(57)【要約】  本発明は、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を阻害することができる抗原結合タンパク質に関する、又は該抗原結合タンパク質に由来する組成物及び方法を提供する。実施形態では、抗原結合タンパク質は、特異的にＰＣＳＫ９に結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体、こうした抗体の結合フラグメント及び誘導体、並びにＰＣＳＫ９に特異的に結合するポリペプチドである。その他の実施形態は、このような抗原結合タンパク質並びにそのフラグメント及びその誘導体類、並びにポリペプチド、こうしたポリヌクレオチドからなる細胞をコードする核酸のほか、このような抗原結合タンパク質並びにそのフラグメント及びその誘導体、並びにポリペプチドの作製方法、及び高コレステロール血症及び関連疾患又は病態に罹患している対象の治療方法又は診断方法など、このような抗原結合タンパク質、そのフラグメント及びその誘導体並びにポリペプチドの使用方法、を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質であって、前記抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質は、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド又はその機能性フラグメント及び免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド又はその機能性フラグメントを含み、１０１Ｆ７、１０３Ｂ７又は１３１Ｄ１２抗原結合タンパク質によるヒトＰＣＳＫ９への結合に競合する、前記単離抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質。
【請求項２】
抗体３１Ｈ４及び抗体２６Ｈ５の双方によるヒトＰＣＳＫ９への結合に競合する、請求項１に記載の単離抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質。
【請求項３】
配列番号２０、２１、２２又は２３のいずれか１つと少なくとも８５％の配列同一性を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメインポリペプチド又はその機能性フラグメントを含む、請求項１又は２に記載の単離抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質。
【請求項４】
配列番号２０、２１、２２又は２３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメインポリペプチド又はその機能性フラグメントを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質。
【請求項５】
配列番号２０、２１、２２又は２３のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメインポリペプチド又はその機能性フラグメントを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質。
【請求項６】
配列番号２０、２１、２２又は２３のいずれか１つによるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメインポリペプチド又はその機能性フラグメントを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質。
【請求項７】
配列番号１６、１７、１８又は１９のいずれか１つと少なくとも８５％の配列同一性を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインポリペプチド又はその機能性フラグメントを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質。
【請求項８】
配列番号１６、１７、１８又は１９のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインポリペプチド又はその機能性フラグメントを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質。
【請求項９】
配列番号１６、１７、１８又は１９のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインポリペプチド又はその機能性フラグメントを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
配列番号１６、１７、１８又は１９のいずれか１つによるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインポリペプチド又はその機能性フラグメントを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質。
【請求項１１】
前記抗原結合タンパク質が、モノクローナル抗体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質。
【請求項１２】
前記抗体は、ヒト化されている、請求項１１に記載の抗ＰＣＳＫ９抗体。
【請求項１３】
前記抗体は、ヒト抗体である、請求項１１又は１２に記載の抗ＰＣＳＫ９抗体。
【請求項１４】
前記抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は（Ｆａｂ’）．ｓｕｂ．２フラグメントから選択される抗体フラグメントである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の抗ＰＣＳＫ９抗体。
【請求項１５】
少なくとも一部のフレームワーク配列が、ヒトコンセンサスフレームワーク配列である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の抗ＰＣＳＫ９抗体。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質をコードする単離核酸。
【請求項１７】
請求項１６に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１８】
発現ベクターである、請求項１７に記載のベクター。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
原核生物である、請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
真核生物である、請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質の製造方法であって、抗ＰＣＳＫ９抗体をコードする核酸の発現に好適な条件下にて、請求項１に記載の前記抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質をコードする核酸を含むベクターを含有する宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項２３】
前記宿主細胞から前記抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質を回収することを更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質及び医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項２５】
対象中でＬＤＬコレステロールレベルを低下させる方法であって、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の有効量の抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２６】
対象中でのコレステロール関連疾患の治療方法であって、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の有効量の抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２７】
対象中での高コレステロール血症の治療方法であって、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の有効量の抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２８】
抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質が、第１の薬剤であり、有効量の第２の薬剤を前記対象へ投与することを更に含む、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２の薬剤によりＬＤＬＲレベルが上昇する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２の薬剤によりＬＤＬ-コレステロールレベルが低下する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２の薬剤がスタチンを含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記スタチンは、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
対象中でのＰＣＳＫ９によるＬＤＬＲへの結合の阻害方法であって、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の有効量の抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項３４】
試料中のＰＣＳＫ９タンパク質を検出する方法であって、（ａ）前記試料を請求項１〜１５のいずれか一項に記載の前記抗原結合タンパク質と接触させることと、（ｂ）抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質とＰＣＳＫ９タンパク質との複合体の形成を検出することとを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロタンパク質コンベルターゼスブチリシンケクシン９型（以下、「ＰＣＳＫ９」に結合する抗原結合タンパク質（「ＡＰＢ」）をコードする核酸分子、並びにＰＣＳＫ９とＬＤＬ受容体への結合を阻害する抗原結合タンパク質など、ＰＣＳＫ９に結合する抗原結合タンパク質を含む医薬組成物、及び核酸、ポリペプチド又は医薬組成物などを用いる代謝異常の治療方法に関する。また、抗原結合タンパク質を用いる診断方法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
プロタンパク質コンベルターゼスブチリシンケクシン９型（ＰＣＳＫ９）は、低比重リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質のレベルの制御に関与するセリンプロテアーゼである（Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；  Ｓｅｉｄａｈ  ａｎｄ  Ｐｒａｔ，２００７）。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験により、ＰＣＳＫ９をＨｅｐＧ２細胞に添加することによって、細胞表面ＬＤＬＲのレベルが低下することが明らかになっている（Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｌａｇａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｍａｘｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。マウスを用いた実験からは、ＰＣＳＫ９タンパク質レベルを増加させることによって肝臓中のＬＤＬＲタンパク質のレベルを減少させるが（Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；  Ｌａｇａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｍａｘｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；  Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）、ＰＣＳＫ９ノックアウトマウスでは肝臓中のＬＤＬＲレベルが上昇したことが明かになった（Ｒａｓｈｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。さらに、血漿ＬＤＬレベルの上昇又は減少のいずれかをもたらす様々なヒトＰＣＳＫ９変異が同定されている（Ｋｏｔｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。ＰＣＳＫ９により、肝臓中でのＬＤＬ−受容体レベルが低下し、その結果、血漿中のＬＤＬ−コレステロールレベルが高くなり、冠状動脈性心疾患の罹患率が上昇することが明かになっている（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４９（７）：１５９５−９（２００８））。このため、様々な病状におけるＰＣＳＫ９の活性及びＰＣＳＫ９が果たす、その対応する役割を阻害する、ＰＣＳＫ９の治療用アンタゴニストを作製することは非常に有利である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７
【非特許文献２】Ｓｅｉｄａｈ  ａｎｄ  Ｐｒａｔ，２００７
【非特許文献３】Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４
【非特許文献４】Ｌａｇａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６
【非特許文献５】Ｍａｘｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５
【非特許文献６】Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４
【非特許文献７】Ｒａｓｈｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００５
【非特許文献８】Ｋｏｔｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６
【非特許文献９】Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６
【非特許文献１０】Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４９（７）：１５９５−９（２００８）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明、一部、ＰＣＳＫ９に対する様々な抗体に基づく。ＰＣＳＫ９は、重要かつ有利な治療標的として発現し、また、本発明は、ＰＣＳＫ９の発現及び／又は活性に関与する標的となる病理学的症状に使用する治療薬及び診断用薬として、抗体を提供する。したがって、本発明は、ＰＣＳＫ９に関連する方法、組成物、キット及び製造物品を提供する。
【０００５】
一実施形態では、単離した抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質は、免疫グロブリン重鎖ポリペプチド又はその機能的フラグメント及び免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド又はその機能的フラグメントを含み、抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質は、１０１Ｆ７、１０３Ｂ７又は１３１Ｄ１２抗原結合タンパク質によるヒトＰＣＳＫ９への結合するにあたって競合し、また、１０１Ｆ７、１０３Ｂ７又は１３１Ｄ１２抗原結合タンパク質の分割された成熟ヒトＰＣＳＫ９（アミノ酸配列番号２のアミノ酸３１〜６９２）への結合を少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％阻害する単離抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質が提供される。一実施形態では、抗体３１Ｈ４及び抗体２６Ｈ５の双方を有するヒトＰＣＳＫ９への結合について競合し、３１Ｈ４及び２６Ｈ５の双方の分割された、成熟ヒトＰＣＳＫ９（アミノ酸配列番号２のアミノ酸３１〜６９２）への結合を、少なくとも、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％阻害する単離抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質１が、提供される。
【０００６】
更なる実施形態では、配列番号２０、２１、２２又は２３のいずれか１つとの配列同一性が少なくとも、８５％である免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド又はその機能的フラグメントを含む前述のＡＢＰのいずれかの単離抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質が提供される。更なる実施形態では、配列番号２０、２１、２２又は２３のいずれか１つとの配列同一性が少なくとも、９０％である免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド又はその機能的フラグメントを含む前述のＡＢＰのいずれかの単離抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質が提供される。更なる実施形態では、配列番号２０、２１、２２又は２３のいずれか１つとの配列同一性が少なくとも、９５％である免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド又はその機能的フラグメントを含む前述のＡＢＰのいずれかの単離抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質が提供される。更なる実施形態では、配列番号２０、２１、２２又は２３のいずれか１つによるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域ポリペプチド又はその機能的フラグメントを含む前述のＡＢＰのいずれかの単離抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質が提供される。更なる実施形態では、配列番号１６、１７、１８又は１９のいずれか１つとの配列同一性が少なくとも、８５％である免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド又はその機能的フラグメントを含む前述のＡＢＰのいずれかの単離抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質が提供される。更なる実施形態では、配列番号１６、１７、１８又は１９のいずれか１つとの配列同一性が少なくとも、９０％である免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド又はその機能的フラグメントを含む前述のＡＢＰのいずれかの単離抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質が提供される。更なる実施形態では、配列番号１６、１７、１８又は１９のいずれか１つとの配列同一性が少なくとも、９５％である免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド又はその機能的フラグメントを含む前述のＡＢＰのいずれかの単離抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質が提供される。更なる実施形態では、配列番号１６、１７、１８又は１９のいずれか１つよるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域ポリペプチド又はその機能的フラグメントを含む前述のＡＢＰのいずれかの単離抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質が提供される。
【０００７】
更なる実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５または６のＣＤＲを含み、アミノ酸配列番号３４〜５２を有する上記の任意のＡＢＰの単離抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質が提供される。更なる実施形態では、配列番号４３、４５、４７、５３、５５及び５７に従って、アミノ酸配列を含むＣＤＲＳを含む上記の任意のＡＢＰの単離抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質が提供される。更なる実施形態では、配列番号４３、４５、４８、５３、５５及び５７に従って、アミノ酸配列を含むＣＤＲＳを含む上記の任意のＡＢＰの単離抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質が提供される。更なる実施形態では、配列番号４４、４６、４９、５４、５６及び５８に従って、アミノ酸配列を含むＣＤＲＳを含む上記の任意のＡＢＰの単離抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質が提供される。更なる実施形態では、配列番号５０、５１、５２、５９、６０及び６１に従って、アミノ酸配列を含むＣＤＲＳを含む上記の任意のＡＢＰの単離抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質が提供される。
【０００８】
更なる実施形態では、抗原結合タンパク質が、モノクローナル抗体である、上記の任意のＡＢＰＳの抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質が提供される。更なる実施形態では、抗体がヒト化されている、上記の任意のＡＢＰＳの抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質が提供される。更なる実施形態では、抗体がヒトである、上記の任意の抗体の抗ＰＣＳＫ９抗体が提供される。更なる実施形態では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は（Ｆａｂ’）２フラグメントから選択される抗体フラグメントである、上記の任意の抗体の抗ＰＣＳＫ９抗体が提供される。更なる実施形態では、少なくとも一部のフレームワーク配列が、ヒトコンセンサスフレームワーク配列である、上記の任意の抗体の抗ＰＣＳＫ９抗体が提供される。
【０００９】
更なる実施形態では、上記の任意のＡＢＰＳの抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質をコードする単離核酸が提供される。更なる実施形態では、上記のＡＢＰをコードする核酸を含むベクターが提供される。一実施形態では、本発明のベクターは、発現ベクターである。別の実施形態では、本発明のベクターを含む宿主細胞が提供される。一実施形態では、本発明の宿主細胞は、原核宿主細胞である。本発明の別の実施形態では、宿主細胞は、真核宿主細胞である。更なる実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体をコードする核酸の発現に好適な条件下にて、上記の抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質１をコードする核酸を含むベクターを含有する宿主細胞を培養することを含む方法である、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質製造方法が提供される。更なる実施形態では、宿主細胞から抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質を回収することを更に含む、本発明の方法が提供される。
【００１０】
別の実施形態では、上記の抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質及び医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物が提供される。更なる実施形態では、対象中でのＬＤＬ−コレステロールレベルを低下させる方法が提供される。該方法は、有効量の上記の任意の抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質を対象に投与することを含む。更なる実施形態では、対象中でのコレステロール関連疾患の治療方法が提供される。該方法は、有効量の上記の任意の抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質を対象に投与することを含む。更なる実施形態では、対象中での高コレステロール血症の治療方法が提供される。該方法は、有効量の上記の任意の抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質を対象に投与することを含む。別の実施形態では、抗―ＰＣＳＫ抗原結合タンパク質が、第１の薬剤である有効量の第２の薬剤を対象へ投与することを更に含む上記の治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、第２の薬剤により、ＬＤＬＲレベルが上昇する方法を提供する。いくつかの実施形態では、第２の薬剤により、ＬＤＬ−コレステロールレベルが低減する方法を提供する。いくつかの実施形態では、第２の薬剤がスタチンを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、スタチンは、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される方法が提供される。別の実施形態では、対象中でのＰＣＳＫ９によるＬＤＬＲへの結合の阻害方法が提供される。該方法は、有効量の上記の任意の抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質を対象に投与することを含む。
【００１１】
更なる実施形態では、試料中でのＰＣＳＫ９タンパク質の検出方法が提供され、該方法は、（ａ）試料を上記の任意の抗原結合タンパク質と接触させることと、（ｂ）抗ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質とＰＣＳＫ９タンパク質との間に複合体の形成を検出することからなる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書で使用するセクション表題は、構成上のみの目的であって、記述された主題を制限するものと解釈されるものではない。
【００１３】
他に本明細書で定義されていない限り、本明細書の文脈にて使用される科学的用語及び専門用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、別に文脈により必要とされない場合、単数の用語は、複数を包含し、複数の用語は、単数を包含する。
【００１４】
一般に、関連して使用される、細胞・組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質、核酸化学、交配の専門用語及び技術は、当業者に周知であり、一般的に使用される。本明細書の方法及び技術は、別に記述されていない限り、一般に、当該技術分野において周知の従来の方法、本明細書全体について引用され、かつ、検討されている更に具体的な参照文献に従って実施される。参考として本明細書に組み込まれている、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．（２００１）  ａｎｄ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｅｄｉｔｉｏｎｓ，  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  （１９９２）及びＨａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）を参照のこと。酵素反応及び精製技術は、一般に、当該技術分野において達成されるか、又は本明細書に記載されるとおり、製造業者の仕様に従って実施される。本明細書に記載の分析化学、有機合成化学、薬用・医薬品化学に関連して使用される用語、検査手順及び技術は、当該技術分野において周知であり、かつ、一般的に使用される。標準的な技術は、化学合成、化学分析、製剤、配合及び送達並びに患者の治療に使用され得る。
【００１５】
本開示は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコール及び試薬などに限定されず、それ自体変化し得ると理解すべきである。本明細書で使用される用語は、具体的な実施形態を記述することのみを目的としており、本開示の範囲を制限することを意図するものではない。
【００１６】
実施する例において以外に、又は別に明記されていない限り、本明細書で使用される成分量を示す全ての数又は反応条件は、あらゆる場合において、用語「約」に変更されるように、理解するものとする。百分率に関連して使用するとき、用語「約」は、±５％（例えば、１％、２％、３％又は４％）を意味する。
I.定義
【００１７】
本明細書で使用するとき、用語「ａ」及び「ａｎ」は、特に別に明記されていない限り、「１つ以上」を意味する。
【００１８】
本明細書で使用するとき、「抗原結合タンパク質」は、抗原又は標的並びに任意により抗原結合部位が抗原結合タンパク質と抗原との結合を促進させる立体配座を取るスカフォールド又はフレームワーク部分を含むタンパク質である。抗原結合タンパク質の例としては、ヒト抗体、ヒト化抗体；キメラ抗体；組換え型抗体；一本鎖抗体；ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）；トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）；テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）；Ｆａｂフラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；ＩｇＤ抗体；ＩｇＥ抗体；ＩｇＭ抗体；ＩｇＧ１抗体；ＩｇＧ２抗体；ＩｇＧ３抗体；又はＩｇＧ４抗体、及びこれらのフラグメントが挙げられる。抗原結合タンパク質は、例えば、代替タンパク質スカフォールド又は移植ＣＤＲ又はＣＤＲ誘導体を有する人工スカフォールドを含むことができる。このようなスカフォールドとしては、これらに限定されないが、例えば、抗原結合タンパク質の三次元構造体を安定させるように誘導された突然変異を含む抗体誘導スカフォールド、並びに、例えば、生体適合性ポリマーなどを含む完全合成スカフォールドが挙げられる。例えば、Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，５３（１）：１２１−１２９；Ｒｏｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４を参照されたい。さらに、ペプチド抗体模倣体（「ＰＡＭ」）並びにスカフォールドとして、フィブロネクチン成分を使用する抗体模倣体をベースとしたスカフォールドは、使用することができる。
【００１９】
抗原結合タンパク質は、例えば、天然免疫グロブリン構造体を有することができる。「免疫グロブリン」は、四量体分子である。天然免疫グロブリンでは、各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対で構成され、各対は、１つの「軽鎖」（約２５ｋＤａ）及び１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原識別を担う約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクタ−機能を担う一定の領域を画定する。ヒト軽鎖は、カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）又はイプシロン（ε）と分類され、それぞれ、抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと定義する。軽鎖及び重鎖内では、可変領域及び定常領域がアミノ酸が約１２個以上である「Ｊ」領域によって結合し、また、重鎖は、アミノ酸が約１０個以上である「Ｄ」領域を含む。一般に、本出願においてその全体が参考として組み込まれる、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域により、無傷の免疫グロブリンが２つの結合部位を有するように、抗体結合部位が形成される。
【００２０】
自然免疫グロブリン鎖は、比較的保たれた、相補的決定領域又はＣＤＲとも呼ばれている３つの超可変領域によって結合しているフレームワーク領域（ＦＲ）と同じ一般的構造を示す。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖及び重鎖はいずれも、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。アミノ酸の各ドメインへの配置は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，第５版，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ  出版番号．９１−３２４２の定義に従って行うことができる。必要に応じて、Ｋａｂａｔ表記法を用いて本明細書に記述しているが、本明細書に開示されたＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，（１９８７）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３  ｏｒ  Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ＆  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，（２００１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０を参照されたい）などの代替表記法に従って、再度定義することができる。
【００２１】
本開示の文脈では、抗原結合タンパク質は、解離定数（ＫＤ）が≦１０−８Ｍであるとき、その標的抗原と「特異的に結合している」又は「選択的に結合している」と言われる。抗体は、ＫＤが≦５ｘ１０−９Ｍであるとき、「高親和性」を有する抗原に特異的に結合し、ＫＤが≦５ｘ１０−１０Ｍであるとき、「非常に高い親和性」を有する抗原に特異的に結合する。一実施形態では、抗体は、ＫＤ約１０−７Ｍ〜１０−１２Ｍを有するＰＣＳＫ９に結合し、さらに別の実施形態では、抗体は、ＫＤ≦５ｘ１０−９で結合する。
【００２２】
「抗体」は、別に明記されていない限り、非標的免疫グロブリン又は特異的結合について、非標識抗体と競合するその抗原結合部分を意味する。抗原結合部分は、組み換えＤＮＡ技術若しくは、酵素的開裂又は非標識抗体の化学的開裂によって作製され得る。抗原結合部分としては、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）のほか、相補的決定領域（ＣＤＲ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及び、抗原を特異的にポリペプチドに結合するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部分を含むポリペプチドを含有するフラグメントが挙げられる。
【００２３】
Ｆａｂフラグメントは、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインを有する一価のフラグメントであり、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合されている２つのＦａｂフラグメントを有する二価のフラグメントであり、Ｆｄフラグメントは、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを有し、Ｆｖフラグメントは、抗体の一つの腕のＶＬドメイン及びＶＨドメインを有し、かつ、ｄＡｂフラグメントは、ＶＨドメイン又はＶＬドメインを有し、又は抗原−結合フラグメントは、ＶＨ又はＶＬドメインである（米国特許番号第６，８４６，６３４号及び同第６，６９６，２４５号及び米国特許公開番号第０５／０２０２５１２号、同第０４／０２０２９９５号、同第０４／００３８２９１号、同第０４／０００９５０７号、同第０３／００３９９５８号，Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６（１９８９））。
【００２４】
