(57)【要約】  Ｘおよび／またはＹ染色体を示すように標識された精子を有する家畜。一方の性のみの子孫を生産する雄家畜。マーカーを有する精子。
2016519955.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘ染色体を有する精子またはＹ染色体を有する精子の選択のためのマーカーを含む精子を生産する、遺伝子改変家畜動物。
【請求項２】
前記Ｘ染色体が、前記マーカーをコードする外因性遺伝子を含む、請求項１に記載の動物。
【請求項３】
前記Ｙ染色体が、前記マーカーをコードする外因性遺伝子を含む、請求項１に記載の動物。
【請求項４】
前記マーカーが、誘導性プロモーターの制御下にある外因性遺伝子により発現される、請求項１に記載の動物。
【請求項５】
前記マーカーが、配偶子形成において選択的に活性化される遺伝子発現エレメントの制御下にある外因性遺伝子により発現される、請求項１に記載の動物。
【請求項６】
前記遺伝子発現エレメントが、サイクリンＡ１プロモーター、Ｓｔｒａ８、ＳＰ−１０プロモーター、Ｓｔｒａ８プロモーター、Ｃ−Ｋｉｔ、ＡＣＥ、およびプロタミンからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項５に記載の動物。
【請求項７】
前記マーカーが、前記マーカーおよびマイクロＲＮＡの融合物をコードする外因性遺伝子により発現される、請求項１に記載の動物。
【請求項８】
前記マーカーが、外因性遺伝子により発現され、かつ前記マーカーが、選択マーカー、静電選別剤、可視化剤、および外因性抗原からなる群から選択される、請求項１に記載の動物。
【請求項９】
前記マーカーが、可視化剤であり、かつ蛍光マーカー、色素、ＤＮＡインターカレート蛍光色素、カルシウム活性化色素、および放射線不透過剤からなる群から選択される、請求項８に記載の動物。
【請求項１０】
前記マーカーが、前記選択マーカーである、請求項８に記載の動物。
【請求項１１】
前記選択マーカーが、毒性分子を含む、請求項１０に記載の動物。
【請求項１２】
前記毒性分子が、毒素、ヌクレアーゼ、アポトーシス因子、および致死ドミナントネガティブからなる群から選択される、請求項１１に記載の動物。
【請求項１３】
前記毒性分子が、毒素遺伝子、ベルナーゼ、ジフテリア毒素Ａ、チミジンキナーゼ、およびリシン毒素からなる群から選択される毒素または毒性遺伝子産物である、請求項１１に記載の動物。
【請求項１４】
前記選択マーカーが、毒素に対する解毒剤を含む、請求項１０に記載の動物。
【請求項１５】
前記マーカーが、抗原であり、前記抗原が、ビオチン、アビジン、およびポリＨｉｓからなる群から選択される、請求項８に記載の動物。
【請求項１６】
前記マーカーが、精子運動性を損傷させる因子を含む、請求項１に記載の動物。
【請求項１７】
前記マーカーが、前記精子の外部上で発現され、かつ二分子因子についての特異的結合を有する、請求項１に記載の動物。
【請求項１８】
前記マーカーが、前記精子に天然に存在するタンパク質を含む融合タンパク質の一部である、請求項１に記載の動物。
【請求項１９】
前記精子に天然に存在する前記タンパク質が、外部タンパク質、内部タンパク質、頭部、中片、尾部、鞭毛、終末部、主部、および頸部からなる群から選択される、請求項１８に記載の動物。
【請求項２０】
請求項１に記載の動物の精子。
【請求項２１】
生物発現マーカーの存在または不存在に基づき、Ｙ染色体を含む精子からＸ染色体を含む精子を分離することを含む、精子を選別する方法。
【請求項２２】
前記生物発現マーカーが、蛍光マーカー、色素、ＤＮＡインターカレート蛍光色素、カルシウム活性化色素、および放射線不透過剤、可視光波長の色、蛍光波長の色、蛍光、放射線不透過性、外因性エピトープ、結合リガンド、ならびに抗体の少なくとも一部からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
マーカーを発現するＸ染色体を含む精子、または
マーカーを発現するＹ染色体を含む精子、または
第１のマーカーを発現するＸ染色体を含む精子と第２のマーカーを発現するＹ染色体を含む精子との混合物；
および
前記マーカーに選択的に結合する結合部分または前記マーカーを使用して前記精子を選別する装置
を含む精子選別のための系。
【請求項２４】
精細胞により発現される外因性配列を含むＸ染色体またはＹ染色体を含む遺伝子改変精細胞。
【請求項２５】
前記Ｘ染色体を含む、請求項２４に記載の精細胞。
【請求項２６】
前記Ｙ染色体を含む、請求項２４に記載の精細胞。
【請求項２７】
前記外因性配列が、静電選別剤、可視化剤、マーカー、毒素、リガンド、抗原、解毒剤をコードする、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の精細胞。
【請求項２８】
前記可視化剤が、蛍光マーカー、色素、ＤＮＡインターカレート蛍光色素、カルシウム活性化色素、および放射線不透過剤からなる群から選択され、
前記毒性分子が、毒素、ヌクレアーゼ、アポトーシス因子、致死ドミナントネガティブ、毒素遺伝子、ベルナーゼ、ジフテリア毒素Ａ、チミジンキナーゼ、およびリシン毒素からなる群から選択され、または
前記解毒剤／毒素が、ベルナーゼ／バルスターを含む、
請求項２７に記載の精細胞。
【請求項２９】
前記外因性配列が、抗原に結合する抗体の少なくとも一部、外因性エピトープ、ビオチン、アビジン、またはポリＨｉｓをコードする、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の精細胞。
【請求項３０】
前記外因性配列が、精子運動性を効率的に損傷させる、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の精細胞。
【請求項３１】
前記外因性配列が、融合タンパク質の一部である、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の精細胞。
【請求項３２】
前記外因性配列が、シス制限性である、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の精細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年５月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／８２９，６７２号明細書および２０１３年８月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／８７０，５８６号明細書の優先権を主張し、これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府支援に関する記述
本明細書に記載の研究の諸側面は、農務省（ＵＳＤＡ）−飲食農業研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）のバイオテクノロジーリスク評価プログラム競争的助成金第２０１２−３３５２２−１９７６６号による支援を受けた。米国政府は本発明において一定の権利を有し得る。
【０００３】
技術分野は、遺伝子改変動物、特に性により選別するために遺伝子改変された精子を有する動物に関する。
【背景技術】
【０００４】
精子を事前に選別してＸ染色体配偶子を有する精子からＹ染色体配偶子を有する精子を選別することができれば、動物交配および育成の実施が改善される。次いで、動物をその精子から所定の性を有するように作出することができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
容易に選別可能な精子を有するファウンダー動物が提供される。精子は、効率的なエクスビボ選別法に好適である。実施形態は、マーカーにより標識された精子を含む。マーカーは、可視化および／または結合のためのタグを提供する。陽性および陰性選択の両方が提供される。精子を使用するエクスビボ選別法としては、例えば、可視化、マーカーベース選別、例えば、毒素による陰性選択に基づく技術または運動性に基づくアッセイが挙げられる。以下の特許出願は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれ、矛盾する場合、本明細書が優先する：米国特許出願公開第２０１０／０１４６６５５号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０１０５１４０号明細書、米国特許出願公開第２０１１／００５９１６０号明細書、および米国特許出願公開第２０１１／０１９７２９０号明細書。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】遺伝子改変精子を有する動物を作出するための遺伝子ツールの使用を説明する。
【図２Ａ】精子外部および／または内部の改変部位を有する哺乳動物精子を説明する。
【図２Ｂ】精子表面上のマーカーに結合するリガンドを有する固相を使用して精子を選別するための一実施形態を説明する。
【図３】性を示すように標識された精子を有する動物の作出を示す。
【図４】脊椎動物Ｙ染色体の改変についての実験結果を示す。
【図５】イボイノシシからのｐ６５Ｓ５３１Ｐ突然変異を慣用のブタ中に遺伝子移入するために使用されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲを示す実施例６および７の実験結果のモンタージュである。パネルａ）は、Ｓ５３１Ｐミスセンス突然変異を示し、パネルｂ）は、形質移入されたＬａｎｄｒａｃｅ線維芽細胞のＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを示し、パネルｃおよびｄ）は、３および１０日目に試料採取された細胞のＲＦＬＰ分析を示す。パネルａの配列の最上段の行および最下段の行は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（配列番号１を有するＰ６５＿Ｇ１Ｓおよび配列番号２を有するＰ６５＿Ｇ２Ａ）である。２段目の行は、野生型（Ｗｔ）Ｐ６５配列、配列番号３である。３段目の行は、本実験において使用されたＨＤＲテンプレート、配列番号４である。左側ＴＡＬＥＮ（配列番号５）および右側ＴＡＬＥＮ（配列番号６）を示す。
【図６】ブタＡＰＣにおけるＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲの比較を示す実験結果のモンタージュである。パネルａ）は、野生型ＡＰＣ配列に対するＡＰＣ１４．２ＴＡＬＥＮおよびｇＲＮＡ配列ＡＰＣ１４．２Ｇ１ａを示す。下に、新規ＨｉｎｄＩＩＩ部位をもたらす４ｂｐ挿入（下線文字）を送達するＨＤＲオリゴを示す。パネルｂ）は、ＲＦＬＰおよびＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ結果を示すチャートを示す。パネルａの最上段の行は、ＡＰＣ１４．２ＴＡＬＥＮ配列、配列番号７である。２段目の行は、野生型ＡＰＣＳ配列、配列番号８である。第３行は、ｇＲＮＡ配列Ｇ１ａ、配列番号９を示す。最下段の配列は、ＨＤＲテンプレート、配列番号１０である。
【図７】ＴＡＬＥＮおよびプラスミド相同性テンプレートを使用する２つの部位（ＡＭＥＬＹおよびＳＲＹ）中の脊椎動物Ｙ染色体を標的化する遺伝子を示す。相同性アームの外側の遺伝子座特異的プライマーおよび相同性テンプレート内のトランス遺伝子特異的プライマーを使用して個々のコロニーをスクリーニングする。相同性テンプレートの遺伝子座および配向を、それらの対応するウェル上部に示し、陽性対照を（＋）で示す。
【図８】ＴＡＬＥＮおよびプラスミド相同性カセットによるクローン中のＹ標的化の分析結果を示す表である。
【図９】Ｙ染色体中の３つの部位へのユビキチンＥＧＰＦの短鎖相同性標的化である。ＳＲＹの３’ジャンクションについてのプライマーは、ＴＡＬＥＮの有無にかかわらず非特異的バンドパターンも与えた。
【図１０】ＴＡＬＥＮならびにＡＭＥＬＹおよびＳＲＹ部位に特異的な短鎖相同性テンプレートにより処理された細胞中のＥＧＦＰマーカーの発現を示す棒グラフである。
【図１１】ＥＧＦＰマーカーを発現するクローンのジャンクション分析である。
【図１２】シスＸベクターの一般的模式図を提供する。ブタＳＰ１０、ＡＣＥ、またはＣＫ１５プロモーターのいずれかをシスＸカセットの上流に配置した。このシスＸカセットは、ＥＧＦＰトランス遺伝子をフランキングするＳｍｏｋ１５および３’ＵＴＲからなる。プロモーター−トランス遺伝子カセット全体をＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  ＩＲＤＲによりフランキングしてトランスポゼースＳＢ１００Ｘの資源の提供によるトランス遺伝子の酵素的挿入を容易にする。
【図１３】最上段、Ｉｔｇａ６に正規化されたマウス精巣中のＥＧＦＰ転写物についてのｑＰＣＲ。ファウンダー系列を、分析マウスがＦ０であったかＦ１であったかとともに下方に示す。トランス遺伝子のＦ０伝達を提供し、トランス遺伝子の総コピー数の推定を与える。
【図１４】緑色蛍光タンパク質に対する抗体を使用するＳＰ１０プロモーター下のシス制限（ｃｉｓ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）により調節されるＧＦＰを発現するマウス中の精巣組織の蛍光標識。
【図１５】緑色蛍光タンパク質に対する抗体を使用するＳＰ１０プロモーター下のシス制限により調節されるＧＦＰを発現する雄マウス中の精子の蛍光標識。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
精子中の性染色体の性を示すように標識された精子を有する動物が提供される。高度に効率的なエクスビボ選別法を使用して標識精子を分離することができる。マーカーは、マーカーの画像化を使用する精子の選別に使用することができ、またはマーカーは、結合のための部位を提供し得る。陽性および／または陰性選択を使用することができる。精子を使用するエクスビボ選別法としては、例えば、可視化、マーカーベース選別、例えば、毒素による陰性選択に基づく技術が挙げられる。例えば、野生型遊泳精子から分離される遊泳が不十分な精子による運動性ベースアッセイも利用可能である。実施形態は、例えば、マーカーおよび精子構成要素の融合タンパク質を含む。融合タンパク質を作製するために改変することができるタンパク質および遺伝子を本明細書に詳述する。性染色体になされた改変を詳述するデータを含める。
【０００８】
精子の構造および形成
哺乳動物精細胞は、頭部、中片および尾部を有する。頭部は、雌卵への侵入に使用される酵素を含有する先体により前方で包囲された緻密にコイルされたクロマチン線維を有する核を含有する。中片は、雌頸部、子宮および卵管を通る遊走のためのＡＴＰ生産に使用される多くのミトコンドリアが周辺にパックされている中心糸状コアを有する。尾部または「鞭毛」は、精母細胞を推進させる鞭様の移動を遂行する。
【０００９】
精子形成は、基底膜上に存在する精原細胞または精子母細胞から精細管内で精子が形成されるプロセスを指す。精子形成は、２つの区別される期を有する：精原細胞が精子細胞を形成する一連の分裂である精母細胞形成。第２期は、精子形成である：精子細胞が精子を形成する変態を受ける期。プロセス全体は、数週間、例えば、雄牛においては約６０日間、雄羊においては約４９日間を要する。
【００１０】
精母細胞形成は、４つの期を有する。第１期（一般に、約１５日間の持続期間）は、精原細胞の減数分裂である。休眠精原細胞は、基底膜近くの生殖上皮中に残留してプロセスを後で繰り返す。活性精原細胞は、４回の減数分裂を受け、最終的に１６個の一次精母細胞を形成する。第２期（約１５日間の持続期間）は、染色体の数が半減する一次精母細胞の減数分裂である（第１減数分裂）。第３期（一般に、数時間）は、二次精母細胞の精子細胞への分裂である（第７減数分裂）。第４期は、４個の精子細胞がそれぞれの一次精母細胞から形成され、または６４個がそれぞれの活性精原細胞から形成される場合に生じる。精母細胞形成に続き、精子細胞が完全に成熟して精子を形成する段階が生じる。
【００１１】
改変のための遺伝子
精子上または精子中で発現される種々の生物分子が存在する。哺乳動物精子タンパク質は、一般に十分に保存されており、その結果、ある哺乳動物の精子上のタンパク質は、別の種中の相当物を有する。当業者は、特定の種中のタンパク質が同定されたら、その相当物を種にわたるタンパク質に位置付けることに慣れている。１つのカテゴリーは、精子線維鞘タンパク質である。Ｃｈｒｉｖａ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００８，（８）：８−１３が、この群を概説している。精子の鞭毛は、（ａ）連結片；（ｂ）ミトコンドリアを含む中片；（ｃ）主部、および（ｄ）短い終末部を有する。主要な細胞骨格構造は、軸糸、外側緻密線維、および線維鞘（ＦＳ）である。ＦＳは、細胞膜下に存在し、軸糸および外側緻密線維を包囲する。ＦＳは、糖分解酵素およびシグナリング分子のための足場として機能すると考えられる。ＦＳ中に局在するいくつかのタンパク質、例として、例えば、Ｓｐ１７、ＣＡＢＹＲ、ＡＫＡＰ３、ＡＫＡＰ４、ＴＡＫＡＰ−８０、ロピリン（Ｒｈｏｐｉｌｉｎ）、ロッポリン（Ｒｏｐｐｏｒｉｎ）、ＧＳＴＭ５およびフィブラウシーシン（ｆｉｂｒｏｕｓｈｅａｔｈｉｎ）が同定されている。
【００１２】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、精子表面において局在する、Ｈｅｍａｃｈａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，１１５（１０）：２０５３−２０６５参照。ＧＳＴは、多数のグルタチオン（ＧＳＨ）依存性反応を触媒する酵素のファミリーであり、細胞内結合タンパク質としても機能し得る細胞質またはミクロソーム解毒酵素として主に記載されている。
【００１３】
Ｎａａｂｙ−Ｈａｎｓｅｎは、論文“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｅｒｍ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ”，Ｄａｎ  Ｍｅｄ  Ｊ，２０１２，５９（３）：Ｂ４４１４において精子タンパク質を概説した。約２００個の精子表面タンパク質が標識技術により同定された。これらのタンパク質を単離および使用してそれらの対応する遺伝子を同定することができる。実際、これらの一部は、実際に単離および微小配列決定され、微小配列の２つが使用されてＳＡＭＰ１４およびＳＡＭＰ３２と命名された２つの精子表面タンパク質のクローン化のためのプライマーが作製された。別の精子表面タンパク質は、ＰＨ−２０（いくつかの哺乳動物種からの精子の表面全体上に局在化する）である。ＣＤ５２は、タンパク質ＳＡＧＡ−１上のエピトープであり、精子結合モノクローナル抗体Ｓ１９についての抗原でもあり；ＳＡＧＡ−１は、ヒト精子中の全ての表面ドメインにわたり局在している。血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）として同定されたタンパク質は、２６．５ｋＤａのＭＷを有する豊富なカルシウム結合表面タンパク質である。８０Ｋ−Ｈは、別の精子表面タンパク質であり；これは、種々の機能、例として、ＰＫＣ経路を有する多機能Ｃａ２＋センサである。さらに、カルシウム結合オプソニンＳＡＰならびに３つのカルシウム結合ＨＳＰ７０シャペロンＨＹＯＵ１、ＨＳＰＡ５およびＨＳＰＡ２が、精子細胞膜の公知の構成要素である。
