(57)【要約】本明細書に例示される態様により、肺炎連鎖球菌の血清学的検出に好適なセンサーチップ、該センサーチップを使用して肺炎連鎖球菌の血清型を検出するための方法、該センサーチップを含む検出システム、及び本明細書に記載される検出システムを使用して肺炎連鎖球菌の血清型を検出するための方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）の血清学的検出に好適なアレイ画像化反射率測定（ＡＩＲ）センサーチップであって、
それぞれが肺炎連鎖球菌の２つ以上の異なる血清型のうちの１つに特異的に結合する抗体または抗体結合断片がその上に結合した状態で含まれる表面を備える多層基板
を備え、前記抗体または抗体結合断片が、異なる場所で前記表面に結合し、前記表面には、肺炎連鎖球菌結合の非存在下で適切な入射角及び波長で前記表面を照明する偏光の弱め合う干渉をもたらす被覆が形成され、前記抗体もしくは抗体結合断片が結合する肺炎連鎖球菌を含む試料への前記表面の曝露が、抗体または抗体結合断片の結合時に、ある場所で検出可能な反射率の変化を生じさせる、前記アレイ画像化反射率測定（ＡＩＲ）センサーチップ。
【請求項２】
前記抗体または抗体結合断片が、肺炎球菌多糖体に特異的に結合する、請求項１に記載のセンサーチップ。
【請求項３】
前記肺炎球菌多糖体が、完全長多糖体である、請求項２に記載のセンサーチップ。
【請求項４】
前記肺炎球菌多糖体が、多糖体断片である、請求項２に記載のセンサーチップ。
【請求項５】
前記肺炎球菌多糖体が、莢膜多糖体である、請求項２に記載のセンサーチップ。
【請求項６】
前記抗体または抗体結合断片が、前記基板に共有結合される、請求項１に記載のセンサーチップ。
【請求項７】
アレイ画像化反射率測定（ＡＩＲ）を使用して肺炎連鎖球菌の血清型を検出するための方法であって、
請求項１〜６のいずれか一項に記載のセンサーチップを提供する段階と、
前記センサーチップを、前記チップ表面上に存在する前記抗体または抗体結合断片による肺炎連鎖球菌表面抗原への特異的結合を許容する条件下で試料と接触させる段階と、
特異的に結合された肺炎連鎖球菌表面抗原を特定するのに有効な条件下で前記チップの前記表面から反射された光を検出する段階であって、それにより肺炎連鎖球菌の血清型を検出する、段階と
を含む、前記方法。
【請求項８】
前記センサーチップをすすいで、前記抗体または抗体結合断片によって特異的に結合されていない任意の肺炎連鎖球菌表面抗原を除去する段階をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記試料が、ヒト、非ヒト霊長類、家畜動物、または野生動物から得られる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出する段階が、
前記チップから反射された光を測定することと、
前記測定された反射光に基づいて、特異的に結合された肺炎連鎖球菌表面抗原を特定する出力を提供することと、を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記反射された光を測定することが、前記チップの前記表面の少なくとも実質的な部分の画像を捕捉することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の肺炎連鎖球菌の血清学的検出に好適なアレイ画像化反射率測定（ＡＩＲ）センサーチップと、
前記センサーチップを照明するように位置付けられた光源と、
前記チップの前記表面から反射された光を検出するように位置付けられ、それにより前記チップ表面上に存在する前記抗体または抗体結合断片による肺炎連鎖球菌表面抗原への特異的結合を決定する検出器と
を備え、前記表面を照明する偏光の弱め合う干渉が前記抗体または抗体結合断片による肺炎連鎖球菌表面抗原への特異的結合の非存在下で起こり、前記検出器により検出可能な反射率の変化を生じさせる、検出システム。
【請求項１３】
肺炎連鎖球菌の血清学的検出のための方法であって、
請求項１２に記載の検出システムを提供する段階と、
前記センサーチップの表面に光を向ける段階と、
前記センサーチップを、前記チップ表面上に存在する前記抗体または抗体結合断片による肺炎連鎖球菌表面抗原への特異的結合を許容する条件下で試料と接触させる段階と、
抗体−肺炎連鎖球菌結合を特定するのに有効な条件下で前記チップから反射された光を検出する段階と
を含む、前記方法。
【請求項１４】
前記試料が、ヒト、非ヒト霊長類、家畜動物、または野生動物から得られる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出する段階が、
前記チップから反射された光を測定することと、
前記測定された反射光に基づいて、前記試料の肺炎連鎖球菌により結合された前記抗体または抗体結合断片を特定する出力を提供することと、を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記反射された光を測定することが、前記チップの前記表面の少なくとも実質的な部分の画像を捕捉することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
肺炎連鎖球菌の血清学的検出に好適なセンサーチップであって、
それぞれが肺炎連鎖球菌の２つ以上の異なる血清型のうちの１つに特異的に結合する抗体または抗体結合断片がその上に結合した状態で含まれる表面を備える基板
を備え、前記抗体または抗体結合断片が、異なる場所で前記表面に結合し、前記表面には、肺炎連鎖球菌結合の非存在下で適切な入射角及び波長でその表面を照明する偏光の弱め合う干渉をもたらす被覆が形成され、前記抗体または抗体結合断片が結合する肺炎連鎖球菌を含む試料への前記表面の曝露が、抗体または抗体結合断片の結合時に、ある場所で検出可能な反射率の変化を生じさせる、前記センサーチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年１０月９日出願の米国仮特許出願第６１／８８８，８０６号の利益を主張し、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
分野
本明細書に例示される態様により、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）の血清学的検出のためのセンサーチップ及び検出システム、ならびにそれらの使用方法が提供される。
【背景技術】
【０００３】
背景
組換えタンパク質及びそれらをコードする遺伝子を産生し増幅させる研究者の能力から付随して開発されたものは、ハイスループットマイクロアレイである。ハイスループットスクリーニングの初期適用ではゲノムアレイに焦点を当てていたが（Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  Ｗｉｔｈ  ａ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４６７−４７０（１９９５）（非特許文献1）、Ｌｉｐｓｈｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．「Ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｒｒａｙｓ」、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：２０−２４（１９９９）（非特許文献2））、タンパク質マイクロアレイも同様に種々の重要な用途を見出した。例えば、タンパク質マイクロアレイを介したプロテオームプロファイリングは、無数の新規の相互作用を明らかにした（ＭａｃＢｅａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．「Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：１７６０−１７６３（２０００）（非特許文献3）、Ｍｉｃｈａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．「Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｗｉｔｈ  Ｗｈｏｌｅ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：１５０９−１５１２（２００３）（非特許文献4）、及びＣｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｐａｔｈｗａｙｓ」、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：１３９０−１３９６（２００４）（非特許文献5））。タンパク質マイクロアレイは、抗原タンパク質を発見し、それらに対するヒト免疫学的応答を監視するために使用されている（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．「Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｈｕｍｏｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２：５４７−５５２（２００５）（非特許文献6）、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  Ｌｉｖｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ」、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７３：３７３４−３７３９（２００５）（非特許文献7）、及びＱｉｕ  ｅｔ  ａｌ．「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ＳＡＲＳ  Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．７：８８２−８８９（２００５）（非特許文献8））。この手段は、肺炎連鎖球菌の血清学的検出のための複数の抗体または抗体結合断片の固定化にはこれまでに���用されていない。なおまた、これらの報告のそれぞれにおいて、検出は、標識された試薬を使用して達成された。
【０００４】
以前の報告（Ｈｏｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．「Ａ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  Ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ」、Ｂｉｏｓｅｎ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔ．２１：１６５９−１６６３（２００６）（非特許文献9）及びＭａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．「Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｒｒａｙｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｆｌｅｃｔｏｍｅｔｒｙ  ａｓ  ａ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７８：５５７８−５５８３（２００６）（非特許文献10））は、２つの相互作用するタンパク質のアレイ画像化反射率測定検出について説明しているが、完全な血清型レベルの特定を提供することはできていない。同様に、Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｒａｍ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｕｓｉｎｇ  Ｎａｎｏｓｃａｌｅ  Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｍｉｃｒｏｃａｖｉｔｉｅｓ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：１１７９７−１１７９８（２００１）（非特許文献11）は、リポサッカライドセンサーが、異なる型のグラム（−）細菌を区別できないことを認めている。例えば、莢膜多糖体のアレイ画像化反射率測定法が非特異的結合に打ち負かされ得るかどうかについていくらかの疑問が存在している。
【０００５】
