(57)【要約】  【解決手段】  本発明は、対象への導入遺伝子または治療的な核酸の送達のためのＡＡＶベクターおよびその使用の方法を提供する。  【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の脳に核酸分子を送達する方法であって、前記対象にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを投与する工程を有し、前記ＡＡＶベクターは前記核酸分子と、配列ＩＤ番号１または３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質とを有する方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記カプシドタンパク質は配列ＩＤ番号１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するものである方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、前記カプシドタンパク質は配列ＩＤ番号１を有するものである方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、前記核酸分子は治療用タンパク質または抑制性核酸分子をコードするものである方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法において、前記核酸分子は脳内のニューロンに送達されるものである方法。
【請求項６】
対象の脳に影響を及ぼす疾患または障害を治療する方法であって、前記対象にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを投与する工程を有し、前記ＡＡＶベクターは治療用タンパク質または抑制性核酸分子をコードする核酸分子と、配列ＩＤ番号１または３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質とを有する方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法において、前記カプシドタンパク質は配列ＩＤ番号１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するものである方法。
【請求項８】
請求項６記載の方法において、前記カプシドタンパク質は配列ＩＤ番号１を有するものである方法。
【請求項９】
請求項６記載の方法において、前記核酸分子は治療用タンパク質をコードするものである方法。
【請求項１０】
請求項６記載の方法において、前記疾患または障害はリソソーム蓄積症である方法。
【請求項１１】
請求項６記載の方法において、前記疾患または障害は神経変性疾患である方法。
【請求項１２】
請求項６記載の方法において、前記核酸分子はβ−グルクロニダーゼをコードするものである方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年３月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／７８０，４２３号への３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）による優先権を主張する。当該出願はこの参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、国立神経疾患・脳卒中研究所（ＮＩＮＤＳ）により授与されたＲ０１ＮＳ０３８６９０および国立糖尿病・消化器・腎疾病研究所（ＮＩＤＤＫ）により授与されたＲ０１ＤＫ０６３９７３に従い政府支援でなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
本出願は、遺伝子治療および分子生物学の分野に関する。より詳しくは、本発明は、脳への改善した遺伝子導入を伴うアデノ随伴ウイルスベクターを提供する。
【背景技術】
【０００４】
いくつかの出版物および特許文献が、本発明に関連する最先端の技術を記述するため、明細書を通し引用される。これらの引用の各々は、参照することにより全体が記載されているように本明細書に組み込まれる。
【０００５】
アデノ随伴ウイルスはパルボウイルス科のヘルパー依存型ウイルス（ディペンドウイルス）であり、複製のためにヘルパーウイルスを必要とする。感染の後、一般的にＡＡＶは潜伏相、具体的に言うとＡＡＶゲノムが宿主染色体にインテグレートされた部位に入る。ＡＡＶゲノムはただ、ヘルパーウイルスによる再度の感染により、レスキューされ、複製され、感染性ウイルスにパッケージングされるのみである。したがって、自然感染は、アデノウイルスまたは単純疱疹ウイルスのようなヘルパーウイルスの感染を背景として生じる。
【０００６】
ＡＡＶベクターは非病原性で、コードされた異種遺伝子の長期の発現をもたらすのみならず、それらはまた、中枢神経系（ＣＮＳ）の治療に必要不可欠である、分裂しない細胞を形質導入するという能力を有する。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、拡張性があり、効率的で、遺伝性疾患の治療のために主に用いられる非細胞変性の遺伝子送達ベクターである。実際に、ＡＡＶベクターにより、脳、心臓、肺、目、および肝臓の疾患を含む広範囲のヒト疾患動物モデルの治療に成功した（Ｍｉｎｇｏｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１２：３４１−３５５）。さらに、例えば、レーバーの先天性黒内障、血友病、鬱血性心不全、リポタンパクリパーゼ欠損症、およびパーキンソン病を含む様々な疾患の治療において、ＡＡＶベクターを用いた多数の臨床試験は、現在肯定的な結果で進行中である（Ｍａｇｕｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５８：２２４０−２２４８；Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５８：２２３１−２２３９；Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１９：９７９−９９０；Ｎａｔｈｗａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３６５：２３５７−２３６５；Ｊｅｓｓｕｐ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２４：３０４−３１３；ＬｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．，１０：３０９−３１９）。様々な障害の治療のためのＡＡＶをベースにした遺伝子治療法の見込みがあるにもかかわらず、標的組織への特異的な送達を行う改良されたＡＡＶベクターが望まれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、脳、特にその中のニューロンへの核酸分子の改善された送達のための組成物および方法が提供される。特定の実施形態において、この方法は、目的の核酸分子を有するＡＡＶベクターを対象に投与する工程を有し、前記ＡＡＶベクターはｈｕ．３２またはｒｈ．８カプシドタンパク質またはそのバリアントを有する。特定の実施形態において、カプシドタンパク質は、配列ＩＤ番号１または３と、少なくとも９０％、９５％若しくはそれ以上の相同性／同一性を有し、または配列ＩＤ番号２または４と少なくとも９０％、９５％若しくはそれ以上の相同性／同一性を有する核酸分子によってコードされる。ＡＡＶは、例えば、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を有する組成物の一部として、経脈管的に対象に送達されてもよい。
【０００８】
