(57)【要約】  インターロイキン-4(IL4)と、特異的結合メンバーとを含むコンジュゲートが開示される。特異的結合メンバーは、好ましくは、新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合し、このコンジュゲートを、in vivoで組織に対してIL4を標的化するために用いることができる。特に、がんおよび/または関節リウマチ(RA)、多発性硬化症(MS)、子宮内膜症、炎症性腸疾患(IBD)、乾癬、乾癬性関節炎、および歯周炎などの自己免疫疾患などの、疾患/障害の処置におけるそのようなコンジュゲートの治療的使用が想定される。コンジュゲートを用いて処置または防止することができる他の疾患としては、自己免疫性膵島炎および糖尿病、特に、自己免疫性糖尿病が挙げられる。がんの処置においては、前記コンジュゲートを、インターロイキン-12(IL12)またはインターロイキン-2(IL2)のいずれかと、特異的結合メンバーとを含むコンジュゲートと組み合わせて投与することができる。自己免疫疾患の処置においては、コンジュゲートを、デキサメタゾンなどの糖質コルチコイドと組み合わせて投与することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン-4(IL4)と、新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する特異的結合メンバーとを含むコンジュゲート。
【請求項２】
特異的結合メンバーが抗体である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
特異的結合メンバーがダイアボディである、請求項２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
特異的結合メンバーがフィブロネクチンに結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
特異的結合メンバーがフィブロネクチンのエクストラドメイン-A(ED-A)に結合する、請求項４に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
特異的結合メンバーが配列番号12〜17に記載の抗体F8の相補性決定領域(CDR)を有する抗原結合部位を含む、請求項５に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
特異的結合メンバーが配列番号18および19に記載の抗体F8のVHおよびVLドメインを含む、請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
特異的結合メンバーが配列番号20に記載の抗体F8のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
コンジュゲートが配列番号22に記載のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
特異的結合メンバーがフィブロネクチンのエクストラドメイン-B(ED-B)に結合する、請求項４に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
特異的結合メンバーが配列番号25〜30に記載の抗体L19の相補性決定領域(CDR)を有する抗原結合部位を含む、請求項１０に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
特異的結合メンバーが配列番号31および32に記載の抗体L19のVHおよびVLドメインを含む、請求項１１に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
特異的結合メンバーが配列番号33または配列番号59または配列番号62に記載の抗体L19のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
特異的結合メンバーがテナシンCのA1ドメインに結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
特異的結合メンバーが配列番号34〜39に記載の抗体F16の相補性決定領域(CDR)を有する抗原結合部位を含む、請求項１４に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
特異的結合メンバーが配列番号40および41に記載の抗体F16のVHおよびVLドメインを含む、請求項１５に記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
特異的結合メンバーが配列番号42または配列番号60に記載の抗体F16のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
IL4がヒトIL4である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
該IL4が、配列番号54に記載の配列を含むか、もしくはそれからなる；あるいは、配列番号54に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、ただし配列番号54の位置38の残基がアスパラギン残基の代わりにセリン、グルタミン、またはアラニン残基である、請求項１８に記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
IL4が配列番号67に記載の配列を含むか、またはそれからなる、請求項１９に記載のコンジュゲート。
【請求項２１】
療法によるヒトまたは動物の身体の処置のための方法における使用のための請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項２２】
in vivoで新血管系にIL4を標的化することにより、患者における血管新生を阻害する方法における使用のための請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項２３】
患者における、血管新生の結果である新血管系の部位にIL4を送達する方法における使用のための請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項２４】
治療上有効量の請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートを患者に投与することを含む、患者における新血管系の部位にIL4を標的化することにより血管新生を阻害する方法。
【請求項２５】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートをヒトまたは動物に投与することを含む、ヒトまたは動物における血管新生の結果である新血管系の部位にIL4を送達する方法。
【請求項２６】
炎症性自己免疫疾患を処置する方法における使用のための請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項２７】
患者における炎症性自己免疫疾患の部位にIL4を送達する方法における使用のための請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項２８】
治療上有効量の請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートを患者に投与することを含む、患者における炎症性自己免疫疾患を処置する方法。
【請求項２９】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートをヒトまたは動物に投与することを含む、ヒトまたは動物における炎症性自己免疫疾患の部位にIL4を送達する方法。
【請求項３０】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートと、糖質コルチコイドとを、それを必要とする個体に投与することを含む、炎症性自己免疫疾患を処置する方法における使用のための前記コンジュゲート。
【請求項３１】
糖質コルチコイドと、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートとを、それを必要とする個体に投与することを含む、炎症性自己免疫疾患を処置する方法における使用のための糖質コルチコイド。
【請求項３２】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートと、糖質コルチコイドとを、それを必要とする個体に投与することを含む、炎症性自己免疫疾患を処置する方法。
【請求項３３】
糖質コルチコイドがデキサメタゾンである、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の使用ためのコンジュゲートもしくは糖質コルチコイド、または方法。
【請求項３４】
炎症性自己免疫疾患が関節リウマチ(RA)、多発性硬化症(MS)、子宮内膜症、自己免疫性糖尿病、炎症性腸疾患(IBD)、乾癬、感染性関節炎、歯周炎である、請求項２６、２７、３０、３１もしくは３３に記載の使用のためのコンジュゲートもしくは糖質コルチコイド、または請求項２８、２９、３２もしくは３３に記載の方法。
【請求項３５】
関節リウマチを処置する方法における使用のための請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項３６】
患者における関節リウマチの部位の新血管系にIL4を送達する方法における使用のための請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項３７】
治療上有効量の請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートを患者に投与することを含む、患者における関節リウマチを処置する方法。
【請求項３８】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートをヒトまたは動物に投与することを含む、ヒトまたは動物における関節リウマチの部位の新血管系にIL4を送達する方法。
【請求項３９】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートと、糖質コルチコイドとを、それを必要とする個体に投与することを含む、関節リウマチを処置する方法における使用のための前記コンジュゲート。
【請求項４０】
糖質コルチコイドと、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートとを、それを必要とする個体に投与することを含む、関節リウマチを処置する方法における使用のための糖質コルチコイド。
【請求項４１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートと、糖質コルチコイドとを含むキット。
【請求項４２】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートと、糖質コルチコイドとを、それを必要とする個体に投与することを含む、関節リウマチを処置する方法。
【請求項４３】
糖質コルチコイドがデキサメタゾンである、請求項３９もしくは４０のいずれか１項に記載の使用のためのコンジュゲートもしくは糖質コルチコイド、請求項４１に記載のキット、または請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
乾癬を処置する方法における使用のための請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項４５】
患者における乾癬の部位の新血管系にIL4を送達する方法における使用のための請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項４６】
治療上有効量の請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートを患者に投与することを含む、患者における乾癬を処置する方法。
【請求項４７】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートをヒトまたは動物に投与することを含む、ヒトまたは動物における乾癬の部位の新血管系にIL4を送達する方法。
【請求項４８】
多発性硬化症を処置する方法における使用のための請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項４９】
患者における多発性硬化症の部位の新血管系にIL4を送達する方法における使用のための請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項５０】
治療上有効量の請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートを患者に投与することを含む、患者における多発性硬化症を処置する方法。
【請求項５１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートをヒトまたは動物に投与することを含む、ヒトまたは動物における多発性硬化症の部位の新血管系にIL4を送達する方法。
【請求項５２】
子宮内膜症を処置する方法における使用のための請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項５３】
患者における子宮内膜症の部位の新血管系にIL4を送達する方法における使用のための請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項５４】
治療上有効量の請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートを患者に投与することを含む、患者における子宮内膜症を処置する方法。
【請求項５５】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートをヒトまたは動物に投与することを含む、ヒトまたは動物における子宮内膜症の部位の新血管系にIL4を送達する方法。
【請求項５６】
in vivoで新血管系にIL4を標的化することによってがんを処置する方法における使用のための請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項５７】
患者における腫瘍新血管系にIL4を送達する方法における使用のための請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項５８】
治療上有効量の請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートを患者に投与することを含む、患者における新血管系にIL4を標的化することによってがんを処置する方法。
【請求項５９】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートをヒトまたは動物に投与することを含む、ヒトまたは動物における腫瘍新血管系にIL4を送達する方法。
【請求項６０】
がんが、奇形癌などの胚細胞がん；結腸直腸がん；ホジキンもしくは非ホジキンリンパ腫；メラノーマ；膵臓がん；軟部組織肉腫；または腎細胞癌である、請求項５６もしくは５７に記載のコンジュゲート、または請求項５８もしくは５９に記載の方法。
【請求項６１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートと、第2のコンジュゲートとを、それを必要とする個体に投与することを含み、第2のコンジュゲートが、インターロイキン-12(IL12)と、新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する特異的結合メンバーとを含む、がんを処置する方法における使用のための請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項６２】
第2のコンジュゲートと、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートとを、それを必要とする個体に投与することを含む、がんを処置する方法における使用のための、IL12と、新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する特異的結合メンバーとを含む第2のコンジュゲート。
【請求項６３】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートと、IL12ならびに新生物疾患および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する特異的結合メンバーを含む第2のコンジュゲートとを含むキットであって、前記コンジュゲートががんの処置のためのものである、前記キット。
【請求項６４】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートと、IL12ならびに新生物疾患および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する特異的結合メンバーを含む第2のコンジュゲートとを、それを必要とする個体に投与することを含む、がんを処置する方法。
【請求項６５】
第2のコンジュゲートの一部を形成する特異的結合メンバーが一本鎖ダイアボディである、請求項６１〜６４のいずれか１項に記載のコンジュゲート、キットまたは方法。
【請求項６６】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートと、インターロイキン-2(IL2)ならびに新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する特異的結合メンバーを含む第2のコンジュゲートとを、それを必要とする個体に投与することを含む、がんを処置する方法における使用のための請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項６７】
第2のコンジュゲートと、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の第1のコンジュゲートとを、それを必要とする個体に投与することを含む、がんを処置する方法における使用のための、IL2ならびに新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する特異的結合メンバーを含む第2のコンジュゲート。
【請求項６８】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートと、IL2ならびに新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する特異的結合メンバーを含む第2のコンジュゲートとを含むキットであって、前記コンジュゲートががんの処置のためのものである、前記キット。
【請求項６９】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートと、IL2ならびに新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する特異的結合メンバーを含む第2のコンジュゲートとを、それを必要とする個体に投与することを含む、がんを処置する方法。
【請求項７０】
第2のコンジュゲートがダイアボディを含む、請求項６１〜６９のいずれか１項に記載の使用のためのコンジュゲート、キットまたは方法。
【請求項７１】
第2のコンジュゲートが、フィブロネクチンに結合する特異的結合メンバーを含む、請求項６１〜７０のいずれか１項に記載の使用のためのコンジュゲート、キットまたは方法。
【請求項７２】
第2のコンジュゲートが、フィブロネクチンのエクストラドメイン-A(ED-A)に結合する特異的結合メンバーを含む、請求項７１に記載の使用のためのコンジュゲート、キット、または方法。
【請求項７３】
第2のコンジュゲートが、配列番号12〜17に記載の抗体F8の相補性決定領域(CDR)を有する抗原結合部位を含む特異的結合メンバーを含む、請求項７２に記載の使用のためのコンジュゲート、キット、または方法。
【請求項７４】
第2のコンジュゲートが、配列番号18および20に記載の抗体F8のVHおよびVLドメインを含む特異的結合メンバーを含む、請求項７３に記載の使用のためのコンジュゲート、キットまたは方法。
【請求項７５】
第2のコンジュゲートが、配列番号20に記載の抗体F8のアミノ酸配列を含む特異的結合メンバーを含む、請求項７４に記載の使用のためのコンジュゲート、キットまたは方法。
【請求項７６】
第2のコンジュゲートが、フィブロネクチンのエクストラドメイン-B(ED-B)に結合する特異的結合メンバーを含む、請求項７１に記載の使用のためのコンジュゲート、キットまたは方法。
【請求項７７】
第2のコンジュゲートが、配列番号25〜30に記載の抗体L19の相補性決定領域(CDR)を有する抗原結合部位を含む特異的結合メンバーを含む、請求項７６に記載の使用のためのコンジュゲート、キットまたは方法。
【請求項７８】
第2のコンジュゲートが、配列番号31および32に記載の抗体L19のVHおよびVLドメインを含む特異的結合メンバーを含む、請求項７７に記載の使用のためのコンジュゲート、キットまたは方法。
【請求項７９】
第2のコンジュゲートが、配列番号33または配列番号59または配列番号62に記載の抗体L19のアミノ酸配列を含む特異的結合メンバーを含む、請求項７８に記載の使用のためのコンジュゲート、キットまたは方法。
【請求項８０】
第2のコンジュゲートが、テナシンCのA1ドメインに結合する特異的結合メンバーを含む、請求項６１〜７０のいずれか１項に記載の使用のためのコンジュゲート、キットまたは方法。
【請求項８１】
第2のコンジュゲートが、配列番号34〜39に記載の抗体F16の相補性決定領域(CDR)を有する抗原結合部位を含む特異的結合メンバーを含む、請求項８０に記載の使用のためのコンジュゲート、キットまたは方法。
【請求項８２】
配列番号40および41に記載の抗体F16のVHおよびVLドメインを含む特異的結合メンバーを含む、請求項８１に記載の使用のためのコンジュゲート、キットまたは方法。
【請求項８３】
第2のコンジュゲートが、配列番号42または配列番号60に記載の抗体F16のアミノ酸配列を含む特異的結合メンバーを含む、請求項８２に記載の使用のためのコンジュゲート、キットまたは方法。
【請求項８４】
がんが、奇形癌などの胚細胞がん；結腸直腸がん；ホジキンもしくは非ホジキンリンパ腫；メラノーマ；膵臓がん；軟部組織肉腫；または腎細胞癌である、請求項６１〜８３のいずれか１項に記載の使用のためのコンジュゲート、キットまたは方法。
【請求項８５】
患者におけるがんおよび関節リウマチを処置する方法における使用のための請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項８６】
患者における腫瘍新血管系および関節リウマチの部位の新血管系にIL4を送達する方法における使用のための請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項８７】
治療上有効量の請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートを患者に投与することを含む、患者における新血管系にIL4を標的化することによってがんおよび関節リウマチを処置する方法。
【請求項８８】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートをヒトまたは動物に投与することを含む、ヒトまたは動物における腫瘍新血管系および関節リウマチの部位の新血管系にIL4を送達する方法。
【請求項８９】
がんが、奇形癌などの胚細胞がん；結腸直腸がん；ホジキンもしくは非ホジキンリンパ腫；メラノーマ；膵臓がん；軟部組織肉腫；または腎細胞癌である、請求項８５〜８８のいずれか１項に記載の使用のためのコンジュゲートまたは方法。
【請求項９０】
患者における自己免疫性膵島炎または自己免疫性糖尿病を処置する、防止する、またはその開始を遅延させる方法における使用のための請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項９１】
患者における自己免疫性膵島炎または自己免疫性糖尿病の部位にIL4を送達する方法における使用のための請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項９２】
治療上有効量の請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートを患者に投与することを含む、患者における自己免疫性膵島炎または自己免疫性糖尿病を処置する、防止する、またはその開始を遅延させる方法。
【請求項９３】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲートをヒトまたは動物に投与することを含む、ヒトまたは動物における自己免疫性膵島炎または自己免疫性糖尿病の部位にIL4を送達する方法。
【請求項９４】
IL4が膵臓に送達される、請求項９１に記載の使用のためのコンジュゲート、または請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
自己免疫性糖尿病が1型糖尿病である、請求項９０〜９４のいずれか１項に記載の使用のためのコンジュゲートまたは方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン-4(IL4)と、特異的結合メンバーとを含むコンジュゲートに関する。特異的結合メンバーは、好ましくは、新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合し、コンジュゲートはin vivoでIL4を組織に対して標的化するために用いることができる。特に、本発明は、がんならびに/または関節リウマチ(RA)、多発性硬化症(MS)、子宮内膜症、炎症性腸疾患(IBD)、乾癬、乾癬性関節炎、および歯周炎などの自己免疫疾患の処置におけるそのようなコンジュゲートの治療的使用に関する。本発明のコンジュゲートを用いて処置または防止することができる他の疾患としては、自己免疫性膵島炎および糖尿病、特に、自己免疫性糖尿病が挙げられる。がんの処置においては、前記コンジュゲートを、インターロイキン-12(IL12)またはインターロイキン-2(IL2)を含むコンジュゲートと、特異的結合メンバーとを含むコンジュゲートと共に投与することができる。自己免疫疾患の処置においては、前記コンジュゲートを、デキサメタゾンなどの糖質コルチコイドと共に投与することができる。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインは、自然免疫および適応免疫の重要なメディエータである。多くのサイトカインが、進行がんを有する患者などの患者において治療目的で用いられてきたが、その投与は、典型的には重篤な毒性と関連し、例えば、治療的に活性なレジメンに対する用量上昇および抗がん剤としてのその開発を阻害する。これらの問題を克服するために、正常組織を損傷せずに疾患部位に免疫系の刺激活性を集中させることを目的として、「免疫サイトカイン」（すなわち、抗体または抗体断片に融合されたサイトカイン）の使用が提唱されてきた(Savageら、1993; Schramaら、2006; Neriら、2005; Dela Cruzら、2004; Reisfeldら、1997; Kontermanら、2012)。
【０００３】
例えば、いくつかの前炎症性免疫サイトカイン(例えば、IL2、IL12、IL15、TNFに基づくもの)が、がんのマウスモデルにおいて強力な抗腫瘍効果を示すことが示されている(Borsiら、2003; Carnemollaら、2002; Freyら、2010; Kasparら、2007; Pascheら、2012)。対照的に、抗炎症性免疫サイトカイン(例えば、IL10に基づくもの)は、慢性炎症状態(関節リウマチ、子宮内膜症[Schwagerら、2011; Schwagerら、2009])のマウスモデルにおいて治療利益を提供することができるが、腫瘍増殖に対する影響はないことが示されている。
【０００４】
フィブロネクチンおよびテナシン-Cのスプライスアイソフォームに特異的な抗体は、これらの抗原が固形腫瘍およびリンパ腫、ならびに他の疾患の多くで強力に発現されるが、正常な健康な成体においては実質的に検出不可能である(胎盤、子宮内膜および卵巣中のいくつかの血管を除く)ため、薬剤送達適用のためのビヒクルとして記載されている(Brackら、2006; Pedrettiら、2009; Schliemannら、2009)。例えば、それぞれ、フィブロネクチンの選択的にスプライシングされたEDAおよびEDBドメインに特異的な、抗体F8およびL19、ならびに抗テナシンC抗体F16(Brackら、2006, Villaら、2008, Vitiら、1999)が、武装抗体(armed antibody)の開発のために用いられており、そのいくつかは腫瘍学およびリウマチ学において臨床試験を開始している(Eigentlerら、2011; Papadiaら、2012)。これらの抗体の腫瘍標的化特性もまた、がんのマウスモデルおよび患者において実証されている。
【０００５】
