(57)【要約】ヒトＴＦＰＩ−２クニッツ型プロテイナーゼの第１の阻害剤ドメイン（ＫＤ１）の構造バリアントである、新規のプラスミン阻害ポリペプチドに関する組成物および方法が開示される。本ポリペプチドは、強力なプラスミン阻害剤であり、ある特定の実施形態では、抗線維素溶解活性および／または野生型ＴＦＰＩ−２  ＫＤ１と比べて減少した抗凝固活性を有し、高度な免疫原性を示さない。本プラスミン阻害ポリペプチドは、抗がん剤、抗線維素溶解剤、プロテアーゼ阻害剤としての使用に加えて、他の状況での使用も見出すと予想される。
2016514459.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
Ｎ−Ｙ−Ｊ−Ｚ−Ｃ（Ｉ）
のポリペプチドを含むプラスミン阻害ポリペプチドであって、式中、
（ａ）Ｎは、前記プラスミン阻害ポリペプチドのアミノ末端であり、天然および非天然アミノ酸から独立して選択される０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５〜３０、３１〜４０、４１〜５０または５１〜６０アミノ酸からなり、
（ｂ）Ｙは、存在しないか、またはメチオニンもしくはＮ−ホルミルメチオニンであり、
（ｃ）Ｊは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する５７アミノ酸のクニッツ型プロテイナーゼの第１の阻害剤ドメイン（ＫＤ１）ポリペプチドであり、
（ｄ）Ｚは、
（ｉ）一般式（ＩＩ）：
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ４−Ｋ（ＩＩ）［配列番号２］
のＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであって、式中、Ｘ３およびＸ４は、天然および非天然アミノ酸から独立して選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない、ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、
（ｉｉ）一般式（ＩＩＩ）：
Ｉ−Ｘ３−Ｋ（ＩＩＩ）
のＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであって、式中、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない、ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、
（ｉｉｉ）一般式（ＩＶ）：
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ５（ＩＶ）［配列番号２０］
のＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであって、式中、Ｘ３およびＸ５は、独立しており、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもなく、Ｘ５は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない、ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、
（ｉｖ）一般式（Ｖ）：
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ（Ｖ）［配列番号２１］
のＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであって、式中、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない、ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、
（ｖ）一般式（ＶＩ）：
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｘ６（ＶＩ）［配列番号３０］
のＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであって、式中、Ｘ３およびＸ６は、天然および非天然アミノ酸から独立して選択されるアミノ酸であり、Ｘ３は、ＣでもＦでもＲでもＷでもなく、Ｘ６は、いずれかの天然または非天然アミノ酸である、ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、ならびに
（ｖｉ）一般式（ＶＩＩ）：
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｘ６−Ｘ７（ＶＩＩ）［配列番号３１］
のＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであって、式中、Ｘ３、Ｘ６およびＸ７は、天然および非天然アミノ酸から独立して選択されるアミノ酸であり、Ｘ３は、ＣでもＦでもＲでもＷでもなく、Ｘ６は、いずれかの天然または非天然アミノ酸であり、Ｘ７は、いずれかの天然または非天然アミノ酸である、ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド
から選択されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであり、
（ｅ）Ｃは、前記プラスミン阻害ポリペプチドのカルボキシ末端であり、天然および非天然アミノ酸から独立して選択される０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５〜３０、３１〜４０、４１〜５０または５１〜６０アミノ酸からなり、
（ｆ）前記プラスミン阻害ポリペプチドは、プラスミン活性を阻害する、
プラスミン阻害ポリペプチド。
【請求項２】
（ａ）Ｎ、ＹおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する前記ＫＤ１ポリペプチドであり、そしてＺが、一般式（ＩＩ）：
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ４−Ｋ（ＩＩ）
の前記ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであり、式中、Ｘ３およびＸ４は、天然および非天然アミノ酸から独立して選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない、前記プラスミン阻害ポリペプチド、
（ｂ）Ｎ、ＹおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する前記ＫＤ１ポリペプチドであり、そしてＺが、一般式（ＩＩＩ）：
Ｉ−Ｘ３−Ｋ（ＩＩＩ）
の前記ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであり、式中、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない、前記プラスミン阻害ポリペプチド、
（ｃ）Ｎ、ＹおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する前記ＫＤ１ポリペプチドであり、そしてＺが、一般式（ＩＶ）：
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ５（ＩＶ）［配列番号２０］
の前記ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであり、式中、Ｘ３およびＸ５は、独立しており、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもなく、Ｘ５は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない、前記プラスミン阻害ポリペプチド、
（ｄ）Ｎ、ＹおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する前記ＫＤ１ポリペプチドであり、そしてＺが、一般式（Ｖ）：
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ（Ｖ）［配列番号２１］
の前記ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであり、式中、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない、前記プラスミン阻害ポリペプチド、
（ｅ）ＮおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｙが、メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンであり、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する前記ＫＤ１ポリペプチドであり、そしてＺが、一般式（ＩＩ）：
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ４−Ｋ（ＩＩ）
の前記ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであり、式中、Ｘ３およびＸ４は、天然および非天然アミノ酸から独立して選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない、前記プラスミン阻害ポリペプチド、
（ｆ）ＮおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｙが、メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンであり、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する前記ＫＤ１ポリペプチドであり、そしてＺが、一般式（ＩＩＩ）：
Ｉ−Ｘ３−Ｋ（ＩＩＩ）
の前記ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであり、式中、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない、前記プラスミン阻害ポリペプチド、
（ｇ）ＮおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｙが、メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンであり、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する前記ＫＤ１ポリペプチドであり、そしてＺが、一般式（ＩＶ）：
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ５（ＩＶ）［配列番号２０］
の前記ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであり、式中、Ｘ３およびＸ５は、独立しており、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもなく、そしてＸ５は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない、前記プラスミン阻害ポリペプチド、ならびに
（ｈ）ＮおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｙが、メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンであり、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する前記ＫＤ１ポリペプチドであり、そしてＺが、一般式（Ｖ）：
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ（Ｖ）［配列番号２１］
の前記ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであり、式中、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない、前記プラスミン阻害ポリペプチド
から選択される、請求項１に記載のプラスミン阻害ポリペプチド。
【請求項３】
（ａ）Ｎ、ＹおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する前記ＫＤ１ポリペプチドであり、Ｚが、配列ＩＥＫＶＰＫ［Ｘ３がＥであり、Ｘ４がＰである配列番号２］を有する式（ＩＩ）の前記ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、前記プラスミン阻害ポリペプチド、
（ｂ）Ｎ、ＹおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する前記ＫＤ１ポリペプチドであり、Ｚが、配列ＩＥＫを有する式（ＩＩＩ）の前記ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、前記プラスミン阻害ポリペプチド、
（ｃ）Ｎ、ＹおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する前記ＫＤ１ポリペプチドであり、Ｚが、配列ＩＥＫＶＰ［配列番号２０］を有する式（ＩＶ）の前記ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、前記プラスミン阻害ポリペプチド、
（ｄ）Ｎ、ＹおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する前記ＫＤ１ポリペプチドであり、Ｚが、配列ＩＥＫＶ［配列番号２１］を有する式（Ｖ）の前記ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、前記プラスミン阻害ポリペプチド、
（ｅ）ＮおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｙが、メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンであり、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する前記ＫＤ１ポリペプチドであり、Ｚが、配列ＩＥＫＶＰＫ［Ｘ３がＥであり、Ｘ４がＰである配列番号２］を有する式（ＩＩ）の前記ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、前記プラスミン阻害ポリペプチド、
（ｆ）ＮおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｙが、メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンであり、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する前記ＫＤ１ポリペプチドであり、Ｚが、配列ＩＥＫを有する式（ＩＩＩ）の前記ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、前記プラスミン阻害ポリペプチド、
（ｇ）ＮおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｙが、メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンであり、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する前記ＫＤ１ポリペプチドであり、Ｚが、配列ＩＥＫＶＰ［配列番号２０］を有する式（ＩＶ）の前記ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、前記プラスミン阻害ポリペプチド、ならびに
（ｈ）ＮおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｙが、メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンであり、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する前記ＫＤ１ポリペプチドであり、Ｚが、配列ＩＥＫＶ［配列番号２１］を有する式（Ｖ）の前記ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、前記プラスミン阻害ポリペプチド
から選択される、請求項１に記載のプラスミン阻害ポリペプチド。
【請求項４】
プラスミン活性を阻害する、配列番号３〜１８、２２〜２９および３２〜３５のうちいずれか１種に記載のアミノ酸配列を含む、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４または６３アミノ酸以下のプラスミン阻害ポリペプチド。
【請求項５】
一般式（Ｉ）：
Ｎ−Ｙ−Ｊ−Ｚ−Ｃ（Ｉ）
のプラスミン阻害ポリペプチドのアミノ酸配列に対し少なくとも９６、９７、９８または９９％同一のアミノ酸配列を有する、６０または６１アミノ酸のプラスミン阻害ポリペプチドであって、式中、
（ａ）Ｎは、前記プラスミン阻害ポリペプチドのアミノ末端であり、
（ｂ）Ｙは、存在しないか、またはメチオニンもしくはＮ−ホルミルメチオニンであり、
（ｃ）Ｊは、配列番号１の１１位におけるアミノ酸Ｘ１が、Ｄ、ＮまたはＳであり、配列番号１の１７位におけるアミノ酸Ｘ２が、Ｒであり、システイン残基が、配列番号１のアミノ酸の１４位および３８位のそれぞれに存在する、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する５７アミノ酸のクニッツ型プロテイナーゼの第１の阻害剤ドメイン（ＫＤ１）ポリペプチドであり、
（ｄ）Ｚは、一般式（ＩＩＩ）：
Ｉ−Ｘ３−Ｋ（ＩＩＩ）
のＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであり、式中、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもなく、
（ｅ）Ｃは、前記プラスミン阻害ポリペプチドのカルボキシ末端であり、そして
（ｆ）前記プラスミン阻害ポリペプチドは、プラスミン活性を阻害する、
プラスミン阻害ポリペプチド。
【請求項６】
一般式（Ｉ）：
Ｎ−Ｙ−Ｊ−Ｚ−Ｃ（Ｉ）
のプラスミン阻害ポリペプチドのアミノ酸配列に対し少なくとも９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一のアミノ酸配列を有する、６３または６４アミノ酸のプラスミン阻害ポリペプチドであって、式中、
（ａ）Ｎは、前記プラスミン阻害ポリペプチドのアミノ末端であり、
（ｂ）Ｙは、存在しないか、またはメチオニンもしくはＮ−ホルミルメチオニンであり、
（ｃ）Ｊは、配列番号１の１１位におけるアミノ酸Ｘ１が、Ｄ、ＮまたはＳであり、配列番号１の１７位におけるアミノ酸Ｘ２が、Ｒであり、システイン残基が、配列番号１のアミノ酸の１４位および３８位のそれぞれに存在する、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する５７アミノ酸のクニッツ型プロテイナーゼの第１の阻害剤ドメイン（ＫＤ１）ポリペプチドであり、
（ｄ）Ｚは、一般式（ＩＩ）：
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ４−Ｋ（ＩＩ）［配列番号２］
のＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであり、式中、Ｘ３およびＸ４は、天然および非天然アミノ酸から独立して選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもなく、
（ｅ）Ｃは、前記プラスミン阻害ポリペプチドのカルボキシ末端であり、そして
（ｆ）前記プラスミン阻害ポリペプチドは、プラスミン活性を阻害する、
プラスミン阻害ポリペプチド。
【請求項７】
一般式（Ｉ）：
Ｎ−Ｙ−Ｊ−Ｚ−Ｃ（Ｉ）
のプラスミン阻害ポリペプチドのアミノ酸配列に対し少なくとも９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一のアミノ酸配列を有する、６１、６２、６３または６４アミノ酸のプラスミン阻害ポリペプチドであって、式中、
（ａ）Ｎは、前記プラスミン阻害ポリペプチドのアミノ末端であり、
（ｂ）Ｙは、存在しないか、またはメチオニンもしくはＮ−ホルミルメチオニンであり、
（ｃ）Ｊは、配列番号１の１１位におけるアミノ酸Ｘ１が、Ｄ、ＮまたはＳであり、配列番号１の１７位におけるアミノ酸Ｘ２が、Ｒであり、システイン残基が、配列番号１のアミノ酸の１４位および３８位のそれぞれに存在する、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する５７アミノ酸のクニッツ型プロテイナーゼの第１の阻害剤ドメイン（ＫＤ１）ポリペプチドであり、
（ｄ）Ｚは、以下：
（ｉ）一般式（ＩＩ）：
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ４−Ｋ（ＩＩ）［配列番号２］
のＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであって、式中、Ｘ３およびＸ４は、天然および非天然アミノ酸から独立して選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない、ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、
（ｉｉ）一般式（ＩＩＩ）：
Ｉ−Ｘ３−Ｋ（ＩＩＩ）
のＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであって、式中、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない、ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、
（ｉｉｉ）一般式（ＩＶ）：
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ５（ＩＶ）［配列番号２０］
のＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであって、式中、Ｘ３およびＸ５は、独立しており、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもなく、Ｘ５は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない、ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、
（ｉｖ）一般式（Ｖ）：
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ（Ｖ）［配列番号２１］
のＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであって、式中、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない、ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、
（ｖ）一般式（ＶＩ）：
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｘ６（ＶＩ）［配列番号３０］
のＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであって、式中、Ｘ３およびＸ６は、天然および非天然アミノ酸から独立して選択されるアミノ酸であり、Ｘ３は、ＣでもＦでもＲでもＷでもなく、Ｘ６は、いずれかの天然または非天然アミノ酸である、ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、ならびに
（ｖｉ）一般式（ＶＩＩ）：
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｘ６−Ｘ７（ＶＩＩ）［配列番号３１］
のＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであって、式中、Ｘ３、Ｘ６およびＸ７は、天然および非天然アミノ酸から独立して選択されるアミノ酸であり、Ｘ３は、ＣでもＦでもＲでもＷでもなく、Ｘ６は、いずれかの天然または非天然アミノ酸であり、Ｘ７は、いずれかの天然または非天然アミノ酸である、ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド
から選択されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであり、
（ｅ）Ｃは、前記プラスミン阻害ポリペプチドのカルボキシ末端であり、
（ｆ）前記プラスミン阻害ポリペプチドは、プラスミン活性を阻害する、
プラスミン阻害ポリペプチド。
【請求項８】
配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する野生型ヒト組織因子経路阻害剤−２（ＴＦＰＩ−２）ポリペプチドの第１のクニッツ型プロテイナーゼ阻害剤ドメイン（ＫＤ１）と比較して、減少した抗凝固活性を有する、請求項１、４、５、６および７のいずれか一項に記載のプラスミン阻害ポリペプチド。
【請求項９】
融合ポリペプチドドメインに融合された請求項１〜７のいずれか一項に記載のプラスミン阻害ポリペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項９に記載の融合タンパク質と、生理学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１１】
ＰＡＧ化ポリペプチドを形成するためにポリアルキレン（ｐｏｌｙａｋｙｌｅｎｅ）グリコールが付着している、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプラスミン阻害ポリペプチドを含む、組成物。
【請求項１２】
前記ポリアルキレン（ｐｏｌｙａｋｙｌｅｎｅ）グリコールが、ポリエチレングリコールであり、前記ＰＡＧ化ポリペプチドが、ＰＥＧ化ポリペプチドである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載のプラスミン阻害ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１に記載のプラスミン阻害ポリペプチドを産生する方法であって、
ａ）前記プラスミン阻害ポリペプチドの発現を可能にするのに十分な条件下でかつ十分な時間にわたり、請求項１５に記載の宿主細胞を培養するステップと、
ｂ）培養された前記宿主細胞から前記プラスミン阻害ポリペプチドを単離するステップと
を含む、方法。
【請求項１７】
前記宿主細胞によって発現された前記プラスミン阻害ポリペプチドが、Ｎ末端メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンを含み、かつ前記宿主細胞は、メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）が前記プラスミン阻害ポリペプチドから前記Ｎ末端メチオニンまたは前記Ｎ−ホルミルメチオニンを除去するのに十分な条件下でかつ十分な時間にわたり、前記ＭＡＰを発現する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ａ）請求項１〜７のいずれか一項に記載のプラスミン阻害ポリペプチドと、
ｂ）生理学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
プラスミン活性を阻害するための方法であって、
（ｉ）プラスミンを（ｉｉ）請求項１〜７のいずれか一項に記載のプラスミン阻害ポリペプチドと、前記プラスミン阻害ポリペプチドが前記プラスミンに結合するのに十分な条件下でかつ十分な時間にわたり接触させて、これにより、プラスミン活性を阻害するステップ
を含む、方法。
【請求項２０】
前記接触させるステップが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
プラスミン活性の阻害を必要とする被験体を処置するための方法であって、前記被験体に、有効量の請求項１〜７のいずれか一項に記載のプラスミン阻害ポリペプチドまたは請求項１３に記載の単離されたポリヌクレオチドを投与するステップを含む、方法。
【請求項２２】
前記被験体が、がん、血友病、関節リウマチもしくは全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を有する、もしくはそのリスクが疑われるか、または前記被験体が、血管新生、骨リモデリングもしくは冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ）を必要とする、もしくはそれを受けた、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記被験体が、外科手術を受けているか、または外科手術を最近受けた、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記外科手術が、心血管外科手術、腫瘍学的外科手術、尿生殖器外科手術、整形外科手術、胸部外科手術、形成外科手術、外傷外科手術、腹部外科手術、移植外科手術、神経学的外科手術または耳鼻科学的外科手術である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
クニッツ型プロテイナーゼの第１の阻害剤ドメイン（ＫＤ１）を含むプラスミン阻害ポリペプチドを単離するための方法であって、前記方法は：
（ａ）（ｉ）不活性化されたプラスミンが固定化された固相を、（ｉｉ）クニッツ型プロテイナーゼの第１の阻害剤ドメイン（ＫＤ１）を含むプラスミン阻害ポリペプチドおよび不純物を含む試料と、前記不活性化プラスミンへの前記ＫＤ１の結合に十分な条件下でかつ十分な時間にわたり接触させるステップと、
（ｂ）ＫＤ１−プラスミン結合を破壊しない条件下で前記固相を洗浄して、不純物を除去するステップと、
（ｃ）前記固相から前記ＫＤ１を溶出させて、これにより、前記ＫＤ１を含む前記ポリペプチドを単離するステップと
を含む、方法。
【請求項２６】
前記試料が、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプラスミン阻害ポリペプチドを含有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
単離されたタンパク質または単離された生体試料中のタンパク質をタンパク質分解から保護するための方法であって、
前記単離されたタンパク質または前記単離された生体試料を、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプラスミン阻害ポリペプチドと接触させるステップ
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１３年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／７９３，１３１号、および２０１３年１２月３０日に出願された米国仮出願第６１／９２２，０２６号（これらの出願は、その全体が参考として本明細書に援用される）への利益を主張する。
【０００２】
政府の利益についての記載
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって付与される助成金第ＨＬ０３６３６５号および第ＨＬ０８９６６１号の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列表に関する記載
本願に関連する配列表は、書面の代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルの名称は、７２０１５６＿４０３ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。このテキストファイルは、３０ＫＢであり、２０１４年３月１４日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子提出されている。
【０００４】
背景
技術分野
本明細書に開示されている本発明の実施形態は、全般的には、タンパク質加水分解を阻害するための、特に、有害な過剰出血をもたらし得る線維素溶解を阻害し、がん転移を含む腫瘍成長および進行に寄与し得るタンパク質分解を阻害するための組成物および方法に関する。より具体的には、本実施形態は、強力なプラスミン阻害剤であり、有利に低い抗凝固活性および低い免疫原性を示す、新規のクニッツ型阻害剤ポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００５】
関連技術の説明
タンパク質分解酵素プラスミン（Ｅ．Ｃ．３．４．４．１４）は、その酵素原であるプラスミノーゲンから組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）またはウロキナーゼ（ｕＰＡ）により活性化された後にヒト血漿中に存在する、９０ｋＤａの広域セリンプロテアーゼである。プラスミンは、線維素溶解過程および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成成分の代謝回転調節における中心的役割を果たす。ｔＰＡは、主に、脈管構造における血栓溶解をもたらすプラスミン活性化に関与すると考えられるが、ｕＰＡは、主に、ＥＣＭ分解をもたらすプラスミンの活性化の原因であると思われる。膜ｕＰＡ受容体（ｕＰＡＲ）に結合している細胞表面ｕＰＡは、プラスミノーゲン活性化と、その結果としてのプラスミン依存性タンパク質加水分解を増強する。細胞表面に結合している間、プラスミンは、循環しているアルファ２−抗プラスミンによる阻害から保護され、これにより、プラスミン媒介性タンパク質加水分解を、細胞表面またはその付近の部位へと局所的に限局する。
【０００６】
プラスミンタンパク質分解活性は、炎症、腫瘍細胞成長および腫瘍転移等、病理過程に対する主要な寄与因子である。例えば、腫瘍細胞の浸潤特性は、少なくとも一部には、ＥＣＭ構成成分の直接的なプラスミン媒介性タンパク質加水分解と、間接的には、プロマトリックスメタロプロテイナーゼ（プロＭＭＰ）およびコラゲナーゼ等、ＥＣＭ分解過程に関与する他のプロテアーゼのプラスミン媒介性活性化とに依存し得る。腫瘍形成効果は、細胞表面におけるｕＰＡ／ｕＰＡＲ複合体を介したプラスミンによるＭＭＰ−３およびＭＭＰ−９の活性化により加速され得る。よって、直接的および間接的なプラスミン誘導性タンパク質加水分解性事象は、血管透過性を増加させて、腫瘍細胞による血管侵入およびその全身性播種を容易にする。
【０００７】
プラスミンおよびＭＭＰは、ＥＣＭから、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）等の特異的マトリックス由来増殖因子の放出を促進することにより、さらに潜在型のトランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）およびインスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）を活性化することにより、血管新生に関与することもできる。さらに、新たに形成された血管の最先端における内皮細胞は、共通増殖因子およびサイトカインの調節下で、プラスミンおよびＭＭＰ経路の両方の構成成分を発現する。
【０００８】
プラスミンの阻害は、周術期出血の低下ならびに外科手術、特に、臓器移植、整形および心臓外科手術の際の輸血の必要の最小化において広く求められていた。過剰出血は輸血を必要とする場合があるが、輸血は、感染の伝播、アレルギー性反応および輸血ミスマッチ（例えば、血液型抗原、主要もしくは非主要組織適合抗原または他のマーカーの１種または複数における輸血ドナーとレシピエント間の偶発性または未検出のミスマッチ）等、１種または複数の有害な後遺症のリスク増加を伴う。
【０００９】
以前、プラスミン阻害剤であるアプロチニン（Ｔｒａｓｙｌｏｌ（登録商標））が周術期出血を低下させるために広く使用されてきたが、大規模な多施設試験（無作為化治験における抗線維素溶解薬を使用した血液保存、ＢＡＲＴ）により、この薬物に伴う死亡率が高リスク心臓外科手術における代替処置よりも高いことが見出された後、２００７年に使用中止になった（Ｆｕｒｇｕｓｓｏｎら、２００８年、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３５８巻：２３１９頁）。アプロチニンは、本来ウシ肺組織から単離された、事実上あらゆるセリンプロテアーゼを阻害するクニッツ型阻害剤（ＬａｓｋｏｗｓｋｉおよびＫａｔｏ、１９８０年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４９巻：５９３頁）である。アプロチニンは、その中止より前には公知の最も有効な抗線維素溶解剤であったが、アプロチニンが心筋梗塞、静脈グラフト凝固亢進、腎不全および死亡の発生率増加と関連付けられた後に、その使用は中断された。その上、所定のヒト患者における、ウシタンパク質であるアプロチニンの２回目およびそれに続く使用は、異種タンパク質の免疫原性によるアナフィラキシーショックの見込みが増加することと関連付けられた。
【００１０】
臨床的に利用できる他の線維素溶解阻害剤は、一般的にリシン類似体と称され、イプシロン−アミノカプロン酸（ε−ＡＣＡまたはＥＡＣＡ、Ａｍｉｃｏｒ）およびトラネキサム酸（ＴＸＡ）を含む。これらの阻害剤は、プラスミノーゲンの第１および第４のクリングルドメインに存在するリシン結合部位に結合し、これにより、フィブリンへのプラスミノーゲン結合を防止し、ｔＰＡまたはｕＰＡによる効率的プラスミノーゲン活性化を妨げる。臨床研究により、リシン類似体が、周術期出血を低下させる能力において高度に可変性であり、その使用に伴う潜在的リスクに関して十分に特徴付けされていないことが見出された。出血を低下させるために、アプロチニンに使用されたものよりも高用量のリシン類似体が要求され、最近の報告は、リシン類似体が発作を引き起こし得ることを示唆した。よって、候補治療用プラスミノーゲン阻害剤として、リシン類似体は信頼することができないと考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｆｕｒｇｕｓｓｏｎら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．（２００８年）３５８巻：２３１９頁
【非特許文献２】ＬａｓｋｏｗｓｋｉおよびＫａｔｏ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８０年）４９巻：５９３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
腫瘍形成および転移に寄与するタンパク質分解機序の分子レベルでの認識におけるこのような進歩にもかかわらず、依然として、がん進行を遮断および／または転移を防止するための安全かつ有効な治療法の必要がある。同様に、当業界における、フィブリノーゲン活性化およびプラスミン媒介性タンパク質加水分解の過程の一般理解にもかかわらず、有害な周術期出血を減少させるための、および／またはさもなければプラスミン活性を阻害するための、安全、有効かつ信頼できる抗線維素溶解剤の必要は未だに満たされていない。ここに開示されている実施形態のいくつかは、これらの必要に取り組み、他の関係する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本明細書に開示されている本発明のある特定の実施形態において、一般式（Ｉ）、Ｎ−Ｙ−Ｊ−Ｚ−Ｃ（Ｉ）で表されるポリペプチドを含むプラスミン阻害ポリペプチドであって、式中、（ａ）Ｎは、プラスミン阻害ポリペプチドのアミノ末端であり、天然および非天然アミノ酸から独立して選択される０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５〜３０、３１〜４０、４１〜５０または５１〜６０アミノ酸からなり、（ｂ）Ｙは、存在しないか、またはメチオニンもしくはＮ−ホルミルメチオニンであり、（ｃ）Ｊは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する５７アミノ酸のクニッツ型プロテイナーゼの第１の阻害剤ドメイン（ＫＤ１）ポリペプチドであり、（ｄ）Ｚは、（ｉ）一般式（ＩＩ）、Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ４−Ｋ（ＩＩ）［配列番号２］（式中、Ｘ３およびＸ４は、天然および非天然アミノ酸から独立して選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、（ｉｉ）一般式（ＩＩＩ）、Ｉ−Ｘ３−Ｋ（ＩＩＩ）（式中、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、（ｉｉｉ）一般式（ＩＶ）、Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ５（ＩＶ）［配列番号２０］（式中、Ｘ３およびＸ５は、独立しており、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもなく、Ｘ５は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、（ｉｖ）一般式（Ｖ）、Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ（Ｖ）［配列番号２１］（式中、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、（ｖ）一般式（ＶＩ）、Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｘ６（ＶＩ）［配列番号３０］（式中、Ｘ３およびＸ６は、天然および非天然アミノ酸から独立して選択されるアミノ酸であり、Ｘ３は、ＣでもＦでもＲでもＷでもなく、Ｘ６は、いずれかの天然または非天然アミノ酸である）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、および（ｖｉ）一般式（ＶＩＩ）、Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｘ６−Ｘ７（ＶＩＩ）［配列番号３１］（式中、Ｘ３、Ｘ６およびＸ７は、天然および非天然アミノ酸から独立して選択されるアミノ酸であり、Ｘ３は、ＣでもＦでもＲでもＷでもなく、Ｘ６は、いずれかの天然または非天然アミノ酸であり、Ｘ７は、いずれかの天然または非天然アミノ酸である）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドから選択されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであり、（ｅ）Ｃは、プラスミン阻害ポリペプチドのカルボキシ末端であり、天然および非天然アミノ酸から独立して選択される０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５〜３０、３１〜４０、４１〜５０または５１〜６０アミノ酸からなり、（ｆ）プラスミン阻害ポリペプチドは、プラスミン活性を阻害する、プラスミン阻害ポリペプチドが提供される。
