(57)【要約】  本開示は、危険な病原菌であるクロストリジウム・ディフィシル細菌を、特異的に死滅させるＲ型高分子量バクテリオシンをコードする全遺伝子クラスターの発見及び単離に関する。本開示はまた、無害な好気性細胞中での当該Ｒ型バクテリオシンの産生法の開示である。本開示はまた、低分子、非ＯＲＦ１３７４受容体結合ドメイン（ＲＢＤｓ）の開示であり、それらは、遺伝子組換えでまたは改変された殺菌スペクトルを持つ異種ディフォシンを形成するために、ディフォシンに組み入れられる。本開示で提供される異種ディフォシンは、異種ＲＢＤ及びその同族基板接合領域（ＢＰＡＲ）、または融合ＢＰＡＲを含んでいてよい。本発明は、大きな傷害及び感染患者または家畜の死亡さえ引き起こす場所である胃腸管環境においてクロストリジウム・ディフィシル菌を選択的に死滅させるために、向上した熱安定性及びｐＨ安定性を持つ強力な殺菌剤、及びその産生方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒ型高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンをコードする単離された核酸分子であって、核酸分子が、クロストリジウム・ディフィシル菌の第一菌株のゲノム由来であり及び以下から成る前記核酸分子。
配列番号６６−７７をコードする第二ポリヌクレオチドに少なくとも８０％同一である第一ポリヌクレオチド配列であり、ここで前記核酸分子がさらに、クロストリジウム・ディフィシル菌の第二菌株のゲノム由来のプロファージまたはプロファージ残余物の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）またはクロストリジウム・ディフィシル菌に感染するバクテリオファージのＲＢＤをコードする異種配列から成り、及び、
ここで、前記Ｒ型ｈｍｗバクテリオシンが、ポリペプチドの配列番号７８に少なくとも８０％同一である第一基板接合領域（ＢＰＡＲ）ポリペプチドのアミノ末端部の少なくとも５０個の連続アミノ酸から成り、及び、
ここで、前記Ｒ型ｈｍｗバクテリオシンが、クロストリジウム・ディフィシル菌の少なくとも一つに殺菌活性を持ち、及び、
ここで、前記ＲＢＤに同族の第二ＢＰＡＲのＣ末端部を少なくともコードする第三ポリヌクレオチドである。
【請求項２】
前記ＲＢＤが、配列番号９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、および１１６から成る遺伝子群から選ばれるＲＢＤに少なくとも８０％同一である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記第三ポリヌクレオチドが、そのＲＢＤの同族ＢＰＡＲの全ての部分をコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
ＲＢＤの同族ＢＰＡＲの全ての部分をコードする前記第三ポリヌクレオチドが、核酸分子に挿入され、そのためＲＢＤの同族ＢＰＡＲのＣ末端が、第一ＢＰＡＲのアミノ末端部に融合されている、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
ＲＢＤの同族ＢＰＡＲのＣ末端部をコードする前記第三ポリヌクレオチドが、配列番号８８、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、および１１５からなる遺伝子群から選ばれる配列に少なくとも８０％同一であるＢＰＡＲをコードする配列から成る、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項６】
ＲＢＤの同族シャペロンをコードする第四ポリヌクレオチドからさらに成る、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記同族シャペロンが、配列番号８９、９０、１１３、１１４、および１１７から成る遺伝子群から選ばれる、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項８】
請求項１に記載の核酸分子からなる発現カセット。
【請求項９】
Ｒ型高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンの前記発現カセットが誘導的または抑制的である、請求項８に記載の発現カセット。
【請求項１０】
発現が、低分子の誘導因子（インデューサー）または抑制解除因子（デリプレッサー）に誘導される、請求項９に記載の発現カセット。
【請求項１１】
前記低分子のインデューサーまたはデリプレッサーが、活性酸素種（ＲＯＳ）またはＲＯＳの発生体である請求項１０に記載の発現カセット。
【請求項１２】
前記ＲＯＳが、ヒトまたは他の動物に対して無毒の過酸化物である、請求項１１に記載の発現カセット。
【請求項１３】
前記過酸化物が過酸化水素である、請求項１２に記載の発現カセット。
【請求項１４】
請求項１によりコードされるＲ型ｈｍｗバクテリオシン。
【請求項１５】
バクテリオシンが動物に経口投与でき、そして殺菌活性が依然として存在している形態で糞に排泄されうる、請求項１４に記載のＲ型ｈｍｗバクテリオシン。
【請求項１６】
バクテリオシンが、ｐＨ２．５からｐＨ１０の間において、２５℃、３０分間の培養後もある殺菌活性を残している、請求項１４に記載のＲ型ｈｍｗバクテリオシン。
【請求項１７】
バクテリオシンが、４５℃、３０分間の培養後もある殺菌活性を残している、請求項１４に記載のＲ型ｈｍｗバクテリオシン。
【請求項１８】
Ｒ型ｈｍｗバクテリオシンの産生法であって、請求項１に従う核酸分子から成るプロデューサー細胞の暴露から成り、誘導プロモーターに遺伝子組換えで結合し、Ｒ型ｈｍｗバクテリオシンの発現を誘導するのに効果的な濃度で誘導剤に結合し、それによってＲ型ｈｍｗバクテリオシンを産生する、方法。
【請求項１９】
Ｒ型ｈｍｗバクテリオシンをコードする核酸分子が、プロデューサー細胞のゲノムに対して異種であり、及び当該核酸分子が、当該プロデューサー細胞の染色体に含まれ、または当該プロデューサー細胞の染色体外発現ベクターに含まれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記プロデューサー細胞が、非病原性でかつ偏性嫌気性細菌ではない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記非病原性でかつ偏性嫌気性ではない細菌が、枯草菌、乳酸菌、乳酸球菌、及びリステリア菌からなる群から選ばれる細菌の遺伝子由来の種である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細菌種が枯草菌である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記枯草菌が、Ｒ型ｈｍｗバクテリオシンの産生のために誘導された時に溶解しない、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
病原性クロストリジウム・ディフィシル菌の、請求項１４のＲ型ｈｍｗバクテリオシンの有効量への接触を含み、当該Ｒ型ｈｍｗバクテリオシンが、当該病原性クロストリジウム・ディフィシル菌と結合し及び死滅させる、クロストリジウム・ディフィシル菌の殺菌方法。
【請求項２５】
クロストリジウム・ディフィシル菌が動物の体内にあり、及び当該Ｒ型ｈｍｗバクテリオシンの殺菌量が当該動物に投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記動物が哺乳動物である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記バクテリオシンの殺菌量を産生するのに必要な量の、請求項１に従う核酸分子を含むプロデューサー細胞を動物に投与し、それによって当該感染を治療する、動物におけるクロストリジウム・ディフィシル菌感染の治療法。
【請求項２９】
請求項１４に記載のＲ型バクテリオシン及び医薬的に許容されるキャリアを含む、組成物。
【請求項３０】
ＲＢＤが、クロストリジウム・ディフィシル菌の第二株に感染するバクテリオファージ由来である、請求項１に記載の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本出願は、バクテリオシンを産生するのに十分な遺伝子クラスターの同定及び単離に関し、より具体的には、特にクロストリジウム・ディフィシル菌を死滅させるＲ型高分子量バクテリオシンに関し、及びその殺菌特異性を改変、産生、及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グランド情報
本発明は、アメリカ国立衛生研究所、国立アレルギー・感染症研究所によって与えられたグラント番号Ｒ４３ＡＩ０９８１８６−０１により、政府の助成をうけ達成された。アメリカ合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の背景
クロストリジウム・ディフィシル菌は、偏性嫌気性、芽胞形成グラム陽性菌であり、ヒト及び他の哺乳動物への悪名高い病原体である（Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７， Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｋｅｅｌ  ｅｔａｌ．，２００７，Ｓｕｎｅｎｓｈｉｎｅ  ＆  ＭｃＤｏｎａｌｄ，２００６）。クロストリジウム・ディフィシル菌は、低密度であれば、哺乳動物の胃腸管（ＧＩ）に無害で定住する。しかし、増殖時には、抗生物質投与がしばしば共生細菌を減らす結果、軽度の下痢症から特徴的な偽膜性大腸炎までの範囲の疾患を引き起こすのに十分な菌体外毒素を産生する。それら毒素は、生命にかかわり、特に高齢のヒト及び他の哺乳動物に重大な合併症を引き起こす（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，２００２）。
【０００４】
この病原体が蔓延して形成される芽胞は、病院や慢性疾患ケア施設における不活化または根絶が困難であるため、クロストリジウム・ディフィシル菌に侵さる患者の確率は、そのような施設全体で急上昇する（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，２００７）。事実、クロストリジウム・ディフィシル菌の比較的新しい強毒素産生菌株で、大規模な流行により重篤な疾患を引き起こしているＢＩ／ＮＡＰ１／０２７は、最近よく記録されている（Ｓｐｉｇａｇｌｉａ  et   al．，２００２；Ｐｅｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４， ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｍｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｌｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｅｌｍａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。 これまでは低リスクに留まっていた、子供におけるクロストリジウム・ディフィシル菌関連疾患（ＣＤＡＤ）の発症例は、大幅に増加している（Ｂｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｚｉｌｂｅｒｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０００５】
無症性キャリアまたは保菌対象において、抗生物質投与により予防的に病原体を排除することは、クロストリジウム・ディフィシル菌関連疾患を誘発するため、是非とも避けねばならない。
【０００６】
グラム陰性菌によって作られたＲ型バクテリオシンが記述されており、及びグラム陰性菌の他の種または属という環境においてさえも、他の競合するグラム陰性菌株を死滅させるＲ型バクテリオシンが活用されている（Ｋａｇｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９６４，Ｋａｇｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９６４ａ，Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，Ｄ，１９６６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｌａｗ，１９８１，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｃａｍｐａｇｎａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｔｒａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊａｂｒａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。Ｒ型ピオシンの基板接合領域（ＢＰＡＲ）の異種の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）への融合が記述され、その結果である、グラム陰性菌に対する新規の殺菌特性を備えた新規のＲ型ピオシンの創出が記述されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｓｃｈｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０００７】
その他の高分子量バクテリオシンまたはＲ型バクテリオシンは、グラム陽性菌として記述されている（Ｃｏｅｔｚｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９６８，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐａｔｔｅｅ，１９８１，Ｚｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。しかしながら、グラム陽性菌によって産生されるＲ型高分子量バクテリオシンの構造については、ほとんど知られていない。しかも、そのような菌が記載されている一方で、遺伝子レベルで特徴付けされたものは無く、または有効薬を開発するため、対症的で必要不可欠な方法で処置された菌は無い。高分子量バクテリオシンとしては、２種のクロストリジウム菌、ボツリヌス菌、及びウェルシュ菌が記載されている（Ｅｌｌｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋａｕｔｔｅｒ，１９７０，Ａｎａｓｔａｓｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９７１，Ｎｉｅｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１）。クロストリジウム・ディフィシル菌により産生するもの、もしくはクロストリジウム・ディフィシル菌を死滅させるものの記載は無い。
【発明の概要】
【０００８】
発明の概要
本発明は、クロストリジウム・ディフィシル菌の他の株に対して殺菌性であるクロストリジウム・ディフィシル菌特異のＲ型バクテリオシン（本明細書中、ディフォシン「ｄｉｆｆｏｃｉｎ」と呼ぶ）について、それをコードする全遺伝子座または全遺伝子クラスターの単離に基づく。即ち、ディフォシン遺伝子クラスターの発現、および好気性細菌においてのディフォシンの産生、即ち、前記ディフォシン遺伝子クラスターのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１３７４が決定する、クロストリジウム・ディフィシル菌株に対抗するディフォシンの殺菌スペクトルの発見に基づく。本発明は、新規ディフォシンを産生し、及びヒトを含む動物の胃腸管（ＧＩ）から、そこに定住するクロストリジウム・ディフォシル菌を排除するための直接的または間接的な製法および投与法を与えるため、ディフォシン特異性を遺伝子工学により改変する実験的手段を提供する。ディフォシンの投与は、従来の抗生物質がそうであるように、治療や健康のためにとても必要な共生胃腸（GI）細菌を傷つけることなく、クロストリジウム・ディフィシル菌感染（ＣＤＩ）の発症を治療または予防することができる。
【０００９】
本発明によれば、Ｒ型高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンをコードする単離された核酸分子を提供する。一つの実施形態において、当該核酸分子は、クロストリジウム・ディフィシル菌株のゲノムから単離され、Ｒ型高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンをコードする核酸分子であり、及びＲ型ｈｍｗバクテリオシンは、配列番号４−１６、１８、１９、及び６６−８０からなる群から選ばれたポリペプチドに対し、少なくとも８０％同一のポリペプチドからなるＲ型ｈｍｗバクテリオシンであり、及び当該Ｒ型ｈｍｗバクテリオシンが、少なくとも一つの他のクロストリジウム・ディフィシル菌の受容体を結合し、それゆえその他の菌株またはクロストリジウム・ディフィシル菌株に対して殺菌活性を持つ受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を持つ。特定の実施形態において、前記核酸分子は、Ｃｄ４、Ｃｄ１６、Ｃｄ１９１０８、Ｃｄ１９１２３、Ｃｄ１９１２６、Ｃｄ１９１４５、及びＡＴＣＣ受託番号４３５９３で寄託された群から選択されるクロストリジウム・ディフィシル菌株のゲノム由来である。いくつかの実施形態において、前記株がＣｄ１６及び前記核酸分子が配列番号１を含むか、または前記株がＣｄ４及び前記核酸分子が配列番号６１を含む。
