(57)【要約】多能性脂肪由来幹細胞（ＰＡＳＣ）の効率的な単離および使用のための方法が提供される。ある一定の実施形態では、方法は脂肪組織試料を提供する工程を含み、これに由来する間質血管細胞群が脂肪細胞画分と共培養される。ＰＡＳＣは、高度の精製で単離することができ、追加の細胞濃縮プロセス（例えば細胞選別）は要求されない。ＰＡＳＣおよびそれらの条件培地は、脂肪組織の収集の数時間以内に、組織再生のために使用することができ、細胞の増殖が必要とされない。ＰＡＳＣは浮遊する個々の細胞として、細胞のクラスターとして、または培養容器の表面（複数可）に接着されて増殖することができる。ＰＡＳＣは、移植されると、インビボで奇形腫を生成せず、免疫拒絶反応を誘導せず、それらはグラフティングで高い効率を達成する。細胞および組成物は、細胞治療および新しい薬物のスクリーニングのために使用することができる。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞（ＰＳＣ）を脂肪組織から単離する方法であって、
（ａ）脂肪組織試料を提供すること；
（ｂ）前記試料中の細胞をストレス条件に供すること；
（ｃ）脂肪細胞および間質血管細胞群を２−３６時間共培養すること；
（ｄ）生細胞を回収すること；ならびに
（ｅ）任意で回収された細胞を培養すること
を含む、方法。
【請求項２】
前記工程（ｂ）のストレス条件は、前記細胞をタンパク質分解酵素を含む培地でインキュベートすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素はコラゲナーゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ｃ）の共培養はタンパク質分解酵素の存在下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素はコラゲナーゼである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記共培養は血清なしで実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記共培養は４−２４時間実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
細胞選別なしで実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記共培養は低酸素条件下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（ｄ）の回収は、少なくとも１００，０００のＰＡＳＣを回収することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１−１０のいずれかに記載の方法により単離したＰＡＳＣ、またはその後代、および治療的に許容される培地を含み、前記ＰＳＣは培地に懸濁される、組成物。
【請求項１２】
前記細胞は、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｔｒａ１−６０、およびＮａｎｏｇを発現する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１−１０のいずれかに記載の方法により単離した細胞、またはその後代の培養物から培地を回収することにより調製した条件培地を含む、細胞を含まない組成物。
【請求項１４】
被験体において組織損傷を寛解する方法であって、
請求項１１または１２に記載の組成物を前記被験体に、前記組成物のＰＳＣが分裂し、組織損傷部位に集合することができる条件下で、投与すること
を含む、方法。
【請求項１５】
前記組織損傷は外傷性障害または疾患関連損傷を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記外傷性障害は低酸素症、骨損傷、裂傷、銃撃創傷、または脳卒中を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記疾患関連損傷は、糖尿病、血管疾患、感染、変性神経疾患、癌、または自己免疫疾患と関連する損傷を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物は、脂肪吸引から単離されたＰＡＳＣを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記脂肪吸引は、前記組成物が投与される被験体に対して実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物は前記被験体に脂肪吸引の６時間以内に投与される、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年５月２２日出願された米国仮特許出願番号６１／８２６，４１７号（その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞は全ての型の細胞（内胚葉、外胚葉および中胚葉起源）に分化する能力を有し、そのため適正な操作により全ての種類の組織を再生する可能性がある。現在のところ、２つの代表的な多能性幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳＣ）および人工多能性幹細胞が知られており、それらは再プログラミングされた成体体細胞（ｉＰＳＣ）である。
【０００３】
ＥＳ細胞は幹細胞研究の分野で明白に注目を集めてきた。ＥＳ細胞は、それらの組織を生成する能力により大量の以前の不可逆的な障害を治療し、よって、再生医学に革命をもたらす可能性を示す（１−３）。しかしながら、それ以来、ＥＳ細胞は移植されると高い免疫拒絶反応率を示し、それらの抑制のきかない増殖の結果として奇形腫を形成するという証拠があがっている（４）。ヒト胚の使用に関する生命倫理問題を取り巻く論争と共に、この催奇性傾向が再生医学におけるＥＳ細胞の実用化を不可能にする。
【０００４】
細胞治療に対するＥＳ細胞の使用を取り巻く倫理的ジレンマに対処すると、ｉＰＳ細胞が幹細胞分野において興味の対象となった（５−６）。ｉＰＳ細胞は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４を含むいわゆる「山中因子（Ｙａｍａｎａｋａ  ｆａｃｔｏｒｓ）」の誘導を含む複雑なメカニズムにより再プログラミングする能力を有し、それらはその後、多能性：３つの生殖系列から細胞を自己再生し、生成し、よって奇形腫を形成する能力を確立する特性マーカーとなった（７−９）。ｉＰＳ細胞は患者自身の、または自己の細胞から作成することができるので、免疫拒絶反応の懸念、ならびにヒト胚から抽出された幹細胞の使用を妨害する倫理的問題を解決するが、移植時の抑制のきかない細胞増殖の結果としての奇形腫の生成および宿主生物への再導入時のｉＰＳおよびＥＳ細胞の両方の非常に低い生存率が、これらの細胞のトランスレーショナルな使用を妨げる（１０−１２）。さらに、成熟ｉＰＳ細胞は翻訳後ヒストンおよびＤＮＡ修飾の残遺物により規定されるエピジェネティックメモリを有し、完全に成功した再プログラミングを防止し、しばしば元の幹細胞源と同じ系統内の細胞に対しそれらの生理的機能を制限することもまた見出されている（１３−１５）。研究者らは、これらの問題に対処しようと試みたが、ほとんど無益に近かった（１６−１７）。過剰な金銭的および時間的努力がＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞の両方の研究に費やされたにもかかわらず、これらの幹細胞およびそれらの細胞治療のための使用に直面するハードルを克服するのに進歩はほとんどなかった。
【０００５】
他の、再プログラミングされない多能性幹細胞集団が、倫理的に論争が起きやすいＥＳ細胞および遺伝子改変ｉＰＳ細胞の代わりとして、科学界の注意を引いてきた。しかしながら、成体幹細胞の複数の集団が提示されてきたが、多くが再現不可能性のために多くの疑いに直面してきた。骨髄から単離された、多分化能成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）は多能性および非腫瘍形成性の両方であり、マウスモデルに注入されるとキメラ子孫の一因となり、損傷組織をインビボで再生させることが報告された（１８−１９）。ヒト骨髄単離成体多系統誘導性（ＭＩＡＭＩ）細胞および極小胚様幹細胞（ＶＳＥＬ）は、骨髄に加えて臍帯血から単離され、すぐに追従し、同様の多能性および非腫瘍形成特性を示した。ＶＳＥＬのように、非制限的な体性幹細胞（ＵＳＳＣ）は、臍帯血から単離され、報告によれば多能性であるが、古典的多能性幹細胞マーカー発現を欠いている（２０）。これらの成体多能性幹細胞系は全て、さらなる調査および複製に対し公的に警告を受けており、またはＶＳＥＬの場合、完全に否定されている。刺激惹起性多能性獲得（ＳＴＡＰ）は、脾臓のＣＤ４５＋リンパ球を酸性条件に曝露し、続いて、白血病抑制因子（ＬＩＦ）とインキュベートすることにより特徴付けられ、近年、多能性を体細胞に与える方法として記載されている（２１）。しかしながら、ＳＴＡＰ細胞は奇形腫を形成し、それらの臨床適用を妨げる。ＳＴＡＰ細胞は現在のところ、公開された結果の全体としての正当性ならびにそれらの再プログラミングの背景となるメカニズムを決定するために調査中である。
【０００６】
奇形発生をインビボで受けない高い移植後生存率を有するヒト多能性幹細胞の集団は、人間に影響する多くの障害の治療を促進することができる。近年、日本の東北大学出身の研究者のグループが、多能性特性を有する皮膚および骨髄から単離された幹細胞集団を単離し、培養した（２２−２３）。ミューズ細胞（多種系統に分化する、ストレス耐性のある細胞）と命名されたこれらの細胞は、インビトロで細胞ストレス条件下で作成することができる。ミューズ細胞は増殖しながら、細胞クラスターを形成する。ミューズ細胞は、間葉系幹細胞として特徴付けられ、これらは、多能性と関連する遺伝子のセットを発現する能力を有する。
【０００７】
さらに、ミューズ細胞は、内胚葉、外胚葉、および中胚葉細胞にインビトロおよびインビボの両方で分化することができる。より重要なことには、ＥＳＣおよびｉＰＳＣとは異なり、ミューズ細胞が（局所または静脈注射により）組織再生のために免疫不全マウスモデルに移植された場合、ミューズ細胞は損傷した皮膚、筋肉、または肝臓内に組み込まれ、新しい組織が再生される。ミューズ細胞は腫瘍化増殖を受けず、そのため、奇形腫をインビボで生成する傾向も、宿主において自己移植で免疫拒絶を誘導する傾向もない（２２−２３）。さらに、ｉＰＳＣと対照的に、ミューズ細胞は、それらの多能性のために外来遺伝子の導入を必要としない。加えて、ミューズ細胞は、血流中に注入されると、損傷部位にインビボで誘導され、組織再生に寄与する微小環境により、自然に組織特異的細胞に分化することが示されている（２２）。
【０００８】
ミューズ細胞は、組織再生に大きく寄与する可能性があるが、骨髄ストロマ細胞およびヒト皮膚線維芽細胞の抽出、および細胞選別、限界希釈による細胞クローニング、長期間の細胞培養を含む時間のかかる精製方法のために妨害される。この場合、骨髄ストロマ細胞またはヒト皮膚線維芽細胞から、ＳＳＥＡ３細胞選別、および１ヶ月の細胞の増殖後に１，０００，０００ミューズ細胞しか最終的に生成されない。このように、組織再生源としての非腫瘍形成性多能性細胞の単離、およびそのような細胞を単離する改善された方法が必要なままである。
【発明の概要】
【０００９】
幹細胞治療の進歩は、奇形発生をインビボで受けず、高い移植後生存率を有するヒト多能性幹細胞の自己移植により特に誘発される主な臨床上の限界に直面している。低酸素、栄養欠乏、炎症性サイトカイン、および反応性酸素種などの生着微小環境の適さない宿主因子はそれぞれ、望まれない分化またはアポトーシスの一因となり得る。発明は、組織損傷および疾患を寛解するため、ならびに新しい治療薬を同定し、スクリーニングし、試験するのに使用するための細胞、方法および組成物を提供することにより、これらの要求などに対処する。
【００１０】
１つの実施形態では、発明は、脂肪組織から多能性脂肪幹細胞（ＰＡＳＣ）を単離する方法を提供する。方法は典型的には、下記工程を含む：（ａ）脂肪組織試料を提供する工程；（ｂ）前記試料中の細胞をストレス条件に供する工程；（ｃ）脂肪細胞および間質血管細胞群を２−３６時間、典型的に６−８時間共培養する工程；（ｄ）生細胞を回収する工程；ならびに（ｅ）任意で回収された細胞を培養する工程。１つの実施形態では、工程（ｂ）のストレス条件は、細胞をタンパク質分解酵素を含む培地でインキュベートすることを含む。工程（ｃ）の共培養は同様に、タンパク質分解酵素の存在下で実施することができる。より特定的な実施形態では、酵素はコラゲナーゼである。
【００１１】
工程（ｂ）のストレス条件としては下記が挙げられるが、それらに限定されない：プロテアーゼ処理、細胞を飢餓条件（栄養分なし、グルコースなし）、低酸素条件（酸素の欠乏）、低温、ヒートショック、および超音波処理などの機械的手順による溶解に曝露すること。２つ以上のそのようなストレス要因が、一緒に使用され得る。これらの条件下では、ＰＡＳＣの高く精製された集団が時間のかかる細胞選別方法、磁気ビーズまたは特別な装置および長期細胞培養手順の必要なく単離される。ストレス条件は典型的に、共培養工程により適用される。例えば、脂肪組織から得られる細胞は最初にプロテアーゼ（例えば、コラゲナーゼ）で約４５分間３７℃で処理され、続いて、工程（ｂ）のストレス条件を受け、ここで、細胞４℃で２−８時間の間低酸素条件に曝露され（または一晩；工程（ｃ））、その時間の間、タンパク質分解活性が続くことが許される。
【００１２】
典型的な実施形態では、共培養は、血清なしで実施される。例えば、共培養は、ダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）、または当技術分野で知られている同様の基本培地で実施することができる。共培養は細胞を５０ｍｌ遠心管中で保存するほど簡単なものとすることができる。ストレス要因は、例えば、管のキャップを閉めて低酸素条件を作る、管または他の容器を冷蔵庫に入れる（冷却）、ならびに栄養分を含まない培地を使用する（飢餓）ことにより適用することができる。
【００１３】
１つの実施形態では、共培養は、４−２４時間実施される。典型的には、共培養は、６−８時間（または一晩）実施される。共培養の長さはタイミング留意事項を適応させるために改変することができる。例えば、単離したＰＡＳＣが、例えば外傷性障害の治療のために、緊急で要求される場合、工程（ｂ）および（ｃ）は短くすることができ、複数のストレス要因が適用され、ストレス抵抗性細胞を選択するプロセスが加速される。
【００１４】
１つの実施形態では、工程（ｄ）の回収は、少なくとも２００，０００のＰＡＳＣ／ｍｌの吸引脂肪組織材料を回収することを含む。これは、１リットルの吸引脂肪組織材料で回収された２００，０００，０００のＰＡＳＣと等価である。他の実施形態では、回収は少なくとも５０，０００，０００のＰＡＳＣ、または少なくとも１００，０００，０００のＰＡＳＣ／ｌｔの吸引脂肪組織材料を回収することを含む。これらの量のＰＡＳＣは、典型的には、工程（ｂ）のストレス条件開始の６−８時間（または一晩）以内に回収可能である。いくつかの実施形態では、少なくとも５００，０００，０００のＰＡＳＣ／リットルの吸引脂肪組織が、工程（ｂ）のストレス条件開始の８時間以内に回収される。他の実施形態では、ＰＡＳＣが、１２−１６時間以内に回収される。１つの実施形態では、方法は細胞選別なしで実施される。１つの実施形態では、生細胞の回収は、培地を遠心分離すること、上清を除去すること、残った細胞ペレットを洗浄することおよび細胞ペレットを緩衝溶液および／または培地に再懸濁させることを含む。いくつかの実施形態では、生細胞の回収は、細胞を含む溶液または培地においてを提供することを含む。
【００１５】
発明はさらに本明細書で記載されるＰＡＳＣを提供する。ＰＡＳＣは典型的には本質的に他の細胞型を含まない組成物中に存在する（例えば、少なくとも９５％純粋、およびいくつかの実施形態では、少なくとも９９％純粋）。本明細書で記載される方法により単離したＰＡＳＣ、またはその後代、および治療的に許容される培地を含む組成物もまた提供される。本明細書で記載される方法により単離したＰＡＳＣの培養物から回収した条件培地を含む組成物もまた提供される。培養条件培地は、２４−７２時間培養下で維持したＰＡＳＣにより分泌される因子（サイトカイン、ケモカイン、成長因子、ペプチド、タンパク質）を含む。条件培地は典型的には標準条件下（例えばＤＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清、３７℃、５％ＣＯ２）で培養されたＰＡＳＣから調製された。ＰＡＳＣの条件培地中に放出されたこれらの因子は抗炎症および／または免疫調節特性を有し、それらは、疾患、特に免疫または自己免疫疾患の治療のために使用することができる。
【００１６】
１つの実施形態では、組成物は、脂肪吸引から単離されたＰＡＳＣを含む。１つの実施形態では、脂肪吸引は、組成物が投与される被験体に対して実施される。ＰＡＳＣの自己および同種移植の両方が企図される。典型的な実施形態では、組成物は被験体に、脂肪吸引の６−２４時間以内、またはそれ以下で投与される。
【００１７】
発明はさらに、被験体において組織損傷を寛解する方法を提供する。典型的には、方法は発明の組成物を被験体に投与することを含む。組成物が、ＰＡＳＣを含む場合、これは、組成物のＰＡＳＣが分裂し、組織損傷部位に集合することができる条件下で投与することができるが、ＰＡＳＣの損傷部位への移動は全ての実施形態では要求されない。
【００１８】
いくつかの実施形態では、組織損傷は外傷性障害または疾患関連損傷を含む。外傷性障害の代表例は低酸素症、骨損傷、裂傷、および銃撃創傷を含む。別の実施形態では、疾患関連損傷は、糖尿病、血管疾患、感染、変性神経疾患、癌、ハンチントン病、多発性硬化症、関節リウマチ、ループス、Ｉ型糖尿病、クローン病と関連する損傷を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１Ａ−１Ｃは、（１Ａ）脂肪細胞、他の細胞型の中で、脂肪組織マクロファージ（ＡＴＭ）および多分化能脂肪幹細胞（ＡＤＳＣ）を含む間質血管細胞群も含む脂肪組織におけるＰＡＳＣ、（１Ｂ）脂肪細胞画分（浮遊細胞）（顕微鏡写真）および（１Ｃ）間質血管細胞群（顕微鏡写真画像）を示し、ＰＡＳＣは両方の画分に存在する（丸で印付けされている）。
【図２】脂肪組織の異なる細胞成分における高い程度の細胞可塑性を示す。ＡＤＳＣは、骨髄に由来する多分化能間質細胞と同様に脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、および他の間葉系細胞系統に分化することができる。成熟脂肪細胞は定期的に、有糸分裂を受けず、よって、脂肪細胞の増加は、通常前脂肪細胞の分化を反映することが一般に認められている。しかしながら、いくつかの研究により、成熟脂肪細胞もまた、増殖活性を有することができることが示されている。最近の研究では、脂肪細胞は前脂肪細胞に脱分化することができ、多分化能細胞集団に分化することさえ可能であることが示唆される。注目すべきことに、前脂肪細胞はまた、迅速にかつ効率的に典型的なマクロファージに分化すること、またはその逆が観察されており、これらの細胞の著しい可塑性が証明される。
