(57)【要約】  １つ以上の毛包の基準代謝指標に対する活性剤又はストレッサーの効果を測定する方法であって、この方法は、（ａ）１つ以上の毛包を得る工程と、（ｂ）容器内に１つ以上の毛包を配置する工程であって、１つ以上の毛包が１つ以上のセンサーの下に置く、工程と、（ｃ）１つ以上のセンサーを使用して、解糖及び酸化的リン酸化の両方に対する１つ以上の毛包の基準代謝指標を測定する工程と、（ｄ）１つ以上の毛包を活性剤又はストレッサーに曝露する工程と、（ｅ）１つ以上のセンサーを使用して、解糖及び酸化的リン酸化の両方に対する１つ以上の毛包の応答代謝指標を測定する工程と、を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の毛包の基準代謝指標に対する活性剤又はストレッサーの効果を測定する方法であって、
ａ．１つ以上の毛包を得る工程と、
ｂ．該１つ以上の毛包を容器内に配置する工程であって、該１つ以上の毛包が１つ以上のセンサーの下に置く、該工程と、
ｃ．該１つ以上のセンサーを使用して、解糖及び酸化的リン酸化の両方に対する該１つ以上の毛包の基準代謝指標を測定する工程と、
ｄ．該１つ以上の毛包を活性剤又はストレッサーに曝露する工程と、
ｅ．該１つ以上のセンサーを使用して、解糖及び酸化的リン酸化の両方に対する該１つ以上の毛包の応答代謝指標を測定する工程と、を任意の順序で含む、方法。
【請求項２】
ａ．前記１つ以上の毛包を活性剤に曝露する工程と、
ｂ．前記１つ以上の毛包をストレッサーに曝露する工程と、を任意の順序で含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酸化的リン酸化に対する前記基準代謝指標及び前記応答代謝指標が、酸素消費速度である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
酸化的リン酸化に対する前記基準代謝指標及び前記応答代謝指標が、二酸化炭素生成速度である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
解糖経路に対する前記基準代謝指標及び前記応答代謝指標が、細胞外酸性化速度である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記１つ以上の毛包が、１つ以上の牛の毛包を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上の毛包が、１つ以上の３次元培養（three-dimensional tissue-engineered）毛包を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記１つ以上の毛包の基準代謝指標は、非致死的に測定される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記容器は、島状の容器又はマルチウェルマイクロプレートである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ以上の毛包を、前記容器内に細胞接着剤で固定する工程を更に含み、好ましくは該細胞接着剤は、前記１つ以上の毛包を前記容器内に固定する前に中和緩衝液と混合されない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ストレッサーは、毛髪染料、毛髪スプレー、酸化剤、溶媒、熱、ホットオイル、パーマ処理、物理的揺動、紫外線、煙草の煙、オゾン、排気ガス、ディーゼル排気、スモッグ、界面活性剤、放射線、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
発育している１つ以上の毛包をスクリーニングする工程を更に含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記活性剤は、カフェイン、カルニチン、クレアチン、アルファリポ酸、ナイアシンアミド、コエンザイムＱ１０、アシルカルニチン、アセチルカルニチン、ユビキノン、ユビキノン誘導体、エトキシキン、創傷治癒ペプチド、アシル基に結合した創傷治癒ペプチド、タウリン、アセチル補酵素Ａ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、好ましくは、前記活性剤は、カルニチンである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