【００１０】
他の実施形態において、Ｒ型高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンをコードする単離された核酸分子を提供する。ここで、前記核酸分子は、クロストリジウム・ディフィシル菌の第一株のゲノム由来であり、そして配列番号６６−７７をコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％が同一である第一ポリヌレオチドの配列を含み、さらにここで、前記核酸分子は、クロストリジウム・ディフィシル菌の第二株またはクロストリジウム・ディフィシル菌に感染するバクテリオファージのＲＢＤのゲノム由来のプロファージまたはプロファージ遺残物の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）をコードする異種配列を含み、ここで、前記Ｒ型ｈｍｗバクテリオシンは、少なくとも５０個の連続アミノ酸がアミノ末端で連結し、ポリペプチドの配列番号７８に対して少なくとも８０％同一である第一基板接合領域（ＢＰＡＲ）ポリペプチドを含み、及びここで、前記Ｒ型ｈｍｗバクテリオシンは、少なくとも一つのクロストリジウム・ディフィシル菌株にたいして殺菌活性を持つ。
【００１１】
本発明の他の実施形態において、本発明の核酸分子によりコードされる単離されたＲ型バクテリオシンを提供する。一つの態様において、前記Ｒ型バクテリオシンは、好気性産生バクテリアにおいて発現する。ある実施形態において、前記Ｒ型バクテリオシンは、動物に経口投与することができ、殺菌活性のある状態で糞便中に排泄させることができる。特定の実施形態において、前記Ｒ型バクテリオシンは、ｐＨ２．５及びｐＨ１０．６において、２５℃、３０分間 の培養後も、ある種の殺菌活性を保持する。一つの態様において、前記Ｒ型バクテリオシンは、ｐＨ３．４及びｐＨ９において、２５℃、３０分間 の培養後も、ある種の殺菌活性を保持する。他の実施形態において、前記Ｒ型バクテリオシンは、４５℃、６０分間 の培養後も、ある種の殺菌活性を保持する。
【００１２】
本発明の他の実施形態において、殺菌活性をもつ単離されたＲ型高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンを提供する。ここで、前記Ｒ型ｈｍｗバクテリオシンは、クロストリジウム菌遺伝子の第一バクテリアの第一菌株の基板接合領域（ＢＰＡＲ）を含み、及び前記第一バクテリアの第二菌株の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含み、または前記クロストリジウム菌遺伝子またはクロストリジウム菌種に感染するバクテリオファージの第二バクテリアの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む。ここで、前記バクテリオシンは、クロストリジウム・ディフィシル菌の少なくとも一つの株に対して殺菌活性を持つ。特定の実施形態において、前記ＢＰＡＲは、クロストリジウム・ディフィシル菌の第一菌株由来であり、及び前記ＲＢＤは、クロストリジウム・ディフィシル菌の第一菌株由来であるか、またはクロストリジウム・ディフィシル菌に感染するバクテリオファージ由来である。ある実施形態において、前記ＢＰＡＲは、配列番号１６、５４−５６及び７８の一つまたはそれ以上の対応セグメントに対して少なくとも８０％同一である。ある実施形態において、前記ＢＰＡＲは、配列番号１６または７８のアミノ酸が５０個またはそれ以上連結しているポリペプチド、または配列番号５４−５６のアミノ酸が５０個またはそれ以上連結しているポリペプチドに対して少なくとも８０％同一である。ある実施形態において、前記ＢＰＡＲは、配列番号７８に少なくとも８０％同一である第一ＢＰＡＲのアミノ末端部と、異種ＲＢＤと同族である第二ＢＰＡＲのＣ末端部の融合体である。
【００１３】
いくつかの実施形態において、前記ＲＢＤが、配列番号１７、及び４９−５６の一つまたはそれ以上の対応セグメントに対して少なくとも８０％同一である。他の実施形態において、コードされた前記ＲＢＤが、配列番号９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、及び１１６の群から選ばれたＲＢＤに対して少なくとも８０％同一である。
【００１４】
本発明の他の実施形態において、本発明の核酸分子を含む発現カセットを提供する。発現カセットは、プラスミドのような発現ベクター内に含まれるし、プロデューサー細胞の染色体に含まれてもよい。いくつかの実施形態において、当該発現カセットは、前記Ｒ型バクテリオシンをコードする核酸分子に遺伝子組換えで連結される異種プロモーターを含む。当該プロモーターは、誘導的、抑制的、または恒常活性的でありうる。当該プロモーターは、一つの態様において誘導的であり、他の態様においては抑制的である。いくつかの実施形態において、当該プロモーターは、低分子の誘導因子（インデューサー）、抑制因子（リプレッサー）、または抑制解除因子（デリプレッサー）を加えるかまたは除去することによって誘導される。一つの態様において、当該プロモーターは、低分子のインデューサー、またはデリプレッサーによって誘導される。ある実施形態において、前記低分子のインデューサーまたはデリプレッサーは、反応性酸素生成物（ＲＯＳ）またはＲＯＳの発生因子（ジェネレーター）である。一つの態様において、当該ＲＯＳは、ヒト及び他の動物に無毒の過酸化物である。ひとつの実施例において、当該過酸化物は、過酸化水素である。特定の態様において、前記カセットの発現は、ＲｅｃＡ恒常活性タンパク質をコードするｒｅｃＡ遺伝子を操作して連結し、そして低分子インデューサーまたはデリプレッサーに応答性のある異種プロモーターを制御下におくことによって、制御する。
【００１５】
本発明のさらに他の実施形態において、本発明の発現カセットを含むプロデューサー細胞を提供する。当該発現カセットは、プロデューサー細胞内のエピソーム発現ベクターに含まれてもよい。あるいは、プロデューサー細胞が、染色体内に核酸分子または本発明の発現カセットを含んでもよい。ある実施形態において、当該プロデューサー細胞は、非病原性であって偏性嫌気性菌ではない。いくつかの実施形態において、前記の非病原性であり非偏性嫌気性の菌は、桿菌、乳酸菌、リステリア菌からなる群から選ばれた細菌属からの種である。ある実施形態において、前記の非病原性であり非偏性嫌気性の菌は、桿菌属から選ばれる。いくつかの態様において、当該細菌は、枯草菌である。特定の態様において、当該枯草菌は、ＰＢＳＸ遺伝子クラスターの欠損がある。他の実施形態において、当該プロデューサー細胞は、偏性嫌気性であるが非病原性細菌である。
【００１６】
本発明のさらに他の実施形態において、本発明のＲ型ｈｍｗバクテリオシンの産生方法を提供する。当該方法は、誘導剤または抑制解除剤に感受性の誘導プロモーターまたは抑制解除プロモーターに遺伝子操作で連結された本発明の核酸配列を含むプロデューサー細胞を、当該Ｒ型バクテリオシンの発現を誘導するのに効果的な濃度の前記製剤に暴露し、及び発現したＲ型バクテリオシンを精製することを含む。いくつかの実施形態において、当該Ｒ型バクテリオシンをコードする前記核酸分子は、前記プロデューサー細胞のゲノムに対して異種である。特定の態様において、前記核酸分子は、前記プロデューサー細胞の染色体に含まれるか、または前記プロデューサー細胞の染色体外発現ベクターに含まれる。ある実施形態において、前記プロデューサー細胞は、非病原性であり及び偏性嫌気性細菌ではない。いくつかの実施形態において、前記非病原性及び非偏性嫌気性細菌は、枯草菌、乳酸菌、及びリステリア菌から成る群より選ばれる細菌遺伝子由来の種である。ある実施形態において、前記非病原性及び非偏性嫌気性細菌は、枯草菌遺伝子由来である。ある態様において、当該細菌は、枯草菌である。特定の態様において、当該枯草菌は、当該Ｒ型バクテリオシンを産生するため誘導されても溶解しない。さらなる態様において、当該枯草菌は、ＰＢＳＸ遺伝子クラスターの欠損がある。
【００１７】
本発明のさらなる実施形態において、病原性細菌を死滅させる方法を提供する。当該方法は、病原性細菌を本発明のＲ型バクテリオシンに接触させることによって、ここで前記Ｒ型バクテリオシンは病原性細菌に結合し死滅させる。一つの態様において、病原性細菌が、クロストリジウム・ディフィシル菌である。一つの態様において、当該クロストリジウム・ディフィシル菌が動物の体内にあり、及び殺菌量の当該Ｒ型バクテリオシンが、前記動物に投与される。
【００１８】
他の実施形態において、動物におけるクロストリジウム・ディフィシル菌の感染疾患の治療または予防法を提供する。当該方法は、本発明のＲ型バクテリオシンの殺菌量の動物への直接投与、プロデューサー細胞の投与による間接的試薬投与、または毒素を産生しないよう遺伝的に修正された天然ディフォシンを産生するクロストリジウム・ディフィシル細菌の芽胞の投与を含む。特定の実施形態において、クロストリジウム・ディフィシル菌の動物感染は、本発明のプロデューサー細胞の動物への必要量の投与により殺菌量のバクテリオシンが産生され、治療される。一つの態様において、バクテリオシンをコードする核酸は、ラクトースプロモーターの制御下にあり、そして動物にラクトースが投与される。いくつかの実施形態において、当該動物が哺乳動物である。一つの態様において、当該哺乳動物がヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１−１】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−２】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−３】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−４】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−５】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−６】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−７】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−８】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−９】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−１０】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−１１】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−１２】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−１３】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−１４】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−１５】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−１６】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−１７】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−１８】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−１９】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−２０】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−２１】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−２２】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−２３】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−２４】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−２５】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−２６】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−２７】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−２８】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−２９】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−３０】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−３１】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−３２】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−３３】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図１−３４】配列番号１〜８０の核酸またはアミノ酸配列を提供する。
【図２】クロストリジウム・ディフィシル菌の臨床的単離におけるディフォシンの殺菌活性を示す。指標菌番号は、マトリクスの上段に沿って示される、即ち、アスタリスク付の菌株は、ＮＡＰ１／０２７／ＢＩ菌株である。ディフォシンで試験された当該クロストリジウム・ディフィシル菌の由来識別は、左端に沿って示される。菌株は、ＬＣ  Ｆｏｒｔｉｅｒ（４及び１６）、ＡＴＣＣ（４３５９３）、または ＲＭ  Ａｌｄｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ，Ｃｕｌｖｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ．から入手した。
【図３】ディフォシン１６の走査型電子顕微鏡写真を示す。花状の尾部繊維の器官に注目のこと。
【図４】標的株Ｃｄ１９１３５に対するディフォシン４のスポットアッセイ結果の写真である。精製ディフォシンを、連続的に１０倍希釈し、そして５μｌの希釈液標本を、標的のクロストリジウム・ディフィシル菌の菌叢上に滴下した。３７℃で、一晩の嫌気性培養の後、前記菌叢上の明瞭化判定により、ディフォシンの殺菌性が示された。
【図５】ディフォシン４（「４」）及びディフォシン１６（「１６」）のふるい（「Ｆ」）及び非ふるい（「ＵＦ」）効果標本の銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真を示す。矢印は、切除され、質量分析により特定されたバンドを示す。
【図６】Ｃｄ６３０及びＣｄ１６からのディフォシン遺伝子クラスターの概略図を示す。ミオウイルスファージ尾部器官の典型的な構造タンパク質および集合タンパク質をコードするＯＲＦからなる遺伝子座、ＯＲＦ１３６２からＯＲＦ１３７５、が以下のマップに示されている。隣接するこれらの遺伝子は、推定上のファージ状調整タンパク質をコードする遺伝子である。図の下の矢印は、当該ＯＲＦが転写される位置を示し、そして当該ＯＲＦの推定機能がマップ上部に示される。
【図７】クロストリジウム・ディフィシル菌株１９０９９の菌叢で試験された枯草菌ＢＤＲ１２３−４８８（セクター１）及びＢＤＲ１２３−４９１（セクター２）により産生されるディフォシン１６のスポットアッセイのイメージである。
【図８−１】活性ディフォシンを産生するクロストリジウム・ディフィシル菌の５株それぞれからのＯＲＦ１３７４遺伝子にコードされる部分アミノ酸配列（配列番号８１−８６、各々の登場順）の１Ｗクラスター分析の結果を提供する。各々の配列の下部のアスタリスク  「*」は、５株すべてによってコードされた位置でのアミノ酸の同定を表し、「：」は、５株すべてによってコードされた位置での高位に類似したアミノ酸であることを表し、「・」は、５株すべてによってコードされた位置でのいくらか類似したアミノ酸であることを表し、及び配列の既知の位置においての空白は、５株すべてによってコードされた類似のアミノ酸が無いことを表す。
【図８−２】活性ディフォシンを産生するクロストリジウム・ディフィシル菌の５株それぞれからのＯＲＦ１３７４遺伝子にコードされる部分アミノ酸配列（配列番号８１−８６、各々の登場順）の１Ｗクラスター分析の結果を提供する。各々の配列の下部のアスタリスク  「*」は、５株すべてによってコードされた位置でのアミノ酸の同定を表し、「：」は、５株すべてによってコードされた位置での高位に類似したアミノ酸であることを表し、「・」は、５株すべてによってコードされた位置でのいくらか類似したアミノ酸であることを表し、及び配列の既知の位置においての空白は、５株すべてによってコードされた類似のアミノ酸が無いことを表す。