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、リンカー（例えば、アミノ酸残基の合成配列）を介してＶＬ領域及びＶＨ領域が結合し、リンカーが、タンパク質鎖をその上で折り畳み、一価の抗原結合部位を形成できるように、十分に長い連続的なタンパク質鎖を形成している抗体である（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−２６及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−８３を参照のこと）。ダイアボディは、２つのポリペプチド鎖を含む二価の抗体であって、各ポリペプチド鎖は、同じ鎖上の２つのドメイン間でペアリングするには短く、したがって、各ドメインを別のポリペプチド鎖上で相補ドメインとペアリングさせることができるリンカーで連結されたＶＨドメイン及びＶＬドメインからなる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−４８、及びＰｏｌｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−２３を参照されたい）。ダイアボディの２つのポリペプチド鎖が同一であり、これらのペアリングからなるダイアボディの場合、２つの同一の抗原結合部位を有することになる。異なる配列を有するポリペプチド鎖は、２つの異なる抗原結合部位を有するダイアボディを作製するために使用することができる。同様に、トリアボディ及びテトラボディは、それぞれ、同じであるか、又は異なる３つ及び４つのそれぞれ３つ及び４つの結合部位を形成するポリペプチド鎖からなる抗体である。
【００２５】
抗体の相補的決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，５ｔｈ  Ｅｄ．，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１−３２４２に記述されている系を用いて、識別され得る。必要に応じて、Ｋａｂａｔ表記法を用いて記述しているが、本明細書に開示されたＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，（１９８７）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３  ｏｒ  Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ＆  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，（２００１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０を参照されたい）などの代替表記法に従って、再度定義することができる。１つ以上のＣＤＲを分子に共有結合か、又は非供給結合にいずれかにより組み込み、それを抗原結合タンパク質とすることもできる。抗原結合タンパク質は、大きいポリペプチド鎖の一部として、ＣＤＲ（複数可）を組み込むことができ、共有結合によりＣＤＲ（複数可）を別のポリペプチド鎖に連結してもよいか、又は非共有結合によりＣＤＲ（複数可）を組み込んでもよい。ＣＤＲにより、抗原結合タンパク質は、関心のある特定の抗原に特異的に結合することができる。
【００２６】
抗原結合タンパク質は、１つ以上の結合部位を有し得るが、必須ではない。２つ以上の結合部位がある場合には、結合部位は、互いに同一であるか、又は異なってもよい。例えば、自然ヒト免疫グロブリンは、典型的には、２つの同一の結合部位を有し、「二重特異性」又は「ニ官能性」抗体は、２つの異なる結合部位を有する。こうした特定の二重特異性形態の抗原結合タンパク質は、（例えば、本明細書で提供される種々の重鎖及び軽鎖からなるＣＤＲ）は、本開示の態様を含む。
【００２７】
用語「ヒト抗体」としては、ヒト免疫グロブリン配列から誘導された１つ以上の可変領域及び定常領域を有するすべての抗体が挙げられる。一実施形態では、すべての可変ドメイン及び定常ドメインは、ヒト免疫グロブリン配列から誘導される（完全ヒト抗体）。これらの抗体は、ヒト重鎖及び／又はヒト軽鎖コード遺伝子由来の抗体を発現させるために遺伝子改変マウスの対象となる抗原での免疫付与を介するなど、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）、ＵＬＴＩＭＡＢ（商標）、ＨＵＭＡＢ−ＭＯＵＳＥ（登録商標）、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）、ＫＹＭＯＵＳＥ又はＡＬＩＶＡＭＡＢ系由来マウス、若しくは、ヒト重鎖トランスジェニックマウス、トランスジェニックラットヒト抗体レパートリー、トランスジェニックウサギヒト抗体レパートリー又はウシヒト抗体レパートリー由来のマウス若しくはＨＵＴＡＲＧ（商標）技術由来のマウスなど、以下に示す様々な方法及び例において作製され得る。ファージ-ベース法も使用することができる。
【００２８】
ヒト化抗体は、ヒト対象に投与するとき、非ヒト類抗体と比較し、ヒト化抗体が免疫応答をほとんど生じさせないように、又は強くはない免疫応答をほとんど生じさせないように、１つ以上のアミノ酸置換、欠失及び／又は付加による非ヒト類から誘導される抗体の配列とは異なる配列を有する。一実施形態では、非ヒト類抗体の重鎖及び／又は軽鎖のフレームワークドメイン及び定常ドメイン内の特定のアミノ酸を突然変異させて、ヒト化抗体を作製する。別の実施形態では、ヒト抗体の定常ドメイン（複数可）を非ヒト類の可変ドメイン（複数可）に融合させる。別の実施形態では、ヒト対象に投与されるとき、非ヒト化抗体の１つ以上のＣＤＲ配列内での１つ以上のアミノ酸残基は、改変されて、非ヒト化抗体の免疫原性を低減させる。ここで、改変されたアミノ酸残基のいずれかが抗体がその抗原に免疫特異結合するのに重大ではない場合、又は、アミノ酸配列に対して行われる変更は、ヒト化抗体と抗原との結合が非ヒト化抗体と抗原との結合より有意に劣ることがないような、保存的変化である。ヒト化抗体の作製方法の例は、米国特許第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号及び同５，８７７，２９３号に見出される。
【００２９】
用語「キメラ抗体」は、１つの抗体の１つ以上の領域及び１つ以上の他の抗体の１つ以上の領域を含む抗体を意味する。１つの実施形態では、１以上のＣＤＲは、ＰＣＳＫ９に結合するヒト抗体から誘導される。別の実施形態では、すべてのＣＤＲは、ＰＣＳＫ９に結合するヒト抗体から誘導される。別の実施形態では、ＰＣＳＫ９に結合する２つ以上のヒト抗体由来のＣＤＲは、キメラ抗体内で混合され、適合される。例えば、キメラ抗体は、ＰＣＳＫ９に結合する第１のヒト抗体の軽鎖のＣＤＲ１、ＰＣＳＫ９に結合する第２のヒト抗体の軽鎖のＣＤＲ２及びＣＤＲ３及びＰＣＳＫ９に結合する第３の重鎖のＣＤＲを含むことができる。更に、フレームワーク領域は、ＰＣＳＫ９に結合する同一抗体の１つ、ヒト抗体など、１つ以上の異なる抗体又はヒト化抗体から誘導することができる。キメラ抗体の一実施例では、一部の重鎖及び／又は軽鎖は、同一であるか、相同であるか、又は、特定の種の抗体から誘導されるか、若しくは、特定の抗体クラス又はサブクラスに属し、鎖（複数可）の残部は、同一であるか、相同であるか、又は、別の種の抗体（複数可）から誘導されるか、若しくは、別の抗体クラス又はサブクラスに属している。また、所望の生物活性（例えばＰＣＳＫ９と特異的に結合する能力）を示す抗体などのフラグメントも含む。
【００３０】
用語「軽鎖」は、軽鎖全長及び特異的に結合を付与するための十分な可変領域配列を有するそのフラグメントを含む。軽鎖全長は、可変領域ドメインＶＬ及び定常領域ドメインＣＬを含む。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端基にある。軽鎖としては、カッパ(「κ」)鎖及びラムダ(「λ」)鎖が挙げられる。
【００３１】
用語「重鎖」は、重鎖全長及び特異的に結合を付与するための十分な可変領域配列を有するそのフラグメントを含む。鎖全長は、可変領域ドメインＶＨ及び３つの定常領域ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。ＶＨドメインは、ポリペプチドのアミノ末端基にあり、ＣＨドメインは、カルボキシ末端基にあり、ＣＨ３は、ポリペプチドのカルボキシ末端基に最も近い。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４サブタイプなど）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２サブタイプなど）ＩｇＭ及びＩｇＥなど、任意のイソタイプであってもよい。
【００３２】
本明細書で使用するとき、例えば、抗体又は免疫グロブリン鎖（重鎖又は軽鎖）などの抗原結合タンパク質の用語「免疫学的機能性フラグメント」（又は単に「フラグメント」）は、アミノ酸の少なくともいくつかが欠失し、鎖全長内に存在するが、抗原に特異的に結合できる抗体部分（一部が得られる又は合成される方法にかかわらず）を含む抗原結合タンパク質である。このようなフラグメントは、標的抗原に特異的に結合し、所与のエピトープへの特異的結合に関して、非標識抗体など他の抗原結合タンパク質と競合し得る生物学的活性物質である。一態様では、このようなフラグメントは、軽鎖全長又は重鎖全長中に存在する少なくとも１つのＣＤＲを保持し、かつ、いくつかの実施形態では、単一の重鎖及び／又は軽鎖若しくはその部分を含む。これらの生物学的活性フラグメントは、組み換えＤＮＡ技術によって作製し得るか、又は、非標識抗体など、抗原結合タンパク質の酵素的開裂又は化学的開裂によって作製され得る。免疫学的機能性免疫グロブリンフラグメントとしては、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体及び一本鎖抗体が挙げられ、かつ、これらに限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ラクダ科又はウサギなど、任意の哺乳類源から誘導され得る。本明細書にて開示された抗原結合タンパク質の官能性部分、例えば、１つ以上のＣＤＲは、共有結合により第２のタンパク質又は低分子に結合し、体内の特定の標的に指示される治療薬を調製することができ、ニ官能性治療特性を有するか、又は長い血清半減期を有すると更に考えられる。
【００３３】
「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有する２つの重鎖フラグメントを含む。２つの重鎖フラグメントは、２つ又はそれ以上のジスルフィド結合によって及びＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって共に保持される。
【００３４】
「Ｆａｂ’」フラグメントは、２つのＦａｂ’フラグメントの２つの重鎖間に鎖内ジスルフィド結合が形成され、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成することができるように、１つの軽鎖及びＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン、並びに、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の領域も含む１つの重鎖部分を含む。
【００３５】
「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、２つの重鎖間に鎖内ジスルフィド結合を形成するように、２つの軽鎖及びＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の定常領域部分を含有する２つの重鎖部分を含む。したがって、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、２つの「重」鎖間で、ジスルフィド結合によって共に保持される２つのＦａｂ’フラグメントから構成される。
【００３６】
「Ｆｖ領域」は、重鎖及び軽鎖の双方の可変領域からなるが、定常領域を有していない。
【００３７】
「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域又は軽鎖の可変領域のみを含有する免疫学的機能性免疫グロブリンフラグメントである。場合によっては、２つ又はそれ以上のＶＨ領域が共有結合によりペプチドリンカーと連結し、二価ドメイン抗体を産生する。二価のドメイン抗体の２つのＶＨ領域は、同一又は異なる抗原を標的にすることができる。
【００３８】
「半抗体」は、完全重鎖、完全軽鎖及び完全重鎖のＦｃ領域とペアになった第２の重鎖Ｆｃ領域を含む免疫学的機能性免疫グロブリン構成体である。リンカーは、必須ではないが、重鎖Ｆｃ領域と第２の重鎖Ｆｃ領域との連結に使用し得る。特定の実施形態では、半抗体は、本明細書にて開示された抗原結合タンパク質の一価の形態である。他の実施形態では、１つのＦｃ領域と第２のＦｃ領域を関連付けるために電荷残基対を使用することができる。
【００３９】
「二価抗原結合タンパク質」又は「二価抗体」は、２つの抗原結合部位からなる。場合によっては、２つの結合部位が同一の抗原特異性を有する。二価抗原結合タンパク質及び二価抗体は、本明細書で記載されるように、二重特異性であってよく、本開示の態様を形成する。
【００４０】
「多特異的抗原結合タンパク質」又は「多特異的抗体」は、１つ以上の抗原又はエピトープを標的するものであり、かつ本開示の別の態様を形成する。
【００４１】
「二重特異性」、「二重−特異性」又は「二官能性」抗原結合タンパク質又は抗体は、ハイブリッド抗原結合タンパク質又は抗体であり、それぞれ、２つの異なる抗原結合部位を有する。二重特異性抗原結合タンパク質と抗体は、多特異性抗原結合タンパク質又は多特異性抗体の一種であり、これに限定されないが、ハイブリドーマの融合又はＦａｂ’フラグメントの連結など、様々な方法によって作製し得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎｎ，（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３を参照されたい。二重特異性抗原結合タンパク質又は抗体の２つの結合部位は、２つの異なるエピトープに結合し、同一（例えば、ＰＣＳＫ９）又は異なるプロテイン標的（例えば、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）、アンジオポイエチン様−３（ＡＮＧＰＴＬ３）、ＡＮＧＰＴＬ４、内皮リパーゼ（ＥＬ）、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）、リポタンパクリパーゼ（ＬＰＬ）、繊維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１））に残留し得る。
【００４２】
用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、一本鎖及び二本鎖ヌクレオチドポリマーのいずれをも含む。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド若しくはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾であり得る。本修飾には、ブロモウリジン誘導体及びイノシン誘導体などの塩基修飾体、２’，３’−ジデオキシリボーゼなどのリボース修飾、及びホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート、ホスホルアニラダート及びホスホロアミダートなどのヌクレオチド間結合修飾が含まれる。
【００４３】
用語「オリゴヌクレオチド」は、２００個以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの長さは、１０〜６０個の塩基である。他の実施形態のオリゴヌクレオチドの長さは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０〜４０のヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、例えば、突然変異遺伝子の構築に使用する一本鎖の又は二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドとしては、検出アッセイ用の放射線標識、蛍光標識、ハプテン標識又は抗原標識などの標識を含み得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲプライマー、クローニングプライマー又はハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。
【００４４】
「単離核酸分子」とは、ゲノムＤＮＡ又はゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、若しくは、合成起源又は単離ポリヌクレオチドが実際に発見される、又は、実際は、連結していないポリヌクレオチドに連結しているポリヌクレオチドのすべて又は部分と関連のないこれらのいくつかの組み合わせを意味する。本開示の目的では、特定のヌクレオチド配列を含む「核酸分子」には、非標識染色体は含まれないと理解される。指定の核酸配列「からなる」単離核酸分子としては、指定の配列に加えて、１０以下のコード配列又は２０以下の他のタンパク質又はその一部さえも含むことができるか、又は、引用された核酸配列のコード領域の発現を制御する操作可能に連結された制御配列を含み得る、かつ／又はベクター配列を含み得る。
【００４５】
特に明記されていない限り、本明細書で記載される任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は、５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側の方向は、５’方向と称される。５’から３’方向への新生ＲＮＡ転写物の付加は、転写方向と称され、ＲＮＡ転写物の５’末端部に対して、５’であるＲＮＡ転写物と同一の配列を有するＤＮＡ鎖の配列領域は、「上流配列」と称され、ＲＮＡ転写物の３’末端部に対して、３’であるＲＮＡ転写物と同一の配列を有するＤＮＡ鎖の配列領域は、「下流配列」と称される。
【００４６】
用語「制御配列」は、ライゲーションが行われるコード配列の発現及び処理に影響を与え得るポリヌクレオチド配列を意味する。こうした制御配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態では、原核生物の制御配列には、プロモーター、リボゾーム結合部位及び転写末端配列を含み得る。例えば、真核生物の制御配列は、転写因子、転写エンハンサー配列及び転写末端配列の１つ又は複数の認識部位からなる、プロモーターを含み得る。「制御配列」は、リーダー配列及び／又は融合パートナー配列を含み得る。
【００４７】
用語「ベクター」とは、タンパク質コード情報を宿主細胞に転写するために使用される任意の分子又は独立体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ又はウイルス）を意味する。
【００４８】
用語「発現ベクター」又は「発現構成体」は、宿主細胞の形質転換に好適であり、かつ、操作可能に連結される１つ以上の異種コード領域の発現を指示及び／又は制御（宿主細胞と共に）する核酸配列を含むベクターを意味する。発現構造体は、これに限定されないが、転写、翻訳に影響を与える又は制御し、かつ、イントロンが存在する場合、操作可能にその領域に連結させるコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす配列が挙げられる。
【００４９】
本明細書で使用するとき、「操作可能に連結される」は、その用語を適用した成分が好適な条件下で固有の機能を実施することができる関係にあることを意味する。例えば、タンパク質コード配列に「操作可能に連結される」ベクター中の制御配列は、制御配列の転写活性に適合し得る条件下でタンパク質コード配列の発現が得られるように、ライゲートされる。
【００５０】
用語「宿主細胞」は、核酸配列で形質転換された細胞又は形質転換することができ、これによって、対象の遺伝子を発現させる細胞を意味する。この用語には、モルホロジー又は遺伝子構造において、対象の遺伝子が存在する限り、後代が本来の親細胞と同一であるか否かにかかわらず、親細胞の後代を含む。
【００５１】
用語「形質導入」は、１つのバクテリアから別のバクテリアへの、通常、バクテリオファージによる遺伝子の伝達を意味する。また、「形質導入」は、複製欠損レトロウイルスによる真核細胞配列の獲得及び転写を指す。
【００５２】
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡ又は外因性ＤＮＡの導入を意味し、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されるとき、細胞は、「導入される」。多数のトランスフェクション技術は、当該技術分野において周知であり、本明細書にて開示される。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１），ｓｕｐｒａ；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照されたい。このような技術を使用して、１つ以上の外来性ＤＮＡ部分を好適な宿主細胞に導入することができる。
【００５３】
用語「形質転換」とは、細胞の遺伝形質の変化を意味し、細胞は、修飾されて、新規ＤＮＡ又は新規ＲＮＡを含むとき形質転換される。例えば、トランスフェクション、形質導入又は他の技術により、新規遺伝物質を導入することによって、その自然状態から遺伝子改変される場合、細胞は、形質転換される。トランスフェクション又は形質導入後、形質転換ＤＮＡは、物理的にその細胞の染色体に統合することによって、細胞のＤＮＡに再結合することができるか、又はエピソーム要素として、複製されることなく、一時的に維持することができるか、又はプラスミドとして独立して複製することができる。細胞分裂により、形質転換ＤＮＡが複製されると、細胞は、「安定して形質転換される」と考えられる。
【００５４】
用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、本明細書では、同義的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを意味する。また、用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する自然アミノ酸の類縁体又は模倣体並びに自然アミノ酸ポリマーである、アミノ酸ポリマーに適用する。また、この用語は、例えば、炭水化物残基を添加し、糖タンパク質又を形成することによって改変されたか、又は、リン酸化されたアミノ酸ポリマーを包含し得る。ポリペプチド及びタンパク質は、自然発生細胞及び非組換え細胞によって作製することができるか、又はポリペプチド及びタンパク質は、遺伝子組換え細胞又は組換え細胞によって作製することができる。ポリペプチド及びタンパク質は、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子又は天然配列の１つ以上のアミノ酸の消失、付加、及び／又は置換を有する分子からなる。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、特異的又は選択的にＰＣＳＫ９に結合する抗原結合タンパク質又はＰＣＳＫ９に特異的又は選択的に結合する抗原結合タンパク質の１つ以上のアミノ酸の消失、付加、及び／又は置換を有する配列を包含する。用語「ポリペプチドフラグメント」は、全長タンパク質と比較して、アミノ−末端消失、カルボキシ基末端消失及び／又は内部消失を有するポリペプチドを指す。こうしたフラグメントは、全長タンパク質と比較したとき、修飾アミノ酸を含み得る。ある実施形態では、フラグメントは、約５〜５００のアミノ酸長である。例えば、フラグメントは、少なくともアミノ酸長が５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００又は４５０である。有用なポリペプチドフラグメントとしては、結合ドメインなど、抗体の免疫学的機能性フラグメントが挙げられる。ＰＣＳＫ９に結合する抗原結合タンパク質の場合、有用なフラグメントとしては、これに限定されないが、ＣＤＲ領域、重鎖又は軽鎖の様々なドメイン、抗体鎖の部分、又は２つのＣＤＲを含むちょうどその可変領域などが挙げられる。
【００５５】
用語「単離タンパク質」は、対象のタンパク質が、以下であることを意味する。（１）通常、発見される少なくともいくつかの他のタンパク質を含まない、（２）同じ源（例えば、同種）からの他のタンパク質を本質的に含まない、（３）異なる種からの細胞によって発現される、（４）自然と関連付けられるポリヌクレオチド、脂質、炭化水素又は他の物質の少なくとも約５０％から単離されている、（５）自然と関連づけられることはない、ポリペプチドに操作可能に関連付けられる（共有結合又は非共有結合相互作用によって）、（６）自然に発生しない。典型的には、「単離タンパク質」は、所与の試料の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％又は少なくとも約５０％から構成される。合成起源のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又は他のＲＮＡ又は任意のそれらの組み合わせは、このような単離タンパク質をコードすることができる。好ましくは、単離タンパク質は、タンパク質又はポリペプチド若しくはその治療、診断、予防、研究又はその他の使用と干渉するその自然環境において発見される他の汚染物質を実質的に含まない。
【００５６】
ポリペプチドの（例えば、抗原結合タンパク質又は抗体）「変異型」は、１つ以上のアミノ酸残基が、別のポリペプチド配列に対してアミノ酸配列の挿入、消失及び／又は置換が行われるアミノ酸配列を含む。変異型としては、融合タンパク質が挙げられる。
【００５７】
ポリペプチドの「誘導体」は、別の化学部分への接合によるなど、変異型の挿入、消失又は置換とは異なるいくつかの方法で、化学修飾されたポリペプチド（例えば、抗原結合タンパク質又は抗体）である。
【００５８】
本明細書全体で生体物質に関連して使用されるとおり、用語「自然」は、ポリペプチド、核酸、宿主細胞など、自然の中で発見される物質を示す。
【００５９】
「抗原結合領域」は、ＰＣＳＫ９など特定の抗原と特異的に結合するタンパク質又はタンパク質部分を意味する。例えば、抗原と相互作用し、抗原結合タンパク質上で抗原にその特異性及び親和性が付与されるアミノ酸残基を含む抗原結合タンパク質の部分は、「抗原結合領域」と呼ばれる。抗原結合領域は、典型的には、１つ以上の「相補性結合領域」（「ＣＤＲ」）を含む。また、ある種の抗原結合領域は、１つ以上の「フレームワーク」領域を含む。「ＣＤＲ」は、抗原結合特異性及び親和性に寄与するアミノ酸配列である。「フレームワーク」領域は、抗原結合領域と抗原との間の結合を促進するＣＤＲの適切な立体配座の維持に役立ち得る。
【００６０】
ある種の態様では、ＰＣＳＫ９に結合する組換え抗原結合タンパク質が提供される。本文脈中、「組換えタンパク質」は、本明細書に記載されているように、組換え技術を用いて、即ち、組換え核酸の発現を介して作製されたタンパク質である。組換えタンパク質の製造方法及びその技術は、当該技術分野において周知である。
【００６１】
抗原結合タンパク質（例えば、抗原結合タンパク質の中和、抗体の中和、作動性抗原結合タンパク質、作動性抗体及び標的上の同一のエピトープ又は結合部位について競合するＰＣＳＫ９に結合する結合タンパク質）の文脈で使用するとき、用語「競合する」は、検討中の抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその免疫学的機能性フラグメント）は、標準分子（例えば、標準リガンド又は標準抗体などの標準抗原結合タンパク質）の共通抗原（例えば、ＰＣＳＫ９又はそのフラグメント）への特異的結合を防止又は阻害するアッセイによって決定されるように、抗原結合タンパク質間での競合を意味する。多数の種類の競合的結合アッセイは、試験分子が標準分子と結合について競合する場合、決定に使用することができる。使用できるアッセイの例としては、固相直接又は間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接又は間接酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９：２４２−２５３を参照されたい）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４−３６１９を参照されたい）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，（１９８８）を参照されたい）；Ｉ−１２５標識を用いる固相直接標識ＲＩＡ（例えば、上記Ｍｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）  Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７−１５を参照されたい）、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：５４６−５５２を参照されたい）；及び直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７−８２）が挙げられる。典型的には、このようなアッセイとしては、固体表面若しくは非標識試験抗原結合タンパク質又は標識参照抗原結合タンパク質のいずれかを担持する細胞に結合される精製抗原の使用を伴う。競合的阻害は、試験抗原結合タンパク質の存在下で、固体表面又は細胞に結合される標識量を決定することによって測定される。通常、試験抗原結合タンパク質は、過剰に存在する。立体障害の発生に関して、競合アッセイによって識別される抗原結合タンパク質（抗原結合タンパク質の競合）としては、同一エピトープに結合している抗原結合タンパク質及び標準抗原結合タンパク質によって結合されるエピトープに十分に近位である近接するエピトープに結合する抗原結合タンパク質が挙げられる。競合的結合の決定に関する方法の更なる詳細は、本明細書の実施例に記載する。通常、抗原結合タンパク質の競合が過剰に存在する場合、標準抗原結合タンパク質の共通抗原への特異的結合を少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％阻害する。いくつかの例では、結合が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９７％以上、阻害される。
【００６２】
用語「抗原」は、例えば、抗原結合タンパク質など（例えば、抗体又はこれらの免疫的機能性フラグメントなど）、選択的結合剤によって結合される分子又は分子の一部を意味する。また、動物において、その抗原に結合することができる抗体を作製するために使用することができる。抗原は、異なる抗原結合タンパク質、例えば、抗体と相互作用が可能である１つ以上のエピトープを処理することができる。
【００６３】
用語「エピトープ」は、抗原結合タンパク質が標的分子に結合されると、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）が接触する標的分子のアミノ酸を意味する。この用語には、抗体などの抗原結合タンパク質が標的分子に結合されると、接触している標的分子のアミノ酸の完全なリストにおける任意のサブセットを含む。エピトープは、連続又は非連続であってもよい（例えば、（ｉ）ポリペプチド配列中で互いに隣接していないが、標的分子の文脈では、抗原結合タンパク質によって結合されているアミノ酸残基の一本鎖ポリペプチド、又は（ｉｉ）１つ以上の各構成成分に存在するが、依然として抗原結合タンパク質によって結合されているアミノ酸残基である、２つ又はそれ以上の各構成成分を含む多重結合受容体）。ある実施形態では、エピトープは、抗原結合タンパク質の発生に使用される抗原エピトープと類似している３次元構造を含む模倣体であり得、さらに、抗原結合タンパク質を発生させるために使用されるエピトープ中に見出されるアミノ酸残基を含まないか、わずかに含む。ほとんどの場合、エピトープは、タンパク質に残留するが、場合によっては、核酸など、他の種類の分子に残留し得る。エピトープ決定基としては、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基又はスルホニル基などの化学的表面活性分子群を挙げることができ、また、特定の３次元構造的特性及び／又は特定の電荷特性を有し得る。一般に、特定の標的分子に特異的である抗原結合タンパク質は、タンパク質の複合体混合物及び／又は巨大分子中で、標的分子上のエピトープを優先的に認識する。
【００６４】
用語「同一性」は、配列の配置及び比較によって決定されるように、２つ又はそれ以上のポリペプチド分子若しくは２つ又はそれ以上の核酸分子間の配列の関係を指す。「パーセント同一性」は、比較分子中において、アミノ酸とヌクレオチドとの間の同一の残基のパーセントを意味し、比較する最小分子のサイズに基づいて計算される。これらの計算では、アライメント中の間隙（ある場合には）は、特定の数理モデル又はコンピュータプログラム（即ち、「アルゴリズム」）によって指定する必要がある。整列された核酸又はポリペプチドの同一性を算出するために使用できる方法は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），（１９８８）Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，（１９８７）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；ａｎｄ  Ｃａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８：１０７３に記述されている。
【００６５】
パーセント同一性の計算では、比較される配列は、配列間で最も適合率の大きい方法で整列される。パーセント同一性の決定に使用されるコンピュータプログラムは、ＧＣＧプログラムパッケージであり、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に記載されている。コンピュータアルゴリズムＧＡＰは、パーセント配列の同一性が決定される２つのポリペプチド又はポリヌクレオチドの整列に使用される。配列は、それぞれのアミノ酸又はヌクレオチドの最適の適合（アルゴリズムによって決定されるとおり「適合スパン」）で整列される。ギャップオープニングペナルティ（平均対角の３倍として計算；「平均対角」は、用いる比較マトリックスの対角の平均であり；「対角」は、特定の比較マトリックスによる、各完全アミノ酸に割り当てられたスコア又は数字である）及びギャップ伸長ペナルティ（通常、ギャップオープニングペナルティの１／１０）、ならびにＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２などの比較マトリックスを、アルゴリズムと組み合わせて用いる。また、ある実施形態では、標準比較マトリックス（ＰＡＭ２５０比較マトリックスについては、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：３４５−３５２；ＢＬＯＳＵＭ  ６２比較マトリックスについては、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５−１０９１９を参照されたい）は、アルゴリズムによって使用される。
【００６６】
ＧＡＰプログラムを用いてポリペプチドまたはヌクレオチド配列に対するパーセント同一性を決定するために推奨パラメータは、以下に示す。
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３
比較マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ  ６２、上記Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２、
ギャップペナルティ：１２（エンドギャップにペナルティがない場合）
ギャップ長さペナルティ：４
類似度しきい値：０
【００６７】
２つのアミノ酸配列のアライメントを行うための特定のアライメントスキームにより、２つの配列の短い領域のみ適合させることができ、この小さいアライメント領域は、２つの完全長配列間に有意な関係がない場合であっても、非常に高い配列同一性を有し得る。したがって、標的ポリペプチドの少なくとも５０連続アミノ酸にまたがるアライメントとなることが所望される場合、選択されたアライメント方法（例えば、ＧＡＰプログラム）は、調整し得る。
【００６８】
本明細書で使用するとき、「実質的に純粋である」は、記述された分子種は、存在する優勢種である、つまり、モル基準で、同じ混合物中において任意の他の各種よりも豊富であることを意味する。ある実施形態では、実質的に純粋な分子は、目的種は、存在する全巨大分子種の少なくとも５０％（モル基準で）を含む組成物である。他の実施形態では、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全巨大分子種の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％含まれる。他の実施形態では、従来の検出方法によって、組成物中に汚染種を検出することのできない必須の均質性となるまで目的種を精製する。このため、組成物は、単一の検出可能な巨大分子種から構成される。
【００６９】
用語「治療」及び「治療する」は、寛解、症状軽減、損傷、病状又は病態を、患者にとってさらに耐えられるものにすること、変性速度又は低下速度を示すこと、変性の最終ポイントがより悪化が少なくなるようにすること、患者の身体的又は精神的健康状態を改善することなどの任意の主観的パラメータ又は客観的パラメータなど、損傷、症状又は病態の治療又は改善が奏功した任意の兆候を指す。症候の治療又は改善は、身体検査、神経精神病学的検査及び／又は精神医学的評価の結果など、主観的パラメータ又は客観的パラメータに基づく。例えば、本明細書で提示された特定の方法は、予防的に又は急性期治療のいずれかとして、循環しているコレステロールレベルを低下させる、かつ／又は原発性高脂血症（異型接合家族性及び非家族性）、混合型脂質異常症及び同型接合家族性高コレステロール血症に伴う症候を改善するために、異脂肪血症の治療に使用され得る。
【００７０】