【図３】脂肪組織マクロファージ（造血幹細胞起源、ＣＤ１４（＋）細胞）の前脂肪細胞（間葉系幹細胞起源、Ｓ−１００（＋）細胞）に分化する能力により示される、脂肪組織において存在する細胞可塑性の別の例を示す。前脂肪細胞へのＡＴＭ分化中、細胞はＣＤ１４（＋）およびＳ−１００（＋）マーカーの両方を発現する。観察されるほとんどの前脂肪細胞は、さまざまな程度にＣＤ１４（＋）であった。マクロファージが前脂肪細胞形態に向かって分化するに従い、細胞はより少ないＣＤ１４およびより多くのＤＬＫ／Ｓ−１００を発現した。
【図４】脂肪組織中の多能性脂肪幹細胞（ＰＡＳＣ）の存在を示す。コラゲナーゼ処理および遠心分離後、脂肪細胞画分（浮遊細胞）および間質血管細胞群（ＳＶＦ）（細胞ペレット）が脂肪組織から放出される。消化された材料は、その後、重度の細胞ストレスに供せられ、これはコラゲナーゼとの長期インキュベーション（６−８時間）、栄養分の欠乏、低温、高度低酸素および脂肪細胞画分と間質血管細胞群間でのパラクリン／オートクリン相互作用を含み、それは、脂肪細胞およびＳＶＦ中に存在する細胞からのサイトカイン／ケモカインの放出をひきおこす。ＰＡＳＣはそのような外部ストレス条件に生き残ることができる唯一の細胞型である。ＰＡＳＣは脂肪細胞および間質血管細胞群の両方に存在する。
【図５】吸引脂肪組織材料からのＰＡＳＣ単離の単純なスキームを示す。３０分／３７℃の脂肪組織の消化後、脂肪組織から放出された全ての細胞は重度の細胞ストレスに曝露された（コラゲナーゼとの長期インキュベーション、栄養分の欠乏、低温、高度低酸素、脂肪細胞および他の細胞成分からのサイトカイン／ケモカインの放出）。ＰＡＳＣはそのような外部ストレスを生き残ることができる唯一の細胞型である。ＰＡＳＣは脂肪細胞および間質血管細胞群の両方に存在する。ＰＡＳＣは、個々の細胞として、また、細胞のクラスターを懸濁液中で形成することにより増殖することができ、ならびに接着細胞として増殖する。それらの多能性特性、奇形腫形成なしおよび高いパーセンテージのグラフティングに基づき、ＰＡＳＣは、組織工学、再建医学、ならびに変性および免疫障害の治療において使用される可能性がある。
【図６】脂肪吸引、吸引された脂肪のコラーゲン消化、ＰＡＳＣ単離およびＰＡＳＣの注入（静注を介してまたは損傷組織中に）を含む異なる手順の概略図である。この手順は非常に速く（５−７時間）、効率的である（１，０００，０００のＰＡＳＣ／ｌの吸引脂肪組織材料）。実時間で患者に注入されたＰＡＳＣの数、注入された細胞の流量、酸素圧、血管新生レベルおよび処置による他のパラメータを測定することが可能である。この技術の利点の１つは急性傷害、脳卒中、重度心臓発作、または傷害が起きた直後の火傷を患う患者を治療することができることである。これらの型の傷害の組織修復にはクリティカルな時間枠が存在する。ＰＡＳＣはそのため、そのような急性障害を治療する理想的な細胞である。さらに、全ての手順は、同じ手術室で実施することができる。
【図７】自己再生のためのＰＡＳＣの能力を示す。懸濁液中でのＰＡＳＣの増殖には、ＰＡＳＣクラスターを単細胞に脱凝集させるための穏やかなピペット操作のみが必要とされる。これらの個々の細胞は細胞のクラスターを形成し始める。細胞クラスターが５０μｍより大きくなるとすぐに、増殖プロセスが再び繰り返される（第三世代）。ＰＡＳＣは１−１／２日／細胞分裂の低い増殖速度を有する。
【図８】正常女性の吸引脂肪組織から単離されたＰＡＳＣは正常な核型および性染色体ＸＸを含む２３対の染色体（女性ドナー）を示すことを示す。
【図９】図９Ａ−９Ｂは、ＰＡＳＣにおける表面抗原分類（ＣＤ）マーカーに対する表面タンパク質発現のフローサイトメトリー分析を示す。ＰＡＳＣは、下記ＣＤマーカーを使用することにより特徴付けられた：ＣＤ１０５（間葉系幹細胞のマーカー）、ＣＤ２９（Ｔ細胞のためのマーカー）、ＣＤ９０（胸腺細胞のためのマーカー）、ＣＤ７３（リンパ球分化のためのマーカー）、ＣＤ３４（造血幹細胞のためのマーカー）、ＣＤ４５（造血幹細胞のためのマーカー）、ＣＤ４４（活性化Ｔリンパ球のためのマーカー）、ＨＬＡ−ＤＲ（ＨＬＡクラスＩのためのマーカー）およびＨＬＡ−ＤＲ（ＨＬＡクラスＩＩのためのマーカー）。（９Ａ）図の棒はミューズ細胞上での表面マーカーの発現のパーセンテージを表す。（９Ｂ）いくつかの表面抗原分類（ＣＤ）の代表的なヒストグラム。
【図１０Ａ】ＰＡＳＣは凝集物を形成することを、個々の細胞と共に（どちらも特徴的な多能性幹細胞マーカー（ＳＳＥＡ３、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびＴＲ１−６０）を発現する）ことを示す。ＡＤＳＣを陰性対照として使用した。
【図１０Ｂ】重度の細胞ストレス処理を生き延びた細胞は全て、実際にはＰＡＳＣであることを示す（多能性幹細胞マーカーＳＳＥＡ４、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２およびＴＲＡ１−６０による全ての細胞の認識を確認されたい（多能性幹細胞マーカー、ＤＡＰＩおよび光学顕微鏡法により検出される総細胞、ＢＷ間の重なりを確認されたい）。
【図１１】図１１Ａ−１１Ｃは、中胚葉細胞系統へのＰＡＳＣ分化を示す。（１１Ａ）ＰＡＳＣの中胚葉系統への自発的分化を、ＤＬＫ（前脂肪細胞のためのマーカー、ＢＯＤＩＰＹ−Ｃ１６（脂質蓄積を検出するための蛍光色素）、およびミオシンＤ重鎖）（骨格筋細胞において見出されるミオシンＩＩタンパク質の重鎖部分のためのマーカー）への抗体を使用して決定した。（１１Ｂ）脂肪生成培地における脂肪細胞へのＰＡＳＣ分化（３および６日）。新たに形成された脂肪細胞の脂質蓄積をＢＯＤＩＰＹ−Ｃ１６を用いて決定した。（１１Ｃ）筋原性培地における筋細胞へのＰＡＳＣ分化（３および６日）。平滑筋細胞がＳＭＡ抗体を使用して検出された。ＡＤＳＣを対照として使用した。
【図１２】図１２Ａ−１２Ｂは、内胚葉細胞系統へのＰＡＳＣ分化を示す。（１２Ａ）ＰＡＳＣの、中胚葉系統への自発的分化を、α−フェトプロテイン（内胚葉の発生および肝細胞の前駆体のためのマーカー）およびパンケラチン（胆道上皮細胞に特徴的な線維のためのマーカー）抗体を使用して決定した。（１２Ｂ）肝細胞様細胞へのＰＡＳＣ分化を肝性分化培地中で（３および６日）サイトケラチン７（胆汁細胞中の中間径線維タンパク質のためのマーカー）α−フェトプロテイン抗体を使用して決定した。ＡＤＳＣを陰性対照として使用した。
【図１３】図１３Ａ−１３Ｃは、外胚葉細胞系統へのＰＡＳＣ分化を示す。（１３Ａ）ＰＡＳＣの、外胚葉細胞系統への自発的分化を、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ、新皮質ニューロン前駆体を検出するために使用されるマーカー）、代謝型グルタミン酸受容体（Ｇｌｕｔ−Ｒ、ミクログリアおよび神経様細胞を検出するために使用されるマーカー）およびＮｅｕｒｏＤ（新皮質前駆細胞を検出するために使用されるマーカー）に対する抗体を使用して決定した。（１３Ｂ）第１および第２の神経原性分化培地の両方におけるインキュベーションにわたるＰＡＳＣのニューロンへの形態学的な進行。ＰＡＳＣは、指様突起を有する大きな細胞球の形成から、長いニューロン様細胞への進行を示し、これはその後、大きなネットワークを形成した。（１３Ｃ）ＰＡＳＣ由来の神経細胞が、第１および第２の神経原性分化培地の両方におけるＰＡＳＣのインキュベーション後に生成された。神経様細胞を、ネスチン（神経前駆細胞のマーカー）およびＭＡＰ２（微小管の重合に関与するマーカー）を用いて特徴付けた。ＡＤＳＣを対照として使用した。
【図１４】図１４Ａ−１４Ｇは、ＰＡＳＣは奇形腫を生成しないことを示す。奇形腫形成アッセイのために、ＮＯＤｓｃｉｄマウスに１０６のＰＡＳＣを精巣内注入した（１４Ａ）。細胞株Ｆ１９を、注入後２１日後に奇形腫を形成した陽性対照として使用した。ミューズ細胞は（１４Ｂ）１ヶ月、（１４Ｃ）２ヶ月（１４Ｄ）４ヶ月には奇形腫を形成しなかった。（１４Ｅ）１０５のＰＡＳＣがＮＯＤｓｃｉｄマウスの精巣に注入され、注入後６ヶ月には、奇形腫を形成しなかった。（１４Ｆ−１４Ｇ）注入後（１０５のＰＡＳＣ）６ヶ月後にＮＯＤｓｃｉｄマウスから得られた精巣の組織学的研究は、正常な精巣組織を示す。矢印はＰＡＳＣが注入された精巣示す。左側は、それらの個々の対照である。
【図１５】ＰＡＳＣにおいて発現されるが、ＡＤＳＣでは発現されない、そよびその逆の遺伝子の機能グループのマイクロアレイ分析を示す。ＰＡＳＣは、下記と関連する遺伝子の非常に低い発現を示す：有糸分裂、細胞周期、細胞増殖、細胞接着、ＤＮＡ修復、細胞生存、ユビキチン化、アクチンリモデリング、代謝および遺伝子。対照的に、ＰＡＳＣは、下記と関連する遺伝子の非常に高いレベルの発現を示す：免疫、炎症、免疫制御、免疫応答、免疫抑制、リンパ球活性化、Ｔ細胞マーカー、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞活性化、同時刺激。ＰＡＳＣは感染部位で樹状細胞またはヘルパーＴ細胞を制御することができる。
【図１６】ＰＡＳＣ対ＡＤＳＣにおける全ての差次的に発現された遺伝子（２倍以上）の１位から１０位の機能グループ経路を示す。フィッシャーの正確確率検定を使用して、機能グループを用いて、データセット中の遺伝子間の関係の確率を決定するｐ値を計算した。機能グループはｘ軸に沿って表され、一方、ｙ軸は、フィッシャーの正確確率検定により、統計学的有意性に対する閾値を０．０５で設定して、ある機能グループにおけるＰＡＳＣ対ＡＤＳＣでの差次的に発現された遺伝子（２倍以上）の遺伝子数をその機能グループまたは経路を構成する遺伝子の総数で割った比間で計算したｐ値の対数を示す。分析は、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路分析ソフトウェアにより実施した。
【図１７】ＰＡＳＣ対ＡＤＳＣにおける全ての差次的に発現された遺伝子（２倍以上）の１位から１０位の古典的経路を示す。フィッシャーの正確確率検定を使用して、古典的経路を用いて、データセット中の遺伝子間の関係の確率を決定するｐ値を計算した。古典的経路はｘ軸に沿って表され、ｙ軸は、統計学的有意性に対する閾値を０．０５で設定して、フィッシャーの正確確率検定により、ある古典的経路におけるＰＡＳＣ対ＡＤＳＣでの差次的に発現された遺伝子（２倍以上）の遺伝子数を、古典的経路を構成する遺伝子の総数で割った比間で計算したｐ値の対数を示す。分析は、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路分析ソフトウェアにより実施した。
【図１８】マイクロＲＮＡ  Ｌｅｔ−７がＰＡＳＣ対ＡＤＳＣにおいて存在する最も重要な上流制御因子であることを示す。Ｌｅｔ−７は細胞周期分裂の減少（例えば、ＣＤＣＡ３、ＣＤＣ１６）、細胞分化（ＤＺＩＰ１）、細胞成長および増殖（ＳＳＲ１）、ＤＮＡ複製（ＭＣＭ６）、複製因子および癌（ＲＦＣ３、ＲＦＣ５）ならびに細胞死および生存（ＮＵＦ２、ＢＲＣＡ１、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＤＣ１６と関連する１１の下流遺伝子を制御する。ＰＡＳＣにおけるＬｅｔ−７の過剰発現は潜在的に、Ｌｉｎ２８発現を阻害するのに重要な役割を果たし、そのため、これらの細胞が腫瘍化増殖および奇形腫形成しないように保護するであろう。
【図１９】図１９Ａ−１９Ｃは、ＰＡＳＣは食作用活性を有することを示す。ＰＡＳＣの形成は脂肪細胞画分（浮遊細胞）および間質血管細胞群（接着細胞）の共培養後に観察された。前脂肪細胞（Ｓ−１００（＋）細胞）とＰＡＳＣの間には明確な相互作用が存在し、（ＣＤ３４（＋）細胞、造血幹細胞のマーカー）により示され、これは、形成されたと考えられる最も小さく、最も原始的ＰＡＳＣである。（１９Ａ）ＰＡＳＣは、前脂肪細胞のおよそ３分の１にしっかりと接着する。この接着は外見上選択的であり、というのも、一見すると同一の前脂肪細胞がＰＡＳＣに完全に貪食されているからである。（１９Ｂ）有糸分裂を受けている前脂肪細胞はＰＡＳＣにより乱されていないままであるが、真上の前脂肪細胞はＰＡＳＣにより貪食され、ＤＡＰＩ陽性核のみが被覆されずに残される。前脂肪細胞およびＰＡＳＣはどちらもＳ−１００＋およびＳＳＥＡ３であるが、（図１９Ｃ−ａ、１９Ｃ−ｂ）は、脂肪細胞は１−２秒の蛍光曝露で陽性Ｓ−１００染色を示し、ＰＡＳＣはたった１ミリ秒曝露時間で陽性結果を示すことを示す。曝露強度の大きな食い違いにより、ＰＡＳＣはＳ−１００を、ずっと高いレベルで発現し、あるいはより容易にＳ−１００抗体にそのドメインに結合させることが示唆される。個々のＰＡＳＣは元々、それらの小核の明確なＤＡＰＩ染色により同定された。前脂肪細胞は、貪食される異なる段階で明確に見ることができるであろう。全細胞を貪食するマクロファージとは異なり、ＰＡＳＣは前脂肪細胞の核をそのまま残し、（図１９Ａ）多くの場合、前脂肪細胞核が培養中に裸で残される（図１９Ｂ）。
【図２０】図２０Ａ−２０Ｅは、ＰＡＳＣの抗原特異的免疫調節細胞としての役割を示す。ＮＯＤ  ＢＤＣ２．５トランスジェニックマウスの脾細胞はＣＤ４（＋）Ｔ細胞を含み、これは、ミメトープ（Ｍｉｍｅｔｏｐｅ）（Ｍｉｍ）と命名された特異ペプチド（その配列はクロモグラニンＡ（ＣｈｇＡ）の一部である）のみを認識する。脾細胞（５ｘｌ０５細胞）を２４ウェルクラスターにおいてミメトープと共に、７２時間、ＰＡＳＣ（１０３−１０５細胞／ウェル）の存在下（共培養）で、またはこれなしで培養した。脾細胞の数（細胞増殖）をカルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）染色脾細胞上で、Ｍｉｍ±ＰＡＳＣとのインキュベーション前後でＦＡＣＳにより決定した。ＩＦＮγ生成をそれぞれＦＡＣＳおよびＲＩＡにより決定した。Ｍｉｍにより刺激された、ＰＡＳＣのＮＯＤ  ＢＤＣ２．５トランスジェニックマウス脾細胞との共培養は、Ａｇ特異的受刺激脾細胞によるＩＮＦγの分泌を著しく低減させた。ヒストグラムはＴ  ＣＤ３＋依存性細胞におけるＣＦＳＥの希釈を示す。Ｔ細胞増殖は、ＰＡＳＣ条件培地により影響されなかった。（２０Ａ）ＮＯＤ  ＢＤＣ２．５脾細胞（ｓｐｌ）を、ミモトープ（Ｍｉｍ）で刺激し、７２時間（２０Ｂ）１０５のＰＡＳＣ、（２０Ｃ）１０４のＰＡＳＣおよび（２０Ｄ）１０３のＰＡＳＣなしで、およびこれと共に培養した。（２０Ｅ）Ｍｉｍにより刺激された、脾細胞によるＩＮＦγ分泌は、培養物中のＰＡＳＣの存在により劇的に減少した。
【図２１】図２１Ａ−２１Ｄは、ＰＡＳＣ条件培地は、抗原特異的免疫調節において重要な役割を果たす因子（サイトカイン、成長因子、ペプチド）を含むことを示す。ＮＯＤ  ＢＤＣ２．５トランスジェニックマウス脾細胞を、ミメトープ（Ｍｉｍ）で刺激し、ＰＡＳＣ条件培地のいくつかの指示された希釈物と共に７２時間培養した。ＰＡＳＣ条件培地は、Ａｇ特異的受刺激脾細胞によるＩＮＦγの分泌を著しく低減させた。ＥＬＩＳＡキットを使用して、マウスＩＮＦγを定量した。二人の異なる患者から単離されたＰＡＳＣの条件培地（ＰＡＳＣ−ＣＭ＃１およびＰＡＳＣ−ＣＭ＃２）を培養下で７２時間維持した。ＮＯＤ  ＢＤＣ２．５脾細胞を、カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）で染色し、Ｍｉｍと共に７２時間インキュベートし、ＣＦＳＥ希釈を細胞増殖の測定としてＦＡＣＳにより分析した。ヒストグラムはＴ  ＣＤ３＋依存性細胞におけるＣＦＳＥの希釈を示す。Ｔ細胞増殖は、ＰＡＳＣ条件培地により影響されなかった。（２１Ａ、２１Ｃ）ＰＡＳＣ−ＣＭ＃１の効果；（２１Ｂ、２１Ｄ）ＰＡＳＣ−ＣＭ＃２の効果。
【図２２】図２２Ａ−２２Ｃは、糖尿病マウスモデルにおけるＰＡＳＣの効果を示す。（２２Ａ）ＮＯＤｓｃｉｄマウスをストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の複数回（４５ｍｇ／ｋｇ、４連続日）注入により糖尿病とした。ＰＡＳＣを（１０６細胞、腹腔内）糖尿病（血糖＞２４０ｍｇ／ｄｌ）ＮＯＤｓｃｉｄマウスに、１回または２回（示される通り）注入した。血糖および体重を１週間に１回記録した。（２２Ａ）ほとんどのＰＡＳＣ処置マウスが、ほぼ６週まで体重増加の増加を維持しながら、長期間生き残った。７匹のうち６匹のマウスが処置後８週間生き残り、７匹のうち５匹が、処置後第１１週に到達した。（２２Ｂ）ほとんどのＰＡＳＣ処置マウスは、変動する血糖を、処置後少なくとも６週の中５００ｍｇ／ｄｌ未満で維持した。（２２Ｃ）ＰＢＳを受けた全ての糖尿病ＮＯＤｓｃｉｄマウスは（対照群）、第５日まで血糖＞５００ｍｇ／ｄｌを有し、第１の注入後第６日に死亡し、または瀕死となった。
【図２３】図２３Ａ−２３Ｃは、自然に生じた糖尿病ＮＯＤマウスモデルにおけるＰＡＳＣの効果を示す。高血糖症の発症の直後に、ＰＡＳＣを、ＮＯＤマウスに注入した（１０６細胞、腹腔内）。（２３Ａ）４匹中３匹のＰＡＳＣが注入されたＮＯＤ糖尿病マウスが、処置後５週まで体重増加を示した。（２３Ｂ）血糖は、長期間の間、変動するレベルを示し、著しく遅延して、＞５００ｍｇ／ｄｌに到達した。（２３Ｃ）ＰＢＳ（対照群）を受けた全ての糖尿病ＮＯＤマウスは、血糖値＞５００ｍｇ／ｄｌに到達し（第４日）、体重が一定して損失した。第１０日に、ＮＯＤ糖尿病マウスは死亡した（ｎ＝２）。これらの結果から、ＰＡＳＣ処置マウスは長期間生き残り、対照よりも著しく高い生存率を示したことが示される。
【図２４】ＰＡＳＣを組織再生および細胞治療のための理想的な多能性幹細胞とするその特性の多くを表す。ＰＡＳＣは正常な生理的環境下、細胞ニッチ内で、本質的に静止状態で存在する。複数の成体幹細胞系統が、それらの寿命を通して様々な時間点で静止状態で存在することが示されており、造血幹細胞および上皮幹細胞が挙げられ、その静止状態はそれらの自己再生の保存において役割を果たすと考えられる。重度の細胞ストレス（飢餓、低温、タンパク質分解酵素コラゲナーゼとの長期インキュベーション）は、ＰＡＳＣを活性化し、解糖代謝の増加および高レベルのＲＯＳスカベンジャーが得られる。さらに、ＰＡＳＣは細胞増殖および分化を受けることなく、それらの多能性を維持する。ＰＡＳＣは一部には、腫瘍抑制因子の高発現と関連するそれらの低レベルの発癌遺伝子の発現のために、インビボで奇形腫を生成しない。最後に、細胞ストレスに対するそれらの高い抵抗性のために、ＰＡＳＣは高い生存の程度および非常に高い効率での損傷組織再生を有する。
