(57)【要約】【課題】本発明は、モノアセチルジアシルグリセロール化合物を有効性分として含有する、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療用薬学的組成物、慢性閉塞性肺疾患の予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。【解決手段】本発明のモノアセチルジアシルグリセロール化合物は、ＥＬ−４細胞でＩＬ−４の発現を抑制し、動物モデルで気管支内炎症細胞浸潤を抑制する。また、本発明の化合物は、ＣＸＣＬ−１、ＴＮＦ−αまたはＭＩＰ−２の発現を抑制する効果が優れているので、現在使用される慢性閉塞性肺疾患治療剤の副作用を克服し、毒性がなく、かつ治療効果が優秀な化合物として慢性閉塞性肺疾患の予防、治療および改善用組成物に有用に用いられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化学式１で表示されるモノアセチルジアシルグリセロール化合物を有効性分として含有する、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療用薬学的組成物。
［化学式１］
2016528278.tif 000016
上記の式において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ炭素数１４ないし２０の脂肪酸基である。
【請求項２】
前記Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、パルミトイル（ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）、オレオイル（ｏｌｅｏｙｌ）、リノレオイル（ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ）、リノレノイル（ｌｉｎｏｌｅｎｏｙｌ）、ステアロイル（ｓｔｅａｒｏｙｌ）、ミリストイル（ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ）、アラキドノイル（ａｒａｃｈｉｄｏｎｏｙｌ）で構成される群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記Ｒ１およびＲ２の組み合わせ（Ｒ１／Ｒ２）は、オレオイル／パルミトイル、パルミトイル／オレオイル、パルミトイル／リノレオイル、パルミトイル／リノレノイル、パルミトイル／アラキドノイル、パルミトイル／ステアロイル、パルミトイル／パルミトイル、オレオイル／ステアロイル、リノレオイル／パルミトイル、リノレオイル／ステアロイル、ステアロイル／リノレオイル、ステアロイル／オレオイル、ミリストイル／リノレオイル、ミリストイル／オレオイルで構成される群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記モノアセチルジアシルグリセロール化合物は下記の化学式２で表示される化合物であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
［化学式２］
2016528278.tif 000017
【請求項５】
前記モノアセチルジアシルグリセロール化合物は鹿茸から分離したことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記慢性閉塞性肺疾患は、慢性気管支炎または肺気腫（Ｅｍｐｈｙｓｅｍａ）であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記モノアセチルジアシルグリセロール化合物は、ＩＬ−４、ＣＸＣＬ−１、ＴＮＦ−αおよびＭＩＰ−２水準からなる群から選択されるいずれか一つ以上の蛋白質の分泌を減少させることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記モノアセチルジアシルグリセロール化合物は、気管支または血管周囲の炎症細胞数を減少させたりＣＤ４＋またはＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ＋Ｇｒ−１＋細胞数を減少させることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物は、化学式１で表示されるモノアセチルジアシルグリセロール化合物を０．００１ないし５０重量％含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
［化学式１］
2016528278.tif 000018
上記の式において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ炭素数１４ないし２０の脂肪酸基である。
【請求項１０】
下記の化学式１で表示されるモノアセチルジアシルグリセロール化合物を有効性分として含有することを特徴とする、慢性閉塞性肺疾患の予防または改善用健康機能食品組成物。
［化学式１］
2016528278.tif 000019
上記の式において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ炭素数１４ないし２０の脂肪酸基である。
【請求項１１】
前記Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、パルミトイル（ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）、オレオイル（ｏｌｅｏｙｌ）、リノレオイル（ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ）、リノレノイル（ｌｉｎｏｌｅｎｏｙｌ）、ステアロイル（ｓｔｅａｒｏｙｌ）、ミリストイル（ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ）、アラキドノイル（ａｒａｃｈｉｄｏｎｏｙｌ）で構成される群から選択されることを特徴とする請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記Ｒ１およびＲ２の組み合わせ（Ｒ１／Ｒ２）は、オレオイル／パルミトイル、パルミトイル／オレオイル、パルミトイル／リノレオイル、パルミトイル／リノレノイル、パルミトイル／アラキドノイル、パルミトイル／ステアロイル、パルミトイル／パルミトイル、オレオイル／ステアロイル、リノレオイル／パルミトイル、リノレオイル／ステアロイル、ステアロイル／リノレオイル、ステアロイル／オレオイル、ミリストイル／リノレオイル、ミリストイル／オレオイルで構成される群から選択されることを特徴とする請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１乃至９のうちいずれか一項に記載の組成物を非人間個体に投与する段階を含むことを特徴とする、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノアセチルジアシルグリセロール化合物を有効性分として含有する慢性閉塞性肺疾患の予防または治療用薬学的組成物、慢性閉塞性肺疾患の予防または改善用健康機能食品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性閉塞性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＣＯＰＤ）は、肺の非正常的な炎症反応で気道が狭くなる肺疾患のうちの一つである。