(57)【要約】本開示は、（ｉ）アミログルコシダーゼ（ＡＧＬ）ポリペプチドと（ｉｉ）内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドを提供する。ある一定の実施形態において、かかるキメラポリペプチドは、（ｉ）本明細書に記載するＡＧＬポリペプチドのいずれか１つおよび（ｉｉ）本明細書に記載する内在化モイエティのいずれか１つを含む。かかるキメラポリペプチドには、インビトロおよび／もしくはインビボで細胞の細胞質への送達を評価すること、酵素活性を評価すること、細胞の酵素活性を増加させること、またはＡＧＬの結合パートナーもしくは基質を同定することなどの、非常に多くの使い道がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）アミログルコシダーゼ（ＡＧＬ）ポリペプチドと（ｉｉ）内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドであって、
アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有するキメラポリペプチド。
【請求項２】
前記内在化モイエティが、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター（ＥＮＴ）トランスポーターによる細胞への前記キメラポリペプチドの送達を促進する、請求項１に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３】
前記内在化モイエティが、ＥＮＴ２による細胞への前記キメラポリペプチドの送達を促進する、請求項１または２に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４】
前記内在化モイエティが、筋肉細胞への前記キメラポリペプチドの送達を促進する、請求項１または２に記載のキメラポリペプチド。
【請求項５】
前記内在化モイエティが、筋肉細胞、肝細胞および線維芽細胞のうちの１つ以上への前記キメラポリペプチドの送達を促進する、請求項１〜４のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項６】
前記ＡＧＬポリペプチドが、配列番号１、２または３のいずれかと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、キメラポリペプチドであって、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する、請求項１〜５のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項７】
前記ＡＧＬポリペプチドが、配列番号１、２または３のいずれかと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、キメラポリペプチドであって、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する、請求項６に記載のキメラポリペプチド。
【請求項８】
前記ＡＧＬポリペプチドが、Ｎ末端メチオニンが存在するまたは不存在の状態での配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項９】
前記ＡＧＬポリペプチドが、Ｎ末端メチオニンが存在するまたは不存在の状態での配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項１０】
前記ＡＧＬポリペプチドが、Ｎ末端メチオニンが存在するまたは不存在の状態での配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項１１】
インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、または精製のうちの１つ以上を向上させる１つ以上のポリペプチド部分をさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項１２】
野生型ＡＧＬポリペプチド中に存在する１つ以上のＮ−グリコシル化基を欠く、請求項１〜１１のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項１３】
野生型ＡＧＬポリペプチド中に存在する１つ以上のＯ−グリコシル化基を欠く、請求項１〜１２のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号１のアミノ酸位置６９、２１９、７９７、８１３、８３９、９２７、１０３２、１２３６および１３８０に対応するアミノ酸位置のいずれか１つまたは組み合わせにあるアスパラギンが、前記ＡＧＬポリペプチドにおいて置換または欠失されている、請求項１〜１３のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号１のアミノ酸位置８１５、８４１、９２９および１０３４に対応するアミノ酸位置のいずれか１つまたは組み合わせにあるセリンが、前記ＡＧＬポリペプチドにおいて置換または欠失されている、請求項１〜１４のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号１のアミノ酸位置７１、２２１、７９９、１２３８および１３８２に対応するアミノ酸位置のいずれか１つまたは組み合わせにあるトレオニンが、前記ＡＧＬポリペプチドにおいて置換または欠失されている、請求項１〜１５のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号１のアミノ酸位置２２０、７９８、８１４、８４０、９２８、１０３３、１２３７および１３８１のいずれか１つまたは組み合わせに対応するアミノ酸位置に存在するアミノ酸が、前記ＡＧＬポリペプチドにおいてプロリンで置換されている、請求項１〜１６のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項１８】
前記内在化モイエティが、抗体または抗原結合断片を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項１９】
前記抗体が、モノクローナル抗体またはその断片である、請求項１８に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２０】
前記抗体が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、またはその抗原結合断片である、請求項１９に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２１】
前記内在化モイエティが、ホーミングペプチドを含む、請求項１〜１７のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項２２】
前記ＡＧＬポリペプチドが、前記内在化モイエティに化学的に結合体化されている、請求項１〜２１のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項２３】
前記ＡＧＬポリペプチドと前記内在化モイエティとを含む融合タンパク質である、請求項１〜２１のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項２４】
前記内在化モイエティが、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター２（ＥＮＴ２）トランスポーターによって細胞膜を通過する、請求項１〜２３のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項２５】
前記抗体または抗原結合断片が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０と同じエピトープと結合するその変異体、または３Ｅ１０と実質的に同じ細胞透過活性を有し、かつ３Ｅ１０と同じエピトープと結合する抗体、または前述のもののいずれかの抗原結合断片から選択される、請求項１８〜２０のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項２６】
前記抗体または抗原結合断片が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０もしくは前記３Ｅ１０変異体の抗原結合断片である、請求項１８〜２０のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項２７】
前記抗体または抗原結合断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体あるいは抗原結合断片である、請求項１８〜２０または２５〜２６に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２８】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号６と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項１８〜２０または２５〜２７のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項２９】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号８と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項１８〜２０または２５〜２８のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項３０】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項１８〜２０または２５〜２９のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項３１】
前記抗体または抗原結合断片が、
配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；
配列番号１１のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および
配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む、請求項１８〜２０または２５〜３０のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項３２】
前記ＡＧＬポリペプチドを前記内在化モイエティに組換えにより結合体化させるように組換え生産される、請求項１〜３１のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項３３】
原核細胞または真核細胞において生産される、請求項３２に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３４】
前記真核細胞が、酵母細胞、鳥類細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞から選択される、請求項３３に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３５】
前記原核細胞が、細菌細胞である、請求項３３に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３６】
融合タンパク質である、請求項１〜３５のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項３７】
前記融合タンパク質が、リンカーを含む、請求項３６に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３８】
リンカーを含む、請求項１〜３６のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項３９】
前記リンカーが、前記ＡＧＬポリペプチドを前記内在化モイエティに結合体化または連結させる、請求項３８に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４０】
前記ＡＧＬポリペプチドを前記内在化モイエティに相互接続するリンカーを含まない、請求項１〜３６のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項４１】
前記リンカーが、切断可能リンカーである、請求項３７〜３９のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項４２】
前記内在化モイエティが、前記ＡＧＬポリペプチドのＮ末端またはＣ末端アミノ酸に直接または間接的に結合体化または連結されている、請求項３５〜４１のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項４３】
前記内在化モイエティが、前記ＡＧＬポリペプチドの内部アミノ酸に直接または間接的に結合体化または連結されている、請求項３５〜４１のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項４４】
請求項１〜４３のいずれかに記載のキメラポリペプチドを融合タンパク質としてコードするヌクレオチド配列を含む、核酸構築物。
【請求項４５】
内在化モイエティをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、ＡＧＬポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸構築物であって、ＡＧＬ酵素活性を有し、かつ前記内在化モイエティの内在化活性を有するキメラポリペプチドをコードする、核酸構築物。
【請求項４６】
前記内在化モイエティが、筋肉細胞、肝細胞および線維芽細胞のうちの少なくとも１つへの送達を促進する、請求項４５に記載の核酸構築物。
【請求項４７】
前記内在化モイエティが、ＥＮＴトランスポーターによって細胞膜を通過する、請求項４５または４６に記載の核酸構築物。
【請求項４８】
前記内在化モイエティが、ＥＮＴ２トランスポーターによって細胞膜を通過する、請求項４５〜４７のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項４９】
前記ＡＧＬポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号１、２または３のいずれかと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＡＧＬポリペプチドをコードする、請求項４５〜４８のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項５０】
前記ＡＧＬポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号１、２または３のいずれかと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＡＧＬポリペプチドをコードする、請求項４９に記載の核酸構築物。
【請求項５１】
前記ＡＧＬポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号１、２または３のいずれかと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むＡＧＬポリペプチドをコードする、請求項５０に記載の核酸構築物。
【請求項５２】
ＡＧＬポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１７、１８、１９または２０を含む、請求項４５〜５１のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項５３】
ＡＧＬポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２１または２２を含む、請求項４５〜５１のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項５４】
リンカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項４５〜５３のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項５５】
前記内在化モイエティが、抗体または抗原結合断片である、請求項４５〜５４のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項５６】
前記抗体または抗原結合断片が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０もしくは前記変異体の抗原結合断片である、請求項５５に記載の核酸構築物。
【請求項５７】
前記抗体または抗原結合断片が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０と同じエピトープと結合するその変異体、または３Ｅ１０と実質的に同じ細胞透過活性を有し、かつ３Ｅ１０と同じエピトープと結合する抗体、または前述のもののいずれかの抗原結合断片から選択される抗体または抗原結合断片である、請求項５５または５６に記載の核酸構築物。
【請求項５８】
前記抗体または抗原結合断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体あるいは抗原結合断片である、請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５９】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号６と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項５５〜５７のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項６０】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号８と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項５５〜５８のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項６１】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項５５〜６０のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項６２】
前記抗体または抗原結合断片が、
配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；
配列番号１１のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および
配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む、請求項５５〜６１のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項６３】
請求項１〜４３のいずれかに記載のキメラポリペプチドと薬学的に許容され得る担体とを含む組成物。
【請求項６４】
実質的に発熱物質を含まない、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
フォーブス・コリ病の処置を、それを必要とする被験体において行う方法であって、
（ｉ）ＡＧＬポリペプチドと（ｉｉ）内在化モイエティとを含む有効量のキメラポリペプチドを前記被験体に投与するステップを含み；
前記キメラポリペプチドが、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する、方法。
【請求項６６】
細胞のグリコーゲン脱分枝酵素活性を増加させる方法であって、
前記細胞を（ｉ）ＡＧＬポリペプチドと（ｉｉ）内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドと接触させるステップを含み；
前記キメラポリペプチドが、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する、方法。
【請求項６７】
前記内在化モイエティが、ＥＮＴトランスポーターによる細胞への前記キメラポリペプチドの送達を促進する、請求項６５または６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記細胞が、それを必要とする被験体の細胞である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記それを必要とする被験体が、フォーブス・コリ病に関連付けられる肝臓の症状を有する、請求項６５〜６８のいずれかに記載の方法。
【請求項７０】
前記それを必要とする被験体が、フォーブス・コリ病に関連付けられる神経筋症状を有する、請求項６５〜６８のいずれかに記載の方法。
【請求項７１】
前記内在化モイエティが、筋肉細胞への前記キメラポリペプチドの送達を促進する、請求項６５〜７０のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
前記内在化モイエティが、筋肉細胞、肝細胞および線維芽細胞のうちの１つ以上への前記キメラポリペプチドの送達を促進する、請求項６５〜７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
前記ＡＧＬポリペプチドが、配列番号１、２または３のいずれかと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記キメラポリペプチドが、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する、請求項６５〜７２のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
前記ＡＧＬポリペプチドが、配列番号１、２または３のいずれかと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、前記キメラポリペプチドが、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＡＧＬポリペプチドが、Ｎ末端メチオニンが存在するまたは不存在の状態での配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＡＧＬポリペプチドが、Ｎ末端メチオニンが存在するまたは不存在の状態での配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記ＡＧＬポリペプチドが、Ｎ末端メチオニンが存在するまたは不存在の状態での配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記キメラポリペプチドが、野生型ＡＧＬポリペプチド中に存在する１つ以上のＮ−グリコシル化基を欠く、請求項６５〜７７のいずれかに記載の方法。
【請求項７９】
前記キメラポリペプチドが、野生型ＡＧＬポリペプチド中に存在する１つ以上のＯ−グリコシル化基を欠く、請求項６５〜７８のいずれかに記載の方法。
【請求項８０】
配列番号１のアミノ酸位置６９、２１９、７９７、８１３、８３９、９２７、１０３２、１２３６および１３８０に対応するアミノ酸位置のいずれか１つまたは組み合わせにあるアスパラギンが、前記ＡＧＬポリペプチドにおいて置換または欠失されている、請求項６５〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
配列番号１のアミノ酸位置８１５、８４１、９２９および１０３４に対応するアミノ酸位置のいずれか１つまたは組み合わせにあるセリンが、前記ＡＧＬポリペプチドにおいて置換または欠失されている、請求項６５〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
配列番号１のアミノ酸位置７１、２２１、７９９、１２３８および１３８２に対応するアミノ酸位置のいずれか１つまたは組み合わせにあるトレオニンが、前記ＡＧＬポリペプチドにおいて置換または欠失されている、請求項６５〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
配列番号１のアミノ酸位置２２０、７９８、８１４、８４０、９２８、１０３３、１２３７および１３８１のいずれか１つまたは組み合わせに対応するアミノ酸位置に存在するアミノ酸が、前記ＡＧＬポリペプチドにおいてプロリンで置換されている、請求項６５〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記内在化モイエティが、抗体または抗原結合断片を含む、請求項６５〜８３のいずれかに記載の方法。
【請求項８５】
前記抗体が、モノクローナル抗体またはその断片である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記抗体が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、またはその抗原結合断片である、請求項８４または８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記内在化モイエティが、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター２（ＥＮＴ２）トランスポーターによって細胞膜を通過する、請求項６５〜８６のいずれかに記載の方法。
【請求項８８】
前記抗体または抗原結合断片が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０と同じエピトープと結合するその変異体、または３Ｅ１０と実質的に同じ細胞透過活性を有し、かつ３Ｅ１０と同じエピトープと結合する抗体、または前述のもののいずれかの抗原結合断片から選択される抗体または抗原結合断片である、請求項８４〜８７のいずれかに記載の方法。
【請求項８９】
前記抗体または抗原結合断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体あるいは抗原結合断片である、請求項８５〜８８のいずれかに記載の方法。
【請求項９０】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号６と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項８５〜８９のいずれかに記載の方法。
【請求項９１】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号８と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項８５〜９０のいずれかに記載の方法。
【請求項９２】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項８５〜９１のいずれかに記載の方法。
【請求項９３】
前記抗体または抗原結合断片が、
配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；
配列番号１１のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および
配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む、請求項８５〜９２のいずれかに記載の方法。
【請求項９４】
前記抗体または抗原結合断片が、ヒト化抗体、キメラ抗体または完全ヒト抗体あるいは抗原結合断片である、請求項８５〜９３のいずれかに記載の方法。
【請求項９５】
前記キメラポリペプチドが、前記ＡＧＬポリペプチドを前記内在化モイエティに結合体化または連結させるリンカーを含む、請求項６５〜９４のいずれかに記載の方法。
【請求項９６】
前記キメラポリペプチドが、前記ＡＧＬポリペプチドを前記内在化モイエティに相互接続するリンカーを含まない、請求項６５〜９４のいずれかに記載の方法。
【請求項９７】
前記リンカーが、切断可能リンカーである、請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
前記キメラポリペプチドが、薬学的に許容され得る担体を用いて製剤化される、請求項６５〜９７のいずれかに記載の方法。
【請求項９９】
前記キメラポリペプチドが、全身投与される、請求項６５〜９８のいずれかに記載の方法。
【請求項１００】
前記キメラポリペプチドが、局所投与される、請求項６５〜９８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０１】
前記キメラポリペプチドが、静脈内投与される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
局所投与が、肝門脈経由での投与を含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
前記内在化モイエティが、ＥＮＴ２トランスポーターによって細胞膜を通過する、請求項７０〜１０２のいずれかに記載の方法。
【請求項１０４】
フォーブス・コリ病の処置を、それを必要とする被験体において行う方法であって、有効量の請求項１〜６４のいずれかに記載のキメラポリペプチド、核酸構築物または組成物を前記被験体に投与するステップを含む方法。
【請求項１０５】
フォーブス・コリ病を処置するための医薬の製造における、請求項１〜４３のいずれかに記載のキメラポリペプチドの使用。
【請求項１０６】
フォーブス・コリ病を処置するための、請求項１〜４３のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項１０７】
フォーブス・コリ病を処置するための医薬の製造における、請求項４４〜６２のいずれかに記載の核酸構築物の使用。
【請求項１０８】
フォーブス・コリ病を処置するための、請求項４４〜６２のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１０９】
フォーブス・コリ病の処置において使用するための、請求項６３または６４に記載の組成物。
【請求項１１０】
キメラポリペプチドを受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター（ＥＮＴ２）経路によって細胞に送達する方法であって、
細胞を（ｉ）ＡＧＬポリペプチドと（ｉｉ）ＥＮＴ２によって細胞を透過する内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドと接触させるステップを含み；
前記キメラポリペプチドが、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する、方法。
【請求項１１１】
前記内在化モイエティが、細胞への前記キメラポリペプチドの送達を促進する、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記細胞が筋肉細胞であり、前記内在化モイエティが、筋肉細胞への前記キメラポリペプチドの送達を促進する、請求項１１０または１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記ＡＧＬポリペプチドが、配列番号１、２または３のいずれかと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記キメラポリペプチドが、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する、請求項１１０〜１１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１１４】
前記キメラポリペプチドが、野生型ＡＧＬポリペプチド中に存在する１つ以上のＮ−グリコシル化基を欠く、請求項１１０〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記キメラポリペプチドが、野生型ＡＧＬポリペプチド中に存在する１つ以上のＯ−グリコシル化基を欠く、請求項１１０〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
配列番号１のアミノ酸位置６９、２１９、７９７、８１３、８３９、９２７、１０３２、１２３６および１３８０に対応するアミノ酸位置のいずれか１つまたは組み合わせにあるアスパラギンが、前記ＡＧＬポリペプチドにおいて置換または欠失されている、請求項１１０〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
配列番号１のアミノ酸位置８１５、８４１、９２９および１０３４に対応するアミノ酸位置のいずれか１つまたは組み合わせにあるセリンが、前記ＡＧＬポリペプチドにおいて置換または欠失されている、請求項１１０〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
配列番号１のアミノ酸位置７１、２２１、７９９、１２３８および１３８２に対応するアミノ酸位置のいずれか１つまたは組み合わせにあるトレオニンが、前記ＡＧＬポリペプチドにおいて置換または欠失されている、請求項１１０〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
配列番号１のアミノ酸位置２２０、７９８、８１４、８４０、９２８、１０３３、１２３７および１３８１のいずれか１つまたは組み合わせに対応するアミノ酸位置に存在するアミノ酸が、前記ＡＧＬポリペプチドにおいてプロリンで置換されている、請求項１１０〜１１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記内在化モイエティが、抗体または抗原結合断片を含む、請求項１１０〜１１９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２１】
前記抗体または抗原結合断片が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０と同じエピトープと結合するその変異体、または３Ｅ１０と実質的に同じ細胞透過活性を有し、かつ３Ｅ１０と同じエピトープと結合する抗体、または前述のもののいずれかの抗原結合断片から選択される抗体または抗原結合断片である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記抗体または抗原結合断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体あるいは抗原結合断片である、請求項１１０〜１２１のいずれかに記載の方法。
【請求項１２３】
キメラポリペプチドを筋肉細胞に送達する方法であって、
筋肉細胞を（ｉ）ＡＧＬポリペプチドと（ｉｉ）筋肉細胞への送達を促進する内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドと接触させるステップを含み；
前記内在化モイエティが、細胞への前記キメラポリペプチドの輸送を促進し；および
前記キメラポリペプチドが、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する、方法。
【請求項１２４】
キメラポリペプチドを肝細胞に送達する方法であって、
肝細胞を（ｉ）ＡＧＬポリペプチドまたはその機能性断片と（ｉｉ）内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドと接触させるステップを含み；
前記キメラポリペプチドが、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する、方法。
【請求項１２５】
前記ＡＧＬポリペプチドが、配列番号１、２または３のいずれかと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記キメラポリペプチドが、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する、請求項１２３または１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記内在化モイエティが、抗体または抗原結合断片を含む、請求項１２４または１２５のいずれかに記載の方法。
【請求項１２７】
前記抗体がモノクローナル抗体３Ｅ１０またはその抗原結合断片である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記内在化モイエティが、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター２（ＥＮＴ２）トランスポーターによって細胞膜を通過する、請求項１２２〜１２７のいずれかに記載の方法。
【請求項１２９】
前記抗体または抗原結合断片が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または３Ｅ１０の細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０もしくは前記３Ｅ１０変異体の抗原結合断片である、請求項１２６〜１２７のいずれかに記載の方法。
【請求項１３０】
前記抗体または抗原結合断片が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０と同じエピトープと結合するその変異体、または３Ｅ１０と実質的に同じ細胞透過活性を有し、かつ３Ｅ１０と同じエピトープと結合する抗体、または前述のもののいずれかの抗原結合断片から選択される抗体または抗原結合断片である、請求項１２５〜１２８のいずれかに記載の方法。
【請求項１３１】
前記抗体または抗原結合断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体あるいは抗原結合断片である、請求項１２６〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号６と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項１２６〜１３１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３３】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号８と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項１２６〜１３２のいずれかに記載の方法。
【請求項１３４】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項１２６〜１３３のいずれかに記載の方法。
【請求項１３５】
前記抗体または抗原結合断片が、
配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；
配列番号１１のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および
配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む、請求項１２６〜１３４のいずれかに記載の方法。
【請求項１３６】
前記ＡＧＬポリペプチドが、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、または精製のうちの１つ以上を向上させる１つ以上のポリペプチド部分をさらに含む、請求項１２２〜１３５のいずれかに記載の方法。
【請求項１３７】
前記キメラポリペプチドが、野生型ＡＧＬポリペプチド中に存在する１つ以上のＮ−グリコシル化基を欠く、請求項１２２〜１３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記キメラポリペプチドが、野生型ＡＧＬポリペプチド中に存在する１つ以上のＯ−グリコシル化基を欠く、請求項１２２〜１３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
配列番号１のアミノ酸位置６９、２１９、７９７、８１３、８３９、９２７、１０３２、１２３６および１３８０に対応するアミノ酸位置のいずれか１つまたは組み合わせにあるアスパラギンが、前記ＡＧＬポリペプチドにおいて置換または欠失されている、請求項１２２〜１３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４０】
配列番号１のアミノ酸位置８１５、８４１、９２９および１０３４に対応するアミノ酸位置のいずれか１つまたは組み合わせにあるセリンが、前記ＡＧＬポリペプチドにおいて置換または欠失されている、請求項１２２〜１３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４１】
配列番号１のアミノ酸位置７１、２２１、７９９、１２３８および１３８２に対応するアミノ酸位置のいずれか１つまたは組み合わせにあるトレオニンが、前記ＡＧＬポリペプチドにおいて置換または欠失されている、請求項１２２〜１４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４２】
配列番号１のアミノ酸位置２２０、７９８、８１４、８４０、９２８、１０３３、１２３７および１３８１のいずれか１つまたは組み合わせに対応するアミノ酸位置に存在するアミノ酸が、前記ＡＧＬポリペプチドにおいてプロリンで置換されている、請求項１０８〜１２３ｅのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
筋肉細胞のアミログルコシダーゼ（ＡＧＬ）酵素活性を増加させる方法であって、
筋肉細胞を（ｉ）ＡＧＬポリペプチドと（ｉｉ）内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドと接触させるステップを含み；
前記内在化モイエティが、細胞への前記キメラポリペプチドの輸送を促進し；および
前記キメラポリペプチドが、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する、方法。
【請求項１４４】
肝細胞のアミログルコシダーゼ（ＡＧＬ）酵素活性を増加させる方法であって、
肝細胞を（ｉ）ＡＧＬポリペプチドまたはその機能性断片と（ｉｉ）内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドと接触させるステップを含み；
前記キメラポリペプチドが、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する、方法。
【請求項１４５】
前記ＡＧＬポリペプチドが、配列番号１、２および３のいずれかと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記キメラポリペプチドが、ＡＧＬ酵素活性を有する、請求項１４３または１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記内在化モイエティが、抗体または抗原結合断片を含む、請求項１４３〜１２６のいずれかに記載の方法。
【請求項１４７】
前記抗体がモノクローナル抗体３Ｅ１０またはその抗原結合断片である、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
前記内在化モイエティが、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター２（ＥＮＴ２）トランスポーターによって細胞膜を通過する、請求項１４３〜１４６のいずれかに記載の方法。
【請求項１４９】
前記抗体または抗原結合断片が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または３Ｅ１０の細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０もしくは前記３Ｅ１０変異体の抗原結合断片である、請求項１４５〜１４９のいずれかに記載の方法。
【請求項１５０】
前記抗体または抗原結合断片が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０と同じエピトープと結合するその変異体、または３Ｅ１０と実質的に同じ細胞透過活性を有し、かつ３Ｅ１０と同じエピトープと結合する抗体、または前述のもののいずれかの抗原結合断片から選択される抗体または抗原結合断片である、請求項１４５〜１４９のいずれかに記載の方法。
【請求項１５１】
前記抗体または抗原結合断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体あるいは抗原結合断片である、請求項１４５〜１４６または１４９〜１５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５２】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号６と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項１４５〜１４６または１４９〜１５１のいずれかに記載の方法。
【請求項１５３】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号８と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項１４５〜１４６または１４９〜１５２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５４】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項１４５〜１４６または１４９〜１５３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５５】
前記抗体または抗原結合断片が、
配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；
配列番号１１のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および
配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む、請求項１４５〜１４６または１４９〜１５４のいずれかに記載の方法。
【請求項１５６】
前記キメラポリペプチドが、全身投与される、請求項１１０〜１５５のいずれかに記載の方法。
【請求項１５７】
