(57)【要約】  本発明は、植物、特にカランコエ属に属する植物に、装飾的な花を咲かせる表現型を与えることができるタンパク質に関する。本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸配列、またはｃＤＮＡ配列、および遺伝子にも関する。さらに、本発明は、装飾的な花を咲かせるカランコエ植物を選択するための本発明のタンパク質、核酸配列、および遺伝子の使用と、本発明のタンパク質、本発明のｃＤＮＡのｍＲＮＡ形態、または本発明の遺伝子を含む、装飾的な花を咲かせるカランコエ植物とに関する。具体的には、本発明は、カランコエ植物のメチルトランスフェラーゼタンパク質の１３６番目のアミノ酸であるヒスチジンおよび／または３３８番目のアミノ酸であるアラニンのアミノ酸置換を含むタンパク質であって、そのアミノ酸置換が、装飾的な花を咲かせる表現型を本発明のカランコエ植物に与える、タンパク質に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物のメチルトランスフェラーゼタンパク質の１３６番目のアミノ酸であるヒスチジンおよび／または３３８番目のアミノ酸であるアラニンのアミノ酸置換を含むタンパク質であって、前記アミノ酸置換が、装飾的な花を咲かせる表現型を前記植物に与える、タンパク質。
【請求項２】
前記植物が、カランコエ・アデラエ、カランコエ・アルボレセンス、カランコエ・ビウベルディ、カランコエ・ベハレンシス、カランコエ・ベンチ、カランコエ・ブロッスフェルディアナ、カランコエ・ボウベチイ、カランコエ・ブラクテアタ、カランコエ・カンパヌラタ、カランコエ・クレナタ、カランコエ・クルンダリイ、カランコエ・ダイグレモンティアナ、カランコエ・デラゴエンシス、カランコエ・ジンクラゲイ、カランコエ・エリオフィラ、カランコエ・ファリナセア、カランコエ・フェドチェンコイ、カランコエ・フィグエレイドイ、カランコエ・フラメア、カランコエ・ガストニス、カランコエ・グラウケスケンス、カランコエ・グラシリペス、カランコエ・グランディディエリ、カランコエ・グランディーフローラ、カランコエ・ヒルデブランチイ、カランコエ・ヨングマンシィ、カランコエ・キューエンシス、カランコエ・ラキニナータ、カランコエ・ラエチビレンス、カランコエ・ラテリティア、カランコエ・ラクシフロラ、カランコエ・リネアリフォリア、カランコエ・ロンギフローラ、カランコエ・ルシアエ、カランコエ・マクロクラミス、カランコエ・マンギニー、カランコエ・マルニエリアナ、カランコエ・マルモラータ、カランコエ・ミロッティー、カランコエ・ミニアータ、カランコエ・ニカエ、カランコエ・オブツーサ、カランコエ・オルギアリス、カランコエ・ペルタタ、カランコエ・ペティティアナ、カランコエ・ピンナタ、カランコエ・ポルフィロカリクス、カランコエ・プロリフェラ、カランコエ・プベスケンス、カランコエ・プミラ、カランコエ・クアルチニアナ、カランコエ・ロンボピロサ、カランコエ・ロブスタ、カランコエ・ロランジ、カランコエ・ロゼイ、カランコエ・ロツンディフォリア、カランコエ・シゾフィラ、カランコエ・セラタ、カランコエ・セキサングラリス、カランコエ・ストレプタンサ、カランコエ・スアレゼンシス、カランコエ・シンセパラ、カランコエ・シンセパラｆ．ディセクタ、カランコエ・ティルシフローラ、カランコエ・トメントサ、カランコエ・ツビフローラ、カランコエ・ユニフローラ、カランコエ・ベルチナ、およびカランコエ・ビグエリーからなる群；好ましくは、Ｋ．ブロッスフェルディアナ、Ｋ．ラキニナータ、Ｋ．ロツンディフォリア、Ｋ．アロマティカ、Ｋ．プベスセンス、Ｋ．グランディーフローラ、Ｋ．シトリナ、Ｋ．アムボレンシス、Ｋ．ファウスチイ、Ｋ．スクマケリイ、Ｋ．プリトウィトジイ、Ｋ．フラメア、Ｋ．フィグエレドイ、Ｋ．ラウヒイ、Ｋ．オブツーサ、Ｋ．プミラ、Ｋ．マルモラータ、Ｋ．ポルフィロカルクス、Ｋ．ヨングマンシィ、Ｋ．ピンナタ、Ｋ．ジアグレモンチアナ、Ｋ．グラシリペス、Ｋ．カンパヌラタ、Ｋ．ラチセペラ、Ｋ．コッシネア、Ｋ．フェドチェンコイ、Ｋ．ツビフローラ、Ｋ．デクンベンス、Ｋ．マンギニー、Ｋ．オルギアリス、Ｋ．クレナタ、Ｋ．トメントサ、およびそれらの交配種からなる群から選択される、装飾的な花を咲かせるカランコエ植物から選択される、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
１３６番目のアミノ酸であるヒスチジンおよび／または３３８番目のアミノ酸であるアラニンのアミノ酸置換を有する図７に示すアミノ酸配列を含み、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有し、メチルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項１または請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
１３６番目の位置の前記アミノ酸置換が、アミノ酸アルギニンによるアミノ酸ヒスチジンの置換である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
３３８番目の位置の前記アミノ酸置換が、アミノ酸セリンによるアミノ酸アラニンの置換である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
図８に示すアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項７】
図３に示すアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
装飾的な花を咲かせる前記表現型が、花１つ当たりの花弁が４枚より多い、好ましくは、少なくとも６枚、８枚、１０枚、１５枚、２５枚、３５枚、または４０枚より多い花を特徴とし、実質的にすべての花が、装飾的な花を咲かせる前記表現型を呈する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項９】