肺炎連鎖球菌は、依然として極めて重要なヒト病原体である。２０１１年の推定１３０万件の死に至る小児肺炎の世界的症例のうち、１８．３％（２３７，９００）は、肺炎連鎖球菌によって引き起こされた（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．「Ｇｌｏｂａｌ  Ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ａｎｄ  Ｄｉａｒｒｈｅａ」、Ｌａｎｃｅｔ  ３８１：１４０５−１４１６（２０１３）（非特許文献12））。肺炎球菌による肺炎は、成人においても重大な問題である（Ｓａｉｄ  ｅｔ  ａｌ．「Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ａｍｏｎｇ  Ａｄｕｌｔｓ：Ａ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  Ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８（４）：ｅ６０２７３（２０１３）（非特許文献13））。肺炎連鎖球菌には９０種を超える別個の血清型が存在するため、この生物は、血清学に関して相当の困難を提示する。
【０００６】
伝統的なクェルング反応法（Ｌｕｎｄ「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ」、Ｂｕｌｌ．Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ．２３：５−１３（１９６０）（非特許文献14））に加えて、肺炎連鎖球菌検出における近年の進歩は、競合ビーズに基づくイムノアッセイの開発を含んでいる（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．「Ａ  Ｒａｐｉｄ  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  Ｓｅｒｏｔｙｐｉｎｇ  Ｓｓｙｔｅｍ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ＰＣＲ」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂ．５７：１７１−１７８（２００８）（非特許文献15））。重要な進歩であるが、このようなアッセイは、依然として複雑な器具及び等しく複雑なワークフローを必要とする。加えて、全てのサンドイッチイムノアッセイと同様に、アッセイによって網羅される血清型の数を増加させることは、アッセイの各構成要素を交差反応性について再認定する必要性により複雑化される。ＰＣＲに基づく方法は、広く使用されており人気であるが、これらは間接的、複雑、かつ高価であり、それらの菌株網羅に関して限界が認識されている（Ｍｅｎｅｚｅｓ  ｅｔ  ａｌ．「Ｕｐｄａｔｅ  ｏｆ  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  'ＰＣＲ−Ｓｅｒｏｔｙｐｉｎｇ'ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｃｏｍｍｏｎｌｙ  Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  Ｔｙｐｅ  １９Ｆ  ｗｚｙ  Ｖａｒｉａｎｔ  ｉｎ  Ｂｒａｚｉｌ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＣＭ．００７４３−１３（２０１３）（非特許文献16））。
【０００７】
当該技術分野の現状及びヒトの健康に対する重要性を考慮して、肺炎球菌に対する新たな血清学的方法が明らかに必要とされている。
【０００８】
肺炎連鎖球菌の異なる血清型を区別するために使用することができる固定化された抗体または抗体結合断片のアレイを提供することが望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  Ｗｉｔｈ  ａ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４６７−４７０（１９９５）
【非特許文献２】Ｌｉｐｓｈｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．「Ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｒｒａｙｓ」、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：２０−２４（１９９９）
【非特許文献３】ＭａｃＢｅａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．「Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：１７６０−１７６３（２０００）
【非特許文献４】Ｍｉｃｈａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．「Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｗｉｔｈ  Ｗｈｏｌｅ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：１５０９−１５１２（２００３）
【非特許文献５】Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｐａｔｈｗａｙｓ」、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：１３９０−１３９６（２００４）
【非特許文献６】Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．「Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｈｕｍｏｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２：５４７−５５２（２００５）
【非特許文献７】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  Ｌｉｖｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ」、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７３：３７３４−３７３９（２００５）
【非特許文献８】Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ＳＡＲＳ  Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．７：８８２−８８９（２００５）
【非特許文献９】Ｈｏｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．「Ａ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  Ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ」、Ｂｉｏｓｅｎ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔ．２１：１６５９−１６６３（２００６）
【非特許文献１０】Ｍａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．「Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｒｒａｙｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｆｌｅｃｔｏｍｅｔｒｙ  ａｓ  ａ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７８：５５７８−５５８３（２００６）
【非特許文献１１】Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｒａｍ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｕｓｉｎｇ  Ｎａｎｏｓｃａｌｅ  Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｍｉｃｒｏｃａｖｉｔｉｅｓ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：１１７９７−１１７９８（２００１）
【非特許文献１２】Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．「Ｇｌｏｂａｌ  Ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ａｎｄ  Ｄｉａｒｒｈｅａ」、Ｌａｎｃｅｔ  ３８１：１４０５−１４１６（２０１３）
【非特許文献１３】Ｓａｉｄ  ｅｔ  ａｌ．「Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ａｍｏｎｇ  Ａｄｕｌｔｓ：Ａ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  Ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８（４）：ｅ６０２７３（２０１３）
【非特許文献１４】Ｌｕｎｄ「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ」、Ｂｕｌｌ．Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ．２３：５−１３（１９６０）
【非特許文献１５】Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．「Ａ  Ｒａｐｉｄ  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  Ｓｅｒｏｔｙｐｉｎｇ  Ｓｓｙｔｅｍ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ＰＣＲ」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂ．５７：１７１−１７８（２００８）
【非特許文献１６】Ｍｅｎｅｚｅｓ  ｅｔ  ａｌ．「Ｕｐｄａｔｅ  ｏｆ  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  'ＰＣＲ−Ｓｅｒｏｔｙｐｉｎｇ'ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｃｏｍｍｏｎｌｙ  Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  Ｔｙｐｅ  １９Ｆ  ｗｚｙ  Ｖａｒｉａｎｔ  ｉｎ  Ｂｒａｚｉｌ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＣＭ．００７４３−１３（２０１３）
【発明の概要】
【００１０】
概要
本明細書に例示される態様により、肺炎連鎖球菌の血清学的検出に好適なアレイ画像化反射率測定（「ＡＩＲ」）センサーチップが提供される。このセンサーチップは、それぞれが肺炎連鎖球菌の２つ以上の異なる血清型のうちの１つに特異的に結合する抗体または抗体結合断片がその上に結合した状態で含まれる表面を備える多層基板を含む。抗体または抗体結合断片は、異なる場所で表面に結合する。この表面には、肺炎連鎖球菌結合の非存在下で適切な入射角及び波長で表面を照明する偏光の弱め合う干渉をもたらす被覆が形成される。抗体または抗体結合断片が結合する肺炎連鎖球菌を含む試料への表面の曝露は、抗体または抗体結合断片の結合時に、ある場所で検出可能な反射率の変化を生じさせる。
【００１１】
本明細書に例示される態様により、アレイ画像化反射率測定（ＡＩＲ）を使用して肺炎連鎖球菌の血清型を検出するための方法が提供される。この方法は、本明細書に記載されるセンサーチップを提供する段階を含む。このセンサーチップは、チップ表面上に存在する抗体または抗体結合断片による肺炎連鎖球菌表面抗原への特異的結合を許容する条件下で試料と接触させられる。チップの表面から反射された光は、特異的に結合した肺炎連鎖球菌表面抗原を特定するのに有効な条件下で検出され、それにより肺炎連鎖球菌の血清型を検出する。
【００１２】