【００１４】
Ｎａａｂｙ−Ｈａｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｒ，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１０，８４（１）：３２−４０は、質量分析およびエドマン分解を使用してビオチンおよび放射性ヨウ素より標識された精子表面から単離された精子タンパク質のアイデンティティを解明した。この研究者らは、ＨＹＯＵ１（ＯＲＰ１５０）、ＨＳＰＣ１（ＨＳＰ８６）、ＨＳＰＡ５（Ｂｉｐ）、ＨＳＰＤ１（ＨＳＰ６０）を含む４つの異なる熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）ファミリー、および２つの精巣特異的ＨＳＰ７０シャペロンＨＳＰＡ２およびＨＳＰＡ１Ｌのいくつかのアイソフォームからの７つのメンバーが同定されたことを報告した。精巣特異的ＨＳＰＡ２シャペロンに対して生じた抗血清は、３つの６５ｋＤａのＨＳＰＡ２アイソフォームおよび３つの高分子量表面タンパク質（７８〜７９ｋＤａ、８４ｋＤａおよび９０〜９３ｋＤａ）と反応した。これらのタンパク質は、７つの６５ｋＤａ  ＨＳＰ７０形態と一緒になって、ヒトにおける体外受精を遮断するヒト抗精子ＩｇＧ抗体と反応した。これらの表面ビオチン化ヒト精子抗原の３つを、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ＨＳＰ７０中の直鎖ペプチドエピトープに対して生じたウサギ抗血清により免疫沈降させた。結果は、多様なＨＳＰシャペロンがヒト精子上の表面標識について接近可能であることを示した。
【００１５】
Ｆａｂｒｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２０１１，９（９６）：１−１３は、精子表面タンパク質が、アルファ−フェルチリン（ＡＤＡＭ−１）およびベータ−フェルチリン（ＡＤＡＭ−２）と命名された２つの統合膜糖タンパク質（モルモットにおけるＰＨ−３０アルファおよびＰＨ−３０ベータ）から構成されるヘテロダイマー複合体のフェルチリンを含むことを記載し、いくつかの他のＡＤＡＭは精子−卵母細胞認識および膜融合に関与することが報告された。ＡＤＡＭは、「ア・ディスインテグリン・アンド・メタロプロテイナーゼ（Ａ  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｎｄ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）」、規定の特徴、例として、プロドメイン、メタロプロテイナーゼ、ディスインテグリンおよびシステインリッチドメイン、ＥＧＦ様リピート、膜貫通ドメインおよびカルボキシ末端細胞質テールを有するファミリーを意味する。Ｆａｂｒｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．は、雄ブタモデルにおけるＡＤＡＭを研究した。
【００１６】
Ｌａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ．，１９９７，５７：４４２−４５３。種々の哺乳動物種からの精子は、ベータ１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴａｓｅ）をそれらの表面上で発現する。著者らは、６つの種からの精子に対してＧａｌＴａｓｅ酵素アッセイを実施し、６つ全てがＧａｌＴａｓｅをそれらの表面上で発現した。ＧａｌＴａｓｅの量は、種間で変動した。モルモット、マウス、およびラット精子は、ウシ、ブタ、およびウサギ精子より高いレベルのＧａｌＴａｓｅを有した。
【００１７】
Ｄｏｒｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．，２０１０，２７（６）：１２３５−１２４６は、精子タンパク質を調査し、精子中の膜上または他箇所における種々のタンパク質を報告した。細胞膜に、または精子全体に局在する精子タンパク質および遺伝子が同定され、互いに区別された。精子中または上の多くのタンパク質が公知である。Ｄｏｒｕｓは、多くのタンパク質、局在、およびそれらを発現する遺伝子の長い説明およびリストを提供する。
【００１８】
ある家畜種中の遺伝子は、他の家畜種中、ならびにヒトおよびマウス中のオルソログを常に有する。ヒトおよびマウス遺伝子は、家畜、特にウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、およびウサギ中のオルソログを常に有する。これらの種および魚類間の遺伝子オルソログは、遺伝子機能に応じて一致することが多い。生物学者らは、遺伝子オルソログを見出す方法に精通しているため、オルソログを列記せずに種の１つに関して遺伝子を本明細書に記載することができる。したがって、遺伝子の不活性化、標識、またはエピトープタグ化を記載する実施形態は、他の種中の同一または異なる名称を有するオルソログの不活性化、標識、またはエピトープタグ化を含む。一般的な遺伝子データベースならびに遺伝子オルソログの同定に特殊化されたデータベースが存在する。
【００１９】
当業者は、当技術分野において公知の技術を使用して融合タンパク質を調製することができる。実施形態は、細胞を形質移入し、それにより細胞を遺伝子操作して融合タンパク質をインビボで作製する（細胞を、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで形質移入し、細胞は、組織移植片のメンバーであり、またはそれから区別される）ためのベクター、およびその方法を含む。以下の米国特許出願は、全ての目的、例として、融合タンパク質を作製する目的のために参照により本明細書に組み込まれ、矛盾する場合は本明細書が優先する：米国特許第５２２７２９３号明細書、米国特許第５３５８８５７号明細書、米国特許第５８８５８０８号明細書、米国特許第５９４８６３９号明細書、米国特許第５９９４１０４号明細書、米国特許第６５１２１０３号明細書、米国特許第６５６２３４７号明細書、米国特許第６９０５６８８号明細書、米国特許第７１７５９８８号明細書、米国特許第７７０４９４３号明細書、米国特許出願公開第２００２／０００４０３７号明細書、米国特許第出願公開第２００５／００５３５７９号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２０３０２２号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２５０９３６号明細書、米国特許出願公開第２００９／０３２４５３８号明細書。
【００２０】
選別
図２Ａは、遺伝子改変精子：表面上で改変された精子；内部で改変された精子；内部および表面上の両方で改変された精子の実施形態を示す。内部改変は、可視化技術に基づく選別法または例えば、生存もしくは他の変化、例えば、運動性の変更に基づく他の選択法に有用である。マーカーは、それらがリガンドにより結合され、または特異的に結合されるように選択することができる。図２Ｂは、マーカーに結合するリガンドを含むビーズに結合するマーカーを発現する精子を示す。精子をビーズに曝露し、標識精子がリガンドを介してビーズに結合し、ビーズを未結合精子から、例えば、磁気、遠心分離、または重力により分離する。代替法としては、例えば、試料を受容するカラム中のビーズへのリガンドの固定化、リガンドによりコーティングされた計深棒の試料中への配置、およびリガンドによるビーカーまたは容器壁のコーティングが挙げられる。別の代替法は、複数のリガンドを可溶性材料に結合させ、材料が標識精子を架橋して物質相分離、または沈殿を作出することを可能とすることである。
【００２１】
他の選別法は、可視化に頼り、これは、画像を生成するための広義の用語である。可視化は、可視光、蛍光の波長におけるものであり得、または放射線不透過性に頼り得る。フローサイトメトリーなどのツールを使用することができる。マーカーは、可視化のために精細胞上または内側に存在し得る。
【００２２】
他の選別メンバーは、静電変化に頼る。細胞を電荷により分離するフローサイトメトリー装置が公知である。マーカーは、マーカーを発現しない細胞から、マーカーを有する細胞を選別するための表面電荷を生産するために静電的に活性であり得る。
【００２３】
別の選別の実施形態は、毒性因子をマーカーに結合させることによる精細胞の殺滅に頼る。毒性因子は、細胞死を惹起し、または毒もしくは他の生物学的手段、例えば、ナチュラルキラー細胞による破壊について細胞を標識する。毒性因子の例は、毒およびアポトーシス因子である。例えば、エンテロロキシンの融合物を作製することができ：エンテロトキシンは、種々の作用方式を有する。例えば、ジフテリア毒素は、宿主細胞膜中の穴、または細孔の形成を惹起する。細孔形成外毒素の別の例は、アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）により生産されるアエロリシンである。第２のタイプのエンテロロキシンは、スーパー抗原毒素である。スーパー抗原毒素は、Ｔ細胞を刺激することにより機能する。スーパー抗原外毒素の例としては、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのものが挙げられる。プロトコルとしては、リガンド毒素融合分子を有する細胞の殺滅に応答性の免疫細胞のインビトロ調製を挙げることできる。例えば、補体媒介溶解系を使用し、マーカーを発現する精子を不能とすることができる、例えば、両アレルヌル細胞をＦＡＣＳによりＧＧＴＡ１依存性表面エピトープの不存在について濃縮することができる（Ｈａｕｓｃｈｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）参照。第３のタイプのエンテロトキシンは、Ａ−Ｂ毒素である。Ａ−Ｂ毒素は、一緒に機能する２つ以上の毒素サブユニットからなる。典型的には、Ａサブユニットは、宿主細胞壁に結合し、膜を通るチャネルを形成する。チャネルにより、Ｂサブユニットが細胞中に到達することが可能となる。Ａ−Ｂ毒素の一例は、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）により生産されるエンテロトキシンである。マーカーを担持する精子と毒性因子に結合しているリガンドを混合する。マーカーはリガンドに結合し、その結果、毒性因子が細胞に近接する。
【００２４】
他の実施形態は、精細胞内側で発現させるべき毒性因子を提供する。細胞は結果として死滅する。したがって、毒性因子を発現するＹ染色体を有する配偶子は死滅し、Ｘ染色体を有する精子が残る。この実施形態は、２０１３年８月２７日に出願された米国特許出願第６１／８７０，５５８号明細書および２０１３年５月３１日に出願された米国特許出願第６１／８２９，６５６号明細書、ならびにさらには同時係属の２０１４年４月２８日に出願された米国特許出願第１４／２６３，４０８号明細書に詳述されており、これらのそれぞれは全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【００２５】
別の実施形態は、毒に対する解毒剤の発現に関する。毒を含有する溶液中に精子を装入する。解毒剤を欠く精子は破壊される。
【００２６】
陽性および／または陰性選択を使用することができる。したがって、マーカーを使用して使用すべき精細胞、または使用に望まれないものを同定することができる。一部の場合においては、マーカーを有する性が好ましいことがある一方、別の場合においては、マーカーを有さない性が好ましいことがある。２つの異なるマーカーを異なる性染色体上で使用する場合、一方のマーカーを陽性選択することができる一方、別のマーカーを陰性選択する。性染色体は、１つ、または２つ以上のマーカーを発現し得る。
【００２７】
選択的結合部分
マーカーに選択的に結合する結合部分は、より一般的な相互作用、例えば、静電性、イオン性、または疎水性親和性により結合するリガンドまたは化学基であり得る。リガンドは、その標的への特異的結合を示す化学部分である。リガンド相互作用としては、酵素−基質、受容体−リガンド、および抗体−抗原結合イベントが挙げられる。
【００２８】
抗体は、タンパク質について容易に生成することができる。精子の表面において発現されるマーカーは、実験的に容易に生成することができる抗体により特異的に結合される可能性が極めて高い。標的についての結合親和性を有する抗体の一部を使用する方法が周知である。これに関して、抗原という用語は、抗原に応答する宿主免疫系により認識される部位を指す。抗原選択は、とりわけ抗体発生の分野において公知である。抗体断片という用語は、抗体の抗原結合機能を保持する抗体の一部を指す。断片は、文字通り、より大きい抗体の一部から作製することができ、またはデノボ合成することができる。抗体断片としては、例えば、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が挙げられる。ｓｃＦｖは、リンカーペプチド、例えば、約１０〜約５０アミノ酸と連結している免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と連結させ得、またはその逆で連結させ得る。ｓｃＦｖという用語は、二価ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディおよび抗体断片の他の組合せを含む。抗体は、パラトープと称される抗原結合部分を有する。ペプチドリガンドという用語は、パラトープの部分でないペプチドを指す。
【００２９】
アプタマーは、一般に、マーカーに高親和性で特異的に結合するように作製することができる。ＤＮＡおよびＲＮＡアプタマーを使用して非共有結合を提供することができる。これらはヌクレオチドのみから構成されるため、スクリーニング方法論が十分確立されており、それらは容易に化学合成され、それらの急速なインビボクリアランスに起因して限定された副作用毒性および／または免疫原性を提供するという点で有望な生体分子標的化部分である（Ｋｅｅｆｅ，Ｐａｉ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。アプタマーは、特異的標的分子に結合するオリゴ核酸またはペプチドである。アプタマーは、通常、大きいランダム配列プールからそれらを選択することにより目的標的に結合するように作出される。アプタマーは、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、またはペプチドアプタマーとして分類することができる。核酸アプタマーは、標的、例えば、小分子、タンパク質、核酸、細胞、組織および生物に特異的に結合させるためにインビトロ選択または指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（ＳＥＬＥＸ）法（Ａｒｃｈｅｍｉｘ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）（Ｓａｍｐｓｏｎ，２００３）の反復ラウンドを介して遺伝子操作された核酸種である。ペプチドアプタマーは、典型的には、タンパク質足場に両末端において付着している短鎖可変ペプチドドメインを有する。ペプチドアプタマーは、細胞内側の他のタンパク質相互作用を干渉するために設計されるタンパク質である。これらは、タンパク質足場に両末端において付着している可変ペプチドループからなる。この二重構造拘束は、抗体と同等になるようにペプチドアプタマーの結合親和性を大幅に増加させる。可変ループ長は、典型的には、約１０〜約２０個のアミノ酸から構成され、足場は、良好な溶解度を有する小型のタンパク質である。例えば、細菌タンパク質チオレドキシン−Ａは足場タンパク質であり、可変ループは、還元活性部位内に挿入されており、これは野生型タンパク質において−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ループであり、２つのシステイン側鎖は、ジスルフィド架橋を形成し得る。アプタマーを作製するための一部の技術は、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，２００９，１０９（５）：１９４８−１９９８、ならびにさらには米国特許第７，８９２，７３４号明細書、米国特許第７，８１１，８０９号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０１２９８２０号明細書、米国特許出願公開第２００９／０１４９６５６号明細書、米国特許出願公開第２００６／０１２７９２９号明細書、および米国特許出願公開第２００７／０１１１２２２号明細書に詳述されている。
【００３０】
ペプチド配列は、マーカーに特異的に結合するように生成することができる。結合タンパク質またはポリペプチドの親和性選択のためのいくつかの方法、例えば、ファージディスプレイ、酵母表面ディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイまたはペプチドオンビーズディスプレイが存在する。Ｂｏｄｅｒ  ＥＴ，Ｗｉｔｔｒｕｐ  ＫＤ．Ｓｍｉｔｈ  ＧＰ，Ｐｅｔｒｅｎｋｏ  ＶＡ．Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１９９７，９７−２：３９１−４１０；Ｙｅａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９７，１５−６：５５３−５５７；Ｘｕ  Ｌ，Ａｈａ  Ｐ，Ｇｕ  Ｋ，Ｋｕｉｍｅｌｉｓ  ＲＧ，Ｋｕｒｚ  Ｍ，Ｌａｍ  Ｔ，Ｌｉｍ  ＡＣ，Ｌｉｕ  Ｈ，Ｌｏｈｓｅ  ＰＡ，Ｓｕｎ  Ｌ，Ｗｅｎｇ  Ｓ，Ｗａｇｎｅｒ  ＲＷ，Ｌｉｐｏｖｓｅｋ  Ｄ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｍｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍＲＮＡ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００２，９−８：９３３−９４２；Ｌａｍ  ＫＳ，Ｌｅｂｌ  Ｍ，Ｋｒｃｈｎａｋ  Ｖ．Ｔｈｅ“Ｏｎｅ−Ｂｅａｄ−Ｏｎｅ−Ｃｏｍｐｏｕｎｄ”Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１９９７，９７−２：４１１−４４８；Ｚａｃｈｅｒ  ＡＮ，３ｒｄ，Ｓｔｏｃｋ  ＣＡ，Ｇｏｌｄｅｎ  ＪＷ，２ｎｄ，Ｓｍｉｔｈ  ＧＰ．Ａ  ｎｅｗ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ：ｆｄ−ｔｅｔ．Ｇｅｎｅ，１９８０，９−１−２：１２７−１４０参照。
【００３１】
これらの場合の全てにおいて、タンパク質が精子の表面において接近可能である限り、タンパク質を精子中で発現させることができ、特異的結合エレメントをそれに結合するように生産することができる高い成功予測が存在する。
【００３２】
動物の遺伝子改変
配偶子形成において選択的に活性化されるプロモーターの制御下にある外因性遺伝子を含む染色体を含む細胞を含む遺伝子改変動物の一実施形態。動物は、細胞または胚の遺伝子改変により作出することができる。性染色体、すなわち、ＸまたはＹ染色体の一方または両方を改変する。外因性遺伝子により発現されるマーカーは、精子形成の段階に選択的な発現エレメントの制御下にある。発現エレメントは、例えば、プロモーター、マイクロＲＮＡである。
【００３３】