インターロイキン4(IL4)は、3つの内部ジスルフィド結合により安定化される、14kDaの小型の球状サイトカインである。それはB細胞活性化因子として1980年代前半に初めて同定されたものであり、多くの生物学的機能および免疫調節機能を示す。それは、骨髄細胞、肥満細胞、樹状細胞、内皮細胞、筋肉細胞およびニューロン細胞などの非造血起源のいくつかの細胞型における増殖、分化およびアポトーシスを制御することができる(Janeway, Immunobiology, 2005; Zamoranoら、1996)。体液性免疫および適応免疫における重要な調節因子として、IL4はリンパ球のための増殖および生存因子として作用し、活性化B細胞およびT細胞の増殖を刺激する。このサイトカインは、Th1とTh2免疫応答の間の平衡に決定的に関与し、抗原チャレンジ後にナイーブなヘルパーT細胞のTh2細胞への分化を誘導する(Janeway, Immunobiology, 2005)。この活性は、免疫応答のTh1極性化を誘導するIL12の活性とは全く対照的である。インターロイキン4はまた、NK(ナチュラルキラー)細胞の増殖も刺激し、MHCクラスII産生を上方調節し、従って、抗原提示を増強する(Chomaratら、1997)。
【０００６】
最近では、IL4は抗炎症性サイトカインであると主に考えられている。しかしながら、IL4は高用量のマウスIL4を投与した場合にコラーゲン誘導性関節炎のin vivoマウスモデルにおいて疾患抑制効果を示すことが示されているが(Joostenら、1999)、低用量のマウスIL4の投与は、同じマウスモデルにおいて関節炎の経過に対する効果を示さなかった(Joostenら、1999; Joostenら、1997)。対照的に、このマウスモデルにおいては、低用量のマウスIL10の投与でも、関節炎の抑制を誘導する(Joostenら、1997)。さらに、IL4はあらゆる条件下で抗炎症特性を確実に示すわけではない。例えば、IL4処置は、疾患のマウスモデルにおいて大腸炎の発生を有意に促進することが示されている(Fortら、2001)。IL10は従って、特に、RAおよび大腸炎などの炎症状態の処置のための、免疫コンジュゲートの調製にとって、IL4よりも有望な候補である。
【０００７】
腫瘍に対するIL4の効果も、全く分かっていない。発現パターンと用量の両方が、腫瘍増殖に対するIL4の効果に影響すると考えられる。例えば、内皮細胞移動に対する反対の生物学的効果が、低濃度(促進)および高濃度(阻害)のIL4で観察されたが(Volpertら、1998)、Liら(2008)は、内因性IL4はアポトーシスに対する腫瘍細胞の耐性を増加させることによって腫瘍の発達を促進するが、外因性IL4は抗腫瘍効果を有すると報告している。Fukushiら(2000)も同様に、文献で報告された血管新生に対するIL4の変化する効果を考察しており、その著者自身が、IL4は角膜ポケットアッセイにおいてin vitroとin vivoの両方において血管新生を誘導すると結論付けている。腫瘍に対するIL4の矛盾した効果は、例えば、Liら(2009)にまとめられている。
【０００８】
さらに、治療剤としての組換え、非標的化マウスIL4を用いる前臨床試験により、がんの様々なマウスモデルにおける有望な抗腫瘍活性が示され(Tepperら、1989; Tepperら、1992; Weiら、1995; Yuら、1993)、いくつかのがん型において組換えヒトIL4の臨床調査をもたらしたが(Wiernikら、2010; Whiteheadら、2002)、154人を超える患者を用いるいくつかの臨床試験においては、最小の抗腫瘍活性しか観察されなかった。播種性悪性メラノーマを有する患者においてはただ1つの完全な応答ならびに再発性および耐性NHLを有する患者においては1つが観察された。さらに、IL4療法は実質的な毒性を有し、その最も一般的な副作用は、等級4の毒性の事例を含む、悪心、嘔吐、下痢、頭痛/疼痛または不快感/疲労/倦怠感であった。結果として、IL4の全身的使用は、がん処置にとって好適ではないと決定された(Whiteheadら、2002; Whiteheadら、1998; Kurtzら、2007)。
【０００９】
サイトカインを抗体分子にコンジュゲートさせて、上記の免疫サイトカインを作製することができる。しかしながら、いくつかの免疫サイトカインは成功裏に作製されたが、治療効果が非標的サイトカインを用いる処置の効果に基づいて期待される場合であっても、全ての免疫サイトカインがそのような効果を示すわけではない。例えば、F8-IL7、F8-IL17、F8-IFN-アルファおよびIFN-ガンマは、マウスにおいて試験した場合、期待された治療効果または薬剤品質を示さなかった(Pascheら、2011; Pascheら、2012; Freyら、2011; Ebbinghausら、2005)。さらに、全ての免疫サイトカインが、親抗体のin vivoでの標的化特性を保持するわけではない(Pasche & Neri 2012)。親抗体の標的化特性が保持され、免疫サイトカインが疾患部位に効率的に局在する場合であっても、免疫サイトカインの治療効果は、非標的化免疫サイトカインのものよりも良好でないこともある(Freyら、2011)。従って、抗腫瘍活性または抗炎症活性などの治療効果を有する免疫サイトカインの調製、特に、非標的化サイトカインよりも強力な治療活性を有する免疫サイトカインの調製は、決して簡単なことではない。
【００１０】
マウスIgG2aのFc領域に融合させたIL4を含むコンジュゲートの調製は、Walzら(2002)に記載されている。この著者らは、IL4へのFc領域の融合は、モノマーIL4と比較してコンジュゲートの半減期の増加をもたらすと主張しているが、この証拠は提供されていない。従って、この場合のFc領域の目的は、前の段落に記載の免疫サイトカインと同様、疾患の領域にIL4を標的化することではない。
【００１１】
標的化部分にIL4をコンジュゲートさせる可能性は、WO03/092737およびWO01/10912に記載されている。しかしながら、IL4と、新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する特異的結合メンバーとを含むコンジュゲートは、これらの文献には開示されておらず、そのようなコンジュゲートの治療効果も示されていない。
【発明の概要】
【００１２】
本発明者らは、非コンジュゲート化抗体の標的化特性だけでなく、IL4の生物活性も保持しながら、新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する抗体にインターロイキン-4(IL4)をコンジュゲートさせることができることを示した。さらに、本発明者らは、これらのコンジュゲートが、いくつかの疾患モデルにおいて非標的化IL4より優れた活性を示すことを示した。上記で説明された通り、そのような免疫コンジュゲートの調製は依然として困難かつ予測不可能であり、かくして、成功の保証はない。さらに、特に、がん、ならびに炎症疾患の処置に関して、当業界でIL4について知られていたことを考慮すれば、IL4を含む免疫コンジュゲートを調製する動機はなかった。さらにより驚くべきことに、IL4を含む免疫コンジュゲートは、がん、RA、乾癬、子宮内膜症、MSおよび1型糖尿病における治療活性を示す。本発明者らの知る限り、これは、抗腫瘍活性と抗炎症活性の両方を示す免疫サイトカインの初めての報告である。
【００１３】
従って、一態様において、本発明は、インターロイキン-4(IL4)と特異的結合メンバーとを含むコンジュゲートに関する。例えば、本発明のコンジュゲートは、特異的結合メンバーにコンジュゲートされたインターロイキン-4(IL4)からなってもよい。特異的結合メンバーは、好ましくは、新生物増殖、および/もしくは血管新生、ならびに/または組織再モデリングと関連する細胞外マトリックス成分に結合する。最も好ましくは、特異的結合メンバーは、新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する。
【００１４】
特異的結合メンバーは、好ましくは、抗体である。特異的結合メンバーは、一本鎖Fv(ScFv)を含むか、もしくはそれからなるか、またはダイアボディであってもよい。最も好ましくは、特異的結合メンバーは、ダイアボディである。
【００１５】
ダイアボディは、各ポリペプチドが免疫グロブリン軽鎖の結合領域を含む第1のドメインと、免疫グロブリン重鎖の結合領域を含む第2のドメインとを含み、2つのドメインが連結される(例えば、ペプチドリンカーによる)が、互いに会合して抗原結合部位を形成することができず、抗原結合部位が、マルチマー内のあるポリペプチドの第1のドメインと、マルチマー内の別のポリペプチドの第2のドメインとの会合により形成される、ポリペプチドのマルチマーである(WO94/13804; HolligerおよびWinter, Cancer Immunol. Immunother. (1997) 45:128-130; Holligerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993)。
【００１６】
ダイアボディにおいては、重鎖可変ドメイン(VH)は、同じポリペプチド鎖上の軽鎖可変ドメイン(VL)に接続される。VHドメインとVLドメインは、2つのドメインの間での対形成を可能にするには短すぎるペプチドリンカー(一般に、約5アミノ酸)により接続される。これは、別の鎖の相補的なVHおよびVLドメインと対形成させる。この形式の例は、配列番号20、59、60および62に示される。かくして、ダイアボディ中のVHおよびVLドメインは、好ましくは5アミノ酸のリンカーによって連結される。このリンカーは、好ましくは、配列番号23に示される配列を有する。リンカーは、3、4、5または6アミノ酸からなってもよい。
【００１７】
あるいは、本発明における使用のためのダイアボディは、一本鎖ダイアボディであってもよい。一本鎖ダイアボディにおいては、2セットのVHおよびVLドメインが、同じポリペプチド鎖上で連続して一緒に接続される。例えば、2セットのVHおよびVLドメインを、以下のように一本鎖配列中で集合させることができる：(VH-VL)--(VH-VL)(ここで、括弧はセットを示す)。一本鎖ダイアボディ形式においては、セット内のそれぞれのVHおよびVLドメインは、短いか、または「非可撓性（ノンフレキシブル）」ペプチドリンカーにより接続される。この型のペプチドリンカー配列は、セット内のVHおよびVLドメインの対形成を可能にするのに十分な長さのものではない。一般に、短いか、または「非可撓性」ペプチドリンカーは、約5アミノ酸である。2セットのVHおよびVLドメインは、長いか、または「可撓性（フレキシブル）」ペプチドリンカーにより一本鎖として接続される。この型のペプチドリンカー配列は、第1のセットのVHおよびVLドメインと、第2のセットの相補的なVHおよびVLドメインとの対形成を可能にするのに十分な長さのものである。一般に、長いか、または「可撓性」リンカーは、約15アミノ酸である。一本鎖ダイアボディは、以前に作成されている(Kontermann, R. E.およびMuller, R. (1999), J. Immunol. Methods 226: 179-188)。二特異的一本鎖ダイアボディは、内皮細胞に対してアデノウイルスを標的化するために用いられている(Nettelbeckら、Molecular Therapy (2001) 3, 882-891)。
【００１８】
特異的結合メンバーは、好ましくは、上記のような、新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス(ECM)成分に結合する。特異的結合メンバーは、フィブロネクチンに結合してもよい。例えば、特異的結合メンバーは、フィブロネクチンのエクストラドメイン-A(ED-A)アイソフォームもしくはエクストラドメイン-B(ED-B)アイソフォーム、またはテナシンCに結合してもよい。好ましくは、特異的結合メンバーは、フィブロネクチンのED-AもしくはED-Bに結合するか、またはテナシンCのA1ドメインに結合する。最も好ましくは、特異的結合メンバーは、フィブロネクチンのED-Aに結合する。
【００１９】
特異的結合メンバーは、目的の抗原に特異的に結合することができる抗体の相補的決定領域(CDR)、またはVHおよび/もしくはVLドメイン、例えば、ECMの抗原に特異的に結合することができる抗体の1つ以上のCDRまたはVHおよび/もしくはVLドメインを有する抗原結合部位を含んでもよい。そのような抗原は、上記のような、フィブロネクチンおよびテナシンCを含む。
【００２０】
かくして、特異的結合メンバーは、抗体F8、抗体L19または抗体F16の抗原結合部位を含んでもよく、全てECM抗原に特異的に結合することが示されている。特異的結合メンバーは、抗体F8、L19またはF16の1、2、3、4、5もしくは6つのCDR、またはVHおよび/もしくはVLドメインを有する抗原結合部位を含んでもよい。特異的結合メンバーは、scFvまたはダイアボディ形式の、抗体F8、L19またはF16の配列を含むか、またはそれからなってもよい。好ましくは、特異的結合メンバーは、ダイアボディである。
【００２１】
本明細書に記載のF8は、フィブロネクチンの選択的にスプライスされたED-Aドメインに対するヒトモノクローナルダイアボディである。この抗体の配列は、配列番号20に示される。この抗体のscFvバージョンは、Villa Aら、Int. J. Cancer. 2008 Jun 1; 122(11): 2405-13に記載されている。L19は、フィブロネクチンの選択的にスプライスされたED-Bドメインに特異的なヒトモノクローナルscFvであり、以前に記載されている(WO2006/119897)。この抗体の配列は、配列番号33に示される。この抗体のダイアボディバージョンの配列は、配列番号59および62に示される。F16は、テナシンCのA1ドメインに特異的なヒトモノクローナルscFvであり、以前に記載されている(WO2006/050834)。この抗体の配列は、配列番号42に示される。この抗体のダイアボディバージョンの配列は、配列番号60に示される。
【００２２】
抗原結合部位は、抗体F8の1、2、3、4、5または6つのCDRを含んでもよい。F8のCDRのアミノ酸配列は、
配列番号12(CDR1 VH);
配列番号13(CDR2 VH);
配列番号14(CDR3 VH);
配列番号15(CDR1 VL);
配列番号16(CDR2 VL);および/または
配列番号17(CDR3 VL)
である。
【００２３】
配列番号12〜14は、ヒトモノクローナル抗体F8のVH CDR領域(それぞれ、1〜3)のアミノ酸配列である。配列番号15〜17は、ヒトモノクローナル抗体F8のVL CDR領域(それぞれ、1〜3)のアミノ酸配列である。配列番号12〜17に示されるF8のCDRは、それぞれ、配列番号1〜6に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。F8のVHおよびVLドメインのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号18および配列番号19に対応する。F8のVHおよびVLドメインをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号7および配列番号8に対応する。F8ダイアボディの配列は、配列番号20に示される。
【００２４】
抗原結合部位は、抗体L19の1、2、3、4、5または6つのCDRを含んでもよい。L19のCDRのアミノ酸配列は、
配列番号25(CDR1 VH);
配列番号26(CDR2 VH);
配列番号27(CDR3 VH);
配列番号28(CDR1 VL);
配列番号29(CDR2 VL);および/または
配列番号30(CDR3 VL)
である。
【００２５】
配列番号25〜27は、ヒトモノクローナル抗体L19のVH CDR領域(それぞれ、1〜3)のアミノ酸配列である。配列番号28〜30は、ヒトモノクローナル抗体L19のVL CDR領域(それぞれ、1〜3)のアミノ酸配列である。抗体L19のVHおよびVLドメインのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号31および配列番号32に対応する。scFv(L19)のアミノ酸配列は、配列番号33に与えられる。L19ダイアボディのアミノ酸配列は、配列番号59に与えられる。配列番号59のものに対する代替的VH/VLリンカー配列を有するL19ダイアボディのアミノ酸配列は、配列番号62に与えられる。
【００２６】
抗原結合部位は、抗体F16の1、2、3、4、5または6つのCDRを含んでもよい。F16のCDRのアミノ酸配列は、
配列番号34(CDR1 VH);
配列番号35(CDR2 VH);
配列番号36(CDR3 VH);
配列番号37(CDR1 VL);
配列番号38(CDR2 VL);および/または
配列番号39(CDR3 VL)
である。
【００２７】
配列番号34〜36は、ヒトモノクローナル抗体F16のVH CDR領域(それぞれ、1〜3)のアミノ酸配列である。配列番号37〜39は、ヒトモノクローナル抗体F16のVL CDR領域(それぞれ、1〜3)のアミノ酸に対するものである。抗体F16のVHおよびVLドメインのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号40および配列番号41に対応する。scFv(F16)のアミノ酸配列は、配列番号42に与えられる。F16ダイアボディのアミノ酸配列は、配列番号60に与えられる。
【００２８】
特異的結合メンバーは、配列番号18のF8 VHドメインアミノ酸配列、配列番号31のL19 VHドメインアミノ酸配列、または配列番号40のF16 VHドメインアミノ酸配列に対する少なくとも70%、より好ましくは、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%のうちの1つの配列同一性を有するVHドメインを含んでもよい。VHドメインは、配列番号7に記載のF8 VHドメインヌクレオチド配列に対する少なくとも70%、より好ましくは、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%のうちの1つの配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされていてもよい。
【００２９】
特異的結合メンバーは、配列番号19のF8 VLドメインアミノ酸配列、配列番号32のL19 VLドメインアミノ酸配列、または配列番号41のF16 VLドメインアミノ酸配列に対する少なくとも70%、より好ましくは、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%のうちの1つの配列同一性を有するVLドメインを含んでもよい。VLドメインは、配列番号8に記載のF8 VLドメインヌクレオチド配列に対する少なくとも70%、より好ましくは、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%のうちの1つの配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされていてもよい。
【００３０】
配列同一性は、GAPアルゴリズム(Wisconsin GCG package, Accelerys Inc, San Diego USA)を参照して一般的に定義される。GAPは、一致数を最大化し、ギャップ数を最小化する2つの完全な配列を整列させるためのNeedlemanおよびWunschのアルゴリズムを用いる。一般に、デフォルトパラメータが用いられ、ギャップ作出ペナルティ=12およびギャップ伸長ペナルティ=4である。GAPの使用が好ましいが、他のアルゴリズム、例えば、一般に、デフォルトパラメータを用いるBLAST(Altschulら(1990) J. MoI. Biol. 215: 405-410の方法を用いる)、FASTA (PearsonおよびLipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448の方法を用いる)、またはSmith-Watermanのアルゴリズム(SmithおよびWaterman (1981) J. MoI Biol. 147: 195-197)、またはAltschulら(1990)上掲のTBLASTNプログラムを用いることができる。特に、psi-Blastアルゴリズム(Nucl. Acids Res. (1997) 25 3389-3402)を用いることができる。
【００３１】
これらのVHおよびVLドメインならびにCDRの変異体を、本明細書に記載のコンジュゲートにおける使用のための特異的結合メンバーにおいて用いることもできる。好適な変異体を、配列変化、または突然変異、およびスクリーニングの方法の手段によって取得することができる。本明細書に記載の使用のための特定の変異体は、1つ以上のアミノ酸配列変化(アミノ酸残基の付加、欠失、置換および/または挿入)を含んでもよく、約20個未満の変化、約15個未満の変化、約10個未満の変化または約5個未満の変化、4、3、2または1個の変化であってもよい。変化は、1つ以上のフレームワーク領域および/または1つ以上のCDR中で作製してもよい。特に、変化は、VH CDR1、VH CDR2および/またはVH CDR3中で作製してもよい。
【００３２】
F8ダイアボディのアミノ酸配列は、配列番号20に見出される。F8ダイアボディは、配列番号20のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなってもよい。F8ダイアボディをコードするヌクレオチド配列は、配列番号9に見出される。
【００３３】
本発明における使用のためのダイアボディは、配列番号20に記載のF8ダイアボディのアミノ酸配列に対する少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%のうちの1つの配列同一性を有してもよい。それは、配列番号9に記載のヌクレオチド配列に対する少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%のうちの1つの配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされてもよい。
【００３４】
好ましくは、特異的結合メンバーは、CDR、VHおよび/もしくはVLドメイン、またはF8抗体の配列を含む。
【００３５】
本発明のコンジュゲートは、インターロイキン-4(IL4)を含む。IL4は、好ましくはヒトIL4である。IL4は、配列番号54に示される配列を含むか、またはそれからなってもよい。典型的には、IL4は、配列番号54に示されるアミノ酸配列に対する少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%のうちの1つの配列同一性を有する。IL4は、配列番号53に対する少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%のうちの1つの配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされてもよい。本発明者らは、配列番号54の位置38のアスパラギン残基のグルタミンとの置換が、この残基でのIL4のグリコシル化を防止することを示した。配列番号54の位置38のアスパラギン残基のセリンまたはアラニンとの置換は、同様にIL4のグリコシル化を防止すると予想される。グリコシル化はバッチ一貫性などのコンジュゲート産生を阻害し、患者の体内からのコンジュゲートのより急速なクリアランスをもたらし得るため、グリコシル化を回避するのが一般に好ましい。好ましくは、本発明のコンジュゲート、特に、本発明のコンジュゲート中に存在するIL4は、グリコシル化されない。かくして、IL4は、配列番号54に示される配列を含むか、またはそれからなってもよく、ただし配列番号54の位置38の残基はアスパラギン残基ではなくセリン、グルタミン、またはアラニン残基である。好ましくは、IL4は、配列番号54に示される配列を含むか、またはそれからなり、ただし配列番号54の位置38の残基はアスパラギン残基ではなくグルタミン残基である。この配列は、配列番号67に示される。あるいは、IL4は、配列番号54に示される配列を含むか、またはそれからなってもよく、ただし配列番号54の位置38の残基はアスパラギン残基ではなくセリン残基である。さらなる代替として、IL4は、配列番号54に示される配列を含むか、またはそれからなってもよく、ただし配列番号54の位置38の残基はアスパラギン残基ではなくアラニン残基である。場合により、IL4は、配列番号54の位置105でグリコシル化されていてもよい。かくして、上記の突然変異に加えて、配列番号54の位置105の残基は、この位置でのグリコシル化を防止するために、アスパラギン残基の代わりにセリン、グルタミン、またはアラニン残基でありうる。
【００３６】
本発明のコンジュゲート中のIL4は、IL4の生物活性、例えば、抗炎症活性；細胞増殖および/もしくは分化を阻害する能力；アポトーシスを誘導する能力；活性化されたB細胞およびT細胞の増殖を刺激する能力；抗原チャレンジ後にナイーブなヘルパーT細胞のTh2細胞への分化を誘導する能力；NK細胞の増殖を刺激する能力；MHCクラスII産生を上方調節する能力；ならびに/または腫瘍増殖および/もしくは転移を阻害する能力を保持する。
【００３７】
特異的結合メンバーとIL4とを連結するペプチドリンカーは、可撓性ペプチドリンカーであってもよい。ペプチドリンカー配列の好適な例は、当業界で公知である。リンカーは、10〜20アミノ酸、好ましくは、15〜20アミノ酸の長さであってもよい。最も好ましくは、リンカーは、15アミノ酸の長さである。最も好ましくは、リンカーは、配列SSSSGSSSSGSSSSG(配列番号24)を有する。
【００３８】
好ましい実施形態においては、本発明のコンジュゲートは、配列番号22に示される配列を含むか、またはそれからなってもよい(F8-[ヒト]IL4)。コンジュゲートは、配列番号22に示されるアミノ酸配列に対する少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%のうちの1つの配列同一性を有してもよい。コンジュゲートは、配列番号11に対する少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%のうちの1つの配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされてもよい。
【００３９】
別の好ましい実施形態においては、本発明のコンジュゲートは、配列番号68に示される配列を含むか、またはそれからなってもよい(F8-[ヒト]IL4 N284Q)。コンジュゲートは、IL4がグリコシル化されていないという条件で、配列番号68に示されるアミノ酸配列に対する少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%のうちの1つの配列同一性を有してもよい。
【００４０】
本発明者らは、本発明のコンジュゲートを、様々な状態および疾患、特に、フィブロネクチンのED-Aアイソフォーム、フィブロネクチンのED-Bアイソフォーム、および/または選択的にスプライスされたテナシンCの発現を特徴とする状態および疾患の処置において用いることができることを示した。この文脈における発現とは、正常組織中でのタンパク質の発現と比較した過剰発現を指してもよい。
【００４１】
別の態様において、従って、本発明は、本発明によるコンジュゲートを患者(典型的には、ヒト患者)に投与することを含む、療法によるヒトまたは動物体の処置のための方法における使用のための前記コンジュゲートに関する。本明細書で記載される処置は、予防的処置および/または防止を含んでもよい。本発明はまた、状態または疾患の処置のための、本発明のコンジュゲート、例えば、そのようなコンジュゲートを含む医薬組成物を投与することを含む処置方法、および本発明のコンジュゲートを、生理的に許容される担体または賦形剤と共に製剤化することを含む薬剤または医薬組成物を作製する方法も提供する。
【００４２】
フィブロネクチンのED-Aアイソフォーム、フィブロネクチンのED-Bアイソフォーム、および選択的にスプライスされたテナシンCは、新生物増殖および/または血管新生と関連する。従って、本発明によるコンジュゲートを、IL4をin vivoで新血管系(neovasculature)に標的化することにより患者における血管新生を阻害する方法において用いることができる。本発明のコンジュゲートを、患者における、血管新生および/または組織再モデリングの結果である、新血管系の部位にIL4を送達する方法において用いることもできる。患者における新血管系の部位にIL4を標的化することにより血管新生を阻害する方法、本発明によるコンジュゲートの治療上有効量を投与することを含む方法、および本発明による特異的結合メンバーをヒトまたは動物に投与することを含む、ヒトまたは動物における、血管新生の結果である、新血管系の部位にIL4を送達する方法も提供される。さらに、患者における、血管新生を阻害するための薬剤の調製、または製造のための本発明のコンジュゲートの使用、ならびに血管新生の結果である新血管系の部位にIL4を送達するための薬剤の調製、または製造のための本発明のコンジュゲートの使用が提供される。
【００４３】
また、本発明者らは驚くべきことに、IL4と、新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する特異的結合メンバーとを含むコンジュゲートが、高い効力（有効性）で関節リウマチを処置することができることを示した。IL4と、新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する特異的結合メンバーとを含むコンジュゲートは、TNF阻害剤、TNFR-Fcと少なくとも同じ有効性で、関節リウマチを処置することができることがわかった。Enbrel(商標)およびHumeira(商標)などのTNF阻害剤は、関節リウマチ患者における標準治療である。
【００４４】
