(57)【要約】患者への同時再注入のために、患者のベッドサイドにおいて調整自己血小板溶液の産生を提供する、デバイス、システム、および方法の実施形態が、本明細書に開示される。ある実施形態では、限定ではないが、採血、血小板溶解、溶液調製、および患者への再注入を含む、ステップのすべてが、患者を再配置せずに、単回の診察所訪問または診療所訪問において達成され得る。したがって、本明細書に開示される装置、デバイス、およびシステムは、概して、血小板含有溶液を受容し、血小板含有溶液中で１つ以上の血小板体の溶解を誘発し、患者への注入のために好適な様式において、結果として生じる調整血小板溶液を提供するように構成される、実質的に独立型の機械、デバイス、またはシステムを含む。
2016504165.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デバイスであって、
筐体と、
血小板含有溶液の流入を提供する、前記筐体の中への流入ポートと、
前記流入ポートと流体連通し、前記筐体内部に位置付けられる溶解／活性化チャンバであって、前記デバイスに流入される前記血小板含有溶液中の１つ以上の血小板は、前記溶解／活性化チャンバ内において溶解または活性化を受けさせられ、それによって、調整溶液を作る、溶解／活性化チャンバと、
前記溶解／活性化チャンバと流体連通し、流出ポートを通して取り出される前記調整溶液を提供する、前記筐体からの流出ポートと、
を備える、デバイス。
【請求項２】
前記溶解／活性化チャンバと熱連絡する加熱および冷却モジュールをさらに備え、前記加熱および冷却モジュールは、前記溶解／活性化チャンバ内部で前記血小板含有溶液の１つ以上の血小板の熱溶解または活性化を提供する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記溶解／活性化チャンバは、ある長さの使い捨て滅菌チューブを備える、請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記加熱および冷却モジュールは、前記溶解／活性化チャンバ内部で、前記血小板含有溶液を、全体的にまたは部分的に凍結させ、そして全体的にまたは部分的に解凍させる、請求項２に記載のデバイス。
【請求項５】
前記加熱および冷却モジュールは、前記溶解／活性化チャンバ内部で、前記血小板含有溶液に、１回より多くの凍結および解凍サイクルを受けさせる、請求項４に記載のデバイス。
【請求項６】
前記筐体の中への、前記溶解／活性化チャンバと連通する少なくとも１つの補助流入ポートをさらに備え、前記補助流入ポートは、前記溶解／活性化チャンバ内部で１つ以上の血小板の溶解または活性化を生じさせるために、前記血小板含有溶液と接触する物質の導入を提供する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項７】
前記筐体内部にある少なくとも１つの音響変換器をさらに備え、前記音響変換器は、前記溶解／活性化チャンバに機械的に結合され、前記音響変換器は、前記溶解／活性化チャンバ内において血小板含有溶液中の１つ以上の血小板の超音波溶解または活性化を生じさせるために、音響エネルギーを前記溶解／活性化チャンバに通すように構成される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項８】
前記溶解／活性化チャンバはさらに、前記溶解／活性化チャンバ内部に血小板を維持しながら、前記流出ポートから流体の除去を提供する、前記流出ポートと動作可能に関連付けられるフィルタを備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項９】
前記フィルタは、０．４５μｍまたはそれ未満のフィルタ孔径を有するＰＶＤＦまたはＰＥＳフィルタを備える、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記フィルタは、０．２２μｍまたはそれより大きいフィルタ孔径を有するＰＶＤＦまたはＰＥＳフィルタを備える、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記筐体内部に真空システムをさらに備え、前記真空システムは、前記流出ポートと動作可能に関連付けられ、前記血小板含有溶液からの血漿の採取を提供する、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記溶解／活性化チャンバに結合され、前記筐体内部での前記溶解／活性化チャンバの回転を提供する回転デバイスをさらに備える、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１３】
方法であって、
血小板含有溶液を、筐体を有するデバイスの流入ポートの中に導入するステップと、
前記血小板含有溶液を、前記流入ポートから前記筐体内部にある溶解／活性化チャンバまで流動させるステップと、
前記溶解／活性化チャンバ内において、前記血小板含有溶液中の１つ以上の血小板の溶解または活性化を生じさせ、調整溶液を作るステップと、
前記筐体の流出ポートを通して前記調整溶液を収集するステップと、
を含む、方法。
【請求項１４】
患者への前記調整溶液の再注入をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
血小板溶解または活性化は、前記溶解／活性化チャンバ内において、前記血小板含有溶液を循環的に冷却および加熱して、前記血小板含有溶液中の１回以上の部分的または完全な凍結および解凍サイクルを生じさせることによって、前記溶解／活性化チャンバ内部でもたらされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
血小板溶解または活性化は、前記溶解／活性化チャンバ内において、前記血小板含有溶液と、溶解または活性化誘発剤を混合することによってもたらされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
血小板溶解または活性化は、前記溶解／活性化チャンバ内において、音響エネルギーを前記血小板含有溶液に印加することによってもたらされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
血小板溶解または活性化は、前記溶解／活性化チャンバ内において、前記血小板含有溶液を浸透圧に曝すことによってもたらされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
血小板溶解／活性化は、前記溶解／活性化チャンバ内において、前記血小板含有溶液を部分的または全体的に乾燥することによってもたらされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
