(57)【要約】  マイクロ粒子およびナノ粒子ならびにそれらの組成物が提供される。マイクロ粒子およびナノ粒子ならびに組成物は、外傷などの傷害および骨関節炎などの筋骨格疾患の処置に使用できる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における結合組織へ活性薬剤を送達する方法であって、
１０ｎｍより大きい平均粒子サイズを有するマイクロ粒子を対象に投与することを含み、マイクロ粒子が、結合組織に結合する化合物により官能化され、第１の活性薬剤を含み、第１の活性薬剤が、マイクロ粒子から放出されるときに結合組織へ送達される、前記方法。
【請求項２】
筋骨格疾患または傷害を処置する方法であって、
１０ｎｍより大きい平均粒子サイズを有するマイクロ粒子を対象に投与することを含み、マイクロ粒子が、結合組織に結合する化合物により官能化され、筋骨格疾患または傷害の処置用治療薬剤を含む、前記方法。
【請求項３】
マイクロ粒子が、ポリマーを含み、ポリマーが任意にペプチドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
結合組織に結合する化合物がアビジンである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
ペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からの５個以上のアミノ酸である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からの１５個以上のアミノ酸である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
１０ｎｍ以下の平均粒子サイズを有するナノ粒子を更に含み、ナノ粒子が、第２の活性薬剤を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
第１の活性薬剤が骨関節炎の処置用治療薬剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
対象が筋骨格疾患または傷害を有し、第１の活性薬剤が、筋骨格疾患または傷害の処置用治療薬剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
第２の活性薬剤が、筋骨格疾患または傷害の処置用治療薬剤である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
筋骨格傷害が外傷である、請求項２、９、または１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
第２の活性薬剤が鎮痛剤である、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
第２の活性薬剤が骨関節炎の処置用治療薬剤である、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
第１の活性薬剤が鎮痛剤である、請求項１または３〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
マイクロ粒子が、鎮痛剤および骨関節炎の処置用治療薬剤を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ナノ粒子が、鎮痛剤および骨関節炎の処置用治療薬剤を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
マイクロ粒子およびナノ粒子が、対象に別々に送達される、請求項７に記載の方法。
【請求項１８】
マイクロ粒子およびナノ粒子が、同一の組成物中で対象に送達される、請求項７に記載の方法。
【請求項１９】
マイクロ粒子およびナノ粒子が、同時に対象に送達される、請求項７に記載の方法。
【請求項２０】
筋骨格疾患が骨関節炎である、請求項２、９または１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
対象が外傷後骨関節炎を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２２】
対象が後期の骨関節炎を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２３】
筋骨格傷害が外傷である、請求項２、９、または１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
マイクロ粒子が結合組織に結合する化合物により官能化され、第１の活性薬剤を含む、１０ｎｍより大きい平均粒子サイズを有するマイクロ粒子と、ナノ粒子が第２の活性薬剤を含む、１０ｎｍ以下の平均粒子サイズを有するナノ粒子とを含む、組成物。
【請求項２５】
マイクロ粒子がポリマーを含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
マイクロ粒子がペプチドを含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
ペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からの５個以上のアミノ酸である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
ペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からの１５個以上のアミノ酸である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２９】
第１の活性薬剤が、骨関節炎の処置用治療薬剤である、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
第１の活性薬剤が、筋骨格疾患または傷害の処置用治療薬剤である、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
第２の活性薬剤が鎮痛剤である、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
第２の活性薬剤が、骨関節炎の処置用治療薬剤である、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
第１の活性薬剤が鎮痛剤である、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
第２の活性薬剤が、筋骨格疾患または傷害の処置用治療薬剤である、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
マイクロ粒子が、鎮痛剤および骨関節炎の処置用治療薬剤を含む、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
ナノ粒子が、鎮痛剤および骨関節炎の処置用治療薬剤を含む、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
ナノ粒子がペプチドを含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３８】
ペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からの５個以上のアミノ酸である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３９】
ペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からの１５個以上のアミノ酸である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項４０】
ペプチドがデキサメタゾン抱合アビジンである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項４１】
マイクロ粒子が、結合組織に結合する化合物により官能化され、骨関節炎の処置用治療薬剤を含む、１０ｎｍより大きい平均粒子サイズを有するマイクロ粒子。
【請求項４２】
マイクロ粒子がポリマーを含む、請求項４１に記載のマイクロ粒子。
【請求項４３】
マイクロ粒子がペプチドを含む、請求項４１に記載のマイクロ粒子。
【請求項４４】
ペプチドが、配列番号１からの５個以上のアミノ酸である、請求項４３に記載のマイクロ粒子。
【請求項４５】
ペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からの１５個以上のアミノ酸である、請求項４３に記載のマイクロ粒子。
【請求項４６】
１０ｎｍ以下の平均粒子サイズを有するナノ粒子を更に含み、ナノ粒子が、第２の活性薬剤を含む、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載のマイクロ粒子。
【請求項４７】
第１の活性薬剤が、骨関節炎の処置用治療薬剤である、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載のマイクロ粒子。
【請求項４８】
第１の活性薬剤が、筋骨格疾患または傷害の処置用治療薬剤である、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載のマイクロ粒子。
【請求項４９】
第２の活性薬剤が鎮痛剤である、請求項４６に記載のマイクロ粒子。
【請求項５０】
第２の活性薬剤が、骨関節炎の処置用治療薬剤である、請求項４６に記載のマイクロ粒子。
【請求項５１】
第１の活性薬剤が鎮痛剤である、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載のマイクロ粒子。
【請求項５２】
第２の活性薬剤が、筋骨格疾患または傷害の処置用治療薬剤である、請求項４６に記載のマイクロ粒子。
【請求項５３】
マイクロ粒子が、鎮痛剤および骨関節炎の処置用治療薬剤を含む、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載のマイクロ粒子。
【請求項５４】
ナノ粒子が、鎮痛剤および骨関節炎の処置用治療薬剤を含む、請求項４６に記載のマイクロ粒子。
【請求項５５】
活性薬剤を対象における結合組織へ送達する方法であって、
１０ｎｍ以下の平均粒子サイズを有するナノ粒子を、対象に投与することを含み、ナノ粒子が６より大きい正味の正電荷を有するポリマーを含み、ナノ粒子が活性薬剤により官能化されている、前記方法。
【請求項５６】
ポリマーが分子量６０〜９０ｋｄである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ポリマーが分子量６０〜８０ｋｄである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
ポリマーが分子量６０〜７０ｋｄである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
ポリマーがペプチドである、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
ペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からの５個以上のアミノ酸である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からの１５個以上のアミノ酸である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
ナノ粒子が、６〜２０の正味の正電荷を有するポリマーを含む、請求項５５〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
ナノ粒子が、７〜１４の正味の正電荷を有するポリマーを含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
活性薬剤が、骨関節炎の処置用治療薬剤である、請求項５５〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
活性薬剤が、デキサメタゾン、疾患修飾性抗骨関節炎薬（ＤＭＯＡＤ）、ＩＧＦ（インスリン様成長因子）、ＩＧＦ‐１、ＦＧＦ‐１５およびＢＭＰ７などの同化促進成長因子、トリアムシノロンなどのステロイド薬のグルココルチコイドクラスなどの抗異化剤、炎症性サイトカインの遮断薬、ＴＮＦ、ＩＬ‐１、アグリカナーゼおよびマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害薬からなる群から選択される、請求項５５〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
１０ｎｍ以下の平均粒子サイズを有するナノ粒子を含む組成物であって、ナノ粒子が活性薬剤を含み、活性薬剤が骨または結合組織の疾患状態の処置用治療薬剤であり、ナノ粒子が正味の正電荷が６より大きいポリマーを含む、前記組成物。
【請求項６７】
ポリマーが、分子量が９０ｋｄ未満である、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
ポリマーが、分子量１０ｋｄ〜９０ｋｄである、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６９】
治療薬剤がＩＧＦである、請求項６６に記載の組成物。
【請求項７０】
ポリマーが、分子量６０〜９０ｋｄである、請求項６６に記載の組成物。
【請求項７１】
ポリマーが、分子量６０〜８０ｋｄである、請求項６６に記載の方法。
【請求項７２】
ポリマーが、分子量６０〜７０ｋｄである、請求項６６に記載の方法。
【請求項７３】
ポリマーがペプチドである、請求項６６に記載の組成物。
【請求項７４】
ペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からの５個以上のアミノ酸である、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７５】
ペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からの１５個以上のアミノ酸である、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７６】
ナノ粒子が、６〜２０の正味の正電荷を有するポリマーを含む、請求項６６〜７５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７７】
ナノ粒子が、７〜１４の正味の正電荷を有するポリマーを含む、請求項７６に記載の組成物。
【請求項７８】
ペプチドが、アビジン、アルブミン、ゼラチン、リゾチームおよび両性トリブロックペプチドからなる群から選択される、請求項６６に記載の組成物。
【請求項７９】
アビジンまたはその断片のナノ粒子と、疾患修飾性抗骨関節炎薬（ＤＭＯＡＤ）、同化促進成長因子および抗異化剤からなる群から選択される治療薬剤とを含む組成物。
【請求項８０】
治療薬剤がデキサメタゾンである、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８１】
アビジンまたはその断片が完全長アビジンである、請求項７９または８０に記載の組成物。
【請求項８２】
アビジンまたはその断片が、配列番号１に記載の断片である、請求項７９または８０に記載の組成物。
【請求項８３】
アビジンが、共有結合で治療薬剤に結合している、請求項７９〜８２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８４】
共有結合が、エステルまたはヒドラゾン結合である、請求項８３に記載の組成物。
【請求項８５】
アビジンが、非共有結合で治療薬剤に結合している、請求項７９〜８２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８６】
アビジンが、１〜４個のビオチンと会合している、請求項７９〜８５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８７】
筋骨格疾患または傷害の処置に使用する組成物であって、
１０ｎｍより大きい平均粒子サイズを有するマイクロ粒子を含み、マイクロ粒子が結合組織に結合する化合物により官能化され、筋骨格疾患または傷害の処置用治療薬剤を含む、前記組成物。
【請求項８８】
活性薬剤を対象における結合組織へ送達するために使用される組成物であって、
１０ｎｍ以下の平均粒子サイズを有するナノ粒子を含み、ナノ粒子が６より大きい正味の正電荷を有するポリマーを含み、ナノ粒子が活性薬剤により官能化される、前記組成物。
【請求項８９】
ナノ粒子と骨または結合組織の疾患状態の処置用治療薬剤とを含む組成物であって、ナノ粒子が、１０ｎｍ以下の平均粒子サイズを有し、６より大きい正味の正電荷を有するポリマーを含むか、または、アビジンまたはその断片から構成される、前記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１３年８月２７日に出願された米国特許仮出願第６１／８７０，２８８号、名称「ナノ粒子表面結合に基づく薬物の組織への送達」に対して、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を主張し、その全開示を参照により本明細書に組み込むものである。本出願は、２０１３年１月４日に出願された米国特許仮出願第６１／７４８，８０９号、名称「ナノ粒子表面結合に基づく薬物の組織への送達」に対して、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を主張し、その全開示を参照により本明細書に組み込むものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、粒子を用いた薬物送達システムのための方法および試薬に関する。
連邦政府により資金提供を受けた研究
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）からの助成金番号第ＡＲ０６０３３１号により、政府の支援のもとになされたものである。米国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
骨関節炎（ＯＡ）は、ヒト関節の軟骨を攻撃し、生産性および生活の質に影響を与え、患者の身体に極度の障害をもたらす。世界中で１億５千万人以上が骨関節炎に罹患しているが、有効な治癒法はない。現行の治療は、疼痛および炎症の短期間の軽減をもたらすだけであり、末期ＯＡの特徴である関節軟骨の更なる変性が不可避であるが、それに対する予防とはならない。その結果、（骨および他の柔組織の劣化など）完全な関節機能不全となり、患者は関節置換が必要となる。
【発明の概要】
【０００４】
いくつかの側面では、本発明は、放出されるときに結合組織へ送達される第１の活性薬剤を含み、結合組織に結合する化合物により官能化されている、平均粒子サイズが１０ｎｍより大きいマイクロ粒子を対象に投与することによって、対象における結合組織へ活性薬剤を送達する方法である。いくつかの実施態様では、対象が筋骨格疾患または傷害を有する。
【０００５】
