(57)【要約】罹患又は機能不全の、膵臓又は肝臓を修復する方法が提供される。本方法は、患者の健康な組織から胆道系幹細胞、肝幹細胞、膵臓幹細胞又はその子孫、委任前駆細胞などの幹細胞および／又は前駆細胞の懸濁液、又は非自己ドナーの胆道系の懸濁液を調製し、治療されるべき臓器の近くの胆管壁に細胞を移植することを含む。移植片は、生体材料と、必要に応じて、生着する細胞の成熟系統段階に適切なサイトカインおよび／又は天然上皮間葉細胞と混合された、幹細胞又は前駆細胞で構成される。細胞は、特に、その後、肝臓疾患の処置のために肝臓の近くの胆管壁へ、又は膵臓疾患の処置のために対象の総肝膵管に導入され、膵臓又は肝臓に移動し、拡大させてから、全体の罹患又は機能不全の臓器の一部又は全体を再構築する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵臓の機能不全又は疾患を処置する方法であって、
（ａ）幹／前駆細胞の懸濁液を得る工程と、
（ｂ）膵臓の機能不全又は疾患を有する対象における胆道系壁の内又は上に、前記懸濁液を導入する工程と、を含み、前記細胞の実質的な部分が前記胆管壁に存し、前記細胞が機能的な膵臓細胞に成熟し、膵臓に移って、前記膵臓の機能不全又は疾患を処置する、方法。
【請求項２】
前記膵臓前駆細胞は、胆道系幹細胞又は膵臓幹細胞、若しくはこれらの幹細胞に由来する委任前駆細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記懸濁液は、基質複合体を形成するために一つ以上の生体材料と併用される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記一つ以上の生体材料は、コラーゲン、接着分子、プロテオグリカン、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン鎖、キトサン、アルギン酸塩、及び合成の生分解性及び生体適合性ポリマー、又はこれらの組み合わせを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記懸濁液は、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、追加の細胞、又はこれらの組み合わせと併用される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記増殖因子は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｒ−スポンジン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−１）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦ−２）、オンコスタチン−Ｍ、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、トランスフェリン、インスリン、糖質コルチコイド、成長ホルモン、エストロゲン、アンドロゲン、甲状腺ホルモン、下垂体ホルモン、及びこれらの組み合わせのうちの一つ以上を含むことができる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記追加の細胞は、胆道系幹細胞、血管芽細胞、及び内皮細胞及び星状細胞の前駆体、又はこれらの組み合わせを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞は、罹患又は機能不全のない対象の胆道系の一部から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が非自己ドナーの胆道系から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記懸濁液は、腹腔鏡手術により、又は内視鏡検査によって導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞の懸濁液は、注射、生分解性被覆を有する移植複合体、又はスポンジを介して導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
罹患又は機能不全状態にある膵臓を有する対象における、膵臓の機能を修復する方法であって、
（ａ）幹／前駆細胞の懸濁液を得る工程と、
（ｂ）前記対象の総肝膵管壁の内に又は上に前記懸濁液を導入する工程と、を含み、導入された前記細胞の実質的な部分が生体内での成熟膵臓細胞として、前記膵臓の少なくとも一部の内又は上に存する、方法。
【請求項１３】
肝臓の機能不全又は疾患を処置する方法であって、
（ａ）肝臓の幹／前駆細胞の懸濁液を得る工程と、
（ｂ）肝臓の機能不全又は疾患を有する対象における胆道系の壁に、前記懸濁液を導入する工程と、を含み、前記細胞の実質的な部分が前記胆管壁に存し、前記細胞が機能的な肝細胞に成熟し、肝臓に移って、前記肝臓の機能不全又は疾患を処置する、方法。
【請求項１４】
前記細胞は、胆道系幹細胞又は肝幹細胞、若しくはこれらの幹細胞に由来する委任前駆細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞は、胆道系幹細胞又は肝幹細胞、若しくはこれらの幹細胞に由来する委任前駆細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記懸濁液は、基質複合体を形成するために一つ以上の生体材料と併用される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記一つ以上の生体材料は、コラーゲン、接着分子、プロテオグリカン、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン鎖、キトサン、アルギン酸塩、及び合成の生分解性及び生体適合性ポリマー、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記懸濁液は、増殖因子、追加の細胞、又はこれらの組み合わせと併用される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記増殖因子は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｒ−スポンジン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−１）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦ−２）、オンコスタチン−Ｍ、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、トランスフェリン、インスリン、糖質コルチコイド、成長ホルモン、エストロゲン、アンドロゲン、甲状腺ホルモン、下垂体ホルモン、及びこれらの組み合わせのうちの一つ以上を含むことができる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞は、胆道系幹細胞、肝臓又は膵臓幹細胞、委任幹細胞、血管芽細胞、及び内皮細胞及び星状細胞の前駆体、又はこれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上の幹細胞集団を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞は、罹患又は機能不全のない対象の胆道系の一部から得られる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が非自己ドナーの胆道系から得られる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
前記懸濁液は、腹腔鏡手術により、又は内視鏡検査によって導入される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞の懸濁液は、注射を介して、生分解性被覆を有するパッチ、又はスポンジとして導入される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
罹患又は機能不全状態にある肝臓を有する対象における、肝臓の機能を修復する方法であって、
（ａ）幹／前駆細胞の懸濁液を得る工程と、
（ｂ）前記対象の肝臓の近くの胆管壁に前記懸濁液を導入する工程と、を含み、導入された前記細胞の実質的な部分が生体内での成熟肝細胞として、肝臓の少なくとも一部の内又は上に存する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１３年３月１３日に出願された米国仮特許出願番号第６１／７８０，６４４号及び２０１４年３月１２日に出願された米国特許出願番号第１４／２０７，１９１号の利益を主張するものであって、その両方が、全て本明細書に参照として組み込まれる。
【０００２】
本発明は、一般的に細胞に基づく治療法の分野に関する。より具体的には、本発明は、膵臓及び肝臓の疾患を処置するために、細胞に基づく治療法、特に幹／前駆細胞治療法に関する。決定された幹／前駆細胞集団は、胆道系幹細胞、肝幹細胞、膵臓幹細胞、委任肝臓又は膵臓の前駆細胞、若しくは間葉系幹細胞であることができる。それらはまた、胚性幹（ＥＳ）細胞又は誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞の誘導体であってもよい。本出願は、２０１３年３月１３日に出願された米国仮特許出願番号第６１／７８０，６４４号の優先権を主張するものであって、これは全て本明細書に参照として組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
再生医療は、肝臓及び膵臓などの損傷組織又は病変組織を復元するために、幹細胞集団を、患者に移植する新局面に入っていた。肝疾患は、潜在的に、肝炎ウイルス、アルコール消費量、食事及び代謝障害、及び他の原因によって臓器不全につながるものであって、世界的に大部分の医療費を占めている。同様に、膵臓疾患、特に糖尿病は、世界的に健康問題及び死亡を引き起こす主要な原因である。幹／前駆細胞治療法は、これらの処置のニーズに対処するための可能な方法を代表するものであって、これらの新規治療法を模索するために、臨床プログラムが、さらに世界的な規模に拡大されている。多くの種類の前駆体が肝臓及び膵臓の処置の臨床プログラムに試験されているが、短期的な臨床プログラムには、特定の前駆体のみが使用可能である。
