(57)【要約】  本発明は、宿主細胞、例えば未刺激幹細胞内へのウイルスベクターの導入効率を増強するための方法を提供する。該方法は、ＳＡＭＨＤ１インヒビター（例えば、Ｖｐｘタンパク質）およびｍＴＯＲ複合体のインヒビター（例えば、ラパマイシンまたはその類似化合物）の存在下、ベクターを宿主細胞に導入することを含む。高い標的化頻度および負荷運搬で標的細胞内に治療用物質を運搬するためのキットまたは医薬組合せも本発明において提供する。該キットまたは医薬組合せは典型的には、治療用物質をコードするウイルスベクター、ＳＡＭＨＤ１インヒビターまたはＳＡＭＨＤ１インヒビターをコードするポリヌクレオチド、およびｍＴＯＲ複合体のインヒビターを含有する。【選択図】図１
2016528900.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ｍＴＯＲインヒビター化合物ならびに（２）ＳＡＭドメインおよびＨＤドメイン含有タンパク質１（ＳＡＭＨＤ１）のインヒビターの存在下、ウイルスベクターを宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞内へのウイルスベクターの導入効率を増強するための方法。
【請求項２】
宿主細胞への導入の前に、ＳＡＭＨＤ１インヒビターを該ベクターと共にビリオン内にパッケージングさせる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該ベクターの導入の前に、宿主細胞をサイトカインで予め刺激しない、請求項１記載の方法。
【請求項４】
宿主細胞が未刺激幹細胞または静止Ｔ細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
幹細胞が造血幹細胞（ＨＳＣ）である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ウイルスベクターがＨＩＶ−１ベクターである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
ＳＡＭＨＤ１インヒビターがアクセサリータンパク質ウイルスタンパク質Ｘ（Ｖｐｘ）またはウイルスタンパク質Ｒ（Ｖｐｒ）である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
アクセサリータンパク質ＶｐｘがＨＩＶ−２、ＳＩＶＳＭまたはＳＩＶＭＡＣによりコードされる、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
アクセサリータンパク質ＶｐｒがＳＩＶｍｕｓおよびＳＩＶｄｅｂによりコードされる、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
ｍＴＯＲインヒビターがｍＴＯＲ複合体１（ｍＴＯＲＣ１）および／またはｍＴＯＲ複合体２（ｍＴＯＲＣ２）を抑制または拮抗する、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
ｍＴＯＲインヒビターがラパマイシンまたはその類似化合物である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ウイルスベクターを５、１０、２５、５０または１００の感染多重度（ＭＯＩ）で幹細胞内に導入する、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
ｍＴＯＲインヒビター化合物が全導入過程中または特定の間隔で存在する、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
ウイルスベクターが治療用物質をコードする、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
ウイルスベクターが非組込み性レンチウイルスベクターである、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）治療用物質をコードするウイルスベクター、（ｂ）ｍＴＯＲ複合体のインヒビター、および（ｃ）ＳＡＭＨＤ１インヒビターまたはＳＡＭＨＤ１インヒビターをコードするポリヌクレオチドを含む、高い標的化頻度および負荷運搬で治療用物質を標的細胞内に運搬するためのキット。
【請求項１８】
ｍＴＯＲインヒビターがラパマイシンまたはその類似体であり、ＳＡＭＨＤ１インヒビターがＶｐｘもしくはＶｐｒタンパク質またはその機能的断片である、請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
ＳＡＭＨＤ１インヒビターをウイルスベクターと共にビリオン内にパッケージングさせるための試薬を更に含む、請求項１７記載のキット。
【請求項２０】
ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１７記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は宿主細胞へのレトロウイルスの導入（トランスダクション）の効率の増強に関する。
【０００２】
関連出願に対する相互参照
本特許出願は米国仮特許出願第６１／８６９，１７２号（２０１３年８月２３日付け出願）に基づく優先権の利益を主張するものである。該優先権出願の全開示をその全体において且つあらゆる目的において参照により本明細書に組み入れることとする。
【背景技術】
【０００３】
ウイルスは、感染宿主免疫系による探知を回避しつつ、特定の細胞型への核酸運搬において非常に効率的である。これらの特徴は或るウイルスを遺伝子治療用の遺伝子運搬ビヒクルとしての魅力的な候補にする。レトロウイルスベクターは最も一般に使用される遺伝子運搬ビヒクルである。レトロウイルスゲノムは宿主染色体ＤＮＡ内に組込まれて、その長期的な維持および導入細胞の将来の全後代への安定な伝達を保証し、レトロウイルスベクターを持続的遺伝的修飾に適したものにする。レトロウイルスに基づくベクターは大量に製造可能であり、このことは医薬製剤におけるそれらの標準化および使用を可能にする。
【０００４】
全造血系の長寿命前駆体である造血幹細胞（ＨＳＣ）はＨＩＶ−１の複製に対して本質的に抵抗性である。ヒトＣＤ３４＋  造血幹および前駆細胞は低レベルでインビトロで感染しうるが、インビボ感染の発生は依然として議論の的となっている。同様に、それらは、ＨＩＶ−１に基づくレンチウイルスベクターによる導入に対して抵抗性であり、ＨＳＣ遺伝子治療の有効性を著しく阻害している。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ再増殖細胞（真に原始的なＨＳＣと実験的に定められている）は低レベルのレンチウイルス媒介性遺伝子標識を示しているに過ぎず、これは極めて高いベクター対細胞比によってでさえも克服され得ない。該阻止は侵入後に生じると考えられている。なぜなら、始原ＨＳＣはＨＩＶ−１受容体を発現し、レンチウイルスベクターは一般に水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）で偽型化（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）されて普遍的指向性を可能にするからである。
【０００５】
サイトカイン活性化を伴わない迅速な様態の遺伝子導入のための、種々の宿主細胞（例えば幹細胞、および他の造血細胞、例えばＴ細胞）内へのレトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクター、例えば、ＨＩＶに基づくベクターの効率的な導入を促進する条件が当技術分野において必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概括
１つの態様においては、本発明は、宿主細胞内へのウイルスベクターの導入（トランスダクション）効率を増強するための方法を提供する。該方法は、（１）ｍＴＯＲインヒビター化合物ならびに（２）ＳＡＭドメインおよびＨＤドメイン含有タンパク質１（ＳＡＭＨＤ１）のインヒビターの存在下、ウイルスベクターを宿主細胞に導入することを含む。該方法の幾つかのおいては、宿主細胞への導入の前に、ＳＡＭＨＤ１インヒビターをウイルスベクターと共にビリオン内にパッケージングさせる。幾つかの実施形態においては、該ベクターの導入の前に、宿主細胞をサイトカインで予め刺激しない。これらの方法の幾つかは未刺激幹細胞または静止Ｔ細胞、例えば造血幹細胞（ＨＳＣ）への導入に関するものである。種々の実施形態においては、宿主細胞はインビボで、例えばヒトまたは非ヒト対象内に存在する。
【０００７】
幾つかの実施形態においては、導入されるウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。例えば、ウイルスベクターはＨＩＶ−１に基づくベクターでありうる。本発明の幾つかの実施形態においては、ＳＡＭＨＤ１インヒビターはアクセサリータンパク質ウイルスタンパク質Ｘ（Ｖｐｘ）またはウイルスタンパク質Ｒ（Ｖｐｒ）である。本発明において使用されるアクセサリータンパク質Ｖｐｘは、例えばＨＩＶ−２、ＳＩＶＳＭまたはＳＩＶＭＡＣによりコードされうる。本発明に適したアクセサリータンパク質Ｖｐｒは、例えばＳＩＶｍｕｓおよびＳＩＶｄｅｂによりコードされうる。本発明の幾つかの実施形態においては、使用されるｍＴＯＲインヒビターは、ｍＴＯＲ複合体１（ｍＴＯＲＣ１）および／またはｍＴＯＲ複合体２（ｍＴＯＲＣ２）を抑制または拮抗する分子でありうる。幾つかの実施形態においては、使用されるｍＴＯＲインヒビターはラパマイシンまたはその類似化合物である。
【０００８】
本発明の実施形態の幾つかの実施においては、ウイルスベクターは例えば５、１０、２５、５０または１００の感染多重度（ＭＯＩ）で幹細胞内に導入されうる。種々の実施形態においては、ｍＴＯＲインヒビター化合物は全導入過程中または特定の間隔で存在しうる。幾つかの実施形態においては、ウイルスベクターは治療用物質をコードしうる。幾つかの実施形態においては、使用されるウイルスベクターは非組込み性レンチウイルスベクターである。
【０００９】
もう１つの態様においては、本発明は、高い標的化頻度および負荷（ｐａｙｌｏａｄ）運搬で治療用物質を標的細胞内に運搬するためのキットまたは医薬組合せを提供する。幾つかの実施形態においては、該キットは（ａ）治療用物質をコードするウイルスベクター、（ｂ）ｍＴＯＲ複合体のインヒビター、および（ｃ）ＳＡＭＨＤ１インヒビターまたはＳＡＭＨＤ１インヒビターをコードするポリヌクレオチドを含有する。幾つかの実施形態においては、ｍＴＯＲインヒビターはラパマイシンまたはその類似体であり、ＳＡＭＨＤ１インヒビターはＶｐｘもしくはＶｐｒタンパク質またはその機能的断片である。幾つかの実施形態は、ＳＡＭＨＤ１インヒビターをウイルスベクターと共にビリオン内にパッケージングさせるための試薬を更に含有する。幾つかのキットにおいては、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。
【００１０】
本発明の性質および利点の更なる理解は特許請求の範囲および明細書の残部を参照することによりもたらされうる。
【００１１】
発明の詳細な説明
Ｉ．概観
