドメインと相対的な受容体結合ドメインとの間のランダムコイル内で終わっている。このＤＴ担毒体ＤＡＢ３８９に遺伝子的に融合しているため、多くの他の標的リガンドがある。他の細菌タンパク質および遺伝子的融合毒素を用い、同様の手法を使用すると、製造および精製がもっと簡単になることが多い。
【０１９７】
［ＶＩＩＩ．核酸、ベクターおよび宿主細胞］
本発明の別の態様は、改質されたＤＴ改変体またはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（核酸、ＤＮＡ）を含有するベクターに関する。
【０１９８】
種々の遺伝子のためのヌクレオチドおよびポリペプチドの配列がすでに開示されており、当業者なら知っているコンピュータによるデータベースから発見することができる。このようなデータベースの１つは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ’ｓ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｎｄ  ＧｅｎＰｅｐｔのデータベースである。これらの既知の遺伝子のコード領域を、本明細書に開示される技術を用いて、または当業者が知っているであろう任意の技術によって、増幅させ、および／または発現させることができる。さらに、ポリペプチド配列は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（フォスターシティ、カリフォルニア）から入手可能なような自動化ポリペプチド合成機を用いたポリペプチド合成のように、当業者が知っている方法によって合成することができる。
【０１９９】
本明細書で使用する場合、「発現ベクターまたは構築物」という用語は、核酸コード配列の一部または全部を転写することができる、遺伝子産物をコードする核酸を含有する任意の種類の遺伝子構築物を意味する。転写によってタンパク質に翻訳されてもよいが、必須ではない。従って、特定の実施形態では、発現は、遺伝子の転写と、ＲＮＡから遺伝子産物への翻訳の両方を含む。他の実施形態では、発現は、例えば、アンチセンス構築物を作成するための核酸の転写のみを含む。
【０２００】
特に有用なベクターは、ＤＮＡセグメントのコード部分が、全長タンパク質、ポリペプチドまたはもっと小さなペプチドをコードするかによらず、プロモーターの転写制御下に配置されるベクターであると想定される。「プロモーター」は、細胞の合成装置によって認識されるか、または合成機によって導入され、遺伝子の特異的な転写を開始するために必要なＤＮＡ配列を指す。「作動可能に配置される」、「制御下」または「転写制御下」という句は、ＲＮＡポリメラーゼ開始および遺伝子発現を制御するための遺伝子産物をコードする核酸に対し、プロモーターが正しい位置および配向にあることを意味する。
【０２０１】
プロモーターは、本明細書に開示する組成物と組み合わせて、例えば、組み換えクローニングおよび／またはＰＣＲ技術を用い、コードセグメントまたはエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得ることができるような、遺伝子と天然で会合するプロモーターの形態であってもよい。
【０２０２】
他の実施形態では、組み換えプロモーターまたは異種プロモーターの制御下、ＤＮＡセグメントを配置することによって特定の利点が得られることを想定している。本明細書で使用する場合、組み換えプロモーターまたは異種プロモーターは、天然環境で遺伝子と天然では会合しないプロモーターを指すことを意図している。このようなプロモーターは、他の遺伝子と天然で会合するプロモーター、および／または任意の他の細菌、ウイルス、真核細胞または哺乳動物細胞から単離されたプロモーター、および／または「天然に存在する」ものではなく、人の手によって作られたプロモーター、すなわち、異なるプロモーターに由来する異なる要素を含有するプロモーター、または発現を高め、低下させ、または改変する変異を含有するプロモーターを含んでいてもよい。
【０２０３】
細胞種、有機体、または動物でさえも、ＤＮＡセグメントの発現を効果的に命令するプロモーターが、発現のために選択される。プロモーターの使用と、タンパク質分解のための細胞種の組み合わせは、一般的に、分子生物学の当業者に知られており、例えば、本明細書に参考として組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）を参照。使用されるプロモーターは、構成的であってもよく、または誘導性であってもよく、組換えタンパク質またはペプチドの大量生産に有利なように、導入されたＤＮＡセグメントの高レベルでの発現を命令するのに適切な条件下で使用することができる。
【０２０４】
プロモーター中の少なくとも１つのモジュールは、一般的に、ＲＮＡ合成の開始部位を位置決めするように機能する。このモジュールの最もよく知られた例は、ＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスを欠くいくつかのプロモーター（例えば、哺乳動物の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０後期遺伝子のプロモーター）では、開始部位自体に重なる別個の要素が、開始の位置を固定するのに役立つ。
【０２０５】
さらなるプロモーター要素は、転写開始の頻度を制御する。典型的には、これらの要素は、開始部位の上流の３０〜１１０塩基対（ｂｐ）の領域に位置するが、多くのプロモーターは、同様に、開始部位の下流に機能的要素を含むことが示されている。プロモーター要素間の間隔は、多くは柔軟性があり、その結果、要素が互いに相対的に逆転するか、または移動したときに、プロモーターの機能が保存される。ｔｋプロモーターでは、プロモーター要素間の間隔は、活性が低下し始めるまで、５０ｂｐまで延ばすことができる。プロモーターによっては、個々の要素が、協働して、または独立して転写を活性化するように機能し得るようである。
【０２０６】
核酸の発現を制御するために使用される特定のプロモーターは、標的細胞内で核酸を発現させることができるものであれば、重要ではないと考えられる。従って、ヒト細胞を標的とする場合、ヒト細胞内で発現することができるプロモーター制御下で、プロモーターに隣接して核酸コード領域を配置することが好ましい。概して、このようなプロモーターは、ヒトプロモーターまたはウイルスプロモーターのいずれかを含んでもよい。
【０２０７】
発現において、典型的には、転写体の適切なポリアデニル化を行うためのポリアデニル化シグナルを含むだろう。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の首尾良い実施のためには重要ではないと考えられ、任意のこのような配列を使用してもよい。ポリアデニル化シグナルとしては、限定されないが、簡便であり、種々の標的細胞において十分に機能することが知られている、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが挙げられる。発現カセットの要素として、ターミネーター配列も想定される。これらの要素は、メッセージのレベルを高め、このカセットを通って他の配列内での読み取られるのを最低限にするように働くことができる。
【０２０８】
コード配列の効果的な転写のために、特異的な開始シグナルが必要な場合もある。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含め、外からの転写制御シグナルを提供することが必要な場合もある。当業者は、これを容易に決定し、必要なシグナルを提供することができるだろう。開始コドンは、全挿入物の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームに対し「フレーム内」になければならないことがよく知られている。外からの翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然であってもよく、または合成であってもよい。発現効率は、適切な転写エンハンサー要素を含むことによって高められるだろう。
【０２０９】
ポリペプチドを他の選択されたタンパク質と共発現させてもよいことが想定され、このタンパク質は、同じ細胞内で共発現してもよく、または遺伝子は、別の選択されたタンパク質をすでに含む細胞に対して与えられてもよい。それぞれのいずれかのＤＮＡの複写物を含む２種類の別個の組み換えベクターを用い、細胞をコトランスフェクトすることによって、共発現させることができる。これに代えて、両方のタンパク質についてのコード領域を含むように単一の組み換えベクターを構築し、次いで、この単一のベクターでトランスフェクションされた細胞内で発現させてもよい。いずれの事象においても、「共発現」という用語は、遺伝子および他の選択されたタンパク質が両方とも同じ組み換え細胞内で発現することを指す。
【０２１０】
本明細書で使用する場合、「操作された」および「組み換え」細胞または宿主細胞という用語は、外因性ＤＮＡセグメントまたは遺伝子、例えば、ｃＤＮＡまたはタンパク質をコードする遺伝子が導入された細胞を指すことを意図している。従って、操作された細胞は、組み換えによって導入された外因性ＤＮＡセグメントまたは遺伝子を含有しない天然に存在する細胞とは区別することができる。従って、操作された細胞は、人の手によって導入された１つ以上の遺伝子を有する細胞である。組み換え細胞は、導入されたｃＤＮＡまたはゲノム遺伝子を有する細胞を含み、特定の導入された遺伝子と天然では会合しないプロモーターに隣接する位置にある遺伝子も含む。
【０２１１】
改質されたか、または野生型であるかによらず、本発明の組み換えポリペプチドを発現するために、１つ以上のプロモーター制御下、野生型または改質されたタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを調製するだろう。「プロモーター制御下」でコード配列を生じさせるために、選択されたプロモーターの（すなわち、３’の）「下流」にある一般的に約１〜約５０ヌクレオチドの転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端を配置する。「上流」のプロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされた組み換えタンパク質の発現を促進する。この文脈で、このことは、「組み換え発現」を意味する。
【０２１２】
種々の宿主発現系において、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの発現を達成するために、適切な核酸および転写／翻訳制御配列を含有する発現ベクターを構築するために多くの標準的な技術が利用可能である。発現のために利用可能な細胞種としては、限定されないが、細菌、例えば、組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓが挙げられる。
【０２１３】
原核生物宿主の特定の例は、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＲＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ  １７７６（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３１５３７）およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（Ｆ−、ラムダ−、原栄養性、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２７３３２５）；桿菌、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ；および他の腸内細菌、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓおよび種々のシュードモナス種である。
【０２１４】
一般的に、宿主細胞と適合性の種から誘導されるレプリコンおよび制御配列を含有するプラスミドベクターを、これらの宿主と組み合わせて使用する。ベクターは、通常、複製部位と、形質転換された細胞において表現型を選択することができるマーキング配列とを有する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、Ｅ．ｃｏｌｉ種から誘導されるプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形質転換されることが多い。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリンに対する耐性のための遺伝子を含有し、従って、形質転換された細胞を同定する簡単な手段を提供する。ｐＢＲプラスミド、または他の微生物プラスミドまたはファージは、自身のタンパク質を発現するための微生物有機体によって使用可能なプロモーターを含んでいなければならないか、または含むように改質されなければならない。
【０２１５】
それに加えて、宿主微生物と適合性のレプリコンおよび制御配列を含有するファージベクターを、これらの宿主と組み合わせて、形質転換ベクターとして使用してもよい。例えば、ファージラムダＧＥＭＴＭ−１１を、宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２を形質転換するために使用可能な組み換えファージベクターを製造するときに利用してもよい。
【０２１６】
さらに有用なベクターとしては、ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅら、１９８５）、および後の精製および分離または開裂のためのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）可溶性の融合タンパク質を作成するときに使用するためのｐＧＥＸベクターが挙げられる。他の適切な融合タンパク質は、β−ガラクトシダーゼ、ユビキチンなどを含むものである。
【０２１７】
組み換えＤＮＡの構築に最も一般的に用いられるプロモーターとしては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースおよびトリプトファン（ｔｒｐ）のプロモーター系があげられる。これらは最も一般的に用いられるが、他の微生物プロモーターが発見され、利用されており、このヌクレオチド配列に関する詳細が公開され、当業者は、これらをプラスミドベクターと機能的にライゲーションすることができる。
【０２１８】
細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける組み換えタンパク質の産生に関連する以下の詳細は、一般的に、組み換えタンパク質の産生に関する例示的な情報の例として与えられ、その適合は、当業者が知っているであろう特定の組み換え発現系に対するものである。
【０２１９】
発現ベクターを含有する細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）は、多くの適切な培地のいずれか（例えば、ＬＢ）で成長する。例えば、この培地にＩＰＴＧを加えることによって、または、もっと高い温度でのインキュベーションに切り替えることによって、組み換えタンパク質の発現を誘発してもよい。細菌をさらに所定期間、一般的には２〜２４時間培養した後、遠心分離処理によって細胞を集め、洗浄して残留する培地を除去する。
【０２２０】
次いで、例えば、細胞ホモジナイザで破壊し、遠心分離処理して、可溶性細胞成分から濃い封入体および細胞膜を分離することによって、細菌細胞を溶解する。この遠心分離処理は、糖類（例えば、ショ糖）をバッファーに組み込み、選択された速度で遠心分離処理することによって、濃い封入体が選択的に濃縮される条件下で行うことができる。
【０２２１】
組み換えタンパク質が封入体の中で発現する場合、多くの場合のように、これらを数種類の溶液のいずれかで洗浄し、汚染している宿主タンパク質の一部を除去し、次いで、還元剤（例えば、β−メルカプトエタノールまたはＤＴＴ（ジチオトレイトール））存在下、高濃度の尿素（例えば、８Ｍ）またはカオトロピック剤（例えば、塩酸グアニジン）を含有する溶液に溶解させることができる。
【０２２２】
本明細書に記載される方法によって作られるポリペプチドを、過剰発現させる（すなわち、細胞内での通常の発現に対し、高いレベルで発現させる）ことができることが想定される。このような過剰発現は、放射能標識および／またはタンパク質精製を含む種々の方法によって評価することができる。しかし、単純で直接的な方法、例えば、ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびタンパク質染色またはウェスタンブロッティング、その後、定量分析、例えば、得られるゲルまたはブロットの比重走査を含む方法が好ましい。天然の細胞のレベルと比較して、組み換えタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのレベルの特異的な増加は、宿主細胞によって産生する（例えば、ゲル上で可視化される）他のタンパク質に対し、特定のポリペプチドの相対存在量であるように、過剰発現の指標である。
【０２２３】
本明細書で提供される発現ベクターは、宿主細胞内でポリヌクレオチドを発現させるのに適した形態で、改質されたＤＴまたはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。発現ベクターは、一般的に、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の制御配列を有し、発現されるべきポリヌクレオチド配列に作動可能に接続する。当業者は、発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、望ましいタンパク質の発現レベルなどの因子によって変わり得ることを理解するだろう。本明細書に記載される発現ベクターを宿主細胞に導入し、本明細書に記載されるポリヌクレオチドによってコードされる、融合タンパク質を含むタンパク質（例えば、改質されたＤＴまたはＤＴ融合タンパク質など）を製造することができる。
【０２２４】
原核生物または真核細胞の中で改質されたＤＴまたはＤＴ融合タンパク質を発現するように発現ベクターを設計することができる。真核細胞の中に１つのＤＴ遺伝子が存在すると、細胞を殺すだろう。具体的には、毒素は、翻訳およびリボシル化に必要なＥＦ−２に結合する。従って、ＤＴは、ＤＴをもはや認識しないように改質されたＥＦ−２を有する真核細胞内でのみ発現させることができる（例えば、Ｌｉｕら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ、３０：２６２〜２７４（２００３）；Ｐｈａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８（１２）：８６６５〜８（１９９３）；Ｃｈｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、５（１２）：３３５７〜６０（１９８５）；Ｋｏｈｎｅら、Ｓｏｍａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１１（５）：４２１〜３１（１９８５）；Ｍｏｅｈｒｉｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、４（４）：６４２〜５０（１９８４）を参照）。それに加えて、改質されたＤＴまたはその融合タンパク質を、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの中で発現させることができる（Ｂｉｓｈａｉら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １６９（１１）：５１４０〜５１（１９８７））。発現および活性の種類、宿主のプロテアーゼ発現のレベルを考慮し、これは、操作されたＤＴ担毒体中に存在する開裂部位に依存する。本来の発現宿主のプロテアーゼ発現プロフィールは、産生されるＤＴ融合毒素の収率に悪い影響を与える場合がある（Ｂｉｓｈａｉら、前出（１９８７））。この必要な開裂部位を、得られる融合タンパク質の細胞選択性を調節するように改変することができる程度まで、このような開裂部位の変異体が、ＶＬＳ改質された担毒体の中にあってもよいことが想定される（Ｇｏｒｄｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ、６３（ｌ）：８２〜７（１９９５）；Ｇｏｒｄｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ、６２（２）：３３３〜４０（１９９４）；Ｖａｌｌｅｒａら、Ｊ  Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．、９４：５９７〜６０６（２００２）；Ａｂｉ−Ｈａｂｉｂら、Ｂｌｏｏｄ．、１０４（７）：２１４３〜８（２００４））。これに代えて、発現ベクターをｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写し、翻訳することができる。
【０２２５】
本出願は、さらに、発現のために細胞、組織、または哺乳動物にポリヌクレオチドを送達するための遺伝子送達ビヒクルを提供する。例えば、本発明のポリヌクレオチド配列を、遺伝子送達ビヒクルで局所的に、または全身に投与することができる。これらの構築物は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏの様式において、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターによる手法を利用することができる。このようなコード配列の発現は、内因性の哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを用いて誘発することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでのコード配列の発現は、構成的であってもよく、制御されていてもよい。本発明は、ウイルスベクターを含む想定されたポリヌクレオチドを発現することができる遺伝子送達ビヒクルを含む。例えば、Ｑｉａｏらは、ＰＧ１３パッケージング細胞を使用するシステムを開発し、がん細胞を殺すＤＴフラグメントを含む組み換えレトロウイルスを産生し、自滅ベクター（ｓｕｉｃｉｄｅ  ｖｅｃｔｏｒ）成分としてＤＴを用いる方法を提供する。Ｑｉａｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（１４）：７３４３〜８（２００２）。
【０２２６】
発現した毒素−変異体および毒素−融合タンパク質について、その機能活性を試験することができる。ＤＴ活性を試験する方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、ＤＴ−変異体およびＤＴ−融合タンパク質のＶＬＳに与える影響は、実施例２に記載するように、ＨＵＶＥＣで試験することができる。ＤＴ改変体またはＤＴ−融合タンパク質のリボシルトランスフェラーゼ活性は、実施例３に記載されるリボシルトランスフェラーゼアッセイによって試験することができる。ＤＴ改変体またはＤＴ−融合タンパク質の細胞毒性は、実施例４に記載されるように試験することができる。
【０２２７】
本出願は、本明細書に記載される１つ以上の方法を用いて発現される、精製されたポリペプチド、好ましい実施形態では、実質的に精製されたポリペプチドも提供する。「精製された」という用語は、本明細書で使用する場合、哺乳動物細胞または組み換え宿主細胞から単離可能であり、少なくとも１つのポリペプチドが、天然で得られる状態と比較して、すなわち、細胞抽出物中の純度と比較して、ある程度まで精製されたタンパク質組成物を指すことを意図している。従って、精製されたポリペプチドは、天然に存在する環境を含まない野生型または改質されたポリペプチドも指す。
【０２２８】
「実質的に精製された」という用語を使用する場合、特定のポリペプチドが、組成物の主要成分を形成する、例えば、組成物中の約５０％またはもっと多くを構成する組成物を指すだろう。一実施形態では、実質的に精製されたポリペプチドは、組成物中のポリペプチドの約６０％より多く、約７０％より多く、約８０％より多く、約９０％より多く、約９５％より多く、約９９％より多く、またはもっと多くを構成する。
【０２２９】
「均質になるまで精製された」ポリペプチドは、本明細書に適用される場合、ポリペプチドが実質的に他のタンパク質および生体成分を含まないレベルの純度を有することを意味する。例えば、精製されたポリペプチドは、分解によるシークエンシングを行うことができるのに十分なほど、他のタンパク質成分を含まないことが多いだろう。
【０２３０】
ポリペプチドの精製度を定量するための種々の方法は、本開示の観点で当業者に知られているだろう。これらの方法としては、例えば、あるフラクションの特定のタンパク質の活性を決定すること、またはゲル電気泳動によって、あるフラクション内のポリペプチドの数を評価することが挙げられる。
【０２３１】
望ましいポリペプチドを精製するために、少なくともいくつかの特定のポリペプチドを含む天然または組み換えの組成物に対し、フラクション化を行い、組成物から種々の他の要素を除去する。本明細書で以下に詳細に記載されるこれらの技術に加え、タンパク質精製で使用するのに適した種々の他の技術は、当業者によく知られているだろう。これらの技術としては、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などを用いた沈殿、または熱変性の後、遠心分離処理、クロマトグラフィー工程、例えば、イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイト、レクチンアフィニティおよび他のアフィニティクロマトグラフィー工程、等電点分画法、ゲル電気泳動、およびこのような技術と他の技術の組み合わせが挙げられる。
【０２３２】
別の例は、特定の結合対を用いた、特定の融合タンパク質の精製である。このような精製方法は、当該技術分野で一般的である。本発明が、特定のタンパク質のためのＤＮＡ配列を提供するため、任意の融合タンパク質精製方法を実施することができる。これは、特定のタンパク質−グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質の生成、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現、グルタチオン−アガロースでのアフィニティクロマトグラフィーを用いた均質になるまでの単離、またはタンパク質のＮ末端またはＣ末端でのポリヒスチジンタグの生成、およびＮｉ−アフィニティクロマトグラフィーを用いたその後の生成によって例示される。しかし、多くのＤＮＡおよびタンパク質が知られており、または、本発明に記載される方法を用いて同定され、増幅されてもよく、任意の精製方法を使用することができる。
【０２３３】
ポリペプチドが、その最も精製された状態で常に与えられることは一般的に必要とされない。実際に、あまり実質的に精製されていないが、それでも天然の状態と比較して、望ましいタンパク質組成物を豊富に含むポリペプチドが、特定の実施形態で有用性を有することが想定される。相対的に低い精製度を示すポリペプチドは、タンパク質生成物の全体的な回収という点で、または発現したタンパク質の活性を維持するという点で利点を有する場合がある。
【０２３４】
本明細書で提供されるのは、（ａ）本明細書に示される改質されたジフテリア毒素のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを構築することと、（ｂ）前記ベクターを含む宿主細胞内で、前記ポリペプチドを発現させることとを含む、組成物を製造するための方法である。一実施形態では、このような方法によって作られる組成物であって、この組成物が、配列番号２、１４８または２００の配列を有するＤＴ分子と比較して、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対する低下した結合性を有する、組成物。さらに、本明細書で提供されるのは、（ａ）少なくとも１つのＴ細胞エピトープの改質を有する毒素をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを構築することと、（ｂ）前記ベクターを含む宿主細胞内で、前記ポリペプチドを発現させることとを含む、組成物を製造するための方法である。一実施形態では、毒素がＤＴである、このような方法によって作られる組成物。一実施形態では、前記組成物が、配列番号２、１４８または２００の配列を有するＤＴ分子と比較して、低下した免疫原性を有する、このような方法によって作られる組成物。
【０２３５】
本明細書で提供されるのは、改質されていない毒素と比較して、低下した免疫原性を有する改質された毒素を製造するための方法であって、この方法が、（ａ）毒素をコードする核酸を含むベクターを構築し、前記改質されたジフテリア毒素が、１つ以上のアミノ酸改質を有する配列番号２に引用されるようなアミノ酸配列を有するジフテリア毒素を含み、少なくとも１つのアミノ酸改質が、Ｔ細胞エピトープ内で行われ、前記改質されたジフテリア毒素が、改質されていないジフテリア毒素に匹敵する細胞毒性を有する工程と、（ｂ）前記ベクターを含む宿主細胞内で、前記ポリペプチドを発現させる工程と、を含む、方法である。
【０２３６】
さらなる実施形態は、改質されていないジフテリア毒素と比較して、低下した免疫原性およびヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対する低下した結合活性を有する改質されたジフテリア毒素を製造するための方法を含み、この方法は、（ａ）改質されたジフテリア毒素をコードする核酸配列を含むベクターを構築し、この改質されたジフテリア毒素は、１つ以上のアミノ酸改質を有する配列番号２、１４８または２００に引用されるようなアミノ酸配列を有するジフテリア毒素を含み、少なくとも１つのアミノ酸改質が、Ｔ細胞エピトープ内で、配列番号２、１４８または２００の残基７〜９、２９〜３１および２９０〜２９２からなる群から選択される領域中の（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフ内で、Ｂ細胞エピトープ内で、またはこれらの組み合わせ内で行われ、前記改質されたジフテリア毒素は、改質されていないジフテリア毒素に匹敵する細胞毒性を有する工程と、（ｂ）前記ベクターを含む宿主細胞内で、前記ポリペプチドを発現させる工程とを含む。非限定的な一例では、改質されたＶＬＳの（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフは、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、Ｇ、Ｌおよび表１からの改変されたアミノ酸または異常アミノ酸から選択されるアミノ酸残基による、ＶまたはＩの置換である、位置（ｘ）での改質であってもよく、位置Ｄ／Ｅでの改質は、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ｇ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｒおよび表１からの改変されたアミノ酸または異常アミノ酸から選択されるアミノ酸残基による、Ｄ／Ｅの置換である。一実施形態では、位置（ｙ）での改質は、Ｉ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｖおよび表１からの改変されたアミノ酸または異常アミノ酸から選択されるアミノ酸残基による置換である。
【０２３７】
ほんの一例として、改質されていないジフテリア毒素は、例えば、配列番号２、１４８または２００のアミノ酸配列を有していてもよい。
【０２３８】
本出願は、ある改質が行われ、その後、１つ以上の次の改質が行われるような、段階的または逐次的な様式で改質されたタンパク質を作成することができることも想定する。このような逐次的または段階的な改質は、このプロセスを行う１つの様式および本明細書に記載され、特許請求の範囲で請求される、改質されたタンパク質を産生する１つの様式を表す。
【０２３９】
細菌および植物のホロトキシンは、２つのジスルフィドが結合した鎖（Ａ鎖およびＢ鎖）を含有することが多い。Ｂ鎖は、細胞結合領域（その受容体は、多くは特性決定されていない）と、転写領域の両方を有し、サイトゾル内の酸細胞内コンパートメントの膜を通るＡ鎖の挿入を促進する。その後、Ａ鎖は、取り込みの後に細胞を殺す。ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用のために、リガンドと毒素は、血流および組織を通過する間は安定なまま維持され、毒性部分をサイトゾルに放出することができるように標的細胞の中で不安定になるような様式で接続する。しかし、薬理学的見地から、適切な生体応答を与えることができる最小の分子を使用することが望ましいだろう。従って、十分な抗細胞応答性を与え得るもっと小さなＡ鎖ペプチドを使用することも望ましいだろう。この目的のために、ＤＴは、「トランケーションされ」ていてもよく、それでも、十分な毒素活性を保持する。所望な場合、このトランケーションされたＡ鎖を、本明細書に記載される実施系対に従って、融合タンパク質で使用することができることが提案される。
【０２４０】
これに代えて、組み換えＤＮＡ技術を毒素部分に適用し、さらなる利点を与え得ることが発見されるだろう。生体活性のあるＤＴが、クローン化され、組み換えによって発現する場合、適切な毒素活性を示すもっと小さな分子ペプチドまたはその他の改変ペプチドを同定することができる。さらに、ＤＴがクローン化されたという事実によって、部位特異的変異導入を適用することができ、それにより、ＤＴのＡ鎖、毒素から誘導されるペプチドを簡単に調製し、スクリーニングし、ここに記載される化合物と組み合わせて使用するためのさらなる有用な部分を得ることができる。同定されると、これらの部分を変異させ、ＶＬＳを促進する能力の低下、ＥＣ損傷を起こす活性の低下および／または本明細書に記載されるか、または当業者に知られているこのような配列の他の影響の低下を示す毒素を製造することができる。
【０２４１】
本明細書で提供されるのは、このような方法によって製造された改質されたジフテリア毒素と、非ジフテリア毒素ポリペプチドとを含み、前記非ジフテリア毒素ポリペプチドが、抗体またはその抗原結合フラグメント、ＥＧＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＮＦα、ＩＮＦγ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、Ｅｐｈｒｉｎ、ＢＦＧＦ、ＴＧＦ、およびこれらの細胞結合部分から選択される、融合タンパク質である。一実施形態では、非ジフテリア毒素のポリペプチドは、例えば、ＩＬ−２またはその細胞結合部分である。特定の実施形態では、融合タンパク質または毒素は、さらに、少なくとも別の薬剤を含む。このような薬剤は、限定されないが、本明細書の他の箇所で記載されるような、少なくとも１つのエフェクター（治療薬部分）またはレポーター分子（検出可能な標識）を含む分子または部分であってもよい。
【０２４２】
［ＩＸ．検出可能な標識］
本発明は、標的エピトープ（例えば、罹患組織または疾患を引き起こす細胞で発現するエピトープ（例えば、がん細胞でＩＬ−２受容体））に対する融合タンパク質を提供する。特定の実施形態では、融合タンパク質は、本明細書に記載される改質されたＤＴを含む。他の実施形態では、融合タンパク質は、さらに、第２の薬剤を含む。このような薬剤は、分子または部分（例えば、レポーター分子または検出可能な標識）であってもよい。レポーター分子は、アッセイを用いて検出可能な任意の部分である。ポリペプチドにコンジュゲーションしたレポーター分子の非限定的な例としては、酵素、放射能標識、ハプテン、蛍光標識、燐光分子、化学発光分子、発色団、発光分子、光アフィニティ分子、着色した粒子またはリガンド、例えば、ビオチンが挙げられる。検出可能な標識としては、特定の機能特性および／または化学特徴に起因して検出することができる化合物および／または元素が挙げられ、この標識の使用によって、この標識が接続したポリペプチドを検出することができ、および／または所望な場合、さらに定量することができる。多くの適した検出可能な（画像化）薬剤は、これらをポリペプチドに対し接続するための方法のように、当該技術分野で知られている（例えば、米国特許第５，０２１，２３６号；４，９３８，９４８号；および４，４７２，５０９号を参照。それぞれ本明細書に参考として組み込まれる）。使用される画像化部分は、常磁性イオン；放射性同位体；蛍光色素；ＮＭＲで検出可能な物質；Ｘ線撮像であってもよい。アジド基を含有する分子を使用し、低強度の紫外線によって生成する反応性ニトレン中間体を介し、タンパク質に対する共有結合を生成することもできる（Ｐｏｔｔｅｒ  ＆  Ｈａｌｅｙ、１９８３）。特に、プリンヌクレオチドの２−アジド類似体および８−アジド類似体を、部位特異的な光プローブとして使用し、未精製細胞抽出物中のヌクレオチド結合タンパク質を同定する（Ｏｗｅｎｓ  ＆  Ｈａｌｅｙ、１９８７；Ａｔｈｅｒｔｏｎら、１９８５）。精製されたタンパク質のヌクレオチド結合ドメインのマップを作成するためにも、２−アジドヌクレオチドおよび８−アジドヌクレオチドを使用し（Ｋｈａｔｏｏｎら、１９８９；Ｋｉｎｇら、１９８９；およびＤｈｏｌａｋｉａら、１９８９）、これをポリペプチド結合剤として使用することができる。
【０２４３】
［Ｘ．組成物および治療での使用］
許容され得る担体または賦形剤と組み合わせると、本明細書に記載されるそれぞれの化合物を、組成物として使用することができる。このような組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの分析のため、または開示されている化合物を用いて被検者を治療するためにｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで被検者に投与するのに有用である。
【０２４４】
従って、医薬組成物は、活性成分に加え、医薬的に許容され得る賦形剤、担体、バッファー、安定化剤、または当業者によく知られている他の物質を含んでいてもよい。このような物質は、非毒性であるべきであり、活性成分の効能を妨害しないものであるべきである。担体または他の物質の正確な性質は、投与経路によって変わるだろう。
【０２４５】
貯蔵のために、望ましい純度を有するタンパク質と、任意要素の生理学的に許容され得る担体、賦形剤または安定化剤とを混合することによって、本明細書に記載される方法によって同定された目的のタンパク質（例えば、抗体）を含む医薬製剤を、凍結乾燥された製剤または水溶液の形態で調製することができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｓｏｌ、Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。許容され得る担体、賦形剤または安定化剤は、使用される投薬量および濃度では受容者に対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のようなバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤、例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含め、単糖類、二糖類または他の炭水化物；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩を生成する対イオン、例えば、ナトリウム；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【０２４６】
本明細書に記載される製剤は、処置される特定の徴候に必要な場合には、１種類より多くの活性化合物を含有することもできる。このような分子は、適切には、意図する目的のために効果的な量で組み合わせた状態で存在する。
【０２４７】
許容され得る担体は、投与される患者に対して生理学的に許容され得るものであり、投与されるとき／投与中に、化合物の治療特性を保持するものである。許容され得る担体およびその製剤は、一般的に、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、編集Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、イーストン、ＰＡ  １９９０）に記載される。１つの例示的な担体は、生理食塩水である。「医薬的に許容され得る担体」という句は、本明細書で使用する場合、ある臓器の投与部位または身体の一部から別の臓器または身体の一部へと、対象化合物を運ぶか、または輸送するか、または、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ系に関与する医薬的に許容され得る物質、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固体のフィラー、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料を意味する。それぞれの担体は、製剤の他の成分と適合性であり、投与される被検者に対し、有害でないという観点で「許容され得る」ものでなければならない。許容され得る担体は、対象化合物の特異的な活性を改変すべきではない。例示的な担体および賦形剤は、本明細書の他の箇所で与えられる。
【０２４８】
