(57)【要約】  本開示は、味覚調節物質を特定するのに有用な味覚受容体インターナリゼーションアッセイを提供する。
2016519313.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
味覚調節物質を特定する方法において、
ａ）機能性味覚受容体を含む細胞を試験化合物と接触させるステップ；
ｂ）前記細胞を、細胞核に特異的な検出可能な標識を含む第１試薬及び前記味覚受容体に特異的な第２の検出可能な標識を含む第２試薬と接触させるステップ；および
ｃ）前記受容体のインターナリゼーションを検出するステップ
を含み、
前記試験化合物の存在下での前記受容体のインターナリゼーションは、前記試験化合物が潜在的な味覚調節物質であることを示す、方法。
【請求項２】
前記味覚受容体が甘味受容体である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記甘味受容体がＴ１Ｒ２を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記甘味受容体がＴ１Ｒ３を含む、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記甘味受容体がＧＬＵＴ４を含む、請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記味覚受容体が苦味受容体である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記苦味受容体が、Ｔ２Ｒ１、Ｔ２Ｒ３、Ｔ２Ｒ４、Ｔ２Ｒ５、Ｔ２Ｒ７、Ｔ２Ｒ８、Ｔ２Ｒ９、Ｔ２Ｒ１０、Ｔ２Ｒ１３、Ｔ２Ｒ１４、Ｔ２Ｒ１６、Ｔ２Ｒ３８、Ｔ２Ｒ３９、Ｔ２Ｒ４０、Ｔ２Ｒ４１、Ｔ２Ｒ４２、Ｔ２Ｒ４３、Ｔ２Ｒ４４（Ｔ２Ｒ３１）、Ｔ２Ｒ４５、Ｔ２Ｒ４６、Ｔ２Ｒ４７（Ｔ２Ｒ３０）、Ｔ２Ｒ４８（Ｔ２Ｒ１９）、Ｔ２Ｒ４９（Ｔ２Ｒ２０）、Ｔ２Ｒ５０、及びＴ２Ｒ６０の少なくとも１つを含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記細胞がＮＣＩ−Ｈ７１６細胞である、請求項１〜７いずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記味覚受容体の位置を分析するステップをさらに含む、請求項１〜８いずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本開示に引用した各参照文献は、その全体を本明細書に組み込むものとする。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、概して、味覚受容体調節物質を特定するのに有用なアッセイに関する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
味覚調節物質を特定する方法において、
ａ）機能性味覚受容体を含む細胞を試験化合物と接触させるステップ；
ｂ）前記細胞を、細胞核に特異的な検出可能な標識を含む第１試薬及び前記味覚受容体に特異的な第２の検出可能な標識を含む第２試薬と接触させるステップ；および
ｃ）前記受容体のインターナリゼーションを検出するステップ
を含み、
前記試験化合物の存在下での前記受容体のインターナリゼーションは、前記試験化合物が潜在的な味覚調節物質であることを示す。
【０００４】
１つの態様において、前記味覚受容体は甘味受容体である。
【０００５】
１つの態様において、前記甘味受容体はＴ１Ｒ２を含む。
【０００６】
１つの態様において、前記甘味受容体はＴ１Ｒ３を含む。
【０００７】
１つの態様において、前記甘味受容体はＧＬＵＴ４を含む。
【０００８】
１つの態様において、前記味覚受容体は苦味受容体である。
【０００９】
１つの態様において、  前記苦味受容体は、Ｔ２Ｒ１、Ｔ２Ｒ３、Ｔ２Ｒ４、Ｔ２Ｒ５、Ｔ２Ｒ７、Ｔ２Ｒ８、Ｔ２Ｒ９、Ｔ２Ｒ１０、Ｔ２Ｒ１３、Ｔ２Ｒ１４、Ｔ２Ｒ１６、Ｔ２Ｒ３８、Ｔ２Ｒ３９、Ｔ２Ｒ４０、Ｔ２Ｒ４１、Ｔ２Ｒ４２、Ｔ２Ｒ４３、Ｔ２Ｒ４４（Ｔ２Ｒ３１）、Ｔ２Ｒ４５、Ｔ２Ｒ４６、Ｔ２Ｒ４７（Ｔ２Ｒ３０）、Ｔ２Ｒ４８（Ｔ２Ｒ１９）、Ｔ２Ｒ４９（Ｔ２Ｒ２０）、Ｔ２Ｒ５０、及びＴ２Ｒ６０の少なくとも１つを含む。
【００１０】
１つの態様において、前記細胞はＮＣＩ−Ｈ７１６細胞である。
【００１１】
１つの態様において、前記味覚受容体の位置を分析するステップをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＲｅｂＡ処理によって、ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞にＴ２Ｒ１４インターナリゼーション（「リング」アッセイ）が誘導される。ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞におけるＴ２Ｒ１４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の免疫蛍光染色。
【図２】ＲｅｂＡ処理後の「リング」陽性細胞のパーセンテージ（平均±ＳＤ）。
