(57)【要約】  本開示は、いくつかの側面では、加圧下のバイオリアクター中で、メタン、酸素、ならびにメタンモノオキシゲダーゼ、メタノールデヒドロゲナーゼ、およびホルムアルデヒドのイソブタノールへの変換を触媒する酵素を含有する細胞溶解物を混合して無細胞反応混合物を作成すること、および好適な条件下で無細胞反応をインキュベートしてメタンをイソブタノールに変換することを含む、ラージスケールでメタンをイソブタノールに変換する無細胞方法およびシステムに関連する。
2016504034.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタンをイソブタノールにラージスケールで変換する無細胞方法であって、
加圧下のバイオリアクター中で、メタン、酸素、並びにメタンモノオキシゲナーゼ、メタノールデヒドロゲナーゼ、およびホルムアルデヒドのイソブタノールへの変換を触媒する酵素を含有する細胞溶解物を混合して、無細胞反応混合物を作成すること；および
無細胞反応を好適な条件下でインキュベートしてメタンをイソブタノールに変換すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
メタンモノオキシゲナーゼがメタン資化菌から得られる、請求項１に記載の無細胞方法。
【請求項３】
メタノールデヒドロゲナーゼが異種ＮＡＤ関連メタノールデヒドロゲナーゼである、請求項１または２に記載の無細胞方法。
【請求項４】
ホルムアルデヒドのイソブタノールへの変換を触媒する酵素が、組換え細菌由来である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の無細胞方法。
【請求項５】
組換え細菌が組換え大腸菌である、請求項４に記載の無細胞方法。
【請求項６】
ホルムアルデヒドのイソブタノールへの変換を触媒する酵素が、ヘキスロース−６−リン酸シンターゼ、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、トランスケトラーゼ、リボース−５−リン酸イソメラーゼ、リボース−５−リン酸−３−エピメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、アセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ、およびイソブタノールデヒドロゲナーゼの１つ以上を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の無細胞方法。
【請求項７】
圧力が１バール以上である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の無細胞方法。
【請求項８】
圧力が２バール以上である、請求項７に記載の無細胞方法。
【請求項９】
圧力が５バール以上である、請求項８に記載の無細胞方法。
【請求項１０】
イソブタノールが１ｇ／Ｌ−ｈ以上の生成速度で生成される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の無細胞方法。
【請求項１１】
イソブタノールが１０ｇ／Ｌ−ｈ以上の生成速度で生成される、請求項１０に記載の無細胞方法。
【請求項１２】
イソブタノールが２５ｇ／Ｌ−ｈ以上の生成速度で生成される、請求項１１に記載の無細胞方法。
【請求項１３】
バイオリアクターが気相および水相を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の無細胞方法。
【請求項１４】
バイオリアクターが更に有機溶媒を含む、請求項１３に記載の無細胞方法。
【請求項１５】
有機溶媒がアルカンである、請求項１４に記載の無細胞方法。
【請求項１６】
アルカンが、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、およびデカンからなる群から選択される、請求項１５に記載の無細胞方法。
【請求項１７】
メタンをピルビン酸にラージスケールで変換する無細胞方法であって、
加圧下のバイオリアクター中で、メタン、酸素、並びにメタンモノオキシゲナーゼ、メタノールデヒドロゲナーゼ、およびホルムアルデヒドのピルビン酸への変換を触媒する酵素を含有する細胞溶解物を混合して、無細胞反応混合物を作成すること；および
無細胞反応を好適な条件下でインキュベートして、メタンをピルビン酸に変換すること
を含む、前記方法。
【請求項１８】
メタンモノオキシゲナーゼがメタン資化菌から得られる、請求項１７に記載の無細胞方法。
【請求項１９】
メタノールデヒドロゲナーゼが異種ＮＡＤ関連メタノールデヒドロゲナーゼである、請求項１７または１８に記載の無細胞方法。
【請求項２０】
ホルムアルデヒドのイソブタノールへの変換を触媒する酵素が、組換え細菌由来である、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の無細胞方法。
【請求項２１】
組換え細菌が組換え大腸菌である、請求項２０に記載の無細胞方法。
【請求項２２】
ホルムアルデヒドのピルビン酸への変換を触媒する酵素が、ヘキスロース−６−リン酸シンターゼ、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、トランスケトラーゼ、リボース−５−リン酸イソメラーゼ、リボース−５−リン酸−３−エピメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、エノラーゼ、およびピルビン酸キナーゼの１つ以上を含む、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の無細胞方法。
【請求項２３】
圧力が１バール以上である、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の無細胞方法。
【請求項２４】
圧力が２バール以上である、請求項２３に記載の無細胞方法。
【請求項２５】
圧力が５バール以上である、請求項２４に記載の無細胞方法。
【請求項２６】
イソブタノールが１ｇ／Ｌ−ｈ以上の生成速度で生成される、請求項１７〜２５のいずれか一項に記載の無細胞方法。
【請求項２７】
イソブタノールが１０ｇ／Ｌ−ｈ以上の生成速度で生成される、請求項２６に記載の無細胞方法。
【請求項２８】
イソブタノールが２５ｇ／Ｌ−ｈ以上の生成速度で生成される、請求項２７に記載の無細胞方法。
【請求項２９】
バイオリアクターが気相および水相を含む、請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の無細胞方法。
【請求項３０】
バイオリアクターが更に有機溶媒を含む、請求項２９に記載の無細胞方法。
【請求項３１】
有機溶媒がアルカンである、請求項３０に記載の無細胞方法。
【請求項３２】
アルカンが、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、およびデカンからなる群から選択される、請求項３１に記載の無細胞方法。
【請求項３３】
メタンをバイオ燃料または他の化合物にラージスケールで変換する無細胞方法であって、
加圧下のバイオリアクター中で、メタン、酸素、並びにメタンモノオキシゲナーゼ、メタノールデヒドロゲナーゼ、ホルムアルデヒドのピルビン酸への変換を触媒する酵素、およびピルビン酸のバイオ燃料または他の化合物への変換を触媒する酵素を含有する細胞溶解物を混合して無細胞反応混合物を作成すること；および
無細胞反応を好適な条件下でインキュベートしてメタンをバイオ燃料または他の化合物に変換すること
を含む、前記方法。
【請求項３４】
メタンモノオキシゲナーゼがメタン資化菌から得られる、請求項３３に記載の無細胞方法。
【請求項３５】
メタノールデヒドロゲナーゼが異種ＮＡＤ関連メタノールデヒドロゲナーゼである、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
ホルムアルデヒドのピルビン酸への変換および／またはピルビン酸のバイオ燃料または他の化合物への変換を触媒する酵素が組換え細菌由来である、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の無細胞方法。
【請求項３７】
組換え細菌が組換え大腸菌である、請求項３６に記載の無細胞方法。
【請求項３８】
ホルムアルデヒドのピルビン酸への変換を触媒する酵素が、ヘキスロース−６−リン酸シンターゼ、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、トランスケトラーゼ、リボース−５−リン酸イソメラーゼ、リボース−５−リン酸−３−エピメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、エノラーゼ、およびピルビン酸キナーゼの１つ以上を含む、請求項３３〜３７のいずれか一項に記載の無細胞方法。
【請求項３９】
圧力が１バール以上である、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載の無細胞方法。
【請求項４０】
圧力が２バール以上である、請求項３９に記載の無細胞方法。
【請求項４１】
圧力が５バール以上である、請求項４０に記載の無細胞方法。
【請求項４２】
イソブタノールが１ｇ／Ｌ−ｈ以上の生成速度で生成される、請求項３３〜４１のいずれか一項に記載の無細胞方法。
【請求項４３】
イソブタノールが１０ｇ／Ｌ−ｈ以上の生成速度で生成される、請求項４２に記載の無細胞方法。
【請求項４４】
イソブタノールが２５ｇ／Ｌ−ｈ以上の生成速度で生成される、請求項４３に記載の無細胞方法。
【請求項４５】
バイオリアクターが気相および水相を含む、請求項３３〜４４のいずれか一項に記載の無細胞方法。
【請求項４６】
バイオリアクターが更に有機溶媒を含む、請求項４５に記載の無細胞方法。
【請求項４７】
有機溶媒がアルカンである、請求項４６に記載の無細胞方法。
【請求項４８】
アルカンが、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、およびデカンからなる群から選択される、請求項４７に記載の無細胞方法。
【請求項４９】
メタンをイソブタノールにラージスケールで変換する無細胞システムであって、
メタンおよび酸素を含む気相；および
メタンモノオキシゲナーゼ、メタノールデヒドロゲナーゼ、およびホルムアルデヒドのイソブタノールへの変換を触媒する酵素を含有する細胞溶解物を含む水相
を含むバイオリアクターを含む、前記システム。
【請求項５０】
メタンモノオキシゲナーゼがメタン資化菌から得られる、請求項４９に記載の無細胞システム。
【請求項５１】
メタノールデヒドロゲナーゼが異種ＮＡＤ関連メタノールデヒドロゲナーゼである、請求項４９または５０に記載の無細胞システム。
【請求項５２】
ホルムアルデヒドのイソブタノールへの変換を触媒する酵素が組換え細菌由来である、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の無細胞システム。
【請求項５３】
組換え細菌が組換え大腸菌である、請求項５２に記載の無細胞システム。
【請求項５４】
ホルムアルデヒドのイソブタノールへの変換を触媒する酵素が、ヘキスロース−６−リン酸シンターゼ、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、トランスケトラーゼ、リボース−５−リン酸イソメラーゼ、リボース−５−リン酸−３−エピメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、アセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ、およびイソブタノールデヒドロゲナーゼの１つ以上を含む、請求項４９〜５３のいずれか一項に記載の無細胞システム。
【請求項５５】
バイオリアクターが更に有機溶媒を含む、請求項４９〜５４のいずれか一項に記載の無細胞システム。
【請求項５６】
有機溶媒がアルカンである、請求項５５に記載の無細胞システム。
【請求項５７】
アルカンが、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、およびデカンからなる群から選択される、請求項５６に記載の無細胞システム。
