(57)【要約】本発明は、ＣＤＣ７を阻害し、したがってがん治療において有用で有り得る、イソインドリノン化合物、または薬学的に許容可能なその塩を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、または薬学的に許容可能なその塩もしくは水和物である、化合物。
【請求項２】
３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体２、または薬学的に許容可能なその塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体２である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体１、または薬学的に許容可能なその塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体１である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、またはその水和物である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
２θ±０．２において、２２．２７ならびに１３．４６、１６．５４、１６．６６、１８．１０および２３．１３の１つまたは複数で生じる特性ピークを有する粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶形態である、請求項７に記載の水和物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物または塩、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の有効量の化合物または塩を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、がんを治療する方法。
【請求項１１】
前記がんは、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、卵巣がん、肺がん、大腸がん、血液がん、および白血病からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記がんは、大腸がんである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
療法における使用のための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物または塩。
【請求項１４】
がんの治療における使用のための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物または塩。
【請求項１５】
前記がんは、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、卵巣がん、肺がん、大腸がん、血液がん、および白血病からなる群から選択される、請求項１４に記載の使用のための化合物または塩。
【請求項１６】
前記がんは、大腸がんである、請求項１５に記載の使用のための化合物または塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤＣ７を阻害しかつがん治療に有用であり得る、イソインドリノン化合物、または薬学的に許容可能なその塩に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤＣ７は、ＤＮＡ複製の開始およびＳ期細胞周期チェックポイントの制御において重要な役割を果たすセリン／トレオニンキナーゼである。ＣＤＣ７の上方制御は、非常に多くの腫瘍細胞株において観察されている。また、こうした細胞株におけるＣＤＣ７の阻害は、細胞周期停止をもたらしている。したがって、ＣＤＣ７阻害は、がん療法に有用であり得る。
【０００３】
ＣＤＣ７阻害剤は、当技術分野において既知である。イソインドリノン化合物も、当技術分野において既知である。特許文献１は、ニコチン性アセチルコリン受容体反応性化合物としてある種のイソインドリノン化合物を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００５／１００３５１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
がんの治療のための代替的なＣＤＣ７阻害剤を提供する必要性は依然として存在する。したがって、本発明は、がん治療に有用であり得るＣＤＣ７の阻害剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、または薬学的に許容可能なその塩である化合物を提供する。
【０００７】
本発明は、３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体２、または薬学的に許容可能なその塩である化合物を提供する。
【０００８】
本発明は、３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体１、または薬学的に許容可能なその塩である化合物を提供する。
【０００９】
特定の一実施形態として、本発明は、３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オンである化合物を提供する。別の特定の実施形態として、本発明は、３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体２である化合物を提供する。さらなる特定の実施形態として、本発明は、３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体１である化合物を提供する。
【００１０】
本発明は、３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、または薬学的に許容可能なその塩、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。本発明は、３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。本発明は、３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体２、または薬学的に許容可能なその塩、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物も提供する。本発明はさらに、３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体２、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。本発明は、３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体１、または薬学的に許容可能なその塩、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物も提供する。本発明はさらに、３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体１、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
本発明は、それを必要とする患者に有効量の３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、または薬学的に許容可能なその塩を投与することを含むがん治療のための方法を提供する。本発明は、それを必要とする患者に有効量の３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オンを投与することを含むがん治療のための方法を提供する。本発明は、それを必要とする患者に有効量の３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体２、または薬学的に許容可能なその塩を投与することを含むがん治療のための方法も提供する。本発明はさらに、それを必要とする患者に有効量の３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体２を投与することを含むがん治療のための方法を提供する。本発明は、それを必要とする患者に有効量の３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体１、または薬学的に許容可能なその塩を投与することを含むがん治療のための方法も提供する。本発明はさらに、それを必要とする患者に有効量の３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体１を投与することを含むがん治療のための方法を提供する。
【００１２】
本発明は、療法において使用するための３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、または薬学的に許容可能なその塩を提供する。本発明は、がんの治療において使用するための３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、または薬学的に許容可能なその塩を提供する。本発明は、医薬組成物が３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、または薬学的に許容可能なその塩を含む、がん治療において使用するための医薬組成物を提供する。
【００１３】
本発明は、療法において使用するための３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オンを提供する。本発明は、がんの治療において使用するための３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オンを提供する。本発明は、医薬組成物が３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オンを含む、がん治療において使用するための医薬組成物を提供する。