対応する基準代謝指標と比較して、前記応答代謝指標のうちの１つが前記１つ以上の毛包の代謝活性における向上に相当する場合、前記活性剤を有益剤として特定する工程を更に含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ａ．請求項１９に記載の方法で特定された前記有益剤と、
ｂ．皮膚科学的に容認できる担体と、を含む、ヘアケア組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、１つ以上の毛包の代謝指標を測定する方法を対象とする。より具体的には、本発明は、１つ以上の毛包の基準代謝指標に対する活性剤又はストレッサーの効果を測定する方法を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
生命の基本原則として、生物はエネルギーの生成を必要とし、及びエネルギー生成能を有する。細胞が食品の有用な成分（例えば、炭水化物、脂肪及びタンパク質）を利用可能エネルギーへと変換する代謝経路は複雑であり、完全には理解されていない様式で多様な要因から影響を受ける。毛包は、例外ではない。
【０００３】
毛包は、体内で代謝的に最も活性な細胞のうち、たった１グラムの毛髪繊維を生成するために、およそ６７０キロカロリーを利用する。これは、毛包内でエネルギー生産の摂動があるたびに、毛包機能の喪失によって証明される。これは、薬剤が特に増殖性及びエネルギー集約的細胞を速やかに攻撃することを目標とする場合の化学療法で発生する。更にこれは、ストレス又は突然の食事の変化を含む、体内でのエネルギー生産に影響する多数の生理的変化の第１の症状のうち、脱毛症によって証明される。
【０００４】
毛包は、動的で複雑な関係下で毛髪の健康を維持するために協調して機能する、多様な異なる細胞型を含む。例えば、ケラチノサイトが毛幹を作るために増殖及び分化し、メラノサイトが毛色素沈着のためにメラニンを提供し、繊維芽細胞が細胞外基質及びコラーゲンを合成し、並びに真皮乳頭細胞が上記細胞の複合体相互作用を調節して、毛髪の健康を維持する。同様に、ミオサイト、幹細胞、脂腺細胞、神経細胞、及び脂肪細胞等の毛包内又は周囲で発見されたその他の細胞は全て、複合代謝経路由来のエネルギーを必要とし、多様な異なる要因によって影響される場合がある。
【０００５】
多様なストレッサーが、細胞の生体エネルギー、細胞老化、及び疾患（例えば、がん、神経変性疾患、糖尿病、及び循環器疾患）に影響を与えるという認識が強まっている。多様なストレッサーの影響の基礎となる説の１つは、遊離基説である。遊離基説では、哺乳類細胞を活性酸素種（「ＲＯＳ」）に曝露することで、ミトコンドリア等の細胞構造及び細胞小器官に損傷が生じる。ＲＯＳは、酸素を含む高反応性分子である。ＲＯＳは、正常な酸素代謝の天然の副生成物として細胞内で生成され、細胞のシグナル伝達及び恒常性維持に関与する。しかしながら、細胞が熱、きつい化学薬品、又は紫外線等のストレッサーに曝露されたとき、ＲＯＳ濃度は増加する場合があり、場合によっては劇的に増加する場合がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
毛包細胞は、グルタチオン及びニコチン酸アデニンジヌクレオチド、並びにＲＯＳを中和する多様な酵素等のレドックス制御分子を用いることによってＲＯＳを防ぐ。しかし、これらの防衛が、ストレッサーにより誘導されたＲＯＳの急増したスパイクにより圧倒され、代謝効率において急性及び慢性の変化の両方をもたらし、全体的な小胞体機能障害を引き起こす。厄介なことに、ヒトの毛包に関連する細胞型の多様性及び毛包の代謝経路の複雑性が、特定の酸化ストレッサーに曝露することに関連する毛量減少効果の除去を助ける好適な化合物の特定を難しくしている。特定の酸化ストレッサーは、異なる種類の細胞及び代謝経路に別個に作用する。これは、特定のストレッサーの望ましくない効果を除去する好適な有益剤の選択を難しくしている。
【０００７】