血小板溶解／活性化はさらに、前記溶解／活性化チャンバ内において、前記乾燥血小板含有溶液と溶解または活性化誘発剤を混合することによってもたらされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記溶解／活性化チャンバ内において、前記血小板含有溶液を部分的または全体的に乾燥するステップに先立って、前記血小板含有溶液から血漿を濾過するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記溶解／活性化チャンバ内において、前記血小板含有溶液を部分的または全体的に乾燥するステップに先立って、前記血小板含有溶液内にある前記血小板を濃縮するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記血小板は、前記溶解／活性化チャンバを軸の周囲で回転させることによって濃縮される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
単回の使用の後に、前記血小板含有溶液または前記調整溶液のうちの１つによって湿潤された少なくとも１つのデバイス構成要素を廃棄するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本明細書に開示される実施形態は、血小板溶解または活性化のためのデバイス、システム、および方法を対象とする。実施形態は、より具体的には、単回の処置セッションの間、患者のベッドサイドにおいて実装され得る、血小板溶解または活性化のためのシステムおよび方法を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
背景
血小板は、哺乳類の血液中において循環する、小さな円板形状の無核細胞片である。血小板は、限定ではないが、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子上皮成長因子、血管内皮細胞成長因子、および他のものが挙げられる、成長因子の自然源である。前述の因子に加えて、血小板はまた、α顆粒、サイトカイン、タンパク質、細胞成分、ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、ＤＮＡ、化学物質を含む小分子、ホルモン、およびシグナリング分子を含む。前述の因子および他の血小板内容物は、本明細書では、集合的に、「治療用血小板内容物」と称される。治療用血小板内容物は、限定ではないが、ヒトの結合組織を含む、傷害または損傷された生物組織の修復および生成において、重要な役割を果たすことが示されている。自己血小板の内容物を濃縮された溶液の投与によって、増加された濃度の種々の血小板由来の治療用血小板内容物の局所の適用が、創傷治癒を促進する既知の技術である。
【０００３】
多くの方法が、細胞または血小板の内容物を溶液中に放出する目的のために、細胞膜または細胞片膜の溶解または断裂を生じさせる、または誘発することが知られている。典型的な方法は、６つの分類、すなわち、光、機械、音響、電気、化学、および熱にグループ化され得る。前述の方法のうちの１つ以上は、血小板含有溶液のバッチ溶解のために採用される可能性がある。代替として、溶解方法が、内容物の分析のために、単一の細胞に適用されている。
【０００４】
血小板溶解の既知の方法は、大規模な資本設備、特殊な使い捨て消耗品、および複雑な技術を要求する。加えて、既知の技術を使用して調整血小板溶液を作るために要求される時間は、非常に長く、採取したばかりの、または事前処理された患者血液から始め、単回の診察所訪問の時間フレームの範囲内で注入可能な調整血小板溶液を作ることは、合理的ではない。さらに、医療提供者が、現場で、好適な調整血小板溶液を産生かつ処理するために必要であるクリーンルームおよび研究機器にアクセスする可能性は、非常に低い。これらの困難点は、高いコストでの自己血小板溶解物治療の採用を特殊な研究室に制限し、通常の臨床設定における自己血小板溶解物治療の使用を妨げている。本明細書に開示される実施形態は、上記に議論される問題のうちの１つ以上を克服することを対象とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
実施形態の要旨
患者への同時再注入のために、患者のベッドサイドにおいて調整自己血小板溶液の産生を提供する、デバイス、システム、および方法の実施形態が、本明細書に開示される。ある実施形態では、限定ではないが、採血、血小板溶解／活性化、溶液調製、および患者への再注入を含む、ステップの全てが、患者を再配置せずに、単回の診察所訪問または診療所訪問において達成され得る。
【０００６】
したがって、本明細書に開示される装置、デバイス、およびシステムは、概して、血小板含有溶液を受容し、血小板含有溶液中のある量の血小板体の溶解または活性化を誘発し、患者への注入のために好適な様式において、結果として生じる調整血小板溶液を提供するように構成される、実質的に独立型の機械、デバイス、またはシステムを含む。したがって、説明される実施形態は、説明されるデバイス、および関連付けられる消耗可能または使い捨ての装置または部品の他に、付加的な研究室ベースの機器の必要がなくても、注入可能な調整溶液の生産を提供する。
【０００７】
本明細書に開示される一実施形態は、筐体を有するデバイスである。デバイスの中に血小板含有溶液の流入を可能にする流入ポートが、筐体を通して提供される。流入ポートから、血小板含有溶液が、デバイスの筐体内部に同様に位置付けられる溶解／活性化チャンバの中に、流動される、移送される、または別様に留置される。溶解／活性化チャンバ内部では、血小板含有溶液の１つ以上の血小板は、下記に説明されるような溶解または活性化を受けさせられる。したがって、調整溶液が、溶解／活性化チャンバ内部で形成される。流出ポートから取り出される調整溶液を提供する流出ポートが、溶解／活性化チャンバと流体連通するように、筐体から提供される。
【０００８】
溶解／活性化チャンバ内部にある血小板の溶解または活性化は、いくつかの開示される技術または技術の任意の組み合わせによってもたらされる可能性がある。例えば、血小板の溶解および／または活性化は、血小板含有溶液を１回以上の全体的または部分的な凍結／解凍サイクルに曝すことによってもたらされ得る。したがって、血小板溶解／活性化チャンバは、デバイスの筐体内部に同様に維持される加熱および冷却モジュールと熱接触し得る。加熱および冷却モジュールは、限定ではないが、溶解／活性化チャンバを、気体、液体、または他の加熱および冷却剤と接触させること、従来の冷却または加熱サイクルを適用すること、あるいは他の手段を含む、血小板含有溶液を加熱および冷却するためのいくつか技術のうちの１つを利用し得る。一非限定代替実施例では、溶解／活性化チャンバは、筐体内部にある加熱または冷却剤と接触される、ある長さの使い捨て滅菌チューブを備えてもよい。
【０００９】