【請求項５８】
メタンをピルビン酸にラージスケールで変換する無細胞システムであって、
メタンおよび酸素を含む気相；および
メタンモノオキシゲナーゼ、メタノールデヒドロゲナーゼ、およびホルムアルデヒドのピルビン酸への変換を触媒する酵素を含有する細胞溶解物を含む水相
を含むバイオリアクターを含む、前記システム。
【請求項５９】
メタンモノオキシゲナーゼがメタン資化菌から得られる、請求項５８に記載の無細胞システム。
【請求項６０】
メタノールデヒドロゲナーゼが異種ＮＡＤ関連メタノールデヒドロゲナーゼである、請求項５８または５９に記載の無細胞システム。
【請求項６１】
ホルムアルデヒドのイソブタノールへの変換を触媒する酵素が組換え細菌由来である、請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の無細胞システム。
【請求項６２】
組換え細菌が組換え大腸菌である、請求項６１に記載の無細胞システム。
【請求項６３】
ホルムアルデヒドのピルビン酸への変換を触媒する酵素が、ヘキスロース−６−リン酸シンターゼ、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、トランスケトラーゼ、リボース−５−リン酸イソメラーゼ、リボース−５−リン酸−３−エピメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、エノラーゼ、およびピルビン酸キナーゼの１つ以上を含む、請求項５８〜６２のいずれか一項に記載の無細胞システム。
【請求項６４】
バイオリアクターが更に有機溶媒を含む、請求項５８〜６３のいずれか一項に記載の無細胞システム。
【請求項６５】
有機溶媒がアルカンである、請求項６４に記載の無細胞システム。
【請求項６６】
アルカンが、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、およびデカンからなる群から選択される、請求項６５に記載の無細胞システム。
【請求項６７】
メタンをピルビン酸にラージスケールで変換する無細胞システムであって、
メタンおよび酸素を含む気相；および
無細胞反応混合物を作成するための、メタンモノオキシゲナーゼ、メタノールデヒドロゲナーゼ、ホルムアルデヒドのピルビン酸への変換を触媒する酵素、およびピルビン酸のバイオ燃料または他の化合物への変換を触媒する酵素を含有する細胞溶解物を含む水相
を含むバイオリアクターを含む、前記システム。
【請求項６８】
メタンモノオキシゲナーゼがメタン資化菌から得られる、請求項６７に記載の無細胞システム。
【請求項６９】
メタノールデヒドロゲナーゼが異種ＮＡＤ関連メタノールデヒドロゲナーゼである、請求項６７または６８に記載の無細胞システム。
【請求項７０】
ホルムアルデヒドのイソブタノールへの変換を触媒する酵素が組換え細菌由来である、請求項６７〜６９のいずれか一項に記載の無細胞システム。
【請求項７１】
組換え細菌が組換え大腸菌である、請求項７０に記載の無細胞システム。
【請求項７２】
ホルムアルデヒドのピルビン酸への変換を触媒する酵素が、ヘキスロース−６−リン酸シンターゼ、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、トランスケトラーゼ、リボース−５−リン酸イソメラーゼ、リボース−５−リン酸−３−エピメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、エノラーゼ、およびピルビン酸キナーゼの１つ以上を含む、請求項６７〜７１のいずれか一項に記載の無細胞システム。
【請求項７３】
バイオリアクターが更に有機溶媒を含む、請求項６７〜７１のいずれか一項に記載の無細胞システム。
【請求項７４】
有機溶媒がアルカンである、請求項７３に記載の無細胞システム。
【請求項７５】
アルカンが、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、およびデカンからなる群から選択される、請求項７４に記載の無細胞システム。
【請求項７６】
請求項１〜７５のいずれか一項に記載の細胞溶解物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１２年１２月２１日に出願された米国特許仮出願第６１／７４０，９７２号に対して、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を主張し、その全開示を参照により本明細書に組み込むものである。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
イソブタノールは炭水化物の発酵時に自然に生成され、また有機物の腐敗プロセスの副生成物でもありうる（Atsumi et al.2008 Nature 451:86-89）。イソブタノールを生成するために使用される生合成経路は、クロストリジウム属の細菌種で最初に発見された。この経路は、クロストリジウム属の微生物よりもより容易に現行の科学的方法により操作される、数種の微生物へ遺伝子改変により組み入れられる（Peralta-Yahya et al. 2012 Nature 488:320-328）。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、天然ガス、特にメタンを、目的のバイオ燃料（例えば、イソブタノール）および他の化合物に変換する無細胞システムを提供する。天然ガスは、メタンを主成分とする炭化水素ガス混合物であるが、様々な量の他の高級アルカンおよびより少量の割合で二酸化炭素、窒素および硫化水素を含んでいる。本発明の側面では、生合成プロセスと化学工学プロセスをユニークに組合わせて、１Ｌの天然ガスから例えば毎時１０ｇ〜２５ｇ以上のバイオ燃料を生成可能な無細胞生合成システムを提供する。例えば、１５５ｍ３の反応器を使用する規模の産業または商業プラントでは、いくつかの例では製品価格の２０％未満の原料コストで、年間３０，０００メートルトン以上のバイオ燃料（例えば、イソブタノール）を生産可能である（例えば、＞５００ＢＰＤスケール）。
【０００４】
本明細書で提供される無細胞プロセスは、いくつかの実施態様では、（ｉ）メタンをメタノールまたはホルムアルデヒドに変換する酵素（例えば、メタンモノオキシゲナーゼ、ＭＭＯ）を発現するメタン代謝性メタン資化菌（例えば、Methylococcus capsulatus Bath）由来の無細胞溶解物を、（ｉｉ）メタノールまたはホルムアルデヒドをバイオ燃料または他の化合物に変換するための酵素を発現する組換え細菌細胞（例えば、大腸菌）由来の無細胞溶解物と混合する。
【０００５】
これらの細胞溶解物を、加圧バイオリアクター（例えば、１バール以上）中で、ともにＭＭＯ活性化に必要であるメタンおよび酸素と混合して、メタンをバイオ燃料または他の化合物に変換する。本開示の無細胞プロセスは、通常メタンおよび酸素をまず水相に拡散することにより、露出した脂質二重膜（例えば、細胞溶解物の細胞内小胞の）へこれらの気体を送達するのに特に有用な多相反応システムを使用する。いくつかの実施態様では、メタンをホルムアルデヒドに変換および／またはホルムアルデヒドをバイオ燃料または他の化合物に変換するための酵素を、無細胞システムへ外因的に添加する。そのような外因的に添加した酵素は、精製または部分的に精製することができる。
【０００６】
本開示は、メタンをホルムアルデヒドに変換する酵素の発現／生成のためのメタン資化菌の使用を記載するが、メタンをホルムアルデヒドに変換する酵素の生成に使用する他の生物が本明細書において意図されることは理解されるであろう。
【０００７】
いくつかの側面では、メタンをバイオ燃料または他の化合物へラージスケールで変換する無細胞方法であって、加圧下のバイオリアクター中で、メタンのホルムアルデヒドへの変換を触媒する酵素およびホルムアルデヒドのバイオ燃料または他の化合物への変換を触媒する酵素を含有する１つ以上の細胞溶解物、メタン並びに酸素を混合して無細胞反応混合物を作成すること；および無細胞反応を好適な条件下で（例えば、高圧、３７℃）インキュベートしてメタンをバイオ燃料または他の化合物に変換することを含む、前記方法が提供される。いくつかの実施態様では、バイオリアクターは更に有機溶媒（例えば、デカン）を含むことができる。いくつかの実施態様では、有機相は、メタンで飽和または過飽和されている。「好適な条件」とは、限定されることなく、圧力１バール以上（例えば、１バール〜１０バール、または５バール〜１０バール）および／または温度３５℃〜４０℃（例えば、３７℃）が挙げられる。
【０００８】
いくつかの実施態様では、メタンをイソブタノールへラージスケールで変換する無細胞方法であって、加圧下のバイオリアクター中で、メタンのホルムアルデヒドへの変換を触媒する、メタンモノオキシゲナーゼおよびメタノールデヒドロゲナーゼ（例えば、組換えＮＡＤ関連メタノールデヒドロゲナーゼ）、およびホルムアルデヒドのイソブタノールへの変換を触媒する、ヘキスロース−６−リン酸シンターゼ、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、トランスケトラーゼ、リボース−５−リン酸イソメラーゼ、
【０００９】
リボース−５−リン酸−３−エピメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、アセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼおよびイソブタノールデヒドロゲナーゼの１つ以上を含有する１つ以上の細胞溶解物、メタン並びに酸素を混合して無細胞反応混合物を作成すること；および好適な条件下で無細胞反応をインキュベートしてメタンをイソブタノールに変換することを含む、前記方法が提供される。いくつかの実施態様では、バイオリアクターは更に有機溶媒（例えば、デカン）を含むことができる。
【００１０】
ホルムアルデヒドのバイオ燃料または他の化合物への変換の中間生成物の１つは、ピルビン酸である。従って、ある側面では、メタンをピルビン酸へラージスケールで変換する無細胞方法であって、加圧下のバイオリアクター中で、メタンのホルムアルデヒドへの変換を触媒する酵素およびホルムアルデヒドのピルビン酸への変換を触媒する酵素を含有する１つ以上の細胞溶解物、メタン並びに酸素を混合して無細胞反応混合物を作成すること；および好適な条件下で無細胞反応をインキュベートしてメタンをピルビン酸に変換することを含む、前記方法が提供される。いくつかの実施態様では、バイオリアクターは更に有機溶媒（例えば、デカン）を含むことができる。
【００１１】
いくつかの実施態様では、メタンをピルビン酸へラージスケールで変換する無細胞方法であって、加圧下のバイオリアクター中で、メタンのホルムアルデヒドへの変換を触媒する、メタンモノオキシゲナーゼおよびメタノールデヒドロゲナーゼ（例えば、組換えＮＡＤ関連メタノールデヒドロゲナーゼ）、およびホルムアルデヒドのピルビン酸への変換を触媒する、ヘキスロース−６−リン酸シンターゼ、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、トランスケトラーゼ、リボース−５−リン酸イソメラーゼ、リボース−５−リン酸−３−エピメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、エノラーゼ、およびピルビン酸キナーゼの１つ以上を含有する１つ以上の細胞溶解物、メタン並びに酸素を混合して無細胞反応混合物を作成すること；および好適な条件下で無細胞反応をインキュベートしてメタンをピルビン酸に変換することを含む、前記方法が提供される。いくつかの実施態様では、バイオリアクターは更に有機溶媒（例えば、デカン）を含むことができる。
【００１２】
他の側面では、メタンをバイオ燃料または他の化合物へラージスケールで変換する無細胞システムおよび組成物であって、メタンおよび酸素を含む気相；およびメタンのホルムアルデヒドへの変換を触媒する酵素およびホルムアルデヒドのバイオ燃料または化合物への変換を触媒する酵素を含有する細胞溶解物を含む水相を含むバイオリアクターを含む、前記システムおよび組成物が提供される。いくつかの実施態様では、バイオリアクターが更に有機溶媒（例えば、デカン）を含む有機相を含むことができる。
