(57)【要約】  本特許文書は、ヘパリン及び／又はヘパリン様構造（ＡＴβＨ）と複合体化したヒト抗トロンビンβに対する、抗体、抗原結合抗体断片（Ｆａｂ）、及び他のタンパク質スキャフォールドに関する。これらのＡＴβＨ結合タンパク質は、ＡＴβの抗凝固活性をブロックし、凝固を誘導し得る。抗体及び結合剤の治療的使用は特異的抗体のパニング及びスクリーニングの方法として、本書中で記載される。【選択図】図１４
2016519081.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗トロンビン（β）ヘパリン複合体（ＡＴβＨ）に結合可能であるモノクローナル抗体であって、ここで、前記抗体の重鎖は、配列番号２のアミノ酸３１〜３５（ＡＹＲＭＧ）のＣＤＲ１配列、配列番号２のアミノ酸５０〜６６（ＲＩＹＳＳＧＧＲＴＲＹＡＤＳＶＫＧ）のＣＤＲ２配列、及び配列番号２のアミノ酸９７〜１１４（ＡＲＥＫＡＳＤＬＳＧＳＦＳＥＡＬＤＹ）のＣＤＲ３配列を含み；並びに前記抗体の軽鎖は、配列番号１のアミノ酸２４〜３４（ＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ）のＣＤＲ１配列、配列番号１のアミノ酸５０〜５６（ＧＫＮＮＲＰＳ）のＣＤＲ２配列；及び配列番号１のアミノ酸８９〜９９（ＮＳＲＤＳＳＧＮＨＬＶ）のＣＤＲ３配列を含む、前記抗体。
【請求項２】
ＡＴβＨに結合可能であるモノクローナル抗体であって、ここで、前記抗体の重鎖は、配列番号４のアミノ酸３１〜３５（ＫＹＫＭＤ）のＣＤＲ１配列、配列番号４のアミノ酸５０〜６６（ＲＩＧＰＳＧＧＫＴＭ  ＹＡＤＳＶＫＧ）のＣＤＲ２配列、及び配列番号４のアミノ酸９７〜１１４（ＡＲＥＫＡＳＤＬＳＧ  ＴＹＳＥＡＬＤＹ）のＣＤＲ３配列を含み；並びに、前記抗体の軽鎖は、配列番号３のアミノ酸２６〜３７（ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ）のＣＤＲ１配列、配列番号３のアミノ酸５３〜５９（ＧＡＳＳＲＡＴ）のＣＤＲ２配列、及び配列番号３のアミノ酸９２〜９９（ＱＱＹＧＳＳＲＴ）のＣＤＲ３配列を含む、前記抗体。
【請求項３】
ＡＴβＨに結合可能であるモノクローナル抗体であって、ここで、前記抗体の重鎖は、配列番号６のアミノ酸３１〜３５（ＫＹＲＭＤ）のＣＤＲ１配列、配列番号６のアミノ酸５０〜６６（ＲＩＧＰＳＧＧＫＴＴ  ＹＡＤＳＶＫＧ）のＣＤＲ２配列、及び配列番号６のアミノ酸９７〜１１４（ＡＲＥＫＴＳＤＬＳＧ  ＳＹＳＥＡＬＤＹ）のＣＤＲ３配列を含み；並びに、前記抗体の軽鎖は、配列番号５のアミノ酸２６〜３６（ＲＡＳＱＮＩＮＲＮＬＡ）のＣＤＲ１配列、配列番号５のアミノ酸５２〜５８（ＴＡＳＴＲＡＰ）のＣＤＲ２配列、及び配列番号６のアミノ酸９１〜９９（ＱＱＹＡＳＰＰＲＴ）のＣＤＲ３配列を含む、前記抗体。
【請求項４】
ＡＴβＨに結合可能であるモノクローナル抗体であって、ここで、前記抗体の重鎖は、配列番号８のアミノ酸３１〜３５（ＲＹＡＭＹ）のＣＤＲ１配列、配列番号８のアミノ酸５０〜６６（ＲＩＳＰＳＧＧＫＴＨ  ＹＡＤＳＶＫＧ）のＣＤＲ２配列、及び配列番号８のアミノ酸９７〜１１５（ＡＲＬＳＱＴＧＹＹＰ  ＨＹＨＹＹＧＭＤＶ）のＣＤＲ３配列を含み；並びに、前記抗体の軽鎖は、配列番号７のアミノ酸２６〜３７（ＲＡＳＱＲＶＳＳＳＹＬＴ）のＣＤＲ１配列、配列番号７のアミノ酸５３〜５９（ＧＡＳＳＲＡＴ）のＣＤＲ２配列；及び配列番号７のアミノ酸９２〜１０１（ＱＱＹＤＳＴＰＰＬＴ）のＣＤＲ３
配列を含む、前記抗体。
【請求項５】
ＡＴβＨに結合可能であるモノクローナル抗体であって、ここで、前記抗体の重鎖は、配列番号１０のアミノ酸３１〜３５（ＳＹＲＭＳ）のＣＤＲ１配列、配列番号１０のアミノ酸５０〜６６（ＲＩＹＳＳＧＧＲＴＲ  ＹＡＤＳＶＫＧ）のＣＤＲ２配列、及び配列番号１０のアミノ酸９７〜１１４（ＡＲＥＬＫＡＳＤＬＳＧ  ＳＦＳＥＡＬＤＹ）のＣＤＲ３配列；並びに、前記抗体の軽鎖は、配列番号９のアミノ酸２３〜３３（ＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ）のＣＤＲ１配列、配列番号９のアミノ酸４９〜５５（ＧＫＮＮＲＰＳ）のＣＤＲ２配列；並びに配列番号９のアミノ酸８８〜９６（ＮＳＲＤＳＳＧＮＨ）のＣＤＲ３配列を含む、前記抗体。
【請求項６】
ＡＴβＨに結合して抗凝血活性を阻害する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号２、４、６、８、及び１０、並びに配列番号２、４、６、８、及び１０に対し実質的な相同性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、前記抗体。  
【請求項７】
配列番号１、３、５、７、及び９、並びに配列番号１、３、５、７、及び９に対し実質的な相同性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、請求項６に記載の抗体。  
【請求項８】
ＡＴβＨに結合して抗凝血活性を阻害する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号１、３、５、７、及び９、並びに配列番号１、３、５、７、及び９に対し実質的な相同性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、前記抗体。
【請求項９】
ＡＴβＨに結合して抗凝血活性を阻害する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号４６、４７、４８、４９及び５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、前記抗体。
【請求項１０】
請求項９に記載の単離されたモノクローナル抗体であって、以下：（ａ）配列番号３６、３７、３８、３９、及び４０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；（ｂ）配列番号４１、４２、４３、４４、及び４５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；又は（ｃ）配列番号３６、３７、３８、３９、及び４０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１並びに配列番号４１、４２、４３、４４、及び４５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２の両方、をさらに含む前記抗体。
【請求項１１】
ＡＴβＨに結合して抗凝血活性を阻害する単離されたモノクローナル抗体であって、配列番号３１、３２、３３、３４、及び３５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、前記抗体。
【請求項１２】
請求項１１に記載の単離されたモノクローナル抗体であって、以下：（ａ）配列番号２１、２２、２３、２４、及び２５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；（ｂ）配列番号２６、２７、２８、２９、及び３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；又は（ｃ）配列番号２１、２２、２３、２４、及び２５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１並びに配列番号２６、２７、２８、２９、及び３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２の両方、をさらに含む前記抗体。
【請求項１３】
ＡＴβＨの活性部位に結合する、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項１４】
ＡＴβＨに結合して抗凝固活性を提供するモノクローナル抗体であって、前記単離されたモノクローナル抗体は、ＡＴに対する最小限の結合を示し、前記抗体は、完全ヒト抗体である、前記抗体。
【請求項１５】
前記抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ抗体、及び抗体断片からなる群より選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１６】
ヒトＡＴβＨに結合する、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項１７】
前記抗体は、非ヒト種のＡＴβＨにさらに結合する、請求項１６に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項１８】
前記抗体の存在下で、血液凝固時間が短くなる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体と競合する抗体。
【請求項２０】
治療有効量の請求項１〜１４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、及び製薬的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物。
【請求項２１】
治療有効量の請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、遺伝性又は後天性の凝固における不全を処置するための方法。
【請求項２２】
治療有効量の請求項２０に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、凝固障害を処置するための方法。
【請求項２３】
