(57)【要約】  プロテアーゼを含む、ＮＥＴｏｓｉｓに関連する疾患のためのタンパク質バイオマーカーが本明細書において提供される。このようなプロテアーゼの基質配列およびその使用も提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
好中球細胞死を形成する細胞外トラップであるＮＥＴｏｓｉｓに関連する炎症状態を有する被検体を特定するための方法であって、
（ａ）ＮＥＴに関連するプロテアーゼ含有物についての情報を前記被検体からのサンプルから得ることと；
（ｂ）ＮＥＴに関連するプロテアーゼ含有物のレベルと、健康な被検体からの匹敵するサンプルのものとを比較することと、
（ｃ）前記サンプルの前記ＮＥＴに関連するプロテアーゼ含有物が、前記健康な被検体からの前記匹敵するサンプルのものより大きい場合、前記被検体がＮＥＴｏｓｉｓに関連する炎症状態を有することを特定することとを含む方法。
【請求項２】
前記サンプルが血液サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロテアーゼが、好中球エラスターゼ（ＮＥ）、カテプシンＧ（ＣＧ）、プロテイナーゼ３（ＰＲ３）および好中球が分泌するタンパク質４（ＮＳＰ４）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＮＥＴｏｓｉｓに関連する炎症状態を処置することをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記炎症状態が、感染、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、嚢胞性線維症、深部静脈血栓、子癇前症、歯周炎、虫垂炎、結核およびクローン病からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
処置することは、プロテアーゼ阻害剤を前記被検体に投与することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記プロテアーゼ阻害剤は、図４〜９に示された配列を含むペプチド基質の開裂を阻害する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
処置することは、ステロイドまたは非ステロイド系抗炎症薬を前記被検体に投与することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
処置することは、抗生物質を前記被検体に投与することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
情報を得ることは、前記被検体からのサンプルを得ることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
情報を得ることは、プロテアーゼ含有物評価を前記サンプルに行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記プロテアーゼ含有物評価は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、質量分析、クロマトグラフィー、電気泳動、ラジオイムノアッセイ、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、またはウエスタンブロッティングによって決定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルと前記匹敵するサンプルとの間の前記プロテアーゼ含有物の差は、＋１０％、＋２０％、＋２５％、＋３０％、＋４０％、＋５０％、＋７５％または＋１００％である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記被検体がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記被検体が非ヒト哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権の主張）
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／７９９，６５８号明細書に対する優先権の利益を主張し、その内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本出願は、好中球細胞外トラップ（（１または複数の）ＮＥＴとも呼ばれる）に関する。
【背景技術】
【０００３】
好中球は、血漿中に最も多く存在する白血球である。好中球は、病原体侵入に応答して傷害部位に動員される最初の細胞であり、好中球は、自然免疫防御の最初のラインで作用する。好中球は、細胞内食作用によって機能し溶菌プロテアーゼ、反応性酸素種（ＲＯＳ）および殺菌性タンパク質を感染因子の攻撃のために使用する炎症性応答および急性免疫のためのエフェクター細胞と伝統的に考えられていた。最近の研究は、好中球が、他の免疫細胞、例えば、樹状細胞、Ｂ細胞およびＴ細胞を用いたシグナル伝達のためにサイトカイン、ケモカイン、Ｆｃ受容体および補体成分を発現することによって免疫調節能も有することを示している（Ｍａｎｔｏｖａｎｉ、Ｃａｓｓａｔｅｌｌａら、２０１１）。
【０００４】
プロテアーゼは、好中球の重要なエフェクターである。プロテアーゼは、直接的に殺菌活性に寄与するだけではなく、ケモカイン、サイトカインおよび受容体のタンパク質分解プロセシングにおいて機能する（Ｐｈａｍ  ２００６；Ｍｅｙｅｒ−ＨｏｆｆｅｒｔおよびＷｉｅｄｏｗ  ２０１０）。この調整活性は、ＮＥ、ＰＲ３およびＣＧによるＩＬ−１βおよびＩＬ−１８のカスパーゼ非依存性活性化（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｙｏｕｎｇら、２００６；Ｇｕｍａ、Ｒｏｎａｃｈｅｒら、２００９；Ｊｏｏｓｔｅｎ、Ｎｅｔｅａら、２００９）、またはＮＥおよびＰＲ３による抗炎症性プログラニュリンから炎症誘発性グラニュリンへの変換（Ｋｅｎｓｓｅｎｂｒｏｃｋ、２００８）によって例示される。また、ＮＥは、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）上の組織因子経路阻害剤を開裂することによって、好中球が媒介する炎症と凝固経路とを結びつけることが示されている。
【０００５】