「有効量」は、一般に、症候の重症度及び／又は頻度を低下させる、症候及び／又は根本原因を消失させる、症候及び／又はそれらの根本原因の発生を防止する、かつ／又は、糖尿病、肥満症及び異脂肪血症が原因であるか又は関連する損傷を改善又は修正する、十分な量を示す。いくつかの実施形態では、有効量は、治療的有効量又は予防的に有効量である。「治療的有効量」は、病態（例えば、糖尿病、肥満症又は異脂肪血症）又は症候、特に、病態に関連付けられる状態又は症候を治療する、若しくは、病態又はいかなる任意の方法で疾病に関連付けられる任意の他の望ましくない症候の進行を防止、妨害、遅延又は逆転するのに十分な量である。「予防的有効量」は、対象に投与されるとき、例えば、糖尿病、肥満症又は異脂肪血症の発症（又は再発）を防止又は遅延させる、若しくは、糖尿病、肥満症又は異脂肪血症の又は関連症候の発症（又は再発）の可能性を低下させる、目的の予防的効果を有する医薬組成物の量である。完全な治療的効果又は予防的効果は、１回の投与により必ず発生するものではなく、一連の投与を行った後のみ発生することもある。したがって、１回以上の投与で、治療的又は予防的有効量を投与することができる。
【００７１】
「アミノ酸」は、当該技術分野における通常の意味である。２０個の自然アミノ酸及びその略語は、従来の使用方法に従う。あらゆる目的のために、参照によって本明細書に引用される、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，ｅｄｓ．），Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１）を参照されたい。２０の従来のアミノ酸、α−アミノ酸、α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸及び他の非従来のアミノ酸などの不自然又は非天然アミノ酸若しくはコードアミノ酸の立体異性体（例えばＤアミノ酸）は、また、ポリペプチドの好適な成分であり得、語句「アミノ酸」に含まれる。非自然及び非天然コードアミノ酸（所望のとおり、本明細書に開示の任意の配列に発見される任意の自然アミノ酸と置き換えることができる）の例としては、以下が挙げられる。４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸塩、ε−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン及び他の類似アミノ酸及びイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。本明細書で使用のポリペプチド表記法では、標準的用法及び慣習に従って、左手方向はアミノ末端基方向であり、右手方向はカルボキシル末端基方向である。抗原結合タンパク質に挿入し得る、又は抗原結合配列において野生型残基に置換され得る非自然／コードアミノ酸の非限定例としては、β−アミノ酸、ホモアミノ酸、周期的アミノ酸及び誘導された側鎖を有するアミノ酸が挙げられる。例としては、（Ｌ型又はＤ型で括弧内に略語を示す）、シトルリン（Ｃｉｔ）、ホモシトルリン（ｈＣｉｔ）、Ｎα−メチルシトルリン（ＮＭｅＣｉｔ）、Ｎα−メチルホモシトルリン（Ｎα−ＭｅＨｏＣｉｔ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、Ｎα−メチルオルニチン（Ｎα−ＭｅＯｒｎ又はＮＭｅＯｒｎ）、サルコシン（Ｓａｒ）、ホモリジン（ｈＬｙｓ又はｈＫ）、ホモアルギニン（ｈＡｒｇ又はｈＲ）、ホモグルタミン（ｈＱ）、Ｎα−メチルアルギニン（ＮＭｅＲ）、Ｎα−メチルロイシン（Ｎα−ＭｅＬ又はＮＭｅＬ）、Ｎ−メチルホモリジン（ＮＭｅＨｏＫ）、Ｎα−メチルグルタミン（ＮＭｅＱ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸（Ｏｉｃ）、３−（１−ナフチル）アラニン（１−Ｎａｌ）、３−（２−ナフチル）アラニン（２−Ｎａｌ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、２−インダニルグリシン（ＩｇＩ）、パラ−ヨードフェニルアラニン（ｐＩ−Ｐｈｅ）、パラ−アミノフェニルアラニン（４ＡｍＰ又は４−Ａｍｉｎｏ−Ｐｈｅ）、４−グアニジノフェニルアラニン（Ｇｕｆ）、グリシルリシン（略語「Ｋ（Ｎε−グリシル）」又は「Ｋ（グリシル）」又は「Ｋ（ｇｌｙ）」）、ニトロフェニルアラニン（ｎｉｔｒｏｐｈｅ）、アミノフェニルアラニン（ａｍｉｎｏｐｈｅ又はＡｍｉｎｏ−Ｐｈｅ）、ベンジルフェニルアラニン（ｂｅｎｚｙｌｐ���ｅ）、γ−カルボキシグルタミン酸（γ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕ）、ヒドロキシプロリン（ヒドロキシプロ）、ｐ−カルボキシル−フェニルアラニン（Ｃｐａ）、α−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、Ｎα−メチルバリン（ＮＭｅＶａｌ）、Ｎ−α−メチルロイシン（ＮＭｅＬｅｕ）、Ｎα−メチルノルロイシン（ＮＭｅＮｌｅ）、シクロペンチルグリシン（Ｃｐｇ）、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、アセチルアルギニン（ａｃｅｔｙｌａｒｇ）、α、β−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、α、γ−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、４−メチル−フェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、β、β−ジフェニル−アラニン（ＢｉＰｈＡ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、４−フェニル−フェニルアラニン（又はビフェニルアラニン；４Ｂｉｐ）、α−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）、β‐アラニン、β‐アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、イソデスモシン、アロイソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、４‐ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、γ−カルボキシグルタミン酸塩、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ‐ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ω−メチルアルギニン、４−アミノ−Ｏ−フタル酸（４ＡＰＡ）、及び他の類似のアミノ酸及び特に列挙されるそれらの任意の誘導体形状が挙げられる。
II.概要
【００７２】
本明細書では、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の長いＰＣＳＫ９に結合する抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、半減期の長い本発明の抗原結合タンパク質は、ｐＨ感受性結合剤である。いくつかの実施形態では、半減期の長い本発明の抗原結合タンパク質は、その定常領域に突然変異を含む。いくつかの実施形態では、半減期の長い本発明の抗原結合タンパク質は、ｐＨ感受性結合剤であり、その定常領域に突然変異を含む。
【００７３】
本開示のいくつかの実施形態では、提供される抗原結合タンパク質は、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を組み込むかつ／又は結合し得るポリペプチドを含み得る。こうした抗原結合タンパク質では、ＣＤＲが「フレームワーク」領域に組み込まれ得る。これにより、ＣＤＲ（複数可）の適切な抗原結合特性が得られるように、ＣＤＲ（複数可）を配向する。一般に、このような提供された抗原結合タンパク質により、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合が阻害される。したがって、高コレステロール血症、原発性高脂血症（家族性ヘテロ接合及び非家族性ヘテロ接合）、混合型脂質異常血症、ホモ接合家族性高コレステロール血症、心血管疾患、及びｉｎ  ｖｉｖｏでＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を阻害することが望ましい幅広い任意の病態の状態の範囲に対して、本明細書において、抗原結合タンパク質が提供され、潜在的治療的有用性が提供される。
【００７４】
本明細書に記載されたある種の抗原結合タンパク質は、抗体又は抗体から誘導されたものである。ある実施形態では、抗原結合タンパク質のポリペプチド構造体は、これに限定されないが、例えば、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニ抗体、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では「抗体模倣体」と称する場合もある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合（本明細書では「抗体は接合する」と称する場合もある）、半抗体及びそのフラグメント、などの抗体に基づく。様々な構造体は、本明細書中以下において更に詳細に記述する。
【００７５】
本明細書で提供される抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９（例えば、ヒトＰＣＳＫ９）への結合を示した。ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、様々な有用性を有する。例えば、いくつかの抗原結合タンパク質は、特異的結合アッセイ、ヒトＰＣＳＫ９などのＰＣＳＫ９の親和性精製、及びＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合の他の阻害剤を識別するためのスクリーニングアッセイにおいて有用である。
【００７６】
本明細書で説明しているように、様々な治療適用において、本明細書に開示されているＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗原結合タンパク質を使用してもよい。例えば、特定の抗原結合タンパク質は、異脂肪血症及び心血管疾患の減少、軽減、又は治療など、患者内でのコレステロールレベルの上昇に関連付けられる状態の治療に有用である。抗原結合タンパク質のその他の使用としては、例えば、ＰＣＳＫ９に関連する疾患又は病態の診断及びＰＣＳＫ９の有無を判定するためのスクリーニングアッセイが挙げられる。本明細書に記載されるいくつかの抗原結合タンパク質は、コレステロールレベルの上昇に関連付けられる病態、症候、及び／又は症状において有用であり得る。例示的病態としては、これに限定されないが、異脂肪血症心血管疾患が挙げられる。
ＰＣＳＫ９
【００７７】
本明細書にて開示された抗原結合タンパク質は、本明細書に記載されているとおり、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を阻害する。Ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＰＣＳＫ９の成熟形態は、分子の活性形態である。ヒトＰＣＳＫ９の全長をコート化するヌクレオチド配列を提供し、プロドメイン配列をコードするヌクレオチド配列については、下線を付けている。
【化１】
2016514668.tif 000002
【００７８】
ヒトＰＣＳＫ９の全長のアミノ酸配列がを提供され、プロドメイン配列を構成するアミノ酸については、下線を付けている。
【化２】
2016514668.tif 000003
【００７９】
カニクイザルＰＣＳＫ９の全長をコート化するヌクレオチド配列を提供し、プロドメイン配列をコードするヌクレオチド配列については、下線を付けている。
【化３】
2016514668.tif 000004
2016514668.tif 000005
【００８０】
カニクイザルＰＣＳＫ９の全長のアミノ酸配列がを提供され、プロドメイン配列を構成するアミノ酸については、下線を付けている。
【化４】
2016514668.tif 000006
2016514668.tif 000007
【００８１】
本明細書に記載されるとおり、ＰＣＳＫ９プロテインもフラグメントを含み得る。用語ＰＣＳＫ９は、ＰＣＳＫ９アミノ酸配列の翻訳後修飾、例えば、可能なＮ−結合グリコシル化部位なども含む。したがって、抗原結合タンパク質は、結合することができるか、又は１つ以上の位置でグリコシル化されたタンパク質から産生し得る。
ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗原結合タンパク質
【００８２】
ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を阻害する種々の選択的結合剤が提供される。これらの結合剤としては、例えば、抗原結合ドメインを含有し、特異的にＰＣＳＫ９、特にヒトＰＣＳＫ９に結合される抗原結合タンパク質（例えば、一本鎖抗体、ドメイン抗体、半抗体、免疫接着及び抗原結合領域を有するポリペプチド）が挙げられる。
【００８３】
一般に、提供される抗原結合タンパク質は、典型的には、本明細書に記載されるように、１つ以上のＣＤＲを含む（例えば、１、２、３、４、５又は６ＣＤＲ）。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、クローンによって自然に発現され、その一方で、他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、（ａ）ポリペプチドフレームワーク構造及び（ｂ）ポリペプチドフレームワーク構造体に挿入するかつ／又は接合される１つ以上のＣＤＲを含むことができる。これらの実施形態のいくつかでは、ＣＤＲは、本明細書で記載のクローンによって発現される重鎖又は軽鎖の構成部分を形成し、他の実施形態では、ＣＤＲが自然に発現しないフレームワークにＣＤＲを挿入することができる。ポリペプチドフレームワーク構造は、異なる様々な形態を取ることができる。例えば、ポリペプチドフレームワーク構造体は、天然抗体又はフラグメント若しくはそれらの変異体のフレームワークであるか、又はフレームワークを含んでもよく、又は実際には、完全に合成であってもよい。様々な抗原結合タンパク質構造体については、以下に更に詳細に記述する。
【００８４】
抗原結合タンパク質が（ａ）ポリペプチドフレームワーク構造体及び（ｂ）ポリペプチドフレームワーク構造体に挿入するかつ／又は接合される１つ以上のＣＤＲを含むいくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のポリペプチドフレームワーク構造体は、抗体であるか、又は抗体から誘導されたものであり、これらに限定されないが、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニ抗体、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では、「抗体模倣体」と称されることもある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合（「抗体抱合体」と称されることもある）及びそれぞれの部分又はフラグメントが挙げられる。場合によっては、抗原結合タンパク質は、抗体の免疫的フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２，又はｓｃＦｖ）である。
【００８５】
ある種の抗原結合タンパク質は、本明細書で提供されるとおり、本タンパク質のヒト形態などのＰＣＳＫ９へ特異的に結合する。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、アミノ酸配列２のアミノ酸３１〜６９２を含むヒト自己開裂型成熟分泌ＰＣＳＫ９に特異的に結合し、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を阻害する。
抗原結合タンパク質構造体
【００８６】
本明細書で提供される、ヒト形態など、ＰＣＳＫ９と特異的に結合する抗原結合タンパク質のいくつかは、典型的に天然抗体に関連付けられる構造を有する。これらの抗体の構造単位は、典型的には、１つ以上の四量体を含み、それぞれが２つの同一のポリペプチド鎖対からなり、いくつかの哺乳類種では、単一の重鎖のみを有する抗体も産生される。典型的な抗体では、各ペア又は対には、１つの完全長「軽」鎖（ある実施形態では、約２５ｋＤａ）及び１つの完全長「重」鎖（ある実施形態では、約５０ｋＤａ〜７０ｋＤａ）を含む。個々の免疫グロブリン鎖は、いくつかの「免疫グロブリンドメイン」からなり、それぞれがおおよそ９０〜１１０のアミノ酸からなり、特徴的折り畳みパターンを発現させる。これらのドメインは、抗体ポリペプチドが構成される基本単位である。各鎖のアミノ末端部分は、典型的には、抗原認識を担う可変ドメインを含む。カルボキシ末端部分は、鎖の他の末端部より、更に進化的に保存され、「定常領域」又は「Ｃ領域」と称される。ヒト軽鎖は、一般に、カッパ(「κ」）とラムダ（「λ」）軽鎖とに分類され、これらのそれぞれが１つの可変ドメイン及び１つの定常ドメインを含む。重鎖は、典型的には、ミュー（μ）鎖、デルタ（δ）鎖、ガンマ（γ）鎖、アルファ（α）鎖又はイプシロン（ε）鎖と分類され、これらは、それぞれ、抗体のアイソタイプＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥが定義される。ＩｇＧは、これに限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４などのサブタイプを有する。ＩｇＭサブタイプとしては、ＩｇＭ及びＩｇＭ２が挙げられる。ＩｇＡサブタイプとしては、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２が挙げられる。ヒトでは、ＩｇＡ及びＩｇＤアイソタイプは、４つの重鎖及び４つの軽鎖を含み、ＩｇＧ及びＩｇＥアイソタイプは、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含み、ＩｇＭアイソタイプは、５つの重鎖及び５つの軽鎖を含む。重鎖Ｃ領域は、典型的には、エフェクター機能を担い得る１つ以上のドメインからなる。重鎖定常領域の数は、アイソタイプに依存する。例えば、ＩｇＧ重鎖は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３として周知の、それぞれ３つのＣ領域ドメインを含む。提供される抗体は、これらの任意のアイソタイプ及びサブタイプを有し得る。ある実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する。
【００８７】
全長軽鎖及び重鎖では、可変領域及び定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって接合され、重鎖は、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，  Ｗ．，ｅｄ．）１９８９，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ（あらゆる目的のために、その全体において参照によって組み込まれる）を参照されたい。各軽鎖／重鎖ペアの可変領域は、典型的には、抗原結合部位を形成する。
【００８８】
ＰＣＳＫ９に特異的に結合する例示的モノクローナル抗体のＩｇＧ２重鎖定常ドメインの一例は、以下のアミノ酸配列を有する。
【化５】
2016514668.tif 000008
【００８９】
ＰＣＳＫ９に結合する例示的モノクローナル抗体のカッパ軽鎖定常ドメインの一例は、以下のアミノ酸配列を有する。
【化６】
2016514668.tif 000009
【００９０】
ＰＣＳＫ９に結合する例示的モノクローナル抗体のラムダ軽鎖定常ドメインの一例は、以下のアミノ酸配列を有する。
【化７】
2016514668.tif 000010
【００９１】
自然免疫グロブリン鎖の可変領域は、一般に、同じ全体構造を呈し、相補的決定領域又はＣＤＲとも呼ばれることの多い、３つの超可変領域によって結合している比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。上述の各重鎖／軽鎖ペアの２つの鎖のＣＤＲは、典型的には、フレームワーク領域によって整列され、標的タンパク質（例えば、ＰＣＳＫ９）上で特定のエピトープと特異的に結合する構造を形成している。Ｎ末端からＣ末端まで、天然軽鎖及び重鎖可変領域はいずれも、典型的には、以下の順番のこれらの要素と一致する。ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４。これらの各ドメイン内での位置を占有するアミノ酸に番号を付けるためのナンバリング法が考察されている。このナンバリング法は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，５ｔｈ  Ｅｄ．，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，  ＮＩＨ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１−３２４２に記述されている。必要に応じて、Ｋａｂａｔ表記法を用いてに記述しているが、本明細書に開示されたＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，（１９８７）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３  または  Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ＆  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，（２００１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０を参照されたい）などの代替表記法に従って、再度定義することができる。
【００９２】
本明細書で提供される抗原結合タンパク質の様々な重鎖及び軽鎖可変領域は、表２に示す。これらの可変領域は、開示された重鎖及び軽鎖定常領域に吸着し、それぞれ完全な抗体重鎖及び軽鎖を形成し得る。さらに、こうして作製された重鎖配列及び軽鎖配列を結合して、完全な抗体構造を作り出すことができる。本明細書で提供された重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、また、上述の例示的配列とは異なる配列を有する他の定常ドメインに接着し得ることを理解すべきである。
【００９３】
提供された抗体のいくつかの全長軽鎖及び重鎖及び対応するアミノ酸配列の具体例は、表１Ａ及び表１Ｂにまとめる。表１Ａは、例示的軽鎖配列を示し、表１Ｂは、例示的重鎖配列を示す。
【表１】
2016514668.tif 000011
【表２】
2016514668.tif 000012
2016514668.tif 000013
【００９４】
下表１Ｂに列挙されている各例示的重鎖（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３など）は、下表１Ａの例示的軽鎖のいずれかと組み合わせて、抗体を形成することができる。このような組み合わせの例としては、Ｈ１とＬ１〜Ｌ４のいずれかとの組み合わせ、Ｈ２とＬ１〜Ｌ４のいずれかとの組み合わせ、Ｈ３とＬ１〜Ｌ４のいずれかとの組み合わせ、Ｈ４とＬ１〜Ｌ４のいずれかとの組み合わせ、など、が挙げられる。場合によっては、抗体としては、下表１Ａ及び下表１Ｂに列挙されているものの少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖が挙げられる。具体的な軽鎖と重鎖のペアリングの例としては、Ｌ１とＨ１、Ｌ２とＨ２、Ｌ３とＨ３、Ｌ４とＨ４、Ｌ１とＨ２、Ｈ３又はＨ４、Ｌ２とＨ１、Ｈ３又はＨ４、Ｌ３とＨ２、Ｈ１又はＨ４、Ｌ４とＨ１、Ｈ２又はＨ３が挙げられる。同一クローンからの重鎖及び軽鎖を含む抗原結合タンパク質に加えて、第１のクローンの重鎖は、第２のクローンの軽鎖とペアリングすることができる（例えば第１のクローンの重鎖は、第２のクローンの軽鎖とペア又は第１のクローンの重鎖は、第２のクローンの軽鎖とペア）。一般に、こうしたペアリングには、ＶＬを９０％以上含む、又は相同性は、天然クローンの重鎖とペアリングさせることができる。
【００９５】
場合によっては、抗体は、下表１Ａ及び下表１Ｂに列挙されている２つの異なる重鎖及び２つの異なる軽鎖を含む。その他の場合、抗体は、２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖を含有する。一例として、抗体又は免疫学的機能性フラグメントは、２つのＬ１軽鎖と２つのＨ１重鎖、２つのＬ２軽鎖と２つのＨ１重鎖、２つのＬ３軽鎖と２つのＨ２重鎖又は２つのＨ３重鎖、並びに、下表１Ａ及び下表１Ｂに列挙されているように、軽鎖及び重鎖ペアを含む他の類似の組み合わせペアを含み得る。
【００９６】
本開示の別の態様では、「半抗体」が提供される。半抗体は、任意によりリンカーを介して、Ｆｃ領域（例えば、配列番号５のＩｇＧ２  Ｆｃ領域）に融合する（ｉ）非標識軽鎖及び（ｉｉ）重鎖を含む、一価の抗原結合タンパク質である。リンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｘリンカー（配列番号７７）であってもよく、「ｘ」は、ゼロ以外の整数（例えば、（Ｇ４Ｓ）２、（Ｇ４Ｓ）３、（Ｇ４Ｓ）４、（Ｇ４Ｓ）５、（Ｇ４Ｓ）６、（Ｇ４Ｓ）７、（Ｇ４Ｓ）８、（Ｇ４Ｓ）９、（Ｇ４Ｓ）１０、それぞれ配列番号：７８〜７５）である。半抗体は、提供された重鎖成分及び軽鎖成分を使用して構築することができる。
【００９７】
提供されている他の抗原結合タンパク質は、下表１Ａ及び下表１Ｂに示す重鎖及び軽鎖の組み合わせによって形成される抗体の変異体であり、かつ、これらの鎖のアミノ酸配列に対して、それぞれ、少なくとも、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する軽鎖及び／又は重鎖を含む。場合によっては、こうした抗体は、少なくとも１つの重鎖及び１つの軽鎖を含み、他の場合には、変異体型は、２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖を含む。
抗原結合タンパク質の可変ドメイン
【００９８】
表２Ｂに示すとおり、ＶＨ１，ＶＨ２、又はＶＨ３から成る群から選択される抗体重鎖可変領域、及び／又は表２Ａに示すとおり、ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３又はＶＬ４から成る群から選択される抗体軽鎖可変領域、及びこれらの軽鎖及び鎖可変領域の免疫学的機能性フラグメント、誘導体、突然変異タンパク質及び変異型を含む抗原結合タンパク質も提供される。
【表３】
2016514668.tif 000014
【表４】
2016514668.tif 000015
【表５】
2016514668.tif 000016
【表６】
2016514668.tif 000017
【００９９】
表２Ｂに記載されている各重鎖可変領域は、抗原結合性タンパク質を形成するために、表２Ａに示されている任意の軽鎖可変領域と組み合わせることができる。このような組み合わせの例としては、ＶＨ１を任意のＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３又はＶＬ４と組み合わせたもの；ＶＨ２を任意のＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３又はＶＬ４と組み合わせたもの；ＶＨ３を任意のＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３又はＶＬ４と組み合わせたもの、などが挙げられる。実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、ＶＨ１をＶＬ１と組み合わせたもの、ＶＨ１をＶＬ２と組み合わせたもの、ＶＨ２をＶＬ３と組み合わせたもの及びＶＨ３をＶＬ４と組み合わせたものを含む。
【０１００】
場合によっては、抗原結合タンパク質は、表２Ａ及び表２Ｂに列挙されるものの、少なくとも１つの重鎖可変領域及び／又は１つの軽鎖可変領域を含む。場合によっては、抗原結合タンパク質は、表２Ｂに列挙されるものの、少なくとも異なる２つの重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む。このような抗原結合タンパク質の一例として、（ａ）１つのＶＨ１及び（ｂ）１つのＶＨ２、ＶＨ３などを含む。このような抗原結合タンパク質の更なる別の例として、（ａ）１つのＶＬ１及び（ｂ）１つのＶＬ２、ＶＬ３などを含む。また、このような抗原結合タンパク質の別の例として、（ａ）１つのＶＬ２及び（ｂ）１つのＶＬ１又はＶＬ３などを含む。また、このような抗原結合タンパク質の別の例として、（ａ）１つのＶＬ３及び（ｂ）１つのＶＬ１又はＶＬ２などを含む。
【０１０１】
重鎖可変領域の種々の組み合わせは、任意の種々の軽鎖可変領域の組み合わせと組み合わせることができる。
【０１０２】
他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、２つの同一の軽鎖可変領域及び／又は２つの同一の重鎖可変領域を含む。一例として、抗原結合タンパク質は、抗体又は表２Ａ及び表２Ｂに列挙されるように、軽鎖可変領域ペアと重鎖可変領域ペアとの組み合わせにおいて、２つの軽鎖可変領域及び２つの重鎖可変領域を含むその免疫学的機能性フラグメントであり得る。
【０１０３】
提供されているいくつかの抗原結合タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５のみのアミノ酸残基でＶＨ１又はＶＨ２から選択された重鎖可変ドメインの配列とは異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み、こうした各配列の差は、単独で１つのアミノ酸の欠失、挿入又は置換のいずれかであり、その欠失、挿入及び／又は置換は、前述の可変ドメイン配列に対して、１５以下のアミノ酸の変化をもたらす。いくつかの抗原結合タンパク質中の重鎖可変領域は、ＶＨ１又はＶＨ２の重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して、少なくとも、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０４】
提供されているある特定の抗原結合タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５のみのアミノ酸残基でＶＬ１、ＶＬ２又はＶＬ３から選択された軽鎖可変ドメインの配列とは異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含み、こうした各配列の差は、単独で１つのアミノ酸の欠失、挿入又は置換のいずれかであり、その欠失、挿入及び／又は置換は、前述の可変ドメイン配列に対して、１５以下のアミノ酸の変化をもたらす。いくつかの抗原結合タンパク質中の軽鎖可変領域は、ＶＬ１、ＶＬ２又はＶＬ３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対して、少なくとも、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０５】
更なる例では、抗原結合タンパク質は、軽鎖及び重鎖可変ドメインの以下のペアリングを含む。ＶＬ１とＶＨ１、ＶＬ２とＶＨ１、ＶＬ３とＶＨ１、ＶＬ１とＶＨ２、ＶＬ２とＶＨ２又はＶＬ３とＶＨ２。
【０１０６】
場合によっては、上記のペアリング内の抗原結合タンパク質は、特定の重鎖可変ドメインを有する少なくとも、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し、特定の軽鎖可変ドメインを有する少なくとも、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態では、上記ペアリング中の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、特定の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインをそれぞれ有する少なくとも、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を含む。
【０１０７】
更なる他の抗原結合タンパク質、例えば抗体又は免疫学的機能性フラグメントとしては、ちょうど今述べたとおり、変異重鎖及び変異軽鎖の変異形態が挙げられる。
抗原結合タンパク質ＣＤＲ
【０１０８】
様々な実施形態では、本明細書にて開示された抗原結合タンパク質は、１つ以上のＣＤＲが移植、挿入かつ／又は接合されているポリペプチドを含むことができる。抗原結合タンパク質は、１、２、３、４、５又は６のＣＤＲを有することができる。したがって、抗原結合タンパク質は、例えば、１つの重鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲＨ１」）及び／又は１つの重鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲＨ２」）及び／又は１つの重鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＨ３」）及び／又は１つの軽鎖ＣＤＲ１（「ＣＤＲＬ１」）及び／又は１つの軽鎖ＣＤＲ２（「ＣＤＲＬ２」）及び／又は１つの軽鎖ＣＤＲ３（「ＣＤＲＬ３」）を有することができる。いくつかの抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ３をいずれも含む。特定の重鎖及び軽鎖ＣＤＲは、下表３Ａ及び下表３Ｂにそれぞれ示す。
【０１０９】
本明細書で使用するとき、所与の抗体の相補的決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，５ｔｈ  Ｅｄ．，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１−３２４２に記述されている系によって、特定される。本明細書にて開示された特定の抗体は、下表３Ａ（ＣＤＲＨ）及び下表３Ｂ（ＣＤＲＬ）に示される１つ以上のＣＤＲのアミノ酸配列に対して、同一であるか、又は実質的に配列同一性を有する１つ以上のアミノ酸配列を含む。
【表７】
2016514668.tif 000018
【表８】
2016514668.tif 000019
【表９】
2016514668.tif 000020
【表１０】
2016514668.tif 000021
【０１１０】
天然抗体のＣＤＲの構造及び性質は、上述した。要約すると、従来の抗体内では、ＣＤＲは、抗原の結合及び認識を担う領域を構成する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域中のフレームワーク内に組み込まれている。可変領域は、少なくとも３つの重鎖又は軽鎖ＣＤＲをフレームワーク領域内に含む（フレームワーク領域１〜４、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４を指定。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９１）。また、前記Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ、（１９８７）を参照されたい。例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”、５ｔｈ  Ｅｄ．，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＰＨＳ、ＮＩＨ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１−３２４２を参照されたい。また、  Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ、（１９８７）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７；  Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３）を参照されたい。しかし、本明細書で提供されたＣＤＲは、従来の抗体構造の抗原結合ドメインの指定に使用するだけでなく、本明細書で記載されているように、様々な他のポリペプチド構造に組み込むこともできる。
【０１１１】
一態様では、提供されるＣＤＲは、（ａ）（ｉ）配列番号１２〜１５、２０〜２３、３４、３５及び４０からなる群から選択されるＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号１２〜１５、２０〜２３、３６、３７からなる群から選択されるＣＤＲＨ２、（ｉｉｉ）配列番号１２〜１５、２０〜２３、３８、３９及び４２からなる群から選択されるＣＤＲＨ３、及び（ｉｖ）５、４、３、２又は１以下のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含む１つ以上のアミノ酸を含有する（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のＣＤＲＨから成る群から選択されるＣＤＲＨ、（Ｂ）（ｉ）配列番号８〜１１、１６〜１９、４３、４４及び５０からなる群から選択されるＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号８〜１１、１６〜１９、４５、４６及び５１からなる群から選択されるＣＤＲＬ２、（ｉｉｉ）配列番号８〜１１、１６〜１９、４７、４８及び５２からなる群から選択されるＣＤＲＬ３、及び（ｉｖ）１、２、３、４又は５以下のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含む１つ以上のアミノ酸を含有する（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のＣＤＲＬからなる群から選択されるＣＤＲＬ、を含む。
【０１１２】