本発明は、未刺激幹細胞または静止Ｔ細胞を含む種々の宿主細胞内へのレトロウイルスベクターまたはビリオン（例えば、ＨＩＶのようなレンチウイルス）の導入を増強するための有効な手段を提供する。本明細書に例示されているとおり、サイトカイン刺激の非存在下の新鮮に単離されたＣＤ３４＋  細胞内への１２時間以内のＨＩＶ−１の導入は本明細書に記載の方法により著しく増強された。本発明の幾つかの実施形態は、ｍＴＯＲインヒビター（例えば、ラパマイシンまたはトリン（Ｔｏｒｉｎ））、そしてまた、早期作用性制限因子ＳＡＭＨＤ１の存在下、宿主細胞（例えば、ＣＤ３４＋  細胞）に導入することを含む。ＳＡＭＨＤ１は、ｄＮＴＰを切断してデオキシヌクレオシドおよびトリホスファートを与える、そしてまた、３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を示すデオキシヌクレオシドトリホスホヒドロラーゼである。幾つかの実施形態においては、ＳＡＭＨＤ１インヒビターは、ＳＡＭＨＤ１の活性を阻止しうるＨＩＶ−２アクセサリータンパク質Ｖｐｘである。幾つかの実施形態においては、Ｖｐｘタンパク質はレンチウイルスビリオンパッケージング中にＨＩＶ−１ビリオン内にパッケージングされる。本明細書に例示されているとおり、ｍＴＯＲインヒビターとＳＡＭＨＤ１インヒビターとの組合せは宿主細胞内へのウイルス導入の増強における相乗効果をもたらす。
【００１２】
本発明の方法に関連した種々の利点が存在する。例えば、該方法は未刺激幹細胞または静止Ｔ細胞への有効な導入を可能にする。幾つかの実施形態においては、サイトカイン前刺激も細胞増殖も要求されない。サイトカインにさらされていない導入細胞は依然として多能性でありうる。また、ウイルス導入期間は短く、典型的にはＨＳＣでは１２時間以下である。一方、当技術分野で公知の現在の方法は、ＨＳＣ内に有効に導入するためには組織培養に２〜３日までを要し、これはＨＳＣの多能性を低下させうるであろう。更に、本発明の方法は幹細胞以外の他の宿主細胞、例えば静止Ｔ細胞への効率的導入に適している。本発明の方法は、骨髄および他の造血またはリンパ含有器官内への直接注入（例えば、インビボ遺伝子運搬）において先行技術方法より優れている。
【００１３】
ＩＩ．定義
特に示されていない限り、本明細書において用いられる全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。以下の参考文献は、本発明において用いられる用語の多くの一般的定義を当業者に提供する：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｒｒｉｓ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１ｓｔ  ｅｄ．，１９９２）；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｍｉｔｈら（編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｄ．，２０００）；Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉｃ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｕｍａｒ（編），Ａｎｍｏｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら（編），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（３ｒｄ  ｅｄ．，２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｈｕｎｔ（編），Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ（１ｓｔ  ｅｄ．，１９９９）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｈｌｅｒ（編），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｔｅｌｏｓ（１９９４）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＫｕｍａｒおよびＡｎａｎｄａｎｄ（編），Ａｎｍｏｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；ならびにＡ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐａｐｅｒｂａｃｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ），ＭａｒｔｉｎおよびＨｉｎｅ（編），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（４ｔｈ  ｅｄ．，２０００）。また、本発明の実施において読者を補助するために、以下の定義を記載する。
【００１４】
「類似体」なる語は、本明細書においては、参照分子に構造的に類似しているが、参照分子の特定の置換基を代替置換基で置換することにより、標的化および制御された様態で修飾された分子を意味するものとして用いられる。参照分子（例えば、ラパマイシン）と比較して、類似体は、同じ、類似した又は改善された有用性を示しうる。改変または改善された特性を有する類似体（例えば、ＩＬ−２に対するリンパ球応答に対する、ラパマイシンより増強した抑制活性を有するラパマイシン類似体化合物）を特定するために参照分子の候補類似体化合物を合成しスクリーニングするための方法は当技術分野においてよく知られている。
【００１５】
「接触」なる語はその通常の意味を有し、２以上の物質（例えば、２つの化合物、または化合物および細胞）を一緒にすること、または物質と細胞とを一緒にすることを意味する。接触は、例えば、試験管または他の容器内で化合物および培養細胞を混合することにより、インビトロで行われうる。それは（化合物を対象内の細胞と接触させて）インビボでも、または（対象の体外で細胞を化合物と接触させ、ついで該処理細胞を該対象内に再導入して）エクスビボでも行われうる。
【００１６】
宿主細胞制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）はウイルス感染に対する細胞の抵抗または防御を意味する。哺乳類細胞は種々のメカニズムによりウイルス感染に抵抗しうる。ウイルスは、その遺伝物質を成功裏に再生するためには、宿主細胞の制限を克服しなければならない。
【００１７】
レトロウイルスは、ウイルス科レトロウイルスに属するエンベロープウイルスである。ウイルス自体がその核酸を＋ｍＲＮＡ（ビリオン内に５’−キャップおよび３’−ポリＡを含む）ゲノムの形態で保持し、偏性寄生生物としてそれが標的とする宿主細胞内へのそのゲノムの運搬の手段として働き、感染を構成する。宿主の細胞内に一旦入れば、該ウイルスは、そのＲＮＡをＤＮＡへと転写するためにウイルス逆転写酵素を使用することにより複製する。ついで該ＤＮＡはインテグラーゼ酵素により宿主のゲノム内に組込まれる。該レトロウイルスＤＮＡは宿主ゲノムの一部として複製し、プロウイルスと称される。レトロウイルスはアルファレトロウイルス属（例えば、トリ白血病ウイルス）、ベータレトロウイルス属（例えば、マウス乳腺腫瘍ウイルス）、ガンマレトロウイルス属（例えば、マウス白血病ウイルスまたはＭＬＶ）、デルタレトロウイルス属（例えば、ウシ白血病ウイルスおよびヒトＴリンパ球向性ウイルス）、イプシロンレトロウイルス属（例えば、スケトウダラ皮膚肉腫ウイルス）およびレンチウイルス属を含む。
【００１８】
レンチウイルスは、長い潜伏期間により特徴づけられる、レトロウイルス科のウイルスの属である。レンチウイルスは宿主細胞のＤＮＡ内に相当な量の遺伝情報を運搬することが可能であり、したがってそれは遺伝子運搬ベクターの最も効率的な方法の１つである。レンチウイルスの例には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）が含まれる。追加的な例には、ＢＬＶ、ＥＩＡＶおよびＣＥＶが含まれる。
【００１９】
ｍＴＯＲ、すなわち「ラパマイシンの哺乳類標的」は、ヒトにおいてＦＲＡＰ１遺伝子によりコードされるタンパク質である。ｍＴＯＲは、細胞成長、細胞増殖、細胞運動性、細胞生存、タンパク質合成および転写を調節するセリン／トレオニンプロテインキナーゼである。ｍＴＯＲはホスファチジルイノシトール  ３−キナーゼ関連キナーゼタンパク質ファミリーに属し、２つの分子複合体（ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２）の触媒サブユニットである。
【００２０】
ｍＴＯＲ複合体１（ｍＴＯＲＣ１）はｍＴＯＲ、ｍＴＯＲの調節関連タンパク質（ラプター（Ｒａｐｔｏｒ））、哺乳類致死性ＳＥＣ１３タンパク質８（ＭＬＳＴ８；ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｌｅｔｈａｌ  ｗｉｔｈ  ＳＥＣ１３  ｐｒｏｔｅｉｎ  ８）ならびにパートナーＰＲＡＳ４０およびＤＥＰＴＯＲから構成される。この複合体は、栄養素／エネルギー／レドックスセンサーとして機能しタンパク質合成を制御することによるｍＴＯＲの古典的特徴により特徴づけられる。この複合体の活性はインスリン、増殖因子、血清、ホスファチジン酸、アミノ酸（特にロイシン）および酸化ストレスにより刺激される。ｍＴＯＲ複合体２（ｍＴＯＲＣ２）はｍＴＯＲ、ｍＴＯＲのラパマイシン非感受性随伴物（ＲＩＣＴＯＲ；ｒａｐａｍｙｃｉｎ−ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｏｆ  ｍＴＯＲ）、ＧβＬおよび哺乳類ストレス活性化プロテインキナーゼ相互作用性タンパク質１（ｍＳＩＮ１）から構成される。ｍＴＯＲＣ２は、Ｆ−アクチンストレスファイバー、パキシリン、ＲｈｏＡ、Ｒａｃ１、Ｃｄｃ４２およびプロテインキナーゼＣα（ＰＫＣα）のその刺激により、細胞骨格の重要な調節因子として機能することが示されている。ｍＴＯＲＣ２は、「ＰＤＫ２」として公知のこれまでに十分に理解されていないタンパク質の活性を有するらしい。ｍＴＯＲＣ２はセリン／トレオニンプロテインキナーゼＡｋｔ／ＰＫＢをセリン残基Ｓ４７３においてリン酸化する。
【００２１】
「突然変異誘発」または「突然変異誘発する」なる語は、コード化ポリヌクレオチド配列の塩基対配列に対する変化（突然変異）およびそのコード化ポリペプチドに対する結果的に生じる変化を導入する過程を意味する。特に示されていない限り、本明細書中で用いるこの用語は、例えば細胞分裂中の複製エラーにより引き起こされるまたは減数分裂もしくは超突然変異のような過程中に天然に生じる突然変異とは対照的に、分子に人工的に導入される突然変異に関するものである。突然変異誘発は、幾つかの手段により、例えば、紫外線またはイオン化照射、化学的突然変異原またはウイルスへの曝露により達成されうる。それは部位特異的突然変異誘発、制限消化および再連結、エラープローンＰＣＲ、ポリヌクレオチドシャッフリングなどのような組換え技術によっても実現されうる。標的ポリペプチドをコードする与えられたポリヌクレオチドに関して、突然変異誘発は、種々のタイプの突然変異、例えば点突然変異（例えば、サイレント突然変異、ミスセンス突然変異およびナンセンス突然変異）、挿入または欠失を含有する突然変異体または変異体を与えうる。
【００２２】
核酸に言及する場合の「機能的に連結」なる語は機能的な関係におけるポリヌクレオチド要素の連結を意味する。核酸が「機能的に連結」されていると言えるのは、それが別の核酸配列との機能的な関係で配置されている場合である。例えば、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列に機能的に連結されていると言えるのは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合である。機能的に連結（されている）は、連結されているＤＮＡ配列が典型的には連続的であり、２つのタンパク質コード領域を結合させる必要がある場合には、連続的であり且つリーディングフレーム内にあることを意味する。
【００２３】