ＮＥＴは、ＮＥＴｏｓｉｓと呼ばれる特定の細胞死の形態において、刺激された好中球によって放出される。ＮＥＴｏｓｉｓは、病原体侵入に対する応答して、好中球が媒介する自然免疫の新しい機構を表すという仮説がある（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ、Ｒｅｉｃｈａｒｄら、２００４；Ｒｅｍｉｊｓｅｎ、Ｋｕｉｊｐｅｒｓら、２０１１）。ＮＥＴｏｓｉｓは、脱凝縮されたクロマチンおよび抗菌性タンパク質およびペプチドから作られるネットワークであるＮＥＴの形成を特徴とする。自然免疫防御の最初のラインで作用するＮＥＴｏｓｉｓは、多くの態様においてアポトーシスおよび壊死とは異なる細胞死の新しい典型を表す。核断片化または膜小胞形成は観察されず、活性化は、カスパーゼ活性化とは独立しているが、ＮＡＤＰＨオキシダーゼおよびＭＡＰＫキナーゼ経路を必要とする。ＮＥＴｏｓｉｓは、ＮＥ、ミエロペルオキシダーゼ、ならびにヒストンシトルリン化およびクロマチン脱凝集に関与する酵素であるペプチジルアルギニンデイミナーゼ４の活性化にも関与する（Ｗａｎｇ、Ｌｉら、２００９；Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ、Ｍｅｔｚｌｅｒら、２０１０）。ＮＥＴの主な機能は、病原体を捕捉し死滅させることであるという仮説がある。それに加え、主な機能は、その後に起こる自然免疫応答および獲得免疫応答のためのエフェクターおよびメディエーターの高い局所濃度のためのマトリックスも提供する。ＮＥＴ成分の以前のプロテオミクス研究は、３つの主要なプロテアーゼ、すなわち、好中球ＮＥ、ＣＧおよびＰＲ３を特定した（Ｕｒｂａｎ、Ｅｒｍｅｒｔら、２００９）。
【０００６】
ＮＥＴに関連するタンパク質分解活性を不偏の様式で特性決定するために、ＮＥＴに捕捉されたタンパク質が放出され、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｂｙ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＭＳＰ−ＭＳ）方法でアッセイされた（Ｏ’Ｄｏｎｏｇｈｕｅら、２０１２）。この方法は、開裂部位の検出のためのタンデム型液体クロマトグラフィー−質量分析での多重アッセイにおいて、高度に多様化した１２４のペプチドのライブラリを利用する。ＭＳＰ−ＭＳアッセイを使用して、複雑なＮＥＴｏｓｉｓサンプル中の各酵素の寄与は、精製されたヒト好中球プロテアーゼからの基質特異性プロフィールと比較することによってデコンボリューションされた。それに加え、ＮＥ、ＣＧ、ＰＲ３およびＮＳＰ４の非プライマー側の基質特異性は、テトラペプチド蛍光基質ライブラリを使用して調査された。本発明者らが知る限りでは、本発明者ＮＥ、ＰＲ３、ＣＧおよびＮＳＰ４の広範囲の基質特異性を同一の条件で並行して比較する最初の完全な研究がここに報告されている。３人の独立した健康なドナーからのＮＥＴに関連するプロテアーゼ混合物の分析によって、主要な活性は、ＮＥに起因し得る。ＮＥ活性の免疫枯渇は、ＰＲ３からの活性に寄与し、より少ない程度でＣＧからの活性に寄与し、わずかなＮＳＰ４活性に寄与することを明らかに示した。基質特異性、およびＮＥＴに関連する全体的な活性へのＮＥＴに関連する各プロテアーゼの寄与を特定することによって、急性および慢性の免疫疾患における病的ＮＥＴｏｓｉｓのための改良された治療介入を開発することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍａｎｔｏｖａｎｉ、Ｃａｓｓａｔｅｌｌａら、２０１１
【非特許文献２】Ｐｈａｍ  ２００６；Ｍｅｙｅｒ−ＨｏｆｆｅｒｔおよびＷｉｅｄｏｗ  ２０１０
【非特許文献３】Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｙｏｕｎｇら、２００６
【非特許文献４】Ｇｕｍａ、Ｒｏｎａｃｈｅｒら、２００９
【非特許文献５】Ｊｏｏｓｔｅｎ、Ｎｅｔｅａら、２００９
【非特許文献６】Ｋｅｎｓｓｅｎｂｒｏｃｋ、２００８
【非特許文献７】Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ、Ｒｅｉｃｈａｒｄら、２００４
【非特許文献８】Ｒｅｍｉｊｓｅｎ、Ｋｕｉｊｐｅｒｓら、２０１１
【非特許文献９】Ｗａｎｇ、Ｌｉら、２００９
【非特許文献１０】Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ、Ｍｅｔｚｌｅｒら、２０１０
【非特許文献１１】Ｕｒｂａｎ、Ｅｒｍｅｒｔら、２００９
【非特許文献１２】Ｏ’Ｄｏｎｏｇｈｕｅら、２０１２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ＮＥＴｏｓｉｓに関連する疾患のためのタンパク質バイオマーカーが本明細書において提供される。ある実施形態では、このようなバイオマーカーは、例えば、好中球エラスターゼ（ＮＥ）、カテプシンＧ（ＣＧ）、プロテイナーゼ３（ＰＲ３）および好中球が分泌するタンパク質４（ＮＳＰ４）を含むプロテアーゼである。
【０００９】
好中球エラスターゼ（ＮＥ）、カテプシンＧ（ＣＧ）、プロテイナーゼ３（ＰＲ３）および好中球が分泌するタンパク質４（ＮＳＰ４）が認識および／または開裂する基質配列も提供される。
【００１０】
ある実施形態では、基質配列は、このようなプロテアーゼのプローブまたは阻害剤を開発するために使用できる。さらに、このような基質配列は、開裂がＮＥＴｏｓｉｓに関連する疾患において望ましいポリペプチド中の開裂部位を開発するために使用できる。
【００１１】
よって、好中球細胞死を形成する細胞外トラップであるＮＥＴｏｓｉｓに関連する炎症状態を有する被検体を特定するための方法であって、（ａ）ＮＥＴに関連するプロテアーゼ含有物についての情報を被検体からのサンプルから得ることと；（ｂ）ＮＥＴに関連するプロテアーゼ含有物のレベルと、健康な被検体からの匹敵するサンプルのものとを比較することと、（ｃ）サンプルのＮＥＴに関連するプロテアーゼ含有物が、健康な被検体からの匹敵するサンプルのものより大きい場合、被検体がＮＥＴｏｓｉｓに関連する炎症状態を有することを特定することとを含む方法が提供される。
【００１２】
サンプルは、血液サンプルであってもよい。プロテアーゼは、好中球エラスターゼ（ＮＥ）、カテプシンＧ（ＣＧ）、プロテイナーゼ３（ＰＲ３）および好中球が分泌するタンパク質４（ＮＳＰ４）からなる群から選択されてもよい。方法は、ＮＥＴｏｓｉｓに関連する炎症状態、例えば、感染、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、嚢胞性線維症、深部静脈血栓、子癇前症、歯周炎、虫垂炎、結核およびクローン病を処置することをさらに含んでもよい。処置することは、プロテアーゼ阻害剤を被検体に投与することを含んでもよい。プロテアーゼ阻害剤は、図４〜９に示された配列を含むペプチド基質の開裂を阻害してもよい。処置することは、ステロイドもしくは非ステロイド系抗炎症薬、または抗生物質を被検体に投与することも含んでもよい。被検体は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物であってもよい。
【００１３】