【図３Ａ】リング形成アッセイ、Ｔ１Ｒ２インターナリゼーション。図３Ａは、ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞におけるＴ１Ｒ２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の免疫蛍光染色である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、「リング」陽性細胞のパーセンテージ（平均±ＳＤ）である。Ｔ１Ｒ２受容体の再循環は、「リング」陽性細胞の数の減少と相関する。
【図４Ａ】ＧＬＵＴ４は、人工甘味料の共通の受容体である。図４Ａは、ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞におけるＧＬＵＴ４（Ｓｉｇｍａ）の免疫蛍光染色である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、「リング」陽性細胞のパーセンテージ（平均±ＳＤ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．味覚受容体インターナリゼーションアッセイ（「リングアッセイ」）
本開示は、味覚受容体インターナリゼーションを測定するためのアッセイを提供する。このアッセイは、以下の具体的実施例で説明し、且つ図１に概略的に示され、これは、非常に頑強であり、Ｔ２Ｒ１４（苦味受容体）及びＴ１Ｒ２（甘味受容体）局在化を正確に定量する。このアッセイは、甘味分子並びに苦味抑制物質を特定するのに用いることができ、ハイスループットアッセイ（high-throughput assays）に用いるのに特に適している。
【００１４】
いわゆる「リングアッセイ」とも呼ばれる本明細書に開示するインターナリゼーションアッセイは、受容体に特異的な抗体を用いて、受容体の局在化を検出するものである。核酸に特異的な第１の検出可能な標識（例えば、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７、ＤＲＡＱ９）を用いて、細胞核を標識する。この標識により、特定の範囲内の細胞数などの情報が得られ、核（例えば、ＤＡＰＩ陽性）及び細胞質（例えば、ＤＡＰＩ陰性）コンパートメントが識別される。味覚受容体と特異的に結合する抗体を、第１の検出可能な標識から区別され得る第２の検出可能な標識（例えば、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ３５０、４８８、５４６、５５５、５６８、５９４、６３３、６４７）と結合した二次抗体との結合に用いる。刺激因子の非存在下で（例えば、バッファー単独の存在下で）、拡散環状染色（Ｄｉｆｆｕｓｅ  ｃｉｒｃｌｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を観察する。刺激因子の存在下で、インターナライズした受容体の「リング（ｒｉｎｇ）」を視覚化する。一部の実施形態では、核及び受容体シグナルの画素値のリング陽性細胞を相関係数により計算する。インターナリゼーションの範囲は、複数（例えば、４反復（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ））のデータ点からの連続的リング染色を示す細胞のパーセンテージ（平均±ＳＤ）として表すことができる。
【００１５】
ｉ．甘味受容体
一部の実施形態では、リングアッセイを用いて、例えば、Ｔ１Ｒ２、Ｔ１Ｒ３、又はＧＬＵＴ４のインターナリゼーションを検出する。Ｔ１Ｒ２及びＴ１Ｒ３の共発現により、天然及び人工甘味料などの甘味刺激に応答する味覚受容体が生じる。甘味リガンドは、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３受容体に結合して、受容体インターナリゼーション及び細胞内カルシウム動態化を含むＧタンパク質経路形質導入、並びにＥＲＫ１／２のリン酸化などの下流標的の誘導を活性化する。甘味受容体は、例えば、米国特許第７，４０２，４００号明細書に記載されている。甘味受容体に特異的に結合する抗体は、市販のものか、又は当技術分野では公知の方法を用いて作製することができる。
【００１６】
ｉｉ．苦味受容体
一部の実施形態では、リングアッセイを用いて、例えば、Ｔ２Ｒ１、Ｔ２Ｒ３、Ｔ２Ｒ４、Ｔ２Ｒ５、Ｔ２Ｒ７、Ｔ２Ｒ８、Ｔ２Ｒ９、Ｔ２Ｒ１０、Ｔ２Ｒ１３、Ｔ２Ｒ１４、Ｔ２Ｒ１６、Ｔ２Ｒ３８、Ｔ２Ｒ３９、Ｔ２Ｒ４０、Ｔ２Ｒ４１、Ｔ２Ｒ４２、Ｔ２Ｒ４３、Ｔ２Ｒ４４（Ｔ２Ｒ３１）、Ｔ２Ｒ４５、Ｔ２Ｒ４６、Ｔ２Ｒ４７（Ｔ２Ｒ３０）、Ｔ２Ｒ４８（Ｔ２Ｒ１９）、Ｔ２Ｒ４９（Ｔ２Ｒ２０）、Ｔ２Ｒ５０、及びＴ２Ｒ６０などの苦味受容体のインターナリゼーションを検出する。Ｔ２Ｒ１４及び他の苦味受容体の発現により、天然及び人工甘味料の苦味相などの苦味刺激に応答する味覚受容体が生じる。苦味リガンドは、苦味受容体に結合して、受容体インターナリゼーション及び細胞内カルシウム動態化を含むＧタンパク質経路形質導入、並びに下流標的の誘導を活性化する。苦味受容体は、例えば、米国特許第７，０２２，４８８号明細書に記載されている。苦味受容体に特異的に結合する抗体は、市販のものか、又は当技術分野では公知の方法を用いて作製することができる。
【００１７】