いくつかの側面では、本発明は、筋骨格疾患または傷害の処置用治療薬剤を含み、結合組織に結合する化合物により官能化されている、平均粒子サイズが１０ｎｍより大きいマイクロ粒子を対象に投与することによって、筋骨格疾患または傷害を処置する方法である。いくつかの実施態様では、筋骨格疾患が骨関節炎である。他の実施態様では、対象が外傷後骨関節炎を有する。更に他の実施態様では、対象が後期の骨関節炎を有する。
【０００６】
対象に、第２の活性薬剤を含む、平均粒子サイズが１０ｎｍ以下のナノ粒子を投与することもできる。
マイクロ粒子またはナノ粒子は、従来のマイクロ粒子テクノロジーにおいて使用される如何なる材料から作成することができる。例えば、マイクロ粒子またはナノ粒子は、ポリマー、例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列からの５個以上のアミノ酸などのペプチド、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０００７】
マイクロ粒子またはナノ粒子中の第１の活性薬剤は、骨関節炎の処置用治療薬剤、筋骨格疾患の処置用治療薬剤、および／または鎮痛剤であることができる。
他の実施態様では、第２の活性薬剤は、鎮痛剤、骨関節炎の処置用治療薬剤および／または筋骨格疾患または傷害の処置用治療薬剤であることができる。
いくつかの実施態様では、マイクロ粒子またはナノ粒子は、鎮痛剤および骨関節炎の処置用治療薬剤を含む。他の実施態様では、ナノ粒子は、鎮痛剤および骨関節炎の処置用治療薬剤を含む。
【０００８】
マイクロ粒子およびナノ粒子は、対象へ別々に送達することができる。あるいは、マイクロ粒子およびナノ粒子は、同一の組成物中で対象へ送達することができる。他の実施態様では、マイクロ粒子およびナノ粒子は、対象へ同時に送達される。
【０００９】
本発明の他の側面によれば、組成物が提供される。組成物は、第１の活性薬剤を含み、結合組織に結合する化合物により官能化されている、平均粒子サイズが１０ｎｍより大きいマイクロ粒子と、第２の活性薬剤を含む、平均粒子サイズが１０ｎｍ以下のナノ粒子とである。
他の側面では、本発明は、骨関節炎などの筋骨格疾患または外傷などの傷害の処置用治療薬剤を含み、結合組織に結合する化合物により官能化されている、平均粒子サイズが１０ｎｍより大きいマイクロ粒子である。いくつかの側面では、マイクロ粒子は、第２の活性薬剤を含む、平均粒子サイズが１０ｎｍ以下のナノ粒子と混合する。
【００１０】
マイクロ粒子またはナノ粒子は、従来のマイクロ粒子テクノロジーにおいて使用される如何なる材料から作成することができる。例えば、マイクロ粒子またはナノ粒子は、ポリマー、例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列からの５個以上のアミノ酸などのペプチド、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
マイクロ粒子またはナノ粒子中の第１の活性薬剤は、骨関節炎の処置用治療薬剤、筋骨格疾患または傷害の処置用治療薬剤、および／または鎮痛剤であることができる。
【００１１】
他の実施態様では、第２の活性薬剤は、鎮痛剤、骨関節炎の処置用治療薬剤および／または筋骨格疾患または傷害の処置用治療薬剤であることができる。
いくつかの実施態様では、マイクロ粒子は、鎮痛剤および骨関節炎の処置用治療薬剤を含む。他の実施態様では、ナノ粒子は鎮痛剤および骨関節炎の処置用治療薬剤を含む。
【００１２】
いくつかの実施態様では、活性薬剤が、デキサメタゾン、疾患修飾性抗骨関節炎薬（ＤＭＯＡＤ）、ＩＧＦ（インスリン様成長因子）、ＩＧＦ‐１、ＦＧＦ‐１５およびＢＭＰ７などの同化促進成長因子、トリアムシノロンなどのステロイド薬のグルココルチコイドクラスなどの抗異化剤、炎症性サイトカインの遮断薬、ＴＮＦ、ＩＬ‐１、アグリカナーゼおよびマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害薬からなる群から選択される。
【００１３】
他の側面によると、組成物が提供される。組成物は、骨または結合組織の疾患状態の処置用治療薬剤である活性薬剤を含み、正味の正電荷が６より大きいポリマーを含む、平均粒子サイズが１０ｎｍ以下のナノ粒子を含む。いくつかの実施態様では、ポリマーの分子量が９０ｋｄ未満、１０ｋｄ〜９０ｋｄ、６０〜９０ｋｄ、６０〜８０ｋｄ、または６０〜７０ｋｄである。
いくつかの実施態様では、ポリマーは、ペプチドである。ペプチドは、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列からの５個以上のアミノ酸または配列番号１に記載のアミノ酸配列からの１５個以上のアミノ酸であってもよい。
【００１４】
いくつかの実施態様では、ナノ粒子は、正味の正電荷が６〜２０または正味の正電荷が７〜１４のポリマーを含む。
いくつかの実施態様では、ペプチドは、アビジン、アルブミン、ゼラチン、リゾチームおよび両性トリブロックペプチドからなる群から選択される。
他の実施態様では、治療薬剤はＩＧＦである。
【００１５】
他の側面では、疾患修飾性抗骨関節炎薬（ＤＭＯＡＤ）、同化促進成長因子および抗異化剤からなる群から選択された治療薬剤と、アビジンまたはその断片とのナノ粒子の組成物が提供される。いくつかの実施態様では、治療薬剤は、デキサメタゾンである。
いくつかの実施態様では、アビジンまたはその断片が完全長アビジンである。他の実施態様では、アビジンまたはその断片が、配列番号１に記載の断片である。更に他の実施態様では、アビジンが、エステル結合またはヒドラゾン結合などの共有結合を介して治療薬剤に結合している。他の実施態様では、アビジンが、非共有結合を介して治療薬剤に結合している。
いくつかの実施態様では、アビジンは、１〜４個のビオチン分子と会合している。
【００１６】
本発明は、その適用を、以下の説明に記載または図面に図示した成分の構成や構造の詳細に限定されるものではない。本発明は、他の実施態様でも可能であり、様々に実行および実施されることが可能である。前記の各実施態様および側面は、他の任意の実施態様または側面と組み合わせることができる。さらに、本明細書で使用された語句や用語は説明の目的であって、限定するものと解釈されるべきではない。本明細書における用語「含む」、「備える」、「有する」、「含有する」、「関与する」およびそれらの変形の使用は、その後に挙げられた要素およびその均等物ならびに追加の要素を包含することを意図している。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１（Ａ）は、表層ゾーンから進入する溶質の軟骨半円板片への一方向拡散（Ｘ方向）を可能とするように設計された輸送チャンバーを示す。（Ｂ）スライス（１００〜２００μｍ厚）を、軟骨半円板片（６ｍｍ直径、１ｍｍ厚）の中心から切り出し、選択した期間溶質輸送を行った後、透過およびＸ方向の溶質濃度プロフィールを評価するために、スライスのＸ‐Ｙ面を共焦点顕微鏡により１０倍の倍率で画像化した。矢印は、表層ゾーン（ＳＺ）を通過する溶質の拡散方向を示す。半円板片の最上部および最下部のエッジ効果を回避するために、スライスの中間領域（点線の境界で示す）の画像を撮像した。ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）フィルターキューブを、ＦＩＴＣを抱合する溶質を画像化するために使用した。量子ドット（ＱＤ）は、グリーンＱＤ用５６５／３０ｎｍフィルター、レッドＱＤ用６４０／５０ｎｍフィルターおよび６２５ｎｍＬＰダイクロイックミラーを含有するフィルターキューブを使用して画像化した。
【００１８】
【図２】図２は、軟骨円板片の中へ取り込まれた量子ドットＱＤ（ＱＤ）を示す。図２Ａは、１５ｎｍの中性ドットの２４時間取り込みを示す。図２Ｂは、正に帯電したＱＤを示す；矢印は、軟骨の表層ゾーンを示す。図２Ｃは１５ｎｍの中性のＱＤ、図２Ｄは正に帯電したＱＤの（１ＸＰＢＳ浴への）２４時間脱着を示す。
【００１９】
【図３】図３は、ウシ軟骨外植片内部の濃度プロフィールの共焦点画像を図示する。グラフは、各スライスの厚さ（共焦点画像のＸ方向、図示せず）を横断する平均蛍光強度を、共焦点画像の左端からの距離の関数としてプロットしたものである。図３Ａは、ＦＩＴＣ（ＭＷ３８９Ｄａ、直径約０．９ｎｍ）のプロフィールを示す。図３Ｂは、ＦＩＴＣ‐デキストラン（ＭＷ８ｋＤａ、直径約４．３ｎｍ）のプロフィールを示す。図３Ｃは、２４時間軟骨中への拡散した後のＦＩＴＣ‐デキストラン（ＭＷ４０ｋＤａ、直径約１０ｎｍ）のプロフィールを示す。図３Ｄは、２４時間拡散後の軟骨外植片内部のＦＩＴＣ‐デキストラン（ＭＷ４０ｋＤａ、直径約１０ｎｍ）濃度のプロフィールの共焦点画像を、図３Ｅは４８時間、図３Ｆは９６時間をグラフとして示す。図３Ｇは、軟骨外植片の中へ２４時間拡散した後のニュートラアビジン（中性電荷、ＭＷ６０ｋＤａ、直径約７ｎｍ）の濃度のプロフィールの共焦点画像を、図３Ｈは４８時間、図３Ｉは９６時間をグラフとして示す。
【００２０】
【図４】図４は、正常な軟骨外植片内部での直径１５ｎｍの濃度プロフィールの分析に関する。非官能化Ｃｄ‐ＳｅＱＤを、２４時間吸収および２４時間脱着（１ＸＰＢＳ浴中へ）後に測定した。正常な軟骨外植片内部での１５ｎｍのアミン官能化ＱＤの濃度プロフィールも、２４時間吸収および（１ＸＰＢＳ浴中へ）２４時間脱着後に評価した。２４時間吸収または（１ＸＰＢＳ浴中へ）２４時間脱着後のトリプシン処理軟骨外植片（１ｍｇ／ｍＬ、２４時間処理）内部の１５ｎｍの非官能化ＱＤの濃度のプロフィールも評価した。図４Ａは、２４時間で正常なおよびトリプシン処理ウシ軟骨外植片へ吸収されたＣｄ‐ＳｅＱＤ浴中のカドミウムの初期モル率を示す。図４Ｂは、２４時間で吸収したカドミウムのうち、１ＸＰＢＳまたは１０ＸＰＢＳ中へ２４時間脱着後に軟骨外植片内部に保持された率を示す。外植片は、ＨＮＯ３を使用して完全に消化し、全カドミウム量は誘導結合プラズマ質量分析計（ＩＣＰ‐ＭＳ）を使用して検出した。データは、正常およびトリプシン処理軟骨の両方のものである。各値は、平均値±ＳＥＭで表し、各条件でｎ＝６の軟骨サンプルである。棒の上の水平な線は、処理群間の有意差を示す；＊は、トリプシン処理および正常な軟骨間の有意差を示す；ｐ＜０．０５。
【００２１】
【図５】図５は、ＦＩＴＣおよびＦＩＴＣ‐デキストランの軟骨外植片を通過して拡散する実験における表面積により標準化した蛍光強度を示す。図５Ａは、２４時間でのＦＩＴＣ（３００Ｄａ）、ＦＩＴＣ‐デキストラン（８ｋＤａ＆４０ｋＤａ）を示し、図５Ｂは、２４時間〜９６時間のＦＩＴＣ‐デキストラン（４０ｋＤａ）を示す。
【００２２】
【図６】図６は、関節傷害をシミュレートするためのin vitroシステムを使用して、機械的傷害およびＴＮＦαおよびＩＬ‐６の併用で処理した正常なヒト膝軟骨（ドナー組織）に対するデキサメタゾンの効果を示す（従来例）。
【００２３】
【図７】図７は、正常なウシ軟骨中でのＧＡＧ損失および軟骨細胞生合成に対するデキサメタゾンの効果を示す。図７Ａは、ウシ軟骨からのＧＡＧ損失を示す。図７Ｂは、ウシ軟骨中での硫酸塩取り込みを示す（従来例）。
【００２４】
【図８】図８は、１０ｎｍの担体粒子によるナノ粒子の自由拡散（ＦＤＮ）アプローチを示す。
【００２５】
【図９】図９は、サイズが１０ｎｍより大きい荷電担体粒子によるナノ粒子表面結合（ＳＢＮ）アプローチを示す。
【００２６】
【図１０】図１０は、ＰＰＡ薬物ポリマー抱合体の特性を示す。図１０Ａは、ＰＰＡの分子構造を示し、ＰＰＡは、薬物放出速度を制御するための任意のリンカーを介して薬物を抱合するポリエチレン‐グリコール由来ポリ‐Ｌ‐グルタミン酸骨格からなる。図１０Ｂは、ＰＰＡナノ粒子の動的光散乱を示す。サイズは、サイズ選択フィルターに基づいて予想したものよりより小さいものであるが、傾向は一致している。（挿入図）サイズ選択後の５ｎｍＰＰＡナノ粒子のゲル浸透クロマトグラフを示す。図１０Ｃは、９５％ウシ胎仔血清で３７℃で４時間インキュベーションした後のＰＰＡナノ粒子の血清タンパク質との非特異的結合を示す。非特異的結合は観察されなかった。図１０Ｄは、ＰＰＡナノ粒子のＮＭＲの結果を示す。ＰＰＡナノ粒子は、高度の薬物負荷およびペグ化を示す。
【００２７】
【図１１】図１１は、アビジン取り込みを表すグラフを示す。図１１Ａは、ニュートラアビジンと比較してアビジンの２４時間における取り込みが有意に高いことを視覚的に証明している、図１Ａの輸送チャンバーを示す。‘Ａｖ’＝アビジン；‘Ｎｕ’＝ニュートラアビジン。図１１Ｂおよび図１１Ｃは、２４時間正常な軟骨外植片へ吸収されたアビジン（正電荷、ＭＷ６６ｋＤａ、直径約７ｎｍ）およびニュートラアビジンの正常な軟骨外植片内の濃度プロフィールをグラフとして示す。図１１Ｄおよび図１１Ｅは、アビジンの（Ｄ）１ＸＰＢＳおよび（Ｅ）１０ＸＰＢＳの中への２４時間脱着の効果をグラフとして示す。
【００２８】
【図１２】図１２は、アビジン、ニュートラアビジンの取り込み比の測定値および脱着の結果のグラフを示す。図１２Ａおよび図１２Ｂは、正常な軟骨外植片および４０％ＧＡＧ枯渇軟骨外植片（コンドロイチナーゼ‐ＡＢＣによる）での１〜４日間の平衡化期間後の（Ａ）アビジンおよび（Ｂ）ニュートラアビジンを示す。図１２Ｃは、２４時間で吸収されたアビジンおよびニュートラアビジンの１Ｘおよび１０ＸＰＢＳ中へ脱着後の外植片の内部に保持されたモル率を示す。各値は、平均値±ＳＥＭで表され；正常な軟骨条件の処理群毎にｎ＝１８の軟骨サンプル（３匹の動物の各々から６個の円板片）および４０％ＧＡＧ枯渇軟骨の処理群毎にｎ＝６の軟骨サンプル（１匹の動物から）を使用した。水平な棒の上の線は、処理群間の統計的有意差を示す。＊は、ＧＡＧ枯渇および正常な軟骨間の有意差を示す；ｐ＜０．０５。
【００２９】
【図１３】図１３は、プロテアーゼ阻害剤添加１ＸＰＢＳ中３７℃で３日間平衡化後の軟骨外植片中のＦＩＴＣ標識アビジンの濃度依存性取り込み比を示す。段階的量の未標識アビジンを固定量のＦＩＴＣ‐アビジン（＜１μＭ）に添加した。等式（５）の理論カーブ（実線）をデータにフィットさせて、Ｋ、ＫＥＱ、およびＮＴの最適値を得る。予測値は、Ｋ約６、ＫＥＱ約１５０μＭおよびＮＴ約３０００μＭである。浴中全アビジン濃度は、標識および未標識アビジンの合計である。データは平均値±ＳＤで表され、条件毎にｎ＝４の円板片を使用した。
【００３０】
【図１４】図１４は、上流での添加濃度に対して標準化した下流濃度測定値を時間に対してプロットした。６ｍｍ直径、４００μｍ厚の軟骨外植片３片からなる群を横切るアビジン‐ＦＩＴＣの非平衡拡散輸送を示す。ｔ＝０分にアビジン‐ＦＩＴＣを上流チャンバーに添加した。有効拡散率はτlagから、定常状態拡散率はアビジン‐ＦＩＴＣの拡散流速測定値から算出した（すなわち、時間に対する濃度の傾き）。ｔ＝１８６分で、フリーなＦＩＴＣを上流チャンバーに添加し、未結合ＦＩＴＣの全流速への寄与を推定した。
【００３１】
【図１５】図１５は、蛍光標識したアビジンの軟骨中の組織内サイトへの競合的結合を示す。図１３のデータを、式（２）の結合等温線の形式で再プロットした。
【００３２】
【図１６】図１６は、アビジンの取り込み量Ｒｕ（ＫNeutrAvidinｒｚ）をＹ軸に、ＣAvidinBath‐finalをＸ軸にプロットした最適化のグラフを示す。
【００３３】
【図１７】図１７は、アビジン（Ａｖ）の６時間、２４時間、４日および７日およびニュートラアビジン（Ｎｕ）の２４時間でのラット膝関節から得た異なる組織におけるＡｖおよびＮｕの取り込み量および保持量を示す。各処理条件には、６匹のラットの右側膝関節由来の組織試験片を用いた。対側（左側）膝関節由来の組織試験片を各処理条件の対照とし使用し、蛍光はゼロであった。データは平均値＋／−ＳＤで与えられる。
【００３４】
【図１８】図１８は、ｓＧＡＧ濃度測定値を表す一連のグラフを示す。図１８Ａは、組織の湿重量ｍｇあたりのｓＧＡＧをμｇで表した、ＤＭＭＢアッセイで測定したラット膝の異なる組織におけるｓＧＡＧ濃度を示す。データは、平均値＋／−ＳＤで表し、Ｎ＝７匹の動物で行った。＊は、軟骨と比較した統計的有意性を示す；ｐ＜０．０５。図１８Ｂは、異なる組織でのｓＧＡＧ濃度とアビジン半減期の関係を示す（Ｃ‐関節軟骨；ＱＴ‐四頭筋腱；Ｌ‐靭帯（ＡＣＬ＆ＰＣＬ）；Ｍ‐半月板；ＰＴ‐膝蓋腱）。菱形は、実験データを示し、実線は線形最小二乗法による近似を示し、点線は９５％信頼区間を示す。Ｒ２＝０．８３
【００３５】
【図１９】図１９は、冠状（Ａ〜Ｂ）または矢状（Ｃ〜Ｊ）断面でのナイーブラット膝組織のトルイジンブルー染色を示す画像セットを示す。写真は、２．５倍（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、およびＩ）および１０倍の倍率（Ｂ、Ｄ、Ｆ、ＨおよびＪ）で撮像した。（Ａ〜Ｂ）骨端軟骨板上の内側大腿顆。（Ｃ〜Ｄ）脛骨プラトーおよび半月板を示す内側関節区画。（Ｅ〜Ｆ）大腿骨滑車部および膝蓋腱。（Ｇ〜Ｈ）膝蓋骨および軟骨の近位部と四頭筋腱および隣接するスープラパテラ。（Ｉ〜Ｊ）脛骨および大腿付着前十字靱帯。ＡＣＬ‐前十字靱帯、ＡＨＣ‐関節硝子軟骨、ＡＨＭＭ‐内側半月前角、ＢＭ‐骨髄、ＥＰ‐骨端軟骨板、ＦＢ‐大腿骨、ＨＦＰ‐ホッファ脂肪パッド、ＰＢ‐膝蓋骨、ＰＴ‐膝蓋腱、ＱＴ‐四頭筋腱、ＳＰ‐スープラパテラ、ＳＹ‐滑膜、ＴＢ‐脛骨。
【００３６】
【図２０】図２０は、一連のグラフを示す。図２０Ａは、アビジンの１回用量０、１００ｎＭ、１μＭおよび１００μＭでの４日間および１０日間処理に対して、ウシ軟骨から培地へのｓＧＡＧ累積損失値を示す。培地は、アビジンの補充なしに２日ごとに交換した。図２０Ｂは、図２０Ａと同じ軟骨円板片に対してプロリン（Ｈ３）取り込み速度を使用して測定した培養の最後の４８時間の間のウシ軟骨細胞のタンパク質合成を示し、図２０Ｃは、硫酸（Ｓ３５）でのｓＧＡＧ合成を示す。各値は、平均値＋／−ＳＥＭで表し；Ｎ＝２匹の動物（６個の円板片／動物）で行った。＊は、対照無処理条件と比較した統計的有意性を示す；ｐ＜０．０５。
【００３７】
【図２１】図２１Ａは、ＰＥＧアビジン内でのデキサメタゾンの超分子捕捉を示す。図２１Ｂは、ＰＥＧアビジン内でエステル結合したデキサメタゾンを示す。図２１Ｃは、ＰＥＧアビジン内でヒドラゾン結合したデキサメタゾンを示す。
【００３８】
【図２２】図２２Ａは、超分子捕捉（非共有結合）構造の薬物放出速度を示す。図２２Ｂは、エステルリンカー（共有結合）を有する構造と非共有結合的抱合からの薬物放出速度の比較を示す。図２２Ｃは、ｐＨ７およびｐＨ４でのヒドラゾンリンカー（共有結合）の薬物放出速度を示す。
【００３９】
【図２３】図２３は、デキサメタゾン固定化アビジン（エステル結合）の合成経路スキームを示す。
【００４０】
【図２４】図２４は、ヒドラゾン結合の形成を介したデキサメタゾン固定化アビジンの合成スキームを示す。
【００４１】
【図２５】図２５は、図２３に示すようにエステル結合を用いて作成したアビジン‐デキサメタゾン構造を用いた結果を示す。図２５Ａは軟骨組織を、対照、ＩＬ‐１（１ｎｇ／ｍＬ）、単一用量のデキサメタゾン（１００μｍ）、単一用量のアビジン‐デキサメタゾン粒子（２５〜１００μｍ）、または８日間連続用量のデキサメタゾン（１００ｎＭ）に暴露したときのｓＧＡＧ累積損失率を示す。図２５Ｂは、同一条件のそれぞれのｓＧＡＧ合成速度を示す。
【００４２】
詳細な説明