一態様では、本明細書で提供されるのは、医薬品投与に適合性の溶媒（水系または非水系）、溶液、エマルション、分散媒体、コーティング、等張性の吸収促進剤または吸収遅延剤を含む、医薬的に許容され得る組成物または生理学的に許容され得る組成物である。従って、医薬組成物または医薬製剤は、被検者で医薬として使用するのに適した組成物を指す。医薬組成物および製剤は、所定量の本明細書に記載される化合物（例えば、有効な量の本明細書に記載される改質された融合タンパク質）と、医薬的または生理学的に許容され得る担体とを含む。
【０２４９】
組成物は、全身または局所といった特定の投与経路に適合するように配合することができる。従って、組成物は、種々の経路で投与するのに適した担体、希釈剤または賦形剤を含む。経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液体の形態であってもよい。錠剤は、固体の担体（例えば、ゼラチンまたはアジュバント）を含んでいてもよい。液体医薬組成物は、一般的に、液体担体、例えば、水、石油、動物油または植物油、鉱物油または合成油を含む。生理食塩水溶液、デキストロースまたは他の糖溶液またはグリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）を含んでいてもよい。
【０２５０】
さらなる実施形態では、組成物は、さらに、組成物中の化合物の安定性を高め、および／または組成物の放出速度を制御するために、必要な場合には、許容され得る添加剤を含んでいてもよい。許容され得る添加剤は、対象化合物の特異的な活性を改変しない。例示的な許容され得る添加剤としては、限定されないが、糖、例えば、マンニトール、ソルビトール、グルコース、キシリトール、トレハロース、ソルボース、ショ糖、ガラクトース、デキストラン、デキストロース、フルクトース、ラクトース、およびこれらの混合物が挙げられる。許容され得る添加剤を、許容され得る担体および／または賦形剤、例えば、デキストロースと合わせてもよい。これに代えて、例示的な許容され得る添加剤としては、ペプチドの安定性を高め、溶液のゲル化を少なくするために、限定されないが、界面活性剤、例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０が挙げられる。界面活性剤を、溶液の０．０１％〜５％の量で組成物に加えてもよい。このような許容され得る添加剤を加えると、貯蔵中の組成物の安定性および半減期が向上する。
【０２５１】
医薬組成物を、皮下、筋肉内、腹腔内、経口または静脈内に投与してもよい。組成物のエアロゾル送達も、従来の方法を用いて本発明で想定される。例えば、静脈内送達は、現在は、カニューレまたは直接注射によって、または超音波によって誘導される微細な針によって可能である。Ｍｉｓｈｒａ（Ｍｉｓｈｒａら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ、３（７）：１１７３〜１１８０（２００３））は、腫瘍内注射を提供する。
【０２５２】
経腸（経口）投与のための製剤は、錠剤（コーティングされているもの、またはコーティングされていないもの）、カプセル（硬質または軟質）、微小球、エマルション、粉末、顆粒、結晶、懸濁物、シロップまたはエリキシル剤に含まれていてもよい。例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウムを含む従来の非毒性固体担体を使用し、固体製剤を調製することができる。補助的な活性化合物（例えば、防腐剤、抗菌剤、抗ウイルス剤および抗真菌剤）も製剤に組み込むことができる。経腸投与のために液体製剤を使用することもできる。担体は、石油、動物油、植物油または合成油、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油を含む種々の油から選択することができる。適切な医薬賦形剤としては、例えば、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールが挙げられる。
【０２５３】
注射のための組成物は、水溶液（水溶性の場合）または分散物、および滅菌の注射溶液または分散物を即座に調製するための滅菌粉末を含む。静脈内投与のために、適切な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、パーシッパニー、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含有する、溶媒または分散媒体であってもよい。例えば、レシチンのようなコーティングを使用することによって、分散物の場合には必要な粒径を維持することによって、界面活性剤を使用することによって、流動性を維持することができる。抗菌剤および抗真菌剤としては、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸およびチメロサールが挙げられる。等張性薬剤、例えば、糖類、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、および塩化ナトリウムが、組成物に含まれてもよい。得られる溶液をそのまま使用のために包装してもよく、または凍結乾燥させてもよい。凍結乾燥された調製物を、後で、投与前に滅菌溶液と合わせてもよい。
【０２５４】
組成物は、伝統的には、例えば、単位投薬量の注射によって静脈内に投与することができる。注射のために、活性成分は、実質的に発熱物質を含まず、適切なｐＨを有し、等張性であり、安定な非経口で許容され得る水溶液の形態であってもよい。例えば、等張性ビヒクル（例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液）を用い、適切な溶液を調製することができる。必要な場合、防腐剤、安定化剤、バッファー、酸化防止剤および／または他の添加剤が含まれていてもよい。
【０２５５】
一実施形態では、組成物は、凍結乾燥される。この組成物が医薬のために検討される場合、または本明細書に提供される任意の方法での使用のために検討される場合、組成物が、炎症反応または安全ではないアレルギー反応を引き起こさないように、組成物は、実質的に発熱物質を含まなくてもよいことが想定される。
【０２５６】
許容され得る担体は、吸収または排出を安定化し、高めるか、または遅らせる化合物を含有していてもよい。このような化合物としては、例えば、炭水化物、例えば、グルコース、ショ糖またはデキストラン；低分子量タンパク質；ペプチドの排出または加水分解を減らす組成物；または賦形剤、または他の安定化剤および／またはバッファーが挙げられる。吸収を遅らせる薬剤としては、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンが挙げられる。洗剤を使用し、リポソーム担体を含む医薬組成物を安定化させるか、または医薬組成物の吸収を高めるか、または低下させることもできる。消化から保護するために、化合物を、組成物と複合体形成させ、酸性および酵素加水分解に耐えられるようにしてもよく、または、化合物を、リポソームのような適切な耐性を有する担体中で複合体形成させてもよい。化合物を消化から保護する手段は、当該技術分野で知られている（例えば、治療薬剤の経口送達のための脂質組成物を記載する、Ｆｉｘ（１９９６）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．１３：１７６０  １７６４；Ｓａｍａｎｅｎ（１９９６）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４８：１１９  １３５；および米国特許第５，３９１，３７７号を参照）。
【０２５７】
静脈内注射、または罹患部位への注射のために、活性成分は、発熱物質を含まず、適切なｐＨを有し、等張性であり、安定な非経口で許容され得る水溶液の形態であってもよい。当業者は、例えば、等張性ビヒクル（例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液）を用い、適切な溶液を十分に調製することができる。必要な場合、防腐剤、安定化剤、バッファー、酸化防止剤および／または他の添加剤が含まれていてもよい。
【０２５８】
「医薬的に許容され得る」という句は、ヒトに投与したとき、生理学的に忍容され、典型的には、アレルギー反応または同様の不都合な反応（例えば、胃のむかつき、めまいなど）を起こさない分子部分および組成物を指す。
【０２５９】
「単位投薬量」という用語は、治療組成物に言及して使用される場合は、ヒトのための投薬単位として適切な物理的に別個の単位を指し、それぞれの単位は、必要な希釈剤（すなわち、担体またはビヒクル）と組み合わせて望ましい治療効果が得られるように計算された所定量の活性物質を含有する。
【０２６０】
組成物を、投薬量の製剤に適合する様式で、治療に適切な量で投与することができる。投与される量は、処置される被検者、被検者の免疫系が活性成分を利用する能力および望ましい結合能力の程度によって変わる。投与するのに必要な活性成分の正確な量は、医師の判断によって変わり、それぞれの個人に固有である。初期投与および追加注射のための適切な計画も変動し得るが、初期投与の後、１時間以上の間隔をあけて、その後の注射または他の投与を繰り返すのが典型的である。これに代えて、血中濃度を１０ナノモル濃度から１０マイクロモル濃度までに維持するのに十分な連続的な静脈注入が想定される。
【０２６１】
医師または獣医師は、必要な組成物の「有効な量」を簡単に決定し、処方することができる。例えば、医師または獣医師は、組成物中で使用される化合物の投薬を、望ましい治療効果を達成するために、必要な量より低いレベルで開始し、望ましい効果が達成されるまで投薬量を徐々に上げることができる。
【０２６２】
「治療に有効な量」は、本明細書で使用する場合、臓器または組織において望ましい治療効果または予防効果を少なくとも部分的に達成する量である。一例では、疾患の予防的処置および／または治療的処置をもたらすのに必要な改質されたＤＴの量は、それ自体は固定されていない。投与される改質されたＤＴ融合毒素の量は、疾患の種類、疾患の程度およびその疾患を患う哺乳動物種の大きさによって変わるだろう。一般的に、量は、がんの処置において使用される他の細胞毒性薬剤について使用される量の範囲であると思われるが、特定の場合には、改質されたＤＴ融合毒素の特異性と、増加した毒性のため、必要な量は、もっと少なくすむだろう。ほんの一例として、本明細書に記載される構築物の例示的な投薬量は、９μｇ／ｋｇ／日または１８μｇ／ｋｇ／日であってもよい。
【０２６３】
特定の状況では、これによって達成することができるように、融合毒素の量を特定の部位に局所的に高めて送達しようとする現時点で利用可能な技術（例えば、カニューレまたは対流強化送達（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、選択的な放出）も望ましいだろう。
【０２６４】
ある実施形態は、本明細書に記載される状態、疾患または障害を治療するための医薬を製造するための本明細書に記載される組成物の使用を想定する。医薬は、治療を必要とする患者／被検者の身体的特徴に基づいて配合することができ、状態、疾患または障害の段階に基づいて、単一または複数の製剤として配合することができる。医薬を、病院およびクリニックに配布するために適切なラベルを付けた適切なパッケージで包装してもよく、このラベルは、本明細書に記載される疾患を有する被検者を治療する指示のためのものである。医薬を１個または複数個の単位として包装してもよい。組成物の投薬量および投与のための使用説明が、以下に記載されるようなパッケージとともに含まれていてもよい。
【０２６５】
本発明は、さらに、本明細書で上に記載される改質された毒素またはその融合タンパク質と、医薬的に許容され得る担体とを含む医薬組成物に関する。
【０２６６】
必要な場合、上述の１つ以上の成分の組み合わせとともに、適切な溶媒中、活性成分を必要な量で組み込み、その後、濾過によって滅菌することによって、滅菌注射溶液を調製してもよい。一般的に、塩基性分散媒体と、上述のものから必要な他の成分とを含有する活性成分を滅菌ビヒクルに組み込むことによって、分散物が調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、すでに滅菌濾過した溶液から、活性成分と任意のさらなる望ましい成分の粉末が得られる減圧乾燥および凍結乾燥である。
【０２６７】
特定の実施形態では、融合タンパク質を本質的に含む調製物を得るための、この混合物のさらなる精製である。この精製は、さらなるクロマトグラフィー分離によって達成され、例えば、さまざまな種類の免疫毒素を溶出させるための塩勾配を用いたアフィニティクロマトグラフィー、もっと大きな分子から免疫毒素を分離するためのゲル濾過によって達成することができる。
【０２６８】
本明細書に記載される化合物の精製に用いられるゲルは、ランダム構造を有する三次元網目構造である。分子ふるいゲルは、分析対象または分離対象の物質とは結合も反応もしない架橋したポリマーである。ゲル濾過の目的のために、ゲル材料は、一般的に帯電していない。ゲル内の空間は、液体で満たされており、液相は、ゲル容積の大部分を構成する。ゲル濾過カラムに一般的に用いられる材料としては、デキストラン、アガロースおよびポリアクリルアミドが挙げられる。
【０２６９】
デキストランは、グルコース残基で構成される多糖であり、ＳＥＰＨＡＤＥＸの名称で市販されている（Ｐｈａｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）。そのビーズは、種々の孔径を与えることによって異なる大きさの分子を分離するために、種々の架橋度で調製される。アルキルデキストランは、Ν，Ν’−メチレンビスアクリルアミドで架橋してＳＥＰＨＡＣＲＹＬ−Ｓ１００からＳ１０００を生成し、ＳＥＰＨＡＤＥＸによって達成することができるよりも大きな範囲で分画する強いビーズを作ることができる。
【０２７０】
ポリアクリルアミドをゲル濾過媒体として使用することもできる。ポリアクリルアミドは、架橋剤としてΝ，Ν’−メチレンビスアクリルアミドを用いて調製された、架橋したアクリルアミドポリマーである。ポリアクリルアミドは、異なる大きさの粒子の分離に使用するために、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＵＳＡ）から種々の孔径のものが入手可能である。
【０２７１】
ゲル材料は、水およびいくつかの有機溶媒で膨潤する。膨潤は、孔に溶出液として使用される液体が充填されるプロセスである。分子が小さいほど、孔に入るので、これらの分子は、孔に入らない大きな分子と比較して、ゲルを通って進むのが遅く、これが分離の基礎を形成する。ビーズは、異なる用途で使用されるさまざまな微細度で入手可能である。ビーズが粗いほど、流れは速くなり、解像度は悪くなる。Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅは、最大の解像度のために使用することができるが、流れが非常に遅い。Ｆｉｎｅは、もっと速い流速が必要な大きなカラムでの分取作業に用いられる。粗いグレードのものほど、解像度よりもかかる時間が重要な大量の調製のためのものであるか、または分子量が大きく異なる分子を分離するためのものである。
【０２７２】
アフィニティクロマトグラフィーは、一般的に、基質（例えば、リガンドまたは抗体）によるタンパク質の認識に基づく。例えば、不溶性マトリックスに結合分子（例えば、活性化された染料）を共有結合させることによって、カラム材料を合成することができる。次いで、カラム材料に、溶液からの望ましい基質を吸着させる。次に、結合が起こらず、基質が溶出されるような状態に変化させる。アフィニティクロマトグラフィーの成功に必要なことは、マトリックスが分子を吸着しなければならないこと、その結合活性を変えることなく、リガンドが結合しなければならないこと、結合が十分に強いリガンドを選択しなければならないこと、基質を壊すことなく溶出させることが可能でなければならないことである。
【０２７３】
本明細書に記載される化合物の一実施形態は、マトリックスが反応性染料−アガロースマトリックスであるアフィニティクロマトグラフィー方法である。Ｂｌｕｅ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥは、Ｂｌｕｅ  ３ＧＡおよびアガロースで構成されるカラムマトリックスであり、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥをアフィニティクロマトグラフィーのマトリックスとして使用することができる。これに代えて、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＣＬ−６Ｂは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＣｏｍｐａｎｙからＲｅａｃｔｉｖｅ  Ｂｌｕｅ  ２として入手可能である。このマトリックスは、融合タンパク質に直接結合し、塩勾配を用いた溶出によって分離することができる。
【０２７４】
本明細書で提供されるのは、改質された毒素を含有する組成物である。一実施形態では、改質された毒素は、ジフテリア毒素を含み、この改質されたジフテリア毒素は、１つ以上のアミノ酸改質を有する配列番号２、１４８または２００に引用されるようなアミノ酸配列を含み、少なくとも１つのアミノ酸改質が、Ｔ細胞エピトープ内で、配列番号２、１４８または２００の残基７〜９、２９〜３１および２９０〜２９２から選択される領域中の（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフ内で、Ｂ細胞エピトープ内で、またはこれらの組み合わせ内で行われ、前記改質されたジフテリア毒素は、改質されていないジフテリア毒素に匹敵する細胞毒性を有する。非限定的な一例では、改質されたＶＬＳの（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフは、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、Ｇ、Ｌおよび表１からの改変されたアミノ酸または異常アミノ酸から選択されるアミノ酸残基による、ＶまたはＩの置換である、位置（ｘ）での改質を含み、位置Ｄ／Ｅでの改質は、Ａ、Ｓ、Ｅ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ｇ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｒおよび表１からの改変されたアミノ酸または異常アミノ酸から選択されるアミノ酸残基による、ＤまたはＥの置換である。一実施形態では、位置（ｙ）での改質は、Ｉ、Ｆ、Ｃ、Ｍ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｖおよび表１からの改変されたアミノ酸または異常アミノ酸による置換である。
【０２７５】
ほんの一例として、改質されていないジフテリア毒素は、例えば、配列番号２、１４８または２００のアミノ酸配列を有していてもよい。
【０２７６】
改質されていないジフテリア毒素と比較して、低下した免疫原性、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対する低下した結合活性、およびこれらの組み合わせを有する改質されたジフテリア毒素を含む、組成物。このような組成物は、さらに、非ジフテリア毒素ポリペプチドを含んでいてもよく、非ジフテリア毒素ポリペプチドとしては、限定されないが、抗体またはその抗原結合フラグメント、ＥＧＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＮＦα、ＩＮＦγ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、Ｅｐｈｒｉｎ、ＢＦＧＦおよびＴＧＦが挙げられる。非ジフテリア毒素ポリペプチドは、このようなポリペプチドのフラグメント、例えば、その細胞結合部分であってもよい。一実施形態では、非ジフテリア毒素のポリペプチドは、ＩＬ−２またはその細胞結合部分である。
【０２７７】
細胞毒性を維持しつつ、低下した免疫原性、ＨＵＶＥＣに対する低下した結合活性、低下した副作用、またはこれらの組み合わせを有する改質された毒素およびその融合タンパク質を、種々の血液がん（例えば、白血病）、リンパ球から誘導される悪性腫瘍（例えば、がん）、固形腫瘍および非悪性疾患、例えば、ＧＶＨＤまたは乾癬の治療に使用することができる。
【０２７８】
（がん）
「腫瘍細胞抗原」という用語は、本明細書では、無関係の腫瘍細胞、正常な細胞または正常な体液よりも腫瘍細胞または腫瘍体液に多量に存在する抗原であると定義される。抗原の存在は、当業者に知られているいくつかのアッセイによって試験されてもよく、限定されないが、抗体を用いたネガティブおよび／またはポジティブの選択、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、ラジオイムノアッセイまたはウェスタンブロットが挙げられる。
【０２７９】
「アポトーシスを誘発する薬剤」は、本明細書では、アポトーシス／プログラム細胞死を誘発すると定義され、例えば、細胞（例えば、腫瘍細胞）がプログラム細胞死を誘発される抗がん剤および治療を含む。例示的なアポトーシスを誘発する薬剤を以下にもっと詳細に記載する。
【０２８０】
「アポトーシス」または「プログラム細胞死」という用語は、望ましくない細胞または無用な細胞が、成長中および他の正常な生体プロセス中に脱離する生理学的プロセスを指す。アポトーシスは、正常な生理学的状態で起こる細胞死の一態様であり、細胞が自身の死に積極的に関与する（「細胞の自殺」）。正常な細胞ターンオーバーおよび組織のホメオスタシス、胚形成、免疫寛容の誘発および維持、神経系の成長および内分泌依存性組織萎縮の間に最も多くみられる。アポトーシスを受ける細胞は、特徴的な形態学的特徴および生物化学的特徴を示す。これらの特徴としては、クロマチンの凝集、核および細胞質の凝縮、細胞質および核から、膜に結合した小胞（アポトーシス小体）への分割が挙げられ、アポトーシス小体は、リボソーム、形態学的に変化していないミトコンドリアと核材料を含有する。ｉｎ  ｖｉｖｏで、これらのアポトーシス小体は、マクロファージ、樹状細胞または隣接する上皮細胞に迅速に認識され、貪食される。ｉｎ  ｖｉｖｏでアポトーシス細胞を除去するためのこの効果的な機構に起因して、炎症応答は誘発されない。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、アポトーシス小体および残った細胞フラグメントは、最終的には膨潤し、最後には溶解する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞死のこの終末段階は、「二次性ネクローシス」と呼ばれる。アポトーシスは、ＤＮＡフラグメント化、アネキシンＶへの曝露、カスパーゼの活性化、チトクロムｃの放出など、当業者に知られている方法によって測定することができる。死亡するように誘発された細胞は、本明細書で「アポトーシス細胞」と呼ばれる。
【０２８１】
アポトーシスは、標準的なアネキシンＶアポトーシスアッセイによっても試験することができる。ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３細胞を６ウェルプレート（ＮＵＮＣ）で成長させ、照射するか、またはアンタゴニスト（または他の抗がん薬と組み合わせたもの）で４〜４８時間処理し、洗浄し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で１時間染色する。フローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）によって細胞を分析し、ヨウ化プロピジウムで対比染色し、フローサイトメーターで再び分析する。
【０２８２】
治療計画の前、最中および後を含む１つ以上の複数の時間点で、症状について患者を評価することができる。治療によって被検者の状態を向上させることができ、腫瘍の大きさの減少、細胞増殖の低下、細胞数の減少、血管新生の減少、アポトーシスの増加、または腫瘍細胞の少なくとも一部の生存率の低下のうち、１つ以上の因子が発生したかどうかを決定することによって評価することができる。これらの１つ以上の発生によって、ある場合には、がんが部分的または完全になくなり、患者の生存期間が延びるだろう。これに代えて、末期がんについては、治療によって、疾患の進行が止まり、生活の質が良くなり、および／または生存期間が延びるだろう。
【０２８３】
（細胞移動をアッセイする方法）
細胞移動のためのアッセイは、例えば、Ｂｒｏｏｋｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １９９７、９９：１３９０〜１３９８のような文献に記載されており、細胞移動を測定するための方法は、当業者に知られている。本明細書に記載される細胞移動を測定する１つの方法において、トランスウェル移動チャンバからの膜を基質でコーティングし、トランスウェルを洗浄し、非特異的な結合部位をＢＳＡで遮断する。コンフルエントに至っていない培養物からの腫瘍細胞を集め、洗浄し、アッセイ抗体存在下または非存在下、移動バッファーに再懸濁させる。腫瘍細胞を、コーティングされたトランスウェル膜の下側に移動させた後、この膜の上側に残った細胞を除去し、下側に移動する細胞をクリスタルバイオレットで染色する。次いで、顕微鏡の視野あたりの細胞数を直接計測することによって、細胞移動を定量する。
【０２８４】
（腫瘍の成長をアッセイする方法）
腫瘍の成長は、当業者に知られている方法によって、例えば、ＳＣＩＤマウスモデル、ヌードマウスモデルおよび同一遺伝子型の腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスを用いてアッセイすることができる。腫瘍の成長のためのＳＣＩＤマウスモデルは、以下のように実施される。コンフルエントに至っていないヒトＭ２１黒色腫細胞（または任意の望ましい腫瘍細胞型）を集め、洗浄し、滅菌ＰＢＳに再び懸濁させる（１ｍＬあたり、２０×１０６）。ＳＣＩＤマウスに、Ｍ２１ヒト黒色腫細胞（２×１０６）懸濁物１００μＬを皮下注射する。腫瘍細胞を注射してから３日後、マウスを、処置しないか、または望ましい投薬範囲のアンタゴニストを用いて腹腔内で処置する。マウスを２４日間、毎日処置する。腫瘍の大きさをカリパスで測定し、式Ｖ＝（Ｌ×Ｗ２）／２を用いて体積を概算する。ここで、Ｖは、体積に等しく、Ｌは長さに等しく、Ｗは幅に等しい。
【０２８５】
これに代えて、ヌードマウスモデル、ＳＣＩＤマウスモデルおよび／またはＢＡＬＢ／ｃ同一遺伝子型マウスモデルも、ヒト化抗−エンドグリン抗体または本明細書に記載される抗原結合フラグメントによって、腫瘍の成長とその阻害を評価するために利用することができる。
【０２８６】
（細胞増殖をアッセイする方法）
細胞増殖を、当業者に知られている方法によってアッセイすることができる。本明細書に記載されるように、コンフルエントに至っていないヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、ＥＣＶ細胞またはＥＣＶＬ細胞に由来するＣＭ（２５μＬ）存在下または非存在下、低血清（５．０％）を含有する増殖バッファーに再懸濁させ、内皮細胞を２４時間かけて増殖させる。市販のＷＳＴ−１アッセイキット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を用いてミトコンドリアデヒドロゲナーゼ活性を測定することによって、増殖を定量することができる。また、本明細書に記載されるように、標準的な方法を用い、３Ｈの組み込みを測定することによって、増殖を定量することができる（Ｓｈｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１０８：２５１〜２５７（２００４））。
【０２８７】
細胞増殖を評価する他の方法は、当該技術分野で知られており、本発明で想定される。さらに非限定的な例を、実施例でさらに詳細に記載する。
【０２８８】
本明細書に記載される分類および病期分類のシステムは、本明細書に記載されるがんの治療を評価する１つの手段を表すことが理解されるだろう。さらに、他の病期分類スキームは、当該技術分野で知られており、本明細書に記載される方法と組み合わせて使用してもよい。ほんの一例として、悪性腫瘍のＴＮＭ分類を、患者の身体のがん度を記述するためのがん病期分類システムとして使用してもよい。Ｔは、腫瘍の大きさおよび付近の組織に浸潤しているかどうかを記載し、Ｎは、関与する所属リンパ節を記載し、Ｍは、遠隔転移を記載する。ＴＮＭは国際対がん連合（ＵＩＣＣ）によって整備され、癌米国合同委員会（ＡＪＣＣ）および国際産婦人科連合（ＦＩＧＯ）によって使用される。すべての腫瘍にＴＮＭ分類があるわけではないことが理解されるだろう（例えば、脳腫瘍）。一般的に、Ｔ（ａ、ｉｓ、（０）、１〜４）は、原発性腫瘍の大きさまたは直接的な程度として測定される。Ｎ（０〜３）は、所属リンパ節への広がりの程度を指す。Ｎ０は、腫瘍細胞が所属リンパ節に存在しないことを意味し、Ｎ１は、所属リンパ節の最も近い部分または少数に腫瘍細胞が広がっていることを意味する。Ｎ２は、Ｎ１とＮ３の間の程度まで腫瘍細胞が広がっていることを意味する。Ｎ３は、最も遠いか、または多くの所属リンパ節にまで腫瘍細胞が広がっていることを意味する。Ｍ（０／１）は、転移が存在することを指す。Ｍ０は、遠隔転移が存在しないことを意味し、Ｍ１は、（所属リンパ節を超えて）遠い臓器まで転移が起こっていることを意味する。他のパラメータを評価してもよい。Ｇ（１〜４）は、がん細胞のグレードを指す（すなわち、正常な細胞と似ている場合には、低グレードであり、低分化の場合には、高グレードである）。Ｒ（０／１／２）は、手術の完全さを指す（すなわち、切除境界にがん細胞がないか、あるか）。Ｌ（０／１）は、リンパ管への浸潤を指す。Ｖ（０／１）は、静脈への浸潤を指す。Ｃ（１〜４）は、Ｖの確実性（質）の修正因子を指す。
【０２８９】
本明細書で提供されるのは、がん細胞と、がん細胞の成長を抑え、阻害するか、またはがん細胞を殺すのに有効な量の本明細書に記載される化合物とを接触させることを含む、がん細胞の成長を抑え、阻害するか、またはがん細胞を殺すための方法である。
【０２９０】
本明細書で提供されるのは、腫瘍が大きくなるのを阻害し、腫瘍の大きさを小さくし、腫瘍の増殖を低下させ、または腫瘍の増殖を防ぐのに有効な量の本明細書に記載される化合物を個人に投与することを含む、個人において、腫瘍が大きくなるのを阻害し、腫瘍の大きさを小さくし、腫瘍の増殖を低下させ、または腫瘍の増殖を防ぐ方法である。腫瘍の治療は、ある場合には、症状の進行の停止を含み、すなわち、患者を治療することによって、がんは悪化せず、患者の生存期間が長くなる。
【０２９１】
治療計画の前、最中および後を含む１つ以上の複数の時間点で、症状について患者を評価することができる。治療によって被検者の状態を向上させることができ、腫瘍の大きさの減少、腫瘍細胞増殖の低下、細胞数の減少、血管新生の減少および／またはアポトーシスの増加のうち、１つ以上の因子が発生したかどうかを決定することによって評価することができる。これらの１つ以上の発生によって、ある場合には、がんが部分的または完全になくなり、患者の生存期間が延びるだろう。これに代えて、末期がんについては、治療によって、疾患の進行が止まり、生活の質が良くなり、および／または生存期間が延びるだろう。治療を評価する他の方法は、当該技術分野で知られており、本発明で想定される。
【０２９２】
例示的な実施形態では、本発明のＴ細胞エピトープが改質されたＤＴ融合毒素は、医学的障害、例えば、がん、または標的リガンドが選択的に結合することができる望ましくない細胞種の存在を特徴とする非悪性状態を患う被検者、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与される。
【０２９３】
本明細書に記載される方法を用いて治療される患者について、主要転帰の測定値が評価されてもよく、例えば、無増悪生存期間が挙げられる。一実施形態では、無増悪生存期間の増加は、治療をしなかったときと比較して、約２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、またはもっと大きい量が観察される。別の実施形態では、無増悪生存期間の増加は、治療をしなかったときと比較して、生存期間が約３ヶ月、約６ヶ月、約９ヶ月、約１２ヶ月、約１８ヶ月、約２年、約３年、約４年、約５年、またはもっと長くなる。
【０２９４】
二次転帰の測定値も評価してもよく、効果の持続期間、腫瘍進行までの時間、全生存期間、重篤および非重篤な有害事象が挙げられる。例えば、治療によって、疾患の進行を防いでもよく（すなわち、進行の停止）、または、向上させてもよい。これに代えて、またはこれに加えて、腫瘍組織量の減少、血管新生の減少、副作用の減少、有害事象の減少、および／または患者のコンプライアンスの上昇のうち、１つ以上の観点で、他の目標を測定することができる。
【０２９５】
（血液がん）
血液がんは、本明細書に記載される方法を用いて治療し得るがんの一種を表す。血液がんとしては、限定されないが、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄白血病（ＣＭＬ）などが挙げられる。
【０２９６】
（慢性リンパ球性白血病）
慢性リンパ球性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）（「ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ」または「ＣＬＬ」としても知られる）は、白血病の一種であるか、または白血球（リンパ球）のがんである。ＣＬＬは、骨髄から発生し、リンパ節で成長し、通常は感染と戦う特定のリンパ球（Ｂ細胞）が影響を受ける。ＣＬＬでは、Ｂ細胞のＤＮＡが損傷を受け、その結果、感染と戦うことができなくなるが、制御されずに成長し、感染と戦うことができる正常な血液細胞を追い出してしまう。ＣＬＬは、Ｂ細胞の異常な新生物性増殖であり、細胞は、主に骨髄および血液に蓄積する。世界保健機関は、ＣＬＬと、主にリンパ節に存在する非ホジキンリンパ腫の一種である小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）は、同じ疾患の異なる段階であると考えている。ほとんどのヒトは、白血球の数が多いという通常の血液検査が戻ってきた結果として、症状がない状態で診断されるが、ＣＬＬが進行するにつれて、リンパ節、脾臓、肝臓が腫れ、最終的に、貧血症および感染が生じる。初期ＣＬＬは、治療されず、後期ＣＬＬは、現在は、化学療法およびモノクローナル抗体で治療される。
【０２９７】
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるような改質されたＤＴ融合タンパク質を投与することによる、慢性リンパ球性白血病を有する被検者を治療する方法である。一実施形態では、被検者は、治療歴がある。ほんの一例として、本明細書に記載されるような改質されたＤＴ融合タンパク質は、２１日ごとに５日間、１８μｇ／ｋｇ／日の投薬量を６０分間静脈内注入し、これを８サイクルまで行って投与されてもよい。全体として、患者は、末梢血の慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞の減少、リンパ節の大きさの減少、ある場合には、骨髄生検から長時間にわたって同定されるような寛解を示してもよい。ある場合には、治療される患者は、フルダラビンに対して化学療法抵抗性であってもよい。
【０２９８】
（ヒトＴ細胞リンパ好性ウイルス１に関連する急性Ｔ細胞白血病／リンパ腫）
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるような改質されたＤＴ融合タンパク質を投与することによる、ヒトＴ細胞リンパ好性ウイルス１に関連する急性Ｔ細胞白血病／リンパ腫を有する被検者を治療する方法である。ほんの一例として、改質されたＤＴ融合タンパク質を４サイクル投与してもよい。正常な造血の回復および骨髄線維症の減少という観点で、被検者を評価してもよい。疾患が進行した後、臨床的に完全寛解が達成されるまで、４サイクルのｈｙｐｅｒ−ＣＶＡＤ（多分割されたシクロホスファミド／ドキソルビシン／ビンクリスチン／デカドロン）を投与してもよい。患者は、１年間、維持療法を受けてもよい。一実施形態では、被検者は、ｈｙｐｅｒ−ＣＶＡＤ療法でさらに治療されてもよい。
【０２９９】
（急性骨髄性白血病）
別の態様では、本明細書で提供されるのは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、好ましくは、末梢血の急性前骨髄球性白血病を治療する方法である。ＡＭＬは、骨髄で始まるが、リンパ節、肝臓、脾臓、中枢神経系、精巣を含む身体の他の部分に広がっていく能力を有する。急性とは、すばやく進行することを意味し、治療しないと数ヶ月で死に至る場合もある。ＡＭＬは、通常は顆粒球または単核細胞になる未熟な骨髄細胞を特徴とし、複製し、蓄積し続ける。
【０３００】
本明細書で提供される方法によって治療することもできる他の種類の白血病が存在し、限定されないが、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞性白血病、脊髄異形成、骨髄増殖性障害が挙げられる。
【０３０１】
本明細書で提供される方法は、改質されたＤＴ融合タンパク質の投与、または改質されたＤＴ融合タンパク質の投与と１つ以上の抗がん治療の組み合わせによって、白血病患者に有益な効果を与えるだろう。
【０３０２】
（固形腫瘍）
例示的な固形腫瘍としては、限定されないが、平滑筋腫、脳腫瘍（例えば、悪性、前悪性または良性の脳腫瘍、例えば、神経膠芽腫、星状細胞腫、髄膜腫、髄芽腫または末梢性神経外胚葉性腫瘍）、癌腫（例えば、胆嚢がん、気管支がん、基底細胞がん、腺がん、扁平上皮がん、小細胞がん、大細胞未分化がん、腺腫、嚢腺腫など）、基底細胞がん、奇形腫、網膜芽腫、脈絡膜悪性黒色腫、セミノーマ、肉腫（例えば、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、頭蓋咽頭腫、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、平滑筋肉腫、Ａｓｋｉｎ腫瘍、リンパ肉腫、神経肉腫、カポジ肉腫、皮膚線維肉腫、血管肉腫など）、形質細胞腫、頭頸部腫瘍（例えば、口腔、喉頭、上咽頭、食道など）、肝臓腫瘍、腎臓腫瘍、腎細胞腫瘍、扁平上皮がん、子宮腫瘍、骨腫瘍、前立腺腫瘍、限定されないが、Ｈｅｒ２および／またはＥＲおよび／またはＰＲの乳房腫瘍を含む、乳房腫瘍、膀胱腫瘍、膵臓腫瘍、子宮内膜腫瘍、扁平上皮がん、胃腫瘍、グリオーマ、結腸直腸腫瘍、精巣腫瘍、結腸腫瘍、直腸腫瘍、卵巣腫瘍、子宮頸管腫瘍、眼腫瘍、中枢神経系腫瘍（例えば、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊椎腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫など）、甲状腺腫瘍、肺腫瘍（例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）または小細胞肺がん）、リンパ腫（例えば、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、非皮膚末梢Ｔ細胞リンパ腫、ヒトＴ細胞リンパ好性ウイルス（ＨＴＬＶ）に関連するリンパ腫、例えば、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、成人Ｔ細胞白血病リンパ腫、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）、慢性または肝細胞がんなど）、多発性骨髄腫、皮膚腫瘍（例えば、基底細胞がん、扁平上皮がん、黒色腫、例えば、悪性黒色腫、皮膚黒色腫または眼内黒色腫、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞がんまたはカポジ肉腫）、婦人科腫瘍（例えば、子宮肉腫、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がんなど）、ホジキン病、小腸のがん、内分泌系のがん（例えば、甲状腺、副甲状腺または副腎のがんなど）、中皮腫、尿道のがん、陰茎のがん、ゴーリン症候群に関連する腫瘍（例えば、髄芽腫、髄膜腫など）、未知の由来の腫瘍；またはこれらに対する転移が挙げられる。
【０３０３】
従って、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるような改質されたＤＴ融合タンパク質を投与することによる、１つ以上の固形腫瘍を有する被検者を治療する方法である。
【０３０４】
（乳がん）
一態様では、本明細書で提供されるのは、乳がん、例えば、乳腺の管組織中の腺管癌、Ｈｅｒ２および／またはＥＲおよび／またはＰＲである乳がんを治療する方法である。
【０３０５】
本明細書に記載される方法によって治療可能な数種類の乳がんが存在する。非浸潤性小葉癌および非浸潤性腺管がんは、それぞれ小葉および腺管で進行するが、乳房の周囲にある脂肪組織または身体の他の領域には広がらない乳がんである。小葉がんおよび腺管がんの浸潤（または侵入）は、それぞれ小葉および腺管で進行し、乳房の脂肪組織および／または身体の他の部分のいずれかに広がるがんである。この方法による治療が有益であり得る他の乳房のがんは、髄様癌、粘液癌、管状癌および炎症性乳がんである。
【０３０６】
一実施形態では、乳がんは、ＴＮＭシステムに従って病期分類される。予後は、病期分類の結果と密接に関係があり、病期分類は、臨床試験および臨床診療の両方の治療に患者を割り当てるためにも使用される。
【０３０７】