【０００４】
［幹細胞生物学の概要］
幹細胞又はその子孫、委任前駆細胞は、持続的に増殖することも、特異性細胞へ分化することもできる。幹細胞を定義する重要な特徴は、自己再生能力、すなわち、対称又は非対称細胞分裂のいずれかを介して、同一の特性を有する集団を無期限に維持する能力である。対照的に、前駆細胞は、成長又は再生時の細胞集団の増幅における一時的な役割を果たす。前駆体の自己再生能力を厳密に確認することができない場合、研究者は、しばしば「幹／前駆細胞」の用語を使用する。この用語は、幹細胞及び／又は前駆細胞の使用を含む細胞治療法のためにも用いられる。
【０００５】
後期段階での始原生殖細胞と共に、成長哺乳動物胚の最初の段階での幹細胞は、身体の全ての細胞型を生じる著しい能力を有するため、多能性と呼ばれる。胚性幹（ＥＳ）細胞は、樹立細胞株としての広範囲の増殖時に多能性を維持する。自然突然変異及び染色体再配列の蓄積は、最終的にＥＳ細胞の実用性を低下させるが、ＥＳ細胞の自己再生能力は、実質的に制限されないと思われる。同様に、多能性幹細胞は、定義された遺伝的要因の小さいセットを導入することにより、成熟体細胞の再プログラミングを介して生成することができ、該当細胞は、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞と呼ばれる。
【０００６】
間葉系幹細胞又はＭＳＣは、骨髄、脂肪組織、臍帯組織、ホウォートンゼリー及び羊水に由来することができ、通常の培養条件下で培養物中において容易に成長し、血管の経路により、又は移植により移植することができ、そして任意の中胚葉の運命（例えば、骨、軟骨、腱、筋肉）に系統限定される。ＭＳＣは、内胚葉又は外胚葉運命に系統制限されるが、効率が非常に低くて、この機能は、臨床プログラムに関する実用性がない。臨床プログラムのためのＭＳＣの有用性は、主に分泌パラクリン信号（基質及び溶解性因子）の産生によって、又は免疫調節メカニズムによって、肝疾患、及び糖尿病を含む膵臓疾患を緩和するために世界的な臨床プログラムでＭＳＣを使用する結果をもたらした発見であることが、証明されている。
【表１】
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【０００７】
決定幹細胞は、一般に「成人幹細胞」と呼ばれているものであって、胎児及び出生後の組織中にあるが、胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）で定義された特定の系統に制限される。決定幹細胞（及びその子孫、委任前駆細胞）は、通常の代謝回転率又は怪我及び病気によって失われた成熟細胞を補充する。血液細胞及び胃腸又は皮膚の外層をライニングしたもののような、いくつかの成熟細胞型は、限られた寿命を有し、迅速に交換しなければならない。心筋細胞及び特定の神経細胞のような他の成熟細胞は、数年間持続することができる。正常的な状態下では、また病気又は怪我によって細胞が交換される場合、幹細胞の増殖及び分化は、適切な数の特異性細胞及び幹細胞区画自体の長年の維持を確保するために厳密に調整しなければならない。
【０００８】
本発明は、直接注射によって、又は肝臓及び膵臓を生じる幹細胞ニッチの貯蔵器への移植戦略によって送達することを目標と定めることで、任意の幹細胞集団、最も特に決定幹細胞又はそれらの委任前駆細胞の送達のための方法を提供する。幹細胞培養物の「フィーダー効果」及び移植方法の議論については、米国特許出願番号第１２／２１３，１００号及び第１３／１０２，９３９号を参照し、それらの開示は全て本明細書に参照として組み込まれる。
【０００９】
肝臓、胆道系、及び膵臓は、グリコーゲン及び脂質代謝、生体異物の解毒、最適な利用のための栄養素の処理、エネルギー需要の調整、及び凝固タンパク質からキャリアタンパク質（例えば、ＡＦＰ、アルブミン、トランスフェリン）に至る多様な因子の合成を処理する中心となる中腸内胚葉臓器である。身体の完全性は、肝臓、胆道系、及び膵臓の機能に大きく依存し、それらのいずれか、特に肝臓における不全は、急速な死をもたらす。近年では、これらの組織が上皮−間葉細胞と相互関係されている、成熟の細胞系統を含むことが明らかになった。各系統樹は、間葉系幹細胞（例えば、血管芽細胞）と相互関係されている、上皮幹細胞（例えば、肝幹細胞）から始まる。
【００１０】
これらは協調的に成熟する細胞の子孫を生じる。成熟過程は、それらの形態、倍数性、成長性、バイオマーカー、遺伝子発現及び他の表現型形質に関連して段階的に変化する上皮及び間葉細胞を生成する。肝臓及び膵臓の機能は、全体の成熟系統を通して全ての細胞の表現型特性の純合計である。表１では、異なる成熟系統段階で肝臓内の実質細胞の表現型特性を要約することで、この代表例を提供する。膵臓に存在する、幹細胞又は前駆細胞から成熟細胞までの同等の系統段階があることが想定されるが、これらは十分に定義されていない。
【００１１】
膵臓は、腹膜後に位置しており、十二指腸に消化酵素を提供し、また代謝を調節するホルモンを提供している。この臓器は、機械的な取り扱いに特に敏感であり、自己消化につながるその酵素を局部的に放出する傾向がある。この傾向により、膵臓の疾患又は状態のための細胞治療法を含む、この臓器で行うことができる手術の種類が限られている。肝臓は、膵臓より手動操作に対する感度が低いが、肝臓にアクセスするには、腹部手術又は腹腔鏡検査、若しくは内視鏡検査により胆道系を介するアクセスが必要である。
【００１２】
従って、本発明は、これらの臓器の物理的完全性を物理的に妨害するか、又は損なうことなく、細胞を、肝臓へ及び膵臓へ導入することも意図している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一形態では、膵臓又は肝臓の機能不全又は疾患を処置する方法が提供され、該方法は、（ａ）幹細胞又はその子孫、委任前駆細胞それぞれの懸濁液を得る工程と、（ｂ）膵臓の場合には総肝膵管壁、又は肝臓の場合には肝臓により近い胆道系壁の内又は上に前記懸濁液を導入する工程と、を含み、細胞の実質的な部分が前記壁内に存し、前記細胞が、機能的な膵臓細胞又は機能的な肝細胞に成熟し、膵臓又は肝臓に移って（「コンベアベルト」メカニズムに従うと仮定する）、前記膵臓又は肝臓の機能不全又は疾患をそれぞれ処置する。細胞は、胆道系幹細胞又はその子孫、委任前駆細胞、若しくは肝臓及び膵臓の間葉系幹細胞、若しくは肝幹細胞又は肝臓の委任前駆細胞、若しくは膵臓幹細胞又は膵臓のための委任前駆細胞であってもよい。将来的に、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞が臨床的に使用され得るように、腫瘍形成能に対するＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞を制御することに成功した場合、肝臓又は膵臓の状態の処置のために、このような方法でＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞も送達される可能性がある。
【００１４】
細胞の懸濁液は、好ましくは、一つ以上の生体材料（例えば、コラーゲン、接着分子、プロテオグリカン、ヒアルロン酸、他のグリコサミノグリカン鎖、キトサン、アルギン酸塩、及び合成の生分解性及び生体適合性ポリマー、又はそれらの組み合わせ）、増殖因子（例えば、Ｒ−スポンジン、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−１）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦ−２）、オンコスタチン−Ｍ、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、トランスフェリン、インスリン、糖質コルチコイド、成長ホルモン、エストロゲン、アンドロゲン、甲状腺ホルモン、下垂体ホルモン、及びこれらの組み合わせ）、追加の細胞、又はそれらの組み合わせと配合して移植片の複合体を形成してもよい。
【００１５】
追加の細胞は、上皮幹細胞及びそれらの間葉系パートナーを含んでもよい。例えば、胆道系幹細胞（又は肝幹細胞）、血管芽細胞、及び内皮細胞及び星状細胞の前駆体又はそれらの組み合わせを含み、罹患又は機能不全のない対象の胆道系の一部から得られ、及び／又は非自己ドナーの胆道系から得られる。この方法によれば、移植複合体（細胞＋生体材料＋ホルモン／増殖因子）は、腹腔鏡手術、又は注射を介する内視鏡検査、胆管の表面への移植、胆管の周りの生分解性のカバー、又はスポンジによって導入することができる。
【００１６】
本発明の別の形態では、膵臓が罹患又は機能不全の状態である対象における肝臓又は膵臓の機能を修復する方法が提供され、（ａ）幹細胞及び／又は委任前駆細胞の懸濁液を得る工程と、（ｂ）膵臓の場合には総肝膵管壁へ又は肝臓の場合には肝臓により近い胆管壁へ前記懸濁液を導入する工程と、を含み、導入された細胞の実質的な部分が生体内でそれぞれ成熟膵臓細胞又は肝臓として、膵臓又は肝臓の少なくとも一部の内又は上に存する。
【００１７】
この方法は、胆道系内の幹細胞集団が、肝臓及び膵臓の臓器形成に寄与している前駆体であるという理解に基づいている。細胞の系統は、幹細胞ニッチ内で、胆管周囲腺から開始し、臓器内で成熟細胞に進む。胆道系全体にわたる胆管周囲腺は、表現型形質を示す細胞を含んでいるものであって、これは（線維筋層に近い）胆管壁内深くの幹細胞集団から、肝臓又は膵臓のいずれかに近接する胆管の内腔に近い成熟細胞に行く成熟系統の証拠を構成する。これらの細胞は、臓器に近接する表現型形質の変化を特徴とし、かつ表す。
【００１８】