精子に発達する細胞は細胞質を共有し、精子形成サイクルに入る。細胞質の共有は、娘細胞間の細胞質架橋が減衰したときに終了する。この共有が終了する前に遺伝子を発現する遺伝子改変は、効率的でない。これは、細胞質を共有する娘の一部はＸ染色体を有し、一部はＹ染色体を有するためである。本明細書に記載のある群の実施形態は、発現を制御するために遺伝子発現エレメント（プロモーターおよび／またはマイクロＲＮＡ）を使用する。別の群の実施形態は、細胞質架橋が消失した後に発現されるタンパク質、例えば、本明細書に記載のあるテールタンパク質上にマーカーを配置する。
【００３４】
図１および３は、動物の遺伝子改変を作製するプロセスを示す。例えば、クローン化技術により細胞を改変し、それを使用して胚を作製し、または胚を直接処理して細胞を改変する。細胞は、配偶子形成発現エレメントの制御下にある因子により改変する。因子は、Ｘ、Ｙ、もしくは常染色体上の外因性遺伝子であり得、またはそれは遺伝子を調節／破壊するエレメントであり得る。配偶子形成が進行するにつれ、因子が活性化される。因子は、種々の効果、例えば、Ｘ染色体を有する配偶子における殺滅またはマーカーの発現、Ｙ染色体を有する配偶子における殺滅またはマーカーの発現を有し得、マーカーは、本明細書に記載のとおりであり、例えば、可視化、陽性選択、陰性選択、同時選択、生存、リガンド、抗原である。
【００３５】
マーカーを定位置に残し、動物外でのその交配を可能とする方法を使用し、または動物中にマーカーを配置しない方法により、染色体改変について単アレルまたは両アレル性の動物を作製することができる。例えば、本発明者らは、相同依存性組換え（ＨＤＲ）の方法を使用して動物の染色体の変化、または動物の染色体中への外因性遺伝子の挿入を作製した。ツール、例えば、ＴＡＬＥＮおよびリコンビナーゼ融合タンパク質、ならびに慣用の方法は、本明細書の他箇所で考察する。本明細書に開示の遺伝子改変を支持する実験データの一部を以下のとおりまとめる。本発明者らは、改変細胞の多遺伝子集団からクローン化する場合の例外的なクローン化効率を既に実証し、単離コロニーについての体細胞核移植（ＳＣＮＴ）によるクローン化効率の変動を回避するためにこのアプローチを推奨している（Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。しかしながら、さらに、標的化エンドヌクレアーゼ、例えば、ＴＡＬＥＮ媒介ゲノム改変、およびリコンビナーゼ融合分子による改変は、単一世代における両アレル変更の達成を提供する。例えば、ノックアウト遺伝子についてホモ接合性の動物は、ＳＣＮＴにより、ホモ接合性を生産するための同系交配なしで作製することができる。家畜、例えば、ブタおよびウシについての妊娠期間および生殖齢への成熟は、研究および生産に対する顕著な障壁である。例えば、クローン化および交配によるヘテロ接合性突然変異細胞（両方の性）からのホモ接合性ノックアウトの生成は、ブタおよびウシについてそれぞれ１６および３０ヵ月を要求する。一部は、遺伝子改変およびＳＣＮＴ（Ｋｕｒｏｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）の連続サイクルによりこの負荷を低減させているが、これは、技術的に困難であり、かなり費用を要する。ＳＣＮＴ前に両アレルＫＯ細胞を定型的に生成する能力は、大型動物の遺伝子操作において顕著な発展である。両アレルノックアウトは、他の方法、例えば、ＺＦＮおよび希釈クローン化を使用して不死細胞系において達成されている（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。別のグループは、市販のＺＦＮ試薬を使用してブタＧＧＴＡ１の両アレルＫＯを近年実証し（Ｈａｕｓｃｈｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、両アレルヌル細胞をＧＧＴＡ１依存性表面エピトープの不存在についてＦＡＣＳにより濃縮することができる。これらの研究は、ある有用な概念を実証する一方、研究者らは動物または家畜を改変することができることを示していない。これは、単一クローン希釈は一般に初代線維芽細胞単離株に適しておらず（線維芽細胞は、低密度における成長が不十分である）、ヌル細胞についての生物学的濃縮が大多数の遺伝子に利用可能でないためである。
【００３６】
本発明者らは、非トランスジェニック線維芽細胞と１５０個の細胞／ｃｍ２超の密度においてプレーティングした場合にトランスジェニック初代線維芽細胞を効率的に拡張させ、コロニーとして単離し、トランスポゾン同時選択技術を使用して薬物選択に供することができることを既に示している（Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、米国特許出願公開第２０１１／０１９７２９０号明細書）。６つのＴＡＬＥＮペアにより処理された細胞についてピューロマイシン耐性コロニーを単離し、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイまたは標的部位をフランキングするＰＣＲ産物の直接配列決定によりそれらの遺伝子型について評価したことがさらに示された（２０１２年２月２４日に出願された米国特許出願第１３／４０４，６６２号明細書参照）。一般に、インデル陽性クローンの比率は、３日目の改変レベルに基づきなされた予測と類似した。両アレルＫＯクローンを６つのＴＡＬＥＮペアの５つについて同定し、インデル陽性細胞の最大３５％で生じた。特に、大多数のＴＡＬＥＮペアについての両アレルＫＯクローンの頻度は、それぞれの染色体の開裂を独立イベントとして処理する場合に予測される頻度を超過する。
【００３７】
ＴＡＬＥＮ誘導相同組換えにより、選択マーカーの結合の必要性が排除される。ＴＡＬＥＮを使用して特異的アレルを相同性依存性修復（ＨＤＲ）により家畜ゲノム中に正確に移植することができる。パイロット試験において、特異的１１ｂｐ欠失（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅアレル）（Ｇｒｏｂｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｋａｍｂａｄｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）をウシＧＤＦ８遺伝子座中に導入した（２０１２年２月２４日に出願された米国特許出願第１３／４０４，６６２号明細書参照）。ｂｔＧＤＦ８．１ＴＡＬＥＮペアは、単独で形質移入した場合、標的遺伝子座における染色体の最大１６％を開裂した。１１ｂｐ欠失を保有するスーパーコイルド相同性ＤＮＡ修復テンプレートとの同時形質移入は、所望のイベントについての選択なしで３日目における最大５％の遺伝子変換頻度（ＨＤＲ）をもたらした。遺伝子変換は、スクリーニングされた単離コロニーの１．４％で同定された。これらの結果は、ＴＡＬＥＮを使用して選択マーカーの結合の支援なしでＨＤＲを効率的に誘導することができることを実証した。実施例１は、例えば、ＴＡＬＥＮを使用することによりＹ染色体、または他の染色体を遺伝的に変更することができることを示す実験データを提供する。ＴＡＬＥＮは、本明細書の他箇所でより詳細に考察する。
【００３８】
実施例１（図４参照）は、Ｙ染色体における標的に指向されるＴＡＬＥＮを記載する。３つのＴＡＬＥＮペアが活性を示した。したがって、Ｙ染色体上のインデルを有する細胞、およびその細胞からの動物を作製することができる。実施例２は、単一世代における両アレルノックアウトを達成するためのＴＡＬＥＮ媒介ゲノム改変の方法を提供する。ブタおよびウシについての妊娠期間および生殖齢への成熟は顕著であり；例えば、クローン化および交配によるヘテロ接合性突然変異細胞（両方の性）からのホモ接合性ノックアウトの生成は、ブタおよびウシについてそれぞれ１６および３０ヵ月を要求する。両アレルノックアウトは、ＺＦＮおよび希釈クローン化を使用して不死細胞系において達成されている（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。別のグループは、市販のＺＦＮ試薬を使用してブタＧＧＴＡ１の両アレルノックアウトを近年実証し（Ｈａｕｓｃｈｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、両アレルヌル細胞をＧＧＴＡ１依存性表面エピトープの不存在についてＦＡＣＳにより濃縮することができる。これらの他の研究は有用である一方、研究者らは単純なクローン希釈を使用する。このような方法は、大多数の初代線維芽細胞単離株に適しておらず、ヌル細胞についての生物学的濃縮は、大多数の遺伝子に利用可能でない。しかしながら、実施例２において、両アレルノックアウトをスクリーニングするための個々のコロニーの拡張を許容する方法に基づき初代細胞を使用した。実施例３は、クローン化動物の作製に有用な細胞を改変する代替法を実証する。実施例４は、クローン化のための細胞を作製する他の方法、特に、ＨＤＲテンプレートとしての一本鎖オリゴヌクレオチドを含む方法を実証する。実施例５は、一本鎖オリゴヌクレオチド法を使用してある種からの遺伝子を、マーカーを有さない効率的な方法で別の種に移動させる。
【００３９】
実施例６〜８は、遺伝子のＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ編集を記載する。実施例７および８は、目的部位における二本鎖分解の効率的な生産を示すＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ結果である。このような分解は、ＨＤＲテンプレート修復法による遺伝子編集のための機会を提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲは、３日目において６パーセントより低く、１０日目において検出未満であった（図５）。第２の遺伝子座ｓｓＡＰＣ１４．２におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導標的化の分析は、かなり効率的であったが、依然としてこの部位においてＴＡＬＥＮにより誘導されたＨＤＲのレベルに達することはなく、約３０％と６０％であった（図６）。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲは、それらの実験により示されるとおり、効率的なツールであった。
【００４０】
実施例９および１０は、プラスミドカセット（図７および８）または直鎖の短鎖相同性テンプレート（図９〜１１）によるＹ染色体の標的化を記載する。両方の技術は、ＴＡＬＥＮを使用して目的標的化部位における二本鎖分解を作出し、相同性テンプレートは目的遺伝子を標的局在に指向させた。効率は１および２４％の間であり、両方の方法は効率的であった。
【００４１】
実施例１１（図１２〜１５参照）は、マウスとの比較データに基づき本出願人らのチームにより全て最初にクローン化されたブタＡＣＥ、ＣＫ−１５またはＳＰ１０プロモーターのいずれかの方向下で推定シス制限トランス遺伝子を担持するように作出された一連のベクターを記載する。ｑＰＣＲの結果と一致して、シグナルはＳＰ１０ファウンダーからの精子中のみで検出された。本発明の実施形態は、配偶子中の、または配偶子形成に関与する１つ以上のシス制限トランス遺伝子をプロモーター、例えば、組織特異的プロモーターの方向下で含む。
【００４２】
本発明の実施形態は、遺伝子改変動物を作製する方法であって、胚または細胞を、標的化ヌクレアーゼ（例えば、メガヌクレアーゼ、亜鉛フィンガー、ＴＡＬＥＮ）をコードするベクターまたはｍＲＮＡに曝露させること（標的化ヌクレアーゼは、胚または細胞中の標的染色体部位に特異的に結合して細胞染色体の変化を作出する）、細胞を代理母中でクローン化し、または胚を代理母中に移植することを含み、それにより代理母はレポーター遺伝子なしで、標的化される染色体部位においてのみ遺伝子改変されている動物を妊娠する方法を含む。標的化される部位は、本明細書に記載のもの、例えば、本明細書に記載の種々の遺伝子であり得る。標的化されるヌクレアーゼ系としては、タンパク質−ＤＮＡ結合、または核酸−ＤＮＡ結合のいずれかによりコグネートＤＮＡに結合するモチーフが挙げられる。本明細書に報告される効率は、顕著である。本発明者らは、これらの効率をさらに増加させるさらなる技術を他箇所に開示した。
【００４３】
配偶子形成および配偶子形成発現エレメント
配偶子形成は、生殖系列前駆細胞が細胞分裂および分化を受けて成熟半数体配偶子を形成する生物学的プロセスを指す。動物は、性腺中の減数分裂を介して配偶子を生産する。始原生殖細胞（ＰＧＣ）は、発生の間に生殖原細胞を形成する。雌生殖原細胞は、卵母細胞形成、卵子細胞形成（ｏｏｔｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ）および卵子を形成するための成熟（卵子形成と称されることもある）の下位プロセスを有する卵子形成を受ける。雄生殖原細胞は、精子形成を受ける。生殖原細胞は、一次精母細胞（二倍体）を生じさせる精原細胞（二倍体）を生産するための減数分裂を受ける雄一次精細胞（二倍体）の前駆体である。一次精母細胞は、減数分裂を受け、精細胞としても公知の成熟精子（半数体）に発達する精子細胞（半数体）を形成する二次精母細胞（半数体）を形成する。精巣の精細管は、このプロセスのための出発点であり、内管壁に隣接する幹細胞は壁から開始して求心方向で分裂し、最も内側の部分に進行して精子細胞を生産する。精子細胞の成熟は、精巣上体中で生じる。マウスまたはラットにおける研究は、第１の動物の精細管がドナー動物からの組織および／または精原細胞を受容し得、その結果、供与された細胞が機能的な精子に成熟することを示している。レシピエントの精細管は、ドナー細胞についての精子形成プロセスを効率的に受け入れ得る。
【００４４】
配偶子形成プロモーターは、配偶子形成プロセスに選択的なプロモーターである。一部の配偶子形成プロモーターは、配偶子形成の減数分裂段階前に作用する一方、他のものは配偶子形成のプロセスの種々の時点において特異的に活性化される。特に目的とするのは、細胞質共有が停止した後にのみ精子形成において活性となるプロモーターである。実施形態は、配偶子形成に選択的な、または卵母細胞形成、卵子細胞形成、卵母細胞成熟、精子形成、精原細胞への成熟、一次精母細胞への成熟、二次精母細胞への成熟、精子細胞への成熟、および精細胞への成熟からなる群から選択される１つ以上の配偶子形成下位プロセスの間に選択的に活性化されるプロモーターの制御下にある細胞または胚中に配置された外因性遺伝子を含む。一部のプロモーターは一般に配偶子形成の間に活性である一方、他のものはある下位プロセスにおいて開始して活性化されるが、配偶子形成の他の期を通して継続し得る。実施形態は、配偶子形成プロセスに選択的な組織特異的プロモーターの制御下にある細胞または胚中に配置された外因性遺伝子をさらに含み：例えば、組織特異的プロモーターは、精巣、精細管、および精巣上体からなる群から選択される組織中で選択的に活性である。減数分裂前および減数分裂後配偶子形成プロモーターは、太糸期の精母細胞中だけでなく、より早期の精子形成においても活性であるサイクリンＡ１プロモーターである（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｔｉｄｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．，２００３  Ｍａｒ，１１（３）：３１１−３１５；Ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｃｌｉｎ  Ａ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ）。ＳＰ−１０のプロモーター（−４０８／＋２８または−２６６／＋２８；ＳＰ−１０プロモーターと称される）は、精子細胞特異的転写にのみ指向される。実際、トランスジェニックマウスにおいて、ｐａｎ活性ＣＭＶエンハンサーに隣接するトランス遺伝子統合にかかわらず、−４０８／＋２８プロモーターは、精子細胞特異性を維持し、トランス遺伝子の異所性発現は得られない（Ｐ  Ｒｅｄｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｅｒｍａｔｉｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＳＰ−１０  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｓ  ａｎ  ｉｎｓｕｌａｔｏｒ  ｉｎ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００３）２６２（１）：１７３−１８２）。レチノイン酸遺伝子８（Ｓｔｒａ８）プロモーター（Ｓｔｒａ８プロモーターとして称される）により刺激される４００ｂｐ調節領域は、減数分裂および減数分裂後生殖細胞中で選択的に活性であり、未分化生殖細胞中では活性でない（Ａｎｔｏｎａｎｇｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ａ  ４００−ｂｐ  Ｓｔｒａ８  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ；Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（２００９）７２（１１）：８１６−８２２）。表１：ＨＤアレルを有するコロニーの回収頻度参照。
【００４５】
本発明者らは、農業に、研究ツールに、または生物医学目的に有用な、ほぼ別々の家畜細胞および／または動物中の種々の遺伝子の正確な高頻度の編集を開発した。これらの家畜遺伝子編集方法は、例えば、プラスミド、ｒＡＡＶおよびオリゴヌクレオチドテンプレートを使用するＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９刺激相同性指向修復（ＨＤＲ）を含む。レポーターおよび／または選択マーカーなしで遺伝子変化を作製することができるほど高い効率を達成するためのこれらの方法が、本発明者により開発された。さらに、この方法は、目的部位における目的変化のみを有する遺伝子改変動物を作製するためのファウンダー生成において使用することができる。例えば、ヌクレアーゼの標的化のための方法およびデータは、参照により本明細書に組み込まれる２０１４年１月１４日に出願された米国特許出願第１４／１５４，９０６号明細書に提供される。
【００４６】
相同性指向修復（ＨＤＲ）
相同性指向修復（ＨＤＲ）は、ｓｓＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）損傷を修復するための細胞中の機序である。この修復機序は、損傷部位と顕著な相同性を有する配列を有するＨＤＲテンプレートが存在する場合に細胞により使用され得る。特異的結合は、生物学分野において一般に使用される用語であり、非標的組織と比較して相対的に高い親和性で標的に結合し、一般に複数の非共有相互作用、例えば、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などを含む分子を指す。特異的ハイブリダイゼーションは、相補的配列を有する核酸間の特異的結合の形態である。タンパク質も、例えば、ＴＡＬＥＮもしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系において、またはＧａｌ４モチーフによりＤＮＡに特異的に結合し得る。アレルの遺伝子移入は、テンプレートガイド型プロセスにより内因性アレルを上回って外因性アレルをコピーするプロセスを指す。内因性アレルは実際に切り出され、一部の状況において外因性核酸アレルにより置き換えられ得るが、現在の理論は、このプロセスはコピー機序であるということである。アレルは遺伝子ペアであるため、それらの間には顕著な相同性が存在する。アレルは、タンパク質をコードする遺伝子であり得、またはそれは他の機能、例えば、生物活性ＲＮＡ鎖をコードすることまたは調節タンパク質もしくはＲＮＡを受容するための部位を提供することを有し得る。