【００１３】
いくつかの実施態様では、メタンをイソブタノールへラージスケールで変換する無細胞システムおよび組成物であって、メタンおよび酸素を含む気相；並びにメタンのホルムアルデヒドへの変換を触媒する、メタンモノオキシゲナーゼおよびメタノールデヒドロゲナーゼ（例えば、組換えＮＡＤ関連メタノールデヒドロゲナーゼ）、およびホルムアルデヒドのイソブタノールへの変換を触媒する、ヘキスロース−６−リン酸シンターゼ、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、トランスケトラーゼ、リボース−５−リン酸イソメラーゼ、リボース−５−リン酸−３−エピメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、アセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ、およびイソブタノールデヒドロゲナーゼを含有する１つ以上の細胞溶解物を含む水相を含むバイオリアクターを含む、前記システムおよび組成物が提供される。いくつかの実施態様では、バイオリアクターが更に有機溶媒（例えば、デカン）を含む有機相を含むことができる。
【００１４】
いくつかの実施態様では、メタンをピルビン酸へラージスケールで変換する無細胞システムおよび組成物であって、メタンおよび酸素を含む気相；並びにメタンのホルムアルデヒドへの変換を触媒する、メタンモノオキシゲナーゼおよびメタノールデヒドロゲナーゼ（例えば、組換えＮＡＤ関連メタノールデヒドロゲナーゼ）、およびホルムアルデヒドのピルビン酸への変換を触媒する、ヘキスロース−６−リン酸シンターゼ、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、トランスケトラーゼ、リボース−５−リン酸イソメラーゼ、リボース−５−リン酸−３−エピメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、エノラーゼ、およびピルビン酸キナーゼを含有する１つ以上の細胞溶解物を含む水相を含むバイオリアクターを含む、前記システムおよび組成物が提供される。いくつかの実施態様では、バイオリアクターが更に有機溶媒（例えば、デカン）を含む有機相を含むことができる。
【００１５】
いくつかの側面では、メタンをピルビン酸へラージスケールで変換する無細胞方法であって、（ａ）メタン資化菌においてメタンをホルムアルデヒドに変換する１つ以上の酵素を発現すること、（ｂ）組換え細菌においてホルムアルデヒドをピルビン酸に変換する１つ以上の酵素を発現すること、（ｃ）メタン資化菌および組換え細菌由来の細胞溶解物をメタン、有機溶媒（例えば、デカン）および酸素と混合して無細胞反応混合物を作成すること、および（ｄ）無細胞反応を好適な条件下でインキュベートしてメタンをピルビン酸に変換することを含む、前記方法が提供される。
【００１６】
いくつかの実施態様では、メタンをホルムアルデヒドに変換する１つ以上の酵素は、メタンモノオキシゲナーゼおよびメタノールデヒドロゲナーゼから選択される。いくつかの実施態様では、ホルムアルデヒドをピルビン酸に変換する１つ以上の酵素は、ヘキスロース−６−リン酸シンターゼ、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、トランスケトラーゼ、リボース−５−リン酸イソメラーゼ、リボース−５−リン酸−３−エピメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、エノラーゼ、およびピルビン酸キナーゼから選択される。
【００１７】
いくつかの実施態様では、前記方法は、（例えば、混合する工程の前に）メタン資化菌および／または組換え細菌細胞を溶解することを更に含む。
いくつかの実施態様では、前記方法は、組換え細菌細胞において酵素を切断し不活性化するプロテアーゼを発現することを更に含む。例えば、プロテアーゼは、ピルビン酸デヒドロゲナーゼおよび／またはホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼを切断し不活性化することができる。あるいは、プロテアーゼは外因的に添加することができる。
【００１８】
また、メタンをホルムアルデヒドに変換する１つ以上の酵素を含む細胞溶解物、およびホルムアルデヒドをバイオ燃料または他の化合物に変換する１つ以上の酵素を含む細胞溶解物も提供される。いくつかの実施態様では、細胞溶解物が、ホルムアルデヒドをピルビン酸に変換する１つ以上の酵素、またはホルムアルデヒドをイソブタノールに変換する１つ以上の酵素を含む。細胞溶解物は、酵素機能のための小分子または補助因子（例えば、アデノシン三リン酸、ＮＡＤ（ＰＨ））、およびマグネシウムなどの塩を更に含むことができる。
更に、本明細書に記載する無細胞プロセスのいずれか１つ以上により生成された、バイオ燃料および他の化合物または中間物が本明細書で提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、メタンおよび酸素を水相へ高速度で送達するよう設計された本発明の無細胞多相反応システムの例を示す図である。
【図２】図２は、本発明の無細胞変換プラットフォームの例を示す図である。
【図３】図３は、本発明の無細胞変換プラットフォームの例を示す図である。
【図４】図４は、イソブタノール経路を示す図である。
【図５】図５は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）結合型メタノールデヒドロゲナーゼにより適切なＮＡＤＨが供給されている場合のメタンモノオキシゲナーゼ（ＭＭＯ）触媒システムを示す図である。
【図６】図６は、いくつかの実施態様において、気液界面の形成および安定性の評価に使用する装置を示す図である。
【図７】図７は、いくつかの実施態様において、システムの性能および安全性の評価に使用する装置を示す図である。
【００２０】
【図８】図８は、ＭＭＯ活性およびメタン資化菌細胞増殖の評価に使用する多重化計装反応器を示す図である。
【図９】図９は、原料融通性を示す図である。
【図１０】図１０は、単一の抽出物がグルコースまたはリボース−５−Ｐを用いることが可能なことを示すデータのグラフである。
【図１１】図１１は、無細胞反応において、五炭糖（Ｃ５）および六炭糖（Ｃ６）の使用を示す図である。
【図１２】図１２は、メタン代謝を示す図である。
【図１３】図１３は、エネルギーおよび還元性等価物を必要とするイソプレン経路を示す図である。
【図１４】図１４は、イソプレンの唯一の炭素源としてのメタンを示す図である。
【発明の詳細な説明】
【００２１】
いくつかの実施態様では、天然ガス、特にメタンをバイオ燃料および他の化合物に変換する無細胞システムが提供される。このプロセスでは、通常高圧下（例えば、１バール以上、または５バール以上）で運転される反応器において、メタン資化菌由来の無細胞溶解物を他の組換え細菌由来のものと混合する。本発明の無細胞プロセス、システム、反応混合物、組成物、組換え有機体、および核酸構築体は、メタンまたは天然ガスから多種類のバイオ燃料または他の化合物を効率的に生成することを可能とするプラットフォームテクノロジーの一部とみなされる。
【００２２】
無細胞生合成システムを使用すれば、細胞生存率を維持する必要がなくなり、反応パラメーター（例えば、基質供給速度、温度、ｐＨ、圧力、溶存酸素）を直接モニターし調整することが可能となり、柔軟な反応環境が得られ、炭素およびエネルギーフラックスの制御が可能となる（例えば、参照により本明細書に取り込む、国際特許第ＷＯ２０１０／０７７８０６号および第ＷＯ２０１２／０３０９８０号参照）。いくつかの実施態様では、本発明の無細胞プロセスは、高圧下で操作すること、メタンがより高い溶解度を有する有機相を提供すること、高圧の気体を注入してメタン泡および空気泡の表面積を増加することにより、メタンおよび酸素の溶解度に関連する物質輸送の問題に対処するものである。
【００２３】
一般に、本発明の無細胞プロセスは、（ｉ）メタンをホルムアルデヒドに変換する酵素（例えば、ＭＭＯ）を発現するメタン資化菌の使用、（ｉｉ）バイオ燃料および他の化合物を生成する生合成経路における酵素を発現する組換え細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）の使用、および（ｉｉｉ）従来は無機触媒を使用した化学プロセスによってのみ提供された融通性のある反応環境および制御システムの使用を含む。
【００２４】
本発明のいくつかの側面は、図１に示すような、多相反応システムを使用する無細胞プロセスを提供する。無細胞バイオリアクターの反応混合物は、いくつかの実施態様では：（ｉ）メタンおよび酸素を送達し、ＣＯ２を除去するための気相、および（ｉｉ）酵素および膜小胞を含む水性、すなわち連続相を含む。いくつかの実施態様では、無細胞バイオリアクターは、天然ガス（メタンを含む）を送達し、所望の生成物を優先的に吸収するための有機（無極性）相も含む（図１）。
【００２５】
いくつかの実施態様では、例えば有機相が含まれる場合は、水相は、細胞溶解物（例えば、細胞内容物の酵素および膜小胞を含む）と、気相（例えば、酸素を送達しＣＯ２を除去するための空気泡として、およびメタンを送達するためのメタン泡として）と、有機相（例えば、メタンを送達し生成物を捕獲するための有機溶媒の液滴）との乳状液を含むものである。いくつかの実施態様では、乳状液は反応器の外部で作成される。他の実施態様では、乳状液は、バイオリアクターへ有機相を高圧注入することにより作成される。本明細書で使用される「高圧」とは、１バール以上の圧力である。例えば、高圧とは、１バール以上、２バール以上、５バール以上、または１０バール以上の圧力を意味する。いくつかの実施態様では、高圧とは、１〜５バール、１〜１０バール、または５〜１０バールの圧力を意味する。
【００２６】
有機相の有機溶媒はアルカンであることができる。本明細書で使用されるアルカンの例としては、限定されることなく、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、およびデカンが挙げられる。他の有機溶媒を使用することもできる。例えば、以下の性質を有する有機溶媒が想到される：（ｉ）それを使用することで、無細胞反応におけるピルビン酸生成速度の減少が１０％未満であるもの、および（ｉｉ）大気圧でのメタン溶解度が２５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ（例えば、２３ｍｇ／Ｌ）であるもの。
【００２７】
図２は、限定するものではないが、本発明の無細胞プロセスの例を示す図である。プロセスの各工程を符号１〜８で示す。工程１では、組換えメタン資化菌が、天然ガス中のメタンをホルムアルデヒドに変換する酵素を発現する。工程２では、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が、ホルムアルデヒドをバイオ燃料、このケースではイソブタノールに変換する酵素を発現し、また区画化プロテアーゼを提供する（例えば、参照により本明細書に取り込む、国際特許第ＷＯ２０１０／０７７８０６号および第ＷＯ２０１２／０３０９８０号参照）。
【００２８】
プロテアーゼは、例えば、同族プロテアーゼ認識部位を含有するように操作された（メタン資化菌により発現された）標的化ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼを切断する。ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼは、ホルムアルデヒドをギ酸塩に変換するので、それは無細胞反応システムにおいてホルムアルデヒドをバイオ燃料または他の化合物に変換することを妨害する。このように、工程３において、工程１および工程２からの有機体を溶解し混合すると、プロテアーゼが細胞区画（例えば、周辺質）から遊離し、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼを切断して不活性化する。
【００２９】
このホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼの不活性化により、バイオ燃料の変換収量が増加する。メタンのバイオ燃料への変換は、工程４において、例えば１以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上、または２５ｇ／Ｌ−ｈｒ以上の容量生産性となるよう物質輸送速度を達成するように、例えば圧力１０バールに加圧された工学操作・コンピューター制御バイオリアクター中で行われる。工程４のバイオリアクターは、細胞溶解物の酵素触媒を支持するための水相と、任意に、天然ガスまたはメタンの送達を促進しバイオ燃料生成物を吸収するための有機相とを含有する多相液体を含む。
【００３０】
いくつかの実施態様では、これらの相を工程５において分離し、有機相は工程６での燃料除去のために送達する。いくつかの実施態様では、その後、有機相に天然ガス（またはメタン）を再充填し、多数の箇所でバイオリアクターに注入し戻す。いくつかの実施態様では、空気および天然ガスを別々に注入することができる。また、いくつかの場合では、外部の熱交換器および冷却ジャケットにより、プロセス熱を除去し、反応器温度を制御する。安全な操作を確保するために、通常反応器の全体にわたる多数の温度センサーにより、自然発火により生じる可能性のある「ホットスポット」を検出する。これにより、メタンおよび／または空気の注入を即座に減少させて、分布された注入口の再均衡を図る。
【００３１】
無細胞プロセスの工程のいくつかは、同時にまたは逐次的に行うことができることを理解されたい。例えば、メタンをホルムアルデヒドに変換する酵素の発現およびホルムアルデヒドをバイオ燃料に変換する酵素の発現は、細胞溶解の前に（例えば、１つの反応器の別々の区画において）同時に行うことができる。
【００３２】
図３は、限定するものではないが、本発明の無細胞プロセスの他の例を示す図である。理解しやすいように、種菌調製醗酵槽、圧縮機、冷却器、熱交換器、およびポンプなどの要素は示していない。この例では、メタン資化菌は遠心分離により濃縮した後、遠心分離していない組換えＥ．ｃｏｌｉ培養物と混合する。混合した細胞は、高圧ホモジナイザーでの溶解を行うまでの間冷却タンクの中で保持する。その後、細胞溶解物を遠心分離して、２つ目の保持タンクへ移送する。
【００３３】
いくつかの実施態様では、アルカン（例えば、デカン）中での推定バイオ燃料吸着容量が１６％であることに基づいて、毎時無細胞反応液体の約半分を反応器からデカンテーション遠心機に圧送する。気相を除去し、液相を分離する。いくつかの実施態様では、有機相を、バイオ燃料除去用の蒸留装置に移送する。再精製したアルカンはその後冷却しメタンと共に注入して、無細胞反応器へ分散して戻し入れるための冷却メタン・イン・アルカン泡沫を生成する。無細胞反応器内を一定量に保つためおよび水溶性毒素となりうるものを除去するために、デカンテーション遠心機を出た水相の約１０％を除去する。その後、水性触媒流は、バイオリアクターの唯一の入口に到達する前に冷却する。
【００３４】
無細胞システム
本明細書で提供される無細胞プロセスは、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）発酵の間に（例えば、細菌人工染色体から）多種類の酵素を発現することを可能とする。いくつかの実施態様では、基質（例えば、メタン）を所望の化学生成物（例えば、ピルビン酸）に変換するための酵素は、通常急速に増殖している組換え細菌株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現される。
【００３５】
細胞の回収および溶解の前に、酵素は最適なレベルで蓄積する。細胞溶解により、周辺質で発現されたプロテアーゼ（以下に記載）が副経路を排除することが可能となり、炭素を目的の生成物へ回すことになる。最適化した化学環境により、細胞溶解の間に形成された内膜小胞により触媒される呼吸が活性化され、それによって大量のＡＴＰを供給し、必要に応じてＮＡＤ＋および／またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）をリサイクルするために過剰の還元性等価物を除去する（参照により本明細書に取り込む、国際特許第ＷＯ２０１０／０７７８０６号および第ＷＯ２０１２／０３０９８０号参照）。
【００３６】
本明細書で使用される「無細胞」組成物とは、実質的に無傷細胞を含まない組成物を意味する。当業者には、溶解の後もいくらかの割合、例えば、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満、または０．５％未満の細胞が無傷であることが理解されるであろう。本明細書で使用される「無細胞システム」は、酵素、または（例えば、酵素経路中で）所与の順番および割合で特定の基質に作用するとき、所望の生成物（例えば、バイオ燃料または他の化合物、またはその中間物）の産生をもたらす一連の酵素を含むように特に改変された細胞溶解物または抽出物を含有する、単離した無細胞システムである。
【００３７】
本明細書で使用される「細胞溶解物」とは、溶解細胞の内容物を含有する液体を意味する。細胞溶解物は、細胞溶解物全体および／または粗製（未精製）細胞溶解物であってもよい。いくつかの実施態様では、（例えば、破損した細胞外膜などの細胞デブリ／粒子を除去するために）細胞溶解物は部分的に精製することができる。いくつかの実施態様では、細胞溶解物を高圧溶解により調製し、それによって細胞溶解物における酸化的リン酸化を可能とする細胞内小胞を作成する。細胞溶解物を調製する他の方法が当業分野では公知であり、限定されることなく、超音波処理、ホモジナイゼーション、リゾチームを使用した酵素溶解、凍結粉砕が挙げられる。
【００３８】
超音波処理には、液体せん断およびキャビテーションによって細胞を溶解することが含まれる。超音波処理の間にはＤＮＡもせん断されるので、細胞懸濁液へＤＮＡ分解酵素を添加する必要がないかもしれない。通常細胞懸濁液は温度制御のために氷上に保持し、再度低温とするためにショートパルス（５〜１０秒）を間隔（１０〜３０秒）をおいて使用することができる。
【００３９】
細胞懸濁液を加圧して急激に圧力を解放することにより溶解細胞を押圧するために、ホモジナイザーを使用することができる。これにより、細胞を溶解することが可能な液体せん断力を発生する。一般に、適切な溶解を達成するために複数回（２〜３回）の操作が必要とされる。しかしながら、操作圧力が高いため操作温度が上昇する。従って、加圧した細胞は使用前に冷却（４℃）してもよい。温度制御の他に、泡沫化によるタンパク質の不活性化を避けるよう注意すべきである。
【００４０】
酵素溶解は、リゾチームによる細菌細胞壁のペプチドグリカン層の消化に基づいている。しかしながら、グラム陰性細菌は細胞壁の外側に外膜を有し、ペプチドグリカン層を露出するために透過処理をする必要があるかもしれない。溶解法における緩衝液としてよく使用されるトリス緩衝生理食塩水は、効果的に外膜を透過処理する。この効果は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、例えば１ｍＭ）などのキレート剤を添加することにより高めることが可能である。ＥＤＴＡは、膜を安定化させるマグネシウムイオンをキレート化する。細胞溶解の間ＤＮＡが遊離されるので、調製物の粘度を低下させるためにＤＮＡ分解酵素（１ｍｇ／ｍＬ）を添加する必要があるかもしれない。酵素細胞溶解はいかなる規模で行うことも可能である。細胞溶解のレベルを上げるために溶液を超音波処理することもできる。
【００４１】
他の溶解法は、液体窒素中で直接細胞を凍結すること、液体窒素で冷却した乳鉢と乳棒を使用して凍結した細胞を粉砕して粉体とすることである。粉体は、−８０℃で無期限で保管することが可能であり、細胞溶解物は粉体を緩衝液に添加することで調製可能である。
【００４２】
メタン資化菌および組換え細菌の細胞溶解物は、所望のバイオ燃料または他の化合物を生成するのに必要な少なくとも１つの基質、補助因子、またはそれらの組合わせと無細胞システム中で混合する。本明細書で使用する「基質」は、目的の化合物を合成するのに必要とされる元素を提供することができる化合物または化合物の混合物である。ある実施態様では、基質は炭素源を意味することができる。いくつかの実施態様では、メタンが基質である。
【００４３】
本明細書で使用される「補助因子」は、タンパク質（例えば、酵素）の生物学的活性に必要な非タンパク化合物である。いくつかの実施態様では、補助因子は、メタンのバイオ燃料または他の化合物への無細胞生体内変換に必要である。補助因子の例としては、限定されることなく、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ＋、ＡＴＰ、ＡＤＰ、Ｐｉ、およびＮＡＤＰＨが挙げられる。いくつかの実施態様では、補助因子は、細胞抽出物により提供される（例えば、その中に存在する）。
【００４４】
プロテアーゼ標的化
本開示のいくつかの側面では、生体内変換プロセスの特定のステージに有害な１つ以上の酵素を不活性化することにより、不必要な副反応を阻害する（例えば、排除または抑制する）方法を使用する。いくつかの実施態様では、有害な酵素は、生合成経路において律速段階となる工程を触媒するものである。いくつかの実施態様では、これは、プロテアーゼ認識部位を含むように酵素を操作することにより達成される。そのような組換え酵素は、通常プロテアーゼ認識配列を、認識配列の存在にもかかわらず、組換えタンパク質の活性が細胞の野生型の増殖を可能とするのに十分であるように一次アミノ酸配列に選択的に配置している。
【００４５】
組換え酵素は、組換え目的のタンパク質を特異的にプロテアーゼ認識配列で切断する同族プロテアーゼの導入、発現、および／または活性化により選択的に不活性化可能であり、それによって組換え酵素を不活性化する（または活性を抑制する）。同族プロテアーゼは、組換え酵素の不活性化が必要とされるときまで細胞区画（例えば、周辺質）に隔離され、必要とされるときにプロテアーゼを組換え酵素と接触させて酵素を切断し不活性化する。
【００４６】
本明細書で提供される組換え酵素は、特定の認識配列で切断する多様なプロテアーゼのいずれか１つによって不活性化できる。本明細書で使用されるように、酵素の文脈における「プロテアーゼ認識配列」とは、同族プロテアーゼにより認識・切断されるアミノ酸配列を意味する。タンパク質をコードする核酸の文脈では、「プロテアーゼ認識配列」は、同族プロテアーゼにより認識・切断されるアミノ酸配列をコードする配列を意味する。本明細書で使用されるように、「同族プロテアーゼ」は、組換え酵素を切断することにより不活性化するプロテアーゼを意味する。本明細書で使用できる同族プロテアーゼとしては、単一な特定の認識配列を有するものが挙げられ、それは、プロテアーゼが１つ以上のアミノ酸の特定の配列内または隣接で切断することを意味する。いくつかの実施態様では、本発明のタンパク質は、改変したヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ認識配列により調製される。
【００４７】
本発明に使用できるプロテアーゼの他の例としては、限定されることなく、アラニンカルボキシペプチダーゼ、ナラタケ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ  ｍｅｌｌｅａ）アスタシン、細菌性ロイシルアミノペプチダーゼ、がんプロコアグラント、カテプシンＢ、クロステリパイン、サイトゾルアラニルアミノペプチダーゼ、エラスターゼ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンテロキナーゼ、ガストリクシン、ゼラチナーゼ、Ｇｌｙ−Ｘカルボキシペプチダーゼ、グリシルエンドペプチダーゼ、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、ハイポダーミンＣ、Ｉｇａ−特異的なセリンエンドペプチダーゼ、ロイシルアミノペプチダーゼ、ロイシルエンドペプチダーゼ、ｌｙｓＣ、リソソームプロ−Ｘカルボキシペプチダーゼ、リジルアミノペプチダーゼ、メチオニルアミノペプチダーゼ、粘液細菌、ナーディライシン、膵エンドペプチダーゼＥ、ピコルナイン２Ａ、ピコルナイン３Ｃ、プロエンドペプチダーゼ、プロリルアミノペプチダーゼ、プロタンパク質転換酵素Ｉ、プロタンパク質転換酵素ＩＩ、ルスセリリシン、サッカロペプシン、セメノゲラーゼ、Ｔ−プラスミノーゲン活性化因子、トロンビン、組織カリクレイン、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）、トガビリン、トリプトファニルアミノペプチダーゼ、Ｕ−プラスミノーゲン活性化因子、Ｖ８、ベノンビンＡ、ベノンビンＡＢおよびＸａａ−Ｐｒｏアミノペプチダーゼが挙げられる（本明細書に記載のプロテアーゼの構造化学および生物学の側面に関する教示に関しては、参照によって本明細書に取り込まれる、Rawlings, S. D., et al., Handbook of Proteolytic Enzymes, Academic Press, 2013, Science, Elsevier Ltd., 4094 pages参照）。他のプロテアーゼを本発明に従って使用することができる。