胆道系は、幹細胞治療における細胞の移植のための論理的な対象である。胆道系内の放射軸及び近位−遠位軸に成熟系統で組織された幹／前駆細胞のネットワークがあって、生涯を通じて肝臓及び膵臓の臓器形成に寄与している。移植のための対象部位として胆道系を使用することは多くの利点がある。移植術は、外来手術（例えば内視鏡）として、又は簡単な外科手術（腹腔鏡）として行うことができる。このような戦略は、（もしあれば）最小限の免疫原性を有する幹細胞又は前駆細胞の移植を可能にし、それによって、患者のための免疫抑制剤を回避する可能性を提供する。このような移植術は、すでに対象臓器への移植を容易にするために実証された移植戦略を伴っている。血管経路で細胞を移植する多くの研究者によって現在文書に記載されている肝臓での生着が約２０％であるが、この移植戦略の生着はほぼ１００％である。これは、異所性細胞分布、血管経路による細胞移植における重大な懸念を回避し、ドナー細胞の使用を最適化する（それは死から、又は異所性細胞分布からの細胞の損失を回避する）。
【００１９】
膵臓の手動操作に対する感度によって臓器に直接細胞治療する必要はないので、膵臓の処置に特に大きな利点がある。膵臓の近い胆道系の部分である総肝膵管に移植された幹細胞は、この主要な困難を克服し、膵臓の幹細胞治療が現実になることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】肝臓、胆道系及び膵臓の十二指腸への接続を示す概略図である。
【図２】総肝膵管のより詳細な概略図である。
【図３】ファーター膨大部で膵管及び胆管の接続部における代表的な変形を示している。
【図４】胆道系における幹細胞及び前駆細胞ニッチのネットワークを示すフローチャートである。
【図５】肝臓、胆道系及び膵臓を生じる幹／前駆細胞の亜集団を示すフローチャートである。
【図６】近位−遠位軸に沿って十二指腸から始まり、肝臓又は膵臓のいずれかでの成熟細胞で終わる概略的な仮想系統図である。
【図７】クボタ培地及びホルモン限定培地の選択した成分を示すものである。
【図８】プラスチック上に及びクボタ培地中に培養された胆道系幹細胞の培養物を示している。
【図９】内視鏡の戦略を用いて、肝臓の又は膵臓の幹細胞治療のための本発明の戦略を図示している。
【図１０】陰窩における幹細胞及び前駆細胞の位置を示す人間胆嚢の免疫組織化学検査図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
図１は、肝臓、胆道系及び膵臓の十二指腸への接続を示す概略図である。壁内及び壁外の胆管周囲腺（ＰＢＧｓ）である、胆道系幹細胞ニッチは、胆道系全体で発見されている。壁内ＰＢＧｓは、線維筋層に近い位置である胆管内で最も内側の位置から、胆管の内腔に最も近い位置に、胆管壁内で多数存在する。線維筋層の近いＰＢＧｓ内の細胞は、非常に原始的である最多数の細胞で構成されている（高いレベルの多能性遺伝子及び幹細胞遺伝子、存在する場合最小レベルの成熟細胞遺伝子の発現を有する）。胆管の内腔に転移すると、（成熟の放射軸）多能性遺伝子の発現は減少し、そして成熟細胞遺伝子の発現が増加する。
【００２２】
このような原始的な幹細胞の数は、胆道系全体で非常に多く、これらのＰＢＧｓ内の細胞の平均２〜４％である。また、ＰＢＧｓは、特に胆道系の分岐点で特に多数存在する。多数のＰＢＧｓがある、いくつかの部位が、示されている（概略的に青色の星で表示される）。壁外のＰＢＧｓは、主に、非常に原始的な幹細胞（高レベルの多能性及び幹細胞遺伝子、無視できるレベルの成熟細胞遺伝子）を含み、組織のコードによって胆管の表面につながれている。最も多くのすべてのＰＢＧｓは、十二指腸に近い総肝膵管内で発見され、これらには、非常に原始的な幹細胞としての細胞の約９％が含まれている。従って、胆道系は、肝臓及び膵臓のための幹細胞の真の「ルートシステム」である。
【００２３】
図２は、総肝膵管のより詳細な概略図である。肝臓及び膵臓の形成は、２部位で十二指腸からの組織の伸長として発生するものであって、これは、背側膵管を形成する部位及び腹側膵管と肝臓につながる胆道系を形成する部位である。腸が形成されると、腹側膵管／及び総胆管を１８０度振るねじる運動につながって、腹側膵を生じる組織である腹側膵「原基」は、背側膵の位置より下の位置に移動し、接続胆道系は現在、十二指腸の左側に位置している。統合された肝管と膵管は、「総肝膵管」と呼ばれる。
【００２４】
総肝膵管内でのＰＢＧｓは、肝臓及び／又は膵臓のいずれかを生じることができる胆道系幹細胞を含む。また、ＰＢＧｓは、胆道系幹細胞からの子孫であり、現在、膵臓のために決定された幹細胞であることを示す表現型形質を有する最も多い膵臓幹細胞の部位でもある。また、肝幹細胞になるように資格を与えられた、細胞の亜集団があるが、該当細胞の数は、胆道系に沿って肝臓の近くに進行すると、増加する。肝臓内であっても、大きな肝内胆管中では、肝臓及び膵臓の両方の前駆体である細胞を小さい割合で含むＰＢＧｓが存在し、そして膵臓幹細胞として資格を与えられた集合及び肝幹細胞として資格を与えられた別の集合も小さな割合で存在することを注目すべきである。
【００２５】
図３は、ファーター膨大部で膵管及び胆管の接続部における代表的な変形を示している。最も一般的な変化の一つは、介在された隔膜を持つことである。ヒト内で肝管及び膵管を統合する方法には変形がある。これは、総肝膵管への移植が行われる方法において関連を持つ。２つ（例えば、長い共通管及び短い共通管）の完全な融合があるものは、細胞の注入／移植のための部位として機能する。完全に別個的なチャネルがある場合、又は、２つの間に介在された隔膜があるものは、肝臓対膵臓について関連するものへの移植を必要とする。
【００２６】
図４は、胆道系における幹細胞及び前駆細胞ニッチのネットワークを示すフローチャートである。幹細胞及び前駆細胞ニッチは、胆道系全体で発見され、肝臓へ及び膵臓へ延びている。これらのニッチの仮想開始点は、十二指腸内の粘膜下腺として発見された、ブルンナー腺である。これらの腺は、腸内の別の位置では発見されていない。従来、その役割は、胃と十二指腸の機能面に関連すると想定されている。しかし、上記腺内の細胞の形態学的構造及び表現型形質は、ＰＢＧｓ内の細胞の形質と広範囲にわたって重複している。
【００２７】
ＰＢＧｓは、胆道系全体で発現されている。これらは、胆嚢につながる胆嚢管で発見されている。胆嚢内ではＰＢＧＳがないので、本発明者らは、幹細胞及び前駆細胞が、（腸内の陰窩と同様のパターンで）陰窩で局在化し、胆嚢内で絨毛の上部に進行することによって成熟する細胞を生じるため、異なって組織されていることを発見した。
【００２８】
肝臓内のＰＢＧｓは、大きな肝内胆管中にあり、これらは、胎児及び新生児の肝臓で見られる乳管板に解剖学的に接続し、小児及び成人の肝臓に見られるヘリング管に転移する。ＰＢＧｓ、乳管板、及びヘリング管は、幹細胞及び前駆細胞を含む。
【００２９】
十二指腸近傍の総肝膵管内ＰＢＧｓは、膵臓内膵管腺に転移する。このような転移によって細胞が完全に委任前駆細胞に変換する。したがって、膵管又は膵管腺内でのみ非常にまれな幹細胞が存在する。むしろ、胆道系幹細胞及び膵臓幹細胞は、完全に総肝膵管内又は膵臓と独立している胆道系の他の部分で見られたＰＢＧｓ内で本質的に局在化している。
【００３０】
図５は、肝臓、胆道系及び膵臓を生じる幹／前駆細胞の亜集団を示すフローチャートである。胆道系全体に複数の幹細胞及び前駆細胞の亜集団がある。壁内ＰＢＧｓ内のもの及び肝臓内又は膵臓内のいずれかの前駆体であるものが示される（胆嚢内のものは図示されていない）。胆道系を通して放射軸内で発生した表現型形質の変化の一部が実証されている（最初の３つの段階が示されている）。次に、膵臓（膵臓幹細胞から系統を引く細胞の系統）近傍の総肝膵管内のものが示されている。また、大きな肝内胆管のＰＢＧｓ内で最も多数で発見され、乳管板（胎児又は新生児）又はヘリング管（小児又は成人）に転移する、肝幹細胞からの子孫がある。幹細胞及び前駆細胞のこれらのすべての系統段階に共通の表現型形質は、サイトケラチン８と１８及びヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）である。
【００３１】
図６は、近位−遠位軸に沿って十二指腸から始まり、肝臓又は膵臓のいずれかでの成熟細胞で終わる概略的な仮想系統図である。系統段階の放射軸が系統段階の近位−遠位軸によって補充される。したがって、最も多い非常に原始的な幹細胞（高レベルの多能性遺伝子発現及び他の幹細胞マーカー）は、十二指腸に近い総肝膵管内で見られる。膵管内で、もしあれば幹細胞の形質、並びに委任前駆細胞のみの形質及び腺房又は島細胞に向かって進行する系統における中間体のみの形質のいくつかがある場合、膵管に向かって進行すると、ＰＢＧｓは、ますます膵臓運命を示すマーカーを有するより高い割合の細胞を含む。胆道系（共通管、続いて総肝管など）に沿って進行すると、肝運命を示すマーカーを有するＰＢＧｓ内で細胞の割合が増加する。
【００３２】
図７は、クボタ培地及びホルモン限定培地の選択した成分を提供する。生体外での幹細胞及び前駆細胞を維持する能力は、細胞に必要な必須成分で構成され、完全に限定された無血清培地の確立に依存してきた。クボタ培地（ＫＭ）は、内胚葉幹細胞及び前駆細胞の生体外での維持のために、完全に限定された無血清培地として設立された。また、肝臓、胆道系、膵臓から、又は肺からの幹細胞及び前駆細胞で成功的であり、いくつかを修正すると、腸に対しても成功的であると証明された。クボタ培地では、幹細胞及び前駆細胞のみが生存し、成熟細胞生存は許可していない。
【００３３】
成熟細胞の限定培地は、図面に記載されているように、追加因子の補充を必要とし、具体的に特定な成人の運命のために特定な追加物の補充を必要とする。これらは、分化過程に必要な溶解性因子である。成人細胞の運命への成熟に対する幹細胞の自己複製のいずれかを最適に達成するために、系統段階特異的な細胞外基質成分の基層を使用する必要がある。自己複製のために、基質成分は、ヒアルロン酸、及び最小限の硫酸化を有するプロテオグリカンの形態を含むが、成人細胞状態に成熟するために、複数の基質成分、理想的には、バイオ基質骨格で見られたもの、成人組織由来の基質抽出物を必要とする。
【００３４】
図８は、プラスチック上に及びクボタ培地中に培養された胆道系幹細胞の培養物を示している。これらの条件下で、発現する胆道系幹細胞は２つの主要な種類があって、２型細胞はすべての細胞でＥｐＣＡＭを発現する。１型細胞はＥｐＣＡＭを発現していないが、わずかな分化を受ける部位であるコロニーのエッジでＥｐＣＡＭを発現する。１型細胞は、図８Ａに形態学的に示すように２型細胞を生じる。
【００３５】