方法は、情報を得ることも含んでもよく、情報を得ることは、例えば、プロテアーゼ含有物評価をサンプルに行うことによって、被検体からのサンプルを得ることを含む。評価は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、質量分析、クロマトグラフィー、電気泳動、ラジオイムノアッセイ、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、またはウエスタンブロッティングによるものであってもよい。サンプルと匹敵するサンプルとの間のプロテアーゼ含有物の差は、＋１０％、＋２０％、＋２５％、＋３０％、＋４０％、＋５０％、＋７５％または＋１００％である。
【００１４】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に提示された特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面のうちの１つまたは複数を参照することによってよりよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】好中球セリンプロテアーゼ（上段の列：カテプシンＧ（１００ｎＭ）、中段の列：プロテイナーゼ３（５０ｎＭ）、下段の列：エラスターゼ（５０ｎＭ））の非プライマー側の特異性の比較を示すグラフである。
【図２】好中球セリンプロテアーゼの広範囲の基質特異性の比較を示す図である。
【図３】エラスターゼ（ＥＬＡ）、プロテイナーゼ３（ＰＲ３）およびカテプシンＧ（ＣＧ）の開裂を同時に監視するための蛍光基質の特定、ならびにドナーの好中球中の全タンパク質分解を決定するためのこの基質の使用を示す図である。
【図４】ＮＥＴのタンパク質分解プロフィールおよび主要な活性の免疫枯渇の比較を示す図である。
【図５】エラスターゼ開裂部位、ならびにエラスターゼがカテプシンＧおよびプロテイナーゼ３と共有する開裂部位を示す図である。
【図６】プロテイナーゼ３開裂部位、ならびにプロテイナーゼ３がエラスターゼおよびカテプシンＧと共有する開裂部位を示す図である。
【図７】カテプシンＧ開裂部位、ならびにカテプシンＧがエラスターゼおよびプロテイナーゼ３と共有する開裂部位を示す図である。
【図８】ＮＥＴｏｓｉｓドナーからのプロテアーゼ開裂部位を示す図である。
【図９】エラスターゼ、プロテイナーゼ３、カテプシンＧ、好中球が分泌するタンパク質４の開裂部位、およびＮＥＴｏｓｉｓドナーからのプロテアーゼ開裂結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書に記載された任意の方法または組成物は、本明細書に記載された任意の他の方法または組成物に対して実施できることが企図される。本発明のこれらの実施形態および他の実施形態は、以下の説明および添付の図面と組み合わせて考慮される場合、よりよく認識および理解されよう。しかし、以下の説明は、本発明の種々の実施形態および多くの特定のそれらの詳細を示しているが、例示として与えられ、限定するものではないことを理解されたい。多くの置換、改変、付加および／または再編成が、本発明の精神から逸脱することなく本発明の範囲内でなされてもよく、本発明は、このようなすべての置換、改変、付加および／または再編成を含む。
【００１７】
本開示は、記載された特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物の種または属、構築物および試薬に限定されず、そのため異なってもよいことを理解されたい。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明する目的のみであり、本開示の範囲を限定することを意図しておらず、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されたい。
【００１８】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」といった単数形は、内容が特に明確に示さない限り、複数形の言及を含むことに留意されたい。よって、例えば、「１つのプロテアーゼ（ａ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）」の言及は、１つ以上のプロテアーゼの言及であり、当業者に公知のその均等物などを含む。
【００１９】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、提供された単位値の±１０％を指す。本明細書で使用される場合、用語「実質的に」は、目的の特徴または特性の全体またはおおよその程度を示す定性的な状態を指す。生物学的および化学的な組成物および材料の試験、製造および貯蔵に影響を与える多くの変数のため、かつ生物学的および化学的な組成物および材料の試験、製造および貯蔵において使用される設備および装置における固有の誤差のため、生物学的現象および化学的現象は、存在すれば、絶対的な結果を達成するまたは避けることはまれであることが生物学の当業者には理解されよう。したがって、実質的という用語は、多くの生物学的現象および化学的現象における固有の完全さの潜在的欠如をとらえるために本明細書において使用される。
【００２０】
特に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと同様または均等の任意の方法、デバイスおよび材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法、デバイスおよび材料をここに記載する。
【００２１】
本明細書に述べられたすべての刊行物および特許は、例えば、本実施形態に関して使用し得る刊行物に記載の構築物および方法論を記載および開示するために、参照によって本明細書に組み込まれている。上記の刊行物および本文全体に記載された刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示を単に与えている。従来発明という観点で、本発明より、このような開示の日付が前であるという権利を有することを認めるものではないと解釈すべきである。
【００２２】
セリンプロテアーゼは、好中球が媒介する免疫の重要なエフェクターであり、好中球が媒介する免疫は自然免疫応答の最前線で機能する。好中球セリンプロテアーゼは、毒性の病原性因子を分解することによって直接的に機能し、サイトカイン、ケモカインおよび受容体を含むそれらの基質のプロセシングを介して間接的に機能する。プロテアーゼは、好中球細胞死の新しい形態であるＮＥＴｏｓｉｓにおける重要なエフェクターであるとも予想される。ＮＥＴｏｓｉｓは、侵入する病原体を捕捉し死滅させるために好中球によって利用される細胞外防御機構であるという仮説がある。これらの好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）は、細胞外ＤＮＡのウェブに埋め込まれた抗菌性分子の宿主からなる。
【００２３】