本明細書中で用いる「ポリヌクレオチド」または「核酸」なる語は、プリンおよびピリミジン塩基あるいは他の天然の、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然の又は誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む任意長のヌクレオチドの重合形態（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む）を意味する。本発明の実施形態のポリヌクレオチドは、天然源から単離されうる、組換え製造されうる又は人工的に合成されうるデオキシリボポリヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボポリヌクレオチド（ＲＮＡ）、またはリボポリヌクレオチドのＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）の配列を含む。ポリヌクレオチドのもう１つの例はポリアミドポリヌクレオチド（ＰＮＡ）である。ポリヌクレオチドおよび核酸は一本鎖または二本鎖として存在しうる。ポリヌクレオチドのバックボーンは、ＲＮＡまたはＤＮＡにおいて典型的に見出されうるとおり、糖およびリン酸基を含むことが可能であり、あるいは修飾または置換された糖またはリン酸基を含むことが可能である。ポリヌクレオチドは修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含みうる。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により遮断されうる。ヌクレオチドから構成される重合体、例えば核酸、ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドも本明細書においてはヌクレオチド重合体と称されうる。
【００２４】
ポリペプチドは、アミド結合（ペプチド結合）により互いに連結されたアミノ酸残基単量体から構成される重合体鎖である。アミノ酸はＬ−光学異性体またはＤ−光学異性体でありうる。一般に、ポリペプチドはアミノ酸残基の長い重合体、例えば、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００またはそれ以上のアミノ酸残基単量体からなる重合体を意味する。しかし、特に示されていない限り、本明細書中で用いるポリペプチドなる語は、典型的には２以上、但し通常は１０、１５または２０個以下のアミノ酸単量体を含有する短いペプチドをも含む。
【００２５】
タンパク質は、ペプチド結合により連結されたアミノ酸の長い重合体であり、２以上のポリペプチド鎖から構成されうる。より詳細には、「タンパク質」なる語は、特定の順序（例えば、タンパク質をコードする遺伝子におけるヌクレオチドの塩基配列により決定される順序）のアミノ酸の鎖の１以上から構成される分子である。タンパク質は身体の細胞、組織および器官の構造、機能および調節に必須であり、各タンパク質は特有の機能を有する。具体例としては、ホルモン、酵素および抗体が挙げられる。幾つかの実施形態においては、ポリペプチドおよびタンパク質なる語は互換的に用いられうる。
【００２６】
幹細胞は、全ての多細胞生物において見出される生物学的細胞であり、（有糸分裂により）分裂し、多様な専門化細胞型へと分化し、自己再生して、より多数の幹細胞を産生しうる。哺乳動物においては、以下の２つの広範なタイプの幹細胞が存在する：胚盤胞の内部細胞塊から単離される胚幹細胞および、種々の組織に見出される成体幹細胞である。成体生物においては、幹細胞および前駆細胞は身体の修復系として作用して、成体組織を補充する。発生中の胚においては、幹細胞は専門化細胞の全てに分化しうるが（これらは多能性細胞と称される）、血液、皮膚または腸組織のような再生器官の正常なターンオーバーをも維持する。ヒトには３つの利用可能な自己成体幹細胞源、すなわち、骨髄、脂肪組織（脂肪細胞）および血液が存在する。幹細胞は出生直後の臍帯血からも採取されうる。
【００２７】
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、骨髄（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）からリンパ系統（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）まで全ての血液細胞型を生成しうる多能性幹細胞の不均質集団である。これらの細胞は成体の骨髄に見出され、大腿骨、骨盤、肋骨、胸骨および他の骨内に見出される。該細胞は通常、特殊な針および注射器を使用して、骨盤骨の腸骨稜部から直接的に得られうる。それらはサイトカイン、例えばＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）または骨髄区画からの細胞の遊離を誘導する他の試薬での前処理の後の末梢血からも収集される。臨床的および科学的な使用のための他の入手源には、臍帯血および末梢血が含まれる。
【００２８】
細胞が外因性または異種ポリヌクレオチドにより「形質転換」または「トランスフェクト」されていると言えるのは、そのようなポリヌクレオチドが該細胞の内部に導入されている場合である。形質転換ポリヌクレオチドは細胞のゲノム内に組込まれて（共有結合されて）いても組込まれていなくてもよい。例えば原核生物、酵母および哺乳類細胞においては、形質転換ポリヌクレオチドはプラスミドのようなエピソーム要素上に維持されうる。真核細胞に関しては、安定に形質転換された細胞は、形質転換ポリヌクレオチドが染色体内に組込まれていて、それが染色体複製により娘細胞に受け継がれるような細胞である。この安定性は、形質転換ポリヌクレオチドを含有する娘細胞の集団から構成される細胞系またはクローンを真核細胞が樹立する能力により示される。「クローン」は、単細胞または共通の祖先から有糸分裂により誘導された細胞の集団である。「細胞系」は、多数の世代にわたってインビトロで安定な成長が可能な初代細胞のクローンである。
【００２９】
ステリル（ｓｔｅｒｉｌｅ）アルファモチーフドメインおよびＨＤドメイン含有タンパク質１（ＳＡＭＨＤ１）は、ヒトにおいてはＳＡＭＨＤ１遺伝子によりコードされるタンパク質である。ＳＡＭＨＤ１は、樹状細胞、マクロファージおよび単球におけるＨＩＶの複製の阻止をもたらす細胞酵素である。それは、ヌクレオチド三リン酸をヌクレオシドおよび三リン酸に変換するホスホヒドロラーゼ活性を示す酵素である。それを行う際に、ＳＡＭＨＤ１は、ウイルスｃＤＮＡ合成のための逆転写酵素に利用されうるヌクレオチドのプールを枯渇させ、したがってウイルス複製を妨げる。ＳＡＭＨＤ１はヌクレアーゼ活性をも有する。
【００３０】
ＳＡＭＨＤ１は、骨髄細胞および静止ＣＤ４＋  Ｔ細胞において観察されるＨＩＶ−１感染のための逆転写を阻止する細胞タンパク質として特定された。ＳＡＭＨＤ１は、ｄＮＴＰの細胞内プールを制限することにより、骨髄細胞におけるＨＩＶ−１感染を抑制する。ＳＡＭＨＤ１のｄＮＴＰトリホスホヒドロラーゼ活性は細胞内ｄＮＴＰレベルを低減して、ＨＩＶ−１複製を制限し、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡおよびＲＮＡに対する並びにＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドにおけるＲＮＡに対するヌクレアーゼ活性、免疫系の活性化を妨げると提示されている。ＳＡＭＨＤ１のレトロウイルス制限能はリン酸化を要し、この目的のために、ＳＡＭＨＤ１は、トレオニン５９２におけるそのリン酸化を媒介するサイクリンＡ２／ＣＤＫ１複合体と結合する。
【００３１】
ウイルスタンパク質Ｘ（Ｖｐｘ）は、ヒト免疫不全ウイルスおよび幾つかのサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）によりコードされるアクセサリータンパク質である。Ｖｐｘは、ＳＡＭＨＤ−１媒介性制限を標的化し妨げることにより、宿主細胞、例えばマクロファージおよびＤＣのウイルス感染を促進する。ＶｐｘはＳＡＭＨＤ１をカリン４Ａ−ＲＩＮＧ  Ｅ３ユビキチンリガーゼ（ＣＲＬ４）へとリクルートし、これはプロテアソーム分解のために該酵素を標的化する。
【００３２】
参照分子（例えば、ラパマイシン）の「変異体」は、参照分子から誘導された構造または参照分子の構造に類似した構造を有する分子を意味する。典型的には、変異体は、制御された又はランダムな様態での参照分子の修飾により得られる。本明細書に詳細に記載されているとおり、参照分子の特性と比較して類似した又は改善された特性を有する機能的誘導体化合物を得るために参照分子を修飾するための方法は当技術分野でよく知られている。
【００３３】
「ベクター」は、別のポリヌクレオチドセグメントが結合して該結合セグメントの複製を引き起こしうるプラスミド、ファージまたはコスミドのようなレプリコンである。１以上のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を導きうるベクターは「発現ベクター」と称される。
【００３４】
レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）に基づくベクターまたはレトロウイルスベクターは、該ベクターのゲノムがバックボーンとして該ウイルスからの成分を含むことを意味する。全体として該ベクターから生じるウイルス粒子は、逆転写および組込み系を含むＲＮＡゲノムに適合した必須ベクター成分を含有する。通常、これらは、該ウイルスに由来するｇａｇおよびｐｏｌタンパク質を含むであろう。該ベクターがレンチウイルスに由来する場合、ウイルス粒子は非分裂細胞に感染し、形質導入しうる。組換えレトロウイルス粒子は、選択された外因性遺伝子またはポリヌクレオチド配列、例えば治療的に活性な遺伝子を標的細胞のゲノムに運搬しうる。
【００３５】
ＩＩＩ．ウイルス導入を増強するためのＳＡＭＨＤ１インヒビター
本発明の種々の組成物および方法は、レトロウイルス導入を増強するためにｍＴＯＲインヒビター化合物（例えば、ラパマイシン）と組合された制限因子ＳＡＭＨＤ１のインヒビターを使用することが可能である。該インヒビターは標的宿主細胞に適用されることが可能であり、これは、ウイルスベクターまたはビリオンを該細胞と接触させる前、それと同時またはその後に行われうる。ウイルスベクターまたはビリオンを該細胞と接触させるのと同時に該インヒビター（特にＳＡＭＨＤ１インヒビター）を該細胞に適用する場合、それらは該ビリオンとは独立して又は該ビリオンの一部として存在しうる。後者の場合、該インヒビター（例えば、ＳＡＭＨＤ１インヒビター）は例えば化学結合または組換え発現により該ビリオンに結合されうる。例えば、本明細書に詳細に記載されているとおり、ウイルスタンパク質Ｘ（Ｖｐｘ）またはウイルスタンパク質Ｒ（Ｖｐｒ）は、レトロウイルスベクターと共にビリオン内にパッケージングすることにより、ビリオン上で発現されうる。
【００３６】
いずれかの化学的クラスのＳＡＭＨＤ１インヒビターが本発明において使用されうる。これらには、例えば、ＳＡＭＨＤ１抑制タンパク質またはポリペプチド、例えばＶｐｘまたはＶｐｒタンパク質およびそれらの断片が含まれる。適当なＳＡＭＨＤ１インヒビターには、ＳＡＭＨＤ１の細胞活性または生物活性（例えば、その酵素活性）の１以上を抑制または拮抗しうる小分子有機化合物も含まれる。そのようなインヒビターは、標準的なプロトコール（例えば、コンビナトリアルライブラリースクリーニング法）を用いる候補化合物のライブラリーのスクリーニングにより、容易に入手可能である。幾つかの実施形態においては、使用されるＳＡＭＨＤ１インヒビターは、本明細書に記載されているアクセサリータンパク質ＶｐｘもしくはＶｐｒまたはその機能的類似体もしくは断片である。これらには、インヒビター機能を有するＶｐｘまたはＶｐｒタンパク質に由来するポリペプチドまたはペプチドが含まれる。
【００３７】