図９は、内視鏡の戦略を用いて、肝臓の又は膵臓の幹細胞治療のための本発明の戦略を図示している。膵臓が処置されている場合、移植片は、壁内に配置されるか、又は総肝膵管の壁につぎ合わせられる。肝臓が処置されている場合、内視鏡は、共通管内に、場合によって総肝管に移動し、管壁の内に又は上に移植される。
【００３６】
図１０は、陰窩における幹細胞及び前駆細胞の位置を示す人間胆嚢の免疫組織化学である。
【００３７】
糖尿病は、膵臓に影響する遺伝的疾患であって、細胞治療戦略によって処置することができる。（糖尿病は、単に本発明の戦略によって治療することができる代表的疾患であるが、任意の肝疾患又は肝臓病は、同様の方法によって処置することができることに注目すべきである。）糖尿病の世界的な発生率は、過去数年にわたって劇的に増加しており、増加し続けている。血糖値を正規化して、外因性インスリン治療からの独立性を提供する治癒療法の追求は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の患者及びインスリン生産の機能不全を持っている２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）の患者の有意なサブセットに影響する。膵島移植が試みられているが、このような手法は、膵島を単離するために利用することができる品質のドナー膵臓の限られた収率によって制約されている。したがって、膵島細胞に系統制限され得る１つ以上の前駆体集団を同定することが試されており、これによって、移植可能な及び機能的膵島のほぼ無限かつ再現可能な供給物を構成する。
【００３８】
従来、膵臓の決定された幹細胞は、非常にまれな膵臓幹細胞のみがあり、代わりに本質的には、出生後の膵臓組織において委任前駆細胞のみがあるという知見に基づくオプションとして考えられていない。膵臓内の委任前駆細胞は、膵管で、特に膵管腺（ＰＤＧｓ）で、見られる。これらの委任前駆細胞の表現型及びそれらの膵臓の内分泌区画への実際の寄与は、活発に議論されているが、一般的に、これらは島の一次前駆体集団であり、適切な膵臓内で発見されている、ことが合意されている。
【００３９】
最近、膵島前駆体の新しいソースは、すべての年齢層のドナーにおいて胆道系で同定された。米国特許出願番号第１２／９２６，１６１号を参照し、その開示は、全て参照により本明細書に組み込まれる。胆道系は、培養中の無限の増殖能を有する決定された幹細胞の複数の亜集団を含有するものであって、これは、生体内又は生体外での微小環境に依存して、肝細胞、胆管細胞又は膵島に成熟することができる（幹細胞が腺房細胞も生じることができることはまだ示されていないと想定する）ことが見出されている。
【００４０】
胆管周囲腺（ＰＢＧｓ）は、十二指腸から肝臓まで及び膵臓まで、分岐された胆道系の全体で胆管壁内において見られる幹細胞ニッチである。胆管周囲腺（ＰＢＧｓ）は、胆道系の分岐点で多数が発生し、特に大きい肝内胆管に及び十二指腸に近い総肝膵管に集中している。ＰＢＧｓは、肝臓内の幹細胞の貯蔵器、胎児及び新生児の肝臓の乳管板への直接的な解剖学的接続を形成し、小児及び成人の肝臓のヘリング管に転移し、かつ膵臓内で委任前駆細胞の貯蔵器、膵管腺（ＰＤＧｓ）への直接的な解剖学的接続を形成し、このネットワークは、すべての年齢の人々において明らかである。幹細胞及び／又は委任前駆細胞を含有するニッチのネットワークは、肝臓、胆道系、及び膵臓の形成に寄与した幹細胞の連続的なネットワークをもたらし、生涯にわたる肝臓、胆道系及び膵臓の継続的な臓器形成の仮説を支持する。
【００４１】
総肝膵管で見られた最多数のＰＢＧｓは、肝臓に向かって又は膵臓へ進行すると細胞成分内で転移するＰＢＧｓに解剖学的に接続する。ＰＢＧｓ内の細胞は、肝外胆道系内でのＰＢＧｓの場所に応じて、総肝膵管（又は大きな肝内胆管）内の均質な幹細胞集団から、特定の成熟細胞の運命を持つ前駆細胞に支配されるものであって、成熟肝実質細胞対成熟胆管細胞対成熟膵臓細胞に変形する。
【００４２】
腸内でのものと類似な「コンベアベルト方式」で仮想的に進行すると、２つの重複軸である放射軸及び近位−遠位軸に沿って転移する。放射軸は、線維筋層に近い部位での胆管壁内深くの壁内ＰＢＧｓに位置する原始幹細胞で始まり、胆管の内腔における成熟細胞で終わる。膵臓に近い放射軸は膵臓様細胞に転移し、肝臓に近い放射軸は成熟肝実質細胞に転移し、その間の放射軸は胆管の形質を有する成熟細胞を生じる。
【００４３】
近位−遠位軸は、十二指腸の傍に原始幹細胞を含むＰＢＧｓから進行し、胆道系の長さ方向に沿って大きな肝内胆管内で位置するＰＢＧｓに、そして肝臓腺房内のヘリング管に進行しているが、これらは幹細胞と委任前駆細胞との混合物を含有する。成熟過程はまた、十二指腸に近い総肝膵管内ＰＢＧｓにおける幹細胞から膵臓内の膵管腺（ＰＤＧｓ）まで発生し、ＰＢＧｓは委任膵臓前駆細胞のみを含む。十二指腸に最も近いＰＢＧｓは、多能性（Ｎａｎｏｇ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＳＡＬＬ４、ＫＬＦ４）、増殖（Ｋｉ６７）、及び初期肝膵臓コミットメント（ＳＯＸ１７、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＬＧＲ５）のマーカーを発現するが、ＥｐＣＡＭのような中間マーカー、又はインスリン又はアルブミンなどの成熟マーカーを発現しない原始幹細胞を含有する。成熟軸に沿って進行すると、多能性遺伝子及び増殖マーカーが減少した後、損失し、ＳＯＸ９を維持するが、肝臓に向かって進行するためのＰＤＸ１を損失するか、又は膵臓に向かって進行するためのＳＯＸ１７を損失する。ＥｐＣＡＭは、成熟の中期段階で、細胞内で活性化し、肝臓、胆管、又は膵臓のいずれかに進む。肝臓に向かう中間マーカーは、アルブミン及びα‐フェトプロテイン（ＡＦＰ）を含むが、膵臓に向かうものは、ＮＧＮ３、ＭＵＣ６及びインスリンを含む（図５参照）。
【００４４】
胆道系幹細胞は、免疫選択によって又は培養物選択によって単離することができる。今までに同定されていて、免疫選択が、胆道系の細胞懸濁液からの胆道系幹細胞の亜集団のために行われる可能性がある、マーカーは、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＬＧＲ５、ＮＣＡＭ、ＣＤ４４（ヒアルロン酸受容体）、及びＣＸＣＲ４を含む。培養物選択の場合には、胆道系の組織を、細胞懸濁液として調製し、次いで、培養プラスチック上に、及び無血清クボタ培地中で培養する。これらのプロトコルの詳細を以下に示す。
【００４５】
拡張条件の下で、人間胆道系由来幹細胞（ｈＢＴＳＣｓ）は、未分化細胞として数ヶ月間増殖することができるが、膵臓に由来する前駆体は委任前駆細胞として振る舞って、約８〜１０分裂を受けるが、その後一部の内分泌分化を行う。膵島への細胞の分化のために調整されたホルモン限定培地（ＨＤＭ）は、生体内で、膵島と関連して見られた基質成分の混合物に細胞を包埋することと組み合わせて使用されると、新しい膵島の超微細構造の、電気生理学的及び機能的特性を持つ細胞凝集体、球状体を形成する。これらの新しい膵島は、糖尿病疾患にかかる動物がインスリンを産生できるようにすることで、それらの動物を救出することができた。そのため、胆管周囲腺由来幹細胞は、生涯を通じて継続的な膵臓の臓器形成の一環として、膵管腺の委任前駆細胞に転移する。
【００４６】
本発明は、細胞治療法の形態を含む膵臓の処置が、総肝膵管を対象とすることができ、これらの処置が、膵臓を生じる細胞を変更しり、調整するという理解に基づいている。処置は、腹腔鏡手術によって、又は内視鏡検査によって、若しくは総肝膵管の周りにカフを形成するカバーと一緒に総肝膵管の外側の周りにヒドロゲルとして、外科的に総肝膵管に接着される移植片を配置することにより、総肝膵管に送達することができる。細胞は、送達されると、「成熟」し、コンベアベルト方式で「膵臓」へ移動していて、膵臓で、細胞は、疾患又は機能不全の膵臓を交換したり補充したりする「膵臓」機能を実行する。このように、膵臓自体は、細胞を導入する際、妨害されない。むしろ、必須細胞は「上流」へ導入し、膵臓内の本来の場所に移動させている。
【００４７】
本発明は、必要な増殖及び生着を促進するために疾患組織に局在化することができる骨格の上又は内に凝集体として移植された細胞の送達を伴う移植技術に関する。したがって、本発明は、移植される細胞型だけでなく、適切な生体材料と組み合わせた細胞型、及び最も効率的かつ成功的な移植療法のための移植方法を考慮する。本発明の移植技術は、患者における治療的用途に翻訳可能であり、再生医療によって罹患又は機能不全の組織を再構成するための代替治療を提供している。本出願は、実際には、主として総肝膵管内への移植を用いた治療のための代表的な戦略として、糖尿病について起草されているが、この戦略は、肝臓に近いものである胆管系の異なる領域内で、胆管壁内に移植することによる、肝臓病の処置のために適用されることができる。
【００４８】
［細胞ソース］
本発明によれば、所望の細胞集団は、「正常」、「健康」な組織及び／又は細胞を有するドナーから直接得られて、これは任意の組織及び／又は細胞が罹患又は機能不全のないことを意味する。もちろん、このような細胞集団は、罹患した又は機能不全の臓器に苦しんでいる人から得てもよいが、このような状態ではない臓器の一部から得てもよい。細胞は、年齢に関係なく、胎児、新生児、小児、及び成人の組織を含む、任意の適切な哺乳動物組織、好ましくは完全の肝臓及び膵臓に接続された胆嚢又は胆管組織から供給することができる。
【００４９】
多能性人間胆道系幹細胞（ｈＢＴＳＣｓ）は、本発明の方法のための好ましい細胞であり、胆嚢又は胆管系組織の任意の部分から単離することができるが、胆管周囲腺内及び胆道系の分岐点で、特に総肝膵管内又は大きな肝内胆管内で、特に多数が見られている。本出願の明確化のために、「胆道系幹細胞」という用語は、本発明の哺乳動物の多能性幹細胞又は前駆細胞、このような本発明の細胞を含む細胞集団、及び本発明の細胞のために豊富にされた細胞集団を指すために本明細書中で使用される。米国特許出願番号第１２／９２６，１６１号を参照し、その開示は、全て本明細書に参照として含まれている。
【００５０】
ヒト胆嚢は、胆管周囲腺を持っていないが、これらは粘膜陰窩内に、ｈＢＴＳＣｓの機能と重複する、幹／前駆細胞の集団を含む。したがって、「胆道系幹細胞」という用語は、ヒト胆嚢から単離可能な幹／前駆細胞も含む。胆嚢の除去は、日常的に多くの理由で行われているものであって、患者に対する否定的な結果が最小限であり、細胞治療法で処置されている患者の必要性に応じて、自己細胞治療法又は同種異系療法を可能にすることを考えれば、これは、有利なものである。