前記凝固障害は、血友病Ａ、血友病Ｂ又は血友病Ｃである、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記凝集障害は、外傷誘発型凝固障害及び重症の出血からなる群より選択される、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２５】
凝固因子を投与することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記凝固因子は、因子ＶＩＩａ、因子ＶＩＩＩ及び因子ＩＸからなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
治療有効量の請求項２０に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、出血時間を短くするための方法。
【請求項２８】
ＡＴβＨに結合して抗凝血活性を阻害する抗体をコードする単離された核酸分子であって、前記抗体は、配列番号１、３、５、７、及び９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、前記核酸分子。
【請求項２９】
ＡＴβＨに結合して抗凝血活性を阻害する抗体をコードする単離された核酸分子であって、前記抗体は、配列番号２、４、６、８、及び１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、前記核酸分子。
【請求項３０】
前記凝固における不全は、血友病Ａ、血友病Ｂ又は血友病Ｃである、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、ＰＣＴ国際特許出願として２０１４年３月１４日に提出され、２０１３年３月１４日に提出された米国仮特許出願第６１／７８４，５９０号に対する優先権を主張する。この出願の全開示は、それ自体において参考によって組み込まれる。
【０００２】
配列表提出
本出願は、２０１４年３月１４日に作成され「配列−ＬＩＳＴＩＮＧ−１７２０７．０００６ＷＯＵ２」と題された、６５．１キロバイト（ＫＢ）のサイズを有するｔｘｔファイルとしての電子フォーマットにおける配列表を含む。ｔｘｔファイル「配列−ＬＩＳＴＩＮＧ−１７２０７．０００６ＷＯＵ２」の内容は、本書中で参考によって組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
血友病分野における現在満たされていない医学的需要は、主に以下である：（１）インヒビター保有血友病患者の処置（血友病患者の約３０％）；並びに（２）長く活性であり且つ有効な凝固因子（ＦＶＩＩＩ／ＦＩＸ）及び／又はその代替物（バイパス薬物）（ＷＦＨ  ｒｅｐｏｒｔ  ２０１２，Ｐａｒｉｓ）。インヒビター保有血友病患者を処置するための最も広範に使用されているバイパス薬物は、ｒＦＶＩＩである。これは、血栓形成性の危険性、血漿中での短い半減期、及び製造コストの高さなどの主な欠点を有する。抗凝固因子に対する抗体、例えば、組織因子タンパク質インヒビター（ＴＦＰＩ）、ＡＰＣ（活性型タンパク質Ｃ）及び抗トロンビン（ＡＴ）が、新規の処置パラダイムを代表する。これらの抗体は、インヒビター保有血友病患者におけるＦＶＩＩＩ又はＦＩＸ凝固因子を回避するか、その必要性を軽減するだけでなく、また、より長い血漿半減期を示し（このことは、投薬頻度を下げる）、従って、患者コンプライアンスを上げる。現在、非臨床開発又は研究段階において、幾つかの抗体ベースの凝固促進薬物、例えば、抗ＴＦＰＩ及び抗ＡＰＣが存在する。
【０００４】
ＡＴは、ヒト血漿における主な抗凝固薬である。これは、トロンビン、ＦＸａ及び凝固経路において機能する他のセリンプロテアーゼ類を阻害する。これは、４３２のアミノ酸から成り、肝臓の肝細胞によって産生され、３日間もの長い血漿半減期を有する（Ｃｏｌｌｅｎ，Ｓｃｈｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．１９７７）。ＡＴのアミノ酸配列は、十分に保存されており、雌ウシ、ヒツジ、ウサギ、マウス及びヒトの間の相同性は、８４％〜８９％である（Ｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｂｊｏｒｋ  １９９４）。ＡＴの生理学的な一次標的は、トロンビン及びＦＸａであり、ＡＴはまた、ＦＩＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ並びにＦＶＩＩａをも、より低い程度で阻害する。ＡＴは、その阻害を、ヘパリンと共に発揮する。ヘパリンの存在下で、トロンビン及びＦＸａのＡＴによる阻害速度は、それぞれ７〜１１×１０３Ｍ−１ｓ−１から１．５〜４×１０７Ｍ−１ｓ−１まで、及び２．５×１０−３Ｍ−１ｓ−１から１．２５  −２．５Ｍ−１ｓ−１まで、３〜４桁増大する（Ｏｌｓｏｎ，Ｓｗａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。
【０００５】
それぞれ開始ステージ及び増幅ステージでのみ凝固を阻害するＴＦＰＩ及びＡＰＣとは異なり、ＡＴは、開始ステージ及び増幅ステージの両方で、凝固に対する阻害を発揮する。従って、ＡＴをブロッキングすることは、ＴＦＰＩ又はＡＰＣのいずれかのみをブロッキングすることよりも、より強力な凝固促進効果を有し得る。ＡＴレベル及び活性の低減は、ヒトにおける血栓症の増加と相関することが示されている。ＡＴ欠損を有する患者は、静脈血栓症及び肺血栓症の再発を示す傾向がある（ｖａｎ  Ｂｏｖｅｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  １９９７）。さらに、ホモ接合性ＡＴノックアウトマウスは、過度の凝固亢進状態により胚段階で死ぬ（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｋｏｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。近年の研究は、ＡＴが５０％低減しているヘテロ接合ＡＴノックアウトマウスは尾切断出血モデルにおいて、より少ない失血及び増大したトロンビン産生を、有意に有した（Ｂｏｌｌｉｇｅｒ，Ｓｚｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。
【０００６】
ＡＴは、Ａｓｎ１３５における異なるグリコシル化に基づく２つのイソ型、ＡＴα及びＡＴβを有する、糖タンパク質である（Ｂｊｏｒｋ  １９９７）。ＡＴβは、Ａｓｎ１３５におけるグリコシル化を有さず、ヒト血漿ＡＴ中の１０％を表す、少数派の糖イソ型である。Ａｓｎ１３５は、最初のヘパリン付着部位に隣接して位置し、アロステリック活性化及びＤへリックス伸長の後に、ヘパリン結合部位の一部を構成する（ｄｅｌａ  Ｃｒｕｚ，Ｊａｉｒａｊｐｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。Ａｓｎ１３５におけるかさばる大きさのグリカンの欠如は、以下の２つの様式で、ＡＴβ活性化に大いに影響する：１）ＦＸａ及びＦＩＸａの阻害に必要であるヘパリン結合の際のより速いアロステリック活性化；及び２）架橋メカニズムによるＦＸａ及びトロンビンの阻害のための、より親和性の高いヘパリン結合のための余分のアクセス可能な結合部位。実際に、生理学的塩濃度下で、血漿由来ＡＴβは、ヘパリンに、３６＋／−３ｎｍのＫＤで結合し、他方で、ＡＴαは、ヘパリンに、５００＋／−５０ｎｍのＫＤで結合する（Ｔｕｒｋ  ＩＶ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。ヘパリンに対するＡＴβのより高い親和性は、ヘパリン様構造グリコサミノグリカンが豊富な内皮下層への優先的分布をもたらす。結果として、ＡＴβは、脈管損傷部位におけるＦＸａ及びトロンビン阻害において、主要且つ強力な役割を果たすと提唱されている（Ｃａｒｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｔｅｎｃｉｏ  １９８２；ＭｃＣｏｙ  ＡＪ，Ｐｅｉ  ＸＹ．ｅｔ  ａｌ．２００３；Ｔｕｒｋ  Ｂ，Ｂｒｉｅｄｉｔｉｓ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．１９９７；Ｗｉｔｍｅｒ  ＭＲ，Ｈａｔｔｏｎ  ＭＷ．１９９１；Ｆｒｅｂｅｌｉｕｓ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．１９９６）。ＡＴαと比較したＡＴβの重要性且つより強い能力はまた、臨床研究においても報告されている。患者において、ヘパリン結合において欠損しているＡＴホモ接合突然変異の重症度は、ＡＴのベータ型によって緩和される（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｎａｖａｒｒｏ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。別の研究において、ＡＴのボーダーラインレベル（正常ＡＴ抗原及び活性の約７０％）は、血漿中の２０％〜３０％のＡＴβによって埋め合わされる（Ｂａｙｓｔｏｎ，Ｔｒｉｐｏｄｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＷＦＨ  ｒｅｐｏｒｔ  ２０１２，Ｐａｒｉｓ
【非特許文献２】Ｃｏｌｌｅｎ，Ｓｃｈｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．１９７７
【非特許文献３】Ｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｂｊｏｒｋ  １９９４