アクセサリータンパク質Ｖｐｘは、単球、樹状細胞および成熟マクロファージに効率的に感染する霊長類レンチウイルスの能力に決定的に重要である。Ｖｐｘは、制限因子ＳＡＭＨＤ１を分解するように標的化することにより重要な免疫調節細胞型に霊長類レンチウイルスが感染することを可能にする。ＳＡＭＨＤ１は、レトロウイルスの逆転写を抑制するために細胞ｄＮＴＰプールを抑制しうるデオキシヌクレオチドトリホスホヒドロラーゼ酵素である。Ｖｐｘはヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ−２）、スーティーマンガベイのサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）（ＳＩＶｓｍ）、白襟マンガベイのＳＩＶ（ＳＩＶｒｃｍ）およびマカクのＳＩＶ（ＳＩＶｍａｃ）系統のウイルスに限定され、ＨＩＶ−１には存在しない。幾つかの他の霊長類レンチウイルス系統においては、異なるアクセサリタンパク質であるウイルスタンパク質Ｒ（Ｖｐｒ）が、ＳＡＭＨＤ１を分解するこの機能を果たすようである。これらには、例えば、ＳＩＶｍｕｓ（ヒゲザルに感染するＳＩＶ）、ＳＩＶｄｅｂ（デブラッザ（Ｄｅ  Ｂｒａｚｚａ’ｓ）サルに感染するＳＩＶ）およびＳＩＶａｇｍＶｅｒ（ベルベットアフリカミドリザルに感染するＳＩＶ）が含まれ、これらは全て、霊長類ＳＡＭＨＤ１タンパク質に対する広域特異性を有するＶｐｒタンパク質をコードしている（例えば、Ｌｉｍら，Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ．１１：１９４−２０４，２０１２を参照されたい）。
【００３８】
これらのＳＡＭＨＤ１抑制性ウイルスアクセサリータンパク質のいずれもが本発明の実施において使用されうる。ＳＡＭＨＤ１を分解しうる種々のレトロウイルスからのＶｐｘおよびＶｐｒタンパク質が当技術分野において報告されており、特徴づけられている。例えば、Ｔｒｉｓｔｅｍら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：３４０５−１２，１９９２；Ｙｕら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：５０８８−５０９１，１９９１；Ｋａｐｐｅｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８４：１９７−２０９，１９９１；Ｇｏｕｊｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１２３３５−４５，２００８；Ｂｅｌｓｈａｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３４６１１８−１２６，２００６；Ｇｏｕｊｏｎら，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４２，２００７；およびＰａｒｋら，Ｊ．Ａｃｑｕｉｒ．Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎｄｒ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．８：３３５−３４４，１９９５を参照されたい。これらのタンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列も公知である。また、ＶｐｘまたはＶｐｒがＳＡＭＨＨＤ１を分解するメカニズムおよび構造的要件は当技術分野において既に記載されている。例えば、Ｖｐｘのアミノ末端は、細胞制限因子の結合部位として働く活性化ドメインを含有することが報告されている。例えば、Ｇｒａｍｂｅｒｇら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４：１３８７−９６，２０１０；Ｂｅｒｇａｍａｓｃｈｉら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．８３：４８５４−４８６０，２００９；Ｓｈａｒｏｖａら，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．４：ｅ１００００５７，２００８；Ｌｉｍら，Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ．１１：１９４−２０４，２０１２；およびＷｅｉら，Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４：１７４５−５６，２０１２を参照されたい。
【００３９】
当技術分野で公知のＶｐｘ／Ｖｐｒの構造的および機能的情報に基づき、ＶｐｘもしくはＶｐｒタンパク質または機能的断片の組換え製造および精製が分子生物学の標準的な技術により容易に行われうる。ＶｐｘまたはＶｐｒタンパク質の発現およびウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）の存在下のビリオン（例えば、ＨＩＶ−１ビリオン）内へのパッケージングも、当技術分野でよく知られており通常に実施されている方法または本明細書に例示されている特定のプロトコールに従い行われうる。例えば、Ｇｏｕｊｏｎら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３：９９１−４，２００６；Ｇｒａｍｂｅｒｇら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４：１３８７−９６，２０１０；Ｈｏｆｍａｎｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８６：１２５５２−６０，２０１２；Ｓｗａｎら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３：１４８０−９２，２００６；Ａｙｉｎｄｅら，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７：３５，２０１０；およびＳｈａｒｏｖａら，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．４：ｅ１００００５７，２００８を参照されたい。他のタイプのＳＡＭＨＤ１インヒビター、例えば小分子有機化合物も、有機化学および生化学の通常に実施されている方法により入手可能である。
【００４０】
当技術分野で公知のＶｐｘ／Ｖｐｒの構造的および機能的情報に基づき、ＶｐｘもしくはＶｐｒタンパク質または機能的断片の組換え製造および精製が分子生物学の標準的な技術により容易に行われうる。ＶｐｘまたはＶｐｒタンパク質の発現およびウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）の存在下のビリオン（例えば、ＨＩＶ−１ビリオン）内へのパッケージングも、当技術分野でよく知られており通常に実施されている方法または本明細書に例示されている特定のプロトコールに従い行われうる。例えば、Ｇｏｕｊｏｎら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３：９９１−４，２００６；Ｇｒａｍｂｅｒｇら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４：１３８７−９６，２０１０；Ｈｏｆｍａｎｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８６：１２５５２−６０，２０１２；Ｓｗａｎら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３：１４８０−９２，２００６；Ａｙｉｎｄｅら，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７：３５，２０１０；およびＳｈａｒｏｖａら，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．４：ｅ１００００５７，２００８を参照されたい。他のタイプのＳＡＭＨＤ１インヒビター、例えば小分子有機化合物も、有機化学および生化学の通常に実施されている方法により入手可能である。
【００４１】
ＩＶ．本発明に適したｍＴＯＲ複合体のインヒビター
本発明の幾つかの態様は宿主細胞へのウイルスベクターの高頻度標的化および効率的負荷運搬のための新規方法および組成物に関する。本発明者らは、宿主細胞における制限因子ＳＡＭＨＤ１およびｍＴＯＲ複合体の同時抑制が、宿主細胞内への、より効率的なウイルス導入を可能にすることを見出した。本発明に適した「ｍＴＯＲ複合体のインヒビター」（または「ｍＴＯＲ複合体インヒビター」）は、ｍＴＯＲ複合体、ｍＴＯＲＣ１および／またはｍＴＯＲＣ２の一方または両方を抑制またはこれらに拮抗する任意の化合物である。これらには、ｍＴＯＲキナーゼを抑制する化合物、およびそうでなければｍＴＯＲ複合体のシグナリング活性を抑制もしくはこれに拮抗する又はそれらの生物学的特性に負の影響を及ぼす（例えば、該タンパク質複合体を不安定化または破壊する）化合物が含まれる。例えば、それらは、ｍＴＯＲキナーゼに直接的には影響を及ぼさないがｍＴＯＲタンパク質複合体の他の化合物（例えば、ラプター（Ｒａｐｔｏｒ）またはＲＩＣＴＯＲ）を介してｍＴＯＲＣ１複合体および／またはｍＴＯＲＣ２複合体を破壊し又はそれらの形成を抑制する或いは下流シグナリング分子との該複合体の相互作用を抑制する化合物でありうる。
【００４２】
本発明の幾つかの実施形態においては、使用されるインヒビターは、ｍＴＯＲキナーゼに拮抗する化合物（ｍＴＯＲインヒビター）である。当技術分野で公知の種々のｍＴＯＲインヒビターが本発明の個々の実施形態の実施において使用されうる。本明細書中で用いる「ｍＴＯＲインヒビター」または「ｍＴＯＲインヒビター化合物」なる語は、ｍＴＯＲの生物活性（例えば、キナーゼ活性）またはｍＴＯＲ媒介性シグナリング活性を直接的または間接的に抑制または拮抗する任意の化合物を広く包含する。したがって、ｍＴＯＲインヒビターは、ｍＴＯＲ発現を抑制する又はその細胞安定性に影響を及ぼす化合物、ｍＴＯＲ複合体の形成を抑制または阻害する化合物、ｍＴＯＲの、その細胞内受容体ＦＫＢＰ１２への結合を抑制する化合物、ｍＴＯＲの酵素活性を抑制または拮抗する化合物、あるいはそうでなければ下流分子とのｍＴＯＲの相互作用を抑制する化合物でありうる。
【００４３】