ｉｉｉ．試験化合物
試験化合物は、天然に存在するものでもよく、又は合成により製造することもできる。タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、及び小分子は、本明細書に開示する方法を用いて、スクリーニングすることができる試験化合物の例である。
【００１８】
ｉｖ．細胞
機能性味覚受容体を含む、又はそれを含むように操作することができるあらゆる細胞をリングアッセイに用いることができる。一部の実施形態では、ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞を用いる（ＡＴＣＣカタログ＃ＣＣＬ−２５１）。これらの細胞は、苦味受容体Ｔ２Ｒ１、Ｔ２Ｒ３、Ｔ２Ｒ４、Ｔ２Ｒ５、Ｔ２Ｒ７、Ｔ２Ｒ８、Ｔ２Ｒ９、Ｔ２Ｒ１０、Ｔ２Ｒ１３、Ｔ２Ｒ１４、Ｔ２Ｒ１６、Ｔ２Ｒ３８、Ｔ２Ｒ３９、Ｔ２Ｒ４０、Ｔ２Ｒ４１、Ｔ２Ｒ４２、Ｔ２Ｒ４３、Ｔ２Ｒ４４（Ｔ２Ｒ３１）、Ｔ２Ｒ４５、Ｔ２Ｒ４６、Ｔ２Ｒ４７（Ｔ２Ｒ３０）、Ｔ２Ｒ４８（Ｔ２Ｒ１９）、Ｔ２Ｒ４９（Ｔ２Ｒ２０）、Ｔ２Ｒ５０、及びＴ２Ｒ６０、甘味受容体Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３、α−ガストデューシン、並びにグルコース輸送体ＧＬＵＴ４を発現する。当技術分野では公知の方法を用いて、Ｔ２Ｒ１４、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３、α−ガストデューシン、及び／又はＧＬＵＴ４を発現するように、他の細胞を操作することができる。ＧＬＵＴ４は、中でも、米国特許第７，７９９，５３８号明細書及び本明細書に引用する参照文献に記載されている。α−ガストデューシンについての説明は、米国特許第８，３３８，１１５号明細書及び本明細書に引用する参照文献並びにＡｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １００，６９３−７０２，２０００を参照されたい。
【００１９】
開示するアッセイに用いることができる他の細胞としては、限定はしないが、以下のものが挙げられる：１Ａ２，ＡＲＨ−７７、ＲＷＰＥ−１、ＷＩ−３８，ＥＪＭ、ＮＣＩ−Ｈ１１５５、Ｌ−１２３６、ＮＣＩ−Ｈ５２６、ＪＭ１，ＳＨＰ−７７、ＳＮＵ−８７８、ＮＣＩ−Ｈ２１９６、Ｃ３Ａ、ＣＡ４６、ＳＮＵ−４６６、ＫＳ−１、ＳＮＵ−７３８、ＭＯＬＰ−２、ＨＤＬＭ−２、ファイファー（Ｐｆｅｉｆｆｅｒ）、ＨＣＣ−１５、アレキサンダー（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）細胞、Ｌ−５４０、ＫＭＳ−１２−ＢＭ、ＪＫ−１、ＮＣＩ−Ｈ１０９２、ＳＷ  １９９０、ＮＣＩ−Ｈ１１８４、ＳＵ−ＤＨＬ−１、Ｈｅｐ  ３Ｂ２．１−７、Ｐ３ＨＲ−１、ＮＣＩ−Ｈ２０２９、ＳＵ−ＤＨＬ−５、ＳＮＵ−１、ＭＯＬＰ−８、ＳＵＰ−Ｍ２、ＭＯＮＯ−ＭＡＣ−１、ＳＮＵ−１０４０、ＫＹＭ−１、ＨＥＣ−５９、ＨＣＣ１５６９、ＯＣＩ−ＬＹ３、Ｈｓ８１９．Ｔ、ＤＵ４４７５、ＣＩ−１、Ｓ−１１７、ＯＶＣＡＲ−８、ＳＮＵ−６２６、ＨＬ−６０、ＳＵＩＴ−２、Ｔ３Ｍ−４、ＲＫＯ、ＭＯＲ／ＣＰＲ、ＤＫ−ＭＧ、ＧＡ−１０、ＯＣＵＭ−１、ＨＣＴ−１５、ＨＴ、ＭＯＮＯ−ＭＡＣ−６、Ｇ−４０２、トレド（Ｔｏｌｅｄｏ）、ＣＯＶ３６２、ＳＵ−ＤＨＬ−８、Ｄａｏｙ、ＮＣＩ−Ｈ１４３５、ＬＳ５１３、Ｈｓ８３９．Ｔ、Ｈｓ１７２．Ｔ、ＢＴ−４８３、ＫＭＳ−２１ＢＭ、ＡＧＳ、ＮＣＩ−Ｈ２１７２、ＬＣ−１／ｓｑ−ＳＦ、ＳＮＵ−２０１、ＮＵＧＣ−４、ＳＫ−ＨＥＰ−１、ＳＵＰ−Ｂ１５、ＳＮＵ−５、ＨＴ−１１９７、ＳＵＰ−Ｔ１、ＡＭＯ−１、ＫＵ８１２、ＡＮ３ＣＡ、ＡＭＬ−１９３、ＶＭＲＣ−ＲＣＷ、ＨＬＥ、ＨｕＨ２８、Ｈｓ７５１．Ｔ、ＮＣＩ−Ｈ２１１０、ＭＥＧ−０１、ＭＶ−４−１１、ＨｅｐＧ２、ＫＹＳＥ−３０、ＫＡＬＳ−１，ＢＩＣＲ６、ＲＭＵＧ−Ｓ、ＪＨＨ−６、Ｋｉ−ＪＫ、ＩＳＴ−ＭＥＳ１、ＨＣＣ−９５、ＨＰＢ−ＡＬＬ、ＨＳＣ−３，６９７、ＬＯＵ−ＮＨ９１、ＫＡＲＰＡＳ−２９９、ＧＩ−１、ＣＯＬＯ７９２、ＳＫ−Ｎ−ＦＩ、Ｄ３４１Ｍｅｄ、ＨＧＣ−２７、ＳＲ−７８６、ＣＯＬＯ−８１８、ＭＨＨ−ＣＡＬＬ−２、ＳＦ１２６、ＮＣＩ−Ｈ３２２、Ａ−２５３、ＮＣＩ−Ｈ１６２３、ＭＣＦ７、ＨＣＣ−４４、ＦＵ９７、ＯＣＩ−ＬＹ−１９、Ｈｓ７６６Ｔ、ＮＣＩ−Ｈ５２２、ＲＬ、ＨＣＣ１４２８、ＲＰＭＩ６６６６、Ｕ−９３７、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＳＷ１０８８、ＮＣＩ−Ｈ１７９２、ＮＣＩ−Ｈ１６９３、ＵＡＣＣ−２５７、ＪＨＵＥＭ−２、ＨｕＴ７８、ＵＡＣＣ−８９３、ＮＣＩ−Ｈ９２９、Ａ−７０４、ＯＶ５６、ＬＮ−２２９、ＯＥ１９、ＳＫ−ＭＥＬ−２４、ＲＤ−ＥＳ、ＮＣＩ−Ｈ２１１、ＫＣＩ−ＭＯＨ１、ＮＣＩ−Ｈ１９６３、Ｈｓ７０６．Ｔ、ＣｈａＧｏ−Ｋ−１、ＥＰＬＣ−２７２Ｈ、ＯＰＭ−２、ＫＨＭ−１Ｂ、Ａ５４９、ＨｕＧ１−Ｎ、ＮＣＩ−Ｈ５０８、ＭＨＨ−ＣＡＬＬ−３、ＳＮＵ−１０７６、Ａ３／ＫＡＷ、ＭＥＬ−ＨＯ、ＴＯ１７５．Ｔ、Ｃａｋｉ−１、Ｈｓ９３６．