前記キメラポリペプチドが、局所投与される、請求項１１０〜１５６のいずれかに記載の方法。
【請求項１５８】
前記キメラポリペプチドが、静脈内投与される、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５９】
前記局所投与が、肝門脈経由での投与を含む、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６０】
筋肉細胞および肝臓細胞の一方または両方への前記キメラポリペプチドの送達のための、請求項１〜４３のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項１６１】
筋肉細胞および肝臓細胞の一方または両方への送達のための医薬の製造における、請求項１〜４３のいずれかに記載のキメラポリペプチドの使用。
【請求項１６２】
（ｉ）ＡＧＬポリペプチドと、（ｉｉ）モノクローナル抗体３Ｅ１０、または細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０と同じエピトープと結合するその変異体、または３Ｅ１０と実質的に同じ細胞透過活性を有し、かつ３Ｅ１０と同じエピトープと結合する抗体、または前述のもののいずれかの抗原結合断片から選択される抗体または抗原結合断片とを含むキメラポリペプチドであって、
アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有するキメラポリペプチド。
【請求項１６３】
前記抗体または抗原結合断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体あるいは抗原結合断片である、請求項１６２に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１６４】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号６と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、またはそのヒト化抗体を含む、請求項１６２または１６３に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１６５】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号８と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化抗体を含む、請求項１６２〜１６４のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項１６６】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項１６２〜１６５のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項１６７】
前記抗体または抗原結合断片が、
配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；
配列番号１１のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および
配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む、請求項１６２〜１６６のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項１６８】
（ｉｉ）が、細胞への前記キメラポリペプチドの送達を促進する、請求項１６２〜１６７のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項１６９】
前記ＡＧＬポリペプチドが、配列番号１、２および３のいずれかと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、キメラポリペプチドであって、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する、請求項１６２〜１６８のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項１７０】
前記抗体または抗原結合断片が、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター２（ＥＮＴ２）トランスポーターによって細胞膜を通過する、請求項１６２〜１６９のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項１７１】
（ｉｉ）が、一本鎖Ｆｖを含む抗原結合断片である、請求項１６２〜１７０のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項１７２】
フォーブス・コリ病の処置を、それを必要とする被験体において行う方法であって、
細胞を（ｉ）成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）細胞への送達を促進する内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドと接触させるステップを含み；
前記キメラポリペプチドが、酸性α−グルコシダーゼ活性を有し；および前記キメラポリペプチドが、約１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まない、方法。
【請求項１７３】
前記成熟ＧＡＡポリペプチドが、約７０〜７６キロダルトンの分子量を有する、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
前記成熟ＧＡＡポリペプチドが、配列番号４の残基１２２−７８２または配列番号５の残基２０４−７８２から選択されるアミノ酸配列から成る、請求項１７２〜１７３のいずれかに記載の方法。
【請求項１７５】
前記内在化モイエティが、細胞への前記キメラポリペプチドの送達を促進する、請求項１７２〜１７４のいずれかに記載の方法。
【請求項１７６】
前記内在化モイエティが、筋肉細胞への前記キメラポリペプチドの送達を促進する、請求項１７２〜１７５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７７】
前記内在化モイエティが、肝細胞への前記キメラポリペプチドの送達を促進する、請求項１７２〜１７６のいずれかに記載の方法。
【請求項１７８】
前記キメラポリペプチドが、細胞質グリコーゲン蓄積を低減させる、請求項１７２〜１７７のいずれかに記載の方法。
【請求項１７９】
前記成熟ＧＡＡポリペプチドが、グリコシル化されている、請求項１７２〜１７８のいずれかに記載の方法。
【請求項１８０】
前記成熟ＧＡＡポリペプチドが、グリコシル化されていない、請求項１７２〜１７９のいずれかに記載の方法。
【請求項１８１】
前記それを必要とする被験体が、前記キメラポリペプチドでの処置開始前に病的細胞質グリコーゲン蓄積を有する被験体である、請求項１７２〜１８０のいずれかに記載の方法。
【請求項１８２】
前記内在化モイエティが、抗体または抗原結合断片を含む、請求項１７２〜１８１のいずれかに記載の方法。
【請求項１８３】
前記抗体が、モノクローナル抗体またはその断片である、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８４】
前記抗体が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、またはその抗原結合断片である、請求項１８２または１８３に記載の方法。
【請求項１８５】
前記内在化モイエティが、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーターによって細胞膜を通過する、請求項１７１〜１８４のいずれかに記載の方法。
【請求項１８６】
前記内在化モイエティが、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター２（ＥＮＴ２）トランスポーターによって細胞膜を通過する、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８７】
前記抗体または抗原結合断片が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０と同じエピトープと結合するその変異体、または３Ｅ１０と実質的に同じ細胞透過活性を有し、かつ３Ｅ１０と同じエピトープと結合する抗体、または前述のもののいずれかの抗原結合断片である、請求項１８２〜１８６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８８】
前記抗体または抗原結合断片が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または３Ｅ１０の細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０もしくは前記３Ｅ１０変異体の抗原結合断片である、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１８９】
前記抗体または抗原結合断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体あるいは抗原結合断片である、請求項１８２〜１８８のいずれかに記載の方法。
【請求項１９０】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号６と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項１８２〜１８９のいずれかに記載の方法。
【請求項１９１】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号８と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項１８２〜１９０のいずれかに記載の方法。
【請求項１９２】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項１８２〜１９１のいずれかに記載の方法。
【請求項１９３】
前記抗体または抗原結合断片が、
配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；
配列番号１１のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および
配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む、請求項１８２〜１９２のいずれかに記載の方法。
【請求項１９４】
前記キメラポリペプチドが、前記成熟ＧＡＡポリペプチドを前記内在化モイエティに結合体化または連結させるリンカーを含む、請求項１７２〜１９３のいずれかに記載の方法。
【請求項１９５】
前記キメラポリペプチドが、前記成熟ＧＡＡポリペプチドを前記内在化モイエティに相互接続するリンカーを含まない、請求項１７２〜１９３のいずれかに記載の方法。
【請求項１９６】
前記リンカーが、切断可能リンカーである、請求項１９５に記載の方法。
【請求項１９７】
前記キメラポリペプチドが、薬学的に許容され得る担体を用いて製剤化される、請求項１７２〜１９６のいずれかに記載の方法。
【請求項１９８】
前記キメラポリペプチドが、全身投与される、請求項１７２〜１９６のいずれかに記載の方法。
【請求項１９９】
前記キメラポリペプチドが、静脈内投与される、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２００】
フォーブス・コリ病患者の細胞の細胞質におけるグリコーゲン蓄積を減少させる方法であって、
筋肉細胞を（ｉ）成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）細胞の細胞質への輸送を促進する内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドと接触させるステップを含み；
前記キメラポリペプチドが、酸性α−グルコシダーゼ活性を有し；および前記キメラポリペプチドが、約１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まない、方法。
【請求項２０１】
細胞の細胞質におけるＧＡＡ活性を増加させる方法であって、
（ｉ）成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）細胞の細胞質への輸送を促進する内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドを送達するステップを含み；
前記キメラポリペプチドが、酸性α−グルコシダーゼ活性を有し；および
前記キメラポリペプチドが、約１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まない、方法。
【請求項２０２】
前記細胞が被験体におけるものであり、前記被験体がフォーブス・コリ病を有する、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０３】
インビトロである、請求項２００または２０１に記載の方法。
【請求項２０４】
前記成熟ＧＡＡポリペプチドが、約７０〜７６キロダルトンの分子量を有する、請求項２００〜２０３のいずれかに記載の方法。
【請求項２０５】
前記成熟ＧＡＡポリペプチドが、約７０キロダルトンの分子量を有する、請求項２００〜２０４のいずれかに記載の方法。
【請求項２０６】
前記成熟ＧＡＡポリペプチドが、約７６キロダルトンの分子量を有する、請求項２００〜２０４のいずれかに記載の方法。
【請求項２０７】
前記成熟ＧＡＡポリペプチドが、配列番号４もしくは５の残基１２２−７８２、配列番号４もしくは５の残基１２３−７８２、または配列番号４もしくは５の残基２０４−７８２から選択されるアミノ酸配列から成る、請求項２００〜２０６のいずれかに記載の方法。
【請求項２０８】
前記キメラポリペプチドが、配列番号４または５の残基１２２−７８２を含む、請求項２００〜２０６のいずれかに記載の方法。
【請求項２０９】
前記キメラポリペプチドが、配列番号４または５の残基１２３−７８２を含む、請求項２００〜２０６のいずれかに記載の方法。
【請求項２１０】
前記キメラポリペプチドが、配列番号４または５の残基２０４−７８２を含む、請求項２００〜２０６のいずれかに記載の方法。
【請求項２１１】
前記成熟ＧＡＡポリペプチドが、グリコシル化されている、請求項２００〜２１０のいずれかに記載の方法。
【請求項２１２】
前記成熟ＧＡＡポリペプチドが、グリコシル化されていない、請求項２００〜２１１のいずれかに記載の方法。
【請求項２１３】
前記成熟ＧＡＡポリペプチドが、天然に存在するヒトＧＡＡのものとは異なるグリコシル化パターンを有する、請求項２００〜２１０のいずれかに記載の方法。
【請求項２１４】
前記内在化モイエティが、細胞の細胞質への前記キメラポリペプチドの送達を促進する、請求項２００〜２１３のいずれかに記載の方法。
【請求項２１５】
前記内在化モイエティが、抗体または抗原結合断片を含む、請求項２００〜２１４のいずれかに記載の方法。
【請求項２１６】
前記抗体が、モノクローナル抗体またはその断片である、請求項２１５に記載の方法。
【請求項２１７】
前記抗体が、モノクローナル抗体３Ｅ１０またはその抗原結合断片である、請求項２１５または２１６に記載の方法。
【請求項２１８】
前記内在化モイエティが、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーターによって細胞膜を通過する、請求項２０３〜２１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２１９】
前記内在化モイエティが、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター２（ＥＮＴ２）トランスポーターによって細胞膜を通過する、請求項２１８に記載の方法。
【請求項２２０】
前記抗体または抗原結合断片が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０と同じエピトープと結合するその変異体、または３Ｅ１０と実質的に同じ細胞透過活性を有し、かつ３Ｅ１０と同じエピトープと結合する抗体、または前述のもののいずれかの抗原結合断片である、請求項２１５〜２１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２２１】
前記抗体または抗原結合断片が、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または３Ｅ１０の細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０もしくは前記３Ｅ１０変異体の抗原結合断片である、請求項２２０に記載の方法。
【請求項２２２】
前記抗体または抗原結合断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体あるいは抗原結合断片である、請求項２１５〜２２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２２３】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号６と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項２１５〜２２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２２４】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号８と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項２１５〜２２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２２５】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む、請求項２１５〜２２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２２６】
前記抗体または抗原結合断片が、
配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；
配列番号１１のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および
配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む、請求項２１５〜２２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２２７】
前記キメラポリペプチドが、前記成熟ＧＡＡポリペプチドを前記内在化モイエティに結合体化または連結させるリンカーを含む、請求項２００〜２２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２２８】
前記キメラポリペプチドが、前記成熟ＧＡＡポリペプチドを前記内在化モイエティに相互接続するリンカーを含まない、請求項２００〜２２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２２９】
前記リンカーが、切断可能リンカーである、請求項２２８に記載の方法。
【請求項２３０】
前記キメラポリペプチドが、薬学的に許容され得る担体を用いて製剤化される、請求項２００〜２３０のいずれかに記載の方法。
【請求項２３１】
請求項４５〜６２のいずれかに記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項２３２】
請求項２３１のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２３３】
請求項２３１のベクターを含み、かつ発現することが可能な宿主細胞。
【請求項２３４】
キメラポリペプチドを生産する方法であって、前記ポリペプチドの発現を生じさせるために適切な条件下で請求項２３２または２３３に記載の宿主細胞を培養するステップを含む方法。
【請求項２３５】
インビトロ法である、請求項６６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年２月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／７６６，９４０号のに対する優先権の利益を請求し、本明細書によりその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出した配列表を含み、前記配列表はその全体が参照により本明細書に援用されている。２０１４年２月２０日に作成した前記ＡＳＣＩＩコピーの名は１０６１９９−００１０−ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは１３０，９２４バイトである。
【背景技術】
【０００３】
フォーブス・コリ（Ｆｏｒｂｅｓ−Ｃｏｒｉ）病は、糖原病ＩＩＩ型またはグリコーゲン脱分岐酵素欠損症としても公知であり、１００，０００回の出生に１回の推定発生率を有する常染色体劣性神経筋／肝疾患である。フォーブス・コリ病は、全糖原病のおおよそ２７％に相当する。フォーブス・コリ病の臨床像は、かなりよく確立されているが、非常に可変的である。肝腫脹および肝硬変を伴う肝臓の疾患と一般に考えられているが、フォーブス・コリ病は、様々な他の系の異常も特徴とする。筋衰弱、筋消耗、低血糖、脂質異常症およびときには知的障害もこの疾患で観察されることがある。顔面の異常をもつ患者もいる。骨粗鬆症のリスクが高い患者もいる。これらの症状の１つに罹患している患者もおり、これらの症状の１つより多くに罹患している患者もいる。この疾患の臨床症状の相違は、多くの場合、この疾患の異なる亜型に関連付けられる。
【０００４】
フォーブス・コリ病には４つの亜型がある。亜型Ａ型は、この症例の約８０％を占め、酵素活性（例えば、ネイティブ酵素活性に関連したグルコシダーゼおよびトランスフェラーゼ活性両方）を欠き、肝臓と筋肉の両方を罹患させる。亜型Ｂ型は、この症例の約１５％を占め、酵素活性（例えば、ネイティブ酵素活性に関連したグルコシダーゼおよびトランスフェラーゼ活性両方）を欠き、肝臓のみを罹患させる。亜型ＣおよびＤ型は、この症例の５％未満を占め、グルコシダーゼ活性（Ｃ型）またはトランスフェラーゼ活性（Ｄ型）の選択的喪失を随伴し、臨床的には亜型Ａ型に似ている。
【０００５】
フォーブス・コリ病は、ＡＧＬ遺伝子の突然変異によって引き起こされる。ＡＧＬ遺伝子は、アミロ−１，６−グルコシダーゼ（ＡＧＬ）タンパク質をコードし、このタンパク質は、グリコーゲンおよび類似分子の末端α−１，６−グルコシド結合の切断を触媒することに関与する細胞質酵素である。ＡＧＬタンパク質は、２つの異なる酵素活性、すなわち、４−α−グルコトランスフェラーゼ（ｇｌｕｃｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）活性およびアミロ−１，６−グルコシダーゼ活性を有する。両方の触媒活性が正常なグリコーゲン脱分枝活性に求められる。グリコーゲンは、グルコース残基の高分枝ポリマーである。
【０００６】
ＡＧＬは、グリコーゲンの３つのグルコースサブユニットの一方の平行鎖から他方への転移に関与し、それによって一方の線状枝を短縮し、同時に他方を延長する。その後、ドナー枝は、α−１，６−結合を伴う単一のグルコース残基をなお含有することになる。その後、ＡＧＬのα−１，６−グルコシダーゼは、その残存する残基を除去し、その結果、「脱分枝」形態のその鎖がグリコーゲン分子上に生成されることになる。機能性ＡＧＬ不存在下で起こるのだが、適正なグリコーゲン脱分枝がされないと、アミロペクチン様構造（ポリグルコサン）に似ている異常なグリコーゲンが生じ、肝細胞および筋細胞をはじめとする体内の様々な組織に蓄積する。この異常形態のグリコーゲンは、典型的に不溶性であり、細胞に対して毒性であり得る。
【０００７】
現在、フォーブス・コリの主な処置は規定食であり、正常血糖の維持を目的とする（Ｏｚｅｎら、２００７、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、１３（１８）：２５４５−４６）。これを達成するために、患者に炭水化物の多い食事およびトウモロコシデンプンサプリメントを頻繁に食べさせる。筋疾患を有する患者には高タンパク質食も食べさせる。肝臓移植は、肝臓に関連した生化学的異常すべてを解消するが、筋疾患／心筋症に対する肝臓移植の長期効果は不明である。（Ｏｚｅｎら、２００７）。フォーブス・コリを管理するためのこれらのツールは不十分である。食餌療法には−特に若い患者に関して−顕著なコンプライアンス問題がある。したがって、フォーブス・コリ病の基礎原因、すなわち患者のグリコーゲン破壊不能を処置し、かつフォーブス・コリ病の筋肉および肝臓の症状を処置する、フォーブス・コリ療法が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｏｚｅｎら、２００７、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、１３（１８）：２５４５−４６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
フォーブス・コリ病患者の細胞質グリコーゲン集積を排除するための方法および組成物が当該技術分野において必要とされている。かかる方法および組成物は、フォーブス・コリ病の処置を改善するだろう。本開示は、かかる方法および組成物を提供する。本明細書において提供する方法および組成物は、機能性ＡＧＬを補充するために、ならびに／または肝臓および筋肉の細胞などの細胞の細胞質への有害なグリコーゲン集積を別様に減少させるために使用することができる。同様に、本明細書において提供する方法および組成物は、フォーブス・コリ病の有害な症状を改善するために使用することができ、例えば、アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼおよびクレアチンホスホキナーゼレベルを低下させるために（例えば、上昇した１つ以上のかかる酵素レベル、例えば血清中レベル、を低下させるために）使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、（ｉ）アミログルコシダーゼ（ＡＧＬ）ポリペプチドと（ｉｉ）内在化モイエティ（ｍｏｉｅｔｙ）とを含むキメラポリペプチドを提供する。ある一定の実施形態において、かかるキメラポリペプチドは、（ｉ）本明細書に記載するＡＧＬポリペプチドのいずれか１つおよび（ｉｉ）本明細書に記載する内在化モイエティのいずれか１つを含む。かかるキメラポリペプチドには、インビトロおよび／もしくはインビボで細胞の細胞質への送達を評価すること、酵素活性を評価すること、細胞の酵素活性を増加させること、またはＡＧＬの結合パートナーもしくは基質を同定することなどの、非常に多くの使い道がある。
【００１１】
例として、１つの態様において、本開示は、（ｉ）アミログルコシダーゼ（ＡＧＬ）ポリペプチドと（ｉｉ）内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドであって、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有するキメラポリペプチドを提供する。別の態様において、本開示は、（ｉ）ＡＧＬポリペプチドと、（ｉｉ）モノクローナル抗体３Ｅ１０、または細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０と同じエピトープに結合するその変異体、またはＤＮＡと結合するその変異体、または３Ｅ１０と実質的に同じ細胞透過活性を有し、かつ３Ｅ１０と同じエピトープに結合する抗体、または前述のもののいずれかの抗原結合断片から選択される抗体または抗原結合断片とを含むキメラポリペプチドであって、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有するキメラポリペプチドを提供する。
【００１２】
一部の実施形態において、前記内在化モイエティは、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター（ＥＮＴ）トランスポーターによる細胞への前記キメラポリペプチドの送達を促進する。一部の実施形態において、前記内在化モイエティは、ＥＮＴ２による細胞への前記キメラポリペプチドの送達を促進する。一部の実施形態において、前記内在化モイエティは、筋肉細胞への前記キメラポリペプチドの送達を促進する。一部の実施形態において、前記内在化モイエティは、筋肉細胞、肝細胞および線維芽細胞のうちの１つ以上への前記キメラポリペプチドの送達を促進する。内在化モイエティを、筋肉細胞への送達を促進すると記載するとき、送達が専ら筋肉細胞へのものであることを含意しないことに留意すべきである。それが含意するのは、１つ以上の他の細胞タイプに対して筋肉細胞への送達が多少強化されること、および細胞への通過がすべての細胞タイプにわたって遍在的なものではないことだけである。
【００１３】
一部の実施形態において、前記ＡＧＬポリペプチドは、配列番号１、２または３のいずれかと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、この場合、前記キメラポリペプチドは、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する。一部の実施形態において、前記ＡＧＬポリペプチドは、配列番号１、２または３のいずれかと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、この場合、前記キメラポリペプチドは、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する。一部の実施形態において、前記ＡＧＬポリペプチドは、Ｎ末端メチオニンが存在するまたは不存在の状態の配列番号１、２または３のいずれかと同一のアミノ酸配列を含み、この場合、前記キメラポリペプチドは、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する。
【００１４】
一部の実施形態において、前記ＡＧＬポリペプチドは、完全長または実質的に完全長ポリペプチドである。一部の実施形態において、前記ＡＧＬポリペプチドは、少なくとも５００、少なくとも７００、少なくとも７５０、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１２００、少なくとも１３００、または少なくとも１４００アミノ酸配の機能性断片であり、この機能性断片は、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する。
【００１５】
一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、または精製のうちの１つ以上を向上させる１つ以上のポリペプチド部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）をさらに含む。一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、野生型ＡＧＬポリペプチド中に存在する１つ以上のＮ−グリコシル化基を欠く。一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、野生型ＡＧＬポリペプチド中に存在する１つ以上のＯ−グリコシル化基を欠く。一部の実施形態では、配列番号１のアミノ酸位置６９、２１９、７９７、８１３、８３９、９２７、１０３２、１２３６および１３８０に対応するアミノ酸位置のいずれか１つまたは組み合わせにあるアスパラギンが前記ＡＧＬポリペプチドにおいて置換または欠失されている。一部の実施形態では、配列番号１のアミノ酸位置８１５、８４１、９２９および１０３４に対応するアミノ酸位置のいずれか１つまたは組み合わせにあるセリンが前記ＡＧＬポリペプチドにおいて置換または欠失されている。一部の実施形態では、配列番号１のアミノ酸位置７１、２２１、７９９、１２３８および１３８２に対応するアミノ酸位置のいずれか１つまたは組み合わせにあるトレオニンが前記ＡＧＬポリペプチドにおいて置換または欠失されている。一部の実施形態では、配列番号１のアミノ酸位置２２０、７９８、８１４、８４０、９２８、１０３３、１２３７および１３８１のいずれか１つまたは組み合わせに対応するアミノ酸位置に存在するアミノ酸が前記ＡＧＬポリペプチドにおいてプロリンで置換されている。
【００１６】
一部の実施形態において、前記内在化モイエティは、抗体または抗原結合断片を含む。一部の実施形態において、前記抗体は、モノクローナル抗体またはその断片である。一部の実施形態において、前記抗体は、モノクローナル抗体３Ｅ１０、またはその抗原結合断片である。一部の実施形態において、前記内在化モイエティは、ホーミングペプチドを含む。一部の実施形態において、前記ＡＧＬポリペプチドは、前記内在化モイエティに化学的に結合体化されている。一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、前記ＡＧＬポリペプチドと前記内在化モイエティとを含む融合タンパク質である。一部の実施形態において、前記内在化モイエティは、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター２（ＥＮＴ２）トランスポーターによって細胞膜を通過する。一部の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０と同じエピトープに結合するその変異体、または３Ｅ１０と実質的に同じ細胞透過活性を有し、かつ３Ｅ１０と同じエピトープに結合する抗体、または前述のもののいずれかの抗原結合断片から選択される。一部の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、モノクローナル抗体３Ｅ１０、または細胞透過活性を保持するその変異体、または３Ｅ１０もしくは前記３Ｅ１０変異体の抗原結合断片である。一部の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体あるいは抗原結合断片である。一部の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、配列番号６と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む。一部の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、配列番号８と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む。一部の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそのヒト化変異体を含む。一部の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、
配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；
配列番号１１のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および
配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む。
【００１７】
一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、前記ＡＧＬポリペプチドを前記内在化モイエティに組換えにより結合体化させるように組換え生産される。一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、原核細胞または真核細胞において生産される。一部の実施形態において、前記真核細胞は、酵母細胞、鳥類細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞から選択される。一部の実施形態において、前記原核細胞は、細菌細胞である。
【００１８】
一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、融合タンパク質である。一部の実施形態において、前記融合タンパク質は、リンカーを含む。一部の実施形態において、前記結合体は、リンカーを含む。一部の実施形態において、前記リンカーは、前記ＡＧＬポリペプチドを前記内在化モイエティに結合体化または連結させる。一部の実施形態において、前記結合体は、リンカーを含まず、前記ＡＧＬポリペプチドは、前記内在化モイエティに直接結合体化または連結されている。一部の実施形態において、前記リンカーは、切断可能リンカーである。一部の実施形態において、前記内在化モイエティは、前記ＡＧＬポリペプチドのＮ末端またはＣ末端アミノ酸に直接または間接的に結合体化または連結されている。一部の実施形態において、前記内在化モイエティは、前記ＡＧＬポリペプチドの内部アミノ酸に直接または間接的に結合体化または連結されている。
【００１９】
本開示は、ＡＧＬ部分と内在化モイエティ部分（ｍｏｉｅｔｙ  ｐｏｒｔｉｏｎ）とを含むキメラポリペプチドを提供する。ＡＧＬ部分の特徴のいずれかおよび内在化モイエティ部分の特徴のいずれかを有する、本明細書に記載する任意のかかるキメラポリペプチドを「本開示のキメラポリペプチド」と呼ぶこともあり、または「ＡＧＬキメラポリペプチド」と呼ぶこともあり、または「本開示のＡＧＬキメラポリペプチド」と呼ぶこともある。ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する。
【００２０】
別の態様において、本開示は、融合タンパク質として上に記載したキメラポリペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物を提供する。本開示は、内在化モイエティをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、ＡＧＬポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物であって、ＡＧＬ酵素活性を有し、かつ前記内在化モイエティの内在化活性を有するキメラポリペプチドをコードする核酸構築物も提供する。一部の実施形態において、前記ＡＧＬポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１、２および３のいずれかと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＡＧＬポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、前記ＡＧＬポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１、２および３のいずれかと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むＡＧＬポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、前記ＡＧＬポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１、２および３のいずれかと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むＡＧＬポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、前記ＡＧＬポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１７、１８、１９または２０を含む。一部の実施形態において、前記ＡＧＬポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２１または２２を含む。一部の実施形態において、前記核酸構築物は、リンカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態において、前記核酸構築物は、内在化モイエティをコードし、前記内在化モイエティは、本明細書に開示する任意の抗体または抗原結合断片である。
【００２１】
別の態様において、本開示は、本明細書に開示するキメラポリペプチドのいずれかと薬学的に許容され得る担体とを含む組成物を提供する。一部の実施形態において、前記組成物は、実質的に発熱物質不含である。
【００２２】
別の態様において、本開示は、フォーブス・コリ病の処置を、それを必要とする被験体において行う方法であって、（ｉ）ＡＧＬポリペプチドと（ｉｉ）内在化モイエティとを含む有効量のキメラポリペプチドを前記被験体に投与するステップを含み；前記キメラポリペプチドが、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する、方法を提供する。一部の実施形態において、フォーブス・コリ病の処置を、それを必要とする被験体において行う前記方法は、前記被験体に有効量の、本明細書に開示するキメラポリペプチド、核酸構築物または組成物のいずれかを投与するステップを含む。
【００２３】
別の態様において、本開示は、細胞のグリコーゲン脱分枝酵素活性を増加させる方法であって、前記細胞を（ｉ）ＡＧＬポリペプチドと（ｉｉ）内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドと接触させるステップを含み；前記キメラポリペプチドが、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する、方法を提供する。一部の実施形態において、前記内在化モイエティは、ＥＮＴトランスポーターによる細胞への前記キメラポリペプチドの送達を促進する。一部の実施形態において、前記細胞は、それを必要とする被験体の細胞である。一部の実施形態において、前記それを必要とする被験体は、フォーブス・コリ病に関連付けられる肝臓の症状を有する。一部の実施形態において、前記それを必要とする被験体は、フォーブス・コリ病に関連付けられる神経筋症状を有する。一部の実施形態において、前記内在化モイエティは、筋肉細胞への前記キメラポリペプチドの送達を促進する。一部の実施形態において、前記内在化モイエティは、筋肉細胞、肝細胞および線維芽細胞のうちの１つ以上への前記キメラポリペプチドの送達を促進する。一部の実施形態において、本明細書に開示する方法において使用するためのキメラポリペプチドのＡＧＬポリペプチドは、本明細書に記載する任意のＡＧＬポリペプチドである。一部の実施形態において、本明細書に開示する方法において使用するための内在化モイエティは、本明細書に開示する任意の抗体または抗原結合断片である。一部の実施形態において、前記内在化モイエティは、リンカーによって前記ＡＧＬポリペプチドに結合体化されている。一部の実施形態において、前記リンカーは、切断可能リンカーである。他の実施形態において、前記内在化モイエティは、前記ＡＧＬポリペプチドに直接結合体化または連結されている。
【００２４】
別の態様において、本開示は、フォーブス・コリ病を処置するための医薬の製造における、本明細書に開示する任意のキメラポリペプチドの使用を提供する。別の態様において、本開示は、フォーブス・コリ病を処置するための、本明細書に開示する任意のキメラポリペプチドを提供する。別の態様において、本開示は、本明細書に開示する任意のキメラポリペプチドであって、筋肉細胞および肝臓細胞の一方または両方への前記キメラポリペプチドの送達のためのものであるキメラポリペプチドを提供する。別の態様において、本開示は、筋肉細胞および肝臓細胞の一方または両方への送達のための医薬の製造における、本明細書に開示する任意のキメラポリペプチドの使用を提供する。
【００２５】
別の態様において、本開示は、フォーブス・コリ病を処置するための医薬の製造における、本明細書に開示する任意の核酸構築物の使用を提供する。一部の実施形態において、本開示は、フォーブス・コリ病を処置するための、本明細書に開示する任意の核酸構築物を提供する。
【００２６】
別の態様において、本開示は、フォーブス・コリ病を処置する際に使用するための、本明細書に開示する任意の組成物を提供する。
【００２７】
別の態様において、本開示は、キメラポリペプチドを受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター（ＥＮＴ２）経路によって細胞に送達する方法であって、細胞を（ｉ）ＡＧＬポリペプチドと（ｉｉ）ＥＮＴ２によって細胞を透過する内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドと接触させるステップを含み；前記キメラポリペプチドが、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する、方法を提供する。一部の実施形態において、本明細書に開示する方法において使用するためのキメラポリペプチドのＡＧＬポリペプチドは、本明細書に記載する任意のＡＧＬポリペプチドである。一部の実施形態において、本明細書に開示する方法において使用するための内在化モイエティは、本明細書に記載する任意の内在化モイエティである。一部の実施形態において、前記内在化モイエティは、本明細書に開示する任意の抗体または抗原結合断片である。一部の実施形態において、前記内在化モイエティは、細胞への前記キメラポリペプチドの送達を促進する。一部の実施形態において、前記細胞は、筋肉細胞であり、前記内在化モイエティは、筋肉細胞への前記キメラポリペプチドの送達を促進する。
【００２８】
別の態様において、本開示は、キメラポリペプチドを筋肉細胞に送達する方法であって、筋肉細胞を（ｉ）ＡＧＬポリペプチドと（ｉｉ）筋肉細胞への輸送を促進する内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドと接触させるステップを含み；前記内在化モイエティが、細胞への前記キメラポリペプチドの輸送を促進し；および前記キメラポリペプチドが、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する、方法を提供する。一部の実施形態において、本明細書に開示する方法において使用するためのキメラポリペプチドのＡＧＬポリペプチドは、本明細書に記載する任意のＡＧＬポリペプチドである。一部の実施形態において、本明細書に開示する方法において使用するための内在化モイエティは、本明細書に開示する任意の内在化モイエティである。一部の実施形態において、前記内在化モイエティは、本明細書に開示する任意の抗体または抗原結合断片である。