【００４７】
ＨＤＲテンプレートは、遺伝子移入されているアレルを含む核酸である。テンプレートは、ｄｓＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）であり得る。ｓｓＤＮＡテンプレートは、好ましくは、約２０〜約５０００残基であるが、他の長さを使用することができる。当業者は、明示範囲内の全ての範囲および値が企図されることを直ちに認識し；例えば、５００〜１５００残基、２０〜１００残基などである。テンプレートは、内因性アレルに隣接するＤＮＡまたは置き換えるべきＤＮＡとの相同性を提供するフランキング配列をさらに含み得る。テンプレートは、標的化されるヌクレアーゼ系に結合される配列も含み得、したがって、その系のＤＮＡ結合メンバーについてのコグネート結合部位である。コグネートという用語は、典型的には、相互作用する２つの生体分子、例えば、受容体およびそのリガンドを指す。ＨＤＲプロセスに関して、生体分子の一方は目的の、すなわち、コグネートＤＮＡ部位またはタンパク質部位と結合する配列を用いて設計することができる。
【００４８】
部位特異的ヌクレアーゼ系
ゲノム編集ツール、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）および亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、バイオテクノロジー、遺伝子療法および多くの生物における機能的ゲノム研究の分野に影響を与えた。ごく最近、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）が、相補的ＲＮＡ分子によりその標的部位に指向される。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ系は、ＲＧＥＮである。ｔｒａｃｒＲＮＡは、別のそのようなツールである。これらは、標的化されるヌクレアーゼ系の例であり：これらの系は、ヌクレアーゼを標的部位に局在化させるＤＮＡ結合メンバーを有する。次いで、部位はヌクレアーゼにより切断される。ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮは、ＤＮＡ結合メンバーに融合しているヌクレアーゼを有する。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲは、標的ＤＮＡ上で互いに遭遇するコグネートである。ＤＮＡ結合メンバーは、染色体ＤＮＡ中のコグネート配列を有する。ＤＮＡ結合メンバーは、典型的には、目的部位における、またはその近くの核酸分解作用を得るように目的コグネート配列に照らして設計される。ある実施形態は、全てのそのような系、限定されるものではないが、例として、ヌクレアーゼ再開裂を最小化する実施形態、目的残基において正確にＳＮＰを作製するための実施形態、およびＤＮＡ結合部位において遺伝子移入されているアレルの配置に適用可能である。
【００４９】
ＴＡＬＥＮ
本明細書において使用されるＴＡＬＥＮという用語は広義であり、別のＴＡＬＥＮからの支援なしで二本鎖ＤＮＡを開裂し得るモノマーＴＡＬＥＮを含む。ＴＡＬＥＮという用語は、同一部位においてＤＮＡを開裂するために一緒に機能するように遺伝子操作されたＴＡＬＥＮのペアの一方または両方のメンバーを指すためにも使用される。一緒に機能するＴＡＬＥＮは、ＤＮＡまたはＴＡＬＥＮペアの掌性を参照する左側ＴＡＬＥＮおよび右側ＴＡＬＥＮと称することができる。
【００５０】
それぞれのＤＮＡ結合リピートが標的ＤＮＡ配列中の１つの塩基対の認識を担うＴＡＬについての暗号が報告されている（ＰＣＴ公開国際公開第２０１１／０７２２４６号パンフレット）。残基は、ＤＮＡ配列を標的化するようにアセンブルすることができる。手短に述べると、ＴＡＬＥＮの結合のための標的部位を決定し、ヌクレアーゼおよび標的部位を認識する一連のＲＶＤを含む融合分子を作出する。結合時、ヌクレアーゼがＤＮＡを開裂し、その結果、細胞修復機構が作動して切断末端における遺伝子改変を作製することができる。ＴＡＬＥＮという用語は、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含むタンパク質を意味し、それ自体、機能的なモノマーＴＡＬＥＮおよび別のモノマーＴＡＬＥＮとのダイマー化を要求する他のものを含む。ダイマー化は、両方のモノマーＴＡＬＥＮが同一である場合にはホモダイマーＴＡＬＥＮをもたらし得、またはモノマーＴＡＬＥＮが異なる場合にはヘテロダイマーＴＡＬＥＮをもたらし得る。ＴＡＬＥＮは、２つの主要な真核ＤＮＡ修復経路、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同性指向修復により不死化ヒト細胞における遺伝子改変を誘導することが示されている。ＴＡＬＥＮは、ペアで使用されることが多いが、モノマーＴＡＬＥＮも公知である。ＴＡＬＥＮ（および他の遺伝子ツール）における処理のための細胞としては、培養細胞、不死化細胞、初代細胞、初代体細胞、接合子、生殖細胞、始原生殖細胞、胚盤胞、または幹細胞が挙げられる。一部の実施形態において、ＴＡＬエフェクターを使用して他のタンパク質ドメイン（例えば、非ヌクレアーゼタンパク質ドメイン）を特異的ヌクレオチド配列に標的化することができる。例えば、ＴＡＬエフェクターは、限定されるものではないが、ＤＮＡ２０相互作用酵素（例えば、メチラーゼ、トポイソメラーゼ、インテグラーゼ、トランスポゼース、またはリガーゼ）、転写活性化因子もしくは抑制因子、または他のタンパク質、例えば、ヒストンと相互作用し、またはそれを改変するタンパク質からのタンパク質ドメインに連結させることができる。このようなＴＡＬエフェクター融合物の適用としては、例えば、エピジェネティック調節エレメントの作出または改変、ＤＮＡ中の部位特異的挿入、欠失、または修復の作製、遺伝子発現の制御、およびクロマチン構造の改変が挙げられる。
【００５１】
ヌクレアーゼという用語は、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼを含む。エンドヌクレアーゼという用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、好ましくは、ＤＮＡ分子内の核酸間の結合の加水分解（開裂）を触媒し得る任意の野生型またはバリアント酵素を指す。エンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄｌＩＩ、ＮｏｔＩ、ＢｂｖＣｌ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ、およびＡｌｗＩが挙げられる。エンドヌクレアーゼは、典型的には約１２〜４５塩基対（ｂｐ）長、より好ましくは、１４〜４５ｂｐのポリヌクレオチド認識部位を有する場合にレアカットエンドヌクレアーゼも含む。レアカットエンドヌクレアーゼは、規定の遺伝子座におけるＤＮＡ二本鎖分解（ＤＳＢ）を誘導する。レアカットエンドヌクレアーゼは、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ、遺伝子操作された亜鉛フィンガードメインと、制限酵素、例えば、ＦｏｋＩおよび化学的エンドヌクレアーゼの触媒ドメインとの融合物から得られるキメラ亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であり得る。化学的エンドヌクレアーゼにおいて、化学またはペプチド性開裂因子は、核酸のポリマーまたは特異的標的配列を認識する別のＤＮＡのいずれかにコンジュゲートされ、それにより開裂活性を特異的配列に標的化する。化学的エンドヌクレアーゼは、特異的ＤＮＡ配列に結合することが公知のオルトフェナントロリン、ＤＮＡ開裂分子、および三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）の合成ヌクレアーゼ様コンジュゲートも包含する。このような化学的エンドヌクレアーゼは、本発明による用語「エンドヌクレアーゼ」に含まれる。このようなエンドヌクレアーゼの例としては、Ｉ−ＳｅｅＩ、Ｉ−ＣｈｕＬＩ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、ＰＩ−ＳｅｅＬＰＩ−ＴｔｉＬＰＩ−ＭｔｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＳｅｅＩＬ１−ＳｅｅＩＩＩ、ＨＯ、ＰＩ−ＣｉｖＩ、ＰＩ−ＣｔｒＬＰＩ−ＡａｅＩ、ＰＩ−ＢｓｕＩ、ＰＩ−ＤｈａＩ、ＰＩ−ＤｒａＬＰＩ−ＭａｖＬＰＩ−ＭｅｈＩ、ＰＩ−ＭｆｕＬＰＩ−ＭｆｌＩ、ＰＩ−ＭｇａＬＰＩ−ＭｇｏＩ、ＰＩ−ＭｉｎＬＰＩ−ＭｋａＬＰＩ−ＭｌｅＩ、ＰＩ−ＭｍａＩ、ＰＩ−３０ＭｓｈＬＰＩ−ＭｓｍＩ、ＰＩ−ＭｔｈＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｘｅＩ、ＰＩ−ＮｐｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＬＰＩ−ＲｍａＩ、ＰＩ−ＳｐｂＩ、ＰＩ−ＳｓｐＬＰＩ−ＦａｅＬＰＩ−ＭｊａＩ、ＰＩ−ＰｈｏＬＰＩ−ＴａｇＬＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｋｏＩ、ＰＩ−ＴｓｐＩ、Ｉ−ＭｓｏＩが挙げられる。
【００５２】
ＴＡＬＥＮまたは他のツールにより作製される遺伝子改変は、例えば、挿入、欠失、外因性核酸断片の挿入、および置換からなるリストから選択することができる。挿入という用語は、染色体中への文字どおりの挿入または修復のためのテンプレートとしての外因性配列の使用のいずれかを意味するために広義で使用される。一般に、標的ＤＮＡ部位を同定し、その部位に特異的に結合するＴＡＬＥＮペアを作出する。ＴＡＬＥＮは、細胞または胚に、例えば、タンパク質、ｍＲＮＡとして、またはＴＡＬＥＮをコードするベクターにより送達する。ＴＡＬＥＮは、ＤＮＡを開裂して二本鎖分解を作製し、次いでそれを修復し、多くの場合にインデルの作出がもたらされ、または染色体中に挿入され、もしくは改変配列による分解の修復のためのテンプレートとして機能する同伴する外因性核酸中に含有される配列もしくは多型が取り込まれる。このテンプレートドライブ型の修復は、染色体を変化させる有用なプロセスであり、細胞染色体の効率的な変化を提供する。
【００５３】
外因性核酸という用語は、細胞または胚に添加される核酸を意味し、核酸が細胞中に天然に存在する核酸配列と同一か異なるかを問わない。核酸断片という用語は広義であり、染色体、発現カセット、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはそれらの一部を含む。細胞または胚は、例えば、家畜、偶蹄目、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ウサギ、および魚類からなる群から選択することができる。家畜という用語は、食料または生物学的材料のために商品として育成される飼育動物を意味する。偶蹄目という用語は、それぞれの足に通常２本または時に４本のこともある偶数の指を有する偶蹄目（Ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）の有蹄の哺乳動物を意味し、それとしては、ウシ、シカ、ラクダ、カバ、ヒツジ、およびヤギが挙げられる。
【００５４】
一部の実施形態は、ＴＡＬＥＮペアを家畜および／または偶蹄目細胞または胚中に導入し、ＴＡＬＥＮペアにより特異的に結合される部位における細胞または胚のＤＮＡの遺伝子改変を作製し、細胞から家畜／偶蹄目を生産することを含む、遺伝子改変家畜動物および／または偶蹄目を作製する組成物または方法を含む。直接注入を細胞または胚に、例えば、接合子、線維芽細胞、または胚中に使用することができる。あるいは、タンパク質、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、またはベクターの導入のための多くの公知技術のいずれかを使用してＴＡＬＥＮおよび／または他の因子を細胞中に導入することができる。遺伝子改変動物は、公知の方法、例えば、妊娠宿主中への胚の移植、または種々のクローン化法により胚または細胞から作製することができる。語句「ＴＡＬＥＮにより特異的に結合される部位における細胞のＤＮＡの遺伝子改変」などは、ＴＡＬＥＮがその標的部位に特異的に結合している場合、ＴＡＬＥＮ上のヌクレアーゼにより切断される部位において遺伝子改変が作製されることを意味する。ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮペアが結合する場所を正確に切断するのではなく、２つの結合部位間の規定部位において切断する。
【００５５】
一部の実施形態は、動物のクローン化に使用される細胞の組成物または処理を含む。細胞は、家畜および／または偶蹄目細胞、培養細胞、初代細胞、初代体細胞、接合子、生殖細胞、始原生殖細胞、または幹細胞であり得る。例えば、実施形態は、ＴＡＬＥＮタンパク質または１つもしくは複数のＴＡＬＥＮをコードする核酸に培養物中の複数の初代細胞を曝露することを含む、遺伝子改変を作出する組成物または方法である。ＴＡＬＥＮは、ｍＲＮＡまたはベクター中のＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質として、または核酸断片として導入することができる。
【００５６】
亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ開裂ドメインに融合させることにより生成される人工的制限酵素である。亜鉛フィンガードメインは、所望のＤＮＡ配列を標的化するように遺伝子操作することができ、これにより、亜鉛フィンガーヌクレアーゼが複合体ゲノム内のユニーク配列を標的化することが可能となる。内因性ＤＮＡ修復機構を利用することにより、これらの試薬を使用して高等生物のゲノムを変更することができる。ＺＦＮは、遺伝子を不活性化させる方法において使用することができる。
【００５７】
亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインは、約３０アミノ酸を有し、安定的構造にフォールドする。それぞれのフィンガーは、主としてＤＮＡ基質内のトリプレットに結合する。キー位置におけるアミノ酸残基は、ＤＮＡ部位との配列特異的相互作用のほとんどに寄与する。これらのアミノ酸は、残りのアミノ酸を維持して必要な構造を保存しながら変化させることができる。より長いＤＮＡ配列への結合は、いくつかのドメインをタンデムで連結させることにより達成される。他の機能性、例えば、非特異的ＦｏｋＩ開裂ドメイン（Ｎ）、転写活性化因子ドメイン（Ａ）、転写抑制因子ドメイン（Ｒ）およびメチラーゼ（Ｍ）を、ＺＦＰに融合させてそれぞれのＺＦＮ、亜鉛フィンガー転写活性化因子（ＺＦＡ）、亜鉛フィンガー転写抑制因子（ＺＦＲ、亜鉛フィンガーメチラーゼ（ＺＦＭ）を形成することができる。遺伝子改変動物の作製のために亜鉛フィンガーおよび亜鉛フィンガーヌクレアーゼを使用するための材料および方法は、例えば、米国特許第８，１０６，２５５号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０１９２２９８号明細書、米国特許出願公開第２０１１／００２３１５９号明細書、および米国特許出願公開第２０１１／０２８１３０６号明細書に開示されている。
【００５８】
ベクターおよび核酸
ノックアウト目的のため、遺伝子の不活性化のため、遺伝子の発現を得るため、または他の目的のために、種々の核酸を細胞中に導入することができる。本明細書において使用される核酸という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および核酸アナログ、および二本鎖または一本鎖（すなわち、センスまたはアンチセンス一本鎖）である核酸を含む。核酸アナログは、例えば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度を改善するように塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格において改変することができる。デオキシリボースリン酸骨格は、それぞれの塩基部分が６員モルホリノ環に連結しているモルホリノ核酸、またはデオキシリン酸骨格がシュードペプチド骨格により置き換えられており、４つの塩基が保持されるペプチド核酸を生産するように改変することができる。
【００５９】
標的核酸配列は、調節領域、例えば、プロモーターに作動可能に連結させることができる。調節領域は、ブタ調節領域であり得、または他の種からのものであり得る。本明細書において使用される、作動可能に連結させるとは、標的核酸の転写を可能とし、または容易にするような核酸配列に対する調節領域の位置決めを指す。
【００６０】
あるタイプのプロモーターを標的核酸配列に作動可能に連結させることができる。マーカーを有する精子を作製する場合、配偶子形成プロモーターまたは他の発現エレメントが好ましいが、しかしながら、マーカーのより一般的な発現が効率的であり得る。プロモーターのタイプとしては、限定されるものではないが、組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、および特定の刺激に応答性または不応答性のプロモーターが挙げられる。他の実施形態において、顕著な組織または時間的特異性なしで核酸分子の発現を容易にするプロモーターを使用することができる（すなわち、構成的プロモーター）。例えば、ベータ−アクチンプロモーター、例えば、ニワトリベータ−アクチン遺伝子プロモーター、ユビキチンプロモーター、ミニＣＡＧプロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、または３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを使用することができるとともに、ウイルスプロモーター、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを使用することができる。一部の実施形態において、ニワトリベータアクチン遺伝子プロモーターおよびＣＭＶエンハンサーの融合物をプロモーターとして使用することができる。例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１２：５６３；およびＫｉｗａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，７：８２１参照。
【００６１】
核酸構築物において有用であり得る追加の調節領域としては、限定されるものではないが、ポリアデニル化配列、翻訳制御配列（例えば、内部リボソーム進入セグメント、ＩＲＥＳ）、エンハンサー、誘導性エレメント、またはイントロンが挙げられる。このような調節領域は、必須であり得ないが、それらはｍＲＮＡの転写、安定性、翻訳効率などに影響することにより発現を増加させ得る。このような調節領域は、細胞中の核酸の最適な発現を得ることが望まれる核酸構築物中に含めることができる。しかしながら、十分な発現をそのような追加のエレメントなしで得ることができることもある。