本発明の別の観点によれば、疾患または障害、特に脳に関連した遺伝性疾患の治療、抑制、および／または予防のための治療法が提供される。特定の実施形態において、この疾患または障害は脳以外にも影響を及ぼす（例えば、この疾患または障害は、多臓器疾患または障害（例えば、ＬＳＤ）である）。特定の実施形態において、この方法は、治療用タンパク質または抑制性核酸分子をコードする核酸分子を有するＡＡＶベクターを対象に投与する工程を有し、前記ＡＡＶベクターはｈｕ．３２またはｒｈ．８カプシドタンパク質またはそのバリアントを有する。特定の実施形態において、前記カプシドタンパク質は、配列ＩＤ番号１または３と少なくとも９０％、９５％若しくはそれ以上の相同性／同一性を有し、または配列ＩＤ番号２または４と少なくとも９０％、９５％若しくはそれ以上の相同性／同一性を有する核酸分子によってコードされる。前記ＡＡＶは、例えば、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と、任意選択で、少なくとも１つの他の治療剤とを有する組成物の一部として経脈管的に対象に送達されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１Ａは、ｈｕ．３２カプシドのアミノ酸配列を提供する（配列ＩＤ番号１）。図１Ｂは、ｈｕ．３２カプシドのヌクレオチド配列を提供する（配列ＩＤ番号２）。図１Ｃは、ｒｈ．８カプシドのアミノ酸配列を提供する（配列ＩＤ番号３）。図１Ｄは、ｒｈ．８カプシドのヌクレオチド配列を提供する（配列ＩＤ番号４）。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、ＧＦＰ発現により証明されるようにＡＡＶ感染を示すマウス脳の様々な領域の画像を提供する。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現により証明されるようにＡＡＶ感染を示すマウス脳の様々な領域の画像を提供する。図３Ａは、ＡＡＶ２／ｈｕ３２であり、図３Ｂは、ＡＡＶ２／ｒｈ８であり、図３ＣはＡＡＶ２／９であり、図３Ｄは、ＡＡＶ２／ｈｕ１１である。
【図４】図４は、ＧＦＰ発現により証明されるようにＡＡＶ感染を示すネコ脳の様々な領域の画像を提供する。
【図５】図５Ａは、ＡＡＶ感染を示すＧＦＰ発現およびニューロンを示すＮｅｕＮ（Ｆｏｘ−３）染色を示す大脳皮質（ｃｔｘ）、海馬（ｈｐ）、小脳（ｃｅｒ）、および線条体（ｓｔｒ）由来の脳切片の画像を提供する。図５Ｂは、ＡＡＶ感染を示すＧＦＰ発現および星状膠細胞を示すグリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）染色を示す大脳皮質（ｃｔｘ）、海馬（ｈｐ）、および線条体（ｓｔｒ）由来の脳切片の画像を提供する。図５Ｃは、ＡＡＶ感染を示すＧＦＰ発現および希突起神経膠細胞を示すａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｉ（ＡＰＣ）染色を示す大脳皮質（ｃｔｘ）、および線条体（ｓｔｒ）由来の脳切片の画像を提供する。
【図６】図６は、正常マウス、無治療ＭＰＳ  ＶＩＩマウス、およびＡＡＶ．ｈｕ３２．ｈＧＢｐ．ＧＵＳＢで形質導入したＭＰＳ  ＶＩＩマウス由来の海馬、視床、および内嗅皮質脳切片の組織病理画像を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、インビボ遺伝子導入のためのウイルスベクターの中でも最も有望なものである。プロトタイプＡＡＶ２ベクターは、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞の比較的限られた形質導入という結果に終わり、多くのヒトはＡＡＶ２の血清反応陽性であり、それにより臨床応用におけるその使用は制限的である。しかしながら、別のＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質を用いたＡＡＶ２ゲノムのクロスパッケージングは、脳を含む様々な組織で、改善された遺伝子導入をもたらした（Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：３４２８−３４３２；Ｐａｓｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７：７０３４−７０４０；Ｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１０：３０２−３１７；Ｃｅａｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３：５２８−５３７；Ｔａｙｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．，１８：１９５−２０６；Ｃｅａｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１６：１７１０−１７１８）。多くのＡＡＶカプシド配列は、内因性ＡＡＶｓの配列の分子レスキューにより、ヒトおよびヒト以外の霊長類から分離された。カプシド配列は、ＡからＦの６つの分岐群に系統学的に特徴づけられた（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９９：１１８５４−１１８５９；Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１００：６０８１−６０８６；Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１−６３８８）。他のＡＡＶ血清型はニューロン投射に沿ってベクター輸送を行うことが可能であるが、特定のＡＡＶ血清型は、ニューロン特異的な親和性を有し、星状膠細胞または希突起神経膠細胞のような脳内の他の種類の細胞を効率的に形質導入することが不可能である（Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：３４２８−３４３２；Ｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１０：３０２−３１７；Ｃｅａｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３：５２８−５３７；Ｋａｓｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：８３９−８４２；Ｐａｓｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１１：７５４−７６２；Ｃｅａｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２７：９９２８−９９４０；Ｃｅａｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１６：１７１０−１７１８；Ｆｏｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２７：５９−６５）。
【００１１】
本発明は、ｈｕ．３２またはｒｈ．８、特にｈｕ．３２カプシドタンパク質を有するＡＡＶベクターが、血管内注射の後にマウスの脳にＡＡＶベクター遺伝子導入を調節することを提示する。学名の最初の２つの文字は、単離の種を指し（ｈｕ：ヒト）、その後にその種からの単離の番号が続く。ＡＡＶベクターは特に脳、特に大脳皮質においてニューロンを形質導入し、非常に広範にわたる。脳内の分布量と同様に、本発明のＡＡＶベクターにより形質導入される細胞の種類は特有である。さらに、本発明のＡＡＶベクターは、肝臓の形質導入において他のＡＡＶ血清型より効率的でなく、それにより、多くのＡＡＶベクターの臨床的障害である、インビボにおけるＡＶＶベクターに対する有害な免疫反応を軽減する。脳内の分布が、本発明のＡＡＶベクターを、リソソーム蓄積症および神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病）のような脳に影響を及ぼす遺伝性疾患を含む（脳に加え、体の他の箇所にも影響を及ぼす疾患または障害を含む）様々な疾患の治療に対する優れたベクターにしている。
【００１２】
