(57)【要約】本発明の態様は、標的化された様式で遺伝子発現を増加させるための方法に関する。いくつかの実施形態において、標的化された様式でタンパク質および／またはＲＮＡのレベルを転写後に変化させるために有用な方法および組成物が提供される。本明細書中に開示される本発明の態様は、ＲＮＡを分解（例えば、エキソヌクレアーゼ媒介性分解）から保護するために有用な方法および組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される方法は、標的化されたＲＮＡの分解またはプロセシングを減少させるかまたは妨げ、それにより、標的化されたＲＮＡの定常状態レベルを上昇させる工程を含む。
2016528897.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞において遺伝子発現を増加させる方法であって、該方法は、
一般式５’−Ｘ１−Ｘ２−３’を含むオリゴヌクレオチドを細胞に送達する工程を含み、式中、Ｘ１は、該遺伝子によってコードされるＲＮＡ転写物の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を有する５〜２０ヌクレオチドを含み、Ｘ１の該相補性領域の３’末端におけるヌクレオチドは、該ＲＮＡ転写物の転写開始部位におけるヌクレオチドと相補的であり；Ｘ２は、１〜２０ヌクレオチドを含む、方法。
【請求項２】
前記ＲＮＡ転写物が、その５’末端に７−メチルグアノシンキャップを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡ転写物が、７−メチルグアノシンキャップを有し、Ｘ１の前記相補性領域の３’末端におけるヌクレオチドが、該７−メチルグアノシンキャップに対してすぐ内側に存在する該ＲＮＡ転写物のヌクレオチドと相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｘ２の５’末端における少なくとも１番目のヌクレオチドが、グアニンと相補的なピリミジンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｘ２の５’末端における２番目のヌクレオチドが、グアニンと相補的なピリミジンである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
Ｘ２が、式５’−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−３’を含み、ここで、Ｘ２は、Ｙ２のヌクレオチドを含むループ領域およびＹ３の少なくとも２個連続したヌクレオチドとハイブリダイズしたＹ１の少なくとも２個連続したヌクレオチドを含むステム領域を有するステムループ構造を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｙ１、Ｙ２およびＹ３が、独立して、１〜１０個のヌクレオチドを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｙ３が、前記ステム領域の３’末端のすぐ後ろの位置に、グアニンと相補的なピリミジンを含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
グアニンと相補的な前記ピリミジンが、シトシンである、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
Ｘ２が、Ｘ１の相補性領域と相補的なＲＮＡ転写物の領域と重複しない該ＲＮＡ転写物の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
Ｘ２の前記相補性領域が、前記ＲＮＡ転写物のポリアデニル化ジャンクションの１００ヌクレオチド以内に存在する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｘ２の前記相補性領域が、前記ＲＮＡ転写物のポリアデニル化ジャンクションとすぐ隣接しているかまたは重複している該ＲＮＡ転写物と相補的である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｘ２が、前記ＲＮＡ転写物のポリ（Ａ）テイルのアデニンヌクレオチドと相補的な少なくとも２個連続したピリミジンヌクレオチドをさらに含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＲＮＡ転写物が、ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ、ｍｉＲＮＡもしくはｓｎｏＲＮＡまたは他の任意の好適なＲＮＡである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＲＮＡ転写物が、ｍＲＮＡ転写物であり、Ｘ２が、該転写物の３’−ＵＴＲにおける少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＲＮＡ転写物が、ｍＲＮＡであり、送達により、該ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルが上昇する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルの上昇が、前記オリゴヌクレオチドが送達されていなかった適切なコントロール細胞と比べて少なくとも５０％の上昇である、請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＲＮＡ転写物が、ＡＢＣＡ１、ＡＰＯＡ１、ＡＴＰ２Ａ２、ＢＤＮＦ、ＦＸＮ、ＨＢＡ２、ＨＢＢ、ＨＢＤ、ＨＢＥ１、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、ＳＭＮ、ＵＴＲＮ、ＰＴＥＮ、ＭＥＣＰ２およびＦＯＸＰ３からなる群より選択される遺伝子から発現されるｍＲＮＡである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
Ｘ１が、配列５’−ＣＧＣＣＣＴＣＣＡＧ−３’を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
Ｘ２が、配列ＣＣを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｘ２が、配列５’−ＣＣＡＡＡＧＧＴＣ−３’を含む、任意の前述の請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチドが、配列５’−ＣＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＣＡＡＡＧＧＴＣ−３’を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＲＮＡ転写物が、ＡＢＣＡ４、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＧ５、ＡＢＣＧ８、ＡＤＩＰＯＱ、ＡＬＢ、ＡＰＯＥ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＲＣＡ１、ＣＤ２７４、ＣＥＰ２９０、ＣＦＴＲ、ＥＰＯ、Ｆ７、Ｆ８、ＦＬＩ１、ＦＭＲ１、ＦＮＤＣ５、ＧＣＨ１、ＧＣＫ、ＧＬＰ１Ｒ、ＧＲＮ、ＨＡＭＰ、ＨＰＲＴ１、ＩＤＯ１、ＩＧＦ１、ＩＬ１０、ＩＬ６、ＫＣＮＭＡ１、ＫＣＮＭＢ１、ＫＣＮＭＢ２、ＫＣＮＭＢ３、ＫＣＮＭＢ４、ＫＬＦ１、ＫＬＦ４、ＬＤＬＲ、ＭＳＸ２、ＭＹＢＰＣ３、ＮＡＮＯＧ、ＮＦ１、ＮＫＸ２−１、ＮＫＸ２−１−ＡＳ１、ＰＡＨ、ＰＴＧＳ２、ＲＢ１、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１９、ＳＣＡＲＢ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ６、ＳＭＡＤ７、ＳＴ７、ＳＴＡＴ３、ＴＳＩＸおよびＸＩＳＴからなる群より選択される遺伝子から発現されるｍＲＮＡである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
細胞において遺伝子発現を増加させる方法であって、該方法は、該遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ転写物の５’−ＵＴＲの少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な第１の領域、および該ｍＲＮＡ転写物の３’−ＵＴＲの、ポリ（Ａ）テイルの、またはポリアデニル化ジャンクションと重複している、少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な第２の領域を有する１０〜５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを細胞に送達する工程を含む、方法。
【請求項２５】
前記５’−ＵＴＲの少なくとも５個連続したヌクレオチドの１番目が、前記ｍＲＮＡ転写物の５’−メチルグアノシンキャップの１０ヌクレオチド以内に存在する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２の領域が、前記ポリアデニル化ジャンクションと重複している少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的である、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１の領域の５’末端を前記第２の領域の３’末端と連結する２〜２０ヌクレオチドをさらに含む、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の領域の３’末端を前記第２の領域の５’末端と連結する２〜２０ヌクレオチドをさらに含む、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記オリゴヌクレオチドが、１０〜５０ヌクレオチド長である、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記オリゴヌクレオチドが、９〜２０ヌクレオチド長である、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
細胞において遺伝子発現を増加させる方法であって、該方法は、一般式５’−Ｘ１−Ｘ２−３’を含むオリゴヌクレオチドを細胞に送達する工程を含み、式中、Ｘ１は、アデニンと塩基対を形成する２〜２０個のピリミジンヌクレオチドを含み；Ｘ２は、該遺伝子によってコードされるポリアデニル化されたＲＮＡ転写物の少なくとも３個連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を含み、Ｘ２の相補性領域の５’末端におけるヌクレオチドは、該ＲＮＡ転写物のポリアデニル化ジャンクションに対してすぐ内側に存在する該ＲＮＡ転写物のヌクレオチドと相補的である、方法。
【請求項３２】
Ｘ１が、２〜２０個のチミジンまたはウリジンを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１つのヌクレオチドが、２’Ｏ−メチルを含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのリボヌクレオチド、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド、少なくとも１つの２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドまたは少なくとも１つの架橋ヌクレオチドを含む、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記架橋ヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチドまたはＥＮＡ修飾ヌクレオチドである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチドである、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドと２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドまたは架橋ヌクレオチドとが交互になっているものを含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
前記オリゴヌクレオチドが、ミックスマーである、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記オリゴヌクレオチドが、モルホリノである、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞が、インビトロにおけるものである、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞が、インビボにおけるものである、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
細胞において遺伝子発現を増加させる方法であって、該方法は、該遺伝子のＲＮＡ転写物を発現している細胞に、８〜５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを送達する工程を含み、該オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ転写物の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を含み、該相補性領域の３’末端におけるヌクレオチドは、該ＲＮＡ転写物の転写開始部位の１０ヌクレオチド以内のヌクレオチドと相補的であり、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合または少なくとも１つの架橋ヌクレオチドによって連結されたヌクレオチドを含む、方法。
【請求項４５】
細胞において遺伝子発現を増加させる方法であって、該方法は、該遺伝子のＲＮＡ転写物を発現している細胞に、２つの相補性領域を含むオリゴヌクレオチドを送達する工程を含み、該２つの相補性領域の各々は、ＲＮＡ転写物の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的であり、第１の相補性領域の３’末端におけるヌクレオチドは、該ＲＮＡ転写物の転写開始部位の１００ヌクレオチド以内のヌクレオチドと相補的であり、第２の相補性領域は、該ＲＮＡ転写物の３’末端の３００ヌクレオチド以内で終わる該ＲＮＡ転写物の領域と相補的である、方法。
【請求項４６】
細胞においてＲＮＡ転写物の安定性を高める方法であって、該方法は、該ＲＮＡ転写物の５’領域を標的化する第１の安定化オリゴヌクレオチドおよび該ＲＮＡ転写物の３’領域を標的化する第２の安定化オリゴヌクレオチドを該細胞に送達する工程を含む、方法。
【請求項４７】
前記第１の安定化オリゴヌクレオチドが、前記第２の安定化オリゴヌクレオチドと共有結合的に連結されている、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記第１の安定化オリゴヌクレオチドが、前記ＲＮＡ転写物の５’末端における１番目に転写されたヌクレオチドの１０ヌクレオチド以内の位置における該ＲＮＡ転写物と相補的な相補性領域を含む、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＲＮＡ転写物が、５’−メチルグアノシンキャップを含み、前記第１の安定化オリゴヌクレオチドが、該５’−メチルグアノシンキャップに対してすぐ内側のヌクレオチドの１０ヌクレオチド以内の位置における該ＲＮＡ転写物と相補的な相補性領域を含む、請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記第２の安定化オリゴヌクレオチドが、前記ＲＮＡ転写物の３’末端の２５０ヌクレオチド以内の位置における該ＲＮＡ転写物と相補的な相補性領域を含む、請求項４６〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＲＮＡ転写物が、３’−ポリ（Ａ）テイルを含み、前記第２の安定化オリゴヌクレオチドが、該ＲＮＡ転写物のポリアデニル化ジャンクションの１００ヌクレオチド以内の位置における該ＲＮＡ転写物と相補的な相補性領域を含む、請求項４６〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記第２の安定化オリゴヌクレオチドの相補性領域が、前記ＲＮＡ転写物のポリアデニル化ジャンクションとすぐ隣接しているかまたは重複している、請求項４６〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
細胞においてＲＮＡ転写物の安定性を高める方法であって、該方法は、該ＲＮＡ転写物を標的化する請求項６４〜１０４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを、該ＲＮＡ転写物を発現する細胞に送達し、それにより、該ＲＮＡ転写物の安定性を高める工程を含む、方法。
【請求項５４】
前記細胞が、インビトロにおけるものである、請求項４６〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞が、インビボにおけるものである、請求項４６〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
被験体における低レベルのＲＮＡ転写物に関連する状態または疾患を処置する方法であって、該方法は、請求項６４〜１０４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを該被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項５７】
前記ＲＮＡ転写物が、ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、細胞外のＲＮＡまたは他の任意の好適なＲＮＡである、請求項４６〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＲＮＡ転写物が、ｍＲＮＡである、請求項４６〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＲＮＡ転写物が、長い非コードＲＮＡである、請求項４６〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＲＮＡ転写物が、ＡＢＣＡ１、ＡＰＯＡ１、ＡＴＰ２Ａ２、ＢＤＮＦ、ＦＸＮ、ＨＢＡ２、ＨＢＢ、ＨＢＤ、ＨＢＥ１、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、ＳＭＮ、ＵＴＲＮ、ＰＴＥＮ、ＭＥＣＰ２およびＦＯＸＰ３からなる群より選択される遺伝子から発現されるｍＲＮＡである、請求項４６〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＲＮＡ転写物が、ＡＢＣＡ４、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＧ５、ＡＢＣＧ８、ＡＤＩＰＯＱ、ＡＬＢ、ＡＰＯＥ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＲＣＡ１、ＣＤ２７４、ＣＥＰ２９０、ＣＦＴＲ、ＥＰＯ、Ｆ７、Ｆ８、ＦＬＩ１、ＦＭＲ１、ＦＮＤＣ５、ＧＣＨ１、ＧＣＫ、ＧＬＰ１Ｒ、ＧＲＮ、ＨＡＭＰ、ＨＰＲＴ１、ＩＤＯ１、ＩＧＦ１、ＩＬ１０、ＩＬ６、ＫＣＮＭＡ１、ＫＣＮＭＢ１、ＫＣＮＭＢ２、ＫＣＮＭＢ３、ＫＣＮＭＢ４、ＫＬＦ１、ＫＬＦ４、ＬＤＬＲ、ＭＳＸ２、ＭＹＢＰＣ３、ＮＡＮＯＧ、ＮＦ１、ＮＫＸ２−１、ＮＫＸ２−１−ＡＳ１、ＰＡＨ、ＰＴＧＳ２、ＲＢ１、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１９、ＳＣＡＲＢ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ６、ＳＭＡＤ７、ＳＴ７、ＳＴＡＴ３、ＴＳＩＸおよびＸＩＳＴからなる群より選択される遺伝子から発現されるｍＲＮＡである、請求項４６〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
８〜５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ転写物の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を含み、該相補性領域の３’末端におけるヌクレオチドは、該ＲＮＡ転写物の転写開始部位の１０ヌクレオチド以内のヌクレオチドと相補的であり、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合または少なくとも１つの架橋ヌクレオチドによって連結されたヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項６３】
２つの相補性領域を含むオリゴヌクレオチドであって、該２つの相補性領域の各々は、ＲＮＡ転写物の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的であり、第１の相補性領域の３’末端におけるヌクレオチドは、該ＲＮＡ転写物の転写開始部位の１００ヌクレオチド以内のヌクレオチドと相補的であり、第２の相補性領域は、該ＲＮＡ転写物の３’末端の３００ヌクレオチド以内で終わる該ＲＮＡ転写物の領域と相補的である、オリゴヌクレオチド。
【請求項６４】
一般式５’−Ｘ１−Ｘ２−３’を含むオリゴヌクレオチドであって、式中、
Ｘ１は、ＲＮＡ転写物の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を有する５〜２０ヌクレオチドを含み、Ｘ１の相補性領域の３’末端におけるヌクレオチドは、該ＲＮＡ転写物の転写開始部位におけるヌクレオチドと相補的であり；Ｘ２は、１〜２０ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項６５】
前記ＲＮＡ転写物が、その５’末端に７−メチルグアノシンキャップを有する、請求項６２〜６４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６６】
前記ＲＮＡ転写物が、７−メチルグアノシンキャップを有し、Ｘ１の相補性領域の３’末端におけるヌクレオチドは、該７−メチルグアノシンキャップに対してすぐ内側に存在する該ＲＮＡ転写物のヌクレオチドと相補的である、請求項６４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６７】
Ｘ２の５’末端における少なくとも１番目のヌクレオチドが、グアニンと相補的なピリミジンである、請求項６４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６８】
Ｘ２の５’末端における２番目のヌクレオチドが、グアニンと相補的なピリミジンである、請求項６７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６９】
Ｘ２が、式５’−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−３’を含み、ここで、Ｘ２は、Ｙ２のヌクレオチドを含むループ領域およびＹ３の少なくとも２個連続したヌクレオチドとハイブリダイズしたＹ１の少なくとも２個連続したヌクレオチドを含むステム領域を有するステムループ構造を形成する、請求項６４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７０】
Ｙ１、Ｙ２およびＹ３が、独立して、１〜１０個のヌクレオチドを含む、請求項６９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７１】
Ｙ３が、前記ステム領域の３’末端のすぐ後ろの位置に、グアニンと相補的なピリミジンを含む、請求項６９または７０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７２】
グアニンと相補的な前記ピリミジンが、シトシンである、請求項６７〜７１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７３】
Ｘ２が、Ｘ１の相補性領域と相補的なＲＮＡ転写物の領域と重複しない該ＲＮＡ転写物の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を含む、請求項６４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７４】
Ｘ２の前記相補性領域が、前記ＲＮＡ転写物のポリアデニル化ジャンクションの１００ヌクレオチド以内に存在する、請求項７３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７５】
Ｘ２の前記相補性領域が、前記ＲＮＡ転写物のポリアデニル化ジャンクションとすぐ隣接しているかまたは重複している該ＲＮＡ転写物と相補的である、請求項７４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７６】
Ｘ２が、前記ＲＮＡ転写物のポリ（Ａ）テイルのアデニンヌクレオチドと相補的な少なくとも２個連続したピリミジンヌクレオチドをさらに含む、請求項７４または７５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７７】
前記ＲＮＡ転写物が、ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ、ｍｉＲＮＡもしくはｓｎｏＲＮＡまたは他の任意の好適なＲＮＡである、請求項６２〜７６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７８】
前記ＲＮＡ転写物が、ｍＲＮＡ転写物であり、Ｘ２が、該転写物の３’−ＵＴＲにおける少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を含む、請求項６４〜７７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７９】
前記ＲＮＡ転写物が、ＡＢＣＡ１、ＡＰＯＡ１、ＡＴＰ２Ａ２、ＢＤＮＦ、ＦＸＮ、ＨＢＡ２、ＨＢＢ、ＨＢＤ、ＨＢＥ１、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、ＳＭＮ、ＵＴＲＮ、ＰＴＥＮ、ＭＥＣＰ２およびＦＯＸＰ３からなる群より選択される遺伝子から発現されるｍＲＮＡである、請求項６２〜７８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８０】
Ｘ１が、配列５’−ＣＧＣＣＣＴＣＣＡＧ−３’を含む、請求項６４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８１】
Ｘ２が、配列ＣＣを含む、請求項７９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８２】
Ｘ２が、配列５’−ＣＣＡＡＡＧＧＴＣ−３’を含む、任意の前述の請求項７９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８３】
前記オリゴヌクレオチドが、配列５’−ＣＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＣＡＡＡＧＧＴＣ−３’を含む、請求項６４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８４】
前記ＲＮＡ転写物が、ＡＢＣＡ４、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＧ５、ＡＢＣＧ８、ＡＤＩＰＯＱ、ＡＬＢ、ＡＰＯＥ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＲＣＡ１、ＣＤ２７４、ＣＥＰ２９０、ＣＦＴＲ、ＥＰＯ、Ｆ７、Ｆ８、ＦＬＩ１、ＦＭＲ１、ＦＮＤＣ５、ＧＣＨ１、ＧＣＫ、ＧＬＰ１Ｒ、ＧＲＮ、ＨＡＭＰ、ＨＰＲＴ１、ＩＤＯ１、ＩＧＦ１、ＩＬ１０、ＩＬ６、ＫＣＮＭＡ１、ＫＣＮＭＢ１、ＫＣＮＭＢ２、ＫＣＮＭＢ３、ＫＣＮＭＢ４、ＫＬＦ１、ＫＬＦ４、ＬＤＬＲ、ＭＳＸ２、ＭＹＢＰＣ３、ＮＡＮＯＧ、ＮＦ１、ＮＫＸ２−１、ＮＫＸ２−１−ＡＳ１、ＰＡＨ、ＰＴＧＳ２、ＲＢ１、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１９、ＳＣＡＲＢ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ６、ＳＭＡＤ７、ＳＴ７、ＳＴＡＴ３、ＴＳＩＸおよびＸＩＳＴからなる群より選択される遺伝子から発現されるｍＲＮＡである、請求項６２〜７８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８５】
ｍＲＮＡ転写物の５’−ＵＴＲの少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な第１の領域、および該ｍＲＮＡ転写物の３’−ＵＴＲの、ポリ（Ａ）テイルの、またはポリアデニル化ジャンクションと重複している、少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な第２の領域を有する１０〜５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド。
【請求項８６】
前記５’−ＵＴＲの少なくとも５個連続したヌクレオチドの１番目が、前記ｍＲＮＡ転写物の５’−メチルグアノシンキャップの１０ヌクレオチド以内に存在する、請求項８５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８７】
前記第２の領域が、前記ポリアデニル化ジャンクションと重複している少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的である、請求項８５または８６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８８】
前記第１の領域の５’末端を前記第２の領域の３’末端と連結する２〜２０ヌクレオチドをさらに含む、請求項８５〜８７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８９】
前記第１の領域の３’末端を前記第２の領域の５’末端と連結する２〜２０ヌクレオチドをさらに含む、請求項８５〜８７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９０】
前記オリゴヌクレオチドが、１０〜５０ヌクレオチド長である、請求項８５〜８７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９１】
前記オリゴヌクレオチドが、９〜２０ヌクレオチド長である、請求項８５〜８７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９２】
一般式５’−Ｘ１−Ｘ２−３’を含むオリゴヌクレオチドであって、式中、
Ｘ１は、アデニンと塩基対を形成する２〜２０個のピリミジンヌクレオチドを含み；Ｘ２は、ポリアデニル化されたＲＮＡ転写物の少なくとも３個連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を含み、Ｘ２の相補性領域の５’末端におけるヌクレオチドは、該ＲＮＡ転写物のポリアデニル化ジャンクションに対してすぐ内側に存在する該ＲＮＡ転写物のヌクレオチドと相補的である、オリゴヌクレオチド。
【請求項９３】
Ｘ１が、２〜２０個のチミジンまたはウリジンを含む、請求項８０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９４】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む、請求項６２〜９３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９５】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項６２〜９３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９６】
少なくとも１つのヌクレオチドが、２’Ｏ−メチルを含む、請求項６２〜９５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９７】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのリボヌクレオチド、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド、少なくとも１つの２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドまたは少なくとも１つの架橋ヌクレオチドを含む、請求項６２〜９３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９８】
前記架橋ヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチドまたはＥＮＡ修飾ヌクレオチドである、請求項９７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９９】
前記オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチドである、請求項６４〜９８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１００】
前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドと２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドまたは架橋ヌクレオチドとが交互になっているものを含む、請求項６４〜９９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０１】
前記オリゴヌクレオチドが、ミックスマーである、請求項６４〜９４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０２】
前記オリゴヌクレオチドが、モルホリノである、請求項６４〜９４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０３】
表３、７、８または９に示されているようなヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１０４】
表３、７、８または９に示されているようなヌクレオチド配列の少なくとも８ヌクレオチドのフラグメントを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１０５】
ヌクレオシド間結合を介して連結された５〜２５個のヌクレオチドを有する第１のオリゴヌクレオチドおよびヌクレオシド間結合を介して連結された５〜２５個のヌクレオチドを有する第２のオリゴヌクレオチドを含む組成物であって、ここで、該第１のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ転写物の５’末端の１００ヌクレオチド以内の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的であり、該第２のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ転写物の３’末端の１００ヌクレオチド以内の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的である、組成物。
【請求項１０６】
前記第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドとが、前記ＲＮＡ転写物と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドではないリンカーによってつなげられている、請求項１０５に記載の組成物。
【請求項１０７】
前記リンカーが、オリゴヌクレオチドである、請求項１０６に記載の組成物。
【請求項１０８】
前記リンカーが、ポリペプチドである、請求項１０６に記載の組成物。
【請求項１０９】
複数のオリゴヌクレオチドを含む組成物であって、ここで、該オリゴヌクレオチドの少なくとも７５％の各々は、請求項６４〜１０４のいずれか１項から選択されるオリゴヌクレオチドである、組成物。
【請求項１１０】
前記オリゴヌクレオチドが、一価カチオンと複合体を形成している、請求項１０９に記載の組成物。
【請求項１１１】
前記オリゴヌクレオチドが、凍結乾燥された形態で存在する、請求項１０９または１１０に記載の組成物。
【請求項１１２】
前記オリゴヌクレオチドが、水溶液で存在する、請求項１０９または１１０に記載の組成物。
【請求項１１３】
請求項６４〜１０４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドおよびキャリアを含む組成物。
【請求項１１４】
請求項６４〜１０４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを緩衝液中に含む組成物。
【請求項１１５】
キャリアに結合体化された請求項６４〜１０４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む組成物。
【請求項１１６】
前記キャリアが、ペプチドである、請求項１１５に記載の組成物。
【請求項１１７】
前記キャリアが、ステロイドである、請求項１１５に記載の組成物。
【請求項１１８】
請求項６４〜１０４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物。
【請求項１１９】
請求項１０９〜１１８のいずれか１項に記載の組成物が収容されている容器を備えるキット。
【請求項１２０】
細胞においてタンパク質の発現を増加させるための方法であって、該方法は、該タンパク質をコードする環状化した合成ＲＮＡを細胞に送達する工程を含み、該細胞における該タンパク質の合成は、該細胞への該環状化した合成ＲＮＡの送達後に増加する、方法。
【請求項１２１】
前記環状化した合成ＲＮＡが、１つまたはそれを超える修飾ヌクレオチドを含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
合成ＲＮＡを安定化する方法であって、該方法は、該合成ＲＮＡの５’領域を標的化する第１の安定化オリゴヌクレオチドおよび該合成ＲＮＡの３’領域を標的化する第２の安定化オリゴヌクレオチドと該合成ＲＮＡを、該第１の安定化オリゴヌクレオチドおよび第２の安定化オリゴヌクレオチドが該合成ＲＮＡ上の標的配列とハイブリダイズする条件下で接触させる工程を含み、該合成ＲＮＡが、該第１および第２の安定化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたとき、環状化した生成物を形成することができるように、該第１の安定化オリゴヌクレオチドは、該第２の安定化オリゴヌクレオチドと共有結合的に連結されている、方法。
【請求項１２３】
前記合成ＲＮＡを、前記第１および第２の安定化オリゴヌクレオチドと細胞の外側で接触させる、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
細胞に合成ＲＮＡを送達する方法であって、該方法は、
該合成ＲＮＡの５’領域を標的化する第１の安定化オリゴヌクレオチドおよび該合成ＲＮＡの３’領域を標的化する第２の安定化オリゴヌクレオチドと該合成ＲＮＡを、該第１の安定化オリゴヌクレオチドおよび第２の安定化オリゴヌクレオチドが該合成ＲＮＡ上の標的配列とハイブリダイズする条件下で接触させる工程であって、該合成ＲＮＡが、該第１および第２の安定化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたとき、環状化した生成物を形成することができるように、該第１の安定化オリゴヌクレオチドは、該第２の安定化オリゴヌクレオチドと共有結合的に連結されている、工程；および