したがって、毛包の代謝指標に対する活性剤及び／又はストレッサーの効果を測定する方法が必要とされている。また、前述の方法を用いてヘアケア組成物で使用され得る有益剤を特定することが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の実施形態によると、１つ以上の毛包の基準代謝指標に対する活性剤又はストレッサーの効果を測定する方法が提供されており、方法は、（ａ）１つ以上の毛包を得る工程と、（ｂ）容器内に１つ以上の毛包を配置する工程であって、１つ以上の毛包が１つ以上のセンサーの下に置く、工程と、（ｃ）１つ以上のセンサーを使用して、解糖及び酸化的リン酸化の両方に対する１つ以上の毛包の基準代謝指標を測定する工程と、（ｄ）１つ以上の毛包を活性剤又はストレッサーに曝露する工程と、（ｅ）１つ以上のセンサーを使用して、解糖及び酸化的リン酸化の両方に対する１つ以上の毛包の応答代謝指標を測定する工程と、を含む。
【０００９】
他の実施形態によると、活性剤は、対応する基準代謝指標と比較して、応答代謝指標のうちの１つが１つ以上の毛包の代謝活性における向上に相当する場合、有益剤として特定されてもよい。
【００１０】
更に別の実施形態によると、上記で特定されたように、有益剤を含むヘアケア組成物が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
全ての百分率は、特に指示がない限り、ヘアケア組成物の重量による。全ての比率は、特に記述のない限り、重量比である。全ての数範囲は、より狭い範囲を包含し、表現された上方及び下方範囲の限界値は互換可能であって、明示されていない範囲を更に作成する。有効数字の数は、指示されている量を限定するものでもなく、測定の精度を限定するものでもない。
【００１２】
「有益剤」とは、本明細書で使用するとき、毛髪及び／又は頭皮に適用されたときに、一般的に細胞内で発見される細胞の型に対する急性及び／又は慢性の効果を提供する化合物又は化合物の併用を意味する。有益剤は、毛髪及び／又は頭皮若しくはそれらに関連する細胞の代謝指標を調節すること及び／又は改善することによって効果を達成することができる。
【００１３】
「皮膚科学的に容認できる担体」とは、本明細書で使用するとき、過度の毒性、不適合性、不安定性、アレルギー反応等のないヒトの毛髪及び／又は皮膚に接触する組成物の使用に適した担体を意味する。
【００１４】
「ヘアケア組成物」とは、本明細書で使用するとき、動物又はヒトの毛髪及び／又は頭皮の領域に対して、所望する視覚又は触覚効果を提供することが可能な任意の組成物を意味する。視覚又は触覚効果は、一時的、半永久的、又は永久的であり得る。ヘアケア組成物のいくつかの非限定的な例は、シャンプー等の毛髪を清潔にするための製品を含む。その他の製品は、コンディショナー、残留型トリートメント、スタイリング剤、染毛剤等を含んでもよい。
【００１５】
「毛包」とは、本明細書で使用するとき、無傷哺乳類の毛包及び／又は３次元培養（three-dimensional tissue-engineered）毛包を意味する。哺乳類の毛包は、ペットの毛包を含んでもよい。
【００１６】
「非致死的に」とは、本明細書で使用するとき、試験手順又は試験測定が、試験又は観察されている毛包細胞を殺さない又は破壊しないことを意味する。例えば、非致死的に基準代謝指標を検出することは、少なくとも７５％の毛包細胞が、検出後に生存している（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％又は更には最大９９％以上の細胞が生存し続ける）ことを意味する。理想的には、非致死的試験後には１００％の細胞が生存するものの、いくつかの細胞の死又は破壊は、試験にとって不可避的及び／又は無関係であり得ることが認識される。
【００１７】
「ストレッサー」とは、本明細書で使用するとき、細胞内の望ましくない活性酸素種の形成を引き起こす任意の要素を意味する。ストレッサーの非限定的な例は、毛髪染料、毛髪スプレー、酸化剤、溶媒、熱、ホットオイル、パーマ処理、物理的揺動、紫外線、煙草の煙、オゾン、排気ガス、ディーゼル排気、スモッグ、界面活性剤、放射線、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。
【００１８】
