(57)【要約】  Ｈ＆Ｅ染色した生体試料において複数の標的をプロービングすることを含む方法が提供される。本方法には、複数の標的を含有するヘマトキシリン・エオジン染色された生体試料を準備する段階、所望により試料のＨ＆Ｅ染色を検出する段階、ヘマトキシリン・エオジン信号を除去する段階、及び生体試料で追加の特徴又は標的を検出する段階を含む。検出段階には、１以上のプローブと１以上の標的を試料に対して結合させる段階、プローブからの信号を検出する段階、及び試料と漂白剤を接触させる段階を実施することが含まれてよい。結合、検出及び漂白のプロセスは、反復して繰り返されてよい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色された生体試料を分析する方法であって、
（ａ）所望により、複数の標的を含有する生体試料のヘマトキシリン・エオジン染色を検出する段階と、
（ｂ）ヘマトキシリン・エオジン染色された生体試料から蛍光Ｈ＆Ｅ信号を除去する段階と、
（ｃ）生体試料で追加の特徴又は標的を検出する段階と
を含む、方法。
【請求項２】
エオジンが低い蛍光を有し、除去段階が、緩衝水溶液を用いる簡単な洗浄を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
エオジンが、エオジン−Ｂ、フロキシンＢ又はエリスロシンである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
除去段階が、
（ｉ）緩衝水溶液を用いて試料を洗浄して、ヘマトキシリンを除去し、エオジンを部分的に除去する段階と、
（ｉｉ）試料と電荷移動試薬とを接触させて、残留蛍光を消光する段階と
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
電荷移動試薬が、メチルビオローゲン（パラコート）、ジクワット又はフェニレンジアミン二塩酸塩から選択される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
除去段階が、
（ｉ）緩衝水溶液を用いて試料を洗浄して、ヘマトキシリンを除去し、エオジンを部分的に除去する段階と、
（ｉｉ）試料と過酸化水素及び金属塩とを接触させてヒドロキシルラジカルを生成する段階と、
（ｉｉｉ）所望により、試料を照射する段階と
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
除去段階が、
（ｉ）緩衝水溶液を用いて試料を洗浄して、ヘマトキシリンを除去し、エオジンを部分的に除去する段階と、
（ｉｉ）試料と電子移動試薬とを接触させる段階と、
（ｉｉｉ）試料を照射して、残留蛍光を消光する段階と
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
試料の照射が、試料を３５０ｎｍ〜１．３μｍの波長の光に露光することにより達成される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
試料の照射が、試料を４００〜７００ｎｍの波長の光に露光することにより達成される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
試料の照射が、５〜９のｐＨの緩衝液の存在下で実施される、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
試料の照射が、４〜５０℃の温度で実施される、請求項７記載の方法。
【請求項１２】
試料の照射が、約２０秒〜約１５分間実施される、請求項７記載の方法。
【請求項１３】
エオジンが不可逆的に修飾されている、請求項７記載の方法。
【請求項１４】
試料照射後に検出可能な信号が検出されない、請求項７記載の方法。
【請求項１５】
電子移動試薬がボレート塩である、請求項７記載の方法。
【請求項１６】
ボレート塩が、以下の構造式で表される、請求項１５記載の方法。
【化１】
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式中、
各Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はヘテロアリールであって、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はヘテロアリールは、（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ4）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ4）アルキルアミノ、アミノ、ヒドロキシル、シアノ、ハロゲン又はニトロからなる群から選択される１以上の置換基で適宜置換されていてもよく、
Ｒ4は、アルキル、アルケニル又はアルキニルであって、アルキル、アルケニル又はアルキニルは、（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル、アリール、（Ｃ1〜Ｃ4）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ4）アルキルアミノ、アミノ、ヒドロキシル、シアノ、ハロゲン又はニトロからなる群から選択される１以上の置換基で適宜置換されていてもよく、
Ｍ+は、有機カチオン及び無機カチオンからなる群から選択される。
【請求項１７】
各Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が各々独立に適宜置換されていてもよいアリールであり、Ｒ4が適宜置換されていてもよいアルキルである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
各Ｒ1、Ｒ2及びＲ3がフェニルであり、Ｒ4がブチル又はベンジルである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
Ｍ+が、Ｌｉ+、Ｎａ+又はＫ+からなる群から選択される無機カチオンである、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
検出段階が、
（ｉ）１以上のプローブと試料の１以上の標的を結合させる段階と、
（ｉｉ）結合したプローブからの信号を検出する段階と、
（ｉｉｉ）所望により、信号を除去し、段階（ｉ）から（ｉｉｉ）を繰り返す段階と
によって１以上の標的を検出する、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
段階３で信号を除去することが、光活性化化学漂白剤に触れされること、及び３５０ｎｍ〜１．３μｍの波長の光に露光することにより試料の照射を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
段階（ｉ）のプローブが蛍光信号発生器を含み、段階（ｉｉ）で検出される信号が蛍光信号である、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
信号除去段階（ｉｉｉ）が、試料を漂白剤又は抜染剤と接触させるか、或いは試料を加熱してプローブ又はプローブ信号を除去することを含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
抜染剤がＳＤＳであり、プローブが抗体である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
プローブが、緩衝液の存在下、直接の熱又はマイクロ波に誘導される熱によって除去される、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
除去段階が、残留蛍光を消光するために、検出段階（ｉｉ）の前に、電荷移動試薬を試料に添加することを含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２７】
ヘマトキシリン・エオジン染色した生体試料において複数の標的をプロービングする方法であって：
（ａ）所望により、複数の標的を含有する生体試料のヘマトキシリン・エオジン染色を検出する段階と、
（ｂ）所望により、試料を洗浄することによりヘマトキシリンを除去し、エオジンを部分的に除去する段階と、
（ｃ）試料を抗原回復プロセスに付して関心領域の１以上の抗原を露出させる段階と、
（ｄ）所望により、ブロッキング試薬を塗布して、１以上の抗原の非特異的結合をブロックする段階と、
（ｅ）ヘマトキシリン・エオジン染色された生体試料から蛍光信号を除去する段階と、
（ｆ）１以上のプローブを、試料に存在する１以上の標的と結合させる段階と、
（ｇ）結合したプローブから信号を検出する段階と、
（ｈ）所望により、信号を除去し、段階（ｆ）から（ｈ）を繰り返す段階と
を含む。
【請求項２８】
段階（ｈ）の信号除去が、試料を漂白剤又は抜染剤と接触させるか、或いは試料を加熱してプローブ又はプローブ信号を除去することを含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
プローブがタンパク質結合剤である、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
ヘマトキシリン・エオジン染色された生体試料で複数の標的をプロービングする方法であって、
（ａ）所望により、複数の標的を含有する生体試料のヘマトキシリン・エオジン染色を検出する段階と、
（ｂ）ヘマトキシリン・エオジン染色された生体試料から蛍光信号を除去する段階と、
（ｃ）１以上のプローブを、試料に存在する１以上の標的と結合させる段階と、
（ｄ）結合したプローブから信号を検出する段階と、
（ｅ）所望により、信号を除去し、段階（ｃ）から（ｅ）を繰り返す段階と
を含む、方法。
【請求項３１】
段階（ｅ）における信号除去が、試料を漂白剤、タンパク質変性剤、ＤＮＡ変性剤、熱、ＳＤＳ又はこれらの組合せに曝すことを含む、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
１以上のプローブがＦＩＳＨプローブである、請求項３０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｈ＆Ｅ染色された生体試料を分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
伝統的に、ヘマトキシリン・エオジン染色（Ｈ＆Ｅ）は、組織学において最も一般的な染色方法の一つである。Ｈ＆Ｅからの形態は、癌検出のための医学的診断で最も広く使用されている。かし、免疫組織化学（ＩＨＣ）又は免疫蛍光（ＩＦ）及び蛍光インサイチュハイブリダイゼーションによる組織の分子分析は、次第に形態学的評価に加えて癌診断の主要部分となってきている。標的療法の大きな進歩によって、癌組織の詳細な分子評価は、ますます必要条件になっている。さらに、初期癌のために検出試料サイズは減少しており、疾患の完全な特徴づけに必要とされる様々な分析を実施することを困難にする。
【０００３】
有用なものである一方、これらの現行技法の多くは、単一の試料で一度に２〜３個の標的しか検出できない（例えば、ＩＨＣ又は蛍光に基づく検出系によって検出可能な標的の数が限られている蛍光に基づくウエスタン・ブロットなど）。標的のさらなる分析は、供給源からさらなる生体試料の使用を必要とすることがあり、生体試料中の複数の生物学的標的の存在、欠如、濃度、及び／又は空間分布などの標的の相対的特徴を決定する能力を制限する。さらに、特定の例では、制限された量の試料を分析に使えるかもしれないし、又は、個々の試料がさらなる分析を必要とするかもしれない。
【０００４】
さらに、利用可能な試料だけがＨ＆Ｅ染色したスライドであり、患者が再発している多くの以前の例では、この組織の分子分析は、患者の疾患と利用可能な標的療法を組合せることによって大いにこれらの患者のためになることができる。ＩＨＣ及びＦＩＳＨのために既にＨ＆Ｅ染色したスライドを使用することによる主な問題は、ＩＨＣでの発色検出とＩＦ及びＦＩＳＨの蛍光検出の両方におけるＨ＆Ｅ染色からの干渉である。照合のために組織からＨ＆Ｅを除去する試みがなされている。これは発色検出でＩＨＣを可能にしたが、ＩＦ及びＦＩＳＨは、エオジンからの強い残留蛍光に起因して実現不可能である。残留エオジン蛍光の除去は、これまで試みられた多くの様々な技法で実現不可能であった。
【０００５】
この理由のために、一般診療はＨ＆Ｅ及び分子分析に異なる組織切片を使用してきた。既に染色されたＨ＆Ｅスライドが唯一の利用可能な試料である稀な例では、Ｈ＆Ｅの部分的除去を実施し、発色性信号を用いてスライドをＩＨＣに使用する（Ｂｅｎｈａｒｒｏｃｈ  ｅｔ．ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １９９８，９１：２０７６−２０８４）。限られた状況下では、その放出がエオジン蛍光から一層取り除かれたフルオロフォアを用いて、ＩＦ又はＦＩＳＨを実施することも可能であり得るが、大部分の市販のプローブ又は標識抗体は、その放出がエオジン放出と重複するフルオロフォアで標識されている。