別の態様では、抗原結合タンパク質は、１、２、３、４、５又は６の下表３Ａ及び下表３Ｂに記載されているＣＤＲの変異形態を含み、それぞれ、下表３Ａ及び３Ｂに記載されているＣＤＲ配列に対して、少なくとも、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。いくつかの抗原結合タンパク質は、１、２、３、４、５又は６の下表３Ａ及び下表３Ｂに記載されているＣＤＲを含み、これらの表に記載されるＣＤＲとは、それぞれ、１、２、３、４又は５以下のアミノ酸が異なる。
【０１１３】
更に別の態様では、抗原結合タンパク質は、便宜上表の形態で示し、関連のクローン源を参照する以下のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の関連を含む。
【表１１】
2016514668.tif 000022
【０１１４】
更なる態様では、抗原結合タンパク質は、便宜上表の形態で示し、関連のクローン源を参照する以下のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の関連を含む。
【表１２】
2016514668.tif 000023
【０１１５】
更なる態様では、抗原結合タンパク質は、便宜上表の形態で示し、関連のクローン源を参照する以下のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の関連を含む。
【表１３】
2016514668.tif 000024
例示的抗原結合タンパク質
【０１１６】
一態様に従って、単離抗原結合タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号１２〜１５、２０〜２３、３４、３５及び４０からなる群から選択されるＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号１２〜１５、２０〜２３、３６、３７からなる群から選択されるＣＤＲＨ２、（ｉｉｉ）配列番号１２〜１５、２０〜２３、３８、３９及び４２からなる群から選択されるＣＤＲＨ３、及び（ｉｖ）１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１以下のアミノ酸の置換、欠失又は挿入及びこれらを組み合わせたものを含む（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のＣＤＲＨの１つ以上の、１つ以上の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、（ｂ）（ｉ））（ｉ）配列番号８〜１１、１６〜１９、４３、４４及び５０からなる群から選択されるＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号８〜１１、１６〜１９、４５、４６及び５１からなる群から選択されるＣＤＲＬ２、（ｉｉｉ）配列番号８〜１１、１６〜１９、４７、４８及び５２からなる群から選択されるＣＤＲＬ３、及び（ｉｖ）１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１以下のアミノ酸の置換、欠失又は挿入及びこれらを組み合わせたものを含む（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のＣＤＲＬからなる群から選択されるＣＤＲＬ、の１つ以上を含む、１つ以上の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）、又は（ｃ）（ａ）の１つ以上の重鎖ＣＤＲＨ又は（ｂ）の１つ以上の軽鎖ＣＤＲＬを含む。
【０１１７】
別の実施形態では、ＣＤＲＨは、配列番号１２〜１５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し、ＣＤＲＬは、配列番号８〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。更なる実施形態では、ＶＨは、配列番号１２〜１５からなる群から選択され、かつ／又は、ＶＬは、配列番８〜１１からなる群から選択される。
【０１１８】
一態様に従って、単離抗原結合タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号１２−１５、及び（ｉｉ）１０、９、８、７、６、５，４、３、２、１のアミノ酸の置換、欠失、挿入及びこれらを組み合わせたものを含む（ｉ）のＶＨの１つ以上を含む、１つ以上の可変重鎖（ＶＨ）、（ｂ）（ｉ）配列番号８〜１１及び（ｉｉ）１０、９、８、７、６、５，４、３、２、１のアミノ酸の置換、欠失、挿入及びこれらを組み合わせたものを含む（ｉ）のＶＬ、からなる群から選択される１つ以上の可変軽鎖（ＶＬ）、又は（ｃ）（ａ）の１つ以上の可変重鎖及び（ｂ）の１つ以上の可変軽鎖、を含む。
【０１１９】
別の実施形態では、可変重鎖（ＶＨ）は、配列番号１２〜１５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し、かつ／又は可変軽鎖（ＶＬ）は、配列番号８〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。
【０１２０】
また、一態様では、１つ以上のＰＣＳＫ９のアミノ酸残基、特に、ヒトＰＣＳＫ９からなる直鎖状又は３次元エピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質が提供される。
【０１２１】
更に他の実施例では、本明細書に記載の上記単離抗原結合タンパク質は、本明細書に開示されている少なくとも１つのＣＤＲＨコンセンサス配列からなる第１のアミノ酸配列及び本明細書に開示されている少なくとも１つのＣＤＲＬコンセンサス配列からなる第２のアミノ酸配列を含む。
【０１２２】
一態様では、第１のアミノ酸配列は、少なくとも２つのＣＤＲＨコンセンサス配列を含み、かつ／又は第２のアミノ酸配列は、少なくとも２つのＣＤＲＬコンセンサス配列を含む。ある実施形態では、第１及び第２のアミノ酸配列は、互いに共有結合により結合している。
【０１２３】
更なる実施形態では、単離抗原結合タンパク質の第１のアミノ酸配列は、各クローンとも、６に示すＣＤＲＨ３、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ１ペアリングを含み、かつ／又は単離抗原結合タンパク質の第２のアミノ酸配列は、各クローンとも、表４に示すＣＤＲＬ３、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ１ペアリングを含む。
【０１２４】
更なる実施形態では、抗原結合タンパク質は、表３Ａに示すとおり、重鎖配列のＣＤＲＨ配列、ＣＤＲＨ１−１、ＣＤＲＨ２−１、ＣＤＲＨ３−１、ＣＤＲｈ１−２、ＣＤＲＨ２−２及びＣＤＲＨ３−２の少なくとも２つを含む。
【０１２５】
更なる実施形態では、抗原結合タンパク質は、表３Ｂに示すとおり、軽鎖配列のＣＤＲＬ配列、ＣＤＲＬ１−１、ＣＤＲＬ２−１、ＣＤＲＬ３−１、ＣＤＲＬ１−２、ＣＤＲＬ２−２、ＣＤＲＬ３−２及びＣＤＲＬ３−３の少なくとも２つを含む。
【０１２６】
更なる実施形態では、抗原結合タンパク質は、表３Ａに示すとおり、重鎖配列のＣＤＲＨ配列、ＣＤＲＨ１−１、ＣＤＲＨ２−１、ＣＤＲＨ３−１、ＣＤＲｈ１−２、ＣＤＲＨ２−２及びＣＤＲＨ３−２の少なくとも２つを含み、更なる実施形態では、抗原結合タンパク質は、表３Ｂに示すとおり、軽鎖配列のＣＤＲＬ配列、ＣＤＲＬ１−１、ＣＤＲＬ２−１、ＣＤＲＬ３−１、ＣＤＲＬ１−２、ＣＤＲＬ２−２及びＣＤＲＬ３−２及びＣＤＲＬ３−３の少なくとも２つを含む。
【０１２７】
また、別の実施形態では、表３Ａに示すとおり、抗原結合タンパク質は、重鎖配列Ｈ１、Ｈ２及びＨ３のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３配列を含む。
【０１２８】
また、更に別の実施形態では、表３Ｂに示すとおり、抗原結合タンパク質は、軽鎖配列Ｌ１、Ｌ２及びＬ３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３配列を含む。
【０１２９】
更に他の実施例では、抗原結合タンパク質は、表２Ａ、表２Ｂ及び表６に示すとおり、以下のＶＨ及びＶＬペアからなる抗原結合タンパク質のＣＤＲを６個すべて含む。ＶＬ１とＶＨ１、ＶＬ２とＶＨ１、ＶＬ３とＶＨ１、ＶＬ１とＶＨ２、ＶＬ２とＶＨ２及びＶＬ３とＶＨ２など。
【０１３０】
一態様では、本明細書で提供されるＰＣＳＫ９に特異的に結合する単離抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え型抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多特異的抗体又はその抗体フラグメントであってよい。
【０１３１】
別の実施形態では、本明細書で提供された単離結合タンパク質の抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ダイアボディ又は一本鎖抗体分子であってよい。
【０１３２】
更なる実施形態では、本明細書で提供されるＰＣＳＫ９に特異的に結合する単離抗原結合タンパク質は、ヒト抗体であり、ＩｇＧ１−、ＩｇＧ２−、ＩｇＧ３−又はＩｇＧ４−タイプであり得る。
【０１３３】
別の実施形態では、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する単離抗原結合タンパク質は、表１Ａ〜表１Ｂに記載するとおり、軽鎖又は重鎖ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する単離抗原結合タンパク質は、表２Ａ〜表２Ｂに記載するものなど、可変軽鎖ドメイン又は重鎖ドメインを含む。更にその他の実施形態では、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、下表３Ａ〜下表３Ｂ、下表４Ａ〜下表４Ｂに記載されているとおり、２つ又は３つのＣＤＲＨ、若しくは１つ、２つ又は３つのＣＤＲＬを含む。更に他の実施形態では、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、表６に示すとおり、６つのすべてのＣＤＲを含む。このような抗原結合タンパク質及び実際に本明細書にて開示された任意の抗原結合タンパク質は、例えば、５Ｋ、１０Ｋ、２０Ｋ、４０Ｋ、５０Ｋ、６０Ｋ、８０Ｋ、１００Ｋ又は１００Ｋ超からなる群から選択される分子量を有するＰＥＧ分子など、１つ以上のＰＥＧ分子によりＰＥＧ化することができる。
【０１３４】
更に別の態様では、本明細書で提供されたＰＣＳＫ９に特異的に結合する任意の抗原結合タンパク質は、標識基に連結することができ、本明細書で提供された単離抗原結合タンパク質の１つの抗原結合タンパク質によりＰＣＳＫ９への結合に関して競合し得る。一実施形態では、患者に投与したとき、本明細書で提供された単離抗原結合タンパク質により、血液総コレステロール値、ＬＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、アポリポタンパク質Ｂ、非−ＨＤＬ−Ｃ、リポタンパク質（ａ）の低下及びＨＤＬ−Ｃの上昇など、血液トリグリセリドレベル及びコレステロールレベルを低下させることができるか、又は、他の心血管リスク要因を改善することができる。
【０１３５】
理解されるように、表３Ａ〜表３Ｂに提示されている１つ以上のＣＤＲを含む任意の抗原結合タンパク質については及び独立して、示された配列から選択されるＣＤＲの任意の組み合わせは、有用であり得る。このため、独立して選択された１、２、３、４、５，６のＣＤＲを有する抗原結合タンパク質は、産生することができる。しかし、当該技術分野において明かなように、特定の実施形態は、一般に、例えば、抗原結合タンパク質が一般に、２つのＣＤＲＨ２領域などで作製されないなど、非−反復性のＣＤＲの組み合わせを利用している。
【０１３６】
本明細書で提供されたＰＣＳＫ９に特異的に結合するいくつかの抗原結合タンパク質は、以下に更に詳細に記載する。
抗原結合タンパク質及び結合エピトープ及び結合ドメイン
【０１３７】
抗原結合タンパク質がＰＣＳＫ９上でエピトープと結合しているといわれる場合、抗原結合タンパク質がＰＣＳＫ９の特定部分に特異的に結合することを意味する。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、特定の残基（例えば、ＰＣＳＫ９の特定のセグメント）から構成されるポリペプチドに特異的に結合し得る。
【０１３８】
任意の前述の実施形態では、このような抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９のすべての残基に接触させる必要はない。ＰＣＳＫ９内でのすべての単一のアミノ酸置換又は欠失は、必ずしも有意に結合親和性に影響を及ぼすわけではない。
【０１３９】
抗原結合タンパク質のエピトープ特異性及び結合ドメイン（複数可）は、様々な方法によって決定することができる。例えば、いくつかの方法では、抗原の切断部分を使用することができる。その他の方法では、アラニンスキャン又はアルギニンスキャン型方法を用いることによって、様々なドメイン、領域又はアミノ酸が２つのタンパク質（例えば、マウス形態及びヒト形態１つ以上の抗原又は標的タンパク質）間で交換される、キメラタンパク質の産生及び研究によって、又はプロテアーゼ保護アッセイによって、など、１つ以上の特異残基で突然変異する抗原を利用する。
抗原結合タンパク質の競合
【０１４０】
別の態様では、１つの例示的抗体又はＰＣＳＫ９結合の機能性フラグメントにより競合する抗原結合タンパク質が提供される。また、このような抗原結合タンパク質は、本明細書で例示された抗原結合タンパク質の１つ又は重複エピトープと同一のエピトープと結合し得る。例示されている抗原結合タンパク質と同一のエピトープと競合する又は結合する抗原結合タンパク質及びフラグメントは、類似の機能特性を示すと予測されている。例示されている抗原結合タンパク質及びフラグメントは、重鎖及び軽鎖Ｈ１〜Ｈ３及びＬ１〜Ｌ４、可変領域ドメインＶＬ１〜ＶＬ４及びＶＨ１〜ＶＨ３及び本明細書で提供されたＣＤＲを有するものを含む、表１、２、３、４、５及び６のものなど、が挙げられる。したがって、具体的な例ととしては、提供された抗原結合タンパク質は、以下を含む抗体と競合するものを含む。
（ａ）下表３Ａ及び下表３Ｂに列挙されている抗原結合タンパク質に関して列挙されている１、２、３、４、５又は６すべてのＣＤＲ、
（ｂ）ＶＬ１〜ＶＬ３及びＶＨ１〜ＶＨ２から選択され、かつ、表２Ａ及び表２Ｂに記載された抗原結合タンパク質として列挙されているＶＨ及びＶＬ又は
（ｃ）下表１Ａ及び下表１Ｂに列挙されている高原結合タンパク質について明記されている２つの軽鎖及び２つの重鎖。
【０１４１】
このため、一実施形態では、本開示は、標準抗体を有するＰＣＳＫ９との結合について競合するヒト抗体などの抗原結合タンパク質を提供し、標準抗体は、以下からなる群から選択される軽鎖可変ドメイン配列及び重鎖可変ドメイン配列の組み合わせを含む。ＶＬ１とＶＨ１、ＶＬ２とＶＨ１、ＶＬ３とＶＨ１、ＶＬ１とＶＨ２、ＶＬ２とＶＨ２及びＶＬ３とＶＨ２など。
【０１４２】
別の実施形態では、本開示は、ＰＣＳＫ９について標準抗体と競合するヒト抗体などを含む抗原結合タンパク質を提供する。ここで、標準抗体は１０１Ｆ７、１０３Ｂ７、１３１Ｄ１２又は２７Ｂ２である。
【０１４３】
更なる実施形態では、標準抗体と実質的に同じＫｄを有する、ＰＣＳＫ９に結合し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒトＨｅｐＧ２細胞アッセイ（又は他の好適な細胞株又は培養中の）において、標準抗体と同じ程度までＰＣＳＫ９の能力を低下させてＬＤＬの取り込みをブロックさせ、血清コレステロールレベルを低下させ、かつ／又はＰＣＳＫ９への結合について、該標準抗体と競合するヒト抗体などの単離抗原結合タンパク質が提供され、標準抗体は、１０１Ｆ７、１０３Ｂ７、１３１Ｄ１２及び２７Ｂ２からなる群から選択される。抗体と競合する能力は、本明細書に記載の任意の好適なアッセイを用いて、測定することができ、抗原結合タンパク質１０１Ｆ７、１０３Ｂ７，１３１Ｄ１２及び２７Ｂ２は、標準抗体として使用することができる。
モノクローナル抗体
【０１４４】
提供される抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９に結合するモノクローナル抗体などを含み、かつ、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を様々な程度まで阻害する。モノクローナル抗体は、当該技術分野において既知の任意の技術を使用して、例えば、不死化スケジュール完了後、トランスジェニック動物から採取した脾臓細胞などを不死化することによって、生成することができる。脾臓細胞は、当該技術分野において既知の任意の技術を用いて、例えば、骨髄腫細胞を融合させて、ハイブリドーマを産生することによって、不死化することができる。ハイブリドーマの産生融合手順に使用する骨髄腫細胞は、好ましくは、非−抗体−産生され、高い融合効率及び所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの発育を支持するある選択的培地中で発育することができないようにする酵素欠乏を有する。マウス融合に使用する好適な細胞株の例としては、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４  １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７及びＳ１９４／５ＸＸＯ  Ｂｕｌが挙げられ、ラット融合で使用される細胞株の例としては、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ及び４Ｂ２１０が挙げられる。細胞融合に有用な他の細胞は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２及びＵＣ７２９−６である。
【０１４５】
場合によっては、ハイブリドーマ細胞株は、（１）アミノ酸配列２のアミノ酸３１〜６９２を含むヒト自己開裂型成熟分泌ＰＣＳＫ９（実施例１に示すとおり）を含む免疫原を用いて、動物の不死化によって産生し（例えば、ヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニック動物）、不死化動物から脾臓細胞を収集し、採取した脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによってハイブリドーマ細胞を産生する、ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を樹立し（実施例２に記載されているように）、ＰＣＳＫ９に結合し、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合をブロックするハイブリドーマ細胞株を識別する（例えば、実施例３に記載されているように）。このようなハイブリドーマ細胞株及びそれらによって産生されたモノクローナル抗体は、本開示の態様を形成する。
【０１４６】
ハイブリドーマ細胞株によって分泌されたモノクローナル抗体は、当該技術分野において既知の任意の技術を用いて、精製することができる。ハイブリドーマ又はｍＡｂは、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合しないようにブロックする能力など、特定の性質を有するｍＡｂを識別するために、更にスクリーニングすることができる。このようなスクリーンの例は、本明細書で提供される。
キメラ抗体及びヒト化抗体
【０１４７】
前述の配列に基づくキメラ抗体及びヒト化抗体は、容易に産生することができる。１つの例としては、キメラ抗体であり、これは、共有結合により連結され、機能性免疫グロブリン軽鎖又は重鎖、若しくは、その免疫学的機能性部分を産生する異なる抗体のタンパク質セグメントから構成される抗体である。一般に、特定の種から誘導される抗体又は特定の抗体クラス又はサブクラスに族する抗体において、重鎖及び／又は軽鎖の一部は、対応する配列と同一であるか、又は相同であり、別の種から誘導される抗体又は別の抗体クラス又はサブクラスに族する抗体において、鎖（複数可）の残部が、対応する配列と同一であるか、又は相同である。キメラ抗体に関する方法は、参照によって本明細書に組み込まれる、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６８５１−６８５５を参照されたい。ＣＤＲグラフト化は、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、同第５，５８５，０８９号及び同第５，５３０，１０１号に記載されている。
【０１４８】
一般に、キメラ抗体を産生する目的は、目的とする患者／レシピエントの種からのアミノ酸の数が最大化するキメラを作製することにある。一例としては、「ＣＤＲ−グラフト化」抗体であり、抗体が、特定の種からのもの又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する１つ以上の相補的決定領域（ＣＤＲ）を含み、別の種から誘導される抗体又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体において、抗体鎖（複数可）の残部が、対応する配列と同一であるか、又は相同である。ヒトに使用するために、可変領域又はげっ歯類抗体から選択されたＣＤＲは、多くの場合、ヒト抗体にグラフト化され、ヒト抗体の自然可変領域又はＣＤＲに取って代わる。
【０１４９】
キメラ抗体の１つの有用な型は「ヒト化抗体」である。一般に、ヒト化抗体は、非−ヒト動物で初めに生育されたモノクローナル抗体から産生される。本モノクローナル抗体において、典型的には、抗体の非−抗原認識部分の特定のアミノ酸残基は、対応するアイソタイプのヒト抗体において、対応する残基に相同であるように、変性される。例えば、様々な方法を用いて、げっ歯類可変領域の少なくとも一部分をヒト抗体の対応する領域に置き換えることによって、ヒト化を行うことができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、及び同第５，６９３，７６２号、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６を参照されたい）。
【０１５０】
一態様では、本明細書で提供された抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のＣＤＲ（例えば、表３〜表６）は、同じか又は異なる系統学的種の抗体からフレームワーク領域（ＦＲ）にグラフト化される。例えば、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域ＶＨ１、ＶＨ２及び／又はＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３のＣＤＲは、コンセンサスヒトＦＲにグラフト化することができる。コンセンサスヒトＦＲを作製するために、いくつかのヒト重鎖又は軽鎖アミノ酸配列を配置して、コンセンサスアミノ酸配列を識別することができる。他の実施形態では、本明細書にて開示された重鎖又は軽鎖のＦＲは、異なる重鎖又は軽鎖のフレームワーク（「ＦＲ」）によって置換される。一態様では、ＰＣＳＫ９に特異的に結合される重鎖及び軽鎖のＦＲにおいて稀なアミノ酸（例えば、抗体）は、置換されず、ＦＲアミノ酸の残部は、置換される。「稀なアミノ酸」とは、この特定のアミノ酸が通常、ＦＲで発見されない場所にある特異的アミノ酸である。あるいは、１つの重鎖又は軽鎖のグラフト化可変領域は、本明細書で開示した特定の重鎖又は軽鎖の定常領域とは異なる定常領域と共に使用され得る。他の実施形態では、グラフト化可変領域は、Ｆｖ抗体の一本鎖の一部である。
【０１５１】
ある実施形態では、ヒト以外の種の定常領域をヒト可変領域（複数可）と共に、ハイブリッド抗体を作製するために、使用することができる。
完全ヒト抗体
【０１５２】
完全ヒト抗体は、本開示によって提供される。所与の抗原に特異的な完全ヒト抗体を抗原となるヒトに曝露することなく製造するにあたって、方法が使用できる（「完全ヒト抗体」）。完全ヒト抗体の作製を行うにあたって提供される１つの特殊な手段は、マウスの液性免疫系の「ヒト化」である。内因性Ｉｇ遺伝子が不活化されたヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座をマウスに導入することは、マウス（任意の所望の抗原で免疫化することができる動物）において１つの完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の作製手段である。完全ヒト抗体を使用することにより、治療薬として、マウス又はマウス誘導ｍＡｂをヒトに投与することによって引き起こされる場合がある免疫応答及びアレルギー応答を最小化することができる。
【０１５３】
完全ヒト抗体は、ヒト抗体のレパートリーを作製することができるトランスジェニック動物（典型的には、マウス）の免疫化により、内因性免疫グロブリンを作製することなく、作製することができる。この目的のための抗原は、典型的には、６以上の連続アミノ酸を有し、任意により、ハプテンなどの担体に接合される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：２５５１−２５５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８；ａｎｄ  Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３を参照されたい。このような方法の一実施例では、マウス重免疫グロブリン鎖及び軽免疫グロブリン鎖をコードし、ヒト重鎖及び軽鎖タンパク質類をコードするヒトゲノムＤＮＡ含有遺伝子座のマウスゲノム大型フラグメントに挿入する内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座を無力化することによって、トランスジェニック動物を作製する。ヒト免疫グロブリン遺伝子座を完全に相補することのない、部分的に改変された動物は、交雑種であり、所望される免疫系の全改変を有する動物を得る。免疫原を投与すると、これらのトランスジェニック動物から免疫原に対して免疫特異的であるが、マウスの代わりに、可変領域を含むヒトアミノ酸配列を有する抗体が産生される。このような方法の更なる詳細については、ＷＯ９６／３３７３５及びＷＯ９４／０２６０２を参照されたい。トランスジェニックマウスに関連する追加のヒト抗体の作製方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、同第６，７１３，６１０号、同第６，６７３，９８６号、同第６，１６２，９６３号、同第５，５４５，８０７号、同第６，３００，１２９号、同第６，２５５，４５８号、同第５，８７７，３９７号、同第５，８７４，２９９号、同第５，５４５，８０６号、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９１／１０７４１、ＷＯ９０／０４０３６及びＥＰ５４６０７３及びＥＰ５４６０７３に記載されている。
【０１５４】
特定の実施形態に従って、挿入されたゲノムを産生するヒト抗体の実質的な部分を有するが、内因性マウス抗体の作製において、欠失しているトランスジェニックマウスを用いて、本発明の抗体を調整することができる。次いで、このようなマウスは、ヒト免疫グロブリン分子及び抗体を産生することができ、マウス免疫グロブリン分子及び抗体の産生にあたって、欠損している。この結果を達成するために使用される技術は、本明細書に開示されている特許、出願及び参考文献中に開示されている。ある種の実施形態において、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９８／２４８９３又はＭｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６−１５６（あらゆる目的のために、参照により、本明細書に組み込まれる。）に開示される方法などの方法を使用することができる。
【０１５５】
一般に、ＰＣＳＫ９に対して特異的な完全ヒトモノクローナルは以下のように作製することができる。ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックマウスは、目的の抗原（例えば、本明細書に記載される抗原）で免疫化され、抗体を発現するマウスからのリンパ細胞（Ｂ細胞など）が得られる。不死化ハイブリドーマ細胞株を調製するために、このような回収された細胞は骨髄性細胞株と融合され、目的の抗原に対して特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定するために、このようなハイブリドーマ細胞株はスクリーニング及び選択される。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対して特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株の産生が提供される。
【０１５６】
ある種の実施形態において、完全ヒト抗体は、ヒト脾細胞（Ｂ又はＴ細胞）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗原に曝露させ、次いで、免疫不全化されたマウス（例えば、ＳＣＩＤ又はｎｏｄ／ＳＣＩＤ）中で曝露された細胞を再構成させることによって産生される。例えば、Ｂｒａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：２０５１−２０５８（１９９８）；Ｃａｒｂａｌｌｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，６：１０３−１０６（２０００）を参照されたい。ある種のこのようなアプローチにおいて、ＳＣＩＤマウス（ＳＣＩＤ−ｈｕ）中へのヒト胎児組織の移植は、長期造血及びヒトＴ細胞の成長をもたらす。例えば、ＭｃＣｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１５３２−１６３９（１９８８）；Ｉｆｖｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：２４３−２４８（１９９６）を参照されたい。ある種の事例において、このようなキメラマウス中での液性免疫応答は、動物内でのヒトＴ細胞の同時成長に依存する。例えば、Ｍａｒｔｅｎｓｓｏｎｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８３：１２７１−１７９（１９９４）を参照されたい。ある種のアプローチにおいて、ヒト末梢血液リンパ球はＳＣＩＤマウス中に移植される。例えば、Ｍｏｓｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３５：２５６−２５９（１９８８）を参照されたい。ある種のこのような実施形態において、ブドウ球菌のエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）などの刺激剤で、又は抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体の何れかで、このような移植された細胞が処理されると、より高いレベルでのＢ細胞産生が検出される。例えば、Ｍａｒｔｅｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８４：２２４−２３０（１９９５）；Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８６：１９４６−１９５３（１９９５）を参照されたい。
【０１５７】
したがって、ある種の実施形態において、完全ヒト抗体は、宿主細胞中での組換えＤＮＡの発現によって、又はハイブリドーマ細胞中での発現によって産生され得る。他の実施形態において、抗体は、本明細書中に記載されているファージディスプレイ技術を用いて産生され得る。
【０１５８】
本明細書中に記載されている抗体は、本明細書中に記載されているように、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）技術の使用を通じて調製された。次いで、このようなマウスは、ヒト免疫グロブリン分子及び抗体を産生することができ、マウス免疫グロブリン分子及び抗体の産生にあたって、欠損している。同じことを達成するために使用される技術は、本明細書の背景技術の部に開示されている特許、出願及び参考文献中に開示されている。しかし、特に、マウスのトランスジェニック産生及びそこから得られる抗体の好ましい実施形態は、１９９６年１２月３日に出願された米国特許出願０８／７５９，６２０及び１９９８年６月１１日に公開された国際特許出願ＷＯ９８／２４８９３及び２０００年１２月２１日に公開されたＷＯ００／７６３１０（これらの開示は、参照により、本明細書に組み込まれている。）に開示されている。また、その開示が、参照により、本明細書に組み込まれるＭｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６−１５６  （１９９７）を参照されたい。
【０１５９】
このような技術の使用を通じて、様々な抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体が産生されてきた。基本的に、マウスのＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）系統は、目的の抗原（例えば、本明細書に記載の抗原）で免疫化され、リンパ細胞（Ｂ細胞など）は高度免疫化されたマウスから回収され、回収されたリンパ球は、不死化されたハイブリドーマ細胞株を調製するために、骨髄型細胞株と融合される。目的の抗原に対して特異的な抗体を産生されるハイブリドーマ細胞株を同定するために、これらのハイブリドーマ細胞株は、スクリーニング及び選択される。ＰＣＳＫ９に対して特異的な抗体を産生する複数のハイブリドーマ細胞株を作製するための方法が本明細書において提供される。さらに、このような抗体の重鎖及び軽鎖のヌクレオチド及びアミノ酸配列分析など、このような細胞株によって産生される抗体の性質決定が本明細書に提供される。
【０１６０】
マウスのＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）系統の作製は、１９９０年１月１２日に出願された米国特許出願第０７／４６６，００８号、１９９０年１１月８日に出願された第０７／６１０，５１５号、１９９２年７月２４日に出願された第０７／９１９，２９７号、１９９２年７月３０日に出願された第０７／９２２，６４９号、１９９３年３月１５日に出願された第０８／０３１，８０１号、１９９３年８月２７日に出願された第０８／１１２，８４８号、１９９４年４月２８日に出願された第０８／２３４，１４５号、１９９５年１月２０日に出願された第０８／３７６，２７９号、１９９５年４月２７日に出願された第０８／４３０，９３８号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４６４，５８４号、１９９５年６月５日に出願された０８／４６４，５８２号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４６３，１９１号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４６２，８３７号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４８６，８５３号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４８６，８５７号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４８６，８５９号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４６２，５１３号、１９９６年１０月２日に出願された第０８／７２４，７５２号、１９９６年１２月３日に出願された第０８／７５９，６２０号、２００１年１１月３０日に出願された米国公開第２００３／００９３８２０号及び米国特許第６，１６２，９６３号、同第６，１５０，５８４号、同第６，１１４，５９８号、同第６，０７５，１８１号、同第５，９３９，５９８号及び日本国特許第３  ０６８  １８０  Ｂ２、３  ０６８  ５０６  Ｂ２及び３  ０６８  ５０７Ｂ２中に論述され、記載されている。１９９６年６月１２日に許諾公表された欧州特許ＥＰ０４６３１５１Ｂ１、１９９４年２月３日に公開された国際特許出願ＷＯ９４／０２６０２、１９９６年１０月３１日に公開された国際特許出願ＷＯ９６／３４０９６、１９９８年６月１１日に公開されたＷＯ９８／２４８９３、２０００年１２月２１日に公開されたＷＯ００／７６３１０も参照されたい。上記特許、出願及び参考文献の各々の開示の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。
【０１６１】
本明細書に記載されいているようなトランスジェニックマウスから、ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトｍＡｂを作製し、選択することができる。このような抗体を好適なベクター及び宿主細胞を用いて、クローン化し、発現させることができるか、又は培養したハイブリドーマ細胞から抗体を採取することができる。
【０１６２】
また、完全ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーからも誘導し得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１に記載されているとおり）。ファージディスプレイ技術では、糸状バクテリオファージ表面上の抗体レパートリーのディスプレイ及びその後の最適な抗原への結合によるファージの選択を介して、免疫選択を模倣する。このような技術の１つは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／１０４９４（参照によって組み込まれる）に記載され、このような方法を用いるＭＰＬ−及びｍｓｋ−受容体の高親和性かつ機能性アゴニスト抗体の単離が記述されている。
二重特異性又は二官能性抗原結合タンパク質
【０１６３】