【図８−３】活性ディフォシンを産生するクロストリジウム・ディフィシル菌の５株それぞれからのＯＲＦ１３７４遺伝子にコードされる部分アミノ酸配列（配列番号８１−８６、各々の登場順）の１Ｗクラスター分析の結果を提供する。各々の配列の下部のアスタリスク  「*」は、５株すべてによってコードされた位置でのアミノ酸の同定を表し、「：」は、５株すべてによってコードされた位置での高位に類似したアミノ酸であることを表し、「・」は、５株すべてによってコードされた位置でのいくらか類似したアミノ酸であることを表し、及び配列の既知の位置においての空白は、５株すべてによってコードされた類似のアミノ酸が無いことを表す。
【図８−４】活性ディフォシンを産生するクロストリジウム・ディフィシル菌の５株それぞれからのＯＲＦ１３７４遺伝子にコードされる部分アミノ酸配列（配列番号８１−８６、各々の登場順）の１Ｗクラスター分析の結果を提供する。各々の配列の下部のアスタリスク  「*」は、５株すべてによってコードされた位置でのアミノ酸の同定を表し、「：」は、５株すべてによってコードされた位置での高位に類似したアミノ酸であることを表し、「・」は、５株すべてによってコードされた位置でのいくらか類似したアミノ酸であることを表し、及び配列の既知の位置においての空白は、５株すべてによってコードされた類似のアミノ酸が無いことを表す。
【図８−５】活性ディフォシンを産生するクロストリジウム・ディフィシル菌の５株それぞれからのＯＲＦ１３７４遺伝子にコードされる部分アミノ酸配列（配列番号８１−８６、各々の登場順）の１Ｗクラスター分析の結果を提供する。各々の配列の下部のアスタリスク  「*」は、５株すべてによってコードされた位置でのアミノ酸の同定を表し、「：」は、５株すべてによってコードされた位置での高位に類似したアミノ酸であることを表し、「・」は、５株すべてによってコードされた位置でのいくらか類似したアミノ酸であることを表し、及び配列の既知の位置においての空白は、５株すべてによってコードされた類似のアミノ酸が無いことを表す。
【図９】ＢＤＲ１２３−５８０によって産生された「ディフォシン４」及び「ディフォシン４−１６」のスポットアッセイのイメージである。後者は、ディフォシン４のＯＲＦ１３７４（配列番号４９）が、ディフォシン１６のＯＲＦ１３７４（配列番号１７）に交換されたことにおいて、枯草菌ＢＤＲ１２３−５８７によって産生された。枯草菌により産生されたこれら２種のディフォシンは、図に見られるように、１９１３７および１９１４５の両菌叢上で検査された。「ディフォシン４−１６」による殺菌特異性は、ディフォシン４の特異性をディフォシン１６の特異性に変換し得られた。
【図１０】異種ディフォシンを投与されたマウスのクロストリジウム・ディフィシル菌による負荷を、非投与のマウスの負荷と比較したプロット図である。新規の、非―１３７４ベースＲＢＤを含むディフォシンは、体内でＣＤＩを減少させるように機能した。クロストリジウム・ディフィシル菌の芽胞に攻撃された非投与マウス（「無Ｄｉｆｆ」）との比較では、クロストリジウム・ディフィシル菌の芽胞に攻撃されさらに新規の、非―１３７４ベースＲＢＤを含むディフォシンを経口投与されたマウス（「＋Ｄｉｆｆ」）は、クロストリジウム・ディフィシル菌の糞便中への排出量において、統計的に有意な（スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５）著しい減少を示した。
【図１１−１】配列番号８７〜１６３の核酸配列またはアミノ酸配列を提供する。
【図１１−２】配列番号８７〜１６３の核酸配列またはアミノ酸配列を提供する。
【図１１−３】配列番号８７〜１６３の核酸配列またはアミノ酸配列を提供する。
【図１１−４】配列番号８７〜１６３の核酸配列またはアミノ酸配列を提供する。
【図１１−５】配列番号８７〜１６３の核酸配列またはアミノ酸配列を提供する。
【図１１−６】配列番号８７〜１６３の核酸配列またはアミノ酸配列を提供する。
【図１１−７】配列番号８７〜１６３の核酸配列またはアミノ酸配列を提供する。
【図１１−８】配列番号８７〜１６３の核酸配列またはアミノ酸配列を提供する。
【図１１−９】配列番号８７〜１６３の核酸配列またはアミノ酸配列を提供する。
【図１１−１０】配列番号８７〜１６３の核酸配列またはアミノ酸配列を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
定義
ここで使用される、Ｒ型高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンは、単純にはＲ型バクテリオシンとして公知であり、そしてＲ型タンパク質、ディフォシン、モノシン、エンテロコリティシン、メニンゴシン、または構造的あるいは遺伝子的にバクテリオファージのミオウイルスファミリーに関連する他の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンを含む。Ｒ型バクテリオシンは、Ｒ型タンパク質、ディフォシン、モノシン、エンテロコリティシン、メニンゴシンの改変型を含む（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｓｔｒａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，１９６６，Ｚｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。
【００２１】
本明細書中で使用される用語「ディフォシン」は、クロストリジウム・ディフィシル菌から単離または誘導されたＲ型高分子量バクテリオシンを指し、及びクロストリジウム・ディフィシル菌から得られる未変性の球状物を含むと同時に、人工の産生セルにおいて当該ディフォシン遺伝子クラスターの発現を通して得られる球状物をも含む。ディフォシンは、クロストリジウム・ディフィシル菌の一つまたはそれ以上の菌株から誘導された遺伝子にコードされるポリペプチドから成る遺伝子組換えの球状物であってよく、そして配列番号２−２３、４９及び６２−８０の一つまたはそれ以上のポリペプチドと８０％またはそれ以上同一であるポリペプチドから成る。
【００２２】
本発明のＲ型バクテリオシンは、熱不安定性、弱い耐酸性、トリプシン耐性、約６５，０００ｘｇの遠心分離機での沈降を示し、そして電子顕微鏡で解析できる（Ｋａｇｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９６２，Ｂｒａｄｌｅｙ，１９６７，Ｄａｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊａｂｒａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｆｏｒｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。多く場合、ここで開示される遺伝子組換えされたＲ型バクテリオシンは、いかなる組み合わせにおいても、これら性質の一つまたはそれ以上を有する。ここで開示される当該Ｒ型バクテリオシンに普通にみられる付随的な性質は、核酸を含まず、多くのバクテリオファージでは可能であるが、標的細菌の殺菌後またはその間にそれら自身では再産生できない複製欠損性である。本発明のＲ型バクテリオシンは、純粋にタンパク質であり、有機生命体ではない。
【００２３】
ここで開示されるＲ型バクテリオシンは、複数のタンパク質またはポリペプチドを構成する複合分子であり、ミオウイルスファミリーのサブユニットであり及びバクテリオファージの尾部構造に類似している。天然状態で現れるＲ型バクテリオシンは、サブユニット構造が、クロストリジウム・ディフィシル菌または緑膿菌のような細菌ゲノムによってコードされ、そして他の細菌に対する自然な防衛を果たすためにＲ型バクテリオシンが形成される（Ｋａｇｅｙａｍａ．，１９７５）。感受性がある標的細菌は、単純なＲ型バクテリオシン分子によって典型的に死滅する（Ｋａｇｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９６４，Ｋａｇｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９６４ａ，Ｍｏｒｓｅ  ｅｔａｌ．，１９８０，Ｓｔｒａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【００２４】
「標的細菌」または「標的細菌群」とは、当開示のＲ型バクテリオシンに結合され、及び／または成長が悪化し、残存し、または複製が抑制される細菌または細菌群を呼ぶ。いくつかの実施形態において、当該標的細菌は、クロストリジウム菌属から選ばれる。特定の実施形態において、当該細菌は、クロストリジウム・ディフィシル菌である。一つの態様において、クロストリジウム・ディフィシル菌の一つ以上の株が標的となる。クロストリジウム・ディフィシル菌の典型的な株を含めるが、図２に記載されているように、ＮＡＰ１／ＢＩ／リボ型０２７に限定されない。
【００２５】
本明細書中で使う用語「成長阻害」または変異とは、細菌の細胞分裂割合の緩徐化または停止または細胞分裂の休止、または当該細菌または細菌群の死滅を指す。
【００２６】
本明細書中で使用される用語「核酸」または「核酸分子」は、典型的には、一本鎖または二本鎖を形成するデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマー（精製もしくは混合されたもの）を指す。当該用語は、ヌクレオチド類似体または改変された骨格残基または連鎖含む核酸でよく、それらは合成され、自然発生し、および人工的に出現したのでよく、参照される核酸と類似の結合状態、構造、または機能的性質を持つものでよく、および参照されるヌクレオチドに類似した方法で代謝されたものでよく、それらを包含してよい。そのような類似体の例として、これに限定されないが、ホスホロチオエート、オキサザホスホリジン、メチル酸、キラルメチル酸、２−０メチルリボヌクレオチド、及びペプチド核酸 （ＰＮＡｓ）がある。用語の核酸は、ある文脈においては、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドと交換可能で使用される。
【００２７】
特定の核酸配列は、示唆的に示される配列と同様に、保存的に変更された変異配列（縮退コドン置換のような方法で）及び相補的配列をも網羅する。特に、縮退コドン置換は、混合塩基及び／またはデオキシノイシン残基で置換されているコドンの一つまたはそれ以上（またはすべて）の第三位（「ゆらぎ」）にある遺伝子配列によって達成されうる。このように、本明細書で開示されるタンパク質配列をコードする核酸配列は、ここで記述されるような改変された異種をも網羅する。
【００２８】
本明細書中で、アミノ酸配列に関連して使用される用語「セグメント」は、長さが１０、１２、１５、２０、２５、５０ または１００個のアミノ酸残基であるアミノ酸の連続配列を指す。
【００２９】
本明細書中で使用される用語「異種性」とは、タンパク質配列または核酸配列の位置に関連して使用されるが、当該配列が、天然状態では互いに同様の関係性において通常見られない二つまたはそれ以上の置換を含む配列を指す。一つの実施例において、異種配列は、細菌の異なった種から産生される。別の実施例において、異種配列は、細菌の同じ種の異なった株から産生される。一つの態様において、当該異種配列は、クロストリジウム・ディフィシル菌の異なった株から産生される。他の態様において、当該異種配列は、細菌群及びバクテリオファージまたはプロファージから、または細菌群および合成されたＤＮＡの人工配列から産生される。
【００３０】
本明細書中で使用される用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「たんぱく質」とは、アミノ酸残基ポリマーに関連して典型的に交換可能な用語を指す。アミノ酸は、広く公知の三つの文字記号または、国際生化学連合の命名委員会（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ）によって提唱される一つの文字記号によって引用される。
【００３１】
病原性因子とは、生命体の一般的な生存率に関わらず病原性に関わる分子である。よって病原性因子の欠如は、生命体は病原性を減らし、生存率を低めることはない。病原性因子は、多数の機能、例えば、遺伝子発現抑制、定着性または移動性供与、毒素供与、毒素注入、抗生物質の排除、または生物膜を含む保護被膜の形成などのいくつかを有する。
【００３２】
適合因子とは、生命体の一般的な生存率、成長率またはその環境における競合性に関わる分子である。よって、適合因子の欠如は、生命体が生存率を低めまたは競合状態になり、そのような妥協の結果、間接的に病原性を減らす。適合因子はまた、多数の機能、例えば、栄養素、イオンまたは水の獲得、細胞膜または細胞壁の成分や保護層の形成、核酸の複製、修復、または変異誘発、環境傷害または競合傷害への保護や攻撃のいくつかを有する。
【００３３】
本明細書中で使用される用語「プロデューサー細胞」とは、ディフォシンをコードし、自然には含まれない核酸分子を産生しまたは発現する能力のある細胞を指す。プロデューサー細胞は、酸素の存在下で生存し成長することができ、及び当該ディフォシンをコードする核酸分子を含むベクターが、プロデューサー細胞の染色体に組み込まれるかまたはエピゾームになりえて、プロデューサー細胞の形質を転換する。当該プロデューサー細胞は、グラム陽性細菌である。ある実施形態において、当該プロデューサー細胞は、桿菌属、乳酸菌属、乳酸球菌属、クロストリジウム菌属、またはリステリア菌属から選ばれる細菌でよい。望ましい実施形態において、当該プロデューサー細胞は、桿菌属、乳酸菌属、乳酸球菌属、またはリステリア菌属から選ばれる細菌である。いくつかの実施形態において、当該細菌は、枯草菌、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、及び巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｎ）からなる群から選ばれる桿菌の中の一種である。一つの態様において、当該細菌は、枯草菌である。特定の態様において、当該プロデューサー細胞は、ＰＢＳＸ遺伝子クラスターを欠損する枯草菌株である。他の態様において、当該細菌は、乳酸菌、カゼイ菌、およびブルガリア乳酸桿菌の群から選ばれる乳酸菌属の中の一種である。さらに他の実施形態において、当該細菌は、リステリア菌である。他の実施形態において、当該非病原性プロデューサー細胞は、大腸菌またはクロストリジウム菌遺伝子の細胞であってよい。
【００３４】
本開示の実施様式の詳細な説明
クロストリジウム・ディフィシル菌から単離されるＲ型バクテリオシンは、殺菌活性を有する。
殺菌活性試験のため、中長期の厳格な嫌気環境下での細胞培養と、３μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ培養液への暴露を通して、２種のクロストリジウム・ディフィシル菌株、Ｃｄ４及びＣｄ１６（ＬＣ  Ｆｏｒｔｉｅｒより入手）、の溶菌液を作成した。細菌溶解の後、当該溶解液の粒子を、高速遠心分離機により濃縮および精製した（実施例１）。これらの試料は、頭部のないファージ状粒子（図３）の濃縮物を含んでいることが、電子顕微鏡で示された。濃縮および精製の後、当該試料の殺菌活性をスポットアッセイにて評価するため、サンプルを厳格な嫌気環境の下で標的のクロストリジウム・ディフィシル菌の菌叢に供した。ほとんどのファージ尾部状バクテリオシンは、その産生細菌とは異なる菌株を標的にするので、初期段階として、臨床的に単離された２９のクロストリジウム・ディフィシル菌のパネルからなる標的株の試験を行った。一晩培養の後、前記精製物質を斑点滴下したクロストリジウム・ディフィシル菌叢を、明瞭化判定によって、試験体の殺菌活性の存在を評価した。図４は、Ｃｄ４から産生したディフォシン（ｄｉｆ４）をクロストリジウム・ディフィシル菌株、Ｃｄ１９１３５、上に滴下した典型的なスポットアッセイを示している。
【００３５】
Ｄｉｆ４（Ｃｄ４産生のディフォシン）およびｄｉｆ１６（Ｃｄ１６産生のディフォシン）は、スポットアッセイの結果では異なる殺菌スペクトルを示した（図２）。Ｄｉｆ４は、臨床的に単離された２９のクロストリジウム・ディフィシル菌株の内、１０株において殺菌活性を示し、ｄｉｆ１６は、２９株中の８株において活性を持っていた。重複して両ディフォシンの影響を受けたいくつかの株があり、当該２種のディフォシンは、明らかな殺菌スペクトルを有していた。Ｃｄ１０８及びＣｄ４３５９３から産生したディフォシンは、大変に類似した殺菌スペクトルを有し、２９のクロストリジウム・ディフィシル菌のパネル中の１０のＮＡＰ１／０２７／ＢＩ強毒性株の内の少なくとも９株を死滅させた。さらなる試験で、ｄｉｆ４３５９３は、１８すべての追加、単独のＮＡＰ１／０２７／ＢＩ単離株を死滅させた。このように、ｄｉｆ４３５９３は、ＮＡＰ１／０２７／ＢＩ型クロストリジウム・ディフィシル菌の２８すべての試験株を死滅させた（図２）。
【００３６】
ディフォシン遺伝子座の特定
ディフォシン粒子、Ｃｄ４株から単離し精製したものを変性し、及びタンパク質成分を、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）によって分離し、そして銀染色によって検出した（図５）。二つの独立したバンド、〜２００ｋＤ及び〜４０ｋＤ、を切除し、質量分析を行った。４０ｋＤバンドからのペプチドは、参照株Ｃｄ６３０（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＣ＿００９０８９．１）を含む完全な遺伝子配列を持つ多様なクロストリジウム・ディフィシル菌株の中で、２種のクロストリジウム・ディフィシル菌のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からコードされる予測物資と一致することを発見した。最初の物質は、ＯＲＦ１３６３（配列番号５）に対応した、３９，１９２ダルトンのファージ状タンパク質であった。このバンドにおける二番目に優位のポリペプチドは、ＯＲＦ１３７１（配列番号１４）に対応しており、３９，５６５ダルトンのファージ状基板タンパク質であった。これらのタンパク質は、分子量が偶然にも非常に近く、ＳＤＳ  ＰＡＧＥの同じバンドに移行した。前記２００ｋＤバンドは、他の二つのファージ状ＯＲＦのすぐ下流にあるＯＲＦ１３７４（配列番号１７）のＣ末端のタンパク質に対応した主要なタンパク質を産生した。