デバイスまたはシステムの代替実施形態は、筐体の中への、溶解／活性化チャンバと連通する、１つ以上の補助流入ポートを含んでもよい。該補助流入ポート（単数または複数）は、血小板含有溶液と接触し、溶解／活性化チャンバ内部で１つ以上の血小板の溶解または活性化を生じさせるか、または促進する物質の導入を提供し得る。溶解または活性化を生じさせる物質は、限定ではないが、ＣａＣｌ２、代替塩、ＡＤＰ、エピネフリン、トロンビン、コラーゲン、またはフォンヴィレブランド因子であってもよい。
【００１０】
他の代替装置が、血小板溶解または活性化を生じさせる、または促進するために、筐体内部に提供されてもよい。代替装置は、限定ではないが、音響エネルギーを印加すること、血小板含有溶液を剪断応力に曝すこと、血小板含有溶液を浸透応力に曝すこと、あるいは血小板含有溶液を、限定ではないが、ガラスまたはコラーゲンを含む活性化促進表面または物質と接触させることを含むプロセスに、血小板含有溶液を曝してもよい。あるデバイス実施形態は、熱的、化学的、機械的、または他の血小板溶解あるいは活性化ステップの任意の組み合わせを提供する要素を含んでもよい。
【００１１】
あるデバイス実施形態の流出ポートは、フィルタを含んでもよい。加えて、ある実施形態では、溶解／活性化チャンバは、選択された溶解または活性化ステップの実施に先立って、またはその後に、血小板含有溶液からの血漿等の流体の除去を提供する真空源と連通してもよい。さらに、本装置は、溶解／活性化チャンバに結合され、筐体内部で溶解／活性化チャンバの回転を提供し、選択された溶解／活性化ステップの前またはその後に、血小板含有溶液中で血小板の濃縮を生じさせる、回転デバイスを含んでもよい。
【００１２】
代替実施形態は、本明細書に開示されるようなデバイスの１つ以上の実施形態を利用して、血小板含有溶液から調整溶液を調製する方法を含む。本方法は、筐体を通して、血小板含有溶液をデバイスの流入ポートの中に導入するステップを含む。本方法の実施形態はまた、血小板含有溶液を筐体内部にある溶解／活性化チャンバに流動させる、または別様に移送させ、溶解／活性化チャンバ内において、血小板含有溶液中で血小板の溶解または活性化を生じさせるプロセスを含む。したがって、本方法の実施形態は、患者のベッドサイドにおいて、または診療所内における使用のために好適な独立型デバイス内部で調製される調整溶液をもたらす。本方法の実施形態はさらに、患者への調整溶液の再注入を含んでもよい。
【００１３】
本方法の実施形態は、溶解／活性化チャンバ内部にある血小板の全体的または部分的な溶解および／または活性化を生じさせる技術の任意の組み合わせを特徴とし得る。溶解／活性化技術は、限定ではないが、１回以上の凍結／解凍サイクルを生じさせるために溶液を加熱および冷却するステップ、溶液を乾燥させるステップ、溶液を剪断応力に曝すステップ、溶液を音響エネルギーに曝すステップ、溶液を１つ以上の溶解／活性化誘発剤と混合するステップ、１つ以上の溶解または活性化誘発表面にわたり溶液を流動させるステップ、溶液を浸透応力もしくは他の手段に曝すステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本明細書に開示されるようなデバイスおよびシステムの概略図である。
【図２】図２は、本明細書に説明されるような方法のフローチャート説明図である。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｉは、代替デバイスおよび方法の実施形態の概略説明図である。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｉは、代替デバイスおよび方法の実施形態の概略説明図である。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｉは、代替デバイスおよび方法の実施形態の概略説明図である。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｉは、代替デバイスおよび方法の実施形態の概略説明図である。
【図３Ｅ】図３Ａ〜３Ｉは、代替デバイスおよび方法の実施形態の概略説明図である。
【図３Ｆ】図３Ａ〜３Ｉは、代替デバイスおよび方法の実施形態の概略説明図である。
【図３Ｇ】図３Ａ〜３Ｉは、代替デバイスおよび方法の実施形態の概略説明図である。
【図３Ｈ】図３Ａ〜３Ｉは、代替デバイスおよび方法の実施形態の概略説明図である。
【図３Ｉ】図３Ａ〜３Ｉは、代替デバイスおよび方法の実施形態の概略説明図である。
【図４】図４は、代替方法の実施形態のフローチャート説明図である。
【図５】図５は、選択された凍結／解凍温度範囲において、１回のみの凍結／解凍サイクルに曝された類似するサンプルと比較した、複数回の凍結／解凍サイクル後の選択された血小板溶解または活性化パラメータの増加率を示す、グラフ比較である。
【図６】図６は、冷却剤として空気を利用する類似する凍結／解凍サイクルに曝された類似するサンプルと比較した、冷却剤としてイソプロピルアルコールを利用する、複数回の凍結／解凍サイクル後の選択された血小板溶解または活性化パラメータの増加率または減少率を示す、グラフ比較である。
【図７】図７は、複数回の凍結／解凍サイクルと剪断応力に曝されることに加え、溶解／活性化剤としてＣａＣｌ２が添加されたサンプルと、複数回の凍結／解凍と唯一の溶解／活性化ステップとしての剪断応力サイクルに曝された類似するサンプルとを比較した、選択された血小板溶解または活性化パラメータの増加率を示す、グラフ比較である。
【図８】図８は、浸透応力下に留置されたサンプルと、低張液および浸透応力下に留置されない類似するサンプルとを比較した、選択された血小板溶解または活性化パラメータの増加率を示す、グラフ比較である。
【図９】図９は、遠心分離による血小板分離をせずに１回以上の凍結／解凍サイクルに曝された類似するサンプルと比較した、遠心分離による血小板分離後の１回以上の凍結／解凍サイクル後の選択された血小板溶解または活性化パラメータの増加率を示す、グラフ比較である。
【図１０】図１０は、１回以上の凍結／解凍サイクルのみに曝された類似するサンプルと比較した、複数回の凍結／解凍サイクルと、血小板が、溶液から遠心分離され、浸透応力を提供する選択された濃度の塩化カルシウムと水に暴露されることを含む、代表的組み合わせプロセス後の選択された血小板溶解または活性化パラメータの増加率を示す、グラフ比較である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
別様に示されない限り、明細書および請求項において使用される成分、寸法、反応条件、およびその他の量を表現する全ての数字は、用語「ａｂｏｕｔ（約）」によって、全ての事例において修飾されるものとして理解されたい。
【００１６】