該環状化した生成物を該細胞に送達する工程
を含む、方法。
【請求項１２５】
前記第１の安定化オリゴヌクレオチドと第２の安定化オリゴヌクレオチドとが、ヌクレオシド間結合を介して共有結合的に連結されている、請求項１２２〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記第１の安定化オリゴヌクレオチドと第２の安定化オリゴヌクレオチドとが、オリゴヌクレオチドを介して共有結合的に連結されている、請求項１２４または１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記第１の安定化オリゴヌクレオチドと第２の安定化オリゴヌクレオチドとが、本明細書中に開示される任意の適切なリンカーを介して共有結合的に連結されている、請求項１２６に記載の組成物。
【請求項１２８】
前記第１の安定化オリゴヌクレオチドが、前記合成ＲＮＡの５’末端における１番目のヌクレオチドの１０ヌクレオチド以内の位置における該合成ＲＮＡと相補的な相補性領域を含む、請求項１２２〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記合成ＲＮＡが、５’−メチルグアノシンキャップを含み、前記第１の安定化オリゴヌクレオチドが、該５’−メチルグアノシンキャップに対してすぐ内側のヌクレオチドの１０ヌクレオチド以内の位置における該合成ＲＮＡと相補的な相補性領域を含む、請求項１２２〜１２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記第２の安定化オリゴヌクレオチドが、前記合成ＲＮＡの３’末端の２５０ヌクレオチド以内の位置における該合成ＲＮＡと相補的な相補性領域を含む、請求項１２２〜１２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記合成ＲＮＡが、３’−ポリ（Ａ）テイルを含み、前記第２の安定化オリゴヌクレオチドが、該合成ＲＮＡのポリアデニル化ジャンクションの１００ヌクレオチド以内の位置における該合成ＲＮＡと相補的な相補性領域を含む、請求項１２２〜１３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記第２の安定化オリゴヌクレオチドの相補性領域が、前記合成ＲＮＡのポリアデニル化ジャンクションとすぐ隣接しているかまたは重複している、請求項１２２〜１３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記合成ＲＮＡが、１つまたはそれを超える修飾ヌクレオチドを含む、請求項１２０〜１３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記１つまたはそれを超える修飾ヌクレオチドが、２’−アミノ−２’−デオキシヌクレオチド、２’−アジド−２’−デオキシヌクレオチド、２’−フルオロ−２’−デオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル−ヌクレオチド、２’糖超修飾剤、２’−修飾熱安定性向上剤、２’−フルオロ−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸、２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、２’−フルオロ−２’−デオキシグアノシン−５’−三リン酸、２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸、２’−Ｏ−メチルアデノシン−５’−三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン−５’−三リン酸、２’−Ｏ−メチルグアノシン−５’−三リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン−５’−三リン酸、シュードウリジン−５’−三リン酸、２’−Ｏ−メチルイノシン−５’−三リン酸、２’−アミノ−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸、２’−アジド−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、２’−アジド−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸、２’−Ｏ−メチルシュードウリジン−５’−三リン酸、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン−５’−三リン酸、２’−アジド−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸、２’−アミノ−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸、２’−フルオロ−チミジン−５’−三リン酸、２’−アジド−２’−デオキシグアノシン−５’−三リン酸、２’−アミノ−２’−デオキシグアノシン−５’−三リン酸およびＮ４−メチルシチジン−５’−三リン酸からなる群より選択される、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
１つまたはそれを超える修飾ヌクレオチドを含む環状化した合成ＲＮＡ。
【請求項１３６】
合成ＲＮＡの５’領域とハイブリダイズされる第１の安定化オリゴヌクレオチド、および
該合成の３’領域とハイブリダイズされる第２の安定化オリゴヌクレオチドを含み、該第１の安定化オリゴヌクレオチドは、該第２の安定化オリゴヌクレオチドと共有結合的に連結され、該合成ＲＮＡとともに、環状化した生成物を形成する、請求項１３５に記載の環状化した合成ＲＮＡ。
【請求項１３７】
請求項１３５または１３６に記載の環状化した合成ＲＮＡおよび薬学的に許容され得るキャリアまたは賦形剤を含む薬学的組成物。
【請求項１３８】
請求項１３５または１３６に記載の環状化した合成ＲＮＡ、ならびにナノ粒子、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リピドイド、リポプレックス、リポソーム、ポリマー、炭水化物（単糖類を含む）、カチオン性脂質、フィブリンゲル、フィブリンヒドロゲル、フィブリン糊、フィブリンシーラント、フィブリノゲン、トロンビンおよび迅速に排除される脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ）のうちの１つまたはそれを超えるものを含む組成物。
【請求項１３９】
前記環状化した合成ＲＮＡが、ＧａｌＮａｃなどの炭水化物または他の標的化部分に結合体化される、請求項１３５に記載の環状化した合成ＲＮＡ。
【請求項１４０】
前記第１または第２の安定化オリゴヌクレオチドが、ＧａｌＮａｃなどの炭水化物または他の標的化部分に結合体化される、請求項１３５に記載の環状化した合成ＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法§１１９（ｅ）のもと、「ＲＮＡ安定性を調節するための組成物および方法」という名称であり、２０１４年６月１０日に出願された米国仮出願第６２／０１０，４１７号、「ＲＮＡ安定性を調節するための組成物および方法」という名称であり、２０１３年１０月３１日に出願された米国仮出願第６１／８９８，４６１号および「ＲＮＡ安定性を調節するための組成物および方法」という名称であり、２０１３年８月１６日に出願された米国仮出願第６１／８６６，９８９号の利益を請求する。その各々の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、オリゴヌクレオチドに基づく組成物、ならびに核酸を調節するためにオリゴヌクレオチドに基づく組成物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ヒトの疾患のかなりの部分は、疾患に関連する転写単位（非コードＲＮＡ、タンパク質をコードするＲＮＡまたは他の制御性のコードゲノム領域もしくは非コードゲノム領域）のタンパク質レベルおよび／またはＲＮＡレベルを選択的に変化させることによって処置され得る。遺伝子の発現を阻害するための方法は、当該分野で公知であり、その方法としては、例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉ、およびｍｉＲＮＡによって媒介されるアプローチが挙げられる。そのような方法は、ｍＲＮＡの翻訳を阻止する工程または標的ＲＮＡの分解を引き起こす工程を含み得る。しかしながら、遺伝子の発現を増加させるために利用可能なアプローチは限られている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の要旨
本明細書中に開示される本発明の態様は、核酸を調節するために有用な方法および組成物に関する。いくつかの実施形態において、本明細書中に提供される方法および組成物は、分解（例えば、エキソヌクレアーゼ媒介性分解）からＲＮＡ（例えば、ＲＮＡ転写物）を保護するために有用である。いくつかの実施形態において、保護されるＲＮＡは、細胞の外側に存在する。いくつかの実施形態において、保護されるＲＮＡは、細胞の中に存在する。いくつかの実施形態において、標的化された様式でタンパク質および／またはＲＮＡのレベルを転写後に変化させるために有用な方法および組成物が提供される。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される方法は、標的化されたＲＮＡの分解またはプロセシングを減少させるかまたは妨げ、それにより、標的化されたＲＮＡの定常状態レベルを上昇させる工程を含む。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される方法は、標的化されたＲＮＡの翻訳を増加させるかまたはその転写を増加させ、それにより、標的化された様式でＲＮＡのレベルおよび／またはタンパク質のレベルを上昇させる工程も含み得るか、またはその工程を代替的に含み得る。
【０００５】
本発明の態様は、ある特定のＲＮＡ分解がエキソヌクレアーゼによって媒介されるという認識に関する。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼは、ＲＮＡをその３’末端および／または５’末端から破壊し得る。理論に拘束されることを望むものではないが、いくつかの実施形態において、ＲＮＡの一方または両方の末端は、その一方もしくは両方の末端または末端付近においてそのＲＮＡとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（オリゴ）とそのＲＮＡを接触させ、それにより、そのＲＮＡの安定性および／またはレベルを高めることによって、エキソヌクレアーゼ酵素活性から保護され得ると考えられる。本明細書中に開示されるように、一方もしくは両方の末端または末端付近においてＲＮＡを標的化することによってそのＲＮＡの安定性および／またはレベルを高めることができることは、そのＲＮＡを内部切断によって破壊することができるエンドヌクレアーゼが（例えば、細胞内に）存在するという部分的な理由から、驚くべきことである。さらに、いくつかの実施形態において、５’標的化オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡの安定化またはＲＮＡレベルの上昇において、単独で（例えば、３’標的化オリゴヌクレオチドと組み合わせせずに、または偽環状化（ｐｓｅｕｄｏｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）オリゴヌクレオチドの状況において）有効であることは、驚くべきことである。なぜなら、細胞内には、例えば、３’末端をプロセシングするエキソヌクレアーゼが主要であり得る（例えば、５’末端をプロセシングするエキソヌクレアーゼと比べて）からである。しかしながら、いくつかの実施形態において、３’標的化オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡを安定化するために、５’標的化オリゴヌクレオチドと組み合わせて使用されるか、または単独で使用される。
【０００６】
標的化されるＲＮＡがタンパク質をコードするいくつかの実施形態において、そのＲＮＡの定常状態レベルの上昇は、コードされたタンパク質のレベルの上昇を同時にもたらす。したがって、いくつかの実施形態において、細胞に送達されたときに標的ＲＮＡのタンパク質レベルを上昇させるオリゴヌクレオチド（５’−標的化オリゴヌクレオチド、３’−標的化オリゴヌクレオチドおよび偽環状化オリゴヌクレオチドを含む）が本明細書中に提供される。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡレベルが上昇するだけでなく、結果として生じる翻訳産物も増加することは注目すべきことである。いくつかの実施形態において、翻訳が生じる場合、翻訳を促進するために、リボソーム機構がＲＮＡのある特定の領域（例えば、５’キャップ領域、開始コドンなど）に接近する必要があると理解されているという部分的な理由から、この結果は驚くべきことである。
【０００７】
標的化されるＲＮＡが非コードであるいくつかの実施形態において、その非コードＲＮＡの定常状態レベルの上昇は、その非コードＲＮＡに関連する活性の増加を同時にもたらす。例えば、非コードＲＮＡがｍｉＲＮＡである場合、そのｍｉＲＮＡの定常状態レベルの上昇は、そのｍｉＲＮＡによって標的化されるｍＲＮＡの分解の増加をもたらし得る。
【０００８】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物を標的化するためおよび安定化するために、送達、ハイブリダイゼーションおよび細胞内での安定性に適した化学的性質を有するオリゴヌクレオチドが提供される。さらに、いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの薬物動態、体内分布、バイオアベイラビリティおよび／または有効性をコントロールするために有用なオリゴヌクレオチドの化学的性質が提供される。
【０００９】
本発明のいくつかの態様において、合成ＲＮＡ（例えば、細胞に送達される合成ＲＮＡ）を安定化するための方法が提供される。いくつかの実施形態において、それらの方法は、合成ＲＮＡの５’領域および合成ＲＮＡの３’領域に結合し、かつ合成ＲＮＡに結合されたときにその合成ＲＮＡとともに環状化した生成物を形成する１つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチドと合成ＲＮＡを接触させる工程を含む。いくつかの実施形態において、合成ＲＮＡは、１つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチドと細胞の外側で接触する。いくつかの実施形態において、それらの方法は、環状化した生成物を細胞に送達する工程をさらに含む。
【００１０】
本発明のいくつかの態様において、細胞においてタンパク質の発現を増加させるための方法が提供され、その方法は、そのタンパク質をコードする環状化した合成ＲＮＡを細胞に送達する工程を含み、ここで、その細胞におけるタンパク質の合成は、環状化したＲＮＡが細胞に送達された後に増加する。いくつかの実施形態において、環状化した合成ＲＮＡは、１つまたはそれを超える修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質をコードする環状化した合成ＲＮＡを細胞に送達する工程を含む方法が提供され、ここで、その細胞におけるタンパク質の合成は、環状化した合成ＲＮＡが細胞に送達された後に増加する。いくつかの実施形態において、環状化した合成ＲＮＡは、一本鎖の共有結合的に閉環状のＲＮＡである。いくつかの実施形態において、一本鎖の共有結合的に閉環状のＲＮＡは、１つまたはそれを超える修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、環状化した合成ＲＮＡは、５’末端および３’を有するＲＮＡを合成し、その５’末端および３’末端を互いにライゲートすることによって、形成される。いくつかの実施形態において、環状化した合成ＲＮＡは、合成ＲＮＡを生成し（例えば、インビトロ転写または人工的な（非天然の）化学合成によって）、その合成ＲＮＡの５’領域およびその合成ＲＮＡの３’領域に結合し、かつ合成ＲＮＡに結合されたときに、その合成ＲＮＡとともに環状化した生成物を形成する１つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチドとその合成ＲＮＡを接触させることによって形成される。
【００１１】
いくつかの実施形態において、合成ＲＮＡを安定化するための方法が提供され、その方法は、合成ＲＮＡの５’領域を標的化する第１の安定化オリゴヌクレオチドおよび合成ＲＮＡの３’領域を標的化する第２の安定化オリゴヌクレオチドと合成ＲＮＡを、その第１の安定化オリゴヌクレオチドおよび第２の安定化オリゴヌクレオチドが合成ＲＮＡ上の標的配列とハイブリダイズする条件下において接触させる工程を含む。いくつかの実施形態において、第１の安定化オリゴヌクレオチドは、合成ＲＮＡが、第１および第２の安定化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたときに、環状化した生成物を形成するように、第２の安定化オリゴヌクレオチドと共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、合成ＲＮＡは、第１および第２の安定化オリゴヌクレオチドと細胞の外側で接触する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、合成ＲＮＡを細胞に送達する方法が提供され、その方法は、合成ＲＮＡの５’領域を標的化する第１の安定化オリゴヌクレオチドおよび合成ＲＮＡの３’領域を標的化する第２の安定化オリゴヌクレオチドと合成ＲＮＡを、第１の安定化オリゴヌクレオチドおよび第２の安定化オリゴヌクレオチドが合成ＲＮＡ上の標的配列とハイブリダイズする条件下において接触させる工程；および環状化した生成物を細胞に送達する工程を含む。いくつかの実施形態において、第１の安定化オリゴヌクレオチドは、合成ＲＮＡが、第１および第２の安定化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたときに、環状化した生成物を形成するように、第２の安定化オリゴヌクレオチドと共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、第１の安定化オリゴヌクレオチドおよび第２の安定化オリゴヌクレオチドは、本明細書中に開示される任意の適切なリンカー（例えば、オリゴヌクレオチドリンカー）を介して共有結合的に連結される。
【００１３】
本発明の態様は、細胞においてＲＮＡ転写物の安定性を高める方法に関する。いくつかの実施形態において、本明細書中に提供される方法は、ＲＮＡ転写物を安定化する本明細書中に開示される１つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチドを細胞に送達する工程を含む。いくつかの実施形態において、それらの方法は、ＲＮＡ転写物の５’領域を標的化する第１の安定化オリゴヌクレオチドおよびＲＮＡ転写物の３’領域を標的化する第２の安定化オリゴヌクレオチドを細胞に送達する工程を含む。いくつかの実施形態において、第１の安定化オリゴヌクレオチドは、第２の安定化オリゴヌクレオチドと共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、第１の安定化オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ転写物の５’末端における１番目に転写されたヌクレオチドの１０ヌクレオチド以内の位置におけるＲＮＡ転写物と相補的な相補性領域を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物は、５’−メチルグアノシンキャップを含み、第１の安定化オリゴヌクレオチドは、その５’−メチルグアノシンキャップに対してすぐ内側のヌクレオチドの１０ヌクレオチド以内の位置におけるＲＮＡ転写物と相補的な相補性領域を含む。いくつかの実施形態において、第２の安定化オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ転写物の３’末端の２５０ヌクレオチド以内の位置におけるＲＮＡ転写物と相補的な相補性領域を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物は、３’−ポリ（Ａ）テイルを含み、第２の安定化オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ転写物のポリアデニル化ジャンクションの１００ヌクレオチド以内の位置におけるＲＮＡ転写物と相補的な相補性領域を含む。いくつかの実施形態において、第２の安定化オリゴヌクレオチドの相補性領域は、ＲＮＡ転写物のポリアデニル化ジャンクションとすぐ隣接しているかまたは重複している。いくつかの実施形態において、細胞は、インビトロにおけるものである。いくつかの実施形態において、細胞は、インビボにおけるものである。いくつかの実施形態において、第２の安定化オリゴヌクレオチドは、３’−ポリ（ａ）テイル内の位置におけるＲＮＡ転写物と相補的な相補性領域を含む。いくつかの実施形態において、第２の安定化オリゴヌクレオチドは、５〜１５個のピリミジン（例えば、チミン）ヌクレオチドを含む領域を含む。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、被験体における低レベルのＲＮＡ転写物に関連する状態または疾患を処置する方法に関する。いくつかの実施形態において、その方法は、オリゴヌクレオチドを被験体に投与する工程を含む。
【００１５】
前述の方法のいくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物は、ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡまたは他の任意の好適な転写物である。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物は、ＡＢＣＡ１、ＡＰＯＡ１、ＡＴＰ２Ａ２、ＢＤＮＦ、ＦＸＮ、ＨＢＡ２、ＨＢＢ、ＨＢＤ、ＨＢＥ１、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、ＳＭＮ、ＵＴＲＮ、ＰＴＥＮ、ＭＥＣＰ２およびＦＯＸＰ３からなる群より選択される遺伝子から発現されるｍＲＮＡである。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物は、ＡＢＣＡ４、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＧ５、ＡＢＣＧ８、ＡＤＩＰＯＱ、ＡＬＢ、ＡＰＯＥ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＲＣＡ１、ＣＤ２７４、ＣＥＰ２９０、ＣＦＴＲ、ＥＰＯ、Ｆ７、Ｆ８、ＦＬＩ１、ＦＭＲ１、ＦＮＤＣ５、ＧＣＨ１、ＧＣＫ、ＧＬＰ１Ｒ、ＧＲＮ、ＨＡＭＰ、ＨＰＲＴ１、ＩＤＯ１、ＩＧＦ１、ＩＬ１０、ＩＬ６、ＫＣＮＭＡ１、ＫＣＮＭＢ１、ＫＣＮＭＢ２、ＫＣＮＭＢ３、ＫＣＮＭＢ４、ＫＬＦ１、ＫＬＦ４、ＬＤＬＲ、ＭＳＸ２、ＭＹＢＰＣ３、ＮＡＮＯＧ、ＮＦ１、ＮＫＸ２−１、ＮＫＸ２−１−ＡＳ１、ＰＡＨ、ＰＴＧＳ２、ＲＢ１、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１９、ＳＣＡＲＢ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ６、ＳＭＡＤ７、ＳＴ７、ＳＴＡＴ３、ＴＳＩＸおよびＸＩＳＴからなる群より選択される遺伝子から発現されるｍＲＮＡである。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物は、ＨＯＴＡＩＲおよびＡＮＲＩＬからなる群より選択される非コードＲＮＡである。
【００１９】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物は、ＦＸＮ、ＥＰＯ、ＫＬＦ４、ＡＣＴＢ、ＵＴＲＮ、ＨＢＦ、ＳＭＮ、ＦＯＸＰ３、ＰＴＥＮ、ＮＦＥ２Ｌ２およびＡＴＰ２Ａ２からなる群より選択される遺伝子から発現されるｍＲＮＡである。
【００２０】
本発明のいくつかの態様において、ＲＮＡ転写物の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を含むオリゴヌクレオチドが提供され、ここで、その相補性領域の３’末端におけるヌクレオチドは、ＲＮＡ転写物の転写開始部位の１０ヌクレオチド以内のヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合または少なくとも１つの架橋ヌクレオチド（ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）によって連結されたヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、８〜５０または９〜２０ヌクレオチド長である。
【００２１】
本発明のいくつかの態様において、２つの相補性領域を含むオリゴヌクレオチドが提供され、その２つの相補性領域の各々は、ＲＮＡ転写物の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的であり、第１の相補性領域の３’末端におけるヌクレオチドは、ＲＮＡ転写物の転写開始部位の１００ヌクレオチド以内のヌクレオチドと相補的であり、第２の相補性領域は、ＲＮＡ転写物の３’末端の３００ヌクレオチド以内で終わるＲＮＡ転写物の領域と相補的である。
【００２２】
本発明のいくつかの態様において、一般式５’−Ｘ１−Ｘ２−３’を含むオリゴヌクレオチドが提供され、式中、Ｘ１は、ＲＮＡ転写物の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を有する５〜２０ヌクレオチドを含み、Ｘ１の相補性領域の３’末端におけるヌクレオチドは、ＲＮＡ転写物の転写開始部位におけるヌクレオチドと相補的であり；Ｘ２は、１〜２０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物は、その５’末端に７−メチルグアノシンキャップを有する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物は、７−メチルグアノシンキャップを有し、Ｘ１の相補性領域の３’末端におけるヌクレオチドは、その７−メチルグアノシンキャップに対してすぐ内側に存在するＲＮＡ転写物のヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施形態において、Ｘ２の５’末端における少なくとも１番目のヌクレオチドは、グアニンと相補的なピリミジンである。いくつかの実施形態において、Ｘ２の５’末端における２番目のヌクレオチドは、グアニンと相補的なピリミジンである。いくつかの実施形態において、Ｘ２は、式５’−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−３’を含み、ここで、Ｘ２は、Ｙ２のヌクレオチドを含むループ領域およびＹ３の少なくとも２個連続したヌクレオチドとハイブリダイズしたＹ１の少なくとも２個連続したヌクレオチドを含むステム領域を有するステムループ構造を形成する。いくつかの実施形態において、Ｙ１、Ｙ２およびＹ３は、独立して、１〜１０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｙ３は、ステム領域の３’末端のすぐ後ろの位置に、グアニンと相補的なピリミジンを含む。いくつかの実施形態において、Ｙ３は、ステム領域の３’末端の後に１〜２個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ステム領域の３’末端の後のＹ３のヌクレオチドは、ＤＮＡヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ステム領域は、２〜３個のＬＮＡを含む。いくつかの実施形態において、グアニンと相補的なピリミジンは、シトシンである。いくつかの実施形態において、Ｙ２のヌクレオチドは、少なくとも１つのアデニンを含む。いくつかの実施形態において、Ｙ２は、３〜４個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｙ２のヌクレオチドは、ＤＮＡヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、Ｙ２は、少なくとも１つのアデニンヌクレオチドを含む３〜４個のＤＮＡヌクレオチドを含む。１つまたはそれを超える修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル、ＬＮＡヌクレオチド）が、Ｙ２に存在し得ることが認識されるべきである。いくつかの実施形態において、Ｘ２は、Ｘ１の相補性領域と相補的なＲＮＡ転写物の領域と重複しないＲＮＡ転写物の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を含む。いくつかの実施形態において、Ｘ２の相補性領域は、ＲＮＡ転写物のポリアデニル化ジャンクションの１００ヌクレオチド以内に存在する。いくつかの実施形態において、Ｘ２の相補性領域は、ＲＮＡ転写物のポリアデニル化ジャンクションとすぐ隣接しているかまたは重複しているＲＮＡ転写物と相補的である。いくつかの実施形態において、Ｘ２は、ＲＮＡ転写物のポリ（Ａ）テイルのアデニンヌクレオチドと相補的な少なくとも２個連続したピリミジンヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、Ｘ２の相補性領域は、ポリ（ａ）テイル内に存在する。いくつかの実施形態において、Ｘ２の相補性領域は、５〜１５個のピリミジン（例えば、チミン）ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物は、ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡまたは他の任意の好適なＲＮＡ転写物である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物は、ｍＲＮＡ転写物であり、Ｘ２は、その転写物の３’−ＵＴＲにおける少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物は、ＡＢＣＡ１、ＡＰＯＡ１、ＡＴＰ２Ａ２、ＢＤＮＦ、ＦＸＮ、ＨＢＡ２、ＨＢＢ、ＨＢＤ、ＨＢＥ１、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、ＳＭＮ、ＵＴＲＮ、ＰＴＥＮ、ＭＥＣＰ２およびＦＯＸＰ３からなる群より選択される遺伝子から発現されるｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、Ｘ１は、配列５’−ＣＧＣＣＣＴＣＣＡＧ−３’を含む。いくつかの実施形態において、Ｘ２は、配列ＣＣを含む。いくつかの実施形態において、Ｘ２は、配列５’−ＣＣＡＡＡＧＧＴＣ−３’を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列５’−ＣＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＣＡＡＡＧＧＴＣ−３’を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物は、ＡＢＣＡ４、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＧ５、ＡＢＣＧ８、ＡＤＩＰＯＱ、ＡＬＢ、ＡＰＯＥ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＲＣＡ１、ＣＤ２７４、ＣＥＰ２９０、ＣＦＴＲ、ＥＰＯ、Ｆ７、Ｆ８、ＦＬＩ１、ＦＭＲ１、ＦＮＤＣ５、ＧＣＨ１、ＧＣＫ、ＧＬＰ１Ｒ、ＧＲＮ、ＨＡＭＰ、ＨＰＲＴ１、ＩＤＯ１、ＩＧＦ１、ＩＬ１０、ＩＬ６、ＫＣＮＭＡ１、ＫＣＮＭＢ１、ＫＣＮＭＢ２、ＫＣＮＭＢ３、ＫＣＮＭＢ４、ＫＬＦ１、ＫＬＦ４、ＬＤＬＲ、ＭＳＸ２、ＭＹＢＰＣ３、ＮＡＮＯＧ、ＮＦ１、ＮＫＸ２−１、ＮＫＸ２−１−ＡＳ１、ＰＡＨ、ＰＴＧＳ２、ＲＢ１、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１９、ＳＣＡＲＢ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ６、ＳＭＡＤ７、ＳＴ７、ＳＴＡＴ３、ＴＳＩＸおよびＸＩＳＴからなる群より選択される遺伝子から発現されるｍＲＮＡである。
【００２３】
本発明のいくつかの態様において、１０〜５０または９〜５０または９〜２０ヌクレオチド長であって、ｍＲＮＡ転写物の５’−ＵＴＲの少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な第１の領域、およびｍＲＮＡ転写物の３’−ＵＴＲの、ポリ（Ａ）テイルの、またはポリアデニル化ジャンクションと重複する、少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な第２の領域を有する、オリゴヌクレオチド提供される。いくつかの実施形態において、５’−ＵＴＲの少なくとも５個連続したヌクレオチドの１番目は、ｍＲＮＡ転写物の５’−メチルグアノシンキャップの１０ヌクレオチド以内に存在する。いくつかの実施形態において、第２の領域は、ポリアデニル化ジャンクションと重複する少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施形態において、第２の領域は、ポリ（ａ）テイルの少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施形態において、第２の領域は、５〜１５個のピリミジン（例えば、チミン）ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、第１の領域の５’末端を第２の領域の３’末端と連結する２〜２０個のヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、第１の領域の３’末端を第２の領域の５’末端と連結する２〜２０個のヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１０〜５０または９〜５０または９〜２０ヌクレオチド長である。
【００２４】
本発明のいくつかの態様において、一般式５’−Ｘ１−Ｘ２−３’を含むオリゴヌクレオチドが提供され、式中、Ｘ１は、アデニンと塩基対を形成する２〜２０個のピリミジンヌクレオチドを含み；Ｘ２は、ポリアデニル化されたＲＮＡ転写物の少なくとも３個連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を含み、Ｘ２の相補性領域の５’末端におけるヌクレオチドは、ＲＮＡ転写物のポリアデニル化ジャンクションに対してすぐ内側に存在するＲＮＡ転写物のヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施形態において、Ｘ１は、２〜２０個のチミジンまたはウリジンを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されるオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む。いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されるオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのヌクレオチドは、２’Ｏ−メチルを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのリボヌクレオチド、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド、少なくとも１つの２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドまたは少なくとも１つの架橋ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、架橋ヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチドまたはＥＮＡ修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドまたは架橋ヌクレオチドとが交互になっているものを含む。いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されるオリゴヌクレオチドは、ミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）である。いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されるオリゴヌクレオチドは、モルホリノである。
【００２６】
本発明のいくつかの態様において、表３、７、８または９に示されているようなヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドが提供される。本発明のいくつかの態様において、表３、７、８または９に示されているようなヌクレオチド配列の少なくとも８ヌクレオチドのフラグメントを含むオリゴヌクレオチドが提供される。
【００２７】
本発明のいくつかの態様において、ヌクレオシド間結合を介して連結された５〜２５個のヌクレオチドを有する第１のオリゴヌクレオチドおよびヌクレオシド間結合を介して連結された５〜２５個のヌクレオチドを有する第２のオリゴヌクレオチドを含む組成物が提供され、ここで、その第１のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ転写物の５’末端の１００ヌクレオチド以内の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ転写物の３’末端の１００ヌクレオチド以内の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドとは、ＲＮＡ転写物と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドではないリンカーによってつなげられている。いくつかの実施形態において、リンカーは、オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、リンカーは、ポリペプチドである。
【００２８】
本発明のいくつかの態様において、本明細書中に開示される１つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチドを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチドを含む組成物が提供され、ここで、それらのオリゴヌクレオチドの各々の少なくとも７５％は、表３、７、８または９に示されているようなヌクレオチド配列を含むか、またはそのヌクレオチド配列からなる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、一価カチオン（例えば、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃｓ＋）と複合体を形成している。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、凍結乾燥された形態で存在する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、水溶液で存在する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、キャリア（例えば、薬学的に許容され得るキャリア）とともに提供されるか、そのキャリアと組み合わされるか、または混合される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、緩衝液中に提供される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、キャリア（例えば、ペプチド、ステロイドまたは他の分子）と結合体化されている。本発明のいくつかの態様において、組成物が収容されている容器を備えるキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、３’ＲＮＡ末端を標的化するための例示的なオリゴデザインを描写している説明図である。第１の例は、ポリＡテイルの前の、ＲＮＡの３’末端に相補的なオリゴを示している。第２の例は、ポリＡテイルにハイブリダイズする５’Ｔ−ストレッチを有するＲＮＡの３’末端に相補的なオリゴを示している。