本発明によれば、疾患の予防および／または処置のための粒子を用いた薬物送達システムを容易にする方法および試薬が提供される。特に、本明細書に記載される粒子システムは、例えば筋骨格疾患および／または傷害の処置のために薬剤を骨および結合組織へ送達するのに有用である。筋骨格疾患および／または傷害の処置に使用される送達システムが、軟骨および他の結合組織または骨のより深いゾーンまで薬物を透過できることが重要である。本発明の組成物は、より深部の組織ゾーンへの薬物の透過を可能とすること、かつ効果的な処置を確保するために数週間組織内での薬物の保持を容易にすることに効果的である。従来の治療法では、深部への透過および持続する薬物送達を提供することができないため、これらの効果は、当該分野において、多大の進歩をもたらすものである。粒子は、例えば毒性や安定性の問題のために全身へ送達できない薬剤を局部へ送達するためにも有用である。例えば、本発明の粒子は、ＩＧＦを骨組織へ送達するために使用可能である。
【００４３】
本発明の方法は、いくつかの例では、結合組織を透過することが不可能なより大きい粒子および／または結合組織を透過することが可能なより小さい粒子の使用を含む。より大きい粒子の表面は、軟骨の表面への結合を可能とするために、結合組織に結合する化合物により官能化することができる。例えば、分子量の小さい薬物（例えば、ステロイドまたはグルココルチコイド（約３００Ｄａ））を、サイズが１０ｎｍ未満のナノ粒子へ抱合または内部に組み込ませることができる。ＩＧＦ（約７ｋＤａ）のような成長因子などのより大きい薬物は、より大きい粒子（１０ｎｍ以上）の表面に係留または内部に組み込ませることができる。異なるサイズの粒子を利用した２つのアプローチを組合わせることにより、抗異化特性および同化促進特性を有する複数の薬物の軟骨への送達を可能とする。
【００４４】
従って、本発明は、いくつかの側面では、マイクロ粒子、ナノ粒子およびそれらの組成物ならびにそれらの使用に関する。本明細書で使用される「マイクロ粒子」とは、平均粒子サイズが１０ｎｍより大きい粒子である。いくつかの実施態様では、マイクロ粒子のサイズは、１０ｎｍより大きく１００ｎｍまでである。他の実施態様では、マイクロ粒子のサイズは、１０ｎｍより大きく８０ｎｍまでであり、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、または１５ｎｍまでである。いくつかの例では、マイクロ粒子の最小サイズは、１２ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、または３０ｎｍである。いくつかの例では、マイクロ粒子の最大サイズは５００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、２０ｎｍ、または１５ｎｍである。マイクロ粒子における「マイクロ」という用語は、ミクロンのサイズを有する粒子を意味するのではない。むしろ、本特許出願の文脈では、マイクロ粒子という用語は、本明細書に記載される２つのタイプの粒子のうちのより大きいものを意味するために使用される。
【００４５】
本明細書で使用される「ナノ粒子」は、平均粒子サイズが１０ｎｍ以下の粒子である。平均粒子サイズとは、粒子のグループ内の平均粒子直径を意味する。いくつかの実施態様では、マイクロ粒子のサイズは、１〜１０ｎｍ、２〜１０ｎｍ、３〜１０ｎｍ、４〜１０ｎｍ、５〜１０ｎｍ、６〜１０ｎｍ、２〜８ｎｍ、３〜７ｎｍ、または１〜９ｎｍである。
【００４６】
他の例では、粒子は、正味の正電荷が６より大きいポリマーからなる。ポリマーは、例えば、９０ｋｄ未満の分子量であり、ペプチドであることができる。正味の正電荷が６より大きいペプチドに基づくナノ粒子である。いくつかの例では、ナノ粒子の正味の正電荷は７〜１４である。これらのナノ粒子は、結合組織を透過するのに特に有用である。有用なペプチドとしては、限定されるものではないが、アビジン、アルブミン、ゼラチン、リゾチームおよび両親媒性のトリブロックペプチドおよびそれらの断片が挙げられる。
【００４７】
本発明のペプチドに基づくナノ粒子の例は、限定するものではないが、図２１に示される。本発明において有用なナノ粒子の代表例は、アビジンが共有結合または非共有結合でデキサメタゾンなどの活性薬剤に抱合しているアビジンペプチドである。アビジンは、デキサメタゾンへのエステル結合またはヒドラゾン結合を介して直接デキサメタゾンに連結することができる。あるいは、アビジンは、１つ以上のこれらの結合でデキサメタゾンに共有結合で結合したかまたはデキサメタゾンに非共有結合で会合した１つ以上のビオチンに連結することができる。アビジンは、１〜４個のビオチン分子と会合可能である。ビオチンと連結していない、または１、２、３または４個のビオチンと連結したアビジンを有する構造が、本発明によって想到される。そして、各ビオチンは、同一または異なる結合を介して直接または間接的に活性薬剤に連結することができる。
【００４８】
「粒子」という用語は、本明細書に記載されるマイクロ粒子およびナノ粒子の総称として使用される。本発明の粒子は、通常治療薬が到達するのが困難な結合組織と相互作用するように設計される。例えば、軟骨は、コラーゲン原線維と、高度に負に帯電したＧＡＧ鎖を含有するアグリカンプロテオグリカンと、低密度の細胞（軟骨細胞）により合成され続ける多くの他の細胞外のタンパク質との高密度のネットワークからなる高度に複雑な血管性無リンパ性組織である。高密度のネットワーク組織への透過は大変難しいので、いかなる形態の徐放システムにおいても、軟骨へ薬物を送達することは困難である。
【００４９】
ナノ粒子は、組織の中へ透過および拡散することが可能なように、より小さい直径（約１０ｎｍ以下）を有するように設計される。これらの粒子が徐々に分解するにつれて、その中に含有されていたり、粒子表面に結合していた薬物が放出される。タンパク質の薬物には、軟骨基質内に可逆的に結合することを可能とする結合特性を有するものがある（例えば、ヘパリン様結合領域を有する成長因子のコンドロイチン硫酸およびヘパラン‐硫酸ＧＡＧ鎖への結合）。ナノ粒子の使用の模式図を、図８に示す。
【００５０】
マイクロ粒子は、本明細書に記載されるナノ粒子より大きい。本明細書に記載されるマイクロ粒子の使用は、図９に示される。このアプローチでは、粒子はまず軟骨の表面層（表層ゾーン）内で結合可能とさせる。粒子が徐々に分解するに連れて、薬物が放出され、ある期間の間薬物を持続的に放出する。薬物の分子量がとても小さい（ｋＤａ程度）ために、軟骨組織の厚さ全体に拡散することが可能である。
【００５１】
本発明の粒子は、粒子を調製するための従来技術で公知の任意の材料から作成できる。例えば、粒子はポリマーから作成できる。
【００５２】
本発明の粒子には、いかなるポリマーも使用することができる。ある実施態様では、例えば生体適合性ポリマーなどの生命システムでの使用に好適である公知のポリマーが使用される。ポリマーは、ヒトおよび／または動物での使用がＦＤＡにより承認されているものであってもよい。いくつかの実施態様では、ポリマーは生分解性である。ポリマーとしては、限定されるものではないが、ペグ化ポリ‐Ｌグルタミン酸（ＰＰＡ）、ポリエステル類、ポリ酸無水物類、ポリエーテル類、ポリアミド類、ポリアクリレート類、ポリメタクリレート類、ポリカルバメート類、ポリカーボネート類、ポリスチレン類、ポリ尿素類、ポリアミン類、ポリアクリルアミド類、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルトルエン、およびポリジビニルベンゼンが挙げられる。
【００５３】
ある実施態様では、ポリマーは、混合ポリマー、直鎖共重合体、分岐鎖共重合体、またはデンドリマー分岐鎖共重合体である。他の実施態様では、合成ポリマー（例えば、ポリ（乳酸‐ｃｏ‐グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリエステル類、ポリ酸無水物類、ポリアミド類など）が使用される。他の実施態様では、ポリマーは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）またはポリ（β‐アミノエステル）である。
【００５４】
ポリマーは、以下のモノマーの１つ以上から調製できる：アクリル酸、またはアクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ブチル、アクリル酸２‐エチルヘキシルまたはアクリル酸グリシジルなどのその任意のエステル；メタクリル酸または、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸セチル、メタクリル酸ステアリル、エチレングリコールジメタクリレート、テトラエチレングリコールジメタクリレート、メタクリル酸グリシジルまたはＮ、Ｎ‐（メタクリルオキシヒドロキシプロピル）（ヒドロキシアルキル）アミノエチルアミダゾリジノンなどのその任意のエステル；アリルメタクリレートなどのアリルエステル類；イタコン酸またはそのエステル；クロトン酸またはそのエステル；マレイン酸、またはマレイン酸ジブチル、マレイン酸ジオクチル、マレイン酸ジオクチルまたはマレイン酸ジエチルなどのそのエステル；
【００５５】
スチレン、またはエチルスチレン、ブチルスチレンまたはジビニルベンゼンなどのその置換誘導体；メタクリル酸ジメチルアミノエチルまたはメタクリル酸ブチルアミノエチルなどのアミン官能基を含むモノマーユニット；アクリルアミドまたはメタクリルアミドなどのアミド官能基を含むモノマーユニット；ビニルエーテル類などのビニル含有モノマー；ビニルチオエーテル類；ビニルアルコール類；ビニルケトン類；塩化ビニル類などのハロゲン化ビニル類；酢酸ビニルまたはバーサチック酸ビニルなどのビニルエステル類；アクリロニトリルまたはメタクリロニトリルなどのビニルニトリル類；塩化ビニリデンおよびフッ化ビニリデンなどのハロゲン化ビニリデン類；テトラフルオロエチレン；ブタジエンおよびイソプレンなどのジエンモノマー類；およびアリルグリシジルエーテルなどのアリルエーテル類。
【００５６】
ポリマーは、ペプチドであってもよい。ペプチドとしては、限定されるものではないが、アビジン、アルブミン、ゼラチン、リゾチームおよび両性トリブロックペプチドおよびそれらの断片が挙げられる。いくつかの実施態様では、粒子はアビジンまたはその断片から作成される。例えば、アビジンのアミノ酸配列は：mvhatsplll llllslalva pslsarkcsl tgkwtndlgs nmtigavnsr geftgtyita vtatsneike splhgtqnti nkrtqptfgf tvnwkfsest tvftgqcfid rngkevlktm wllrssvndi gddwkatrvg iniftrlrtq ke（配列番号１）である。アビジンの断片は、アビジンタンパク質内に存在する長さが少なくとも５個のアミノ酸からなる任意のペプチド配列である。いくつかの実施態様では、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または３０個のアミノ酸である。
【００５７】
両性トリブロックペプチドとしては、例えば：ＷＷＷＷＷＨＨＨＨＲＲＲＲＲＲＲＲ；［配列番号：２］ＩＩＩＩＩＨＨＨＨＲＲＲＲＲＲＲＲ；［配列番号：３］ＦＦＦＦＦＨＨＨＨＲＲＲＲＲＲＲＲ；［配列番号：４］ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＨＨＨＨＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫ；［配列番号：５］およびＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＨＨＨＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫ［配列番号：６］などのペプチドが挙げられる。
【００５８】
ペプチドは、様々なサイズであってもよい。いくつかの例では、ペプチドは、下限サイズが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または３０である。他の例では、ペプチドの上限サイズが５００、４５０、４２５、４００、３７５、３５０、３２５、３００、２７５、２５０、２２５、２００、１７５、１５２、１５０、１２５、１００、９０、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または９である。本発明に従って有用であるペプチドには、サイズの範囲をなす上記の下限および上限サイズの任意の組み合わせが含まれる。
【００５９】
「ペプチド」または「タンパク質」は互換的に使用可能であり、ペプチド結合により一緒に連結された少なくとも３個のアミノ酸の列を意味する。ペプチドとは、天然アミノ酸だけを含むものや、非天然のアミノ酸（すなわち、天然には生成しないがポリペプチド鎖に組み込み可能な化合物）および／またはアミノ酸類似体を含む、個々のペプチドまたはペプチドの集合体を意味することができる。また、１つ以上のアミノ酸が、例えば炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、または抱合、官能化、または他の修飾用リンカーなどの化学物質を添加することによって修飾する事ができる。他の修飾としては、ペプチドの環化、Ｄ‐アミノ酸の組み込みなどが挙げられる。
【００６０】
粒子は、脂質粒子であることができる。いくつかの脂質粒子システムには、脂質成分、カチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、多糖および／または正に帯電したペプチドが含まれる。
【００６１】
他の実施態様では、ポリマーは炭水化物である（例えば、デキストラン、フルクトース、フルクトース、グルコース、転化糖、ラクチトール、ラクトース、マルチトール、マルトデキストリン、マルトース、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、イソマルト、キシリトール、ポリデキシトロース、セルロース、メチルセルロース、アミロース、デキストラン、デキストリン、デンプンなど）。
【００６２】
いくつかの実施態様では、ポリマーの平均分子量は、１，０００ｇ／ｍｏｌ〜５０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲であり、好ましくは２，０００ｇ／ｍｏｌ〜４０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲、より好ましくは５，０００ｇ／ｍｏｌ〜２０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲、更に好ましくは１０，０００ｇ／ｍｏｌ〜１７，０００ｇ／ｍｏｌの範囲である。
【００６３】
ポリマーの混合物を、本発明の粒子に使用することもできる。混合物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の異なるポリマーを含むことができる。ある実施態様では、混合物は、ポリ‐乳酸‐ｃｏ‐グリコール酸（ＰＬＧＡ）および／またはポリ（β‐アミノエステル）などの２または３個の異なるポリマーを含むことができる。
【００６４】
マイクロ粒子およびナノ粒子は、関節空間に長期間保持し、かつ最小限の毒性で局部の処置のために薬物の所望の速度での制御放出およびより小さい粒子からの鎮痛剤などの薬剤の即時放出のために粒子を設計するように、組成物として一緒に処方することができる。使用できる好ましいポリマーとしては、限定されるものではないが、ペグ化ポリ‐Ｌグルタミン酸（ＰＰＡ）および治療的使用にＦＤＡが認可したポリマーの中のグラフト共重合体が挙げられる。
【００６５】
適切な大きさおよび電荷を有する粒子を設計できることが重要である。第１の工程は、軟骨の中へおよびそれを通過して透過できるか、または組織表面に結合できるこれらの粒子の最適サイズおよび表面化学を決定することを含む。例に示すように、ナノサイズ量子ドットを使用した実験を行った。結果は、直径１５ｎｍ量子ドット（マイクロ粒子）が組織の最表層約５０ミクロンを透過することが可能であることを示した。正に帯電した量子ドットは、負に強く帯電した軟骨基質に結合することができることも発見した。
【００６６】
粒子、特にマイクロ粒子は、結合組織に結合する化合物で官能化することができる。結合組織に結合する化合物は、１つ以上の結合組織に結合可能な任意の化合物である。マイクロ粒子（例えば、＞１０ｎｍ）は、軟骨表面への結合を可能とする官能基を含有し、従って長期持続性薬物送達を提供する。これらの粒子は分解して薬物を放出し、薬物は分子量が小さいため自由に組織全体へ拡散可能である。結合組織に結合する化合物は、in vivoでのマイクロ粒子の結合組織への結合を容易にする。
【００６７】
結合組織に結合する化合物としては、限定されるものではないが、アミン類、リジン類、アルギニン類、結合組織に見られる高分子／タンパク質に特異的に結合可能な官能基が挙げられる。結合組織としては、軟骨（全タイプ：骨の間の関節、胸郭、耳、鼻、椎間板、顎関節の関節板などの体の多くの部位にみられる弾性、硝子、線維軟骨）特に軟骨の表層ゾーン、滑膜や滑膜内膜などの滑膜カプセルの要素、半月板、靭帯、および腱が挙げられる。接線方向の軟骨表層ゾーンは、コラーゲン含有量が最大であり、乾燥重量で約８５％を含む。結合組織にみられる高分子／タンパク質としては、限定されるものではないが、ラブリシン、コラーゲンＶＩ、コラーゲンＩＸ、プロテオグリカン、糖タンパク質、エラスチン、フィブリリン、フィブロネクチン、およびラミニンが挙げられる。
【００６８】
いくつかの例では結合組織に結合する化合物は軟骨結合性化合物である。軟骨結合性化合物は、軟骨または周囲組織に結合して粒子を局部に残存させる任意の化合物である。軟骨結合性化合物は、例えば、ペプチド、多糖、または小分子であってもよい。
【００６９】
本発明の粒子は、薬剤を結合組織へ送達するのに有用である。いくつかの例では、様々な割合で薬剤を組合わせたものを送達することが可能である。薬物放出のタイミングの制御は、マイクロ粒子の特性を制御することによって可能となる。例えば、第１の薬剤を、薬剤を時間をかけてゆっくりと放出するように設計されたマイクロ粒子の中に取り込むことが可能である。マイクロ粒子の放出特性は、従来公知である。第２の薬剤を、すばやく組織へ送達し、急速に放出されるように、ナノ粒子に含有させることが可能である。
【００７０】
活性薬剤を充填した粒子とは、活性薬剤が何らかの方法で会合した粒子を意味する。活性薬剤は粒子の全体と一体化することができ、または表面上に抱合することができ、または粒子内にカプセル化するなど任意の他の可能な方法で粒子と会合することができる。
【００７１】
マイクロ粒子は第１の活性薬剤を含み、ナノ粒子は第２の活性薬剤を含む。第１および第２の活性薬剤は、同一の活性薬剤または異なる活性薬剤であることができる。本明細書で使用される活性薬剤は、結合組織に効果を付与可能な任意の化合物を意味する。通常は、活性薬剤、第１または第２の活性薬剤は、筋骨格疾患の処置用の治療化合物、鎮痛剤または抗炎症薬剤などの疾患の症状を処置するのに有用な受動的な薬剤、または診断用または他の研究に基づく薬剤である。
【００７２】
筋骨格疾患の処置のための治療的薬剤は、疾患に影響を与える化合物である。これらの薬剤としては、限定されるものではないが、疾患修飾性抗骨関節炎薬（ＤＭＯＡＤ）、同化促進成長因子および抗異化剤が挙げられる。同化促進因子とは、限定されるものではないが、ＩＧＦ（インスリン様成長因子）：例えばＩＧＦ‐１、ＦＧＦ‐１５（線維芽細胞成長因子）、およびＢＭＰ７（骨形成タンパク質）が挙げられる。抗異化薬剤としては、限定されるものではないが、グルココルチコイドクラスのステロイド薬（例えば、トリアムシノロン、デキサメタゾンなどのグルココルチコイド類）、および炎症性サイトカインの遮断薬（例えば、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）やＩＬ‐１（インターロイキン）阻害薬、およびアグリカナーゼおよびマトリックスメタロプロテアーゼ）などのプロテイナーゼ類などの他の薬剤が挙げられる。