【図２５】異常なストレス条件（例えば電離放射線、紫外光、化学化合物、誤りがちなＤＮＡ修復、など）下で活性化された場合、ＰＡＳＣが癌幹細胞（ＣＳＣ）となる可能性を示す。同様に、ＰＡＳＣを山中因子でプログラミングすると、ｉＰＳ細胞の形成につながる（催奇性の可能性を有する細胞）。内在性ＰＡＳＣを活性化することも可能であり得、これはｉＰＳ細胞に変換される細胞の小集団を構成する可能性がある。そのような理論は、癌細胞の生成における非対称分裂中の成体臓器特異的陽性Ｏｃｔ４（＋）幹細胞の役割の可能性に関する研究により支持される。ＣＳＣは、ＰＡＳＣにより、異常な刺激の下で、潜在的に生成され得る。それらは非常に迅速に分裂することができ、非常に活性な解糖代謝を有する。ＣＳＣは早期分化、細胞死を刺激し、癌遺伝子発現を増加させ、腫瘍抑制因子の低い発現を示すことができ、腫瘍増殖が駆動される。さらに、ＰＡＳＣ由来の潜在的ＣＳＣは、化学および放射線療法に対し抵抗性があり、治療後のその再発の一因となる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書で記載される発明は主な臨床上の限界を克服し、特にインビボで奇形発生を受ける多能性幹細胞の自己移植により引き起こされる問題、および高い移植後生存率の必要性に対処する。生着微小環境の適さない宿主因子、例えば低酸素、栄養欠乏、炎症性サイトカイン、および反応性酸素種はそれぞれ、望まれない分化またはアポトーシスの一因となり得る。
【００２１】
発明は、多能性脂肪幹細胞（「ＰＡＳＣ」）と呼ばれる脂肪組織（ＡＴ）由来多能性幹細胞の新集団の単離およびキャラクタリゼーションを提供する。ＰＡＳＣは、タンパク質分解酵素コラゲナーゼへの長期曝露、血清欠乏、低温および低酸素を含む、重度の細胞ストレス条件を用いて単離される。これらの条件下では、ＰＡＳＣの高く精製された集団が、細胞選別方法、磁気ビーズまたは特別な装置および長期細胞培養手順の利用なしで単離される。
【００２２】
脂肪吸引、吸引された脂肪のコラーゲン消化、続いてＰＡＳＣ単離（１００，０００，０００−２００，０００，０００のＰＡＳＣ／ｌの吸引脂肪組織材料）、およびＰＡＳＣの注入（静注を介してまたは損傷組織中に）の完全なプロセスには約５−７時間かかる。この手順は非常に速く、効率的であり、これにより、急性傷害、脳卒中、重度心臓発作、または火傷の場合に特に有用となり、そのような場合、迅速な治癒および機能の回復のために組織環境を増強させることにより、損傷組織の治療を始めることが重要である。全ての手順は、同じ手術室で実施することができる。
【００２３】
脂肪吸引によりヒト脂肪組織を収集することは安全な非侵襲性手順（２４）であり、何億もの脂肪細胞が１−２リットルの吸引脂肪組織材料から単離され得る（２５）。この手順には１時間かからないので、脂肪組織は単離骨髄または真皮とは対照的に、ミューズ細胞のための理想的な起源であると証明することができるであろう。
【００２４】
吸引脂肪組織材料を使用して、発明は、重度の細胞ストレス条件（例えば、タンパク質分解酵素との長期インキュベーション、４℃、血清欠乏、および／または低酸素）下でのヒトミューズ細胞の集団の単離のための新規方法を提供する。ヒトＰＡＳＣの精製は細胞選別、磁気ビーズ、特別な装置、または細胞培養手順の使用を要求しない。
【００２５】
ＰＡＳＣはヒトＥＳ細胞由来胚様体と同様に、懸濁液中で増殖し、細胞球を形成することができる。しかしながら、接着培養皿では、ＰＡＳＣは最初に凝集物を形成し、これが前駆体および成熟細胞に分化し始め、前に報告されるようにそれらの多能性が損失される（２６）。免疫細胞化学研究により、ＰＡＳＣは、ＳＳＥＡ３、ＴＲ−１−６０、Ｏｃｔ３／４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２（２６）を含む多能性幹マーカーを発現することが証明される。
【００２６】
ＰＡＳＣは、それぞれ２３％、２０％および２２％の効率で自然に間葉系、内胚葉および外胚葉細胞系統に分化することができる（２６）。興味深いことに、ＰＡＳＣは、自然に脂肪細胞に優先的に分化し（６１％）、ＰＡＳＣはそれらの起始組織のエピジェネティックメモリを有することが示唆される。脂肪組織は細胞のための天然リザーバーとして作用することが可能であり、ストレスなしではＰＡＳＣは休眠状態にあり続け得る（２６−２８）。
【００２７】
特定の培養条件に導入されると、ＰＡＳＣは間葉系（脂肪細胞、骨格および平滑筋細胞）、内胚葉（肝細胞および胆管）および外胚葉（神経細胞）細胞系統に、８０−９０％の効率で分化することができる。
【００２８】
マイクロアレイデータにより、ＰＡＳＣは多能性幹細胞マーカーＳＯＸ２、ＯＣＴ３／４、（ＰＯＵ５Ｆ１）およびＲＥＸ１を前に研究された多能性脂肪幹細胞（ＡＳＣ）に比べ３−４倍過剰発現することが確認され、ＰＡＳＣの内因多能性および分化能力が示される。調和して、ＰＡＳＣは、ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣで観察されるよりもずっと低いレベルではあるが、胚発生と関連する遺伝子の上方制御を示す。
【００２９】
マイクロアレイ分析により、ＰＡＳＣは、酸化ストレスに対する細胞保護に関与する遺伝子を高く発現することが明らかにされている。例えば、ＰＡＳＣはＡＬＤＨ１Ａ２（ＡＳＣに対し４７倍変化）およびＳＯＤ２（ＡＳＣに対し４１倍変化）を過剰発現し、これらは、抗酸化ストレスおよび抗アポトーシス機能を有する（２７、２８）。加えて、これらの細胞はまた、ＣＸＣＬ２遺伝子発現の上方制御、幹細胞ホーミングに関与する重要なケモカインを示す（２９−３０）。
【００３０】
ＰＡＳＣは、ＡＤＳＣに比べ、組織発達、細胞構築および組織化、細胞機能および維持、ＤＮＡ複製、修復、および細胞周期に関与する多くの遺伝子の比較的低い発現を有する。これらの結果から、インビボで移植されても奇形腫の生成のないミューズ細胞の再生特性の前に公開されたデータと同様に、ＰＡＳＣの内因非腫瘍形成性能力が示唆される（２２−２３）。しかしながら、異常なストレス条件下では（例えば、ミューズ細胞を山中因子でプログラミングする）、内在性ミューズ細胞を活性化することが可能であり得、これはｉＰＳ細胞に変換される細胞の小集団の一因となり得るであろう（２３）。そのような理論は、癌細胞の生成における非対称分裂中の成体臓器特異的陽性Ｏｃｔ４（＋）幹細胞の役割の可能性に関する前の研究により支持される（３１）。
【００３１】
ＤＮＡ修復に関連する多くの遺伝子がＰＡＳＣにおいて上方制御され、重度の細胞ストレスの結果としてのＤＮＡ損傷に抵抗する潜在的に高い能力が示される。さらに、いくつかのＡＢＣ−カセット遺伝子がＰＡＳＣにおいて差次的に発現され、薬物トランスポーター遺伝子の積極的な発現が観察されるストレス抵抗性において役割を果たし得ることが示される。
【００３２】
ＰＡＳＣにおいて差次的に発現される遺伝子の多くは高く保存され、相同体が多くの小生物（酵母、Ｓ．セレビシエ、線虫、クラミドモナス、ゴマフシビレエイ、ショウジョウバエ、など）に存在する。これにより、ＰＡＳＣは、重度の細胞ストレスに応じた細胞生存に関連する高く保存された細胞メカニズムにおいて役割を果たす可能性が示される（３２−３３）。
【００３３】
様々な実施形態では、多能性幹細胞の集団の単離および増殖のための新しい方法が提供される。これらの細胞は、重度の細胞ストレス条件を含む、単純であるが、非常に効率的な精製技術を用いて、高い純度で（＞９０％）単離することができる。本明細書で記載される方法は、かなりの数の細胞を提供し、細胞選別、ナノビーズ技術および長期の細胞の増殖が必要ない。その上、脂肪吸引は安全な非侵襲性手順であり、治療応用のための好適な起源材料の迅速な調達を可能にする。
【００３４】
特定の理論には縛られないが、本明細書で記載される方法により単離された多能性脂肪幹細胞（ＰＡＳＣ）を生じさせる細胞は、脂肪細胞画分（上層、ＰＡＳＣは脂肪細胞を取り囲む）ならびに間質血管細胞群（ＳＶＦ）の両方における脂肪組織中に存在する小細胞であると考えられる。脂肪ＳＶＦは異なる細胞型を含み、とりわけ、脂肪組織マクロファージ（ＡＴＭ）、多能性脂肪幹細胞（ＡＤＳＣ）、内皮細胞、周皮細胞が含まれる。
【００３５】
ＰＡＳＣは、細胞ストレス破壊前、正常な生理的環境下、細胞ニッチ内に静止状態で存在する（３４−３５）。複数の成体幹細胞系統が、それらの寿命を通して様々な時間点で静止状態で存在することが示されており、造血幹細胞および上皮幹細胞が挙げられ、それらはそれらの自己再生の保存において役割を果たすと言われている（３６−３７）。
【００３６】
脂肪細胞画分とＳＶＦ中に存在する細胞成分の間のパラクリン／オートクリン相互作用は、静止状態段階の破壊（正常な生理的環境）に対して重要な一因となり得、ＰＡＳＣの両方の画分からの放出および活性化が誘導される。このパラクリン相互作用は細胞−細胞接触ならびに可溶性因子（サイトカイン、成長因子、など）の分泌を含み、これらは、そのような活性化プロセスにおいて重要な役割を果たすことができるであろう。
【００３７】
定義
幹細胞（ｓｔａｍｍｚｅｌｌｅｎ）という用語は、１世紀前にわたってドイツの科学者Ｅｒｎｓｔ  Ｈａｅｃｋｅｌにより確立され（３８−４０）、自己再生能力および様々な細胞型に分化する能力を有する細胞を示す。３つの胚性生殖細胞系統の成体組織を生じさせるそれらの能力に基づき、異なる型の幹細胞が存在する。
【００３８】
「単能性」幹細胞という用語は、１つの細胞型に分化する能力を有する細胞、例えば、成熟筋肉細胞に分化する筋肉幹細胞を示す。
【００３９】
「少能性幹細胞」という用語は、特定の組織内の少数であるが、すべてではない細胞型に分化するそのような細胞の能力を示す（例えばリンパまたは骨髄幹細胞）（４１）。
【００４０】
「多分化能幹細胞」という用語は、特定の胚葉から全ての細胞型に分化するそのような細胞の能力を示し、これには間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が含まれる（４２−４３）。例えば、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）は、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、および筋芽細胞を含む、間葉系細胞系統にのみに、インビトロで分化する、および骨髄に由来する多分化能間質細胞と同様に、インビボで分化を受ける可能性がある多分化能幹細胞である（２４、４４）。
【００４１】
「全能性」幹細胞は最も原始的な幹細胞であり、接合体として最も一般的に知られており、胚性および胚外細胞型（胎盤）に分化することができ、生物全体さえも生成させる（４５−４６）。
【００４２】
「多能性」および「多能性幹細胞」または「ＰＳＣ」により、そのような細胞は、生物内の全ての型の細胞に分化する能力を有することが意味される。多能性細胞は、当業者に知られているいくつかの多能性マーカーの発現により特徴付けられる。そのようなマーカーとしては下記が挙げられるが、それらに限定されない：アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＤＧＦ１、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＦｏｘＤ３、ＧＤＦ３、Ｃｙｐ２６ａｌ、ＴＥＲＴ、およびｚｆｐ４２。ある一定の実施形態では、多能性細胞は生体内の外胚葉、中胚葉、または内胚葉組織を形成する、またはこれに寄与することができる。
【００４３】
胚性幹細胞（「ＥＳＣ」）および人工多能性幹細胞（「ｉＰＳＣ」）は、頻繁に制御されず、しばしば奇形腫形成を生じさせる自己再生を示すので、細胞多能性はしばしば誤って、全ての型の細胞に分化し、奇形腫を生成させる細胞の固有の能力として規定される。
【００４４】
本明細書では、「ＰＡＳＣ（多能性脂肪幹細胞）」はＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｏｃｔ３／４、ＳＯＸ−２、ＴＲＡ１−６０、およびＮａｎｏｇに対して陽性である。ＰＡＳＣは、脂肪組織から重度のストレス条件下で単離され、本明細書で記載されるＰＡＳＣは、低い増殖性およびテロメラーゼ活性の両方、正常な核型、ならびに非対称増殖を示し、宿主生物（例えば免疫不全マウス）に移植されても腫瘍形成または奇形腫形成を受けないという点で、ｉＰＳＣおよびＥＳＣから区別される。加えて、ｈＥＳおよびｉＰＳ細胞は、以上で列挙されるマーカーを、ＰＡＳＣで観察される低レベルの発現よりも何千倍も高いレベルで発現する。ＰＡＳＣはミューズ（多種系統に分化する、ストレス耐性のある）細胞とは、多能性細胞マーカーのそれらの発現の点で異なる。ＰＡＳＣＳは、中胚葉、内胚葉または外胚葉起源の任意の型の細胞に分化する能力を有する。
【００４５】
「多分化能幹細胞」という用語は、特定の胚葉から全ての細胞型に分化するそのような細胞の能力を示し、それは、ますます人気が高まっている間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む（４２−４３）。例えば、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）は、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、および筋芽細胞を含む間葉系細胞系統のみにインビトロで分化し、骨髄に由来する多分化能間質細胞と同様に、インビボで分化を受ける可能性がある多分化能幹細胞である（２４、４４）。
【００４６】
ミューズ（多系統に分化するストレス耐性のある）細胞は、身体の間葉系組織中に存在する多能性幹細胞である。これらの細胞は、細胞ストレスに非常に抵抗性である。ミューズ細胞は細胞選別により、ストレス条件を使用せずに単離されたＳＳＥＡ３（＋）／ＣＤ１０５（＋）細胞である。ミューズ細胞は３つ全ての胚葉を代表する細胞を生成させることができ、宿主環境にインビボで移植されても、奇形腫形成を受けない（２２−２３）。
【００４７】
「初代細胞」、「初代細胞株」、および「初代培養」という用語は本明細書では同じ意味で使用され、被験体由来であり、培養の限られた数の継代、すなわち分割のためにインビトロで増殖された細胞および細胞培養物を示す。例えば初代培養物は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、または１５回継代され得る培養物であるが、危機段階を経験するには十分な回数ではない。典型的には、本発明の初代脂肪細胞は、使用前にインビトロで１０継代より少なく維持される。
【００４８】
本明細書では、細胞の「共培養」は２つ以上の細胞の集団を互いに接触させて維持し、よって、その条件により、細胞集団間でオートクリンおよび／またはパラクリン相互作用が可能になることを示す。共培養環境は従来の細胞培養環境とすることができ、または、それは共通の容器、例えば遠心管または培養フラスコ中での細胞集団のインキュベーションまたは貯蔵とすることができる。
【００４９】
「治療」、「治療すること」、「治療する」などという用語は、本明細書では、一般に、所望の薬理および／または生理的効果を得ることを示すために使用される。効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に防止する観点から予防的とすることができ、および／または疾患および／または疾患に起因する有害作用に対する部分的または完全安定化または治癒の観点から治療的とすることができる。「治療」は、本明細書では、哺乳類、特にヒトまたは獣医学的被験体における疾患の任意の治療を包含し、下記が挙げられる：（ａ）疾患または症状に罹る可能性があるが、まだ、それを有するとは診断されていない被験体において疾患または症状が起こらないように防止すること；（ｂ）疾患症状を阻止すること、すなわち、その発達を抑止すること；または（ｃ）疾患症状を緩和すること、すなわち、疾患または症状の退行を引き起こすこと。
【００５０】
「個体」、「被験体」、「宿主」および「患者」という用語は本明細書では同じ意味で使用され、診断、治療、および療法が所望される任意の哺乳類被験体、特にヒトを示す。獣医学的被験体、例えば、限定はされないが、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、および齧歯類もまた、企図される。
【００５１】
「脂肪」により、任意の脂肪組織が意味される。脂肪組織は、大網／内臓、乳房、生殖腺、または他の脂肪組織部位に由来する褐色または白色脂肪組織とすることができる。ある一定の実施形態では、脂肪は皮下白色脂肪組織または内臓脂肪組織または脂肪細胞を含む任意の他の組織である。脂肪組織は脂肪組織を有する任意の生物由来とすることができる。好ましくは、脂肪組織は哺乳類のものであり、最も好ましくは、脂肪組織ヒトのものである。脂肪組織の好都合な起源は脂肪吸引外科手術から得られ、しかしながら、脂肪組織の起源はそのように限定される必要はない。
【００５２】
初代細胞の組織からの単離のために、コラゲナーゼ（０．１％）を含む適切な溶液が分散または懸濁のために使用され得る。そのような溶液は一般に、平衡塩類溶液、例えばイスコフ改変ＤＭＥＭ、正常な生理食塩水、ＰＢＳ、ハンクス平衡塩類溶液、などであり、低濃度、一般に５−２５ｍＭの許容される緩衝液と併用される。好都合な緩衝液としてはＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸塩緩衝液、などが挙げられる。コラゲナーゼ消化により、脂肪組織中に存在する全ての細胞が放出され、（ｉ）脂肪細胞画分（上層中の浮遊細胞）および（ｉｉ）間質血管細胞群（遠心分離後に沈殿可能な細胞、例えば脂肪組織マクロファージ、脂肪由来幹細胞、内皮細胞、線維芽細胞）が含まれる。ＰＡＳＣは脂肪細胞および間質血管細胞群の両方に存在する。この消化は、典型的には吸引脂肪組織材料の０．１％コラゲナーゼを含む等体積のＤＭＥＭとの、３０−４５分間の、３７℃での、振盪インキュベーターにおける１１０ｒｐｍでのインキュベーションにより実施される。
【００５３】
「重度の細胞ストレス」としては、細胞をコラゲナーゼ、コラーゲン中のペプチド結合を破壊するタンパク質分解酵素に曝露することが挙げられるが、これに限定されない。コラーゲンは動物体内の肉および結合組織における細胞外マトリクスの重要な部分である。セリンプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、およびエラスターゼ）と対照的に、コラゲナーゼは自己分解を受けず、非常に有効なプロテアーゼとなっている。重度の細胞ストレスはまた、細胞を飢餓条件（栄養分なし、グルコースなし）、低酸素条件（酸素の欠乏）、低温、ヒートショック、および機械的手順例えば超音波処理による溶解に曝露することを含む。
【００５４】
ＰＡＳＣの単離の方法