【００３０】
【図２】図２は、５’ＲＮＡ末端を標的化するための例示的なオリゴを描写している説明図である。第１の例は、ＲＮＡの５’末端に相補的なオリゴを示している。第２の例は、ＲＮＡの５’末端に相補的なオリゴを示しており、そのオリゴは、３’オーバーハング残基を有することにより、陥凹末端を有するＲＮＡ−オリゴ二重鎖をもたらす。オーバーハングは、５’メチルグアノシンキャップと潜在的に相互作用し、さらにそのキャップを安定化する、Ｃを含むがこれに限定されないヌクレオチドの組み合わせを含み得る。
【００３１】
【図３Ａ】図３Ａは、５’ＲＮＡ末端を標的化するための例示的なオリゴならびに５’および３’ＲＮＡ末端を標的化するための例示的なオリゴを描写している説明図である。この例は、５’ＲＮＡキャップを安定化するループを有するオリゴ、または５’および３’ＲＮＡ末端に結合して偽環状化した（ｐｓｅｕｄｏ−ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚｅｄ）ＲＮＡをもたらすオリゴを示している。
【００３２】
【図３Ｂ】図３Ｂは、オリゴによって媒介される例示的なＲＮＡ偽環状化を描写している説明図である。この説明図は、例示的なＲＮＡの５’および３’領域に結合するＬＮＡミックスマーオリゴを示している。
【００３３】
【図４】図４は、フラタキシン（ＦＸＮ）３’ポリＡ部位を描写している略図である。
【００３４】
【図５】図５は、ＦＸＮ５’開始部位を描写している略図である。
【００３５】
【図６】図６は、実施例において試験された５’および３’オリゴヌクレオチドの位置を描写している略図である。
【００３６】
【図７】図７は、３’末端オリゴの試験の結果を描写しているグラフである。スクリーニングをＧＭ０３８１６  ＦＲＤＡ患者細胞株において行い、ＦＸＮ  ｍＲＮＡのレベルをトランスフェクションの１〜３日後に計測した。トランスフェクションのために使用されたオリゴ濃度は、１００ｎＭだった。
【００３７】
【図８】図８は、３’末端オリゴの試験の結果を描写しているグラフである。スクリーニングをＧＭ０３８１６  ＦＲＤＡ患者細胞株において行い、ＦＸＮ  ｍＲＮＡのレベルをトランスフェクションの１〜３日後に計測した。トランスフェクションのために使用されたオリゴ濃度は、４００ｎＭだった。
【００３８】
【図９】図９は、ＦＸＮ  ｍＲＮＡをアップレギュレートすると示されたＦＸＮ３’オリゴ７３、７５、７６および７７の位置および配列を描写している略図である。これらのオリゴのすべてが、ポリＴ配列を含んでいた。ｍＲＮＡへの各オリゴの結合の概略図が示されている。
【００３９】
【図１０】図１０は、５’末端オリゴの試験の結果を描写しているグラフである。スクリーニングをＧＭ０３８１６  ＦＲＤＡ患者細胞において行い、ＦＸＮ  ｍＲＮＡのレベルをトランスフェクションの２日後に計測した。トランスフェクションのために使用されたオリゴ濃度は、１００ｎＭ（赤色のバー、各対における左のバー）および４００ｎＭ（青色のバー、各対における右のバー）だった。４００ｎＭレベルを用いて得られたより低い反応レベルは、高すぎるオリゴ濃度、および送達のために各オリゴを適切にコーティングするトランスフェクション剤の利用可能性の低下に起因し得る。
【００４０】
【図１１】図１１は、ＧＭ０３８１６  ＦＲＤＡ患者細胞においてＦＸＮ３’オリゴ７５と組み合わせて５’末端オリゴを試験した結果を描写しているグラフである。ＦＸＮ  ｍＲＮＡのレベルをトランスフェクションの２および３日後に計測した。オリゴＡ／Ｂの場合、オリゴＡは、５’末端を標的化し、オリゴＢは、３’末端を標的化する。トランスフェクションのために使用されたオリゴ濃度は、最終２００ｎＭ＝１００ｎＭオリゴＡ＋１００ｎＭオリゴＢ）だった。
【００４１】
【図１２】図１２は、図８に提示されたものと同じグラフを示している。バーを囲んでいる四角は、ＧＭ０３８１６  ＦＲＤＡ患者細胞におけるＦＸＮのアップレギュレートにおいて特に有効だった５’および３’オリゴ対を示している。
【００４２】
【図１３】図１３は、ＦＸＮ  ｍＲＮＡをアップレギュレートすると示されたＦＸＮ  ５’オリゴ５１、５２、５７および６２の位置および配列を描写している略図である。これらのオリゴのすべてが、モチーフＣＧＣＣＣＴＣＣＡＧを含んでいた。オリゴ６２によって形成されるステムループ構造の概略図が示されている。
【００４３】
【図１４】図１４は、ＦＸＮオリゴ６２の予測される構造を描写している説明図である。ヌクレオチド１〜１５は、ＦＸＮアイソフォームのうちの１つの５’末端に相補的である。ヌクレオチド２〜８において示されている予測されるループは、細胞内では存在しない可能性がある。なぜなら、この部分は、ＲＮＡにハイブリダイズし得るがゆえにこのループは開いてＲＮＡにハイブリダイズし得るからである。ヌクレオチド１６〜２４は、最も３’のＣ残基をＦＸＮ  ｍＲＮＡの５’メチルグアノシンキャップと近接して配置するために人工的に付加されたループである。
【００４４】
【図１５Ａ】図１５Ａおよび１５Ｂは、処置の２日後における細胞傷害性（ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＣＴＧ）を描写しているグラフである。オリゴによるＦＲＤＡ患者細胞株ＧＭ０３８１６の処置は、１００および４００ｎＭでのオリゴ処置の２日目（図１５Ａ）および３日目（図１５Ｂ）に細胞傷害性をもたらさなかった。
【図１５Ｂ】図１５Ａおよび１５Ｂは、処置の２日後における細胞傷害性（ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＣＴＧ）を描写しているグラフである。オリゴによるＦＲＤＡ患者細胞株ＧＭ０３８１６の処置は、１００および４００ｎＭでのオリゴ処置の２日目（図１５Ａ）および３日目（図１５Ｂ）に細胞傷害性をもたらさなかった。
【００４５】
【図１６】図１６は、ＧＭ０３８１６  ＦＲＤＡ患者細胞株における先の実験からのオリゴの組み合わせの試験を示しているグラフのセットである。これらのオリゴのうちのいくつかのＦＸＮ  ｍＲＮＡレベルは、ＧＭ０３２１Ｂ正常線維芽細胞におけるＦＸＮ  ｍＲＮＡのレベルとほぼ等しかった。オリゴＡ／Ｂの場合、オリゴＡは、５’末端を標的化し、オリゴＢは、３’末端を標的化する。トランスフェクションのために使用されたオリゴ濃度は、最終２００ｎＭ＝１００ｎＭオリゴＡ＋１００ｎＭオリゴＢ）だった。
【００４６】
【図１７】図１７は、オリゴによる２および３日間の処置におけるＦＸＮ  ｍＲＮＡのレベルを描写しているグラフである。ＧＭ０３８１６  ＦＲＤＡ患者細胞における先の実験でのポジティブヒットの生物学的反復実験（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）から、２〜３日後の高い定常状態ＦＸＮ  ｍＲＮＡレベルが確かめられた。オリゴＡ／Ｂの場合、オリゴＡは、５’末端を標的化し、オリゴＢは、３’末端を標的化する。トランスフェクションのために使用されたオリゴ濃度は、最終２００ｎＭ＝１００ｎＭオリゴＡ＋１００ｎＭオリゴＢ）だった。
【００４７】
【図１８】図１８は、ＧＭ０４０７８  ＦＲＤＡ患者線維芽細胞におけるオリゴの試験を描写しているグラフである。
【図１９】図１９は、「正常」細胞株であるＧＭ０３２１Ｂ線維芽細胞におけるオリゴの試験を描写しているグラフである。ＧＭ０３２１Ｂ細胞は、ＦＲＤＡ患者細胞よりもおよそ４倍多いＦＸＮ  ｍＲＮＡを発現する。
【００４８】
【図２０】図２０は、５’および３’ＦＸＮオリゴ組み合わせ６２／７７に対するトランスフェクションの用量反応試験を描写しているグラフである。ＧＭ０３８１６  ＦＲＤＡ患者細胞株におけるＦＸＮオリゴ６２／７７組み合わせの生物学的反復実験および用量反応は、２〜３日後において高い定常状態ＦＸＮ  ｍＲＮＡレベルを示した。オリゴＡ／Ｂの場合、オリゴＡは、５’末端を標的化し、オリゴＢは、３’末端を標的化する。トランスフェクション試薬の量は、異なる濃度のオリゴにわたって一定に維持され、これは、オリゴ処置に対する比較的平坦な反応の原因であり得る。濃度は、最終のｎＭである（すなわち、最終１０ｎＭ＝５ｎＭオリゴ６２＋５ｎＭオリゴ７７）。
【００４９】
【図２１】図２１は、オリゴで（１００ｎＭの単一オリゴ）または組み合わせて（２つのオリゴを最終２００ｎＭで）処理されたＧＭ０３８１６  ＦＲＤＡ患者線維芽細胞におけるＦＸＮタンパク質レベルおよびＧＭ０３２１Ｂ正常線維芽細胞におけるＦＸＮタンパク質レベルを描写しているグラフである。
【００５０】
【図２２】図２２は、オリゴ処置したときのＦＸＮタンパク質のレベルを描写しているグラフである。ＦＸＮタンパク質（１００ｎＭ，ｄ３）ｎ＝２。
【００５１】
【図２３】図２３Ａおよび２３Ｂは、新規転写阻害剤アクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ）の存在下における、オリゴ６２と７５（それぞれオリゴ３８５および３９８とも称される）の組み合わせによる処置ありおよびなしのｍＲＮＡの相対的なレベルを描写しているグラフである。図２３Ａは、ＭＹＣ  ｍＲＮＡの相対的なレベルを描写している。図２２Ｂは、ＦＸＮ  ｍＲＮＡの相対的なレベルを描写している。ｃＭｙｃは、比較的短い半減期（約１００分）を有し、ＡｃｔＤ処理に対するポジティブコントロールとして使用された。
【００５２】
【図２４】図２４は、アクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ）で処理されたＧＭ０３８１６細胞におけるオリゴを描写しているグラフである。０、２、４および８時間後におけるＦＸＮの発現が描写されている。
【００５３】
【図２５Ａ】図２５Ａおよび２５Ｂは、５’および３’ＦＸＮオリゴの組み合わせで処理された、ＧＭ１５８５０およびＧＭ１５８５１細胞（図２５Ａ）またはＧＭ１６２０９およびＧＭ１６２２２（図２５Ｂ）におけるＦＸＮ  ｍＲＮＡレベルを描写しているグラフである。これは、１０マイクロモル濃度のオリゴヌクレオチドを用いた裸の（ｇｙｍｎｏｔｉｃ）実験だった。
【図２５Ｂ】図２５Ａおよび２５Ｂは、５’および３’ＦＸＮオリゴの組み合わせで処理された、ＧＭ１５８５０およびＧＭ１５８５１細胞（図２５Ａ）またはＧＭ１６２０９およびＧＭ１６２２２（図２５Ｂ）におけるＦＸＮ  ｍＲＮＡレベルを描写しているグラフである。これは、１０マイクロモル濃度のオリゴヌクレオチドを用いた裸の（ｇｙｍｎｏｔｉｃ）実験だった。
【００５４】
【図２６】図２６は、５’末端標的化オリゴと３’末端標的化オリゴとの組み合わせおよび他のＦＸＮ標的化オリゴでの細胞の処理が、ＦＸＮ  ｍＲＮＡレベを上昇させることを示しているグラフである。
【００５５】
【図２７】図２７は、３’末端オリゴのスクリーニングを示している一連のグラフである。細胞を１０または４０ｎＭのオリゴでトランスフェクトし、ＦＸＮ  ｍＲＮＡをトランスフェクションの２日後に計測した。
【００５６】
【図２８】図２８は、３’末端オリゴのスクリーニングを示している一連のグラフである。細胞を１０または４０ｎＭのオリゴでトランスフェクトし、ＦＸＮ  ｍＲＮＡをトランスフェクションの３日後に計測した。
【００５７】
【図２９】図２９は、５’末端オリゴのスクリーニングを示しているグラフおよび表である。細胞を１０または４０ｎＭのオリゴでトランスフェクトし、ＦＸＮ  ｍＲＮＡをトランスフェクションの２日後に計測した。
【００５８】
【図３０】図３０は、５’および３’末端オリゴの組み合わせの試験を示している一連のグラフである。細胞を１０または４０ｎＭのオリゴの組み合わせでトランスフェクトし、ＦＸＮ  ｍＲＮＡをトランスフェクションの２日後に計測した。
【００５９】
【図３１】図３１は、５’および３’末端オリゴの組み合わせの試験を示している一連のグラフである。細胞を１０または４０ｎＭのオリゴの組み合わせでトランスフェクトし、ＦＸＮ  ｍＲＮＡをトランスフェクションの３日後に計測した。
【００６０】
【図３２】図３２は、ＦＸＮ  ｍＲＮＡの定常状態レベルが、５’および３’末端オリゴの組み合わせで処理された細胞において経時的に上昇することを示しているグラフである。細胞を１０ｎＭのオリゴの組み合わせでトランスフェクトし、ＦＸＮ  ｍＲＮＡをトランスフェクションの２および３日後に計測した。
【００６１】
【図３３】図３３は、ＦＸＮ  ｍＲＮＡの定常状態レベルが、５’および３’末端オリゴの組み合わせで処理された細胞において経時的に上昇することを示しているグラフである。細胞を４０ｎＭのオリゴの組み合わせでトランスフェクトし、ＦＸＮ  ｍＲＮＡをトランスフェクションの２および３日後に計測した。
【００６２】
【図３４】図３４は、ＦＸＮを、例えば、内部において、ポリＡテイルの近くで、またはエキソンにわたって、標的化する他のオリゴの試験の結果を示しているグラフである。
【００６３】
【図３５】図３５は、ＦＸＮ  ｍＲＮＡレベルが、単一のオリゴヌクレオチドを用いたとき上昇することを示しているグラフである。細胞を１０ｎＭのオリゴでトランスフェクトし、ＦＸＮ  ｍＲＮＡをトランスフェクションの２および３日後に計測した。
【００６４】
【図３６】図３６は、ＦＸＮ  ｍＲＮＡレベルが、単一のオリゴヌクレオチドを用いたとき上昇することを示しているグラフである。細胞を４０ｎＭのオリゴでトランスフェクトし、ＦＸＮ  ｍＲＮＡをトランスフェクションの２および３日後に計測した。
【００６５】
【図３７】図３７は、ＦＸＮ  ｍＲＮＡレベルが、５’オリゴヌクレオチドと３’オリゴヌクレオチドとの組み合わせを用いたとき上昇することを示しているグラフである。細胞を１０または４０ｎＭのオリゴの組み合わせでトランスフェクトし、ＦＸＮ  ｍＲＮＡをトランスフェクションの２および３日後に計測した。
【００６６】
【図３８Ａ】図３８Ａおよび３８Ｂは、１０または４０ｎＭのオリゴによるトランスフェクションが、トランスフェクションの２日後（図３８Ａ）または３日後（図３８Ｂ）の細胞にとって細胞傷害性（ｃｙｔｏｘｉｃ）でないことを示しているグラフである。
【図３８Ｂ】図３８Ａおよび３８Ｂは、１０または４０ｎＭのオリゴによるトランスフェクションが、トランスフェクションの２日後（図３８Ａ）または３日後（図３８Ｂ）の細胞にとって細胞傷害性（ｃｙｔｏｘｉｃ）でないことを示しているグラフである。
【００６７】
【図３９Ａ】図３９Ａおよび３９Ｂは、ＦＸＮのタンパク質レベル（図３９Ａ）およびｍＲＮＡレベル（図３９Ｂ）が、１０ｎＭのオリゴでトランスフェクトされた細胞において上昇することを示しているグラフである。タンパク質およびｍＲＮＡのレベルをトランスフェクションの２または３日後に計測した。
【図３９Ｂ】図３９Ａおよび３９Ｂは、ＦＸＮのタンパク質レベル（図３９Ａ）およびｍＲＮＡレベル（図３９Ｂ）が、１０ｎＭのオリゴでトランスフェクトされた細胞において上昇することを示しているグラフである。タンパク質およびｍＲＮＡのレベルをトランスフェクションの２または３日後に計測した。
【００６８】
【図４０Ａ】図４０Ａおよび４０Ｂは、ＦＸＮのタンパク質レベル（図４０Ａ）およびｍＲＮＡレベル（図４０Ｂ）が、４０ｎＭのオリゴでトランスフェクトされた細胞において上昇し得ることを示しているグラフである。タンパク質およびｍＲＮＡのレベルをトランスフェクションの２または３日後に計測した。
【図４０Ｂ】図４０Ａおよび４０Ｂは、ＦＸＮのタンパク質レベル（図４０Ａ）およびｍＲＮＡレベル（図４０Ｂ）が、４０ｎＭのオリゴでトランスフェクトされた細胞において上昇し得ることを示しているグラフである。タンパク質およびｍＲＮＡのレベルをトランスフェクションの２または３日後に計測した。
【００６９】
【図４１】図４１は、ＫＬＦ４  ５’および３’末端標的化オリゴで処理された細胞におけるＫＬＦ４  ｍＲＮＡの発現レベルを描写しているグラフである。
【００７０】
【図４２】図４２は、ＫＬＦ４  ５’および３’末端標的化オリゴで処理された細胞におけるＫＬＦ４タンパク質の発現レベルを描写しているウエスタンブロットの像である。
【００７１】
【図４３】図４３は、ＫＬＦ４  ５’および３’末端標的化オリゴ（ＫＬＦ４の５’末端と３’末端の両方を標的化する環状化したオリゴヌクレオチド、ならびにＫＬＦ４の５’および３’末端を標的化する個々のオリゴヌクレオチドを含む）で処理された細胞におけるＫＬＦ４  ｍＲＮＡの発現レベルを描写しているグラフである。
【００７２】
【図４４Ａ】図４４Ａおよび４４Ｂは、ＰＴＥＮオリゴで処理された細胞における３日目のＰＴＥＮ  ｍＲＮＡの発現レベルを描写しているグラフである。ＧＭ０４０７８線維芽細胞をそれらのオリゴでトランスフェクトし、溶解産物を３日目に回収した。オリゴの配列は、表９に提供されている。
【図４４Ｂ】図４４Ａおよび４４Ｂは、ＰＴＥＮオリゴで処理された細胞における３日目のＰＴＥＮ  ｍＲＮＡの発現レベルを描写しているグラフである。ＧＭ０４０７８線維芽細胞をそれらのオリゴでトランスフェクトし、溶解産物を３日目に回収した。オリゴの配列は、表９に提供されている。
【００７３】
【図４５】図４５は、ＰＴＥＮオリゴＰＴＥＮ−１０８およびＰＴＥＮ−１１３のいずれか単独または組み合わせで処理されたＧＭ０４０７８線維芽細胞からの１日目および２日目のＰＴＥＮタンパク質の発現レベルを描写しているウエスタンブロットの像である。ＧＭ０４０７８線維芽細胞をトランスフェクトし、溶解産物を１日目および２日目に回収した。オリゴの配列は、表９に提供されている。
【００７４】
【図４６】図４６は、ＫＬＦ４オリゴで処理された細胞における３日目のマウスＫＬＦ４  ｍＲＮＡの発現レベルを描写しているグラフである。Ｈｅｐａ１−６細胞をそれらのオリゴでトランスフェクトし、溶解産物を３日目に回収した。オリゴの配列は、表９に提供されている。
【００７５】
【図４７】図４７は、偽環状化オリゴで処理された細胞における３日目のマウスＫＬＦ４タンパク質の発現レベルを描写しているウエスタンブロットの像である。Ｈｅｐａ１−６細胞をそれらのオリゴでトランスフェクトし、溶解産物を３日目に回収した。試験されたオリゴは、マウスＫＬＦ４−８、ＫＬＦ４−９、ＫＬＦ４−１１、ＫＬＦ４−１２、ＫＬＦ４−１３、ＫＬＦ４−１４およびＫＬＦ４−１５だった。オリゴの配列は、表９に提供されている。
【００７６】
【図４８】図４８は、安定性組み合わせオリゴで処理された細胞における３日目のマウスＫＬＦ４タンパク質の発現レベルを描写しているウエスタンブロットの像である。Ｈｅｐａ１−６細胞をそれらのオリゴでトランスフェクトし、溶解産物を３日目に回収した。試験されたオリゴは、様々な組み合わせでの、マウスＫＬＦ４−１、ＫＬＦ４−２、ＫＬＦ４−３、ＫＬＦ４−１６、ＫＬＦ４−１７、ＫＬＦ４−１８およびＫＬＦ４−１９だった。オリゴの配列は、表９に提供されている。
【００７７】
【図４９】図４９は、単独でまたは組み合わせて使用された（「／」によって示されている）環状化オリゴおよび個々の安定性オリゴの存在下または非存在下における（ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ）ヒトＫＬＦ４の安定性の計測を示しているグラフである。オリゴの配列は、表７に提供されている。４７＝ＫＬＦ４−４７ｍ０２、４８＝ＫＬＦ４−４８ｍ０２、５０＝ＫＬＦ４−５０ｍ０２、５１＝ＫＬＦ４−５１ｍ０２、５３＝ＫＬＦ４−５３ｍ０２。
【００７８】
【図５０】図５０は、５’／３’末端オリゴ組み合わせおよび環状化オリゴが、長いｍＲＮＡ半減期を有すると知られているベータアクチンｍＲＮＡを増加させるために使用できることを示しているグラフである。
【００７９】
【図５１】図５１は、ＦＸＮオリゴで単独でまたは様々な組み合わせで処理されたＧＭ０３８１６細胞におけるヒトＦＸＮ  ｍＲＮＡアップレギュレーションを示しているグラフである。濃度は、総オリゴ濃度として示されている（例えば、２０ｎＭは、各オリゴに対して１０ｎＭであることを意味する）。
【００８０】
【図５２】図５２および５３は各々、様々なＦＸＮオリゴによって誘導された未成熟ＦＸＮおよび成熟ＦＸＮのタンパク質レベルを示しているウエスタンブロットの写真である。
【図５３】図５２および５３は各々、様々なＦＸＮオリゴによって誘導された未成熟ＦＸＮおよび成熟ＦＸＮのタンパク質レベルを示しているウエスタンブロットの写真である。
【００８１】
【図５４】図５４は、ＦＸＮオリゴで単独でまたは様々な組み合わせで処理されたＧＭ０３８１６細胞におけるＦＸＮ  ｍＲＮＡアップレギュレーションを示している一連のグラフである。ＧＡＰＤＨギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）の値は、ＦＸＮ  ｍＲＮＡレベルに対するＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルを示している。残りの値は、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルに対するＦＸＮ  ｍＲＮＡレベルを示している。
【００８２】
【図５５】図５５は、単独でまたは様々な組み合わせでＦＸＮオリゴで処理されたＧＭ０３８１６細胞におけるＦＸＮ  ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示しているグラフである。ＧＡＰＤＨギャップマーの値は、ＦＸＮ  ｍＲＮＡレベルに対するＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルを示している。残りの値は、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルに対するＦＸＮ  ｍＲＮＡレベルを示している。
【００８３】
【図５６−１】図５６は、様々なＦＸＮオリゴで単独でまたは組み合わせて処理された細胞におけるＦＸＮ下流遺伝子候補であるＰＰＡＲＧＣ１およびＮＦＥ２Ｌ２のｍＲＮＡレベルを示している一連のグラフを提供している。
【図５６−２】図５６は、様々なＦＸＮオリゴで単独でまたは組み合わせて処理された細胞におけるＦＸＮ下流遺伝子候補であるＰＰＡＲＧＣ１およびＮＦＥ２Ｌ２のｍＲＮＡレベルを示している一連のグラフを提供している。
【００８４】
【図５７】図５７は、ＦＸＮオリゴで単独でまたは様々な組み合わせで処理されたＧＭ０３８１６細胞におけるＦＸＮ  ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示しているグラフである。
【００８５】
【図５８−１】図５８Ａ〜５８Ｃは、様々なＦＸＮオリゴで単独でまたは組み合わせて処理されたＦＲＤＡマウスモデル線維芽細胞における、それぞれ４日目、７日目および１０日目のＦＸＮ  ｍＲＮＡのレベルを示している一連のグラフである。
【図５８−２】図５８Ａ〜５８Ｃは、様々なＦＸＮオリゴで単独でまたは組み合わせて処理されたＦＲＤＡマウスモデル線維芽細胞における、それぞれ４日目、７日目および１０日目のＦＸＮ  ｍＲＮＡのレベルを示している一連のグラフである。
【００８６】
【図５９】図５９Ａおよび５９Ｂは、用量反応研究における、様々なＦＸＮオリゴで処理されたＧＭ０３８１６細胞におけるＦＸＮ  ｍＲＮＡのレベルを示している一連のグラフである。図５９Ａでは、計測を３日目および５日目に行った。図５９Ｂでは、計測を５日目に行った。
【００８７】
【図６０】図６０Ａおよび６０Ｂは、ＦＸＮ−５３２オリゴと組み合わされた様々な５’ＦＸＮオリゴで処理されたＧＭ０３８１６細胞におけるＦＸＮ  ｍＲＮＡのレベルを示している一連のグラフである。
【００８８】
【図６１】図６１は、様々なＦＸＮオリゴで処理されたＧＭ０３８１６細胞におけるＦＸＮタンパク質のレベルを示しているウエスタンブロットの写真である。
【００８９】
【図６２】図６２は、図６４におけるウエスタンブロットから定量されたＵＴＲＮタンパク質のレベルを示しているグラフである。
【００９０】
【図６３】図６３は、様々なＵＴＲＮオリゴで処理された細胞からの上清中のＵＴＲＮタンパク質のレベルを示しているウエスタンブロットの写真である。
【００９１】
【図６４−１】図６４Ａは、図６４Ｂおよび６４Ｃにおけるウエスタンブロットから定量されたＵＴＲＮタンパク質のレベルを示しているグラフである。図６４Ｂおよび６４Ｃは各々、様々なＵＴＲＮオリゴで処理された細胞からの上清またはペレットにおけるＵＴＲＮタンパク質のレベルを示しているウエスタンブロットの写真である。
【図６４−２】図６４Ａは、図６４Ｂおよび６４Ｃにおけるウエスタンブロットから定量されたＵＴＲＮタンパク質のレベルを示しているグラフである。図６４Ｂおよび６４Ｃは各々、様々なＵＴＲＮオリゴで処理された細胞からの上清またはペレットにおけるＵＴＲＮタンパク質のレベルを示しているウエスタンブロットの写真である。
【００９２】
【図６５−１】図６５Ａ〜６５Ｃは、様々なＡＰＯＡ１オリゴで処理された初代マウス肝細胞におけるマウスＡＰＯＡ１  ｍＮＲＡレベルのレベルを示している一連のグラフである。
【図６５−２】図６５Ａ〜６５Ｃは、様々なＡＰＯＡ１オリゴで処理された初代マウス肝細胞におけるマウスＡＰＯＡ１  ｍＮＲＡレベルのレベルを示している一連のグラフである。
【００９３】
【図６６】図６６は、様々なＡＰＯＡ１オリゴで処理された初代マウス肝細胞におけるＡＰＯＡ１タンパク質のレベルを示している２つのウエスタンブロットの写真である。チューブリンを、下の写真に対するローディングコントロールとして使用した。
【００９４】
【図６７】図６７Ａ〜６７Ｇは、フリードライヒ運動失調症のマウスモデルにおけるオリゴ処置のショートアーム（ｓｈｏｒｔ  ａｒｍ）（ＳＡ）またはロングアーム（ｌｏｎｇ  ａｒｍ）ＬＡ）研究におけるヒトフラタキシン（Ａ、Ｂ、Ｅ）またはマウスフラタキシンのレベルを示している一連のグラフである。図６７Ａ〜６７Ｅは、心臓のデータを示している。図６７Ｆおよび６７Ｇは、肝臓のデータを示している。図６７Ｃおよび６７Ｅは、各群における５匹のマウスを平均すること（図６７Ｃ）およびそれらの群の中の各個別のマウスにおける値を示すこと（図６７Ｅ）によって、同じロングアームの心臓のヒトＦＸＮ値を示している。このモデルの心臓および肝臓におけるヒトＦＸＮおよびマウスＦＸＮを、ＱＰＣＲを用いて計測し、ＰＢＳ群に対して正規化した。各処置群は、５匹のマウスを有した（ｎ＝５）。
【００９５】
【図６８】図６８は、マウスＦＸＮに対するヒトＦＸＮオリゴの潜在的な標的化を示している一連の略図を示している。左の略図は、ヒトＦＸＮ−３７５（上のパネル）およびＦＸＮ−３８９（下のパネル）の潜在的な相互作用位置に対応するマウスＦＸＮゲノム領域のＵＳＣＳゲノムビューを示している。四角は、マウスゲノムに対するこれらのオリゴのマッピング位置を示している。右のパネルは、マウスゲノムに対するヒトオリゴ配列のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを示している。
【００９６】
【図６９】図６９は、ｍＲＮＡ−Ｓｅｑシグナルおよびリボソームポジショニングに対するオリゴ位置を示している一連の略図である。各略図の上のパネルにおけるシグナルは、リボソームポジショニングデータのすべて（開始時および伸長時のリボソームを含む）を示している。各略図の下のパネルにおけるシグナルは、ｍＲＮＡ−Ｓｅｑデータを示している。四角の中の黒色のバーは、示されているオリゴ局在化を示している。
【００９７】
【図７０】図７０Ａおよび７０Ｂは、様々な５’および３’末端ＡＰＯＡ１オリゴで処置されたマウスの肝臓におけるＡＰＯＡ１  ｍＲＮＡレベルを示している一連のグラフである。図７０Ａの場合、肝臓の回収を、オリゴまたはコントロール（ＰＢＳ）の最終投与の２日後である５日目に行った。図７０Ｂの場合、肝臓の回収を、オリゴまたはコントロール（ＰＢＳ）の最終投与の４日後である７日目に行った。
【００９８】
図７０Ｃおよび７０Ｄは、様々な５’および３’末端ＡＰＯＡ１オリゴで処置されたマウスにおけるＡＰＯＡ１タンパク質レベルを示しているウエスタンブロットの写真である。図７０Ｃの場合、サンプル１〜５は、ＰＢＳで処置された動物であり、サンプル６〜１０は、ＡＰＯＡ１＿ｍｕｓ−３＋ＡＰＯＡ１＿ｍｕｓ−１７オリゴで処置された動物由来である。星印で示されたレーン１０の血液サンプルは、溶血を含んだので、解析から省いた。図７０Ｄの場合、サンプル１〜５は、ＰＢＳで処置された動物であり、サンプル６〜１０は、ＡＰＯＡ１＿ｍｕｓ−７＋ＡＰＯＡ１＿ｍｕｓ−２０オリゴで処置された動物由来である。図７０Ｄにおける上のブロットは、１０匹の動物すべての採血前のデータを示している。下のプロットは、オリゴ処置後の血漿ＡＰＯＡ１レベルを示している。コントロールで処置されたサンプル４は、研究中に死亡したので、ブロットから省いた。
【発明を実施するための形態】
【００９９】
発明のある特定の実施形態の詳細な説明
本明細書中に開示される方法および組成物は、ＲＮＡを分解から保護すること（細胞の内側または外側でＲＮＡを保護することを含む）が望ましい種々の異なる状況において有用である。いくつかの実施形態において、標的化された様式で、細胞においてタンパク質および／またはＲＮＡのレベルを転写後に変化させるために有用な方法および組成物が提供される。例えば、標的化されたＲＮＡの分解またはプロセシングを減少させるかまたは妨げることにより、標的化されたＲＮＡの定常状態レベルを上昇させる工程を含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡの安定性は、そのＲＮＡの一方または両方の末端（５’または３’末端）をエキソヌクレアーゼ活性から保護することにより、そのＲＮＡの安定性を高めることによって、高められる。
【０１００】
いくつかの実施形態において、遺伝子発現を増加させる方法が提供される。本明細書中で使用されるとき、用語「遺伝子発現」とは、細胞、組織または被験体における遺伝子産物のレベルまたは提示のことを広く指す。遺伝子産物は、例えば、ＲＮＡ転写物またはタンパク質であり得ることが認識されるべきである。ＲＮＡ転写物は、タンパク質をコードするものであり得る。ＲＮＡ転写物は、タンパク質をコードしないもの、例えば、長い非コードＲＮＡ、遺伝子間の長い非コードＲＮＡ、非コードＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）または他の機能性ＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態において、遺伝子発現を増加させる方法は、ＲＮＡ転写物の安定性を高め、それにより、細胞内のＲＮＡ転写物のレベルを上昇させる工程を含み得る。遺伝子発現を増加させる方法は、代替的にまたは追加的に、ＲＮＡの転写または翻訳を増加させる工程を含み得る。いくつかの実施形態において、遺伝子発現を操作する他の機構が、本明細書中に開示される方法に含められ得る。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供される方法は、ＲＮＡ転写物と一方もしくは両方の末端または末端付近においてハイブリダイズして、それによりそのＲＮＡ転写物をエキソヌクレアーゼ媒介性分解から保護する１つまたはそれを超える配列特異的オリゴヌクレオチドを細胞に送達する工程を含む。標的化されたＲＮＡ転写物がタンパク質をコードするものである実施形態では、そのＲＮＡの定常状態レベルの上昇は、代表的には、コードされたタンパク質レベルの上昇を同時にもたらす。標的化されたＲＮＡが非コードである実施形態では、その非コードＲＮＡの定常状態レベルの上昇は、代表的には、非コードＲＮＡに関連する活性の増加を同時にもたらす。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を高める機構によって、ＲＮＡ転写物を標的化するオリゴヌクレオチドを使用してＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルを制御することに基づく本明細書中に開示されるアプローチは、他のタイプのオリゴまたは化合物（例えば、シスまたは非コードに基づく機構を使用して標的ＲＮＡの転写レベルを変化させるオリゴヌクレオチド）に勝るいくつかの利点を有し得る。例えば、いくつかの実施形態において、複数コピーの標的分子が存在する細胞質においてＲＮＡ転写物を標的化する際に、より低い濃度のオリゴが使用され得る。対照的に、いくつかの実施形態において、多くの場合、転写プロセスを標的化するオリゴは、核に入る前、および細胞１つあたり１コピー／２コピーしか存在しない対応するゲノム領域と相互作用する前に、細胞質を飽和させる必要がある場合がある。いくつかの実施形態において、ＲＮＡコピーは、転写的に合成される必要がないので、ＲＮＡ転写物の標的化に対する応答時間は、より短いことがある。いくつかの実施形態において、連続的な用量反応が、より容易に達成され得る。いくつかの実施形態において、明確に定義されたＲＮＡ転写物配列は、そのような転写物を標的化するオリゴヌクレオチドのデザインを容易にする。いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されるオリゴヌクレオチドデザインアプローチ、例えば、配列オーバーハング、ループおよび他の特徴を有するデザインは、他のタイプのオリゴヌクレオチド、例えば、転写プロセスを標的化するある特定のオリゴヌクレオチドと比べて、高いオリゴ特異性および高感受性を促進する。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供される方法は、ＲＮＡの５’および／または３’領域においてハイブリダイズすることによってそのＲＮＡを安定化するオリゴヌクレオチドの使用を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡとハイブリダイズすることによってそのＲＮＡの分解を妨げるかまたは阻害するオリゴヌクレオチドは、本明細書中において「安定化オリゴヌクレオチド」と称され得る。いくつかの例において、そのようなオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡとハイブリダイズし、エキソヌクレアーゼ媒介性分解を妨げるかまたは阻害する。エキソヌクレアーゼ媒介性分解の阻害には、エキソヌクレアーゼによる特定のＲＮＡの分解の範囲を縮小させることが含まれるが、これに限定されない。例えば、一本鎖ＲＮＡだけをプロセシングするエキソヌクレアーゼは、二重鎖領域を効果的にプロセシングできない（例えば、通過する）ので、そのエキソヌクレアーゼは、オリゴヌクレオチドがＲＮＡとハイブリダイズしている領域までそのＲＮＡの一部を切断し得る。したがって、いくつかの実施形態において、ＲＮＡの特定の領域を標的化するオリゴヌクレオチドを使用することにより、エキソヌクレアーゼによるその領域までのそのＲＮＡの分解の範囲をコントロールすることが可能になる。例えば、ＲＮＡの一端においてハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの使用は、その末端から一本鎖ＲＮＡだけをプロセシングするエキソヌクレアーゼによる分解を減少させ得るかまたは排除し得る。例えば、ＲＮＡの５’末端においてハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの使用は、５’から３’への方向で一本鎖ＲＮＡをプロセシングするエキソヌクレアーゼによる分解を減少させ得るかまたは排除し得る。同様に、ＲＮＡの３’末端においてハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの使用は、３’から５’への方向で一本鎖ＲＮＡをプロセシングするエキソヌクレアーゼによる分解を減少させ得るかまたは排除し得る。いくつかの実施形態において、オリゴがＲＮＡの５’領域と３’領域の両方においてハイブリダイズするとき、より低い濃度のオリゴが使用され得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡの５’領域と３’領域の両方にハイブリダイズするオリゴは、そのＲＮＡの５’および３’領域を分解（例えば、エキソヌクレアーゼによる分解）から保護する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡの５’領域と３’領域の両方にハイブリダイズするオリゴは、偽環状ＲＮＡ（例えば、その環から突出するポリＡテイルの領域を有する環状化したＲＮＡ、図３Ｂを参照のこと）を形成する。いくつかの実施形態において、偽環状ＲＮＡは、非偽環状ＲＮＡよりも高い効率で翻訳される。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡと相補性である複数の領域を含むオリゴヌクレオチドが使用され得、１つの領域では、そのオリゴヌクレオチドは、そのＲＮＡの５’末端または５’末端付近においてハイブリダイズし、別の領域では、それは、そのＲＮＡの３’末端または３’末端付近においてハイブリダイズし、それにより、そのＲＮＡが両方の末端においてエキソヌクレアーゼによって分解されるのが妨げられるかまたは阻害される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡの５’末端または５’末端付近とＲＮＡの３’末端または３’末端付近の両方においてハイブリダイズするとき、エキソヌクレアーゼ媒介性分解から保護される環状化した複合体が、結果として生じる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドが、ｍＲＮＡの５’末端または５’末端付近とｍＲＮＡの３’末端または３’末端付近の両方においてハイブリダイズするとき、結果として生じる環状化した複合体は、エキソヌクレアーゼ媒介性分解から保護され、その複合体におけるｍＲＮＡは、タンパク質に翻訳される能力を保持する。
【０１０５】
本明細書中で使用されるとき、用語「合成ＲＮＡ」とは、インビトロ転写反応または人工的な（非天然の）化学合成によって生成されるＲＮＡのことを指す。いくつかの実施形態において、合成ＲＮＡは、ＲＮＡ転写物である。いくつかの実施形態において、合成ＲＮＡは、タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、合成ＲＮＡは、機能性ＲＮＡ（例えば、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）である。いくつかの実施形態（ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓｔ）において、合成ＲＮＡは、１つまたはそれを超える修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、合成ＲＮＡは、最大０．５キロベース（ｋｂ）、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂまたはそれを超える長さである。いくつかの実施形態において、合成ＲＮＡは、０．１ｋｂ〜１ｋｂ、０．５ｋｂ〜２ｋｂ、０．５ｋｂ〜１０ｋｂ、１ｋｂ〜５ｋｂ、２ｋｂ〜５ｋｂ、１ｋｂ〜１０ｋｂ、３ｋｂ〜１０ｋｂ、５ｋｂ〜１５ｋｂまたは１ｋｂ〜３０ｋｂの長さの範囲内である。