ここで、不偏のペプチドライブラリを図５〜９に示されている基質として使用するＮＥＴに関連するプロテアーゼの全体的なプロファイリングが報告される。これらのペプチド系アッセイでは、好中球エラスターゼ（ＮＥ）、カテプシンＧ（ＣＧ）、プロテイナーゼ３（ＰＲ３）および好中球が分泌するタンパク質４（ＮＳＰ４）は、重複する異なるエンドペプチダーゼ活性を有し、同じペプチド基質の中の固有の部位で開裂されることが多かった。ＮＥＴにおける優性なタンパク質分解活性は、ＮＥに起因したが、ＣＧ活性およびＰＲ３活性に対応する開裂部位は明らかであった。ＮＥが免疫枯渇された場合、残りの活性は、ＣＧに起因し、より少ない程度でＰＲ３およびＮＳＰ４に起因した。よって、ＮＥ活性を遮断することは、ＮＥＴに関連する主なプロテアーゼ活性を抑止し得る。それに加え、新しく特定された基質特異性署名は、ＮＥＴに関連するプロテアーゼを標的とするより特異的なプローブおよび阻害剤を設計するために使用できる。
【００２４】
２つの異なる相補的なペプチド系基質ライブラリ、つまり、ＰＳ−ＳＣＬおよびＭＳＰ−ＭＳを使用し、ＮＥ、ＰＲ３、ＣＧおよびＮＳＰ４の４つの好中球セリンプロテアーゼの基質特異性が決定された。Ｐ１位置での好ましいアミノ酸および好ましくないアミノ酸が、それぞれの方法と強く相関関係にあり、一方、ＮＥおよびＰＲ３が、複数の部位で強い相関関係を有することが観察された。ＣＧは、ＰＳ−ＳＣＬライブラリ対ＭＳＰ−ＭＳライブラリにはおおよそ１００倍大きな配列多様性があるが、ＰＳ−ＳＣＬ法によって不完全にプロファイリングされるプロテアーゼの一例である可能性がある。設計によって、ＣＧの活性は、Ｐ２’の占有を必要とする場合があり、または、Ｐ１’での蛍光ＡＣＣ基によって悪影響を受ける場合がある。
【００２５】
以前、ＰＩＣＳは、ＮＥ、ＣＧおよびＮＳＰ４の広範囲にわたる基質特異性プロフィールを作成するために利用されてきた（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ  ＆  Ｏｖｅｒａｌｌ  ２００８；Ｐｅｒｅｒａ  ２０１２）が、ＰＲ３の基質特異性プロフィールを作成するためには利用されていない。これらの研究では、プロテオーム由来のペプチドが基質ライブラリとして使用され、好中球セリンプロテアーゼによる開裂は、質量分析によって監視された。ＰＳ−ＳＣＬ方法について観察されたように、各酵素のＰ１基質プロフィールは、本発明者らのＭＳＰ−ＭＳデータとの非常に強い相関関係を示し、したがって、このクラスの酵素に対する基質選択性のほとんどがこのサブサイトで起こる可能性がある。それに加え、ＮＥおよびＣＧのＳ２’部位が、これらの部位が方法間で強く相関関係があるため、基質認識に重要であり得ると決定された。各好中球セリンプロテアーゼに対して選択的である蛍光基質が開発できる。これらの基質は、セルピンの反応性ループ由来の配列、結晶学的データまたは位置スキャニングから設計された（Ｐｏｌａｎｏｗｓｋａ、１９９８；Ｈａｊｊａｒ、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００６；Ｗｙｓｏｃｋａ  ２０１２）。これにより、特定された選択的な基質は、切断性結合のプライマー側および非プライマー側の両方でより大きな選択性を有する基質を開発するために利用できる。
【００２６】
ヒト血清から単離された新しい好中球はＰＭＡで処理されてＮＥＴｏｓｉｓを誘発し、その後、ＮＥＴに埋め込まれたタンパク質は、ヌクレアーゼでの処理の後、放出された。プロテオミクス分析は、ＮＥＴから放出されたタンパク質を特定するために使用され、タンパク質の多くは、以前の研究で観察されている（Ｕｒｂａｎ、Ｅｒｍｅｒｔら、２００９）。興味深いことに、ＮＥは、インタクトなＤＮＡに密に結合したままであり、ヌクレアーゼ処理なしのサンプルにおいて見出されなかった。ＣＧは、処理計画と独立してすべてのサンプルにおいて見出されたが、一方、ＰＲ３およびＮＳＰ４は、まったく観察されなかった。機能的なレベルで、上澄みにおけるタンパク質分解活性は、埋め込まれたＮＥＴタンパク質の放出の際に増加し、したがって、多重基質プロファイリングのための一連のヒト好中球調製物を提供した。
【００２７】
ＭＳＰ−ＭＳは、複雑な生体サンプルをプロファイリングするのに理想的な技術であり、なぜなら、ＰＳ−ＳＣＬ方法およびＰＩＣＳ方法とは異なり、基質集団は所定の一連のペプチドからなり、したがって、開裂部位は特定の酵素に直接的に結合させることができるためである。３つの独立したドナーサンプルにおいて開裂された基質のほとんどが同一であったため、サンプル調製およびプロテアーゼアッセイの両方の再現性は明らかであった。これにより、すべての共通の開裂部位について基質署名を作成することができた。この署名は、特にＰ４からＰ２’までのサブサイトでＮＥ署名と同様の特徴を有し、したがって、ＮＥは、好中球調製物において優勢なタンパク質分解活性である可能性があった。その後、この優勢さは、酵素の免疫沈降がＮＥに特異的な開裂部位の欠損および全体的な基質署名の改変を結果としてもたらしたとき、確認された。残った活性は、ＣＧの産物である可能性があり、より少ない程度でＰＲ３、ＮＳＰ４および他のまだ特定されていない好中球プロテアーゼの産物である可能性があった。
【００２８】
全体的な不偏の基質プロファイリングアッセイの利点は、すべてのプロテアーゼの活性が同時に監視できることである。それに加え、優勢なプロテアーゼは簡単に特定できる。この研究では、ＮＥＴ上のＮＥの標的化が、ＮＥＴｏｓｉｓに関連する調節されていないタンパク質分解のいかなる有害な影響も最小限にすることは明らかである。この研究で特定された好中球セリンプロテアーゼの選択的な開裂配列は、基質、阻害剤およびプロテアーゼによって活性化可能なプロドラッグの設計に有益になる（Ｃｈｏｉ  ２０１２；ＰＭＩＤ  ２２４０００６３）。それに加え、ＮＥＴに関連するプロテアーゼ活性の基質署名は、好中球ＮＥＴｏｓｉｓによって駆り立てられる炎症性疾患のためのバイオマーカーとして監視できる。
【００２９】
［実施例］
本明細書に記載された実施例および実施形態は、例示としてのものであり限定するものではないこと、ならびに特定の実施形態の精神および範囲から逸脱することなく特許請求の範囲に示されているように他の実施例が使用されてもよいことが当業者には明らかであろう。
【００３０】
［実施例１．材料および方法］
コンビナトリアル蛍光発生基質ライブラリを使用するタンパク質分解活性
切断性結合に対し、Ｎ末端配列としての非プライマー側の配列特異性は、プロテアーゼ命名法で名付けられ、コンビナトリアル蛍光発生基質ライブラリを使用して、プロテアーゼについてアッセイされた（Ｈａｒｒｉｓ、２０００）。この蛍光ペプチドライブラリは、精製されたセリンプロテアーゼの詳細なプロファイリングに好適であり、密接に関係する酵素におけるサブサイト好ましさを区別する。ヒトＮＥ（５０ｎＭ）、ＣＧ（１００ｎＭ）、ＰＲ３（５０ｎＭ）（Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号１６−１４−０５１２００；カタログ番号１６−１４−０３０１０７；カタログ番号１６−１４−１６１８２０）およびＮＳＰ４（１００ｎＭ）を、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ中、この蛍光発生ライブラリでアッセイした。各位置でのアミノ酸好ましさは、１秒あたり放出されるフルオロフォアのピコモルの単位で活性を直接的に比較することによって決定できる。
