(57)【要約】  生物活性治療薬の制御された送達の方法が提供される。治療用埋込体を含む組成物が提供される。
2016513653.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トレハロース含有ヒドロゲルと、
治療薬と
を含む、組成物。
【請求項２】
前記トレハロース含有ヒドロゲルが天然または合成ポリマーを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記トレハロースが、トレハロースのｎ個の反復単位を有するトレハロース反復単位の形態であり、かつｎが２以上である、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記治療薬が生物学的治療薬である、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記生物学的治療薬が、成長因子、タンパク質、ペプチド、酵素、抗体、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ワクチンおよびウィルスからなる群より選択される、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
前記生物学的治療薬が、コンドロイチナーゼＡＢＣ（ｃｈＡＢＣ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、ノイロトロピン−３（ＮＴ−３）、インスリン、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）またはＢＭＰ関連ファミリー、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＦＧ）、細胞外酵素Ｃ３転移酵素（Ｃｅｔｈｒｉｎ）およびその誘導体、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ｂ１（ＴＧＦ−β１）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、およびａｎｔｉ−Ｎｏｇｏ抗体、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）抗体、オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（ＯＭｇｐ）抗体、エフリンＢ３抗体、セマフォリン４ａ／４ｄ／６ａ抗体、ネトリン１抗体、反発的ガイダンス分子Ａ（ＲＧＭａ）抗体、およびエリスロポエチンからなる群より選択される、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
第一ポリマーと、
第二ポリマーと
を含み、
前記第一ポリマーまたは前記第二ポリマーの少なくとも一方が、それと共有結合したトレハロースを含む、トレハロース含有ヒドロゲル。
【請求項８】
前記第一ポリマーが、それと架橋したトレハロースを含む、請求項７記載のトレハロース含有ヒドロゲル。
【請求項９】
前記トレハロース含有ヒドロゲルが、第一ポリマー成分と第二ポリマー成分との逐次または連鎖重合反応の生成物であり、前記第一ポリマー成分が、求核性官能基を有し、２以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマーおよび多官能性ポリマーからなる群より選択され、さらに前記第二ポリマー成分が、求電子性官能基を有し、２以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマーおよび多官能性ポリマーからなる群より選択される、請求項７記載のトレハロース含有ヒドロゲル。
【請求項１０】
前記逐次または連鎖重合反応が水性溶媒中で行われる、請求項９記載のトレハロース含有ヒドロゲル。
【請求項１１】
前記第一ポリマー成分が天然または合成ポリマーである、請求項９記載のトレハロース含有ヒドロゲル。
【請求項１２】
前記第二ポリマー成分がそれと架橋したトレハロースを含む、請求項９記載のトレハロース含有ヒドロゲル。
【請求項１３】
前記架橋トレハロースが、メタクリラート官能基化トレハロース、エタクリラート官能基化トレハロース、マレイミド官能基化トレハロース、またはビニルスルホン官能基化トレハロース、またはアクリラート官能基化トレハロースのうちの１つから誘導される、請求項１２記載のトレハロース含有ヒドロゲル。
【請求項１４】
前記架橋トレハロースが、トレハロースのｎ個の反復単位を有するトレハロース反復単位の形態である、請求項１２記載のトレハロース含有ヒドロゲル。
【請求項１５】
前記第二ポリマー成分が、メタクリラート、エタクリラート、マレイミド、およびビニルスルホンまたはアクリラートからなる群より選択される末端官能基を有する、請求項１４記載のトレハロース含有ヒドロゲル。
【請求項１６】
ｎが２または３に等しい、請求項１４記載のトレハロース含有ヒドロゲル。
【請求項１７】
前記第二ポリマー成分が、トレハロースジアクリラートおよびポリ（エチレングリコール）ジアクリラートからなる群より選択される、請求項１２記載のトレハロース含有ヒドロゲル。
【請求項１８】
前記第一ポリマー成分と前記第二ポリマー成分との官能性度の和が５以上である、請求項１２記載のトレハロース含有ヒドロゲル。
【請求項１９】
第三ポリマーをさらに含む、請求項７記載のトレハロース含有ヒドロゲル。
【請求項２０】
前記トレハロース含有ヒドロゲルが、第一ポリマー成分と、第二ポリマー成分と、第三ポリマー成分との逐次または連鎖重合反応の生成物であり、前記第一ポリマー成分が、求核性官能基を有し、２以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマーおよび多官能性ポリマーからなる群より選択され、前記第二ポリマー成分が、求電子性官能基を有し、２以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマーおよび多官能性ポリマーからなる群より選択され、さらに前記第三ポリマー成分が、求電子性または求核性官能基を有し、１以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマーおよび多官能性ポリマーからなる群より選択される、請求項１９記載のトレハロース含有ヒドロゲル。
【請求項２１】
治療薬をさらに含む、請求項７〜２０いずれか１項記載のトレハロース含有ヒドロゲル。
【請求項２２】
前記治療薬が生物学的治療薬である、請求項２１記載のトレハロース含有ヒドロゲル。
【請求項２３】
前記生物学的治療薬が、成長因子、タンパク質、酵素、ペプチド、抗体、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ワクチンおよびウィルスからなる群より選択される、請求項２２記載のトレハロース含有ヒドロゲル。
【請求項２４】
前記生物学的治療薬が、コンドロイチナーゼＡＢＣ（ｃｈＡＢＣ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、ノイロトロピン−３（ＮＴ−３）、インスリン、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）またはＢＭＰ関連ファミリー、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＦＧ）、細胞外酵素Ｃ３転移酵素（Ｃｅｔｈｒｉｎ）およびその誘導体、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ｂ１（ＴＧＦ−β１）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、およびａｎｔｉ−Ｎｏｇｏ抗体、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）抗体、オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（ＯＭｇｐ）抗体、エフリンＢ３抗体、セマフォリン４ａ／４ｄ／６ａ抗体、ネトリン１抗体、反発的ガイダンス分子Ａ（ＲＧＭａ）抗体、およびエリスロポエチンからなる群より選択される、請求項２３記載のトレハロース含有ヒドロゲル。
【請求項２５】
求核性官能基を有し、２以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマーおよび多官能性ポリマーからなる群より選択される第一ポリマー成分と、
求電子性官能基を有し、２以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマーおよび多官能性ポリマーからなる群より選択される第二ポリマー成分と
を含み、
前記第一ポリマー成分または前記第二ポリマー成分の少なくとも一方が、架橋性トレハロースを含む、組成物。
【請求項２６】
第一ポリマー成分が架橋性トレハロースを含む、請求項２５記載の組成物。
【請求項２７】
前記第一ポリマー成分が、末端チオール基で官能基化されたマルチアームポリ（エチレングリコール）を含む、請求項２５記載の組成物。
【請求項２８】
前記第一ポリマー成分が、エトキシル化トリメチロールプロパントリ（３−メルカプトプロピナート）を含む、請求項２５記載の組成物。
【請求項２９】
前記第二ポリマー成分が架橋性トレハロースを含む、請求項２５記載の組成物。
【請求項３０】
前記架橋性トレハロースが、メタクリラート官能基化トレハロース、エタクリラート官能基化トレハロース、マレイミド官能基化トレハロース、またはビニルスルホン官能基化トレハロース、またはアクリラート官能基化トレハロースのうちの１つから誘導される、請求項２９記載の組成物。
【請求項３１】
前記架橋性トレハロースが、トレハロースのｎ個の反復単位を有するトレハロース反復単位の形態である、請求項２９記載の組成物。
【請求項３２】
ｎが２または３に等しい、請求項２９記載の組成物。
【請求項３３】
前記第二ポリマー成分が、トレハロースジアクリラートおよびポリ（エチレングリコール）ジアクリラートからなる群より選択される、請求項２９記載の組成物。
【請求項３４】
前記第一ポリマー成分が、メタクリラート、エタクリラート、マレイミド、およびビニルスルホンまたはアクリラートからなる群より選択される末端官能基を有する、請求項２５記載の組成物。
【請求項３５】
前記第一ポリマー成分と前記第二ポリマー成分との官能性度の和が５以上である、請求項２５記載の組成物。
【請求項３６】
水性溶媒をさらに含む、請求項２５記載の組成物。
【請求項３７】
前記第一ポリマー成分が、エトキシル化トリメチロールプロパントリ（３−メルカプトプロピナート）であり、かつ前記第二成分が、トレハロースジアクリラートである、請求項２５記載の組成物。
【請求項３８】
求電子性または求核性官能基を有し、２以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマーおよび多官能性ポリマーからなる群より選択される第三ポリマー成分をさらに含む、請求項２５記載の組成物。
【請求項３９】
治療薬をさらに含む、請求項２５〜３８いずれか１項記載の組成物。
【請求項４０】
前記治療薬が生物学的治療薬である、請求項３９記載の組成物。
【請求項４１】
前記生物学的治療薬が、成長因子、タンパク質、ペプチド、酵素、抗体、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ワクチンおよびウィルスからなる群より選択される、請求項４０記載の組成物。
【請求項４２】
前記生物学的治療薬が、コンドロイチナーゼＡＢＣ（ｃｈＡＢＣ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、ノイロトロピン−３（ＮＴ−３）、インスリン、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）またはＢＭＰ関連ファミリー、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＦＧ）、細胞外酵素Ｃ３転移酵素（Ｃｅｔｈｒｉｎ）およびその誘導体、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ｂ１（ＴＧＦ−β１）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、およびａｎｔｉ−Ｎｏｇｏ抗体、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）抗体、オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（ＯＭｇｐ）抗体、エフリンＢ３抗体、セマフォリン４ａ／４ｄ／６ａ抗体、ネトリン１抗体、反発的ガイダンス分子Ａ（ＲＧＭａ）抗体、およびエリスロポエチンからなる群より選択される、請求項４１記載の組成物。
【請求項４３】
トレハロース含有ヒドロゲルを含む組成物において、前記ヒドロゲルが天然または合成ポリマーを含む、組成物。
【請求項４４】