【００３７】
これらのＯＲＦは、Ｃｄ６３０遺伝子内の非常に隣接した位置にあるので、その周辺領域を分析した。１５７４５９３塩基と１５９６３８４塩基の間に、ＯＲＦ１３６０Ａ−１３７９（図６および配列番号１−２３）を含む１個のプロファージ状要素を発見した。特に注目点として、この領域にコードされた構造遺伝子が、典型的なミオウイルスファージの尾部構造の成分だけに対応していた事である。つまり、カプシド対応遺伝子、カプシドをもったタンパク質、またはポータルタンパク質は発見されなかった。さらに推定のＤＮＡ複製またはＤＮＡパッケージ構造をコードしたいかなるＯＲＦもなかった。このように、この遺伝子座は、一つのＲ型（ミオウイルスファージの尾部状の）バクテリオシンの遺伝子配列であるとことに間違いなかった。隣接する構造遺伝子は、推定のファージ状抑制タンパク質をコードする複数のＯＲＦであった。この遺伝子座のＯＲＦが、ディフォシン粒子の中に発見されたポリペプチドをコードし、そして遺伝子クラスターがＲ型バクテリオシンのものと類似していたという事実から、我々は、この領域が当該ディフォシン遺伝子座であると指定した。
【００３８】
当該構造遺伝子は、一つの染色分体状にコードされ、同じ方向で転写された。遺伝子構成は、Ｒ型ピオシン及び多数のミオウイルスファージの構造に類似していた。構造タンパク質のいくつかは、ファージΦ１１９、及びΦＣ２（Ｇｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｇｏｖｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）を含む公知のクロストリジウム・ディフィシル菌ファージとの配列類似性を示した。またクロストリジウム・ディフィシル菌株Ｃｄ６３０は、二つの無傷プロファージをコードすることが知られている。ディフォシンＯＲＦのいくつかは、クロストリジウム・ディフィシル菌株Ｃｄ６３０のプロファージ１及び２との配列類似性を有し、これはこれらのクロストリジウム・ディフィシル菌のミオウイルスファージ及びディフォシンが共通の系統を有することを示唆する。
【００３９】
特別の注目点として、当該ディフォシンのＯＲＦ１３７４（配列番号１７）遺伝子があげられる。この遺伝子、ＯＲＦ１３７３、は、配列番号１６の隣接する下流に巨大ポリペプチドをコードした。ＯＲＦ１３７４が当該Ｒ型バクテリオシン尾部繊維の一部であることを示した遺伝子群の位置は、すなわち、受容体結合ドメインである（ＲＢＤ）。ディフォシンとして設計されたものの電子顕微鏡写真で、その尾部繊維領域において、大きな花状構造が明らかになったので、この構造が、巨大タンパク質を含んでいることが明白になった。ＯＲＦ１３７３（配列番号１６）は、当該ディフォシン尾部繊維の基板接合領域、ＢＰＡＲ、をコードしており、そしてＢＰＡＲとともにＲＢＤをコードしていたクロストリジウム・ディフィシル菌ファージにおける類似ＯＲＦ１３７３の省略形であることが明らかになった。そのようなファージは、ＯＲＦ１３７４を欠いている。このように、天然産生するディフォシンの尾部繊維は、二つのタンパク質、ＯＲＦ１３７３及びＯＲＦ１３７４から成り、結合尾部繊維を形成している。そこでは、クロストリジウム・ディフィシル菌のバクテリオファージは、一本鎖のタンパク質である、ディフィシル菌のＢＰＡＲ及びＲＢＤの機能を提供する幾分長めのＯＲＦ１３７３からなる尾部繊維を持つ。この知見に伴って、本発明において、ＯＲＦ１３７３（配列番号１６）または ＯＲＦ１３７４（配列番号１７）のいずれかをコードする核酸を、新規ＲＢＤ特異性機能を遺伝子組換えで得るための基質として検討した。
【００４０】
ディフォシンは、単離したクロストリジウム・ディフィシル菌に広汎性である。
単一のクロストリジウム・ディフィシル菌の臨床的単離品のシリーズを使用して、異なる殺菌スペクトルを持つと思われるディフォシン粒子の産生能力を評価した。臨床的に単離したＣｄ１９１２３、Ｃｄ１９１４５、Ｃｄ１９１２６、Ｃｄ１９１０８（ＲＭ  Ａｌｄｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｕｌｖｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ．から入手）及び ＡＴＣＣ  Ｃｄ４３５９３を、厳格な嫌気性環境の下、マイトマイシンＣに誘導した。次いで、産生された粒子の精製と濃縮を行った。精製物は、殺菌活性を検出するために臨床的に集められた他のクロストリジウム・ディフィシル菌叢に別々に斑点滴下した。それらの結果は、これら単離株の各々が粒子を産生し（臨床的単離株 Ｃｄ１９１２３、Ｃｄ１９１４５、Ｃｄ１９１２６、Ｃｄ１９１０８、及びＡＴＣＣ  Ｃｄ４３５９３の各々からのディフォシンを、ｄｉｆ１２３、ｄｉｆ１４５、ｄｉｆ１２６、ｄｉｆ１０８、及びｄｉｆ４３５９３と命名）、異なる殺菌スペクトルを示した（図２）。Ｄｉｆ１０８及びｄｉｆ４３５９３は、非常に類似した広範囲のスペクトルを示す一方で、Ｃｄ１９１４５株は、狭い殺菌スペクトルをもった粒子を産生した。誘導試験したＣｄ１９１１３及びＣｄ１９１５０を含むいくつの単離株は、マイトマイシンに暴露後に溶菌したが、検出可能なディフォシン粒子を産生しなかった。
【００４１】
本試験で、ゲノム配列の試験株Ｃｄ６３０は、ディフォシン遺伝子座をコードしたことが認められた。事実、このゲノムは、当該ディフォシン遺伝子を特定するために使用された。しかしながら一方で、マイトマイシンＣで誘導後に溶菌したＣｄ６３０株は、検出可能なディフォシン粒子を産生しなかった。その代り、少量のプロファージ１及びプロファージ２を産生した。
【００４２】
ディフォシン遺伝子群の特定とクローン化
Ｃｄ６３０は、マイトマイシンＣによる溶菌誘導で検出可能なディフォシン粒子を産生しなかった。したがって、それと引き換えにＣｄ１６由来の当該ディフォシン遺伝子クラスターをクローン化した。Ｃｄ１６の遺伝子配列の概要が初めて得られた。Ｃｄ６３０の遺伝子座に類似しているディフォシン遺伝子座を特定し、注釈を施した。Ｃｄ１６プロデューサー株からのディフォシンの全遺伝子クラスター（配列番号１）をクローニングベクター（ＢＡＣ）にクローン化し、次いで偏性嫌気性細菌ではない非病原性微生物に活性ディフォシンを産生するために必要な全遺伝子を含むように発現させた。クロストリジウム・ディフィシル菌は、病原性でありかつ偏性嫌気性細菌であるため、天然産生のディフォシンまたは人工的なＤＮＡ組み換えによって変性されたディフォシンにとって常識に反した産生細胞である。単離されたディフォシン遺伝子クラスターはまた、遺伝子組み換え技術によって加工し、無毒低分子インデューサーまたはその遺伝子クラスターに加えられたデリプレッサーに対応する異種プロモーターによって発現を制御できる。このような低分子物は、これに限定されないが、テトラサイクリン、無水テトラサイクリン、ラクトース、アラビノース、キシロース及びラクトースを置き換えるＩＰＴＧのような、それらの非代謝類似物を含む。
【００４３】
ディフォシン
ディフォシンは、クロストリジウム・ディフィシル菌から単離されたＲ型ｈｍｗバクテリオシンであり、他のクロストリジウム・ディフィシル菌株に対して殺菌性である。ディフォシンは、マイトマイシンＣの存在下において嫌気性環境の下で成長するクロストリジウム・ディフィシル菌株から単離されてもよい。いくつかの実施形態において、当該ディフォシンは、クロストリジウム・ディフィシル菌の臨床的単離菌株であるＣｄ４、Ｃｄ１６、Ｃｄ１９１２３、Ｃｄ１９１４５、Ｃｄ１９１２６、Ｃｄ１９１０８、またはＡＴＣＣ  Ｃｄ４３５９３（各々 ｄｉｆ４、ｄｉｆ１６、ｄｉｆ１２３、ｄｉｆ１４５，ｄｉｆ１２６，ｄｉｆ１０８、及びｄｉｆ４３５９３と呼ぶ）から単離される。一つの態様において、当該ディフォシンは、Ｃｄ４から単離され、他の態様において、Ｃｄ１６から単離される。
【００４４】
本発明の他の実施形態において、クロストリジウム菌属のゲノムから誘導されるディフォシンをコードする単離された核酸分子を提供する。一つの態様において、当該核酸分子は、配列番号１の遺伝子クラスターを含む。他の態様において、当該核酸分子は、配列番号６１の遺伝子クラスターを含む。他の実施形態において、当該核酸分子は、配列番号２−２３、４９、６２−８０からなる群から選ばれる一つまたはそれ以上のポリペプチドを含むディフォシンをコードする。さらに他の実施形態において、当該核酸分子は、配列番号４−１６、１８、１９、及び６６−８０からなる群から選ばれる一つまたはそれ以上のポリペプチドを含むディフォシンをコードする。一つの態様において、当該核酸分子は、配列番号２−２３のポリペプチドをコードする。他の態様において、当該核酸分子は、配列番号４９及び６２−８０のポリペプチドをコードする。
【００４５】
さらに変異ディフォシンを提供する。変異ディフォシンは、配列番号４−１６、１８、１９、及び６６−８０からなる遺伝子群から選ばれるポリペプチドに、少なくとも８０％が同一であるアミノ酸配列を持つディフォシンを含む。他の実施形態において、当該変異ディフォシンは、配列番号４−１６、１８、１９、および６６−８０からなる遺伝子群から選ばれるポリペプチドに、少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が同一であるアミノ酸配列を持つ。
【００４６】
いくつかの実施形態において、当該変異ディフォシンは、異種の基板接合領域（ＢＰＡＲ）を含んでよく、前記ＢＰＡＲは、配列番号１６、５４−５６、及び７８の一つまたはそれ以上の対応セグメントに少なくとも８０％同一である。他の実施形態において、当該ＢＰＡＲは、配列番号１６、５４−５６、及び７８の一つまたはそれ以上の対応セグメントに少なくとも８５％同一である。他の実施形態において、当該ＢＰＡＲは、配列番号１６、５４−５６、及び７８の一つまたはそれ以上の対応セグメントに少なくとも８９％同一である。他の実施形態において、当該ＢＰＡＲは、配列番号１６、５４−５６、及び７８の一つまたはそれ以上の対応セグメントに少なくとも９０％同一である。さらに他の実施形態において、当該ＢＰＡＲは、配列番号１６、５４−５６、及び７８の一つまたはそれ以上の対応セグメントに少なくとも９５％同一である。その上さらに他の実施形態において、当該ＢＰＡＲは、配列番号１６、５４−５６、及び７８の一つまたはそれ以上の対応セグメントに少なくとも９８％同一である。さらなる実施形態において、当該ＢＰＡＲは、配列番号１６、５４−５６、及び７８の一つまたはそれ以上の対応セグメントに少なくとも９９％同一である。
【００４７】
いくつかの実施形態において、当該変異ディフォシンは、未変性のＢＰＡＲポリペプチドのアミノ末端に、少なくとも５０個の連続アミノ酸を含む。さらなる実施形態において、当該変異ディフォシンは、未変性のＢＰＡＲポリペプチドのアミノ末端に、少なくとも１００個の連続アミノ酸を含む。特定の実施形態において、少なくとも５０個のアミノ酸の結合鎖は、配列番号７８のポリペプチドに少なくとも８０％同一であるＢＰＡＲのアミノ酸末端にある。ある態様において、少なくとも５０個のアミノ酸の結合鎖は、配列番号７８のポリペプチドに少なくとも８５％、９０％、９５％、または９８％同一であるＢＰＡＲのアミノ酸末端にある。他の態様において、少なくとも１００個のアミノ酸の結合鎖は、配列番号７８のポリペプチドに少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＢＰＡＲのアミノ酸末端にある。
【００４８】
他の実施形態において、当該変異ディフォシンは、ＲＢＤが同族のＢＰＡＲを含む。ここで使用する、「ＲＢＤと同族のＢＰＡＲ」または「同族ＢＰＡＲ」とは、天然ディフォシン、クロストリジウム・ディフィシル菌ゲノム、バクテリオファージ、またはプロファージにおいて同時に現れるＢＰＡＲとＲＢＤのペアーを指す。特定の実施形態において、当該ＲＢＤとその同族ＢＰＡＲは、発現したディフォシン分子以外には、異種である。一つの態様において、当該同族ＢＰＡＲは、ディフォシンの未変性ＢＰＡＲのアミノ末端に融合し、「融合ＢＰＡＲ」を形成する。このように、いくつかの実施形態において、当該変異ディフォシンは、融合ＢＰＡＲを含む。ある実施形態において、当該変異ディフォシンは、異種ＲＢＤ及びその同族ＢＰＡＲを含む。いくつかの実施形態において、当該融合ＢＰＡＲは、配列番号８８、９１、９３、９５、９７，９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９，１１１、及び１１５からなる遺伝子群から選ばれる配列に少なくとも８０％同一である。他の実施形態において、当該融合ＢＰＡＲは、配列番号８８、９１、９３、９５、９７，９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９，１１１、及び１１５からなる遺伝子群から選ばれる配列に少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。
【００４９】
さらなる実施形態において、当該変異ディフォシンは、異種受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含んでよく、ここで、前記ＲＢＤは、配列番号１７及び４９−５３の一つまたはそれ以上の対応セグメントに少なくとも８０％同一であるか、または配列番号５４−５６からなる遺伝子群から選ばれたポリペプチドの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）領域を含むポリペプチドに少なくとも８０％同一である。他の実施形態において、当該ＲＢＤは、配列番号１７および４９−５３の一つまたはそれ以上の対応セグメントに少なくとも８５％同一であるか、または配列番号５４−５６からなる遺伝子群から選ばれたポリペプチドの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）領域を含むポリペプチドに少なくとも８５％同一である。他の実子形態において、当該ＲＢＤは、配列番号１７および４９−５３の一つまたはそれ以上の対応セグメントに少なくとも８９％同一であるか、または配列番号５４−５６からなる遺伝子群から選ばれたポリペプチドの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）領域を含むポリペプチドに少なくとも８９％同一である。他の実施形態において、当該ＲＢＤは、配列番号１７及び４９−５３の一つまたはそれ以上の対応セグメントに少なくとも９０％同一であるか、または配列番号５４−５６からなる遺伝子群から選ばれたポリペプチドの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）領域を含むポリペプチドに少なくとも９０％同一である。他の実施形態において、当該ＲＢＤは、配列番号１７及び４９−５３の一つまたはそれ以上の対応セグメントに少なくとも９５％同一であるか、または配列番号５４−５６からなる遺伝子群から選ばれたポリペプチドの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）領域を含むポリペプチドに少なくとも９５％同一である。他の実施形態において、当該ＲＢＤは、配列番号１７および４９−５３の一つまたはそれ以上の対応セグメントに少なくとも９８％同一であるか、または配列番号５４−５６からなる遺伝子群から選ばれたポリペプチドの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）領域を含むポリペプチドに少なくとも９８％同一である。他の実施形態において、当該ＲＢＤは、配列番号１７および４９−５３の一つまたはそれ以上の対応セグメントに少なくとも９９％同一であるか、または配列番号５４−５６からなる遺伝子群から選ばれたポリペプチドの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）領域を含むポリペプチドに少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態において、当該受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）領域は、配列番号５４、５５、または５６のカルボキシ末端残基に結合したアミノ酸残基５１を含む。
【００５０】
そのうえ他の実施形態において、当該ＲＢＤは、クロストリジウム・ディフィシル菌ゲノム、バクテリオファージ、クロストリジウム・ディフィシル菌に含まれるプロファージ挿入物またはプロファージ残物から産生する。「プロファージ残物」またはプロファージ要素または部位とは、完全なファージ分子よりむしろ、ファージまたは分離ファージタンパク質の位置のみをコードする配列を指す。このように、いくつかの実施形態において、プロファージ残物は、例えば、ＲＢＤおよびその同族ＢＰＡＲをコードする配列、そして基板遺伝子を含んでよい。いくつかの実施形態において、当該ＲＢＤは、配列番号９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２及び１１６からなる遺伝子群から選ばれるＲＢＤに少なくとも８０％同一である。他の実施形態において、当該ＲＢＤは、配列番号９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２及び１１６からなる遺伝子群から選ばれるＲＢＤに少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、また９９％同一である。