簡単にいうと、病期分類の情報は以下の通りである。ＴＸ：原発性腫瘍を評価することができない。Ｔ０：腫瘍の証拠なし。Ｔｉｓ：本来の場所にとどまる癌腫、浸潤なし。Ｔ１：腫瘍は２ｃｍ以下である。Ｔ２：腫瘍は、２ｃｍより大きいが、５ｃｍ以下である。Ｔ３：腫瘍は、５ｃｍを超える。Ｔ４：胸壁または皮膚の中で成長する、任意の大きさの腫瘍、または炎症性の乳がん。ＮＸ：隣接するリンパ節を評価することができない。Ｎ０：がんは、所属リンパ節に広がっていない。Ｎ１：がんは、１〜３個の腋窩リンパ節または１個の内胸リンパ節に広がっている。Ｎ２：がんは、４〜９個の腋窩リンパ節または複数の内胸リンパ節に広がっている。Ｎ３：以下の１つを適用する。がんは、１０個以上の腋窩リンパ節に広がっているか、またはがんは、鎖骨（首周りの骨）の下にあるリンパ節に広がっているか、またはがんは、鎖骨の上のリンパ節に広がっているか、またはがんは、腋窩リンパ節を含み、内胸リンパ節に拡大しているか、またはがんは、４個以上の腋窩リンパ節を含み、少量のがんが、センチネルリンパ節生検について内胸リンパ節中にみられる。ＭＸ：遠隔への広がり（転移）の存在を評価することができない。Ｍ０：遠隔への広がりなし。Ｍ１：（鎖骨上のリンパ節を含まない）遠い臓器への広がりがみられた。本明細書で提供される方法は、改質されたＤＴ融合タンパク質の投与、または改質されたＤＴ融合タンパク質の投与と１つ以上の抗がん治療の組み合わせによって、乳がん患者に有益な効果を与えるだろう。
【０３０８】
（皮膚Ｔ細胞リンパ腫）
皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）は、皮膚に影響を与えるＴ細胞（免疫機能を担う白血球の一種）由来のリンパ腫である。その症状はさまざまである。皮膚に限局されることが多く、治療および治癒が可能である。浸潤性形態は、皮膚を超えて、リンパ節、血液、内臓へと広がる能力を有する。
【０３０９】
皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）のＷＨＯ−ＥＯＲＴＣ分類は、典型的には、インドレント臨床挙動または浸潤性臨床挙動と分類される。インドレント臨床挙動は、限定されないが、菌状息肉腫（ＭＦ）；菌状息肉腫の改変体およびサブタイプ（例えば、毛包向性ＭＦ、パジェット様細網症、および肉芽腫性皮膚弛緩症）；原発性皮膚ＣＤ３０＋リンパ増殖性障害（例えば、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫およびリンパ腫様丘疹症）；皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫（暫定）；および原発性皮膚ＣＤ４＋小／中細胞型多型性Ｔ細胞リンパ腫（暫定）を包含する。浸潤性臨床挙動は、限定されないが、セザリー症候群；成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫；節外ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫鼻型；原発性皮膚末梢Ｔ細胞リンパ腫、未分化；原発性皮膚進行性表皮向性ＣＤ８＋Ｔ細胞リンパ腫（暫定）；および皮膚ｇ／ｄＴ細胞リンパ腫（暫定）を包含する。
【０３１０】
血液前駆細胞腫瘍は、Ｔ細胞リンパ腫ではなく、一般的に、ＣＤ４＋／ＣＤ５６＋血液皮膚新生物（分芽型ＮＫ細胞リンパ腫）によって特徴づけられる。
【０３１１】
ＣＴＣＬ病期分類は、一般的に、３つの部分に分かれる。（１）初期：ＩＡ：１０％未満の紅斑／局面、ＩＢ：１０％を超えるＢＳＡ紅斑／局面、ＩＩＡ：触診可能なリンパ節腫脹；（２）中期：ＩＩＢ：皮膚腫瘍（Ｔ３）、ＩＩＩ：紅皮症（Ｔ４）、ＩＶＡ：節生検がポジティブ；および（３）進行した状態：内臓の関与（心臓、肺、肝臓、膵臓または腸）。
【０３１２】
ほんの一例として、ＣＴＣＬ分類は、以下のとおりである。Ｔ１：紅斑、局面、または両方、体表面の１０％未満を含む、Ｔ２：紅斑、局面、または両方、体表面のＰ１０％を含む、Ｔ３：１つ以上の皮膚腫瘍、Ｔ４：全般性紅皮症、Ｎ０：リンパ節は臨床的に関与していない、Ｎ１：リンパ節は、臨床的に大きくなっているが、組織学的には関与していない、Ｎ２：リンパ節は、臨床的に触診可能ではいが、組織学的には関与している、Ｎ３：リンパ節は、臨床的に大きくなっており、組織学的に関与している、Ｍ０：内臓転移なし、Ｍ１：内臓転移、Ｂ０：血中異型細胞（セザリー細胞）なし、５％未満、Ｂ１：血中異型細胞（セザリー細胞）、５％以上。
【０３１３】
本明細書に記載される改質されたＤＴ融合タンパク質（コンジュゲート）を使用し、被検者の皮膚Ｔ細胞リンパ腫に関連する症状を予防し、治療し、または調整してもよい。皮膚Ｔ細胞リンパ腫のために、被検者をあらかじめ治療してもよい。簡単にいうと、本明細書に記載されるコンジュゲートは、例えば、４μｇ／ｋｇ／日、９μｇ／ｋｇ／日または１８μｇ／ｋｇ／日の投薬量を３日または５日の連続した日に、静脈内に３〜２１サイクル投与してもよい。全体的な応答および／または改良を観察してもよい。
【０３１４】
（菌状息肉腫（ＭＦ））
臨床的に、菌状息肉腫（ＭＦ）は、高齢者が罹患する（診断時の年齢の中央値：５５〜６０歳）。特徴的には、紅斑、局面および腫瘍の組み合わせを示し、潰瘍形成を示すことが多く、一部の患者では、この疾患の後期にはリンパ節および内臓が関与するようになるだろう。
【０３１５】
疾患は、一般的に、皮膚に限局され、従って、皮膚を標的とする治療が一般的に用いられ、例えば、ソラレン紫外線Ａ［ＰＵＶＡ］療法）、ナイトロジェンマスタードまたはクロルムスチンの局所的な塗布（ＢＣＮＵ）および放射線療法が挙げられ、皮膚全体への電子線照射を含む。リンパ節または全身の関与、または皮膚を標的とする治療薬に対し、難治性の広範囲にわたる腫瘍段階のＭＦを伴う場合には、一般的に化学療法で治療される。もっと新しい治療としては、例えば、インターフェロンαおよび他のサイトカイン（例えば、インターロイキン−１２［ＩＬ−１２］）；新しいレチノイド、例えば、ベキサロテン；および受容体を標的とする細胞毒性融合タンパク質（例えば、ＤＡＢ３８９ＩＬ−２；デニロイキンジフチトクス／ＯＮＴＡＫ（登録商標））が挙げられる。
【０３１６】
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される改質されたＤＴ毒素融合タンパク質を投与することによる、ＭＦを治療する方法である。
【０３１７】
（セザリー症候群）
アグレッシブ挙動（Ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ）を伴うＣＴＣＬの一例は、セザリー症候群である。臨床的には、セザリー症候群は、もっぱら成人にみられる。一般的な知見としては、限定されないが、紅皮症（顕著な剥離と関係があるだろう）、浮腫、苔癬化（強い痒みがある）、リンパ節腫脹、脱毛が挙げられる。予後は、以下の通りである。急激な進行を伴うアグレッシブな臨床経過、生存期間の中央値は２〜４年、ほとんどの患者は、免疫抑制に起因する日和見感染によって死亡する。
【０３１８】
現行の治療としては、体外循環光療法を単独で、または他の治療方法と組み合わせたもの（例えば、インターフェロンα）；インターフェロンαを単独で、またはＰＵＶＡ治療と組み合わせたもの；または低用量のクロラムブシルと、プレドニゾンまたはメトトレキサートとの組み合わせを用いた長期間治療が挙げられる。
【０３１９】
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるような改質されたＤＴ融合タンパク質を投与することによる、被検者のセザリー症候群の症状を予防し、治療し、または調整する方法である。一実施形態では、被検者は、さらに、体外循環光療法、体外循環光療法／インターフェロンα、インターフェロンα、インターフェロンα／ＰＵＶＡ、または低用量のクロラムブシルとプレドニゾンまたはメトトレキサートを投与される。
【０３２０】
（再発／難治のＴ細胞およびＢ細胞の非ホジキンリンパ腫）
リンパ腫は、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫の２つの包括的な種類に分けられる。ホジキンリンパ腫も非ホジキンリンパ腫も、ＡＩＤＳ患者で起こる場合があるが、非ホジキンリンパ腫の方が一般的である。ＡＩＤＳを有するヒトが非ホジキンリンパ腫を有する場合、ＡＩＤＳ関連リンパ腫と呼ばれる。非ホジキンリンパ腫は、インドレント（ゆっくり成長する）またはアグレッシブ（すばやく成長する）であってもよい。ＡＩＤＳ関連リンパ腫は、通常は、アグレッシブである。３種類の主なＡＩＤＳ関連リンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞免疫分芽型リンパ腫および小型非切れ込み核細胞性リンパ腫である。
【０３２１】
ＡＩＤＳ関連リンパ腫の治療は、リンパ腫の治療と、ＡＩＤＳのための治療とを合わせる。ＡＩＤＳ患者は、免疫系が弱っており、治療によってさらに損傷を受ける場合がある。この理由のために、ＡＩＤＳ関連リンパ腫患者は、通常は、ＡＩＤＳを有していないリンパ腫患者よりも低用量の薬物で治療される。ＨＩＶの進行を遅らせるために、高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）を使用する。感染（重篤な場合もある）を予防し、治療するための医薬も使用される。
【０３２２】
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるような改質されたＤＴ融合タンパク質を投与することによる、被検者の再発／難治のＴ細胞およびＢ細胞の非ホジキンリンパ腫を予防し、治療し、または調整する方法である。ほんの一例として、適した被検者に、本明細書に記載される改質されたＤＴ融合タンパク質（１８μｇ／ｋｇ／日）を３週間ごとに５日間、８サイクルまで投与してもよい。このような投与計画は、被検者に十分に忍容され、再発／難治のＴ細胞およびＢ細胞の非ホジキンリンパ腫を治療するのに有用であろう。さらに、またはこれに代えて、本明細書に記載されるような改質されたＤＴ融合タンパク質を、再発／難治のＢ細胞の非ホジキンリンパ腫患者を治療するためのリツキシマブと組み合わせて投与してもよい。
【０３２３】
（脂肪織炎Ｔ細胞リンパ腫）
脂肪織炎は、顕著な特徴が皮下脂肪組織の炎症である疾患群である。脂肪織炎は、任意の脂肪組織（皮膚または内臓）で起こる場合があり、深部皮膚生検に基づいて診断されることが多く、さらに、炎症細胞の位置（脂肪小葉の中、またはこれを分離する隔壁の中）および脈管炎の有無に基づく組織学的特徴によって分類することができる。症状としては、柔らかい皮膚結節、体重減少および疲労のような全身徴候が挙げられる。全身疾患を伴う脂肪織炎は、例えば、リンパ増殖性疾患、例えば、リンパ腫または組織球症によって、膵炎または膵がんによって引き起こされる場合がある。皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫は、脂肪織炎と臨床的によく似た原発性皮膚Ｔ細胞リンパ腫のまれなサブタイプである。臨床経過は、通常は、再発性の皮膚病変を長引かせるが、まれに初期の真皮外播種を伴う。
【０３２４】
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるような改質されたＤＴ融合タンパク質を投与することによる、脂肪織炎Ｔ細胞リンパ腫を有する被検者を治療する方法である。一態様では、被検者は、ベキサロテンおよびインターフェロンαで前に治療され、２ヶ月間の治療の間に再発していてもよい。ほんの一例として、被検者は、改質されたＤＴ融合タンパク質（９μｇ／ｋｇ／日を５日間）を静脈内に１サイクル治療してもよい。すべての皮膚疾患が回復して、臨床的な寛解が観察されてもよく、３サイクル目の静脈内注入を終了した後、約２週間以内に全身症状が一定基準に達してもよい。非限定的な実施形態では、必要な場合、被検者を、１つ以上の他の治療、例えば、ベキサロテンおよび／またはインターフェロンαと組み合わせて治療してもよい。
【０３２５】
（節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ球腫、鼻型）
節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ球腫、鼻型は、米国ではまれな疾患であるが、アジア、メキシコ、中央アメリカおよび南アメリカではもっと流行している。最も一般的な部位は、鼻腔または副鼻腔である。他の部位としては、皮膚、胃腸管、精巣、腎臓、上気道、まれに、眼／眼窩が挙げられるだろう。臨床症状は、関与する主な部位によって変わる。ある場合には、被検者には、出血を伴う鼻の腫瘤、局所的な骨破壊が現れる。他の多くのまれな症例では、被検者には、皮膚または胃腸管が主に関与する場合、皮膚潰瘍または胃腸管穿孔が存在することがある。鼻ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫が存在している患者の約１０〜２０％は、同時に皮膚の関与もある場合がある。
【０３２６】
節外ＮＫ  Ｔ細胞リンパ腫、鼻型は、種々の場所で発見されるが、全体的に非常に類似した組織学的特徴を有することが多い。特徴的な特徴としては、顕著ではあるが変化しない血管中心性／血管破壊性の成長パターン、広範囲にわたる粘膜潰瘍生成、凝固壊死および偽上皮腫性増殖症が挙げられる。ある場合には、形質細胞、組織球、多くは好酸球を含む顕著な炎症細胞が混合している。腫瘍細胞は、大きさがさまざまであるが、ほとんどの場合には、中程度の大きさの細胞、または小さな細胞と大きな細胞の混合物で構成される。腫瘍細胞は、不規則な輪郭を有し、目立たない核小体を有し、中程度に青白色から透明の細胞質を有する、粒状または小胞状の核を有することが多い。有糸分裂は容易に見出される。
【０３２７】
節外ＮＫ  Ｔ細胞リンパ腫の最も典型的な免疫表現型は、ＣＤ２＋、ＣＤ５６＋、表面ＣＤ３−、細胞質ＣＤ３＋、細胞毒性顆粒、例えば、ＴＩＡ−１＋および生殖系のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である。ＣＤ８およびＣＤ７の発現は、変わりやすい。ある場合には、ＣＤ５６−およびＴＣＲの再配列された細胞毒性Ｔ細胞リンパ腫であってもよい。大部分の症例で、ＥＢＶポジティブ性がみられる。
【０３２８】
本明細書で提供される方法は、改質されたＤＴ融合タンパク質の投与、または改質されたＤＴ融合タンパク質の投与と１つ以上の抗がん治療（例えば、ベキサロテン、局所的な放射線と合わせた化学療法（例えば、ＣＨＯＰ）、ダウノルビシン、またはＬ−アスパラギナーゼ）の組み合わせによって、節外ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型患者に有益な効果を与えるだろう。
【０３２９】
（卵巣がん）
別の態様では、本明細書で提供されるのは、上皮卵巣腫瘍を含む、卵巣がんを治療する方法である。好ましくは、この方法は、卵巣内の腺癌、卵巣から腹腔に移動した腺癌から選択される卵巣がんを治療する。
【０３３０】
本明細書で提供される方法は、改質されたＤＴ融合タンパク質の投与、または改質されたＤＴ融合タンパク質の投与と１つ以上の抗がん治療の組み合わせによって、卵巣がん患者に有益な効果を与えるだろう。
【０３３１】
（子宮頸がん）
別の態様では、この方法は、子宮頸がん、好ましくは頸部上皮の腺癌を治療する。このがんには、主に扁平上皮がんおよび腺がんの２種類が存在する。扁平上皮がんは、すべての子宮頸がんの約８０〜９０％を構成し、子宮頸膣部（膣に最も近い部分）および子宮頸内膜（子宮に最も近い部分）の接合部で進行する。腺がんは、子宮頸内膜の粘膜を産生する腺細胞で進行する。子宮頸がんには、これら両方の特徴を有するものもあり、腺扁平上皮がんまたは混合がんと呼ばれる。
【０３３２】
本明細書で提供される方法は、改質されたＤＴ融合タンパク質の投与、または改質されたＤＴ融合タンパク質の投与と１つ以上の抗がん治療の組み合わせによって、子宮頸がん患者に有益な効果を与えるだろう。
【０３３３】
（前立腺がん）
ある他の態様では、本明細書で提供されるのは、前立腺がん、好ましくは、腺癌、または骨に移動した腺癌から選択される前立腺がんを治療する方法である。前立腺がんは、尿道の第一部分を取り囲む、男性の前立腺臓器で進行する。前立腺は、数種類の細胞型を含むが、腫瘍の９９％は、精液の生成を担う腺細胞で進行する腺癌である。
【０３３４】
前立腺がんの病期判断のために一般的に用いられる２つのスキームが存在する。最も一般的なのはＴＮＭシステムであり、腫瘍の大きさ、関与するリンパ節の程度、任意の転移（遠隔への広がり）を評価する。多くのがんと同様に、これらは、多くは４ステージ（Ｉ〜ＩＶ）に分けられることが多い。あまり一般的には用いられないが、別のスキームは、Ｗｈｉｔｍｏｒｅ−Ｊｅｗｅｔｔ病期判断である。
【０３３５】
簡単にいうと、ステージＩの疾患は、前立腺組織が他の理由（例えば、良性の前立腺肥大）で除去されたときに、サンプルの小さい部分から偶発的に見つかる癌であり、細胞は、正常な細胞に非常に似ており、試験者の指で触っても腺は正常に感じる。ステージＩＩでは、前立腺の多くが関与しており、腺の中に腫れを感じることができる。ステージＩＩＩでは、腫瘍が前立腺被膜を通って広がっており、腺の表面で腫れを感じることができる。ステージＩＶの疾患では、腫瘍が周囲の構造に浸潤しているか、またはリンパ節または他の臓器に広がっている。グレード判断は、生検からの細胞内容物および組織の構造に基づき（Ｇｌｅａｓｏｎ）、破壊の可能性および最終的な疾患の予後の推定を与える。
【０３３６】
本明細書で提供される方法は、改質されたＤＴ融合タンパク質の投与、または改質されたＤＴ融合タンパク質の投与と１つ以上の抗がん治療の組み合わせによって、前立腺がん患者に有益な効果を与えるだろう。
【０３３７】
（膵がん）
別の態様では、本明細書で提供されるのは、膵がん、好ましくは、膵管組織での上皮性癌および膵管での腺癌から選択される膵がんを治療する方法である。膵がんの最も一般的な種類は、腺癌であり、膵管の内側に発生する。
【０３３８】
本明細書で提供される方法は、改質されたＤＴ融合タンパク質の投与、または改質されたＤＴ融合タンパク質の投与と１つ以上の抗がん治療の組み合わせによって、膵がん患者に有益な効果を与えるだろう。
【０３３９】
（膀胱がん）
別の態様では、本明細書で提供されるのは、膀胱がん、好ましくは膀胱での移行性上皮癌を治療する方法である。膀胱がんは、尿路上皮癌（移行性上皮癌）または膀胱の内側の尿路上皮細胞での腫瘍である。膀胱がんの残りの症例は、扁平上皮がん、腺癌および小細胞がんである。尿路上皮がんのいくつかのサブタイプは、非浸潤性であるか、または浸潤性であるか、乳頭状であるか、または平らであるかに依存して存在する。非浸潤性の腫瘍は、膀胱の最内側層である尿路上皮にあり、一方、浸潤性の腫瘍は、尿路上皮から、膀胱の主要な筋肉壁のもっと深い層へと広がる。浸潤性の乳頭状尿路上皮癌は、細い指状の突起部であり、膀胱の空洞部中心へとぶら下がり、さらに、膀胱の壁に外側方向に成長する。非浸潤性の乳頭状尿路上皮腫瘍は、膀胱の中央部に向かって成長する。非浸潤性の平らな尿路上皮腫瘍（本来の場所にとどまる平坦な癌とも呼ばれる）は、膀胱内側の空洞部分に最も近い細胞層に限局され、浸潤性の平らな尿路上皮癌は、膀胱のもっと深い層、特に、筋肉層に浸潤する。
【０３４０】
本明細書で提供される方法は、改質されたＤＴ融合タンパク質の投与、または改質されたＤＴ融合タンパク質の投与と１つ以上の抗がん治療の組み合わせによって、膀胱がん患者に有益な効果を与えるだろう。
【０３４１】
（肺がん）
別の態様では、本明細書で提供されるのは、肺がんを治療するための方法である。最も一般的な種類の肺がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）であり、肺がんの約８０〜８５％を占め、扁平上皮がん、腺がん、大細胞未分化がんに分けられる。小細胞肺がんは、肺がんの１５〜２０％を占める。
【０３４２】
肺がんの病期分類は、元々の原発箇所からの癌の広がり度の評価である。癌の広がり度は、予後および肺がんの治療可能性に影響を与える重要な因子である。非小細胞肺癌は、ＩＡ（「１Ａ」；予後が最良）からＩＶ（「４」」；予後が最悪）までに病期分類される。小細胞肺癌は、胸部の半分に限局し、１回の放射線治療場の範囲内である場合には、限局型に分類される。それ以外は、進展型である。
【０３４３】
肺がんは、ＥＵＳ（超音波内視鏡）またはＴＮＭを用いて病期分類されてもよい。非小細胞肺癌患者の評価の一部分の病期分類。これらの患者は、予後および治療を考慮するプロセスの一部として、病期分類を受ける。ＡＪＣＣは、ＴＮＭ病期分類の後、さらにグループ分けすることを推奨している。
【０３４４】
原発性腫瘍（Ｔ）：ＴＸ：原発性腫瘍を評価することができない、または唾液または気管支肺胞洗浄液の中に悪性の細胞が存在するが、画像診断および気管支鏡法ではみられない；Ｔｉｓ：上皮内がん。Ｔ０：原発性腫瘍の証拠なし。Ｔ１：肺または内臓胸膜によって囲まれた、最大寸法が３ｃｍ未満であり、気管支鏡法によって主気管支への浸潤がない腫瘍。Ｔ２：以下のいずれかの腫瘍。最大寸法が３ｃｍより大きい；主気管支へと延びている（が、気管分岐部から２ｃｍより遠い）、閉塞性肺炎（しかし、肺全体は関与していない）。Ｔ３：以下のいずれかの腫瘍。胸壁、横隔膜、縦隔胸膜または、壁側心膜への浸潤；気管分岐部から２ｃｍ以内の主気管支まで延びているが、気管分岐部は関与していない；肺全体の閉塞性肺炎。Ｔ４：以下のいずれかの腫瘍。隔膜、心臓、大血管、気管、食道、脊椎または気管分岐部の浸潤；同一肺葉内に分離した腫瘍結節；および悪性胸水。リンパ節（Ｎ）：ＮＸ：リンパ節を評価することができない；Ｎ０：リンパ節は関与していない；Ｎ１：同側の気管支周囲リンパ節または同側の肺門リンパ節への転移；Ｎ２：同側の縦隔または気管分岐下リンパ節への転移；およびＮ３：同側の鎖骨上リンパ節；同側の三角筋リンパ節；および反対側のリンパ節のいずれかへの転移。遠隔転移（Ｍ）：ＭＸ：遠隔転移を評価することができない；Ｍ０：遠隔転移なし；およびＭ１：遠隔転移が存在する。
【０３４５】
本明細書で提供される方法は、改質されたＤＴ融合タンパク質の投与、または改質されたＤＴ融合タンパク質の投与と１つ以上の抗がん治療の組み合わせによって、肺がん患者に有益な効果を与えるだろう。
【０３４６】
（皮膚がん）
別の態様では、本明細書で提供されるのは、皮膚がんを治療するための方法である。皮膚からはじまるがんは数種類存在する。最も一般的な種類は、基底細胞がんおよび扁平上皮がんであり、これらは、黒色腫ではない皮膚がんである。紫外線角化症は、扁平上皮がんへと進行することがある皮膚の状態である。黒色腫ではない皮膚がんは、身体の他の部分にはほとんど広がらない。黒色腫は、皮膚がんの中で最もまれながんであり、周囲の組織に浸潤し、身体の他の部分に広がる可能性が高い。
【０３４７】
本明細書で提供される方法は、改質されたＤＴ融合タンパク質の投与、または改質されたＤＴ融合タンパク質の投与と１つ以上の抗がん治療の組み合わせによって、皮膚がん患者に有益な効果を与えるだろう。
【０３４８】
（目のがん、網膜芽腫）
別の態様では、本明細書で提供されるのは、目の網膜芽腫を治療するための方法である。網膜芽腫は、網膜の悪性腫瘍である。網膜芽腫は、あらゆる年齢で起こり得るが、最も多くは、低年齢児、通常は、５歳になる前に起こる。この腫瘍は、片目のみに存在する場合もあり、両目に存在する場合もある。網膜芽腫は、通常は、目に限局され、周囲の組織または身体の他の部分に広がらない。
【０３４９】
本明細書で提供される方法は、改質されたＤＴ融合タンパク質の投与、または改質されたＤＴ融合タンパク質の投与と１つ以上の抗がん治療の組み合わせによって、目の網膜芽腫患者に有益な効果を与えるだろう。
【０３５０】
（目のがん、眼内黒色腫）
別の態様では、本明細書で提供されるのは、眼内（目の）黒色腫を治療する方法である。眼内黒色腫は、まれながんであり、がん細胞がぶどう膜と呼ばれる目の一部にみられる疾患である。ぶどう膜は、虹彩、毛様体、脈絡膜を含む。眼内黒色腫は、最も多くは、中年世代のヒトに起こる。
【０３５１】
本明細書で提供される方法は、改質されたＤＴ融合タンパク質の投与、または改質されたＤＴ融合タンパク質の投与と１つ以上の抗がん治療の組み合わせによって、眼内黒色腫患者に有益な効果を与えるだろう。
【０３５２】
（子宮内膜がん）
別の態様では、本明細書で提供されるのは、子宮内膜がんを治療するための方法である。子宮内膜がんは、子宮の内壁である子宮内膜から始まるがんである。子宮および子宮内膜のがんのいくつかの例としては、限定されないが、腺がん、腺類がん、腺扁平上皮がん、漿液性乳頭状腺がん、明細胞腺がん、子宮肉腫、間質肉腫、悪性中胚葉性混合腫瘍、平滑筋肉腫が挙げられる。
【０３５３】
本明細書で提供される方法は、改質されたＤＴ融合タンパク質の投与、または改質されたＤＴ融合タンパク質の投与と１つ以上の抗がん治療の組み合わせによって、子宮内膜がん患者に有益な効果を与えるだろう。
【０３５４】
（肝がん）
別の態様では、本明細書で提供されるのは、肝がん（肝臓から始まるがん）を治療するための方法である。原発性肝がんは、成人でも子供でも起こり得る。
【０３５５】
本明細書で提供される方法は、改質されたＤＴ融合タンパク質の投与、または改質されたＤＴ融合タンパク質の投与と１つ以上の抗がん治療の組み合わせによって、肝がん患者に有益な効果を与えるだろう。
【０３５６】
（腎がん）
別の態様では、本明細書で提供されるのは、腎がんを治療するための方法である。腎がん（腎細胞がんまたは腎腺癌とも呼ばれる）は、悪性細胞が腎臓の細管の内壁に見出される疾患である。
【０３５７】
本明細書で提供される方法は、改質されたＤＴ融合タンパク質の投与、または改質されたＤＴ融合タンパク質の投与と１つ以上の抗がん治療の組み合わせによって、腎がん患者に有益な効果を与えるだろう。
【０３５８】
（甲状腺がん）
別の態様では、本明細書で提供されるのは、甲状腺がんを治療するための方法である。甲状腺がんは、がん（悪性）細胞が、甲状腺組織中にみられる疾患である。甲状腺がんの主な４種類は、乳頭がん、濾胞がん、髄様がん、未分化がんである。
【０３５９】
本明細書で提供される方法は、改質されたＤＴ融合タンパク質の投与、または改質されたＤＴ融合タンパク質の投与と１つ以上の抗がん治療の組み合わせによって、甲状腺がん患者に有益な効果を与えるだろう。
【０３６０】
（ＡＩＤＳに関連するがん）
本明細書で提供されるのは、限定されないが、ＡＩＤＳ関連リンパ腫およびカポジ肉腫を含む、ＡＩＤＳに関連するがんを治療するための方法である。本明細書で提供される方法は、改質されたＤＴ融合タンパク質の投与、または改質されたＤＴ融合タンパク質の投与と１つ以上の抗がん治療の組み合わせによって、ＡＩＤＳに関連するがんに有益な効果を与えるだろう。
【０３６１】
（ＡＩＤＳ関連リンパ腫）
別の態様では、本明細書で提供されるのは、ＡＩＤＳ関連リンパ腫を治療するための方法である。ＡＩＤＳ関連リンパ腫は、悪性細胞が、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を有する患者のリンパ系で生成する疾患である。ＡＩＤＳは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって引き起こされ、このウイルスは、体内の免疫系を攻撃し、弱らせる。次いで、免疫系が、身体を襲う感染および疾患と闘うことができなくなる。ＨＩＶ疾患を有するヒトは、感染、リンパ腫および他の種類のがんが進行する危険性が高まる。リンパ腫は、リンパ系の白血球に影響を与えるがんである。リンパ腫は、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫の２つの包括的な種類に分けられる。ホジキンリンパ腫も非ホジキンリンパ腫も、ＡＩＤＳ患者で起こる場合があるが、非ホジキンリンパ腫の方が一般的である。ＡＩＤＳを有するヒトが非ホジキンリンパ腫を有する場合、ＡＩＤＳ関連リンパ腫と呼ばれる。非ホジキンリンパ腫は、インドレント（ゆっくり成長する）またはアグレッシブ（すばやく成長する）であってもよい。ＡＩＤＳ関連リンパ腫は、通常は、アグレッシブである。３種類の主なＡＩＤＳ関連リンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞免疫分芽型リンパ腫および小型非切れ込み核細胞性リンパ腫である。
【０３６２】
ＡＩＤＳ関連リンパ腫の治療は、リンパ腫の治療と、ＡＩＤＳのための治療とを合わせる。ＡＩＤＳ患者は、免疫系が弱っており、治療によってさらに損傷を受ける場合がある。この理由のために、ＡＩＤＳ関連リンパ腫患者は、通常は、ＡＩＤＳを有していないリンパ腫患者よりも低用量の薬物で治療される。ＨＩＶの進行を遅らせるために、高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）を使用する。感染（重篤な場合もある）を予防し、治療するための医薬も使用される。
【０３６３】
（カポジ肉腫）
別の態様では、本明細書で提供されるのは、カポジ肉腫を治療するための方法である。カポジ肉腫は、口、鼻および肛門の内側の皮膚または粘膜の下にある組織にがん細胞がみられる疾患である。古典的カポジ肉腫は、通常は、ユダヤ人、イタリア人または地中海地方の高齢の男性で起こる。この種のカポジ肉腫は、ゆっくりと進行し、時に、１０〜１５年かけて進行する。カポジ肉腫は、免疫抑制剤を摂取しているヒトで起こる場合がある。後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を有する患者のカポジ肉腫は、流行性カポジ肉腫と呼ばれる。ＡＩＤＳを有するヒトのカポジ肉腫は、通常は、他の種類のカポジ肉腫よりも速く広がり、多くは、身体の多くの部分でみられる。
【０３６４】
本明細書で提供される方法は、改質されたＤＴ融合タンパク質の投与、または改質されたＤＴ融合タンパク質の投与と１つ以上の抗がん治療の組み合わせによって、カポジ肉腫に有益な効果を与えるだろう。
【０３６５】
（ウイルスによって誘発されるがん）
別の態様では、本明細書で提供されるのは、ウイルスによって誘発されるがんを治療するための方法である。いくつかの一般的なウイルスは、特定の悪性腫瘍の因果関係において、明確な原因であるか、またはおそらく原因である。これらのウイルスは、通常は、潜伏するか、または、ほとんどが継続的に感染する能力を持たない。腫瘍発生は、多量のウイルス量を反映する、感染した宿主でのウイルス活性化レベルの上昇、または易感染性の免疫制御とおそらく関係がある。主要なウイルス−悪性腫瘍系としては、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）と、肝細胞癌；ヒトリンパ好性ウイルス１（ＨＴＬＶ−１）と、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫；およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）と、子宮頸がんが挙げられる。一般的に、これらの悪性腫瘍は、人生の比較的初期に起こり、典型的には、中年以前にピークがある。
【０３６６】
（ウイルスによって誘発される肝細胞癌）
ＨＢＶおよびＨＣＶと、肝細胞癌または肝がんとの因果関係は、かなりの疫学事象によって確立されている。両方とも、肝臓での慢性的な複製を介し、細胞死およびその後の再生が生じることによって機能すると思われる。
【０３６７】
（ウイルスによって誘発される成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫）
ＨＴＬＶ−１と、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）の関係は、しっかりと確立されている。世界中で発見されている他の腫瘍ウイルスと異なり、ＨＴＬＶ−１は、地理的にきわめて制限されており、主に、日本南部、カリブ海、西アフリカおよび中央アフリカ、南太平洋上の島々でみられる。因果関係の証拠としては、キャリアにおけるほとんどすべてのＡＴＬの症例でのウイルスゲノムのモノクローナル統合（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）が挙げられる。ＨＴＬＶ−１に関連する悪性腫瘍の危険因子は、周産期感染、高いウイルス負荷、男性であることのようである。成人Ｔ細胞白血病は、血液および骨髄のがんである。
【０３６８】
（ウイルスによって誘発される子宮頸がん）
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）による頸部の感染は、子宮頸がんの最も一般的な原因である。しかし、ＨＰＶ感染したすべての女性が子宮頸がんになるわけではない。子宮頸がんは、通常は、時間をかけてゆっくりと進行する。頸部にがんが現れる前に、頸部の細胞は、異形成として知られる変化が進み、正常ではない細胞が頸部組織に現れ始める。その後、がん細胞が成長し始め、頸部の深部および周囲の領域へと広がる。
【０３６９】
本明細書で提供される方法は、改質されたＤＴ融合タンパク質の投与、または改質されたＤＴ融合タンパク質の投与と１つ以上の抗がん治療の組み合わせによって、ウイルスによって誘発されるがんに有益な効果を与えるだろう。
【０３７０】
（中枢神経系（ＣＮＳ）のがん）
脳腫瘍および脊髄腫瘍は、中枢神経系（ＣＮＳ）の主な要素である頭蓋骨または骨の脊柱の内側にみられる組織の異常な成長である。良性腫瘍は、非癌性であり、悪性腫瘍は、癌性である。ＣＮＳは、硬い骨で覆われた４分の１部分（すなわち、頭蓋骨および脊柱）に収容されており、異常な成長をすると、それが良性であるか悪性であるかにかかわらず、感受性の高い組織への圧力が加わり、機能不全を起こすことがある。脳または脊髄から発生する腫瘍は、原発性腫瘍と呼ばれる。ほとんどの原発性腫瘍は、ニューロンに囲まれ、支えられている細胞の中で、制御を失った状態によって引き起こされる。少数の個人では、原発性腫瘍は、特定の遺伝疾患（例えば、神経線維腫症、結節性硬化症）から、または放射線曝露から、または発がん性化学物質にさらされることから起こる場合がある。ほとんどの原発性腫瘍の原因は依然として謎である。
【０３７１】
脳腫瘍および脊柱腫瘍を診断する第１の試験は、神経学的試験である。特殊な画像診断技術（コンピュータ断層映像法および磁気共鳴画像診断法、陽電子放射断層撮像装置）も使用される。実験室での試験としては、ＥＥＧおよび脊椎穿刺が挙げられる。疑わしい腫瘍から組織サンプルを採取する生検、外科手術は、医師が腫瘍の種類を診断するのに役立つ。
【０３７２】
腫瘍は、腫瘍が発生したと思われる細胞の種類に従って分類される。ほとんどの一般的な成人の原発性脳腫瘍は、星状細胞と呼ばれる脳内の細胞から生じ、星状細胞は、血液脳関門を構成し、中枢神経系に栄養摂取を担う。これらの腫瘍は、グリオーマ（星状細胞腫、未分化星状細胞腫または膠芽腫）と呼ばれ、すべての原発性中枢神経系腫瘍の６５％を占める。腫瘍のいくつかは、限定されないが、乏突起膠腫、上衣腫、髄膜腫、リンパ球腫、神経鞘腫および髄芽腫である。
【０３７３】
（ＣＮＳの神経上皮腫瘍）
星状細胞腫、例えば、星状細胞腫；未分化（悪性）星状細胞腫、例えば、大脳半球、間脳、目、脳幹、小脳；膠芽腫；毛様細胞性星状細胞腫、例えば、大脳半球、間脳、目、脳幹、小脳；上衣下巨細胞性星状細胞腫；および多形黄色星状細胞腫。乏突起膠腫瘍、例えば、乏突起膠腫；および未分化（悪性）乏突起膠腫。上衣細胞腫瘍、例えば、上衣腫；未分化上衣腫；粘液乳頭状上衣腫；および上衣下腫。混合型グリオーマ、例えば、混合型オリゴデンドログリオーマ；未分化（悪性）オリゴデンドログリオーマ；およびその他（例えば、上衣星状細胞腫）。未特定の臓器の神経上皮腫瘍、例えば、極性海綿芽細胞腫；星状芽細胞腫；およびグリオマトーシス。脈絡叢の腫瘍、例えば、脈絡叢パピローマ；および脈絡叢癌（未分化脈絡叢パピローマ）。神経腫瘍および混合型神経−グリア腫瘍、例えば、神経節細胞腫；小脳異形成性神経節細胞腫（レルミット・ダクロス病）；神経節膠腫；未分化（悪性）神経節膠腫；線維形成性乳児神経節膠腫、例えば、線維形成性乳児星状細胞腫；中枢性神経細胞腫；胚芽異形成性神経上皮腫瘍；嗅神経芽細胞腫（鼻腔神経芽細胞腫）。松果体実質腫瘍、例えば、松果体細胞腫；松果体芽細胞腫；および混合型松果体細胞腫／松果体芽細胞腫。神経芽細胞または膠芽細胞の要素を伴う腫瘍（胚芽腫）、例えば、髄上皮腫；多分化能を有する原始神経外胚葉腫瘍、例えば、髄芽腫；大脳原始神経外胚葉性腫瘍；神経芽細胞腫；網膜芽腫；および上衣芽腫。
【０３７４】
（他のＣＮＳ新生物）
トルコ鞍部領域の腫瘍、例えば、下垂体腺腫；下垂体癌；および頭蓋咽頭腫。造血器腫瘍、例えば、原発性悪性リンパ腫；形質細胞腫；および顆粒球性肉腫。胚細胞腫瘍、例えば、胚細胞腫；胎生期癌；卵黄嚢腫瘍（内胚葉洞腫瘍）；絨毛腫；奇形腫；および混合型胚細胞腫瘍。髄膜の腫瘍、例えば、髄膜腫；非定型髄膜腫；および未分化（悪性）髄膜腫。髄膜の非髄膜性腫瘍、例えば、良性の間葉病変；悪性間葉病変；原発性色素細胞性病変；造血器新生物；および不特定の組織形成腫瘍、例えば、血管芽腫（毛細血管芽腫）。頭蓋神経および脊髄神経の腫瘍、例えば、神経鞘腫（神経線維腫症、神経鞘腫）；神経線維腫；悪性末梢神経鞘腫瘍（悪性神経鞘腫）、例えば、類上皮腫瘍、分岐型の間葉または上皮の分化、黒色性腫瘍。局所性腫瘍からの局所進展；例えば、傍神経節腫（ケモデクトーマ）；脊索腫；軟骨腫；軟骨肉腫；および癌腫。転移腫瘍、未分類腫瘍および嚢胞および腫瘍様病変、例えば、ラトケ嚢胞；類表皮；皮膚；第三脳室のコロイド嚢胞；腸性嚢胞；神経膠嚢胞；顆粒細胞腫瘍（分離腫、下垂体細胞腫）；視床下部神経過誤腫；鼻神経膠転位；および形質細胞肉芽腫。
【０３７５】
本明細書で提供される方法は、改質されたＤＴ融合タンパク質の投与、または改質されたＤＴ融合タンパク質の投与と１つ以上の抗がん治療の組み合わせによって、ＣＮＳ新生物に有益な効果を与えるだろう。
【０３７６】
（末梢神経系（ＰＮＳ）のがん）
末梢神経系は、脳および脊髄から分岐した神経からなる。これらの神経は、ＣＮＳと身体の部分との通信ネットワークを生成する。さらに、末梢神経系は、体性神経系と自律神経系に分けられる。体性神経系は、皮膚および筋肉に向かう神経からなり、意識のある活動に関与する。自律神経系は、ＣＮＳを内臓（例えば、心臓、胃および腸）に繋ぐ神経からなる。自律神経系は、無意識の活動を媒介する。
【０３７７】
聴神経腫は、８番目の脳神経または内耳神経とも呼ばれる平衡神経から生じる良性の線維成長である。これらの腫瘍は、非悪性であり、身体の他の部分に広がらず、転移しないことを意味する。これらの腫瘍の位置は、頭蓋骨内部の深い部分であり、脳幹の生命に関わる脳の中心に近い。腫瘍が拡大するにつれて、腫瘍は、生命に関わる機能を発揮必要がある周囲の構造を巻き込む。大部分の症例で、これらの腫瘍は、何年もかかってゆっくりと成長する。
【０３７８】
悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）は、良性軟組織腫瘍（例えば、神経線維腫および神経鞘腫）に対応する悪性のものである。悪性末梢神経鞘腫瘍は、深い部分の軟組織で最も一般的であり、通常は、神経幹に非常に近い部分である。最も一般的な部位としては、坐骨神経、腕神経叢および仙骨神経叢である。最も一般的な症状は、疼痛であり、通常は生検を促す。まれに浸潤性型の致死性の眼窩新生物があり、通常は、成人において、三叉神経の感覚枝から生じる。悪性ＰＮＳ腫瘍は、神経に沿って広がり、脳を巻き込み、ほとんどの患者は、臨床診断から５年以内に死亡する。ＭＰＮＳＴは、類上皮、間葉または腺の特徴を有する３つの主要なカテゴリーに分類されてもよい。ＭＰＮＳＴの一部としては、限定されないが、軟骨分化を伴う皮下悪性類上皮神経鞘腫、腺悪性神経鞘腫、神経周膜の分化を伴う悪性末梢神経鞘腫瘍、棒状の特徴を有する皮膚類上皮悪性神経鞘腫瘍、表面類上皮ＭＰＮＳＴ、トライトン腫瘍（桿状分芽型分化を伴うＭＰＮＳＴ）、桿状分芽型分化を伴う神経鞘腫が挙げられる。まれなＭＰＮＳＴ症例は、多発性肉腫性組織型、特に、骨肉腫、軟骨肉腫および血管肉腫を含む。これらは、軟組織の悪性間葉腫と区別できないことがある。
【０３７９】
他の種類のＰＮＳがんとしては、限定されないが、悪性線維性細胞腫、悪性線維性組織球腫、悪性髄膜腫、悪性中皮腫および悪性混合型ミュラー腫瘍が挙げられる。
【０３８０】
本明細書で提供される方法は、改質されたＤＴ融合タンパク質の投与、または改質されたＤＴ融合タンパク質の投与と１つ以上の抗がん治療の組み合わせによって、ＰＮＳがんに有益な効果を与えるだろう。
【０３８１】
（口腔および咽頭のがん）
中枢神経系（ＣＮＳ）がん患者の管理は、依然として手強い任務である。下咽頭がん、喉頭がん、鼻咽頭がん、咽頭がんのような癌を、本明細書に記載される化合物を用いて治療してもよい。
【０３８２】
本明細書で提供される方法は、改質されたＤＴ融合タンパク質の投与、または改質されたＤＴ融合タンパク質の投与と１つ以上の抗がん治療の組み合わせによって、口腔および咽頭のがんに有益な効果を与えるだろう。
【０３８３】
（胃がん）
胃がんは、胃の内壁の細胞変化の結果である。胃がんには、主に、リンパ腫、消化管間質腫瘍、カルチノイド腫瘍の３種類がある。リンパ腫は、免疫系組織のがんであり、胃壁で見つかることがある。消化管間質腫瘍は、胃壁の組織から進行する。カルチノイド腫瘍は、胃のホルモン産生細胞の腫瘍である。胃がんの原因は、まだ議論が続いている。遺伝と環境（食事、喫煙など）の組み合わせが、ある役割を果たすと皆が考えている。
【０３８４】
本明細書で提供される方法は、改質されたＤＴ融合タンパク質の投与、または改質されたＤＴ融合タンパク質の投与と１つ以上の抗がん治療の組み合わせによって、胃がんに有益な効果を与えるだろう。
【０３８５】
（精巣がん）
精巣がんは、典型的には、若い男性の片方の精巣または両方の精巣で進行するがんである。睾丸のがんは、生殖細胞として知られる特定の細胞で進行する。男性で起こる２種類の主な胚細胞腫瘍（ＧＣＴ）は、セミノーマ（６０％）および非セミノーマ（４０％）である。腫瘍は、睾丸の支持組織およびホルモン産生組織（すなわちストロマ）でも生じることがある。このような腫瘍は、性腺間質腫瘍として知られる。主に、ライディッヒ細胞腫瘍およびセルトリ細胞腫瘍の２種類がある。二次性精巣腫瘍は、別の臓器から始まり、睾丸に広がる腫瘍である。リンパ腫は、最も一般的な二次性精巣がんである。