【０１０６】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＲＮＡ転写物」とは、ポリメラーゼ酵素によって核酸から転写されたＲＮＡのことを指す。ＲＮＡ転写物は、細胞の内側または外側で生成され得る。例えば、ＲＮＡ転写物は、組換えポリメラーゼ酵素または精製されたポリメラーゼ酵素を利用するインビトロ転写反応を用いて、ＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ鋳型から生成され得る。ＲＮＡ転写物は、細胞において、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩまたはＩＩＩ）によってＤＮＡ鋳型（例えば、染色体遺伝子、発現ベクター）からも生成され得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物は、タンパク質をコードするｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物は、非コードＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物は、最大０．５キロベース（ｋｂ）、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂまたはそれを超える長さである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物は、０．１ｋｂ〜１ｋｂ、０．５ｋｂ〜２ｋｂ、０．５ｋｂ〜１０ｋｂ、１ｋｂ〜５ｋｂ、２ｋｂ〜５ｋｂ、１ｋｂ〜１０ｋｂ、３ｋｂ〜１０ｋｂ、５ｋｂ〜１５ｋｂまたは１ｋｂ〜３０ｋｂの長さの範囲内である。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物は、転写後に、例えば、７’−メチルグアノシンキャップでキャップされる。いくつかの実施形態において、７’−メチルグアノシンは、転写中に（例えば、ＲＮＡ転写物が２０〜５０ヌクレオチド長になる前に）グアニリルトランスフェラーゼによってＲＮＡ転写物に付加される。いくつかの実施形態において、７’−メチルグアノシンは、１番目に転写されたヌクレオチドに５’−５’三リン酸架橋を介して連結される。いくつかの実施形態において、キャップに対してすぐ内側のヌクレオチドは、Ｎ６メチル化されたアデノシンである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物のキャップに対してすぐ内側の１番目および２番目のヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル化されていない。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物のキャップに対してすぐ内側の１番目のヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル化されている。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物のキャップに対してすぐ内側の２番目のヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル化されている。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物のキャップに対してすぐ内側の１番目および２番目のヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル化されている。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物は、キャップされていない転写物（例えば、ミトコンドリア遺伝子から生成された転写物）である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物は、キャップされたが脱キャップされていない核ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡの脱キャップは、例えば、キャップに結合するｅＩＦ−４Ｅと競合し得る、Ｄｃｐ１およびＤｃｐ２から構成され得る、脱キャップ複合体によって触媒される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ脱キャップのプロセスは、５’一リン酸を露出しているＲＮＡ上における５’キャップ構造の加水分解を含む。いくつかの実施形態において、この５’一リン酸は、エキソヌクレアーゼＸＲＮ１に対する基質である。したがって、いくつかの実施形態において、ＲＮＡの５’領域を標的化するオリゴヌクレオチドは、脱キャップされたＲＮＡを安定化するため（または安定性を回復するため）に使用され得、例えば、それをＸＲＮ１などのエキソヌクレアーゼによる分解から保護する。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、インビトロ転写（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼまたは他の好適なポリメラーゼを介して行われる）が、ＲＮＡ転写物を生成するために使用され得る。いくつかの実施形態において、転写は、抗逆キャップアナログ（ＡＲＣＡ）（ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｃａｔ．＃Ｎ−７００３）の存在下において行われ得る。いくつかの実施形態において、ＡＲＣＡを用いた転写は、望ましい配向での、ＲＮＡに対するキャップ（例えば、キャップアナログ（ｍＣＡＰ））の挿入をもたらす。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、転写は、１つまたはそれを超える修飾ヌクレオチド（例えば、シュードウリジン、５−メチルシトシンなど）の存在下において行われ、それらの修飾ヌクレオチドは、ＲＮＡ転写物に組み込まれる。免疫刺激を減少させ、翻訳を増加させ、ヌクレアーゼ安定性を高める修飾ヌクレオチドを含むがこれらに限定されない任意の好適な修飾ヌクレオチドが使用され得ると認識されるべきである。使用され得る修飾ヌクレオチドの非限定的な例としては、２’−アミノ−２’−デオキシヌクレオチド、２’−アジド−２’−デオキシヌクレオチド、２’−フルオロ−２’−デオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル−ヌクレオチド、２’糖超修飾剤（ｓｕｇａｒ  ｓｕｐｅｒ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）、２’−修飾熱安定性向上剤（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）、２’−フルオロ−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸、２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、２’−フルオロ−２’−デオキシグアノシン−５’−三リン酸、２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸、２’−Ｏ−メチルアデノシン−５’−三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン−５’−三リン酸、２’−Ｏ−メチルグアノシン−５’−三リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン−５’−三リン酸、シュードウリジン−５’−三リン酸、２’−Ｏ−メチルイノシン−５’−三リン酸、２’−アミノ−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸、２’−アジド−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、２’−アジド−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸、２’−Ｏ−メチルシュードウリジン−５’−三リン酸、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン−５’−三リン酸、２’−アジド−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸、２’−アミノ−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸、２’−フルオロ−チミジン−５’−三リン酸、２’−アジド−２’−デオキシグアノシン−５’−三リン酸、２’−アミノ−２’−デオキシグアノシン−５’−三リン酸およびＮ４−メチルシチジン−５’−三リン酸が挙げられる。１つの実施形態において、ＲＮＡの分解またはプロセシングを減少させる／妨げることにより、定常状態のＲＮＡを増加させることができ、少なくともタンパク質をコードする転写物の場合はタンパク質レベルを上昇させることができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物の分解の大部分は、エキソヌクレアーゼによって行われる。そのような実施形態において、これらの酵素は、３’または５’末端のいずれかからＲＮＡの破壊を開始する。ＲＮＡの安定性は、ＲＮＡ転写物の末端をエキソヌクレアーゼ酵素活性から保護することによって、例えば、適切な送達、ハイブリダイゼーションおよび細胞内での安定性のために適切な化学的性質を有する配列特異的ブロッキングオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって、タンパク質をコードする転写物に対するタンパク質レベルとともに上昇し得る。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、５’末端に対しては、ＲＮＡの５’末端の１０〜２０ｎｔに完全／部分的に相補的なオリゴヌクレオチドが使用され得る。いくつかの実施形態において、そのようなオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡの５’キャップを保護するためにヘアピンを形成するオーバーハングを有し得る（例えば、オリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチドは、ｍＲＮＡの５’キャップのＧヌクレオシドと相互作用するＣであり得るがこれに限定されない）。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドのすべてが、平滑末端または陥凹末端の５’ＲＮＡ−オリゴ二重鎖をもたらす数ヌクレオチドのオーバーハングありまたはなしで、ＲＮＡ転写物の５’末端に相補的であり得る。いくつかの実施形態において、３’末端に対しては、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡの３’末端の最後のいくつかのヌクレオチドに部分的に相補的であり得、必要に応じて、ポリ（Ａ）テイルを完全な分解から保護するためにポリ（Ｔ）ストレッチを有し得る（ポリ（Ａ）テイルを有する転写物に対して）。いくつかの実施形態において、異なる５’および３’配列の組成および構造を有する他のＲＮＡ種（例えば、３’ポリ（Ｕ）ストレッチを含む転写物または代替の５’構造を有する転写物）に対しても同様のストラテジーが使用され得る。いくつかの実施形態において、例えば、オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドを含む、本明細書中に記載されるようなオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ配列に完全に相補的であるようにデザインされたオリゴヌクレオチドと比べて、それらの標的ＲＮＡ末端領域に対してより高い特異性および感受性を有し得る。なぜなら、オーバーハングは、ミスマッチ領域に不安定化作用をもたらし、それらのＲＮＡの５’または３’末端に存在する領域における結合を好むからである。いくつかの実施形態において、ループ形成機構を有するポリ（Ａ）テイルのまさしく３’末端を保護するオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＣＣ，配列番号４５８）。いくつかの実施形態において、この後者のアプローチは、タンパク質をコードする転写物のすべてを非特異的に標的化し得る。しかしながら、いくつかの実施形態において、そのようなオリゴヌクレオチドは、他の標的特異的オリゴとの併用において有用であり得る。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供される方法は、ＲＮＡ転写物の１番目に転写されたヌクレオチドまたはそのヌクレオチド付近における位置においてＲＮＡ転写物と相補的な相補性領域を含むオリゴヌクレオチドの使用を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ転写物を安定化するオリゴヌクレオチド）は、転写物の５’末端の１００ヌクレオチド以内、５０ヌクレオチド以内、３０ヌクレオチド以内、２０ヌクレオチド以内、１０ヌクレオチド以内または５ヌクレオチド以内に始まる位置にＲＮＡ転写物（例えば、少なくとも５個連続したヌクレオチド）と相補的な相補性領域を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ転写物を安定化するオリゴヌクレオチド）は、転写物の５’末端から始まる位置にＲＮＡ転写物（例えば、ＲＮＡ転写物の少なくとも５個連続したヌクレオチド）と相補的な相補性領域を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ転写物を安定化するオリゴヌクレオチド）は、転写物開始部位から、翻訳開始部位（例えば、転写物のＫｏｚａｋ配列の中に現れる開始コドンＡＵＧ）の５０、１００、１５０、２００、２５０、５００個またはそれを超えるヌクレオチド上流にまでに及ぶ、ＲＮＡ転写物の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）の領域内の位置におけるＲＮＡ転写物と相補的な相補性領域を含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物は、ポリアデニル化される。ポリアデニル化とは、ＲＮＡ転写物へのポリアデノシン（ポリ（Ａ））テイルの転写後付加のことを指す。タンパク質をコードするＲＮＡ転写物と非コードＲＮＡ転写物の両方が、ポリアデニル化され得る。ポリ（Ａ）テイルは、ヌクレオシド間結合を介して互いに連結された複数のアデノシンを含む。いくつかの実施形態において、ポリ（Ａ）テイルは、１０〜５０個、２５〜１００個、５０〜２００個、１５０〜２５０個またはそれを超えるアデノシンを含み得る。いくつかの実施形態において、ポリアデニル化（ｐｏｌｙａｄｅｎｌｙａｔｉｏｎ）のプロセスは、ＲＮＡ転写物のその３’末端または３’末端付近でのエンドヌクレアーゼ的（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）切断に続く、ポリアデニル酸ポリメラーゼによる転写物への複数のアデノシンの１つずつの付加を含み、それらのアデノシン（ａｄｅｎｏｎｓｉｎｅｓ）の１番目は、３’切断部位において転写物に付加される。したがって、しばしば、ポリアデニル化されたＲＮＡ転写物は、３’末端においてポリ（Ａ）テイルに連結される、ヌクレオシド間結合を介して互いに連結された、転写されたヌクレオチド（およびおそらく編集されたヌクレオチド）を含む。転写されたヌクレオチドとポリ（Ａ）テイルとの間の結合の位置は、本明細書中において「ポリアデニル化ジャンクション」と称され得る。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼ的切断は、ＲＮＡ転写物の中の、可能性のあるいくつかの部位のうちのいずれか１つにおいて生じ得る。そのような実施形態において、それらの部位は、エンドヌクレアーゼ機構によって認識されることによりその機構による切断の位置をガイドする、ＲＮＡ転写物の中の配列モチーフによって決定され得る。したがって、いくつかの実施形態において、ポリアデニル化は、単一の遺伝子から異なるＲＮＡ転写物を生成し得、例えば、ＲＮＡ転写物は、異なるポリアデニル化ジャンクションを有する。いくつかの実施形態において、ポリ（Ａ）テイルの長さは、３’−５’プロセシング活性を有するエキソヌクレアーゼによる酵素分解に対するＲＮＡ転写物の感受性を決定し得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物を３’末端または３’末端付近において標的化するオリゴヌクレオチドは、ポリアデニル化ジャンクションと重複する領域を標的化する。いくつかの実施形態において、そのようなオリゴヌクレオチドは、転写物の転写された部分（ジャンクションに対して５’）と相補的な少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個またはそれを超えるヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態において、ジャンクションのポリＡ側に相補的な、限られた数のヌクレオチド（例えば、Ｔ、Ｕ）を有することが有益である。いくつかの実施形態において、ジャンクションのポリＡ側に相補的な、限られた数のヌクレオチドを有することは、有益である。なぜなら、それにより、細胞において、非標的ＲＮＡのポリアデニル化領域とオリゴヌクレオチドとのクロスハイブリダイゼーションに関連する毒性が減少するからである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ポリＡ領域に相補的なヌクレオチドを１、２、３、４、５または６個しか有しない。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供される方法は、標的ＲＮＡ転写物とその３’末端もしくは３’末端付近においてハイブリダイズするものであって、３’−５’エキソヌクレアーゼによるＲＮＡ転写物の分解を妨げるかまたは阻害する、オリゴヌクレオチドの使用を含む。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されるＲＮＡ安定化方法は、ＲＮＡ転写物の最後に転写されるヌクレオチドの１００ヌクレオチド以内、５０ヌクレオチド以内、３０ヌクレオチド以内、２０ヌクレオチド以内、１０ヌクレオチド以内、５ヌクレオチド以内の位置におけるＲＮＡ転写物と相補的な相補性領域を含むオリゴヌクレオチドの使用を含む。ＲＮＡ転写物が、ポリアデニル化された転写物である場合、そのＲＮＡ転写物の最後に転写されるヌクレオチドは、ポリアデニル化ジャンクションの上流の１番目のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されるＲＮＡ安定化方法は、ＲＮＡ転写物のポリアデニル化ジャンクションとすぐ隣接しているかまたは重複している位置におけるＲＮＡ転写物と相補的な相補性領域を含むオリゴヌクレオチドの使用を含む。いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されるＲＮＡ安定化方法は、ポリ（Ａ）テイル内のＲＮＡ転写物と相補的な相補性領域を含むオリゴヌクレオチドの使用を含む。
【０１１５】
転写物開始部位およびポリアデニル化ジャンクションを同定するための方法は、当該分野で公知であり、その方法は、ＲＮＡ転写物を安定させるためにこれらの領域に特異的に結合するオリゴヌクレオチドを選択する際に使用され得る。いくつかの実施形態において、３’末端オリゴヌクレオチドは、ポリＡテイルの定量的末端解析を使用してＲＮＡの３’末端を同定することによってデザインされ得る。いくつかの実施形態において、５’末端オリゴヌクレオチドは、キャップ解析遺伝子発現（ＣＡＧＥ）を使用して５’開始部位を同定することによってデザインされ得る。適切な方法は、例えば、Ｏｚｓｏｌａｋら、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅ  Ｍａｐｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｖｅａｌ  Ｐｅｒｖａｓｉｖｅ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ．Ｖｏｌｕｍｅ  １４３，Ｉｓｓｕｅ  ６，２０１０，１０１８−１０２９頁；Ｓｈｉｒａｋｉ，Ｔら、Ｃａｐ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｕｓａｇｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１００（２６）：１５７７６−８１．２００３−１２−２３；およびＺｈａｏ，Ｘら（２０１１）．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｔａｒｔ  Ｓｉｔｅ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ（Ｐｕｂｌｉｃ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）６（８）：ｅ２３４０９（これらの各々の内容は、参照により本明細書中に援用される）に開示されている。転写物開始部位およびポリアデニル化ジャンクションを同定するための他の適切な方法もまた、使用され得、それらとしては、例えば、ＲＮＡペアエンドタグ（ＲＮＡ−Ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ  ｔａｇｓ）（ＰＥＴ）（例えば、Ｒｕａｎ  Ｘ，Ｒｕａｎ  Ｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２；８０９：５３５−６２を参照のこと）；標準的なＥＳＴデータベースの使用；マイクロアレイまたは配列決定と併用されるＲＡＣＥ、ＰＡＳ−Ｓｅｑ（例えば、Ｐｅｔｅｒ  Ｊ．Ｓｈｅｐａｒｄら、ＲＮＡ．２０１１  Ａｐｒｉｌ；１７（４）：７６１−７７２を参照のこと）；および３Ｐ−Ｓｅｑ（例えば、Ｃａｌｖｉｎ  Ｈ．Ｊａｎ，Ｎａｔｕｒｅ．２０１１  Ｊａｎｕａｒｙ  ６；４６９（７３２８）：９７−１０１を参照のこと；などが挙げられる。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、本明細書中に開示されるオリゴヌクレオチドによって標的化されるＲＮＡ転写物は、真核細胞のＲＮＡ転写物である。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示されるオリゴヌクレオチドによって標的化されるＲＮＡ転写物は、脊椎動物の細胞のＲＮＡ転写物である。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示されるオリゴヌクレオチドによって標的化されるＲＮＡ転写物は、哺乳動物の細胞、例えば、霊長類細胞、マウス細胞、ラット細胞またはヒト細胞のＲＮＡ転写物である。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示されるオリゴヌクレオチドによって標的化されるＲＮＡ転写物は、心筋細胞のＲＮＡ転写物である。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示されるオリゴヌクレオチドによって標的化されるＲＮＡ転写物は、細胞の核において転写されたＲＮＡである。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示されるオリゴヌクレオチドによって標的化されるＲＮＡ転写物は、細胞のミトコンドリアにおいて転写されたＲＮＡである。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示されるオリゴヌクレオチドによって標的化されるＲＮＡ転写物は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ酵素によって転写されたＲＮＡ転写物である。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、本明細書中に開示されるオリゴヌクレオチドによって標的化されるＲＮＡ転写物は、ＡＢＣＡ１、ＡＰＯＡ１、ＡＴＰ２Ａ２、ＢＤＮＦ、ＦＸＮ、ＨＢＡ２、ＨＢＢ、ＨＢＤ、ＨＢＥ１、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、ＳＭＮ、ＵＴＲＮ、ＰＴＥＮ、ＭＥＣＰ２およびＦＯＸＰ３からなる群より選択される遺伝子から発現されるｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示されるオリゴヌクレオチドによって標的化されるＲＮＡ転写物は、ＡＢＣＡ４、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＧ５、ＡＢＣＧ８、ＡＤＩＰＯＱ、ＡＬＢ、ＡＰＯＥ、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＲＣＡ１、ＣＤ２７４、ＣＥＰ２９０、ＣＦＴＲ、ＥＰＯ、Ｆ７、Ｆ８、ＦＬＩ１、ＦＭＲ１、ＦＮＤＣ５、ＧＣＨ１、ＧＣＫ、ＧＬＰ１Ｒ、ＧＲＮ、ＨＡＭＰ、ＨＰＲＴ１、ＩＤＯ１、ＩＧＦ１、ＩＬ１０、ＩＬ６、ＫＣＮＭＡ１、ＫＣＮＭＢ１、ＫＣＮＭＢ２、ＫＣＮＭＢ３、ＫＣＮＭＢ４、ＫＬＦ１、ＫＬＦ４、ＬＤＬＲ、ＭＳＸ２、ＭＹＢＰＣ３、ＮＡＮＯＧ、ＮＦ１、ＮＫＸ２−１、ＮＫＸ２−１−ＡＳ１、ＰＡＨ、ＰＴＧＳ２、ＲＢ１、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１９、ＳＣＡＲＢ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ６、ＳＭＡＤ７、ＳＴ７、ＳＴＡＴ３、ＴＳＩＸおよびＸＩＳＴからなる群より選択される遺伝子から発現されるｍＲＮＡである。これらのおよび他の遺伝子に対するＲＮＡ転写物は、実験によって、例えば、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）または他の適切な方法を用いて、選択され得るか、または同定され得る。ＲＮＡ転写物は、公的なデータベース（例えば、ＵＣＳＣ、ＥｎｓｅｍｂｌおよびＮＣＢＩゲノムブラウザなど）における情報に基づいても選択され得る。ある特定の遺伝子に対するＲＮＡ転写物の非限定的な例を表１に列挙する。
【表１Ａ−１】
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【表１Ａ−２】
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【表１Ａ−３】
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【表１Ａ−４】
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【表１Ａ−５】
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【表１Ａ−６】
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【表１Ａ−７】
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【表１Ａ−８】
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【表１Ａ−９】
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【表１Ａ−１０】
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【表１Ａ−１１】
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【表１Ａ−１２】
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【表１Ａ−１３】
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【表１Ａ−１４】
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オリゴヌクレオチド
【０１１８】
本明細書中に提供されるオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡの分解（例えば、エキソヌクレアーゼによって媒介される分解）を阻害するかまたは妨げることによってそのＲＮＡを安定化するために有用である。そのようなオリゴヌクレオチドは、「安定化オリゴヌクレオチド」と称され得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡの５’および／または３’領域においてハイブリダイズし、一本鎖プロセシング活性を有するエキソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）による分解を妨げることによってＲＮＡを安定化する二重鎖領域をもたらす。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物の５’領域の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な領域を有するオリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物の３’領域の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な領域を有するオリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物の５’領域の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な第１の領域およびＲＮＡ転写物の３’領域の少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な第２の領域を有するオリゴヌクレオチドが提供される。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ転写物の５’−ＵＴＲの少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な領域を有するオリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ転写物の３’−ＵＴＲの、ポリ（Ａ）テイルの、またはポリアデニル化ジャンクションと重複する、少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な領域を有するオリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ転写物の５’−ＵＴＲの少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な第１の領域、およびｍＲＮＡ転写物の３’−ＵＴＲの、ポリ（Ａ）テイルの、またはポリアデニル化ジャンクションと重複する、少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的な第２の領域を有するオリゴヌクレオチドが提供される。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物の５’末端と近接したＲＮＡ転写物に相補的な相補性領域を有するオリゴヌクレオチドが提供される。そのような実施形態において、そのオリゴヌクレオチドの相補性領域の３’末端におけるヌクレオチドは、ＲＮＡ転写物の転写開始部位の１０ヌクレオチド以内、２０ヌクレオチド以内、３０ヌクレオチド以内、４０ヌクレオチド以内、５０ヌクレオチド以内または１００ヌクレオチド以内、２００ヌクレオチド以内、３００ヌクレオチド以内、４００ヌクレオチド以内またはそれを超える位置におけるＲＮＡ転写物と相補的であり得る。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物の３’末端と近接したＲＮＡ転写物に相補的な相補性領域を有するオリゴヌクレオチドが提供される。そのような実施形態において、その相補性領域の３’末端および／または５’末端におけるヌクレオチドは、ＲＮＡ転写物の３’末端の１０ヌクレオチド以内、２０ヌクレオチド以内、３０ヌクレオチド以内、４０ヌクレオチド以内、５０ヌクレオチド以内、１００ヌクレオチド以内、２００ヌクレオチド以内、３００ヌクレオチド以内、４００ヌクレオチド以内またはそれを超える位置におけるＲＮＡ転写物と相補的であり得る。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡ転写物が、ポリアデニル化されている場合、オリゴヌクレオチドの相補性領域の３’末端におけるヌクレオチドは、ポリアデニル化ジャンクションの１０ヌクレオチド以内、２０ヌクレオチド以内、３０ヌクレオチド以内、４０ヌクレオチド以内、５０ヌクレオチド以内、１００ヌクレオチド以内、２００ヌクレオチド以内、３００ヌクレオチド以内、４００ヌクレオチド以内またはそれを超える位置におけるＲＮＡ転写物と相補的であり得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡの３’領域を標的化するオリゴヌクレオチドは、アデニンと相補的なピリミジンのひと続き（例えば、４〜１０個または５〜１５個のチミンヌクレオチド）である相補性領域を含む。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、５’標的化オリゴヌクレオチドと３’標的化オリゴヌクレオチドとの組み合わせを、標的ＲＮＡと接触させる。いくつかの実施形態において、５’標的化オリゴヌクレオチドおよび３’標的化オリゴヌクレオチドは、リンカー（例えば、標的ＲＮＡと相補的でないヌクレオチドのひと続き）を介して互いに連結される。いくつかの実施形態において、５’標的化オリゴヌクレオチドの相補性領域は、３’末端標的化オリゴヌクレオチドの相補性領域に相補的な標的ＲＮＡの領域から少なくとも２、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０００、５０００、１００００ヌクレオチド上流の、標的ＲＮＡの中の領域に相補的である。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、一般式５’−Ｘ１−Ｘ２−３’を有するオリゴヌクレオチドが提供され、式中、Ｘ１は、ＲＮＡ転写物（例えば、ＲＮＡ転写物の少なくとも５個連続したヌクレオチド）と相補的な相補性領域を有する。いくつかの実施形態において、Ｘ１の相補性領域の３’末端におけるヌクレオチドは、ＲＮＡ転写物の転写開始部位と近接したヌクレオチドと相補的であり得る。いくつかの実施形態において、Ｘ１の相補性領域の３’末端におけるヌクレオチドは、ＲＮＡ転写物の転写開始部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチド以内に存在するヌクレオチドと相補的であり得る。いくつかの実施形態において、Ｘ１の相補性領域の３’末端におけるヌクレオチドは、ＲＮＡ転写物の転写開始部位におけるヌクレオチドと相補的であり得る。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、Ｘ１は、５〜１０個のヌクレオチド、５〜１５個のヌクレオチド、５〜２５個のヌクレオチド、１０〜２５個のヌクレオチド、５〜２０個のヌクレオチドまたは１５〜３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｘ１は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０個またはそれを超えるヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｘ１の相補性領域は、ＲＮＡ転写物の少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個または少なくとも１０個連続したヌクレオチドと相補的であり得る。いくつかの実施形態において、Ｘ１の相補性領域は、ＲＮＡ転写物の４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれを超える数だけ連続したヌクレオチドと相補的であり得る。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、Ｘ２は、存在しない。いくつかの実施形態において、Ｘ２は、１〜１０個、１〜２０個のヌクレオチド、１〜２５個のヌクレオチド、５〜２０個のヌクレオチド、５〜３０個のヌクレオチド、５〜４０個のヌクレオチドまたは５〜５０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｘ２は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個またはそれを超えるヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｘ２は、ＲＮＡ転写物の少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個または少なくとも１０個連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を含む。いくつかの実施形態において、Ｘ２は、ＲＮＡ転写物の４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれを超える数だけ連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物は、その５’末端に７−メチルグアノシンキャップを有する。いくつかの実施形態において、Ｘ１の相補性領域の３’末端におけるヌクレオチドは、７−メチルグアノシンキャップに対してすぐ内側に存在するかまたはそのキャップと近接したＲＮＡ転写物のヌクレオチド（例えば、そのキャップの１０ヌクレオチド）と相補的である。いくつかの実施形態において、Ｘ２の５’末端における少なくとも１番目のヌクレオチドは、グアニンと相補的なピリミジン（例えば、シトシンまたはそのアナログ）である。いくつかの実施形態において、Ｘ２の５’末端における１番目および２番目のヌクレオチドは、グアニンと相補的なピリミジンである。したがって、いくつかの実施形態において、Ｘ２の５’末端における少なくとも１つのヌクレオチドは、そのキャップの７−メチルグアノシンと安定化水素結合を形成し得るピリミジンである。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、Ｘ２は、ステムループ構造を形成する。いくつかの実施形態において、Ｘ２は、式５’−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−３’を含み、ここで、Ｘ２は、Ｙ２のヌクレオチドを含むループ領域およびＹ３の少なくとも２個連続したヌクレオチドとハイブリダイズしたＹ１の少なくとも２個連続したヌクレオチドを含むステム領域を有するステムループ構造を形成する。いくつかの実施形態において、ステム領域は、１〜６個、１〜５個、２〜５個、１〜４個、２〜４個または２〜３個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ステム領域は、ＬＮＡヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ステム領域は、１〜６個、１〜５個、２〜５個、１〜４個、２〜４個または２〜３個のＬＮＡヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｙ１およびＹ３は、独立して、２〜１０個のヌクレオチド、２〜２０個のヌクレオチド、２〜２５個のヌクレオチドまたは５〜２０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｙ１およびＹ３は、独立して、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５個またはそれを超えるヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｙ２は、３〜１０個のヌクレオチド、３〜１５個のヌクレオチド、３〜２５個のヌクレオチドまたは５〜２０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｙ２は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５個またはそれを超えるヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｙ２は、２〜８個、２〜７個、２〜６個、２〜５個、３〜８個、３〜７個、３〜６個、３〜５個または３〜４個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｙ２は、少なくとも１つのＤＮＡヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｙ２のヌクレオチドは、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５個またはそれを超えるアデニン）を含む。