【００２９】
別の態様において、本開示は、本開示は、キメラポリペプチドを肝細胞に送達する方法であって、肝細胞を（ｉ）ＡＧＬポリペプチドまたはその機能性断片と（ｉｉ）内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドと接触させるステップを含み；前記キメラポリペプチドが、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する、方法を提供する。一部の実施形態において、本明細書に開示する方法において使用するためのキメラポリペプチドのＡＧＬポリペプチドは、本明細書に記載する任意のＡＧＬポリペプチドである。一部の実施形態において、本明細書に開示する方法において使用するための内在化モイエティは、本明細書に記載する任意の内在化モイエティである。一部の実施形態において、前記内在化モイエティは、本明細書に開示する任意の抗体または抗原結合断片である。
【００３０】
別の態様において、本開示は、筋肉細胞のアミログルコシダーゼ（ＡＧＬ）酵素活性を増加させる方法であって、筋肉細胞を（ｉ）ＡＧＬポリペプチドと（ｉｉ）内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドと接触させるステップを含み；前記内在化モイエティが、細胞への前記キメラポリペプチドの輸送を促進し；および前記キメラポリペプチドが、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する、方法を提供する。一部の実施形態において、本明細書に開示する方法において使用するためのキメラポリペプチドのＡＧＬポリペプチドは、本明細書に記載する任意のＡＧＬポリペプチドである。一部の実施形態において、本明細書に開示する方法において使用するための内在化モイエティは、本明細書に記載する任意の内在化モイエティである。一部の実施形態において、前記内在化モイエティは、本明細書に開示する任意の抗体または抗原結合断片である。
【００３１】
別の実施形態において、本開示は、肝細胞のアミログルコシダーゼ（ＡＧＬ）酵素活性を増加させる方法であって、肝細胞を（ｉ）ＡＧＬポリペプチドまたはその機能性断片と（ｉｉ）内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドと接触させるステップを含み；前記キメラポリペプチドが、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する、方法を提供する。一部の実施形態において、本明細書に開示する方法において使用するためのキメラポリペプチドのＡＧＬポリペプチドは、本明細書に記載する任意のＡＧＬポリペプチドである。一部の実施形態において、本明細書に開示する方法において使用するための内在化モイエティは、本明細書に記載する任意の内在化モイエティである。一部の実施形態において、前記内在化モイエティは、本明細書に開示する任意の抗体または抗原結合断片である。
【００３２】
上述のいずれについても、ある一定の実施形態において、本開示のＡＧＬキメラポリペプチドの投与、例えば、細胞またはそれを必要とする被験体への投与は、フォーブス・コリ病の処置（フォーブス・コリ病の１つ以上の症状の改善）に有用であり得る。一部の実施形態において、ＡＧＬキメラポリペプチドの投与は、次の効果（ａｆｆｅｃｔｓ）のうちのいずれか１つ以上を有することがある：細胞の細胞質へのグリコーゲンの蓄積を減少させる；筋肉細胞の細胞質へのグリコーゲンの蓄積を減少させる；肝臓の細胞質へのグリコーゲンの蓄積を減少させる；上昇したアラニントランスアミナーゼレベル（例えば、上昇した血清中レベル）を低下させる；上昇したアスパラギン酸トランスアミナーゼレベル（例えば、上昇した血清中レベル）を低下させる；上昇したアルカリホスファターゼレベル（例えば、上昇した血清中レベル）を低下させる；および／または上昇したクレアチンホスホキナーゼレベル（例えば、上昇した血清中レベル）を低下させる。上に記載してまたは本明細書に記載する任意のＡＧＬキメラポリペプチドを、本明細書に記載する任意の方法で使用してよいことに留意すべきである。
【００３３】
別の態様において、本開示は、フォーブス・コリ病の処置を、それを必要とする被験体において行う方法であって、細胞を（ｉ）成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）細胞への送達を促進する内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドと接触させるステップを含み；前記キメラポリペプチドが、酸性α−グルコシダーゼ活性を有し；および前記キメラポリペプチドが、約１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まない（例えば、ＧＡＡ前駆体ポリペプチドの残基１−２７または１−５６を含まない）、方法を提供する。かかるキメラポリペプチドの使用を、本明細書では、本開示のＧＡＡキメラポリペプチドの使用と呼ぶことがある。同様に、かかるポリペプチドを本開示のＧＡＡキメラポリペプチドと呼ぶことがある。
【００３４】
別の態様において、本開示は、フォーブス・コリ病患者の細胞の細胞質へのグリコーゲン蓄積を減少させる方法であって、筋肉細胞を（ｉ）成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）細胞の細胞質への輸送を促進する内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドと接触させるステップを含み；前記キメラポリペプチドが、酸性α−グルコシダーゼ活性を有し；および前記キメラポリペプチドが、約１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まない、方法を提供する。
【００３５】
別の態様において、本開示は、細胞の細胞質のＧＡＡ活性を増加させる方法であって、（ｉ）成熟酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドと（ｉｉ）細胞の細胞質への輸送を促進する内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドを送達するステップを含み；前記キメラポリペプチドが、酸性α−グルコシダーゼ活性を有し；および前記キメラポリペプチドが、約１１０キロダルトンのＧＡＡ前駆体ポリペプチドを含まない、方法を提供する。一部の実施形態において、前記細胞は、被験体におけるものであり、前記被験体はフォーブス・コリ病を有し、および細前記胞を接触させるステップが、送達経路による前記ＧＡＡキメラポリペプチドの患者への投与を含む。一部の実施形態において、前記それを必要とする被験体は、前記キメラポリペプチドでの処置開始前に病的細胞質グリコーゲン蓄積を有する被験体である。一部の実施形態において、前記方法は、インビトロ法であり、細胞は、培養細胞である。一部の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドは、約７０〜７６キロダルトンの分子量を有する。一部の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドは、配列番号４の残基１２２−７８２または配列番号５の残基２０４−７８２から選択されるアミノ酸配列から成る。一部の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドは、約７０〜７６キロダルトンの分子量を有する。一部の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドは、約７０キロダルトンの分子量を有する。一部の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドは、約７６キロダルトンの分子量を有する。一部の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドは、グリコシル化されている。他の実施形態において、前記ＧＡＡポリペプチドは、グリコシル化されていない。一部の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドは、天然に存在するヒトＧＡＡのものとは異なるグリコシル化パターンを有する。
【００３６】
一部の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドを含むキメラポリペプチドは、細胞質グリコーゲン蓄積を低減させる。
【００３７】
一部の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドを含むキメラポリペプチドは、本明細書に開示する任意の内在化モイエティを含む。一部の実施形態において、前記融合タンパク質は、リンカーを含む。一部の実施形態において、前記結合体は、リンカーを含む。一部の実施形態において、前記リンカーは、前記ＡＧＬポリペプチドを前記内在化モイエティに結合体化または連結させる。一部の実施形態において、前記結合体は、リンカーを含まず、前記ＡＧＬポリペプチドは、前記内在化モイエティに直接結合体化または連結されている。一部の実施形態において、前記リンカーは、切断可能リンカーである。
【００３８】
本明細書に開示するキメラポリペプチド（例えば、ＡＧＬキメラポリペプチドまたはＧＡＡキメラポリペプチド）のいずれかを被験体、例えばフォーブス・コリ病患者に投与するための本明細書に開示する任意の方法の一部の実施形態では、前記キメラポリペプチドを、薬学的に許容され得る担体を用いて製剤化する。一部の実施形態では、前記キメラポリペプチドを全身投与する。一部の実施形態では、前記キメラポリペプチドを局所投与する。一部の実施形態において、局所投与は、肝門脈経由での投与を含む。一部の実施形態では、前記キメラポリペプチドを静脈内投与する。
【００３９】
別の態様において、本開示は、ＧＡＡキメラポリペプチド、例えば、フォーブス・コリ病を処置する際の使用について記載した任意のＧＡＡキメラポリペプチドを提供する。ある一定の実施形態において、ＧＡＡキメラポリペプチドの投与は、次の効果（ａｆｆｅｃｔｓ）のうちのいずれか１つ以上を有することがある：細胞の細胞質へのグリコーゲンの蓄積を減少させる；筋肉細胞の細胞質へのグリコーゲンの蓄積を減少させる；肝臓の細胞質へのグリコーゲンの蓄積を減少させる；上昇したアラニントランスアミナーゼレベル（例えば、上昇した血清中レベル）を低下させる；上昇したアスパラギン酸トランスアミナーゼレベル（例えば、上昇した血清中レベル）を低下させる；上昇したアルカリホスファターゼレベル（例えば、上昇した血清中レベル）を低下させる；および／または上昇したクレアチンホスホキナーゼレベル（例えば、上昇した血清中レベル）を低下させる。上に記載してまたは本明細書に記載する任意のＧＡＡキメラポリペプチドを、本明細書に記載する任意の方法で使用してよいことに留意すべきである。
【００４０】
本開示は、上で詳述した本開示の態様および実施形態のいずれか１つ以上を互いに、および／または下で開示する特徴のいずれかと、組み合わせることができることを企図している。さらに、下で説明する本開示の特徴のいずれか１つ以上を組み合わせてもよい。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
グリコーゲン脱分枝酵素（遺伝子、ＡＧＬ）アミログルコシダーゼ（ＡＧＬ）は、２つの独立した触媒活性、すなわち、オリゴ−１，４−１，４−グルコトランスフェラーゼ活性およびアミロ−１，６−グルコシダーゼ活性を有する二機能性酵素である。これらの独立した触媒活性は、同じポリペプチド鎖上の別々の位置で発生する。ＡＧＬは、１６０〜１７５ｋＤａの分子質量を有する大きい単量体タンパク質である。例えば、Ｓｈｅｎら、２００２、Ｃｕｒｒ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、２：１６７−１７５；およびＣｈｅｎ、１９８７、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、４１（６）：１００２−１５を参照されたい。ＡＧＬの６つの異なるｍＲＮＡ転写変異体がヒトには存在し、それらは、３つの異なるＡＧＬアイソフォームをコードする。これらの転写変異体は、それらの５’非翻訳領域および組織分布が異なる。ＡＧＬ転写変異体１（配列番号１７）は、（肝臓および筋肉を含む）検査したあらゆる組織タイプにおいて発現され、そして転写変異体２〜４（配列番号１８〜２０）は、骨格筋および心臓において特異的に発現される。転写変異体５および６（配列番号２１〜２２）は、より少ないアイソフォームである。例えば、Ｓｈｅｎら、２００２、Ｃｕｒｒ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、２：１６７−１７５を参照されたい。ＡＧＬ転写変異体１〜４は、ＡＧＬアイソフォーム１（配列番号１）をコードし、ＡＧＬ転写変異体５は、ＡＧＬアイソフォーム２（配列番号２）をコードし、およびＡＧＬ転写変異体６は、ＡＧＬアイソフォーム３（配列番号３）をコードする。
【００４２】
酸性α−グルコシダーゼ酵素（ＧＡＡ）は、リソソームにおけるグリコーゲンのグルコースへの分解に不可欠な酵素である。ＧＡＡのいくつかのアイソフォームが存在する（例えば、配列番号４および５を参照されたい）。ＧＡＡ酵素は、触媒活性、未成熟１１０ｋＤａ前駆体として合成され、それがゴルジにおいてマンノース６−リン酸残基（Ｍ６Ｐ）の付加によりグリシル化および修飾される。例えば、Ｒａｂｅｎら、２００６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１、４８−５６を参照されたい。
【００４３】
フォーブス・コリ病は、ＡＧＬ遺伝子の突然変異によって引き起こされる。ＡＧＬ遺伝子はＡＧＬタンパク質をコードし、このＡＧＬタンパク質は、細胞質においてホスホリラーゼと協働してグリコーゲンを分解する。ＡＧＬタンパク質の２つの触媒活性は、トランスフェラーゼ活性（４α−グルコトランスフェラーゼ）およびグルコシダーゼ活性（アミロ−α１，６−グルコシダーゼ）である。グリコーゲンは、グルコース残基の高分枝ポリマーである。エネルギーを生産するために身体によりグリコーゲンが分解されると、グルコース分子がグリコーゲン鎖から除去される。機能性ＡＧＬの不存在下で起こるのだが、適正なグリコーゲン脱分枝ないと、グリコーゲンは、肝細胞および筋細胞をはじめとする体中の細胞に蓄積し始める。グリコーゲンの蓄積は、細胞に対して毒性であり得、蓄積されたグリコーゲンからの遊離グルコースの不存在は、細胞に対するエネルギー供給を低減させる結果となり得る。
【００４４】
理論により拘束されないが、本明細書に記載するＡＧＬキメラポリペプチドのフォーブス・コリ患者への投与は、その患者の失われたまたは低い内因性ＡＧＬタンパク質レベルを補充または補給することになり、それによって患者の細胞へのグリコーゲン蓄積に関連付けられる症状の一部またはすべてを緩和することになる。理論により拘束されないが、前記内在化モイエティは、フォーブス・コリ病患者の最も重度に罹患した組織、例えば筋肉または肝臓、の一部への送達を促進するのに役立つことになり、およびＡＧＬタンパク質をこれらの組織に送達して、これらの組織へのグリコーゲンのさらなる蓄積を逆転または防止するのに役立つことになる。加えて、肝臓および筋肉への高度なグリコーゲン沈着の結果の１つは、高いおよび漸増アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼおよびクレアチンホスホキナーゼレベル−特に血清中レベルである。本開示のＡＧＬキメラポリペプチドの投与は、前記患者において観察されるこれらの酵素の異常に高いレベルを低下させるために用いることができる。
【００４５】
最近の研究において、フォーブス・コリ細胞へのＧＡＡの投与がこれらの細胞中の総合グリコーゲンレベルの低減をもたらすことが実証された。米国特許出願公開第２０１１０１０４１８７号明細書を参照されたい。しかし、この研究において使用されたＧＡＡポリペプチドは、完全長、未成熟前駆体ＧＡＡポリペプチドであり、その完全長ＧＡＡポリペプチドの活性は、主としてリソソームに限られていた（米国特許出願公開第２０１１０１０４１８７号明細書を参照されたい）。加えて、成熟ＧＡＡポリペプチドは未成熟前駆体より活性であり、前駆体ＧＡＡと比較して向上されたグリコーゲンクリアランスを促進することが、その後、実証された（Ｂｉｊｖｏｅｔら、１９９８、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ、７（１１）：１８１５−２４）が、成熟形態のＧＡＡは、細胞によってあまり内在化されない（Ｂｉｊｖｏｅｔら、１９９８）。加えて、成熟ＧＡＡは、より低いｐＨで最適な活性を有するリソソームタンパク質でありながら、成熟ＧＡＡは、中性ｐＨ（すなわち、細胞質のｐＨ）で約４０％活性を保持する（Ｍａｒｔｉｎ−Ｔｏｕａｕｘら、２００２、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ、１１（１４）：１６３７−４５）。本開示まで、より活性の高い成熟ＧＡＡポリペプチドをフォーブス・コリ患者に、その成熟ＧＡＡがそれを最も必要とする組織および区画、例えば、筋肉および肝臓細胞の細胞質に到達することになるように投与する方法についてのガイダンスは、当該技術分野にはなかった。成熟ＧＡＡと内在化モイエティとを含む本明細書に開示する任意のキメラポリペプチドの患者への投与は、成熟ＧＡＡを筋肉および肝臓などの組織に確実に到達させること、および成熟ＧＡＡ活性がリソソームに限定されないことを保証するだろう。理論により拘束されないが、投与された成熟ＧＡＡポリペプチドは、フォーブス・コリ患者における失われたまたは低減されたレベルのＡＧＬタンパク質のグルコシダーゼ活性を補充することになり、それによってその患者の細胞へのグリコーゲン蓄積に関連付けられる症状の一部またはすべてを緩和することになる。例えば、肝臓および筋肉への高度なグリコーゲン沈着の結果の１つは、高いおよび漸増アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼおよびクレアチンホスホキナーゼレベル−特に血清中レベルである。本開示のＧＡＡキメラポリペプチドの投与は、前記患者において観察されるこれらの酵素の１つ以上についての異常に高いレベルを低下させるために用いることができる。本明細書中で詳述するように、これらの上昇した酵素レベルのかかる低減は、本開示のＡＧＬキメラポリペプチドの投与後にも低減され得る。
【００４６】
ある一定の態様において、本開示は、フォーブス・コリ病の際の起こるものなどの異常グリコーゲンの異常な堆積に関連付けられる状態を処置するための成熟ＧＡＡまたはＡＧＬタンパク質の使用を提供する。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書ではアミノ酸残基のポリマーを指すために交換可能に用いている。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーばかりでなく、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的ミメティックであるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００４７】
ある一定の実施形態において、本開示は、（ｉ）ＡＧＬポリペプチド（例えば、ＡＧＬポリペプチドもしくはその機能性断片）または成熟ＧＡＡポリペプチド（例えば、成熟ＧＡＡポリペプチドまたはその機能的断片）と（ｉｉ）肝臓および／または筋肉細胞への送達を促進する内在化モイエティとを含むキメラポリペプチドを提供する。本開示のＡＧＬキメラポリペプチドを、本明細書に記載する任意の方法で使用してよい。本開示のＧＡＡキメラポリペプチドを、本明細書に記載する任意の方法で使用してよい。さらに、かかるＡＧＬまたはＧＡＡキメラポリペプチドを、本明細書に記載するように、適切に製剤化し、任意の適切な投与経路によって送達してよい。
【００４８】
Ｉ．ＡＧＬポリペプチド
本明細書において用いる場合、ＡＧＬポリペプチドは、野生型ＡＧＬポリペプチドの様々な機能性断片および変異体、融合タンパク質、ならびに修飾形態を含む。ＡＧＬポリペプチドのかかる機能性断片または変異体、融合タンパク質、および修飾形態は、ネイティブＡＧＬタンパク質と実質的配列同一性のアミノ酸配列の少なくとも一部分を有し、ネイティブＡＧＬタンパク質の機能を保持する（例えば、ネイティブＡＧＬの２つの酵素活性を保持する）。「機能を保持する」は、特定の断片の活性がそのネイティブタンパク質のものと同一または実質的に同一でなければならないことを、一部の実施形態では意味することもあるが、意味しないことに留意すべきである。しかし、ネイティブ活性を保持するために、そのネイティブ活性は、同じまたは同様の条件下で比較を行って、かかる活性を比較しているネイティブタンパク質のものの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％であるべきである。一部の実施形態において、ネイティブ活性の保持は、断片または変異体が、同じまたは同様の条件下で比較を行って、かかる活性を比較しているネイティブタンパク質に対して改善された活性、例えば、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％または少なくとも１２５％の活性を有するシナリオを含むことがある。
【００４９】
ある一定の実施形態において、ＡＧＬポリペプチドの機能性断片、変異体または融合タンパク質は、ＡＧＬポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一（例えば、配列番号１〜３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む。
【００５０】
ある一定の実施形態において、本開示のキメラポリペプチドおよび方法において使用するためのＡＧＬポリペプチドは、完全長または実質的完全長ＡＧＬポリペプチドである。ある一定の実施形態において、本開示のキメラポリペプチドおよび方法において使用するためのＡＧＬポリペプチドは、アミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有する機能性断片である。
【００５１】
ある一定の実施形態において、前記ＡＧＬポリペプチドの断片または変異体は、ＡＧＬポリペプチドをコードする核酸の対応する断片から組換え生産されたポリペプチドをスクリーニングすることによって得ることができる。加えて、当該技術分野において公知の技術、例えば、従来のメリーフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃケミストリー用いて、断片または変異体を化学合成することができる。断片または変異体を（組換えによりまたは化学合成によって）生産し、試験して、例えば、フォーブス・コリ病をインビボで処置するそれらの能力を試験することにより、および／またはその断片または変異体がアミロ−１，６−グルコシダーゼ活性および４−α−グルコトランスフェラーゼ活性を有することをインビトロで（例えば、無細胞もしくは細胞ベースのアッセイで）確認することにより、ネイティブＡＧＬタンパク質として機能することができる断片または変異体を同定することができる。本明細書に開示するＡＧＬポリペプチドの活性を試験するためのインビトロアッセイの例は、フォーブス・コリ細胞をＡＧＬ含有キメラポリペプチドでまたはなしで処置し、その後、インキュベーション期間の後、例えば過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染料を使用することにより、グリコーゲンの存在について細胞を染色することであろう。
【００５２】
ある一定の実施形態において、本開示は、治療もしくは予防有効度または安定性（例えば、エクスビボ保存可能期間、およびインビボでのタンパク質分解に対する耐性）を向上させることなどを目的としてＡＧＬポリペプチドの構造を修飾することも企図している。修飾ポリペプチドは、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加によって生産することができる。例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンでの、アスパラギン酸塩のグルタミン酸塩での、トレオニンのセリンでの孤立した置換、またはアミノ酸の構造的関連性のあるアミノ酸での同様の置換（例えば、保存的突然変異）が、結果として得られる分子のＡＧＬ生物学的活性に対して大きな影響を及ぼさないことを例えば予想することは、理に適っている。保存的置換は、それらの側鎖において関連性のあるアミノ酸のファミリー内で起こるものである。
【００５３】
本開示は、ＡＧＬポリペプチドのコンビナトリアル突然変異体（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｍｕｔａｎｔｓ）のセットの生成、ならびにトランケーション突然変異体の生成もさらに企図しており、機能性変異体配列の同定に特に有用である。天然に存在するＡＧＬポリペプチドに対して選択的効力（ｓｅｌｅｃｒｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｃｙ）を有するコンビナトリアル誘導変異体（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｌｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖａｒｉａｎｔ）を生成することができる。同様に、突然変異誘発は、対応する野生型ＡＧＬポリペプチドとは劇的に異なる細胞内半減期を有する変異体を生じさせることができる。例えば、ＡＧＬの破壊または別様の不活性化をもたらすタンパク質分解または他の細胞プロセスに対して、変性タンパク質をより安定にまたはより不安定にさせることができる。かかる変異体を利用して、それらの半減期を調節することによりＡＧＬポリペプチドレベルを変えることができる。可能性のあるＡＧＬ変異体の配列のライブラリーを、例えば縮重オリゴヌクレオチド配列から、生成することができる多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成装置で行い、その後、合成遺伝子を発現のために適切な遺伝子にライゲートすることができる。縮重遺伝子セットの目的は、可能性のあるポリペプチド配列の所望のセットをコードする配列すべてを１つの混合物で提供することである。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，ＳＡ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８１）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ、Ｐｒｏｃ．３ｒｄ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｓｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ＡＧ  Ｗａｌｔｏｎ編、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ｐｐ．２７３−２８９；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅら、（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照されたい）。かかる技術は、他のタンパク質の定方向進化に活用されている（例えば、Ｓｃｏｔｔら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓら、（１９９２）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：２４２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら、（１９９０）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：６３７８−６３８２；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，１９８，３４６号および同第５，０９６，８１５号明細書を参照されたい）。
【００５４】
あるいは、他の形態の突然変異誘発を利用してコンビナトリアルライブラリーを生成することができる。例えば、ＡＧＬポリペプチド変異体を生成し、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発などを用いるスクリーニング（Ｒｕｆら、（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１５６５−１５７２；Ｗａｎｇら、（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３０９５−３０９９；Ｂａｌｉｎｔら、（１９９３）Ｇｅｎｅ  １３７：１０９−１１８；Ｇｒｏｄｂｅｒｇら、（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：５９７−６０１；Ｎａｇａｓｈｉｍａら、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２８８８−２８９２；Ｌｏｗｍａｎら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３８；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍら、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）によって、リンカースキャニング突然変異誘発（Ｇｕｓｔｉｎら、（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９３：６５３−６６０；Ｂｒｏｗｎら、（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：２６４４−２６５２；ＭｃＫｎｉｇｈｔら、（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３１６）によって、飽和突然変異誘発（Ｍｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：６１３）によって、ＰＣＲ突然変異誘発（Ｌｅｕｎｇら、（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １：１１−１９）によって、または化学的突然変異誘発などを含むランダム突然変異誘発（Ｍｉｌｌｅｒら、（１９９２）Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；およびＧｒｅｅｎｅｒら、（１９９４）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７：３２−３４）によって、ライブラリーから単離することができる。特にコンビナトリアル設定での、リンカースキャニング突然変異誘発は、トランケート（生物活性）形態のＡＧＬポリペプチドの魅力的な同定方法である。
【００５５】
点突然変異およびトランケーションによって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、ついでに言えば、ある一定の特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための広範な技術が当該技術分野において公知である。かかる技術は、一般に、ＡＧＬポリペプチドのコンビナトリアル突然変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適応させることができるであろう。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広範に用いられている技術は、遺伝子ライブラリーを複製可能発現ベクターにクローニングするステップ、得られたベクターライブラリーで適切な細胞を形質転換させるステップ、および所望の活性の検出が、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を助長する条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させるステップを典型的に含む。下で説明する実例となるアッセイの各々は、コンビナトリアル突然変異誘発技術によって作り出された多数の縮重配列をスクリーニングするために必要に応じて高スループット解析に適用できる。
【００５６】
ある一定の実施形態において、ＡＧＬポリペプチドは、ペプチドミメティックを含むことがある。本明細書において用いる場合、「ペプチドミメティック」は、天然に存在しないアミノ酸、ペプトイドなどを含有する化学修飾ペプチドおよびペプチド様分子を含む。ペプチドミメティックは、被験体に投与されたとき、向上された安定性をはじめとするペプチドに対する様々な利点を提供する。ペプチドミメティックを同定するための方法は当該技術分野において周知であり、可能性のあるペプチドミメティックのライブラリーを収録しているデータベースのスクリーニングを含む。例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄａｔａｂｅｓｅは、結晶構造が判っている３００，０００を超える化合物のコレクションを収録している（Ａｌｌｅｎら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｂ、３５：２３３１（１９７９））。標的分子の結晶構造を入手できない場合、例えば、プログラムＣＯＮＣＯＲＤ（Ｒｕｓｉｎｋｏら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．２９：２５１（１９８９））を使用して構造を作成することができる。もう１つのデータベース、Ａｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ  Ｃａｌｉｆ．）は、市販されている約１００，０００の化合物を収録しており、このデータベースを検索して、ＡＧＬポリペプチドについての可能性のあるペプチドミメティックを同定することもできる。
【００５７】
ある一定の実施形態において、ＡＧＬポリペプチドは、翻訳後修飾をさらに含むことがある。例示的翻訳後タンパク質修飾としては、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰ−リボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、カルボニル化、スモイル化、ビオチン化またはポリペプチド側鎖のまたは疎水性基の付加が挙げられる。結果として、修飾されたＡＧＬポリペプチドは、非アミノ酸要素、例えば、脂質、多糖類または単糖類、およびホスフェートを含有することがある。ＡＧＬポリペプチドの官能性に対するかかる非アミノ酸要素の影響をその生物学的活性について、例えば、グリコーゲンを加水分解するまたはフォーブス・コリ病を処置するその能力について試験してもよい。ある一定の実施形態において、前記ＡＧＬポリペプチドは、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、および／または精製のうちの１つ以上を向上させる１つ以上のポリペプチド部分をさらに含むことがある。他の実施形態において、前記内在化モイエティは、抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００５８】
一部の実施形態において、ＡＧＬポリペプチドは、Ｎ−グリコシル化されないか、または野生型ＡＧＬポリペプチド中に存在するＮ−グリコシル化基の１つ以上を欠く。例えば、本開示において使用するためのＡＧＬポリペプチドは、ネイティブＡＧＬに比べて、すべてのＮ−グリコシル化部位を欠くこともあり、または本開示において使用するためのＡＧＬポリペプチドは、ネイティブＡＧＬに比べて、グリコシル化不十分であることもある。一部の実施形態において、ＡＧＬポリペプチドは、１つ以上のＮ−グリコシル化部位でＮ−グリコシル化を受けることができない修飾アミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＡＧＬポリペプチドにおいて少なくとも１つの予測Ｎ−グリコシル化部位（すなわち、アミノ酸配列Ａｓｎ−Ｘａａ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒによって表されるコンセンサス配列）のアスパラギン（Ａｓｎ）は、別のアミノ酸によって置換されている。ＡＧＬアミノ酸配列におけるＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ配列伸長の例としては、配列番号１のアミノ酸位置８１３−８１５、８３９−８４１、９２７−９２９、および１０３２−１０３４に対応するアミノ酸が挙げられる。ＡＧＬアミノ酸配列におけるＡｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ配列伸長の例としては、アミノ酸位置６９−７１、２１９−２２１、７９７−７９９、１２３６−１２３８、および１３８０−１３８２に対応するアミノ酸が挙げられる。一部の実施形態において、配列番号１のアミノ酸位置６９、２１９、７９７、８１３、８３９、９２７、１０３２、１２３６および１３８０に対応するアミノ酸位置のいずれか１つまたは組み合わせにあるアスパラギンは、置換または欠失されている。一部の実施形態において、配列番号１のアミノ酸位置８１５、８４１、９２９および１０３４に対応するアミノ酸位置のいずれか１つまたは組み合わせにあるセリンは、置換または欠失されている。一部の実施形態において、配列番号１のアミノ酸位置７１、２２１、７９９、１２３８および１３８２に対応するアミノ酸位置のいずれか１つまたは組み合わせにあるトレオニンは、置換または欠失されている。一部の実施形態において、配列番号１のアミノ酸位置２２０、７９８、８１４、８４０、９２８、１０３３、１２３７および１３８１のいずれか１つまたは組み合わせに対応するアミノ酸位置に存在するＸａａアミノ酸は、欠失されているか、プロリンで置換されている。本開示は、本開示のＡＧＬポリペプチドが１つ以上のＮ−グリコシル化部位を欠き、したがって、グリコシル化されないか、またはネイティブＡＧＬに比べてグリコシル化不足であるように、上述の例のいずれか１つ以上を組み合わせることができることを企図している。
【００５９】
一部の実施形態において、ＡＧＬポリペプチドは、Ｏ−グリコシル化されないか、または野生型ＡＧＬポリペプチド中に存在するＯ−グリコシル化基の１つ以上を欠く。一部の実施形態において、ＡＧＬポリペプチドは、１つ以上のＯ−グリコシル化部位でＯ−グリコシル化を受けることができない修飾アミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＡＧＬポリペプチド配列中のいずれか１つ以上の予測Ｏ−グリコシル化部位のセリンまたはトレオニンは、置換または欠失されている。本開示は、本開示のＡＧＬポリペプチドが１つ以上のＮ−グリコシル化および／またはＯ−グリコシル化部位を欠き、したがって、グリコシル化されないか、またはネイティブＡＧＬに比べてグリコシル化不足であるように、上述の例のいずれか１つ以上を組み合わせることができることを企図している。
【００６０】
本開示の１つの特定の実施形態において、ＡＧＬポリペプチドは、非タンパク質様ポリマーで修飾されていることがある。１つの特定の実施形態において、前記ポリマーは、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号明細書に示されているように、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンである。ＰＥＧは周知の水溶性ポリマーであり、このポリマーは、市販されており、または当該技術分野において周知の方法に従ってエチレングリコールの開環重合によって調製することができる（Ｓａｎｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｏ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第３巻、１３８−１６１頁）。
【００６１】
用語「生物学的活性」、「生物活性」または「機能性の」は、例えばオリゴ−１，４−１，４−グルコトランスフェラーゼ活性および／またはアミロ−１，６−グルコシダーゼ活性を有する、野生型ＡＧＬタンパク質に随伴する機能を行うＡＧＬタンパク質の能力を意味する。用語「生物学的活性」、「生物活性」および「機能性の」を本明細書では交換可能に用いている。本明細書において用いる場合、「断片」は、本明細書に記載するような「生物活性」を呈示する生物活性断片（機能性断片とも呼ばれる）または生物活性変異体を含むと解される。すなわち、ＡＧＬの生物活性断片または変異体は、測定および試験することができる生物活性を呈示する。例えば、生物活性断片／機能性断片または変異体は、ネイティブ（すなわち、野生型、または正常な）ＡＧＬタンパク質と同じまたは実質的に同じ生物活性を呈示し、かかる生物活性は、例えばＡＧＬ断片のまたは変異体の４−α−グルコトランスフェラーゼ活性および／またはアミロ−１，６−グルコシダーゼ活性によってグリコーゲンを脱分枝する、その断片または変異体の能力によって評定することができる。本明細書において用いる場合、「実質的に同じ」は、対照（これに対してパラメータを測定する）の少なくとも７０％である任意のパラメータ（例えば、活性）を指す。ある一定の実施形態において、「実質的に同じ」は、対照（これに対してパラメータを測定する）の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０２％、１０５％または１１０％である任意のパラメータ（例えば、活性）も指す。ある一定の実施形態において、前記ＡＧＬポリペプチドの断片または変異体は、同じまたは実質的に同じ条件下で評定したとき、ネイティブＡＧＬポリペプチドに随伴するＡＧＬ生物学的活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％を好ましくは保持することになる。
【００６２】
ある一定の実施形態において、前記ＡＧＬポリペプチドの断片または変異体は、そのネイティブタンパク質の半減期に比べて向上された半減期（ｔ１／２）を有する。好ましくは、ＡＧＬ断片または変異体の半減期は、ネイティブＡＧＬタンパク質の半減期に比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％、またはさらには１０００％向上される。一部の実施形態では、前記タンパク質半減期をインビトロで、例えば、緩衝食塩溶液中または血清中で判定する。他の実施形態において、前記タンパク質半減期は、インビボ半減期、例えば、動物の血清または他の体液中のタンパク質の半減期である。加えて、断片または変異体を当該技術分野において公知の技術、例えば、従来のメリーフィールド固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃケミストリーを用いて化学合成することができる。前記断片または変異体を（組換えによりまたは化学合成によって）生産し、試験して、ネイティブＡＧＬタンパク質と同程度にまたは実質的に同様に機能することができる断片または変異体を同定することができる。
【００６３】
細胞におけるＡＧＬ生物活性を増加させる方法に関して、本開示は、任意の上述の態様および実施形態のすべての組み合わせ、ならびに「発明を実施するための形態」および「実施例」で述べる任意の実施形態との組み合わせも企図している。キメラポリペプチドの投与または細胞とキメラポリペプチドの接触に基づく前記方法をインビトロで（例えば、細胞または培養で）行うことができ、またはインビボで（例えば、患者または動物モデルで）行うことができる。ある一定の実施形態において、前記方法は、インビトロ法である。ある一定の実施形態において、前記方法は、インビボ法である。
【００６４】
一部の態様において、本開示は、本明細書に記載の任意の上述のキメラポリペプチドの生産方法も提供する。さらに、本開示は、上述の方法および組成物の任意の数の組み合わせを企図している。
【００６５】
ある一定の態様において、ＡＧＬポリペプチドは、１つ以上の融合ドメインをさらに含む融合タンパク質であることもある。かかる融合ドメインの周知の例としては、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、および免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が挙げられるがこれらに限定されず、これらはアフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフィニティー精製を目的として、アフィニティークロマトグラフィーのための適切なマトリックス、例えば、グルタチオン結合樹脂、アミラーゼ結合樹脂、およびニッケル結合樹脂またはコバルト結合樹脂を使用する。融合ドメインは「エピトープタグ」も含み、エピトープタグは、通常、特異的抗体が利用可能である短鎖ペプチド配列である。特異的モノクローナル抗体が容易に利用可能である周知エピトープタグとしては、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）、Ｈｉｓ、およびｃ−ｍｙｃタグが挙げられる。例示的Ｈｉｓタグは、配列ＨＨＨＨＨＨ（配列番号２３）を有し、例示的ｃ−ｍｙｃタグは、配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号２４）を有する。場合によっては、前記融合ドメインは、適切なプロテアーゼに融合タンパク質を部分的に消化させ、それによってそれらから組換えタンパク質を遊離させるプロテアーゼ切断部位、例えば、第Ｘａ因子またはトロンビンについてのプロテアーゼ切断部位を有する。その後、遊離されたタンパク質を後続のクロマトグラフィー分離によって融合ドメインから単離することができる。ある一定の実施形態において、前記ＡＧＬポリペプチドは、それらのポリペプチドを安定化することが可能である１つ以上の修飾を含むことがある。例えば、かかる修飾は、前記ポリペプチドのインビトロ半減期を向上させるか、前記ポリペプチドの循環半減期を向上させるか、または前記ポリペプチドのタンパク質分解を低減させる。
【００６６】