【０００６】
従って、Ｈ＆Ｅ信号を組織から除去し、免疫蛍光及びＦＩＳＨなどのその後の分析に同じ組織切片を使用する方法に対する必要性がなおある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００８／１３３７２９号
【発明の概要】
【０００８】
ヘマトキシリン・エオジン染色された生体試料において複数の標的をプロービングするための新規な方法が本明細書に開示される。一部の実施形態では、いくつかの段階を含む、生体試料において複数の標的をプロービングする方法が開示される。これらの段階は、所望により、複数の標的を含有する生体試料のヘマトキシリン・エオジン染色を検出する段階と、蛍光Ｈ＆Ｅ信号をヘマトキシリン・エオジン染色された生体試料から除去する段階と、生体試料で追加の特徴又は標的を検出する段階とを含む。追加の特徴には、Ｈ＆Ｅ染色以外の異なる染色方法によって検出され得る任意の形態学的特徴、例えばムチン、脂肪、結合組織、アミロイド、ミエリンなどが含まれてよい。
【０００９】
ある種の実施形態では、ヘマトキシリン・エオジン染色は、弱い蛍光を有するエオジンＹ類似体を使用し、除去段階は、エオジン信号の望ましい減少量に応じて、緩衝水溶液を用いる洗浄又は溶媒及び緩衝液による一連の洗浄を含む。弱い蛍光をもつエオジン類似体には、例えば、エオジン−Ｂ、フロキシンＢ又はエリスロシンが含まれ得る。
【００１０】
ある種の実施形態では、蛍光Ｈ＆Ｅ信号の除去は、
（ｉ）緩衝水溶液を用いて試料を洗浄して、ヘマトキシリンを除去し、エオジンを部分的に除去すること；
（ｉｉ）試料を電荷移動剤と接触させて、エオジン蛍光を消光すること；及び
（ｉｉｉ）所望により、緩衝水溶液を用いて試料を洗浄すること
により達成される。
【００１１】
第四級アンモニウム塩電荷移動試薬は、例えば、メチルビオローゲン（パラコート）、ジクワット及びフェニレンジアミン二塩酸塩から選択されてよい。
【００１２】
ある種の実施形態では、蛍光Ｈ＆Ｅ信号の除去は、緩衝水溶液を用いて試料を洗浄して、ヘマトキシリンを除去し、エオジンを部分的に除去すること；及び試料をインサイチュで生成されたヒドロキシルラジカルと接触させることによって達成される。ある種の実施形態では、ヒドロキシルラジカルは、過酸化水素及び金属塩を適用することによりインサイチュで生成される。ある種のその他の実施形態では、それは、試料の光による照射をさらに含む。
【００１３】
ある種の実施形態では、蛍光Ｈ＆Ｅ信号の除去は、
（ｉ）緩衝水溶液を用いて試料を洗浄して、ヘマトキシリンを除去し、エオジンを部分的に除去すること；
（ｉｉ）試料を電子電荷移動試薬と接触させること；及び
（ｉｉｉ）試料を照射して残留蛍光を除去することにより達成される。ある種の実施形態では、試料を照射することは、試料を３５０ｎｍ〜１．３μｍの波長の光に露光することにより達成される。ある種の好ましい実施形態では、試料を照射することは、試料を４００〜７００ｎｍの波長の光に露光することにより達成される。ある種のその他の実施形態では、エオジンは、不可逆的に修飾されている。さらにその他の実施形態では、試料照射後にエオジンから検出可能な蛍光信号は検出されない。
【００１４】
一部の実施形態では、電子移動試薬（光惹起化学漂白（ＰＩＣＢ）剤）は、ボレート塩である。一部の実施形態では、ボレート塩は、以下の構造式で表される。
【００１５】
【化１】
2016513794.tif 000003
式中、
各Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はヘテロアリールであって、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はヘテロアリールは、（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ4）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ4）アルキルアミノ、アミノ、ヒドロキシル、シアノ、ハロゲン又はニトロからなる群から選択される１以上の置換基で適宜置換されていてもよく、
Ｒ4は、アルキル、アルケニル又はアルキニルであって、アルキル、アルケニル又はアルキニルは、（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル、アリール、（Ｃ1〜Ｃ4）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ4）アルキルアミノ、アミノ、ヒドロキシル、シアノ、ハロゲン又はニトロからなる群から選択される１以上の置換基で適宜置換されていてもよく、
Ｍ+は、有機カチオン及び無機カチオンからなる群から選択される〕。
【００１６】
さらにその他の実施形態では、生体試料で追加の特徴又は標的を検出する段階は、試料においてさらなる標的を検出することを含む。
【００１７】
従って、本方法の検出段階は、１以上のプローブと試料の１以上の標的と結合させ、結合したプローブからの信号を検出し、所望により該信号を除去し、そして、結合、検出及び随意の除去段階を繰り返すさらなる段階を含む。
【００１８】
信号除去段階は、試料を漂白剤又は抜染剤と接触させるか、或いは試料を熱に当ててプローブ又はプローブ信号を除去することを含んでよい。ある種の実施形態では、抜染剤はＳＤＳであり、プローブは抗体である。ある種のその他の実施形態では、プローブは、緩衝液の存在下、直接の熱又はマイクロ波に誘導される熱によって除去される。
【００１９】
漂白剤は、光活性化化学漂白剤であってよく、漂白剤と接触する試料は、３５０ｎｍ〜１．３μｍの波長の光に露光することによってさらに照射される。ある種の実施形態では、試料を照射することは、試料を４００〜７００ｎｍの波長の光に露光することにより達成される。ある種のその他の実施形態では、１以上のプローブは、蛍光信号発生器を含み、検出される信号は蛍光信号である。さらにその他の実施形態では、本方法は、検出段階で検出した信号の１以上の強度値を測定することをさらに含む。その他の実施形態では、強度値は、試料に存在する標的の量に相関する。
【００２０】
さらにその他の実施形態では、エオジンＹ信号は、残留蛍光を消光するために信号検出段階の前に電荷移動試薬を試料に添加することによって消光させてよい。
【００２１】
ある種の実施形態では、Ｈ＆Ｅ染色からの蛍光信号の除去は、残留エオジン蛍光を消光するために、プローブから信号を検出する前に電荷移動試薬を試料に添加することを含む。
【００２２】
さらにその他の実施形態では、結合段階、検出段階及び随意の接触段階が２回以上繰り返される。
【００２３】
ある種の実施形態では、本発明は、ヘマトキシリン・エオジン染色した生体試料において複数の標的をプロービングする方法を提供し、それは：
（ａ）所望により、複数の標的を含有する生体試料のヘマトキシリン・エオジン染色を検出すること；
（ｂ）所望により、試料を洗浄することによりヘマトキシリンを除去し、エオジンを部分的に除去すること；
（ｃ）試料を抗原回復プロセスに付して関心領域の１以上の抗原を露出させること；
（ｄ）所望により、ブロッキング試薬を塗布して、１以上のプローブの非特異的結合をブロックすること；
（ｅ）ヘマトキシリン・エオジン染色された生体試料から蛍光信号を除去すること；
（ｆ）１以上のプローブを、試料に存在する１以上の標的と結合させること；
（ｇ）結合したプローブから信号を検出すること；及び
（ｈ）所望により、信号を除去し、段階（ｆ）から（ｈ）を繰り返すこと
を含む。
【００２４】
ある種の実施形態では、プローブは、タンパク質結合剤である。
【００２５】
ある種のその他の実施形態では、段階（ｈ）の信号除去は、試料を漂白剤又は抜染剤と接触させるか、或いは試料を熱に当ててプローブ又はプローブ信号を除去することを含む。例えば、信号除去は、熱、マイクロ波により生成した熱又は洗剤、例えばＳＤＳでプローブを変性させることによって達成されてよい。また、信号除去は、漂白剤、例えば光活性化化学漂白剤などを用いて達成されてもよく、信号除去段階は、試料を３５０ｎｍ〜１．３μｍの波長の光に露光することによって試料を照射することをさらに含む。
【００２６】
ある種のその他の実施形態では、電子移動剤は、信号除去のために段階（ｅ）と（ｈ）の両方に使用され、これらの段階は、試料を３５０ｎｍ〜１．３μｍの波長の光に露光することによって試料を照射することをさらに含む。
【００２７】
ある種の実施形態では、本発明は、ヘマトキシリン・エオジン染色された生体試料において複数の標的をプロービングする方法を提供し、それは：
（ａ）所望により、複数の標的を含有する生体試料のヘマトキシリン・エオジン染色を検出すること；
（ｂ）ヘマトキシリン・エオジン染色された生体試料から蛍光信号を除去すること；
（ｃ）１以上のプローブを、試料に存在する１以上の標的と結合させること；
（ｄ）結合したプローブから信号を検出すること；及び
（ｅ）所望により、信号を除去し、段階（ｃ）から（ｅ）を繰り返すこと
を含む。
【００２８】
ある種の実施形態では、段階（ｅ）の信号除去は、試料を漂白剤、タンパク質変性剤、ＤＮＡ変性剤、熱、ＳＤＳ、又はその組合せに曝すことを含む。
【００２９】
ある種のその他の実施形態では、１以上のプローブは、ＦＩＳＨプローブである。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】様々なボレート塩を用い、可視光源による２分漂白の後、対照試料と比較した信号強度の百分率を示す、標準化されたグラフを示す図である。
【図２】可視光源による２分漂白の後の、ボレート濃度の影響をグラフで表す図である。
【図３】２枚のスライドを用いる、Ｈ＆Ｅ及びＩＨＣ又はＩＦイメージングへの現在のアプローチの例を示す図であり（図３Ａ）、エオジン染色を除去するためにＰＩＣＢを用いる単一スライドアプローチと比較される図である（図３Ｂ）。
【図４】従来法によるＨ＆Ｅ除去後の残留エオジン蛍光（下画像）を示す図である。一方、中央の明視野像は、ヘマトキシリン・エオジンの完全な除去を示すように見える。
【図５】光惹起化学漂白による残留エオジン蛍光のほぼ完全な除去を示す図である。
【図６】ＰＩＣＢで漂白したＨ＆Ｅスライドの免疫蛍光染色が、Ｈ＆Ｅ染色に付していない対照スライドの免疫染色に匹敵することを示す図である。
【図７】Ｈ＆Ｅのためのスライドを使用し、Ｈ＆Ｅ信号を除去してスライドをその後にその他の分析に使用することができるようにする方法に関する段階のフローチャートを示す図である。
【図８】緩衝液／塩、洗剤、変性剤及び溶媒を用いてエオジン蛍光を除去する、様々な失敗した試みを示す図である。
【図９】図８に示される様々な処置に付したスライドのＰＩＣＢによるエオジン蛍光のほぼ完全な除去を示す図である。
【図１０】ＰＩＣＢによって漂白したスライド（図９に図示）での、Ｃｙ３標識ＡＥ１抗体によるパン−サイトケラチン染色のグレースケール画像を示す図である。
【図１１】ＰＩＣＢで漂白したＨ＆ＥスライドでのＦＩＳＨが、Ｈ＆Ｅ染色に付していない対照スライドでのＦＩＳＨに匹敵することを示す図である。
【図１２】ヒト結腸（上部）及び前立腺（下部）組織切片―未染色（左）、エオジン染色し、再水和及び抗原回復に付したもの（中央、残留エオジン蛍光を示す）及び電荷移動試薬によるエオジン蛍光の物理的消光後（右、水中２０ｍｇ／ｍＬのパラコート５００μＬ中で２０分間インキュベートし、１Ｘ  ＰＢＳで３回洗浄し、カバーガラスを取り付けて撮像）の比較を示す図である。
【図１３】パラコート処置／洗浄後の結腸のＰＣＫ２６−Ｃｙ３及びＮａＫＡＴｐａｓｅ−Ｃｙ５での染色を示す図である。
【図１４】装着媒体におけるパラコートの存在下での前立腺のＰＣＫ２６−Ｃｙ３及びＮａＫＡＴｐａｓｅ−Ｃｙ５での染色を示す図である。
【図１５】ヒト前立腺組織切片―未染色（左）、エオジン染色し、再水和及び抗原回復に付したもの（中央、残留エオジン蛍光を示す）及び、インサイチュでのヒドロキシルラジカルの光触媒生成によるエオジン蛍光の漂白後の比較を示す図である。
【図１６】エタノール溶媒中の様々なエオジン誘導体の相対蛍光発光スペクトルを示す図である。
【図１７】エオジンＢでの染色のための異なるプロトコールの評価から生じる例を示す図である。エオジンＢ染色は、使用するプロトコールによって劇的に影響を受ける。
【図１８】エオジンＹ及びエオジンＢでの染色は、Ｈ＆Ｅ染色に変化を示さないが、残留蛍光に大きな違いを示すことを示す図である。ＡＦＲ：自己蛍光。