提供されるのは、１つ以上の毛包の基準代謝指標に対する活性剤の効果を測定する方法であって、（ａ）１つ以上の毛包を得る工程と、（ｂ）容器内に１つ以上の毛包を配置する工程であって、１つ以上の毛包が１つ以上のセンサーの下に置く、工程と、（ｃ）１つ以上のセンサーを使用して、解糖及び酸化的リン酸化の両方に対する１つ以上の毛包の基準代謝指標を測定する工程と、（ｄ）１つ以上の毛包を活性剤又はストレッサーに曝露する工程と、（ｅ）１つ以上のセンサーを使用して、解糖及び酸化的リン酸化の両方に対する１つ以上の毛包の応答代謝指標を測定する工程と、を含んでもよい。
【００１９】
哺乳類細胞がエネルギーを生成するために重要な２つの代謝経路は、酸化的リン酸化（「ｏｘｐｈｏｓ」）経路及び解糖経路である。いずれの経路も、ほとんどの哺乳類毛包内で健康的なエネルギー平衡を維持するのに必要とされる。酸化的リン酸化は、レドックス反応における酸素等の、電子供与体から電子受容体への電子の移動に関与する。これらのレドックス反応は、ＡＴＰを形成するために用いられるエネルギーを解放する。哺乳類では、ミトコンドリア膜内の一連のタンパク質複合体よりレドックス反応が実施され、この連結しているタンパク質セットは電子伝達系と呼ばれる。電子がこの電子伝達系を通過することにより放出されたエネルギーを利用して、ミトコンドリア膜を通過して化学浸透と呼ばれるプロセスでプロトンが輸送され、これにより膜を介してｐＨ勾配及び電位の形態で位置エネルギーが生成される。ＡＴＰ合成酵素として一般に知られる酵素は、位置エネルギーを利用してＡＴＰを生成することができる。酸化的リン酸化経路は酸素を利用してＡＴＰを生成することから、毛包が酸素を消費する速度を毛包の代謝指標として利用することもできる。つまり、毛包の酸素消費量は、酸化的リン酸化を介する毛包によるエネルギー生産に直接相関していてもよい。追加的に又は別の方法として、二酸化炭素は細胞代謝の副生成物であることから、二酸化炭素生成速度を代謝指標として利用することもできる。より高い酸素消費速度又は二酸化炭素生成速度は、酸化的リン酸化経路からのエネルギー生産の増加、ひいては毛包の代謝及び／又は健康における向上を意味することもあり得る。反対に、より低い酸素消費量又は二酸化炭素生成量は、毛包の代謝及び／又は健康における減少を意味することもあり得る。
【００２０】
解糖はグルコースをピルビン酸に変換する代謝経路である。このプロセスで放出される自由エネルギーを利用して、ＡＴＰ及びＮＡＤＨ（還元ＮＡＤ）が形成される。解糖は、１０種の中間体化合物を包含する確実な一連の１０の反応（工程のうちの１つには２つの中間体が関与する）であり、典型的には毛包細胞の細胞質基質で生じる。中間体は、解糖の開始点を提供する。単糖（例えば、フルクトース、グルコース、及びガラクトースなど）のほとんどは、これらの中間体のいずれかに変換され得る。中間体が直接的に有用である場合もある。例えば、中間体ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）は、脂肪酸と結合して脂肪を形成するグリセロール源である。解糖の副生成物は、溶液中で乳酸アニオンに加えてプロトンを形成し得る乳酸である。したがって、乳酸、乳酸塩又はプロトン濃度を解糖の代謝指標として使用できる。すなわち、細胞外ｐＨ又は細胞外酸性化速度における変化は、細胞による、解糖経路を介したエネルギー生産と直接関連付けられ得る。より高い細胞外酸性化速度は、解糖経路を介したエネルギー生産の増加、ひいては毛包の代謝及び／又は健康の向上を意味することもあり得る。反対に、より低い細胞外酸性化量は、毛包の解糖代謝及び／又は健康における減少を意味することもあり得る。
【００２１】
提供されるのは、１つ以上の毛包の基準代謝指標に対する活性剤又はストレッサーの効果を測定する方法であって、この方法は、（ａ）１つ以上の毛包を得る工程と、（ｂ）容器内に１つ以上の毛包を配置する工程であって、１つ以上の毛包が１つ以上のセンサーの下に置く、工程と、（ｃ）１つ以上のセンサーを使用して、解糖及び酸化的リン酸化の両方に対する１つ以上の毛包の基準代謝指標を測定する工程と、（ｄ）１つ以上の毛包を活性剤又はストレッサーに曝露する工程と、（ｅ）１つ以上のセンサーを使用して、解糖及び酸化的リン酸化の両方に対する１つ以上の毛包の応答代謝指標を測定する工程と、を含む。
【００２２】
１つ以上の毛包の基準代謝指標に対する活性剤又はストレッサーの効果を測定する方法は、１つ以上の毛包を得る工程を含んでもよい。１つ以上の毛包は、ペット及びヒトを含む任意の哺乳類から得ることができる。一実施形態では、１つ以上の毛包は、牛の皮から得られてもよい。他の実施形態では、１つ以上の毛包は、１つ以上の３次元培養毛包を含んでもよい。