ＰＡＳＣの分化および増殖への１つの限定されないアプローチは、以下で記載され、および図４−５で概略的に図示されるように実施することができる。簡単に言うと、脂肪組織は任意の性別、年齢および人種の被験体（例えば、ヒト、非ヒト哺乳類）から、局所麻酔下での脂肪吸引により収集することができる。組織は、皮下腹部組織または／および脂肪を含む身体の他の部分（例えばタイツ（ｔｉｇｈｔｓ））から簡単な手順により、例えば、手作業で特定のシリンジを使用して、または自動脂肪吸引器を使用して、標準プロトコルに従い収集される。吸引脂肪組織材料中に普通存在する血液は、ＰＢＳ（または他の緩衝液）を用いた複数回の洗浄により除去される。吸引脂肪組織材料は、その後、遠心分離に供せられ、油（上層（ｔｏｐ  ｌａｗｙｅｒ））およびチューメンセント溶液（下層（ｌｏｗ  ｌａｗｙｅｒ））が脂肪組織（中層（ｍｉｄｄｌｅ  ｌａｗｙｅｒ））から除去される。濃縮された脂肪組織はその後、タンパク質分解酵素、例えば０．０２−１％コラゲナーゼ、典型的には０．１％コラゲナーゼで消化され、３７℃で３０分、振盪インキュベーターを使用して１００ｒｐｍでインキュベートされる。消化された材料はその後、２−１２℃、典型的には４℃で、約４、６、８、１０、１２、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、または３０時間、好ましくは約６−８時間維持される（図５）。そのプロセス中、試料は、わずかに振盪（２０−３０ｒｐｍ）または角度を回転させることができる（９０°−１８０°、脂肪細胞画分とＳＶＦ画分の間の細胞−細胞接触を最大にする）。低酸素条件は典型的には０．０１％〜１０％酸素の環境を意味する。１つの実施形態では、低酸素条件は０．０１％〜５％酸素、例えば、例えば、約１％酸素の環境である。
【００５５】
いくつかの実施形態では、タンパク質分解酵素はセリンプロテアーゼ酵素（例えば、トリプシン、キモトリプシン）；アスパラギン酸プロテアーゼ（例えばペプシン）；システインプロテアーゼ（例えばパパイン、キモパパイン）；メタロプロテイナーゼ（例えばサーモリシン、グルタミン酸プロテアーゼ）である。これらのタンパク質分解酵素の濃度は、ＰＡＳＣを活性化し、放出させるそれらの効率により変動する。重度の細胞ストレス条件はまた、細胞を短期間（３０秒）〜長期間の時間（１０分）の間ボルテックスすることを含むことができ、任意で追加のタンパク質分解が含まれる。重度の細胞ストレス条件のための他の代替方法は、異なる出力ポテンシャル（１−５０ｋＨｚ）、異なる時間（１分〜１時間）および／または異なる温度（４−３７℃）での細胞（外部）の超音波処理を含み、任意で追加のタンパク質分解が含まれる。
【００５６】
再懸濁された材料はその後、１，０００ｒｐｍ／４℃／１０分で遠心分離される。脂肪細胞画分（浮遊細胞）は、吸引により間質血管細胞群（細胞ペレット）から除去される。この間質血管細胞群は、長期コラゲナーゼ／栄養分の欠乏／４℃／低酸素処理に対し抵抗性がある生きたＰＡＳＣ（図５）および、そのような環境に抵抗性のない他の死亡細胞成分、例えばＡＤＳＣ、脂肪組織マクロファージ、内皮細胞を含む（図５）。これらの死細胞は、例えば、ＤＭＥＭ／５％ＦＣＳ／抗生物質中での連続洗浄によりＰＡＳＣから除去される。高度に精製されたＰＡＳＣは懸濁液中で個々の細胞としてまたは細胞クラスターを形成することにより、あるいは細胞培養皿に接着して増殖することができる（図５）。ＰＡＳＣはそれらの多能性特性を無期限に維持する。ＰＡＳＣの単離、分化および増殖は、どの細胞生物学者（Ｐｈ．Ｄ．、科学修士、技術者）によっても、適切な訓練を受けた後に、容易に実施することができる。
【００５７】
様々な実施形態では、多能性脂肪幹細胞（ＰＡＳＣ）の集団の単離および増殖のための方法が提供される。人工多能性幹細胞と対照的に、発明の多能性脂肪幹細胞は、遺伝子操作を使用せずに単離することができる。その上、本明細書で記載される方法はかなりの数の細胞を長期の細胞の増殖の必要なしで提供する。
【００５８】
ある一定の実施形態では、ヒト脂肪組織が多能性脂肪幹細胞の起源として使用される。というのも、この組織からの細胞単離には低侵襲技術が要求されるからである。脂肪組織中には、異なる細胞型（脂肪由来幹細胞、前駆体、および成熟細胞）が非常に豊富である。しかしながら、本明細書で記載される方法は脂肪組織の使用に制限される必要はなく、他の組織（例えば、骨髄、皮膚、血液、など）を同様に使用することができる。脂肪組織からの細胞の収集は、骨髄からの細胞単離よりも著しい利点を提供する。細胞の脂肪組織からの収集手順は、痛みが少なく、より多くの細胞が収集され得る。例えば、脂肪組織中に存在するＡＤＳＣ（間葉系起源）の数は、骨髄中の間葉系幹細胞の数より、１ミリリットルあたり１００〜１０００倍高い（２６）。
【００５９】
１つの実施形態では、発明は、脂肪組織から多能性脂肪幹細胞（ＰＡＳＣ）を単離する方法を提供する。方法は典型的には、下記工程を含む：（ａ）脂肪細胞組織試料を提供する工程；（ｂ）前記試料中の細胞を初期ストレス条件に供する工程；（ｃ）脂肪細胞および間質血管細胞群を２−３６時間共培養する工程；（ｄ）生細胞を回収する工程；ならびに（ｅ）任意で回収された細胞を培養する工程。１つの実施形態では、工程（ｂ）のストレス条件は、細胞を、タンパク質分解酵素を含む培地でインキュベートすることを含む。工程（ｃ）の共培養は、同様に、タンパク質分解酵素の存在下で実施することができる。より特定的な実施形態では、酵素はコラゲナーゼである。
【００６０】
脂肪組織試料は、当業者に知られている手段、例えば脂肪吸引を介して得ることができる。１つの実施形態では、脂肪吸引は、単離したＰＡＳＣが投与される被験体で実施される。あるいは、吸引脂肪組織は好適なドナー、好ましくはレシピエントと同種のものから得られ得る。典型的には、試料は、ドナーから収集されるとすぐに、通常、収集の約１−２時間以内で使用される。任意で、吸引脂肪組織材料は、４℃で、脂肪吸引手順後４８時間まで維持することができる。ＰＡＳＣが宿主に治療目的で投与される場合、組織適合性の検討が、最大の関心事項である。そのような検討は、他の適用、例えば実験的使用、スクリーニングまたは試験のいくつかの場合、条件培地（細胞ではない）がレシピエントに投与される場合より重要ではなく、あるいは全く重要ではない。しかしながら、予備データから、同種移植（１つの個体からの別の個体へのＰＡＳＣ移植）は、宿主個体の免疫拒絶反応なしで実施することができることが示される。
【００６１】
脂肪組織から単離されたＰＡＳＣはインビトロで様々な培養条件下で培養することができる。ＰＡＳＣは典型的には未分化多能性幹細胞として、非接着培養皿／フラスコにおいて増殖する。培地は液体または半固体であってもよく、例えば寒天、メチルセルロース、などを含む。細胞集団は便宜上、通常、ウシ胎仔血清（約５−１０％）、Ｌ−グルタミン、チオール、特に２−メルカプトエタノール、および抗生物質、例えばペニシリンおよびストレプトマイシンが補充された適切な栄養培地、例えばイスコフ改変ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０において懸濁させることができる。ＰＡＳＣは間葉系起源を有するので、間葉系幹細胞を最適条件下で増殖させるように設計された様々な特注の細胞培地が使用され得る。これらの特別な培地は、例えばＢＤ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、などの会社から市販されている。
【００６２】
１つの実施形態では、脂肪細胞は、支持細胞層細胞なしで培養下で維持される。ある一定の実施形態では、培養物は、細胞が応答する成長因子を含み得る。成長因子は、本明細書で規定されるように、細胞の生存、増殖および／または分化を、培養下または無傷の組織中のいずれかで促進することができる分子である。成長因子はポリペプチドおよび非ポリペプチド因子を含む。
【００６３】
ＰＡＳＣはミューズ細胞（ストレス条件で単離された別の多能性幹細胞）より容易に単離することができ、というのも、ＰＡＳＣの単離では細胞選別、培養手順が要求されないからである。
【００６４】
工程（ｂ）のストレス条件としては、プロテアーゼ処理、細胞を飢餓条件（栄養分なし、グルコースなし）に曝露すること、低酸素条件（酸素の欠乏）、低温、ヒートショック、および超音波処理などの機械的手順による溶解が挙げられるが、それらに限定されない。２つ以上のそのようなストレス要因が、一緒に使用され得る。ストレス条件は典型的には２０−６０分間適用され、共培養工程を通じて続けられ得る。例えば、脂肪組織から得られる細胞は、最初にプロテアーゼ（例えば、コラゲナーゼ）で約４５分３７℃にて処理することができ（工程（ｂ））、続いて、低酸素条件で、４℃にて２−８時間貯蔵することができ（または一晩；工程（ｃ））、その時間の間、タンパク質分解活性が続くことが許される。別の実施形態では、ストレス条件は脂肪組織をコラゲナーゼ中で３０−４５分間、３７℃でインキュベートし、続いて６−８時間、細胞を４℃で共培養すること（冷蔵庫）を含む。細胞の温度の３７℃から４℃への減少は、１つの実施形態では、段階的である（７−８分毎に約１℃）。
【００６５】
典型的な実施形態では、共培養は、血清なしで実施される。例えば、共培養は、ダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）、または当技術分野で知られている同様の基本培地において実施することができる。共培養は、わずかな振盪または角度回転なし、またはありで細胞を遠心管中で保存することと同じくらい簡単なものとすることができる。ストレス要因は、例えば、管のキャップを閉めて低酸素条件を作る、管または他の容器を冷蔵庫に入れる（冷却）、ならびに栄養分を含まない培地を使用する（飢餓）ことにより適用することができる。
【００６６】
１つの実施形態では、共培養は、４−２４時間実施される。共培養の長さは、タイミング留意事項を調整するように改変することができる。例えば、単離したＰＡＳＣが緊急に、例えば外傷性障害の治療のために必要とされる場合、工程（ｂ）および（ｃ）は短くすることができ、複数のストレス要因が適用され、ストレス抵抗性細胞を選択するプロセスが加速される。
【００６７】
１つの実施形態では、工程（ｄ）の回収は、少なくとも２００，０００のＰＡＳＣを回収することを含む。他の実施形態では、回収は少なくとも５０，０００、１００，０００、５００，０００のＰＡＳＣ、または少なくとも１，０００，０００のＰＡＳＣを回収することを含む。これらの量のＰＡＳＣは典型的には工程（ｂ）のストレス条件開始の２４時間以内に回収可能である。いくつかの実施形態では、少なくとも５００，０００のＰＡＳＣが、工程（ｂ）のストレス条件開始の８時間以内に回収される。他の実施形態では、ＰＡＳＣが、１週間以内に回収される。１つの実施形態では、方法は細胞選別なしで実施される。典型的には、１００，０００，０００のＰＡＳＣは１リットルの吸引脂肪組織材料から、脂肪吸引後６時間に得ることができる。ＰＡＳＣは通常、個々の細胞として存在し、またはクラスターを形成し、懸濁液中で増殖し、ならびに接着細胞を形成することができる（図５）。
【００６８】
細胞、組成物＆条件培地
脂肪組織から得られる脂肪細胞および間質血管細胞群では、ＰＡＳＣが非常に豊富である（図１）。ＰＡＳＣは、ヒトにおいて自己組織工学および再生医学のために使用される可能性がある。さらに、ＰＡＳＣは３つの生殖系列細胞から前駆体だけでなく、成熟細胞に分化する可能性がある（体内に存在する全ての種類の細胞）。ＰＡＳＣは多くの障害の治療のため、ならびに新しい薬物の試験のために使用することができる。
【００６９】
１つの実施形態では、ＰＡＳＣ、例えばここで記載される単離方法を用いて回収されたものはＳＳＥＡ−３および／またはＣＤ１０５陽性である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＳＳＥＡ３、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ、およびＴＲ１−６０からなる群より選択される、１つ以上の多能性マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、内胚葉前駆細胞の１つ以上のマーカー、例えばサイトケラチン１９、ＨＮＦ−３α／ＦｏｘＡｌ、ＥＯＭＥＳ、ＨＮＦ−３β／ＦｏｘＡ２、ＦＡＢＰ１／Ｌ−ＦＡＢＰ、ＳＯＸ７、ＦＡＢＰ２／Ｉ−ＦＡＢＰ、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ−４、ＴＣＦ−２／ＨＮＦ−１β、およびグースコイドを発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、α−フェトプロテイン／ＡＦＰ、ＨＮＦ−４α／ＮＲ２Ａ１、βカテニン、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ−４、ＳＡＬＬ４、ＧＡＴＡ−６、ＳＯＸ７、ＧＤＦ−１、ＳＯＸ１７、およびＧＤＦ−３からなる群より選択される１つ以上のマーカーを発現する。他の実施形態では、細胞は、中胚葉前駆細胞の１つ以上のマーカー、例えばＥｐＣＡＭ／ＣＤ３２６、ＮＣＡＭ／ＣＤ５６、心臓サルコメアアクチン、およびＢＯＤＩＰＹＣ−１６を発現する。さらに他の実施形態では、細胞は、外胚葉前駆細胞の１つ以上のマーカー、例えばＢＭＰ−４、ノギン、コーディン、Ｏｔｘ２、ＦＧＦ−８、ｐ６３／ＴＰ７３Ｌ、ＦｏｘＪ３、Ｐａｘ２、ＧＢＸ２、Ｐａｘ６、ネスチン、およびβ−ＩＩＩチューブリンを発現する。
【００７０】
脂肪組織はエネルギー貯蔵物および内分泌器官としてのその役割により代謝恒常性において重要である（４７−４８）。脂肪組織は、数ある成分の中でも、脂肪細胞（成熟細胞）、脂肪組織マクロファージ（ＡＴＭ）を含む間質血管細胞群、脂肪幹細胞（ＡＤＳＣ）という名の間葉系幹細胞および多能性脂肪幹細胞（ＰＡＳＣ）という名の本明細書で開示される集団（脂肪細胞および間質血管細胞群の両方に非常に豊富である）を含む（図１）。
【００７１】
脂肪生成は、ＡＤＳＣが脂肪細胞に変換されるプロセスであり、３つの主な段階を含む：（ｉ）典型的な紡錘形細胞の細胞質脂質封入体を含むより円い細胞への変換の形成により特徴付けられる、前脂肪細胞表現型へのｈＡＳＣ関与（前脂肪細胞（ｐｒｅａｄｉｏｃｙｔｅｓ））；（ｉｉ）脂肪細胞への初期前脂肪細胞分化（未熟脂肪細胞）、および（ｉｉｉ）ＰＰＡＲγおよびＣ／ＥＢＰαのさらなる活性化を伴う細胞周期抑止により特徴付けられる、脂肪細胞への後期前脂肪細胞分化。これらの脂肪生成促進イベントはさらに他の転写因子により調整され、段階的細胞内脂質蓄積および脂肪細胞への成熟が促進される（図２）（４９−５２）。
【００７２】
ＡＤＳＣは脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、および筋芽細胞を含む間葉系細胞系統にのみインビトロで分化し、骨髄に由来する多分化能間質細胞と同様に、インビボで分化を受ける可能性がある多分化能幹細胞である（２４−２５、４４）（図２）。
【００７３】
成熟脂肪細胞は定期的に、有糸分裂を受けず、よって、脂肪細胞の増加は、通常前脂肪細胞の分化を反映することが一般に認められている（２４−２５）。しかしながら、いくつかの研究により、成熟脂肪細胞もまた、増殖活性を有することができることが示されている（５３−５４）。最近の研究では、脂肪細胞は前脂肪細胞に脱分化することができること［２１］およびさらに多分化能細胞集団に分化することができることが示唆される（図２）（５５−５６）。注目すべきことに、脂肪細胞前駆体および前脂肪細胞もまた、迅速にかつ効率的に典型的なマクロファージに分化することが近年観察されている（５７−５８）（図２）。いくつかの報告では、非常に低い効率ではあるが、脂肪組織マクロファージ（造血幹細胞起源）は、前脂肪細胞に分化することができる（間葉系幹細胞起源）ことが示されている（５９）（図３）。これらの結果により、脂肪組織の異なる細胞成分における高い程度の細胞可塑性が示される。
【００７４】
発明はさらに本明細書で記載されるＰＡＳＣを提供する。ＰＡＳＣは典型的には本質的に他の細胞型を含まない組成物中に存在する（例えば、少なくとも９０％純粋、典型的には９５％純粋、およびいくつかの実施形態では、少なくとも９９％純粋）。別の実施形態では、ＰＡＳＣは、要望通り、ＡＤＳＣと共に、例えば５０：５０、７５：２５、２５：７５の比、または他の比で存在する。ＡＤＳＣは、現在のところ、軟部組織再生のために使用される（顔、乳房、など）。ＰＡＳＣはＡＤＳＣよりもずっと速く脂肪および筋肉細胞に分化する（少なくとも３倍速い）ので、それらは、そのような治療に対してはＡＤＳＣよりも効率的であろう。ＰＡＳＣとＡＤＳＣの間の組み合わせは両方の細胞型の特徴を組み合わせるための１つの選択肢となるであろう。ＰＡＳＣ細胞は損傷組織の環境に類似する重度の細胞ストレスにすでに適合されているので、それらは移植後の高い生存率および高いグラフティング効率を有し、これは組織再生にとって重要である。
【００７５】
本明細書で記載される方法により単離したＰＡＳＣ、またはその後代（これに由来する細胞株を含む）、および治療的に許容される緩衝溶液を含む組成物もまた提供され、ここで、ＰＡＳＣは生理的に適合可能な緩衝溶液（例えばＰＢＳ）に懸濁されている。本明細書で記載される方法により単離したＰＡＳＣの培養物から回収された条件培地を含む組成物もまた提供される。治療的条件培地を調製するための戦略は、例えば、Ｂｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（６０）に記載される。培養条件培地は約２４−７２時間の期間、培養下で維持されたＰＡＳＣにより分泌される様々な因子（サイトカイン、ケモカイン、成長因子、ペプチド、タンパク質）を含む。これらの因子は抗炎症および／または免疫調節特性を有し、これらは多くの疾患、とりわけ免疫または自己免疫疾患と関連するものの治療のために使用することができる。
【００７６】
１つの実施形態では、組成物は、脂肪吸引から単離されたＰＡＳＣを含む。１つの実施形態では、脂肪吸引は、組成物が投与される被験体に対して実施される。典型的な実施形態では、組成物は被験体に脂肪吸引の６時間以内に投与される。他の実施形態では、組成物は脂肪吸引の１２、２４、または３６時間以内に投与される。
【００７７】
ＰＡＳＣの使用方法
発明は、被験体において組織損傷を寛解する方法を提供する。発明はさらに、被験体において患部または損傷組織を修復または再生する方法を提供する。別の実施形態では、発明は、組織機能を増強させる方法および／またはサイトカインを被験体の組織に送達させる方法を提供する。典型的には、方法は発明の組成物を被験体に投与することを含む。組成物がＰＡＳＣを含む場合、任意で、これは、組成物のＰＡＳＣが分裂し、組織損傷部位に集合することを可能にする条件下で投与される。ＰＡＳＣにより放出される因子が治療効果を提供するので、ＰＡＳＣの損傷部位への移動は全ての実施形態では要求されない。
【００７８】
いくつかの実施形態では、組織損傷は外傷性障害または疾患関連損傷を含む。外傷性障害の代表例は低酸素症、骨損傷、裂傷、銃撃創傷、および脊髄損傷を含む。別の実施形態では、疾患関連損傷は、糖尿病、血管疾患、感染、変性神経疾患、癌と関連する損傷を含む。１つの実施形態では、組成物は軟部組織を再生するため、例えば乳房および顔再建、および他の形態の形成手術および美的医学のために使用される。別の実施形態では、組成物は筋組織を再生するため、例えば急性傷害の治療およびスポーツ医学のために使用される。さらに別の実施形態では、組成物は、免疫および自己免疫疾患、例えば、例として、ハンチントン病、多発性硬化症、関節リウマチ、ループス、Ｉ型糖尿病、クローン病を治療するために使用される。別の実施形態では、組成物は抗老化試薬として、例えば、若返りのための顔面および他の組織における注射により使用される。組成物は、クリーム、オイル、または他の局所適用物として調製される、細胞若返りにおいて使用するための、ＰＡＳＣからのタンパク質、脂質および／または他の物質の抽出物を含むことができる。組成物は、被験体自体の身体から単離された材料から調製される、個別化された若返り製品とすることができる。ＰＡＳＣのこれらの適用可能性に基づき、「ＰＡＳＣバンク」の作成は、予防医学において使用するのに理想的なものとなり得るであろう。