従って、本発明はさらに、炎症性自己免疫疾患を処置する方法における使用のための本発明によるコンジュゲートに関する。本発明によるコンジュゲートを、患者における炎症性自己免疫疾患の部位にIL4を送達する方法において用いることもできる。治療上有効量の本発明によるコンジュゲートを投与することを含む、患者における炎症性自己免疫疾患を処置する方法、および本発明による特異的結合メンバーをヒトまたは動物に投与することを含む、ヒトまたは動物における炎症性自己免疫疾患の部位の新血管系にIL4を送達する方法も提供される。さらに、患者における炎症性自己免疫疾患を処置するための薬剤の調製、または製造のための本発明のコンジュゲートの使用、ならびに患者における炎症性自己免疫疾患の部位にIL4を送達するための薬剤の調製、または製造のための本発明のコンジュゲートの使用が提供される。
【００４５】
本発明者らはまた、驚くべきことに、本発明のコンジュゲートが、糖質コルチコイドと共に投与した場合、侵攻性関節リウマチのマウスモデルにおいて、脚の腫れおよび関節炎スコアを含む、関節リウマチ症状を完全に除去することができることを示した。関節リウマチ症状のそのような完全な抑制は、本発明者らの知る限り、侵攻性関節リウマチのモデルにおいては以前には決して見られなかった。本発明のコンジュゲートおよび糖質コルチコイドで処置されたマウスにおいて観察される、関節炎スコアおよび脚の腫れの減少、ならびに体重減少はまた、本発明によるコンジュゲートまたは糖質コルチコイドのみで処置されたマウスにおいて見られるこれらの症状の減少よりも有意に大きかった。組合せ処置は単剤療法よりも有意な改善を常にもたらすわけではないため、これ自体、驚くべきことである。例えば、本発明のコンジュゲートと、IL10を含むコンジュゲートとの組合せで処置されたマウスにおける関節リウマチ症状の減少は、本発明によるコンジュゲートのみで処置されたマウスに見られる減少よりも中程度にのみ大きいものであった。
【００４６】
かくして、本発明によるコンジュゲートと、糖質コルチコイドとを、それを必要とする個体に投与することを含む、炎症性自己免疫疾患を処置する方法における使用のための前記コンジュゲートが提供される。また、糖質コルチコイドと、本発明によるコンジュゲートとを、それを必要とする個体に投与することを含む、炎症性自己免疫疾患を処置する方法における使用のための糖質コルチコイドも提供される。
【００４７】
本明細書で記載される糖質コルチコイドは、デキサメタゾン、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、フルドロコルチゾン、デオキシコルチコステロン、またはアルドステロンであってもよい。好ましくは、糖質コルチコイドは、デキサメタゾンである。
【００４８】
本発明はまた、本発明によるコンジュゲートが炎症性自己免疫疾患の処置のためのものであってよい、前記コンジュゲートと、糖質コルチコイドとを含むキット、ならびに本発明によるコンジュゲートと、糖質コルチコイドとを、それを必要とする個体に投与することを含む、炎症性自己免疫疾患を処置する方法に関する。
【００４９】
炎症性自己免疫疾患は、特に、患者における炎症部位での、フィブロネクチンのED-Aアイソフォーム、フィブロネクチンのED-Bアイソフォーム、および/または選択的にスプライスされたテナシンCの発現を特徴とする任意の炎症性自己免疫疾患であってもよい。好ましくは、炎症性自己免疫疾患は、関節リウマチ(RA)、多発性硬化症(MS)、炎症性腸疾患(IBD)、乾癬、乾癬性関節炎、歯周炎、子宮内膜症、ベーチェット病、自己免疫性膵島炎、または自己免疫性糖尿病(1型糖尿病など)である。炎症性自己免疫疾患を、関節リウマチ(RA)、多発性硬化症(MS)、炎症性腸疾患(IBD)、乾癬、乾癬性関節炎、子宮内膜症、ベーチェット病または歯周炎からなる群から選択することができる。好ましくは、炎症性自己免疫疾患は、RA、MS、乾癬、子宮内膜症、または自己免疫性糖尿病(1型糖尿病など)である。より好ましくは、炎症性自己免疫疾患は、RA、MS、乾癬、または子宮内膜症である。炎症性自己免疫疾患は、RAまたは乾癬であってもよい。炎症性自己免疫疾患は、RAであってもよい。炎症性自己免疫疾患は、乾癬であってもよい。炎症性自己免疫疾患は、子宮内膜症であってもよい。炎症性自己免疫疾患は、MSであってもよい。炎症性自己免疫疾患は、自己免疫性糖尿病(1型糖尿病など)であってもよい。炎症性自己免疫疾患は、ベーチェット病であってもよい。
【００５０】
特に、本発明は、関節リウマチを処置する方法における使用のための本発明によるコンジュゲート、および患者における関節リウマチの部位の新血管系にIL4を送達する方法における使用のための本発明によるコンジュゲートに関する。また、患者における関節リウマチを処置する方法、治療上有効量の本発明によるコンジュゲートを患者に投与することを含む方法、およびヒトまたは動物に本発明による特異的結合メンバーを投与することを含む、ヒトまたは動物における関節リウマチの部位の新血管系にIL4を送達する方法も提供される。さらに、患者における関節リウマチを処置するための薬剤の調製、または製造のための本発明のコンジュゲートの使用、ならびに患者における関節リウマチの部位にIL4を送達するための薬剤の調製、または製造のための本発明のコンジュゲートの使用が提供される。
【００５１】
また、本発明によるコンジュゲートと糖質コルチコイドとを、それを必要とする個体に投与することを含む、関節リウマチを処置する方法における使用のための前記コンジュゲートも提供される。また、糖質コルチコイドと本発明によるコンジュゲートとを、それを必要とする個体に投与することを含む、関節リウマチを処置する方法における使用のための糖質コルチコイドも提供される。
【００５２】
本発明はまた、コンジュゲートが関節リウマチの処置のためのものであってもよい、本発明によるコンジュゲートと糖質コルチコイドとを含むキット、ならびに本発明によるコンジュゲートと糖質コルチコイドとを、それを必要とする個体に投与することを含む、関節リウマチを処置する方法にも関する。
【００５３】
本発明はまた、乾癬を処置する方法における使用のための本発明によるコンジュゲート、および患者における乾癬の部位の新血管系にIL4を送達する方法における使用のための本発明によるコンジュゲートにも関する。また、治療上有効量の本発明によるコンジュゲートを患者に投与することを含む、患者における乾癬を処置する方法、およびヒトまたは動物に、本発明による特異的結合メンバーを投与することを含む、ヒトまたは動物における乾癬の部位の新血管系にIL4を送達する方法も提供される。さらに、患者における乾癬を処置するための薬剤の調製、または製造のための本発明のコンジュゲートの使用、ならびに患者における乾癬の部位にIL4を送達するための薬剤の調製、または製造のための本発明のコンジュゲートの使用が提供される。乾癬の部位は、乾癬組織であってもよい。
【００５４】
驚くべきことに、本発明者らはまた、IL4と、新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する特異的結合メンバーとを含むコンジュゲートを用いる処置を用いてMSを処置することができることも示した。特に、本発明者らは、そのようなコンジュゲートを用いる処置が、マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)(MSのためのマウスモデル)の重症度を有意に低下させるだけでなく、フィンゴリモドにとって必要とされる連日投与と比較して、コンジュゲートは3日毎に投与すれば十分であるという追加の利点と共に、EAEの処置において、MS処置のための判断基準であるフィンゴリモドと同程度に有効であったことを示した。
【００５５】
かくして、本発明は、MSを処置する方法における使用のための本発明によるコンジュゲート、および患者におけるMSの部位の新血管系にIL4を送達する方法における使用のための本発明によるコンジュゲートにも関する。また、治療上有効量の本発明によるコンジュゲートを患者に投与することを含む、患者におけるMSを処置する方法、およびヒトまたは動物に、本発明による特異的結合メンバーを投与することを含む、ヒトまたは動物におけるMSの部位の新血管系にIL4を送達する方法も提供される。さらに、患者におけるMSを処置するための薬剤の調製、または製造のための本発明のコンジュゲートの使用、ならびに患者におけるMSの部位にIL4を送達するための薬剤の調製、または製造のための本発明のコンジュゲートの使用が提供される。
【００５６】
本発明者らはまた、IL4と、新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する特異的結合メンバーとを含むコンジュゲートを用いて子宮内膜症を処置することができることも見出した。IL4は子宮内膜症の進行において役割を果たすことが以前に示されていたため(OuYangら、2008; OuYangら、2010)、これは特に驚くべきことであった。特に、OuYangら、(2008)は、局所的に産生されたIL-4により誘導される子宮内膜間質細胞(ESC)の増殖が子宮内膜症の発症に関与することを証明するin vitroでの実験を開示する(要約および考察を参照されたい)。同じグループからのより後の論文、OuYangら(2010)は、IL-4がin vitroでESC中でのエオタキシン発現を誘導することをさらに示し、IL4が血管新生およびその後の子宮内膜症の発症を促進し得ると主張している。これらの知見に基づいて、著者らは、IL4が子宮内膜症の処置における抗血管新生療法のための可能な標的であることを示唆している(要約および考察を参照されたい)。対照的に、本発明者らによって実施されたin vivoでの実験は、IL4と、新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する特異的結合メンバーとを含むコンジュゲートの投与が、子宮内膜症病変の容量および数の両方を減少させ、いくつかの事例では、疾患を完全に治癒することさえできたことを示す。IL4を含む対照抗体コンジュゲートの投与は、子宮内膜症病変に対する有意な効果を示さず、新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する結合メンバーの使用を介する子宮内膜症組織へのIL4の標的化が、治療効果を観察するために必要とされることを証明している。
【００５７】
かくして、本発明は、子宮内膜症を処置する方法における使用のための本発明によるコンジュゲート、および患者における子宮内膜症の部位の新血管系にIL4を送達する方法における使用のための本発明によるコンジュゲートに関する。また、治療上有効量の本発明によるコンジュゲートを患者に投与することを含む、患者における子宮内膜症を処置する方法、およびヒトまたは動物に、本発明による特異的結合メンバーを投与することを含む、ヒトまたは動物における子宮内膜症の部位の新血管系にIL4を送達する方法も提供される。さらに、患者における子宮内膜症を処置するための薬剤の調製、または製造のための本発明のコンジュゲートの使用、ならびに患者における子宮内膜症の部位にIL4を送達するための薬剤の調製、または製造のための本発明のコンジュゲートの使用が提供される。子宮内膜症の部位は、子宮内膜病変などの子宮内膜組織であってもよい。
【００５８】
本発明者らはまた、驚くべきことに、IL4と、新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する特異的結合メンバーとを含むコンジュゲートが、がんの3つの異なる同系免疫応答モデルにおいて腫瘍増殖を強力に阻害することができることも示した。非標的化インターロイキン4を用いる以前の研究は、IL4の毒性のため、試験した用量で、がん患者における悪性腫瘍の部位で十分に高い濃度のサイトカインを達成することができなかった。本出願に開示される結果に基づけば、本発明のコンジュゲートの使用は、この問題を克服すると期待される。特に、本出願におけるデータは、IL4を、本発明のコンジュゲートを用いて腫瘍部位に送達することができることを示す。これは、全てのサイトカインについて可能であるわけではない。
【００５９】
さらに、本発明のコンジュゲートは、IL2またはIL12と、新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する特異的結合メンバーとを含むコンジュゲートと共に用いた場合、非常に良好に許容され、持続的ながん根絶を媒介することがわかった。IL4に基づくコンジュゲートをIL12に基づくコンジュゲートと共に投与した場合に観察される相乗効果は、これらの2つのサイトカインがT細胞活性の調節に対する反対の効果を媒介すると考えられるため、特に驚くべきことであった。
【００６０】
かくして、別の態様においては、本発明は、in vivoで新血管系にIL4を標的化することによりがんを処置する方法における使用のための本発明によるコンジュゲート、および患者における腫瘍新血管系にIL4を送達する方法における使用のための本発明によるコンジュゲートに関する。治療上有効量の本発明によるコンジュゲートを投与することを含む、患者における新血管系にIL4を標的化する方法ことによりがんを処置する方法および本発明による特異的結合メンバーをヒトまたは動物に投与することを含む、ヒトまたは動物における腫瘍新血管系にIL4を送達する方法も提供される。さらに、患者におけるがんを処置するための薬剤の調製、または製造のための本発明のコンジュゲートの使用、ならびに患者における腫瘍新血管系にIL4を送達するための薬剤の調製、または製造のための本発明のコンジュゲートの使用が提供される。また、本発明によるコンジュゲートと、第2のコンジュゲートとを、それを必要とする個体に投与することを含み、第2のコンジュゲートが、インターロイキン-12(IL12)、またはインターロイキン-2(IL2)、および新生物増殖および/もしくは血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する特異的結合メンバーを含む、がんを処置する方法における使用のための本発明によるコンジュゲート；ならびに第2のコンジュゲートと、本発明による第1のコンジュゲートとを、それを必要とする個体に投与することを含む、がんを処置する方法における使用のための、IL12、またはIL2、および新生物増殖および/もしくは血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する特異的結合メンバーを含む第2のコンジュゲートも提供される。
【００６１】
本発明によるコンジュゲートと、IL12、またはIL2、および新生物増殖および/もしくは血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する特異的結合メンバーを含む第2のコンジュゲートとを含むキットであって、前記コンジュゲートががんの処置のためのものである前記キット、ならびに本発明によるコンジュゲートと、IL12、またはIL2、および新生物増殖および/もしくは血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する特異的結合メンバーを含む第2のコンジュゲートとを、それを必要とする個体に投与することを含む、がんを処置する方法。
【００６２】
第2のコンジュゲートは、scFvまたはダイアボディを含んでもよい。第2のコンジュゲートは、IL12またはIL2にコンジュゲートした一本鎖ダイアボディを含んでもよい。第2のコンジュゲートは、本発明のコンジュゲートよりも、新生物増殖および/または血管新生と関連する同じか、または異なる細胞外マトリックス成分に結合してもよい。第2のコンジュゲートは、本発明のコンジュゲートよりも、新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分上の異なるエピトープに結合してもよい。
【００６３】
第2のコンジュゲートは、本明細書に記載の特異的結合メンバーを含んでもよい。特に、第2のコンジュゲートは、フィブロネクチンまたはテナシンCに結合する特異的結合メンバーを含んでもよい。例えば、第2のコンジュゲートは、フィブロネクチンのエクストラドメイン-A(ED-A)アイソフォーム、エクストラドメイン-B(ED-B)アイソフォーム、またはテナシンCに結合する特異的結合メンバーを含んでもよい。好ましくは、第2のコンジュゲートは、フィブロネクチンのED-AもしくはED-Bに結合するか、またはテナシンCのA1ドメインに結合する特異的結合メンバーを含む。最も好ましくは、第2のコンジュゲートは、フィブロネクチンのED-Aに結合する特異的結合メンバーを含む。
【００６４】
第2のコンジュゲートは、配列番号12〜17に記載の抗体F8の相補性決定領域(CDR)を有する抗原結合部位を含む特異的結合メンバーを含んでもよい。第2のコンジュゲートは、配列番号18および19に記載の抗体F8のVHおよびVLドメインを含む特異的結合メンバーを含んでもよい。第2のコンジュゲートは、配列番号20に記載の抗体F8のアミノ酸配列を含む特異的結合メンバーを含んでもよい。
【００６５】
あるいは、第2のコンジュゲートは、配列番号25〜30に記載の抗体L19の相補性決定領域(CDR)を有する抗原結合部位を含む特異的結合メンバーを含んでもよい。第2のコンジュゲートは、配列番号31および32に記載の抗体L19のVHおよびVLドメインを含む特異的結合メンバーを含んでもよい。第2のコンジュゲートは、配列番号33に記載のscFv形式の抗体L19のアミノ酸配列、または配列番号59もしくは配列番号62に記載のダイアボディ形式の抗体L19のアミノ酸配列を含む特異的結合メンバーを含んでもよい。
【００６６】
さらなる代替として、第2のコンジュゲートは、配列番号34〜39に記載の抗体F16の相補性決定領域(CDR)を有する抗原結合部位を含む特異的結合メンバーを含んでもよい。第2のコンジュゲートは、配列番号40および41に記載の抗体F16のVHおよびVLドメインを含む特異的結合メンバーを含んでもよい。第2のコンジュゲートは、配列番号42に記載のscFv形式の抗体F16のアミノ酸配列または配列番号60に記載のダイアボディ形式の抗体F16のアミノ酸配列を含む特異的結合メンバーを含んでもよい。
【００６７】
好ましくは、第2のコンジュゲートは、CDR、VHおよび/もしくはVLドメイン、またはF8抗体の配列を含む特異的結合メンバーを含む。好ましくは、第2のコンジュゲートは、ダイアボディである特異的結合メンバーを含む。第2のコンジュゲートは、一本鎖融合タンパク質であってもよい。
【００６８】
第2のコンジュゲートは、IL2またはIL12を含む。IL2およびIL12は、好ましくは、それぞれ、ヒトIL2およびヒトIL12である。IL2は、配列番号56に示されるIL2の配列を含むか、またはそれからなってもよい。典型的には、IL2は、配列番号56に示されるアミノ酸配列に対する少なくとも70%、より好ましくは、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%のうちの1つの配列同一性を有する。IL2は、配列番号55に対する少なくとも70%、より好ましくは、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%のうちの1つのヌクレオチド配列によりコードされてもよい。IL12は、配列番号58に示されるIL12の配列を含むか、またはそれからなってもよい。典型的には、IL12は、配列番号58に示されるアミノ酸配列に対する少なくとも70%、より好ましくは、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%のうちの1つの配列同一性を有する。IL12は、配列番号57に対する少なくとも70%、より好ましくは、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%のうちの1つの配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされてもよい。本発明における使用のためのコンジュゲート中のIL2およびIL12は、それぞれ、IL2またはIL12の生物活性、例えば、腫瘍増殖および/または転移を阻害する能力を保持する。
【００６９】
本発明の第2のコンジュゲートは、配列番号50に示される配列を含むか、またはそれからなってもよい(F8-[ヒト]IL2)。コンジュゲートは、配列番号50に示されるアミノ酸配列に対する少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%のうちの1つの配列同一性を有してもよい。コンジュゲートは、配列番号49に対する少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%のうちの1つの配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされてもよい。
【００７０】
あるいは、本発明の第2のコンジュゲートは、マウスIL12の配列が、例えば、配列番号58に示されるようなヒトIL12の配列で置き換えられる場合を除いて、配列番号48に示される配列([マウス]IL12-F8-F8)を含むか、またはそれからなってもよい。そのようなコンジュゲートは、WO2013/014149に開示される。そのようなコンジュゲートの配列は、配列番号61に示される。コンジュゲートは、そのような配列との少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%のうちの1つの配列同一性を有してもよい。コンジュゲートは、マウスIL12のコード配列が配列番号57のようなヒトIL12をコードする配列で置き換えられる場合を除いて、配列番号47との少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%のうちの1つの配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされてもよい。
【００７１】
上記の第2のコンジュゲートと組み合わせようと、またはそうでなかろうと、本発明のコンジュゲートを用いて処置することができるがんおよび他の腫瘍および新生物状態は、ドメインED-AもしくはED-Bを含むフィブロネクチンのアイソフォーム、または例えば、ドメインA1を含む選択的にスプライスされたテナシン-Cを発現するがんを含む。例えば、本発明のコンジュゲートを用いて、任意の型の固形または非固形のがんまたは悪性リンパ腫、特に、胚細胞がん(奇形癌)、肝臓がん、リンパ腫(ホジキンまたは非ホジキンリンパ腫など)、白血病(例えば、急性骨髄性白血病)、皮膚がん、メラノーマ、肉腫(例えば、線維肉腫)、膀胱がん、乳がん、子宮がん、卵巣がん、前立腺がん、肺がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、頭頸部がん、食道がん、膵臓がん、腎臓がん、胃がんおよび脳のがんを処置することができる。がんは、家族性または散発性のものであってもよい。がんは、転移性または非転移性のものであってもよい。好ましくは、がんは、胚細胞がん(奇形癌)；結腸直腸がん；ホジキンもしくは非ホジキンリンパ腫；メラノーマ；膵臓がん；軟部組織肉腫；線維肉腫；または腎細胞癌からなる群から選択されるがんである。がんは、奇形癌などの胚細胞がん；結腸直腸がん；およびリンパ腫からなる群から選択することができる。
【００７２】
いくつかの例においては、処置を要する患者は、多病性(polymorbid)である。これは、特に患者が高齢者である場合である。従って、本発明のコンジュゲートは、それらががんおよび関節リウマチなどの炎症性自己免疫疾患の両方を処置する能力により、そのような多病性患者を処置するのに特に好適になる。
【００７３】
かくして、別の態様において、本発明は、患者におけるがんおよび関節リウマチを処置する方法における使用のための本発明によるコンジュゲート；ならびに患者における腫瘍新血管系および関節リウマチの部位の新血管系にIL4を送達する方法における使用のための本発明によるコンジュゲートに関する。また、治療上有効量の本発明によるコンジュゲートを患者に投与することを含む、患者における新血管系にIL4を標的化することによりがんおよび関節リウマチを処置する方法、ならびにヒトまたは動物に、本発明による特異的結合メンバーを投与することを含む、ヒトまたは動物における腫瘍新血管系および関節リウマチの部位の新血管系にIL4を送達する方法も提供される。さらに、患者におけるがんおよび関節リウマチを処置するための薬剤の調製、もしくは製造のための本発明のコンジュゲートの使用、ならびに患者における腫瘍新血管系および関節リウマチの部位にIL4を送達するための薬剤の調製、もしくは製造のための本発明のコンジュゲートの使用が提供される。
【００７４】
別の態様において、本発明は、患者における自己免疫性膵島炎または自己免疫性糖尿病を処置する、防止する、またはその開始を遅延させる方法における使用のための本発明によるコンジュゲート、ならびに患者における自己免疫性膵島炎または自己免疫性糖尿病の部位にIL4を送達する方法における使用のための本発明によるコンジュゲートを提供する。また、治療上有効量の本発明によるコンジュゲートを患者に投与することを含む、患者における自己免疫性膵島炎または自己免疫性糖尿病を処置する、防止する、またはその開始を遅延させる方法、およびヒトまたは動物に、本発明によるコンジュゲートを投与することを含む、ヒトまたは動物における自己免疫性膵島炎または自己免疫性糖尿病の部位にIL4を送達する方法も提供される。さらに、患者における自己免疫性膵島炎または自己免疫性糖尿病を処置する、防止する、またはその開始を遅延させるための薬剤の調製、または製造のための本発明のコンジュゲートの使用、ならびに患者における自己免疫性膵島炎または自己免疫性糖尿病の部位にIL4を送達するための薬剤の調製、または製造のための本発明のコンジュゲートの使用が提供される。自己免疫性膵島炎または自己免疫性糖尿病の部位へのIL4の送達は、膵臓へのIL4の送達を指してもよい。自己免疫性糖尿病は、1型糖尿病を指してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】非共有ダイマーF8-IL4(モノマーは39.6kDa、ダイマーは79.2kDaである)の発現およびin vitroでの特性評価を示す図である。A:SDS-Page分析(M=分子マーカー；N=非還元条件；R=還元条件)。B:サイズ排除クロマトグラフィープロファイル。C:EDA被覆センサーチップ上でのF8-IL4の表面プラズモン分析。表面プラズモン共鳴(SPR)シグナル(応答単位[RU]で表される)を、左側に示す。13.8mlの保持容量でのピークは、ホモダイマーF8-IL4に対応する。
【図２】共有ホモダイマーmuTNFR-Fcダイマーの発現およびin vitroでの特性評価を示す図である。A:精製されたmuTNFR-FcのSDS-PAGE分析(M=分子マーカー；N=非還元条件；R=還元条件)。B:サイズ排除クロマトグラフィー(SEC200)。C:muTNFR-Fcの生物活性アッセイ。muTNFR-Fcは、マウス線維芽細胞のTNF誘導性殺傷を阻害する。
【図３−１】マウスにおけるコラーゲン誘導性関節炎の侵攻性モデルにおけるF8-マウスIL4の治療能力の特性評価を示す図である。関節炎の症状(足および/または足指の腫れ)を示す場合、ウシコラーゲン/CFAで免疫されたDBA/J1マウスは療法実験に含有され、1、4および7日目(矢印は注入時点を示す)でのTNFR-Fc(30μg；菱形)、F8-IL4(5μg；三角)、F8-IL4(100μg；丸)またはPBS(バッファービヒクル；四角)の静脈内注射を受けた。A:関節炎スコアを毎日評価し、その結果を平均関節炎スコア(±平均の標準誤差[SEM])として表す(n≧9)。高用量スケジュールにあるF8-IL4は、この侵攻性関節炎モデルにおいてEnbrel(TNFR-Fc)のマウス型よりも強力な疾患調節効果を示した。B:療法の開始時の体重と比較した、処置されたマウスの体重の変化を示す図である。注射1回あたり100μgの用量のF8-IL4を受けたマウスは、バッファービヒクル(PBS)のみを受けるマウスよりも体重減少が少なかった。これは、療法が良好に許容され、マウスがより良好な一般的健康状態にあったことを示す。
【図３−２】C:足の腫れを毎日測定し、足の厚さを、各動物の全部で4本の足の厚さの平均(±SEM)として表す。100μgのF8-IL4で処置されたマウスは、他の処置群におけるマウスよりも足の腫れがあまり重篤ではなかった。
【図３−３】DおよびE：F8-IL4は、関節炎スコアおよび足の腫れの減少において、非標的化対照免疫サイトカインKSF-IL4よりも優れた治療活性を示した。F8-IL4をTNFR-Fcと共に投与した場合には、相乗効果は見られなかった。
【図４】CTLL2細胞(20000細胞/ウェル)を用いる生物活性アッセイの結果を示す図である。EC50：KSF-IL4(20pM)、F8-IL4(23pM)、組換えIL4(28pM)。B：腫瘍切片に関するビオチン化F8-IL4とそれぞれのKSF-IL4の免疫蛍光分析の結果を示す図である(スケールバー=100μm)。C:処置されたマウスの体重変化のモニタリングを示す図である。結果を、療法の開始時の体重のパーセンテージとして表す。
【図５】F9奇形癌におけるF8-IL4の標的化を示す図である。A：放射性ヨード化F8-IL4(黒色のバー)と、それぞれのKSF-IL4(灰色のバー)の定量的生体分布試験である。皮下(s.c.)腫瘍を担持するマウスに、15μgの放射標識タンパク質を静脈内(i.v.)注入した。マウスを24時間後に犠牲にした。臓器を切り出し、放射活性を計数し、組織1グラムあたりの注入用量のパーセント(%ID/g±SE)として結果を表した。B:処置された腫瘍の分析による標的化の組織化学的確認を示す図である。マウスは3回のタンパク質注入を受け、24h後、腫瘍を切り出した。腫瘍の凍結切片を、抗IL4抗体(Alexa488)および抗CD31抗体(Alexa594)を用いて染色した。スケールバー=100μm。図5AおよびBは、非標的化KSF-IL4とは対照的に、EDA標的化F8-IL4コンジュゲートが、健康な組織を損傷せずに腫瘍組織中に蓄積することを示す(腫瘍と血液の比=12)。血液中の低レベルのF8-IL4は、望ましくない全身効果の観点から好ましい、血流からの迅速なクリアランスを示す。