【００２３】
１つ以上の毛包の基準代謝指標に対する活性剤又はストレッサーの効果を測定する方法は、発育している１つ以上の毛包のためのスクリーニングを含んでもよい。
【００２４】
発育毛包のためのスクリーニングは、以下の方法によって達成されてもよい。
（１）脂腺の下を横断するバルブ領域又は真皮さやを傷つけることなく外科用メス及び先の細い鉗子を使用して、解剖顕微鏡で哺乳類の組織から１つ以上の毛包を分離する工程、
（２）毛包を、Ｌ−グルタミン、インスリン、ヒドロコルチゾン、及び抗生物質／抗真菌剤が２ｍＭ補充されたＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ内に配置する工程、
（３）０．５ｍＬの補充されたＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅを含有する培養プレートのウェル内にそれぞれの毛包を配置する工程、
（４）Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＤＦ  Ｐｌａｎ  １Ｘ  Ｏｐｔｉｃで２．５倍の倍率にしたＯｌｙｍｐｕｓ  ＳＺＨ  Ｍｉｃｒｏ−Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ  Ｓｃｏｐｅに接続されたＭｏｔｉｃａｍ  ２３００カメラでデジタル基準イメージを得る工程、
（５）５％  ＣＯ2で３７℃に加湿された培養器内に培養プレートを２４時間配置する工程、及び
（６）毛包を基準イメージと比較する工程であって、発育は、毛根鞘及び繊維拡大が同時に発生した場合に決定される、工程。
【００２５】
１つ以上の毛包の基準代謝指標に対する活性剤又はストレッサーの効果を測定する方法は、１つ以上の毛包を容器内に配置する工程を含んでもよく、１つ以上の毛包が１つ以上のセンサーの下に置く。１つ以上のセンサーは、代謝指標を測定するための任意の好適な装置の上に位置したセンサーでもよく、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手可能なＸＦ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｘ  Ａｎａｌｙｚｅｒを含む。一実施形態では、容器は、島状の容器又はマルチウェルマイクロプレートであってもよい。
【００２６】
一実施形態では、１つ以上の毛包は、細胞接着材を使用して容器に固定されてもよい。任意の好適な細胞接着材が使用されてもよく、Ｃｅｌｌ−Ｔａｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を含む。一実施形態では、細胞接着材は、１つ以上の毛包を容器に固定する前に中和緩衝液と混合されなくてもよい。
【００２７】
細胞接着材は、以下の方法を使用して容器に適用されてもよい。
（１）２０マイクロリットル（μｌ）の純Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を容器に追加する工程、
（２）層流封じ込めキャビネット内で容器の空気乾燥を許容する工程、
（３）１ｍＬの水性７０％エタノールで１回容器をすすぐ工程、
（４）１ｍＬ減滅水で２回容器をすすぐ工程、及び
（５）容器の空気乾燥を許容する工程。
【００２８】
１つ以上の毛包の基準代謝指標に対する活性剤又はストレッサーの効果を測定する方法は、１つ以上のセンサーを使用して、解糖及び酸化的リン酸化の両方に対する１つ以上の毛包の基準代謝指標を測定する工程を含んでもよい。一実施形態では、基準代謝指標は、同時に検出される。一実施形態では、１つ以上の毛包の基準代謝指標は、非致死的に測定されてもよい。一実施形態では、基準代謝指標の測定は、制御環境で行われてもよい。
【００２９】