【００５１】
他の実施形態において、ディフォシンは、遺伝子組換えでディフォシンＯＲＦ１３７３の産生物にファージ尾部ＲＢＤを融合させることにより、改変された殺菌スペクトルを持つようにすることが可能である。ＯＲＦ１３７４は、初期スペクトルの決定因子または天然ディフォシンＲＢＤをコードする一方で、この巨大タンパク質は、ＯＲＦ１３７３タンパク質と複合し、そしてＯＲＦ１３７３タンパク質はＢＰＡＲを与え、つまり、ＯＲＦ１３７４タンパク質のＲＢＤを当該ディフォシン基板構造に接合させる。ＯＲＦ１３７３は、Ｒ型ピオシンの尾部繊維のみならず、ΦＣＤ２（配列番号５４）、ΦＣＤ１１９（配列番号５５）、及びΦＣＤ２７（配列番号５６）のようなミオウィルス・バクテリオシンの尾部繊維遺伝子に類似しており、同一なアミノ酸配列を持つ。ディフォシンのＯＲＦ１３７３（例えば、配列番号１６または７８）は、特にＮ末端タンパク質またはＢＰＡＲにおける最初の１６０個のアミノ酸において特徴的であるが、クロストリジウム・ディフィシル菌ミオウイルスファージ、ΦＣＤ２（配列番号５４）、の尾部繊維と非常に類似した配列を持つ。しかしながら、それらのファージ尾部繊維は、ディフォシンＯＲＦ１３７３タンパク質より長く、そしてそれらの標的バクテリアを識別するためにＣ末端ＲＢＤを含んでいる。ディフォシンのＯＲＦ１３７３タンパク質は、この後者のドメインを含まず、ＲＢＤ機能は、ＯＲＦ１３７４にコードされた、分離ポリペプチドに置き換えられている。このように、ＯＲＦ１３７４は、ディフォシン遺伝子クラスターおよびΦＣＤ２の尾部繊維のようなファージ尾部繊維のＲＢＤから、共に削除することができ、ＯＲＦ１３７３にコードされたディフォシンＢＰＡＲに融合することができ、それゆえ結果として、ファージ尾部状タンパク質を持ち、ドナーファージのホスト領域に関連した殺菌スペクトルを持つディフォシンを生み出すことができる。重要なことは、クロストリジウム・ディフィシル菌のファージ尾部状繊維とうまく機能融合するＯＲＦ１３７３タンパク質の間で、アミノ酸配列の領域が相同なので、片方が突然変異または非突然変異のクロストリジウム・ディフィシル菌ファージからホスト領域の異性体を選ぶことができ、そしてその領域は、新規の殺菌スペクトルを備えた改変ディフォシンを創出するための新規ＲＢＤ源となることである。
【００５２】
遺伝子組換えディフォシンの一つの実施形態において、そのＲＢＤが、他のクロストリジウム・ディフィシル菌株またはクロストリジウム・ディフィシル菌に感染するバクテリオファージからのＲＢＤで置き換えられたディフォシンを提供する。一つの実施例において、当該ディフォシンの核酸分子は、配列番号１６または７８をコードする配列からなり、未変性のＲＢＤに対応したもの（すなわち、各々配列番号１７または４９をコードする配列）を含まない、言い換えれば、未変性ＲＢＤが、異性体の配列をコードするＲＢＤで置き換えられる。特定の実施形態において、当該核酸分子は、クロストリジウム菌の異なる菌株のＲ型バクテリオシンの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）をコードする異種配列を含む。一つの態様において、当該核酸分子は、配列番号１６または７８をコードする配列および配列番号４９−５３からなる遺伝子群から選ばれるポリペプチドまたは配列番号５４−５６からなる遺伝子群から選ばれるポリペプチドの受容体結合ドメインをコードする配列を含む。他の態様において、当該核酸分子は、配列番号２−１６及び１８−２３または配列番号６２−８０をコードする配列、そして配列番号１７及び４９−５６からなる遺伝子群から選ばれるポリペプチドからのＲＢＤをコードする異種配列からなる。
【００５３】
遺伝子組換えによるディフォシンの他の実施形態において、当該ディフォシンのＲＢＤは、未変性のＲＢＤの改変型で置き換えてよい。「未変性ＲＢＤ」とは、クロストリジウム・ディフィシル菌株またはクロストリジウム・ディフィシル菌に感染するバクテリオファージから単離またはクローン化されたＲＢＤに特定されるアミノ酸配列を有するＲＢＤを指す。複数のクロストリジウム・ディフィシル菌株由来の未変性ＲＢＤの例として、配列番号１７及び４９−５３を含む。クロストリジウム・ディフィシル菌感染のバクテリオファージ由来の未変性ＲＢＤの例として、配列番号５４−５６を含む（例えばカルボキシ末端残基に結合したアミン酸残基５１）。いくつかの実施形態において、改変ＲＢＤは、未変性ＲＢＤに関連のあるＲＢＤのアミノ酸配列の変更を含む。アミノ酸配列の変更の非限定な例として、一つまたはそれ以上のアミノ酸の挿入（または付加）、または除去がある。さらなる実施形態において、ディフォシンは、特許出願ＵＳ  ２００６−０１２１４５０、Ｊｕｎ．８，２００６公開（その全体を参照としてここに組み入れる）に記載されるように、多様性を生み出すレトレオメント（ＤＧＲ）の開発により構造を多様化させる生物から誘導したＲＢＤでの置換、またはそれの挿入を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態において、改変ＲＢＤは、非改変または未変性ＲＢＤとは異なる殺菌スペクトルを有する。特定の実施形態において、改変ＲＢＤは、未変性ＲＢＤに少なくとも８０％同一である。他の実施形態において、当該ＲＢＤは、配列番号１７及び４９−５３からなる遺伝子群から選ばれたポリペプチド、または配列番号５４−５６からなる遺伝子群から選ばれたポリペプチドの受容体結合領域に少なくとも８５％、８８％、８９％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、そして当該改変ＲＢＤは、非改変または未変性ＲＢＤとは異なる殺菌スペクトルを有する。
【００５５】
いくつかの実施形態において、当該核酸分子はさらに、当該ＲＢＤの同族シャペロンをコードするポリヌクレオチドを含む。一つの態様において、当該シャペロンは、配列番号８９、９０、１１３、１１４、及び１１７からなる遺伝子群から選ばれる。
【００５６】
標的細菌
クロストリジウム・ディフィシル菌株は、その病原性によって、パルスゲル電気泳動により非常に幅広い患者から単離された。ＢＩ／ＮＡＰ１ またはリボタイプ ０２７菌株の異常増殖毒素は、トキシンＡ及びトキシンＢの発現レベルを抑制的に調整するｔｃｄＣ遺伝子の機能を欠いている結果、猛毒性である（ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【００５７】
事実、ｔｃｄＣの変異誘発遺伝子を内包しているクロストリジウム・ディフィシル菌株は、医療施設内や施設間で流行性の広がりを示してきた。これら流行性の猛毒株は、特に重要な標的細菌であり、従来からの抗生物質治療開始の前または直後の経口投与によってキャリア患者の胃腸管から予防的に排除できることが重要である。野生型レベルのトキシンＡ及びトキシンＢを産生するクロストリジウム・ディフィシル細菌は、潜在的には致死性であり、特に５０歳以上の患者には合併症を伴うため非常に重要な標的病原体である（ＢａｒｔｌｅｔｔＪＧ，２００２）。
【００５８】
クロストリジウム・ディフィシル菌株が持つ標的物表面に付着できる病毒性またはＳ層タンパク質のような適応因子、流行性などの因子は、菌株が流行性産生であるか否かにかかわらず、もしこれら因子が、標的とするＲ型バクテリオシンへの対抗勢力として現れるなら、そのような病原体に、かれらの病毒性または適応因子を解決させる魅力的な手段を与える。ディフォシンＲＢＤの高い特異性のために、クロストリジウム・ディフィシル菌以外の生命体は標的ではなく、胃腸管の共生細菌―正常な消化機能及び健康に必要な細菌に、付随的な傷害を引き起こさないので、これらの点は、ディフォシンの特異的で強力な利点となる。
【００５９】
「感染」は、部位または組織または非細菌細胞における細菌の増殖を指し、そこでは細菌は、現実的にまたは潜在的に、その部位または組織または非細菌細胞に疾患または症候を引き起こす。感染治療には、薬物、材料物、プロデューサー細胞、またはｄｉｆ４３５９３のようなディフォシンを産生する無害化クロストリジウム・ディフィシル菌の芽胞を伴う予防的治療を含めてよい。治療対象には、非限定的だが、提供された臓器、組織、及び細胞、人工呼吸器や透析機のような医療機器、手術中または術後の傷を含む。他の使用例として、さらなる増殖の問題を引き起こす標的細菌の除去を含む。追加的な実施形態において、ｈｍｗバクテリオシンを、食物、植物、または細菌感染または混入した植物の収穫物の治療に、または標的細菌の医療または商業施設のような場所における環境発生の治療に使用される。
【００６０】
本開示の記述として、抗菌性のＲ型バクテリオシンは、特定細菌群の増殖、残存、または複製を抑制するために使用してよい。その細菌群は、病原性または環境に有害な菌株であり、または予防的方法で治療されていてもよい。一般に病原性微生物は疾患を引き起こし、時として特定の状況下でのみ引き起こす。
【００６１】
ディフォシンの調製及び使用
ディフォシンは、約１千万ダルトンの粒子であり、そして差動遠心分離、差分ろ過、水性二相分離、ポリエチレングリコール （ＰＥＧ） 沈殿物及び／またはバイオ医薬品グレード経口抗菌薬を作成するイオン交換クロマトグラフィーによって分離及び精製できる。Ｒ型バクテリオシンは、凍結−解凍に安定であることがわかっており、乾燥噴霧で安定な製剤を作成することができる。
【００６２】
本発明のいくつかの実施形態において、Ｒ型ｈｍｗバクテリオシンの産生法を提供する。本方法は、当該Ｒ型バクテリオシンの発現を導く濃度での誘導剤に感受性のある誘導プロモーターに遺伝子操作でリンクしている核酸配列であり、Ｒ型ｈｍｗバクテリオシンをコードする前記核酸配列にプロデューサー細胞を暴露し、そして発現したＲ型バクテリオシンを精製する方法を含む。一つの態様において、当該Ｒ型高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンは、配列番号２−２３または配列番号４９及び６２−８０からなる遺伝子群から選ばれる一つまたはそれ以上のポリペプチドを含む。当該核酸分子は、プロデューサー細胞の天然の核酸に対して異種であり、及びプロデューサー細胞の染色体に含まれるかまたは、エピゾーム発現ベクターに含まれていてよい。
【００６３】
目標とした強力な殺菌薬のように、ディフォシンは、ヒト及び他の動物の下方胃腸管からクロストリジウム・ディフィシル菌を排除、または非定住化し、その結果としてＣＤＡＤを防ぐために使用される。広い範囲の殺菌スペクトルをもつ抗生物資で治療された動物及びヒトは、もしクロストリジウム・ディフィシル菌に感染した場合には、潜在的に致命的なＣＤＡＤを発症する高いリスクにさらされる。非定住化は、健康な胃腸管の細菌叢を温存させるために、ディフォシンの特に魅力的な効用である。加えて、ディフォシンは、急性 ＣＤＡＤ の病原体の負荷を減らすため及び／またはＣＤＡＤの高い発症率または再発または他の療法による治療成功後の再発を減らすために、プロデューサー細胞またはディフォシン産生能力のある無毒化したクロストリジウム・ディフィシル菌の芽胞を、直接または間接に投与することができる。
【００６４】
投与様式
胃と上部十二指腸に送られたＲ型バクテリオシンは、通常そこで機能している酸性度のｐＨ４．０またはそれ以下で不活性化する。しかしながら、下部胃腸管に主に定住している標的の病原性細菌に到達するためには、ディフォシンが上部胃腸管を通過しなくてはならない。このような場合に、上部胃腸管の酸とプロテアーゼからの影響を受けやすい薬剤を保護し、そして遠部の上部胃腸管または下部胃腸管 に活性状態のその薬剤を送り届けるためのひとつまたは複数の公知の方法で、ディフォシンを処方できる。加えて、動物は、Ｒ型バクテリオシンの経口投与の前に胃の酸性化を防ぐために、シメチジンやプロトンポンプ阻害薬などの抗ヒスタミン薬で治療できる。このように、正常なまたは薬で酸性化を防いでいる胃腸を持つヒトまたは動物に、適切に処方されたディフォシン、ディフォシンを産生することができるプロデューサー細胞、またはディフォシン産生の無毒クロストリジウム・ディフィシル菌の芽胞を経口投与することで、病原細菌の定住部へ送り届けて効果を有効にする。腸内移動時間によって、ディフォシンの直接または間接の経口投与の頻度は、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、１週間、または一か月ごとでよい。ディフォシンはまた、ＣＤＡＤ発症患者、または最近ＣＤＡＤから回復した患者に対しは、前記と同じかもしくはそれ以上の頻度で投与されてよい。特に発症中のＣＤＡＤの管理においては、直腸への坐剤、浣腸、または大腸灌流のたびに、ディフォシンが直接または間接に調剤され及び経口投与されてよい。
【００６５】
本開示の遺伝子組換えディフォシンは、細菌感染また細菌混入の疑いで傷害を受け、傷害と診断され、またはそう疑われるいかなる被検体に対しても投与してよい。非限定例として、そのような被検体には、動物 (哺乳類、爬虫類、両生類、鳥、魚) 種だけでなく、昆虫、植物、菌類も含む。非限定的な、個々の哺乳類の例として、人間、ヒト以外の霊長類、牛、豚、山羊、及び羊などの農業関連の種、マウスやラットなどのげっ歯類、愛玩、展示、ショーなどの犬、猫、モルモット、ウサギ、及び馬などの動物、そして犬や馬などの作業用動物を含む。非限定的な、個々の鳥類の例として、鶏、アヒル、ガチョウ、オウムやインコのような愛玩またはショーのための鳥を含む。本開示の遺伝子組換えディフォシンで治療される動物被検体はまた、四足や 二足の、水生動物、脊椎動物、無脊椎動物、昆虫類を含んでもよい。
【００６６】
いくつかの実施形態において、治療される被検体は、まだ未成熟の人間の子供や他の若い動物などである。このように、本開示は、本開示のディフォシンに感受性の強い細菌または他の微生物の感染である小児条件の治療を含む。
【００６７】
本開示は、日和見感染症の治療または予防に関して、ヒトまたはヒト以外の動物の微生物叢に存在する細菌の望ましくない増殖に起因する結果を提供する。日和見感染症は、被検体の免疫が抑制された状態の結果または泌尿生殖器 （ＧＵ） または胃腸 管（ＧＩ）の共生細菌叢を変える抗生物質治療の結果である。本開示はまた免疫抑制状態の被検体及び他の医薬品に暴露された被検体の治療または予防の結果を提供する。抗菌活性をもつディフォシンは、非限定的な例としての抗生物質や抗真菌薬のような、他の抗菌または抗微生物剤との組み合わせで使用してよい。「抗微生物剤」は、単細胞生物の成長または死滅のために使用可能な製剤または成分である。抗微生物剤は、抗生物質、化学療法薬、抗体（補体を含むまたは含まない）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、 タンパク質、脂質、または細胞壁合成または機能の化学抑制剤を含む。
【００６８】
いくつかの実施形態において、ディフォシン、プロデューサー細胞、またはディフォシン産生能力のある無毒化されたクロストリジウム・ディフィシル菌の芽胞は、「製薬上許容される医薬品添加物」、腸溶性コーティングまたはキャリアとともに処方される。そのような成分は、ヒト、動物、および／または植物に過度の副作用なしで適切に使用できるものである。非限定的な副作用の例として、毒性、刺激性、及び／またはアレルギー反応を含む。当該医薬品添加物またはキャリアは、合理的な利点／リスク比に相応している典型的なものである。非限定的な製薬上適切なキャリアは、滅菌水溶液や非水溶液、懸濁液、及びエマルジョンを含む。非限定的な例として、リン酸緩衝生理食塩水、水、油/水エマルジョンなどのエマルジョン、及びさまざまな種類の湿潤剤など標準的な医薬品添加剤を含む。非水溶液の例として、プロピレングリコール、ポリエチレング リコール、オリーブオイルなどの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射用の有機エステルがある。水溶性キャリアは、水、アルコール／水溶液、エマルションまたは懸濁液、生理食塩水を含んだ緩衝溶媒を含む。非経口輸液は、塩化ナトリウム溶液、リンゲル液ブドウ糖、ブドウ糖と塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液または固定油を含む。静脈内輸液は、液体の栄養補充薬、電解質 （リンゲル液ブドウ糖を基にしたものなど）などを含む。
【００６９】
本明細書で開示される追加の処方及び製薬成分は、細菌性病原体に特化した単離されたディフォシンからなり、２種、３種、５種、１０種、または２０種またはそれ以上の異なるディフォシンの混合物、プロデューサー細胞または同じ細菌性病原体を標的とする複数のディフォシン産生能力を持つ無毒化したクロストリジウム・ディフィシル菌の芽胞からなり、及び異なる細菌性病原体または同じ細菌性病原体の異なる菌株の２種、３種、５種、１０種、または２０種またはそれ以上の混合物を標的とする複数のディフォシン産生能力を持つ無毒化したクロストリジウム・ディフィシル菌の芽胞からなる。
【００７０】
随意的であるが、本開示のディフォシンまたはプロデューサー細胞からなる成分は、当該分野で公知の手段を使用した乾燥または凍結乾燥で噴霧してよい。
【００７１】
ディフォシンは、通常は「安全かつ効果的な」量と濃度で使用される。「安全で効果的な」量と濃度とは、前述のような過度の副作用無しで目的の治療応答を示すのに十分な分量を指す。ディフォシンはまた、「治療に効果的な」 量と濃度で使用される。「治療に効果的な」 量と濃度とは、非限定的であるが、細菌の細胞分裂の速度を遅くする、または細菌の細胞分裂の停止が発生する、または細菌増殖率を止めたり減少させたりするなどの、目的の治療応答を生成するのに効果的な分量を指す。安全かつ効果的な量または治療や予防に効果的な量は、多様な要因により変動するが、熟練した実務者によって過剰な実験を行わなくても容易に決定されるであろう。非限定的な要因の例として、治療中の特別な条件、被検体（治療対象）の物理的な条件、治療されている被検体のタイプ、治療期間、（もしあれば）同時療法、及び採用されている特定の処方を含む。