【０３８６】
本明細書で提供される方法は、改質されたＤＴ融合タンパク質の投与、または改質されたＤＴ融合タンパク質の投与と１つ以上の抗がん治療の組み合わせによって、精巣がんに有益な効果を与えるだろう。
【０３８７】
（胸腺がん）
胸腺は、胸の上部／前部に位置する小さな臓器であり、喉元から心臓の前部まで延びている。胸腺は、主に、胸腺上皮細胞とリンパ球の２種類の細胞を含む。胸腺腫および胸腺癌は、胸腺上皮細胞に由来する場合がある。リンパ球は胸腺のリンパ球であるかリンパ節のリンパ球であるかにかかわらず、悪性となり、ホジキン病および非ホジキンリンパ腫と呼ばれるがんへと進行することがある。胸腺は、Ｋｕｌｃｈｉｔｓｋｙ細胞、つまり、通常は特定のホルモンを放出する神経内分泌細胞と呼ばれる、別のあまり一般的ではない種類の細胞も含む。これらの細胞からがんが生じることがあり、このがんは、カルチノイドまたはカルチノイド腫瘍と呼ばれ、同じ種類のホルモンを放出することが多く、身体の他の場所の神経内分泌細胞から生じる他の腫瘍と似ている。
【０３８８】
本明細書で提供される方法は、改質されたＤＴ融合タンパク質の投与、または改質されたＤＴ融合タンパク質の投与と１つ以上の抗がん治療の組み合わせによって、胸腺がんに有益な効果を与えるだろう。
【０３８９】
（結腸がんおよび結腸直腸がん）
結腸直腸がんは、結腸がんまたは大腸がんとも呼ばれ、結腸、直腸および虫垂での癌性の成長を含む。１年に世界中で６５５，０００人が亡くなっており、がんの中で３番目に一般的であり、西欧諸国ではがんに関連する死亡の２番目の主因である。多くの結腸直腸がんは、結腸の腺腫性ポリープから生じると考えられる。これらのマッシュルーム状の成長は、通常は良性であるが、時間をかけてがんに進行する場合がある。
【０３９０】
別の実施形態では、Ｄｕｋｅｓ分類を使用し、結腸直腸がんをステージＡ〜Ｄに基づいて分類してもよい。ステージＡは、粘膜に限局している結腸直腸がんを指す（すなわち、腸壁への浸潤がない）。ステージＢ１は、筋固有層に延びているが、筋固有層を通過してはいないことを指す（すなわち、リンパ節には浸潤していない）。一方、ステージＢ２のがんは、筋固有層を通過しているが、現時点で筋固有層を通過してはいない（すなわち、リンパ節には浸潤していない）。ステージＣ１は、筋固有層に延びているが、筋固有層を通過してはいないがんを指す（すなわち、リンパ節を含んでいる）。一方、ステージＣ２は、筋固有層に延び、筋固有層を通過しているがんを指す（すなわち、リンパ節を含んでいる）。ステージＤは、遠隔転移が広がっていることを指す。ＴＮＭシステムを使用し、当該技術分野で知られている従来の手段に従って、結腸直腸癌の病期判断をしてもよい。
【０３９１】
本明細書で提供される方法は、改質されたＤＴ融合タンパク質の投与、または改質されたＤＴ融合タンパク質の投与と１つ以上の抗がん治療の組み合わせによって、結腸直腸がんに有益な効果を与えるだろう。
【０３９２】
（急性移植片対宿主疾患）
急性移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）は、ＩＬ−２のための高アフィニティ受容体を発現する活性化されたＴ細胞によって部分的に媒介される。この疾患（ＧＶＨＤ）の急性型または劇症型は、通常は、移植後の最初の１００日の間に観察され、関連する罹患率および死亡率のために、移植の大きな問題である。
【０３９３】
古典的に、急性移植片対宿主疾患は、肝臓、皮膚、粘膜、胃腸管に対する選択的な損傷を特徴とする。もっと最近の研究は、他の移植片対宿主疾患の標的臓器が、免疫系（造血系、例えば、骨髄および胸腺）自体および特発性肺炎の形態の肺を含むことを示す。
【０３９４】
胃腸管の急性ＧＶＨＤは、重篤な腸の炎症、粘膜の痂皮腐肉形成、重度の下痢、腹痛、吐き気、嘔吐を引き起こす場合がある。皮膚ＧＶＨＤは、びまん性斑点状丘疹、時には、レース状のびまん性斑点状丘疹を引き起こす。
【０３９５】
急性ＧＶＨＤは、以下のように病期判断される。それぞれの臓器について、個々に低いグレードの１から高いグレードの４までを含む全体的なグレード（皮膚−肝臓−消化管）。グレードＩＶのＧＶＨＤ患者は、通常は、予後が悪い。ＧＶＨＤが重度であり、制御した状態で与られるステロイドおよびさらなる薬剤を含む強い免疫抑制による制御が必要な場合、患者は、重度の状態に進行する場合がある。
【０３９６】
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される改質されたＤＴ融合タンパク質を投与することによる、ＧＶＨＤを有する被検者を治療する方法である。ほんの一例として、ステロイド耐性のＧＶＨＤを患う被検者に、４．５μｇ／ｋｇを１〜５日目に１日１回、次いで、試験８日目、１５日目、２２日目、２９日目に週に１回の投薬計画で投与してもよい。これに代えて、被検者に、同じ計画で９μｇ／ｋｇの投薬計画で投与してもよい。３６日目および１００日目に応答を評価してもよい。例えば、腸の炎症、粘膜の痂皮形成、重篤な下痢、腹痛、吐き気、嘔吐および／または斑点状丘疹のような１つ以上の症状について、被検者を評価してもよい。治療は、治療をしない場合と比較して、症状の進行の停止または向上を含む。
【０３９７】
（乾癬）
乾癬は、Ｔ細胞が、皮膚の抗原提示細胞によって慢性的に刺激される、免疫によって媒介される皮膚疾患である。乾癬は、断続的な治療を必要とする慢性の再発する疾患である。乾癬は、皮膚および関節に影響を与える非伝染性の障害である。乾癬によって生じるうろこ状の紅斑（乾癬性局面と呼ばれる）は、炎症および過剰な皮膚産生の領域である。皮膚は、これらの領域に迅速に蓄積し、銀白色の外観になる。局面は、肘および膝の皮膚に頻繁に起こるが、頭皮および性器を含む領域が影響を受けることがある。この障害は、小さな局在化した局面から、体全体を覆う状態まで、重篤度がさまざまな慢性の再発する状態である。指の爪および足の爪が、頻繁に冒され（乾癬性爪形成異常）、単独所見としてみとめることができる。乾癬は、関節の炎症を引き起こすこともあり、これは、乾癬性関節炎として知られている。
【０３９８】
乾癬の症状は、種々の形態で表現することができる。局面乾癬（尋常性乾癬）は、乾癬の最も一般的な形態である。乾癬を有するヒトの８０〜９０％が罹患している。局面乾癬は、典型的には、銀白色のうろこ状の皮膚で覆われた炎症を起こした皮膚の領域の増加として現れる。これらの領域は、局面と呼ばれる。
【０３９９】
屈曲部乾癬（反転型乾癬）は、皮膚の平滑な炎症を起こした紅斑として現れる。皮膚の折り畳み部分、特に、性器の周囲（太腿から鼠径部まで）、脇の下、過体重の腹部の下（パンヌス）、乳房の下（炎症性の折り畳み）に生じる。摩擦および汗によって悪化し、真菌感染しやすい。
【０４００】
滴状乾癬は、多数の小さな丸い斑点を特徴とする（識別診断−バラ色粃糖疹は、卵型の病変）。これらの多数の乾癬の斑点は、身体の大きな領域（例えば、体幹、脚および頭皮）に現れる。滴状乾癬は、連鎖状球菌の喉感染と関係がある。
【０４０１】
膿疱性乾癬は、非感染性の膿（膿疱）で満たされた盛り上がった塊として現れる。膿疱の下および周囲の皮膚は、赤くなり、柔らかい。膿疱性乾癬は、一般的に、手および脚に局在化する場合があり（掌蹠膿疱症）、または、身体の任意の部分にランダムに発生する広がった紅斑を伴い全身性である場合もある。
【０４０２】
爪乾癬は、指および足の爪の外観にさまざまな変化を起こす。これらの変化としては、爪甲の下の変色、爪の陥凹、爪に沿って走る線、爪の下の皮膚の肥厚化、爪のゆるみ（爪剥離症）、爪の崩れが挙げられる。
【０４０３】
乾癬性関節炎は、関節および結合組織の炎症を含む。乾癬性関節炎は、任意の関節が影響を受けるが、最も一般的には、指と足の関節が冒される。これにより、指および足がソーセージ状に腫れ、これは、指炎として知られる。乾癬性関節炎は、臀部、膝および脊椎が冒される場合もある（脊椎炎）。
【０４０４】
乾癬性紅皮症は、広がった炎症と、身体のほとんどの表面にわたる皮膚の剥離を含む。ひどい痒み、腫れ、痛みを伴う場合がある。多くは、不安定な局面乾癬の悪化の結果であり、特に、全身治療の突然の停止後の悪化の結果である。この形態の乾癬は、極度の炎症および剥離が、温度を制御する身体の能力と、皮膚がバリア機能を行う能力を破壊するため、命に関わる場合がある。
【０４０５】
乾癬は、通常は、軽度（身体の約３％未満に罹患）、中度（身体の３〜１０％に罹患）または重度にグレード分けされる。乾癬の重症度を測定するためにいくつかのスケールが存在する。重篤度は、一般的に、罹患した身体表面積の割合；疾患の活動度（局面の赤みの程度、厚み、落屑化）；以前の治療に対する応答；およびそのヒトに対する疾患の影響といった因子に依存する。乾癬部位重症度指数（ＰＡＳＩ）は、乾癬についてもっと広く使用される測定ツールである。ＰＡＳＩを、病変の重症度および罹患した領域の評価と合わせ、０（疾患なし）から７２（最大の疾患）の範囲の１つのスコアにする。
【０４０６】
活性化されたＴ細胞を効果的に標的化し、乾癬を改善するために、本明細書に記載される改質されたＤＴ融合タンパク質を投与してもよい。ほんの一例として、重篤な乾癬を患う患者を、３種類の投薬量の本明細書に記載される改質されたＤＴ融合タンパク質（０．５、１．５または５μｇ／ｋｇ／日）のいずれかを用いて治療し、８週間にわたって週に３回摂取する。乾癬部位重症度指数（ＰＡＳＩ）および医師の総合評価（ＰＧＡ）によって測定されるような症状について患者を評価してもよい。別の実施形態では、乾癬を有する被検者に、さらに、皮膚に塗布される医療用軟膏またはクリームを投与してもよく、紫外線（ＵＶ）照射（光治療）および／または全身治療を行ってもよい。
【０４０７】
（他の使用）
さらに本明細書に想定されるのは、本明細書に記載される非免疫原性ＤＴ融合タンパク質を投与することによって維持療法を提供する方法である。
【０４０８】
ＲＮＡトランスフェクトされた樹状細胞（ＤＣ）を用いた免疫化は、転移がんを有する患者において強力なＴ細胞応答を刺激するのに有効な戦略である。ＩＬ−２受容体のα鎖（ＣＤ２５）を構成的に発現するＣＤ４＋Ｔ細胞は、他のＴ細胞の活性化および機能を抑制することによる制御能力において作用する。この生理学的役割は、正常な組織によって発現される抗原に対する免疫応答を制御することによって、宿主を自己免疫の開始から保護することである。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋制御Ｔ細胞（ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞）は、胸腺で分化し、胸腺から末梢へと移動すると考えられる。Ｔｒｅｇ細胞は、複数の抑制態様によって、後天性の免疫および先天性の免疫の両方を制御することができる。Ｔｒｅｇ細胞は、自己免疫性疾患、腫瘍および臓器移植の免疫病原性において中心的な役割を果たす。腫瘍抗原が、主に自己抗原であるため、Ｔ制御細胞（Ｔｒｅｇ）は、腫瘍が存在する宿主が、効果的な抗腫瘍免疫応答を開始するのを妨げてしまう場合がある。以前の研究は、進行したがん患者において、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの数の増加を見出すことができ、Ｔｒｅｇの数が多いことが、生存率の低下と関係があることを示している。さらに、一時的にＴ細胞が枯渇すると、黒色腫転移が退縮することが観察されている。腫瘍の成長を制御する際のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの重要な役割は、抗−ＣＤ２５抗体を用いたＴｒｅｇの枯渇によって、マウスにおける効果的な抗腫瘍免疫を呼び起こすことができることを示すことによって、さらに強調された。さらに、抗−ＣＤ２５治療は、ＧＭ−ＣＳＦを分泌するＢ１６腫瘍細胞の治療効能を高め、腫瘍を有する動物の生存期間を延ばした。累積的に、これらの実験データは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの優先的な枯渇を導く薬剤（例えば、ＩＬ−２受容体のＣＤ２５サブユニットを発現する細胞を標的とする化合物）の投与によって、がん治療の効能を高めることができることを示唆する。
【０４０９】
転移腎細胞がん（ＲＣＣ）患者において、Ｔｒｅｇを発現するＣ２５を脱離するための組み換えＩＬ−２ジフテリア毒素コンジュゲートＤＡＢ３８９ＩＬ−２（デニロイキンジフチトクスおよびＯＮＴＡＫ（登録商標）としても知られる）。ＤＡＢ３８９ＩＬ−２の細胞毒性の作用は、高アフィニティＩＬ−２受容体に結合し、その後に内部に移行し、タンパク質合成を酵素によって阻害し、最終的に、細胞死をもたらす結果として生じる。
【０４１０】
ＤＡＢ３８９ＩＬ−２は、中程度から低度のＣＤ２５を発現しつつ、他のＰＢＭＣまたはＣＤ４＋Ｔ細胞に対する明らかなバイスタンダー毒性がなく、用量依存的な様式でヒトＰＢＭＣからＴｒｅｇを選択的に脱離することが示された。Ｔ細胞プライミング段階の前にＤＡＢ３８９ＩＬ−２を使用し、その最中は省かれるとき、Ｔｒｅｇの枯渇によって、
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞の増殖応答および細胞毒性応答の刺激が高まった。ＲＣＣ患者でのＤＡＢ３８９ＩＬ−２を用いたＴｒｅｇの枯渇、その後、腫瘍ＲＮＡをトランスフェクトしたＤＣを用いて免疫化すると、腫瘍ＲＮＡをトランスフェクトしたＤＣのみを投与した場合と比較して、腫瘍特異的なＴ細胞の刺激が高まった。ＤＡＢ３８９ＩＬ−２を単回投与すると、明らかなバイスタンダー毒性がなく、ＣＤ２５を発現する他の細胞の機能に影響を与えることなく、ＣＤ４＋ＣＤ２５高Ｔｒｅｇをなくすことができる。ＤＡＢ３８９ＩＬ−２は、ＲＣＣ患者の末梢血中に存在するＴｒｅｇの数を顕著に減らし、末梢血から誘導されるＦｏｘＰ３転写物の量を減らし、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴｒｅｇが媒介する免疫抑制活性を無効にした。さらに、ＤＡＢ３８９ＩＬ−２およびＤＣ免疫化を合わせて治療した患者において、ＤＣのみを摂取した被検者と比較して、顕著に高い頻度の腫瘍特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を測定することができた。さらに、組み合わせた治療の後、ＣＤ４＋Ｔ細胞の応答が向上する傾向があった。
【０４１１】
新生物細胞に対する同種免疫は、エフェクターＴ細胞と、制御Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞とのバランスに依存して変わる。エフェクターＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を直接的に抑制することによって、Ｔｒｅｇ細胞が、正常な細胞および新生物細胞に対して攻撃するのを防ぐ。組み換えインターロイキン２／ジフテリア毒素コンジュゲート（ＤＡＢ／ＩＬ２；Ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ  Ｄｉｆｔｉｔｏｘ；ＯＮＴＡＫ（登録商標））の使用は、Ｔｒｅｇ細胞を枯渇させ、ヒトにおける新生物腫瘍に対する耐性を破壊するための戦略として試験された。ＤＡＢ／ＩＬ２（１２μｇ／ｋｇ；４回の１日１回投与；２１日サイクル）を１６人の転移黒色腫患者に投与し、いくつかのＴ細胞サブセットの末梢血での濃度および腫瘍組織量に対する影響を測定する。
【０４１２】
ＤＡＢ／ＩＬ２は、Ｔｒｅｇ細胞と、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の合計とを一時的に枯渇させることが示された（２１日未満）。テトラマーＭＡＲＴ−１、チロシナーゼおよびｇｐ１００ペプチド／ＭＨＣコンジュゲートを用いたフローサイトメトリーによって決定されるように、Ｔ細胞の再増殖は、数人の患者における黒色腫抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞のｄｅ  ｎｏｖｏでの出現と一緒に起こった。１６人の患者が、ＤＡＢ／ＩＬ２を少なくとも１サイクル摂取し、ＣＴおよび／またはＰＥＴ画像診断によって測定されるように、これらの患者のうち５人が、転移黒色腫の退縮を経験した。１人の患者は、ほぼ完全な応答を経験し、ＭＡＲＴ−１特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞のｄｅ  ｎｏｖｏでの出現に合わせて、いくつかの肝転移および肺転移が退縮した。この患者には、手術による切除の後に、１個の転移腫瘍が残っており、免疫組織化学分析から、ＭＡＲＴ１＋黒色腫細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞に取り囲まれていることがわかった。がん患者におけるＴ細胞の一時的な枯渇は、同種免疫のホメオスタシス制御を破壊し、新生物細胞に対して特異性を有するエフェクターＴ細胞の増殖を可能にし得る。
【０４１３】
天然で誘発される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫を失わせることは、単に受動的なプロセスではない。腫瘍は、能動的に、ＴＡＡに特異的な耐性の誘発によって、ＴＡＡに特異的な免疫の誘発を抑える。この耐性は、一部には、制御Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）によって媒介された。Ｂａｒｎｅｔｔらは、デニロイキンジフチトクス（ＯＮＴＡＫ（登録商標））を用いてヒトのがん（卵巣がんを含む）でＴｒｅｇが枯渇すると、免疫が向上するという証拠を提示した。
【０４１４】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋制御Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞は、有効な抗腫瘍免疫をなくすことに関与している。デニロイキンジフチトクス（ＤＡＢ（３８９）ＩＬ−２）は、Ｔｒｅｇ細胞を標的とする手段を与える。正常なＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓、末梢血および骨髄の中のＴｒｅｇ細胞は、デニロイキンジフチトクスを腹腔内に１回投与した後、さまざまに減少し、この減少は、２４時間以内に現れ、約１０日間続いた。他の薬剤で免疫化する１日前にデニロイキンジフチトクスを注射すると、免疫化のみによって誘発されるレベルよりも、抗原特異的なＴ細胞の応答が高まった。マウスモデルにおいて、異なる細胞コンパートメントにおけるＴｒｅｇ細胞に対するデニロイキンジフチトクスの異なる効果、デニロイキンジフチトクスと別の薬剤を合わせ、抗原特異的なＴ細胞の免疫応答を高めるという利点、生きたウイルスベクターに対する宿主免疫応答のデニロイキンジフチトクスによる阻害がないこと、抗原と組み合わせて使用するとき、デニロイキンジフチトクスの投薬計画の重要性。
【０４１５】
Ｔｒｅｇは、成長する腫瘍細胞に対する免疫応答を制御し、時には抑制さえする重要な部分であることが示された。Ｔｒｅｇの枯渇および／または脱離、Ｔｒｅｇ（ＰＣ６１）で見出されるＩＬ−２受容体に対して指向する特異的な抗体である低用量のシクロホスファミド（ＣＹ）の利用、デニロイキンジフチトクス（ＤＤ）の使用という３つの方法を比較した。ＤＤの利用によって、他のＴ細胞サブセットに対する並行した細胞致死性の影響はなく、５０％を超えるＴｒｅｇ細胞の低下が起こったが、Ｂ１６黒色腫に対する抗腫瘍免疫は向上しなかった。最後に、ＰＣ６１は、ＣＤ８（＋）Ｔ細胞の合計数を下げることなく、他の試薬より長く続くＴｒｅｇの中程度の低下を示した。
【０４１６】
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質を投与することによる、患者の黒色腫転移の退縮を誘発する方法である。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋制御Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞は、本明細書に記載される構築物を投与することによって枯渇するだろう。一実施形態では、ＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質を投与した後、抗がん剤を投与する。非限定的な一例では、抗がん剤の前、または後にＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質を投与する。
【０４１７】
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質を投与することによる、抗がん剤（例えば、ＲＮＡによってトランスフェクトされたＤＣ、抗−ＣＬＴＡ４抗体、ＭＩＳＩＩＲ  ｓｃＦｖｓなど）の活性を高める方法である。一実施形態では、ＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質を投与した後、抗がん剤を投与する。非限定的な一例では、抗がん剤の少なくとも４日前にＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質を投与する。
【０４１８】
さらに本明細書で提供されるのは、抗がん剤（例えば、ＲＮＡによってトランスフェクションされたＤＣ、抗−ＣＬＴＡ４抗体、ＭＩＳＩＩＲ  ｓｃＦｖなど）および本明細書に記載されるＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質を投与することによってＴｒｅｇを減らすか、またはなくすことによる、転移がんを治療する方法である。転移腫瘍としては、例えば、転移腎細胞がん、転移前立腺がん、転移卵巣がんおよび転移肺がんが挙げられる。一実施形態では、ＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質が投与され、その後、抗がん剤が投与される。ある非限定的な例では、抗がん剤の少なくとも４日前に、ＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質が投与される。
【０４１９】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、抗がん剤（例えば、ＲＮＡによってトランスフェクションされたＤＣ、抗−ＣＬＴＡ４抗体、ＭＩＳＩＩＲ  ｓｃＦｖなど）および本明細書に記載されるＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質を投与することによってＴｒｅｇを減らすか、またはなくすことによる、前立腺腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍または黒色腫を治療する方法である。一実施形態では、ＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質が投与され、その後、抗がん剤が投与される。ある非限定的な例では、抗がん剤の少なくとも４日前に、ＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質が投与される。
【０４２０】
例えば、ＬＤ５０（集合の５０％が死に至る投薬量）、ＬＣ５０（集合の５０％が死に至る濃度）、ＥＤ５０（集団の５０％において治療に有効な投薬量）およびＥＣ５０（集団の５０％に対して治療に有効な濃度）を決定するために、細胞培養物または実験動物の標準的な医薬手順によって、このような成分の毒性および治療効能を決定することができる。毒性がある投薬量と治療効果がある投薬量との比率は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比またはＬＣ５０／ＥＣ５０比で表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を使用してもよいが、非癌性細胞およびその他の健康な細胞へ損傷を与える可能性を最低限にし、そのため、副作用を減らすために、このような化合物が患部組織の部位を標的とする送達系を設計するように注意をはらうべきである。
【０４２１】
ヒトに使用するための投薬範囲を配合するときに、細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータを使用することができる。このような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどないか、まったくなく、ＥＤ５０またはＥＣ５０を含む血中濃度の範囲内にある。投薬量は、使用される投薬形態および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変動してもよい。本発明の方法で使用される化合物について、治療に有効な投薬量は、最初に、細胞培養アッセイから概算することができる。投薬量を、培地で決定され、実施例４で以下に示すように、動物モデルにおいてＩＣ５０（すなわち、症状の最大の半分の阻害を達成する、試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように配合してもよい。このような情報を使用し、ヒトにおける有用な投薬量をもっと正確に決定することができる。例えば、高速液体クロマトグラフィーによって、血漿中のレベルを測定してもよい。
【０４２２】
本出願の化合物および方法の実施形態は、説明することを意図しており、限定することを意図していない。当業者ならば、上の教示、具体的には、タンパク質毒素構築物においてＤＴ担毒体として使用する能力について、ネイティブ型に近い機能を維持しつつ、低下した免疫原性および／または低下したＨＵＶＥＣへの結合が得られ得る、Ｔ細胞エピトープ配列に対する記載した改質、記載したＶＬＳ配列およびＢ細胞エピトープ配列の周囲にあるＤＴ担毒体における改変に関してもよいという教示の観点で、改変および変更を行うことができる。
【０４２３】
当業者ならば、例えば、選択した細胞集合に対して他の新規分子の送達を含む、他の目的のために本明細書に記載される化合物および方法を使用することができることを想像することもできる。
【０４２４】
本発明は、免疫化の実施形態に使用するための組成物を想定する。１つ以上の（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔおよび／またはフランキング配列で改変することによって、ＶＬＳまたは他の毒素の影響を促進するという点で、ほとんど効果的ではないタンパク質組成物が、毒素に対する免疫応答を刺激するための抗原として有用であることが想定される。特定の実施形態では、１つ以上の改質された（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）、（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）Ｔおよび／またはフランキング配列を含むＤＴは、有用な抗原として想定される。好ましくは、組成物は、広範囲に透析され、望ましくない低分子量分子を除去し、および／または望ましいビヒクルへともっと簡単に配合するために凍結乾燥させる。他の実施形態では、免疫化のために、１つ以上の活性部位の残基を欠く毒素（すなわち、トキソイド）を使用することもできる。
【０４２５】
本出願の化合物および方法の実施形態を、免疫原性、ＶＬＳ、またはこれらの組み合わせの可能性をできる限り減らすのに望ましいような臨床設定または設定において、このような薬剤を送達するために所定量の毒素が使用される状況で使用してもよい。この設定で、触媒ドメインまたはその一部を置き換え、不活性にし、望ましい薬剤または分子と融合させてもよい。触媒ドメインの残りの部分と望ましい薬剤または分子との間に、酸感受性またはプロテアーゼ感受性の開裂部位を挿入することができる。
【０４２６】
本明細書に開示されているような改質された毒素に接続し得る薬剤または分子としては、限定されないが、選択的な送達を必要とするペプチドまたはタンパク質フラグメント、核酸、オリゴヌクレオチド、酸への感度が低いタンパク質、糖タンパク質、タンパク質または新規化学物質が挙げられる。
【０４２７】
従って、記載される範囲内の開示される特定の実施形態において、変更が行われてもよいことが理解されるべきである。
【０４２８】
（副作用）
本明細書に記載される毒素および細胞結合部分に対する改質によって、ＯＮＴＡＫ（登録商標）を投与した場合に現時点で観察される１つ以上の副作用が低下するだろう。現時点での薬物有害事象（ＡＤＥ）／毒性としては、毛細血管漏出症候群、脱水症状、低血圧、発熱、低アルブミン血症、皮膚障害、胸部痛、血管脆弱化、疲労、過敏症、心筋虚血、尿路感染症、血圧低下、関節硬直、筋肉痛、手根管症候群、意識消失、呼吸困難、剥脱性皮膚炎、紅斑、および全身発疹、過敏症のうち１つ以上が挙げられる。１つ以上の薬物有害事象（ＡＤＥ）／毒性の低下は、約１．５分の１、約２分の１、約３分の１、約４分の１、約５分の１、約６分の１、約７分の１、約８分の１、約９分の１、約１０分の１、約１５分の１、約２０分の１、約３０分の１、約４０分の１、約５０分の１、またはもっと大きくてもよい（またはこの間の任意の整数）。
【０４２９】
化合物単独で、または他の抗新生物化合物と組み合わせた疾患の治療は、抗新生物薬剤によって生じる副作用を軽減し得る医薬薬剤の投与を伴っていてもよい。本明細書で使用するのに適したこのような薬剤としては、限定されないが、鎮吐剤、抗粘膜炎剤、疼痛管理剤、感染制御剤、抗貧血症剤／抗血小板減少剤が挙げられる。本明細書で使用するのに適した鎮吐剤の例としては、限定されないが、５−ヒドロキシトリプタミン３受容体アンタゴニスト、メトクロプラミド、ステロイド、ロラゼパム、オンダンセトロン、カンナビノイド、これらの類似体および誘導体が挙げられる。本明細書で使用するのに適した抗粘膜炎剤の例としては、限定されないが、パリフェルミン（ケラチノサイト成長因子）、グルカゴン様ペプチド−２、テデュグルチド、Ｌ−グルタミン、アミフォスチン、線維芽細胞成長因子２０が挙げられる。本明細書で使用するのに適した疼痛管理剤の例としては、限定されないが、オピオイド、アヘン剤、非ステロイド抗炎症化合物が挙げられる。本明細書で使用するのに適した感染の制御に使用される薬剤の例としては、限定されないが、抗菌剤、例えば、アミノグリコシド、ペニシリン、セファロスポリン、テトラサイクリン、クリンダマイシン、リンコマイシン、マクロライド、バンコマイシン、カルバペネム、モノバクタム、フルオロキノロン、スルホンアミド、ニトロフラントイン、これらの類似体および誘導体が挙げられる。本明細書で使用するのに適した化学療法に関連する貧血症および血小板減少症を治療し得る薬剤の例としては、限定されないが、エリスロポエチンおよびトロンボポエチンが挙げられる。
【０４３０】
改質されたＤＴ毒素融合タンパク質および本明細書に記載される他の化合物と組み合わせて使用するのに適した他のいくつかの治療も利用可能である。例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １１ｔｈ  ｅｄ．Ｂｒｕｎｔｏｎ  ＬＬ、Ｌａｚｏ  ＪＳ、ａｎｄ  Ｐａｒｋｅｒ  ＫＬ、ｅｄ．ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００６を参照。
【０４３１】
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される疾患の治療のための医薬の製剤における、本明細書に記載される化合物の使用である。
【０４３２】
（ＸＩ．パッケージおよびキット）
なおさらなる実施形態では、本出願は、上述の化合物とともに使用するためのキットに関する。免疫原性、ＶＬＳの促進または毒性の影響、またはこれらの組み合わせの低下を示す毒素をキットで提供してもよい。このようなキットを使用し、毒素と、特異的な細胞結合リガンドとを合わせ、使用準備ができており、保存可能な容器中に、細胞上の特定の受容体（例えば、がん細胞のＩＬ−２受容体）を標的とする融合タンパク質を製造してもよい。従って、キットは、適切な容器手段の中に、免疫原性、ＶＬＳの促進または毒性の影響、またはこれらの組み合わせの低下を有する組成物を含むだろう。キットは、適切な容器手段の中に、改質されたＤＴまたはその融合タンパク質を含んでいてもよい。
【０４３３】
キットの容器手段としては、一般的に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジ、および／または他の容器手段が挙げられ、この中に、少なくとも１つのポリペプチドが入れられてもよく、および／または好ましくは、適切には小分けされている。キットは、商業的な販売のための厳重に閉じ込めた状態で、少なくとも１つの融合タンパク質、検出可能な部分、レポーター分子を含有する手段、および／または任意の他の試薬容器を含んでいてもよい。このような容器としては、注射および／または望ましいバイアルが保存される、吹き込み成形したプラスチック容器が挙げられるだろう。キットは、キット中の材料を使用するための印刷材料を含んでいてもよい。
【０４３４】
パッケージおよびキットは、さらに、緩衝化剤、防腐剤および／または安定化剤を医薬製剤に含んでいてもよい。キットのそれぞれの成分は、個々の容器内に入れられていてもよく、種々の容器すべてが１個のパッケージに入っていてもよい。本発明のキットは、冷温保存または室温保存のために設計されていてもよい。
【０４３５】
さらに、調製物は、キットの貯蔵寿命を長くするために安定化剤（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を含んでいてもよい。組成物が凍結乾燥される場合、キットは、凍結乾燥した調製物を再構築するための溶液の調製物をさらに含んでいてもよい。許容され得る再構築溶液は、当該技術分野でよく知られており、例えば、医薬的に許容され得るリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。
【０４３６】
さらに、本明細書で提供されるパッケージまたはキットは、さらに、本明細書で提供される他のいずれかの分子、例えば、例えば、１つ以上のレポーター分子および／または１つ以上の検出可能な部分／薬剤を含んでいてもよい。
【０４３７】
パッケージおよびキットは、さらに、アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、細胞毒性アッセイ、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性アッセイなどのための１つ以上の要素を含んでいてもよい。この用途で試験されるサンプルとしては、例えば、血液、血漿および組織片および分泌物、尿、リンパ液およびこれらの生成物が挙げられる。パッケージおよびキットは、さらに、サンプルを集めるための１つ以上の要素（例えば、シリンジ、カップ、スワブなど）を含んでいてもよい。
【０４３８】
パッケージおよびキットは、さらに、例えば、製品の記載、投与態様および／または治療の適応を特定するラベルを含んでいてもよい。本明細書で提供されるパッケージは、本明細書に記載される任意の組成物を含んでいてもよい。パッケージは、さらに、がんを治療するためのラベルを含んでいてもよい。
【０４３９】
「包装材料」という用語は、キットの要素を収容する物理的な構造を指す。包装材料は、要素を滅菌に維持してもよく、このような用途に一般的に使用される材料から作られていてもよい（例えば、紙、段ボール、ガラス、プラスチック、箔、アンプルなど）。ラベルまたは添付文書は、適切な書面での指示を含んでいてもよい。従って、キットは、さらに、本発明の任意の方法でキットの要素を使用するためのラベルまたは説明書を含んでいてもよい。キットは、本明細書に記載される方法において化合物を投与するための指示とともに、パックまたはディスペンサを含んでいてもよい。
【０４４０】
指示は、治療方法を含め、本明細書に記載されるいずれかの方法を実施するための指示を含んでいてもよい。指示は、さらに、満足のいく臨床エンドポイントまたは起こり得る任意の有害な症状の指標、またはヒトに使用するための米国食品医薬品局のような規制機関によって必要とされるさらなる情報を含んでいてもよい。
【０４４１】
指示は、キットに入っているか、またはキットに貼り付けられた、例えば、紙または厚紙の上に「印刷されたもの」であってもよく、またはキットまたは包装材料に貼り付けられたラベルであってもよく、またはキットの要素を含むバイアルまたはチューブに添付されたラベルであってもよい。指示は、さらに、コンピュータで読み取り可能な媒体に含まれていてもよい。例えば、ディスク（フロッピーディスクまたはハードディスク）、光学ＣＤ、例えば、ＣＤ−またはＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭ、磁気テープ、電子記憶媒体、例えば、ＲＡＭおよびＲＯＭ、ＩＣチップ、およびこれらの磁気／光学保存媒体のハイブリッドであってもよい。
【実施例】
【０４４２】
本出願は、本出願の例示的な実施形態として提供される以下の非限定的な実施例を参照することによって、もっと良く理解されるだろう。本発明の実施形態をもっと完全に説明するために、以下の実施例が提示されるが、いかなる様式にも本出願の広い範囲を限定するものと解釈すべきではない。本出願の特定の実施形態が本明細書に示され、記述されているが、このような実施形態は、単なる例として与えられることは明らかであろう。多くの変種、変化および置き換えが、本発明から逸脱することなく、当業者によって行われるだろう。本明細書に記載される方法を実施するときに、本明細書に記載される実施形態の種々の代替例を使用してもよいことが理解されるべきである。
【０４４３】
（実施例１）
（ＤＴ改変体およびＤＴ融合タンパク質の構築、発現および精製）
（ＤＴ融合タンパク質の構築）
Ｎ末端にメチオニン残基と、ネイティブＤＴのアミノ酸残基１〜３８６（配列番号２）（トランケーションされた担毒体では残基２〜３８７）を含むトランケーションされたＤＴ由来の担毒体が、ＤＴ３８７またはＤＴ３８７の残基１〜３８２として構築される。ＤＴ由来の担毒体は、Ｎ末端にメチオニン残基と、ネイティブＤＴのアミノ酸残基１〜３８６（配列番号２）（トランケーションされた担毒体では残基２〜３８７）と、ネイティブＤＴの残基４８４〜４８５とを含むことも可能であり、ＤＴ３８９として構築される。ＤＴ３８７およびＤＴ３８９は、残基７〜９（ＶＤＳ）、残基２９〜３１（ＶＤＳ）および残基２９０〜２９２（ＩＤＳ）に３つの（ｘ）Ｄ（ｙ）モチーフを含有する。ＤＴ３８２は、ＤＴ３８７またはＤＴ３８９の残基１〜３８２を含む。本明細書に記載されるような他のＣ末端トランケーションされたＤＴ構築物を、ＤＴ改変体の機能を試験するための本明細書で提供されるアッセイに使用することができる。ＤＴ３８９に対してなされる改質が、トランケーションされた構築物（例えば、ＤＴ３８２）においても行われ、機能が試験されてもよいことが理解されるだろう。実施例２０は、野生型ＤＴ３８２、ＤＴ３８２改変体およびヌル構築物ＤＴ３８２（Ｇ５３Ｅ）の例示的なアミノ酸配列を提供し、下線が引かれた配列は、ベクター／タグ配列であり、エンテロキナーゼ開裂部位は、イタリック体で強調されており、野生型配列からの変異は、太字で示されている。
【０４４４】
部位特異的変異導入を使用し、ＤＴ内の（ｘ）Ｄ（ｙ）モチーフを改変する。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ変異導入キットを使用し、変異を構築する。オリゴヌクレオチドプライマーは、ＶＬＳに関与している（ｘ）Ｄ（ｙ）モチーフ内のコードする残基を改変するように設計される。
【０４４５】
この変異体を、ヒトインターロイキン２（配列番号３または５８８）またはこれらの細胞結合部分をコードする配列に遺伝子的に融合したタンパク質融合毒素という観点で試験する。ＤＴ融合タンパク質が発現し、精製される。
【０４４６】
（ＤＴ改変体およびＤＴ融合タンパク質の発現および精製）
トランケーションおよび／または改質されたＤＴタンパク質、改質されたＤＴ変異体および改質されたＤＴ融合タンパク質をコードするプラスミド構築物で、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＭＳ  １７４（ＤＥ３）細胞を形質転換させる。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＭＳ  １７４は、プロテアーゼ欠失株であり、組み換えタンパク質の過剰発現を達成することができる。この組み換えタンパク質発現の誘発は、イソプロピルチオガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）をＥ．ｃｏｌｉ  ＨＭＳ  １７４に添加することによって得られる。インキュベーション後、細菌細胞を遠心分離処理によって集め、溶解し、Ｍｕｒｐｈｙ  ａｎｄ  ｖａｎｄｅｒＳｐｅｋ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１４５：８９〜９９  Ｈｕｍａｎａ  ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．（２０００）に記載されるような封入体調製から、組み換えタンパク質をさらに精製する。ＨＵＶＥＣに対する影響がＶＬＳ由来であり、内毒素の存在に起因するものではないことを確実にするために、タンパク質調製から内毒素を除去することが必要な場合がある。内毒素は、イオン交換樹脂に通すことによって、２５０ＥＵ／ｍｌ未満になるまで除去される。全長材料からの分解産物の分離も、イオン交換クロマトグラフィー中に起こる。イオン交換樹脂を超える別の最終的な精製の後、内毒素は、２５ＥＵ／ｍｌ未満まで減少し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＵＶＥＣ細胞結合の関数としてのＶＬＳについて、担毒体を試験した。担毒体ＤＴ３８７またはＤＴ３８９の分析は、上述のプロセスから得たサンプルが、本明細書に記載され、当該技術分野で既知の従来の技術を用いてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって解像される場合、クマシンブルー染色およびウェスタンブロットを用いて行うことができる。