また、上述のように、１つ以上のＣＤＲ又は１つ以上の可変領域を含む二重特異性及びニ官能性抗体が提供される。場合によっては、二重特異性及びニ官能性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖ペア及び２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体であり得る。二重特異性抗体は、これに限定されないが、ハイブリドーマの融合又はＦａｂ’フラグメントの連結など、様々な方法によって作製することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ，（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３を参照されたい。本開示の抗原結合タンパク質がＰＣＳＫ９に結合するとき、結合は、実施例３に記載のとおり、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を阻害し得る。
様々な他の形態
【０１６４】
本開示に提供されるＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗原結合タンパク質のいくつかは、本明細書に開示の様々な抗原結合タンパク質の形態が挙げられる（例えば、表１〜４に記載の配列を有するもの）。
【０１６５】
様々な実施形態では、本明細書にて開示された抗原結合タンパク質は、１つ以上の非天然／コードアミノ酸を含み得る。例えば、いくつかの抗原結合タンパク質は、表１〜６に記載の１つ以上の重鎖又は軽鎖、可変領域又はＣＤＲにおいて、１つ以上の非天然／コードアミノ酸置換を有する。非天然／コードアミノ酸（所望のとおり、本明細書に開示の任意の配列に発見される任意の自然アミノ酸と置換ができる）の例としては、以下が挙げられる。４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸塩、ε−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン及び他の類似アミノ酸及びイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。本明細書で使用のポリペプチド表記法では、標準的用法及び慣習に従って、左手方向はアミノ末端基方向であり、右手方向はカルボキシル末端基方向である。抗原結合タンパク質に挿入し得る、又は抗原結合配列において野生型残基に置換され得る非自然／コードアミノ酸の非限定例としては、β−アミノ酸、ホモアミノ酸、周期的アミノ酸及び誘導された側鎖を有するアミノ酸が挙げられる。例としては、（Ｌ型又はＤ型で括弧内に略語を示す）、シトルリン（Ｃｉｔ）、ホモシトルリン（ｈＣｉｔ）、Ｎα−メチルシトルリン（ＮＭｅＣｉｔ）、Ｎα−メチルホモシトルリン（Ｎα−ＭｅＨｏＣｉｔ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、Ｎα−メチルオルニチン（Ｎα−ＭｅＯｒｎ又はＮＭｅＯｒｎ）、サルコシン（Ｓａｒ）、ホモリジン（ｈＬｙｓ又はｈＫ）、ホモアルギニン（ｈＡｒｇ又はｈＲ）、ホモグルタミン（ｈＱ）、Ｎα−メチルアルギニン（ＮＭｅＲ）、Ｎα−メチルロイシン（Ｎα−ＭｅＬ又はＮＭｅＬ）、Ｎ−メチルホモリジン（ＮＭｅＨｏＫ）、Ｎα−メチルグルタミン（ＮＭｅＱ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸（Ｏｉｃ）、３−（１−ナフチル）アラニン（１−Ｎａｌ）、３−（２−ナフチル）アラニン（２−Ｎａｌ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、２−インダニルグリシン（ＩｇＩ）、パラ−ヨードフェニルアラニン（ｐＩ−Ｐｈｅ）、パラ−アミノフェニルアラニン（４ＡｍＰ又は４−Ａｍｉｎｏ−Ｐｈｅ）、４−グアニジノフェニルアラニン（Ｇｕｆ）、グリシルリシン（略語「Ｋ（Ｎε−グリシル）」又は「Ｋ（グリシル）」又は「Ｋ（ｇｌｙ）」）、ニトロフェニルアラニン（ｎｉｔｒｏｐｈｅ）、アミノフェニルアラニン（ａｍｉｎｏｐｈｅ又はＡｍｉｎｏ−Ｐｈｅ）、ベンジルフェニルアラニン（ｂｅｎｚｙｌｐｈｅ）、γ−カルボキシグルタミン酸（γ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕ）、ヒドロキシプロリン（ヒドロキシプロ）、ｐ−カルボキシル−フェニルアラニン（Ｃｐａ）、α−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、Ｎα−メチルバリン（ＮＭｅＶａｌ）、Ｎ−α−メチルロイシン（ＮＭｅＬｅｕ）、Ｎα−メチルノルロイシン（ＮＭｅＮｌｅ）、シクロペンチルグリシン（Ｃｐｇ）、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、アセチルアルギニン（ａｃｅｔｙｌａｒｇ）、α、��−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、α、γ−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、４−メチル−フェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、β、β−ジフェニル−アラニン（ＢｉＰｈＡ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、４−フェニル−フェニルアラニン（又はビフェニルアラニン；４Ｂｉｐ）、α−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）、β‐アラニン、β‐アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、イソデスモシン、アロイソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、４‐ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、γ−カルボキシグルタミン酸塩、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ‐ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ω−メチルアルギニン、４−アミノ−Ｏ−フタル酸（４ＡＰＡ）、及び他の類似のアミノ酸及び特に列挙されるそれらの任意の誘導体形状が挙げられる。
【０１６６】
更に、抗原結合タンパク質は、表１〜６に記載の１つ以上の重鎖又は軽鎖、可変領域又はＣＤＲにおいて、１つ以上の保存的アミノ酸置換を有し得る。天然アミノ酸は、共通の側鎖特性に基づいて、クラスに分類され得る。
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の方向性に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ及び
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１６７】
保存的アミノ酸置換は、これらのクラスの１つの一員を同じクラスの一員で交換することを含み得る。保存アミノ酸置換は、生物系における合成よりも、典型的に、化学的ペプチド合成によって導入される非天然／コードアミノ酸残基を包含することができる。下表８を参照されたい。これらには、ペプチド模倣薬及び他のアミノ酸部分の逆転又は反転形態が挙げられる。
【０１６８】
非保存的置換は、上記のクラスの１つの一員を別のクラスの一員で交換することを含み得る。こうした置換残基は、ヒト抗体と相同である抗体領域又は分子の非相同領域に導入し得る。
【０１６９】
特定の実施形態によって、こうした変化をさせるには、アミノ酸の疎水性指標を考慮することができる。タンパク質の疎水性親水性性質は、各アミノ酸に番号を付け（「疎水性親水性指標」）、次いで、ペプチド鎖に沿って、繰り返し、これらの値の平均値を出すことによって求められる。各アミノ酸は、その疎水性及び電荷特性に基づいて、疎水性指標に割り当てられる。疎水性親水性指標は、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）及びアルギニン（−４．５）である。
【０１７０】
相互作用的生物学的機能をタンパク質に付与するにあたって、疎水性親水性指標プロファイルの重要性は、当該技術において理解されている（例えば、Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３１を参照されたい）。ある種のアミノ酸は、類似の疎水性親水性指標又はスコアを有する他のアミノ酸と置換することができ、それでもなお類似の生物活性を保持することが知られている。疎水性親水性指標に基づいて変化させる際には、ある実施形態において、疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換を含む。いくつかの態様では、±１以内であるアミノ酸の置換を含み、他の態様では、±０．５以内であるアミノ酸の置換を含む。
【０１７１】
類似アミノ酸の置換は、本事例のように、それによって産生される生物学的機能性タンパク質又はペプチドを免疫学的実施形態に用いることを意図する場合には特に、親水性に基づいて効果的に実施することができることも当分野では理解されている。ある実施形態においては、その隣接アミノ酸の親水性によって支配される、タンパク質の局所的な最大平均親水性は、その免疫原性及び抗原性、すなわち、タンパク質の生物学的特性と相関がある。
【０１７２】
以下の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）及びトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて変化させる際には、ある実施形態において、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれ、ある実施形態において、±１以内であるアミノ酸の置換が含まれ、更にある実施形態において、±０．５以内であるアミノ酸の置換が含まれる。場合によっては、親水性に基づいて、一次アミノ酸配列からエピトープを特定することもできる。これらの領域は、「エピトープコア領域」とも称される。
【０１７３】
アミノ酸置換の例は、表８に示す。
【表１４】
2016514668.tif 000025
2016514668.tif 000026
【０１７４】
当業者は、本明細書に提供されている情報と共に、周知の技術を用いて、本明細書中に記載されているように、ポリペプチドの好適な変異型を決定することができる。ある種の実施形態において、当業者は、活性にとって重要でないと思われる領域を標的とすることによって、活性を破壊せずに変化させ得る分子の好適な領域を同定することができる。当業者は、類似のポリペプチド間で保存されている分子の残基及び部分を同定することができる。更なる実施形態では、生物活性にとって又は構造にとって重要であり得る領域でさえ、生物活性を破壊せずに、又はポリペプチド構造に悪影響を及ぼさずに、保存的アミノ酸置換に供することができる。
【０１７５】
さらに、当業者は、活性又は構造にとって重要である類似のポリペプチド中の残基を同定する構造−機能研究を検討することができる。このような比較に照らして、類似のタンパク質中の活性又は構造にとって重要であるアミノ酸残基に対応する、タンパク質中のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、このような予測された重要なアミノ酸残基に対する、化学的に類似のアミノ酸置換を選ぶことができる。
【０１７６】
当業者は、三次元構造及び類似のポリペプチド中のその構造に関連するアミノ酸配列を分析することもできる。こうした情報を鑑みて、当業者は、その三次元構造に関して、抗体のアミノ酸残基のアライメントを予測することができる。ある種の実施形態において、タンパク質の表面上に存在すると予想されるアミノ酸残基は他の分子との重要な相互作用に関連し得るので、当業者は、このような残基に対して急激な変化がおこらないように選択することができる。さらに、当業者は、それぞれの所望されるアミノ酸残基に単一のアミノ酸置換を含有する試験変異型を作製することができる。これらの変異型は、次いで、アッセイを用いて、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合の阻害について（本明細書に提供されている実施例に記載されているものも含む）、スクリーニングすることができ、このため、どのアミノ酸を変化させることができ、どのアミノ酸は変化させてはならないかに関する情報を得ることができる。換言すれば、このようなルーチン実験から得られた情報に基づいて、当業者は、単独又は他の変異型と組み合わせるかのいずれかの更なる置換を避ける必要のあるアミノ酸の位置を容易に決定することができる。
【０１７７】
多数の科学文献において、二次構造の予測に注力されている。Ｍｏｕｌｔ，（１９９６）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ７：４２２−４２７；Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １３：２２２−２４５；Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１３：２１１−２２２；Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ａｄｖ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  Ｒｅｌａｔ．  Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４７：４５−１４８；Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７９）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４７：２５１−２７６；ａｎｄ  Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７９）Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  ２６：３６７−３８４を参照されたい。さらに、二次構造の予測を補助するために、現在、コンピュータプログラムが利用可能である。二次構造を予測する１つの方法は、相同性のモデル化に基づいている。例えば、３０％を上回る配列同一性を有する又は４０％を上回る類似性を有する２つのポリペプチド又はタンパク質は、しばしば、類似の構造的トポロジーを有し得る。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の発達により、ポリペプチド又はタンパク質の構造内に存在する可能性がある折り畳みの数など、二次構造の増大した予測可能性がもたらされた。Ｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．２７：２４４−２４７を参照されたい。所与のポリペプチド又はタンパク質中に、折り畳みの限定された数が存在すること、及び一旦、臨界数の構造が解明されると、構造的な予測は、劇的により正確になることが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒ    ｅｔ    ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，  ７：３６９−３７６  （１９９７））。
【０１７８】
二次構造を予測するさらなる方法には、“ｔｈｒｅａｄｉｎｇ”  （Ｊｏｎｅｓ，（１９９７）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ７：３７７−３８７；  Ｓｉｐｐｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：１５−１９），“ｐｒｏｆｉｌｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ”  （Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４−１７０；  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍ．  １８３：１４６−１５９；  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８４：４３５５−４３５８），ａｎｄ  “ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ”  （上記Ｈｏｌｍ，（１９９９）及び上記Ｂｒｅｎｎｅｒ，（１９９７）参照）が含まれる。
【０１７９】
ある種の実施形態によれば、以下の場合、アミノ酸置換が行われる。（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させる、（２）酸化に対する感受性を低下させる、（３）タンパク質複合体を形成させるための結合親和性を変化させる、（４）リガンド又は結合親和性を変化させる及び／又は（４）このようなポリペプチドに対して他の物理化学的若しくは機能的特性を付与若しくは修飾する。例えば、単一又は複数のアミノ酸置換（いくつかの実施形態において、保存的なアミノ酸置換）は、天然に存在する配列中に作製され得る。置換は、分子間接触を形成するドメイン（複数可）外の抗体のその部分において行われ得る。このような実施形態において、保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させないように使用し得る（例えば、親配列又は生来の抗原結合タンパク質を特徴付ける二次構造を崩壊させることのない１つ以上の置換アミノ酸）。本分野で認められるポリペプチド二次及び三次構造の例は、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９２，Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，１９８４，Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．），２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９９，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；Ｐｅｔｓｋｏ  ＆  Ｒｉｎｇｅ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，２００４，Ｎｅｗ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ；及びＴｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５に記載され、それぞれ、参照により、本明細書中に組み込まれる。
【０１８０】
さらなる好ましい抗体変異型としては、親アミノ酸配列又は生来のアミノ酸配列で１つ以上のシステイン残基が欠失され、又は別のアミノ酸（例えば、セリン）に置換されているシステイン変異型が挙げられる。生物学的に活性な立体構造へ抗体が再度折り畳まれる必要がある場合は特に、システイン変異型は有用であり得る。システイン変異型は、固有の抗体より少ないシステイン残基を一般に有し、ペアを形成していないシステインから生じた相互作用を最少化するために、通常、偶数を有する。
【０１８１】
開示されている重鎖及び軽鎖可変領域ドメイン及びＣＤＲを使用して、ＰＣＳＫ９に特異的に結合することができ、また、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を阻害することができる、抗原結合領域含有ポリペプチドを調製することができる。例えば、表３〜６に列挙される１つ以上のＣＤＲは、共有結合又は非共有結合により分子（例えば、ポリペプチド）に組み込み、免疫吸着を作ることができる。免疫吸着は、大きいポリペプチド鎖の一部として、ＣＤＲ（複数可）を組み込むことができ、共有結合によりＣＤＲ（複数可）を別のポリペプチド鎖に連結してもよいか、又は非共有結合によりＣＤＲ（複数可）を組み込んでもよい。ＣＤＲ（複数可）により、免疫吸着では、特定の対象抗原（例えば、エピトープを含むＰＣＳＫ９に対する）に特異的に結合することができる。
【０１８２】
開示されている重鎖及び軽鎖可変領域ドメイン及びＣＤＲを使用して、ＰＣＳＫ９に特異的に結合することができ、また、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を阻害することができる、抗原結合領域含有ポリペプチドを調製することができる。例えば、表３〜６に列挙される１つ以上のＣＤＲは、抗原結合領域が一価（Ｆａｂフラグメントなど）であるが、二量体のＦｃ部分を有するように、Ｆｃフラグメントとペアの抗原結合タンパク質の重鎖、軽鎖を含む構造上、「半」抗体に類似している分子（例えば、ポリペプチド）に組み込むことができる。
【０１８３】
本明細書に記載される可変領域ドメイン及びＣＤＲに基づく模倣体（例えば、「ペプチド模倣体」又は「ペプチド模倣物」）が提供される。これらの類縁体は、ペプチド、非ペプチド又はペプチド領域と非ペプチド領域とを組み合わせたものであり得る。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，（１９８６）Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９；  Ｖｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，（１９８５）  ＴＩＮＳ  ｐ．３９２；及びＥｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．  ３０：１２２９（あらゆる目的のために、参照により、本明細書に組み込まれる）。治療的に有用なペプチドと構造的に類似するペプチド模倣物は、類似の治療効果又は予防効果を生じさせるために使用し得る。このような化合物は、多くの場合、コンピュータ化された分子モデリングの補助により、開発される。一般に、ペプチド模倣物は、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する能力など、所望の生物活性を示す抗体と構造的に類似のタンパク質であるが、本分野で周知の方法によって、任意により以下より選択された連結によって置換された１つ以上のペプチド連結を有する：−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ−ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、及び−ＣＨ２ＳＯ−。コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸を同種のＤアミノ酸で体系的に置換すること（例えば、Ｌ−リジンに代えてＤ−リジン）は、ある種の実施形態において、より安定なタンパク質を作製するために使用し得る。さらに、コンセンサス配列又は実質的に同一なコンセンサス配列変異を含む拘束されたペプチドは、本分野で公知の方法によって、例えば、ペプチドを環状化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を付加することによって、作製され得る（（Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ（１９９２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７、参照により、あらゆる目的のために、本明細書に組み込まれる。）。
【０１８４】
本明細書で記載されたＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗原結合タンパク質の誘導体も提供される。誘導された抗原結合タンパク質は、特定の使用において半減期が上昇するなど、所望の特性を抗体又はフラグメントに付与する任意の分子又は物質を含むことができる。誘導された抗原結合タンパク質は、例えば、検出可能（又は標識）部分（例えば、放射性分子、比色分子、抗原性分子又は酵素分子）、検出可能ビーズ（磁気ビーズ又は電子密度が高い（ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｎｓｅ）ビーズ（例えば金））、又は別の分子に結合する分子（例えばビオチン又はストレプトアビジン））、療法又は診断部分（例えば放射性、細胞傷害性、又は薬学的活性部分）、あるいは特定の使用（例えばヒト対象などの対象への投与、あるいは他のｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用）のための抗原結合タンパク質の適合性を増加させる分子を含むことも可能である。抗原結合タンパク質を誘導体化するのに使用可能な分子の例としては、アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。アルブミンと結合した又はＰＥＧ化された抗原結合タンパク質の誘導体は本分野で周知の技術を使用して調製することができる。特定の抗原結合タンパク質としては、本明細書に記載のようにＰＥＧ化一本鎖ポリペプチドが挙げられる。ある実施形態において、抗原結合タンパク質をトランスサイレチン（ＴＴＲ）又はＴＴＲ変異体に抱合させるか又は別の方法で連結させる。ＴＴＲ又はＴＴＲ変異体を、例えば、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）、ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、酸化ポリプロピレン／酸化エチレンコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール及びポリビニルアルコールからなる群より選択される化学薬品で化学的に修飾してもよい。
【０１８５】
他の誘導体としては、他のタンパク質又はポリペプチドと共に、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を阻害する抗原結合タンパク質のＮ末端又はＣ末端に融合した異種ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質の発現によるなど、特異的に本明細書で開示のＰＣＳＫ９に結合する抗原結合タンパク質の共有又は凝集コンジュゲートが挙げられる。例えば、コンジュゲート化されるペプチドは、異種シグナル（又はリーダー）ポリペプチド、例えば酵母アルファ因子リーダー、又はエピトープタグなどのペプチドであってもよい。本明細書に開示の抗原結合タンパク質を含有する融合タンパク質は、特異的にＰＣＳＫ９に結合する（例えば、ポリ−Ｈｉｓタグ）及び特異的にＬＤＬＲに結合するＰＣＳＫ９を阻害する抗原結合タンパク質の精製又は同定を促進するために付加されるペプチドを含んでもよい。また、特異的にＰＣＳＫ９に結合する抗原結合タンパク質を、Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４，（１９８８）、及び米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるような、ＦＬＡＧペプチドに連結してもよい。ＦＬＡＧペプチドは、非常に抗原性であり、特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって可逆的に結合されるエピトープを提供することから、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイ及び容易な精製が可能になる。ＦＬＡＧペプチドが所与のポリペプチドに融合される融合タンパク質を調製するのに有用な試薬が、商業的に入手可能である（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
【０１８６】
ＰＣＳＫ９に特異的に結合する１つ以上の抗原結合タンパク質を含む多量体は、本開示の別の態様を形成する。多量体は、共有結合した又は非共有結合した、二量体、三量体、又はより高次の多量体の形態を取ることも可能である。ＰＣＳＫ９に結合し、ＬＤＬＲへＰＣＳＫ９の結合を阻害する２つ以上の抗原結合タンパク質を含む多量体は、治療、診断での使用および同様に他の使用が考慮される。その一例として、多量体がホモ二量体である。他の例示的多量体としては、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体などが挙げられる。
【０１８７】
１つの実施形態は、ＰＣＳＫ９に特異的に結合された抗原結合タンパク質に融合したペプチド部分間の共有相互作用又は非共有相互作用を介して連結された、ＰＣＳＫ９に特異的に結合された多数の抗原結合タンパク質を含む多量体に向けられる。こうしたペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）、又は多量体化を促進する特性を有するペプチドであってもよい。以下により詳細に記載するように、ロイシンジッパー及び抗体由来の特定のポリペプチドは、それに付着した抗原結合タンパク質の多量体化を促進することができるペプチドの中にある。
【０１８８】
特定の実施形態において、多量体は、ＰＣＳＫ９に結合する２〜４の抗原結合タンパク質を含む。多量体の抗原結合タンパク質は、例えば変異体又はフラグメントなど、任意の上述の型であってもよい。好ましくは、多量体は、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する能力を有する、抗原結合タンパク質を含む。
【０１８９】
１つの実施形態において、免疫グロブリン由来のポリペプチドを用いて、オリゴマーを調製する。抗体由来ポリペプチドの多様な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合した特定の異種ポリペプチドを含む、融合タンパク質の調整は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：１０５３５；Ｂｙｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６７７；及びＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．  ４，１０．１９．１−１０．１９．１１ページに記載されている。
【０１９０】
１つの実施形態は、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗原結合タンパク質を、抗体のＦｃ領域に融合させることによって生成される。二量体は、例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を、適切な発現ベクター内に挿入し、組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞において、遺伝子融合体を発現させ、発現された融合タンパク質を抗体分子とほぼ同様に集合させて、その際、Ｆｃ部分間に鎖間ジスルフィド結合が形成されるのを可能にして、二量体を生じることによって、作製可能である。
【０１９１】
用語「Ｆｃポリペプチド」には、本明細書において、抗体のＦｃ領域由来のポリペプチドの天然型及び突然変異タンパク質型が含まれる。二量体化を促進するヒンジ領域を含有する、こうしたポリペプチドの一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）型もまた含まれる。Ｆｃ部分（及びそこから形成されるオリゴマー）を含む融合タンパク質は、プロテインＡ又はプロテインＧカラム上のアフィニティクロマトグラフィーによって精製が容易であるという利点を提供する。
【０１９２】
国際公開出願ＷＯ９３／１０１５１並びに米国特許第５，４２６，０４８号及び第５，２６２，５２２号に記載される別の有用なＦｃポリペプチドは、Ｎ末端ヒンジ領域からヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域の天然Ｃ末端へと延在する一本鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第５，４５７，０３５号及びＢａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：３９９２−４００１に記載されているＦｃ突然変異タンパク質である。この突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化し、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化し、かつ、アミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化していることを除けば、ＷＯ９３／１０１５１に示される天然Ｆｃ配列のものと同一である。この突然変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対し、減少したアフィニティを示す。
【０１９３】
他の実施形態において、本明細書に開示されているものなど、抗原結合タンパク質の重鎖及び／又は軽鎖の可変部分を、抗体重鎖及び／又は軽鎖の可変部分に対して置換してもよい。
【０１９４】
あるいは、オリゴマーは、ペプチドリンカーを含むか又は含まない（スペーサーペプチド）、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する多数の抗原結合タンパク質を含む融合タンパク質である。好適なペプチドリンカーの中には、米国特許第４，７５１，１８０号及び第４，９３５，２３３号に記載されるものがある。
【０１９５】
ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗原結合タンパク質を含むオリゴマー性誘導体を調製する別の方法は、ロイシンジッパーの使用を伴う。ロイシンジッパードメインは、このドメインが見られるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、元来、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質で同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｔｚら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１７５９−６４）、以来、多様な異なるタンパク質で発見されてきた。既知のロイシンジッパーの中には、二量体化又は三量体化する天然存在ペプチド及びその誘導体がある。可溶性オリゴマー性タンパク質を産生するのに適したロイシンジッパードメインの例が、本明細書に援用される、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／１０３０８に記載され、肺界面活性タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーが、Ｈｏｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ，（１９９４），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４４：１９１に記載される。融合された異種タンパク質の安定な三量体化を可能にする、修飾ロイシンジッパーの使用が、Ｆａｎｓｌｏｗら，１９９４，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７−７８に記載される。１つのアプローチでは、特異的にＰＣＳＫ９に結合する抗原結合タンパク質フラグメント又は誘導体を含む組換え融合タンパク質をロイシンジッパーペプチドに融合させて、好適な宿主細胞に発現させて、形成される可溶性オリゴマー性抗原結合タンパク質フラグメント又は誘導体を、培養上清から回収する。
【０１９６】
ある実施形態では、抗原結合タンパク質は、１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２５ｎＭ又は５０ｎＭ未満のＫＤ（平衡結合親和性）を有する。
【０１９７】
別の態様において、本開示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで（例えばヒト対象に投与したとき）、少なくとも１日の半減期を有する抗原結合タンパク質を提供する。１つの実施形態において、抗原結合タンパク質は、少なくとも３日の半減期を有する。別の実施形態において、抗体又はその部分は、４日以上の半減期を有する。別の実施形態において、抗体又はその部分は、８日以上の半減期を有する。別の実施形態において、抗体又はその部分は、１０日以上の半減期を有する。別の実施形態において、抗体又はその部分は、１１日以上の半減期を有する。別の実施形態において、抗体又はその部分は、１５日以上の半減期を有する。別の実施形態では、非誘導体化又は非修飾抗体と比較した際、より長い半減期を有するように、抗体又はその抗原結合部分を誘導体化するか又は修飾する。別の実施形態では、ＰＣＳＫ９に特異的に結合される抗原結合タンパク質は、本明細書に援用される、２０００年２月２４日公開のＷＯ００／０９５６０に記載されるような、血清半減期を増加させる点突然変異を含有する。
グリコシル化
【０１９８】
ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、天然種で発見されるものとは異なる又は変えられたグリコシル化パターンを有し得る。本分野で公知なように、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、以下に記述するとおり、特定のグリコシル化アミノ酸残基の有無）若しくは宿主細胞又はタンパク質が産生される生命体に依存し得る。特定の発現系については、以下に記述する。