【００１４】
ある特定のさらなる実施形態では、プラスミン阻害ポリペプチドは、（ａ）Ｎ、ＹおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、そしてＺが、一般式（ＩＩ）、Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ４−Ｋ（ＩＩ）（配列番号２）（式中、Ｘ３およびＸ４は、天然および非天然アミノ酸から独立して選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、（ｂ）Ｎ、ＹおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、そしてＺが、一般式（ＩＩＩ）、Ｉ−Ｘ３−Ｋ（ＩＩＩ）（式中、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、（ｃ）Ｎ、ＹおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、そしてＺが、一般式（ＩＶ）、Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ５（ＩＶ）［配列番号２０］（式中、Ｘ３およびＸ５は、独立しており、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもなく、Ｘ５は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、（ｄ）Ｎ、ＹおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、そしてＺが、一般式（Ｖ）、Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ（Ｖ）［配列番号２１］（式中、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、（ｅ）ＮおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｙが、メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンであり、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、そしてＺが、一般式（ＩＩ）、Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ４−Ｋ（ＩＩ）（配列番号２）（式中、Ｘ３およびＸ４は、天然および非天然アミノ酸から独立して選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、（ｆ）ＮおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｙが、メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンであり、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、そしてＺが、一般式（ＩＩＩ）、Ｉ−Ｘ３−Ｋ（ＩＩＩ）（式中、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、（ｇ）ＮおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｙが、メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンであり、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、そしてＺが、一般式（ＩＶ）、Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ５（ＩＶ）［配列番号２０］（式中、Ｘ３およびＸ５は、独立しており、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもなく、Ｘ５は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、ならびに（ｈ）ＮおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｙが、メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンであり、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、そしてＺが、一般式（Ｖ）、Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ（Ｖ）［配列番号２１］（式中、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチドから選択される。
【００１５】
ある特定の他の実施形態では、プラスミン阻害ポリペプチドは、（ａ）Ｎ、ＹおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、Ｚが、配列ＩＥＫＶＰＫ［Ｘ３がＥであり、Ｘ４がＰである配列番号２、配列番号３９］を有する式（ＩＩ）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、（ｂ）Ｎ、ＹおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、Ｚが、配列ＩＥＫを有する式（ＩＩＩ）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、（ｃ）Ｎ、ＹおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、Ｚが、配列ＩＥＫＶＰ［配列番号４０；Ｘ３がＥであり、Ｘ５がＰである配列番号２０］を有する式（ＩＶ）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、（ｄ）Ｎ、ＹおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、Ｚが、配列ＩＥＫＶ［配列番号４１；Ｘ３がＥである配列番号２１］を有する式（Ｖ）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、（ｅ）ＮおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｙが、メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンであり、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、Ｚが、配列ＩＥＫＶＰＫ［Ｘ３がＥであり、Ｘ４がＰである配列番号２、配列番号３９］を有する式（ＩＩ）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、（ｆ）ＮおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｙが、メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンであり、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、Ｚが、配列ＩＥＫを有する式（ＩＩＩ）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、（ｇ）ＮおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｙが、メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンであり、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、Ｚが、配列ＩＥＫＶＰ［配列番号４０；Ｘ３がＥであり、Ｘ５がＰである配列番号２０］を有する式（ＩＶ）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、ならびに（ｈ）ＮおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｙが、メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンであり、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する前記ＫＤ１ポリペプチドであり、Ｚが、配列ＩＥＫＶ［配列番号４１；Ｘ３がＥである配列番号２１］を有する式（Ｖ）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチドから選択される。
【００１６】
ある特定の実施形態では、プラスミン活性を阻害する、配列番号３〜１８、２２〜２９および３２〜３５のうちいずれか１種に記載のアミノ酸配列を含む、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４または６３アミノ酸以下のプラスミン阻害ポリペプチドが提供される。
【００１７】
ある特定の実施形態では、一般式（Ｉ）、Ｎ−Ｙ−Ｊ−Ｚ−Ｃ（Ｉ）で表されるプラスミン阻害ポリペプチドのアミノ酸配列に対し少なくとも９６、９７、９８または９９％同一のアミノ酸配列を有する、６０または６１アミノ酸のプラスミン阻害ポリペプチドであって、式中、（ａ）Ｎは、プラスミン阻害ポリペプチドのアミノ末端であり、（ｂ）Ｙは、存在しないか、またはメチオニンもしくはＮ−ホルミルメチオニンであり、（ｃ）Ｊは、配列番号１の１１位におけるアミノ酸Ｘ１が、Ｄ、ＮまたはＳであり、配列番号１の１７位におけるアミノ酸Ｘ２が、Ｒであり、システイン残基が、配列番号１のアミノ酸の１４位および３８位のそれぞれに存在する、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する５７アミノ酸のクニッツ型プロテイナーゼの第１の阻害剤ドメイン（ＫＤ１）ポリペプチドであり、（ｄ）Ｚは、一般式（ＩＩＩ）、Ｉ−Ｘ３−Ｋ（ＩＩＩ）（式中、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであり、（ｅ）Ｃは、プラスミン阻害ポリペプチドのカルボキシ末端であり、（ｆ）プラスミン阻害ポリペプチドは、プラスミン活性を阻害する、プラスミン阻害ポリペプチドが提供される。
【００１８】
ある特定の実施形態では、一般式（Ｉ）、Ｎ−Ｙ−Ｊ−Ｚ−Ｃ（Ｉ）で表されるプラスミン阻害ポリペプチドのアミノ酸配列に対し少なくとも９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一のアミノ酸配列を有する、６３または６４アミノ酸のプラスミン阻害ポリペプチドであって、式中、（ａ）Ｎは、プラスミン阻害ポリペプチドのアミノ末端であり、（ｂ）Ｙは、存在しないか、またはメチオニンもしくはＮ−ホルミルメチオニンであり、（ｃ）Ｊは、配列番号１の１１位におけるアミノ酸Ｘ１が、Ｄ、ＮまたはＳであり、配列番号１の１７位におけるアミノ酸Ｘ２が、Ｒであり、システイン残基が、配列番号１のアミノ酸の１４位および３８位のそれぞれに存在する、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する５７アミノ酸のクニッツ型プロテイナーゼの第１の阻害剤ドメイン（ＫＤ１）ポリペプチドであり、（ｄ）Ｚは、一般式（ＩＩ）、Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ４−Ｋ（ＩＩ）［配列番号２］（式中、Ｘ３およびＸ４は、天然および非天然アミノ酸から独立して選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであり、（ｅ）Ｃは、プラスミン阻害ポリペプチドのカルボキシ末端であり、（ｆ）プラスミン阻害ポリペプチドは、プラスミン活性を阻害する、プラスミン阻害ポリペプチドが提供される。
【００１９】
ある特定の実施形態では、一般式（Ｉ）、Ｎ−Ｙ−Ｊ−Ｚ−Ｃ（Ｉ）で表されるプラスミン阻害ポリペプチドのアミノ酸配列に対し少なくとも９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一のアミノ酸配列を有する、６１、６２、６３または６４アミノ酸のプラスミン阻害ポリペプチドであって、式中、（ａ）Ｎは、プラスミン阻害ポリペプチドのアミノ末端であり、（ｂ）Ｙは、存在しないか、またはメチオニンもしくはＮ−ホルミルメチオニンであり、（ｃ）Ｊは、配列番号１の１１位におけるアミノ酸Ｘ１が、Ｄ、ＮまたはＳであり、配列番号１の１７位におけるアミノ酸Ｘ２が、Ｒであり、システイン残基が、配列番号１のアミノ酸の１４位および３８位のそれぞれに存在する、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する５７アミノ酸のクニッツ型プロテイナーゼの第１の阻害剤ドメイン（ＫＤ１）ポリペプチドであり、（ｄ）Ｚは、（ｉ）一般式（ＩＩ）、Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ４−Ｋ（ＩＩ）［配列番号２］（式中、Ｘ３およびＸ４は、天然および非天然アミノ酸から独立して選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、（ｉｉ）一般式（ＩＩＩ）、Ｉ−Ｘ３−Ｋ（ＩＩＩ）（式中、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、（ｉｉｉ）一般式（ＩＶ）、Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ５（ＩＶ）［配列番号２０］（式中、Ｘ３およびＸ５は、独立しており、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもなく、Ｘ５は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、（ｉｖ）一般式（Ｖ）、Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ（Ｖ）［配列番号２１］（式中、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、（ｖ）一般式（ＶＩ）、Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｘ６（ＶＩ）［配列番号３０］（式中、Ｘ３およびＸ６は、天然および非天然アミノ酸から独立して選択されるアミノ酸であり、Ｘ３は、ＣでもＦでもＲでもＷでもなく、Ｘ６は、いずれかの天然または非天然アミノ酸である）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、および（ｖｉ）一般式（ＶＩＩ）、Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｘ６−Ｘ７（ＶＩＩ）［配列番号３１］（式中、Ｘ３、Ｘ６およびＸ７は、天然および非天然アミノ酸から独立して選択されるアミノ酸であり、Ｘ３は、ＣでもＦでもＲでもＷでもなく、Ｘ６は、いずれかの天然または非天然アミノ酸であり、Ｘ７は、いずれかの天然または非天然アミノ酸である）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドから選択されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであり、（ｅ）Ｃは、プラスミン阻害ポリペプチドのカルボキシ末端であり、（ｆ）プラスミン阻害ポリペプチドは、プラスミン活性を阻害する、プラスミン阻害ポリペプチドが提供される。
【００２０】
ある特定のさらなる実施形態では、上述のプラスミン阻害ポリペプチドは、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する野生型ヒト組織因子経路阻害剤−２（ＴＦＰＩ−２）ポリペプチドの第１のクニッツ型プロテイナーゼ阻害剤ドメイン（ＫＤ１）と比較して、減少した抗凝固活性を有する。ある特定の実施形態では、融合ポリペプチドドメインに融合された上述のプラスミン阻害ポリペプチドのうちいずれか１種を含む融合タンパク質が提供される。ある特定の実施形態では、斯かる融合タンパク質と、生理学的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。ある特定の実施形態では、ＰＡＧ化（ＰＡＧｙｌａｔｅｄ）ポリペプチドを形成するためにポリアルキレン（ｐｏｌｙａｋｙｌｅｎｅ）グリコールが付着している、上述のプラスミン阻害ポリペプチドのうちいずれかが提供される。ある特定のさらなる実施形態では、ポリアルキレン（ｐｏｌｙａｋｙｌｅｎｅ）グリコールが、ポリエチレングリコールであり、ＰＡＧ化ポリペプチドは、ＰＥＧ化ポリペプチドである。
【００２１】
続いて、別の実施形態では、上述のプラスミン阻害ポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。別の実施形態では、斯かるポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。別の実施形態では、斯かる発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞が提供される。別の実施形態にでは、上述のプラスミン阻害ポリペプチドを産生する方法であって、ａ）プラスミン阻害ポリペプチドの発現を可能にするのに十分な条件下でかつ十分な時間にわたり、上述の宿主細胞を培養するステップと、ｂ）培養された宿主細胞からプラスミン阻害ポリペプチドを単離するステップとを含む前記方法が提供される。ある特定の実施形態では、宿主細胞によって発現されたプラスミン阻害ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンを含み、宿主細胞は、メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）がプラスミン阻害ポリペプチドからＮ末端メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンを除去するのに十分な条件下でかつ十分な時間にわたり、ＭＡＰを発現する。
【００２２】
別の実施形態では、ａ）上述のプラスミン阻害ポリペプチドのうちいずれかと、ｂ）生理学的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。別の実施形態では、プラスミン活性を阻害するための方法であって、（ｉ）プラスミンを（ｉｉ）上述のプラスミン阻害ポリペプチドと、プラスミン阻害ポリペプチドがプラスミンに結合するのに十分な条件下でかつ十分な時間にわたり接触させて、これにより、プラスミン活性を阻害するステップを含む方法が提供される。ある特定の実施形態では、接触ステップは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。
【００２３】
別の実施形態では、プラスミン活性の阻害を必要とする被験体を処置するための方法であって、被験体に、有効量の上述のプラスミン阻害ポリペプチドまたは上述の単離されたポリヌクレオチドを投与するステップを含む方法が提供される。ある特定の実施形態では、被験体は、がん、血友病、関節リウマチもしくは全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を有する、もしくはそのリスクが疑われるか、または被験体は、血管新生、骨リモデリングもしくは冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ）を必要とする、もしくはそれを受けた。ある特定の他の実施形態では、被験体は、外科手術を受けているか、または外科手術を最近受けており、外科手術は、ある特定のさらなる実施形態では、心血管外科手術、腫瘍学的外科手術、尿生殖器外科手術、整形外科手術、胸部外科手術、形成外科手術、外傷外科手術、腹部外科手術、移植外科手術、神経学的外科手術または耳鼻科学的外科手術である。
【００２４】
別の実施形態において、クニッツ型プロテイナーゼの第１の阻害剤ドメイン（ＫＤ１）を含むプラスミン阻害ポリペプチドを単離するための方法であって、（ａ）（ｉ）不活性化されたプラスミンが固定化された固相を、（ｉｉ）クニッツ型プロテイナーゼの第１の阻害剤ドメイン（ＫＤ１）を含むプラスミン阻害ポリペプチドおよび不純物を含む試料と、不活性化プラスミンへのＫＤ１の結合に十分な条件下でかつ十分な時間にわたり接触させるステップと、（ｂ）ＫＤ１−プラスミン結合を破壊しない条件下で固相を洗浄して、不純物を除去するステップと、（ｃ）固相からＫＤ１を溶出させて、これにより、ＫＤ１を含むポリペプチドを単離するステップとを含む方法が提供される。ある特定の実施形態では、試料は、上述のプラスミン阻害ポリペプチドのうち１種または複数を含有する。
【００２５】
別の実施形態では、単離されたタンパク質または単離された生体試料中のタンパク質をタンパク質分解から保護するための方法であって、単離されたタンパク質または単離された生体試料を、上述のプラスミン阻害ポリペプチドのうち少なくとも１種と接触させるステップを含む方法が提供される。
【００２６】
本発明の上述および他の態様は、次の詳細な説明および添付の図面を参照することにより明らかになるものと予想される。本明細書で述べられた、および／または出願データシートに収載されたあらゆる米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は、これらのそれぞれが個々に組み込まれているかのように、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる。様々な特許、出願および刊行物の概念を採用して本発明のさらに別の実施形態を提供するために、本発明の態様は必要に応じて修正することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むプラスミン阻害ポリペプチドによるプラスミン活性の阻害を示す。計算された阻害定数（Ｋｉ）は、２．３６ｎＭであった。
【図２】図２は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むプラスミン阻害ポリペプチドによるプラスミン活性の阻害を示す。計算された阻害定数（Ｋｉ）は、０．４９ｎＭであった。
【図３】図３は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むプラスミン阻害ポリペプチドの、第ＶＩＩａ因子−組織因子アミド分解（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ）活性に関するアッセイにおける効果を示す。計算された阻害定数（Ｋｉ）は、５８６９．５ｎＭであった。
【図４】図４は、第ＸＩａ因子アミド分解活性（黒丸）およびカリクレインアミド分解活性（白丸）の阻害に関するアッセイにおける、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むプラスミン阻害ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｉｄｅ）の効果を示す。
【図５】図５は、血漿凝固線維素溶解アッセイの凝固時間における、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むプラスミン阻害ポリペプチド（ＳＭ）および配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むプラスミン阻害ポリペプチド（ＤＭ）およびアプロチニン（ＢＰＴＩ）の効果を示す。
【図６】図６は、表面プラズモン共鳴アッセイにおける、固定化された活性部位遮断プラスミンへの変動濃度のプラスミン阻害ポリペプチドによる結合を示す。上のパネル（６０Ａ）、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むプラスミン阻害ポリペプチド；中央のパネル（６０Ｂ）、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むプラスミン阻害ポリペプチド；下のパネル（６３残基）、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むプラスミン阻害ポリペプチド。アプロチニンは、表面プラズモン共鳴アッセイにおいて活性部位遮断プラスミンに結合しなかった。
【図７】図７は、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴおよびＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１、還元ＥＺ−Ｒｕｎ（商標）タンパク質マーカーの混合物（Ｆｉｓｈｅｒ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ）；レーン２、５μｇの未還元ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ；レーン３、５μｇの未還元ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ；レーン４、５μｇの還元ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ；およびレーン５、５μｇの還元ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ。使用したアクリルアミドの濃度は、１５％であった。
【図８】図８は、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴと、出発分子（ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ）およびＢＰＴＩのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＥＳＩ質量分析データおよびアミノ酸配列アライメントである。（Ａ）Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｏｙａｇｅｒ（商標）ＤＥ−ＳＴＲを使用して得られたＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴの質量分析データ。質量が理論値の０．１％以内となるように、スペクトルを較正した。（Ｂ）ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴおよび２種のＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ種（一方（配列番号４７）はＮ末端配列Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ（約８０％、配列番号４９）を有し、２番目（配列番号４８）はＮ末端配列Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ（約２０％、配列番号５０）を有する）のアミノ酸配列。少ない方の配列は、多い方の配列に対し内側であり、サイクル３（アスパラギン）から開始し、２種間のＭＷの計算された差は１７１Ｄａであり、図８（Ａ）に示す質量分析データと一致した。非限定的な理論に従い、ＩＩａまたは混入するプロテアーゼが、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴのＮ末端側におけるアミノ酸Ｔｈｒ−ＧｌｙおよびＡｓｎ−Ａｓｎの間ならびにＣ末端側におけるＬｙｓ−Ｖａｌの間のペプチド結合を切断した（↓で示す）ことが推測される。使用したナンバリング方式は、ＢＰＴＩ（プロトタイプクニッツ阻害剤）のものである。ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴにおけるＮ末端Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ配列は、クローニングの際に導入されたＩＩａ切断部位に由来した。プラスミンによって認識されるＰ１およびＰ２’サブサイトをマークする。
【図９】図９は、３種の観察される切断部位における、ＩＩａのＳ１ポケット残基Ａｓｐ１８９およびＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴのＰ１残基（ＩＩａによって認識される）の間の分子相互作用の略図である。ＩＩａ（薄い陰を付けたリボン図）およびＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ（矢印で標識した濃色の細い鎖）のモデル化された複合体を漫画的表現で示す。ＩＩａのＡｓｐ１８９は、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴのＰ１残基Ｌｙｓ６３（Ａ）と直接的な水素結合を形成することができる一方、Ｔｈｒ（Ｂ）およびＡｓｎ（Ｃ）との間の類似の水素結合のそれぞれは、水分子に媒介された。ＩＩａの活性部位の三つ組残基（Ｈｉｓ５７、Ａｓｐ１０２、Ｓｅｒ１９５）およびＡｓｐ１８９ならびにＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴのＰ１残基（Ｌｙｓ、ＴｈｒおよびＡｓｎ）の側鎖は、棒状表現で示す。水分子（「Ｗ」）は、球として示す（図９Ｂ、図９Ｃ）。切断部位のそれぞれは、図８Ｂにおいて、表示のアミノ酸配列における矢印で示されている。
【図１０】図１０は、ＳＰＲによって測定される、ｔＰＡおよびＧｌｕ−ＰｌｇとＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴとの相互作用を示す。（Ａ）ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴへのｔＰＡ結合。アミンカップリング方法によりｔＰＡをＣＭ５チップにカップリングし、結合したタンパク質に対し１１９３応答単位（ＲＵ）の固定化レベルが達成された。５種の濃度（０．１〜２μＭ）のＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴを使用した；６分間の会合および１０分間の解離時間（流速１０μｌ／分）を用いた。１μＭのＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴにより得られたＲＵ値は、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴによる１５５の代わりに、１６であった。（Ｂ）ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴへのＧｌｕ−Ｐｌｇ結合。Ｇｌｕ−ＰｌｇをＣＭ５チップにカップリングし、結合したタンパク質に対し７４２ＲＵの固定化レベルが達成された。使用したＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴの濃度ならびに分析物会合および解離プロトコールは、（Ａ）と同じものであった。１μＭのＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴにより得られたＲＵ値は、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴによる８６の代わりに、１２であった。（Ｃ）プラスミノーゲンクリングルドメイン１とＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴのモデル化された複合体。プラスミノーゲンクリングルドメイン１の静電表面（空間充填モデル）およびＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴの漫画的表現（リボンモデル）を描写する。クリングルドメインおよびＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴの間に水素結合および塩橋（破線で示す）を形成した残基は、棒状表現で示す。ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ残基は、接尾語「Ｉ」で標識する。静電表面において、濃色の区域は、荷電領域を表し、白色は、中性区域を表す。
【図１１】図１１は、プラスミン、ＦＸＩａおよびｐＫＬＫによるＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴの平衡阻害定数（Ｋｉ）の決定を示す。酵素活性は、増加する阻害剤濃度におけるパーセント分率活性（阻害率／非阻害率）として表した。実施例５の「実験手順」に概要を述べる方程式１および２を使用して、阻害定数（Ｋｉ）を決定した。プラスミンの濃度は３ｎＭであり；ＦＸＩａおよびｐＫＬＫの濃度はそれぞれ１ｎＭであった。
【図１２】図１２は、ヒトＮＰＰにおける線維素溶解におけるＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴおよびεＡＣＡの効果を示す図である。ＩＩａをＮＰＰに添加して、４０５ｎｍにおける光学密度の増加を伴う血栓形成を開始した（Ａ、ＢおよびＣにおける曲線１）。ｔＰＡの同時添加は、プラスミノーゲンをプラスミンに変換し、これは、ＯＤ４０５の初期増加と続く減少によって示される通り（Ａ、ＢおよびＣにおける曲線２）、約１０分間以内にフィブリン血栓を完全に溶解した。（Ａ）ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴおよびＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴによる線維素溶解の阻害。ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ：２μＭ（「２μＭ」白三角）、３μＭ（「３μＭ」白三角）および５μＭ（「５μＭ」白三角）。ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ：２μＭ（「２μＭ」黒三角）、３μＭ（「３μＭ」黒三角）および５μＭ（「５μＭ」黒三角）。各事例では、ＩＩａを使用して凝固を開始し、ｔＰＡを使用して線維素溶解を開始した。（Ｂ）ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴによる線維素溶解の阻害におけるεＡＣＡの効果。ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ：２μＭ（「２μＭ」白三角）、３μＭ（「３μＭ」白三角）および５μＭ（「５μＭ」白三角）。ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ＋等モル濃度のεＡＣＡ：２μＭ（「２μＭ」黒三角）、３μＭ（「３μＭ」黒三角）および５μＭ（「５μＭ」黒三角）。（Ａ）と同様に、各事例では、ＩＩａを使用して凝固を開始し、ｔＰＡを使用して線維素溶解を開始した。（Ｃ）εＡＣＡ単独による線維素溶解の阻害。０．１ｍＭ（「０．１ｍＭ」黒四角）、０．３ｍＭ（「０．３ｍＭ」白三角）、０．５ｍＭ（「０．５ｍＭ」黒三角）、１．０ｍＭ（「１．０ｍＭ」黒四角）および５ｍＭ（「５ｍＭ」白丸）。（Ａ）および（Ｂ）と同様に、各事例では、ＩＩａを使用して凝固を開始し、ｔＰＡを使用して線維素溶解を開始した。
【図１３】図１３は、マウス肝臓裂傷出血モデルにおけるＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴおよびεＡＣＡの効果を示す。動物を静脈内注射により生理食塩水、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴまたはεＡＣＡで処置した。５ｍｍ横切開を肝臓左葉に入れた。３０分間の全持続時間において切開部位から滲出する血液を全て収集した。異なる群間で総失血量を比較した。それぞれ生理食塩水、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴおよびＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴは１０匹の動物ならびにεＡＣＡは１６匹の動物の平均±Ｓ．Ｅ．としてデータを提示する。異なる群間の確率ｐ値を次に示す：生理食塩水対ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ、０．００２；生理食塩水対ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ、０．００１；生理食塩水対εＡＣＡ、０．００２；ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ対ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ、＜０．０５；およびＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ対εＡＣＡ、＜０．０５。＊、ｐ値＜０．０１、生理食塩水対照と比較。
【図１４】図１４は、マウス肝臓裂傷出血モデル（６６、下記参照）において以前に特徴付けされたＫＤ１−Ｌ１７Ｒ調製物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析データおよびアミノ酸配列を示す。
【図１５】図１５は、μ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴによるＰＭＡ刺激非接着性Ｕ９３７細胞へのＧｌｕ−Ｐｌｇ結合の阻害を示す。（Ａ）Ｕ９３７細胞表面に生成されたプラスミンのタンパク質分解活性。ＨＢＳ／ＢＳＡ、ｐＨ７．５におけるＰＭＡ刺激Ｕ９３７細胞（２００μｌ、１×１０６細胞／ｍｌ）を、様々な濃度のμ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ複合体（０〜３μＭに及ぶ）またはμ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ複合体（２および４μＭ）を含有する２μＭ  Ｇｌｕ−Ｐｌｇと共に３７℃で１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、細胞表面結合したＧｌｕ−Ｐｌｇを１０ｎＭ  ｕＰＡにより２０分間３７℃で活性化させた。試料を１０倍希釈し、形成されたプラスミンをＳ−２２５１合成基質加水分解（ＯＤ４０５）により測定した。μ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴは、形成されたプラスミンを用量依存性様式で低下させたが、一方、μ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴは、効果がなかった（パネルＢを参照）。挿入図、分子ふるいゲル精製μ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴおよびμ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ複合体の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％アクリルアミド）。発現されたμ−プラスミンは、Ｒ５６１（キモトリプシンナンバリングにおけるＲ１５）およびＶ５６２（キモトリプシンナンバリングにおけるＶ１６）の間で切断された残基５４２〜７９１を有した。重鎖（ＨＣ）は、残基５６２〜７９１からなり、軽鎖は、５４２〜５６１の２０残基からなり、ゲルには見られなかった。レーン１、ＭＷマーカー；レーン２、μ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ複合体；レーン３、μ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ複合体。（Ｂ）精製μ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ複合体およびμ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ複合体によるプラスミン生成のパーセント低下。プラスミン活性は、増加する阻害剤濃度におけるパーセント分率活性（阻害率／非阻害率）として表した。（○）μ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ；および（●）μ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ。