【００１４】
本発明は、療法において使用するための３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体２、または薬学的に許容可能なその塩を提供する。本発明は、がんの治療において使用するための３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体２、または薬学的に許容可能なその塩を提供する。本発明は、医薬組成物が３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体２、または薬学的に許容可能なその塩を含む、がん治療において使用するための医薬組成物を提供する。
【００１５】
本発明は、療法において使用するための３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体２を提供する。本発明は、がんの治療において使用するための３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体２を提供する。本発明は、医薬組成物が３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体２を含む、がん治療において使用するための医薬組成物を提供する。
【００１６】
本発明は、療法において使用するための３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体１、または薬学的に許容可能なその塩を提供する。本発明は、がんの治療において使用するための３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体１、または薬学的に許容可能なその塩を提供する。本発明は、医薬組成物が３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体１、または薬学的に許容可能なその塩を含む、がん治療において使用するための医薬組成物を提供する。
【００１７】
本発明は、療法において使用するための３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体１を提供する。本発明は、がんの治療において使用するための３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体１を提供する。本発明は、医薬組成物が３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体１を含む、がん治療において使用するための医薬組成物を提供する。
【００１８】
本発明は、がんの治療のための薬物の製造における、３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、または薬学的に許容可能なその塩の使用を提供する。本発明は、がんの治療のための薬物の製造における３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オンの使用も提供する。
【００１９】
本発明は、がんの治療のための薬物の製造における、３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体２、または薬学的に許容可能なその塩の使用を提供する。本発明は、がんの治療のための薬物の製造における３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体２の使用も提供する。
【００２０】
本発明は、がんの治療のための薬物の製造における、３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体１、または薬学的に許容可能なその塩の使用を提供する。本発明は、がんの治療のための薬物の製造における３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体１の使用も提供する。
【００２１】
本発明は、３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体２、結晶形態の水和物を提供する。本発明は、２θ±０．２において２２．２７ならびに１３．４６、１６．５４、１６．６６、１８．１０および２３．１３の１つまたは複数で生じる特性ピークを有する粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体２、結晶形態の水和物も提供する。
【００２２】
本発明は、あるいは（３Ｒ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、または薬学的に許容可能なその塩として特定される、３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体２、または薬学的に許容可能なその塩である化合物を提供する。
【００２３】
本発明は、あるいは（３Ｓ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、または薬学的に許容可能なその塩として特定される、３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体１、または薬学的に許容可能なその塩である化合物を提供する。
【００２４】
特定の一実施形態として、本発明は、（３Ｒ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オンである化合物を提供する。さらなる特定の一実施形態として、本発明は、（３Ｓ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オンである化合物を提供する。
【００２５】
本発明は、（３Ｒ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、または薬学的に許容可能なその塩、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物も提供する。本発明はさらに、（３Ｒ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。本発明は、（３Ｓ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、または薬学的に許容可能なその塩、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物も提供する。本発明はさらに、（３Ｓ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００２６】
本発明は、療法において使用するための（３Ｒ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、または薬学的に許容可能なその塩を提供する。本発明は、がんの治療において使用するための（３Ｒ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、または薬学的に許容可能なその塩を提供する。本発明は、医薬組成物が（３Ｒ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、または薬学的に許容可能なその塩を含む、がん治療において使用するための医薬組成物を提供する。
【００２７】
本発明は、療法において使用するための（３Ｒ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オンを提供する。本発明は、がんの治療において使用するための（３Ｒ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オンを提供する。本発明は、医薬組成物が（３Ｒ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オンを含む、がん治療において使用するための医薬組成物を提供する。
【００２８】
本発明は、療法において使用するための（３Ｓ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、または薬学的に許容可能なその塩を提供する。本発明は、がんの治療において使用するための（３Ｓ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、または薬学的に許容可能なその塩を提供する。本発明は、医薬組成物が（３Ｓ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、または薬学的に許容可能なその塩を含む、がん治療において使用するための医薬組成物を提供する。
【００２９】
本発明は、療法において使用するための（３Ｓ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オンを提供する。本発明は、がんの治療において使用するための（３Ｓ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オンを提供する。本発明は、医薬組成物が（３Ｓ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オンを含む、がん治療において使用するための医薬組成物を提供する。
【００３０】
本発明は、がんの治療のための薬物の製造における、（３Ｒ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、または薬学的に許容可能なその塩の使用を提供する。本発明は、がんの治療のための薬物の製造における（３Ｒ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オンの使用も提供する。
【００３１】
本発明は、がんの治療のための薬物の製造における、（３Ｓ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、または薬学的に許容可能なその塩の使用を提供する。本発明は、がんの治療のための薬物の製造における（３Ｓ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オンの使用も提供する。