前記トレハロース含有ヒドロゲルが、ポリ（エチレングリコール）ポリマーを含む、請求項４３記載の組成物。
【請求項４５】
治療薬をさらに含む、請求項４３または４４記載の組成物。
【請求項４６】
前記治療薬が生物学的治療薬である、請求項４５記載の組成物。
【請求項４７】
前記生物学的治療薬が、成長因子、タンパク質、ペプチド、酵素、抗体、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ワクチンおよびウィルスからなる群より選択される、請求項４６記載の組成物。
【請求項４８】
前記生物学的治療薬が、コンドロイチナーゼＡＢＣ（ｃｈＡＢＣ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、ノイロトロピン−３（ＮＴ−３）、インスリン、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）またはＢＭＰ関連ファミリー、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＦＧ）、細胞外酵素Ｃ３転移酵素（Ｃｅｔｈｒｉｎ）およびその誘導体、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ｂ１（ＴＧＦ−β１）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、およびａｎｔｉ−Ｎｏｇｏ抗体、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）抗体、オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（ＯＭｇｐ）抗体、エフリンＢ３抗体、セマフォリン４ａ／４ｄ／６ａ抗体、ネトリン１抗体、反発的ガイダンス分子Ａ（ＲＧＭａ）抗体、およびエリスロポエチンからなる群より選択される、請求項４７記載の組成物。
【請求項４９】
求核性官能基を有し、２以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマーおよび多官能性ポリマーからなる群より選択される第一ポリマー成分を含有する第一容器と、
求電子性官能基を有し、２以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマーおよび多官能性ポリマーからなる群より選択される第二ポリマー成分を含有する第二容器と
を含み、
前記第一ポリマー成分または前記第二ポリマー成分の少なくとも一方が、架橋性トレハロースを含む、キット。
【請求項５０】
前記第一容器、前記第二容器、または第三容器の少なくとも１つの中に治療薬をさらに含む、請求項４９記載のキット。
【請求項５１】
求電子性または求核性官能基を有し、２以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマーおよび多官能性ポリマーからなる群より選択される第三ポリマー成分を含有する第三容器をさらに含む、請求項４９記載のキット。
【請求項５２】
前記キットの内容物を利用したトレハロース含有ヒドロゲルの作製に関する説明書をさらに含む、請求項４９〜５１いずれか１項記載のキット。
【請求項５３】
請求項１〜４８いずれか１項記載のトレハロース含有ヒドロゲルまたは組成物を、それを必要としている患者の治療部位に埋め込むステップを含む、制御された治療薬送達の方法。
【請求項５４】
前記埋め込むステップが、前記治療部位に前記トレハロース含有ヒドロゲルの前駆体を注入することを含む、請求項５３記載の制御された治療薬送達の方法。
【請求項５５】
少なくとも１つの投与治療部位が、前記患者の脊髄柔膜、前記患者のくも膜、前記患者の脊髄神経の髄腔内部分、硬膜外、および前記患者の脊髄実質への直接投与からなる群より選択される、請求項５３記載の制御された治療薬送達の方法。
【請求項５６】
前記治療薬が、コンドロイチナーゼＡＢＣ、ノイロトロピン−３、または細胞外酵素Ｃ３転移酵素である、請求項５５記載の制御された治療薬送達の方法。
【請求項５７】
治療用埋込体の製造方法において、架橋性トレハロースポリマーを合成ポリマーヒドロゲル内に挿入して架橋ヒドロゲルを形成するステップと、前記架橋ヒドロゲル中に治療薬を組み込んで前記治療用埋込体を形成するステップと、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１３年３月１３日出願の米国仮特許出願第６１／７７９，５０６号明細書の利益を請求し、またこれはあたかも完全に示されているかのように参照により本明細書中に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、架橋性トレハロース、ヒドロゲル中へのトレハロースの共有結合による取込み、およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒドロゲルは、医療器具産業において、特に薬物送達および再生医療の分野において関心が高まっているバイオマテリアル群を表わす。これらの材料は、器具を不溶性にする架橋ポリマー網目構造(crosslinked polymer networks)からなる。さらにヒドロゲルは主に水から作られ、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用するための望ましい機械的性質を生じさせる。ヒドロゲルは、物理的封入または化学的修飾により、様々な治療薬（小分子、成長因子、酵素、抗体、ＲＮＡ、ＤＮＡなど）をヒドロゲル内に組み込むことができる、制御薬物送達用の賦形剤(controlled drug delivery vehicles)として広く使用されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
合成ポリマーは、その得られる化学的および物理的材料特性が高度に制御されるため、ヒドロゲルに使用される望ましい前駆体分子として探索されてきた。しかしながらヒドロゲルマトリックス内で天然産物の生来の利点を有効に使うことへの関心が存在する。これら分子の特定官能基による修飾は、マトリックスで独特な特性を設計する手段としてヒドロゲル材料内への容易な取込みを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ある態様において本発明は組成物に関する。その組成物は、トレハロース含有ヒドロゲルと、治療薬とを含む。
【０００６】
ある態様において本発明は、トレハロース含有ヒドロゲルに関する。このトレハロース含有ヒドロゲルは、第一ポリマーおよび第二ポリマーを含む。第一ポリマーまたは第二ポリマーの少なくとも一方は、それに共有結合しているトレハロースを含む。
【０００７】
ある態様において本発明は組成物に関する。この組成物は、第一ポリマー成分および第二ポリマー成分を含む。第一ポリマー成分は、求核性官能基を含み、２以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマー、および多官能性ポリマーからなる群より選択される。第二ポリマー成分は、求電子性官能基を含み、２以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマー、および多官能性ポリマーからなる群より選択される。第一ポリマー成分または第二ポリマー成分の少なくとも一方は、架橋性トレハロースを含む。
【０００８】
ある態様において本発明は組成物に関する。この組成物は、トレハロース含有ヒドロゲルを含む。ヒドロゲルは、少なくとも１種類の天然または合成ポリマーを含む。
【０００９】
ある態様において本発明はキットに関する。このキットは、求核性官能基を有し、２以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマー、および多官能性ポリマーからなる群より選択される第一ポリマー成分を含有する第一容器を含む。キットはまた、求電子性官能基を有し、２以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマー、および多官能性ポリマーからなる群より選択される第二ポリマー成分を含有する第二容器を含む。第一ポリマー成分または第二ポリマー成分の少なくとも一方は、架橋性トレハロースを含む。
【００１０】
ある態様において本発明は組成物に関する。この組成物は、糖含有ヒドロゲルおよび治療薬を含む。
ある態様において本発明は糖含有ヒドロゲルに関する。この糖含有ヒドロゲルは、第一
ポリマーおよび第二ポリマーを含む。第一ポリマーまたは第二ポリマーの少なくとも一方は、それに共有結合している糖を含む。
【００１１】
ある態様において本発明は組成物に関する。この組成物は、第一ポリマー成分および第二ポリマー成分を含む。第一ポリマー成分は、求核性官能基を含み、２以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマー、および多官能性ポリマーからなる群より選択される。第二ポリマー成分は、求電子性官能基を含み、２以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマー、および多官能性ポリマーからなる群より選択される。第一ポリマー成分または第二ポリマー成分の少なくとも一方は、架橋性の糖を含む。
【００１２】
ある態様において本発明は組成物に関する。この組成物は、糖含有ヒドロゲルを含む。このヒドロゲルは、少なくとも１種類の天然または合成ポリマーを含む。
【００１３】
ある態様において本発明はキットに関する。このキットは、求核性官能基を有し、２以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマー、および多官能性ポリマーからなる群より選択される第一ポリマー成分を含有する第一容器を含む。キットはまた、求電子性官能基を有し、２以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマー、および多官能性ポリマーからなる群より選択される第二ポリマー成分を含有する第二容器を含む。第一ポリマー成分または第二ポリマー成分の少なくとも一方は、架橋性の糖を含む。
【００１４】
ある態様において本発明は、制御された治療薬送達の方法に関する。この方法は、トレハロース含有ヒドロゲルまたはトレハロース含有ヒドロゲルの前駆体を、それを必要としている患者の治療部位に埋め込むステップを含む。
【００１５】
ある態様において本発明は、制御された治療薬送達の方法に関する。この方法は、糖含有ヒドロゲルまたは糖含有ヒドロゲルの前駆体を、それを必要としている患者の治療部位に埋め込むステップを含む。
【００１６】
ある態様において本発明は、架橋性トレハロース含有ポリマーを高分子ヒドロゲル内に挿入して架橋ヒドロゲルを形成するステップと、その架橋ヒドロゲル中に治療薬を組み込んで治療用埋込体(therapeutic implant)を形成するステップとを含む治療用埋込体の製造方法に関する。
【００１７】
ある態様において本発明は、架橋性糖含有ポリマーを高分子ヒドロゲル内に挿入して架橋ヒドロゲルを形成するステップと、その架橋ヒドロゲル中に治療薬を組み込んで治療用埋込体を形成するステップとを含む治療用埋込体の製造方法に関する。
【００１８】
ある態様において本発明は、トレハロース含有ヒドロゲルの配合方法に関する。この方法は、トレハロース含有ヒドロゲルの複数成分を混ぜ合わせるステップと、それら成分を重合させるステップとを含む。
【００１９】
ある態様において本発明は、糖含有ヒドロゲルの配合方法に関する。この方法は、糖含有ヒドロゲルの複数成分を混ぜ合わせるステップと、それら成分を重合させるステップとを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】トレハロース含有ヒドロゲルおよびそれを得る方法を例示する。
【図２】トレハロースジアクリラートのＬＣ−ＭＳを例示する。
【図３】トレハロースジアクリラートの１Ｈ−ＭＮＲを例示する。
【図４】トレハロースジメタクリラートのＬＣ−ＭＳを例示する。
【図５】トレハローステトラチオールのＬＣ−ＭＳを例示する。
【図６】トレハローステトラチオールの１Ｈ−ＭＮＲを例示する。
【図７】ＦＴＩＲによるヒドロゲルの試験を例示する。ヒドロゲル（２０重量％、ただしすべてのアクリラートがトレハロースジアクリラート由来である）を配合して体積６０μＬの小さなヒドロゲルの円板にし、ＰＢＳに入れ、そのインキュベーション緩衝液を２４時間に一回取り替えて４８時間平衡させた。次いでこの試料を、高真空乾燥下に７２時間置いてから、ＺｎＳｅ  ＡＴＲ結晶モジュールによるα−ＦＴＩＲを使用したＦＴＩＲによって試験した。
【図８】トレハロース含有ヒドロゲルのレオロジー特性を例示する。白／黒丸：トレハロースジアクリラート＋４アーム  ＰＥＧ−ＳＨ（５ｋＤａ）。白／黒三角：トレハロースジアクリラート（アクリラート５０％）＋ＰＥＧＤＡ  ５７５（アクリラート５０％）＋４アーム  ＰＥＧ−ＳＨ（５ｋＤａ）。
【図９】様々な緩衝液ｐＨ中での２０重量％ヒドロゲル（すべてのアクリラートがトレハロースジアクリラート由来である）のレオロジーを例示する。