【００４８】
細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞質または周辺質における酵素の区画化により生合成経路の成分を過剰発現し、細胞の健全性および増殖に影響することなく、特定のプロテアーゼを蓄積する機会が与えられる。例えばスケーラブルな高圧ホモジナイザーで細胞を溶解すると、細胞内区画が混合して経路を活性化し、有害な酵素を不活性化する；本質的に触媒システムを再構築する。これにより、いくつかの例では、酵素触媒を安価に生成することが可能となる。
【００４９】
さらに、細胞壁がないこと、および高分子触媒が反応容積全体に分散していることにより、いくつかの実施態様では、オンラインのモニタリングのために正確なサンプリングが可能となり、また添加した基質や反応制御試薬（例えば、ｐＨ作用因子、基質）を即時に分散することが可能となる。これにより、いくつかの実施態様では、本明細書に記載する従来の不均一触媒プロセスで用いられる技術を使用した、複雑な生物学的変換（例えば、メタンをバイオ燃料に変換すること）へのアプローチが可能となる。
【００５０】
本明細書で議論されるように、本発明のいくつかの側面は、バイオ燃料（例えば、イソブタノール）生成に有害な酵素の不活性化に関する。例えば、いくつかの実施態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼを、本明細書に記載の方法でプロテアーゼの標的とすることができる。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＣ）の第１成分酵素である。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体は、ピルビン酸の脱炭酸と呼ばれるプロセスにより、ピルビン酸をアセチルＣｏＡに変換することに寄与する。アセチルＣｏＡは、その後、細胞呼吸を行うクエン酸回路に使用することができ、このようにピルビン酸デヒドロゲナーゼは、解糖代謝経路をクエン酸回路にリンクし、ＮＡＤＨによるエネルギーの放出に寄与する。
【００５１】
いくつかの実施態様では、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼを、本明細書に記載の方法でプロテアーゼの標的とすることができる。ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼは、ホルムアルデヒドのギ酸への化学変換を触媒する酵素である。
【００５２】
メタン資化菌
本発明のいくつかの側面は、メタンのホルムアルデヒドへの変換を触媒する、メタン資化菌由来の酵素に関する。酵素は、有機体中で発現されたり有機体から得られる場合、その有機体「由来」であるとみなされる。従って、いくつかの実施態様では、本発明の無細胞プロセスは、メタン資化菌（例えば、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ）からの細胞抽出物を使用して、メタン活性化の生物学的触媒であるメタンモノオキシゲナーゼを提供する。本明細書で使用される「メタン資化菌」とは、炭素およびエネルギーの唯一の供給源としてメタンを代謝することが可能である原核生物を意味する。メタン資化菌は、好気的または嫌気的に増殖可能であり、生存のために一炭素化合物を必要とする。
【００５３】
いくつかの実施態様では、メタンをバイオ燃料または他の化合物に変換するためにメタン資化菌を使用する際に考慮すべき因子として、限定されることなく：メタン資化菌培養物濃度が１Ｌ当たりの細胞乾燥重量５〜１５グラム程度（例えば、１Ｌ当たりの細胞乾燥重量１０グラム）または２〜５年内（例えば、２．５年間）で１Ｌ当たりの乾燥重量２５〜１００グラム（例えば、１Ｌ当たりの乾燥重量５０グラム）；メタンモノオキシゲナーゼによるメタン酸化の代謝頻度が２５〜７５  ５０ｓｅｃ−１程度（例えば、５０ｓｅｃ−１）および有効触媒寿命が１０〜３０時間；メタンからバイオ燃料または他の化合物への炭素のフラックスを最大とするために、バイオ燃料生成の前駆体化合物へのメタンの酸化において還元性等価物の正味ゼロ消費および副プロセスのプロテアーゼ標的化が挙げられる。
【００５４】
いくつかの実施態様では、バッチ式培養システムおよび／または連続式培養システムを使用して、例えば、メタン資化菌（例えば、Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ）における増殖速度および細胞密度の向上を促進するためにパラフィンを添加すると共に（Han B, et al. 2009 Appl Microbiol Biotechnol 83:669-77）窒素、リン、鉄、銅、および温度を変化させることにより、系統的に増殖条件を操作する。従って、いくつかの実施態様では、メタン資化菌増殖速度およびＭＭＯの蓄積を高めるために、窒素、リン、鉄、銅、およびパラフィンのいずれか１つ以上を本発明の無細胞プロセスにおいて使用できる。
いくつかの実施態様では、メタン資化菌のゲノムを改変して、ｐＭＭＯ発現および活性を向上させている。
【００５５】
組換え細菌
本発明のいくつかの側面は、ホルムアルデヒドのバイオ燃料または他の化合物への変換を触媒する組換え細菌由来の酵素に関する。本明細書で使用される、「組換え細菌」または「組換え細胞」とは、外来、すなわち外因性の核酸（すなわち、細胞にネイティブではない核酸）を導入した細胞を意味する。組換え細胞としては、異なる供給源の核酸を組み合わせて人工的に形成した組換え核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を挙げることができる。いくつかの実施態様では、外来の核酸が細胞のゲノムに組み込まれるが、他の実施態様では、外来の核酸は細胞のゲノムに組み込まれていない。「組換え細胞」および「遺伝子改変細胞」という用語は、本明細書では互換的に使用することができる。
【００５６】
本明細書で提供される実施態様の多くは、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の使用を記載しているが、本発明はそのように限定されるものではなく、急速に増殖しかつ遺伝子操作が容易である任意の細菌細胞を使用することを意図するものであることを理解されたい。従って、本開示に関連する方法は、例えば原核生物および真核生物細胞などの任意のタイプの細胞からの溶解物を含むものである。いくつかの実施態様では、細胞は、エシェリキア属、ストレプトミセス属、ザイモモナス属、アセトバクター属、シトロバクター属、シネコシスティス属、リゾビウム属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、
【００５７】
ストレプトコッカス属、キサントモナス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、バチルス属、アルカリゲネス属、シュードモナス属、アエロモナス属、アゾトバクター属、コマモナス属、マイコバクテリウム属、ロドコッカス属、グルコノバクター属、ラルストニア属、アシドチオバシラス属、ミクロルナタス属、ジオバクター属、ジオバチルス属、アースロバクター属、フラボバクテリウム属、セラチア属、サッカロポリスポラ属、サーマス属、ステノトロホモナス属、クロモバクテリウム属、シノリゾビウム属、サッカロポリスポラ属、アグロバクテリウム属、パントエア属などの細菌細胞である。
【００５８】
細菌細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などのグラム陰性細胞またはバシラス属の菌種などのグラム陽性細胞であってもよい。他の実施態様では、細胞はイースト細胞などの真菌細胞であり、例えばサッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ピキア属、パフィア属、クルイベロミセス属、カンジダ属、タラロマイセス属、ブレタノマイセス属、パキソレン属、デバリオミセス属、ヤロウイア属、および商業倍数体イースト株が挙げられる。限定するものではないが、真菌の他の例としては、アスペルギルス属、ペニシリウム属、フザリウム属、リゾプス属、アクレモニウム属、ニューロスポラ属、ソルダリア属、マグナポルテ属、アロミセス属、ウスチラゴ属、ボトリチス属、ペクトバクテリウム属、トリコデルマ属が挙げられる。
【００５９】
いくつかの実施態様では、細胞は、藻類細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞である。本発明で適合できるいくつかの細胞は、組換え複製物とともに、本発明に関する１つ以上の遺伝子の内因性複製物を発現することができることを理解されたい。また、本発明に従って使用されるいくつかの細胞は、野生型の酵素（例えば、細胞に導入された遺伝子改変の酵素に対応する野生型の酵素）をコードする遺伝子の野生型の染色体コピーを含まないと理解されたい。
【００６０】
いくつかの実施態様では、経済的であり、よく研究されており、遺伝子操作に適しているという理由で、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞が使用される。いくつかの実施態様では、酵母細胞が使用される。
いくつかの実施態様では、ホルムアルデヒドのバイオ燃料または他の化合物への変換を触媒する酵素を含む細胞溶解物は、本明細書に記載の１つ以上の酵素を過剰発現するように操作された組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞の溶解物である。いくつかの実施態様では、細胞溶解物は酵素の群、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０以上の酵素を過剰発現するよう操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞の溶解物である。
【００６１】
いくつかの実施態様では、細胞溶解物は、異なる細胞溶解物の組合わせであり、例えばホルムアルデヒドをバイオ燃料または化合物に変換する１つ以上の酵素を過剰発現するように操作された異なる有機体から得た２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の異なる細胞から得た、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の異なる細胞溶解物の組合わせである。いくつかの実施態様では、異なる有機体（例えば、異なる細菌株）からの溶解物を組合わせる。いくつかの実施態様では、すべてのタンパク質を過剰発現するよう操作された単一の株を作成する前に、酵素レベルを最適化するために、操作された異なるＥ．ｃｏｌｉ株（例えば、異なる生成経路のタンパク質を過剰発現する）を組合わせる。
【００６２】
本明細書で提供される細胞は、いくつかの実施態様では、本明細書で提供されるような酵素をコードする核酸で形質転換されても良い原核生物細胞である。形質転換および形質移入は、それぞれ原核生物細胞および真核生物細胞に外因性の遺伝子材料を導入するプロセスである。形質転換は、エレクトロポレーションまたは化学的手法により達成可能である。形質転換する細胞は、通常コンピテントな状態にある。従って、いくつかの実施態様では、本明細書で提供される細胞は、電気的にコンピテントまたは化学的にコンピテントな細胞である（例えば、それぞれ参照により本明細書に取り込む、Donahue et al. Focus 20, 1998, (2):54-56; Donahue et al. Focus 20, 1998, (2):77-78’ Inoue et al. Gene 96, 1990, (1): 23-28参照）。様々な電気的にコンピテントな細胞および化学的にコンピテントな細胞が当該分野で公知であり、本発明に従って使用できる。