装飾的な花を咲かせるカランコエ・ブロッスフェルディアナ植物から得られるか、またはそれに由来する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸配列。
【請求項１１】
図４に示す核酸配列。
【請求項１２】
請求項１０もしくは請求項１１に記載の核酸配列へと転写される、または、請求項１〜９のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする、遺伝子。
【請求項１３】
装飾的な花を咲かせるカランコエ植物を選択するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のタンパク質の、または、請求項１０もしくは請求項１１に記載の核酸配列の、または、請求項１２に記載の遺伝子の、使用。
【請求項１４】
装飾的な花を咲かせる前記カランコエ植物が、カランコエ・アデラエ、カランコエ・アルボレセンス、カランコエ・ビウベルディ、カランコエ・ベハレンシス、カランコエ・ベンチ、カランコエ・ブロッスフェルディアナ、カランコエ・ボウベチイ、カランコエ・ブラクテアタ、カランコエ・カンパヌラタ、カランコエ・クレナタ、カランコエ・クルンダリイ、カランコエ・ダイグレモンティアナ、カランコエ・デラゴエンシス、カランコエ・ジンクラゲイ、カランコエ・エリオフィラ、カランコエ・ファリナセア、カランコエ・フェドチェンコイ、カランコエ・フィグエレイドイ、カランコエ・フラメア、カランコエ・ガストニス、カランコエ・グラウケスケンス、カランコエ・グラシリペス、カランコエ・グランディディエリ、カランコエ・グランディーフローラ、カランコエ・ヒルデブランチイ、カランコエ・ヨングマンシィ、カランコエ・キューエンシス、カランコエ・ラキニナータ、カランコエ・ラエチビレンス、カランコエ・ラテリティア、カランコエ・ラクシフロラ、カランコエ・リネアリフォリア、カランコエ・ロンギフローラ、カランコエ・ルシアエ、カランコエ・マクロクラミス、カランコエ・マンギニー、カランコエ・マルニエリアナ、カランコエ・マルモラータ、カランコエ・ミロッティー、カランコエ・ミニアータ、カランコエ・ニカエ、カランコエ・オブツーサ、カランコエ・オルギアリス、カランコエ・ペルタタ、カランコエ・ペティティアナ、カランコエ・ピンナタ、カランコエ・ポルフィロカリクス、カランコエ・プロリフェラ、カランコエ・プベスケンス、カランコエ・プミラ、カランコエ・クアルチニアナ、カランコエ・ロンボピロサ、カランコエ・ロブスタ、カランコエ・ロランジ、カランコエ・ロゼイ、カランコエ・ロツンディフォリア、カランコエ・シゾフィラ、カランコエ・セラタ、カランコエ・セキサングラリス、カランコエ・ストレプタンサ、カランコエ・スアレゼンシス、カランコエ・シンセパラ、カランコエ・シンセパラｆ．ディセクタ、カランコエ・ティルシフローラ、カランコエ・トメントサ、カランコエ・ツビフローラ、カランコエ・ユニフローラ、カランコエ・ベルチナ、およびカランコエ・ビグエリーからなる群；好ましくは、Ｋ．ブロッスフェルディアナ、Ｋ．ラキニナータ、Ｋ．ロツンディフォリア、Ｋ．アロマティカ、Ｋ．プベスセンス、Ｋ．グランディーフローラ、Ｋ．シトリナ、Ｋ．アムボレンシス、Ｋ．ファウスチイ、Ｋ．スクマケリイ、Ｋ．プリトウィトジイ、Ｋ．フラメア、Ｋ．フィグエレドイ、Ｋ．ラウヒイ、Ｋ．オブツーサ、Ｋ．プミラ、Ｋ．マルモラータ、Ｋ．ポルフィロカルクス、Ｋ．ヨングマンシィ、Ｋ．ピンナタ、Ｋ．ジアグレモンチアナ、Ｋ．グラシリペス、Ｋ．カンパヌラタ、Ｋ．ラチセペラ、Ｋ．コッシネア、Ｋ．フェドチェンコイ、Ｋ．ツビフローラ、Ｋ．デクンベンス、Ｋ．マンギニー、Ｋ．オルギアリス、Ｋ．クレナタ、Ｋ．トメントサ、およびそれらの交配種からなる群から選択される、装飾的な花を咲かせるカランコエ植物から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項１０もしくは請求項１１に記載の核酸、または、請求項１２に記載の遺伝子を含む、植物、プロトプラスト、または植物部分。
【請求項１６】
カランコエ・アデラエ、カランコエ・アルボレセンス、カランコエ・ビウベルディ、カランコエ・ベハレンシス、カランコエ・ベンチ、カランコエ・ブロッスフェルディアナ、カランコエ・ボウベチイ、カランコエ・ブラクテアタ、カランコエ・カンパヌラタ、カランコエ・クレナタ、カランコエ・クルンダリイ、カランコエ・ダイグレモンティアナ、カランコエ・デラゴエンシス、カランコエ・ジンクラゲイ、カランコエ・エリオフィラ、カランコエ・ファリナセア、カランコエ・フェドチェンコイ、カランコエ・フィグエレイドイ、カランコエ・フラメア、カランコエ・ガストニス、カランコエ・グラウケスケンス、カランコエ・グラシリペス、カランコエ・グランディディエリ、カランコエ・グランディーフローラ、カランコエ・ヒルデブランチイ、カランコエ・ヨングマンシィ、カランコエ・キューエンシス、カランコエ・ラキニナータ、カランコエ・ラエチビレンス、カランコエ・ラテリティア、カランコエ・ラクシフロラ、カランコエ・リネアリフォリア、カランコエ・ロンギフローラ、カランコエ・ルシアエ、カランコエ・マクロクラミス、カランコエ・マンギニー、カランコエ・マルニエリアナ、カランコエ・マルモラータ、カランコエ・ミロッティー、カランコエ・ミニアータ、カランコエ・ニカエ、カランコエ・オブツーサ、カランコエ・オルギアリス、カランコエ・ペルタタ、カランコエ・ペティティアナ、カランコエ・ピンナタ、カランコエ・ポルフィロカリクス、カランコエ・プロリフェラ、カランコエ・プベスケンス、カランコエ・プミラ、カランコエ・クアルチニアナ、カランコエ・ロンボピロサ、カランコエ・ロブスタ、カランコエ・ロランジ、カランコエ・ロゼイ、カランコエ・ロツンディフォリア、カランコエ・シゾフィラ、カランコエ・セラタ、カランコエ・セキサングラリス、カランコエ・ストレプタンサ、カランコエ・スアレゼンシス、カランコエ・シンセパラ、カランコエ・シンセパラｆ．