【図１０】ヒドロゲルの膨潤を例示する。トレハロースジアクリラートおよびＰＥＧＤＡ  ５７５を様々な比率で使用して、アクリラート基の総量を形成した。２０重量％ヒドロゲルを形成し、図８で述べたものに似た条件下で平衡させた。硬化質量および４８時間平衡で観察された質量を使用して膨潤比を評価した。
【図１１】トレハロースジアクリラート（ＴＤＡ）またはトレハロースジメタクリラート（ＴＤＭＡ）を使用したＮＴ−３の安定化を例示する。
【図１２】様々な量のトレハロースを含有する溶液またはヒドロゲル内での７０℃で２時間のインキュベーション後のＨＲＰ（２００μｇ／ｍＬ）の活性を例示する。溶液試料の場合、非修飾トレハロース脱水物を、それらの対応するヒドロゲル中のトレハロースジアクリラートのモル量と等しくなるように加えた。データは、ｎ＝２の平均として標準偏差と共に示した。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の好ましい実施形態の下記の説明は、添付の図面と併せて読むとき、より良く理解されるはずである。本発明を例示する目的で、現在の好ましい実施形態を図面中に示す。しかしながら本発明は、示されたまさにその配置構成および手段に限定されないことを理解されたい。
【００２２】
ある種の術語が下記の説明において便利のためにのみ使用されるが、限定するものではない。
【００２３】
本明細書中で使用される「生物活性」または「活性」は区別なく使用され、特定の標的、基質、または受容体に対して治療作用を有する治療分子を指す。
【００２４】
本明細書中で使用される「生物学的治療薬」とは、自然界に見出されるモノマー単位を含む分子、またはその誘導体を指し、このモノマー単位は、これらに限定されないが、生物活性のあるアミノ酸、ヌクレオチド、または糖類、およびこれらの任意の組合せであることができる。
【００２５】
本明細書中で使用される「架橋性トレハロース」とは、求核性官能基または求電子性官能基のいずれかで化学的に修飾されるトレハロース二糖を指す。この求核性官能基はチオールであることができる。この求電子性官能基はアクリラートであることができる。
【００２６】
本明細書中で使用される「トレハロース含有ヒドロゲル」は、そのヒドロゲル内に架橋されたトレハロースを含む、またはそのヒドロゲル中の架橋したポリマーと共有結合したトレハロースを含むヒドロゲルである。トレハロース含有ヒドロゲルはまた、本明細書中では架橋ヒドロゲルと呼ぶこともある。
【００２７】
本明細書中で使用される「糖含有ヒドロゲル」とは、そのヒドロゲル内で架橋された糖、またはそのヒドロゲル中の架橋した合成または天然ポリマーと共有結合した糖を含むヒドロゲルである。糖には、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、または多糖類を挙げることができる。糖含有ヒドロゲルの糖であることができる糖の非限定的な例は、スクロース、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、トレハロース、または上記糖の混合物を含有するオリゴ糖類である。多糖類の非限定的な例には、キトサン、デキストラン、アルギン酸エステル、ヒアルロン酸、セルロース（非修飾または修飾）、アミロース、コンドロイチン硫酸、およびヘパリン硫酸が挙げられる。
【００２８】
本明細書中で使用される「部位特異的修飾」とは、化学修飾が分子内の指定された位置で起こることを意味する。
【００２９】
本明細書中で使用される「多官能性」とは、分子がｎ個（ただしｎ≧２）の反応性官能基で修飾されることを意味する。
【００３０】
本明細書中で使用される「官能性度(degree of functionality)」は、分子内の所望の反応性官能基の数を表現する。
【００３１】
本明細書中で使用される「活性化アルケン」とは、電子不足になるように炭素−炭素二重結合を引き起こし、かつミカエル付加反応のアクセプターとして作用することができる電気的陰性の置換基の近くに位置する、またはそれと結合する炭素−炭素二重結合を指す。
【００３２】
特許請求の範囲において、また明細書の対応する部分において使用される単語「或る（“ａ”）」および「一つの（“ｏｎｅ”）」は、別段の具体的な指定がない限り、その言及された事項を１個または複数個含むものと定義する。この術語は、前に具体的に述べられた単語、それらの派生語、および似た意味の単語を含む。「Ａ、Ｂ、またはＣ」などの２つ以上の事項の羅列を伴う語句「少なくとも１つ」は、Ａ、Ｂ、またはＣの任意の個別の１つおよびそれらの任意の組合せを意味する。
【００３３】
ある実施形態では糖含有ヒドロゲルを提供する。実施形態はまた、糖含有ヒドロゲルの使用方法およびその配合方法を含む。糖含有ヒドロゲルを、本明細書中ではトレハロース含有ヒドロゲル、それらの使用方法、およびそれらの配合方法によって例示する。トレハロース含有ヒドロゲル、それらの使用方法、およびそれらの配合方法についての記述に基づいて、その他の糖含有ヒドロゲルおよび方法を記述する。当業者は、その他の糖がトレハロースの代わりになることを認めるはずである。下記の記述においてトレハロースの代わりになることができる糖の非限定的な例は、スクロース、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、トレハロース、または上記糖の混合物を含有するオリゴ糖である。多糖類の非限定的な例には、キトサン、デキストラン、アルギン酸エステル、ヒアルロン酸、セルロース（非修飾または修飾）、アミロース、コンドロイチン硫酸、およびヘパリン硫酸が挙げられる。糖含有ヒドロゲルは、２種類以上の糖を含むことができる。
【００３４】
ある実施形態ではトレハロース含有ヒドロゲルを提供する。トレハロース含有ヒドロゲルはさらに、１種類または複数種類の生物学的治療薬を含むことができる。比較的大きな球形の生物学的治療薬が、トレハロース含有ヒドロゲル中に生物学的治療薬を取り込むのに役立つこともある。生物学的治療薬の例には、これらに限定されないが、タンパク質、抗体、ペプチド、酵素、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ワクチン、およびウィルスが挙げられる。生物学的治療薬を、トレハロース含有ヒドロゲルの架橋したポリマー網目構造内に物理的に閉じ込めることができる。トレハロース含有ヒドロゲルは、そのヒドロゲルから外側へ生物学的治療剤を拡散させる速度を遅らせるか、制御することができる。このためヒドロゲルは、デポと呼ばれることもある。しかしながら長期間にわたって生物学的治療薬の生物活性および安定性を維持するために熱、加水分解、またはタンパク質加水分解による損傷を防止することは、依然として重要な課題のままである。トレハロースは、製剤に賦形剤として加えた場合、生物学的治療薬の活性を高め、かつ／または維持することが示されている天然に産出される二糖である。上記で列挙したＳｔａｎｗｉｃｋ等（２０１２）およびＬｅｅ等（２０１０）を参照されたい（これらはあたかも完全に示されているかのように参照により本明細書中に組み込まれる）。タンパク質安定化の正確な機構は分かっていない。しかしながら、水素結合によるトレハロース−タンパク質の相互作用、保護剤として機能してタンパク質表面近くの水分子を隔離すること、またはトレハロースが介在するタンパク質分子の閉じ込めのうちの一つであるという仮説が立てられる。本明細書中の実施形態は、長期にわたる制御された薬物の送達の用途のための三次元バイオマテリアル環境において生物活性安定化効果を再現する手段として、架橋性トレハロースから形成することができるトレハロース含有ヒドロゲルの新規な使用法を含む。ある実施形態は、天然または合成高分子ヒドロゲルを含む組成物を含み、その天然高分子ヒドロゲルは、そのヒドロゲルのポリマーとしてペプチド、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、またはオリゴヌクレオチドを含むことができ、またその合成ポリマーヒドロゲルは、そのヒドロゲル中にポリマーとしてエチレンオキシド、グリコシド、ラクチド、またはカプロラクトンの反復単位を含むことができる。ある実施形態は、トレハロース含有ヒドロゲルの製造方法を含む。
【００３５】
ある実施形態は、制御された活性治療薬の送達方法を含む。この方法は、合成高分子ヒドロゲル内に架橋性トレハロースを挿入して架橋ヒドロゲルを形成するステップと、この架橋ヒドロゲル中に治療薬を組み込んで治療用埋込体を形成するステップとを含むことができる。この方法はまた、その治療用埋込体を埋め込むステップを含むことができる。この治療薬は、生物学的治療薬であることができる。埋込みは、治療用埋込体を患者の治療部位に物理的に配置することを含むことができる。物理的配置は、外科的な配置を含むことができる。埋込みは、架橋性トレハロースおよび治療薬を含むヒドロゲル前駆体を患者の治療部位に投与することを含むことができる。この前駆体の投与は、その前駆体を治療部位に注入することを含むことができる。その治療部位は、これらに限定されないが、損傷の部位または疾患の部位であることができる。治療部位は、脊髄および／または脳とその関連する構造体とを含めた中枢神経系であることができる。治療部位は、脊柱内および脊柱上の部位を含めた末梢神経系、または眼であることができる。治療部位は、外科的処置の部位であることもできる。
【００３６】
方法は、トレハロース含有ヒドロゲルを埋め込むステップを含むことができる。トレハロース含有ヒドロゲルは、生物学的治療薬、したがってまた治療用埋込体であることができる治療薬を含むことができる。この方法は、トレハロース含有ヒドロゲルに治療薬を加えるステップを含むことができる。埋込みは、形成されたトレハロース含有ヒドロゲルまたは治療用埋込体を患者の治療部位に配置するステップを含むことができる。埋込みは、架橋性トレハロースを含むヒドロゲル前駆体を患者の治療部位に配置するステップを含むことができる。前駆体の投与は、その前駆体を治療部位に注入するステップを含むこともできる。ヒドロゲル前駆体の混合物は、生物学的治療薬であることができる少なくとも１種類の治療薬を含むことができる。その治療部位は、これらに限定されないが損傷の部位または疾患の部位であることができる。治療部位は、脊髄および／または脳とその関連する構造体とを含めた中枢神経系であることができる。治療部位は、脊柱内および脊柱上の部位を含めた末梢神経系、または眼であることができる。治療部位は、外科的処置の部位であることもできる。
【００３７】
本明細書中で使用される患者とは動物である。その動物は哺乳動物であることができる。その哺乳動物はヒトであることができる。この患者は、治療の必要な状態であることができる。患者は、脊髄の損傷、腫瘍の切除、椎間板疾患、腰部椎間板疾患、末梢神経の損傷、眼の適応症、脳卒中、外傷性脳損傷、動脈瘤、または脊椎固定術を患っており、かつその治療の必要な状態にあることができる。患者は、損傷または疾患に対する予防の必要な状態であることができ、この治療用埋込体またはトレハロース含有ヒドロゲルは、その予防を達成することができる。予防は、生物学的治療薬としてワクチン成分を手段とすることもできる。
【００３８】
架橋性トレハロース
トレハロースは、可能な化学修飾のために複数個の水酸基を含有する。６および６’位の第一水酸基を部位特異的に修飾するために酵素触媒による方法を採用することができる。この反応スキームを利用して多官能性トレハロースを得ることができる。トレハロースを求電子基で修飾（エステル化反応）するためには、それをＣ．アンタルクチカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢの存在下でビニルエステル官能基化Ｃ＝ＣＯ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１分子（ただし、Ｒ１はアクリラート、メタクリラート、エタクリラート、アクリルアミド、マレイミド、またはビニルスルホンであることができる）と反応させる。Ｒ１は、アクリラートであることができる。下記の反応スキーム１を参照されたい。ある実施形態ではＣ．アンタルクチカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢをマクロ孔質アクリル樹脂と結合させ、反応物をこの樹脂と接触させる。この１段階反応は、二官能基化トレハロース分子を生成することができる。
【００３９】
【化１】
2016513653.tif 000003
【００４０】
【化２】
2016513653.tif 000004
【００４１】