【図６】F9奇形癌に対するF8-IL4の治療性能を示す図である。A:F9担持マウスに関する用量上昇試験。腫瘍が70mm3の容量に達した時、処置を開始し、マウスにPBS(x)、45μgのF8-IL4(白菱形)または90μgのF8-IL4(黒菱形)を48h(矢印で示される)毎に注入した。データは、1群あたりn=4匹のマウスの平均腫瘍体積(±SEM)である。B：IL4の標的化された送達と、非標的化投与との比較。マウスは、2日毎(矢印で示される)に90μgのF8-IL4(黒菱形)、90μgのKSF-IL4(黒菱形)またはPBS(x)のi.v.注入を受けた。データは、1群あたりn=5匹のマウスの平均腫瘍体積(±SEM)である。
【図７】F9奇形癌に対するF8-IL2またはF8-IL12と組み合わせたF8-IL4の治療活性を示す図である。A:F8-IL4とF8-IL2との組合せ処置。F9腫瘍が明確に触診可能であった場合、マウスを無作為に群化し、PBS、90μgのF8-IL4、20μgのF8-IL2または両方の組合せ(90μgのF8-IL4と20μgのF8-IL2)を注入した。データは、1群あたりn=5匹のマウスの平均腫瘍体積(±SEM)である。B：F9腫瘍を担持するマウスに、PBS、90μgのF8-IL4、8.75μgのF8-IL12または単剤の組合せ(90μgのF8-IL4と8.75μgのF8-IL12)を注入した。データは、1群あたりn=5匹のマウスの平均腫瘍体積(±SEM)である。C:示されるようなPBS、F8-IL4、F8-IL2、F8-IL12およびその組合せで処置された腫瘍担持マウスの体重モニタリング。
【図８】PBS、KSF-IL4、F8-IL4、F8-IL2、F8-IL2と組み合わせたF8-IL4、F8-IL12またはF8-IL12と組み合わせたF8-IL4で処置した後のF9腫瘍切片に対する腫瘍浸潤細胞のex vivoでの免疫蛍光分析を示す図である。スケールバーは100μmである。
【図９】CT26結腸癌に対する標的化されたIL4の抗腫瘍活性を示す図である。A:CT26腫瘍担持マウスを用いる放射性ヨード化されたF8-IL4の生体分布試験。マウスを、24時間後に犠牲にした。臓器を切り出し、放射活性を計数し、組織1グラムあたりの注射用量のパーセント(%ID/g±SE)として結果を表した。B:腫瘍切片に対するビオチン化F8-IL4と、それぞれのKSF-IL4の免疫蛍光分析(スケールバー=100μm)。C:F8-IL4とKSF-IL4(陰性対照、卵リゾチームに特異的)との治療的比較。マウスは、48h毎に、90μgのF8-IL4(黒菱形)、90μgのKSF-IL4(黒三角)またはPBS(x)のi.v.注射を受けた。データは、1群あたりn=5匹のマウスの平均腫瘍体積(±SEM)である。D:CT26腫瘍の処置におけるF8-IL4とF8-IL12との組合せ。マウスに、注射1回あたり、PBS(x)、90μgのF8-IL4(黒菱形)、8.75μgのF8-IL12(白四角)および組合せ(90μgのF8-IL4と8.75μgのF8-IL12)(黒四角)のいずれかを4回注射した(48h毎)。データは、1群あたりn=5匹のマウスの平均腫瘍体積(±SEM)である。
【図１０】A20リンパ腫に対するF8-IL4の機能的活性を示す図である。A:A20腫瘍担持マウスを用いる放射性ヨード化されたF8-IL4の定量的生体分布試験。マウスを、15μgの放射性ヨード化タンパク質の注射の24時間後に犠牲にした。臓器を切り出し、放射活性を計数した。結果を、組織1グラムあたりの注入用量のパーセント(%ID/g±SE)として表す。B:A20腫瘍切片上でのビオチン化F8-IL4と、それぞれのKSF-IL4の蓄積(スケールバー=100μm)。C:標的化されたIL4と非標的化投与との比較。マウスは、2日毎に90μgのF8-IL4、90μgのKSF-IL4またはPBSのi.v.注射を受けた。データは、1群あたりn=5匹のマウスの平均腫瘍体積(±SEM)である。D:F8-IL12と組み合わせたF8-IL4の治療活性。腫瘍が70mm3の体積に達した時、処置を開始し、マウスに、注射1回あたりPBS(x)、90μgのF8-IL4(黒菱形)、8.75μgのF8-IL12(白四角)および組合せ(90μgのF8-IL4と8.75μgのF8-IL12)(黒四角)のいずれかを(48h毎に)4回注射した。データは、1群あたりn=5匹のマウスの平均腫瘍体積(±SEM)である。
【図１１−１】乾癬のIMQ誘導性炎症モデルにおけるF8-IL4の機能的活性を示す図である。A:実験のスケジュール表。イミキモッド含有Aldaraクリームを、C57BL/6マウスの耳に塗布し、1、2、3、4、5および7日目に処置した。療法を7日目に開始し、9および11日目に繰り返した。マウスを13日目に犠牲にした。B:1日目〜13日目までのC57BL/6マウスの耳の厚さ。処置を7日目に開始し、9および11日目に繰り返した。マウスに、PBS(黒丸)、100μgのSIP(F8)(黒四角)、30μgのマウスTNFR-Fc(黒三角)、100μgのF8-IL4(黒菱形)、または100μgのKSF-IL4(x)のいずれかを注射した。結果を、μm±SEMで耳の厚さとして表す。C:処置の開始(7日目)からの耳の厚さの変化。結果を、μm±SEMでデルタ耳の厚さとして表す。
【図１１−２】D:耳介リンパ節(ear draining lymph node)の重量の差異。マウスを13日目に犠牲にし、耳介リンパ節を切り出し、計量した。E:処置を受けるマウスの重量。マウスを、処置の開始(7日目)から毎日計量した。体重減少は観察されなかった。
【図１２】耳におけるIMQ誘導性炎症を有するマウスに由来する組織中でのSIP(F8)およびF8-IL4の生体分布の定量分析を示す図である。マウスに、10μgの放射性ヨード化タンパク質(I-125)を注射し、24h後、マウスを犠牲にし、臓器を切り出した。結果を、%注射用量/グラムとして表す。A:SIP(F8)の生体分布分析。B:F8-IL4の生体分布分析。
【図１３−１】乾癬のCHS誘導性皮膚炎症モデルにおけるF8-IL4の機能的活性を示す図である。A:実験のスケジュール表。ヘテロ接合性メスVEGF-Aトランスジェニックマウスを感作した。感作の5日後、耳にチャレンジした(0日目)。療法を7日目に開始した。マウスを15日目に犠牲にした。B:1、7、9、11、13および15日目のマウスの耳の厚さ。処置を7日目に開始し、9、11および13日目に繰り返した。マウスに、PBS(黒丸)、100μgのSIP(F8)(黒四角)、30μgのマウスTNFR-Fc(黒三角)、100μgのF8-IL4(黒菱形)、または100μgのKSF-IL4(x)のいずれかを注射した。結果を、μm±SEMで耳の厚さとして表す。C:処置の開始(7日目)からの耳の厚さの変化。結果を、μm±SEMでデルタ耳の厚さとして表す。
【図１３−２】D:耳介リンパ節の重量の差異。マウスを15日目に犠牲にし、耳介リンパ節を切り出し、計量した。E:処置を受けるマウスの体重。マウスを、処置の開始時(7日目)ならびに9、11、13および15日目に計量した。体重減少は観察されなかった。
【図１４−１】乾癬モデルからの組織抽出物中のサイトカインレベルの分析を示す図である。A:乾癬のIMQ誘導性炎症モデルにおける処置後のマウスの組織のサイトカインレベルの分析。
【図１４−２】B:CHS誘導性耳炎症モデルにおける処置後のマウスの組織のサイトカインレベルの分析。
【図１５】デキサメタゾンまたはL19-IL10と組み合わせたF8-IL4を用いるマウスにおけるコラーゲン誘導性関節炎の侵攻性モデルにおける関節リウマチの処置を示す図である。DBA/J1マウスを、ウシコラーゲン/完全Freundアジュバント(CFA)で免疫した。図15に示される実験のために用いられたマウスは、1〜4の臨床スコアを有し、皮下(s.c.)(100μg；菱形)、もしくは静脈内(i.v.)(100μg；三角)でF8-IL4の注射を受けたか、またはデキサメタゾン(100μg；丸)、L19-IL10(200μg；「x」で示される)、F8-IL4とデキサメタゾン(それぞれ100μg；十字)、もしくはF8-IL4とL19-IL10(それぞれ、100μgと200μg；黒四角)、もしくはPBS(白四角)を受けた。F8-IL4およびL19-IL10の注射を、1、3および7日目に与えた。デキサメタゾン注射を、9日目まで毎日与えた。A:処置されたマウスに関する関節炎スコアを示す。関節炎スコアを毎日評価し、結果を平均関節炎スコア(+平均の標準誤差[SEM])として表す。F8-IL4とデキサメタゾンとの組合せを用いる処置は、F8-IL4またはデキサメタゾンのみを用いる処置よりも強力な疾患調節効果を示した。F8-IL4とL19-IL10との組合せを用いる処置もまた、L19-IL10のみを用いる処置よりも強力な疾患調節効果を示した。B:足の腫れを毎日測定し、足の厚さを、各動物の全部で4本の足の厚さの平均(+SEM)として表す。F8-IL4とデキサメタゾンとの組合せで処置されたマウスは、F8-IL4またはデキサメタゾンのみで処置されたマウスよりも少ない足の腫れを示した。F8-IL4とL19-IL10との組合せで処置されたマウスも、L19-IL10のみで処置されたマウスよりも少ない足の腫れを示した。破線は、1.8mmのベースライン厚さを示し、これは健康なDBA/J1マウスの平均の足の厚さである。C:療法の開始時での体重と比較した、処置されたマウスの体重の変化を示す。F8-IL4とデキサメタゾンとの組合せで処置されたマウスは、F8-IL4のみで処置されたマウスよりも少ない体重減少を示した。同様に、F8-IL4とL19-IL10との組合せで処置されたマウスは、F8-IL4またはL19-IL10にみで処置されたマウスよりも少ない体重減少を示した。これは、両組合せ処置が良好に許容されたことを示す。
【図１６】Wehi 164マウス線維肉腫に対するL19-IL4の抗腫瘍活性を示す図である。マウスに、48h毎に、L19-IL10(黒四角)、KSF-IL10(黒三角)、L19-IL4(x)、KSF-IL4(*)、またはPBS(黒菱形)を静脈内注射した。データは、1群あたりn=3〜4匹の平均腫瘍体積(+SEM)である。結果を、時間(日)に対する平均腫瘍重量(mg)として示す。
【図１７】F8-IL4を用いて、マウスにおける子宮内膜症を処置することができることを示す図である。A:子宮内膜症病変の体積[cm3]を、PBSを受けたマウスと比較してF8-IL4を用いて処置されたマウスにおいて有意に減少させた。B:子宮内膜症病変の数も、PBSを受けたマウスと比較して、F8-IL4で処置されたマウスにおいて有意に減少した。10匹のマウスのうちの3匹において、F8-IL4の投与は、疾患の完全な治癒をもたらした。対照的に、KSF-IL4(卵リゾチームに特異的)を用いるマウスの処置は、PBSで処置された対照マウスと比較して、子宮内膜症病変の体積または数に対する効果を示さなかった。
【図１８】F8-IL4を用いて、マウスにおける、多発性硬化症のモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を処置することができることを示す図である。F8-IL4(黒丸)を用いて処置されたマウスにおけるEAE重症度は、PBS(ビヒクル；黒菱形)を受けたマウスと比較して有意に減少した。F8-IL4もまた、EAEの処置において、MSの処置のための判断基準であるフィンゴリモド(黒四角)と同程度に有効であった。*=P<0.05、n.s.=有意でない(二元配置分散分析、次いで、Bonferroni補正により決定された)。
【図１９】IL4を、糖尿病マウスの膵臓中の血管周囲腔に標的化することができることを示す図である。CD31+血管(充填された白矢印)は、糖尿病マウスの膵臓中にEDA(開いた白矢印)と同時局在化する。細胞を、卵リゾチームに特異的であるKSF抗体を用いて、または一次抗体の非存在下(図19の「抗体なし」を参照されたい)で染色した場合、そのような同時局在化は見られなかった。
【図２０】野生型F8-ヒトIL4(F8-hIL4)はグリコシル化されるが、突然変異体F8-hIL4 N284Qはグリコシル化されないことを示す図である。AおよびBは、それぞれ、野生型F8-hIL4の統合およびデコンボリューション質量スペクトルを示す。CおよびDは、それぞれ、F8-hIL4 N284Q突然変異体の統合およびデコンボリューション質量スペクトルを示す。野生型F8-hIL4に関するデコンボリューションスペクトル(B)は、43289.6および42998.5Daで2つの主要ピークを示し、これは5個のジスルフィド結合を有する野生型F8-hIL4の予想される質量(40938.0Da)よりも有意に高く、N-結合グリコシル化の存在を示している。対照的に、40951.4Daで唯一の単一ピークを示すF8-hIL4 N284Q突然変異体のデコンボリューションスペクトル(D)は、5個のジスルフィド結合を有するF8-hIL4 N284Q突然変異体の質量理論値(40952.0Da)と一致し、この突然変異体がグリコシル化されないことを示している。共通のESI付加物ピークは、図20中で星印(*)で示される。
【図２１】野生型F8-hIL4およびF8-hIL4-N284Q突然変異体が、in vivoで同等の標的化特性を有することを示す図である。A:野生型F8-hIL4のin vivoでの標的化性能。B:F8-hIL4-N284Qのin vivoでの標的化性能。図21は、それぞれの抗体の静脈内投与の24時間後の組織1グラムあたりの注射用量パーセンテージ(%ID/g+SE)を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
用語
(コンジュゲート)
コンジュゲートは、特異的結合メンバーと、IL4、IL2またはIL12などのインターロイキンとを含んでもよい。特異的結合メンバーは、好ましくは、本明細書に記載のような、抗体、最も好ましくは、ダイアボディである。コンジュゲートがダイアボディを含む場合、ダイアボディの一本鎖Fv(scFv)の一方または両方を、インターロイキン、例えば、IL4にコンジュゲートすることができる。融合タンパク質として発現させるscFv-インターロイキン構築物を可能にするペプチドリンカーを用いて、scFvをIL4などのインターロイキンにコンジュゲートすることができる。「融合タンパク質」とは、1つのオープンリーディングフレーム(ORF)への2つ以上の遺伝子または核酸コード配列の融合の結果得られる翻訳産物であるポリペプチドを意味する。ORF中の2つの遺伝子の融合発現産物を、インフレームでコードされたペプチドリンカーによりコンジュゲートすることができる。好適なペプチドリンカーは、本明細書に記載される。
【００７７】
(特異的結合メンバー)
これは、互いに特異的に結合する一対の分子の一方のメンバーを記載する。特異的結合対のメンバーは、天然由来であるか、または全体的もしくは部分的に合成的に産生することができる。分子対の一方のメンバーは、分子対の他方のメンバーの特定の空間的および極性的構造に結合し、従って、それと相補的である、その表面上にある領域を有するか、または空洞を有する。結合対の型の例は、抗原-抗体、ビオチン-アビジン、ホルモン-ホルモン受容体、受容体-リガンド、酵素-基質である。本発明は、抗原-抗体型反応に関する。
【００７８】
特定の結合メンバーは通常、抗原結合部位を有する分子を含む。例えば、特異的結合メンバーは、抗原結合部位を含む抗体分子または非抗体タンパク質であってもよい。本明細書に記載の特異的結合メンバーは、好ましくは抗体分子である。
【００７９】
フィブロネクチンもしくはシトクロムBなどの非抗体タンパク質足場上の相補性決定領域(CDR)の配置により(Haan & Maggos, (2004), BioCentury, 12(5): A1-A6; Koideら(1998), Journal of Molecular Biology, 284: 1141-1151; Nygrenら(1997), Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469)、または所望の標的に対して結合特異性を付与するためのタンパク質足場内のループのアミノ酸残基を無作為化もしくは突然変異させることにより、抗原結合部位を提供することができる。タンパク質中で新規結合部位を操作するための足場は、Nygrenら(1997) (Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469)によって詳細に概説されている。抗体模倣体のためのタンパク質足場は、本発明者らが少なくとも1つの無作為化されたループを有するフィブロネクチンIII型ドメインを含むタンパク質(抗体模倣体)を記載するWO/0034784に開示されている。1つ以上のCDR、例えば、HCDRのセットを移植するための好適な足場を、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの任意のドメインメンバーにより提供することができる。この足場は、ヒトまたは非ヒトタンパク質であってもよい。非抗体タンパク質足場の利点は、それが少なくともいくつかの抗体分子よりも小さい、および/または製造が容易である足場分子中の抗原結合部位を提供することができるということである。小さいサイズの特異的結合メンバーは、細胞に進入する能力、組織中に深く浸透する能力もしくは他の構造内の標的に到達する能力、または標的抗原のタンパク質空洞内に結合する能力などの有用な生理学的特性を付与してもよい。非抗体タンパク質足場中での抗原結合部位の使用は、Wess, 2004, In: BioCentury, The Bernstein Report on BioBusiness, 12(42), A1-A7に概説されている。典型的なものは、安定な骨格と、ループまたは複数のループのアミノ酸配列を特異的または無作為に突然変異させて、標的抗原に結合する抗原結合部位を作出する、1つ以上の可変ループとを有するタンパク質である。そのようなタンパク質としては、黄色ブドウ球菌(S.aureus)由来プロテインAのIgG結合ドメイン、トランスフェリン、テトラネクチン、フィブロネクチン(例えば、第10フィブロネクチンIII型ドメイン)およびリポカリンが挙げられる。他のアプローチとしては、分子内ジスルフィド結合を有する小さいタンパク質であるシクロチドに基づく合成「ミクロボディ」(Selecore GmbH)が挙げられる。
【００８０】
抗体配列および/または抗原結合部位に加えて、本発明における使用のための特異的結合メンバーは、例えば、折畳まれたドメインなどのペプチドもしくはポリペプチドを形成するか、または抗原に結合する能力に加えて別の機能的特徴を分子に付与する他のアミノ酸を含んでもよい。
【００８１】
例えば、特異的結合メンバーは、触媒部位(例えば、酵素ドメイン中に)ならびに抗原結合部位を含んでもよく、抗原結合部位は抗原に結合し、かくして、触媒部位を抗原に標的化する。触媒部位は、例えば、切断により、抗原の生物学的機能を阻害してもよい。
【００８２】
上述の通り、CDRは非抗体足場により担持されていてもよいが、CDRまたはCDRのセットを担持させるための構造は、一般に、CDRまたはCDRのセットが、再配置された免疫グロブリン遺伝子によりコードされる天然のVHおよびVL抗体可変ドメインのCDRまたはCDRのセットに対応する位置に位置する、抗体重鎖もしくは軽鎖配列またはその実質的な部分である。免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置を、現在ではインターネット(immuno.bme.nwu.eduで、または任意の検索エンジンを用いて「Kabat」を探す)で入手可能な、Kabatら(1987) (Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services.)、およびそのアップデートを参照することにより決定することができる。
【００８３】
CDR領域またはCDRとは、Kabatら(1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Edition, US Department of Health and Human Services (Kabatら(1991a), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington, およびより後の版)により定義される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を示すことが意図される。抗体は、典型的には、3つの重鎖CDRおよび3つの軽鎖CDRを含有する。用語CDRまたはCDRsは、事例によれば、抗原または抗体が認識するエピトープに対する抗体の親和性により結合を担うアミノ酸残基の大部分を含有する、これらの領域の1つもしくはいくつか、またはさらにはこれらの領域の全部を示すために本明細書で用いられる。
【００８４】
6つの短いCDR配列のうち、重鎖の第3のCDR(HCDR3)は、より大きいサイズ変動性(それを生じる遺伝子の配置の機構に本質的に起因するより大きい多様性)を有する。それは、2アミノ酸ほどの短いものであってもよいが、知られる最長のサイズは26である。機能的には、HCDR3は、抗体の特異性の決定において一部役割を果たす(Segalら(1974), PNAS, 71:4298-4302; Amitら(1986), Science, 233:747-753; Chothiaら(1987), J. Mol. Biol., 196:901-917; Chothiaら(1989), Nature, 342:877-883; Catonら(1990), J. Immunol., 144:1965-1968; Sharonら(1990a), PNAS, 87:4814-4817; Sharonら(1990b), J. Immunol., 144:4863-4869; Kabatら(1991b), J. Immunol., 147:1709-1719)。
【００８５】
(抗体分子)
これは、天然のものである、または部分的もしくは全体的に合成的に産生される免疫グロブリンを記載する。この用語はまた、抗体抗原結合部位を含む任意のポリペプチドまたはタンパク質にも関する。それは、本発明が天然形態の抗体に関するものである、すなわち、それらがその天然の環境にはないが、それらを天然の起源から単離するか、もしくは精製により取得するか、または他に遺伝子組換えにより、もしくは化学合成により取得することができたこと、およびその後、それらが後に記載されるように非天然アミノ酸を含有してもよいことが、ここで理解されなければならない。抗体抗原結合部位を含む抗体断片としては、限定されるものではないが、Fab、Fab'、Fab'-SH、scFv、Fv、dAb、Fdなどの抗体分子；およびダイアボディが挙げられる。本発明における使用のための特異的結合メンバー、または抗体は、好ましくは、scFvを含むか、またはダイアボディである。最も好ましくは、本発明における使用のための特異的結合メンバー、または抗体は、ダイアボディである。
【００８６】
標的抗原に結合する他の抗体またはキメラ分子を産生するために、モノクローナル抗体および他の抗体を取得し、組換えDNA技術の技術を用いることができる。そのような技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域、またはCDRをコードするDNAを、異なる免疫グロブリンの定常領域、または定常領域とフレームワーク領域に導入することを含んでもよい。例えば、EP-A-184187、GB2188638AまたはEP-A-239400、および多数のその後の文献を参照されたい。抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞を、産生される抗体の結合特異性を変化させるか、または変化させない、遺伝子突然変異または他の変化にかけることができる。
【００８７】
抗体をいくつかの方法で改変することができるため、用語「抗体分子」は、必要とされる特異性および/または抗原への結合を示す抗体抗原結合部位を有する任意の特異的結合メンバーまたは物質を包含すると解釈されるべきである。かくして、この用語は、天然であるか、または全体的もしくは部分的に合成のものである抗体抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを含む、抗体断片および誘導体を包含する。従って、別のポリペプチド(例えば、別の種から誘導されるか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する)に融合された、抗体抗原結合部位を含むキメラ分子、または等価物が含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、EP-A-0120694およびEP-A-0125023、および多くのその後の文献に記載されている。
【００８８】
抗体操作の当業界で利用可能なさらなる技術により、ヒトおよびヒト化抗体を単離することができるようになった。例えば、ヒトハイブリドーマを、Kontermann & Dubel (2001), S, Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC; ISBN: 3540413545により記載のように作製することができる。特異的結合メンバーを作製するための別の確立された技術であるファージディスプレイは、WO92/01047 (以下でさらに考察される)および米国特許第5969108号、第5565332号、第5733743号、第5858657号、第5871907号、第5872215号、第5885793号、第5962255号、第6140471号、第6172197号、第6225447号、第6291650号、第6492160号、第6521404号およびKontermann & Dubel (2001), S, Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC; ISBN: 3540413545などの多くの刊行物に詳細に記載されている。マウス抗体遺伝子が不活化され、マウス免疫系の他の成分を無傷のままにしながらヒト抗体遺伝子と機能的に置き換えられたトランスジェニックマウスを、ヒト抗体を単離するために用いることができる(Mendezら(1997), Nature Genet, 15(2): 146-156)。
【００８９】
例えば、Knappikら(2000) J. Mol. Biol. 296, 57-86またはKrebsら(2001) Journal of Immunological Methods, 254 67-84により記載されたような、好適な発現ベクター内で合成および集合されるオリゴヌクレオチドを用いて作製される遺伝子からの発現により、合成抗体分子を作出することができる。
【００９０】
全抗体の断片は抗原に結合する機能を実行することができることが示されている。結合断片の例は、(i)VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなるFab断片；(ii)VHおよびCH1ドメインからなるFd断片；(iii)単一抗体のVLおよびVHドメインからなるFv断片；(iv)VHまたはVLドメインからなるdAb断片(Wardら(1989) Nature 341, 544-546; McCaffertyら(1990) Nature, 348, 552-554; Holtら(2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490)；(v)単離されたCDR領域；(vi)2つの連結されたFab断片を含む二価断片であるF(ab')2断片；(vii)VHドメインとVLドメインとが、抗原結合部位を形成するように2つのドメインを会合させるペプチドリンカーにより連結された一本鎖Fv分子(scFv)(Birdら(1988) Science, 242, 423-426; Hustonら(1988) PNAS USA, 85, 5879-5883)；(viii)二特異的一本鎖Fvダイマー(PCT/US92/09965)および(ix)遺伝子融合により構築された多価または多特異的断片である「ダイアボディ」(WO94/13804; Holligerら(1993a), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448)である。Fv、scFvまたはダイアボディ分子を、VHドメインとVLドメインを連結するジスルフィド架橋の組込みにより安定化することができる(Reiterら(1996), Nature Biotech, 14, 1239-1245)。CH3ドメインに連結されたscFvを含むミニボディを作製することもできる(Huら(1996), Cancer Res., 56(13):3055-61)。結合断片の他の例は、抗体ヒンジ領域に由来する1個以上のシステインなどの、重鎖CH1ドメインのカルボキシル末端での数個の残基の付加によりFab断片と異なるFab'、および定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担持するFab'断片であるFab'-SHである。
【００９１】
本発明における使用のための抗体断片を、ペプシンもしくはパパインなどの酵素による消化などの方法による、および/または化学的還元によるジスルフィド架橋の切断により、本明細書に記載の任意の抗体分子、例えば、本明細書に記載の任意の抗体のVHおよび/もしくはVLドメインまたはCDRを含む抗体分子から出発して取得することができる。別の様式では、本発明の抗体断片を、同様に当業者には周知の遺伝子組換えの技術により、または他に、例えば、Applied Biosystems社などにより供給されるものなどの自動ペプチド合成装置を用いるペプチド合成により、もしくは核酸合成および発現により取得することができる。
【００９２】
本発明による機能的抗体断片は、化学的改変、特に、PEG化、またはリポソーム中への組込みにより半減期が増大した任意の機能的断片を含む。
【００９３】