【図１９】異なるエオジン類似体を用いるＨ＆Ｅ染色後、及びＨ＆Ｅ信号を除去するための抗原回復の後の異なる組織型の残留自己蛍光の画像を示す図である。上部：内在性組織自己蛍光を示す、標準的な洗浄、水和及び抗原回復に付した対照未染色スライド、中央：対照よりも強いバックグラウンドを示す、エオジンＹで染色した組織試料、全てのエオジンＹを除去することはできなかったことを示す、下部：対照未染色スライドに匹敵する自己蛍光を示す、エオジンＢで染色した組織試料、エオジンＢ信号のほとんど完全な除去を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈上明らかに指示されている場合を除いて複数形への言及が含まれる。本明細書中で明細書及び特許請求の範囲の全体を通して使用される近似を表す語は、その関連する基本機能を変えることなく許容範囲内で変化し得る任意の量的表現を修飾するために適用されてよい。従って、「約」などの用語によって修飾された値は、特定される正確な値に限定されない。別に指定されない限り、明細書及び特許請求の範囲で使用される構成成分の量、分子量などの性質、反応条件などを表す全ての数は、全ての例において「約」という用語で修飾されていると理解される。従って、他にそうでないことが示されていない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲で示される数値パラメータは本発明によって得ようとする望ましい性質によって変化する可能性のある近似値である。少なくとも、各々の数値パラメータは、少なくとも報告される有効数字の数を考慮し、通常の丸め技法を適用することによって解釈されるべきである。
【００３２】
本明細書において、用語「アルキル」とは、飽和脂肪族基をさし、それには、直鎖アルキル基（例、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなど）、分枝鎖アルキル基（イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチルなど）が含まれる。ある種の実施形態では、直鎖もしくは分枝鎖アルキルは６個以下の炭素原子をその主鎖に有するか（例、直鎖の場合Ｃ１−Ｃ６、分枝鎖の場合Ｃ３−Ｃ６）又は４個以下の炭素原子をその主鎖に有する（例、直鎖の場合Ｃ１−Ｃ４、分枝鎖の場合Ｃ３−Ｃ４）。用語「Ｃ１−Ｃ６」アルキルとは、１〜６個の炭素原子を含有するアルキル基をさす。用語「Ｃ１−Ｃ４」アルキルとは、１〜４個の炭素原子を含有するアルキル基をさす。さらに、アルキルという用語には、「非置換アルキル」及び「置換アルキル」の両方が含まれ、この後者とは、炭化水素主鎖の１以上の炭素で水素に置換されている置換基を有するアルキル部分をさす。そのような置換基には、例えば、（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ4）アルコキシ、アミノ（（Ｃ1〜Ｃ4）アルキルアミノ及び（Ｃ1〜Ｃ4）ジアルキルアミノを含む）、アリール（フェニル、ナフチルを含む）、シクロアルキル、ヒドロキシル、シアノ、ハロゲン又はニトロが含まれ得る。アリールアルキル及びシクロアルキルは、例えば上記の置換基でさらに置換することができる。
【００３３】
本明細書において、用語「アルケニル」とは、上記のアルキルと長さ及び可能性のある置換が類似するが、１以上の二重結合を含む、不飽和脂肪族基をさす。例えば、用語「アルケニル」には、直鎖アルケニル基（例、エチレニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニルなど）、分枝鎖アルケニル基が含まれる。さらに、「アルケニル」という用語には、「非置換アルケニル」及び「置換アルケニル」の両方が含まれ、この後者とは、炭化水素主鎖の１以上の炭素で水素に置換されている置換基を有するアルキル部分をさす。そのような置換基には、例えば、（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ4）アルコキシ、アリール、アミノ（（Ｃ1〜Ｃ4）アルキルアミノ及び（Ｃ1〜Ｃ4）ジアルキルアミノを含む）、ヒドロキシル、シアノ、ハロゲン又はニトロが含まれ得る。
【００３４】
本明細書において、用語「アルキニル」とは、上記のアルキルと長さ及び可能性のある置換が類似するが、１以上の三重結合を含む、不飽和脂肪族基をさす。例えば、用語「アルキニル」には、直鎖アルキニル基（例、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、へプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニルなど）、又は分枝鎖アルキニル基が含まれる。さらに、「アルキニル」という用語には、「非置換アルキニル」及び「置換アルキニル」の両方が含まれ、この後者とは、炭化水素主鎖の１以上の炭素で水素に置換されている置換基を有するアルキル部分をさす。そのような置換基には、例えば、（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ4）アルコキシ、アリール、アミノ（（Ｃ1〜Ｃ4）アルキルアミノ及び（Ｃ1〜Ｃ4）ジアルキルアミノを含む）、ヒドロキシル、シアノ、ハロゲン又はニトロが含まれ得る。
【００３５】
本明細書において、用語「アルコキシ」とは、酸素原子と共有結合している置換及び非置換アルキル、アルケニル、及びアルキニル基をさす。アルコキシ基の例としては、限定されるものではないが、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、プロポキシ、ブトキシ、及びペントキシ基が挙げられる。ある種の実施形態では、直鎖もしくは分枝鎖アルコキシは、４個以下の炭素原子をその主鎖に有する（例、直鎖の場合Ｃ１−Ｃ４、分枝鎖の場合Ｃ３−Ｃ４）。用語「Ｃ１−Ｃ４」アルキルとは、１〜４個の炭素原子を含有するアルキル基をさす。
【００３６】
本明細書において、用語「アミン」又は「アミノ」とは、窒素原子が１以上の炭素又はヘテロ原子と共有結合している化合物又は置換基をさす。この用語には、窒素が１以上のさらなるアルキル基と結合している基及び化合物を含む「アルキルアミノ」が含まれる。用語「ジアルキルアミノ」には、窒素原子が２以上のさらなるアルキル基と結合している基が含まれる。ある種の実施形態では、これらのアルキル基は、４個以下の炭素原子をその主鎖に有する（例、直鎖の場合Ｃ１−Ｃ４、分枝鎖の場合Ｃ３−Ｃ４）。用語（Ｃ1〜Ｃ4）アルキルアミノとは、窒素が１以上のさらなるＣ１−Ｃ４アルキル基と結合している基及び化合物をさす。用語（Ｃ1〜Ｃ4）ジアルキルアミノとは、窒素が２以上のさらなるＣ１−Ｃ４アルキル基と結合している基及び化合物をさす。
【００３７】
本明細書において、用語「アリール」とは、基、例えば、０〜４個のヘテロ原子を含み得る５員及び６員の単環芳香族基、例えば、ベンゼン、フェニル、ピロール、フラン、チオフェン、チアゾール、イソチアゾール、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、及びピリミジンなどをさす。さらに、用語「アリール」には、多環式アリール基、例えば、三環式、二環式、例えば、ナフタレン、ベンゾオキサゾール、ベンゾジオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾチオフェン、メチレンジオキシフェニル、キノリン、イソキノリン、ナフチリジン、インドール、ベンゾフラン、プリン、ベンゾフラン、デアザプリン、又はインドリジンが含まれる。環構造にヘテロ原子を有するアリール基は、「アリール複素環」、「ヘテロアリール」又は「ヘテロ芳香族」と呼ばれることもある。芳香環は、１以上の環位置で、上記のような置換基、例えば、（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ4）アルコキシ、アミノ（（Ｃ1〜Ｃ4）アルキルアミノ及び（Ｃ1〜Ｃ4）ジアルキルアミノを含む）、ヒドロキシル、シアノ、ハロゲン又はニトロで置換され得る。アリール基は、多環（例、テトラリン）を形成するように芳香族でない脂環式もしくは複素環式環で縮合又は架橋することもできる。ヘテロアリールという用語には、不飽和環状化合物、例えばアジリン、オキシレン、ジチエト、ピロリン、ピロール、フラン、ジヒドロフラン、ジヒドロチオチオフェン、チオフェン、ピラゾール、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、１２，２，３−トリアゾール、１，２，４，トリアゾール、ジチアゾール、テトラゾール、ピリジン、ピラン、ピリミジン、ピラン、チアピラン、ジアジン、チアジン、ダイオキシン、トリアジン及びテトラゼンが含まれる。
【００３８】
本明細書において、用語「抗体」とは、別の分子の特定の空間構成及び極性構成と特異的に結合し、そのためその構成と相補的であると定義される免疫グロブリンをさす。抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであってよく、宿主の免疫化及び血清（ポリクローナル）の回収などの当技術分野で周知の技法によって、或いは、連続したハイブリッド細胞株を調製し、分泌されたタンパク質（モノクローナル）を回収することによって、或いは、少なくとも天然抗体の特異的結合に必要なアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチド配列又はその突然変異誘発型をクローニング及び発現させることによって、調製されてよい。抗体には、完全な免疫グロブリン又はそのフラグメントが含まれてよく、その免疫グロブリンには、様々なクラス及びアイソタイプ、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３、ＩｇＭなどが含まれる。機能性抗体フラグメントには、全長抗体に似た親和性で結合を保持することが可能な抗体の部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ及びＦ（ａｂ’）2又はＦａｂ’）が含まれてよい。その上、特定の分子に対する結合親和性が実質的に維持される限り、免疫グロブリン又はそのフラグメントの凝集体、ポリマー、及びコンジュゲートも、適宜使用することができる。
【００３９】
明細書において、用語「結合剤」とは、生体試料において１以上の標的と結合し得る分子をさす。結合剤は標的と特異的に結合することができる。適した結合剤としては、１以上の天然又は修飾ペプチド、タンパク質（例、抗体、アフィボディ、又はアプタマー）、核酸（例、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はアプタマー）；多糖類（例、レクチン、糖）、脂質、酵素、酵素基質又は阻害剤、リガンド、受容体、抗原、又はハプテンを挙げることができる。適した結合剤は、分析する試料及び検出に利用可能な標的に応じて選択されてよい。例えば、試料中の標的にはリガンドが含まれてよく、結合剤には受容体が含まれてよいか、或いは、標的には受容体が含まれてよく、結合剤にはリガンドが含まれてよい。同様に、標的には、抗原が含まれてよく、結合剤には、抗体又は抗体フラグメントが含まれてよく、逆も同じである。一部の実施形態では、標的には核酸が含まれてよく、結合剤には相補核酸が含まれてよい。一部の実施形態では、標的と結合剤の両方には、互いと結合することのできるタンパク質が含まれてよい。
【００４０】
本明細書において、用語「生体試料」とは、生物学的対象から得られた試料をさし、それにはインビボ又はインビトロで得られた生体組織もしくは生体流体起源の試料が含まれる。そのような試料は、限定されるものではないが、体液（例、血液、血漿、血清、又は尿）、器官、組織、断片、ヒトを含む哺乳動物から単離された細胞、及び細胞小器官であり得る。また、生体試料には、組織を含む生体試料の切片（例、器官又は組織の断面部分）も含まれてよい。また、生体試料には、生体試料からの抽出物も含まれてよい。生体試料は、タンパク質、炭水化物又は核酸を含んでよい。
【００４１】
生体試料は、原核生物起源、古細菌起源、又は真核生物起源（例、昆虫、原虫、鳥類、魚類、及び爬虫類）のものであってよい。一部の実施形態では、生体試料は、哺乳動物である（例、ラット、マウス、ウシ、イヌ、ロバ、モルモット、又はウサギ）。ある種の実施形態では、生体試料は、霊長類起源のものである（例えば、チンパンジー、又はヒト）。
【００４２】
本明細書において、用語「対照プローブ」とは、信号発生器が電子移動試薬との接触及びその後の照射の後に少なくとも８０パーセントの信号を保持するように、結合剤が信号発生器又は直接染色できる信号発生器に連結された薬剤をさす。対照プローブ中の適した信号発生器は、電子移動試薬と接触し、照射された場合に、実質的に不活性化されない、例えば、光活性化化学漂白によって実質的に漂白される。信号発生器の適した例としては、用いる条件（例、ＤＡＰＩ）下で漂白を受けないフルオロフォアを挙げることができる。