【００６３】
いくつかの実施態様では、細胞は選択可能なマーカーを含むことができる。選択可能なマーカーとしては、限定されることなく、抗生物質または他の化合物への耐性または感受性のどちらかを増加または減少させるタンパク質をコードする遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびクロラムフェニコール耐性遺伝子）、当該分野で公知の標準的な試験法により検出可能な活性を有する酵素をコードする遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたはアルカリホスファターゼ）、および形質転換または形質移入細胞、宿主、コロニー、またはプラークの表現型（例えば、緑色蛍光タンパク質）に可視可能に影響する遺伝子が挙げられる。当該分野で公知の他の選択可能なマーカーも、本発明に従って使用することができる。
【００６４】
本明細書で使用される「核酸」とは、共有結合した少なくとも３つのヌクレオチド（例えば、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、ウラシル）のポリマーである。ポリマーは、天然のヌクレオシド（すなわち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニルウリジン、Ｃ５−プロピニルシチジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、
【００６５】
ジヒドロウリジン、メチルプソイドウリジン、１−メチルアデノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、および２−チオシチジン）、化学修飾した塩基、生物学的に修飾した塩基（例えば、メチル化塩基）、介在塩基、修飾した糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、２’−Ｏ−メチルシチジン、アラビノース、およびヘキソース）、または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホラミダイト結合）を含むことができる。本開示の核酸は、一般にリン酸ジエステル結合を有する。
【００６６】
核酸は、一本鎖（ｓｓ）または二本鎖（ｄｓ）のＤＮＡまたはＲＮＡであることができる。いくつかの実施態様では、核酸はｃＤＮＡの形態である。いくつかの実施態様では、核酸はゲノムＤＮＡの形態である。本開示の核酸としては、限定されることなく、プラスミド、コスミド、および人工染色体（例えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ））などのベクターの形態であることができる。他の核酸に基づくベクターを以下に記載する。
【００６７】
本明細書で使用される、ＲＮＡ、ｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ベクター、ウイルスまたはそれらのハイブリッドである核酸は、様々なソースから単離、遺伝子改変、増幅、および／または組換えで発現・作成することができる。これらの核酸から作成した組換えポリペプチドは、個々に単離またはクローン化し、所望の活性があるかどうかテストすることが可能である。細菌、哺乳類、酵母、昆虫または植物細胞発現システムなどの任意の組換え発現システムが使用可能である。
【００６８】
例えばサブクローニング、標識プローブ（例えば、クレノウポリメラーゼを使用したランダムプライマー標識化、ニックトランスレーション、増幅）、配列決定、ハイブリダイゼーションなどの核酸の操作技術は、科学文献や特許文献ですでに詳細に記載されており、例えば、参照により本明細書に取り込む、Sambrook, ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); Current Protocols In Molecular Biology, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993)が参照できる。
【００６９】
あるいは、これらの核酸は、例えば、参照により本明細書に取り込む、Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859；米国特許第４，４５８，０６６号に記載のような公知の化学合成技術によりin vitroで合成可能である。
【００７０】
本開示の酵素をコードする核酸は、コード配列に作動可能に結合した制御配列を含むことができる。本明細書で使用される、制御配列（例えば、プロモーター配列）およびコード配列は、コード配列の発現または転写を制御配列の影響または制御下におくような仕方で（例えば、制御配列が、コード配列の転写開始および／または発現を「駆動する」など）それらが共有結合しているとき「作動可能に」結合しているという。
【００７１】
例えば、機能的酵素に翻訳されるべきコード配列では、５’制御配列中のプロモーターの誘導がコード配列の転写をもたらす場合および２つのＤＮＡ配列間の結合の性質が（１）フレームシフト変異の導入をもたらさない、（２）コード配列の転写を誘導するプロモーター領域の能力と干渉しない、または（３）酵素に翻訳される対応するＲＮＡ転写物の能力と干渉しない場合、２つのＤＮＡ配列は、作動可能に結合しているとみなされる。従って、得られた転写物が所望の酵素に翻訳可能なようにプロモーター領域がＤＮＡ配列の転写を引き起こすことが可能な場合、プロモーター領域は、コード配列に作動可能に結合しているであろう。
【００７２】
本明細書で提供される酵素のいずれかをコードする核酸を細胞中で発現するときは、様々な転写制御配列をその発現を誘導するために使用することができる。例えば、核酸は、プロモーター、エンハンサー、および／またはターミネーターを含有することができる。あるいは、核酸が挿入されたベクターは、そのような制御配列を含有することができる。
【００７３】
本明細書で使用される「プロモーター」とは、核酸配列の他の領域の転写の開始および速度を制御する核酸配列の制御領域を意味する。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの制御タンパク質および分子が結合できるサブ領域を含有することができる。プロモーターは、恒常的な（例えば、未制御の）、誘導可能な、活性可能な、抑制可能な、組織特異的なまたはそれらの任意の組み合わせであることができる。プロモーターは、それが制御する核酸配列の発現または転写を駆動する。プロモーターは、所与の遺伝子または配列のコードセグメントおよび／またはエクソンの上流に位置する５’−非コード配列を単離することで得られるような、遺伝子または配列と自然に関連しているものであってもよい。そのようなプロモーターは、「内因性」または「ネイティブ」と呼ぶことができる。
【００７４】
いくつかの実施態様では、コード核酸セグメントは、天然の環境でコード化された核酸配列とは通常関連していないプロモーターを意味する組換えまたは異種プロモーターの制御の下に置かれることができる。そのようなプロモーターとしては、他の遺伝子のプロモーター、任意の他の原核生物、ウイルス、または真核生物細胞から単離されたプロモーター、異なる転写制御領域の異なる要素および／または例えば当該分野で公知の遺伝子操作方法によって発現を変えた変異などの「天然に存在」しない合成プロモーターが挙げられる。プロモーターの核酸配列を合成的に生成することに加えて、組換えクローニングおよび／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの核酸増幅技術を使用して配列を生成することができる。
【００７５】
原核生物宿主との使用が好適なプロモーターとしては、限定されることなく、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーターシステム、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、およびｔａｃプロモーターなどの多数のハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかしながら、他の公知の細菌プロモーターも好適であり、例えばｌａｃＩプロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、アラビノースプロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰＲプロモーター、ラムダＰＬプロモーター、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）などの解糖系の酵素をコードするオペロンからのプロモーター、および酸ホスファターゼプロモーターが挙げられる。
【００７６】
それらのヌクレオチド配列は公表されており、当業者はリンカーまたはアダプターを使用してそれらを対象となる配列に作動可能に連結することが可能である。また、細菌システムで使用するプロモーターは、コード配列に作動可能に結合したＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（Ｓ．Ｄ．）配列を含むであろう。いくつかの実施態様では、宿主細胞は、培養物中のすべての細胞が等価に誘発されるように代謝物またはインデューサートランスポータータンパク質の濃度を調製するために遺伝的に改変することができる。
【００７７】
酵母細胞などの真核生物細胞に好適なプロモーターも、当該分野で公知である。実質的にすべての真核生物遺伝子が、転写が開始される部位の上流約２５〜３０塩基に位置するＡＴリッチ領域を有している。多くの遺伝子の転写開始の上流７０〜８０塩基にみられる他の配列は、Ｘが任意のヌクレオチドであるＣＸＣＡＡＴ領域である。ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端には、コード配列の３’末端へのポリＡテール付加のシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列である。
【００７８】
これらの配列のすべては、真核生物発現ベクターに好適に挿入される。酵母宿主と使用するのに好適なプロモーター配列の例としては、限定されることなく、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどの他の解糖系の酵素用のプロモーターが挙げられる。
【００７９】
本明細書で使用される「誘導可能プロモーター」とは、インデューサーまたは誘導剤の存在で、それに影響されて、またはそれと接触するときに転写活性を開始または高めることにより特徴付けられるものである。「インデューサー」または「誘導剤」は、内因性、または誘導可能プロモーターから転写活性を誘導するのに活性であるように投与される通常外因性の化合物またはタンパク質であることができる。本発明に従って使用される誘導可能プロモーターには、本明細書に記載または当業者に公知の任意の誘導可能プロモーターが含まれる。
【００８０】
誘導可能プロモーターの例としては、限定されることなく、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）被制御プロモーター、アルコール被制御プロモーター、テトラサイクリン被制御プロモーター（例えば、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）応答性プロモーター、およびテトラサイクリン抑制タンパク質（ｔｅｔＲ）、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）およびテトラサイクリントランス活性化因子融合タンパク質（ｔＴＡ）などの他のテトラサイクリン応答性プロモーターシステム）、