【図１６】図１６は、プラスミンのプロテアーゼドメインおよびプラスミノーゲン／プラスミンのクリングルドメイン１とＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴのモデル化された三元複合体を示す。プラスミンプロテアーゼドメイン（濃色のリボン構造、上）およびプラスミノーゲン／プラスミンクリングルドメイン１（濃色のリボン構造、下）に結合したＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ（淡色のリボン構造、中心）の漫画的表現を示す。クリングルドメイン１の残基と水素結合および塩橋を形成するＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴのＣ末端残基は、棒状表現で示す。同様に、プラスミンプロテアーゼドメインの残基Ａｓｐ１８９およびＧｌｕ７３（キモトリプシンナンバリング）と相互作用するクニッツドメインの残基Ａｒｇ１５およびＡｒｇ１７は、棒状表現で示す。ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ残基は、接尾語「Ｉ」で標識される。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本明細書に開示されている本発明のある特定の実施形態は、ヒト組織因子経路阻害剤−２（ＴＦＰＩ−２、マトリックスセリンプロテアーゼ阻害剤または胎盤タンパク質５としても公知；Ｓｐｒｅｃｈｅｒら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１巻：３３５３頁；Ｃｈａｎｄら、２００４年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７９巻：１７５００頁；配列番号１９）のクニッツ型阻害剤の第１のポリペプチドドメインに僅かな構造修飾を含有するよう遺伝子操作されたポリペプチドが、野生型ＴＦＰＩ−２ポリペプチドと比較して減少した（例えば、統計的に有意な様式で低下した）抗凝固活性を有しながら、プラスミン阻害剤として予想外の効力を保有するという驚くべき発見に基づく。よって、上述および関連する実施形態では、以前に記載されたプラスミン阻害剤と比べて優れたプラスミン阻害能力を有し、また、ネイティブＴＦＰＩ−２に対するその高度な構造類似性を考慮して免疫原性がほとんどないまたは全くないことを有利に示す、プラスミン阻害ポリペプチドが提供される。
【００２９】
特に、ある特定の実施形態では次の一般式で表されるプラスミン阻害ポリペプチドを含む、遺伝子操作されたプラスミン阻害性クニッツ型阻害剤ドメイン１様含有ポリペプチドが、本明細書に開示される：
Ｎ−−（ＫＤ１）−−Ｃ
（式中、ＫＤ１は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する本明細書に開示されているクニッツ型プロテイナーゼの第１の阻害剤ドメインポリペプチドを含み、配列番号２、２０もしくは２１（一般式ＩＩ、ＩＶまたはＶ）のうち１種または本明細書に記載されている一般式（ＩＩＩ）で表記されるアミノ酸配列を有するＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドも含む）。上述および構造的に関連するプラスミン阻害ポリペプチドは、プラスミン活性を阻害する（即ち、適切な対照と比べて統計的に有意な様式で減少させる）ことができ、任意選択で、ある特定のさらなる実施形態では、野生型ＴＦＰＩ−２ポリペプチドと比較して減少した抗凝固活性を示すこともできる。
【００３０】
ここに開示されているプラスミン阻害ポリペプチドは、がん治療法、自己免疫性疾患および炎症（例えば、関節リウマチ、全身性炎症反応症候群）の処置、血管新生のモジュレート（例えば、統計的に有意な様式における血管新生の見込みまたは程度の阻害または低下）のため、外科手術、移植、輸血における斯かる使用を含む抗線維素溶解剤として、ならびにプラスミン阻害が有益となり得る他の状況等、強力なプラスミン阻害が求められる可能性がある多種多様な状況における使用を見出すと予想される（例えば、Ｂａｊａｊら、２０１１年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２８６巻：４３２９頁；ＵＳ２００９／００１８０６９を参照）。本明細書に記載されている通り、例えば、（ａ）プラスミンが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、その不活性酵素原（前駆体）型で主に存在するが、その活性型は、腫瘍形成または転移の部位等、組織リモデリングの局所的部位において大部分が生じる、（ｂ）プラスミンが、直接的および間接的機序の両方により、腫瘍成長および進行を伴うＥＣＭ分解における主要な役割を有する、ならびに（ｃ）活性プラスミンが、血管新生過程における役割を果たすことから、望ましく阻害されて固形腫瘍血管形成の程度を減少し、これにより腫瘍成長を妨げることができる場合、プラスミンは、がん治療法のためにここに開示されているプラスミン阻害ポリペプチドを使用することにより、有利に標的化され得る。他のプラスミン阻害剤の使用も以前に記載されており（例えば、ＵＳ２００９／００１８０６９）、例えば、外科手術、血栓溶解療法および臓器移植ならびに出血性素因の高い発生率によって特徴付けられる他の臨床状態における過剰出血を弱めるためのものである。
【００３１】
よって、本明細書に記載されている実施形態は、治療上の使用を見出すことができるが、本開示はこのように限定されることを企図されておらず、タンパク質分解からタンパク質を保護するための方法等の他の適用におけるプラスミン阻害特性の活用も考慮され、例えば研究（例えば、生物医学的および生化学的研究）および産業（例えば、バイオリアクター、発酵、組換えタンパク質発現、天然産物単離等）の環境でも望ましい可能性がある。
【００３２】
ここに開示されているプラスミン阻害ポリペプチドは、ある特定の好ましい実施形態では、次の一般式（Ｉ）、
Ｎ−Ｙ−Ｊ−Ｚ−Ｃ（Ｉ）
で表されるポリペプチドを含んでいてもよく、式中、
（ａ）Ｎは、プラスミン阻害ポリペプチドのアミノ末端であり、天然および非天然アミノ酸から独立して選択される０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５〜３０、３１〜４０、４１〜５０または５１〜６０アミノ酸からなり、
（ｂ）Ｙは、存在しないか、またはメチオニンもしくはＮ−ホルミルメチオニンであり、
（ｃ）Ｊは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する５７アミノ酸のクニッツ型プロテイナーゼの第１の阻害剤ドメイン（ＫＤ１）ポリペプチドであり、
（ｄ）Ｚは、
（ｉ）一般式（ＩＩ）、
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ４−Ｋ（ＩＩ）［配列番号２］
（式中、Ｘ３およびＸ４は、天然および非天然アミノ酸から独立して選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、
（ｉｉ）一般式（ＩＩＩ）、
Ｉ−Ｘ３−Ｋ（ＩＩＩ）
（式中、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、
（ｉｉｉ）一般式（ＩＶ）、
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ５（ＩＶ）［配列番号２０］
（式中、Ｘ３およびＸ５は、独立しており、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもなく、Ｘ５は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、
（ｉｖ）一般式（Ｖ）、
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ（Ｖ）［配列番号２１］
（式中、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、
（ｖ）一般式（ＶＩ）、
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｘ６（ＶＩ）［配列番号３０］
（式中、Ｘ３およびＸ６は、天然および非天然アミノ酸から独立して選択されるアミノ酸であり、Ｘ３は、ＣでもＦでもＲでもＷでもなく、Ｘ６は、いずれかの天然または非天然アミノ酸である）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、および
（ｖｉ）一般式（ＶＩＩ）、
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｘ６−Ｘ７（ＶＩＩ）［配列番号３１］
（式中、Ｘ３、Ｘ６およびＸ７は、天然および非天然アミノ酸から独立して選択されるアミノ酸であり、Ｘ３は、ＣでもＦでもＲでもＷでもなく、Ｘ６は、いずれかの天然または非天然アミノ酸であり、Ｘ７は、いずれかの天然または非天然アミノ酸である）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド
から選択されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであり、
（ｅ）Ｃは、プラスミン阻害ポリペプチドのカルボキシ末端であり、天然および非天然アミノ酸から独立して選択される０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５〜３０、３１〜４０、４１〜５０または５１〜６０アミノ酸からなり、
（ｆ）プラスミン阻害ポリペプチドは、プラスミン活性を阻害し、任意選択で、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する野生型ヒト組織因子経路阻害剤−２（ＴＦＰＩ−２）ポリペプチドの第１のクニッツ型プロテイナーゼ阻害剤ドメイン（ＫＤ１）と比較して、減少した抗凝固活性を有する。
【００３３】
ある特定の実施形態では、プラスミン阻害ポリペプチドは、
（ａ）Ｎ、ＹおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、そしてＺが、一般式（ＩＩ）、
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ４−Ｋ（ＩＩ）（配列番号２）
（式中、Ｘ３およびＸ４は、天然および非天然アミノ酸から独立して選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、
（ｂ）Ｎ、ＹおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、そしてＺが、一般式（ＩＩＩ）、
Ｉ−Ｘ３−Ｋ（ＩＩＩ）
（式中、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、
（ｃ）Ｎ、ＹおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、そしてＺが、一般式（ＩＶ）、
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ５（ＩＶ）［配列番号２０］
（式中、Ｘ３およびＸ５は、独立しており、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもなく、Ｘ５は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、
（ｄ）Ｎ、ＹおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、そしてＺが、一般式（Ｖ）、
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ（Ｖ）［配列番号２１］
（式中、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、
（ｅ）ＮおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｙが、メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンであり、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、そしてＺが、一般式（ＩＩ）、
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ４−Ｋ（ＩＩ）（配列番号２）
（式中、Ｘ３およびＸ４は、天然および非天然アミノ酸から独立して選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、
（ｆ）ＮおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｙが、メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンであり、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、そしてＺが、一般式（ＩＩＩ）、
Ｉ−Ｘ３−Ｋ（ＩＩＩ）
（式中、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、
（ｇ）ＮおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｙが、メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンであり、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、そしてＺが、一般式（ＩＶ）、
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ５（ＩＶ）［配列番号２０］
（式中、Ｘ３およびＸ５は、独立しており、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもなく、Ｘ５は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、ならびに
（ｈ）ＮおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｙが、メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンであり、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、そしてＺが、一般式（Ｖ）、
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ（Ｖ）［配列番号２１］
（式中、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド
から選択される。
【００３４】
ある特定の実施形態では、プラスミン阻害ポリペプチドは、
（ａ）Ｎ、ＹおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、Ｚが、配列ＩＥＫＶＰＫ［Ｘ３がＥであり、Ｘ４がＰである配列番号２；配列番号３９］を有する式（ＩＩ）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、
（ｂ）Ｎ、ＹおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、Ｚが、配列ＩＥＫを有する式（ＩＩＩ）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、
（ｃ）Ｎ、ＹおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、Ｚが、配列ＩＥＫＶＰ［配列番号４０；Ｘ３がＥであり、Ｘ５がＰである配列番号２０］を有する式（ＩＶ）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、
（ｄ）Ｎ、ＹおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、Ｚが、配列ＩＥＫＶ［配列番号４１；Ｘ３がＥである配列番号２１］を有する式（Ｖ）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、
（ｅ）ＮおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｙが、メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンであり、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、Ｚが、配列ＩＥＫＶＰＫ［Ｘ３がＥであり、Ｘ４がＰである配列番号２；配列番号３９］を有する式（ＩＩ）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、
（ｆ）ＮおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｙが、メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンであり、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、Ｚが、配列ＩＥＫを有する式（ＩＩＩ）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、
（ｇ）ＮおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｙが、メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンであり、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、Ｚが、配列ＩＥＫＶＰ［配列番号４０；Ｘ３がＥであり、Ｘ５がＰである配列番号２０］を有する式（ＩＶ）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチド、ならびに
（ｈ）ＮおよびＣがそれぞれ存在せず、Ｙが、メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンであり、Ｊが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＫＤ１ポリペプチドであり、Ｚが、配列ＩＥＫＶ［配列番号４１；Ｘ３がＥである配列番号２１］を有する式（Ｖ）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである、プラスミン阻害ポリペプチドから選択される。
【００３５】
ある特定の実施形態では、配列番号３〜１８、２２〜２９および３２〜３５のうちいずれか１種に記載のアミノ酸配列を含む、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４または６３アミノ酸以下のプラスミン阻害ポリペプチドが提供され、該プラスミン阻害ポリペプチドは、プラスミン活性を阻害し、任意選択で、該プラスミン阻害ポリペプチドは、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する野生型ヒト組織因子経路阻害剤−２（ＴＦＰＩ−２）ポリペプチドの第１のクニッツ型プロテイナーゼ阻害剤ドメイン（ＫＤ１）と比較して、減少した抗凝固活性を有する。
【００３６】
ある特定の実施形態では、一般式（Ｉ）、
Ｎ−Ｙ−Ｊ−Ｚ−Ｃ（Ｉ）
で表されるプラスミン阻害ポリペプチドのアミノ酸配列に対し少なくとも９６、９７、９８または９９％同一のアミノ酸配列を有する、６０または６１アミノ酸のプラスミン阻害ポリペプチドであって、式中、
（ａ）Ｎは、プラスミン阻害ポリペプチドのアミノ末端であり、
（ｂ）Ｙは、存在しないか、またはメチオニンもしくはＮ−ホルミルメチオニンであり、
（ｃ）Ｊは、配列番号１の１１位におけるアミノ酸Ｘ１が、Ｄ、ＮまたはＳであり、配列番号１の１７位におけるアミノ酸Ｘ２が、Ｒであり、システイン残基が、配列番号１のアミノ酸の１４位および３８位のそれぞれに存在する、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する５７アミノ酸のクニッツ型プロテイナーゼの第１の阻害剤ドメイン（ＫＤ１）ポリペプチドであり、
（ｄ）Ｚは、一般式（ＩＩＩ）、
Ｉ−Ｘ３−Ｋ（ＩＩＩ）
（式中、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであり、
（ｅ）Ｃは、プラスミン阻害ポリペプチドのカルボキシ末端であり、
（ｆ）プラスミン阻害ポリペプチドは、プラスミン活性を阻害し、任意選択で、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する野生型ヒト組織因子経路阻害剤−２（ＴＦＰＩ−２）ポリペプチドの第１のクニッツ型プロテイナーゼ阻害剤ドメイン（ＫＤ１）と比較して、減少した抗凝固活性を有する、プラスミン阻害ポリペプチドが提供される。
【００３７】
ある特定の他の実施形態では、一般式（Ｉ）、
Ｎ−Ｙ−Ｊ−Ｚ−Ｃ（Ｉ）
で表されるプラスミン阻害ポリペプチドのアミノ酸配列に対し少なくとも９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一のアミノ酸配列を有する、６３または６４アミノ酸のプラスミン阻害ポリペプチドであって、式中、
（ａ）Ｎは、プラスミン阻害ポリペプチドのアミノ末端であり、
（ｂ）Ｙは、存在しないか、またはメチオニンもしくはＮ−ホルミルメチオニンであり、
（ｃ）Ｊは、配列番号１の１１位におけるアミノ酸Ｘ１が、Ｄ、ＮまたはＳであり、配列番号１の１７位におけるアミノ酸Ｘ２が、Ｒであり、システイン残基が、配列番号１のアミノ酸の１４位および３８位のそれぞれに存在する、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する５７アミノ酸のクニッツ型プロテイナーゼの第１の阻害剤ドメイン（ＫＤ１）ポリペプチドであり、
（ｄ）Ｚは、一般式（ＩＩ）、
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ４−Ｋ（ＩＩ）［配列番号２］
（式中、Ｘ３およびＸ４は、天然および非天然アミノ酸から独立して選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであり、
（ｅ）Ｃは、プラスミン阻害ポリペプチドのカルボキシ末端であり、
（ｆ）プラスミン阻害ポリペプチドは、プラスミン活性を阻害し、任意選択で、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する野生型ヒト組織因子経路阻害剤−２（ＴＦＰＩ−２）ポリペプチドの第１のクニッツ型プロテイナーゼ阻害剤ドメイン（ＫＤ１）と比較して、減少した抗凝固活性を有する、プラスミン阻害ポリペプチドが提供される。
【００３８】
ある特定の他の実施形態では、一般式（Ｉ）、
Ｎ−Ｙ−Ｊ−Ｚ−Ｃ（Ｉ）
で表されるプラスミン阻害ポリペプチドのアミノ酸配列に対し少なくとも９４、９５、９６、９７、９８または９９％同一のアミノ酸配列を有する、６１、６２、６３または６４アミノ酸のプラスミン阻害ポリペプチドであって、式中、
（ａ）Ｎは、プラスミン阻害ポリペプチドのアミノ末端であり、
（ｂ）Ｙは、存在しないか、またはメチオニンもしくはＮ−ホルミルメチオニンであり、
（ｃ）Ｊは、配列番号１の１１位におけるアミノ酸Ｘ１が、Ｄ、ＮまたはＳであり、配列番号１の１７位におけるアミノ酸Ｘ２が、Ｒであり、システイン残基が、配列番号１のアミノ酸の１４位および３８位のそれぞれに存在する、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する５７アミノ酸のクニッツ型プロテイナーゼの第１の阻害剤ドメイン（ＫＤ１）ポリペプチドであり、
（ｄ）Ｚは、
（ｉ）一般式（ＩＩ）、
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ４−Ｋ（ＩＩ）［配列番号２］
（式中、Ｘ３およびＸ４は、天然および非天然アミノ酸から独立して選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、
（ｉｉ）一般式（ＩＩＩ）、
Ｉ−Ｘ３−Ｋ（ＩＩＩ）
（式中、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、
（ｉｉｉ）一般式（ＩＶ）、
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ５（ＩＶ）［配列番号２０］
（式中、Ｘ３およびＸ５は、独立しており、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもなく、Ｘ５は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、
（ｉｖ）一般式（Ｖ）、
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ（Ｖ）［配列番号２１］
（式中、Ｘ３は、天然および非天然アミノ酸から選択されるアミノ酸であり、かつＣでもＦでもＲでもＷでもない）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、
（ｖ）一般式（ＶＩ）、
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｘ６（ＶＩ）［配列番号３０］
（式中、Ｘ３およびＸ６は、天然および非天然アミノ酸から独立して選択されるアミノ酸であり、Ｘ３は、ＣでもＦでもＲでもＷでもなく、Ｘ６は、いずれかの天然または非天然アミノ酸である）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド、および
（ｖｉ）一般式（ＶＩＩ）、
Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｘ６−Ｘ７（ＶＩＩ）［配列番号３１］
（式中、Ｘ３、Ｘ６およびＸ７は、天然および非天然アミノ酸から独立して選択されるアミノ酸であり、Ｘ３は、ＣでもＦでもＲでもＷでもなく、Ｘ６は、いずれかの天然または非天然アミノ酸であり、Ｘ７は、いずれかの天然または非天然アミノ酸である）で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド
から選択されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドであり、
（ｅ）Ｃは、プラスミン阻害ポリペプチドのカルボキシ末端であり、
（ｆ）プラスミン阻害ポリペプチドは、プラスミン活性を阻害し、任意選択で、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する野生型ヒト組織因子経路阻害剤−２（ＴＦＰＩ−２）ポリペプチドの第１のクニッツ型プロテイナーゼ阻害剤ドメイン（ＫＤ１）と比較して、減少した抗凝固活性を有する、プラスミン阻害ポリペプチドが提供される。
【００３９】
ヒト組織因子経路阻害剤−２（ＴＦＰＩ−２；配列番号１９；完全ＴＦＰＩ−２  ＫＤ１配列に関して、Ｃｈａｎｄら、２００４年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７９巻：１７５００、１７５０５頁目における図４も参照）の野生型の第１のクニッツ型プロテイナーゼ阻害剤ドメイン（ＫＤ１）は、参照配列と称される場合もあり、そのナンバリングされたアミノ酸位置は、本明細書に記載されている配列相同性ツールを使用して類似配列が整列された場合に、ここに記載されているプラスミン阻害ポリペプチドに対応する位置を有するものと記載される。本明細書に記載されている通り、三次元タンパク質モデリング試験は、本プラスミン阻害ポリペプチドに到達するための１７位におけるアルギニンによるロイシンの置換（Ｌ１７Ｒ）に加えて、ＫＤ１の１１位におけるスレオニンによるチロシンの置換（例えば、配列番号３、４、１１、１５、２４、２５、３２、３３におけるＹ１１Ｔ）が、プラスミン阻害ポリペプチドおよびプラスミンの間に水素結合形成を可能にしたことを明らかにした。この水素結合は、Ｌ１７Ｒ置換（例えば、配列番号５、６、１２、２３における）のみが為された場合に可能となる相互作用と比べて、プラスミンおよびプラスミン阻害ポリペプチドの間の相互作用を強化する。モデリング試験において、プラスミン阻害ポリペプチド（例えば、配列番号３）の６０位におけるリシン残基の側鎖が、ヒトプラスミンクリングルドメインのリシン結合部位（ＬＳＢ）に適合することが観察されたことも明らかになった。
【００４０】
したがって、ある特定の実施形態では、Ｌ１７Ｒ置換を含有し、カルボキシ末端リシンを有する６０アミノ酸（例えば、配列番号５）および６３アミノ酸（例えば、配列番号６）のプラスミン阻害ポリペプチドであって、プラスミン活性部位の阻害剤として活性を有し、また、プラスミンのクリングルドメイン（複数可）におけるリシン結合部位（複数可）に結合し、これにより、プラスミンの阻害活性の２種の様式（即ち、二重活性）をもたらすポリペプチドが提供される。さらに、６３アミノ酸型は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける活性化型トロンビンにより活性化された線維素溶解阻害剤（ＴＡＦＩ）によるＣ末端Ｋ６３の除去後であっても、Ｋ６０残基が、その結果得られる６２アミノ酸型に存続し、プラスミンにおけるリシン結合部位との相互作用に利用できるため、リシン結合部位と相互作用する能力を保持する。１１位における置換（例えば、配列番号３、例えば、Ｙ１１Ｔ）および１７位における置換（例えば、配列番号３、例えば、Ｌ１７Ｒ）の両方を含有する６０アミノ酸および６３アミノ酸のプラスミン阻害ポリペプチドは、さらにより強力なプラスミン阻害剤であり、Ｃ末端リシンを介したプラスミノーゲン／プラスミンにおけるリシン結合部位への結合のために二重に反応性である。
【００４１】
ポリペプチドおよびタンパク質
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」および「ペプチド」および「糖タンパク質」は、互換的に使用されており、いずれか特定の長さに限定されないアミノ酸のポリマーを意味する。この用語は、ミリスチル化、硫酸化、グリコシル化、リン酸化、ホルミル化およびシグナル配列の付加または欠失等、修飾を除外しない。用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、アミノ酸の１本または複数の鎖を意味し、その各鎖は、ペプチド結合により共有結合したアミノ酸を含み、前記ポリペプチドまたはタンパク質は、ネイティブタンパク質、即ち、天然起源の、特に非組換え細胞または遺伝子改変もしくは組換え細胞によって産生されたタンパク質の配列を有する、ペプチド結合により一体に非共有結合および／または共有結合した複数の鎖を含むことができ、ネイティブタンパク質のアミノ酸配列を有する分子、またはネイティブ配列に対し１個または複数のアミノ酸の欠失、付加および／または置換を有する分子を含むことができる。よって、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、１本（「単量体」と命名）または複数（「多量体」と命名）のアミノ酸鎖を含むことができる。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本開示の免疫調節性ポリペプチド、または免疫調節性ポリペプチドに対し１個または複数のアミノ酸の欠失、付加および／または置換を有する配列を特に包含する。
【００４２】
用語「単離された」は、材料が、その本来の環境（例えば、天然起源の場合は天然環境）から取り出されたことを意味する。例えば、生きた動物中に存在する天然起源のポリペプチドまたは核酸は、単離されていないが、天然の系において共存する材料の一部または全てから分離された同じポリペプチドまたは核酸は、単離されている。斯かる核酸は、ベクターの一部であってもよいし、および／または斯かる核酸またはポリペプチドは、組成物（例えば、細胞溶解産物）の一部であってもよく、斯かるベクターまたは組成物がその核酸またはポリペプチドにとっての天然環境の一部ではないという点でそれでもなお単離されているといえる。用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、この用語は、コード領域「リーダーおよびトレーラー」の前および後の領域、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
【００４３】
本明細書に参照されている用語「単離されたタンパク質」および「単離されたポリペプチド」は、対象タンパク質またはポリペプチドが、（１）天然においてこれと共に典型的に存在する少なくとも一部の他のタンパク質またはポリペプチドを含まない、（２）同じ供給源、例えば、同じ種に由来する他のタンパク質またはポリペプチドを本質的に含まない、（３）異なる種に由来する細胞によって発現される、（４）天然においてこれが会合するポリヌクレオチド、脂質、炭水化物または他の材料の少なくとも約５０パーセントから分離されている、（５）天然において「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」と会合し得るタンパク質またはポリペプチドの部分と会合（共有結合または非共有結合的相互作用により）していない、（６）天然においてこれと会合していないポリペプチドと作動可能に会合（共有結合または非共有結合的相互作用により）している、あるいは（７）天然において発生しないことを意味する。斯かる単離されたタンパク質またはポリペプチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡによりコードされ得る、あるいは人工ペプチドおよびタンパク質合成のための多数の周知化学のうちいずれかによる合成起源のものまたはこれらのいずれかの組合せとなり得る。ある特定の実施形態では、単離されたタンパク質またはポリペプチドは、その使用（治療的、診断的、予防的、研究的またはその他）に干渉する、その天然環境に存在するタンパク質またはポリペプチドまたは他の夾雑物が実質的にない。
【００４４】
用語「ポリペプチド断片」は、天然起源または組換えにより産生されたポリペプチドのアミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失および／または内部欠失または置換を有する、単量体または多量体となり得るポリペプチドを指す。本明細書において、「近接アミノ酸」は、開示されているアミノ酸配列の中断されていない直鎖状部分に対応する共有結合したアミノ酸を指す。ある特定の実施形態において、ポリペプチド断片は、少なくとも５〜約５００アミノ酸長のアミノ酸鎖を含むことができる。ある特定の実施形態では、断片が、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００または４５０アミノ酸長であることが認められよう。
【００４５】
ポリペプチドは、翻訳時にまたは翻訳後にタンパク質の移行を方向付けるシグナル（またはリーダー）配列をタンパク質のＮ末端に含むことができる。ポリペプチドは、ポリペプチドの合成、精製もしくは同定を容易にするための（例えば、ポリＨｉｓ）または固体支持体へのポリペプチドの結合を増強するためのリンカーまたは他の配列にインフレームで融合またはコンジュゲートすることもできる。融合ドメインポリペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端においてポリペプチドに連接することができ、非限定例として、当業者に知られている通り、Ｉｇ定常領域配列もしくはその部分等の免疫グロブリン由来配列、Ｈｉｓタグ（例えば、ヘキサヒスチジンまたは他のポリヒスチジン）、ＦＬＡＧ（商標）もしくはｍｙｃ等の親和性タグまたは他のペプチド親和性タグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）もしくはそのバリアント（例えば、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、他のエクオリンまたはそれらの誘導体等）等の検出可能ポリペプチド部分または等の他の検出可能ポリペプチド融合ドメイン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等の酵素もしくはその部分、または他の公知酵素検出および／またはレポーター融合ドメインならびにその他を含むことができる。
【００４６】
組換えタンパク質発現系は、当業界公知であり、ある特定の実施形態では、同様に後述する通り、本明細書に記載されているプラスミン阻害ポリペプチドの産生に使用することができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ組換えタンパク質発現系等、ある特定の細菌発現系は、Ｎ末端ホルミル化メチオニンを有するポリペプチド産物を生じる。したがって、状況によっては、プラスミン阻害ポリペプチドは、クニッツ型プロテイナーゼの第１の阻害剤ドメイン（ＫＤ１）ポリペプチド配列に直接先行する、イニシエータメチオニンと称される場合もある、Ｎ末端メチオニン残基（本明細書に提示されている通り、非修飾メチオニンまたはホルミル−メチオニンまたは別のメチオニン類似体、バリアント、ミメティックまたは誘導体となり得る）を含むことができる。斯かるＮ末端メチオニン（例えば、メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンとして）を含有するここに記載されているプラスミン阻害ポリペプチドの非限定例として、配列番号７〜１０、１３、１４、１７、１８、２６〜２９、３４および３５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。Ｎ末端メチオニン（例えば、メチオニンまたはＮ−ホルミルメチオニンとして）を含有する上述または他の本明細書に記載されているプラスミン阻害ポリペプチドのうち１種または複数が、Ｎ末端メチオニンを切断してこれを新生ポリペプチド産物から除去することができる酵素であるメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）も発現する宿主細胞における、当業界における慣例に従って組換え発現され得る実施形態も考慮されている。例えば、Ｎａｔａｒａｊａｎら、２０１１年、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６巻（５号）：ｅ２０１７６頁；Ｓｈｅｎら、１９９３年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０巻：８１０８号；Ｓｈｅｎら、１９９７年、Ｐｒｏｔ．  Ｅｎｇ．１０巻：１０８５頁を参照されたい。あるいは、ＭＡＰ酵素それ自体を、組換えにより産生する（例えば、Ｔｓｕｎａｓａｗａら、１９９７年、Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２２巻：８４３頁；Ｂｒａｄｓｈａｗら、１９９８年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈ．  Ｓｃｉ．２３巻：２６３頁；Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔら、１９８７年、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９巻：７５１頁）、または商業的に得て（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、例えば、カタログ番号Ｍ６４３５）、合成後に本プラスミン阻害ポリペプチドからＮ末端メチオニンを除去するために使用することができる。
【００４７】
システイン含有ペプチドは、本明細書に記載されているプラスミン阻害ポリペプチドのＮおよび／またはＣ末端に連接され得る融合ペプチドとして使用して、確立された方法論に従って、ジスルフィド架橋した二量体、三量体、四量体またはより高次の多量体への斯かるポリペプチドの素早いアセンブリを可能にすることができる。例えば、鎖間ジスルフィドブリッジを形成することができるシステイン残基を含む、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーメンバー由来の配列を含有する融合ポリペプチドが周知であり、Ｓ−Ｓ連結された多量体を遺伝子操作するための他の戦略も周知である（例えば、Ｒｅｉｔｅｒら、１９９４年、Ｐｒｏｔ．  Ｅｎｇ．７巻：６９７頁；Ｚｈｕら、１９９７年、Ｐｒｏｔ．  Ｓｃｉ．６巻：７８１頁；Ｍａｂｒｙら、２０１０年、Ｍａｂｓ  ２巻：２０頁；Ｇａｏら、１９９９年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６巻：６０２５頁；Ｌｉｍら、２０１０年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．１０６巻：２７頁）。本明細書に記載されている免疫調節性ペプチド等、所望のポリペプチドにおける融合ドメインとしての多量体アセンブリを促進するペプチド配列をグラフトするための代替アプローチも考慮される（例えば、Ｆａｎら、２００８年、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２２巻：３７９５頁）。
【００４８】
ポリペプチド修飾は、多種多様な周知の方法論に従って生合成によりおよび／または化学的にもたらすことができ、担体タンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）または他の分子）へのコンジュゲーションおよび固体支持体における共有結合または非共有結合的固定化を含むこともできる。ある特定の実施形態において、担体への化学的または生合成的コンジュゲーションが考慮される。
【００４９】