ディセクタ、カランコエ・ティルシフローラ、カランコエ・トメントサ、カランコエ・ツビフローラ、カランコエ・ユニフローラ、カランコエ・ベルチナ、およびカランコエ・ビグエリーからなる群；好ましくは、Ｋ．ブロッスフェルディアナ、Ｋ．ラキニナータ、Ｋ．ロツンディフォリア、Ｋ．アロマティカ、Ｋ．プベスセンス、Ｋ．グランディーフローラ、Ｋ．シトリナ、Ｋ．アムボレンシス、Ｋ．ファウスチイ、Ｋ．スクマケリイ、Ｋ．プリトウィトジイ、Ｋ．フラメア、Ｋ．フィグエレドイ、Ｋ．ラウヒイ、Ｋ．オブツーサ、Ｋ．プミラ、Ｋ．マルモラータ、Ｋ．ポルフィロカルクス、Ｋ．ヨングマンシィ、Ｋ．ピンナタ、Ｋ．ジアグレモンチアナ、Ｋ．グラシリペス、Ｋ．カンパヌラタ、Ｋ．ラチセペラ、Ｋ．コッシネア、Ｋ．フェドチェンコイ、Ｋ．ツビフローラ、Ｋ．デクンベンス、Ｋ．マンギニー、Ｋ．オルギアリス、Ｋ．クレナタ、Ｋ．トメントサ、およびそれらの交配種からなる群から選択される、装飾的な花を咲かせるカランコエ植物から選択される、請求項１５に記載の植物、プロトプラスト、または植物部分。
【請求項１７】
装飾的な花を咲かせる表現型を示唆する、またはそれに関連付けられる分子マーカーを開発するための、請求項１から９のいずれか１項に記載のタンパク質、または請求項１０もしくは請求項１１に記載の核酸配列、または請求項１２に記載の遺伝子の使用。
【請求項１８】
図１または図７に示すメチルトランスフェラーゼと比べて変異している、装飾的な表現型を与える変異メチルトランスフェラーゼを含む、植物、プロトプラストまたは植物部分。
【請求項１９】
カランコエ・アデラエ、カランコエ・アルボレセンス、カランコエ・ビウベルディ、カランコエ・ベハレンシス、カランコエ・ベンチ、カランコエ・ブロッスフェルディアナ、カランコエ・ボウベチイ、カランコエ・ブラクテアタ、カランコエ・カンパヌラタ、カランコエ・クレナタ、カランコエ・クルンダリイ、カランコエ・ダイグレモンティアナ、カランコエ・デラゴエンシス、カランコエ・ジンクラゲイ、カランコエ・エリオフィラ、カランコエ・ファリナセア、カランコエ・フェドチェンコイ、カランコエ・フィグエレイドイ、カランコエ・フラメア、カランコエ・ガストニス、カランコエ・グラウケスケンス、カランコエ・グラシリペス、カランコエ・グランディディエリ、カランコエ・グランディーフローラ、カランコエ・ヒルデブランチイ、カランコエ・ヨングマンシィ、カランコエ・キューエンシス、カランコエ・ラキニナータ、カランコエ・ラエチビレンス、カランコエ・ラテリティア、カランコエ・ラクシフロラ、カランコエ・リネアリフォリア、カランコエ・ロンギフローラ、カランコエ・ルシアエ、カランコエ・マクロクラミス、カランコエ・マンギニー、カランコエ・マルニエリアナ、カランコエ・マルモラータ、カランコエ・ミロッティー、カランコエ・ミニアータ、カランコエ・ニカエ、カランコエ・オブツーサ、カランコエ・オルギアリス、カランコエ・ペルタタ、カランコエ・ペティティアナ、カランコエ・ピンナタ、カランコエ・ポルフィロカリクス、カランコエ・プロリフェラ、カランコエ・プベスケンス、カランコエ・プミラ、カランコエ・クアルチニアナ、カランコエ・ロンボピロサ、カランコエ・ロブスタ、カランコエ・ロランジ、カランコエ・ロゼイ、カランコエ・ロツンディフォリア、カランコエ・シゾフィラ、カランコエ・セラタ、カランコエ・セキサングラリス、カランコエ・ストレプタンサ、カランコエ・スアレゼンシス、カランコエ・シンセパラ、カランコエ・シンセパラｆ．ディセクタ、カランコエ・ティルシフローラ、カランコエ・トメントサ、カランコエ・ツビフローラ、カランコエ・ユニフローラ、カランコエ・ベルチナ、およびカランコエ・ビグエリーからなる群；好ましくは、Ｋ．ブロッスフェルディアナ、Ｋ．ラキニナータ、Ｋ．ロツンディフォリア、Ｋ．アロマティカ、Ｋ．プベスセンス、Ｋ．グランディーフローラ、Ｋ．シトリナ、Ｋ．アムボレンシス、Ｋ．ファウスチイ、Ｋ．スクマケリイ、Ｋ．プリトウィトジイ、Ｋ．フラメア、Ｋ．フィグエレドイ、Ｋ．ラウヒイ、Ｋ．オブツーサ、Ｋ．プミラ、Ｋ．マルモラータ、Ｋ．ポルフィロカルクス、Ｋ．ヨングマンシィ、Ｋ．ピンナタ、Ｋ．ジアグレモンチアナ、Ｋ．グラシリペス、Ｋ．カンパヌラタ、Ｋ．ラチセペラ、Ｋ．コッシネア、Ｋ．フェドチェンコイ、Ｋ．ツビフローラ、Ｋ．デクンベンス、Ｋ．マンギニー、Ｋ．オルギアリス、Ｋ．クレナタ、Ｋ．トメントサ、およびそれらの交配種からなる群から選択される、装飾的な花を咲かせるカランコエ植物から選択される、請求項１８に記載の植物、プロトプラスト、または植物部分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物、特にカランコエ（Kalanchoe）属に属する植物に、装飾的な花を咲かせる表現型を与えることができるタンパク質に関する。本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸配列、またはｃＤＮＡ配列、および遺伝子にも関する。さらに、本発明は、装飾的な花を咲かせるカランコエ植物を選択するための本発明のタンパク質、核酸配列、および遺伝子の使用と、本発明のタンパク質、本発明のｃＤＮＡのｍＲＮＡ形態、または本発明の遺伝子を含む装飾的な花を咲かせるカランコエ植物とに関する。
【背景技術】
【０００２】
カランコエ属は、ベンケイソウ（Crassulaceae）科の約１２５種の熱帯性多肉顕花植物からなる属である。この属の内で１種のみが、アメリカ大陸が原産地であることが公知であり、５６種は南アフリカおよび東アフリカが原産地であり、６０種はマダガスカルが原産地である。また、カランコエ植物は、東南アジアおよび中国にも存在する。
【０００３】