【００３１】
多重基質プロファイリング−質量分析によるペプチド開裂部位特定
ヒトＮＥ（１ｎＭ）、ＣＧ（５ｎＭ）、ＰＲ３（２ｎＭ）およびＮＳＰ４（２５ｎＭ）を、Ｏ’Ｄｏｎｏｇｈｕｅら、２０１２によって記載されたようにＭＳＰ−ＭＳアッセイを使用してプロファイリングした。それに加え、ＰＭＡ誘発されＭＮａｓｅ処理された３つのドナーＮＥＴサンプルにおけるタンパク質分解活性を、ＭＳＰ−ＭＳアッセイを使用して決定した。対照サンプルは、ＰＭＡまたはＭＮａｓｅ処理されず、各ドナーからの全タンパク質の等しい混合物からなった。すべてのアッセイは、全反応容積９００μＬ中、０．４μｇ／ｍＬのドナータンパク質および５００ｎＭの各ペプチドを含有した。１５分後、６０分後、２４０分後および１２００分後に小分け分を除去し、最終ｐＨが２．５になるまで濃ギ酸でクエンチした。サンプルを脱塩し、ＬＣ−ＭＳＭＳペプチドシーケンシングによって分析した。
【００３２】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳのために、１０，０００ｐｓｉシステムナノＡＣＵＩＴＹ（Ｗａｔｅｒｓ）ＵＰＬＣ装置が取り付けられたＬＴＱ−ＦＴ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ）を、Ｃ１８カラム（ＢＥＨ１３０、ビーズ粒径１．７μｍ、１００μｍ×１００ｍｍ）での逆相クロマトグラフィーに使用した。ＬＣを流速６００ｎＬ／ｍｉｎで操作し、４２分かけて２％Ｂから３０％Ｂまでの線形勾配を使用して、溶媒Ａ：０．１％ギ酸水溶液および溶媒Ｂ：７０％アセトニトリル中の０．１％ギ酸でペプチドを分離した。Ｓｕｒｖｅｙスキャンを３５０〜１８００ｍ／ｚ範囲にわたって記録され、ＭＳ／ＭＳをＣＩＤフラグメント化で６つの最も強い前駆体イオンに行った。質量分析ピークリストを、ＰＡＶＡと呼ばれる自社のソフトウエアを使用して作成し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒソフトウエアｖ．５．１０．０を使用してデータを検索した（Ｃｈａｌｋｌｅｙ、Ｂａｋｅｒら、２００８）。１２４の１４マー合成ペプチドの配列を含むデータベースに対してデータを検索し、同じ１２４エントリーについて、ランダム化された配列の４つの異なるコピーと連結して、偽陽性率を推定するための６２０配列の最終的なデータベースを作成した（Ｏ’Ｄｏｎｏｇｈｕｅら、２０１２）。データベース検索のために、酵素特異性要件なしで、ＧｌｎからのＴｒｐ、ＰｒｏおよびＰｈｅおよびＮ末端ｐｙｒｏＧｌｕの酸化を含むさまざまな改変でペプチド配列をマッチさせた。最小タンパク質スコアが２０であり、最小ペプチドスコアが１５であり、「タンパク質」について最大予測値が０．１であり、ペプチドマッチについて０．０５であるようにＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒスコアの閾値を選択し、結果としてペプチド偽陽性率０．２％を得た。開裂部位データを、「ＭＳＰ  ｅｘｔｒａｃｔｏｒ」ソフトウエアと呼ばれる自社のスクリプトを使用するＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒから抽出した（Ｏ’Ｄｏｎｏｇｈｕｅら、２０１２）。ライブラリにおけるすべての可能な結合（ｎ＝１６１２）の２．５％以上（ｎ＝４１）が開裂される一番早い時間間隔を選択して、酵素特異性を比較した。ＮＥ、ＰＲ３およびＣＧは、それぞれ２４０分、１２００分および６０分でこの値に達し、一方、ＮＳＰ４は、アッセイの過程にわたってペプチド結合の１．２％（ｎ＝１９）のみを開裂した。基質特異性を比較するために、ｉｃｅＬｏｇｏソフトウエアを使用して、特定された開裂部位に隣接する±４位でのアミノ酸についての基質特異性ｌｏｇｏをＰ値の統計０．０５以下で作成した（Ｃｏｌａｅｒｔ、Ｈｅｌｓｅｎｓら、２００９）。
【００３３】
健康なドナーからの好中球の単離
赤血球細胞（ＲＢＣ）沈降、その後のＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離を使用する単球の除去を使用する２工程精製プロトコルによってヒト好中球細胞を単離した。簡単にいうと、５０ｍｌの新しいヒト全血を、ヘパリンを収容する収集管に収集した。血液を比（５：１）でＨｅｔａＳｅｐ（ＳＴＥＭ  ｃｅｌｌ、カタログ番号０７９０６）と混合して、ＲＢＣおよび血小板を沈殿させた。白血球および単球に富む上澄みを、Ｆｉｃｏｌｌ−ＰＡＱＵＥ  ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７−１４４０−０３）の上部に層状にした。Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離の後、好中球を、上澄み中の単球から分離し、ペレット化した。ＲＢＣ溶解バッファー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０−０９４−１８３）を使用する細胞溶解を繰り返すことによって、混入しているＲＢＣをさらに除去した。ＣＤ６６ｂ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍａｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５５７２４）を使用するフローサイトメトリーによって確認した際に５０〜１００百万の好中球を、好中球純度が９８％より大きくなるようにこの方法によって単離した。
【００３４】
ＮＥＴｏｓｉｓ誘発およびＮＥＴ調製
精製された好中球を５回洗浄して血漿タンパク質を除去し、次いで、１０ｍｍ培養プレート中のグルタミンを追加したＲＰＭＩ  １６４０培地に１．７×１０６細胞／ｍｌの密度で接種した。好中球を５０ｎＭのホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ、Ｓｉｇｍａ  Ｐ８１３９）で、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で刺激することによって、ＮＥＴｏｓｉｓをｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘発した。３時間インキュベートした後、培地を除去し、プレートを暖かい培地で３回穏やかに洗浄した。このインキュベーション時間は、ＰＭＡ処理後のＮＥＴからの最大タンパク質放出に必要な最適時間として選択された。次いで、ＮＥＴをＭｉｃｒｏｃｏｃｃａｌ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＭＮａｓｅ）（２０Ｕ／ｍｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐ番号８８２１６）によって１０〜４０分間消化して、ＮＥＴを培地内に分解した。