本明細書に例示される態様により、検出システムが提供される。この検出システムは、本明細書に記載される肺炎連鎖球菌の血清学的検出に好適なアレイ画像化反射率測定（ＡＩＲ）センサーチップを含む。システムには、センサーチップを照明するように位置付けられた光源も含まれる。検出器は、チップの表面から反射された光を検出し、それによりチップ表面上に存在する抗体または抗体結合断片による肺炎連鎖球菌表面抗原への特異的結合を決定するように位置付けられる。表面を照明する偏光の弱め合う干渉は、抗体または抗体結合断片による肺炎連鎖球菌表面抗原への特異的結合の非存在下で起こり、検出器により検出可能な反射率の変化を生じさせる。
【００１３】
本明細書に例示される態様により、肺炎連鎖球菌の血清学的検出のための方法が提供される。この方法は、本明細書に記載される検出システムを提供する段階を含む。光は、センサーチップの表面に向けられる。センサーチップは、チップ表面上に存在する抗体または抗体結合断片による肺炎連鎖球菌表面抗原への特異的結合を許容する条件下で試料と接触させられる。チップから反射された光は、抗体−肺炎連鎖球菌結合を特定するのに有効な条件下で検出される。
【００１４】
本明細書に例示される態様により、肺炎連鎖球菌の血清学的検出に好適なセンサーチップが提供される。このセンサーチップは、それぞれが肺炎連鎖球菌の２つ以上の異なる血清型のうちの１つに特異的に結合する抗体または抗体結合断片がその上に結合した状態で含まれる表面を備える基板を含む。抗体または抗体結合断片は、異なる場所で表面に結合する。表面には、肺炎連鎖球菌結合の非存在下で適切な入射角及び波長で表面を照明する偏光の弱め合う干渉をもたらす被覆が形成される。抗体または抗体結合断片が結合する肺炎連鎖球菌を含む試料への表面の曝露は、抗体または抗体結合断片の肺炎連鎖球菌への結合時に、ある場所で検出可能な反射率の変化を生じさせる。
【００１５】
実施形態の１つの開示される特徴は、肺炎球菌分析のための新たな血清学的方法を見出すことに関する問題に対する簡易で感度の高い安価な解決策を提供する新規の無標識抗体マイクロアレイである。この開示される特徴は、二次抗体の面倒な再認定なしに、必要なだけ多くの肺炎球菌血清型へのアレイの拡張を可能にし、肺炎を引き起こすことで知られている他の生物の試料の試験を許容し、広く有用な診断につながる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＡＩＲ検出システムの一実施形態の概略図である。
【図２】エリプソメトリ検出システムの一実施形態の概略図である。
【図３】図３Ａは、ＳＰＲ検出システムの一実施形態の概略図である。図３Ｂは、ＳＰＲの出力を示す。
【図４】図４Ａ〜Ｃは、ＡＩＲの一実施形態の概略図である。具体的には、図４Ａは、薄膜の概略的なモデリング変数を示す。図４Ｂは、レーザ源がＩ＝６３３ｎｍであり、膜厚ｄ＝１４１９Å及び入射角ｑ＝７０．６°の場合に存在するゼロ条件での、周囲空気における被覆されたシリコンチップの模擬反射率を示すグラフである。図４Ｃは、分子結合がゼロ条件から強力な反射率増加を引き起こす、生体検出方法を示す概略図である。
【図５】肺炎球菌の検出のためのＡＩＲアレイの予備的実証を示す写真である。輝点は、ヒト血清中に配合されたＰＳ６Ａ多糖体の存在に反応する抗肺炎球菌抗体である。
【図６】ＡＩＲプラットフォーム上の２０−プレックス肺炎球菌抗体アレイを示す写真である。この画像中のいくつかの抗体は、過度に濃く（飽和輝度によって示されるように）プリントされていることに留意されたい。さらなる努力が、それらの抗体の析出挙動を改善した。ここで、「対照」列は、１つの抗ＩｇＧスポット（陽性対照）を取り囲む４つの抗フルオレセインスポット（陰性対照）を特徴とする。
【図７】精製された莢膜多糖体の検出を示す。上パネルは、１つの抗３３Ｆスポットの対照画像及び強度ヒストグラムを提供する。下パネルは、１つの抗３３Ｆスポットの実験画像及び強度ヒストグラムを示す。
【図８Ａ】本明細書に記載されるＡＩＲアレイの一実施形態のアレイ性能及び抗体交差反応性を示す画像である。予備的結果を、試験された各血清型に対する所望の標的濃さ（強度）のパーセンテージの関数として表した。
【図８Ｂ】本明細書に記載されるＡＩＲアレイの一実施形態のアレイ性能及び抗体交差反応性を示す画像である。予備的結果を、試験された各血清型に対する所望の標的濃さ（強度）のパーセンテージの関数として表した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
詳細な説明
肺炎連鎖球菌（肺炎球菌）は、肺炎、菌血症、及び髄膜炎などの侵襲性疾患を引き起こすヒト病原体である。肺炎連鎖球菌または肺炎球菌は、ストレプトコッカス属のグラム陽性、α溶血性、胆汁可溶性、酸素耐性、嫌気性のメンバーである。重要なヒト病原菌である肺炎連鎖球菌は、１９世紀後半に肺炎の主原因として認識され、多くの体液性免疫研究の対象である。
【００１８】
肺炎連鎖球菌はオプトヒン感受性であるため、肺炎連鎖球菌は、オプトヒン試験を使用して、その一部がα溶血性でもある緑色連鎖球菌（Streptococcus viridans）から区別され得る。肺炎連鎖球菌はまた、胆汁による溶解に対するその感受性に基づいて区別され得る。莢膜化グラム陽性球状細菌は、グラム染色上で特徴的な形態、いわゆる「ランセット形」双球菌を有する。それらは、生物に対する毒性因子として作用する多糖体莢膜を有し、９０種を超える異なる血清型が知られており、これらの型は病原性、有病性、及び薬物耐性の程度において異なる。肺炎連鎖球菌の既知の血清型として、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ｆ、１０Ａ、ａ０Ｂ、１０Ｃ、１１Ｆ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１２Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１３、１４、１５Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１６Ａ、１７Ｆ、１７Ａ、１８Ｆ、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、２０、２１、２２Ｆ、２２Ａ、２３Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２５Ｆ、２５Ａ、２７、２８Ｆ、２８Ａ、２９、３１、３２Ｆ、３２Ａ、３３Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３４、３５Ｆ、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ｆ、４１Ａ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ｆ、４７Ａ、及び４８が挙げられる（Ｂｅｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａｐｓｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｌｏｃｕｓ  ｆｒｏｍ  Ａｌｌ  ９０  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ」、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．２（３）：ｅ３１（２００６）、この開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００１９】
肺炎連鎖球菌のゲノムは、株に応じて２００万〜２１０万個の塩基対を含有する閉環状ＤＮＡ構造である。それは、１５５３個の遺伝子のコアセットに加えて、そのビルローム内に病原性に寄与する１５４個の遺伝子、及び非侵襲性表現型を維持する１７６個の遺伝子を有する。遺伝子情報は、株間で最大１０％異なり得る。
【００２０】
肺炎連鎖球菌は、正常な上気道フローラの一部であるが、多くの天然フローラと同様に、適正な条件下で（例えば、宿主の免疫系が抑制される場合）病原性となり得る。ニューモリシン、抗貪食性莢膜、様々なアドヘシン、及び免疫原性細胞壁成分などのインベイシンは全て、主要な毒性因子である。
【００２１】
抗生物質が使用可能であるにもかかわらず、肺炎球菌感染はありふれた状態のままであり、特に幼児及び高齢者などの高リスク群においては依然として致死的であり得る。特に発展途上国では、５歳未満の多くの子供が毎年肺炎球菌性肺炎で死亡している。肺炎連鎖球菌は、中耳炎及び副鼻腔炎の主な原因でもある。これらの感染は、それほど深刻ではないが、それでも特に永久難聴などの合併症につながる場合に相当の医療費が発生する。肺炎球菌の正常な生態的ニッチは、ヒトの鼻咽頭である。全人類は、ある時期に肺炎球菌によってコロニー形成され、所与の時点で最大６０％の個人が保菌者であり得る。ヒトによる肺炎球菌の鼻咽頭保菌は、同じ血清型による感染に対する防御の発達をしばしば伴う。ほとんどの感染は、長期保菌後には起こらないが、最近取得された株への曝露に続いて起こる。多くの細菌は、環境に対する保護層として作用する表面多糖体を含有する。病原菌の表面多糖体は、通常、細菌を宿主細胞の防衛機序、例えば、血清の溶解作用または貪食作用に対して耐性にする。この点において、肺炎連鎖球菌の血清型特異的莢膜多糖体（「ＣＰ」）は、重要な毒性因子である。非莢膜化株は無毒性であり、ＣＰに対する抗体は防御的である。防御は、血清型特異的であり、各血清型は、それ自体が特異的なＣＰ構造を有する。９０種の異なる莢膜血清型が特定されてきた。現在では、２３種の血清型のＣＰがワクチンに含まれている。
【００２２】
連鎖球菌感染に対するワクチンは、特に莢膜がこれらの細菌に対する主要毒性因子と見なされるため、典型的には、様々な連鎖球菌血清型の多糖体莢膜に対する免疫応答を利用することを目的とする。感染中、莢膜は、貪食作用に対する耐性を提供し、故に宿主の免疫系、ならびにマクロファージ及び好中球による排除から細菌を保護する。
【００２３】
莢膜は、具体的には、補体媒介性オプソニン化貪食に対する細菌耐性を付与する。加えて、いくつかの細菌は、宿主分子を模倣する莢膜多糖体（ＣＰ）を発現し、それにより宿主の免疫系を回避する。また、細菌が貪食されたときでさえも、莢膜の存在により細胞内殺滅が妨害される。
【００２４】
細菌は、抗莢膜抗体またはその莢膜に結合された血清因子を通して免疫系により認識され、また宿主が抗体または莢膜抗体に対する他の血清因子を有する場合のみに、オプソニン化により貪食及び殺滅されると一般に考えられる。
【００２５】
しかしながら、これらの抗体は血清型特異的であり、しばしば連鎖球菌の群内で既知の多くの血清型のうちの１つのみに対して防御を付与するに過ぎない。例えば、一般にブタ連鎖球菌（S. suis）の細菌全細胞調製物または莢膜富化分画に基づく、現在商業的に入手可能なブタ連鎖球菌ワクチンは、異種株に対しては限られた防御しか付与しない。また１９８３年に米国において認可された現在の肺炎球菌ワクチンは２３種の肺炎球菌血清型の精製されたＣＰを含むが、少なくとも９０種のＣＰ型が存在している。この肺炎球菌ワクチンの組成は、米国における疾患由来単離株の発生頻度及び様々な血清型間の交差反応性に基づいた。このワクチンは、ワクチンに含まれる血清型によって引き起こされる感染から健康な成人を防御するが、１８ヶ月未満の乳児においては防御的免疫応答の上昇に失敗し、高齢者においてはあまり有効ではない。加えて、ワクチンは、免疫不全及び血清学的悪性疾患を持つ患者において限られた防御しか付与しない。
【００２６】
故に、血清型特定の改善が、連鎖球菌感染から防御するために必要である。関連多糖体を産生することによってＣＰワクチンを産生することに多くの注意が向けられている。本明細書に開示されるように、肺炎球菌分析のための新たな血清学的方法を見出すことに関する問題に対して、簡易、高感度、かつ安価な解決策を提供する無標識抗体マイクロアレイは、この努力を大いに助けるであろう。
【００２７】
本明細書に例示される態様により、肺炎連鎖球菌の血清学的検出に好適なセンサーチップが提供される。実施形態の１つの開示される特徴は、肺炎連鎖球菌の血清学的検出に好適なアレイ画像化反射率測定（ＡＩＲ）センサーチップである。このセンサーチップは、それぞれが肺炎連鎖球菌の２つ以上の異なる血清型のうちの１つに特異的に結合する抗体または抗体結合断片がその上に結合した状態で含まれる表面を備える多層基板を含む。抗体または抗体結合断片は、異なる場所で表面に結合する。この表面には、肺炎連鎖球菌結合の非存在下で適切な入射角及び波長で表面を照明する偏光の弱め合う干渉をもたらす被覆が形成される。抗体または抗体結合断片が結合する肺炎連鎖球菌を含む試料への表面の曝露は、抗体または抗体結合断片の結合時に、ある場所で検出可能な反射率の変化を生じさせる。
【００２８】
アレイ画像化反射率測定（ＡＩＲ）検出システムにおける使用に好適であることに加えて、センサーチップは、表面プラズモン共鳴（「ＳＰＲ」）検出システム、ブリュースター角ストラドル干渉測定（「ＢＡＳＩ」）検出システム、及びエリプソメトリ検出システムにおける使用にも好適であり得る。