カランコエ属に属する公知の種は、カランコエ・アデラエ（Kalanchoe adelae）、カランコエ・アルボレセンス（Kalanchoe arborescens）、カランコエ・ビウベルディ（Kalanchoe beauverdii）、カランコエ・ベハレンシス（Kalanchoe beharensis）、カランコエ・ベンチ（Kalanchoe bentii）、カランコエ・ブロッスフェルディアナ（Kalanchoe blossfeldiana）、カランコエ・ボウベチイ（Kalanchoe bouvetii）、カランコエ・ブラクテアタ（Kalanchoe bracteata）、カランコエ・カンパヌラタ（Kalanchoe campanulata）、カランコエ・クレナタ（Kalanchoe crenata）、カランコエ・クルンダリイ（Kalanchoe crundallii）、カランコエ・ダイグレモンティアナ（Kalanchoe daigremontiana）、カランコエ・デラゴエンシス（Kalanchoe delagoensis）、カランコエ・ジンクラゲイ（Kalanchoe dinklagei）、カランコエ・エリオフィラ（Kalanchoe eriophylla）、カランコエ・ファリナセア（Kalanchoe farinacea）、カランコエ・フェドチェンコイ（Kalanchoe fedtschenkoi）、カランコエ・フィグエレイドイ（Kalanchoe figuereidoi）、カランコエ・フラメア（Kalanchoe flammea）、カランコエ・ガストニス（Kalanchoe gastonis）、カランコエ・グラウケスケンス（Kalanchoe glaucescens）、カランコエ・グラシリペス（Kalanchoe gracilipes）、カランコエ・グランディディエリ（Kalanchoe grandidieri）、カランコエ・グランディーフローラ（Kalanchoe grandiflora）、カランコエ・ヒルデブランチイ（Kalanchoe hildebrantii）、カランコエ・ヨングマンシィ（Kalanchoe jongmansii）、カランコエ・キューエンシス（Kalanchoe kewensis）、カランコエ・ラキニナータ（Kalanchoe laciniata）、カランコエ・ラエチビレンス（Kalanchoe laetivirens）、カランコエ・ラテリティア（Kalanchoe lateritia）、カランコエ・ラクシフロラ（Kalanchoe laxiflora）、カランコエ・リネアリフォリア（Kalanchoe linearifolia）、カランコエ・ロンギフローラ（Kalanchoe longiflora）、カランコエ・ルシアエ（Kalanchoe luciae）、カランコエ・マクロクラミス（Kalanchoe macrochlamys）、カランコエ・マンギニー（Kalanchoe manginii）、カランコエ・マルニエリアナ（Kalanchoe marnieriana）、カランコエ・マルモラータ（Kalanchoe marmorata）、カランコエ・ミロッティー（Kalanchoe millottii）、カランコエ・ミニアータ（Kalanchoe miniata）、カランコエ・ニカエ（Kalanchoe nyikae）、カランコエ・オブツーサ（Kalanchoe obtusa）、カランコエ・オルギアリス（Kalanchoe orgyalis）、カランコエ・ペルタタ（Kalanchoe peltata）、カランコエ・ペティティアナ（Kalanchoe petitiana）、カランコエ・ピンナタ（Kalanchoe pinnata）、カランコエ・ポルフィロカリクス（Kalanchoe porphyrocalyx）、カランコエ・プロリフェラ（Kalanchoe prolifera）、カランコエ・プベスケンス（Kalanchoe pubescens）、カランコエ・プミラ（Kalanchoe pumila）、カランコエ・クアルチニアナ（Kalanchoe quartiniana）、カランコエ・ロンボピロサ（Kalanchoe rhombopilosa）、カランコエ・ロブスタ（Kalanchoe robusta）、カランコエ・ロランジ（Kalanchoe rolandi）、カランコエ・ロゼイ（Kalanchoe rosei）、カランコエ・ロツンディフォリア（Kalanchoe rotundifolia）、カランコエ・シゾフィラ（Kalanchoe schizophylla）、カランコエ・セラタ（Kalanchoe serrata）、カランコエ・セキサングラリス（Kalanchoe sexangularis）、カランコエ・ストレプタンサ（Kalanchoe streptantha）、カランコエ・スアレゼンシス（Kalanchoe suarezensis）、カランコエ・シンセパラ（Kalanchoe synsepala）、カランコエ・シンセパラｆ．ディセクタ（Kalanchoe synsepala f.dissecta）、カランコエ・ティルシフローラ（Kalanchoe thyrsiflora）、カランコエ・トメントサ（Kalanchoe tomentosa）、カランコエ・ツビフローラ（Kalanchoe tubiflora）、カランコエ・ユニフローラ（Kalanchoe uniflora）、カランコエ・ベルチナ（Kalanchoe velutina）、およびカランコエ・ビグエリー（Kalanchoe viguieri）である。
【０００４】
ほとんどのカランコエ植物は、低木または多年生草本植物であるが、少数は、一年生または二年生である。最大の植物、すなわち、マダカスカルが原産地であるカランコエ・ベハレンシスは、６メートルに達し得るが、ほとんどの種は１メートル未満である。カランコエ植物は、新しい細胞を、花弁内部表面で増殖させて花弁を外側に向かって押し出し、花弁外側で増殖させて花弁を閉じることによって花を開くことを特徴とする。
【０００５】