【００４３】
本明細書において、用語「酵素」とは、基質の化学反応を触媒することのできるタンパク質分子をさす。一部の実施形態では、適した酵素は基質の化学反応を触媒して、試料に存在する受容体（例、フェノール基）と結合することのできる反応生成物を形成する。受容体は、外来性（つまり、試料又は固相支持体に外来的に付着した受容体）であってもよいし、内在性（試料又は固相支持体に本質的に存在する受容体）であってもよい。適した酵素の例としては、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、ホスファターゼ、エステラーゼ、及びグリコシダーゼが挙げられる。適した酵素の具体例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、リパーゼ、及びグルコースオキシダーゼが挙げられる。
【００４４】
本明細書において、用語「酵素基質」とは、酵素によって化学的に触媒されて反応生成物を形成する化学化合物をさす。一部の実施形態では、反応生成物は、試料中に存在する受容体と結合することができる。一部の実施形態では、本明細書中の方法で用いる酵素基質には、非発色性基質又は非化学発光基質が含まれてよい。信号発生器は、標識として酵素基質に付けられてよい。
【００４５】
本明細書において、用語「電子移動試薬」とは、光励起を受けることのできる分子との光化学反応に関与し得る試薬をさす。この用語はまた、光励起を受けることのできる分子との光化学反応に関与し得る試薬を含む組成物もさす。一部の実施形態では、光励起を受けることのできる分子は、信号発生器であってよい。一部の実施形態では、電子移動試薬は、光化学反応の過程で信号発生器に電子を供与してよい。代替実施形態では、電子移動試薬は、光化学反応の過程で信号発生器から電子を受容してよい。
【００４６】
一部の実施形態では、光化学反応の過程で信号発生器に電子を供与する電子移動試薬は、エオジン蛍光を消光するために本発明で用いられる光惹起化学漂白剤を含むボレート塩であってよい。代替実施形態では、光励起分子から電子を受容する電子移動試薬は、オニウム塩［例、ジフェニルヨードニウムヘキサフルオロホスフェート（ＤＰＩ）又はジメチルフェナシルスルホニウムテトラフルオロボレート（ＤＭＰＳ）］、又はテトラブチルアンモニウムブチルトリフェニルボレート（ＴＢＡＢ）であってよい。電子移動試薬には、光励起を受けることのできる分子との光化学反応に関与し得る１以上の化学薬品が含まれてよい。光励起を受けることのできる分子は、信号発生器であってよい。電子移動試薬は、固体、溶液、ゲル、又は懸濁液の形態の試料と接触させてよい。その他の適した電子移動試薬には、スルフィナート、エノラート、カルボキシレート（例、アスコルビン酸）、有機金属及びアミン（例、トリエタノールアミン、及びＮ−フェニルグリシン）を挙げることができる。これら及びその他の電子移動試薬は既に記載されている（例、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １９７４，７，１７９−１８７；Ｐｈｏｔｏｇｒ．Ｓｃｉ．Ｅｎｇ．１９７９，２３，１５０−１５４；Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍａｔｔａｙ，Ｊ．，Ｅｄ．；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｂｅｒｌｉｎ，１９９０，Ｖｏｌ．１５６，ｐｐ  １９９−２２５；及びＰｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．１９８４，５６，１１９１−１２０２参照）。
【００４７】
本明細書において、用語「フルオロフルオロフォア」又は「蛍光信号発生器」とは、特定の波長の光への曝露によって励起された場合に、異なる波長の光を放出する化学化合物をさす。フルオロフォアは、それらの発光プロフィール又は「色」の点から説明されることもある。緑色のフルオロフォア（例えばＣｙ３、ＦＩＴＣ、及びオレゴングリーン）は、通常、５１５〜５４０ナノメートルの範囲の波長のそれらの発光を特徴とし得る。赤色のフルオロフルオロフォア（例えばテキサスレッド、Ｃｙ５、及びテトラメチルローダミン）は、通常、５９０〜６９０ナノメートルの範囲の波長のそれらの発光を特徴とし得る。フルオロフォアの例としては、限定されるものではないが、４−アミドアセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸、アクリジン、アクリジン及びアクリジンイソチオシアネートの誘導体、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノアミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート（ルシファーイエローＶＳ）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、ブリリアントイエロー、クマリン、クマリン誘導体、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−トリフルオロメチルクルアリン（クマリン１５１）、シアノシン；４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、５’，５’’−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナートフェニル）−４−メチルクマリン、−、４，４’−ジイソチオシアナートジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸、４，４’−ジイソチオシアナートスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）、フルオレセイン及び誘導体、例えば５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）；フルオレスカミン誘導体（アミンとの反応の際に蛍光）；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアナート；４−メチルウンベリフェロン；オルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；フェノールレッド、Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド誘導体（アミンとの反応の際に蛍光）；ピレン及び誘導体、例えばピレン、ピレンブチレート及びスクシンイミジル１−ピレンブチレート；リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ．ＲＴＭ．ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）、ローダミン及び誘導体、例えば６−オキシカルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−オキシカルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１及びスルホローダミン１０１のスルホニルクロライド誘導体（テキサスレッド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸及びランタニドキレート誘導体、シアニン、ピレリウム色素、スクアライン、１，３−ジクロロ−７−ヒドロキシ−９，９−ジメチル−２（９Ｈ）−アクリジノン（ＤＤＡＯ）、及びジメチルアクリジノン（ＤＡＯ）が挙げられる。一部の実施形態では、フルオロフォアは、シアニン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ又は１，３−ジクロロ−７−ヒドロキシ−９，９−ジメチル−２（９Ｈ）−アクリジノン（ＤＤＡＯ）色素である。好ましい実施形態では、フルオロフォアは、シアニン色素である。さらなる実施形態では、シアニン色素はＣｙ３又はＣｙ５である。
【００４８】
本明細書において、用語「Ｈ＆Ｅ染色」は、通常ヘマトキシリン・エオジンＹ染色（Ｈ＆Ｅ染色又はＨＥ染色）をさす。Ｈ＆Ｅで染色された組織学的切片は、多くの場合「Ｈ＆Ｅ切片」、「Ｈ＋Ｅ切片」、又は「ＨＥ切片」と呼ばれる。染色方法は、アルミニウムイオンと酸化ヘマトキシリンから形成された複合体であるヘマラムの適用を伴う。これらは細胞の核（及び少数のその他の物体、例えばケラトヒアリン顆粒など）を青色に染める。核染色の後に、エオジンＹの水溶液又はアルコール溶液で対比染色が行われる。エオジンＹはその他の好酸性構造を様々な色合いの赤、ピンク及びオレンジ色に染める。
【００４９】
ヘマラムによる核の染色は、ＤＮＡの存在を必要としないので、おそらく色素−金属錯体と、ヒストンなどのアルギニンに富む塩基性核タンパク質との結合に起因する。好酸性構造は、通常、細胞内もしくは細胞外タンパク質からなる。レビー小体及びマロリー小体が好酸性構造の例である。大部分の細胞質は好酸性である。赤血球は強く赤色に染色される。
【００５０】
実施例で実証されるように、比較できるＨ＆Ｅ染色を得るために、エオジン−Ｂ、フロキシンＢ又はエリスロシンなどのエオジンＹ類似体を、エオジンＹの代わりに使用してよい。本明細書において、エオジンという用語に関して、類似体とは、エオジンＹの代わりに使用してエオジンＹと同じ形態的特徴を実質的に染色することができ、最適化された条件下でエオジンＹによって得られるものに類似の着色像をもたらす発色性好酸性色素をさす。
【００５１】
従って、用語「Ｈ＆Ｅ染色」は、組織学的染色を得る際のこれらのエオジンＹ類似体の使用も包含する。エオジンＹのこれらの代替物は、低い内在蛍光を有し、特定の染色手順に好ましい可能性がある。
【００５２】
本明細書において、電荷移動試薬という用語は、エオジンと電荷移動錯体を形成することができ、その過程でエオジン蛍光を消光する化学試薬をさす。電荷移動試薬の例としては、限定されるものではないが、パラコート、ジクワット、フェニレンジアミンジヒドロクロリドが挙げられる。
【００５３】
本明細書において、用語「インサイチュ」とは、通常、元の場所、例えば、インタクトな器官又は組織で、或いは器官又は組織の代表的な部分で起こる事象をさす。一部の実施形態では、標的のインサイチュ分析は、生物、器官、組織試料、又は細胞培養を含む多様な源に由来する細胞で実施されてよい。インサイチュ分析は、標的がその起源部位から取り除かれた場合に失われる可能性のある文脈情報を提供する。従って、標的のインサイチュ分析は、標的結合プローブが細胞内に残っている細胞膜が完全にインタクトであろうと部分的にインタクトであろうと、全細胞又は組織試料中に位置する標的結合プローブの分析を説明する。さらに、本明細書に開示される方法は、固定されたか又は固定されていない細胞又は組織試料においてインサイチュで標的を分析するために用いられてよい。
【００５４】
本明細書において、用語「照射」又は「照射する」とは、試料又は溶液を非電離照射に曝露する行為又はプロセスをさす。一部の実施形態では、非電離照射の波長は３５０ｎｍ〜１．３μｍの間である。好ましい実施形態では、非電離照射は、４００〜７００ｎｍの波長の可視光である。照射は、試料又は溶液を、特定の波長又は一連の波長の照射を放射することの可能な放射線源、例えばランプに曝露することによって達成されてよい。一部の実施形態では、光励起を受けることのできる分子は、照射の結果として光励起される。一部の実施形態では、光励起を受けることのできる分子は、信号発生器、例えば、蛍光信号発生器である。一部の実施形態では、蛍光信号発生器の照射が、蛍光信号発生器と電子移動試薬との間の光化学反応を開始させる。一部の実施形態では、照射が、信号発生器を光活性化化学漂白により実質的に不活性化する光化学反応を開始させる。
【００５５】
光学フィルタは、試料又は溶液の特定の波長又は一連の波長への照射を制限するために使用されてよい。一部の実施形態では、光学フィルタを用いて、光励起を受けることのできる１以上の分子の選択的光励起のために、照射を狭い範囲の波長に制限してよい。用語「選択的光励起」とは、光励起を受けることのできる１以上の分子が、照射後に基底電子状態のままで光励起を受けることのできる１以上のその他の分子の存在下で、光励起される行為又はプロセスをさす。
【００５６】
一部の実施形態では、光励起を受けることのできる分子は、蛍光色素、例えば、シアニン色素である。さらなる一実施形態では、５２０〜５８０ｎｍの間の波長範囲に制限される照射が、Ｃｙ３色素の選択的光励起に使用される。別のさらなる実施形態では、６２０〜６８０ｎｍの間の波長範囲に制限される照射が、Ｃｙ５色素の選択的光励起に使用される。代替実施形態では、具体的な波長での試料の照射は、レーザーを使用することによって達成されてもよい。