【０４４７】
十分な発現を伴う安定な構築物が得られ、担毒体ＤＴ３８７およびＤＴ３８９のリボシルトランスフェラーゼ活性に影響を与えない変異を、その後、対応するＶＬＳ改質されたＤＴ−ＥＧＦおよびＶＬＳ改質されたＤＴ−ＩＬ−２タンパク質融合毒素において、標的とする細胞毒性について試験することができる（それぞれ、実施例５）。
【０４４８】
（実施例２）
（細胞透過性アッセイ）
ヒト血管内皮細胞をＥＧＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ、ウォーカーズビル、メリーランドから得られる）中で維持する。コンフルエントに至っていない初期継代細胞を等量の細胞数でプラスチック製カバースリップに接種する。内毒素を含まない精製された野生型ＤＴ担毒体および変異体を、化学コンジュゲーションによって蛍光タグＦ−１５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）で標識する。ＨＵＶＥＣを等量の標識された担毒体とともにインキュベートする。次いで、培地を吸引し、その後、細胞を洗浄し、固定し、分析の準備をする。異なる処理群から得たカバースリップ上の細胞の実験によって、蛍光担毒体によって標識された細胞の数を分析することができる。担毒体の上に標的リガンドは存在せず、その結果、ＨＵＶＥＣ相互作用のレベルは、ＨＵＶＥＣに対する担毒体のアフィニティのみに比例する。蛍光顕微鏡を用いて比較を行い、少なくとも１０の独立した視野、異なるカバースリップまたは異なるスライドから標識された細胞の数を比較する。特に、変異体構築物の場合に、細胞標識が容易に明らかではない場合には、ＤＡＰＩ染色を使用し、細胞の位置を特定する。４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）は、天然の二本鎖ＤＮＡと蛍光複合体を生成することが知られており、そのため、ＤＡＰＩは、種々の細胞化学的観察に有用なツールである。ＤＡＰＩがＤＮＡに結合すると、その蛍光は非常に強化される。従って、ＤＡＰＩは、細胞核を標識する方法として役立つ。対照的に、Ｆ−１５０ＤＴ担毒体で処理された細胞は、簡単に観察される。変異体ＤＴ担毒体構築物の定量を容易にするために、バックグラウンドシグナルのシグナル強度および変化も大きくなる。
【０４４９】
例えば、Ｂａｌｕｎａら（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ．、１８：３５５〜３６１、１９９６）およびＳｏｌｅｒ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、２０６：２２７〜２３４、１９９３）に記載される方法に従って、ＨＵＶＥＣ単層の形態に対するＤＴ改変体ＩＬ−２融合タンパク質の影響も評価することができる。ＤＴ中のＶＬＳ配列およびＩＬ−２がＨＵＶＥＣに損傷を与えるかどうかを決定するために、単層を異なる濃度のＤＴ改変体、ＤＴ改変体−ＩＬ−２−融合タンパク質またはコントロールとともにインキュベートする。ＨＵＶＥＣを単離し、培養し、微視的に調べる。簡単にいうと、ＨＵＶＥＣ単層を、１０−６Ｍのそれぞれの改変体、融合タンパク質、コントロールまたは培地のみとともに３７℃で１８時間インキュベートし、次いで、位相差顕微鏡（倍率２０倍）で調べる。正常な単層は、細長い形状を有する高度に充填された細胞からなり、一方、損傷を受けた細胞は、丸まり、プレートから剥がれる。未処理のＨＵＶＥＣは、密に充填された細長い細胞からなる。２時間インキュベートした後、細胞円形化のために２時間後、および単層内のギャップ生成のために１８時間後に単層を評価することができる。ＨＵＶＥＣに対する毒性の影響を評価する。
【０４５０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで内皮単層の透過性を測定するための別の方法は、すでに詳細に記載されている（Ｆｒｉｅｄｍａｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ、１２９：２３７〜２４９（１９８６）；Ｄｏｗｎｉｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、７（１）：５８〜６５（１９９２））。記載される種々の培地とともにインキュベートした後、コンフルエント状態の内皮細胞を含有するフィルタをＰＢＳで２回洗浄する。次いで、内皮細胞が接着したフィルタを、変更されたフラックスチャンバに取り付け、このチャンバを培養皿に置く。チャンバの上側ウェルを、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓを含有する無血清培地で満たす。この皿を同じ培地で満たす。下側ウェルに攪拌棒を加え、チャンバ全体を電気撹拌器の上に置き、３７℃でインキュベートする。上側ウェルとビーカー中の周囲の流体の培地の高さが等しくなるまで、チャンバをインキュベートする。従って、上側ウェルと下側ウェルの間に静水圧の差はない。この平衡時間の後、上側ウェルから小分けして培地を取り出し、［１２５Ｉ］ウシ血清アルブミン（３０，０００ｃｐｍ／ｍｌ）を含有する培地と交換する。放射能標識されたアルブミンを、使用直前に１Ｍ  ＰＢＳに対して広範囲にわたって透析する。透析された［１２５Ｉ］アルブミンおよび試験終了後の下側ウェルの培地のクロマトグラフィーによるモニタリングから、アルブミンと一緒に９５％より多い１２５Ｉが分離されたことが示される（Ｆｒｉｅｄｍａｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ、１２９：２３７−２４９（１９８６））。１２５Ｉプローブを添加してから１０分後、３０分後、６０分後、１２０分後、１８０分後、２４０分後に、小分けした培地（３個ずつ）を、上側ウェルおよび下側ウェルの両方から連続して取り出す。それぞれの小分け分の１２５Ｉ活性をガンマカウンタで測定し、上側ウェルおよび下側ウェルからのサンプルの平均ｃｐｍ／ｍｌを決定する。実験培地を用い、バックグラウンドに対して適切な補正を行う。ＢＰＡＥＣ単層の［１２５Ｉ］アルブミン移動速度は、９０〜２４０分の定常状態のクリアランスのときに、上側ウェルの計測数／時間に対する下側ウェルの計測数の見かけ比率として表される（Ｆｒｉｅｄｍａｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ、１２９：２３７〜２４９（１９８６））。それぞれのアルブミン移動速度の点（ｎ）は、１つの群の２つずつのフィルタの平均速度をあらわす。それぞれの群のフィルタは、コントールフィルタを２つずつ含んでいた（すなわち、希釈剤のみを用いてインキュベートしたフィルタ上の単層）。さらなるフィルタにおいて、放射能標識されていないウシ血清アルブミン（最終濃度１％）を、上側ウェルに１２５Ｉウシ血清アルブミンとともに加える。単層を通過する１２５Ｉアルブミン移動速度は、すでに記載した方法を用いて決定される。この内皮単層は、ＤＴ改変体−ＩＬ−２融合タンパク質にさらされた後、改質されていないＤＴ−ＩＬ−２融合タンパク質と比較して、変化が少ないことが予想される。
【０４５１】
さらに別のアッセイにおいて、平らな脂質二重層膜系を用い、ＤＴ−ＩＬ−２の変異体のチャネル形成活性を決定し（ｖａｎｄｅｒＳｐｅｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０７７〜１２０８２（１９９３）；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１３７：１７〜２８（１９９４）；Ｈｕら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１１（９）：８１１〜８１７（１９９８））、改質されていないＤＴ−ＩＬ−２と比較する。ポリスチレンカップ中、５０〜１００μｍの開口部を横切るように膜を作成する。天然脂質が除去されたレシチンＩＩＳ型（Ｓｉｇｍａ）の１％ヘキサン溶液（ＫａｇａｗａおよびＲａｃｋｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４６：５４７７−５４８７（１９７１））を使用し、開口部の両側をコーティングし、乾燥させる。次いで、開口部の外側を、軽質石油で調製された１．５％スクアレン溶液でコーティングする。このカップを、Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ハムデン、ＣＴ）によって調製されたブロックのバックチャンバに入れる。このカップに、開口部の面より上になるまでバッファー溶液（１Ｍ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２）を加える（０．５ｍｌ）。このブロックのフロントチャンバを、ＨＥＰＥＳの代わりに３０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．３）を用いた以外は上と同じバッファー溶液１．０ｍｌで満たす。小分けした上述のレシチンヘキサン溶液５０μｌを、フロントチャンバ内のバッファーの上部に層状に乗せ、ヘキサンを蒸発させる。次いで、フロントチャンバ内のバッファーを、開口部の面より上で上げ下げし、平らな脂質二重層を作成する。改質されていないＤＴ−ＩＬ−２融合タンパク質およびそのＤＴ改変体−ＩＬ−２融合タンパク質を、２０〜７３０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度でフロントチャンバに加える。電圧固定条件を用い、膜に＋６０ｍＶの電圧をかける。上述のカップを含むブロックのバックチャンバは、仮想接地状態に維持され、この電圧は、タンパク質が加えられるフロントチャンバを指す。標準的な方法を用いて電圧をモニタリングする（Ｊａｋｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：６９８４−６９９１（１９８９））。チャネルコンダクタンスは、式ｇ＝Ｉ／Ｖを用いて決定され、式中、ｇは、コンダクタンスであり、Ｉは、膜を流れる電流であり、Ｖは、膜にかけられた電圧である。この脂質二重層は、ＤＴ改変体−ＩＬ−２融合タンパク質にさらされた後、改質されていないＤＴ−ＩＬ−２融合タンパク質と比較して、変化が少ないことが予想される。
【０４５２】
（実施例３）
この実施例は、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を試験する方法を記載する。リボソーム不活性化タンパク質毒素（例えば、ジフテリア毒素）は、翻訳伸長因子２（ＥＦ−２）の共有結合による改質を触媒する。ＥＦ−２における改質されたヒスチジン残基のリボシル化は、リボソームでのタンパク質合成を停止させ、細胞死を引き起こす。ＤＴ３８７変異体の触媒活性を決定するためのリボシルトランスフェラーゼアッセイは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  ジチオトレイトール、０．４ｍｇ／ｍｌの精製されたＥＦ−２、および１．０ｐＭ［３２Ｐ］−ＮＡＤ＋（１０ｍＣｉ／ｍｌ、１０００Ｃｉ．ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中で行われる。精製された変異体タンパク質を、最終反応容積４０μｌで試験する。９６ウェルの底部がＶ型のマイクロタイタープレート（Ｌｉｎｂｒｏ）で反応を行い、室温で１時間インキュベートする。２００μｌの１０％ＴＣＡを加えることによってタンパク質を沈殿させ、ガラスファイバーフィルタに集め、標準的なプロトコルによって放射能活性を決定する。ＡＤＰ−リボシル化を測定するための従来の方法は、二本鎖（ｄｓ）アクチベーターＤＮＡオリゴヌクレオチドで処理された、透過処理した細胞を使用し、その後の放射能標識されたＮＡＤ＋の測定は、酸不溶性材料に組み込まれる。ＦＡＣＳに基づく方法、例えば、Ｋｕｎｚｍａｎｎら（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ＆  Ａｇｅｉｎｇ、３：８（２００６））に記載される方法も利用可能である。
【０４５３】
（実施例４）
（改質されたＤＴ−ＩＬ−２融合タンパク質の未精製抽出物の細胞毒性アッセイ）
ＤＴ３８７構築物またはＤＴ３８９構築物を最初に使用し、改質された担毒体が、多くの標的リガンドと化学的に結合し、機能的に標的とする毒素を与えることができることを示す。ＤＴ３８７リンカーＩＬ−２またはＤＴ３８９リンカーＩＬ−２によって例示されるような一本鎖融合毒素は、典型的にはコンジュゲート毒素の開発で直面するようなスケールアップ時の精製の問題を回避する。操作された変化の効果を確認するために、多くの改質されたＤＴ３８７  ＩＬ−２融合物またはＤＴ３８９  ＩＬ−２融合物の毒素を製造し、細胞毒性アッセイで試験する。
【０４５４】
変化を決定するために上述のように行われたアミノ酸置換によって、融合毒素を産生することができない不活性な担毒体は得られず、細胞毒性アッセイが行われる。
【０４５５】
（細胞毒性アッセイ）
高アフィニティインターロイキン−２受容体を発現するヒトＨＴＬＶ１の形質転換されたＴ細胞株であるＨＵＴ１０２／６ＴＧ細胞を用いて細胞毒性アッセイを行う。ＨＵＴ１０２／６ＴＧ細胞を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ  グルタミン、５０ＩＵ／ｍｌ  ペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを追加したＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ）培地中で維持する。９６ウェルのＶ−マイクロタイタープレートに５×１０４／ウェルの密度で細胞を接種する。融合タンパク質毒素を、典型的には、１０−７Ｍ〜１０−１２Ｍの範囲のモル濃度でこのウェルに加える。ウェルの最終容積は２００μｌである。このプレートを３７℃、５％ＣＯ２環境で１８時間インキュベートする。プレートを遠心分離処理して細胞をペレット化し、培地を除去し、ロイシンを含まず、１．０μＣｉ／ｍｌの［１４Ｃ］ロイシン（２８０ｍＣｉ／ｍｍｏｌ未満、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）および２１ｍＭ  グルタミン、５０ＩＵ／ｍｌ  ペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを含有する最小必須培地２００μｌと置き換える。細胞を９０分間パルス処理し、次いで、プレートを遠心分離処理して細胞をペレット化する。上澄みを除去し、細胞を６０μｌの０．４Ｍ  ＫＯＨに溶解させ、その後、室温で１０分間インキュベートする。次いで、１４０μｌの１０％ＴＣＡをそれぞれのウェルに加え、室温でさらに１０分間のインキュベーションを行う。ＰＨＤ細胞収集器を用い、沈殿したタンパク質をガラスファイバーフィルタに集め、標準的な方法を用いて組み込まれた放射能活性を決定する。結果を、コントロール（タンパク質合成を阻害する融合タンパク質が加えられていない）［１４Ｃ］−ロイシン組み込みに対するパーセントとして報告する。ＴｏｘｉｌｉｇｈｔＴＭ、ＶｉａｌｉｇｈｔＴＭおよびＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥＴＭキットは、放射能活性を用いない市販のアッセイであり、改変体を評価するために使用することができる。このアッセイを、感受性の高い細胞株および耐性細胞株を用い、時間をかけて毒素（１０−７〜１０−１２Ｍ）を滴定しつつ、９６ウェルプレートフォーマットで行う。
【０４５６】
Ｅ．ｃｏｌｉから作られる医薬品グレードのＧＭＰ精製されたＤＡＢ３８９ＩＬ−２は、典型的には、ＩＣ５０が５×１０−１１Ｍ〜１×１０−１２Ｍである。部分的に精製された毒素は、部分的に精製された不均質な抽出物よりも１０〜１００倍低い活性を示す。医薬品グレードの毒素は、均質になるまで精製され、再折り畳みされた融合物の活性なフラクションを生体活性のある薬物として使用する。上の例では、本願発明者らは、部分的に精製された改質されたＤＴ−ＩＬ−２融合毒素の受容体特異的な細胞毒性を決定し、同様に精製されたＤＡＢ３８９ＩＬ−２の活性と比較するために、中程度のスループット分析を利用する。これらのアッセイから、改質されたＤＴ３８７リンカーＩＬ−２融合物は、ＤＡＢ３８９ＩＬ−２に匹敵する活性を示す。特異的な細胞毒性は、部分的な融合毒素のサンプル中のタンパク質の合計量に基づくことを注記しておくべきである。アッセイのために、等モル濃度の融合物を試験した。
【０４５７】
それぞれのサンプル中の非融合毒素のタンパク質の相対量によって、任意の所与のＩＣ５０を人為的に変えることができる。すなわち、この分析に用いられるサンプル中の非全長タンパク質または非融合毒素のタンパク質の存在は、ＩＣ５０の小さな差の原因である可能性がある。
【０４５８】
Ｅ．ｃｏｌｉで作られ、精製されたＤＡＢ３８９ＩＬ−２は、典型的には、ＩＣ５０が５×１０−１１Ｍ〜１×１０−１２Ｍである。
【０４５９】
改質されたＤＴ−ＩＬ−２融合毒素の未精製物の精製を分析し、同様に精製されたＤＴ３８７リンカーＩＬ−２の活性と比較するために、中程度のスループットの細胞毒性アッセイを利用する。
【０４６０】
ＩＬ−２内の１つの（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフが、残基１９〜２１（ＬＤＬ）に位置していることを注記すべきである。ＶＬＳに対するＩＬ−２の寄与は、ＩＬ−２内のこの（ｘ）Ｄ／Ｅ（ｙ）モチーフを改質し、上述の細胞毒性アッセイを用いて、改質されたタンパク質を試験することによって決定することができる。例えば、ＤＴ３８７またはＤＴ３８７リンカーＩＬ−２から誘導される改質されたＤＴ変異体を用い、触媒活性に対する変異の影響、ＶＬＳ活性に対する変異の影響、標的細胞のサイトゾルへの標的とする毒素の有効な送達に対する変異の影響を区別することができる。ＤＴ３８７の改質されたＤＴ変異体と、ＤＴ３８７リンカーＩＬ−２の比較から、ＤＴ３８７リンカーＩＬ−２中に存在するＩＬ−２を標的とするリガンドから、担毒体の改質された配列のみの影響も分離される。別の例では、ＤＴ３８９またはＤＴ３８９リンカーＩＬ−２の両方から誘導される改質されたＤＴ変異体を用い、触媒活性に対する変異の影響、ＶＬＳ活性に対する変異の影響、標的細胞のサイトゾルへの標的とする毒素の有効な送達に対する変異の影響を区別することができる。ＤＴ３８９の改質されたＤＴ変異体と、ＤＴ３８９リンカーＩＬ−２の比較から、ＤＴ３８９リンカーＩＬ−２中に存在するＩＬ−２を標的とするリガンドから、担毒体の改質された配列のみの影響も分離される。
【０４６１】
（実施例５）
この実施例は、本明細書に記載される融合タンパク質の影響を試験するためのｉｎ  ｖｉｖｏでの方法を記載する。血管新生したヒト皮膚をＳＣＩＤマウスに移植し、このマウスに、毒素を含有する融合タンパク質を注射し、濡れた状態／乾燥した状態の重量比として、移植片中の流体の蓄積を測定することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏで、毒素を含有する融合タンパク質がヒト内皮に及ぼす影響を試験するためのモデルが開発されている（Ｂａｌｕｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２２（１）：４１〜４７（１９９９））。ヒト皮膚中の流体の蓄積は、凍結乾燥の前後に皮膚移植片のパンチ生検の重さを測ることによって測定される。このモデルを使用し、ｉｎ  ｖｉｖｏで本明細書に記載される改質されたＤＴ融合タンパク質の影響を評価することができる。
【０４６２】
正常なＳＣＩＤマウスの肺での流体の蓄積も、ＶＬＳの代替的なモデルとして使用される。ＩＬ−２は、マウスの肺での流体の蓄積を誘発することが示されている（ＯｒｕｃｅｖｉｃおよびＬａｌａ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８（４）：２１０〜２２０（１９９５））。肺または皮膚移植片の含水量は、濡れた状態／乾燥した状態の重量比として計算される。このモデルにおいて、Ｓｍａｌｌｓｈａｗら、（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１：３８７〜３９１（２００３））に記載される方法に従って静脈内注射された１２５Ｉ−アルブミンの肺での蓄積を測定することによって、肺の血管漏出も評価することができる。
【０４６３】
（実施例６）
本明細書に記載されるＤＴ改変体の機能を試験するために、複数のアッセイ、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管毒性、ｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデル、および本明細書に記載され、または当該技術分野で知られる任意の他のアッセイが利用可能である。
【０４６４】
（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイ）
異なる改質されたＤＴ融合タンパク質の細胞毒性活性は、すでに記載されているようなＣＤ２２＋Ｄａｕｄｉ細胞および［３Ｈ］−ロイシンの組み込みを用いて決定される（Ｇｈｅｔｉｅら、１９８８）。［３Ｈ］−ロイシンの組み込みが、未処理のコントロール培養物と比較して５０％減少する融合タンパク質の濃度は、ＩＣ５０と定義される。
【０４６５】
（血管毒性）
改質されたＤＴを用いて調製された融合タンパク質が血管損傷を誘発する能力を評価するときの第１の工程として、ＨＵＶＥＣを用いる一連のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験を行うことができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイのために、改質されたＤＴ融合タンパク質が、ＨＵＶＥＣ単層の形態に及ぼす影響を、すでに記載されるように試験する（Ｂａｌｕｎａら、１９９６）。
【０４６６】
（ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ）
改質されたＤＴ融合タンパク質の影響を、ＳＣＩＤ／Ｄａｕｄｉ腫瘍モデルで決定することができる（Ｇｈｅｔｉｅら、１９９２）。簡単にいうと、０日目に、雌ＳＣＩＤマウスに５×１０６のＤａｕｄｉ細胞を静脈内注射する（Ｉ．Ｖ．；尾の側面の静脈）。１日目、２日目、３日目および４日目に融合タンパク質をＩ．Ｖ．注射する。各治療群に５匹のマウス群を使用し、試験を繰り返す。治療群は、（１）治療なし（コントロール）；（２）改質されていないＤＴ融合タンパク質；または（３）改質されたＤＴ融合タンパク質を摂取する。マウスを経過観察し、後脚の麻痺が起こったら屠殺する。ＳＣＩＤマウスでの肺血管漏出を、記載されたように評価する（Ｂａｌｕｎａら、１９９９）。肺の含水量は、改質されたＤＴ融合タンパク質１０μｇ／マウス体重（ｇ）を注射されたマウスから除去された肺の濡れた状態／乾燥した状態の重量比として計算される。
【０４６７】
（実施例７）
この実施例は、Ｔ細胞エピトープのための毒素のスクリーニング方法を記載する。ＭＨＣ、ポリペプチドおよびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の相互作用は、Ｔ細胞認識の抗原特異性の構造的な基礎を与える。Ｔ細胞増殖アッセイは、ＭＨＣに対するポリペプチドの結合と、ＴＣＲによるＭＨＣ／ポリペプチド複合体の認識を試験する。この実施例のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ細胞増殖アッセイは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびＴ細胞を含有する、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の刺激を含む。刺激は、合成ペプチド抗原を用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。刺激されたＴ細胞の増殖は、３Ｈ−チミジン（３Ｈ−Ｔｈｙ）を用いて測定され、組み込まれた３Ｈ−Ｔｈｙの存在は、固定された細胞を洗浄し、この細胞のシンチレーションカウンタによる計測を用いて評価される。
【０４６８】
保存期間が１２時間未満の保存されたヒト血液のドナープールからｂｕｆｆｙコートを得て、この毒素のアミノ酸残基配列に対応するポリペプチドライブラリーを、既知の方法によって合成するか、または適切な供給源から得る。ｂｕｆｆｙコートを穏やかに遠心分離処理することによって、血漿および血小板から赤血球と白血球を分離する。上側の相（血漿および血小板を含有する）を除去し、捨てる。１５ｍｌのｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の上に層状に広げる前に、赤血球および白血球をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で１：１に希釈した。製造業者が推奨する条件で遠心分離処理を行い、血清＋ＰＢＳ／ｆｉｃｏｌｌ  局面界面からＰＢＭＣを集める。ＰＢＭＣをＰＢＳと混合し（１：１）、遠心分離処理によって集める。上澄みを除去し、捨て、ＰＭＢＣペレットを５０ｍｌのＰＢＳに再懸濁させる。細胞を遠心分離処理によって再びペレット化し、ＰＢＳ上澄みを捨てる。次いで、５０ｍｌのＡＩＭＶ培地を用いて細胞を再懸濁させ、この時点で、トリパンブルー染料排除を用いて数を計測し、生存能力を評価する。細胞を遠心分離処理によって再び集め、上澄みを捨てる。低温保存のために、細胞を３×１０７／ｍｌの密度で再懸濁させる。保存培地は、９０％（ｖ／ｖ）の熱不活化したＡＢヒト血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。制御された凍結容器に細胞を移し、長期保存のために液体Ｎ２に移す前に、−７０℃で一晩放置する。使用のために必要なときに、１０ｍｌのあらかじめ加温したＡＩＭＶ培地に移す前に、細胞を３７℃の水浴で迅速に解凍する。
【０４６９】
９６ウェルの底が平らなプレート中、ＰＭＢＣを２×１０５ＰＭＢＣ／ウェルの密度で、ポリペプチド抗原を用いて刺激する。３Ｈ−Ｔｈｙを用いてパルス処理する前に、ＰＢＢＣを３７度で７日間インキュベートした。１２アミノ酸ずつ増やすことによって重複する合成ポリペプチド（１５マー）を、毒素の全配列にわたって作成する。
【０４７０】
それぞれのポリペプチドを、２０のナイーブドナーから単離したＰＭＢＣに対して個々にスクリーニングする。すでに免疫原性であることが示されている２種類のコントロールポリペプチドと、強力な非リコール抗原ＫＬＨをそれぞれのドナーアッセイで使用する。使用するコントロール抗原は、クラミジアＨＳＰ  ６０ペプチドおよびＫｅｙｈｏｌｅ  ＬｉｍｐｅｔヘモシアニンといったＦｌｕヘマグルチニンである。ポリペプチドを最終濃度が１０ｍＭになるまでＤＭＳＯに溶解し、次いで、これらのストック溶液をＡＩＭＶ培地で１／５００に希釈する（最終濃度２０μΜ）。ポリペプチドを底が平らな９６ウェルプレートに加え、１００μｌ中、２μＭおよび２０μＭの最終濃度を与える。トリパンブルー染料排除によって、解凍したＰＢＭＣの生存能力を評価し、次いで、細胞を２×１０６細胞／ｍｌの密度で再懸濁させ、１００μｌ（２×１０５ＰＢＭＣ／ウェル）を、ペプチドを含有する各ウェルに移す。それぞれのペプチド濃度で、ウェル培養物を３個ずつアッセイする。３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、プレートを７日間インキュベートする。１μＣｉの３Ｈ−Ｔｈｙ／ウェルを用いて細胞を１８〜２１時間パルス処理した後、フィルタマットに集める。マイクロプレートベータトッププレートカウンタを用い、ＣＰＭ値を決定する。結果を刺激指数として表し、ここで、刺激指数（ＳＩ）は、試験ペプチドについて測定された増殖スコア（例えば、１分あたりの放射能活性の計測値）を、試験ペプチドと接触していない細胞で測定されたスコアで割り算することによって誘導される。
【０４７１】
（実施例８）
植物毒素（ＥＰ１７３７９６１号）および細菌毒素（ＷＯ２００４／０１８６８４号）を含むいくつかのタンパク質のＴ細胞エピトープが欠失した改変体を作成するために、脱免疫化がうまく適用された。脱免疫化技術は、例えば、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎＴＭ（Ａｎｔｉｔｏｐｅ，Ｌｔｄ．、ケンブリッジ、ＵＫ）の開発中に改良され、Ｔ細胞エピトープの測定の感度がもっと高い。
【０４７２】
点変異の導入ではなく、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ＰｒｏｔｅｉｎＴＭ技術（Ａｎｔｉｔｏｐｅ，Ｌｔｄ．）を用い、他のタンパク質からの配列セグメントと置き換えることによって、Ｔ細胞エピトープを除去することができ、その結果、タンパク質の機能を保持しつつ、Ｔ細胞エピトープを除去するという点でもっと自由度の高い解決策を与える。
【０４７３】
本明細書に記載される方法は、以下のように、ＶＬＳの減少および低下した免疫原性を有するＤＴの改変体を作成することである。
ＤＴのＴ細胞エピトープマッピングおよび選択されるリガンド（例えば、ヒトＩＬ−２）の接合点、
ＶＬＳ活性およびＤＴ活性のアッセイ、
複数の改変体をスクリーニングするのに適したフォーマットで、Ｅ．ｃｏｌｉにおける全ＤＴの遺伝子合成、発現および精製（約１００〜２５０の改変体）、
ＶＬＳの低下のためのＤＴ改変体の作成および試験（ＨＵＶＥＣ結合アッセイ）−改変体を２回試験する（単一遺伝子座／複数遺伝子座）、
Ｔ細胞エピトープを除去した後のＤＴ改変体の作成および試験−改変体を複数回試験し（単一エピトープ、複数エピトープ、最適化）、２回目は、ＶＬＳ改変体の組み合わせを含む（段階４）、
段階５からのリードＤＴ改変体とタンパク質リガンド（例えば、ヒトＩＬ−２）との融合による、リードＤＴ−融合物改変体の作成およびタンパク質の精製／試験（この段階は任意である）、
ＥｐｉＳｃｒｅｅｎＴＭ（野生型トランケーションされたＤＴ（ΔＲ）のコントロール）による、リードＤＴ１〜３８９（「トランケーションされたＤＴ（ΔＲ）」）改変体の免疫原性の試験。
【０４７４】
ＨＵＶＥＣ結合アッセイにおける、ＶＬＳモチーフ内に変異を含有するＤＴ改変体の試験、およびＩＶＴＴアッセイにおける有効性に関するすべてのＤＴ改変体の試験は、例えば、野生型受容体結合（Ｒ）ドメイン（ＤＴ（ΔＲ））を含まないトランケーションされたＤＴ改変体を用いて行われる。細胞毒性アッセイにおける効力に関するリード化合物の試験は、全長ＤＴの態様と、ＤＴ（ΔＲ）がＩＬ−２に融合した融合タンパク質の両方を用いて行われる。１つ以上のリードＤＴ改変体のＥｐｉＳｃｒｅｅｎＴＭによるバリデーションのために、改質されたＣドメインおよびＩドメインを有する最適化されたＤＴ改変体は、トランケーションされたＤＴ（ΔＲ）の発現によって試験される。
【０４７５】
（実施例９）
（ＤＴのＥｐｉＳｃｒｅｅｎＴＭ  Ｔ細胞エピトープマッピング）
（ＥｐｉＳｃｒｅｅｎドナーの選択）
Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｌｏｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって付与された承認に従って、ＵＫ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ケンブリッジ、ＵＫ）から得た健康なコミュニティのドナーｂｕｆｆｙコート（血液を抜き取ってから２４時間以内）から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−ｓｈｉｅｌｄ、ダンディー、スコットランド）の密度遠心分離処理によってｂｕｆｆｙコートからＰＭＢＣを単離し、ＣＤ８＋ＲｏｓｓｅｔｔｅＳｅｐＴＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用い、ＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させた。Ｂｉｏｔｅｓｔ  ＨＬＡ  ＳＳＰ−ＰＣＲに基づく組織型判定キット（Ｂｉｏｔｅｓｔ、Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒｓｔｒａβｅ、デンマーク）を使用してＨＬＡ−ＤＲ  ハプロタイプを同定することによって、ドナーを特性決定した。コントロール抗原Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、ＵＳＡ）に対するＴ細胞応答も決定した。世界的な集合で発現するＨＬＡ−ＤＲアロタイプの数および頻度を最もよく表すために、ドナー５４名のコホートを選択した（表１、データは示さない）。世界的な集合で発現するものに対する、このコホートで発現するアロタイプの分析は、８０％を超える包含率を達成し、すべての主要なＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子（世界的な集合で５％を超える頻度で発現する個々のアロタイプ）を十分に代表していることがわかった。表１は、ドナーのハプロタイプと、ドナーＰＢＭＣの処理および単離（試験１）の間に得られるＫＬＨに対する応答を、試験（ＡＮＧ０１）中の再試験の後に得られるドナーの応答と比較したものを示す。ドナーのハプロタイプのまとめが表２に与えられている。
【０４７６】
【表４】
2016519651.tif 000006
【０４７７】
表２．ドナーの詳細およびハプロタイプ。２つの独立した試験について、ＫＬＨに対するドナーの応答（ＳＩ）が示されている。試験１は、新しく単離されたＰＢＭＣについて行われ、ＡＮＧ０１は、現行の試験の再試験である。両試験で同じ結果（すなわち、ポジティブまたはネガティブ）が得られなかった応答は、灰色で強調されている。基底状態のｃｐｍが非常に低い（１５０ｃｐｍ未満の）３人のドナーは、この分析から除外した。
【０４７８】
（ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ分析：増殖アッセイ）
ＥｐｉＳｃｒｅｅｎＴＭを使用し、ＤＴのＣドメインおよびＩドメインを含み、ヒトＩＬ−２の１０アミノ酸をＣ末端に有する、ＤＴ１〜３８９の配列から誘導される重複するペプチドを試験した。Ｃ末端にあるヒトＩＬ−２の１０アミノ酸とともに、ＤＴ−１の残基１〜３８９にわたり、重複するペプチドを設計した（ＤＴ１〜３８９／ＩＬ−２の２〜１０）。１２アミノ酸が重複する一連の１２８×１５マーペプチドを１×１４マーおよび１×１１マーとともに合成し、これを使用して、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎＴＭ  Ｔ細胞エピトープマッピングを用い、５１人の健康なドナーのコホートから誘導される末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を刺激した。個々のペプチドを複製培養物で試験し、Ｔ細胞増殖アッセイを用いて応答を評価し、エピトープの正確な位置を同定した。それぞれのドナーに由来するＰＢＭＣを解凍し、数を計測し、生存能力について評価した。ＡＩＭＶ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア）中、室温で細胞を回復させた後、細胞密度を２．５×１０６ＰＭＢＣ／ｍｌに調節した（増殖細胞ストック）。ペプチドを、最終濃度が１０ｍＬになるまでＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）に溶解した。次いで、最終濃度が５μＭになるまでＡＩＭＶ培地で希釈することによって、ペプチド培養ストックを調製した。それぞれのペプチドおよびそれぞれのドナーについて、底が平らな９６ウェルプレート中、１００μｌのペプチド培養ストックを１００μｌの増殖細胞ストックに加えることによって、６個ずつの培養物を確立した。ポジティブコントロール培養物およびネガティブコントロール培養物も、両方とも６個ずつ確立した。それぞれのドナーに合計で９×９６ウェルプレートを使用し、それぞれのプレートは、１種類のネガティブコントロール（担体のみ）６個を入れて、１５種類のペプチドを試験するのに十分であった。最後のプレートには、ポジティブコントロールＫＬＨを加えた。
【０４７９】
培養物を合計で６日間インキュベートした後、それぞれのウェルに０．５μＣｉ３［Ｈ］−チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（登録商標）、ウォルサム、マサチューセッツ、ＵＳＡ）を加えた。培養物をさらに１８時間インキュベートした後、ＴｏｍＴｅｃ  Ｍａｃｈ  ＩＩＩ細胞収集器を用い、フィルタマットに集めた。ｐａｒａｌｕｘ低バックグラウンド計測モードで、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｂｅｔａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（登録商標）、ウォルサム、マサチューセッツ、ＵＳＡ）でのＭｅｌｔｉｌｅｘＴＭ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（登録商標）、ウォルサム、マサチューセッツ、ＵＳＡ）シンチレーション計測によって、それぞれのウェルの１分あたりの計測数（ｃｐｍ）を決定した。
【０４８０】
増殖アッセイのために、２以上の刺激指数（ＳＩ）（ＳＩ≧２）の経験的な閾値を前もって確立しておき、それによって、この閾値を痴得る増殖応答を誘発するサンプルは、ポジティブであるとされる（含まれる場合、ボーダーラインＳＩ≧１．９０が強調される）。広範囲にわたるアッセイ開発および以前の研究から、この値は、多数の誤ったポジティブ応答を検出することなく、最大の感度を可能にするノイズ閾値に対する最小シグナルであることが示される。ポジティブ応答は、以下の統計的な閾値および経験的な閾値によって定義される。
１．対応のない２標本のスチューデントｔ検定を用い、培地コントロールウェルに対し、試験ウェルのｃｐｍを比較することによる、応答の有意性（ｐ＜０．０５）。
２．２より大きな刺激指数（ＳＩ≧２）。ここで、ＳＩ＝試験ウェル（ｃｐｍ）の平均／平均培地コントロールウェル（ｃｐｍ）。
【０４８１】
それに加えて、複製培養物からの生データの分散および標準偏差（ＳＤ）の係数を計算することによって、アッセイ内の変動を評価した。
【０４８２】
増殖アッセイは、培養物６個ずつで設定された（「調整されていないデータ」）。確実にアッセイ内の変動を低くするために、最大ｃｐｍ値と最小ｃｐｍ値を除去した後にもデータを分析し（「調整されたデータ」）、ドナー応答のＳＩを、両データセットを用いて比較した。この試験のすべてのペプチド＋２×ＳＤ（バックグラウンド応答率）に対する応答の平均頻度を計算することによって、Ｔ細胞エピトープを同定した。この閾値より高い増殖を誘発した任意のペプチドは、Ｔ細胞エピトープを含有すると考えられた。
【０４８３】
（ペプチドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ｉＴｏｐｅＴＭ分析）
増殖アッセイでポジティブであったペプチドの配列を、Ａｎｔｉｔｏｐｅの予測ｉＴｏｐｅＴＭソフトウエアを用いて分析した。このソフトウエアは、ペプチドのアミノ酸側鎖と、ＭＨＣクラスＩＩ結合溝の中の特異的な結合ポケットとの望ましい相互作用を予測する。長いペプチド配列全体にわたる、１アミノ酸によって重複する１０マーを作成することによって、鍵となる結合残基の位置を決定した。ＭＨＣクラスＩＩアロタイプ（合計３２種）のＡｎｔｉｔｏｐｅデータベースに対し、それぞれの１０マーを試験し、そのフィッティングおよびＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用に基づいてスコアを付けた。多数の対立遺伝子に対し、高い結合スコアを得たペプチドは、コア９量体を含有すると考えられた。このような試験は、（ａ）ＤＴ１〜３８９／ＩＬ−２  ２〜１０ＤＴ１〜３８９／ＩＬ−２  ２〜１０の全Ｔ細胞エピトープマップ；（ｂ）個々のＴ細胞エピトープの有効性の評価およびＤＴから除去するための優先順位付け；および（ｃ）ＭＨＣクラスＩＩアロタイプとＴ細胞エピトープの会合の評価を含む、１〜３８９／ＩＬ−２  ２〜１０の包括的なＴ細胞エピトープ分析を与えた。
【０４８４】
（Ｔ細胞エピトープの同定）
上述のＥｐｉＳｃｒｅｅｎＴＭＡｎａｌｙｓｉｓを用いて同定されたすべての１３０種類のペプチドを、５１人の健康なドナーに対して試験するために、首尾良く合成した（５４人のドナーが元々選択されていたが、ドナー１３、２０および３８は、基底状態のｃｐｍが非常に低いため（すなわち、カットオフ値１５０ｃｐｍより低い）、分析から除外された。ポジティブ応答は、任意の所与のペプチドに対し、ＳＩ≧２の優位な（ｐ＜０．０５）応答を生じたドナーによって定義された。ボーダーライン応答（ＳＩ≧１．９０の優位な（ｐ＜０．０５）応答）も含まれた。調整されていないデータと調整されたデータの分析の出力結果を比較し、アッセイ内の変動が低く、ポジティブ応答が、個々のウェルでの偽の増殖の結果ではないことを確実にした。それぞれの分析の結果は、この方法間の差がほとんどないことを示した。その結果、調整されたデータの分析を用い、Ｔ細胞エピトープマップを集めた。この試験のすべてのペプチドに対する応答の平均頻度と、２つの標準偏差（「バックグラウンド応答率」と呼ばれる）を計算することによって、Ｔ細胞エピトープを同定した。この値は、５．６％であると計算され、３人以上のドナーにおいてポジティブ応答を誘発するのと同義であった。この閾値を超える増殖性応答を誘発するペプチドは、Ｔ細胞エピトープを含有すると考えられた。