dAb(ドメイン抗体)は、抗体の小さいモノマー抗原結合断片、すなわち、抗体重鎖または軽鎖の可変領域である(Holtら(2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490)。VH dAbは、ラクダ科動物(例えば、ラクダ、ラマ)に天然に存在し、ラクダ科動物を標的抗原で免疫し、抗原特異的B細胞を単離し、個々のB細胞からdAb遺伝子を直接クローニングすることによって産生することができる。dAbはまた、細胞培養物中で産生可能である。その小さいサイズ、良好な可溶性および温度安定性により、それらは生理学的に有用になり、選択および親和性成熟にとって好適になる。本発明の特異的結合メンバーは、本明細書に実質的に記載されるようなVHもしくはVLドメイン、または本明細書に実質的に記載されるようなCDRのセットを含むVHもしくはVLドメインを含むdAbであってもよい。
【００９４】
本明細書で用いられる語句「実質的に記載される」とは、本明細書に記載の特異的結合メンバーのVHまたはVLドメインの関連するCDRの特徴が、配列が本明細書に記載される特定の領域と同一であるか、またはそれと高度に類似することを指す。1つ以上の可変ドメインの特定の領域に関する、本明細書に記載の語句「高度に類似する」は、1〜約5個、例えば、1〜4個、例えば、1〜3個、または1もしくは2個、または3もしくは4個のアミノ酸置換を、CDRおよび/またはVHもしくはVLドメイン中で作製することができることが企図される。
【００９５】
二特異的または二官能性抗体は、2つの異なる可変領域が同じ分子中で組み合わされる第2世代のモノクローナル抗体を形成する(HolligerおよびBohlen 1999 Cancer and metastasis rev. 18: 411-419)。それらの使用は、新しいエフェクター機能を動員するか、または腫瘍細胞の表面上のいくつかの分子を標的化するその能力から、診断分野と治療分野の両方において証明されている。二特異的抗体を用いようとする場合、これらのものは従来の二特異的抗体であってもよく、様々な方法で製造する(Holligerら(1993b), Current Opinion Biotechnol 4, 446-449)、例えば、化学的に、もしくはハイブリッドハイブリドーマから調製することができるか、または上記の二特異的抗体断片のいずれかであってもよい。これらの抗体を、化学的方法(Glennieら(1987) J. Immunol. 139, 2367-2375; Reppら(1995) J. Hemat. 377-382)または体細胞法(Staerz U. D.およびBevan M. J. (1986) PNAS 83; Sureshら(1986) Method. Enzymol. 121: 210-228)により取得することができるが、同様に、ヘテロダイマー化を起こさせ、かくして、探索される抗体の精製プロセスを容易にする遺伝子操作技術によって取得することができる(Merchandら、1998 Nature Biotech. 16:677-681)。二特異的抗体の例としては、異なる特異性を有する2つの抗体の結合ドメインを使用し、短い可撓性ペプチドを介して直接連結することができるBiTE(商標)技術のものが挙げられる。これは、短い単一のポリペプチド鎖上で2つの抗体を組み合わせるものである。ダイアボディとscFvを、抗イディオタイプ反応の効果を潜在的に低下させる、可変ドメインのみを用いて、Fc領域を用いずに構築することができる。
【００９６】
二特異的抗体を、全IgGとして、二特異的Fab'2として、Fab'PEGとして、ダイアボディとして、または他に二特異的scFvとして構築することができる。さらに、2つの二特異的抗体を、四価抗体を形成する当業界で公知の日常的な方法を用いて連結することができる。
【００９７】
二特異的ダイアボディは、大腸菌中で容易に構築および発現させることができるため、二特異的全抗体とは反対に、特に有用であってもよい。好適な結合特異性のダイアボディ(および抗体断片などの多くの他のポリペプチド)を、ライブラリーからファージディスプレイ(WO94/13804)を用いて容易に選択することができる。ダイアボディの一方のアームを、例えば、標的抗原に対する特異性と共に、一定に保持しようとする場合、他方のアームが変化したライブラリーを作製し、適切な特異性の抗体を選択することができる。二特異的全抗体を、Ridgewayら(1996), Protein Eng., 9, 616-621に記載のような代替的操作方法により作製することができる。
【００９８】
標的抗原に対する抗体を取得するための様々な方法が当業界で利用可能である。抗体は、特に、ヒト、マウス、キメラまたはヒト化起源のモノクローナル抗体であってもよく、当業者には周知の標準的な方法に従って取得することができる。
【００９９】
一般に、特に、マウス起源のモノクローナル抗体またはその機能的断片の調製のために、特に、マニュアル「抗体」(HarlowおよびLane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y., pp. 726, 1988)に記載された技術またはKohlerおよびMilstein, 1975, Nature, 256:495-497により記載されたハイブリドーマからの調製技術を参照することができる。
【０１００】
モノクローナル抗体を、例えば、A-FN、B-FN、もしくはテナシンCまたは前記モノクローナル抗体により認識されるエピトープを含有するその断片、例えば、ED-A、ED-B、テナシンCのA1ドメイン、もしくはそのペプチド断片を含むか、もしくはそれからなる断片に対して免疫された動物細胞から取得することができる。A-FN、B-FN、もしくはテナシンC、またはその断片を、特に、A-FN、B-FN、もしくはテナシンC、もしくはその断片をコードするcDNA配列中に含まれる核酸配列から始まる遺伝子組換えにより、またはB-FN、もしくはテナシンC、および/もしくはその断片のペプチド配列中に含まれるアミノ酸の配列から始まるペプチド合成により、通常の作業方法に従って産生することができる。
【０１０１】
モノクローナル抗体を、例えば、A-FN、B-FN、もしくはテナシンC、または前記モノクローナル抗体により認識されるエピトープを含有するその断片、例えば、ED-A、B-FN、もしくはテナシンCを含むか、もしくはそれからなる断片、またはED-A、B-FN、もしくはテナシンCのペプチド断片が予め固定された親和性カラム上で精製することができる。モノクローナル抗体を、プロテインAおよび/またはG上でのクロマトグラフィー、次いで、残留するタンパク質夾雑物ならびにDNAおよびLPSそのものを除去するためのイオン交換クロマトグラフィーを用いて、または用いずに、次いで、ダイマーもしくは他のマルチマーの存在に起因する潜在的な凝集体を除去するためのセファロースゲル上での排除クロマトグラフィーを用いて、または用いずに精製することができる。これらの技術の全体を、同時に、または連続的に用いることができる。
【０１０２】
(抗原結合部位)
これは、標的抗原の全部または一部に結合し、それと相補的である分子の部分を記載する。抗体分子において、それは抗体抗原結合部位と呼ばれ、標的抗原の全部または一部に結合し、それと相補的である抗体の部分を含む。抗原が大きい場合、抗体は抗原の特定の部分にのみ結合することができ、その部分はエピトープと呼ばれる。抗体抗原結合部位を、1つ以上の抗体可変ドメインにより提供することができる。抗体抗原結合部位は、抗体軽鎖可変領域(VL)と、抗体重鎖可変領域(VH)とを含んでもよい。
【０１０３】
(単離された)
これは、本発明における使用のための特異的結合メンバーまたはそのような特異的結合メンバーをコードする核酸が、一般に、本発明によるものである状態を指す。かくして、その天然の環境から単離および/もしくは精製された、例えば、実質的に純粋もしくは均質な形態で、または、核酸の場合、必要とされる機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の起源の核酸もしくは遺伝子を含まない、もしくは実質的に含まない、本発明の特異的結合メンバー、VHおよび/またはVLドメインを提供することができる。単離されたメンバーおよび単離された核酸は、それらがその天然の環境中に、または調製がin vitroもしくはin vivoで実行される組換えDNA技術によるものである場合、それらが調製される環境(例えば、細胞培養物)中に見出される他のポリペプチドまたは核酸などの、それらが天然で会合する材料を含まないか、または実質的に含まない。特異的結合メンバーおよび核酸を、希釈剤またはアジュバントと共に製剤化し、さらに実用目的のために単離することができる、例えば、メンバーを、通常、免疫アッセイにおける使用のためにマイクロタイタープレートを被覆するために用いる場合、ゼラチンもしくは他の担体と混合するか、または診断もしくは療法において用いられる場合、製薬上許容し得る担体もしくは希釈剤と混合する。特異的結合メンバーは、天然で、もしくは異種真核細胞(例えば、CHOもしくはNS0(ECACC85110503)の系によりグリコシル化されてもよく、またはそれらは非グリコシル化されていてもよい(例えば、原核細胞中での発現により産生される場合)。
【０１０４】
抗体分子を含む異種調製物を、本発明において用いることもできる。例えば、そのような調製物は、完全長重鎖およびC末端リシンを欠く重鎖を有する、様々な程度のグリコシル化を有する、および/またはピログルタミン酸残基を形成するためのN末端グルタミン酸の環化などの誘導体化されたアミノ酸を有する抗体の混合物であってもよい。
【０１０５】
抗原、例えば、A-FN、ED-A、B-FN、ED-B、テナシンC、またはテナシンCのA1ドメインのための1つ以上の特異的結合メンバーを、本発明による特異的結合メンバーのライブラリーと、抗原またはその断片、例えば、ED-A、ED-B、もしくはテナシンCのA1ドメインを含むか、もしくはそれからなる断片、またはそのペプチド断片とを接触させること、および前記抗原に結合することができる前記ライブラリーの1つ以上の特異的結合メンバーを選択することにより取得することができる。
【０１０６】
抗体ライブラリーを、反復コロニーフィルタースクリーニング(ICFS)を用いてスクリーニングすることができる。ICFSにおいては、いくつかの結合特異性をコードするDNAを含有する細菌を、液体培地中で増殖させ、一度、指数増殖期に達したら、数十億のそれらを、好適に予備処理された膜からなる増殖支持体上に分配し、完全に集密な細菌コロニーが出現するまでインキュベートする。第2の捕捉基質は、予め加湿され、所望の抗原で被覆された別の膜フィルターからなる。
【０１０７】
次いで、捕捉膜フィルターを、好適な培養培地を含有するプレート上に置き、細菌コロニーが上を向くように表面を被覆して増殖フィルターで被覆する。かくして得られたサンドイッチを、室温で約16hインキュベートする。かくして、拡散作用を有する抗体断片scFvをコードする遺伝子の発現を得ることができ、捕捉膜上に存在する抗原との結合特異性を有するこれらの断片が捕捉される。次いで、捕捉膜を、この目的のために一般的に用いられる比色分析技術を用いて結合した抗体断片scFvを指示するように処理する。
【０１０８】
捕捉フィルター上の着色したスポットの位置により、増殖膜上に存在し、捕捉された抗体断片を産生する対応する細菌コロニーに戻ることができる。そのようなコロニーを集め、増殖させ、数百万個の細菌を新しい培養膜上に分配し、上記の手順を繰り返す。次いで、捕捉膜上の陽性シグナルが、それぞれ選択において用いられる抗原に対するモノクローナル抗体断片の潜在的な供給源である単一の陽性クローンに一致するまで同様のサイクルを実行する。ICFSは、例えば、WO0246455に記載されている。
【０１０９】
ライブラリーを、粒子または分子複合体、例えば、それぞれの粒子または分子複合体が、その上に展示された抗体VH可変ドメインをコードする核酸を含有し、必要に応じて、存在する場合、展示されたVLドメインも含有する、複製可能な遺伝子パッケージ、例えば、バクテリオファージ(例えば、T7)粒子、または他のin vitroのディスプレイ系上に展示することもできる。ファージディスプレイは、WO92/01047ならびに米国特許第5969108号、第5565332号、第5733743号、第5858657号、第5871907号、第5872215号、第5885793号、第5962255号、第6140471号、第6172197号、第6225447号、第6291650号、第6492160号、および第6521404号に記載されている。
【０１１０】
抗原に結合することができ、バクテリオファージまたは他のライブラリー粒子もしくは分子複合体上に展示された特異的結合メンバーの選択後、前記選択された特異的結合メンバーを展示するバクテリオファージまたは他の粒子もしくは分子複合体から、核酸を取得することができる。そのような核酸を、前記選択された特異的結合メンバーを展示するバクテリオファージまたは他の粒子もしくは分子複合体から取得された核酸の配列を含む核酸からの発現により、特異的結合メンバーまたは抗体VHもしくはVL可変ドメインのその後の産生において用いることができる。フィブロネクチンのA-FN、B-FN、ED-A、またはED-B、テナシンCまたはテナシンCのA1ドメインまたは他の標的抗原もしくはアイソフォームなどの、新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する能力、例えば、フィブロネクチンのA-FN、B-FN、ED-A、またはED-B、テナシンCまたはテナシンCのA1ドメインに特異的な抗体、例えば、抗体F8、L19またはF16と競合する能力をさらに試験することができる。
【０１１１】
本発明における使用のための特異的結合メンバーは、フィブロネクチンのA-FN、B-FN、ED-A、またはED-B、テナシンCまたはテナシンCのA1ドメインなどの、新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に特異的に結合することができる。本発明の特異的結合メンバーは、例えば、ダイアボディ形式の抗ED-A抗体F8と同じ親和性で、またはより良好な親和性で、フィブロネクチンのA-FNおよび/またはED-Aに結合することができる。本発明の特異的結合メンバーは、例えば、scFvもしくはダイアボディ形式の抗ED-B抗体L19と同じ親和性で、またはより良好な親和性で、フィブロネクチンのB-FNおよび/またはED-Bに結合することができる。本発明の特異的結合メンバーは、例えば、scFvもしくはダイアボディ形式の抗ED-A抗体F16と同じ親和性で、またはより良好な親和性で、テナシンCおよび/またはテナシンCのA1ドメインに結合することができる。
【０１１２】
本発明の特異的結合メンバーは、抗ED-A抗体F8と同じ、フィブロネクチンのA-FNおよび/またはED-A上のエピトープに結合することができる。本発明の特異的結合メンバーは、抗ED-A抗体L19と同じ、フィブロネクチンのB-FNおよび/またはED-B上のエピトープに結合することができる。本発明の特異的結合メンバーは、抗体F16と同じ、テナシンCおよび/またはテナシンCのA1ドメイン上のエピトープに結合することができる。
【０１１３】
本明細書に開示される抗体分子の変異体を産生し、本発明において使用することができる。CDR、抗体VHもしくはVLドメイン、特に、VHおよびVLドメインのフレームワーク領域、ならびに特異的結合メンバーのアミノ酸配列内に置換を作製するのに必要とされる技術は、一般に当業界で利用可能である。変異体配列を、活性に対する最小の、または有益な効果を有すると予測されるか、またはされない置換を用いて作製し、フィブロネクチンのA-FNおよび/もしくはED-A、フィブロネクチンのB-FNおよび/もしくはED-B、テナシンCおよび/もしくはテナシンCのA1ドメインに結合する能力について、ならびに/または任意の他の所望の特性について試験することができる。
【０１１４】
配列が本明細書に特に開示されるVHおよびVLドメインのいずれかの可変ドメインアミノ酸配列変異体を、考察されるように、本発明に従って用いることができる。特定の変異体は、1つ以上のアミノ酸配列変化(アミノ酸残基の付加、欠失、置換および/または挿入)を含んでもよく、約20個未満の変化、約15個未満の変化、約10個未満の変化または約5個未満の変化であってもよく、5、4、3、2または1個の変化であってもよい。変化を、1つ以上のフレームワーク領域および/または1つ以上のCDR中で作製することができる。変化は通常、機能の喪失をもたらさず、従って、かくして変化したアミノ酸配列を含む特異的結合メンバーは、フィブロネクチンのA-FNおよび/またはED-A、フィブロネクチンのB-FNおよび/またはED-B、テナシンCおよび/またはテナシンCのA1ドメインに結合する能力を保持してもよい。例えば、それは、例えば、本明細書に記載のアッセイにおいて測定された場合に、変化が作製されない特異的結合メンバーと同じ定量的結合を保持してもよい。かくして変化したアミノ酸配列を含む特異的結合メンバーは、フィブロネクチンのA-FNおよび/またはED-A、フィブロネクチンのB-FNおよび/またはED-B、テナシンCおよび/またはテナシンCのA1ドメインに結合する改善された能力を有してもよい。例えば、本明細書に記載のように、フィブロネクチンのED-AアイソフォームまたはED-Aに結合する特異的結合メンバーは、配列番号18に示されるVHドメインおよび/または配列番号19に示されるVLドメインを含んでもよく、VHおよび/またはVLドメインのフレームワーク領域内に10個以下、例えば、5、4、3、2または1個のアミノ酸置換を含んでもよい。そのような特異的結合メンバーは、配列番号18に示されるVHドメインと配列番号19に示されるVLドメインとを含む特異的結合メンバーと、同じか、もしくは実質的に同じ親和性で、フィブロネクチンのED-AアイソフォームもしくはED-Aに結合するか、または配列番号18に示されるVHドメインと、配列番号19に示されるVLドメインとを含む特異的結合メンバーよりも高い親和性で、フィブロネクチンのED-AアイソフォームもしくはED-Aに結合してもよい。本明細書に記載のように、フィブロネクチンのED-BアイソフォームまたはED-Bに結合する特異的結合メンバーは、配列番号31に示されるVHドメインおよび/または配列番号32に示されるVLドメインを含んでもよく、VHおよび/またはVLドメインのフレームワーク領域内に10個以下、例えば、5、4、3、2または1個のアミノ酸置換を含んでもよい。そのような特異的結合メンバーは、配列番号31に示されるVHドメインと配列番号32に示されるVLドメインとを含む特異的結合メンバーと、同じか、もしくは実質的に同じ親和性で、フィブロネクチンのED-BアイソフォームもしくはED-Bに結合するか、または配列番号31に示されるVHドメインと、配列番号32に示されるVLドメインとを含む特異的結合メンバーよりも高い親和性で、フィブロネクチンのED-BアイソフォームもしくはED-Bに結合してもよい。本明細書に記載のように、テナシンCまたはテナシンCのA1ドメインに結合する特異的結合メンバーは、配列番号40に示されるVHドメインおよび/または配列番号41に示されるVLドメインを含んでもよく、VHおよび/またはVLドメインのフレームワーク領域内に10個以下、例えば、5、4、3、2または1個のアミノ酸置換を含んでもよい。そのような特異的結合メンバーは、配列番号40に示されるVHドメインと配列番号41に示されるVLドメインとを含む特異的結合メンバーと、同じか、もしくは実質的に同じ親和性で、テナシンCもしくはテナシンCのA1ドメインに結合するか、または配列番号40に示されるVHドメインと、配列番号41に示されるVLドメインとを含む特異的結合メンバーよりも高い親和性で、テナシンCもしくはテナシンCのA1ドメインに結合してもよい。
【０１１５】
本発明における使用のためのCDR由来配列を担持する新規VHまたはVL領域を、1つ以上の選択されたVHおよび/またはVL遺伝子の無作為突然変異誘発を用いて作製して、全可変ドメイン内に突然変異を作製することができる。いくつかの実施形態においては、1つまたは2つのアミノ酸置換を、全可変ドメインまたはCDRのセット内で作製する。用いることができる別の方法は、VHまたはVL遺伝子のCDR領域に対して突然変異誘発を指令することである。
【０１１６】
上述の通り、本明細書に実質的に記載されるCDRアミノ酸配列を、ヒト抗体可変ドメインまたはその実質的な部分中にCDRとして担持させることができる。本明細書に実質的に記載されるHCDR3配列は、本発明の実施形態であり、例えば、これらの各々を、ヒト重鎖可変ドメインまたはその実質的な部分中にHCDR3として担持させることができる。
【０１１７】
本発明において用いられる可変ドメインを、任意の生殖系列もしくは再配列されたヒト可変ドメインから取得もしくは誘導するか、またはそれらは公知のヒト可変ドメインのコンセンサスもしくは実際の配列に基づく合成可変ドメインであってもよい。可変ドメインを、非ヒト抗体から誘導することができる。本発明における使用のためのCDR配列(例えば、CDR3)を、組換えDNA技術を用いて、CDR(例えば、CDR3)を欠く可変ドメインのレパートリーに導入することができる。例えば、Marksら(1992)は、可変ドメイン領域に対する、またはその5’末端に隣接するコンセンサスプライマーを、ヒトVH遺伝子の第3のフレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーと共に用いて、CDR3を欠くVH可変ドメインのレパートリーを提供する、抗体可変ドメインのレパートリーを産生する方法を記載する。Marksらはさらに、このレパートリーを特定の抗体のCDR3と組み合わせることができる方法を記載する。同様の技術を用いて、本発明のCDR3由来配列を、CDR3を欠くVHまたはVLドメインのレパートリーを用いてシャッフルし、シャッフルされた完全なVHまたはVLドメインを、同種VLまたはVHドメインと組み合わせて、本発明における使用のための特異的結合メンバーを提供することができる。次いで、レパートリーを、WO92/01047、またはKay, Winter & McCafferty(1996)などのその後の多くの文献のいずれかのファージディスプレイ系などの好適な宿主系中で展示し、好適な特異的結合メンバーを選択することができる。レパートリーは、104個の個々のメンバーから上に向かう任意のもの、例えば、少なくとも105、少なくとも106、少なくとも107、少なくとも108、少なくとも109または少なくとも1010個のメンバーからなっていてもよい。
【０１１８】
同様に、1つ以上、または3つ全部のCDRを、VHまたはVLドメインのレパートリーに移植した後、特異的結合メンバーまたはA-FN、B-FN、フィブロネクチンのED-A、もしくはED-B、テナシンCもしくはテナシンCのA1ドメインのための特異的結合メンバーについてスクリーニングすることができる。
【０１１９】
抗体F8、L19、もしくはF16の1つ以上のHCDR1、HCDR2およびHCDR3、または抗体F8、L19、もしくはF16のHCDRのセットを用いる、ならびに/または抗体F8、L19もしくはF16の1つ以上のLCDR1、LCDR2およびLCDR3、または抗体F8、L19もしくはF16のLCDRのセットを用いることができる。
【０１２０】
同様に、本明細書に開示される他のVHおよびVLドメイン、CDRのセットならびにHCDRのセットおよび/またはLCDRのセットを用いることができる。
【０１２１】
フィブロネクチンのA-FN、B-FN、ED-A、もしくはED-B、テナシンCもしくはテナシンCのA1ドメインなどの、新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分を、本発明における使用のための、特異的結合メンバー、例えば、抗体分子のためのスクリーンにおいて用いることができる。スクリーンは、本明細書の他の場所に開示されるレパートリーのスクリーンであってもよい。
【０１２２】
免疫グロブリン可変ドメインの実質的な部分は、その介在するフレームワーク領域と一緒に、少なくとも3つのCDR領域を含んでもよい。この部分はまた、第1および第4のフレームワーク領域の一方または両方の少なくとも約50%を含んでもよく、その50%は、第1のフレームワーク領域のC末端側50%であり、第4のフレームワーク領域のN末端側50%である。可変ドメインの実質的な部分のN末端またはC末端にあるさらなる残基は、通常は天然に存在する可変ドメイン領域と結合しないものであってもよい。例えば、組換えDNA技術により行われる本発明の特異的結合メンバーの構築は、クローニングまたは他の操作工程を容易にするために導入されるリンカーによりコードされるNまたはC末端残基の導入をもたらしてもよい。他の操作工程としては、本明細書の他の場所に開示される可変ドメインを、抗体定常領域、他の可変ドメイン(例えば、ダイアボディの産生における)または本明細書の他の場所により詳細に考察される検出可能/機能的な標識を含むさらなるタンパク質配列へのリンカーの導入を含む。
【０１２３】
特異的結合メンバーは、一対のVHおよびVLドメインを含んでもよいが、VHまたはVLドメイン配列に基づく単一の結合ドメインを、本発明において用いることもできる。単一の免疫グロブリンドメイン、特に、VHドメインは、特異的な様式で標的抗原に結合することができる。例えば、上記のdAbの考察を参照されたい。
【０１２４】
単一の結合ドメインのいずれかの場合、これらのドメインを用いて、フィブロネクチンのA-FN、B-FN、ED-A、またはED-B、テナシンCまたはテナシンCのA1ドメインなどの、新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合することができる2ドメインの特異的結合メンバーを形成することができる相補的ドメインをスクリーニングすることができる。HまたはL鎖クローンを含有する個々のコロニーを用いて、他方の鎖(LまたはH)をコードするクローンの完全なライブラリーを感染させ、得られる2鎖特異的結合メンバーを、参考文献に記載のものなどのファージディスプレイ技術に従って選択する、WO92/01047に開示されたいわゆる階層的二重組合せアプローチを用いるファージディスプレイスクリーニング法によりこれを達成することができる。この技術も、Marks 1992に開示されている。
【０１２５】
本発明における使用のための特異的結合メンバーは、抗体定常領域またはその一部、例えば、ヒト抗体定常領域またはその一部をさらに含んでもよい。例えば、VLドメインを、そのC末端で、ヒトCカッパまたはCラムダ鎖、例えば、Cラムダを含む抗体軽鎖定常ドメインに結合することができる。同様に、VHドメインに基づく特異的結合メンバーを、そのC末端で、任意の抗体アイソタイプ、例えば、IgG、IgA、IgEおよびIgMならびに任意のアイソタイプサブクラス、特に、IgG1およびIgG4から誘導される免疫グロブリン重鎖の全部または一部(例えば、CH1ドメイン)に結合することができる。これらの特性を有し、可変領域を安定化させる任意の合成または他の定常領域変異体も、本発明の実施形態において有用である。
【０１２６】
本発明の文脈において、本明細書に記載の特異的結合メンバー(例えば、抗体)は、IL4とのコンジュゲートの一部を形成する。IL4は、好ましくはヒトIL4である。特異的結合メンバーは、好ましくは、scFvを含むか、またはダイアボディである。
【０１２７】
特異的結合メンバーとIL4とを、例えば、任意の好適な化学結合を介して直接的に、またはリンカー、例えば、ペプチドリンカーを介して互いに接続することができる。特異的結合メンバーをペプチドリンカーを用いてIL4に連結する場合、コンジュゲートは融合タンパク質であってもよい。
【０１２８】
化学的結合は、例えば、共有結合またはイオン結合であってもよい。共有結合の例としては、ペプチド結合(アミド結合)およびジスルフィド結合が挙げられる。特異的結合メンバーと、IL4とを、例えば、ペプチド結合(アミド結合)により共有的に連結することができる。かくして、特異的結合メンバー、特に、特異的結合メンバーのscFv部分と、IL4とを、融合タンパク質として産生させることができる。特異的結合メンバーは2鎖または多鎖分子(例えば、ダイアボディ)である場合、IL4を、特異的結合メンバー中の1つ以上のポリペプチド鎖との融合ポリペプチドとしてコンジュゲートさせることができる。
【０１２９】
特異的結合メンバーとIL4とを接続するペプチドリンカーは、可撓性ペプチドリンカーであってもよい。ペプチドリンカー配列の好適な例は、当業界で公知である。リンカーは、10〜20アミノ酸長、好ましくは15〜20アミノ酸長であってもよい。最も好ましくは、リンカーは、15アミノ酸長である。最も好ましくは、リンカーは、配列SSSSGSSSSGSSSSG(配列番号24)を有する。
【０１３０】
コンジュゲーションのための他の手段としては、化学的コンジュゲーション、特に、二官能性試薬を用いる架橋(例えば、DOUBLE-REAGENTS(商標)Cross-linking Reagents Selection Guide, Pierceを用いる)が挙げられる。
【０１３１】
また、本発明によるコンジュゲートをコードする単離された核酸分子も提供される。核酸分子は、DNAおよび/またはRNAを含んでもよく、部分的または全体的に合成であってもよい。本明細書に記載のヌクレオチド配列に対する参照は、文脈が別途必要としない限り、特定の配列を有するDNA分子を包含し、UがTに置換された特定の配列を有するRNA分子を包含する。
【０１３２】