【００７２】
一般的に記述される本発明の対象事項は、図示により提供される以下の実施例を参照としてより容易に理解され、及びそれら実施例は、特定されている場合を除き、本開示内容の制約を意図してはいない。
【実施例】
【００７３】
１．ディフォシン殺菌活性の決定
クロストリジウム・ディフィシル培養菌を、フォーマサイエンティフィック環境チャンバー（Ｆｏｒｍａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｃｈａｍｂｅｒ）の中で、１０％ の ＣＯ2、１０％Ｈ2、８０％Ｎ2 雰囲気の厳密な嫌気環境下で培養した。すべての媒体、バッファー、及びプレートは、少なくとも使用の ２４ 時間前からこの雰囲気中で無酸素状態にした。クロストリジウム・ディフィシル菌選択性寒天培地プレート（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＢＢＬ  Ｃａｔ．２２２２２８）、の上に培養菌を筋状につけ、３７℃で二日間培養した。これらプレートを、周囲の温度で嫌気状態を保つように格納した。
【００７４】
ディフォシンを誘導するために、クロストリジウム・ディフィシル菌を、ブルセラ菌溶媒（Ｄｉｆｃｏ）を使った液体培養菌の中で、無振とうの３７℃で増殖した。ＯＤ600が約０．２の時点で、マイトマイシンＣを、最終濃度が３μｇ／ｍｌになるように添加した。そして培養菌を３−１６時間培養した。当該培養菌の目視の透明性確認（ｃｌｅａｒｉｎｇ）で細菌の溶解を検出した。
【００７５】
培養菌を嫌気性チャンバーから移動し、５，０００ｘｇの遠心分離で死滅細菌を除去した。培養上清を ０．２μｍ の酢酸セルロース シリンジ フィルターに通した。当該ディフォシンの沈殿物を得るために、濾液を９０，０００ｘｇで２時間遠心分離した。体積を元の１／５０にした沈殿物を、１０ｍＭでｐＨ７．５のトリス緩衝液、５０ｍＭの塩化ナトリウム液、３％のマンニトール液中で再懸濁した。
【００７６】
標的菌株を、３７℃のブルセラ菌培養液中で増殖した。１００μｌの培養菌を、５ｍｌの予熱し、無酸素状態にし、ブルセラ菌で覆った寒天培地（０．５％寒天）に添加し、ブルセラ菌プレート（１．５％寒天）に流入し、そして固化させた。５μｌのディフォシン調製液のサンプルを、前記プレートに斑点滴下し、そして空気乾燥（３０分）にさらした。それらのプレートを３７℃で一晩、嫌気状態で培養した。抗菌活性を、サンプルを供与した菌叢の位置や斑点の場所での透明性確認、または菌増殖の有無によって決定した。
【００７７】
２．Ｃｄ１６ディフォシン遺伝子座のクローニング
ＤＮＡゲノムの４５４シーケンス解析装置によりクロストリジウム・ディフィシル菌Ｃｄ１６ゲノムの配列概要を得た。Ｄｉｆ１６全遺伝子座または遺伝子クラスター（配列番号１）を、Ｃｄ６３０菌株（上記参照）との比較によって特定した。
【００７８】
バックボーンＢＡＣベクターの調製。開始ベクターは、ｐＥＴｃｏｃｏ１（Ｎｏｖａｇｅｎ）であった。このベクターから二つの酵素ＸｈｏＩを除去するために、酵素ＢｂｓＩ末端を持つプライマーＡＶ１４１９（配列番号２４）及びＡＶ１４２０（配列番号２５）で改変した。除去のために、これらのプライマーを用いて特定領域をｐＥＴｃｏｃｏ１ＤＮＡから増幅し、次いで、そのＰＣＲ生成物をＢｂｓＩで切断し、その前にＸｈｏＩで切断されたより長いｐＥＴｃｏｃｏ１ベクター断片に連結し直した。この連結（ライゲーション）でｐＥＴｃｏｃｏ１の二つのＸｈｏＩ部を破壊した。この後者プラスミドを、プライマーＡＶ１４１６（配列番号２６）及びＡＶ１２４５（配列番号２７）を使用してＥｃｏＲＩを破壊するという同様のやり方で、さらに改変した。その結果えられたベクターをＳＷ２５１と呼ぶ。
【００７９】
ディフォシン遺伝子クラスターの断片を受容するｐＵＣ１９ベクターの調製。ポリリンカーｐＵＣ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによる分解とオリゴＡＶ１３７２（配列番号２８）、ＡＶ１３７３（配列番号２９）、ＡＶ１３７４（配列番号３０）、及びＡＶ１３７５（配列番号３１）との連結により改変した。この改変により、当該ポリリンカーは、ＮｏｔＩ−ＮｈｅＩ−ＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＶ−ＢｓｔＢＩ−ＢｂｓＩ−ＥｃｏＲＩ−ＮｓｉＩ−ＳｐｈＩ−ＢａｍＨｉ−ＡｓｃＩに変化した。これをＳＷ２３２と呼ぶ。
【００８０】
ディフォシン遺伝子クラスターのＳＷ２３２へのクローニング。ディフォシン遺伝子クラスター（配列番号１）の三つの断片のそれぞれを、Ｃｄ１６ＤＮＡからのＰＣＲで増幅した。５′断片（配列番号３２）を、各々ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩ末端のプライマー１３６８（配列番号３５）及び１２８９（配列番号３６）で増幅した。中間断片（配列番号３３）各々ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩ末端のプライマーＡＶ１２８８（配列番号３７）及びＡＶ１３６６（配列番号３８）で増幅した。３′断片（配列番号３４）を、各々ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ末端のプライマーＡＶ１３６７（配列番号３９）及びＡＶ１３００（配列番号４０）で増幅した。これら三つのＰＣＲ断片を分けて、ＳＷ２３２にクローン化した。当該５′、中間、３′タンパク質をそれぞれＳＷ２４１、ＳＷ２４２、ＳＷ２４３と呼ぶ。
【００８１】
ディフォシン遺伝子クラスターのＢＡＣ  ＳＷ２５１へのクローニング。前記ディフォシン遺伝子クラスター（ ＳＷ２４１、ＳＷ２４２、及び ＳＷ２４３に取り込まれている）３断片の各々を、大腸菌にクローニングによって増殖し、及び精製し、ＳＷ２４１、ＳＷ２４２、及びＳＷ２４３ベクターから切り取った。ＳＷ２４１をＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで分解し、ＳＷ２４２をＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで分解し、そして ＳＷ２４３をＥｃｏＲＩ及びＡｓｃＩで分解した。（ＡｓｃＩ部は、上述の改変ＳＷ２３２ポリリンカーの一部であることに留意のこと）
【００８２】
これら３つの断片を、ＮｏｔＩ及びＡｓｃＩで、最初に分解した ＳＷ２５１に組み込んだ。その結果のプラスミドをＤＧ４６１と呼び、そしてｄｉｆ１６全遺伝子クラスターを含んでいた。それを、大腸菌で増幅した。
【００８３】
枯草菌発現のためのディフォシン組み込みベクターの作成。クローニング／プロモーター部及びスペクチノマイシン耐性遺伝子に隣接するａｍｙＥ遺伝子の部位を含む枯草菌組み込みベクター、ｐＤＲ１１１、を使用した。
【００８４】
前記ｐＤＲ１１１ポリリンカーを、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｈＩで分解して、そしてオリゴＤＧ１（配列番号４１）及びＤＧ２（配列番号４２）に連結して改変した。この過程で、ＮｏｔＩ及びＡｓｃＩ 部をｐＤＲ１１１に加えた。当該改変されたポリリンカーを伴うａｍｙＥ全遺伝子の前後部を含む領域を、プライマーＤＧ９（配列番号４３）及びＤＧ１０（配列番号４４）を使用して増幅したが、この両方がＢｓａＩ末端を有する。この断片をＳＷ２５１のＮｏｔＩ及びＡｓｃＩ部に結合し（結果、前記２部位の破壊になる）、そしてＤＧ４８７を創出した。当該ｐＤＲ１１１誘導の改変ポリリンカーの挿入によって、ＤＧ４８７に新規のＮｏｔＩ及びＡｓｃＩが導入されたことに留意すべきである。
【００８５】
大腸菌内でのＤＧ４８７の増殖の後、ＤＧ４６１からのＮｏｔＩ／ＡｓｃＩ断片含有のディフォシンクラスターを活性化し、ＤＧ４８７のＮｏｔＩ／ＡｓｃＩ部にクローン化した。この新規構築物をＤＧ４８８と名付け、ディフォシン全遺伝子クラスターを枯草菌に産生させるためのベクターとして使用した（以下参照）。
【００８６】
３．枯草菌におけるディフォシン全遺伝子クラスターの発現
天然のディフォシンプロデューサーは、クロストリジウム・ディフィシル菌であり、偏性嫌気性菌である。もし、たとえ微量であっても酸素に暴露されたら、クロストリジウム・ディフィシル菌は芽胞を形成し、すみやかに死滅する。培養されたクロストリジウム・ディフィシル菌からたとえ微量のディフォシンであっても、それを生み出すことは困難で、毒性となり、そして予防や治療に有効なディフォシンの分量を確実に産生することは、求められる厳格な嫌気性条件下でも実現しない。適切な方法で、クロストリジウム・ディフィシル菌からのディフォシンの全遺伝子をまず同定し、及び分子のクローニングで単離し、そしてさらなる遺伝子組換え及び産生のために、当該クラスターを嫌気性グラム陽性菌である枯草菌に導入した。
【００８７】
枯草菌組み込みベクター、ＤＧ４８８、を実施例２の記述のように作成し、そしてディフォシン遺伝子座の全２２，８２７の塩基（配列番号１）を含ませた。枯草菌ゲノムに当該ディフォシン遺伝子クラスターを再組み付けするために、このベクターを使用した。
【００８８】
枯草菌受容株はＢＤＲ１２３であり、ａｍｙＥ遺伝子内に挿入されたクロラムフェニコール耐性マーカーを持っていた。この株をＤＧ４８８に形質転換した時に、当該ベクターとａｍｙＥゲノム配列内で、ａｍｙＥ配列の前後で組み換えが起こった。これは、当該ディフォシン遺伝子座およびスペクチノマイシン耐性遺伝子を含むＤＧ４８８のａｍｙＥ遺伝子の前後領域間の全配列が、ＢＤＲ１２３ゲノムに挿入された結果であった。成功した組換え遺伝子は、スペクチノマイシン耐性であったが、組換えの結果、遺伝子マーカーを失ったために、クロラムフェニコールに感受性を有していた。この枯草菌株を、ＢＤＲ１２３−４８８と名付けた。
【００８９】
当該ディフォシンの全遺伝子座を、ＤＧ４８８ベクター（実施例２）に挿入し、それゆえにその全体がＢＤＲ１２３−４８８に挿入された。この挿入ディフォシンの全遺伝子座は、クロストリジウム菌の通常の発現に必要な全ての調整遺伝子を含んでおり、そしてディフォシン粒子の構造遺伝子は、これらの遺伝子及び／または調整要素が制御されていた。枯草菌およびクロストリジウム菌は細菌なので、これらのディフォシンの調整要素は、その自然な状態として、枯草菌のバックグラウンドで機能し、ＲｅｃＡのメカニズムを介した ＤＮＡ損傷によって誘導される、と推測された。事実、推測通り、ディフォシン粒子の産生は、ＤＮＡ損傷剤マイトマイシンＣとの接触によってＢＤＲ１２３−４８８内で誘導され、及びＣｄ１９０９９菌株を死滅させた（図７）。
【００９０】
ディフォシン調整遺伝子（ＯＲＦ１３５９、１３６０、１３６１）は、構造遺伝子に関連した遺伝子座の５′領域にあった。また調整遺伝子（ＯＲＦ１３７７（配列番号２０）、１３７８（配列番号２１）、及び１３７９（配列番号２３））が、下流の構造遺伝子に関連した遺伝子座の３′領域にもあった。後者のこうした調整遺伝子を排除するために、一本鎖のスリーウェイ連結でＤＧ４８８からＤＧ４９１を生成した。一つのＰＣＲ断片を、プライマーＤＧ１３（配列番号４５）及びＤＧ１４（配列番号４６）を使用したＰＣＲ増幅によってＤＧ４８８から作成し、そしてその他断片を、プライマーＤＧ１５（配列番号４７）及びＤＧ１６（配列番号４８）を使用したＰＣＲ増幅によって作成した。両ＰＣＲ断片を、ＡｓｃＩとＳｐｈＩで分解した。ＤＧ４８８をＳｐｈＩで分解し、ＤＧ４９１を産生するために、そして二つの分解ＰＣＲ断片を、ＳｐｈＩ分解のＤＧ４８８由来の長いベクター断片に連結した。ＯＲＦｓ１３７７（配列番号２０）、１３７８（配列番号２１）、及び１３７９（配列番号２３）を欠損しているディフォシン遺伝子クラスターを含む遺伝子組換え枯草菌を生成するために、ＤＧ４９１をＢＤＲ１２３（ＢＤＲ１２３−４９１）に形質転換した。ＢＤＲ１２３−４８８に野生型ディフォシン遺伝子クラスターが形成された結果、これらのＯＲＦを欠いた改変されたディフォシン遺伝子クラスターは、マイトマイシンＣへの暴露で活性ディフォシンを発現した（図７）。
【００９１】
４．多様なディフォシンからの殺菌スペクトル決定配列の特徴付け
Ｃｄ１６ディフォシン遺伝子座（配列番号１）とＣｄ６３０、他のＣｄ配列株（ＱＣＤ−６６ｃ２６、ＱＣＤ−２３ｍ６３、ＱＣＤ−３２ｇ５８、ＱＣＤ−６３ｑ４２）及びＣｄ４（配列番号６１）の遺伝子座との比較で、一つの例外と除いて、全てのオープンリーディングフレーム（配列番号１および６１）は、８９％−１００％のアミノ酸配列同一性を保持した。例外はＯＲＦ１３７４であった。この例外配列は、大きさは類似していたが全てのディフォシン配列間で様々で、３０％の配列同一性にとどまっていた。ディフォシン遺伝子クラスター内のＯＲＦ１３７４の位置は、受容体結合ドメインの位置と一致していた。単離された活性ディフォシンのＯＲＦ１３７４配列を決定し、配列（配列番号１７、４９−５３）が非常に多様であることを発見した。これら配列の比較を図８に示す。さらに、単離されたディフォシンのスペクトル（図２）は、図８のＯＲＦ１３７４アミノ酸配列の類似性または非類似性を反映していた。例えば、ｄｉｆ１６（配列番号１７）とｄｉｆ１２６（配列番号５２）のＯＲＦ１３７４配列は、たった一つのアミノ酸が異なり、殺菌スペクトルは、ほとんど同一であった。一方で、ｄｉｆ１６（配列番号１７）とｄｉｆ１０８（配列番号５０）のＯＲＦ１３７４配列は、１８８個のアミノ酸が異なり、そしてそれらの殺菌スペクトルは、少しの重複を伴いながら非常に違っていた。ＯＲＦ１３７４が、当該遺伝子クラスターの中で、唯一の異種タンパク質であった理由は、ＯＲＦ１３７４が標的認識決定因子であって、各々の特定ディフォシンの特徴的なスペクトルに対応しているためである、と結論付けられた。
【００９２】
５．枯草菌におけるＤｉｆ４の発現とクローニング
ディフォシン４の遺伝子座を、ディフォシン１６の場合と同様のやり方で、Ｃｄ４からクローニングした。しかしながら、ｄｉｆ４遺伝子クラスター内のＥｃｏＲＩ部位、配列番号６１、の欠損のためにいくつかの改変が必要になった。オリゴＤＧ２１１、配列番号５７、及びＤＧ２１２、配列番号５８、を使用するポリリンカーにＸｈｏＩ部位を持たせ、 それぞれＮｏｔＩ部位及びＡｓｃＩ部位を導入するために、プラスミドＳＷ２５１（実施例２を参照）を改変した。この方法で、ベクターＤＧ５７７を創出した。
【００９３】
Ｃｄ４ＤＮＡ由来のディフォシンを、３つの断片において増幅した。一番目の断片は、ＸｈｏＩ 部位と ＮｃｏＩ部位を導入するためにプライマーＤＧ２１０（配列番号５９）及びＡＶ１２８８（配列番号３７）を使用した。二番目の断片は、ＮｃｏＩ 部位及びＡｓｃＩ部位を導入するためにプライマーＤＧ２０９（配列番号６０）及びＤＧ１５（配列番号４７）を使用した。これら二つの断片を、ＤＧ５７８を創出するために事前にＸｈｏＩ／ＡｓｃＩで切断したＤＧ５７７にクローニングした。三番目の断片は、ＸｈｏＩ部位及びＮｏｔＩ部位導入するためにＡＶ１３６８（配列番号３５）及びＡＶ１２８９（配列番号３６）を使用して増幅し、ＤＧ５７９を創出するために事前にＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断したＤＧ５７８にクローニングした。Ｄｉｆ４遺伝子クラスター（配列番号６１）を含む後者の構築物は、ｄｉｆ１６に対するＤＧ４９１と同様の特徴を持っていた。すなわち、ディフォシンの構造遺伝子の下流にある抑制配列と推定される、不要なＯＲＦ１３７７、ＯＲＦ１３７８及びＯＲＦ１３７９を欠いていた。Ｄｉｆ４遺伝子クラスターを導入するための組み込みベクターを、ＤＧ５７９からＮｏｔＩ  ＡｓｃＩ断片を取り、それをＤＧ４８７にクローニングすることにより作成した（実施例２を参照）。この方法で構築されたプラスミドはＤＧ５８０である。
【００９４】
枯草菌中にｄｉｆ４を発現するために、ＯＲＦ１３７７−１３７９（配列番号６１）を欠損するｄｉｆ４遺伝子座を含むＤＧ５８０を、枯草菌ゲノムに遺伝子組換えで組み込んだ。枯草菌株の受容体ＢＤＲ１２３は、ａｍｙＥ遺伝子内に挿入されたクロラムフェニ コール耐性マーカーを持っていた。この菌株をＤＧ５８０で形質転換した時に、ベクターおよびａｍｙＥゲノム配列の範囲内で、ａｍｙＥ配列前後の間で遺伝子組換えが起こった。これは、当該ディフォシン遺伝子座およびスペクチノマイシン耐性遺伝子を含むＤＧ５８０のａｍｙＥ領域前後間のすべての配列が、前記ＢＤＲ１２３ゲノムに挿入された結果であった。成功した遺伝子組換えは、スペクチノマイシン耐性であったが、しかしこの遺伝子組換えの結果としてクロラムフェニコール耐性マーカーを欠いたために、クロラムフェニ コールに感受性を持っていた。この枯草菌株をＢＤＲ１２３−５８０と名付けた。
【００９５】
この遺伝子組換えされたｄｉｆ４は、クロストリジウム・ディフィシル菌における正常なディフォシン発現に必要な全ての調整遺伝子を含んでおり、そして枯草菌におけるｄｉｆ１６について前に示したように、マイトマイシンＣとの接触により、ＢＤＲ１２３−５８０における誘発でｄｉｆ４粒子が産生された、図９。このように、本開示の実施例は、非病原性好気性産生菌の一例としての枯草菌における、ｄｉｆ４及びｄｉｆ１６の両遺伝子座のクローニングそして各々の発現を提供する。
【００９６】
６．ディフォシンの殺菌スペクトルのＯＲＦ１３７４による決定