【００６２】
シグナルペプチドまたは選択マーカーをコードする核酸構築物を使用することができる。コードされるポリペプチドが特定の細胞局在（例えば、細胞表面）に指向されるようにシグナルペプチドを使用することができる。選択マーカーの非限定的な例としては、ピューロマイシン、ガンシクロビル、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ、Ｇ４１８、ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスフトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、およびキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が挙げられる。このようなマーカーは、培養物中の安定的な形質転換体の選択に有用である。他の選択マーカーとしては、蛍光ポリペプチド、例えば、緑色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質が挙げられる。
【００６３】
一部の実施形態において、選択マーカーをコードする配列をリコンビナーゼ、例えば、ＣｒｅまたはＦｌｐなどについての認識配列によりフランキングさせることができる。例えば、選択マーカーは、選択マーカーを構築物から切り出すことができるようにｌｏｘＰ認識部位（Ｃｒｅリコンビナーゼにより認識される３４ｂｐ認識部位）またはＦＲＴ認識部位によりフランキングさせることができる。Ｃｒｅ／ｌｏｘ技術の概説についてはＯｒｂａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９２）８９：６８６１、およびＢｒａｎｄ  ａｎｄ  Ｄｙｍｅｃｋｉ，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ（２００４）６：７参照。選択マーカー遺伝子により中断されるＣｒｅまたはＦｌｐ活性化可能トランス遺伝子を含有するトランスポゾンを使用してトランス遺伝子の条件的発現を有するトランスジェニック動物を得ることもできる。例えば、マーカー／トランス遺伝子の発現をドライブするプロモーターは、ユビキタスまたは組織特異的のいずれかであり得、それはＦ０動物（例えば、ブタ）におけるマーカーのユビキタスまたは組織特異的発現をもたらす。トランス遺伝子の組織特異的活性化は、例えば、マーカー中断トランス遺伝子をユビキタスに発現するブタと、ＣｒｅもしくはＦｌｐを組織特異的に発現するブタとを掛け合わせることにより、またはマーカー中断トランス遺伝子を組織特異的に発現するブタと、ＣｒｅもしくはＦｌｐリコンビナーゼをユビキタスに発現するブタとを掛け合わせることにより達成することができる。トランス遺伝子の発現の制御またはマーカーの切り出しの制御により、トランス遺伝子の発現が可能となる。
【００６４】
一部の実施形態において、外因性核酸は、ポリペプチドをコードする。ポリペプチドをコードする核酸配列は、コードされるポリペプチドの後続の操作を容易にするため（例えば、局在化または検出を容易にするため）に設計された「タグ」をコードするタグ配列を含み得る。タグ配列は、コードされるタグがポリペプチドのカルボキシまたはアミノ末端のいずれかにおいて局在するようにポリペプチドをコードする核酸配列中に挿入することができる。コードされるタグの非限定的な例としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびＦＬＡＧ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）が挙げられる。
【００６５】
核酸構築物は、ＳｓｓＩ  ＣｐＧメチラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用してメチル化することができる。一般に、核酸構築物は、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびＳｓｓＩ  ＣｐＧ−メチラーゼと緩衝液中で３７℃においてインキュベートすることができる。高メチル化は、構築物を１単位のＨｉｎＰ１Ｉエンドヌクレアーゼと３７℃において１時間インキュベートし、アガロースゲル電気泳動によりアッセイすることにより確認することができる。
【００６６】
核酸構築物は、任意のタイプの胚、胎児または生体偶蹄目／家畜細胞、例として、例えば、生殖細胞、例えば、卵母細胞または卵、前駆細胞、成体または胚性幹細胞、始原生殖細胞、腎細胞、例えば、ＰＫ−１５細胞、島細胞、ベータ細胞、肝細胞、または線維芽細胞、例えば、皮膚線維芽細胞中に種々の技術を使用して導入することができる。技術の非限定的な例としては、トランスポゾン系、細胞に感染し得る組換えウイルス、もしくはリポソームまたは核酸を細胞に送達し得る他の非ウイルス法、例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、もしくはリン酸カルシウム沈殿の使用が挙げられる。
【００６７】
トランスポゾン系において、核酸構築物の転写単位、すなわち、外因性核酸配列に作動可能に連結している調節領域は、トランスポゾンの反転リピートによりフランキングされている。いくつかのトランスポゾン系、例として、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（米国特許第６，６１３，７５２号明細書および米国特許出願公開第２００５／０００３５４２号明細書参照）；Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ（Ｍｉｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：６８７３）；Ｔｏｌ２（Ｋａｗａｋａｍｉ（２００７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ７；Ｍｉｎｏｓ（Ｐａｖｌｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ２）；Ｈｓｍａｒ１（Ｍｉｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７））Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２７：４５８９）；およびＰａｓｓｐｏｒｔが、核酸を細胞、例として、マウス、ヒト、およびブタ細胞中に導入するために開発されている。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンが特に有用である。トランスポゼースは、外因性核酸と同一の核酸構築物上でコードされるタンパク質として送達することができ、別個の核酸構築物上で導入することができ、またはｍＲＮＡ（例えば、インビトロ転写およびキャップ化ｍＲＮＡ）として提供することができる。
【００６８】
核酸は、ベクター中に取り込むことができる。ベクターは、担体から標的ＤＮＡ中に移動するように設計された任意の規定のＤＮＡセグメントを含む広義の用語である。ベクターは、発現ベクター、またはゲノムもしくは他の標的化されるＤＮＡ配列、例えば、エピソーム、プラスミド、もしくはさらにはウイルス／ファージＤＮＡセグメント中へのＤＮＡ挿入を生じさせるために必要とされる構成要素のセットであるベクター系と称することができる。動物における遺伝子送達に使用されるベクター系、例えば、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび統合ファージウイルス）、および非ウイルスベクター（例えば、トランスポゾン）は、２つの基本構成要素を有する：１）ＤＮＡ（またはｃＤＮＡに逆転写されるＲＮＡ）を含むベクターおよび２）トランスポゼース、リコンビナーゼ、またはベクターおよびＤＮＡ標的配列の両方を認識し、ベクターを標的ＤＮＡ配列中に挿入する他のインテグラーゼ酵素。ベクターは、１つ以上の発現制御配列を含む１つ以上の発現カセットを含有することが最も多く、発現制御配列は、それぞれ別のＤＮＡ配列またはｍＲＮＡの転写および／または翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列である。
【００６９】
多くの異なるタイプのベクターが公知である。例えば、プラスミドおよびウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターが公知である。哺乳動物発現プラスミドは、典型的には、複製起点、好適なプロモーターおよび任意選択のエンハンサー、ならびにさらには任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、ならびに５’フランキング非転写配列を有する。ベクターの例としては、プラスミド（別のタイプのベクターの担体でもあり得る）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（例えば、改変ＨＩＶ−１、ＳＩＶまたはＦＩＶ）、レトロウイルス（例えば、ＡＳＶ、ＡＬＶまたはＭｏＭＬＶ）、およびトランスポゾン（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、Ｐエレメント、Ｔｏｌ−２、Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ、ｐｉｇｇｙＢａｃ）が挙げられる。
【００７０】
本明細書において使用される、核酸という用語は、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方、例として、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成（例えば、化学合成）ＤＮＡ、ならびに天然存在および化学修飾核酸、例えば、合成塩基または代替骨格を指す。核酸分子は、二本鎖または一本鎖（すなわち、センスまたはアンチセンス一本鎖）であり得る。トランスジェニックという用語は、本明細書において広義に使用され、遺伝子操作技術を使用して遺伝子材料が変更された遺伝子改変生物または遺伝子操作生物を指す。したがって、ノックアウト偶蹄目は、外因性遺伝子または核酸がその動物またはその子孫中で発現されるか否かにかかわらず、トランスジェニックである。
【００７１】
遺伝子改変動物
動物は、ＴＡＬＥＮまたは他の遺伝子操作ツール、例として、リコンビナーゼ融合タンパク質、または公知の種々のベクターを使用して改変することができる。このようなツールにより作製される遺伝子改変は、遺伝子の破壊を含み得る。遺伝子の破壊という用語は、機能的遺伝子産物の形成の妨害を指す。遺伝子産物は、それがその通常の（野生型）機能を実行する場合にのみ機能的である。遺伝子の破壊は、遺伝子によりコードされる機能的因子の発現を妨害し、遺伝子によりコードされる配列中ならびに／または動物中の遺伝子の発現に必要なプロモーターおよび／もしくはオペレーターの１つ以上の塩基の挿入、欠失、または置換を含む。破壊される遺伝子は、例えば、動物のゲノムからの遺伝子の少なくとも一部の除去、遺伝子によりコードされる機能的因子の発現を妨害するための遺伝子の変更、干渉ＲＮＡ、または外因性遺伝子によるドミナントネガティブ因子の発現により破壊することができる。遺伝子改変動物の材料および方法は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる２０１２年２月２４日に出願された米国特許出願第１３／４０４，６６２号明細書、２０１２年５月９日に出願された米国特許出願第１３／４６７，５８８号明細書、および２００９年１１月１０日に出願された米国特許出願第１２／６２２，８８６号明細書にさらに詳述されており、矛盾する場合、本明細書が優先する。トランス作用という用語は、異なる分子からの標的遺伝子に対して（すなわち、分子間）作用するプロセスを指す。トランス作用エレメントは、通常、遺伝子を含有するＤＮＡ配列である。この遺伝子は、標的遺伝子の調節において使用されるタンパク質（またはマイクロＲＮＡもしくは他の拡散性分子）をコードする。トランス作用遺伝子は、標的遺伝子と同一の染色体上に存在し得るが、活性は、中間タンパク質またはそれがコードするＲＮＡを介するものである。ドミナントネガティブを使用する遺伝子の不活性化は、一般に、トランス作用エレメントを含む。シス調節またはシス作用という用語は、タンパク質もＲＮＡもコードしない作用を意味し；遺伝子不活性化に関して、これは、一般に、遺伝子のコード部分、または機能的遺伝子の発現に必要なプロモーターおよび／もしくはオペレーターの不活性化を意味する。
【００７２】
当技術分野において公知の種々の技術を使用して遺伝子を不活性化してノックアウト動物を作製し、および／または核酸構築物を動物中に導入してファウンダー動物を生産し、ノックアウトまたは核酸構築物がゲノム中に統合されている動物系列を作製することができる。このような技術としては、限定されるものではないが、前核マイクロインジェクション（米国特許第４，８７３，１９１号明細書）、生殖系列中へのレトロウイルス媒介遺伝子導入（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：６１４８−１６５２）、胚性幹細胞中への遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｃｅｌｌ，５６：３１３−３２１）、胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３：１８０３−１８１４）、精子媒介遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１４２３０−１４２３５；Ｌａｖｉｔｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．，１８：１９−２３）、および体細胞、例えば、卵丘もしくは乳腺細胞、または生体、胎児、もしくは胚性幹細胞のインビトロ形質転換とそれに続く核移植（Ｗｉｌｍｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ，３８５：８１０−８１３；およびＷａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ，３９４：３６９−３７４）が挙げられる。前核マイクロインジェクション、精子媒介遺伝子導入、および体細胞核移植が特に有用な技術である。ゲノム改変されている動物は、細胞の全て、例として、生殖系列細胞が遺伝子改変を有する動物である。遺伝子改変がモザイクである動物を生産する方法を使用する場合、動物を同系交配することができ、ゲノム改変されている子孫を選択することができる。細胞が胚盤胞状態において改変される場合、例えば、クローン化を使用してモザイク動物を作製することができ、単一細胞が改変される場合、ゲノム改変が生じ得る。特定の遺伝子がノックアウト改変により不活性化される場合、ホモ接合性が通常要求される。特定の遺伝子がＲＮＡ干渉またはドミナントネガティブ方針により不活性化される場合、ヘテロ接合性が適切であることが多い。
【００７３】
典型的には、前核マイクロインジェクションにおいて、核酸構築物を受精卵中に導入し；精子頭部および卵からの遺伝子材料を含有する前核が原形質内で可視的であるため、１または２つの細胞受精卵を使用する。前核段階の受精卵は、インビトロまたはインビボ（すなわち、ドナー動物の卵管から外科的に回収する）で得ることができる。体外受精卵は、以下のとおり生産することができる。例えば、ブタ卵巣を食肉処理場において回収し、輸送の間２２〜２８℃において維持することができる。卵巣を洗浄し、卵胞吸引のために単離することができ、４〜８ｍｍに及ぶ卵胞を５０ｍＬのコニカル遠心管中に１８ゲージ針を使用して真空下で吸引することができる。卵胞液および吸引された卵母細胞は、市販のＴＬ−ＨＥＰＥＳ（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）によりプレフィルターに通してリンスすることができる。コンパクトな卵丘塊により包囲される卵母細胞を選択し、０．１ｍｇ／ｍＬのシステイン、１０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子、１０％のブタ卵胞液、５０μＭの２−メルカプトエタノール、０．５ｍｇ／ｍｌのｃＡＭＰ、１０ＩＵ／ｍＬの妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のそれぞれが補給されたＴＣＭ−１９９卵母細胞成熟培地（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）中に加湿空気中で３８．７℃および５％のＣＯ２において約２２時間配置することができる。続いて、卵母細胞をｃＡＭＰも、ｍＰＭＳＧも、ｈＣＧを含有しない新たなＴＣＭ−１９９成熟培地に移動させ、さらに２２時間インキュベートすることができる。成熟卵母細胞をそれらの卵丘細胞から、０．１％のヒアルロニダーゼ中の１分間のボルテックス処理により剥がすことができる。
【００７４】
ブタについて、成熟卵母細胞を５００μｌのＭｉｎｉｔｕｂｅ  ＰＯＲＣＰＲＯ  ＩＶＦ培地系（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）中においてＭｉｎｉｔｕｂｅ５ウェル受精ディッシュ中で受精させることができる。体外受精（ＩＶＦ）についての調製において、新たに回収され、または冷凍された雄ブタ精液を洗浄し、ＰＯＲＣＰＲＯ  ＩＶＦ培地中で４×１０５個の精子に再懸濁させることができる。精子濃度は、コンピュータ支援精液分析（ＳＰＥＲＭＶＩＳＩＯＮ，Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，ＷＩ）により分析することができる。最終的な試験管内授精は、雄ブタに応じて１０μｌの容量で約４０個の運動性精子／卵子の最終濃度において実施することができる。全ての受精卵母細胞を、５．０％のＣＯ２雰囲気中で３８．７℃において６時間インキュベートする。授精の６時間後、推定接合子をＮＣＳＵ−２３中で２回洗浄し、０．５ｍＬの同一培地に移動させることができる。この系は、ほとんどの雄ブタにわたり、１０〜３０％の多精子授精率で２０〜３０％の胚盤胞を定型的に生産し得る。
【００７５】
直鎖化核酸構築物を前核の１つの中に注入することができる。次いで、注入された卵をレシピエント雌に（例えば、レシピエント雌の卵管中に）移植し、レシピエント雌中で発育させてトランスジェニック動物を生産することができる。特に、体外受精胚は、１５，０００×ｇにおいて５分間遠心分離して脂質を沈降させ、前核の可視化を可能とすることができる。胚は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＦＥＭＴＯＪＥＴ注入器を使用して注入することができ、胚盤胞形成まで培養することができる。胚分割および胚盤胞形成の速度ならびに質を記録することができる。
【００７６】
胚は、非同期レシピエントの子宮中に外科的に移植することができる。典型的には、５．５インチＴＯＭＣＡＴ（登録商標）カテーテルを使用して１００〜２００（例えば、１５０〜２００）個の胚を卵管の膨大部−峡部境界中に配置することができる。術後、妊娠のリアルタイム超音波試験を実施することができる。
【００７７】