さらに、そのような核酸を含むプラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態の構築物が提供される。プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および必要に応じて他の配列を含む、適切な調節配列を含有する好適なベクターを選択または構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、例えば、ファージミド、またはウイルス、例えば、「ファージ」であってもよい。さらなる詳細については、例えば、Sambrook & Russell (2001) Molecular Cloning: a Laboratory Manual:  3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞中へのDNAの導入および遺伝子発現における核酸の操作、ならびにタンパク質の分析のための多くの公知の技術およびプロトコールが、Ausubelら(1999) 4th eds., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sonsに詳細に記載されている。
【０１３３】
上記の1つ以上の構築物を含む組換え宿主細胞も提供される。好適な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、糸状菌、酵母およびバキュロウイルス系ならびにトランスジェニック植物および動物が挙げられる。
【０１３４】
本発明によるコンジュゲートを、そのような組換え宿主細胞を用いて産生させることができる。産生方法は、上記の核酸または構築物を発現させることを含んでもよい。コンジュゲートの産生のための適切な条件下で組換え宿主細胞を培養することにより、発現を都合良く達成することができる。産生後、任意の好適な技術を用いてコンジュゲートを単離および/または精製した後、必要に応じて使用することができる。コンジュゲートを、製薬上許容し得る賦形剤などの、少なくとも1つのさらなる成分を含む組成物に製剤化することができる。
【０１３５】
様々な異なる宿主細胞中でのポリペプチドのクローニングおよび発現のための系は周知である。原核細胞中での、抗体のコンジュゲートを含む抗体の発現は、当業界でよく確立されている。概説については、例えば、Pluckthun (1991), Bio/Technology 9: 545-551を参照されたい。一般的な細菌宿主は、大腸菌である。
【０１３６】
培養物中の真核細胞中での発現も、コンジュゲートの産生のための選択肢として当業者には利用可能である。例えば、Chaddら(2001), Current Opinion in Biotechnology 12: 188-194); Andersenら(2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 117; Larrick & Thomas (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:411-418。異種ポリペプチドの発現のために当業界で利用可能な哺乳動物細胞系としては、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、NS0マウスメラノーマ細胞、YB2/0ラットミエローマ細胞、ヒト胚性腎細胞、ヒト胚性網膜細胞およびその他の多くが挙げられる。
【０１３７】
本明細書に開示される核酸または構築物を宿主細胞中に導入することを含む方法も記載される。導入は、任意の利用可能な技術を用いてもよい。真核細胞については、好適な技術は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性トランスフェクションおよびレトロウイルスまたは他のウイルス、例えば、ワクシニア、もしくは、昆虫細胞については、バキュロウイルスを用いる形質導入を含んでもよい。宿主細胞、特に、真核細胞中への核酸の導入は、ウイルスまたはプラスミドに基づく系を用いてもよい。プラスミド系をエピソームとして維持するか、または宿主細胞もしくは人工染色体中に組込むことができる。組込みは、単一または複数の遺伝子座での1以上のコピーの無作為な、または標的化された取込みによるものであってもよい。細菌細胞については、好適な技術は、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーションおよびバクテリオファージを用いるトランスフェクションを含んでもよい。
【０１３８】
核酸または構築物を、宿主細胞のゲノム(例えば、染色体)中に取込むことができる。標準的な技術に従って、ゲノムとの組換えを促進する配列の含有により、取込みを促進することができる。
【０１３９】
本発明のコンジュゲートを、患者、好ましくはヒト患者の処置方法において使用されるように設計する。本発明のコンジュゲートを、がんおよび/または関節リウマチ(RA)、多発性硬化症(MS)、炎症性腸疾患(IBD)、乾癬、乾癬性関節炎、子宮内膜症、ベーチェット病および歯周炎などの自己免疫疾患などの疾患/障害の処置において用いることができる。本発明のコンジュゲートを用いて処置または防止することができる他の疾患としては、自己免疫性膵島炎および糖尿病、特に、自己免疫性糖尿病が挙げられる。多病性患者、すなわち、2つ以上のこれらの疾患に罹患している患者を、本発明のコンジュゲートを用いて処置することもできる。好ましくは、本発明のコンジュゲートを用いて、がんおよび/またはRAを処置する。最も好ましくは、本発明のコンジュゲートを用いて、RAを処置する。
【０１４０】
従って、本発明は、本発明によるコンジュゲートの投与を含む処置方法、そのようなコンジュゲートを含む医薬組成物、および例えば、前記コンジュゲートを製薬上許容し得る賦形剤と共に製剤化することを含む、薬剤または医薬組成物を作製する方法における、投与のための薬剤の製造におけるそのようなコンジュゲートの使用を提供する。製薬上許容し得るビヒクルは周知であり、選択される活性化合物の性質および投与様式の関数として当業者によって適合させることができる。
【０１４１】
本発明によるコンジュゲートは通常、特異的結合メンバーに加えて、少なくとも1つの成分を含んでもよい医薬組成物の形態で投与することができる。かくして、本明細書に記載の、および本発明による使用のための医薬組成物は、活性成分に加えて、製薬上許容し得る賦形剤、担体、バッファー、安定剤または当業者には周知の他の材料を含んでもよい。そのような材料は、非毒性的であるべきであり、活性成分の有効性を阻害するべきではない。担体または他の材料の正確な性質は、例えば、静脈内注射または皮下注射によるものであってもよい投与経路に依存する。好ましくは、本発明のコンジュゲートは、特に、処置または防止される疾患ががん、MS、IBD、乾癬、乾癬性関節炎、歯周炎、子宮内膜症、ベーチェット病、膵島炎または糖尿病である場合、静脈内投与される。処置がRAに関する場合、コンジュゲートを皮下投与することができる。
【０１４２】
液体医薬組成物は一般に、水、石油、動物または植物油、鉱油または合成油などの液体担体を含む。生理食塩溶液、デキストロースまたは他のサッカリド溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含有させることができる。
【０１４３】
静脈内注射、または罹患部位での注射のためには、活性成分は、発熱原を含まず、好適なpH、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水性溶液の形態にある。関連する当業者であれば、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液などの等張性ビヒクルを用いて好適な溶液を調製することができる。保存剤、安定剤、バッファー、酸化防止剤および/または他の添加物を、必要に応じて用いてもよい。医薬製剤の調製のための多くの方法が当業者には公知である。例えば、Robinson ed., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。
【０１４４】
本発明によるコンジュゲートを含む組成物を、処置される状態に応じて、単独で、もしくは他の処置と組み合わせて、同時に、もしくは連続的に、または別の治療剤もしくは薬剤との組合せ調製物として投与することができる。
【０１４５】
例えば、本発明における使用のための特異的結合メンバーを、処置される疾患のための存在する治療剤と組み合わせて用いることができる。
【０１４６】
本発明のコンジュゲートを、がんの処置、または腫瘍新血管系へのIL4の送達において用いる場合、本発明のコンジュゲートは、好ましくは、IL12またはIL2と、新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する結合メンバーとを含む第2のコンジュゲートと組み合わせて投与される。
【０１４７】
本発明のコンジュゲートを、RAなどの炎症性自己免疫疾患の処置、または炎症性自己免疫疾患の部位へのIL4の送達において用いる場合、本発明のコンジュゲートは、好ましくは、糖質コルチコイドと組み合わせて投与される。糖質コルチコイドは、好ましくはデキサメタゾンである。
【０１４８】
本発明によるコンジュゲートと、上記の、および本明細書の他の場所に記載の第2のコンジュゲートまたは糖質コルチコイドなどの1つ以上のさらなる医学的成分とを、薬剤の製造において用いることができる。薬剤は、個体への別々の、または組み合わせた投与のためのものであってよく、従って、前記コンジュゲートと、組合せ調製物として、または別々の調製物としてのさらなる成分とを含んでもよい。別々の調製物を用いて、別々の投与および連続的または同時的投与を容易にすることができ、異なる経路による成分の投与を可能にする。
【０１４９】
本発明によれば、提供される組成物を、哺乳動物、好ましくは、ヒトに投与することができる。投与は、「治療上有効量」にあってよく、これは、患者に対する利益を示すのに十分なものである。そのような利益は、少なくとも1つの症状の少なくとも改善であってもよい。かくして、特定の疾患の「処置」とは、少なくとも1つの症状の改善を指す。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、処置されるものの性質および重症度、処置される特定の患者、個々の患者の臨床状態、障害の原因、組成物の送達部位、コンジュゲートの型、投与の方法、投与のスケジュールならびに医師には公知の他の因子に依存する。処置の処方、例えば、用量の決定などは、一般開業医および他の医師の責任の範囲内にあり、症状の重症度および/または処置される疾患の進行に依存し得る。抗体の適切な用量は、当業界で周知である(Ledermannら(1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; およびBagshaweら(1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922)。本明細書、または投与される薬剤の型にとって適切なPhysician's Desk Reference (2003)に示される特定の用量を用いることができる。本発明における使用のためのコンジュゲートの治療上有効量または好適な用量を、動物モデルにおけるそのin vitroでの活性とin vivoでの活性とを比較することによって決定することができる。マウスおよび他の試験動物における有効用量のヒトへの外挿のための方法は公知である。正確な用量は、抗体が診断、防止または処置のためのものであるかどうか、処置される領域のサイズおよび位置、コンジュゲートの正確な性質などの、いくつかの因子に依存する。典型的なコンジュゲートは、全身適用については100μg〜1gの範囲にある。初期のより高い負荷用量、次いで、1回以上のより低い用量を投与することができる。これは、成人患者の単回処置のための用量であり、子供および幼児については比例的に調整し、また、分子量に比例してコンジュゲート形式に従って調整することもできる。処置を、医師の裁量で、毎日、週に2回、毎週または毎月の間隔で反復してもよい。処置は、皮下投与については2〜4週間毎、静脈内投与については4〜8週間毎であってもよい。本発明のいくつかの実施形態においては、処置は周期的なものであり、投与間の期間は約2週間以上、例えば、約3週間以上、約4週間以上、または月に約1回である。本発明の他の実施形態においては、処置は、外科手術の前および/または後に与えてもよく、外科的処置の解剖学的部位に直接的に投与または適用してもよい。
【０１５０】
(フィブロネクチン)
フィブロネクチンは、選択的スプライシングを受ける抗原であり、血管新生の公知のマーカーである、それぞれED-AまたはED-Bドメインを含む、選択的にスプライスされたアイソフォームA-FNおよびB-FNなどのフィブロネクチンのいくつかの選択的アイソフォームが公知である。本明細書で記載される特異的結合メンバーは、新血管系において選択的に発現されるフィブロネクチンのアイソフォームに選択的に結合することができる。特異的結合メンバーは、フィブロネクチンアイソフォームA-FNに結合してもよく、例えば、それはED-Aドメイン(エクストラドメインA)に結合してもよい。特異的結合メンバーは、ED-B(エクストラドメインB)に結合してもよい。
【０１５１】
フィブロネクチンエクストラドメイン-A(EDAまたはED-A)は、ED、エクストラIII型リピートA(EIIIA)またはEDIとしても知られる。ヒトED-Aの配列は、Kornblihttら(1984), Nucleic Acids Res. 12, 5853-5868およびPaolellaら(1988), Nucleic Acids Res. 16, 3545-3557により公開されている。ヒトED-Aの配列はまた、受託番号P02751の下で預託されたアミノ酸配列のアミノ酸1631〜1720(フィブロネクチンIII型12；エクストラドメイン2)としてSwissProtデータベース上で入手可能である。マウスED-Aの配列は、受託番号P11276の下で預託されたアミノ酸配列のアミノ酸1721〜1810(フィブロネクチンIII型13；エクストラドメイン2)としてSwissProtデータベース上で入手可能である。
【０１５２】
フィブロネクチンのED-Aアイソフォーム(A-FN)は、エクストラドメイン-A(ED-A)を含有する。ヒトA-FNの配列を、受託番号P02751の下でSwissProtデータベース上で入手可能である対応するヒトフィブロネクチン前駆体配列から推定することができる。マウスA-FNの配列を、受託番号P11276の下でSwissProtデータベース上で入手可能である対応するマウスフィブロネクチン前駆体配列から推定することができる。A-FNは、フィブロネクチンのヒトED-Aアイソフォームであってもよい。ED-Aは、ヒトフィブロネクチンのエクストラドメイン-Aであってもよい。
【０１５３】
ED-Aは、選択的スプライシングによりフィブロネクチン(FN)に挿入された90アミノ酸の配列であり、FNのドメイン11と12の間に位置する(Borsiら(1987), J. Cell. Biol., 104, 595-600)。ED-Aは主に、血漿形態のFN中には存在しないが、胚形成、組織再モデリング、線維症、心臓移植および固形腫瘍増殖の間には豊富である。
【０１５４】
フィブロネクチンアイソフォームB-FNは、血管新生の最も知られたマーカーの1つである(US10/382,107、WO01/62298)。91アミノ酸のエクストラドメイン「ED-B」は、B-FNアイソフォーム中に見出され、マウス、ラット、ウサギ、イヌおよびヒトにおいて同一である。B-FNは、増殖期の子宮内膜などの血管新生を受けている侵攻性腫瘍および他の組織における新血管構造ならびに病的状態にあるが、そうでなければ正常な成体組織中では検出不可能であるいくつかの眼構造の周囲に蓄積する。
【０１５５】
(テナシンC)
テナシン-Cは、細胞接着を調節する細胞外マトリックスの大きいヘキサマー糖タンパク質である。それは、細胞増殖および細胞移動などのプロセスに関与し、形態形成および胚形成の間に、ならびに腫瘍形成または血管新生の下で生じる組織構造の変化と関連する。テナシン-Cのいくつかのアイソフォームは、ドメインAIからドメインDまでの範囲の、このタンパク質の中心部分への(複数の)ドメインの含有をもたらし得る選択的スプライシングの結果として生成され得る(Borsi Lら、Int J Cancer 1992; 52:688-692、Carnemolla Bら、Eur J Biochem 1992; 205:561-567、WO2006/050834)。本明細書に記載される特異的結合メンバーは、テナシン-Cに結合することができる。特異的結合メンバーは、テナシン-CのドメインA1に結合することができる。
【０１５６】
(がん)
本明細書で記載されるがんは、フィブロネクチンのED-Aアイソフォーム、フィブロネクチンのED-Bアイソフォームおよび/または選択的にスプライスされたテナシンCを発現するか、または発現することが示されたがんであってもよい。好ましくは、がんは、フィブロネクチンのED-Aアイソフォームを発現する。例えば、がんは、任意の型の固形もしくは非固形がんまたは悪性リンパ腫、特に、胚細胞がん（奇形癌）、肝臓がん、リンパ腫（ホジキンまたは非ホジキンリンパ腫）、白血病（例えば、急性骨髄性白血病）、肉腫、皮膚がん、メラノーマ、肉腫、膀胱がん、乳がん、子宮がん、卵巣がん、前立腺がん、肺がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、頭頸部がん、食道がん、膵臓がん、腎臓がん、胃がんおよび脳のがんであってもよい。がんは、家族性または散発性であってもよい。がんは、転移性または非転移性であってもよい。好ましくは、がんは、胚細胞がん(奇形癌）；結腸直腸がん；ホジキンもしくは非ホジキンリンパ腫；メラノーマ；膵臓がん；軟部組織肉腫；または腎細胞癌からなる群から選択されるがんである。
【０１５７】
(炎症性自己免疫疾患)
本明細書で記載される炎症性自己免疫疾患は、フィブロネクチンのED-Aアイソフォーム、フィブロネクチンのED-Bアイソフォームおよび/またはテナシンCの発現を特徴とする、または特徴とすることが示された炎症性自己免疫疾患であってもよい。炎症性自己免疫疾患の処置、または患者における炎症性自己免疫疾患の部位へのIL4の送達において用いられるコンジュゲートを、前記炎症性自己免疫疾患におけるフィブロネクチンのED-Aアイソフォーム、フィブロネクチンのED-BアイソフォームおよびテナシンCの発現に基づいて選択することができる。好ましくは、炎症性自己免疫疾患は、関節リウマチ(RA)、多発性硬化症(MS)、子宮内膜症、自己免疫性糖尿病(1型糖尿病など)、炎症性腸疾患(IBD)、乾癬、乾癬性関節炎、および歯周炎からなる群から選択される。より好ましくは、自己免疫性疾患は、関節リウマチ(RA)、多発性硬化症(MS)、子宮内膜症、自己免疫性糖尿病(1型糖尿病など)、および乾癬からなる群から選択される。
【０１５８】
(関節リウマチ)
関節リウマチ(RA)は、多くの組織および臓器に影響し得るが、原理的には可撓性(滑液)関節を攻撃する慢性の全身性炎症障害をもたらし得る自己免疫疾患である。
【０１５９】
(乾癬)
乾癬は、身体の任意の部分に影響し得るが、最も一般的には肘、膝、腰部および頭皮に認められる慢性全身性炎症障害をもたらし得る自己免疫疾患である。乾癬は、銀白色の鱗屑に覆われた皮膚の赤い、かさかさの斑点をもたらし得る。
【０１６０】
(乾癬性関節炎)
乾癬性関節炎は、関節における炎症および疼痛を引き起こすが、身体の他の部分も影響され得る自己免疫疾患である。乾癬性関節炎は、炎症性関節炎の1種であり、乾癬と関連することが多い。
【０１６１】
(子宮内膜症)
子宮内膜症は、子宮の内側に由来する細胞(子宮内膜)が子宮腔の外部に出現し、蔓延する(flourish)婦人科疾患である。子宮内膜症は、疼痛および不妊症を引き起こす。
【０１６２】
(ベーチェット病)
ベーチェット病は、粘膜潰瘍形成および眼の問題をもたらすことが多い、免疫媒介性小血管全身性血管炎である。
【０１６３】
(多発性硬化症)
多発性硬化症は、脳および脊髄の軸索周囲の脂肪ミエリン鞘が損傷され、脱髄および瘢痕化をもたらす炎症性疾患である。本明細書で記載される「多発性硬化症」は、再発寛解型、二次性進行型、一次性進行型、および/または進行再発型の多発性硬化症を指してもよい。
【０１６４】
(子宮内膜症)
子宮内膜症は、子宮内膜に由来する細胞が子宮腔の外側で増殖する状態である。子宮内膜症の症状としては、骨盤痛および妊孕性の問題が挙げられる。本明細書で記載される子宮内膜症は、Revised Classification of the American Society of Reproductive Medicine, 1996, Fertility and Sterility 67 (5): 817-21によるステージI、ステージII、ステージIII、および/またはステージIVの子宮内膜症であってもよい。
【０１６５】
(自己免疫性膵島炎)
自己免疫性膵島炎は、膵臓のランゲルハンス島のリンパ球浸潤を指す。自己免疫性膵島炎は、初発の1型糖尿病と関連することが多い。自己免疫疾患である糖尿病は、成人と子供の両方において生じ得る。本明細書で記載される自己免疫性糖尿病は、好ましくは、1型糖尿病である。
【０１６６】
（自己免疫性糖尿病）
自己免疫性糖尿病は、膵臓のインスリン産生ランゲルハンス島の自己免疫破壊の結果生じる（真性）糖尿病の一形態である。自己免疫疾患性糖尿病 は、成人でも子供でも生じうる。本明細書でいう自己免疫性糖尿病は、好ましくは１型糖尿病である。 
【０１６７】
(炎症性腸疾患(IBD))
炎症性腸疾患は、結腸および小腸に影響する炎症状態の一群である。主な型のIBDは、クローン病(CD)および潰瘍性大腸炎(UC)であるが、その他の型のIBDとしては、コラーゲン蓄積大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置性大腸炎(diversion colitis)、ベーチェット病および不確定大腸炎が挙げられる。CDは、消化管の任意の部分に影響し得るが、UCは典型的には結腸および直腸に限られる。
【０１６８】
本明細書で記載されるIBDは、CD、UC、コラーゲン蓄積大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置性大腸炎、ベーチェット病または不確定大腸炎であってもよい。特に、本明細書で用いられる場合、CD、UC、コラーゲン蓄積大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置性大腸炎、ベーチェット病および不確定大腸炎の用語は、それぞれ、活動性CD、活動性UC、活動性コラーゲン蓄積大腸炎、活動性リンパ球性大腸炎、活動性虚血性大腸炎、活動性空置性大腸炎、および活動性不確定大腸炎を指してもよい。一実施形態においては、IBDはCDまたはUCであってもよい。
【０１６９】
本発明のさらなる態様および実施形態は、以下の実験的例示を含む本開示を考慮すれば当業者には明らかである。
【０１７０】
本明細書に記載の全ての文献は、その全体が参照により本明細書に組込まれるものとする。
【０１７１】
本明細書で用いられる場合、「および/または」は、他方を含むか、または含まない、2つの特定の特徴または成分のそれぞれの特定の開示と取られるべきである。例えば、「Aおよび/またはB」は、それぞれが本明細書に個別に記載されるかのように、(i)A、(ii)Bならびに(iii)AおよびBのそれぞれの特定の開示と取られるべきである。
【０１７２】
文脈が別途指摘しない限り、上記の特徴の説明および定義は、本発明の任意の特定の態様または実施形態に限定されず、記載される全ての態様および実施形態に同等に適用される。
【０１７３】
ここで、本発明のある特定の態様および実施形態を、例として、また、上記の図面を参照して例示する。
【０１７４】
(実施例)
本実施例は、抗体-IL4コンジュゲートの構築を記載し、関節リウマチおよびがんを処置するためのそのようなコンジュゲートの好適性を実証する。
抗体-IL4コンジュゲートの調製およびin vitroでの特性評価に関する実施例
【実施例１】
【０１７５】
(F8-IL4のクローニング、発現およびin vivoでの特性評価)
可撓性15アミノ酸リンカー(配列番号24)を介してマウスインターロイキン4(Source BioScienceからの遺伝子)にC末端で連続的に融合された、安定な非共有ホモダイマーダイアボディ形式(すなわち、VHとVLドメインの間に5アミノ酸のリンカーを有するscFv断片)の抗体F8(Villaら、2008)(腫瘍血管新生のマーカーであるフィブロネクチンのEDAドメインに特異的である)を含有するコンジュゲートF8-IL4を調製した。F8抗体(配列番号9)をコードする遺伝子およびマウスIL4をコードする遺伝子(配列番号51)をPCR増幅し、以前に記載された(Pascheら、2011)標準的な手順を用いてPCR集合させて、F8-IL4(配列番号21)を調製した。生成物を、HindIII/NotI制限部位により哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1(+)(Invitrogen)に連結した。
【０１７６】
融合タンパク質を、供給業者のプロトコールに従って増殖させた安定にトランスフェクトされたCHO細胞(Invitrogen)中で発現させ、SDS-PAGE分析およびサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex200 10/300GL, GE Healthcare)により文書化されたように、プロテインAクロマトグラフィーにより均質になるまで精製した(図1Aおよび図1Bを参照されたい)。生成物は、EDA抗原被覆センサーチップ上での表面プラズモン分析(BIAcore)により示されるように、同種抗原に対する高い親和性を保持していた(図1C)。
抗体-IL4コンジュゲートを用いるRAの処置に関する実施例
【実施例２】
【０１７７】
(TNFR-Fcの調製およびin vitroでの特性評価)
マウス融合タンパク質muTNFR-Fc(ヒンジ領域を含有する、マウスIgG1 Fc部分のN末端に付加されたマウスp75-TNF受容体の細胞外部分)を、供給業者のプロトコールに従って、CHO細胞中での安定なトランスフェクションにより発現させた。融合タンパク質を、プロテインAクロマトグラフィーにより細胞上清から精製して調製物を得たところ、SDS-PAGE分析およびサイズ排除クロマトグラフィーにおいて純粋であった(図2Aおよび図2Bを参照されたい)。muTNFR-Fcの生物活性を、LM線維芽細胞のTNF媒介性殺傷の阻害により試験した(図2Cを参照されたい)。Enbrel(商標)およびHumeira(商標)などのTNF阻害剤は、関節リウマチ患者における標準治療である。muTNFR-Fcは、疾患のマウスモデルにおける使用のためのTNF阻害剤のマウスバージョンである。
【実施例３】
【０１７８】
(マウスにおけるコラーゲン誘導性関節炎の侵攻性モデルにおけるF8-mIL4の治療能力の特性評価)
オスのDBA/1Jマウスを、Janvier(Le Genest-St-Isle, France)から入手した。8週齢のオスDBA/1Jマウスを、0.645mg/mLの濃度のコラーゲンと共に完全Freundアジュバント(CFA)中で乳化されたウシII型コラーゲンの乳濁液0.05mL(Hooke Laboratories, Lawrence, USA)を用いて、尾の基部での皮下注射により免疫した。3週間後、0.98mg/mlのウシコラーゲン/CFA  0.04mLの追加注射を与えた。追加注射の後、マウスを毎日検査し、各スコア(0=正常、1=1本の足指の炎症および腫れ、2=2本以上であるが、全部ではない足の炎症および腫れまたは全部の足の軽度の腫れ、3=全部の足の炎症および腫れ、4=足の非常な炎症および腫れ；Hooke Laboratoriesから適合化)への臨床スコアの割り当てによりモニタリングした。16の最大スコアに達し得る。さらに、罹患した足の腫れを、イソフルラン麻酔下でカリパスを用いて毎日測定した。足の厚さを、各動物の4本全部の足の平均として表す。1〜3の合計スコアを有する関節炎症の兆候を示す動物を、療法実験に含有させた。関節炎症が1日目に高すぎた場合(2本以上の足、3を超えるスコア)、マウスを療法実験に含有させなかった。実験を、Veterinaeramt des Kantons Zuerich, Switzerland (208/2010)により付与されたプロジェクトライセンスの下で実施した。
【０１７９】
1〜3の新しい臨床スコアを有するマウスを、処置群または対照群に無作為に割り当て、療法を開始した(=1日目)。マウスは、1、4および7日目にmuTNFR-Fc(30μg)、F8-IL4(5μg)、F8-IL4(100μg)またはPBS(バッファービヒクル、陰性対照)の静脈内注射を受けた。マウスを1群(n≧9)あたり毎日分析し、関節炎スコア、炎症した足の厚さおよび体重をモニタリングした。これらの実験の結果を、図3A〜Cに示す。マウスを、関節炎スコア(4日を超えて6を超える)および体重減少(15%を超える)のため、部分規則に従って犠牲にした。TNFR-FcおよびF8-IL4は、異なるエフェクター機能および毒性を有するため、それらを異なる量で投与した。TNFR-Fcの用量を、融合タンパク質の生物活性と比較したヒトENBREL用量および近似局所TNF濃度からの算出により決定した。TNFR-Fcの30μg用量は、RAのより中等度のマウスモデルを用いる以前の実験において確認され、この用量ではより強力な疾患調節効果が観察された。従って、この実験においてマウスに投与された30μg用量のTNFR-Fcは、RAの処置におけるF8-IL4コンジュゲートの有効性を決定するための適切な比較である。
【０１８０】