【０４８５】
表３は、それぞれのペプチドに対する個々のドナーの応答のまとめを与える。９種類のペプチドが、バックグラウンド応答率よりも大きな増殖応答を誘発し（ペプチド２、３１、３５、３９、４０、４１、４２、４９および１００）、従って、Ｔ細胞エピトープを含有すると考えられた。これらの９種類のペプチドから、ＤＴ−１配列内に合計で７つのＴ細胞エピトープが同定され、以下にさらに詳細に記載する。
【０４８６】
【表５】
2016519651.tif 000007
2016519651.tif 000008
2016519651.tif 000009
表３．個々のペプチドに対するドナーの応答のまとめ。ポジティブ応答（ＳＩ≧２およびｐ＜０．０５）は、ドナー番号によって示され、個々のＳＩは、対応するドナーの次に、カッコ内に示されている。ボーダーライン応答（ＳＩ≧１．９およびｐ＜０．０５）は、（＊）で示されている。バックグラウンド応答率は、５．６％であり、３人のドナーに同等であった。
【０４８７】
（ＥｐｉＳｃｒｅｅｎによって同定されたＴ細胞エピトープ）
（ａ）エピトープ１−ペプチド２
ペプチド２（ＤＤＶＶＤＳＳＫＳＦＶＭＥＮＦ；配列番号１５９）は、表２に示されるようなＴ細胞エピトープを含む。合計で３人のドナー（３０、３６および４７）が、ペプチド２に応答するが、ドナー３０の応答は、ボーダーラインであった（ＳＩが１．９２）。明細書で上に記載されるように、Ｔ細胞エピトープの脱離は、同定されたエピトープ内のアミノ酸の改質によって達成することができる。エピトープ内のアミノ酸（例えば、ＭＨＣクラスＩＩ結合クレフトのアンカーポケット（ｐ１およびｐ９）の結合と関連するアミノ酸残基）の改質は、ＭＨＣクラスＩＩ分子上のエピトープの首尾良い提示に影響を与え、および／または提示を防ぐ（すなわち、エピトープを脱離させる）ことができる。同様に、ＭＨＣクラスＩＩ結合クレフトの内側ポケットの結合と関連するアミノ酸残基および／またはＭＨＣクラスＩＩ分子に影響を与えるか、またはこれと相互作用するコア９量体エピトープの外側にある残基の改質によって、エピトープを脱離させることができる。本明細書に記載される方法によって、Ｔ細胞エピトープの脱離のためのアミノ酸残基の改質の種々の組みあわせを行い、試験することができる。
【０４８８】
Ａｎｔｉｔｏｐｅのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ｉＴｏｐｅＴＭＭＨＣクラスＩＩ予測ソフトウエアを用い、９量体ＭＨＣクラスＩＩ結合レジスターの可能性についてペプチド２を分析した。このソフトウエアは、対立遺伝子の平均結合スコアとともに、結合する能力を有する対立遺伝子の数（合計３２）に基づき、エピトープについて最も望ましい結合レジスターを予測する（ポジティブ閾値は０．５に設定）。この分析結果は、このコア９量体が、バリン（Ｖ８）を潜在的なｐ１アンカー残基として有するＶＤＳＳＫＳＦＶＭ（配列番号１６１）であることを示した（データは示さない）。この配座では、この分析は、３２の対立遺伝子のうち、２５の結合を予測した。ＶＤＳＳＫＳＦＶＭコア９量体（配列番号１６１）は、ペプチド１と３の両方に存在し、ペプチド２と重複している。興味深いことに、ドナー３６は、ペプチド２と３の両方に応答し（Ｓ１は、それぞれ２．１３および２．０２）、ペプチド１に対しても高い応答を有しており（ＳＩ＝１．８８）、これは、統計的に有意であり（ｐ＜０．０５）、このことは、ＶＤＳＳＫＳＦＶＭ（配列番号１６１）が、コア９量体結合レジスターであることを示す。同様に、ドナー３０は、ペプチド１に応答し、ＳＩが１．６４であり、これは、明らかに１．９〜２．０のカットオフより下だったが、統計的に有意であり（ｐ＜０．０５）、全体的なバックグラウンドＳＩより高い。ドナー４７は、ペプチド１および３に対し、ポジティブ応答を有さなかった。これは、おそらく、ペプチド内のコア９量体ペプチドの位置に起因し、９量体結合レジスターの外側にある残基が、ペプチド：ＭＨＣクラスＩＩ複合体の安定性を補助することが十分に記載されている（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄら、１９９４）。従って、ペプチド２は、コア９量体をＭＨＣクラスＩＩ結合のための最適な配座で含むと思われる。ＤＴ−１結晶構造の観察（Ｓｔｅｅｒｅら、２０００）から、ｐ１バリン残基（Ｖ８）は、部分的に露出した位置にあることがわかり、従って、極性部分が表面に露出し、疎水性領域が埋め込まれるように、置き換える極性残基を選択することができる。Ｔ細胞エピトープに対するこのような改質によって、毒素の免疫毒性を低下させることができる。
【０４８９】
（ｂ）エピトープ２−ペプチド３１
表３は、４人のドナー（ドナー１２、２３、３０および３６）は、ペプチド３１（ＫＶＬＡＬＫＶＤＮＡＥＴＩＫＫ；配列番号１６２）に応答し、この領域にＴ細胞エピトープが存在することを示す。さらに、重複するペプチドの分析は、ドナー２３が、ペプチド３２に対してボーダーライン応答を生じ、ドナー３６もペプチド３２に対して応答し、その応答は閾値より下（ＳＩ＝１．８１）であったが、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）ことを示した。ｉＴｏｐｅＴＭｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析を用い、このペプチドのためのコア９量体は、ＶＤＮＡＥＴＩＫ（配列番号１６４の残基１〜８）であり、主なｐ１アンカー残基としてバリン（Ｖ９７）を有すると予想された（データは示さない）。このことは、同じコア９量体を含む、ペプチド３２に対するドナー２３の応答、ペプチド３２に対するドナー３６の閾値より低い応答によって裏付けられた（データは示さない）。この配座で、分析は、３２のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子のうち、２８の結合を示した。構造および同一性モデリングから、Ｖ９７の位置が分子表面に十分に露出し、活性部位と会合しないことがわかった。
【０４９０】
（ｃ）エピトープ３−ペプチド３５
上述のような刺激の後にポジティブ増殖応答を生じた３人のドナー（ドナー１、２および３５）によって示されるように、ペプチド３５（配列番号１６６）は、Ｔ細胞エピトープを含有する（データは示さない、表３）。ｉＴｏｐｅＴＭによる分析から、このペプチドに最も望ましい結合レジスターは、ＬＧＬＳＬＴＥＰＬ（配列番号１６７）であり、主なアンカー残基ｐ１としてロイシン（Ｌ１０７）を有することがわかった（データは示さない）。この９量体は、３２のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子のうち、１３に結合する可能性を有していた。ドナー３５も、同じコア９量体を含むペプチド３４に増殖応答を有していた（ＳＩ＝１．８３）。これは、ポジティブ応答のための１．９〜２．０のカットオフ値より下であったが、統計的に有意であり（ｐ＜０．０５）、配列ＬＧＬＳＬＴＥＰＬ（配列番号１６７）が、この領域内のエピトープであることを示す。
【０４９１】
このエピトープのｐ１アンカーの結晶構造分析および同一性モデリングは、これがほとんど埋め込まれており、少しだけ表面に露出していることを示す。エピトープ１と同様に、極性残基を置換し、ＭＨＣクラスＩＩに対する結合を除去することが可能であろう。このペプチドのｐ９アンカーも埋め込まれており、従って、毒素の表面に十分に露出しているｐ６およびｐ７を含む他のポケット位置での変化が考えられる。
【０４９２】
（ｄ）エピトープ４−ペプチド３９
３人のドナー（ドナー５、１５および５０）は、ペプチド３９（ＬＭＥＱＶＧＴＥＥＦＩＫＲＦＧ；配列番号１６８）で刺激した後、ポジティブ増殖応答を生じたが、ドナー５０の応答は、ボーダーラインであった（ＳＩは１．９４）（データは示さない、表３）。このペプチド内のＴ細胞エピトープは、ｉＴｏｐｅＴＭ分析後に、ＭＥＱＶＧＴＥＥＦ（配列番号１６９）をコア９量体ＭＨＣクラスＩＩ結合レジスターとして含むと予測された（データを示さない）。この配座では、位置１１６のメチオニンがｐ１アンカー残基を形成し、このエピトープは、３２のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子のうち、１９に結合すると予測された。このＭＨＣクラスＩＩ結合レジスターの位置１および９は、毒素の触媒ドメインのコアに埋め込まれており、互いに充填されている。従って、これらの残基は、タンパク質の全体的な安定性に重要であると考えられる。エピトープ３と同様に、コア９量体の他のポケット、例えば、ｐ６およびｐ７（十分に露出している）と相互作用する残基が、置換のために考慮される。
【０４９３】
（ｅ）エピトープ５−ペプチド４０、４１および４２
強力なＴ細胞エピトープは、ペプチド４０、４１および４２（配列番号１７０〜１７２）の中にあるようである。試験コホートの１５．７％を表す全体で８人の異なるドナーで応答を誘発する能力によって示されるように、検出されたすべてのエピトープの中で、この領域内のエピトープが最も免疫原性である（表３、データは示さない）。６人のドナーが、ペプチド４０に応答し（ドナー１５、３６、４６、４７、４９および５０）、ペプチド４１に応答し（ドナー３５、３６、４０、４６、４９、５０）、４２に応答し（ドナー３５、３６、４０、４７、４９、５０）、３種類すべての重複するペプチドに対する応答が、ドナー４９および５０について観察され、一方、ドナー３０、４０、４６および４７は、２種類の重複するペプチドに応答した。ｉＴｏｐｅＴＭｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析は、このペプチドの結合モチーフが、ＦＩＫＲＦＧＤＧＡ（配列番号１７３）であり、ｐ１アンカー残基としてフェニルアラニン（Ｆ１２４）を含むことを予測した（データは示さない）。この９量体は、３種類すべての重複するペプチド中に存在し、３２のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子のうち２３に結合すると予測された。フェニルアラニン１２４は、触媒ドメインのコア内に実質的に埋め込まれ、Ｍ１１５およびＶ１１８に対して充填され、従って、構造的に重要である可能性があると考えられる。しかし、アンカーの位置４、６、７および９は、さまざまな程度まで露出しており、エピトープを除去することを標的とすることができる。
【０４９４】
（ｆ）エピトープ６−ペプチド４９
ペプチド４９（ＳＳＳＶＥＹＩＮＮＷＥＱＡＫＡ；配列番号１７４）は、Ｔ細胞エピトープも含有する。表３は、３人のドナー（ドナー３０、３９および４９）が、ペプチド４９で刺激した後にポジティブ増殖応答を生じたことを示す。ｉＴｏｐｅＴＭｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析を用い、このペプチドのために最も望ましい結合レジスターは、ＶＥＹＩＮＮＷＥＱ（配列番号１７５；データは示さない）であると予測され、３２のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子のうち２２に結合する可能性を有していた。この結合レジスターは、ｐ１アンカー残基としてバリン（Ｖ１４８）を有していた。ペプチド４８および５０は、ペプチド４９と重複しており、同じコア９量体を含んでいたが、ドナー３０、３９および４９は、この重複するペプチドに応答せず、コア９量体の外側にある残基も、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対するペプチドの結合に重要であることを示している。バリン１４８は、部分的に表面に露出しており、従って、親水性部分が表面に露出し、疎水性領域が埋め込まれるように、置き換える極性残基を選択することができる。
【０４９５】
（ｇ）エピトープ７−ペプチド１００
エピトープ７は、ペプチド１００（ＬＥＫＴＴＡＡＬＳＩＬＰＧＩＧ；配列番号１７７）内に発見された。４人のドナー（ドナー１、１５、３０および３５）は、ペプチド１００に応答し、ドナー１５の応答は、ボーダーラインであった。ｉＴｏｐｅＴＭ分析は、このペプチドのためのコア９量体結合レジスターが、ＬＥＫＴＴＡＡＬＳ（配列番号１７８）であり、ｐ１アンカー残基としてロイシン（Ｌ２９８）を有することを予測した（データは示さない）。この９量体は、３２の可能なＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子のうち２４に結合すると予測された。この９量体は、ペプチド９９内にも存在し、これに対し、ドナー３０は、統計的に有意であり（ｐ＜０．０５）、応答が閾値より低く（ＳＩ＝１．８４）、従って、ＬＥＫＴＴＡＡＬＳ（配列番号１７８）がこれらのペプチドの結合モチーフであることを裏付けている。ロイシン２９８は、転移ドメインの表面に十分に露出しており、このドメインの活性と関係がない。従って、置き換えることに明らかな問題はない。従って、このＴ細胞エピトープを改質／脱離するために、この残基を簡単に置き換えることができる。
【０４９６】
（Ｔ細胞エピトープおよびアロタイプの応答）
表４は、ＤＴ−１配列内に発見された７つのＴ細胞エピトープの詳細をまとめている。ＤＴ−１とＤＴ−２の接合点の中には、エピトープは検出されなかった。
【０４９７】
ペプチド４０、４１および４２に位置するＴ細胞エピトープ（エピトープ５）は、コホートの１５．７％で応答を誘発した。ペプチド３１および１００内に位置するエピトープ（それぞれ、エピトープ２および７）は、試験コホートの７．８４％で応答を誘発した（表４）。ペプチド２内のエピトープ（エピトープ１）、ペプチド３５内のエピトープ（エピトープ３）、ペプチド３９内のエピトープ（エピトープ４）およびペプチド４９内のエピトープ（エピトープ６）は、コホートの５．８８％で応答を誘発した。それぞれのエピトープに対するポジティブ応答の大きさ（平均ＳＩ）の分析から、すべてがその効力においてかなり同等であるようであり、平均ＳＩが２〜２．５であることを示した。しかし、エピトープ３は、３．１３ともっと大きな平均ＳＩを有していた。
【０４９８】
表４：Ｔ細胞エピトープを含有するペプチドに対するポジティブ応答の大きさおよび頻度のまとめ
【表６】
2016519651.tif 000010
【０４９９】
ＨＬＡ−ＤＲアロタイプの発現と、個々のペプチドに応答するドナーの相関関係も分析した。エピトープ２、５および７（ペプチド３１、４０〜４２および１００）を評価した。表４は、ＡＮＧ０１試験コホートで発現するアロタイプの頻度と比較して、それぞれのペプチドに応答するドナーによって発現するアロタイプの頻度を示す。応答する集合内のアロタイプの頻度が、観察された頻度の２倍より大きい（すなわち、試験集合の頻度の２倍）場合、ＭＨＣクラスＩＩアロタイプと、特定のエピトープに対する応答に相関関係があると考えられた。
【０５００】
個々のドナーによって発現するＭＨＣクラスＩＩアロタイプに対するＥｐｉＳｃｒｅｅｎＴＭアッセイで観察されたポジティブドナー応答の比較は、エピトープ２、５および７に対する応答するドナーが、特定のアロタイプと関係があることを示していた。エピトープ５に対するＴ細胞の応答は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５およびＨＬＡ−ＤＲ５の発現と相関関係があった。このエピトープに応答し、これらのアロタイプを発現するドナーの頻度は、それぞれ、１２％、１５％および１５％であった。これらはすべて、それぞれ５％、７％および７％であったＡＮＧ０１試験コホート内のこれらのアロタイプの頻度の２倍より高かった。それに加えて、このペプチドのｉＴｏｐｅＴＭ分析は、ＨＬＡ−ＤＲ５が、予測されたコア９量体に結合するだろうことを示した。エピトープ２および７に対するＴ細胞の応答は、両方とも、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５およびＨＬＡ−ＤＲＢ５と相関関係があるようであった。エピトープ２または７に応答し、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５およびＨＬＡ−ＤＲＢ５を発現するドナーの頻度は、それぞれの対立遺伝子について２０％および２１％であり、ＡＮＧ０１試験コホート内のそれぞれの対立遺伝子について観察された７％の頻度の２倍より高かった。これらのペプチドのｉＴｏｐｅＴＭ分析は、それぞれのペプチドのための予測される結合レジスターが、ＨＬＡ−ＤＲ５に結合する可能性を有することを示していた。Ｔ細胞エピトープの同定に加え、これらの分析は、特定のペプチドに対するＴ細胞の応答と、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の発現との相関関係をも示す。
【０５０１】
表５：試験集団の中で発現したアロタイプの頻度と比較した、応答するドナーアロタイプの頻度（パーセントとして示される）。ＭＨＣクラスＩＩアロタイプと、エピトープに対する応答との相関関係を灰色で強調する。
【表７】
2016519651.tif 000011
【０５０２】
（実施例１０）
（ＶＬＳアッセイ）
種々のアッセイを使用し、本明細書に記載されるようなＤＴ改変体のＶＬＳ活性を評価することができる。
【０５０３】
あるアッセイでは、ＤＴ−ＩＬ２または改変体をフルオレセインにコンジュゲーションした。標識された細胞の蛍光顕微鏡／手動での計測を用い、ＶＬＳ活性のための代替物としてＨＵＶＥＶ細胞に対する直接的な結合を評価することができる。
【０５０４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験では、形態学的変化；細胞単層の透過能力または細胞膜の完全性の消失；およびＣＤ３１発現との相関は、本明細書に記載される改変体を検出することができる種々の手段を表し、これを使用し、ＶＬＳ活性を評価することもできる。
【０５０５】
（ａ）抗体を用いた検出
ＤＴ特異的な抗体を使用し、ＶＬＳモチーフを介して内皮細胞に結合したＤＴを検出することができる。共通のエピトープを直接的に標識し、改変体の間の結合差を検出した。ＥＬＩＳＡを使用し、入手可能な抗−ＤＴ抗体の特異性／アフィニティを確認した。本明細書に記載される方法に加え、Ｈｉｓ−タグＡｂは、ＤＴ改変体を選択することができる別の手段を与える。
【０５０６】
ＨＵＶＥＣ細胞に対するＤＴ改変体（ＤＴ−Ｇｌｕ５２；ＣＲＭ変異体）の結合およびＦＡＣＳ分析を用いた抗体による検出を決定した（データは示さない）。
【０５０７】
（ｂ）直接的なコンジュゲート
蛍光色素（Ａｌｅｘａ  ４８８）に対するＤＴおよび毒素改変体の直接的なコンジュゲートを使用し、本明細書に記載されるＤＴ改変体を評価することができる。Ａｌｅｘａ染料は、非常に安定であり、明るかった。Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ａ３０００６）によって、タンパク質のマイクロスケールの標識が可能になる（２０〜１００μｇ）。標識の程度（ＤＯＬ）を最適化することができ、染料：タンパク質（Ｄ：Ｐ）比は、分光光度計によって測定され、再現性がある。ＦＡＣＳを使用して蛍光を測定する。
【０５０８】
このアッセイは、ＨＵＶＥＣ細胞に対するＯＮＴＡＫ−Ａ１４８８およびコントロールＤＴ−Ｇｌｕ５２−Ａ１４８８の結合の良好な検出を達成した（データは示さない）。このアッセイは、ＢＳＡ−Ａ１４８８の結合と比較して、ＨＵＶＥＣ細胞に対するＯＮＴＡＫ−Ａ１４８８およびコントロールＤＴ（ΔＲ）−Ａ１４８８の結合の良好な検出を達成した（データは示さない）。
【０５０９】
ＨＵＶＥＣ細胞について、ＩＬ−２Ｒの発現をＦＡＣＳによって試験した。ＨＵＶＥＣ細胞に対するＯＮＴＡＫ−Ａ１４８８の結合が、ＩＬ−Ｒと独立していることを確認した（データは示さない）。
【０５１０】
さらなる変異体を試験し、結果を図１７および図１８に示す。
【０５１１】
図１７は、例示的なＶＬＳ結合アッセイを示す。コントロールおよび試験サンプルについて、Ｏｎｔａｋ、ＷＴ  ＤＴΔＲおよびＶＬＳ変異体のＡｌｅｘａ−４８８コンジュゲートのＦＡＣＳプロットが与えられる。
【０５１２】
図１８は、図１９に示される分散データのグラフを与える。
【０５１３】
（ｃ）細胞膜の一体性
細胞膜の一体性を評価し、毒素にさらされた後の細胞膜の一体性の消失を測定することができる。ＶＬＳモチーフを取り囲むペプチドを、Ｂａｌｕｎａら（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、９６：３９５７（１９９９））に記載されるような方法を用い、蛍光色素に直接的にコンジュゲーションした。これに代えて、本明細書に記載されるか、または当該技術分野で知られる他のアッセイを利用することができる。
【０５１４】
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いて細胞膜の一体性アッセイ（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ａｓｓａｙ）を行い、毒素の影響をＦＡＣＳによって評価し、毒素とともに短期間インキュベートした後の細胞膜の一体性の消失についての代用物として、ＰＩ取り込みを測定した（データは示さない）。
【０５１５】
ＶＬＳを誘発する可能性について、ＨＵＶＥＣ細胞ＤＴ結合アッセイを、ＣドメインとＩドメインのみを含むトランケーションされたＤＴ（ΔＲ）を用いて試験する。ＨＵＶＥＣに対する結合を分析するために、ＤＴ分子を標識する。この工程は、ＤＴ（ΔＲ）の発現を利用し、そのため、ＨＵＶＥＣアッセイの作成は、ＤＴ発現後に開始される。
【０５１６】
（ｄ）ｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルでのＶＬＳをアッセイする方法
他のモデルも、腫瘍の成長をアッセイするために利用可能である。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイのために、ＳＣＩＤ／Ｄａｕｄｉ腫瘍モデルにおいて、例えば、Ｇｈｅｔｉｅら、（１９９２）に記載されるように、改質された毒素（およびその融合物）の影響を決定する。簡単にいうと、０日目に、雌ＳＣＩＤマウスに５×１０６のＤａｕｄｉ細胞をＩ．Ｖ．注射する（尾の側面の静脈）。１日目、２日目、３日目および４日目に改質された毒素（およびその融合物）をＩ．Ｖ．注射する。各治療群に４匹のマウス群を使用し、試験を繰り返す。治療群は、（１）治療なし（コントロール）；（２）改質された毒素（またはその融合物）；（３）ＯＮＴＡＫ（登録商標）；または（４）プラセボ（例えば、ＰＢＳ）を摂取する。マウスを経過観察し、後脚の麻痺が起こったら殺す。改質された毒素（およびその融合物）を注射したＳＣＩＤマウスでの肺血管漏出を、記載されたように評価する（Ｂａｌｕｎａら、１９９９）。肺の含水量は、改質された毒素（およびその融合物）／マウス体重（ｇ）を注射されたマウスから除去された肺の濡れた状態／乾燥した状態の重量比として計算される。
【０５１７】
ヒトと異なり、改質された毒素（またはその融合物）を注射したマウスは、顕著な体重減少および肺血管漏出という観点で全身ＶＬＳを示す。ＳＣＩＤマウスに、変異体改質された毒素（またはその融合物）を用いて調製された改質された毒素（またはその融合物）を注射し、体重減少および肺血管漏出の両方をモニタリングする。
【０５１８】
（ＤＴ活性／細胞毒性アッセイ）
ＤＴ活性の測定に適したアッセイが確立された。細胞毒性アッセイを利用し、ＤＴ−ＩＬ２  Ｔ細胞エピトープおよびＩＶＴＴアッセイで選択されたＶＬＳ改変体リード化合物の毒素活性を確認する。
【０５１９】
（ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写−翻訳（ＩＶＴＴ）アッセイ
ＤＴ活性を測定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写−翻訳（ＩＶＴＴ）アッセイを用い、ウサギ網状赤血球溶解物系を用いて、ＤＴ遺伝子の直接的な転写／翻訳を試験した。典型的には、標的プラスミド（Ｔ７−ルシフェラーゼ）に活性な毒素を測定する化学発光アッセイを用いる、ＩＶＴＴを測定するルシフェラーゼ遺伝子と化学発光アッセイの組み合わせた転写／翻訳を含み、ルシフェラーゼシグナルを阻害し、低下させる。ＰＣＲ産物を利用し、滴定曲線を用いて中程度スループットスクリーニング（ＭＴＳ）を可能にし、同じ９６ウェルアッセイプレートにおいて、すべての改変体をＷＴ  ＤＴと比較する。代用となるＩＣ５０を、阻害イオン曲線から決定することができる。ＤＴが結合し、伸長因子−２（ＥＦ−２）の共有結合による改質を引き起こすため、活性なＤＴ改変体のルシフェラーゼ産生を阻害すべきである。リボソーム阻害タンパク質を分析するために組み合わせた転写／翻訳アッセイを使用し、ＤＴのＣドメインの活性に関する情報を得ることができる。このような組み合わせた転写／翻訳アッセイ反応を実行するのに有用な種々の方法が当業者に知られており、例えば、米国特許第５，９７６，８０６号および第５，６９５，９８３号に記載されており、それぞれ、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。
【０５２０】
本明細書に記載されるＩＶＴＴアッセイを用い、ＷＴ  ＤＲ  ＤＴは、Ｔ７−ｌｕｃプラスミドの転写／翻訳の用量依存性の阻害が９０％に達し、一方、ヌル体では、約２０％の阻害でプラトーになることが示された（データは示さない）。
【０５２１】
本明細書に記載されるＩＶＴＴアッセイを用い、さらなる変異体を試験した。
【０５２２】
図１４は、６つの改質を含有するＤＴ毒素が活性であることを示すＩＶＴＴアッセイを示す。
【０５２３】
図１５は、７つの改質を含有するＤＴ毒素が活性であることを示すＩＶＴＴアッセイを示す。
【０５２４】
（ｂ）発光細胞毒性アッセイ
ＴｏｘｉｌｉｇｈｔＴＭ、ＶｉａｌｉｇｈｔＴＭおよびＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥＴＭキットは、放射能活性を用いない市販のアッセイであり、細胞毒性を測定するために使用することができる。このアッセイを、感受性の高い細胞株および耐性細胞株を用い、時間をかけて毒素（１０−７〜１０−１２Ｍ）を滴定しつつ、９６ウェルプレートフォーマットで行う。
【０５２５】
（ＶＬＳ改質された毒素）
野生型ＤＴ、ネガティブコントロールおよび多くの改変体の細胞毒性を、ＴｏｘｉｌｉｇｈｔＴＭキットを用いて評価した。
【０５２６】
ヒトＴ細胞に対するＯＮＴＡＫ（登録商標）  対  ＩＬ−２の細胞毒性を、ＴｏｘｉｌｉｇｈｔＴＭキットを用いて４８時間で評価し、１秒あたりの発光数（ＬＣＰＳ）は、アデニレートキナーゼ放出度を反映する（データは示さない）。
【０５２７】
図１は、野生型ＤＴおよびネガティブコントロールと比較した、ＶＬＳモチーフで改質された種々のＤＴ毒素の最大溶解率％を示す。構築物は、以下のとおりである。ｐＡＮＧ１９＝Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｎ  Ｉ２９０Ｎ；ｐＡＮＧ２０＝Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｎ  Ｓ２９２Ａ；ｐＡＮＧ２１＝Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｎ  Ｓ２９２Ｔ；ｐＡＮＧ２２＝Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｓ２９２Ａ；ｐＡＮＧ２３＝Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｉ２９０Ｔ；ｐＡＮＧ２４＝Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｉ２９０Ｎ；およびｐＡＮＧ  ２５＝Ｖ７Ｎ。
【０５２８】
構築物についてＩＣ５０を決定し、手段を以下の表に与える。
【表８】
2016519651.tif 000012
【０５２９】
野生型ＤＴおよび変異体ＤＴの現時点での平均ＩＣ５０値；それぞれの変異体についてｎ＝４またはそれ以上；および「０．０Ｅ＋００」＝１Ｅ−７Ｍ未満で活性なし。
【０５３０】
図２は、野生型ＤＴおよびネガティブコントロール（Ｈｉｓ溶出バッファー）と比較した、ＶＬＳモチーフで改質された種々のＤＴ毒素の最大溶解率％を示す。構築物は、以下のとおりである。ｐＡＮＧ２３−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｉ２９０Ｔ；ｐＡＮＧ２４−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｉ２９０Ｎ；ｐＡＮＧ３３−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ；ｐＡＮＧ３５−Ｖ７Ｎ  Ｄ３０Ｅ  Ｉ２９０Ｔ；ｐＡＮＧ４６−Ｖ７Ｎ  Ｄ３０Ｅ  Ｉ２９０Ｎ；ｐＡＮＧ４７−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｄ２９１Ｋ；およびｐＡＮＧ４８−Ｖ７Ｎ  Ｄ３０Ｅ  Ｄ２９１Ｋ。
【０５３１】
図３は、野生型ＤＴおよびネガティブコントロール（Ｈｉｓ溶出バッファー）と比較した、ＶＬＳモチーフで改質された種々のＤＴ毒素の最大溶解率％の別の例を示す。構築物は、以下のとおりである。ｐＡＮＧ２３−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｉ２９０Ｔ；ｐＡＮＧ２４−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｉ２９０Ｎ；ｐＡＮＧ３３−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ；ｐＡＮＧ３５−Ｖ７Ｎ  Ｄ３０Ｅ  Ｉ２９０Ｔ；ｐＡＮＧ４６−Ｖ７Ｎ  Ｄ３０Ｅ  Ｉ２９０Ｎ；ｐＡＮＧ４７−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｄ２９１Ｋ；およびｐＡＮＧ４８−Ｖ７Ｎ  Ｄ３０Ｅ  Ｄ２９１Ｋ。
【０５３２】
構築物についてＥＣ５０を決定し、手段を以下の表に与える。
【表９】
2016519651.tif 000013
【０５３３】
図４は、野生型ＤＴと比較した、ＶＬＳモチーフで改質された種々のＤＴ毒素の最大溶解率％の別の例を示す。構築物は、以下のとおりである。ｐＡＮＧ２３−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｉ２９０Ｔ；ｐＡＮＧ３３−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ；ｐＡＮＧ３５−Ｖ７Ｎ  Ｄ３０Ｅ  Ｉ２９０Ｔ；ｐＡＮＧ３６−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｓ  Ｉ２９０Ｔ；およびｐＡＮＧ３７−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｄ  Ｉ２９０Ｔ。
【０５３４】
構築物についてＥＣ５０を決定し、手段を以下の表に与える。
【表１０】
2016519651.tif 000014
【０５３５】
図５は、野生型ＤＴと比較した、ＶＬＳモチーフで改質された種々のＤＴ毒素の最大溶解率％の別の例を示す。構築物は、以下のとおりである。ｐＡＮＧ２３−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｉ２９０Ｔ；ｐＡＮＧ２５−Ｖ７Ｎ；ｐＡＮＧ３５−Ｖ７Ｎ  Ｄ３０Ｅ  Ｉ２９０Ｔ；ｐＡＮＧ４７−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｄ２９１Ｋ；およびｐＡＮＧ４８−Ｖ７Ｎ  Ｄ３０Ｅ  Ｄ２９１Ｋ。
【０５３６】
図６は、野生型ＤＴと比較した、ＶＬＳモチーフで改質された種々のＤＴ毒素の最大溶解率％の別の例を示す。構築物は、以下のとおりである。ｐＡＮＧ２３−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｉ２９０Ｔ；ｐＡＮＧ２５−Ｖ７Ｎ；ｐＡＮＧ３５−Ｖ７Ｎ  Ｄ３０Ｅ  Ｉ２９０Ｔ；ｐＡＮＧ４７−Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｄ２９１Ｋ；およびｐＡＮＧ４８−Ｖ７Ｎ  Ｄ３０Ｅ  Ｄ２９１Ｋ。
【０５３７】
構築物についてＥＣ５０を決定し、手段を以下の表に与える。
【表１１】
2016519651.tif 000015
【０５３８】
例示的な多くのＶＬＳ改変体による、ＥＣ５０と、ＨＵＶＥＣ細胞に対する結合をまとめた表を以下の表に提供する。
【表１２】
2016519651.tif 000016
【０５３９】
（Ｔ細胞エピトープ改質された毒素）
Ｔ細胞エピトープ改変体も、上に記載したＴｏｘｉｌｉｇｈｔＴＭアッセイを用いて試験した。
【０５４０】
図７は、野生型ＤＴと比較した、Ｔ細胞エピトープで改質された種々のＤＴ毒素の最大溶解率％の一例を示す。構築物は、以下のとおりである。ｐＡＮＧ５０−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ａ；ｐＡＮＧ５１−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ；ｐＡＮＧ５３−Ｖ７Ｎ  Ｌ１０７Ａ；ｐＡＮＧ５４−Ｖ７Ｎ  Ｌ１０７Ｎ；およびｐＡＮＧ５５−Ｖ７Ｎ  Ｍ１１６Ａ。
【０５４１】
図８は、野生型ＤＴと比較した、Ｔ細胞エピトープで改質された種々のＤＴ毒素の最大溶解率％の別の例を示す。構築物は、以下のとおりである。ｐＡＮＧ５６−Ｖ７Ｎ  Ｍ１１６Ｎ；ｐＡＮＧ５７−Ｖ７Ｎ  Ｍ１１６Ｑ；ｐＡＮＧ６０−Ｖ７Ｎ  Ｌ２９８Ａ；ｐＡＮＧ６１−Ｖ７Ｎ  Ｌ２９８Ｎ。
【０５４２】
図９は、野生型ＤＴと比較した、Ｔ細胞エピトープで改質された種々のＤＴ毒素の最大溶解率％の別の例を示す。構築物は、以下のとおりである。ｐＡＮＧ５０−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ａ；ｐＡＮＧ５１−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ；ｐＡＮＧ５２−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｄ；ｐＡＮＧ５８−Ｖ７Ｎ  Ｖ１４８Ａ；およびｐＡＮＧ５９−Ｖ７Ｎ  Ｖ１４８Ｔ。
【０５４３】
構築物についてＥＣ５０を決定し、手段を以下の表に与える。
【表１３】
2016519651.tif 000017
【０５４４】
図１０は、野生型ＤＴおよびＨｉｓ溶出バッファーと比較した、Ｔ細胞エピトープで改質された種々のＤＴ毒素の最大溶解率％の別の例を示す。構築物は、以下のとおりである。ｐＡＮＧ５１−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ；ｐＡＮＧ６０−Ｖ７Ｎ  Ｌ２９８Ａ；ｐＡＮＧ７０−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ２９８Ａ；およびｐＡＮＧ７１−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ２９８Ｎ。
【０５４５】
図１１は、野生型ＤＴおよびＨｉｓ溶出バッファーと比較した、Ｔ細胞エピトープで改質された種々のＤＴ毒素の最大溶解率％の別の例を示す。構築物は、以下のとおりである。ｐＡＮＧ５１−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ；ｐＡＮＧ６０−Ｖ７Ｎ  Ｌ２９８Ａ；ｐＡＮＧ７０−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ２９８Ａ；およびｐＡＮＧ７１−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ２９８Ｎ。
【０５４６】
構築物についてＥＣ５０を決定し、手段を以下の表に与える。
【表１４】
2016519651.tif 000018
【０５４７】
図１２は、野生型ＤＴと比較した、Ｔ細胞エピトープで改質された種々のＤＴ毒素の最大溶解率％の別の例を示す。構築物は、以下のとおりである。ｐＡＮＧ７２−Ｖ７Ｎ  Ｉ１２５Ｈ；ｐＡＮＧ７３−Ｖ７Ｎ  １２７Ａ；ｐＡＮＧ７４−Ｖ７Ｎ  Ｒ１２７Ｔ；ｐＡＮＧ７８−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７Ａ；およびｐＡＮＧ７９−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７Ｔ。
【０５４８】
図１３は、野生型ＤＴと比較した、Ｔ細胞エピトープで改質された種々のＤＴ毒素の最大溶解率％の別の例を示す。構築物は、以下のとおりである。ｐＡＮＧ７３−Ｖ７Ｎ  １２７Ａ；ｐＡＮＧ７４−Ｖ７Ｎ  Ｒ１２７Ｔ；ｐＡＮＧ７８−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７Ａ；およびｐＡＮＧ７９−Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｒ１２７Ｔ。
【０５４９】
構築物についてＥＣ５０を決定し、手段を以下の表に与える。
【表１５】
2016519651.tif 000019
【０５５０】
ＮＢ  １１２５ＡおよびＩ１２５Ｔも、あまり発現せず、活性ではなかった（データは示さない）。
【０５５１】
（ｃ）リボシルトランスフェラーゼアッセイ
組み合わせた転写／翻訳アッセイに加え、リボシルトランスフェラーゼアッセイ（実施例３に記載されるような）を９６ウェルで確立した。このアッセイは、Ｅ．ｃｏｌｉ内のＤＴ遺伝子の発現からのＤＴサンプルを使用し、上の組み合わせた転写／翻訳アッセイと合わせて試験される。ＡＤＰ−リボシル化を測定するための従来の方法は、二本鎖（ｄｓ）アクチベーターＤＮＡオリゴヌクレオチドで処理された、透過処理した細胞を使用し、その後の放射能標識されたＮＡＤ＋の測定は、酸不溶性材料に組み込まれる。
【０５５２】
新しいＦＡＣＳに基づく方法、例えば、Ｋｕｎｚｍａｎｎら（２００６  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ＆  Ａｇｅｉｎｇ）に記載される方法も利用可能である。
【０５５３】
ＤＴ改変体の細胞毒性の測定のために、ＨＵＴ１０２−６ＴＧ細胞を用い、全長ＤＴ改変体を分析するための９６ウェルフォーマットで、細胞の細胞毒性アッセイ（実施例４に記載されるような）を開発する（ＨＵＴ１０２−６ＴＧは、リードＤＴ−ＩＬ−２タンパク質の最終的な分析に使用される細胞株である）。細胞の細胞毒性アッセイが全長ＤＴの発現を必要とするため、このアッセイは、ＤＴ発現後に使用する。
【０５５４】
（実施例１１）
（遺伝子合成、発現および精製）
当該技術分野で知られている従来の技術を用い、Ｅ．ｃｏｌｉで発現するために最適化されたコドンを用いてＤＴおよびヒトＩＬ−２の遺伝子を合成した。細胞の細胞毒性の分析およびＨＵＶＥＣ結合アッセイで使用する全長ＤＴおよびＤＴ（ΔＲ）（ＣドメインとＩドメインのみを含む）を作成するために、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞周辺腔にＤＴを運ぶための分泌リーダー配列を含むベクター系を使用する。可溶性産物を得るために、プラスミドとＥ．ｃｏｌｉ株を最適化する。Ｈｉｓタグ化ＤＴ産物を、Ｎｉ−ＩＤＡカラムで精製し、スピンカラムによって、リード化合物を並行して精製することができる。ＤＴを精製するための方法としては、例えば、ＤＴに融合したアフィニティタグを介する精製（例えば、Ｈｉｓ６タグ（配列番号４０８））が挙げられる。本発明で開発された方法は、これらの改変体の活性を、リード候補物質を同定するために正確に比較することができるように、同様の品質を有する複数のＤＴ改変体を信頼性高く製造する。
【０５５５】
（実施例１２）
（ＤＴのＶＬＳ改変体の設計および構築）
ＶＬＳを誘発する可能性を低下させるためのＤＴ改変体を、２回の変異によって作成した。第１に、ＤＴ内の３つの（ｘ）Ｄ（ｙ）モチーフそれぞれでの別個の変異、第２に、先の変異と任意のさらなる変異の組みあわせ。それぞれのＤＴ改変体をＨＵＶＥＣ結合アッセイで試験し、２回目の変異の後に選択される最適な要素の変異を、Ｔ細胞エピトープ変異と合わせる。これらのアッセイのためのＤＴ改変体の作成は、Ｅ．Ｃｏｌｉ内のトランケーションされたＤＴ（ΔＲ）の発現による。
【０５５６】
（実施例１３）
（ＤＴのＴ細胞エピトープ改変体の設計、構築および試験）
Ｔ細胞エピトープを脱離させ、免疫原性を低下させるためのＤＴ改変体を、ＣドメインおよびＩドメインでの２回の置換によって作成する。改変体の１回目の操作は、１つのエピトープ遺伝子座での別個の置換を含み、次いで、改変体の２回目の操作と合わせ、（Ｔ細胞エピトープの数および優先度に依存して）２つ、３つまたはそれより多い改変体遺伝子座の組み合わせを作成する。改変体の２回目の操作は、ＶＬＳ改変体との組み合わせを含む。Ｔ細胞エピトープの置換とＶＬＳ変異を組み合わせるさらなる工程に起因して、ＤＴ改変体の任意の３回目の操作は、リードＤＴ改変体の最適化が必要な場合には含まれる。
【０５５７】