【００５１】
胆道系幹細胞は、複数の内胚葉運命に分化させることができる。実際、幹細胞は、膵臓又は肝臓を含むいくつかの内胚葉系統の成熟細胞型に分化するように誘導されてよい。膵島細胞の場合、胆道系幹細胞は、クボタ培地から修飾されている培地で培養されていて、このような培地は、無糖質コルチコイドなしで調製した後、銅（１０−１２Ｍ）、カルシウム（濃度約０．６ｍＭ）、１０ｎｇ／ｍｌ基本線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、２％Ｂ２７、０．１ｍＭのアスコルビン酸、０．２５μＭシクロパミン、及び０．５μＭＲＡ（レチノイン酸）を補充される。４〜５日後、ｂＦＧＦを５０ｎｇ／ｍｌのエキセンジン−４で置換している。使用された移植片のための基質骨格は、６０％ＩＶ型コラーゲン及びラミニン（１：１の比率）及び４０％のヒアルロン酸から構成されて、また基質成分の混合物にＶＩ型コラーゲン及びナイドジェンを添加しても効果的である。また、系統限定過程は、ヒアルロン酸及び他の基質成分とともに行うよりも、徐々に行うことを理解して、単純なヒアルロン酸及びホルモンの混合物を使用することができる。
【００５２】
細胞はまた、治療の必要性に基づいて、「系統段階」集団とは異なる治療のために調達することができる。例えば、後期段階の「成熟」細胞は、後期系統細胞のみによって提供される機能の迅速な取得が必要である場合、又は受容者がＣ型肝炎又はパピローマウイルスに伴う、優先的に幹細胞及び／又は前駆細胞を感染させる系統依存性ウイルスを有している場合に好ましいことがある。とにかく、「前駆」細胞は、それぞれの組織の系統段階のいずれかを確立するために使用されてもよい。系統段階肝細胞集団及びそれらの単離方法の議論については、米国特許出願番号第１１／５６０，０４９号及び第１２／２１３，１００号を参照し、その開示は、両方とも全て本明細書に参照として含まれている。
【００５３】
胆道系組織のサンプルは、移植のために入手され、その後、脂肪症、解剖学的異常、又は主要血管疾患のなどの理由のために移植を拒否された肝臓又は膵臓から外科的に切除することができ、又はこれらは、切除された材料から得ることができる。該当サンプルは、多様な理由で除去された胆嚢から得ることができる。その後、組織は、切片に分割され、さらに処理される。胆道系幹細胞で特に多い切片としては、大きな肝内胆管、門、総肝管、胆嚢管、共通管、総肝膵管及び胆嚢が挙げられる。各部分は、さらに、長手方向の直径に沿って切断片に切除することができる。
【００５４】
胆道系幹細胞は、肝臓、胆道系、及び膵臓細胞を含む複数の内胚葉の運命を生じることが示されている。原始的な幹細胞として、胆道系幹細胞は、多能性遺伝子（Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＡＬＬ４）、肝臓及び膵臓内胚葉転写因子（例えば、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ９、ＦＯＸＡ２、ＰＤＸ１；）、及びＬＧＲ５（ロイシンリッチ反復含有Ｇタンパク質共役受容体５）、ＣＤ４４（ヒアルロン酸受容体）、ＣＤ１３３（プロミニン）、ＣＤ５６／神経細胞接着分子又はＮＣＡＭ）、及びＣＸＣＲ４（ＣＸＣケモカイン受容体４）を含む幹細胞の典型的な表面マーカーを発現する。胆道系幹細胞は、膵臓又は肝臓の運命に向かって成熟し始めると、これらは、ＣＤ３２６／上皮細胞接着分子又はＥｐＣＡＭの発現を得る。
【００５５】
さらに、成熟系統で肝臓に向かって進行すると、胆道系幹細胞は、膵臓マーカー（例えば、ＰＤＸ１）を失い、ＨＮＦ６、ＨＥＳ１、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びアルブミンなどの肝臓の初期系統マーカーの発現を得て、徐々に増加させる。
【００５６】
膵臓に向かって成熟進行すると、胆道系幹細胞は、肝臓マーカー（例えば、ＳＯＸ１７）を失うが、膵臓マーカー（例えば、ＰＤＸ１）を失わず、膵臓の初期系統マーカー（例えば、ＮＧＮ３、ＭＵＣ６、インスリン、アミラーゼ）の発現を得て、徐々に増加させる。特に、ＰＤＸ１及びＮＧＮ３は、それぞれ、膵臓及び内分泌性膵臓の発達に必要であることが知られている。
【００５７】
しかし、胆道系幹細胞は、胆管細胞の成熟マーカー（例えば、セクレチン受容体、ＣＦＴＲ、アクアポリン）、肝細胞の成熟マーカー（例えば、チロシンアミノ転移酵素又はＴＡＴ、トランスフェリン、又はＰ４５０−３Ａ４のような「後期」のＰ４５０）又は膵島細胞の成熟マーカー（例えば、グルカゴン、ソマトスタチン、高レベルのインスリン）などの成熟細胞のマーカーを発現しない（又はただかすかに発現する）。胆道系幹細胞は、間葉細胞のマーカー（例えば、ＣＤ１４６、デスミン）、内皮細胞のマーカー（例えば、ＶＥＧＦ受容体、ＣＤ３１、ヴァン・ヴィレブランド因子）又は造血細胞のマーカー（例えば、ＣＤ４５）を全く発現していない。抗原の発現パターンは、それらがクボタ培地又はその等価物からなり、培養プラスチック又はヒアルロン酸の基層を有する自己複製条件下で、維持されている限り、培養液の生涯を通じて安定する。
【００５８】
これらの表現型形質は、エンドポイント及び定量（ｑ）−ＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用して、生体内での組織、新たに単離された細胞、又は培養細胞の、免疫組織化学によって決定することができる。同一胆管周囲腺内の細胞内又は同一細胞内における内胚葉幹／前駆細胞の複数のマーカー（例えば、ＳＯＸ９、ＳＯＸ１７、ＰＤＸ１、ＮＧＮ３、ＦＯＸＡ２）の共発現は、膵臓への系統制限を受ける胚性幹（ＥＳ）細胞に関する所見と異なり、これらの転写因子が連続的に観察されるが、すべてが同時というわけではない、独特の驚くべき特徴である。さらに、これらの転写因子の発現は、胆管の管腔表面の成熟胆管細胞では存在しない。
【００５９】
本発明の胆道系幹細胞は、上述したように、肝臓、胆道系、及び膵臓を含む複数の内胚葉組織の成熟細胞を生じる幹／前駆細胞である。
【００６０】
人間胆道系組織からの幹細胞集団は、免疫選択技術（例えば、フローサイトメトリー、パニング、磁気ビーズ分離）により単離することができる。代替的に、又は免疫選択に加えて、胆道系幹細胞は、特定の条件下で細胞を培養する組織を含む培養選択技術によって同定し、単離することができる。例えば、胆道系組織から調製した細胞懸濁液は、プラスチック又はヒアルロン酸上に培養され得る（又はヒアルロン酸中に埋め込まれる）。他の形態では、プラスチックは、任意に、ＩＩＩ型コラーゲン、又はヒアルロン酸、などの胚／胎児組織で見られた基質成分、又はこれらの組み合わせで被覆される。
【００６１】
培養液の選択に使用される培地である、無血清クボタ培地又はその等価物は、胆道系幹細胞及びそのパートナーの間葉系細胞、血管芽細胞及び星状細胞前駆体の生存及び増殖に対して強く選択的であるが、胆道系の成熟細胞に対して選択的ではない。この培地の特質は、銅を含有しなく、低カルシウム（＜０．５ｍＭ）、インスリン、トランスフェリン／Ｆｅ、精製アルブミンに結合された遊離脂肪酸、必要に応じて、高密度リポタンパク質を含む任意の基礎培地であることである。
【００６２】
クボタ培地又はその等価物は、無血清であって、ホルモン、増殖因子、及び栄養素の、精製され、限定された混合物だけを含む。具体的には、培地は、銅を含有しなく低カルシウム（＜０．５ｍＭ）を含み、そしてインスリン（５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン／Ｆｅ（５μｇ／ｍｌ）、高密度リポタンパク質（１０μｇ／ｍｌ）、セレン（１０−１０Ｍ）、亜鉛（１０−１２Ｍ）、ニコチンアミド（５μｇ／ｍｌ）及び精製アルブミンの形態に結合した精製遊離脂肪酸の混合物を補充した無血清基礎培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０又はＤＭＥ／Ｆ１２）で構成される。この培地を製造するための詳細な方法は、例えば、久保田Ｈ、リードＬＭ、全米科学アカデミー（米国）２０００年の議事、９７：１２１３２―１２１３７で公開されていて、その開示は参照としてその全体が本明細書に組み込まれている。
【００６３】
罹患又は機能不全の臓器の「機能」自体を提供するために必要な細胞に加えて、移植片は、好ましくは、すべての組織の細胞基盤である、上皮−間葉細胞の関係を含む細胞の種類と類似していることが好ましい追加の細胞成分を含む。上皮−間葉細胞の関係は、すべての成熟系統段階で目立つ。上皮幹細胞は、間葉系幹細胞とパートナーを組んでいるものであって、これらは組織内ですべての種々の成人細胞型に成熟するので、これらの成熟は互いに同等である。両者の相互作用は、溶解性信号（例えば、増殖因子）を含むパラクリン信号及び細胞外基質成分によって調節される。
【００６４】
本発明の一形態によれば、必要に応じて、移植片を最適化するために、単離された細胞集団を、（後述する）既知のパラクリン信号及び「天然の」上皮−間葉パートナーと混合する。したがって、移植片には、上皮幹細胞（例えば肝幹細胞）が天然の間葉パートナー（例えば、血管芽細胞）と共に混合されて含まれている。一過性増殖細胞ニッチの移植片のために、肝芽細胞は、肝星状細胞及び／又は内皮細胞の前駆体とパートナーを組んでいることができる。一部の移植片では、上皮−間葉パートナーの二組の混合を作ることができていて、これは、宿主組織における肝細胞の樹立を最適化するための、肝星状細胞前駆体及び内皮細胞前駆体と、血管芽細胞及び肝芽細胞とを有する肝幹細胞である。細胞を播種している移植片の微小環境は、移植に使用される関連系統段階で製造されるパラクリン信号、基質及び溶解性信号で構成される。
【００６５】
移植片はまた、病状を管理するために調整することができる。例えば、初期の系統段階に感染した後、宿主細胞と共に成熟する系統依存ウイルス（例えば、特定の肝炎ウイルス）の影響を最小限にするために、いくつかのウイルスによるウイルス感染が許容されていない後期系統段階の移植片（例えば、肝細胞及びその天然のパートナー、類洞内皮細胞）を準備することができる。