カランコエ属は、１７６３年に植物学者Ｍｉｃｈｅｌ  Ａｄａｎｓｏｎによって最初に報告された。伝えられるところによれば、その名称は、「それらの種の内の１つの中国名」に由来した。この中国種は、カランコエ・セラトフィラ（Kalanchoe ceratophylla）またはカランコエ・スパツラタ（Kalanchoe spathulata）のいずれかであったと考えられている。ブリオフィルム（Bryophyllum）属は、１８０６年にＳａｌｉｓｂｕｒｙによって報告され、キチンギア（Kitchingia）属は、１８８１年にＢａｋｅｒによって設けられた。現在、キチンギアがカランコエの同義語とみなされている一方で、一部の植物学者は、ブリオフィルムを別の属として扱っている。
【０００６】
カランコエ植物は、通常、観賞用の室内用鉢植え植物および岩石庭園または多肉植物庭園用の植物として栽培される。カランコエ植物は、繁殖が容易であり、水分必要量が少なく、典型的には栄養生長部のかなり上に房になって生じる花の色が多種多様であるため、人気がある。以前は独立した属であったブリオフィルム節は、「着生植物」カランコエ・ピンナタなどの種を含む。これらの植物では、新しい個体が、鱗芽または無性芽としても公知である小植物として、葉の縁のへこみに無性的に発育する。これらの若い植物は、最終的には落ちて、根を下ろす。花を咲かせ、種を実らせ、一般にユキノシタ（Mother of Thousands）と名付けられているこの属の種において、雄性植物は見出されていない。
【０００７】
他のベンケイソウ科（チレコドン（Tylecodon）属、コチレドン（Cotyledon）属、およびアドロミスクス（Adromischus）属など）と同じように、いくつかのカランコエ種は、特に草食動物に心臓中毒を引き起こし得るブファジエノリド強心配糖体を含有する。これは、南アフリカのカルー地域にある多くのカランコエ種の天然分布域に特有の問題であり、結果として生じる動物疾患は、クリンプジークテ（萎縮する疾患）またはコチレドノシスとして公知である。同様の中毒が、オーストラリアでも起きている。
【０００８】
従来の医学において、カランコエ種は、感染症、リウマチ、および炎症などの疾患を治療するのに使用されていた。カランコエ抽出物は、免疫抑制効果も有している。カランコエ・ピンナタは、高血圧に対する伝統的な治療薬として使用されていることが、トリニダードおよびトバゴにおいて記録されている。
【０００９】
様々なブファジエノリド化合物が、様々なカランコエ種から単離されている。カランコエ・ダイグレモンティアナからは、５種の異なるブファジエノリドが単離されている。これらの内の２種、すなわち、ダイグレモンチアニンおよびベルサルデゲニン１，３，５−オルトアセタートは、顕著な鎮静効果を有することが示されている。また、これらは、強心配糖体に関連する強い陽性変力作用も有しており、用量が増えるほど、中枢神経系に対する効果が大きくなる。カランコエ・ピンナタから単離されるブファジエノリド化合物は、強い抗腫瘍促進活性を示したブリオフィリンＡ、ならびに活性が劣っていたベルサルデゲニン−３−アセタートおよびブリオフィリンＣを含む。また、ブリオフィリンＣは、殺虫性も示した。
【００１０】
記載したように、Ｋ．ブロッスフェルディアナ、Ｋ．ラキニナータ、Ｋ．ロツンディフォリア、Ｋ．アロマティカ（aromatica）、Ｋ．プベスセンス（pubescens）、Ｋ．グランディーフローラ、Ｋ．シトリナ（citrina）、Ｋ．アムボレンシス（ambolensis）、Ｋ．ファウスチイ（faustii）、Ｋ．スクマケリイ（schumacherii）、Ｋ．プリトウィトジイ（pritwitzii）、Ｋ．フラメア、Ｋ．フィグエレドイ（figueredoi）、Ｋ．ラウヒイ（rauhii）、Ｋ．オブツーサ、Ｋ．プミラ、Ｋ．マルモラータ、Ｋ．ポルフィロカルクス（porphyrocalux）、Ｋ．ヨングマンシィ、Ｋ．ピンナタ、Ｋ．ジアグレモンチアナ（diagremontiana）、Ｋ．グラシリペス、Ｋ．カンパヌラタ、Ｋ．ラチセペラ（latisepela）、Ｋ．コッシネア（coccinea）、Ｋ．フェドチェンコイ、Ｋ．ツビフローラ、Ｋ．デクンベンス（decumbens）、Ｋ．マンギニー、Ｋ．オルギアリス、Ｋ．クレナタ、Ｋ．トメントサ、およびそれらの交配種などいくつかのカランコエ種は、観賞用の室内用鉢植え植物および岩石庭園または多肉植物庭園用の植物として栽培される。したがって、これらの植物の外観、特に花を咲かせる様式は、それらの経済的価値および用途を決定する主要因子である。花を咲かせる１つの様式は、いわゆる、装飾的な花を咲かせる様式である。このような装飾的な花を咲かせる様式を示すカランコエ植物は、花１つ当たりの花弁が４枚より多い、例えば、少なくとも６枚、８枚、１０枚、１５枚、２５枚、３５枚、または４０枚より多い花を有することを特徴とし、これらのカランコエ植物の実質的にすべての花が、装飾的な花を咲かせる表現型を呈する。
【００１１】
装飾的な花を咲かせる表現型を呈するカランコエ植物は、当技術分野において公知であるが、装飾的な花を咲かせる表現型の遺伝学的原因因子、例えば遺伝子が、当技術分野において必要とされている。それによって、カランコエ植物の育種を容易かつ簡便にする（発育の比較的早期に形質の移入を制御し、選択することができるため）だけでなく、カランコエ植物の新しい品種、特に、２種以上のカランコエ種が混ざった遺伝子構成を有し、装飾的な花を咲かせる表現型を呈する植物を提供するためである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、他にも目的はあるが、特に、当技術分野における上記の必要性を満たすこと、すなわち、装飾的な花を咲かせる表現型の遺伝学的原因因子を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