反応スキーム１に示した一般的反応の実施形態では、その反応はトレハロースジアクリラートを生成することになる。代わりのトレハロース化学修飾は、まず糖を化学量論的過剰量の複ビニルエステル(double vinyl ester)と反応させることによって得ることができ、それを精製すると他の第一水酸基含有分子との後続の反応に利用できる糖の６および６’位にビニルエステル官能基を有するトレハロースを生成する（反応スキーム２）。複ビニルエステルをＲ２として使用することができる。Ｒ２は、アジピン酸ジビニルを与える（ＣＨ２）４またはセバシン酸ジビニルを与える（ＣＨ２）８ものであることができる。Ｒ２は、（ＣＨ２）ｎ（ただしｎ＝１〜２０）、または（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎであることも、またグリコリド、ラクチド、またはカプロラクトンの反復単位、あるいはペプチドを含有することもできる。トレハロースを求核基で修飾するためには、トレハロースジビニルエステルと、これもまたより強い求核基Ｒ３を含む第一水酸基含有分子との間で第二エステル化反応を行うことができる。Ｒ３は、チオールであることができる。Ｒ３は、多官能性求核基を含むことができる。Ｒ３は、（ＳＨ）ｍ（ＣＨ２）ｎ（ただし、ｍ＝１〜１０、ｎ＝１〜２０）を含むことができる。Ｒ３は、ジチオールを含むことができる。第一水酸基含有チオール分子の例は、２，３−ジメルカプト−１−プロパノール、２−メルカプトエタノール、および１−チオグリセロールである。トレハロースジビニルエステルと２，３−ジメルカプト−１−プロパノールの反応は、チオール部分を有する多官能性（この実施例では四官能性）トレハロースを生成することができる。
【００４２】
トレハロース含有ヒドロゲル
ある実施形態では、方法はヒドロゲル前駆体を混合して架橋ヒドロゲルを形成するステップを含む。これら前駆体は、第一ポリマー成分および第二ポリマー成分であることができる。これら前駆体は、第一ポリマー成分、第二ポリマー成分、および第三ポリマー成分であることができる。第一ポリマー成分は、第二ポリマー成分と異なることができる。第三ポリマー成分は、第一ポリマー成分または第二ポリマー成分と異なることができる。本明細書中のトレハロース含有ヒドロゲルは、この方法によって形成することができる。本明細書中で使用される「ポリマー成分」とは、反応してヒドロゲルを形成することができる分子前駆体を指す。ポリマー成分は、架橋性トレハロース、架橋性の糖、天然または合成ポリマー、分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマー、または多官能性ポリマーであることができる。
【００４３】
第一ポリマー成分は、２以上の官能性度を有し、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマー、および多官能性ポリマーからなる群より選択することができる。第一ポリマー成分は、求核性官能基を含むことができる。第一ポリマー成分は、架橋性トレハロースであることができる。第一ポリマー成分は、チオール修飾トレハロースであることができる。第一ポリマー成分は、末端チオール基で官能基化されたマルチアームポリ（エチレングリコール）であることもできる。第一ポリマー成分は、エトキシル化トリメチロールプロパントリ（３−メルカプトプロピナート）（ＥＴＴＭＰ）であることもできる。
【００４４】
第二ポリマー成分は、２以上の官能性度を有し、分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマー、および多官能性ポリマーからなる群より選択することができる。第二ポリマー成分は、求電子性官能基を含むことができる。第二ポリマー成分は、架橋性トレハロースであることができる。第二ポリマー成分は、求電子性官能基を含むことができる。第二ポリマー成分は、メタクリラート官能基化トレハロース、エタクリラート官能基化トレハロース、マレイミド官能基化トレハロース、ビニルスルホン官能基化トレハロース、またはアクリラート官能基化トレハロースであることができる。第二ポリマー成分はまた、二量体、三量体、またはそのポリマーの末端官能基がメタクリラート、エタクリラート、マレイミド、ビニルスルホン、またはアクリラートのいずれかである任意の他の数の反復トレハロース単位であることができる。第二ポリマー成分は、トレハロースジアクリラートであることができる。第二ポリマー成分は、ポリ（エチレングリコール）ジアクリラートであることができる。
【００４５】
第三ポリマー成分を加えて、トレハロース含有ヒドロゲル中のトレハロースの量を変えることができる。第三ポリマー成分は、１以上の官能性度を有し、分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマー、および多官能性ポリマーからなる群より選択することができる。第三ポリマー成分は、求電子性または求核性官能基を含有することができる。第三ポリマー成分は、エチレンオキシドまたはエチレングリコールの反復単位と、求核性または求電子性官能基のいずれかと、を含有することができる。第三ポリマー成分は、ポリ（エチレングリコールジアクリラート）であることができる。
【００４６】
分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマー、および多官能性ポリマーは、エチレングリコール単位、エチレンオキシド単位、カプロラクトン単位、ラクチド単位、グリコリド単位、ヒドロキシエチルメタクリラート単位、アクリルアミド単位、またはトレハロース単位を含有することができる。
【００４７】
ある実施形態では、第一ポリマー成分がエトキシル化トリメチロールプロパントリ（３−メルカプトプロピナート）であり、かつ第二ポリマー成分がトレハロースジアクリラートであり、第三ポリマー成分がＰＥＧジアクリラートである。
【００４８】
ある実施形態では、第一ポリマー成分がエトキシル化トリメチロールプロパントリ（３−メルカプトプロピナート）であり、かつ第二ポリマー成分がトレハロースジアクリラートであり、第三ポリマー成分が８アームＰＥＧビニルスルホン（Ｍｎは約１０ｋＤａ）である。
【００４９】
混合は、第一ポリマー成分を第二ポリマー成分に、官能基を基準にした化学量論的当量で加えるステップを含むことができる。混合は、第一ポリマー成分を第二ポリマー成分および第三ポリマー成分に、官能基を基準にして化学量論的当量で加えるステップを含むことができる。例えば第一ポリマー成分の求核性官能基は、第二ポリマー成分中の求電子性官能基に等しい。別法では、求核性官能基の濃度が求電子性官能基と化学量論的に等価である場合、すべてのポリマー成分が一緒に加えられる。
【００５０】
混合は、第一ポリマー成分を、緩衝媒体中で第二ポリマー成分に加えるステップを含むことができる。混合は、第一ポリマー成分を、緩衝媒体中で第二ポリマー成分および第三ポリマー成分に加えるステップを含むことができる。緩衝媒体は、７を超えるｐＨを有することができる。緩衝媒体は、７〜９．５のｐＨを有することができる。
【００５１】
混合は、トレハロースジアクリラートおよびＰＥＧジアクリラートをエトキシル化トリメチロールプロパントリ（３−メルカプトプロピナート）に、アクリラートおよびチオールの濃度を基準にして化学量論的当量で加えるステップを含むことができる。
【００５２】
トレハロース含有ヒドロゲルは、治療部位（例えば組織）に送達された（または埋め込まれた）場合にインサイチュ−で硬化するように設計することができる。インサイチュ−での硬化とは、溶液から架橋された材料への移行を表現する。生物学的治療薬は、プレポリマー溶液（前駆体の混合物）内に組み込むことができ、そのポリマー成分の架橋時に物理的に閉じ込められるようになる。さらに、トレハロース含有ヒドロゲルを、カプセル化された生物学的治療薬と一緒にして前もって作り、続いて脱水することもできる。この架橋ゲルは、ワクチンなどの敏感な生物学的治療薬の有効期間および貯蔵量を増すという実用性を有することができる。この架橋ゲルを予め形成された埋込体として送達することもでき、またその生物学的治療薬を水性環境中で平衡させるとインビトロで回収することができ、続いてそれを注射により送達することもできる。この架橋ヒドロゲルの使用方法は、これらの役に立つものを埋め込むことを目論んでいる。例えば方法は、予め形成された埋込体を水性環境中で平衡させるステップを含むことができる。
【００５３】
ヒドロゲルは、逐次または連鎖重合反応機構によって形成される架橋ポリマー網目構造である。ある実施形態ではトレハロースジアクリラートは、ヒドロゲルを単独で形成することもでき、また他のコポリマーの存在下でアクリラート基のラジカル重合によって形成することもできる。ラジカル開始剤（熱、レドックス、または光）を使用して、この重合反応を開始させることができる。さらに、多官能性反応基によるこれら成分のラジカル重合は、その構造中に連鎖を有するヒドロゲルを生成する。多官能性アクリラートをラジカル開始機構により重合して架橋ゲルを形成する場合、その得られる材料は、疎水性ポリアクリラート連鎖を含有することになる。逐次重合反応は、少なくともＡ−Ａモノマーまたはポリマーと、Ｂ−Ｂモノマーまたはポリマーとを続けて（Ａ−ＡＢ−Ｂ）ｎポリマーを形成する。ある実施形態ではトレハロース含有ヒドロゲルまたは治療薬埋込体は、スルフヒドリルと、アクリラートであることができる活性化アルケンとの塩基触媒によるミカエル型反応により形成されるポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）系ヒドロゲルである。ＰＥＧ−ジアクリラート（Ｍｎは５００〜１０００ｇｍｏｌ−１の範囲にある）とエトキシル化トリメチロールプロパントリ（３−メルカプトプロピナート）（ＥＴＴＭＰ）（Ｍｎは約１３００ｇｍｏｌ−１）を、チオール（求核基）およびアクリラート（求電子基）の濃度を基準にした化学量論的当量で混ぜ合わせて、ゲル化を開始させる。
【００５４】
生物学的治療薬を閉じ込めてその活性を高めまたは延長させる、架橋ヒドロゲル内に含まれる成分としての架橋トレハロースの利用を、本明細書中で実証する。可溶性で天然のトレハロースは、プレポリマー溶液の状態で含まれる場合、その糖の高度の水溶性および小さな構造サイズ（流体力学的半径）のため、短い時間的尺度（数分〜数時間）でヒドロゲルから溶出することになる。その糖がマトリックス内で共有結合により架橋することを可能にするようにそれを修飾することにより、その分子の拡散を阻止する仕組みを提供し、かつ分子がヒドロゲルから自由に溶出する場合よりも長い時間的経過にわたってその保護効果を与える。
【００５５】
ある実施形態ではトレハロースジアクリラートおよびＰＥＧ−ジアクリラートは、ヒドロゲル反応にそのアクリラート官能基を与え、一方、ＥＴＴＭＰは、混合物にそのスルフヒドリル官能基を与える。そのアクリラートの濃度は、スルフヒドリルの濃度に等しい。トレハロースジアクリラートとＰＥＧ−ジアクリラートの比を調整して、望ましいタンパク質保護効果を有する様々なゲル特性を達成することができる。例えば図８〜１０は、目的に合わせることができる機械的性質、ゲル化速度、およびヒドロゲル膨潤の制御を実例で示す。
【００５６】
架橋ヒドロゲルは、５および４０％を含めた５〜４０％の間のポリマー重量％を有することができる。架橋ヒドロゲルのポリマー重量％は、５〜４０％の間の任意の値であることができる。架橋ヒドロゲル重量％は、５〜４０の間の、かつ任意の２つの整数％を含めた範囲の値を有することができる。本明細書中で使用される「ヒドロゲル重量％」は、（架橋ヒドロゲル中の共有結合で接合または架橋した成分の質量）／（ヒドロゲル中の共有結合で接合または架橋した成分の質量に水の質量を加えた和）である。
【００５７】
治療剤とも呼ぶことができるこの治療薬は、小分子、成長因子、タンパク質、ペプチド、酵素、抗体、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ワクチン、ウィルスであることができる。治療薬は、コンドロイチナーゼＡＢＣ（ｃｈＡＢＣ、１〜５０単位／ｍＬ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ、１〜５０単位／ｍＬ）、ノイロトロピン−３（ＮＴ−３、１〜１０００μｇ／ｍＬ）、インスリン、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ、１〜１０００μｇ／ｍＬ）、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２、１〜１０００μｇ／ｍＬ）またはＢＭＰ関連ファミリー(related family of BMP’s)、神経成長因子（ＮＧＦ、１〜１０００μｇ／ｍＬ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ、１〜１０００μｇ／ｍＬ）、肝細胞増殖因子（ＨＦＧ、１〜１０００μｇ／ｍＬ）、細胞外酵素Ｃ３転移酵素（Ｃｅｔｈｒｉｎ、１〜１０００μｇ／ｍＬ）およびその誘導体、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、１〜１０００μｇ／ｍＬ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ、１〜１０００μｇ／ｍＬ）、トランスフォーミング増殖因子ｂ１（ＴＧＦ−β１、１〜１０００μｇ／ｍＬ）、上皮成長因子（ＥＧＦ、１〜１０００μｇ／ｍＬ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ、１〜１０００μｇ／ｍＬ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１、１〜１０００μｇ／ｍＬ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ、１〜１０００μｇ／ｍＬ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ、１〜１０００μｇ／ｍＬ）およびａｎｔｉ−Ｎｏｇｏ抗体（１〜１００ｍｇ／ｍＬ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）抗体（１〜１００ｍｇ／ｍＬ）、オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（ＯＭｇｐ）抗体（１〜１００ｍｇ／ｍＬ）、エフリンＢ３抗体（１〜１００ｍｇ／ｍＬ）、セマフォリン４ａ／４ｄ／６ａ抗体（１〜１００ｍｇ／ｍＬ）、ネトリン１抗体（１〜１００ｍｇ／ｍＬ）、反発的ガイダンス分子Ａ（ＲＧＭａ）抗体（１〜１００ｍｇ／ｍＬ）、およびエリスロポエチン（２５，０００〜２，５００，０００ＩＵ／ｍＬ）からなる群より選択される少なくとも１種類の治療薬であることができる。本明細書中の方法および組成物は、上記に列挙した生物学的治療薬または様々な医学的介入のための他の生物学的治療薬と共に適用することができる。制御されたタンパク質送達による治療法の場合、その治療薬の有効性は、それが活性であり続けるかどうかに左右される。