Ｔ、ＳＫ−ＬＵ−１、ＷＭ−９８３Ｂ、Ｋ−５６２、ＥＦＥ−１８４、ＳＮＵ−５２０、ＮＣＩ−Ｈ２２９１、ＨＣＣ−１１９５、ＡＢＣ−１、ＫＥ−３９、ＮＨ−６、ＨＣＣ２２１８、ＣＭＫ、ＲＳ４；１１、ＫＹＳＥ−４��０、ＯＶ７、ＫＹＳＥ−５１０、ＳＫ−ＵＴ−１、ＳＮＵ−Ｃ１、ＯＥ３３、Ｐ１２−ＩＣＨＩＫＡＷＡ、ＤＬＤ−１、ＣＯＶ４３４、ＨｕＮＳ１、ＳＮＵ−８９９、ＳＷ４８０、ＣＯＬＯ−６７８、ＬＵ９９、ＫＯＰＮ−８、ＮＣＩ−Ｈ２２２７、ＳＷ１４６３、Ｈｓ６７５．Ｔ、ＪＨＨ−４、ＮＣＩ−Ｈ１７０３、ＨＥＣ−１−Ａ、ＢＤＣＭ、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２、ＰＣ−３、ＴＥ−１５、ＰＫ−４５Ｈ、ＭＫＮ−４５、ＨＣＣ−３６６、ＣＡＬ−２９、ＨＥＣ−５０Ｂ、ＣＰＣ−Ｎ、ＫＭＲＣ−２０、ＳＷ１１１６、ＥＯＬ−１、ＣＯＬＯ２０５、ＥＨＥＢ、ＹＤ−３８、ＭＣ１１６、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、ＢＶ−１７３、ＮＣＩ−Ｈ２３４７、ＬＵ６５、ＲＴ４、Ｕ−８７ＭＧ、ＬＫ−２、ＫＰ−Ｎ−ＹＮ、ＨＥＣ−２５１、ＮＣＩ−Ｈ１６５１、ＧＰ２ｄ、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳ、ＮＢ−４、ＮＣＩ−Ｈ２２８６、ＳＮＵ−６１、Ｔ−４７Ｄ、ｈｕＨ−１、ＫＹＳＥ−１８０、ＳＴ４８６、ＳＷ１３５３、Ｍ−０７ｅ、ＫＡＳＵＭＩ−１、ＹＨ−１３、ＮＣＩ−Ｈ２８、ＧＡＭＧ、ＪｅＫｏ−１、ＧＯＳ−３、ＳＮＵ−３２４、ＰＡ−ＴＵ−８９０２、ＭＦＥ−２８０、ＳＮＵ−２４５、ＮＡＬＭ−１、ＲＥＲＦ−ＬＣ−Ｓｑ１、ＢＩＣＲ２２、ＺＲ−７５−１、ＣＯＲ−Ｌ２３、ＳＷ５７９、ＣＯＲ−Ｌ８８、ＫＭ１２、Ｈｓ６１１．Ｔ、ＯＵＭＳ−２３、ＲＥＲＦ−ＬＣ−Ａｄ１、ＮＣＩ−Ｈ１３８５、ＳＫ−ＬＭＳ−１、ＣＯＬＯ−３２０、ＢＬ−７０、ＧＲＡＮＴＡ−５１９、ＭＣＡＳ、Ｐａｎｃ０８．１３、ＡＭ−３８、ＫＭＳ−１１、ＳＩＧ−Ｍ５、ＳＮＵ−４０７、ＪＨＯＳ−２、ＯＶＣＡＲ−４、Ｓｅｔ−２、ＯＶ−９０、ＭｅＷｏ、ＨＥＬ、ＨＴ−２９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＴＯＶ−２１Ｇ、ＮＣＩ−Ｈ１３５５、ＫＭＳ−２７、ＮＡＬＭ−６、ＫＭＳ−２６、Ｃａｏｖ−４、ＫＡＳＵＭＩ−２、ＵＡＣＣ−６２、Ｕ２６６Ｂ１、Ｈｓ６９５Ｔ、ＨＴ５５、ＢＩＣＲ３１、ＴＣＣ−ＰＡＮ２、ＫＭＳ−２０、Ｈｓ５７８Ｔ、ＲＩ−１、Ｈｓ６０６．Ｔ、ＮＣＩ−Ｈ１３４１、ＴＨＰ−１、ＢＣＰ−１、Ｈｓ７３７．Ｔ、ＳＷ１４１７、ＭＯＬＴ−４、Ｒａｊｉ、ＥＳＳ−１、ＭＥＬ−ＪＵＳＯ、ＳＨ−１０−ＴＣ、Ｈｓ６８３、ＭＥ−１、ＥＢ２、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＮＣＩ−Ｈ１３３９、Ａ４／Ｆｕｋ、ＳＥＭ、ＨＥＣ−２６５、ＩＳＴ−ＭＥＳ２、ＫＥ−９７、ＮＣＩ−Ｈ１４３７、ＣＯＬＯ−７０４、ＮＣＩ−Ｈ１９１５、ＴＥ−５、ＮＣＩ−Ｈ２０２３、ＮＣＩ−Ｈ８２、Ｔ１−７３、ＳＮＵ−８４０、ＨｕＴ１０２、ＮＣＩ−Ｈ１９４４、ＫＹＳＥ−５２０、Ｋａｓｕｍｉ−６、１３２１Ｎ１、Ｈｓ７４２．Ｔ、ＩＭ９５、ＰＬ４５、ＣＬ−４０、ＷＭ１７９９、ＫＭＭ−１、ＳＮＵ−４４９、ＪＨＵＥＭ−１、ＫＡＲＰＡＳ−６２０、Ｌｏｕｃｙ、ＳＮＵ−１０７９、ダウジ（Ｄａｕｄｉ）、ＨＣＣ−５６、ＨＳＣ−２、ＣＯＲ−Ｌ４７、ＰＡ−ＴＵ−８９８８Ｓ、ＯＡＷ２８、ＣＯＲ−Ｌ３１１、Ｌ−３６３、Ｍａｌｍｅ−３Ｍ、ＮＯＭＯ−１、Ｈｓ８７０．Ｔ、ＳＵ−ＤＨＬ−１０、Ｈｓ２２９．Ｔ、ＮＣＩ−Ｈ８１０、ＫＹＳＥ−４１０、ＲＰＭＩ−８４０２、ＳＮＵ−１７５、ＥＢＣ−１、ＲＶＨ−４２１、Ｋ０２９ＡＸ、ＰＡ−ＴＵ−８９８８Ｔ、ＬＸＦ−２８９、ＯＶＳＡＨＯ、ＣＡＬ−１２Ｔ、Ｈｓ９４０．Ｔ、ＭＭ１−Ｓ、ＳＵＰ−ＨＤ１、ＬＮＣａＰクローンＦＧＣ、ＨＳＣ−４、ＮＵ−ＤＨＬ−１、ＮＣＩ−Ｈ２２２８、ＢＥＮ、ＣＡＬ−７８、Ｓｑ−１、ＮＣＩ−Ｈ１７９３、ＳＮＵ−Ｃ２Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−１３４−ＶＩ、ＣＯＶ３１８、ＫＥ−３７、ＴＹＫ−ｎｕ、ＭＯＴＮ−１、Ｔ９８Ｇ、ＳＷ８３７、ＥＢ１、ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）、ＰＥ／ＣＡ−ＰＪ３４（クローンＣ１２）、Ｈｓ６１６．Ｔ、ＮＣＩ−Ｈ４４６、ＷＭ−８８、ＣＨＰ−１２６、Ｃａｌｕ−１、ＳＮＵ−２８３、ＮＣＩ−Ｈ１５７３、ＳＷ１２７１、ＳＮＵ−１６、ＪＨＯＳ−４、ＡＣＨＮ、Ｃａｌｕ−３、ＫＭＲＣ−１、ＳＷ１７８３、ＴＥ−１１、ＴＥ−９、ＨｕＨ−６、Ｐ３１／ＦＵＪ、ＨＴ−１３７６、ＮＣＩ−Ｈ５２０、７８６−Ｏ、ＫＮＳ−６０、Ｃａｋｉ−２、ＯＶＫ１８、ＰＬ−２１、ＮＣＩ−Ｈ２４５２、ＪＵＲＬ−ＭＫ１、ＴＥＮ、ＪＨＨ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７、Ｃａｌｕ−６、ＲＫＮ、ＮＵＧＣ−２、ＯＮＳ−７６、Ｊ８２、ＯＵＭＳ−２７、ＳＮＵ−１１９６、Ｈｓ７３９．Ｔ、ＲＰＭＩ−７９５１、ＮＣＩ−Ｈ８５４、ＪＨＨ−５、ＪＶＭ−２、Ｈｅｙ−Ａ８、５６３７、ＫＹＳＥ−１４０、Ｃａｐａｎ−２、ＫＹＳＥ−１５０、ＨＥＣ−１−Ｂ、ＢＩＣＲ１６、ＨＥＬ９２．