【００３２】
本発明は、（３Ｒ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、結晶形態の水和物を提供する。本発明は、２θ±０．２において、２２．２７ならびに１３．４６、１６．５４、１６．６６、１８．１０および２３．１３の１つまたは複数で生じる特性ピークを有する粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる（３Ｒ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、結晶形態の水和物も提供する。
【００３３】
さらには、本発明は、がんが、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、卵巣がん、肺がん、大腸がん、血液がん、および白血病からなる群から選択される、本明細書に述べるような方法および使用の好ましい実施形態を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
上記で用いたように、および本発明の記述全体にわたって、以下の語は、別段の指示がない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。
【００３５】
「薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤」は、哺乳動物、例えば、ヒトへの生物学的活性薬剤の送達のために当技術分野において一般に認められた媒体である。
【００３６】
「薬学的に許容可能な塩」は、比較的非毒性の、本発明の化合物の無機および有機の塩を指す。
【００３７】
「有効量」は、研究者、獣医師、医師または他の臨床医によって求められている組織、器官、動物、哺乳動物またはヒトへの生物学的もしくは医学的反応または所望の治療効果を誘発するであろう、本発明の化合物、または薬学的に許容可能なその塩、あるいは本発明の化合物、または薬学的に許容可能なその塩を含有する医薬組成物の量を意味する。
【００３８】
「治療」、「治療する」、「治療すること」および同類の語は、障害の進行を遅らせるまたは逆転させることを含むことが意図される。これらの語は、たとえ障害または状態が実際に解消されないおよび障害または状態の進行自体が遅くならないもしくは逆転しないとしても、障害の１種または複数の症状あるいは状態を軽減する、改善する、弱める、解消する、または減少することも含む。
【００３９】
本発明の化合物は、例えば、いくつかの無機酸および有機酸と、反応して薬学的に許容可能な塩を形成する能力がある。こうした薬学的に許容可能な塩およびそれらを調製するための一般的な方法論は、当技術分野においてよく知られている。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌら、ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，  ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＵＳＥ、（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００２）、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、６６巻、Ｎｏ．１、１９７７年１月を参照されたい。
【００４０】
本発明の化合物は、好ましくは薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を用いて医薬組成物として配合されて種々の経路によって投与される。好ましくは、こうした組成物は、経口投与用である。こうした医薬組成物およびそれらを調製するためのプロセスは、当技術分野においてよく知られている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら、編、第２１版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、２００５）を参照されたい。
【００４１】
実際に投与される本発明の化合物の量は、治療される状態、選択された投与の経路、投与された実際の化合物または本発明の化合物、個々の患者の年齢、体重および反応、ならびに患者の症状の重症度を含めた、関連する状況の下で内科医によって決定されるであろう。１日当たりの用量は、通常は約１から約１０００ｍｇの範囲に入る。場合によっては、前述の範囲の下限を下回る用量レベルが、適量よりも多い可能性があるが、それでも他の場合においてはより多い投与量を用いてよい。用量レベルは、当業者によって決定され得る。
【００４２】
本発明の化合物、または薬学的に許容可能なその塩は、当技術分野において既知の種々の手順ならびに下記の調製および実施例に記載されている手順によって調製され得る。記載された経路のそれぞれのための具体的な合成ステップは、本発明の化合物、または薬学的に許容可能なその塩を調製するために異なる方法において組み合わせてよい。
【００４３】
試薬および出発原料は、一般には当業者にとって容易に入手可能である。他は、有機化学および複素環化学の標準技術、当業者に既知の技術、ならびに任意の新規の手順を含めた下記の実施例に記載されている手順によって作成され得る。以下の調製および実施例は、本発明をさらに例示する。本明細書に例示される化合物は、Ｓｙｍｙｘ  Ｄｒａｗ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．２、Ｓｙｍｙｘ  Ｄｒａｗ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０、またはＩＵＰＡＣＮＡＭＥ  ＡＣＤＬＡＢＳを用いて命名および番号付けされる。
【００４４】
個々の異性体、鏡像異性体、またはジアステレオ異性体は、化合物の合成における任意の都合のよい時点で選択的結晶化技術またはキラルクロマトグラフィーなどの方法によって当業者によって分離または分析され得る（例えば、Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ，ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｊ．Ｊａｃｑｕｅｓら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９８１年）を参照されたい）。名称「異性体１」は、キラルクロマトグラフィーから最初に溶離する化合物を指す。名称「異性体２」は、キラルクロマトグラフィーから２番目に溶離する化合物を指す。
【００４５】
本明細書で使用する場合、以下の語は示される意味を有する：「ＡＤＰ」は、アデノシン二リン酸を指し、「ＡＴＰ」は、アデノシン三リン酸を指し、「Ｂａｌｂ／ｃ」は、アルビノを指し、「ＢＣＡ」は、ビシンコニン酸を指し、「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドを指し、「ＤＴＴ」は、ジチオスレイトールを指し、「ＥＤＴＡ」は、エチレンジアミン四酢酸を指し、「ｅｅ」は、鏡像体過剰率を指し、「Ｅｘ」は、実施例を指し、「ＦＢＳ」は、ウシ胎児血清を指し、「ＦＰ」は、蛍光偏光を指し、「ＧＡＰＤＨ」は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを指し、「ＨＥＣ」は、ヒドロキシエチルセルロースを指し、「ＨＥＰＥＳ」は、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸を指し、「ｈｒ」は、時間（単数または複数）を指し、「ＩＣ５０」は、その薬剤について可能な最大阻害反応の５０％を生じる薬剤の濃度を指し、「ＩＶＴＩ」は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの標的阻害を指し、「ＭＣＭ２」は、ミニ染色体維持タンパク質（ｍｉｎｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を指し、「ｍｉｎ」は、分（単数または複数）を指し、「ＰＢＳ」は、リン酸緩衝食塩水を指し、「Ｐ．Ｏ．」は、経口投与を指し、「Ｐｒｅｐ」は、調製を指し、「ＰＶＤＦ」は、二フッ化ポリビニルイジン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｉｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）を指し、「ＲＰＭＩ」は、ロズウェルパーク記念研究所を指し、「ＲＮａｓｅ」は、リボヌクレアーゼを指し、「ＲｕＰｈｏｓ」は、２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’，６’−ジイソプロポキシビフェニルを指し、「Ｒｔ」は、保持時間を指し、「ＳＤＳ−Ｐａｇｅ」は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を指し、「ＳＣＸ」は、強陽イオン交換を指し、「ＳＦＣ」は、超臨界流体クロマトグラフィーを指し、および「ＴＨＦ」は、テトラヒドロフランを指す。
【実施例】
【００４６】
調製１
５−ブロモ−２−ヨード安息香酸メチル
【化１】
2016512498.tif 000002
【００４７】