【００７３】
受動的な薬剤は、結合組織において疼痛の軽減または炎症の軽減などの生物学的効果を発揮する化合物である。受動的な薬剤としては、限定されるものではないが、クロニジン、カプサイシン、リドカイン、ブピバカイン、メピバカイン、ロピバカイン、テトラカイン、エチドカイン、クロロプロカイン、プリロカイン、プロカイン、ベンゾカイン、ジブカイン、塩酸ジクロニン、塩酸プラモキシン、ベンゾカイン、プロパラカイン、エプタゾシン、トラマドール、ペンタゾシンなどの鎮痛剤、およびアスピリンおよびイブプロフェンなどの非ステロイド抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）が挙げられる。
【００７４】
診断薬としては、気体；陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、コンピューター支援断層撮影像（ＣＡＴ）、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法、Ｘ線、蛍光透視法、および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に使用される市販のイメージング用薬剤；および造影剤が挙げられる。ＭＲＩにおける造影剤として適切に使用される材料の例としては、鉄、マグネシウム、マンガン、銅およびクロムならびにガドリニウムキレート化合物が挙げられる。
【００７５】
本発明の組成物は、筋骨格疾患を処置するのに有用である。ここで「筋骨格疾患」とは、身体の筋肉、関節、腱、靭帯および神経に影響を与える疾患を意味する。これらの疾患としては、限定されるものではないが、骨関節炎、背部痛、関節リウマチ、骨粗鬆症、化膿性関節炎、痛風、線維筋痛症および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）が挙げられる。
【００７６】
関節リウマチは、若年者に進行性の関節損傷および能力障害を引き起こす対称性炎症性多発性関節炎および肺および他の臓器の非関節性の併発により特徴付けられる全身性自己免疫慢性疾患である。化膿性関節炎は、血流や、おできなどの感染の局部サイトを介して、または時として骨髄炎の隣接サイトから、関節に到達可能な化膿性微生物、最も頻繁には黄色ブドウ球菌による関節の感染により起こるものである。痛風は、尿酸代謝の異常であり、尿酸ナトリウムの結晶が関節、柔組織、および尿路に堆積する。ＳＬＥは、核成分に対する抗体の存在により特徴付けられる。それは関節痛および発疹が最も一般的な臨床的特徴である多システム疾患であるが、血管炎、肺、心臓、腎臓、神経系、目の疾患ならびに胃腸管の合併症のすべてが起こる可能性がある。
【００７７】
いくつかの実施態様では、筋骨格疾患は骨関節炎である。骨粗鬆症はありふれた疾患であり、骨量の減少を引き起こす。骨関節炎は、世界中で１億５千万人以上が罹患している最もありふれた慢性病の１つであり、世界における最も蔓延している病気の１つである（WHO, 2009）。ＯＡは身体の関節を攻撃し、生産性および生活の質に影響を与え、患者に極度の障害を与える。関節リウマチ（ＲＡ）の薬の開発には多大な進歩があったが、ＯＡに使用可能な疾患修飾薬はない。
【００７８】
現行の治療は、短期間の疼痛および炎症の軽減をもたらすだけであり、末期ＯＡの特徴である必然的な関節軟骨の更なる劣化に対しての予防をもたらすものではない。これにより、完全な関節機能不全（骨および他の柔組織の変性など）がもたらされ、患者は関節置換が必要となる。従って、ＯＡ疾病機序を更に理解すること、そしてその治癒のために有効な治療薬および薬物送達システムを開発することが重要である。重要なことに、関節を損傷（例えば、若年者におけるスポーツ傷害による前十字靱帯（ＡＣＬ）断裂）した患者を含む外傷後ＯＡが最近関心を集めている。この患者集団では、ＯＡへの進行が速く、外傷が始まった時期および正確な原因がわかっているので早期介入および臨床試験の実施を可能とする機会が提供される（Anderson et. al., J. Orthop. Res. 2011）。
【００７９】
しかしながら、関節内での細胞生物学的および生化学的（タンパク質分解）異常が、ＯＡの進行においてＸ線検査での異常に何年も先行することがしばしば認められるようになっている。本発明は、傷害の正確な時期がわかっているので、疾病の早期介入および処置の新しい機会を提供する。この早期の処置は、関節炎の発症を予防し損傷した軟骨を修復するために傷害の直後に投与される「ワクチン」に類似したものとみなすことができる。短期間（数ヶ月）の処置が、最初期のＯＡの処置に効果的でありえる。そのような薬物は、全身性副作用を防ぐために傷害を受けた関節へ局所的および安全に送達することが重要である。さらに、薬物を軟骨中またはそれを通過して透過させ、有効な処置を確保するために数週間関節軟骨内に保持することが重要である。本発明の粒子を用いた薬物送達システムは、複数の生理活性のある分子を投与し、局部への送達および保持を可能とする。
【００８０】
従って、薬物送達機構は外傷後ＯＡなどの疾患を処置することに限定されず、ＯＡのより後期での関節中へ治療薬剤および鎮痛剤を送達することおよび／またはヒトおよび動物において局所的処置を要する任意の他のタイプの筋骨格疾患に使用することが可能である。
【００８１】
発明者等は、デキサメタゾンおよび同化促進薬剤で動物軟骨を短期間処置したところ、in vitroにおいて傷害後の軟骨変性を阻止し、生合成レベルが正常なレベルに回復することを報告した（Lu et. al., Arthritis Res. 2011）。現行の研究では（Y Wang, Y Li, P Kopesky, SG Chubinskaya, B Schoeberl, AJ Grodzinsky, IGF-1 and Dex Reduced Matrix Degradation in IL-1α-Treated Bovine Cartilage  and IL-1α±Injury-treated Human Cartilage, Trans Orthop Res Soc, San Antonio, Jan 26-29, 2013）、ヒト軟骨において同様のポジティブな効果を示している。in vitroでデキサメタゾン（ＤＥＸ）によりヒトおよびウシ軟骨外植片を短期間処置したところ、傷害直後に投与した場合、軟骨劣化の進行を阻止し、組織合成を維持することが可能であることが示された。
【００８２】
この処置は、傷害のすぐ後に投与する場合、ＯＡの発症を予防するために使用することができる。これらの従来のデータを、図６および図７に示す。１００ｎＭＤＥＸでのヒト軟骨の処置は、機械的な傷害により引き起こされるアグリカン‐ＧＡＧ損失、ならびに炎症性サイトカインＴＮＦαおよびＩＬ‐６を有意に減少させた（図６）。図７Ａおよび図７Ｂは、１０ｎＭＤＥＸでのウシ軟骨の処置でも、ＧＡＧ損失を有意に減少させ、アグリカン‐ＧＡＧ生合成レベルを正常なレベルに回復させることを示している。in vitro軟骨器官培養システムは、関節傷害（ＡＣＬ断裂など）の直後数週間に関節軟骨の微小環境における状態をシミュレートする方法で設定された（Lu et. al., Arthritis Res. 2011）。
【００８３】
これらの研究は当該分野において多大な進展をもたらしたが、筋骨格疾患の治療的処置には未解決の問題が存在する。例えば、ＤＥＸおよび成長因子の慢性的な全身での使用は、ネガティブな全身性副作用の原因となる。そのような化合物を関節の特定標的組織へ持続的に局部送達するために使用可能な薬物送達技術は現在のところ存在しない。ＯＡ処置の開発における未解決の問題のひとつは、経口またはＩＶ注射では薬物が循環系全体に分配され、罹患している関節組織への特異性を低減し、全身性有害作用をもたらすことである。
【００８４】
本発明の知見は従来の問題点を解決する。例えば、本発明は、グルココルチコイド類や生物学的製剤などの薬物を局所的に特定の関節組織に投与し、他の部位への送達を最小限としながら罹患した部位において最適な薬物濃度を可能とする、薬物送達システムの開発に関する。本発明の組成物は、薬物保持時間の増加および薬物放出速度の制御という利点も有する。特に、組成物は、有効な処置を確保するために、薬物を軟骨深部ゾーンへ透過することおよび軟骨内部で薬物を数週間保持することを可能とする。
【００８５】
組成物は対象に投与される。対象とは、ヒトまたは他の哺乳類、限定するものではないがイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シチメンチョウ、ニワトリ、例えばサルなどの霊長類を意味するものであってもよい。いくつかの実施態様では、対象は筋骨格疾患または骨関節炎を有する。
【００８６】
活性薬剤は、マイクロ粒子またはナノ粒子から放出されるとすぐに結合組織へ送達される。いくつかの例では、本発明の組成物は対象の関節へ送達される。関節としては、限定されるものではないが、膝、股、足首、脊椎、肩および肘関節が挙げられる。関節鏡下処置は、現在はこれらの関節において日常的に行われている。
【００８７】
本明細書で使用される、処置する、処置した、または処置しているという用語は、骨関節炎などの疾患に関して使用される場合は、骨関節炎が悪化することを阻止するための、処置しない場合と比較して最低限結合組織に関する更なる損傷を防止する治療を意味する。いくつかの例では、処置は、対象における症状の改善、またいくつかの例では対象が無症状となるような完全な治療的回復をもたらすであろう。それはまた、骨関節炎に罹患するリスクにある対象の処置で、そのような疾患の影響を防止するか、対象が発症する場合にはそれを低減するための処置を意味する。
【００８８】
活性薬剤の有効量という用語は、所望の生物学的効果を達成するために必要または十分な量を意味する。本明細書の教示と合わせて、様々な活性化合物の中から選択し、効力、相対的な生物学的利用率、患者の体重、有害な副作用の重篤度および好ましい投与態様などの因子を比較検討することで、有効な予防的または治療的処置法を、実質的に毒性を引き起こさないが、特定の対象の処置に完全に有効であるように計画することが可能である。ある特定の適用に有効な量は、処置する疾病または病状、投与される特定の活性薬剤、対象の大きさまたは疾病または病態の重篤度などの因子に依存して変動可能である。当業者は、過度の実験を必要とせずに特定の活性薬剤の有効な量を経験的に決定することが可能である。
【００８９】
本明細書に記載される粒子に使用される活性薬剤の対象用量は、通常投与１回につき約０．１μｇ〜１０ｍｇであり、適用によっては毎日、毎週、毎月、あるいはそれらの間の他の任意量で投与することが可能である。より典型的には、用量は投与または粒子につき約１０μｇ〜５ｍｇの範囲であり、最も典型的には約１００μｇ〜１ｍｇの範囲である。より典型的には、用量は投与毎に１μｇ〜１０ｍｇの範囲であり、最も典型的には１０μｇ〜１ｍｇの範囲である。
【００９０】
本明細書に記載される任意の化合物では、治療的に有効な量は最初に動物モデルで決定することが可能である。治療的に有効な用量は、ヒトですでにテストされた活性薬剤のヒトのデータから決定することも可能である。適用する用量は、投与される化合物の相対的生物学的利用率および効力に基づいて調整することが可能である。上記の方法および従来公知の他の方法に基づいて最大効力を達成するために用量を調整することは、当業者の能力により容易に可能である。
【００９１】
本発明の製剤は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性のある担体、補助剤、および任意に他の治療用成分を通常含有してもよい薬学的に許容される溶液として投与される。
【００９２】
治療での使用は、有効量の粒子およびそれに会合する活性薬剤を、粒子を所望の結合組織表面へ送達する任意の態様により対象に投与することが可能である。いくつかの実施態様では、関節内注射が、本発明の粒子の投与の態様として好ましい。特定の薬物によっては、他の投与経路としては、限定されるものではないが、経口、非経口、筋肉内、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、眼内、膣内、および直腸が挙げられる。
【００９３】
経口投与では、化合物は、活性化合物を従来公知の薬学的に許容される担体と混合して容易に処方することが可能である。そのような担体は、処置すべき対象が経口で摂取するように、本発明の化合物を、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方することを可能とする。経口用の医薬用調剤は、得られた混合物を任意に粉砕し、顆粒混合物を加工し、所望であれば適切な補助剤を添加した後、錠剤または糖衣錠などの固体賦形剤として得ることができる。
【００９４】
適切な賦形剤としては、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールなどの糖などのフィラー；例えば、コーンスターチ、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース製剤が挙げられる。所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤を添加することができる。任意に、経口製剤は、生理食塩水または緩衝液、すなわち内部の酸状態を中和するためのＥＤＴＡ中に処方することもでき、またはなんら担体なしに投与することもできる。
【００９５】
頬側投与では、組成物は、従来の仕方で処方した錠剤またはトローチ剤の形態をとってもよい。
【００９６】
吸入投与では、本発明に従って使用する化合物は、適切な噴霧剤例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体を使用して、加圧パックや噴霧吸入器からのエアロゾルスプレイの形態で従来の方法で送達することができる。加圧エアロゾルの場合、用量ユニットは、定量を送達するための弁を設けることで測定することができる。例えば吸入器または吹き入れ器において使用するゼラチンのカプセルおよびカートリッジが、化合物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉体基材の粉末状混合物を含有するように処方することができる。
【００９７】
全身へ送達することが望ましい場合には、化合物は、大量瞬時注射または持続点滴などの注射による非経口投与用に処方することができる。注射用製剤は、保存剤を添加した、アンプルなどのユニット用量形態または多用量容器で提供することができる。組成物は、油性または水性溶媒の懸濁液、溶液または乳濁液の形態であることができ、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの配合剤を含有することができる。
【００９８】
非経口投与用の医薬品としては、水溶性の形態の活性化合物の水性溶液が挙げられる。さらに、活性化合物の懸濁液は、適宜油性注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒または媒体としては、胡麻油などの油脂、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームを挙げることができる。水性注射懸濁液は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストランなどの、懸濁液の粘度を増加させる物質を含むことができる。任意に、懸濁液は、高濃度の溶液の調製を可能とするために適切な安定剤または化合物の溶解度を増加させる添加剤も含むことができる。
【００９９】
あるいは、活性な化合物は、使用前に、例えば無菌の発熱性物質のない水などの適切な溶媒と調製する粉体であってもよい。
化合物は、例えばカカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を含有する座薬または保持浣腸剤などの直腸または膣用組成物に処方することもできる。
【０１００】
以下の例は本発明の実施の具体例を示すためのものであり、本発明の範囲を限定する意図ではない。当業者には明らかなように、本発明は様々な組成物および方法に適用されるであろう。
【０１０１】
例
本明細書に記載される実験は、組織表面に結合可能な粒子が、徐々に分解し、薬物負荷量を放出することにより、持続性送達を提供できることを示すものである。これらの薬物（同化促進＋抗異化）は、軟骨全体へ拡散し、最深ゾーンにある標的（細胞および基質）にさえ到達することが可能である。
【０１０２】
例１：コンパクトな生体適合性ポリマー粒子の開発：
ポリエチレングリコール由来ポリ‐Ｌ‐グルタミン酸（ＰＰＡ）ナノ粒子を、（ｉ）５〜１５ｎｍの間の異なるサイズを有し、（ｉｉ）サイズ分布が狭く、（ｉｉｉ）薬物負荷が高く、（ｉｖ）制御可能なペグ化を有し、（ｖ）表面電荷が可変であり、（ｖｉ）表面が官能化されており、（ｖｉｉ）スケールアップおよび製造に適しており、（ｖｉｉｉ）様々な薬物との抱合に多用でき、（ｉｘ）安全性が高いように設計する。
【０１０３】
最適な治療効力のために、粒子は、軟骨における透過、薬物濃度、時間および空間的なプロフィールを最大とするよう設計することが可能である。いくつかの好ましいナノ粒子は、透過のために１０ｎｍ未満に製造されるが、滑液からすぐに消失しないように十分に大きいものである。サイズ分布の狭いナノ粒子のセットは、一連の異なる膜孔径を通過させるろ過により開発された（図１０Ｂの挿入図）。さらに、「リビング重合」と呼ばれる技術は、単分散ポリ‐Ｌ‐グルタミン酸（ＰＧＡ）を操作および合成するために使用された。この技術は、ＰＤＩが１．０１〜１．０４の間の３ｋＤａ〜１２０ｋＤａのＰＧＡを合成するために使用できる。ＰＥＧを６０％ｗ／ｗまで添加したが、それは高分子量ポリマーを水溶性とするのに重要である。６０％ｗ／ｗまでのＰＥＧは、ペグ化の量によるが薬物負荷を３８％ｗ／ｗまで増加させることができる。メトキシ‐ＰＥＧをアミノ‐ＰＥＧで置き換えることで、表面電荷を変化し、粒子を官能化することができる。
【０１０４】
例２：粒子の最適サイズの決定
ナノサイズ量子ドットを使用して、生きたウシ軟骨外植片への粒子の輸送を理解するための研究を行った。薬物は、軟骨の厚さ全体を透過し、有効な処置のために保持されることが好ましい。ウシ外植片を、粒子が軟骨表面ゾーン（図２Ａおよび図２Ｂの右側）に入るようにした特殊な輸送チャンバーにおいて１５ｎｍの中性量子ドット中で様々な時間インキュベートした。中性（図２Ｂ）および正に帯電した（図２Ａ）量子ドットの右側から左側への２４時間中の輸送は、１ｍｍ厚の軟骨外植片の表層ゾーンの最上部５０ミクロンの中へ透過したことを示した。
【０１０５】
データは、直径１５ｎｍの粒子が複雑な軟骨の網目構造の中へまたはその全厚を通って透過するのには大きすぎることを示している。しかしながら、これらの結果は、このサイズの粒子が軟骨表面内に残存し、生分解時に薬物負荷量を放出する能力、すなわち、本明細書で表面結合ナノ粒子（ＳＢＮ）アプローチとも呼ばれる能力を示した。
【０１０６】