本願および請求項では、単数形の使用は、別様に具体的に主張されない限り、複数形を含む。加えて、「ｏｒ（または）」の使用は、別様に主張されない限り、「ａｎｄ／ｏｒ（および／または）」を意味する。さらに、用語「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、ならびに「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（含む）」および「ｉｎｃｌｕｄｅｄ（含まれる）」等の他の形態の使用は、限定ではない。また、「ｅｌｅｍｅｎｔ（要素）」または「ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ（構成要素）」等の用語は、別様に具体的に主張されない限り、１つのユニットを構成する要素および構成要素と、２つ以上のユニットを構成する要素および構成要素の両方を包含する。
【００１７】
本明細書に開示される、種々のデバイス、システム、および方法の実施形態は、患者への同時再注入のために、患者のベッドサイドにおいて調整自己血小板溶液の産出を提供する。ある実施形態では、限定ではないが、採血、血小板溶解および／または血小板活性化、溶液調製、および患者への再注入を含む、ステップの全てが、患者を再配置せずに、単回の診察所訪問または診療所訪問において達成され得る。用語「ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｌｙｓｉｓ（血小板溶解）」は、血小板細胞膜の断裂をもたらし、それによって、血小板から、治療用内容物を放出するプロセスまたは方法として本明細書では定義される。用語「ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ（血小板活性化）」は、創傷治癒を促進するための、血小板凝集、粘着、ならびに特定のタンパク質および成長因子の放出を制御する、一連の事象をトリガーするプロセスとして本明細書では定義される。血小板活性化は、例えば、創傷に応答して、血流中で生じる可能性がある。本明細書で言及される血小板活性化は、人体の外側において生じ、必ずしも、血小板細胞膜の断裂を生じさせずに、血小板から治療用内容物の放出を生じさせる。
【００１８】
したがって、本明細書に開示される装置、デバイス、およびシステムは、概して、血小板含有溶液を受容し、血小板含有溶液中で１つ以上の血小板体の溶解および／または活性化を誘発し、患者への注入のための好適な様式において、結果として生じる調整血小板溶液を提供するように構成される、一体型機械、デバイス、またはシステムを含む。したがって、説明される実施形態は、説明されるデバイスおよび関連付けられる消耗可能または使い捨ての装置の他に、付加的な研究室ベースの機器の必要がなくても注入可能な調整血小板溶液の生産を提供する。
【００１９】
一デバイスおよび方法の実施形態では、調整血小板溶液が、血小板含有溶液を凍結させ、続いて、解凍させ、それによって、血小板体に、溶解および／または活性化を通して、その治療用内容物を放出させるために、熱エネルギーを使用することによって作られる。例えば、図１は、血小板含有溶液の一部または全てを凍結させ、血小板含有溶液中である量の血小板の溶解および／または活性化を誘発するために、加熱および冷却装置の使用を特徴とする、システム実施形態１００を概略的に図示する。図１のシステム１００では、患者の自己血小板含有溶液を収容する、注射器、滅菌バッグ、または他の好適なコンテナ１０４が、流入ポート１０２においてシステム１００に接続される。患者の自己血小板含有溶液は、患者の血液に由来する。血小板含有溶液は、血小板を濃縮するために、事前処理される、希釈される、他の流体と混合される、または別様に調整されてもよい。典型的には、血小板含有溶液は、処置セッションの開始時、患者から採取された血液を事前処理かつ調製されるであろう。代替として、血小板含有溶液は、何日か前に患者から採取された血液から調製され得、そして事前処理の前後に保存され得る。
【００２０】
血小板含有溶液は、システム１００を通して、溶解／活性化チャンバ１０４に、かつそれを通して移送される。血小板含有溶液は、任意の選択された形状、体積、または構成を有する流体経路１０５内を移送されてもよい。図１の特定のシステムの実施形態では、溶解／活性化チャンバ１０４は、熱溶解／活性化チャンバとして実装される。代替溶解／活性化方法に依拠する代替溶解／活性化チャンバが、下記に詳細に説明される。溶解／活性化チャンバ１０４およびそれと関連付けられる流体経路１０５は、任意の好適な形状または構成であり、任意の選択された体積を有することができる。典型的には、血小板含有溶液は、少なくとも部分的に、下記に詳述されるように、使い捨て滅菌チューブであり得る滅菌チューブを備える、流体経路１０５内で移送される。弁、計測器、ポンプ、ゲート、貯蔵リザーバ、および他の流体制御装置が、本システム内部にある流体の流動を制御するために、要求に応じて、実装されてもよい。例えば、流出弁１０６が、既定の時間の間、血小板含有溶液を溶解／活性化チャンバ内部に留まらせるために利用されてもよい。
【００２１】
システム１００はまた、典型的には、血小板溶解および／または活性化プロセスの間に使用される、使い捨てコンテナ、または他の流入構成、あるいは消耗可能な添加物、化学物質、添加物、溶媒、または他の物質の量を受容するために随意に使用され得る、１つ以上の補助流体または組成物ポート１０８を含んでもよい。補助ポート１０８は、チューブ、パイプ、固形物コンベヤシステム、または他の物質操作装置を使用して、溶解／活性化チャンバ１０４および／または流体経路１０５と流体流通するように留置される。例えば、関連付けられるデジタル制御装置を伴っても伴わなくてもよい、１つ以上の弁、ポンプ、または材料コンベヤが、タイミングと、任意の所望の２次物質と流体経路１０５および／または溶解／活性化チャンバ１０４の内部にある血小板含有溶液との混合率とを制御するために実装されてもよい。
【００２２】
システム１００に導入される血小板含有溶液の量は、溶解／活性化チャンバ１０４内部にある流体経路１０５の体積が、本システムの中に導入される血小板含有溶液体積の全体で占有されるように、事前決定されてもよい。したがって、システム１００は、患者への再注入または他の治療的使用に先立って、血小板含有溶液の規定されたバッチを処理するために利用されてもよい。代替として、本システムは、血小板含有溶液がシステム１００にフィードされ、患者に再注入されるにつれて、血小板含有溶液を連続的に処理するように構成されてもよい。
【００２３】
上記のように、図１に図示される特定の実装は、熱溶解／活性化チャンバ１０４を含む。したがって、システム１００は、溶解チャンバ１０４と熱連絡する加熱および冷却モジュール１１０を含む。加熱および冷却モジュール１１０は、熱交換装置、任意の種類の従来の電気、気体、または他の加熱および低温要素、あるいは別の種類の加熱および冷却装置で実装されてもよい。加熱および冷却モジュール１１０は、熱交換表面１１２を通して溶解／活性化チャンバ１０４と熱連絡する。例えば、熱交換表面１１２は、熱交換表面１１２と熱溶解／活性化チャンバ１０４との表面積接触が最大限にされるように、構成されてもよい。