【００５８】
実施形態
下記の一覧表は、本発明の特定の実施形態を含む。しかし、当技術分野の当業者であれば理解するように、この一覧表は限定するものではなく、代わりの実施形態を排除しない。
【００５９】
１．トレハロース含有ヒドロゲルと、治療薬とを含む、組成物。
【００６０】
２．そのトレハロース含有ヒドロゲルは、天然または合成ポリマーを含む、組成物。
【００６１】
３．そのトレハロース含有ヒドロゲルは、エトキシル化トリメチロールプロパントリ（３−メルカプトプロピナート）とトレハロースジアクリラートとの逐次または連鎖重合反応の生成物を含む、実施形態１〜２のいずれか１つまたは複数の組成物。
【００６２】
４．そのトレハロース含有ヒドロゲルは、エトキシル化トリメチロールプロパントリ（３−メルカプトプロピナート）とトレハロースジアクリラートとＰＥＧジアクリラートとの逐次または連鎖重合反応の生成物を含む、前述の実施形態のいずれか１つまたは複数の組成物。
【００６３】
５．そのトレハロース含有ヒドロゲルは、エトキシル化トリメチロールプロパントリ（３−メルカプトプロピナート）とトレハロースジアクリラートと８アームＰＥＧビニルスルホンとの逐次または連鎖重合反応の生成物を含む、前述の実施形態のいずれか１つまたは複数の組成物。
【００６４】
６．そのトレハロースは、トレハロースのｎ個の反復単位を有するトレハロース反復単位の形態であり、かつｎが２以上である、前述の実施形態のいずれか１つまたは複数の組成物。
【００６５】
７．その治療薬は、生物学的治療薬である、前述の実施形態のいずれか１つまたは複数の組成物。
【００６６】
８．その生物学的治療薬は、成長因子、タンパク質、ペプチド、酵素、抗体、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ワクチン、およびウィルスからなる群より選択される、実施形態７の組成物。
【００６７】
９．その生物学的治療薬は、コンドロイチナーゼＡＢＣ（ｃｈＡＢＣ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、ノイロトロピン−３（ＮＴ−３）、インスリン、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）またはＢＭＰ関連ファミリー、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＦＧ）、細胞外酵素Ｃ３転移酵素（Ｃｅｔｈｒｉｎ）およびその誘導体、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ｂ１（ＴＧＦ−β１）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、およびａｎｔｉ−Ｎｏｇｏ抗体、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）抗体、オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（ＯＭｇｐ）抗体、エフリンＢ３抗体、セマフォリン４ａ／４ｄ／６ａ抗体、ネトリン１抗体、反発的ガイダンス分子Ａ（ＲＧＭａ）抗体、およびエリスロポエチンからなる群より選択される、実施形態７〜８のいずれか１つまたは複数の組成物。
【００６８】
１０．第一ポリマーと、第二ポリマーとを含むトレハロース含有ヒドロゲルであって、その第一ポリマーまたは第二ポリマーの少なくとも一方は、それと共有結合したトレハロースを含む、トレハロース含有ヒドロゲル。
【００６９】
１１．その第一ポリマーは、それと架橋したトレハロースを含む、実施形態１０のトレハロース含有ヒドロゲル。
【００７０】
１２．そのトレハロース含有ヒドロゲルは、求核性官能基を有し、２以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマー、および多官能性ポリマーからなる群より選択される第一ポリマー成分と、求電子性官能基を有し、２以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマー、および多官能性ポリマーからなる群より選択される第二ポリマー成分との逐次または連鎖重合反応の生成物である、実施形態１０〜１１のいずれか１種類または複数種類のトレハロース含有ヒドロゲル。
【００７１】
１３．その逐次または連鎖重合反応は、水性溶媒中で行われる、実施形態１２のトレハロース含有ヒドロゲル。
【００７２】
１４．その第一ポリマー成分は、天然または合成ポリマーである、実施形態１３〜１４のいずれか１種類または複数種類のトレハロース含有ヒドロゲル。
【００７３】
１５．その第一ポリマー成分は、末端チオール基で官能基化されたマルチアームポリ（エチレングリコール）を含む、実施形態１３〜１４のいずれか１種類または複数種類のトレハロース含有ヒドロゲル。
【００７４】
１６．その第一ポリマー成分は、エトキシル化トリメチロールプロパントリ（３−メルカプトプロピナート）を含む、実施形態１３〜１５のいずれか１種類または複数種類のトレハロース含有ヒドロゲル。
【００７５】
１７．その第二ポリマー成分は、それと架橋したトレハロースを含む、実施形態１３〜１６のいずれか１種類または複数種類のトレハロース含有ヒドロゲル。
【００７６】
１８．その架橋トレハロースは、メタクリラート官能基化トレハロース、エタクリラート官能基化トレハロース、マレイミド官能基化トレハロース、ビニルスルホン官能基化トレハロース、アクリラート官能基化トレハロース、またはチオール官能基化トレハロースのうちの１つから誘導される、実施形態１３〜１７のいずれか１種類または複数種類のトレハロース含有ヒドロゲル。
【００７７】
１９．その架橋トレハロースは、トレハロースのｎ個の反復単位を有するトレハロース反復単位の形態である、実施形態１３〜１８のいずれか１種類または複数種類のトレハロース含有ヒドロゲル。
【００７８】
２０．その第二ポリマー成分は、メタクリラート、エタクリラート、マレイミド、およびビニルスルホンまたはアクリラートからなる群より選択される末端官能基を有する、実施形態１３〜１９のいずれか１種類または複数種類のトレハロース含有ヒドロゲル。
【００７９】
２１．ｎは２または３に等しい、実施形態１９のトレハロース含有ヒドロゲル。
【００８０】
２２．その第二ポリマー成分は、トレハロースジアクリラートおよびポリ（エチレングリコール）ジアクリラートからなる群より選択される、実施形態１３〜２１のいずれか１種類または複数種類のトレハロース含有ヒドロゲル。
【００８１】
２３．その第一ポリマー成分と第二ポリマー成分との官能性度の和は５以上である、実施形態１３〜２２のいずれか１種類または複数種類のトレハロース含有ヒドロゲル。
【００８２】
２４．その第一ポリマー成分は、エトキシル化トリメチロールプロパントリ（３−メルカプトプロピナート）であり、かつ第二ポリマー成分は、トレハロースジアクリラートである、実施形態１３〜２３のいずれか１種類または複数種類のトレハロース含有ヒドロゲル。
【００８３】
２５．第三ポリマーをさらに含む、実施形態１０〜２４のいずれか１種類または複数種類のトレハロース含有ヒドロゲル。
【００８４】
２６．その第三成分は、ポリ（エチレングリコールジアクリラート）である、実施形態２５のトレハロース含有ヒドロゲル。
【００８５】
２７．そのトレハロース含有ヒドロゲルは、求核性官能基を有し、２以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマー、および多官能性ポリマーからなる群より選択される第一ポリマー成分と、求電子性官能基を有し、２以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマー、および多官能性ポリマーからなる群より選択される第二ポリマー成分と、求電子性または求核性官能基を有し、１以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマー、および多官能性ポリマーからなる群より選択される第三ポリマー成分との逐次または連鎖重合反応の生成物である、実施形態２５〜２６のいずれか１種類または複数種類のトレハロース含有ヒドロゲル。
【００８６】
２８．その第一成分は、エトキシル化トリメチロールプロパントリ（３−メルカプトプロピナート）であり、かつ第二ポリマー成分は、トレハロースジアクリラートであり、かつ第三ポリマー成分は、ＰＥＧジアクリラートである、実施形態２７のトレハロース含有ヒドロゲル。
【００８７】
２９．その第一成分は、エトキシル化トリメチロールプロパントリ（３−メルカプトプロピナート）であり、かつ第二ポリマー成分は、トレハロースジアクリラートであり、かつ第三ポリマー成分は、８アームＰＥＧビニルスルホンである、実施形態２８のトレハロース含有ヒドロゲル。
【００８８】
３０．治療薬をさらに含む、実施形態１０〜２９のいずれか１種類のトレハロース含有ヒドロゲル。
【００８９】
３１．その治療薬は、生物学的治療薬である、実施形態３０のトレハロース含有ヒドロゲル。
【００９０】
３２．その生物学的治療薬は、成長因子、タンパク質、ペプチド、酵素、抗体、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ワクチン、およびウィルスからなる群より選択される、実施形態３１のトレハロース含有ヒドロゲル。
【００９１】
３３．その生物学的治療薬は、コンドロイチナーゼＡＢＣ（ｃｈＡＢＣ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、ノイロトロピン−３（ＮＴ−３）、インスリン、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）またはＢＭＰ関連ファミリー、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＦＧ）、細胞外酵素Ｃ３転移酵素（Ｃｅｔｈｒｉｎ）およびその誘導体、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ｂ１（ＴＧＦ−β１）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、およびａｎｔｉ−Ｎｏｇｏ抗体、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）抗体、オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（ＯＭｇｐ）抗体、エフリンＢ３抗体、セマフォリン４ａ／４ｄ／６ａ抗体、ネトリン１抗体、反発的ガイダンス分子Ａ（ＲＧＭａ）抗体、およびエリスロポエチンからなる群より選択される、実施形態３１〜３２のいずれか１種類のトレハロース含有ヒドロゲル。
【００９２】
３４．求核性官能基を有し、２以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマー、および多官能性ポリマーからなる群より選択される第一ポリマー成分と、求電子性官能基を有し、２以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマー、および多官能性ポリマーからなる群より選択される第二ポリマー成分とを含む組成物であって、その第一ポリマー成分または第二ポリマー成分の少なくとも一方が、架橋性トレハロースを含む、組成物。
【００９３】
３５．その第一ポリマー成分は、架橋性トレハロースを含む、実施形態３４の組成物。
【００９４】
３６．その第一ポリマー成分は、末端チオール基で官能基化されたマルチアームポリ（エチレングリコール）を含む、実施形態３４〜３５のいずれか１つの組成物。