【００６６】
膵臓細胞治療法をモデルとして用いた幹細胞移植の一例は、胆道系幹細胞及び血管芽細胞を含む。対照的に、「成熟した」肝細胞の移植片は、肝細胞、成熟した内皮細胞及び成熟した星状細胞を含む。肝臓の上皮−間葉細胞の関係の議論については、米国特許出願番号第１１／７５３，３２６号を参照し、その開示は、全て参照により本明細書に組み込まれる。
【００６７】
［移植材料］
本発明の生体材料を使用すると、移植及び再生過程の成功を助ける信号及び細胞支持のための骨格が提供される。生物体内で固形臓器の組織が持続的に再形成されると、解離した細胞は、適切な環境条件下で、固有の構造を改める傾向がある。本発明の適用に適した移植方法に関する議論については、米国特許出願番号第１３／１０２，９３９号を参照し、その開示は、全て参照により本明細書に組み込まれる。
【００６８】
全ての組織では、パラクリン信号は、溶解性（無数の増殖因子及びホルモン）、及び不溶性（細胞外基質（ＥＣＭ））信号の両方を含む。溶解性基質因子と（不溶性）基質因子との間の相乗効果は、移植された細胞による増殖及び分化応答を決定する。基質成分は、付着、生存、細胞形状（並びに細胞骨格の組織化）、そして特定の細胞外信号に応答するための細胞を刺激するのに必要な細胞表面受容体の安定化の主要な決定因子である。
【００６９】
ＥＣＭは、細胞形態、成長及び細胞遺伝子の発現を調節することが知られている。生体内でのものと同様の組織特異的な化学物質は、精製されたＥＣＭ成分を用いて生体外で達成することができる。これらの化学物質の多くは、市販されており、生体内でそれを模倣する細胞の挙動を促す。
【００７０】
適切な基質成分としては、コラーゲン、接着分子（例えば、細胞接着分子、密着結合、基礎接着分子）、エラスチン、及びプロテオグリカン（ＰＧ類）及びグリコサミノグリカン（ＧＡＧ類）を形成する炭水化物が挙げられる。これらの種類は各々、分子の種類を定義する。例えば、少なくとも２５種類のコラーゲンが存在し、各々は、異なる遺伝子によって特異的な制御及び機能で符号化される。タンパク質（例えば、コラーゲン、付着タンパク質）である種々の基質成分は、一般に市販されている。グリコサミノグリカンの組織特異的な形態（例えば、組織特異的ヘパリン）は、天然の供給源から精製することができ、かつ／又はいくつかを合成することができる。確かに、移植片は、グリコサミノグリカンなくても成功することができるが、時間がかかり、グリコサミノグリカンが決定する特異性の一部を持っていない可能性がある。
【００７１】
移植方法を提供し得る追加の生体材料としては、多くの合成の生分解性及び生体適合性ポリマーだけでなく、キトサン及びアルギン酸のような無機天然素材が挙げられる。これらの材料は、しばしば熱ゲル化、光架橋、又は化学的架橋を含む方法により「凝固」（例えば、ゲル化）されている。しかし、それぞれの方法を使用すると、細胞損傷（例えば、過度の温度範囲、ＵＶ照射によるもの）を説明する必要がある。生体材料のより詳細な議論、具体的にヒアルロン酸ヒドロゲルの使用については、米国特許出願番号第１２／０７３，４２０号を参照し、その開示は、全て参照により本明細書に組み込まれる。
【００７２】
基質成分の特定の選択は、例えば、幹細胞区画から後期半系統段階細胞に変化する、生体内での勾配によって導かれてもよい。好ましくは、移植生体材料は、移植のために望ましい特定の系統段階の基質の化学性質を模倣する。基質成分の選択された混合物の有効性は、適正製造基準（ＧＭＰ）プロトコルに従って、大部分が市販されている精製基質成分及び溶解性信号を使用して生体外での試験でアッセイすることができる。移植のために選択された生体材料は、好ましくは、成功的移植のために細胞が必要とする適切な増殖及び分化応答を誘発する。
【００７３】
肝臓に関しては、肝幹細胞に関連する基質特性は、大きな肝内胆管の胆管周囲腺で、及びヘリング管（小児及び成人の肝臓）になるように転移する乳管板（胎児と新生児の肝臓）で、存在する。肝実質細胞の後期系統段階は、実質細胞及び内皮細胞又は間葉細胞の他の形態の間に位置する領域である、ディッセ腔内にある。
【００７４】
肝臓の異なる領域内の細胞の成熟度の変化に加えて、基質特性の変化も観察される。乳管板又はヘリング管（及び潜在的に肝内胆管周囲腺）における基質特性は、胎児の肝臓に見られるものと同様であり、ＩＩＩ型及びＶ型コラーゲン（Ｉ型コラーゲンなし）、ヒアルロン酸、α６／β４インテグリン（例えば、ラミニン５）に結合するラミニンの形態、最小限の硫酸化を持っているコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳ−ＰＧ類）の形態で構成されている。
【００７５】
この領域は、ヘリング管に隣接しかつ肝芽細胞と結合する場所で異なる基質特性に転移して、ＩＶ型、Ｖ及びＶＩ型コラーゲン、ヒアルロン酸、α／β１インテグリンと結合するラミニンの形態、強く硫酸化されたＣＳ−ＰＧＳ及び弱く硫酸化されたヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳ−ＰＧ類）で構成される。
【００７６】
さらに、一過性増殖細胞区画は、さらに後期の系統段階に転移し、各連続段階では、基質特性がより安定し（例えば、より高い安定性のコラーゲン）、少し代謝回転し、ＧＡＧとのＰＧのより高度に硫酸化した形態を含む。最も成熟した細胞は、ヘパリン‐ＰＧ（ＨＰ−ＰＧ類）の形態と結合するものであって、これは、無数のタンパク質（例えば、増殖因子及びホルモン、凝固タンパク質）が基質に結合し、ＧＡＧにおける分離及び特定の硫酸化パターンへの結合を介してそこで安定に保持することができることを意味する。したがって、基質特性は、高代謝回転率及び最小の硫酸化に関連した不安定な基質特性を持つ幹細胞のニッチでの開始点から（したがって細胞に近く安定した方法で、信号の最小の結合）、硫酸化の量が増加する安定した基質特性（したがって、細胞の近くでますます高いレベルの信号結合が維持される）に転移する。
【００７７】
膵臓について、幹細胞から成熟細胞への基質特性における転移は、膵島に対して腺房細胞に結合された異なる化学組成物を生じる。特質の中で、膵島は、特にナイドジェンで、及びネットワークコラーゲンで（例えば、ＩＶ型、ＶＩ型）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（グリピカン及びシンデカン）の形態が豊富であるが、腺房細胞は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、フィブロネクチン、及び様々な線維性コラーゲンの形態が豊富であることが公知されている。同様に、膵臓幹／前駆細胞に関連する基質特性は、肝膵管の胆管周囲腺に存在する。膵臓実質細胞の後期の系統段階に関連する基質は、膵管及び膵管腺にある。成熟段階での基質には、膵臓腺房組織及び膵島細胞に接触しているものが含まれる。
【００７８】
従って、本発明は、基質分子の化学的性質が、成熟の段階、宿主の年齢及び病状によって変化することを考慮する。適切な材料を用いて移植する場合、組織内に移植された細胞の生着を最適化し、異所性部位への細胞の分散を防ぎ、塞栓形成の問題を最小限に抑え、可能な限り迅速に組織内に統合する細胞の能力を強化する必要がある。また、移植片内での因子はまた、免疫原性の問題を最小限にするように選択され得る。
【００７９】
人間の肝臓の又はヒト胆道系組織の場合では、細胞は、無血清条件下で培養されてもよい。ヒト肝幹細胞又は肝芽細胞（ｈＨｐＳＣ又はｈＨＢ）は単独で、又は血管芽細胞／内皮細胞と組み合わせて移植することができる。細胞は、チオール化及び化学的に修飾されたＨＡ（ＣＭＨＡ−Ｓ、又はユタ州ソルトレイクシティのグリコサン・バイオシステムズ（Ｇｌｙｃｏｓａｎ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）製のグリコシル（Ｇｌｙｃｏｓｉｌ））内に及びＫＭ（クボタ培地）内に懸濁し、一組の注射器対のうちの一方の注射器に充填してもよい。もう一方の注射器には、ＫＭで調合された架橋剤、例えばポリ（エチレングリコール）ジアクリレート若しくはＰＥＧＤＡを充填してもよい。これら２本の注射器を針で連結し、それを２つのルアーロック接続部へ展開する。従って、ヒドロゲル中の細胞と架橋剤とが１本の針を通って現れて、ＣＭＨＡ−Ｓを素早く架橋させて、注入時にゲルを形成することができる。
【００８０】
ＣＭＨＡ−Ｓ中の細胞懸濁液及び架橋剤は、組織（例えば、網組織）又は合成物質（クモの糸）から製造されたパウチを用いて対象組織へ直接注入又は移植することできる。あるいは、細胞は、懸濁液を大気中で一晩放置することによって、ＰＥＧＤＡ架橋剤を用いずにグリコシル中に封入し、柔軟で粘稠なヒドロゲルへのジスルフィド結合架橋を引き起こしてもよい。また、他のチオール修飾マクロモノマー、例えばゼラチン−ＤＴＰＨ、ヘパリン−ＤＴＰＨ、コンドロイチン硫酸−ＤＴＰＨを添加することで、生体内の特定のニッチの基質特性を模倣する共有ネットワークを形成してもよい。別の具現化手段では、システイン又はチオール残基含有ポリペプチドをＰＥＧＤＡと結合させてから、当該ＰＥＧＤＡをグリコシルに添加することで、特定のポリペプチド信号をヒドロゲル中に統合し得る。あるいは、任意のポリペプチド、増殖因子又は基質成分、例えばイソ型コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチン等をグリコシル及び細胞溶液に添加してから架橋することで、重要なポリペプチド成分をヒドロゲル中に受動的に捕獲させてもよい。
【００８１】
ヒアルロン酸；ヒアルロン酸類（ＨＡｓ）は、６つの大きなグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）族炭化水素のうちの１つの構成員であり、いずれもウロン酸とアミノ糖とのポリマーである［１〜３］。他のグリコサミノグリカン族炭化水素には、コンドロイチン硫酸（ＣＳ、［グルクロン酸−ガラクトサミン］ｘ）、デルマタン硫酸（ＤＳ、より高度に硫酸化された［グルクロン酸−ガラクトサミン］ｘ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ、［グルクロン酸−グルコサミン］ｘ）、ヘパリン（ＨＰ、より高度に硫酸化された［グルクロン酸−グルコサミン］ｘ）及びケラタン硫酸（ＫＳ、［ガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン］ｘ）が含まれている。