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５３０５９７およびＡＡＳ９９２８２は、ｈｕ．３２カプシド（ｖｐ１）のアミノ酸およびヌクレオチド配列の例を提供する。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＯ８８１８３およびＡＹ２４２９９７は、ｒｈ．８カプシド（ｖｐ１）のアミノ酸およびヌクレオチド配列の例を提供する。ＡＡＶカプシドは３つのタンパク質、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３から成り、それは選択的スプライスバリアントである。言い換えると、ｖｐ２およびｖｐ３は、ｖｐ１の断片である。図１Ａは、ｈｕ．３２  ｖｐ１カプシドの野生型アミノ酸配列である配列ＩＤ番号１を提供する。図１Ｂは、ｈｕ．３２  ｖｐ１カプシドの野生型ヌクレオチド配列である配列ＩＤ番号２を提供する。図１Ｃは、ｒｈ．８  ｖｐ１カプシドの野生型アミノ酸配列である配列ＩＤ番号３を提供する。図１Ｄは、ｒｈ．８  ｖｐ１カプシドの野生型ヌクレオチド配列である配列ＩＤ番号４を提供する。本発明は、ｈｕ．３２およびｒｈ．８カプシドのバリアントを包含する。特定の実施形態において、本発明のカプシドは、配列ＩＤ番号１または配列ＩＤ番号３と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％一致するアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、本発明のカプシドをコードする核酸分子は、配列ＩＤ番号２または配列ＩＤ番号４と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％一致するヌクレオチド配列を有する。
【００１３】
本発明は、特に対象（すなわち、インビボ）において、目的の（例えば、異種の）核酸分子を細胞に送達する方法を包含する。特定の実施形態において、この方法は、核酸分子をニューロンまたは脳、特に脳内のニューロンに送達する。特定の実施形態において、この方法は、核酸分子を嗅球、線条体、大脳皮質、海馬、視床下部、視床腹部、中脳、脳幹、上丘、下丘、内嗅皮質、鉤状回、および／または小脳に送達する。この方法は本発明のｈｕ．３２またはｒｈ．８カプシドを有するＡＡＶベクターに、（例えば、対象への投与によって）細胞を接触させる工程を有してもよく、前記ＡＡＶベクターは送達される核酸分子を有する。パッケージングされた核酸分子は、例えば、目的のタンパク質（例えば、治療用タンパク質）または抑制性核酸分子（例えば、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ＤｓｉＲＮＡ（Ｄｉｃｅｒ  ｓｉＲＮＡ／Ｄｉｃｅｒ−基質ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）など）をコードしてもよい。特定の実施形態において、対象に送達する核酸分子は機能獲得型操作である。本発明による目的の核酸分子の送達は、対象において疾患モデル（例えば、脳疾患モデル）をつくるために用いられてもよい（例えば、疾患または障害と関連する少なくとも１つの目的のタンパク質の発現（例えば、変異体））。例えば、本発明による目的の核酸分子の送達が、（例えば、アルツハイマー病と関連した少なくとも１つの遺伝子（例えば、変異体）を発現させることによる（例えばＣｈｉｎ，Ｊ．（２０１１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６７０：１６９−８９；Ｍｉｎｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎｅｕｒａｌ．Ｐｌａｓｔ．，１２：２９９−３１０；Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ８８：３−１２）を参照））アルツハイマー病、または（例えば、ハンチントン病と関連した変異ハンチンチン遺伝子（別名ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  １５（ＩＴ１５１）遺伝子）を発現させることによる）ハンチントン病のような神経変性疾患の疾患モデルをつくるために用いられてもよい。本発明はまた、本発明の方法により作出した疾患モデルを包含する。本発明の核酸分子はさらに、タンパク質または抑制性核酸分子をコードしたものを発現するためのプロモーターまたは発現オペロンのような適切な制御エレメントを有してもよい。
【００１４】
対象における疾患または障害を治療、抑制、および／または予防する方法はまた、本発明により包含される。特定の実施形態において、この方法は、その必要に応じて対象に本発明のｈｕ．３２またはｒｈ．８カプシドを有するＡＡＶベクターを投与する工程を有し、前記ＡＡＶベクターは送達される目的の核酸分子（例えば、治療的な核酸分子）を有する。特定の実施形態において、ＡＡＶベクターは、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を有する組成物の一部として投与される。本発明のＡＡＶベクターは、疾患または障害の治療のため、他の任意の治療法と同時投与されてもよい。ＡＡＶベクターの核酸分子は、治療用タンパク質または治療用抑制性核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）をコードしてもよい。核酸分子はさらに、タンパク質または抑制性核酸分子をコードするものを発現するためのプロモーターまたは発現オペロンのような適切な制御エレメントを有してもよい。
【００１５】
特定の実施形態において、疾患または障害は、脳に影響を及ぼす遺伝性疾患または障害である。治療することができる疾患または障害の例は、これに限定されるものではないが、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病（ＨＤ）、脳卒中、心的外傷、感染症、髄膜炎、脳炎、神経膠腫、（脳転移を含む）がん、多系統萎縮症、進行性核上麻痺、レヴィー小体病、神経炎症疾患、脊髄性筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、神経エイズ、クロイツフェルト・ヤコブ病、ピック病、多発脳梗塞性認知症、前頭葉変性症、大脳皮質基底核変性症、ＨＩＶ−１関連認知症（ＨＡＤ）、ＨＩＶ関連神経認知障害（ＨＡＮＤ）、麻痺、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルー・ゲーリック病）、多発性硬化症（ＭＳ）、ＣＮＳ関連の心血管疾患、プリオン病、肥満、代謝異常、炎症性疾患、代謝異常、およびリソソーム蓄積症（ＬＳＤ、例えば、限定されずに、ゴーシェ病、ポンぺ病、ニーマン・ピック、ハンター症候群（ＭＰＳ  ＩＩ）、ムコ多糖症（ＭＰＳ）（例えば、ムコ多糖症Ｉ（ＭＰＳ  Ｉ）、ムコ多糖症ＶＩＩ（ＭＰＳ  ＶＩＩ）など）、ＧＭ２−ガングリオシドーシス、サンフィリッポ症候群（ＭＰＳ  ＩＩＩＡ）、テイ・サックス病、サンドホフ病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、およびファブリー病）を含む。特定の実施形態において、疾患または障害は、リソソーム蓄積症である。
【００１６】
遺伝子導入は、様々な病態に治療を提供するのに用いることができる。一般に、遺伝子導入は以下を治療するのに用いられてもよい。１）欠乏状態であり、タンパク質（例えば、酵素）が、異常に低いレベルで発現し、または（例えば、変異して）不完全であり、活性が減退しており、それはタンパク質（例えば、野生型タンパク質）をエンコードする核酸を誘導することにより治療されることが可能である。および２）過剰発現状態であり、タンパク質が異常に高いレベルで発現し、または（例えば、変異して）不完全であり、増加または無制御な活性を有し、それはタンパク質に対する抑制性核酸分子を誘導することにより治療されることが可能である。突然変異を引き起こす、または異常を修正する核酸配列の部位特異的インテグレーションの使用はまた、本発明に包含される。
【００１７】
特定の実施形態において、治療用タンパク質は、細胞または対象においてタンパク質の欠損または異常から生じる症状を軽減または緩和するペプチドまたはタンパク質である。治療用タンパク質は、疾患または障害の治療において用いることのできるペプチドまたはタンパク質であってもよい。治療用タンパク質は、これに限定されるものではないが、酵素、抗体、ホルモン、成長因子、他のポリペプチドを含み、それの細胞（例えば、ニューロン）への投与は、疾患、障害、病変、および／またはそれとともに関連する症状の改善および／または治癒をもたらすことが可能である。本発明における有用な神経刺激性ポリペプチドは、これに限定されるものではないが、これらの（神経栄養因子レセプターのような）ポリペプチド、サイトカイン、エンドルフィン、酵素、ポリペプチド拮抗薬、ＣＮＳ細胞により発現されるレセプターの作動薬、リソソーム蓄積症に関係するポリペプチドなどのレセプターと結合する、任意の（神経栄養因子、成長因子、およびその他のような）上記のポリペプチド、抗体、および抗体断片と結合する内分泌因子、成長因子、視床下部放出因子、神経栄養因子、パラクリン因子、神経伝達物質ポリペプチド、抗体、および抗体断片を含む。特定の実施形態において、治療用タンパク質は、ＣＮＳ、特に脳に対しその効果を発揮する。