【００２９】
センサーチップの全体設計及び構造は、それが使用される特定の検出システムにより異なり得る。これらは、例えば非限定的に、ＡＩＲ検出システム、ＳＰＲ検出システム、ＢＡＳＩ検出システム、及びエリプソメトリ検出システム、ならびに任意の他の無標識または蛍光標識アレイ技法とともに使用するために設計されたセンサーを含む。
【００３０】
ＡＩＲ検出システムは、Ｍｉｌｌｅｒらの米国特許第７，２９２，３４９号に記載され、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。この設定は、図１に示される。システム１０は、光源１２、偏光子１４、受容器１６（すなわち、本明細書に記載される官能化センサーチップ）、及び検出器１８を含む。光源１２は、光（Ｌ）を生成し、設定波長で受容器の表面に向かって透過する。１つ以上のレンズ及びフィルターを用いて、システムを最適化することができる。ＡＩＲは、受容器上の媒質／被覆及び被覆／基板界面からの反射間の干渉を利用して、被覆への生体分子の結合時に反射率の変化を呈する。実際に、酸化物被覆を有するシリコンウエハを使用し、入射角及び波長の適切な選択をｓ−偏光とともに使用して、肺炎連鎖球菌の異なる血清型のこの例において、標的の非存在下でほぼ完全な弱め合う干渉（すなわち、いくつかの状況下で例えば約１０−５またはさらに１０−６未満である反射率）を得ることができる。ほぼ完全な（またはほぼ完璧な）弱め合う干渉の状態は、標的結合時に解消される。故に、少量の肺炎連鎖球菌の異なる血清型の高感度検出が可能である。
【００３１】
ｓ−偏光を使用するＡＩＲは、種々の生体分子検体の定量的検出のための高感度簡易分析方法であることを証明したが、上で参照されるＭｉｌｌｅｒらの米国特許第７，２９２，３４９号に記載されるシステムは、乾燥状態で、つまり水性／酸化物界面よりもむしろ空気／酸化物界面を用いて、はるかにより容易に実行される。水性環境においてＡＩＲを行うための改善されたシステムは、Ｍａｃｅらの米国特許第８，５０２，９８２号に記載され、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。基本的に、そこに記載されるフローセルは、標的結合の検出のために、水性環境へのｓ−偏光の結合を可能にする。
【００３２】
湿式及び乾式ＡＩＲシステムの両方において、センサーチップは、基板、基板上の１つ以上の被覆層、次に別個の場所で被覆表面に結合されたプローブ分子（この場合、それぞれが肺炎連鎖球菌の２つ以上の異なる血清型のうちの１つに特異的に結合する抗体または抗体結合断片）を持つ同じ基本構造を有する。上で参照されるＭｉｌｌｅｒらの米国特許第７，２９２，３４９号、及びＭａｃｅらの米国特許第８，５０２，９８２号に記載されるように（それらの開示は参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）、基板及び被覆（複数可）に対して多くの異なる材料を選択することができる。ＡＩＲ検出システムにおいて使用されるセンサーチップに対して、基板及び被覆の任意の好適な組合せが企図される。一実施例は、シリコン基板及び二酸化ケイ素被覆である。
【００３３】
一実施形態によると、本明細書に記載される肺炎連鎖球菌の血清学的検出に好適なアレイ画像化反射率測定（ＡＩＲ）センサーチップを含む検出システムが提供される。このシステムには、センサーチップを照明するように位置付けられた光源も含まれる。検出器は、チップの表面から反射された光を検出し、それによりチップ表面上に存在する抗体または抗体結合断片による肺炎連鎖球菌表面抗原への特異的結合を決定するように位置付けられる。表面を照明する偏光の弱め合う干渉は、抗体または抗体結合断片による肺炎連鎖球菌表面抗原への特異的結合の非存在下で起こり、検出器によって検出可能な、反射率の変化を生じさせる。
【００３４】
ＢＡＳＩ検出システムは、Ｒｏｔｈｂｅｒｇの米国特許第７，５５１，２９４号に記載されており、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＡＩＲシステムのように、ＢＡＳＩシステムは、媒質／被覆及び被覆／基板界面からの反射間の干渉を利用し、被覆への生体分子の結合時に反射率の変化を呈する。システムの基本設計は、図１（ＡＩＲの場合）に示されるものに類似するが、センサーチップの構造は異なる。ＢＡＳＩシステムは、被覆が非常に薄い場合（例えば、シリコン上の天然酸化膜）、及び２つの界面のうちの一方（基板／被覆または被覆／媒質）上の入射角がそのブリュースター角よりも大きく、２つの界面のうちのもう一方上の入射角がそのブリュースター角よりも小さい場合、いかなる基板／被覆の組合せによっても機能的である。入射ｓ−偏光とともに使用するために商業的に開発されたＡＩＲシステムとは異なり、ＢＡＳＩシステムは、ｐ−偏光の検出に依存する。ブリュースター角ストラドル及びｐ−偏光を使用する結果として、被覆の厚さが＜＜λである場合、反射された偏光のフリップ相は、ほぼ完全な弱め合う干渉を許容する（この場合、標的結合の非存在下で反射率が、例えば、約１０−４またはさらには１０−５未満）。ＡＩＲ検出システムと同様に、少量の肺炎連鎖球菌の異なる血清型の高感度検出が可能である。
【００３５】
エリプソメトリ検出システムは、センサーチップの表面上の被覆の厚さの変化の尺度として、反射された光の偏光成分を測定する。エリプソメトリは、電磁放射線が試料によって反射または透過されるときに、偏光状態の変化を高感度に測定する。図２に示されるこのようなエリプソメトリ検出システムの典型的実施形態は、直線偏光子（Ｐ）と１／４波長板の形態の補償器（Ｃ）との組合せによって付与される、可変偏光コントローラを通るコリメート光線を放出する光源を含む。偏光光線は、既知の斜角でセンサー表面（Ｓ）上に入射し、試料表面から反射されて、好適な光検出器に結合された第２の直線偏光子（集合的にＡ）によって分析される。このエリプソメータ設定において、測定は、Ｃの光学軸を定方位、例えば、入射面に対して４５°で保持しながら、光検出器が最小強度を受信するまで、構成要素Ｐ及びＡの方位角を変化させることによって行われてもよい。この「ヌリング（nulling）」状態の構成要素Ｐ、Ｃ、及びＡの方位角を使用して、エリプソメトリ角δ及びΨを計算してもよく、これらは所与の光の入射角及び波長での試料の光学パラメータに特異的である。好適な光学モデル及び数値回帰を使用して、δ及びΨの量を、光学層の厚さまたは成長過程中のその変化に関して再計算してもよい。生体分子の結合反応を観測するためのエリプソメトリの適用は、１９４２年に遡り（Ｒｏｔｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．「Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｉｌｍｓ  ａｎｄ  Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  ７６：４３７（１９４２）、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、結合反応中に表面で吸着された生体物質の量は、δ及びΨの量から再計算されてもよい。
【００３６】
例えば、Ｃｏｈｎらの米国特許第５，０７６，６９６号（その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるような画像化エリプソメトリは、空間分解検出器及び画像化光学を使用して、例えば、δ及び／またはΨマップの形態で、エリプソメトリデータの超並列測定を可能にする。このようなマップは、層の厚さ、光学屈折率、化学組成、またはアレイ上の各スポットの吸着物質の量の表面マップに順に変換されてもよい。固有の並列検出スキームを持つ画像化エリプソメトリは、これらのいわゆるバイオチップ、マイクロアレイ、またはマイクロプレートに対する検出技法として有利に使用されてもよい（Ｅｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｅｌｌｉｐｓｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＩＳＢＮ  ３−９８０７２７９−６−３（２００２）、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００３７】
画像化エリプソメトリは、測定される表面に作用する測定に用いられる、周囲媒質から来る光で実証された。他の測定設定は、例えば、Ｋｅｍｐｅｎの米国特許第６，５９４，０１１号（その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、全内部反射に基づく。ここで、光源からの光は、内部反射要素を通して、検出される標本から反射するように向けられる。
【００３８】
検出シグナルの強化は、図３Ａに示されるＳＰＲエリプソメトリを使用して達成することができる。ＳＰＲエリプソメトリ中に用いられる基板２３２は、薄い金属層２３４を使用して、表面プラズモンの励起及び伝播を可能にする。金属層２３４の片側は、通常、光を斜角で結合させるようにプリズム２３８に取り付けられる透明な支持構造２３６と接触しているが、層の反対側は、周囲媒質２４０に曝露されている。吸着層の形成による周囲の光学屈折率の変化は（例えば、この具体例では、３つの異なる血清型のうちの莢膜多糖体２４２に結合する表面結合抗体２４４）は、表面プラズモン共鳴を生成する入射角の推移（Δθ）として観測され、反射光強度の変化を引き起こす（図３Ｂを参照）。ＳＰＲに基づくセンサーの場合、金属膜とプローブ表面との間の中間絶縁層が、感度をさらに増加させる手段として作用し得ることが知られている。
【００３９】
センサーチップ基板またはその基板が使用されることを意図される検出システムにかかわらず、センサーチップは、該センサーチップの表面に結合された抗体または抗体結合断片を含む。
【００４０】
標識状態またはシグナル伝達の手段にかかわらず、全てのバイオセンサーに固有の性質は、プローブの固定化である。二酸化ケイ素表面の末端水酸基の役割は、それが求核試薬として作用し得るか（Ｂｉｋｉａｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．「Ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＰＰ−ｇ−ＭＡ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｏｎ  ｉＰＰ／ＳｉＯ２  Ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ  Ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｂｙ  Ｍｅｌｔ  Ｍｉｘｉｎｇ」、Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．４１：１９６５−１９７８（２００５）、Ｔｒｉｐｐ  ｅｔ  ａｌ．「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅｓ  ｔｏ  Ｓｉｌｉｃａ：Ａ  Ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  Ａｍｉｎｅ−ｐｒｏｍｏｔｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．９７：５６９３−５６９８（１９９３）、その開示は参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）または吸着を支持し得るため非常に柔軟である。この理由で二酸化ケイ素は、種々の化学的方法により容易に誘導体化される。これらの化学反応は、アミン（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．「Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｏｎｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ｉｎｔｏ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１：６３０−６３３（２００１）、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）またはハロゲン化物（Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．「Ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ａｌｃｏｈｏｌ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｎ  Ｇｌａｓｓ  Ｓｌｉｄｅｓ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：７８４９−７８５０（２００１）、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を含むが、当然これらに限定されない多くの化学官能基のうちのいずれかへの、水酸基の有効な変換をもたらす。各初期反応から、二次化学物質が添加されて、表面反応性をさらに改変することができ、またはプローブが直接結合されてもよい。さらに、多数の官能化シラン、二酸化ケイ素に結合され、その上に自己集合する分子（Ｏｎｃｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ」、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．４４：２−２４（２００５）、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は商業的に入手可能であり、基板の表面に多様な化学的状況（アミン、エポキシド、アルケンなど）を付与し得る。多くのこれらの手法は、Ｃｈａｎらの米国特許第７，２２６，７３３号及びＭｉｌｌｅｒらの米国特許第７，２９２，３４９号に概説されており、それらの開示は参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【００４１】
ＭａｃｅらのＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／０３９８０８号（その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、アレイ表面に結合されるプローブ分子を含有する製剤における非求核性添加剤の使用を教示している。非求核性添加剤は、反応物質が結合されるアレイ上のスポットにわたる反応物質の不均一な分布により引き起こされた表面形態学的異常を回避またはその重篤度を低減するのに有効な量で使用される。これらの表面形態学的異常は、特定スポットにおける標的分子結合の正確な検出を干渉し得る、中心輝点及び「コーヒーの染み」の環（または光輪）を含む。換言すれば、有効量の非求核性添加剤の使用は、プローブが位置するアレイ上のスポットのそれぞれにわたる反応物質の実質的に均一な分布を促進する。均一な分布によって、スポットの表面にわたる反応物質濃度の変動を（非求核性添加剤の非存在下で調製されたスポットに比べて）最小限にすることが意図される。言い換えれば、例えば、アレイスポットにわたって約１０％未満の画素の変動、または約５％未満の変動、または約３％未満の変動、２％未満の変動、またはさらには約１％未満の変動がある。
【００４２】
任意の有効量の非求核性添加剤を使用することができる。典型的には、このような有効量は、約０．００１〜約３ｖ／ｖ％、または約０．０１〜約１ｖ／ｖ％である。
【００４３】
非求核性添加剤の一実施形態は、以下の式（Ｉ）
Ｒ１−Ｏ−［（ＣＨ２）ｍＯ］ｎ−Ｒ２            （Ｉ）
の構造を有する化合物を含み、式中、ｎは、０〜約２５０の整数であり、ｍは、１〜３の整数、または１もしくは２であり、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１〜Ｃ３アルキルの群から選択されるか、またはＲ１及びＲ２が一緒になってＣ１〜Ｃ３アルキルを形成し、この場合、式（Ｉ）の化合物は、環状構造を有する。Ｒ１及びＲ２は、一実施形態によると、メチルもしくはエチルであるか、または一緒になってエチル基を形成する。これらの添加剤は、約５０００Ｄａ以下、または約４０００Ｄａ以下、または約３０００Ｄａ以下、または約２０００Ｄａ以下、またはさらには約１０００Ｄａ以下である分子量を有してもよい。式（Ｉ）の例示的な非求核性添加剤として、非限定的に、クラウンエーテル（１８−クラウン−６、１５−クラウン−５、１２−クラウン−４など）、ビス（２−メトキシエチル）エーテル、ジアルキルエーテル、及びポリエチレングリコールが挙げられる。
【００４４】
別の実施形態によると、非求核性添加剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。
【００４５】
官能化チップ基板への反応物質（またはプローブ前駆体）の化学的結合に関与しない非求核性添加剤を用いる利点は、添加剤が、アレイ上のそれぞれ別個の場所にわたって、プローブ分子のより良好な分散を促進することである。この改善された分散は、結果として検出システムの感度を減少させ得る表面形態学的異常の存在を最小限にするか、または全体的に回避する。結果として、標的分子の検出に対する改善された感度が達成され得る。
【００４６】
血清型を区別することに関して、肺炎連鎖球菌に対する抗体は現在入手可能であり、多くの血清型に対する抗体は、文献に記載されている（例えば、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ａｎｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｓｅｒｏｔｙｐｉｎｇ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８：１９００−１９０７（２０１１）、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．「Ａ  Ｒａｐｉｄ  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  Ｓｅｒｏｔｙｐｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ＰＣＲ」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：１７１−１７８（２００８）、及びＹｕ  ｅｔ  ａｌ．「Ｒａｐｉｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｓｅｒｏｔｙｐｉｎｇ  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ  ｗｉｔｈ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１５６（２００５）を参照、それらの開示は参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。
【００４７】
一実施形態によると、抗体または抗体結合断片は、肺炎球菌多糖体に特異的に結合する。一実施形態では、肺炎連鎖球菌への特異的結合は、細菌の表面抗原に対するものである。故に、特異的結合は、細菌全体に対するものである必要はない。「表面抗原」とは、通常は抗原が、細菌上に曝露された表面であることを意味するが、試料中に存在する場合、それは細菌から単離または回収されてもよい。
【００４８】
一実施形態では、肺炎球菌多糖体は完全長多糖体であり、他の実施形態では、肺炎球菌多糖体は多糖体断片である。抗体または抗体結合断片が肺炎球菌多糖体断片に結合する場合、各断片は、抗体または抗体結合断片のうちの少なくとも１つが結合するエピトープを含む。
【００４９】
センサーチップに好適な抗体は、購入されても、あるいは調製されてもよい。抗体を調製及び特性化するための手段は、当該技術分野において周知である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８及び米国特許第４，１９６，２６５号を参照、その開示は参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。
【００５０】
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、必要な特異性を持つ結合ドメインを有する任意の特異的結合物質である。故に、この用語は、天然源または組換え源から誘導された無傷の免疫グロブリン、ならびに無傷の免疫グロブリンの免疫反応性部分（すなわち、結合部分）を含むことを意味する。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、細胞内抗体（「イントラボディ」）、抗体断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ）２）、ならびに単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、及びヒト化抗体を含む様々な形態で存在してもよい（Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，ＵＳＩＮＧ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｈｏｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ：Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ａｎ  Ａｎｔｉ−Ｄｉｇｏｘｉｎ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  Ａｎａｌｏｇｕｅ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ「Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）、それらの開示は参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。
【００５１】
全抗体に加えて、このような抗体の結合部分が企図される。このような結合部分は、一価Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片（例えば、単鎖抗体、ｓｃＦｖ）、単一可変ＶＨ及びＶＬドメイン、ならびに二価Ｆ（ａｂ′）２断片、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、低分子化抗体などを含む。これらの抗体断片は、Ｊａｍｅｓ  Ｇｏｄｉｎｇ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ９８−１１８（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８３）及びＥｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）（それらの開示は参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるようなタンパク質分解断片化手順などの従来手順、または当該技術分野において既知の他の方法によって作製することができる。
【００５２】
本明細書で使用される場合、表現「に特異的に結合する」は、抗体またはその結合断片が所定の標的（例えば、肺炎連鎖球菌の１つの血清型の肺炎球菌多糖体）に、それが他の標的に結合するよりも高い親和性で結合することを意味する。一実施形態によると、肺炎連鎖球菌の２つ以上の異なる血清型のうちの１つに特異的に結合する抗体またはその結合断片は、肺炎連鎖球菌の１つの血清型にだけ結合する。別の実施形態によると、肺炎連鎖球菌の２つ以上の異なる血清型のうちの１つに特異的に結合する抗体またはその結合断片は、それが肺炎連鎖球菌の任意の他の血清型に結合するよりも優れた親和性で１つの血清型に結合する。
【００５３】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を生成するための方法は、一般に、ポリクローナル抗体を調製するための方法と同じ系列に沿って始まる。これら両方の方法の第１ステップは、適切な宿主の免疫付与、または以前の自然感染に起因する免疫がある対象の特定である。当該技術分野において周知のように、免疫付与のための所与の組成物は、その免疫原性が異なってもよい。したがって、ペプチドまたはポリペプチド免疫原を担体に結合させることによって達成され得るように、しばしば宿主免疫系を増大させる必要がある。例示的な担体は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。オボアルブミン、マウス血清アルブミン、またはウサギ血清アルブミンなどの他のアルブミンを担体として使用することもできる。多糖体を担体タンパク質に結合するための手段は、当該技術分野において周知であり、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンコイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド、及びビス−ビアゾ化ベンジジンを含む。また当該技術分野において周知のように、特定の免疫原組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られる、免疫応答の非特異的刺激剤の使用によって強化することができる。例示的なアジュバントとして、完全フロイントアジュバント（死滅した結核菌を含有する免疫応答の非特異的刺激剤）、不完全フロイントアジュバント、及び水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。