５−ブロモ−２−ヨード安息香酸（１９９８ｇ、６．１１ｍｏｌ）を、メタノール（１３Ｌ）中硫酸（１００ｍＬ）の２０℃溶液に一部ずつ加える。懸濁液を加熱して２４時間還流させ、次いで２０℃に冷却して減圧下で溶媒を除去する。残留物をメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルと氷水との１：１混合物（２０Ｌ）に注いで相を分離する。水相をメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１．５Ｌ）で抽出し、有機相を組み合わせて０．２Ｍ  ＮａＯＨ水溶液（５Ｌ）で洗い、塩化ナトリウム飽和水溶液で洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過して、減圧下で蒸発させる。粗製生成物を４０〜４５℃の石油エーテル（１０Ｌ）に溶解し、珪藻土のパッドを通してろ過して減圧下で蒸発させる。残留物を石油エーテル（５Ｌ）に溶解して−５０℃に冷却し、第１の収穫物固体をろ過し、固体を氷冷石油エーテルで洗う。母液を蒸発させ、固体を石油エーテル（１Ｌ）に再溶解し、−５０℃に冷却して、第２の収穫物をろ過する。第１および第２の収穫物を組み合わせ開放空気中で乾燥させて標記化合物を黄色固体として与える（１８８０ｇ、９０％）。
【００４８】
調製２
５−ブロモ−２−エチル安息香酸メチル
【化２】
2016512498.tif 000003
【００４９】
ジエチル亜鉛（３０５０ｍＬ、３．０５ｍｏｌ、１Ｍヘキサン）を、３時間掛けて５−ブロモ−２−ヨード安息香酸メチル（１８７６ｇ、５．５０ｍｏｌ）および（１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン）パラジウム（ＩＩ）塩化物（４０ｇ、０．０５ｍｏｌ）の５℃溶液に加える。混合物を２時間掛けて６０〜６５℃に加熱してさらに２時間撹拌し、次いで１０〜１５℃に冷却して氷冷１Ｍ  ＨＣｌ水溶液（１０Ｌ）に注ぎ入れる。相を分離し、水層をメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２×１０Ｌ）で抽出して、有機相を組み合わせ、塩化ナトリウム飽和水溶液で洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過して、減圧下で蒸発させる。酢酸エチル（４００ｍＬ）に溶解して石油エーテル（８Ｌ）を加え、次いで１５〜２０℃で１６時間静置してシリカゲルのパッドを通してろ過し、酢酸エチル／石油エーテル（１：２０、８Ｌ）で洗い減圧下でろ液を蒸発させて標記化合物を淡黄色油として与える（１３０６ｇ、９６％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｅ：（７９Ｂｒ／８１Ｂｒ）  ２４３／２４５  （Ｍ＋Ｈ）。
【００５０】
調製３
５−ブロモ−２−（１−ブロモエチル）安息香酸メチル
【化３】
2016512498.tif 000004
【００５１】
Ｎ−ブロモスクシンイミド（１０９０ｇ、６．１２ｍｏｌ）および２，２’−アゾ−ビス−イソブチロニトリル（１１．４ｇ、０．０６９ｍｏｌ）を、四塩化炭素（７Ｌ）中５−ブロモ−２−エチル安息香酸メチル（１２９６ｇ、５．３３ｍｏｌ）の２０℃溶液に加える。加熱して４時間還流させ、２０〜３０℃に冷却して水（１０Ｌ）で洗い、水相をジクロロメタン（５Ｌ）で抽出し、有機層を組み合わせて、水（１０Ｌ）、Ｎａ２ＳＯ３（５Ｌ）および塩化ナトリウム飽和水溶液で洗う。硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、減圧下で蒸発させて標記化合物を淡黄色固体として与える（１７９１ｇ、１０４％粗製）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ：２４１  （Ｍ−ＨＢｒ）。
【００５２】
調製４
６−ブロモ−２−［（１Ｒ）−１−（４−メトキシフェニル）エチル］−３−メチル−イソインドリン−１−オン
【化４】
2016512498.tif 000005
【００５３】
固体５−ブロモ−２−（１−ブロモエチル）安息香酸メチル（１７２４ｇ、５．３５ｍｏｌ）を、市販の（Ｒ）−１−（４−メトキシフェニル）エタンアミン（ＢｅＰｈａｒｍ、ＷＺＧ１１１２１９−０７１、９７４ｇ、６．４４ｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１７１０ｍＬ、１２．２６ｍｏｌ）のメタノール溶液（１２Ｌ）に加える。混合物を６７℃で１０時間加熱し次いで減圧下で蒸発乾固する。残留物を酢酸エチル（５Ｌ）および１Ｎ  ＨＣｌ水溶液（１０Ｌ）で分配させ、相を分離し、有機相を再び１Ｎ  ＨＣｌ水溶液（５Ｌ）、飽和炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム飽和水溶液で洗い、次いで硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過して、減圧下で蒸発させる。暗赤色油をメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（７５０ｍＬ）に溶解して勢いよく撹拌しながら石油エーテル（３Ｌ）を加える。固体をろ過し、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル／石油エーテル（１：８）、石油エーテルで洗い、開放空気中で乾燥して標記化合物を灰白色固体として与える（１０１４ｇ、５２％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ：３６０  （Ｍ＋Ｈ）。
【００５４】
調製５
２−［（１Ｒ）−１−（４−メトキシフェニル）エチル］−３−メチル−６−（１−テトラヒドロピラン−２−イルピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン
【化５】
2016512498.tif 000006
【００５５】
６−ブロモ−２−［（１Ｒ）−１−（４−メトキシフェニル）エチル］−３−メチル−イソインドリン−１−オン（６４ｇ、１７７ｍｍｏｌ）、１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール（６７ｇ、２９５ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（７０ｇ、５０６ｍｍｏｌ）、（１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン）パラジウム（ＩＩ）塩化物（９ｇ、１１ｍｍｏｌ）、ジオキサン（８００ｍＬ）、および水（２１２ｍＬ）を窒素下で組み合わせて７０〜７５℃に１６時間加熱する。１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール（１５ｇ、５４ｍｍｏｌ）を加えて８０〜８５℃に２時間加熱する。減圧下で２００ｍＬに濃縮し、酢酸エチル（５００ｍＬ）および水（５００ｍＬ）を加え、３０分間撹拌して、固体をろ過する。固体と有機層を組み合わせて減圧下で蒸発させる。残留物をジクロロメタンに溶解してシリカゲルのパッドを通してろ過する。シリカゲルパッドをジクロロメタン／酢酸エチル（１：０）および次いで（２：１）で洗って減圧下で蒸発乾固する。固体を石油エーテル／酢酸エチルの２：１混合物（６００ｍＬ）に２５〜３０℃で３０分間懸濁させろ過して固体を回収し標記化合物を灰白色固体として与える（６８ｇ、８９％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ：４３２  （Ｍ＋Ｈ）。
【００５６】
調製６
３−（６−クロロ−５−フルオロ−ピリミジン−４−イル）−２−［（１Ｒ）−１−（４−メトキシフェニル）エチル］−３−メチル−６−（１−テトラヒドロピラン−２−イルピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン
【化６】
2016512498.tif 000007
【００５７】
ナトリウムビス（トリメチルシリル）アミド（２１０ｍＬ、２１０ｍｍｏｌ、１Ｍ  ＴＨＦ）を、テトラヒドロフラン（６２０ｍＬ）中２−［（１Ｒ）−１−（４−メトキシフェニル）エチル］−３−メチル−６−（１−テトラヒドロピラン−２−イルピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン（６２ｇ、１４４ｍｍｏｌ）および４，６−ジクロロ−５−フルオロピリミジン（３１ｇ、１８６ｍｍｏｌ）の氷冷懸濁液に６０分掛けて滴下して加える。溶液を０℃で６０分撹拌し次いで混合物を酢酸エチル（１Ｌ）および水（１Ｌ）で希釈する。有機相を塩化ナトリウム飽和水溶液で洗って減圧下で蒸発させる。残留物を１：１の石油エーテル／酢酸エチルに溶解し、シリカゲルのパッドを通してろ過し、蒸発させて標記化合物を黄色泡沫として与える（８３ｇ、１０３％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ：５６２  （Ｍ＋Ｈ）。
【００５８】
調製７
３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−２−［（１Ｒ）−１−（４−メトキシフェニル）エチル］−３−メチル−６−（１−テトラヒドロピラン−２−イルピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン
【化７】
2016512498.tif 000008
【００５９】
トリエチルアミン（４０ｍＬ、２８７ｍｍｏｌ）および２０％水酸化パラジウム炭素（１４ｇ）を、３−（６−クロロ−５−フルオロ−ピリミジン−４−イル）−２−［（１Ｒ）−１−（４−メトキシフェニル）エチル］−３−メチル−６−（１−テトラヒドロピラン−２−イルピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン（８０ｇ、１４２ｍｍｏｌ）の酢酸エチル（２．１Ｌ）溶液に加えて水素気体（３０ｐｓｉ）で２０〜２５℃で１６時間水素化する。５グラムの３−（６−クロロ−５−フルオロ−ピリミジン−４−イル）−２−［（１Ｒ）−１−（４−メトキシフェニル）エチル］−３−メチル−６−（１−テトラヒドロピラン−２−イルピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オンで反応条件を繰り返す。両方の反応を組み合わせて珪藻土を通してろ過し蒸発させて標記化合物を黄色泡沫として与える（７７ｇ、１０２％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ：５２８（Ｍ＋Ｈ）。
【００６０】
調製８