ペプチドリンカー／スペーサー配列を用いて、必要に応じて、各ポリペプチドがその二次および／または三次構造にフォールドすることを確実にするのに十分な距離に、複数のポリペプチド構成成分を隔てることもできる。斯かるペプチドリンカー配列は、当業界周知の標準技法を使用して、融合ポリペプチドに取り込むことができる。ある特定のペプチドスペーサー配列は、例えば、（１）可動性の延長された立体構造を採るその能力；（２）第１および第２のポリペプチドにおける機能エピトープと相互作用し得る二次構造を採ることができないこと；および／または（３）ポリペプチド機能エピトープと反応し得る疎水性または荷電残基の欠如に基づき選ぶことができる。
【００５０】
例証的な一実施形態では、ペプチドスペーサー配列は、例えば、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含有する。ＴｈｒおよびＡｌａ等、他の中性付近のアミノ酸も、スペーサー配列に含まれ得る。スペーサーとして有用に用いることができる他のアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ  ４０巻：３９  ４６頁（１９８５年）；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３巻：８２５８  ８２６２頁（１９８６年）；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されているアミノ酸配列を含む。他の例証的なスペーサーは、例えば、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（配列番号３６）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９９０年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．８７巻：１０６６〜１０７０頁）およびＬｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（配列番号３７）（Ｂｉｒｄら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２巻：４２３〜４２６頁）を含むことができる。
【００５１】
一部の実施形態において、第１および第２のポリペプチドが、機能ドメインを隔て、立体的干渉を防止するために使用され得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合、スペーサー配列は必要とされない。２種のコード配列は、いかなるスペーサーも用いず直接的に融合することができ、または例えば、１〜３回反復されるペンタマーＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３８）で構成された可動性のポリリンカーを使用することにより融合することができる。
【００５２】
ある特定の例証的な実施形態では、ペプチドスペーサーは、１〜５アミノ酸の間、５〜１０アミノ酸の間、５〜２５アミノ酸の間、５〜５０アミノ酸の間、１０〜２５アミノ酸の間、１０〜５０アミノ酸の間、１０〜１００アミノ酸の間、またはいずれか介在する範囲のアミノ酸である。他の例証的な実施形態では、ペプチドスペーサーは、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ超のアミノ酸の長さを含む。
【００５３】
ある特定の好ましい実施形態において、プラスミン阻害ポリペプチドは、配列番号３〜１８、２２〜２９および３２〜３５のうちいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４または６３アミノ酸以下のポリペプチドと密接な配列同一性または構造的特色を含むまたはこれを共有する、ペプチド、ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｅｔｉｄｅ）またはペプチド模倣を含むことができ、プラスミン阻害ポリペプチドは、プラスミン活性を阻害し、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する野生型ヒト組織因子経路阻害剤−２（ＴＦＰＩ−２）ポリペプチドの第１のクニッツ型プロテイナーゼ阻害剤ドメイン（ＫＤ１）と比較して、減少した抗凝固活性を有する。ある特定の実施形態では、プラスミン阻害ポリペプチドは、配列番号３、５、１５または１６のうちいずれか１つに記載の６０アミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。ある特定の実施形態では、プラスミン阻害ポリペプチドは、配列番号７、９、１７、１８、２２、２４または３２のうちいずれか１つに記載の６１アミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。ある特定の実施形態では、プラスミン阻害ポリペプチドは、配列番号２３、２５、２６、２８、３３または３４のうちいずれか１つに記載の６２アミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。ある特定の実施形態では、プラスミン阻害ポリペプチドは、配列番号４、６、１０、１１、１３、１４、２７、２９または３５のうちいずれか１つに記載の６３アミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。
【００５４】
プラスミン阻害活性および抗凝固活性の決定のための方法は、当業界公知であり、例えば、Ｃｈａｎｄら（２００４年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７９巻：１７５００頁）、Ｐｅｔｅｒｓｅｎら（１９９６年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５巻：２６６頁）およびＵＳ２００９／００１８０６９（例えば、段落００６２〜００７０、０１２４〜０１２７、０１３３〜０１３５、０１３７〜０１３８およびこれに組み込まれている参考文献を含む他の箇所）に記載されている。したがって、プラスミン阻害ポリペプチドは、ある特定の実施形態では、プラスミン阻害ポリペプチドの非存在下で存在するプラスミン活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％の検出可能な阻害となり得る、統計的に有意な様式で検出可能なプラスミン活性（例えば、プラスミンのタンパク質分解活性）の阻害に基づいて同定することができる。プラスミン阻害の例示的なアッセイは、候補プラスミン阻害剤の非存在および存在下で、発色性プラスミン基質Ｈ−Ｄ−バリル−ロイシル−リシンｐ−ニトロアニリン二塩酸塩（Ｓ２２５１、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ／ＤｉａＰｈａｒｍａ  Ｇｒｏｕｐ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＯＨ）からのｐ−ニトロアニリンのプラスミンによる遊離を反映する４０５ｎｍにおける溶液の光学密度の変化を測定する。
【００５５】
当業界において一般に言及されている通り、また本明細書で使用されているように、配列同一性および配列相同性は、互換的に使用され、一般に、配列を整列し、必要であればギャップを導入して、最大パーセント配列同一性を達成した後に、任意選択で、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮せず、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列におけるそれぞれヌクレオチドまたはアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを指すことができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている実施形態のプラスミン阻害ポリペプチドまたはコードポリヌクレオチドは、本明細書に記載されている一般式（Ｉ）［Ｎ−Ｙ−Ｊ−Ｚ−Ｃ］（式中、Ｊは、配列番号１であり、Ｚは、一般式（ＩＩ）［配列番号２］、一般式（ＩＩＩ）（Ｉ−Ｘ３−Ｋ（式中、Ｘ３は、Ｃ、Ｆ、ＲまたはＷではない天然または非天然アミノ酸である））、一般式（ＩＶ）［配列番号２０］または一般式（Ｖ）［配列番号２１］から選択される）で表されるプラスミン阻害ポリペプチドの配列と、アミノ酸残基（または斯かるプラスミン阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド）の少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％もしくは９４％または少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％を共有する。斯かる配列同一性は、ＦＡＳＴＡ、Ｇａｐ、Ｂｅｓｔｆｉｔ、ＢＬＡＳＴまたはその他等、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から入手できるアルゴリズムを含む周知の配列解析アルゴリズムに従って決定することができる。
【００５６】
「天然または非天然アミノ酸」は、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の生合成の構成単位（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ）として機能する一般的な天然起源のアミノ酸のうちいずれかを含み（例えば、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ））、天然起源であれ合成であれ、修飾された、誘導体化された、鏡像異性の、稀なおよび／または珍しいアミノ酸、例えば、Ｎ−ホルミルメチオニン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、デスモシン、イソデスモシン、ε−Ｎ−メチルリシン、ε−Ｎ−トリメチルリシン、メチルヒスチジン、デヒドロブチリン、デヒドロアラニン、α−アミノ酪酸、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、ホモシステイン、ホモセリン、シトルリン、オルニチンならびに天然の供給源から単離したり、および／または化学合成したりすることができる他のアミノ酸も含み、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ（Ｗｈｉｔｅ，  Ｊ．Ｓ．およびＷｈｉｔｅ，  Ｄ．Ｃ．、２００２年、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）またはＡｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｊｏｎｅｓ，  Ｊ．、２００２年、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ  ＵＳＡ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）またはＵｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ、ＣｈｅｍＦｉｌｅｓ、１巻、５号（２００１年、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはＵｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ＩＩ、ＣｈｅｍＦｉｌｅｓ、２巻、４号（２００２年、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に見出すことができる。天然および／または非天然アミノ酸に関する追加的な記載は、例えば、Ｋｏｔｈａ、２００３年、Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．３６巻：３４２頁；Ｍａｒｕｏｋａら、２００４年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１巻：５８２４頁；Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔら、２００１年、Ｏｒｇ．  Ｌｅｔｔ．３巻：７８１頁；Ｔａｎｇら、２００２年、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．６７巻：７８１９頁；Ｒｏｔｈｍａｎら、２００３年、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．６８巻：６７９５頁；Ｋｒｅｂｓら、２００４年、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １０巻：５４４頁；Ｇｏｏｄｍａｎら、２００１年、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ６０巻：２２９頁；Ｓａｂａｔら、２０００年、Ｏｒｇ．  Ｌｅｔｔ．２巻：１０８９頁；Ｆｕら、２００１年、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．６６巻：７１１８頁；およびＨｒｕｂｙら、１９９４年、Ｍｅｔｈｓ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．３５巻：２４９頁に見出すことができる。標準３文字略語および１文字記号が本明細書において使用されて、天然および非天然アミノ酸を命名する。
【００５７】
他の非天然アミノ酸またはアミノ酸類似体は、当業界公知であり、その例として、非天然ＬまたはＤ誘導体（上述および本明細書における他の箇所に示されているもの等、ペプチドおよび／またはペプチド模倣に存在するＤ−アミノ酸等）、蛍光標識アミノ酸と共に、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、３−ヨード（ｉｄｉｏ）−チロシン、Ｏ−プロパルギル−チロシン、ホモグルタミン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−ドーパ（Ｄｏｐａ）、フッ化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、セレノメチオニン、テルロメチオニン、セレノシステイン、アルキンフェニルアラニン、Ｏ−アリル−Ｌ−チロシン、Ｏ−（２−プロピニル）−Ｌ−チロシン、ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ホモプロパルギル（ｐｒｏｐａｒｇｌｙ）グリシン、アジドホモアラニン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、ジヒドロキシ−フェニルアラニン、ジヒドロキシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−メトキシ−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニンおよびイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、トリフルオロロイシン、ノルロイシン（「Ｎｌｅ」）、Ｄ−ノルロイシン（「ｄＮｌｅ」または「Ｄ−Ｎｌｅ」）、５−フルオロ−トリプトファン、パラ−ハロ−フェニルアラニン、ホモ−フェニルアラニン（「ホモ−Ｐｈｅ」）、セレノ−メチオニン、エチオニン、Ｓ−ニトロソ−ホモシステイン、チア−プロリン、３−チエニル−アラニン、ホモ−アリル−グリシン、トリフルオロイソロイシン、トランスおよびシス−２−アミノ−４−ヘキセン酸、２−ブチニル−グリシン、アリル−グリシン、パラ−アジド−フェニルアラニン、パラ−シアノ−フェニルアラニン、パラ−エチニル−フェニルアラニン、ヘキサフルオロロイシン、１，２，４−トリアゾール−３−アラニン、２−フルオロ−ヒスチジン、Ｌ−メチルヒスチジン、３−メチル−Ｌ−ヒスチジン、β−２−チエニル−Ｌ−アラニン、β−（２−チアゾリル）−ＤＬ−アラニン、ホモプロパルギル（ｐｒｏｐａｒｇｌｙ）グリシン（ＨＰＧ）およびアジドホモアラニン（ＡＨＡ）およびその他を含む具体例が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５８】
ある特定の実施形態では、例えば、芳香環系が存在する場合に当業者が容易に認識する構造に基づく他の天然または非天然アミノ酸を含む、フェニルアラニンもしくはトリプトファンまたはこれらの類似体に見出される、典型的には、水素および炭素のみからなり、６〜１９個の炭素原子を含有する芳香族単環式または多環式炭化水素環系であって、部分的にまたは完全に飽和されていてよい、フルオレニル、フェニルおよびナフチル等の基を含むがこれらに限定される必要のない基として存在し得る環系の形態の、芳香族側鎖を含む天然または非天然アミノ酸が存在し得る。
【００５９】
ある特定の実施形態では、疎水性側鎖（例えば、典型的には、生理学的環境において非極性の側鎖）が存在する場合に当業者であれば容易に認識できる構造に基づき、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンもしくはメチオニンまたはこれらの類似体（他の天然または非天然アミノ酸を含む）に見出される疎水性側鎖を含む、天然または非天然アミノ酸が存在し得る。ある特定の実施形態では、塩基性（例えば、典型的には、極性であり、生理学的環境において正電荷を有する）が存在する場合に当業者であれば容易に認識できる構造に基づき、例えば、リシン、アルギニンもしくはヒスチジンまたはこれらの類似体（他の天然または非天然アミノ酸を含む）に見出される塩基性側鎖を含む、天然または非天然アミノ酸が存在し得る。
【００６０】
本明細書に開示されているプラスミン阻害ポリペプチドおよびタンパク質は、該ポリペプチドの生物学的活性が維持されるのであれば（例えば、プラスミンタンパク質分解活性の阻害および／またはＴＦＰＩ−２  ＫＤ１（配列番号１９）と比較して減少した抗凝固活性）、Ｌ−および／またはＤ−アミノ酸を含むことができる。単離されたプラスミン阻害ポリペプチドは、ある特定の実施形態では、グリコシル化（例えば、アスパラギン残基におけるＮ結合型糖鎖付加、セリンもしくはスレオニン残基におけるＯ結合型糖鎖付加、グリケーションまたはその他）、脂肪酸アシル化、アセチル化、ホルミル化、ＰＡＧ化、ＰＥＧ化およびリン酸化を含み得る反応による、種々の公知の天然および人工の翻訳後または合成後共有結合化学修飾のうちいずれかを含むこともできる。本明細書に開示されているポリペプチドは、１個または複数のアミノ酸残基のアミノ酸欠失または他の天然起源のアミノ酸残基もしくは非天然アミノ酸残基による付加もしくは置換を含有し得る、類似体、対立遺伝子および対立遺伝子バリアントをさらに含むことができる。
【００６１】
ペプチドおよび非ペプチド類似体は、ペプチドミメティックまたはペプチド模倣と称することができ、製薬業界において公知のものである（Ｆａｕｃｈｅｒｅ、Ｊ．  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５巻：２９頁（１９８６年）；Ｅｖａｎｓら、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．３０巻：１２２９頁（１９８７年））。このような化合物は、１個もしくは複数の非天然アミノ酸残基（複数可）、１個もしくは複数の化学修飾部分（例えば、グリコシル化、ＰＥＧ化、蛍光、放射性または他の部分）、および／または１個もしくは複数の非天然ペプチド結合（複数可）（例えば、還元型ペプチド結合：−−ＣＨ２−ＮＨ２−−）を含有することができる。ペプチド模倣は、コンピュータ処理による分子モデリング、ランダムまたは部位特異的変異誘発、ＰＣＲに基づく戦略、化学的変異誘発およびその他を含む種々の方法により開発することができる。
【００６２】
したがって、ある特定のここに開示されている実施形態において、プラスミン阻害ポリペプチドは、ある特定の実施形態では、配列番号３〜１８、２２〜２９および３２〜３５のうちいずれか１つに記載の酸配列を含み得る、本明細書に記載されている一般式（Ｉ）［Ｎ−Ｙ−Ｊ−Ｚ−Ｃ］で表されるポリペプチドを含む、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４または６３アミノ酸以下のポリペプチドを含むことができ、該プラスミン阻害ポリペプチドは、プラスミン活性を阻害し、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する野生型ヒト組織因子経路阻害剤−２（ＴＦＰＩ−２）ポリペプチドの第１のクニッツ型プロテイナーゼ阻害剤ドメイン（ＫＤ１）と比較して、減少した抗凝固活性を有する。
【００６３】
よって、上述および他の実施形態において、ある特定のプラスミン阻害ポリペプチドのアミノ末端が、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５〜３０、３１〜４０、４１〜５０または５１〜６０個の独立して選択された天然または非天然アミノ酸からなることができ、および／またはある特定の実施形態では、プラスミン阻害ポリペプチドのカルボキシ末端が、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５〜３０、３１〜４０、４１〜５０または５１〜６０個の独立して選択された天然または非天然アミノ酸からなることができ、単離されたプラスミン阻害ポリペプチドが、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４または６３アミノ酸以下のものであり、本明細書に列挙されている一般式（Ｉ）［Ｎ−Ｙ−Ｊ−Ｚ−Ｃ］で表されるポリペプチドを含み、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する野生型ＴＦＰＩ−２  ＫＤ１と比較して減少した抗凝固活性を示しつつ、プラスミン活性を阻害することができる限りにおいて、斯かるアミノおよびカルボキシ末端がいかなる配列も有し得ることが認められよう。
【００６４】
本明細書に記載されている通り、一般式（Ｉ）［Ｎ−Ｙ−Ｊ−Ｚ−Ｃ］で表されるポリペプチドにおいて、Ｙは、存在しないか、またはメチオニン（例えば、プラスミン阻害ポリペプチドの組換えによる遺伝子操作および発現の経過中に導入することができるＮ末端メチオニン；これは、細菌において産生される場合はＮ−ホルミルメチオニンとなり得る）であり；Ｊは、クニッツ型プロテイナーゼの第１の阻害剤ドメイン（ＫＤ１、Ｃｈａｎｄら、２００４年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７９巻：１７５００頁を参照）であり、但し、Ｊが配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する５７アミノ酸のポリペプチドであることを除く；Ｚは、一般式（ＩＩＩ）［Ｉ−Ｘ３−Ｋ］、一般式（Ｖ）［配列番号２１］、一般式（ＶＩ）［配列番号３０］、一般式（ＶＩＩ）［配列番号３１］、一般式（ＩＶ）［配列番号２０］または一般式（ＩＩ）［配列番号２］で表されるＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドが存在するか否かに応じて、３、４、５または６アミノ酸の長さとなり得るＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドである。当業者であれば、本開示を考慮して、本実施形態に係る追加的なプラスミン阻害ポリペプチドを容易に作製および使用することができるように、一般式（Ｉ）で表される多数の代表的プラスミン阻害ポリペプチドが、本明細書に開示されている。
【００６５】
例えば、その結果得られる構造バリアントが、ここに開示されている化学種の空間充填特性を保持するか決定する目的のために、選択された天然または非天然アミノ酸による１個または複数のアミノ酸の置換がバーチャルにモデル化され得るように、ルーチンの方法論により、代表的プラスミン阻害ポリペプチドの三次元構造の決定を為すことができる。例えば、Ｂａｊａｊら、２０１１年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２８６巻：４３２９頁；Ｃｈａｎｄら、２００４年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７９巻：１７５００頁；Ｂａｊａｊ、ＵＳ２００９／００１８０６９；Ｈｕｂｅｒら、１９７４年、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．８９巻：７３〜１０１頁；Ｓｃｈｍｉｄｔら、２００５年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８０巻：２７８３２〜２７８３８頁；Ｗａｎｇら、１９９８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８１巻、１６６２〜１６６５頁；Ｂａｊａｊら、２００１年、Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．８６巻、９５９〜９７２頁を参照されたい；例えば、Ｄｏｎａｔｅら、１９９４年、Ｐｒｏｔ．  Ｓｃｉ．３巻：２３７８頁；Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９巻：１８６８〜１８７１頁（２００５年）；Ｓｃｈｕｅｌｅｒ−Ｆｕｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０巻：６３８頁（２００５年）；Ｄｉｅｔｚら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０３巻：１２４４頁（２００６年）；Ｄｏｄｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４５０巻：１７６頁（２００７年）；Ｑｉａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４５０巻：２５９頁（２００７年）；Ｒａｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７巻：１０１４〜１０１８頁（２０１０年）も参照されたい。本明細書に提供されている免疫調節性ポリペプチドの合理的設計等、上述および関連する実施形態のために使用することができるコンピュータアルゴリズムのいくつかの追加的な非限定例として、３−Ｄグラフィックスおよび内蔵スクリプティングを使用して大型の生体分子系を表示、動画化および解析するための分子可視化プログラムである、ＶＭＤが挙げられる（Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、Ｕｒｂａｎａ−Ｃｈａｍｐａｇｎｅのウェブサイト、ｋｓ．ｕｉｕｃ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｖｍｄ／を参照）。
【００６６】
多くの他のコンピュータプログラムは、当業界公知であり、当業者に利用でき、エネルギー最小化された立体構造の空間充填モデルから原子寸法（ファンデルワールス半径）の決定を可能にする；異なる化学基に対し高親和性の領域を決定しようとし、これにより結合を増強するＧＲＩＤ、数学的アライメントを計算するモンテカルロ検索、ならびに力場計算および解析を評定するＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓら（１９８３年）Ｊ．  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｃｈｅｍ．４巻：１８７〜２１７頁）およびＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒら（１９８１年）Ｊ．  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｃｈｅｍ．１０６巻：７６５頁）（Ｅｉｓｅｎｆｉｅｌｄら（１９９１年）Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６１巻：Ｃ３７６〜３８６頁；Ｌｙｂｒａｎｄ（１９９１年）Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｅｌｇ．４６巻：４９〜５４頁；Ｆｒｏｉｍｏｗｉｔｚ（１９９０年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８巻：６４０〜６４４頁；Ｂｕｒｂａｍら（１９９０年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ７巻：９９〜１１１頁；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ（１９８５年）Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．６１巻：１８５〜１９０頁；およびＫｉｎｉら（１９９１年）Ｊ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｄｙｎ．９巻：４７５〜４８８頁も参照されたい）。Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ（Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）等から、種々の適切な計算的コンピュータプログラムも市販されている。
【００６７】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリアルキレングリコールを治療剤に付着させることができることが当業界周知である。ポリアルキレングリコール化（ＰＡＧ化）治療剤、特に、ＰＥＧ化治療剤は、溶解性、循環寿命、安全性を増加させ、腎排泄を減少させ、免疫原性を減少させると報告されており、よって、改善された薬物送達方法を潜在的に提供する。ＰＥＧ化治療剤は、（ａ）対応する非ＰＥＧ化化合物と比較して増加されたｉｎ  ｖｉｖｏにおける血漿循環半減期、（ｂ）対応する非ＰＥＧ化化合物と比較して増強された治療指数、および（ｃ）対応する非ＰＥＧ化化合物と比較して増加された溶解性を示し、可能な改善された薬物送達をもたらすことができる。
【００６８】
ＰＥＧ化は、非限定的な理論によると、オリゴ糖およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の合成ポリマーが、治療タンパク質標的分子に部位特異的に共有結合により付着させられる過程である。ＰＥＧ化は、タンパク質分解酵素からポリペプチドを遮蔽し、タンパク質の見かけ上のサイズを増加させ、これによりクリアランス速度を低下させることにより、タンパク質半減期を有意に増強することができる。さらに、ＰＥＧコンジュゲートは、タンパク質溶解性を増強し、体内分布における有益な効果を有することができる。ＰＥＧ化タンパク質の物理的および薬理学的特性は、ポリペプチドに付着したＰＥＧ鎖の数およびサイズ、ＰＥＧ部位の位置ならびにＰＥＧ化に使用された化学に影響される。タンパク質へのＰＥＧコンジュゲーションの例として、Ｎ−ヒドロキシサクシニミジルエステル誘導体化ＰＥＧとリシンとの反応、マレイミドおよびビニルスルホン誘導体化ＰＥＧとシステインとの１，４−付加反応、ならびにヒドラジド含有ＰＥＧと、糖タンパク質の酸化により生成されたアルデヒドとの縮合が挙げられる。ＰＥＧ化のための組成物および方法の詳細は、本明細書に記載されており、当業界公知であり、例えば、米国特許第７，８２９，６５９号に記載されている。
【００６９】
ＰＥＧは、水溶性であると共に多くの有機溶媒に可溶性であるため、ＰＥＧは、有用なポリマーである。ＰＥＧは、一般に、無毒性かつ非免疫原性である。ＰＥＧが、水不溶性化合物に化学的に取り付けられる場合、その結果得られるコンジュゲートは、一般に、水溶性であると共に多くの有機溶媒に可溶性となる。よって、本明細書において、ＰＥＧ化ポリペプチドは、いずれかの重量および／またはサイズの、直鎖状および分枝状ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ、加水分解または酵素により分解することができるＰＥＧ、懸垂ＰＥＧ、デンドリマーＰＥＧ、ＰＥＧおよび１個または複数のポリオールのコポリマー、ならびにＰＥＧおよびＰＬＧＡのコポリマー（ポリ（乳酸／グリコール酸）を含むがこれらに限定されないことが企図されるＰＥＧ部分をそれに化学的に取り付けることができ得る。
【００７０】
薬物送達をもたらすためにＰＥＧ化が使用された例は、例えば、米国特許第６，６２３，７２９号；米国特許第６，５１７，８２４号；米国特許第６，５１５，０１７号；米国特許第６，２１７，８６９号；米国特許第６，１９１，１０５号；米国特許第５，６８１，８１１号；米国特許第５，４５５，０２７号；米国特許出願公開第２００４００１８９６０号；米国特許出願公開第２００３０２２９０１０号；米国特許出願公開第２００３０２２９００６号；米国特許出願公開第２００３０１８６８６９号；米国特許出願公開第２００３００２６７６４号；および米国特許出願公開第２００３００１７１３１号に開示されている。米国特許第６，２１４，９６６号、米国特許出願公開第２００３０００４４７号および米国特許出願公開第２００１０２１７６３号は、結合した分子を溶液に放出制御するための可溶性、分解性ポリ（エチレングリコール）誘導体について記載する。
【００７１】
ＰＥＧ化に関する総説は、例えば、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．  Ｒｅｖ．２００３年、５５巻：２１７頁；Ｍｏｌｉｎｅｕｘ、Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  ２００３年（８Ｐｔ２）：３Ｓ〜８Ｓ；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．２００２年、５４巻：４５９頁；Ｂｈａｄｒａら、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ  ２００２年、５７巻：５頁、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００１年、７４巻：１５９頁；Ｖｅｒｏｎｅｓｅら、Ｆａｒｍａｃｏ．１９９９年、５４巻：４９７頁；およびＺａｌｉｐｓｋｙ、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．１９９５年：１６巻、１５７頁に提供されている。ＰＥＧ化誘導体を調製するための方法が、上述ならびに例えば、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．１９９６年、３９巻：４２４頁および米国特許第７，７８６，１１９号に記載されている。代替反応ステップは、当業者によって容易に認識され、例えば、「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ」、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｃ．  Ｌａｒｏｃｋ、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ：１９９９年および「Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、Ｊｅｒｒｙ  Ｍａｒｃｈ  ＆  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓｍｉｔｈ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ：２００１年に記載されている反応ステップを含む。
【００７２】
多くの異なる種類および分子量の市販のＰＥＧは、例えば、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＳｕｎＢｉｏ、Ｓｅｒｖａ（Ｃｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）およびＦｌｕｋａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）から得ることができ、活性化ＰＥＧ−ＮＨＳエステル試薬およびＮＨＳ  ＰＥＧビニルスルホン等が挙げられるがこれらに限定されない例を含むことができる。これらの活性化ＰＥＧ試薬の例を使用して、アミノシクロアルキルエーテル化合物と直接的にコンジュゲートすることができる。Ｐｏｌｙｐｕｒｅ  ＡＳ、Ｎｏｒｗａｙは、１個のオリゴマーのみで実質的に構成された単分散ＰＥＧおよびＰＥＧ誘導体を供給する。必要に応じて、これらの単分散ＰＥＧおよびＰＥＧ誘導体を有利に利用して、より明確に定義されたＰＥＧ誘導体を生成することができる。
【００７３】
同様に上述されている通り、ある特定の実施形態は、また、ペプチド模倣または「人工」ポリペプチドに関する。斯かるポリペプチドは、１個もしくは複数のアミノ酸挿入、欠失もしくは置換、１個もしくは複数の変更されたもしくは人工のペプチド結合、１個もしくは複数の化学部分（ポリエチレングリコール、グリコシル化、標識、毒素または他の部分等）、および／または１個もしくは複数の非天然アミノ酸を含有することができる。ペプチド模倣の合成は、当業界周知であり、化学的変異誘発、単一または複数部位特異的変異誘発、ＰＣＲシャッフリング、変更されたアミノアシルｔＲＮＡもしくはアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ分子の使用、アンバーサプレッサー等の「終止」コドンの使用、４もしくは５塩基対コドンの使用、または他の手段により、天然起源のタンパク質またはポリペプチドを変更するステップを含むことができる。
【００７４】
ポリヌクレオチド
ある特定の実施形態は、本明細書に記載されているプラスミン阻害ポリペプチドをコードする核酸分子に関する。所望の核酸および／またはポリペプチドの産生のための方法は、当業界周知のものである。例えば、核酸および／またはポリペプチドは、細胞から単離することができ、または化学合成によりｄｅ  ｎｏｖｏ合成することができる。斯かる核酸またはポリペプチドは、ベクターに取り込まれて宿主細胞に形質転換させることができる。宿主細胞は、プロモーターを誘導するため、形質転換体を選択するため、または適切な配列を増幅するために必要なサプリメントまたは添加物が追加された標準栄養培地で培養することができる。
【００７５】
加えて、プラスミン阻害ポリペプチドのコードポリヌクレオチドまたはポリペプチドバリアントはそれぞれ、ネイティブ（例えば、野生型または優勢もしくは天然起源の対立遺伝子型）と比べて、１個または複数のヌクレオチドまたはアミノ酸置換、付加、欠失および／または挿入を含有することができる。一部の実施形態において、バリアントは、Ｎ末端Ｌ−アミノ酸がＤ−アミノ酸に置き換えられた分子を含み、ある特定の他の実施形態では、１個または複数の他のアミノ酸（例えば、Ｎ末端に位置しない）を、その上またはそれに代えて、Ｄ−アミノ酸に置き換えることができる。ある特定の実施形態では、バリアントは、Ｎ末端アルファアミノ酸がベータまたはガンマアミノ酸に置き換えられた分子を含む。バリアントは、好ましくは、プラスミン阻害ポリペプチド配列または斯かるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の部分に対し、少なくとも約７５％、７８％、８０％、８５％、８７％、８８％または８９％同一性、より好ましくは、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を示す。パーセント同一性は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドバリアントの配列を全長ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの対応する部分と比較することにより、容易に決定することができる。配列比較のためのいくつかの技法は、ＮＣＢＩウェブサイト（［オンライン］インターネット：＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴを参照）において利用できるＡｌｉｇｎまたはＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２１９巻：５５５〜５６５頁、１９９１年；ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９巻：１０９１５〜１０９１９頁、１９９２年）等、当業者に周知のコンピュータアルゴリズムの使用を含む。デフォルトパラメータを使用することができる。
【００７６】
用語「作動可能に連結された」は、この用語が適用される構成成分同士が、適した条件下でその固有の機能の実行を可能にする関係性にあることを意味する。例えば、タンパク質コード配列に「作動可能に連結された」転写制御配列は、該制御配列の転写活性と適合性の条件下で該タンパク質コード配列の発現が達成されるように、これにライゲーションされている。
【００７７】
用語「制御配列」は、本明細書において、それがライゲーションまたは作動可能に連結されたコード配列の発現、プロセシングまたは細胞内局在化に影響し得るポリヌクレオチド配列を指す。斯かる制御配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態では、原核生物のための転写制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列を含むことができる。他の特定の実施形態において、真核生物のための転写制御配列は、転写因子のための１個または複数の認識部位を含むプロモーター、転写エンハンサー配列、転写終結配列およびポリアデニル化配列を含むことができる。ある特定の実施形態では、「制御配列」は、リーダー配列および／または融合パートナー配列を含むことができる。
【００７８】