慢性閉塞性肺疾患は、主に有害な粒子やガスの吸入によって発生することになり、特に喫煙が主要原因として知られている。現在、韓国の４０歳以上の慢性閉塞性肺疾患有病率は毎年増加傾向にあり、また、全世界でも慢性閉塞性肺疾患は有病率と死亡率が増加している唯一の疾患であり、２０２０年には世界で３番目の死亡原因となると推定されている。喫煙は肺組織内で強力な刺激物質として作用して、多様な感染症因子、成長因子、酸化物質および化学走性因子の生成を増加させ、炎症性信号伝達体系を活性化して好中球および大食細胞をはじめとする多くの炎症細胞の遊走を促進させて肺の炎症をさらに悪化させることになる。タバコ煙および炎症細胞に由来するメタロプロテアーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）のような蛋白分解酵素が活性化して肺間質組織内構成物を破壊することになる。これは、結局、肺組織の非正常的な変化、例えば気道壁の肥厚、肺繊維化を起こして肺機能を低下させる。したがって、慢性閉塞性肺疾患の予防および治療のために、病気の主要原因である肺の炎症の改善に重点を置いて多様な物質の開発が行われている。そのうち、喘息治療と類似な慢性閉塞性肺疾患の炎症改善のためのステロイド製剤および抗生剤の治療は非常に魅力的な治療方法である。しかし、ステロイド製剤および抗生剤の場合、免疫抑制および免疫寛容などによる多くの副作用が発生する可能性があるため、長期間の治療を必要とする慢性閉塞性肺疾患患者にとっては適さないという制限がある。
【０００３】
ＥＣ−１８はモノアセチルジグリセリド（ｍｏｎｏａｅｔｙｌｄｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）の一種であって、鹿茸から分離した。ＥＣ−１８は造血作用があるものとして知られており、ｃｅｃａｌ−ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｐｕｎｃｔｕｒｅを利用した敗血症動物モデルで伝染症因子の減少とともに動物の生存率を大きく増加させたことが開示されており、ＧＬＰ（Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）毒性試験でも毒性がないことが示された。しかし、このようなＥＣ−１８を含むモノアセチルジアシルグリセロール類化合物が慢性閉塞性肺疾患においていかなる効果を現すかについてはまだ開示されていない。これに本発明者らは、天然物由来あるいは新たな化合物の慢性閉塞性肺疾患の治療剤を開発するために鋭意努力した結果、モノアセチルジアシルグリセロール化合物がＩＬ−４の発現を抑制し、ＣＸＣＬ−１、ＴＮＦ−αまたはＭＩＰ−２の分泌を抑制し、気管支内炎症細胞の浸潤を抑制して慢性閉塞性肺疾患の予防または治療に有用に使用できることを確認し本発明を完成させるに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の一つの目的は、下記化学式１で表示されるモノアセチルジアシルグリセロール化合物を有効性分として含有する、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療用薬学的組成物、および慢性閉塞性肺疾患の予防または改善用健康機能食品組成物を提供することにある。
［化学式１］
2016528278.tif 000002
上記の式において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ炭素数１４ないし２０の脂肪酸基である。
【０００５】
本発明の他の目的は、前記薬学的組成物を慢性閉塞性肺疾患の発症可能性があるか慢性閉塞性肺疾患を患っている個体に投与する段階を含む、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するための一つの様態として、本発明は、下記化学式１で表示されるモノアセチルジアシルグリセロール化合物を有効性分として含有する、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
［化学式１］
2016528278.tif 000003
上記の式において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ炭素数１４ないし２０の脂肪酸基である。本明細書で脂肪酸基は脂肪酸のカルボキシル基から−ＯＨ基を除いた残りの部分を意味する。
【０００７】
具体的に、本発明の慢性閉塞性肺疾患の予防または治療用薬学的組成物は、前記化学式１で表示されるモノアセチルジアシルグリセロール化合物を含むことができる。本発明において、用語“モノアセチルジアシルグリセロール化合物”とは、１つのアセチル基と２つのアシル基を有するグリセロールの誘導体を意味し、モノアセチルジグリセロール（ＭＡＤＧ）ともいう。
【０００８】
前記化学式１で表示されるモノアセチルジアシルグリセロール化合物においてＲ１およびＲ２はそれぞれ炭素数１４ないし２０の脂肪酸基であることもあり、好ましくはパルミトイル（ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）、オレオイル（ｏｌｅｏｙｌ）、リノレオイル（ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ）、リノレノイル（ｌｉｎｏｌｅｎｏｙｌ）、ステアロイル（ｓｔｅａｒｏｙｌ）、ミリストイル（ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ）またはアラキドノイル（ａｒａｃｈｉｄｏｎｏｙｌ）などであることができるが、これらに限定されない。さらに好ましくは、前記Ｒ１およびＲ２の組み合わせ（Ｒ１／Ｒ２）はオレオイル／パルミトイル、パルミトイル／オレオイル、パルミトイル／リノレオイル、パルミトイル／リノレノイル、パルミトイル／アラキドノイル、パルミトイル／ステアロイル、パルミトイル／パルミトイル、オレオイル／ステアロイル、リノレオイル／パルミトイル、リノレオイル／ステアロイル、ステアロイル／リノレオイル、ステアロイル／オレオイル、ミリストイル／リノレオイルまたはミリストイル／オレオイルなどであることができるが、これらに限定されない。また、前記モノアセチルジアシルグリセロール化合物は光学活性において、（Ｒ）−形、（Ｓ）−形またはラセミ体であることができる。
【０００９】
前記モノアセチルジアシルグリセロール化合物は、好ましくは、下記化学式２で表示される化合物であることができる。
［化学式２］