【非特許文献４】ｖａｎ  Ｂｏｖｅｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  １９９７
【非特許文献５】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｋｏｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．２０００
【非特許文献６】Ｂｏｌｌｉｇｅｒ，Ｓｚｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．２０１０
【非特許文献７】Ｂｊｏｒｋ  １９９７
【非特許文献８】ｄｅｌａ  Ｃｒｕｚ，Ｊａｉｒａｊｐｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２００６
【非特許文献９】Ｔｕｒｋ  ＩＶ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３
【非特許文献１０】Ｃａｒｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｔｅｎｃｉｏ  １９８２
【非特許文献１１】ＭｃＣｏｙ  ＡＪ，Ｐｅｉ  ＸＹ．ｅｔ  ａｌ．２００３
【非特許文献１２】Ｔｕｒｋ  Ｂ，Ｂｒｉｅｄｉｔｉｓ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．１９９７
【非特許文献１３】Ｗｉｔｍｅｒ  ＭＲ，Ｈａｔｔｏｎ  ＭＷ．１９９１
【非特許文献１４】Ｆｒｅｂｅｌｉｕｓ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．１９９６
【非特許文献１５】Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｎａｖａｒｒｏ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．２０１２
【非特許文献１６】Ｂａｙｓｔｏｎ，Ｔｒｉｐｏｄｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ヒトＡＴβＨ（ヘパリン及び／又はヘパリン様構造と複合体化したＡＴβ）に対するモノクローナル抗体が、提供される。少なくとも１つの実施形態において、上記抗ＡＴβＨモノクローナル抗体は、ヘパリンと複合体化したＡＴβへの結合を示す。
【０００９】
他の実施形態において、ＡＴβＨに対する上記モノクローナル抗体は、例えば、親和性を増大するか、又は機能活性を増大するために、最適化されてもよい。また、ヒトＡＴβＨ上にあり得且つ単離されたモノクローナル抗体によって結合され得る特異的エピトープが、提供される。さらに、これをコードする単離された核酸が、提供される。
【００１０】
抗ＡＴβＨモノクローナル抗体を含有する医薬組成物、並びに血友病Ａ及びＢなどの、遺伝的及び後天的な凝固における不全若しくは欠損の処置の方法もまた、提供される。
【００１１】
また、必要とする患者に抗ＡＴβＨモノクローナル抗体を投与することによって、出血時間を短くするための方法も、提供される。ヒトＡＴβＨに結合するモノクローナル抗体を産生するための方法もまた、提供される。
【００１２】
当業者は、以下に説明される図面は、説明の目的のみのものであることを、理解する。
【００１３】
図面は、本教示又は特許請求の範囲を制限することを、多少なりとも意味しない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ヘパリンに結合したＡＴβ及びＡＴβの種々の結合ドメインの模式図を示す。
【図２Ａ】１つのＮ−グリカンの欠如によって、いかにしてＡＴβがＡＴαと識別されるかを示す。
【図２Ｂ】１つのＮ−グリカンの欠如によって、いかにしてＡＴβがＡＴαと識別されるかを示す。
【図２Ｃ】１つのＮ−グリカンの欠如によって、いかにしてＡＴβがＡＴαと識別されるかを示す。
【図３Ａ】ヘパリンへのＡＴαよりも迅速な結合及びＡＴαよりも強力な阻害を有するＡＴβを示す。
【図３Ｂ】ヘパリンへのＡＴαよりも迅速な結合及びＡＴαよりも強力な阻害を有するＡＴβを示す。
【図３Ｃ】ヘパリンへのＡＴαよりも迅速な結合及びＡＴαよりも強力な阻害を有するＡＴβを示す。
【図３Ｄ】ヘパリンへのＡＴαよりも迅速な結合及びＡＴαよりも強力な阻害を有するＡＴβを示す。
【図４Ａ】ビオチン化ｈＡＴ及びｒＡＴが、Ｆｘａ産生の阻害において機能的であることを示す。
【図４Ｂ】ファージディスプレイによる抗体発見のための種々の戦略を示す。
【図４Ｃ】ファージディスプレイによる抗体発見のための種々の戦略を示す。
【図５】Ａｔβ：：ヘパリンの機能的阻害が可能である抗体を同定するためのスクリーニング方法を示す。
【図６Ａ】抗体ＴＰＰ−２００９（それぞれ配列番号１及び配列番号２）、ＴＰＰ−２０１５（それぞれ配列番号３及び配列番号４）、ＴＰＰ−２０１６（それぞれ配列番号５及び配列番号６）、ＴＰＰ−２０１９（それぞれ配列番号７及び配列番号８，）、及びＴＰＰ−２８０３（それぞれ配列番号９及び配列番号１０）の、それぞれ軽鎖ドメイン及び重鎖ドメインのアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図６Ｂ】抗体ＴＰＰ−２００９（それぞれ配列番号１及び配列番号２）、ＴＰＰ−２０１５（それぞれ配列番号３及び配列番号４）、ＴＰＰ−２０１６（それぞれ配列番号５及び配列番号６）、ＴＰＰ−２０１９（それぞれ配列番号７及び配列番号８，）、及びＴＰＰ−２８０３（それぞれ配列番号９及び配列番号１０）の、それぞれ軽鎖ドメイン及び重鎖ドメインのアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図７Ａ】Ｂｉａｃｏｒｅ（図７Ａ）及びＥＬＩＳＡ（図７Ｂ）試験によって決定された抗体結合特異性、並びにヒトＡｔβＨに対する抗体結合親和性（図７Ｃ）を示す。
【図７Ｂ】Ｂｉａｃｏｒｅ（図７Ａ）及びＥＬＩＳＡ（図７Ｂ）試験によって決定された抗体結合特異性、並びにヒトＡｔβＨに対する抗体結合親和性（図７Ｃ）を示す。
【図７Ｃ】Ｂｉａｃｏｒｅ（図７Ａ）及びＥＬＩＳＡ（図７Ｂ）試験によって決定された抗体結合特異性、並びにヒトＡｔβＨに対する抗体結合親和性（図７Ｃ）を示す。
【図８Ａ】ヒトＨＥＭ−Ａ血漿におけるトロンビン産生に対するＴＰＰ抗体の効果のグラフ表示であり、ヒトＨＥＭ−Ａ血漿におけるピークトロンビン産生の増大を提示することを説明する。
【図８Ｂ】ヒトＨｅｍＡ血漿及びＡｔβ又はＡｔαを加えたヒトＡＴ欠損血漿において、抗体が凝固時間を短縮することを示す表である。
【図９】３匹のマウスへの１時点あたり０．３、３及び３０ｍｇ／ｋｇのＩＶ投薬（２１日間にわたり１０時点）を用いた、ＨＥＭ−Ａマウスにおける抗体ＴＰＰ  ２００９のＰＫのグラフ表示、及び関連のＰＫパラメータである。
【図１０Ａ】ＨｅｍＡにおける尾静脈切断（ＴＶＴ）モデルについての実験プロトコール、及びＨｅｍＡマウスにおけるＴＶＴモデルにおける抗体ＴＰＰ−２００９の効力を示す。図１０Ｂは、抗体ＴＰＰ−２００９が、ＨｅｍＡマウスにおける尾静脈切断（ＴＶＴ）モデルにおいて強力な効力を有することを示す。
【図１０Ｂ】ＨｅｍＡにおける尾静脈切断（ＴＶＴ）モデルについての実験プロトコール、及びＨｅｍＡマウスにおけるＴＶＴモデルにおける抗体ＴＰＰ−２００９の効力を示す。図１０Ｂは、抗体ＴＰＰ−２００９が、ＨｅｍＡマウスにおける尾静脈切断（ＴＶＴ）モデルにおいて強力な効力を有することを示す。
【図１１Ａ】ヘパリンと複合体化した／複合体化しない天然のＡＴβ、及びその予測エピトープ構造の三次元構造の分子モデルを示す。へリックスＤは、ヘパリン結合Ｂの上に伸長される。
【図１１Ｂ】ヘパリンに結合した完全活性型抗体ＴＰＰ２００９、及びその予測エピトープ構造の三次元構造の分子モデルを示す。へリックスＤは、ヘパリン結合Ｂの上に伸長される。
【図１２】ＴＰＰ２８０３が、正常ヒト血漿及び血友病患者血漿の両方において凝固時間の用量依存型短縮を示したことを、ＦＸａ活性型凝固アッセイを用いて示す。ＣＴ：凝固時間、ＨＥＭ−Ａ：血友病Ａ血漿。
【図１３】ヘパリン化ウサギ出血モデルの実験設計を示す；実験群：ビヒクル、ＰＢＳ；陽性対照、硫酸プロタミン、（２８ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ）；陰性対照、Ｍ１４  ＩｇＧ２；処置：３０ｍｇ／ｋｇ；ＴＰＰ２８０３，３ｍｇ／ｋｇ；ＴＰＰ２８０３，３０ｍｇ／ｋｇ。
【図１４】ヘパリン化ウサギ出血モデルにおけるＬＭＷＨ及び化合物投与の前後の、出血時間に対する対照及びＴＰＰ２８０３の効果を示す。
【図１５】デルタ出血時間に対する対照及びＴＰＰ２８０３の効果を示し、これは、ＰＢＳとは有意に異なった（ｐ＜０．０５；Ｔ検定）。
【図１６】ＬＭＷＨ及び抗体投与の前後の、失血に対する対照及びＴＰＰ２８０３の効果を示す（Ｔ検定によって有意）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示は、ＡＴβの活性型形態に特異的に結合するが、天然又は活性型のいずれであっても、ＡＴαに対しては比較的わずかな反応性しか示さないか又は全く反応性を示さない、モノクローナル抗体を含む抗体、並びに他の結合タンパク質を提供する。
【００１６】
定義
本明細書を解釈する目的のために、以下の定義を適用する。以下に示す何らかの事象が、本書中で参考によって組み込まれる任意の文書を含め何らかの他の文書における語と矛盾する場合、（例えば、その用語が元々使用された文書において）反する意味が明らかに意図されない限り、以下に示す定義が、本書及びその添付特許請求の範囲を解釈する目的で常に支配する。