本明細書に参照されている用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖核酸ポリマーを意味する。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾形態となり得る。斯かる修飾は、ブロモウリジン等の塩基修飾、アラビノシドおよび２’，３’−ジデオキシリボース等のリボース修飾ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロジセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホラニラデート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）およびホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）等のヌクレオチド間連結修飾を含むことができる。用語「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡの一本および二本鎖型を特に含む。
【００７９】
用語「天然起源のヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。用語「修飾されたヌクレオチド」は、修飾または置換された糖基その他を有するヌクレオチドを含む。用語「オリゴヌクレオチド連結」は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート、ホスホロアミデートその他等のオリゴヌクレオチド連結を含む。例えば、いかなる目的に対しても参照によりその開示内容が本明細書に組み込まれる、ＬａＰｌａｎｃｈｅら、１９８６年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１４巻：９０８１頁；Ｓｔｅｃら、１９８４年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１０６巻：６０７７頁；Ｓｔｅｉｎら、１９８８年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６巻：３２０９頁；Ｚｏｎら、１９９１年、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、６巻：５３９頁；Ｚｏｎら、１９９１年、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、８７〜１０８頁（Ｆ．  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｔｅｃら、米国特許第５，１５１，５１０号；ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ、１９９０年、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、９０巻：５４３頁を参照されたい。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドまたはそのハイブリダイゼーションの検出を可能にするための検出可能な標識を含むことができる。
【００８０】
用語「ベクター」は、宿主細胞へのコード情報の移入に使用されるいずれかの分子（例えば、核酸、プラスミドまたはウイルス）を指すよう使用される。用語「発現ベクター」は、宿主細胞の形質転換に適したベクターを指し、挿入された異種核酸配列の発現を方向付けるおよび／または制御する核酸配列を含有する。発現としては、転写、翻訳およびイントロンが存在する場合はＲＮＡスプライシング等の過程が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８１】
当業者であれば理解できる通り、ポリヌクレオチドは、ゲノム配列、ゲノム外（ｅｘｔｒａ−ｇｅｎｏｍｉｃ）およびプラスミドにコードされた配列、ならびにタンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよびその他を発現するまたはそれらの発現に適応され得るより小型の遺伝子操作された遺伝子セグメントを含むことができる。当業者は、斯かるセグメントを天然に単離してもよく、または合成により修飾してもよい。
【００８２】
同様に当業者によって認識される通り、ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードまたはアンチセンス）であっても二本鎖であってもよく、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）であってもＲＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡ分子は、イントロンを含有し、１対１（ｏｎｅ−ｔｏ−ｏｎｅ）様式でＤＮＡ分子に対応するＨｎＲＮＡ分子と、イントロンを含有しないｍＲＮＡ分子を含むことができる。追加的なコードまたは非コード配列は、本開示に係るポリヌクレオチド内に存在することができるが、必ずしもそうでなくてもよく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材料に連結することができるが、必ずしもそうでなくてもよい。ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列を含むことができ、または斯かる配列のバリアントもしくは誘導体をコードする配列を含むことができる。
【００８３】
したがって、上述および関連する実施形態において、本開示は、本明細書に記載されているプラスミン阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されているプラスミン阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の一部または全てを含むポリヌクレオチドおよび斯かるポリヌクレオチドの相補体が提供される。
【００８４】
他の関連する実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、本明細書に記載されているプラスミン阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対し実質的な同一性を有することができる。例えば、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されている方法（例えば、後述する標準パラメータを使用するＢＬＡＳＴ解析）を使用して、本明細書に開示されているアミノ酸配列を有するプラスミン阻害ポリペプチドをコードする配列等の参照ポリヌクレオチド配列と比較して、少なくとも７０％配列同一性、好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％またはそれより高い配列同一性を含むポリヌクレオチドとなり得る。当業者であれば、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置決めその他を考慮に入れることにより、これらの値を適切に調整して、２種のヌクレオチド配列にコードされるタンパク質の対応する同一性を決定し得ることを認識するであろう。
【００８５】
典型的には、好ましくは、バリアントポリヌクレオチドにコードされるプラスミン阻害ポリペプチドのプラスミンに対する結合親和性が、本明細書で具体的に記載されたアミノ酸配列を有するプラスミン阻害ポリペプチドと比べて実質的に縮小されないように、ポリヌクレオチドバリアントは、１個または複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含有するであろう。
【００８６】
ある特定の他の関連する実施形態において、ポリヌクレオチド断片は、本明細書に記載されているプラスミン阻害ポリペプチドをコードする配列と同一のまたはこれと相補的な配列の様々な長さの近接ストレッチを含むまたはこれから本質的になることができる。例えば、本明細書に開示されているプラスミン阻害ポリペプチドまたはそのバリアントをコードする配列の少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００個またはそれ超の近接ヌクレオチドと共にその間のあらゆる中間の長さを含むまたはこれから本質的になるポリヌクレオチドが提供される。この文脈における「中間の長さ」が、２００〜５００；５００〜１，０００の間のあらゆる整数を含む、５０、５１、５２、５３等；１００、１０１、１０２、１０３等；１５０、１５１、１５２、１５３等；その他等、引用されている値の間のいずれかの長さを意味することが容易に理解されよう。ここに記載されているポリヌクレオチド配列は、ネイティブ配列に存在しない追加的なヌクレオチドにより、一端または両端において延長することができる。この追加的な配列は、本明細書に記載されているプラスミン阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのいずれかの末端における、または本明細書に記載されているプラスミン阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの両端における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドからなることができる。
【００８７】
別の実施形態では、プラスミン阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列または本明細書に提示されているそのバリアントまたはその断片またはその相補的配列へと、中程度から高度なストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドが提供される。ハイブリダイゼーション技法は、分子生物学の当業界周知のものである。例証目的のため、本明細書に提示されているポリヌクレオチドと他のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを検査するために適した中程度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液における予洗；５０℃〜６０℃、５×ＳＳＣにおける一晩のハイブリダイズ；続いて、それぞれ０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣによる６５℃２０分間で２回洗浄を含む。当業者であれば、ハイブリダイゼーション溶液の塩含量および／またはハイブリダイゼーションが行われる温度を変更すること等により、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを容易に操作できることを理解できよう。例えば、別の実施形態において、適した高度ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションの温度が例えば６０℃〜６５℃または６５℃〜７０℃に増加されることを除き、上述の条件を含む。
【００８８】
プラスミンプロテイナーゼドメインと複合体形成したときの斯かるポリペプチドの三次元構造を含む、代表的プラスミン阻害ポリペプチド（例えば、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１〜１１０、１１１〜１２０、１２１〜１３０、１３１〜１４０、１４１〜１５０、１５１、１６０、１６１〜１７０、１７１〜１８０、１８１〜１９０または１９１〜２００アミノ酸のポリペプチド）の三次元構造の決定は、得られた構造バリアントがここに開示されているプラスミン阻害化学種の空間充填特性を保持するか決定する目的で、選択された天然または非天然アミノ酸による１個または複数のアミノ酸の置換、付加、欠失または挿入をバーチャルにモデル化できるように、ルーチンの方法論（例えば、Ｃｈａｎｄら、２００４年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．１７巻：１７５００頁；Ｂａｊａｊ、ＵＳ２００９／００１８０６９；Ｈｕｂｅｒら、１９７４年、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．８９巻：７３〜１０１頁；Ｓｃｈｍｉｄｔら、２００５年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８０巻：２７８３２〜２７８３８頁；Ｗａｎｇら、１９９８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１巻、１６６２〜１６６５頁；Ｂａｊａｊら、２００１年、Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．８６巻、９５９〜９７２頁）により行うことができる。例えば、プラスミンプロテイナーゼドメインに対する親和性が維持されるまたはより優れた親和性が達成されるような、プラスミン阻害ポリペプチド内の適切なアミノ酸置換（またはアミノ酸配列をコードする適切なポリヌクレオチド）を決定するための種々のコンピュータプログラムが、当業者に公知である。
【００８９】
本明細書に記載されているポリヌクレオチドまたはその断片は、コード配列それ自体の長さにかかわらず、その全体の長さが顕著に変動し得るように、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、追加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、他のコードセグメントその他等、他のＤＮＡ配列と組み合わせることができる。したがって、ほとんどあらゆる長さの核酸断片を用いることができ、総計の長さは、好ましくは、企図される組換えＤＮＡプロトコールにおける調製および使用の容易さによって限定されることが考慮される。例えば、総計の長さが、約１０，０００、約９０００、約８０００、約７０００、約６０００、約５０００、約４０００、約３０００、約２，０００、約１，０００、約９００、約８００、約７００、約６００、約５００、約４００、約３００、約２００、約１９０、約１８０、約１７０塩基対の長さなど（その間のあらゆる中間の長さを含む）である例証的なポリヌクレオチドセグメントが有用であると考慮される。
【００９０】
ポリヌクレオチド配列を比較する際に、２種の配列は、後述する最大一致のために整列されるときに、該２種の配列におけるヌクレオチドの配列が同じである場合、「同一」であると言われる。２種の配列の間の比較は、典型的に、比較ウィンドウにわたり両配列を比較して、配列類似性の局所的領域を同定および比較することにより行われる。「比較ウィンドウ」は、本明細書において、２種の配列が最適に整列された後に、配列が同数の近接位置の参照配列と比較され得る、少なくとも約２０近接位置、通常、３０〜約７５、４０〜約５０のセグメントを指す。
【００９１】
比較のための配列の最適アライメントは、デフォルトパラメータを使用した、バイオインフォマティクスソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＬａｓｅｒｇｅｎｅ（商標）一式におけるＭｅｇａｌｉｇｎ（商標）プログラムを使用して行うことができる。このプログラムは、次の参考文献に記載されている数種類のアライメントスキームを具体化する：Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ｍ．Ｏ．（１９７８年）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  −  Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．、Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、５巻、追補３号、３４５〜３５８頁；Ｈｅｉｎ  Ｊ．、Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ、６２６〜６４５頁（１９９０年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，  Ｐ．Ｍ．、ＣＡＢＩＯＳ  ５巻：１５１〜１５３頁（１９８９年）；Ｍｙｅｒｓ，  Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．、ＣＡＢＩＯＳ  ４巻：１１〜１７頁（１９８８年）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｅ．Ｄ．、Ｃｏｍｂ．  Ｔｈｅｏｒ  １１巻：１０５頁（１９７１年）；Ｓａｎｔｏｕ，  Ｎ．  Ｎｅｓ，  Ｍ．、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．４巻：４０６〜４２５頁（１９８７年）；Ｓｎｅａｔｈ，  Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，  Ｒ．Ｒ．、Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  −  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ（１９７３年）；Ｗｉｌｂｕｒ，  Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，  Ｄ．Ｊ．、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．，  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０巻：７２６〜７３０頁（１９８３年）。
【００９２】
あるいは、比較のための配列の最適アライメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｄ．  ＡＰＬ．  Ｍａｔｈ  ２巻：４８２頁（１９８１年）の局所的同一性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．４８巻：４４３頁（１９７０年）の同一性アライメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５巻：２４４４頁（１９８８年）の類似性方法の検索、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理による実行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）または点検により行うことができる。
【００９３】
パーセント配列同一性および配列類似性の決定に適したアルゴリズムの好ましい一例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５巻：３３８９〜３４０２頁（１９７７年）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）に記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０は、例えば、本明細書に記載されているパラメータにより使用して、２種またはそれより多いポリヌクレオチドの間のパーセント配列同一性を決定することができる。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより公開されている。例証的な一例において、ヌクレオチド配列のために、パラメータＭ（マッチする残基のペアのための報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基のための罰則スコア；常に＜０）を使用して、累積スコアを計算することができる。累積的アライメントスコアが、含量Ｘによりその最大達成値から脱落する；１種または複数の負のスコア付けの残基アライメントの蓄積により、累積スコアがゼロまたはそれを下回る値になる；またはいずれかの配列の端に達した場合、各方向におけるワードヒットの延長は停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１および期待値（Ｅ）１０を使用し、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア付け行列（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９巻：１０９１５頁（１９８９年）を参照）アライメントは、（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を用いる。
【００９４】
ある特定の実施形態では、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０の位置の比較ウィンドウにわたり２種の最適に整列された配列を比較することにより決定され、該比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、該２種の配列の最適アライメントのための参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、２０パーセントまたはそれ未満、通常、５〜１５パーセントまたは１０〜１２パーセントの付加または欠失（即ち、ギャップ）を含むことができる。パーセンテージは、両配列に同一核酸塩基が生じた位置の数を決定して、マッチした位置の数を得て、このマッチした位置の数を参照配列における位置の総数（即ち、ウィンドウサイズ）で割り、この結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算される。
【００９５】
当業者であれば、遺伝コードの縮重の結果として、本明細書に記載されているプラスミン阻害ポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが認められよう。これらのポリヌクレオチドの一部は、本明細書に開示されているアミノ酸配列を有するプラスミン阻害ポリペプチドをコードする本来のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド配列に対し最小配列同一性を有する。にもかかわらず、コドン使用頻度の差により変動するポリヌクレオチドは、本開示により明確に考慮される。ある特定の実施形態において、哺乳動物による発現のためにコドン最適化された配列が、特に考慮される。
【００９６】
したがって、本発明の別の実施形態では、本明細書に記載されているプラスミン阻害ポリペプチドのバリアントおよび／または誘導体の調製のために、部位特異的変異誘発等、変異誘発アプローチを用いることができる。このアプローチにより、ポリペプチド配列における特異的な修飾は、これをコードする根底にあるポリヌクレオチドの変異誘発により行うことができる。このような技法は、配列バリアントを調製および検査するための単刀直入なアプローチ、例えば、１個または複数のヌクレオチド配列変化をポリヌクレオチドに導入することによる、前述の考慮のうち１種または複数の取り込みをもたらす。
【００９７】
部位特異的変異誘発は、所望の変異のＤＮＡ配列をコードする特異的オリゴヌクレオチド配列および十分な数の隣接ヌクレオチドを使用して、十分なサイズおよび配列複雑性のプライマー配列を用意して、横断しようとする欠失接合部の両側に安定的二重鎖を形成させることにより、変異体の産生を可能にする。変異は、選択されたポリヌクレオチド配列において用いて、ポリヌクレオチドそれ自体の特性を改善、変更、減少、修飾もしくは他の仕方で変化させる、および／またはコードされているポリペプチドの特性、活性、組成、安定性もしくは一次配列を変更することができる。
【００９８】
ある特定の実施形態では、ペプチドもしくはそのバリアントのプラスミン結合親和性またはプラスミン阻害効果等、コードされているポリペプチドの１種または複数の特性を変更するための、本明細書に開示されているプラスミン阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列またはそのバリアントの変異誘発が考慮される。部位特異的変異誘発の技法は、当業界周知であり、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの両方のバリアントを作製するために広く使用されている。例えば、部位特異的変異誘発は、多くの場合、ＤＮＡ分子の特異的部分を変更するために使用される。斯かる実施形態では、変更しようとする配列の接合部の両側における約５〜約１０残基を有する、典型的に約１４〜約２５ヌクレオチド前後の長さを含むプライマーが用いられる。
【００９９】
当業者であれば認めるであろうが、部位特異的変異誘発技法は、多くの場合、一本鎖および二本鎖型の両方で存するファージベクターを用いた。部位特異的変異誘発において有用な典型的なベクターは、Ｍ１３ファージ等、ベクターを含む。このようなファージは、簡便に市販されており、その使用は、当業者に一般に周知のものである。プラスミドからファージへと目的の遺伝子を移入するステップを排除する二本鎖プラスミドも、部位特異的変異誘発においてルーチンに用いられている。
【０１００】
一般に、本明細書に従った部位特異的変異誘発は、先ず、一本鎖ベクターを得る、またはその配列内に所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む二本鎖ベクターの２本の鎖を融解して離すことにより行われる。所望の変異した配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーが一般に合成により調製される。次に、変異を有する鎖の合成を完了するために、このプライマーを一本鎖ベクターとアニーリングさせ、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩクレノウ断片等、ＤＮＡ重合酵素に付す。これにより、一方の鎖が本来の非変異配列をコードし、第２の鎖が所望の変異を有するヘテロ二重鎖が形成される。次に、このヘテロ二重鎖ベクターを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞等、適切な細胞を形質転換し、変異した配列配置を有する組換えベクターを含むクローンを選択する。
【０１０１】
部位特異的変異誘発を使用した選択されたペプチドコードＤＮＡセグメントの配列バリアントの調製は、潜在的に有用な化学種を産生する手段を提供し、ペプチドおよびこれをコードするＤＮＡ配列の配列バリアントを得ることができる他の仕方が存在することから、これが限定的であるとは意図されない。例えば、所望のペプチド配列をコードする組換えベクターをヒドロキシルアミン等、変異誘発物質で処理して、配列バリアントを得ることができる。このような方法およびプロトコールに関する特異的な詳細は、この目的のために参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれる、Ｍａｌｏｙら、１９９４年；Ｓｅｇａｌ、１９７６年；ＰｒｏｋｏｐおよびＢａｊｐａｉ、１９９１年；Ｋｕｂｙ、１９９４年；およびＭａｎｉａｔｉｓら、１９８２年の教示するところに見出すことができる。
【０１０２】
本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド指定変異誘発法」は、その初期濃度と比べて特異的核酸分子の濃度の増加または増幅等の検出可能シグナルの濃度の増加をもたらす、鋳型依存性過程およびベクター媒介性繁殖を指す。本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド指定変異誘発法」は、プライマー分子の鋳型依存性延長に関与する過程を指すよう企図される。用語、鋳型依存性過程は、新たに合成された核酸鎖の配列が、相補的塩基対形成の周知の規則（例えば、Ｗａｔｓｏｎ、１９８７年を参照）によって検出される、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子の核酸合成を指す。典型的には、ベクター媒介性方法論は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターへの核酸断片の導入、ベクターのクローン増幅および増幅された核酸断片の回収に関与する。斯かる方法論の例は、参照によりその内容全体が本明細書に明確に組み込まれる米国特許第４，２３７，２２４号によって提供される。
【０１０３】
ポリペプチドバリアントの産生のための別のアプローチでは、米国特許第５，８３７，４５８号に記載されている再帰的配列組換えを用いることができる。このアプローチでは、組換えおよびスクリーニングまたは選択の繰り返しサイクルが行われて、例えば、プラスミンに対する増加した結合親和性を有する個々のポリヌクレオチドバリアントを「進化」させる。ある特定の実施形態は、本明細書に記載されている少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む、プラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態の構築物も提供する。
【０１０４】
ある特定の関連する実施形態において、本明細書に記載されている１種または複数の構築物を含む組換え宿主細胞；プラスミン阻害ポリペプチドまたはそのバリアントをコードする核酸；およびコードされた産物を産生する方法であって、そのコード核酸からの発現を含む方法が提供される。発現は、核酸を含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することにより簡便に達成することができる。発現による産生後に、プラスミン阻害ポリペプチドは、いずれかの適した技法を使用して単離および／または精製し、続いて望む通りに使用することができる。
【０１０５】
種々の異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のための系は、周知のものである。適した宿主細胞は、細菌、哺乳動物細胞、酵母およびバキュロウイルス系を含む。異種ポリペプチドの発現のために当業界において利用できる哺乳動物細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウスメラノーマ細胞およびその他多数を含む。一般的な好ましい細菌宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
【０１０６】
Ｅ．ｃｏｌｉ等、原核細胞におけるペプチドの発現は、当業界において十分に確立されている。総説に関して、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ａ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９巻：５４５〜５５１頁（１９９１年）を参照されたい。組換えポリペプチドの産生のための選択肢として、培養下の真核細胞における発現も当業者には利用でき、最近の総説、例えば、Ｒｅｆ（１９９３年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．４巻：５７３〜５７６頁；Ｔｒｉｌｌら（１９９５年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ６巻：５５３〜５６０頁を参照されたい。
【０１０７】
必要に応じてプロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の配列を含む適切な調節配列を含有する、適したベクターを選ぶまたは構築することができる。ベクターは、必要に応じてプラスミド、ウイルス、例えば、ファージまたはファージミドとなり得る。さらなる詳細に関して、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。例えば、核酸構築物の調製における核酸の操作、変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入および遺伝子発現ならびにタンパク質の解析のための多くの公知の技法よびプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９２年またはその後のアップデート版に詳細に記載されている。
【０１０８】
用語「宿主細胞」は、本明細書に記載されている免疫調節性ポリペプチドのうち１種または複数をコードする核酸配列が導入されたまたは導入することができ、いずれかの本明細書に記載されているプラスミン阻害ポリペプチドをコードする遺伝子等、選択された目的の遺伝子をさらに発現するまたは発現することができる細胞を指すよう使用される。この用語は、選択された遺伝子が存在する限り、後代が本来の親と形態または遺伝的構成が同一であるか否かにかかわらず、親細胞の後代を含む。したがって、斯かる核酸を宿主細胞に導入するステップを含む方法も考慮される。導入は、いかなる利用できる技法を用いてもよい。真核細胞のため、適した技法は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性トランスフェクションおよびレトロウイルスもしくは他のウイルス、例えば、ワクシニアまたは昆虫細胞に対してはバキュロウイルスを使用した形質導入を含むことができる。細菌細胞のため、適した技法は、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーションおよびバクテリオファージを使用したトランスフェクションを含むことができる。導入に続き、例えば、遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を培養することにより、核酸からの発現を引き起こすまたはもたらすことができる。一実施形態では、核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）中に組み込まれる。組み込みは、標準技法に従って、ゲノムとの組換えを促進する配列の包接により促進され得る。
【０１０９】
本発明は、ある特定の実施形態では、本明細書に記載されているプラスミン阻害ポリペプチド等、特定のポリペプチドを発現させるために、上に記述されている構築物を発現系において使用するステップを含む方法も提供する。用語「形質導入」は、通常、ファージによる、ある細菌から別の細菌への遺伝子の移入を指すように使用される。「形質導入」は、レトロウイルスによる真核細胞配列の取得および移入も指す。用語「トランスフェクション」は、細胞による外来性または外因性ＤＮＡの取り込みを指すように使用されており、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入された場合、細胞は「トランスフェクト」されている。多数のトランスフェクション技法は、当業界周知であり、本明細書に開示されている。例えば、Ｇｒａｈａｍら、１９７３年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２巻：４５６頁；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｄａｖｉｓら、１９８６年、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；およびＣｈｕら、１９８１年、Ｇｅｎｅ  １３巻：１９７頁を参照されたい。斯かる技法を使用して、適した宿主細胞に１種または複数の外因性ＤＮＡ部分を導入することができる。
【０１１０】
用語「形質転換」は、本明細書において、細胞の遺伝的特徴の変化を指し、細胞は、新たなＤＮＡを含有するよう改変された場合、形質転換されている。例えば、細胞は、そのネイティブ状態から遺伝子改変される場合、形質転換される。トランスフェクションまたは形質導入後に、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体へと物理的に組み込むことにより、細胞のＤＮＡと組換えることができ、または複製されることのないエピソームエレメントとして一過的に維持することができ、またはプラスミドとして独立して複製することができる。細胞の分裂に伴い該ＤＮＡが複製される場合、細胞は、安定的に形質転換されたと考慮される。用語「天然起源」または「ネイティブ」は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞その他等の生物学的材料に関連して使用される場合、天然において見出され、ヒトによって操作されていない材料を指す。同様に、「非天然起源」または「非ネイティブ」は、本明細書において、天然において見出されず、ヒトによって構造的に改変または合成された材料を指す。
【０１１１】
ある特定の実施形態は、「ノックアウト」動物の作製に使用することができる、またはプラスミン阻害ポリペプチドの産生に使用することができる、本明細書に記載されているプラスミン阻害ポリペプチドのうち１種または複数をコードするポリヌクレオチド等、１種または複数の核酸分子（複数可）を含むトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物も考慮する。使用することができるトランスジェニック動物のいくつかの例として、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、ラット、マウス、ウサギ、ハムスターまたは他の動物が挙げられる。トランスジェニック動物は、キメラ、非キメラヘテロ接合体または非キメラホモ接合体となり得る（例えば、Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９年）；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ（２０００年）；Ｐｉｎｋｅｒｔ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９年）を参照）。
【０１１２】
がん
同様に上に記されている通り、ある特定のここに開示されている実施形態は、多数の固形および／または悪性腫瘍、例えば、肺がん、乳がん、前立腺がんまたは結腸がん等、望ましくないプラスミン活性および／またはプラスミン過剰発現の直接的または間接的帰結であるところの、有害な、そうでなければ不適切なタンパク分解によって特徴付けられるがんであることが知られたまたはそのリスクが疑われる被験体におけるがん進行を防止もしくは減弱化するためまたは転移を遮断するための方法を対象とする。ある特定の例証的な例が、特定の種類のがんを参照しつつ本明細書に記載されているが、本発明は、このように限定されるようには企図されず、有害プラスミン活性によって特徴付けられる他のがんの処置における使用を見出すこともできる。
【０１１３】
被験体におけるがんまたは悪性状態の存在は、当業界公知であり、それに従った徴候および症状および／またはリスク因子として、特定の種類のがんまたは悪性状態であるまたはそのリスク（またはその進行）が疑われると個体を同定することができる診断および分類のための基準が確立されている、例えば、新生物、腫瘍、非接触阻害または腫瘍形成的に形質転換された細胞その他（例えば、肺、乳、結腸もしくは前立腺がんまたは子宮内膜もしくは卵巣がん、または腺癌、腎細胞癌、扁平上皮癌、小細胞癌、燕麦細胞癌等の癌腫、軟骨肉腫、骨肉腫等の肉腫、メラノーマ）を含む、被験体における形成異常、がん性および／または形質転換された細胞の存在を指す（例えば、Ｒｏｕｌｓｔｏｎ，  Ｊ．Ｅ．およびＢａｒｔｌｅｔｔ，  Ｊ．Ｍ．Ｓ．（編）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（第２版）、２００４年、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ；Ｈａｙａｔ，  Ｍ．Ａ．（編）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ、２００７年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ｓｋａｒｉｎ、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２００２年、Ｍｏｓｂｙ／Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ；Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｒ．Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、２００４年、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ；等）。よって、上述および関連する基準は、公知であり、がん進行および転移または転移性疾患、即ち、組織または臓器における初期または原発性腫瘍部位から１個または複数の別個の続発性部位（そこで腫瘍細胞が留まり増殖して、被験体にとって有害な臨床帰結を有する続発性腫瘍を形成する）への１個または複数のがん細胞の拡散の決定をさらに含むことができる。
【０１１４】
本開示によって考慮されるある特定の実施形態では、例えば、斯かるがん細胞は、癌細胞等、新生物的に形質転換された上皮細胞である。ある特定の好ましい実施形態は、過剰なプラスミン活性および／または過剰発現が存在する組織における発生によって特徴付けられるがんの処置のための、本明細書に記載されている組成物および方法の適用を考慮する。
【０１１５】
例えば、固形腫瘍を形成するがんは、腫瘍−リンパ節−転移（ＴＮＭ）ステージ分類システム（例えば、Ｃｈａｎｇら、２００８年、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ５８巻：５４〜５９頁）に従ったグレード分け等、疾患の進行において認識されるステージに従って分類することができる。当業界で現在実施されている通り、がんの初期ステージは、疾患の進行における初期ステップを表し、現代の診療は、管理戦略としていわゆる「経過観察」を含む。「経過観察」において、疾患進行の定期的な評定が為されるが、がんが、根底にある基底膜を破壊することなく周囲の上皮によって限局されたままである限り、大規模な観血的手順（例えば、外科手術）は行われない。
【０１１６】