【００５７】
本明細書において、用語「ペルオキシダーゼ」とは、電子供与体とともに酵素基質の酸化反応を触媒する酵素の種類をさす。ペルオキシダーゼ酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、シトクロムＣペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、又はダイズペルオキシダーゼが挙げられる。
【００５８】
本明細書において、用語「ペルオキシダーゼ基質」とは、ペルオキシダーゼによって化学的に触媒されて反応生成物を形成する化学化合物をさす。一部の実施形態では、本明細書中の方法で用いるペルオキシダーゼ基質には、非発色性基質又は非化学発光基質が含まれてよい。蛍光信号発生器は、標識としてペルオキシダーゼ基質に付けられてよい。
【００５９】
本明細書において、用語「漂白」、「光活性化化学漂白」又は「光惹起化学漂白」とは、信号発生器により生成された信号が光反応の過程で修飾される行為又はプロセスをさす。ある種の実施形態では、信号発生器は、不可逆的に修飾されている。
【００６０】
一部の実施形態では、信号は、光活性化化学漂白の結果として縮小又は除去される。一部の実施形態では、信号発生器は、完全に漂白される、すなわち、信号強度が約１００％低下する。一部の実施形態では、信号は光信号であり、信号発生器は光信号発生器である。用語「光活性化化学漂白」は、光退色か、或いは、電子移動試薬の不在下で、例えばフルオロフォアなどの信号発生器の連続照射の後、又は光への連続曝露の後に起こり得る信号（例、蛍光信号）の喪失の排除を意味する。
【００６１】
本明細書において、用語「光励起」とは、放射線エネルギーの吸収時（例、照射時）に分子が基底電子状態から励起電子状態に移行する行為又はプロセスをさす。光励起分子は、化学反応（例、電子移動反応）に関与することができる。一部の実施形態では、光励起を受けることのできる分子は、信号発生器、例えば、蛍光信号発生器である。
【００６２】
本明細書において、用語「光化学反応」又は「光誘導性反応」とは、１以上の反応体の光励起の結果として、開始及び／又は進行する化学反応をさす。光反応における反応体は、電子移動試薬及び光励起を受けることのできる分子であってよい。一部の実施形態では、光化学反応は、電子移動試薬から光励起を受けた分子、すなわち光励起分子への電子移動を伴うことがある。代替実施形態では、光化学反応は、光励起を受けた分子から電子移動試薬への電子移動を伴うこともある。一部の実施形態では、光励起を受けることのできる分子は、蛍光信号発生器、例えば、フルオロフォアである。一部の実施形態では、光化学反応は、光化学反応の１以上の成分の不可逆修飾をもたらす。一部の実施形態では、光化学反応は、光活性化化学漂白によって信号発生器を実質的に不活性化する。
【００６３】
一部の実施形態では、光化学反応は、電子移動試薬と光励起分子との間の分子間電子移動を伴ってよく、例えば、電子移動は、電子移動試薬と光励起分子との間の結合が一時的であり、電子移動の直前に形成され、電子移動の後に分離される場合に起こる。
【００６４】
一部の実施形態では、光化学反応は、電子移動試薬と光励起分子との間の分子間電子移動を伴ってよく、例えば、電子移動は、電子移動プロセスの開始の前に、電子移動試薬と光励起分子が結合された場合に（例、共有結合的又は静電的相互作用により）起こる。分子間電子移動を伴う光化学反応は、例えば、光励起を受けることができる分子と電子移動試薬が反対の電荷を有し、静電相互作用により保持される複合体を形成する場合に起こり得る。例えば、カチオン色素、例えば、カチオン性シアニン色素及びトリフェニルブチルボレートアニオンは複合体を形成することがあり、この際、分子間電子移動は、照射によってシアニン部分とボレート部分との間に起こり得る。
【００６５】
本明細書において、用語「プローブ」とは、結合剤及び標識、例えば信号発生器又は酵素などを有する薬剤をさす。一部の実施形態では、結合剤及び標識（信号発生器又は酵素）は、単一の実体に具体化される。結合剤及び標識は、直接的に（例、結合剤に組み込まれた蛍光分子を介して）又は間接的に（例、リンカーを通じて）結合され、単一段階で生体試料に適用されることができる。代替実施形態では、結合剤及び標識は別個の実体に具体化される（例、標的及び酵素を結びつけることのできる一次抗体又は一次抗体を結びつけることのできる信号発生器で標識した二次抗体）。結合剤及び標識（信号発生器又は酵素）が別々の実体である場合、それらは単一段階又は複数の段階で生体試料に適用されてよい。本明細書において、用語「蛍光プローブ」とは、蛍光信号発生器に連結された結合剤を有する薬剤をさす。一部の実施形態では、観測／検出される信号が光信号であるようなために、プローブは光信号発生器を含んでよい。一部の実施形態では、観測／検出される信号が蛍光信号であるようなために、プローブは蛍光信号発生器を含んでよい。
【００６６】
本明細書において、用語「信号発生器」とは、１以上の検出技法（例、分光分析、熱量測定、分光法、また目視検査）を用いて検出可能な信号を提供することのできる分子をさす。検出可能な信号の適した例には、光信号、及び電気信号が含まれてよい。信号発生器の例としては、１以上の発色団、フルオロフォア、又はラマン活性タグが挙げられる。上に述べたように、プローブに関して、信号発生器及び結合剤は、一部の実施形態では、単一の実体に存在してよい（例、蛍光標識をもつ標的結合タンパク質）。或いは、結合剤及び信号発生器は、試料に導入する前又は導入時に互いに会合する別個の実体であってよい（例、受容体タンパク質と、その特定の受容体タンパク質に対する標識抗体）。
【００６７】
一部の実施形態では、信号発生器は光信号発生器であってよい。一部の実施形態では、光信号発生器は蛍光信号発生器、例えば、フルオロフォアであってよい。好ましい実施形態では、蛍光信号発生器は、シアニン色素、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５又はＣｙ７であってよい。一部の実施形態では、信号発生器、例えば、フルオロフォアは、電荷されていてもよい。一実施形態では、信号発生器はカチオン性蛍光色素である。
【００６８】
本明細書において、用語「固相支持体」とは、生体試料中に存在する標的がその上に固定化され、その後に本明細書において開示される方法によって検出され得る物品をさす。標的は、物理的吸着により、共有結合形成により、又はその組合せにより固相支持体上に固定化されてよい。固相支持体には、ポリマー、ガラス、又は金属の材料が含まれてよい。固相支持体の例としては、膜、マイクロタイタープレート、ビーズ、フィルタ、試験片、スライド、カバーガラス、及び試験管が挙げられる。
【００６９】
本明細書において、用語「特異的結合」とは、他方の分子の認識がかなり低いことに比べて、２つの異なる分子のうちの１つを他方に対して特異的に認識することをさす。分子は、その表面上又は空洞中に、静電相互作用、水素結合、又は疎水性相互作用の１以上より生じる二分子間の特異的認識をもたらす領域を有することができる。特異的結合の例としては、限定されるものではないが、抗体−抗原相互作用、酵素−基質相互作用、ポリヌクレオチド相互作用、及び同類のものが挙げられる。一部の実施形態では、結合剤分子は、約６〜約８のｐＨ及び約０℃〜約３７℃の範囲の温度などの周囲条件下で、標的に対して約１０５Ｍ−１以上の固有の平衡結合定数（ＫＡ）を有してよい。
【００７０】
本明細書において、用語「標的」とは、生体試料中に存在する場合に、検出され得る生体試料の成分をさす。標的は、天然に存在する特異的結合剤（例、抗体）が存在するか、又は、特異的結合剤が調製される（例、小分子結合剤又はアプタマー）任意の物質であってよい。一般に、結合剤は、標的の１以上の個別の化学部分又は標的の三次元構造の成分（例、ペプチドフォールディングによる３Ｄ構造）を通じて標的に結合することができる。標的には、１以上の天然又は修飾ペプチド、タンパク質（例、抗体、アフィボディ、又はアプタマー）、核酸（例、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はアプタマー）；多糖（例、レクチン又は糖）、脂質、酵素、酵素基質、リガンド、受容体、抗原、又はハプテンが含まれてよい。一部の実施形態では、標的にはタンパク質又は核酸が含まれてよい。
【００７１】
開示される方法は、一般に、その分析中のいずれかの時点でヘマトキシリン・エオジン染色（Ｈ＆Ｅ）に付され、Ｈ＆Ｅ信号を組織から除去することを可能にする、単一生体試料中の複数の標的の検出に関する。同じ組織は、その後、免疫蛍光及びＦＩＳＨ染色に付されてよい。一部の実施形態では、同じ検出チャネルを用いて単一のＨ＆Ｅ染色した生体試料において複数の標的を検出する方法が開示される。本発明は、分析物検出、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、組織化学、免疫組織化学、又は免疫蛍光などの分析、診断、又は予後用途に適用可能な方法に関する実施形態を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、特に、組織化学、免疫染色、免疫組織化学、イムノアッセイ、免疫蛍光又は蛍光インサイチュハイブリダイゼーションに適用可能であり得る。
【００７２】
開示される方法は、所望により、複数の標的を含有する生体試料のヘマトキシリン・エオジン染色を検出すること；蛍光Ｈ＆Ｅ信号をヘマトキシリン・エオジン染色された生体試料から除去すること；及び生体試料で追加の特徴又は標的を検出することを含む。従って、生体試料は、Ｈ＆Ｅ染色の後、ＩＨＣ、ＩＦ又はＦＩＳＨのいずれかによるさらなる分子分析に利用可能であり、エオジンのための同じ検出チャネルがそのような分子相互作用の検出に利用可能である。
【００７３】
一部の実施形態では、開示される方法は、Ｈ＆Ｅ染色に低蛍光エオジン類似体を使用することを含む。そのため、除去段階は、緩衝水溶液を用いて洗浄することを含む。例となる低蛍光エオジンとしては、エオジン−Ｂ、フロキシンＢ及びエリスロシンが挙げられる。一部の実施形態では、緩衝水溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の緩衝溶液である。一部の実施形態では、溶液は、５〜９のｐＨで緩衝されている。好ましい実施形態では、溶液のｐＨは６〜８である。
【００７４】
一部の実施形態では、開示される方法は、第一段階で、異なる洗浄プロトコールによってＨ＆Ｅ染色した試料からヘマトキシリン及び大部分のエオジンが除去されるプロトコールを含む。次の段階では、試料を電荷移動試薬と接触させて残留蛍光を消光し；所望により、緩衝水溶液を用いて洗浄して過剰な試薬及び電荷移動錯体を除去する。例となる電荷移動試薬は、メチルビオローゲン（パラコート）、ジクワット及びフェニレンジアミン二塩酸塩から選択される。
【００７５】
試料と電荷移動試薬の接触は、予め決定された時間実施されてよい。一部の実施形態では、接触段階は、約２０秒〜約１００分間、好ましくは約１分〜約６０分間、さらにより好ましくは、約５分〜約２０分間実施されてよい。一部の実施形態では、接触段階は、エオジン染色から残留信号が検出されなくなるまで実施されてよい。
【００７６】
一部の実施形態では、接触段階は、４〜５０℃の温度で、より好ましくは、２０〜３０℃の温度で実施されてよい。
【００７７】
一部の実施形態では、接触段階は、溶液中で実施されてよい。一部の実施形態では、溶液は、緩衝溶液である。さらなる実施形態では、緩衝溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の緩衝溶液である。一部の実施形態では、溶液は、５〜９のｐＨで緩衝されている。好ましい実施形態では、溶液のｐＨは６〜８である。
【００７８】
一部の実施形態では、開示される方法は、第一段階で、異なる洗浄プロトコールによってＨ＆Ｅ染色した試料からヘマトキシリン及び大部分のエオジンが除去されるプロトコールを含む。次の段階では、試料をインサイチュで生成したヒドロキシルラジカルと接触させる；一部の実施形態では、ヒドロキシルラジカルの生成は、光による照射によって増強される。
【００７９】
ヒドロキシルラジカル（過酸化物及び金属塩、例、第一鉄塩）を生成するための試薬と接触させた試料の照射は、予め決定された時間実施してよい。照射の持続時間は、ヒドロキシルラジカルとエオジン染色との間の光化学反応の望ましい持続時間に依存し得る。一部の実施形態では、照射段階は、約２０秒〜約６０分間、好ましくは約２０秒〜約１５分間、さらにより好ましくは、約２０秒〜約５分間実施されてよい。一部の実施形態では、照射段階は、エオジン染色から残留信号が検出されなくなるまで実施されてよい。
【００８０】