その後、上澄みを遠心分離して、細胞および細胞片を除去した。ＰＭＡ未処理の好中球およびＰＭＡ処理されたＭＮａｓｅ消化なしの好中球からの上澄みを負の対照として調製した。各サンプルのフラクションをプロテアーゼ阻害剤カクテルで処理してプロテオミクス分析のためのサンプルを保存し、一方、プロテアーゼ活性スクリーニングのためのサンプルの残りは、プロテアーゼ阻害剤で処理されなかった。Ｓｙｔｏｘ  Ｏｒａｎｇｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓ１１３６８）を使用して、細胞を含まないＤＮＡを測定することによって、ＮＥＴｏｓｉｓの進行を監視した。フィルタが５４４ｎｍ（ｅｘ）／５９０ｎｍ（ｅｍ）に設定され既知の濃度のＤＮＡ標準で標準曲線によって較正したＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２蛍光計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）での相対的な蛍光測定によってＤＮＡを定量化した。ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）エラスターゼアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２０５６）を使用してＮＥ活性を測定することによって、ＮＥＴｏｓｉｓも定量化した。最後に、共焦点免疫蛍光顕微鏡によって、ＮＥＴｏｓｉｓを視覚的に調べた。好中球（５×１０５細胞／ｍｌ）をポリ−Ｌ−リジンでコーティングされたカバースリップに接種し、５０ｎＭ  ＰＭＡで処理したか、または処理しなかった。ＮＥＴｏｓｉｓ誘発後の異なる時間点で、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、次いで０．０５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中１０％ＦＢＳで透過処理し、ブロックした。ヒストン染色のために、カバースリップをマウス抗ヒトコアヒストン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ａｎｔｉ−ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｃｌｏｎｅ  Ｈ１１−４、ＭＡＢ３４２２）と共にインキュベートし、その後、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）が接合した二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号Ｔ２７６２）と共にインキュベートした。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（ＡｎａＳｐｅｃ  Ｉｎｃ、カタログ番号８３２１８）でＤＮＡを対比染色した。獲得前に、Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ設置培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号Ｐ３６９３０）を使用して、ガラススライド上にカバースリップを設置した。
【００３５】
ＮＥＴ上澄みからのエラスターゼの枯渇
ＮＥＴサンプルのＭＮａｓｅ調製物は、３７℃で、ＤＮａｓｅ（１００Ｕ／ｍｌ）で１０分間二次的に消化されて、ＮＥＴに関連するタンパク質を完全に放出した。次いで、ＮＥＴ上澄みを、エラスターゼ抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＰＡＩ−７４１３２）でコーティングされたＰｉｅｒｃｅ  Ｇ／Ａ磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号８８８０２）と４℃で１時間混合した。インキュベーション後、ＤＹＮＡＬ−磁気ビーズ分離ラック（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号１２３−２１Ｄ）で上澄みをビーズから分離した。ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）エラスターゼアッセイを使用してプロテアーゼの枯渇を確認した。
【００３６】
質量分析によるＮＥＴタンパク質特定
ＮＥＴによって誘発されたサンプルにおけるタンパク質特定を、すでに報告されたように質量分析によるペプチドシーケンシングを使用して行った（Ｏ’Ｄｏｎｏｇｈｕｅら、２０１２）。ＮＥＴサンプルを、３人のドナーから上述のように以下の組合せ、＋ＰＭＡ／＋ＭＮａｓｅ、＋ＰＭＡ／−ＭＮａｓｅおよび−ＰＭＡ／＋ＭＮａｓｅの処理で調製した。＋ＰＭＡ／＋ＭＮａｓｅ処理されたサンプルを、各ドナーについて個々にアッセイし、一方、＋ＰＭＡ／−ＭＮａｓｅおよび−ＰＭＡ／＋ＭＮａｓｅ対照サンプルを、３人のドナーからの質量をマッチさせたプールサンプルとして調製した。ＮＥＴタンパク質濃度は、ＰＢＳ中２５〜４０μｇ／ｍｌの範囲であり、したがって、溶液中のトリプシン消化プロトコルをわずかに修正したものを以下のように適用した。サンプルを、１００ｍＭ炭酸水素アンモニウムバッファー（合計体積７００μＬ中約２０μｇ）で３０μｇ／ｍｌの標準化された濃度にし、これに、最終４Ｍになるまで固体尿素を加えた。サンプルを５６℃１０分間の１０ｍＭ  ＤＴＴインキュベーションで還元し、次いで、１２ｍＭヨードアセトアミド（４５分、暗状態、２１℃）でアルキル化し、次いで、５ｍＭのさらなるＤＴＴでクエンチした。最終的な容積を、さらなる１００ｍＭの炭酸水素アンモニウムで１．４ｍｌに調整し、尿素濃度を２Ｍにした。トリプシン（シーケンシンググレード、Ｐｒｏｍｅｇａ）を１：５０のトリプシン：合計タンパク質で加えて、３７℃での一晩の消化を行った。次いで、サンプルをギ酸で酸性化してｐＨ  ２〜３にし、Ｃ１８  ＯＭＩＸチップ（Ｖａｒｉａｎ）を使用して脱塩した。上記のＬＴＱ−ＦＴシステムと同一の分離および分析条件で操作されるＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ（Ｔｈｅｒｍｏ）質量分析計を使用する２つの技術的な複製物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析で各サンプルをアッセイした。
【００３７】