本発明の幾つかの実施形態はラパマイシンを使用する。ラパマイシン（Ｖｅｚｉｎａら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９７５；２８：７２１＼ｕ２０１３６）はシロリムス（Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）としても公知であり、臓器移植における拒絶を防ぐために使用される免疫抑制薬である。それは、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化を、インターロイキン２（ＩＬ−２）に対するそれらの応答を抑制することにより妨げる。それは１９９９年９月にＦＤＡにより承認されており、商品名ラパミューン（Ｒａｐａｍｕｎｅ）としてファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ）により販売されている。ラパマイシンはｍＴＯＲのアロステリックインヒビターである。ラパマイシン以外に、ラパマイシンの生物活性（例えば、ｍＴＯＲのＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合ドメインへの結合および／またはｍＴＯＲキナーゼ活性の抑制）を特異的に模倣または増強する任意の化合物が本発明において使用されうる。例えば、ｍＴＯＲはラパマイシンの主要細胞標的である。したがって、ｍＴＯＲに対する類似または改善した抑制活性を有するラパマイシン類似体または機能的誘導体は本発明の個々の実施形態に好適でありうる。これらには、当技術分野で公知のラパマイシン類似体化合物が含まれる。具体例には、例えば、Ｒｉｔａｃｃｏら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５；７１：１９７１−１９７６；Ｂａｙｌｅら，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００６；１３：９９−１０７；Ｗａｇｎｅｒら，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．２００５；１５：５３４０−３；Ｇｒａｚｉａｎｉら，Ｏｒｇ  Ｌｅｔｔ．２００３；５：２３８５−８；Ｒｕａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００８；１０５：３３−８；米国特許第５１３８０５１号；およびＷＯ／２００９／１３１６３１に記載されている化合物が含まれる。幾つかの半合成ラパマイシン類似体（ラパログ（ｒａｐａｌｏｇｕｅ）としても公知）が臨床開発のために製薬会社により評価されており、それらには、例えば、テムシロリムス（ｔｅｍｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）（ＣＣＩ−７７９，Ｔｏｒｉｓｅｌ，Ｗｙｅｔｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、エベロリムス（ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）（ＲＡＤ００１，Ａｆｉｎｉｔｏｒ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびリダホロリムス（ｒｉｄａｆｏｒｏｌｉｍｕｓ）（ＡＰ２３５７３；旧称デホロリムス（ｄｅｆｏｒｏｌｉｍｕｓ），ＡＲＩＡＤ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が挙げられる。
【００４４】
本発明の幾つかの他の実施形態はＡＴＰ競合性ｍＴＯＲインヒビターである。これらのｍＴＯＲインヒビターは、ｍＴＯＲにおけるキナーゼドメインへの結合に関してＡＴＰと競合することによりｍＴＯＲキナーゼ活性を抑制するＡＴＰ類似体である。ｍＴＯＲＣ１のみを主に抑制するラパマイシンとは異なり、該ＡＴＰ類似体はｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２の両方を抑制する。ｍＴＯＲのキナーゼドメインとＰＩ３Ｋとの間の類似性ゆえに、これらの化合物の幾つかによるｍＴＯＲ抑制はＰＩ３Ｋ抑制と重複する。ＡＴＰ競合性インヒビターの幾つかはｍＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ二重インヒビター（これは両方のキナーゼを類似有効濃度で抑制する）である。そのようなインヒビターの例には、ＰＩ１０３、ＰＩ５４０、ＰＩ６２０、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＧＳＫ２１２６４５８およびＸＬ７６５が含まれる。これらの化合物は全て当技術分野でよく知られている。例えば、Ｆａｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ９：３４１−３４９，２００６；Ｒａｙｎａｕｄら，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．８：１７２５−１７３８，２００９；Ｍａｉｒａら，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．７：１８５１−６３，２００８；Ｋｎｉｇｈｔら，ＡＣＳ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１：３９−４３，２０１０；およびＰｒａｓａｄら，Ｎｅｕｒｏ．Ｏｎｃｏｌ．１３：３８４−９２，２０１１を参照されたい。幾つかの他のＡＴＰ競合性ｍＴＯＲインヒビターはｍＴＯＲに対して、より選択的であり（ｐａｎ−ｍＴＯＲインヒビター）、これらは、ＰＩ３Ｋの場合より有意に低い、ｍＴＯＲ抑制に関するＩＣ５０を有する。これらには、例えば、ＰＰ２４２、ＩＮＫ１２８、ＡＺＤ８０５５、ＡＺＤ２０１４、ＯＳＩ０２７、ＴＯＲＫｉ  ＣＣ２２３；およびＰａｌｏｍｉｄ  ５２９が含まれる。これらの化合物も当技術分野において構造的および機能的に特徴づけられている。例えば、Ａｐｓｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４：６９１−９，２００８；Ｊｅｓｓｅｎら，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．８（Ｓｕｐｐｌ．１２），Ａｂｓｔｒ．Ｂ１４８，２００９；Ｐｉｋｅら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２３：１２１２−６，２０１３；Ｂｈａｇｗａｔら，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．１０：１３９４−４０６，２０１１；およびＸｕｅら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８：９５５１−７，２００８を参照されたい。
【００４５】
本発明において使用されうる追加的なＡＴＰ競合性ｍＴＯＲインヒビターには、例えば、ＷＡＹ６００、ＷＹＥ３５４、ＷＹＥ６８７およびＷＹＥ１２５１３２が含まれる。例えば、Ｙｕら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６９：６２３２−４０，２００９；およびＹｕら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７０：６２１−３１，２０１０を参照されたい。これらの化合物は全て、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２に対して、ＰＩ３Ｋに対する場合より大きな選択性を有する。それらはＷＡＹ００１から誘導されたものであり、ＷＡＹ００１は、組換えｍＴＯＲに対してハイスループットスクリーニングから特定されたリード化合物であって、ＰＩ３Ｋに対して、ｍＴＯＲに対する場合より強力である。当技術分野で公知の種々の他のｍＴＯＲインヒビターも本発明の実施において使用されうる。これらには、例えば、Ｔｏｒｉｎ（トリン）１（Ｔｈｏｒｅｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４：８０２３−３２，２００９）、Ｔｏｒｉｎ２（Ｌｉｕら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５４：１４７３−８０，２０１１）、Ｋｕ００６３７９４（Ｇａｒｃｉａ−Ｍａｒｔｉｎｅｚら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．４２１：２９−４２，２００９）、ＷＪＤ００８（Ｌｉら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３３４：８３０−８，２０１０）、ＰＫＩ４０２（Ｍａｌｌｏｎら，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．９：９７６−８４，２０１０）、ＮＶＰ−ＢＢＤ１３０（Ｍａｒｏｎｅら，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７：６０１−１３，２００９）、ＮＶＰ−ＢＡＧ９５６（Ｍａｒｏｎｅら，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７：６０１−１３，２００９）およびＯＸＡ−０１（Ｆａｌｃｏｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７１：１５７３−８３，２０１１）が含まれる。
【００４６】
ｍＴＯＲＣ１および／またはｍＴＯＲＣ２複合体に結合しそれを直接的に抑制するｍＴＯＲインヒビター以外に、他の様態でｍＴＯＲ活性に拮抗する化合物も本発明の実施において使用されうる。これらには、例えば、ＡＭＰＫの活性化を介してｍＴＯＲＣ１を間接的に抑制するメトホルミン（Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）；ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２から形成される多タンパク質ＴＯＲ複合体の標的化破壊が可能である化合物、例えばヌトリン（ｎｕｔｌｉｎ）３およびＡＢＴ−２６３（Ｓｅｃｃｈｉｅｒｏら，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１７，５６９−７７，２０１１；およびＴｓｅら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８：３４２１−８，２００８）；ｍＴＯＲのホスファチジン酸媒介活性化に拮抗し又はそれを抑制する化合物、例えばＨＴＳ−１（Ｖｅｖｅｒｋａら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２７：５８５−９５，２００８）；ならびにｍＴＯＲＣ１アクチベーターＲＨＥＢの活性を阻止する化合物、例えばファルネシルチオサリチル酸（ＭｃＭａｈｏｎら，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９：１７５−８３，２００５）が含まれる。
【００４７】
本発明の個々の実施形態における使用のための適当な化合物にはまた、当技術分野で通常実施されるスクリーニングアッセイにより特定されうる新規のｍＴＯＲインヒビターまたはｍＴＯＲ複合体のインヒビター（例えば、ラパマイシン類似体以外）が含まれる。例えば、候補化合物のライブラリーは、ｍＴＯＲを抑制するラパマイシン誘導体またはｍＴＯＲインヒビターに関してインビトロでスクリーニングされうる。これは、例えば、Ｙｕら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６９：６２３２−４０，２００９；Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅら，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２００９，１６：１２４０−９；Ｃｈｅｎら，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１２，７：７１５−２２；およびＢｈａｇｗａｔら，Ａｓｓａｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．２００９，７：４７１−８に記載されている方法を用いて行われうる。該候補化合物は、ランダムに合成された化合物、ペプチド化合物、または他の化学的性質の化合物でありうる。該候補化合物は、本明細書に記載されている公知ｍＴＯＲインヒビター（例えば、ラパマイシンまたは類似体）から構造的に誘導された分子を含みうる。
【００４８】