体細胞核移植において、上記の核酸構築物を含むトランスジェニック偶蹄目細胞（例えば、トランスジェニックブタ細胞またはウシ細胞）、例えば、胚割球、胎児線維芽細胞、成体耳線維芽細胞、または顆粒膜細胞を、除核卵母細胞中に導入して複合細胞を樹立することができる。卵母細胞は、極体付近で部分的に透明帯を切開し、次いで切開区域において細胞質を押し出すことにより除核することができる。典型的には、鋭く斜めに切られた先端部を有する注入ピペットを使用してトランスジェニック細胞を、第２減数分裂において停止させた除核卵母細胞中に注入する。一部の慣用例において、第２減数分裂において停止させた卵母細胞を卵と称する。ブタまたはウシ胚を生産した後（例えば、卵母細胞の融合および活性化により）、活性化の約２０〜２４時間後に胚をレシピエント雌の卵管に移植する。例えば、Ｃｉｂｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０：１２５６−１２５８および米国特許第６，５４８，７４１号明細書参照。ブタについて、レシピエント雌は、胚の移植約２０〜２１日後に妊娠について確認することができる。
【００７８】
精原幹細胞は、家畜の遺伝子改変の第２の方法を提供する。遺伝子改変または遺伝子編集は、ドナー精巣から単離された精原幹細胞中でインビトロで遂行することができる。改変された細胞は、レシピエントの生殖細胞枯渇精巣中に移植する。移植された精原幹細胞は、人工授精（ＡＩ）または体外受精（ＩＶＦ）を介する交配に使用してファウンダー動物を誘導することができる遺伝子改変を担持する精子を生産する。
【００７９】
標準的な交配技術を使用して最初のヘテロ接合性ファウンダー動物からの外因性核酸についてホモ接合性の動物を作出することができる。しかしながら、ホモ接合性は、要求されないこともある。本明細書に記載のトランスジェニックブタは、他の目的のブタと交配することができる。
【００８０】
一部の実施形態において、目的核酸および選択マーカーは、別個のトランスポゾン上で提供し、不等量で胚または細胞のいずれかに提供することができ、選択マーカーを含有するトランスポゾンの量は、目的核酸を含有するトランスポゾンを大幅に超過する（５〜１０倍過剰）。目的核酸を発現するトランスジェニック細胞または動物は、選択マーカーの存在および発現に基づき単離することができる。トランスポゾンはゲノム中に正確に、および非連鎖で統合するため（独立転移イベント）、目的核酸および選択マーカーは、遺伝的に連鎖させず、標準的な交配を介する遺伝的分離により容易に分離することができる。したがって、公衆安全性の観点からの一部の懸念事項である、後続の世代における選択マーカーの保持が拘束されないトランスジェニック動物を生産することができる。
【００８１】
トランスジェニック動物を生成したら、標準的技術を使用して外因性核酸の発現を評価することができる。初回スクリーニングは、サザンブロット分析により達成して構築物の統合が生じたか否かを決定することができる。サザン分析の記載については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ；ＮＹのセクション９．３７〜９．５２参照。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を初回スクリーニングにおいて使用することもできる。ＰＣＲは、標的核酸を増幅させる手順または技術を指す。一般に、目的領域の末端またはその外側からの配列情報を用いて増幅させるべきテンプレートの逆鎖と配列が同一または類似のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。ＰＣＲを使用してＤＮＡおよびＲＮＡからの特異的配列、例として、全ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡからの配列を増幅させることができる。プライマーは、典型的には、１４〜４０ヌクレオチド長であるが、１０ヌクレオチドから数百ヌクレオチド長に及び得る。ＰＣＲは、例えば、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５に記載されている。核酸は、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、自律配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、または増幅核酸配列ベース増幅により増幅させることもできる。例えば、Ｌｅｗｉｓ（１９９２）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ，１２：１；Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１８７４；およびＷｅｉｓｓ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１２９２参照。胚盤胞段階において、胚は、ＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーションおよびスプリンケレットＰＣＲによる分析のために個々に処理することができる（例えば、Ｄｕｐｕｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００２）９９：４４９５参照）。
【００８２】
トランスジェニックブタの組織中のポリペプチドをコードする核酸配列の発現は、例えば、動物から得られた組織試料のノザンブロット分析、インサイチューハイブリダイゼーション分析、ウエスタン分析、免疫アッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ、および逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられる技術を使用して評価することができる。
【００８３】
干渉ＲＮＡ
種々の干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）が公知である。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、相同遺伝子転写物の配列特異的分解を誘導する。ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）は、ｄｓＲＮＡを小さい２１〜２３ヌクレオチドの小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に代謝する。ＲＩＳＣは、二本鎖ＲＮアーゼ（ｄｓＲＮアーゼ、例えば、ダイサー）およびｓｓＲＮアーゼ（例えば、Ａｒｇｏｎａｕｔ２またはＡｇｏ２）を含有する。ＲＩＳＣは、開裂可能な標的を見出すためのガイドとしてアンチセンス鎖を利用する。ｓｉＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の両方が公知である。遺伝子改変動物中の遺伝子を破壊する方法は、標的遺伝子および／または核酸の発現が低減するように標的遺伝子および／または核酸に対するＲＮＡ干渉を誘導することを含む。
【００８４】
例えば、外因性核酸配列は、ポリペプチドをコードする核酸に対するＲＮＡ干渉を誘導し得る。例えば、標的ＤＮＡと相同な二本鎖小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または小分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用してそのＤＮＡの発現を低減させることができる。ｓｉＲＮＡのための構築物は、例えば、Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８０６；Ｒｏｍａｎｏ  ａｎｄ  Ｍａｓｉｎｏ（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６：３３４３；Ｃｏｇｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）ＥＭＢＯ  Ｊ．，１５：３１５３；Ｃｏｇｏｎｉ  ａｎｄ  Ｍａｓｉｎｏ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ，３９９：１６６；Ｍｉｓｑｕｉｔｔａ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：１４５１；およびＫｅｎｎｅｒｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｈｅｗ（１９９８）Ｃｅｌｌ，９５：１０１７に記載のとおり生産することができる。ｓｈＲＮＡのための構築物は、ＭｃＩｎｔｙｒｅ  ａｎｄ  Ｆａｎｎｉｎｇ（２００６）ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１により記載されているとおりに生産することができる。一般に、ｓｈＲＮＡは、アニールし、短鎖ヘアピンを形成し得る相補的領域を含有する一本鎖ＲＮＡ分子として転写される。
【００８５】
特異的遺伝子に指向される単一の個々の機能的ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを見出す確率は、高い。例えば、ｓｉＲＮＡの特異的配列の予測可能性は、約５０％であるが、少なくとも１つが効率的な良好な信頼性を有する多数の干渉ＲＮＡを作製することができる。
【００８６】
実施形態は、遺伝子、例えば、発生段階に選択的な遺伝子に対して指向されるＲＮＡｉを発現するインビトロ細胞、インビボ細胞、および遺伝子改変動物、例えば、家畜動物を含む。例えば、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＲＩＳＣおよびｍｉＲＮＡからなる群から選択することができる。
【００８７】
誘導性系
誘導性系を使用して遺伝子の発現を制御することができる。遺伝子の発現の時空間的制御を可能とする種々の誘導性系が公知である。いくつかは、トランスジェニック動物中でインビボで機能的であることが証明されている。誘導性系という用語は、慣習的なプロモーターおよび誘導性遺伝子発現エレメントを含む。
【００８８】
誘導性系の一例は、核酸の転写を調節するために使用することができるテトラサイクリン（ｔｅｔ）−ｏｎプロモーター系である。この系においては、突然変異Ｔｅｔ抑制因子（ＴｅｔＲ）を単純ヘルペスウイルスＶＰ１６トランス活性化因子タンパク質の活性化ドメインに融合させてテトラサイクリン制御性転写活性化因子（ｔＴＡ）を作出し、これはｔｅｔまたはドキシサイクリン（ｄｏｘ）により調節される。抗生物質の不存在下では転写は最小限である一方、ｔｅｔまたはｄｏｘの存在下では転写が誘導される。代替的な誘導性系としては、エクジソンまたはラパマイシン系が挙げられる。エクジソンは、エクジソン受容体およびウルトラスピラクル遺伝子（ＵＳＰ）の産物のヘテロ二量体により生産が制御される昆虫脱皮ホルモンである。発現は、エクジソンまたはエクジソン類似体、例えば、ムリステロンＡによる処理により誘導される。誘導性系を惹起するために動物に投与される薬剤は、誘導剤と称される。
【００８９】
より一般に使用される誘導性系には、テトラサイクリン誘導性系およびＣｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系（構成的または誘導性のいずれか）がある。テトラサイクリン誘導性系は、テトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）／リバースｔＴＡ（ｒｔＴＡ）を含む。これらの系をインビボで使用する方法は、２つの系統の遺伝子改変動物を生成することを含む。１つの動物系統は、選択されたプロモーターの制御下で活性化因子（ｔＴＡ、ｒｔＴＡ、またはＣｒｅリコンビナーゼ）を発現する。トランスジェニック動物の別のセットは、目的遺伝子（または改変すべき遺伝子）の発現がｔＴＡ／ｒｔＴＡトランス活性化因子についての標的配列の制御下にある（またはｌｏｘＰ配列によりフランキングされている）アクセプターを発現する。２つのマウス株の交配は、遺伝子発現の制御を提供する。
【００９０】
テトラサイクリン依存性調節系（ｔｅｔ系）は、２つの構成要素、すなわち、テトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡまたはｒｔＴＡ）および下流ｃＤＮＡの発現を制御するｔＴＡ／ｒｔＴＡ依存性プロモーターにテトラサイクリン依存的に頼る。テトラサイクリンまたはその誘導体（例えば、ドキシサイクリン）の不存在下では、ｔＴＡはｔｅｔＯ配列に結合し、ｔＴＡ依存性プロモーターの転写活性化を可能とする。しかしながら、ドキシサイクリンの存在下では、ｔＴＡはその標的と相互作用し得ず、転写は生じない。ｔＴＡを使用するｔｅｔ系は、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンが転写下方調節を可能とするため、ｔｅｔ−ＯＦＦと称される。テトラサイクリンまたはその誘導体の投与により、インビボでのトランス遺伝子発現の時間的制御が可能になる。ｒｔＴＡは、ドキシサイクリンの不存在下では機能的でないが、トランス活性化のためにリガンドの存在を要求するｔＴＡのバリアントである。したがって、このｔｅｔ系はｔｅｔ−ＯＮと称される。ｔｅｔ系は、例えば、レポーター遺伝子、癌遺伝子、またはシグナリングカスケードに関与するタンパク質をコードするいくつかのトランス遺伝子の誘導性発現にインビボで使用されている。
【００９１】
Ｃｒｅ／ｌｏｘ系はＣｒｅリコンビナーゼを使用し、これは、２つの区別されるＣｒｅ認識配列、すなわち、ｌｏｘＰ部位の間で入れ換わることによる部位特異的組換えを触媒する。２つのｌｏｘＰ配列の間に導入されたＤＮＡ配列（フロックスＤＮＡと称される）がＣｒｅ媒介組換えにより切り出される。空間的制御（組織特異的または細胞特異的プロモーターによる）または時間的制御（誘導性系による）のいずれかを使用するトランスジェニック動物におけるＣｒｅ発現の制御は、２つのｌｏｘＰ部位間のＤＮＡの切り出しの制御をもたらす。１つの適用は、条件的遺伝子不活性化（条件的ノックアウト）である。別のアプローチは、フロックス終止コドンがプロモーター配列および目的ＤＮＡ間に挿入されるタンパク質過剰発現である。遺伝子改変動物は、Ｃｒｅが発現されてフロックス終止コドンの切り出しがもたらされるまでトランス遺伝子を発現しない。この系は、組織特異的腫瘍形成およびＢリンパ球中のアンチジーン（ａｎｔｉｇｅｎｅ）受容体発現の制御に適用されている。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼも開発されている。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼは、外因性リガンドの投与によってのみ活性化される。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼは、元のＣｒｅリコンビナーゼおよび特異的リガンド結合ドメインを含有する融合タンパク質である。Ｃｒｅリコンビナーゼの機能的活性は、融合タンパク質中のこの特異的ドメインに結合し得る外部リガンドに依存的である。
【００９２】
実施形態は、誘導性系の制御下にある遺伝子を含むインビトロ細胞、インビボ細胞、および遺伝子改変動物、例えば家畜動物を含む。動物の遺伝子改変は、ゲノミックまたはモザイクであり得る。誘導性系は、例えば、Ｔｅｔ−Ｏｎ、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ、Ｃｒｅ−ｌｏｘ、およびＨｉｆ１アルファからなる群から選択することができる。一実施形態は、本明細書に記載の遺伝子である。
【００９３】
ファウンダー動物、動物系統、形質、および生殖
ファウンダー動物は、クローン化および本明細書に記載の他の方法により生産することができる。ファウンダーは、接合子または初代細胞がホモ接合性の改変を受ける場合のように、遺伝子改変についてホモ接合性であり得る。同様に、ヘテロ接合性のファウンダーを作製することもできる。ファウンダーはゲノム的に改変されていてもよく、このことは、そのゲノムにおける細胞の全てが改変を受けていることを意味する。ファウンダーは、ベクターを胚における複数の細胞の１つに、典型的には胚盤胞段階において導入する場合に起こり得るように、改変についてモザイクであり得る。モザイク動物の子孫を試験してゲノム的に改変されている子孫を同定することができる。有性生殖させることができ、または生殖補助技術により生殖させることができ、異種またはホモ接合性の子孫が常に改変を発現する動物のプールが作出された場合、動物系統が樹立される。
【００９４】
家畜において、多くのアレルが、種々の形質、例えば、生産形質、体型形質、作業性形質、および他の機能的形質に結びつけられることが公知である。当業者はこれらの形質を監視し、定量化することに慣れている、例えば、Ｖｉｓｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９４）４０：１２３−１３７、米国特許第７，７０９，２０６号明細書、米国特許出願公開第２００１／００１６３１５号明細書、米国特許出願公開第２０１１／００２３１４０号明細書、および米国特許出願公開第２００５／０１５３３１７号明細書。動物系統は、生産形質、体型形質、作業性形質、受精能形質、母性形質、および疾患耐性形質からなる群の形質から選択される形質を含み得る。さらなる形質としては、組換え遺伝子産物の発現が挙げられる。実施形態は、１つ以上のそのような形質、または遺伝子導入された形質を有する動物を選択し、標識精子を含むようにそのゲノムを改変することを含む。
【００９５】
リコンビナーゼ
本発明の実施形態は、標的化されるヌクレアーゼ系をリコンビナーゼ（例えば、ＲｅｃＡタンパク質、Ｒａｄ５１）またはＤＮＡ組換えに関連する他のＤＮＡ結合タンパク質と投与することを含む。リコンビナーゼは、核酸断片とフィラメントを形成し、事実上、細胞ＤＮＡを探索してその配列と実質的に相同なＤＮＡ配列を見出す。例えば、リコンビナーゼは、ＨＤＲについてのテンプレートとして機能する核酸配列と組み合わせることができる。次いで、リコンビナーゼをＨＤＲテンプレートと組み合わせてフィラメントを形成し、細胞中に配置することができる。リコンビナーゼおよび／またはリコンビナーゼと組み合わさるＨＤＲテンプレートは、細胞または胚中に、タンパク質、ｍＲＮＡとして配置し、またはリコンビナーゼをコードするベクターにより配置することができる。米国特許出願公開第２０１１／００５９１６０号明細書（米国特許出願第１２／８６９，２３２号明細書）の開示が、本明細書により全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれ、矛盾する場合、本明細書が優先する。リコンビナーゼという用語は、細胞中で２つの比較的長いＤＮＡ鎖間の比較的短いＤＮＡ片の結合を酵素的に触媒する遺伝子組換え酵素を指す。リコンビナーゼとしては、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、ＲｅｃＡ、ＲＡＤ５１、Ｃｒｅ、およびＦＬＰが挙げられる。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位間のＤＮＡの部位特異的組換えを触媒するＰ１バクテリオファージからのＩ型トポイソメラーゼである。Ｈｉｎリコンビナーゼは、細菌のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）中に見出される１９８アミノ酸から構成される２１ｋＤのタンパク質である。Ｈｉｎは、ＤＮＡ開裂および組換えの開始を活性部位セリンに頼るＤＮＡインベルターゼのセリンリコンビナーゼファミリーに属する。ＲＡＤ５１はヒト遺伝子である。この遺伝子によりコードされるタンパク質は、ＤＮＡ二本鎖分解の修復を支援するＲＡＤ５１タンパク質ファミリーのメンバーである。ＲＡＤ５１ファミリーメンバーは、細菌ＲｅｃＡおよび酵母Ｒａｄ５１と相同である。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位によりフランキングされる規定の配列を欠失させるための実験において使用される酵素である。ＦＬＰは、パン酵母の出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２μプラスミドに由来するフリッパーゼ組換え酵素（ＦＬＰまたはＦｌｐ）を指す。