ＯＲＦ１３７４は、質量分析法で精製ディフォシン構造の一部として示される、長い予測ペプチド（〜２００ｋＤａ）をコードする。主要な当該遺伝子産生物であるｄｉｆ４及びｄｉｆ１６の遺伝子クラスラーを比較すると、構造コンポーネントであると推測されるこれらクラスターは、特にそのアミノ酸レベルがほぼ同一である。前記２種のクラスター間で異なる主要なアミノ酸配列はＯＲＦ１３７４である。この理由および下記で議論される他の理由により、この遺伝子産物が、ディフォシンの標的特異性を付与することが推測された。これを評価するために、ｄｉｆ４のＯＲＦ１３７４（すなわち、配列番号４９をコードする配列）を、ＤＧ５８７を生成するように、ＤＧ５８０においてＣｄ１６由来のＯＲＦ１３７４（すなわち、配列番号１７をコードする配列） に置き換えた。ｄｉｆ１６及びｄｉｆ４に対して行ったように、ＢＤＲ１２３−５８７の遺伝子組換えのために、ＤＧ５８７を枯草菌ゲノムＢＤＲ１２３ に組み換えた。その結果得られたＢＤＲ１２３−５８７をマイトマイシンに暴露し、及びディフォシンを調整する溶菌液を手当てした。その結果得られたディフォシン粒子は、ディフォシン１６に感受性であるクロストリジウム・ディフィシル菌株１９１４５に対して殺菌活性を有しており、そしてディフォシン４に感受性である菌株１９１３７を死滅する能力を有してはいなかった（図９）。
【００９７】
この実験をさらに洗練させた。ＤＧ５８７の構築は、Ｃｄ４及びＣｄ１６のキメラであるＯＲＦ１３７３に帰結した。構築体は、ＤＧ５８７のＯＲＦ１３７３を、その由来源であるＣｄ４の１３７４、配列番号７８に１００％相同であるように復元されたものであった。このように、ＯＲＦ１３７４、配列番号１７、のみの完全交換である構築体を創出した。この構築体を、ＤＧ６０３と名付けた。この構築体を、枯草菌ゲノムＢＤＲ１２３に組み換え、そして上述のマイトマイシンＣで誘導した。その結果得られたディフォシン粒子は、菌株１９０９９および１９１４５に対する殺菌活性を有し、及び１９１３７の殺菌力を欠いていた。このように、ＯＲＦ１３７４にコードされたタンパク質により、及びディフォシンの殺菌スペクトルを変えるＯＲＦ１３７４の変更により、ここに現わされるように、ディフォシンの殺菌スペクトルを決定した。
【００９８】
７．ＲｅｃＡが活性化された時に溶菌しないＰＢＳＸ無しのプロデューサー細胞
ＰＢＳＸプロファージは、野生タイプの枯草菌中に偏在している。誘導されたプロファージは、発育を妨げられたヘッド構造を所有し、小さなランダムなＤＮＡの断片を含んでおり、欠陥がある。ＰＢＳＸプロファージは、ＲｅｃＡの制御下にあり、このようにＤＮＡに損傷を与える遺伝子、例えばマイトマイシンＣ、及び細菌に重度のストレスを与える他の形質により誘導される。このプロファージが誘導された時、溶菌を起こしＰＢＳＸを切り離す。ＲｅｃＡまたはｄｉｎＲ／ｌｅｘＡの活性の改変によりディフォシンの発現を制御する際に、ＰＢＳＸ粒子を含む菌媒体の混入を避け、及び枯草菌のプロデューサー細胞の溶解を排除するために、当該ＰＢＳＸ遺伝子クラスラーを、枯草菌ＢＤＲ１１細菌から排除した。
【００９９】
Ｌｉｕらによって概説された手順に従い、当該ＰＢＳＸの遺伝子ノックアウト（欠損）を構築した。簡単に記載すると、Ｌｉｕの資料に使用されたプライマーおよび重複拡張ＰＣＲ技術を使用し、親株ＢＤＲ１１のａｒａＲ遺伝子を削除し、そしてＢＤＧ２を作成するために、枯草菌アラビノースプロモーター、ＰaraA−ｎｅｏR、の存在下で、ネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子に置き換えた。このａｒａＲ遺伝子の削除を、ＰＣＲおよびカナマイシン耐性の付与で確認した。
【０１００】
次いで、当該ＰＢＳＸ遺伝子座それ自身を削除するためのＤＮＡ構築を行った。この構築のため、以下の５個のＰＣＲ生成物を、重複拡張ＰＣＲにより一つの大きな生成物へと接合した。すなわち、ＢＤＲ１１から増幅した１ｋｂのｘｙｌＢ遺伝子の５′配列、ＢＤＲ１１から増幅した１ｋｂのｘｙｌＡ遺伝子の３′配列、プラスミドｐＪＷ０３４から増幅した、ｃａｔ遺伝子であるクロラムフェニ コール耐性遺伝子、ＢＤＲ１１から増幅したａｒａＲ、及びＢＤＲ１１から増幅したｘｙｌＢ遺伝子を含む１ｋｂの配列である。当該重複拡張ＰＣＲ生成物を、ｐＵ１９のＸｍａＩ及びＳｐｅＩ部位にクローン化した。この構築物をＳａｃＩＩで直線化し、そしてＢＤＧ２細菌株に形質転換し、それを５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを添加した ＬＢ寒天培地プレート上に広げた。菌コロニーをこのプレートから取り出し、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールまたは２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加したＬＢ寒天培地プレートに斑点接種した。クロラムフェニコール耐性およびカナマイシン耐性である菌株を、抗菌選択制のないＬＢ流体培地で４時間培養し、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加したＬＢ寒天培地プレートに広げた。これらのプレートで成長した菌コロニーを、ＰＢＳＸ遺伝子の存在を確認するコロニーＰＣＲで評価した。ＢＤ１２３のｗｔ株におけるＰＢＳＸ遺伝子の部位をまたがるＰＣＲ生成物の配列確認で、ＢＤＧ９株における当該ＰＢＳＸ遺伝子クラスラーの排除を確認した。さらなる解析で、枯草菌非類似株、ＢＤ１２３またはＢＤＧ２、ＢＤＧ９は、３μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣの存在下ではＰＢＳＸ粒子を溶菌または産生しないことが判明した。
【０１０１】
ＰＢＳＸ欠損株、ＢＤＧ９、を、ＢＤＧ２７を創出するために、プラスミドＤＧ５８０で形質転換した。Ｃｄ４ディフォシンの遺伝子クラスラーの形質転換を、スペクチノマイシン耐性により確認した。ＢＤＧ２７を増殖し、前述のマイトマイシンＣで誘導した。１６時間後、ディフォシンが細胞内に蓄積することを期待して、細胞を集め、ＰＢＳＸ欠損の細胞を破壊するためにＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で溶菌した。ＢｕｇＢｕｓｔｅｒで細胞を溶解後、遠心分離で残骸を取り除き、及びその上清で菌株１９１３７に対する殺菌活性を評価した。ＢＤＧ２７により産生したディフォシンは、Ｃｄ１９１３７に耐性を示したが、Ｃｄ１９０９９には耐性を示さなかった。このように、この非溶解、ＰＢＳＸ欠損菌株でディフォシン４が産生されたことが証明された。
【０１０２】
８．低分子インデューサー、過酸化水素、の誘導による枯草菌におけるディフォシン発現
実施例３において、枯草菌株ＢＤＲ１２３においてディフォシン産生を誘導するため、マイトマイシンＣを使用した。マイトマイシンＣは、ＤＮＡ損傷遺伝子でありかつ発癌物質なので、それに代わる低分子インデューサーを求めた。過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）は、マイトマイシンＣと同様にＳＯＳ感受性を引き出すことを示した（Ｉｍｌａｙ及びＬｉｎｎ，１９８７）。しかしながら、過酸化水素は、アメリカＦＤＡで一般的に安全と認められている（ＧＲＡＳ）。さらに、大腸菌と枯草菌を含むいくつかの好気性細菌種において、プロファージ 誘導を引き起こすことが判っている（Ｉｍｌａｙ及びＬｉｎｎ，１９８７，Ｂｏｌ及びＹａｓｂｉｎ，１９９０）。プロファージ及び／またはクロストリジウム・ディフィシル菌でのディフォシン産生における過酸化水素の効果は知られておらず、クロストリジウム・ディフィシル菌は、偏性嫌気性であり、通常は過酸化水素を含まない胃腸管にわずかに存在する。
【０１０３】
過酸化水素が、枯草菌中でディフォシン産生を誘導できるかどうかを決定するために、枯草菌株ＢＤＧ４５においてディフォシンを産生するマイトマイシンＣと過酸化水素との比較研究を実施した。ＢＤＧ４５は、その遺伝子には、ａｍｙＥ配列に形質転換されたクロラムフェニコール耐性にリンクした当該ディフォシン４遺伝子クラスラー（配列番号６１）を含んでいる。ＢＤＧ４５培養菌を、一晩で増殖し、希釈し戻し、そしてＯＤ６００が１．０に到達するまで増殖した。その時点で、増殖菌を放置、または０．５ｕｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ、０．２ｍＭまたは１ｍＭの過酸化水素で処理し、２８℃で培養した。サンプルは、誘導完了までに２１時間かかった。ディフォシン沈降物を、１０ｍＭでｐＨ７．４のＨｅｐｅｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ＨＮ５０）中で再懸濁した場合以外のディフォシン調製を、実施例１のように行った。調製物の殺菌活性を、実施例１のように、ディフォシン４に感受性の単離株（１９１３７）を含む細菌叢に斑点滴下する前にＨＮ５０で連続的に希釈（５倍）し、決定した。殺菌活性アッセイの結果を表Ｉに示す。２１時間の誘導時間で、マイトマイシンＣ及び１ｍＭの過酸化水素処理サンプルは、各々６２５倍および３１２５倍希釈の後も容易にディフォシン殺菌活性を産生した。０．２ｍＭの過酸化水素処理サンプルは、わずかにディフォシン産生を誘導した。その後の研究で、ディフォシン産生は、０．２ｍＭから２０ｍＭ濃度の過酸化水素水に誘導されることが証明された。
【０１０４】
【表１】
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【０１０５】
９．異種ディフォシンのための機能性ＲＢＤタンパク質をコードするクロストリジウム・ディフィシル菌ゲノムから単離された核酸、ファージおよびプロファージ
クロストリジウム・ディフィシル単離菌Ｍ６８から得られるディフォシン調製物は、幅広い殺菌スペクトルを有していた（表II）。ディフォシン４のＯＲＦ１３７４（配列番号４９）を、菌株Ｍ６８由来の異種ＯＲＦ１３７４（配列番号８７）に組み換え、及びディフォシン４のＢＰＡＲ（配列番号７８）の３′位を、ＡＴＣＣ４３５９３（配列番号８９および９０）のシャペロンと共に菌株Ｍ６８由来の同族ＢＰＡＲ（配列番号８８）に組み換え、そして実施例６に記述されるように枯草菌中に発現させた。その結果得られたディフォシン、Ｄｉｆｆ４＿Ｍ６８−１３７４、は、マイトマイシンＣ誘導Ｍ６８株から直接単離したディフォシン調製物より狭い殺菌スペクトルを有していた。当該Ｍ６８遺伝子配列には、その他のディフォシン遺伝子クラスターは、見つからなかった一方で、公知のミオウイルスに相同性を有する複数の推定プロファージ遺伝子の挿入を発見した。当該ディフォシン遺伝子クラスターのいくつかの遺伝子は、クロストリジウム・ディフィシル菌のミオウイルスファージの収縮性尾部にある遺伝子との相同性を持っており、クロストリジウム・ディフィシル菌ファージおよびクロストリジウム・ディフィシル菌ゲノムの遺伝子は、非限定的なプロファージ配列を含み、ディフォシンの標的を変えるために異種ＲＢＤ源として機能しているかもしれないと仮定できた。しかしながら、当該スペクトル決定因子またはいかなるクロストリジウム・ディフィシル菌ファージに対応するＲＢＤ遺伝子、プロファージまたはその遺伝子配列にある他のＯＲＦは、これまで同定されていない。
【０１０６】
【表２】
2016512428.tif 000003
【０１０７】
当該ディフォシン遺伝子クラスター由来のＯＲＦと、Ｍ６８への推定挿入プロファージ由来のＯＲＦとの比較で、多数の類似性遺伝子および類似性遺伝子クラスター構造物が確認された。しかしながら、推測基板Ｊ集合タンパク質およびそのＢＰＡＲとの相同性を持つＯＲＦの下流で、そこは典型的なディフォシンＲＢＤ（例えば、配列番号１７、４９−５３）に対して１，７００個までのアミノ酸残基をコードするＯＲＦが存在する場所であるが、典型的なディフォシンＲＢＤと相同性をシエアーしない４００−５６０個のアミノ酸残基のタンパク質をコードするより短いＯＲＦ（表III および配列番号９２、９４、９６、９８）を見出した。
【０１０８】
【表３】
2016512428.tif 000004
【０１０９】
推定プロファージＢＰＡＲの下流に位置するこれらＯＲＦの配列解析で明らかになったのは、それらは、少なくとも３ドメイン（Ｎ末端、中間部、およびＣ末端）の一つに互いに相同性を持ち、およびｐｈｉＣ２ファージ、配列番号５４、にある注釈付きＢＰＡＲの下流にあるＯＲＦ（配列番号９２）と相同性を持っているということである。興味深いことに、ｐｈｉＣ２にある配列番号９２をコードするＤＮＡ配列は、ｐｈｉＣ２ファージにある予想タンパク質と注釈されていなかった。なぜなら、ファージおよびプロファージ配列におけるＢＰＡＲのすぐ下流のＯＲＦは、ドメイン状形式に相同性を持ち、すべて同族ＢＰＡＲの下流で、それゆえにＯＲＦ１３７４をコードする遺伝子であることが、見出されていたからであり、これらＯＲＦが、潜在的にＲＢＤをコードすると予測されていた。本開示で提供されるように、他のクロストリジウム・ディフィシル菌単離株のゲノムにあるか、またはクロストリジウム・ディフィシル菌に感染するファージにある推定ＢＰＡＲの下流に位置する潜在的なＲＢＤをコードするより多くのＤＮＡ配列が特定された。それは、クロストリジウム・ディフィシル菌Ｍ６８からの独創的な観察の結果である。機能性異種ディフォシンを得るために使用するＲＢＤの配列番号を表（表III ）に記載した。
【０１１０】
これらの、これまで未知であった機能を持つ新規に特定されたＯＲＦが、新規クロストリジウム・ディフィシル菌の標的株に対して殺菌性のある直接的なディフォシンであるかどうかを決定するために、ディフォシン４のＯＲＦ１３７４（配列番号４９）を推定ＲＢＤをコードするＯＲＦに遺伝子組換えで交換し、新規の異種ディフォシンを作った。推定ＲＢＤをコードするアミノ酸配列およびその同族ＢＰＡＲをコードするＯＲＦの隣接する３′位を、Ｄｉｆｆ４遺伝子クラスター（配列番号６１）を含むベクター（実施例２に記述）にクローン化し、ディフォシン４のＯＲＦ１３７４（配列番号４９）および当該ディフォシン４のＢＰＡＲのＣ末端（配列番号７８）を取り換えた。融合ＢＰＡＲのアミノ酸残基の配列番号を、表III に記載した。我々は、最小の殺菌活性または無活性である同族ＢＰＡＲの少なくとも半分のＣ末端を含まずに、異種ディフォシン４に組み込まれた目的の推定ＲＢＤを観察した。挿入体は、ベクターバックボーン内で互換性のあるクローニング部位を持っていなかったので、この障壁を克服する三つのクローニング戦略を立案した。
【０１１１】
戦略Ｉで作られる構築体のために、重複末端を持つ３つの二本鎖ＤＮＡセグメント（上流セグメント、中間セグメント、および下流セグメントと呼ぶ）をＰＣＲによって生成した（表IV、パネルＡ，Ｂ及びＣ）。上流セグメント（表IV、パネルＡ）は、配列番号７８をコードするＢＰＡＲ遺伝子の５′末端までを含んだ配列番号６１のユニークなＢｓｔＢＩから成る。中間セグメント（表IV、パネルＢ）は、推定ＲＢＤの全ＯＲＦ及びその上流の同族ＢＰＡＲの３′の１／２から成る。下流セグメント（表IV、パネルＣ）は、配列番号４９のすぐ下流域で、そして上記実施例２に記述されるベクターポリリンカーにあるユニークなＡｓｃＩ制限部位に拡張する配列番号７９及び８０をコードする領域から成る。全ての３セグメントは、適切な組み立てのために、テンプレートに相補的なオリゴヌクレオチドを使用し、そして隣接する断片に相補的なオーバーハングを含む。各々の構築体を増幅するために使用されるコードおよび非コードのらせん構造をもつオリゴヌクレオチドを、配列番号によって表IVに記載した。また各々のＰＣＲ反応に対するＤＮＡテンプレートを表IVに記載した。次いで、３セグメントの各々の構築体を、上流セグメントのコードらせんおよび下流セグメントの非コードらせんに相補的なオリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲによって一つの断片に組み合わせ、そして増幅した（表IVの配列番号を参照）。その結果、表に記載した構築体を作るために、組み合わせられた一本鎖のＰＣＲ断片をＢｓｔＢＩ及びＡｓｃＩで開裂し、そしてＢｓｔＢＩ及びＡｓｃＩで事前に分解したＤｉｆｆ４ベクターバックボーンに連結した。次いで互いの構築体を、前記実施例３のように０．５ｍＭの過酸化水素を低分子インデューサーとして使用し、枯草菌に形質転換しそして発現させた。
【０１１２】
戦略IIで作成する構築体のために、上流セグメント、ＲＢＤ領域を含む中間セグメント、及び下流セグメントに相補的な重複ＰＣＲ産生物を、表IVに記載されるオリゴヌクレオチドと各々の構築物に対するテンプレートを使って、戦略Ｉに記載されるように作成した。次いで、当該重複ＰＣＲ産生物を、ＢｓｔＢＩ及びＡｓｃＩで事前に分解され、及びギブソン法（Ｇｉｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）によって一本鎖の構築物に組み立てられた配列番号６１を含むベクターバックボーン（実施例４に記載）と混合した。その結果得られた各々の構築物を、別々に枯草菌に形質転換し、０．５ｍＭの過酸化水素を低分子インデューサーとして使用するという点を除いて、前記実施例３に記述した方法で発現させた。
【０１１３】
戦略III の構築物を、下流セグメントを創出しないという点を除いて、戦略IIで特定した方法で作成した。その代りに、ＲＢＤ領域を含む中間セグメントを、推定ＲＢＤ（表IVの各々の構築体に対して記載された配列番号）の直ぐ下流のＯＲＦを含むように及びベクターバックボーンＡｓｃＩ部位と重なるように拡張した。結果として、配列番号７９−８０をコードするＤＮＡ、つまりディフォシン４の尾部構造組み立てのための推定シャペロンであるＤＮＡを、同族推定ＲＢＤで直ぐ下流に見出されたＯＲＦをコードするＤＮＡ配列で、そしてそれは同族推定ＲＢＤを組み立てるシャペロンであると思われるＤＮＡ配列に置き換えた。次いでその結果の各々の構築体を、枯草菌に形質転換し、そして０．５ｍＭの過酸化水素を低分子インデューサーとして使用するという点を除いて、前記実施例３に記述した方法で発現させた。
【０１１４】
【表４】
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【０１１５】