2016528278.tif 000004
上記化学式２で表示される化合物は１−パルミトイル（ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）−２−リノレオイル（ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ）−３−アセチルグリセロール（ａｃｅｔｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）といい、ＥＣ−１８とも命名される。前記化合物のＲ１とＲ２は、それぞれパルミトイルとリノレオイルに該当する。
【００１０】
前記モノアセチルジアシルグリセロール類化合物は、鹿茸から抽出／分離したり、公知の有機合成法（大韓民国特許登録番号１０−０７８９３２３号公報）により製造される。具体的に、 鹿茸をヘキサンで抽出し、その抽出の残余を再びクロロホルムにより抽出した後、収得した抽出液を減圧蒸留して鹿茸のクロロホルム抽出物を収得することができる。前記抽出において使用される抽出溶媒であるヘキサンおよびクロロホルムの量はそれぞれ使用された鹿茸が浸る程度の量であれば十分で、一般的には、鹿茸１ｋｇに対しヘキサンおよびクロロホルムをそれぞれ４〜５リットルの割合で使用されるが、抽出溶媒の種類および使用量は、これに限定されない。このような方法で収得した鹿茸のクロロホルム抽出物が、次いで一連のシリカゲルコラムクロマトグラフィーおよびＴＬＣ方法によりさらに分画化され精製されて、本発明に使用されるモノアセチルジアシルグリセロール類化合物が得られる。前記クロマトグラフィー精製段階の溶離液としてはクロロホルム／メタノール、ヘキサン／酢酸エチル、ヘキサン／酢酸エチル／酢酸などが用いられるが、これに限定されない。
【００１１】
一方、本発明に使用されるモノアセチルジアシルグリセロール類化合物を化学的に合成する方法は、大韓民国特許登録番号１０−０７８９３２３号公報に開示されている。具体的に、（ａ）１−Ｒ１−グリセロールの３番位置に保護基を導入して１−Ｒ１−３−保護基−グリセロールを製造する過程、（ｂ）１−Ｒ１−３−保護基−グリセロールの２番位置にＲ２基を導入して１−Ｒ１−２−Ｒ２−３−保護基−グリセロールを製造する過程および、（ｃ）１−Ｒ１−２−Ｒ２−３−保護基−グリセロールの脱保護反応およびアセチル化反応を同時に実行する過程を含み、必要に応じて精製して、目的とするモノアセチルジアシルグリセロール類化合物を合成でき、他の方法としてはホスファチジルコリンを加酢酸分解（ａｃｅｔｏｌｙｓｉｓ）して得られるが、これに限定されない。前記化学式１の化合物の立体異性体もすべて本発明の範囲内に含まれる。
【００１２】
本発明によってモノアセチルジアシルグリセロール化合物は、ＩＬ−４、ＣＸＣＬ−１、ＴＮＦ−αまたはＭＩＰ−２の分泌の減少が認められることによって、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療に効果的に用いられることが確認された。本発明において、用語“慢性閉塞性肺疾患”とは、有害な粒子やガスの吸入によって肺に非正常的な炎症反応が起こり、これによって漸次気流制限が進行して肺機能が低下し呼吸困難を誘発することになる呼吸器疾患をいう。慢性閉塞性肺疾患の主な症状は、慢性の咳または慢性の痰（喀痰）をはじめとして呼吸困難などがあり、ベータ亢進剤、抗コリン剤、メチルキサンチン類などの気管支拡張剤または副腎皮質ホルモン吸入剤などが代表的な治療剤として使用される。本発明において前記慢性閉塞性肺疾患は、好ましくは慢性気管支炎（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ）または肺気腫（ｅｍｐｈｙｓｅｍａ）であることもあるが、これに制限されない。本発明において、用語“慢性気管支炎（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ）”とは、２年以上連続し、毎年３ヶ月以上痰があり咳が継続する疾患を意味する。喫煙、大気汚染、職業上の露出などの刺激による気管支損傷が原因と推定されており、主な症状としては慢性咳、痰、運動時の息切れなどがある。また、慢性閉塞性肺疾患の特徴である急性増悪があることもあり、この場合は、数時間から数日間の間呼吸困難が急速に悪化して痰の量が増えたり痰の性状が粘液性から化膿性になりながら濃い黄色ややや緑色となり、粘度が高くなって吐きにくくなる。本発明において、用語“肺気腫（ｅｍｐｈｙｓｅｍａ）”とは、終末細気管支（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｅ）末端の空気空間（ａｉｒｓｐａｃｅ）の破壊によって非正常的であり永久的な末梢気道および肺胞の拡張状態を意味する。有害な粒子とガスの吸入によって発生し、臨床的に最も意味のある危険因子は喫煙と知られている。主な症状としては慢性の咳、痰、呼吸困難などである。本発明において、用語“予防”とは、前記組成物の投与で慢性閉塞性肺疾患の発症を抑制または遅延したりするあらゆる行為を意味し、“治療”とは、前記組成物によって慢性閉塞性肺疾患による症状が好転したり有益に変更されるあらゆる行為を意味する。
【００１３】
ＩＬ−４のようなサイトカインは気管支炎症のみならず、気道過敏性と密接な関係があり、気道過敏性は慢性閉塞性肺疾患の代表的な危険因子である（Ｃｈｅｓｔ２００４、１２６（６）、１８３２−９）。したがって、ＩＬ−４発現を抑制させることで、気管支炎症を抑制し気道過敏性を低くして、慢性閉塞性肺疾患の進行を抑制することができる。ＴＮＦ−αのようなサイトカインとＭＩＰ−２のようなＣＸＣケモカインは肺血管循環から肺胞までの好中球のトラフィキング（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）活性に関与することで知られている。これらはいずれも炎症に関連するサイトカインまたはケモカインであって、慢性閉塞性肺疾患の場合、好中球数が増加し、前記サイトカインまたはケモカインが分泌される。したがって、気道に炎症が生じ、筋肉の壁が厚くなり、粘液分泌を増加させて気管支閉塞が現れる。気管支が閉塞されると肺胞は拡張、損傷して酸素と二酸化炭素の交換能力が損傷を受けることになり、呼吸不全発生が高くなることになる。特に、これらサイトカインまたはケモカインはＣＯＰＤを患っている患者からの発現が増加していることが明らかになり、慢性閉塞性肺疾患との関連が知られている。したがって、前記ＩＬ−４、ＣＸＣＬ−１、ＴＮＦ−αおよびＭＩＰ−２からなる群から選択される蛋白質の分泌を抑制させることによって慢性閉塞性肺疾患反応を抑制することができる。
【００１４】