【００９５】
３７．その第一ポリマー成分は、エトキシル化トリメチロールプロパントリ（３−メルカプトプロピナート）を含む、実施形態３４〜３５のいずれか１つの組成物。
【００９６】
３８．その第二ポリマー成分は、架橋性トレハロースを含む、実施形態３４〜３７のいずれか１つの組成物。
【００９７】
３９．その架橋性トレハロースは、メタクリラート官能基化トレハロース、エタクリラート官能基化トレハロース、マレイミド官能基化トレハロース、ビニルスルホン官能基化トレハロース、アクリラート官能基化トレハロース、またはチオール官能基化トレハロースのうちの１つから誘導される、実施形態３４〜３８のいずれか１つの組成物。
【００９８】
４０．その架橋トレハロースは、トレハロースのｎ個の反復単位を有するトレハロース反復単位の形態である、実施形態３８の組成物。
【００９９】
４１．ｎは２または３に等しい、実施形態４０の組成物。
【０１００】
４２．その第二ポリマー成分は、トレハロースジアクリラートおよびポリ（エチレングリコール）ジアクリラートからなる群より選択される、実施形態３４〜３８のいずれか１つの組成物。
【０１０１】
４３．その第二ポリマー成分は、メタクリラート、エタクリラート、マレイミド、およびビニルスルホンまたはアクリラートからなる群より選択される末端官能基を有する、実施形態３４〜４２のいずれか１つの組成物。
【０１０２】
４４．その第一ポリマー成分と第二ポリマー成分との官能性度の和は５以上である、実施形態３４〜４３のいずれか１つの組成物。
【０１０３】
４５．水性溶媒をさらに含む、実施形態３４〜４４のいずれか１つの組成物。
【０１０４】
４６．その第一ポリマー成分は、エトキシル化トリメチロールプロパントリ（３−メルカプトプロピナート）であり、かつ第二ポリマー成分は、トレハロースジアクリラートである、実施形態３４〜４５のいずれか１つの組成物。
【０１０５】
４７．求電子性または求核性官能基を有し、２以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマー、および多官能性ポリマーからなる群より選択される第三ポリマー成分をさらに含む、実施形態３４〜４６のいずれか１つの組成物。
【０１０６】
４８．その第三成分は、ポリ（エチレングリコールジアクリラート）である、実施形態４７の組成物。
【０１０７】
４９．その第一成分は、エトキシル化トリメチロールプロパントリ（３−メルカプトプロピナート）であり、かつ第二ポリマー成分は、トレハロースジアクリラートであり、かつ第三ポリマー成分は、ＰＥＧジアクリラートである、実施形態３４〜４７のいずれか１つの組成物。
【０１０８】
５０．その第一成分は、エトキシル化トリメチロールプロパントリ（３−メルカプトプロピナート）であり、かつ第二ポリマー成分は、トレハロースジアクリラートであり、かつ第三ポリマー成分は、８アームＰＥＧビニルスルホンである、実施形態３４〜４７のいずれか１つの組成物。
【０１０９】
５１．治療薬をさらに含む、実施形態３４〜５０のいずれか１つの組成物。
【０１１０】
５２．その治療薬は生物学的治療薬である、実施形態５１の組成物。
【０１１１】
５３．その生物学的治療薬は、成長因子、タンパク質、ペプチド、酵素、抗体、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ワクチン、およびウィルスからなる群より選択される、実施形態５２の組成物。
【０１１２】
５４．その生物学的治療薬は、コンドロイチナーゼＡＢＣ（ｃｈＡＢＣ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、ノイロトロピン−３（ＮＴ−３）、インスリン、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）またはＢＭＰ関連ファミリー、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＦＧ）、細胞外酵素Ｃ３転移酵素（Ｃｅｔｈｒｉｎ）およびその誘導体、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ｂ１（ＴＧＦ−β１）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、およびａｎｔｉ−Ｎｏｇｏ抗体、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）抗体、オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（ＯＭｇｐ）抗体、エフリンＢ３抗体、セマフォリン４ａ／４ｄ／６ａ抗体、ネトリン１抗体、反発的ガイダンス分子Ａ（ＲＧＭａ）抗体、およびエリスロポエチンからなる群より選択される、実施形態５２〜５３のいずれか１つの組成物。
【０１１３】
５５．トレハロース含有ヒドロゲルを含む組成物であって、そのヒドロゲルは、天然または合成ポリマーを含む、組成物。
【０１１４】
５６．そのトレハロース含有ヒドロゲルは、ポリ（エチレングリコール）ポリマーを含む、実施形態５５の組成物。
【０１１５】
５７．そのトレハロース含有ヒドロゲルは、エトキシル化トリメチロールプロパントリ（３−メルカプトプロピナート）とトレハロースジアクリラートとの逐次または連鎖重合反応の生成物を含む、実施形態５５〜５６のいずれか１つの組成物。
【０１１６】
５８．そのトレハロース含有ヒドロゲルは、エトキシル化トリメチロールプロパントリ（３−メルカプトプロピナート）とトレハロースジアクリラートとＰＥＧジアクリラートとの逐次または連鎖重合反応の生成物を含む、実施形態５５〜５６のいずれか１つの組成物。
【０１１７】
５９．そのトレハロース含有ヒドロゲルは、エトキシル化トリメチロールプロパントリ（３−メルカプトプロピナート）とトレハロースジアクリラートと８アームＰＥＧビニルスルホンとの逐次または連鎖重合反応の生成物を含む、実施形態５５〜５６のいずれか１つの組成物。
【０１１８】
６０．治療薬をさらに含む、実施形態５５〜５９のいずれか１つの組成物。
【０１１９】
６１．その治療薬は生物学的治療薬である、実施形態６０の組成物。
【０１２０】
６２．その生物学的治療薬は、成長因子、タンパク質、ペプチド、酵素、抗体、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ワクチン、およびウィルスからなる群より選択される、実施形態６０または６１のいずれか１つの組成物。
【０１２１】
６３．その生物学的治療薬は、コンドロイチナーゼＡＢＣ（ｃｈＡＢＣ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、ノイロトロピン−３（ＮＴ−３）、インスリン、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）またはＢＭＰ関連ファミリー、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＦＧ）、細胞外酵素Ｃ３転移酵素（Ｃｅｔｈｒｉｎ）およびその誘導体、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ｂ１（ＴＧＦ−β１）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、およびａｎｔｉ−Ｎｏｇｏ抗体、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）抗体、オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（ＯＭｇｐ）抗体、エフリンＢ３抗体、セマフォリン４ａ／４ｄ／６ａ抗体、ネトリン１抗体、反発的ガイダンス分子Ａ（ＲＧＭａ）抗体、およびエリスロポエチンからなる群より選択される、実施形態６０〜６２のいずれか１つの組成物。
【０１２２】
６４．求核性官能基を有し、２以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマー、および多官能性ポリマーからなる群より選択される第一ポリマー成分を含有する第一容器と、
求電子性官能基を有し、２以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマー、および多官能性ポリマーからなる群より選択される第二ポリマー成分を含有する第二容器と
を含むキットであって、
その第一ポリマー成分または第二ポリマー成分の少なくとも一方は、架橋性トレハロースを含む、キット。
【０１２３】
６５．その第一容器、第二容器、または第三容器の少なくとも１つの中に治療薬をさらに含む、実施形態６４のキット。
【０１２４】
６６．求電子性または求核性官能基を有し、１以上の官能性度であり、かつ分岐モノマー、多官能性モノマー、分岐ポリマー、および多官能性ポリマーからなる群より選択される第三ポリマー成分を含有する第三容器をさらに含む、実施形態６４〜６５のいずれか１つキット。
【０１２５】
６７．そのキットの内容物を利用したトレハロース含有ヒドロゲルの作製に関する説明書をさらに含む、実施形態６４〜６５のいずれか１つキット。
【０１２６】
６８．実施形態１〜６３のいずれか１種類のトレハロース含有ヒドロゲルまたは組成物を、それを必要としている患者の治療部位に埋め込むステップを含む、制御された治療薬送達の方法。
【０１２７】
６９．埋込みは、治療部位にトレハロース含有ヒドロゲルを配置するステップを含む、制御された治療薬送達の実施形態６８の方法。
【０１２８】
７０．埋込みは、治療部位にトレハロース含有ヒドロゲルの前駆体を注入するステップを含む、制御された治療薬送達の実施形態６８の方法。
【０１２９】
７１．実施形態３４〜６２のいずれか１つの組成物を治療部位に注入するステップを含む、制御された治療薬送達の実施形態６８の方法。
【０１３０】
７２．制御された治療薬送達の方法であって、実施形態６４〜６７のいずれか１つのキットの容器のうちの１個または複数個の内容物を、それを必要としている患者の治療部位に注入するステップを含む、方法。
【０１３１】
７３．制御された治療薬送達の方法であって、実施形態６４〜６７のいずれか１つのキットの容器のうちの１個または複数個の内容物からトレハロース含有ヒドロゲルを形成するステップと、そのトレハロース含有ヒドロゲルを、それを必要としている患者の治療部位に埋め込むステップとを含む、方法。
【０１３２】
７４．治療用埋込体の製造方法であって、架橋性トレハロースを合成ポリマーヒドロゲル内に挿入して架橋ヒドロゲルを形成するステップと、その架橋ヒドロゲル中に治療薬を組み込んで治療用埋込体を形成するステップとを含む、方法。
【０１３３】
７５．トレハロース含有ヒドロゲルの製造方法であって、実施形態３４〜６２のいずれか１つの組成物を形成するステップ、または実施形態６４〜７４のいずれか１つまたは複数のキットの容器のうちの１個または複数個の内容物を混ぜ合わせるステップを含む、方法。
【０１３４】
７６．「トレハロース」を「糖」で置き換える、前述の実施形態のいずれか。
【０１３５】
７７．その糖は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、または多糖類、スクロース、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、オリゴ糖類、本明細書中で列挙した糖の混合物を含有するオリゴ糖類、キトサン、デキストラン、アルギン酸エステル、ヒアルロン酸、セルロース（非修飾または修飾）、アミロース、またはコンドロイチン硫酸から選択される、実施形態７６。
【０１３６】
本明細書中のさらなる実施形態は、ある実施形態を本明細書中の任意の１つまたは複数の他の実施形態からの１つまたは複数の要素で補完することによって、かつ／または１つの実施形態からの１つまたは複数の要素を、本明細書中の１つまたは複数の他の実施形態からの１つまたは複数の要素と置き換えることによって形成することができる。
【実施例】
【０１３７】
下記の非限定的実施例は、特定の実施形態を例示するために提供される。全体を通してこれら実施形態は、下記の１つまたは複数の実施例からの１つまたは複数の細部で補完することができ、かつ／または或る実施形態からの１つまたは複数の要素は、下記の１つまたは複数の実施例からの１つまたは複数の細部で置き換えることができる。
【０１３８】
実施例１：トレハロースジアクリラートの合成