卵巣がん進行のために類似のステージ分類パラダイムが確立されており、例えば、世界産婦人科連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ）（ＦＩＧＯ）のパラダイムに従い、一般に、上皮卵巣がんステージＩ（卵巣内部位に限定されたがん細胞の発生）、ＩＩ（卵巣内プラス骨盤がん細胞）、ＩＩＩ（卵巣内、骨盤および腹部または近接領域部位に限定されたがん細胞の発生）およびＩＶ（ＩＩＩプラスがん部位として他の（遠位）臓器の関与）ならびに再発性卵巣がんが分類されている（ＴＮＭ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｔｕｍｏｕｒｓ、第６版、ＵＩＣＣ、２００２年）。子宮内膜がん進行は、同様の様式（例えば、ＮＩＨ／ＮＣＩ  ＰＤＱ（登録商標）がん情報データベース、国立がん研究所、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤを参照）におけるステージによっても分類されている：ステージＩ（子宮内のみにおけるがん細胞の発生に限局）、ＩＩ（子宮および子宮頸部において検出されるがん）、ＩＩＩ（子宮および子宮頸部を越えたが骨盤領域に制限されるがん細胞）およびＩＶ（膀胱、腸、腹部もしくは鼠径部リンパ節またはこれを越える部位を含む、骨盤を越えて検出されるがん）。
【０１１７】
腎細胞癌進行も、ＴＮＭステージ分類システム（対がん米国合同委員会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ）（ＡＪＣＣ）、ＴＮＭ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｔｕｍｏｕｒｓ、第６版、ＵＩＣＣ、２００２年）に従って定義されてきた。したがって、ステージＩ腎細胞癌は、７センチメートル以下の直径の腎臓内腫瘍に関与し、ステージＩＩは、７センチメートルを上回る腎臓内腫瘍に関与し、ステージＩＩＩは、腎（ゲロタ（Ｇｅｒｏｔａ））筋膜へのおよび罹患腎臓近傍の１個のリンパ節までへの腫瘍の限局に関与し、ステージＩＶ腎癌において、がん細胞は、罹患腎臓近傍の２個以上のリンパ節または少なくとも１個の遠位部位におけるがんにより証明される通り、腎筋膜を越える組織に侵入している。
【０１１８】
浸潤性および／または転移性がん細胞を含有するがん性組織を除去するための外科的介入の後遺症の多くは、望ましくないがしばしば不可避な副作用を含むため、ある特定の本明細書に開示されている実施形態において、浸潤性および／または転移性ステージへのがんの進行を防止する、即ち、「経過観察」状態を維持する処置により、がん進行を防止もしくは減弱するまたは転移を遮断することが望ましくなり得る。したがって、理論に制約されることは望まず、ある特定の本明細書に開示されている実施形態は、がん進行に干渉し、これにより外科手術の必要を妨げる様式で、本明細書に開示されているプラスミン阻害ポリペプチドのうち１種または複数を投与することによる、斯かる前浸潤性、前転移性ステージにおける被験体のがんの維持に関する。
【０１１９】
よって、関連する実施形態では、プラスミン活性の阻害に十分な条件下でかつ十分な時間にわたり、本明細書に提供されている治療有効量のプラスミン阻害ポリペプチドを投与するステップを含む、プラスミン活性を阻害する方法が提供される。上述および関連する実施形態では、例えば、プラスミン阻害ポリペプチドの存在下における検出可能セリンプロテアーゼ基質（例えば、発色性基質）のプラスミンによる酵素切断のレベルとは異なる（統計的有意性により）、プラスミン阻害ポリペプチドの非存在下における検出可能セリンプロテアーゼ基質（例えば、発色性基質）のプラスミンによる酵素切断のレベルを検出することにより、プラスミン阻害ポリペプチドによりプラスミンのタンパク質分解活性の阻害を決定することがさらに考慮され得る。
【０１２０】
タンパク質分解からのタンパク質の保護
本開示のある特定の明確に考慮される実施形態は、特定の実施形態においてセリンプロテアーゼとなり得る、プロテアーゼまたはプロテイナーゼ等、タンパク質分解酵素によるタンパク質分解からタンパク質を保護するための、本明細書に記載されているプラスミン阻害ポリペプチドのうちいずれか１種または複数の使用を対象とする。したがって、種々の公知または考慮される過程のいずれかにおいて、本プラスミン阻害ポリペプチドのうち１種または複数を含むことによる、タンパク質分解を阻害するまたは実質的に低下させるための（例えば、阻害剤が存在しない場合に検出可能なタンパク質分解と比べて、統計的に有意な様式での減少）数多くの方法が提供される。当業者であれば、プロテアーゼによる望ましくない分解から有益に保護される、多種多様なタンパク質およびタンパク質産物に気付くであろう。このような当業者は、タンパク分解が存在するか決定し、本プラスミン阻害ポリペプチドのうちいずれか１種または複数が、斯かるタンパク分解の阻害または実質的な低下に有効となり得るかさらに決定するための広範な公知の酵素的、生化学的および他のアッセイにも気付くであろう。
【０１２１】
本プラスミン阻害ポリペプチドの斯かる有益な使用の例として、所望のタンパク質産物の発現が行われる細胞培養における；生体試料を含む天然の供給源および細胞培養物からタンパク質を精製する際に；ならびに、そのままではプラスミン、トリプシンおよび他のプロテアーゼにより分解性となり得るタンパク質の発現に使用されるトランスジェニック動物の乳汁における、タンパク分解を防止するためのその包接が挙げられる。よって、上述および関連する実施形態は、研究、製造、産業および他の状況における適用を見出すであろう。
【０１２２】
カルボキシ末端リシン（複数可）を有するプラスミン阻害ポリペプチドを精製するための活性部位不活性化プラスミン
本明細書に記載されている通り、多数の本プラスミン阻害ポリペプチドは、カルボキシ末端にアミノ酸リシンを有するＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド配列を含む。理論に制約されることは望まず、本明細書に記載されている本プラスミン阻害ポリペプチドのプラスミン結合、プラスミン阻害および阻害剤−プラスミン相互作用特性を考慮すると、このようなポリペプチドにおけるカルボキシ末端リシン残基が、プラスミン阻害ポリペプチドの機能活性に寄与することが考えられる。特に、また、さらに、非限定的な理論によると、カルボキシ末端リシンは、プラスミン酵素活性部位とは空間的および機能的に別個であるリシン結合部位を介したプラスミンへのプラスミン阻害ポリペプチドの結合を可能にするまたは促進すると思われる。このようにして、ある特定の本明細書に記載されているプラスミン阻害ポリペプチドに存在するカルボキシ末端リシン残基は、プラスミン阻害ポリペプチドに別個のプラスミン結合特性を付与し、この結合は、フィブリンへのプラスミン結合に干渉することもできる。よって、本プラスミン阻害ポリペプチドの二重反応性は、一部には、配列番号１９の未変更のＴＦＰＩ−２  ＫＤ１配列における１１位および１７位に対応する、本明細書に記載されているポリペプチド（例えば、配列番号３〜１８、２２〜２９および３２〜３５）における変更されたアミノ酸残基を介したプラスミン活性部位の直接的阻害として、また、一部には、Ｃ末端リシンを介したプラスミノーゲン／プラスミンにおけるリシン結合部位へのプラスミン阻害ポリペプチドの結合として顕在化され得る。
【０１２３】
したがって、本開示は、プラスミンに対する本明細書に記載されているプラスミン阻害ポリペプチドの結合親和性と、特定の実施形態では、プラスミンにおけるリシン結合部位とのカルボキシ末端リシン相互作用から生じる斯かる結合親和性が、これを用いてカルボキシ末端リシンを有するＫＤ１含有ポリペプチドを単離するための固定化された親和性リガンドとして、プラスミノーゲンまたは不活性化プラスミンを使用することにより活用され得る実施形態を想定する。
【０１２４】
例えば、プラスミノーゲンは、標準的な許容される手順に従ってリシン−セファロースカラムを使用して、期限切れの血液（または新鮮血）から得られる血漿から単離することができ、それによると、血漿をリシン−セファロースカラムに通し、そのクリングルドメインを介してプラスミノーゲンを捕捉する。カラムに非特異的に結合する血漿由来の不純物を、高塩バッファーで洗浄することにより除去し、続いて、結合したプラスミノーゲンを、競合的親和性リガンドとしてリシンを含有するバッファーにより特異的に溶出させる。次に、溶出したプラスミノーゲンを、リシンを含まない状態にし（例えば、透析または限外濾過または他の適した手段により）、任意選択で、これをプラスミンに変換するよう活性化させ、次に、クロロメチルケトン阻害剤（例えば、Ｄ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓクロロメチルケトン）等の公知の化学的阻害剤による処理により、その活性部位を遮断することができる。次に、プラスミノーゲンまたは遮断されたプラスミンを、標準方法、例えば、セファロース（Ｓｅｐａｒｈａｒｏｓｅ）の臭化シアン活性化に従って、セファロースまたは他の適した担体等の固相マトリックスにカップリングさせる。次に、プラスミノーゲン／プラスミンセファロースカラムを使用して、親和性相互作用により、カルボキシ末端リシンを有する野生型ＫＤ１含有ポリペプチドまたはカルボキシ末端リシンを有する本明細書に記載されているＫＤ１含有プラスミン阻害ポリペプチドのうちいずれか（例えば、配列番号３〜１８、２２〜２９および３２〜３５）を捕捉することができる。次に、結合したＫＤ１含有ポリペプチドは、ＫＤ１含有ポリペプチドのカルボキシ末端リシンおよびプラスミンのリシン結合部位の間の相互作用を破壊する、リシンを含有するバッファーと競合的に溶出される。次に、脱塩カラムまたは透析等、標準手順により、ＫＤ１含有ポリペプチドを濃縮し、調製物から遊離リシンを除去する。この方法または本開示に基づき当業者であれば明らかとなる関連する変種により、カルボキシ末端リシンを有する野生型ＫＤ１含有ポリペプチドまたはカルボキシ末端リシンを有する本明細書に記載されているＫＤ１含有プラスミン阻害ポリペプチド（例えば、配列番号３〜１８、２２〜２９および３２〜３５）のうちいずれかを得ることができ、次に、例えば、本明細書に記載されている方法のうちいずれかに従って、これを望む通りに使用することができる。
【０１２５】
医薬組成物および投与
本発明は、また、ある特定の実施形態では、本明細書に開示されているプラスミン阻害ポリペプチドを含有する医薬組成物に関する。一実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤中に、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトに投与されると、がん進行の防止もしくは減弱または転移の遮断に有効な量でプラスミン阻害ポリペプチドを含む。他の実施形態では、医薬組成物は、例えば、本明細書に開示されている有効量のプラスミン阻害ポリペプチドを被験体に投与するステップを含む方法において、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤中に、プラスミン活性の阻害を必要とする被験体の処置に有効な量でプラスミン阻害ポリペプチドを含む。
【０１２６】
プラスミンの阻害の必要に関する疾患、障害および処置の例として、腫瘍形成、血管新生、骨リモデリング、外科手術、血友病、整形外科手術、冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ）および全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書に開示されている有効量のプラスミン阻害ポリペプチドを被験体に投与するステップを含む、それを必要とする被験体における関節リウマチを処置する方法も開示されている。他の状況における、例えば、抗線維素溶解性組成物として、およびプラスミン過量投与またはプラスミンもしくは他の関連するプロテアーゼの活性を直接的もしくは間接的に促進し得るｔＰＡもしくは他の血液学的活性物質の過量投与の解毒剤として出血を制御するための、本明細書に記載されているプラスミン阻害ポリペプチドを含む医薬組成物の使用も考慮されている。
【０１２７】
類似の有用性をもたらすための薬剤投与の許容される様式のいずれかにより、純粋形態のまたは適切な医薬組成物におけるプラスミン阻害ポリペプチドの投与を行うことができる。医薬組成物は、プラスミン阻害ポリペプチドを適切な薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせることにより調製することができ、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、注射、吸入剤、ゲル、マイクロスフェアおよびエアロゾル等、固体、半固体、液体または気体形態の調製物へと製剤化することができる。斯かる医薬組成物を投与する典型的な経路は、経口、外用、経皮、吸入、非経口、舌下、直腸、腟、鼻腔内、腹腔内、静脈内、動脈内、経皮、舌下、皮下、筋肉内、直腸、頬側経由（ｔｒａｎｓｂｕｃｃａｌ）、鼻腔内、リポソーム、吸入による、眼内（ｉｎｔｒａｏｃｃｕｌａｒ）、カテーテルによる（例えば、血管形成術における）、局所的送達による、皮下、脂肪組織内（ｉｎｔｒａａｄｉｐｏｓａｌ）、関節内またはくも膜下腔内を限定することなく含む。用語、非経口は、本明細書において、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）注射または注入技法を含む。医薬組成物は、患者への組成物の投与後に、それに含有される活性成分が生体利用可能となることができるように製剤化される。被験体または患者に投与される組成物は、１または複数の投薬量単位の形態を採り、例えば、錠剤は、単一投薬量単位となることができ、エアロゾル形態の本発明の化合物の容器は、複数の投薬量単位を保持することができる。斯かる剤形を調製する実際の方法は、公知のものである、または当業者には明らかとなるであろう；例えば、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００年）を参照されたい。投与されるべき組成物は、いかなる場合においても、本教示に従った目的の疾患または状態の処置のための治療有効量のプラスミン阻害ポリペプチドを含有するであろう。
【０１２８】
本明細書において有用な医薬組成物は、組成物を与えている個体に有害な抗体の産生をそれ自体は誘導しないいずれかの医薬品製剤を含み、過度の毒性なしで投与され得る、いずれかの適した希釈剤または賦形剤を含む、薬学的に許容される担体も含有する。薬学的に許容される担体として、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールその他等、液体が挙げられるがこれらに限定されない。薬学的に許容される担体、希釈剤および他の賦形剤に関する徹底的な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．、現行版）に示されている。
【０１２９】
医薬組成物は、固体または液体の形態となり得る。一態様では、組成物が、例えば、錠剤または粉末形態となることができるように、担体（複数可）は粒状である。担体（複数可）は液体となることができ、組成物は、例えば、吸入投与において有用な、例えば、経口シロップ、注射用液体またはエアロゾルである。経口投与を対象とする場合、医薬組成物は、好ましくは、固体または液体形態のいずれかであり、半固体、半液体、懸濁液およびゲル形態は、本明細書において固体または液体のいずれかと考慮される形態の内に含まれる。
【０１３０】
経口投与のための固体組成物として、医薬組成物は、粉末、顆粒、圧縮錠剤、丸薬、カプセル、チューインガム、ウエハーその他の形態へと製剤化することができる。斯かる固体組成物は、典型的に、１種または複数の不活性希釈剤または食用担体を含有するであろう。加えて、次のうち１種または複数が存在し得る：カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、トラガントガムまたはゼラチン等、結合剤；デンプン、ラクトースまたはデキストリン等、賦形剤；アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、コーンスターチその他等、崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｘ等、潤滑剤；コロイド性二酸化ケイ素等、流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）；スクロースまたはサッカリン等、甘味料；ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジフレーバー等、香味料；および着色料。
【０１３１】
医薬組成物が、カプセル、例えば、ゼラチンカプセルの形態である場合、これは、上述の種類の材料に加えて、ポリエチレングリコールまたは油等、液体担体を含有することができる。
【０１３２】
医薬組成物は、液体、例えば、エリキシル剤、シロップ、溶液、エマルションまたは懸濁液の形態となり得る。液体は、２例として、経口投与または注射による送達のためのものとなり得る。経口投与を対象とする場合、好ましい組成物は、本化合物に加えて、甘味料、保存料、色素／着色剤および風味増強剤のうち１種または複数を含有する。注射による投与を企図する組成物において、界面活性剤、保存料、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、バッファー、安定剤および等張剤のうち１種または複数が含まれ得る。
【０１３３】
溶液であれ、懸濁液であれ他の同様の形態であれ、液体医薬組成物は、次のアジュバントのうち１種または複数を含むことができる：注射用の水等の無菌希釈剤、生理食塩水溶液、好ましくは生理的食塩水、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウム、溶媒または懸濁化剤として機能し得る合成モノまたはジグリセリド等の固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗細菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤；アセテート、シトレートまたはホスフェート等のバッファー、および塩化ナトリウムまたはデキストロース等の浸透圧の調整のための薬剤。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアルに封入することができる。生理的食塩水が好ましいアジュバントである。注射用医薬組成物は、好ましくは無菌である。
【０１３４】
非経口または経口投与のいずれかを対象とする液体医薬組成物は、適した投薬量が得られるような、プラスミン阻害ポリペプチドの量を含有するべきである。典型的には、この量は、組成物におけるプラスミン阻害ポリペプチドの少なくとも０．０１％である。経口投与を対象とする場合、この量は、組成物の重量の０．１〜約７０％の間となるよう変動され得る。好ましい経口医薬組成物は、約４％〜約５０％の間のプラスミン阻害ポリペプチドを含有する。本発明に係る好ましい医薬組成物および調製物は、非経口投薬量単位が、０．０１〜１０重量％のプラスミン阻害ポリペプチドを含有するように調製される。
【０１３５】
医薬組成物は、外用投与を対象とすることができ、この場合、担体は、溶液、エマルション、軟膏またはゲル基剤を適宜含むことができる。基剤は、例えば、次のうち１種または複数を含むことができる：ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜ろう、鉱物油、水およびアルコール等の希釈剤ならびに乳化剤および安定剤。外用投与のための医薬組成物に増粘剤が存在していてもよい。経皮投与を対象とする場合、組成物は、経皮パッチまたはイオン泳動装置を含むことができる。外用製剤は、約０．１〜約１０％ｗ／ｖ（単位容量当たりの重量）のプラスミン阻害ポリペプチドの濃度を含有することができる。
【０１３６】
特に、ある特定の実施形態は、フィブリノーゲンパッチまたはフィブリノーゲン含有パッチ等、止血を促進するためのパッチへの本明細書に開示されているプラスミン阻害ポリペプチドの製剤化を考慮する。斯かるパッチは、例えば、大きな創傷部位における多数の記載されている適用のうちいずれかにおける使用を見出すことができる。種々の外用および他の止血パッチが公知であり（例えば、Ｅｒｄｏｇａｎら、２００８年、Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔ．  Ｒｅｓ．  Ｂ  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｍａｔ．８５巻：２７２頁；Ｓｐｏｔｎｉｔｚら、２０１２年、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ５２巻：２２４３頁；Ｓｃｈｕｅｔｚら、２００４年、Ａｎｎ．  Ｔｈｏｒａｃ．  Ｓｕｒｇ．７８巻：５６９頁；ｖａｎ  ｄｅ  Ｗａｌｌｅら、２０１２年、Ａｃｔａ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒ．８巻：４０８０頁）、そのようなものとして、当業者であれば、本明細書における教示に基づき、斯かるパッチへのここに開示されているプラスミン阻害ポリペプチドの取り込みを容易に想定することができる。
【０１３７】
本医薬組成物は、他の実施形態において、例えば、直腸内で融解し、プラスミン阻害ポリペプチドを放出する坐剤の形態における、直腸投与を対象とすることができる。直腸投与のための組成物は、適した非刺激性賦形剤として油性基剤を含有することができる。斯かる基剤は、ラノリン、ココアバターおよびポリエチレングリコールを限定することなく含む。
【０１３８】
本明細書に提供されているプラスミン阻害ポリペプチドを含む本医薬組成物は、固体または液体投薬量単位の物理的形態を修飾する様々な材料を含むこともできる。例えば、組成物は、活性成分の周りにコーティング殻を形成する材料を含ことができる。コーティング殻を形成する材料は、典型的に、不活性であり、例えば、糖、セラックおよび他の腸溶コーティング剤から選択することができる。あるいは、活性成分は、ゼラチンカプセルに包むことができる。固体または液体形態の医薬組成物は、プラスミン阻害ポリペプチドに結合する薬剤を含み、これにより、ポリペプチドの送達に役立つことができる。この能力において作用し得る適した薬剤は、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、タンパク質またはリポソームを含む。
【０１３９】
医薬組成物は、エアロゾルとして投与することができる投薬量単位からなることができる。用語、エアロゾルは、コロイド性質の系から加圧パッケージからなる系に及ぶ種々の系を示すように使用される。送達は、液化もしくは圧縮ガスによってまたは活性成分を分注する適したポンプ系によって為され得る。エアロゾルは、活性成分（複数可）を送達するために、単一相、二相性または三相性の系において送達することができる。エアロゾルの送達は、一体にキットを形成し得る、必要な容器、アクチベーター、バルブ、サブ容器その他を含む。当業者であれば、過度の実験を行うことなく、好ましいエアロゾルを決定することができる。
【０１４０】
本医薬組成物は、製薬技術分野において周知の方法論によって調製することができる。例えば、注射による投与が企図される医薬組成物は、溶液を形成することができるように、プラスミン阻害ポリペプチドを無菌蒸留水ならびに任意選択で適した安定化剤、溶質および／または浸透圧調節物質と組み合わせることにより調製することができる。界面活性剤を添加して、均一な溶液または懸濁液の形成を容易にすることができる。界面活性剤は、水性送達系におけるポリペプチドの溶解または均一な懸濁を容易にすることができるように、プラスミン阻害ポリペプチドと非共有結合的に相互作用する化合物である。
【０１４１】
プラスミン阻害ポリペプチドは、治療有効量で投与され、これは、特異的ポリペプチドの活性；プラスミン阻害ポリペプチドの作用の代謝的安定性および長さ；患者の年齢、体重、全体的な健康、性別および食事；投与の様式および時間；排泄率；薬物組合せ；特定の障害または状態の重症度；ならびに治療法を受けている被験体を含む種々の因子に応じて変動する。一般に、治療的有効１日用量は（７０Ｋｇ哺乳動物に対し）、約０．００１ｍｇ／Ｋｇ（即ち、０．０７ｍｇ）〜約１００ｍｇ／Ｋｇ（即ち、７．０ｇ）であり；好ましくは、治療的有効用量は（７０Ｋｇ哺乳動物に対し）、約０．０１ｍｇ／Ｋｇ（即ち、０．７ｍｇ）〜約５０ｍｇ／Ｋｇ（即ち、３．５ｇ）であり；より好ましくは、治療的有効用量は（７０Ｋｇ哺乳動物に対し）、約１ｍｇ／ｋｇ（即ち、７０ｍｇ）〜約２５ｍｇ／Ｋｇ（即ち、１．７５ｇ）である。
【０１４２】
本明細書に提供されている有効用量の範囲は、限定を企図することなく、好ましい用量範囲を表す。しかし、最も好ましい投薬量は、関連する当業者によって理解され、決定することができる通り、個々の被験体に合わされるであろう（例えば、Ｂｅｒｋｏｗら編、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ、第１６版、Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．、１９９２年；Ｇｏｏｄｍａｎら編、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１０版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｅｌｍｓｆｏｒｄ、Ｎ．Ｙ．（２００１年）；Ａｖｅｒｙ’ｓ  Ｄｒｕｇ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第３版、ＡＤＩＳ  Ｐｒｅｓｓ，  ＬＴＤ．、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ．（１９８７年）、Ｅｂａｄｉ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ｌｉｔｔｌｅ，  Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｂｏｓｔｏｎ（１９８５年）；Ｏｓｏｌｃｉら（ａｌ．）編、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９９０年）；Ｋａｔｚｕｎｇ、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ（１９９２年）を参照）。
【０１４３】
各処置に必要とされる総用量は、必要に応じて１日の経過にわたり、複数用量または単一用量で投与することができる。一般に、処置は、プラスミン阻害ポリペプチドの最適用量未満である、より少ない投薬量から開始される。その後、この状況下での最適効果に達するまで、投薬量は僅かな増分で増加される。プラスミン阻害ポリペプチドは、単独で、または病態を対象とするもしくは病態の他の症状を対象とする他の診断品および／もしくは医薬品と併せて投与することができる。プラスミン阻害ポリペプチドの投与のレシピエントは、哺乳動物等、いずれかの脊椎動物となり得る。哺乳動物の中で、好ましいレシピエントは、Ｐｒｉｍａｔｅ目（ヒト、類人猿およびサルを含む）、Ａｒｔｅｒｉｏｄａｃｔｙｌａ目（ウマ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、ブタを含む）、Ｒｏｄｅｎｔａ目（マウス、ラット、ウサギおよびハムスターを含む）およびＣａｒｎｉｖｏｒａ目（ネコおよびイヌを含む）の哺乳動物である。鳥類の中で、好ましいレシピエントは、シチメンチョウ、ニワトリおよび同じ目の他の種類である。最も好ましいレシピエントはヒトである。
【０１４４】
外用適用のため、標的区域、例えば、皮膚表面、粘膜および処置しようとする組織に隣接するその他の区域に、プラスミン阻害ポリペプチドを含有する有効量の本医薬組成物を投与することが好ましい。この量は、一般に、処置しようとする区域、使用が診断であるか予防であるか治療法であるか、症状の重症度および用いた外用媒体の性質に応じて、適用当たり約０．０００１ｍｇ〜約１ｇのプラスミン阻害ポリペプチドに及ぶであろう。好ましい外用調製物は、軟膏であり、軟膏基剤１ｃｃ当たり約０．００１〜約５０ｍｇの活性成分が使用されている。医薬組成物は、経皮組成物または経皮送達装置（「パッチ」）として製剤化することができる。斯かる組成物は、例えば、バッキング（ｂａｃｋｉｎｇ）、活性化合物リザーバ、制御膜、ライナーおよび接触接着剤を含む。斯かる経皮パッチは、望み通り本プラスミン阻害ポリペプチドの連続的拍動性またはオンデマンド送達をもたらすために使用することができる。
【０１４５】
プラスミン阻害ポリペプチドは、当業界公知の手順を用いることにより、患者への投与後に活性成分の迅速な、持続性のまたは遅延した放出をもたらすよう製剤化することができる。放出制御薬物送達系は、ポリマーコーティングされたリザーバまたは薬物−ポリマーマトリックス製剤を含有する、浸透圧ポンプ系および溶解性の系を含む。放出制御系の例は、これら全て参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第３，８４５，７７０号および同第４，３２６，５２５号ならびにＰ．  Ｊ．  Ｋｕｚｍａら、Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ  ２２巻（６号）：５４３〜５５１頁（１９９７年）に示す。
【０１４６】
プラスミン阻害ポリペプチドは、局所的、全身性および鼻から脳への医学療法のために、鼻腔内薬物送達系により送達することもできる。Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ（ＣＰＤ）（商標）技術、伝統的点鼻薬ボトル、インヘラーまたはネブライザーは、嗅部および副鼻腔を標的化することにより、薬物の有効な局所的および全身性送達をもたらすことが当業者に公知である。
【０１４７】
ある特定の実施形態は、また、ヒトまたは動物の雌への投与に適した腟内殻またはコア薬物送達装置に関する。この装置は、鞘に囲まれた、ポリマーマトリックスにおける活性医薬品成分で構成されてよく、ＰＣＴ公開特許番号ＷＯ９８／５００１６に記載されているテストステロンの適用に使用されている装置と同様に、毎日実質的にゼロ次パターンでプラスミン阻害ポリペプチドを放出することができる。
【０１４８】
眼内送達のための現在の方法は、外用投与（点眼）、結膜下注射、眼周囲注射、硝子体内注射、外科的植え込みおよびイオン泳動（僅かな電流を使用して、体組織へとおよびそれを通してイオン化された薬物を輸送する）を含む。当業者であれば、安全かつ有効な眼内投与のために、プラスミン阻害ポリペプチドと最良の適した賦形剤を組み合わせるであろう。
【０１４９】
最も適した経路は、処置されている状態性質および重症度に依存するであろう。当業者は、投与方法（例えば、経口、静脈内、吸入、皮下、直腸等）、剤形、適した医薬品賦形剤およびプラスミン活性の阻害を必要とする被験体へのプラスミン阻害ポリペプチドの送達に関連する他の事項の決定にも精通している。
【０１５０】
様々な考慮されている実施形態において、プラスミン活性の阻害を必要とする被験体は、がん（例えば、肺、乳、前立腺もしくは結腸がん等の固形腫瘍または別のがん）、血友病、関節リウマチもしくは全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）である、もしくはそうであるリスクが疑われる被験体であってもよく、または被験体は、血管新生、骨リモデリングもしくは冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ）を必要とする、もしくはそれを受けた被験体であってもよい。被験体は、外科手術を受けた被験体であってもよく、または外科手術、例えば、心血管外科手術、腫瘍学的外科手術、尿生殖器外科手術、整形外科手術、胸部外科手術、形成外科手術、外傷外科手術、腹部外科手術、移植外科手術、神経学的外科手術または耳鼻科学的外科手術を最近（例えば、１、２、４、６、８、１０、１２もしくは２４時間以内または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０日間以内に）受けた被験体であってもよい。
【０１５１】
関連する技術分野の当業者は、本明細書に記載されている医薬組成物の投与を適応することができる、数多の診断的、外科的および他の臨床基準に精通しているであろう。例えば、Ｈｕｍａｒら、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００６年、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；Ｋｕｏら、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００４年、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｇｒｕｅｓｓｎｅｒら、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｄｏｎｏｒ  Ｏｒｇａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００７年、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ；Ａｎｔｉｎら、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００９年、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｗｉｎｇａｒｄら（編）、Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：  Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ、２００９年、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋｓ；Ｓａｂｉｓｔｏｎ、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ、２０１２年、Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ＆  Ｃｏ．；Ｍｕｌｈｏｌｌａｎｄ、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ’ｓ  Ｓｕｒｇｅｒｙ、２０１０年、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ、２００９年、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ；Ｌａｗｒｅｎｃｅ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｕｒｇｅｒｙ、２０１２年、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓを参照されたい。
【０１５２】
本発明のいくつかの実施形態の実施が、それとは反対のことが特に示されていなければ、ウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技法における従来方法を当業者の技能範囲内で用いることが認められ、その多くについて例証目的のために後述する。斯かる技法は、文献中で十分に説明されている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｒ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（２００９年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９５年；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１年）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２年）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉ＆ＩＩ巻（Ｄ．  Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．  Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５年）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６年）；Ｐｅｒｂａｌ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）および他の同様の参考文献を参照されたい。
【０１５３】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成および組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために標準技法を使用することができる。酵素反応および精製技法は、メーカーの明細書に従って、または当業界で一般的に達成される通りに、または本明細書に記載されている通りに行うことができる。上述および関連する技法および手順は、一般に、当業界周知の従来方法に従って、また、本明細書を通して引用および記述されている様々な一般およびより特異的な参考文献に記載されている通りに行うことができる。特異的な定義が提示されていなければ、本明細書に記載されている分子生物学、分析化学、合成有機化学ならびに薬用および医薬品化学に関連して利用されている命名法ならびにその実験検査手順および技法は、当業界周知であり、一般的に使用されている。組換え技術、分子生物学的、微生物学、化学合成、化学分析、医薬品調製、製剤および送達ならびに患者処置のために標準技法を使用することができる。
【０１５４】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されている通り、単数形（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、内容がそれ以外のことを明らかに指示しない限り、複数の参照を含む。本明細書を通して、文脈上それ以外のことが要求されていない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変化形は、記述されている要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の包接を示すが、他のいかなる要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の除外も示すものではないことが理解されるであろう。本明細書における各実施形態は、それ以外のことが明確に記述されていない限り、他のあらゆる実施形態に準用されるものと予想される。
【０１５５】
均等物
本発明の特定のステップ、要素、実施形態および適用を例証目的で本明細書に示し、記載してきたが、特に、前述の教示を踏まえつつ、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者によって修正を行うことができるため、当然ながら、本発明がこれらに限定されないことが理解されるであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によるものを除き、限定されない。
【０１５６】
以下の実施例は、限定ではなく例証のために記載される。
【実施例】
【０１５７】
（実施例１）
プラスミン阻害ポリペプチドの阻害活性
本開示に係るプラスミン阻害ポリペプチドを、ヒト組織因子経路阻害剤−２の第１のクニッツドメイン（ＫＤ１）のコード配列の部位特異的変異誘発により遺伝子操作し、組換え技法を使用してＥ．ｃｏｌｉで発現させ、本プラスミン阻害ポリペプチド配列が初めて本明細書に開示されていることを除き、基本的に確立された方法論（Ｂａｊａｊら、２０１１年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２８６巻：４３２９頁）に従って精製した。本実施例は、配列番号３および５に記載のアミノ酸配列を有するプラスミン阻害ポリペプチドの特徴付けについて記載する。
【０１５８】
記載されている（Ｂａｊａｊら、２０１１年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２８６巻：４３２９頁）プラスミン活性のアッセイにおいて、ヒトプラスミン（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｓｓｅｘ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ、ＶＴ）、プラスミン基質としてＨ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２２５１、Ｄｉａｐｈａｒｍａ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＯＨ）および変動濃度の表示のプラスミン阻害ポリペプチドを使用して、プラスミン阻害ポリペプチドによるプラスミン阻害を検査した。図１は、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むプラスミン阻害ポリペプチドによるプラスミン活性の阻害を示す。計算された阻害定数（Ｋｉ）は、２．３６ｎＭであった。配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むプラスミン阻害ポリペプチドによるプラスミン活性の阻害は、図２に示されている。計算された阻害定数（Ｋｉ）は、０．４９ｎＭであった。
【０１５９】
配列番号３を含むプラスミン阻害ポリペプチドも、可溶性ヒト組織因子（１００ｎＭ）および第ＶＩＩａ因子（５０ｎＭ）および発色性基質Ｓ−２２８８（Ｈ−Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド、Ｄｉａｐｈａｒｍａ）を使用したアッセイにおいて、基本的に記載通りに（Ｃｈａｎｄら、２００４年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７９巻：１７５００頁；Ｂａｊａｊら、２０１１年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２８６巻：４３２９頁）、第ＶＩＩａ因子−組織因子アミド分解活性の阻害に関して変動濃度で検査した。図３は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むプラスミン阻害ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｉｄｅ）の、第ＶＩＩａ因子−組織因子アミド分解活性における効果を示す。計算された阻害定数（Ｋｉ）は、５８６９．５ｎＭであった。