【００１８】
特定の治療用タンパク質の例は、これに限定されるものではないが、β−グルクロニダーゼ（例えば、リソソーム蓄積症の治療のため）、カタラーゼ、テロメラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタミナーゼ、サイトカイン、エンドルフィン（例えば、エンケファリン）、成長因子（例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ））、酸性、および塩基性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ）、インシュリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ、例えば、Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，ＲＷ（１９９６）Ｎｅｕｒｏｎ  １７：１９５−１９７；Ｔｈｏｅｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１２４：４７−５５；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，ＣＥ（１９９５）Ａｄｖ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６８：２３５−２４０）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ、例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，３９０：９４７−９５１）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ＮＴ−４／５、プロテアーゼネキシンＩ（ＰＮＩ、例えば、アルツハイマー病の治療のため（Ｈｏｕｅｎｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＰＮＡＳ  ９２：８９５−８９９）））、セリンプロテアーゼ阻害剤タンパク質（ＳＰＩ３、例えば、Ｓａｆａｅｉ，Ｒ．（１９９７）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｄｅｖ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，１００：５−１２）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管増殖因子（ＶＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、インシュリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、腫瘍壊死因子−Ｂ（ＴＧＦ−Ｂ）、ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ（ＳＭＮ、例えば、脊髄性筋萎縮症の治療のため、Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｅｌｌ  ８０：１５５−１６５；Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｅｌｌ  ８０：１６７−１７８）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、抗アポトーシスタンパク質（例えば、ＢＣＬ−２、ＰＩ３キナーゼ）、アミロイドベータバインダー（例えば、抗体）、ブチリルコリンエステラーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼ（例えば、Ｃａｒｍｏｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．，２８：３６７−３７１；Ｃａｒｍｏｎａ（２００５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５１７：１８６−１９０）、α−、β−、および／またはγ−セクレターゼのモジュレータ、血管作動性腸管ポリペプチド、レプチン、酸性アルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵ）、β−ヘキソサミニダーゼＡ（ＨｅｘＡ）、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼＡ、β−グルコセレブロシダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、および神経伝達物質（例えば、Ｓｃｈａｐｉｒａ，ＡＨ（２００３）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ６１：Ｓ５６−６３；Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．２６５：９３−９９；Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，Ｒｅｓ．３０：４９３−４９７；Ｋｏｌｉａｔｓｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３０：８３１−８４０；Ｄｏｇｒｕｋｏｌ−Ａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２４：４３７−４４４；Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｄ．３：１３２−１３８；Ｓｉｍｏｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，７１：１４１３−１４１９；Ｍｕｅｎｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ  Ｓｕｐｐｌ．９１：９８−９９；Ｗｒａｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ．１４４：５８１−５８８；Ｗｉｃｋｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ．１２７Ａ：１５８−１６６；Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ（２００４）Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ．１４４：Ｓ１５−１９；Ａｕｃｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ．７８：１６３−１７４；Ｐｒｚｙｂｙｌｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．６：８５−９２）を含む。特定の実施形態において、治療用タンパク質は、β−グルクロニダーゼである。
【００１９】
本発明は治療用タンパク質の送達について前述されるが、本発明のＡＡＶは検出可能なタンパク質をコードする核酸分子を（例えば、単独療法あるいは治療用タンパク質との併用療法で）送達してもよい。検出可能なタンパク質は、これに限定されるものではないが、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコアミラーゼ、フェリチン、ドーパミン受容体、およびβ−ガラクトシダーゼを含む。
【００２０】