他にも目的はあるが、特に、この目的は、添付の特許請求の範囲において概説するタンパク質、核酸配列（ｃＤＮＡまたはコード配列）、および遺伝子を提供することにより、本発明によって達成される。
【００１４】
具体的には、この目的は、本発明の第１の態様により、カランコエ植物のメチルトランスフェラーゼタンパク質の１３６番目のアミノ酸であるヒスチジンおよび３３８番目のアミノ酸であるアラニンのアミノ酸置換を含むタンパク質によって達成され、ここで、本発明のアミノ酸置換は、装飾的な花を咲かせる表現型を本発明のカランコエ植物に与える。
【００１５】
具体的には、この目的は、本発明の第１の態様により、カランコエ植物のメチルトランスフェラーゼタンパク質の１３６番目のアミノ酸であるヒスチジンのアミノ酸置換を含むタンパク質によって達成され、ここで、本発明のアミノ酸置換は、装飾的な花を咲かせる表現型を本発明のカランコエ植物に与える。
【００１６】
具体的には、この目的は、本発明の第１の態様により、カランコエ植物のメチルトランスフェラーゼタンパク質の３３８番目のアミノ酸であるアラニンのアミノ酸置換を含むタンパク質によって達成され、ここで、本発明のアミノ酸置換は、装飾的な花を咲かせる表現型を前記本発明のカランコエ植物に与える。
【００１７】
この第１の態様の好ましい実施形態によれば、本発明は、１３６番目のアミノ酸であるヒスチジンおよび３３８番目のアミノ酸であるアラニンのアミノ酸置換を有する図７に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、ならびにメチルトランスフェラーゼ活性を有するという条件のもとで、それらに対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは９９％の配列同一性を有するタンパク質に関する。
【００１８】
この第１の態様の好ましい実施形態によれば、本発明は、１３６番目のアミノ酸であるヒスチジンのアミノ酸置換を有する図７に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、およびメチルトランスフェラーゼ活性を有するという条件のもとで、それらに対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは９９％の配列同一性を有するタンパク質に関する。
【００１９】
この第１の態様の好ましい実施形態によれば、本発明は、３３８番目のアミノ酸であるアラニンのアミノ酸置換を有する図７に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、およびメチルトランスフェラーゼ活性を有するという条件のもとで、それらに対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは９９％の配列同一性を有するタンパク質に関する。
【００２０】
本発明の文脈において、相同タンパク質は、これらのタンパク質が、図７に示すタンパク質配列に対して全長にわたって少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは９９％の配列同一性を示すという条件のもとで、かつ図７に示すタンパク質配列の１３６番目または３３８番目に対応する少なくとも１つの位置が変異しているという条件のもとで考慮の対象になる。
【００２１】
図１および図７に示すアミノ酸配列は、装飾的な花を咲かせる表現型を与えないタンパク質のアミノ酸配列であり、図３および図８に示すアミノ酸配列は、変異、すなわち、本発明の場合、アミノ酸置換によって、装飾的な花を咲かせる表現型を与えるタンパク質のアミノ酸配列である。図３および図８では、アミノ酸置換または変異を示しているが、欠失、短縮、およびアミノ酸挿入も、本発明において検討される。
【００２２】
本発明の装飾的な花を咲かせる表現型は、変異タンパク質を結果として生じる、コード配列中の単一の遺伝子変異、すなわち、１３６番目もしくは３３８番目のアミノ酸置換または１３６番目および３３８番目のアミノ酸置換によって与えることができる。遺伝実験により、変異が優性であること、すなわち、これらの変異の両方について、ホモ接合性カランコエ植物およびヘテロ接合性カランコエ植物は、装飾的な花を咲かせる表現型を呈することが示されたが、ヘテロ接合性カランコエ植物の方が好ましい。
【００２３】
本発明のこの第１の態様のより好ましい実施形態によれば、本発明のタンパク質は、３３８番目の位置のアラニン（ＡまたはＡｌａ）からセリン（ＳまたはＳｅｒ）へのアミノ酸置換、および１３６番目の位置のヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）からアルギニン（ＲまたはＡｒｇ）へのアミノ酸置換を含むが、他のアミノ酸による置換、例えば、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、トレオニン、バリン、トリプトファン、およびチロシンによる置換も、本発明において検討される。
【００２４】
本発明のこの第１の態様のより好ましい実施形態によれば、本発明のタンパク質は、３３８番目の位置のアラニン（ＡまたはＡｌａ）からセリン（ＳまたはＳｅｒ）へのアミノ酸置換を含むが、他のアミノ酸による置換、例えば、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、トレオニン、バリン、トリプトファン、およびチロシンによる置換も、本発明において検討される。
【００２５】
本発明のこの第１の態様のより好ましい実施形態によれば、本発明のタンパク質は、１３６番目の位置のヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）からアルギニン（ＲまたはＡｒｇ）へのアミノ酸置換を含むが、他のアミノ酸による置換、例えば、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、トレオニン、バリン、トリプトファン、およびチロシンによる置換も、本発明において検討される。