【表５】
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【０１１６】
【表６】
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【０１１７】
戦略Ｉ−III で発現した異種ディフォシンＤＮＡ構築体由来のディフォシン調製物を作成し、単離クロストリジウム・ディフィシル菌パネルに対する殺菌活性を検査した。各々の異種ディフォシン構築体の殺菌活性にたいする単離体の感受性を表IIに記載した。Ｒ２０２９１−ＲＢＤ１に対して天然ディフォシン４のシャペロン（配列番号７９−８０）を含んでいるＤｉｆｆ４＿Ｒ２０２９１−ＲＢＤ１構築体との比較において、Ｄｉｆｆ４＿Ｒ２０２９１−ＲＢＤ１＋同族シャペロンを含む構築体（配列番号１１３，１１４）に、より安定した殺菌活性が観測された。
【０１１８】
１０．新規、非―１３７４ベースＲＢＤを含む異種ディフォシンの安定性増進
ディフォシンが効果的に産生され及び必要とする動物に配送されるためには、多様な異なる物理環境において活性である必要がある。そのような趣旨で、天然発現で異種のディフォシンの物理特性を検討した。ディフォシンを、調製したディフォシンの遠心分離ペレットを各研究において適切なバッファー中で再懸濁するという点を除いて、実施例９に記述される方法で作成した。
【０１１９】
温度安定性研究（表Ｖ）に対して、ディフォシンをＨＮ５０（ｐＨ７．４）中で再懸濁し、そして指示された温度と時間で培養した。
【０１２０】
【表７】
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【０１２１】
ｐＨ感受性研究（表VI）において、指定された酸性ｐＨになるようクエン酸で酸性化した ５ｍＭのクエン酸ナトリウム溶液中で、または１２．５ｍＭの重炭酸水素ナトリウム／ＨＮ５０の（または指定されたアルカリｐＨになるように水酸化ナトリウムでアルカリ化したディフォシン４溶液に対してはＴＮ５０中で）、当該ディフォシンを再懸濁した。指定されたｐＨにおいて、サンプルを室温で３０分間培養した。
【０１２２】
【表８】
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【０１２３】
【表９】
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【０１２４】
両研究において、サンプルをＨＮ５０中で連続（５倍）希釈しそしてクロストリジウム・ディフィシル菌単離株への感受性をスポットアッセイによる殺菌活性で検査した（各々のディフォシンの殺菌活性を検査するために用いた感受性菌株を、表Ｖ及び表VIに記載した）。研究対象のディフォシンは以下を含む。すなわち、天然ディフォシン４ (配列番号６１によりコード) 、異種 Ｄｉｆｆ４＿４３５９３−１３７４（配列番号５３によりコードされるＲＢＤ）、異種Ｄｉｆｆ４＿Ｍ６８−ＲＢＤ１（配列番号９１および９２にコードされるＢＰＡＲ及びＲＢＤ）、異種Ｄｉｆｆ４＿Ｍ６８−ＲＢＤ４（配列番号９５および９６にコードされるＢＰＡＲ及びＲＢＤ）、異種Ｄｉｆｆ４＿Ｍ６８−ＲＢＤ５（配列番号９７および９８にコードされるＢＰＡＲ及びＲＢＤ）。
【０１２５】
ファージＲＢＤを含む異種ディフォシンは、天然ディフォシンまたはＲＢＤとしてＯＲＦ１３７４タンパク質を含む異種ディフォシンに比べより高温で長期に安定化であった（表Ｖ）。新規ＲＢＤｓＭ６８−ＲＢＤ１（配列番号９１，９２）、Ｍ６８−ＲＢＤ４（配列番号９５，９６）及びＭ６８＿ＲＢＤ５（配列番号９７，９８）を含む異種ディフォシンの調製物を、３７℃、１５分の培養との比較で４５℃、１時間で培養し、活性を修正または増進させた（表Ｖ）。興味深いことに、同じ温度条件下で、新規、低分子、非―１３７４ベースＲＢＤの異種ディフォシンが殺菌活性を保持したのに比べ、天然ディフォシン４のＲＢＤ（配列番号４９）及び異種Ｄｉｆｆ４＿４３５９３−１３７４のＲＢＤ（配列番号５３）のようなＣＤ１３７４ベースＲＢＤを含むディフォシンは、それを保持しなかった。これら２種の１３７４ベースＲＢＤを含む前者ディフォシンを、４５℃で１時間過熱した時、各々８０％および９５％以上の殺菌活性を失った。
【０１２６】
熱安定性増進の展開に加えて、ＲＢＤ  Ｍ６８−ＲＢＤ４（配列番号９６）を含む異種ディフォシンは、ＯＲＦ１３７４を含む天然ディフォシン４に比べて、広いｐＨ範囲にわたり安定であった（表VI）。スポットアッセイによる殺菌活性検査の結果は、Ｄｉｆｆ４＿Ｍ６８−ＲＢＤ４は、ｐＨ３．４からｐＨ９において殺菌活性を保持し、そのうえｐＨ２．５及びｐＨ１０．６までの範囲でさえ、検出可能な残余活性を保持した。ディフォシン４は、ｐＨ５．５からｐＨ１０の範囲でのみ活性を残した。拡大したｐＨへの対応力をもつディフォシンは、胃などの酸性環境が発生する可能性がある場所での体内機能に適している。これらの結果は、非１３７４、低分子ＲＢＤの新規分類にあたるＲＢＤを含む異種ディフォシンは、天然ディフォシンまたは高分子、異種１３７４ベースＲＢＤを含むディフォシンなどに比べて安定であり、そして効率的な産生や治療への応用のための利点を保有している、ということを示した。
【０１２７】
１１．マウスの胃腸管で残存する、新規ＲＢＤを含む異種ディフォシンの殺菌活性
ディフォシン経口投与が体内で残存するための能力をマウスで評価した。ポシティブコントロールとして、天然ディフォシン４（配列番号６１でコードされる）、異種Ｄｉｆｆ４＿Ｍ６８−ＲＢＤ４、及び本開示に関係のない遺伝子操作でえられたＲ型バクテリオシン、ＡｖＲ２−Ｖ１０、からなる混合物（Ｓｃｈｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）を、１２．５ｍＭの重炭酸ナトリウム中で調製し、正常で健康なマウス（ｎ＝３）に経口で投与した。投与の２時間前に、胃の酸性化を防止または最小限に抑えるために、Ｈ2容体拮抗薬、ラニチジン（１００ｍｇ／ｋｇ）、を注射した。糞を１時間ごとに８時間採取し、プロテアーゼ阻害剤を含むＨＮ５０の中で均質化し、そして組織片を取り除くために遠心分離した。上清を０．４５ミクロンフィルターでろ過し、ＨＮ５０で５倍希釈し、感染しやすいクロストリジウム・ディフィシル菌単離株の菌叢上で、スポットアッセイで殺菌活性を検査した。クロストリジウム・ディフィシル菌１９１３７は、ディフォシン４の殺菌性に固有の感受性があり、およびクロストリジウム・ディフィシル菌ＣＦ５は、ディフォシン４＿Ｍ６８−ＲＢＤ４の殺菌性に固有の感受性があり、そして大腸菌ＥＤＬ９３３は、ＡｖＲ２−Ｖ１０の殺菌性に固有の感受性があり、当該経口混合物において互いに固有の殺菌コンポーネントにたいする感受性が観察された。各感受性菌株における殺菌性検査の結果は、試験マウスの糞にたいして対照的な結果であった。経口カクテルの一定分量を保管しそして各菌叢にポジティブコントロールとして平行して斑点点滴した。
【０１２８】
マウス糞のサンプルにおける殺菌活性は、異種Ｄｉｆｆ４＿Ｍ６８−ＲＢＤ４において発揮され、天然ディフォシン４においては発揮されなかった（表VII ）。
【０１２９】
【表１０】
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【０１３０】
マウス間での活性比較において、Ｄｉｆｆ４＿Ｍ６８−ＲＢＤ４の活性は、強制経口投与後、早やければ２時間で及び遅くとも８時間で観測された。２５倍希釈後に観測される殺菌活性において、活性復元のピークは、強制経口投与後３、４時間後に観測された。天然ディフォシン４は、いかなる時点の糞サンプルにおいても活性をしめさなかった。別に保管した当該カクテル溶液の一定量の菌株１９１３７に対する活性が確認され、当該経口カクテル中の天然ディフォシン４は、経口投与時点では活性であったことが確認された。これらの結果および実施例１０の事実は、新規を含む異種ディフォシン、非―１３７４ベースＲＢＤを含む異種ディフォシンを天然ディフォシンと比較すると、高温およびより酸性度の強い環境で安定であることが示された。さらに関連して、経口投与で、クロストリジウム・ディフィシル菌の増殖および病原発生の部位である動物の胃腸管への暴露においても、これらの殺菌活性が残存したことが示された。
【０１３１】
１２．生体内ＣＤＩを減らす異種ディフォシン
クロストリジウム・ディフィシル菌感染（ＣＤＩ）におけるディフォシンの効果を、クロストリジウム・ディフィシル菌芽胞にさらしたマウスを使って検討した。事前処置として、２グループ（各６匹）のマウスに、適量のセフォペラゾン（０．５ｍｇ／ｍＬ）を含んだ水を５日間飲ませ、胃腸管の細菌叢を破壊しそして芽胞の経口投与でマウスをクロストリジウム・ディフィシル菌に感染しやすくした。両マウスグループは、飲料水でのラニチジン投与（投与量１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）の前に、３６時間の回復期を与えられた。ラニチジン投与を開始した１２時間後、治療グループには、強制経口投与によって１２．５ｍＭの重炭酸ナトリウム溶液中に入った異種Ｄｉｆｆ４＿Ｍ６８−ＲＢＤ４を与えた（投与量１０11殺菌ユニット−Ｇｅｂｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｒｉｔｃｈｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｓｃｈｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９によって記述され定義されている殺菌単位）。２時間後、両グループのマウスを、ＣＤ６３０から調製した２ｘ１０5ＣＦＵのクロストリジウム・ディフィシル菌芽胞にさらした。治療グループに対するディフォシンの強制投与を、芽胞接触の４時間後に開始し、６時間毎に継続した。芽胞接触の２４時間後、両グループのマウスの糞を収集し、重量を計測し、均質化して、そして発芽を促進するために ０．０５％ナトリウム タウロコール酸含んだクロストリジウム・ディフィシル菌選択製剤プレートに、連続１０倍希釈溶液にして広げた。サンプルあたりの総ＣＦＵを数え、そしてＣＦＵ／ｇ糞に換算した（図１０）。各グループの幾何平均ＣＦＵ／ｇ糞を計算し、そしてスチューデントｔ検定で比較した。
【０１３２】
異種ディフォシン、Ｄｉｆｆ４＿Ｍ６８−ＲＢＤ４は、生体内で活性であり、体外排出およびクロストリジウム・ディフィシル菌株ＣＤ６３０のコロニー化を減らすことが、データ解析の結果示された。異種ディフォシンを受ける前、および間クロストリジウム・ディフィシル菌が攻撃されたマウスは、クロストリジウム・ディフィシル菌を３．７ｘ１０4ＣＦＵ／ｇ糞（幾何平均）の割合で排出した一方で、ディフォシン投与無しのマウスは、クロストリジウム・ディフィシル菌を６．９ｘ１０5ＣＦＵ／ｇ糞（幾何平均）の割合で排出した。これは、クロストリジウム・ディフィシル菌の１８．６倍希釈を意味した。スチューデントｔ検定による排出結果の比較は、帰無仮説＜０．０５を与え、そしてディフォシンによって引き起こされる排出の違いは統計的に有意であることが示された。この実験は、新規、非−１３７４ベースＲＢＤを含む異種ディフォシンは生体内で活性であり、およびクロストリジウム・ディフィシル菌の排出とコロニー化を低減することを証明した。
【０１３３】
用語「から成る（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」または「特徴付けられる（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」と入れ替え可能で使用するが、包括的または制約の無い言葉であり、そして付加的な、復唱されない要素および方法の手順を排除しない。熟語「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、いかなる要素、手順、またはその請求項に特定されない構成物をも排除しない。熟語「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、請求の範囲を、特定の物質または手順および請求する発明の基本的および新規の特徴に物質的に悪影響しないそれら特定の物質または手順に限定する。本開示は、各文章の範囲に対応した発明組成物および方法の実施形態を意図している。このように、復唱される要素または手順から成る組成物または方法は、それら要素または手順を、本質的に含むまたは含む組成物または方法において、特定の実施形態を考慮している。
【０１３４】
本開示で引用される特許、特許提案、および公開を含む全ての参照は、これまでに特別に参照されたか否かにかかわらず、その全体を参照としてここに組み入れる。
【０１３５】
本発明の記述全体をもって、広範囲の同等のパラメーター、濃度、および条件内で、本発明の意図および範囲から逸脱することなく、及び過剰な実験をすることなく、同様のことが実施可能であること、当業者には理解されるであろう。
【０１３６】
一方、本発明を特定の実施形態に関連して説明したが、さらなる変更が可能であることは理解されよう。本出願は、一般に、本発明の原理及び公知の範囲内または当業者内で習慣的行われる実践の範囲内での本開示からの逸脱を含み、そしてこれまでに明記した本質的な特質に応用できるとする、いかなる本発明の変更、使用、適応をも含むことを意図している。
【０１３７】
本発明は、上記の実施例を参考として記述しているが、本発明の意図および範囲内の修正および変更を包含していることは理解されよう。したがって、本発明は、以下の請求項によってのみ制約される。
【０１３８】
【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【０１３９】
本出願は、電子的にＡＳＣII フォーマットに対応し、本明細書にその全体が参照として援用される配列表を含んでいる。ＡＳＣIIコピーは、２０１４年３月６日に作成され、名称はＣＦ２１０３４１＿ＳＬ．ｔｘｔで、サイズは４７６，９２１バイトである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図１−１５】
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【図１−１６】
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【図１−１７】
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【図１−１８】
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【図１−１９】
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【図１−２０】
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【図１−２１】
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【図１−２２】
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【図１−２３】
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【図１−２４】
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【図１−２５】
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【図１−２６】
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【図１−２７】
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【図１−２８】
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【図１−２９】
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【図１−３０】
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【図１−３１】
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【図１−３２】
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【図１−３３】
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【図１−３４】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
2016512428.tif 000064
【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
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【図１１−７】
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【図１１−８】
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【図１１−９】
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【図１１−１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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