【００８２】
ＨＡは、グルコサミンとグルロン酸（ｇｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）とをβ１−４、β１−３型の結合で結合した二糖類単位から構成される。生物学的には、ポリマーグリカンは、数百から２０，０００以上もの二糖類単位の線形の繰り返しから構成される。ＨＡの分子量は一般に、血清中では１００，０００Ｄａから、滑液中では２，０００，０００程度まで、臍帯及びガラス体液中では８，０００，０００程度までである。ＨＡは、負の電荷密度が高いため、陽イオンを引き付け、水中に誘引する。この水和反応によって、ＨＡは非常に圧縮力のある荷重を支持することができる。ＨＡは、あらゆる組織及び体液に含まれ、最も豊富には柔軟な結合組織に含まれており、また、その天然の保水力は、組織の形状及び機能の影響等の他の役割を推測するのに役立つ。それは、細胞外基質に、細胞表面に、また、細胞内部にも含まれている。
【００８３】
天然型ＨＡの構造は多種多様である。最も一般的な変数は鎖長である。あるものは、長い炭水化物鎖を有するために高分子量であり（例えば、家禽のとさかの中及び臍帯中のもの）、また、あるものは、短鎖を有するために低分子量である（例えば、バクテリア培養由来のもの）。ＨＡ類の鎖長は、誘発される生物学的機能において重要な役割を果たす。低分子量ＨＡ（３．５×１０４ｋＤａ未満）は、基質の代謝回転率に関連しかつ組織の炎症に関連すると示されたサイトカイン活性を誘発する可能性がある。高分子量のもの（２×１０５ｋＤａ超）は、細胞増殖を抑制する可能性がある。１〜４ｋＤａの小さなＨＡ断片は、血管新生を増強することが示された。
【００８４】
天然型ＨＡは、所望の特性を導き出すように修飾されてきた（例えば、ＨＡ類を修飾してチオール基を持たせると、そのチオールが、他の基質成分又はホルモンの結合又は新たな架橋形態に利用できる）。また、自然に発生する架橋形態（例えば、酸素で制御されるもの）、更には、天然型ＨＡ類及び修飾型ＨＡ類を特定の試薬（例えば、アルキル化試薬）で処理することによって又は先に述べたような、新たな架橋形態を容認させる修飾型ＨＡ類の構築（例えば、チオール修飾ＨＡにおけるジスルフィド架橋の形成）によって人工的に導き出したものもある。
【００８５】
本発明によれば、チオール修飾ＨＡ、及びそのために用いられる原位置での重合法が、好ましい形態の一部である。これらの方法は、ＣＭＨＡ−Ｓ又はグリコシルとして知られる、チオール化したカルボキシメチル化ＨＡのジスルフィド架橋を伴う。生体内での実験では、低分子量（例えば、７０〜２５０ｋＤａ）のＨＡを使用することがある。これは、ジスルフィド又はＰＥＧＤＡのいずれかを架橋して、非常に高い分子サイズのヒドロゲルが生成されるためである。チオール反応性リンカーであるポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）架橋剤は、細胞の封入及び生体内注入の両方に適している。このグリコシル−ＰＥＧＤＡ混合材は共有結合反応によって短時間で架橋するものであって、生体適合性を有し、しかも細胞を成長及び増殖させることができる。
【００８６】
ヒドロゲル材料であるグリコシルは、生体内での幹細胞の再生医療につながるゲル特性を考慮したものである。グリコシルは、ユタ州ソルトレイクシティのグリコサン・バイオサイエンシズ（Ｇｌｙｃｏｓａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（今は、カリフォルニア州アラメダにあるビオチム（Ｂｉｏｔｉｍｅ）の下位部門である）から入手可能な半合成細胞外基質（ｓＥＣＭ）技術の一部である。エクストラセル（Ｅｘｔｒａｃｅｌ）及びハイステム（ＨｙＳｔｅｍ）といった商標ラインで様々な製品が販売されている。これらの材料は、生体適合性及び生分解性を有し、しかも非免疫原性である。
【００８７】
さらに、グリコシル及びエクストラリンク（Ｅｘｔｒａｌｉｎｋ）は、再生医療用途のための他のＥＣＭ材料と容易に混合できる。ＨＡは、多くの市販元から入手可能であり、ストレプトマイセス種（例えば、ジェンザイム社（Ｇｅｎｚｙｍｅ）、ライフコア社（ＬｉｆｅＣｏｒｅ）、ノヴァマトリクス（ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ）社等）を用いた細菌発酵法、又はＩＳＯ９００１：２０００工程で宿主として枯草菌を用いた細菌発酵法（ノヴァザイムズ（Ｎｏｖａｚｙｍｅｓ）に特有のもの）が好ましい。
【００８８】
細胞集団の理想比率は、生体内及び組織細胞懸濁液中に含まれているものを再現しなければならない。細胞混合物は、前駆細胞の成熟及び／又は成人細胞型の維持と同時に、必要とされる血管新生の展開も可能にする。このように、複数の基質成分及び溶解性因子を含有する複合体用の塩基としてのヒアルロン酸を使用して、しかも特異的成熟系統段階で上皮細胞及び間葉細胞によって産生されるパラクリン信号の特異的集合から構成された特異的な微小環境ニッチを模倣するように設計された複合微小環境が得られる。米国特許出願番号第６１／３３２，４４１号を参照し、その開示は、全て本明細書に参照として含まれている。
【００８９】
肝臓内の幹細胞ニッチの微小環境は、肝幹細胞と血管芽細胞との間のパラクリン信号から成る。それは、ヒアルロン酸、ＩＩＩ型コラーゲン、特定の型のラミニン（例えば、ラミニン５）、ほとんど硫酸化されていない新型コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳ−ＰＧ）、及び肝幹／前駆細胞用に展開された培地である「クボタ培地」に近いか又はまさにその通りの溶解性信号／培地組成物で構成されている。他の因子は厳密には必要ではないが、幹細胞因子、Ｒ−スポンジン、白血病抑制因子（ＬＩＦ）及び／又は特定のインターロイキン（例えば、ＩＬ６、ＩＬ１１及びＴＧＦ−β１）を補充することによって効果が認められることもある。幹細胞ニッチ形態のＣＳ−ＰＧは未だ入手できていない。
【００９０】
肝臓内の一過性増殖細胞微小環境は、形態学的には肝芽細胞と肝星細胞前駆体又は内皮細胞前駆体との間にある。この微小環境の成分としては、ヒアルロン酸、ＩＶ型コラーゲン、αβ１−インテグリンと結合する特定の型のラミニン、より高度に硫酸化されたＣＳ−ＰＧ類、ヘパラン硫酸プロテオグリカン型（ＨＳ−ＰＧ類）、並びに上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、間質細胞由来増殖因子（ＳＧＦ）及びレチノイド類（例えば、ビタミンＡ）を含む溶解性信号が挙げられる。
【００９１】
［移植方法］
注入用移植片は、任意の欠損形状又は欠損空間（例えば、損傷した臓器又は組織）を補うことができる点で有利である。本発明の方法によれば、細胞を同時培養して、ゲル形成生体材料に埋め込まれた細胞懸濁液に入れて送達され、それを様々な架橋方法を利用してその場で凝固させる。懸濁液は、内視鏡検査によって、又は腹腔鏡検査によって、若しくは管の周囲においてカフ形状で管の外壁に配置されたヒドロゲルを含むパッチとして総肝膵管の壁に直接的に送達することができる。これらは、ヒアルロン酸基質混合物をゲル化させる架橋剤、ＰＥＧＤＡを提供することにより、壁に固定することができる。この手術は、患者の罹患率を最小限にして合理的に迅速に行うことができる必要がある。
【００９２】
胆管壁に直接注入する。総肝膵管の線維筋壁は、総肝膵管の上皮構造に付着し、総肝膵管の上皮構造を包む筋肉及び結合組織の層で構成されている。線維筋組織のこれらの層は、ファーター膨大部の開口部から総胆管とウィルソング管の分離部に延びるスリーブを形成する。線維筋組織の別々の構造は、これら二つの構造に沿って継続する。線維筋壁は、解剖学的バリエーション及び個人の年齢に依存して、膵臓の頭部の実質組織内に、又は線維脂肪組織に埋め込まれている。
【００９３】
胆管壁の表面上にパッチ移植する。また、適切な生体材料の内に、そして関連する溶解性の信号と混合されている幹／前駆細胞の移植片は、カバー内に配置（例えば、クモの糸、網）され、カバーは（管を取り囲むカフとして）胆管又は胆管の周りに外科的に接着されている。幹細胞の移植片は、胆管の表面につながれた壁外胆管周囲腺と相互作用する。このように、移植された幹／前駆細胞は、管の外側を通って管内に組み込まれていることができる。
【００９４】
腹腔鏡手術又は内視鏡送達の両方が、管腔内のアプローチを利用することができる。簡単に言えば、内視鏡は、口から胃を通して十二指腸に挿入することができた。内視鏡上のサイドポートを使用すると、これは、膨大部を通して総肝膵管内に入ることができる。総肝膵管は、膵臓について意図された細胞の送達部位に使用される。内視鏡は、肝臓を対象とする細胞の送達のために肝臓の近くの部位に到達するために胆管に沿って移動することができる。このアプローチを用いて、移植片として細胞を管周囲の領域へ移植することができ、移植化戦略は、細胞の生着を促進するべきである。この手術は、一般的な鎮静下で実施されなければならない。
【００９５】
腹腔鏡手術では、患者は全身麻酔を受け、腹腔鏡ポートと機器の配置を可能にするために、皮膚及び筋膜内で小さな切開（通常は１ｃｍ未満）を行う。カメラは、視線誘導のために腹腔内に導入し、超音波を含む他の機器も、腹部内に導入することができる。これらの可視化技術は、膵管を含む膵臓及びその実質特徴を識別するための手段を提供する。外科医は、超音波又は他の造影指針にしたがって、細胞を送達するために、小さいゲージの針を膵臓の好適な場所に向かわせるようにする。この方法は、外科医によって、出血を識別して制御し、周囲の臓器への不注意な送達又は怪我を最小限にし、治療介入に関連する罹患率を最小化するメカニズムを提供することを可能にする。
【００９６】
注射は、例えば、上述したように二連注射器を用いて、実行することができる。簡単に述べると、一方の注射器の側に、架橋剤ＰＥＧＤＡを含有する他方の注射器に針を接続して、細胞−基質−培地混合物を充填する。混合物は、総肝膵管内に直接に２５ゲージの針を通して注射され、直ちに架橋されてヒドロゲルを形成することができる。ＰＥＧＤＡ及びＣＭＨＡ−ＳをｐＨ７．４で使用すると、１〜２分の期間にわたって架橋反応が起こるので、細胞の封入だけでなく、生体内での注入が可能になる。
