(57)【要約】  治療用癌ワクチンとしての多価ガングロシド（ｇａｎｇｌｏｓｉｄｅ）糖質が提供される。開示されるコンジュゲートしたＧＤ２及びＧＤ３糖質は、スペーサーにより連結されて、天然に存在するＧＤ２またはＧＤ３の本来の構造的特徴を保存している多量体を形成し、その四量体は、免疫原性であり、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞傷害性抗ガングリオシド液性応答及び細胞性応答を誘発する。【選択図】図３Ａ
2016539172.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
Ｇ−Ａｒｙｌ−ＮＨ2
のガングリオシド炭水化物であって、式中、Ｇが、１つまたは複数のシアル酸（例えば、ｎ−アセチルノイラミン酸）を含むオリゴ糖であり、前記Ｇが、Ｃ１アノマー酸素原子によりアリールと結合しており、Ａｒｙｌが、任意に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールである、ガングリオシド炭水化物。
【請求項２】
式
【化１】
2016539172.tif 000014
を有する、請求項１に記載のガングリオシド糖質。
【請求項３】
式
【化２】
2016539172.tif 000015
2016539172.tif 000016
を有する、請求項１に記載のガングリオシド糖質。
【請求項４】
多量体コア分子と共有結合した少なくとも１つまたは少なくとも２つの糖質ガングリオシド類似体を含む、ガングリオシド糖質多量体。
【請求項５】
請求項１に記載のガングリオシド糖質からなる少なくとも１つまたは少なくとも２つの糖質ガングリオシド類似体を含む、請求項４に記載のガングリオシド糖質多量体。
【請求項６】
前記少なくとも２つの糖質ガングリオシド類似体が、少なくとも１つのＧＤ２糖質ガングリオシド類似体または少なくとも１つのＧＤ３糖質ガングリオシド類似体を含む、請求項４または５に記載のガングリオシド糖質多量体。
【請求項７】
前記ガングリオシド糖質多量体が、前記糖質ガングリオシド類似体の四量体である、請求項４〜６のいずれか１項に記載のガングリオシド糖質多量体。
【請求項８】
前記少なくとも１つまたは少なくとも２つの糖質ガングリオシド類似体が、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２及びＧＴ１ｂのうちの少なくとも１つの類似体である、請求項４に記載のガングリオシド糖質多量体。
【請求項９】
式
【化３】
2016539172.tif 000017
を有し、式中、Ａｒｙｌが、任意に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；ＸがＯまたはＳであり、Ｇが
【化４】
2016539172.tif 000018
である、請求項４に記載のガングリオシド糖質多量体。
【請求項１０】
腫瘍に対して免疫原性である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のガングロシド（ｇａｎｇｌｏｓｉｄｅ）糖質。
【請求項１１】
癌を予防または治療するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のガングロシド（ｇａｎｇｌｏｓｉｄｅ）糖質。
【請求項１２】
前記癌が、ガングリオシド陽性の癌である、請求項１１に記載のガングロシド（ｇａｎｇｌｏｓｉｄｅ）糖質。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のガングリオシド糖質と特異的に結合する、抗体。
【請求項１４】
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはヒト化抗体である、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
癌を予防または治療するための、請求項１３または１４に記載の抗体。
【請求項１６】
前記癌が、ガングリオシド陽性の癌である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のガングリオシド糖質と、担体とを含む、ワクチン。
【請求項１８】
癌を予防または治療するための、請求項１７に記載のワクチンン。
【請求項１９】
癌の予防または治療を必要とする患者における癌を予防または治療する方法であって、前記患者に有効量の請求項１〜１２のいずれか１項に記載のガングリオシド糖質、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の抗体または請求項１７〜１８のいずれか１項に記載のワクチンを投与する段階を含む、方法。
【請求項２０】
前記癌が、ガングリオシド陽性の癌である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記癌が、神経芽腫、メラノーマまたは神経膠腫である、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記癌が、乳癌または小細胞肺癌である、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
免疫原性応答の誘発を必要とする患者における免疫原性応答を誘発する方法であって、前記患者に有効量の請求項１〜１２のいずれか１項に記載のガングリオシド糖質、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の抗体または請求項１７〜１８のいずれか１項に記載のワクチンを投与する段階を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本記載は、ガングリオシド(ganglioside)複合糖質(glicoconjugate)及びその抗腫瘍ワクチンとしての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガングリオシドは、細胞膜外葉に蓄積するノイラミン酸含有スフィンゴ糖脂質である。ＧＤ２及びＧＤ３などのガングリオシドは広く認められている腫瘍マーカーである。これらは神経芽腫、メラノーマ、小細胞肺癌及び神経膠腫（Ｈａｋｏｍｏｒｉ，１９９６，Ｃａｎｃｅｒ，５６：５３０９）のほか、乳癌幹細胞（Ｂａｔｔｕｌａら，２０１２，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ，１２２：２０６６）にも発現するが、正常細胞には存在しない。このため、ＧＤ２及びＧＤ３は腫瘍標的として利用されており、臨床標的として有効であることが確認されている。精製抗ＧＤ２（Ｃｈｅｕｎら，１９８７，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，５：１４３０）または抗ＧＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｈｏｕｇｈｔｏｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２：１２４２）を受動的に投与することにより局所治療を達成することができる。しかし、受動免疫は経済的コストが高く、重大な副作用がみられ、介入の頻度が限られるほか、治療効果も低い（Ｎａｖｉｄら，２０１０，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，１０：２００）。
【０００３】