ＤＴにおけるＴ細胞エピトープ遺伝子座での置換は、（主に）Ｔ細胞エピトープからのコアＭＨＣ結合９量体内のアミノ酸を、他のタンパク質（特にＤＴに関連するタンパク質）で同質の遺伝子座を生じさせるアミノ酸と置換し、同様の三次構造を有する他のタンパク質からの配列セグメントを用いることによって作られる。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ結合予測ソフトウエアｉＴｏｐｅＴＭ（Ａｎｔｉｔｏｐｅ，Ｌｔｄ．）による分析は、Ｔ細胞エピトープを脱離するための置換を選択するための手引きとして用いられる。ＤＴ結晶構造の構造分析も、ＤＴの活性を低下させるか、またはＤＴ構造の安定性を下げることがほとんどないような変異に対する手引きとして使用される。特定の場合には、このような構造分析は、Ｔ細胞エピトープ遺伝子座の外側にあり、活性または安定性を損なうことなくＴ細胞エピトープ内に特定の置換を組み入れることができる互助的置換を示唆してもよい。
【０５５８】
ＤＴのＴ細胞エピトープ改変体は、主に、Ｃドメインでの置換を分析するためのウサギ網状赤血球アッセイと、ＣドメインおよびＩドメインでの置換を分析するための細胞の細胞毒性アッセイを用いて試験される。これらのアッセイのためのＤＴ改変体の発現は、それぞれ、転写／翻訳、Ｅ．Ｃｏｌｉ内での全長ＤＴの発現を使用する。２回目（および場合により３回目）の置換からのリード化合物について、リボシルトランスフェラーゼおよびＨＵＶＥＣの結合アッセイも使用し、リード候補物質を同定する。
【０５５９】
２６のエピトープ改変体を設計し、構築した（データは示さない）。２６のうち１０の（１０／２６）改変体を、本明細書に記載されるようにＩＶＴＴアッセイで試験した。Ｔ細胞エピトープは、相対強度（データは示さない）に基づいて優先順位を付けた。７つのエピトープの変異体についての代表的な結果を得て、この結果は、それぞれのエピトープについて、野生型の活性を維持する異性体が得られたことを示している（データは示さない）。
【０５６０】
（ＤＴエピトープ改変体は、タンパク質合成を阻害する）
ＤＴ３８２構築物を使用し、この構築物は、ＤＴの配列番号２または１４９のアミノ酸残基１〜３８２と、ＩＬ２とを含んでいた。ＲドメインまたはＩＬ部分のいずれかにおけるクローニングのためにアミノ酸残基３８２に制限酵素部位があるように操作した。以下のように改質を組み込む。
【０５６１】
Ｔ細胞エピトープ１、３および５が、推定ＭＨＣクラスＩＩＩ結合ｐ１アンカー残基で改質されたＤＴ３８２遺伝子の改変体を作成した。野生型ＤＴ配列内の残基Ｖ７、Ｌ１０７およびＦ１２４を、活性を保持しつつ（ＭＨＣクラスＩＩ結合を破壊することによって）Ｔ細胞エピトープを除去すると予想されたアミノ酸と置換した（個々の置換は、１つのエピトープ改変体において活性であると同定された）。１つの改変体および合わせた改変体の活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳アッセイで測定した。それぞれの改変体の精製されたＰＣＲ産物を、全容積１０．５μｌ中、反応物あたり１ｎｇ〜６４ｎｇのＤＮＡ範囲を用い、ウサギ網状赤血球溶解物、ＴｎＴバッファー、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸混合物−Ｍｅｔ、アミノ酸混合物−ＬｅｕおよびＲＮａｓｉｎ（Ｎ２５１１型Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）を含む、ＴｎＴが結合した転写／翻訳反応混合物（Ｌ４６１０型Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ、製造業者の指示に従う）で滴定した。異なる改変体間でＤＴ遺伝子の翻訳速度の可能な差がでるように、反応物を３０℃で３０分間インキュベートした。次いで、２５０ｎｇのＴ７−ルシフェラーゼコントロールプラスミドを加え、反応物を３０℃でさらに４５分間インキュベートした。ルシフェラーゼの発現を、製造業者の指示に従って（Ｅ２５１０型Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）、反応物をＳｔｅａｄｙＧｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬とともにインキュベートした後の発光によって測定した。発光の読みは、ＢＭＧ  ＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡ蛍光プレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）を用いて測定した。
【０５６２】
２８のＶＬＳ変異体を設計し、構築した。２８のうち１８（１８／２８）のＶＬＳ変異体をＩＶＴＴアッセイで試験した。既知のＶＬＳ改変体は、野生型（ＷＴ）と同等であるか、もっと大きい活性を有することが示され、ＷＴと同等であるか、もっと大きい活性を示す代替となるネイティブＶＬＳ改変体の数が同定された（データは示さない）。
【０５６３】
タンパク質合成の阻害率を、この反応のＤＮＡ濃度に対してプロットし、得られた曲線を使用し、それぞれの改変体についてＩＣ５０を計算した。野生型ＤＴ（それぞれのアッセイプレートに含まれる）のＩＣ５０を、ＤＴ改変体のＩＣ５０で割り算することによって、アッセイ間の変動を正規化し、値１は、野生型と等しい活性を示し、１より大きな値は、ＤＴ活性の増加を示し、１より小さな値は、ＤＴ活性の低下を示す。
【０５６４】
表６：野生型およびヌル型のＤＴ改変体と比較した、改質されたＤＴ改変体のＩＣ５０データ。四重改変体について、１つの改変体についてのデータが得られた（データは示さない）。
【表１６】
2016519651.tif 000020
【０５６５】
四重改変体Ｖ７Ｄ  Ｖ９７Ａ  Ｌ１０７Ｎ  Ｆ１２４Ｈ、Ｖ７Ｄ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ１０７Ｎ  Ｆ１２４Ｈ、Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ａ  Ｌ１０７Ｎ  Ｆ１２４ＨおよびＶ７Ｎ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ１０７Ｎ  Ｆ１２４Ｈは、ＷＴと同等のＩＣ５０活性を示した。
【０５６６】
四重改変体Ｖ７Ｄ  Ｖ９７Ｄ  Ｌ１０７Ｎ  Ｆ１２４Ｈ、Ｖ７Ｎ  Ｖ９７Ｄ  Ｌ１０７Ｎ  Ｆ１２４Ｈ、Ｖ７Ｔ  Ｖ９７Ａ  Ｌ１０７Ｎ  Ｆ１２４Ｈ、Ｖ７Ｔ  Ｖ９７Ｄ  Ｌ１０７Ｎ  Ｆ１２４ＨおよびＶ７Ｔ  Ｖ９７Ｔ  Ｌ１０７Ｎ  Ｆ１２４Ｈは、ＷＴと比較して、向上したＩＣ５０活性を示した。
【０５６７】
表７：ＷＴと比較した、ＶＬＳおよび／またはＴ細胞エピトープ改変体の相対的なＩＶＴＴスコア。相対的なＩＶＴＴスコアは、野生型ＤＴのＩＣ５０を変異体ＤＴのＩＣ５０で割り算することによって決定される。
【表１７】
2016519651.tif 000021
2016519651.tif 000022
【０５６８】
タンパク質合成の阻害における野生型ＤＴ３８２と比較した、ＤＴ３８２のエピトープ改変体の相対的な活性を決定した（データは示さない）。このデータは、以下のＤＴのＴ細胞エピトープ改変体Ｖ７Ｎ  Ｌ１０７Ｎ  Ｆ１２４Ｈ、Ｖ７Ｎ  Ｌ１０７Ａ  Ｆ１２４Ｈ、Ｖ７Ｄ  Ｌ１０７Ｎ  Ｆ１２４Ｈ、Ｖ７Ｄ  Ｌ１０７Ａ  Ｆ１２４Ｈ、Ｖ７Ｔ  Ｌ１０７Ｎ  Ｆ１２４ＨおよびＶ７Ｔ  Ｌ１０７  Ａ  Ｆ１２４ＨおよびＶ７Ｔ  Ｖ２９Ｔ  Ｉ２９０Ｔが、すべて、タンパク質合成の阻害において、野生型ＤＴ３８２と同様の活性を示すことを示している。対照的に、Ｇ５３Ｅの置換によって活性が低下する。本明細書に記載されるように、Ｇ５２の改質に関する言及は、Ｎ末端にメチオニンを含まない配列番号１のＤＴ分子のアミノ酸残基の番号を指す。
【０５６９】
（実施例１４）
（ＤＴ  ＶＬＳ改変体は、タンパク質合成を阻害する）
認識されるｘ（Ｄ）ｙモチーフが破壊されるようにＶＬＳモチーフが変異したＤＴ３８２遺伝子改変体を製造した。ＰＣＲ産物を用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性について、１つの遺伝子座および複数の遺伝子座での改変体の活性を評価した（実施例１に記載されるように）。
【０５７０】
タンパク質合成の阻害における野生型ＤＴ３８２と比較した、ＤＴ３８２のＶＬＳ改変体の相対的な活性を決定した（データは示さない）。このデータは、以下のＶＬＳ改変体Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｎ  Ｉ２９０Ｎ、Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｎ  Ｉ２９０Ｔ、Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｎ  Ｓ２９２Ａ、Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｎ  Ｓ２９２Ｔ、Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｉ２９０Ｎ、Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｉ２９０Ｔ、Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｓ２９２ＡおよびＶ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｓ２９２Ｔが、すべて、タンパク質合成の阻害において、ＤＴ３８２と同等の活性を示すことを示している。
【０５７１】
（実施例１５）
（ＨＵＶＥＣに対するＶＬＳ改変体の結合）
ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をＥＢＭ（ＣＣ−３１２４  Ｌｏｎｚａ、ベーゼル、スイス）中で維持した。使用前に、酵素を含まない解離バッファー（Ｃ５９１４  Ｓｉｇｍａ、プール、ＵＫ）を用い、細胞を基質下層から剥がし、１％  ＢＳＡおよび０．０５％  ＮａＮ３を含有するリン酸緩衝化生理食塩水に再び懸濁させた。次いで、細胞を、５％の正常なヒト血清を含有する同じバッファー中で２０分間インキュベートした後、製造業者の指示に従って、Ａｌｅｘａ４８８蛍光色素（Ａ３０００６  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド  ＣＡ）にコンジュゲートされた、精製されたＤＴ３８２タンパク質またはＤＴ３８２  ＶＬＳ改変体の滴定液を加えた。標識したタンパク質とともに細胞を３０分間インキュベートした後、洗浄し、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．０５％ＮａＮ３バッファーに再懸濁させた。標識したＤＴ−３８９−ＩＬ２融合物をポジティブコントロールとして使用し、標識したＢＳＡをネガティブコントロールとして使用した。次いで、細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、フランクリンレイクス、ＮＪ）で分析し、細胞集合の蛍光染色を測定した。次いで、バックグラウンドを上回る染色を示した細胞の割合を、使用する標識したタンパク質の濃度に対してプロットした。
【０５７２】
ＨＵＶＥＣ細胞に対する、標識したＤＴ３８２  ＶＬＳ改変体の結合を決定した（データは示さない）。標識したＤＴ−３８９−ＩＬ２融合物（ＯＮＴＡＫ（登録商標））をポジティブコントロールとして使用し、標識したＢＳＡをネガティブコントロールとして使用した。このデータは、精製されたＡｌｅｘａ４８８標識したＤＴ３８２およびＤＴ３８９−ＩＬ２（ポジティブコントロール）が、同様のレベルでＨＵＶＥＣに結合することを示す。対照的に、ＶＬＳ改変体Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｓ２９２Ａ、Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｔ  Ｉ２９０Ｎ、ａｎｄ  Ｖ７Ｎ  Ｖ２９Ｎ  Ｉ２９０Ｎの結合は、ＤＴ３８２またはＤＴ３８９−ＩＬ２のいずれかと比較して、ＨＵＶＥＣに対する結合のレベルの低下を示す。
【０５７３】
図１６は、ＨＵＶＥＣ細胞に対する、直接標識したＤＴΔＲ、ＶＬＳ変異体およびコントロールの直接的な結合を示す。
【０５７４】
（実施例１６）
潜在的なＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドを予測するＡｎｔｉｔｏｐｅのｉＴｏｐｅＴＭソフトウエアを用い、ＤＴから誘導されるペプチドの配列を分析した。ｉＴｏｐｅＴＭソフトウエアは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＭＨＣクラスＩＩ結合試験からのデータと、スコアリングマトリックス内のｅｘ  ｖｉｖｏ  Ｔ細胞アッセイを介してＴ細胞エピトープであることが示されているペプチドの大きなデータベースのアラインメントとを合わせる。全ＤＴ配列について、１アミノ酸ずつ増やしながら、ｉＴｏｐｅＴＭを用い、重複する１３マーペプチドをスクリーニングした。スコアリングマトリックスから誘導されるような鍵となるポケット位置のペプチド中のそれぞれのアミノ酸の寄与を合計することによって、結合スコアを作成した。潜在的なＴ細胞エピトープを含有するペプチド（９ｍｅｒｓ）を同定し（下線が引かれた配列）、平均結合スコアは、０．６より高く（試験した３２  ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子について）、１５より多いＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子が結合すると予測された（データは示さない）。それぞれの９量体のｐ１アンカー位置が太字で強調され、潜在的な結合ペプチドの全リストを表８にまとめている。比較のために、ｅｘ  ｖｉｖｖｏ  Ｔ細胞アッセイを用いて同定されたＴ細胞エピトープを、枠に示している。
【０５７５】
表８．ｉＴｏｐｅＴＭＭＨＣクラスＩＩ結合ソフトウエアを用い、Ｔ細胞エピトープを含有すると予測された９量体配列のリスト。
【表１８】
2016519651.tif 000023
【０５７６】
（実施例１７）
（改変体ＤＴ−ＩＬ２の構築および発現）
リードＤＴ改変体とヒト−ＩＬ２（２〜１３３）遺伝子の融合物によって、リードＤＴ−ＩＬ２改変体を作成する。Ｅ．ｃｏｌｉにおける野生型およびリードＤＴ−ＩＬ２改変体の発現は、従来の方法（例えば、ＩＬ−２を伴う、封入体へのタンパク質凝集物の蓄積および再折り畳み）に従う。次いで、野生型および１つ以上のリードＤＴ−ＩＬ２改変体について、細胞毒性およびＶＬＳ関連アッセイで試験する。
【０５７７】
（実施例１８）
（ＥｐｉＳｃｒｅｅｎＴＭを用いたリードＤＴ改変体の免疫原性試験）
ＥｐｉＳｃｒｅｅｎＴＭによる経時変化Ｔ細胞アッセイを用い、リードＤＴ（ΔＲ）改変体を精製し、野生型ＤＴ（ΔＲ）と比較する。ＨＬＡアロタイプの発現によって世界的な集合を表す多数の健康なドナーを、上述のドナーライブラリーから選択する。２〜４×１０６ＣＤ８＋Ｔ細胞が枯渇したＰＢＭＣを含有する別個のバルク培養物中のそれぞれのタンパク質を用いてドナーを刺激する。バルク培養物から５〜８日目に（Ｔ芽球の）複製サンプルを取り出し、ＩＬ−２分泌（ＥＬＩＳＰＯＴ）とともに増殖を評価する。野生型とＤＴ（ΔＲ）改変体の評価をさらに検証するために、試験コホートに、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎＴＭＴ細胞エピトープマッピング試験から応答するドナーを追加する（十分な数のＣＤ８＋Ｔ細胞が枯渇したＰＢＭＣが残るように）。
【０５７８】
リードＤＴ（ΔＲ）改変体において免疫原性がないことを確認するために、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎＴＭによる経時変化Ｔ細胞アッセイによるＴ細胞の免疫原性の分析を以下のように行う。
【０５７９】
（ｉ）健康なドナー（世界的な集合の８０％を超えるＤＲＢ１アロタイプを包含する）からのｂｕｆｆｙコートを使用し、生理学的レベルのＡＰＣおよびＣＤ４＋Ｔ細胞を含有するＰＭＢＣを単離する。
【０５８０】
（ｉｉ）各ドナーを、ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔヘモシアニン（強力な新抗原）またはＴｅｔａｎｕｓ  Ｔｏｘｏｉｄ（リコール抗原）を含むポジティブコントロール抗原に対して試験する。
【０５８１】
（ｉｉｉ）ＭＨＣクラスＩ制限されたＴ細胞応答の検出を除くために、ＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させる。
【０５８２】
（ｉｖ）リードＤＴ（ΔＲ）改変体および野生型ＤＴ（ＡＲ）を互いに比較し、Ｔ細胞ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する相対的な能力を評価する。
【０５８３】
（ｖ）あらかじめ検証しておいたアッセイパラメータを用い、データを分析し、ポジティブ応答のＳＩ＞２が、統計分析および頻度分析を含むさらなる情報によって裏付けられる。
【０５８４】
（ｖｉ）ＥｐｉＳｃｒｅｅｎＴＭによる経時変化Ｔ細胞アッセイからのデータは、個々のＤＴ分子に対するＴ細胞の応答の大きさおよび速度に関する情報を与える。
【０５８５】
（ｖｉｉ）ポジティブ応答を生じるドナーからの残りのＰＢＭＣを保管し、繰り返し試験に使用するのに利用することができる。
【０５８６】
（ｖｉｉｉ）ドナーアロタイプと、ＤＴ（ΔＲ）に対する応答と、改変体ＤＴ（ΔＲ）リード化合物に対する応答の関係について評価を行う。
【０５８７】
これらの実験からの免疫原性のデータは、以下のとおりである。
【表１９】
2016519651.tif 000024
【０５８８】
（実施例１９）
（ＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質のアジュバントの効果）
（臨床試験の設計および患者の適格性）
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ＢｏａｒｄおよびＦＤＡによって承認されたプロトコルの一部として、同意書に従って、患者の治療を行う。組織学的に転移ＲＣＣを有すると確認された患者が、試験に適している。すべての患者は、十分な肝臓、腎臓、神経の機能を有し、余命が６ヶ月より長く、Ｋａｒｎｏｆｓｋｙ全身状態が７０％以上であることが必要である。患者は、前の治療に関連するすべての毒性から回復しており、試験に参加するまでの少なくとも６週間は、化学療法、放射線療法および免疫療法を受けていない必要がある。ＣＮＳ転移を有し、自己免疫疾患の疾病歴があり、重篤な慢性または急性の疾病を併発している患者は、この試験から除外される。免疫抑制剤に対する患者も除外される。ＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質（１８μｇ／ｋｇ）単回投与後、腫瘍ＲＮＡによってトランスフェクトされたＤＣまたはＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質を用いた免疫化のみを等しい確率で受けられるように、適した被検者をランダムに分けた。すべての被検者が、腫瘍ＲＮＡによってトランスフェクトされたＤＣの皮内注射を３回受ける。この注射は、２週間に１回の間隔で皮内投与され、各注射液に２００μｌの０．９％塩化ナトリウムに懸濁した１×１０７細胞からなる。治療後、臨床的な毒性、免疫応答および臨床応答について被検者を評価する。規制制限のため、ある被検者では、腫瘍組織への接触が制限され、腫瘍生検も行われない。
【０５８９】
（ＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質および組成物の調製）
ＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質を、２ｍｌの使い捨てバイアル中、濃度１５０μｇ／ｍｌで、クエン酸バッファー中で配合された凍結した滅菌溶液として与える。解凍した後、ＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質を通常の滅菌生理食塩水で最終濃度が１５μｇ／ｍｌになるまで希釈し、３０分かけて静脈内注入によって送達する。患者は、注入の３０〜６０分前に、アセトアミノフェン（６００ｍｇ）および抗ヒスタミンを摂取する。ＤＣ培養物の場合、濃縮した白血球画分を白血球分離によって集める。密度勾配遠心分離（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によって、白血球分離生成物からＰＭＢＣを単離する。組み換えヒトＩＬ−４（５００Ｕ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ；８００Ｕ／ｍｌ；Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．）を追加した、血清を含まないＸ−ＶＩＶＯ  １５培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｃｏｒｐ．）中のＤＣ培養物について、半接着性細胞画分を使用する。７日後、未熟ＤＣを集め、組織学的に明細胞がんと分類された腫瘍組織から抽出された全ＲＮＡでトランスフェクトする。免疫学的モニタリング試験のために使用されるコントロールＲＮＡを、自家良性腎細胞（ＲＥ）またはＰＢＭＣから単離する。未熟ＤＣのトランスフェクションは、電気穿孔によって行われる。ＤＣをＰＢＳで洗浄し、４×１０７細胞／ｍｌの濃度でＶｉａＳｐａｎ（Ｂａｒｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に再懸濁させる。次いで、細胞を、１×１０６細胞あたり５μｇのＲＮＡと一緒に５分間インキュベートし、０．４ｃｍキュベット中、３００Ｖ、１５０μＦの指数関数的減衰によって電気穿孔する（Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）。電気穿孔の後、細胞をＸ−ＶＩＶＯ  １５培地に再懸濁させ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−α、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１β、１５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および、１μｇ／ｍｌ  プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２；Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）存在下、２０時間かけて成熟させる。投与前に、細胞を特性決定し、完全に成熟したＤＣＬｉｎｎｅｇ、ＨＬＡクラスＩおよびＩＩｈｉｇｈ、ＣＤ８６ｈｉｇｈおよびＣＤ８３ｈｉｇｈの典型的な表現型を満たすことを確認する。
【０５９０】
（免疫状態の評価）
免疫化前、免疫化中、免疫化後に、ＰＢＭＣを用い、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のＥＬＩＳＰＯＴ分析を行う。完全ＲＰＭＩ  １６４０培地中、ＰＢＭＣを一晩培養する。ネガティブ分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によって、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をＰＭＢＣから単離する。ブロッキング後、１×１０５のＴ細胞および１×１０４のＲＮＡによってトランスフェクトされたＤＣを、２μｇ／ｍｌ  ＩＦＮ−γ捕捉抗体（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）またはＩＬ−４捕捉抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）であらかじめコーティングされた９６ウェルニトロセルロースプレート（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ−ＩＰ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の各ウェルに加える。プレートを３７℃で２０時間インキュベートし、ビオチン化ＩＦＮ−γ検出抗体（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）またはビオチン化ＩＬ−４抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を各ウェルに加える。次いで、細胞を室温でさらに２時間インキュベートし、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（１μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、基質（ＫＰＬ）でプレートを現像する。洗浄後、自動化ＥＬＩＳＰＯＴリーダ（Ｚｅｉｓｓ）を用い、スポットを計測する。
【０５９１】
ＲＮＡによってトランスフェクトされたＤＣと自己ＰＭＢＣを一緒に培養することによって、ＣＴＬアッセイを行う。細胞を一旦再懸濁させ、５日後およびその後１日おきにＩＬ−２（２０単位／ｍｌ）を加える。１２日培養した後、エフェクター細胞を集める。２００μｌの完全ＲＰＭＩ１６４０中、標的細胞を１００μＣｉのＮａ２［５１ＣｒＯ４］（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で、３７℃、５％ＣＯ２で１時間標識し、５１Ｃｒ標識された標的細胞を、エフェクター細胞とともに、完全ＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃で５時間インキュベートする。次いで、５０μｌの上澄みを集め、５１Ｃｒの放出をシンチレーションカウンタで測定する。
【０５９２】
増殖アッセイのために、ｍＲＮＡによってトランスフェクトされたＤＣ存在下、精製されたＣＤ３＋Ｔ細胞を丸底マイクロプレートに接種する。Ｔ細胞のみをバックグラウンドコントロールとして使用する。４日後、１μＣｉの［メチル−３Ｈ］チミジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）をさらに１６時間かけて各ウェルに加える。チミジンの組み込みを、液体シンチレーションカウンタを用いて決定する。
【０５９３】
（ＭＴＴアッセイにおいて決定されたＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質の細胞毒性）
さまざまな濃度のＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質とともに６時間インキュベートした後、細胞を５×１０３細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに接種する。４８時間インキュベートした後、５ｍｇ／ｍｌストックから２０μｌのＭＴＴを加える。４時間後、１００μｌのイソプロパノール／０．１Ｍ塩酸を加えることによって、ホルマザン結晶を可溶化する。ホルマザン生成物の吸光度を、５７０ｎｍで、ＥＬＩＳＡプレートリーダーで測定する。
【０５９４】
ワクチンによって誘発されたＣＤ４＋Ｔ細胞によるサイトカイン分泌を、ヒトＴｈ−１／Ｔｈ−２サイトカインキット（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用い、製造業者の指示に従って測定する。単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＲＮＡによってトランスフェクトされたＤＣを１０：１の比率で用い、一晩かけて再び刺激する。
【０５９５】
以下の抗体を用い、４色ＦＡＣＳ分析を行う。抗−ＣＤ４  ＦＩＴＣ、抗−ＣＤ４５ＲＯ、抗−ＣＤ４５ＲＡ（ＣＡＬＴＡＧ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、抗−ＣＤ２５  ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および抗−ＧＩＴＲ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびアイソタイプのコントロール（ＣＡＬＴＡＧ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。抗体標識後、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａセルソーターを用い、ＣＤ４＋／ＣＤ２５ｎｅｇ、ＣＤ４＋／ＣＤ２５ｉｎｔおよびＣＤ４＋／ＣＤ２５ｈｉｇｈ  Ｔ細胞のソーティングを行う。ＦｏｘＰ３の細胞内検出のために、４℃で４５分間、３０μｇ／ｍｌ  ジギトニンを細胞に浸透させる。その後、１０μｇ／ｍｌのジギトニン存在下、細胞を抗−ＦｏｘＰ３抗体（Ａｂｅａｍ）およびＲ−フィコエリスリン抗−ヤギＩｇＧを用い、４℃で３０分間かけて染色する。染色後、細胞を固定し、ＦＡＣＳによって分析する。細胞内ＣＴＬＡ−４検出のために、Ｔ細胞を透過処理し、固定し、ビオチン化抗−ＣＤ１５２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、次いで、ＡＰＣ−ストレプトアビジン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色する。合計で１×１０６細胞を染色バッファー（１％  ＰＣＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％のアジ化ナトリウムを含むＰＣ）に懸濁させ、抗体とともに４℃で２０分間インキュベートする。
【０５９６】
ＤＴ改変体−ＩＬ２融合タンパク質を投与する前および投与して４日後に、試験被検者のＰＢＭＣから単離されたＴｒｅｇの抑制活性を、すでに記載されているように分析する（Ｔｓａｋｎａｒｉｄｉｓら、２００３．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．７４：２９６〜３０８）。磁気ビーズ分離技術を用い、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔ細胞を試験被検者のＰＭＢＣから単離する。細胞をＰＢＳで洗浄し、完全ＲＰＭＩ  １６４０培地に再懸濁させ、抗−ＣＤ３／ＣＤ２８抗体（０．４μｇ／ウェル）（ＣＡＬＴＡＧ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）であらかじめコーティングした９６ウェル丸底プレートに接種する。ＣＤ４＋／ＣＤ２５−細胞を２．０×１０４／ウェルで単独で、またはＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞と組み合わせて１：２（ＣＤ４＋／ＣＤ２５：ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）の比率で、３ウェルずつに接種する。５日目に、最後の１６時間の培養のために１μＣｉの３Ｈ−チミジンを加える。次いで、細胞をガラスファイバーフィルタに集め、放射能標識されたチミジンの取り込みについて評価する。
【０５９７】
β−アクチン転写体のリアルタイムＰＣＲに基づく定量の詳細は、文献にすでに記載されている。Ｈｓ００２０３９５８ｍｌ  Ｔａｑ−Ｍａｎ遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、製造業者によって与えられるプロトコルに従って、ＦｏｘＰ３  ｍＲＮＡ転写体を定量した。全長ＦｏｘＰ３挿入物を含むプラスミドを使用し、標準曲線を作成する。
【０５９８】
治療前後のＴ細胞分析は、免疫治療が終了したすべての患者について、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴによって行われる。免疫摂取後の抗原特異的なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を、ウィルコクソンの符号順位検定を用いて比較し、Ｔ細胞応答の変化率が治療前後で同等であるというヌル仮説を分析する。両側Ｐ値が０．５未満であれば、統計的に有意であるとされる。
【０５９９】
（実施例２０）
（Ｖｅｒｏ細胞におけるＤＴ改変体の細胞毒性試験）
実施例１に従って、ＤＴタンパク質の以下の改変体を構築し、発現し、精製した。本明細書に記載されるプロトコルに従って細胞毒性アッセイを行い、結果を野生型ＤＴの細胞毒性のレベルと比較した。
【表２０】
2016519651.tif 000025
【０６００】
結果：ＤＴ改変体は、野生型ＤＴに匹敵する顕著な細胞毒性を示した。
【０６０１】
（実施例２１）
（ＤＴ−ＩＬ２融合タンパク質の改変体の細胞毒性試験）
実施例１に従って、ＤＴ−ＩＬ２融合タンパク質の以下の改変体を構築し、発現し、精製した。
【表２１】
2016519651.tif 000026
【０６０２】
本明細書に記載されるプロトコルに従って細胞毒性アッセイを行った。合計６種類の濃度について（各々２つずつ）、ジフテリア毒素改変体の２倍順次希釈を用いてＨＨ−ＣＤ２５細胞を処理し、４．５日目に、生存細胞／死亡細胞の分析をフローサイトメトリー（７ＡＡＤに対する前方散乱）によって行った。最終的なタンパク質の濃度は、１０００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ｍｌ、６２．５ｎｇ／ｍｌ、３１．３ｎｇ／ｍｌであった。
【０６０３】
Ｏｎｔａｋ／ＤＴ−ＩＬ２タンパク質の２倍順次希釈物を４８ウェル組織培養プレート中で調製する。培地は、１０％ＦＢＳを追加したＲＰＭＩ−１６４０であり、抗生物質は、ペニシリン／ストレプトアビジンである。
【０６０４】
４８ウェルプレートにおいて、ＤＴ−ＩＬ２希釈物の設定は、以下のとおりである。それぞれの希釈セットの１つめのウェルでは、合計１ｍｌの培地中に２，０００ｎｇ／ｍｌのＤＴ−ＩＬ２を接種する。例えば、ＤＴ−ＩＬ２の濃度が５００ｎｇ／μｌである場合、９９６μｌの培地に４．０μｌのＤＴ−ＩＬ２を接種する。必ず、培地のために正確なＰ−１０００ピペットを使用し、ＤＴ−ＩＬ２をピペット操作するために、正確なＰ−１０ピペットまたは等価物を使用すべきである。十分に混合する。
【０６０５】
それぞれの希釈セットの他のすべてのウェルにおいて、培地５００μｌをピペットで測り取る。次いで、Ｐ−１０００ピペットを用い、ウェル１からウェル２に５００μｌを移し（十分に混合し）、次いで、ウェル２からウェル３に移すなどによって、合計で８〜１０の希釈物について、通常の順次希釈を行う。最後の希釈の後に、使用しなかった最後の物質５００μｌを捨てる。
【０６０６】
希釈が終了したら、それぞれのウェルに、開始濃度４×１０４細胞／ｍｌでＲＰＭＩ培地中のＨＨ−ＣＤ２５細胞５００μｌを移す。
【０６０７】
このようにして終了すると、すべてのウェルは、合計容積が１．０ｍｌである。ウェル番号１のＤＴ−ＩＬ２の濃度は、１０００ｎｇ／ｍｌ（１６．６ｎＭ）であり、ウェル番号２では５００ｎｇ／ｍｌであり、ウェル番号３では２５０ｎｇ／ｍｌなどである。すべてのウェルに２０，０００個のＨＨ−ＣＤ２５細胞／ウェルが存在している。未治療群のためのコントロールとして、４〜６ウェルの未処理の細胞を培養する。さらに、統計分析が望ましい場合、希釈物を３個ずつ培養する。
【０６０８】
３７℃、５％ＣＯ２でプレートを５日間培養する。５日目に、それぞれのウェル中の細胞をＰ−１０００ピペットを用いて十分に再懸濁させ、フローサイトメトリー分析のために、個々のＦＡＣＳ管に移す。細胞を遠心分離処理し、７−ＡＡＤ生存細胞／死亡細胞株（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の１：５００希釈物を含有するＤＰＢＳで１回洗浄し、次いで、２５０μｌのＤＰＢＳに細胞を再懸濁させる。これ以降は、細胞を染色トレー中、氷の上に乗せておく。
【０６０９】
２パラメータ、７−ＡＡＤ組み込みに対する前方散乱（ＦＳＣ）で、細胞をフローサイトメトリーによって分析する。Ｆｌｏｗｊｏソフトウエア（または等価物）を用いたその後の分析のために、最初に、細胞破壊片（膜フラグメント、細胞小器官、アポトーシス小体などを含む低前方散乱材料）を除外するゲートを作成する。次いで、それぞれのサンプルにおいて、死亡細胞（７−ＡＡＤポジティブ、ＦＳＣによって小さい）に対し、生存細胞（７−ＡＡＤネガティブ、ＦＳＣによって大きい）の頻度を決定するための第２のゲートを作成する。
【０６１０】
結果を以下の比率として通常の状態でプロットする：それぞれの治療群の生存細胞％／未治療のコントロール群の生存細胞％。
【０６１１】
結果：ＤＴ  Ｍ１５Ｔ，Ｓ３０６Ｇ−ＩＬ２は、ＤＴ  ｗｔ−ＩＬ２に匹敵する顕著な細胞毒性を示した（図１９：ＤＴ−ＩＬ２濃度は、左から右に以下のとおりである。１．  １０００ｎｇ／ｍｌ（１６．６ｎＭ）；２．  ５００ｎｇ／ｍｌ（８．３２ｎＭ）；３．  ２５０ｎｇ／ｍｌ（４．１６ｎＭ）；４．  １２５ｎｇ／ｍｌ（２．０８ｎＭ）；５．  ６２．５ｎｇ／ｍｌ（１．０４ｎＭ）；６．  ３１．３ｎｇ／ｍｌ（０．５２ｎＭ））。ＤＴ  Ｍ１５Ｔ，Ｓ３０６Ｇ−ＩＬ２は、ＤＴ  Ｍ１５Ｄ，Ｓ３０６Ｇ−ＩＬ２およびＤＴ  Ｆ１３Ｄ，Ｓ３０６Ｇ−ＩＬ２と比較して、予想できない優れた細胞毒性を示した。
【０６１２】
（実施例２２）
（ＤＴ−ハーセプチンＳｃＦｖ融合タンパク質改変体の細胞毒性試験）
実施例１に従って、以下のＤＴ−ハーセプチンＳｃＦｖ融合タンパク質改変体を構築し、発現させ、精製した。
【０６１３】
（１）ＤＴｗｔ−ＨＥＲ（１０００ｕｇ／ｍｌストック）；（２）ＤＴ−Ｍ１５Ｔ，Ｓ３０６Ｇ−ＨＥＲ（９００ｕｇ／ｍｌストック）；（３）ハーセプチン（Ｅｕｒｅｋａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．製のＥＴ１０１Ｈ  ｍＡｂ；３０００ｕｇ／ｍｌストック）。
【０６１４】
本明細書に記載されるプロトコルに従って、細胞毒性アッセイを行った。改変体の細胞毒性を試験するために、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（ＨＥＲ２ネガティブ）およびＳＫ−ＢＲ−３細胞（ＨＥＲ２ポジティブ）をネガティブコントロールとしてそれぞれ使用した。合計１８種類の濃度について、ＤＴ−ＨＥＲ  ＳｃＦｖ改変体の２倍順次希釈を用いて細胞を処理した。５日目に細胞を集め、トリプシンを使用して、生きている接着性細胞を脱着させた。生存細胞／死亡細胞の分析をフローサイトメトリー（７ＡＡＤに対する前方散乱）によって行った。タンパク質の濃度は、２．５μｇ／ｍｌから１９ｐｇ／ｍｌの範囲であった。
【０６１５】
結果：試験したどのタンパク質も、予想通り、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞に細胞毒性を示さなかった（ＨＥＲ２ネガティブ）（図２０）。ＤＴ  Ｍ１５Ｔ，Ｓ３０６Ｇ−ＨＥＲは、ＤＴ  ｗｔ−ＨＥＲに匹敵する顕著な細胞毒性を示した（図２１）。ＤＴ−ハーセプチンＳｃＦｖ濃度は、左から右に以下のとおりである。１．  ２５００ｎｇ／ｍｌ（３４．６ｎＭ）；２．  １２５０ｎｇ／ｍｌ（１７．３ｎＭ）；３．  ６２５ｎｇ／ｍｌ（８．６５ｎＭ）；４．  ３１３ｎｇ／ｍｌ（４．３３ｎＭ）；５．  １５６ｎｇ／ｍｌ（２．１６ｎＭ）；６．  ７８．１ｎｇ／ｍｌ（１．０８ｎＭ）；７．  ３９．１ｎｇ／ｍｌ（５４１ｐＭ）；８．  １９．５ｎｇ／ｍｌ（２７０ｐＭ）；９．  ９．８ｎｇ／ｍｌ（１３６ｐＭ）；１０．  ４．９ｎｇ／ｍｌ（６７．８ｐＭ）；１１．  ２．４ｎｇ／ｍｌ（３３．２ｐＭ）；１２．  １．２ｎｇ／ｍｌ（１６．６ｐＭ）；１３．  ０．６１ｎｇ／ｍｌ（８．４４ｐＭ）；１４．  ０．３１ｎｇ／ｍｌ（４．２９ｐＭ）；１５．  ０．１５ｎｇ／ｍｌ（２．０８ｐＭ）；１６．  ０．０７６ｎｇ／ｍｌ（１．０５ｐＭ）；１７．  ０．０３８ｎｇ／ｍｌ（５２６ｆＭ）；１８．  ０．０１９ｎｇ／ｍｌ（２６３ｆＭ）。
【０６１６】
（実施例２３）
（２種類のＨＥＲ２ポジティブ細胞株における、ＤＴ−ハーセプチンＳｃＦｖ融合タンパク質改変体の細胞毒性）
実施例１に従って、以下のＤＴ−ハーセプチンＳｃＦｖ融合タンパク質改変体を構築し、発現させ、精製した。
【０６１７】
（１）ＤｉＤＴ−ＨＥＲ（ＤＴ−Ｍ１５Ｔ，Ｓ３０６Ｇ−ＨＥＲ；９００ｕｇ／ｍｌストック）；（３）ハーセプチンバイオシミラー（Ｅｕｒｅｋａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．製のＥＴ１０１Ｈ  ｍＡｂ；３０００ｕｇ／ｍｌストック）。
【０６１８】
本明細書に記載されるプロトコルに従って、細胞毒性アッセイを行った。改変体の細胞毒性を試験するために、ＢＴ−４７４細胞（ＨＥＲ２ポジティブ）およびＳＫ−ＢＲ−３細胞（ＨＥＲ２ポジティブ）を使用した。２５００ｎｇ／ｍｌ〜０．３ｐｇ／ｍｌの範囲の合計２４種類の濃度について、ＤｉＤＴ−ＨＥＲ  ＳｃＦｖの２倍順次希釈を用いて細胞を処理した。最も高い１２種類の濃度についてのみＥＴ１０１Ｈを使用した。５日目に細胞を集め、トリプシンを使用して、生きている接着性細胞を脱着させた。生存細胞／死亡細胞の分析をフローサイトメトリー（７ＡＡＤに対する前方散乱）によって行った。
【０６１９】