いくつかの実施形態において、Ｙ３は、ステム領域の３’末端の後に１〜５個、１〜４個、１〜３個または１〜２個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ステム領域の３’末端の後のＹ３のヌクレオチドは、ＤＮＡヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、Ｙ３は、グアニンと相補的なピリミジン（例えば、シトシンまたはそのアナログ）を含む。いくつかの実施形態において、Ｙ３は、ステム領域の３’末端の後の位置にグアニンと相補的な１つまたはそれを超える（例えば、２つの）ピリミジン（例えば、ステム領域の３’末端の後に１、２、３個またはそれを超えるヌクレオチド）を含む。したがって、ＲＮＡ転写物がキャップされている実施形態では、Ｙ３は、そのキャップの７−メチルグアノシンと安定化水素結合を形成するピリミジンを有し得る。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、Ｘ１およびＸ２は、ＲＮＡ転写物の重複しない領域と相補的である。いくつかの実施形態において、Ｘ１は、ＲＮＡ転写物の５’領域と相補的な領域を含み、Ｘ２は、ＲＮＡ転写物ＲＮＡ転写物の３’領域と相補的な領域を含む。例えば、ＲＮＡ転写物が、ポリアデニル化されている場合、Ｘ２は、そのＲＮＡ転写物のポリアデニル化ジャンクションの１００ヌクレオチド以内、５０ヌクレオチド以内、２５ヌクレオチド以内または１０ヌクレオチド以内の領域におけるＲＮＡ転写物と相補的な相補性領域を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｘ２は、ＲＮＡ転写物のポリアデニル化ジャンクションとすぐ隣接しているかまたは重複しているＲＮＡ転写物と相補的な相補性領域を含む。いくつかの実施形態において、Ｘ２は、ＲＮＡ転写物のポリ（Ａ）テイルのアデニンヌクレオチドと相補的な少なくとも２個連続したピリミジンヌクレオチド（例えば、５〜１５個のピリミジンヌクレオチド）を含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、一般式５’−Ｘ１−Ｘ２−３’を含むオリゴヌクレオチドが提供され、式中、Ｘ１は、アデニンと塩基対を形成する少なくとも２つのヌクレオチド（例えば、チミジンもしくはウリジンまたはそれらのアナログ）を含み；Ｘ２は、ポリアデニル化されたＲＮＡ転写物の少なくとも３個連続したヌクレオチドと相補的な相補性領域を含み、ここで、Ｘ２の相補性領域の５’末端におけるヌクレオチドは、ＲＮＡ転写物のポリアデニル化ジャンクションに対してすぐ内側に存在するＲＮＡ転写物のヌクレオチドと相補的である。そのような実施形態において、Ｘ１は、２〜１０個、２〜２０個、５〜１５個または５〜２５個のヌクレオチドを含み得、Ｘ２は、独立して、２〜１０個、２〜２０個、５〜１５個または５〜２５個のヌクレオチドを含み得る。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、ヌクレオシド間結合を介して連結された少なくとも５つのヌクレオチド（例えば、５〜２５個のヌクレオチド）を含む第１のオリゴヌクレオチドおよびヌクレオシド間結合を介して連結された少なくとも５つのヌクレオチド（例えば、５〜２５個のヌクレオチド）を含む第２のオリゴヌクレオチドを含む組成物が提供され、ここで、第１のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ転写物の５’末端と近接した少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ転写物の３’末端と近接した少なくとも５個連続したヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドの５’末端は、第２のオリゴヌクレオチドの３’末端と連結される。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドの３’末端は、第２のオリゴヌクレオチドの５’末端と連結される。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドの５’末端は、第２のオリゴヌクレオチドの５’末端と連結される。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドの３’末端は、第２のオリゴヌクレオチドの３’末端と連結される。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドとは、リンカーによってつなげられる。用語「リンカー」は、通常、２つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチドを共有結合的に連結することができる化学的部分のことを指す。いくつかの実施形態において、リンカーは、ある特定の生物学的状況において、例えば、哺乳動物細胞の抽出物、例えば、エンドソーム抽出物中において、切断に対して抵抗性である。しかしながら、いくつかの実施形態において、リンカー内に構成されるまたは含まれる少なくとも１つの結合は、切断されることが可能であり（例えば、ある生物学的状況において、例えば、哺乳動物の抽出物、例えば、エンドソーム抽出物中において）、結合の切断の後、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドは、もはや互いに共有結合的に連結されない。いくつかの実施形態において、リンカーは、ＲＮＡ転写物と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドではない。いくつかの実施形態において、リンカーは、オリゴヌクレオチド（例えば、２〜８個のチミン）である。いくつかの実施形態において、リンカーは、ポリペプチドである。他の適切なリンカーも使用され得、それには、例えば、２０１３年３月２１日に公開されたＭＵＬＴＩＭＥＲＩＣ  ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ  ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳという表題の国際特許出願公開ＷＯ２０１３／０４０４２９Ａ１に開示されているリンカーが含まれる。リンカーに関するこの公報の内容は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【０１３３】
オリゴヌクレオチドは、等しい長さのオフターゲットＲＮＡ転写物のヌクレオチドの全配列と閾値レベル未満の相補性を有する標的ＲＮＡ転写物（例えば、哺乳動物（ｍａｍｍａｌｉｎ）ｍＲＮＡ転写物）と相補性領域を有し得る。例えば、オリゴヌクレオチドが、標的ＲＮＡ転写物以外の細胞内のＲＮＡ転写物を標的化する配列を有しないことを保証するように、オリゴヌクレオチドはデザインされ得る。配列同一性の閾値レベルは、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性であり得る。
【０１３４】
オリゴヌクレオチドは、異なる種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、サルなど）にわたる遺伝子のホモログによってコードされるＲＮＡ転写物に相補的であり得る。いくつかの実施形態において、これらの特色を有するオリゴヌクレオチドは、複数の種（例えば、ヒトおよびマウス）において有効性についてインビボまたはインビトロにおいて試験され得る。このアプローチは、ヒトの疾患に対して適切な動物が存在する種を選択することによって、そのヒト疾患を処置するための臨床候補の開発も容易にする。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの相補性領域は、標的ＲＮＡの少なくとも８〜１５、８〜３０、８〜４０または１０〜５０または５〜５０または５〜４０塩基、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個連続したヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施形態において、相補性領域は、標的ＲＮＡの少なくとも８個連続したヌクレオチドと相補的である。
【０１３６】
相補的とは、この用語が当該分野において使用されているように、２つのヌクレオチドの間で正確に対形成する能力のことを指す。例えば、オリゴヌクレオチドのある特定の位置におけるヌクレオチドが、標的ＲＮＡの対応する位置におけるヌクレオチドと水素結合することができる場合、そのオリゴヌクレオチドのヌクレオチドと標的ＲＮＡのヌクレオチドとは、その位置において互いに相補的である。オリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡとは、各分子における十分な数の対応する位置が、それらの塩基を介して互いと水素結合し得るヌクレオチドによって占められているとき、互いに相補的である。したがって、「相補的」は、オリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡとの間に安定した特異的結合が生じるような十分な程度の相補性または正確な対形成を示すために使用される用語である。例えば、オリゴヌクレオチドの１つの位置における塩基が、標的ＲＮＡの対応する位置における塩基と水素結合することができる場合、それらの塩基は、その位置において互いに相補的であると考えられる。１００％の相補性は、必要とされない。
【０１３７】
オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの連続したヌクレオチドに少なくとも８０％相補的（必要に応じて、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相補的のうちの１つ）であり得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの連続したヌクレオチドの部分と比べて、１、２または３塩基のミスマッチを含み得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１５塩基にわたって最大３つのミスマッチまたは１０塩基にわたって最大２つのミスマッチを有し得る。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、相補的な核酸配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的の核酸配列に１００％相補的である必要はない。いくつかの実施形態において、本開示の目的のオリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡとのハイブリダイゼーションが、標的ＲＮＡの分解を妨げるかまたは阻害するとき、ならびに非特異的結合の回避が望まれる条件下、例えば、インビボアッセイまたは治療的処置の場合の生理学的条件下、およびインビトロアッセイの場合の、それらのアッセイが好適なストリンジェンシー条件下で行われる条件下において、その配列と非標的配列との非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在するとき、そのオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡと特異的にハイブリダイズ可能である。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０ヌクレオチド長またはそれを超える。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、８〜５０、１０〜３０、９〜２０、１５〜３０または８〜８０ヌクレオチド長である。
【０１４０】
塩基対形成には、カノニカルなワトソン−クリック塩基対形成と非ワトソン−クリック塩基対形成（例えば、ゆらぎ塩基対形成およびフーグスティーン塩基対形成）の両方が含まれ得る。相補的な塩基対形成のために、アデノシンタイプの塩基（Ａ）は、チミジンタイプの塩基（Ｔ）またはウラシルタイプの塩基（Ｕ）に相補的であり、シトシンタイプの塩基（Ｃ）は、グアノシンタイプの塩基（Ｇ）に相補的であり、ユニバーサル塩基（例えば、３−ニトロピロールまたは５−ニトロインドール）は、任意のＡ、Ｃ、ＵまたはＴにハイブリダイズし得、任意のＡ、Ｃ、ＵまたはＴに相補的であると考えられると理解される。イノシン（Ｉ）も、ユニバーサル塩基であると当該分野において考えられており、任意のＡ、Ｃ、ＵまたはＴに相補的である。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、配列表に提供される配列を含む本明細書中に提供される配列におけるいずれか１つまたはそれを超えるチミジン（Ｔ）ヌクレオチド（またはその修飾ヌクレオチド）またはウリジン（Ｕ）ヌクレオチド（またはその修飾ヌクレオチド）は、アデノシンヌクレオチドとの塩基対形成（例えば、ワトソン−クリック塩基対を介したもの）に適した他の任意のヌクレオチドで置き換えられてもよい。いくつかの実施形態において、配列表に提供される配列を含む本明細書中に提供される配列におけるいずれか１つまたはそれを超えるチミジン（Ｔ）ヌクレオチド（またはその修飾ヌクレオチド）またはウリジン（Ｕ）ヌクレオチド（またはその修飾ヌクレオチド）は、異なるピリミジンヌクレオチドで適切に置き換えられてもよいし、逆もまた同じである。いくつかの実施形態において、配列表に提供される配列を含む本明細書中に提供される配列におけるいずれか１つまたはそれを超えるチミジン（Ｔ）ヌクレオチド（またはその修飾ヌクレオチド）は、ウリジン（Ｕ）ヌクレオチド（またはその修飾ヌクレオチド）で適切に置き換えられてもよいし、逆もまた同じである。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ひと続きのグアノシンヌクレオチド（例えば、３個またはそれを超える、４個またはそれを超える、５個またはそれを超える、６個またはそれを超える数だけ連続したグアノシンヌクレオチド）を含まない配列を有し得る。いくつかの実施形態において、ひと続きのグアノシンヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドは、ひと続きのグアノシンヌクレオチドを有しないオリゴヌクレオチドと比べて、高い非特異的結合および／またはオフターゲット効果を有する。３個またはそれを超えるＧまたはＣが連続した一続きは、いくつかの実施形態において、好ましくないことがある。したがって、いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、３個またはそれを超えるひと続きのグアノシンヌクレオチドを含まない。
【０１４３】
オリゴヌクレオチドは、３０％超のＧ−Ｃ含量、４０％超のＧ−Ｃ含量、５０％超のＧ−Ｃ含量、６０％超のＧ−Ｃ含量、７０％超のＧ−Ｃ含量または８０％超のＧ−Ｃ含量を有する配列を有し得る。オリゴヌクレオチドは、最大１００％のＧ−Ｃ含量、最大９５％のＧ−Ｃ含量、最大９０％のＧ−Ｃ含量または最大８０％のＧ−Ｃ含量を有する配列を有し得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのＧＣ含量は、好ましくは、約３０〜６０％である。
【０１４４】
本明細書中に提供される任意のオリゴヌクレオチドが除外され得ることが理解されるべきである。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、本明細書中に開示されるオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの安定性を少なくとも約５０％（すなわち、通常の１５０％または１．５倍）または約２倍〜約５倍高め得ることが見出された。いくつかの実施形態において、安定性（例えば、細胞における安定性）は、少なくとも約１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍もしくは１００倍または前述の数字のいずれかの間の任意の範囲だけ高められ得る。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡの高い安定性は、高いタンパク質発現に相関することが示されている。同様に、いくつかの実施形態において、非コードの高い安定性は、そのＲＮＡの高い活性と正に相関する。
【０１４６】
この説明全体におけるオリゴヌクレオチドまたは他の分子の使用に対するいずれの言及も、低レベルまたは低活性のＲＮＡ転写物に関連する状態または疾患の処置において使用するための薬学的組成物または薬の調製におけるそれらのオリゴヌクレオチドまたは他の分子の使用を企図していると理解される。したがって、１つの非限定的な例として、本発明のこの態様は、疾患の処置において使用するための薬の調製におけるオリゴヌクレオチドまたは他の分子の使用を含み、ここで、その処置は、標的化された様式でタンパク質レベルおよび／またはＲＮＡレベルを転写後に変化させることを含む。
オリゴヌクレオチド修飾
【０１４７】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写物を標的化して安定化するために、送達、ハイブリダイゼーションおよび細胞内での安定性に適した化学的性質を有するオリゴヌクレオチドが提供される。さらに、いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの薬物動態、体内分布、バイオアベイラビリティおよび／または有効性をコントロールするために有用なオリゴヌクレオチドの化学的性質が提供される。したがって、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドは、修飾され得、例えば、修飾された糖部分、修飾されたヌクレオシド間結合、修飾ヌクレオチドおよび／またはそれらの組み合わせを含み得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、以下の特性のうちの１つまたはそれを超える特性を示し得る：標的ＲＮＡの実質的な切断または分解を誘導しない；標的ＲＮＡの実質的に完全な切断または分解を引き起こさない；ＲＮＡｓｅＨ経路を活性化しない；ＲＩＳＣを活性化しない；いかなるＡｒｇｏｎａｕｔｅファミリータンパク質もリクルートしない；Ｄｉｃｅｒによって切断されない；選択的スプライシングを媒介しない；免疫賦活性でない；ヌクレアーゼ抵抗性である；無修飾のオリゴヌクレオチドと比べて改善された細胞取り込みを有する；細胞もしくは哺乳動物に対して毒性でない；および改善されたエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｅｘｉｔ）を有する。
【０１４８】
遺伝子発現を調節するＲＮＡと相互作用するようにデザインされたオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ標的に結合するようにデザインされたものと異なるサブセットの塩基配列である（例えば、ＲＮＡが転写される、基礎をなすゲノムＤＮＡ配列と相補的である）。
【０１４９】
本明細書中に開示される任意のオリゴヌクレオチドが、リンカー、例えば、切断可能なリンカーによって、本明細書中に開示される１つまたはそれを超える他のオリゴヌクレオチドに連結され得る。
【０１５０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾、例えば、ヌクレオチド修飾を組み込むことなどによって、核酸分解（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）に対して安定化され得る。例えば、本発明の核酸配列は、ヌクレオチド配列の５’または３’末端の少なくとも１番目、２番目または３番目のヌクレオチド間結合にホスホロチオエートを含む。別の例として、核酸配列は、２’−修飾ヌクレオチド、例えば、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）または２’−Ｏ−−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−−ＮＭＡ）を含み得る。別の例として、核酸配列は、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル−修飾ヌクレオチドを含み得、いくつかの実施形態において、それらのヌクレオチドのすべてが、２’−Ｏ−メチル修飾を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、「ロック」されており、すなわち、リボース環が、２’−Ｏ原子と４’−Ｃ原子とを接続するメチレン橋架けによって「ロック」されている、核酸アナログを含む。
【０１５１】
本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドの修飾される化学的性質または修飾される形式の任意のものが、互いと組み合わされ得、その１、２、３、４、５個またはそれを超える異なるタイプの修飾が、同じ分子の中に含められ得る。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのリボヌクレオチド、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドおよび／または少なくとも１つの橋架けヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、橋架けヌクレオチド（例えば、ロックト（ｌｏｃｋｅｄ）核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、拘束（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）エチル（ｃＥｔ）ヌクレオチドまたはエチレン橋架け核酸（ＥＮＡ）ヌクレオチド）を含み得る。そのようなヌクレオチドの例は、本明細書中に開示され、当該分野で公知である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下の米国特許または米国特許出願公開のうちの１つに開示されているヌクレオチドアナログを含む：米国特許第７，３９９，８４５号、同第７，７４１，４５７号、同第８，０２２，１９３号、同第７，５６９，６８６号、同第７，３３５，７６５号、同第７，３１４，９２３号、同第７，３３５，７６５号および同第７，８１６，３３３号、米国特許出願公開第２０１１０００９４７１号（これらの各々の全内容が、すべての目的のために参照により本明細書中に援用される）。オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれを超える２’Ｏ−メチルヌクレオチドを有し得る。オリゴヌクレオチドは、全体的に、２’Ｏ−メチルヌクレオチドからなり得る。
【０１５３】
しばしば、上記オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれを超えるヌクレオチドアナログを有する。例えば、上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチドアナログを有しないオリゴヌクレオチドと比べてそのオリゴヌクレオチドのＴｍを１℃、２℃、３℃、４℃または５℃の範囲内で上昇させる少なくとも１つのヌクレオチドアナログを有し得る。上記オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドアナログを有しないオリゴヌクレオチドと比べてそのオリゴヌクレオチドのＴｍを合計で２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃またはそれを超える範囲内で上昇させる複数のヌクレオチドアナログを有し得る。
【０１５４】
上記オリゴヌクレオチドは、最大５０ヌクレオチド長であり得、ここで、そのオリゴヌクレオチドの２〜１０個、２〜１５個、２〜１６個、２〜１７個、２〜１８個、２〜１９個、２〜２０個、２〜２５個、２〜３０個、２〜４０個、２〜４５個またはそれを超えるヌクレオチドが、ヌクレオチドアナログである。上記オリゴヌクレオチドは、８〜３０ヌクレオチド長であり得、ここで、そのオリゴヌクレオチドの２〜１０個、２〜１５個、２〜１６個、２〜１７個、２〜１８個、２〜１９個、２〜２０個、２〜２５個、２〜３０個のヌクレオチドが、ヌクレオチドアナログである。
【０１５５】
上記オリゴヌクレオチドは、８〜１５ヌクレオチド長であり得、ここで、そのオリゴヌクレオチドの２〜４個、２〜５個、２〜６個、２〜７個、２〜８個、２〜９個、２〜１０個、２〜１１個、２〜１２個、２〜１３個、２〜１４個のヌクレオチドが、ヌクレオチドアナログである。必要に応じて、そのオリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチド以外、すべてのヌクレオチドが修飾され得る。
【０１５６】
上記オリゴヌクレオチドは、全体的に、橋架けヌクレオチド（例えば、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド）からなり得る。上記オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドとが交互になっているものを含み得る。上記オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドとが交互になっているものを含み得る。上記オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドとＥＮＡヌクレオチドアナログとが交互になっているものを含み得る。上記オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドとＬＮＡヌクレオチドとが交互になっているものを含み得る。上記オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドとが交互になっているものを含み得る。上記オリゴヌクレオチドは、橋架けヌクレオチド（例えば、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド）である５’ヌクレオチドを有し得る。上記オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである５’ヌクレオチドを有し得る。
【０１５７】
上記オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドの５’および３’末端の各々において少なくとも１つの橋架けヌクレオチド（例えば、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド）に隣接したデオキシリボヌクレオチドを含み得る。上記オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドの５’および３’末端の各々において１、２、３、４、５、６、７、８個またはそれを超える橋架けヌクレオチド（例えば、ＬＮＡヌクレオチド、ｃＥｔヌクレオチド、ＥＮＡヌクレオチド）に隣接したデオキシリボヌクレオチドを含み得る。上記オリゴヌクレオチドの３’位は、３’ヒドロキシル基を有し得る。上記オリゴヌクレオチドの３’位は、３’チオホスフェートを有し得る。
【０１５８】
上記オリゴヌクレオチドは、標識に結合体化され得る。例えば、上記オリゴヌクレオチドは、その５’または３’末端において、ビオチン部分、コレステロール、ビタミンＡ、ホレート（ｆｏｌａｔｅ）、シグマレセプターリガンド、アプタマー、ペプチド、例えば、ＣＰＰ、疎水性分子、例えば、脂質、アシアロ糖タンパク質レセプターのリガンド（ＡＳＧＰＲ）、例えばＧａｌＮａｃ、またはダイナミックポリコンジュゲート（ｄｙｎａｍｉｃ  ｐｏｌｙｃｏｎｊｕｇａｔｅ）およびそれらのバリアントに結合体化され得る。
【０１５９】
好ましくは、上記オリゴヌクレオチドは、修飾された糖部分および／または修飾されたヌクレオシド間結合および／または修飾ヌクレオチドおよび／またはそれらの組み合わせを含む１つまたはそれを超える修飾を含む。所与のオリゴヌクレオチドにおけるすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際に、本明細書中に記載される１つより多い修飾が、単一のオリゴヌクレオチドに、またはあるオリゴヌクレオチドの中の単一のヌクレオシド内に組み込まれ得る。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、２つまたはそれを超える化学的に異なる領域（各々が、少なくとも１つのヌクレオチドで構成されている）を含むキメラオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、代表的には、１つまたはそれを超える有益な特性（例えば、高いヌクレアーゼ抵抗性、細胞内への多い取り込み、標的に対する高い結合親和性）を付与する修飾ヌクレオチドの少なくとも１つの領域、およびＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素に対する基質である領域を含む。本発明のキメラオリゴヌクレオチドは、上に記載されたような、２つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチド模倣物の複合構造物として形成され得る。そのような化合物は、当該分野ではハイブリッドまたはギャップマーとも称されている。そのようなハイブリッド構造の調製を教示している代表的な米国特許としては、米国特許第５，０１３，８３０号；同第５，１４９，７９７号；同第５，２２０，００７号；同第５，２５６，７７５号；同第５，３６６，８７８号；同第５，４０３，７１１号；同第５，４９１，１３３号；同第５，５６５，３５０号；同第５，６２３，０６５号；同第５，６５２，３５５号；同第５，６５２，３５６号；および同第５，７００，９２２号（これらの各々は参照により本明細書中に援用される）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、糖の２’位において修飾された少なくとも１つのヌクレオチド、最も好ましくは、２’−Ｏ−アルキル−修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル−修飾ヌクレオチドまたは２’−フルオロ−修飾ヌクレオチドを含む。他の好ましい実施形態において、ＲＮＡ修飾としては、ＲＮＡの３’末端のピリミジンのリボース上、無塩基残基上または反転した（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）塩基上の２’−フルオロ、２’−アミノおよび２’Ｏ−メチル修飾が挙げられる。そのような修飾は、日常的にオリゴヌクレオチドに組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対して、２’−デオキシオリゴヌクレオチドよりも高いＴｍ（すなわち、より高い標的結合親和性）を有することが示されている。
【０１６２】
いくつかのヌクレオチド修飾は、天然のオリゴデオキシヌクレオチドよりもヌクレアーゼ消化に対してより高い抵抗性が組み込まれたオリゴヌクレオチドをもたらすことが示されており；これらの修飾オリゴは、無修飾のオリゴヌクレオチドよりも長い時間にわたってインタクトな状態で残存する。修飾オリゴヌクレオチドの特定の例としては、修飾された骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキル糖間結合もしくはシクロアルキル糖間結合または短鎖ヘテロ原子糖間結合もしくは複素環式糖間結合を含むものが挙げられる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格；ヘテロ原子骨格（例えば、メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格）；アミド骨格（Ｄｅ  Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９５，２８：３６６−３７４を参照のこと）；モルホリノ骨格（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｅｒ、米国特許第５，０３４，５０６号を参照のこと）；またはペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（ここで、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格は、ポリアミド骨格で置き換えられ、それらのヌクレオチドは、ポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１，２５４，１４９７を参照のこと）を有し得る。リン含有結合としては、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに通常の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合アナログおよび極性が反転したもの（ここで、ヌクレオシド単位の隣接する対は、３’−５’と５’−３’または２’−５’と５’−２’とで連結される）が挙げられるが、これらに限定されない；米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；および同第５，６２５，０５０号を参照のこと。
【０１６３】
モルホリノに基づくオリゴマー化合物は、Ｄｗａｉｎｅ  Ａ．Ｂｒａａｓｃｈ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｒ．Ｃｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１（１４），４５０３−４５１０）；Ｇｅｎｅｓｉｓ，ｖｏｌｕｍｅ  ３０，ｉｓｓｕｅ  ３，２００１；Ｈｅａｓｍａｎ，Ｊ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２００２，２４３，２０９−２１４；Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０００，２６，２１６−２２０；Ｌａｃｅｒｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２０００，９７，９５９１−９５９６；および１９９１年７月２３日に発行された米国特許第５，０３４，５０６号に記載されている。いくつかの実施形態において、モルホリノに基づくオリゴマー化合物は、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）（例えば、Ｉｖｅｒｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，３：２３５−２３８，２００１；およびＷａｎｇら、Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．，１２：３５４−３６４，２０１０に記載されているようなもの；これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書中に援用される）である。
【０１６４】
シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣物は、Ｗａｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００，１２２，８５９５−８６０２に記載されている。
【０１６５】
中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルヌクレオシド間結合またはシクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子ヌクレオシド間結合とアルキルヌクレオシド間結合もしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合とが混合したもの（mixed  heteroatom  and  alkyl  or  cycloalkyl  internucleoside  linkages）、または１つもしくはそれを超える短鎖ヘテロ原子ヌクレオシド間結合もしくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合を有するもの（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；スルフィド骨格、スルホキシド骨格およびスルホン骨格；ホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ骨格およびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート骨格およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびにＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２の構成要素部分が混合したその他のものが含まれる；米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および同第５，６７７，４３９号（これらの各々は参照により本明細書中に援用される）を参照のこと。
【０１６６】
アラビノヌクレオチド残基もしくは修飾アラビノヌクレオチド残基に基づくかまたはそれらから構築されるオリゴヌクレオチドを含む修飾オリゴヌクレオチドも知られている。アラビノヌクレオシドは、リボヌクレオシドの立体異性体であり、糖環の２’位における配置だけが異なる。いくつかの実施形態において、２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆアラビノである。いくつかの実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、２’−フルオロ−Ｄ−アラビノ核酸（ＦＡＮＡ）（例えば、Ｌｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４１：３４５７−３４６７，２００２およびＭｉｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１２：２６５１−２６５４，２００２に記載されているようなもの；これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書中に援用される）である。類似の修飾は、糖における他の位置、特に、３’末端のヌクレオシド上の、または２’−５’連結されたオリゴヌクレオチドにおける糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位においても行われ得る。
【０１６７】
ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／６７３７８は、相補的なメッセンジャーＲＮＡへの会合を介した遺伝子発現の配列特異的阻害の改善のためのアラビノ核酸（ＡＮＡ）オリゴマーおよびそれらのアナログを開示している。
【０１６８】