【００２４】
加熱および冷却モジュール１１０は、血小板含有溶液が、部分的にまたは全体的に、凍結するまで、熱交換表面１１２を通して血小板含有溶液から熱を除去するように構成されてもよい。この完全または部分相変化が生じた後に、熱は、例えば、熱交換器、従来の加熱器、または他の手段の逆動作によって、加熱および冷却モジュール１１０を用いて、熱溶解チャンバ１０４に印加されてもよい。部分的にまたは全体的に凍結された血小板含有溶液を加熱することが、血小板含有溶液の凍結部分を解凍させる。１回以上の完全な凍結／解凍サイクルが、溶解／活性化チャンバ１０４内部において、実装されてもよい。１回以上の凍結／解凍サイクルの間、血小板溶解／活性化が生じ、治療用血小板内容物を溶液中に放出させ、それによって、無傷活性化血小板を含有しても含有しなくてもよい、血小板溶解物溶液（ＰＬ溶液）を作る。ＰＬ溶液の最終的解凍および／または加温の後に、弁１０６は、ＰＬ溶液が、流出ポート１１４に向かって、患者へのＰＬ溶液の一部または全ての再投与を提供する担体として使用するために好適な第２のコンテナ（例えば、注射器）の中に、流動することを可能にするために開放されてもよい。
【００２５】
システム１００は、取り外し可能なコンテナ１０４、１０８、および１１６以外の全ての要素が、単一のおそらく携帯可能な筐体内部に格納される、実質的に自己収容型デバイスとして、実装されてもよい。さらに、血小板含有溶液によって湿潤された全ての構成要素が、各手技の後に交換される使い捨て部品で実装されてもよい。流体経路１０５の少なくとも一部を実装するための使い捨てチューブキットの使用は、患者ごとに滅菌された装置の使用を確実にする役割を果たす。
【００２６】
図１のシステムは、図２に図示されるような非排他的方法２００に従って、以下のように利用されてもよい。事前にまたは同時に、患者の血液に由来する血小板含有溶液が、システム１００に導入される（ステップ２０２）。血小板含有溶液は、導管の好適なシステムを通して、熱溶解／活性化チャンバ１０４の流体経路１０５の中に送られる（ステップ２０４）。上記のように、溶解／活性化チャンバ１０４は、血小板含有溶液が、１回以上の冷却および／または加熱サイクルにおいて、熱エネルギーと接触されるようにする。上記のように、加熱および冷却モジュール１１０の構成は、種々のエネルギー源および熱交換方法に依拠して、種々の構成であり得る。例えば、一具体的なデバイス構成では、シェルおよびチューブシステムが、最初に、血小板含有溶液が入口プレナムの中に導入され、次いで、１つ以上のチューブの中に分配されるように、組み込まれてもよい。血小板含有溶液の流動は、血小板含有溶液の部分量または全量が、該チューブのうちの１つ以上の中に移動されるように制御される。いったん血小板含有溶液が熱交換チューブ内に入ると、流動は、停止させられてもよい。
【００２７】
この特定の実施形態では、チューブ（単数または複数）は、シェル内部に含有される。チューブとシェルとの間には、流体連通は存在しない。シェルおよびチューブシステムは、シェルの内部体積を考慮したチューブ（単数または複数）の表面積が、最大限にされるように構成される。
【００２８】
熱交換流体が、血小板含有溶液の凍結点未満である第１の温度において、第１の入口ポートを通してシェルの中に導入される。熱交換流体の温度は、加熱および冷却モジュール１１０、関連付けられるセンサ、ならびに関連付けられる制御装置によって制御されてもよい。熱交換流体は、チューブ（単数または複数）から、結果として、その中に含有される血小板含有溶液から、熱を除去する。熱交換流体は、第１の温度よりも高い第２の温度において、第２の出口ポートを通してシェルから流出する。したがって、熱は、血小板含有溶液中での十分な温度降下が、液体血小板含有溶液中で部分的な液体または総液体に固体相変化を誘発するまで、血小板含有溶液から除去される（ステップ２０６）。血小板膜内部での氷晶の形成が、血小板内容物の体積膨張を生じさせ、それによって、血小板膜に機械的応力を付与する。機械的応力は、この膜の断裂と、周辺溶液中への目的の種々の因子を含む治療用血小板内容物の放出とを生じさせる。加えて、下記のように、凍結は、溶解を受けなかった血小板の活性化を生じさせる可能性がある。
【００２９】
血小板含有溶液が、部分的にまたは完全に、液体から固体に相変化を受けた後に、熱交換プロセスは、血小板含有溶液が固体から液体に解凍相変化を受けるように、選択的に逆にされてもよい（ステップ２０８）。一実施形態では、デジタル制御システムと通信する温度センサが、ある温度基準点、例えば、凍結点または解凍点に到達されるときを判定するために、血小板含有溶液の温度を監視する。他の実施形態では、制御は、血小板含有溶液の熱除去のサイクルのための時間を事前にプログラムして、血小板含有溶液の部分的または完全な相変化が生じることを確実にするために、経験的データと、本システムの挙動のモデリングとに基づくであろう。十分な血小板溶解および／または活性化を達成することが望まれる場合、凍結および解凍のサイクルは、要求に応じて繰り返されてもよい（ステップ２１０）。
【００３０】
代替方法が、血小板含有溶液中での部分的または完全な相変化の１回以上のサイクルを識別および／または制御するために利用されてもよい。代替の監視および制御方法は、限定ではないが、血小板含有溶液の体積変化、血小板含有溶液の光透過率、血小板含有溶液中での音響波伝送、および他のものを含む、限定ではないが、１つ以上のパラメータを監視することを含む。
【００３１】
１回以上の凍結／解凍サイクルが、十分な数の血小板体の溶解および／または活性化を確実にするために実施された後に、最終的加温または解凍ステップが、実施されてもよい。この時点で、血小板含有溶液は、血小板溶解物溶液（ＰＬ溶液）と称されてもよく、あるいは代替として、１つ以上の溶解または活性化血小板体を含有する調整溶液と称されてもよい。ＰＬ溶液は、次いで、熱溶解／活性化チャンバ１０４から、患者への再注入のための好適なコンテナの中に送られてもよい（ステップ２１２および２１４）。上記のように、システム１００は、血小板含有溶液またはＰＬ溶液によって湿潤された全ての構成要素が容易に交換可能かつ使い捨て可能であるよう設計されるように、構成されてもよい。加えて、全てのステップは、医師の診察所、診療所、または病室に位置する、自己含有型の可能性として携帯可能なシステムにおいて実施されてもよい。したがって、全処置方法は、患者が単回または限定された回数だけ診察所を訪問することのみを要求しながら、実装されてもよい。
【００３２】