１．７、ＭＨＨ−ＮＢ−１１、ＳＮＵ−３８７、ＳＫ−ＯＶ−３、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ＩＧＲＯＶ１、ＭＬ−１、ＨＬＦ−ａ、ＣＨＬ−１、ＹＫＧ１、Ａ−２０４、ＯＣＩ−Ｍ１、８５０５Ｃ、ＪＶＭ−３、ＮＣＩ−Ｈ６４７、ＤＢ、ＣＯＬＯ−８００、ＰＫ−５９、ＦａＤｕ、ＨＬＦ、ＯＶＭＡＮＡ、ＥＦＯ−２７、ＰＦ−３８２、ＮＣＩ−Ｈ７４７、ＬＳ１２３、ＳＵ−ＤＨＬ−６、ＳＪＲＨ３０、ＰＡＮＣ−１、ＮＣＩ−Ｈ２３４２、ＫＭ−Ｈ２、ＤＮＤ−４１、ＨＨ、ＨｕＣＣＴ１、Ｆ−３６Ｐ、ＤＭＳ４５４、Ｈｓ２７４．Ｔ、ＡＵ５６５、ＮＣＩ−Ｈ１６６６、ＥＮ、ＲＨ−４１、ＮＣＩ−Ｈ１３７３、ＮＣＩ−Ｈ８３８、ＳＫ−ＭＥＬ−３０、ＭＯＬＭ−６、ＤＥＬ、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ１６４８、ＮＣＩ−Ｈ６６１、１４３Ｂ、ミノ（Ｍｉｎｏ）、Ｃ３２、ＫＭＳ−３４、ＮＣＩ−Ｈ１６９４、ＳＫ−ＥＳ−１、ＵＡＣＣ−８１２、ＧＤＭ−１、ＮＣＩ−Ｈ２３、Ｐａｎｃ０２．０３、ＣＣＦ−ＳＴＴＧ１、ＬＯＸ  ＩＭＶＩ、ＳＪＳＡ−１、ＭＤＳＴ８、ＰＫ−１、ＮＣＩ−Ｈ７１６、ＳＵ−ＤＨＬ−４、ＭＰＰ８９、ＭＪ、ＣＯＬＯ８２９、ＰＥ／ＣＡ−ＰＪ１５、ＨＤ−ＭＹ−Ｚ、ＢｘＰＣ−３、ＷＭ−７９３、ＣＯＬＯ６６８、Ｔ８４、ＪＨＯＭ−１、ＰＥＥＲ、ＬＳ４１１Ｎ、ＧＭＳ−１０、ＫＭＢＣ−２、ＲＭＧ−Ｉ、ＫＥＬＬＹ、ＳＮＵ−７６１、ＮＡＬＭ−１９、ＨＥＣ−１５１、Ｇ−３６１、ＯＶＴＯＫＯ、Ａ−４９８、ＳＷ  ９００、ＬＣＬＣ−１０３Ｈ、ＦＴＣ−１３３、ＱＧＰ−１、Ｒｅｈ、ＣＭＫ−１１−５、ＮＵ−ＤＵＬ−１、ＢＴ−２０、Ｈｓ６００．Ｔ、Ｈｓ６０４．Ｔ、ＫＡＴＯＩＩＩ、ＳＮＵ−４１０、ＮＣＩ−Ｈ２１２６、ＳＫ−ＭＥＬ−５、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＡｓＰＣ−１、ＨＵＰ−Ｔ３、ＫＰ−Ｎ−ＳＩ９ｓ、Ｌ−４２８、ＳＮＵ−１１０５、ＨＵＰ−Ｔ４、７６９−Ｐ、ＬＭＳＵ、ＮＣＩ−Ｈ１８６９、ＮＣ��２、ＭＯＬＭ−１６、ＣＡＬ  ２７、ＨＣＣ７０、ＮＣＩ−Ｈ１９３０、ＣＯＶ６４４、Ｈｓ８６３．Ｔ、ＨＣＣ−２２７９、Ｄ２８３Ｍｅｄ、Ｈｓ９４４．Ｔ、ＨＣＣ１５９９、ＭＤＡ−ＭＢ−４１５、ＨＣＣ２１５７、ＮＣＩ−Ｈ１６１８、ＳＮＵ−３０８、ＨＣＣ１９５４、ＤＭＳ１５３、ＨＰＡＦ−ＩＩ、Ｔ２４、ＣＪＭ、ＶＭ−ＣＵＢ１、ＵＭ−ＵＣ−３、ＬＡＭＡ−８４、ＮＣＩ−Ｈ１７３４、ＪＨＨ−２、ＶＭＲＣ−ＲＣＺ、ＭＦＥ−３１９、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＳＮＵ−５０３、ＴＯＶ−１１２Ｄ、Ｂ−ＣＰＡＰ、ＧＳＵ、ＨＣＣ−７８、ＮＣＩ−Ｈ２１７１、ＣＡＭＡ−１、ＨＥＣ−１０８、ＨＣＣ４００６、ＣＡＬ−８５−１、ＮＣＩ−Ｈ２１２２、ＣＯＬＯ−６９９、ＮＣＩ−Ｈ１９６、ＬＵＤＬＵ−１、ＳＷ７８０、ＲＰＭＩ８２２６、ＬＰ−１、ＰＣ−１４、ＨｕＴｕ８０、Ｔ．Ｔ、ＳＷ９４８、２２Ｒｖ１、ＨＡＲＡ、ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＩＰＣ−２９８、ＳＣａＢＥＲ、ＮＣＩ−Ｈ１８３８、ＮＢ−１、Ｈｓ９３４．Ｔ、Ｈｓ８９５．Ｔ、ＤＭＳ１１４、ＫＹＳＥ−７０、ＫＰ−３、ＫＰ４、ＤＡＮ−Ｇ、ＮＣＩ−Ｈ２００９、ＯＣ３１６、ＳＣＣ−２５、Ｕ−１３８ＭＧ、ＲＣＣ１０ＲＧＢ、ＭＦＥ−２９６、ＮＣＩ−Ｈ１７５５、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＫＪ、８３０５Ｃ、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２、ＥＳ−２、ＭＳＴＯ−２１１Ｈ、ＳＣＣ−１５、ＺＲ−７５−３０、ＰＳＮ１、ＳＮＵ−４２３、ＮＣＩ−Ｈ２１０６、ＴＥ−１、ＵＴ−７、ＫＭＳ−２８ＢＭ、ＮＣＩ−Ｈ２０８１、ＳＫ−ＭＭ−２、ＣＯＬＯ７４１、ＯＣ３１４、ＨＣＣ１３９５、ＭＯＬＴ−１３、ＬＮ−１８、Ｐａｎｃ１０．０５、ＰＥ／ＣＡ−ＰＪ４１（クローンＤ２）、Ｈｓ７４６Ｔ、ＣＷ−２、ＳＫＭ−１、ＮＵＧＣ−３、ＴＥ−１０、ＮＣＩ−Ｈ３５８、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＢＦＴＣ−９０９、ＨＯＳ、ＢＩＣＲ１８、ＮＣＩ−Ｈ１３９５、ＯＶＫＡＴＥ、Ｈｓ６９８．Ｔ、ＥＦＭ−１９、ＣＯＬＯ−７８３、ＭＨＨ−ＣＡＬＬ−４、ＡＣＣ−ＭＥＳＯ−１、ＮＣＩ−Ｈ１４３６、ＫＰ−Ｎ−ＲＴ−ＢＭ−１、ＳＫ−ＭＥＬ−３１、ＮＣＩ−Ｈ１１０５、ＣＡＬ−５１、ＹＤ−１５、ＮＣＩ−Ｈ２０８５、ＮＣＩ−Ｈ２４４４、ＨＣＣ１１８７、Ｈｓ９３９．Ｔ、ＣＡＬ−１２０、ＳＣＣ−９、ＴＵＨＲ１４ＴＫＢ、ＫＭＲＣ−２、ＫＧ−１−Ｃ、ＥＣＣ１０、ＣＧＴＨ−Ｗ−１、ＮＣＩ−Ｈ８４１、Ｃ２ＢＢｅ１、ＳＵＰ−Ｔ１１、ＲＣＨ−ＡＣＶ、ＣＡＤＯ−