一部の実施形態では、照射段階は、４〜５０℃の温度で、より好ましくは、２０〜３０℃の温度で実施されてよい。
【００８１】
一部の実施形態では、照射段階は、溶液中で実施されてよい。一部の実施形態では、溶液は、緩衝溶液である。さらなる実施形態では、緩衝溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の緩衝溶液である。一部の実施形態では、溶液は、５〜９のｐＨで緩衝されている。好ましい実施形態では、溶液のｐＨは酸性である。
【００８２】
一部の実施形態では、開示される方法は、第一段階で、異なる洗浄プロトコールによってＨ＆Ｅ染色した試料からヘマトキシリン及び大部分のエオジンが除去される二段階プロトコールを含む。第２の段階において、残留エオジン信号を除去するために、光誘導性電子移動に基づく化学による残留エオジン蛍光の不可逆的消光（本明細書において光惹起化学漂白（ＰＩＣＢ）と呼ばれる）が次に適用される。このＰＩＣＢプロセスは、電子供与体又はアクセプターの存在下でのエオジンの励起を伴う。励起に続いて、電子は色素と供与体か又はアクセプターのいずれかとの間を移動し、結果として生じる反応性の色素は光学的性質の変化を伴ってさらなる反応又は再配列を受ける。例えば、生体試料はエオジンで染色される。イメージング並びにヘマトキシリンの除去及びエオジンの部分的除去の後、スライドをボレート塩緩衝液で浸し、水銀、ハロゲン又はキセノンランプ、ＬＥＤ又は別の光源からの光を組織に照射してエオジン信号を漂白する。
【００８３】
決定的ではないが、エオジン漂白の機構は、エオジンの光励起とそれに続くアルキルラジカルのボレートラジカルの分解からの生成の後の、ボレートからエオジン分子への電子移動に基づき得る。その後の色素とアルキルラジカル又は緩衝液中のその他の種との反応は、次に色素信号を破壊する可能性がある。一部の実施形態では、光化学反応は、分子間電子移動を含む。その他の実施形態では、光化学反応は、分子内電子移動を含む。
【００８４】
一部の実施形態では、エオジン信号は、不可逆的に修飾されている。一部の実施形態では、光活性化化学漂白によって信号発生器、例えばエオジンを不活性化する光化学反応によって、エオジン信号は不可逆的に修飾されている。
【００８５】
一部の実施形態では、光惹起化学漂白（ＰＩＣＢ）を受ける電子移動剤は、ボレート塩である。一部の実施形態では、該ボレート塩は、以下の構造式で表される：
【００８６】
【化２】
2016513794.tif 000004
式中、
各Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はヘテロアリールであって、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はヘテロアリールは、（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ4）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ4）アルキルアミノ、アミノ、ヒドロキシル、シアノ、ハロゲン又はニトロからなる群から選択される１以上の置換基で適宜置換されていてもよく、
Ｒ4は、アルキル、アルケニル又はアルキニルであって、アルキル、アルケニル又はアルキニルは、（Ｃ1〜Ｃ4）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ4）アルコキシ、アリール、（Ｃ1〜Ｃ4）アルキルアミノ、アミノ、ヒドロキシル、シアノ、ハロゲン又はニトロからなる群から選択される１以上の置換基で適宜置換されていてもよく、
Ｍ+は、有機カチオン及び無機カチオンからなる群から選択される。
【００８７】
一部の実施形態では、各Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、所望により置換アリールである。一部の実施形態では、アリールはフェニルである。一部の実施形態では、フェニルは非置換フェニルである。
【００８８】
一部の実施形態では、Ｒ4は、所望により置換アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ4はブチル又はベンジルである。
【００８９】
一部の実施形態では、各Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、所望により置換アリールであり、Ｒ4は所望により置換アルキルである。さらなる実施形態では、各Ｒ1、Ｒ2及びＲ3はフェニルであり、Ｒ4はブチル又はベンジルであり、ボレート塩はトリフェニルブチルボレート塩又はトリフェニルベンジルボレート塩である。
【００９０】
一部の実施形態では、Ｍ＋は無機カチオンである。一部の実施形態では、無機カチオンは、Ｌｉ＋、Ｎａ＋又はＫ＋である。
【００９１】
以下の構造は、ＰＩＣＢ剤として有用なボレート塩の限定されない例である：
【００９２】
【化３】
2016513794.tif 000005
一部の実施形態では、ＰＩＣＢ剤は、溶液の形態であってよい。一実施形態では、ＰＩＣＢ剤は、緩衝水溶液の形態中に存在する。一部の実施形態では、電子移動試薬はボレート塩であってよい。さらなる実施形態では、ＰＩＣＢ剤は、０．００１ｍＭ〜１０００ｍＭの濃度で存在するトリフェニルブチルボレート塩である。好ましい実施形態では、トリフェニルブチルボレートの濃度は、２０ｍＭ〜１００ｍＭである。ある種の実施形態では、ＰＩＣＢ剤は、０．００１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度、より好ましくは２００ｕＭ〜１０ｍＭの濃度で存在するトリフェニルベンジルボレートであってよい。
【００９３】
ＰＩＣＢ剤と接触させた試料の照射は、予め決定された時間実施されてよい。照射の持続時間は、ＰＩＣＢ剤とエオジン染色との間の光化学反応の望ましい持続時間に依存し得る。一部の実施形態では、照射段階は、約２０秒〜約６０分間、好ましくは約２０秒〜約１５分間、さらにより好ましくは、約２０秒〜約５分間実施されてよい。一部の実施形態では、照射段階は、エオジン染色から残留信号が観察／検出されなくなるまで実施されてよい。一部の実施形態では、照射段階は、室温で実施されてよい。
【００９４】
一部の実施形態では、光化学反応は、４〜５０℃の温度で、より好ましくは、２０〜３０℃の温度で実施される。
【００９５】
一部の実施形態では、光化学反応は、溶液中で実施される。一部の実施形態では、溶液は、緩衝溶液である。さらなる実施形態では、緩衝溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の緩衝溶液である。一部の実施形態では、溶液は、５〜９のｐＨで緩衝されている。好ましい実施形態では、溶液のｐＨは６〜８である。
【００９６】
代表的なボレート塩の光退色の結果を図１及び図２にグラフで示す。図１は、様々なボレート塩を用い、可視光源による２分漂白の後、対照試料と比較した信号強度の百分率を示す、標準化されたグラフである。図２は、可視光源による２分の漂白の後の、ボレート濃度の影響をグラフで表す図である。示されるように、２つのボレート塩の濃度は変化した（０〜３．２５ｍＭ）。濃度が増加するほど、Ｃｙ５強度の減衰が示される。
【００９７】
一部の実施形態では、エオジン信号の特徴は、漂白の有効性を決定するために蛍光信号除去後に検出されてよい。例えば、色は、蛍光信号除去段階の前に検出されてよく、その色は蛍光信号除去段階の後に存在しないかもしれない。或いは、比色検出は蛍光検出ほど感受性が高くなく、色が存在しない場合でさえも、かなりの蛍光が残っている可能性があるので、蛍光は信号除去の前後に測定されてよい。一部の実施形態では、予め定められた量の信号強度の低下は、信号修飾、又は漂白と呼ばれてよい。一部の実施形態では、信号の修飾は、約５０パーセントを超える範囲で信号強度の量が低下することをさし得る。一部の実施形態では、信号の修飾は、約６０パーセントを超える範囲で信号強度の量が低下することをさし得る。一部の実施形態では、信号の修飾は、約８０パーセントを超える範囲で信号強度の量が低下することをさし得る。一部の実施形態では、信号の修飾は、約９０パーセントを超える範囲で信号強度の量が低下することをさし得る。一部の実施形態では、信号の修飾は、約９５パーセントを超える範囲で信号強度の量が低下することをさし得る。一部の実施形態では、信号の修飾は、約１００パーセントの範囲で信号強度の量が低下すること、又は完全な漂白をさし得る。
【００９８】
従って、一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、蛍光信号が除去される場合に、Ｈ＆Ｅ染色した試料がさらなる免疫染色手順に付されるプロセスで使用されてよい。例えば、Ｈ＆Ｅ染色した試料の蛍光信号が除去されている場合に利用可能なさらなる免疫染色手順は、生体試料の完全性にほとんど又は全く影響なく同じ生体試料中の複数の標的の検出を可能にすることができる。同じ生体試料中の標的を検出することは、生体試料中での標的の空間情報がさらに得られる可能性がある。本明細書に開示される方法はまた、限られた量の生体試料しか分析に利用できず、複数の分析に同じ試料が処理されなければならない分析用途にも適用可能であり得る。本明細書に開示される方法はまた、固体状態の試料（例、組織切片）又は固相支持体に付着した試料の複数の分析を容易にし得る。さらに、同じ検出チャネルを試料中の異なる標的の検出に用いてよいので、複数の標的の分析のより少ない化学要件を可能にする。この方法は、分析できる信号が限られているために同時に検出可能な標的の数が制限され得る検出方法に基づく分析をさらに容易にすることができる。例えば、蛍光に基づく検出を用いると、同時に検出されてよい標的の数は、その励起及び発光波長特性に基づいて約４の蛍光信号しか分析可能でないので、約４に制限される可能性がある。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、蛍光に基づく検出系を用いて４よりも多くの標的の検出を可能にすることができる。
【００９９】
個々の試料を繰り返し分析する方法は、米国特許第７，６２９，１２５号及び米国特許第７，７４１，０４６号に記載されている。特に、米国特許第７，７４１，０４６号は、信号発生器を不活性化するために酸化の使用を含む（例、蛍光色素を漂白するため）、生体試料において複数の標的を検出する方法を提供する。酸化反応は、酸化試薬、例えば過酸化水素など、並びに光酸化を使用することにより達成され、それは参照により本明細書に組み込まれる。繰り返し分析のさらなる方法は、文献、例えば、Ｂｏｒｄｕｃｈｉ  Ａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９９，２２，１７３−１７５、Ｔｏｔｈ  ＺＥ  ａｎｄ  Ｍｅｚｅｙ  Ｅ．，Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ２００７，５５，５４５−５５４、及びＺｒａｚｈｅｖｓｋｉｙ  Ｐ  ａｎｄ  Ｇａｏ  Ｘ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２０１３，４，１６１９に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１００】
さらにその他の方法では、この方法は、例えば、各々のサイクルにおいて、１つの光化学反応段階が、さらなるマーカー（例、タンパク質）を検出するためにその後のサイクルで同じ信号発生器（例、フルオロフォア）を再使用することを可能にする信号循環プロセスを用いる。これらの方法は、例えば、数ある中で、生体試料中の複数の生物学的標的の存在、欠如、濃度、及び／又は空間分布を識別するために生体試料を順次分析するために用いることができる。光化学反応段階には、電子移動剤（例、ボレート塩）を適用すること、及び光化学反応を開始させて（例えば、試料を可視光で照射することによる）信号発生器（例、蛍光色素）を不活性化することを含むことができる。
【０１０１】
本明細書によって与えられるある種のプロセス改良を図３に示す。図３Ａは、２枚の別々のスライドがＨ＆Ｅ及びＩＨＣ、ＩＦ又はＦＩＳＨのために処理される、現在のアプローチを表す。一部の例では、Ｈ＆Ｅスライドが最初に処理され、関心領域（ＲＯＩ）を特定するために染色される。次に、連続組織切片の一部であってよい２枚目のスライドを、例えばＩＨＣ又はＦＩＳＨを用い、１枚目のスライドのＨ＆Ｅ染色から得られた情報を用いて処理する。
【０１０２】