【０１６０】
図４は、第ＸＩａ因子アミド分解活性（黒丸）およびカリクレインアミド分解活性（白丸）の阻害のアッセイにおける、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むプラスミン阻害ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｉｄｅ）の効果を示す。これらのアッセイは、Ｂａｊａｊら、２０１１年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２８６巻：４３２９頁に記載されている手順に従って行った。
【０１６１】
Ｂａｊａｊら、２０１１年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２８６巻：４３２９頁に記載されている手順に従って、但し、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む本明細書に記載されているプラスミン阻害ポリペプチド（ＳＭ）および配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む本明細書に記載されているプラスミン阻害ポリペプチド（ＤＭ）およびアプロチニン（ＢＰＴＩ）の変動濃度を使用して、血漿凝固線維素溶解アッセイの凝固時間における効果も検査した。典型的な結果を図５に示す。
【０１６２】
（実施例２）
プラスミン阻害ポリペプチドのプラスミン阻害活性（ＡＣＩＶＩＴＩＥＳ）
実験の別個のセットにおいて、配列番号３、４、５および６に記載のアミノ酸配列を含む精製された組換えにより産生されたプラスミン阻害ポリペプチドを、基質としてＨ−Ｄ−バリル−ロイシル−リシンｐ−ニトロアニリン二塩酸塩（Ｓ２２５１、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ／Ｄｉａｐｈａｒｍａ）を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトプラスミン活性を阻害するこれらそれぞれの能力に関して検査した。陽性対照としてアプロチニンを使用した。プラスミン阻害剤をＴｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）において系列希釈し、０．１ｎＭ〜６０ｎＭに及ぶ最終濃度となるよう９６ウェルプレートのウェルに分配した。プラスミンを添加して、各反応において最終濃度１．２ｎＭを得た。ウェルを１時間、室温でインキュベートし、次にＳ２２５１を各ウェルに添加して、最終濃度３００μＭを達成し、プレートをさらに１時間３７℃でインキュベートした。基質からのｐ−ニトロアニリンの放出による４０５ｎｍにおける光学密度の変化の比率に基づき、プラスミン活性を計算した。次に、データを４パラメータロジスティック曲線に適合させて、見かけ上のＩＣ５０を決定した。２種の別個の実験を行い、試料毎にプラスミン阻害活性の別個の決定を行った。結果を表１に示す：
【０１６３】
【表１】
2016514459.tif 000003
（実施例３）
プラスミンへのプラスミン阻害ポリペプチドの直接的結合
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を行って、固定化されたプラスミンと、配列番号３、５および６を含む本明細書に記載されているプラスミン阻害ポリペプチドのそれぞれとの間の結合相互作用を特徴付けした。メーカーの説明書に従って、これらのアッセイのためにＢｉａＣｏｒｅ（商標）ＳＰＲ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。クロロメチルケトン阻害剤（例えば、Ｄ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓクロロメチルケトン二塩酸塩、ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）によりヒトプラスミンの活性部位を遮断し、ＢｉａＣｏｒｅ（商標）ＣＭ５チップ上に活性部位遮断プラスミンを固定化した。
【０１６４】
図６は、表面プラズモン共鳴アッセイにおける、固定化された活性部位遮断プラスミンへの、変動濃度（配列番号３および５は１、２、４、８および１０μＭ；配列番号６は１、２、４、８、１０および１２μＭ）のプラスミン阻害ポリペプチドによる結合を示す。上のパネル（６０Ａ）は、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むプラスミン阻害ポリペプチドの、プラスミンへの結合を示す。ＳＰＲにより親和性結合定数を１３０ｎＭであると決定した。中央のパネル（６０Ｂ）は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むプラスミン阻害ポリペプチドの、プラスミンへの結合を示す。ＳＰＲにより親和性結合定数を３１３ｎＭであると決定した。下のパネル（６３残基）は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むプラスミン阻害ポリペプチドの、プラスミンへの結合を示す。ＳＰＲにより親和性結合定数を２９０ｎＭであると決定した。表面プラズモン共鳴アッセイにおいて、アプロチニンは、活性部位遮断プラスミンに結合しなかった。全３種のプラスミン阻害ポリペプチドは、トラネキサム酸またはε−アミノカプロン酸よりも４〜８倍高い親和性でプラスミンに結合した。
【０１６５】
（実施例４）
プラスミンへのプラスミン阻害ポリペプチドのモデル化された結合
ヒトプラスミンクリングル１ドメインと、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する６３アミノ酸プラスミン阻害ポリペプチドとの間の相互作用も、記載されている方法論（Ｂａｊａｊら、２０１１年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２８６巻：４３２９頁）に従って三次元的にモデル化した。配列番号４において、ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド（アミノ酸５８〜６３）は、Ｘ３がＥであり、Ｘ４がＰである配列番号２に記載の配列Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ４−Ｋを有する。配列番号４の６０位におけるリシン残基の側鎖は、外向きであることが観察され、プラスミンおよびプラスミン阻害ポリペプチドの間の結合相互作用に干渉または寄与しない。配列番号４の６３位におけるリシン残基は、活性化されたＴＡＦＩ（トロンビン活性化された線維素溶解阻害剤）によりｉｎ  ｖｉｖｏで切断されることが予想され、これにより、Ｘ３がＥであり、Ｘ５がＰである配列番号２０に記載のＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド（アミノ酸５８〜６２）Ｉ−Ｘ３−Ｋ−Ｖ−Ｘ５を有する配列番号２５の６２アミノ酸プラスミン阻害ポリペプチドをもたらして、Ｃ末端配列ＩＥＫＶＰ（配列番号４０）を生じる。
【０１６６】
ヒトプラスミンクリングル１ドメインと、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する６０アミノ酸プラスミン阻害ポリペプチドとの間の相互作用も、記載されている方法論（Ｂａｊａｊら、２０１１年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２８６巻：４３２９頁）に従って三次元的にモデル化した。配列番号３において、ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド（アミノ酸５８〜６０）は、Ｘ３がＥである配列Ｉ−Ｘ３−Ｋ−を有する。この結合相互作用において、配列番号３の６０位におけるリシン残基の側鎖は、ヒトプラスミンクリングルドメインのリシン結合部位（ＬＳＢ）に適合することが観察された。このような相互作用は、ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチド（アミノ酸５８〜６２）が配列ＩＥＫＶＰ（配列番号４０；Ｘ３がＥであり、Ｘ５がＰである配列番号２０）を有する配列番号２５の６２アミノ酸プラスミン阻害ポリペプチドを使用してプラスミン相互作用をモデル化したときに観察されたものと類似している。
【０１６７】
非限定的な理論として、配列番号３の６０アミノ酸プラスミン阻害ポリペプチドからのＣ末端Ｋ６０のＴＡＦＩによる除去は、ヒトプラスミンクリングルドメインにおけるＬＳＢに結合する能力を持たない分子をもたらすと考えられる。対照的に、また、同様に上に記されている通り、代わりに、ＫＤ１カルボキシ領域ポリペプチドとしてＩＥＫ６０ＶＰＫ６３を有する配列番号４の６３アミノ酸プラスミン阻害ポリペプチドを用いて開始した場合、ＴＡＦＩによるＫ６３の除去は、依然として、プラスミンにおけるＬＳＢに結合するＫＤ１（Ｃ末端ＩＥＫＶＰ６２を有する）の能力を保持する、６２アミノ酸プラスミン阻害ポリペプチド（配列番号２５）をもたらすであろう。この６２アミノ酸プラスミン阻害ポリペプチド（配列番号２５）は、ＴＡＦＩの基質ではなく、したがって、プラスミンにおけるＬＳＢに結合するその潜在力を失わない。
【０１６８】
三次元的モデリング試験により、ヒト組織因子経路阻害剤−２（ＴＦＰＩ−２；配列番号１９）の野生型第１のクニッツ型プロテイナーゼ阻害剤ドメイン（ＫＤ１）と比べて、１７位におけるアルギニンによるロイシンの置換（Ｌ１７Ｒ）に加えた１１位におけるスレオニンによるチロシンの置換（例えば、配列番号３、４、１１、１５、２４、２５、３２、３３におけるＹ１１Ｔ）が、Ｌ１７Ｒ置換のみが為された場合（例えば、配列番号５、６、１２、２３における）に可能な相互作用と比べてプラスミンおよびプラスミン阻害ポリペプチドの間の相互作用を強化する、プラスミン阻害ポリペプチドおよびプラスミンの間の水素結合形成を可能にすることが明らかになった。
【０１６９】
したがって、また、前述を考慮して、６０アミノ酸（例えば、配列番号５）およびＬ１７Ｒ置換を含有する６３アミノ酸プラスミン阻害ポリペプチド（例えば、配列番号６）の両方が、プラスミン活性部位の阻害剤としての活性を有し、クリングルドメイン（複数可）におけるリシン結合部位（複数可）に結合し、プラスミンの阻害活性の２種の様式をもたらす。よって、両方の型が、二重活性を保有する。さらに、Ｋ６０が、その結果得られた６２アミノ酸型に残り、リシン結合部位と相互作用するため、６３アミノ酸型は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて活性化されたＴＡＦＩによるＣ末端Ｋ６３の除去後にリシン結合部位と相互作用するその能力を保持する。１１位における置換（例えば、配列番号３、例えば、Ｙ１１Ｔ）および１７位における置換（例えば、配列番号３、例えば、Ｌ１７Ｒ）の両方を含有する６０アミノ酸および６３アミノ酸プラスミン阻害ポリペプチドは、さらにより強力なプラスミン阻害剤であり、Ｃ末端リシンを介したプラスミノーゲン／プラスミンにおけるリシン結合部位への結合により二重に反応性である。
【０１７０】
（実施例５）
選択的クニッツ阻害ドメインを含有するデコイプラスミノーゲン受容体
本実施例は、Ｐ２’残基Ｌｅｕ１７（ウシ膵トリプシン阻害剤ナンバリング）がＡｒｇに変異した、約５倍改善された親和性によりプラスミンの活性部位を選択的に阻害する、組織因子経路阻害剤−２のクニッツドメイン１（ＫＤ１）について記載する。ＫＤ１変異体（Ｌｅｕ１７Ａｒｇ）のトロンビン切断（１：５０の酵素対基質比における２４時間延長されたインキュベーション）は、活性部位阻害機能に検出可能な変化がないインタクトなクニッツドメインを含有する、より小型の分子を生じた。ＮＨ２末端配列決定およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＥＳＩデータは、出発分子が、Ｃ末端バリンを有した（ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ）一方、より小型の分子が、Ｃ末端リシンを有した（ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ）ことを明らかにした。Ｃ末端リシンを有するＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴを、プラスミノーゲン活性化および作製されたプラスミンの活性部位の阻害を含む、プラスミノーゲン／プラスミンに対するデコイ受容体としての潜在的活性に関して試験した。
【０１７１】
表面プラズモン共鳴実験において、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）およびＧｌｕ−プラスミノーゲンは、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ（約０．２〜０．３μＭのＫｄ）に結合したが、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴに結合していない。さらに、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴは、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴよりも効率的にｔＰＡ誘導性血漿血餅線維素溶解を阻害した。その上、ε−アミノカプロン酸と比較して、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴは、線維素溶解性系が活性化されたマウス肝臓裂傷傷害モデルにおける失血量の低下においてより有効であった。マイクロ（μ）−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ複合体は、ホルボール−１２−ミリスチン酸−１３−アセテート刺激Ｕ９３７単球様細胞におけるウロキナーゼ誘導性プラスミノーゲン活性化を阻害したが、μ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ複合体は、この過程を阻害することができなかった。
【０１７２】
ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴは、プラスミンの活性部位を阻害し、プラスミノーゲン／プラスミンのクリングルドメイン（複数可）に対するデコイ受容体であった；したがって、これは、プラスミン生成およびプラスミン活性の両方を限定することができた。よって、二重機能を有するＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴは、ある特定の好ましい実施形態において、病理的過程におけるプラスミノーゲン活性化の制御に好ましい薬剤となり得る。
【０１７３】
実施例５において使用されている略語：ＢＰＴＩ、ウシ膵トリプシン阻害剤；ＢＳＡ、ウシ血清アルブミン；εＡＣＡ、ε−アミノカプロン酸；ＥＣＭ、細胞外マトリックス；ＦＸＩａ、第ＸＩａ因子；Ｇｌｕ−Ｐｌｇ、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン；ＨＢＳ／ＢＳＡ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、ｐＨ７．５を含有する５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ；ＨＢＳ−Ｐ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｐ２０、ｐＨ７．４を含有する２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ；ＩＩａ、トロンビン；ＩＰＴＧ、イソプロピルチオガラクトピラノシド；ＫＤ１、クニッツドメイン１；ＭＭＰ、マトリックスメタロプロテアーゼ；ＮＰＰ、正常プール血漿；ＰＡＩ−１、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−１；ＰＡＩ−２、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−２；ＰＭＡ、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート；Ｓ−２２５１、Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリド；Ｓ−２３６６、ピロＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド；ＳＰＲ、表面プラズモン共鳴；ＴＢＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５を含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；ＴＢＳ／ＢＳＡ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含有するＴＢＳ；ＴＥ、トラネキサム酸；ＴＦＰＩ−２、組織因子経路阻害剤−２；ｔＰＡ、組織プラスミノーゲンアクチベーター；ｐＫＬＫ、血漿カリクレイン；ｕＰＡ、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター。
【０１７４】
ＫＤ１およびＢＰＴＩ残基ナンバリング。ＫＤ１およびＢＰＴＩ残基Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２’は、ＳｃｈｅｃｈｔｅｒおよびＢｅｒｇｅｒ６５に従ってナンバリングされる。対応するサブサイトは、それぞれ酵素におけるＳ２、Ｓ１、Ｓ１’、Ｓ２’である。残基ナンバリングは、残基１５がＰ１位に存在し、残基１７がＰ２’位に存在するように、ＢＰＴＩに対応する。比較のために、ＫＤ１は、ＢＰＴＩにおける残基１５および１７が、それぞれＫＤ１における残基２４および２６に対応するように、ＢＰＴＩナンバリング方式を使用してナンバリングされる。よって、ＫＤ１における残基は、ＢＰＴＩとは９異なる。
【０１７５】
ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ命名。ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴは、ヒトＴＦＰＩ−２の残基１〜７３を含有する；これは、クローニングの際に導入された４個の追加的な残基（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ）もＮ末端に有する。これは、Ｃ末端残基バリンを有する６６。
【０１７６】
ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ命名。ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴのおよそ８０％は、残基８〜７２を含有し、残る２０％は、ヒトＴＦＰＩ−２の残基１０（ＢＰＴＩにおける残基１）〜７２を有する；これは、Ｃ末端残基リシンを有する。ここでは、これら２種をまとめてＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴと称する。
【０１７７】
プラスミンおよびＩＩａのプロテアーゼドメインのために、キモトリプシンアミノ酸ナンバリング方式が使用される。キモトリプシンナンバリングにおける残基１９５は、プラスミンにおける７４１およびＩＩａにおける５２５に対応する。同様に、キモトリプシンナンバリングにおける残基１８９は、プラスミンにおける７３５およびＩＩａにおける５１９に対応する。
【０１７８】
さらに短い背景として、プラスミンは、一本鎖不活性酵素原、プラスミノーゲンとして血液中を循環する多機能タンパク質分解酵素（ＭＷ９２，０００）である１。プラスミノーゲンは、体内で遍在的に発現されるが２、肝細胞は、その合成の優勢部位を表す３、４。循環するプラスミノーゲンは、ＮＨ２末端グルタミン酸（Ｇｌｕ−Ｐｌｇ）を有し、Ｐａｎ−ａｐｐｌｅドメイン、５個のクリングルドメインおよびカルボキシ末端潜在型セリンプロテアーゼドメインを含有する５。ネイティブプラスミノーゲンは、Ｐａｎ−ａｐｐｌｅドメインがクリングルドメイン５に結合した緊密な立体構造で存在する６、７。Ａｒｇ５６１−Ｖａｌ５６２の解離しやすい結合の切断により、一本鎖プラスミノーゲンは、ジスルフィド連結された２本の鎖の活性プロテアーゼプラスミンに変換される８、９。Ｇｌｕ−プラスミンの重鎖が、Ｐａｎ−ａｐｐｌｅドメインおよび５個のクリングルドメインからなる一方、軽鎖は、Ｃ末端プロテアーゼドメインを含有する９。プラスミノーゲンは、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）または組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）のいずれかにより活性化され得る９〜１１。自己触媒作用により、Ｐａｎ−ａｐｐｌｅドメインを欠くＬｙｓ−プラスミン（およびＬｙｓ−プラスミノーゲン）が生成される５、８。Ｐａｎ−ａｐｐｌｅドメインおよびクリングル５ドメインの間の相互作用（複数可）の非存在により、Ｌｙｓ−プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ−Ｐｌｇよりもオープンな立体構造で存在する１２、１３。Ｌｙｓ−プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ−Ｐｌｇと比較して、プラスミノーゲンアクチベーターによってより容易に活性化される１４、１５。プラスミノーゲンアクチベーター、ｔＰＡおよびｕＰＡは、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−１（ＰＡＩ−１）１６およびＰＡＩ−２１７、１８によって阻害され、一方、プラスミンは、α２−抗プラスミン１９およびα２−マクログロブリン２０によって阻害される。
【０１７９】
プラスミンは、線維素溶解において重要な役割を果たし、血栓形成の部位における血餅溶解の原因である９。線維素溶解において、プラスミノーゲンは、主に、ｔＰＡにより活性化され、損傷した内皮から放出される２１、２２。Ｎ末端から開始して、ｔＰＡは、フィンガードメイン、上皮増殖因子様ドメイン、２個のクリングルドメインおよびＣ末端プロテアーゼドメインからなる２３、２４。ｔＰＡのフィンガードメインおよび第２のクリングルドメインは、血栓血餅において露出したＣ末端リシン残基に結合する２５、２６。プラスミノーゲンは、また、そのクリングルドメイン１および４を介してフィブリン血栓に局在化し、そこでｔＰＡがそれをプラスミンに局所的に変換する２７。フィブリンの分解において、プラスミンは、追加的なＣ末端リシン残基を生成し、これは、効率的な溶解のために血餅へのｔＰＡおよびプラスミノーゲン／プラスミン結合を増強する２８。さらに、循環するプラスミンと比較して、フィブリン結合プラスミンは、α２−抗プラスミンによる阻害が不十分である２１。よって、斯かる局在化された線維素溶解機序は、循環するフィブリノーゲンの分解を防止する。
【０１８０】
重度外傷２９において、また、心臓外科手術等の大規模な外科手技において、線維素溶解性系は活性化過剰となる３０、３１。外傷において、制御できない出血は、予防可能な死亡の主因である３２。抗線維素溶解剤は、予防的に使用される場合、失血および大規模輸血の必要を有意に低下させることができる３０、３３、３４。プラスミン活性部位の強力な阻害剤であるアプロチニン（ウシ膵トリプシン阻害剤、ＢＰＴＩ）は、心血管バイパス外科手術における失血防止に使用される主要な抗線維素溶解剤であった３５。しかし、腎臓損傷、心筋梗塞およびアナフィラキシーの可能性等、その副作用のため、これは、臨床市場から排除された３６、３７、３８。現在使用されている抗線維素溶解剤は、トラネキサム酸（ＴＥ）およびε−アミノカプロン酸（εＡＣＡ）であるが３９、これらのリシン類似体は両者共に、アプロチニンよりも有効性が低く、腎不全および発作も伴う３９、４０。よって、優れた有効性を有する分子が、抗線維素溶解剤としての使用において望ましい。
【０１８１】
プラスミノーゲン系も、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の細胞周囲のタンパク分解依存性分解４１〜４６およびサイトカインの活性化４７における必要不可欠な役割を果たす。プラスミンは、コラーゲン等の他のマトリックス構成成分を分解する５０、５１、プロＭＭＰ３、９、１２および１３を含む数種類のプロマトリックスメタロプロテアーゼ（プロＭＭＰ）を活性化する４８、４９。さらに、プラスミンは、線維芽細胞増殖因子および血管内皮増殖因子等、ある特定のマトリックス関連増殖因子を放出させることにより血管新生における５２、５３、また、潜在型トランスフォーミング増殖因子−βの活性化における５４有意な役割を果たす。よって、プラスミンは、炎症、創傷治癒、細胞遊走、腫瘍成長およびアポトーシスに関与する９。これらの機能は全て、単球／マクロファージ、平滑筋細胞、内皮および上皮細胞、ケラチノサイトおよび線維芽細胞と共に血小板上に存在する細胞表面受容体に結合したプラスミノーゲンのｕＰＡ（ｕＰＡ受容体と会合した）媒介性活性化に起因する５５。Ｃ末端リシン残基を有するプラスミノーゲン受容体は、異なる細胞型によって大量に発現される５６〜５８、腫瘍細胞の浸潤特性は、ＥＣＭのプラスミン媒介性タンパク分解に依存する５９、６０。よって、細胞表面受容体へのその結合を防止することによるプラスミノーゲン活性化の減弱化および生成されたプラスミンの阻害は、これらの病理的過程の制御に有用であると予想される。
【０１８２】
胎盤タンパク質５またはマトリックスセリンプロテアーゼ阻害剤としても公知である、組織因子経路阻害剤−２（ＴＦＰＩ−２）は、３個のクニッツ型阻害ドメインをタンデムに含有する６１〜６３。ＴＦＰＩ−２のクニッツドメイン１（ＫＤ１）は、唯一の阻害ドメインであり、これは、プラスミン、第（Ｆ）ＸＩａ因子、血漿カリクレイン（ｐＫＬＫ）およびＦＶＩＩａ／組織因子を阻害する６４。セリンプロテアーゼサブサイトａＳ２’／Ｐ２’プロファイリング６５を使用して、プラスミンのさらにより強力な阻害剤であるバリアントＫＤ１−Ｌ１７Ｒ分子を設計した；さらに、これは、ｐＫＬＫまたはＦＸＩａを阻害しない６６。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉが発現したＫＤ１−Ｌ１７Ｒ６６は、Ｃ末端バリンを有し、クニッツドメインの一部ではない９残基をＮ末端に有する；本明細書においてこれをＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴｂと命名する。
【０１８３】
ある特定の実施形態において、Ｃ末端リシンを有し、最初の７〜９残基を欠く、より小型のＫＤ１分子種が本明細書に記載されている；これは、本明細書においてＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴｃと称される。プラスミンのその阻害およびプラスミノーゲンのクリングルドメインへの結合を含むＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴの構造的および機能的特徴付けが、本明細書に開示されている。よって、その二重機能を有するＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴは、ある特定の本明細書に開示されている実施形態において、プラスミン生成および病理的過程におけるその阻害の制御に好ましい薬剤となり得る。
【０１８４】
実験手順
材料。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳおよびｐＥＴ２８ａ発現ベクターをＮｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から入手した。Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）遠心分離フィルター装置（３０００Ｍｒカットオフ）をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）から購入した。Ｑ−セファロース（登録商標）ＦＦ、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）−２００およびＨｉｓ−Ｔｒａｐ（商標）ＨＰカラムをＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。カナマイシン、イソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）および１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＰＭＡ）をＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。ヒトα−トロンビン（ＩＩａ）、ＦＸＩａ、ｐＫＬＫおよびプラスミンをＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．から購入した。ｔＰＡ（Ａｌｔｅｐｌａｓｅ（商標））をＧｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）から購入した。ｕＰＡをＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手した。Ｇｌｕ−ＰｌｇをＥｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｏｕｔｈ  Ｂｅｎｄ、ＩＮ）から入手した。εＡＣＡ（Ａｍｉｃａｒ（商標））をＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（Ａｕｒｏｒａ、Ｏｈｉｏ）から入手した。正常プール血漿（ＮＰＰ）をＧｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．（Ｏｖｅｒｌａｎｄ  Ｐａｒｋ、Ｋａｎｓａｓ）から購入した。プラスミン基質Ｓ−２２５１（Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリド）、ｐＫＬＫおよびＦＸＩａ基質Ｓ−２３６６（ピロＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド）をＤｉａｐｈａｒｍａ  Ｉｎｃ．から入手した。他のあらゆる試薬は、商業的に入手できる最高純度のものであった。
【０１８５】
ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴの発現および精製。ＫＤ１  ｃＤＮＡ配列を含有するヒトＴＦＰＩ−２の残基１〜７３のコード配列をクローニングし、Ｔ７プロモーター系を使用して、アミノ末端Ｈｉｓ６タグ付けされた融合タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳにおいて過剰発現させた６６〜６９。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ）を使用して、点変異体ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴを作製した。１５ｍｇ／リットルのカナマイシンを含有するルリア（Ｌｕｒｉａ）ブロスにおいて育成したＥ．ｃｏｌｉにおいて、Ｈｉｓ６タグ付けされたＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴを発現させ、１ｍＭ  ＩＰＴＧにより３７℃で誘導した。Ｈｉｓ６タグ付けされたＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴを封入体から精製し、記載されている通りにリフォールドさせた６６、６８〜７０。
【０１８６】
精製されたＨｉｓ６タグ付けされたＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴを、１：１０００酵素／基質モル比のＩＩａで２時間３７℃にて消化した。経時的アリコートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、ＩＩａによるＫＤ１の完全消化を確認した６９。１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５（ＴＢＳ）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）−２００ゲル濾過クロマトグラフィーを使用して、Ｈｉｓ６タグなしのタンパク質をＨｉｓ６タグおよびＩＩａから分離した６６。生化学的実験における使用に先立ち、１ｍｇ／ｍｌにおける２．４５の消衰係数（Ａ２８０）、純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、Ｎ末端配列および質量分析を使用して、タンパク質濃度に関して調製物を特徴付けた。
【０１８７】
ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴの調製および単離。１：５０酵素／基質モル比におけるＩＩａとＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ（１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．５のＴＢＳに溶解）の２４時間３７℃のインキュベーションは、より小型のＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ分子種を生じた。ＴＢＳ、ｐＨ７．５で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）−２００ゲル濾過クロマトグラフィーを使用して、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴをＩＩａから分離した６６。生化学的実験における使用に先立ち、１ｍｇ／ｍｌにおける２．８４の消衰係数（Ａ２８０）、純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、Ｎ末端配列および質量分析を使用して、タンパク質濃度に関して精製ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴを特徴付けした。
【０１８８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）バッファー系を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った７１。使用したアクリルアミド濃度は、１０％〜１５％の間であり、ゲルをクーマシーブリリアントブルー色素で染色した。
【０１８９】
アミノ酸配列解析および質量分析。Ｎ末端配列解析のために、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥから二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜にタンパク質を転写した。ＵＣＬＡ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｒｅ施設（ＵＣＬＡ、Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）における、オンラインフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸解析によるパルス液体固相シークエネーター（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｃＬＣ系）を使用して、自動化Ｎ末端タンパク質配列決定を行った。マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）−ＭＳおよびエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）−ＭＳにより、質量分析（ＭＳ）データを収集した。ピペットチップに充填された逆相培地（Ｃ４−樹脂ＺｉｐＴｉｐ（商標）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ  ＵＳＡ）を使用して、ＭＳ測定に先立ちタンパク質溶液を脱塩および濃縮した。線形モードで操作するＶｏｙａｇｅｒ（商標）ＤＥ−ＳＴＲ  ＭＡＬＤＩ飛行時間型質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ  ＵＳＡ）を、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ測定に使用した。ステンレススチール試料プレート上にタンパク質試料溶液（０．５μＬ）をスポットし、続いて０．５μＬのＭＡＬＤＩマトリックス溶液、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）をスポットした。データ取得に先立ちスポットした試料を室温で乾かした。ナノスプレー源およびｓｏｌａｒｉＸ（商標）ハイブリッド１５−Ｔｅｓｌａフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ−ＩＣＲ）質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、ＥＳＩ−ＭＳデータを収集した。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用したｔＰＡおよびＧｌｕ−ＰｌｇへのＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ結合。Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００フローバイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）において２５℃で結合試験を行った。アミンカップリング化学を使用して、Ｇｌｕ−Ｐｌｇ（約９８％の純度、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用）またはｔＰＡ（＞９８％純度、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用）をカルボキシメチル−デキストランフローセル（ＣＭ５センサーチップ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に固定化した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスルホサクシニミドの混合物により５分間（流速１０μｌ／分）、フローセル表面を活性化させ、その後、タンパク質（２０μｇ／ｍｌ、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５に溶解）を表面上に注射した。未反応部位を１Ｍエタノールアミンで５分間ブロッキングした。ＨＢＳ−Ｐバッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｐ２０）において１０μｌ／分で６分間、フローセルを通して各分析物（ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴおよびＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ、１００〜２０００ｎＭ）を灌流した。タンパク質なしのＨＢＳ−Ｐバッファーに交換した後、分析物解離を１０分間モニターした。２０ｍＭ  εＡＣＡを含有するＨＢＳ−Ｐにより、フローセルを再生した。カップリングされたタンパク質なしでフローセルを通して注入された分析物により得られるシグナルを減算することにより、非特異的結合に対してデータを補正した。１：１結合モデルを使用して、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（商標）ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ）により結合を解析した。導かれた解離（ｋｄ）および会合（ｋａ）速度定数の商からＫｄ値を計算した。
【０１９０】
プロテアーゼ阻害アッセイ。記載されている通り、０．１ｍｇ  ＢＳＡ／ｍｌ（ＴＢＳ／ＢＳＡ）および２ｍＭ  Ｃａ２＋（ＴＢＳ／ＢＳＡ／Ｃａ２＋、ｐＨ７．５）を含有するＴＢＳ、ｐＨ７．５において全反応を行った６６、６８。９６ウェルマイクロタイトレーションプレート（総容量１００μＬ）において、各酵素（プラスミン、ｐＫＬＫおよびＦＸＩａ）を様々な濃度（１０−１〜２×１０３ｎＭ）のＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴと共に１時間ＲＴでインキュベートした。次に、各酵素に適切な合成基質（５μＬ）を１ＫＭの最終濃度となるよう添加し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｖｍａｘ動態マイクロプレートリーダーにおいて残渣アミド分解活性を測定した。非線形回帰データ解析プログラムＧｒａｆｉｔを使用して、阻害定数、Ｋｉ＊を決定した。緊密結合阻害剤の方程式（方程式１）（式中、ｖｉおよびｖ０は、それぞれ阻害および非阻害率であり、［Ｉ］０および［Ｅ］０は、それぞれ阻害剤および酵素の総濃度である）により、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴのデータを解析した７２、７３。
【０１９１】
【化１】