ＡＡＶベクターを合成する方法は、本技術分野で周知である（例えばＰＣＴ／ＵＳ０４／０２８８１７およびＧａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９９：１１８５４−１１８５９を参照）。特定の実施形態において、この方法は、ｈｕ．３２またはｒｈ．８カプシドをコードする核酸配列と、ｒｅｐをコードする核酸と、少なくとも目的の核酸分子に隣接するＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲｓ）を有する核酸コンストラクトとを有する宿主細胞を培養する工程を有し、目的の核酸がＡＡＶベクター中でパッケージングされる。特定の実施形態において、全長ＡＡＶゲノムが用いられる。自己相補型ベクター（ｓｃＡＡＶ；ＡＡＶ９とともに一般的に用いられるベクター等）を本発明で用いてもよいが、ｒＡＡＶにおいて認められる最大のコーディング能力が約４．５ｋｂまたはそれより大きいのに対して、ｓｃＡＡＶは一般的に約２．３ｋｂの能力を有する。特定の目的のタンパク質（例えば、酵素）がｓｃＡＡＶの能力を上回る長さを有する核酸によってコードされる可能性があるため、全長ＡＡＶベクターが望ましい。宿主細胞はまた、ＡＡＶベクターをパッケージするヘルパー機能（例えば、ヘルペスウイルスまたはアデノウイルスにより供給されるそれら）を提供することができる。ＡＡＶベクターに核酸分子をパッケージングするのに宿主細胞が必要とする構成要素は、ｔｒａｎｓで、または安定して形質導入された宿主細胞により提供されてもよい。ｒｅｐ遺伝子および／またはＡＡＶ  ＩＴＲｓは任意のＡＡＶ血清型由来であってもよい。例えば、ｒｅｐ遺伝子および／またはＡＡＶ  ＩＴＲｓは、限定されずに、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９など由来であってもよい。特定の実施形態において、ＡＡＶ  ＩＴＲｓはＡＡＶ２血清型由来である。封入された核酸分子は複数のタンパク質またはポリペプチドをコードしてもよい。核酸分子が複数のタンパク質／ポリペプチドをコードする場合、エンコーディング領域は２Ａペプチドのような自己切断型のペプチドをコードする内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）または核酸配列により分離されてもよい。
【００２１】
本発明は、その必要に応じて対象に本発明のＡＡＶベクターおよび少なくとも１つの薬学的に許容される担体を有する組成物を投与する工程を有する、対象における疾患または障害（例えば、神経疾患または障害）を治療する方法を包含する。「対象」という本明細書において用いられる用語は、ヒトまたは動物の（特に哺乳類の）対象を指す。
【００２２】
本発明のＡＡＶベクターは、任意の薬学的に許容される担体とともに投与のために都合よく製剤することができる。例えば、ウイルスベクターは、水、緩衝食塩水、エタノール、多価アルコール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、油、洗浄剤、懸濁化剤、または適切なそれらの混合物のような許容できる媒体とともに製剤することができる。選択した媒体におけるＡＡＶベクターの濃度は変化させることができ、媒体は医薬品の投与の望ましい経路に基づいて選択することができる。任意の従来型の媒体または薬剤が、投与されるＡＡＶベクターと互換性がない場合以外は、医薬品のその使用は検討される。
【００２３】
特定の患者への投与に適した、本発明による組成物の投与量および投与計画は、患者の年齢、性別、体重、全身病状、およびＡＡＶベクターが投与される特定の条件およびその重症度を考慮する医者／獣医／医療専門家によって決定されてもよい。医者／獣医／医療専門家はまた、投与の経路、医薬担体、およびＡＡＶベクターの生物活性を考慮することができる。治療効果を達成するための典型的な投与量は、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６形質導入単位若しくはそれ以上、特に約１０８から１０１３の形質導入単位のＡＡＶ力価である。本発明の特定の実施形態において、複数の投与（例えば、２、３、４、若しくはそれ以上の投与）が、望まれる遺伝子発現の（例えば治療的な）レベルを達成するために使用することができる。
【００２４】
適切な医薬品の選択はまた、選択される投与方法に依存する。医薬品は、注射部位と互換性を持つ媒体で望ましくは分散するＡＡＶベクターを有する。本発明のＡＡＶベクターは、血流への注射、経口投与、または皮下投与、頭蓋内投与、筋肉内投与、腹腔内注射のような任意の方法によって投与してもよい。本発明のＡＡＶベクターは、隣接した領域または血液脳関門全体に、直接注射によって投与してもよい。特定の実施形態において、ＡＡＶベクターを有する組成物は、ニューロンに直接、または隣接した領域に投与される。特定の実施形態において、ＡＡＶベクターを有する組成物は、血管内投与または静脈内投与される。本発明のＡＡＶベクターは、これに限定されるものではないが、血液または脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む対象の任意の流体部分に投与してもよい。注射のための医薬品は、当技術分野で周知である。注射がＡＡＶベクターを投与する方法として選択される場合、ウイルスベクターの十分な量が生物学的効果を及ぼすためそれらの標的細胞に到達することを確実にするための手段をとる必要がある。
【００２５】
薬学的に許容される担体との密な混合物における有効成分として本発明のＡＡＶベクターを含む医薬組成物は、従来の製薬技術技術に従い調製されることが可能である。担体は投与、例えば、血管内、直接注射、頭蓋内、および筋肉内投与のために求められる製剤の形態に依存し、多種多様な形態をとってもよい。
【００２６】
本発明の医薬品は、投与の簡便性および投薬量の均一性のために用量単位の形態で製剤することができる。本明細書において用いられるように、用量単位の形態は、治療を受けている患者に適切な医薬品の物理的に個別の単位を指す。各々の用量は、選択した医薬担体と関連し、望ましい影響を生じることが予測される有効成分の量を含む必要がある。適切な用量単位を決定する方法は、当業者に周知である。
【００２７】
本発明によれば、動物モデルにおいて、ＡＡＶベクターの投与のための適切な用量単位は、もしあれば毒性を評価することによって決定することができる。医薬品における様々な濃度のＡＡＶベクターは、マウスまたは他の動物（例えば、治療する疾患のモデル）に投与することができ、最小および最大の投薬量は治療の結果として観察される有益な結果および副作用に基づいて決定してもよい。適切な用量単位はまた、他の標準的な薬剤と組み合わせてＡＡＶベクター治療の有効性を評価することで測定することができる。ＡＡＶベクターの用量単位は、個々に、または各々の治療と組み合わせて検出される効果に従い決定してもよい。
【００２８】
本発明のＡＡＶベクター、試薬、および方法は、核酸を分裂する、または分裂しない細胞に向かわせ、安定してその中の核酸を発現するため用いられることが可能である。本発明のベクターは、このように、病態における、または細胞生理学の実験的な改変における遺伝子治療に有用であることがある。
【００２９】
定義
単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明白に他の意味を指示する場合を除き、複数形指示を含む。
【００３０】
「遺伝子治療」は、疾患または障害、一般的な先天性または遺伝性疾患を治療するため、個人の細胞および／または組織への核酸（例えば、遺伝子）の挿入である（例えば、不完全な変異対立遺伝子は置換される、または機能的なもので補完される）。
【００３１】
「治療」という本明細書において用いられる用語は、病気に苦しむ患者に恩恵を与える任意の種類の治療を指し、患者の状態（例えば、１若しくはそれ以上の症状）の改善、状態の進行の遅延などを含む。
【００３２】
化合物または医薬組成物の「治療的に有効な量」は、それに関連した特定の障害または疾患および／または症状を予防、抑制、治療、または減少させるための有効な量を指す。本明細書における神経疾患または障害の治療は、神経疾患または障害、それの症状、またはそれの素因を治癒、緩和、抑制、および／または予防することを指すことができる。
【００３３】
「抑制性核酸分子」は、標的ｍＲＮＡの発現レベルを調節することが可能な小さな核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＤｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）を指す。これらの分子は疾患過程の仲介に関与する標的遺伝子の発現を抑制することができ、それによりそれと関連した疾患および／または症状を予防または軽減する。
【００３４】