図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃは、２４時間でＦＩＴＣ‐デキストラン（３００Ｄａ、８ｋＤａ、および４０ｋＤａ）がウシ軟骨外植片を通って拡散したときの蛍光グラフを示す。サイズ依存性の輸送が観察された：３００Ｄａの溶質は、組織全体を透過することができたが、４０ｋＤａの分子では透過勾配が明らかであった。このことは、サイズのより小さい粒子（例えば、図１０Ｂの７ｎｍのナノ粒子）が軟骨の深部ゾーンを透過するのに十分であることを示している。これは、本明細書でＦＤＮアプローチとも呼ばれる。
【０１０７】
結合を可能とする粒子の最適表面化学を決定すること。軟骨基質への結合に対する表面化学の影響を調べるために、粒子を開発した。軟骨は高度に負に帯電しているので、粒子の組織への結合を可能とするように正に帯電したアミン基を含有する粒子を開発しテストした。結果を図２に示す。図２Ｃおよび図３Ｄは、１ＸＰＢＳ中で２４時間インキュベーションした後のこれらのサンプルの脱着の結果を示す。中性の量子ドットはサンプルの外へ拡散したが、荷電した量子ドットは拡散しなかった。  
【０１０８】
例３：ナノ粒子および高分子の軟骨中へのサイズ依存性輸送
サンプル調製：軟骨円板片（６ｍｍ直径、１ｍｍ厚）は、１〜２週齢仔ウシ膝関節の大腿膝蓋溝からすでに報告された方法で収集した（Patwari et al., Arth. Rheum. 2003）。円板片は、３７℃５％ＣＯ２インキュベーター中でプロテアーゼ阻害剤（ロシェ製、５０ｍＬＰＢＳ中コンプリート）を添加したＰＢＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋無し）中で予め４８時間平衡化した。
【０１０９】
溶質タイプ：２種類の直径１５ｎｍ（ＭＷ約３００ｋＤａ）の量子ドット（ＱＤ）を使用した：（ｉ）正に帯電した、および（ｉｉ）中性電荷を持つ；同一濃度。ＦＩＴＣ（ＭＷ約３００Ｄａ、直径約０．９ｎｍ）および異なるＭＷ（約８ｋＤａ、直径約４．３ｎｍ；約４０ｋＤａ、直径約１０ｎｍ）のＦＩＴＣ抱合デキストラン類（Ｄｅｘ）（Sigma Aldrich製）の輸送も試験した。
【０１１０】
輸送試験：特別なＰＭＭＡ透明輸送チャンバーを、軟骨の円板片の一側（表層ゾーン）だけに溶質が拡散できるように設計した。チャンバー表面への溶質の非特異的結合を阻止するために、チャンバーをカゼインで処理した。その後、平衡化した軟骨円板片を半分に切り、固定具の‘スロットチャンバー’の中央に配置した。表層ゾーンに対向するチャンバーの一側を約４５μＬの溶質‐ＰＢＳ溶液で満たした；他の側は１ＸＰＢＳだけで満たした。
【０１１１】
その後、固定具を脱イオン水を含有するペトリ皿に置き、カバーをし、軟骨表面での滞留層を最小とするためにインキュベーター内側の低速ロッカー上に配置した。２４時間後、円板片を浴槽から取り除き、１ＸＰＢＳで軽くリンスし、サンプル表面に付着した粒子を取り除くために払き取った。スライスをサンプルの中心から切り出し、共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ製ＴＥ２０００‐Ｕ）を使用して１０倍の倍率で画像化した。画像化に使用したゲインで軟骨からの自己蛍光を除去するためにフィルターを選択した。適切な画像比較を確実にするために、各溶液中のＦＩＴＣ濃度を同一とする溶質濃度を選んだ。脱着を検討するために、溶質／粒子溶液をチャンバーから取り除き、ＰＢＳで置換した。
【０１１２】
結果
図２Ａおよび図２Ｂを作成するために使用した共焦点画像の右縁は、１５ｎｍのＱＤが軟骨表層ゾーンに侵入し、組織の最初の４０〜５０μｍを透過するだけであることを示した。図２Ｃおよび図２Ｄは、１ＸＰＢＳ中で２４時間インキュベーションした後のＱＤの同一のサンプルからの脱着を示す。中性ＱＤはサンプルから外へ拡散したが、荷電したＱＤはしなかった。
【０１１３】
ＦＩＴＣ‐デキストラン（３００Ｄａ、８ｋＤａ、４０ｋＤａ）は、２４時間でウシ軟骨外植片全体へ拡散した。サイズ依存性輸送が観察された：３００ＤａのＦＩＴＣは組織全体を迅速に透過したが、４０ｋＤａのＦＩＴＣ‐デキストランでは透過勾配が明らかであった。ＦＩＴＣ‐デキストラン（４０ｋＤａ）は、２４時間、４８時間、および９６時間で様々な透過深度を示した。図５Ａ、Ｂは、サンプルの表面積で標準化した強度（すなわち、曲線の下の面積）を示すが、観察された傾向を更に明確にしている。
【０１１４】
考察
結果は、分子量約４０ｋＤａ（直径約１０ｎｍ）の溶質が４日間で１ｍｍ厚のウシ外植片の主な部分を透過・拡散したが、直径１５ｎｍの粒子は６日間で表層ゾーンの最初の４０〜５０μｍを透過することができるだけであったことを示した。これは、１５ｎｍの直径は軟骨の複雑な網目構造を透過するには大きすぎることを示している。また、結果は、中性粒子は１ＸＰＢＳ中で脱着したが、正に帯電した粒子はしなかったことを示した。
【０１１５】
これらの知見は、直径１０ｎｍ未満のナノ粒子は、ナノ粒子が軟骨の厚さを通って透過できることを更に示した。より小さいサイズの粒子におけるin vivoクリアランスの問題が、最小の実用的な粒子のカットオフサイズ限度を規定するであろう。これは、約１０ｎｍのポリマー粒子が組織中へ透過・拡散できることを示している。それらが徐々に分解されるにしたがって、表面内に含有または表面に結合した官能化薬物を放出することができる。理想的なサイズは７〜１０ｎｍの範囲である。
薬物それ自身が、軟骨基質内で可逆的に結合することを可能とする結合特性を有することができる。このアプローチは、本明細書では「ナノ粒子フリー拡散（ＦＤＮ）」とも呼ばれる。
【０１１６】
本明細書で開示される他のアプローチでは、粒子は、ＱＤデータ（図２）で示されるように軟骨の表面層（表層ゾーン）内にまず結合することが可能である。粒子が徐々に分解されるに連れて、薬物が放出され、ある期間における持続性薬物放出を提供する。薬物の分子量（約ｋＤａ）が大変小さいため、軟骨の組織の厚さを通過して拡散できる。このアプローチは、本明細書では「ナノ粒子表面結合（ＳＢＮ）」とも呼ばれる。
【０１１７】
例４：軟骨中への電荷駆動型輸送のモデルとしてのアビジン：外傷後骨関節炎薬物送達との関連
材料および方法
緒言：輸送に関する一連の研究において、軟骨円板片を、サイズおよび電荷の異なる蛍光タグを付けた種々の溶質を含有する培地でインキュベートした。その後、組織内での各溶質タイプの透過の深度および空間分布を決定するために、軟骨の断面を共焦点顕微鏡を使用して画像化した。溶質の全取り込み量を得るための別の実験では、軟骨円板片を選択した溶質の溶液中で平衡化後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）浴中へ脱着した。吸収および脱着浴中での蛍光測定値を使用して、組織内でのこれらの溶質の平衡溶質取り込み比、溶質分配係数、および平衡結合特性を数値化した。軟骨円板片を通過する非平衡輸送の追加の検討により、軟骨内での選択した溶質の有効拡散率の推定が可能となった。
【０１１８】
ウシ軟骨収集および培養
軟骨円板片は、１〜２週齢仔ウシ膝関節（Research87, Hopkinton, MAより入手）の大腿膝蓋溝からすでに報告されている方法で収集した（Patwari et al., Arthritis Rheum, 2003）。簡潔に述べると、円柱状の軟骨円板片（直径３ｍｍまたは６ｍｍ）の芯をダーマルパンチを使用して取得し、その後スライスしてインタクトな表層ゾーンを有する軟骨の最上部１ｍｍを得た。すべての処理群で軟骨円板片は、関節表面に沿った深さおよび位置を一致させた。円板片はその後３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中でプロテアーゼ阻害剤（５０ｍＬＰＢＳ中コンプリートプロテアーゼカクテル錠剤、Roche Applied Science IN）を添加したＰＢＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋無し）中で予め２４〜４８時間平衡化した。
【０１１９】
溶質のタイプ
サイズ排除試験：直径約０．９ｎｍ〜１５ｎｍの広いサイズ範囲を有する溶質を使用した：（ｉ）フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ、ＭＷ３８９．３Ｄａ、直径約０．９ｎｍ）、（ｉｉ）ＦＩＴＣ‐デキストラン（８ｋＤａ、水力学的直径４．３ｎｍ）、（ｉｉｉ）ＦＩＴＣ‐デキストラン（４０ｋＤａ、直径約１０ｎｍ（以上、Sigma Aldrich, MO）；（ｉｖ）ＦＩＴＣ‐抱合ニュートラアビジン、ｐＨ７で電気的に中性な球状タンパク質（６０ｋＤａ、直径約７ｎｍ；Invitrogen, CA）および（ｖ）直径１５ｎｍのＣｄ‐Ｓｅ量子ドット（ＭＩＴで合成（Liu et al., J Am Chem Soc, 2010））。
【０１２０】
結合／保持試験：静電相互作用の溶質輸送、取り込みおよび結合への影響を（ｉ）ＦＩＴＣ‐抱合および非標識アビジン（ｐＩ１０．５、６６ｋＤａ、直径約７ｎｍ、Invitrogen, CA）、ニュートラアビジンの正に帯電したカウンターパート、および（ｉｉ）アミンで官能化した直径１５ｎｍのＣｄ‐Ｓｅ量子ドット（ＱＤ）（Invitrogen, CA, USA）を使用して試験した。ＦＩＴＣ‐デキストラン（８ｋＤａ）は、１ｋＤａ分子量カットオフ透析チューブ（フロート‐Ａ‐ライザーＧ２、SpectrumLabs Inc., CA）を使用して透析し、他のすべての溶質は３ｋＤａカットオフ分子量遠心分離フィルター（アミコンウルトラ‐４、Millipore Corp, MA）を使用して透析し、フリーなＦＩＴＣの量を求めた；透析後のこれらの溶液の蛍光読み取り値は、フリーなＦＩＴＣの量が無視できることを示した。溶質タイプをそれらの物性とともにを表１に示す。
【０１２１】
【表１】
2016511747.tif 000003
【０１２２】
共焦点顕微鏡画像化用輸送構造体
特別なポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）輸送チャンバーを、組織の表層ゾーン（ＳＺ）から軟骨に侵入する溶質の一方向の拡散（すなわち、図１のＸ方向の輸送）を研究するために設計した。チャンバーの壁は、溶質のＰＭＭＡ表面への非特異的結合を阻止するためにカゼインで処理した。予め平衡化した軟骨円板片（６ｍｍ直径、１ｍｍ厚）をまず半分に切断し、半円板片試験片をチャンバーに加工した保持スロット内に配置した（図１Ａ）。表層ゾーンに面するチャンバーの上流側に、プロテアーゼ阻害剤（Roche Applied Science, IN）を添加した４５μＬの濃度既知の溶質の１Ｘ‐ＰＢＳ溶液を充填した；チャンバーの下流側に、プロテアーゼ阻害剤だけを含有する４５μＬの１Ｘ‐ＰＢＳを充填した。その後、チャンバーを脱イオン水を含有するペトリ皿に配置し、カバーをし（蒸発を最小とするため）、軟骨表面の滞留層を最小とするためにで３７℃のインキュベーター内の低速ロッカー上に配置した。
【０１２３】
２４〜９６時間後、軟骨半円板片を浴中から取り除き、１ＸＰＢＳ中で軽くリンスし、表面の液を吸収されなかった溶質とともにキムワイプで軽く除去した。メスを使用して各円板片の中心からスライス（１００〜２００μｍ厚）を切り取った（図１Ｂ）。スライスの中間領域（点線の境界線で示す）を、共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ製ＴＥ２０００‐Ｕ）を使用し１０倍の倍率でＸ‐Ｙ面で画像化、組織内の透過およびＸ方向の溶質濃度プロフィールを確認した。画像化に使用する設定における軟骨の自己蛍光を除去するために適切なフィルターを選択した。脱着試験では、溶質溶液を図１のチャンバーから取り除き、プロテアーゼ阻害剤を含有する１Ｘまたは１０ＸＰＢＳで置換した。画像の適切な比較を確保するために、各溶液のＦＩＴＣ濃度が同一となり、等しい蛍光強度を与えるように溶質濃度を選んだ。吸収浴の名目濃度は２．５μＭ（ＦＩＴＣ）、１２５μＭ（ＦＩＴＣ‐デキストラン、８ｋＤａ）、２５μＭ（ＦＩＴＣ‐デキストラン、４０ｋＤａ）、１８μＭ（アビジン）、および３０μＭ（ニュートラアビジン）であった。１００μＭ（ＦＩＴＣ‐デキストラン、４０ｋＤａ）も、別の２４〜９６時間輸送研究に使用した（図３Ｄ〜Ｆ）。２タイプのＱＤ溶液の濃度は、それらの蛍光強度が等しくなるように選んだ。
【０１２４】
軟骨の中への溶質取り込み量の定量分析
誘導結合プラズマ測定を使用した量子ドット取り込み量：軟骨半円板片の中へのＱＤの取り込み全量は、各ＱＤ取り込み実験の直後に収集した組織および吸収／脱着浴中に存在するカドミウム（１１１Ｃｄ）の量の定量化により測定した。（ＣｄはＱＤの芯に存在する）。誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ‐ＭＳ）を、ＵＬＴＩＭＡ２ＩＣＰ質量分析計（HoribaScientific, NJ）を使用して行い、１１１Ｃｄの量を既知の方法で定量した（Wongetal., PNAS, 2011）。浴中および軟骨半円板片中のＣｄの最終合計量は、出発物質であった４５μＬのＱＤ‐ＰＢＳ上流溶液中のＣｄの初期量に対応した。Ｃｄ量は、テストした各ＱＤのために作製した較正プロットを使用してＱＤ濃度に変換した。新鮮な無処理軟骨中のＣｄのバックグラウンド量を測定したところゼロであった。
【０１２５】
アビジンおよびニュートラアビジンの平衡取り込み量：直径３ｍｍ厚さ１ｍｍの軟骨外植片を、９６穴プレート中でプロテアーゼ阻害剤を添加した３００μＬの既知の濃度（３μＭ）のＦＩＴＣ‐アビジンおよびＦＩＴＣ‐ニュートラアビジン中３７℃で特定の時間インキュベートした。吸収浴から取り出した後、円板片をリンスし、軽く払拭後、プロテアーゼ阻害剤を添加した１Ｘまたは１０ＸＰＢＳ中で特定したように２４時間以上インキュベートした。実験の最後に、各円板片の表面円板片をすばやくキムワイプで吸い取り、湿重量を測定した。
【０１２６】
その後、円板片を凍結乾燥し、乾燥重量を測定した；水分重量は、組織の湿重量および乾燥重量から算出した。吸収および脱着浴中の蛍光シグナルは、プレートリーダー（1400 Wallace Victor, PerkinElmer, MA）を使用して定量化した；軟骨円板片内の溶質含有量は、インキュベーション前後の吸収／脱着浴の蛍光読み取り値の差から求めた。標準カーブを確立し、ＦＩＴＣ‐アビジンおよびＦＩＴＣ‐ニュートラアビジンの両者の蛍光強度および溶質濃度は、浴中濃度と線形であることがわかった。溶質取り込み比は、平衡化浴中のＦＩＴＣ‐溶質の濃度に対して標準化した軟骨中のＦＩＴＣ‐溶質の濃度（組織内水分重量当たり）として算出した。
【０１２７】
ｓＧＡＧ枯渇の溶質取り込み量への影響
軟骨基質内での負に帯電したグリコサノミグリカン（ＧＡＧ）鎖の溶質取り込みおよび結合に対する影響を理解するために、軟骨円板片群（３ｍｍ直径、１ｍｍ厚）を、コンドロイチナーゼ‐ＡＢＣ（SigmaAldrich, MO, USA）、またはトリプシン（Invitrogen, CA）のどちらかで処理した。コンドロイチナーゼ‐ＡＢＣは、ＧＡＧ鎖（主に、軟骨中に大変豊富なアグリカンプロテオグリカンのコンドロイチン硫酸ＧＡＧ鎖）を消化・除去し、一方プロテアーゼのトリプシンは、アグリカンおよび他のＧＡＧを含有するプロテオグリカンおよび糖タンパク質のコアタンパク質を切断する。
【０１２８】
しかしながら、両処理は、軟骨のコラーゲンネットワークをインタクトなままに残す（Liotta et al., ProcNatlAcadSci, 1979）。ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）染料結合アッセイ（Farndale et al., Biochim Biophys Acta, 1986）を使用して、酵素処理の後の円板片中に残存している硫酸化ＧＡＧ（ｓＧＡＧ）と培地へ損失したものの含有量を既知の方法で定量化し（Lu et al., Arthritis Research & Therapy, 2011）、特定の酵素処理によるＧＡＧ除去率をそれにより算出した。
【０１２９】
一連の実験のために、２４時間コンドロイチナーゼ‐ＡＢＣ処理（０．１５ＭＮａＣｌ、０．０５ＭＮａリン酸中０．１Ｕ／ｍＬ、ｐＨ７．２、２４時間３７℃）を用いたところ、主として外側組織表面からのｓＧＡＧ枯渇が３８．６％（約４０％）の結果が得られ、それはin vivoでの外傷性関節傷害による初期ＧＡＧ損失（Lotz et al., Arthritis Research & Therapy, 2010）およびin vitroの軟骨傷害のモデル（Bendele et al., J musculoskelet Neuronal Interact, 2001）を模倣するものであった。
【０１３０】
第２群の円板片を、トリプシン（０．１５ＭＮａＣｌ、０．０５ＭＮａリン酸中１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．２、２４時間３７℃）で処理した。以前の研究では、同様の仔ウシ軟骨円板片を１ｍｇ／ｍＬトリプシンで２４時間処理すると、測定可能なｓＧＡＧが略全部損失したことを示した（Bonassar et al., Arthritis Rheum, 1995）。酵素処理の後、円板片を新鮮なＰＢＳ中で３回洗浄した。その後、取り込み量の実験は、追加のプロテアーゼ活性を最小とするためにプロテアーゼ阻害剤を含有する溶質‐ＰＢＳ溶液を使用して行った。その後、輸送および結合特性を正常な軟骨のそれと比較した。
【０１３１】
有効拡散率を求めるための輸送の測定
若年ウシ軟骨円板片（インタクトな表層ゾーンを有する）を通過するアビジンおよびニュートラアビジンの拡散輸送のリアルタイム測定を、既に報告されているような２区画からなる拡散チャンバーを使用して測定した（Garcia et al., Arch Biochem Biophys, 2003）。３つの軟骨円板片（６ｍｍ直径、４００μｍ厚）の群を、上流区画から軟骨円板片中およびそれを横切った溶質輸送が、同時に軟骨の表層ゾーンからのみ可能であるように、拡散チャンバーの２つの区画間にＯリングにより固定した（輸送用露出組織全面積０．２８ｃｍ２／円板片）（図１４の挿入図に模式的に示す）。
【０１３２】
チャンバー表面への溶質の非特異的吸着を防止するために、区画をカゼインで処理した。その後、各区画を２５ｍＬのプロテアーゼ阻害剤添加０．１５ＭＮａＣｌで充填し、２０℃に維持した。開始時ｔ＝０に、ＦＩＴＣ標識化アビジンまたはニュートラアビジンを「上流」区画に添加したところ、組織を通過して下流区画へ輸送された。両区画の浴槽は、溶液‐組織界面での滞留層の効果を最小とするために磁気的に撹拌した。一定分量を異なる時間間隔で各チャンバーから取り出し、プレートリーダーを使用して蛍光を測定した。
【０１３３】
２５ｍＬの区画容量は、図１４（挿入図）の構造での軟骨円柱片の容量より約１，０００倍大きい。その結果、上流および下流両方の軟骨‐溶液界面での境界溶質濃度は、これらの輸送実験の間、初期（ｔ＝０）の値の約５％以内に留まった。従って、この構造は、定常状態溶質流速の定量化および軟骨内での有効な溶質拡散率の評価に焦点をおいている。対照的に、図１の構造における輸送チャンバー区画容量は相対的に小さく、軟骨円板片の容量により近く、in vivoでの関節における軟骨および隣接する滑液の相対固‐液容量により近似する構造である。例えば、ヒト脛骨プラトー軟骨容量は約４ｍＬ（Adam et al., J Anat, 1998）、膝関節滑液容量は約１〜４ｍＬの範囲である（Huffman et al., Rheumatology, 2007）。
【０１３４】
統計分析