【００９７】
注入用生体材料としては、キトサンのような無機天然素材、アルギン酸塩、ヒアルロン酸、フィブリン、ゼラチン、並びに多数の合成ポリマーで十分である。これらの材料は、多くの場合、熱ゲル化、光架橋又は化学的架橋等の方法で凝固する。細胞懸濁液には、溶解性信号又は特定の基質成分を補充してもよい。これら移植片は対象部位に比較的容易に注入できるので、侵襲的手術は全く（わずかしか）必要とせず、経費、患者の不快感、感染の危険性及び傷跡の形成が抑えられる。また、ＣＭＨＡは、その長続きする効果によって、生体適合性も保持されるので、再生医療のための注入用材料としても使用できる。さらには、架橋方法は材料の生体適合性も維持し、しかもそれが広範な再生可能部位又は幹／前駆細胞ニッチ内に存在すると、魅力的な注入用材料となる。
【００９８】
一部の実施態様では、移植片は、総肝膵管壁の表面に直接配置するように設計されてもよく、その場合、移植片は、生体適合性を有しかつ生分解性被膜（「救急絆創膏（ｂａｎｄａｉｄ）」）と共に適切な位置に保持される。このように送達された細胞は、疾患又は遺伝的疾患を治すために、膵臓の中に移動することができる子孫を生じるべきである。胆管の表面を通じて生じるように移動することが困難である場合、その表面は、接近し得るように、化学的に又は外科的に研磨されることができる。
【００９９】
特に定義のない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語はいずれも、本発明の属する技術分野における当業者が一般に理解しているのと同様の意味を有する。本明細書で挙げる刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献はいずれも、その全体が参照として組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含めた本明細書に準拠するものとする。また、材料、方法及び実施例は、単に例示的なものであり、これらに限定されるものではない。
【０１００】
本発明を以下の代表的な実施例によって詳細に説明するが、本発明の範囲は以下に例示される実施態様に限定されることを意図したものではなく、また、それらに限定されるものではない。
【０１０１】
［実施例１：ヒアルロン酸移植片を使用する移植戦略の有効性の例］
マウス肝前駆細胞は、宿主であるＣ５７／ＢＬ６マウス（４〜５週齢）から、報告されたプロトコルに従って単離した。「移植」実験において、ＧＦＰレポーターを肝前駆細胞に導入した。次に、前記細胞を、ヒアルロン酸（ＨＡ）ヒドロゲルと混合し、このＨＡを架橋してから対象マウスに導入した。導入／移植のために、マウスをケタミン（９０〜１２０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔して開腹した。その後、前記細胞を、ＨＡと共に又はＨＡを用いずに、肝臓に徐々に注入した。切開部を閉じ、そして動物に、ブプレノルフィン０．１ｍｇ／ｋｇを１２時間毎に４８時間与えた。４８時間後、動物を安楽死させ、組織を取り出して固定して、組織学的検査用の薄片を作製した。
【０１０２】
マウスモデル体内での細胞の局在性を確認するために、「対照」肝前駆細胞を、５０ＰＯＩのルシフェラーゼ発現アデノウィルスベクターに３７℃で４時間感染させた。生存手術を上述と同様にして行い、そして細胞（１〜１．５Ｅ６個）は、血管経路（肝動脈又は門脈）によって肝葉に、若しくは直接注射によって又は移植によって総肝膵管内に注入した。撮像直前に、マウスにルシフェリンを皮下注射して、移植された細胞から発光信号を生じさせた。ＩＶＩＳ動力学的光学画像装置（Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｉｍａｇｅｒ）を用いて、マウス体内での細胞の局在性を確かめた。実験的な宿主には、ＨＡとの緩衝液中で懸濁した細胞を注射した。
【０１０３】
２４時間後では、ＨＡ移植を用いずに注入した「対照」細胞は、肝臓と肺の両方で見つかった。しかし、７２時間後では、前記「対照」細胞はほとんど存在しておらず、肝臓内には、識別可能な「対照」細胞がほんの少量残存していた。これとは対照的に、本発明に従って移植された細胞では、肝臓に上手く融合した細胞群が２４時間後及び７２時間後にいずれも認められ、２週間後もまだ残存していた。また、この幹細胞ニッチ移植によって移植された細胞は、ランダム化組織試料に対するアッセイによれば、ほとんど肝臓組織にだけ局在化していることが分かり、しかも他の組織では見つからなかった
【０１０４】
［実施例２：膵臓幹細胞］
ワンら、幹細胞（２０１３）、３１（９）、１９６６〜１９７９頁は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。近位（ＰＢＧｓ）−遠位（ＰＤＧｓ）の成熟系統は、多能性のマーカー（ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２）、増殖のマーカー（Ｋｉ６７）、自己複製のマーカー（ＳＡＬＬ４）、及び初期肝膵臓委任のマーカー（ＳＯＸ９、ＳＯＸ１７、ＰＤＸ１、ＬＧＲ５）を発現する細胞を有する十二指腸付近で始まり、多能性又は自己複製マーカーを発現せず、膵臓遺伝子（ＰＤＸ１）のマーカーを維持し、膵臓内分泌成熟（ＮＧＮ３、ＭＵＣ６、インスリン）のマーカーを発現するＰＤＧ細胞に転移する。放射軸系統は、幹細胞を持つ管の線維筋層の近くＰＢＧｓで始まり、幹細胞形質を欠いていて膵内分泌遺伝子に対して陽性である細胞を持つ管腔で終わる。
【０１０５】
胆道系由来細胞は、拡張条件である、培養プラスチック及び無血清クボタの培地（ＫＭ）下で培養中の幹細胞として作用し、数ヶ月未分化細胞として増殖するが、膵臓由来細胞は約８〜１０分裂のみを受けた後、膵島の運命に部分的に分化した。胆道系由来細胞は、膵臓の委任前駆細胞の前駆体であることを証明した。両方は、３次元の条件、膵島由来の基質成分、及び膵島運命（ＨＤＭ−Ｐ）のための無血清のホルモン限定培地によって駆動されて、グルコース調節性を持つ、新しい膵島の微細構造の電気生理学的及び機能的特性を有するスフェロイドを形成する。これらの新しい膵島を、化学的糖尿病患者である、免疫不全にかかるマウスの精巣上体脂肪パッド内に移植すると、ヒトＣペプチドを分泌して、グルコースによって調節可能であり、宿主において高血糖を軽減することができる。胆道系由来の幹細胞、及びそれらの膵臓委任前駆細胞への接続は、生涯の膵臓臓器形成のための生物学的な骨格を構成する。
【０１０６】
［実施例３：胆嚢内の幹細胞］
胆嚢は、症候性胆石症ための腹腔鏡手術及び臓器提供者から得られた。組織又は単離された細胞は、免疫組織化学及びフローサイトメトリー分析法により特徴付けられた。ＥｐＣＡＭ＋（上皮細胞接着分子）の細胞は、磁性マイクロビーズにより免疫選択され、自己複製条件でプラスチック上に培養され、その後、具体的な成人の運命への分化のために調節された個別の無血清のホルモン限定培地に移した。生体内実験は、肝硬変の実験モデルで行った。
【０１０７】
結果：胆嚢は胆管周囲腺を持っていないが、その代わりに、粘膜陰窩で組織化された幹／前駆細胞を持っている。これらは、ＥｐＣＡＭのための免疫選択によって単離することができる。原位置での約１０％のＥｐＣＡＭ＋細胞及び約１０％の免疫選択されたＥｐＣＡＭ＋細胞は、複数の多能性遺伝子及び種々の幹細胞マーカーを同時発現し、他のＥｐＣＡＭ＋細胞が、前駆細胞として見なされた。シングルのＥｐＣＡＭ＋細胞は自己複製条件で幹細胞性を維持して生体外でクローン原性拡大を示した。新たに単離された又は培養されたＥｐＣＡＭ＋細胞は、複数の異なる成人の運命である、アルブミン分泌肝細胞のコード、セクレチン受容体＋胆管細胞の分岐管、又はグルコース応答性の、インスリン／グルカゴンを分泌する新しい膵島に分化することができる。免疫不全宿主における生体内に移植されたＥｐＣＡＭ＋細胞は、肝細胞を生成するヒトアルブミンを生じて、また、肝硬変マウスに移植すると多数で発生したヒトサイトケラチン７＋を生じた。このように、ヒト胆嚢は、容易に単離可能な細胞を含み、これは、多分化の内胚葉幹細胞の表現型及び生物学的特性を持つ。
【０１０８】
［実施例４：原位置で成熟系統を実証する分析の純合計］
胆道系内又は胆嚢内の多様な部位での胆管周囲腺の細胞は、多能性遺伝子、幹細胞遺伝子、及び、成熟した肝臓又は膵臓の遺伝子の発現について評価した。これらの遺伝子の発現は、放射軸と近位−遠位軸とにおける成熟系統を示すパターンを形成した。この要約は、表２に与えられている。線維筋層に最も近い胆管周囲腺内の細胞は、高いレベルの多能性遺伝子（例えば、ＳＡＬＬ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ）の、及び内胚葉幹細胞の特性（例えば、ＳＯＸ９、ＳＯＸ１７、ＰＤＸ１、ＬＧＲ５）の発現、並びに最小限の（もしあれば）成熟細胞マーカー（アルブミン、インスリン、ＣＦＴＲ）の発現を有する最も原始的なものであることが見出された。胆管の内腔に向かって進行すると、多能性遺伝子の発現は、減少し、成熟細胞運命のマーカーは漸進的に取得された。細胞が膵臓の近くのＰＢＧｓにあった場合は、成熟マーカーは、インスリン及び他の膵島ホルモン又はアミラーゼ及び腺房細胞の他のマーカーであった。細胞が肝臓の近くのＰＢＧｓにあった場合は、成熟マーカーは、アルブミン、トランスフェリン、Ｐ４５０遺伝子及び肝細胞の他のマーカー又はＣＦＴＲ、セクレチン受容体及び胆管細胞の他の成熟マーカーであった。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【０１０９】
本発明は、その特定の態様に関連して説明してきたが、本発明は更に修正することが可能であるものと解することができ、また、本出願は、本発明のあらゆる変化、用途又は変更を網羅するものである。一般に、本発明の原理に従い、本開示内容から逸脱するような、本発明の属する技術における既知の方法又は慣用の方法、及び上述の本質的な特徴に当てはめまるもの、並びに添付の特許請求の範囲の範疇に入るものも網羅するものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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