【０１９９】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的に、Ｎ−結合又はＯ−結合のいずれかである。Ｎ−結合とは、炭水化物部分がアスパラギン残基の側鎖に接着することを意味する。トリ−ペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素的接着の認識配列である。したがって、これらのトリ−ペプチド配列のいずれかが存在することにより、潜在的グリコシル化部位が産生される。Ｏ−結合グリコシル化は、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースのうちの１つの糖のヒドロキシアミノ酸、最も一般的には、セリン又はスレオニンへ接着を意味するが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンも使用され得る。
【０２００】
アミノ酸配列が改変されることによって、都合よく、１つ以上の上記のトリ−ペプチド配列（Ｎ−結合型グリコシル化部位）を含むように、グリコシル化部位の抗原結合タンパク質への付加が得られる。また、１つ以上のセリン残基又はスレオニン残基の開始配列への付加又は置換（Ｏ−結合型グリコシル化部位）によって改変が行われ得る。容易にするため、抗原結合タンパク質アミノ酸配列を、ＤＮＡレベルでの変化を通じて改変してもよく、特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成するように、あらかじめ選択された塩基で標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを突然変異させることによってもよい。
【０２０１】
抗原結合タンパク質上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、タンパク質に対するグリコシドの化学的又は酵素的カップリングによる。これらの方法は、Ｎ及びＯ結合グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞におけるタンパク質の産生を必要としない点で、有利である。用いるカップリング様式に応じて、糖（複数可）を、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離（ｆｒｅｅ）カルボキシル基、（ｃ）システインのものなどの、遊離スルフィドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン、又はヒドロキシプロリンのものなどの、遊離遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、又はトリプトファンのものなどの、芳香族残基、あるいは（ｆ）グルタミンのアミド基に付着させてもよい。これらの方法は、ＷＯ８７／０５３３０及びＡｐｌｉｎ  ＆  Ｗｒｉｓｔｏｎ，（１９８１）ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １０：２５９−３０６に記載される。
【０２０２】
出発抗原結合タンパク質上に存在する炭水化物部分の除去を化学的又は酵素的に達成してもよい。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸又は同等の化合物へのタンパク質の曝露を必要とする。この処理は、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン）を除く、大部分の又はすべての糖の切断を生じる一方、ポリペプチドを損なわれない状態とする。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７），Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２−５７及びＥｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８１），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１−３７によって記載される。Ｔｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７），Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０−５９に記載されるように、多様なエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用によって、ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断を達成してもよい。潜在的なグリコシル化部位でのグリコシル化は、Ｄｕｓｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３１０５−０９に記載されるように、化合物ツニカマイシンの使用によって防止され得る。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド連結の形成を遮断する。
【０２０３】
したがって、本開示の態様としては、親ポリペプチドのアミノ酸配列に比較して、グリコシル化部位（複数可）の数及び／又はタイプが改変されている、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗原結合タンパク質のグリコシル化変異体が挙げられる。特定の実施形態において、抗原結合タンパク質変異体は、天然抗体よりも、より多数又はより少数のＮ−結合グリコシル化部位を含む。Ｎ−結合グリコシル化部位は、以下の配列によって特徴付けられる。Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（アミノ酸残基は、Ｘとし、プロリンを除く任意のアミノ酸残基であってもよい）。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換により、Ｎ−結合炭水化物鎖の付加のための潜在的新規部位が提供される。あるいは、この配列を除去するか又は改変する置換は、天然ポリペプチド中に存在するＮ結合炭水化物鎖の付加を防止するであろう。例えば、Ａｓｎの欠失によって、又はＡｓｎを異なるアミノ酸で置換することによって、グリコシル化を減少させてもよい。他の実施形態では、１つ以上の新規Ｎ−結合部位が作製される。抗体は、典型的には、Ｆｃ領域中にＮ結合グリコシル化部位を有する。
標識及びエフェクター基
【０２０４】
いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、１つ以上の標識を含み得る。用語「標識基」又は「標識」は、任意の検出可能標識を指す。好適な標識基の例としては、限定されるわけではないが、以下：放射性同位体又は放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光基（例えばＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド・リン光体（ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｓ））、酵素基（例えば西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基、又は二次レポーターに認識されることがあらかじめ決定されているポリペプチドエピトープ（例えばロイシンジッパー対配列、二次抗体結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、多様な長さのスペーサーアームを介して抗原結合タンパク質に標識基をカップリングさせて、潜在的な立体障害を減少させる。多様なタンパク質標識方法が当該技術分野において周知であり、適切であると考えられるため、こうした方法を用いてもよい。
【０２０５】
用語「エフェクター基」は、細胞傷害性剤として作用する、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗原結合タンパク質にカップリングした任意の基を意味する。好適なエフェクター基の例としては、放射性同位体又は放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）が挙げられる。他の好適な基としては、毒素、治療基又は化学治療基が挙げられる。好適な基の例としては、カリケアマイシン、アウリスタチン、ゲルダナマイシン及びカンタンシン（ｃａｎｔａｎｓｉｎｅ）が含まれる。いくつかの実施形態では、多様な長さのスペーサーアームを介して抗原結合タンパク質にエフェクター基をカップリングさせて、潜在的な立体障害を減少させる。
【０２０６】
一般的に、標識は、それらが検出されるべきアッセイに応じて、多様なクラスに属する：ａ）放射性であっても又は重同位体であってもよい、同位体標識；ｂ）磁気標識（例えば磁気粒子）；ｃ）レドックス活性部分；ｄ）光学的色素；酵素基（例えば西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；ｅ）ビオチン化基；及びｆ）二次レポーターによって認識される、あらかじめ決定されたポリペプチドエピトープ（例えばロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ等）。いくつかの実施形態では、多様な長さのスペーサーアームを介して抗原結合タンパク質に標識基をカップリングさせて、潜在的な立体障害を減少させる。当該技術分野において、多様なタンパク質標識方法が公知である。
【０２０７】
特定の標識としては、これに限定するものではないが、発色団、リン光体及び蛍光体が挙げられ、後者は多くの場合、特異的である、光学色素を含む。蛍光体は、「低分子」蛍光体又はタンパク質様蛍光体のいずれであってもよい。
【０２０８】
「蛍光標識」によることは、その固有の蛍光特性を介して検出し得る任意の分子を意味する。好適な蛍光標識としては、これに限定するものではないが、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリトロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラカイトグリーン（Ｍａｌａｃｉｔｅ  ｇｒｅｅｎ）、スチルベン、ルシファーイエロー（Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ）、カスケードブルー（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＬＣ  Ｒｅｄ  ６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣ  Ｒｅｄ  ７０５、オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ  ｇｒｅｅｎ）、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０）、カスケードブルー（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ）、カスケードイエロー（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ）及びＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ＦＩＴＣ、ローダミン及びテキサスレッド（Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，  ＰＡ）が挙げられる。蛍光体など、好適な光学染色については、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄによる１９９８  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ及びその後の版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  １１ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｐｅｎｃｅ  （ｅｄｓ））に記載されており、これは本明細書中で参考として明確に援用される。
【０２０９】
好適なタンパク質様蛍光体標識は、これに限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質、Ｒｅｎｉｌｌａ、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ又はＡｅｑｕｏｒｅａ種由来ＧＦＰ（Ｃｈａｌｆｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：８０２−８０５）、ｅＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ．，  Ｉｎｃ．，  Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ５５７６２）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ，  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｑｕｅｂｅｃ，  Ｃａｎａｄａ；  Ｓｔａｕｂｅｒ，  （１９９８）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４：４６２−７１；  Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）  Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８−８２）、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ，  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ．，  Ｉｎｃ．）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５４０８−１７）、β−ガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２６０３−０７）及びＲｅｎｉｌｌａ（ＷＯ９２／１５６７３，ＷＯ９５／０７４６３，ＷＯ９８／１４６０５，ＷＯ９８／２６２７７，ＷＯ９９／４９０１９，米国特許第５２９２６５８号、同第５４１８１５５号、同第５６８３８８８号、同第５７４１６６８号、同第５７７７０７９号、同第５８０４３８７号、同第５８７４３０４号、同第５８７６９９５号及び同第５９２５５５８号）が挙げられる。
抗原結合タンパク質の調整
【０２１０】
提供される非−ヒト抗体は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ロバ又は非−ヒト霊長類（サルなど、（例えば、カニクイザル又はアカゲザル）若しくは類人猿（例えば、チンパンジー））など、任意の抗体−産生動物由来であってもよい。が提供される。非−ヒト抗体は、抗体に対する免疫応答が発生しないか、又は重要でない場合、防止できる場合、関係していない場合、又は所望の場合、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養及び細胞培養を用いた適用においても使用可能である。ある種の実施形態にて抗体は、アミノ酸配列番号２の３１〜６９２のアミノ酸を含む組換え自己開裂成熟内分泌ＰＣＳＫ９により免疫化することによって又は、全長ＰＣＳＫ９、又はＰＣＳＫ９を発現させる全細胞、又はＰＣＳＫ９を発現している細胞から調整されたメンブレン、又はＦｃに融合された融合タンパク質（例えば、ＰＣＳＫ９含有Ｆｃ融合（又はその細胞外ドメイン）、および当業者に周知の他の方法（例えば、本明細書の実施例に示すとおり）によって、作製することができる。あるいは、特定の非−ヒト抗体は、本明細書で提供された特定の抗体が結合する一部のエピトープを形成するセグメントＰＣＳＫ９であるアミノ酸により免疫化することによって、生育させることができる。抗体は、多クローン体、モノクローン体であってもよく、又は、組み換えＤＮＡを発現させることによって、宿主細胞中で合成されてもい。
【０２１１】
完全ヒト抗体は、上述のとおり、ヒト免疫グロブリン遺伝子座含有トランスジェニック動物を免疫化することによって、又は、ヒト抗体レパートリーを発現させるファージディスプレイ技術を選択することによって、調整され得る。
【０２１２】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体方法論（例えば、ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｏｆ  Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−９７）など、様々な技術で作成することができる。あるいは、例えば、Ｂ−リンパ球のウイルス性又は発癌性形質転換など、モノクローナル抗体を作製する他の技術を使用してもよい。ハイブリドーマの調製に好適な動物系の１つは、マウス系であり、確実に構築された手順である。免疫付与プロトコール及び免疫化脾細胞の単離技術は、当技術分野において既知である。こうした手順については、免疫化マウスのＢ細胞を好適な不死化する融合パートナー（マウス骨髄腫細胞株など）と融合させる。その上、所望であれば、ラット又は他の哺乳動物は、マウスの代わりに免疫化することができ、こうした動物のＢ細胞は、マウス骨髄腫細胞株と融合して、ハイブリドーマを形成することができる。あるいは、マウス以外の発生源の骨髄腫細胞株を使用することもできる。ハイブリドーマを作製する融合手順も周知である。また、ＳＬＡＭ技術を抗体の作製に使用することもできる。
【０２１３】
アミノ酸架橋（短いペプチドリンカー）を介して重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン（Ｆｖ領域）フラグメントを結合することによって提供される一本鎖抗体を形成することもでき、それによって、一本鎖ポリペプチド鎖が形成される。このような一本鎖（ｓｃＦｖ）は、２つの可変ドメインポリペプチド（ＶＬ及びＶＨ）をコードするＤＮＡ間で、ペプチドリンカーをコードするＤＮＡの融合によって、調製することができる。得られたポリペプチドは、それ自体で折り畳み、抗原結合ポリマーを形成することができるか、又は２つの可変ドメイン間の柔軟なリンカーの長さに応じて、多量体（例えば、二量体、三量体又は四量体）を形成することができる（Ｋｏｒｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）  Ｐｒｏｔ．  Ｅｎｇ．  １０：４２３；  Ｋｏｒｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｅｎｇ．  １８：９５−１０８）。異なるＶＬ及びＶＨ−含有ポリペプチドを組み合わせることによって、異なるエピトープに結合する多量体ｓｃＦｖｓを形成することができる（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）  Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：３１−４０）。一本鎖抗体の作製のために開発された技術としては、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−２６；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５８７９−８３；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−４６，  ｄｅ  Ｇｒａａｆ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １７８：３７９−３８７に記載されている技術が挙げられる。本明細書で提供された抗体に由来する一本鎖抗体としては、これらに限定されないが、表２に示す重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を組み合わせたもの又は表３〜４及び表６〜２３に示すＣＤＲを含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を組み合わせたものを含むｓｃＦｖが挙げられる。
【０２１４】
１つのサブクラスである本明細書で提供された抗体は、サブクラススイッチング方法を用いて、異なるサブクラスの抗体に改変することができる。したがって、ＩｇＧ抗体は、例えばＩｇＭ抗体から誘導することができ、逆もまた同様である。このような技術により、所与の抗体（親抗体）の抗原結合性質を有するが、抗体アイソタイプ又は親抗体とは異なるサブクラスに関連する生物学的性質を示す新規抗体を調製できる。組み換えＤＮＡ技術を用いることができる。例えば、所望のアイソタイプの抗体の定常ドメインをコードしているＤＮＡなど、特定の抗体ポリペプチドをコードするクローン化ＤＮＡは、こうした手順に適用し得る。例えば、Ｌａｎｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：３０３−１６参照のこと。
【０２１５】
したがって、提供される抗体としては、例えば、所望のアイソタイプを有する（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ及びＩｇＤ）並びにそのＦａｂフラグメント又はＦ（ａｂ’）２フラグメントを有する上述の可変ドメインの組み合わせを含む抗体が挙げられる。さらに、ＩｇＧ４が所望である場合、ヒンジ領域において、点突然変異（例えば、ＣＰＳＣＰからＣＰＰＣＰ（それぞれ、出現順により、配列番号１８２８及び１８２９）への変異）を導入することを所望することも可能であり（参照によって、本明細書に援用されるＢｌｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６：４０７−１５に記載のとおり）、ＩｇＧ４抗体中で、不均質性をもたらし得るＨ鎖間ジスルフィド結合を形成する傾向を低減する。
【０２１６】
さらに、異なる性質を有する抗体を抽出する技術（即ち、結合する抗原の可変親和性を変化させる）は周知である。Ｃｈａｉｎシャフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）とも呼ばれるこうした技術の１つは、糸状バクテリオファージの表面上で免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーをディスプレイすることを含み、多くの場合、ファージディスプレイとも称される。Ｃｈａｉｎシャフリングを使用して、ハプテン２−フェニルオキサゾール−５−オンに対する高親和性抗体を調製してきた（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−８３に記載されているとおり）。
【０２１７】
表２に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域又は表３Ａ及び３Ｂ並びに表４Ａ及び４Ｂ.６〜２３に記載のＣＤＲ（及びコード核酸に対して対応する修飾）に対して、保存的修飾を行い、機能的特性及び生化学的特性を有する抗原結合タンパク質を作製することもできる。このような修飾を得る方法は、本明細書に記載される。
【０２１８】
ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、更に様々な方法で修飾し得る。例えば、治療目的で使用される場合、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）と共役し、血清半減期を延長するか、又はタンパク質送達を増強することができる。ＰＥＧは、直接抗原結合タンパク質に接着することができるか、又は、グリコシド結合などのリンカーを介して接着することができる。
【０２１９】
あるいは、対象抗体又はそのフラグメントのＶ領域を異なる抗体分子のＦｃ領域と融合させることができる。この目的のために使用されるＦｃ領域は、補体に結合しないように修飾することができる。このため、融合タンパク質を治療薬として用いるとき、患者において細胞溶解が引き起こされる可能性を低下させる。さらに、対象抗体又はその機能性フラグメントは、ヒト血清アルブミンと共役し、抗体又はそのフラグメントの血清半減期を改善することができる。抗原結合タンパク質又はこれらのフラグメントの別の有用な融合パートナーは、トランスチレチン（ＴＴＲ）である。ＴＴＲは、四量体を形成する能力を有する。このため、抗体−ＴＴＲ融合タンパク質は、その結合親和力を高める多価抗体を形成することができる。
【０２２０】
あるいは、本明細書に記載される抗原結合タンパク質の機能的特性及び／又は生化学的特性における実質的な修飾は、（ａ）例えば、シート構造又はヘリカル構造などの置換エリアでの分子骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷又は疎水性又は（ｃ）側鎖のかさ高性の維持に及ぼす影響が大幅に異なる重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列での置換を作り出すことによって、達成され得る。「保存的アミノ酸置換」は、その位置のアミノ酸残基の極性又は電荷に対して殆ど又は全く影響が存在しないように、固有のアミノ酸残基を非固有の残基で置換することを含み得る。上表８を参照されたい。さらに、アラニンスキャンニング突然変異導入に対して以前に記載されているように、ポリペプチド中の任意の固有の残基もアラニンで置換され得る。
【０２２１】
対象抗体のアミノ酸置換（保存的であるか、又は非保存的であるかにかかわらず）は、ルーチン技術を適用することによって、当業者によって実施することができる。ある種の実施形態において、本明細書に記載されている抗体の重要な残基を同定するために、又はＰＣＳＫ９に対する抗体の親和性を増加若しくは減少させるために、又は本明細書に記載の他の抗原結合タンパク質の結合親和性を変化させるために、アミノ酸置換を使用することができる。
抗原結合タンパク質の発現方法
【０２２２】
また、上記のように少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、発現ベクター、転写又は発現カセットの形態での発現系及び構造体、並びにこうした発現系又は構造体を含む宿主細胞も本明細書に提供する。
【０２２３】
本明細書で提供される抗原結合タンパク質は、いくつかの任意の従来技術によって調製することができる。例えば、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、当該技術分野において既知の任意の技術を用いて、組換え系によって、作製し得る。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，（Ｋｅｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（１９８０）及び継続版；及び上述のＨａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ（１９８８）を参照されたい。
【０２２４】
抗原結合タンパク質は、ハイブリドーマ細胞株（例えば、特に、抗体は、ハイブリドーマ内で発現し得る）又はハイブリドーマ以外の細胞株において発現させることができる。抗体をコードする発現構造体を使用して哺乳類、昆虫又は微生物宿主細胞を形質転換することができる。形質転換は、国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号及び同第４，９５９，４５５号によって例示されているように、例えば、ポリヌクレオチドをウイルス中又はバクテリオファージ中にパッケージし、米本分野において公知の形質移入手法によって、宿主細胞を構造体で形質導入することなど、宿主細胞中にポリヌクレオチドを導入するための任意の公知の方法により行い得る。最適な形質転換手法は、形質転換されるべき宿主の種類に依存し得る。哺乳動物細胞中に異種のポリヌクレオチドを導入するための方法は本分野において周知であり、デキストランによって媒介される形質移入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレンによって媒介される形質移入、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソーム中のポリヌクレオチド（複数可）の封入化、核酸と正電荷脂質との混合及びＤＮＡの核内への直接的微小注入が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２５】
組換え発現構造体は、典型的には、本明細書で提供される以下の１つ以上のＣＤＲの１つ以上を含むポリペプチドをコードする核酸分子を含む。軽鎖定常領域、軽鎖可変領域、重鎖定常領域（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２及び／又はＣＨ３）及び／又は抗原結合タンパク質の別のスカフォールド部分。これらの核酸配列は、標準ライゲーション方法を用いて、適切な発現ベクターに挿入される。一実施形態では、重鎖又は軽鎖定常領域は、抗ＰＣＳＫ９特異的重鎖又は軽鎖可変領域のＣ末端に付属し、発現ベクター内にライゲーションされる。ベクターは、典型的には、使用される特定の宿主細胞において機能的となるように選択される（すなわち、ベクターは、宿主細胞内機構と共生可能であり、これにより、遺伝子の増幅及び／又は発現が可能になる）。いくつかの実施形態では、ジヒドロ葉酸還元酵素などのタンパク質レポーターを用いて、タンパク質−フラグメント相補性アッセイによるベクターを使用する（参照によって本明細書に援用される、例えば、米国特許第６，２７０，９６４号を参照されたい）。好適な発現ベクターは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ又はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入することができる。抗体及びフラグメントのクローン化及び発現に有用な他のベクターとしては、参照によって本明細書に援用される、Ｂｉａｎｃｈｉ  ａｎｄ  ＭｃＧｒｅｗ，（２００３）Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８４：４３９−４４に記載されているものが挙げられる。更なる好適な発現ベクターは、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ｖｏｌ．１８５，（Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄ．），（１９９０），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【０２２６】
典型的には、任意の宿主細胞中で使用される発現ベクターは、プラスミド保持及び外因性クレオチド配列のクローン化及び発現のための配列を含むことになる。ある実施形態では、このような配列は、まとめて「フランキング配列」と称し、典型的には、１つ以上の以下のヌクレオチド配列を含む。プロモータ−、１つ以上のエンハンサー配列、複製発生源、転写終結配列、供与体及び受容体スプライシング部位を含む競合イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列コード配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、ポリペプチドを発現させるようにコードする核酸を挿入するポリリンカー領域及び選択性マーカーエレメント。
【０２２７】
任意により、発現ベクターは、「タグ」−コード配列を含有することができる。即ち、抗原結合タンパク質コード配列の５’末端又は３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子、オリゴヌクレオチド配列は、ｐｏｌｙＨｉｓ（ｈｅｘａＨｉｓ、ＨＨＨＨＨＨ（配列番号：７２など）又はＦＬＡＧ、ＨＡ（ヘマグルチニンインフルエンザウイルス）又はｍｙｃなど他の「タグ」をコードし、入手可能な抗体が存在する。このタグは、典型的には、ポリペプチド発現時に、ポリペプチドに融合され、親和性精製手段又は検出手段又は宿主細胞からの抗原結合タンパク質検出手段として機能し得る。親和性精製は、例えば、タグに対する親和性マトリックスとして抗体を使用して、カラムクロマトグラフィーによって実施することができる。任意により、タグは、開裂用に特定のペプチダーゼを用いるなど、様々な手段によって、実質的に精製された抗原結合タンパク質から除去し得る。
【０２２８】
フランキング配列は、相同（即ち、宿主細胞と同じ種及び／又は細胞株より）、異種（すなわち、宿主細胞種以外の種又は細胞株）、ハイブリッド（すなわち１２つ以上の源のフランキング配列を組み合わせたもの）、合成又は未変性であり得る。このように、フランキング配列源は、任意の原核生物又は真核生物、任意の脊椎動物又は無脊椎動物若しくは任意の植物であってもよく、フランキング配列は、宿主細胞機構内で機能的であり、また、宿主細胞機構内によって活性化され得るものとする。
【０２２９】
ベクターにおいて有用なフランキング配列は、当該技術分野において周知の任意のいくつかの方法によって得ることができる。典型的には、本明細書で有用なフランキング配列は、マッピング及び／又は制限エンドヌクレアーゼの消化によってあらかじめ同定しており、このため、この配列を適切な組織源から適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、単離させることができる。場合によっては、フランキング配列の全ヌクレオチド配列を知ることができる。本明細書では、フランキング配列は、本明細書記載の核酸合成方法又はクローン化方法により合成することができる。
【０２３０】
フランキング配列の全て又はほんの一部がわかっている場合は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、及び／又はオリゴヌクレオチド及び／又は同種又は別の種のフランキング配列フラグメントなど、好適なプローブを用いるゲノムライブラリーのスクリーニングにより得ることができる。フランキング配列が不明である場合、フランキング配列含有ＤＮＡフラグメントは、例えば、コード配列又は更に別の遺伝子（複数可）を含み得る大きい片のＤＮＡから単離することができる。制限エンドヌクレアーゼ消化によって単離を行って、適切なＤＮＡフラグメントを産生し、その後、アガロースゲル精製、カラムクロマトグラフィー又は当該分野で周知の他の方法によって単離することができる。この目的を果たす好適な酵素を選択することは、当業者にとって容易に明かであろう。
【０２３１】
複製源は、典型的には、購入した原核発現ベクターの一部であり、その複製源は、宿主細胞内でのベクターの増幅に役立つ。選択したベクターが、複製源部位を含まない場合、既知の配列に基づいて化学的合成を行い、ベクター中にライゲーションすることができる。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２の複製源（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｊ０１７４９，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）は、好適であり、様々なウイルス源（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎（ＶＳＶ）又はＨＰＶ又はＢＰＶなどの乳頭腫ウイルス）は、哺乳類細胞内のベクターをクローン化するのに有用である。一般に、複製成分源は、哺乳類発現ベクターである必要はない。（例えば、、ＳＶ４０源がよく用いられるのは単にそれがウイルス初期プロモータも含むためである）。
【０２３２】
転写末端配列は、典型的には、３’からポリペプチドコード領域端部に位置し、転写の終結のために機能する。通常、原核細胞中の転写末端配列は、Ｇ−Ｃリッチフラグメントであり、それにポリ−Ｔ配列が続く。配列がライブラリーから容易にクローン化されるか、又はベクター部分として市販で購入され、本明細書に記載のものなどの核酸合成方法を用いて、容易に合成され得る。
【０２３３】
選択マーカー遺伝子は、選択的培地培養液中で発育する宿主細胞の生存及び発育に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、以下のようなタンパク質をコードする。（ａ）抗菌性又は他の毒素（例えば、原核宿主細胞については、アンピシリン、テトラサイクリン又はカナマイシン）に対して耐性を付与するタンパク質、（ｂ）細胞の栄養要求性欠損（ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ）を補完するタンパク質、又は（ｃ）複合培地又は確定培地からは入手できない必須栄養素を供給するタンパク質。特定の選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。有利なことに、原核宿主細胞及び真核宿主細胞をいずれも選択する場合に、ネオマイシン耐性遺伝子も使用可能である。
【０２３４】
その他の選択可能遺伝子を使用して、発現される遺伝子の増幅を行ってもよい。増幅とは、発育又は細胞生存に必須であるタンパク質の産生に必要な遺伝子が組換え細胞の継続的世代の染色体内で縦一列になって繰り返される工程である。哺乳類細胞の好適な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）及びプロモーターを持たないチミジンキナーゼ遺伝子が挙げられる。哺乳類細胞の形質転換体は、形質転換体のみ独自に適合させて、ベクター内に存在する選択遺伝子によって生存させる淘汰圧下に配置される。培地中の選択剤の濃度が連続して上昇し、これによって、選択制遺伝子及びＰＣＳＫ９に結合する抗原結合タンパク質など、他の遺伝子をコードするＤＮＡをいずれも増幅する条件下で、形質転換細胞の培養によって淘汰圧がかかる。その結果、抗原結合タンパク質など、増量するポリペプチドを増幅ＤＮＡより合成する。
【０２３５】
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳の開始に必要であり、シャイン・ダルガノ配列（原核生物）又はコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。エレメントは、典型的には、３’〜プロモーター及び５’〜発現されるポリペプチドのコード配列に位置する。
【０２３６】