【００５４】
ポリクローナル抗体の産生に使用される免疫原性組成物の量は、免疫原の性質ならびに免疫付与に使用される動物によって異なる。様々な経路を使用して、免疫原を投与することができる（皮下、筋肉内、皮内、静脈内、及び腹腔内）。ポリクローナル抗体の産生は、免疫付与後の様々な時点で免疫付与された動物の血液をサンプリングすることによって観測されてもよい。第２のブースター注射が付与されてもよい。好適な力価が達成されるまでブースト及び力価測定のプロセスが繰り返される。所望のレベルの免疫原性が得られた場合、免疫付与された動物から採血し、血清を単離して保管する、及び／またはその動物を使用してＭＡｂを生成することができる。
【００５５】
ヒトモノクローナル抗体の場合は、代わりに、免疫応答を生成したこと、この場合は肺炎連鎖球菌に曝露されたかまたはＰｎｅｕｍｏｖａｘ（登録商標）２３で免疫付与されたことが既に知られている個人を、単に探すだけでよい。
【００５６】
上記のように免疫付与または以前に感染した対象から細胞を得た後、抗体、具体的にはＢリンパ球（Ｂ細胞）を産生するための能力を有する体細胞が、ＭＡｂ生成プロトコルで使用するために選択される。これらの細胞は、生検された脾臓もしくはリンパ節から、または循環血から得られ得る。次に免疫付与された動物からＢリンパ球を産生する抗体を、不死化骨髄腫細胞の細胞、一般に免疫付与された動物と同じ種のうちの１つ、またはヒトもしくはヒト／マウスキメラ細胞と融合する。ハイブリドーマ産生融合手順での使用に適した骨髄腫細胞株は、例えば、非抗体産生であり、高い融合効率、及び所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの成長を支持する特定の選択培地中で成長できないようにする酵素欠乏を有する。
【００５７】
当業者に既知のように、多くの骨髄腫細胞のうちのいずれか１つが使用されてもよい。例えば、免疫付与された動物がマウスである場合、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４１、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ  １．７、及びＳ１９４／５ＸＸ０  Ｂｕｌを使用してもよく、ラットの場合、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ、及び４Ｂ２１０を使用してもよく、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２、及びＵＣ７２９−６は全て、ヒト細胞融合との関連で有用である。１つの具体的なマウス骨髄腫細胞は、ＮＳ−１骨髄腫細胞株であり（Ｐ３−ＮＳ−１−Ａｇ−４−１とも呼ばれる）、細胞株レポジトリ番号ＧＭ３５７３を要求することによってＮＩＧＭＳヒト遺伝子変異細胞レポジトリから容易に入手可能である。使用され得る別のマウス骨髄腫細胞株は、８−アザグアニン耐性マウスのマウス骨髄腫ＳＰ２／０非産生細胞株である。より最近では、ヒトＢ細胞とともに使用するための追加の融合パートナー株が説明されており、ＫＲ１２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８６５８）、Ｋ６Ｈ６／Ｂ５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１８２３）、ＳＨＭ−Ｄ３３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６６８）、及びＨＭＭＡ２．５が挙げられる。
【００５８】
抗体産生脾臓またはリンパ節細胞及び骨髄腫細胞のハイブリッドを生成するための方法は、通常、体細胞を骨髄腫細胞と２：１の比率で混合することを含むが、この比率は、細胞膜の融合を促進する１つまたは複数の剤（化学的もしくは電気的）の存在下で、それぞれ、約２０：１〜約１：１まで異なり得る。
【００５９】
融合手順では、通常、生存可能なハイブリッドが、約１×１０−６〜１×１０−８の低頻度で産生される。しかしながら、生存可能な融合されたハイブリッドは、選択培地中で培養することによって、親注入細胞（具体的には、通常は無限に分割し続ける融合骨髄腫細胞）から分化するため、これは問題を生じない。選択培地は、一般に組織培養培地中のヌクレオチドのデノボ合成を遮断する剤を含有するものである。例示的な剤は、アミノプテリン、メトトレキセート、及びアザセリンである。アミノプテリン及びメトトレキセートは、プリン及びピリミジン両方のデノボ合成を遮断するが、アザセリンは、プリン合成のみを遮断する。アミノプテリンまたはメトトレキセートが使用される場合、培地には、ヌクレオチド源としてヒポキサンチン及びチミジンが補充される（ＨＡＴ培地）。アザセリンが使用される場合、培地には、ヒポキサンチンが補充される。Ｂ細胞源がエプスタイン・バーウイルス（「ＥＢＶ」）形質転換ヒトＢ細胞株である場合、骨髄腫に融合されなかったＥＢＶ形質転換株を排除するために、ウアバインが添加される。
【００６０】
一実施形態によると、選択培地は、ＨＡＴまたはウアバインを含むＨＡＴである。ヌクレオチドサルベージ経路を操作することができる細胞のみがＨＡＴ培地中で生存できる。骨髄腫細胞は、サルベージ経路の鍵酵素、例えば、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（「ＨＰＲＴ」）を欠失しており、それらは生存することができない。Ｂ細胞は、この経路を操作することができるが、それらは培養物中で限られた寿命を有し、一般に約２週間で死滅する。したがって、選択培地中で生存できる細胞のみが、骨髄腫及びＢ細胞から形成されたそのようなハイブリッドである。融合に使用されるＢ細胞の源がＥＢＶ形質転換Ｂ細胞の株である場合、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞が薬物による殺滅の影響を受け易いため、ここではウアバインもハイブリッドの薬物選択に使用されるが、使用される骨髄腫パートナーは、ウアバイン耐性であるように選択される。
【００６１】
培養によってハイブリドーマの集団が提供され、そこから特定のハイブリドーマが選択される。典型的に、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレートにおける単一クローン希釈により細胞を培養することによって行われ、その後に個々のクローン上清が（約２〜３週間後に）所望の反応性について試験される。このアッセイは、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、細胞毒性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイなどの、高感度、簡易、かつ迅速であるべきである。
【００６２】
次に選択されたハイブリドーマは、連続的に希釈されるか、またはフローサイトメトリー分類によって単一の細胞に選別され、個々の抗体産生細胞株にクローン化される。次にクローンは無限に増殖してｍＡｂを提供することができる。細胞株は、２つの基本的方法でＭＡｂ産生に利用されてもよい。ハイブリドーマの試料を動物（例えば、マウス）に（多くの場合、腹腔内に）注入することができる。任意選択で、動物は、注入前に炭化水素、特にプリスタン（テトラメチルペンタデカン）などの油で準備刺激される。ヒトハイブリドーマがこのように使用される場合、腫瘍拒絶を防止するために、ＳＣＩＤマウスなどの免疫不全マウスに注入することが最適である。注入された動物は、融合された細胞ハイブリッドによって産生された特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発達させる。次に血清または腹水などの動物の体液を穿刺回収して、高濃度のＭＡｂを提供することができる。個々の細胞株は、インビトロで培養することもでき、ＭＡｂは、それらを高濃度で容易に得ることができる培養培地中に天然に分泌される。代替として、ヒトハイブリドーマ細胞株をインビトロで使用して、細胞上清中に免疫グロブリンを産生することができる。細胞株を無血清培地中での増殖のために適合させて、高純度のヒトモノクローナル免疫グロブリンを回収する能力を最適化することができる。
【００６３】
いずれかの手段によって産生されたＭＡｂは、必要に応じて、ろ過、遠心分離、及びＦＰＬＣまたは親和性クロマトグラフィーなどの様々なクロマトグラフィー方法を使用してさらに精製されてもよい。
【００６４】
モノクローナル抗体の断片は、ペプシンまたはパパインなどの酵素による消化を含む方法によって、及び／または化学還元によるジスルフィド結合の切断によって精製されたモノクローナル抗体から得ることができる。代替として、モノクローナル抗体断片は、自動ペプチド合成機を使用して合成することができる。例示的な断片として、非限定的に、抗体のＦａｂ断片が挙げられる。
【００６５】
分子クローニング手法を使用してモノクローナル抗体を生成してもよいことも企図される。このために、ハイブリドーマ株からＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲによって得られた抗体遺伝子を、免疫グロブリン発現ベクターにクローニングすることができる。代替として、組合せの免疫グロブリンファージミドライブラリは、細胞株から単離されたＲＮＡから調製され、適切な抗体を発現するファージミドは、ウイルス抗原を使用してパニングすることによって選択される。従来のハイブリドーマ技法に勝るこの手法の利点は、１０４倍を超える抗体を１回で産生及びスクリーニングできること、及びＨ鎖とＬ鎖の組合せによって新たな特異性が生成され、それが適切な抗体を見出す機会をさらに増加させることである。
【００６６】
有用な抗体の産生は、例えば、米国特許第５，５６５，３３２号（その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、組合せ手法を使用するキメラ抗体の産生を説明する）、米国特許第４，８１６，５６７号（その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、組換え免疫グロブリン調製を説明する）、及び米国特許第４，８６７，９７３号（その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、抗体治療薬の複合体を説明する）に記載されている方法を含む。
【００６７】
抗体は、第一にそれらの結合特異性によって定義されてもよい。当業者は、当業者に周知の技法を使用して、所与の抗体の結合親和性を評価することができる。
【００６８】
抗体特異性は、肺炎連鎖球菌血清型に関連する。Ｐｎｅｕｍｏｖａｘ（登録商標）２３に代表される２３種の異なる血清型が存在し、次の呼称、すなわち１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆによって表される。代表的抗体のＣＤＲ領域配列は、米国特許出願公開第２０１３／０１９５８７６号に記載され、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６９】
様々な実施形態では、特定された抗体または抗体結合断片の配列を操作するように選択してもよい。以下は、抗体操作のための関連技法に関する一般的記述である。
【００７０】
ハイブリドーマを培養した後、細胞を融解し、全ＲＮＡを抽出してもよい。ランダムヘキサマーを逆転写酵素（ＲＴ）とともに使用して、ＲＮＡのｃＤＮＡコピーを生成し、次に全てのヒト可変遺伝子配列を増幅させることが予想されるＰＣＲプライマーの多重混合物を使用して、ＰＣＲを行ってもよい。ＰＣＲ産生物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（登録商標）ベクターにクローニングし、次に標準ベクタープライマーを使用して、自動ＤＮＡ配列決定法によって配列決定することができる。結合及び中和のアッセイは、ハイブリドーマ上清から収集されプロテインＧカラムを使用する高速タンパク質液体クロマトグラフィー（「ＦＰＬＣ」）によって精製された抗体を使用して行ってもよい。