「ｓｍａｌｌ，ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」という語句は、（ｓｉＲＮＡは、より長いｄｓＲＮＡ分子の切断により生じさせることができるが）短い（一般的に３０未満のヌクレオチド長、特に１２〜３０または２０〜２５のヌクレオチドの長さ）二重鎖ＲＮＡ分子を指す。一般的に、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡがターゲットとする遺伝子の発現を調節する。ｓｉＲＮＡｓは、ターゲット遺伝子の同族ｍＲＮＡの配列と相同性（例えば、完全な相補性）を有する。ｓｉＲＮＡ分子を特定し、合成する方法は、当技術分野で周知である（例えばＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃを参照）。ｓｉＲＮＡ分子の典型的な修飾は米国出願公開第２００５／００３２７３３号において提供される。ｓｉＲＮＡ分子の発現のための発現ベクターは、構成的であるか制御することができる強力なプロモーターを望ましくは使用する。そのようなプロモーターは当技術分野で周知であり、これに限定されるものではないが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、およびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターＵ６およびＨ１を含む（例えばＭｙｓｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９：２５０２−０９を参照）。
【００３５】
「短ヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」という用語は、ｓｉＲＮＡおよび少なくとも１、一般的に１〜１０ヌクレオチドの一本鎖ループ部分を有するヘアピン構造に折りたたまれる単一のＲＮＡ分子であるｓｉＲＮＡ前駆体を指す。ｓｈＲＮＡ分子は、エンドヌクレアーゼにより細胞の中でｓｉＲＮＡに典型的にプロセシングされる。
【００３６】
本明細書において用いられるように、「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」という用語は、これに限定されるものではないが、（天然にゲノムに存在する）内在性マイクロＲＮＡおよび人工マイクロＲＮＡを含む任意の種類のｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡを指す。マイクロＲＮＡは一般的に、約１８から約３０までのヌクレオチド、特に約２１から約２５までのヌクレオチドの範囲の長さを有する。マイクロＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡ分子であってもよい。マイクロＲＮＡはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、一般的に約５０から約９０までのヌクレオチド、特に約６０から約８０までのヌクレオチドの長さを有する短いステム−ループ構造の形態であってもよく、それは機能的なｍｉＲＮＡにその後プロセシングされる。
【００３７】
「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」という用語は、標的分子（例えば、標的遺伝子、タンパク質、またはＲＮＡ）が二本鎖ＲＮＡにより下方制御される、配列特異的または選択的なプロセスを指す。ＲＮＡｉ活性を一般的にドライブする二本鎖ＲＮＡ構造は、ｓｉＲＮＡｓ、ｓｈＲＮＡｓ、マイクロＲＮＡ、およびＲＮＡ干渉により標的転写物の発現を抑制するスモールＲＮＡ種を産生するようプロセシングされることが可能である他の二本鎖構造である。
【００３８】
「Ｄｉｃｅｒ  基質ＲＮＡ」または「ＤｓｉＲＮＡ」という用語は、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子を有し、ｓｉＲＮＡ分子、一般的に長さ２１ヌクレオチドを放出するＤｉｃｅｒのための基質として用いられるオリゴヌクレオチドを指す。ＤｓｉＲＮＡは二本鎖であり、ＲＮＡまたはＤＮＡおよびＲＮＡを有する。一般的に、ＤｓｉＲＮＡは長さ約１００未満のヌクレオチド、長さ約５０未満のヌクレオチド、長さ約４０未満のヌクレオチド、長さ約３５未満のヌクレオチド、または長さ約３０未満のヌクレオチドである。特定の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは長さが２７ヌクレオチドである。ＤｓｉＲＮＡの例は、米国特許出願公開第２００５／０２４４８５８号、２００５／０２７７６１０号、２００７／０２６５２２０号、および２０１０／０１８４８４１号において提供される。
【００３９】
「アンチセンス核酸分子」および「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、目的のタンパク質の発現を抑制する選択した配列に（例えば、翻訳開始部位および／または金色のスプライス部位に）ターゲティングされる（相補的な）核酸分子（例えば、一本鎖分子）を含む。そのようなアンチセンス分子は、一般的に、長さ約１０と約１００間のヌクレオチド、特に約１５と約５０間のヌクレオチド、とりわけ約１５と約３０間のヌクレオチドであり、多くの場合ｍＲＮＡ分子の翻訳開始部位に及ぶ。逆方向で標的核酸分子の全ての配列を含むアンチセンスコンストラクトはまた、作成することができる。任意の既知のヌクレオチド配列にターゲティングされるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標準的な方法によるオリゴヌクレオチド合成により調製されることがある。
【００４０】
「薬学的に許容される」は、連邦政府または州政府または米国薬局方または他の承認された薬局方においてリストされる規制機関による、動物における、特にヒトにおける使用に対する承認を意味する。
【００４１】
「担体」は、例えば、希釈剤、補助剤、防腐剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、ピロ亜硫酸ナトリウム）、可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（商標）８０、ポリソルベート８０）、乳化剤、バッファ（例えば、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、アセテート、リン酸塩）、水、水溶液、油、増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）、賦形剤、助剤、または投与される本発明の活性薬剤を有するベクターを指す。適切な医薬担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）；Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ）；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；ａｎｄ  Ｋｉｂｂｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（３ｒｄ  Ｅｄ．），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．において記述される。
【００４２】
本明細書において用いられる「プロモーター」という用語は、組換え産物をコードするＤＮＡ配列に隣接して位置するＤＮＡ配列を指すことがある。プロモーターは、隣接するＤＮＡ配列に望ましくは動作可能に連結される。プロモーターは、一般的に、プロモーターが存在しない場合の発現された組換え産物の量と比較して、ＤＮＡ配列から発現される組換え産物の量を増加する。ある生物由来のプロモーターを、別の生物由来のＤＮＡ配列からの組換え産物の発現を増強するために利用することができる。例えば、脊椎動物のプロモーターを、脊椎動物においてクラゲＧＦＰを発現するために用いてもよい。さらに、あるプロモーターエレメントは、タンデムに結合させた複数のＤＮＡ配列を発現する組換え産物の量を増加させることが可能である。従って、あるプロモーターエレメントは、１若しくはそれ以上の組換え産物の発現を増強することが可能である。複数のプロモーターエレメントは、本技術分野における当業者に周知である。誘導可能なプロモーター、組織特異的プロモーター、天然のプロモーター、または構成的または高レベルプロモーターが用いられてもよい。特定の実施形態において、高レベルの構成的発現が望まれる場合がある。そのようなプロモーターの例は、これに限定されるものではないが、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター／エンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時初期プロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、細胞質β−アクチンプロモーター、およびホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを含む。