2016514459.tif 000004
方程式２（式中、［Ｓ］は、基質濃度であり、ＫＭは、各酵素に特異的である）を使用して、Ｂｅｉｔｈ７２に従って基質の効果に対し補正することにより、Ｋｉ値を得た。  
【０１９２】
【化２】
2016514459.tif 000005
線維素溶解（血餅溶解）アッセイ。先に概要を述べた通り６６、若干修正しつつＳｐｅｒｚｅｌおよびＨｕｅｔｔｅｒの方法７４に従った。簡潔に述べると、ＩＩａを使用して、ＮＰＰにおけるフィブリン形成を開始し、ｔＰＡの同時添加により、形成された血餅の溶解（線維素溶解）を誘導した。４０５ｎｍにおける光学密度を測定するＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓマイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ（登録商標）１９０）により、血栓形成および溶解をモニターした。簡潔に述べると、１０μＬの各被験化合物（ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ、εＡＣＡ）または生理食塩水対照を２４０μＬのＮＰＰに添加した。次に、この混合物の２２５μＬを、２５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有するＴＢＳ／ＢＳＡに溶解した２５μＬのＩＩａおよびｔＰＡに添加した。２５０μＬ最終容量において、ＩＩａの濃度は０．１５μｇ／ｍｌであり、ｔＰＡの濃度は１μｇ／ｍｌであった。対照条件（ゼロｔＰＡおよびゼロ被験化合物）下において、ＯＤ４０５は直ちに増加し、凝固とそれに続く線維素溶解を表す極めて緩慢な減少を示した。凝固は５分後にほとんど完了したため、最大６０分間のＯＤ４０５の相対減少として、ｔＰＡにより誘導される線維素溶解を評価した。ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ（プラス／マイナスεＡＣＡ）およびＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴを２μＭ〜５μＭの最終濃度で、εＡＣＡ（ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴなし）を０．１ｍＭ〜５ｍＭで検査した。
【０１９３】
マウス肝臓裂傷モデル。ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴおよびＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴの有効性を試験するためにこのマウスモデルを使用したプロトコールは、ＵＣＬＡ  Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒ’ｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。Ｃ５７／ＢＬ６マウス（８〜１０週齢）を使用し、それぞれ約２０ｇｍの重量であった。動物に、標準齧歯類固形飼料および水を与え、正常室温および１２時間の明暗サイクルの生態動物園（ｖｉｖａｒｉｕｍ）室に収容した。ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴまたはＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴの投薬量は、ヒトに使用したアプロチニン用量、即ち、４μｇ／ｇｍに基づき、マウス重量に対し調整した７５。この用量により達成される計算血液レベルは、約８μｇ／ｍｌ（約１μＭ）であった。εＡＣＡ（１００μｇ／ｇｍ、２００μｇ／ｍｌまたは約１．３ｍＭの計算血液レベル）を注射した動物を陽性対照として使用し、生理食塩水を与えた動物を陰性対照として使用した。εＡＣＡの投薬量は、ヒトプロトコールに使用される用量に基づいた３９、７５。Ｐｏｌｙｍｉｘｉｎ  Ｂ固定化樹脂（Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ（商標）内毒素除去ゲル、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ製）を使用して、生理食塩水、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴおよびＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴからリポ多糖を除去した。リポ多糖なし生理食塩水において２０ｍｇ／ｍｌとなるようεＡＣＡを溶解した。抗線維素溶解剤および生理食塩水は両者共に、Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ溶解キット（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を使用して検査される通り、リポ多糖を含まない。
【０１９４】
麻酔直前に、１００μＬ容量の無菌平衡塩類溶液に溶解した薬物を、尾静脈を介してマウスに静脈内注射した。イソフルランにより麻酔を導入および維持した。手順を通して加温パッドの上に仰臥位で動物を置き、直腸温度を３７℃に維持した。腹部を剪毛し、準備した。右前肋骨下切開により肝臓を露出した。左脇腹を後側に穏やかに連続して押圧することにより、肝臓の左葉を外面化した。鋭い無菌＃１０メス刃を使用して、左葉に、その下縁から１ｃｍのところに５ｍｍ横切開を入れた。左葉切開の部位から滲出する血液を全て、無菌の予め秤量した３ｃｍ×３ｃｍプラスチックトレーに全持続時間３０分間で収集した。この３０分間の期間の終わりに動物を安楽死させた。
【０１９５】
要因一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）方法を使用して、４種の処置群（生理食塩水、εＡＣＡ、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴおよびＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ）にわたり、マウス肝臓からのｍｇで表す平均総失血量を比較した。このＡＮＯＶＡモデルにおいて事後検定を使用して、いずれか２平均を比較するためのｐ値をコンピュータ処理した。全４種の処置にわたりプールされた平均総失血量誤差分布の試験は、処置の効果の制御後に、正規（ガウス）であったことを示した。シャピロ・ウイルク適合度検定を使用して、この分布をガウス分布と公式に比較した。よって、総失血量の変換は必要なかった。
【０１９６】
マイクロ（μ）−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴによるＵ９３７細胞表面受容体へのＧｌｕ−Ｐｌｇ結合の低下。ヒトプラスミノーゲンプロテアーゼドメイン７６の残基５４２〜７９１を含有する組換えＮ末端Ｈｉｓ６タグ付けされたμ−プラスミノーゲンを、Ｅ．Ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）において、ｐＥＴ２８ａベクターを使用して封入体として発現させた。概要を述べる通り７６、ニッケルチャージしたＨｉｓ−Ｔｒａｐカラムを使用して、Ｈｉｓ６タグ付けされたμ−プラスミノーゲンを単離し、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦカラムを使用して、リフォールドおよび精製した。１：１０００の酵素／基質モル比で２時間３７℃にて、単離されたμ−プラスミノーゲン（１ｍｇ／ｍｌ）をＩＩａで消化して、Ｈｉｓ６タグ［６６］を除去し、ｕＰＡによりμ−プラスミンへと活性化した。μ−プラスミンへの活性化を可能にするＨｉｓ６タグの除去を、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％アクリルアミド）により確認した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）−２００ゲル濾過カラム７６を使用して、ＩＩａ、ｕＰＡおよびＨｉｓ６タグをμ−プラスミンから分離した。ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴおよびＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴをそれぞれ、精製μ−プラスミンと共にモル比１．２：１で２時間室温にてインキュベートした。次に、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）−２００ゲル濾過カラム７６を使用して、各ＫＤ１−プラスミン複合体を遊離ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴまたはＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴから分離した。
【０１９７】
先に概要を述べた通り７７、７８、３７℃、５％ＣＯ２にて、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地を使用して、Ｕ９３７単球様細胞を維持した。記載されている通り７８４０ｎＭ  ＰＭＡで１８時間、無菌条件下で細胞を刺激した。非接着性細胞を穏やかなデカントにより回収し、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、ｐＨ７．５を含有する５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ＨＢＳ／ＢＳＡ、ｐＨ７．５）において洗浄および懸濁した。次に、細胞（１０６／ｍｌ、２００μｌ）を、３７℃で１時間、変動濃度のμ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴまたはμ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴを含有する２μＭ  Ｇｌｕ−Ｐｌｇと共にインキュベートした。細胞を洗浄し、２００μｌのＨＢＳ／ＢＳＡ、ｐＨ７．５に再懸濁し、細胞に結合したＧｌｕ−Ｐｌｇを１０ｎＭ  ｕＰＡで２０分間３７℃にて活性化させた。各反応混合物を１０倍希釈し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ動態マイクロプレートリーダー５８、７８を使用して、Ｓ−２２５１合成基質加水分解によりプラスミン活性（結合したＧｌｕ−Ｐｌｇを反映）を測定した。下に示すＨａｌｆｍａｎ７９の次のＩＣ５０  ４−パラメータロジスティック方程式にデータを適合させることにより、ＩＣ５０（細胞表面受容体へのＧｌｕ−Ｐｌｇ結合の５０％減少に必要とされるμ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ濃度）を決定した。
【０１９８】
【化３】
2016514459.tif 000006
（式中、ｙは、ｘによって表される所定の濃度のＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴまたはＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴの存在下でＵ９３７細胞受容体に結合したＧｌｕ−Ｐｌｇから生成されたプラスミンによるＳ−２２５１加水分解の速度であり、ａは、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴまたはＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴの非存在下でのＳ−２２５１加水分解の最大速度であり、ｓは、傾き因数である）。各点は等しく重み付けし、Ｅｒｉｔｈｃｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ製の非線形回帰解析プログラムＧｒａＦｉｔ（商標）を使用して方程式３にデータを適合させた。ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴとＧｌｕ−Ｐｌｇとの相互作用に関するＫｄ値を得るために、本出願人らは、ＣｈｅｎｇおよびＰｒｕｓｏｆｆ８０に記載され、Ｃｒａｉｇ８１によってさらに精巧に作り上げられた次の方程式を使用した。
【０１９９】
【化４】
2016514459.tif 000007
（式中、用いた［Ｇｌｕ−Ｐｌｇ］濃度は、２μＭ（ほぼ生理的濃度）であった）９。Ｇｌｕ−Ｐｌｇのための
【０２００】
【化５】
2016514459.tif 000008
を得るために、本出願人らは、Ｋｄ（Ｇｌｕ−Ｐｌｇ／細胞表面受容体）９、７８、８２に対し１μＭの値を使用した。
【０２０１】
分子モデリング。μ−プラスミン８３、プラスミノーゲンクリングルドメイン１８４および野生型ＫＤ１６９の結晶構造を鋳型として使用して、プラスミンクリングルドメイン１とＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴの二元複合体ならびにプラスミンプロテアーゼドメインおよびクリングルドメイン１とＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴの三元複合体をモデリングした。これらの複合体をモデリングするためのプロトコールは、先に記載されている６６、８５。Ｃ末端残基は、野生型ＫＤ１結晶構造において不規則化されているため、本出願人らは、ＭＯＤＥＬＬＥＲプログラム８６を使用して、ＫＤ１分子のこの部分を築いた。Ｓｔｅｅｐｅｓｔ  Ｄｅｓｃｅｎｔの５０ステップと、続くＡｄｏｐｔｅｄ  Ｂａｓｉｓ  Ｎｅｗｔｏｎ−Ｒａｐｈｓｏｎの５００ステップからなる、ＣＨＡＲＭＭ１９力場によるプログラムＣＨＡＲＭＭ８７を使用したエネルギー最小化により、築かれたモデルをさらに緻密化した。全体最小化において、タンパク質のＣα原子に１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ／Å２の高調波抑制を適用した。
【０２０２】
結果
ＩＩａによるＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴのタンパク分解。ＢＰＴＩ−クニッツドメインに対応する５８残基に加えて、７３残基ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ構築物は、Ｎ末端に追加的な９残基を含有する。ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴにおけるＣ末端テイル残基（５９ＥＫＶＰＫＶ６４、ＢＰＴＩナンバリング、配列番号４４）は、２個のリシン残基を含有する６６。Ｈｉｓ６タグの除去において使用されたものと比較してより高濃度のＩＩａとＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴのインキュベーションが、Ｋ６０−Ｖ６１の間および／またはＫ６３−Ｖ６４残基の間（５９ＥＫ↓ＶＰＫ↓Ｖ６４）を切断することができるか決定するための実験を行った。切断できるのであれば、その結果得られた分子（複数可）は、プラスミンの活性部位の阻害に加えて、同様に非限定的な理論により、病理的プラスミノーゲン活性化を減弱化するためのデコイ受容体として機能することが考えられる。ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ（１ｍｇ／ｍｌ、ＴＢＳ  ｐＨ７．５に溶解）とＩＩａとの１：５０酵素／基質モル比で２４時間、３７℃のインキュベーションは、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴと称されるより小さい分子量の種の形成をもたらした。ＫＤ１Ｌ１７−ＶＴおよびＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴのＳＤＳ−ＰＡＧＥデータを図７に示す。さらなる試験のために、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）−２００ゲル濾過クロマトグラフィーを使用して、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴをＩＩａから分離した。
【０２０３】
ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴのＮＨ２末端配列（複数可）を表１に示し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＥＳＩデータを図８Ａに示す。約８０ｐｍｏｌレベルの優勢配列（ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ（約８０％）、配列番号４７）と、約２０ｐｍｏｌレベルの少数派の配列（ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ（約２０％）、配列番号４８）の、２種の可読配列が存在した。少ない方の配列（配列番号４８）は、多い方の配列（配列番号４７）に対し内側であり、サイクル３から開始した。
【０２０４】
【表２】
2016514459.tif 000009
配列（複数可）および質量分析データの解析組合せは、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴの約８０％が、Ｎ末端配列ＧＮＮＡＥＩ（配列番号４９）を有し、約２０％が、Ｎ末端配列ＮＡＥＩ（配列番号５０）を有した；両方の化学種が、同じＣ末端配列ＥＫＶＰＫ（配列番号５１）を有したことを明らかにした。ＢＰＴＩ、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴおよびＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴのアミノ酸配列アライメントを図８Ｂに示す。非限定的な理論により、ＩＩａが、Ｃ末端におけるＶＰＫ↓Ｖの間でＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴを切断した；しかし、Ｎ末端におけるＰＴ↓ＧＮおよびＧＮ↓ＮＡにおける加水分解は、ＩＩａまたはおそらく混入するプロテアーゼによるものとなり得ることが考えられる。Ｃ末端におけるＥＫ↓ＶＰの間に切断は観察されなかった。よって、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴは、Ｃ末端において均一であり、この分子の約２０％は、Ｎ末端における最初の２個のアミノ酸を欠く（図８Ａおよび図８Ｂ）。
【０２０５】
ＩＩａは、Ａｒｇ／Ｌｙｓ（Ｐ１サブサイト）−ｘｘｘペプチド結合を切断し、Ｐ２位におけるプロリンまたは小型の疎水性残基に対し強い優先度を有する８８。さらに、Ｐ２位における大型または酸性残基は、ＩＩａによって強く忌避される８８、８９。したがって、使用されるより高濃度のＩＩａの条件下において、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴの６２Ｐｒｏ−Ｌｙｓ↓Ｖａｌ６４（図９）の間の切断が予想され、一方、５９Ｇｌｕ−Ｌｙｓ↓Ｖａｌ−Ｐｒｏ６２の間の切断は忌避される（図８Ｂ）。Ｐ１サブサイトにおけるスレオニンまたはアスパラギンは、ＩＩａに好まれないが、そのＳ１ポケット残基Ａｓｐ１８９は、水分子を介してＴｈｒまたはＡｓｎと相互作用することができる（図９）。ＩＩａによるＰｒｏ−Ｔｈｒ↓Ｇｌｙ−ＡｓｎまたはＧｌｙ−Ａｓｎ↓Ａｓｎ−Ａｌａの間のタンパク分解も、非限定的な理論によると、Ｐ２位におけるＰｒｏまたはＧｌｙの存在によって容易にされると考えられる（図９）。結果として、インタクトなクニッツドメインを有し、Ｃ末端リシンを含有した、安定的ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴタンパク質を得た。
【０２０６】
ｔＰＡおよびＧｌｕ−ＰｌｇへのＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ結合。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、固定化されたｔＰＡ（図１０Ａ）およびＧｌｕ−Ｐｌｇ（図１０Ｂ）へのＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴの結合を試験した。ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴへのｔＰＡの結合に対するｋｏｎは、０．９１±０．２×１０３Ｍ−１ｓ−１であり；ｋｏｆｆは、１．９±０．３×１０−４ｓ−１であり、Ｋｄは、２１０±２０ｎＭであった。ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴへのＧｌｕ−Ｐｌｇの結合に対するｋｏｎは、１．１±０．４×１０３Ｍ−１ｓ−１であり；ｋｏｆｆは、３．１±０．８×１０−４ｓ−１であり、Ｋｄは、２８０±３０ｎＭであった。ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴは、ＳＰＲ実験においてｔＰＡまたはＧｌｕ−Ｐｌｇへの無視できる結合を示し、非限定的な理論によると、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴにおけるＣ末端リシンが、この相互作用に重要であることを示唆した。
【０２０７】
次に、プラスミノーゲンのクリングルドメイン１とＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴの複合体をモデル化した。Ｃ末端リシンは、εＡＣＡと類似の様式で結合した（図１０Ｃ）。加えて、２種の他の相互作用に注目した：（１）阻害剤ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴのＧｌｕ５９のカルボン酸塩は、プラスミノーゲンのＡｒｇ３２のグアニジノ基と塩橋を形成した；および（２）阻害剤のＬｙｓ６０のカルボニル基は、プラスミノーゲンのクリングルドメイン１のＡｒｇ７０の側鎖と水素結合を形成した。これらの追加的な相互作用は、εＡＣＡに対するその親和性と比較した、プラスミノーゲンのクリングルドメイン１に対するＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴのより高い親和性を反映した８４、９０。
【０２０８】
ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴの阻害プロファイル。ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴは、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴと非常に同様に、高い親和性（Ｋｉ＝１±０．２ｎＭ）でプラスミンを阻害した（図１１）。さらに、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ６６およびＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴの両方は、Ｋｉ＞１０μＭでＦＸＩａおよびｐＫＬＫを阻害した（図１１）。さらに、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ６６またはＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ（データ図示せず）は、ＩＩａを阻害せず、プロテインＣ、ｔＰＡ、ｕＰＡまたは組織カリクレインを活性化した。まとめて、データは、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴにおけるクニッツ（Ｋｕｎｔｉｚ）ドメインが十分に機能的であったことを示す。
【０２０９】
線維素溶解アッセイ。ｔＰＡ誘導血漿血餅線維素溶解を阻害するＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴおよびεＡＣＡのそれぞれの能力を比較した。ＮＰＰへのＩＩａの添加は、ＯＤ４０５の増加によって反映されるフィブリン形成を引き起こした（図１２Ａ〜図１２Ｃ、曲線１）。ｔＰＡの同時添加は、初期血栓形成と、続くプラスミノーゲンからプラスミンへのｔＰＡ媒介性変換によって誘導されるフィブリンの溶解を引き起こした（曲線２、図１２Ａ〜図１２Ｃ）；各事例において、線維素溶解の中点は、６〜７分間の間であった。全３種の抗線維素溶解剤は、用量依存性様式で線維素溶解を阻害した。ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴは、線維素溶解中点を、それぞれ２μＭにおいて２２分間へと、３μＭにおいて２９分間へとおよび５μＭにおいて４３分間へと増加させた（図１２Ａ）。対照的に、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴは、線維素溶解中点を、それぞれ２μＭにおいて２７分間へと、３μＭにおいて３７分間へとおよび５μＭにおいて＞６０分間へと増加させた（図１２Ａ）。よって、検査した各濃度において、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴは、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴと比較して、抗線維素溶解剤としてより有効であった。ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ６６およびＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴの両方によるプラスミンの活性部位阻害は、類似していたため（図１１）、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴの追加的な効力増加は、ｔＰＡおよび／またはプラスミノーゲンのクリングルドメインへのその結合によるものとなり得る（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。結果として、フィブリン血栓に局在化されたプラスミノーゲン活性化も減弱化されることが予想される。
【０２１０】
プラスミン阻害に対しＫｉ値から予測されるものよりも高濃度のＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴまたはＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴが、線維素溶解の阻害に必要とされた。理論に制約されることは望まず、これらの観察に対する説明は、抗線維素溶解性アッセイが、動態に基づくアッセイであった一方、平衡阻害定数Ｋｉが、プラスミンと阻害剤の延長されたインキュベーションにより得られたこととなり得る。
【０２１１】
εＡＣＡの抗線維素溶解活性は、ｔＰＡおよびプラスミノーゲンのクリングルドメインへのその結合に起因する８４、９０。したがって、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴに観察される線維素溶解性阻害を増大化させるその能力に関してεＡＣＡを検査した。これらのデータを図１２Ｂに示す。２、３または５μＭにおけるＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴへのεＡＣＡの等モル濃度添加は、血漿血餅線維素溶解の阻害の程度における観察可能な効果がなかった。この観察に対する最も可能性の高い非限定的な説明は、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ（約０．２〜０．３μＭのＫｄ、図１０）と比較して、ｔＰＡまたはプラスミノーゲンに対するεＡＣＡの低い親和性（約１０μＭのＫｄ）であった８４、９０。これらのデータと一致して、さらにより高濃度のεＡＣＡが、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴの非存在下における血漿血餅線維素溶解の阻害に必要とされた（図１２Ｃ）。εＡＣＡの添加は、血餅溶解中点を、それぞれ０．１ｍＭにおいて１０分間へと、０．３ｍＭにおいて１９分間へとおよび０．５ｍＭにおいて＞６０分間へと増加させた。１または５ｍＭ  εＡＣＡの濃度が使用された場合、線維素溶解は基本的に観察されなかった。
【０２１２】
マウス肝臓裂傷モデル。増大化された線維素溶解は、マウス肝臓裂傷モデル９１における小血管からの出血の重要な原因であるため、失血量減少におけるＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴの有効性を評価し、この動物モデルにおけるεＡＣＡおよびＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴの有効性と比較した。使用したεＡＣＡ、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴまたはＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴの用量は、臨床設定において典型的に使用される用量に匹敵した。これら２種の抗線維素溶解剤のそれぞれの半減期は短いが（約２時間）、３０分間の出血の全持続時間は、有効性試験に対する各阻害剤の十分なレベルを保持すると予想される。失血量における３種の抗線維素溶解剤の効果は、図１３に描写されている。生理食塩水と比較して、失血はＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴによって約７４％（ｐ  ０．００１）、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴによって約５０％（ｐ  ０．００２）およびεＡＣＡによって約４９％（ｐ  ０．００２）低下した。ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴおよびεＡＣＡ処置動物の間に、失血量における差は基本的になかった。この動物モデルにおけるプラスミン誘導性線維素溶解および失血の阻害において、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴは、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ（ｐ＜０．０５）またはεＡＣＡ（ｐ＜０．０５）よりも有効であった。
【０２１３】
マウス肝臓裂傷モデルにおいて、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ（配列番号４７：４８、約８０％：約２０％）と、Ｃ末端にＶａｌを有すると推定された「ＫＤ１−Ｌ１７Ｒ」と以前に記載された遺伝子操作されたＫＤ１ポリペプチド調製物６６との間に統計的に有意な差はなかった。したがって、ＫＤ１−Ｌ１７Ｒを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析およびＮ末端配列解析により特徴付けした（図１４）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、タンパク質が、著しくは分解されていないことを示した。Ｎ末端配列決定は、最初の１０残基としてＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ（配列番号５３）を明らかにし、質量分析データは、試料が、８７９２．１Ｄａの分子質量を有することを明らかにし、これは、配列番号５２（７６アミノ酸）の理論上の質量８７８７Ｄａの標準誤差内であるが、Ｃ末端バリンを有するＫＤ１−Ｌ１７Ｒ（配列番号４６、７７アミノ酸）の理論上の質量８８８８Ｄａよりも約１００Ｄａ少なかった。よって、ＫＤ１−Ｌ１７Ｒ６６は、本明細書において配列番号５２と表記されている７６アミノ酸配列を有することが示され、これは、Ｃ末端バリンを欠いたが、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴと同様にＣ末端リシンを有した。Ｃ末端リシンを有するＫＤ１−Ｌ１７Ｒ（配列番号５２）およびＣ末端リシンも有するＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ（配列番号４７：４８、約８０％：約２０％）は両者共に、マウス肝臓裂傷モデルにおける失血防止において、Ｃ末端バリンを有するＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ（配列番号４６）よりも優れた有効性を示した。
【０２１４】
εＡＣＡで処置した１６匹の動物のうち４匹（各日４匹のうち１匹）が、この薬物の注射の直後に全般発作を示したことも観察された。外科手術において、これらの動物は、３〜４．５％イソフルランにおいて片側性または両側性間代性運動を有した。麻酔導入の際に異常運動は観察されなかったが、外科手術開始１５〜２０分後にある程度観察された。発作は、１または複数の四肢の反復性間代性運動として現れたが、動物は、麻酔下で無応答のままであった。何らかの強直性運動を有する動物は観察されなかった。痙攣および発作は、εＡＣＡまたはＴＥを与えた動物において以前に観察され、抗線維素溶解剤としてのこれらの薬物の主な副作用を表す９２、９３。他の最近の試験は、εＡＣＡ３９，４０，９４またはＴＥ３９，９４，９５が、有意な数の患者において発作および痙攣を引き起こすことを報告した。ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴまたはＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴのいずれかで処置した動物において、発作は観察されなかった。
【０２１５】
さらに、εＡＣＡ、ＴＥおよびアプロチニンの使用は、腎機能障害／不全を伴った３６〜３９、９４が、ＴＦＰＩ−２の２種のＫＤ１分子（Ａｒｇ１５→ＬｙｓまたはＬｅｕ１７→Ａｒｇを有する）は、マウス６６またはラット９６における腎毒性を引き起こさなかった。よって、本明細書に開示されている一部の実施形態に従って、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの線維素溶解の減弱化における好ましい薬剤である。
【０２１６】
ＰＭＡ刺激した非接着性Ｕ９３７細胞へのＧｌｕ−Ｐｌｇ結合におけるμ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴの効果。プラスミノーゲンに対する細胞表面受容体の大部分は、そのＣ末端残基としてリシンを有する８２。実験を計画して、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ（ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴではない）が、Ｇｌｕ−Ｐｌｇのクリングルドメイン（複数可）に結合し、Ｕ９３７細胞表面受容体へのその結合を損なったか決定した。μ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴおよびμ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ複合体を調製して、クニッツドメイン機能を遮断した。μ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴおよびμ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴのＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）−２００ゲル精製した複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを図１５Ａの挿入図に示す。ＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞を、変動濃度のμ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴ複合体またはμ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ複合体を含有するＧｌｕ−Ｐｌｇと共にインキュベートした（図１５Ａ）。図１５Ａに示すＳ−２２５１加水分解データから推論される通り、増加濃度のμ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ（μ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴではない）は、細胞表面受容体へのＧｌｕ−Ｐｌｇ結合を阻害した。精製μ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴまたはμ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＶＴによるプラスミン生成のパーセント低下を図１５Ｂに示す。μ−プラスミン−ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴ複合体は、ＰＭＡ刺激されたＵ９３７細胞へのＧｌｕ−Ｐｌｇ結合に干渉した。方程式３および４を使用して、Ｇｌｕ−ＰｌｇとＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴの相互作用に対するＫｄ値を、約３００ｎＭと計算し、この値は、ＳＰＲデータから得た値（約２８０ｎＭ）と一致した（図１０Ｂ）。
【０２１７】
図１５に示すデータは、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴの単一分子が、プラスミノーゲン／プラスミンのクリングルドメインおよびプラスミンの活性部位と同時に結合したモデルと一致した。プラスミンプロテアーゼドメインおよびプラスミノーゲン／プラスミンクリングルドメイン１とＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴの分子的にモデル化された三元複合体を作成し、図１６に描写する。図１６に示す通り、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴは、そのＰ５−Ｐ５’残基を介して、プラスミンの活性部位と相互作用し、これは、セリンプロテアーゼドメインへのクニッツドメイン結合の典型的様式である。同様に、プラスミノーゲン／プラスミンのクリングルドメイン１とＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴのＣ末端リシンとの相互作用は、クリングルドメイン１およびリシン類似体εＡＣＡまたはＴＥの間の相互作用と類似である。しかし、リシン類似体と比較して、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴは、結合相互作用を強化するプラスミノーゲン／プラスミンのクリングルドメイン１との接触の追加的な点を特色とする（図１６）。
【０２１８】
したがって、また、非限定的な理論として、抗線維素溶解剤としての二重機能が、本明細書に記載されているＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴポリペプチドに考慮される。第一に、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴは、フィブリンにおける露出したＣ末端リシン残基へのｔＰＡおよびプラスミノーゲン結合を減弱化し、これは、プラスミン生成を低下させる。第二に、ＫＤ１Ｌ１７Ｒ−ＫＴは、生成されたプラスミンの活性部位を阻害する。
【０２１９】
【化６】
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【０２２０】
【化７】
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【０２２１】
【化８】
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【０２２２】
【化９】
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【０２２３】
【化１０】
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【０２２４】
【化１１】
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【０２２５】
【化１２】
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【０２２６】
【化１３】
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【０２２７】
【化１４】
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上に記載されている様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書に言及および／または出願データシートに収載されているあらゆる米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる。様々な特許、出願および刊行物の概念を用いて、さらに別の実施形態を提供することが必要であれば、実施形態の態様を修正することができる。
【０２２８】
上述の詳細な説明を踏まえて、実施形態に対し上述および他の変更を行うことができる。一般に、次の特許請求の範囲において、使用されている用語は、本明細書および特許請求の範囲に開示されている特異的な実施形態へと特許請求の範囲を限定するものと解釈するべきではなく、斯かる特許請求の範囲が権利を付与された均等の全範囲と共にあらゆる可能な実施形態を含むものと解釈するべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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