【００１７】
適切な場合はいつでも、単数形で使用される幼用語は複数形をも含み、逆もまたしかりである。本書中で「１つの（ａ）」の使用は、そうでないことを言及するか、又は「１以上の」の使用が明らかに不適当でない限り、「１以上の」を意味する。「又は（ｏｒ）」の使用は、そうでないことを言及しない限り、「及び／又は」を意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」及び「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」は、相互交換可能であり、且つ、限定しない。用語「例えば（ｓｕｃｈ  ａｓ）」、「ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ」及び「ｅ．ｇ．」もまた、限定することを意図しない。例えば、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「含むが、これに限定しない」ことを意味するべきである。
【００１８】
本書中で使用される場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、提供される単位値の＋／−１０％をいう。本書中で使用される場合、用語「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」は、目的の特徴又は特性の全て又はそれに近い程度を示す定性的状態をいう。生物学分野の当業者は、生物学的及び化学的組成物並びに材料の試験、産生及び保存に影響を及ぼす多くの変数ゆえに、並びに、生物学的及び化学的組成物並びに材料の試験、産生及び保存において使用される器具及び装置における固有の誤りゆえに、生物学的及び化学的現象が、絶対的な結果を達成するか又はこれを避けることは、仮にあったとしても、滅多にないことを理解する。実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）の用語は、従って、本書中で、多くの生物学的及び化学的現象に固有の、完全性の潜在的欠如を捕らえるために使用される。
【００１９】
用語「ＡＴβ」又は「ＡＴβＨ」は、本書中で使用される場合、細胞によって天然に発現され、血漿中に存在し、且つＡＴαとは異なる形態であるＡＴの、任意のバリアント、イソ型及び／又は種ホモログをいう。さらに、本書中で使用される用語「ＡＴβ」又は「ＡＴβＨ」はまた、ヘパリン又はヘパリン様構造と複合体化したＡＴβの活性型形態をもいう。
【００２０】
用語「抗体」は、本書中で使用される場合、抗体全体及びその任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）又は１本鎖をいう。この用語は、天然に存在するか又は正常な免疫グロブリン遺伝子断片李コンビナトリアルプロセスから形成された完全長免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）、又は免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部位、例えば特異的結合活性を保持する抗体断片を含む。構造に関係なく、抗体断片は、完全長抗体によって認識されるものと同じ抗原に結合する。例えば、抗ＡＴβＨモノクローナル抗体断片は、ＡＴβＨのエピトープに結合する。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって発揮され得る。抗体の「抗原結合部分」の用語に含まれる結合断片の例としては、以下が挙げられる：（Ｉ）ＶＬ，ＶＨ，ＣＬ及びＣＨ１ドメインから成る一価の断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の１本の腕のＶＬ及びＶＨドメインから成Ｆｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインから成るｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；（ｖｉｉ）ミニボディ、ディアボディ、トライアボディ、テトラボディ、及びカッパボディ（例えば、Ｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １９９７；１０：９４９−５７を参照されたい）；（ｖｉｉｉ）ラクダＩｇＧ；並びに（ｉｘ）ＩｇＮＡＲ。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別個の遺伝子によってコードされているが、これらは、組換え方法を用いて、ＶＬ及びＶＨ領域が対形成して一価の分子を形成した１本のタンパク質鎖として作成することができる合成リンカーにより、合わせられてもよい（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知である；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；ａｎｄ  Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照されたい）。このような単鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」の用語に含まれる。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技術を用いて得られ、この断片は、無傷の抗体と同じ様式での用途のために分析される。
【００２１】
さらに、抗原結合断片は、抗体模倣物に含まれ得ることが企図される。用語「抗体模倣物」又は「模倣物」は、本書中で使用される場合、特定の抗体に類似の結合活性を示すが、より小さい代替抗体であるか、又は非抗体タンパク質であるタンパク質をいう。このような抗体模倣物は、スキャフォールドに含まれてもよい。用語「スキャフォールド」は、あつらえた機能及び特徴を有する新規な産物の操作のための、ポリペプチドプラットフォームをいう。
【００２２】
用語「抗ＡＴβ抗体」は、本書中で使用される場合、ヘパリン又はヘパリン様物と結合したＡＴβのエピトープに特異的に結合する抗体をいう。インビボでＡＴβＨのエピトープに結合する場合、本書中で開示される抗ＡＴβ抗体は、血液凝固カスケードの１以上の局面を増大する。
【００２３】
用語「結合を阻害する」及び「結合をブロックする」（例えば、ＡＴβ基質のＡＴβＨに対する阻害／ブロッキングをいう）は、本書中で使用される場合、相互交換可能に使用され、且つ基質によるタンパク質の部分的な若しくは完全な阻害又はブロッキング、例えば少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、９９％、又は約１００％の阻害又はブロッキングを含む。
【００２４】
Ａｔβ基質のＡＴβへの結合の阻害及び／又はブロッキングに関して、阻害及びブロッキングの用語はまた、抗ＡＴβ抗体と接触しないＡＴβと比較した、抗ＡＴβ抗体と接触した際のＡＴβ及び／又はＡＴβＨの生理学的基質への結合親和性における任意の測定可能な低減、例えば、ＡＴβとその基質との相互作用の、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％のブロッキングをも含む。
【００２５】
用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、本書中で使用される場合、１分子組成物の抗体分子をいう。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する１つの結合特異性及び親和性を呈示する。従って、用語「ヒトモノクローナル抗体」は、本書中で使用される場合、１つの結合特異性を呈示する、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体をいう。ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロのランダム若しくは部位特異的突然変異誘発によって、又はインビボの体細胞突然変異によって誘導される突然変異）を含み得る。
【００２６】
用語「単離された抗体」は、本書中で使用される場合、異なる抗原特異性を有する抗体を含む他の生物学的分子を実質的に含まない抗体をいうことを意図する（例えば、ＡＴβＨに結合する単離された抗体は、ＡＴβＨ以外の抗原に結合する抗体を実質的に含まない）。幾つかの実施形態において、単離された抗体は、乾燥重量で、少なくとも約７５％、約８０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９９％、約９９．９％又は約１００％純粋である。幾つかの実施形態において、純度は、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はＨＰＬＣ分析などの方法によって測定され得る。ヒトＡＴβＨのエピトープ、イソ型又はバリアントに結合する単離された抗体は、しかし、他の関連の抗原、例えば、他の種由来の抗原（例えば、ＡＴβＨ種ホモログ）との、交差反応性を有し得る。さらに、単離された抗体は、他の細胞性材料及び／又は化学物質を、実質的に含まない。
【００２７】