結果：ＤＴ  Ｍ１５Ｔ，Ｓ３０６Ｇ−ＨＥＲは、ＤＴ  ｗｔ−ＨＥＲに匹敵する顕著な細胞毒性を示した（図２２）。ＤＴ−ハーセプチンＳｃＦｖ濃度は、左から右に以下のとおりである。１．  ２５００ｎｇ／ｍｌ（３４．６ｎＭ）；２．  １２５０ｎｇ／ｍｌ（１７．３ｎＭ）；３．  ６２５ｎｇ／ｍｌ（８．６５ｎＭ）；４．  ３１３ｎｇ／ｍｌ（４．３３ｎＭ）；５．  １５６ｎｇ／ｍｌ（２．１６ｎＭ）；６．  ７８．１ｎｇ／ｍｌ（１．０８ｎＭ）；７．  ３９．１ｎｇ／ｍｌ（５４１ｐＭ）；８．  １９．５ｎｇ／ｍｌ（２７０ｐＭ）；９．  ９．８ｎｇ／ｍｌ（１３５ｐＭ）；１０．  ４．９ｎｇ／ｍｌ（６７．６ｐＭ）；１１．  ２．４ｎｇ／ｍｌ（３３．８ｐＭ）；１２．  １．２ｎｇ／ｍｌ（１６．９ｐＭ）；１３．  ０．６１ｎｇ／ｍｌ（８．４５ｐＭ）；１４．  ０．３１ｎｇ／ｍｌ（４．２２ｐＭ）；１５．  ０．１５ｎｇ／ｍｌ（２．１１ｐＭ）；１６．  ０．０７６ｎｇ／ｍｌ（１．０６ｐＭ）；１７．  ０．０３８ｎｇ／ｍｌ（５２８ｆＭ）；１８．  ０．０１９ｎｇ／ｍｌ（２６４ｆＭ）；１９．  ０．００９５ｎｇ／ｍｌ（１３２ｆＭ）；２０．  ０．００４８ｎｇ／ｍｌ（６６ｆＭ）；２１．  ０．００２４ｎｇ／ｍｌ（３３ｆＭ）；２２．  ０．００１２ｎｇ／ｍｌ（１６ｆＭ）；２３．  ０．０００６ｎｇ／ｍｌ（８．２ｆＭ）；２４．  ０．０００３ｎｇ／ｍｌ（４．１ｆＭ）。ＥＴ１０１Ｈを、左側に示される最も高い１２種類の濃度で使用した（２５００ｎｇ／ｍｌから１．２ｎｇ／ｍｌ）。
【０６２０】
（実施例２４）
本明細書に記載される方法を用いて製造された例示的な改質されたジフテリア毒素分子は、限定されないが、以下に提供されるものを含む。ジフテリア毒素分子は、１つ以上のＶＬＳモチーフ、１つ以上のＴ細胞エピトープまたはこれらの組み合わせ内で改質されている。
【０６２１】
（ジフテリア毒素−ΔＲアミノ酸配列）
DT382-FLAG-His(SEQ ID NO: 412): 
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSELADYKDDDDKGLEHHHHHH.
【０６２２】
DT382(V7S)(SEQ ID NO: 413):
MGADDVSDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６２３】
DT382(V7T)(SEQ ID NO: 414):
MGADDVTDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６２４】
DT382(V7N)(SEQ ID NO: 415):
MGADDVNDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６２５】
DT382(V7D) (SEQ ID NO: 416):
MGADDVDDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６２６】
DT382(D8E) (SEQ ID NO: 417):
MGADDVVESSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６２７】
DT382(D8N) (SEQ ID NO: 418):
MGADDVVNSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６２８】
DT382(S9A) (SEQ ID NO: 419):
MGADDVVDASKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６２９】
DT382(S9G) (SEQ ID NO: 420):
MGADDVVDGSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６３０】
DT382(S9T) (SEQ ID NO: 421):
MGADDVVDTSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６３１】
DT382(V29S) (SEQ ID NO: 422):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYSDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６３２】
DT382(V29T) (SEQ ID NO: 423):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYTDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６３３】
DT382(V29N) (SEQ ID NO: 424):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYNDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６３４】
DT382(V29D) (SEQ ID NO: 425):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYDDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６３５】
DT382(D30E) (SEQ ID NO: 426):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVESIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６３６】
DT382(D30N) (SEQ ID NO: 427):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVNSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６３７】
DT382(S31T) (SEQ ID NO: 428):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDTIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６３８】
DT382(S31G) (SEQ ID NO: 429):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDGIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６３９】
DT382(S31N) (SEQ ID NO: 430):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDNIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKM.SESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６４０】
DT382(I290S) (SEQ ID NO: 431):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVSDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６４１】
DT382(I290T) (SEQ ID NO: 432):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVTDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６４２】
DT382(I290D) (SEQ ID NO: 433):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVDDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６４３】
DT382(D291E) (SEQ ID NO: 434):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIESETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６４４】
DT382(S292A) (SEQ ID NO: 435):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDAETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６４５】
DT382(S292T) (SEQ ID NO: 436):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDTETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６４６】
DT382(S292G) (SEQ ID NO: 437):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDGETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６４７】
DT382(V7N V29N) (SEQ ID NO: 438):
MGADDVNDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYNDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６４８】
DT382(V7N V29T) (SEQ ID NO: 439):
MGADDVNDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYTDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６４９】
DT382(V7N V29D) (SEQ ID NO: 440):
MGADDVNDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYDDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６５０】
DT382(V7T V29N) (SEQ ID NO: 441):
MGADDVTDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYNDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６５１】
DT382(V7T V29T) (SEQ ID NO: 442):
MGADDVTDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYTDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６５２】
DT382(V7T V29D) (SEQ ID NO: 443):
MGADDVTDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYDDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６５３】
DT382(V7N V29N I290N)-FLAG-His: Variant 13(SEQ ID NO: 444):
MGADDVNDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYNDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVNDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSELADYKDDDDKGLEHHHHHH.
【０６５４】
DT382(V7N V29N S292A)-FLAG-His: Variant 14(SEQ ID NO: 445):
MGADDVNDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYNDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDAETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSELADYKDDDDKGLEHHHHHH.
【０６５５】
DT382 (V7N V29N S292T)-FLAG-His: Variant 15(SEQ ID NO: 446):
MGADDVNDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYNDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDTETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSELADYKDDDDKGLEHHHHHH.
【０６５６】
DT382(V7N V29T S292T)-FLAG-His: Variant 16(SEQ ID NO: 447):
MGADDVNDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYTDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDTETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSELADYKDDDDKGLEHHHHHH.
【０６５７】
DT382(V7N V29T I290T)-FLAG-His: Variant 17(SEQ ID NO: 448):
MGADDVNDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYTDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVTDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSELADYKDDDDKGLEHHHHHH.
【０６５８】
DT382(V7N V29T I290N)-FLAG-His: Variant 18(SEQ ID NO: 449):
MGADDVNDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYTDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVNDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSELADYKDDDDKGLEHHHHHH.
【０６５９】
DT382 (V7N V29T S292A) (SEQ ID NO: 450):
MGADDVNDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYTDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDAETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６６０】
DT382(V7T V29T I290N) (SEQ ID NO: 451):
MGADDVTDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYTDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVNDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６６１】
DT382(V7T V29T I290T) (SEQ ID NO: 452):
MGADDVTDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYTDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVTDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６６２】
DT382(V7T V29T S292A) (SEQ ID NO: 453):
MGADDVTDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYTDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDAETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６６３】
DT382(V7T V29T S292T) (SEQ ID NO: 454):
MGADDVTDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYTDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDTETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６６４】
DT382(G53E): Null construct(SEQ ID NO: 455):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６６５】
DT382(V7S) (SEQ ID NO: 456):
MGADDVSDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６６６】
DT382(V7T) (SEQ ID NO: 457):
MGADDVTDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６６７】
DT382(V7N) (SEQ ID NO: 458):
MGADDVNDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６６８】
DT382(V7D) (SEQ ID NO: 459):
MGADDVDDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６６９】
DT382(V97A) (SEQ ID NO: 460):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKADNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６７０】
DT382(V97T) (SEQ ID NO: 461):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKTDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６７１】
DT382(V97D) (SEQ ID NO: 462):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKDDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６７２】
DT382(L107A) (SEQ ID NO: 463):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKEAGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６７３】
DT382(L107N) (SEQ ID NO: 464):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKENGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６７４】
DT382(M116A) (SEQ ID NO: 465):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLAEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６７５】
DT382(M116Q) (SEQ ID NO: 466):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLQEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６７６】
DT382(M116N) (SEQ ID NO: 467):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLNEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６７７】
DT382(F124A) (SEQ ID NO: 468):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEAIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６７８】
DT382(F124H) (SEQ ID NO: 469):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEHIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６７９】
DT382(F124K) (SEQ ID NO: 470):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEKIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６８０】
DT382(V148A) (SEQ ID NO: 471):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSAEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６８１】
DT382(V148T) (SEQ ID NO: 472):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSTEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６８２】
DT382(L298A) (SEQ ID NO: 473):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNAEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６８３】
DT382(L298N) (SEQ ID NO: 474):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNNEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６８４】
DT382(V7T F124H) (SEQ ID NO: 475):
MGADDVTDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEHIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６８５】
DT382(V7N F124H) (SEQ ID NO: 476):
MGADDVNDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEHIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６８６】
DT382(V7D F124H) (SEQ ID NO: 477):
MGADDVDDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEHIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６８７】
DT382(V7T L107A F124H) (SEQ ID NO: 478):
MGADDVTDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKEAGLSLTEPLMEQVGTEEHIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６８８】
DT382(V7N L107A F124H) (SEQ ID NO: 479):
MGADDVNDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKEAGLSLTEPLMEQVGTEEHIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６８９】
DT382(V7D L107A F124H) (SEQ ID NO: 480):
MGADDVDDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKEAGLSLTEPLMEQVGTEEHIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６９０】
DT382(V7T L107N F124H) (SEQ ID NO: 481):
MGADDVTDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKENGLSLTEPLMEQVGTEEHIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６９１】
DT382(V7N L107N F124H) (SEQ ID NO: 482):
MGADDVNDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKENGLSLTEPLMEQVGTEEHIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６９２】
DT382(V7D L107N F124H) (SEQ ID NO: 483):
MGADDVDDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKENGLSLTEPLMEQVGTEEHIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６９３】
DT382(V7T V97A L107N F124H) (SEQ ID NO: 484):
MGADDVTDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKADNAETIKKENGLSLTEPLMEQVGTEEHIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６９４】
DT382(V7N V97A L107N F124H) (SEQ ID NO: 485):
MGADDVNDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKADNAETIKKENGLSLTEPLMEQVGTEEHIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６９５】
DT382(V7D V97A L107N F124H) (SEQ ID NO: 486):
MGADDVDDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKADNAETIKKENGLSLTEPLMEQVGTEEHIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６９６】
DT382(V7T V97D L107N F124H) (SEQ ID NO: 487):
MGADDVTDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKDDNAETIKKENGLSLTEPLMEQVGTEEHIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６９７】
DT382(V7N V97D L107N F124H) (SEQ ID NO: 488):
MGADDVNDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKDDNAETIKKENGLSLTEPLMEQVGTEEHIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６９８】
DT382(V7D V97D L107N F124H) (SEQ ID NO: 489):
MGADDVDDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKDDNAETIKKENGLSLTEPLMEQVGTEEHIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０６９９】
DT382(V7T V97T L107N F124H) (SEQ ID NO: 490):
MGADDVTDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKTDNAETIKKENGLSLTEPLMEQVGTEEHIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０７００】
DT382(V7N V97T L107N F124H) (SEQ ID NO: 491):
MGADDVNDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKTDNAETIKKENGLSLTEPLMEQVGTEEHIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０７０１】
DT382(V7D V97T L107N F124H) (SEQ ID NO: 492):
MGADDVDDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKTDNAETIKKENGLSLTEPLMEQVGTEEHIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０７０２】
DT382(V7N V29N F124H I290N) (SEQ ID NO: 493):
MGADDVNDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYNDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEHIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVNDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０７０３】
DT382(V7N V29N F124H S292A) (SEQ ID NO: 494):
MGADDVNDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYNDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEHIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDAETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０７０４】
DT38 (V7N V29N F124H S292T) (SEQ ID NO: 495):
MGADDVNDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYNDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEHIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDTETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０７０５】
DT382(V7N V29T F124H S292A) (SEQ ID NO: 496):
MGADDVNDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYTDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEHIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDAETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０７０６】
DT382(V7N V29T F124H I290T) (SEQ ID NO: 497):
MGADDVNDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYTDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEHIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVTDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０７０７】
DT382(V7N V29T F124H I290N) (SEQ ID NO: 498):
MGADDVNDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYTDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEHIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVNDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０７０８】
DT382 (V7N V29N I290T) (SEQ ID NO: 499):
MGADDVNDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYNDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVTDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０７０９】
DT382 (M15T)(SEQ ID NO: 500):
MGADDVVDSSKSFVTENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０７１０】
DT382 (M15D)(SEQ ID NO: 501):
MGADDVVDSSKSFVDENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０７１１】
DT382 (T112D)(SEQ ID NO: 502):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLDEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０７１２】
DT382 (E117D)(SEQ ID NO: 503):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMDQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０７１３】
DT382 (R127A)(SEQ ID NO: 504):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKAFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０７１４】
DT382 (S306G)(SEQ ID NO: 505):
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALGILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０７１５】
DT382 (M15T V97A)(SEQ ID NO: 506):
MGADDVVDSSKSFVTENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKADNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０７１６】
DT382 (M15T V97T)(SEQ ID NO: 507):
MGADDVVDSSKSFVTENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKTDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０７１７】
DT382 (M15T T112D)(SEQ ID NO: 508):
MGADDVVDSSKSFVTENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLDEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０７１８】
DT382 (M15T E117D)(SEQ ID NO: 509):
MGADDVVDSSKSFVTENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMDQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０７１９】
DT382 (M15T R127A)(SEQ ID NO: 510):
MGADDVVDSSKSFVTENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKAFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０７２０】
DT382 (M15T V148T)(SEQ ID NO: 511):
MGADDVVDSSKSFVTENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSTEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０７２１】
DT382 (M15T S306G)(SEQ ID NO: 512):
MGADDVVDSSKSFVTENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALGILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０７２２】
DT382 (M15T V97T T112D E117D R127A V148T S306G)(SEQ ID NO: 513):
MGADDVVDSSKSFVTENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKTDNAETIKKELGLSLDEPLMDQVGTEEFIKAFGDGASRVVLSLPFAEGSSSTEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALGILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYS.
【０７２３】
本発明は、本発明の精神または必須の特徴から逸脱することなく、他の形態で具現化されてもよく、または他の様式で行われてもよい。従って、本開示は、示されているすべての態様におけるものとして考慮されるべきであり、限定的ではなく、その意味に含まれるすべての変化およびその等価な範囲は、本発明に包含されることを意図している。
【０７２４】
種々の参考文献が本明細書全体で引用されており、それぞれが、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。
【図１】
2016519651.tif 000027
【図２】
2016519651.tif 000028
【図３】
2016519651.tif 000029
【図４】
2016519651.tif 000030
【図５】
2016519651.tif 000031
【図６】
2016519651.tif 000032
【図７】
2016519651.tif 000033
【図８】
2016519651.tif 000034
【図９】
2016519651.tif 000035
【図１０】
2016519651.tif 000036
【図１１】
2016519651.tif 000037
【図１２】
2016519651.tif 000038
【図１３】
2016519651.tif 000039
【図１４】
2016519651.tif 000040
【図１５】
2016519651.tif 000041
【図１６】
2016519651.tif 000042
【図１７】
2016519651.tif 000043
【図１８】
2016519651.tif 000044
【図１９】
2016519651.tif 000045
【図２０】
2016519651.tif 000046
【図２１】
2016519651.tif 000047
【図２２】
2016519651.tif 000048
【配列表】
2016519651000001.app
【国際調査報告】
2016519651.tif 000049
2016519651.tif 000050
2016519651.tif 000051
2016519651.tif 000052