一部の実施形態において、ＡＧＬタンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ領域との融合タンパク質であることもある。公知であるように、各免疫グロブリン重鎖定常領域は、４または５つのドメインを含む。これらのドメインは、次のように順次名づけられる：ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４）。前記重鎖ドメインのＤＮＡ配列は、免疫グロブリンクラスの間で交差相同性を有し、例えば、ＩｇＧのＣＨ２ドメインは、ＩｇＡおよびＩｇＤのＣＨ２ドメインと相同であり、かつＩｇＭおよびＩｇＥのＣＨ３ドメインと相同である。本明細書において用いる場合、用語「免疫グロブリンＦｃ領域」は、免疫グロブリン鎖定常領域の、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常領域の、またはその一部分の、カルボキシル末端部分を意味すると解される。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、または５）２つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域の組み合わせを含むことがある。好ましい実施形態において、免疫グロブリンＦｃ領域は、少なくとも免疫グロブリンヒンジ領域ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、かつ好ましくはＣＨ１ドメインを欠く。１つの実施形態において、重鎖定常領域が由来する免疫グロブリンのクラスは、ＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１、２、３または４）である。免疫グロブリンの他のクラス、ＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）およびＩｇＭ（Ｉｇμ）を用いてもよい。適切な免疫グロブリン重鎖定常領域の選択は、米国特許第５，５４１，０８７号および同第５，７２６，０４４号明細書において詳細に論じされている。特定の結果を達成するための、ある一定の免疫グロブリンクラスおよびサブクラスからの特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列の選択は、当該技術分野における技術レベルの範囲内であると考えられる。免疫グロブリンＦｃ領域をコードするＤＮＡ構築物の部分は、好ましくはヒンジドメインの少なくとも一部分、および好ましくはＦｃγのＣＨ３ドメインまたはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥもしくはＩｇＭのうちのいずれかにおける相同ドメインの少なくとも一部分を含む。さらに、免疫グロブリン重鎖定常領域内のアミノ酸の置換または欠失が本発明の実施の際に有用であり得ると考えられる。一例は、Ｆｃ受容体に対する親和性が低減されたＦｃ変異体を生じさせるようなアミノ酸置換の上方ＣＨ２領域への導入であろう（Ｃｏｌｅら（１９９７）Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．１５９：３６１３）。通常の当業者は、周知の分子生物学技術を用いてかかる構築物を調製することができる。
【００６７】
上述のいずれかについてのある一定の実施形態において、本開示のキメラポリペプチドのＡＧＬ部分は、ＡＧＬポリペプチドを含み、このＡＧＬポリペプチドは、ある一定の実施形態では、ＡＧＬポリペプチドの機能性断片であってもよく、または実質的完全長ＡＧＬポリペプチドであってもよい。一部の実施形態において、前記ＡＧＬポリペプチドは、最Ｎ末端アミノ酸位置のメチオニンを欠く（すなわち、配列番号１〜３のいずれか１つの第一のアミノ酸のメチオニンを欠く）。本開示のキメラポリペプチドにおける使用に適するＡＧＬポリペプチドおよび方法は、インビトロまたはインビボで評価して、オリゴ−１，４−１，４−グルコトランスフェラーゼ活性およびアミロ−１，６−グルコシダーゼ活性を有する。例示的機能性断片は、完全長ＡＧＬポリペプチド（例えば、配列番号１〜３）の少なくとも５００、少なくとも５２５、少なくとも５５０、少なくとも５７５、少なくとも６００、少なくとも６２５、少なくとも６５０、少なくとも６７５、少なくとも７００、少なくとも７２５、少なくとも７５０、少なくとも７７５、少なくとも８００、少なくとも８２５、少なくとも８５０、少なくとも８７５、少なくとも９００、少なくとも９２５、少なくとも９２５、少なくとも９５０、少なくとも９７５、少なくとも１０００、少なくとも１０２５、少なくとも１０５０、少なくとも１０７５、少なくとも１１００、少なくとも１１２５、少なくとも１１５０、少なくとも１１７５、少なくとも１２００、少なくとも１２２５、少なくとも１２５０、少なくとも１２７５、少なくとも１３００、少なくとも１３２５、少なくとも１３５０、少なくとも１３７５、少なくとも１４００、少なくとも１４２５、少なくとも１４５０、少なくとも１４７５、少なくとも１５００、少なくとも１５２５または少なくとも１５３２アミノの連続したアミノ酸残基を含む。一部の実施形態において、前記機能性断片は、完全長ＡＧＬポリペプチド（例えば、配列番号１〜３）の連続する５００〜７５０、５００〜１０００、５００〜１２００、５００〜１３００、５００〜１５００、１０００〜１１００、１０００〜１２００、１０００〜１３００、１０００〜１４００、１０００〜１５００、１０００〜１５３２のアミノ酸を含む。同様に、ある一定の実施形態において、本開示は、ＡＧＬ部分が任意の上述のＡＧＬポリペプチドまたは生物活性断片の変異体である、キメラタンパク質を企図している。例示的変異体は、ネイティブＡＧＬポリペプチドまたはその機能性断片のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有し、かかる変異体は、そのＡＧＬ変異体のオリゴ−１，４−１，４−グルコトランスフェラーゼ活性およびアミロ−１，６−グルコシダーゼ活性によってグリコーゲンを脱分枝する能力を保持する。本開示は、ＡＧＬ部分が、本明細書に記載するＡＧＬポリペプチド、断片または変異体のいずれかを本明細書に記載する任意の内在化モイエティとの組み合わせで含む、キメラポリペプチドおよびかかるポリペプチドの使用を企図している。さらに、ある一定の実施形態において、任意の上述のキメラポリペプチドのＡＧＬ部分は、ある一定の実施形態では、融合タンパク質であってよい。ＡＧＬ部分と内在化モイエティ部分の任意の組み合わせを含み、場合により１つ以上のリンカー、１つ以上のタグなどを含む任意のかかるキメラポリペプチドを、本開示の任意の方法で使用してよい。
【００６８】
ＩＩ．ＧＡＡポリペプチド
成熟ＧＡＡポリペプチドが、低ｐＨ（例えば、リソソーム様）条件でであろうと、中性ｐＨ（例えば、細胞質様）条件においてであろうと、前駆体成熟ＧＡＡと比較して向上されたグリコーゲンクリアランスを有する（例えば、成熟ＧＡＡのほうが活性が高い）ことは立証されている（Ｂｉｊｖｏｅｔら、１９９８、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ、７（１１）：１８１５−２４）。加えて、成熟ＧＡＡは、より低いｐＨで最適な活性を有するリソソームタンパク質でありながら、成熟ＧＡＡは、中性ｐＨ（すなわち、細胞質のｐＨ）で約４０％活性を保持する（Ｍａｒｔｉｎ−Ｔｏｕａｕｘら、２００２、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ、１１（１４）：１６３７−４５）。実際、中性ｐＨでの成熟ＧＡＡの低減された活性でさえ、内因性の低ｐＨ条件下で観察される未成熟ＧＡＡの活性よりまだ大きい。したがって、成熟ＧＡＡは、先行技術で遭遇する細胞質にタンパク質を送達する難しさに対処することができるのであれば、細胞質での使用に適している。本開示は、かかる困難を克服して成熟ＧＡＡを細胞質に送達するアプローチを提供する。
【００６９】
本明細書において用いる場合、成熟ＧＡＡポリペプチドは、当該タンパク質の変異体、および特に、成熟、活性形態（活性約７６ｋＤａもしくは約７０ｋＤａ形態または代替開始残基および／もしくは終了残基を有する類似の形態、総称して「成熟ＧＡＡ」）を含む。用語「成熟ＧＡＡ」は、内因的にプロセッシングされたとき、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約７０ｋＤａから約７６ｋＤａの見かけの分子量を有する未成熟ＧＡＡタンパク質の部分に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに上記の代替開始残基および／または終了残基を有する類似のポリペプチドも指す。用語「成熟ＧＡＡ」は、シグナル配列（配列番号４または５のアミノ酸１−２７）を欠くＧＡＡポリペプチドを指すこともある。例示的成熟ＧＡＡポリペプチドとしては、配列番号４もしくは５の残基１２２−７８２；配列番号４もしくは５の残基１２３−７８２；または配列番号４もしくは５の残基２０４−７８２を有するポリペプチドが挙げられる。用語「成熟ＧＡＡ」は、内因性成熟タンパク質と同じまたは実質的に同じ方法でグリコシル化される、およびそれ故、予測分子量と同じまたは同様である分子量を有する、ポリペプチドを含む。この用語は、グリコシル化されていないまたは過剰グリコシル化さているので同じ一次アミノ酸配列を含むにもかかわらず見かけの分子量が異なるポリペプチドも含む。成熟ＧＡＡポリペプチドのいずれのかかる変異体またはアイソフォーム、機能性断片または変異体、融合タンパク質および修飾形態も、ネイティブ成熟ＧＡＡタンパク質と実質的配列同一性のアミノ酸配列の少なくとも一部分を有し、酵素活性を保持する。ある一定の実施形態において、成熟ＧＡＡポリペプチドの機能性断片、変異体または融合タンパク質は、配列番号１５または１６の一方または両方に記載の成熟ＧＡＡポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列、あるいは配列番号４もしくは５の残基１２２−７８２；配列番号４もしくは５の残基１２３−７８２；または配列番号４もしくは５の残基２０４−７８２のうちの１つ以上に対応する成熟ＧＡＡポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００７０】
ある一定の特定の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、成熟ＧＡＡポリペプチドを含み、１１０ｋＤａ前駆形態のＧＡＡを含まない。したがって、かかるキメラポリペプチドは、未成熟前駆形態（すなわち、ヒトにおけるＧＡＡの１１０ｋＤａ前駆形態）をリソソームに指向させるアミノ末端配列を有さず、同じまたは同様の条件下で比較を行って（例えば、成熟ＧＡＡ−キメラポリペプチドを酸性または中性ｐＨ条件下で内因性ヒトＧＡＡと比較して）、約７６ｋＤａまたは約７０ｋＤａであるヒトＧＡＡの内因性形態の活性と同様または実質的に等価である活性を有する。例えば、前記成熟ＧＡＡは、グリコーゲン加水分解について１１０ｋＤａ前駆形態より７〜１０倍活性が高いことがある。前記成熟ＧＡＡポリペプチドは、ＧＡＡの７６ｋＤａまたは７０ｋＤａ形態であってもよく、または代替開始残基および／または終了残基を使用する類似の形態であってもよい。Ｍｏｒｅｌａｎｄら（Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ａｃｉｄ  α−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  Ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ  Ｆｏｕｒ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｐｒｏｃｅｓｓｓｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８０（８）：６７８０−６７９１、２００５）に述べられているように、ＧＡＡのプロセッシングされた形態について用いられる命名法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されるような見かけの分子質量に基づく。一部の実施形態において、成熟ＧＡＡは、通常は小胞体内でグリコシル化されるＮ末端部位を欠くことがある。例示的成熟ＧＡＡポリペプチドは、配列番号１５または配列番号１６を含む。さらなる例示的成熟ＧＡＡポリペプチドは、大体：配列番号４もしくは５の残基１２２−７８２；配列番号４もしくは５の残基１２３−７８２、例えば配列番号１５で示すもの；配列番号４もしくは５の残基２０４−７８２；配列番号４もしくは５の残基２０６−７８２；配列番号１６で示すような、配列番号４もしくは５の残基２８８−７８２に対応するアミノ酸配列を含むこと、またはから成ることがある。成熟ＧＡＡポリペプチドは、上に記載したＮ末端およびＣ末端残基も有することもある。
【００７１】
他の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドは、グリコシル化されていてもよいし、またはグリコシル化されていなくてもよい。グリコシル化されている成熟ＧＡＡポリペプチドについて、そのグリコシル化パターンは、天然に存在するヒトＧＡＡのものと同じであってもよく、または異なってもよい。最終成熟ＧＡＡ構築物において前駆体成熟ＧＡＡタンパク質上のグリコシル化部位の１つ以上が除去されていてもよい。
【００７２】
成熟ＧＡＡは、ウシ精巣、ラット肝臓、ブタ肝臓、ヒト肝臓、ウサギ筋肉、ヒト心臓、ヒト尿、およびヒト胎盤などの組織から単離されている。組換え技術を用いて、例えば、完全長ヒトＧＡＡを発現するベクターまたは成熟ＧＡＡを発現するベクターでチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をトランスフェクトすることによって、成熟ＧＡＡを生産してもよい。その後、Ｍｏｒｅｌａｎｄら（Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ａｃｉｄ  α−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  Ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ  Ｆｏｕｒ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｐｒｏｃｅｓｓｓｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８０（８）：６７８０−６７９１、２００５）によって記載されているように、一連の限外濾過、ダイアフィルトレーション、洗浄および溶離ステップを用いて、組換えヒトＧＡＡ（ｒｈＧＡＡ）または成熟ＧＡＡをＣＨＯ馴化培地から精製する。成熟ＧＡＡ画分を当該技術分野において公知の方法、例えば、アフィニティークロマトグラフィーおよびＳＤＳｐａｇｅに従って分離してもよい。
【００７３】
ある一定の実施形態において、成熟ＧＡＡ、または断片もしくは変異体は、ヒト成熟ＧＡＡである。
【００７４】
ある一定の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドの断片または変異体は、成熟ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸の対応する断片から組換え生産されたポリペプチドをスクリーニングすることによって得ることができる。加えて、当該技術分野において公知の技術、例えば、従来のメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃケミストリーを用いて、断片または変異体を化学合成することができる。断片または変異体を（組換えによりまたは化学合成によって）生産し、試験して、例えば、グリコーゲンを加水分解する、および／またはフォーブス・コリ病の症状を処置するそれらの能力を試験することにより、ネイティブＧＡＡタンパク質として機能することができる断片または変異体を同定することができる。
【００７５】
ある一定の実施形態において、本開示は、治療もしくは予防有効度または安定性（例えば、エクスビボ保存可能期間、およびインビボでのタンパク質分解に対する耐性）を向上させることなどを目的として成熟ＧＡＡポリペプチドの構造を修飾することも企図している。かかる修飾成熟ＧＡＡポリペプチドは、天然に存在するＧＡＡポリペプチドの機能的等価物とみなされる。修飾ポリペプチドは、例えば、アミノ酸置換、欠失または付加によって生産することができる。例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンでの、アスパラギン酸のグルタミン酸での、トレオニンのセリンでの孤立した置換、またはアミノ酸の構造的関連性のあるアミノ酸での同様の置換（例えば、保存的突然変異）が、結果として得られる分子のＧＡＡ生物学的活性に対して大きな影響を及ぼさないことを、例えば予想することは、理に適っている。保存的置換は、それらの側鎖において関連性のあるアミノ酸のファミリー内で起こるものである。
【００７６】
本開示は、成熟ＧＡＡポリペプチドのコンビナトリアル突然変異体（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｍｕｔａｎｔｓ）のセットの生成、ならびにトランケーション突然変異体の生成もさらに企図しており、機能性変異体配列の同定に特に有用である。天然に存在するＧＡＡポリペプチドに比べて選択的効力（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｃｙ）を有するコンビナトリアル誘導変異体（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｌｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖａｒｉａｎｔ）を生成することができる。同様に、突然変異誘発は、対応する野生型ＧＡＡポリペプチドとは劇的に異なる細胞内半減期を有する変異体を生じさせることができる。例えば、ＧＡＡ機能の破壊または別様の不活性化をもたらすタンパク質分解または他の細胞プロセスに対して、変性タンパク質をより安定にまたはより不安定にさせることができる。かかる変異体を利用して、それらの半減期を調節することにより成熟ＧＡＡポリペプチドレベルを変えることができる。可能性のある成熟ＧＡＡ変異体配列のライブラリーを、例えば縮重オリゴヌクレオチド配列から、生成することができる多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成装置で行い、その後、合成遺伝子を発現のために適切な遺伝子にライゲートすることができる。縮重遺伝子セットの目的は、可能性のあるポリペプチド配列の所望のセットをコードする配列すべてを１つの混合物で提供することである。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，ＳＡ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８１）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ、Ｐｒｏｃ．３ｒｄ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｓｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ＡＧ  Ｗａｌｔｏｎ編、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ｐｐ．２７３−２８９；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅら、（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照されたい）。かかる技術は、他のタンパク質の定向進化に活用されている（例えば、Ｓｃｏｔｔら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓら、（１９９２）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：２４２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら、（１９９０）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：６３７８−６３８２；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，１９８，３４６号および同第５，０９６，８１５号明細書を参照されたい）。
【００７７】
あるいは、他の形態の突然変異誘発を利用してコンビナトリアルライブラリーを生成することができる。例えば、成熟ＧＡＡポリペプチド変異体を生成し、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発などを用いるスクリーニング（Ｒｕｆら、（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１５６５−１５７２；Ｗａｎｇら、（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３０９５−３０９９；Ｂａｌｉｎｔら、（１９９３）Ｇｅｎｅ  １３７：１０９−１１８；Ｇｒｏｄｂｅｒｇら、（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：５９７−６０１；Ｎａｇａｓｈｉｍａら、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２８８８−２８９２；Ｌｏｗｍａｎら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３８；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍら、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）によって、リンカースキャニング突然変異誘発（Ｇｕｓｔｉｎら、（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９３：６５３−６６０；Ｂｒｏｗｎら、（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：２６４４−２６５２；ＭｃＫｎｉｇｈｔら、（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３１６）によって、飽和突然変異誘発（Ｍｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：６１３）によって、ＰＣＲ突然変異誘発（Ｌｅｕｎｇら、（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １：１１−１９）によって、または化学的突然変異誘発などを含むランダム突然変異誘発（Ｍｉｌｌｅｒら、（１９９２）Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；およびＧｒｅｅｎｅｒら、（１９９４）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７：３２−３４）によって、ライブラリーから単離することができる。特にコンビナトリアル設定での、リンカースキャニング突然変異誘発は、トランケート（生物活性）形態の成熟ＧＡＡの魅力的な同定方法である。
【００７８】
点突然変異およびトランケーションによって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、ついでに言えば、ある一定の特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための広範な技術が当該技術分野において公知である。かかる技術は、一般に、成熟ＧＡＡポリペプチドのコンビナトリアル突然変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適応させることができるであろう。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広範に用いられている技術は、遺伝子ライブラリーを複製可能発現ベクターにクローニングするステップ、得られたベクターライブラリーで適切な細胞を形質転換させるステップ、および所望の活性の検出が、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を助長する条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させるステップを典型的に含む。下で説明する実例となるアッセイの各々は、コンビナトリアル突然変異誘発技術によって作り出された多数の縮重配列をスクリーニングするために必要に応じて高スループット解析に適用できる。
【００７９】
ある一定の実施形態において、成熟ＧＡＡポリペプチドは、ペプチドおよびペプチドミメティックを含むことがある。本明細書において用いる場合、用語「ペプチドミメティック」は、天然に存在しないアミノ酸、ペプトイドなどを含有する化学修飾ペプチドおよびペプチド様分子を含む。ペプチドミメティックは、被験体に投与されたとき、向上された安定性をはじめとするペプチドに対する様々な利点を提供する。ペプチドミメティックを同定するための方法は当該技術分野において周知であり、可能性のあるペプチドミメティックのライブラリーを収録しているデータベースのスクリーニングを含む。例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅは、結晶構造が判っている３００，０００を超える化合物のコレクションを収録している（Ａｌｌｅｎら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｂ、３５：２３３１（１９７９））。標的分子の結晶構造を入手できない場合、例えば、プログラムＣＯＮＣＯＲＤ（Ｒｕｓｉｎｋｏら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．２９：２５１（１９８９））を使用して構造を作成することができる。もう１つのデータベース、Ａｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ  Ｃａｌｉｆ．）は、市販されている約１００，０００の化合物を収録しており、このデータベースを検索して、成熟ＧＡＡポリペプチドについての可能性のあるペプチドミメティックを同定することもできる。
【００８０】
ある一定の実施形態において、成熟ＧＡＡポリペプチドは、翻訳後修飾をさらに含むことがある。例示的翻訳後タンパク質修飾としては、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰ−リボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、カルボニル化、スモイル化、ビオチン化またはポリペプチド側鎖のもしくは疎水性基の付加が挙げられる。結果として、修飾された成熟ＧＡＡポリペプチドは、非アミノ酸要素、例えば、脂質、多糖類または単糖類、およびホスフェートを含有することがある。成熟ＧＡＡポリペプチドの官能性に対するかかる非アミノ酸要素の影響をその生物学的活性について、例えば、フォーブス・コリ病を処置するその能力について試験してもよい。ある一定の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドは、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、および／または精製のうちの１つ以上を向上させる１つ以上のポリペプチド部分をさらに含むことがある。他の実施形態において、前記内在化モイエティは、抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００８１】
本開示の１つの特定の実施形態において、成熟ＧＡＡポリペプチドは、非タンパク質様ポリマーで修飾されていることがある。１つの特定の実施形態において、前記ポリマーは、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号明細書に示されているように、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンである。ＰＥＧは周知の水溶性ポリマーであり、このポリマーは、市販されており、または当該技術分野において周知の方法に従ってエチレングリコールの開環重合によって調製することができる（Ｓａｎｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｏ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第３巻、１３８−１６１頁）。
【００８２】
用語「生物学的活性」、「生物活性」または「機能性の」は、野生型ＧＡＡタンパク質に随伴する機能、例えば、グリコーゲン、例えば細胞質グリコーゲンのα−１，４−およびα−１，６−グリコシド結合の加水分解を行う成熟ＧＡＡタンパク質の能力を意味する。用語「生物学的活性」、「生物活性」および「機能性の」を本明細書では交換可能に用いている。ある一定の実施形態において、および本明細書に記載するように、生物学的活性を有する成熟ＧＡＡタンパク質またはキメラポリペプチドには、グリコーゲンを加水分解する能力がある。他の実施形態において、生物学的活性を有する成熟ＧＡＡタンパク質またはキメラポリペプチドには、細胞質および／またはリソソームグリコーゲンの濃度を低下させる能力がある。さらに他の実施形態において、成熟ＧＡＡタンパク質またはキメラポリペプチドには、フォーブス・コリ病に伴う症状を処置する能力がある。本明細書において用いる場合、「断片」は、本明細書に記載するような「生物活性」を示す生物活性断片（機能性断片とも呼ばれる）または生物活性変異体を含むと解される。すなわち、成熟ＧＡＡの生物活性断片または変異体は、測定および試験することができる生物活性を示す。例えば、生物活性断片／機能性断片または変異体は、ネイティブ（すなわち、野生型、または正常な）ＧＡＡタンパク質と同じまたは実質的に同じ生物活性を呈示し、かかる生物活性は、例えばインビトロまたはインビボでグリコーゲンを加水分解する、その断片または変異体の能力によって評定することができる。本明細書において用いる場合、「実質的に同じ」は、対照（これに対してパラメータを測定する）の少なくとも７０％である任意のパラメータ（例えば、活性）を指す。ある一定の実施形態において、「実質的に同じ」は、対照（これに対してパラメータを測定する）の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０２％、１０５％または１１０％である任意のパラメータ（例えば、活性）も指す。ある一定の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドの断片または変異体は、同じまたは実質的に同じ条件下で評定したとき、ネイティブＧＡＡポリペプチドに随伴するＧＡＡ生物学的活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％を好ましくは保持することになる。ある一定の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドの断片または変異体は、そのネイティブタンパク質の半減期に比べて向上された半減期（ｔ１／２）を有する。好ましくは、成熟ＧＡＡ断片または変異体の半減期は、同じまたは実質的に同じ条件下で評定したとき、ネイティブＧＡＡタンパク質の半減期に比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％、またはさらには１０００％向上される。一部の実施形態では、前記タンパク質半減期をインビトロで、例えば、緩衝食塩溶液中または血清中で判定する。他の実施形態において、前記タンパク質半減期は、インビボ半減期、例えば、動物の血清または他の体液中の��ンパク質の半減期である。加えて、断片または変異体を当該技術分野において公知の技術、例えば、従来のメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃケミストリーを用いて化学合成することができる。前記断片または変異体を（組換えによりまたは化学合成によって）生産し、試験して、ネイティブＧＡＡタンパク質と同程度にまたは実質的に同様に機能することができる断片または変異体を同定することができる。
【００８３】
細胞におけるＧＡＡ生物活性を増加させる方法に関して、本開示は、任意の上述の態様および実施形態のすべての組み合わせ、ならびに「発明を実施するための形態」および「実施例」で述べる任意の実施形態との組み合わせも企図している。キメラポリペプチドの投与または細胞とキメラポリペプチドの接触に基づく前記方法をインビトロで（例えば、細胞または培養で）行うことができ、またはインビボで（例えば、患者または動物モデルで）行うことができる。ある一定の実施形態において、前記方法は、インビトロ法である。ある一定の実施形態において、前記方法は、インビボ法である。
【００８４】
一部の態様において、本開示は、本明細書に記載の任意の上述のキメラポリペプチドの生産方法も提供する。さらに、本開示は、上述の方法および組成物の任意の数の組み合わせを企図している。
【００８５】
ある一定の態様において、成熟ＧＡＡポリペプチドは、１つ以上の融合ドメインをさらに含む融合タンパク質であることもある。かかる融合ドメインの周知の例としては、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、および免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が挙げられるがこれらに限定されず、これらはアフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフィニティー精製を目的として、アフィニティークロマトグラフィーのための適切なマトリックス、例えば、グルタチオン結合樹脂、アミラーゼ結合樹脂、およびニッケル結合樹脂またはコバルト結合樹脂を使用する。融合ドメインは「エピトープタグ」も含み、エピトープタグは、通常、特異的抗体が利用可能である短鎖ペプチド配列である。特異的モノクローナル抗体が容易に利用可能である周知エピトープタグとしては、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）、Ｈｉｓ、およびｃ−ｍｙｃタグが挙げられる。例示的Ｈｉｓタグは、配列ＨＨＨＨＨＨ（配列番号２３）を有し、例示的ｃ−ｍｙｃタグは、配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号２４）を有する。任意のかかるタグまたは融合体を前記キメラポリペプチドの成熟ＧＡＡ部分に追加してもよく、または前記キメラポリペプチドの内在化モイエティ部分に追加してもよく、または両方であってもよい。
【００８６】
場合によっては、前記融合ドメインは、適切なプロテアーゼに融合タンパク質を部分的に消化させ、それによってそれらから組換えタンパク質を遊離させるプロテアーゼ切断部位、例えば、第Ｘａ因子またはトロンビンについてのプロテアーゼ切断部位を有する。その後、遊離されたタンパク質を後続のクロマトグラフィー分離によって融合ドメインから単離することができる。ある一定の実施形態において、前記成熟ＧＡＡポリペプチドは、それらのポリペプチドを安定化することが可能である１つ以上の修飾を含むことがある。例えば、かかる修飾は、前記ポリペプチドのインビトロ半減期を向上させるか、前記ポリペプチドの循環半減期を向上させるか、または前記ポリペプチドのタンパク質分解を低減させる。
【００８７】
一部の実施形態において、成熟ＧＡＡポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ領域との融合タンパク質であることもある。公知であるように、各免疫グロブリン重鎖定常領域は、４または５つのドメインを含む。これらのドメインは、次のように順次名づけられる：ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４）。前記重鎖ドメインのＤＮＡ配列は、免疫グロブリンクラス間で交差相同性を有し、例えば、ＩｇＧのＣＨ２ドメインは、ＩｇＡおよびＩｇＤのＣＨ２ドメインと相同であり、かつＩｇＭおよびＩｇＥのＣＨ３ドメインと相同である。本明細書において用いる場合、用語「免疫グロブリンＦｃ領域」は、免疫グロブリン鎖定常領域の、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常領域の、またはその一部分の、カルボキシル末端部分を意味すると解される。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、または５）２つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域の組み合わせを含むことがある。好ましい実施形態において、免疫グロブリンＦｃ領域は、少なくとも免疫グロブリンヒンジ領域ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、かつ好ましくはＣＨ１ドメインを欠く。１つの実施形態において、重鎖定常領域が由来する免疫グロブリンのクラスは、ＩｇＧ（Ｉｇγ）（γサブクラス１、２、３または４）である。免疫グロブリンの他のクラス、ＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）およびＩｇＭ（Ｉｇμ）を用いてもよい。適切な免疫グロブリン重鎖定常領域の選択は、米国特許第５，５４１，０８７号および同第５，７２６，０４４号明細書において詳細に論じられている。特定の結果を達成するための、ある一定の免疫グロブリンクラスおよびサブクラスからの特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列の選択は、当該技術分野における技術レベルの範囲内であると考えられる。免疫グロブリンＦｃ領域をコードするＤＮＡ構築物の部分は、好ましくはヒンジドメインの少なくとも一部分、および好ましくはＦｃγのＣＨ３ドメインまたはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥもしくはＩｇＭのうちのいずれかにおける相同ドメインの少なくとも一部分を含む。さらに、免疫グロブリン重鎖定常領域内のアミノ酸の置換または欠失が本開示の実施の際に有用であり得ると考えられる。一例は、Ｆｃ受容体に対する親和性が低減されたＦｃ変異体を生じさせるようなアミノ酸置換の上方ＣＨ２領域への導入であろう（Ｃｏｌｅら（１９９７）Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．１５９：３６１３）。通常の当業者は、周知の分子生物学技術を用いてかかる構築物を調製することができる。
【００８８】
上述のいずれかについてのある一定の実施形態において、前記キメラタンパク質のＧＡＡ部分は、ＧＡＡの成熟形態、例えば、７６ｋＤａ断片、７０ｋＤａ断片、代替開始部位および／もしくは終止部位を使用する類似の形態、またはそれらの機能性断片のうちの１つを含む。ある一定の実施形態において、かかる成熟ＧＡＡポリペプチドまたはその機能性断片は、インビトロまたはインビボで評価して、グリコーゲンを加水分解する能力を保持する。さらに、ある一定の実施形態において、かかる成熟ＧＡＡポリペプチドまたはその機能性断片を含むキメラポリペプチドは、グリコーゲンを加水分解することができる。例示的生物活性断片は、完全長成熟ＧＡＡポリペプチドの連続した少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２３０、少なくとも２５０、少なくとも２６０、少なくとも２７５、または少なくとも３００のアミノ酸残基を含む。同様に、ある一定の実施形態において、本開示は、成熟ＧＡＡ部分が任意の上述の成熟ＧＡＡポリペプチドまたは機能性断片の変異体である、キメラタンパク質を企図している。例示的変異体は、ネイティブＧＡＡポリペプチドまたはその生物活性断片のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有し、かかる変異体は、インビトロまたはインビボで評価してグリコーゲンを加水分解するネイティブＧＡＡの能力を保持する。本開示は、ＧＡＡ部分が、本明細書に記載する成熟ＧＡＡポリペプチド、形態または変異体のいずれかを本明細書に記載する任意の内在化モイエティとの組み合わせで含む、キメラタンパク質およびかかるタンパク質の使用を企図している。例示的成熟ＧＡＡポリペプチドを配列番号３および４に記載する。さらに、ある一定の実施形態において、任意の上述のキメラポリペプチドの成熟ＧＡＡ部分は、ある一定の実施形態では、融合タンパク質である。ＧＡＡ部分と内在化モイエティ部分の任意の組み合わせを含み、場合により１つ以上のリンカー、１つ以上のタグなどを含む任意のかかるキメラポリペプチドを、本開示の任意の方法で使用してよい。
【００８９】
ＩＩＩ．内在化モイエティ
本明細書において用いる場合、用語「内在化モイエティ」は、標的組織または細胞タイプと相互作用して付着分子の細胞への送達を果たす（すなわち、所望の細胞を透過する；細胞膜を横断して輸送する；細胞膜を横断して少なくとも細胞質に送達する）ことが可能なモイエティを指す。好ましくは、この開示は、例えば筋肉細胞および肝臓細胞への送達を促進する内在化モイエティに関する。限られた交差反応性を有する内在化モイエティが一般に好ましい。ある一定の実施形態において、この開示は、筋肉細胞を、必ずしも専ら筋肉細胞のみにではないが、選択的に標的化および透過する内在化モイエティに関する。ある一定の実施形態において、内在化モイエティは、限られた交差反応性を有し、それ故、特定の細胞または組織タイプを優先的に標的化する。しかし、本開示の内在化モイエティが専ら特定の細胞タイプのみを標的化するわけでないことは理解されるはずである。むしろ、内在化モイエティは、他の細胞タイプより優先的に１つ以上の特定の細胞タイプへの送達を促進し、それ故、遍在的ではない送達をもたらす。ある一定の実施形態において、適する内在化モイエティとしては、例えば、抗体、モノクローナル抗体、またはそれらの誘導体もしくは類似体が挙げられる。他の内在化モイエティとしては、例えば、ホーミングペプチド、融合タンパク質、受容体、リガンド、アプタマー、ペプチドミメティック、および特異的結合ペアの任意のメンバーが挙げられる。ある一定の実施形態において、内在化モイエティは、ＥＮＴ２トランスポーターによる細胞膜通過を媒介する。一部の実施形態において、内在化モイエティは、キメラポリペプチドが細胞膜を有効かつ効率的に通過するのに役立つ。一部の実施形態において、内在化モイエティは、受動拡散型ヌクレオシド（ＥＮＴ）トランスポーターによって細胞膜を通過する。一部の実施形態において、内在化モイエティは、ＥＮＴ１、ＥＮＴ２、ＥＮＴ３またはＥＮＴ４トランスポーターによって細胞膜を通過する。一部の実施形態において、内在化モイエティは、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター２（ＥＮＴ２）トランスポーターによって細胞膜を通過する。一部の実施形態において、内在化モイエティは、筋肉細胞（例えば、骨格筋および心筋）への送達を促進する。他の実施形態において、内在化モイエティは、筋肉細胞以外の細胞、例えば、ニューロン、上皮細胞、肝臓細胞、腎臓細胞またはライディッヒ細胞への送達を促進する。上述のいずれについても、ある一定の実施形態において、内在化モイエティは、キメラポリペプチドの細胞質への送達を促進する。
【００９０】
ある一定の実施形態において、内在化モイエティは、キメラポリペプチドの細胞質への送達を促進する。理論に拘束されないが、キメラポリペプチドのＡＧＬまたはＧＡＡポリペプチド部分がＡＧＬまたは成熟ＧＡＡを含むのか、それから成るのかにかかわらず、これは、細胞質への、ならびに場合によりリソソームおよび／または自己貪食小胞への送達を助長する。
【００９１】
ある一定の実施形態において、内在化モイエティは、ポリヌクレオチドと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、内在化モイエティは、ＤＮＡと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、内在化モイエティは、１μＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、内在化モイエティは、１００ｎＭ未満、７５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満またはさらには３０ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合することが可能である。ＫＤは、現行標準法に従って、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）または水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）を用いて測定することができる。例として、抗体または抗体断片（配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＶＨと配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＶＬとを含む抗体または抗体断片を含む）が１００ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合することは公知である。
【００９２】
一部の実施形態において、内在化モイエティは、ＡＧＬまたはＧＡＡポリペプチドを筋肉細胞および／または肝臓に標的化し、筋肉細胞の細胞質への前記ポリペプチドの細胞膜を横断しての通過を媒介する。
【００９３】