用語「特異的結合」は、本書中で使用される場合、所定の抗原への抗体結合をいう。特定の結合を示す抗体は、代表的に、少なくとも約１０５Ｍ−１の親和性で抗原に結合し、無関係な抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に対する結合親和性よりも高い、例えば、少なくとも２倍高い親和性で、この抗原に対して結合する。語句「抗原を認識する抗体」及び「抗原について特異的な抗体」は、「抗原に特異的に結合する抗体」の用語と、本書中で相互交換可能に使用される。本書中で使用される場合、用語「最小限の結合」は、特定の抗原に対し結合せず、及び／又は低い親和性を示す抗体をいう。代表的には、抗原に対し最小限の結合を有する抗体は、約１０２Ｍ−１よりも低い親和性でこの抗原に結合し、無関係な抗原よりも高い親和性で所定の抗原に結合しない。
【００２８】
抗体、例えばＩｇＧ抗体などについて本書中で使用される場合、用語「高い親和性」は、少なくとも約１０７Ｍ−１、少なくとも１つの実施形態において少なくとも約１０８Ｍ−１、幾つかの実施形態において少なくとも約１０９Ｍ−１、約１０１０Ｍ−１、約１０１１Ｍ−１又はそれ以上、例えば、約１０１３Ｍ−１以上の結合親和性をいう。しかし、「高い親和性」結合は、他の抗体イソ型について変動し得る。例えば、ＩｇＭイソ型についての「高い親和性」結合は、少なくとも約１０７Ｍ−１の結合親和性をいう。
【００２９】
用語「イソ型」は、本書中で使用される場合、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ１）をいう。
【００３０】
用語「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」は、本書中で使用される場合、結合抗原の三次元構造に相補的であるＮ末端抗原結合表面を形成する、抗体の重鎖の可変領域又は軽鎖の可変領域内の１〜３の超可変領域をいう。重鎖又は軽鎖のＮ末端から進み、これらの相補性決定領域は、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」及び「ＣＤＲ３」と名付けられる［Ｗｕ  ＴＴ，Ｋａｂａｔ  ＥＡ，Ｂｉｌｏｆｓｋｙ  Ｈ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９７５  Ｄｅｃ；７２（１２）：５１０７及びＷｕ  ＴＴ，Ｋａｂａｔ  ＥＡ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９７０  Ａｕｇ  １；１３２（２）：２１１］。ＣＤＲは、抗原−抗体結合に関与し、ＣＤＲ３は、抗原−抗体結合に特異的な独特の領域を含む。従って、抗原結合部位は、重鎖及び軽鎖Ｖ領域のそれぞれに由来する６つのＣＤＲを含み得る。用語「エピトープ」は、抗体が特異的に結合するか又は相互作用する抗原の区域又は領域をいい、幾つかの実施形態において、抗原が抗体に物理的に接触する領域を示す。反対に、用語「パラトープ」は、抗原が特異的に結合する抗体の区域又は領域をいう。競合結合によって特徴づけられるエピトープは、対応する抗体の結合が相互排他的である、すなわち、１つの抗体が別の抗体の同時の結合を排除する場合、重複するといわれる。抗原が、両方の対応する抗体の同時の結合を受け入れることができる場合、エピトープは、分離型（独特）であるといえる。
【００３１】
用語「競合抗体」は、本書中で使用される場合、本書中で記載されるＡＴβＨに対する抗体と、およそ同じエピトープ、実質的に同じエピトープ、本質的に同じエピトープ、又は同じエピトープにすら、結合する抗体をいう。競合抗体は、エピトープ特異性が重複する抗体を含む。従って、競合抗体は、ＡＴβＨへの結合について、本書中で記載される抗体と効果的に競合できる。幾つかの実施形態において、競合抗体は、本書中で記載される抗体と同じエピトープに結合してもよい。視点を変えると、競合抗体は、本書中で記載される抗体と同じエピトープ特異性を有する。
【００３２】
用語「保存的置換」は、本書中で使用される場合、１以上のアミノ酸の、類似の生化学特性を有するアミノ酸に対する置換を含むポリペプチドの改変をいい、これは、このポリペプチドの生物学又は生化学機能の欠失をもたらさない。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸と置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。本開示の抗体は、なお抗原結合活性を保持する、１以上の保存的アミノ酸置換を有し得る。
【００３３】
核酸及びポリペプチドについて、用語「実質的に相同である」は、本書中で使用される場合、２つの核酸又は２つのポリペプチド、又はその指定された配列が、最適に並べられて比較された際に、適切なヌクレオチド又はアミノ酸の挿入又は欠失を伴って、ヌクレオチド又はアミノ酸の少なくとも約８０％、通常少なくとも約８５％、幾つかの実施形態において、ヌクレオチド又はアミノ酸の約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、又は約９５％、少なくとも１つの実施形態において、少なくとも約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．１％、約９９．２％、約９９．３％、約９９．４％又は約９９．５％が、同一であることを示す。あるいは、核酸についての実質的相同性は、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、セグメントがその相補鎖にハイブリダイズする場合に、存在する。また、本書中で記載される特定の核酸配列及びアミノ酸配列に対し実質的な相同性を有する核酸配列及びポリペプチド配列もまた、含まれる。２つの配列の間の同一性百分率は、これらの配列によって共有される同一の位置の数の関数であり（すなわち、％相同性＝同一の位置の＃／全ての位置の＃×１００）、この２つの配列の最適なアラインメントを導入するために必要なギャップの数及び各ギャップの長さを考慮に入れる。配列の比較及び２つの配列の間の同一性百分率の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得、これは、例えば、非限定で、ＡｌｉｇｎＸ（商標）ｍｏｄｕｌｅ  ｏｆ  ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）である。ＡｌｉｇｎＸ（商標）について、複数のアラインメントのデフォルトパラメータは、以下である：ギャップオープニングペナルティ：１０；ギャップ伸長ペナルティ：０．０５；ギャップ分離ペナルティ範囲：８；アラインメント遅延についての％同一性：４０。
【００３４】
２つの配列の間の同一性百分率は、これらの配列によって共有される同一の位置の数の関数であり（すなわち、％相同性＝同一の位置の＃／全ての位置の＃×１００）、この２つの配列の最適なアラインメントを導入するために必要なギャップの数及び各ギャップの長さを考慮に入れる。配列の比較及び２つの配列の間の同一性百分率の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得、これは、例えば、非限定で、ＡｌｉｇｎＸ（商標）ｍｏｄｕｌｅ  ｏｆ  ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）である。ＡｌｉｇｎＸ（商標）について、複数のアラインメントのデフォルトパラメータは、以下である：ギャップオープニングペナルティ：１０；ギャップ伸長ペナルティ：０．０５；ギャップ分離ペナルティ範囲：８；アラインメント遅延についての％同一性：４０。（さらなる詳細は、以下に見いだされる：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ＬＩＮＮＥＡ−Ｏｎｌｉｎｅ−Ｇｕｉｄｅｓ／ＬＩＮＮＥＡＣｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ／Ｖｅｃｔｏｒ−ＮＴＩ−Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ／Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ａｎａｌｙｓｉｓ−ａｎｄ−ｄａｔａ−ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ−ｓｏｆｔｗａｒｅ−ｆｏｒ−ＰＣｓ／ＡｌｉｇｎＸ−Ｍｏｄｕｌｅ−ｆｏｒ−Ｖｅｃｔｏｒ−ＮＴＩ−Ａｄｖａｎｃｅ．ｒｅｇ．ｕｓ．ｈｔｍｌ）。
【００３５】
問い合わせ配列（本開示の配列）と目的の配列との間の全体的マッチを決定するための、グローバル配列アラインメントとも呼ばれる別の方法もまた、ＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータープログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，２（２２）：４６７３−４６８０）を用いて決定され得、これは、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡＢＩＯＳ），１９９２，８（２）：１８９−１９１のアルゴリズムに基づく。配列アラインメントにおいて、問い合わせ配列及び目的の配列は、両方ともＤＮＡ配列である。上記のグローバル配列アラインメントの結果は、同一性百分率である。ＤＮＡ配列のＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントにおいて、対のアラインメントを介して同一性百分率を計算するために使用され得るパラメータは、以下である：Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝１、Ｔｏｐ  Ｄｉａｇｏｎａｌの数＝５、ギャップペナルティ＝３、ギャップオープンペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．１。複数のアラインメントについて、以下のＣＬＵＳＴＡＬＷパラメータが、使用され得る：ギャップオープニングペナルティ＝１０、ギャップ伸長パラメータ＝０．０５、ギャップ伸長ペナルティ範囲＝８；アラインメント遅延についての％同一性＝４０。