これに代わるものとして、多くのグループが能動的免疫療法ガングリオシドを追究してきた（Ａｓｔｒｏｎｏｍｏ及びＢｕｒｔｏｎ，２０１０，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ，９：３０８）。しかし、ガングリオシドに付随する重大な困難として、免疫原性及び溶解性が低く、製剤に不向きであり、十分に特徴付けられた均一な免疫原を調製するには方法が限られ困難であるほか、選択性が低く、構造的に関係が深い非腫瘍ガングリオシドに対する交差反応性のリスクの可能性があるといった点が挙げられる。
【０００４】
例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と化学的にコンジュゲートしたＧＤ２ラクトンは免疫原性であり、マウスの腫瘍成長を遅らせる抗体を誘導することができる（Ｃｈａｐｍａｎら，２０００，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６：４６５８）。このワクチンによって誘導された抗体は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）機序を介して作用する（Ｋｉｍら，２０１１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，６０：６２１）。しかし、ＫＬＨとガングリオシドのコンジュゲーションでは化学的に不均一な生成物が生じ（Ｄａｎｉｅｓｈｅｆｓｋｙ及びＡｌｌｅｎ，２０００，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ，３９：８３６）、このことが重大な欠点となっている。その他のガングリオシドコンジュゲートは免疫原性が低く、一般に低い一過性の抗ガングリオシド抗体応答を誘発することが明らかにされている（Ｒａｇｕｐａｔｈｉら，２０００，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，８５：６５９）。最も免疫原性の高いガングリオシドであるＧＭ２−ＫＬＨワクチンでさえ臨床的有用性が認められず（Ｋｉｒｋｗｏｏｄら，２００１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１９：２３７０）、中止された。実験的方法としてほかにも、ＧＤ２に対する交差反応免疫を引き起こし得るＧＤ２−ペプチドミモトープ（Ｗｏｎｄｉｍｕら，２００８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，５７：１０７９）、ＧＤ２模倣ペプチド（Ｂｏｌｅｓｔａら，２００５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６５：３４１０）及びＧＤ２ミモトープＤＮＡワクチン（Ｚｅｙｔｉｎら，２０００，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，７：１４２６）が挙げられる。しかし、腫瘍治療のパラダイムでは、免疫応答は宿主の保護にあまり効果的ではなかった（Ｂｌｅｅｋｅら，２００９，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，４５：２９１５）。
【０００５】
このため、ガングリオシドを標的として用いる新規な治療法を提供することが未だ必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
一態様では、式：Ｇ−Ａｒｙｌ−ＮＨ2のガングリオシド糖質（carbohydrate）が提供され、式中、Ｇは、１つまたは複数のシアル酸（例えば、ｎ−アセチルノイラミン酸）を含むオリゴ糖であり、前記ＧはＣ１アノマー酸素原子によりアリールと共有結合しており、Ｇは免疫原性であり、Ａｒｙｌは任意に置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールである。
【０００７】
本明細書に提供されるガングロシド（ｇａｎｇｌｏｓｉｄｅ）糖質は、腫瘍に対して免疫原性である。より具体的には、癌を予防または治療するための腫瘍に対して免疫原性のガングロシド（ｇａｎｇｌｏｓｉｄｅ）糖質が提供される。
【０００８】
本記載ではほかにも、多量体(multimeric)コア分子と共有結合した少なくとも１つまたは少なくとも２つの本明細書に記載される糖質ガングリオシド類似体またはガングリオシド糖質を含むガングリオシド糖質多量体が提供される。
【０００９】
本明細書で定義されるガングリオシド糖質またはガングリオシド糖質多量体と特異的に結合する抗体が提供される。
【００１０】
このほか、本明細書で定義されるガングリオシド糖質またはガングリオシド糖質多量体を含むワクチンが提供される。
【００１１】
このほか、本明細書で定義されるガングリオシド糖質またはガングリオシド糖質多量体の癌の予防または治療への使用が提供される。
【００１２】
このほか、癌を予防または治療する薬剤の製造への本明細書で定義されるガングリオシド糖質またはガングリオシド糖質多量体の使用が提供される。
【００１３】
このほか、必要とする患者の癌を予防または治療する方法であって、前記患者に有効量の本明細書で定義されるガングリオシド糖質またはガングリオシド糖質多量体を投与する工程を含む方法が提供される。
【００１４】
このほか、必要とする患者に免疫原性応答を誘発する方法であって、前記患者に有効量の本明細書で定義されるガングリオシド糖質またはガングリオシド糖質多量体を投与する工程を含む方法が提供される。
【００１５】
このほか、有効量の本明細書で定義されるガングリオシド糖質多量体と、薬学的に適切な担体または補形剤とを含む、医薬組成物が提供される。
【００１６】
ここで添付図面に言及する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】ガングリオシドＧＭ１、ＧＤ３及びＧＤ２の構造を示す図である。
【図１Ｂ】本明細書に開示されるＧＤ２類似体及びＧＤ３類似体を合成するスキームを示す図である。
【図１Ｃ】本明細書に開示される抗原を合成するスキームを示す図である。
【図２Ａ】ＧＤ２（ＡＰ−ＧＤ２）のアミノフェニルエーテル類似体の質量スペクトルを示す図である。
【図２Ｂ】重水素化水中のＧＤ２（ＡＰ−ＧＤ２）のアミノフェニルエーテル類似体のＨ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２Ｃ】重水素化水中のテトラＧＤ２デンドリマーのＨ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図３Ａ】ＩｇＧクラスの抗ＧＤ２反応性抗体の存在を示す代表的なＦＡＣＳｃａｎデータを示す図である。
【図３Ｂ】抗マウスＩｇＧ二次試薬を用いて試験した被験血清または対照血清の段階希釈物を示す図である。
【図３Ｃ】各免疫化後にＩｇＧアイソタイプ及びＩｇＭアイソタイプが増加したことを示す血清アイソタイピングを示す図である。
【図３Ｄ】示された抗体とともに培養した完全培地で指数関数的に増殖するＥＬ４−ＧＤ２+細胞及び２４時間後にＭＴＴにより定量化したその生存／代謝を示す図である。
【図４Ａ】3Ｈ−チミジン取込みアッセイにより評価したＴ細胞増殖を示す図であり、ここでは、腫瘍細胞と、ワクチン接種マウスまたは無感作マウスから精製したＴ細胞とを１：１０の比で培養した。
【図４Ｂ】トリパンブルー排除法により測定したＧＤ２依存性Ｔ細胞増殖を示す図である。
【図５Ａ】腹腔内にワクチン接種したマウスで測定した腫瘍体積を示す図である。
【図５Ｂ】対照マウスで測定した腫瘍体積の平均値に対する免疫化マウスで測定した腫瘍体積の平均値を示す図である。
【図５Ｃ】腹腔内にテトラＧＤ２をワクチン接種したマウスで測定した腫瘍体積を示す図である。
【図５Ｄ】対照マウスで測定した腫瘍体積の平均値に対する免疫化マウスで測定した腫瘍体積の平均値を示す図である。