６２，６１１エントリーを含むＨ．ｓａｐｉｅｎｓ  ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（２０１２年３月２１日にダウンロードした）に対してデータベース検索を行った。偽陽性率を推定するために、このデータベースを、完全にランダム化された一連の配列エントリーと連結した（ＥｌｉａｓおよびＧｙｇｉ  ２００７）。親イオンについて質量許容差２０ｐｐｍおよびフラグメントイオンについて０．８Ｄａでデータを検索した。ペプチド配列を、失われた開裂がないトリプシン性ペプチドおよび固定された改変としてのカルバミドメチル化システインとマッチさせた。さまざまな改変は、ＧｌｎからのＭｅｔ、Ｎ末端ｐｙｒｏＧｌｕの酸化、Ｍｅｔの欠失およびＮ末端アセチル化を含んだ。タンパク質前駆体スコアパラメータは、最小タンパク質スコアが２２であり、最小ペプチドスコアが１５であり、タンパク質について最大予想値が０．０１であり、ペプチドマッチについて０．００１であり、結果として偽陽性率１．１％が得られた。タンパク質特定結果を、固有のペプチド数、タンパク質存在量の概算値としてのペプチド数、配列包含率およびタンパク質特定の確率についての予想値と共に報告する（Ｃｈｏｉ、Ｆｅｒｍｉｎら、２００８）（Ｌｉｕ、Ｓａｄｙｇｏｖら、２００４）。タンパク質は、試験された３つの条件（＋ＰＭＡ／＋ＭＮａｓｅ、＋ＰＭＡ／−ＭＮａｓｅおよび−ＰＭＡ／＋ＭＮａｓｅ）の１つにおいて、少なくとも２つの固有のペプチドで特定して報告する必要があった。
【００３８】
［実施例２．ＰＳ−ＳＣＬおよびＭＳＰ−ＭＳによる好中球セリンプロテアーゼの基質プロファイリング］
今日まで、８０を超えるエンドプロテアーゼの基質特異性が、ＰＳ−ＳＣＬアッセイ（ＰＭＩＤ  １０８６９４３４）を使用してプロファイリングされており、一方、最近開発されたＭＳＰ−ＭＳアッセイは、今日までに３０を超えるプロテアーゼをプロファイリングしており、プロテアーゼはエンド型およびエキソ型で作用するプロテアーゼを含む（Ｏ’Ｄｏｎｏｇｈｕｅら、２０１２）。ＮＥ、ＣＧ、ＰＲ３およびＮＳＰ４の不偏の包括的な基質プロフィールを得るために、本発明者らは、同一のバッファー条件でＰＳ−ＳＣＬおよびＭＳＰ−ＭＳ方法を使用して、各酵素をアッセイした。ＰＳ−ＳＣＬライブラリは、テトラペプチド配列のカルボキシ末端に結合した７−アミノ−４−カルバモイルメチルクマリン（ＡＣＣ）基を使用する。ライブラリは、非プライマー側（切断性結合に対してＮ末端）の基質特異性を決定するために使用でき、相同性が高いプロテアーゼを区別するために特に情報価値がある（Ｃｈｏｅ、Ｌｅｏｎｅｔｔｉら、２００６）。ＰＳ−ＳＣＬ方法を使用する本発明者らの研究では、ＮＥおよびＰＲ３の両方が、Ｐ１部位で、バリンおよびアラニンが好ましく、より少ない程度でトレオニンが好ましい（図１）。ＮＥは、この位置でイソロイシンを収容することもできるが、ＰＲ３はそのようなことはない。対照的に、ＣＧは、これらのアミノ酸に対する許容性が低く、そのＰ１部位でチロシンおよびフェニルアラニンを好み、一方、ＮＳＰ４は、アルギニンが非常に好ましい。ＮＥがプロリンおよびアラニンを好み、一方、ＰＲ３が、アスパラギン酸、グルタミン酸およびアスパラギンへの好ましさを示すため、ＮＥおよびＰＲ３はＰ２特異性によって簡単に区別可能である。興味深いことに、ＣＧおよびＮＳＰ４は、Ｐ２でトレオニン、セリン、プロリンおよび他の小さな疎水性アミノ酸を好むが、ＮＳＰ４ではそうではなく、この活性は、アルギニンに対するＰ１部位特異性について最小である。Ｐ３で、ＮＥおよびＣＧは、同様の特異性プロフィールを有し、一方、ＰＲ３は、嵩高い残基、特に、トリプトファンおよびチロシンについて異なる好ましさを有する。最後にＰ４で、ＮＥ、ＣＧおよびＮＳＰ４は、幅広い特異性を有し、一方、ＰＲ３は、この部位でフェニルアラニンまたは任意の帯電したアミノ酸を許容しない。
【００３９】
ＭＳＰ−ＭＳアッセイは、プロテアーゼの特異性をプロファイリングするために、基質ライブラリとして１２４テトラデカペプチドの混合物を使用する。切断性結合のアミノおよびカルボキシ側での開裂されたペプチドは、質量分析を使用するペプチドシーケンシングによって簡単に特定できる。アッセイは、プロテアーゼ開裂事象の定性的評価を得るために種々の時間間隔でクエンチできる。すべての４つのプロテアーゼは、Ｐ１位置でアミノ酸の顕著な富化を有し（図２）、アミノ酸の好ましさは、Ｐｅａｒｓｏｎ分析によって−１．０から１．０までのスケールでスコアが０．４以上であるＰＳ−ＳＣＬ方法において観察されたものと強い相関関係があった（表１）。ここで、ＮＥは、バリンおよびトレオニンよりイソロイシンを好み、一方、ＰＲ３は、アラニン、バリン、トレオニンおよびイソロイシンについてほぼ等しい好ましさを有した。ＣＧは、Ｐ１で、チロシンおよびリジンよりもフェニルアラニンを好むが、アラニンを好まず、一方、ＮＳＰ４は、アルギニンについて厳格な好ましさを有した。Ｐ１サブサイトの外側で、各酵素に対する特異性は、異なるサブサイトに由来し、特に、Ｐ３では、グルタミンおよびロイシンが好ましく、ＮＥのＰ２’ではトリプトファンが好ましく、ＰＲ３のＰ２ではグルタミン酸およびアスパラギン、ＣＧのＰ２ではノルロイシンが好ましい。興味深いことに、ＰＲ３およびＮＥは、これらの２つの方法間で比較できるＰ４−Ｐ１部位内で強い相関関係を有し、ＣＧは、ＰＳ−ＳＣＬ方法における設計によって試験されていないプライマー側の特異性が潜在的な原因で（図２）、より弱い相関関係を有した（表１）。ＭＳＰ−ＭＳ結果は、プロテアーゼ開裂部位のプロテオミクス特定（ＰＩＣＳ）方法を使用して作成された（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ  ２００８、Ｐｅｒｅｒａ  ２０１２）Ｐ２’部位およびＰ１でのＮＥおよびＣＧの両方についての以前公開された特異性データとの強い相関関係を示した（表１）。
【００４０】
表１．ＭＳＰ−ＭＳからの基質特異性と、ＰＳ−ＳＣＬおよびＰＩＣＳからの基質特異性との比較
【表１】
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【００４１】
陰影のついていない値は、弱い相関関係があること、または相関関係がないことを示し、一方、灰色および黒色は、それぞれ、強い関係および非常に強い関係を表す。
【００４２】
［実施例３．プロテアーゼ活性に富むＮＥＴの誘発］
好中球においてＰＭＡで誘発されたＮＥＴｏｓｉｓにおいてタンパク質分解活性を推定するために、本発明者らは、内部でクエンチされた一連の蛍光ペプチドをスクリーニングし、４つの好中球セリンプロテアーゼのうち３つによって簡単に開裂された基質を特定した。この基質Ｋ（ｍｃａ）−ＰＬＧＫＱＶＥＹ−Ｋ（ｄｎｐ）は、以前、真菌から分泌されたグルタミン酸プロテアーゼをアッセイするために使用された（Ｏ’Ｄｏｎｏｇｈｕｅ、２００８）。このプローブを使用して、ＰＭＡおよびＭＮａｓｅ処理された好中球由来のＮＥＴから放出されたタンパク質分解活性は、ＰＭＡ処理なしの対照サンプルよりおおよそ５倍大きく、ＭＮａｓｅ処理なしの対照サンプルより２０〜４０倍大きかった（図３）。本発明者らは、同じサンプルを分析するためにＭＳＰ−ＭＳも用い、ＮＥＴに関連するプロテアーゼ由来の９８の開裂されたペプチド結合を観察した。蛍光基質を使用する本発明者らの研究において明らかなように、ＰＭＡ処理のみのサンプルおよびＭＮａｓｅ処理のみのサンプルの両方において活性プロテアーゼが存在するが、これらの低いレベルの開裂は、好中球のＰＭＡ処理およびＭＮａｓｅ処理の後に観察された開裂された合計結合の１５〜１９％のみを占める。これらを合わせると、これらの研究は、好中球が誘発されて、タンパク質分解活性に富むＮＥＴを形成することができることを決定した。