システム１００は、上記に具体的に記載される要素に限定されない。例えば、熱溶解／活性化チャンバ１０４の代替構成では、血小板含有流体は、その境界壁が加熱／冷却要素または熱交換器と直接接触するチャンバを含む、流体経路１０５内部で送られる。チャンバは、血小板含有溶液流体と接触するチャンバ境界壁の表面積が最大限にされるように、構成されてもよい。加えて、チャンバは、熱交換器と接触するチャンバの表面積が最大限にされるように、構成されてもよい。この実施形態では、血小板含有溶液は、血小板含有溶液が、実質的に、チャンバの内側の体積の全体を占有するまで、チャンバの中に送られ、この時点において、流動は、停止させられる。熱交換器または他の加熱／冷却要素は、血小板含有溶液の部分的または完全な相変化が生じるまで、血小板含有溶液から熱を除去する。凍結および解凍のサイクルが、ＰＬ溶液が産生され、患者への注入または他方法による再導入のために、本システムから除去されるまで、上記に説明されるように進行してもよい。
【００３３】
直接的または間接的熱交換に依拠する加熱および冷却モジュールの多くの可能性として考えられる変形例が、本開示の範囲内にある。例えば、一実施形態では、加熱および冷却要素は、非消耗品熱伝達媒体を伴う閉鎖型システムとして実装される。したがって、本システムにおける熱伝達媒体のレベルは、本デバイスの複数回の使用の過程を通して低下しない。そのような熱交換システムは、Ｒ−１１、Ｒ−１２、Ｒ−１１４、Ｒ−２２、Ｒ１２３、Ｒ−１３４ａ、Ｒ−５０２、Ｒ−４０、Ｒ−７６４、Ｒ−１７０、またはＲ−２９０等の公知の熱伝達媒体を採用する標準的空調または冷却システムに類似する蒸気圧縮サイクルを活用する、圧縮および膨張チャンバで実装されてもよい。
【００３４】
本システムの他の実施形態では、熱伝達媒体は、必要に応じて、本システムの中に導入されてもよい。例えば、気体、流体、または液化気体の使い捨てコンテナ（あるいは、気体または流体供給への接続）が、血小板含有溶液から熱を迅速に除去するために使用されてもよい。小体積を占有する圧縮気体がより低い圧力においてより高い体積に膨張することを可能にされるとき生じる、温度降下は、血小板含有溶液から熱を除去するために活用されてもよい。開放端システムにおいて使用される好適な冷却気体は、否定的な結果を伴わずに大気中に放出され得るように、不活性かつ環境的に安全であり得る。他のあまり本質的に安全ではない気体は、濾過、処理、または再捕捉の手段を要求し得る。開放型システムのための好適な熱伝達媒体は、限定ではないが、二酸化炭素、酸素、ヘリウム、水素、窒素、および他のものを含む。冷却気体または流体は、部屋の中に直接放出されても、建物用ＨＶＡＣの中に放出されても、大気中への直接的放出のために建物の外側に通気されてもよい。開放端実施形態では、熱伝達媒体のコンテナは、各手技の後、または必要性に応じた既定の回数の手技の後に、交換されるであろう消耗品として設計される。
【００３５】
代替実施形態では、温度誘発相変化以外の溶解および／または活性化方法が、血小板溶解および／または血小板活性化を達成するために利用されてもよい。例えば、血小板含有溶液が、混合チャンバとして実装される溶解／活性化チャンバ１０４を特徴とする、システム１００に導入されてもよい。混合チャンバでは、血小板含有溶液は、塩化カルシウム（ＣａＣｌ）、トロンビン、または他のもの等の溶解および／または活性化誘発化合物または物質と混合される。
【００３６】
任意の種類の溶解／活性化チャンバを特徴とするベッドサイドに位置するシステムの有効性は、血小板に治療用内容物を溶液中に放出させるために、他の薬剤を導入することによって向上させられ得る。血小板に生物機構を介してその内容物を放出させる補助的方法が、血小板を「活性化」させる方法と本明細書では称される。血小板含有溶液に添加される選択された活性化剤の体積は、患者間ベースで判定されてもよい。活性化剤の添加は、血小板体に、該血小板体内部にある治療用内容物をより効果的に放出させる。活性化剤は、限定ではないが、トロンビン、ＣａＣｌ２、ＡＤＰ、およびエピネフリンを含む。
【００３７】
血小板を活性化させるための方法はまた、血小板を高剪断応力に暴露することと、血小板をガラスまたはコラーゲンコーティング表面に暴露することとを含む。したがって、血小板の活性化を向上させる付加的なチャンバまたは流体経路が、システム１００または溶解／活性化チャンバ１０４内部に含まれてもよい。例えば、システムが、凍結解凍段階をもたらし、その後、血小板溶液が、次いで、注入のための収集の前に、ガラスまたはコラーゲンコーティングチューブを通して流動する、１つのチャンバを含んでもよい。同様に、１回以上の凍結／解凍サイクルが、１つのチャンバ内でもたらされた後、溶解および活性化の量を最大限にするために、コーティングチューブを通して、凍結／解凍チャンバ中に戻るように、血小板溶液の後続流動が続いてもよく、各ステップは、要求に応じて繰り返される。
【００３８】
血小板活性化のために好適な高剪断応力は、２２ｇ〜２７ｇのニードルのサイズに類似する非常に小さなチューブを通して血小板溶液を押勢することによって、取得されてもよい。溶解または血小板活性化を生じさせる種々の方法は、任意の順序で提供されてよい。例えば、血小板含有溶液が、比較的狭い通路または開口に給送する高圧ポンプによって、システムの中に給送されてもよい。したがって、血小板は、剪断応力に曝される。溶液は、次いで、凍結／解凍サイクルが適用される、あるいは塩化物、トロンビン、ＡＤＰ、またはエピネフリン等の活性化剤が血小板含有溶液と混合される、処理用後続チャンバに流入してもよい。各別個のプロセスは、次いで、血小板溶解および活性化を最大限にするために、要求に応じて、繰り返されてもよい。
【００３９】
代替実施形態では、血小板体の溶解または活性化は、血小板含有溶液への音響エネルギーの印加（超音波処理）によって誘発される。超音波処理は、血小板含有溶液中で溶解および／または活性化を生じさせるための選択周波数および振幅における音響エネルギーの結合を指す。超音波処理の実施形態では、血小板含有溶液は、本システムの中に導入され、流体経路１０５を通して、超音波処理チャンバとして実装される溶解チャンバに送られる。超音波処理チャンバでは、超音波振動が、血小板膜のキャビテーションおよび後続の剪断を生じさせる局所的高圧面積を誘発する、１つ以上の好適な変換器１１８から溶液に結合される。超音波処理チャンバの熱管理は、血小板含有溶液温度がタンパク質を変性させ得る規定の臨界温度を上回って上昇しない、または別様に不可逆的損傷を溶液に生じさせないため有益となる。
【００４０】
さらなる別の実施形態では、血小板の溶解／活性化は、血小板含有溶液を低張液に導入することによってもたらされる、浸透応力によって誘発される。浸透応力は、水を周辺溶液から血小板体に流入させる。水は、血小板膜が、血小板の溶解または活性化が生じるように機械的に応力を受けるまで、継続して膜を横切るであろう。低張液は、有利には、注入が安全である物質、例えば、水である。
【００４１】