【図５Ｅ】養子移植治療の効果を示す図である。
【図５Ｆ】リンパ節への転移の定量化を示す図である。
【図６】２群の無感作腫瘍担持マウス（対照またはワクチン接種）から精製したＴ細胞及びＦＡＣＳｃａｎにより定量化した細胞のＣＤ４／ＣＤ８プロファイルを示す図である。
【図７】ＩｇＧサブクラスの抗ＧＤ３反応性抗体を示す血清の代表的なＥＬＩＳＡのデータを示す図である。
【図８】テトラＧＤ３によるワクチン接種の結果を示す図である。
【図９】テトラＧＤ３によるワクチン接種の結果を示す図である。
【図１０】ＧＤ３ワクチンを用いたワクチン接種後の転移性小結節のカウント数を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（詳細な説明）
本開示は、
【化１】
2016539172.tif 000003
からなるガングリオシド糖質に関する。
【００１９】
本開示は特に、
【化２】
2016539172.tif 000004
からなるガングリオシド糖質を提供する。
【００２０】
本明細書で使用されるＧは、各ガングリオシドに対応するオリゴ糖及びシアル酸（例えば、ｎ−アセチルノイラミン酸、ＮＡＮＡ）のみを含む各ガングリオシド（ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２及びＧＴ１ｂなど）の一部分を指す。換言すれば、Ｇは、本明細書ではアミノ−アリール残基（アミノ−フェニルなど）に置き換わったガングリオシドのセラミド部分を除く、対応するガングリオシドのオリゴ糖及びシアル酸を指す。本明細書で使用されるＧの例としては、
【化３】
2016539172.tif 000005
などのＧＤ３及びＧＤ２の残基が挙げられる。
【００２１】
本明細書で使用される「アリール」という用語は、６〜１０員芳香族基、例えばフェニルまたはナフチル、好ましくはフェニルを指すものとして理解される。芳香環は、１つまたは複数の環位置、好ましくは置換基が存在しない位置で置換されていてよく、アミノ基は糖部分に対してフェニルのパラ位にあるのが好ましい。したがって、「−アリール−ＮＨ2」は４−アミノフェニルであるのが好ましい。
【００２２】
アリールに関する「任意に置換された」という用語は、任意の利用可能な１つまたは複数の位置で、アルキル、アリールまたはハロゲンのうちの１つまたは複数によって、任意に置換されていることを意味する。置換基は存在しないのが好ましい。
【００２３】
本開示は、多量体コア分子と共有結合した少なくとも１つまたは少なくとも２つの糖質ガングリオシド類似体を含む、ガングリオシド糖質多量体を提供する。
【００２４】
一実施形態では、糖質ガングリオシド類似体は、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２及びＧＴ１ｂのうちの少なくとも１つの類似体である。
【００２５】
一実施形態では、糖質ガングリオシド類似体またはガングリオシド糖質多量体は、少なくとも１つのＧＤ２糖質ガングリオシド類似体または少なくとも１つのＧＤ３糖質ガングリオシド類似体を含む。
【００２６】
一実施形態では、糖質ガングリオシド類似体またはガングリオシド糖質多量体は、糖質ガングリオシド類似体の四量体である。一実施形態では、糖質ガングリオシド類似体またはガングリオシド糖質多量体は、癌の予防または治療に有用である。一実施形態では、糖質ガングリオシド類似体またはガングリオシド糖質多量体は、癌の治療に有用である。一実施形態では、癌は、ガングリオシド陽性の癌である。別の実施形態では、癌は、神経芽腫、メラノーマまたは神経膠腫である。一実施形態では、癌は乳癌または小細胞肺癌である。
【００２７】
一実施形態では、本明細書で定義される糖質ガングリオシド類似体またはガングリオシド糖質多量体と特異的に結合する抗体が提供される。一実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはヒト化抗体である。一実施形態では、抗体は、癌を予防または治療するためのものである。一実施形態では、癌は、ガングリオシド陽性の癌である。一実施形態では、癌は、神経芽腫、メラノーマまたは神経膠腫である。一実施形態では、癌は乳癌または小細胞肺癌である。一実施形態では、癌は乳癌または小細胞肺癌である。
【００２８】
一実施形態では、本明細書で定義される糖質ガングリオシド類似体またはガングリオシド糖質多量体と、担体とを含む、ワクチンが提供される。一実施形態では、ワクチンは、癌を予防または治療するためのものである。一実施形態では、癌は、ガングリオシド陽性の癌である。一実施形態では、癌は、神経芽腫、メラノーマまたは神経膠腫である。一実施形態では、癌は乳癌または小細胞肺癌である。
【００２９】
一実施形態では、本明細書で定義される方法または使用のための糖質ガングリオシド類似体またはガングリオシド糖質多量体を注射用に製剤化する。一実施形態では、ワクチンを経皮投与または非経口投与用に製剤化する。一実施形態では、親投与（ｐａｒｅｎｔａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）は、筋肉内投与、皮下投与または静脈内投与である。
【００３０】
特定の実施形態では、抗腫瘍ワクチンとして適用される免疫原性のＧＤ２複合糖質が開示される。
【００３１】
コンジュゲートしてデンドリマー（例えば、四量体、以降「テトラＧＤ２」または「テトラＧＤ３」）を形成するＧＤ２及びＧＤ３糖質の水溶性類似体の設計及び特徴付けが本明細書に開示される。
【００３２】
四量体ガングリオシド糖質は、例えば天然に存在するＧＤ２またはＧＤ３の本来の構造的特徴を保存しているが、免疫原性であり、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞傷害性抗ガングリオシド液性応答及び細胞性応答を誘発する。例えば、テトラＧＤ２は、予防パラダイム及び治療パラダイムにおいてＧＤ２−癌ワクチンとして有効である。細胞表面糖質を標的とし、治療パラダイムにおいて防御的な液性免疫応答及び細胞性免疫応答を迅速に誘発する、有効な抗腫瘍ワクチンが提供される。
【００３３】
ガングリオシドは細胞膜外葉に蓄積し、セラミド及び脂質は埋没し、糖質頭部は露出している。このことは、複雑なガングリオシドがネオ抗原であり、腫瘍マーカーとしての特徴を示すことから、免疫系による認識を可能にするはずである。さらに、抗原性のガングリオシドでさえ免疫原性が低い。免疫系は、糖質を「自己」として認識し応答を開始しないか、交差反応性の病理的応答を生じ得る（例えば、ギラン・バレー症候群は抗ＧＭ１抗体に起因するものである）。
【００３４】
免疫原性であり、腫瘍に対して選択的な免疫を生じさせるのに用いることができる、ＧＤ２及びＧＤ３の合成糖質類似体を作製した。
【００３５】
Ｇの類似体（ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２及びＧＴ１ｂのうちの少なくとも１つの類似体）は、多量体、すなわち二量体、三量体、四量体または適切な空間的配置を可能にするのに適した他の任意の形態であり得ると考えられる。
【００３６】
特に、ＧＤ２及びＧＤ３の類似体は多量体、すなわち二量体、三量体、四量体またはＧＤ２またはＧＤ３の適切な空間的配置を可能にするのに適した他の任意の形態であり得ると考えられる。本明細書に包含されるものには、本明細書に記載される糖質ガングリオシド類似体の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６の多量体がある。
【００３７】
下のスキーム１は、四量体形態のＧＤ２及びＧＤ３の免疫原性合成糖質類似体を示している。
【化４】
2016539172.tif 000006
【００３８】