本発明の実施例においては、ｉ）ハツカネズミＴ細胞リンパ腫（ｍｏｕｓｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）細胞であるＥＬ−４細胞でホルボールミリスタートアセタート（ｐｈｏｒｂｏｌ  ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  ａｃｅｔａｔｅ、ＰＭＡ）によって誘導されたＩＬ−４の発現をモノアセチルジアシルグリセロール化合物による阻害度を測定した結果、ＥＣ−１８を含む多数のモノアセチルジアシルグリセロール化合物の有意な阻害活性を確認し（実施例２）、ｉｉ）喘息誘発動物モデルで気管支肺胞洗浄液内のＣＸＣＬ−１、ＴＮＦ−αおよびＭＩＰ−２の発現量を測定した結果、ＣＸＣＬ−１、ＴＮＦ−αおよびＭＩＰ−２いずれもＣＯＰＤ誘発群で正常対照群に比べて大きく増加した反面、モノアセチルジアシルグリセロール類化合物（ＥＣ−１８）の投与群ではこれら因子が有意に減少したことを確認した（実施例６）。これは、前記モノアセチルジアシルグリセロール類化合物が慢性閉塞性肺疾患の治療に有効であることを良く示しているのである。
【００１５】
また、前記モノアセチルジアシルグリセロール類化合物は、気管支周囲の炎症細胞数を減少させたりＣＤ４＋およびＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ Ｇｒ−１＋細胞を減少させることができることが本発明によって確認された。ＣＤ４＋細胞は免疫を促進する細胞として知られており、前記細胞が過度に増加する場合、自己免疫が発生することができる。慢性閉塞性肺疾患患者の場合、正常な人よりＣＤ４＋細胞数が顕著に増加すると知られている（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．７（２００７），ｐｐ．５１２−５２１．）。一方、慢性閉塞性肺疾患の場合、Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ Ｇｒ−１＋細胞数も増加する（Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ２０１１；３８：２８５-２９４．；Ｎｉｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１１，１２：３９）。したがって、前記ＣＤ４＋およびＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ Ｇｒ−１＋細胞を減少させることによって慢性閉塞性肺疾患反応を抑制することができる。
【００１６】
本発明の一実施例においては、トリパンブルー染色を通じて肺組織内の炎症細胞を測定し、免疫蛍光染色および流動細胞分析を通じてＣＤ４＋およびＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ Ｇｒ−１＋細胞を観察した結果、ｉ）ＣＯＰＤ誘発群炎症細胞の数が顕著に増加することが観察された反面、モノアセチルジアシルグリセロール類化合物（ＥＣ−１８）投与群でいずれも、炎症細胞の数が減少したことを確認し（実施例４）、ｉｉ）ＣＯＰＤ誘発群ではＣＤ４＋およびＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ Ｇｒ−１＋細胞数の増加が観察された反面、モノアセチルジアシルグリセロール類化合物（ＥＣ−１８）投与群でいずれもＣＤ４＋およびＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ Ｇｒ−１＋細胞数が顕著に減少したことを確認した（実施例５）。このような結果も前記モノアセチルジアシルグリセロール類化合物が慢性閉塞性肺疾患の治療に有効であることを良く示しているのである。
【００１７】
本発明のモノアセチルジアシルグリセロール化合物を含む薬学的組成物は、薬学的組成物の製造に通常使用する適切な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含むことができる。このとき、前記組成物に含まれるモノアセチルジアシルグリセロール類化合物またはその薬学的に許容可能な塩の含有量は、特に限定されないが、組成物総重量に対して０．０００１ないし１００．０重量％、好ましくは０．００１ないし５０．０重量％、さらに好ましくは０．０１ないし２０重量％を含むことができる。
【００１８】
前記薬学的組成物は錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、油剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤および坐剤からなる群から選択されるいずれか一つの剤形を有することができ、経口または非経口の様々な製剤であることができる。製剤化に際して、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いることができる。経口投与のための固形製剤には錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、一つ以上の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混合して調製することができる。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクなどのような潤滑剤も用いることができる。経口投与のための液状製剤としては懸濁剤、内用液剤、油剤、シロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを含むことができる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤にはプロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが用いることができる。坐剤の基剤にはウィテプソル（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが用いることができる。
【００１９】
本発明の組成物は薬学的に有効な量で投与することができる。本発明において、用語“薬学的に有効な量”とは、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／危険の比率で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量のレベルは個体の種類および重症度、年齢、性別、病気の種類、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素と、その他医学分野によく知られている要素とによって決定できる。本発明の組成物は個別治療剤として投与したり、他の治療剤と併用して投与が可能であり、従来の治療剤とは順次または同時に投与が可能である。そして、単一または多重投与することができる。前記要素いずれもを考慮して副作用なしに最小限の量で最大効果が得られる量を投与するのが重要であり、当業者によって容易に決定可能である。本発明の組成物の望ましい投与量は、患者の状態および体重、病気の程度、薬物形態、投与経路および期間により異なり、適した一日の総使用量は、正しい医学的判断の範囲内で担当医によって決定されるが、一般に０．００１ないし１０００ｍｇ／ｋｇの量、好ましくは０．０５ないし２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１ないし１００ｍｇ／ｋｇの量を一日１回乃至複数回に分けて投与することができる。前記組成物は、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療を目的とする個体であれば特に限定されず、あらゆる個体に適用可能である。例えば、猿、犬、猫、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、牛、羊、豚、ヤギなどのような動物、人間、鳥類および魚類などすべての個体に適用でき、投与の方式は当業系の通常の方法であれば、限りはない。例えば、経口、直腸、または静脈、筋肉、皮下、子宮内頚膜または脳血管内注射によって投与できる。