溶質取り込み量および脱着に関するデータ（例えば、図４Ａ〜Ｂおよび図１２Ａ〜Ｃ）は、平均値±ＳＥＭとして与えられる。動物での一般化線形混合効果モデルを分析用ランダム変数として使用し、その後複数の処理条件間の比較用にＴｕｋｅｙ法を使用した。図４のデータは、異なる２匹の動物から得た。各処理条件毎に各動物につき合計でｎ＝３の軟骨サンプルを使用した。平均値とは、処理条件ごとに６つのサンプルの平均値を意味し、動物の影響はなかった。
【０１３５】
図１２のデータは、正常な軟骨条件で異なる３匹の動物および４０％ＧＡＧ枯渇条件で１匹の動物から得たものである。各処理条件毎に各動物につき合計でｎ＝６の軟骨サンプルを使用した；平均値とは、正常な軟骨条件下で各処理条件毎に１８個のサンプルの平均値を意味し（動物の影響はなかった）、および４０％ＧＡＧ枯渇条件下で各処理毎に平均６個のサンプルの平均値を意味する。ｐ＜０．０５を統計的有意性とした。
【０１３６】
結果
軟骨中への輸送に対する溶質サイズおよび分子構造の影響：
ＦＩＴＣ（３８９Ｄａ、直径約０．９ｎｍ）およびＦＩＴＣ‐デキストラン（８ｋＤａ、直径約４．３ｎｍ）での輸送試験は、水力学的直径が５ｎｍ未満の粒子は２４時間以内に軟骨外植片の全厚（１ｍｍ）を通して透過したが、一方４０ｋＤａのＦＩＴＣ‐デキストラン（直径約１０ｎｍ）の透過勾配は２４時間で依然として明白であることを示した（図３Ａ〜Ｃ）。
【０１３７】
軟骨中の透過距離に対する相対蛍光強度を示すが、それはサイズ依存性輸送を例証している。４０ｋＤａのＦＩＴＣ‐デキストラン溶質（拡張性多糖コイル）は、４日間で軟骨厚さの主な部分へ拡散した（図３Ｄ〜Ｆ）が、球状タンパク質のニュートラアビジン（ＭＷ６０ｋＤａ、直径約７ｎｍ）はサンプル厚さの約半分を透過した（図３Ｇ〜Ｉ）。直径１５ｎｍのＱＤは軟骨表層ゾーンに捕捉され、２４時間で組織の最初の４０〜５０μｍだけを透過した。これらのＱＤの透過深度は６日間でも変化せず（データ示さず）、直径１５ｎｍの粒子は大きすぎるため軟骨基質の複雑な網目構造を透過することができないことを示唆している。
【０１３８】
しかしながら、トリプシン処理サンプルは、１５ｎｍのＱＤが２４時間で軟骨円板片の全厚を透過することを可能とした。図５Ａ、Ｂは、サンプルの表面積により標準化した蛍光強度を示すが（すなわち、曲線の下の面積）、観察された傾向をさらに明確にしている。図５Ａは、２４時間でのＦＩＴＣ（３００Ｄａ）およびＦＩＴＣ‐デキストラン（８ｋＤａおよび４０ｋＤａ）を、図５Ｂは２４時間〜９６時間のＦＩＴＣ‐デキストラン（４０ｋＤａ）を示す。
【０１３９】
軟骨内での取り込み、保持および結合への粒子表面特性の影響：
アミン官能化されたＱＤは１ＸＰＢＳ中で２４時間後でも脱着しなかったが、官能基を持たないＱＤは脱着した。１０ＸＰＢＳ中での脱着により、軟骨円板片中に保持されるＱＤの吸収量は、２４時間で６４％から０．４％へと有意に低減した（図４Ｂ）。トリプシン処理サンプルは、正常な軟骨と比較して（約６４％）、保持を有意に低減したが（約４０％）、１Ｘおよび１０Ｘ脱着で同等の量が保持されており（図４Ｂ）、電荷に基づく相互作用を示唆した。トリプシン処理による基質の分解は、予期されたように、両タイプのＱＤの透過および取り込みを有意に高めた（図４Ａ）。
【０１４０】
静電相互作用の影響を更にテストするために、アビジン（高度に正に荷電した球状タンパク質）の輸送および結合特性を、中性カウンターパートであるニュートラアビジンと比較した。それらのサイズが同じであるにもかかわらず、ニュートラアビジンは４日間で試験片厚さの半分だけを透過したが（平均取り込み約０．４４）、アビジンは１日以内で軟骨の全厚を拡散し（平均取り込み約１８３）、アビジンの取り込み量はニュートラアビジンと比較して４００倍以上高かった（図１１Ａ〜Ｃ；図１２Ａおよび図１２Ｂ）。吸収したニュートラアビジンの約５０％は、１ＸＰＢＳ中で１日以内に軟骨の外へ拡散したが、一方吸収したアビジンの９６％は１ＸＰＢＳ中で１５日間（実験を行った期間）たっても軟骨の内部に残存した（図１２Ｃ）。
【０１４１】
しかしながら、有意に高い割合（約６９％）の吸収アビジンが２４時間以内に１０ＸＰＢＳ中で軟骨から拡散し、強い静電相互作用の効果を示唆している。アビジンが軟骨基質中の負に帯電したＧＡＧ鎖に（可逆的に）結合できることが支持される。軟骨ｓＧＡＧの４０％の枯渇（コンドロイチナーゼ‐ＡＢＣを使用）は、２４時間でのアビジンの取り込み量を、正常な軟骨中の平均値１８３からＧＡＧ枯渇組織中の２４へと有意に低減した（図１２Ａ）。これは電荷相互作用の効果をさらに確証し、軟骨基質の負に帯電したｓＧＡＧ鎖が、アビジンのようなサイズの大きい正に帯電した球状タンパク質の輸送、取り込みおよび結合特性を高めるのに重要な役割を果たすことを示した。しかしながら、ニュートラアビジンの取り込み量は、２４時間で正常な軟骨での０．２８からＧＡＧ枯渇軟骨の０．５５（図１２Ｂ）へ増加し、それは４０％ｓＧＡＧ枯渇の結果としての基質ポアサイズの増加によるかもしれない。
【０１４２】
浴中アビジン濃度の関数としてのアビジン取り込み量：
図１２に示す結果から、アビジンが軟骨内のサイトに結合できることがわかった。この仮説をテストするために、直径３ｍｍの軟骨円板片を、固定量の（蛍光標識した）ＦＩＴＣ‐アビジン（１μＭ）および段階的量の未標識アビジン（０、１０、７６、１００、および２０３μＭ）を含有する３００μＬ緩衝液中で、３日間平衡化する競合的結合実験を行った。平衡化に要する時間を短縮するために軟骨円板片を半円板片に分割し、平衡化は３７℃で９６穴プレートで行った。取り込み比ＲＵを測定し、アビジンの全浴中濃度（標識＋未標識、図１３）に対してプロットした。ＲＵは、平衡化浴中のアビジン濃度（ＣBath）に対して標準化した、組織内水分重量に対する軟骨内部のアビジン全濃度（結合（ＣＢ）＋フリー（ＣＦ））と定義した：
【数１】
2016511747.tif 000004
【０１４３】
標識および未標識アビジンは保持され軟骨中へ同等に分配された。標識アビジンが極度に低濃度（１μＭ以下）のとき、約１２０の高い取り込みが観察された。未標識アビジンを浴槽へ添加したとき、両者（標識および未標識）とも、組織（サイト濃度ＮＴ）中で使用可能な結合サイトと同等（一定）の数を競合できた。未標識アビジンの濃度が増加するに連れて、標識アビジンの取り込み量は劇的に減少することが観察された（図１３）。図１３のデータをモデル化するために、一次二分子可逆反応を、軟骨内の唯一の優占的な結合種へのアビジンの結合を記述するために作成した。
【０１４４】
軟骨基質内に均一に網目にからませ固定した可溶性インスリン様成長因子‐１（ＩＧＦ‐１）のＩＧＦ‐結合タンパク質（ＩＧＦ‐ＢＰｓ）への結合をキャラクタライズするために以前使用された理論的モデルを採用した（Garcia et al., Arch Biochem Biophys, 2003）。このモデルによれば、フリーな溶質の平衡モル濃度（ＣＦ）、結合溶質（ＣＢ）、組織内結合サイト密度（ＮＴ）および平衡解離定数（ＫＥＱ）は、以下の結合等温式により関連付けられる：
【数２】
2016511747.tif 000005
それは、ラングミュアの吸着等温式と同様の形式である。
【０１４５】
更に、溶質であるアビジンの平衡分配係数（Κ）を、浴中の溶質濃度に対して標準化した軟骨円板片内部のフリーな溶質の濃度（組織内水分重量に対する）として定義した：
【数３】
2016511747.tif 000006
【０１４６】
これらの実験では、アビジンの軟骨の中への取り込み量がとても多いので、式（３）における最終アビジン浴中濃度ＣBath‐finalは一般に初期浴中濃度ＣBath‐initialと異なる。初期アビジン浴中濃度に対する最終濃度の比は、ｆと定義される：
【数４】
2016511747.tif 000007
【０１４７】
そして、標識および未標識アビジンの軟骨の中への分配は：
【数５】
2016511747.tif 000008
となり、式１〜４を合わせると：
【数６】
2016511747.tif 000009
が得られる。
【０１４８】
ＲＵの理論曲線は、非線形最小二乗法を使用して図１３のデータ（実線）にフィットされる；３個の未知のパラメーターの最適値は、Ｋ＝５．９、ＫＥＱ＝１５０．３μＭ、ＮＴ＝２９２０μＭであった。分配係数Ｋは、アビジン浴中濃度が非常に高い限界での式（５）のＲＵの値である（すなわち、すべての結合サイトが未標識アビジンで占領される限界）。従って、Ｋは、立体障害および静電（ドナン）相互作用の両方により決定される。図１３のデータを式（２）の結合等温式の形式で再プロットして図１５に示す。
【０１４９】
ウシ軟骨を横切るアビジンの非平衡輸送のキャラクタリゼーション：
図１４の挿入図に示す輸送セル構造を使用して、軟骨円板片の中へおよびそれを横切るアビジンおよびニュートラアビジンの過渡期輸送を測定した。図１４は、平行な３個の軟骨外植片の群を通って拡散するＦＩＴＣ‐アビジンの下流濃度（上流濃度に標準化）のリアルタイムの測定値を示す。
【０１５０】
時間対濃度（ｔ＝５０分からｔ＝１５０分の間）の直線の傾きを時間軸に対して外挿して、定常状態流速に達するまでのタイムラグτlagを得、アビジンではτlagは約３５分であった（Crank et al., Clarendon Press, 1975）。このτlagは、初期輸送過渡期をキャラクタライズするアビジンの有効拡散率ＤBFFの関数である（Crank et al., Clarendon Press, 1975）：
【数７】
2016511747.tif 000010
ここで、δは軟骨円板片の厚さである（約４００μｍ）。アビジンのＤBFFは、３．８ｘ１０−７ｃｍ２／ｓと算出された。このタイムラグ、従ってＤBFFは、軟骨内のアビジンの結合の影響に部分的に関連しているとみなされた。
【０１５１】
この結合が定常状態に達すると、図１４のｔ＝３５分からｔ＝１８６分に示すように、対応する定常状態流速が達成されるであろう。この定常状態流速は、下記の式により定常状態拡散率ＤSSを使用して：
【数８】
2016511747.tif 000011
【０１５２】
ここでΦは、組織空隙率（湿重量および乾燥重量から測定、Φ＝０．８１）、Κは分配係数、ＣＵおよびＣＤはそれぞれ上流および下流浴中濃度である。標準化した下流濃度（傾き）の時間微分は、下記式のように定常状態流速の関数である。
【数９】
2016511747.tif 000012
式中、Ａは全露出組織面積（０．８４ｃｍ２）であり、ＶＤ（２５ｃｍ３）は下流浴の容量である。式８を使用して、アビジンの積ＫＤＳＳを算出したところ１．４ｘ１０−５ｃｍ２／ｓであった。
【０１５３】
同様に、ニュートラアビジンのＫＤＳＳを算出したところ２．３ｘ１０−６ｃｍ２／ｓであり、（ＫＤＳＳ）NeutrAvidinに対する（ＫＤＳＳ）Avidinの比は約１０であった。アビジンおよびニュートラアビジンは同様のサイズであり、従って同様の定常状態拡散率ＤＳＳを有すると予想される。ニュートラアビジンの分配係数ＫNeutrAvidinは、図１２Ｂのデータから０．４４と推定された。これらの値を使用して、ＫAvidinは４．４、ＤＳＳは３．２ｘ１０−６ｃｍ２／ｓと算出された。
【０１５４】
全流速の測定すなわち拡散率推定値に影響を与え得る未結合ＦＩＴＣが存在するかどうかテストするために、フリーＦＩＴＣ（ＭＷ３８９）をｔ＝１８６分に上流浴中へ添加した。ほぼ直後、軟骨を横切る蛍光標識した化学種の拡散流速が劇的に増加した（図１４）。従って、フリーＦＩＴＣの拡散率は、２．８ｘ１０−５ｃｍ２／ｓと推定され、算出されたアビジンの定常状態拡散率（ＤＳＳ）よりも一桁以上高く、ＦＩＴＣ‐アビジンの流速の測定に影響を与える可能性のあるフリーＦＩＴＣの存在量は無視できるものであることを示唆している。
【０１５５】
ＤＥＦＦには結合の影響が含まれるものと仮定して、一次可逆性二分子反応速度論を使用してモデル化し、ＤＥＦＦをＤＳＳから導くことが可能である（Garcia et al., Arch Biochem Biophys, 2003）。標識アビジンの初期の添加の間、すなわち、ＣＦ＜ＫＥＱである限度では、ＤＥＦＦは下記の式によりＤＳＳで表される（Garcia et al., Arch Biochem Biophys, 2003）：
【数１０】
2016511747.tif 000013
【０１５６】
最適値（セクション３．２）から、［１＋ＮＴ／ＫＥＱ］＝２０．４。ＤＥＦＦが約３．８ｘ１０−７ｃｍ２／ｓ（図１４から）であることから、ＤＳＳ＝７．７ｘ１０−６ｃｍ２／ｓであり、これは輸送セル実験から算出されたものと同じ桁である。（アビジンの推定輸送特性は、表２を参照）
【０１５７】
【表２】
2016511747.tif 000014
【０１５８】
考察：
外傷性関節損傷は、多数の軟組織および硬組織に損傷を付与することが可能である。関節軟骨はしばしば損傷されないままであっても、（ＭＲＩまたは生検では視認できない）基質へのわずかなミクロな損傷から明白な繊維形成や亀裂までの程度の異なる変化が観察される（Johnson etal., Am J Sports Med, 1998）。外傷は、同時に滑液中の炎症性サイトカインのレベルを増加させ、それらは傷害後の最初の数日／数週間内に、未損傷軟骨さえ急速な軟骨細胞媒介タンパク質分解およびアグリカンや他の基質分子の損失を起こしやすくすることが可能であり（Anderson et al., J Orthop Res, 2011; Lu et al., Arthritis Research & Therapy, 2011; Lotz et al., Arthritis Research & Therapy, 2010; Johnson et al., Am J Sports Med, 1998; Sui et al., Arthritis Rheum, 2009）、最終的にＰＴＯＡを引き起こす。組織全体を通って薬物を細胞および基質標的へ持続的に送達するために、軟骨内を迅速に透過することが可能である薬物運搬ナノ粒子を同定する必要があり、様々な粒子サイズおよびタイプについて、迅速で持続的な取り込みが可能かどうかを検討した。
【０１５９】
直径１０ｎｍ未満の粒子は、正常な（未損傷）軟骨へより深く透過することがわかった（図３〜図４）。関節内に注入される場合、in vivoクリアランスがサイズの実用的な最小限度を規定するであろう（Goldberg et al.,  J Biomater Sci Polym Ed, 2007; Wang et al., Biomaterials, 2010）。直径１５ｎｍの粒子は立体障害があり、正常な軟骨の表層ゾーンに捕捉されるが、それらはプロテオグリカン枯渇軟骨の深部ゾーンへは透過でき（図４）、溶質透過についての以前の報告と一致している（Maroudas  et al., J  Anat, 1976; Snowden et al., Biochim Biophys Acta, 1976; Leddy et al., J. Biomed. Mater. Res., Part B, 2004; Greene et al., Biomaterials, 2008; Torzilli et al., J Biomech, 1997; Torzilli et al., J Biomed Mater Res Part A, 1998）。
【０１６０】
軟骨の一定の高い負の電荷密度は、薬物担体の輸送、結合および保持を増強するために静電相互作用を利用するユニークな機会を提供する。近年、小さいカチオン性ペプチド治療薬の軟骨外植片中への輸送が研究されている（Ａｒｇ‐Ｔｙｒ‐Ｌｙｓ‐Ａｒｇ‐Ｔｈｒ（配列番号：７）；７６０Ｄａ、正味電荷＋３；ｐＩ＝１１）。ペプチドの濃度は、ドナン（静電）分配のため、（予想されるように）実際に軟骨中で高くなっているが、ペプチドは軟骨内で結合せず、従って迅速に外部へ拡散した（Byun et al., Arch Biochem Biophys, 2010）。
【０１６１】
組織内サイトへの可逆性結合は、局部への持続性送達のために組織内濃度を高く維持するために必要であり、所与のナノ粒子に関して静電相互作用が非平衡輸送および平衡取り込み（後者は、溶質の基質への結合および／または未結合溶質の組織内液の中への上向きのドナン分配に関連している）に同時に影響を与えることが可能であるかどうかテストするために別々の実験を行わなくてはならない。
【０１６２】
サイズおよび高い正電荷のため、アビジンの構造は粒子を用いた薬物送達システムの明確な利点の例証となることがわかった。アビジンは２４時間以内に軟骨外植片の全厚を通して透過するが、同一サイズの中性カウンターパートであるニュートラアビジンは半分の厚さまで透過するのに４日間かかった（図３、図１１）。アビジンは、正常な軟骨における平衡取り込み量がニュートラアビジンと比較して４００倍高かった。さらに、アビジンは少なくとも１５日間軟骨内に保持されたが、ニュートラアビジンの場合は外植片を１ＸＰＢＳ脱着浴中（生理学的イオン強度）に２４時間放置するとほとんどが放出された（図１２）。高濃度の塩（１０ＸＰＢＳ）中に放置すると、静電相互作用が遮蔽されるためにアビジンも容易に脱着した。
【０１６３】
アビジンのような正に帯電した大きな分子を負に帯電した軟骨を通過して輸送することは、以下の３つの現象に影響される；（ｉ）高密度組織ＥＣＭのための立体障害（式（７）のＤＳＳにより特徴付けられる）、（ｉｉ）組織内サイトへの結合（式（９）におけるＤＳＳ、ＮＴ、およびＫＥＱの関数であるＤＥＦＦにより特徴付けられる）、および（ｉｉｉ）静電相互作用のため、未結合アビジンのドナン分配（式（３、７）のＫにより特徴付けられる）。アビジンを浴中へ添加した初期には、静電相互作用が溶液‐軟骨界面でのアビジンの高い上向きのドナン分配をもたらす（Ｋを介して）。
【０１６４】
観察されたように、その結果得られる傾斜の急な組織内濃度勾配が、同様なサイズであるが中性のニュートラアビジンと比較して、アビジンの組織内への過渡期輸送を大いに高めることになる（図１１、図１２）。最終的な平衡状態で、アビジンの高い取り込み量は、組織内結合および／または組織全体での上向きドナン分配のどちらかによるものであろう。これらの効果を区別するために、追加の競合的結合実験を行った（図１３）。その結果は、アビジンがＫＤ約１５０μＭで弱くかつ可逆的に軟骨中のサイトへ結合することを示している。予測された高結合サイト密度（ＮＴ約２９２０μＭ）は、高濃度の組織内ＧＡＧと一貫しており、アビジンの組織内での長い保持時間（約１５日間）を説明している。
【０１６５】
結合相互作用の存在を示す更なる証拠は、図１４の非平衡輸送実験により提供された：拡散ラグタイム（τlag)の測定値は、結合が、組織を横切る最終定常状態拡散輸送に比較して、アビジンの軟骨の中への初期輸送を遅延させることを示した。有効拡散率ＤＥＦＦ（式（９）の結合の効果を含む）がτlag（式（６））の測定値から推定された；ＤＥＦＦは、結合が定常状態に達した後の拡散率であるＤＳＳより一桁小さい。にもかかわらず、この弱い可逆性結合は、ドナン分配による組織内濃度勾配が急であるため、外植片の全深さ方向へのアビジンの迅速な透過を阻止しなかった。
【０１６６】
軟骨中のアビジンの取り込みおよび輸送において静電相互作用が重要であるので、いくつかのアプローチを使用して、観察された実験結果をもたらしたアビジン四量体の有効な正味電荷を推定した。まず、アビジンのアミノ酸構造は、酸性残基に対する塩基性残基の正味過剰分に基づいて、四量体正味電荷＋２０であることを示唆した。
正味電荷は、ｐＨ７でイオン化することが可能である塩基性基（リジン、アルギニン）および酸性基（グルタミンおよびアスパラギン酸）を合計して推定した：
【０１６７】
【表３】
2016511747.tif 000015