本明細書において用いる場合、用語「内在化モイエティ」は、標的組織または細胞タイプと相互作用することが可能なモイエティを指す。好ましくは、この開示は、例えば筋肉細胞および肝臓細胞への送達を促進する内在化モイエティに関する。限られた交差反応性を有する内在化モイエティが一般に好ましい。しかし、本開示の内在化モイエティが専ら特定の細胞タイプのみを標的化するわけでないことは理解されるはずである。むしろ、内在化モイエティは、他の細胞タイプより優先的に１つ以上の特定の細胞タイプへの送達を促進し、それ故、遍在的ではない送達をもたらす。ある一定の実施形態において、適する内在化モイエティとしては、例えば、抗体、モノクローナル抗体、またはそれらの誘導体もしくは類似体が挙げられ；および他の内在化モイエティとしては、例えば、ホーミングペプチド、融合タンパク質、受容体、リガンド、アプタマー、ペプチドミメティック、および特異的結合ペアの任意のメンバーが挙げられる。一部の実施形態において、内在化モイエティは、キメラポリペプチドが細胞膜を有効かつ効率的に通過するのに役立つ。一部の実施形態において、内在化モイエティは、受動拡散型ヌクレオシド（ＥＮＴ）トランスポーターによって細胞膜を通過する。一部の実施形態において、内在化モイエティは、ＥＮＴ１、ＥＮＴ２、ＥＮＴ３またはＥＮＴ４トランスポーターによって細胞膜を通過する。一部の実施形態において、内在化モイエティは、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター２（ＥＮＴ２）トランスポーターによって細胞膜を通過する。一部の実施形態において、内在化モイエティは、筋肉細胞（例えば、骨格筋または心筋）への送達を促進する。他の実施形態において、内在化モイエティは、筋肉細胞以外の細胞、例えば、ニューロン、上皮細胞、肝臓細胞、腎臓細胞またはライディッヒ細胞への送達を促進する。
【００９４】
（ａ）抗体
ある一定の態様において、内在化モイエティは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体およびヒト化抗体をはじめとする抗体を含むことがある。理論により拘束されないが、かかる抗体は、標的組織の抗原に結合し、かくして対象キメラポリペプチドの標的組織（例えば、筋肉）への送達を媒介し得る。一部の実施形態において、内在化モイエティは、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、シングルドメイン抗体、ラクダ化抗体および抗体断片、ヒト化抗体および抗体断片、ヒト抗体および抗体断片、ならびに前述のものの多価バージョンを限定ではないが含む、抗体断片、それらの誘導体または類似体；Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、シングルドメイン抗体、ラクダ化抗体および抗体断片、ヒト化抗体および抗体断片、ヒト抗体および抗体断片、ならびに前述のものの多価バージョンを限定ではないが含む、多価内在化モイエティ；単一特異性または二重特異性抗体、例えばジスルフィド安定化Ｆｖ断片、ｓｃＦｖタンデム（（ｓｃＦｖ）２断片）、典型的に共有結合で連結されたまたは別様に安定化された（すなわち、ロイシンジッパーもしくはヘリックス安定化された）ｓｃＦｖ断片であるダイアボディー、トリボディーまたはテトラボディーを限定ではないが含む、多価内在化モイエティ；所望の標的分子と自然に相互作用する受容体分子を含むことがある。一部の実施形態において、前記抗体またはそれらの変異体は、キメラのものであってよく、例えば、それらは、マウス３Ｅ１０抗体からの可変重鎖または軽鎖領域を含むことがあるが、別の種（例えば、ヒト）の抗体からの定常領域を含むこともある。一部の実施形態において、抗体またはそれらの変異体は、いくつかの異なる抗体サブクラス定常ドメインのハイブリッド（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の任意の組み合わせ）である定常領域を含むこともある。
【００９５】
ある一定の実施形態では、抗体またはその変異体を、被験体に投与するとき、免疫原性を低くするように修飾することがある。例えば、被験体がヒトである場合、前記抗体は、例えばＪｏｎｅｓ，Ｐ．ら、（１９８６）、Ｎａｔｕｒｅ、３２１、５２２−５２５またはＴｅｍｐｅｓｔら、（１９９１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９、２６６−２７３に記載されているような、ハイブリドーマ由来抗体の相補性決定領域（単数または複数）がヒトモノクローナル抗体に移植された「ヒト化された」ものであってもよい。抗体に言及するときの用語ヒト化およびヒト化されたは、当該技術分野において十分理解されている。一部の実施形態において、前記内在化モイエティは、３Ｅ１０抗体配列の、または３Ｅ１０と同じエピトープ（例えば、同じ標的、例えばＤＮＡ）と結合する抗体の、相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する任意のペプチドまたは抗体様タンパク質である。また、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物を使用してヒト化またはヒト抗体を発現させてもよい。かかるヒト化は、部分的であってもよく、または完全であってもよい。
【００９６】
ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、モノクローナル抗体３Ｅ１０またはその抗原結合断片を含む。例えば、前記抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体３Ｅ１０であってもよく、または細胞透過活性を保持するその変異体であってもよく、または３Ｅ１０もしくは前記３Ｅ１０変異体の抗原結合断片であってもよい。加えて、前記抗体またはその抗原結合断片は、３Ｅ１０と同じエピトープ（例えば、ＤＮＡなどの標的）に結合する抗体であってもよく、または３Ｅ１０と実質的に同じ細胞透過活性を有する抗体であってもよく、またはその抗原結合断片であってもよい。これらは、ＥＮＴ２を標的化する作用物質の例である。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、ポリヌクレオチドと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、ＤＮＡと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、１μＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、１００ｎＭ未満、７５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満またはさらには３０ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合することが可能である。ＫＤは、製造業者の説明書および現行作業方法に従って、ＳＰＲまたはＱＣＭを用いて測定される。
【００９７】
ある一定の実施形態において、前記抗原結合断片は、ＦｖまたはそのｓｃＦｖ断片である。モノクローナル抗体３Ｅ１０は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）にＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−２４３９で永久寄託されているハイブリドーマ３Ｅ１０によって生産することができ、米国特許第７，１８９，３９６号明細書に開示されている。加えて、またはあるいは、前記３Ｅ１０抗体は、その３Ｅ１０抗体の重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞において発現させることによって生産することができる。用語「３Ｅ１０抗体」または「モノクローナル抗体３Ｅ１０」は、当該抗体を生産するために用いる方法にかかわらず、当該抗体を指すために用いている。同様に、３Ｅ１０の変異体または抗原結合断片に言及するとき、かかる用語は、当該抗体が生産される様式に関係なく用いている。この点で、３Ｅ１０は、一般にハイブリドーマによって生産されず、組換え生産される。したがって、本出願に関連して、３Ｅ１０抗体は、ハイブリドーマの配列を有する抗体、または配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン（これは、本明細書に記載のＡＴＣＣに寄託されている３Ｅ１０抗体のものに比べて１つのアミノ酸置換を有する）と、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む抗体を指すことになる。
【００９８】
前記内在化モイエティは、ｍＡｂ  ３Ｅ１０の変異体、例えば、ｍＡｂ  ３Ｅ１０と同じ細胞透過特性を保持する３Ｅ１０の変異体、ならびにその有用性を改善するような突然変異によって修飾された変異体（例えば、特異的細胞タイプに対する改善された標的化能力、細胞膜に対する改善された透過能力、細胞ＤＮＡに対する改善された局在化能力、適便な結合体化部位など）も含むことがある。かかる変異体は、１つ以上の保存的置換が抗体の重鎖、軽鎖および／または定常領域（単数または複数）に導入されている変異体を含む。かかる変異体は、３Ｅ１０または３Ｅ１０変異体のヒト化バージョンを含む。一部の実施形態において、前記軽鎖または重鎖は、Ｎ末端またはＣ末端が修飾されていることがある。同様に、変異体についての上述の説明は、抗原結合断片にもあてはまる。これらのいずれの抗体、変異体または断片も、宿主細胞でのヌクレオチド配列（単数または複数）の発現によって組換えにより作製され得る。
【００９９】
モノクローナル抗体３Ｅ１０は、細胞を透過して、タンパク質および核酸を標的組織の細胞質または核空間に送達することが証明されている（Ｗｅｉｓｂａｒｔ  ＲＨら、Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．１９９８  Ｏｃｔ；１１（５）：５３９−４６；Ｗｅｉｓｂａｒｔ  ＲＨら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３  Ｍａｒ；３９（１３）：７８３−９；Ｚａｃｋ  ＤＪら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６  Ｓｅｐ  １；１５７（５）：２０８２−８）。さらに、３Ｅ１０のＶＨおよびＶｋ配列は、ヒト抗体と高相同性であり、それぞれのヒト化度（ｈｕｍａｎｎｅｓｓ）ｚ−スコアは０．９４３および−０．８８０である。したがって、Ｆｖ３Ｅ１０は、多くの他の認可されているヒト化抗体より誘導する抗抗体反応が小さいと予想される（Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ  ＫＲら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００７  ３６９、８５２−８６２）。３Ｅ１０の一本鎖Ｆｖ断片は、原モノクローナル抗体の細胞透過能すべてを有し、タンパク質、例えばカタラーゼ、ジストロフィン、ＨＳＰ７０およびｐ５３は、Ｆｖ３Ｅ１０との結合体化後にそれらの活性を保持する（Ｈａｎｓｅｎ  ＪＥら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．２００６  Ｍａｙ  ９；１０８８（１）：１８７−９６；Ｗｅｉｓｂａｒｔ  ＲＨら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２００３  Ｊｕｎ  １０；１９５（２）：２１１−９；Ｗｅｉｓｂａｒｔ  ＲＨら、Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ．２００５  Ｆｅｂ；１３（２）：８１−７；Ｗｅｉｓｂａｒｔ  ＲＨら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  Ｊｕｎ  １；１６４（１１）：６０２０−６；Ｈａｎｓｅｎ  ＪＥら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００７  Ｊｕｌ  ２０；２８２（２９）：２０７９０−３）。３Ｅ１０は、すべての哺乳動物に存在する抗体足場；マウス可変重鎖および可変κ軽鎖に基づき構築される。３Ｅ１０は、特に骨格筋および癌細胞に多く含まれているＥＮＴ２ヌクレオチドトランスポーターによって細胞に入り、またインビボ研究により３Ｅ１０は非毒性であることが証明されている（Ｗｅｉｓｂａｒｔ  ＲＨら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３  Ｍａｒ；３９（１３）：７８３−９；Ｐｅｎｎｙｃｏｏｋｅ  Ｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００１  Ｊａｎ  ２６；２８０（３）：９５１−９）。
【０１００】
前記内在化モイエティは、ｍＡｂ  ３Ｅ１０の突然変異体、例えば、ｍＡｂ  ３Ｅ１０と同じまたは実質的に同じ細胞透過特性を保持する３Ｅ１０の変異体、ならびにその有用性を改善するような突然変異によって修飾された変異体（例えば、特異的細胞タイプに対する改善された標的化能力、細胞膜に対する改善された透過能力、細胞ＤＮＡに対する改善された局在化能力、改善された結合親和性など）も含むことがある。かかる突然変異体は、１つ以上の保存的置換が抗体の重鎖、軽鎖および／または定常領域（単数または複数）に導入される変異体を含む。ｍＡｂ  ３Ｅ１０の非常に多くの変異体が、例えば、米国特許第７，１８９，３９６号明細書および国際公開第２００８／０９１９１１号パンフレットにおいて特性評価されており、前記特許文献の教示は、それら全体が参照により本明細書に援用されている。
【０１０１】
ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、配列番号６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび／または配列番号８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９９％もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む抗体または抗原結合断片、あるいはそれらのヒト化変異体を含む。もちろん、かかる内在化モイエティは、ＥＮＴ２によって細胞を通過し、および／または３Ｅ１０と同じエピトープ（例えば、ＤＮＡなどの標的）と結合する。
【０１０２】
ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、ポリヌクレオチドと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、ＤＮＡと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、１μＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、１００ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合することが可能である。
【０１０３】
ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、抗原結合断片、例えば、配列番号６および８を含む３Ｅ１０の一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、３Ｅ１０の一本鎖Ｆｖ（または別の抗原結合断片）を含み、そのＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号６と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり、およびそのＶＬのアミノ酸配列は、配列番号８と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。前記変異体３Ｅ１０またはその断片は、内在化モイエティの機能を保持する。内在化モイエティがｓｃＦｖであるとき、典型的に、ＶＨおよびＶＬドメインは、リンカー、例えばｇｌｙ／ｓｅｒリンカーによって接続されている。ＶＨドメインは、ＶＬドメインに対してＮ末端であり得るか、またはその反対であり得る。
【０１０４】
一部の実施形態において、前記内在化モイエティは、３Ｅ１０抗体のＣＤＲの１つ以上を含む。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、配列番号６と同一であるＶＨドメインのアミノ酸配列と、配列番号８と同一であるＶＬドメインのアミノ酸配列とを含む抗体のＣＤＲの１つ以上を含む。前記３Ｅ１０抗体のＣＤＲを、当該技術分野において利用可能な任意のＣＤＲ同定スキームを用いて決定してよい。例えば、一部の実施形態において、前記３Ｅ１０抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載のカバット定義に準拠して定義される。他の実施形態において、前記３Ｅ１０抗体のＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８７、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７およびＣｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ．３４２：８７７−８８３に準拠して定義される。他の実施形態において、前記３Ｅ１０抗体のＣＤＲは、ＬｅＦｒａｎｃら、２００３、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２７：５５−７７に記載のｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ）に準拠して定義される。他の実施形態において、前記３Ｅ１０抗体のＣＤＲは、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  Ａ、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ．、２００１、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、３０９：６５７−６７０に準拠して定義される。一部の実施形態において、前記３Ｅ１０抗体のＣＤＲは、Ｋｕｎｉｋら、２０１２、ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ．８（２）：ｅ１００２３８８において論じられているＣＤＲ同定スキームのいずれかに準拠して定義される。当該技術分野において公知のＣＤＲ同定スキームのいずれかに準拠するＣＤＲの同定を目的として３Ｅ１０抗体の残基に番号付けするために、３Ｅ１０抗体を当該抗体の配列の相同性領域において、選ばれたＣＤＲ同定スキームについての当該技術分野において公知の「基準」番号付き配列とアラインしてもよい。フレームワーク残基の最大アラインメントは、Ｆｖ領域に用いられるような、番号付け体系への「スペーサー」残基の挿入を必要とすることが多い。加えて、任意の所与の部位番号におけるある一定の個々の残基の同一性は、種間または対立遺伝子多様性のため抗体鎖ごとに変わることがある。
【０１０５】
ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、カバットＣＤＲ同定スキームを用いて決定された３Ｅ１０のＣＤＲ（例えば、配列番号９−１４に記載のＣＤＲ）の少なくとも１、２、３、４または５つを含む。他の実施形態において、前記内在化モイエティは、ＩＭＧＴ同定スキームを用いて決定された３Ｅ１０のＣＤＲ（例えば、配列番号２７−３２に記載のＣＤＲ）の少なくとも１、２、３、４または５つを含む。ある一定の実施形態において、前記内在化モイエティは、カバットＣＤＲ同定スキームを用いて決定された３Ｅ１０の６つすべてのＣＤＲを含む（例えば、配列番号９−１４を含む）。他の実施形態において、前記内在化モイエティは、ＩＭＧＴ同定スキームを用いて決定された３Ｅ１０の６つすべてのＣＤＲを含む（例えば、これらを配列番号２７−３２として記載する）。上述のいずれについても、ある一定の実施形態において、内在化モイエティは、３Ｅ１０と同じエピトープ（例えば、同じ標的、例えばＤＮＡ）と結合する抗体であり、および／または内在化モイエティは、抗原への結合について３Ｅ１０と競合する。例示的内在化モイエティは、細胞を標的化し、ＥＮＴ２によって細胞を通過する。
【０１０６】
本開示は、３Ｅ１０または３Ｅ１０断片もしくは変異体の細胞透過能力を利用して、ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡのインビボでのまたはインビトロで細胞への、例えば細胞の細胞質への送達を促進する。３Ｅ１０ならびに３Ｅ１０変異体および断片は、骨格筋および心筋をはじめとする筋肉細胞ならびに横隔膜への送達を有効に促進するそれらの実証された能力のため、この送達に特によく適している。したがって、ある一定の実施形態において、３Ｅ１０ならびに３Ｅ１０変異体および断片（または同じエピトープに結合するおよび／もしくはＥＮＴ２によって細胞を通過する、抗体もしくは抗体断片）は、フォーブス・コリ病を有するまたはフォーブス・コリ病を繰り返す症状を有する被験体、例えばヒト患者またはモデル生物、の細胞への有効な送達の促進に有用である。ある一定の実施形態において、内在化モイエティが３Ｅ１０に関係付けられるキメラポリペプチドは、細胞の細胞質へのＡＧＬおよび／または成熟ＧＡＡを含むポリペプチドの送達を助長するのに適している。
【０１０７】
下でさらに説明するように、組換え３Ｅ１０または３Ｅ１０様変異体または断片をＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチドに結合体化、結合または別様に連結させることができる。キメラポリペプチドの作製に関連して、ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡへの化学的結合体化、ならびにキメラポリペプチドの融合タンパク質としての作製も利用可能であり、当該技術分野において公知である。
【０１０８】
抗体またはその断片（例えば、ＶＨ−リンカー−ＶＬもしくはＶＬ−リンカー−ＶＨによってコードされた一本鎖Ｆｖ断片、またはＦａｂ）の調製は、当該技術分野において周知である。特に、ｍＡｂ  ３Ｅ１０抗体断片の組換え生産方法は、国際公開第２００８／０９１９１１号に記載されている。さらに、抗体またはＦａｂのｓｃＦｖ断片の生成方法は、当該技術分野において周知である。抗体または抗体断片を組換え生産する場合、リンカーを使用することがある。例えば、柔軟なタンパク質領域における典型的な表面アミノ酸としては、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒが挙げられる。１つの例示的リンカーを配列番号７に提供する。Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒを含有するアミノ酸配列の並べ替えは、リンカー配列の基準（例えば、柔軟性で最小の疎水性または荷電性）を満たすと予想される。もう１つの例示的リンカーは、式（Ｇ４Ｓ）ｎ（この式中のｎは、１〜１０の整数、例えば２、３または４である）（配列番号３３）のものである。他のほぼ中性のアミノ酸、例えばＴｈｒおよびＡｌａもリンカー配列に使用することができる。
【０１０９】
例えばｓｃＦｖの部分を相互接続するリンカーに加えて、本開示は、例えば、キメラポリペプチドの抗体部分にＡＧＬまたは成熟ＧＡＡ部分を相互接続するための追加のリンカーの使用を企図している。
【０１１０】
モノクローナル抗体を産生するための任意の数の周知の方法によって抗体の調製を遂行してもよい。これらの方法は、典型的に、動物、典型的にはマウスを所望の免疫原（例えば、所望の標的分子またはその断片）で免疫するステップを含む。マウスを免疫し、好ましくは所望の免疫原（単数または複数）で１回以上追加免疫したら、周知の方法に従ってモノクローナル抗体生産性ハイブリドーマを調製し、スクリーニングしてよい（例えば、モノクローナル抗体生産の総括（この部分は参照により本明細書に援用されている）については、Ｋｕｂｙ、Ｊａｎｉｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、ｐｐ．１３１−１３９、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．（１９９７）を参照されたい）。過去数十年の間に、抗体生産は極めて堅固なものになってきた。抗体認識法とファージディスプレイ技術を併用するインビトロ法は、極めて特異的な結合能を有する抗体の増幅および選択を可能にする。例えば、参照により本明細書に援用されているＨｏｌｔ，Ｌ．Ｊ．ら、「Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０００、１１：４４５−４４９を参照されたい。これらの方法は、典型的に、旧来のモノクローナル抗体調製方法によるハイブリドーマの調製よりはるかに扱いやすい。１つの実施形態では、ファージディスプレイ技術を用いて、所望の標的分子に対して特異的な内在化モイエティを産生することがある。選択された免疫原に対する免疫応答を動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギまたは他の動物）において惹起し、その応答を追加刺激して免疫原特異的Ｂ細胞集団を増やす。メッセンジャーＲＮＡをそれらのＢ細胞から、または場合によりモノクローナルもしくはポリクローナルハイブリドーマ集団から単離する。ポリ−Ａプライマーを使用するか、または典型的には所望のＶＨおよびＶＬ鎖に隣接した配列に特異的な、マウス免疫グロブリン特異的プライマー（単数もしくは複数）を使用して、公知の方法によりｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを得る。ＶＨおよびＶＬ特異的プライマーセットを典型的に使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって所望のＶＨおよびＶＬ鎖を増幅し、リンカーによって隔てて互いにライゲートする。ＶＨおよびＶＬ特異的プライマーセットは、例えばカリフォルニア州ラホーヤのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．から、市販されている。（ｓｃＦｖ断片をコードする）組み立てられたＶＨ−リンカー−ＶＬ産物をＰＣＲによって選択し、増幅する。制限部位を含むプライマーを用いるＰＣＲによってそのＶＨ−リンカー−ＶＬ産物の末端に制限部位を導入し、ファージディスプレイに適する発現ベクター（典型的にはプラスミド）にそのｓｃＦｖ断片を挿入する。Ｆａｂ’断片などの他の断片をファージ粒子上での表面発現のためにファージディスプレイベクターにクローニングしてもよい。前記ファージは、ラムダなどの任意のファージであってよいが、典型的には糸状ファージ、例えば、ｆｄおよびＭ１３、典型的にはＭ１３である。
【０１１１】
ある一定の実施形態では、抗体または抗体断片を宿主細胞において組換えにより作製する。言い換えると、抗体の配列が（例えば、上で説明した方法を用いて）判ったら、標準的な技術を用いてその抗体を組換えにより作製することができる。
【０１１２】
ある一定の実施形態では、前記内在化モイエティを、プロテアーゼによる切断に対してより耐性にするように修飾することがある。例えば、（Ｌ）立体配置の天然に存在するアミノ酸の１つ以上をＤ−アミノ酸で置換することによって、ポリペプチドを含む内在化モイエティの安定性を増加させてもよい。様々な実施形態において、内在化モイエティのアミノ酸残基の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、５０％、８０％、９０％または１００％は、Ｄ立体配置のものであってよい。Ｌアミノ酸からＤアミノ酸への切り換えは、消化管内で見いだされる多くの遍在ペプチダーゼの消化能を中和する。あるいは、ペプチド結合を含む内在化モイエティの向上した安定性を、旧来のペプチド結合の修飾の導入によって実現してもよい。例えば、ポリペプチド主鎖内へのシクロ環の導入は、胃または他の消化器官内および血清中のポリペプチドを消化することが公知の多くのタンパク質分解酵素の影響を回避するために向上した安定性をもたらすことがある。さらに他の実施形態では、内在化モイエティのアミノ酸間に１つ以上の右旋性アミノ酸（例えば、右旋性フェニルアラニンまたは右旋性トリプトファン）を挿入することによって内在化モイエティの向上した安定性を実現することもある。例示的実施形態において、かかる修飾は、所望の標的分子との相互作用の活性または特異性に影響を及ぼすことなく、内在化モイエティのプロテアーゼ耐性を増加させる。
【０１１３】
（ｂ）ホーミングペプチド
ある一定の態様において、内在化モイエティは、対象キメラＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチドを標的組織（例えば、筋肉）に選択的に指向させるホーミングペプチドを含むことがある。例えば、ＡＳＳＬＮＩＡ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むホーミングペプチドによって、キメラポリペプチドの筋肉への送達を媒介することができる。さらなる例示的ホーミングペプチドは、国際公開第９８／５３８０４号に開示されている。標的組織（または器官）に対するホーミングペプチドは、当該技術分野において周知の様々な方法を用いて同定することができる。ホーミングペプチドのさらなる例としては、核局在化配列Ｔａｔ４８−６０を含むＨＩＶ転写トランス活性化因子（ＴＡＴ）；ショウジョウバエアンテナペディア転写因子ホメオドメイン（例えば、Ａｎｔｐ４３−５８ホメオドメイン第３ヘリックスを含むペネトラチン）；ホモ−アルギニンペプチド（例えば、虚血ラット心のＡｒｇ７ペプチド−ＰＫＣ−εアゴニスト保護（「Ａｒｇ７」を配列番号３５として開示する））；α−ヘリックスペプチド；カチオン性ペプチド（「超正」電荷を持つタンパク質）が挙げられる。一部の実施形態において、ホーミングペプチドは、受動拡散型ヌクレオシド（ＥＮＴ）トランスポーターによって細胞膜を通過する。一部の実施形態において、ホーミングペプチドは、ＥＮＴ１、ＥＮＴ２、ＥＮＴ３またはＥＮＴ４トランスポーターによって細胞膜を通過する。一部の実施形態において、ホーミングペプチドは、ＥＮＴ２を標的化する。他の実施形態において、ホーミングペプチドは、筋肉細胞を標的化する。ホーミングペプチドにより標的化される筋肉細胞としては、骨格筋細胞、心筋細胞または平滑筋細胞が挙げられるだろう。他の実施形態において、ホーミングペプチドは、ニューロン、上皮細胞、肝臓細胞、腎臓細胞またはライディッヒ細胞を標的化する。
【０１１４】
ある一定の実施形態において、ホーミングペプチドは、ポリヌクレオチドと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、ホーミングペプチドは、ＤＮＡと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、ホーミングペプチドは、１μＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合することが可能である。ある一定の実施形態において、ホーミングペプチドは、１００ｎＭ未満のＫＤでＤＮＡと結合することが可能である。
【０１１５】
加えて、標的組織（または器官）に対するホーミングペプチドは、当該技術分野において周知の様々な方法を用いて同定することができる。同定されたら、ある一定の実施形態では、特定の標的組織に対して選択的であるホーミングペプチドを使用することができる。
【０１１６】
例示的方法は、インビボファージディスプレイ法である。具体的には、ランダムペプチド配列をファージの表面タンパク質との融合タンパク質として発現させ、このランダムペプチドライブラリーを全身循環に注入する。宿主マウスへの注入後、標的組織または器官を回収してファージを単離し、増やし、前記注射手順をさらに２回繰り返す。注射されたウイルスは、組織にランダムに結合する機会または非標的組織に特異的に結合する機会があるので、各注射ラウンドは、デフォルトで陰性選択を含む。非標的組織に特異的に結合するウイルス配列は、選択プロセスによって直ぐに削除されることになり、その一方で非特異的結合ファージの数は、各選択ラウンドに伴って減少する。多くの研究室が脳、腎臓、肺、皮膚、膵臓、腸、子宮、副腎、網膜、筋肉、前立腺または腫瘍の血管系に対して選択的であるホーミングペプチドを同定した。例えば、Ｓａｍｏｙｌｏｖａら、１９９９、Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ、２２：４６０；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ、３８０：３６４；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９５、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３：２６５；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９５、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１３０：１１８９；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９６、Ｍｏｌｅ．Ｐｓｙｃｈ．、１：４２１、４２３；Ｒａｊｏｔｔｅら、１９９８、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０２：４３０；Ｒａｊｏｔｔｅら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４：１１５９３を参照されたい。米国特許第５，６２２，６９９号、同第６，０６８，８２９号、同第６，１７４，６８７号、同第６，１８０，０８４号、同第６，２３２，２８７号、同第６，２９６，８３２号、同第６，３０３，５７３号、同第６，３０６，３６５号明細書も参照されたい。任意の上記組織を標的化するホーミングペプチドをその組織にＡＧＬまたはＧＡＡタンパク質を標的化するために使用してよい。
【０１１７】
（ｃ）リソソームおよび自己貪食小胞へのさらなる標的化
一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチド、内在化モイエティ、および場合により追加の細胞内標的化モイエティを含む。一部の実施形態において、前記追加の細胞内標的モイエティは、前記キメラポリペプチドをリソソームに標的化する。他の実施形態において、前記追加の標的化モイエティは、前記キメラポリペプチドを自己貪食空胞に標的化する。タンパク質をリソソームに標的化する旧来の方法は、Ｍ６Ｐ残基での前記タンパク質の修飾であって、Ｍ６Ｐ残基とゴルジ体または後期エンドソームなどの構造の内面のＭ６ＰＲ分子との相互作用によりそれらの輸送をリソソームに指向させる修飾である。ある一定の実施形態において、本開示のキメラポリペプチド（例えば、成熟ＧＡＡまたはＡＧＬと内在化モイエティとを含むポリペプチド）は、Ｍ６ＰＲによるまたはＭ６ＰＲ非依存性経路でのリソソームへのさらなる標的化を助長するために、修飾をさらに含むことがある、例えば、１つ以上のＭ６Ｐ残基のさらなる付加で修飾されていることがある。かかる標的化モイエティを、例えば、キメラポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に、および３Ｅ１０または成熟ＧＡＡへの結合体化によって、付加させてもよい。一部の実施形態では、Ｍ６Ｐ残基をキメラポリペプチドに付加させる。
【０１１８】
一部の実施形態において、本開示のキメラポリペプチドは、自己貪食空胞に輸送される。自己貪食は、リソソーム機構による不必要なまたは機能不全の細胞成分の細胞分解を伴う異化メカニズムである。このプロセス中に標的細胞質成分は、細胞の他の部分からオートファゴソームと呼ばれる小胞内へと単離され、前記オートファゴソームは、その後、リソソームと融合され、分解または再循環される。自己貪食小胞へのタンパク質の取り込みは、細胞の標的領域周囲の膜の形成、およびその後のその小胞とリソソームの融合によって媒介される。細胞小器官およびタンパク質が自己貪食空胞と呼ばれる小胞の中の細胞内に捕捉されるマクロオートファジーを含む、いくつかの自己貪食メカニズムが公知である。リソソームと融合すると、自己貪食空胞の内容物は、酸性リソソームヒドロラーゼによって分解される。ミクロオートファジーでは、リソソームが細胞質を直接飲み込み、シャペロン媒介自己貪食では、コンセンサスペプチド配列を有するタンパク質にｈｓｃ７０含有シャペロン−コシャペロン複合体が結合し、その複合体がリソソームタンパク質によって認識され、リソソーム膜を越えて転位される。自己貪食空胞は、成熟ＧＡＡなどの酵素の活性の助けになるリソソーム環境（低ｐＨ）を有する。
【０１１９】
自己貪食は哺乳動物の筋肉細胞で天然に起こる（Ｍａｓｉｅｒｏら、２００９、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、１０（６）：５０７−１５）。
【０１２０】
ある一定の実施形態において、本開示のキメラポリペプチドは、自己貪食小胞へのさらなる標的化を助長するための修飾をさらに含むことがある。１つの公知シャペロン標的化モチーフは、ＫＦＥＲＱ様モチーフである（ＫＦＥＲＱ配列は、配列番号３６である）。したがって、このモチーフを本明細書に記載のキメラポリペプチドに付加させて、それらのポリペプチドを自己貪食の標的にすることができる。例えば、キメラポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に、および３Ｅ１０または成熟ＧＡＡまたはＡＧＬへの結合体化によって、かかる標的化モイエティを付加させてもよい。
【０１２１】
ＩＩＩ．キメラポリペプチド
本開示のキメラポリペプチドは、様々な手法で作製することができる。前記キメラポリペプチドは、本明細書に開示する任意の内在化モイエティまたはＡＧＬ／成熟ＧＡＡポリペプチドを含んでよい。加えて、本明細書に開示する任意のキメラポリペプチドを本明細書に開示する任意の方法または組成物において使用してよい。一部の実施形態において、内在化モイエティ（例えば、抗体またはホーミングペプチド）は、本明細書に開示するＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチド、断片または変異体のいずれか１つに連結されている。一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、ｉ）約１１０ｋＤａの未成熟ＧＡＡポリペプチド、および／またはｉｉ）シグナル配列、すなわち、配列番号４もしくは５のアミノ酸残基１−２７を有する未成熟ＧＡＡ、および／またはｉｉｉ）配列番号４もしくは５の残基１−５６を含まない。
【０１２２】
ある一定の実施形態では、ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチドのＣ末端を、内在化モイエティ（例えば、抗体またはホーミングペプチド）のＮ末端に連結させることができる。一部の実施形態において、前記ＡＧＬポリペプチドは、最Ｎ末端位置のメチオニン（すなわち、配列番号１〜３のいずれか１つの第一のアミノ酸）を欠く。あるいは、内在化モイエティ（例えば、抗体またはホーミングペプチド）のＣ末端をＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチドのＮ末端に連結させることができる。一部の実施形態において、前記ＡＧＬポリペプチドは、最Ｎ末端位置のメチオニン（すなわち、配列番号１〜３のいずれか１つの第一のアミノ酸）を欠く。例えば、ｍＡｂ  ３Ｅ１０の抗体重鎖または軽鎖いずれかのアミノまたはカルボキシ末端にＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチドを配置するようにキメラポリペプチドを設計することができる。ある一定の実施形態において、可能性のある構成は、付着ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチドの機能的完全性を維持するために必要に応じて抗体の重鎖および軽鎖配列（例えば、ｍＡＢ  ３Ｅ１０）のトランケート部分の使用を含む。さらになお、前記内在化モイエティをＡＧＬまたは成熟ＧＡＡまたはその変異体の露出された内部（非末端）残基に連結させることができる。さらなる実施形態では、ＡＧＬ−または成熟ＧＡＡ−内在化モイエティ構成の任意の組み合わせを用いることができ、それによって、１：１より大きいＡＧＬ：内在化モイエティ比または成熟ＧＡＡ：内在化モイエティ比（例えば、２つのＡＧＬまたは成熟ＧＡＡ分子対１つの内在化モイエティ）が得られる。
【０１２３】
前記ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチドおよび前記内在化モイエティを互いに直接連結させてもよい。あるいは、前記ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチドおよび前記内在化モイエティを、各ドメインが適正にその二次および三次構造に確実にフォールディングするのに十分な距離だけ離隔するリンカー配列を介して、互いに連結させてもよい。好ましいリンカー配列は、（１）柔軟な伸長された高次構造をとるべきであり、（２）ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチドまたは内在化モイエティの機能性ドメインと相互作用することができる規則二次構造を発生させる傾向を示してはならず、そして（３）機能性タンパク質ドメインとの相互作用を促進することができる最小の疎水性または荷電性を有するべきである。柔軟なタンパク質領域の典型的な表面アミノ酸としては、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒが挙げられる。Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒを含有するアミノ酸配列の並び替えは、リンカー配列についての上記基準を満たすと予想される。他のほぼ中性のアミノ酸、例えばＴｈｒおよびＡｌａもリンカー配列に使用することができる。特定の実施形態では、約２０アミノ酸のリンカー配列長を使用して、機能性タンパク質ドメインの適する離隔をもたらすことができるが、より長いまたはより短いリンカー配列を使用してもよい。ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチドと内在化モイエティを離隔するリンカー配列の長さは、長さ５から５００アミノ酸、またはさらに好ましくは長さ５から１００アミノ酸であることができる。好ましくは、前記リンカー配列は、長さ約５〜３０アミノ酸である。好ましい実施形態において、前記リンカー配列は、約５から約２０アミノ酸であり、有利には約１０から約２０アミノ酸である。他の実施形態において、ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチドを内在化モイエティに連結させるリンカーは、抗体の定常ドメイン（例えば、ｍＡｂ  ３Ｅ１０の定常ドメイン、または別の抗体のＦｃ領域のすべてもしくは一部分）であることができる。ある一定の実施形態において、前記リンカーは、切断可能リンカーである。
【０１２４】
他の実施形態では、前記ＡＧＬもしくは成熟ＧＡＡポリペプチドまたはその機能性断片を前記内在化モイエティに直接結合体化または連結させることがある。例えば、組換え結合体化キメラポリペプチドを、前記ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡ部分と前記内在化モイエティ部分のインフレーム融合体として生産することができる。ある一定の実施形態において、前記リンカーは、切断可能リンカーであってよい。上述の実施形態のいずれにおいても、前記内在化モイエティを前記ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチドのＮ末端またはＣ末端アミノ酸に（直接またはリンカーを介して）結合体化させてよい。他の実施形態では、前記内在化モイエティを前記ＡＧＬまたは前記成熟ＧＡＡポリペプチドの内部アミノ酸に（直接または間接的に）結合体化させてもよい。前記構築物の２つの部分が互いに結合体化／連結されることに留意されたい。別段の指定がない限り、ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡ部分の内在化モイエティへの結合体化としてのキメラポリペプチドの記載は、内在化モイエティのＡＧＬまたは成熟ＧＡＡ部分への結合体化と同義で用いている。
【０１２５】
ＡＧＬまたはＧＡＡ部分を内在化モイエティに相互接続するためにリンカーを使用するかどうかにかかわらず、本開示は、前記キメラポリペプチドが１つ以上のタグ（例えば、ｈｉｓ、ｍｙｃまたは他のタグ）も含むことがあることを企図している。かかるタグは、例えば、Ｎ末端に位置してもよく、Ｃ末端に位置してもよく、または内部に位置してもよい。内部に存在する場合、前記タグは、リンカーと連続していてもよい。さらに、本開示のキメラポリペプチドは、１つ以上のリンカーを有することがある。
【０１２６】
ある一定の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、「ＡＧＩＨ」部分（配列番号２５）をそのキメラポリペプチドのＮ末端に含み、かかるキメラポリペプチドを１つ以上のエピトープタグが存在するまたは不存在の状態で提供することがある。さらなる実施形態において、前記キメラポリペプチドは、そのポリペプチドの最Ｎ末端位置にセリンを含む。一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、「ＳＡＧＩＨ」（配列番号２６）部分をそのポリペプチドのＮ末端に含み、かかるキメラポリペプチドを１つ以上のエピトープタグが存在するまたは不存在の状態で提供することがある。
【０１２７】