【００７１】
組換え完全長ＩｇＧ抗体は、重鎖及び軽鎖Ｆｖ  ＤＮＡをクローニングベクターから、Ｌｏｎｚａ  ｐＣｏｎｌｇＧ１またはｐＣｏｎＫ２プラスミドベクターなどの第２のベクターにサブクローニングすることによって生成し、２９３フリースタイル細胞またはＬｏｎｚａ  ＣＨＯ細胞の中にトランスフェクトすることができ、次に抗体を細胞上清から収集及び精製することができる。
【００７２】
ｐＣｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（商標）は、全抗体を再発現させるための容易な方法である。定常領域ベクターは、ｐＥＥベクターにクローニングされた一連の免疫グロブリン定常領域ベクターを提供するベクターの群である。これらのベクターは、ヒト定常領域を持つ完全長抗体の容易な構築及びＧＳ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）の便宜性を提供する。
【００７３】
抗体分子は、例えば、ｍＡｂのタンパク質分解切断によって産生される断片（Ｆ（ａｂ′）、Ｆ（ａｂ′）２など）、または例えば、組換え手段によって産生可能な単鎖免疫グロブリンを含む。このような抗体誘導体は、一価である。一実施形態では、このような断片を、互いにまたは他の抗体断片もしくは受容体リガンドと組み合わせて、「キメラ」結合分子を形成することができる。重要なことに、このようなキメラ分子は、同じ分子の異なるエピトープに結合することができる置換基を含有してもよい。
【００７４】
関連実施形態では、抗体は、抗体誘導体、例えば、開示される抗体のものと同一のＣＤＲ配列を含む抗体（例えば、キメラまたはＣＤＲ移植抗体）である。なおもさらなる実施形態では、抗体は、完全ヒト組換え抗体である。代替として、保存的変更を抗体分子に導入するなど、より細かい修正を加えようとしてもよい。このような変更を行う際に、アミノ酸のハイドロパシーインデックスが考慮され得る。相互作用する生物学的機能をタンパク質に付与する際のアミノ酸ハイドロパシーインデックスの重要性は、当該技術分野において一般に理解されている。アミノ酸の相対ハイドロパシー特性が、結果として得られるタンパク質の二次構造に寄与することが認められており、ひいては、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などの他の分子とのタンパク質の相互作用を特徴付ける。
【００７５】
当該技術分野において、同様のアミノ酸の置換が親水性に基づいて有効に行われ得ることも理解されている。アミノ酸は、類似の親水性を有する別のものと置換することができ、生物学的または免疫学的に修飾されたタンパク質を産生できることが理解される。このような変更において、親水性値が±２以内、±１以内、または±０．５以内であるアミノ酸の置換が用いられてもよい。
【００７６】
アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。様々な前述の特徴を考慮する例示的な置換は、当業者には周知であり、アルギニン及びリジン、グルタミン酸塩及びアスパラギン酸塩、セリン及びトレオニン、グルタミン及びアスパラギン、ならびにバリン、ロイシン、及びイソロイシンが挙げられる。
【００７７】
修飾された抗体は、標準的分子生物学的技法による発現またはポリペプチドの化学合成を含む、当業者に既知の任意の技法によって作製されてもよい。
【００７８】
単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、短い（通常はセリン、グリシン）リンカーと一緒に連結される免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域の融合である。このキメラ分子は、定常領域の除去及びリンカーペプチドの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。この修飾は、通常、特異性を未改変のまま残す。これらの分子は、ファージディスプレイを促進するために歴史的に創出されており、抗原結合ドメインを単一ペプチドとして発現させるために非常に便利である。代替として、ｓｃＦｖは、ハイブリドーマから誘導されたサブクローンニングした重鎖及び軽鎖から直接創出することができる。単鎖可変断片は、完全な抗体分子において見出される定常Ｆｃ領域、及びしたがって、抗体を精製するために使用される一般的な結合部位（例えば、プロテインＡ／Ｇ）を欠失する。これらの断片は、プロテインＬがκ軽鎖の可変領域と相互作用するため、しばしばプロテインＬを使用して精製／固定化され得る。
【００７９】
可撓性リンカーは、一般に、アラニン、セリン、及びグリシンなどのらせん及びターン促進アミノ酸残基で構成される。しかしながら、他の残基も同様に機能することができる。
【００８０】
別個の実施形態では、単鎖抗体は、非ペプチドリンカーまたは化学単位を使用して、受容体軽鎖及び重鎖を結合することによって創出され得る。一般に、軽鎖及び重鎖は、別個の細胞中で産生され、精製され、後次に適切な様式で一緒に連結される（すなわち、重鎖のＮ末端は、適切な化学架橋によって軽鎖のＣ末端に結合される）。
【００８１】
本明細書に記載される態様において使用するために開発された抗体は、精製されてもよい。用語「精製された」は、本明細書で使用される場合、他の成分から単離可能な組成物を指すことを意図し、タンパク質がその天然に入手可能な状態に対して任意の程度に精製される。したがって、精製されたタンパク質は、それが天然に存在し得る環境から遊離したタンパク質も指す。用語「実質的に精製された」が使用される場合、この呼称は、タンパク質またはペプチドが組成物の主成分を形成する、例えば、組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％以上を構成する組成物を指す。
【００８２】
タンパク質精製技法は、当業者には周知である。これらの技法は、あるレベルで、ポリペプチド及び非ポリペプチド分画に対する細胞環境の粗分画化を含む。ポリペプチドを他のタンパク質から分離した後、対象となるポリペプチドをクロマトグラフィー及び電気泳動技法を使用してさらに精製して、部分的または完全な精製（もしくは均質性への精製）を達成することができる。純粋なペプチドの調製に特に適した分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動である。タンパク質精製のための他の方法として、後に遠心分離を行う、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などによる沈殿、または熱変性；ゲルろ過、逆相ヒドロキシアパタイト及び親和性クロマトグラフィー；ならびにこのような技法及び他の技法の組合せが挙げられる。
【００８３】
抗体を精製する際に、原核または真核発現系においてポリペプチドを発現させ、変性条件を使用してタンパク質を抽出することが望ましい場合がある。ポリペプチドは、ポリペプチドのタグ付けされた部分に結合する親和性カラムを使用して、他の細胞成分から精製されてもよい。当該技術分野において一般に知られているように、様々な精製ステップを行う順序は変更されてもよいし、または特定のステップが省略されてもよく、依然として実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの調製に好適な方法をもたらすと考えられる。
【００８４】
一般に、完全抗体は、その抗体のＦｃ部分に結合する剤（すなわち、プロテインＡ）を利用して分画化される。代替として、抗原を使用して、適切な抗体を同時に精製し、選択してもよい。このような方法は、しばしばカラム、フィルター、またはビーズなどの支持体に結合された選択剤を利用する。抗体は支持体に結合され、汚染物質が除去され（例えば、洗い流され）、条件（塩、熱など）を適用することによって放出される。
【００８５】
タンパク質またはペプチドの精製の程度を定量化するための様々な方法は、本開示に照らして当業者に知られるであろう。これらは、例えば、活性分画の特異的活性を決定すること、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって分画内のポリペプチドの量を評価することを含む。分画の純度を評価するための別の方法は、分画の特異的活性を計算すること、それを初期抽出物の特異的活性と比較すること、及びしたがって純度を計算することである。活性の量を表すために使用される実際の単位は、当然のことながら、精製後に選択される特定のアッセイ技法及び発現されたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を呈するかに依存する。
【００８６】
例示的な多糖体標的として、非限定的に、莢膜多糖体が挙げられる。例えば、莢膜多糖体は、莢膜６Ｂ型または莢膜１９Ｆ型を含む。
【００８７】
当業者に理解されるように、チップ上の各別個の場所に結合された抗体または抗体結合断片の量は、検出を行う場所の表面積に基づいて最適化される。例として、約５０〜８００ｐＬの場所あたりの抗体及び／または抗体結合断片の濃度で最適な結果が達成されると考えられる。
【００８８】
それぞれが肺炎連鎖球菌の２つ以上の異なる血清型のうちの１つに特異的に結合する抗体及び／または抗体結合断片は、抗体及び／またはポリペプチドを結合するための任意の好適な化学反応を使用して、アレイ表面に結合され得る。一実施形態によると、抗体または抗体結合断片は、基板に共有結合される。
【００８９】
抗体及び／または抗体結合断片の各別個の場所への結合は、手動または自動システムを使用して行うことができる。手動アレイの場合、２倍ストック（修飾されたリン酸緩衝生理食塩水（「ＭＰＢＳ」）中）から１０％グリセロール及び０．０１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０を含有する溶液への１：１希釈後に、抗体溶液を、約１μＬの量、最終濃度１〜５００μｇ／ｍＬでアレイすることができる。周囲環境で１０分間インキュベートした後、チップをブロッキング緩衝液（Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（「ＨＢＳ」）中１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」））中に４５分間浸漬した後、追加の３ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．００５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（「ＭＰＢＳ−ＥＴ」）を含有するＭＰＢＳ緩衝液ですすぐことができる。自動アレイの場合、２倍ストック（ＭＰＢＳ中）からＭＰＢＳ中０．０１〜１％（ｖ／ｖ）１２−クラウン−４エーテルを含有する溶液への１：１希釈後に、抗体溶液を、例えば５０〜８００ｐＬの最終濃度で、Ｓｃｉｅｎｉｏｎ  Ｓ３アレイヤーまたは相当する方法／デバイスによる圧電スポッティングを使用してロボットプリントすることによってアレイすることができる。マイクロアレイチャンバ内で６０分間、華氏７０度及び相対湿度７０％でインキュベートした後、チップをブロッキング緩衝液（ＨＢＳ中のＢＳＡ）に６０分間浸漬し、次にＭＰＢＳ−ＥＴですすぐことができる。
【００９０】
本明細書に例示される他の態様によると、肺炎連鎖球菌の血清学的検出に好適なセンサーチップが提供される。センサーチップは、それぞれが肺炎連鎖球菌の２つ以上の異なる血清型のうちの１つに特異的に結合する抗体または抗体結合断片がその上に結合した状態で含まれる表面を備える基板を含む。特定の実施形態では、抗体または抗体結合断片は、肺炎連鎖球菌多糖体に特異的に結合する。抗体または抗体結合断片は、異なる場所で表面に結合する。この表面には、肺炎連鎖球菌結合の非存在下で適切な入射角及び波長で表面を照明する偏光の弱め合う干渉をもたらす被覆が形成される。抗体または抗体結合断片が結合する肺炎連鎖球菌を含む試料への表面の曝露は、抗体または抗体結合断片結合時に、ある場所で検出可能な反射率の変化を生じさせる。
【００９１】
本明細書に開示されるアレイは、肺炎及び肺炎球菌莢膜型決定のための診断ツールとして特に有用である。
【００９２】
一旦アレイが調製されると、センサーチップを、個体から得られた血清試料（または希釈された血清試料）に曝露することができ、次に肺炎連鎖球菌の１つ以上の血清型の存在（または非存在）を、血清試料へのセンサーチップの曝露後の検出器出力における変化（または変化の欠失）の検出に基づいて決定することができる。当該技術分野において周知のように、検出可能なシグナルの非存在は、肺炎連鎖球菌が存在しないことを必ずしも意味するものではないが、むしろそれは検出可能な限度を下回っており、したがっておそらく肺炎連鎖球菌は存在しないことを意味する。画像捕捉は、上記の検出システムのうちのいずれかによって、例えば、チップの表面の少なくとも実質的部分の画像を捕捉する画像アレイ検出器を介して達成することができる。数百または数千のプローブのアレイの場合、自動チップ読取り器を、捕捉された画像に基づいてアレイ上の各スポットの反射率変化を評価するようにプログラムすることができる。