６−ブロモ−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−２−［（１Ｒ）−１−（４−メトキシフェニル）エチル］−３−メチル−イソインドリン−１−オン
【化８】
2016512498.tif 000009
【００６１】
６−ブロモ−２−［（１Ｒ）−１−（４−メトキシフェニル）エチル］−３−メチル−イソインドリン−１−オン（２．８１４ｍｍｏｌ、１．０１４ｇ）を、テトラヒドロフラン（２８ｍＬ）に溶解する。４−クロロ−５−フルオロ−ピリミジン（５．６２８ｍｍｏｌ、５１８μＬ）を加えて０℃に冷却する。カリウムヘキサメチルジシラジド（トルエン中４．５０２ｍｍｏｌ、９ｍＬ、０．５Ｍ）を７分掛けて加えて１時間撹拌し、次いで周囲温度に温めて９０分間撹拌する。メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルおよび１Ｍ  ＨＣｌ水溶液中に注ぎ、水を加えて層を分離する。１Ｎ  ＨＣｌ水溶液で洗い、ろ過し、塩化ナトリウム飽和水溶液で洗い、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、２ｃｍのシリカゲルのパッドを通してろ過して、減圧下で蒸発させて油を与える。シリカゲル上で２０〜４０％の酢酸エチル／ヘキサンを用いて精製して標記化合物を泡沫として与える（５４７ｍｇ、４３％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ：４５６（Ｍ＋Ｈ）。
【００６２】
実施例１
３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン
【化９】
2016512498.tif 000010
【００６３】
３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−２−［（１Ｒ）−１−（４−メトキシフェニル）エチル］−３−メチル−６−（１−テトラヒドロピラン−２−イルピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン（６５ｇ、１２３ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（６００ｍＬ）に溶解して７５〜８０℃に１６時間加熱する。減圧下で蒸発させて酢酸エチル（５００ｍＬ）および水（５００ｍＬ）で希釈する。水層のｐＨを６Ｎ  ＮａＯＨ水溶液で８〜９に調整し、水層を酢酸エチル（３×５００ｍＬ）で抽出し、有機層を組み合わせ、塩化ナトリウム飽和水溶液で洗い、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して、減圧下で蒸発させる。粗製生成物をシリカゲル上で５０〜１００％の酢酸エチル／石油エーテルを用いてクロマトグラフィーで分離する。生成物画分を組み合わせ減圧下で蒸発させて黄色泡沫を与える（３３ｇ、８７％粗製）。３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−２−［（１Ｒ）−１−（４−メトキシフェニル）エチル］−３−メチル−６−（１−テトラヒドロピラン−２−イルピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オンで反応条件を繰り返して生成物を組み合わせる（１０ｇ、１８．９ｍｍｏｌ）。組み合わせた生成物をメタノールに溶解してＳｉｌｉａＢｏｎｄ（登録商標）  Ｔｈｉｏｌ（Ｓｉｌｉａ  ＭｅｔＳ（登録商標）  Ｔｈｉｏｌ）を用いて１５〜２０℃で２０時間撹拌し、ろ過し、減圧下で蒸発させて標記化合物を７７％ｅｅで与える（３８ｇ、８７％）。
【００６４】
実施例２
３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体２
【化１０】
2016512498.tif 000011
【００６５】
分取キラルＨＰＬＣ超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）（カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＯＪ−Ｈ（５μ）、３０×２５０ｃｍ、溶離剤：ＣＯ２中１５％イソプロパノール、流速１２０ｇ／分、ＵＶ２１４ｎｍ）によって３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オンの主鏡像異性体（異性体２）（３８ｇ、１２３ｍｍｏｌ）を、３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オンの副鏡像異性体（異性体１）から分離する。２番目に溶離する異性体（異性体２）は標記化合物である（１７ｇ、４５％、＞９８％ｅｅ）。キラル分析（カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＯＪ−Ｈ（５μｍ）  ４．６×２５０ｍｍ、溶離剤：ＣＯ２中２０％イソプロパノール、流速：３ｍＬ．分  ＵＶ２１４ｎｍ、Ｒｔ＝５．７８分。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ：３１０  （Ｍ＋Ｈ）。
【００６６】
実施例３
３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン
【化１１】
2016512498.tif 000012
【００６７】
ＲｕＰｈｏｓフェネチルアミンパラジウム（ＩＩ）塩化物（６０μｍｏｌ、４３ｍｇ）、ジオキサン（０．５ｍＬ）およびカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１Ｍテトラヒドロフラン、６０μｍｏｌ、６０μＬ）を窒素下で組み合わせ、混合物を０．５分間超音波処理する。Ｒｕｐｈｏｓ触媒混合物を、窒素下で６−ブロモ−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−２−［（１Ｒ）−１−（４−メトキシフェニル）エチル］−３−メチル−イソインドリン−１−オン（５４４ｍｇ、１．１９２ｍｍｏｌ）、４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ピラゾール−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１．７９ｍｍｏｌ、５２６ｍｇ）、１，４−ジオキサン（６ｍＬ）、炭酸ナトリウム（３．６ｍｍｏｌ、２．４ｍＬ  １．５Ｍ水溶液）を含有する反応容器に加えてマイクロ波内で１５０℃で３０分間加熱する。混合物を酢酸エチルで希釈し、１．５Ｍ炭酸ナトリウム水溶液で洗い、塩化ナトリウム飽和水溶液で洗い、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、珪藻土を通してろ過し、蒸発させて淡黄色の残留物にする。残留物をアニソール（１ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（７ｍＬ）に溶解して８０℃に４時間加熱し、次いで７０℃に１８時間加熱する。混合物を減圧下で蒸発させ、メタノールに溶解し、１０ｇのＳＣＸカラムに充填し、メタノール（１００ｍＬ）で洗い、メタノール中２Ｍアンモニアで溶離して、蒸発させる。４０ｇのシリカゲル上で１〜８％メタノール／ジクロロメタンのグラジエントを用いて精製して標記化合物を白色泡沫として与える（２７９ｍｇ、７６％）。ＥＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ：３１０  （Ｍ＋Ｈ）。
【００６８】
実施例４
３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体２、水和物
【化１２】
2016512498.tif 000013
【００６９】
３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体２（９．６ｇ、０．０３ｍｏｌ）を水（５０ｍＬ）中２％アセトンに懸濁させ、混合物を５０℃で１．５時間撹拌する。アセトン（１ｍＬ）を加えて混合物を６５℃に１時間加熱後１２時間掛けて室温にゆっくり冷却する。固体をろ過して４体積の水ですすぐ。固体を真空下で５０℃で６時間乾燥させて標記化合物を与える（８．６ｇ、９０％）。
【００７０】
粉末Ｘ線回折
結晶性固体のＸＲＤパターンは、ＣｕＫａ源（λ＝１．５４０６０Å）およびＶａｎｔｅｃ検出器を備えたＢｒｕｋｅｒ  Ｄ４  Ｅｎｄｅａｖｏｒ粉末Ｘ線回折計で、３５ｋＶおよび５０ｍＡで運転して得られる。２θにおいて０．００８７°のステップサイズおよび０．５秒／ステップの走査速度、ならびに０．６ｍｍ発散、５．２８ｍｍ固定散乱防止、および９．５ｍｍ検出器スリットを用いて２θにおいて４から４０°の間で試料を走査する。乾燥粉末を石英試料ホルダーに詰めてスライドガラスを用いて滑らかな表面を得る。任意の所与の結晶形に関して、回折ピークの相対強度は、結晶モフォロジーおよび晶癖などの因子から生じる好ましい配向性に起因して多様であり得ることが、結晶学技術において良く知られている。好ましい配向性の影響がある場合、ピーク強度は変わるが、同質異像の特性ピーク位置は不変である。さらには、任意の所与の結晶形に関して角度のピーク位置はわずかに変化し得ることも結晶学技術において良く知られている。例えば、ピーク位置は、試料が解析される温度または湿度の変動、試料の変位、または内部標準の有無に起因して移動し得る。この場合、２θにおける±０．２のピーク位置変動は、示された結晶形の明確な識別を妨げることなくこれらの可能性がある変動を許容するであろう。結晶形の確認は、（°２θを単位として）ピークを区別する任意の固有の組み合わせ、典型的にはより突出したピークに基づいて行ってよい。周囲温度および相対湿度において収集された結晶形回折パターンは、ＮＩＳＴ  ６７５標準ピークに基づいて８．８５および２６．７７度２シータにおいて調整される。
【００７１】
実施例４の調製した試料は、下表１に記載のような回折ピーク（２シータ値）を有するものとしてＣｕＫａ線を使用してＸＲＤパターンによって特徴付けられる。具体的にはパターンは、０．２度の回折角に関する許容差を有して１３．４６、１６．５４、１６．６６、１８．１０および２３．１３からなる群から選択されるピークの１つまたは複数と組み合わせた２２．２７におけるピークを含む。