【００９６】
本明細書において、「ＲｅｃＡ」または「ＲｅｃＡタンパク質」は、同一機能、特に：（ｉ）ＤＮＡポリメラーゼによる後続の伸長のため、オリゴヌクレオチまたはポリヌクレオチドをその相同性標的上に適切に位置決めする能力；（ｉｉ）ＤＮＡ合成のため、二重鎖核酸をトポロジー的に調製する能力；および（ｉｉｉ）相補的配列を効率的に見出してそれに結合するＲｅｃＡ／オリゴヌクレオチドまたはＲｅｃＡ／ポリヌクレオチド複合体の能力の本質的に全てまたはほとんどを有するＲｅｃＡ様組換えタンパク質のファミリーを指す。最良に特徴決定されたＲｅｃＡタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのものであり；このタンパク質の元のアレル形態に加え、いくつかの突然変異ＲｅｃＡ様タンパク質、例えば、ＲｅｃＡ８０３が同定されている。さらに、多くの生物、例として、例えば、酵母、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ヒトを含む哺乳動物、および植物が、ＲｅｃＡ様鎖転移タンパク質を有する。これらのタンパク質としては、例えば、Ｒｅｃ１、Ｒｅｃ２、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｂ、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｒａｄ５１Ｅ、ＸＲＣＣ２およびＤＭＣ１が挙げられる。組換えタンパク質の一実施形態は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質である。あるいは、ＲｅｃＡタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異ＲｅｃＡ−８０３タンパク質、別の細菌源由来のＲｅｃＡタンパク質または別の生物からの相同組換えタンパク質であり得る。
【００９７】
組成物およびキット
本発明はまた、例えば、部位特異的エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ、Ｃａｓ９、ＺＮＦ、ＴＡＬＥＮをコードする核酸分子、そのポリペプチドを含有する組成物およびキット、そのような核酸分子もしくはポリペプチド、または遺伝子操作細胞系を含有する組成物を提供する。示されるアレルの遺伝子移入について効率的なＨＤＲを提供することもできる。このようなアイテムは、例えば、研究ツールとして、または治療的に使用することができる。
【実施例】
【００９８】
材料および方法、例として、ＴＡＬＥＮを作製する方法は、一般に、特に記載のない限り、２０１２年８月２４日に出願された米国特許出願第１３／５９４，６９４号明細書に記載されているとおりである。
【００９９】
実施例１：Ｙ染色体改変のためのＴＡＬＥＮ
形質移入  −  線維芽細胞を培養し、既に記載されているヌクレオフェクションにより形質移入する（Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。トランスポゾンは、実験中の合計１μｇを構成する。相同性依存性修復（ＨＤＲ）分析のため、二本鎖分解（ＤＳＢ）誘導のための最良の実施条件を選択し、修復テンプレートをＴＡＬＥＮプラスミドに等量、３および１０倍過剰において添加する。細胞培養  −  個々のコロニーの単離は、所定密度における９６ウェルプレート中の選択により実施してウェルの３０〜５０％中のコロニーをもたらす。インデル検出集団  −  約５００ｂｐのアンプリコンをもたらすように標的部位をフランキングするプライマーを設計する。ＰＣＲアンプリコンをＳＵＲＶＥＹＯＲ（登録商標）ヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，Ｏｍａｈａ  ＮＥ）により提案のとおりにより処理し、８〜１０％のポリアクリルアミドゲル上で分解する。インデル陽性胚盤胞からのアンプリコンの一部をクローン化し、配列決定して突然変異を特徴決定した。インデル検出コロニー  −  上記で使用される標的部位をフランキングするプライマーを、高解像度融解分析ｑＰＣＲマスターミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する増幅に使用し、融解曲線分析を実施する。リアルタイムＰＣＲ産物の融解プロファイルの変動は、ＴＡＬＥＮ誘導突然変異を担持するクローンを野生型配列から区別する。アンプリコン由来非形質移入対照細胞の融解温度の通常の変動を参照として使用する。通常の変動外の融解プロファイルを有するアンプリコンをクローン化し、配列決定して突然変異を特徴決定する。Ｙ標的化検出  −  ＰＣＲアッセイを相同性アームの外側のプライマーおよびアーム内の１つのプライマーにより開発して相同組換えが生じた場合にのみ考えられる産物をもたらす。ＰＣＲ陽性コロニーをホールゲノム増幅サザンブロッティングにより検証する。Ｙ標的化を確認するためのＷＧＡサザンブロッティング  −  ＲＥＰＬＩ−ｇ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）の半反応を「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  ｏｒ  Ｃｅｌｌｓ」プロトコルに従って使用してＷＧＡを個々のクローンに対して実施する。サザンブロッティングのためのプローブをハイブリダイズさせて標的化される細胞の５’および３’ジャンクションを検証する。ＦＡＣＳ−ＸおよびＹ担持精細胞のソーティングのために、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２が６．２５ｕＭの濃度に添加された１ｍｌのＢＴＳ中に１５００万個の精子を装入することにより新たな精液を調製する。この調製物を３５℃において４５分間インキュベートする。精子ソーティングのための標準的な改変を有する改変フローサイトメーターを使用してＸおよびＹ担持精子をＤＮＡ含有率によりソーティングする（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｉｎｋｅｌ，１９８６）。ソーティングされた集団の精度は、ＸおよびＹ標的についての定量的ＰＣＲにより決定する。血清ホルモン計測  −  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）からの市販のＥＬＩＳＡキットを使用してテストステロンおよびＦＳＨの血清レベルを評価する。
【０１００】
Ｙ染色体遺伝子付加についての２つの候補遺伝子座に対して指向される４つのＴＡＬＥＮペアを作製した（図４）。第１の候補は、２つの最大ランキングポリアデニル化シグナル外でＳＲＹの３’側１．７ｋｂで局在する。第２の候補遺伝子座は、ＡＭＥＬＹ遺伝子のＹ特異的イントロンである。これらの遺伝子座は、ウシとの比較およびブタ：ウシ比較遺伝子マッピングデータに基づきＳＳＣＹの偽常染色体境界の外側に存在すると予測される（Ｑｕｉｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｖａｎ  Ｌａｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。したがって、これらはＳＳＣＸまたは常染色体との組換えを受け得ず、したがって、多世代にわたりＳＳＣＹ上で維持されることが予測される。試験された４つのＴＡＬＥＮペアの３つにより、高い活性が明らかになった（図４）。
【０１０１】
実施例２：単および両アレルＫＯクローンの単離。
Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２は、トランスジェニック初代線維芽細胞を効率的に拡張させ、非トランスジェニック線維芽細胞（フィーダー細胞）と標準的密度（＞１５０個の細胞／ｃｍ２）においてプレーティングし、上記に適用されるトランスポゾン同時選択技術を使用する薬物選択に供した場合にコロニーとして単離する家畜における標的遺伝子の改変を記載している（Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．，２０：１１２５および２０１２年５月９日に出願された米国特許出願公開第２０１２／０２２００３７号明細書）。これらの技術は、動物をクローン化するために使用することができる体細胞の遺伝子変化の作製に有用である。
【０１０２】
一例として、６つのＴＡＬＥＮペアにより処理された細胞についてピューロマイシン耐性コロニーを単離し、それらの遺伝子型を評価した。一般に、インデル陽性クローンの比率は、３日目の改変レベルに基づきなされた予測と類似した。両アレルノックアウトクローンは、７つの異なるＴＡＬＥＮペアの６つについて同定され、インデル陽性細胞の最大３５パーセント中で生じた。大多数の例において、インデルは、それぞれのアレル上のユニークなインデルではなくホモ接合性であり（それぞれのアレル上の同一のインデル）、このことは、姉妹染色分体テンプレート化修復が共通であることを示唆した。特に、改変クローンでは、大多数のＴＡＬＥＮペアについての両アレル改変の頻度（１７〜６０％）は、染色体開裂を独立イベントとして処理する場合、３日目の改変レベル（１０〜１７％）に基づく予測を超過する。
【０１０３】
実施例３：家畜細胞中のＨＤＲのための標的としてのＴＡＬＥＮ媒介ＤＮＡ開裂。
ブタ低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子の第４エキソンに標的化されるＴＡＬＥＮペア（ＬＤＬＲ４．２）を、ブタＬＤＬＲ遺伝子に対応する相同性アームおよびＨＤＲ時にネオマイシンホスホトランスフェラーゼの発現を可能とする遺伝子トラップを含有するスーパーコイルドプラスミドＬｄｌｒ−Ｅ４Ｎ−ｓｔｏｐと同時形質移入した。培養３日後、ＰＣＲ分析により、抗生物質選択なしでも、ＨＤＲイベントに対応するバンドを３０℃において標的化される遺伝子座において検出することができることが明らかになった。ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８）による１４日間の培養細胞の集団の選択は、ＨＤＲ細胞の顕著な濃縮をもたらした。
【０１０４】
実施例４：テンプレート化のための一本鎖ＤＮＡ。
Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１３は、遺伝子のテンプレートドライブ型改変の一本鎖ＤＮＡの使用を記載している。一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）は、ＴＡＬＥＮ刺激ＨＲのための効率的なテンプレートである。１１塩基対のＢｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅウシ突然変異をＷａｇｙｕ細胞中に遺伝子移入させるように遺伝子座を標的化した。１１塩基対を欠失するＢＢ  ＧＤＦ８遺伝子のセンスまたはアンチセンス鎖のいずれかを模倣するように２つの７６塩基対ｓｓＯＤＮを設計した。４マイクログラムのＴＡＬＥＮコードプラスミドをＷａｇｙｕ細胞中に形質移入し、０．３ｎＭｏｌのｓｓＯＤＮをＴＡＬＥＮ（Ｎ）と同時形質移入し、またはＭｉｒｕｓＬＴ１（Ｍ）試薬もしくはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ試薬（Ｌ）のいずれかによりＴＡＬＥＮヌクレオフェクションの２４時間後に送達した。３日目における半定量ＰＣＲは、ｓｓＯＤＮをＴＡＬＥＮ形質移入の２４時間後にＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ＬＴＸ試薬により送達した条件において最大５％のアレル変換頻度が送達されたことを示した。標的に対して設計されたセンスおよびアンチセンスｓｓＯＤＮ間でＰＣＲシグナルの差は観察されなかった。
【０１０５】
実施例５：オリゴＨＤＲを使用してブタ（Ｏｓｓａｂａｗ）細胞中に導入されるアレル。
Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）は、ある種中で天然に生じるアレルを別の種に配置する（種間移動）ためのｍＲＮＡコードＴＡＬＥＮおよび一本鎖オリゴヌクレオチドの組合せによる細胞の改変を記載している。ＰｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅＧＦＤ８ＳＮＰ  Ｃ３１３Ｙが、一例として選択され、Ｏｓｓａｂｏｗブタ細胞中に導入された。これらの細胞中では、いずれの段階においてもマーカーは使用されなかった。０．４ｎｍｏｌのｓｓＯＤＮにおいてＨＤＲの類似ピークがブタおよびウシ細胞間で観察されたが（示さず）、ＨＤＲは、Ｏｓｓａｂａｗ線維芽細胞中のより高濃度のｓｓＯＤＮによっては消失しなかった。
【０１０６】
実施例６：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９設計および生産。
遺伝子特異的ｇＲＮＡ配列をＣｈｕｒｃｈ実験室ｇＲＮＡベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ番号：４１８２４）中にその研究者らの方法に従ってクローン化した。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ｈＣａｓ９プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ番号：４１８１５）またはＲＣＩＳｃｒｉｐｔ−ｈＣａｓ９から合成されたｍＲＮＡのいずれかの同時形質移入により提供された。このＲＣＩＳｃｒｉｐｔ−ｈＣａｓ９は、ｈＣａｓ９プラスミド（ｈＣａｓ９ｃＤＮＡを包含）からのＸｂａＩ−ＡｇｅＩ断片の、ＲＣＩＳｃｒｉｐｔプラスミド中へのサブクローン化により構築した。ｍＲＮＡの合成は、上記のとおり実施したが、但し直鎖化はＫｐｎＩを使用して実施した。
【０１０７】
実施例７：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲを使用してイボイノシシからのｐ６５Ｓ５３１Ｐ突然変異を慣用のブタ中に遺伝子移入した。図５を参照すると、パネルａ）において、Ｓ５３１Ｐミスセンス突然変異をブタｐ６５（ＲＥＬＡ）のヌクレオチド１５９１におけるＴ−Ｃトランシジョンにより引き起こした。Ｓ−Ｐ  ＨＤＲテンプレートは、新規ＸｍａＩ部位を導入し、ＲＦＬＰスクリーニングを可能とする原因ＴＣトランシジョン突然変異（大文字）を含む。２つのｇＲＮＡ配列（Ｐ６５＿Ｇ１ＳおよびＰ６５＿Ｇ２Ａ）を、予備実験において使用されるｐ６５．８ＴＡＬＥＮとともに示す。パネルｂ）において、Ｌａｎｄｒａｃｅ線維芽細胞を、Ｓ−Ｐ−ＨＤＲオリゴ（２μＭ）、ｈＣａｓ９をコードする２つの量のプラスミド（０．５μｇと２．０μｇ）；５つの量のＧ２Ａ転写プラスミド（０．０５〜１．０μｇ）により形質移入した。それぞれの形質移入からの細胞を６０：４０に分け、それぞれ３０および３７℃において３日間培養してから１０日目まで３７℃において培養を延長した。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより、１６〜３０％に及ぶ活性が明らかになった。パネルｃおよびｄ）３および１０日目において試料採取された細胞のＲＦＬＰ分析。１９１および１１８ｂｐの予測開裂産物を黒色矢印により示す。ＤＳＢと標的ＳＮＰとの近接性にかかわらず、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲはＳ５３１Ｐの遺伝子移入についてＴＡＬＥＮより効率的でなかった。それぞれのｇＲＮＡ配列を使用して個々のコロニーも分析した。
【０１０８】
実施例８：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９
ブタＡＰＣにおけるＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲの比較。図６を参照すると、パネルａ）において、ＡＰＣ１４．２ＴＡＬＥＮおよびｇＲＮＡ配列ＡＰＣ１４．２Ｇ１ａを、野生型ＡＰＣ配列に対して示す。最下段に、新規ＨｉｎｄＩＩＩ部位をもたらす４ｂｐ挿入（文字参照）を送達するＨＤＲオリゴを示す。次いで、２μＭのオリゴＨＤＲテンプレート、および１μｇのＴＡＬＥＮｍＲＮＡ、ｈＣａｓ９をコードする１μｇのそれぞれのプラスミドＤＮＡおよびｇＲＮＡ発現プラスミドのいずれか；またはｈＣａｓ９をコードする１μｇのｍＲＮＡおよび０．５μｇのｇＲＮＡ発現プラスミドにより形質移入されたブタ線維芽細胞を分け、３０または３７℃のいずれかにおいて３日間培養してから１０日目まで３７℃において拡張させた。パネルｂ）ＲＦＬＰおよびＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ結果を示すチャート。既に決定されたとおり、ＴＡＬＥＮ刺激ＨＤＲは３０℃において最も効率的であった一方、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲが３７℃において最も効率的であった。この遺伝子座について、ＴＡＬＥＮは、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイにより計測された類似ＤＮＡ切断頻度にかかわらずＨＤＲの刺激についてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系より効率的であった。ＴＡＬＥＮとは対照的に、ｈＣａｓ９をプラスミドに対してｍＲＮＡとして送達した場合にＨＤＲにほとんど差が存在しなかった。
【０１０９】
実施例９：Ｙ染色体の標的化
ＴＡＬＥＮおよびプラスミド相同性カセットの組合せを使用してｍＣａｇｇｓ−ＥＧＦＰカセットをＹ染色体に標的化した。この実験目的のため、陽性配向は、トランス遺伝子カセットの両方および内因性遺伝子（ＳＲＹまたはＡＭＥＬＹ）が同一配向である場合であり、陰性配向は、それらを逆の配向である場合である。１マイクログラムのＴＡＬＥＮｍＲＮＡと５００ｎｇの相同性カセットを、単一の１００ｕｌのエレクトロポレーションで６００，０００個の細胞と混合した。ＮＥＯＮエレクトロポレーション系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して細胞を形質移入し、３０℃において３日間培養し、単一細胞由来コロニーの誘導のために低密度においてプレーティングした。相同性アームの外側の１つプライマーおよびトランス遺伝子カセット内の第２のプライマーを使用するジャンクションＰＣＲによりＹ染色体の正確な標的化についてコロニーを分析した。いくつかのコロニーを予測アンプリコンについて陽性であった。図８は、図７に示される結果のまとめである。Ｙ標的化について陽性のクローンは、６〜２４パーセントに及んだ。トランス遺伝子カセットの配向は、Ｙ標的化の効率に対するいくらかの効果を有すると考えられた。