【００８１】
ステロイド被制御プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体、ヒトエストロゲン受容体、蛾エクジソン受容体に基づいたプロモーター、およびステロイド／レチノイド／甲状腺受容体スーパーファミリーからのプロモーター）、金属被制御プロモーター（例えば、酵母、マウス、およびヒトからのメタロチオネイン（金属イオンに結合、捕捉するタンパク質）由来プロモーター遺伝子）、病態形成被制御プロモーター（例えば、サリチル酸、エチレンまたはベンゾチアジアゾール（ＢＴＨ）に誘発される）、温度／熱誘導可能プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター）、および光被制御プロモーター（例えば、植物細胞からの光応答性プロモーター）などの化学的・生化学的に制御されたおよび物理的に制御されたプロモーターが挙げられる。他の誘導可能プロモーターも本発明に従って使用できる。
【００８２】
本明細書で使用される「コドン」とは、アミノ酸をコードする３つの隣接するヌクレオチドのセットを意味する。いくつかの実施態様では、核酸は、本発明に有用な遺伝子改変酵素の発現を向上させるようにコドンを最適化されている。偏ったコドンの使用とも呼ばれるコドン最適化とは、コードＤＮＡ中の同義のコドンの発生頻度の違いを意味する。
【００８３】
本明細書で使用される「アイソザイム」とは、アミノ酸配列は異なるが、同じ化学反応を触媒するか、または原料から同じ反応生成物を生成する酵素を意味する。
【００８４】
いくつかの実施態様では、本開示の酵素は、エピソームとして発現することがきる。従って、本開示は、本明細書に記載の酵素を発現する核酸を含むベクターの使用を想到する。本明細書で使用される「ベクター」は、異なる遺伝的環境間の輸送または細胞における発現のために、制限または連結により所望の配列が挿入される任意のいくつかの核酸であることができる。ベクターは通常ＤＮＡからなるが、ＲＮＡベクターも利用可能である。本開示に関わるベクターの例としては、限定されることなく、プラスミド、コスミド、ホスミド、ファージミド、ウイルスゲノム、および人工染色体（例えば、ＢＡＣ、ＹＡＣ）が挙げられる。いくつかの実施態様では、本開示の核酸は、組換えクローニングベクター中に提供される。いくつかの実施態様では、核酸変異体が、組換え発現ベクター中に発現される。
【００８５】
本開示のクローニングベクターは、自己複製可能であるかまたは細胞のゲノムに組み込まれる。クローニングベクターは、新しい組換えベクターが細胞中で複製する能力を保持するように、ベクターが決まった様式で切断され、所望のＤＮＡ配列が連結されるエンドヌクレアーゼ制限配列を有する。プラスミドの場合、所望の配列の複製は、プラスミドが細菌などの細胞内でコピー数を増加させるに連れて、多数回起こることも、または細胞が有糸分裂により複製する前に細胞につき１回だけ起こることもできる。
【００８６】
本開示の発現ベクターは、所望のＤＮＡコード配列が、制御配列に作動可能に結合してＲＮＡ転写物として発現することができるように、制限および連結により挿入されたものである。
【００８７】
本発明のベクターは、ベクターで形質転換または形質移入されたまたはされていない細胞の同定に使用するためのマーカー配列をさらに含むことができる。マーカーとしては、例えば、抗生物質または他の化合物に対する耐性または感受性のどちらかを増加または減少するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子）、当該分野で公知の通常の分析法で検出可能な活性を有する酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたはアルカリホスファターゼ）をコードする遺伝子、形質転換または形質移入された細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型に視覚的に影響を与える遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質）が挙げられる。いくつかの実施態様では、本明細書で使用されるベクターは、作動可能に結合したＤＮＡセグメントに存在する構造遺伝子産物の自己複製および発現の能力がある。
【００８８】
本開示に関連する酵素をコードする核酸は、様々なソースから得ることが可能である。当業者は認識しているように、これらの酵素の相同遺伝子は多くの種に存在し、例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）により利用可能となったインテーネットによるブラスト（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）の使用による相同性検索により同定可能である。これらの酵素をコードする核酸は当業者には理解されるように、例えば縮重プライマーを用いて所与の酵素を含有する任意のソース由来のＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により増幅可能である。いくつかの実施態様では、所与の酵素をコードする核酸は合成物であることが可能である。本明細書で説明する酵素をコードする核酸を得るすべての手段が、本開示の側面に適合するものである。
【００８９】
本開示の酵素の発現は、当業者に公知の通常の方法を使用して決定することができる。これらの方法としては、限定されるものではないが、ダイレクトＲＮＡ増幅、ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写、リアルタイムＲＴ-ＰＣＲ、ｃＤＮＡの増幅、ハイブリダイゼーション、および限定されるものではないがウェスタンブロット、免疫組織化学、抗体サンドイッチ法、ＥＬＩＳＡ、および酵素結合免疫スポット法（エリスポット法）などの免疫学に基づいた試験法が挙げられる。例えば、組織または細胞溶解物などのサンプル中の本発明の核酸分子のレベルの存在の決定は、ＰＣＲなどの任意の通常の核酸決定試験、または標識化ハイブリダイゼーションプローブによる試験で行うことが可能である。そのようなハイブリダイゼーション方法としては、限定されるものではないが、マイクロアレイ法が挙げられる。
【００９０】
従って、本開示は、ある側面では、酵素、これらの酵素をコードする核酸、それらの機能的修飾体および変異体が関与する方法、およびそれらに関する使用が含まれる。本明細書に記載の核酸の相同体および対立遺伝子は、従来の方法によって同定可能である（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York参照）。
【００９１】
本開示の側面は、遺伝子改変細胞中における１つ以上の酵素の発現およびその後の細胞溶解に関する。いくつかの実施態様では、１つ以上の酵素は細胞の細胞質中で発現され、必要に応じて溶解に先立って隔離される。いくつかの実施態様では、１つ以上の酵素は、細胞膜周辺腔中で発現され、必要に応じて隔離される。細胞膜周辺腔中での酵素の隔離は当該分野で公知であり、例えば参照により本明細書に取り込まれる国際特許第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３５６３９号が参照される。細胞溶解物を提供するための細胞の溶解にあたって、隔離した酵素はその溶解物または異なる溶解物に存在する１つ以上の基質と自由に反応する。
【００９２】
メタンのバイオ燃料および他の化合物への無細胞生体内変換
本明細書で提供される無細胞生合成システムは、メタンからバイオ燃料または他の化合物（例えば、ピルビン酸）を生成するのに有用である。例えば、第二世代バイオ燃料としての使用に好適な比較的高純度（９９％）のイソブタノールを、本発明に従ってメタンから生成することができる。イソブタノールは、ガソリンの代替物として理想的とするいくつかの性質を有する：そのエネルギー密度はガソリンの密度の９８％である、それは水を容易に吸収しない（エタノールと異なる）、従ってエンジン部品の腐食を回避できる、それはガソリンと任意の比率で混合でき、現行の可燃性のインフラに「ドロップイン」することを可能とする。天然ガス由来イソブタノールは、迅速な商業化のためには、従来のガソリンと混合することが可能であり、またはプロセスの経済性および世界のオイル価格によっては、それをオイル由来燃料を全面的に代替するものとして使用することも可能である。
【００９３】
メタンのホルムアルデヒドへの変換を触媒する酵素としては、限定されることなく、メタンモノオキシゲナーゼ（メタンをメタノールへ触媒する）およびメタノールデヒドロゲナーゼ（メタノールをホルムアルデヒドへ触媒する）が挙げられる。いくつかの実施態様では、メタンモノオキシゲナーゼおよびメタノールデヒドロゲナーゼは、メタン資化菌から得られる１つ以上の細胞溶解物の中に提供される。他の実施態様では、メタンモノオキシゲナーゼは、メタン資化菌から得られる細胞溶解物の中に提供され、一方メタノールデヒドロゲナーゼは、例えば大腸菌などの組換え細菌由来の細胞溶解物中に提供される。本発明は、またメタンモノオキシゲナーゼおよび／またはメタノールデヒドロゲナーゼを、例えば精製または部分的に精製した態様で外因的に提供することも想到するものである。
【００９４】
ホルムアルデヒドのピルビン酸への変換を触媒する酵素としては、限定されることなく、ヘキスロース−６−リン酸シンターゼ、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、トランスケトラーゼ、リボース−５−リン酸イソメラーゼ、リボース−５−リン酸−３−エピメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、エノラーゼ、およびピルビン酸キナーゼが挙げられる。
【００９５】
ピルビン酸のイソブタノールへの変換を触媒する酵素としては、限定されることなく、アセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ、およびイソブタノールデヒドロゲナーゼが挙げられる。
【００９６】
本発明において使用する酵素を、表１に示す。
【表１】
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【００９７】
本明細書で提供されるいずれか１つ以上の酵素は、本発明の無細胞生合成プロセスのいずれか１つ以上の細胞溶解物中で使用することができることを理解されたい。また、本発明は、例えば、基質（例えば、メタン）を生成物（例えば、イソブタノール）または生成物中間体（例えば、ホルムアルデヒドまたはピルビン酸）に変換する酵素の異なる組み合わせをそれぞれ含む１つ以上の細胞溶解物の使用も想到するものである。
【００９８】
本発明によるメタンのイソブタノールへの無細胞変換の生合成経路の一例を図５に示す。本明細書で提供される、メタン資化菌（例えば、Methylococcus capsulatus Bath）などの少なくとも２つの異なる細菌細胞由来の細胞抽出物の組合わせである、無細胞アプローチは、メタンをバイオ燃料に変換するのに必要なすべての酵素を単一の有機体に操作することに関連する問題を極小とする。にもかかわらず、いくつかの実施態様では、単一の有機体を、メタンをバイオ燃料または他の化合物に変換するのに必要なすべての酵素を発現するために使用することができる。
【００９９】
図５に示す例では、Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ細胞およびＥ．ｃｏｌｉ細胞由来の細胞溶解物を使用する。第１の工程であるメタンのメタノールへの変換はメタン資化菌の溶解物中に提供されるメタンモノオキシゲナーゼ（ＭＭＯ）により触媒される。第２の工程であるメタノールのホルムアルデヒドへの変換は、メタン資化菌にネイティブのメタノールデヒドロゲナーゼを代替する、異種（例えば、異なる種由来の）ＮＡＤ関連メタノールデヒドロゲナーゼ（例えば、参照により本明細書に取り込む、Bacillus methanolicus, de Vries GE, et al. 1992 J Bacteriol 174:5346-53）により触媒される。このＮＡＤ関連メタノールデヒドロゲナーゼは、メタンモノオキシゲナーゼに必要なＮＡＤＨ還元体を提供し、メタンをホルムアルデヒドに変換するための電子の消費を正味ゼロとしている。従って、いくつかの実施態様では、本発明の無細胞システムのメタン資化菌は、メタンモノオキシゲナーゼおよび外因性、すなわち組換えＮＡＤ関連メタノールデヒドロゲナーゼを発現することができる。