【００９３】
ＡＩＲ検出システム、ＳＰＲ検出システム、ＢＡＳＩ検出システム、またはエリプソメトリ検出システムを使用して検出を行ってもよい。
【００９４】
故に、本明細書に例示される態様によると、アレイ画像化反射率測定（ＡＩＲ）を使用して肺炎連鎖球菌の血清型を検出するための方法が提供される。この方法は、本明細書に記載されるセンサーチップを提供する段階を含む。センサーチップを、チップ表面上に存在する抗体または抗体結合断片による肺炎連鎖球菌表面抗原への特異的結合を許容する条件下で試料と接触させる。チップの表面から反射された光は、特異的に結合された肺炎連鎖球菌表面抗原を特定するのに有効な条件下で検出され、それにより肺炎連鎖球菌の血清型を検出する。
【００９５】
本明細書で使用される場合、血清試料が得られる個体は、肺炎連鎖球菌による感染を受け易い任意の動物であり得、ヒト及び非ヒト霊長類、家畜、飼育動物、ならびに野生動物が挙げられる。血清試料は、生きている個体及び検死死体の両方から得ることができる。
【００９６】
一実施形態では、本明細書に記載される方法は、センサーチップをすすいで、抗体または抗体結合断片により特異的に結合されない任意の肺炎連鎖球菌表面抗原を除去する段階をさらに含む。
【００９７】
本明細書に記載される方法に従う検出は、一実施形態によると、チップから反射された光を測定することと、測定された反射光に基づいて、その場所及び反射光の強度を含む、特異的に結合された肺炎連鎖球菌表面抗原を特定する出力を提供することとを含み得る。一実施形態では、反射光を測定することは、チップの表面の少なくとも実質的部分の画像を捕捉することをさらに含む。
【００９８】
さらなる分析として、非限定的に、ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、質量分析、及び液体クロマトグラフィー−ＮＭＲ分光法を挙げることができる。
【実施例】
【００９９】
本明細書に例示される態様は、以下の実施例を参照することによりさらに説明され得る。
【０１００】
実施例１−肺炎球菌血清学アレイ
肺炎球菌診断アレイは、分子相互作用に関する無標識分析の、簡易で、高感度のマルチプレックスな技法であるアレイ画像化反射率測定（ＡＩＲ）プラットフォーム上に構築される。ＡＩＲセンサーは、シリコンチップの表面上の反射防止被覆への結合によって誘起される乱れに基づく。手短に説明すると、ほぼヌルの反射条件は、ｓ−偏光の入射角及び波長を、シリコン表面上の絶縁物質の光学厚さに注意深く一致させることによって得てもよい（図４Ａ〜Ｃ）。これは、ヘリウムネオンレーザー（λ＝６３２．８ｎｍ）を７０．６度の入射角、及び絶縁層（ＳｉＯ２＋抗体）の厚さ１４１９Åで使用することによって得られる。オングストロームレベルで厚さを制御する極めて平坦なＳｉＯ２層を調製するための再現性の高い方法が開発された。同様に、強固な蒸気及び溶液相化学蒸着戦略は、多くのクラスの機能的捕捉分子を固定化するのを可能にする。
【０１０１】
ＡＩＲは画像化技法であるため、１０００スポットものアレイをおよそ数ミリ秒で「読み取る」ことができる。これは、分光エリプソメトリ、角度走査ＳＰＲ、またはＯＩ−ＲＤ（斜め入射−反射率差）などの技法（それらの方法の走査要件は、著しく長い取得時間を要する）に勝る、特定の利点を提供する。開発中の他の無標識システムに勝るＡＩＲの重要な利点として、（１）マルチプレックスな能力（標的多重化は単にチップ上のスポットの数を増加させるだけでよく、試料多重化は原則として９６ウェルシステムで実行され得る）、（２）器具の簡易性（光学系は可動部を有さず、温度制御の必要がなく、３０００ドル未満の費用で既製の構成要素から構築され得る）、及び（３）簡易チップ製造（ＡＩＲはミクロ電子光学産業からの基材を用い、リング共振器、カンチレバー、ほとんどの２−Ｄフォトニック結晶とは異なり、光またはＥ光線リソグラフィーを必要としない）が挙げられる。
【０１０２】
このアレイは、事前に官能化されたＡＩＲチップ上で形成された、血清型特異的抗肺炎球菌多糖体スポットのグリッドを含む。アレイはまた、陽性及び陰性対照として機能する多数のスポットを組み込み、抗ヒトＩｇＧ及び抗フルオレセインは、前者及び後者の代表例である。肺炎球菌を含有すると考えられるヒト血清へのアレイの曝露に続く、すすぎ、乾燥、及びＡＩＲ反射測定における画像化は、特定のアレイスポットの反射強度の増加に基づいて、特定の血清型の存在を明らかにする。
【０１０３】
肺炎球菌抗原を検出するＡＩＲアレイの能力の初期評価を提供するために、２つの抗体（１つはＩｇＧであり、１つはＩｇＭであった）を、それぞれ、血清型１４及び６Ａから誘導された２つの肺炎球菌多糖体に対して固定化した。抗ヒトＩｇＧを陽性対照としてアレイ上に含め、抗フルオレセインイソチオシアネート（抗ＦＩＴＣ）を陰性対照としてプリントした。抗原を配合したアッセイ緩衝液（ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０）で１：４に希釈されたプール正常ヒト血清（ＰＮＨＳ）へのアレイの曝露の後、アレイの画像化により、適切な多糖体の選択的検出が示された（図５）。初期実験は、ｐｇ／ｍＬでの検出が可能であることを示唆する。
【０１０４】
実施例２−抗体ＡＩＲアレイの良好な産生及び使用
予備データに基づいて、次に、より複雑なアレイを産生することを目的とした。２０種の肺炎球菌血清型に対する抗体を、アミン反応性Ａｄａｒｚａ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  ＡＩＲチップ上で、２５０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬの範囲のストック濃度で、Ｓｃｉｅｎｉｏｎ  Ｓ３圧電式プリンターを使用してアレイした。この方法で産生されたＡＩＲアレイの代表的画像を図６に示す。
【０１０５】
材料及び方法
基板を、熱的に成長させたＳｉＯ２を有する５×６ｍｍシリコンチップから調製し、フッ化水素酸（ＨＦ）で約１３６０Åにエッチングした。表面を、化学蒸着（ＣＶＤ）によって約７．５Åのコハク酸無水物（ＳＡ）で官能化した。基板の官能化後の厚さは、約１３７３Åであった。
【０１０６】
プローブに関しては、肺炎連鎖球菌の様々な血清型の莢膜多糖体に特異的なマウスハイブリドーマ細胞株からの免疫グロブリンを使用した。プローブを、４℃、ストック濃度（１１００〜２０００μｇ／ｍＬ）で保持する。プローブは、ｐＨ５．５の１×ｍＰＢＳ中、約５００μｇ／ｍＬで調製した。
【０１０７】
標的プローブと同じ方法で調製された２つの対照プローブをアッセイに使用した。陰性対照は、抗フルオレセインイソチオシアネート（抗ＦＩＴＣ）であり、陽性対照は、抗ヒトＩｇＧであった。
【０１０８】
標的は、トッド・ヒューイット培地（ＴＨＭ）中で増殖した肺炎連鎖球菌の溶解物であり、−２０℃で保管し、次のように調製した。溶解物を室温で解凍し、反転／ボルテックスによって均質化して、１ｍＬのアリコートを作製した（これも−２０℃で保管した）。必要なときにアリコートを解凍し、５分間、１０ｋＲＰＭで遠心分離して、上清を引き抜いて、標的溶液、すなわち、５％プール正常ヒト血清（ＰＮＨＳ）を含む自家全血（ＡＷＢ）中１％または５％分の血液喪失（ＢＬ）物を調製して濃さを調整し、陽性対照プローブを活性化した。対照標的は、自家全血（ＡＷＢ）中にプール正常ヒト血清（ＰＮＨＳ）のみを含有していた。
【０１０９】
アレイヤーに関しては、圧電分注により作動するＳｃｉｅｎｉｏｎ  Ｓ３マイクロアレイヤーを使用した。システムに、オートクレーブによって脱気された、０．２２μｍでろ過されたナノ純水（１７．５ｍＯｈｍ）を戻した。プリントしている間、システムは６５％の相対湿度で保持した。
【０１１０】
各スポットに関しては、プローブ溶液の滴をアレイヤーによって、基板の上に約４５０ｐＬの量で分注した。典型的には、４〜８の陰性対照が配置されている各チップ上に１プローブ当たり５つのスポットが存在する。
【０１１１】
アッセイを、９６ウェルプレートにおいて実行した。すすぎ、ブロッキング、及び標的への曝露を、１ウェル当たり１つのチップを用いてプレート上で行った。プレートを、室温で旋回式撹拌器上６５ＲＰＭの速度で保持した。
【０１１２】
手順
基板をアレイヤー内に置き、プローブ溶液をスポットした。次に基板を接着性裏材でストリップに接着した。全ての基板を接着させた後、それらをｐＨ５のＮａＯＡｃ緩衝液を含有するウェルの中に浸漬した（撹拌なし）。約１分後、基板をＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５）中に１％ＢＳＡを含有するウェルに移動させ、撹拌しながら３０分間ブロッキングした。
【０１１３】
基板を、１×自家全血（ＡＷＢ）を含有するウェルに移動させて、撹拌しながら５分間洗浄した。次に基板を、標的溶液を含有するウェルに移動させて、撹拌しながら６０分間インキュベートした。次に基板を、１×自家全血（ＡＷＢ）を含有するウェルに移動させて、撹拌しながら１０分間洗浄した。（洗浄試験２は、基板をより高い回転速度（約２３０ＲＰＭ）で１５分間洗浄した場合、交差反応性の低減を示した。）
【０１１４】
基板をプレートから除去し、０．２２μｍでろ過されたナノ純水で洗浄した。ピンセットを使用して基板に接着されたストリップを挟み、それを水中で５回時計回りに、５回前後に、そしてさらに３回時計回りに動かした。次に、基板をＮ２ガス流で乾燥させ、接着ストリップから除去して、チップホルダー内に置いた。
【０１１５】
基板を、数回の曝露時にプロトタイプオープンスカイ読取り器を用いて、記載される条件下では最も使用に適する５００ｍｓで、画像化した。
【０１１６】
画像からのスポットの強度中央値を、Ａｄａｒｚａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって生成されたモデルデータを使用して濃さに変換した。標的に曝露されたチップ上の実験スポットと局所対照スポットとの間の差を、対照が発現されたチップ上の実験スポットと対照スポットとの間の差と比較して、任意の検出が起こったかどうかを決定した。
【０１１７】
図６は、ＡＩＲチップ上の１６の血清型に対する抗体の良好な固定化の、初期実証を示す。各抗体によって標的とされた血清型を欄外に列挙し、各抗体を５つの複製スポットにおいて固定化した。ほとんどの抗体を５００μｇ／ｍＬの濃度で固定化したが、抗体スポットの濃さを低減するために使用できる方法の実施例として、一部は２５０μｇ／ｍＬの濃度でも固定化した。これは、非常に高い効率で固定化する抗体の濃さを低減することを可能にし、したがって、ＡＩＲシグナルにおける飽和応答（例えば、５００μｇ／ｍＬの抗２３Ｆ）を生じさせるのに対し、最小反射率により近いスポットの濃さをもたらす（抗２３Ｆ、２５０μｇ／ｍＬ）。
【０１１８】
実施例３−精製された莢膜多糖体の検出の実証
トッド・ヒューイット培地／ＭＰＢＳ中の精製された３３Ｆ莢膜多糖体に対する暴露なし（対照、上）及び暴露後（実験、下）に画像化されたアレイの抽出物である、血清型３３Ｆに対応する莢膜多糖体を検出するためのアレイの結果を図７に示す。１つの選択されたスポットの平均強度は、２２６９７から３５６４４に増加した。陰性対照スポットの強度のごくわずかな変化が観察された。これは、３３Ｆ莢膜多糖体の特異的検出を示す。
【０１１９】
実施例４−交差反応性の評価
アレイ性能及び抗体の交差反応性を評価するために、アレイを、１０％のプール正常ヒト血清を担体として含有するＭＰＢＳ緩衝液中の細菌溶解物の１％または５％溶液に曝露した。所望の標的濃さ（強度）のパーセンテージの関数として表される予備結果を、試験された各血清型に対して図８Ａ〜Ｂに示す。インキュベーション及び洗浄ステップの両方の観点を含む、実験プロトコルのさらなる最適化によって、観察された交差反応性の一部は排除されるであろう。
【０１２０】
上に開示される及び他の特徴と機能の変型、またはそれらの代替例は、多くの他の異なるシステムまたは適用に組み入れられてもよいことが理解されるだろう。現在では予測されないまたは予期されない様々な代替例、修正、変型、またはそこでの改善は、当業者によって後次に行われてもよく、それらも以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【国際調査報告】
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