【００７２】
【表１】
2016512498.tif 000014
【００７３】
実施例５
（３Ｒ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、二塩酸塩、アセトニトリル溶媒和物
【化１３】
2016512498.tif 000015
【００７４】
０．２５Ｍ  ＨＣｌ（１ｍＬ）を３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン（実施例３、０．０８４ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）に加えて試料を超音波処理する。全ての材料は、可溶性である。混合物を蒸発乾固し、油状の残留物を生じる。アセトニトリル（２ｍＬ）を加えて溶液が黄色くなり結晶が形成し始める。単結晶Ｘ線回折のために単結晶を単離する。試料は、二塩酸塩のアセトニトリル溶媒和物であると測定される。塩素原子は、単結晶Ｘ線回折によって測定される分子の絶対立体化学を可能にさせる十分な異常散乱を与える。
【００７５】
Ｃ１８Ｈ１７Ｃｌ２ＦＮ６Ｏの透明無色のプリズム状試験片、寸法約０．１８０ｍｍ×０．２００ｍｍ×０．２２０ｍｍを、Ｘ線結晶解析に用いる。合計３３１８フレームを収集する。合計暴露時間は、１．８４時間である。フレームを、Ｂｒｕｋｅｒ  ＳＡＩＮＴソフトウェアパッケージでナローフレームアルゴリズム（ｎａｒｒｏｗ−ｆｒａｍｅ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いて積分する。斜方晶単位格子を用いたデータの積分は、６６．３０°の最大θ角に合計１３４１１反射を生じ（分解能０．８４Å）、その内３３０４は独立であり（平均冗長度４．０５９、完全性＝９７．８％、Ｒｉｎｔ＝７．２５％、Ｒｓｉｇ＝６．３０％）、かつ２８８５（８７．３２％）は２σ（Ｆ２）より大きかった。最終格子定数のａ＝８．０５８３（２）Å、ｂ＝３６．３８０３（９）Å、ｃ＝６．９６８４０（１０）Å、体積＝２０４２．８８（８）Å３は、１１．２４°＜２θ＜１３２．０°で２０σ（Ｉ）を超える６２９５反射のＸＹＺ質量中心の精密化に基づく。データを、マルチスキャン法（ＳＡＤＡＢＳ）を用いて吸収効果について訂正する。最小見かけ透過率の最大見かけ透過率に対する比は、０．７６１である。計算された最小および最大透過係数（結晶サイズに基づく）は、０．５４６６および０．６０３３である。
【００７６】
構造を、Ｂｒｕｋｅｒ  ＳＨＥＬＸＴＬ（商標）ソフトウェアパッケージを用いて、空間群Ｐ  ２１  ２１  ２を用いて、式単位、Ｃ１８Ｈ１７Ｃｌ２ＦＮ６ＯについてＺ＝４で解明および精密化する。２５５変数を用いたＦ２での最終異方性完全行列最小二乗法精密化は、観察されたデータについてＲ１＝４．２７％および全てのデータについてｗＲ２＝１０．８０％で収束した。適合度は、１．０６６である。０．０５６ｅ−／Å３のＲＭＳ偏差を用いて最終差電子密度合成における最大ピークは０．２９５ｅ−／Å３および最大正孔は−０．２０４ｅ−／Å３である。最終モデルに基づいて、計算された密度は、１．３７６ｇ／ｃｍ３およびＦ（０００）、８７２ｅ−である。絶対構造パラメータは、分子の絶対構造が標記化合物と一致することを示す、０．０（０）に精密化される。アセトニトリル溶媒分子は、幾分不規則であるため等方的に精密化されるのに対して、（３Ｒ）−３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オンおよび塩化物イオンは、異方的に精密化される。実施例５に関してのこの結果は、分子の絶対立体化学をＲ鏡像異性体であるとして確定し、それによって実施例３の立体化学も確定し、そこから実施例５が導かれる。
【００７７】
さらには、実施例２および３を、それぞれの実施例について存在する鏡像異性体を決定するために同条件を用いてキラルＨＰＬＣ超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）による分析にかける。（カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＪ−Ｈ  ４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、ＣＯ２中２０％イソプロパノール、５ｍＬ／分、ＵＶ２２５ｎｍ）。実施例２および実施例３について、異性体１は１．５３’で溶離し異性体２は１．８１〜１．８４’で溶離する。本分析において、実施例２は１００％ｅｅを有し実施例３は９６．４％ｅｅを有する。これらの結果は、実施例２および実施例３の両方に存在する鏡像異性体が異性体２であることを実証する。上記で規定したように、実施例３の絶対立体化学はＲ鏡像異性体であり、ならびに実施例２および３は共にキラルＨＰＬＣ  ＳＦＣによって異性体２と特定されるので、実施例２の絶対立体化学も、したがって、Ｒ鏡像異性体である。さらには、実施例４を行うために実施例２を用いるので、実施例４の絶対立体化学は、Ｒ鏡像異性体である。
【００７８】
Ｈ１２９９細胞におけるリン酸化ＭＣＭ２の検出のためのＡｃｕｍｅｎ（登録商標）イメージングアッセイ
Ａｃｕｍｅｎ（登録商標）  ｅＸ３を用いてセリン５３（ｐＭＣＭ２−Ｓ５３）における内因性リン酸化ＭＣＭ２の形成への化合物の影響を測定する。ＭＣＭ２のＣＤＣ７によるリン酸化は、Ａｃｕｍｅｎ（登録商標）  ｅＸ３によって特異的な抗ｐＭＣＭ２−Ｓ５３抗体を用いて測定し蛍光タグ二次抗体で定量化して細胞におけるＣＤＣ７活性を観測する。セリン５３におけるＭＣＭ２のリン酸化は、ＣＤＣ７阻害と相互に関連していると知られている。
【００７９】
Ｈ１２９９細胞（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ−５８０３）は、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ−１６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＳＨ３０８０９．０１）成長培地中に保持する。細胞を、標準細胞培養手順を用いて採取し次いでＶｉ−Ｃｅｌｌ  ＸＲ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ）を用いて計数する。１００μＬの成長培地中の３０００〜６０００個のＨ１２９９細胞を、平底のＢｉｏＣｏａｔ（商標）  Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）細胞培養プレート３５６６４０を備えたＢｉｏｃｏａｔ  Ｐｏｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓｉｎｅ  ９６ウェル黒色／透明プレートのそれぞれのウェル内に平板化して３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。
【００８０】
細胞を、０．６％ＤＭＳＯを含有する培地内に希釈した試験化合物（５０μＬ／ウェル）で処置して３７℃で４時間インキュベートする。それぞれのウェルに、３７％ホルムアルデヒドストックからＰＢＳで希釈した７．４％ホルムアルデヒド（１５０μＬ）を加えてプレートを室温で３０分間インキュベートする。ホルムアルデヒドを除去して冷メタノール（１００μＬ）を加える。プレートを４℃で２０分間インキュベートして細胞を透過処理する。プレートを、１００μＬ／ウェルのＰＢＳで３回洗う。プレートを１：１０００に希釈した５０μＬ／ウェルの抗ｐＭＣＭ２−Ｓ５３抗体でインキュベートし（ＮＰ＿００４５１７．２を用いて生成（ＰｕｂＭｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅを参照）、ウサギポリクローナル抗体産生のための標準９０日ウサギ免疫プロトコールによって（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））、マレイミド活性化を用いて、２％ＢＳＡを添加したＰＢＳ中で４℃で一晩キーホールリンペットヘモシアニンに接合する。プレートを、ＰＢＳ（４×１００μＬ／ウェル）で洗ってＰＢＳ中１：１０００に希釈した１００μＬ／ウェルの抗ウサギＩｇＧヤギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＣＡ１１３０４ｓ）中で室温で１時間インキュベートする。プレートを、ＰＢＳ（４×１００μＬ／ウェル）で洗う。ＲＮａｓｅ（５０  μｇ／ｍｌ）およびヨウ化プロピジウム（１５μＭ）を含有するＰＢＳ（５０μＬ／ウェル）を加えてプレートを室温で３０分間インキュベートする。プレートを黒色シールで密封してそれぞれＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８およびヨウ化プロピジウム用に５００〜５３０ナノメートルおよび５７５〜６４０ナノメートルの光学フィルターを用いてＡｃｕｍｅｎ（登録商標）  ｅＸ３（ＴＴＰ  ＬＡＢＴＥＣＨ）上で読み取る。それぞれのウェルについてｐＭＣＭ２−Ｓ５３陽性細胞の数を総細胞数に正規化してプレート上の対照と比較した阻害率として計算する。十点化合物濃度データから４パラメータロジスティック方程式へ阻害率を生成してＩＣ５０値を導く。
【００８１】
本発明の範囲内の化合物は、実質的に上述の通りに本アッセイにおいて試験する。実施例２の化合物は、０．２６１μＭ＋０．００４（ｎ＝２）のＩＣ５０を有すると判定される。実施例３の化合物は、０．２９μＭのＩＣ５０を有すると判定される。実施例４の化合物は、０．２９μＭ＋０．０８１３（ｎ＝２）のＩＣ５０を有すると判定される。これらの結果は、実施例２、３および４が、Ｈ１２９９細胞アッセイにおいてｐＭＣＭ２−Ｓ５３を阻害することおよびしたがってＣＤＣ７阻害剤であることを示す。
【００８２】
ＣＤＣ７／ＤＢＦ４  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素アッセイ
Ｔｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ（商標）キナーゼＡＤＰ−ＦＰアッセイを用いてＣＤＣ７／ＤＢＦ４キナーゼに対する化合物ＩＣ５０値を測定する。キナーゼＡＤＰ−ＦＰアッセイは、キナーゼ反応において形成されるＡＤＰの濃度を測定することにより化合物阻害剤の存在下でのＣＤＣ７／ＤＢＦ４の活性を評価する。キナーゼ反応は、９６ウェルアッセイプレートにおいて２５マイクロリットルの反応体積を用いて実行する。ＡＤＰ−ＦＰアッセイのために、試薬を加えてＨＥＰＥＳ（２５ｍＭ）  ｐＨ７．５、０．０３％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００、塩化マグネシウム（１０ｍＭ）、ＤＴＴ（１ｍＭ）、ＭＣＭ２（４００ｎＭ）（アミノ酸１−２０９、ＣＤＣ７／ＤＢＦ４の生理学的基質）、スペルミン（４ｍＭ）、ＣＤＣ７／ＤＢＦ４（２，６４０ｎｇ／ｍＬ）（昆虫細胞中で発現した組み換えヒトＣＤＣ７／ＤＢＦ４）、４％ジメチルスルホキシドおよび化合物の段階希釈（２０，０００ｎＭから１ｎＭまで１：３希釈）の最終反応条件を得る。酵素および基質を化合物に加えその後ＡＴＰを５μＭまで加えて反応を開始させる。プレートを、室温で６０分間インキュベートする。
【００８３】
ＡＤＰ−ＦＰフォーマットのためにＨＥＰＥＳ（５２ｍＭ）  ｐＨ７．５、ＥＤＴＡ（２０ｍＭ）、塩化ナトリウム（０．４Ｍ）、ポリオキシエチレングリコールドデシルエーテル（０．０２％）（ＢＲＩＪ−３５（商標））、抗ＡＤＰ抗体（１０μｇ／ｍＬ）、およびＡＤＰ（４ｎＭ）  Ｔｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）  ＡＤＰ  Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６３３トレーサーを含有する２５マイクロリットルのクエンチ検出試薬を加えて反応をクエンチする。プレートを１時間インキュベートし、次いでＷａｌｌａｃ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）  ２１０４  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）において蛍光偏光モードで波長Ｅｘ６２０ｎｍおよびＥｍ６８８ｎｍの偏光フィルターを用いて読み取る。ミリ偏光（Ｍｉｌｌｉｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）（ｍＰ）生データを、反応緩衝液中５μＭ  ＡＤＰ  １：１段階希釈で始まり０．００２５μＭ  ＡＤＰまでの準備したＡＤＰ／ＡＴＰ標準曲線を用いてマイクロモルＡＤＰに変換する。それぞれの化合物についてのＩＣ５０値を、プレート上の対照（ＤＭＳＯ対１００ｍＭ  ＥＤＴＡ阻害した酵素対照）と比較してμＭ  ＡＤＰ反応データから計算した阻害率データを用いて導く。次いで阻害率および十点化合物濃度データを、４パラメータロジスティック方程式に適合する。
【００８４】
本発明の範囲内の化合物は、実質的に上述の通りに本アッセイにおいて試験する。実施例２の化合物は、３．７ｎＭのＩＣ５０を有すると判定される。実施例３の化合物は、４．５ｎＭのＩＣ５０を有すると判定される。実施例４の化合物は、３．３ｎＭ±０．６３４（ｎ＝２）のＩＣ５０を有すると判定される。結果は、実施例２、３および４が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素アッセイにおいてＡＤＰ産生を阻害することおよびしたがってＣＤＣ７阻害剤であることを示す。
【００８５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗増殖性アッセイ
実施例２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗増殖性活性を、ＡＴＣＣ、ＨＳＲＲＢ、ＲＩＫＥＮまたはＥＣＡＣＣから得られる大腸、乳房、肺、および血液（白血病）由来の１１４がん細胞株のパネルに対する細胞数計数アッセイによって測定する。細胞を、製造業者の指示に従って培養し培地内に保持する。それぞれの細胞株の細胞倍加時間を測定し全ての細胞株はマイコプラズマ汚染が無い。細胞を、９６ウェルプレート内で一晩培養した後抗増殖性活性アッセイのための化合物を加える。最適細胞播種密度を、１００μＬの培地中に４つの異なる細胞密度で細胞培養を播種することならびにそれらの倍加時間および細胞サイズを考慮に入れることによりそれぞれの細胞株について慎重に評価する。次いで２つの倍加時間の最後で約９０％の合流点を与える播種密度を化合物試験のために選択する。スタウロスポリンを、参照として１：３希釈で用いる。実施例２を、４ｍＭ  ＤＭＳＯストックとして調製して培養培地中１：２比率で希釈する。化合物を含有する５０μＬの培地を、９６ウェル一晩培養のそれぞれのウェルに加えて所望の最終濃度２０、１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２、０．１５６、０．０７８μＭおよびＤＭＳＯ対照を生成する。それぞれの処置濃度は、複製ウェルを有する。細胞を、化合物の存在下で２倍加時間さらに培養する。処置時間の終わりに、最初に細胞を細胞死または見かけ上の細胞サイズ増加などの形態学的変化について顕微鏡下で検査する。それぞれの複製ウェルにおける細胞を別々に回収する。接着細胞を、最初にトリプシン処理（ｔｒｉｐｓｉｎｉｚａｔｉｏｎ）によって採取する。採取した細胞を、成長培地中に再懸濁させて細胞計数器を用いて計数する。
【００８６】
本発明の範囲内の化合物は、実質的に上述の通りに本アッセイにおいて試験する。下表２に示すように、実施例２の化合物は、薬理学的に適切な濃度（＜８μＭ）において試験した１１４がん細胞株の大部分に対する有意な抗増殖性活性を実証する。さらには、約１０％のがん細胞株は、２倍加時間の処置期間内にこれらのがん細胞について発生する大量の細胞死によって実証されるように、化合物への特定の感受性を示す。これらの特に感受性のがん細胞株の多くは、大腸がんおよび白血病性がん由来である。感受性を、Ｃｏｌｏ−２０５およびＳＷ６２０などの異種移植腫瘍モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでさらに確認する（下記詳細を参照）。このデータは、実施例２が、試験した細胞株におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの広範な抗増殖性活性を有することを実証する。
【００８７】
【表２】
2016512498.tif 000016
【００８８】
Ｃｏｌｏ−２０５異種移植腫瘍モデルを用いたＭＣＭ２−Ｓ４０／４１リン酸化（ｐＭＣＭ２−Ｓ４０／４１）でのＣＤＣ７  ｉｎ  ｖｉｖｏ標的阻害（ＩＶＴＩ）
ヒトｃｏｌｏ−２０５大腸がん細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２２２）を、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中に保持する。対数期成長細胞を採取し、洗い、無血清培地とＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）との１：１混合物中に再懸濁させる。それらを、皮下腫瘍異種移植モデルとして５×１０６細胞／動物／部位でｂａｌｂ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）雌マウス（６〜８週間で体重２０から２５グラム／マウス）のひ腹において皮下に注射する。動物を、平均腫瘍体積１５０から２５０ｍｍ３のマウスにおいて無作為化する（ｖ＝ｌ×ｗ×０．５３６（式中、ｌ＝測定されたより大きい直径およびｗ＝垂直方向のより小さい直径である）。化合物を、標準１％ＨＥＣ  ｗ／ｖ、Ｐ８０  ０．２５％  ｖ／ｖ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  １５１０−ＵＳ  ０．０５％  ｖ／ｖ配合物においてＰ．Ｏ．により投与する。腫瘍を、投与４時間後に採取してプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）およびホスファターゼ阻害剤（ＲｏｃｈｅまたはＳｉｇｍａ）を含有する溶解緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で均質化によって破壊する。腫瘍溶解産物からのタンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定して５から１０μｇのタンパク質を標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  （ＢｉｏＲａｄ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）ゲル）または（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｅＰａｇｅ（商標）ゲル）によって分離する。次いでタンパク質をＰＶＤＦまたはニトロセルロース膜に移して製造業者および標準ウエスタンブロットプロトコールに従ってｐＭＣＭ２−Ｓ４０／４１（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＃Ａ３００−７８８Ａ）またはＧＡＰＤＨ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  １０Ｒ−Ｇ１０９ＡまたはＡｂｃａｍ  ａｂ９４８５）に対する抗体で調査する。ｐＭＣＭ２−Ｓ４０／４１のレベルを、ＬｉｃｏｒまたはＦＵＪＩ  ｉｍａｇｅｒのいずれかによって測定および定量して総ＧＡＰＤＨレベルに正規化する。ｐＭＣＭ２−Ｓ４０／４１帯強度の阻害変化率を、最大シグナルとしてＧＡＰＤＨに正規化したビヒクル処置した対照腫瘍の平均強度を用いて計算する。処置した腫瘍グループにおけるシグナルの阻害率を計算するために下記の式を使用する：阻害率＝（正規化データ−正規化最大）／（ゼロ−正規化最大）＊１００。ＴＥＤ７０値は、経口投与後４時間でのｉｎ  ｖｉｖｏの異種移植実験におけるＧＡＰＤＨ（標的阻害％）に正規化されたｐＭＣＭ２の平均ＣＤＣ７／ＤＢＦ４介在リン酸化を７０％阻害するのに必要な化合物の正確な用量に関係する。ＴＥＣ７０は、経口投与後４時間でのｉｎ  ｖｉｖｏの異種移植実験におけるＧＡＰＤＨ（標的阻害％）に正規化されたｐＭＣＭ２の平均ＣＤＣ７／ＤＢＦ４介在リン酸化を７０％阻害するのに必要な化合物の正確な血漿濃度に関係する。