【００７９】
本発明の組成物は負傷兵を治療するために使用することができる。四肢血管傷害は全ての戦争傷害の５０−７０％を示す。現代の戦場でのこれらの傷害の管理は、多くの特有で、要求の多い挑戦を提示する。四肢血管傷害は、爆薬、軍需物資、および高速ミサイルにより生成され、しばしば軟部組織破壊が引き起こされる。これらの型の外科的介入では、多くの軍人が複数の修正手術を経験し、少なくともいくらかの瘢痕に直面する。その上、この型の創傷は、頻繁に慢性疼痛および制限された運動につながる。骨および他の生命構造の不十分な軟部組織被覆は、疼痛、制限された運動およびさらには切断の一因となる頻回因子である。重度の虚血は組織の完全壊死を発生させるが、中程度の虚血では、前駆細胞は生き残り、組織再生を開始することができる。傷害後できる限り早く治療を提供すると、生命を救うだけでなく、戦場で負傷した軍人に対し保存することができる四肢機能の程度を著しく増加させた。新しい組織を再生し、新血管新生を促進するまでの時間は、傷害を受けた領域での細胞死および組織壊死を回避するのに重要である。傷害後できる限り早く治療を提供すると、生命が救われ、戦場で負傷した人員のほとんどの最適機能が保存された。それらの多能性、非奇形発生、速い細胞分化プロセス、高いグラフティング効率のために、ＰＡＳＣは、負傷軍人に義装具に代わるものを提供するため、および患者自身の多能性幹細胞を使用して瘢痕となった非機能性治癒を緩和すために理想的な細胞である。ＰＡＳＣは新しい組織を再生するだけでなく、傷害のゾーン内の細胞の生存を改善し、局所組織の再生能力を積極的に増強し、誘導し、生体構成要素、例えば神経、脈管構造および骨、ならびにそれらを取り囲む脆弱な軟部組織エンベロープを保存および回復させることができるであろう。ＰＡＳＣの使用は機能性軟部組織量を負傷兵の頭蓋顔面領域および四肢に戻す可能性を提供し、彼等のリハビリテーションを促進することができる。さらに、ＰＡＳＣ単離および移植は、負傷兵をレベルＩＩＩ−治療施設に輸送せずに、戦場またはレベルＩＩ−治療施設に配置された同じ手術室で容易に実施することができるであろう。
【００８０】
ＰＡＳＣは、例えば、癌幹細胞、静止状態、悪性腫瘍および処置後再発に関して、癌研究の新しい手段を解明する可能性がある。いくつかの実施形態では、発明のＰＡＳＣは新しい治療薬のためのスクリーニング、例えば抗癌剤スクリーニングにおいて使用される。
【００８１】
初代細胞集団は、直ちに使用され得る。あるいは、ある一定の実施形態では、細胞集団は液体窒素温度で凍結し、長期間保存することができ、解凍され、再利用することができる。そのような場合、細胞は通常、１０％ＤＭＳＯ、５０％血清、４０％緩衝培地、または、細胞をそのような凍結温度で保存するために当技術分野で普通に使用される、いくつかの他のそのような溶液中で凍結され、凍結された培養細胞を解凍するために当技術分野で普通に知られている様式で解凍される。
【００８２】
ヒト多能性幹細胞の脂肪組織からの単離は、組織工学、再建医学および変性および免疫障害（例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、糖尿病、ハンチントン病、など）の治療を含む自己細胞に基づく療法に対して新しい道を開く（図６）。
【００８３】
１つの実施形態では、ＰＡＳＣは抗原特異的免疫調節細胞として使用される（図２０）。ＰＡＳＣにより分泌される異なる因子（サイトカイン、成長因子、ペプチド）もまた、抗原特異的免疫調節において重要な役割を果たすことができる（図２１）。
【００８４】
ＰＡＳＣは、（ｉ）ＮＯＤｓｃｉｄ糖尿病マウスおよび（ｉｉ）自然に生じた糖尿病マウスにおいて体重損失および血糖レベルを著しく改善し、生存期間を増強させた（図２２−２３）。
【００８５】
要約すると、ＰＡＳＣは、多能性を誘導するために外来遺伝子または細胞ストレスを使用せずに、全ての人間（または他の哺乳類）の脂肪組織から容易に単離することができる。ＰＡＳＣは、自然に前駆体および成熟細胞に分化する可能性を有する。ＥＳおよびｉＰＳＣとは異なり、ＰＡＳＣは奇形腫を形成せずには損傷組織を再生することができると考えられる。
【００８６】
ＰＡＳＣの利点
ミューズ細胞、細胞ストレスに抵抗性のある別の多能性幹細胞は単離され、細胞選別され、１００％ＣＤ１０５（＋）／ＳＳＥＡ３（＋）細胞の集団が得られている。ミューズ細胞は成体組織の１−３％しか構成しないので、ミューズ細胞は他の起源、例えば皮膚線維芽細胞および骨髄からの低い収率により妨害されてきた。さらに、ミューズ細胞単離には、細胞選別だけでなく、細胞の増殖手順もまた必要とされ、これにより、１，０００，０００のミューズ細胞を得るには最大６週まで要求される。対照的に、およそ１億のＰＡＳＣがたったの１−２リットルの組織から抽出することができ、抽出可能なＰＡＳＣの数は増強され、細胞の増殖手順および／または細胞選別は必要ない。
【００８７】
単離手順、典型的にはタンパク質分解酵素中、血清欠乏、低温および重度の低酸素下での４−８時間消化は、時間効率が良く、コスト効率が良く、細胞選別技術（高価な試薬および機器を必要とする）の必要がなくなる。脂肪吸引、吸引された脂肪のコラーゲン消化、続いてＰＡＳＣ単離（１００，０００，０００のＰＡＳＣ／ｌｔの吸引脂肪組織材料）、およびＰＡＳＣの注入（静注を介してまたは損傷組織中に）の完全なプロセスには約７−９時間必要とされる。
【００８８】
この手順は非常に速く効率的であり、急性傷害、脳卒中、重度心臓発作、火傷、および迅速な治癒および機能の回復が重要な他の緊急病状の場合に特別な利点が提供される。全ての手順は、同じ手術室で実施することができる。
【００８９】
ＰＡＳＣは脂肪細胞および間質血管細胞群の両方で休眠段階にあるので、両方の成分の相互作用（共培養）は、ＰＡＳＣの活性化および放出にとって重要である。この現象は非常に高い数のＰＡＳＣ（約１００，０００，０００のＰＡＳＣ／ｌｔｒの吸引脂肪組織）の短期間（６−８時間）での生成に寄与する。さらに、共培養なし、本明細書で示される同じストレス条件下での、脂肪細胞または間質血管細胞群単独からのＰＡＳＣの単離は、より少ない数のＰＡＳＣを生成させる。そのため、脂肪細胞および間質血管細胞群の共培養は、多数のＰＡＳＣ生成させるために有益である。
【００９０】
ＰＡＳＣは、ＡＳＣとは異なり、細胞死および生存と関連する遺伝子を発現し、重度の細胞ストレスの結果として、静止状態から活性状態への移行に対する遺伝的素因が示される。ＰＡＳＣ中に存在する高いＬｅｔ−７／Ｌｉｎ２８比は、それらの多能性にも関わらず、これらの細胞を奇形発生から保護する。組織発達、細胞構築および組織化、細胞機能および維持、ＤＮＡ複製、修復、および細胞周期に関与する多くの遺伝子のＰＡＳＣによる中から低の発現は、それらの腫瘍化感受性の内因欠乏を示す。その上、ＰＡＳＣは幹細胞ホーミングに関与することが知られているケモカイン受容体およびリガンドをコードする、多くのリンパ球および造血遺伝子、例えばＣＣＲ１およびＣＸＣＬ２を発現する。
【００９１】
ＰＡＳＣは、重度の細胞ストレスに応じた細胞生存、ならびに損傷組織および原始種における切断された肢の機能再生に関連する高く保存され細胞メカニズムに従い機能する可能性がある。ＤＮＡ分解および突然変異は、老化の始まった身体の次第に厳しくなる環境の一因となる。ＰＡＳＣは本質的に細胞ストレスに抵抗性があり、ＤＮＡ損傷に対し遺伝学的に弾力的であるので、加齢性および変性疾患の調査のためのそれらの適用は適切で有望である。
【００９２】
ＰＡＳＣは食作用活性を有する。全細胞を貪食するマクロファージとは異なり、ＰＡＳＣは成熟細胞の核をそのまま残し、これは同一で健康な成熟細胞を生成させるための遺伝情報として、ＰＡＳＣにより使用され得る。さらに、ＰＡＳＣは、Ｂおよび／Ｔ細胞との細胞間接触により、抗原特異的免疫調節細胞として挙動する可能性がある。ＰＡＳＣにより分泌される異なる因子（サイトカイン、成長因子、ペプチド）もまた、抗原特異的免疫調節において重要な役割を果たす。
【００９３】
ＰＡＳＣは正常な生理的環境下細胞ニッチ内で、本質的に静止状態で存在する（３４−３５）。複数の成体幹細胞系統が、それらの寿命を通して様々な時間点で静止状態で存在することが示されており、造血幹細胞および上皮幹細胞が挙げられ、これらは、それらの自己再生の保存において役割を果たすと言われている（３４、３５）。重度の細胞ストレス（飢餓、低温、タンパク質分解酵素コラゲナーゼとの長期インキュベーション）は、ＰＡＳＣを活性化し、解糖代謝の増加および高レベルのＲＯＳスカベンジャーが得られる。さらに、ＰＡＳＣは、細胞増殖および分化を受けることなく、それらの多能性を維持する。ＰＡＳＣは、おそらく、それらの低レベルの癌遺伝子発現腫瘍および高レベルの腫瘍抑制因子発現のために、インビボで奇形腫を生成しない。最後に、ＰＡＳＣは、細胞ストレスに対するそれらの高い抵抗性のために、高い生存の程度を有し、損傷組織を非常に高い効率で再生する（図２４）。
【００９４】
細胞ストレスが発癌性ストレス条件（例えば電離放射線、紫外光、化学化合物、誤りがちなＤＮＡ修復、など）下で実施されると、ＰＡＳＣは癌幹細胞（ＣＳＣ）となる可能性がある。例えば、ＰＡＳＣに類似するミューズ細胞（ＣＤ１０５（＋）／ＳＳＥＡ３（＋））は細胞ストレスに抵抗性がある。４つの山中因子の導入によるミューズ細胞のプログラミングにより、ｉＰＳ（腫瘍化活性を有する細胞）の形成が引き起こされる。ｉＰＳ細胞に変換される細胞の小集団の一因である内在性ミューズ細胞の異常な活性化が可能であり得る（２３）。そのような理論は、癌細胞の生成における非対称分裂中の成体臓器特異的陽性Ｏｃｔ４（＋）幹細胞の役割の可能性に関する前の研究により支持される（１５）。ミューズ細胞と同様に、ＰＡＳＣは、ＣＳＣに腫瘍化刺激下で変換される可能性がある。これらの環境下では、ＰＡＳＣは非常に速く分裂することができ、非常に活性な解糖代謝を有し、ＣＳＣに分化することができる。ＰＡＳＣに由来するＣＳＣは高い分化を有し、癌遺伝子発現が増加し、腫瘍抑制因子の発現が低くなり、腫瘍増殖が駆動される。さらに、ＰＡＳＣ由来ＣＳＣは化学および放射線療法に抵抗性を有し、治療後のその再発の一因となり得る（図２５）。ＰＡＳＣはそのため、癌幹細胞、静止状態、悪性腫瘍および処置後再発の調節のための薬剤の同定に関して、特定的に、癌療法の開発のためのツールを提供する。
【００９５】
本明細書で記載される方法および単離した細胞は下記特徴を提供する：（ｉ）多能性幹細胞（ＰＡＳＣ）を脂肪細胞および間質血管細胞群の両方から重度のストレス条件下で容易に単離することが可能である；両方の画分間の共培養は大量のＰＡＳＣ（１００，０００，０００のＰＡＳＣ／ｌｔの吸引脂肪組織）の生成に有益である；（ｉｉ）かなりの量のＰＡＳＣが、個々の細胞として、クラスター内で関連して、脂肪細胞および間質血管細胞群の両方から単離され得る；（ｉｉｉ）何千ものＰＡＳＣを含む何百ものクラスターが比較的少ない量の脂肪組織から得られ得る；（ｉｖ）脂肪組織の収集は安全な非侵襲性手順である；（ｖ）局所麻酔下で得られた２００−２０００ｃｃの吸引脂肪組織材料から、２０，０００，０００−２００，０００，０００のＰＡＳＣを単離することが可能である；（ｖｉ）同じ調製物から、ＡＤＳＣを間質血管細胞群から単離することも可能である（例えば約２００，０００，０００のＡＤＳＣ／リットルの吸引脂肪組織材料）；（ｖｉｉ）ＰＡＳＣのクラスターは吸引脂肪組織材料の収集の数時間以内に形成され得る；（ｖｉｉｉ）ＰＡＳＣは、細胞を多くの日数の間非接着培養皿を使用して培養することにより未分化状態で維持することができる；（ｉｘ）ＰＡＳＣに由来する前駆体は、ＰＡＳＣのクラスターを接着培養皿で培養することにより単離することができる；ならびに（ｘ）３つの胚葉（内胚葉、外胚葉および中胚葉）からの成熟細胞もまた、細胞のクラスターを培養下で長期間接着培養皿において維持することにより、低い効率（２０％）で得ることができる；ＰＡＳＣに由来する成熟細胞は、ＰＡＳＣのクラスターを特定の誘導分化培地中で維持することにより、非常に高い効率（８０−９０％）で得ることができる。
【００９６】
要約すると、ＰＡＳＣは、細胞選別または細胞濃縮のための他の方法（ＰＡＳＣの表現型を変化させる可能性がある）を使用する必要なく、高い純度で容易に単離することができる。ＰＡＳＣは、自発的プロセスで、誘導分化培地の使用なしで、およびこれと共に、前駆体および成熟細胞に分化することができる。ＰＡＳＣは、ＥＳＣおよびｉＰＳＣとは異なり、インビボで損傷組織を、奇形腫を形成せずに修復および再生する能力を提供する。
【００９７】
加えて、本明細書で記載される方法の様々な利点としては下記が挙げられるが、それらに限定されないことが示されている：
（１）多能性幹細胞を脂肪組織から、脂肪吸引により収集することは、これらの細胞を骨髄細胞から収集するよりも痛みが少ない；
（２）ＰＡＳＣは、ストレス細胞処理で自然に生じ、多くのＰＡＳＣのクラスターが少量の脂肪組織から形成され得る；
（３）多くのＰＡＳＣは、簡単な技術により、非常に短い期間で、細胞選別または他の細胞選択技術の必要なく、高度に精製することができる；
（４）細胞単離の迅速な手順および高い収率のために、ＰＡＳＣは、細胞の増殖の必要なく、患者に再注入することができる；
（５）あるいは、ＰＡＳＣは、標準細胞培養技術に従い、培養下で維持され、増殖され得る；
（６）（ｉ）ＰＡＳＣ、（ｉｉ）ＰＡＳＣに由来する前駆体および（ｉｉｉ）ＰＡＳＣに由来する成熟細胞を単離することが可能であり、これにより、ＰＡＳＣ／前駆体／成熟細胞のいずれかを使用した細胞治療が可能である；ならびに
（７）ＰＡＳＣを細胞分化の異なる段階で使用して、新しい薬物をスクリーニングすることが可能である。
【００９８】
癌におけるＰＡＳＣの役割
腫瘍増殖は自己再生能力および高い腫瘍化効力を有する細胞の小集団により駆動され得る。これらの細胞は癌始原または癌幹細胞（ＣＳＣ）と呼ばれる。これらの細胞は化学および放射線療法、ならびに環境因子に対しより抵抗性がある。それらは腫瘍増殖を維持し、治療後のその再発の一因となる。ＰＡＳＣは細胞ストレスに非常に抵抗性があり、癌様抵抗性を示すそのような内在性細胞集団の単離およびキャラクタリゼーションが可能である（図２５）。さらに、マイクロアレイデータは、ＡＤＳＣに比べＰＡＳＣにおいてわずかに過剰発現される、半ダースを超える癌原遺伝子の活性化を示す。これらの癌原遺伝子の発現のレベルは、多能性胚性幹細胞および人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）に比べ、ＰＡＳＣでは、著しく低いレベル（何桁か）で発現されるであろう（２３）。
【００９９】
ＰＡＳＣの癌幹細胞（ＣＳＣ）への変換は、ＰＡＳＣが発癌性ストレス条件（例えば電離放射線、紫外光、化学化合物、誤りがちなＤＮＡ修復、など）下で活性化された場合、誘導され得る。同様に、ＰＡＳＣをＯｃｔ４（Ｐｏｕ５ｆｌ）、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃ、およびＫｌｆ４（山中因子）でプログラミングすると、ｉＰＳの形成が引き起こされる（催奇性の可能性を有する細胞）（図２５）。
【０１００】
古典的経路は、胚性幹細胞多能性におけるＯｃｔ４の役割、ＤＮＡ損傷におけるＢＲＣＡ１および遺伝性乳癌シグナル伝達、染色体の複製の細胞周期制御、ＤＮＡ修復、アルギニン分解、および心臓系統への胚性幹細胞分化を含む。これらのデータはさらにＤＮＡ修復、細胞周期、酸化ストレス、癌細胞制御におけるＰＡＳＣの役割、ならびにそれらの内因多能性についての洞察を提供する（図１６−１７）。
【０１０１】
これらの技術により単離され活性化されたこの細胞型は下記を可能にするであろう：（１）より正確な早期診断のためのＣＳＣの早期検出および同定；（２）ハイスループット適用において使用するのに理想的な、検出のためのバイオマーカー、ならびに治療のための薬物および化学療法アプローチを開発するために使用される、内在性および非操作細胞を用いたＣＳＣの研究のためのモデル、；（３）固有活性化および健康なヒト幹細胞ニッチにおけるそれらの役割を理解することによるこれらの細胞の制御により、これらの細胞の自然休止または老化状態を誘導する新規アプローチへ導くこと。この休止状態は、損傷した内胚葉、外胚葉、および中胚葉細胞系統の組織修復のために使用され、活性化され得る細胞のプールを提供する。ｉＰＣとは異なり、これらの細胞は、いったん適正に分化されると、これらを再生適用における安全使用のためにずっとより好適なものとする、活性腫瘍抑制因子、および前駆体癌原遺伝子（誘導された発癌遺伝子ではなく）を有する。
【０１０２】
ヒト複製におけるＰＡＳＣの役割
不妊症の重大な原因は、体外受精（ＩＶＦ）療法を受けた女性の卵母細胞における低減したミトコンドリア機能である。ＰＡＳＣは、通常、静止状態で存在し、重度の細胞ストレスにより活性化される。ＰＡＳＣは高齢（ＡＭＡ）卵巣の高まる環境の厳しさに対して本質的に弾力的であり、この場合、卵母細胞ミトコンドリアは低酸素およびアポトーシスの有害な効果に対して高度の感受性を示す。そのため、ＰＡＳＣは、それらの内因性ストレス耐久性および胚細胞系統を採用する可能性のために、不妊症のＡＭＡ女性の卵母細胞への自己ミトコンドリア移入に寄与することができる。これにより、第三者および体細胞移入を用いた前の試行において生じた有害な異種性は回避されるであろう。
【０１０３】
ＰＡＳＣは健康なミトコンドリアを有する若い女性、または同一のミトコンドリアを有する同胞または母由来の脂肪組織から単離され得る。この健康なミトコンドリアの起源は、２つの方法の１つにおいて治療として使用することができる：（１）健康なＰＡＳＣミトコンドリアを受精される卵母細胞に移入させることにより、または（２）健康なＰＡＳＣを卵母細胞表現型に分化させ、「ドナー」ＰＡＳＣ核（細胞質中に健康なミトコンドリアを有する）を機能障害性ミトコンドリアを有する卵母細胞の核と交換することにより。
【０１０４】
さらに、哺乳類の雌における本来の卵母細胞産生は出生時に終わり、生殖異常による既存の卵胞のプールの過剰枯渇はインビボでは本質的に回復不能である。ＰＡＳＣに由来するヒト卵母細胞の生成は、自己移植の手段を提供し、不妊症の一般的原因、例えば早期卵巣機能不全、出産の遅延と関連する生殖老化、および不十分な卵母細胞品質（若い女性においてでさえ起こり得る）に対して、機能的卵母細胞を提供する。加えて、ＰＡＳＣからの誘導された配偶子形成および卵母細胞生成の研究はさらに哺乳類配偶子形成および女性性機能の生物学的メカニズムへの洞察を全体として提供することができる。