類似体は本質的に、所望のＧＤ２またはＧＤ３とさらに共有結合しているスペーサーとの共有結合を可能にする中心多量体（または上に示す四量体）コアを含む。このようなスペーサーの典型的な例が−（Ｃ＝Ｘ）−であり、式中、Ｘは、ＮまたはＸである（−（Ｃ＝Ｓ）−または（Ｃ＝Ｏ）−など）。スペーサーは、イソシアナートまたはイソチオシアナートの化学反応を用いることによって導入することができる。図１ｃに具体例を示すが、この化学反応は上に開示したＧＤ２／ＧＤ３−アミノアリール化合物にも適用可能である。
【００３９】
好ましくは、中心コアは、スキーム２に概略的に記載されるように、多数の末端（すなわち、第一級）アミノ基が結合したエチレンジアミン残基を含む。
【化５】
2016539172.tif 000007
【００４０】
このようなコアの例としてはＰＡＭＡＭ化合物が考えられ、その多くが市販されている（ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍのＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｔａｌｏｇを参照されたい）。好ましくは、中心多量体コアは多数の末端（すなわち、第一級）アミノ基を有する。ＰＡＭＡＭ化合物の例としては、ジェネレーション０．０  ＰＡＭＡＭが挙げられる。
【化６】
2016539172.tif 000008
【００４１】
さらにジェネレーションの高いＰＡＭＡＭ化合物としては、末端−ＮＨ2がさらに（一部または全体が）残基：
【化７】
2016539172.tif 000009
で官能化されたＰＡＭＡＭが挙げられる。
【００４２】
このような高いジェネレーションのＰＡＭＡＭの一部分は以下のようなもの：
【化８】
2016539172.tif 000010
であり、式中、残りの「腕」（波線で示される）は任意にほかにも、さらに拡張することが可能な最大８の多量体になるようにアミドアミン残基を有し得る。
【００４３】
上に示したように中心コアがジェネレーション０．０である場合の四量体のＧ（ＧＤ２及びＧＤ３など）の免疫原性合成糖質類似体は、以下のように示すことができ：
【化９】
2016539172.tif 000011
式中、Ｇは上で定義される通りであるか、好ましくは
【化１０】
2016539172.tif 000012
であり、ＸがＯまたはＳであり、好ましくは、ＸがＳである。
【００４４】
ＧＤ２またはＧＤ３誘導体は、Ｔｏｎｇら，２０１０，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，１７：１８３の工程を修正して、ＧＤ２またはＧＤ３と中心多量体コアとの共有結合に用いることができるアミノ基を有する適切に官能化されたβ−Ｄ−ラクトピラノシドを用いると同時に、Ｇｉｌｂｅｒｔら，２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７７：３２７）に記載されている通りに合成することができる。例えば、官能化β−Ｄ−ラクトピラノシドは、Ｃ１−β−Ｄ−ラクトピラノシドアミノアリール誘導体また好ましくはアミノフェニル−β−Ｄ−ラクトピラノシドまたはより好ましくはｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−ラクトピラノシドであり得る。
【００４５】
官能化β−Ｄ−ラクトピラノシドは、中心多量体（または上に示される四量体）コアが共有結合できるようさらに誘導体化することができる。官能化β−Ｄ−ラクトピラノシドを適切な試薬と反応させて、活性化カルボニル残基を得ることができる。例えば、Ｃ１−アミノアリール誘導体または好ましくはアミノフェニル−β−Ｄ−ラクトピラノシドまたはより好ましくはｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−ラクトピラノシドをホスゲン、ジホスゲン、トリホスゲン、チオホスゲン、カルボニルジイミダゾール、ジスクシンイミジルカルボナートをはじめとする適切な試薬と反応させて、対応するイソシアナート、イソチオシアナート、カルボニルイミダゾリルまたはスクシンイミジルカルボニル誘導体を得ることができる。
【００４６】
次いで、中心多量体コアと、上記の活性化カルボニル残基を有する官能化β−Ｄ−ラクトピラノシドとを反応させて、所望の免疫原性分子を得ることができる。
【００４７】
別の合成方法として、最初に中心多量体コア（ＰＡＭＡＭなど）を適切な試薬と反応させて、上記の活性化カルボニル残基を得ることができる。次いで、アミノ基を含む官能化β−Ｄ−ラクトピラノシドを付加して、所望の免疫原性分子を得ることができる。
【００４８】
当業者には、追加の治療剤がさらに必要であるか、望まれる場合、比を容易に調節することが可能であることが明らかであろう。本明細書に記載される組合せの範囲には、特に限定されるわけではないが、原則的に癌の予防または治療に有用な任意の治療剤が含まれることが理解されよう。
【００４９】
治療に使用するのに必要な本発明の化合物の量は、選択する具体的な化合物のみならず、投与経路、治療が必要な病態の性状のほか、患者の年齢及び状態によっても異なり、最終的には担当医師の判断に委ねられることが理解されよう。
【００５０】
所望の用量は、都合に合わせて、単回投与でも、あるいはしかるべき間隔で、例えば、１日２回、３回、４回またはそれ以上投与する分割投与でも提供され得る。
【００５１】
医薬組成物としては、特に限定されないが、経皮投与または非経口（筋肉内、皮下及び静脈内を含む）投与に適した医薬組成物が挙げられる。
【００５２】
医薬組成物を調製する方法は、本明細書で定義される化合物と、薬学的に許容される補形剤とを一緒にする工程を含み得る。
【００５３】
本明細書で定義される化合物及び組合せはこのほか、（例えば、注入、例えばボーラス注入または持続注入による）非経口投与用に製剤化してもよく、またアンプル、予め充填したシリンジ、小容量輸液または保存剤を添加した多回投与容器に入れた単位投与形態で提供してもよい。組成物は、懸濁剤、液剤または油性もしくは水性媒体を用いた乳剤の形態をとってもよく、また懸濁化剤、安定剤及び／または分散剤などの製剤用剤を含有してもよい。あるいは、有効成分は、使用前に適切な溶媒、例えば滅菌水または生理食塩水で構築できるように、滅菌固体の無菌単離または溶液からの凍結乾燥によって得られる粉末形態であってもよい。
【００５４】
具体的な実施形態を以下及びそれに続く実施例に記載する。
【００５５】
セラミド及び脂質に代わってアミノフェニル基を有する以外は正確なＧＤ２糖質構造を有するアミノフェニルエーテル−ＧＤ２類似体（本明細書ではＡＰ−ＧＤ２）を開示する（図１Ｂを参照されたい）。この類似体は水溶性である。ＡＰ−ＧＤ２では、フェニル基と１番目の糖との間の結合は、β配置であるのが好ましく、これは、天然のガングリオシドでセラミドと１番目の糖との間にみられる立体配置である。この結合は、糖質全体を通じて適切で均一な構造を示すのに極めて重要である。予測される質量及び立体配置をそれぞれ質量分析（図２Ａ）及びＮＭＲ分光測定（図２Ｂ）により確認した。
【００５６】
ＡＰ−ＧＤ２をその対応するイソチオシアナトフェニル類似体に変換し、この中間体を四価ＰＡＭＡＭ  Ｇ０リンカー樹状コアの末端遊離アミンと結合させた（図１Ｃ）。ＨＭＢＣのスペクトルに見られる１７８ｐｐｍにおける炭素化学シフト（ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨＰｈ）により、ＡＰ−ＧＤ２とＰＡＭＡＭ  Ｇ０リンカーとの間にチオウレア架橋が形成されたことを確認した。１Ｄ−1Ｈ−ＮＭＲにより四量体生成物の形成を確認した。１Ｄ−1Ｈ−ＮＭＲスペクトルから、いずれの糖単位についても単一シグナルパターンが見て取れたほか、アミドＮＨ、ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨＰｈ、Ｈ−オルト、Ｈ−メタ、ＮＨＡｃ／ＣＨ3／ＨaxまたはＨeqの比が４０：３６：８であることがわかり、ＧＤ２デンドリマーが確かに四価であることが示された（図２Ｃ）。