１つ以上の毛包の基準代謝指標に対する活性剤又はストレッサーの効果を測定する方法は、１つ以上の毛包を、活性剤又はストレッサーに曝露する工程を含んでもよい。活性剤の非限定的な例は、カフェイン、カルニチン、クレアチン、アルファリポ酸、ナイアシンアミド、コエンザイムＱ１０、アシルカルニチン、アセチルカルニチン、ユビキノン、ユビキノン誘導体、エトキシキン、創傷治癒ペプチド、アシル基に結合した創傷治癒ペプチド（すなわち、パルミチン酸）、タウリン、アセチル補酵素Ａ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。一実施形態では、活性剤は、ナイアシンアミドであってもよい。ストレッサーの非限定的な例は、毛髪染料、毛髪スプレー、溶媒、熱、ホットオイル、パーマ処理、物理的揺動、紫外線、煙草の煙、オゾン、排気ガス、ディーゼル排気、スモッグ、界面活性剤、放射線、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。一実施形態では、方法は、１つ以上の毛包を、任意の順序で活性剤及びストレッサーの両方に曝露する工程を含む。
【００３０】
１つ以上の毛包の基準代謝指標に対する活性剤又はストレッサーの効果を測定する方法は、１つ以上のセンサーを使用して、解糖及び酸化的リン酸化の両方に対する該１つ以上の毛包の応答代謝指標を測定する工程を含んでもよい。一実施形態では、応答代謝指標は、同時に検出されてもよい。一実施形態では、応答代謝指標の測定は、制御環境で行われてもよい。
【００３１】
一実施形態では、酸化的リン酸化に対する基準代謝指標及び応答代謝指標は、酸素消費速度である。その他の実施形態では、酸化的リン酸化に対する基準代謝指標及び応答代謝指標は、二酸化炭素発生速度である。
【００３２】
一実施形態では、解糖経路に対する基準代謝指標及び応答代謝指標は、細胞外酸性化速度である。
【００３３】
１つ以上の毛包の基準代謝指標に対する活性剤又はストレッサーの効果を測定する方法は、毛包の応答代謝指標を測定する前に、適宜毛包をストレッサーに曝露する工程を含んでもよい。
【００３４】
提供された方法は、調節された環境下での酸化的リン酸化及び解糖代謝経路に関連する代謝指標を、非致死的に同時に検出することを可能にする。この方法は、動態データの取得も可能にする。ストレッサー又は有効成分に対する代謝応答を評価するとき、２つの代謝経路がどのようにしてストレッサー又は有効成分と相互作用するのか及び／又は互いに相互作用するのかを理解するためには、代謝経路の両方を同時に評価することが重要である。加えて、代謝経路をリアルタイムで（すなわち、周期的な測定を繰り返して）モニターして、静的なデータのみを提供する方法を使用した時には損なわれ得る傾向及び／又は一過性の応答を観察することが重要である。しかし、いくつかの実施形態では、破壊試験が本明細書に好適であり得る。
【００３５】
アーティファクトが混入する可能性を低減させるため、制御環境下で代謝指標を検出することも重要である。好適な制御環境は、外的な環境条件による、何らかの望ましくない影響（例えば、温度、圧力、湿度、光、望ましくない気体、液体又は固体夾雑物による接触）を最低限に抑え、又は予防する。例えば、検出される代謝指標が酸素消費速度であり、試験サンプルが環境に対し露出されている場合に、消費酸素の少なくとも一部は環境中の酸素により置き換えられることから、測定される酸素濃度は毛包細胞により消費される酸素量を正確には反映しない場合がある。加えて、試験方法そのものがアーティファクトを測定値に混入させてはならない。
【００３６】
培地の温度変化などの環境変化が望ましくない環境誤差をもたらし得ることは明らかである。具体的には、培地が溶存気体を保持する容量は温度により変化し、したがって、培地が周囲環境と平衡に近づくにつれて、溶存気体濃度において明白な変化が生じ得る。更に、少なくとも一部の種類のセンサーの測定特性は温度により変化し得る。したがって、試験容器内及び／又は周囲環境下の培地温度などの環境条件を制御すること、あるいは測定値に補正係数を適用することは特に望ましいものであり得る。同様にして、湿度などの他の未調節の環境条件、あるいは気流への曝露に由来する、培地からの任意の蒸発は、溶存気体、イオン、及び温度などを含む、各種センサーにより得られる測定値にアーティファクトによる影響を与える恐れがある。したがって、これらの要因を最小限に抑える又は排除するためには制御環境を提供することが重要である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、代謝パラメータの検出に使用される装置は、毛包を保持する試験容器（例えば、マルチウェルマイクロプレート）を受容するのに適したステージを含んでもよい。装置には、試験容器内の環境を外部環境から単離するためのバリアを受容するよう構成されたプランジャを含有させてもよい。