ある一定の実施形態において、本開示のキメラポリペプチドは、周知の架橋試薬または架橋プロトコルを用いて生成することができる。例えば、当業者に公知であり、ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチドと内在化モイエティ（例えば、抗体）を架橋させるのに有用である、多数の化学的架橋剤がある。例えば、前記架橋剤は、段階的に分子を連結させるために使用することができるヘテロ二官能性架橋剤である。タンパク質を結合体化させるより特異的なカップリング方法が、ヘテロ二官能性架橋剤によって設計できるようになり、それによりホモタンパク質ポリマーなどの望ましくない副反応の発生を低減させることができる。多種多様なヘテロ二官能性架橋剤が当該技術分野において公知であり、それらとしては、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）；Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）；４−スクシンイミジルオキシカルボニル−ａ−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）が挙げられる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分を有する架橋剤を、より大きい水溶性を一般に有するＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド類似体として得ることができる。加えて、連結する鎖内にジスルフィドブリッジを有する架橋剤をアルキル誘導体としてその代りに合成して、インビボリンカー切断量を低減させることができる。ヘテロ二官能性架橋剤に加えて、ホモ二官能性および光反応性架橋剤をはじめとする多数の他の架橋剤が存在する。ジスクシンイミジルスベレート（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｓｕｂｃｒａｔｅ）（ＤＳＳ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）およびジメチルピメルイミデート・２ＨＣｌ（フォーブス・コリ病）は、有用なホモ二官能性架橋剤の例であり、ならびにビス［Ｂ−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）およびＮ−スクシンイミジル−６（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ＳＡＮＰＡＨ）は、本開示における使用のために有用な光反応性架橋剤の例である。タンパク質カップリング技術の最近の概説については、参照により本明細書に援用されているＭｅａｎｓら（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１：２−１２を参照されたい。
【０１２８】
上に含めたヘテロ二官能性架橋剤の１つの特に有用なクラスは、第一級アミン反応性基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、またはその水溶性類似体Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）を含む。アルカリｐＨでの第一級アミン（リジンε基）は、プロトン化されず、ＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳエステルに対する求核攻撃によって反応する。この反応は、アミド結合の形成、そしてＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳの副生成物としての遊離をもたらす。ヘテロ二官能性架橋剤の一部として有用なもう１つの反応性基は、チオール反応性基である。一般的なチオール反応性基としては、マレイミド、ハロゲン、およびピリジルジスルフィドが挙げられる。マレイミドは、弱酸性から中性（ｐＨ６．５〜７．５）条件下で数分で遊離スルフヒドリル（システイン残基）と特異的に反応する。ハロゲン（ヨードアセチル官能基）は、生理ｐＨで−−ＳＨ基と反応する。これら両方の反応性基は、安定したチオエーテル結合の形成をもたらす。ヘテロ二官能性架橋剤の第三の構成要素は、スペーサーアームまたはブリッジである。ブリッジは、２つの反応性末端を接続する構造である。ブリッジの最も明白な特質は、立体障害に対するその効果である。場合によっては、長いブリッジほど、２つの複雑な生体分子を連結させるために必要な距離に容易に架かることができる。
【０１２９】
一部の実施形態において、前記キメラポリペプチドは、複数のリンカーを含む。例えば、キメラポリペプチドがｓｃＦｖ内在化モイエティを含む場合、そのキメラポリペプチドは、ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡを内在化モイエティに結合体化させる第一のリンカーと、ＶＨドメイン（例えば、配列番号６）をＶＬドメイン（例えば、配列番号８）に結合体化させるｓｃＦｖ内の第二のリンカーを含むことがある。
【０１３０】
ヘテロ二官能性試薬を使用するタンパク質結合体の調製は、アミン反応とスルフヒドリル反応を含む二工程プロセスである。第一の工程、アミン反応のために選択されるタンパク質は、第一級アミンを含有すべきである。これは、リジンεアミンまたは殆どのタンパク質のＮ末端に見いだされる第一級αアミンであることができる。前記タンパク質は、遊離スルフヒドリル基を含有してはならない。結合体化される両方のタンパク質が遊離スルフヒドリル基を含有する場合、例えばＮ−エチルマレイミドを使用してすべてのスルフヒドリルをブロックするように一方のタンパク質を修飾することができる（参照により本明細書に援用されているＰａｒｔｉｓら（１９８３）Ｊ．Ｐｒｏ．Ｃｈｅｍ．２：２６３を参照されたい）。エルマン試薬を使用して、特定のタンパク質中のスルフヒドリルの量を計算することができる（例えば、参照により本明細書に援用されているＥｌｌｍａｎら（１９５８）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．７４：４４３およびＲｉｄｄｌｅｓら（１９７９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４：７５を参照されたい）。
【０１３１】
ある一定の特定の実施形態では、ユニバーサル担体系を使用して本開示のキメラポリペプチドを生産することができる。例えば、ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチドを一般的な担体、例えば、プロテインＡ、ポリ−Ｌ−リジン、ｈｅｘ−ヒスチジンなどに結合体化させることができる。その場合、その結合体化された担体は、内在化モイエティとして作用する抗体と複合体を形成することになる。免疫グロブリンと結合する役割を担う担体分子の小部分を担体として使用することもできよう。
【０１３２】
ある一定の実施形態では、Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｍ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３）およびＧｒａｎｔ  Ｇ．  Ａ．（編集）、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）に記載されているものなどの標準的なタンパク質化学技術を用いることにより、本開示のキメラポリペプチドを生産することができる。加えて、自動ペプチド合成装置が市販されている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  Ｍｏｄｅｌ  ３９６；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  ９６００）。ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡの内在化モイエティへの化学的結合体化のための上述のいずれの架橋方法においても、切断可能ドメインまたは切断可能リンカーを使用することができる。切断は、内在化モイエティとＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチドの分離を可能にする。例えば、キメラポリペプチドが細胞を透過した後に、切断可能リンカーの切断によってＡＧＬまたは成熟ＧＡＡの内在化モイエティから分離することが可能になる。
【０１３３】
ある一定の実施形態では、１本の連続ポリペプチド鎖として発現される、ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチドと内在化モイエティ（例えば、抗体またはホーミングペプチド）とを含有する融合タンパク質として、本開示のキメラポリペプチドを生成することができる。かかる融合タンパク質を調製する場合、ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチドおよび内在化モイエティをコードし、場合により、前記ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチドと前記内在化モイエティに架かるようなペプチドリンカー配列もコードする核酸を含む、融合遺伝子を構築する。翻訳産物が所望の融合タンパク質である、融合遺伝子を生じさせるための組換えＤＮＡ技術の使用は、当該技術分野において周知である。遺伝子のコード配列とその調節領域の両方を設計しなおして、タンパク質産物の機能特性、作製されるタンパク質の量、またはそのタンパク質が生産される細胞タイプを変えることができる。遺伝子のコード配列を−−例えば、その一部を異なる遺伝子のコード配列に融合させることによって−−大幅に変更して、融合タンパク質をコードする新規ハイブリッド遺伝子を生産することができる。融合タンパク質の生産方法の例は、参照により本明細書に援用されているＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ８７／０２９６８号、同第ＰＣＴ／ＵＳ８９／０３５８７号および同第ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７３３５号パンフレット、ならびにＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：６８に記載されている。本質的に、異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片の連結は、ライゲーションのための平滑末端またはジグザグ端（ｓｔａｇｇｅｒ−ｅｎｄｅｄ）末端、適切な末端を生じさせるための制限酵素消化、適宜の付着末端の充填、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションを用いる、従来の技術に従って行う。あるいは、自動ＤＮＡ合成装置をはじめとする従来の技術によって融合遺伝子を合成することができる。別の方法では、連続した２つの遺伝子断片間に相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行うことができ、その後、それらのオーバーハングをアニールしてキメラ遺伝子配列を生成することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２を参照されたい）。融合遺伝子によってコードされたキメラポリペプチドを、当該技術分野において周知であるような様々な発現系を使用して組換え生産してもよい（下記も参照されたい）。
【０１３４】
組換え結合体化キメラポリペプチドは、ＡＧＬポリペプチドが内在化モイエティのＮ末端またはＣ末端に結合体化されている実施形態を含む。
【０１３５】
融合タンパク質を組換えにより作製する方法は当該技術分野において周知であることに特に言及しておく。本明細書に記載のいずれのキメラタンパク質も容易に組換えによって作製することができる。これは、１つ以上のタグおよび／または１つ以上のリンカーを有するタンパク質を含む。例えば、キメラポリペプチドがｓｃＦｖ内在化モイエティを含む場合、そのキメラポリペプチドは、ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡを内在化モイエティに結合体化させる第一のリンカー、およびＶＨドメイン（例えば、配列番号６）をＶＬドメイン（例えば、配列番号８）に結合体化させるｓｃＦｖ中の第二のリンカーを含むことがある。さらに、ある一定の実施形態において、キメラポリペプチドは、そのキメラポリペプチドのＮ末端に「ＡＧＩＨ」部分（配列番号２５）を含み、かかるキメラポリペプチドを１つ以上のエピトープタグが存在するまたは不存在の状態で提供することがある。さらなる実施形態において、キメラポリペプチドは、そのポリペプチドの最Ｎ末端位置にセリンを含む。一部の実施形態において、キメラポリペプチドは、そのポリペプチドのＮ末端に「ＳＡＧＩＨ」（配列番号２６）部分を含み、かかるキメラポリペプチドを１つ以上のエピトープタグが存在するまたは不存在の状態で提供することがある。
【０１３６】
一部の実施形態では、米国特許出願公開第２００３／０１６６８７７号明細書に記載されているように、キメラポリペプチドに及ぶ連結領域内の候補Ｔ細胞エピトープを同定し、その連結領域内のアミノ酸を変えることによって、キメラポリペプチドの免疫原性を低減させることがある。
【０１３７】
本開示によるキメラポリペプチドは、非常に多くの目的に用いることができる。本明細書に記載する任意のキメラポリペプチドを本明細書に記載する任意の方法で使用することができること、およびかかる適する組み合わせを具体的に企図していることに、特に言及しておく。
【０１３８】
本明細書に記載するキメラポリペプチドを使用して、ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチドを細胞に、特に筋肉細胞、肝臓細胞またはニューロンに送達することができる。したがって、前記キメラポリペプチドを使用して、ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡの細胞へのインビトロまたはインビボ輸送を助長することができる。細胞への輸送を助長することによって、前記キメラポリペプチドは送達効率を改善し、かくしてＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチドでのインビトロまたはインビボ作用を助長する。さらに、輸送効率を上昇させることにより、前記キメラポリペプチドは、インビトロまたはインビボ実験に必要なＡＧＬまたは成熟ＧＡＡの量を減少させるのに役立つこともある。
【０１３９】
細胞においてキメラポリペプチドを組換えにより作製するための方法についてのさらなる詳細な説明を下に提供する。
【０１４０】
前記キメラポリペプチドを使用して、培養細胞におけるＡＧＬまたは成熟ＧＡＡの機能を研究することができ、ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡの輸送を研究することもできる。前記キメラポリペプチドを使用して、細胞中のＡＧＬまたは成熟ＧＡＡについての基質および／または結合パートナーを同定することができる。前記キメラポリペプチドをスクリーンに使用して、細胞中の成熟ＧＡＡまたはＡＧＬ活性の修飾因子（例えば、小有機分子またはポリペプチド修飾因子）を同定することができる。前記キメラポリペプチドを使用して、ヒトにおけるまたは動物モデルにおけるフォーブス・コリ病の症状（例えば、１つ以上の症状）の処置または緩和を助けることができる。前述は、対象キメラポリペプチドについての使用の単なる例である。
【０１４１】
前記ＡＧＬポリペプチド、ＧＡＡポリペプチド、内在化モイエティおよびリンカーの任意の特徴を兼備するキメラポリペプチドを含めて、本明細書に記載の任意のキメラポリペプチドを、本開示の任意の方法で使用してよい。
【０１４２】
ここでの、および本明細書中の他の箇所での、配列同一性は、配列全体について最大同一性パーセントを達成するために必要な場合には配列をアラインし、ギャップを導入した後の、および一切の保存的置換を配列同一性の一部とみなさない、候補配列を比較する対応配列の残基と同一である候補配列中の残基の百分率を指す。ＮおよびＣ末端伸長も挿入も、同一性または相同性を低下させるとみなさないものとする。
【０１４３】
配列のアラインメントおよび同一性パーセントの計算のための方法およびコンピュータプログラムは、当該技術分野において周知であり、容易に利用できる。配列解析ソフトウェアを使用して配列同一性を測定してもよい。例えば、デフォルトパラメータに設定された、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムなどの、ＥｘＰａｓｙバイオインフォマティクス・リソース・ポータルを通して利用できるアラインメントおよび解析ツール。ペアワイズまたはグローバルアラインメントに基づく適切な配列アラインメントおよび比較を容易に選択することができる。配列同一性および配列類似性パーセントの決定に適しているアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手できる。ある一定の実施形態では、特定のプログラムの今の最新のデフォルト設定を配列のアラインメントおよび同一性パーセントの計算に使用する。
【０１４４】
ＩＶ．ＡＧＬ／ＧＡＡ関連核酸および発現
ある一定の実施形態において、本開示は、ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチド（その機能性断片、変異体および融合体を含む）を生産するために核酸を使用する。ある一定の特定の実施形態において、前記核酸は、本開示の組換えキメラタンパク質を作製するための内在化モイエティ（例えば、抗体またはホーミングペプチド）をコードするＤＮＡをさらに含むことがある。これらの核酸すべてを総称してＡＧＬまたは成熟ＧＡＡ核酸と呼ぶ。
【０１４５】
前記核酸は、一本鎖または二本鎖、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であってよい。ある一定の実施形態において、本開示は、ＡＧＬヌクレオチド配列の領域（例えば、配列番号１７〜２２）または配列番号１５もしくは１６いずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする成熟ＧＡＡヌクレオチド配列の領域と少なくとも少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である単離されたまたは組換え核酸配列に関する。さらなる実施形態において、前記ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡ核酸配列は、単離されている場合があり、組換え型である場合があり、および／または異種ヌクレオチド配列と融合している場合があり、またはＤＮＡライブラリー中のものである場合がある。
【０１４６】
ある一定の実施形態において、ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡ核酸は、上述のネイティブＡＧＬもしくは成熟ＧＡＡヌクレオチド配列またはそれらの相補配列のいずれかに高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件を変えることができることは、通常の当業者には容易に理解されるであろう。例えば、約４５℃で６．０ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でのハイブリダイゼーション、続いて５０℃で２．０ｘＳＳＣの洗浄を行うことができよう。例えば、洗浄工程での塩濃度を５０℃で約２．０ｘＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃で約０．２ｘＳＳＣの高ストリンジェンシーまで選択することができる。加えて、洗浄工程の温度を室温、約２２℃での低ストリンジェンシー条件から約６５℃での高ストリンジェンシー条件に上昇させることができる。温度と塩の両方を変えてもよく、または他の変数を変化させつつ温度もしくは塩濃度を一定に保ってもよい。１つの実施形態において、本開示は、室温で６ｘＳＳＣの低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を提供し、ハイブリダイズ後、室温で２ｘＳＳＣで洗浄する。
【０１４７】
遺伝コードの縮重のためにネイティブＡＧＬまたは成熟ＧＡＡ核酸とは異なっている単離された核酸も本開示の範囲内である。例えば、多数のアミノ酸が複数のトリプレットによって表される。同じアミノ酸を指定するコドン、すなわちシノニム（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣは、ヒスチジンのシノニムである）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」突然変異をもたらすことがある。しかし、対象タンパク質のアミノ酸配列の変化につながるＤＮＡ配列多型が哺乳動物細胞間に存在すると予想される。特定のタンパク質をコードする核酸の１つ以上のヌクレオチド（ヌクレオチドの約３〜５％またはそれ未満）のこれらの変異が、天然対立遺伝子変異のため所与の種の個体間に存在することがあることは、当業者には理解されるであろう。任意のおよびすべてのかかるヌクレオチド変異および結果として生ずるアミノ酸多型が本開示の範囲内である。
【０１４８】
ある一定の実施形態では、前記組換えＡＧＬまたは成熟ＧＡＡ核酸を発現構築物中の１つ以上の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結させることがある。調節ヌクレオチド配列は、一般に、発現に用いられる宿主細胞に適切であるだろう。非常に多くのタイプの適切な発現ベクターおよび適する調節配列が当該技術分野において様々な宿主細胞について公知である。典型的に、前記１つ以上の調節ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を挙げることができるが、これらに限定されない。当該技術分野において公知であるような構成的または誘導性プロモーターを本開示は企図している。前記プロモーターは、天然に存在するプロモーターであってもよく、または１つより多くのプロモーターの要素を兼備するハイブリッドプロモーターであってもよい。発現構築物は、細胞内のプラスミドなどのエピソーム上に存在することもあり、または発現構築物は、染色体に挿入されることもある。好ましい実施形態において、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために選択マーカー遺伝子を含有する。選択マーカー遺伝子は、当該技術分野において周知であり、使用される宿主細胞によって異なることになる。ある一定の態様において、本開示は、ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチドをコードし、かつ少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されているヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。調節配列は当該技術分野において認知されており、そしてコードされたポリペプチドの発現を命じるために選択される。したがって、調節配列という用語は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御要素を含む。例示的調節配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）に記載されている。発現ベクターの設計が、形質転換させる宿主細胞の選択、および／または発現させることを所望するタンパク質タイプなどの因子に依存し得ることは、理解されるはずである。さらに、ベクターのコピー数、コピー数を制御する能力、および抗生物質マーカーなどのベクターによってコードされた任意の他のタンパク質の発現も考慮すべきである。
【０１４９】
一部の実施形態において、ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチドまたはその生物活性断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物は、内在化モイエティをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されており、前記核酸構築物は、ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡ生物活性を有するキメラポリペプチドをコードする。ある一定の実施形態において、前記核酸構築物は、リンカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含むことがある。
【０１５０】
本開示は、本開示のＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする組換え遺伝子でトランスフェクトされた宿主細胞にも関する。前記宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であってよい。例えば、ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチドまたはキメラポリペプチドを細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用する）、酵母または哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）において発現させてもよい。他の適する宿主細胞は、当業者に公知である。
【０１５１】
本開示は、さらに、本開示のＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチドまたはキメラポリペプチドを生産する方法に関する。例えば、ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を、そのポリペプチドの発現を起こさせるような適切な条件下で培養することができる。そのポリペプチドを含有する細胞と培地の混合物からそのポリペプチドを分泌させ、単離してもよい。あるいは、そのポリペプチドを細胞質にまたは膜画分中に保持し、細胞を回収し、溶解し、タンパク質を単離してもよい。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に適する培地は、当該技術分野において周知である。イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、および前記ポリペプチド（例えば、ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチド）の特定のエピトープに対して特異的な抗体を用いるイムノアフィニティー精製をはじめとする、当該技術分野において公知のタンパク質精製技術を用いて、前記ポリペプチドを細胞培養培地、宿主細胞または両方から単離することができる。好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、その精製を助長するドメインを含有する融合タンパク質である。
【０１５２】
組換えＡＧＬまたは成熟ＧＡＡ核酸は、クローン遺伝子またはその一部分を、原核細胞、真核細胞（酵母、鳥類、昆虫もしくは哺乳動物）または両方のいずれかにおける発現に適するベクターにライゲートすることによって生産することができる。組換えポリペプチドの生産のための発現ビヒクルとしては、プラスミドおよび他のベクターが挙げられる。例えば、適するベクターとしては、次のタイプのプラスミドが挙げられる：大腸菌などの原核細胞における発現のためのｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミドおよびｐＵＣ由来プラスミド。好ましい哺乳動物発現ベクターは、細菌におけるそのベクターの増殖を助長するための原核性配列と、真核細胞において発現される１つ以上の真核性転写ユニットの両方を含有する。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来ベクターが、真核細胞のトランスフェクションに適している哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターの一部をｐＢＲ３２２などの細菌プラスミドからの配列で修飾して、原核細胞および真核細胞両方における複製および薬剤耐性選択を助長する。あるいは、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン・バー・ウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）などのウイルスの誘導体を、真核細胞におけるタンパク質の一過性発現に使用することができる。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換に用いられる様々な方法が当該技術分野において周知である。原核細胞および真核細胞両方のための他の適する発現系、ならびに一般組換え手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）第１６および１７章を参照されたい。場合によっては、バキュロウイルス発現系の使用により組換えポリペプチドを発現させることが望ましいこともある。かかるバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来ベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（例えば、ｐＡｃＵＷ１）、およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（例えば、β−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃ  ＩＩＩ）が挙げられる。
【０１５３】
融合遺伝子の作製技術は周知である。本質的に、異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片の連結は、ライゲーションのための平滑末端またはジグザグ端（ｓｔａｇｇｅｒ−ｅｎｄｅｄ）末端、適切な末端を生じさせるための制限酵素消化、適宜の付着末端の充填、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションを用いる、従来の技術に従って行う。別の実施形態では、自動ＤＮＡ合成装置をはじめとする従来の技術によって融合遺伝子を合成することができる。あるいは、連続した２つの遺伝子断片間に相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行うことができ、その後、それらのオーバーハングをアニールしてキメラ遺伝子配列を生成することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２を参照されたい）。
【０１５４】
本開示は、キメラタンパク質を組換え生産する方法、例えば上に記載したものを企図している。タンパク質の例えば酵母または哺乳動物細胞における発現のための適するベクターおよび宿主細胞は、容易に選択され得る。宿主細胞は、キメラポリペプチドをコードするベクターを安定的に発現することもあり、または一過的に発現することもある。細胞培養培地から容易に単離することができるキメラポリペプチドを発現させるのに適する条件下で、かかる宿主細胞を培養してよい。
【０１５５】
本開示のキメラポリペプチド（例えば、ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡポリペプチド部分と内在化モイエティ部分とを含むポリペプチド）を単一ポリペプチド鎖として発現させてもよいし、または１本より多くのポリペプチド鎖として発現させてもよい。単一ポリペプチド鎖の例は、ｓｃＦｖである内在化モイエティにＡＧＬまたはＧＡＡ部分がインフレームで融合する場合である。ある一定の実施形態において、この単一ポリペプチド鎖は、単一ベクターから融合タンパク質として発現される。
【０１５６】
１本より多くのポリペプチド鎖の例は、内在化モイエティが抗体またはＦａｂである場合である。ある一定の実施形態では、前記抗体またはＦａｂの重鎖および軽鎖を、単一ベクターを発現する宿主細胞において発現させてもよいし、または２つのベクター（重鎖を発現するものおよび軽鎖を発現するもの）を発現する宿主細胞において発現させてもよい。いずれの場合も、例えば重鎖のＣ末端への、インフレーム融合体としてＡＧＬまたはＧＡＡポリペプチドを発現させてよく、それによりＡＧＬまたはＧＡＡポリペプチドは内在化モイエティに付けられるが、内在化モイエティの抗原結合領域からはある程度の距離に付けられる。
【０１５７】
上で述べたように、キメラポリペプチドをはじめとするポリペプチドを組換え発現させる方法は当該技術分野において周知である。特定のアミノ酸配列を有するＡＧＬまたはＧＡＡポリペプチド、例えばヒトＡＧＬまたはＧＡＡポリペプチド、を発現するヌクレオチド配列を入手でき、使用することができる。さらに、配列番号６および８に記載のＶＨおよびＶＬを含む３Ｅ１０抗体、ｓｃＦｖまたはＦａｂを発現するものなどの、内在化モイエティ部分を発現するヌクレオチド配列を公的に入手でき、適する重鎖および軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列と組み合わせることができる。本開示は、本開示のキメラポリペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列、かかるヌクレオチド配列を含むベクター（単一ベクターまたはベクターセット）、かかるベクターを含む宿主細胞、およびかかる宿主細胞を培養して本開示のキメラポリペプチドを発現させる方法を企図している。
【０１５８】
Ｖ．処置方法
本明細書に記載するいずれの方法についても、本開示は、本出願を通して記載する任意のキメラポリペプチドの使用を企図している。加えて、本明細書に記載するいずれの方法についても、本開示は、１つの方法の任意のステップ（単数もしくは複数）と別の方法からの任意のステップ（単数もしくは複数）の組み合わせを企図している。
【０１５９】
ある一定の実施形態において、本開示は、培養細胞（インビトロまたはエクスビボ）、および被験体の細胞をはじめとする細胞に、キメラポリペプチドを送達する方法を提供する。培養細胞、例えば健常細胞または疾病モデルからの細胞、への送達には、非常の多く使い道がある。これらの使用には、ＡＧＬおよび／またはＧＡＡ基質あるいは結合パートナーを同定するための使用、（例えば、細胞質、リソソームおよび／または自己貪食小胞への）局在化および／または輸送を評価するための使用、様々な条件（例えば、ｐＨ）下での酵素活性を評価するための使用、グリコーゲン蓄積を評定するための使用などが含まれる。ある一定の実施形態では、健常または疾病状況でのＡＧＬおよび／またはＧＡＡ活性、局在化および輸送を理解するために本開示のキメラポリペプチドを試薬として使用することができる。
【０１６０】
被験体への、例えば被験体の細胞への送達には非常に多くの使い道がある。例示的な治療的使用を下で説明する。さらに、診断または研究目的でキメラポリペプチドを使用してもよい。例えば、本開示のキメラポリペプチドを検出可能に標識し、被験体、例えば疾患の動物モデルまたは患者に投与し、そして被験体の組織内のそのキメラポリペプチド（例えば、筋肉および／または肝臓への局在化）を撮像するために使用してもよい。加えて、例示的使用としては、被験体の細胞への、例えば疾患（例えばフォーブス・コリ病）の動物モデルへの送達が挙げられる。例として、健常または罹病動物におけるＡＧＬおよび／またはＧＡＡ生物活性、局在化および輸送、タンパク質間相互作用、酵素活性、ならびに動物生理に対する影響を理解するために本開示のキメラポリペプチドを試薬として使用して動物に送達してもよい。
【０１６１】
ある一定の実施形態において、本開示は、異常細胞質グリコーゲンに関連付けられる状態、例えばフォーブス・コリ病、を処置する方法を提供する。これらの方法は、治療有効量の上記のキメラポリペプチドを個体に投与するステップを含む。これらの方法は、動物およびより詳細にはヒトの治療的および予防的処置を特に目的とする。フォーブス・コリ病を処置するための方法については、本開示は、任意の上述の態様および実施形態の組み合わせ、ならびに「発明を実施するための形態」および「実施例」に記載の任意の実施形態との任意の組み合わせすべてを企図している。
【０１６２】
本開示は、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター（ＥＮＴ）経路などにより細胞にキメラポリペプチドまたは核酸構築物を送達する方法であって、細胞をキメラポリペプチドまたは核酸構築物と接触させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態において、本開示は、ＥＮＴ１、ＥＮＴ２、ＥＮＴ３またはＥＮＴ４経路により細胞にキメラポリペプチドまたは核酸構築物を送達する方法を提供する。ある一定の実施形態において、前記方法は、細胞とキメラポリペプチドを接触させるステップをさらに含み、このキメラポリペプチドは、ＡＧＬもしくは成熟ＧＡＡポリペプチドまたはその生物活性断片と、ＥＮＴ２経路による細胞膜を横断する輸送、その結果、そのキメラポリペプチドの細胞への送達を媒介する内在化モイエティとを含む。ある一定の実施形態において、前記細胞は筋肉細胞である。本請求項記載の方法を用いて標的化される筋肉細胞は、骨格筋細胞、心筋細胞または平滑筋細胞を含み得る。
【０１６３】
本開示は、筋肉細胞以外の細胞への出入りを可能にする経路によってキメラポリペプチドまたは核酸構築物を細胞に送達する方法も提供する。本請求項記載の方法を用いて標的化され得る他の細胞タイプとしては、例えば、ニューロンおよび肝臓細胞が挙げられる。
【０１６４】
フォーブス・コリ病は、糖原病ＩＩＩ型または限界デキストリン症としても公知であり、８３，０００〜１００，０００回の生児出生に１回の推定発生率を有する常染色体劣性神経筋／肝疾患である。フォーブス・コリ病は、全糖原病の約２４％に相当する。フォーブス・コリ病の臨床像は、かなりよく確立されているが、可変的である。フォーブス・コリ病患者は、骨格筋症、心筋症、肝硬変、肝腫脹、低血糖、低身長、脂質異常症、軽度知的障害、顔面の異常、および／または骨粗鬆症リスク増加を被ることがある（Ｏｚｅｎら、２００７、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、１３（１８）：２５４５−４６）。筋肉病変を伴う形態のフォーブス・コリ病は、筋衰弱、疲労および筋委縮を呈することがある。進行性筋衰弱および遠位筋消耗は、患者が２０代または３０代に入ると日常生活に支障を来すようになることが多いが、この状態は、多くの日本人患者において小児期に始まると報告されている。
【０１６５】
用語「処置」、「処置すること」などは、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを一般に意味するために本明細書では用いている。前記効果は、疾患、状態もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防する観点から予防的であることもあり、ならびに／あるいは疾患もしくは状態についてのおよび／またはその疾患もしくは状態に帰する有害作用についての部分的または完全治癒の観点から治療的であることもある。本明細書において用いる場合の「処置」は、哺乳動物、特にヒトの疾患または状態の任意の処置を包含し、（ａ）その疾患もしくは状態の素因を有するかもしれないが、まだそれを有すると診断されていない被験体においてその疾患もしくは状態の発症を予防すること；（ｂ）その疾患もしくは状態を抑制すること（例えば、その発現を阻止すること）；または（ｃ）その疾患もしくは状態を寛解すること（例えば、その疾患もしくは状態の退行を生じさせること、１つ以上の症状の改善をもたらすこと）を含む。例えば、フォーブス・コリ病の「処置」は、この疾患の完全逆転もしくは治癒、またはフォーブス・コリ病に帰する状態および／もしくは有害作用の任意の範囲の改善を包含する。単に説明するために、フォーブス・コリ病の「処置」は、フォーブス・コリ病に関連付けられる次の作用のいずれかまたはそれらの組み合わせの改善を含む：骨格筋症、心筋症、肝硬変、肝腫脹、低血糖、低身長、脂質異常症、成長障害、知的障害、顔面の異常、骨粗鬆症、筋衰弱、疲労および筋委縮。処置は、異常な細胞質グリコーゲンレベルの低下、アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼまたはクレアチンホスホキナーゼのうちの１つ以上の上昇したレベルの低下、例えば血清中のかかるレベルの低下、のうちの１つ以上も含むことがある。これらの状態のいずれの改善も、当該技術分野において公知の標準的方法および技術に従って容易に評定することができる。上に挙げていない他の症状も、フォーブス・コリ病の処置の有効性を判定するためにモニターしてよい。前記方法によって処置される前記疾患の被験体の集団は、望ましくない状態または疾患に罹患している被験体、ならびにその状態または疾患を発現するリスクがある被験体も含む。
【０１６６】
用語「治療有効用量」は、所望の効果を生じさせる用量であって、そのために投与される用量を意味する。正確な用量は、処置の目的に依存することになり、当業者は公知の技術を用いてそれを突き止めることができよう（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照されたい）。
【０１６７】
ある一定の実施形態では、本開示の１つ以上のキメラポリペプチドを一緒に（同時に）投与することができ、または異なる時点で（逐次的に）投与することができる。加えて、本開示のキメラポリペプチドを単独で投与することができ、またはフォーブス・コリ病を処置するためのまたは一般に糖原病を処置するための１つ以上の追加の化合物または療法と併用で投与することができる。例えば、１つ以上のキメラポリペプチドを１つ以上の治療化合物とともに併用投与することができる。例えば、ＡＧＬを含むキメラポリペプチド、およびＧＡＡを含むキメラポリペプチドを両方とも患者に投与してもよい。併用投与が指示される場合、その併用療法は、同時投与または交互投与を包含し得る。加えて、前記併用は、急性投与または慢性投与を包含し得る。場合により、本開示のキメラポリペプチドと追加の化合物がフォーブス・コリ病の処置に相加的または相乗的に作用する。併用療法で使用することになる追加の化合物としては、小分子、ポリペプチド、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ分子が挙げられるが、これらに限定されない。併用療法の性質に依存して、本開示のキメラポリペプチドの投与を、他の療法が投与されている間、および／またはその後、続けてよい。前記キメラポリペプチドの投与を単回用量で行ってもよいし、または複数回用量で行ってもよい。ある場合には、前記キメラポリペプチドの投与を他の療法の少なくとも数日前に開始するが、他の場合には、投与を、他の療法の投与直前にまたは他の療法の投与と同時に開始する。
【０１６８】
併用療法のもう１つの例では、１つ以上の追加の処置法と組み合わせた治療レジメンの一部として本開示の１つ以上のキメラポリペプチドを使用することができる。例として、かかる他の処置法としては、食事療法、作業療法、物理療法、人工呼吸器支持療法、マッサージ、鍼療法、指圧療法、移動補助、介助動物などが挙げられるが、これらに限定されない。フォーブス・コリ病の現行処置は、単独でのまたは胃経管栄養法を伴う、炭水化物の多い食事およびトウモロコシデンプンを含む。筋疾患を有する患者には、旧来、高タンパク質食も食べさせる。本開示のキメラポリペプチドをこれらの食餌療法とともに投与してもよい。他の実施形態において、本開示の方法は、患者が食事レジメンを続ける必要を低減させる。
【０１６９】
ある一定の実施形態では、本開示の１つ以上のキメラポリペプチドを肝臓移植前にまたは後に投与することができる。
【０１７０】
本明細書に記載するキメラポリペプチドを他の療法と併用することができるが、ある一定の実施形態では、キメラポリペプチドを単独形態の治療として提供することに留意されたい。単独で投与するのか、または他の薬物療法もしくは治療レジメンと併用で投与するのかにかかわらず、前記キメラポリペプチドの投薬量、投与頻度、投与経路、および投与のタイミングは、患者の状態および必要に基づいて医師により決定される。
【０１７１】
ＶＩ．遺伝子療法
従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子導入法を用いて、ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡのポリペプチドをコードする核酸を哺乳動物細胞または標的組織に導入することができる。かかる方法を用いて、本開示のポリペプチド（例えば、ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡ（その変異体を含む））をコードする核酸を細胞にインビトロで投与することができる。一部の実施形態では、ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡをコードする核酸をインビボまたはエクスビボ遺伝子用途のために投与する。他の実施形態では、キメラポリペプチドまたはＡＧＬおよび／もしくはＧＡＡポリペプチドの活性を研究するために、あるいは細胞ベースのモデルまたは動物モデルにおいてフォーブス・コリ病を研究するために、例えば、健常または罹病細胞および組織への送達後に細胞輸送、酵素活性およびタンパク質間相互作用を評価するために、遺伝子送達技術を用いる。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、およびリポソームなどの送達ビヒクルと複合体化された核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、細胞への送達後にエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムいずれかを有する、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられる。かかる方法は、当該技術分野において周知である。
【０１７２】
本開示の改変ポリペプチドをコードする核酸の非ウイルス送達方法としては、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸結合体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤増進ＤＮＡ取り込みが挙げられる。リポフェクション法およびリポフェクション試薬は当該技術分野において周知である（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適しているカチオン性および中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号パンフレット、国際公開第９１／１６０２４号パンフレットのものが挙げられる。送達は、細胞へのもの（エクスビボ投与）または標的組織へのもの（インビボ投与）である場合がある。免疫脂質複合体などの標的化リポソームをはじめとする脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である。
【０１７３】