【０１０５】
前記方法は、例示であり、制限するものではないことが意図される。本明細書で提供される教示を使用して、ＰＡＳＣを単離し、使用する他の方法が当業者に利用可能となるであろう。
【０１０６】
実施例
下記実施例は本発明を説明し、これを製造し、使用するのに当業者を補助するために提示される。実施例は本発明の範囲を制限することをいかなる意味においても意図されない。
【０１０７】
実施例１：ＰＡＳＣの単離およびキャラクタリゼーション
この実施例は、ＰＡＳＣの単離およびキャラクタリゼーションを記載する。要約すると、実施例は下記を示す：ＰＡＳＣは懸濁液中で個々の細胞および胚性幹細胞クラスターによく似ている細胞球として増殖し、自己再生のための能力を有することができるが、中程度の速度で増殖する（図７）。核型研究により、ＰＡＳＣは２３対の染色体を有することが示され、これらは正常な完全性を示す（図８）。少ないパーセンテージのＰＡＳＣ（１０−２０％）が、ＣＤ９０（胸腺細胞のためのマーカー）、ＣＤ７３（リンパ球分化のためのマーカー）、ＣＤ３４（造血幹細胞のためのマーカー）、ＣＤ４５（造血幹細胞のためのマーカー）、ＣＤ４４（活性化Ｔリンパ球のためのマーカー）、およびＨＬＡ−ＤＲ（ＨＬＡクラスＩＩのためのマーカー）により認識され得る（図９Ａ−Ｂ）。対照的に、６０−７０％のＰＡＳＣがＣＤ１０５、ＣＤ２９（Ｔ細胞のためのマーカー）およびＨＬＡ−ＡＢＣ（ＨＬＡクラスＩのためのマーカー）により認識された（図９Ａ−Ｂ）。これらの結果から、ＰＡＳＣは、同種移植のための細胞治療において使用される可能性があり、異なる個体間での、免疫拒絶反応なしでのＰＡＳＣ細胞移植の可能性を開くことが確認される。さらに、これらの結果は、ＰＡＳＣとミューズ細胞、細胞ストレスに抵抗性があり、ＣＤ１０５／ＳＳＥＡ３細胞選別により単離された別の多能性幹細胞の間の表現型の違いを明確に示す。
【０１０８】
加えて、ＰＡＳＣは、多能性マーカーＳＳＥＡ３、ＴＲ−１−６０、Ｏｃｔ３／４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２に対して陽性であり（図１０Ａ−Ｂ）、自然に間葉系、内胚葉および外胚葉細胞系統に２０−２３％の間の効率で分化することができる（図１１Ａ、１２Ａ、１３Ａ）。特定の分化培地の存在下、ＰＡＳＣは、間葉系、内胚葉および外胚葉に、７８−８２％の効率で誘導され得る（図１１Ｂ−Ｃ、１２Ｂ、１３Ｂ−Ｃ）。通常のＡＳＣでは、脂肪生成培地中で、脂肪細胞となるのに１４−１７日の処理が必要であるが、ＰＡＳＣは脂肪生成培地中でのたった５日の処理により、脂肪細胞様細胞に迅速に変換され得る（図１１Ｂ）。通常のＡＳＣは筋原性培地中で、筋細胞となるのに２１日の処理が必要であるが、ＰＡＳＣは迅速に、筋原性培地中でのたった５日の処理により筋細胞様細胞に変換され得る（図１１Ｃ）。ＰＡＳＣは、細胞増殖または腫瘍形成を受けず、これによりＥＳおよびｉＰＳ細胞から区別される。免疫不全マウスの精巣への移植後４ヶ月で、ＰＡＳＣ（１０６細胞／マウス）は奇形腫を形成しなかった。対照的に、腫瘍化細胞株Ｆ１９は、奇形腫を注入後３週に形成した（図１４）。マイクロＲＮＡ  Ｌｅｔ−７はＡＳＣに対してＰＡＳＣに存在する最も重要な上流制御因子である（図１８）。Ｌｉｎ２８、ＲＡ−結合タンパク質遺伝子は、ＥＳおよびｉＰＳ細胞において多能性および腫瘍形成の両方を維持する。ミューズ細胞におけるＬｅｔ−７の過剰発現は、潜在的に、Ｌｉｎ２８発現を阻害するのに重要な役割を果たし、そのため、これらの細胞が腫瘍化増殖および奇形腫形成しないように保護するであろう。
【０１０９】
ＰＡＳＣは非常に低いレベルの細胞分裂および増殖を有し、腫瘍化活性を有さない。対照的に、ＰＡＳＣは免疫、炎症、免疫応答、免疫抑制、リンパ球活性化およびＴ細胞活性化に関連する遺伝子の非常に高いレベルの発現を示し、感染部位での樹状細胞またはヘルパーＴ細胞におけるＰＡＳＣに対する役割が示唆される（図１５）。
【０１１０】
マイクロアレイデータは、ＡＤＳＣに対しＰＡＳＣにおけるＳｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、およびＲｅｘ１の実質的な上方制御を示す。ＰＡＳＣはまた、細胞死および生存、胚発生、ＤＮＡ複製および修復、細胞周期および発癌能と関連する潜在因子に関与する遺伝子の下方制御と関連する遺伝子発現パターンを示す。遺伝子発現分析により、ＰＡＳＣおよびＡＤＳＣは間葉系起源であるが；しかしながら、ＰＡＳＣはまた、多くのリンパ球および造血遺伝子、例えばＣＣＲ１およびＣＸＣＬ２（幹細胞ホーミングに関与するケモカイン受容体およびリガンドをコードする）を発現することが示される。ＰＡＳＣ対ＡＳＣのジーンオントロジー分析により、最も統計的に有意な細胞機能のカテゴリは細胞死および生存、胚発生、組織発達、細胞構築および組織化、細胞機能および維持、ＤＮＡ複製、組換えおよび修復、細胞周期、臓器発生および生命体生存を含むことが示される（図１６）。古典的経路はさらにＤＮＡ修復、細胞周期、酸化ストレス、癌細胞制御、ならびにそれらの内因多能性におけるＰＡＳＣの潜在的役割への洞察を提供する（図１７）。加えて、ＰＡＳＣは食作用活性を示す。全細胞を貪食するマクロファージとは異なり、ＰＡＳＣは成熟細胞の核をそのまま残し、これは同一で健康な成熟細胞を生成させるための遺伝情報として、ＰＡＳＣにより使用され得る（図１９）。
【０１１１】
材料および方法
脂肪吸引された脂肪からのＰＡＳＣの単離
吸引脂肪組織（５０ｍｌ−２０００ｍｌ）は、脂肪吸引を受ける女性の皮下腹部脂肪から取得した。吸引脂肪組織を、血液が組織から完全に除去されるまで繰り返してＰＢＳで洗浄した。５０ｍｌ−２０００ｍｌの吸引脂肪組織を、コラゲナーゼ（０．１％、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む等体積のダルベッコ変法イーグル培地１ｘ（ＤＭＥＭ、ＣｅｌｌＧｒｏ、ＭｅｄｉａｔｅｃｈＩｎｃ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）と、５０ｍｌ管内で混合し、３０分間、３７℃で振盪インキュベーターにて１１０ｒｐｍでインキュベートした。脂肪組織が完全に消化されなかった場合、インキュベーションを同じ条件下でさらに１０−１５分間続け、続いて、４℃で、コラゲナーゼおよび栄養欠乏培地（ＦＣＳなし）において静かに６時間インキュベートした。このために、５０ｍｌ管を、通常の４℃冷蔵庫に移し、温度を、徐々に３７℃から４℃に降下させた。これらの重度の細胞ストレス条件（長期コラゲナーゼインキュベーション、栄養分の欠乏、低温および高度低酸素）下では、吸引脂肪組織消化材料中の存在する全ての細胞が、そのようなストレスに非常に抵抗性があるＰＡＳＣを除き、死滅した。消化された材料をその後、１５００ｒｐｍで１０分分間４℃にて遠心分離した。脂肪細胞デブリ（細胞成分の中でもとりわけ、死亡した脂肪細胞、マクロファージ、赤血球、脂肪幹細胞）を含む上清を、吸引により除去し、残った細胞ペレットを合わせ、新しい５０ｍｌ管に移した。細胞ペレットをその後、それぞれの回に２５ｍｌＤＭＥＭで３回洗浄し、確実に、全てのコラゲナーゼを細胞ペレットから完全に除去した。細胞を１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）および５％抗生物質−抗真菌薬溶液（ＣｅｌｌＧｒｏ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を含むＤＭＥＭに再懸濁させ、懸濁液中の細胞として、ならびに接着細胞として蒔き、さらにＰＡＳＣの純度および多能性を特徴付けた。ＰＡＳＣが動物モデルに注入される場合、新たに単離したＰＡＳＣを少量の生理食塩水溶液に再懸濁させ、標準プロトコルに従い、損傷した領域に直接、または静注を介して注入する。
【０１１２】
ＰＡＳＣの細胞の増殖、クローン性および核型
ＰＡＳＣの細胞の増殖およびクローン性を８つの異なる継代後に決定した。細胞クラスター球が新たに単離したＰＡＳＣを非接着皿に蒔いた数時間後に形成した（第一世代）。いったん、ほとんどの細胞球がサイズ＞５０μｍに到達すると、細胞クラスターをピペット操作により脱凝集させ、新しい非接着皿に移した（第二世代）。ＰＡＳＣを増殖させ、前のように、１−１／２日／細胞分裂の増殖速度で新しい細胞−クラスターを形成させた（第三世代）。全ての増殖した細胞の核型をキナクリン−ヘキスト染色により標準プロトコルに従い決定した。
【０１１３】
フローサイトメトリー分析
浮遊ＰＡＳＣを、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で８時間培養し、続いて、ＦＡＣＳ分析を実施した。細胞を２％不活性化ＦＣＳ／０．０５％ナトリウムアジド／ＰＢＳ中で洗浄し、１００μｌの同じ緩衝液に再懸濁させ、４℃で１時間、一次非結合ラット抗ヒトＳＳＥＡ３（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）の存在下、または非存在下でインキュベートした。細胞をその後２回、同じ緩衝液で洗浄し、対応する二次ＦＩＴＣ結合抗ラットＩｇＭ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と共に４５分間４℃でインキュベートした。細胞をその後洗浄し、２００μｌの同じ緩衝液に再懸濁させた。数および細胞型の分析をＦＡＣＳ  ＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターおよびｃＥｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェアを使用して実施した。さらにＰＡＳＣを特徴づけるために、他のマーカー、例えばＣＤ１０５（間葉系幹細胞のマーカー）、ＣＤ９０（胸腺細胞のためのマーカー）、ＣＤ７３（リンパ球分化のためのマーカー）、ＣＤ３４（造血幹細胞のためのマーカー）、ＣＤ４５（造血幹細胞のためのマーカー）、ＣＤ４４（活性化Ｔリンパ球のためのマーカー）、ＨＬＡ−ＤＲ（ＨＬＡクラスＩＩのためのマーカー）を、ＦＡＣＳのために、標準プロトコルに従い使用した。
【０１１４】
免疫細胞化学
細胞を、４％パラホルムアルデヒド中で固定し（２０分、Ｒ／Ｔ）、ＰＢＳで洗浄し、その後、０．２％トリトン中で２０分間インキュベートした。ＰＢＳでの２連続洗浄後、細胞を１０％正常ヤギ血清を含む１％ＢＳＡ溶液で６０分間、Ｒ／Ｔにてブロックした。細胞をその後、一次抗体と共に一晩４℃でインキュベートした。下記多能性幹細胞マーカーを使用した：ラット抗ヒトステージ特異的胎児抗原（ＳＳＥＡ３、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）、マウス抗ヒト八量体結合転写因子３および４（Ｏｃｔ３／４、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、ウサギ抗ヒトＮａｎｏｇ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）、ウサギ抗ヒトＳＲＹ−ｂｏｘ２（Ｓｏｘ２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）、およびマウス抗ヒトＴＲＡ−１−６０（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）；間葉系細胞系統では：ウサギ抗ヒト前脂肪細胞因子１（Ｐｒｅｆ−１、［ａ．ｋ．ａ．  ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  １  ｈｏｍｏｌｏｇ（ショウジョウバエ）、ＤＬＫ１］前脂肪細胞マーカー、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）；マウス抗ヒトミオシンＤ（ＭｙｏＤ、筋細胞マーカー、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、およびマウス抗ヒト平滑筋アクチン（ＳＭＡ、筋細胞マーカー、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）；内胚葉細胞系統では：マウス抗ヒトパンケラチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）；ウサギ抗ヒトα−フェトプロテイン（Ｄａｋｏ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）；ならびにマウス抗ヒトサイトケラチン７（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）；ならびに外胚葉細胞系統では：マウス抗ヒト神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）；ウサギ抗ヒトグルタミン酸受容体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）；ウサギ抗ヒトＮｅｕｒｏＤ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ  ＣＡ）；マウス抗ヒトネスチン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ  ＣＡ）；ならびにウサギ抗ヒト微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２、ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃｈ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）。全ての一次抗体を、１：２００でＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ溶液中で希釈した。一次抗体による処理後、細胞を３回ＰＢＳで洗浄し、１時間Ｒ／Ｔで二次免疫蛍光抗体（１：１０００）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８結合色素（マウスまたはラット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）またはＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ結合色素（ウサギ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含むＰＢＳ／０．１％ＢＳＡと共にインキュベートした。細胞を４回ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／０．２％ＤＡＰＩで１０分処理した。細胞をその後３回ＰＢＳで洗浄した。画像をＥｖｏｓ免疫蛍光法倒立顕微鏡（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、Ｍｉｌｌ  Ｃｒｅｅｋ、ＷＡ）を用いて取得した。
【０１１５】
結果
Ｉ−脂肪吸引されたヒト脂肪組織からのＰＡＳＣ単離
脂肪組織は脂肪細胞（成熟細胞）および脂肪組織マクロファージ（ＡＴＭ）、脂肪幹細胞（ＡＳＣ）、間葉系幹細胞、および線維芽細胞を含む細胞の不均一集団を含有する間質血管細胞群（ＳＶＦ）から構成される（２４−２５）。単離したＰＡＳＣをそれらの静止状態から、それらを細胞ストレスに曝露することにより活性化した（図４−５）。
【０１１６】
このために、吸引脂肪組織材料を最初に、コラゲナーゼ中で３０分間３７℃でインキュベートし、脂肪細胞（浮遊細胞）および前に記載されるようにＳＶＦ中に存在する異なる細胞成分を放出させた（２５）。この材料をその後、コラゲナーゼとの長期インキュベーション、低温、低血清および低酸素を含む重度の細胞ストレスに供した。細胞ストレスに対するそれらの高い抵抗性のためにＰＡＳＣを除き、全ての細胞がこれらの条件下では死滅する。
【０１１７】
ＰＡＳＣの放出のための最適条件は、コラゲナーゼとの、ＤＭＥＭ培地中でのＦＣＳなし、４℃での、非常に低いＯ２下での６−８時間のインキュベーションであると決定し、これにより、その後、ＰＡＳＣの均一集団が得られた。この高純度は、おそらく他の細胞型の枯渇の原因となる細胞ストレス条件の苛酷さのためである。脂肪組織の吸引脂肪組織の全ての他の成分は生き残ることができなかったので、高度に精製されたＰＡＳＣの集団が得られ、そのためさらなる精製プロセスは必要ではなかった。
【０１１８】
ＰＡＳＣを接着および非接着細胞培養皿の両方に蒔いた。ＰＡＳＣは、前の報告における骨髄および皮膚線維芽細胞由来ミューズ細胞で記載されるように、懸濁液または接着培養のいずれかにより増殖し、ＥＳ細胞由来胚様体で観察される特徴的な細胞クラスターを形成することができることが観察された（図５）（２２−２３）。両方の条件下で、個々のＰＡＳＣは、第１日までに、約１０μｍの直径に到達し、細胞クラスターは、５０−１００μｍまでの直径に到達し、単離した細胞およびクラスター細胞の数において大きな変化はなく（図７）、ミューズ細胞の増殖能力の制限の前のデータが確認された（２２）。
【０１１９】
ＩＩ−ＰＡＳＣは自己再生およびクローン増殖の能力を有する
ＰＡＳＣは少なくとも８つの異なる継代に対し自己再生のための能力を有する。細胞クラスター球が、ＰＡＳＣを非接着皿に蒔いた数時間後に形成する（第一世代）。いったん、ほとんどの細胞球がサイズ＞５０μｍに到達すると、細胞クラスターをピペット操作により脱凝集させ、新しい非接着皿に移した（第二世代）。ＰＡＳＣを増殖させ、前のように、１−１／２日／細胞分裂の増殖速度で新しい細胞−クラスターを形成させた（第三世代）。これにより、ＰＡＳＣは非常に低い低い増殖速度を有することが示される（図７）。
【０１２０】
ＩＩＩ−ＰＡＳＣは正常な核型を有する
全ての増殖細胞の核型は、正常であり、染色体異常を示さなかった。２３対の染色体は、性染色体ＸＸ（女性ドナー）を含み、正常な完全性を示した（図８）
【０１２１】
ＩＶ−フルオサイトメトリー（ｆｌｕｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）分析によるＰＡＳＣのキャラクタリゼーション
ＳＳＥＡ３、ヒトＥＳ細胞を検出するため、およびミューズ細胞を骨髄および真皮から精製するために頻繁に使用される細胞−表面スフィンゴ糖脂質（６１）およびＣＤ１０５、間葉系幹細胞の古典的マーカー（４３）に対する特異抗体をＦＡＣＳ分析のために使用した。およそ４０−５０％のＰＡＳＣが両方のマーカーに対して陽性であった。興味深いことに、細胞選別により単離したミューズ細胞（細胞ストレスに抵抗性のある別の多能性幹細胞）はＳＳＥＡ３およびＣＤ１０５抗体の両方に対して１００％陽性であった（２２−２３）。
【０１２２】