バリアは、例えば、シートと噛み合わせることにより、あるいは試験容器の壁における段差と噛み合わせることにより試験容器の一部分と協働させて、試験容器の開口部を密閉するよう構成することもできる。追加的に又は別の方法として、プランジャ及びバリアは、試験容器の容量、及び少なくとも一部（例えば、５〜５０％）の毛包を含む試験容器内の培地体積を減少及び／又は増加するよう構成することもできる。例えば、バリアは、ステージ及びプランジャを相対的に移動させることにより試験容器に挿入してもよく、及び／又は取り出してもよい。一部の実施態様では、方法は、容器中に追加の培地を灌流すること、及び／又は培地を補充することを含み得る。培地量を減少させることにより、大量の細胞培地内の細胞を一時的に高濃度に濃縮させて、センサーの、毛包細胞の生物活性により生じる培地中の代謝指標における高感受性の変化を検出する性能を、改善することができる。永久的にではなく、一時的に培地量を減少させることで（及びしたがって、細胞／培地混合物を濃縮することで）、細胞は非常に僅かな時間だけ異常環境に曝露されることになり、したがって測定プロセスによる悪影響を及ぼさずに済む。
【００３８】
機器は、所望の代謝指標（１種以上）を分析し得るセンサーも含み得る。一部の実施態様では、センサーは、バリア及び／又はプランジャ上に配置され得る。センサーは、培地との連絡を検知するものであるべきであり、所望の代謝指標を検出するよう構成される。センサーは、代謝指標の存在及び／又は濃度を感知するように構成されてもよく、代謝指標の濃度変化速度を感知するように構成されてもよく、並びに／あるいは第１の代謝指標の第１の濃度を感知し、第２の代謝指標の第２の濃度を感知し、かつ第１の濃度と第２の濃度との間の関係を決定するように構成されてもよい。１つ以上の毛包を妨害することなく、代謝パラメータを検出するようにセンサーを構成することが望ましい。この装置には、データ収集及び記録、１つ以上の試験工程の繰り返し、並びに細胞外環境への活性剤又はストレッサーの移行を含む、１つ以上の試験態様を自動化するようプログラムされたコンピューターを包含させることもできる。いくつかの実施形態では、センサーはコンピューターと接続させることもできる。
【００３９】
制御された環境、代謝指標の非致死的かつ同時検出、並びに動態データを提供する装置の好適な非限定的な例は、米国特許第７，２７６，３５１号、同第７，６３８，３２１号、及び同第７，８５１，２０１号（Ｔｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）、及び米国特許第８，２０２，７０２号（Ｎｅｉｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．）に開示されている。特に好適な装置は、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から入手可能なＸＦ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｘ  Ａｎａｌｙｚｅｒである。
【００４０】
酸素消費速度及び細胞外酸性化速度は、ＸＦ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｘ  Ａｎａｌｙｚｅｒ又は等価物を使用して検出することができる。装置は、制御環境下で、酸化的リン酸化及び解糖経路の代謝指標を非致死的かつ同時に検出でき、並びに運動データを提供できるものであるべきである。１つ以上の毛包は、機器に使用するのに好適なマルチウェルプレート（例えば、２４ウェルプレート又は９６ウェルプレート）中に用意し、試験前に洗浄してもよい。１つ以上の毛包は、当該技術分野において既知の任意の好適な方法（例えば、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＸＦ  ｐｒｅｐ  ｓｔａｔｉｏｎを使用すること）によって洗浄されてもよい。１つ以上の毛包を洗浄するとき、ウェルからは培地を除去し、その後、細胞は好適な量の試験培地で３回洗浄することが望ましいものであり得る（例えば、９６ウェルプレートでは１８０μＬ、又は２４ウェルプレートでは６００μＬ）。１つ以上の毛包の洗浄後、好適な量の試験培地をそれぞれのウェルに配置し、かつ毛包は、プレートを試験のために機器内に配置する前に、１〜１．