トレハロースを酵素により化学選択的に修飾してトレハロースジアクリラートを形成する方法が報告されている。上記に列挙したＪｏｈｎ等（２００６）と、ＺｈｕおよびＤｏｒｄｉｃｋ（２００６）とを参照されたい。これらは、あたかも完全に示されているかのように参照により本明細書中に組み込まれる。具体例としての官能性モノマーは、４モル過剰量のアクリル酸ビニル（ＣＡＳ：２１７７−１８−６）をトレハロース二水化物と、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５（アクリル樹脂に結合させたカンディダ・アンタークチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼＢ）の存在下で無水アセトン中において、５０℃および撹拌条件（オービタルシェーカーまたは磁気撹拌プレートによる）で４８時間反応させることによって合成した。ヒドロキノンモノメチルエーテル（ＭＥＨＱ）およびブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を使用して、生成物の過剰ラジカル単独重合を防止した。粗生成物を、二成分溶媒系として酢酸エチルおよび８０％メタノールを使用するＩＳＣＯ  Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈシステム上でシリカフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物を、ＬＣ−ＭＳ（図２）および１Ｈ−ＮＭＲ（図３）を使用して特性を明らかにした。下記反応スキーム３を参照されたい。
【０１３９】
【化３】
2016513653.tif 000005
【０１４０】
実施例２：多官能性チオールトレハロースの合成
多官能性チオールトレハロースを合成するためにジビニルエステル中間体を伴う２段反応スキームを適用した。合成の第一段階は、トレハロース二水化物を、１２モル過剰量のジビニルエステル架橋剤、例えばアジピン酸ジビニルまたはセバシン酸ジビニルと、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５（アクリル樹脂に結合させたカンディダ・アンタークチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼＢ）の存在下で５０℃のアセトン中において撹拌条件下で４８時間反応させるステップを伴った。反応混合物を濾過してリパーゼ樹脂を除去し、次いで冷ヘキサン中で３回沈殿させることによって精製した。精製したトレハロースジビニルエステルを濾過によって回収した。このジビニルエステルトレハロースの合成は、線状ポリエステル製造用のモノマーとして以前に報告されている。Ｐａｒｋ，Ｏ．−Ｊ．，Ｋｉｍ，Ｄ．−Ｙ．，Ｄｏｒｄｉｃｋ，Ｊ．Ｓ．「糖含有モノマーおよび線状ポリマーの酵素触媒による合成（Ｅｎｚｙｍｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｕｇａｒ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｏｎｏｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｌｉｎｅａｒ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ）」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２０００，７０，２０８−２１６を参照されたい（これはあたかも完全に示されているかのように参照により本明細書中に組み込まれる）。多官能基化チオールトレハロースを合成するために、この精製したトレハロースジビニルエステルをチオール含有第一アルコールと反応させた。このチオール含有第一アルコールは、２，３−ジメルカプト−１−プロパノール、２−メルカプトエタノール、または１−チオグリセロールのうちの１種類または複数種類を含むことができる。例として４モル過剰量の２，３−ジメルカプト−１−プロパノールをトレハロースジビニルエステルと、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５（アクリル樹脂に結合させたカンディダ・アンタークチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼＢ）の存在下で５０℃のアセトン中において不活性条件下で２４時間反応させた。２４時間後、リパーゼＢ樹脂を濾過して除くことによって反応を停止し、その四官能基化チオール含有トレハロースをエチルエーテル中で３回沈殿させることによって精製した。最終の沈殿のステップの後にエチルエーテルを濾過して除くことによって精製された四官能基化チオール含有トレハロースを回収した。生成物を、ＬＣ−ＭＳ（図５）および１Ｈ−ＮＭＲ（図６）を使用して特性を明らかにした。下記反応スキーム４を参照されたい。
【０１４１】
【化４】
2016513653.tif 000006
【０１４２】
実施例３：架橋性トレハロースを使用したＮＴ−３の安定化
トレハロースの安定化能力が、酵素触媒アッセイによる糖のジアクリラートまたはジメタクリラート修飾の後に変わるかどうかを判断するために安定化アッセイを行った。モデルタンパク質としてノイロトロピンＮＴ−３を使用してタンパク質の溶液を準備し、トレハロース単独の安定化能力を、これら２種類の修飾された糖の安定化能力と比較した。トレハロースを含有しない溶液を対照として使用した。ＮＴ−３溶液を３７℃で、決められた期間、すなわち２時間、３日間、７日間、１４日間、および２１日間インキュベートした。各時点で各群の三つ組みの試料を、ＮＴ−３  ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して活性に関してアッセイした。活性比率を、既知の元の出発濃度で観察されるＥＬＩＳＡ濃度と比較することによって計算した。
【０１４３】
実施例４：トレハロースジアクリラートおよびチオール含有４アームＰＥＧポリマーによって架橋されたトレハロースヒドロゲルの調製
トレハロースジアクリラートと、分子量５０００のチオール含有４アームＰＥＧ（４アーム−ＰＥＧ５ｋ−ＳＨ）を混合することによってヒドロゲルを形成した。手短に言えば、トレハロースジアクリラートをＰＢＳ（ｐＨ７．４、１．０６ｍＭのリン酸二水素カリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、２．９７ｍＭのリン酸水素ナトリウム）中に溶解して、５０ｍｇ／ｍＬの濃度のトレハロース含有前駆体溶液を調製した。９．４２ｍｇの４アーム−ＰＥＧ５ｋ−ＳＨ（チオール０．００７５ｍｍｏｌ）を６６．１μＬのＰＢＳ中に溶解し、その溶液を３３．９μＬのトレハロースジアクリラート溶液（１．７ｍｇ、チオールを基準にして１モル当量）と、ボルテックスすることにより混合した。トレハロースジアクリラートおよび４アーム−ＰＥＧ５ｋ−ＳＨは水性緩衝液に可溶であり、その混合液は、室温で数分以内に１０重量％のポリマー含量を有する透明な固体ゲルを形成した。図８に示すようにレオメーターによって機械的性質およびゲル化時間の特徴を明らかにした。
【０１４４】
実施例５：ＰＥＧジアクリラートおよび４アーム−ＰＥＧ５ｋ−ＳＨによって架橋されたヒドロゲル中への共有結合によるトレハロースの取込み
４アーム−ＰＥＧ５ｋ−ＳＨ、ＰＥＧジアクリラート、および様々な量のトレハロースジアクリラートを混合することによってヒドロゲルを形成した。手短に言えば、例としてトレハロースジアクリラートをＢＰＳ中に溶解して、５０ｍｇ／ｍＬの濃度のトレハロース含有前駆体溶液を調製した。分子量５７５のＰＥＧジアクリラート（ＰＥＧＤＡ５７５、チオールを基準にして０．５モル当量）の１．０５ｍｇを、４０．８μＬのＰＢＳ中に溶解し、その溶液を１６．４μＬのトレハロースジアクリラート（０．８２ｍｇ、チオールを基準にして０．５モル当量）溶液と混合した。次いでこのアクリラート含有混合液を、９．２ｍｇの４アーム−ＰＥＧ５ｋ−ＳＨ（チオール０．００７３ｍｍｏｌ）を含有する４１．８μＬのＰＢＳ溶液と混合した。室温で数分以内に１０重量％のポリマー含量を有する透明な固体ゲルが形成された。図８に示すようにレオメーターによって機械的性質およびゲル化時間の特徴を明らかにした。
【０１４５】
実施例６：ＰＥＧジアクリラートおよびチオール含有３アームＰＥＧポリマーによって架橋されたヒドロゲル中への共有結合によるトレハロースの取込み
エトキシル化トリメチロールプロパントリ（チオグリコラート）（ＴＭＰＥ−ＴＧＡ）、ＰＥＧジアクリラート、および様々な量のトレハロースジアクリラートを混合することによってヒドロゲルを形成した。下記のプロトコルを、１５０μＬ規模のゲル配合に使用した。手短に言えば、ＴＭＰＥ−ＴＧＡをＢＰＳ中に溶解して、４０重量％のチオール含有前駆体溶液を調製した。トレハロースジアクリラートをＢＰＳ中に溶解して、４０ｍｇ／ｍＬの濃度のトレハロース含有前駆体溶液を調製した。分子量７００（ＰＥＧＤＡ７００、チオールを基準にして０．７５モル当量）のＰＥＧジアクリラート１０．８７５ｍｇを、４９．９４μＬのＰＢＳ中に溶解し、その溶液を５８．３μＬのトレハロースジアクリラート溶液（２．３３ｍｇ、チオールを基準にして０．２５モル当量）および４１．８μＬのＴＭＰＥ−ＴＧＡ溶液（チオール０．０４１ｍｍｏｌ）と、ボルテックスすることにより混合した。ＴＭＰＥ−ＴＧＡ、トレハロースジアクリラート、およびＰＥＧジアクリラートはすべて水溶性であり、その混合液は、室温で数分以内に２０重量％のポリマー含量を有する透明な固体ゲルを形成した。
【０１４６】
同様に、より高い量のトレハロースのゲルを、まず８．９１ｍｇのＰＥＧＤＡ７００（チオールを基準にして０．６モル当量）を４．４μＬのＰＢＳ中に溶解し、続いてこの溶液を、９５．５μＬのトレハロースジアクリラート溶液（３．８２ｍｇ、チオールを基準にして０．４モル当量）および４２．８μＬのＴＭＰＥ−ＴＧＡ溶液（チオール０．０４２ｍｍｏｌ）と混合した。室温で数分以内に２０重量％のポリマー含量を有する透明な固体ゲルが形成された。
【０１４７】
上記２種類のゲルをＰＢＳ中で３７℃で膨潤させ、２４時間のインキュベーション後にその湿潤ゲルの重量測定を行った。ゲルをまた４８時間のインキュベーション後に湿潤状態で計量したが、湿潤質量の顕著な増加は観察されなかった。膨潤比を、式（Ｍｓｗｅｌｌ／Ｍｃｕｒｅ）×１００％に基づいて計算し、チオールを基準にして０．２５モル当量のトレハロースジアクリラートを含むゲルについては１４２．８％、また０．４モル当量のトレハロースジアクリラートを含むゲルについては１７０．６％と決定された。
【０１４８】
また上記プロトコルを使用して、ＥＴＴＭＰ、ＰＥＧジアクリラート、および様々な量のトレハロースジアクリラートでヒドロゲルを形成した。３アームＰＥＧチオールで形成されたトレハロース含有ヒドロゲルの特徴をＦＴＩＲ（図７）、レオロジー（図９）、および膨潤（図１０）を使用して明らかにした。
【０１４９】
実施例７：ＴＭＰＥ−ＴＧＡおよびビニルスルホン含有マルチアームＰＥＧポリマーによって架橋された非膨潤性ヒドロゲル中への共有結合によるトレハロースの取込み
ＴＭＰＥ−ＴＧＡ、分子量１００００のビニルスルホン含有８アームＰＥＧ（８アーム−ＰＥＧ１０ｋ−ＶＳ）、および様々な量のトレハロースジアクリラートを混合することによってヒドロゲルを形成した。手短に言えば、ＴＭＰＥ−ＴＧＡをＰＢＳ中に溶解して４０重量％のチオール含有前駆体溶液を調製した。トレハロースジアクリラートをＰＢＳ中に溶解して４０ｍｇ／ｍＬの濃度のトレハロース含有前駆体溶液を調製した。５．２ｍｇの８アーム−ＰＥＧ１０ｋ−ＶＳ（チオールを基準にして０．７５モル当量）を１３６．８μＬのＰＢＳ中に溶解し、その溶液を７．７μＬのトレハロースジアクリラート溶液（０．３１ｍｇ、チオールを基準にして０．２５モル当量）に加え、続いて４０重量％のＴＭＰＥ−ＴＧＡ溶液（チオール０．００５４ｍｍｏｌ）５．５μＬと混合した。ＴＭＰＥ−ＴＧＡ、トレハロースジアクリラート、およびＰＥＧジアクリラートはすべて水溶性であり、その混合液は、室温で数分以内に５重量％のポリマー含量を有する透明な固体ゲルを形成した。
【０１５０】
生成されたゲルをＰＢＳ中で３７℃で膨潤させ、２４時間のインキュベーション後にその湿潤ゲルの重量測定を行った。ゲルをまた、４８時間のインキュベーション後に湿潤状態で計量したが、湿潤質量の顕著な増加は観察されなかった。その膨潤比は、式（Ｍｓｗｅｌｌ／Ｍｃｕｒｅ）×１００％に基づいて計算することによって１０９．８％と決定された。
【０１５１】
また上記プロトコルを使用して、ＴＭＰＥ−ＴＧＡ、分子量１０，０００Ｄａのビニルスルホン含有４アームＰＥＧ（４アーム−ＰＥＧ１０ｋ−ＶＳ）、および様々な量のトレハロースジアクリラートでヒドロゲルを形成した。
【０１５２】
実施例８：タンパク質充填トレハロースヒドロゲルの調製
ＴＭＰＥ−ＴＧＡ、ＰＥＧジアクリラート、および様々な量のトレハロースジアクリラートを混合することによって形成したヒドロゲル内にタンパク質を充填した。例えばＴＭＰＥ−ＴＧＡをＰＢＳ中に溶解して、４０重量％のチオール含有前駆体溶液を調製した。４３．９μＬのＴＭＰＥ−ＴＧＡ（チオール０．０４４ｍｍｏｌ）溶液を、ピペットで往復させることによって２０μＬのコンドロイチナーゼＡＢＣ（ｃＡＢＣ、１０単位／μＬ）と静かに混合して溶液Ａを生成した。トレハロースジアクリラートをＰＢＳ中に溶解して、１００ｍｇ／ｍＬの濃度のトレハロース含有前駆体溶液を調製した。９．２ｍｇのＰＥＧＤＡ７００（チオールを基準にして０．６モル当量）を３９．４μＬのＰＢＳ中に溶解し、この溶液を３９．２μＬのトレハロースジアクリラート溶液（３．９ｍｇ、チオールを基準にして０．４モル当量）に加えて、アクリラート含有溶液Ｂを生成した。２０重量％のポリマー含量を有するｃＡＢＣ充填トレハロースヒドロゲルが、室温で溶液Ａと溶液Ｂを混合することによって数分以内に形成された。