他の好ましい修飾としては、エチレン橋架け核酸（ＥＮＡ）（例えば、国際特許公開番号ＷＯ２００５／０４２７７７、Ｍｏｒｉｔａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，Ｓｕｐｐｌ  １：２４１−２４２，２００１；Ｓｕｒｏｎｏら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１５：７４９−７５７，２００４；Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，８：１４４−１４９，２００６およびＨｏｒｉｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ（Ｏｘｆ），４９：１７１−１７２，２００５；これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書中に援用される）が挙げられる。好ましいＥＮＡとしては、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン橋架け核酸が挙げられるが、これに限定されない。
【０１６９】
ＬＮＡの例は、ＷＯ／２００８／０４３７５３に記載されており、それらとしては、以下の一般式の化合物が挙げられる。
【化１】
2016528897.tif 000017
式中、ＸおよびＹは、基−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ（Ｒ）−、−ＣＨ２−もしくは−ＣＨ−（二重結合の一部である場合）、−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−もしくは−ＣＨ２−ＣＨ−（二重結合の一部である場合）、−ＣＨ＝ＣＨ−の中から独立して選択され、ここで、Ｒは、水素およびＣ１−４−アルキルから選択され；ＺおよびＺ＊は、ヌクレオシド間結合、末端基または保護基の中から独立して選択され；Ｂは、天然または非天然のヌクレオチド塩基部分を構成し；不斉基は、いずれかの配向で見出され得る。
【０１７０】
好ましくは、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドにおいて使用されるＬＮＡは、以下の式のいずれかに記載の少なくとも１つのＬＮＡ単位を含み、
【化２】
2016528897.tif 000018
式中、Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−またはＮ（ＲＨ）であり；ＺおよびＺ＊は、ヌクレオシド間結合、末端基または保護基の中から独立して選択され；Ｂは、天然または非天然のヌクレオチド塩基部分を構成し、ＲＨは、水素およびＣ１−４−アルキルから選択される。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドにおいて使用されるロックト核酸（ＬＮＡ）は、ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２のスキーム２に示されているいずれかの式に記載の少なくとも１つのロックト核酸（ＬＮＡ）単位を含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、本発明のオリゴマーにおいて使用されるＬＮＡは、−０−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−０−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−０−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（ＲＨ）−Ｏ−、Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−から選択されるヌクレオシド間結合を含み、ここで、ＲＨは、水素およびＣ１−４−アルキルから選択される。
【０１７３】
ＬＮＡ単位の他の例を下に示す：
【化３】
2016528897.tif 000019
【０１７４】
用語「チオ−ＬＮＡ」は、上記の一般式におけるＸまたはＹのうちの少なくとも１つがＳまたは−ＣＨ２−Ｓ−から選択されるロックトヌクレオチドを含む。チオ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄ配置とアルファ−Ｌ配置との両方で存在し得る。
【０１７５】
用語「アミノ−ＬＮＡ」は、上記の一般式におけるＸまたはＹのうちの少なくとも１つが、−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ（Ｒ）−、ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−および−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−から選択されるロックトヌクレオチドを含み、ここで、Ｒは、水素およびＣ１−４−アルキルから選択される。アミノ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄ配置とアルファ−Ｌ配置との両方で存在し得る。
【０１７６】
用語「オキシ−ＬＮＡ」は、上記の一般式におけるＸまたはＹのうちの少なくとも１つが−Ｏ−または−ＣＨ２−Ｏ−を表わすロックトヌクレオチドを含む。オキシ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄ配置とアルファ−Ｌ配置との両方で存在し得る。
【０１７７】
用語「ｅｎａ−ＬＮＡ」は、上記の一般式におけるＹが−ＣＨ２−Ｏ−であるロックトヌクレオチドを含む（ここで、−ＣＨ２−Ｏ−の酸素原子は、塩基Ｂに対して２’位に結合する）。
【０１７８】
ＬＮＡは、本明細書中でさらに詳細に記載される。
【０１７９】
１つまたはそれを超える置換された糖部分、例えば、以下のうちの１つもまた、２’位に含められ得る：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３ＯＣＨ３、ＯＣＨ３Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２またはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ここで、ｎは１〜約１０である）；Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリール（ａｌｋａｒｙｌ）またはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基および類似の特性を有する他の置換基。好ましい修飾としては、２’−メトキシエトキシ［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）としても知られる２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３］（Ｍａｒｔｉｎら、ＨｅＩｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６）が挙げられる。他の好ましい修飾としては、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−プロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。類似の修飾が、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位においても行われ得る。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどの糖模倣物も有し得る。
【０１８０】
オリゴヌクレオチドは、追加的にまたは代わりに、核酸塩基（当該分野では単純に「塩基」と称されることが多い）の修飾または置換も含み得る。本明細書中で使用されるとき、「無修飾」または「天然」の核酸塩基には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾された核酸塩基には、天然の核酸ではまれにまたは一過性にのみ見出される核酸塩基、例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン、特に、５−メチルシトシン（５−メチル−２’デオキシシトシンとも称され、当該分野では５−Ｍｅ−Ｃと称されることが多い）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣおよびゲントビオシル（ｇｅｎｔｏｂｉｏｓｙｌ）ＨＭＣ、イソシトシン、シュードイソシトシン（ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、ならびに合成核酸塩基、例えば、２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ（ａｍｉｎｏａｌｋｌｙａｍｉｎｏ））アデニンまたは他のヘテロ置換アルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−プロピニルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン、６−アミノプリン、２−アミノプリン、２−クロロ−６−アミノプリンおよび２，６−ジアミノプリンまたは他のジアミノプリンが含まれる。例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，“ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８０，ｐｐ７５−７７；およびＧｅｂｅｙｅｈｕ，Ｇ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５：４５１３（１９８７））を参照のこと。当該分野で公知の「ユニバーサル」塩基、例えば、イノシンも含められ得る。５−Ｍｅ−Ｃ置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃高めることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，ｉｎ  Ｃｒｏｏｋｅ，ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、塩基置換として使用され得る。
【０１８１】
所与のオリゴヌクレオチドにおけるすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際に、本明細書中に記載される１つより多い修飾が、単一のオリゴヌクレオチドに、またはあるオリゴヌクレオチドの中の単一のヌクレオシド内に組み込まれ得る。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、糖とヌクレオシド間結合の両方、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格は、新規の基で置き換えられる。塩基の単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。そのようなオリゴマー化合物の１つである、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃ）は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、例えば、アミノエチルグリシン骨格で置き換えられている。核酸塩基は、保持され、その骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示している代表的な米国特許としては、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号（これらの各々は参照により本明細書中に援用される）が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００に見出すことができる。
【０１８３】
オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれを超える核酸塩基（当該分野では単純に「塩基」と称されることが多い）の修飾または置換も含み得る。本明細書中で使用されるとき、「無修飾」または「天然」の核酸塩基には、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾された核酸塩基には、他の合成および天然の核酸塩基（例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル誘導体および他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピル誘導体および他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニンおよび他の８−置換アデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニンおよび他の８−置換グアニン、５−ハロウラシル、特に、５−ブロモウラシル、５−トリフルオロメチルウラシルおよび他の５−置換ウラシル、５−ハロシトシン、特に、５−ブロモシトシン、５−トリフルオロメチルシトシンおよび他の５−置換シトシン、７−メチルグアニン（ｍｅｔｈｙｌｑｕａｎｉｎｅ）および７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン）が含まれる。
【０１８４】
さらに、核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、“Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，８５８−８５９頁，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの；Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｌｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３頁によって開示されたもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”２８９−３０２頁，Ｃｒｏｏｋｅ，ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３によって開示されたものを含む。これらの核酸塩基のうちのある特定のものが、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を高めるために特に有用である。これらには、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンならびにＮ−２、Ｎ−６および０−６置換プリンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２＜０＞Ｃ高めることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉら、ｅｄｓ，“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、より詳細には２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされるとき、現在、好ましい塩基置換である。修飾された核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに同第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，７５０，６９２号および同第５，６８１，９４１号（これらの各々は参照により本明細書中に援用される）に記載されている。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強する１つまたはそれを超える部分または結合体に化学的に連結される。例えば、同じまたは異なるタイプの１つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチドが、互いに結合体化され得るか；またはオリゴヌクレオチドは、ある細胞型もしくは組織型に対して高い特異性を有する標的化部分に結合体化され得る。そのような部分としては、脂質部分、例えば、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４；Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７−３７８３）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｃｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９−９７３）またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９−２３７）、あるいはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−ｔオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７）が挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；���第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号および同第５，６８８，９４１号（これらの各々は参照により本明細書中に援用される）も参照のこと。
【０１８６】
これらの部分または結合体には、１級または２級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合した結合体基が含まれ得る。本発明の結合体基には、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強する基およびオリゴマーの薬物動態学的特性を増強する基が含まれる。代表的な結合体基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、ホレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび色素が挙げられる。本発明の文脈における薬力学的特性を増強する基としては、取り込みを改善する基、分解に対する抵抗性を増強する基および／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が挙げられる。本発明の文脈における薬物動態学的特性を増強する基としては、本発明の化合物の取り込み、分布、代謝または排泄を改善する基が挙げられる。代表的な結合体基は、１９９２年１０月２３日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６および米国特許第６，２８７，８６０号（これらは、参照により本明細書中に援用される）に開示されている。結合体部分しては、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル−５−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール残基もしくはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、あるいはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号および同第５，６８８，９４１号を参照のこと。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの修飾には、そのオリゴヌクレオチドの５’または３’末端の修飾が含まれる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの３’末端は、ヒドロキシル基またはチオホスフェートを含む。さらなる分子（例えば、ビオチン部分またはフルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒ））が、オリゴヌクレオチドの５’または３’末端に結合体化され得ることが認識されるべきである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、５’ヌクレオチドに結合体化されたビオチン部分を含む。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ロックト核酸（ＬＮＡ）、ＥＮＡ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドまたは２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと２’−フルオロ−デオキシリボヌクレオチドとが交互になっているものを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドとが交互になっているものを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドとＥＮＡ修飾ヌクレオチドとが交互になっているものを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドとロックト核酸ヌクレオチドとが交互になっているものを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ロックト核酸ヌクレオチドと２’−Ｏ−メチルヌクレオチドとが交互になっているものを含む。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドは、ロックト核酸ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドの５’および３’末端の各々おいて少なくとも１つのロックト核酸ヌクレオチドに隣接したデオキシリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの３’位のヌクレオチドは、３’ヒドロキシル基または３’チオホスフェートを有する。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、すべてのヌクレオチドの間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
【０１９１】
オリゴヌクレオチドは、本明細書中に記載されるような任意の組み合わせの修飾を有し得ることが認識されるべきである。
【０１９２】
オリゴヌクレオチドは、以下の修飾パターンのうちの１つまたはそれを超えるパターンを有するヌクレオチド配列を含み得る。
（ａ）（Ｘ）Ｘｘｘｘｘｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘｘｘ、（Ｘ）ｘｘＸｘｘｘ、（Ｘ）ｘｘｘＸｘｘ、（Ｘ）ｘｘｘｘＸｘおよび（Ｘ）ｘｘｘｘｘＸ、
（ｂ）（Ｘ）ＸＸｘｘｘｘ、（Ｘ）ＸｘＸｘｘｘ、（Ｘ）ＸｘｘＸｘｘ、（Ｘ）ＸｘｘｘＸｘ、（Ｘ）ＸｘｘｘｘＸ、（Ｘ）ｘＸＸｘｘｘ、（Ｘ）ｘＸｘＸｘｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘＸｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘｘＸ、（Ｘ）ｘｘＸＸｘｘ、（Ｘ）ｘｘＸｘＸｘ、（Ｘ）ｘｘＸｘｘＸ、（Ｘ）ｘｘｘＸＸｘ、（Ｘ）ｘｘｘＸｘＸおよび（Ｘ）ｘｘｘｘＸＸ、
（ｃ）（Ｘ）ＸＸＸｘｘｘ、（Ｘ）ｘＸＸＸｘｘ、（Ｘ）ｘｘＸＸＸｘ、（Ｘ）ｘｘｘＸＸＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸｘｘ、（Ｘ）ＸＸｘｘＸｘ、（Ｘ）ＸＸｘｘｘＸ、（Ｘ）ｘＸＸｘＸｘ、（Ｘ）ｘＸＸｘｘＸ、（Ｘ）ｘｘＸＸｘＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸｘｘ、（Ｘ）ＸｘｘＸＸｘ（Ｘ）ＸｘｘｘＸＸ、（Ｘ）ｘＸｘＸＸｘ、（Ｘ）ｘＸｘｘＸＸ、（Ｘ）ｘｘＸｘＸＸ、（Ｘ）ｘＸｘＸｘＸおよび（Ｘ）ＸｘＸｘＸｘ、
（ｄ）（Ｘ）ｘｘＸＸＸ、（Ｘ）ｘＸｘＸＸＸ、（Ｘ）ｘＸＸｘＸＸ、（Ｘ）ｘＸＸＸｘＸ、（Ｘ）ｘＸＸＸＸｘ、（Ｘ）ＸｘｘＸＸＸＸ、（Ｘ）ＸｘＸｘＸＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸｘＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸｘ、（Ｘ）ＸＸｘｘＸＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸｘＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸＸｘ、（Ｘ）ＸＸＸｘｘＸ、（Ｘ）ＸＸＸｘＸｘおよび（Ｘ）ＸＸＸＸｘｘ、
（ｅ）（Ｘ）ｘＸＸＸＸＸ、（Ｘ）ＸｘＸＸＸＸ、（Ｘ）ＸＸｘＸＸＸ、（Ｘ）ＸＸＸｘＸＸ、（Ｘ）ＸＸＸＸｘＸおよび（Ｘ）ＸＸＸＸＸｘ、ならびに
（ｆ）ＸＸＸＸＸＸ、ＸｘＸＸＸＸＸ、ＸＸｘＸＸＸＸ、ＸＸＸｘＸＸＸ、ＸＸＸＸｘＸＸ、ＸＸＸＸＸｘＸおよびＸＸＸＸＸＸｘ（ここで、「Ｘ」は、ヌクレオチドアナログを表し、（Ｘ）は、任意選択のヌクレオチドアナログを表し、「ｘ」は、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド単位を表す）。上に列挙されたパターンの各々は、単独で、または他の開示された修飾パターンのいずれかと組み合わせて、オリゴヌクレオチド内に１回またはそれを超える回数だけ出現し得る。
遺伝子発現を調節するための方法
【０１９３】
１つの態様において、本発明は、細胞においてＲＮＡ転写物の安定性を調節する（例えば、高める）ための方法に関する。それらの細胞は、インビトロ、エキソビボまたはインビボにおけるものであり得る。それらの細胞は、ＲＮＡ転写物またはｍＲＮＡの場合はその対応するタンパク質産物の低発現または低活性に起因する疾患を有する被験体内のものであり得る。いくつかの実施形態において、細胞においてＲＮＡ転写物の安定性を調節するための方法は、ＲＮＡを標的化するものであって、エキソヌクレアーゼによるその分解を妨げるかまたは阻害する、オリゴヌクレオチドをその細胞に送達する工程を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドを細胞に送達することにより、コントロール細胞における標的ＲＮＡの安定性のレベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％またはそれより多く、標的ＲＮＡの安定性が高まる。適切なコントロール細胞は、オリゴヌクレオチドが送達されていない細胞またはネガティブコントロール（例えば、スクランブルオリゴ、キャリアなど）が送達された細胞であり得る。
【０１９４】
本発明の別の態様は、被験体における特定のＲＮＡの低レベルに関連する疾患または状態を処置する方法を提供する。したがって、いくつかの実施形態において、タンパク質レベルを高める目的で被験体の細胞においてｍＲＮＡの安定性を高めるために、本明細書中に記載されるようなオリゴヌクレオチドを含む組成物を被験体（例えば、ヒト）に投与する工程を含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、タンパク質レベルの上昇は、投与前の被験体（例えば、被験体の細胞または組織）またはオリゴヌクレオチドを投与されていないかもしくはネガティブコントロール（例えば、スクランブルオリゴ、キャリアなど）を投与されたコントロール被験体におけるタンパク質の量よりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％高いかまたはそれを超える。いくつかの実施形態において、非コードＲＮＡの活性を高める目的で、被験体の細胞においてその非コードＲＮＡの安定性を高めるために、本明細書中に記載されるようなオリゴヌクレオチドを含む組成物を被験体（例えば、ヒト）に投与する工程を含む方法が提供される。
【０１９５】
被験体には、非ヒト哺乳動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ウシまたはウマが含まれ得る。好ましい実施形態において、被験体は、ヒトである。オリゴヌクレオチドは、ヒトを含む動物における疾患状態の処置において治療用部分として使用され得る。オリゴヌクレオチドは、細胞、組織および動物、特に、ヒトを処置するための処置レジメンにおいて有用であるように設定され得る有用な治療様式であり得る。
【０１９６】
治療の場合、あるＲＮＡまたはタンパク質の低レベルに関連する疾患を有すると疑われる動物、好ましくは、ヒトは、本発明に係るオリゴヌクレオチドを投与することによって処置される。例えば、１つの非限定的な実施形態において、その方法は、処置を必要とする動物に、治療有効量の本明細書中に記載されるようなオリゴヌクレオチドを投与する工程を含む。表１には、ｍＲＮＡ転写物を安定化オリゴヌクレオチドで標的化することによって処置され得る疾患または状態の例を列挙した。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される方法において使用される細胞は、例えば、表１に列挙される１つまたはそれを超える状態を有する被験体または表１に列挙される１つまたはそれを超える状態の疾患モデルである被験体から得られる細胞であり得る。
【表１Ｂ−１】
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【表１Ｂ−２】
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【表１Ｂ−３】
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製剤、送達および投与
【０１９７】
本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドは、低レベルの遺伝子発現、または低レベルの遺伝子発現（例えば、低いタンパク質レベルまたは低レベルの機能性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡなど））をもたらすＲＮＡ転写物の不安定性もしくは低い安定性に関連する状態を処置するために被験体への投与に向けて製剤化され得る。製剤化、組成物および方法は、本明細書中に開示される任意のオリゴヌクレオチドを用いて実施され得ることが理解されるべきである。
【０１９８】
製剤は、単位剤形で提供されることが便利である場合があり、薬学の分野において周知の任意の方法によって調製され得る。単一の剤形を作製するためにキャリア材料と組み合わされ得る活性成分（例えば、本発明のオリゴヌクレオチドまたは化合物）の量は、処置される宿主、特定の投与様式、例えば、皮内または吸入に応じて、変動する。単一の剤形を作製するためにキャリア材料と組み合わされ得る活性成分の量は、一般に、治療効果、例えば、腫瘍退縮をもたらす化合物の量であり得る。
【０１９９】
本発明の薬学的製剤は、医薬の製造のために当該分野で公知の任意の方法に従って調製され得る。そのような製剤は、甘味剤、香味剤、着色剤および保存剤を含み得る。製剤は、製造に適した薬学的に許容され得る無毒性の添加剤と混ぜ合わされ得る。製剤は、１つまたはそれを超える賦形剤、乳化剤、保存剤、緩衝剤、添加剤などを含んでよく、液体、粉末、エマルジョン、凍結乾燥粉末、噴霧剤、クリーム、ローション、放出制御製剤、錠剤、丸剤、ゲル、パッチ、埋没物（implant）などのような形態で提供され得る。
【０２００】
製剤化されたオリゴヌクレオチド組成物は、種々の状態を想定し得る。いくつかの例では、その組成物は、少なくとも部分的に結晶性、均一に結晶性、および／または無水（例えば、８０、５０、３０、２０または１０％未満の水）である。別の例では、そのオリゴヌクレオチドは、水相中、例えば、水を含む溶液中に存在する。水相または結晶性の組成物は、例えば、送達ビヒクル、例えば、リポソーム（特に、水相のための）または粒子（例えば、結晶性組成物に適切であり得るような微小粒子）内に組み込まれ得る。通常、オリゴヌクレオチド組成物は、意図された投与方法と適合した様式で製剤化される。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、組成物は、以下の方法のうちの少なくとも１つによって調製される：噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、蒸発、流動層乾燥もしくはこれらの技法の組み合わせ；または脂質を用いた超音波処理、凍結乾燥、凝縮および他の自己集合。
【０２０２】
オリゴヌクレオチド調製物は、別の作用物質、例えば、別の治療薬、またはオリゴヌクレオチドを安定させる作用物質、例えば、オリゴヌクレオチドと複合体を形成するタンパク質と組み合わせて製剤化され得るかまたは投与され得る（共にまたは別々に）。なおも他の作用物質としては、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ（例えば、Ｍｇ２＋などの二価カチオンを除去するため）、塩、ＲＮＡｓｅ阻害剤（例えば、広範な特異性のＲＮＡｓｅ阻害剤、例えば、ＲＮＡｓｉｎ）などが挙げられる。
【０２０３】
１つの実施形態において、オリゴヌクレオチド調製物は、別のオリゴヌクレオチド、例えば、第２の遺伝子の発現を調節する第２のオリゴヌクレオチドまたは第１の遺伝子の発現を調節する第２のオリゴヌクレオチドを含む。なおも他の調製物は、少なくとも３、５、１０、２０、５０もしくは１００個またはそれを超える異なるオリゴヌクレオチド種を含み得る。そのようなオリゴヌクレオチドは、同様の数の異なる遺伝子に対する遺伝子発現を媒介し得る。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチド調製物は、少なくとも第２の治療薬（例えば、オリゴヌクレオチド以外の作用物質）を含む。
【０２０４】
本明細書中に開示される任意の製剤、賦形剤、ビヒクルなどが、細胞への合成ＲＮＡ（例えば、環状化した合成ＲＮＡ）の送達を容易にするために適合され得るかまたは使用され得る。本明細書中に開示される製剤、賦形剤、ビヒクルなどは、インビトロまたはインビボにおける細胞への合成ＲＮＡの送達を容易にするために適合され得るかまたは使用され得る。例えば、合成ＲＮＡ（例えば、環状化した合成ＲＮＡ）は、ナノ粒子、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リピドイド（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）、リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）、リポソーム、ポリマー、炭水化物（単糖類を含む）、カチオン性脂質、フィブリンゲル、フィブリンヒドロゲル、フィブリン糊、フィブリンシーラント、フィブリノゲン、トロンビン、迅速に排除される脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ）およびそれらの組み合わせを用いて製剤化され得る。いくつかの実施形態において、合成ＲＮＡは、細胞に裸で（ｇｙｍｎｏｔｉｃａｌｌｙ）送達され得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドまたは合成ＲＮＡは、細胞への送達を容易にする因子と結合体化され得る。いくつかの実施形態において、合成ＲＮＡ、または合成ＲＮＡを環状化させるために使用されるオリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮａｃなどの炭水化物または他の標的化部分に結合体化される。
送達経路
【０２０５】
オリゴヌクレオチドを含む組成物は、種々の経路によって被験体に送達され得る。例示的な経路としては、静脈内、皮内、局所、直腸、非経口、肛門、膣内、鼻腔内、肺、眼が挙げられる。用語「治療有効量」は、期待される生理反応をもたらすように処置される被験体において所望の遺伝子発現レベルを提供する（例えば、ＲＮＡ転写物を安定化することによって）ために必要な、組成物中に存在するオリゴヌクレオチドの量である。用語「生理的に有効な量」は、所望の緩和効果または治癒効果をもたらすために被験体に送達される量である。用語「薬学的に許容され得るキャリア」は、そのキャリアが、被験体に対して有意な毒物学的有害作用なしにその被験体に投与され得ることを意味する。
【０２０６】
本発明のオリゴヌクレオチド分子は、投与に適した薬学的組成物に組み込まれ得る。そのような組成物は、代表的には、１つまたはそれを超える種のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む。本明細書中で使用されるとき、術語「薬学的に許容され得るキャリア」は、薬学的投与と適合する任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含むことが意図される。薬学的に活性な物質に対するそのような媒体および作用物質の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または作用物質が、活性な化合物と適合しない場合を除いて、その組成物でのそれらの使用が企図される。補助的な活性な化合物もまた、組成物に組み込まれ得る。
【０２０７】
本発明の薬学的組成物は、局所処置が望まれるのか全身処置が望まれるのかに応じて、および処置される領域に応じて、いくつかの方法で投与され得る。投与は、局所（眼、膣、直腸、鼻腔内、経皮を含む）、経口または非経口であり得る。非経口投与には、点滴静注、皮下注射、腹腔内注射もしくは筋肉内注射、または髄腔内もしくは室内（intraventricular）投与が含まれる。
【０２０８】
投与の経路および部位は、標的化を増強するように選択され得る。例えば、筋細胞を標的とするためには、目的の筋肉への筋肉内注射が、当然の選択である。肺細胞は、オリゴヌクレオチドをエアロゾル形態で投与することによって標的とし得る。血管内皮細胞は、バルーンカテーテルをオリゴヌクレオチドでコーティングすることおよびオリゴヌクレオチドを機械的に導入することによって、標的化とし得る。
【０２０９】
局所投与とは、被験体の表面に製剤を直接接触させることによって被験体に送達することを指す。局所送達の最も一般的な形態は、皮膚への送達であるが、本明細書中に開示される組成物は、身体の他の表面、例えば、眼、粘膜、体腔の表面または内部の表面にも直接適用され得る。上で述べたように、最も一般的な局所送達は、皮膚への送達である。その用語は、局所および経皮を含むがこれらに限定されないいくつかの投与経路を包含する。これらの投与様式としては、代表的には、皮膚の浸透性障壁の浸透および標的組織または標的層への効率的な送達が挙げられる。局所投与は、表皮および真皮に浸透し、最終的には組成物の全身性送達を達成する手段として使用され得る。局所投与は、オリゴヌクレオチドを被験体の表皮もしくは真皮またはその特定の層あるいはその下にある組織に選択的に送達する手段としても使用され得る。
【０２１０】
局所投与用の製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤および散剤が挙げられ得る。従来の薬学的キャリア、水性基剤、粉末基剤または油性基剤、増粘剤などが必要であり得るか、または所望され得る。コーティングされたコンドーム、手袋などもまた有用であり得る。  
【０２１１】
経皮送達は、脂溶性治療剤を投与するための有益な経路である。真皮は、表皮よりも浸透性であるので、擦過した、熱傷したまたは剥皮された皮膚を通じた吸収がはるかにより迅速である。炎症、および皮膚への血流を増加させる他の生理学的状態もまた、経皮吸着を増強する。この経路を介した吸収は、油性ビヒクル（塗膏）を使用することまたは１つもしくはそれを超える浸透促進剤を使用することによって増強され得る。経皮経路を通じて本明細書中に開示される組成物を送達する他の有効な方法としては、皮膚の水和および放出制御局所パッチの使用が挙げられる。経皮経路は、全身治療および／または局所治療のために本明細書中に開示される組成物を送達する潜在的に有効な手段を提供する。さらに、イオン導入（電場の影響下での生体膜を通ったイオン性溶質の移入）、フォノフォレーシスまたはソノフォレーシス（生体膜、特に皮膚および角膜を越えた様々な治療薬の吸収を増強するための超音波の使用）ならびに投与位置および投与部位における保持に関するビヒクルの特色の最適化は、局所に適用された組成物を、皮膚および粘膜部位を越えて輸送するのを増強するために有用な方法であり得る。