真核宿主細胞発現系においてグリコシル化が所望されるなど、場合によっては、様々なプレ配列又はプロ配列を処理して、グリコシル化又は収率を改善することができる。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ開裂部位を改変することができるか、又はプロ配列を付加することができ、これは、また、グリコシル化にも影響を与え得る。最終タンパク質産物は、−１位置（成熟タンパク質の第１のアミノ酸に対して）に、発現への、すべてが除去されていない可能性のある１つ以上の更なるアミノ酸付随物を有し得る。例えば、最終タンパク質産物は、ペプチダーゼ開裂部位で見られ、アミノ末端基に接着する１つ又は２つのアミノ酸残基を有し得る。あるいは、酵素は、成熟ポリペプチド内のこうしたエリアで切断する場合、いくつかの酵素開裂部位の使用により、所望のポリペプチドがわずかに切断している型となり得る。
【０２３７】
発現及びクローニングは、典型的には、宿主生物によって認識され、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗原結合タンパク質をコードする分子に作動可能に連結されるプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する構造遺伝子（一般に、約１００〜１０００ｂｐ内）の開始コドンに対して、上流（即ち、５’）に位置する未転写配列である。プロモーターは、従来２つのうちの１つのクラスに分類される（誘導性プロモーター及び構成性プロモーター）。誘導性プロモーターにより、栄養素の有無又は温度の変化など、培養条件下で若干の変化に応答して、制御下において、ＤＮＡからの転写レベルの増加が開始される。その一方で、構成性プロモーターは、遺伝子発現の制御をほとんど又はまったくすることなく、操作可能に連結される遺伝子を均一に転写する。種々の潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターは、公知である。制限酵素の消化及び所望のプロモーター配列をベクターに挿入することによって、好適なプロモーターは、ソースＤＮＡからプロモーターを除去することで、抗原結合タンパク質を含む重鎖又は軽鎖をエンコードするＤＮＡに操作可能に連結される。
【０２３８】
イースト宿主と共に用いるための好適なプロモーターは、当該技術分野において公知である。イーストエンハンサーは、有利にも、イーストプロモーターと共に使用される。哺乳類動物宿主細胞と共に使用するための好適なプロモーターは周知であり、これに限定されないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスとシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）など、ウイルスのゲノムから得られたものが挙げられる。他の好適な哺乳類動物プロモーターとしては、例えば、熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターなど、非相同哺乳類動物プロモーターが挙げられる。
【０２３９】
目的の更なるプロモーターとしては、これに限定するものではないが、ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ  ＆  Ｃｈａｍｂｏｎ，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）；  ＣＭＶプロモーター（Ｔｈｏｒｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６５９−６６３）；  ニワトリ肉腫ウイルスの３’長端繰り返しに含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−９７）；  ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−４５）；  メタロチオネイン遺伝子のプロモーター及び制御配列（Ｐｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）；  およびβ−ラクタマーゼプロモーターなどの原核プロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７５：３７２７−３１）；又はｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）。目的は、組織特異性を示し、トランスジェニック動物においてにて利用されてきた以下の動物の転写制御領域であって、  膵腺房細胞において活性なエラスターゼI遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）  Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−４６；Ｏｒｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｂｉｏｌ．  ５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，（１９８７）  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−２２）；リンパ球様細胞中で活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−５８；  Ａｄａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−３８；  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−４４）；精巣、胸、リンパ球及び肥満細胞において活性なマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−９５）；肝臓中で活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−７６）；肝臓中で活性なα−胎児−タンパク質遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．５：１６３９−４８；Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：５３−５８）；肝臓中で活性なα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．  １：１６１−７１）；骨髄性細胞で活性なβ-グロビン遺伝子制御領域  （Ｍｏｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−４０；Ｋｏｌｌｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９���）；脳の乏突起神経膠芽細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域  （Ｒｅａｄｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−１２）；骨格筋で活性なミオシン軽鎖-２遺伝子制御領域  （Ｓａｎｉ，（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１４：２８３−８６）；及び視床下部で活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域  （Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−７８）。
【０２４０】
エンハンサー配列は、ベクターに挿入して、高位の真核生物（例えば、ＰＣＳＫ９に特異的に結合するヒト抗原結合タンパク質）によって、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗原結合タンパク質を含むＤＮＡコード軽鎖又は重鎖の転写を増加させることができる。エンハンサーは、通常、長さ約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス−作用エレメントであり、プロモーターに作用し、転写を増加させる。エンハンサーは、比較的配向及び位置非依存性であり、転写単位対して、位置５’及び３’の双方で発見されている。哺乳類遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列は、既知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アフブミン、α−胎児−タンパク質及びインスリン）。しかし、典型的には、ウイルスのエンハンサーが使用される。当該技術分野において公知のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーは、真核プロモーターを活性化する例示的促進エレメントである。エンハンサーは、コード配列に対して、ベクター内の５’又は３’のいずれかに位置することができるが、典型的には、プロモーターから５’の位置に配置される。適切な天然又は非相同シグナル配列（リーダー配列又はシグナルペプチド）をコードする配列は、発現ベクターに組み込み、抗体の細胞外分泌を促進することができる。シグナルペプチド又はリーダーの選択は、抗体が産生される宿主細胞のタイプに依存し、非相同シグナル配列は、天然シグナル配列に置き換えることができる。哺乳類の宿主細胞において機能的であるシグナルペプチドの例としては、以下のものが挙げられる。米国特許第４，９６５，１９５号に記載のインターロイキン−７（ＩＬ−７）；Ｃｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８−７１に記載のインターロイキン−２  受容体のシグナル配列；ＥＰ特許第０３６７５６６号に記載されているインターロイキン−４受容体；米国特許第４，９６８，６０７号に記載のタイプＩインターロイキン−１受容体シグナルペプチド；ＥＰ特許第０４６０８４６号に記載のタイプＩＩインターロイキン−１受容体シグナルペプチド。
【０２４１】
発現ベクターは、市販のベクターなど、開始ベクターから構築され得る。このようなベクターは、必須ではないが、所望のフランキング配列をすべて含有し得る。１つ以上のフランキング配列がすでにベクター中に存在しない場合、個別に入手し、ベクター内にライゲーションすることができる。各フランキング配列を得るのに使用される方法は、当該技術分野において周知である。
【０２４２】
ベクターが構築され、核酸分子コード軽鎖、重鎖又はＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗原結合タンパク質を含む軽鎖及び重鎖は、ベクターの適切な部位に挿入され、増幅及び／又はポリペプチドの発現のために、完全ベクターは、好適な宿主細胞内に挿入され得る。選択された宿主細胞への抗原結合タンパク質の発現ベクターの形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション又は他の既知の方法など、既知の方法によって達成することができる。選択された方法は、一部、使用される宿主細胞の種類の機能となる。これらの方法及び他の好適な方法は、当事者に周知であり、例えば、上記、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）に記載されている。
【０２４３】
適切な条件下で培養すると、宿主細胞は、その後に培地培養液から採取できるか、（宿主細胞が培地に分泌した場合）又は直接産生する宿主細胞から（分泌されない場合）抗原結合タンパク質を合成する。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性（グリコシル化又はリン酸化反応など）に望ましい又は必要であるポリペプチド修飾、生物学的に活性な分子への折り畳の容易性など、様々な要因によって異なるであろう。
【０２４４】
宿主細胞として発現に利用できる哺乳類動物細胞株は、当該分野にて公知であり、これらに限定されないが、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な免疫化細胞株が挙げられ、また、これらに限定されないが、ＨｅＬａ細胞、ヒト胚性腎２９３細胞（ＨＥＫ２９３細胞）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、仔ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）及び多くの他の細胞株が挙げられる。ある実施形態では、いずれの細胞株が高い発現レベルを有するかを決定することによって、細胞株を選択することができ、構造的に、所望の結合特性（例えば、ＰＣＳＫ９に結合する能力）を有する抗原結合タンパク質を産生することができる。別の実施形態では、自身の抗体を産生しないが、非相同抗体を産生し、分泌する能力を有するＢ細胞系譜の細胞株を選択し得る。また、ＬＤＬＲに結合するＰＣＳＫ９を阻害する能力により、選択基準が形成される。
診断及び治療を目的とした抗原結合タンパク質の使用
【０２４５】
ある種の事例において、ＰＣＳＫ９活性は、多数のヒトの病状と相関する。例えば、ある種の事例において、高すぎるＰＣＳＫ９活性は、高コレステロール血症などのある種の症状と相関する。したがって、ある種の事例において、ＰＣＳＫ９活性を調節することは治療的に有用であり得る。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する中和的抗原結合タンパク質は、少なくとも１つのＰＣＳＫ９活性（例えば、ＬＤＬＲへの結合）を調節するために使用される。このような方法は、上昇した血清コレステロールレベルと関連する、又は上昇したコレステロールレベルが関連する疾患を治療し、及び／又は予防し、及び／又は疾患のリスクを低減することができる。
【０２４６】
当業者によって理解されるように、本開示に照らして、変動したコレステロール、ＬＤＬ又はＬＤＬＲレベルと関連し、変動したコレステロール、ＬＤＬ又はＬＤＬＲレベルを伴い、又は変動したコレステロール、ＬＤＬ又はＬＤＬＲレベルによって影響を受け得る疾患は、抗原結合タンパク質の様々な実施形態によって対処することができる。いくつかの実施形態において、（「血清コレステロール関連疾患」を含む）「コレステロール関連疾患」には、例えば、上昇した総血清コレステロール、上昇したＬＤＬ、上昇したトリグリセリド、上昇したＶＬＤＬ及び／又は低ＨＤＬを呈し得る以下のもの：高コレステロール血症、心臓病、メタボリックシンドローム、糖尿病、冠状動脈性心臓病、卒中、心血管疾患、アルツハイマー病及び脂質異常症全般の何れか１つ又はそれ以上が含まれる。単独での、又は１つ若しくはそれ以上の他の薬剤と組み合わせたＡＢＰを用いて治療することができる原発性及び続発性脂肪異常症のいくつかの非限定的な例には、メタボリックシンドローム、糖尿病、家族性複合型高脂血症、家族性高トリグリセリド血症、家族性高コレステロール血症（ヘテロ接合型高コレステロール血症、ホモ接合型高コレステロール血症、家族性アポリポタンパク質Ｂ−１００欠損；、多遺伝子性高コレステロール血症；レムナント除去病（ｒｅｍｎａｎｔ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）、肝リパーゼ欠乏症、；以下のもの：暴食、甲状腺機能低下症、エストロゲン及びプロゲスチン療法を含む薬物、β遮断薬及びチアジド利尿薬；ネフローゼ症候群、慢性腎不全、クッシング症候群、原発性胆汁性肝硬変、糖原病、肝癌、胆汁鬱滞、先端巨大症、膵島細胞腫、成長ホルモン単独欠損症ｍＴＯＲ阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、ある種の抗うつ剤およびアルコール誘発性高トリグリセリド血症の何れかに続発する脂肪異常症が含まれる。ＡＢＰは、例えば、冠動脈性心臓病、冠動脈疾患、末梢動脈疾患、卒中（虚血性及び出血性）、狭心症又は心血管疾患及び急性冠動脈症候群、心筋梗塞などのアテローム性動脈硬化疾患を予防又は治療する上でも有用であり得る。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、致命的でない心臓発作、致命的な及び致命的でない卒中、心臓手術のある種類、心不全のための入院、心臓病を有する患者における胸部痛及び／又は以前の心臓発作、以前の心臓手術など確立された心臓病のための心血管現象及び／又は閉塞した動脈の徴候を有する胸部痛のリスクを低下させる上で有用である。いくつかの実施形態において、ＡＢＰ及び方法は、再発性の心血管現象のリスクを低下させるために使用することができる。
【０２４７】
当業者に理解されるように、スタチンの使用を通じて一般に対処可能な（治療可能な又は予防可能な）疾病又は疾患にも、抗原結合タンパク質の適用が有益であり得る。さらに、いくつかの実施形態において、増加したＬＤＬＲ発現が有益であり得る疾患又は疾病も、抗原結合タンパク質の様々な実施形態によって治療することができる。さらに、当業者によって理解されるように、抗ＰＣＳＫ９抗体の使用は、糖尿病の治療に特に有用であり得る。糖尿病は冠動脈性心疾患に対するリスク因子であるのみならず、インシュリンはＰＣＳＫ９の発現を増加させる。すなわち、糖尿病を有する人々は、（高いＰＣＳＫ９レベルと関連し得る）上昇した血漿脂質レベルを有し、血漿脂質レベルを低下させることが有益であり得る。これは、Ｃｏｓｔｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（“Ｈｅｐａｔｉｃ  ＰＣＳＫ９  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  Ｎｕｔｉｒｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｔｕｓ  ｖｉａ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｏｌ    Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｒｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １Ｃ”，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１：６２１１−６２１８，２００６）（これらの全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）中にさらに詳しく、一般的に論述されている。
【０２４８】
いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、糖尿病、異常な大動脈瘤、アテローム性動脈硬化症及び／又は末梢血管疾患を有する者に、その血清コレステロールレベルをより安全な範囲まで低下させるために投与される。いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、本明細書中に記載されている疾患の何れかを発症するリスクを有する患者に投与される。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、喫煙し、高血圧を有し、又は若年心臓発作の家族歴を有する対象に投与される。
【０２４９】
いくつかの実施形態において、対象が２００４ＮＣＥＰ治療目標において中程度のリスク又はそれより高いリスクを有する場合に、対象にＡＢＰが投与される。いくつかの実施形態において、対象のＬＤＬコレステロールレベルが１６０ｍｇ／ｄＬより高ければ、ＡＢＰが対象に投与される。いくつかの実施形態において、対象のＬＤＬコレステロールレベルが１３０ｍｇ／ｄｌより高ければ（及び、２００４ＮＣＥＰ治療目標に従って、対象が、中程度のリスク又はやや高いリスクを有すれば）、ＡＢＰが投与される。いくつかの実施形態において、対象のＬＤＬコレステロールレベルが１００ｍｇ／ｄｌより高ければ（及び、２００４ＮＣＥＰ治療目標に従って、対象が、高いリスク又は極めて高いリスクを有すれば）、ＡＢＰが投与される。
【０２５０】
ある患者の個別の特性に応じて、医師は、適切な治療指標及び標的脂質レベルを選択することができる。高脂血症の治療に指針を与えるための十分に受け入れられている１つの基準は、「Ｔｈｉｒｄ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＮＣＥＰ）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｉｇｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ（Ａｄｕｌｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｐａｎｅｌ  ＩＩＩ）」Ｆｉｎａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．０２−５２１５（２００２）であり、その印刷された刊行物の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。
【０２５１】
いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、異常に高いレベル又は正常なレベルからＰＣＳＫ９活性の量を減少させるために使用される。いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、高コレステロール血症を治療若しくは予防するために、並びに／又は高コレステロール血症及び／若しくは他のコレステロール関連疾患（本明細書中に記載されているものなど）に対する医薬の調製において使用される。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９活性が正常である高コレステロール血症などの症状を治療又は予防するために使用される。このような症状において、例えば、正常を下回るＰＣＳＫ９活性の低下は、治療効果を提供することができる。
【０２５２】
いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する１つ以上の抗原結合タンパク質が、ＰＣＳＫ９活性を調節するために使用される。
【０２５３】
ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する１つ又はそれ以上の抗原結合タンパク質の治療的有効量及び別の治療剤を投与することを含む、高コレステロール血症などのコレステロール関連疾患を治療する方法が提供される。
【０２５４】
ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、単独で投与される。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの他の治療剤の投与前に投与される。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの他の治療剤の投与と同時に投与される。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの他の治療剤の投与後に投与される。他の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの他の治療剤の投与前に投与される。（抗原結合タンパク質とは別の）治療剤は、少なくとも１つの他のコレステロール降下（血清及び／又は全身コレステロール）剤又は薬剤を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＬＤＬＲの発現を増加させ、血清ＨＤＬレベルを増加させ、ＬＤＬレベルを低下させ、又はトリグリセリドレベルを低下させることが観察されている。典型的な治療剤には、スタチン（アトロバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン）、ニコチン酸（ナイアシン）（ＮＩＡＣＯＲ，Ｎｉａｓｐａｎ（徐放性ナイアシン）、Ｓｌｏ−Ｎｉａｃｉｎ（徐放性ナイアシン））、フィブリン酸（Ｌｏｐｉｄ（ゲムフィブロジル）、Ｔｒｉｃｏｒ（フェノフィブラート）、胆汁酸封鎖剤（Ｑｕｅｓｔｒａｎ（コレスチラミン）、コレセベラム（Ｗｅｌｃｈｏｌ）、Ｃｏｌｅｓｔｉｄ（コレスチポール））、コレステロール吸収阻害剤（Ｚｅｔｉａ（エゼチミブ））、スタチンとニコチン酸の組み合わせ（Ａｄｖｉｃｏｒ（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ及びｎｉａｓｐａｎ）、吸収阻害剤とのスタチンの組み合わせ（Ｖｙｔｏｒｉｎ（Ｚｏｃｏｒ及びＺｅｔｉａ）及び／又は脂質修飾剤が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、ＰＰＡＲγアゴニスト、ＰＰＡＲα／γアゴニスト、スクアレン合成酵素阻害剤、ＣＥＴＰ阻害剤、降圧剤、抗糖尿病薬（スルホニル尿素、インシュリン、ＧＬＰ−１類縁体、ＤＤＰＩＶ阻害剤など）、ＡｐｏＢ調節物質、ＭＴＰ阻害剤及び／又は閉塞性動脈硬化症治療と組み合わされる。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、スタチンのほか、オンコスタチンＭのようなある種のサイトカイン、エストロゲン及び／又はベルベリンなどのある種の植物成分のような、対象中のＬＤＬＲタンパク質のレベルを増加させる薬剤と組み合わされる。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、（ある種の抗精神病薬、ある種のＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、高フルクトース、スクロース、コレステロール又はある種の脂肪酸などの食事要因並びにＲＸＲ、ＲＡＲ、ＬＸＲ、ＦＸＲに対するある種の核受容体アゴニスト及びアンタゴニストなど）、対象中の血清コレステロールレベルを増加させる薬剤と組み合わされる。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、スタチン及び／又はインシュリンなどの、対象中のＰＣＳＫ９のレベルを増加させる薬剤と組み合わされる。２つの組み合わせは、他の薬剤の望ましくない副作用をＡＢＰによって軽減させることを可能とし得る。当業者によって理解されるように、いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、他の薬剤／化合物と組み合わされる。いくつかの実施形態において、ＡＢＰ及び他の薬剤は、同時に投与される。いくつかの実施形態において、ＡＢＰと他の薬剤は同時に投与されず、ＡＢＰは薬剤が投与される前又は後に投与される。いくつかの実施形態において、対象は、同じ予防期間、疾患の発症及び／又は治療の期間の間に、ＡＢＰ及び（ＬＤＬＲのレベルを増加させる）他の薬剤を双方とも服用する。
【０２５５】
本発明の医薬組成物は、併用療法により投与され得る（即ち、他の薬剤と組み合わせて）。ある実施形態では、併用療法には、少なくとも１つの抗−コレステロール剤との組み合わせ中にＰＣＳＫ９の結合が可能な抗原結合タンパク質を含む。薬剤は、これらに限定されないが、合成的にｉｎ  ｖｉｔｒｏ調製された化学化合物、抗体、抗原結合領域及びそれらを組み合わせたもの及びその共役体が挙げられる。ある種の実施形態において、薬剤は、アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリック調節物質又はトキシンとして作用することができる。ある種の実施形態において、薬剤は、その標的（例えば、受容体又は酵素の活性又は阻害）を阻害又は刺激するように作用し、これにより、ＬＤＬＲの増加した発現を促進し、又は血清コレステロールレベルを減少させることができる。
【０２５６】
ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、コレステロール低下（血清及び／又は総コレステロール）剤による治療前、同時に及び後に投与することができる。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、高コレステロール血症、心臓病、糖尿病及び／又は任意のコレステロール関連疾患の発症を予防又は軽減するために、予防的に投与することができる。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、既存の高コレステロール血症症状の治療のために投与することができる。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、疾患及び／又は疾患に伴う症候の発症を遅延させる。いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、コレステロール関連疾患の何れか１つの何れかの症候又はそのサブセットを欠如する対象に提供される。
【０２５７】
ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、高コレステロール血症などの様々なコレステロール関連疾患を治療するための治療剤とともに使用される。ある種の実施形態において、症状及び治療の所望されるレベルに照らして、２つ、３つ又はそれ以上の薬剤を投与することができる。ある種の実施形態において、同じ製剤中に含めることによって、このような薬剤を一緒に提供すことができる。ある種の実施形態において、このような薬剤（複数可）及びＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、同じ製剤中に含めることによって一緒に与えることができる。ある種の実施形態において、このような薬剤は、別々に製剤化し、治療キット中に含めることによって一緒に与えることができる。ある種の実施形態において、このような薬剤及びＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、別々に製剤化し、治療キット中に含めることによって一緒に与えることができる。ある種の実施形態において、このような薬剤は別々に与えることができる。ある種の実施形態において、遺伝子療法によって投与された場合に、タンパク質剤及び／又はＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質をコードする遺伝子を同じベクター中に含めることができる。ある種の実施形態において、タンパク質剤及び／又はＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質をコードする遺伝子は、同じプロモーター領域の調節下であり得る。ある種の実施形態において、タンパク質剤及び／又はＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質をコードする遺伝子は、別々のベクター中に存在し得る。
【０２５８】
ある種の実施形態において、本発明は、医薬として許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤及び／又は補助剤と一緒に、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。
【０２５９】
ある種の実施形態において、本発明は、医薬として許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤及び／又は補助剤と一緒に、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質及び少なくとも１つのさらなる治療剤の治療的有効量を含む医薬組成物を提供する。
【０２６０】
ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの炎症用治療剤とともに使用することができる。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの免疫疾患用治療剤とともに使用することができる。炎症及び免疫疾患用の典型的な治療剤には、シクロオキシゲナーゼ１型（ＣＯＸ−１）及びシクロオキシゲナーゼ２型（ＣＯＸ−２）阻害剤、３８ｋＤａ分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ｐ３８−ＭＡＰＫ）の小分子調節物質、炎症経路に関与している細胞内分子の小分子調節物質（このような細胞内分子が、ｊｎｋ、ＩＫＫ、ＮＦ−κＢ、ＺＡＰ７０及びｌｃｋを含むが、これらに限定されない。）が含まれるが、これらに限定されない。ある種の典型的な炎症用治療剤は、例えば、Ｃ．Ａ．  Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ  ＆  Ｌ．Ｌ．  Ｍｏｌｄａｗｅｒ  Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：Ａ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．  Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，  ＣＡに記載されている。
【０２６１】
ある種の実施形態において、薬剤組成物は、１つ以上の異なる、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む。ある種の実施形態において、医薬組成物は、２以上のエピトープを結合する、１つ以上のＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、様々な抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９への結合に関して、互いと競合しない。いくつかの実施形態において、表１〜４に図示されている任意の抗原結合タンパク質が、医薬組成物中で一緒に組み合わせることができる。
【０２６２】
ある種の実施形態において、許容される製剤材料は、好ましくは、使用される投薬量及び濃度で服用者に対して無毒である。いくつかの実施形態において、製剤材料（複数可）は、皮下及び静脈内投与用である。ある種の実施形態において、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解又は放出、吸着又は浸透を改変し、維持し、又は保持するための製剤材料を含有することができる。ある種の実施形態において、好適な製剤材料には、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンなど）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム）、緩衝液（ボラート、バイカーボナート、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、シトラート、ホスファート又は他の有機酸）；増量剤（マニトール又はグリシンなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖；二糖；及び他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなど）；着色剤、着香剤及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；防腐剤（ベンズアルコニウムクロリド、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マニトール又はソルビトールなど）；懸濁剤；界面活性剤又は湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などのポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパールなど）；安定性増強剤（スクロース又はソルビトールなど）；等張性増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは、塩化ナトリウム又は塩化カリウム、マニトールソルビトールなど）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤及び／又は医薬補助剤が含まれるが、これらに限定されない。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （１９９５）。いくつかの実施形態において、製剤は、ＰＢＳ、２０ｍＭＮａＯＡＣ、ｐＨ５．２、５０ｍＭＮａＣｌ；及び／又は１０ｍＭＮＡＯＡＣ、ｐＨ５．２、９％スクロースを含む。
【０２６３】
ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質及び／又は治療分子は、本分野において公知の半減期延長ビヒクルに連結される。このようなビヒクルには、ポリエチレングリコール、グリコーゲン（例えば、ＡＢＰのグリコシル化）及びデキストランが含まれるが、これらに限定されない。このようなビヒクルは、例えば、米国特許出願第０９／４２８，０８２号（現在、米国特許第６，６６０，８４３号）及び公開ＰＣＴ出願ＷＯ９９／２５０４４号（これらは、あらゆる目的のために、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
【０２６４】
ある種の実施形態において、最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式及び所望の投薬量に応じて、当業者により決定される。例えば、上記、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照されたい。ある種の実施形態において、このような組成物は、本発明の抗体の物理的状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出速度及びｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を及ぼし得る。
【０２６５】