ＥＳ１、ＪＵＲＫＡＴ、６４７−Ｖ、ＳＫ−ＭＥＬ−２、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ、ＭＫＮ７４、ＳＮＵ−Ｃ４、ＬＣＬＣ−９７ＴＭ１、ＳＣＣ−４、ＢＨＹ、ＩＧＲ−３７、ＫＹＯ−１、Ｈｓ２８１．Ｔ、ＴＴ、ＴＵＨＲ４ＴＫＢ、ＨＴ−１０８０、ＮＣＩ−Ｈ６６０、ＴＥ４４１．Ｔ、ＬＳ１０３４、ＫＮＳ−４２、Ｐａｎｃ０４．０３、ＨＣＣ１４１９、ＡＺ−５２１、ＳＮＧ−Ｍ、ＮＣＩ−Ｎ８７、Ｇ−２９２、クローンＡ１４１Ｂ１、ＫＰＬ−１、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＣＬ−１４、ＮＣＩ−Ｈ２１７０、ＨｕＨ−７、ＲＤ、ＮＣＩ−Ｈ２０６６、ＩＧＲ−１、ＴＥ−１４、ＶＣａＰ、ＢＬ−４１、ＳＮＵ−６２０、ＳＫ−ＭＥＳ−１、ＭＥＣ−２、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＩＧＲ−３９、ＲＴ１１２／８４、ＳＦ−２９５、ＤＶ−９０、Ａ２７８０、ＢＩＣＲ５６、ＮＣＩ−Ｈ５１０、ＮＣＩ−Ｈ２１４１、ＹＤ−８、ＮＣＩ−Ｈ２４０５、ＴＦ−１、ＭＥＣ−１、ＣＣＫ−８１、ＮＣＩ−Ｈ１０４８、Ｈｓ８２２．Ｔ、ＮＣＩ−Ｈ２０５２、ＫＯ５２、ＣＡＬ−５４、Ｈｓ８４０．Ｔ、ＳＷ６２０、ＳＫ−ＣＯ−１、ＢＴ−４７４、ＣＬ−１１、ＫＮＳ−６２、ＮＣＩ−Ｈ１６５０、Ｇ−４０１、ＭＯＬＴ−１６、ＳＮＵ−３９８、ＣＯＬＯ−６８０Ｎ、ＥＭ−２、Ｈｓ２９４Ｔ、ＣＡＬ−６２、ＫＭＲＣ−３、Ａ１０１Ｄ、ＫＧ−１、ＢＴ−５４９、ＨＴ１１５、Ａ−３７５、ＳＷ−１７１０、ＷＭ−１１５、ＫＬＥ、ＪＨＵＥＭ−３、ＭＫＮ７、ＣＨＰ−２１２、ＨＣＣ２０２、ＢＣ−３Ｃ、ＮＣＩ−Ｈ１５６８、ＫＭＳ−１８、ＰＥ／ＣＡ−ＰＪ４９、ＣＯＬＯ−８４９、ＳＩＭＡ、ＯＣＩ−ＡＭＬ３、ＧＳＳ、ＥＣ−ＧＩ−１０、ＥＦＯ−２１、ＲＣＭ−１、ＤＭＳ２７３、ＫＵ−１９−１９、ＲＥＲＦ−ＧＣ−１Ｂ、ＳＨ−４、ＳＫ−ＭＥＬ−３、ＲＥＲＦ−ＬＣ−Ａｄ２、Ｍ０５９Ｋ、ＪＨＯＭ−２Ｂ、ＭＤＡ  ＰＣａ  ２ｂ、Ｈｓ８５２．Ｔ、ＲＬ９５−２、Ｐａｎｃ０３．２７、ＳＮＵ−２１６、Ｐａｎｃ０２．１３、ＣＦＰＡＣ−１、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＯＣＩ−ＡＭＬ２、ＬｏＶｏ、ＳＢＣ−５、ＮＣＩ−Ｈ１８７６、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＣＯＲ−Ｌ２４、ＨＣＣ３８、ＮＣＩ−Ｈ１７８１、ＤＯＨＨ−２、ＮＣＩ−Ｈ１５６３、Ｕ−２５１ＭＧ、ＨＰＡＣ、ＪＩＭＴ−１、Ｕ−２ＯＳ、Ａ−６７３、ＴＣ−７１、ＮＣＩ−Ｈ６５０、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３、ＣＡＳ−１、ＪＬ−１、ＳＫ−ＭＥＬ−１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、イシカワ（Ｉｓｈｉｋａｗａ）（Ｈｅｒａｋｌｉｏ）０２ＥＲ−、ＴＥ６１７．Ｔ、ＳＵ．８６．８６、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ、ＴＴ２６０９−Ｃ０２、ＬＳ１８０、ＹＡＰＣ、ＨＤＱ−Ｐ１、ＫＮＳ−８１、ＦＵ−ＯＶ−１、ＫＰ−２、ＤＭＳ５３、ＳＮＵ−１２７２、デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ）５６２、４２−ＭＧ−ＢＡ、Ｌ３．３、ＣＯＬＯ−６７９、ＮＣＩ−Ｈ２０８７、ＮＣＩ−Ｈ２０３０、ＧＣＴ、ＮＣＩ−Ｈ８８９、Ｃａｏｖ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＮＣＩ−Ｈ５２４、ＭＫＮ１、ＫＣＬ−２２、Ｃａｐａｎ−１、ＣＭＬ−Ｔ１、Ｈ４、ＮＣＩ−Ｈ７２７、Ｈｓ３４３．Ｔ、ＭＨＨ−ＥＳ−１、ＮＭＣ−Ｇ１、ＨＣＣ−１１７１、ＲＥＣ−１、Ｈｓ６１８．Ｔ、Ａ１７２、ＹＤ−１０Ｂ、ＳＷ４８、ＭＵＴＺ−５、Ｔ��−６、ＪＨＨ−１、ＨＣＴ１１６、ＴＥ−４、ＩＡ−ＬＭ、ＭＧ−６３、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、ＴＡＬＬ−１、ＨＣＣ１８０６、ＨＭＣＢ、ＳＣＬＣ−２１Ｈ、ＨＣＣ１５００、ＣＬ−３４、Ｐａｎｃ０５．０４、ＳＷ４０３、ＴＭ−３１、ＨＣＣ１９３７、ＪＭＳＵ−１、ＤＭＳ７９、ＳＮＢ−１９、ＮＣＩ−Ｈ１８３６、Ｌｉ−７、ＨＣＣ８２７、６３９−Ｖ、ＭＯＬＭ−１３、ＳＫ−ＢＲ−３、ＩＭＲ−３２、ＴＵＨＲ１０ＴＫＢ、ＯＡＷ４２、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＴＧＢＣ１１ＴＫＢ、ＮＣＩ−Ｈ１５８１、ＥＦＭ−１９２Ａ、ＹＭＢ−１、ＨＣＣ２９３５、ＥＣＣ１２、ＨＣＣ−３３、ＤＵ１４５、ＮＣＩ−Ｈ１４６、ＳＮＵ−１２１４、ＳＮＵ−１０７７、２３１３２／８７、ＨＴ−１４４、ＳＮＵ−１８２、Ｈｓ８８８．Ｔ、ＳＮＵ−４７５、ＧＣＩＹ、Ｈｓ７２９、ＪＨＯＣ−５、ＳＷ１５７３、ＨＥＣ−６、ＯＣＩ−ＡＭＬ５、Ｈｓ６８８（Ａ）．Ｔ、Ｈｓ８２１．Ｔ、ＰＣＭ６、ＲＴ−１１２、ＳＫ−Ｎ−ＤＺ、ＳＮＵ−４７８、ＳＮＵ−１１９、ＨＣＣ１１４３、ＮＣＩ−Ｈ２０９、８−ＭＧ−ＢＡ、ＣＯＲ−Ｌ１０５、ＣＯＲ−Ｌ９５、ＳＮＵ−４６、ＣＯＶ５０４、ＣＡＬ−１４８、ＳＮＵ−Ｃ５、ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ、ＢＨＴ−１０１、ＷＭ−２６６−４、ＢＦＴＣ−９０５、ＫＹＳＥ−２７０、ＴＥ−８、ＳＮＵ−２１３、Ｕ２−ＯＳ、及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ。