【０２１２】
口腔粘膜（oral  membrane）と鼻粘膜の両方が、他の投与経路よりも利点を提供する。例えば、これらの膜を通って投与されるオリゴヌクレオチドは、迅速に作用を発生し得、治療的な血漿レベルを提供し得、肝臓代謝の初回通過効果を回避し得、適さない胃腸管（ＧＩ）環境へのオリゴヌクレオチドの曝露を回避し得る。さらなる利点としては、その膜部位に容易に接近できることが挙げられ、その結果、オリゴヌクレオチドは、容易に適用され、局在化し、除去され得る。
【０２１３】
経口送達では、組成物は、口腔の表面、例えば、舌の腹側表面の膜を含む舌下粘膜、および口腔底、または頬の裏打ちを構成する頬側粘膜に標的化され得る。舌下粘膜は、比較的浸透性であるので、多くの作用物質の迅速な吸収および許容され得るバイオアベイラビリティをもたらす。さらに、舌下粘膜は、好都合であり、許容可能であり、容易に接近可能である。
【０２１４】
オリゴヌクレオチドの薬学的組成物は、定量噴霧ディスペンサー、上に記載されたような混合ミセルの薬学的製剤および噴射剤から、吸入なしで、人間の頬腔に噴霧することによっても、頬腔へ投与され得る。１つの実施形態では、まずディスペンサーを振った後、薬学的製剤および噴射剤を頬腔に噴霧する。
【０２１５】
経口投与用の組成物には、散剤もしくは顆粒剤、水の懸濁液もしくは溶液、シロップ剤、スラリー、エマルジョン、エリキシル剤もしくは非水性媒体、錠剤、カプセル剤、舐剤またはトローチ剤が含まれる。錠剤の場合、使用され得るキャリアとしては、ラクトース、クエン酸ナトリウムおよびリン酸の塩が挙げられる。様々な崩壊剤（例えば、デンプン）および滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルク）が、錠剤において通常使用される。カプセルの形態での経口投与のための、有用な賦形剤は、ラクトースおよび高分子量ポリエチレングリコールである。水性懸濁液が経口使用のために必要とされるとき、核酸組成物は、乳化剤および懸濁化剤と混和され得る。所望であれば、ある特定の甘味剤および／または香味剤を加えることができる。
【０２１６】
非経口投与には、点滴静注、皮下注射、腹腔内注射もしくは筋肉内注射、髄腔内投与または室内投与が含まれる。いくつかの実施形態において、非経口（ｐａｒｅｎｔａｌ）投与は、疾患部位への直接的な投与（例えば、腫瘍内への注射）を含む。
【０２１７】
非経口投与用の製剤には、緩衝剤、賦形剤および他の好適な添加物も含み得る滅菌された水性液剤が含まれ得る。室内注射は、例えば、レザバーに取り付けられた、室内カテーテルによって促進され得る。静脈内で使用する場合、溶質の総濃度は、調製物を等張性にするようにコントロールされるべきである。
【０２１８】
本明細書中に記載されるいずれのオリゴヌクレオチドも、眼組織に投与され得る。例えば、組成物は、眼または周辺組織の表面、例えば、眼瞼の内側に適用され得る。眼に投与する場合、軟膏または滴下可能な液体が、塗布器または点眼器などの当該分野で公知の眼送達システムによって送達され得る。そのような組成物は、粘膜模倣物（ｍｕｃｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）（例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはポリ（ビニルアルコール））、保存剤（例えば、ソルビン酸、ＥＤＴＡまたは塩化ベンジルクロニウム（ｂｅｎｚｙｌｃｈｒｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ））ならびに通常量の賦形剤および／またはキャリアを含み得る。オリゴヌクレオチドは、眼の内部にも投与され得、選択された領域または構造物にそれを導入することができる針または他の送達デバイスによって導入され得る。
【０２１９】
肺送達組成物は、ある分散液（dispersion）を患者が吸入することによって送達され得、その組成物、好ましくは、その分散液中のオリゴヌクレオチドは、肺に到達でき、肺でそれは肺胞領域を通って血液循環中に直接、容易に吸収され得る。肺送達は、全身送達と、肺の疾患を処置するための局所送達の両方にとって有効であり得る。
【０２２０】
肺送達は、噴霧吸入される製剤、エアロゾル化された製剤、ミセル（ｍｉｃｅｌｌｕｌａｒ）製剤および乾燥粉末に基づく製剤の使用をはじめとした種々のアプローチによって達成され得る。送達は、液体噴霧吸入器、エアロゾルに基づく吸入器および乾燥粉末分散デバイスを用いて達成され得る。定量デバイスが好ましい。アトマイザまたは吸入器を使用する利点の１つは、それらのデバイスが自己充足型（ｓｅｌｆ−ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）であるので、汚染のおそれが最小になる点である。乾燥粉末分散デバイスは、例えば、容易に製剤化され得る作用物質を乾燥粉末として送達する。オリゴヌクレオチド組成物は、凍結乾燥粉末もしくは噴霧乾燥粉末として単独で、または好適な粉末キャリアと組み合わせて、安定に保管され得る。吸入用の組成物の送達は、タイマー、ドーズカウンター、計時デバイスまたは時間表示器（time  indicator）を備え得る投与タイミングエレメント（dosing  timing  element）によって媒介され得、該デバイスに組み込んだとき、エアロゾル薬の投与中の患者に対して用量の追跡、コンプライアンスのモニタリングおよび／または投与の始動（dose  triggering）を可能にする。
【０２２１】
用語「粉末」は、自由流動性であって、吸入デバイスにおいて容易に分散されることが可能であって、続いて被験体によって吸入されることが可能であり、その結果、それらの粒子が肺に到達して肺胞内への浸透が可能である、細かく分散した固体粒子からなる組成物を意味する。したがって、その粉末は、「呼吸に適する」と言われる。好ましくは、平均粒径は、直径約１０μｍ未満であり、好ましくは、比較的均一な球形の形状の分布を有する。より好ましくは、直径は、約７．５μｍ未満であり、最も好ましくは、約５．０μｍ未満である。通常、粒径分布は、直径約０．１μｍ〜約５μｍであり、特に、約０．３μｍ〜約５μｍである。
【０２２２】
用語「乾燥（した）」は、組成物が、約１０重量％（％ｗ）より少ない水、通常、約５％ｗより少ない、好ましくは、約３％ｗ未満である水分含有量を有することを意味する。乾燥組成物は、粒子が、吸入デバイスにおいて容易に分散可能であり、それによりエアロゾルが形成されるようなものであり得る。
【０２２３】
キャリアとして有用な薬学的添加剤のタイプとしては、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））、増量剤（例えば、炭水化物、アミノ酸およびポリペプチド）；ｐＨ調整剤または緩衝剤；塩（例えば、塩化ナトリウム）などが挙げられる。これらのキャリアは、結晶性もしくは非晶質の形態で存在し得るか、またはそれら２つの混合物であり得る。
【０２２４】
好適なｐＨ調整剤または緩衝剤としては、有機酸および有機塩基から調製される有機塩（例えば、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム）などが挙げられ；クエン酸ナトリウムが好ましい。オリゴヌクレオチドのミセル製剤の肺投与は、噴射剤（例えば、テトラフルオロエタン、ヘプタフルオロエタン、ジメチルフルオロプロパン、テトラフルオロプロパン、ブタン、イソブタン、ジメチルエーテルならびに他の非ＣＦＣ噴射剤およびＣＦＣ噴射剤）を用いる定量噴霧デバイスを通じて達成され得る。
【０２２５】
例示的なデバイスとしては、脈管構造内に導入されるデバイス、例えば、脈管組織の内腔に挿入されるデバイス、またはそのデバイス自体が脈管構造の一部を形成するデバイス（ステント、カテーテル、心臓弁および他の脈管デバイスを含む）が挙げられる。これらのデバイス、例えば、カテーテルまたはステントは、肺、心臓または脚の脈管構造に留置され得る。
【０２２６】
他のデバイスとしては、非脈管デバイス、例えば、腹膜または臓器もしくは腺組織に埋め込まれるデバイス、例えば、人工臓器が挙げられる。そのデバイスは、オリゴヌクレオチドに加えて治療用物質を放出することができ、例えば、あるデバイスは、インスリンを放出できる。
【０２２７】
１つの実施形態において、単位用量のまたは計量された用量の、オリゴヌクレオチドを含む組成物が、埋め込みデバイスによって分配される。そのデバイスは、被験体内のパラメータをモニターするセンサーを備え得る。例えば、そのデバイスは、例えばポンプ、および必要に応じて、関連する電子機器を備え得る。
【０２２８】
組織、例えば、細胞または臓器が、エキソビボにおいてオリゴヌクレオチドで処理され得、次いで、被験体に投与され得るかまたは移植され得る。その組織は、自己組織、同種異系組織または異種組織であり得る。例えば、組織は、移植片対宿主病を減少させるために処理され得る。他の実施形態において、その組織は、同種異系であり、その組織は、その組織における望まれない遺伝子発現を特徴とする障害を処置するために処理される。例えば、組織、例えば、造血細胞、例えば、骨髄造血細胞が、望まれない細胞増殖を阻害するために処理され得る。処理された組織の導入は、自己のものであるかまたは移植片であるかに関係なく、他の治療と併用され得る。いくつかの実施において、オリゴヌクレオチドで処理された細胞は、例えば、それらの細胞が埋没物を離れるのを妨げるが、身体からの分子がそれらの細胞に到達することを可能にし、それらの細胞によって産生される分子が身体に入ることを可能にする、半透性の多孔性隔膜によって、他の細胞から隔離される。１つの実施形態において、その多孔性隔膜は、アルギネートから形成されている。
【０２２９】
１つの実施形態において、避妊具が、オリゴヌクレオチドでコーティングされるか、またはオリゴヌクレオチドを含む。例示的な避妊具としては、コンドーム、ペッサリー、ＩＵＤ（植え込み型の子宮用デバイス）、避妊スポンジ（ｓｐｏｎｇｅｓ）、膣シース（ｖａｇｉｎａｌ  ｓｈｅａｔｈｓ）および受胎調節デバイスが挙げられる。
投与量
【０２３０】
１つの態様において、本発明は、オリゴヌクレオチドを（例えば、化合物として、または組成物の構成要素として）被験体（例えば、ヒト被験体）に投与する方法を特徴とする。１つの実施形態において、単位用量は、体重１ｋｇあたり約１０ｍｇ〜２５ｍｇである。１つの実施形態において、単位用量は、体重１ｋｇあたり約１ｍｇ〜１００ｍｇである。１つの実施形態において、単位用量は、体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇ〜５００ｍｇである。いくつかの実施形態において、単位用量は、体重１ｋｇあたり０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、５、１０、２５、５０または１００ｍｇより多い。
【０２３１】
規定の量は、疾患または障害、例えば、低レベルのＲＮＡまたはタンパク質に関連する疾患または障害を処置するためまたは予防するために有効な量であり得る。例えば、単位用量は、注射（例えば、静脈内または筋肉内）、吸入投与（ｉｎｈａｌｅｄ  ｄｏｓｅ）または局所適用によって投与され得る。
【０２３２】
いくつかの実施形態において、単位用量は、毎日投与される。いくつかの実施形態において、１日１回よりも低い頻度、例えば、２、４、８または３０日毎未満。別の実施形態において、単位用量は、ある頻度で投与されない（例えば、定期的な頻度で投与されない）。例えば、単位用量は、一度投与され得る。いくつかの実施形態において、単位用量は、１日１回よりも多く、例えば、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間に１回などで投与される。
【０２３３】
１つの実施形態において、被験体は、初回用量および１つまたはそれを超える維持用量のオリゴヌクレオチドを投与される。維持用量（単数または複数）は、一般に、初回用量より少なく、例えば、初回用量の２分の１より少ない。維持レジメンは、１日あたり体重１ｋｇあたり０．０００１〜１００ｍｇの範囲の用量（単数または複数）、例えば、１日あたり体重１ｋｇあたり１００、１０、１、０．１、０．０１、０．００１または０．０００１ｍｇで被験体を処置することを含み得る。維持用量は、１、５、１０または３０日毎に１回以下、投与され得る。さらに、処置レジメンは、特定の疾患の性質、その重症度および患者の全体的な状態に応じて変動する期間にわたって続き得る。いくつかの実施形態において、投与量は、１日１回以下、例えば、２４、３６、４８時間またはそれを超える時間ごとに１回以下、例えば、５または８日毎に１回以下、送達され得る。処置の後、患者は、状態の変化および疾患状態に関する症候の軽減についてモニターされ得る。その患者が現在の投与量レベルに有意に反応しない場合は、オリゴヌクレオチドの投与量を増加させてもよいし、疾患状態に関する症候の軽減が観察された場合、疾患状態が除去された場合、または望まれない副作用が観察された場合は、その用量を減少させてもよい。
【０２３４】
有効用量は、所望されるとき、または特定の状況下において適切であると見なされるとき、単回用量または２回もしくまたはそれ超の用量で投与され得る。繰り返しのまたは頻繁な注入を容易にすることが所望される場合、送達デバイス、例えば、ポンプ、半永久的ステント（例えば、静脈内、腹腔内、槽内または嚢内）またはレザバーの埋め込みが得策であり得る。
【０２３５】
場合によっては、患者は、他の治療様式と併せてオリゴヌクレオチドで処置される。
【０２３６】
処置が成功した後、その疾患状態の再発を防ぐために患者に維持療法を施すことが望ましい場合があり、その維持療法では、本発明の化合物は、体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲の維持用量で投与される。
【０２３７】
オリゴヌクレオチド組成物の濃度は、障害の処置または予防において有効であるのに十分な量またはヒトの生理学的状態を制御するのに十分な量である。投与されるオリゴヌクレオチドの濃度または量は、その作用物質に対して測定されるパラメータおよび投与の方法、例えば、経鼻、頬側、肺投与に依存する。例えば、経鼻製剤は、鼻腔の刺激作用または灼熱感（ｂｕｒｎｉｎｇ）を回避するために、いくつかの成分をより低い濃度にする必要がある傾向があり得る。好適な経鼻製剤を提供するために経口製剤を最大１０〜１００倍希釈することが時折望ましい。
【０２３８】
ある特定の因子は、被験体を効果的に処置するために必要とされる投与量に影響し得、その因子としては、疾患または障害の重症度、以前の処置、被験体の全般的な健康状態および／または年齢、ならびに存在する他の疾患が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、治療有効量のオリゴヌクレオチドでの被験体の処置には、単回の処置を含み得るか、または好ましくは、一連の処置を含み得る。処置のために使用されるオリゴヌクレオチドの有効な投与量は、特定の処置の経過にわたって増加させてもよいし、減少させてもよいことも認識される。例えば、被験体は、オリゴヌクレオチド組成物を投与した後にモニターされ得る。モニタリングからの情報に基づいて、さらなる量のオリゴヌクレオチド組成物が、投与され得る。
【０２３９】
投与は、数日間から数ヶ月間続くかまたは治癒がもたらされるまでもしくは疾患状態の減少が達成されるまで続く処置の経過にわたる、処置される疾患状態の重症度および応答性に依存する。当業者は、最適な投与量、投与方法および反復の割合を容易に決定できる。最適な投与量は、個々の化合物の相対的な効力に応じて変動し得、一般に、インビトロおよびインビボ動物モデルにおいて有効であると見出されたＥＣ５０に基づいて推定され得る。
【０２４０】
１つの実施形態において、オリゴヌクレオチド組成物の投与は、非経口、例えば、静脈内（例えば、ボーラスとしてまたは拡散可能な注入として）、皮内、腹腔内、筋肉内、髄腔内、室内、頭蓋内、皮下、経粘膜、頬側、舌下、内視鏡的、直腸、経口、膣、局所、肺、鼻腔内、尿道または眼である。投与は、被験体または別の人間、例えば、医療提供者によって提供され得る。組成物は、測定された用量でまたは計量された用量を送達するディスペンサーにおいて提供され得る。選択される送達様式は、下記で詳細に述べられる。
キット
【０２４１】
本発明のある特定の態様において、オリゴヌクレオチドを含む組成物が収容されている容器を備えるキットが提供される。いくつかの実施形態において、その組成物は、オリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物である。いくつかの実施形態において、その薬学的組成物の個々の構成要素は、１つの容器の中に提供され得る。あるいは、薬学的組成物の構成要素を、２つまたはそれを超える容器の中に別々に提供すること、例えば、オリゴヌクレオチドに対して１つの容器およびキャリア化合物に対して少なくとも別の容器の中に提供することが望ましい場合がある。そのキットは、いくつかの異なる構成で包装され得る（例えば、単一の箱の中の１つまたはそれを超える容器）。それらの異なる構成要素は、例えば、そのキットとともに提供される指示に従って、混和され得る。それらの構成要素は、例えば、薬学的組成物を調製し、投与するために、本明細書中に記載される方法に従って混和され得る。そのキットは、送達デバイスも備え得る。
【０２４２】
本発明は、さらなる限定と決して解釈されるべきでない以下の実施例によってさらに例証される。本願全体にわたって引用されたすべての参考文献（参照文献、発行された特許、公開された特許出願および同時係属の特許出願を含む）の全内容は、明確に参照により本明細書に援用される。
【実施例】
【０２４３】
実施例１．ＲＮＡの５’および３’末端を標的化するためのオリゴヌクレオチド
ｍＲＮＡの安定性を高めるためのいくつかの例示的なオリゴヌクレオチドデザインスキームが、本明細書中で企図される。ＲＮＡの３’末端を標的化するオリゴヌクレオチドに関して、少なくとも２つの例示的なデザインスキームが企図される。第１のスキームとして、ポリＡテイルの前の、ＲＮＡの３’末端に相補的なオリゴヌクレオチドをデザインする（図１）。第２のスキームとして、ポリＡテイルにハイブリダイズする５’ポリＴ領域を有するＲＮＡの３’末端に相補的なオリゴヌクレオチドをデザインする（図１）。
【０２４４】
ＲＮＡの５’末端を標的化するオリゴヌクレオチドに関して、少なくとも３つの例示的なデザインスキームが企図される。スキーム１の場合、ＲＮＡの５’末端に相補的なオリゴヌクレオチドをデザインする（図２）。スキーム２の場合、ＲＮＡの５’末端に相補的であり、陥凹末端を有するＲＮＡ−オリゴ二重鎖を形成する３’オーバーハングを有するオリゴヌクレオチドをデザインする。この例では、オーバーハングは、５’メチルグアノシンキャップと潜在的に相互作用し得、そのキャップをさらに安定化し得る１つまたはそれを超えるＣヌクレオチド、例えば、２つのＣである（図２）。そのオーバーハングは、潜在的に別のタイプのヌクレオチドでもあり得、Ｃに限定されない。スキーム３の場合、５’ＲＮＡキャップを安定化するループ領域を含むようにオリゴヌクレオチドをデザインする。
【０２４５】
実施例１に記載されたようにデザインされたオリゴヌクレオチドが、実施例２において概要が述べられる方法を用いてｍＲＮＡの安定性を高めることによってＲＮＡをアップレギュレートする能力について試験され得る。
実施例２：フラタキシンの５’および３’末端を標的化するためのオリゴ
材料および方法：
リアルタイムＰＣＲ
【０２４６】
ＲＮＡ解析、ｃＤＮＡ合成およびＱＲＴ−ＰＣＲを、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣｔキットおよびＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ装置を用いて行った。構成的に発現される様々なハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡに対するベースラインレベルも測定した。標的遺伝子とほぼ同じレベルのベースライン発現を有する「コントロール」ハウスキーピング遺伝子を、比較目的のために選択した。
ウエスタンブロット
【０２４７】
ウエスタンブロットは、以前に報告されたように行った。ＫＬＦ４抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ４０３８Ｓ）を１：１０００希釈で使用した。蛍光標識された抗ウサギ抗体を使用して、ＵＶＰ  ＣｈｅｍｉｃＤｏｃ−Ｉｔ装置において、像を取得した。
ＥＬＩＳＡ
【０２４８】
ＥＬＩＳＡアッセイは、Ａｂｃａｍ  Ｆｒａｔａｘｉｎ  ＥＬＩＳＡキット（ａｂ１１５３４６）を製造者の指示書に従って使用して行った。
細胞株
【０２４９】
当該分野で公知の条件を用いて細胞を培養した。本明細書中に記載される実験において使用した細胞株の詳細を表２に提供する。
【表２】
2016528897.tif 000023
アクチノマイシンＤ処理
【０２５０】
アクチノマイシンＤ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１０マイクログラム／ｍｌの濃度で細胞培養液に加え、インキュベートした。Ｔｒｉｚｏｌ（Ｓｉｇｍａ）を製造者の指示書に従って使用して、ＲＮＡの単離を行った。ＦＸＮプローブおよびｃ−Ｍｙｃプローブは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。
オリゴヌクレオチドデザイン
【０２５１】
ＦＸＮ  ｍＲＮＡの５’および３’末端を標的化するオリゴヌクレオチドをデザインした。以前に記載されたように、ポリＡテイルの定量的末端解析を使用して推定ｍＲＮＡの３’末端を同定することによって、３’末端オリゴヌクレオチドをデザインした（例えば、Ｏｚｓｏｌａｋら、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅ  Ｍａｐｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｖｅａｌ  Ｐｅｒｖａｓｉｖｅ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ．Ｖｏｌｕｍｅ  １４３，Ｉｓｓｕｅ  ６，２０１０，１０１８−１０２９頁を参照のこと）。図４は、同定されたポリＡ部位を示している。以前に記載されたように、キャップ解析遺伝子発現（ＣＡＧＥ）を使用して潜在的な５’開始部位を同定することによって、５’末端オリゴヌクレオチドをデザインした（例えば、Ｃａｐ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｕｓａｇｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１００（２６）：１５７７６−８１．２００３−１２−２３およびＺｈａｏ，Ｘｉａｏｂｅｉ（２０１１）．“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｔａｒｔ  Ｓｉｔｅ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ”．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ（Ｐｕｂｌｉｃ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）６（８）：ｅ２３４０９を参照のこと）。図５は、同定された５’開始部位を示している。図６は、デザインされた５’および３’末端オリゴヌクレオチドの位置を提供している。
【０２５２】
ｍＲＮＡ−Ｓｅｑシグナルおよびリボソームポジショニングに対するある特定のデザインされたオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド位置もまた、公的なデータセットを使用して計算した（Ｇｕｏ，Ｈ．，Ｉｎｇｏｌｉａ，Ｎ．Ｔ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｓ．，＆  Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．（２０１０）．Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ  ａｃｔ  ｔｏ  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｍＲＮＡ  ｌｅｖｅｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ，４６６（７３０８），８３５−４０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９２６７）。これらのデータセットに対するオリゴヌクレオチド位置を図６９に示す。
【０２５３】
各オリゴヌクレオチドの配列および構造を表３に示す。表５は、表３、７、８  ９、１０、１１および１２に記載されている、試験されたある特定のオリゴヌクレオチドに対して使用されたヌクレオチドアナログ、修飾およびヌクレオシド間（ｉｎｔｒａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）結合の説明を提供している。表３および表４におけるある特定のオリゴは、２つのオリゴ名「オリゴ名」および「代替オリゴ名」を有し、これらは、本明細書中で交換可能に使用され、同じオリゴのことを指すと理解されるべきである。
【表３−１】
2016528897.tif 000024
【表３−２】
2016528897.tif 000025
【表３−３】
2016528897.tif 000026
【表３−４】
2016528897.tif 000027
【表３−５】
2016528897.tif 000028
【表３−６】
2016528897.tif 000029
【表４−１】
2016528897.tif 000030
【表４−２】
2016528897.tif 000031
【表４−３】
2016528897.tif 000032
【表４−４】
2016528897.tif 000033
【表４−５】
2016528897.tif 000034
【表４−６】
2016528897.tif 000035
【表４−７】
2016528897.tif 000036
【表４−８】
2016528897.tif 000037
【表４−９】
2016528897.tif 000038
【表４−１０】
2016528897.tif 000039
【表４−１１】
2016528897.tif 000040
【表４−１２】
2016528897.tif 000041
【表４−１３】
2016528897.tif 000042
【表４−１４】
2016528897.tif 000043
【表５−１】
2016528897.tif 000044
【表５−２】
2016528897.tif 000045
オリゴヌクレオチドによる細胞のインビトロトランスフェクション
【０２５４】
細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに２５，０００細胞／５００μＬの密度で播種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅおよび一本鎖オリゴヌクレオチドを用いてトランスフェクションを行った。コントロールウェルには、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅだけを含めた。トランスフェクション後の時点において、およそ２００μＬの細胞培養上清をＥＬＩＳＡ用またはウエスタンブロット解析用に−８０Ｃで保管し、別の細胞アリコートからＲＮＡを回収し、上で概要を述べたように定量的ＰＣＲを行った。各オリゴヌクレオチドによる標的ｍＲＮＡ発現のパーセント誘導を、オリゴヌクレオチドの存在下のｍＲＮＡレベルをコントロールの存在下（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅのみ）のｍＲＮＡレベルに対して正規化することによって、測定した。
【０２５５】
コントロールとして、上記オリゴを細胞傷害作用について試験した。オリゴでトランスフェクトされた細胞は、１００または４００ｎＭオリゴ濃度において細胞傷害性を示さなかったと判定された（図１５）。
結果：
ＦＸＮ  ｍＲＮＡの５’および３’末端を標的化する一本鎖オリゴヌクレオチドのインビトロ送達は、ＦＸＮ発現をアップレギュレートした
【０２５６】
ＦＸＮは、アップレギュレートしづらいハウスキーピング遺伝子であるので、ＦＸＮを、ＲＮＡの安定化のための例示的な標的として選択した。上に記載された方法を使用して、ＦＸＮ  ｍＲＮＡの推定５’および３’末端に対してオリゴヌクレオチドをデザインした。それらの３’および５’オリゴを、まずは別々に試験し、次いで組み合わせて試験した。
【０２５７】
最初に、３’および５’オリゴを、フリードライヒ運動失調症を有する患者由来の細胞株（細胞株ＧＭ０３８１６）においてスクリーニングした。図７および８は、ＦＸＮ３’末端標的化オリゴヌクレオチドによるその細胞株のトランスフェクトの結果を示しており、いくつかの３’オリゴが、ＦＸＮ  ｍＲＮＡをアップレギュレートできたことを証明している。オリゴ７３、７５、７６および７７は、ＦＸＮ  ｍＲＮＡを可能な最大限までアップレギュレートすると示された。これらの４つのオリゴの配列を調べたところ、オリゴ７３、７５、７６および７７は、ポリＴ配列を含むと判定された（図９）。これらのオリゴは、ポリＡテイルの前の最も３’末端に結合し、ゆえに３’末端を分解から保護すると仮定された。これらの結果は、３’末端を標的化するようにデザインされたオリゴが、ＦＸＮの発現をアップレギュレートし得ることを証明する。これらの結果は、ポリＡテイルに直接隣接するかまたは重複する最も３’末端を標的化するオリゴが、ｍＲＮＡレベルをアップレギュレートし得ることも示唆する。
【０２５８】
図１０は、ＦＸＮ５’末端標的化オリゴヌクレオチドによるＧＭ０３８１６細胞株のトランスフェクトの結果を示しており、いくつかの５’オリゴが、ＦＸＮ  ｍＲＮＡ発現をアップレギュレートできることを証明している。図１１および１２は、ＧＭ０３８１６細胞株においてＦＸＮ３’オリゴ７５と組み合わせたときのＦＸＮ５’末端オリゴのスクリーニングの結果を示している。オリゴ５１と７５、５２と７５、５７と７５および６２と７５との組み合わせは、ＦＸＮ  ｍＲＮＡ発現の最も高いアップレギュレーションを示した。それらの５’オリゴの配列を調べたところ、オリゴ５１、５２、５７および６２のすべてが、ＦＸＮ  ｍＲＮＡアイソフォームに対する推定（ｐｕｔａｔｉｔｉｖｅ）５’開始部位にマッピングされるモチーフＣＧＣＣＣＴＣＣＡＧを含むと判定された（図１３）。それらのオリゴは、ＦＸＮ  ｍＲＮＡの最も５’末端に結合し、ゆえに５’末端を分解から保護すると仮定された。オリゴ６２は、そのモチーフを超えて非常に長いオーバーハング配列を含んだことから、５’メチルグアノシンキャップと相互作用することによって５’末端をさらに保護するループ構造を形成すると仮定された（図１４）。これらの結果は、ｍＲＮＡの最も５’末端（５’メチルグアノシンキャップに隣接し得る）の標的化が、ｍＲＮＡのアップレギュレートにとって有効であることを示唆する。
【０２５９】
次に、先の５’および３’実験からのポジティブオリゴヒットの組み合わせのスクリーニングを、ＧＭ０３８１６  ＦＲＤＡ患者細胞株において行った。試験されたオリゴの組み合わせのうちのいくつかに対するＦＸＮ  ｍＲＮＡレベルが、ＧＭ０３２１Ｂ正常線維芽細胞におけるＦＸＮ  ｍＲＮＡのレベルとほぼ等しいと判定されたことから、これらのオリゴの組み合わせが、ＦＸＮ  ｍＲＮＡをアップレギュレートできたと示唆される（図１６）。次いで、トランスフェクションの２および３日後のＦＸＮ  ｍＲＮＡのレベルを計測したところ、定常状態ＦＸＮ  ｍＲＮＡレベルの上昇がトランスフェクションの２および３日後に観察されたことが確かめられた（図１７）。次いで、ポジティブヒットを検証したところ、第２の細胞株ＧＭ０４０７８  ＦＲＤＡ患者線維芽細胞において有効であると示された（図１８）。最後に、それらのヒットの検証を「正常」細胞株であるＧＭ０３２１Ｂ線維芽細胞において行った。それらのオリゴが、正常細胞株においてさえＦＸＮ  ｍＲＮＡをアップレギュレートできることが見出された（図１９）。まとめると、これらの結果から、５’標的化オリゴと３’標的化オリゴとの組み合わせがＦＸＮ発現をアップレギュレートできること、およびこれらの組み合わせが、場合によっては、５’または３’オリゴ単独の使用よりも有効であり得ることが示唆される。
【０２６０】
５’オリゴと３’オリゴとの例示的な組み合わせであるオリゴ６２およびオリゴ７７を、さらなる最適化のために選択した。すべての濃度が、ＧＭ０３８１６  ＦＲＤＡ患者細胞株においてＦＸＮをアップレギュレートすると示され、トランスフェクションの２〜３日後に定常状態のＦＸＮ  ｍＲＮＡレベルの上昇を示した（図２０）。これらの結果から、それらのオリゴが、１０ｎＭから４００ｎＭまでの広範囲の濃度にわたって有効であることが示唆される。
【０２６１】
次に、ＦＸＮのタンパク質レベルに対する個々のオリゴおよびオリゴの組み合わせの影響を調べた。ＧＭ０３８１６  ＦＲＤＡ患者線維芽細胞を、１００ｎＭの単一のオリゴまたは最終２００ｎＭの２つのオリゴで処理し、ＦＸＮタンパク質のレベルを計測した。いくつかの単一のオリゴおよびオリゴの組み合わせが、ＦＸＮタンパク質発現をある程度アップレギュレートすると示された。オリゴ５２と７５、オリゴ６４と５２、オリゴ５１と７６、オリゴ５２と７６、オリゴ６２と７７およびオリゴ６２と７６との組み合わせによる処理は、トランスフェクションの３日後にＦＸＮタンパク質の有意なアップレギュレーションを引き起こした（図２１および２２）。これらの結果から、５’標的化オリゴおよび３’標的化オリゴが、ＦＸＮタンパク質レベルをアップレギュレートできることが示唆される。
【０２６２】
次に、種々のオリゴの存在下におけるＦＸＮ  ｍＲＮＡの安定性を計測した。それらのオリゴが、ＦＸＮ  ｍＲＮＡの転写を増加させるのではなく、ＦＸＮ  ｍＲＮＡの安定性を高めると仮定した。このことを試験するために、転写阻害剤アクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ）の存在下においてオリゴで細胞をトランスフェクトした。オリゴ６２と７５、５２と７５および５７と７５の組み合わせは、ＡｃｔＤの存在下においてより高いレベルのＦＸＮ  ｍＲＮＡを有したことから、ＦＸＮ  ｍＲＮＡが、無処理の細胞よりも、それらのオリゴの組み合わせで処理された細胞においてより安定だったことが示唆される（図２３および２４）。
【０２６３】
最後に、いくつかのオリゴの組み合わせを、さらなる細胞株において試験した。細胞株の１セットを、フリードライヒ運動失調症を有する患者（細胞株ＧＭ１５８５０）および罹患していないそれらの同胞（細胞株ＧＭ１５８５１）から得た。他の細胞株は、フリードライヒ運動失調症を有する患者（細胞株ＧＭ１６２０９）および罹患していないそれらの半同胞（細胞株ＧＭ１６２２２）から得た。オリゴ５２と７６との組み合わせ、オリゴ５７と７６との組み合わせおよびオリゴ６２と７６との組み合わせによる処理が、ＦＸＮ  ｍＲＮＡレベルを有意にアップレギュレートしたことが見出された（図２５）。ＧＭ１５８５０細胞株では、オリゴ５２および７６またはオリゴ５７および７６で処理された細胞におけるＦＸＮ  ｍＲＮＡのレベルが、罹患していない同胞由来の細胞におけるＦＸＮ  ｍＲＮＡのレベルとほぼ等しかった。これらの結果から、ＦＸＮ  ｍＲＮＡをアップレギュレートする際の５’および３’末端標的化オリゴヌクレオチドの有効性がさらに示唆される。
【０２６４】
全体的に見て、これらの結果は、５’および３’末端標的化オリゴが、ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現のアップレギュレートにとって有効であること、ならびにこの発現のアップレギュレーションが、おそらくそのｍＲＮＡの安定化によるものであることを示している。
【０２６５】
さらなる実験として、５’および３’末端標的化オリゴを、ＦＸＮ遺伝子内の配列に特異的な他のオリゴ（表６）とさらに組み合わせた。５’および３’オリゴのアップレギュレーションは、これらの他のオリゴのサブセットが追加されるとさらに増強されたことから、ＲＮＡまたは遺伝子座の複数の領域を標的化するオリゴ、例えば、５’標的化オリゴ、３’標的化オリゴおよび内部標的化オリゴを提供することが、ｍＲＮＡ発現レベルをアップレギュレートするためのさらなる方法になり得ることが示唆される（図２６）。
【表６】
2016528897.tif 000046
実施例３．ＦＸＮに関するさらなるオリゴヌクレオチド実験
【０２６６】
実施例３において行われる実験は、使用したオリゴヌクレオチド濃度が１０および４０ｎｍだったことを除いては、実施例２と同じ方法を使用した。１０または４０ｎＭのオリゴによるトランスフェクションは、トランスフェクションの２日後および３日後において、細胞にとって細胞傷害性でないと見出された（図３８）。
【０２６７】
３’および５’末端標的化オリゴを、１０および４０ｎＭの濃度においてスクリーニングし、ＦＸＮ  ｍＲＮＡを、トランスフェクションの２および３日後に計測した。オリゴのサブセットは、１０または４０ｎＭの用量においてＦＸＮ  ｍＲＮＡをアップレギュレートできると見出された（図２７〜２９）。
【０２６８】
５’末端オリゴと３’末端オリゴとの組み合わせのスクリーニングもまた、１０および４０ｎＭの濃度において行い、ＦＸＮ  ｍＲＮＡをトランスフェクションの２および３日後に計測した。オリゴの組み合わせのサブセットは、１０または４０ｎＭの用量においてＦＸＮ  ｍＲＮＡをアップレギュレートできると見出された（図３０〜３３）。
【０２６９】
ＦＸＮを、例えば、内部において、ポリＡテイルの近くで、またはエキソンにわたって、標的化する他のオリゴもまた、１０または４０ｎＭの用量においてＦＸＮ  ｍＲＮＡをアップレギュレートできると見出された（図３４）。
【０２７０】
ＦＸＮ  ｍＲＮＡレベルが、１０および４０ｎＭの濃度の単一のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの組み合わせを使用したとき上昇し得ることをさらに証明するために、さらなる実験を行った（図３５〜３７）。
【０２７１】
次に、５’および３’末端標的化オリゴを、１０および４０ｎＭの濃度においてＦＸＮタンパク質レベルをアップレギュレートする能力について個々に試験した。オリゴのサブセットが、１０および４０ｎＭの濃度においてトランスフェクションの２および３日後にＦＸＮタンパク質レベルをアップレギュレートできたと判定された（図３９および４０）。これらの結果から、５’標的化オリゴおよび３’標的化オリゴならびにそれらの組み合わせが、１０ｎＭもの低い濃度でさえ、ＦＸＮ  ｍＲＮＡおよびタンパク質をアップレギュレートできることが示唆される。
実施例４．ｍＲＮＡの安定性を高めるためのさらなるオリゴヌクレオチド
【０２７２】
ＲＮＡの５’末端を標的化するか、ＲＮＡの３’末端を標的化するか、またはＲＮＡの５’末端と３’末端の両方を標的化する（「架橋オリゴ」）いくつかのさらなるオリゴヌクレオチドをデザインした。これらのオリゴを表７に示す。
【０２７３】
ＫＬＦ４に特異的なオリゴヌクレオチドを、各オリゴで細胞を処理することによって試験した。いくつかのＫＬＦ４オリゴは、処理された細胞において、ＫＬＦ４  ｍＲＮＡのレベルをアップレギュレートできた（図４１）。ＫＬＦ４オリゴのサブセットは、処理された細胞において、ＫＬＦ４タンパク質のレベルもアップレギュレートできた（図４２）。これらの結果は、５’および３’標的化オリゴが、ＫＬＦ４に対するｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルをアップレギュレートできたことを示しており、５’および３’標的化オリゴが、ＲＮＡ（およびまた対応するタンパク質）の発現をアップレギュレートするために広く有用であることが証明される。
【０２７４】
さらに、ＫＬＦ４  ｍＲＮＡの発現レベルを、ＫＬＦ４  ５’および３’末端標的化オリゴ（ＫＬＦ４の５’末端と３’末端の両方を標的化する環状化したオリゴヌクレオチド、ならびにＫＬＦ４の５’および３’末端を標的化する個々のオリゴヌクレオチドを含む）で処理された細胞において評価した。結果を図４３に示す。
【０２７５】