別の実施形態において、導入遺伝子のため天然のプロモーターまたは目的の核酸配列が用いられる。導入遺伝子または核酸配列の発現が、天然の発現を模倣することが望まれる場合、天然のプロモーターが好ましいかもしれない。導入遺伝子または他の核酸配列の発現が、時間的に、または発生的に、あるいは、組織特異的に、または特定の転写刺激に応じて制御される必要がある場合、天然のプロモーターが用いられてもよい。さらなる実施形態において、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位、またはコザック共通配列のような他の天然の発現制御エレメントはまた、天然の発現を模倣するのに用いることができる。特定の実施形態において、組織特異プロモーターはニューロン特異的である。ニューロンに特異的なプロモーターの例は、これに限定されるものではないが、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３−１５）、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８８：５６１１−５）、ニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３−８４）などを含む。
【００４３】
「エンハンサー」という本明細書において用いられる用語は、組み換え型産物をコードするＤＮＡ配列に隣接して位置するＤＮＡ配列を指すことがある。エンハンサーエレメントは一般的にプロモーターエレメントの上流、またはコーディングＤＮＡ配列（例えば、組み換え型産物または産物に転写、または翻訳されるＤＮＡ配列）の下流またはその中に位置することがある。それゆえに、エンハンサーエレメントは、組み換え型産物をコードするＤＮＡ配列の１００塩基対、２００塩基対、または３００若しくはそれ以上の塩基対上流または下流に位置することがある。エンハンサーエレメントは、プロモーターエレメントにより提供される上記の発現が増加したＤＮＡ配列から発現される組み換え型産物の量を増加することが可能である。複数のエンハンサーエレメントは、当技術分野における当業者が容易に利用可能である。
【００４４】
本明細書において用いられる「核酸」または「核酸分子」は、任意の一本鎖または二重のＤＮＡまたはＲＮＡ分子および、一本鎖の場合、直線状または環状のその相補的配列の分子を指す。核酸分子について論じる場合、本明細書では、特定の核酸分子の配列または構造は、５’から３’方向に配列を提供する通常の慣例に従って記載される。本発明の核酸に関して、「単離した核酸」という用語が、時として用いられる。ＤＮＡに適用される場合、この用語は、それが起源であるものにおける生物の天然に存在するゲノムにおいて直接に連続する配列から分離されるＤＮＡ分子を指す。例えば、「単離した核酸」は、プラスミドまたはウイルスベクターのようなベクターに挿入される、または原核または真核生物細胞または宿主生物のゲノムＤＮＡに組み込まれるＤＮＡ分子を含むことができる。
【００４５】
「ベクター」は、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、またはウイルスのようなレプリコンであり、それに別の遺伝子配列またはエレメント（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が付着させた配列またはエレメントの発現および／または複製をもたらすように結合できる。
【００４６】
「遺伝子」という用語は、エクソンおよび（任意選択で）イントロン配列を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する核酸を指す。核酸はまた、プロモーターまたはエンハンサー配列のような非翻訳配列を任意選択で含むことができる。「イントロン」という用語は、タンパク質に翻訳されず、エクソンの間に認められる所定の遺伝子に存在するＤＮＡ配列を指す。
【００４７】
「発現オペロン」は、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（例えば、ＡＴＧまたはＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、ターミネータなどのような転写および翻訳制御配列を有することができる核酸断片を指し、それは宿主細胞または生物におけるポリペプチドコード配列の発現を促進する。
【００４８】
「動作可能に連結された」という用語は、コード配列の発現のために必要な制御配列がコード配列の発現を生じるようにコード配列に対して適切な位置でＤＮＡ分子に置かれることを意味する。この同じ定義は、発現ベクターにおける転写ユニットおよび他の転写調節エレメント（例えばエンハンサー）の配置に、時として適用される。
【００４９】
「オリゴヌクレオチド」という本明細書において用いられる用語は、本発明の配列、プライマー、およびプローブを指し、２若しくはそれ以上、望ましくは３以上のリボまたはデオキシリボヌクレオチドを有する核酸分子と定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、様々な要因およびオリゴヌクレオチドの特定の応用および使用に依存する。
【００５０】
「単離した」という用語は、例えば、「実質的には純粋な」形態で存在するように、それが天然に関与する環境から十分に分離されたタンパク質、核酸、化合物、または細胞を指すことができる。「単離した」は、必ずしも他の化合物または材料との人工のまたは合成混合物の除去を意味するというわけではなく、基本的な活性を妨げない不純物の存在、例えば、不完全な精製による存在であってもよい。
【００５１】
「パーセント同一性」という用語は、２若しくはそれ以上の核酸配列の比較において認められる配列同一性のパーセンテージを指す。パーセント同一性は、標準的な整列アルゴリズム、例えば、Ａｌｔｓｈｕｌらにより記述されるＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５：４０３−１０）ならびにＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（ＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ）の一部として利用可能である）により決定されることがある。
【００５２】
「ポリペプチド」および「タンパク質」は、時として同じ意味で本明細書において用いられ、アミノ酸の分子鎖を示す。用語ポリペプチドは、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質を包含する。本用語はまた、ポリペプチド、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などの発現後の修飾を含む。さらに、タンパク質断片、類似物、変異、または変異タンパク質、融合タンパク質などは、ポリペプチドの意義の範囲内で含まれる。
【００５３】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を例示するために提供される。それらは任意の方法で発明を制限することを意図しない。
【実施例１】
【００５４】
ＡＡＶ  ｈｕ．３２カプシドは、記述されるようにフレームにおいてＡＡＶ２ｒｅｐおよび選択的ｃａｐを用いハイブリッドコンストラクトを得るために、ＡＡＶ２ベースのパッケージングプラスミドにクローニングされた（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９９：１１８５４−１１８５９）。すべてのベクターは、サイトメガロウイルスプロモーターを有し、ＧＦＰ導入遺伝子を増強し、記述されるようにトリプルトランスフェクション法を用い、テストしたＡＡＶバリアントからの異種ｃａｐ配列でＡＡＶ２組み換え体ゲノムにクロスパッケージングした（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９９：１１８５４−１１８５９）。パッケージング、精製、およびベクター力価の定量はペンシルバニア大学のベクターコアにより行われた。すべての組み換え型ベクターは塩化セシウム沈殿法を用いて精製し、記述されるように、ゲノムコピー力価を測定した（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１１：２０７９−２０９１）。