【００５７】
腫瘍治療の研究に免疫原として使用するテトラＧＤ抗原を設計した。有望な免疫原としてテトラＧＤ２を設計する理論的根拠は、以下の概念に基づくものであった。第一に、テトラＧＤ２を提示する方が、膜ラフトに通常集積するＧＤ２のオリゴマー提示をより厳密に模倣し得る。第二に、糖ＡＰ−ＧＤ２類似体は、穏やかな条件下でＰＡＭＡＭリンカーと室温で容易にコンジュゲートさせることができる。第三に、化学酵素合成によりグリコシド結合のしかるべき立体配置が確実に得られ、ひいては糖質全体の立体配置が維持される。第四に、抗原が化学的に均一で十分に特徴付けられたものとなる。第五に、得られる生成物が水溶性で安定なものとなる。これらの特徴はいずれもワクチンに望ましいものであり、本明細書に開示されるＡＰ−ＧＤ３になり得る。
【００５８】
マウスをテトラＧＤ２で最大４回免疫化した。各免疫化から４日後、血清を採取し、試料の抗ガングリオシド抗体の有無を検査した。テトラＧＤ２で免疫化することにより、マウス２５匹のうち２２匹（８８％）に腫瘍マーカーであるＧＤ２ガングリオシド及びＧＤ３ガングリオシドに対して高力価で選択的な抗血清が生成された。
【００５９】
ＦＡＣＳｃａｎアッセイのデータから、免疫化マウスの血清に腫瘍細胞の細胞表面ＧＤ２及びＧＤ３と選択的に反応する抗体が認められることがわかった（図３Ａ及び表１を参照されたい）。免疫化マウスの血清には、ＩｇＧアイソタイプ及びＩｇＭアイソタイプ（使用したアイソタイプ特異的二次試薬に基づく）の抗体が含まれていた。血清はＥＬ４−ＧＤ２+細胞及び／またはＥＬ４−ＧＤ３+細胞と結合した。陰性対照である免疫前正常マウスの血清（ＮＭＳ）に反応性は認められなかった。陽性対照のｍＡｂは、ＥＬ４−ＧＤ２+細胞がＧＤ２を発現するがＧＤ３は発現せず、ＥＬ４−ＧＤ３+細胞がＧＤ３は発現するがＧＤ２は発現しないことを示している。細胞対照では、血清は、ＧＤ２もＧＤ３も発現しないが、その他の多くのガングリオシド、例えばＧＭ１などを発現するＪｕｒｋａｔ細胞とは結合しなかった。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
ほかにも、血清が固定化したガングリオシドと直接結合するどうかをＥＬＩＳＡにより検討した。ガングリオシドＧＤ２、ＧＤ３または対照をプレートに固定化し、示した被験血清及び対照免疫前血清の希釈物をアッセイした。ワクチン接種により生成した抗体はＧＤ２と選択的に結合した（図３Ｂを参照されたい）。循環血中抗ＧＤ２  ＩｇＧをバックグラウンドの約２倍に増加させるのに１回の免疫化で十分であり、追加免疫後にはバックグラウンドの約３倍に増加した（図３Ｃ）。抗体はＧＤ３とも結合したが、ＧＭ１とは結合しなかった。抗ＧＤ２  ＩｇＧアイソタイプ及び抗ＧＤ２  ＩｇＭアイソタイプの両方が検出された。ＩｇＧアイソタイプは各追加免疫の後に増加し、Ｂ細胞成熟及びクラススイッチングが示唆された（図３Ｃ）。これらのＥＬＩＳＡのデータは、ＦＡＣＳｃａｎによって得られた結果と一致する。
【００６２】
テトラＧＤ２をワクチン接種したマウスの抗体は、培養ＥＬ４−ＧＤ２+細胞を死滅させた（図３Ｄ）。ＥＬ４−ＧＤ２+細胞は補体の非存在下で免疫血清によって死滅したが、この効果はいくつかの抗ＧＤ２  ｍＡｂで報告されている（Ｙｏｓｈｉｄａら，２００１，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，６１：４２４４）（例えば、ｍＡｂ  ３Ｆ８は細胞を死滅させるが、ｍＡｂ  ＭＥ３６１は死滅させない）。さらに、生体染色色素のトリパンブルーで染色された細胞をカウントし、その形態を評価することにより、ＥＬ４−ＧＤ２+細胞に対する殺作用が確認された。
【００６３】
以上のデータを考え合わせると、テトラＧＤ２が細胞傷害性液性免疫を生じさせ成熟させる免疫原であることが裏付けられる。
【００６４】
糖ペプチドワクチンは、組織適合性クラスＩＩ（ＭＨＣ  ＩＩ）と結合することによって適応免疫系を活性化し得ることが示されている（Ａｖｃｉら，２０１１，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１７：１６０２）。このことから、Ｔ細胞性免疫がテトラＧＤ２によっても活性化され得ることが示唆された。したがって、3Ｈ−チミジン取込みを測定する混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で一次Ｔ細胞を試験した。Ｔ細胞活性化の標的細胞刺激細胞として、マイトマイシン処理ＥＬ４−ＧＤ２+細胞を用い、陰性対照としてＪｕｒｋａｔ細胞（ＧＤ２-）を用いた（図４Ａ）。マイトマイシンで処理したＥＬ４−ＧＤ２+細胞にもＪｕｒｋａｔ細胞にも、3Ｈ−チミジンの取込みはみられず（それぞれ１８８±４ｃｐｍ及び１０７±５ｃｐｍ）、したがって、両細胞は刺激細胞としてのみ作用する。
【００６５】
テトラＧＤ２で２回ワクチン接種したマウスのＴ細胞は、ＥＬ４−ＧＤ２+細胞で攻撃を誘発した場合、盛んに増殖したが、Ｊｕｒｋａｔ細胞で攻撃を誘発した場合、増殖しなかった。対照細胞では、ワクチン接種していないマウスのＴ細胞は、ＥＬ４−ＧＤ２+細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞のいずれを用いて攻撃を誘発しても増殖しなかった。陽性対照では、ＣｏｎＡで処理すると、対照マウスまたはワクチン接種マウスのＴ細胞増殖が同程度刺激された（それぞれ２１，４５７±５０４ｃｐｍ及び１９，８３４±３０９ｃｐｍ）。各グループの増殖Ｔ細胞数をトリパンブルー排除法によりカウントした関連するアッセイでも、ほぼ同じデータが得られた（図４Ｂ）。これらのアッセイでは、テトラＧＤ２をワクチン接種したマウスから得られた応答Ｔ細胞４０，０００個を、刺激細胞であるＪｕｒｋａｔまたはＥＬ４の生細胞とともに播種した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで７日後、ＥＬ４標的細胞がすべて死滅したのに対し、Ｊｕｒｋａｔ細胞は生存し、増殖していた。
【００６６】
以上のデータを考え合わせると、テトラＧＤ２が細胞性免疫を生じさせる免疫原であることが裏付けられる。
【００６７】
腫瘍予防パラダイムでは、侵襲性及び転移性が極めて高い同系ＥＬ４−ＧＤ２+細胞を免疫適格Ｃ５７／Ｂｌ６マウスの腹腔内に１週間置きに２回注射し、次いで皮下に移植して免疫化した。ＥＬ４細胞は同系細胞であり、上記のマウスで極めて短期間のうちに増殖し転移する。いずれの測定日（腫瘍移植後第１１日、第１４日、第１６日）にも、免疫化マウス（５≦ｎ≦９）に対照マウスよりも大きさが有意に小さい原発性腫瘍が認められた（図５Ａ）。この腫瘍予防ワクチンの実験を独立させて３回再現した（総個体数は免疫化マウスがｎ＝２２、対照マウスがｎ＝２２であった）。全３回の独立した実験を比較するため、各実験の第１６日の対照マウスの平均腫瘍体積を１００％に正規化した。この基準を用いたところ、免疫化マウスの腫瘍体積は全体で約５７％減少していた（図５Ｂ）。
【００６８】
腫瘍治療パラダイムでは、最初にＥＬ４−ＧＤ２+細胞をマウスに移植し、腫瘍が肉眼／触知で確認できたとき、マウスをテトラＧＤ２または対照溶媒で２回免疫化した。この臨床的にさらに重要なパラダイムでは、いずれの測定日にも、対照マウスに比して免疫化マウス（４≦ｎ≦６）に原発性腫瘍成長の有意な遅延が認められた（図５Ｃ）。１８日後、全対照マウスに平均約６，０００ｍｍ3の原発性腫瘍及び広範囲に及ぶリンパ節転移が認められた。これに対し、免疫化マウスには約２，３００ｍｍ3の原発性腫瘍が認められた。