ＫＬＦ４  ５’および３’末端オリゴを、ＲＮＡｉｍａｘを使用して３０ｎＭの濃度においてＨｅｐ３Ｂ細胞にトランスフェクトした。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入したＫＬＦ４プライマーおよびアクチン（ハウスキーパーコントロール）プライマーを使用して、Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−Ｃｔキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＲＮＡ解析を行った。ＫＬＦ４タンパク質に対するウエスタンを、ＫＬＦ４ウサギ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ４０３８Ｓ）を用いて行った。
表７：ＲＮＡの５’および３’末端を標的化するようにデザインされたオリゴヌクレオチド
【表７−１】
2016528897.tif 000047
【表７−２】
2016528897.tif 000048
【表７−３】
2016528897.tif 000049
【表７−４】
2016528897.tif 000050
【表７−５】
2016528897.tif 000051
【表７−６】
2016528897.tif 000052
【表７−７】
2016528897.tif 000053
【表７−８】
2016528897.tif 000054
【表７−９】
2016528897.tif 000055
【表７−１０】
2016528897.tif 000056
【表７−１１】
2016528897.tif 000057
【表７−１２】
2016528897.tif 000058
【表７−１３】
2016528897.tif 000059
【表７−１４】
2016528897.tif 000060
【表７−１５】
2016528897.tif 000061
【表７−１６】
2016528897.tif 000062
【表７−１７】
2016528897.tif 000063
【表７−１８】
2016528897.tif 000064
【表７−１９】
2016528897.tif 000065
【表７−２０】
2016528897.tif 000066
【表７−２１】
2016528897.tif 000067
【表７−２２】
2016528897.tif 000068
【表７−２３】
2016528897.tif 000069
【表７−２４】
2016528897.tif 000070
【表７−２５】
2016528897.tif 000071
【表７−２６】
2016528897.tif 000072
【表７−２７】
2016528897.tif 000073
【表７−２８】
2016528897.tif 000074
【表７−２９】
2016528897.tif 000075
【表７−３０】
2016528897.tif 000076
【表７−３１】
2016528897.tif 000077
【表７−３２】
2016528897.tif 000078
【表７−３３】
2016528897.tif 000079
【表７−３４】
2016528897.tif 000080
【表７−３５】
2016528897.tif 000081
【表７−３６】
2016528897.tif 000082
実施例５．ＲＮＡの安定性を高めるためのさらなるオリゴヌクレオチド
【０２７６】
表８は、非コードＲＮＡであるＨＯＴＡＩＲおよびＡＮＲＩＬの５’および３’末端を標的化するための例示的なオリゴヌクレオチドを提供している。
【表８−１】
2016528897.tif 000083
【表８−２】
2016528897.tif 000084
実施例６．他の安定性オリゴ
【０２７７】
【表９−１】
2016528897.tif 000085
【表９−２】
2016528897.tif 000086
【表９−３】
2016528897.tif 000087
【表９−４】
2016528897.tif 000088
【表９−５】
2016528897.tif 000089
【表９−６】
2016528897.tif 000090
【表９−７】
2016528897.tif 000091
【表９−８】
2016528897.tif 000092
【表９−９】
2016528897.tif 000093
【表９−１０】
2016528897.tif 000094
【表９−１１】
2016528897.tif 000095
実施例７．ＰＴＥＮおよびＫＬＦ４オリゴ
方法
【０２７８】
タンパク質の計測：Ｈｅｐａ１−６およびＧＭ０４０７８細胞を１５００００細胞／ウェルでプレーティングした。それらの細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用してＰＴＥＮまたはＫＬＦ４オリゴでトランスフェクトした。５０ｎＭの各ＰＴＥＮオリゴをトランスフェクションのために使用した。２つのオリゴを１つの実験において組み合わせる場合、３０ｎＭの各ＰＴＥＮオリゴをトランスフェクションのために使用した。５０ｎＭの各ＫＬＦ４オリゴをトランスフェクションのために使用した。２つのオリゴを１つの実験において組み合わせる場合、５０ｎＭの各ＰＴＥＮオリゴをトランスフェクションのために使用した。ＰＴＥＮオリゴの場合はトランスフェクションの１もしくは２日後に、またはＫＬＦ４オリゴの場合はトランスフェクションの３日後に、溶解産物を細胞から回収した。検出のために使用した抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＫＬＦ４  ４０３８およびＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＰＴＥＮ  ９５５２だった。
【０２７９】
ＲＮＡの計測：Ｈｅｐａ１−６およびＧＭ０４０７８を４０００細胞／ウェルでプレーティングした。それらの細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用してオリゴでトランスフェクトした。３０ｎＭの各ＰＴＥＮオリゴをトランスフェクションのために使用した。２つのオリゴを１つの実験において組み合わせる場合、３０ｎＭの各ＰＴＥＮオリゴをトランスフェクションのために使用した。５０ｎＭの各ＫＬＦ４オリゴをトランスフェクションのために使用した。２つのオリゴを１つの実験において組み合わせる場合、５０ｎＭの各ＰＴＥＮオリゴをトランスフェクションのために使用した。トランスフェクションの３日後に回収された溶解産物からＲＮＡを抽出した。Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−Ｃｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）手順を使用して、製造者のプロトコルに従ってＲＮＡレベルを解析した。使用したＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製だった：
ＫＬＦ４  Ｍｍ００５１６１０４＿ｍ１
ＰＴＥＮ  Ｈｓ０２６２１２３０＿ｓ１
アクチン  Ｈｓ０１０６０６６５＿ｇ１
Ｇａｐｄｈ  Ｈｓ０２７５８９９１＿ｇ１
【０２８０】
アクチノマイシンＤ処理：アクチノマイシンＤ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１０マイクログラム／ｍｌの濃度で細胞培養液に加え、インキュベートした。Ｔｒｉｚｏｌ（Ｓｉｇｍａ）を製造者の指示書に従って使用して、ＲＮＡの単離を行った。ＫＬＦ４プローブは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。
【０２８１】
試験されたオリゴ配列：図４４〜４８において試験されたオリゴは、表９に提供されたものと同じオリゴ配列に対応する。例えば、図４４ＡにおけるＰＴＥＮ１０１は、表９におけるＰＴＥＮ−１０１と同じであり、図４６におけるｍＫＬＦ４−１ｍ０２は、表９におけるｍＫＬＦ４−１ｍ０２と同じであるなど。
結果
【０２８２】
ＰＴＥＮに特異的なオリゴヌクレオチドを、細胞を各オリゴで処理することによって試験した。いくつかのＰＴＥＮオリゴは、処理された細胞においてＰＴＥＮ  ｍＲＮＡレベルをアップレギュレートできた（図４４Ａおよび４４Ｂ）。ＰＴＥＮオリゴ１０８および１１３は、組み合わせたとき、別々に使用されたいずれかのオリゴよりも、処理された細胞において、ＰＴＥＮタンパク質レベルもアップレギュレートできた（図４５）。
【０２８３】
ＫＬＦ４に特異的なオリゴヌクレオチドを、細胞を各オリゴで処理することによって試験した。いくつかのＫＬＦ４オリゴは、処理された細胞においてＫＬＦ４  ｍＲＮＡレベルをアップレギュレートできた（図４６）。単独でまたは組み合わせて使用されたいくつかのＫＬＦ４オリゴは、処理された細胞において、ＫＬＦ４タンパク質レベルもアップレギュレートできた（図４７および４８）。
【０２８４】
別の実験では、細胞をアクチノマイシンＤおよび環状化オリゴまたは他のタイプの安定性オリゴで処理し、ＫＬＦ４の安定性を計測した。ＲＮＡ安定性の上昇レベル（約２時間  対  約４〜８時間）は、「環状化」オリゴと個々の５’／３’末端オリゴとの間で匹敵していたことが見出されたことから、両方のタイプのオリゴが有効であることが示された（図４９）。
【０２８５】
これらの結果から、ｍＲＮＡレベルとタンパク質レベルの両方が、ＲＮＡの安定性を高めることができるオリゴを使用してアップレギュレートされ得ると証明される。
実施例８．ｍＲＮＡ半減期が長い遺伝子におけるｍＲＮＡ安定性の増大
方法
【０２８６】
ＲＮＡの計測：ＲＮＡ解析、ｃＤＮＡ合成およびＱＲＴ−ＰＣＲを、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣｔキットおよびＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ装置を用いて行った。ＡＣＴＢオリゴを、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して３０ｎＭの濃度においてＨｅｐ３Ｂ細胞にトランスフェクトした。組み合わせの場合、各オリゴを３０ｎＭの濃度でトランスフェクトした。ＲＮＡ解析を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入したアクチンプライマー（Ｈｓ０１０６０６６５＿ｇ１）およびＧＡＰＤＨプライマー（Ｈｓ０２７５８９９１＿ｇ１，ハウスキーパーコントロール）を使用してＣｅｌｌｓ−ｔｏ−Ｃｔキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行った。
【０２８７】
試験されたオリゴ配列：図５０において試験されたオリゴは、表７に提供されたものと同じオリゴ配列に対応する。例えば、図５０におけるＡＣＴＢ−８は、表７におけるＡＣＴＢ−８と同じであり、図５０におけるＡＣＴＢ−９は、表７におけるＡＣＴＢ−９と同じであるなど。
結果
【０２８８】
アクチン−ベータは、高度に安定したｍＲＮＡを有するハウスキーパー遺伝子である。アクチン−ベータｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドを、各オリゴまたはそれらの組み合わせで細胞を処理することによって試験した。いくつかのオリゴ、５’標的化オリゴと３’標的化オリゴの両方、ならびに環状化オリゴは、アクチン−ベータｍＲＮＡレベルをアップレギュレートできた（図５０）。これらのデータは、安定性オリゴが、すでに高度に安定しているｍＲＮＡの安定性さえも改善し得ることを示している。
【０２８９】
前述の記載された明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするのに十分であると考えられる。実施例は、本発明の１つの態様の単一の例証として意図されており、他の機能的に等価な実施形態も本発明の範囲内であるので、本発明は、提供された実施例によって範囲を限定されるべきでない。本明細書中に示されたものおよび記載されものに加えて、本発明の様々な改変が、前述の説明から当業者に明らかになるだろうし、そのような改変は、添付の請求項の範囲内に入る。本発明の利点および目的は、必ずしも本発明の各実施形態によって包含されない。
実施例９．さらなる５’および３’末端標的化オリゴヌクレオチド
【０２９０】
表１０は、複数のヒト遺伝子およびマウス遺伝子に対するさらなる例示的なＲＮＡ５’および３’末端標的化オリゴを提供している。
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１０−３】
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【表１０−４】
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【表１０−５】
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【表１０−６】
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【表１０−７】
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【表１０−８】
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【表１０−９】
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【表１０−１０】
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【表１０−１１】
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【表１０−１２】
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【表１０−１３】
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【表１０−１４】
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【表１０−１５】
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【表１０−１６】
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【表１０−１７】
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【表１０−１８】
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【表１０−１９】
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【表１０−２０】
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【表１０−２１】
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【表１０−２２】
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【表１０−２３】
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【表１０−２４】
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【表１０−２５】
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【表１０−２６】
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【表１０−２７】
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【表１０−２８】
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【表１０−２９】
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【表１０−３０】
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【表１０−３１】
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【表１０−３２】
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【表１０−３３】
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実施例１０．ＦＸＮオリゴに対するさらなるデータ
【０２９１】
ＦＸＮ−３７４およびＦＸＮ−３７５を５’オリゴとして使用して、表３において入手可能なすべての３’オリゴを、２０ｎＭ、５０ｎＭおよび１００ｎＭの濃度でのトランスフェクションによってＧＭ０３８１６細胞においてヒトＦＸＮのＲＮＡアップレギュレーションについてスクリーニングした（図５１）。濃度は、総オリゴ濃度だった（例えば、２０ｎＭは、各オリゴに対して１０ｎＭであることを意味する）。概して、３７５オリゴを含むオリゴの組み合わせで処理された細胞は、無処理の細胞と比べて、ヒトＦＸＮのアップレギュレーションを有した。３７５と３９０との組み合わせは、最も高いレベルにおいてヒトＦＸＮの用量反応性のアップレギュレーションをもたらした（図５１）。
【０２９２】
表３、表６、表７および表１０からの様々なＦＸＮオリゴをＧＭ０３８１６細胞株にトランスフェクトした（１０または３０ｎＭにおけるＦＸＮ−３７５／ＦＸＮ−３９８組み合わせ、１０または３０ｎＭにおけるＦＸＮ−４２９、１０ｎＭにおける５１１、１０ｎＭにおけるＦＸＮ−４５６、１０ｎＭまたは３０ｎＭにおけるＦＸＮ−４８５、１０ｎＭにおけるＦＸＮ−４５８、１０または３０ｎＭにおけるＦＸＮ−４６１ｍ０２）。Ａｂｃａｍ  ａｂ４８２８１抗体を使用して、未成熟ＦＸＮおよび成熟ＦＸＮタンパク質のレベルを計測した。オリゴ４５６、４５８、４８５および４６１は、偽環状化オリゴである。オリゴ４６１は、３７５（５’）および３９０（３’）オリゴの配列を含む偽環状化オリゴである。アクチンをローディングコントロールとして使用した（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，８４５７）。未成熟ＦＸＮおよび成熟ＦＸＮのレベルは、概して、オリゴで処理されたすべての細胞においてアップレギュレートされた（図５２）。未成熟ＦＸＮおよび成熟ＦＸＮは、ＦＸＮ−４５８およびＦＸＮ−４６１によって用量反応性様式で劇的にアップレギュレートされた（図５２）。
【０２９３】
ＦＸＮ−４６１ｍ０２オリゴを用いたさらなる研究を行った。ＦＸＮ−４６１ｍ０２の用量反応を、示されている濃度でのＧＭ０３８１６細胞株へのトランスフェクションを用いて計測した。Ａｂｃａｍ  ａｂ４８２８１抗体を使用して、未成熟および成熟ＦＸＮタンパク質のレベルを計測した。アクチンをローディングコントロールとして使用した（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，８４５７）。ＦＸＮタンパク質レベルは、追跡研究においても強くアップレギュレートされた（図５３）。
【０２９４】
次に、公的なポリＡ−ｓｅｑデータに基づいて潜在的な代替の３’位置を調べるために、さらなる３’−標的化ＦＸＮオリゴ（表１０に示されている）をデザインした。ＦＸＮ−３７５オリゴを、５’オリゴとして使用し、さらなる３’−標的化ＦＸＮオリゴと組み合わせた。ＧＭ０３８１６細胞へのトランスフェクションは、３０ｎＭ濃度で行った。ＦＸＮ  ｍＲＮＡのアップレギュレーションが、いくつかのオリゴ組み合わせにおいて観察され、３’オリゴＦＸＮ−５２７およびＦＸＮ−５３２を用いたとき最も高かった（図５４）。
【０２９５】
３’オリゴによって媒介されるＦＸＮ  ｍＲＮＡのアップレギュレーションの再現性を調べるために、さらなる３’−標的化ＦＸＮオリゴのサブセットを、３７５オリゴの代わりに代替の５’オリゴ（ＦＸＮ−６７５）を用いてスクリーニングした。差が観察されたが、類似の３’オリゴ、例えば、ＦＸＮ−６５４、ＦＸＮ−６６３、ＦＸＮ−６６６、ＦＸＮ−６６８およびＦＸＮ−６７０が、両方の５’オリゴを用いたとき、リード化合物として同定された（図５５）。
【０２９６】
ＦＸＮの下流遺伝子の候補であるＰＰＡＲＧＣ１およびＮＦＥ２Ｌ２の発現の変化を３’オリゴ研究において評価した。最も大きな変化が、ＰＰＡＲＧＣ１遺伝子で観察された（図５６）。
【０２９７】
次に、潜在的な代替の５’位置を調べるため、およびより短い長さを有するオリゴを調べるために、さらなる５’−標的化ＦＸＮオリゴをデザインした。ＧＭ０３８１６細胞へのトランスフェクションは、３０ｎＭ濃度で行った。ＦＸＮ−３９０オリゴを３’オリゴとして使用した。ＦＸＮ  ｍＲＮＡのアップレギュレーションは、５’オリゴＦＸＮ−６７３を用いたとき最も高かった（図５７）。オリゴ６７１〜６７３は、それぞれＦＸＮ−３７５（１５ｍｅｒ）の１３ｍｅｒ、１１ｍｅｒおよび９ｍｅｒバージョンだった。
【０２９８】
続いて、いくつかの５’（ＦＸＮ−３７４、ＦＸＮ−３７５）、３’（ＦＸＮ−３９０）および偽環状化（４８３、４８４、４８７）ＦＸＮオリゴを、４、７および１０日間にわたってインビトロでＦＲＤＡマウスモデル（Ｓａｒｓｅｒｏ）線維芽細胞において裸で試験した。ＦＸＮ  ｍＲＮＡレベルは、ＦＸＮ−３７４＋３９０およびＦＸＮ−３７５＋３９０の組み合わせを用いたとき最も高かった（図５８Ａ〜Ｃ）。
【０２９９】
次に、様々な３’および５’ＦＸＮオリゴ（ＦＸＮ−５２７、ＦＸＮ−５２８、ＦＸＮ−５３２、ＦＸＮ−５３３、ＦＸＮ−５５３、ＦＸＮ−６７４およびＦＸＮ−６７５）を、ＧＭ０３８１６細胞におけるトランスフェクションによって、ＦＸＮ  ｍＲＮＡレベルの用量反応パターンについて調べた（図５９ＡおよびＢ）。オリゴＦＸＮ−５２７、ＦＸＮ−５３２、ＦＸＮ−６７４およびＦＸＮ−６７５は、ＦＸＮ  ｍＲＮＡの用量依存的増加を示した。
【０３００】
続いて、様々な５’ＦＸＮオリゴを、最重要の（ｌｅａｄ）３’オリゴであるＦＸＮ−５３２と組み合わせた。ＦＸＮ  ｍＲＮＡの用量反応パターンを、ＧＭ０３８１６細胞におけるトランスフェクションを用いて計測した。試験されたすべてのオリゴが、ＦＸＮ  ｍＲＮＡの用量依存的増加を示した。計測は、５日目に行った。ＦＸＮ−６７４は、ＦＸＮ−３７５と１１ヌクレオチド重複する１５ｍｅｒである。ＦＸＮ−６７５、ＦＸＮ−６７６およびＦＸＮ−６７７は、それぞれＦＸＮ−６７４の１３ｍｅｒ、１１ｍｅｒおよび９ｍｅｒバージョンである。ＦＸＮ−６７１、ＦＸＮ−６７２およびＦＸＮ−６７３は、それぞれＦＸＮ−３７５の１３ｍｅｒ、１１ｍｅｒおよび９ｍｅｒバージョンである（図６０ＡおよびＢ）。
【０３０１】
次に、５’オリゴ（ＦＸＮ−３７５、ＦＸＮ−６７１、ＦＸＮ−６７２、ＦＸＮ−６７３、ＦＸＮ−６７４、ＦＸＮ−６７５、ＦＸＮ−６７６およびＦＸＮ−６７７）を、単独でまたは３’オリゴＦＸＮ−５３２と組み合わせて、ＦＸＮタンパク質のアップレギュレーションについて試験した。それらのオリゴを単独でまたは組み合わせて、３０ｎＭおよび１０ｎＭの濃度において、ＧＭ０３８１６細胞にトランスフェクトした。計測は、５日目に行った。未成熟および成熟ＦＸＮタンパク質を検出するためにＡｂｃａｍ（ａｂ１１０３２８）抗体を用いてウエスタンブロットを行った。概して、ＦＸＮタンパク質レベルは、単独のまたは組み合わせたオリゴで処理されたすべての細胞においてアップレギュレートされた（図６１）。最も高いタンパク質のアップレギュレーションは、ＦＸＮ−６７２＋５３２の組み合わせを用いたとき観察された（図６１）。
【０３０２】
いくつかの最重要の５’（ＦＸＮ−３７４、ＦＸＮ−３７５）、３’（ＦＸＮ−３９０）、偽環状化オリゴ（ＦＸＮ−４６０：ＦＸＮ−３７４＋３９０；ＦＸＮ−４６１：ＦＸＮ−３７５＋３９０）および多重標的化（ｍｕｌｔｉ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）オリゴ（ＦＸＮ−４６０ＭＴＯおよびＦＸＮ−４６１ＭＴＯ）を、正常なヒト心筋細胞において、ヒトＦＸＮ  ｍＲＮＡのアップレギュレーションについて裸で試験する。多重標的化オリゴ（ＭＴＯ）は、切断可能なリンカー（例えば、オリゴ−ｄＴリンカー（例えば、ｄＴｄＴｄＴｄＴｄＴ））によって連結された５’標的化オリゴおよび３’標的化オリゴを含む。オリゴを複数の濃度において８日間インキュベートする（培地およびオリゴを４日目に交換する）。
実施例１１．ＵＴＲＮオリゴに対するデータ
【０３０３】
表７に示されているようなユートロフィンに対する偽環状化オリゴ（ＵＴＲＮ−２１１〜２２０）を、分化したヒト患者デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）筋管において裸でスクリーニングした。Ｍａｎｃｈｏ５抗体を用いてウエスタンを行った。ＵＴＲＮタンパク質のウエスタンシグナルは、ベータ−アクチンレベルおよび無処理サンプルに対して正規化した。オリゴＵＴＲＮ−２１７は、ネガティブコントロールオリゴ２９３ＬＭおよび細胞のみと比べて、ＵＴＲＮタンパク質のレベルをアップレギュレートすると示された（図６２および６３）。
【０３０４】
次に、ＵＴＲＮ５’および３’オリゴを、分化したヒト患者ＤＭＤ筋管において、個々に裸でスクリーニングした。ウエスタン解析に向けて、遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｇｆｕｇａｔｉｏｎ）によってサンプルをペレットと上清に分離した。サンプルをＳＤＳ溶液中で溶解し、氷上で維持し、次いで、遠心することにより、ペレット画分と上清画分に分離した。Ｍａｎｃｈｏ５抗体を用いてウエスタンを行った。ＵＴＲＮタンパク質のウエスタンシグナルは、ベータ−アクチンレベルおよび無処理サンプルに対して正規化した。ＵＴＲＮタンパク質の正のアップレギュレーションは、ＵＴＲＮ−２０２、２０８、２０９、２１０および２１７オリゴで処理された細胞のペレットにおいて観察された（図６４Ａ〜Ｃ）。
実施例１２．ＡＰＯＡ１オリゴに対するデータ
【０３０５】
マウスＡＰＯＡ１  ５’オリゴ（ＡＰＯＡ１＿ｍｕｓ−１−１３）と３’オリゴ（ＡＰＯＡ１＿ｍｕｓ−２１）との組み合わせを、２０μＭおよび５μＭの濃度で初代マウス肝細胞において２つ組で、裸でスクリーニングした。ＡＰＯＡ１  ｍＲＮＡを計測し、水コントロールのウェルに対して正規化した。試験されたいくつかのオリゴが、水と比べてＡＰＯＡ１のアップレギュレーションを引き起こした（図６５）。
【０３０６】
次に、マウスＡＰＯＡ１  ５’オリゴと３’オリゴとの組み合わせを初代マウス肝細胞において裸でスクリーニングして、ＡＰＯＡ１タンパク質レベルを計測した。測定は、２日目に行った。Ａｂｃａｍ  ａｂ２０４５３をＡＰＯＡ１抗体として使用した。チューブリン（ａｂ１２５２６７）をローディングコントロールとして使用した。オリゴＡＰＯＡ１＿ｍｕｓ−３＋１７、ＡＰＯＡ１＿ｍｕｓ−６＋１７およびＡＰＯＡ１＿ｍｕｓ−７＋２０は、細胞培地と細胞溶解産物の両方において、用量依存的ＡＰＯＡ１タンパク質アップレギュレーションを示す（図６６）。
【０３０７】
続いて、２つのマウスＡＰＯＡ１  ５’オリゴと３’オリゴとの組み合わせ（ＡＰＯＡ１＿ｍｕｓ−３＋ＡＰＯＡ１＿ｍｕｓ−１７またはＡＰＯＡ１＿ｍｕｓ−７＋ＡＰＯＡ１＿ｍｕｓ−２０）を、マウスにおいてインビボで試験した。それらのオリゴの組み合わせを、試験された組み合わせにおける各オリゴに対して５０ｍｇ／ｋｇで１、２および３日目に皮下に注射した。ビヒクル（ＰＢＳ）処置をコントロールとして使用した。第１の研究（図７０Ａ）では、最後の投与の２日後である５日目に回収を行った。第２の研究（図７０Ｂ）では、最後の投与の４日後である７日目に回収を行った。両方の研究での肝臓におけるＲＮＡの計測（図７０ＡおよびＢ）から、７＋２０および３＋２０のＡＰＯＡＡ１オリゴ組み合わせを用いたとき最大８０％のＡＰＯＡ１  ｍＲＮＡアップレギュレーションが示唆される。ＡＰＯＡ１と近接した５つの遺伝子（ＡＰＯＣ３、ＡＰＯＡ４、ＡＰＯＡ５、ＡＰＯＢ、Ｓｉｋ３）は、オリゴ処置によって有意に影響されなかった。
【０３０８】
ＡＰＯＡ１タンパク質のレベルもまた、上記２つのインビボ研究において計測した。図７０Ｃは、オリゴ組み合わせ３＋１７に対する第１の研究のＡＰＯＡ１タンパク質データを示している。ＡＰＯＡ１タンパク質のアップレギュレーションが、処置された４匹すべての動物の血漿において見られた。図７０Ｄは、オリゴ組み合わせ７＋２０に対する第２の研究のＡＰＯＡ１タンパク質データを示している。１０匹すべての動物からの採血前データは、処置開始前の動物にわたって比較的等しいレベルの血漿ＡＰＯＡ１を示した（上のパネル，図７０Ｄ）。サンプル５および１０は、オリゴ組み合わせ７＋２０で処置した後の血漿において、マウスＡＰＯＡ１タンパク質のアップレギュレーションを示した。
【０３０９】
タンパク質アップレギュレーションの存在下における（図７０Ｃ）オリゴ組み合わせ３＋１７に対してＲＮＡの変化がなかったこと（図７０Ａ）、ならびにオリゴ組み合わせ７＋２０の処置を受けた５匹中２匹の動物におけるＡＰＯＡ１のアップレギュレーション（図７０Ｄ）は、オリゴ処置レジメンおよび選択された回収時点に起因し得る。
実施例１３．さらなる非コードＲＮＡ標的化オリゴ
【０３１０】
表１１は、さらなる例示的な非コードＲＮＡ５’および３’末端標的化オリゴを提供している。
【表１１−１】
2016528897.tif 000129
【表１１−２】
2016528897.tif 000130
【表１１−３】
2016528897.tif 000131
実施例１４．フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）マウスモデルからのデータ
【０３１１】
示されている５’（ＦＸＮ−３７５、３８０、３８５）、３’（ＦＸＮ−３９８）および多重標的化オリゴ（ＦＸＮ−４３４：３７５＋３９８、ＦＸＮ−４３６：３８５＋３９８）をＳａｒｓｅｒｏ  ＦＲＤＡマウスモデルの皮下に注射した。ビヒクル（ＰＢＳ）をコントロールとして注射した。ＦＸＮ−４３４および４３６の配列を下記の表１２に示す。
【表１２】
2016528897.tif 000132
【０３１２】
ショートアーム（ＳＡ）研究のために、オリゴおよびコントロールを２５ｍｇ／ｋｇで０日目および４日目に注射した。組織を７日目に回収した。ロングアーム（ＬＡ）研究のために、注射を同じ用量で０日目、４日目、７日目に行い、回収を１４日目に行った。このモデルの心臓および肝臓（ｌｖｉｅｒｓ）におけるヒトＦＸＮおよびマウスＦＸＮをＱＰＣＲで計測し、ＰＢＳ群に対して正規化した。各処置群は、５匹のマウスを有した（ｎ＝５）。
【０３１３】
ヒトＦＸＮ標的化オリゴは、ショートアーム研究において、心臓のマウスフラタキシンｍＲＮＡをアップレギュレートしたことが見出された（図６７）。わずかであって統計的に有意でないアップレギュレーションの傾向もまた、ロングアーム研究において肝臓および心臓のヒトＦＸＮに対して存在した（図６７）。２つのオリゴＦＸＮ−３７５および３８９は、マウスＦＸＮ転写物といくつかのミスマッチありで重複していた（図６８）。主要なマウスＦＸＮ３’部位は、ｃｈｒ１９：２４２６１５０１に存在した。主要なマウスＦＸＮ５’部位は、ｃｈｒ１９：２４２８０５９５に存在する。ＥＳＴならびにＲｅｆＳｅｑのアノテーションは、マウス転写物へのこれらのオリゴの潜在的な結合を示唆した。これらのデータから、ＦＸＮ  ＲＮＡ転写物に対してミスマッチを含むオリゴが、なおもＦＸＮのアップレギュレーションをもたらし得ることが示唆されることから、ミスマッチが許容され得ると示される。
【０３１４】
本発明のいくつかの実施形態は、本明細書に記載され、例証されてきたが、当業者は、その機能を行うため、ならびに／または本明細書中に記載された結果および／もしくは１つもしくはそれを超える利点を得るために、他の種々の手段および／または構造を容易に想定し、そのようなバリエーションおよび／または改変の各々は、本発明の範囲内であるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書中に記載されるすべてのパラメータ、寸法、材料および配置が例示的であると意味されていること、ならびに実際のパラメータ、寸法、材料および／または配置が、本発明の教示が使用する具体的な用途(複数可)に依存することを容易に認識する。当業者は、本明細書中に記載される本発明の具体的な実施形態に対する多くの等価物を認識するかまたは単なる日常的な実験法を使用して確認することができる。ゆえに、上記の実施形態が単に例として提示されていること、ならびに本発明が、添付の特許請求の範囲およびそれに対する等価物の範囲内で、具体的に記載されたものおよび主張されるものと異なる方法で実施され得ることが理解されるべきである。本発明は、本明細書中に記載される各個別の特徴、システム、物品、材料および／または方法に関する。さらに、２つまたはそれを超えるそのような特徴、システム、物品、材料および／または方法の任意の組み合わせは、そのような特徴、システム、物品、材料および／または方法が、相互に相反しない場合、本発明の範囲内に含められる。
【０３１５】
不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書および特許請求の範囲において使用されるとき、明らかにそれとは反対のことが示されていない限り、「少なくとも１つの」を意味していると理解されるべきである。
【０３１６】
句「および／または」は、本明細書および特許請求の範囲において使用されるとき、そのように結合されているエレメント、すなわち、いくつかの場合では接続的に存在し、他の場合では離接的に存在するエレメントの「いずれかまたは両方」を意味していると理解されるべきである。反対のことが明らかに示されていない限り、「および／または」節によって具体的に同定されるエレメントに関係するかまたは関係しないかにかかわらず、それらの具体的に同定されるエレメント以外の他のエレメントが、必要に応じて存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」に対する言及は、「含む」などのオープンエンドな言語とともに使用されるとき、１つの実施形態では、ＢなしのＡ（必要に応じてＢ以外のエレメントを含む）；別の実施形態では、ＡなしのＢ（必要に応じてＡ以外のエレメントを含む）；なおも別の実施形態では、ＡとＢの両方（必要に応じて他のエレメントを含む）；などのことを言及し得る。
【０３１７】
本明細書および特許請求の範囲において使用されるとき、「または」は、上で定義されたような「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リストにおける項目を分けているとき、「または」または「および／または」は、包括的である、すなわち、少なくとも１つの包含であると解釈されるものとするが、いくつかのエレメントまたはエレメントのリストのうちの１つより多いエレメント、および必要に応じて、列挙されていないさらなる項目も含むと解釈されるものとする。それとは反対のことを明らかに示す用語、例えば、「〜のうちのただ１つ」もしくは「〜のうちのまさに１つ」または請求項において使用されるときの「〜からなる」だけが、いくつかのエレメントまたはエレメントのリストのうちのまさに１つのエレメントの包含のことを指す。通常、本明細書中で使用される用語「または」は、排他的な用語、例えば、「いずれか」、「〜のうちの１つ」「〜のうちのただ１つ」また「〜のうちのまさに１つ」が前につくとき、排他的な選択肢（すなわち「一方または他方であって両方ではない」）を示すと単に解釈されるものとする。「〜から本質的になる」は、特許請求の範囲において使用されるとき、特許法の分野において使用される通常の意味を有するものとする。
【０３１８】
本明細書および特許請求の範囲において使用されるとき、句「少なくとも１つ」は、１つまたはそれを超えるエレメントのリストに照らして、エレメントのリストの中のいずれか１つまたはそれを超えるエレメントから選択される少なくとも１つのエレメントを意味すると理解されるべきであるが、必ずしも、エレメントのリストの中に具体的に列挙された各エレメントおよび全エレメントのうちの少なくとも１つを含むわけでもないし、エレメントのリストの中の任意の組み合わせのエレメントを排除するわけでもない。この定義は、句「少なくとも１つ」が指すエレメントのリスト内に具体的に同定されるエレメント以外のエレメントが、それらの具体的に同定されるエレメントに関係するか関係しないかにかかわらず、必要に応じて存在してもよいことも許容する。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、等しく、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または、等しく、「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、１つの実施形態では、必要に応じて、Ｂが存在せずに１つより多いＡを含む（および必要に応じてＢ以外のエレメントを含む）少なくとも１つ；別の実施形態では、必要に応じて、Ａが存在せずに１つより多いＢを含む（および必要に応じてＡ以外のエレメントを含む）少なくとも１つ；なおも別の実施形態では、必要に応じて１つより多いＡを含む少なくとも１つおよび必要に応じて１つより多いＢを含む少なくとも１つ（および必要に応じて他のエレメントを含む）；などのことを指し得る。
【０３１９】
特許請求の範囲ならびに上記の明細書において、すべての移行句、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「有する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」などは、オープンエンドである、すなわち、〜を含むがこれらに限定されないことを意味していると理解されるべきである。Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ２１１１．０３に示されているように、移行句「〜からなる」および「〜から本質的になる」だけが、それぞれクローズドまたはセミクローズドの移行句であるものとされる。
【０３２０】
請求項のエレメントを修飾するために、特許請求の範囲における「第１」、「第２」、「第３」などのような順序の用語の使用は、それ自体が、別のものに対する１つの請求項エレメントの任意の優先権、先例もしくは順序、または方法の行為が行われる時間的順序を意味せず、請求項エレメントを区別するために、ある特定の名称を有する１つの請求項エレメントを、同じ名称を有する（順序の用語の使用を別にすれば）別のエレメントと区別する標示として使用されているだけである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６−１】
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【図５６−２】
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【図５７】
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【図５８−１】
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【図５８−２】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６５−１】
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【図６５−２】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図６３】
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【図６４−１】
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【図６４−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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