【００３６】
核酸は、細胞全体中、細胞溶解物中、又は部分的に精製された形態若しくは実質的に純粋な形態で、存在し得る。核酸は、天然の環境において核酸が通常伴っている他の細胞構成要素から精製されている場合、「単離されている」か、又は「実質的に純粋にされている」。核酸を単離するために、以下のような標準的技術が、使用され得る：アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び当該分野で周知の他の技術。
【００３７】
ＡＴβＨに対するモノクローナル抗体
血友病においてホメオスタシスが調節解除されている場合、又は創傷がホメオスタシスの一時的な欠損をもたらしている外傷患者の場合の出血障害が、ＡＴインヒビターによって処置され得る。抗体その抗原結合断片、及び他のＡＴ特異的タンパク質スキャフォールドが、ＡＴタンパク質機能のサブセットを阻害し他を保持する標的特異性を提供するために、使用され得る。ＡＴβ（＜１２ｕｇ／ｍｌ）対ＡＴα（１２０ｕｇ／ｍｌ）の血漿濃度における少なくとも１０倍の相違があると仮定すると、何らかの潜在的ＡＴβインヒビター治療の特異性の増大は、過剰なＡＴαの高い循環の存在下でＡＴβ機能をブロックすることに役立つ。ＡＴβの抗凝固機能をブロックするＡＴβ特異的抗体は、出血障害を有する患者のための治療として使用され得る。出血障害の例としては、血友病、インヒビター保有血友病患者、外傷誘発型凝固障害、ＡＴによる敗血症処置の間の重症な出血患者、例えば移植、心臓手術、整形手術などの待機的手術からもたらされる出血、及び月経過多による過剰な出血が挙げられる。長い循環半減期を有する抗ＡＴβＨ抗体は、血友病のような慢性疾患を処置する際に有用であり得る。より短い半減期を有するＡＴβＨ抗体断片又はＡＴβＨ結合タンパク質スキャフォールドは、急な使用（例えば、外傷における治療的使用）のためにより有効であり得る。ＡＴβＨ結合抗体は、ヒト抗体ライブラリーを、ヘパリンとの複合体におけるヒトＡＴβに対してパニングしてスクリーニングすることにより、同定される。同定された抗体は、ヒトＡＴβＨへの結合を示す。各単離されたモノクローナル抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を、配列決定し、そのＣＤＲ領域を、同定した。ＡＴβＨ特異的モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域に対応する配列識別子の数（「配列番号」）を、表１Ａにまとめる。
【表１】
2016519081.tif 000003
2016519081.tif 000004
【００３８】
少なくとも幾つかの可能性のある実施形態において、ヒトＡｔβＨに結合して抗凝血活性を阻害する単離されたモノクローナル抗体は、配列番号２、４、６、８及び１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を、さらに含む。
【００３９】
少なくとも幾つかの可能性のある実施形態において、ヒトＡｔβＨに結合して抗凝血活性を阻害する単離されたモノクローナル抗体は、配列番号１、３、５、７、及び９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を、さらに含む。
【００４０】
少なくとも幾つかの可能性のある実施形態において、ヒトＡｔβＨに結合して抗凝血活性を阻害する単離されたモノクローナル抗体は、配列番号２、４、６、８及び１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１、３、５、７、及び９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を、さらに含む。
【００４１】
少なくとも幾つかの可能性のある実施形態において、上記抗体は、以下を含む重鎖及び軽鎖可変領域を含む：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は
（ｄ）配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は
（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【００４２】
表１Ｂは、ヒト化ＩｇＧ  ｍＡｂについての重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を示す。
【表２】
2016519081.tif 000005
2016519081.tif 000006
2016519081.tif 000007
【００４３】
表１Ｃは、生殖系列化されてＩｇＧ２に変換されたＴＰＰ２８０３  ＩｇＧ２を示す。表１Ｃに示されるＴＰＰ２８０３  ＩｇＧ２軽鎖Ｇ２ラムダアミノ酸配列は、配列番号５９であり、表１Ｃに示されるＴＰＰ２８０３重鎖アミノ酸配列は、配列番号６０である。
【表３】
2016519081.tif 000008
2016519081.tif 000009
【００４４】
表２Ａは、ヒトＡＴβＨに結合するモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ領域（「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」及び「ＣＤＲ３」）についての配列番号のまとめを提供する。
【表４】
2016519081.tif 000010
【００４５】
表２Ｂは、ヒトＡＴβＨに結合するモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ領域（「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」及び「ＣＤＲ３」）についての配列番号の配列を提供する。
【表５】
2016519081.tif 000011
2016519081.tif 000012
【００４６】
少なくとも幾つかの可能性のある実施形態において、ヒトＡＴβＨに結合する単離されたモノクローナル抗体が提供され、ここで、この抗体は、配列番号４６〜５０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。これらのＣＤＲ３は、パンニング及びスクリーニングの間に同定された抗体の重鎖に由来する。
【００４７】
さらなる実施形態において、本抗体は、さらに、以下を含む：（ａ）配列番号３６〜４０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；（ｂ）配列番号４１〜４５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；又は（ｃ）配列番号３６〜４０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１及び配列番号４１〜４５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２の両方。
【００４８】
少なくとも幾つかの可能性のある実施形態において、抗体は、パニング及びスクリーニングの間に同定された抗体の軽鎖の１つに由来するＣＤＲ３を共有する。配列番号３１〜３５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、ＡＴβＨに結合して抗凝血活性を阻害する単離されたモノクローナル抗体もまた、提供される。さらなる実施形態において、この抗体はさらに、（ａ）配列番号２１〜２５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、（ｂ）ａ  配列番号２６〜３０，からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２又は（ｃ）配列番号２１〜２５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１及び配列番号２６〜３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２の両方、を含む。少なくとも幾つかの可能性のある実施形態において、この抗体は、パニング及びスクリーニングの間に同定された抗体の重鎖及び軽鎖に由来するＣＤＲ３を含む。配列番号４６〜５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３及び配列番号３１〜３５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、ＡＴβＨに結合して抗凝血活性を阻害する単離されたモノクローナル抗体が、提供される。
【００４９】
さらなる実施形態において、この抗体、さらに、以下を含む：（ａ）配列番号３６〜４０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；（ｂ）配列番号４１〜４５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；（ｃ）配列番号２１〜２５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；及び／又は（ｄ）配列番号２６〜３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２。
【００５０】