【００４３】
［実施例４．ＮＥＴに関連するタンパク質の特定］
ＮＥＴに埋め込まれたタンパク質の全成分を特定するために、上記の同じＮＥＴｏｓｉｓによって誘発された好中球からのタンパク質調製物をプロテオミクス分析に供して、誘発されたＮＥＴ対誘発されていないＮＥＴのタンパク質組成を評価した（表２）。質量分析を使用して、試験された３つの条件（＋ＰＭＡ／＋ＭＮａｓｅ、＋ＰＭＡ／−ＭＮａｓｅおよび−ＰＭＡ／＋ＭＮａｓｅ）で、ＮＥＴに関連する１５個のタンパク質を特定した。ＮＥＴに関連するタンパク質は、それらの機能および細胞位置（核タンパク質、アクチンに関連するタンパク質、酵素、殺菌性ペプチドおよびシグナル伝達）に基づいて６クラスに分類できる。これらの中で、最も存在量が多いタンパク質のうちのほとんどである２１個のタンパク質は、ＮＥＴｏｓｉｓによって誘発された好中球において以前特定された（Ｕｒｂａｎ、Ｅｒｍｅｒｔら、２００９）。以前の研究からの３個のタンパク質、プロテイナーゼ３、α−アクチニンおよびカタラーゼのみが、本発明者らの最適化された手順を使用して検出されなかったが、これらの脱落は、本発明者らがＤｎａｓｅ処理の代わりにＭＮａｓｅ処理を使用して、これらの３個のタンパク質が脱落し得るようにＮＥＴを覆い隠したことによって説明され得る。２９個のタンパク質は、ＰＭＡおよびＭＮａｓｅ処理された好中球サンプルにおいて以前は特定されていないことが明らかに示された。しかし、これらのタンパク質のうちの１１個のみが、すべての３人のドナーにおいて再現可能に特定された。新しく見出されたタンパク質の中で、本発明者らは、ＳＨ３ドメインが結合したグルタミン酸−ｒｃｈ様タンパク質３（ＳＨ３ＢＧＲＬ３）（Ｑ５Ｔ１２３）が、炎症のシグナル伝達経路に関与していることを見出した。ＮＥおよび不活性なセリンプロテアーゼファミリーメンバー、アズロシジンは、すべての３つのドナーサンプルにおいて見出され、一方、ＣＧは、単一のドナーサンプルのみにおいて観察された。驚くべきことに、本発明者らの酵素研究は、対照サンプルと比較して、ＰＭＡおよびＭＮａｓｅ処理された好中球（ＮＥＴ）におけるタンパク質分解活性の富化を示したが、質量分析ベースのプロテオミクスによって分析されたとき、同じサンプルにおいてプロテアーゼの富化がほとんど存在しないか、または存在しなかった。ＮＥは、ＭＮａｓｅ処理なしのいずれのサンプルにおいても見出されなかったが、これはＮＥが、インタクトなＮＥＴ上で効率的に捕捉されることを示す。
【００４４】
表２．３人の健康なドナーのＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって特定されたＮＥＴに関連するタンパク質
【表２】
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【００４５】
［実施例５．ＮＥＴ上のプロテアーゼの多重基質プロファイリング］
ＭＳＰ−ＭＳアッセイを使用して、ＮＥＴに関連するプロテアーゼの基質特異性を評価した。複数のプロテアーゼを含有する生体サンプルをプロファイリングするためのＰＳ−ＳＣＬアッセイと比べ、ＭＳＰ−ＭＳアッセイを使用する利点は、ペプチド基質を、特定のプロテアーゼに直接的に結合させることができることである。各好中球セリンプロテアーゼのこの基質特異性情報を、これらの酵素の混合物を含有する可能性があるＮＥＴの分析に適用した。ＭＳＰ−ＭＳによって、すべての３人のドナーは、同様の基質プロフィールを有する。代表的な「ドナー署名」を作成するために、すべての３つのドナーサンプルにおいて観察された４０の開裂は凝集されて、ＮＥ特異性に非常によく似た単一のモチーフにされた（図４）。このドナー署名は、３つの主要な酵素特異性の凝集体であり、１５、５および１の開裂は、それぞれ、ＮＥ、ＣＧおよびＰＲ３に固有に起因し得る（図４にも示されている）。残りの１９の開裂は、複数の好中球セリンプロテアーゼによって加水分解されたため、固有に帰属させることができなかった。
【００４６】
ＮＥがＮＥＴにおいて主要なタンパク質分解活性であったことを確認するために、本発明者らは、免疫枯渇によって酵素を選択的に除去し、混合物中の残りのプロテアーゼをアッセイした。この場合に、本発明者らは、アッセイ中のＮＥ枯渇のドナータンパク質の合計量を１５倍増加させることができ、これは、アッセイの過程にわたって特定された開裂部位の数において１．７倍増加のみもたらした。３人のドナー間に共通の７６の開裂部位は、主に、ＣＧ活性に起因し得（３６の固有の開裂）、７の固有の開裂を有するＰＲ３活性が比例的に増加していることを明らかに示した。興味深いことに、わずか単一の開裂が、ＮＳＰ４活性の産物である可能性があり、４つの酵素のいずれにも起因し得ない１５の新しい開裂が今や存在した。よって、ＮＥ枯渇は、存在量の少ないプロテアーゼについて、より大きな活性を発揮することができた。
【００４７】
［実施例６．ＮＥＴ上のプロテアーゼの基質］
図５は、エラスターゼ開裂部位、ならびにエラスターゼがカテプシンＧおよびプロテイナーゼ３と共有する開裂部位を示す。図６は、プロテイナーゼ３開裂部位、ならびにプロテイナーゼ３がエラスターゼおよびカテプシンＧと共有する開裂部位を示す。図７は、カテプシンＧ開裂部位、ならびにカテプシンＧがエラスターゼおよびプロテイナーゼ３と共有する開裂部位を示す。図８は、ＮＥＴｏｓｉｓドナーからのプロテアーゼ開裂部位を示す。図９は、エラスターゼ、プロテイナーゼ３、カテプシンＧ、好中球が分泌するタンパク質４の開裂部位、およびＮＥＴｏｓｉｓドナーからのプロテアーゼ開裂結果を示す。
【００４８】
上記の明細書に述べられたすべての刊行物および特許は、参照によって本明細書に組み込まれている。記載された方法の種々の改変および変形は、本開示の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明は具体的な実施形態に関して記載されたが、請求されているものが、このような具体的な実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際に、具体的な実施形態を実施するための上記の態様の当業者に明らかな種々の改変は、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。当業者は、通常の実験を超えない実験を使用して、本明細書に記載された具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または確認することができるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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