【００６９】
腫瘍治療ワクチンのデータを２つの独立した実験で再現した（免疫化マウスはＮ＝１３、対照マウスはｎ＝１８であった）。全実験を比較するため、各実験の第１８日の対照マウスの平均腫瘍体積を１００％に正規化した。この基準を用いたところ、免疫化マウスの腫瘍体積は全体で約５１％減少していた（図５Ｄ）。
【００７０】
皮下腫瘍担持マウスにテトラＧＤ２免疫化ドナーマウスから精製したＴ細胞４×１０6個を腹腔内注射により投与した。いずれの測定日にも、対照未処置マウス（ｎ＝６）に比して養子移植マウス（ｎ＝６）に原発性腫瘍成長の有意な遅延が認められた（図５Ｅ）。腫瘍成長の１４日後、対照群に平均約１２００ｍｍ3の原発性腫瘍が認められた。これに対し、養子移植群には約５００ｍｍ3の原発性腫瘍が認められた。
【００７１】
リンパ節及び胸腺はＥＬ４腫瘍で観察される主要な転移部位であるが、養子移植群にはいずれの器官にも転移の証拠が全くみられなかったのは注目すべきことである。ＥＬ４腫瘍転移により、組織の腫大及び定量化が可能な対応する体重増加が起こる。腫瘍担持マウス（ｎ＝６）には、腫瘍を担持しない未処置マウスよりも大きいリンパ節が認められ、その大きさは無感作マウスの約１０倍増大している。Ｔ細胞の養子移植を実施した腫瘍担持マウス（ｎ＝６）にはこれより小さく、正常なリンパ節と同程度の大きさのリンパ節が認められた（図５Ｆ）。
【００７２】
ワクチン接種後に活性化されたＴ細胞についてさらに、ＣＤ４及びＣＤ８表現型の特徴を明らかにした。ワクチン接種した腫瘍担持マウスまたは対照マウスからＴ細胞を単離し、プラスチックにＧＤ２を固定化したディッシュでその細胞を培養した。ワクチン接種マウスのＴ細胞はＧＤ２でコートしたディッシュで盛んに増殖した。これに対し、対照マウスのＴ細胞はＧＤ２でコートしたディッシュで増殖しなかった。いずれのマウスも腫瘍を担持し、ＧＤ２に曝露するが、この抗原に応答することができるのはワクチン接種したマウスのみである。培養物の特徴を明らかにするＦＡＣＳｃａｎアッセイでは、増殖細胞の表現型が主としてＣＤ８+であることがわかった。増殖細胞ではＣＤ８サブセットの拡大によりＣＤ４／ＣＤ８比が変化したのに対し、対照マウスのＴ細胞では正常なＣＤ４／ＣＤ８比が維持された（図６）。
【００７３】
以上のデータは、ワクチン接種後に活性化されたＴ細胞が、抗原提示細胞の非存在下で、固定化された（多価）抗原に応答し得ることを示している。
【００７４】
原発性腫瘍から作製した免疫染色凍結切片により腫瘍浸潤リンパ球の存在が確認された。ＥＬ４腫瘍は「ダブルネガティブ」Ｔ細胞であり、抗ＣＤ４抗体でも抗ＣＤ８抗体でも染色されない。免疫化マウスのＴ細胞を養子移植したマウスでは、原発性腫瘍に浸潤したＣＤ８+細胞の数が、養子移植を実施しなかった腫瘍担持マウスに比して有意に多かった。両群とも、抗ＣＤ４抗体により浸潤ＣＤ４+細胞が検出された。
【００７５】
以上のデータを考え合わせると、腫瘍が定着した後にワクチンを投与する現実的な治療パラダイムにおいて、原発性腫瘍成長及び腫瘍転移を管理するにはワクチン接種で十分であることがわかる。
【００７６】
有効な糖質免疫原及び治療用癌ワクチンとして新規な四価ＧＤ２糖質デンドリマーが開発された。合成免疫原の生物物理学的特徴付けから、それが所望のβ結合を維持する均一な四量体であることがわかった。免疫系にオリゴマー糖質構造を提示すると、腫瘍膜のラフトＧＤ２を模倣することによって、より本物に近い細胞傷害性抗腫瘍応答が刺激され得る。ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの生物学的研究から、ワクチンが抗ＧＤ２細胞傷害性抗体及び細胞傷害性細胞性免疫を誘導することがわかった。ワクチンにより誘発された免疫は、定着した腫瘍の成長及び転移を遅らせることができる。本明細書に開示されるｉｎ  ｖｉｖｏの研究は、ガングリオシドワクチンが腫瘍の成長を阻害し得るだけでなく、定着した腫瘍の成長も抑制し得ることを裏付けるものである。
【００７７】
本明細書に記載される四価ＧＤ２糖質デンドリマーに関して得られたデータから、これ以外にも、糖質を標的とし、ＧＤ３などの他の腫瘍関連ガングリオシドに適合した癌ワクチンが本明細書に包含される。ＡＰ−ＧＤ２と同じく、アミノフェニルエーテル−ＧＤ３類似体から調製される四量体ＧＤ３糖質が本明細書に開示され（図１Ｂ）、この糖質は、天然に存在するＧＤ３の本来の構造的特徴を保存しており、免疫原性を示し、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞傷害性抗ガングリオシド液性応答及び細胞性応答を誘発することが予測される。
【００７８】
ＡＰ−ＧＤ２について記載したものと同じ合成戦略を用いて、ＧＤ３デンドリマー（テトラＧＤ３）類似体を作製し、免疫化を２回実施したところ、高力価の抗ＧＤ３抗体が検出された。図７に示されるように、テトラＧＤ３を用いたワクチン接種により誘発された液性免疫が検出された。
【００７９】
この新規なＧＤ３ワクチンを抗癌剤としてｉｎ  ｖｉｖｏで評価したところ、いずれの測定日にも、免疫化マウスに大きさが対照マウスよりも有意に小さい原発性腫瘍が認められるほか（図８）、リンパ節（図９）にも肺（図１０）にも実質的に転移が認められないことが明らかになった。ＧＤ３ワクチンによりメラノーマ肺転移が減少する（図１０）。したがって、新規な四価ＧＤ３糖質デンドリマーが有効な糖質免疫原及び治療用癌ワクチンとして開発された。
【００８０】
本開示は、その範囲を限定するのではなく、実施形態を例示するために記載する以下の実施例を参照することにより、さらに容易に理解されよう。
【実施例】
【００８１】
実施例Ｉ
合成ＡＰ−ＧＤ２及びテトラＧＤ２デンドリマー
のちのデンドリマーとのコンジュゲーションのために、本来報告されているチオ−フェニル類似体をｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−ラクトピラノシド（ＡＰ−Ｌａｃ）（Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）に置き換えて、フェニルチオ−ＧＤ２の工程（Ｔｏｎｇら，２０１０，Ｃｅｈｍ  Ｂｉｏｌ，１７：１８３）を修正することにより、記載されている（Ｇｉｌｂｅｒｔら，２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７７：３２７）通りに糖質を合成した（以下を参照されたい）。ＡＰ−ＧＤ２は水溶性（２０ｍｇ／ｍｌ超）であり、サイズ排除（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ３０  １６ｍｍ×８５ｃｍカラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ社）により９９％超の純度まで精製された。ＡＰ−ＧＤ２の分子量の測定値は１２１８ｇ／ｍｏｌであり、予測値と一致していた。１Ｄ及び２Ｄ  ＮＭＲ分光測定ならびに質量分析（ＥＩ−ＭＳ）により構造を確認した（図２Ａ及び２Ｂ）。ＡＰ−ＧＤ２の化学酵素合成では、純物質の最終収率は約９０％超であった。
【００８２】