高用量スケジュール(100μg/注射)のF8-IL4は、侵攻性関節炎のこのマウスモデルにおいてマウスバージョンのEnbrel(TNFR-Fc)と少なくとも同程度に強力である疾患調節効果を示した。100μg/注射の用量のF8-IL4を受けるマウスもまた、バッファービヒクル(PBS)のみを受けるマウスよりも体重減少が少なかった。これは、F8-IL4療法(100μg/注射)が良好に許容され、マウスがより良好な一般的健康状態にあったことを示す。100μgのF8-IL4で処置されたマウスはまた、バッファービヒクルのみ、または少量のF8-IL4を受けるマウスよりも重症度が低い足の腫れを示した。足の腫れの軽減は、マウスバージョンのENBRELで処置されたマウスにおいて観察されたものと少なくとも同等であった。これらの実験において用いられたマウスモデルは、より速い疾患進行および分析のための早期終点をもたらす侵攻性RAのモデルであったため、関節炎スコアが4日を超えて6より大きく、体重減少が15%より大きかった場合、部分規則に従ってマウスを犠牲にしなければならなかった。これは、図3A〜Cにおける、より後の時点、特に、RA開始の7日後での示差的に処置されたマウスに関するデータ点の収束を説明する。より後の時点でのデータ点の収束は、上記にまとめられたように、示差的に処置されたマウス間でのより早期の時点で観察された疾患進行の明確な差異の妥当性に影響しない。
【０１８１】
実施例3a-マウスにおけるコラーゲン誘導性関節炎の侵攻性モデルにおける標的化された、および標的化されていないIL4の治療能力の比較
オスDBA/1Jマウスを、Janvier(Le Genest-St-Isle, France)から入手した。8週齢のオスDBA/1Jマウスを、0.645mg/mLの濃度のコラーゲンと共に完全Freundアジュバント(CFA)中で乳化されたウシII型コラーゲンの乳濁液0.05mL(Hooke Laboratories, Lawrence, USA)を用いて、尾の基部での皮下注射により免疫した。3週間後、0.645mg/mlのウシコラーゲン/CFA  0.04mLの追加注射を与えた。追加注射の後、マウスを毎日検査し、各マウスへの臨床スコア(0=正常、1=1本の足指の炎症および腫れ、2=2本以上であるが、全部ではない足の炎症および腫れまたは全部の足の軽度の腫れ、3=全部の足の炎症および腫れ、4=足の非常な炎症および腫れ；Hooke Laboratoriesから適合化)の割り当てによりモニタリングした。16の最大スコアに達し得る。さらに、罹患した足の腫れを、イソフルラン麻酔下でカリパスを用いて毎日測定した。足の厚さを、各動物の4本全部の足の平均として表す。
【０１８２】
1〜4の新しい臨床スコアを有するマウスを、処置群または対照群に無作為に割り当て、療法を開始した(=1日目)。9匹のマウスはF8-IL4(100μg)(配列番号21)の静脈内(i.v.)注射を受け、8匹のマウスはKSF-IL4(100μg)(配列番号44)の静脈内(i.v.)注射を受け、9匹のマウスはTNFR-Fc(30μg)(配列番号46)の静脈内(i.v.)注射を受け、9匹のマウスはTNFR-Fc(30μg)(配列番号46)およびF8-IL4(100μg)(配列番号21)の静脈内(i.v.)注射を受け、ならびに8匹のマウスはPBSを受けた。注射を、1、3および7日目に投与した。
【０１８３】
マウスを1群(n≧8)あたり毎日分析し、関節炎スコア、炎症した足の厚さおよび体重をモニタリングした。足の腫れを毎日測定し、足の厚さを、各動物の4本全部の足の厚さの平均(±SEM)として表す。これらの実験の結果(関節炎スコアおよび足の厚さ)を、図3DおよびEに示す。マウスを、関節炎スコア(4日を超えて6を超える)および体重減少(15%を超える)のため、部分規則に従って犠牲にした。これは、いくつかの処置スケジュールの早期終結をもたらした。
【０１８４】
図3DおよびEは、図3A〜C(100μg/注射)において最も高い活性を与えることがわかった用量でのF8-IL4とKSF-IL4の効果を比較する。関節炎スコアおよび足の腫れの軽減におけるKSF-IL4と比較したF8-IL4の統計的に有意な優れた活性は、治療有効性にとって標的化が重要であることを示す。F8-IL4とTNFR-Fcとを同時にマウスに投与した場合、相乗効果は観察されなかった。
【０１８５】
2回用量のF8-IL4を比較する実験における追加免疫がはるかにより強力であるほど、キットはより高度に濃縮されていたため、この療法における全ての群が、図3A〜Cに対してわずかにより良好な性能を示した。従って、マウスは、さらにより侵攻的な形態の関節炎を生じた。
【実施例４】
【０１８６】
(デキサメタゾンまたはL19-IL10と組み合わせたF8-マウスIL4を用いた、マウスにおけるコラーゲン誘導性関節炎の侵攻性モデルにおける関節リウマチの処置)
オスDBA/1Jマウスを、Janvier(Le Genest-St-Isle, France)から入手した。8週齢のオスDBA/1Jマウスを、0.645mg/mLの濃度のコラーゲンと共に完全Freundアジュバント(CFA)中で乳化されたウシII型コラーゲンの乳濁液0.05mL(Hooke Laboratories, Lawrence, USA)を用いて、尾の基部での皮下注射により免疫した。3週間後、0.645mg/mlのウシコラーゲン/CFA  0.04mLの追加注射を与えた。追加注射の後、マウスを毎日検査し、各マウスへの臨床スコア(0=正常、1=1本の足指の炎症および腫れ、2=2本以上であるが、全部ではない足の炎症および腫れまたは全部の足の軽度の腫れ、3=全部の足の炎症および腫れ、4=足の非常な炎症および腫れ；Hooke Laboratoriesから適合化)の割り当てによりモニタリングした。16の最大スコアに達し得る。さらに、罹患した足の腫れを、イソフルラン麻酔下でカリパスを用いて毎日測定した。足の厚さを、各動物の4本全部の足の平均として表す。
【０１８７】
1〜4の新しい臨床スコアを有するマウスを、処置群または対照群に無作為に割り当て、療法を開始した(=1日目)。10匹のマウスはF8-IL4(100μg)の皮下(s.c.)注射を受け、9匹のマウスはF8-IL4(100μg)の静脈内(i.v.)注射を受け、8匹のマウスはデキサメタゾン(100μg)を受け、9匹のマウスはF8-IL4およびデキサメタゾン(それぞれ100μg)を受け、10匹のマウスはL19-IL10(200μg)を受け、9匹のマウスはF8-IL4およびL19-IL10(それぞれ、100μgおよび200μg)を受け、9匹のマウスはPBSを受けた。単剤療法群においては、F8-IL4を1、3および7日目に静脈内(i.v.)または皮下(s.c.)注射した。組合せ群（すなわち、デキサメタゾンまたはL19-IL10と共に)においては、F8-IL4を1、3および7日目に常に静脈内(i.v.)投与した。L19-IL10を、1、3および7日目に皮下(s.c.)注射した。デキサメタゾンの腹腔内注射を、9日目まで毎日投与した(注射を、1、2、3、4、5、6、7、8および9日目に与えた)。F8抗体はダイアボディ形式にあり、マウスIL4にコンジュゲートされた。この抗体の配列を、配列番号21に示す。L19-IL10抗体の配列を、配列番号63に示す。L19-IL10を、200μgの量で皮下投与したが、これは、文献中で治療的に有効であることが示されている投与の用量および経路であるからである(Trachselら、2007; Schwagerら、2009)。
【０１８８】
マウスを1群(n≧8)あたり毎日分析し、関節炎スコア、炎症した足の厚さおよび体重をモニタリングした。これらの実験の結果を、図15に示す。マウスを、関節炎スコア(4日を超えて6を超える)および体重減少(15%を超える)のため、部分規則に従って犠牲にした。これは、いくつかの処置スケジュールの早期終結をもたらした。
【０１８９】
図15に示されるように、F8-IL4とデキサメタゾンの組合せを用いる処置は、F8-IL4またはデキサメタゾンのいずれかのみを用いる処置よりも強力な疾患調節効果をもたらした。デキサメタゾンと組み合わせたF8-IL4で処置されたマウスは、F8-IL4のみで処置されたマウスよりも体重減少が少なく、これは、組合せ処置が良好に許容されたことを示している。デキサメタゾンと組み合わせたF8-IL4で処置されたマウスはまた、F8-IL4またはデキサメタゾンのいずれかのみで処置されたマウスよりも有意により低い関節炎スコアおよびより重症度の低い足の腫れを示した。対照的に、F8-IL4とL19-IL10の組合せで処置されたマウスのみが、F8-IL4単剤療法と比較して症状の中程度の改善を示したが、これは、単剤療法を受けるマウスと比較した、F8-IL4およびデキサメタゾンで処置されたマウスにおける症状の有意なさらなる軽減が特に驚くべきものであることを示している。本発明者らの知る限り、これは、RAの症状(関節炎スコアおよび足の腫れにより示される)が、RAのそのような侵攻性モデルにおける処置されたマウスの100%において完全に抑制(すなわち、単に軽減)された初めてのことである。かくして、デキサメタゾンなどの糖質コルチコイドと組み合わせたF8-IL4は、ヒトにおけるRAの処置のための非常に有望な候補である。
【０１９０】
F8-IL4を用いる処置はまた、F8-IL4で処置されたマウスがL19-IL10で処置されたマウスよりも少ない足の腫れ、体重減少、および関節炎スコアのより大きな減少を示したという事実により示されるように、L19-IL10を用いる処置よりも強力な疾患調節効果を示した。F8-IL4と比較して、2倍多くのL19-IL10がマウスに投与されたため(これらの2つのコンジュゲートの分子量はほぼ同一である)、これは特に驚くべきことである。F8-IL4で処置されたマウスにおける体重減少の軽減は、F8-IL4処置が良好に許容されたことをさらに示す。かくして、F8-IL4もまた、ヒトにおけるRAの処置のための有望な候補である。
【０１９１】
抗体-IL4コンジュゲートを用いるがんの処置に関する実施例
以下の実験の説明においては、データは平均(±SEM)で表される。治療群間の腫瘍体積、%ID/gおよび腫瘍対血管比(Tumor-to-blood ratio)の差異を、Graphpad Prismの反復尺度(混合モデル)ANOVA分析を用いて比較した。
【実施例５】
【０１９２】
(KSF-IL4のクローニング、発現およびin vitroでの特性評価)
可撓性15アミノ酸リンカー(配列番号24)を介してマウスインターロイキン4(Source BioScienceに由来する遺伝子)にC末端で連続的に融合された、安定な非共有ホモダイマーダイアボディ形式(すなわち、VHドメインとVLドメインの間に5アミノ酸のリンカーを含むscFv断片)の抗体KSF(Freyら、2011)(鶏卵リゾチームに特異的であり、実験における陰性対照として用いた)を含有する融合タンパク質KSF-IL4を調製した。KSF抗体をコードする遺伝子およびマウスIL4(配列番号51)をコードする遺伝子をPCR増幅し、F8-IL4について上記されたように標準的な手順を用いてPCR集合させて、KSF-IL4(配列番号44)を調製した。再度、生成物をHindIII/NotI制限部位により哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1(+)(Invitrogen)中にライゲーションした。
【０１９３】
融合タンパク質を、F8-IL4について上記されたように発現させ、均質になるまで精製した。KSF-IL4の純度を、再度、F8-IL4について上記されたようにSDS-PAGEおよびサイズ排除クロマトグラフィーにより確認した。KSF-IL4はまた、EDA抗原被覆センサーチップ上での表面プラズモン分析(BIAcore)により示されたように、同種抗原に対する高い親和性を保持していた。
【実施例６】
【０１９４】
(F8-IL4およびKSF-IL4の生物学的サイトカイン活性)
マウスIL4の生物活性を、CTLL2細胞の増殖を刺激するその能力によって決定した。CTLL2細胞を、供給業者のプロトコールに従って増殖させた。細胞(20000細胞/ウェル)を、変化する濃度の組換えマウスIL4(eBioscience)、F8-IL4またはKSF-IL4を添加した培養培地中、96穴プレートに播種した。37℃で24hインキュベートした後、Cell Titer Aqueous One Solution(Promega)を用いて細胞増殖を決定した。図4Aに示されるように、F8-IL4およびKSF-IL4の生物学的サイトカイン活性は、組換えマウスIL4のものと同等であった(図4A)。
【実施例７】
【０１９５】
(腫瘍切片上でのF8-IL4およびKSF-IL4の免疫蛍光試験)
このために、ならびに以下に記載の他の実験のために、F8奇形癌(CRL-1720; ATCC, Molsheim Cedex, France)、CT26結腸癌(CRL-2638; ATCC, Molsheim Cedex, France)およびA20リンパ腫(TIB-208; ATCC, Molsheim Cedex、France)を供給業者のプロトコールに従って増殖させ、25x106個の細胞(F9)、2x106個の細胞(CT26)または8x106個の細胞(A20)を用いて、腫瘍細胞を脇腹に皮下的に埋込んだ。F9奇形癌細胞を、129/SvEvマウス(Charles River, Sulzfeld, Germany)に埋込み、CT26結腸癌細胞をBalb/cマウス(Elevage Janvier, Le Genest-St-Isle, France)に埋込み、A20リンパ腫細胞をBalb/cマウス(Elevage Janvier, Le Genest-St-Isle, France)に埋込んだ。腫瘍体積が2000mm3の最大値に達した時、マウスを犠牲にした。
【０１９６】
免疫蛍光分析のために、未処置の腫瘍の10μm凍結切片を氷冷アセトン中で固定し、ビオチン化F8-IL4とそれぞれのKSF-IL4およびラット抗CD31抗体(BD Bioscience)で染色した。検出のために、ストレプトアビジン-Alexa Fluor 488および抗ラットAlexa Fluor 594(Invitrogen)を用いた。スライドを蛍光マウンティング培地(Dako)を用いてマウントし、Axioskop2 mot plus顕微鏡(Zeiss)を用いて分析した。免疫蛍光により、F8-IL4(KSF-IL4ではない)は、マウスF9、CT26およびA20腫瘍中の腫瘍新血管構造を認識することができた(図4B)。
【実施例８】
【０１９７】
(生体分布試験)
15μgの放射性ヨード化された融合タンパク質を、皮下移植されたF9腫瘍を担持する、免疫応答性の11〜12週齢のメスSv129Evマウス(Charles River[Germany]から入手)の側部尾静脈にi.v.注射する定量生体分布試験により、in vivoでの標的化性能を評価した(標識化プロトコールについては、(Pascheら、2011)を参照されたい)。マウスを、注射の24時間後に犠牲にし、臓器を切り出し、計量し、Packard Cobraγカウンターを用いて放射活性を測定した。臓器の放射活性を、組織1グラムあたりの注射用量のパーセンテージ(%ID/g±SEM)として表した。
【０１９８】
静脈内投与の24時間後の組織1グラムあたりの注射用量のパーセンテージの分析により、腫瘍部位でのF8-IL4の選択的蓄積が示され、これは陰性対照であるKSF-IL4融合タンパク質については観察されなかった(p<0.001)(図5A)。免疫サイトカインの静脈内投与後の腫瘍切片のex vivoでの免疫蛍光アッセイにより、CD31陽性腫瘍新血管構造へのF9-IL4の選択的蓄積が確認された(図5B)。
【実施例９】
【０１９９】
(療法試験)
用量探索試験において、F9腫瘍担持マウスを無作為に群化し(n=5)、腫瘍が明らかに触診可能となった時、側部尾静脈に静脈内(i.v.)注射した。特に、F8-IL4の抗腫瘍活性を、腫瘍が50mgの重量になった時に開始して、45μg〜90μgの用量で2日毎に側部尾静脈に静脈内注射することにより試験した。治療抗体を全てリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に溶解し、このバッファーを陰性対照処置群においても用いた。マウスを毎日モニタリングし、腫瘍体積をカリパスを用いて測定した(体積=長さx幅2x0.5)。高い方の用量が最良の腫瘍遅延結果を示した(図6A)。生成物の不十分な溶解性のため、高い方の用量を試験することができなかった。F8-IL4とKSF-IL4との比較により、EDA特異的免疫サイトカインが実質的により強力な(P値については、以下を参照されたい)治療効果を示すことが示された(図6B)。
【０２００】
F9腫瘍はF8-IL4処置のみによっては治癒しなかった。従って、F8-IL4とF8-IL2とを用いるF9腫瘍担持マウスの処置(Freyら、2010)を実施した。図7Aは、F8-IL4(90μg)およびF8-IL2(20μg)(配列番号50)の4回の注射に関して得られた療法の結果を示す。
【０２０１】
実質的な腫瘍増殖の遅延が組合せレジメンについて観察され、2/5のマウスにおいて完全な腫瘍の根絶をもたらした。しかしながら、F9細胞を用いる再チャレンジの際に、両方の動物は腫瘍を生じた。次いで、がんのいくつかのマウスモデル(Pascheら、Clin. Cancer Research, 2012)において活性を示した新しく開発されたIL12に基づく免疫サイトカインである、F8-IL4とIL12-F8-F8の組合せ(8.6μg)(配列番号48)を試験した(図7B)。ここで、組合せ処置は、4/5のマウスにおいて完全な腫瘍の根絶をもたらした。再度、再チャレンジ実験において、全ての動物が新しい腫瘍病変を生じた。
【０２０２】
IL4とIL12のF8媒介性標的化送達が付加的な抗がん効果をもたらし得るという観察は、2つのサイトカインがT細胞活性の調節に対する反対の効果を媒介すると考えられるため、直感に反するものであり、予想外であった。インターロイキン4はナイーブなT細胞をTh2応答にプライミングするが、IL12はIFNγ産生性Th1細胞へのT細胞分化を促進し、それによって、適応免疫応答の反対のアームを活性化する(26)。2つのサイトカインの異なる免疫生物学にも拘らず、F8-IL4とIL12-F8-F8は両方とも、腫瘍塊への白血球浸潤の同等のパターンを媒介し、強力な単剤治療活性を示した。
【０２０３】
F8-IL4、F8-IL12、IL12-F8-F8および対応する組合せを用いる処置は、体重の減少が5%未満であったという事実により反映されるように、良好に許容された(図7C)。
2016519111.tif 000002
【０２０４】
2016519111.tif 000003
【実施例１０】
【０２０５】
(処置された腫瘍の免疫蛍光試験)
療法後のIL4に基づく免疫サイトカインおよび腫瘍浸潤細胞の局在化のex vivoでの検出のために、マウスに、療法実験のために適切なタンパク質を3回注射し、最後の注射の2日後に犠牲にした。腫瘍を切り出し、凍結包埋媒体(Thermo Scientific)中に埋込み、クリオスタット切片(10μm)を、抗体：抗IL4抗体(eBioscience)、CD45(白血球、BD Biosciences)、CD4(CD4+T細胞、BioXCell)、CD8(CD8+T細胞、BioXCell)、F4/80(マクロファージ、Abcam)、アシアロGM1(NK細胞、Wako Pure Chemical Industries)、CD45R(B細胞、eBioscience)、Foxp3(eBioscience)、CD31(Sant Cruz)を用いて染色し、AlexaFluor488と、それぞれのAlexaFluor594にカップリングした二次抗体(Invitrogen)を用いて検出した。スライドを、蛍光マウンティング媒体(Dako)を用いてマウントし、Axioskop2 mot plus顕微鏡(Zeiss)を用いて分析した。
【０２０６】
免疫サイトカイン処置、血管構造(CD31)、CD45陽性白血球、CD4およびCD8陽性リンパ球、F4/80陽性細胞(主にマクロファージ)、アシアロGM1陽性細胞(主にNK細胞)、CD45R陽性細胞(主にB細胞)ならびにFoxP3(調節T細胞中で発現されるマーカー)に関する染色の後の腫瘍切片の顕微鏡分析により、血管構造またはFoxP3陽性細胞の実質的な変化なしに、免疫サイトカイン処置群における様々な白血球の豊富な浸潤が示された(図8)。
【実施例１１】
【０２０７】
(CT26腫瘍担持マウスにおけるin vivo試験)
がんの第2の免疫応答性マウスモデルを試験するために、本発明者らは、結腸直腸起源の皮下CT26腫瘍を担持するBalb/cマウス(Elevage Janvier [France]から入手)に注目した。F9腫瘍に関して、F8-IL4については選択的腫瘍標的化が観察されたが、新生物病変中での%ID/gはより低かった(図9A)。顕微鏡的ex vivo免疫蛍光分析により、F8-IL4のみが腫瘍部位に選択的に蓄積したことが確認された(図9B)。また、このモデルにおいて、F8-IL4は、KSF-IL4と比較して優れた治療性能を示し(P値については以下を参照されたい)、これは食塩水よりも良好ではなかった(図9C)。F8-IL4 + IL12-F8-F8組合せ群において実質的な腫瘍増殖遅延を観察することができ、2/5のマウスにおいて完全な治癒が示され(図9D)、検出可能な体重減少はなかった。免疫サイトカイン処置後の腫瘍切片の顕微鏡分析により、F9腫瘍について提示されるデータと同様、豊富な白血球浸潤が確認された。
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【実施例１２】
【０２０８】
(A20腫瘍担持マウスにおけるin vivo試験)
固形腫瘍だけでなく、多くのリンパ腫も血管構造の周囲でがん胎児性フィブロネクチンを強力に発現することが報告されているため(Schliemannら、Leuk. Res., 2009; Sauerら、2009; Schliemannら、Blood, 2009)、A20マウスリンパ腫をがんの第3のモデルとして試験した。以前の2つのモデルに関しては、静脈内投与後の定量的生体分布試験およびex vivoでの免疫蛍光分析により、腫瘍新血管構造の周囲へのF8-IL4の選択的蓄積が確認された(図10AおよびB)。その選択的腫瘍標的化特性と一致して、F8-IL4はKSF-IL4と比較して優れた腫瘍増殖遅延を示した(図10C)。F8-IL4とIL12-F8-F8の組合せは、全ての処置されたマウスにおいて埋込まれた腫瘍の完全な根絶をもたらし(図10D)、体重減少を示さなかった。しかしながら、療法の開始の25日後に、腫瘍小結節は4/5のマウスにおいて鼠径部リンパ節に出現し、増殖し続けた。免疫サイトカイン処置後の腫瘍切片の顕微鏡分析により、この場合でも、豊富な白血球浸潤が確認された。B細胞浸潤の分析により、B細胞リンパ腫起源のA20腫瘍のため、CD45Rマーカーに関する有用な結果は得られなかった。
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【０２０９】
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【実施例１３】
【０２１０】
(線維肉腫腫瘍担持マウスにおけるin vivo試験)
線維肉腫Wehi-164指数増殖細胞を収獲し、繰り返し洗浄し、注射の前に無血清培地中に再懸濁した。腫瘍細胞を、Balb/cマウスの右脇腹に皮下注射した(5x106個)。腫瘍重量(mg=mm3)を以下のように算出した：(長さ[mm]x幅2[mm2])/2。
【０２１１】
腫瘍が約100mgに達した時、処置を開始した。マウスは、腫瘍細胞注射の後、5日目から開始して48h毎に4サイクルの療法を受けた。L19-IL4(配列番号64)を、130μg/マウスの用量でi.v.投与した；等モル量のKSF-IL4(130μg/マウス)(配列番号44)、KSF-IL10(150μg/マウス)(配列番号65)およびL19-IL10(150μg/マウス)(配列番号66)を投与した。対照マウスは、滅菌ビヒクル溶液(PBS)を受けた。その結果を図16に示す(経時的な平均腫瘍体重)。各処置群のマウスの数は3〜4匹であった。
【０２１２】
図16は、PBS対照および対照KSF-IL4抗体と比較したこのコンジュゲートで処置されたマウスにおける腫瘍重量の減少により示されるように、L19-IL4、ならびにF8-IL4を用いて、がんを処置することができることを示す。F8抗体とL19抗体は両方とも、新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する。かくして、これらの結果は、IL4と、新生物増殖および/または血管新生と関連する細胞外マトリックス成分に結合する特異的結合メンバーとを含むコンジュゲートを、がんの処置において用いることができることを示す。さらに、これらの結果は、非標的化IL10および非標的化IL4は有意な治療活性を促進しないが、L19-IL10、KSF-IL10およびKSF-IL4で処置されたマウスと比較してL19-IL4で処置されたマウスにおける腫瘍重量の減少を考慮すると、標的化IL10ではなく、標的化IL4が治療活性を示すことを示す。
抗体-IL4コンジュゲートを用いる感染の処置に関する実施例
【実施例１４】
【０２１３】
(乾癬のIMQ誘導性炎症モデル)
乾癬におけるF8-IL4の治療能力を評価するために、イミキモッド(IMQ)誘導性炎症実験を実行した。C57BL/6マウス(Charles River, Germany)を、5mgのAldaraクリーム(0.25mgイミキモッドを含有する)を用いてそれぞれの耳のそれぞれの側で処置した。処置スケジュールを図11Aに例示する。Aldaraクリームを、5日間毎日塗布した(1、2、3、4、5および7日目：それぞれの塗布は図11A中の星印で示される)。クリームの塗布の前に、カリパスで耳の厚さを測定した。7日目に、マウスを無作為に群化し、PBS、100μgのSIP(F8)、30μgのマウスTNFR-Fc(陽性対照)、100μgのF8-IL4または100μgのKSF-IL4のいずれかを静脈内注射した。処置を9日目および11日目に繰り返した(各処置イベントは図11A中に矢印で示される)。
【０２１４】
実験の経過にわたって測定された耳の厚さを図11Bに示す。F8-IL4を用いる処置は、PBSまたはKSF-IL4を用いる処置と比較して13日目までに耳の厚さを有意に減少させた(PBS対F8-IL4=p<0.05；KSF-IL4対F8-IL4=p<0.05、両方とも13日目)。図11B中の結果を、μm±SEMで耳の厚さとして表す。
【０２１５】
処置開始日(7日目)からの耳の厚さの変化を、図11Cに示す。結果を、μm±SEMでデルタ耳の厚さとして表す。F8-IL4で処置されたマウスの耳の厚さの減少は、PBS、F8-SIPまたはKSF-IL4のいずれかの処置を受けるマウスよりも有意に大きかった。
【０２１６】
マウスを13日目に犠牲にし、耳介リンパ節を切除し、計量した(図11D)。結果を、重量±SEMで表す。F8-IL4または陽性対照であるマウスTNFR-Fcで処置されたマウスのリンパ節はより小さかったが、これは、耳の炎症がF8-SIP、KSF-IL4またはPBS処置を受ける群ほど重症ではないことを示している。統計分析を実行した：PBS対F8-IL4 p≦0.05；KSF-IL4対F8-IL4 p≦0.001(両方とも13日目)。
【０２１７】
図11Eは、処置中のマウスの体重変化を示す。体重減少は観察されず、これは、処置が良好に許容され、毒性も示さなかったことを示している。結果を、体重±SEMとして表す。
【０２１８】
生体分布実験を実行して、耳にIMQ誘導性炎症を有するマウスにおけるSIP(F8)およびF8-IL4の分布を分析した。炎症の7日目に、マウスに10μgの放射性ヨード化タンパク質(I-125)を静脈内注射した。24h後、マウスを犠牲にし、臓器を切り出し、計量し、Packard cobraγ-カウンターで計測した。その結果を、図12Aおよび図12Bに例示する(結果を、%注射用量/グラムとして表す)。耳と背中の皮膚の比は、炎症した組織中への抗体の選択的蓄積を示す。
【０２１９】
全ての動物実験は、Veterinaeramt des Kantons Zurich, Switzerland (117/2011)により付与されたプロジェクトライセンスの下で行われた。
【実施例１５】
【０２２０】
(半接合性K14-VEGF-Aマウスにおける接触過敏性誘導性耳炎症)
乾癬の処置におけるF8-IL4の治療能力をさらに評価するために、CHS誘導性耳炎症試験を、K14-VEGF-Aマウスにおいて実行した。
【０２２１】
遅延型過敏症反応を、以前に記載のような(Detmarら、1998; Kunstfeldら、2004; Xiaら、2003)ヒトケラチン14プロモーターの制御下で表皮中にVEGF-Aを過剰発現するメスFVBマウスの耳の皮膚において誘導した。炎症病変が元々存在しないヘテロ接合性VEGF-Aトランスジェニックマウスを、アセトン/オリーブオイル(4:1 vol/vol)中の2%オキサゾロン(4-エトキシメチレン-2-フェニル-2-オキサゾリン-5-オン；Sigma)溶液の剃毛した腹部(50μl)およびそれぞれの足(5μl)への局所適用により感作した。感作の5日後、耳を、20μlの1%オキサゾロン溶液の局所適用によりチャレンジした。療法を7日目に開始し、9、11および13日目に繰り返した。マウスを群化し、PBS、100μgのSIP(F8)、30μgのマウスTNFR-Fc、100μgのF8-IL4および100μgのKSF-IL4を静脈内注射した。耳の厚さを1日おき、および15日目に測定し、マウスを犠牲にし、耳介リンパ節を計量した。この実験に関するスケジュール表を、図13Aに例示する。各処置イベントは、矢印で示される。
【０２２２】
この実験の経過にわたって測定された耳の厚さを、図13Bに示す。F8-IL4を用いる処置は、PBSまたはKSF-IL4を用いる処置と比較して、13日目までに耳の厚さを有意に減少させた(PBS対F8-IL4 p<0.01；KSF-IL4対F8-IL4 p<0.01、両方とも15日目)。結果を、μm±SEMで耳の厚さとして表す。
【０２２３】
処置開始日(7日目)からの耳の厚さの変化を、図13Cに示す。結果を、μm±SEMでデルタ耳の厚さとして表す。F8-IL4を用いる処置は、FSF-IL4、F8-SIPまたはPBSのいずれかを用いる処置よりも有意に大きく、耳の厚さを減少させた。15日目での統計分析：PBS対F8-IL4 p<0.05；KSF-IL4対F8-IL4 p<0.05。