本明細書に記載されているｍＴＯＲ複合体の種々のインヒビター（例えば、ｍＴＯＲインヒビター）は商業的入手源から容易に入手可能である。例えば、ラパマイシン、本明細書に記載されている幾つかのラパログ、および種々のＡＴＰ競合性ｍＴＯＲインヒビター（例えば、Ｔｏｒｉｎ  １）は幾つかの商業的供給業者から購入可能である。これらには、例えばＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＢｉｏｔｅｃｈおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎが含まれる。あるいは、ｍＴＯＲ複合体のインヒビターは、当技術分野における教示に基づいて、有機化学および生化学の通常実施されているプロトコールにより新規合成により製造されうる。例えば、ラパマイシンを合成するための方法は当技術分野において記載されている（例えば、Ｌｅｙら，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００９；１５：２８７４−９１４；Ｎｉｃｏｌａｏｕら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９３，１１５：４４１９；Ｈａｙｗａｒｄら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９３，１１５：９３４５；Ｒｏｍｏら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９３，１１５：７９０６；Ｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５，１１７：５４０７−５４０８；およびＭａｄｄｅｓｓら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００７，４６，５９１）。本発明に適した種々の他のｍＴＯＲインヒビターの構造および化学合成も当技術分野において十分に特徴づけられている。
【００４９】
Ｖ．ＳＡＭＨＤ１およびｍＴＯＲ複合体を共抑制することによるウイルス導入の増強
本発明は更に、静止している又は分化のために前刺激された宿主細胞内へのウイルス導入の増強のための方法および組成物を提供する。幾つかの好ましい実施形態においては、宿主細胞は未刺激細胞である。具体例には、未刺激幹細胞（例えば、ヒトＣＤ３４＋  細胞）または静止Ｔ細胞（例えば、ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞）が含まれる。該方法の幾つかは、種々の外因性遺伝子を発現する組換えレトロウイルスまたはレトロウイルスベクターの導入効率を増強するために用いられうる。例えば、外因性遺伝子または異種ポリヌクレオチド配列を発現する組換えレトロウイルスは、種々の遺伝子治療および農業生物工学用途において、増強した導入効率で宿主細胞内に導入されうる。幾つかの実施形態においては、該方法は遺伝子治療におけるウイルス導入の増強を意図したものである。例えば、臨床の幹細胞に基づく療法の現在の問題は、ウイルスベクターの侵入および負荷運搬が何らかの形態の幹細胞増殖の非存在下では生じないことである。これは、宿主内に戻された場合の幹細胞機能の喪失および幹細胞の分化を潜在的に引き起こしうる。
【００５０】
幾つかの実施形態においては、本発明の方法は、レトロウイルスベクターをＳＡＭＨＤ１インヒビターおよびｍＴＯＲ複合体のインヒビター（例えば、ラパマイシン）の存在下で宿主細胞（例えば幹細胞、例えばヒトＨＳＣ）内にトランスフェクトすることを含む。該宿主細胞は、インビトロ、インビボ（例えば、ヒトまたは非ヒト対象におけるもの）またはエクスビボ（インビトロでトランスフェクトされた細胞を対象内に例えば注射により再導入する）で該ベクターと接触させることが可能である。該細胞は、該ウイルスベクターおよび前記の２つのインヒビターといずれかの順序で接触させることが可能である。したがって、前記の２つのインヒビター化合物は、該レトロウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスの添加の前、それと同時に又はその後で該細胞と接触させることが可能である。また、前記の２つのインヒビター自体も、いずれかの所望の順序で該細胞と接触させることが可能である。例えば、該標的宿主細胞はＳＡＭＨＤ１インヒビターでの処理および／または該ウイルスベクターもしくは組換えウイルスとの接触の前、それと同時に又はその後で該ｍＴＯＲインヒビター（例えば、ラパマイシン）で処理されうる。幾つかの実施形態においては、該標的宿主細胞をＳＡＭＨＤ１インヒビターおよびウイルスベクターと同時に接触させる。本明細書に例示されているとおり、これは、ＳＡＭＨＤ１インヒビターを、導入されるビリオンにコンジュゲート化することにより達成されうる。標的細胞を接触させる個々の順序には無関係に、該処理の後、該宿主細胞を、該ウイルスベクターまたはウイルスが該細胞内に導入されうるように適当な条件下で培養する。
【００５１】
本発明の方法は、多数の状況において遺伝子導入に使用される種々の組換えウイルスまたはウイルスベクターの導入効率を増強するために用いられうる。幾つかの実施形態においては、本発明の方法は、レトロウイルスまたはレトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターの導入を促進するために用いられる。レトロウイルスは、そのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡへと逆転写の過程により感染細胞において変換する能力により特徴づけられる一本鎖ＲＮＡウイルスの一群である。ついで、生じたＤＮＡはプロウイルスとして細胞染色体内に安定に組込まれ、ウイルスタンパク質の合成を導く。該組込みは受容細胞およびその後代におけるウイルス遺伝子配列の保持をもたらす。レトロウイルスゲノムは３つの遺伝子、すなわち、それぞれカプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素およびエンベロープ成分をコードするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含有する。ｇａｇ遺伝子の上流で見出される配列はビリオン内へのゲノムのパッケージングのためのシグナルを含有する。ウイルスゲノムの５’および３’末端には２つの長末端反復（ＬＴＲ）配列が存在する。これらの要素は強力なプロモーターおよびエンハンサー配列を含有し、宿主細胞ゲノム内の組込みにも要求される。
【００５２】
レトロウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスは種々の治療用途または工業用途における遺伝子導入において広く使用されている。例えば、遺伝子治療法は、後天的および先天的な遺伝的欠損を矯正するために、ならびに多数の状況において癌またはウイルス感染を治療するために用いられている。ヒトにおいて人工遺伝子を発現する能力は、他の療法による治療に適合しない多数の疾患を含む多数の重要なヒト疾患の予防および／または治療を促進する。遺伝子治療法の総説としては、以下のものを参照されたい：Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３，１９９２；Ｎａｂｅｌ  ＆  Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：２１１−２１７，１９９３；Ｍｉｔａｎｉ  ＆  Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６２−１６６，１９９３；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９２６−９３２，１９９３；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６７−１７５，１９９３；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５−４６０，１９９２；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１４９−１１５４，１９９８；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８：３５−３６，１９９５；Ｋｒｅｍｅｒ  ＆  Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ５１：３１−４４，１９９５；Ｈａｄｄａｄａら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｅｒｆｌｅｒ  ＆  Ｂｏｈｍ編，１９９５）；ならびにＹｕら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１３−２６，１９９４。
【００５３】
遺伝子導入用のレトロウイルスベクターを構築するためには、関心のある遺伝子をコードする核酸を或るウイルス配列の代わりにウイルスゲノム内に挿入し、複製欠損型のウイルス構築物を生成させる。ビリオンを生成させるために、プロデューサー宿主細胞またはパッケージング細胞系を使用する。該宿主細胞は通常、ＬＴＲおよびパッケージング成分の非存在下でｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を発現する。幾つかの実施形態においては、ＳＡＭＨＤ１抑制性アクセサリータンパク質またはポリペプチド（ＶｐｘまたはＶｐｒ）も、本明細書に例示されているとおり、ビリオン内にパッケージングされうる。関心のある遺伝子をレトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列と共に含有する組換えウイルスベクターを（例えば、リン酸カルシウム沈殿により）この細胞系内に導入すると、該パッケージング配列は、該組換えベクターのＲＮＡ転写産物がウイルス粒子内にパッケージングされることを可能にし、ついで該ウイルス粒子は培地内に分泌される。ついで、該組換えレトロウイルスを含有する培地を集め、所望により濃縮し、遺伝子導入用途における宿主細胞（例えば、幹細胞）への導入のために使用する。
【００５４】
本発明に従い組換えレトロウイルスまたはレトロウイルスベクターを産生させるための適当な宿主またはプロデューサー細胞が当技術分野でよく知られている（例えば、本明細書に例示されている２９３Ｔ細胞）。多数のレトロウイルスは複製欠損型ゲノムおよびパッケージング成分に既に分けられている。他のレトロウイルスに関しては、ベクターおよび対応パッケージング細胞系は、当技術分野で通常実際されている方法で作製されうる。該プロデューサー細胞は典型的には、ベクターゲノムによってはコードされないウイルス成分、例えばｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖタンパク質をコードしている。ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子はプロデューサー細胞内に導入され、細胞ゲノム内に安定に組込まれてパッケージング細胞系を与えうる。ついでレトロウイルスベクターゲノムをトランスフェクションまたは導入（トランスダクション）によりパッケージング細胞系内に導入して、レトロウイルスベクター粒子を産生させるのに要するＤＮＡ配列の全てを有する安定な細胞系を得る。もう１つのアプローチは、レトロウイルスベクター粒子を産生させるのに要する種々のＤＮＡ配列、例えば、ｅｎｖコード配列、ｇａｇ−ｐｏｌコード配列および欠損レトロウイルスゲノムを一過性三重トランスフェクションにより該細胞内に同時に導入することである。あるいは、構造的成分およびベクターゲノムの両方は全て、宿主細胞ゲノム内に安定に組込まれたＤＮＡによりコードされうる。
【００５５】