５時間ＣＯ2フリーの培養器内で３７℃で平衡化する。平衡化期間の後に、１つ以上の毛包を含むプレートを機器の中へ取り付け、かつ製造者の指示にしたがって平衡化する。試験全体は３７℃で実施する。一部の実施態様では、角質細胞については、３分の混合サイクル、２分の待機サイクル、及び３分の測定サイクルを、並びに繊維芽細胞については、２分の混合サイクル、２分の待機サイクル、及び３分の測定サイクルを提供するよう機器を設定することは望ましいものであり得る。このサイクルは少なくとも８８分間反復すべきである。サイクル及び時間は、所望されるように変性されてもよいことが理解できる。
【００４１】
１つ以上の毛包の基準代謝指標に対する活性剤又はストレッサーの効果を測定する方法は、対応する基準代謝指標と比較して、応答代謝指標のうちの１つが１つ以上の毛包の代謝活性における向上に相当する場合、活性剤を有益剤として特定することを含んでもよい。一実施形態では、より高い細胞外酸性化速度は、解糖経路からのエネルギー生産の増加、ひいては１つ以上の毛包の代謝及び／又は健康における向上を意味することもあり得る。一実施形態では、より高い酸素消費速度又は二酸化炭素生成速度は、酸化的リン酸化経路からのエネルギー生産が増加、ひいては毛包の代謝及び／又は健康における向上を意味することもあり得る。
【００４２】
一実施形態では、ヘアケア組成物は、上記で特定されたような有益剤及び皮膚科学的に容認できる担体を含んでもよい。本明細書中の好適なヘアケア組成物は、例えば、乳濁液、液体、固体、乳、クリーム、ゲル、マウス、軟膏、ペースト、血清、スティック、スプレー、トニック、エアロゾル、フォームを含む、当該分野において既知の多様な形態のうちの任意の１つであってもよい。
【００４３】
更にヘアケア組成物には、１つ以上の追加成分を含有させることもできる。これらへの使用に好適な追加成分の非限定的な例は、米国特許出願第２０１０／０２３９５１０号（Ｈａ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０年１月２１日出願）に記載される。
【００４４】
本明細書に組み込まれるヘアケア組成物は、組成物及び局所適用組成物を作製する当該技術分野において既知の従来の方法にしたがって調整されてもよい。かかる方法は、典型的には、加熱、冷却、真空の適用等を用いて、又はそれらを用いずに、１つ又はそれ以上の工程で、成分を比較的均一な状態になるまで混合する工程を伴う。ヘアケア組成物は、治療期間の間十分な量のヘアケア組成物を保存するように寸法設定されたパッケージ中で提供されてもよい。パッケージの寸法、形状、及びデザインは幅広く様々であり得る。
【００４５】
本明細書に開示した寸法及び値は、記載された正確な数値に厳密に限定されるものと理解されるべきではない。むしろ、特に指示がない限り、そのような寸法のそれぞれは、記載された値及びその値の周辺の機能的に同等の範囲の両方を意味するものとする。例えば、「４０ｍｍ」として開示した寸法は、「約４０ｍｍ」を意味することを意図したものである。更に、本明細書に記載される特性は、１つ又は２つ以上の範囲の値を含み得る。当然のことながら、これらの範囲は、範囲内の個々の値が特に開示されていない場合でも範囲内の全ての値を包含するということが理解されるべきである。
【００４６】
「発明を実施するための形態」で引用する全ての文献は、関連部分において本明細書に参照により組み込まれるが、いずれの文献の引用も、それが本発明に関する先行技術であることを容認するものとして解釈されるべきではない。本明細書中の用語の任意の意味又は定義が、参照により組み込まれた文献中の同一用語の任意の意味又は定義と相反する限りにおいては、本明細書においてその用語に与えられた意味又は定義を適用する。
【００４７】
本発明の特定の実施形態が例示され記載されてきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく他の様々な変更及び修正を実施できることが、当業者には自明であろう。したがって、本発明の範囲内にあるそのようなすべての変更及び修正を添付の特許請求の範囲で扱うものとする。
【国際調査報告】
2016514969.tif 000002
2016514969.tif 000003
2016514969.tif 000004