８０％エタノール（３００μｌ）にＡＰ−ＧＤ２（２ｍｇ）を溶かした溶液を攪拌しながら、これにチオホスゲン（２μｌ）を加え、混合物を室温で３時間静置し、この時点で、薄層クロマトグラフィー（酢酸エチル−メタノール、４：１）により、出発物質がすべて反応し、単一の生成物が形成されたことが示された。ほぼ乾燥するまで濃縮して固体とし、水を加えた。生成物をろ過して水で洗浄し、イソチオシアナトフェニルＧＤ２溶液が得られたら、これを凍結乾燥させて白色粉末にした（１．８ｍｇ、収率９０％）。ＰＡＭＡＭ  Ｇ０（Ｄｅｎｄｒｉｔｅｃｈ社）のメタノール溶液の揮発性物質を減圧下で蒸発させ、得られた残渣をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶かした。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．５μｌ）とＰＡＭＡＭ  Ｇ０（０．８５４μｇ／μｌを２μｌ）のＤＭＦ溶液（１００μｌ）を攪拌しながら、これにイソチオシアナトフェニルＧＤ２（１．８ｍｇ）のＤＭＦ（１１０μｌ）溶液を滴加した。ＴＬＣにより出発物質が全く検出されなくなるまで、反応物を室温で２０時間攪拌した。反応混合物を水３ｍｌで希釈し、水に対して透析した（ＭＷカットオフ２ｋＤａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）。得られた溶液を凍結乾燥させて、白色粉末の四価ＰＡＭＡＭ系ＧＤ２を収率８０％（１．３４ｍｇ）で得た。１Ｄ及び２Ｄ  ＮＭＲ分光測定により四価ＰＡＭＡＭ系ＧＤ２を確認した。ＡＴＣＣからマウスリンパ腫ＥＬ４−ＧＤ２+細胞（野生型ＥＬ４細胞）及びＪｕｒｋａｔ白血病細胞を入手した。抗ＧＤ２  ｍＡｂによるＥＬ４−ＧＤ２+のネガティブ選択、次いで限界希釈サブクローニングによりＥＬ４−ＧＤ３+細胞を作製した。ＥＬ４−ＧＤ３+細胞は安定であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの増殖特性及び動態がＥＬ４−ＧＤ２+細胞と同じである。全細胞を３７℃、５％ＣＯ2の加湿雰囲気中、５％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ及びペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｗｉｓｅｎｔ社）で増殖させた。フローサイトメトリーにより、いずれの細胞系も細胞表面ＧＭ１を同レベルで発現することがわかった。フローサイトメトリー及びガングリオシド抽出物の薄層クロマトグラフィーにより、ＥＬ４−ＧＤ２+細胞はＧＤ２を発現するがＧＤ３は発現せず、ＥＬ４−ＧＤ３+細胞はＧＤ３を発現するがＧＤ２は発現せず、Ｊｕｒｋａｔ細胞はＧＤ２もＧＤ３も発現しないことが確認された。
【００８３】
実施例ＩＩ
テトラＧＤ２のｉｎ  ｖｉｖｏの特徴付け
ＦＡＣＳ及びＥＬＩＳＡによる血清の特徴付けのための免疫化
テトラＧＤ２（５０μｇ）のＰＢＳ溶液をＣ５７／Ｂｌ６マウスの腹腔内に投与した。１０日後、ＰＢＳ溶液をマウスの腹腔内（２５μｇ）及び皮下（２５μｇ）に投与して再び免疫化した。４日後、分析用に血液試料を採取した。
【００８４】
ＦＡＣＳｃａｎ：２×１０5個のＥＬ４−ＧＤ２+細胞、ＥＬ４−ＧＤ３+細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ＮａＮ３）で洗浄し、マウス抗血清（１：５０希釈）２μｌまたは陽性対照の抗ＧＤ２  ｍＡｂ（１３ｎＭ）もしくは抗ＧＤ３  ｍＡｂ（１３ｎＭ）と氷上で２０分間インキュベートした。細胞を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＩｇＧまたはＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ社）と氷上で２０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）で新たに調べ、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータを解析した。陰性対照抗体としてマウスＩｇＧまたはＩｇＭ及び正常マウス血清を用いた。陰性対照細胞としてＪｕｒｋａｔ細胞を用いた。
【００８５】
直接結合ＥＬＩＳＡ：ガングリオシド（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍｉｃａｌ社）をポリスチレン製Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｓｔｒｉｐ  Ｗｅｌｌ  ９６ウェルプレート（１０ｎｇ／ウェル）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に固定化した。次いで、０．５％ウシ血清アルブミン（ＰＢＳ−０．５％ＢＳＡ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水でウェルを１時間「ブロック」した。被験血清、対照の前採血マウス血清、マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社）または特異的抗ガングリオシドモノクローナル抗体を含む一次抗体をウェルに加え、２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−０．５％ＢＳＡで３回洗浄し、次いでマウスＩｇＧアイソタイプまたはマウスＩｇＭアイソタイプに特異的な西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗マウス抗体（Ｓｉｇｍａ社）で洗浄した。ＰＢＳ−０．５％ＢＳＡで３回、ＰＢＳで２回洗浄した後、発色基質ＴＭＢ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を加え、０．５Ｎ  Ｈ2ＳＯ4で反応を停止させた。４５０ｎｍでプレートを読み取った（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｌｕｓ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）（３１）。
【００８６】
血清アイソタイピング：毎回免疫化を実施した後に、毛細管血液採取システム（Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ、Ｓａｒｄｓｔｅｄｔ社）を用いて血液を採取し、室温で５分間、１００００×ｇで遠心分離して血清を分離した。次いで、マウスサブアイソタイピングキット（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、カタログ番号３８６４４５）を製造業者の仕様書の通りに用いて、血清中に存在するＩｇのアイソタイピングを実施した。実験は各血清について３連で４回実施した。
【００８７】
ＭＴＴアッセイによる細胞傷害性の評価
示される試薬を添加した通常培地でＥＬ４−ＧＤ２+細胞（Ｃｏｒｎｉｎｇ社の９６ウェルプレートに５，０００個／ウェル）を培養した。２４時間後、テトラゾリウム塩試薬（ＭＴＴ、Ｓｉｇｍａ社）及びＵＶ吸収を用いて細胞の生存／代謝プロファイルを定量化した。アッセイは４連で５回実施した。被験試薬には陽性対照抗ＧＤ２  ｍＡｂ（最終濃度７ｎＭ）、陰性対照正常マウスＩｇＧ（最終濃度７ｎＭ）が含まれる。無感作マウス（陰性対照）または腹腔内２回ワクチン接種した被験マウスから血清を採取した。上記の実験では、第３日及び第１０日にワクチン接種を実施し、第１３日に血清を採取した。血清採取の時間は腫瘍治療パラダイムの時間表に準じるものとした（以下を参照されたい）。血清を半精製し、約５０μｇ／ウェルの血清抗体を用いた。血清抗体のごく一部が抗ガングリオシド抗体であるのに対し、ｍＡｂ対照は抗ガングリオシドＩｇＧを１００％が含有する。
【００８８】
3Ｈ−チミジン組込みアッセイによる混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の評価