【０１５３】
別の例では、タンパク質充填ヒドロゲルを、ＴＭＰＥ−ＴＧＡ、８アーム−ＰＥＧ１０ｋ−ＶＳ、および様々な量のトレハロースジアクリラートを混合することによって調製した。手短に言えば、ＴＭＰＥ−ＴＧＡをＰＢＳ中に溶解して４０重量％のチオール含有前駆体溶液を調製した。５．５μＬのＴＭＰＥ−ＴＧＡ（チオール０．００５５ｍｍｏｌ）溶液を、ピペットで往復させることによって２０μＬのコンドロイチナーゼＡＢＣ（ｃＡＢＣ、１０単位／μＬ）と静かに混合して溶液Ａを生成した。トレハロースジアクリラートをＰＢＳ中に溶解して、４０ｍｇ／ｍＬの濃度のトレハロース含有前駆体溶液を調製した。５．２ｍｇの８アーム−ＰＥＧ１０ｋ−ＶＳ（チオールを基準にして０．７５モル当量）を１１６．８μＬのＰＢＳ中に溶解し、この溶液を７．７μＬのトレハロースジアクリラート溶液（０．３１ｍｇ、チオールを基準にして０．２５モル当量）に加えて、溶液Ｂを生成した。５重量％のポリマー含量を有するｃＡＢＣ充填トレハロースヒドロゲルが、室温で溶液Ａと溶液Ｂを混合することによって数分以内に形成された。
【０１５４】
同様に、より高い量のポリマー含量を有するタンパク質充填ゲルを、ＴＭＰＥ−ＴＧＡ、８アーム−ＰＥＧ１０ｋ−ＶＳ、および様々な量のトレハロースジアクリラートを混合することによって調製した。手短に言えば、ＴＭＰＥ−ＴＧＡをＰＢＳ中に溶解して４０重量％のチオール含有前駆体溶液を調製した。１１．５μＬのＴＭＰＥ−ＴＧＡ（チオール０．０１１ｍｍｏｌ）溶液を、ピペットで往復させることによって２０μＬのコンドロイチナーゼＡＢＣ（ｃＡＢＣ、１０単位／μＬ）と静かに混合して溶液Ａを生成した。トレハロースジアクリラートをＰＢＳ中に溶解して、１００ｍｇ／ｍＬの濃度のトレハロース含有前駆体溶液を調製した。１０．７ｍｇの８アーム−ＰＥＧ１０ｋ−ＶＳ（チオールを基準にして０．７５モル当量）を１０２．１μＬのＰＢＳ中に溶解し、この溶液を６．４μＬのトレハロースジアクリラート溶液（０．６４ｍｇ、チオールを基準にして０．２５モル当量）に加えて、溶液Ｂを生成した。１０重量％のポリマー含量を有するｃＡＢＣ充填トレハロースヒドロゲルが、室温で溶液Ａと溶液Ｂを混合することによって数分以内に形成された。
【０１５５】
実施例９：トレハロース含有ヒドロゲル中の酵素の熱安定化
セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、バイオテクノロジーおよびバイオメディエーションにおいて広く使用されている重要な酵素である。しかしながらＨＲＰの熱安定性が、その工業用途を制限している。本明細書中ではＨＲＰをモデルタンパク質として使用して、タンパク質安定化に与える様々な量のトレハロースを含有するヒドロゲルの効果を評価した。ヒドロゲル内または溶液状態で７０℃に２時間曝露した後のＨＲＰの活性を分析した。様々な量のトレハロースを含有するＨＲＰ充填ヒドロゲルを、上記のように４アーム−ＰＥＧ５ｋ−ＳＨ、ＰＥＧＤＡ５７５、およびトレハロースジアクリラートを使用して調製した。
【０１５６】
一般にＨＲＰ（２ｍｇ／ｍＬ）溶液は、ＨＲＰをｐＨ７．４のＰＢＳに加えることによって調製された。３７．７ｍｇの４アーム−ＰＥＧ５ｋ−ＳＨ（チオール０．０３０１ｍｍｏｌ）を２２４．４μＬのＰＢＳ中に溶解し、その溶液を、ピペットで往復させることによって４０μＬのＨＲＰ溶液（２ｍｇ／ｍＬ）と静かに混合して溶液Ａを生成した。トレハロースジアクリラートをＰＢＳ中に溶解して、５０ｍｇ／ｍＬの濃度のトレハロース含有前駆体溶液を調製した。１３５．６μＬのトレハロースジアクリラート溶液（６．８ｍｇ、チオールを基準にして１モル当量）を、ピペットで往復させることによって溶液Ａに加えた。このプロトコルを、４００μＬ規模で１０重量％のポリマー含量を有するゲルの形成に使用した。得られた混合液を等分してウェル当たり１００μＬでＰＴＦＥの型（直径０．８ｃｍ）に入れた。室温で数分以内にＨＲＰ（各ゲルスラブにつき２０μｇ）を含有する透明な固体ゲルが形成され、これをＰＥＧトレハロース１００と名付けた。
【０１５７】
２２．９ｍｇの４アーム−ＰＥＧ５ｋ−ＳＨ（チオール０．０１８３ｍｍｏｌ）を７９．５μＬのＰＢＳ中に溶解し、この溶液を、ピペットで往復させることによって２５μＬのＨＲＰ溶液（２ｍｇ／ｍＬ）と静かに混合して溶液Ａを生成した。トレハロースジアクリラートをＰＢＳ中に溶解して、５０ｍｇ／ｍＬの濃度のトレハロース含有前駆体溶液を調製した。２．６ｍｇのＰＥＧＤＡ５７５（チオールを基準にして０．５モル当量）を１０２．１μＬのＰＢＳ中に溶解し、その溶液を４１．１μＬのトレハロースジアクリラート溶液（２．１ｍｇ、チオールを基準にして０．５モル当量）に加えてアクリラート含有溶液Ｂを生成した。溶液Ｂを、ピペットで往復させることによって溶液Ａに加えた。このプロトコルを、２５０μＬ規模の１０重量％のポリマー含量を有するゲルの形成に使用した。得られた混合液を等分してウェル当たり１００μＬでＰＴＦＥの型（直径０．８ｃｍ）に入れた。室温で数分以内にＨＲＰ（各ゲルスラブにつき２０μｇ）を含有する透明な固体ゲルが形成され、これをＰＥＧトレハロース５０と名付けた。
【０１５８】
２２．２ｍｇの４アーム−ＰＥＧ５ｋ−ＳＨ（チオール０．０１７７ｍｍｏｌ）を１００μＬのＰＢＳ中に溶解し、この溶液を、ピペットで往復させることによって２５μＬのＨＲＰ溶液（２ｍｇ／ｍＬ）と静かに混合して溶液Ａを生成した。５．１ｍｇのＰＥＧＤＡ５７５（チオールを基準にして１モル当量）を１２０．４μＬのＰＢＳ中に溶解し、その溶液を、ピペットで往復させることによって溶液Ａに加えた。このプロトコルを、２５０μＬ規模の１０重量％のポリマー含量を有するゲルの形成に使用した。得られた混合液を等分してウェル当たり１００μＬでＰＴＦＥの型（直径０．８ｃｍ）に入れた。室温で数分以内にＨＲＰ（各ゲルスラブにつき２０μｇ）を含有する透明な固体ゲルが形成され、これをＰＥＧトレハロース０と名付けた。
【０１５９】
非修飾トレハロースジアクリラート脱水物をＨＲＰ溶液と混合して、２００μＬ／ｍＬの最終濃度のＨＲＰを得た。トレハロース二水化物を加えて、上記ヒドロゲル配合物中でそれぞれトレハロースモル量に関して等しくなるようにした。溶液およびヒドロゲルの試料を７０℃で２時間インキュベートし、また非加熱ＨＲＰ溶液（対照）を活性アッセイを行うまで４℃で貯蔵した。加熱に曝した後、ヒドロゲル試料を室温に平衡させ、へらを使用して手で粉砕し、続いて３７℃で２０時間インキュベートしてＨＲＰ放出を促進させた。この加熱ＨＲＰ溶液もまた、３７℃で２０時間インキュベートした。ブラッドフォードアッセイを行って、回収された試料中のＨＲＰ濃度を求めた。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を基質として使用し、また２Ｍ硫酸を停止液として使用して、４５０ｎｍにおける吸収によりＨＲＰ活性を求めた。加熱試料におけるタンパク質１ｍｇ当たりの活性を、対照の非加熱ＨＲＰ溶液に対して正規化した。
【０１６０】
様々な量のトレハロースを含有する溶液またはヒドロゲル内の３７℃で２時間インキュベートした後のＨＲＰ（２００μｇ／ｍＬ）の活性。溶液試料の場合、非修飾トレハロース脱水物を加えて、それらの対応するヒドロゲル中のトレハロースジアクリラートのモル量と等しくなるようにした。データは、ｎ＝２の平均として標準偏差と共に示した。
【０１６１】
このトレハロース含有ヒドロゲルは、極端な温度環境に曝された場合のＨＲＰ活性のすぐれた保存を実証した。
【０１６２】
参考文献
［１］Ｓｔａｎｗｉｃｋ，Ｊ．Ｃ．，Ｂａｕｍａｎｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｓｈｏｉｃｈｅｔ，Ｍ．Ｓ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−３  ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｌｏａｄｅｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １６０（２０１２）６６６−６７５．
［２］Ｌｅｅ，Ｈ．，ＭｃＫｅｏｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｂｅｌｌａｍｋｏｎｄａ，Ｒ．Ｖ．Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｃｈＡＢＣ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ａｘｏｎａｌ  ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｆｔｅｒ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０７（２０１０）３３４０−３３４５．
［３］Ｊｏｈｎ，Ｇ．，Ｚｈｕ，Ｇ．，Ｌｉ，Ｊ．，Ｄｏｒｄｉｃｋ，Ｊ．Ｓ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｇａｒ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｏｒｇａｎｏｇｅｌｓ  ｗｉｔｈ  ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４５（２００６）４７７２−４７７５．
［４］Ｚｈｕ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｄｏｒｄｉｃｋ，Ｊ．Ｓ．．Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  Ｏｒｇａｎｏｇｅｌ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｌｏｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．１８（２００６）５９８８−５９９５．
［５］Ｄｏｒｄｉｃｋ，Ｊ．Ｓ．，Ｒｅｔｈｗｉｓｃｈ，Ｄ．Ｇ．，Ｐａｔｉｌ，Ｄ．Ｒ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｂ．Ｄ．，Ｌｉｎｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｊ．Ｓｕｇａｒ−ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ．ＵＳ  ５，８５４，０３０  Ｄｅｃ．２９，１９９８．
［６］Ｐａｒｋ，Ｏ．−Ｊ．；Ｋｉｍ，Ｄ．−Ｙ．；Ｄｏｒｄｉｃｋ，Ｊ．Ｓ．Ｅｎｚｙｍｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｕｇａｒ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｏｎｏｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｌｉｎｅａｒ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２０００，７０，２０８−２１６．
本出願全体を通して引用される参考文献は、本明細書中で、またそれら参考文献自体の中で明らかなすべての目的に関して、それぞれの参考文献は、あたかも完全に示されているかのように援用される。提示の目的の場合、これらの参考文献のうちの特定のものが、本明細書中の特定の箇所で引用される。特定の箇所での参考文献の引用とは、その参考文献の教示内容の援用される方法を指す。しかしながら特定の箇所での参考文献の引用はその方法には限定されず、その引用された参考文献の教示内容すべてがあらゆる目的に対して援用される。
【０１６３】
したがって本発明は、開示された特定の実施形態に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲、上述の説明、および／または添付図面で示されているものによって規定される本発明の趣旨および範囲内にあるすべての修正形態を包含することを意図していることを理解されたい。
【図２】
2016513653.tif 000007
【図３】
2016513653.tif 000008
【図４】
2016513653.tif 000009
【図５】
2016513653.tif 000010
【図６】
2016513653.tif 000011
【図７】
2016513653.tif 000012
【図８】
2016513653.tif 000013
【図９】
2016513653.tif 000014
【図１０】
2016513653.tif 000015
【図１１】
2016513653.tif 000016
【図１２】
2016513653.tif 000017
【図１】
2016513653.tif 000018
【国際調査報告】
2016513653.tif 000019
2016513653.tif 000020
2016513653.tif 000021