血小板溶解および／または活性化を効果的に生じさせるために利用され得る、別の代替デバイスおよび方法は、概略的に、図３Ａ〜３Ｉおよび図４に図示される。図３および図４の実施形態は、図１に示されるものに類似するデバイス１００の溶解／活性化チャンバ１０４と、流体経路１０５との組み合わせの範囲内で実装されてもよい。したがって、図３および図４の実施形態もまた、処置する医師の診察所、病室、診療所、または別様に患者ベッドサイドに位置する、単一のデバイス内部で全てのステップを達成する、ベッドサイドシステムにおいて実装されてもよい。
【００４２】
図３および図４に図示される装置および方法は、比較的迅速に実装され得、高品質の溶解物または活性化調整溶液をもたらすであろう。特に、図３および図４に図示される溶解／活性化方法および装置は、血小板αベシクルの完全性を損なわせ、高収率の所望の成長因子をもたらすことができる。
【００４３】
図３Ａに示されるように、図１の溶解／活性化チャンバ１０４および流体経路１０５は、部分的に、任意の好適な体積を有する多血小板血漿チャンバ（ＰＲＰチャンバ３００）として実装されてもよい。ＰＲＰチャンバ３００は、多血小板血漿、典型的には、患者から採取された血液から調製される自己ＰＲＰを受容する。ＰＲＰは、流入ポート３０２を通してＰＲＰチャンバ３００の中に流入されてもよい（図４、ステップ４０２）。続いて、溶解／活性化の後に、ＰＬ溶液は、流出ポート３０４を通して採取され、治療目的のために本明細書に説明されるように使用されてもよい。流出ポート３０４は、最適なこととして、低タンパク質結合を特徴とし、かつ比較的高い流量を保有する、例えば、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜フィルタ、ポリ二フッ化ビニル（ＰＶＤＦ）フィルタ、または他の注射器型フィルタである、フィルタ３０６を含む。流出ポート３０４は、ＰＬ溶液収集を容易にするために、真空および収集システム３０８と流体連通するように留置されてもよい。
【００４４】
図３Ｂに示されるように、溶解／活性化プロセスは、ＰＲＰでＰＲＰチャンバを選択レベルまで充填することによって、開始されてもよい。血小板数が、溶解／活性化に先立って、取得されてもよい。次いで、図３Ｃに示されるように、ＰＲＰチャンバは、十分に高速の遠心分離方式で回転され、血小板をＰＲＰチャンバ３００の外側壁上に収集させてもよい（図４、ステップ４０４）。真空が、次いで、流出ポートに印加され、血漿の採取を生じさせてもよい（図３Ｄ）。図３Ｅ〜３Ｆに示されるように、血小板は、ＰＲＰ壁またはその近傍のいずれかにおいて、チャンバ内に留まるか、あるいはフィルタ３０６によって捕捉される。血小板がフィルタ界面に収集されるにつれて、真空サイクルは、フィルタにおいて、そうでなければＰＲＰチャンバ内部で、継続して血小板を部分的に乾燥させる、または全体的に乾かしてもよい（図３Ｇ）（図４、ステップ４０６）。
【００４５】
乾かすことは、全体的または部分的に、血小板の溶解を生じさせる可能性がある。図３Ｈに示されるように、全体的または部分的に乾燥された血小板は、好適な流体、例えば、滅菌「注射用水」（ＷＦＩ）中に懸濁されてもよい（図４、ステップ４０８）。懸濁された血小板は、一定期間の後、補助的化学溶解／活性化剤、例えば、ＣａＣｌに曝されてもよい（図４、ステップ４１０）。血小板数は、種々の時間点において判定されてもよい。血小板の乾燥、懸濁、および溶解／活性化剤添加の任意の組み合わせが、適切な血小板溶解／活性化を生じさせるために採用されてもよい。次いで、図３Ｉに示されるように、ＰＬ溶液は、ＰＲＰチャンバから採取され得、注射器等の好適な容器中に留置され得、治療の目標を達成するために患者へ再注入され得る（図４、ステップ４１２〜４１４）。
【００４６】
血小板は、顆粒、すなわち、主として、顆粒が、血小板生合成の間、事前包装される、α顆粒（およびある程度の高密度顆粒）から成る。現在の理論によると、いったん血小板が作られ、巨核球から放出されると、必ず含有するであろう全ての成長因子を含有し、これのほとんどは、前述の顆粒中に包装される。さらに、全ての血小板が、顆粒内容物に関して、同一内容物を有するわけではないと考えられる。したがって、いったん血小板が、溶解および／または活性化されると、溶液中の成長因子内容物を最大限にするために、顆粒の完全性を崩壊させることは、有益である。例えば、図３Ｈに関して説明されるように、顆粒崩壊が、図３の一連における「フィルタ乾燥」ステップの後のＣａＣｌ２の添加の間に生じ得る。しかしながら、濾過プロセスの間、無傷のままである顆粒は、孔径があまりに小さい場合、産出物収集容器の中に通過することを避けられ、それによって、最終注入物質から貴重な治療用内容物を除去することになり得る。したがって、一実施形態は、０．２２μｍよりも大きい、例えば、０．４５μｍのフィルタ孔径を含む。
【００４７】
上記に説明されるいずれかの実施形態では、本システムを通して血小板含有溶液を移動させるために要求される力が、いくつかの代替手段によって生成されてもよい。例えば、血小板含有溶液は、注射器を用いて本システム１００に導入されてもよい。注射器プランジャが押下されるにつれて、血小板含有溶液は、本システムの流体経路１０５の中に流動させられる。デバイス動作の選択されたプロトコルが、プランジャの完全押下が、実質的に全ての血小板含有溶液を溶解／活性化チャンバの内側に位置させるように、機械に添加される血小板含有溶液の具体的な体積を識別するために実装されてもよい。いったん溶解／活性化動作が完了すると、流出弁１０６がアクティブ化され得、空の血小板含有溶液の注射器が切断され、熱溶解／活性化チャンバからＰＬ溶液流動をもたらし得る。流動誘因および制御の他の実施形態は、１つ以上の蠕動ポンプまたは他のポンプ、調節可能体積、点滴流動を利用する区分、あるいは他の種類の重力誘発流を含んでもよい。
【００４８】
前述のデバイスおよび方法の実施形態は、血小板を溶解かつ活性化させるためのいくつかの異なる方法を説明する。開示される方法は、任意の順序で組み合わされてもよい。下記に詳述されるように、これら方法の多くは、溶液中で９０％を上回る血小板の溶解をもたらす。例えば、溶解、活性化、および成長因子濃縮のための特に好適な方法の組み合わせの１つは、複数回の凍結／解凍ステップの後、血小板が溶液から遠心分離され、浸透応力を付与するために、選択された濃度の塩化カルシウムおよび水に暴露されることが続く。
【実施例】
【００４９】
以下の実施例は、例証の目的のみのために提供され、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。下記に詳述される実施例のそれぞれにおいて検証されるサンプルは、４人の献血者対象から採取された血液から調製された。最初の採血は、遠心分離を介して分離され、この分離物の多血小板血漿部は、隔離されかつ十分に混合された。多血小板血漿は、次いで、下記に詳述されるような異なる溶解／活性化プロセスを受けるために、等しい体積に分割された。各実施例では、溶解および／または血小板活性化を示す４つのパラメータが、測定された。ＴＧＦ−βおよびＶＥＧＦ成長因子タンパク質濃度が、商業的に入手可能であるＥＬＩＳＡキットを使用して比較された。血小板溶解の量は、溶解／活性化プロセスの前後に、血小板の数を判定するために、２つの陽性血小板表面マーカーＣＤ４１およびＣＤ６１を用いて、フローサイトメトリーを使用して判定された。血小板活性化の量は、活性化された溶解の後に残った血小板の数を判定するために、活性化血小板表面マーカーＣＤ６２ｐを使用して、フローサイトメトリーを用いて判定された。