図３Ｂに示されるように、この方法の改良法が一実施形態では示される。示されるように、単一のスライドは、Ｈ＆ＥとＩＨＣ、ＩＦ又はＦＩＳＨ染色の両方を組合せることができる。スライドは、Ｈ＆Ｅ染色に付され、ＰＩＣＢを受ける。次に、同じスライドをＩＨＣ、ＩＦ又はＦＩＳＨプロトコールに付す。このプロセスは、情報を単一のスライド上で得られるようにし、２時間以上の範囲内であり得るＲＯＩ転送時間の必要性を、０．５時間未満のＨ＆Ｅ除去で処理されるように置き換える。時間の節約に加えて、このプロセスはまた、組織を保存し、形態及び分子情報をここでは同じ切片から得ることができるという点でエラーを減少させる。
【０１０３】
処理時間及び組織保持の改善に加えて、一部の実施形態では、残留エオジン蛍光が以降のイメージングを干渉しないように、この方法はＰＩＣＢによるエオジン蛍光の除去も可能にする。
【０１０４】
図４に示されるように、従来法によるＨ＆Ｅの除去は、明視野像（中央の画像）に示されるように、ヘマトキシリンとエオジンＹの両方を除去するように見えるが、蛍光イメージングは、以降の蛍光に基づく検出を干渉し得る、かなりの残留エオジンＹ蛍光を示す（下の画像）。
【０１０５】
図５は、残留エオジン蛍光がＰＩＣＢ処置によって除去される同じ関心領域（ＲＯＩ）を示す。エオジン蛍光はかなり減少し（中央の画像）、Ｈ＆Ｅ染色に付されていない対照スライドの自己蛍光に匹敵する（下の画像）。
【０１０６】
Ｓ６タンパク質を標的とするＣｙ３標識抗体でのスライドのその後の染色（図６）は、容易に識別できる、タンパク質の特異的染色を示し（中央のパネル、左画像−ＰＩＣＢによるエオジン蛍光除去後、右、ＰＩＣＢ後にＳ６染色画像）、それは制御されたスライドで検出された信号に匹敵する（下のパネル、左画像−Ｈ＆Ｅに付されていないスライドの組織自己蛍光、右画像、Ｓ６染色画像）。
【０１０７】
Ｈ＆Ｅスライドを電荷移動試薬によって接触させ、その後に洗浄して過剰な塩を除去すると、同様の結果が得られる。図１２。スライドは、分子プローブで染色されてよく、信号検出に検出できる差異はなかった。図１３。或いは、電荷移動試薬を分子信号の検出の直前に添加して、Ｈ＆Ｅ染色からの蛍光信号を抑制してもよい。図１４。
【０１０８】
ヒドロキシラジカルを用いて残留エオジン蛍光を同様に除去してもよく、残留エオジン蛍光は、過酸化水素及び金属塩を用いてインサイチュで生成されてよく、光照射によってさらに触媒されてもよい。信号除去の後、その後の分析の前に過剰な試薬及び副生成物を洗浄して除去する。図１５。
【０１０９】
或いは、低蛍光エオジン類似体を用いてＨ＆Ｅ染色プロセスでエオジンＹを置き換えてよい。図１６、１７及び１８。単純な洗浄段階がこれらの代わりのエオジン類似体から蛍光信号を効果的に除去する。図１９。
【０１１０】
一部の実施形態では、この方法は、Ｈ＆Ｅ染色、Ｈ＆Ｅ染色の蛍光信号の除去、及び、各サイクルにおいて染色及びイメージングの後に電子移動試薬の適用及び生体試料の照射又はプローブの除去などによる信号不活性化段階の続く、信号循環プロセスを含む、その後のハイスループット多重生体試料分析を可能にする。この方法は、プローブとは異なる生体試料の成分を大幅に修飾することなく迅速な信号循環を可能にする。
【０１１１】
図７は、本発明の一実施形態を表すフローチャートである。示されるように、この方法は、生体試料を準備することと：
（ａ）生体試料をヘマトキシリン・エオジンで染色すること；
（ｂ）顕微鏡を用いて試料を検出すること及び所望により画像を取り込むこと；
（ｃ）所望により洗浄によってヘマトキシリンを除去し、エオジンを部分的に除去すること；並びに
（ｄ）例えば、光惹起化学漂白を用いて残留エオジン蛍光を除去すること
を含む。
【０１１２】
さらにその他の実施形態では、この方法は、Ｈ＆Ｅ染色プロトコールの後に抗原回復（ＡＲ）の段階をさらに含んでよい。このように曝露された抗原は、その後、さらなるＨ＆Ｅ信号除去及び免疫組織化学染色、例えばＩＦなどに付されてよい。これは図８〜１０にさらに示されている。
【０１１３】
一般に、抗原標的は、生体試料の表面に存在し得る（例えば、組織切片の表面上の抗原）。一部の実施形態では、抗原標的は生体試料の表面に本質的に存在しない場合があり、生体試料は表面上の標的を利用可能にするために処理されなければならない場合がある（例、抗原回収、酵素消化又はエピトープ回復）。抗原回復段階は、従って酸及び又は塩基中での高温加熱を伴って実施されてよい。そのような手順は、参照により本明細書に組み込まれる２０１２年７月１７日出願の米国特許出願公開第１３／５５１１９０号にさらに記載されている。
【０１１４】
一部の実施形態では、エオジン信号は、残留信号の除去の前の抗原回復プロセス中に部分的に除去されてよい。抗原回復プロセス自体又は多様な添加剤を用いるその他の洗浄段階は、全ての蛍光信号をエオジンＹから除去することができない。図８は、塩濃度、ｐＨ、その他の塩の添加又はタンパク質変性剤を変えることによる免疫組織化学のためにスライド処理プロセス（スライド清浄及び抗原回復）を変化させることによって残留エオジンＹ蛍光を除去することの様々な不成功の試みを示す。ＰＩＣＢなどのプロセスは、同じスライドをＣｙ３標識ｐａｎＣＫ（Ｃｙ３−ＡＥ１）抗体で染色することにより示される組織抗原性（図１０）を維持しながら、図９に示されるような信号を除去するために必要である。
【０１１５】
一部の実施形態では、上で考察される試料調製手順を別として、生体試料はさらなる処置に付されることがある。例えば、一部の実施形態では、組織切片は、非特異結合を最小にするためにブロッキング段階に付されてよい。試料の調製の後、結合剤と標的タンパク質（例、免疫蛍光手順の抗原）との結合に適した条件下で十分な時間、試料を結合剤溶液（例、免疫蛍光手順の標識抗体溶液）と接触させてよい。
【０１１６】
一部の実施形態では、生体試料は、接触段階で２以上の結合剤と接触させてよい。複数の結合剤は、生体試料の異なる標的タンパク質と結合できる可能性がある。例えば、生体試料には２つの標的タンパク質：標的１及び標的２が含まれてよく、２組の結合剤：結合剤１（標的１と結合可能）及び結合剤２（標的２と結合可能）がこの場合に使用されてよい。従って、複数の結合剤を同時に生体試料と接触させることができる。例えば、単一混合物としての、ＡＲ、ＥＲ、ｐ５３、Ｈｅｒ２、平滑筋アクチン、ケラチン、及びパン−カドヘリンバイオマーカーなどの異なる蛍光標識抗体による染色。この方法には、試料の画像を生成する、１以上の結合剤からの信号を検出することがさらに含まれる。光惹起化学漂白剤が適用されてよく、その結果、１以上の結合剤の信号を変更する光化学反応を開始する。
【０１１７】
一部の実施形態では、試料はその後複数回の染色及び信号除去でさらなる順次染色及び標的の検出を受けてよい。従って、この方法は、スライドがＨ＆Ｅ染色に付された後に、ＩＨＣ、ＩＦ又はＦＩＳＨを使用することに適用できる。例えば、図１１は、洗浄段階とＰＩＣＢ段階の両方を用いるＨ＆Ｅ除去の後にＨＥＲ２及びＣＥＰ１７プローブによるＦＩＳＨに付された、Ｈ＆Ｅ染色したスライド（ａ）の蛍光に基づく画像である。Ｈ＆Ｅ染色されていないスライドを対照として使用した。図に示されるように、漂白後、４０ｍＭジシクロペンチルジフェニルボレートリチウム塩で１５分間２４Ｗランプで処理した漂白したスライド（ｂ）の残留蛍光は、自己蛍光を示す対照スライド（ｃ）の組織自己蛍光に匹敵する。両方のスライド（ｂ及びｃ）はともに、ＦＩＳＨプローブによる良好な染色をもたらす（それぞれｄ及びｅ）。
【０１１８】
従って、この方法には、限定されるものではないが、複数の標的を含有し、例えば、試料中に存在する１以上の標的に対する酵素と結合された結合剤を有する１以上のプローブで結合する、生体試料の検出及び分析も含むことのできる方法が含まれる。さらにその他の実施形態では、上記の方法は、多様な方法を用いて検出段階で検出することのできる、光学的に標識された生物学的標的を表す一連の少なくとも２枚の画像を提供する。
【０１１９】
一部の実施形態では、対照プローブは、複数の分子情報（反復性のプロービング段階によって取得）及び形態情報（例えばＤＡＰＩを用いて取得）を同時登録するために、本明細書に開示される方法で用いられてよい。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法には、複数の蛍光画像と、上述のＨ＆Ｅプロトコールを用いて取得した明視野形態画像の同時登録が含まれてよい。一部の実施形態では、反復性プロービング段階で用いたプローブは、最初のＨ＆Ｅ画像で登録するために使用することのできる共通する区画情報を全く有さなくてよい。ＤＡＰＩ核染色のような対照プローブは、ヘマトキシリンで染色された核を明視野画像と蛍光画像で同時登録するために用いることができる。蛍光画像及び明視野画像は、画像登録アルゴリズムを用いて同時登録されてよく、画像は２つのカテゴリー：強度に基づく手法及び特徴に基づく手法に分類され得る。
【０１２０】
一部の実施形態では、イメージング（検出段階とも呼ばれてよい）には、試料中の２以上の標的の同時局在化が含まれる。試料中の標的を同時局在化するための方法は、２００７年３月１５日出願の米国特許出願公開第１１／６８６，６４９号、標題「Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  Ｉｍａｇｅｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓａｍｐｌｅｓ」；米国特許第８，１３１，４７６号、標題「Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｃｏ−Ｒｅｇｉｓｔｅｒｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉ−Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｉｍａｇｅｓ  ｏｆ  ａ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ａｒｒａｙ」；米国特許第８，０６０，３４８号、標題「Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｉｍａｇｅｓ  ｏｆ  ａ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ａｒｒａｙ」；及び米国特許第８，０３６，４６２号、標題「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ」に記載されている；その各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２１】
検出段階において、信号発生器からの信号は、検出系を用いて検出されてよい。使用する検出系の性質は、使用する信号発生器の性質に依存し得る。検出系には、電荷結合素子（ＣＣＤ）検出系、蛍光検出系、電気検出系、写真フィルム検出系、化学発光検出系、酵素検出系、光学検出系、近視野検出系、又は内部全反射（ＴＩＲ）検出系が含まれてよい。
【０１２２】
上述の手法の１以上は、（結合剤と結合したか、又は酵素基質と結合した）信号発生器からの信号の１以上の特徴を検出するために使用することができる。一部の実施形態では、信号強度、信号波長、信号位置、信号周波数、又は信号シフトは、上述の手法の１以上を用いて決定されてよい。一部の実施形態では、上述の信号の１以上の特徴は、検出され、測定され、記録されてよい。
【０１２３】
一部の実施形態では、上述の方法の１以上は自動化されてよく、自動化された系を用いて実施されてよい。一部の実施形態では、段階は全て、自動化された系を用いて実施されてよい。
【０１２４】
本明細書に開示される方法は、生物学及び医学分野での分析、診断、及び治療用途に適用を見出すことができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、組織化学、特に、免疫組織化学に適用を見出すことができる。患者由来の細胞又は組織試料の分析は、本明細書に記載される方法に従って、診断的に（例えば、特定の疾患を有する患者、特定の毒に触れた患者又は特定の治療又は臓器移植によく応答している患者を特定するために）、さらに予後的に（例えば、特定の疾患を発症する可能性のある患者、特定の治療によく応答する患者、又は特定の臓器移植を受ける患者を特定するために）用いられてよい。本明細書に開示される方法は、同じ生体試料から複数（例、潜在的に無限数）の標的（例、疾患マーカー）の正確かつ信頼性の高い分析を促進することができる。
【実施例】
【０１２５】
以下の実施例は、本発明に従って方法及び実施形態を説明することだけを意図するものであり、従って特許請求の範囲に制限を課すと解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０１２６】
組織試料の調製
ヒト胸部組織アレイ試料を、パラフィンに包埋された組織スライドとしてＣｌａｒｉｅｎｔ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬより入手した。スライドを６０℃で１５分間ベークした後、Ｈ＆Ｅ染色した。