ＡＧＬまたは成熟ＧＡＡまたはそれらの変異体をコードする核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースの系の使用は、ウイルスを体内の特異的細胞に標的化するため、およびウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化したプロセスを活用する。ウイルスベクターを直接患者に（インビボ）投与することができ、またはウイルスベクターを使用して細胞をインビトロで処置することができ、修飾された細胞を患者に（エクスビボ）投与する。本開示のポリペプチドの送達のための従来のウイルスベースの系としては、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴および単純疱疹ウイルスベクターを挙げることができよう。ウイルスベクターは、標的細胞および組織内への遺伝子導入の現在最も効率的かつ用途の広い方法である。宿主ゲノムへの組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス遺伝子導入法で可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。加えて、高い形質導入効率が多くの異なる細胞タイプおよび標的組織で観察されている。
【０１７４】
外来エンベロープタンパク質を組み込むことによってレトロウイルスの親和性を変更し、それによって標的細胞の潜在的標的集団を増やすことができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入するまたは感染させることができ、かつ典型的に高ウイルス力価を生じさせることができるレトロウイルスベクターである。したがって、レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、６〜１０ｋｂまたはそれ未満の外来配列に対するパッケージング容量を有するシス作用性長鎖末端反復配列から成る。前記最小シス作用性ＬＴＲは、これらのベクターの複製およびパッケージングに十分なものであり、したがって、これらのベクターは、治療用遺伝子を標的細胞に組み込んで永久導入遺伝子発現をもたらすために使用される。広範に用いられているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬ  Ｖ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬ  Ｖ）、シミアン免疫不全ウイルス（ＳＷ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に基づくものおよびこれらの組み合わせが挙げられ、これらのすべてが当該技術分野において周知である。
【０１７５】
本開示のポリペプチドの一過性発現が好ましい応用例では、アデノウイルスベースの系を典型的に使用する。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞タイプにおいて非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。かかるベクターを用いて、高い発現力価およびレベルが得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に生産することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターもまた、標的核酸を細胞に形質導入するために、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ生産において、ならびにインビボおよびエクスビボ遺伝子療法手順のために使用される。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号明細書；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ＆  Ｍｕｚｙｃｚｋａ、ＰＮＡＳ  ８１：６４６６−６４７０（１９８４）；およびＳａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）をはじめとする多数の出版物に記載されている。
【０１７６】
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠陥および非病原性パルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づく有望な代替遺伝子送達系である。すべてのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ１４５ｂｐ逆方向末端反復配列のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入細胞のゲノムへの組み込みに起因する効率的遺伝子導入および安定した導入遺伝子送達は、このベクター系の極めて重要な特徴である。
【０１７７】
複製欠損性組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）を、導入遺伝子がＡｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂおよびＥ３遺伝子を置換するように改変することができ；その後、その複製デフェクターベクター（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄｅｆｅｃｔｏｒ  ｖｅｃｔｏｒ）を、欠失した遺伝機能をトランスで供給するヒト２９３細胞において増殖させる。Ａｄベクターは、非分裂性分化細胞、例えば、肝臓、腎臓および筋肉系組織において見いだされるものを含めて、複数の組織タイプにインビボで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きな担持容量を有する。
【０１７８】
パッケージング細胞は、宿主細胞を感染させることが可能であるウイルス粒子を形成するために使用される。かかる細胞としては、アデノウイルスをパッケージする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージする４２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法で使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージするプロデューサー細胞系統によって産生される。前記ベクターは、典型的に、パッケージングおよびその後の宿主への組み込みのために必要な最小のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、タンパク質を発現するための発現カセットによって置換される。失われたウイルス機能は、パッケージング細胞系統によってトランスで供給される。例えば、遺伝子療法で使用されるＡＡＶベクターは、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組み込みに必要とされるＡＡＶゲノムからのＩＴＲ配列しか典型的には有さない。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐ、をコードするがＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞系統にパッケージされる。この細胞系統もまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスで感染される。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠くため有意な量ではパッケージされない。アデノウイルスでの汚染は、例えば、アデノウイルスの方がＡＡＶより敏感である熱処理によって低減させることができる。
【０１７９】
多くの遺伝子療法応用例では、遺伝子療法ベクターを特定の組織タイプに対して高い特異度で送達することが望ましい。ウイルスベクターは、典型的に、ウイルスの外面にウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることにより所与の細胞タイプに対して特異性を有するように修飾される。目的の細胞タイプ上に存在することが公知の受容体に対して親和性を有するリガンドが選択される。この原理を、リガンド融合タンパク質を発現するウイルスと受容体を発現する標的細胞の他のペアに拡大することができる。例えば、実質的に任意の選択された細胞受容体に対して特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように糸状ファージを改変することができる。上の説明は主としてウイルスベクターに当てはまるが、同じ原理を非ウイルスベクターに当てはめることができる。かかるベクターを、筋肉細胞などの特定の標的細胞による取り込みに有利であると考えられる特定の取り込み配列を含有するように改変することができる。
【０１８０】
遺伝子療法ベクターを、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下もしくは頭蓋内注入）または局所適用による個々の患者への投与によってインビボで送達することができる。あるいは、ベクターをエクスビボで細胞、例えば、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検材料）または万能供血者造血幹細胞に送達し、その後、通常はベクターを組み込まれた細胞を選択した後、それらの細胞を患者に再び内植することができる。
【０１８１】
診断、研究のための、または遺伝子療法のための（例えば、トランスフェクト細胞の宿主生物への再注入による）エクスビボ細胞トランスフェクションは、当業者に周知である。例えば、細胞を被験体生物から単離し、例えばＡＧＬまたは成熟ＧＡＡまたはそれらの変異体をコードする核酸（遺伝子またはｃＤＮＡ）でトランスフェクトし、そして被験体生物（例えば患者）に再び注入して戻す。エクスビボトランスフェクションに適する様々な細胞タイプが当業者に周知である。
【０１８２】
ある一定の実施形態では、細胞トランスフェクションおよび遺伝子療法のためのエクスビボ手順において幹細胞を使用する。幹細胞を使用する利点は、それらを他の細胞タイプにインビトロで分化させることができること、またはそれらが骨髄に外植されることになる哺乳動物（例えば、細胞のドナー）にそれらを導入することができることである。公知の方法を用いて遺伝子導入および分化のために幹細胞を単離する。
【０１８３】
治療用核酸を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）をインビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することもできる。あるいは、裸のＤＮＡを投与することができる。投与は、分子を血液または組織細胞と最終的に接触させるために通常使用される任意の経路による。かかる核酸の適する投与方法を利用でき、前記方法は当業者に周知であり、および１つより多くの経路を用いて特定の組成物を投与することができるが、特定の経路が別の経路より即時的かつ有効な反応をもたらすことができることがしばしばある。
【０１８４】
薬学的に許容され得る担体は、一部は、投与される特定の組成物によって、ならびにその組成物を投与するために用いられる特定の方法によって決まる。したがって、本明細書に記載するように、本開示の医薬組成物の多種多様な適する製剤がある。
【０１８５】
ＶＩＩ．投与方法
様々な送達系、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル内への封入、化合物を発現することが可能な組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照されたい）が公知であり、本開示のキメラポリペプチドを投与するためにそれらを使用することができる。導入方法は、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、肺、鼻腔内、眼内、硬膜外および経口経路を含むがこれらに限定されない、経腸的または非経口的なものであり得る。前記キメラポリペプチドを任意の適便な経路によって、例えば、注入もしくはボーラス注射によって、上皮もしくは粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）による吸収によって投与してよく、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与してもよい。投与は、全身性または局所性であることができる。加えて、本開示の医薬組成物を、中枢神経系に、硬膜外注射、鼻腔内投与または脳室内および髄腔内注射をはじめとする任意の適する経路によって導入することが望ましいことがあり；脳室内注射を、例えばオマヤリザーバーなどのリザーバーに取り付けた、脳室内カテーテルによって助長してもよい。肺投与を、例えば、吸入器またはネブライザー、およびエーロゾル化剤を伴う製剤の使用により、用いてもよい。ある一定の実施形態では、本開示の医薬組成物を肝門脈への注射または注入により投与することが望ましいこともある。ある一定の実施形態において、肝静脈カテーテルを用いて本開示の医薬組成物を投与してもよい。
【０１８６】
ある一定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドを、処置を必要とするエリア（例えば筋肉）に局所的に投与することが望ましいこともある；これは、例えば、限定としてではないが、外科手術中の局所注入、例えば、注射による、カテーテルによる、またはインプラントにる局所適用によって達成することができ、前記インプラントは、膜、例えばサイラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜、繊維または市販の代用皮膚を含む、多孔質、無孔またはゲル状材料のものである。
【０１８７】
一部の実施形態では、前記キメラポリペプチドを局所投与すること、例えば、点眼法を用いて目に投与することが望ましいことがある。別の実施形態において、かかる局所投与は、心臓のすべてまたは一部分へのものであることができる。例えば、投与は、心膜内または心筋内投与によるものであり得る。同様に、心臓の様々な領域への薬剤の送達を意図したカテーテル、ワイヤなどを使用して、心臓組織への投与を達成することができる。
【０１８８】
他の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドを小胞で、特にリポソームで送達することができる（Ｌａｎｇｅｒ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３を参照されたい）。さらに別の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドを制御放出系で送達することができる。別の実施形態では、ポンプを使用することもある（Ｌａｎｇｅｒ、１９９０、上掲を参照されたい）。別の実施形態では、高分子材料を使用することができる（Ｈｏｗａｒｄら、１９８９、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５を参照されたい）。ある一定の特定の実施形態では、本開示のキメラポリペプチドを静脈内送達することができる。
【０１８９】
ある一定の実施形態では、前記キメラポリペプチドを静脈内注入によって投与する。ある一定の実施形態では、前記キメラポリペプチドを少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも３０分間にわたって注入する。他の実施形態では、前記キメラポリペプチドを少なくとも６０、９０または１２０分間にわたって注入する。注入期間にかかわらず、本開示は、各注入が、キメラポリペプチドを規則的なスケジュール（例えば、週１回、月１回など）に従って投与する総合的な処置計画の一部であることを企図している。
【０１９０】
ＶＩＩＩ．医薬組成物
ある一定の実施形態では、本開示の対象キメラポリペプチドを、薬学的に許容され得る担体を用いて製剤化する。１つ以上のキメラポリペプチドを単独でまたは医薬製剤（組成物）の成分として投与することができる。ヒトまたは獣医学での使用のための任意の適便な方法で投与するために前記キメラポリペプチドを製剤化してよい。湿潤剤、乳化剤および滑沢剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、着香剤および芳香剤、保存薬および酸化防止剤も前記組成物中に存在することができる。
【０１９１】
対象キメラポリペプチドの製剤は、経口、鼻、局所、非経口、直腸および／または膣内投与に適しているものを含む。前記製剤を単位剤形で適便に提供してよく、および薬学技術分野において周知の任意の方法によって調製してよい。単一剤形を製造するために担体材料と併せることができる活性成分の量は、処置される宿主、および特定の投与方式に依存して変わることになる。単一剤形を製造するために担体材料と併せることができる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じさせる化合物の量であろう。
【０１９２】
ある一定の実施形態において、これらの製剤または組成物を調製する方法は、別のタイプの治療剤および担体、ならびに場合により１つ以上の補助成分を併せる工程を含む。一般に、液体担体、または微粉固体担体、または両方を用いて製剤を調製し、その後、必要に応じて生成物を成形する。
【０１９３】
経口投与用の製剤を、各々が所定量の対象ポリペプチド治療剤を活性成分として含有する、カプセル、カシェ剤、ピル、錠剤、ロゼンジ（香味基剤、通常はスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントを使用）、粉末、顆粒の形態で、または水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油型もしくは油中水型液体エマルジョンとして、またはエリキシルもしくはシロップとして、または香剤（不活性基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴムを使用）として、および／またはマウスウォッシュなどとして投与してよい。懸濁液は、活性化合物に加えて、懸濁化剤、例えばエトキシ化イソステアリルアルコール、ポリエチレンソルビトール、およびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにこれらの混合物を含有することがある。
【０１９４】
経口投与用の固体剤形（カプセル、錠剤、ピル、糖衣丸、粉末、顆粒など）の場合、本開示の１つ以上のキメラポリペプチド治療剤を、１つ以上の薬学的に許容され得る担体、例えばクエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、および／または次のもののいずれかと混合してもよい：（１）フィラーまたは増量剤、例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸；（２）結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアラビアゴムなど；（３）保湿剤、例えばグリセロール；（４）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある一定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム；（５）溶解遅延剤、例えばパラフィン；（６）吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合物；（７）湿潤剤、例えばセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなど；（８）吸収剤、例えばカオリンおよびベントナイト粘土；（９）滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびこれらの混合物；ならびに（１０）着色剤。カプセル、錠剤およびピルの場合、医薬組成物は、緩衝剤も含むことがある。同様のタイプの固体組成物を、ラクトースまたは乳糖などの賦形剤および高分子量ポリエチレングリコールなどを使用して軟充填カプセルおよび硬充填カプセル中の充填物として利用してもよい。経口投与用の液体剤形としては、薬学的に許容され得るエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルが挙げられる。活性成分に加えて、前記液体剤形は、当該技術分野において一般に使用されている不活性希釈剤、例えば水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリル（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒｙｌ）アルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含有することがある。不活性希釈剤に加えて、前記経口組成物は、アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、着色剤、芳香剤および保存剤も含むことができる。
【０１９５】
特定の実施形態において、本開示の方法は、皮膚、または粘膜、例えば子宮頚および膣上の粘膜のいずれかへ局所投与され得る。局所製剤は、皮膚または角質層浸透増進剤として有効であることが公知の広範な薬剤の１つ以上をさらに含むことがある。これらの例は、２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、プロピレングリコール、メチルまたはイソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシドおよびアゾンである。前記製剤を化粧品として許容され得るものにするために追加の薬剤をさらに含むことがある。これらの例は、脂肪、ワックス、油、色素、着香剤、保存剤、安定剤および界面活性剤である。当該技術分野において公知のものなどの角質溶解剤も含むことがある。例は、サリチル酸および硫黄である。局所または経皮投与用の剤形としては、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入薬が挙げられる。対象ポリペプチド治療剤を薬学的に許容され得る担体と、および必要とされ得る保存剤、緩衝剤または噴射剤と無菌条件下で混合してもよい。軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、対象ポリペプチド剤に加えて、賦形剤、例えば、動物および植物脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはこれらの混合物を含有することがある。粉末およびスプレーは、対象キメラポリペプチドに加えて、賦形剤、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物を含有することができる。スプレーは、通例の噴射剤、例えば、クロロフルオロ炭化水素および揮発性非置換炭化水素、例えばブタンおよびプロパンを追加で含有することができる。
【０１９６】
非経口投与に適する医薬組成物は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、その製剤を所期のレシピエントの血液と等張にさせる溶質、または懸濁化もしくは増粘剤を含有し得る１つ以上の薬学的に許容され得る滅菌等張水性または非水性溶液、分散液、懸濁液もしくはエマルジョン、または使用直前に滅菌注射用溶液もしくは分散液に再構成され得る滅菌粉末との組み合わせで、１つ以上のキメラポリペプチドを含むこともある。本開示の医薬組成物において用いてもよい、適する水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適する混合物、植物油、例えばオリーブ油、ならびに注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用により、分散液の場合は必要粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。
【０１９７】
これらの組成物は、アジュバント、例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤も含有することがある。微生物の作用の予防を、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることによって確実なものにしてもよい。等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを組成物に含めることが望ましいこともある。加えて、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによって、注射用医薬剤形の持続性吸収をもたらしてもよい。
【０１９８】
注射用デポー形は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生体分解性ポリマー中の１つ以上のポリペプチド治療剤のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製される。薬物のポリマーに対する比、および用いられる特定のポリマーの性質に依存して、薬物放出速度を制御することができる。他の生体分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用製剤は、体組織と適合性であるリポソームまたはマイクロエマルジョンの中に薬物を捕捉することによっても調製される。
【０１９９】
好ましい実施形態では、本開示のキメラポリペプチドを、日常的手順に従って、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として製剤化する。必要な場合には、前記組成物は、可溶化剤、および注射部位の痛みを和らげるためのリドカインなどの局所麻酔薬も含むことがある。前記組成物を注入によって投与すべき場合、医薬品グレードの滅菌水または食塩水が入っている輸液ボトルでそれを投薬することができる。前記組成物を注射によって投与する場合、成分を投与前に混合してもよいように注射用滅菌水または食塩水のアンプルを提供することができる。
【０２００】
組織関連状態または疾患（例えば、フォーブス・コリ病の）の処置に有効であろう本開示のキメラポリペプチドの量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。加えて、最適な投薬範囲の特定に役立つようにインビトロアッセイを場合により用いてもよい。製剤に用いる正確な用量は、投与経路およびその状態の重症度にも依存することになり、施術者の判断および各被験体の状況に従ってその正確な用量を決定すべきである。しかし、静脈内投与の適する投薬範囲は、一般に、体重１キログラムにつき約２０〜５０００マイクログラムの活性キメラポリペプチドである。鼻腔内投与の適する投薬範囲は、一般に約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重から１ｍｇ／ｋｇ体重である。インビトロまたは動物モデル試験系から導出された用量−応答曲線から有効用量を推定してもよい。
【０２０１】
ＩＸ．動物モデル
ＡＧＬ遺伝子のフレームシフト突然変異を有するカーリーコーテッドレトリバーイヌは、ヒトのフォーブス・コリ病に類似した疾患を提示する（Ｙｉら、２０１２、Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ、５：８０４−８１１）。これらのイヌは、それらの肝臓および筋肉内に、筋肉および肝臓損傷に合致した、異常に多いグリコーゲン沈着物を有するとともに、それらの血清中に高いかつ漸増レベルのアラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼおよびクレアチンホスホキナーゼを有する。Ｙｉらを参照されたい。加えて、これらのイヌは、進行性肝臓線維症、および筋肉細胞収縮装置の破壊、および筋原線維の摩損を提示した。Ｙｉらを参照されたい。したがって、フォーブス・コリのこのイヌモデルは、進行性肝線維症および筋疾患につながる肝臓および骨格筋へのグリコーゲン蓄積を伴うヒト疾患に近似している。Ｙｉらを参照されたい。
【０２０２】
フォーブス・コリのマウスモデルも最近開発された。このモデルの場合、マウスは、ＡＧＬ遺伝子内に単一ＥＮＵ誘発塩基対突然変異を有する。フォーブス・コリのヒト患者に似て、これらのマウスは、肝臓損傷を示すレベルである、持続的に上昇したトランスアミナーゼおよびアスパラギン酸トランスアミナーゼレベルを提示する。Ａｎｓｔｅｅら、２０１１、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、５４（Ｓｕｐｐ  １−Ａｂｓｔｒａｃｔ  ８８７）：Ｓ３５３。これらのマウスは、著しく増加した肝臓グリコーゲン沈着も提示する。Ａｎｓｔｅｅらを参照されたい。したがって、これらのマウスは、フォーブス・コリ病のヒト患者においても観察されるいくつかの極めて重要な特徴を提示する。
【０２０３】
これらのモデルは、対象キメラポリペプチドの活性および有効性を評定するための適する動物モデルシステムになる。これらのモデルは、フォーブス・コリ病の症状と相関関係を有し、したがって、フォーブス・コリ病を研究するための適切なモデルになる。前記ポリペプチドの活性を一方または両方のモデルで評定することができ、それらの結果を野生型対照動物および前記キメラポリペプチドで処置していない動物で観察された結果と比較することができる。フォーブス・コリマウスまたはイヌの処置における本明細書に開示する任意のキメラポリペプチドの有効度を評定するために使用してもよいアッセイとしては、例えば、血清中のアラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼおよび／もしくはクレアチンホスホキナーゼレベルを評定するアッセイ；処置および未処置フォーブス・コリマウスもしくはイヌからの生検試料におけるグリコーゲンレベルを（例えば、筋肉または肝臓生検材料中のグリコーゲンレベルを、例えば、グリコーゲンレベルを判定するための過ヨウ素酸シッフ染色を使用して、検査することにより）評定するアッセイ；組織グリコーゲンレベルを評定するアッセイ（例えば、Ｙｉら、２０１２を参照されたい）；ならびに／または処置および未処置フォーブス・コリ・イヌもしくはマウスにおいて筋肉機能、心機能、肝臓機能および／もしくは寿命をモニターするアッセイが挙げられる。本明細書に開示するキメラポリペプチドの活性を試験するためのインビトロアッセイのもう１つの例は、基質としての４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコシドを加水分解する前記キメラポリペプチドの能力を評定する細胞または無細胞アッセイであろう。
【０２０４】
本開示のキメラポリペプチドには、インビトロおよびインビボ使用を含めて、非常に多くの使い道がある。インビボ使用は、治療的使用のみならず、例えば上述の動物モデルのずれかにおける、診断および研究使用も含む。例として、健常または罹病（ｄｉｓｅａｓｅｓ）動物におけるＡＧＬおよび／またはＧＡＡ生物活性、局在および輸送、タンパク質間相互作用、酵素活性、ならびに動物生理に対する影響を理解するために本開示のキメラポリペプチドを研究試薬として使用して動物に送達してよい。
【０２０５】
例えば、健常ならびにＡＧＬおよび／またはＧＡＡ欠乏培養細胞をはじめとする培養細胞におけるＡＧＬまたはＧＡＡ生物活性、局在および輸送、タンパク質間相互作用ならびに酵素活性を評価するために、キメラポリペプチドをインビトロで使用してもよい。本開示は、本開示のキメラポリペプチドが、培養細胞をはじめとする細胞の細胞質、リソソームおよび／または自己貪食小胞にＡＧＬおよび／またはＧＡＡを送達するために使用され得ることを企図している。一部の実施形態において、本明細書に記載する任意のキメラポリペプチドを、突然変異イヌもしくはマウスから調製した細胞、またはフォーブス・コリ病に罹患しているヒトからの細胞、例えば線維芽細胞、から調製した細胞において使用してもよい。加えて、当業者は、所与の細胞系統におけるＡＧＬ遺伝子を突然変異させることによりフォーブス・コリ細胞系統を産生することができる。
【０２０６】
Ｘ．キット
ある一定の実施形態において、本開示は、本開示の少なくとも１つのキメラポリペプチドを充填した１つ以上の容器を含む医薬パッケージまたはキットも提供する。場合により、医薬またはバイオ製品の製造、使用または販売を監督する政府機関によって命じられた形式での注意書きがかかる容器（単数または複数）に付随することがあり、この注意書きは、（ａ）ヒトへの投与のための製造、使用もしくは販売についての前記機関による承認、（ｂ）使用説明書、または両方を示す。
【０２０７】
例示
さて、本開示を一般的に説明することにするが、単に本開示のある一定の態様および実施形態の説明のために含めるものであり、本開示を限定することを意図したものではない以下の実施例を参照することによって、本開示は、より容易に理解されるであろう。例えば、本明細書に開示する個々の構築物および実験設計は、適正な機能を検証するための例示的ツールおよび方法の代表である。したがって、開示する特定の構築物および実験計画のいずれも、本開示の範囲内で置換できることは、容易にわかるであろう。
【実施例】
【０２０８】
（実施例１）
３Ｅ１０とｈＡＧＬの化学的結合体化（ｍＡｂ３Ｅ１０＊ｈＡＧＬ）
化学的結合体化
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸スクシンイミジルおよびトランス−４−（マレイミジルメチル）シクロ−ヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジルという２つの異なるヘテロ二官能性試薬を使用して、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（この重鎖可変ドメインは、上で言及したように、ＡＴＣＣに寄託された原マウス３Ｅ１０抗体の重鎖可変ドメインに対して単一アミノ酸置換を有する）にグリシン／セリンリンカーによって相互接続されている配列番号８に対応する軽鎖可変ドメイン（これは、上で言及したように、ＡＴＣＣに寄託された原マウス３Ｅ１０抗体の軽鎖可変ドメインに対応する）を含む１０ミリグラム（１０ｍｇ）の３Ｅ１０  ｓｃＦｖを、１７５ｋＤａヒトＡＧＬ、例えば、そのＮ末端メチオニンが存在するまたは不存在の状態の配列番号１に記載のポリペプチドに、１／１モル比で、共有結合で結合体化させることになる。この反応は、ｍＡｂ３Ｅ１０のリジン残基を修飾してチオールにし、チオ反応性マレイミド基をＡＧＬに付加させる（Ｗｅｉｓｂａｒｔ  ＲＨら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  Ｊｕｎ  １；１６４（１１）：６０２０−６）。脱保護後、各修飾タンパク質を互いに反応させて、安定したチオエーテル結合を生じさせることになる。化学的結合体化を行い、生成物をゲル濾過クロマトグラフィーによって分画することになる。それらの画分の組成を還元および非還元環境でネイティブＰＡＧＥおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評定することになる。３Ｅ１０−ＡＧＬ結合体の遊離３Ｅ１０および遊離ＡＧＬに対する最大比を含有する画分をプールし、後の研究での使用に選択することになる。
【０２０９】
他の例示的結合体としては、内在化モイエティが、完全長３Ｅ１０  ｍＡｂ、またはその変異体、または前述のものの抗原結合断片である結合体、およびＡＧＬ部分が、ＡＧＬアイソフォーム１、２もしくは３ポリペプチド（配列番号１〜３）または前述のもののいずれかの機能性断片である結合体が挙げられる。上述の方法を用いて、ＡＧＬ部分と内在化モイエティ部分の任意の組み合わせを含む化学的結合体を作製することができ、上述のものは単なる例である。さらに、本明細書において詳述する実験アプローチを用いて、任意のかかるキメラポリペプチドを試験することができる。
【０２１０】
化学的に結合体化されたＦｖ３Ｅ１０とＡＧＬのインビトロ評定
１０から１００ｕＭの化学的結合体化Ｆｖ３Ｅ１０−ＡＧＬ、３Ｅ１０とＡＧＬの非結合体化混合物、３Ｅ１０のみ、またはＡＧＬのみを、カーリーコーテッドレトリバーもしくはヒトからの半集密、未分化フォーブス・コリ病または野生型筋芽細胞または肝細胞に適用することになる。３Ｅ１０−ＡＧＬの添加直前の、ＥＮＴ２トランスフェクト細胞へのニトロベンジルメルカプトプリンリボシド（ＮＢＭＰＲ）、ＥＮＴ２特異的阻害剤（Ｈａｎｓｅｎら、２００７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８２（２９）：２０７９０−３）の添加によって、ＥＮＴ２トランスポーターに対する３Ｅ１０−ＧＳ３−ＡＧＬの特異性を検証することになる。８から２４時間後、培地および細胞を免疫ブロットおよびＲＴＰＣＲ分析のために回収することになる。二重反復実験により上記タンパク質の各々をカバーガラス上で成長させたフォーブス・コリ病および野生型筋芽細胞または肝細胞上に塗布し、続いて固定、そしてマウスκ軽鎖（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）およびＡＧＬ（ＰｉｅｒｃｅまたはＡｂｃａｍ）に対する抗体を使用するｍＡｂ３Ｅ１０の免疫組織化学検出を行うことになる。
【０２１１】
ｉ）細胞透過性３Ｅ１０およびＡＧＬの免疫ブロット検出
細胞ペレットを５００ｕＬ  ＰＢＳに再懸濁させ、溶解し、その上清をｍＡｂ３Ｅ１０およびＡＧＬの免疫ブロット分析のために回収することになる。エピトープタグ付を利用しないことになり、したがって、３Ｅ１０のみおよびＡＧＬのみの対照に対する３Ｅ１０＊ＡＧＬ処置細胞中の（完全長３Ｅ１０＋完全長ＡＧＬについての）約１９０ｋＤａの一致した抗３Ｅ１０および抗ＡＧＬ免疫反応性バンドの存在は、化学的結合体化３Ｅ１０＊ＡＧＬの透過成功を構成する。チューブリン検出をローディング対照として用いることになる。
【０２１２】
ｉｉ）細胞透過性３Ｅ１０およびＡＧＬの免疫蛍光
処置細胞のカバーガラスを洗浄し、１００％エタノールで固定し、再水和させ、３Ｅ１０およびＡＧＬを抗ＡＧＬ抗体、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体化二次抗体で検出し、発色させ、光学顕微鏡法によって可視化することになる。
【０２１３】
ｉｉｉ）細胞病理分析
処置細胞のカバーガラスを洗浄し、１００％エタノールまたは１０％ホルマリンで固定し、再水和させ、過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）染料を用いてグリコーゲンを検出することになる。未処置細胞と比較して処置細胞におけるＰＡＳ染色減少は、その処置が細胞へのグリコーゲン蓄積を低減させる点で有効であることを示す。
【０２１４】
（実施例２）
ｆｖ  ３Ｅ１０とｈＡＧＬの遺伝子構築物（Ｆｖ３Ｅ１０−ＧＳ３−ＡＧＬ）
Ｆｖ３Ｅ１０とｈＡＧＬの遺伝子融合体（ＧＳ３リンカーによってｈＡＧＬに融合された３Ｅ１０のｓｃＦｖを含む、ｆｖ３Ｅ１０−ＧＳ３−ｈＡＧＬ）をコードする哺乳動物発現ベクターを産生することになる。本実施例では、３Ｅ１０のｓｃＦｖを指すために「Ｆｖ３Ｅ１０」を用いていることに留意されたい。トランスフェクション後、３Ｅ１０およびｈＡＧＬの培養培地への分泌を検出するために馴化培地も免疫ブロットすることになる。馴化培地の濃縮後、（カーリーコーテッドレトリバーまたはヒトからの）フォーブス・コリ病筋芽細胞からの胎児および成人ＰＣＲ産物の相対存在量を測定し、適切な対照（実施例１を参照されたい）と比較して、分泌されたＦｖ３Ｅ１０−ＧＳ３−ｈＡＧＬが細胞に侵入すること、ならびにオリゴ−１，４−１，４−グルカノトランスフェラーゼ活性およびアミロ−α１，６−グルコシダーゼ活性を保持することをさらに検証することになる。これらの遺伝子融合体を組換え結合体または組換え生産結合体とも呼ぶことに留意されたい。
【０２１５】
後の試験のために追加の組換え生産結合体を同様に作製することになる。非限定的な例として：（ａ）ｈＡＧＬ−ＧＳ３−３Ｅ１０、（ｂ）３Ｅ１０−ＧＳ３−ｈＡＧＬ、（ｃ）ｈＡＧＬ−ＧＳ３−Ｆｖ３Ｅ１０、（ｄ）ｈＡＧＬ−３Ｅ１０、（ｅ）３Ｅ１０−ｈＡＧＬ、（ｆ）ｈＡＧＬ−Ｆｖ３Ｅ１０。本実施例を通して、３Ｅ１０の一本鎖Ｆｖを指すために略語Ｆｖを用いていることに留意されたい。同様に、ｍＡｂ  ３Ｅ１０および３Ｅ１０を交換可能に用いている。これらおよび他のキメラポリペプチドを、例えば本明細書中で詳述するアッセイを用いて、試験することができる。
【０２１６】
ヒトＡＧＬに遺伝子結合体化されたｃＤＮＡ  Ｆｖ３Ｅ１０の生成および検証
ｉ）Ｆｖ３Ｅ１０のｃＤＮＡの合成
３Ｅ１０重鎖に連結されたマウスＦｖ３Ｅ１０可変軽鎖（配列番号６および８）をコードするｃＤＮＡは、Ｆｖ断片の細胞浸透能を向上させる突然変異を有する（Ｚａｃｋら、１９９６、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５７（５）：２０８２−８）。前記３Ｅ１０  ｃＤＮＡは、ＡＧＬ  ｃＤＮＡとインフレームでのクローニングを助長する制限部位に挟まれており、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔまたは他の適格な遺伝子配列製造業者によって合成され、シークエンシングされることになる。発現を最大にするために、前記３Ｅ１０  ｃＤＮＡを哺乳動物およびピキア発現についてコドン最適化することになる。万が一、哺乳動物またはピキアが所与のアミノ酸について異なるコドンを選好する場合は、選好を統一するための次善の候補を使用することになる。得られたｃＤＮＡを哺乳動物発現カセットにクローニングし、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｅｇａ  Ｅｎｄｏ−ｆｒｅｅプラスミド精製キットを使用してプラスミドｐＣＭＶ−３Ｅ１０−ＧＳ３−ＡＧＬの大規模調製を行うことになる。
【０２１７】
ｉｉ）正常およびフォーブス・コリ病細胞のインビトロでのトランスフェクション
哺乳動物細胞トランスフェクションに関して上で説明したのと同様に、野生型およびフォーブス・コリ病細胞を３Ｅ１０、ＡＧＬ、３Ｅ１０−ＡＧＬまたは３Ｅ１０−ＧＳ３−ＡＧＬでトランスフェクトすることになる。
【０２１８】
ｉｉｉ）３Ｅ１０−ＡＧＬの分泌、細胞取り込みおよびグリコーゲン脱分枝活性の評定
３Ｅ１０  ｃＤＮＡは、可変κ鎖のシグナルペプチドを有することになり、３Ｅ１０−ＡＧＬ遺伝子結合体の分泌を駆動するはずである。トランスフェクト細胞による３Ｅ１０−ＡＧＬの分泌を馴化培地の免疫ブロットによって検出することになる。３Ｅ１０−ＧＳ３−ＡＧＬの取り込みおよび欠陥のあるグリコーゲン分枝の修正を評定するために、トランスフェクト細胞からの馴化培地を非トランスフェクト細胞野生型またはフォーブス・コリ病細胞に適用することになる。ｐＣＭＶ（モック）トランスフェクトおよびｐＣＭＶ−ＡＧＬトランスフェクト細胞からの馴化培地は、陰性対照としての役割を果たすことになる。ｐＣＭＶ  ３Ｅ１０−ＧＳ３−ＡＧＬトランスフェクト細胞からのタンパク質抽出物は、３Ｅ１０−ＧＳ３−ＡＧＬの発現の陽性対照としての役割を果たすことになる。２４時間後の総量。３Ｅ１０−ＧＳ３−ＡＧＬがトランスフェクト細胞から培地に分泌され、なおかつ非トランスフェクト・フォーブス・コリ病筋芽細胞または肝細胞への適用後に欠陥的グリコーゲン蓄積を改善する場合、フォーブス・コリ病筋芽細胞をＥＮＴ２トランスポーターｃＤＮＡ（Ｈａｎｓｅｎら、２００７、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２（２９）：２０７９０−３）でトランスフェクトし、その２日後に馴化培地を添加することになる。３Ｅ１０−ＡＧＬの添加直前の、ＥＮＴ２トランスフェクト細胞へのニトロベンジルメルカプトプリンリボシド（ＮＢＭＰＲ）、ＥＮＴ２特異的阻害剤（Ｐｅｎｎｙｃｏｏｋｅら、２００１、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２８０（３）：９５１−９）の添加によって、ＥＮＴ２トランスポーターに対する３Ｅ１０−ＧＳ３−ＡＧＬの特異性を検証することになる。
【０２１９】
ｉｖ）トランスフェクト３Ｅ１０−ＡＧＬの免疫ブロット検出およびフォーブス・コリ病細胞におけるグリコーゲン分枝欠陥のＡＧＬ媒介修正の評価
実施例１において説明したのと同じ手順を用いることになる。
【０２２０】
ＡＧＬに遺伝子結合体化された組換え３Ｅ１０の生産
ｉ）ピキアについてのタンパク質発現ベクターの構築
ピキアのプラスミド構築、トランスフェクション、コロニー選択および培養にはキットおよびマニュアルを製造業者の説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って使用することになる。実施例２において生成し、検証した遺伝子結合体化３Ｅ１０−ＧＳ３−ＡＧＬのｃＤＮＡを２つの代替プラスミドにクローニングすることになる；細胞内発現のためのＰＩＣＺ、および分泌発現のためのＰＩＣＺａｌｐｈａ。各プラスミドからのタンパク質発現をＡＯＸ１プロモーターによって駆動する。トランスフェクトされたピキアをゼオシンで選択し、コロニーを組換え３Ｅ１０−ＧＳ３−ＡＧＬの発現について試験することになる。精製のために高発現物を選択し、拡大することになる。
【０２２１】
ｉｉ）組換え３Ｅ１０−ＧＳ３−ＡＧＬの精製
ｍＡｂ  ３Ｅ１０  ＦｖとのｃＤＮＡ融合体を酵母発現ベクターｐＰＩＣＺＡにライゲートし、その後、それをピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｘ−３３株に電気穿孔する。ゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）でコロニーを選択し、抗ｈｉｓ６抗体（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ、カリフォルニア州バレンシア）で同定する。製造業者のプロトコル（ＥａｓｙＳｅｌｅｃｔ  Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）に従って、緩衝グリセロール／メタノール培地が入っているバッフル付き振盪フラスコの中でＸ−３３細胞を成長させ、０．５％メタノールでタンパク質合成を誘導する。２０，０００ｌｂｓ／ｉｎ２でＦｒｅｎｃｈ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓに２回通すことによって細胞を溶解し、９ＭグアニジンＨＣｌおよび２％ＮＰ４０に可溶化された細胞ペレットから、Ｎｉ−ＮＴＡＡｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）での固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって組換えタンパク質を精製する。３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  イミダゾールおよび２５％グリセロールを含有する５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４中で結合タンパク質を溶離する。溶離画分の試料を４〜２０％勾配ＳＤＳＰＡＧＥ（ＮｕＳｅｐ  Ｌｔｄ、オーストラリア国フレンチフォレスト）で電気泳動させ、カーゴ特異的マウス抗体、続いてマウスＩｇＧに対するアルカリホスファターゼ結合体化ヤギ抗体で顕色されるニトロセルロース膜へのウエスタンブロットによって、組換えタンパク質を同定する。発色性基質、塩化ニトロブルーテトラゾリウム／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸ｐ−トルイジン塩によってアルカリホスファターゼ活性を測定する。ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、イリノイ州ロックフォード）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでタンパク質を同定する。溶離タンパク質を濃縮し、５％までのウシ胎仔血清で再構成し、３０，０００ＭＷＣＯスピンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州ビルリカ）で５％グリセロールを含有するＭｃＣｏｙ培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、ヴァージニア州ハーンドン）に対して１００倍交換透析する。