１０−２０％のＰＡＳＣがＣＤ９０（胸腺細胞のためのマーカー）、ＣＤ７３（リンパ球分化のためのマーカー）、ＣＤ３４（造血幹細胞のためのマーカー）、ＣＤ４５（造血幹細胞のためのマーカー）、ＣＤ４４（活性化Ｔリンパ球のためのマーカー）、ＨＬＡ−ＤＲ（ＨＬＡクラスＩＩのためのマーカー）により認識された。対照的に、４０−６０％のＰＡＳＣがＣＤ１０５（間葉系幹細胞のためのマーカー）により、６０−７０％がＣＤ２９（Ｔ細胞のためのマーカー）およびＨＬＡ−ＡＢＣ（ＨＬＡクラスＩのためのマーカー）により認識された（図９Ａ−Ｂ）。これらの結果から、ＰＡＳＣは同種移植のための細胞治療において使用される可能性があることが確認される。興味深いことに、骨髄および皮膚細胞に由来するミューズ細胞は、ＰＡＳＣとは異なる表現型特性を有する。例えば、ミューズ細胞はＣＤ３４およびＣＤ２９により認識されないが、全てのミューズ細胞は、ＳＳＥＡ３、ＣＤ１０５およびＣＤ９０を発現する（２２）。ミューズ細胞は細胞選別により、ＳＳＥＡ３／ＣＤ１０５抗体を用いて、細胞ストレス処理の使用なしで単離される（２２−２３）。これらの結果から、ＰＡＳＣおよびミューズ細胞は異なる表現型を有し、そのため異なる細胞型であることが示される。
【０１２３】
Ｖ−免疫細胞化学によるＰＡＳＣのキャラクタリゼーション
免疫蛍光染色のためにチェンバースライドに移動、接着させると、ＰＡＳＣ細胞クラスターおよび個々のＰＡＳＣのどちらも、検査された特徴的な多能性幹細胞マーカーの全てを強く発現した。これらは下記を含んだ：ＳＳＥＡ３、ヒトＥＳ細胞を検出し、ミューズ細胞を骨髄および真皮から精製するために頻繁に使用される細胞−表面スフィンゴ糖脂質（６１、２２−２３）；Ｏｃｔ３／４、ヒトＥＳ細胞の自己再生に関与するタンパク質；Ｎａｎｏｇ、ヒトＥＳ細胞の自己再生に関与する転写因子；Ｓｏｘ２、胚発生に関与する遺伝子を制御する転写因子；ならびにＴＲＡ−１−６０（胚性生殖細胞およびＥＳ細胞の表面上の抗原ＴＲＡ−１−６０と反応する）（図１０Ａ−Ｂ）。比較上、同じ脂肪吸引された組織に由来するＡＤＳＣはこれらの多能性幹細胞マーカーに対して陰性または弱陽性のいずれかであった（図１０Ａ−Ｂ）。
【０１２４】
実施例２：ＰＡＳＣの３つの生殖系列細胞系統への分化
材料および方法
免疫細胞化学
固定したＰＡＳＣを免疫細胞化学研究に供し、それらの生殖系列細胞起源を決定した。内胚葉細胞系統では：マウス抗ヒトパンケラチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）；ウサギ抗ヒトα−フェトプロテイン（Ｄａｋｏ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）；ならびにマウス抗ヒトサイトケラチン７（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）；ならびに外胚葉細胞系統では：マウス抗ヒト神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）；ウサギ抗ヒトグルタミン酸受容体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）；ウサギ抗ヒトＮｅｕｒｏＤ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ  ＣＡ）；マウス抗ヒトネスチン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ  ＣＡ）；ならびにウサギ抗ヒト微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２、ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃｈ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）。一次抗体は全て１：２００でＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ溶液中にて希釈した。一次抗体による処理後、細胞を３回ＰＢＳで洗浄し、１時間Ｒ／Ｔで、二次免疫蛍光抗体（１：１０００）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８結合色素（マウスまたはラット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）またはＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ結合色素（ウサギ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含むＰＢＳ／０．１％ＢＳＡと共にインキュベートした。細胞を４回ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／０．２％ＤＡＰＩで１０分間処理した。細胞をその後３回ＰＢＳで洗浄した。画像をＥｖｏｓ免疫蛍光倒立顕微鏡（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、Ｍｉｌｌ  Ｃｒｅｅｋ、ＷＡ）により取得した。
【０１２５】
ＰＡＳＣの誘導分化
様々な分化培地をミューズ細胞−ＡＴの３つの生殖系列細胞系統への分化を誘導するために使用した。
【０１２６】
脂肪細胞形成では、接着ＰＡＳＣを、０．５ｍＭイソブチルメチルキサンチン、１μΜデキサメタゾン、１０μΜインスリン、２００μΜインドメタシンおよびＰＰＡＲ−γ（ＺｅｎＢｉｏ、Ｉｎｃ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、ＮＣ）を有するＤＭＥＭを含む脂肪生成分化培地で３または６日にわたり３７℃および５％ＣＯ２で処理した。脂肪細胞を蛍光脂肪滴マーカーＢＯＤＩＰＹ−Ｃ１６（１：１０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｓｌｂａｄ、ＣＡ）を用いて、製造者仕様書に従い検出した。
【０１２７】
筋細胞形成では、接着ＰＡＳＣを１０％ＦＢＳ、５％ＮＨＳ、５０μΜヒドロコルチゾン、および１％抗生物質−抗真菌薬溶液を含むＤＭＥＭ中、３または６日にわたり、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。平滑筋細胞を平滑筋アクチン（ＳＭＡ）および骨格筋細胞ミオシンＤの発現により同定した。
【０１２８】
肝細胞および胆汁細胞誘導では、接着ＰＡＳＣを肝細胞分化培地中で、３または６日間インキュベートし、前に記載されるように、接着ＰＡＳＣを、１０％ＦＢＳ、１０μｇ／ｍｌインスリン、５．５μｇ／ｍｌトランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）、６．７ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳ；Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、１０ｎＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、１００ｎｇ／ｍｌ肝細胞増殖因子（ＨＧＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＲｏｃｋｙＨｉｌｌ、ＮＪ）および５０ｎｇ／ｍｌおよび線維芽細胞成長因子−４（ＦＧＦ−４、Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）が補充されたＤＭＥＭ中で、３または６日間インキュベートした（６２）。肝細胞を免疫組織化学によりサイトケラチン７およびα−フェトプロテイン発現を使用して同定した（以上を参照されたい）。
【０１２９】
神経細胞形成では、ミューズ細胞−ＡＴを、非接着細胞として、超低接着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）において、Ｂ−２７無血清サプリメント（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、１００μｇ／ｍｌカナマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、２ｍＭグルタミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、３０ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）および３０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）が補充されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を含む神経分化培地１の存在下で、７日間インキュベートした（６３）。細胞をその後、ポリスチレン培養スライド（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）に移し、さらに７日間、接着細胞として、２％ＦＣＳ、２５ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦおよび２５ｎｇ／ｍｌＢＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）が補充された１ＤＭＥＭを含む神経分化培地２の存在下で培養した。神経細胞を免疫組織化学によりネスチンおよびＭＡＰ２を使用して以上で示されるように同定した。
【０１３０】
結果
Ｉ−ＰＡＳＣの中胚葉分化
脂肪組織は間葉系細胞系統：脂肪細胞、軟骨細胞、筋細胞および骨芽細胞に分化する能力を有するＡＳＣを抱えることが示されている［１６，２０］。しかしながら、適切な分化培地中のＡＳＣは成熟脂肪細胞を発達させるのにおよそ２と１／２週を要し、特徴的には融合核を有する筋細胞分化は、およそ３週かかる（２４−２５）。
【０１３１】
中胚葉系統の細胞に自然に分化するＰＡＳＣの可能性を決定するために、ＰＡＳＣを接着細胞として、ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ＋抗生物質のみを含む培地中で３日間増殖させた。ＰＡＳＣの、中胚葉系統への自発的分化を、免疫細胞化学により決定した。中胚葉マーカーは、ＤＬＫ、前脂肪細胞のためのマーカー（５９）、ＢＯＤＩＰＹ−Ｃ１６、脂質蓄積を検出するために使用される蛍光色素（２５、６４−６５）、およびミオシンＤ（重鎖）、骨格筋細胞において見出されるミオシンＩＩタンパク質の重鎖部分のためのマーカー（６６、６７）を含んだ。接着細胞として３日間培養した後、ＰＡＳＣは、ＡＳＣ（ＤＬＫに応答してのみわずかに陽性であった（全ＤＡＰＩ陽性細胞の１７±７％））と比べて、ＤＬＫ（全ＤＡＰＩ陽性細胞の２１±８％）、ＢＯＤＩＰＹ−Ｃ１６（全ＤＡＰＩ陽性細胞の６１±１３％）およびミオシンＤ（全ＤＡＰＩ陽性細胞の２５±４％）の著しい発現を示した（図１１Ａ）。
【０１３２】
脂肪生成培地の存在下、３および６日にわたって、ＰＡＳＣが、ＢＯＤＩＰＹ−Ｃ１６（＋）小滴の形成により示されるかなりの濃度の脂肪滴を蓄積したことが証明され、これは、全ＤＡＰＩ陽性細胞の８０±４％（３ｄ）および８３±３％（６ｄ）を特徴付けた（図１１Ｂ）。対照的に、前脂肪細胞運命へのＡＳＣ関与の結果として、細胞質中で蓄積された脂質の存在のために、ＡＳＣはＢＯＤＩＰＹ−Ｃ１６（＋）に対して弱いが検出可能なシグナルを示した（図１１Ｂ）。３日では、ＰＡＳＣとＡＳＣの間には明確な形態学的相違が存在し、おそらく、より小さなサイズのＰＡＳＣにおいて最もよくわかり、これは、ＤＡＰＩにより示されるように、核サイズにおいて非常に明白である。しかしながら、この形態は実際には、第６日でずっとよく類似し、その時点では、核サイズがＰＡＳＣにおいて著しく成長し、ＡＳＣと大体同じになる。ＰＡＳＣにおいて観察される強度を用いた脂質のＢＯＤＩＰＹ標識は、典型的にはＡＳＣにおいて、培養下２−３週後に観察される（２５、６−６５）。予想通りに、ＡＤＳＣは、脂肪生成培地における１７日のインキュベーション後に脂肪細胞に完全に分化した（２５）。
【０１３３】
筋原性培地の存在下、３および６日間で、ＰＡＳＣは平滑筋細胞に分化し、平滑筋線維の特徴的な形態およびＳＭＡの強い発現を有し、これは、全ＤＡＰＩ陽性細胞の７７±３％（３ｄ）および８３±４％（６ｄ）を特徴付けた（図１１Ｃ）。同じ培養条件下で、ＡＤＳＣは６日のインキュベーション後にわずかに陽性であるにすぎなかった（全ＤＡＰＩ陽性細胞の２５±４％）（図１０Ｃ）。
【０１３４】
ＡＳＣの筋細胞への分化には、筋原性培地への少なくとも２１日間のＡＤＳＣ曝露が必要とされた（データは示されていない、（２５、６６−６７）。これらの結果により、両方の型の脂肪由来幹／前駆細胞は分化する能力を有するが、活性化ＰＡＳＣは、脂肪細胞および筋細胞系統の両方に、ＡＳＣよりもずっと迅速に分化することが証明される。
【０１３５】
ＩＩ−ＰＡＳＣの内胚葉分化
ＰＡＳＣの内胚葉系統（肝細胞）への自発的分化がＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で３日間培養したＰＡＳＣにおいて観察された。ＰＡＳＣはα−フェトプロテイン（全ＤＡＰＩ陽性細胞の１９±７％）（内胚葉および肝細胞の前駆体の発生中に発現される）（６８）およびパンケラチン（全ＤＡＰＩ陽性細胞の２１±８％）、胆道上皮細胞に特徴的な線維のためのマーカー［２７］により認識された（図１２Ａ）。細胞のクラスターでは、α−フェトプロテインは、ヒト肝芽腫細胞株ＨｅｐＧ２において前に記載されたように（６８）、ＰＡＳＣの細胞質および細胞膜の両方に局在する二量体および三量体形態の脂肪酸を強く認識した（図１２Ａ）。対照的に、ＡＳＣはこれらの内胚葉細胞マーカーに対して陰性であった（図１２Ａ）。
【０１３６】
前に肝性分化培地において３および６日間インキュベートしたＰＡＳＣはサイトケラチン７、胆汁細胞中の中間径線維タンパク質（全ＤＡＰＩ陽性細胞の６９±２％（３ｄ）および８０±７％（６ｄ）を特徴付けた）、ならびにα−フェトプロテイン（全ＤＡＰＩ陽性細胞の９０±４％（３ｄ）および９１±５％（６ｄ）を認識した）に対して陽性であったが（図１２Ｂ）、ＡＳＣは陰性であった（図１２Ｂ）。これらの結果により、ＰＡＳＣ分化は、培養下（３日）時間および分化効率の両方の観点から、肝細胞への多能性幹細胞分化の前の研究を映し出すことが証明される（４−５）。
【０１３７】
ＩＩＩ−ＰＡＳＣの外胚葉分化
ＰＡＳＣを３日間ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中、外胚葉細胞マーカー、例えば神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、新皮質ニューロン前駆体を検出するために使用されるマーカー（６９−７０）、代謝型グルタミン酸受容体（Ｇｌｕｔ−Ｒ）、ミクログリアおよび神経様細胞を検出するために使用されるマーカー（７１−７２）およびＮｅｕｒｏＤ、新皮質前駆細胞を検出するために使用されるマーカーにより特徴付けられる抗体と共に培養した。再び、ＰＡＳＣはこれらのマーカー全ての著しい発現を示し、全ＤＡＰＩ陽性細胞の３０±５％（Ｇｌｕｔ−Ｒ）および１５±５％（ＮｅｕｒｏＤ）であり（図１３Ａ）、対照ＡＳＣとは対照的に、外胚葉細胞に自然に分化するそれらの可能性が確認される（図１３Ａ）。
【０１３８】
ＰＡＳＣのニューロンへの形態学的な進行を、ＥＳおよびｉＰＳ細胞の神経起源の細胞への分化のために前に使用された同様のプロトコルに従い、第１および第２の神経原性分化培地（材料および方法を参照されたい）の両方におけるインキュベーションを通してモニタした（６９−７３）。ＰＡＳＣは指様突起を有する大きな細胞球の形成から長いニューロン様細胞への進行を示し、これはその後、大きなネットワークを形成した（図１３Ｂ）（６９）。懸濁液中、７日間神経分化培地１（材料および方法を参照されたい）において培養したＰＡＳＣは漸進的に大きな細胞クラスターを形成する。接着細胞としての７日間の神経分化培地２（材料および方法を参照されたい）中でのその後の処理により、形態により、ならびに軸索および樹状突起特異的マーカーにより検出可能なニューロン様細胞の形成が誘導された。
【０１３９】
前に二段階の神経原性分化を受けたＰＡＳＣに関する免疫細胞化学研究は、ネスチン、神経前駆細胞の生存、再生および増殖の刺激薬（７４）（全ＤＡＰＩ陽性細胞の６５±１１％を特徴付けた）およびＭＡＰ２、微小管の重合に関与するタンパク質［４３］（全ＤＡＰＩ陽性細胞の９２±２％を認識した）の両方の発現を明らかにした（図１３Ｃ）。ＡＳＣはネスチンに対して陰性であったが、ＭＡＰ２はマーカーに固有の最小程度の非特異性を示した（全ＤＡＰＩ陽性細胞の５％）（図１３Ｃ）。
【０１４０】
実施例３：ＰＡＳＣの遺伝子発現
材料および方法
マイクロアレイ分析
ＰＡＳＣおよびＡＳＣを３人の異なる患者の吸引脂肪組織材料から単離した。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出し、Ｈｏｋｋａｉｄｏ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．により分析した。アレイシグナルを処理し、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸバージョン１２．１．０（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて正規化した。データをＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓデータバンクにアクセス番号ＧＳＥ４６３５３を用いて寄託した。差次的に発現された遺伝子を選択するための判断基準は、方向＋統計学的有意性のいずれかにおける少なくとも２倍の差として予め設定された（Ｐ＜０．０５、独立ｔ検定）。マイクロアレイ分析を、ソフトウェアプログラムＩＰＡを用いてＩｎｇｅｎｕｉｔｙ（ａｎａｌｙｓｉｓ（ｄｏｔ）ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ（ｄｏｔ）ｃｏｍ）へのライセンスにより実施し、分析された比較および上流制御因子において変化した遺伝子に由来する関連遺伝子の機能経路（細胞機能、生理的機能、疾患）、古典的シグナル経路ネットワークを同定した（１）。遺伝子機能に関するさらなる情報が、プログラムＧｅｎｅＤｅｃｋｓ  Ｖ３からｇｅｎｅｃａｒｄｓ（ｄｏｔ）ｏｒｇで得られた［２０］。統計分析をフィッシャーの正確確率検定により実施した（ソフトウェアにより自動的に実施される）。どの遺伝子がＰＡＳＣまたはＡＳＣのいずれかにおいてのみ発現されるかの決定では、全ての試料（３通りで実施された）は均一な検出（少なくとも１００標準単位で示される）またはなし（せいぜい３０の標準単位）を、Ｐ値＜０．０５と共に示さなければならなかった。
【０１４１】
結果
Ｉ−ＡＳＣと比較したＰＡＳＣの遺伝子発現