【００２０】
２．ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞を用いたリングアッセイ
一部の実施形態では、ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞を用いて、潜在的な苦味抑制物質に対する細胞の応答を検出する。ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞を試験化合物と接触させる。試験化合物の存在下で苦味受容体のインターナリゼーションは、試験化合物が、潜在的な苦味調節物質であることを示している。苦味調節物質は、食品、飲料、及び医薬品などの様々な消費物に含有させることができる。
【００２１】
一部の実施形態では、ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞を用いて、甘味物質（例えば、それ自体が甘味を引き起こす分子）に対する細胞の応答を検出する。ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞を試験化合物と接触させる。Ｔ１Ｒ２のインターナリゼーションは、試験化合物が、甘味分子であることを示している。甘味分子は、食品、飲料、及び医薬品などの様々な消費物に含有させることができる。
【実施例】
【００２２】
実施例１
Ｔ２Ｒ１４インターナリゼーションのハイコンテントイメージングアッセイ(High-content imaging assay)
細胞培養物、材料。ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞を、１０％ウシ肝臓血清を補充したＲＰＭＩ１６９０中に培養させた。細胞を２０，０００細胞／ウェルの密度で、ＰＤＬコート３８４プレートに接種した。ウサギ抗Ｔ２Ｒ１４抗体及びウサギ抗Ｔ１Ｒ２抗体は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製であった。Ａｌｅｘａ４８８結合抗体及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製であった。
【００２３】
化合物処理。ＰＢＳ＋１０％ＦＢＳ中の２０，０００細胞を、ＨＣＡイメージ化に好適なクリアボトムのＰＤＬコートブラックウォール３８４ウェルプレートに塗布した。Ｔ２Ｒ１４試験のために、化合物を細胞に添加した。全ての化合物の原液は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈し、１０ｍＭで使用した。細胞の対照群は、培地中のＤＭＳＯ（０．１％）も受けた。
【００２４】
リングアッセイ。ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞を、３７℃で表示の時点で、１０ｍＭのＲｅｂＡ（Ｐｕｒｅｃｉｒｃｌｅ）で刺激した。次に、細胞を固定し、苦味受容体Ｔ２Ｒ１４に対する抗体を用いた間接免疫蛍光法のために処理した。画像は全て、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏ自動化顕微鏡を用い、２０×対物レンズで取得した。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色は、擬似カラーの青色であり、抗体特異的染色は、擬似カラーの緑色である。重ねた画像は、バッファーでの処理時の拡散環状染色を示し、ＲｅｂＡでのＮＣＩ−Ｈ７１６細胞の処理によって、「リング」染色が生じた。「リング」陽性細胞は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（核）及びＦＩＴＣ（Ｔ２Ｒ１４）シグナルの画素値についての相関係数により計算した。インターナリゼーションの範囲は、４反復データ点からの連続的「リング」を示す。Ｔ２Ｒ１４受容体の再循環は、「リング」陽性細胞の数の減少と相関する。
【００２５】
統計的分析及びグラフをＴｉｂｃｏ  Ｓｐｏｔｆｉｒｅ又はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて作成した。
【００２６】
リングアッセイでは、Ｔ２Ｒ１４受容体を特異的抗体で染色すると、細胞表面にＴ２Ｒ１４受容体の大部分が観察され、これは、拡散環状染色をもたらした。細胞をＲｅｂＡ又はＲｅｂＣで処理したとき、受容体インターナリゼーション及びＴ２Ｒ１４の輸送が起こり、その結果、「リング」染色が生じた。Ｍｕｌｔｉｗａｖｅｓ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎスコアリング分析アルゴリズム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、ＲｅｂＡ又はＲｅｂＣを用いたＮＣＩ−Ｈ７１６細胞の刺激後にＴ２Ｒ１４インターナリゼーションが増加したことを明らかにした。対照的に、ＲｅｂＤによる処理後にインターナリゼーションは観察されなかった。この実施例は、ハイコンテント細胞アッセイと感覚データとの間の関連を示しており、従って、これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機構に基づく手法を提供し、この手法は、新規の苦味抑制物質を特定するために用いることができる。結果を図２に示す。