幾つかの実施形態において、上記抗体は、以下を含む重鎖及び軽鎖可変領域を含む：
（ａ）配列番号２１、２６及び３１を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号３６、４１及び４６を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｂ）配列番号２２、２７及び３２を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号３７、４２及び４７を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｃ）配列番号２３、２８及び３３を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号３８、４３及び４８を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｄ）配列番号２４、２９及び３４を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号３９、４４及び４９を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｅ）配列番号２５、３０及び３５を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号４０、４５及び５０を含むアミノ酸配列を含む重鎖可変領域。
【００５１】
ＡｔβＨに結合して抗凝固活性を阻害する単離されたモノクローナル抗体もまた提供され、ここで、この抗体は、配列番号１〜１０に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、少なくとも約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００５２】
この抗体は、種特異的であっても、又は他の種と交差反応してもよい。幾つかの実施形態において、この抗体は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ブタ、イヌ、ネコ又は他の哺乳動物種のＡＴβＨと特異的に反応しても、又は交差反応してもよい。
【００５３】
この抗体は、種々の抗体のクラスのいずれかであってもよく、例えば、非限定で、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌型ＩｇＡ及びＩｇＤ、並びにＩｇＥ抗体であってもよい。
【００５４】
１つの実施形態において、ヒトＡＴＩＩＩに対する単離された完全ヒトモノクローナル抗体が、提供される。
【００５５】
抗ＡＴβＨ抗体の最適化バリアント
幾つかの実施形態において、この抗体は、例えば、ＡＴβＨに対する親和性を増大するために、ＡＴαに対する親和性をさらに低減させるために、異なる種との交差反応性を改善するために、又はＡＴβＨのブロッキング活性を改善するために、パニングされ、スクリーニングされて、最適化されてもよい。このような最適化は、例えば、この抗体のＣＤＲ又はＣＤＲに非常に近接したアミノ酸残基、すなわちＣＤＲに隣接した約３又は４残基の、部位飽和突然変異誘発を用いて実施され得る。
【００５６】
また、ＡＴβＨに対して上昇した又は高い親和性を有し得るモノクローナル抗体も、提供される。幾つかの実施形態において、抗ＡＴβＨ抗体は、少なくとも約１０８Ｍ−１の結合親和性を有し得、幾つかの他の実施例において、少なくとも約１０９Ｍ−１、約１０１０Ｍ−１、約１０１１Ｍ−１以上、例えば、約１０１３Ｍ−１まで又はそれ以上の、結合親和性を有し得る。
【００５７】
幾つかの実施形態において、さらなるアミノ酸改変が、生殖系列配列からの相違を低減するように導入され得る。他の実施形態において、アミノ酸改変は、大容量産生プロセスのための抗体産生を容易にするために、導入されてもよい。
【００５８】
幾つかの実施形態において、１以上のアミノ酸改変を含み得る、ヒトＡＴβに特異的に結合する単離された抗ＡＴβＨモノクローナル抗体が、提供される。幾つかの実施形態において、この抗体は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、又は約２０以上の改変を含み得る。
【００５９】
エピトープ
また、ヒトＡＴβＨの予測されるエピトープに結合し得る単離されたモノクローナル抗体も提供され、ここで、このエピトープは、図１１において示されるヒトＡＴβＨ由来の１以上の残基を含む。
【００６０】
幾つかの実施形態において、このエピトープは、ヒトＡＴβＨのＮ１３５部位を含む。他の実施形態において、この部位はヒトＡＴβＨのＲＣＬループのアミノ酸残基配列の一部を含み得る。
【００６１】
また、ヒトＡＴβＨへの結合について本書中で記載される任意の抗体と競合し得る抗体も、提供される。例えば、このような競合抗体は、上に記載された１条のエピトープに結合し得る。
【００６２】
核酸、ベクター及び宿主細胞
また、本書中で記載される任意のモノクローナル抗体をコードする単離された核酸分子も、提供される。従って、ヒトＡＴβＨに結合する抗体をコードする単離された核酸分子が、提供される。表３は、幾つかの抗ＡＴβＨ抗体のヌクレオチド配列を示す。
【表６】
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【００６３】
幾つかの実施形態において、単離された核酸分子は、ＡｔβＨに結合して抗凝血活性を阻害するがＡＴαには最小限の結合を有する抗体をコードし、この抗体は、配列番号２、４、６、８及び１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む。
【００６４】
幾つかの実施形態において、単離された核酸分子は、ＡｔβＨに結合して抗凝血活性を阻害するがＡＴαには最小限の結合を有する抗体をコードし、この抗体は、配列番号１、３、５、７、及び９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む。
【００６５】
他の実施形態において、単離された核酸分子は、Ａｔβに結合してＡｔβの抗凝血活性を阻害する抗体をコードし、この抗体は、配列番号２、４、６、８及び１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１、３、５、７、及び９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、並びに重鎖可変領域又は軽鎖可変領域における１以上のアミノ酸改変をさらに含む。
【００６６】
さらに、上述のモノクローナル抗体のいずれかをコードする単離された核酸分子を含むベクター、並びにこのようなベクターを含む宿主細胞もまた、提供される。
【００６７】
ＡＴβＨに対する抗体を調製する方法
モノクローナル抗体は、本実施形態の１つに従うモノクローナル抗体の可変領域をコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞において組換え的に発現することにより、産生され得る。発現ベクターの助けにより、このヌクレオチド配列を含む核酸はトランスフェクトされ、産生のために好適な宿主細胞において発現される。従って、ヒトＡＴβＨに結合するモノクローナル抗体を産生するための例示的な方法は、以下を含む：（Ａ）モノクローナル抗体をコードする核酸分子を宿主細胞内にトランスフェクトすること；（ｂ）この宿主細胞を培養して、この宿主細胞においてモノクローナル抗体を発現させること、及び（ｃ）この産生されたモノクローナル抗体を、単離し精製してもよく、ここで、この核酸分子は、モノクローナル抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００６８】
一例において、この抗体又はその抗体断片を発現するために、標準的分子生物学技術によって得られた部分的又は完全長の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡは、この遺伝子が転写及び翻訳制御配列に作動可能に連結されるよう、発現ベクター内に挿入される。この文脈において、用語「作動可能に連結される」は、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節するその意図される機能を果たすようにベクター内に連結された抗体遺伝子をいう。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される宿主細胞と適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、別個のベクター内に挿入されてもよく、あるいは、両遺伝子は、同じ発現ベクター内に挿入されてもよい。抗体遺伝子は、標準的方法（例えば、抗体遺伝子断片及びベクターにおける相補的な制限部位の連結、制限部位が存在しない場合には平滑末端連結）によって、発現ベクター内に挿入される。本書中で記載される抗体の軽鎖及び重鎖可変領域は、ベクター内でＶＨセグメントが（１又は複数の）ＣＨセグメントに作動可能に連結し、ベクター内でＶＬセグメントが（１又は複数の）ＣＬセグメントに作動可能に連結するように、既に所望のイソ型の重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をコードする発現ベクター内にこれらを挿入することにより、任意の抗体イソ型の完全長抗体遺伝子を作製するために使用され得る。
【００６９】