ＥＬ４−ＧＤ２+細胞及び対照Ｊｕｒｋａｔ細胞を２５μｇ／ｍｌマイトマイシン（Ｓｉｇｍａ社）で１時間処理して、その増殖を停止させた。細胞を培地で３回洗浄してマイトマイシンを除去した後、９６ウェルプレートに２×１０5細胞／ウェルで播いた。２回免疫化した（上記の通り）マウス及び溶媒を注射した対照マウスから脾細胞の単細胞懸濁液を得た。ＥＡＳＹＳＥＰＴＭマグネット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈ社）のプロトコルに従って細胞を分離した。各マウスの脾臓からほぼ同量のＴ細胞を得た（純度９５％超、データ不掲載）。このＴ細胞をマイトマイシンで処理したＥＬ４細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞と１０：１の比で播いた。対照として、Ｔ細胞単独（刺激腫瘍細胞を含まない）またはコンカナバリンＡ（ＣｏｎｃａｎａｖｉｌｉｎＡ）で処理したＴ細胞を用いた。培養から５日後、3Ｈ−チミジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を０．１μＣｉ／ウェルで加えた。ＤＮＡに取り込まれた3Ｈ−チミジンを液体シンチレーションによりカウントし、データを平均ｃｐｍ±ｓｄで報告する。
【００８９】
実施例ＩＩＩ
腫瘍予防試験
腫瘍予防試験のための免疫化
１週間置きに４回（毎回５０μｇ）、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内にワクチン接種した。対照マウスには溶媒のみを注射した。４回目のワクチン接種から１週間後、５×１０5個のＥＬ４−ＧＤ２+を皮下に注射した。腫瘍による攻撃誘発から１０日後、示される腫瘍移植後の時間に腫瘍を測定した。
【００９０】
腫瘍治療試験のための免疫化
ＥＬ４−ＧＤ２+細胞５×１０5個をＣ５７ＢＬ／６マウスの左側腹部の皮下に注射した。３日後、腫瘍が肉眼／触知で確認できたとき、マウスを無作為に割り付け、右側腹腔内に溶媒対照またはテトラＧＤ２デンジマー（ｄｅｎｄｉｍｅｒ）（ＰＢＳ中５０μｇ）を２回ワクチン接種した。
【００９１】
養子Ｔ細胞移植治療試験
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内にテトラＧＤ２  ５０μｇを２回（１週間置きに）ワクチン接種した。２回目の免疫化から７日後、ＥａｓｙＳｅｐ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｅｍｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて脾臓及びリンパ節からＴ細胞を単離した。養子移植の３日前に皮下にＥＬ４−ＧＤ２+細胞を２．５×１０5個注射したＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内にＴ細胞約４×１０6個を注射した。示される時間に腫瘍を測定し、腫瘍移植から１４日後、同側の鼠径リンパ節及び腋窩リンパ節を解剖し転移を評価するため、マウスを安楽死させた。
【００９２】
腫瘍成長の評価
原発性腫瘍をデジタルノギスで測定し、以下の方程式：Ｖ（ｍｍ3）＝０．５×幅×（長さ）2によりデータを解析した。マウスを安楽死させた後、解剖し、リンパ節及び胸腺（ＥＬ４細胞がホーミングすることが知られている器官）への転移の証拠があるかどうかを顕微鏡により検討した。
【００９３】
スチューデントの両側ｔ検定により、ｐ＜０．０５（*）及びｐ＜０．０１（**）を有意として２つのグループの腫瘍成長の差を解析した。ほかにも、チューキー・クラマー多重比較試験を用いた一元配置ＡＮＯＶＡで５つの異なるグループを比較した。各結果の間にみられる差がｐ＜０．０５（*）及びｐ＜０．０１（**）であれば有意とした。
【００９４】
実施例ＩＶ
テトラＧＤ３のｉｎ  ｖｉｖｏの特徴付け
安全性。ワクチン接種マウスに既知の副作用から予測され得る有害作用の徴候は全く認められなかった。測定した評価項目はいずれも、ＧＤ２またはＧＤ３抗原の形態を用いた臨床試験で問題となることが報告されているもの（痛覚過敏、挙動、運動及び学習／記憶の変化）を含め、陰性であった。過免疫化マウスに正常なガングリオシドに対する交差反応免疫は認められず、血液プロファイル、肝酵素プロファイル、腎酵素プロファイルのいずれにも全く変化が見られなかった。
【００９５】
実施例Ｉに記載したものと同じ合成戦略を用いて、ＧＤ３デンドリマー（テトラＧＤ３）類似体を作製した。免疫化を２回実施した後、高力価の抗ＧＤ３抗体が検出されたが、抗ＧＭ１  Ａｂは検出されなかった。上記の通り、安全性評価で問題はみられなかった。
【００９６】
図７は、テトラＧＤ３のワクチン接種により誘発された液性免疫を示している。ＩｇＧサブクラスの抗ＧＤ３反応性抗体を示す血清の代表的なＥＬＩＳＡのデータ。陰性対照は正常マウスのワクチン接種前の血清及びマウスＩｇ（Ｓｉｇｍａ社）である。結合がＧＤ３に選択的であるのに対して、ＧＭ１  ＥＬＩＳＡプレートは陰性である（不掲載）。示されるデータはｎ＝８の各試料の平均±ｓｅｍである。
【００９７】
新規なＧＤ３ワクチンを抗癌剤としてｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。ＧＤ３を高レベルで発現するＥＬ４−ＧＤ３+を用いた。予防パラダイムでは、マウスを２回免疫化した後、侵襲性の極めて高い同系ＥＬ４−ＧＤ３+を移植した。臨床的に重要な腫瘍治療モデルでは、定着した皮下腫瘍を担持するマウスにワクチン接種ドナーマウスのＴ細胞を養子移植した。両パラダイムとも、いずれの測定日にも免疫化マウスに対照マウスよりも大きさが有意に小さい原発性腫瘍が認められ（図８）、リンパ節（図９）及び肺（図１０）への転移は実質的に認められなかった。
【００９８】
図８は、テトラＧＤ３のワクチン接種によりＧＤ３+腫瘍による攻撃誘発から保護されるという結果を示している。マウスの腹腔内にテトラＧＤ３（２回、１週間置き、毎回１０μｇ／マウス、アジュバントを含まない）をワクチン接種した後、ＥＬ４−ＧＤ３+細胞による皮下腫瘍移植を実施した。原発性腫瘍の平均体積±ｓｄ。
【００９９】
図９は、テトラＧＤ３のワクチン接種によりＧＤ３+腫瘍による攻撃誘発から保護されるという結果を示している。マウスの腹腔内にテトラＧＤ３（２回、１週間置き、毎回１０μｇ／マウス、アジュバントを含まない）をワクチン接種した後、ＥＬ４−ＧＤ３+細胞による皮下腫瘍移植を実施した。リンパ節の平均体積±ｓｄ（リンパ節内のＥＬ４細胞を検出することによって測定される転移の指標）、各グループともｎ＝８。例としてリンパ節が示されている。
【０１００】
図１０は、ＧＤ３ワクチンがメラノーマ肺転移を減少させるという観察結果を示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈内にＢ１６−ＧＤ３メラノーマ細胞５×１０5個を注射した。３日後、マウスを無作為に割り付け、腹腔内に２回ワクチン接種した。１４日後、マウスを屠殺した。転移性小結節の黒点を有する肺を定量化した（腫瘍にはメラニンが含まれており、容易に確認することができる）。
【０１０１】
ここまで、本発明をその特定の実施形態に関連させて説明してきたが、これにさらなる修飾を施すことが可能であるほか、本願が本発明の任意の変更、使用または適応を包含することを意図するものであるとともに、本発明が属する分野の既知のまたは慣例的な実施の範囲内にあり、上に記載した本質的な特徴に適用され得るものであり、また添付の「特許請求の範囲」の範囲内に従うものであることが理解されよう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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