【０２２２】
ｉｉｉ）品質評定および製剤
３Ｅ１０およびＡＧＬに対する免疫ブロットを用いて組換えタンパク質のサイズおよび同一性を検証し、その後、銀染色を用いて３Ｅ１０、ＡＧＬおよび３Ｅ１０−ＧＳ３−ＡＧＬの調製物間の相対純度を同定する。組換え材料を緩衝液中で、および後のインビボ投与の要求に見合った濃度（約０．５ｍｇ／ｍＬ）で製剤化する。
【０２２３】
ｉｖ）組換え材料のインビトロ評定
フォーブス・コリ病細胞におけるグリコーゲン脱分枝欠陥を緩和する馴化培地中の３Ｅ１０−ＧＳ３−ＡＧＬの量を、上に記載した方法を用いて決定することになる。この値を基準として用いて、グリコーゲン脱分枝欠陥を緩和するために必要なピキア由来組換え３Ｅ１０−ＧＳ３−ＡＧＬの量を推定することになる。フォーブス・コリ病および野生型筋芽細胞または肝細胞に対する哺乳動物細胞由来およびピキア由来組換え３Ｅ１０−ＧＳ３−ＡＧＬの相対オリゴ−１，４−１，４−グルカノトランスフェラーゼ活性およびアミロ−α１，６−グルコシダーゼ活性を評定することになる。
【０２２４】
（実施例３）
フォーブス・コリ病カーリーコーテッドレトリバーにおける筋肉標的化ＡＧＬのインビボ評定
評価のためのフォーブス・コリ病イヌモデルの選択
フォーブス・コリ病カーリーコーテッドレトリバー（「フォーブス・コリ・イヌ」）は、多くの点でヒト・フォーブス・コリ病を再現する（Ｙｉら、２０１２）。これらのイヌは、機能性ＡＧＬタンパク質を作らない（Ｙｉら、２０１２）。超生理レベルのＡＧＬが有益な処置であるのか、有害であるのかを検査するために、３Ｅ１０−ＡＧＬ（例えば、Ｆｖ３Ｅ１０−ＡＧＬ；組換え融合タンパク質または化学的結合体のいずれかとしての、およびリンカーが存在するまたは不存在の状態のもの）をフォーブス・コリ・イヌに投与することになる。
【０２２５】
ＡＧＬの用量の選択
現在、フォーブス・コリ・イヌにおける注射材料の安定性、クリアランス率、分布体積または半減期に関する情報はなく、インビトロで細胞系に適用される用量からは動物の適量が正確に推定されない。したがって、フォーブス・コリ・イヌに送達するＡＧＬに化学的に結合体化または遺伝子結合体化された３Ｅ１０の評価用量を実験的に決定しなければならない。３Ｅ１０−ＧＳ３−ＡＧＬに対する中和免疫応答の交絡作用を最小にするために、および治療効果を実証する能力を最大にするために、１週間に送達される２回の高用量の５ｍｇ／ｋｇの３Ｅ１０−ＧＳ３−ＡＧＬを評定し、その後、疾病エンドポイントの変化を評定することになる。抗３Ｅ１０−ＡＧＬ抗体の発生もモニターすることになる。静脈内３Ｅ１０＊ＡＧＬまたは３Ｅ１０−ＧＳ３−ＡＧＬが、グリコーゲン分枝欠陥または異常グリコーゲン貯蔵の改善をもたらすことが確証されたら、他のモデル（例えば、霊長類）でのその後のインビボ評定を開始し、その後、免疫組織化学（例えば、ＰＡＳ染色）によって判定してグリコーゲン脱分枝欠陥の変化を評定することになる。３Ｅ１０＊ＡＧＬまたは３Ｅ１０−ＧＳ３−ＡＧＬの陽性評価は、より徹底した薬理学および毒性学評定を行う必要のあるＧＬＰグレード材料量の生産を正当化することになり、したがって、プレＩＮＤ研究についての用量および投薬範囲を決めることになる。
【０２２６】
材料および方法
ｉ）化学的および遺伝子結合体化３Ｅ１０−ＡＧＬの注射
３Ｅ１０＊ＡＧＬまたは３Ｅ１０−ＧＳ３−ＡＧＬを製剤化し、静脈内注射に見合った緩衝液（例えば、滅菌食塩溶液、または５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌの緩衝溶液）で希釈することになる。各イヌに与える３Ｅ１０＊ＡＧＬまたは３Ｅ１０−ＧＳ３−ＡＧＬの量は、次のように計算することになる：用量（ｍｇ／ｋｇ）×イヌ体重（ｋｇ）×ストック濃度（ｍｇ／ｍＬ）＝イヌ１匹あたりのストックの体積（ｍＬ）、と１００ｕＬにするための適量のビヒクル。
【０２２７】
ｉｉ）採血
動物を組織切除のために屠殺する時点で心穿刺によって血液を採集することになる。血清を除去し、−８０℃で凍結させることになる。解凍および取り扱いの影響を最小にするために、血液中を循環する３Ｅ１０＊ＡＧＬまたは３Ｅ１０−ＧＳ３−ＡＧＬのすべての分析を同じ日に行うことになる。
【０２２８】
ｉｉｉ）組織採集および調製
免疫ブロット、グリコーゲン分析、ホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロックおよびＯＣＴ中の凍結切片のために採取組織を分割することになる。心臓、肝臓、肺、脾臓、腎臓、四頭筋、ＥＤＬ、ヒラメ筋、横隔膜および二頭筋組織（５０〜１００ｍｇ）を細分し、免疫ブロットおよびグリコーゲン分析のためのさらなる処理のためにプラスチックチューブの中で凍結させることになる。心臓、肝臓、肺、脾臓、腎臓、四頭筋、ＥＤＬ、ヒラメ筋、横隔膜および二頭筋の追加の試料を細分し、ＯＣＴ組織切片作成用培地中で凍結させるか、または３％グルタルアルデヒドホルムアルデヒド固定で２４から４８時間４℃で固定し、エポン樹脂に包埋するか、または１０％ＮＢＦで固定し、処理してパラフィンブロックにすることになる。
【０２２９】
ｖｉ）組織学的評価
エポン樹脂包埋試料を１μｍで切断し、グリコーゲン染色のためにＰＡＳ−リチャードソン染料で染色することになる。対照処置フォーブス・コリ・イヌと比較して３Ｅ１０＊ＡＧＬまたは３Ｅ１０−ＧＳ３−ＡＧＬで処置したフォーブス・コリ・イヌの組織（例えば、筋肉または肝臓）へのグリコーゲン蓄積レベル低減は、３Ｅ１０＊ＡＧＬまたは３Ｅ１０−ＧＳ３−ＡＧＬがインビボでグリコーゲンレベルを低減させることが可能であることを示す。
【０２３０】
パラフィン包埋試料を１μｍで切断し、Ｈ＆Ｅまたはトリクローム染料で染色することになる。対照処置フォーブス・コリ・イヌと比較して３Ｅ１０＊ＡＧＬまたは３Ｅ１０−ＧＳ３−ＡＧＬで処置したフォーブス・コリ・イヌからの肝臓試料における線維症低減または筋肉試料における筋原線維の摩損の低減は、３Ｅ１０＊ＡＧＬまたは３Ｅ１０−ＧＳ３−ＡＧＬがこれらのイヌにおける肝臓および／または筋肉欠損を低減させることが可能であることを示す。
【０２３１】
ｖ）免疫蛍光
ポリクローナルまたはモノクローナル抗ＡＧＬ抗体、例えば、Ｃｈｅｎら、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．１９８７  Ｄｅｃ；４１（６）：１００２−１５またはＰａｒｋｅｒら（２００７）．ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ａｌｐｈａ−ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｒｏｍ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３６２：８１１−８１５において使用された抗体を使用して、体外から送達されたＡＧＬを検出することになる。１０マイクロメートル凍結切片を切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ顕微鏡スライドガラス上に載置することになる。
【０２３２】
ｖｉ）免疫ブロット
免疫ブロットを用いて、３Ｅ１０−ＡＧＬ処置筋肉および肝組織中の３Ｅ１０およびＡＧＬ免疫反応性材料を検出することになる。３Ｅ１０およびＡＧＬのタンパク質単離および免疫ブロット検出は、日常的免疫ブロット法に従って行うことになる。ＡＧＬをこのタンパク質に特異的な抗体で検出することになる。ブロットされたタンパク質の抗体検出は、基質としてＮＢＴ／ＢＣＩＰを使用することになる。対照には、ビヒクルおよび処置フォーブス・コリ・イヌならびにビヒクルおよび処置ホモ接合野生型イヌが含まれることになる。
【０２３３】
ｖｉｉ）循環３Ｅ１０−ＡＧＬの分析
入手可能な抗ヒトＡＧＬ抗体およびホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体化抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ヒト３Ｅ１０−ＡＧＬに特異的なＥＬＩＳＡを開発し、検証することになる。組換え３Ｅ１０−ＡＧＬを希釈し、使用して標準曲線を作成する。３Ｅ１０−ＡＧＬのレベルは、（ｎｇ／ｍＬ血清に正規化された）血清抽出物の希釈物または（ｎｇ／ｍｇ組織に正規化された）組織抽出物の希釈物から決定することになる。対照にはビヒクルおよび処置フォーブス・コリおよび野生型イヌが含まれることになる。
【０２３４】
ｖｉｉｉ）抗３Ｅ１０−ＡＧＬ抗体応答のモニタリング
フォーブス・コリ・イヌの注射に使用した精製３Ｅ１０−ＡＧＬを高結合性９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに、コーティング用緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中１ｕｇ／ｍＬでプレーティングし、一晩放置してコーティングし、３０分間、ＴＢＳ中の１％脱脂粉乳（Ｂｉｏｒａｄ）でブロックし、ＴＢＳで３回すすぐことになる。ビヒクルおよび３Ｅ１０−ＡＧＬ注射動物からの血清の２倍希釈物をウェルに付加し、３０分、３７℃で放置してインキュベートし、３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化ウサギ抗イヌＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭとともにインキュベートし、３０分、３７℃で放置してインキュベートし、３回洗浄することになる。イヌ抗３Ｅ１０−ＡＧＬ抗体をＴＭＢ液体基質で検出し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいて４０５ｎｍで読み取ることになる。ポリクローナルウサギ抗イヌＡＧＬ抗体、続いてのＨＲＰ結合体化ヤギ抗ウサギは、陽性対照抗体反応としての役割を果たすことになる。ビヒクル処置フォーブス・コリ・イヌのものより大きい４０５ｎｍでのいずれの吸光度も、陽性抗３Ｅ１０−ＡＧＬ抗体応答に相当することになる。対照には、ビヒクルおよび処置野生型イヌおよびフォーブス・コリ・イヌが含まれることになる。
【０２３５】
ｉｘ）血清酵素レベルの評定
研究期間中、１〜３週間ごとに各イヌの伏在または頸静脈から血液を採集する。試料をアラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼおよび／またはクレアチンホスホキナーゼレベルについて試験する。これらの酵素の１つ以上についての上昇したレベルの低下は、細胞質グリコーゲン蓄積の病理学的作用の一部についての低減を示す。
【０２３６】
ｘ）組織グリコーゲン分析
Ｙｉら（２０１２）に記載されたプロトコルを用いて、組織グリコーゲン含有量を酵素的にアッセイする。凍結肝臓または筋肉組織（５０〜１００ｍｇ）を氷冷脱イオン水（２０ｍＬ水／ｇ組織）中で均質化し、超音波処理器を使用して３０秒のパルス間間隔で２０秒間、３回、超音波処理する。ホモジネートを１２，０００ｇで２０分間、４℃での遠心分離によって清澄化する。上清（２０ｕＬ）を５５ｕＬの水と混合し、３分間沸騰させ、室温に冷却する。アミログルコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）溶液（０．１Ｍ酢酸カリウム緩衝液、ｐＨ５．５、で１：５０希釈したもの２５ｕＬ）を添加し、反応を３７℃で９０分間インキュベートする。試料を３分間沸騰させて反応を停止させ、卓上遠心分離機で３分間、最高速度で遠心分離する。上清（３０ｕＬ）を１ｍＬのＩｎｆｉｎｉｔｙ  Ｇｌｕｃｏｓｅ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合し、室温で少なくとも１０分間放置する。ＵＶ−１７００分光光度計を使用して３４０ｎｍでの吸光度を測定する。アミログルコシダーゼなしでの反応を各試料のバックグラウンド補正に使用する。Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  Ｇｌｕｃｏｓｅ試薬との反応において標準グルコース溶液を使用して標準曲線を作成する（この反応における最終グルコース濃度０〜１２０ｕＭ）。
【０２３７】
ｘｉ）生存分析
上で説明した実験で屠殺していない処置および未処置罹病および対照イヌを生存研究においてモニターすることになる。具体的には、動物の病状、処置状態および死亡日を記録することになる。この研究の結果に基づいて生存曲線を作製することになる。
【０２３８】
ｘｉｉ）統計解析
対比較にはスチューデントｔ検定を用いることになる。多群間の比較にはＡＮＯＶＡを用いることになる。両方の場合、ｐ値＜０．０５を統計的に有意とみなすことになる。
【０２３９】
上述の実験スキームを同様に用いて他のキメラポリペプチドを評価することになる。非限定的な例として、このスキームを用いて、ＡＧＬ部分（またはその断片）と内在化モイエティ部分とを有する化学的結合体および融合タンパク質を評価することになる。
【０２４０】
（実施例４）
３Ｅ１０とｈＧＡＡの化学的結合体化（ｍＡｂ３Ｅ１０＊ｈＧＡＡ）
化学的結合体化
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸スクシンイミジルおよびトランス−４−（マレイミジルメチル）シクロ−ヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジルという２つの異なるヘテロ二官能性試薬を使用して、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインにグリシン／セリンリンカーによって相互接続されている配列番号８に対応する軽鎖可変ドメインを含む１０ミリグラム（１０ｍｇ）の３Ｅ１０  ｓｃＦｖを、７０〜７６ｋＤａヒト成熟ＧＡＡに、１／１モル比で、共有結合で結合体化させることになる。この反応は、ｍＡｂ３Ｅ１０のリジン残基を修飾してチオールにし、チオ反応性マレイミド基をＧＡＡに付加させる（Ｗｅｉｓｂａｒｔ  ＲＨら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  Ｊｕｎ  １；１６４（１１）：６０２０−６）。脱保護後、各修飾タンパク質を互いに反応させて、安定したチオエーテル結合を生じさせることになる。化学的結合体化を行い、生成物をゲル濾過クロマトグラフィーによって分画することになる。それらの画分の組成を還元および非還元環境でネイティブＰＡＧＥおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評定することになる。３Ｅ１０−ＧＡＡ結合体の遊離３Ｅ１０および遊離ＧＡＡに対する最大比を含有する画分をプールし、後の研究での使用のために選択することになる。
【０２４１】
上述の方法を用いて、ＧＡＡ部分と内在化モイエティ部分の任意の組み合わせを含む化学的結合体を作製することができ、上述のものは単なる例である。さらに、本明細書中で詳述する実験アプローチを用いて、任意のかかるキメラポリペプチドを試験することができる。
【０２４２】
化学的に結合体化された３Ｅ１０とＧＡＡのインビトロ評定
１０から１００ｕＭの化学的結合体化３Ｅ１０−ＧＡＡ、ｍＡｂ  ３Ｅ１０とＧＡＡの非結合体化混合物、ｍＡｂ  ３Ｅ１０のみ、または成熟ＧＡＡのみを、カーリーコーテッドレトリバーもしくはヒトからの半集密、未分化フォーブス・コリ病または野生型筋芽細胞または肝細胞に適用することになる。３Ｅ１０−ＧＡＡの添加直前の、ＥＮＴ２トランスフェクト細胞へのニトロベンジルメルカプトプリンリボシド（ＮＢＭＰＲ）、ＥＮＴ２特異的阻害剤（Ｈａｎｓｅｎら、２００７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８２（２９）：２０７９０−３）の添加によって、ＥＮＴ２トランスポーターに対する３Ｅ１０−ＧＳ３−ＧＡＡの特異性を検証することになる。８から２４時間後、培地および細胞を免疫ブロットおよびＲＴＰＣＲ分析のために回収することになる。二重反復実験により上記タンパク質の各々をカバーガラス上で成長させたフォーブス・コリ病および野生型筋芽細胞または肝細胞上に塗布し、続いて固定、そしてマウスκ軽鎖（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）およびＧＡＡ（ＰｉｅｒｃｅまたはＡｂｃａｍ）に対する抗体を使用するｍＡｂ３Ｅ１０の免疫組織化学検出を行うことになる。
【０２４３】
ｉ）細胞透過性３Ｅ１０およびＧＡＡの免疫ブロット検出
細胞ペレットを５００ｕＬ  ＰＢＳに再懸濁させ、溶解し、その上清をｍＡｂ３Ｅ１０およびＧＡＡの免疫ブロット分析のために回収することになる。エピトープタグ付を利用しないことになり、したがって、３Ｅ１０のみおよびＧＡＡのみの対照に対する３Ｅ１０＊ＧＡＡ処置細胞中の（完全長３Ｅ１０＋成熟ＧＡＡについての）約１９０ｋＤａの一致した抗３Ｅ１０および抗ＧＡＡ免疫反応性バンドの存在は、化学的に結合体化された３Ｅ１０＊ＧＡＡの透過成功を構成する。チューブリン検出をローディング対照として用いることになる。
【０２４４】
ｉｉ）細胞透過性３Ｅ１０およびＧＡＡの免疫蛍光
処置細胞のカバーガラスを洗浄し、１００％エタノールで固定し、再水和させ、３Ｅ１０およびＧＡＡを抗ＧＡＡ抗体、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体化二次抗体で検出し、発色させ、光学顕微鏡法によって可視化することになる。
【０２４５】
ｉｉｉ）細胞病理分析
処置細胞のカバーガラスを洗浄し、１００％エタノールまたは１０％ホルマリンで固定し、再水和させ、過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）染料を用いてグリコーゲンを検出することになる。未処置細胞と比較して処置細胞におけるＰＡＳ染色減少は、その処置が細胞へのグリコーゲン蓄積を低減させる点で有効であることを示す。
【０２４６】
（実施例５）
ｆｖ  ３Ｅ１０とｈＧＡＡの遺伝子構築物（Ｆｖ３Ｅ１０−ＧＳ３−ＧＡＡ）
Ｆｖ３Ｅ１０とｈＧＡＡの遺伝子融合体（ＧＳ３リンカーによってｈＧＡＡに融合されたｍＡｂ  ３Ｅ１０のｓｃＦｖを含む、ｆｖ３Ｅ１０−ＧＳ３−ｈＧＡＡ）をコードする哺乳動物発現ベクターを産生することになる。本実施例では、３Ｅ１０のｓｃＦｖを指すために「Ｆｖ３Ｅ１０」を用いていることに留意されたい。トランスフェクション後、３Ｅ１０およびｈＧＡＡの培養培地への分泌を検出するために馴化培地も免疫ブロットすることになる。馴化培地の濃縮後、（カーリーコーテッドレトリバーまたはヒトからの）フォーブス・コリ病筋芽細胞からの胎児および成人ＰＣＲ産物の相対存在量を測定し、適切な対照（実施例１を参照されたい）と比較して、分泌されたＦｖ３Ｅ１０−ＧＳ３−ｈＧＡＡが細胞に侵入すること、およびグルコシダーゼ活性を保持することをさらに検証することになる。これらの遺伝子融合体を組換え結合体または組換え生産結合体とも呼ぶことに留意されたい。
【０２４７】
後の試験のために追加の組換え生産結合体を同様に作製することになる。非限定的な例として：（ａ）ｈＧＡＡ−ＧＳ３−３Ｅ１０、（ｂ）３Ｅ１０−ＧＳ３−ｈＧＡＡ、（ｃ）ｈＧＡＡ−ＧＳ３−Ｆｖ３Ｅ１０、（ｄ）ｈＧＡＡ−３Ｅ１０、（ｅ）３Ｅ１０−ｈＧＡＡ、（ｆ）ｈＧＡＡ−Ｆｖ３Ｅ１０。本実施例を通して、３Ｅ１０の一本鎖Ｆｖを指すために略語Ｆｖを用いていることに留意されたい。同様に、ｍＡｂ  ３Ｅ１０および３Ｅ１０を交換可能に用いている。これらおよび他のキメラポリペプチドを、例えば本明細書中で詳述するアッセイを用いて、試験することができる。
【０２４８】
ヒトＧＡＡに遺伝子結合体化されたｃＤＮＡ  Ｆｖ３Ｅ１０の生成および検証
ｉ）Ｆｖ３Ｅ１０のｃＤＮＡの合成
３Ｅ１０重鎖に連結されたマウスＦｖ３Ｅ１０可変軽鎖（配列番号６および８）をコードするｃＤＮＡは、Ｆｖ断片の細胞浸透能を向上させる突然変異を有する（Ｚａｃｋら、１９９６、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５７（５）：２０８２−８）。前記３Ｅ１０  ｃＤＮＡは、ＧＡＡ  ｃＤＮＡとインフレームでのクローニングを助長する制限部位に挟まれており、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔまたは他の適格な遺伝子配列製造業者によって合成され、シークエンシングされることになる。発現を最大にするために、前記３Ｅ１０  ｃＤＮＡを哺乳動物およびピキア発現についてコドン最適化することになる。万が一、哺乳動物またはピキアが所与のアミノ酸について異なるコドンを選好する場合は、選好を統一するための次善の候補を使用することになる。得られたｃＤＮＡを哺乳動物発現カセットにクローニングし、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｅｇａ  Ｅｎｄｏ−ｆｒｅｅプラスミド精製キットを使用してプラスミドｐＣＭＶ−３Ｅ１０−ＧＳ３−ＧＡＡの大規模調製を行うことになる。
【０２４９】
ｉｉ）正常およびフォーブス・コリ病細胞のインビトロでのトランスフェクション
哺乳動物細胞トランスフェクションに関して上で説明したのと同様に、野生型およびフォーブス・コリ病細胞を３Ｅ１０、ＧＡＡ、３Ｅ１０−ＧＡＡまたは３Ｅ１０−ＧＳ３−ＧＡＡでトランスフェクトすることになる。
【０２５０】
ｉｉｉ）３Ｅ１０−ＧＡＡの分泌、細胞取り込みおよびグリコーゲン加水分解活性の評定
３Ｅ１０  ｃＤＮＡは、可変κ鎖のシグナルペプチドを有することになり、３Ｅ１０−ＧＡＡ遺伝子結合体の分泌を駆動するはずである。トランスフェクト細胞による３Ｅ１０−ＧＡＡの分泌を馴化培地の免疫ブロットによって検出することになる。３Ｅ１０−ＧＳ３−ＧＡＡの取り込みおよび欠陥のあるグリコーゲン分枝の修正を評定するために、トランスフェクト細胞からの馴化培地を非トランスフェクト細胞野生型またはフォーブス・コリ病細胞に適用することになる。ｐＣＭＶ（モック）トランスフェクトおよびｐＣＭＶ−ＧＡＡトランスフェクト細胞からの馴化培地は、陰性対照としての役割を果たすことになる。ｐＣＭＶ  ３Ｅ１０−ＧＳ３−ＧＡＡトランスフェクト細胞からのタンパク質抽出物は、３Ｅ１０−ＧＳ３−ＧＡＡの発現の陽性対照としての役割を果たすことになる。２４時間後の総量。３Ｅ１０−ＧＳ３−ＧＡＡがトランスフェクト細胞から培地に分泌され、なおかつ非トランスフェクト・フォーブス・コリ病筋芽細胞または肝細胞への適用後に欠陥的グリコーゲン蓄積を改善する場合、フォーブス・コリ病筋芽細胞をＥＮＴ２トランスポーターｃＤＮＡ（Ｈａｎｓｅｎら、２００７、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２（２９）：２０７９０−３）でトランスフェクトし、その２日後に馴化培地を添加することになる。３Ｅ１０−ＧＡＡの添加直前の、ＥＮＴ２トランスフェクト細胞へのニトロベンジルメルカプトプリンリボシド（ＮＢＭＰＲ）、ＥＮＴ２特異的阻害剤（Ｐｅｎｎｙｃｏｏｋｅら、２００１、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２８０（３）：９５１−９）の添加によって、ＥＮＴ２トランスポーターに対する３Ｅ１０−ＧＳ３−ＧＡＡの特異性を検証することになる。
【０２５１】
ｉｖ）トランスフェクト３Ｅ１０−ＧＡＡの免疫ブロット検出およびフォーブス・コリ病細胞におけるグリコーゲン分枝欠陥のＧＡＡ媒介修正の評価
実施例１において説明したのと同じ手順を用いることになる。
【０２５２】
ＧＡＡに遺伝子結合体化された組換え３Ｅ１０の生産
ｉ）ピキアについてのタンパク質発現ベクターの構築
ピキアのプラスミド構築、トランスフェクション、コロニー選択および培養にはキットおよびマニュアルを製造業者の説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って使用することになる。実施例２において生成し、検証した遺伝子結合体化３Ｅ１０−ＧＳ３−ＧＡＡのｃＤＮＡを２つの代替プラスミドにクローニングすることになる；細胞内発現のためのＰＩＣＺ、および分泌発現のためのＰＩＣＺａｌｐｈａ。各プラスミドからのタンパク質発現をＡＯＸ１プロモーターによって駆動する。トランスフェクトされたピキアをゼオシンで選択し、コロニーを組換え３Ｅ１０−ＧＳ３−ＧＡＡの発現について試験することになる。精製のために高発現物を選択し、拡大することになる。
【０２５３】
ｉｉ）組換え３Ｅ１０−ＧＳ３−ＧＡＡの精製
ｍＡｂ  ３Ｅ１０  ＦｖとのｃＤＮＡ融合体を酵母発現ベクターｐＰＩＣＺＡにライゲートし、その後、それをピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｘ−３３株に電気穿孔する。ゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）でコロニーを選択し、抗ｈｉｓ６抗体（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ、カリフォルニア州バレンシア）で同定する。製造業者のプロトコル（ＥａｓｙＳｅｌｅｃｔ  Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）に従って、緩衝グリセロール／メタノール培地が入っているバッフル付き振盪フラスコの中でＸ−３３細胞を成長させ、０．５％メタノールでタンパク質合成を誘導する。２０，０００ｌｂｓ／ｉｎ２でＦｒｅｎｃｈ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓに２回通すことによって細胞を溶解し、９ＭグアニジンＨＣｌおよび２％ＮＰ４０に可溶化された細胞ペレットから、Ｎｉ−ＮＴＡＡｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）での固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって組換えタンパク質を精製する。３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  イミダゾールおよび２５％グリセロールを含有する５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４中で結合タンパク質を溶離する。溶離画分の試料を４〜２０％勾配ＳＤＳＰＡＧＥ（ＮｕＳｅｐ  Ｌｔｄ、オーストラリア国フレンチフォレスト）で電気泳動させ、カーゴ特異的マウス抗体、続いてマウスＩｇＧに対するアルカリホスファターゼ結合体化ヤギ抗体で顕色されるニトロセルロース膜へのウエスタンブロットによって、組換えタンパク質を同定する。発色性基質、塩化ニトロブルーテトラゾリウム／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸ｐ−トルイジン塩によってアルカリホスファターゼ活性を測定する。ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、イリノイ州ロックフォード）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでタンパク質を同定する。溶離タンパク質を濃縮し、５％までのウシ胎仔血清で再構成し、３０，０００ＭＷＣＯスピンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州ビルリカ）で５％グリセロールを含有するＭｃＣｏｙ培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、ヴァージニア州ハーンドン）に対して１００倍交換透析する。
【０２５４】
ｉｉｉ）品質評定および製剤
３Ｅ１０およびＧＡＡに対する免疫ブロットを用いて組換えタンパク質のサイズおよび同一性を検証し、その後、銀染色を用いて３Ｅ１０、ＧＡＡおよび３Ｅ１０−ＧＳ３−ＧＡＡの調製物間の相対純度を同定する。組換え材料を緩衝液中で、および後のインビボ投与の要求に見合った濃度（約０．５ｍｇ／ｍＬ）で製剤化する。
【０２５５】
ｉｖ）組換え材料のインビトロ評定
フォーブス・コリ病細胞におけるグリコーゲン脱分枝欠陥を緩和する馴化培地中の３Ｅ１０−ＧＳ３−ＧＡＡの量を、上に記載した方法を用いて決定することになる。この値を基準として用いて、グリコーゲン脱分枝欠陥を緩和するために必要なピキア由来組換え３Ｅ１０−ＧＳ３−ＧＡＡの量を推定することになる。フォーブス・コリ病および野生型筋芽細胞または肝細胞に対する哺乳動物細胞由来およびピキア由来組換え３Ｅ１０−ＧＳ３−ＧＡＡの相対グリコーゲン加水分解活性を評定することになる。
【０２５６】
（実施例６）
フォーブス・コリ病カーリーコーテッドレトリバーにおける筋肉標的化ＧＡＡのインビボ評定
評価のためのフォーブス・コリ病イヌモデルの選択
フォーブス・コリ病カーリーコーテッドレトリバーは、多くの点でヒト・フォーブス・コリ病を再現する（Ｙｉら、２０１２）。これらのイヌは、機能性ＧＡＡタンパク質を作らない（Ｙｉら、２０１２）。超生理レベルのＧＡＡが有益な処置であるのか、有害であるのかを検査するために、３Ｅ１０−ＧＡＡをフォーブス・コリ・イヌに投与することになる。
【０２５７】
ＧＡＡの用量の選択
現在、フォーブス・コリ・イヌにおける注射材料の安定性、クリアランス率、分布体積または半減期に関する情報はなく、インビトロで細胞系に適用される用量からは動物の適量が正確に推定されない。したがって、フォーブス・コリ・イヌに送達するＧＡＡに化学的に結合体化または遺伝子結合体化された３Ｅ１０の評価用量を実験的に決定しなければならない。３Ｅ１０−ＧＳ３−ＧＡＡに対する中和免疫応答の交絡作用を最小にするために、および治療効果を実証する能力を最大にするために、１週間に送達される２回の高用量の５ｍｇ／ｋｇの３Ｅ１０−ＧＳ３−ＧＡＡを評定し、その後、疾病エンドポイントの変化を評定することになる。抗３Ｅ１０−ＧＡＡ抗体の発生もモニターすることになる。静脈内３Ｅ１０＊ＧＡＡまたは３Ｅ１０−ＧＳ３−ＧＡＡが、グリコーゲン分枝欠陥または異常グリコーゲン貯蔵の改善をもたらすことが確証されたら、他のモデル（例えば、霊長類）でのその後のインビボ評定を開始し、その後、免疫組織化学（例えば、ＰＡＳ染色）によって判定してグリコーゲン脱分枝欠陥の変化を評定することになる。３Ｅ１０＊ＧＡＡまたは３Ｅ１０−ＧＳ３−ＧＡＡの陽性評価は、より徹底した薬理学および毒性学評定を行う必要のあるＧＬＰグレード材料量の生産を正当化することになり、したがって、プレＩＮＤ研究についての用量および投薬範囲を決めることになる。
【０２５８】
材料および方法
ｉ）化学的および遺伝子結合体化３Ｅ１０−ＧＡＡの注射
３Ｅ１０＊ＧＡＡまたは３Ｅ１０−ＧＳ３−ＧＡＡを製剤化し、静脈内注射に見合った緩衝液（例えば、滅菌食塩溶液、または５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌの緩衝溶液）で希釈することになる。各イヌに与える３Ｅ１０＊ＧＡＡまたは３Ｅ１０−ＧＳ３−ＧＡＡの量は、次のように計算することになる：用量（ｍｇ／ｋｇ）×イヌ体重（ｋｇ）×ストック濃度（ｍｇ／ｍＬ）＝イヌ１匹あたりのストックの体積（ｍＬ）、と１００μＬにするための適量のビヒクル。
【０２５９】
ｉｉ）採血
動物を組織切除のために屠殺する時点で心穿刺によって血液を採集することになる。血清を除去し、−８０℃で凍結させることになる。解凍および取り扱いの影響を最小にするために、血液中を循環する３Ｅ１０＊ＧＡＡまたは３Ｅ１０−ＧＳ３−ＧＡＡのすべての分析を同じ日に行うことになる。
【０２６０】
ｉｉｉ）組織採集および調製
免疫ブロット、グリコーゲン分析、ホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロックおよびＯＣＴ中の凍結切片のために採取組織を分割することになる。心臓、肝臓、肺、脾臓、腎臓、四頭筋、ＥＤＬ、ヒラメ筋、横隔膜および二頭筋組織（５０〜１００ｍｇ）を細分し、免疫ブロットおよびグリコーゲン分析のためのさらなる処理のためにプラスチックチューブの中で凍結させることになる。心臓、肝臓、肺、脾臓、腎臓、四頭筋、ＥＤＬ、ヒラメ筋、横隔膜および二頭筋の追加の試料を細分し、ＯＣＴ組織切片作成用培地中で凍結させるか、または３％グルタルアルデヒドホルムアルデヒド固定で２４から４８時間４℃で固定し、エポン樹脂に包埋するか、または１０％ＮＢＦで固定し、処理してパラフィンブロックにすることになる。
【０２６１】
ｖｉ）組織学的評価
エポン樹脂包埋試料を１μｍで切断し、グリコーゲン染色のためにＰＡＳ−リチャードソン染料で染色することになる。対照処置フォーブス・コリ・イヌと比較して３Ｅ１０＊ＧＡＡまたは３Ｅ１０−ＧＳ３−ＧＡＡで処置したフォーブス・コリ・イヌの組織（例えば、筋肉または肝臓）へのグリコーゲン蓄積レベル低減は、３Ｅ１０＊ＧＡＡまたは３Ｅ１０−ＧＳ３−ＧＡＡがインビボでグリコーゲンレベルを低減させることが可能であることを示す。
【０２６２】
パラフィン包埋試料を１μｍで切断し、Ｈ＆Ｅまたはトリクローム染料で染色することになる。対照処置フォーブス・コリ・イヌと比較して３Ｅ１０＊ＧＡＡまたは３Ｅ１０−ＧＳ３−ＧＡＡで処置したフォーブス・コリ・イヌからの肝臓試料における線維症低減または筋肉試料における筋原線維の摩損の低減は、３Ｅ１０＊ＧＡＡまたは３Ｅ１０−ＧＳ３−ＧＡＡがこれらのイヌにおける肝臓および／または筋肉欠損を低減させることが可能であることを示す。
【０２６３】
ｖ）免疫蛍光
ポリクローナルまたはモノクローナル抗ＧＡＡ抗体、例えば、Ｃｈｅｎら、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．１９８７  Ｄｅｃ；４１（６）：１００２−１５またはＰａｒｋｅｒら（２００７）．ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ａｌｐｈａ−ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｒｏｍ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３６２：８１１−８１５において使用された抗体を使用して、体外から送達されたＧＡＡを検出することになる。１０マイクロメートル凍結切片を切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ顕微鏡スライドガラス上に載置することになる。
【０２６４】
ｖｉ）免疫ブロット
免疫ブロットを用いて、３Ｅ１０−ＧＡＡ処置筋肉および肝組織中の３Ｅ１０およびＧＡＡ免疫反応性材料を検出することになる。３Ｅ１０およびＧＡＡのタンパク質単離および免疫ブロット検出は、日常的免疫ブロット法に従って行うことになる。ＧＡＡをこのタンパク質に特異的な抗体で検出することになる。ブロットされたタンパク質の抗体検出は、基質としてＮＢＴ／ＢＣＩＰを使用することになる。対照には、ビヒクルおよび処置フォーブス・コリ・イヌならびにビヒクルおよび処置ホモ接合野生型イヌが含まれることになる。
【０２６５】
ｖｉｉ）循環３Ｅ１０−ＧＡＡの分析
入手可能な抗ヒトＧＡＡ抗体およびホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体化抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ヒト３Ｅ１０−ＧＡＡに特異的なＥＬＩＳＡを開発し、検証することになる。組換え３Ｅ１０−ＧＡＡを希釈し、使用して標準曲線を作成する。３Ｅ１０−ＧＡＡのレベルは、（ｎｇ／ｍＬ血清に正規化された）血清抽出物の希釈物または（ｎｇ／ｍＬ組織に正規化された）組織抽出物の希釈物から決定することになる。対照にはビヒクルおよび処置フォーブス・コリおよび野生型イヌが含まれることになる。
【０２６６】
ｖｉｉｉ）抗３Ｅ１０−ＧＡＡ抗体応答のモニタリング
フォーブス・コリ・イヌの注射に使用した精製３Ｅ１０−ＧＡＡを高結合性９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに、コーティング用緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中１ｕｇ／ｍＬでプレーティングし、一晩放置してコーティングし、３０分間、ＴＢＳ中の１％脱脂粉乳（Ｂｉｏｒａｄ）でブロックし、ＴＢＳで３回すすぐことになる。ビヒクルおよび３Ｅ１０−ＧＡＡ注射動物からの血清の２倍希釈物をウェルに付加し、３０分、３７℃で放置してインキュベートし、３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化ウサギ抗イヌＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭとともにインキュベートし、３０分、３７℃で放置してインキュベートし、３回洗浄することになる。イヌ抗３Ｅ１０−ＧＡＡ抗体をＴＭＢ液体基質で検出し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいて４０５ｎｍで読み取ることになる。ポリクローナルウサギ抗イヌＧＡＡ抗体、続いてのＨＲＰ結合体化ヤギ抗ウサギは、陽性対照抗体反応としての役割を果たすことになる。ビヒクル処置フォーブス・コリ・イヌのものより大きい４０５ｎｍでのいずれの吸光度も、陽性抗３Ｅ１０−ＧＡＡ抗体応答に相当することになる。対照には、ビヒクルおよび処置野生型イヌおよびフォーブス・コリ・イヌが含まれることになる。
【０２６７】
ｉｘ）血清酵素レベルの評定
研究期間中、１〜３週間ごとに各イヌの伏在または頸静脈から血液を採集する。試料をアラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼおよび／またはクレアチンホスホキナーゼレベルについて試験する。これらの酵素の１つ以上についての上昇したレベルの低下は、細胞質グリコーゲン蓄積の病理学的作用の一部についての低減を示す。
【０２６８】
ｘ）組織グリコーゲン分析
Ｙｉら（２０１２）に記載されたプロトコルを用いて、組織グリコーゲン含有量を酵素的にアッセイする。凍結肝臓または筋肉組織（５０〜１００ｍｇ）を氷冷脱イオン水（２０ｍＬ水／ｇ組織）中で均質化し、超音波処理器を使用して３０秒のパルス間間隔で２０秒間、３回、超音波処理する。ホモジネートを１２，０００ｇで２０分間、４℃での遠心分離によって清澄化する。上清（２０ｕＬ）を５５ｕＬの水と混合し、３分間沸騰させ、室温に冷却する。アミログルコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）溶液（０．１Ｍ酢酸カリウム緩衝液、ｐＨ５．５、で１：５０希釈したもの２５ｕＬ）を添加し、反応を３７℃で９０分間インキュベートする。試料を３分間沸騰させて反応を停止させ、卓上遠心分離機で３分間、最高速度で遠心分離する。上清（３０ｕＬ）を１ｍＬのＩｎｆｉｎｉｔｙ  Ｇｌｕｃｏｓｅ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合し、室温で少なくとも１０分間放置する。ＵＶ−１７００分光光度計を使用して３４０ｎｍでの吸光度を測定する。アミログルコシダーゼなしでの反応を各試料のバックグラウンド補正に使用する。Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  Ｇｌｕｃｏｓｅ試薬との反応において標準グルコース溶液を使用して標準曲線を作成する（この反応における最終グルコース濃度０〜１２０ｕＭ）。
【０２６９】
ｘｉ）生存分析
上に記載した実験で屠殺していない処置および未処置罹病および対照イヌを生存研究においてモニターすることになる。具体的には、動物の病状、処置状態および死亡日を記録することになる。この研究の結果に基づいて生存曲線を作製することになる。
【０２７０】
ｘｉｉ）統計解析
対比較にはスチューデントｔ検定を用いることになる。多群間の比較にはＡＮＯＶＡを用いることになる。両方の場合、ｐ値＜０．０５を統計的に有意とみなすことになる。
【０２７１】
上述の実験スキームを同様に用いて他のキメラポリペプチドを評価することになる。非限定的な例として、このスキームを用いて、ＧＡＡ部分（またはその断片）と内在化モイエティ部分とを有する化学的結合体および融合タンパク質を評価することになる。
【０２７２】
【化１−１】
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【化１−２】
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【化１−３】
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【化１−４】
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【化１−５】
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【化１−６】
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【化１−７】
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【化１−８】
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【化１−９】
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【化１−１０】
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【化１−１１】
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【化１−１２】
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【化１−１３】
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【化１−１４】
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【化１−１５】
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【化１−１６】
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【化１−１７】
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【化１−１８】
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【化１−１９】
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【化１−２０】
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【化１−２１】
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【化１−２２】
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【化１−２３】
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【化１−２４】
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【化１−２５】
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【化１−２６】
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【化１−２７】
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【化１−２８】
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【化１−２９】
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【化１−３０】
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【化１−３１】
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【化１−３２】
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【化１−３３】
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【化１−３４】
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【０２７３】
参照による援用
本明細書の中で言及するすべての出版物および特許は、個々の出版物または特許各々が具体的にかつ個々に参照により援用されていると示されているがごとく、それら全体が参照により本明細書に援用されている。
【０２７４】
本開示の特定の実施形態を論じたが、上記明細書は説明的なものであり、制限的なものではない。本明細書および下記請求項の再考により当業者には本開示の多くの変形形態が明らかになるであろう。本開示の全範囲は、本請求項をそれらの全範囲の均等物とともに、および本明細書をかかる変形形態ともに参照することにより決定されるべきものである。
【配列表】
2016513114000001.app
【国際調査報告】
2016513114.tif 000036
2016513114.tif 000037
2016513114.tif 000038
2016513114.tif 000039
2016513114.tif 000040