【００２０】
また一つの様態として、本発明は下記化学式１で表示されるモノアセチルジアシルグリセロール化合物を有効性分として含有する、慢性閉塞性肺疾患の予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。
［化学式１］
2016528278.tif 000005
上記化学式１で表示されるモノアセチルジアシルグリセロール類化合物において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ炭素数１４ないし２０の脂肪酸基であることができるが、これに限定されない。
【００２１】
具体的に、本発明のモノアセチルジアシルグリセロール化合物を慢性閉塞性肺疾患の予防または改善を目的で健康機能食品組成物に含むことができる。前記モノアセチルジアシルグリセロール類化合物および慢性閉塞性肺疾患については前述のとおりである。本発明において、用語“改善”とは、前記組成物を利用して慢性閉塞性肺疾患の疑いおよび発症個体の症状が好転したり有益となるあらゆる行為を意味する。
【００２２】
本発明の組成物が健康機能食品に用いられる場合、前記組成物をそのまま添加したり他の健康機能食品または健康機能食品成分と共に使用することができ、通常の方法により適切に使用することができる。有効成分の混合量は、使用目的により適するように決定される。一般に、食品または飲料の製造時に本発明の組成物は原料に対し、好ましくは１５重量部以下、より好ましくは１０重量部以下の量で添加することができる。しかし、健康調節および衛生を目的とする長期間摂取時の場合には前記量は前記範囲以下であることができ、安定性の面でも問題がないため、有効成分は前記範囲以上の量でも使用することができる。本発明の組成物が含まれる健康機能食品の種類としては、特に制限はなく、具体的な例として、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、茶、ドリンク剤、アルコール飲料およびビタミン複合剤などが挙げられ、通常の意味での健康機能食品を全て含み、動物用飼料として利用される食品を含むことができる。また、本発明の健康機能食品組成物が飲料形態に用いられる場合は、通常の飲料と同様に、色々な甘味剤、香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。前記天然炭水化物とは、ブドウ糖、果糖などのモノサッカライド、マルトース、シュークロスなどのジサッカライド、デキストリン、サイクロデキストリンなどのポリサッカライド、およびキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。前記天然炭水化物の比率は、これに限定されないが、本発明の組成物１００ｍｌ当たり好ましくは、約０．０１ないし０．０４ｇ、より好ましくは０．０２乃至０．０３ｇである。前記甘味剤としては、タウマチン、ステビア抽出物などの天然甘味剤およびサッカリン、アスファルタムなどの合成甘味剤などが挙げられる。前記以外に本発明の健康機能食品組成物は種々の栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使われる炭酸化剤などを含有することができる。その他、天然果物ジュース、果物ジュース飲料および野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。
【００２３】
また一つの様態として、本発明は、前記薬学的組成物を慢性閉塞性肺疾患の疑い個体に投与する段階を含む、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療方法を提供する。本発明において前記慢性閉塞性肺疾患の疑い個体は、慢性閉塞性肺疾患が発症したり発症できる人間を含むすべての動物を意味し、本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む薬学的組成物を慢性閉塞性肺疾患の疑い個体に投与することによって、個体を効率的に治療することができる。慢性閉塞性肺疾患については前述したとおりである。本発明において、用語“投与”とは、いかなる適切な方法で慢性閉塞性肺疾患の疑い個体に本発明の薬学的組成物を導入するのを意味し、投与経路は目的組織に到達できる限り経口または非経口の多様な経路を通じて投与されることができる。
【００２４】
本発明の治療方法は、前記化学式１のモノアセチルジアシルグリセロール類化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む薬学的組成物を薬学的有効量で投与するのを含むことができる。適した１日の総使用量は、正しい医学的判断の範囲内で担当医によって決定され、一般に０．００１ないし１０００ｍｇ／ｋｇの量、好ましくは０．０５ないし２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１ないし１００ｍｇ／ｋｇの量を一日１回乃至複数回に分けて投与することができる。しかし、本発明の目的上、特定患者に対する具体的な治療的有効量は達成しようとする反応の種類と程度、場合によって他の製剤を使用するかどうかをはじめとする具体的組成物、患者の年令、体重、一般的な健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物とともに使用されたり同時に使用される薬物をはじめとする多様な因子と医薬分野によく知られた類似因子によって異なるように適用するのが望ましい。
【発明の効果】
【００２５】
本発明のモノアセチルジアシルグリセロール化合物は、ＥＬ−４細胞でＩＬ−４の発現を抑制し、動物モデルで気管支内炎症細胞の浸潤を抑制する。また、本発明の化合物は、ＣＸＣＬ−１、ＴＮＦ−αまたはＭＩＰ−２の発現を抑制する効果が優れているので、現在使用される慢性閉塞性肺疾患治療剤の副作用を克服し、毒性がなく、かつ治療効果が優秀な化合物として慢性閉塞性肺疾患の予防、治療および改善用組成物として有用に用いられる。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。ただし、これらの実施例は本発明の理解を助けるためのものであって、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２７】