【００５５】
成体マウスにＧＦＰ導入遺伝子を有するｈｕ．３２  ＡＡＶベクターを、静脈内に注射した。注射の後、マウスをケタミンおよびキシラジン（マウスにつき〜０．１５ｍｌ）の混合物で麻酔し、リン酸緩衝生理食塩水の溶液の後、４％のパラホルムアルデヒドを心臓を通し灌流させた。その後、動物から脳を取り出し、一晩４％のパラホルムアルデヒドに静置し、その後、それらを凍結保護のために３０％のスクロースへ移動した。脳をスクロース中に沈ませた後、それらをｏｐｔｉｍｕｍ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓａｋｕｒａ、カリフォルニア州Ｔｏｒｒａｎｃｅ）にマウントし、セクショニングまで−２０℃で凍結させた。セクショニングはクライオスタット（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツＷｅｔｚｌａｒ）を用い２０μｍの厚さで行い、切片をその後３組のスライドに載せ、共焦顕微鏡検査によるイメージングまで−２０℃に維持した。
【００５６】
図２において見られるように、ＧＦＰは静脈注射の後、脳全体にわたり強く発現した。さらに具体的に言うと、ＧＦＰ発現は、嗅球、大脳皮質、線条体、海馬、中脳、上丘、内嗅皮質、および小脳におけるニューロンにおいて検出された。これらの結果は、ＡＡＶ９で観察されるより、さらに大幅に増加した形質導入のレベルを示す（Ｆｏｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２７：５９−６５）。さらに、ＧＦＰの広範囲にわたる発現は、Ｂａｌｂ／ｃ、Ｃ３Ｈ、およびＣ５７Ｂｌ／６マウスで観察された。
【００５７】
図３は、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２／ｈｕ１１、ＡＡＶ２／ｒｈ８、およびＡＡＶ２／ｈｕ３２の遺伝子導入の比較を示す。マウスに同じ量のウイルスを静脈注射した。しかしながら、図３により明示されるように、ｈｕ３２は他の系統と比較して脳への送達を劇的に増加した。実際に、ｈｕ１１は脳への最小のターゲティングを示し、ＡＡＶ９は弱いターゲティングを示し、ｒｈ８は改善されたターゲティングを示し、ｈｕ３２は予想外に強いターゲティングを示した。
【実施例２】
【００５８】
本発明のＡＡＶベクターターゲティングはまた、ネコにおいてテストされた。ｈＧＢｐはヒトβ−グルクロニダーゼ（ｈＧＵＳＢ）プロモーター（３７８ｂｐ断片）であり、ＧＦＰは緑色蛍光タンパク質であるＡＡＶ．ｈｕ３２．ｈＧＢｐ．ＧＦＰを６週齢のネコ（ｎ＝３）に２．８８×１０１３ベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇで頸動脈より注射した。ＧＦＰ発現を感染８週間後観察した。図４において見られるように、ＧＦＰは血管内（頸動脈）注射の後、脳全体にわたり強く発現した。さらに具体的に言うと、ＧＦＰ発現は、前頭葉前部皮質、尾状核、果核、大脳皮質、海馬、中脳、小脳、および脳幹におけるニューロンにおいて検出された。
【実施例３】
【００５９】
本発明のｈｕ３２  ＡＡＶベクターがニューロンに感染していることを証明するために、感染した脳領域の細胞の（ＡＡＶベクターによる感染を示す）ＧＦＰ発現および細胞型特異的マーカーの解析を行った。具体的には、ＮｅｕＮ（Ｆｏｘ−３）の発現はニューロンを同定するのに用い、グリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の発現は星状膠細胞を同定するのに用い、ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｉ（ＡＰＣ）の発現は希突起神経膠細胞を同定するのに用いた。図５Ａは、大脳皮質、海馬、小脳、および線条体におけるニューロン（ＧＦＰ＋、ＮｅｕＮ＋）の二重染色を示し、ニューロンがＧＦＰをエンコードするｈｕ３２  ＡＡＶベクターに感染したことを示す。対照的に、図５Ｂおよび５Ｃは、それぞれ、星状膠細胞または希突起神経膠細胞の二重染色がないことを示し、それにより、ｈｕ３２  ＡＡＶベクターがこれらの細胞型を形質導入しなかったことを示す。したがって、これらの結果は、本発明のＡＡＶベクターが星状膠細胞および希突起神経膠細胞でなく、選択的にニューロンに感染することが可能であることを示す。
【実施例４】
【００６０】
アデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＡＶ９）は、血液脳関門を通過することが可能であり、ニューロンおよび星状膠細胞および他の組織に感染することが可能である（Ｆｏｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２７：５９−６５；Ｃｅａｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１６：１７１０−１７１８）。しかしながら、ＡＡＶ９はリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）ムコ多糖症（ＭＰＳ）ＶＩＩのマウスモデルにおいてＣＮＳニューロンを形質導入することが不可能であることが近年明らかとなった（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０：１３９３−１３９９）。
【００６１】
全く対照的に、本発明のｈｕ３２  ＡＡＶベクターは、全身投与でニューロンを形質導入することが可能であった。表１は、ＡＡＶ．ｈｕ３２．ｈＧＢｐ．ＧＵＳＢで治療した４匹のＭＰＳ  ＶＩＩマウスからクライオスタットで切り出した脳切片の溶解物のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）活性を示す。簡潔に言うと、ＧＵＳＢ酵素活性は、ＧＵＳＢによる４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）への基質の分解により測定され、そこで４−ＭＵは蛍光定量的に同定することが可能である。表１において見られるように、ｈｕ３２  ＡＡＶベクターの血管内送達は脳ニューロンの形質導入および非常に高い、治療的なレベルよりはるかに高い、ＧＵＳＢの発現を誘導する。
【００６２】
【表１】
2016514152.tif 000002
【００６３】
図６は、ＡＡＶ．ｈｕ３２．ｈＧＵＳＢ．ＧＦＰを用い形質導入した正常マウス、無治療のＭＰＳ  ＶＩＩマウス、およびＭＰＳ  ＶＩＩマウスの組織病理画像を提供する。海馬、視床、および内嗅皮質の切片を検査した。無治療のＭＰＳ  ＶＩＩマウス脳切片は、ＭＰＳ  ＶＩＩで観察される特徴的病変を示す。全く対照的に、ＡＡＶ．ｈｕ３２．ｈＧＢｐ．ＧＵＳＢで処理したＭＰＳ  ＶＩＩマウスは、ＭＰＳの顕著な特徴的病変を認めず、正常マウスに類似した組織病理を示す。
【００６４】
特定の本発明の好ましい実施形態は、記述され、特に上記に例示されたが、発明がそのような実施形態に限られることを意図しない。以下の請求項に記載したように、本発明の範囲および趣旨を逸脱することなく、様々な修正がそれになされてもよい。
【図１Ａ】
2016514152.tif 000003
【図１Ｂ】
2016514152.tif 000004
【図１Ｃ】
2016514152.tif 000005
【図１Ｄ】
2016514152.tif 000006
【図２Ａ】
2016514152.tif 000007
【図２Ｂ】
2016514152.tif 000008
【図３Ａ】
2016514152.tif 000009
【図３Ｂ】
2016514152.tif 000010
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2016514152.tif 000012
【図４】
2016514152.tif 000013
【図５Ａ】
2016514152.tif 000014
【図５Ｂ】
2016514152.tif 000015
【図５Ｃ】
2016514152.tif 000016
【図６】
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【配列表】
2016514152000001.app
【国際調査報告】
2016514152.tif 000018