本発明の方法は、当技術分野でよく知られた種々のレトロウイルスベクターおよびパッケージング細胞系を使用して実施されうる。レトロウイルスベクターは、外来配列の６〜１０ｋｂまでのパッケージング容量を有するシス作用性長末端反復から構成される。最小シス作用性ＬＴＲは該ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、ついでこれは、治療用遺伝子を標的細胞内に組込んで永久的なトランスジーン発現を得るために使用される。広範に使用されているレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）に基づくもの、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびそれらの組合せが含まれる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９，１９９２；Ｊｏｈａｎｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０，１９９２；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９，１９９０；Ｗｉｌｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８，１９８９；Ｍｉｌｌｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４，１９９１；およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照されたい）。本発明に特に好適なのはレンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に導入または感染可能であり典型的には高いウイルス力価を与えうるレトロウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは多数の疾患に対する遺伝子治療において使用されている。例えば、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターを使用する造血遺伝子治療はｘ連鎖性副腎白質ジストロフィーおよびベータサラセミアに使用されている。例えば、Ｋｏｈｎら，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：２４７−５４，２０１０；Ｃａｒｔｉｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０７：１８７−１９８，２０１２；およびＣａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏら，Ｎａｔｕｒｅ  ４６７：３１８−３２２，２０１０を参照されたい。本発明の方法はそのようなベクターでの遺伝子治療または遺伝子導入に容易に適用されうる。幾つかの他の実施形態においては、他のレトロウイルスベクターは本発明の方法の実施において使用されうる。これらには、例えば、ヒト泡沫状ウイルス（ＨＦＶ）またはスプーマウイルス属の他のウイルスに基づくベクターが含まれる。
【００５６】
特に、幾つかのウイルスベクターアプローチが臨床試験において遺伝子導入のために現在利用可能であり、レトロウイルスベクターが飛び抜けて頻繁に使用されている系である。これらのウイルスベクターの全ては、導入剤を生成させるためにヘルパー細胞系内に挿入された遺伝子による欠損ベクターの相補を含むアプローチを用いる。ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験において使用されているレトロウイルスベクターの具体例である（Ｄｕｎｂａｒら，Ｂｌｏｏｄ  ８５：３０４８−３０５（１９９５）；Ｋｏｈｎら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０１７−１０２（１９９５）；Ｍａｌｅｃｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：２２  １２１３３−１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療治験において使用された最初の治療用ベクターであった（Ｂｌａｅｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４７５−４８０，１９９５）。ＭＦＧ−Ｓパッケージ化ベクターの場合に５０％以上の導入効率が観察された（Ｅｌｌｅｍら，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４：１０−２０，１９９７；Ｄｒａｎｏｆｆら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：１１１−２，１９９７）。レトロウイルスベクターをトランスフェクトする及びウイルス粒子を産生させるための多数のプロデューサー細胞系またはパッケージング細胞系も当技術分野で公知である。本発明において使用されるプロデューサー細胞は標的細胞（例えば、ヒト標的細胞）の種と同じ種から誘導される必要はない。実際、本発明に適したプロデューサーまたはパッケージング細胞系には、ヒトから誘導された細胞系（例えば、ＨＥＫ２９２細胞）、サルから誘導された細胞系（例えば、ＣＯＳ−１細胞）、マウスまたは他の種（例えば、イヌ）から誘導された細胞系（例えば、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞）が含まれる。該細胞系の幾つかは後記実施例に開示されている。遺伝子導入において組換えレトロウイルスを産生させるためのレトロウイルスベクターおよび適合パッケージング細胞系の追加的な例は、例えば以下のものに報告されている：Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら，Ｖｉｒｏｌ．１６７：４００−６，１９８８；Ｍｅｙｅｒｓら，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１１９：２５７−６４，１９９１（脾臓壊死ウイルス（ＳＮＶ）に基づくベクター、例えばｖＳＮＯ２１に関して）；Ｄａｖｉｓら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．８：１４５９−６７，１９９７（「２９３−ＳＰＡ」細胞系）；Ｐｏｖｅｙら，Ｂｌｏｏｄ  ９２：４０８０−９，１９９８（「１ＭＩ−ＳＣＦ」細胞系）；Ｂａｕｅｒら，Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．４：１１９−２７，１９９８（イヌパッケージング細胞系「ＤＡ」）；Ｇｅｒｉｎら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０：１９６５−７４，１９９９；Ｓｅｈｇａｌら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：１０８４−９１，１９９９；Ｇｅｒｉｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１５：９４１−８，１９９９；ＭｃＴａｇｇａｒｔら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１６：８５９−６５，２０００；Ｒｅｅｖｅｓら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．１１：２０９３−１０３，２０００；Ｃｈａｎら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：６９７−７０３，２００１；Ｔｈａｌｅｒら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：２７３−９，２００１；Ｍａｒｔｉｎｅｔら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．２９：３５１−７，２００３；およびＬｅｍｏｉｎｅら，Ｉ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．６：３７４−８６，２００４。これらの及び他のレトロウイルスベクターおよびパッケージングプロデューサー細胞系のいずれもが本発明の実施において使用されうる。
【００５７】
当技術分野において遺伝子導入に使用されているレトロウイルスベクターおよびパッケージング細胞系の多くは商業的に入手可能である。例えば、幾つかのレトロウイルスベクターおよび適合パッケージング細胞系はＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から入手可能である。レンチウイルスに基づくベクターの例には、例えば、ｐＬＶＸ−Ｐｕｒｏ、ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−Ｎｅｏ、ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−ＨｙｇおよびｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏが含まれる。対応するパッケージング細胞系（例えば、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞系）も入手可能である。レンチウイルスに基づくベクターおよびパッケージング系に加えて、他のレトロウイルスに基づくベクターおよびパッケージング系も商業的に入手可能である。これらには、ＭＭＬＶに基づくベクターｐＱＣＸＩＮ、ｐＱＣＸＩＱおよびｐＱＣＸＩＨ、ならびに適合プロデューサー細胞系、例えばＨＥＫ２９３に基づくパッケージング細胞系ＧＰ２−２９３、ＥｃｏＰａｃｋ  ２−２９３およびＡｍｐｈｏＰａｃｋ  ２９３、およびＮＩＨ／３Ｔ３に基づくパッケージング細胞系ＲｅｔｒｏＰａｃｋ  ＰＴ６７が含まれる。これらの及び他のレトロウイルスベクターおよびプロデューサー細胞系のいずれもが本発明の実施において使用されうる。
【００５８】
本発明の幾つかの実施形態は種々の外因性遺伝子または異種ポリヌクレオチド配列の導入および組換え発現に関する。これらの実施形態の幾つかにおいては、該遺伝子または異種ポリヌクレオチド配列は、遺伝子導入において使用されるベクターのバックボーンを与えるレトロウイルスゲノム以外の起源に由来する。該遺伝子は原核生物または真核生物源、例えば細菌、ウイルス、酵母、寄生生物、植物または動物に由来しうる。該組換えレトロウイルスにより発現される外因性遺伝子または異種ポリヌクレオチド配列は２以上の起源に由来することも可能である（すなわち、多遺伝子構築物または融合タンパク質）。また、該外因性遺伝子または異種ポリヌクレオチド配列は、１つの起源に由来しうる調節配列および別の起源からの遺伝子をも含みうる。該ウイルスベクターにより導入されるいかなる遺伝子についても、組換えレトロウイルスベクターは、該遺伝子を該ベクター内に機能的に挿入することで容易に構築され、前記のとおりに適当なパッケージング細胞内で該ベクターを複製させ、それから産生されたウイルス粒子を得、ついで該組換えウイルスを標的細胞（例えば、幹細胞）に感染させることができる。
【００５９】