製造例１：標準タバコ抽出物（Ｃｉｇａｒｅｔｔｅ  ｓｍｏｋｉｎｇ；ＣＳ）製造
製造例１−１：実験材料
標準タバコＣＭ７（Ｃｏｒｅｓｔａ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｃｉｇａｒｅｔｔｅ７、Ｈｅｉｎｒ  Ｂｏｒｇｗａｌｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）６０本およびイソプロパノール（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）、エタノール（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ｎ−ヘプタデカン（ｎ−ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｅ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を使用し、実験装備は自動喫煙装置（Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｓｍｏｋｉｎｇ  ｍａｃｈｉｎｅ、ＩＳＯ３３０８規格品、モデル：ＲＭ２０、Ｈｅｉｎｒ  Ｂｏｒｇｗａｌｄｔ）を使用した。
【００２８】
製造例１−２：標準タバコ煙の捕集
標準タバコＣＭ７（Ｃｏｒｅｓｔａ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｃｉｇａｒｅｔｔｅ７、Ｈｅｉｎｒ  Ｂｏｒｇｗａｌｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）煙凝縮物捕集はＩＳＯ３４０２規定に基づいて喫煙室（温度２２±２℃、相対湿度６０±５％）で実施し、ＩＳＯ３３０８規定によりＲＭ２０（Ｈｅｉｎｒ  Ｂｏｒｇｗａｌｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）自動喫煙装置（ＩＳＯ３３０８規格品）を使用して喫煙体積３５．０±０．３ｍｌ、喫煙周期６０±０．５秒、喫煙時間２．００±０．０２秒、そして吸殻の長さはチップペーパー（ｔｉｐ  ｐａｐｅｒ）の長さ＋３ｍｍ（ｏｖｅｒｗｒａｐ＋３ｍｍ）となるようにＩＳＯ標準喫煙方法でシガレットタバコを燃焼させ、９２ｍｍケンブリッジフィルター（ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ｆｉｌｔｅｒ、ＩＳＯ３３０８規格品）でタバコ煙凝縮物を捕集した（ＩＳＯ３３０８、２０００）。
【００２９】
製造例１−３：標準タバコのタバコ煙凝縮物抽出
タバコ煙凝縮物が捕集されたケンブリッジフィルター（ｃａｍｂｅｒｉｄｇｅ  ｆｉｌｔｅｒ）をシガレット用パイプ（ｃｉｇａｒａｔｔｅ  ｈｏｌｄｅｒ）から分離してそれぞれ１００ｍｌ三角フラスコに入れて抽出溶媒イソプロパノール（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）５０ｍｌずつを加えてよく混ぜた後、室温で８時間以上放置して抽出した。抽出後ろ過し、減圧ろ過濃縮器で濃縮し、３つの三角フラスコに入っている濃縮液をシンチレーションバイアル（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｖｉａｌ）に集めて窒素ガスを使用して完全濃縮した。
【００３０】
製造例１−４：総粒子状物質（ＴＰＭ）含有量の計算
標準タバコ主流煙中ＴＰＭの含有量は、下記数式１を利用して求めた。
【数１】
2016528278.tif 000006
ＴＰＭ：総粒子状粉塵物質（ｍｇ／ｃｉｇ）、ＷＦＨＡ：喫煙後のフィルターホルダーの重量、ＷＦＨＢ：喫煙前のフィルターホルダーの重量、Ｎ：一つのトラップ当たり喫煙本数（ｃｉｇ．）
【００３１】
実施例１：ＥＬ−４細胞でモノアセチルジアシルグリセロール化合物の細胞毒性評価
ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）を１０％添加したＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）に、マウスＴリンパ腫細胞であるＥＬ−４細胞を５Ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度に懸濁し、１００ｕｌずつ９６ウォールプレートに接種して１２時間培養した。次に、下記表１に示されているような種類および濃度のモノアセチルジアシルグリセロール化合物（ＭＡＤＧ）で前記培養液を処理した後、２４時間追加培養した。細胞数を数えるＣＣＫ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）キットにおいて説明した通り、ＣＣＫ−８溶液を１０ｕｌずつ添加し、最小３０分から最大４時間反応させた後、５７０ｎｍで吸光度（ＯＤ）を測定した。細胞生存率（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）は下記数式１により計算し、その結果を下記表１に示す。数式１において、陰性対照群はＤＭＳＯを０．２％処理した培養液を示す。下記表１で、ＰＬＡＧは１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ−３−ａｃｅｔｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ＰＯＡＧは１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ−３−ａｃｅｔｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ＰＳＡＧは１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｓｔｅａｒｏｙｌ−３−ａｃｅｔｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ＰＰＡＧは１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−３−ａｃｅｔｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ＯＰＡＧは１−ｏｌｅｏｙｌ−２−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−３−ａｃｅｔｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ＯＳＡＧは１−ｏｌｅｏｙｌ−２−ｓｔｅａｒｏｙｌ−３−ａｃｅｔｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ＬＰＡＧは１−ｌｉｎｏｅｏｙｌ−２−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−３−ａｃｅｔｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ＬＳＡＧは１−ｌｉｎｏｅｏｙｌ−２−ｓｔｅａｒｏｙｌ−３−ａｃｅｔｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌを示す。