【０１６８】
しかしながら、輸送および取り込み中に検知される有効な電荷がこれらの残基すべてを含むかどうか、または一部の残基が内部にあって軟骨細胞外基質内での電荷‐電荷相互作用に貢献できないかどうかは定かではない。更に、アビジンのグリコシル化の程度が未知であり、これが正味負電荷の増加に貢献しているかもしれず、全正味電荷を低減するかもしれない。
【０１６９】
しかしながら、この推定は、そのような残基のすべてが水性溶液中でイオン化されており、これらの残基が内部に存在して（埋没して）いるため、軟骨基質内の電荷‐電荷相互作用に貢献できない状態ではないことを仮定している。更に、この推定は、合計量に負に帯電した基を追加することができるアビジンのグリコシル化の効果を無視している。推定の正確度を更に確認するために、ドナン平衡理論を図１２Ｂおよび図１３の実験結果に適用してアビジンの電荷を算出した。
【０１７０】
ドナン平衡を使用して推定したアビジンの正味電荷
ＰＢＳおよびアビジンを含有する浴中で平衡にある軟骨外植片を用いて、ドナン平衡分配により、電荷ｚを有するアビジンの分布が、軟骨組織内のＮａ＋およびＣｌ−濃度と関係していることを予測する：
【数１１】
2016511747.tif 000016
ここで、
【数１２】
2016511747.tif 000017
はそれぞれＮａ＋、Ｃｌ−およびフリーな（未結合）アビジンの組織内濃度である。
【０１７１】
【数１３】
2016511747.tif 000018
は、アビジン、Ｎａ＋およびＣｌ−の浴中濃度である。図１２Ｂおよび図１３の結果は、アビジンおよびニュートラアビジンの分配係数を与える：  
【数１４】
2016511747.tif 000019
【０１７２】
浴槽は１ＸＰＢＳであるので（すなわち、生理学的イオン強度）、
【数１５】
2016511747.tif 000020
約０．１５Ｍである。また、全体の電気的中性のため、組織内のすべての電荷の合計はゼロに等しくなる：
【数１６】
2016511747.tif 000021
ここでρは軟骨の固定電荷密度であり、Ｆはファラデー定数である。
【０１７３】
Ｎａ＋およびＣｌ−と比較して、アビジンは少量の担体（約μＭ）であるので、式（１１）の
【数１７】
2016511747.tif 000022
を無視することに問題はない。従って、
【数１８】
2016511747.tif 000023
【０１７４】
１〜２週齢の仔ウシの大腿膝蓋溝軟骨の固定電荷密度ρ／Ｆ（Byun et al., Arch Biochem Biophys, 2010）を測定したところ−０．１３Ｍであった。式（１２）を整理すると以下のようになる：
【数１９】
2016511747.tif 000024
アビジンの有効正味電荷ｚは、約＋６．２と計算された。
【０１７５】
ドナン理論（Grodzinsky et al., New York: Garland Science, 2011）は、（１）すべての自由に移動する荷電化学種（すなわち、アビジンおよび浴中イオン）はボルツマン統計に従って荷電した組織中に分配するであろう、（２）組織における正味電荷（すなわち、組織の固定電荷密度および可動担体密度の合計）は電気的中性によりゼロであるという仮定に基づいている。ドナン理論を図１２Ａの平衡取り込み量のデータに適合することで、アビジンの有効な正味電荷が＋６．２と算出された。この値は、球状粒子動電学のＧｒａｈａｍｅ式に、報告されているアビジンのゼータ電位（Dougherty et al., Langmuir, 2009）を適用して得た有効電荷＋７．３に大変近い値であった。
【０１７６】
報告されている動電学ゼータ電位から推定したアビジンの正味電荷：
ｐＨ５における脱イオン水の希釈溶液中でのアビジン分子のゼータ電位は、１０ｍＶと報告されている（Dougherty et al., Langmuir, 2009）。ゼータ電位を粒子表面電荷密度に関連付ける動電学のＧｒａｈａｍｅ式（Grodzinsky et al., New York: Garland Science, 2011）を使用し、アビジンが球状（直径約７ｎｍ）をなすと仮定すると、１０ｍＶのゼータ電位は、有効正味分子電荷約＋７．３に対応する。
【０１７７】
有効正味電荷の最終上限推定値を、図１３の実験におけるアビジンの取り込み量が、組織内サイトへの結合が全く無い状態で軟骨の中へのドナン分配だけによるものと仮定して得た。この推定値は＋１３〜＋１４の正味電荷であった。
【０１７８】
アビジン電荷の上限推定値：
次に、図１３におけるアビジン取り込みが結合ではなく静電相互作用（ドナン理論）によるものであることが成り立つとして、アビジン電荷の上限推定値を検討した。
【０１７９】
ドナン平衡分配は、電荷ｚを有するアビジンの分布が軟骨組織内のＮａ＋およびＣｌ−の濃度と関連すると予測する：
【数２０】
2016511747.tif 000025
【数２１】
2016511747.tif 000026
ここで
【数２２】
2016511747.tif 000027
【０１８０】
アビジンの取り込みが、組織内サイトへの結合が全く無い状態で軟骨の中へのドナン分配にだけによるものであること、すなわち平衡化後の軟骨内のすべてのアビジンがフリーであることが成り立つとした。アビジンの取り込み量は、Ｒｕ＝ＫNeutrAvidinｒｚで定義される。
【０１８１】
浴槽は１ＸＰＢＳであるので（すなわち、生理学的イオン強度）、
【数２３】
2016511747.tif 000028
、よって
【数２４】
2016511747.tif 000029
【０１８２】
また、全体の電気的中性のため、組織内のすべての電荷の合計がゼロに等しくなる：
【数２５】
2016511747.tif 000030
Ｓ２から、ρ／Ｆの測定値として−０．１３を、ＫNeutrAvidinとして０．４４を使用し、式（１３〜１５）を整理すると下記が得られる：
【数２６】
2016511747.tif 000031
【０１８３】
Ｚは、ＣAvidinBath‐initialおよび計算値ｒの値によって変化する。図１６のグラフに示されるようにＺが＋１３と＋１４の間のとき最適化が得られた。アビジンの取り込み量Ｒｕ（ＫNeutrAvidinｒｚ）をＹ軸に、ＣAvidinBath‐finalをＸ軸にプロットした。
【０１８４】
関節傷害直後の負に帯電したＧＡＧの損失は、組織内のカチオン性溶質の結合および保持に利用可能な静電相互作用の程度を限定するかもしれない。傷害後の状態を、コンドロイチナーゼ‐ＡＢＣを使用してシミュレートし、外植片ＧＡＧ鎖の約４０％を除去した。アビジン取り込み量は、正常な軟骨におけるほど高くはないが、依然２４という大変高い値を達成し（図１２Ａ）、１ＸＰＢＳ脱着浴中に配置しても組織内サイトに結合したままであった。これらの観察を合わせると、アビジンは軟骨の薬物送達機構モデルとしてin vivoで有用であり、アビジンと同様の特性を有する治療的薬物担体（直径約７ｎｍ、高い正電荷）が軟骨の内部への迅速で大量の取り込みを可能とするかもしれず、組織内に結合し、それによって持続性局部薬物送達を提供することが示された。
【０１８５】
結論：上記の結果に基づき、軟骨の全厚を通過して拡散することが可能であり、ＥＣＭ内のサイトに結合できる直径が１０ｎｍ未満の高度に正に荷電した薬物運搬粒子を用いた、軟骨の中へのナノ粒子を用いた薬物送達の機序を提案する。アビジンは、分子量の小さい官能化された薬物を放出およびを送達できるそのようなナノ粒子の優れた例である。
【０１８６】
２番目のアプローチは、軟骨の表層ゾーン内で結合しその後官能化薬物を放出することが可能な、わずかに大きいサイズの粒子を利用する。図２のＱＤデータはこのアプローチを例示する。これらの粒子が徐々に分解するに連れて、薬物が放出され、時間の経過と共に軟骨内へ拡散および／または軟骨内のサイトへ結合する。これら両方のアプローチで、正に帯電したナノ粒子と軟骨ＥＣＭの負の固定電荷の間の静電相互作用を最適化して、そのような薬物担体の輸送、取り込みおよび組織内結合を高めることができる。
【０１８７】
例５：静電相互作用が、ラット膝関節における関節内注入アビジンの迅速な透過、取り込みおよび保持向上を可能とする
緒言：
骨関節炎の局部処置のための関節内薬物送達に関しては、薬物が脈管構造またはリンパ管から、数時間以内と報告されている半減期で迅速にクリアランスするため、依然不十分である。軟骨のような特定の標的組織の局部治療は、コラーゲンの高密度網目構造および負に帯電したプロテオグリカンのため更に複雑であり、それらはナノサイズの溶質が侵入することさえ阻止することが可能である。
【０１８８】
上述の例では、理想的なサイズ（直径７ｎｍ）および高い正電荷（ｐＩ１０．５）のためアビジンはウシ軟骨の全厚を通過して透過し、内部に１５日間保持されることが示された。軟骨への薬物の局部送達のためにアビジンをナノ担体として使用する目的で、in vivo輸送特性を、ラットモデルを使用して検討した。
【０１８９】
アビジンは、６時間以内軟骨の全厚にわたって透過し、半減期２９時間、関節内の貯留時間７日間であった。アビジンの濃度は軟骨で最も高く、膝蓋腱で最も低く、大腿骨ではゼロであったが、ニュートラアビジン（アビジンの中性カウンターパート）は２４時間後に軟骨に存在しなかった。組織ｓＧＡＧ含有量とアビジンの取り込み量の間の正の相関（Ｒ２＝０．８３）は、静電相互作用の効果を実証するものである。生物学的毒性試験は、少なくとも１μＭまでのアビジン用量は安全であることを示した。
【０１９０】
アビジンは球状の６６ｋＤａ（直径約７ｎｍ）であり、高度にグリコシル化された正に帯電したタンパク質（ｐＩ１０．５）である。この例では、電荷駆動型輸送モデルとしてアビジンを使用し、１日以内にウシ軟骨の全厚を透過することを示した。一方、その中性で同じサイズのカウンターパートであるニュートラアビジンは、４日間でサンプルの厚さの半分だけ透過した。
【０１９１】
本明細書に示すように、アビジンは取り込み量が４００倍多く、吸収されたアビジンの９０％以上が、少なくとも１５日間軟骨外植片内の負に帯電した基に結合したままであった。アビジンは、解離定数ＫＤが１５０μＭである可逆的で弱い静電相互作用により、軟骨中の組織内サイトと結合することがわかった。しかしながら、負に帯電した基の有効結合サイト密度が高いため（ＮＴ約２９２０μＭ）アビジンの保持が促進され、その構造を、粒子を用いた軟骨の中への薬物送達に好適なものとしている。
【０１９２】
薬物送達担体としてのアビジンの使用の目的で、蛍光標識したアビジンを健常なラットの膝関節へ注射した。この研究の目的は、（ｉ）対流輸送およびリンパ系が存在するin vivoラットモデルを使用して、７日間にわたるアビジンの関節空間の全体にわたる動態、分布および保持を調べること、かつ（ｉｉ）薬物送達のためのアビジン用量の安全な限度を決めるためにウシ軟骨外植片を使用して、軟骨細胞生存率、ｓＧＡＧ含有量、および生合成レベルに対するアビジンの用量依存性効果を検討することである。
【０１９３】
材料および方法
Ｉｎ  ｖｉｖｏ研究設計
動物試験は、ＢＩＤＭＣの動物保護・利用委員会により承認を得て行った。ＴｅｘａｓＲｅｄ抱合５０μＭアビジン（ｐＩ１０．５、６６ｋＤａ、直径約７ｎｍ）またはニュートラアビジン（ｐＨ７で中性、６０ｋＤａ、直径約７ｎｍ）（以上、Invitrogen, CA）の関節内（ｉ．ａ．）注射剤５０μＬを、健常な１８〜２０週齢Ｆｉｓｃｈｅｒ‐３４４ラット（Charles River Laboratories）の右膝関節に投与した。注射の後、ラットの膝を曲げ伸ばして注入した溶質を関節内空間全体に分布させた。対側の左膝を対照として使用した。アビジンを注射したラットは４つの異なる時点（６時間、１日、４日、７日）で屠殺し、ニュートラアビジンを注射したラットは１日後に屠殺した。
【０１９４】
以下の組織タイプを各関節から抽出した：メスを使用して関節軟骨を膝蓋溝、大腿骨顆部および脛骨プラトーから取り除いた；内側および側部半月板；ｉ．ａ．靭帯（ＡＣＬ＆ＰＣＬ）；膝蓋および四頭筋腱；および大腿骨。各処理条件につき６匹、合計で３０匹のラットを使用した。デジタル式カリパス（Fisher Scientific）を使用して、注射への炎症性反応を示す関節の腫脹をチェックするために注射前および注射後の各時点で関節の厚さを測定した。
【０１９５】
共焦点顕微鏡
アビジン‐ＴｅｘａｓＲｅｄ（５９５ｎｍで励起、６１５ｎｍで発光）を注射し、６時間後に屠殺したラット関節から抽出した組織サンプルを、Ｚ軸方向のスタックとして１０倍の倍率で共焦点顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ，ＦｌｕｏＶｉｅｗＦＶ１０００）を使用して画像化した。画像は、アビジンが拡散する表面であるＸ‐Ｙ面で撮影した。３Ｄ画像をＺ軸方向のスタック（スライス厚さ約４．５μｍ）を使用して再構築し、これら３Ｄ画像のＸ‐Ｚ面での断面を使用した。対照である対側の膝からの組織試験片の共焦点画像は蛍光を示さなかった。
【０１９６】
組織サンプル中へのアビジン／ニュートラアビジン取り込みの定量的分析
すべての処理条件での組織サンプルを、３７℃のインキュベーターで１０ｘＰＢＳ中で４８時間脱着して、静電相互作用を阻害し、アビジン／ニュートラアビジンを脱着浴中へ放出させた。４８時間以上脱着しても、浴中の蛍光シグナルは増加しなかった。実験の最後に、組織サンプルを浴槽から取り出し、凍結乾燥し、乾燥重量を測定した。脱着浴の蛍光シグナルは、プレートリーダー（Synergy HT, BioTek）を使用して定量化した。検量線の作成の際に、アビジン‐Ｒｅｄおよびニュートラアビジン‐Ｒｅｄ両者の蛍光強度および溶質濃度が、浴中濃度と線形であることがわかった。溶質取り込み量は、組織乾燥重量で標準化した組織サンプル中の標識溶質の濃度として算出した。
【０１９７】
ｓＧＡＧ測定および組織学的分析
異なる組織における負に帯電したグリコサノミグリカン（ＧＡＧ）鎖のアビジン取り込みおよび結合に対する影響を理解するために、硫酸化ＧＡＧ（ｓＧＡＧ）濃度をジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）染料結合アッセイを使用して各組織において測定した（Farndale et al., Biochim. Biophys. Act, 1986）。ナイーブラット関節または切開した関節組織を同時に固定し、組織試験片の骨含有量に拠って２４〜７２時間Ｆｏｒｍｉｃａｌ‐４（Decal Chemical Corporation）中で脱灰した。脱灰後、試験片を脱水しパラフィンに埋没し、矢状スライスまたは冠状スライス（５μｍ）のどちらかを、試験片の全体にわたって３００μｍの間隔で作成した。スライスは、ｓＧＡＧの量および分布を画像化するためにトルイジンブルーで、試験片間の染色における変動を最小とするためにすべてのスライスを同時に染色した。
【０１９８】
ウシ軟骨を使用したアビジンの用量依存性生物学的応答（in vitroの研究）
アビジンの用量依存性生物学的応答を、ウシ軟骨外植片を使用してテストした。ウシ軟骨円板片は、１〜２週齢仔ウシ膝関節（Hopkinton, MA の Research 87 から入手）の大腿膝蓋溝から収集した。簡潔に述べると、円柱状軟骨円板片（３ｍｍ）の芯を、ダーマルパンチを使用して取り出し、その後スライスしてインタクトな表層ゾーンを有する軟骨の最上部１ｍｍを得た。すべての処理群用の軟骨円板片は、関節表面に沿った深さおよび位置を一致させた。
【０１９９】
すべての処理の前に、それらを、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター中１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、０．４ｍＭプロリン、２０ｇ／ｍＬアスコルビン酸、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンＧ、１００ｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび０．２５ｇ／ｍＬアンホテリシンＢ（以上、SigmaAldrich, MO）を添加した無血清培地（低グルコースダルベッコ改変イーグル培地［ＤＭＥＭ；１ｇ／Ｌ］）中で４８時間平衡化した。その後、軟骨円板片を、０、１００ｎＭ、１μＭおよび１００μＭの１回用量のアビジンで４８時間培養した。培地は、２日毎にアビジンを補充せずに交換した。これは、１回アビジン注射のin vivo条件をシミュレートした。実験は、２、４および１０日間の３つの期間で行った。
【０２００】
軟骨細胞生存率
これらの時点で培養を終了し、１００〜２００μｍ厚のスライスを各処理条件で得た円板片の中心から切り出した。スライスはすぐにフルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ；ＰＢＳ中４ｍｇ／ｍＬ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ；ＰＢＳ中４０ｍｇ／ｍＬ）（以上、SigmaAldrich, MO）で２〜３分間暗所で染色した。ＦＤＡは生細胞を緑色に染色し、一方ＰＩは非生細胞を赤色に染色した。スライスをＰＢＳで洗浄し、Ｎｉｋｏｎ製蛍光顕微鏡を使用し４倍の対物レンズで画像化した。
【０２０１】
ＧＡＧの培地への損失の測定、軟骨細胞タンパク質およびｓＧＡＧ生合成
４日間および１０日間の実験の培養が終了する２日前に、培地に５μＣｉ／ｍＬ［３５Ｓ］‐硫酸および１０μＣｉ／ｍＬ［３Ｈ］‐プロリン（共に、Perkin Elmer, Norwalk, CT）を添加した。４８時間の放射標識の後、未結合の標識を完全に除去するために円板片を冷ＰＢＳで４回８０分かけて洗浄した。湿重量を各円板片毎に測定し、その後プロテイナーゼＫ（Roche, Indianapolis, MN）で一晩消化した。培地および消化した外植片におけるｓＧＡＧ累積含有量を、ＤＭＭＢアッセイを使用して測定した。各消化サンプルおよび培地標準の放射標識量（３５Ｓおよび３Ｈ）を液体シンチレーションカウンターを使用して測定した。放射標識濃度は、標準値から算出した後、湿重量に標準化した。
【０２０２】
統計分析
図１７および図１８Ａのデータは、平均値±ＳＤとして表され、各処理条件につきそれぞれ６匹および７匹の動物由来であった。一般化線形混合効果モデルで、分析のためのランダム変数として動物を使用し、その後、複数の処理条件間の比較のためにチューキー法を用いた。動物の影響はみられなかった。図２０のデータは、２匹の異なる動物由来であり、各処理条件で動物一匹につき合計６個の外植片を使用した；データは、処理条件毎に１２個のサンプルの平均値±ＳＥＭとして表した（動物の影響はみられなかった）。統計的有意性として、ｐ＜０．０５を使用した。図１８Ｂにおいて、ダイヤモンドは実験データ（平均値）を示し、実線は線形最小二乗法近似、点線は９５％信頼区間である。
【０２０３】
結果
ラット関節におけるアビジンの関節内（ｉ．ａ．）注射：
アビジンのｉ．ａ．注射の後、異なる時点（６時間、１日、４日および７日）でラット膝関節に炎症があるかどうかチェックした。膝関節は、関節の腫脹やこわばりのサインは示さなかった。ラットを屠殺した後、関節軟骨、半月板、ｉ．ａ．靭帯、膝蓋および四頭筋腱を収集し、アビジンの透過深度および保持を調べた。ラット膝関節中のアビジン‐ＴｅｘａｓＲｅｄ（Ｔｅｘａｓｒｅｄ粉体は裸眼には濃紫である）および抽出組織の紫染色は、６時間および２４時間の時点で視認できた。共焦点画像は、ｉ．ａ．注射後６時間以内にアビジンが組織の全厚を通って拡散することを示した（データ示さず）。対照である対側の膝は蛍光を全く示さなかった。