表Ｓ１−２は３人の異なる患者から取得したＲＮＡにおいてマイクロアレイにより実施した、ＡＳＣと比較したＰＡＳＣ細胞遺伝子発現を示す。それぞれ、４３５の上方および４３４の下方制御された遺伝子においてミューズ−ＡＴ細胞対ＡＳＣ間の少なくとも２倍の変化の差次発現が観察された（ｐ＜０．０５、表Ｓ１−Ｓ２）。ＰＡＳＣ対ＡＳＣの最も顕著な上方制御された遺伝子はＣＸＣＬ２（７７７．８倍）、ＥＳＣＭ２（１５３．２倍）ＤＬＬ１（１４７．４倍）、ＮＲ４Ａ２（１３９．２倍）、ＡＤＡＭＴＳ９（１１５．３倍）、ＢＭＸ（９１．５倍）、ＭＹＺＡＰ（８７．６倍）、ＡＬＤＨ１Ａ２（４７．１倍）およびＳＯＤ２（４１．４倍）を含み、これらの遺伝子はそうでなければ、ＡＳＣにおいてオフにされまたは抑制されたことが示される（表Ｓ１）。最も顕著な下方制御された遺伝子はＡＫ５（１３６．６倍）、ＧＲＥＭ２（１１５．２倍）、ＣＥＰ５５（９３．６倍）、ＢＵＢ１Ｂ（６６．４倍）、ＣＤＣＡ３（６２．５倍）、ＮＵＦ２（５４．８倍）およびＤＥＰＤＣ１（５２倍）（表Ｓ２）を含んだ（２６）。（本明細書で参照される表Ｓ１−Ｓ６の各々が参考文献２６において見出され得る）。
【０１４２】
表Ｓ１−２はまた、ＰＡＳＣにおいて差次的に発現される遺伝子の多くは高く保存され、相同体が多くの小生物（酵母、Ｓ．セレビシエ、線虫、クラミドモナス、ゴマフシビレエイ、ショウジョウバエ、など）において存在することを示す。これは、ミューズ細胞は、重度の細胞ストレスに応じて細胞生存に関連する高く保存された細胞メカニズムにおいて役割を果たすという可能性を示す（３２−３３）。
【０１４３】
表Ｓ３−４はＰＡＳＣ細胞においてのみ発現され、ＡＳＣで発現されない遺伝子を示す。９９の遺伝子が全てのＰＡＳＣ試料で発現され、全てのＡＳＣ試料で存在しなかった。ＰＡＳＣのみで発現された遺伝子はＴＮＦＳＦ１４（ｐ＜０．０００２）、ＩＬ３ＲＡ（ｐ＜０．０００７）、ＣＳＦ３（ｐ＜０．００１３）、ＩＬ１０ＲＡ（ｐ＜０．００４）、ＧＡＴＡ２（ｐ＜０．００５）、およびＢＭＰ７（ｐ＜０．０２）を含んだ（表Ｓ３）。興味深いことに、ＰＡＳＣは、ＡＳＣが発現しなかった多くのＣＤ−マーカーを発現し、一方、ＡＳＣのみに特有のＣＤ−マーカーはなかった（表Ｓ４）。
【０１４４】
表Ｓ５はＡＳＣのみで発現され、ＰＡＳＣで発現されない遺伝子を示す。４１の遺伝子がＡＳＣにより発現され、ＰＡＳＣには存在しない（表Ｓ５）。これらの遺伝子は、有糸分裂および細胞周期に大きく関係し、ＥＳＣＯ２（ｐ＜０．０００７）、ＫＩＦ２０Ａ（ｐ＜０．０００９）、ＣＥＮＰＦ（ｐ＜０．００２３）、ＮＥＫ２（ｐ＜０．００２９）、ＲＡＢ３Ｂ（ｐ＜０．００３１）、およびＦＧＦ５（ｐ＜０．００６８）を含んだ。
【０１４５】
ＤＮＡ修復と関連する１４の個々の遺伝子がＡＳＣに対してＰＡＳＣで上方制御された（表Ｓ６Ａ）。加えて、８のＡＢＣ−カセット遺伝子はＰＡＳＣにおいてより高く発現された（表Ｓ６Ｂ）。最後に、細胞間情報伝達の方法を検査するために、ギャップ結合関連遺伝子の発現を分析し、ＰＡＳＣは、３つのコネキシン遺伝子ＧＪＡ４、ＧＪＢ２、ＧＪＢ４、ならびにＣｌｏｒｆ７１（ＣＮＳＴ）を発現したことが観察され、それは近年記載されたコネキシンリサイクルタンパク質、コンソルチン（ｃｏｎｓｏｒｔｉｎ）をコードする［４４］（表Ｓ６Ｃ）。
【０１４６】
図１４は、ＰＡＳＣで発現され、ＡＳＣでは発現されなかった、およびその逆の遺伝子の機能グループのマイクロアレイ分析を表す。ＰＡＳＣは、ＡＳＣと比べて、有糸分裂、細胞周期、細胞増殖、細胞接着、ＤＮＡ修復、細胞生存、ユビキチン化、アクチンリモデリング、代謝と関連する遺伝子およびｉＰＳにおいて活性化される遺伝子の非常に低い発現を有する。対照的に、ＰＡＳＣは免疫、炎症、免疫制御、免疫応答、免疫抑制、リンパ球活性化、Ｔ細胞マーカー、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞活性化、同時刺激と関連する遺伝子の非常に高いレベルの発現を有する。ＰＡＳＣは樹状細胞またはヘルパーＴ細胞を感染部位で制御することができる。
【０１４７】
ＩＩ−ジーンオントロジー分析
ジーンオントロジー分析を実施し、ＰＡＳＣにおいて観察された差次発現は細胞機能のカテゴリと強く相関し、最も統計的に有意なのは下記である：細胞死および生存（ｐ＝２．０４Ｅ−０５〜３．１５Ｅ−０２）、胚発生（ｐ＝５．９２Ｅ−０５〜３．１５Ｅ−０２）、組織発達（ｐ＝５．９２Ｅ−０５〜３．１５Ｅ−０２）、細胞構築および組織化（ｐ＝１．０７Ｅ−０４〜３．１５Ｅ−０２）、細胞機能および維持（ｐ＝４．０４Ｅ−０４〜３．１５Ｅ−０２）、ＤＮＡ複製、組換えおよび修復（ｐ＝１Ｅ−０．３〜３．１５Ｅ−０．２）、細胞周期（ｐ＝１．１２Ｅ−０．３〜３．１５Ｅ−０．２）、臓器発生（ｐ＝１．５４Ｅ−０．３〜３．１５Ｅ−０．２）および生命体生存（ｐ＝２．６３Ｅ−０．３〜２．６３Ｅ−０．３）（図１５、参考文献（２６）の表Ｓ１−Ｓ２）。
【０１４８】
ＩＩＩ−古典的経路
最も高く発現された古典的経路は、胚性幹細胞多能性におけるＯｃｔ４の役割（ＳＯＸ２、ＮＲ６Ａ１、ＢＲＣＡ１、ＡＳＨ２Ｌ、ＰＯＵ５Ｆ１）、ＤＮＡ損傷および遺伝性乳癌シグナル伝達におけるＢＲＣＡ１（ＰＯＬＲＪ２／ＰＯＬＲ２Ｊ３、ＦＡＮＣＢ、ＰＯＬＲ２Ｊ、ＣＤＫ６、ＲＰＡ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＲＦＣ５、ＢＬＭ、ＢＲＣＡ１、ＲＦＣ３）、染色体複製の細胞周期制御（ＭＣＭ６、ＯＲＣ３、ＣＤＫ６、ＲＰＡ１）、ＤＮＡ修復（ＲＰＡ１、ＲＦＣ５、ＲＦＣ３）、アルギニン分解（ＡＬＤＨ４Ａ１、ＯＡＴ）、および胚性幹細胞の心臓系統への分化（ＳＯＸ２、ＰＯＵ５ＤＦ１）を含む（図１７）。これらのデータはＤＮＡ修復、細胞周期、酸化ストレス、癌細胞制御、ならびにそれらの内因多能性における潜在的役割ＰＡＳＣへのさらなる洞察を提供する。
【０１４９】
細胞死および生存に関与する重要な遺伝子の上方および下方制御（例えばＳＧＫ１（ｕｐｌ．６ｘ）、ＭＤＨ１、ＡＴＦ２、ＨＳＰＡ８、ＰＤＩＡ３、ＢＲＤ１、ＣＡＬＭ１、ＮＲ４Ａ２、ＧＡＴＡ２、ＣＤＫ６、ＮＵＦ２、ＣＤＫ６、ＢＲＣ１、ＢＵＢ１ＢおよびＣＣＸＬ２）は重度の細胞ストレス曝露に対するミューズ−ＡＴ細胞抵抗性に寄与することができるであろう。
【０１５０】
ＢＲＣ１  ＤＮＡ損傷および修復経路は、ＡＳＣに対してＰＡＳＣでは下方制御され、重度の細胞ストレスの結果としてのＤＮＡ損傷に抵抗するＰＡＳＣの高い能力が示される。
【０１５１】
ＩＶ−上流制御因子分析
マイクロＲＮＡ  Ｌｅｔ−７はＡＳＣに対してＰＡＳＣにおいて存在する最も重要な上流制御因子である。Ｌｅｔ−７は、下記と関連する１１の下流遺伝子を制御する：細胞周期分裂の減少（例えばＣＤＣＡ３、ＣＤＣ１６）、細胞分化（ＤＺＩＰ１）、細胞成長および増殖（ＳＳＲ１）、ＤＮＡ複製（ＭＣＭ６）、複製因子および癌（ＲＦＣ３、ＲＦＣ５）ならびに細胞死および生存（ＮＵＦ２、ＢＲＣＡ１、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＤＣ１６）（図１８）。
【０１５２】
Ｌｉｎ２８、ＲＮＡ−結合タンパク質遺伝子は、ＥＳおよびｉＰＳ細胞における多能性および腫瘍形成の両方を維持する。Ｌｅｔ−７、胚発生、細胞分化および腫瘍抑制を制御することができるマイクロＲＮＡは、逆の効果を有する（７５）。Ｌｅｔ−７の過剰発現はＬｉｎ２８遺伝子発現をブロックし、強いＬｉｎ２８発現はＬｅｔ−７を分解し、２つの相互に相殺する遺伝子間で平衡が維持される（７５）。
【０１５３】
ＥＳおよびｉＰＳ細胞は非常に高いＬｉｎ２８／Ｌｅｔ７比を有し、これが、それらの腫瘍化傾向において重要な役割を果たすと考えられてきた（７５）。強いＬｉｎ２８影響がないと、ミューズ細胞はそれらの多能性能力を保持する（７５）。ミューズ細胞におけるＬｅｔ−７の過剰発現は潜在的に、Ｌｉｎ２８発現を阻害するのに重要な役割を果たし、そのためこれらの細胞が腫瘍化増殖および奇形腫形成しないように保護するであろう。
【０１５４】
実施例４：免疫および自己免疫疾患におけるＰＡＳＣの役割
材料および方法
脂肪細胞と間質血管細胞群の間の共培養後のＰＡＳＣの形成
ヒト脂肪組織を細かくミンチにし、コラゲナーゼで６０分間３７℃で、輸送緩衝液中で処理した。細胞懸濁液をその後、予め湿らせた１５０ミクロンナイロンメッシュ（Ｓｍａｌｌ  Ｐａｒｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｍｉａｍｉ  Ｌａｋｅｓ、ＦＬ）に通して濾過し、２分間５０×ｇでＲＴにて遠心分離した。上相（浮遊脂肪細胞）を、下相（ＳＶＦ）から分離した。脂肪細胞画分を２回洗浄し、脂肪細胞培地（ＤＭＥＭ、１％ＢＳＡ、３％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）で希釈した。下相を５分間５００×ｇで遠心分離に供した。細胞ペレット（ＳＶＦ）をＰＢＳ中に再懸濁させ、フィコール密度勾配に供し、ＳＶＦをさらに精製した。ＳＶＦ画分を含む界面を除去し、５ｍｌのＰＢＳでＲＴにて洗浄した。５分間の５００×ｇでの最終遠心分離後、細胞ペレットを培地（１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭＬ−グルタミン、１％ＮＥＡＡ、１％ピルビン酸ナトリウム、および１０ｎｇ／ｍｌＧＭ−ＣＳＦが補充されたＲＰＭＩ培地）に再懸濁させた。ＳＶＦ画分からの細胞（１０６／ｍｌ）および脂肪細胞画分からの細胞（１０６／ｍｌ）を別々に一晩、それらの個々の細胞培地中で平衡化させた。カバーガラスをその後、各ウェル内で免疫蛍光法研究のために置いた。２４時間後、再懸濁させた脂肪細胞画分をＳＶＦ画分を含むウェルに、約１：１比で添加した。プールした細胞を２−２４時間３７℃で、５％ＣＯ２にて共培養した。インキュベーション期間の終わりに、脂肪細胞画分を再懸濁させ、ピペットにより移動させ、１ｍｌの脂肪細胞培地を含む別のウェルに入れた（以上を参照されたい）。残りのＳＦＶ画分を５回、１ｍｌのＰＢＳで洗浄し、さらに２日間、新しい標準培地中で培養し（以上を参照されたい）、カバーガラスをその後、免疫蛍光法のために収集した（以下を参照されたい）。脂肪細胞およびＳＶＦ画分もまた別々に、以上で記載した同じ条件下で培養した。免疫組織化学法を、標準プロトコル、および異なるマーカーを用いて実施し、Ｓ−１００およびＤＬＫ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、前脂肪細胞のためのマーカー；造血幹細胞および脂肪幹細胞の初期形成のためのＣＤ３４マーカー（Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）および異なる多能性幹細胞マーカー（Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２、Ｏｃｔ３／４、以上を参照されたい）を使用した。
【０１５５】
Ｉ型糖尿病に対する特異的ＣＤ４（＋）Ｔ細胞エピトープを含む脾細胞に対するＰＡＳＣの効果
ＮＯＤ  ＢＤＣ２．５トランスジェニックマウスの脾細胞を、標準条件を使用して単離した。これらの脾細胞はＣＤ４（＋）Ｔ細胞を含み、これらは、ミメトープ（Ｍｉｍ）という名の特異ペプチドのみを認識する（その配列はクロモグラニンＡ（ＣｈｇＡ）の一部である）（７６）。脾細胞（５×１０５細胞）を、２４ウェルクラスターにおいて、ミメトープと共に７２時間ＰＡＳＣ（１０３−１０５細胞／ウェル）の存在下（共培養）で、またはこれなしで培養した。脾細胞の数（細胞増殖）をＦＡＣＳにより、染色されたカルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）脾細胞に対して、Ｍｉｍ±ＰＡＳＣとのインキュベーション前後で決定した。ＩＦＮγ生成を、それぞれ、ＦＡＣＳおよびＲＩＡにより決定した。
【０１５６】
Ｉ型糖尿病に対する特異的ＣＤ４（＋）Ｔ細胞エピトープを含む脾細胞に対するＰＡＳＣ条件培地の効果
１０６のＰＡＳＣを非接着皿において、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で培養した。条件培地を４８時間後に収集した。ＮＯＤ  ＢＤＣ２．５トランスジェニックマウスから単離された脾細胞（５×１０５細胞）を、２４ウェルクラスターにおいてミメトープと共に７２時間、ＰＡＳＣ条件培地の存在下、または非存在下で、異なる希釈（１／２〜１／５００希釈）で培養した。脾細胞定量化のために、ＣＦＳＥ標識脾細胞をＭｉｍ±ＰＡＳＣ条件培地と共にインキュベートした。ＣＦＳＥ希釈をＦＡＣＳにより分析し、細胞増殖を決定した。ＩＦＮγ生成を、ＲＩＡにより決定した。
【０１５７】
マウス糖尿病モデルにおけるＰＡＳＣの効果
（Ａ）ＮＯＤｓｃｉｄマウスをストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の複数回（４５ｍｇ／ｋｇ、４連続日）注入により糖尿病にした。ＰＡＳＣを糖尿病（血糖＞２４０ｍｇ／ｄｌ）ＮＯＤｓｃｉｄマウスに１回または２回（示される通り）注入した（１０６細胞、腹腔内）。血糖および体重をゼロ時間、ならびに注入後異なる時間に、標準条件を使用して決定した。（Ｂ）糖尿病ＮＯＤマウスは自然糖尿病が起こるマウス系統である。ＮＯＤマウスにおいて高血糖症の発症直後に、ＰＡＳＣを注入した（１０６細胞、腹腔内）。血糖および体重をゼロ時間ならびに注入後異なる時間に標準条件を使用して決定した。いくらかの動物が２回目のＰＡＳＣの注入（１０６細胞、腹腔内）を受けた。
【０１５８】
結果
Ｉ−ＰＡＳＣの食作用活性
ＰＡＳＣの形成を、脂肪細胞画分（浮遊細胞）および間質血管細胞群（接着細胞）の共培養後に検出した（５９）。前脂肪細胞（Ｓ−１００（＋）細胞）とＰＡＳＣ（ＳＳＥＡ３（＋）細胞、赤色）の間には明確な相互作用がある。（図１８Ａ）ＰＡＳＣは前脂肪細胞のおよそ３分の１にしっかりと接着する。この接着は外見上選択的であり、というのも、一見すると同一の前脂肪細胞がＰＡＳＣに完全に貪食されるからである。（図１８Ｂ）有糸分裂を受けている前脂肪細胞はＰＡＳＣにより乱されていないままであったが、真上の前脂肪細胞はＰＡＳＣにより貪食され、ＤＡＰＩ陽性核のみが被覆されずに残る。前脂肪細胞およびＰＡＳＣはどちらもＳ−１００＋およびＳＳＥＡ３であり、（図１８Ｃ−ａ、Ｃ−ｂ）により、前脂肪細胞は１−２秒の蛍光曝露で陽性Ｓ−１００染色を示し、ＰＡＳＣはたった１ミリ秒曝露時間で陽性結果を表すであろうことが示される。曝露強度における大きな食い違いにより、ＰＡＳＣは、Ｓ−１００をずっと高いレベルで発現する、またはより容易にＳ−１００抗体をそのドメインに結合させることが示唆される。個々のＰＡＳＣは元々、それらの小核の明確なＤＡＰＩ染色により同定された。ずっと小さなＰＡＳＣによる前脂肪細胞の食作用が存在する。前脂肪細胞は、貪られる異なる段階で明確に見ることができるであろう。全細胞を貪食するマクロファージとは異なり、ＰＡＳＣは前脂肪細胞の核をそのまま残し、（図１８Ａ）、しばしば、前脂肪細胞核は培養中に裸で残される（図１８Ｂ）。
【０１５９】
ＩＩ−抗原特異的免疫調節細胞としてのＰＡＳＣ
ＰＡＳＣはミメトープにより刺激されたＢＤＣ２．５脾細胞の数を用量応答様式で著しく低減させた。１０３−１０４のＰＡＳＣが細胞増殖において最大阻害を生成させた（図２０Ａ−Ｄ）。ミメトープにより刺激されたＢＤＣ２．５脾細胞によるＩＮＦγ分泌に対するＰＡＳＣの効果はより劇的であった。１０３のＰＡＳＣがＩＮＦγレベルを完全に阻害した（図２０Ｅ）。
【０１６０】
ＰＡＳＣ条件培地はＡｇ特異的受刺激脾細胞によるＩＮＦγの分泌を著しく低減させた。二人の異なる患者から単離されたＰＡＳＣから得られたＰＡＳＣ−ＣＭ＃１および＃２は、１／５希釈で同様の結果を示した（図２１Ａ−Ｂ）。しかしながら、Ｔ細胞増殖は、どちらのＰＡＳＣ条件培地にも影響されなかった（図２１Ｃ−Ｄ）。
【０１６１】
ＩＩ−マウス糖尿病モデルにおけるＰＡＳＣの効果
ＰＡＳＣの効果を、糖尿病がストレプトゾトシンの複数回の注入により誘導されたＮＯＤｓｃｉｄマウスにおいて、最初に分析した。ＰＢＳを受けた全ての糖尿病ＮＯＤｓｃｉｄマウス（対照群）は第５日までに血糖≧５００ｍｇ／ｄｌを有し、第１の注入後第６日に死亡し、または瀕死となった（図２２Ｃ）。対照的に、ほとんどのＰＡＳＣ処置マウス効果（１０６細胞、腹腔内）は長期間、体重増加をほぼ６週まで維持して生き残った（図２２Ａ）。７匹のうち６匹のマウスは移植後８週間生き延び、７匹中５匹は、処置後第１１週に到達した（図２２Ａ）。ＰＡＳＣ処置マウスのほとんどは、変動する血糖を、５００ｍｇ／ｄｌ未満で処置後少なくとも６週の間維持した（図２２Ｂ）。これらの結果により、ＰＡＳＣは、少なくとも６週の処置後、体重損失およびグルコースレベルを劇的に改善したことが明確に示される。これらの効果は糖尿病動物モデルにおいてＰＡＳＣの新しい膵臓および腎臓細胞を再生する能力と関連する可能性がある。
【０１６２】
ＰＡＳＣの効果はまた、自然に生じた糖尿病ＮＯＤマウスでも分析した。高血糖症の発症直後に、ＮＯＤマウスは血糖値＞５００ｍｇ／ｄｌ（第４日）に到達し、体重の一定の損失があった。第１０日に、ＮＯＤ糖尿病マウスは死亡した（ｎ＝２）（図２３Ｃ）。対照的に、４匹中３匹のミューズ細胞注入ＮＯＤ糖尿病マウスは、処置後５週まで体重増加を示した（図２３Ａ）。血糖は変動するレベルを示し、長期間の間、著しく遅延して≧５００ｍｇ／ｄｌに到達した（図２３Ｂ）。明らかに、移植された糖尿病マウスは対照よりも高い生存を有した。これらの結果により、ＰＡＳＣは、少なくとも６週の処置後、体重損失およびグルコースレベルを劇的に改善したことが明確に示される。これらの効果はＮＯＤマウスにおいてＰＡＳＣの新しい膵臓および腎臓細胞を再生する能力と関連する可能性がある。
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【０１６３】
本明細書で記載される実施例および実施形態は例示目的のためにすぎず、これらを考慮すると、様々な改変および変更が当業者に示唆され、これらは本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。本明細書で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願はこれにより、その全体が全ての目的のために参照により組み込まれる。
【図９】
2016519939.tif 000003
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１５】
2016519939.tif 000006
【図１６】
2016519939.tif 000007
【図１７】
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【図１９Ａ−１９Ｃ】
2016519939.tif 000009
【図２０Ａ−２０Ｅ】
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【図２１Ａ−２１Ｄ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１８】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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