【数２】
2016528278.tif 000007
【表１】
2016528278.tif 000008
上記表１に示されているように、本発明のモノアセチルジアシルグリセロール化合物（ＭＡＤＧ）の濃度に応じたＥＬ−４細胞の細胞生存率を観察した結果、ＥＣ−１８は２００μｇ／ｍＬ以下の濃度で細胞毒性が現れなかったし、その他の化合物は２０μｇ／ｍＬ以下の濃度で細胞毒性が現れないことを確認した。
【００３２】
実施例２：モノアセチルジアシルグリセロール化合物のＥＬ−４ ｍＲＮＡの発現抑制
実施例１の結果を土台として、前記モノアセチルジアシルグリセロール化合物を２０μｇ／ｍＬの濃度で投与し、ＥＬ−４細胞でのＰＭＡによるＩＬ−４ ｍＲＮＡの発現抑制効果を測定した。具体的に、ＰＭＡ（１ ｎｇ／ｍＬ）で誘導されたＩＬ−４ ｍＲＮＡの発現量をリアルタイム重合酵素連鎖反応（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ、ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ｑＰＣＲ）を利用して測定した。細胞準備は６ウォールプレートにＥＬ−４細胞を１Ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で分周して１２時間培養した後、モノアセチルジアシルグリセロール化合物を２０μｇ／ｍＬ濃度で１時間処理し、ＰＭＡを１ｎｇ／ｍｌの濃度で処理した後、１２時間培養した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出するために、Ｔｒｉｚｏｌ Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）を用いてリボ核酸（ＲＮＡ）を抽出し、定量後、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ＧｍｂＨ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて相補的核酸（ｃＤＮＡ）を合成した。合成されたｃＤＮＡを鋳型と下記表２に示すＩＬ−４およびＧＡＰＤＨのプライマーをそれぞれ混合し、ＰＣＲ  ｍｉｘ（ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｋｏｒｅａ）を用いて９４℃で５分間変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）し、９５℃で３０秒、６０℃で４５秒、７２℃で４５秒として３０サイクル（ｃｙｃｌｅ）反応させた後、７２℃で１０分間酵素を不活性化させるＰＣＲを行った。このように測定されたＥＬ−４細胞のＩＬ−４ ｍＲＮＡの発現抑制率を下記表３に示した。下記表３で各試料の名称は表１で説明したとおりである。
【表２】
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【表３】
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上記表３に示したように、ＰＭＡを処理した群よりＩＬ−４の発現量が増加し、これを基準（１００％）とするとき、モノアセチルジアシルグリセロール化合物は２０ないし５０％の発現抑制率を示した。
【００３３】
実施例３：閉塞性肺疾患モデルおよび試料投与
ＣＯＰＤハツカネズミモデルは８週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃハツカネズミを７％クロラール水和物（ｃｈｌｏｒａｌ  ｈｙｄｒａｔｅ）で麻酔した後、ＬＰＳ１００μｇ／ｍｌと標準タバコ抽出物（Ｃｉｇａｒｅｔｔｅ  ｓｍｏｋｉｎｇ；ＣＳ）４ｍｇ／ｍｌを１：１に混合した混合物（ＬＰＳ＋ＣＳ混合物）を週１回を３週連続して鼻に１００ｕｌを気管内（ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ）吸入させてＣＯＰＤモデルを作った。つまり、麻酔を少しだけした後、動きがないときにハツカネズミの前歯を輪ゴムで固定した状態でＬＰＳ＋ＣＳ混合物を鼻と口にそれぞれ５０ｕｌずつ（合計１００ｕｌ）を気管内（ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ）に吸入させた。ＥＣ−１８は濃度別に３０ｍｇ／ｋｇと６０ｍｇ／ｋｇを０．５％ＣＭＣ（ｃａｒｂｏｘｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｓｏｄｉｕｍ）に溶かして、ＰＳ＋ＣＳ混合物１００ｕｌを気管内（ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ）吸入１時間前に経口投与した。実験群は、（ｉ）何の処理もしない正常群（Ｉｎｔａｃｔ）、（ｉｉ）ＬＰＳ＋ＣＳ処理した対照群（ＣＯＰＤ−ｃｏｎｔｒｏｌ）、（ｉｉｉ）ＬＰＳ＋ＣＳ処理１時間前にＥＣ−１８を３０ｍｇ／ｋｇ経口投与した実験群、（ｉｖ）ＬＰＳ＋ＣＳ混合物の処理１時間前にＥＣ−１８を６０ｍｇ／ｋｇ経口投与した実験群に分けた。実験終了後、各群はハツカネズミの血液、肺胞洗浄液および肺組織を分離した。
【００３４】
実施例４：気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ  ｆｌｕｉｄ；ＢＡＬＦ）分泌および総細胞数測定
血液採血後解剖して肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）から細胞を分離するためにＦＢＳ−ｆｒｅｅ／ＤＭＥＭ培養液１ｍｌを入れた注射器を気管支（ｔｒａｃｈｅａ）に注入させ、ひもで縛って固定した後、３回循環させて分離してＡＣＫ溶液を３７℃で５分間処理して赤血球を溶解させ、再びＦＢＳ−ｆｒｅｅ／ＤＭＥＭ培養液で洗浄した後、０．０４％トリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）で染めた後総細胞数を測定し、その結果を下記表４に示す。
【表４】
2016528278.tif 000011
その結果、上記表４のように、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）において肺の炎症は主な重要な特徴で、炎症細胞の中で好中球数の増加が観察された。ＣＯＰＤ誘発群は正常対照群に比べて気管支肺胞洗浄液内総炎症細胞数の増加が観察され、また、炎症細胞の中で好中球数が顕著に増加した。反面、薬物投与群であるＥＣ−１８ ３０ｍｇ／ｋｇ投与群では総炎症細胞数が１５．１％抑制され、好中球数は大きい変化が観察されなかった。ＥＣ−１８ ６０ｍｇ／ｋｇ投与群では総炎症細胞が４４．８％（Ｐ<０．０５）抑制され、好中球数も４２％（Ｐ<０．０５）抑制された。