【０２０４】
アビジンの平均濃度は、６時間で関節軟骨中４．７μｇ／ｍｇ組織乾燥重量と報告されており、その値は２４時間で３．３μｇ／ｍｇへ減少した（図１７）。アビジン濃度は、４日間で２４時間の値の約１０．３％（０．３４μｇ／ｍｇ）、７日間で２４時間の値の４．１％（０．１３μｇ／ｍｇ）へと更に減少した。アビジン濃度の同様の減少速度は、７日間にわたって他の組織タイプでも観察された。アビジンの半減期は、実験データに指数曲線を適合させて算出した：
Ｃ（ｔ）＝Ｃ０ｅ−λｔ
【０２０５】
ここで、Ｃ０は初期アビジン濃度であり、Ｃ（ｔ）は時間ｔの後の組織中のアビジン最終濃度であり、λは減衰定数である。表４は、各組織タイプごとに算出した平均寿命τ（τ＝１／λ）および半減期を示す。アビジンの中性カウンターパートであるニュートラアビジンを使用し、ラット膝組織での輸送速度および結合を２４時間の時点でアビジンのものと比較した。２４時間の時点でラット軟骨および膝蓋腱中にはニュートラアビジンは存在しなかったが、アビジンと比較して半月板、靭帯および四頭筋腱中には少量であるが大変有意な量で存在した（図１７）。アビジンもニュートラアビジンも大腿骨においてどの時点でも検出されなかった。
【０２０６】
アビジンの取り込み量とｓＧＡＧ含有量の相関：
ラット軟骨（平均濃度１８．３μｇ／ｍｇ組織湿重量）、四頭筋腱（５．８μｇ／ｍｇ）、靭帯（４．１μｇ／ｍｇ）、半月板（３．６μｇ／ｍｇ）および膝蓋腱（１．５μｇ／ｍｇ）のｓＧＡＧ濃度をＤＭＭＢアッセイを使用して測定した（図１８Ａ）；文献で報告されているデータと一貫している（Kamisan., BMC Vet. Res., 2013; Malda et al., PloS One, 2013; Moyer et al., Acta Biomater, 2013; Amiel et al., J. Orthop. Res. Off. Publ. Orthop., 984; Rumian et al., J. Orthop. Res. Off. Publ. Orthop. Res. Soc., 2007）。
【０２０７】
四頭筋腱における高いｓＧＡＧ濃度は、ラットの膝蓋直上の四頭筋腱のより深部の表面に埋没しているスープラパテラと呼ばれる種子骨の線維軟骨が存在するためかもしれない。ラットのスープラパテラが、リンクタンパク質およびグリコサノミグリカン類と共にアグリカンからなることが既に示されている。スープラパテラはマウス、ラット、ウサギ、イヌなどの多くの哺乳類で存在するが、ヒトでは存在しない（Tischer et al., J. Histochem. Cytochem. Off. J. Histochem. Soc., 2002; Ralphs et al., Anat. Rec., 1991）。異なる組織タイプ中でのアビジン保持の半減期（表４）は、それぞれのｓＧＡＧ濃度と直接相関しており（Ｒ２＝０．８３）、強力な静電相互作用の効果が確認された（図１８Ｂ）。９５％信頼区間は正の傾きであり、傾向が有意であることを示している。
【０２０８】
膝組織のトルイジンブルー染色（図１９）は、関節の異なる区画内のｓＧＡＧの相対濃度および空間分布を明らかにした。グレーの濃淡における異染性の変化は、大腿骨顆部（図１９Ａ〜Ｂ）、脛骨プラトー（図１９Ｃ〜Ｄ）、および大腿滑車部（図１９Ｅ〜Ｆ）の関節軟骨内のｓＧＡＧを特定した。スープラパテラは、ｓＧＡＧ染色の減少および平行なコラーゲン線維の存在の増加により隣接する四頭筋腱から区別することができた（図１９Ｇ〜Ｈ）。染色の強度が小さいことが、膝蓋腱（図１９Ｅ〜Ｆ）および長さが中くらいのｉ．ａ．靭帯内でも（図１９Ｉ〜Ｊ）観察された。これらの観察結果はすべてＤＭＭＢアッセイの結果と一貫している（図１８Ａ）。
【０２０９】
軟骨細胞生存率に対するアビジン用量の影響：
アビジン用量の安全限度を推定するために、細胞生存率を、１回用量の０〜１００μＭアビジンの２、４、および１０日間処理後のウシ外植片中の生死蛍光により評価した。１０日間の対照における細胞死は最小であり、この期間での異なる処理群間で細胞生存率に有意な差はみられなかった（データ示さず）。軟性の表層ゾーン中の様々な細胞死が、関節表面に沿ったどの位置から収集されたかに依存して無処理外植片でも観察された（圧迫性傷害の受け易さによる）ことに留意されたい。
【０２１０】
累積ｓＧＡＧ損失および生合成：
培地へのｓＧＡＧ累積損失に関しては、４日目および１０日目の測定では、無処理対照、１００ｎＭおよび１μＭアビジン処理条件の間に有意な差はなかった（図２０Ａ）。１００μＭ条件では、４日間（対照７％：１００μＭ１４．６％）および１０日間（１３．６％：２０％）で、対照と比較してｓＧＡＧ損失が多かった。アビジン用量を増加させても、タンパク質およびｓＧＡＧ合成の速度に有意な変化はなかった（図２０Ｂおよび図２０Ｃ）。
【０２１１】
考察
軟骨の複雑な構造は、ナノサイズの溶質でさえ、その深部ゾーンへ侵入することを防止可能であり、特定の標的組織の中への薬物の局部送達を困難としている（Larsen, J. Pharm. Sci., 2008）。アビジンはその理想的なサイズおよび高い正電荷（＋６ｔｏ＋１４）のため、速い輸送速度、中性カウンターパートの４００倍の取り込み量、ウシ軟骨中で１０日間以上の９０％を超える保持を示した。これは、アビジンが軟骨の中への薬物局部送達のための担体として理想的な構造を提供できることを示している。
【０２１２】
ここに示すin vivoラット試験は、リンパ液の流れと対流の存在を説明し、in vitroウシ実験でと同様のアビジンの輸送特性を明らかにした。データは、アビジンが６時間以内に異なる組織タイプの全厚を透過することを示し、軟骨内で最大の取り込み量、膝蓋腱で最小、大腿骨内でゼロであった（図１７）。異なる組織でのｓＧＡＧ濃度（図１８Ａ）とそれぞれでのアビジンの半減期（表４）の正の相関（Ｒ２＝０．８３）は、正に帯電したアビジンとこれらの組織における負に帯電した基の間の強い静電相互作用の効果を実証した。静電相互作用は、ドナン分配によりアビジンの輸送速度を向上し、リンパ系によりクリアランスされる前に、関節全体での分布、および組織のより深部への透過を可能とする。
【０２１３】
アビジンは、軟骨での半減期２９時間で７日間ラットの関節内に保持されるが、その中性のカウンターパートであるニュートラアビジンは、ｉ．ａ．注射の２４時間以内に略完全にクリアランスされることが示された。アルブミンなどのサイズが同様な溶質の半減期は、ウサギの膝中で１．２３〜３．９時間の範囲であることが報告されている（Larsen, J. Pharm. Sci., 2008）。
【０２１４】
非ステロイド性抗炎症薬が有効でない場合、コルチコステロイドおよびヒアルロン酸調製剤の関節内注射が、骨関節炎の疼痛および炎症の管理のために処方される。しかしながら、コルチコステロイドは分子量が小さい（＜７００Ｄａ）ため、ヒト関節空間での半減期は短く、１〜４時間と報告されており、ヒアルロン酸調製剤は１２〜２４時間（ＭＷ約３００ｋＤａ）であり、したがって複数回の注射が必要とされる。数種類の薬物が、軟骨の破壊を伴う外傷後骨関節炎（ＰＴＯＡ）を逆行または防止するのに有効であると特定されており、抗異化グルココルチコイド類（例えば、デキサメタゾン）および同化促進成長因子（例えば、ＩＧＦ‐１、ＦＧＦ‐１８、およびＢＭＰ‐７）が挙げられる（Hunter et al., Nat. Rev. Rheumatol., 2011）。
【０２１５】
しかしながら、どの薬物も、体循環への迅速なクリアランスを防止し、全身性の薬物副作用を低減するのに要求される重要な安全性および効力の規準を満たしていない。しかしながら、本発明に示すように、アビジンなどの媒体は、そのような薬物を軟骨の中へ速い速度で輸送することが可能であり、組織内で可逆的に結合し、軟骨内の薬物デポーをなしている。更に、靭帯でのアビジンの高い取り込み量は、靱帯傷害後に同化促進成長因子を送達するために利用することが可能である。
【０２１６】
ラット軟骨中のアビジンの濃度は、in vitroのウシ軟骨で報告されている値の３倍低かった。これは、ラットでは軟骨のｓＧＡＧ濃度が、若年のウシに比べて２．５〜３倍低いためであるかもしれない。ウシ軟骨（in vitro）において少なくとも１５日間９０％を超えるアビジンが保持されることが報告されている。in vitroシステムでは対流輸送がないことから、保持が低下することは予期されることである。
【０２１７】
しかしながら、ラットの研究で７日目に４．１％の保持であったことは、おそらくウシと比較してラット軟骨の厚さが１０倍薄いことによるであろう。拡散‐結合時間定数は厚さの２乗のスケールであるので、ラット軟骨を通過する輸送速度は、１００倍速いことが予期され、保持時間が短いことを説明している。ウサギまたはヤギなどのより厚い軟骨を有する動物モデル（Kamisan., BMC Vet. Res., 2013）が、ヒトの生理機能をよりよく再現できるかもしれない。更に、ｓＧＡＧ濃度の勾配は、ラット関節と比較して、ヒト内の軟骨と靭帯などの他のｉ．ａ．組織の間でより大きく、ヒトでのアビジン輸送が、軟骨ではるかに容易になっている。これは、関節内のアビジン仲介薬物送達後の作用の特異性を意味するものかもしれない。
【０２１８】
また、安全な用量を推定するためにアビジンの用量依存性生物学的効果を検討した。１回用量の０〜１００μＭアビジンは、１０日間ウシ軟骨外植片における軟骨細胞生存率を全く変化させなかった。１０日間で０〜１μＭ用量の範囲ではｓＧＡＧの培地への損失は変化しなかったが、４日および１０日の両方で１００μＭ用量ではｓＧＡＧの損失が、無処理対照条件と比較して約２倍に増加したことが観察された。１００μＭ濃度の正に強く帯電したアビジンは、軟骨内の負に帯電した基の間の静電相互作用を遮蔽し、それによって浸透圧を低減することができる。これにより、水分子およびプロテオグリカンの両方を強制的に外に追い出すかもしれない。
【０２１９】
しかしながら、この用量範囲では細胞生合成速度（ｓＧＡＧおよびタンパク質の両方）は影響されず、アビジンが軟骨毒性の原因とならなかったことを示唆している。これは、少なくとも１μＭまでのアビジン用量が安全であることを示している。近年、in vitroヒト軟骨外植片研究において、連続用量の１００ｎＭデキサメタゾンが、機械的傷害の異化効果を有意に低減させ、炎症性サイトカインのレベルを増加させることが示された（Lu et al., Arthritis Res. Ther., 2011）ビオチン化デキサメタゾンは、アビジンの４個のビオチン結合サイトに抱合することが可能であり（Ellison et al., Protein Sci. Publ. Protein Soc., 1995）、デキサメタゾンのアビジンに対するモル比は少なくとも４：１となる。従って、１μＭ未満の用量のアビジンは、１００ｎＭデキサメタゾンを徐放することができると推定される。
【０２２０】
要約すると、in vivoラットデータは、静電相互作用を、軟骨内部でのデキサメタゾンなどの小分子量薬物の輸送を促進し、保持を増加するために利用することが可能であることを示している。アビジンは、安全で有効な関節内送達を可能とするために、小分子量治療薬を抱合することが可能な理想的な構造（そのサイズおよび高い正電荷のため）を示す。
【０２２１】
【表４】
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【０２２２】
例６：デキサメタゾン抱合アビジン構造体の設計および開発
方法
エステル結合を介したデキサメタゾン抱合アビジンの合成：
デキサメタゾンヘミコハク酸（２）の合成
０．０３０ｇのデキサメタゾン（１、０．０７６ｍｍｏｌ、１．０等量）を１ｍＬのピリジン（非無水）に完全に溶解し、０．０３８ｇのコハク酸無水物（０．３８２ｍｍｏｌ、５．０等量）を得られた透明な溶液へ添加した。その後、１〜２ｍｇのＤＭＡＰ（７．６μｍｏｌ、０．１等量）を溶液に添加し、Ｎ２気流下で室温で４８時間反応させた。４８時間後、ピリジンを減圧下で留去した（ロータリーエバポレーター中）。１０ｍＬのＨ２Ｏを蒸留残滓に添加した。白色の沈殿物ができ、それを１０分間撹拌後、遠心分離した。得られた沈殿物を１０ｍＬのＨ２Ｏで再び洗浄し、洗浄した残滓を凍結乾燥して、目的生成物（２）を得た。
【０２２３】
ビオチン化ＰＥＧ‐アミンによるデキサメタゾンヘミコハク酸の抱合：
デキサメタゾンヘミコハク酸（２、０．０２０ｇ、０．０４０６ｍｍｏｌ、１．０等量）を無水ＤＭＦに完全に溶解した。０．２４４ｇ（０．０４８ｍｍｏｌ、１．２等量）のビオチン化ＰＥＧアミンを２のＤＭＦ溶液に添加した。次に、０．０１８７ｇ（４．０等量）のＮＨＳを、同一の溶液に添加し、１５分間反応させ、その後０．０３９ｇ（５．０等量）のＥＤＣＩを溶液に添加した。反応をＮ２気流下で４８時間行った。４８時間後、ＤＭＦを蒸発させ、反応混合物を最小量のＤＭＦに再び溶解し、ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ２０を充填したサイズ排除クロマトグラフを通過させた。ニンヒドリン試薬でアミンへの陽性を示した溶出分画（ビオチンの二級アミンによる）を収集・貯留した。収集した分画からＤＭＦを留去し、ビオチン化ＰＥＧ‐デキサメタゾン（３）の粘稠な黄色を帯びた生成物を得た。図２３は、デキサメタゾン固定化アビジン（エステル結合）の合成経路スキームを示す。
【０２２４】
ｐＨ感受性ヒドラゾン結合を介してデキサメタゾン抱合するアビジンの合成：
デキサメタゾン（６‐マレイミドプロピロニル）ヒドラゾン（４）の合成：デキサメタゾン塩酸塩（１）およびＮ‐β‐マレイミドプロピオン酸ヒドラジドトリフルオロ酢酸塩（ＢＭＰＨ）を５ｍＬのメタノールに溶解した。トリフルオロ酢酸（１．９２ｕＬ）を添加し、溶液を室温で２４時間撹拌した。メタノール溶液を、減圧下３１℃で０．９６ｍＬの容量に濃縮した。この濃縮溶液に、５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、得られた懸濁液を、生成物の結晶化のために４℃で４８時間放置した。固体状のヒドラゾンを遠心分離で単離し、新鮮なＰＢＳで洗浄し、凍結乾燥し、デキサメタゾン（β‐マレイミドプロピオニル）ヒドラゾン（４）を得た。
【０２２５】
デキサメタゾン（β‐マレイミドプロピオニル）ヒドラゾンのビオチン化ＰＥＧアミンへの抱合：
イミノチオラン塩酸塩（０．００２ｍｇ、２０μｍｏｌ、５．０等量）を、１ｍＬのＥＤＴＡ添加リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した。ビオチン化ＰＥＧアミン（０．０２０ｇ、４．０μｍｏｌ、１．０等量）を、０．５ｍＬの同一の緩衝液に溶解した。得られたイミノチオラン塩酸塩溶液をＰＥＧ溶液に添加し、２０分間撹拌しながら反応させた。デキサメタゾン（β‐マレイミドプロピオニル）ヒドラゾンは、最小量のＤＭＳＯに溶解し、イミノチオラン活性化ビオチン化ＰＥＧアミンを含有する緩衝液溶液に添加した。反応を一晩行った。析出物を遠心分離し、廃棄した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して上澄みを４時間の短期透析しＤＭＳＯを除去し、最終産物を得るために溶液を凍結乾燥した。図２４は、ヒドラゾン結合の形成を介したデキサメタゾン固定化アビジンの合成スキームを示す。
【０２２６】
結果
薬物送達システムは、機械的な傷害の後に疼痛および炎症の即時の軽減を与えるために関節内で薬物を大量に放出し、その後、傷害の異化効果および炎症性サイトカインのレベル上昇を抑制するために数日間少用量の薬物を徐放可能であることが重要である。急性の関節傷害の後、滑液中の炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ‐１、ＩＬ‐６、ＴＮＦα）レベルが即時に上昇し、それらは軟骨の中へ拡散し、タンパク質分解および軟骨基質の損失を急速に開始する。本明細書で示したものは、アビジンを薬物担体として、デキサメタゾンを薬物例として使用して設計した様々な構造物である。
【０２２７】
概して、アビジンおよびデキサメタゾン間の非共有結合的抱合を、薬物の大量放出（即時的効果を与えるため）を可能とするために使用し、直接共有結合的抱合をある期間にわたっての薬物放出を可能とするために使用し、それによって生物学的応答を誘発するための持続性の長期的効果を与える。非共有結合的抱合では、薬物がアビジン構造内部に超分子的に包括されるが、エステルリンカーおよび／またはｐＨ感受性ヒドラゾンリンカーを共有結合的抱合で利用する。さらに、ある構築物ではペグ化アビジンを薬物担体として使用した。
【０２２８】
非共有結合を用いた超分子捕捉は、アビジン＋デキサメタゾンおよびアビジン‐ＰＥＧ２Ｋ＋デキサメタゾンを使用して達成された。共有結合的抱合は、アビジン-デキサメタゾンおよびアビジン‐ＰＥＧ２Ｋ-デキサメタゾンで達成された。無数の他の組合わせが当業者のスキルにより可能であり、本明細書に記載される本発明を使用して達成可能である。
【０２２９】
超分子捕捉（非共有カプセル化）を例えば図２１Ａに示す。図２１Ａは、ペグ化アビジン内でのデキサメタゾンの超分子捕捉を示す。両者の構造で（ペグ化および非ペグ化バージョン）、約３３％の薬物負荷含有量が達成された。両構造でデキサメタゾンが多量に放出された；ｐＨ７、３７℃で薬物の７０％が３〜４時間以内に放出された（図２２Ａ）。
【０２３０】
図２１Ｂ〜Ｃは、それぞれエステルおよびヒドラゾンリンカーを介してデキサメタゾンを抱合するアビジンを示す。エステルリンカーでは平均寿命が２０．８時間（半減期約１４．４時間）であり、ヒドラゾンリンカーではｐＨ７で極度に安定していた。図２２Ｂは、非共有結合的抱合化学およびエステルリンカーでの薬物放出プロフィールの比較を示す。図２２Ｃは、ｐＨ７とｐＨ４でのヒドラゾンリンカーの放出プロフィールの比較を示す。最終産物は、デキサメタゾンを非共有結合的に負荷、またはエステルおよび／またはヒドラゾンリンカーを介して共有結合的に抱合するアビジン（ペグ化または非ペグ化）である。
【０２３１】
表面に連結したまたは内部にカプセル化したアビジン‐Ｄｅｘ共有結合構造を有する直径が４０ｎｍを超えるＰＬＧＡ／ポリマー粒子を作製した。そのような構造は関節内の薬物デポーとして作用し、平均半減期を増加させるであろう。アビジン‐Ｄｅｘ構造がポリマー粒子から放出されるにつれて、静電相互作用のため、そられは軟骨の中へ透過するであろう。
【０２３２】
例７：エステル結合を介したデキサメタゾン抱合アビジンの生物学的応答
例６に示すようにエステル結合を用いて作成したアビジン‐デキサメタゾン構造体の生物学的活性をin vitro軟骨組織システムにおいてテストした。
in vitroシステムにおいて、軟骨組織を、８日間にわたって対照、ＩＬ‐１（１ｎｇ／ｍＬ）、単一用量のデキサメタゾン（１００μｍ）、単一用量のアビジン‐デキサメタゾン粒子（２５〜１００μｍ）、または連続用量のデキサメタゾン（１００ｎＭ）に暴露した。ｓＧＡＧ累積損失率（図２５Ａ）を、２日、４日、６日および８日後に測定した。それぞれのｓＧＡＧ合成の速度も測定した（図２５Ｂ）。単一用量のアビジン‐デキサメタゾン粒子は、連続用量のデキサメタゾンと比較しても累積ＧＡＧ損失を有意に減少させた。
【０２３３】
参考文献
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ＡＢ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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