ある種の実施形態において、実際には、医薬組成物中の主要なビヒクル又は担体は、水性又は非水性であり得る。例えば、ある種の実施形態において、非経口投与用の組成物中で一般的な他の材料を補充することが可能な、好適なビヒクル又は担体は、注射用水、生理食塩水溶液又は人工脳脊髄液であり得る。いくつかの実施形態において、生理食塩水は、等張のリン酸緩衝化生理食塩水を含む。ある種の実施形態において、中性緩衝生理食塩水又は血清アルブミンと混合された生理食塩水は、更なる典型的なビヒクルである。ある種の実施形態において、所望の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥されたケーキ又は水溶液の形態の、場合によって使用される製剤化剤（上記Ｒｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合することによって、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えた又は加えない、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む組成物を保存のために調製することができる。さらに、ある種の実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えた又は加えない、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む組成物は、スクロースなどの適切な賦形剤を用いて、凍結乾燥物質として製剤化され得る。
【０２６６】
ある種の実施形態において、医薬組成物は、非経口送達のために選択することができる。ある種の実施形態において、組成物は、吸入又は経口などの消化管を介した送達のために選択され得る。医薬として許容されるこのような組成物の調製は、当業者の能力の範囲内である。
【０２６７】
ある種の実施形態において、製剤成分は、投与の部位に許容され得る濃度で存在する。ある種の実施形態において、生理学的ｐＨに又は僅かにこれより低いｐＨに、典型的には、約５から約８のｐＨ範囲内に組成物を維持するために、緩衝液が使用される。
【０２６８】
ある種の実施形態において、非経口投与が想定されている場合には、治療的組成物は、医薬として許容されるビヒクル中に、さらなる治療剤を加えて又は加えずに、ＰＣＳＫ９に対する所望の抗原結合タンパク質を含む、非経口的に許容される無発熱物質水溶液の形態であり得る。ある種の実施形態において、非経口注射用ビヒクルは、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えて又は加えずに、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質が適切に防腐された無菌等張溶液として製剤化されている無菌蒸留水である。ある種の実施形態において、調製物は、注射可能な微小球体、生物腐食可能な粒子、ポリマー性化合物（ポリ乳酸又はポリグリコール酸など）、ビーズ又はリポソームなど、産物の徐放又は持続的放出（産物は、その後、デポ注射を介して送達され得る。）を与えることができる薬剤を加えた所望の分子の製剤を含むことができる。ある種の実施形態において、ヒアルロン酸を使用することも可能であり、循環中での持続的な期間を促進する効果を有し得る。ある種の実施形態において、所望の分子を導入するために、インプラント可能な薬物送達装置を使用することができる。
【０２６９】
ある種の実施形態において、医薬組成物は、吸入のために製剤化することができる。ある種の実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えた又は加えない、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、吸入用乾燥粉末として製剤化することができる。ある種の実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えた又は加えない、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む吸入溶液は、エアロゾル送達用の噴射剤とともに製剤化することが可能である。ある種の実施形態において、溶液は噴霧され得る。経肺投与は、化学的に修飾されたタンパク質の経肺送達を記載するＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５中にさらに記載されている。
【０２７０】
ある種の実施形態において、製剤は経口的に投与できることが想定される。ある種の実施形態において、この様式で投与される、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えた又は加えない、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、錠剤及びカプセルなどの固体剤形の配合において慣用される担体とともに又は担体なしに製剤化され得る。ある種の実施形態において、カプセルは、生物学的利用可能性が最大化され、及び前全身分解が最小化されるときに、消化管中の点において製剤の活性部分を放出するように設計することができる。ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質及び／又はあらゆるさらなる治療剤の吸収を促進するために、少なくとも１つの更なる薬剤を含めることができる。ある種の実施形態において、希釈剤、着香剤、低融点ろう、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤及び結合剤も使用し得る。
【０２７１】
ある種の実施形態において、医薬組成物は、錠剤の製造に好適な無毒の賦形剤との混合物中に、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えて又は加えずに、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質の有効量を含むことができる。ある種の実施形態において、無菌水又は別の適切なビヒクル中に錠剤を溶解させることによって、単位投薬形態で溶液を調製することができる。ある種の実施形態において、好適な賦形剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム若しくは重炭酸ナトリウム、ラクトース若しくはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤、又はデンプン、ゼラチン若しくはアラビアゴムなどの結合剤、又はステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸若しくはタルクなどの潤滑剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２７２】
持続的又は制御送達製剤中に、少なくとも１つのさらなる治療剤（複数可）を加えて又は加えずに、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む製剤など、さらなる医薬組成物が当業者に自明である。ある種の実施形態において、リポソーム担体、生体内分解性微粒子又は多孔性ビーズ及びデポ注射などの様々な他の持続的又は制御送達手段を製剤化するための技術も当業者に公知である。例えば、医薬組成物の送達用の多孔性ポリマー微粒子の徐放について記載しているＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９を参照されたい。ある種の実施形態において、徐放調製物は、成型物品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態の半透過性ポリマーマトリックスを含み得る。持続的放出マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号及びＥＰ０５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）及びＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，上記）及びポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が含まれ得る。ある種の実施形態において、徐放組成物は、リポソームも含み得、これは、本分野で公知の任意のいくつかの方法によっても調製することが可能である。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ    ｅｔ    ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８−３６９２（１９８５）；ＥＰ０３６，６７６；ＥＰ０８８，０４６及びＥＰ１４３，９４９を参照されたい。
【０２７３】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために使用されるべき医薬組成物は、典型的には、無菌である。ある種の実施形態において、これは、無菌ろ過膜を通じたろ過によって達成することができる。ある種の実施形態において、組成物が凍結乾燥される場合には、この方法を用いた無菌化は、凍結乾燥及び再構成の前又は後の何れかにおいて実施し得る。ある種の実施形態において、非経口投与用組成物は、凍結乾燥された形態で、又は溶液中に保存し得る。ある種の実施形態において、非経口組成物は、一般的に、無菌アクセスポートを有する容器中に、例えば、皮下注射針によって突き刺すことが可能なストッパーを有する静脈内溶液袋又は容器中に配置される。
【０２７４】
ある種の実施形態において、医薬組成物が調合された後、溶液、懸濁液、ゲル、乳化剤、固体として、又は脱水若しくは凍結乾燥された粉末として、無菌容器中に保存され得る。ある種の実施形態において、このような製剤は、本使用形態で、又は投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥された形態）の何れかで保存し得る。
【０２７５】
ある種の実施形態において、単回投薬投与単位を製造するためのキットが提供される。ある種の実施形態において、キットは、乾燥タンパク質を有する第一の容器と、水性製剤を有する第二の容器の両方を含有し得る。ある種の実施形態において、単一及びは複数チャンバー付きの予め充填された注射器（例えば、液体注射器及び凍結乾燥注射器（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含有するキットが含まれる。
【０２７６】
ある種の実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えて又は加えずに、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む医薬組成物の治療において使用されるべき有効量は、例えば、治療的な文脈及び目的に依存する。従って、当業者は、ある種の実施形態に従って、送達される分子、少なくとも１つの追加の治療剤とともに又は少なくとも１つの追加の治療剤なしに、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質が使用されている適応症、投与の経路及びサイズ（体重、体表面又は臓器サイズ）及び／又は患者の症状（年齢及び一般的な健康）に部分的に依存して、治療用の適切な投薬レベルが変動することを理解する。ある種の実施形態において、医師は、最適な治療効果を得るために、投薬量を滴定し、投与の経路を改変し得る。ある種の実施形態において、典型的な投薬量は、上述の要因に応じて、約０．１μｇ／ｋｇから最大約１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲であり得る。
【０２７７】
ある種の実施形態において、投薬の頻度は、使用される製剤中のＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質及び／又は何れかのさらなる治療剤の薬物動態学的パラメータを考慮に入れる。ある種の実施形態において、臨床医は、所望の効果を達成する投薬量に到達するまで、組成物を投与する。ある種の実施形態において、組成物は、従って、単回用量として、又は経時的に２つ若しくはそれ以上の用量（所望の分子の同じ用量を含有してもよく、含有しなくてもよい。）として、又はインプラント装置若しくはカテーテルを介した連続注入として投与され得る。適切な投薬量をさらに改善することは、当業者によってルーチンとして行われており、当業者によるルーチン作業の範囲内である。ある種の実施形態において、適切な投薬量は、適切な用量応答データの使用を介して確認し得る。いくつかの実施形態において、投与の量及び頻度は、取得されるべき所望のコレステロールレベル（血清及び／又は総）及び対象の現在のコレステロールレベル、ＬＤＬレベル及び／又はＬＤＬＲレベルを考慮に入れることができ、これらの全ては当業者に周知の方法によって取得することができる。
【０２７８】
ある種の実施形態において、医薬組成物の投与経路は、公知の方法に従い、例えば、経口的に、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、皮下、眼内、動脈内、門脈内、又は病変内経路による注射を通じて、徐放システムによって又はインプラント装置によって行われる。ある種の実施形態において、組成物は、ボーラス注射によって、又は注入により連続的に、又はインプラント装置によって投与され得る。
【０２７９】
ある種の実施形態において、組成物は、その上に所望の分子が吸収又は封入されている膜、スポンジ又は別の適切な材料の移植を介して、局所的に投与することができる。ある種の実施形態において、インプラント装置が使用される場合、装置は、何れかの適切な組織又は臓器中に移植することができ、所望の分子の送達は、拡散、時間指定放出型大量瞬時投与又は継続的投与を介して行われ得る。
【０２８０】
ある種の実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えて又は加えずに、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む医薬組成物をｅｘ  ｖｉｖｏ様式で使用することが望ましい場合があり得る。このような事例では、患者から除去された細胞、組織及び／又は臓器は、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えて又は加えずに、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む医薬組成物に曝露され、この後、細胞、組織及び／又は臓器は、続いて、患者中に戻されて移植される。
【０２８１】
ある種の実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質及び／又は何れかのさらなる治療剤は、ポリペプチドを発現及び／又は分泌するために、本明細書に記載されている方法などの方法を用いて、遺伝子操作されたある種の細胞を移植することによって送達することができる。ある種の実施形態において、このような細胞は、動物又はヒトの細胞であってよく、自己、非相同又は異種であり得る。ある種の実施形態において、細胞は不死化され得る。ある種の実施形態において、免疫学的応答の機会を減少させるために、細胞を封入して、周囲組織の浸潤を回避することができる。ある種の実施形態において、典型的には、封入材料は、タンパク質産物（複数可）の放出を可能にするが、患者の免疫系によって又は周囲組織由来の他の有害な因子によって、細胞の破壊を妨げる生態適合性の半透性ポリマー性封鎖又は膜である。
【０２８２】
（以下の実施例に示されているように）ＰＣＳＫ９活性を著しく中和するＡＢＰの能力に基づいて、これらのＡＢＰは、高コレステロール血症などのＰＣＳＫ９によって媒介される活性から生じる症候及び症状を治療及び予防する上で治療効果を有する。
診断用途
【０２８３】
いくつかの実施形態において、ＡＢＰは、診断用ツールとして使用される。ＡＢＰは、試料及び／又は対象中に存在するＰＣＳＫ９の量をアッセイするために使用することができる。当業者によって理解されるように、このようなＡＢＰは中和ＡＢＰである必要はない。いくつかの実施形態において、診断用ＡＢＰは中和ＡＢＰでない。いくつかの実施形態において、診断用ＡＢＰは、中和ＡＢＰが結合するエピトープとは異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、２つのＡＢＰは互いに競合しない。
【０２８４】
いくつかの実施形態において、本明細書中に開示されているＡＢＰは、ＰＣＳＫ９のレベルの変化を伴う疾病又は疾患をスクリーニング／診断するために、哺乳動物組織又は細胞中のＰＣＳＫ９の検出用アッセイキット及び／又は方法において使用され、又は提供される。キットは、ＰＣＳＫ９を結合するＡＢＰ、存在する場合に、ＰＣＳＫ９とのＡＢＰの結合を示し、任意によりＰＣＳＫ９タンパク質レベルを示す手段を含む。ＡＢＰの存在を示すための様々な手段を使用することができる。例えば、蛍光色素、他の分子プローブ又は酵素をＡＢＰに連結することができ、ＡＢＰの存在は様々な様式で観察することができる。このような疾患をスクリーニングするための方法は、キットの使用、又は単純に、開示されているＡＢＰの１つを使用すること、及び試料中でＡＢＰがＰＣＳＫ９に結合するかどうかの測定を含み得る。当業者によって理解されるように、ＰＣＳＫ９の高い又は上昇したレベルは、試料中のＰＣＳＫ９へのＡＢＰ結合のより多い量をもたらす。従って、試料中にどの程度多くのＰＣＳＫ９が存在するかを測定するために、ＡＢＰ結合の程度を使用することができる。所定の量（例えば、ＰＣＳＫ９関連疾患を持たない者が有する量又は範囲）より多いＰＣＳＫ９の量を有する対象又は試料は、ＰＣＳＫ９によって媒介される疾患を有するものとして特徴付けることができる。いくつかの実施形態において、スタチンが対象中のＰＣＳＫ９の量を増大させたかどうかを決定するために、スタチンを服用している対象にＡＢＰが投与される。
【０２８５】
いくつかの実施形態において、ＡＢＰは非中和ＡＢＰであり、ＡＢＰ及び／又はスタチン治療を受けている対象中のＰＣＳＫ９の量を測定するために使用される。
【実施例】
【０２８６】
実施された実験及び得られた結果を含む以下の実施例は、例証の目的のためにのみ提供され、制限するものとして解釈されるものではない。
実施例１
抗ＰＣＳＫ９抗体及びハイブリドーマの生成
【０２８７】
アミノ酸配列２のアミノ酸３１〜６９２を含む自己開裂型成熟分泌ＰＣＳＫ９に対する抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むマウスである、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウス（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）で産生された。免疫付与には、ＸＭＧ２ＫＬ、ＸＭＧ４ＫＬ、ＸＭＧ２／Ｋ及びＸＭＧ４／Ｋを含むＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）菌株を使用した。ＰＣＳＫ９は、参照として（ＮＭ＿１７４９３６）ＧｅｎＢａｎｋ配列を用いて、標準組換え技術により作製した。
【０２８８】
腹腔内投与により腹部に送達させる合計１０μgの抗原を各マウスに注入した。その後の追加免疫量は、５μｇであり、注射法としては、腹部への腹腔内注射と尾基部での皮下注射とを交互に行った。腹腔内注射用に、ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ＃Ｔ２６８４）を加えた乳化剤として抗原を調製し、皮下注射用に抗原はＡｌｕｍ（リン酸アルミニウム）及びＣｐＧオリゴと混合した。マウス１匹当たり５μｇの抗原を最終注入剤をリン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）に入れ、２箇所の部位に送達させた（５０％を腹腔内注射（ＩＰ）により腹部へ、尾基部で５０％を注射投与（ＳＱ））。マウスに対して、抗原を８〜１１回注入した。
【０２８９】
次に、以下の滴定プロトコールを用いて、マウスの抗ＰＣＳＫ９特異的免疫応答をモニターした。Ｃｏｓｔａｒ３３６８培地結合プレートを８μｇ／ｍｌ（５０μｌ／ウェル）コーティングし、１ＸＰＢＳ／０．０５％アジ化物中で、４℃にて一晩インキュベートした。これらをＴｉｔｅｒＴｅｋを用いて洗浄した（逆浸透膜（「ＲＯ」）純水による洗浄を３−サイクル行った）。プレートは、１ｘＰＢＳ／１％ミルク２５０μｌによりブロックし、室温（「ＲＴ」）で少なくとも３０分間インキュベートした。ブロック溶液をＴｉｔｅｒＴｅｋにより洗浄した（ＲＯ水による洗浄を３−サイクル）。１ｘＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋（アッセイ希釈液）５０μｌ／ウェル中でビオチン化（ｂ）−ヒトＰＣＳＫ９  ２μｇ／ｍｌを捕獲し、ＲＴで１時間インキュベートした。非結合ｂ−ＰＣＳＫ９をＴｉｔｅｒＴｅｋにより洗浄した（ＲＯ水による洗浄を３−サイクル）。一次抗体については、血清を滴定して、１：１００から１：３に二回繰り返し行った。この滴定は、アッセイ希釈液５０μｌ／ウェルで行い、ＲＴで１時間インキュベートし、次に、ＴｉｔｅｒＴｅｋによりＲＯ水で３−サイクル洗浄を行った。二次抗体は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  ＨＲＰであり、５０μｌ／ウェルにて、アッセイ希釈液４００ｎｇ／ｍｌとした。これを１時間、ＲＴでインキュベートした。次いで、ＴｉｔｅｒＴｅｋを用いてＲＯ水により３−サイクル洗浄を行い、ペーパータオルで軽く打ち付けて乾燥させる。基質については、１ステップタイプ型ＴＭＢ溶液（Ｎｅｏｇｅｎ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）を使用し（５０μｌ／ウェル）、３０分間、ＲＴで発現させた。プレート結合ＰＣＳＫ９を検出するための陽性対照は、可溶性ＬＤＬ受容体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ  ＃２１４８ＬＤ／ＣＦ）及び多クローンウサギ抗ＰＣＳＫ９抗体（Ｃａｙｍｅｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＃１０００７１８５）であり、１：３に滴定し、アッセイ希釈液中３μｇ／ｍｌから２回繰り返し行った。ヤギ抗ＬＤＬＲ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ＃ＡＦ２１４８）及びウサギ抗ヤギＩｇＧＦｃ  ＨＲＰにより濃度４００ｎｇ／ｍｌでＬＤＬＲを検出した。ウサギ多クローン体は、アッセイ希釈液中４００ｎｇ／ｍｌの濃度でヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃにより検出された。陰性対照は、アッセイ希釈液中１：１００から１：３まで２回繰り返し滴定した未処置ＸＭＧ２−ＫＬ及びＸＭＧ４−ＫＬ血清とした。
【０２９０】
上述のとおり可溶性抗原で免疫化したマウスを対象に、ＥＬＩＳＡ法により、抗体対ヒトＰＣＳＫ９の力価を調べた。ＰＣＳＫ９への特異的免疫応答が上昇していることが明らかになった動物を収集して、抗体産生に進めた。複数回にわたる抗体産生が行われ、本明細書に記載の抗体を選択するために使用されるパネルを作成した。
実施例２
リンパ球の回収、Ｂ細胞の分離、融合及びハイブリドーマの生成
【０２９１】
本実施例では、免疫細胞の回収方法及びハイブリドーマの産生方法について述べる。選択された免疫化マウスは、頚椎脱臼により屠殺し、各コホートから流入領域リンパ節を収集し、プールした。Ｂ細胞は、ＤＭＥＭ中で粉砕してリンパ組織から解離させ、細胞を組織から放出させ、その細胞は、ＤＭＥＭ中で懸濁させた。細胞数をカウントし、リンパ球１億個当たり０．９ｍｌ  ＤＭＥＭを細胞ペレットに添加し、細胞を静かに、しかし、完全に再懸濁した。
【０２９２】
リンパ球は、非分泌性骨髄腫（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞、ＡＴＣＣより購入、ｃａｔ．＃ＣＲＬ１５８０（Ｋｅａｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３，１５４８−１５５０）と比率１：４で混合した。細胞混合物は、４００ｘｇ、４分で緩やかに遠心分離によってペレット状にした。上清をデカント除去後、細胞は、１ｍｌピペットを用いて、緩やかに混合した。あらかじめ加熱したＰＥＧ／ＤＭＳＯ溶液をＳｉｇｍａ（ｃａｔ＃Ｐ７３０６）（Ｂ細胞１００万個当たり１ｍｌ）をゆっくりと添加し、穏やかに１分以上撹拌し、その後、１分間混合した。あらかじめ加熱したＩＤＭＥＭ（Ｂ細胞１００万個当たり２ｍｌ）（グルタミン、Ｌ−グルタミン非含有ＤＭＥＭ、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、ＭＥＭ非必須アミノ酸（インビトロゲンを初めとしてすべて）を２分間以上かけて、穏やかに攪拌しながら、添加した。最後に、あらかじめ加熱したＩＤＭＥＭ（１０６Ｂ細胞当たり８ｍｌ）を３分以上かけて添加した。
【０２９３】
融合細胞は、４００ｘｇ６分にてスピンダウンし、２０ｍｌ選択培地ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中で再懸濁し、Ｂ細胞１００万個に対して、Ｌ−グルタミン、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、ＭＥＭ非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより提供）、ＨＡ−アザセリンヒポキサンチン及びＯＰＩ（オキサロ酢酸、ピルビン酸、ウシインスリン）（いずれもＳｉｇｍａより提供）及びＩＬ−６（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を補完した。細胞は、２０〜３０分間、３７Ｃでインキュベートし、次いで、２００ｍｌ選択培地で再懸濁し、９６ウェルプレーティングの前に、Ｔ１７５フラスコで３〜４日間培養した。したがって、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を作成したハイブリドーマを産生した。
実施例３
ＰＣＳＫ９抗体の選択
【０２９４】
本実施例では、様々なＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質の特性付け及び選択方法について記述する。分泌抗体（実施例１及び２で作製したハイブリドーマから産生）のＰＣＳＫ９への結合を評価した。抗体の選択は、１つ以上の以下の特性、結合データ、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合の阻害、ｐＨ選択的結合、ドメイン−特異的結合及び親和性に基づいて行った。
プライマリースクリーニング
【０２９５】
野生型ＰＣＳＫ９に結合する抗体のプライマリースクリーニングを行った。プライマリースクリーニングは、２つのハーベスト液で行った。プライマリースクリーニングは、ＥＬＩＳＡアッセイ法を含み、以下のプロトコールを用いて実施した。
【０２９６】
Ｃｏｓｔａｒ  ３７０２培地結合３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。プレートは、１ｘＰＢＳ／０．０５％アジド中、濃度４μｇ／ｍｌ、容積４０μｌ／ウェルで、ｎｅｕｔｒａｖａｄｉｎをコーティングした。プレートは、４℃で一晩インキュベートした。次にプレートをＴｉｔｅｒｔｅｋプレートワッシャ（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を使用して洗浄した。洗浄を３−サイクル行った。プレートは、９０μｌ  １ｘＰＢＳ／１％ミルクでブロック処理し、約３０分間室温でインキュベートした。次にプレートを洗浄した。再び、洗浄を３−サイクル行った。獲得試料は、ビオチン化−ＰＣＳＫ９であって、１ＸＰＢＳ／１％ｍｉｌｋ／１０ｍＭ  Ｃａ２＋中、０．９μｇ／ｍｌ、容積４０μｌ／ウェルで添加した。次にプレートを１時間室温でインキュベートした。次に、３−サイクル洗浄により作動させたＴｉｔｅｒｔｅｋプレートウォッシャを用いて、プレートを洗浄した。上清１０μｌを４０μｌ  １ｘＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭ  Ｃａ２＋に入れ、１．５時間室温でインキュベートした。再び、３−サイクル洗浄により作動させたＴｉｔｅｒｔｅｋプレートウォッシャを用いて、プレートを洗浄した。１ｘＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭ  Ｃａ２＋中濃度１００ｎｇ／ｍｌ（１：４０００）のヤギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  ＨＲＰ４０μｌ／ウェルをプレートに添加し、１時間室温でインキュベートした。もう一度、３−サイクル洗浄によりプレートを洗浄した。最終的に、４０μｌ／ウェルのワンステップＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）をプレートに添加し、４０μｌ／ウェルの１Ｎ塩酸で、３０分後、室温でクエンチした。ＯＤ値は、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーにより、即座に４５０ｎｍで読み取った。結果を以下の表１０Ａに記す。陽性結合は、ハイブリドーマ上清である陰性対照の平均シグナルの３倍として測定した。陰性対照の平均ＯＤは、０．１７であった。
【表１５】
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【０２９７】
複数回にわたる免疫付与、ハイブリドーマ産生及びプライマリースクリーニングにより、識別された８３０の抗原特異的ハイブリドーマが確認された。次にパネルでは、ＬＤＬＲ結合相互作用のブロック能力について、スクリーニングを行った。
大規模な受容体リガンドブロック処理スクリーニング
【０２９８】
ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合をブロックする抗体についてスクリーニングするために、Ｄ３７４Ｙ  ＰＣＳＫ９突然変異体を用いるアッセイ法が開発された。突然変異体は、ＬＤＬＲに対してより高い親和性を有し、さらに感度の高い受容体リガンドブロックアッセイを行うことができるため、本アッセイに使用した。以下のプロトコールを受容体リガンドブロックのスクリーニングに用いた。Ｃｏｓｔａｒ  ３７０２培地結合３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）をスクリーニングに使用した。プレートは、１ＸＰＢＳ／０．０５％アジド中、２μｇ／ｍｌ、容積４０μｌ／ウェルで、ヤギ抗−ＬＤＬＲ（Ｒ＆Ｄ  Ｃａｔ  ＃ＡＦ２１４８）でコーティングした。プレートは、４℃で一晩インキュベートした。次にプレートをＴｉｔｅｒｔｅｋプレートワッシャ（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を使用して洗浄した。洗浄を３−サイクル行った。プレートは、９０μｌ  １ＸＰＢＳ／１％ミルクでブロック処理し、約３０分間室温でインキュベートした。次にプレートをＴｉｔｅｒｔｅｋプレートワッシャを使用して洗浄した。洗浄を３−サイクル行った。獲得試料は、ＬＤＬＲ（Ｒ＆Ｄ，Ｃａｔ＃２１４８ＬＤ／ＣＦ）であって、１ｘＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭ  Ｃａ２＋中、０．４μｇ／ｍｌ、容積４０μｌ／ウェルで添加した。次にプレートを１時間１０分、室温でインキュベートした。同時に、２０ｎｇ／ｍｌのビオチン化ヒトＤ３７４Ｙ  ＰＣＳＫ９を１５マイクロリットルのハイブリドーマ抽出上清をＮｕｎｃポリプロピレンプレートでインキュベートし、抽出上清の濃度を１：５に希釈した。次にプレートを約１時間３０分、室温でプレインキュベートした。次に、３−サイクル洗浄により作動させたＴｉｔｅｒｔｅｋプレートウォッシャを用いて、プレートを洗浄した。５０μｌ／ウェルのプレインキュベート済み混合物をＬＤＬＲコートＥＬＩＳＡプレートに移し、１時間室温でインキュベートした。ＬＤＬＲ結合ｂ−ＰＣＳＫ９を検出するために、４０μｌ／ウェルストレプトアビジンＨＲＰをアッセイ希釈液中、５００ｎｇ／ｍｌでプレートに添加した。プレートを１時間室温でインキュベートした。再び、プレートをＴｉｔｅｒｔｅｋプレートワッシャを使用して洗浄した。洗浄を３−サイクル行った。最終的に、４０μｌ／ウェルのワンステップＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）をプレートに添加し、４μｌ／ウェルの１Ｎ塩酸で、３０分後、室温でクエンチした。ＯＤ値は、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーにより、即座に４５０ｎｍで読み取った。本スクリーニングでは、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲウェルとの間の相互作用をブロックした３８４の抗体が認識され、１００の抗体の相互作用が強くブロックされた（ＯＤ＜０．３）。これらの抗体により、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの結合相互作用が９０％以上阻害された（９０％以上の阻害）。これらの結果を表３Ｄに記す。
【表１６】
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実施例４
ＥＬＩＳＡ法による抗体競合ビニング
【０２９９】
次に、ハイブリドーマ上清を直接結合競合法により評価した。抗体の競合をスクリーニングするために、以下のプロトコールを用いて、ＥＬＩＳＡに基づいたアッセイが開発された。非処理３８４のウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ３７０２）に、０．０１％アジ化ナトリウムの入った１ＸＰＢＳ、４０μｌ／ウェルを用いて、以下の抗体をコーティングした。３１Ｈ４  １．０μｇ／ｍｌ、２６Ｈ５  １．０μｇ／ｍｌ。プレートは、プラスチックで包み、室温で一晩保存した。次の日、各ハイブリドーマ上清を１：５最終希釈液で、１００ｎｇ／ｍｌのｂ−ＰＣＳＫ９によりプレインキュベートした。次に、これらの試料を２時間、室温でインキュベートした。次にプレコート済みの抗体捕獲プレートを洗浄し、プレインキュベートしたハイブリドーマ抗体上清及びＢ−ＰＣＳＫ９の試料をプレートに添加し、１時間室温でインキュベートした。１％脱脂粉乳含有１ＸＰＢＳ、５００ｎｇ／ｍｌで、ストレプトアビジンＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐ２１１２６）により、結合ｂ−ＰＣＳＫ９の検出が行われた。１時間インキュベートした後、発色基質ＴＭＢ（３，３’，５，５’−−テトラメチルベンジジン）を添加して、ＯＤに応じて、１５分から６０分のいずれかの時点で４０μｌ／ウェルにてインキュベートし、その後１モーラーの塩酸で停止させた。４５０ｎｍの光学密度をＭｕｌｔｉｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ｒｅａｄｅｒにより読み取った。次に、プレインキュベート後に、ｂ−ＰＣＳＫ９と抗ＰＣＳＫ９ハイブリドーマ上清との結合量と関連のないハイブリドーマ上清を用いた陰性対象ウェルとを比較することによって阻害率を計算した。阻害率％＝１−（Ａｂ上清のＯＤ／Ｂ−ＰＣＳＫ９／陰性対照上清／Ｂ−ＰＣＳＫ９のＯＤ）。その結果を以下の表１１にまとめた。
【表１７】
2016514668.tif 000029
【０３００】
抗体３１Ｈ４及び２６Ｈ５は、以下のアミノ酸配列を有する。
【表１８】
2016514668.tif 000030
2016514668.tif 000031
実施例５
抗体の重鎖及び軽鎖の配列解析
【０３０１】
次いで、上記の抗体の重鎖及び軽鎖の核酸及びアミノ酸配列をサンガー（ジデオキシ）ヌクレオチドシークエンシングによって決定した。次いで、核酸配列のアミノ酸配列を推定した。配列１０１Ｆ７、１０３Ｂ７、１３１Ｄ１２及び２７Ｂ２．６は、本明細書の表１〜６に記載する。
実施例６
抗体の結合親和性特性
【０３０２】
ヒト及びカニクイザルのサルＰＣＳＫ９への抗ＰＣＳＫ９抗体の結合は、ＢＩＡｃｏｒｅによる溶解平衡結合アッセイにて測定した。抗体は、ＣＭ５チップの第２のフローセルで、アミン結合により、密度約６０００ＲＵで固定化させた（試薬は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）提供）。第１のフローセルは、バックグラウンド対照として使用した。PＨ７．４でのアッセイでは、抗体の段階希釈によりＰＣＳＫ９  ０．１ｎＭ又は１．０ｎＭをＰＢＳ／０．１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ／０．００５％Ｐ２０中で混合し（０．００３ｎＭ〜５０ｎＭの範囲）、室温で４時間インキュベートした。ＰＨ５．５でのアッセイでは、抗体の段階希釈によりＰＣＳＫ９  ０．１ｎＭ又は１．０ｎＭ（０．００３ｎＭ〜５０ｎＭの範囲）を、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５／１５０ｍＭＮａＣｌ／０．１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ／０．００５％Ｐ２０中で混合し、室温で４時間インキュベートした。混合溶液中での遊離ＰＣＳＫ９の結合は、抗体被覆チップ表面に注入して測定した。溶液中、抗体の不在下において、抗体表面での１００パーセントＰＣＳＫ９結合シグナルを測定した。溶液中での抗体濃度の上昇を伴うＰＣＳＫ９結合応答の低下により、ＰＣＳＫ９が抗体に結合し、ＰＣＳＫ９が固定化抗体表面に結合しないようにしていることがわかった。ＰＣＳＫ９結合シグナルを抗体濃度に対してプロットすると、ＫｉｎＥｘＡ  Ｐｒｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅで提供されたｎ曲線１部位相同結合モデルを用いて、競合曲線非線形回帰からＫＤを得た。その結果を以下の表１２にまとめた。
【０３０３】
【表１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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