【００２７】
実施例２
Ｔ２Ｒ２インターナリゼーションのハイコンテントイメージングアッセイ
本発明者らは、内因的に甘味受容体Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３及びαガストデューシンを発現するヒト腸内分泌細胞株ＮＣＩ−Ｈ７１６に対する甘味化合物の作用を調べた。非処理ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞は、Ｔ１Ｒ２受容体を細胞表面で発現した。Ｄグルコースによる処理は、Ｔ１Ｒ２インターナリゼーションを誘導し、その結果、典型的な「リング」染色が生じた（図３Ａ）。Ｍｕｌｔｉｗａｖｅｓ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅを用いて、甘味物質で処理したＮＣＩ−Ｈ７１６細胞における内在性Ｔ１Ｒ２のインターナリゼーションを定量した。Ｔ１Ｒ２インターナリゼーションは、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、スクロース、スクラロース、アスパルテーム、及びＡｃｅ−Ｋによる処理後、増加したが、サッカリンでの処理後にＴ１Ｒ２インターナリゼーションは観察されなかった（図３Ｂ）。
【００２８】
糖の分子構造と、Ｔ１Ｒ２再循環経路との間に相関が認められた。従って、Ｔ１Ｒ２は、単糖、すなわちＤグルコース及びＤフルクトースによる処理後迅速に細胞に戻って再循環したが、二糖のスクロース及びその類似体スクラロースでは、緩徐なＴ１Ｒ２再循環が観察された（図３Ｂ）。
【００２９】
実施例３
ＧＬＵＴ４インターナリゼーションのハイコンテントイメージングアッセイ
近年、感覚及び動物試験によって、特にサッカリンなどの人工化合物に応答する、甘味に対する別の受容体が存在し得るというエビデンスがもたらされている。本発明者らは、グルコース輸送体ＧＬＵＴ４（Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ＃６５１７）が、ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞でのサッカリンシグナル伝達における、上流分子であり得ると仮定した。ＧＬＵＴ４は、Ｔ１Ｒ３陽性細胞に優先的に発現され、ＧＬＵＴ４インターナリゼーションは、インスリンの非存在下で、グルコース取り込みの調節のための重要な機構である。ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞は、内在性ＧＬＵＴ４を発現し（Ｏｎｃｏｍｉｎｅデータベース）、これが、これらの細胞株において、認められたＣａ（２＋）応答を媒介する可能性がある。
【００３０】
人工甘味料によるシグナル伝達におけるＧＬＵＴ４の役割をさらに探究するために、ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞における内在性ＧＬＵＴ４のインターナリゼーションを試験した。サッカリンでの処理によって、細胞内にＧＬＵＴ４の急速な再分布が起こり、その結果、「リング」染色が生じた（図４Ａ）。「リング」陽性細胞の数の増加として測定したＧＬＵＴ４インターナリゼーションの定量から、ＧＬＵＴ４インターナリゼーションは、Ａｃｅ−Ｋ、アスパルテーム、及びサッカリンによる刺激後に増大したが、天然の糖は、ＧＬＵＴ４インターナリゼーションプロセスを活性化できなかった（図４Ｂ）ことが明らかになった。
【００３１】
以上を考え合わせると、これらの結果は、ＧＬＵＴ４が、人工甘味料の共通の受容体であることを示唆している。サッカリンは、ＧＬＵＴ４のみを介してＣａ（２＋）応答を活性化するが、Ａｃｅ−Ｋ及びアスパルテームは、Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３及びＧＬＵＴ４経路の両方をターゲティングする。
【図２】
2016519313.tif 000003
【図３Ｂ】
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【図４Ｂ】
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【図１】
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【図３Ａ】
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【図４Ａ】
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【国際調査報告】
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