【０１００】
未変性メタン資化菌代謝において、ホルムアルデヒドは、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼにより更に酸化されてギ酸となり、その後ＣＯ２となり、メタン資化菌細胞機能のためのエネルギーを産生する。これは、無傷メタン資化菌をバイオプロダクションに使用する制約となる。メタン資化菌由来のＭＭＯおよびメタノールデヒドロゲナーゼだけが通常本発明の無細胞プロセスに使用されるので、いくつかの実施態様では、組換え細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中で発現したプロテアーゼにより切断されるようホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼを標的化することにより、メタン資化菌の機能に影響を与えずにこの炭素経路を回避することができる。
【０１０１】
いくつかの実施態様では、本明細書で説明するように、ＮＡＤ関連メタノールデヒドロゲナーゼは、メタン資化菌中ではなく、むしろＥ．ｃｏｌｉなどの他の細菌細胞中で発現される。
【０１０２】
ホルムアルデヒドのイソブタノールへの変換のための図５に示す追加の工程は、他の組換え細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）の抽出物中に提供される酵素により触媒される。２種のリブロースモノリン酸回路酵素であるヘキスロース−６−リン酸シンターゼおよび６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼは、ピルビン酸のイソブタノールへの変換に必要なケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼおよびイソブタノール酸化還元酵素と共に細胞中に過剰発現される。
【０１０３】
ホルムアルデヒドのＣＯ２への更なる酸化を回避することに加えて、ピルビン酸デヒドロゲナーゼをプロテアーゼによる切断に標的化することによりピルビン酸から他の分子への流れを回避するために、プロテアーゼ標的化方法をあるいくつかの実施態様で使用することができる。従って、いくつかの実施態様では、本発明の無細胞システムの組換え細菌は、ヘキスロース−６−リン酸シンターゼ、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ、ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ、およびイソブタノール酸化還元酵素のいずれか１つ以上を発現することができる。いくつかの実施態様では、組換え細菌は、操作されたホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼおよび／またはピルビン酸デヒドロゲナーゼを標的とするプロテアーゼを発現することもできる。いくつかの実施態様では、プロテアーゼは、外因的に追加することができる。
【０１０４】
いくつかの実施態様では、メタンおよび酸素をメタンモノオキシゲナーゼに送達することは、まず気体を水相中へ拡散することにより達成できる。生細胞において横切らなくてはならない細胞壁バリアを除去することにより、本明細書で提供される無細胞プロセスは、物質輸送プロセスを容易化する。ある実施態様では、水相に入る前に気体が混合することを避けるために、気体を反応器に別々に供給し、自然発火に関連する問題を回避する。
【０１０５】
安定な多相システムの一例を図１に示す。この図は、メタンを送達するためおよびイソブタノールが生成と同時に吸収されるのを促進するために使用されるデカン相を含む。メタンの小泡を、無細胞反応器に入る前にデカン相に導入する。メタンは、水にくらべてデカンに対する溶解度がはるかに大きいので、水相に接触するデカン表面が、メタンの水相への拡散を促進する。あるいは、いくつかの実施態様では、メタンガスの一部を水相に直接注入する。
【０１０６】
気／液および液／液界面の形成および安定性、例えばメタン気泡の形成および安定性を評価するために、いくつかの実施態様では図７に示す装置を使用することができる。メタンは、注入ノズルを通過するときに細胞抽出物溶液に注入することができる。最初の高速カメラは、形成した泡のサイズおよび均一性を正確に測定することを可能とする。この液体はその後保持ループ内へ流入し、所定の時間経過後、気泡の安定性を測定するために２番目の高速カメラによりモニターする。いくつかの実施態様では、泡形成後のインキュベーション時間は、保持ループのサイズおよび／または流速を変化することにより調整される。図７に示す装置は、泡サイズおよび安定性への、ノズルのデザインおよび注入圧力の効果ならびに複数のノズルの効果を検討するためにも使用することができる。
【０１０７】
いくつかの実施態様では、脂肪酸および／または界面活性剤を、気液界面の形成および安定化を促進するために使用する。理論に束縛されるものではないが、疎水性の脂肪酸尾部および親水性のカルボキシ酸頭部のため、脂肪酸は気液界面に集まって界面を安定化する。
【０１０８】
いくつかの実施態様では、生成したメタン気泡は直径が３μｍ〜７μｍ未満である。例えば、生成したメタン気泡は、直径が３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、または７μｍ未満であることができる。いくつかの実施態様では、メタン気泡は、初期の泡形成後の一定期間直径が８μｍ〜１２μｍ未満にとどまる。例えば、メタン気泡は、初期の泡形成後少なくとも１、２、３、４または５分間、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１１μｍまたは１２μｍ未満にとどまることができる。
【０１０９】
更に、図７に示す装置を、デカン泡沫中でのメタンの形成および安定性および図１に図示した乳状液の形成を研究するために使用できる。上記したように、界面活性剤を、デカン相中のメタン泡および無細胞反応器の乳状液中のデカン滴を規定する所望の界面の形成および安定化を促進するために使用することができる。
【０１１０】
本発明の無細胞生体内変換プロセスの安全性および生産性を評価するために、いくつかの実施態様では、図８に示す装置を使用することができる。この反応器は、メタンおよび空気の注入速度と圧力を別々に調整することが可能である。これらの容器は、通常作業容積が１０〜１００ｍＬの小型なものであるため、抽出物を節約し安全性リスクを最小限にすることに役立つ。背圧を制御し、温度および溶存酸素をモニターする。冷却／加熱ループは、図８に示す反応器中には示さない。
【０１１１】
そのような反応器は、冷却／加熱用液体の流速および温度上昇（または低下）をモニターすることで熱バランスの計算を可能とするために断熱することができる。更に、原料バランスによりメタンおよび酸素使用速度を得られるように、流入気体流速を記録し、排気質量分析計により排ガス組成物をモニターすることができる。中間体および生成物の蓄積を示すために、液体試料をＨＰＬＣまたは別個の質量分析計により分析することができる。これらの値を熱放出速度の測定値と比較して、性能評価のための信頼度を得ることができる。
【０１１２】
いくつかの実施態様では、図８に示す装置は、気体が混合する可能性に関する安全性の限界の初期評価を得るためにデカン相なしで使用することができる。信頼度が得られ安全性が示されたとき、デカンを単独で導入し乳状液を生成することができる。いくつかの実施態様では、デカン／メタン泡沫を、最終システムを十分に再現するために注入することができる。
【０１１３】
他の実施態様では、図８に示す装置をＭＭＯ活性およびメタン資化菌の増殖を評価するために使用することができる。更に他の実施態様では、性能特性および寿命を向上させる作業条件下において、ＭＭＯ活性および細胞抽出物性能を測定するために、図９に示す多重化反応器システムを使用することができる。
【０１１４】
更に、いくつかの実施態様では、パラフィンまたは他の添加物の補助なしにメタン資化菌を増殖することが経済的に有利でありうる。従って、いくつかの実施態様では、酸素およびメタンを、パラフィンを使用せずに許容可能な増殖速度および細胞蓄積レベルを得るために有機体へ送達することができる。
【０１１５】
本明細書で提供される無細胞生体内変換プロセスは、１ｇ／Ｌ−ｈ以上、５ｇ／Ｌ−ｈ以上、１０ｇ／Ｌ−ｈ以上、１５ｇ／Ｌ−ｈ以上、または２５ｇ／Ｌ−ｈ以上の生成速度でバイオ燃料または他の化合物を生成するために使用することができる。例えば、バイオ燃料または他の化合物は、０．５ｇ／Ｌ−ｈ、１ｇ／Ｌ−ｈ、２ｇ／Ｌ−ｈ、３ｇ／Ｌ−ｈ、４ｇ／Ｌ−ｈ、５ｇ／Ｌ−ｈ、６ｇ／Ｌ−ｈ、７ｇ／Ｌ−ｈ、８ｇ／Ｌ−ｈ、９ｇ／Ｌ−ｈ、１０ｇ／Ｌ−ｈ、１１ｇ／Ｌ−ｈ、１２ｇ／Ｌ−ｈ、１３ｇ／Ｌ−ｈ、１４ｇ／Ｌ−ｈ、１５ｇ／Ｌ−ｈ、１６ｇ／Ｌ−ｈ、１７ｇ／Ｌ−ｈ、１８ｇ／Ｌ−ｈ、１９ｇ／Ｌ−ｈ、２０ｇ／Ｌ−ｈ、２１ｇ／Ｌ−ｈ、２２ｇ／Ｌ−ｈ、２３ｇ／Ｌ−ｈ、２４ｇ／Ｌ−ｈ、２５ｇ／Ｌ−ｈ、またはそれ以上の速度で生成できる。いくつかの実施態様では、バイオ燃料または他の化合物は、１〜５ｇ／Ｌ−ｈ、１〜１０ｇ／Ｌ−ｈ、１〜２５ｇ／Ｌ−ｈ、５〜１０ｇ／Ｌ−ｈ、５〜２５ｇ／Ｌ−ｈ、または１０〜２５ｇ／Ｌ−ｈの速度で生成できる。
【０１１６】
ラージスケールでの生成
本発明のいくつかの側面は、ラージスケール（例えば、１０Ｌを超える反応容積を使用して）でのバイオ燃料（例えば、イソブタノール）または他の化合物生成に関する。本発明より以前は、いくつかの因子が無細胞生体内変換の、例えば工業および／または商業的プロセスへの応用を妨げていた。そのような因子としては、無細胞システム中の酸化還元バランスの制御不能、炭素フラックスの迅速で効率的な制御を可能とする分子生物学的ツールの欠如が挙げられる。本開示は、天然ガス特にメタンを、例えばイソブタノールなどの価値の高い化学品とするプロセスが可能な、完全に制御され個々の目的に適した環境中で様々な微生物由来の酵素の使用を可能とする。
【０１１７】
いくつかの実施態様では、無細胞生体内変換反応は、（例えば、バイオリアクター中）１０Ｌ〜１、０００Ｌの反応容積を使用して行われる。例えば、反応容積は、１０Ｌ〜１００Ｌ、１０Ｌ〜５００Ｌ、１００Ｌ〜５００Ｌ、１００Ｌ〜１０００Ｌ、または５００Ｌ〜１０００Ｌであることができる。
【０１１８】
いくつかの実施態様では、本明細書で提供される無細胞生体内変換プロセスは、週に少なくとも１Ｌのイソブタノールを生成するために使用される。いくつかの実施態様では、本明細書で提供される無細胞生体内変換プロセスは、週に１〜１００メートルトンのイソブタノールを生成するために使用される。例えば、無細胞システムは、週に１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００メートルトンのイソブタノールを生成するために使用される。
【０１１９】
無細胞システムにおける原料の融通性
無細胞システムは、目的物の生成から細胞増殖を完全に分離することが可能である。バイオプロダクションにおいて混合炭素源（例えば、リグノセルロースバイオマスからの混合Ｃ６糖およびＣ５糖としてのグルコースおよびキシロース）を使用するときにおこる典型的な問題として、異化代謝産物抑制、膜輸送、および細胞毒性が挙げられる。無細胞システムはこれらの問題を回避し、これらの安価な糖原料のより効率的な使用を可能とする。プロテアーゼ標的化などの他の技術の使用は、目的の分子炭素骨格としておよびエネルギーおよび還元性等価物の供給源としてのＣ５糖およびＣ６糖の効率的な同時利用を可能とする。
【０１２０】
以下のイソプレン生成の例が挙げられる：（ｉ）混合Ｃ６（グルコース）およびＣ１（メタン）原料および（ｉｉ）Ｃ１（メタン）原料。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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