【００２６】
本発明のこの第１の態様のさらにより好ましい実施形態によれば、本発明のタンパク質は、図３または図８に示すアミノ酸配列を含む。別の表現をすると、本発明のタンパク質は、実質的に、図３または図８に示すアミノ酸配列を有する。
【００２７】
本発明の第２の態様によれば、タンパク質は、図１に示すアミノ酸配列中に、装飾的な花を咲かせる表現型をカランコエ植物に与える少なくとも１つの変異を含む。図１に示すタンパク質が、装飾的な花を咲かせる表現型の原因因子であるという知識を有していれば、当業者であれば、標準的な手段および方法を用いて、例えば、ＥＭＳまたは部位特異的変異誘発によってこのタンパク質を変異させ、続いて、例えば配列決定またはＰＣＲによる適切な選択を行い、それによって、装飾的な花を咲かせる表現型を示すカランコエ植物を提供することは容易である。代替の方法として、本発明の遺伝子を、従来の育種によって、育種対象の生殖質（breeding germplasm）に導入することもできる。
【００２８】
本発明のこれらの第１および第２の態様の特に好ましい実施形態によれば、開示されるタンパク質は、装飾的な花を咲かせるカランコエ・ブロッスフェルディアナ植物から得られるか、またはそれに由来する。
【００２９】
第３の態様によれば、本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸配列、好ましくは、実質的に、図４に示す核酸配列に関する。
【００３０】
第４の態様によれば、本発明は、本発明の核酸配列へと転写可能な遺伝子に関する。別の表現をすると、本発明は、適切な条件下で、ｍＲＮＡへと転写されるための鋳型となることができる遺伝子を包含し、このｍＲＮＡが、次に、本発明のタンパク質配列に翻訳される。
【００３１】
第５の態様によれば、本発明は、装飾的な花を咲かせるカランコエ植物を選択するための、本発明のタンパク質、本発明の核酸配列、または本発明の遺伝子の使用に関する。このような選択は、例えば、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、制限解析、またはノーザン／サザンブロットによって、装飾的な花を咲かせるカランコエ植物を、好ましくは発育早期に同定することを含み、それによって、既存のカランコエ植物および新しいカランコエ植物の育種工程を容易にすることができる。
【００３２】
本発明の使用は、好ましくは、カランコエ・アデラエ、カランコエ・アルボレセンス、カランコエ・ビウベルディ、カランコエ・ベハレンシス、カランコエ・ベンチ、カランコエ・ブロッスフェルディアナ、カランコエ・ボウベチイ、カランコエ・ブラクテアタ、カランコエ・カンパヌラタ、カランコエ・クレナタ、カランコエ・クルンダリイ、カランコエ・ダイグレモンティアナ、カランコエ・デラゴエンシス、カランコエ・ジンクラゲイ、カランコエ・エリオフィラ、カランコエ・ファリナセア、カランコエ・フェドチェンコイ、カランコエ・フィグエレイドイ、カランコエ・フラメア、カランコエ・ガストニス、カランコエ・グラウケスケンス、カランコエ・グラシリペス、カランコエ・グランディディエリ、カランコエ・グランディーフローラ、カランコエ・ヒルデブランチイ、カランコエ・ヨングマンシィ、カランコエ・キューエンシス、カランコエ・ラキニナータ、カランコエ・ラエチビレンス、カランコエ・ラテリティア、カランコエ・ラクシフロラ、カランコエ・リネアリフォリア、カランコエ・ロンギフローラ、カランコエ・ルシアエ、カランコエ・マクロクラミス、カランコエ・マンギニー、カランコエ・マルニエリアナ、カランコエ・マルモラータ、カランコエ・ミロッティー、カランコエ・ミニアータ、カランコエ・ニカエ、カランコエ・オブツーサ、カランコエ・オルギアリス、カランコエ・ペルタタ、カランコエ・ペティティアナ、カランコエ・ピンナタ、カランコエ・ポルフィロカリクス、カランコエ・プロリフェラ、カランコエ・プベスケンス、カランコエ・プミラ、カランコエ・クアルチニアナ、カランコエ・ロンボピロサ、カランコエ・ロブスタ、カランコエ・ロランジ、カランコエ・ロゼイ、カランコエ・ロツンディフォリア、カランコエ・シゾフィラ、カランコエ・セラタ、カランコエ・セキサングラリス、カランコエ・ストレプタンサ、カランコエ・スアレゼンシス、カランコエ・シンセパラ、カランコエ・シンセパラｆ．ディセクタ、カランコエ・ティルシフローラ、カランコエ・トメントサ、カランコエ・ツビフローラ、カランコエ・ユニフローラ、カランコエ・ベルチナ、およびカランコエ・ビグエリーからなる群から選択される、装飾的な花を咲かせるカランコエ植物；より好ましくは、Ｋ．ブロッスフェルディアナ、Ｋ．ラキニナータ、Ｋ．ロツンディフォリア、Ｋ．アロマティカ、Ｋ．プベスセンス、Ｋ．グランディーフローラ、Ｋ．シトリナ、Ｋ．アムボレンシス、Ｋ．ファウスチイ、Ｋ．スクマケリイ、Ｋ．プリトウィトジイ、Ｋ．フラメア、Ｋ．フィグエレドイ、Ｋ．ラウヒイ、Ｋ．オブツーサ、Ｋ．プミラ、Ｋ．マルモラータ、Ｋ．ポルフィロカルクス、Ｋ．ヨングマンシィ、Ｋ．ピンナタ、Ｋ．ジアグレモンチアナ、Ｋ．グラシリペス、Ｋ．カンパヌラタ、Ｋ．ラチセペラ、Ｋ．コッシネア、Ｋ．フェドチェンコイ、Ｋ．ツビフローラ、Ｋ．デクンベンス、Ｋ．マンギニー、Ｋ．オルギアリス、Ｋ．クレナタ、Ｋ．トメントサ、およびそれらの交配種からなる群から選択される、装飾的な花を咲かせるカランコエ植物の選択のために使用される。
【００３３】
第６および第７の態様によれば、本発明は、本発明のタンパク質、本発明の核酸配列（ｍＲＮＡの形態）、または本発明の遺伝子を含む、植物または植物部分に関し、また、本発明のタンパク質、本発明の核酸配列、または本発明の遺伝子を用いて得ることができる、または得られる植物にも関する。
【００３４】