【００５０】
実施例１
上記のように、複数回の凍結解凍サイクルが、溶液中で血小板の溶解または活性化を生じさせ、血小板からの治療用内容物のエキソサイトーシスを促進するために利用されることができる。図５は、１回の凍結解凍サイクルと少なくとも３回の凍結解凍サイクルとの間での血小板溶解の増加率、溶液中に留まる活性化血小板、および成長因子濃度をグラフで図示する。類似する試験が、２つの異なる凍結温度において実施された。実施例１で検証されたサンプルは、上記に説明されるように調製された。図５に図示されるように、観察された溶解／活性化パラメータの増加が、複数回の凍結／解凍サイクルの後に着目された。特に、複数回の凍結／解凍サイクルは、試験が、いずれの温度範囲において実施されたときでも、ＴＧＦ−βおよびＶＥＧＦ成長因子の大幅な増加率が検出される結果をもたらした。血小板溶解および活性化の増加もまた、−６０℃〜−８０℃の温度範囲を除き、複数回の凍結／解凍サイクルについて観察された。
【００５１】
実施例２
代替凍結および解凍方法が、観察された溶解および活性化の量に影響を与えることが分かった。例えば、図６は、凍結剤として空気を使用することに対して、凍結剤としてイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を使用した後に判定された、検出された成長因子内容物、血小板溶解、および血小板活性化の増加率をグラフで表す。実施例２で検証されたサンプルは、最初に、上記のように調製された。各サンプルが、１回の凍結／解凍サイクルに曝された。冷却剤としてＩＰＡを使用して試験された血小板溶液は、低温ＩＰＡ溶液槽を用いて、−１０℃〜−３０℃の範囲の低温に曝され、２０℃〜５０℃の範囲の温度において解凍された。冷却剤として空気を使用して検証された血小板溶液は、−６０℃〜−８０℃の温度において循環空気冷凍装置内に留置され、２０℃〜５０℃の温度において空気中で解凍された。凍結剤としてのイソプロピルアルコールの使用が、冷却剤として圧縮空気を用いて調製された調整血小板溶液と比較されたとき、より高い成長因子濃度と、溶解の少ない減少とを伴うが、活性化血小板の増加を伴う、調整血小板溶液をもたらすことが、図６から観察され得る。実施例２は、血小板活性化が、より少ない程度の血小板溶解の存在下、治療用血小板内容物の放出の重要な役割を果たす可能性があることを実証する。
【００５２】
実施例３
図７は、溶解／活性化プロセスの１つのステップとして、溶解／活性化剤ＣａＣｌ２の添加を伴う、成長因子濃度、血小板溶解、および血小板活性化の増加率をグラフで図示する。実施例３で検証されたサンプルは、最初に、上記に説明されるように調製された。各サンプルは、次いで、複数回の凍結／解凍サイクルに曝され、各解凍ステップ後、血小板溶液が少なくとも５回、２７ｇニードルを通して押勢される、剪断プロセスが続いた。選択されたサンプルは、次いで、０．５μＭ〜４μＭのＣａＣｌ２の添加に曝された。図７は、同一の凍結／解凍および剪断応力ステップを伴うが、最終的ＣａＣｌ２添加を伴わない、調製されたサンプルと比較した、最終的ＣａＣｌ２添加に曝されたサンプルについて観察された溶解／活性化パラメータの増加率を図示する。
実施例４
図８は、浸透応力に曝されなかったサンプルと比較して、低張液を用いて浸透応力を受ける、サンプルの成長因子濃度、血小板溶解、および血小板活性化の増加率をグラフで図示する。図８で検証されたサンプルは、最初に、上記に説明されるように調製された。あるサンプルは、次いで、血小板を多血小板血漿溶液から除去するために、遠心分離を使用して処理された。除去された血小板は、次いで、血小板を浸透応力に曝す低張水中に懸濁された。対照サンプルは、浸透応力に曝されなかった。浸透応力に曝された血小板溶液の成長因子濃度は、浸透応力に曝されなかったサンプルの成長因子濃度よりも有意に高い。
【００５３】
実施例５
実施例５は、血小板が、溶液から可視的に遠心分離され、上清が傾瀉され、結果として生じるペレット化血小板が−１０℃〜−３０℃における凍結に曝された試験結果を図示する。血小板ペレットは、次いで、分析される前に、事前に採取された上清中で再懸濁された。実施例５の対照群は、溶液中に留まりながら、類似する温度において、１回の凍結／解凍サイクルに曝された。各群で実施された溶解／活性化分析の結果比較が、図９にグラフで図示される。成長因子濃度、血小板溶解、および血小板活性化は、溶液中に残された同様に処理された血小板と比較された場合に、血小板が遠心分離を使用して溶液から除去された後に凍結／解凍サイクルで処理されたときの方が、若干上回ることが観察された。
【００５４】
実施例６
図１０は、溶解および活性化方法の代表的組み合わせに関する成長因子濃度、血小板溶解、および血小板活性化の増加率をグラフで図示する。実施例６の試験血小板の１つの群が、溶液から可視的に遠心分離された。結果として生じる血小板ペレットを格納するコンテナは、５分〜６０分の持続時間の間、−１０℃〜−３０℃でＩＰＡ媒体中に留置された。血小板は、次いで、低張液中で再懸濁され、室温において、１〜２０分間、溶解／活性化させられた。０．５μＭ〜４μＭの濃度範囲におけるＣａＣｌ２が、次いで、溶液に添加され、サンプルが、別の凍結サイクルの間、前もって採取された上清中に戻された。サンプルは、次いで、２０℃〜５０℃の温度において解凍され、分析された。対照サンプルは、循環剤として空気を用いて、冷凍装置内において単回の凍結／解凍サイクルに曝された。成長因子濃度および活性化の非常に大幅な増加が、上記のステップの組み合わせの後に、着目される。血小板溶解の増加率は、しかしながら、１０％のみであることが観察された。したがって、溶液中で実施された単回の凍結／解凍手技が、約９０％の血小板の溶解を達成し、組み合わせの方法は、約９９．８％の血小板の溶解をもたらしたと結論され得る。溶液中に留まる活性化血小板の増加率は、単純な単回の凍結／解凍方法と比較して、組み合わせ方法では約３６％であった。
【００５５】
本開示の種々の実施形態はまた、各従属請求項が前項の従属請求項ならびに独立請求項のそれぞれの限定を組み込む複数の従属請求項であるかのように、請求項において記載される種々の要素の順列を含み得る。そのような順列は、明示的に、本開示の範囲内にある。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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