【０２２４】
図13Eは、処置中のマウスの体重変化を示す。体重減少は観察されなかったが、これは、処置が良好に許容され、見かけ上の毒性もなかったことを示している。結果を、体重±SEMで表す。
【０２２５】
15日目にマウスを犠牲にし、耳介リンパ節を切除し、計量した(図13D)。結果を、重量±SEMで表す。F8-IL4または陽性対照であるマウスTNFR-Fcで処置されたマウスのリンパ節はより小さく、これは、耳の炎症がF8-SIP、KSF-IL4またはPBSで処置された群におけるものほど重症ではないことを示している。15日目からの結果に対して統計分析を実行した：PBS対F8-IL4 p≦0.05、KSF-IL4対F8-IL4 p≦0.0001。
【実施例１６】
【０２２６】
(実施例12および実施例13に由来する組織抽出物中でのサイトカインレベルの分析)
13種の異なるサイトカインのレベルを、実施例12および実施例13における乾癬のマウスモデルから得られた組織中で測定して、処置後のサイトカインレベルの変化を分析した。
【０２２７】
耳組織を各マウスから療法の終わりに取得し、以前に記載のように(Schwagerら、2013)組織抽出にかけた。療法の終わりは、実施例14に記載のIMQモデルについては13日目であり、実施例15に記載のCHSモデルについては15日目であった。簡単に述べると、耳を小片に切断し、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche Diagnotics, Rotkreuz, Switzerland)を含有する50mM Tris、150mM NaClバッファー中に懸濁した。均質化のために、5mmのステンレススチール製ビーズ(Qiagen, Hombrechtikon, Switzerland)を添加し、組織をQIAGEN Tissue Lyzer(4x1分、4℃、30Hz)中でホモジェナイズした。遠心分離(5min、4℃、16000g)後、上清を収獲した。タンパク質濃度を、BCAアッセイ(Thermo Fisher Scientific, IL)により決定し、全試料の総タンパク質濃度を正規化した。処置マウスと対照マウスのサイトカインレベルを定量化するために、多重ビーズ-ビーズフローサイトメトリー分析を、マウスTh1/Th2/Th17/Th22 13plex FlowCytomix Multiplexキット(eBioscience)を用いて実施した。FACS分析をBD FACS Canto(BD Bioscience, Allschwil, Switzerland)上で実施し、データをFlowCytomix Pro 3.0ソフトウェア(eBioscience)を用いて評価した。対照試料を用いてFlowCytomix Pro 3.0ソフトウェアにより作成された標準曲線を用いて、定量化のレベルを各サイトカインに割り当てた。
【０２２８】
サイトカイン分析の結果を、IMQ誘導性炎症モデルについては図14Aに、CHS誘導性耳炎症モデルについては図14Bに示す。結果を、平均±SEMとして表す。定量化のレベルを、各グラフにわたる狭い水平の線で示す。
【０２２９】
図14Aおよび図14Bにおける結果は、IL10、IL13およびIL27などのいくつかのサイトカインがF8-IL4により上方調節されるが、他のサイトカイン(例えば、IL2)は濃度の変化を示さないと考えられることを示す。例えば、IMQ誘導性乾癬モデルにおけるIL-1アルファなどの、いくつかのサイトカインはF8-IL4により下方調節され得る。
抗体-IL4コンジュゲートを用いる子宮内膜症の処置に関する実施例
【実施例１７】
【０２３０】
(子宮内膜症の処置)
Somiglianaら(1999)により記載されたプロトコールに従って、68週齢のメスBalb/cマウスにおいて子宮内膜症を誘導した。
【０２３１】
子宮内膜組織の埋込みの1日後、マウスの対(同じドナーに由来する組織を受けた)を、F8-マウスIL4(200μg/マウス；配列番号21)もしくはPBS(第1群)の静脈内(i.v.)注射；またはKSF-マウスIL4(200μg/マウス；配列番号44)もしくはPBS(第2群)のi.v.注射のいずれかを用いて処置した。同じ処置を、4および7日目に繰り返した。マウスを15日目に犠牲にした。F8-IL4またはKSF-IL4で処置されたマウスにおける、病変の総数、ならびに単一の病変のサイズを、Somiglianaら(1999)に従って、PBSで処置されたマウスにおける病変の数および寸法と比較した。特に、F8-IL4またはKSF-IL4で処置された各マウスにおける病変を、PBS処置を受けた同じ対に属するマウスにおけるものと比較した。
【０２３２】
図17に示されるように、F8-IL4処置は、PBS処置対照マウスと比較して、マウスにおける子宮内膜症病変の体積[cm3で測定](図17A)および数(図17B)の両方の統計的に有意な減少をもたらした。10匹のマウスのうちの3匹において、F8-IL4の投与は疾患を完全に治癒させた。対照的に、KSF-IL4を用いるマウスの処置は、PBSで処置されたマウスと比較して子宮内膜症病変の体積[cm3]または数に対する有意な効果を示さなかった。
抗体-IL4コンジュゲートを用いる多発性硬化症の処置に関する実施例
【実施例１８】
【０２３３】
(多発性硬化症の処置)
36匹のC57/BL6マウスを、McCarthyら(2012)に報告されたように注射によってMOG35-55/CFAおよび百日咳毒素で免疫して、多発性硬化症(MS)のモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘導した。マウスを、毎日、進行性麻痺を反映する0〜5の等級付けシステムを用いてスコア化した(McCarthyら、2012)。EAEの新しく生じた臨床兆候を有する任意のマウスを、バランスよく3群のうちの1つに割り当てた。処置を、群への割り当ての日に開始した(EAE開始後1日目)。F8-マウスIL4処置群のマウス(配列番号21)(図18中で丸で示される)は、3日毎に、それぞれ200μgの合計3回のi.v.注射(1mg/ml溶液の200μl)を受けた(図18中の黒色の矢印を参照されたい)。フィンゴリモド(FTY720)処置群のマウス(図18中で四角で示される)は、1mg/kgの用量で強制経口投与を毎日受けた(図18中の開いた矢印を参照されたい)。ビヒクル(PBS)群のマウス(図18中で菱形で示される)は、F8-IL4処置スケジュールに従って、200μlのPBSをi.v.で受けた(図18中の黒色の矢印を参照されたい)。
【０２３４】
図18は、F8-IL4処置が、PBSを用いて処置されたマウスと比較してEAEの重症度を有意に低下させたことを示す。F8-IL4で処置されたマウスにおけるEAE重症度はまた、フィンゴリモドで処置されたマウスにおけるものと有意に異ならなかった(二元配置分散分析[ANOVA]、次いで、Bonderroni補正により決定された；図18中、*=P<0.05、n.s.=有意でない)。臨床試験および市場化後のデータは、フィンゴリモドがMSのための安全で、有効で、良好に許容される処置であることを示唆している。再発型のMSのための疾患調節療法としてのフィンゴリモドに関する規制当局による認可は、2010年に付与された。それは米国およびスイスにおいて制限なしの第1の療法として認可された(Mary A. WillisおよびJeffrey A. Cohen. Semin. Neurol., 2013)。かくして、11日間の試験にわたるフィンゴリモドの毎日の投与(合計11回の投与)と比較して、F8-IL4が3日毎にだけ投与されたとしても(合計3回)、F8-IL4は、MSの処置のための判断基準となるフィンゴリモドと同じ治療活性を示す。
抗体-IL4コンジュゲートを用いる糖尿病の処置に関する実施例
【実施例１９】
【０２３５】
(糖尿病の処置)
1型糖尿病は、膵臓ベータ細胞の進行的破壊を特徴とする自己免疫疾患である。IL4は、1型糖尿病を防止するための潜在的な薬剤として以前に提唱された(Walzら、2002)。6週齢のC57BL/6オスマウスを、ストレプトゾトシン(腹腔内[i.p.]注射による50mg/kg)を用いて5日連続で処置した。血中グルコースレベルを毎日記録し、その非空腹時血中グルコースレベルが300〜400mg/デシリットル(dL)を超える場合、マウスを糖尿病と見なした。膵臓組織を糖尿病マウスから採取し、切断および染色の前に簡易凍結した。染色手順を、Pfaffenら、Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging (2010)に記載の方法に従って実施した。簡単に述べると、抗体F8(配列番号69)などの、SIP形式の精製抗体(2μg/ml)を切片上に添加し、ウサギ抗ヒトIgE抗体(Dako)を用いて検出した。画像化の前に、蛍光標識されたヤギ抗ウサギIgG Alexa Fluor 488抗体(Life Technologies)と共にさらにインキュベートした。血管および細胞核を、ウサギ抗マウスCD31抗体(BD Bioscience)を用いて検出した後、それぞれ、ロバ抗ウサギAlexa 594抗体(Life Technologies)、およびDAPIと共にインキュベートした。図19における充填された白色の矢印は、CD31+血管を示す。血管構造のEDA+陽性染色は、図19中で白色の開いた矢印で示される。図19は、糖尿病マウスの膵臓におけるEDAとCD31の同時局在化を示す。この同時局在化は、IL4を、F8抗体を用いて糖尿病患者の膵臓中の血管周囲空間に標的化することができることを示す。F8抗体が結合するフィブロネクチンのEDAアイソフォームが糖尿病の膵臓中で発現されることは知られていなかったため、これは驚くべきことであった。
非グリコシル化抗体-IL4コンジュゲートの調製に関する実施例
【実施例２０】
【０２３６】
(非グリコシル化F8-hIL4突然変異体の調製、特性評価および生体分布)
適切なタンパク質折畳み、集合および翻訳後改変に関する真核細胞の能力のため、臨床適用のための組換えタンパク質は、主に哺乳動物細胞培養系を用いて産生される。しかしながら、特定の残基においてタンパク質をグリコシル化する哺乳動物細胞の能力のため、哺乳動物細胞に基づく製造方法は、それらが結合する炭水化物成分において異なる高度に異種性の組換えタンパク質をもたらし得る。
【０２３７】
規制事項のため、組換えタンパク質の糖型プロファイルにおけるバッチ間の一貫性を達成するために、生産プロセスにわたる厳密な制御が必要とされる。さらに、タンパク質糖型の詳細な分析が必要であり、開発スケジュールの延長および生産コストの増大をもたらす。
【０２３８】
従って、F8-ヒトIL4(F8-hIL4)の非グリコシル化変異体は、最終治療産物の製造および特性評価に関する重要な利点を提供する。非グリコシル化タンパク質は単一の分子種として産生され、それによって、タンパク質産物の糖型プロファイルを制御する必要性を回避し、製造プロセスを強力に単純化する。さらに、タンパク質治療剤の高度に均質な調製物は、より予測可能な薬物動態/薬力学(PK/PD)ならびに潜在的に改善されたin vivoでの有効性および標的化を有し得るため、それらが望ましい。
【０２３９】
理論的予測により、ヒトIL4が位置38でグリコシル化され得ると示されたため、質量分析試験を行って、F8-hIL4がグリコシル化されるかどうを調査した。さらに、F8-hIL4の位置284(hIL4の位置38に対応する)のアスパラギン(N)がグルタミン(Q)で置換された突然変異体を調製した(配列番号68)。
【０２４０】
Q Exactive質量分析計を用いる電子スプレーイオン化(ESI)質量分析により、野生型F8-hIL4(配列番号22)およびF8-hIL4 N284Q突然変異体(配列番号68)を無傷のタンパク質として分析した。簡単に述べると、タンパク質溶液の試料バッファーを、30kDaのカットオフを有するVivaSpin 6カラム(GE Healthcare)を用いて超純水に対して交換した。バッファー交換を、200μgのタンパク質溶液に対して実施した。バッファーを約1000倍に希釈した後、タンパク質溶液の濃度をUV吸収によりチェックし、50%アセトニトリル(CAN)、0.2%FA中、0.015mg/mlの最終濃度に希釈した。この溶液を、5〜10μl/minの流速での直接的注入によりQ Exactive質量分析計(Thermo Scientific)中に導入した。質量分析計のチューンソフトウェア(Thermo Scientific)を用いて、スペクトルを記録した。典型的には、100〜1000のスペクトルを統合し、Protein Deconvolution 2.0ソフトウェア(Thermo Scientific)を用いて製造業者の説明書に従ってデコンボリューションした。
【０２４１】
図20は、野生型F8-hIL4(A)およびF8-hIL4 N284Q突然変異体(C)に関する統合された質量スペクトルを示す。野生型F8-hIL4(B)およびF8-hIL4 N284Q突然変異体(D)に関するデコンボリューションされたデータも示される。野生型F8-hIL4は、デコンボリューションされたスペクトル中、43289.6および42998.5Daに2つの主要な種を示す。これらの質量は、5個のジスルフィド結合を有する野生型F8-hIL4の予想された質量(40938.0Da)よりも有意に高く、N結合グリコシル化の存在を示している。しかしながら、F8-hIL4 N284Q突然変異体のデコンボリューションされたスペクトルは、40951.4Daの質量を有するただ1つの単一の種を同定し、これは5つのジスルフィド結合を有するF8-hIL4 N284Q突然変異体の理論質量(40952.0Da)と一致する。共通のESI付加物のピークは、星印(*)で示される。かくして、図20Dは、野生型F8-hIL4と違って、F8-hIL4 N284Q突然変異体がグリコシル化されていないことを明確に示している。
【０２４２】
F8-hIL4 N284Q突然変異がグリコシル化されていないことを決定した後、本発明者らは、この突然変異体が野生型F8-hIL4と同等の標的化特性を保持するかどうかを試験した。
【０２４３】
F9奇形癌細胞(受託番号CRL-1720の下でATCCから入手可能)を、供給業者のプロトコールに従って増殖させた。11〜12週齢のメス129/SvEvマウスを、Charles River(Sulzfeld, Germany)から入手した。腫瘍細胞を、25x106個の細胞を用いてマウスの脇腹に皮下的に埋込んだ。
【０２４４】
F8-hIL4、およびその非グリコシル化変異体F8-hIL4-N284Qのin vivoでの標的化性能を、定量的生体分布試験において評価した。抗体を、Pascheら、2011のプロトコールに従って125IおよびクロラミンT水和物を用いて放射性ヨード化した。10μgのそれぞれの放射性ヨード化抗体を、マウスの尾静脈側部に注射した。注射されたマウスを、注射の24時間後に犠牲にした。次いで、臓器を切り出し、Cobraガンマカウンター(Packard, Meriden, CT)中で放射活性を計数した。放射活性を、組織1グラムあたりの注射用量のパーセンテージ(%ID/g±SE)として表した。
【０２４５】
図21は、F8-hIL4(A)およびその対応する非グリコシル化変異体F8-hIL4-N284Q(B)に関する腫瘍部位での同等の選択的蓄積を示し、これは、2つのコンジュゲートがin vivoで同等の標的化特性を有することを示している。
結論
RA、がんおよび乾癬のマウスモデルにおけるF8-IL4の強力かつ良好に許容される治療活性の観察は、RA、乾癬、固形腫瘍およびリンパ腫を有する患者、ならびに多病性患者における対応する完全ヒト免疫サイトカインの使用のための論理的根拠を提供する。これらの臨床開発活動は、F8抗体が同一の親和性でヒトおよびマウス同種抗原を認識するという事実によって、また、フィブロネクチンのEDAドメインが、様々な悪性腫瘍において、ならびにRA患者において強力に発現されるという観察(Pedrettiら、2009; Schliemannら、Leuk. Res., 2009; Rybakら、2007; Pedrettiら、2010; Schwagerら、2011)によって支持される。
【０２４６】
配列表
F8 CDRのヌクレオチド配列
2016519111.tif 000007
【０２４７】
F8-VHのヌクレオチド配列(配列番号7)
2016519111.tif 000008
【０２４８】
F8-VLのヌクレオチド配列(配列番号8)
2016519111.tif 000009
【０２４９】
F8ダイアボディのヌクレオチド配列(配列番号9)
F8抗体のVHおよびVLドメインCDRを太字で示す。VH/VLドメインリンカー配列を、太字かつ下線付きで示す。
2016519111.tif 000010
【０２５０】
F8-(マウス)IL4のヌクレオチド配列(配列番号10)
F8抗体のVHおよびVLドメインCDRを太字で示す。VH/VLドメインリンカー配列およびVLドメインとマウスIL4との間のリンカーを、太字かつ下線付きで示す。マウスIL4の配列は、NCBI参照配列NM_021283.2(GI:226874825)に基づくものであり、斜体で示される。NM_021283.2は、シグナルペプチド(リーダー配列とも呼ばれる)とタンパク質とからなる全インターロイキン4配列を包含する。シグナルペプチドは、発現のために必要であるが、後に切断除去される。成熟タンパク質はこれらのアミノ酸を有さない。F8-IL4の構築のために、IL4タンパク質のみをコードする配列がF8抗体に付加されるため、それが使用され、この融合タンパク質の発現のために用いられるシグナルペプチドは抗体のものであった。
2016519111.tif 000011
2016519111.tif 000012
【０２５１】
F8-(ヒト)IL4のヌクレオチド配列(配列番号11)
VH/VLドメインリンカー配列およびVLドメインとヒトIL4との間のリンカーを、太字かつ下線付きで示す。ヒトIL4の配列を斜体で示す。ヒトIL4の配列は、NCBI参照配列NM_000589.3(GI:391224448)に基づくものである。NM_000589.3は、シグナルペプチド(リーダー配列とも呼ばれる)とタンパク質とからなる全ヒトインターロイキン4配列を包含する。シグナルペプチドは発現のために必要であるが、後に切断除去される。成熟タンパク質はこれらのアミノ酸を有さない。F8-(ヒト)IL4の構築のために、IL4タンパク質のみをコードする配列がF8抗体に付加されるため、それが使用され、従って、この融合タンパク質の発現のために用いられるシグナルペプチドは抗体のものであった。
2016519111.tif 000013
【０２５２】
F8 CDRのアミノ酸配列
2016519111.tif 000014
【０２５３】
F8 VHのアミノ酸配列(配列番号18)
2016519111.tif 000015
【０２５４】
F8 VLのアミノ酸配列(配列番号19)
2016519111.tif 000016
【０２５５】
F8ダイアボディのアミノ酸配列(配列番号20)
F8抗体のVHおよびVLドメインCDRを太字で示す。VH/VLドメインリンカー配列を、太字かつ下線付きで示す。
2016519111.tif 000017
【０２５６】
F8-(マウス)IL4のアミノ酸配列(配列番号21)
F8抗体のVHおよびVLドメインCDRを太字で示す。VH/VLドメインリンカー配列およびVLドメインとIL4との間のリンカーを太字かつ下線付きで示す。マウスIL4の配列は、NM_021283.2(GI:226874825)に基づくものであり、斜体で示される。
2016519111.tif 000018
【０２５７】
F8-(ヒト)IL4のアミノ酸配列(配列番号22)
VH/VLドメインリンカー配列およびVLドメインとIL4との間のリンカーを太字かつ下線付きで示す。ヒトIL4の配列は、NCBI参照配列NM_000589.3(GI:391224448)に基づくものであり、斜体で示される。
2016519111.tif 000019
【０２５８】
F8 VHおよびVLドメインダイアボディリンカーのアミノ酸配列(配列番号23)
2016519111.tif 000020
【０２５９】
F8 VLドメイン-IL4リンカー配列のアミノ酸配列(配列番号24)
2016519111.tif 000021
【０２６０】
L19 CDRのアミノ酸配列
2016519111.tif 000022
【０２６１】
L19 VHドメインのアミノ酸配列(配列番号31)
2016519111.tif 000023
【０２６２】
L19 VLドメインのアミノ酸配列(配列番号32)
2016519111.tif 000024
【０２６３】
scFv(L19)のアミノ酸配列(配列番号33)
2016519111.tif 000025
【０２６４】
F16 CDRのアミノ酸配列
2016519111.tif 000026
【０２６５】
F16 VHドメインのアミノ酸配列(配列番号40)
2016519111.tif 000027
【０２６６】
F16 VLドメインのアミノ酸配列(配列番号41)
2016519111.tif 000028
【０２６７】
scFv(F16)のアミノ酸配列(配列番号42)
VHおよびVLドメインリンカー配列を下線付きで示す。
2016519111.tif 000029
【０２６８】
KSF-IL4のヌクレオチド配列(配列番号43)
VH/VLドメインリンカー配列およびVLドメインとヒトIL4との間のリンカーを、太字で示す。ヒトIL4の配列を斜体で示す。
2016519111.tif 000030
【０２６９】
KSF-マウスIL4のアミノ酸配列(配列番号44)
VH/VLドメインリンカー配列およびVLドメインとヒトIL4との間のリンカーを、太字で示す。IL4の配列を斜体で示す。
2016519111.tif 000031
【０２７０】
TNFR-Fcのヌクレオチド配列(配列番号45)
シグナルペプチド。TNFRIIの細胞外ドメインは下線付きである。ヒンジ領域を太字で示す。CH2を斜体で示す。CH3を太字かつ下線付きで示す。
2016519111.tif 000032
2016519111.tif 000033
【０２７１】
TNFR-FCのアミノ酸配列(配列番号46)
2016519111.tif 000034
【０２７２】
(マウス)IL12-F8-F8のヌクレオチド配列(配列番号47)
VH/VLドメインリンカー配列、マウスp40とマウスp35との間のリンカー、p35と抗体との間のリンカーおよびF8抗体間のリンカーを、太字かつ下線付きで示す。マウスp40を斜体で示し、p35を斜体かつ太字で示す。
2016519111.tif 000035
2016519111.tif 000036
【０２７３】
(マウス)IL12-F8-F8のアミノ酸配列(配列番号48)
マウスp40とマウスp35との間のリンカー、p35と第1のF8抗体との間のリンカーおよびF8抗体間のリンカーを、太字かつ下線付きで示す。マウスp40を斜体で示し、p35を斜体かつ太字で示す。
2016519111.tif 000037
【０２７４】
F8-(ヒト)IL2のヌクレオチド配列(配列番号49)
2016519111.tif 000038
2016519111.tif 000039
【０２７５】
F8-(ヒト)IL2のアミノ酸配列(配列番号50)
VHドメインとヒトIL2との間のリンカーを太字で示す。ヒトIL2の配列を斜体で示す。
2016519111.tif 000040
【０２７６】
マウスIL4のヌクレオチド配列(NM_021283.2；GI:226874825に基づく)(配列番号51)
2016519111.tif 000041
【０２７７】
マウスIL4のアミノ酸配列(NM_021283.2；GI:226874825に基づく)(配列番号52)
2016519111.tif 000042
【０２７８】
ヒトIL4のヌクレオチド配列(配列番号53)
2016519111.tif 000043
ヒトIL4のヌクレオチド配列は、NCBI参照配列番号NM_000589.3(GI:391224448)に基づくものである。
【０２７９】
ヒトIL4のアミノ酸配列(配列番号54)
2016519111.tif 000044
ヒトIL4のアミノ酸配列は、NCBI参照配列番号NM_000589.3(GI:391224448)に基づくものである。
【０２８０】
ヒトIL2のヌクレオチド配列(配列番号55)
2016519111.tif 000045
2016519111.tif 000046
【０２８１】
ヒトIL2のアミノ酸配列(配列番号56)
2016519111.tif 000047
【０２８２】
ヒトIL12のヌクレオチド配列(配列番号57)
IL12のp40とp35サブユニットの間のリンカー配列(GGGGS)3をコードする配列を太字かつ下線付きで示す。p40を斜体で示し、p35を斜体かつ太字で示す。
2016519111.tif 000048
【０２８３】
ヒトIL12のアミノ酸配列(配列番号58)
IL12のp40とp35サブユニットの間のリンカー配列(GGGGS)3をコードする配列を太字かつ下線付きで示す。
2016519111.tif 000049
【０２８４】
L19抗体のアミノ酸配列(配列番号59)
VH/VLドメインリンカー配列を太字かつ下線付きで示す。
2016519111.tif 000050
【０２８５】
F16ダイアボディのアミノ酸配列(配列番号60)
VH/VLドメインリンカー配列は下線付きである。
2016519111.tif 000051
【０２８６】
(ヒト)IL12-F8-F8のアミノ酸配列(配列番号61)
2016519111.tif 000052
【０２８７】
L19ダイアボディのアミノ酸配列(配列番号62)
VH/VLドメインリンカー配列を太字かつ下線付きで示す。
2016519111.tif 000053
【０２８８】
RA実験において用いられるL19-IL10コンジュゲートのアミノ酸配列(配列番号63)
2016519111.tif 000054
VH/VLドメインリンカー配列およびVLドメインとIL10との間のリンカーを太字で示す。IL10の配列を斜体で示す。
【０２８９】
L19-マウスIL4コンジュゲートのアミノ酸配列(配列番号64)
2016519111.tif 000055
VH/VLドメインリンカー配列およびVLドメインとヒトIL4との間のリンカーを太字で示す。マウスIL4の配列を斜体で示す。
【０２９０】
KSF-IL10コンジュゲートのアミノ酸配列(配列番号65)
2016519111.tif 000056
VH/VLドメインリンカー配列およびVLドメインとIL10との間のリンカーを太字で示す。IL10の配列を斜体で示す。
【０２９１】
がん実験において用いられるL19-IL10コンジュゲートのアミノ酸配列(配列番号66)
2016519111.tif 000057
VH/VLドメインリンカー配列およびVLドメインとIL10との間のリンカーを太字で示す。IL10の配列を斜体で示す。
【０２９２】
ヒトIL4 N38Q突然変異体のアミノ酸配列(配列番号67)
2016519111.tif 000058
【０２９３】
F8-(ヒト)IL4 N284Q突然変異体のアミノ酸配列(配列番号68)
VH/VLドメインリンカー配列およびVLドメインとIL4との間のリンカーを太字および下線付きで示す。IL4突然変異体の配列を斜体で示す。
2016519111.tif 000059
【０２９４】
F8-SIPのアミノ酸配列(配列番号69)
VH/VLドメインリンカー配列およびVLドメインとエプシロン-CH4ドメインとの間のリンカーを太字で示し、ヒトIgEのエプシロン-CH4ドメインを斜体で示す。
2016519111.tif 000060
【０２９５】
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【図１】
2016519111.tif 000061
【図２】
2016519111.tif 000062
【図３−１】
2016519111.tif 000063
【図３−２】
2016519111.tif 000064
【図３−３】
2016519111.tif 000065
【図４】
2016519111.tif 000066
【図５】
2016519111.tif 000067
【図６】
2016519111.tif 000068
【図７】
2016519111.tif 000069
【図８】
2016519111.tif 000070
【図９】
2016519111.tif 000071
【図１０】
2016519111.tif 000072
【図１１−１】
2016519111.tif 000073
【図１１−２】
2016519111.tif 000074
【図１２】
2016519111.tif 000075
【図１３−１】
2016519111.tif 000076
【図１３−２】
2016519111.tif 000077
【図１４−１】
2016519111.tif 000078
【図１４−２】
2016519111.tif 000079
【図１５】
2016519111.tif 000080
【図１６】
2016519111.tif 000081
【図１７】
2016519111.tif 000082
【図１８】
2016519111.tif 000083
【図１９】
2016519111.tif 000084
【図２０】
2016519111.tif 000085
【図２１】
2016519111.tif 000086
【配列表】
2016519111000001.app
【国際調査報告】
2016519111.tif 000087
2016519111.tif 000088
2016519111.tif 000089
2016519111.tif 000090
2016519111.tif 000091
2016519111.tif 000092
2016519111.tif 000093
2016519111.tif 000094
2016519111.tif 000095
2016519111.tif 000096