本発明のこの第６および第７の態様の好ましい実施形態によれば、植物は、カランコエ・アデラエ、カランコエ・アルボレセンス、カランコエ・ビウベルディ、カランコエ・ベハレンシス、カランコエ・ベンチ、カランコエ・ブロッスフェルディアナ、カランコエ・ボウベチイ、カランコエ・ブラクテアタ、カランコエ・カンパヌラタ、カランコエ・クレナタ、カランコエ・クルンダリイ、カランコエ・ダイグレモンティアナ、カランコエ・デラゴエンシス、カランコエ・ジンクラゲイ、カランコエ・エリオフィラ、カランコエ・ファリナセア、カランコエ・フェドチェンコイ、カランコエ・フィグエレイドイ、カランコエ・フラメア、カランコエ・ガストニス、カランコエ・グラウケスケンス、カランコエ・グラシリペス、カランコエ・グランディディエリ、カランコエ・グランディーフローラ、カランコエ・ヒルデブランチイ、カランコエ・ヨングマンシィ、カランコエ・キューエンシス、カランコエ・ラキニナータ、カランコエ・ラエチビレンス、カランコエ・ラテリティア、カランコエ・ラクシフロラ、カランコエ・リネアリフォリア、カランコエ・ロンギフローラ、カランコエ・ルシアエ、カランコエ・マクロクラミス、カランコエ・マンギニー、カランコエ・マルニエリアナ、カランコエ・マルモラータ、カランコエ・ミロッティー、カランコエ・ミニアータ、カランコエ・ニカエ、カランコエ・オブツーサ、カランコエ・オルギアリス、カランコエ・ペルタタ、カランコエ・ペティティアナ、カランコエ・ピンナタ、カランコエ・ポルフィロカリクス、カランコエ・プロリフェラ、カランコエ・プベスケンス、カランコエ・プミラ、カランコエ・クアルチニアナ、カランコエ・ロンボピロサ、カランコエ・ロブスタ、カランコエ・ロランジ、カランコエ・ロゼイ、カランコエ・ロツンディフォリア、カランコエ・シゾフィラ、カランコエ・セラタ、カランコエ・セキサングラリス、カランコエ・ストレプタンサ、カランコエ・スアレゼンシス、カランコエ・シンセパラ、カランコエ・シンセパラｆ．ディセクタ、カランコエ・ティルシフローラ、カランコエ・トメントサ、カランコエ・ツビフローラ、カランコエ・ユニフローラ、カランコエ・ベルチナ、およびカランコエ・ビグエリーからなる群；より好ましくは、Ｋ．ブロッスフェルディアナ、Ｋ．ラキニナータ、Ｋ．ロツンディフォリア、Ｋ．アロマティカ、Ｋ．プベスセンス、Ｋ．グランディーフローラ、Ｋ．シトリナ、Ｋ．アムボレンシス、Ｋ．ファウスチイ、Ｋ．スクマケリイ、Ｋ．プリトウィトジイ、Ｋ．フラメア、Ｋ．フィグエレドイ、Ｋ．ラウヒイ、Ｋ．オブツーサ、Ｋ．プミラ、Ｋ．マルモラータ、Ｋ．ポルフィロカルクス、Ｋ．ヨングマンシィ、Ｋ．ピンナタ、Ｋ．ジアグレモンチアナ、Ｋ．グラシリペス、Ｋ．カンパヌラタ、Ｋ．ラチセペラ、Ｋ．コッシネア、Ｋ．フェドチェンコイ、Ｋ．ツビフローラ、Ｋ．デクンベンス、Ｋ．マンギニー、Ｋ．オルギアリス、Ｋ．クレナタ、Ｋ．トメントサ、およびそれらの交配種からなる群から選択される、装飾的な花を咲かせるカランコエ植物から選択される。
【００３５】
明細書および特許請求の範囲の全体を通して、以下の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】装飾的な花を咲かせる表現型をカランコエにもたらさないタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】図１に示すアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列を示す図である。
【図３】装飾的な花を咲かせる表現型をカランコエにもたらすタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図４】図３に示すアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列を示す図である。
【図５】図１および図３に示すアミノ酸配列のアライメントを示す図である。
【図６】図２および図４に示すヌクレオチド配列のアライメントを示す図である。
【図７】装飾的な花を咲かせる表現型をカランコエにもたらさないタンパク質のアミノ酸配列における、Ｘ（任意の天然に存在するアミノ酸）を用いて示した変異性の位置を示す図である。
【図８】装飾的な花を咲かせる表現型をカランコエにもたらすタンパク質のアミノ酸配列における、Ｘ（任意の天然に存在するアミノ酸）を用いて示した変異性の位置を示す図である。
【実施例】
【００３７】
図７および図８に示す本発明のメチルトランスフェラーゼの存在を、装飾的な花を咲かせる表現型を有するいくつかのカランコエ種において明らかにした。対照として、花を咲かせない表現型のいくつかのカランコエ種を含めた。これらの結果を下記の表１に要約する。
【００３８】
【表１】
2016539656.tif 000002
【００３９】
表１に示すように、装飾的な花を咲かせるカランコエ種はすべて、野生型メチルトランスフェラーゼタンパク質に加えて、１３６番目および３３８番目の位置にアミノ酸置換を有する変異メチルトランスフェラーゼタンパク質を含んでいた。
【図１】
2016539656.tif 000003
【図２】
2016539656.tif 000004
【図３】
2016539656.tif 000005
【図４】
2016539656.tif 000006
【図５】
2016539656.tif 000007
【図６−１】
2016539656.tif 000008
【図６−２】
2016539656.tif 000009
【図７】
2016539656.tif 000010
【図８】
2016539656.tif 000011
【配列表】
2016539656000001.app
【国際調査報告】
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2016539656.tif 000013
2016539656.tif 000014