【００３５】
実施例５：流動細胞分析を通じたＣＤ４±およびＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ Ｇｒ−１±細胞数測定
分離したＢＡＬ細胞を５×１０５細胞に調整した後、４℃で免疫蛍光染色（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を実施した。それぞれにＰＥ−ａｎｔｉ−ＣＤ４（５５３０４７、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびＰＥ−ａｎｔｉ−Ｇｒ−１（５５３１２８、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を入れて３０分氷上で反応させた。反応後、３回以上リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、流動細胞分析器（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）のＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔプログラム（６４３２７４、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＣＤ４＋そしてＧｒ−１＋Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ＋細胞頻度を百分率（％）に分析した後、総細胞数（ｔｏｔａｌ  ｃｅｌｌｓ）を適用して各組織での絶対総細胞数（ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｎｕｍｂｅｒ）を算出した。
【表５】
2016528278.tif 000012
その結果、上記表５のように、ＣＯＰＤ誘発群はＣＤ４＋およびＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ＋Ｇｒ−１＋細胞数が正常対照群に比べていずれも大きく増加した。反面、ＥＣ−１８  ３０ｍｇ／ｋｇ投与群ではＣＯＰＤ誘発群に比べてＣＤ４＋細胞数が３９．６％、Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ＋Ｇｒ−１＋細胞数が４０．９％（Ｐ<０．０５）抑制され、６０ｍｇ／ｋｇ投与群ではＣＤ４＋細胞数が７０．０％、Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ＋Ｇｒ−１＋細胞数が６２．７％（Ｐ<０．０５）抑制された。
【００３６】
実施例６：ＥＬＩＳＡ法による肺胞洗浄液内のＣＸＣＬ−１、ＴＮＦ−αおよびＭＩＰ−２の発現量測定
ハツカネズミから分離した肺胞洗浄液でＣＸＣＬ−１、ＴＮＦ−αおよびＭＩＰ−２水準をＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏ−ｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）で測定した。ＣＸＣＬ−１、ＴＮＦ−αおよびＭＩＰ−２の各抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）をコーティング（ｃｏａｔｉｎｇ）用緩衝溶液（２９１１９５、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）で希釈してマイクロウェル（ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ）にコーティング（ｃｏａｔｉｎｇ）した後、４℃で一晩放置した。各ウェル（ｗｅｌｌ）を洗浄緩衝溶液で３回洗浄した後に血清（１０倍稀釈）を１００ｕｌずつ分注した。室温で１時間放置した後、洗浄緩衝溶液で２回洗浄した後、ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｖｉｄｉｎ  ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇｅｔｅｄ（ＤＹ９９８、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）１００ｕｌを処理し、室温で１時間放置した後、再び洗浄した。ＴＭＢ基質を１００ｕｌずつ分注し暗室で３０分間放置した後、５０ｕｌのｓｔｏｐ溶液を処理した後ＥＬＩＳＡ  ｒｅａｄｅｒ（Ｅｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）４５０ｎｍで吸光度を測定し、発現抑制率を計算した結果を下記表６に示す。
【表６】
2016528278.tif 000013
上記表６に示されているように、ＣＯＰＤ誘発群は気管支肺胞洗浄液内ＣＸＣＬ−１の生成が正常対照群に比べて顕著に増加した。しかし、薬物投与群であるＥＣ−１８投与群はＣＯＰＤ誘発群に比べて、３０ｍｇ／ｋｇ投与群では１５．４％、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では５４．３％（Ｐ<０．０１）抑制された。
【表７】
2016528278.tif 000014
また、上記表７に示されているように、ＣＯＰＤ誘発群は気管支肺胞洗浄液内ＴＮＦ−αの生成が正常対照群に比べて顕著に増加した。しかし、薬物投与群であるＥＣ−１８投与群はＣＯＰＤ誘発群に比べて、３０ｍｇ／ｋｇ投与群では３６．０％、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では６１．８％（Ｐ<０．０５）抑制された。
【表８】
2016528278.tif 000015
また、上記表８に示されているように、ＣＯＰＤ誘発群は気管支肺胞洗浄液内ＭＩＰ−２の生成が正常対照群に比べて顕著に増加した。しかし、薬物投与群であるＥＣ−１８投与群はＣＯＰＤ誘発群に比べて、３０ｍｇ／ｋｇ投与群では４０．６％、６０ｍｇ／ｋｇ投与群では６３．８％（Ｐ<０．０５）抑制された。
【００３７】
以上の説明から、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者は本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施され得ることを理解できるものであろう。したがって、以上で記述した実施形態はすべての面で例示的なものであり、限定的ではないものとして理解しなければならない。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは後述する特許請求の範囲の意味および範囲そしてその均等概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれると解釈されなければならない。
【国際調査報告】
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