【００８９】
本発明の範囲内の化合物は、実質的に上述の通りに本アッセイにおいて試験する。ＴＥＤ７０は、用量のプロットおよびｐＭＣＭ２の阻害％から生成され実施例３については２．６ｍｇ／ｋｇである。ＴＥＣ７０は、７０％阻害における用量、ｐＭＣＭ２の阻害％および血漿濃度を用いて生成される。実施例３のＴＥＣ７０は、１．８μＭである。本データは、本発明の範囲内の化合物が、マウスの経口投与後４時間でのｉｎ  ｖｉｖｏ異種移植実験におけるマウスのｐＭＣＭ２のＣＤＣ７／ＤＢＦ４介在リン酸化を阻害することを実証する。
【００９０】
ヒト大腸がんＳＷ６２０マウス異種移植モデルにおける抗腫瘍効果
実施例４のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗がん活性を、上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞計数増殖性アッセイデータに基づいて感受性であると予測されるヒト大腸腺がん細胞株ＳＷ６２０マウス異種移植腫瘍モデルにおいて調査する。ＳＷ６２０細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から取得してＡＴＣＣの指示に従って１０％ウシ胎児血清を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５  Ｍｅｄｉｕｍ中で培養する。ＳＷ６２０細胞懸濁液（５．０×１０６／０．２ｍＬ）を、それぞれの雌胸腺欠損Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの右脇腹に皮下注射する。マウス（到着時５〜６週齢）を、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｓｉｐｐｒ−ｂｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ  Ｌｔｄ．から取得する。受け取り後および調査を通して、動物は、接した寝床を備えた適切なサイズの堅牢な底のケージ内に１ケージ当たり５動物を収容する。動物は、ＳＷ６２０細胞の移植に先立って７日間順応させる。動物は、適宜２３％タンパク質と共にＳｈａｎｇｈａｉ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ認定のＲｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔを与えかつ適宜高圧滅菌した水道水を与える。動物室は、１２時間の明暗周期に維持する。腫瘍体積が平均１５４．９ｍｍ３（腫瘍移植後９日）に達した時に、担腫瘍動物を無作為に類似の平均腫瘍体積および体重を有する９つのグループにグループ分けする（８動物／グループ）。担腫瘍マウスの平均体重は、１７．３ｇである。化合物は、脱イオン水中ＨＥＣ  １％  ｗ／ｖ、Ｐ８０  ０．２５％  ｖ／ｖ、およびａｎｔｉｆｏａｍ  １５２０−ＵＳ  ０．０２５％  ｖ／ｖ中でプローブ音波処理（ｐｒｏｂｅ  ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）によって氷上で１５分間配合して、化合物配合物を動物投薬用に毎日調製する。配合した化合物を、１０．４、２０．８および３１．２ｍｇ／ｋｇの用量で（それぞれ、１０、２０および３０ｍｇ／ｋｇの活性医薬品成分ＡＰＩを含有）２週間強制経口投与（０．１ｍＬ／２０ｇ）により１日２回（ＢＩＤ）投与する。ＢＩＤ投薬は、８時間空けて行う（各日おおよそ午前９時および午後５時）。ビヒクルも、調査のコントロールアームとしてＢＩＤで与える。腫瘍体積および体重を、盲検法で週３回測定する。腫瘍体積を、キャリパ測定（ｍｍ）によっておよび楕円球体の式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝長さ×幅２／２（式中、長さおよび幅は、それぞれの測定において収集された垂直方向のより大きいおよびより小さい寸法を指す）を用いて測定する。動物挙動および動物健康状態を、投薬期間中１日２回観測する。処置開始後２８日目に調査を終了する。
【００９１】
腫瘍体積データの統計的分析は、はじめに時間および処置時間にわたる分散を平均化するためにデータを対数尺度に変換する。対数ボリュームデータを、時間による二元配置反復測定分散分析で分析してＳＡＳソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．３）においてＭＩＸＥＤ手順を用いて処理する。反復測定のための相関モデルは、Ｓｐａｔｉａｌ  Ｐｏｗｅｒである。処置したグループを、各時点において対照グループと比較する。ＭＩＸＥＤ手順をそれぞれの処置グループにも別々に用いて各時点における調整平均および標準誤差を計算する。どちらの分析も、各動物内の自己相関および大きい腫瘍を有する動物を調査から早期に除去した場合に発生するデータの損失を説明している。調整平均および標準誤差を、各処置グループ対時間についてプロットする。処置したグループを対照グループと各時点において比較する分析は、ｌｏｇ１０腫瘍体積を用いてｐ値を生成する。示したｐ値の統計的有意性に関して、「＊＊＊」＝Ｐ＜０．００１である。
【００９２】
Ｔ＞Ｔ０の場合は、Ｄｅｌｔａ  Ｔ／Ｃ、％計算を用いる。Ｔ＜Ｔ０の場合は、Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔ／Ｃ、％計算を用いる。
方程式：
Ｔ＝処置したグループにおける最終腫瘍体積
Ｔ０＝処置したグループにおけるベースライン腫瘍体積（Ｃ０と同等と仮定される）
Ｃ＝対照グループにおける最終腫瘍体積
Ｃ０＝対照グループにおけるベースライン腫瘍体積（Ｔ０と同等と仮定される）
Ｄｅｌｔａ  Ｔ／Ｃ、％＝１００＊（Ｔ−Ｔ０）／（Ｃ−Ｃ０）
Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ、％＝１００＊（Ｔ−Ｔ０）／Ｔ０
【表３】
2016512498.tif 000017
【００９３】
本発明の範囲内の化合物は、実質的に上述の通りに本アッセイにおいて試験する。上表３に示すように、実施例４の化合物は、２週間連続的にＢＩＤで与えられた場合の用量依存的方法におけるＳＷ６２０異種移植腫瘍へのｉｎ  ｖｉｖｏでの抗がん活性を実証する。全ての試験した用量の結果は、ビヒクルの結果よりも有意に小さい。この活性は、ＳＷ６２０がん細胞株で観察されたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性と一致する。最大耐量の３１．２ｍｇ／ｋｇにおいて、化合物は、負の値によって示されるような、有意な腫瘍退縮を生じる。また、投薬中止後の２週間で有意な腫瘍成長は観察されない。本データは、実施例４が、ＳＷ６２０マウス異種移植腫瘍モデルにおいて用量依存的抗腫瘍活性を提供することを実証する。
【手続補正書】
【提出日】平成27年9月9日(2015.9.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オンである化合物、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは水和物。
【請求項２】
３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体２である、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項４】
３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体２である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体１である、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項６】
３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オン、異性体１である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
３−（５−フルオロピリミジン−４−イル）−３−メチル−６−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）イソインドリン−１−オンである、請求項１に記載の化合物、またはその水和物。
【請求項８】
２θ±０．２において、２２．２７ならびに１３．４６、１６．５４、１６．６６、１８．１０および２３．１３の１つまたは複数で生じる特性ピークを有する粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる結晶形態の水和物である、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは水和物、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１０】
がんの治療における使用のための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは水和物を含む医薬組成物。
【請求項１１】
前記がんが、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、卵巣がん、肺がん、大腸がん、血液がん、および白血病からなる群から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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