【０１１０】
実施例１０：Ｙ染色体の短鎖相同性標的化
プラスミド相同性カセットの代替法として、ＡＭＥＬＹおよびＳＲＹ部位を標的化するように短鎖（５０〜１００ｂｐ）相同性アームを有する直鎖テンプレートを開発した。相同性テンプレートは、カセットの５’および３’末端に結合したプライマーを使用するユビキチンＥＧＦＰカセットのＰＣＲ増幅により作出し、Ｏｒｌａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０（ＮＡＲ；２０１０  Ａｕｇ；３８（１５））に記載のとおり、想定ＴＡＬＥＮ誘導二本鎖分解の配列５’および３’に対応するテールを含んだ。プライマーは、内因性ヌクレアーゼによる分解を阻害するための第１の２つのヌクレオチド間のホスポルチオエート（ｐｈｏｓｐｏｒｔｈｉｏａｔｅ）結合を含んだ。２マイクログラムのＴＡＬＥＮｍＲＮＡ（または対照としての不使用）およびそれぞれの部位に特異的な１ｕｇの短鎖相同性テンプレートを、典型的な１００ｕｌのエレクトロポレーションに含めた。エレクトロポレーション後、細胞を３０または３３℃のいずれかにおける３日間の培養のために分割し、次いでジャンクションＰＣＲによりＹ標的化について試験した。３０または３３℃において培養された細胞は、Ｙ標的化が３０℃においてより効率的であることを産物強度が示唆するにもかかわらず、５’および３’ジャンクションの両方におけるＹ標的化について陽性であった。それぞれの部位について、正確なＹ標的化に対応するアンプリコンは、ＴＡＬＥＮに依存的であり、ＳＲＹ３’ジャンクション上段バンドが非特異的バックグラウンドシグナルであることに留意されたい。形質移入後１４日間培養された細胞集団は、非統合テンプレートをもはや発現しないはずである。ＥＧＦＰについてのＦＡＣｓを１４日目の集団に実施しＴＡＬＥＮと短鎖相同性テンプレートの組合せがテンプレート単独に対してＥＧＦＰ陽性細胞の比率を増加させるか否かを決定した。実際、ＥＧＦＰ陽性細胞は、ＴＡＬＥＮを含めた場合に約３倍濃縮されており、温度の効果はほとんど観察されなかった（図１０）。個々のＥＧＦＰ陽性コロニーを、Ｙ標的化についてゲノタイピングした。ＡＭＥＬＹについては、ＥＧＦＰ陽性コロニーの０／５（０％）および２／５（２０％）が３０または３３℃においてそれぞれ最初に培養された細胞からのＹ標的化についても陽性であった（図１１）。ＳＲＹについては、ＥＧＦＰ陽性コロニーの５／２４（２１％）および０／９（０％）が３０または３３℃においてそれぞれ最初に培養された細胞からのＹ標的化についても陽性であった（図１１）。
【０１１１】
実施例１１
マウスとの比較データに基づき本出願人らのチームにより全て最初にクローン化されたブタＡＣＥ、ＣＫ−１５またはＳＰ１０プロモーターのいずれかの方向で推定シス制限トランス遺伝子を担持するように一連の３つのＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンを作出した。マウスをＣａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１に記載のとおりＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンの前核注入により生産した（図１２）。続いて、トランスジェニックマウスをＦ０またはＦ１で最初にｑＲＴ−ＰＣＲにより精巣中のＥＧＦＰトランス遺伝子について分析した（図１３）。有意な発現はＡＣＥでもＣＫ−１５トランス遺伝子でも観察されなかった一方、ＳＰ１０プロモーターを有するＦ０およびＦ１マウスにおいて有意な発現が存在した。この結果は、予測されなかった。これは、オルソロガスネズミＡＣＥおよびＣＫ−１５プロモーターは、マウス精原細胞中で確実に発現するためである（Ｌａｎｇｆｏｒｄ，ＫＧ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ａｌｂａｎｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。精巣中のＥＧＦＰ発現の局在化は、免疫組織化学（ＩＨＣ）検出により分析した。シグナルは、精細管の領域中で濃縮され、このことは精子形成の通常の進行に合致した（図１４）。最後に、精巣上体精子をＥＧＦＰの発現についてＩＨＣにより分析した。ｑＰＣＲの結果と一致して、シグナルがＳＰ１０ファウンダーからの精子中でのみ検出された。ファウンダーＳＰ１０〜１１が複数のコピーのシスＸトランス遺伝子を有することが観察され、高いＦ１伝達頻度により示される。
【０１１２】
免疫組織化学
精巣試料調製。安楽死雄マウスから回収された精巣組織を縦側で１回両断して長さ約４０μｍ×直径４０μｍの二等分のものを形成した。組織をＰＢＳ、ｐＨ７．２中４％のＰＦＡ／１０％のスクロース中で一晩配置し、−７０℃においてＯＣＴ化合物中で包埋した。包埋組織をそれ以降−８０℃において貯蔵した。冷凍切片を６μｍにおいて切断し、帯電スライド上で少なくとも３０分間空気乾燥させ、冷温アセトン中で５分間、後固定（ｐｏｓｔ−ｆｉｘ）した。
【０１１３】
染色。圧力調理器法を使用してスライドを抗原回復のためにクエン酸緩衝液、ｐＨ６．１（Ｄａｋｏ）中で処理した。スライドをＰＢＳ中０．１２５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００中で５分間透過化し、ＰＢＳ中で５分間１回洗浄してから、ブロッキング緩衝液［ＰＢＳ中２．５％のヤギ血清（ＤＧＳ）、２．５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）］中で５０分間浸漬した。スライドをＰＢＳ中で５分間１回洗浄し、それぞれ１．２５％のＤＧＳおよびＦＢＳを有するＰＢＳ中で１：２００に希釈した２００μｌの一次抗体、ポリクローナルウサギ抗ＧＦＰ（Ａｂｃａｍ  ａｂ２９０）を添加した。陰性（二次）対照として機能するスライドは、２００μｌのブロッキング緩衝液を受容した。スライドを加湿チャンバ中で４℃において一晩インキュベートした。スライドをＰＢＳ中で洗浄し（５回交換、それぞれ５分間）、４μｇ／ｍｌにおいてＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にコンジュゲートしている２００μｌの二次抗体、ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２を添加した。スライドを室温において暗所で１時間インキュベートした。スライドをＰＢＳ中で洗浄し（５回交換、それぞれ５分間）、ＤＡＰＩを含有する水性マウンティング培地中でマウントし、顕微鏡観察法に記載のとおり試験した。
【０１１４】
精子試料調製。精子のアリコートを安楽死雄マウスの精子上体から、標準的な精子冷凍保存培地中に回収し、−８０℃において保存した。２０マイクロリットルのそれぞれの試料を１ｍｌのＰＢＳ中で洗浄した（８００×ｇ、１０分間）。精子を２００μｌのＰＢＳ中で再懸濁させた。１２ｍｍポリ−Ｄ−リジンコートカバースリップ（ＢＤ  ＢＩＯＣＯＡＴ／Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、２４ウェルプレートのウェル中に配置した。５０μｌの再懸濁させた精子をそれぞれのカバースリップ上に広げた。カバースリップを３７℃において乾燥（ｄｒｙ  ｄｏｗｎ）させ、１００％のメタノール中で３５秒間固定した。カバースリップを乾燥させておき、−２０℃において貯蔵した。
【０１１５】
染色。カバースリップに固定された精子試料をＰＢＳ中０．１％のＴＲＩＴＯＮ−Ｘ１００中で４０分間さらに透過化し、それぞれ２．５％のＤＧＳおよびＦＢＳを含有するＰＢＳ中で１時間ブロッキングした。カバースリップを１ｍｌのＰＢＳ中で５分間１回洗浄し、それぞれ１．２５％のＤＧＳおよびＦＢＳを有するＰＢＳ中で１：２００に希釈した２００μｌの一次抗体、ポリクローナルウサギ抗ＧＦＰ（Ａｂｃａｍ，ａｂ２９０）をそれぞれのウェルに添加した。陰性（二次）対照として機能するカバースリップは、２００μｌのブロッキング緩衝液を受容した。２４ウェルプレート中に含有されたカバースリップを、４℃において一晩インキュベートした。カバースリップをＰＢＳ中で洗浄し（５回交換、それぞれ５分間）、４μｇ／ｍｌにおいてＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にコンジュゲートしている２００μｌの二次抗体、ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２をそれぞれのウェルに添加した。スライドを暗所で室温において１時間インキュベートした。スライドをＰＢＳ中で洗浄した（５回交換、それぞれ５分間）。カバースリップを慎重にウェルから取り出し、ＤＡＰＩを含有する１０μｌの水性マウンティング培地を使用してスライド上にマウントし、顕微鏡観察法に記載のとおり試験した。
【０１１６】
顕微鏡観察法。Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  ＣＯＯＬＳＮＡＰ  ＭＹＯモノクロカメラおよびＨＰコンピュータにインストールされたＮｉｋｏｎ  ＥＬＥＭＥＮＴＳ  ＡＲソフトウェア（６４ビット）を使用して透過光、ＤＩＣ、落射蛍光、落射偏光、およびハイパースペクトルモードで画像化するように構成されたモータ駆動ステージを備えたＮｉｋｏｎ  Ｅ８００正立顕微鏡上で、精巣および精子試料を含有するスライドを試験した。Ｘ−Ｃｉｔｅ１２０ＬＥＤランプ源により照射された蛍光シグナルを、Ｕ／Ｂ／Ｇ（ＤＡＰＩ／ＦＩＴＣ／Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄの三重）狭帯域キューブを介して得た。Ｎｉｋｏｎ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ＡＲソフトウェアを使用して同一曝露時間（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄについて１６秒間／ＤＡＰＩについて３０秒間）において２０倍対物レンズを使用してそれぞれの試料について組織切片画像（図１３）を回収した一方、４０倍対物レンズおよびそれぞれのチャネルにおける２０秒間の曝露時間を使用して精子画像（図１４）を回収した。
【０１１７】
定量的ＰＣＲ
精巣試料調製。安楽死雄マウスから回収された精巣組織を縦側で１回両断して長さ約４０μｍ×直径４０μｍの二等分のものを形成した。１つの精巣の２分の１をＲＮＡＬＡＴＥＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に配置し、−８０℃において貯蔵した。
【０１１８】
ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ生成。精巣試料をＲＮＡｌａｔｅｒから取り出し、製造業者の指示書（Ｑｉａｇｅｎ，ＲＮＥＡＳＹ）に従ってβ−メルカプトエタノールを含有するＲＬＴ緩衝液中でポリトロン装置を使用して破壊した。トータルＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙキットを使用して精製した。プライマーとしてのオリゴｄＴおよびランダムヘキソマーの専売混合物を取り込む２ステップｃＤＮＡキット（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して１マイクログラムのトータルＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。
【０１１９】
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）。レポーターとしてＳＹＢＲグリーンを使用するｑＰＣＲにおけるテンプレートとして等量のｃＤＮＡを使用した。反応は、ＥＧＦＰおよび正規化のための精原幹細胞のマーカーのインテグリンアルファ６（Ｉｔｇａ６）に対するプライマーを使用してＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸ  Ｃｏｎｎｅｃｔ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ上で実行した。
【０１２０】
配列
シス−Ｘカセット−ＥＧＦＰに下線を付し、ＥＧＦＰの前後の配列は、Ｓｍｏｋ１５および３’ＵＴＲである。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【０１２１】
本明細書に記載の全ての刊行物、特許出願、および特許は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれ、矛盾する場合、本明細書が優先する。
【０１２２】
さらなる開示
実施形態は、例えば、以下を含む：
１．精細胞により発現される外因性配列を含むＸ染色体またはＹ染色体を含む遺伝子改変精細胞。配列は、シス制限、例えば、シス制限トランス遺伝子であり得る。実施形態は、実施例１１に記載のものを含む。２．前記Ｘ染色体を含む、１の精細胞。３．前記Ｙ染色体を含む、１の精細胞。４．前記外因性配列が、静電選別剤をコードする、１〜３のいずれかの精細胞。５．前記外因性配列が、可視化剤をコードする、１〜３のいずれかの精細胞。６．前記可視化剤が、蛍光マーカー、色素、ＤＮＡインターカレート蛍光色素、カルシウム活性化色素、および放射線不透過剤からなる群から選択される、０の精細胞。７．前記外因性配列が、毒性分子をコードする、１〜３のいずれかの精細胞。８．前記毒性分子が、毒素、ヌクレアーゼ、アポトーシス因子、および致死ドミナントネガティブからなる群から選択される、０の精細胞。９．前記毒性分子が、毒素遺伝子、ベルナーゼ、ジフテリア毒素Ａ、チミジンキナーゼ、およびリシン毒素からなる群から選択される毒素または毒性遺伝子産物である、０の精細胞。１０．前記外因性配列が、毒素に対する解毒剤をコードする、１〜３のいずれかの精細胞。１１．前記解毒剤／毒素の組合せが、ベルナーゼ／バルスター（Ｂａｒｓｔａｒ）を含む、０の精細胞。１２．前記外因性配列が、抗原に結合する抗体の少なくとも一部をコードする、１〜３のいずれかの精細胞。１３．前記外因性配列が、外因性エピトープをコードする、１〜３のいずれかの精細胞。１４．前記外因性配列が、ビオチン、アビジン、またはポリＨｉｓをコードする、１〜３のいずれかの精細胞。１５．前記外因性配列が、精子運動性を効率的に損傷させる、１〜３のいずれかの精細胞。１６．前記外因性配列が、融合タンパク質の一部である、１〜１３のいずれかの精細胞。１７．前記融合タンパク質が、外因性配列および精子の細胞膜（精細胞外部の細胞膜を指す）に局在化するためのタンパク質をコードする配列の融合物である、０の精細胞。１８．前記融合タンパク質が、前記外因性配列および頭部、中片、尾部、鞭毛、終末部、主部、および頸部からなる群から選択される精子の一部に選択的に局在化するタンパク質をコードする配列の融合物である、０の精細胞。１９．前記外因性配列が、前記精細胞外部上で発現される、１〜０のいずれかの精細胞。２０．前記外因性配列が、前記精細胞内部中で発現される、１〜０のいずれかの精細胞。２１．請求項１〜０のいずれかの精細胞を生産する遺伝子改変動物。２２．１〜０のいずれかの精細胞を発現する、０の動物の子孫。２３．０または０の動物から生産された精子。２４．１〜０のいずれかの動物を作出することを含む、精子を選別する方法。２５．少なくとも１つの生物発現マーカーの存在または不存在に基づき、Ｙ染色体を含む精子からＸ染色体を含む精子を分離することを含む、精子を選別する方法。２６．前記精子を生産するファウンダー動物を作出することをさらに含む、０の方法。２７．前記生物発現マーカーが、蛍光マーカー、色素、ＤＮＡインターカレート蛍光色素、カルシウム活性化色素、および放射線不透過剤、可視光波長の色、蛍光波長の色、蛍光、放射線不透過性、外因性エピトープ、結合リガンド、ならびに抗体の少なくとも一部からなる群から選択される、０の方法。２８．前記マーカーを有する精子を可視化することを含む、０または０の方法。２９．ＦＡＣ−ＳＯＲＴまたは精子選択装置の使用を含む、０または０の方法。３０．前記生物発現マーカーを、前記マーカーに特異的に結合するリガンドと結合させることを含む、０または０の方法。３１．前記生物発現マーカーを、前記マーカーに特異的に結合するリガンドを含む固体表面と結合させること、または前記発現マーカーに特異的に結合する複数のリガンドを発現する架橋剤を介して複数の精子を互いに結合させることを含む、０または０の方法。３２．前記分離が、精子運動性に基づく、０の方法。３３．前記分離が、生存／死亡アッセイを含む、０の方法。３４．前記マーカーが、毒性物質および解毒剤からなる群から選択される、０の方法。３５．マーカーを発現するＸ染色体を含む精子、またはマーカーを発現するＹ染色体を含む精子、または第１のマーカーを発現するＸ染色体を含む精子と第２のマーカーを発現するＹ染色体を含む精子との混合物；および前記マーカーに選択的に結合する結合部分、例えば、前記マーカーについての特異的結合を有するリガンドまたは実質的に前記マーカーにのみ結合し、他の精子には結合しない物質を含む精子選別のための系。３６．前記結合部分が、固体表面またはポリマーに固定化されている、０の系。３７．前記結合部分が、前記リガンドにより結合される精細胞を損傷させる毒性物質に付着している、０の系。３８．前記結合部分が、アビジン、ビオチン、前記マーカーに結合する抗体の少なくとも一部、前記マーカーに特異的に結合するペプチド、アプタマー、および前記マーカーに特異的に結合する核酸からなる群から選択されるリガンドである、０の系。３９．前記マーカーが、陰性選択のためのものである、０の系。あるいは、前記マーカーは、陽性選択のためのものである。４０．マーカーを発現するＸ染色体を含む精子、またはマーカーを発現するＹ染色体を含む精子、または第１のマーカーを発現するＸ染色体を含む精子と第２のマーカーを発現するＹ染色体を含む精子との混合物を含む精子選別のための系であって、前記マーカーが可視化による分離を提供する系。４１．Ｘ染色体またはＹ染色体上の外因性遺伝子を含む遺伝子改変家畜動物であって、前記遺伝子が、前記動物中の精子中でマーカーを発現する動物。４２．前記外因性遺伝子が、配偶子形成において選択的に活性化される遺伝子発現エレメントの制御下にある、４０または４１の動物。４３．前記外因性遺伝子が、誘導性プロモーターの制御下にある、０の動物。４４．前記染色体が、Ｙ染色体である、０または０の動物。４５．前記染色体が、Ｘ染色体である、０または０の動物。４６．前記遺伝子発現エレメントが、サイクリンＡ１プロモーター、Ｓｔｒａ８、ＳＰ−１０プロモーター、Ｓｔｒａ８プロモーター、Ｃ−Ｋｉｔ、ＡＣＥ、およびプロタミンからなる群から選択されるプロモーターを含む、０〜０の動物。４７．前記外因性遺伝子が、前記因子およびマイクロＲＮＡの融合物をコードする、０〜０の動物。４８．それぞれの精子中の性染色体の性を示すように標識された精子を有する動物。４９．前記性染色体が、Ｘであり、前記Ｘ染色体が、前記マーカーを担持する、０の動物。５０．前記性染色体が、Ｙであり、前記Ｙ染色体が、前記マーカーを担持する、０の動物。５１．１〜５０のいずれかの使用。１〜５０のいずれかを作製するためのキット。
【０１２３】
【表１】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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