【実施例２】
【０１２７】
Ｈ＆Ｅ染色
全てのスライドを、下に列挙される標準的な逆行プロトコールに従ってヘマトキシリン・エオジンで染色した。染色後、下の表１に記載されるように画像を入手した。手順では、組織を含むスライドを、最初のキシレン（ＸＹＬＥＮＥ）段階の前に６０℃で１５分間ベークする。ヘマトキシリン及びエオジンは各々の使用前に濾過した。カバーガラスを取り付ける前にスライドが乾燥するのを防ぐために、カバーガラスはキシレンから直接適用された。
【０１２８】
【表１】
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【実施例３】
【０１２９】
イメージング
明視野及び蛍光画像は、全てのスライドについてライカ明視野顕微鏡及びオリンパス顕微鏡をそれぞれ用いて撮影した。蛍光に関して、エオジン染色画像は、Ｃｙ２（Ｅｘ：４８２／３５、Ｅｍ：５３６／４０）、Ｃｙ３（Ｅｘ：５３１／４０、Ｅｍ：５９３／４０）、及びＣｙ５（Ｅｘ：６２８／４０、Ｅｍ：６９２／４０）チャネルで収集した。
【実施例４】
【０１３０】
組織の再水和及び透過処理
イメージングの後、１００％、９５％、７０％、及び５０％の順序で濃度が減少する４つのエタノール溶液で洗浄し、それに続いて１ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄することにより試料を水和させた。再水和の後、スライドを１ｘＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳ中０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１０分の洗浄を組織の膜透過処理のために実施し、それに続いて１ｘＰＢＳで洗浄した。次に、スライドを異なる緩衝液に付してＨ＆Ｅ除去を試みた。
【実施例５】
【０１３１】
抗原回復
水和させたスライドを二重緩衝液加熱誘導性エピトープ回復で処理した。スライドを予熱した７０℃のクエン酸緩衝液、ｐＨ６．０（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｕｎｍａｓｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に浸漬し、圧力鍋で１１０℃の温度までさらに加熱し、この温度を４分間維持し、その後徐々に冷却した（最終温度９６℃）。スライドをクエン酸緩衝液の中に合計２０分間入れ、次に熱（９６℃）トリス−ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ９．０に移し、気圧の鍋の中で徐々に冷却しながら２０分間静置させた。これに続いて室温で１０分間冷却し、１ｘＰＢＳ中で一連の洗浄を行った。明視野及び蛍光顕微鏡によってスライドを画像化した。明視野像は、実際にヘマトキシリン・エオジンの色の完全な除去を示したが、明るい蛍光が残留エオジンから観察／検出された。
【実施例６】
【０１３２】
ＰＩＣＢなしで試みたＨ＆Ｅの除去
Ｈ＆Ｅを除去する試みで、スライドをさらに以下の条件に付した。１０ｘクエン酸塩（標準時間が２０分の抗原回復の間の標準的な１Ｘクエン酸の代用）、クエン酸塩ｐＨ５．０（標準時間２０分の抗原回復の間の標準的なクエン酸塩ｐＨ６．０の代用）、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中に作成したクエン酸塩（標準時間２０分の抗原回復の間のＰＢＳ中に作成した標準的なクエン酸塩の代用）、１００ｍＭ尿素ｐＨ４．５（抗原回復に進む前の１０分洗浄とそれに続く３回の短時間水洗）、１００ｍＭグアニジウムｐＨ５．０（抗原回復に進む前の１０分洗浄とそれに続く３回の短時間水洗）、１．５Ｍ  ＮＨ４ＯＨ中、７０％エタノール（標準的な２Ｘ５分の再水和の間の水中７０％エタノールの代用）。
【実施例７】
【０１３３】
ブロッキング
抗原回復の後、４℃の１０％ロバ血清、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液中で一晩インキュベートすることにより、スライドを非特異的結合に対してブロッキングした。
【実施例８】
【０１３４】
残留エオジンの漂白
ブロッキング後の全てのＨ＆Ｅスライドを４０ｍＭのジシクロペンチルジフェニルボレート（５００ｕｌ）で処理し、５００ｎｍの光で３０分間照射した。ＰＢＳで３回洗浄して残留ボレートを除去した。
【実施例９】
【０１３５】
免疫染色
スライドをＤＡＰＩで染色し、カバーガラスを取り付けた。タンパク質染色の前に２０倍で画像を撮影して、Ｃｙ２、Ｃｙ３及びＣｙ５チャネルのエオジンの自己蛍光を確かめた。スライドは、１ｘＰＢＳ中でカバーガラスを外し、１Ｘ  ＰＢＳ中の３％ＢＳＡに希釈したサイトケラチンＡＥ１−Ｃｙ３コンジュゲートで染色した。インキュベーションは室温で１時間であった。インキュベーションの後、１ｘＰＢＳ中の一連の洗浄によって過剰な抗体を除去し、スライドにカバーガラスを取り付けた。試料を画像化した。
【実施例１０】
【０１３６】
同一スライド上でのＨ＆Ｅ及び蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
段階１〜７を上記の実施例１〜５、７＆８のように実施した。次に、ＦＩＳＨプロトコールを適用した。スライドは、イメージング後にカバーガラスを外し、予熱した０．１％ペプシン溶液に８分間浸漬し、その後室温のＰＢＳに２分間入れた。試料を４％ホルマリン中で１０分間再固定し、次にＰＢＳ中で２Ｘ５分洗浄した。スライドをエタノール系列５０％、７０％、及び９５％で各々２分脱水し、ベンチトップの上で１０分間乾燥させた。予め混合した二重Ｈｅｒ２／ＣＥＰ１７プローブをボルテックスし、回転させ、試料に添加した。試料にカバーガラスを取り付け、慣用手段によってゴムのりで密封した。ゴムのりを１０分間硬化させた後、プローブをＴｈｅｒｍｏｂｒｉｔｅサイクラーでハイブリダイズした：８０℃で１０分間変性の後、３７℃で一晩インキュベーション。ゴムのりを除去し、スライドを予熱した３７℃の２ｘＳＳＣに５分間入れてカバーガラスを外した後、予熱した７２℃の２ｘＳＳＣ、０．３％ＮＰ−４０に移して２分間置いた。スライドを２ｘＳＳＣで２Ｘ２分洗浄し、緩衝液から取り出して乾燥させ、９０％グリセログリセロール／２ｘＳＳＣ中４％ＤＡＢＣＯでカバーガラスを取り付け、ＤＡＰＩ（２ｍｓ）、スペクトルグリーン（ＣＥＰ１７−２００ｍｓ）、及びスペクトルオレンジ（Ｈｅｒ２−４００ｍｓ）に４０Ｘ対物レンズを使用し、オリンパスＩＸ８１蛍光顕微鏡で撮像した。ｚ−スタック値１２、ゲイン１０、及び段階サイズ０．７５μを使用した。
【実施例１１】
【０１３７】
電荷移動試薬を用いる残留エオジン漂白（物理的手段による蛍光クエンチング）
スライドを、実施例１〜５に記載される全ての段階によって処理し、画像化して残留自己蛍光を捕獲した。抗原回復の後、スライドを２．５〜２０ｍｇ／ｍＬのメチルビオローゲン（パラコート）、ジクワット又はフェニレンジアミン二塩酸塩（５００ｕｌ）で処理し、暗い加湿チャンバで２０分間インキュベートした。スライドを１Ｘ  ＰＢＳで３回洗浄して過剰な塩を除去し、ブロッキング及び実施例７＆９に記載されるようにＣｙ３標識パンサイトケラチン抗体ＰＫＣ２６及びＣｙ５標識抗ＮａＫＡＴＰアーゼ抗体による染色の前に再び画像化した。スライドにカバーガラスを取り付け、再び画像化してタンパク質染色を捕獲した。図１２に示されるように、抗原回復の後、未染色の連続切片の残留自己蛍光（図１２、左の画像）と比較して、かなりの残留エオジン蛍光（図１２、中央の画像）が残っている  電荷移動試薬でのインキュベーションの後、この残留自己蛍光は容易に消光されることができ（図１２、右の画像）、スライドは目的の分子標的について染色することができる（図１３）。
【実施例１２】
【０１３８】
電荷移動試薬を用いる残留エオジン漂白（代替法）或いは、電荷移動試薬（２．５〜２０ｍｇ／ｍＬ）を、装着媒体［９０％グリセロール／４％没食子酸プロピル及び１％ＤＡＢＣＯ］に溶解した。
【０１３９】
スライドを、実施例１〜５、７及び９（Ｃｙ３−ＰＫＣ２６及びＣｙ５−ＮａＫＡＴＰアーゼでの染色）に記載される段階に付し、イメージングの前に装着媒体を含有する電荷移動試薬を用いてカバーガラスを取り付けた。図１４に示されるように、スライドが色素標識抗体で染色された後に、エオジン自己蛍光を消光するために電荷移動試薬を適用することができる。信号強度はわずかに減少したように見える；しかし、両方の標的は容易に検出することができる。
【０１４０】
実施例１３：光触媒ヒドロキシルラジカル生成を用いる残留エオジンＹ蛍光除去
スライドを、実施例１〜５に記載される全ての段階によって処理し、画像化して残留自己蛍光を捕獲した。抗原回復後、スライドを、３００μＬの水中ＦｅＳＯ4.７Ｈ2Ｏ−２．７ｍｇ／５０ｍＬ及び３００μＬのＨ2Ｏ2：１．２ｍｇ／ｍＬの新鮮な混合物とともにインキュベートした。スライドを１０分間白色光照射（水中灯）に付した。照射後、スライドを１Ｘ  ＰＢＳで３回洗浄して過剰な試薬を除去し、画像化した。Ｈ＆Ｅ染色からの残留エオジン蛍光をヒドロキシルラジカルによって効果的に漂白する（図１５）。
【０１４１】
実施例１４：交互染色（エオジンＢ及びエリスロシン）の使用：
エオジンＹの類似体、例えばエオジン−Ｂ、フロキシンＢ及びエリスロシンなどは、エオジン−Ｙと比較して蛍光の規模が小さく（図１６）、その容易な除去を可能にし得るアルコール及び水などの極性プロトン性溶媒に高い溶解性を有する。しかし、１つの鍵となる要件は、それらが、ヘマトキシリン・エオジンＹによって得られるＨ＆Ｅ画像に相当するＨ＆Ｅ画像をもたらすということである。
【０１４２】
ａ．修正Ｈ＆Ｅ染色プロトコール：実施例２に記載されるＨ＆Ｅプロトコールを、エオジン類似体の溶液の様々な組成を評価することにより各エオジン類似体について最適化し（図１７）、訓練された病理学者によって決定される、エオジンＹによって得られる画像と見分けのつかないＨ＆Ｅ染色した画像（図１８）を提供するために以下の条件（下の修正プロトコールを参照）を特定した。
【０１４３】
表：エオジンＢによる染色のための修正Ｈ＆Ｅ染色プロトコール：主な違いは、エオジンＢによる染色に５０％水性エタノールを使用することである。
【０１４４】
【表２】
2016513794.tif 000007
ｂ．エオジンＢを用いて生成したＨ＆ＥからのＨ＆Ｅ信号の除去：修正プロトコールを用いてエオジンＢで染色したＨ＆Ｅスライドを、実施例３〜５に記載される段階に付し、スライドを画像化して残留蛍光を捕獲した。実施例２に記載されるプロトコールを用いるエオジンＹ染色スライドを対照として使用し、エオジンＢ染色スライドと同じ段階によって処理した。図１８に示されるように、エオジンＹ染色した対照スライドは、以前に行った観察から予測されるように相当な残留蛍光を有するが、エオジンＢ染色したスライドの自己蛍光は、未染色のスライド対照に匹敵する。同様の結果は、主要な癌タイプを表すいくつかの異なる組織種においても観察された（図１９）。
【０１４５】
本発明の特定の実施形態が示され記載されたが、本発明の教示から逸脱することなく変更及び修正がなされてよいことは当業者には明らかである。前述の説明及び添付の図面に示される事項は、説明のために提供されるものであり、制限として提供されるものではない。本発明の実際の範囲は、先行技術に基づいて正しい見方で考察される場合、以下の特許請求の範囲において定義されるものとする。
【図１】
2016513794.tif 000009
【図２】
2016513794.tif 000010
【図３】
2016513794.tif 000011
【図４】
2016513794.tif 000012
【図５】
2016513794.tif 000013
【図６】
2016513794.tif 000014
【図７】
2016513794.tif 000015
【図８】
2016513794.tif 000016
【図９】
2016513794.tif 000017
【図１０】
2016513794.tif 000018
【図１１】
2016513794.tif 000019
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2016513794.tif 000023
【図１６】
2016513794.tif 000024
【図１７】
2016513794.tif 000025
【図１８】
2016513794.tif 000026
【図１９】
2016513794.tif 000027
【国際調査報告】
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2016513794.tif 000029
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