幾つかの実施形態においては、該組換えレトロウイルスにより保持される外因性遺伝子または異種ポリヌクレオチド配列は治療用遺伝子である。該治療用遺伝子は、例えば、癌細胞を治療するため、免疫調節遺伝子を発現させるため、ウイルス感染と闘うため、または遺伝的欠損の結果としての遺伝子機能を置換するために導入されうる。該組換えレトロウイルスにより発現される外因性遺伝子は、抗体の産生のために、関心のある抗原をもコードしうる。幾つかの典型的な実施形態においては、本発明の方法で導入される外因性遺伝子は、治療用ポリペプチドをコードする遺伝子である。例えば、ヒト乳癌細胞系内への腫瘍抑制遺伝子ｐ５３のトランスフェクションは該細胞における成長抑制の回復をもたらした（Ｃａｓｅｙら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６：１７９１−７，１９９１）。幾つかの他の実施形態においては、本発明の方法で導入される外因性遺伝子は酵素をコードしている。例えば、該遺伝子はサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）をコードしうる。ｐ１６ＩＮＫ４を発現するベクターでのトランスフェクションによる野生型サイクリン依存性キナーゼｐ１６ＩＮＫ４の機能の回復は幾つかのヒト癌細胞系によるコロニー形成を低減することが示された（Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１０４５−９，１９９４）。本発明の追加的な実施形態は、細胞接着分子、他の腫瘍抑制因子、例えばｐ２１およびＢＲＣＡ２、アポトーシスの誘導因子、例えばＢａｘおよびＢａｋ、他の酵素、例えばシトシンデアミナーゼおよびチミジンキナーゼ、ホルモン、例えば成長ホルモンおよびインスリン、ならびにインターロイキンおよびサイトカインをコードする外因性遺伝子を標的細胞内に導入することを含む。
【００６０】
外因性遺伝子を発現する組換えレトロウイルスまたはレトロウイルスベクターは、該外因性遺伝子の組換え発現のために、ｍＴＯＲ複合体のインヒビター（例えばｍＴＯＲインヒビター、例えばＡＴＰ競合性インヒビターまたはアロステリックインヒビターであるラパマイシン）の存在下、いかなる標的細胞内にも導入されうる。本明細書に例示されているとおり、本発明の好ましい標的細胞は幹細胞である。本発明の実施に適した幹細胞には、限定的なものではないが造血幹細胞（ＨＳＣ）、胚幹細胞または間葉系幹細胞が含まれる。それらには、ヒトおよび非ヒト動物（脊椎動物および哺乳動物を含む）の両方から得られる幹細胞が含まれる。標的細胞の他の具体例には、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、鳥類、硬骨魚類および軟骨魚類、げっ歯類、例えばマウスおよびラット、霊長類、例えばヒトおよびサル、ならびに他の動物、例えばフェレット、ヒツジ、ウサギおよびモルモットに由来する細胞が含まれる。
【００６１】
ｍＴＯＲ複合体のインヒビター（例えば、ラパマイシン）および／またはＳＡＭＨＤ１インヒビターの存在下で組換えレトロウイルスベクターを標的細胞内に導入することは、当技術分野でよく知られた方法または後記実施例に例示されている方法に従い行われうる。例えば、宿主細胞（例えば、ＨＳＣ）は該レトロウイルスベクターでのトランスフェクションの前に該インヒビター化合物で前処理されうる。あるいは、該標的宿主細胞は、本明細書に記載されているｍＴＯＲ複合体のインヒビター（例えば、ラパマイシンまたは類似化合物）の存在下、該ウイルスベクターでトランスフェクトされうる。使用されるインヒビターの濃度は、使用される化合物、組換えベクターまたはウイルスの性質、および該細胞が該化合物といつ接触されるか（該ベクターでのトランスフェクションの前またはそれと同時）に応じて、当業者により容易に決定され、最適化されうる。典型的には、該インヒビター（ラパマイシンまたは類似体）は約１０ｎＭ〜約２ｍＭの範囲で存在すべきである。好ましくは、該方法において使用される化合物は約５０ｎＭ〜約５００μＭ、約１００ｎＭ〜１００μＭ、または約０．５μＭ〜約５０μＭの濃度で存在する。より好ましくは、該化合物を約１μＭ〜約２０μＭ、例えば１μＭ、２μＭ、５μＭまたは１０μＭの濃度でプロデューサー細胞と接触させる。
【００６２】
本発明はまた、本明細書に開示されている種々の方法を行うために使用されうる医薬組合せ、例えばキットを提供する。そのような医薬組合せは典型的には、ＳＡＭＨＤ１インヒビター（例えば、ＶｐｘもしくはＶｐｒタンパク質、またはその機能的誘導体もしくは断片）またはＳＡＭＨＤ１インヒビターをコードするポリヌクレオチド、ｍＴＯＲインヒビター化合物（例えば、ラパマイシンまたは本明細書に記載されているラパマイシン類似体）を遊離形態で、又は、１以上の不活性物質および他の成分を伴う組成物中に含有する。該医薬組合せは、関心のある標的遺伝子をクローニングするための１以上の適当なレトロウイルスベクター（例えば、本明細書に記載されているレンチウイルスベクター）を含有しうる。該医薬組合せは更に、関心のある挿入標的遺伝子またはポリヌクレオチドを発現する組換えレトロウイルスベクターを産生させるためのパッケージングまたはプロデューサー細胞系（例えば、２９３Ｔ細胞系）を含有しうる。ＳＡＭＨＤ１インヒビターを該ウイルスベクターと共にビリオン内にパッケージングするための追加的な試薬は該医薬組合せまたはキットにおいて提供されうる。幾つかの実施形態においては、該医薬組合せは、該組換えレトロウイルスベクターまたはウイルスにより保持される外因性遺伝子が導入される宿主細胞または標的細胞を含有する。種々の実施形態においては、本発明の医薬組合せまたはキットは、所望により更に、組換えレトロウイルスまたはレトロウイルスベクターを高効率で導入するためのｍＴＯＲ複合体のインヒビター（例えばｍＴＯＲインヒビター、例えばラパマイシン）の使用法を詳述した説明または説明書を含有しうる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、未サイトカイン刺激ヒトＣＤ３４＋  細胞への効率的なレンチウイルスベクターの導入がラパマイシン処理およびビリオン内のＶｐｘの存在の両方を要することを示している。左パネルは、ビリオンにおけるＶｐｘの非存在下または存在下のレンチウイルスベクターの導入の後のＧＦＰで標識された造血細胞の百分率を示し、ここで、未サイトカイン処理ＣＤ３４＋  ＨＳＣは処理されず（黒塗り四角形）、または１０μｇ／ｍｌ（白丸）もしくは２０μｇ／ｍｌのラパマイシンで処理された。右側のパネルは、左パネルに示されているのと同じ処理群に関する平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。ＭＦＩは細胞当たりの組込みベクター数の代用物である。全処理時間は１２時間であった。
【図２】図２は、ラパマイシンが静止未刺激ＣＤ４＋  Ｔ細胞へのレンチウイルスベクターの導入をも増強することを示している。
【００６４】
実施例
以下の実施例は、本発明を更に詳細に例示するために記載されており、その範囲を限定するものではない。
【００６５】
実施例１．ラパマイシンとＶｐｘとの組合せは未刺激ＣＤ３４＋  細胞のレンチウイルス導入を増強する
この実施例は未サイトカイン刺激ＣＤ３４＋  細胞のレンチウイルスベクター導入効率に対するラパマイシンまたはＶｐｘの効果を記載する。Ｓｗａｎら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３：１４８０−９２，２００６に記載されている方法に多少の変更を加えた方法にて、ＨＩＶ−２  Ｖｐｘタンパク質を含有するＨＩＶ−１ビリオンの調製を行った。具体的には、Ｓｗａｎらにおいて使用されたＣＡＤの代わりにＦＧ１２導入ベクター（Ｑｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：１８３−８，２００３）を使用し、プラスミドｐＣＧ−２３９−Ｖｐｘ（Ｊａｃｅｋ  Ｓｋｏｗｒｏｎｓｋｉ博士から入手）をトランスフェクション混合物に含有させた。対照として、Ｖｐｘアクセサリータンパク質を含有しないＨＩＶ−１ビリオンも調製した。
【００６６】
該細胞へのレンチウイルスの導入を、ラパマイシンもＶｐｘも無しで、ラパマイシンのみで、Ｖｐｘのみで、またはラパマイシンおよびＶｐｘの両方で調べた。図１に示されているとおり、ラパマイシンまたはＶｐｘは、いずれかの条件での処理を伴わない場合と比較して導入を若干しか増強しないことを、結果は示している（図１、左パネル）。しかし、ラパマイシンおよびＶｐｘの両方が存在する場合には、導入効率は２．５〜３倍増加した。更に、ラパマイシンおよびＶｐｘの両方で処理されたＣＤ３４＋  細胞からの平均蛍光強度を評価したところ、ＧＦＰレベルはラパマイシンのみでの処理に比べて増加したことが明らかである。重要なことに、ラパマイシンおよびＶｐｘの両方の組合せはＣＤ３４＋  細胞へのレンチウイルスベクターの導入をいずれかの単独体または各効果が単に相加的である場合に予想されるものより著しく増強することを、該結果は示した。これらの知見は、ラパマイシンおよびＶｐｘの両方での組合せ処置がＣＤ３４＋  細胞内へのレンチウイルスベクタービリオンの導入頻度を相乗的に増加させることを示している。これは、平均蛍光強度（ＭＦＩ、右パネル）の結果に基づく、細胞当たりのベクターコピーの増加と合致している。
【００６７】
実施例２．ラパマイシン／Ｖｐｘは静止Ｔ細胞へのレンチウイルスベクターの導入を増強する
本発明者らはまた、ラパマイシンが未刺激ＣＤ４＋  Ｔ細胞へのレンチウイルスベクターの導入を増強するかどうかを評価した。具体的には、新鮮に単離されたヒト末梢血ＣＤ４＋  ＣＤ２５ｌｏｗ、ＣＤ６９ｌｏｗ  Ｔ細胞またはＣＤ４＋  Ｔ細胞を種々の濃度のラパマイシンと共に１２時間培養するか、または培養せず、その時間中に、レンチウイルスベクター無し（ＭＯＩ  ０）または感染多重度２０（ＭＯＩ  ２０）のレンチウイルスベクターにさらした。その結果を図２に示す。図２の左パネルに示されているのは、新鮮に単離された未刺激（無サイトカインまたはＴ細胞媒介活性化）のＣＤ４  Ｔ細胞であり、これを、単離直後に、レンチウイルスベクターおよびラパマイシンで１２時間処理した。該細胞を洗浄し、ついで、１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２の存在下、ＣＤ３およびＣＤ２８抗体が結合したビーズで刺激した。８日後、該細胞をＧＦＰ発現に関して評価した。図２の右パネルは、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下、ビーズに結合したＣＤ３およびＣＤ２８抗体で１日間刺激されたＣＤ４  Ｔ細胞を示す。活性化の第２日に、該細胞をレンチウイルスベクターおよびラパマイシンで直ちに１２時間処理した。ついで該細胞を洗浄し、１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２の存在下、ＣＤ３およびＣＤ２８が結合したビーズで再刺激した。６日後、該細胞をＧＦＰ発現に関して評価した。
【００６８】
図２に示されているとおり、ラパマイシンは未刺激ＣＤ４＋  Ｔ細胞へのレンチウイルスベクターの導入を増強したが、活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞への導入を増強しなかった。更に、ラパマイシンの濃度の増加はレンチウイルスベクターの導入を増強した。ラパマイシンを使用する未刺激静止ＣＤ＋４  Ｔ細胞へのレンチウイルスベクターの導入の増強は、Ｖｐｘの存在下で見出されるＨＩＶ感染の限定的増強を連想させる。未刺激ＣＤ３４＋  細胞での本発明者らの知見（図１に示されている）の機能拡大により、Ｖｐｘと組合せて使用された場合のラパマイシンは静止未刺激ＣＤ４＋  Ｔ細胞へのレンチウイルスの導入の相乗的増強をももたらすはずである。
【００６９】
前記の本発明は理解の明瞭化を目的として例示および具体例によりかなり詳細に記載されているが、本発明の教示を考慮して、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、ある変化および修飾がそれに対して施されうる、と当業者に容易に理解されるであろう。
【００７０】
本明細書中で引用されている全ての刊行物、データベース、ＧｅｎＢａｎｋ配列、特許および特許出願を、それぞれが参照により本明細書に組み入れられると具体的かつ個別に示されているのと同様に、参照により本明細書に組み入れることとする。
【図１】
2016528900.tif 000003
【図２】
2016528900.tif 000004
【国際調査報告】
2016528900.tif 000005