さらに、又はあるいは、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を容易にするシグナルペプチドをコードしてもよい。この抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端の枠内に連結するようにベクター内にクローニングされてもよい。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドであっても、又は異種のシグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であってもよい。抗体鎖をコードする遺伝子に加え、組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー及び抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御する他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）において記載される。制御配列の選択を含めた発現ベクターの設計は、形質転換させるための宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどの因子に依存し得る。哺乳動物宿主細胞のための調節配列の例としては、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指向するウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルスに由来するプロモーター及び／又はエンハンサー（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、及びポリオーマに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーが挙げられる。あるいは、非ウイルス調節配列、例えば、ユビキチンプロモーター又はβ−グロブリンプロモーターが、調節され得る。
【００７０】
抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、組換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）及び選択可能マーカー遺伝子を有してもよい。選択可能マーカー遺伝子は、導入されているベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号；同第４，６３４，６６５号；及び同第５，１７９，０１７号、全てＡｘｅｌ  ｅｔ  ａｌ．による）。例えば、代表的には、選択可能マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ヒグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬物に対する抵抗を、このベクターが導入された宿主細胞に付与する。選択可能マーカー遺伝子の例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ−宿主細胞におけるメトトレキサート選択／増幅と共の使用のため）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）が、挙げられる。
【００７１】
軽鎖及び重鎖の発現のために、重鎖及び軽鎖をコードする（１つ又は複数の）発現，ベクターは、標準的技術によって、宿主細胞内にトランスフェクトされる。様々な形の用語「トランスフェクション」は、外来性ＤＮＡの原核宿主細胞及び真核宿主細胞内への導入のために一般的に使用される種々の技術、例えば、エレクトロポレーション、カルシウム−リン酸沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを含む。この抗体を、原核宿主細胞又は真核宿主細胞のどちらで発現させることも、理論的には可能であるが、哺乳動物細胞を含めた真核細胞における抗体の発現が、代表的である。何故なら、このような真核細胞は、及び詳細には哺乳動物細胞は、原核細胞よりも、適切に折りたたまれ且つ免疫学的に活性な抗体を、組み立てて分泌しやすいからである。組換え抗原を発現するための哺乳動物宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えばＲ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１において記載されるようなＤＨＦＲ選択可能マーカーと共に使用される、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０において記載されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＫＢ１１細胞及びＳＰ２細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞内に導入された場合、この抗体は、宿主細胞における抗体の発現又は宿主細胞が増殖している培養培地中への抗体の分泌を可能にするために十分な期間の間、この宿主細胞を培養することによって、産生される。抗体は、培養培地から、標準的タンパク質精製方法、例えば、限外濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び遠心分離を用いて回収され得る。
【００７２】
インタクトな抗体を発現するための部分的抗体配列の使用
抗体は、６の重鎖及び軽鎖ＣＤＲに配置されるアミノ酸残基を通して、優勢に標的抗原に対して相互作用する。この理由のために、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ外の配列よりも、個々の抗体間で多様に異なる。ＣＤＲ配列は、殆どの抗体−抗原相互作用に反応性であるので、種々の特性を有する種々の抗体由来のフレームワーク配列上にグラフトされた特異的な天然に存在する抗体からＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、天然に存在する抗体に特異的な特性を模倣する組換え抗体を発現することができる（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；及びＱｕｅｅｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３）。このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公のＤＮＡデータベースから得られ得る。これらの生殖系列配列は、完全に集合した可変遺伝子を含まず、Ｂ細胞成熟の間にＶ（Ｄ）Ｊ結合によって形成されるので、成熟抗体遺伝子配列とは異なる。元の抗体の結合特性と類似の結合特性を有するインタクトな組換え抗体を再現するために、特定の抗体のＤＮＡ配列全体を得る必要はない（例えば、ＷＯ  ９９／４５９６２）。
【００７３】
代表的に、ＣＤＲ領域に及ぶ部分的重鎖及び軽鎖配列は、この目的のために十分である。部分的配列は、生殖系列可変遺伝子セグメント及び生殖系列結合遺伝子セグメントが組換え抗体可変遺伝子に寄与したことを決定するために使用される。次いで、生殖系列配列は、可変領域の失われた部分を埋めるために使用される。重鎖及び軽鎖リーダー配列は、タンパク質突然変異の間に開裂し、最終抗体の特性に寄与しない。この目的のために、対応する生殖系列リーダー配列は、発現構築物のために使用される。失われた配列を加えるために、クローニングされたｃＤＮＡ配列は、ライゲーション又はＰＣＲ増幅によって、合成オリゴヌクレオチドと合わせられてもよい。あるいは、可変領域全体は、短い、重複するオリゴヌクレオチドとして合成され得、合成可変領域クローン全体を作製するためのＰＣＲ増幅によって合わせられ得る。このプロセスは、排除又は包含、又は特定の制限部位、特定のコドンの最適化など、利点を有する。重鎖及び軽鎖転写物のヌクレオチド配列は、合成オリゴヌクレオチドの重複するセットを設計し、天然の配列と同じアミノ酸コード能力を有する合成Ｖ配列を作製するために、使用される。合成重鎖及び軽鎖配列は、天然の配列とは異なっていてもよい。例えば、繰り返されたヌクレオチド塩基の鎖は中断されて、オリゴヌクレオチド合成及びＰＣＲ増幅を容易にする；及び、最適な翻訳開始部位は、Ｋｏｚａｋ法則に従って組み込まれる（Ｋｏｚａｋ，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０）；及び、制限部位は、翻訳開始部位の上流又は下流で操作される。重鎖及び軽鎖可変領域の両方について、最適化されたコード鎖配列、及び対応する非コード配列は、対応する非コードヌクレオチドのおよそ真ん中で３０〜５０ヌクレオチドの断片に分解される。各鎖について、オリゴヌクレオチドは、１５０〜４００ヌクレオチドの断片に及ぶ重複する二本鎖セットに組み立てられてもよい。次いで、このプールが、１５０〜４００ヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物を産生するためのテンプレートとして使用される。
【００７４】
代表的には、１つの可変領域オリゴヌクレオチドセットは、２つの重複するＰＣＲ産物を作製するために別個に増幅される２つのプールに分解される。これらの重複する産物は、次いで、ＰＣＲ増幅によって合わせられ、完全な可変領域を形成する。また、重鎖又は軽鎖定常領域の重複する断片をＰＣＲ増幅に含め、ベクター構築物内に容易にクローニングされ得る断片を作製することもまた、望ましくあり得る。再構築された重鎖及び軽鎖可変領域は、次いで、クローニングされたプロモーター配列、翻訳開始配列、定常領域配列、３’非翻訳配列、ポリアデニル化配列、及び転写終結配列と合わせられ、ベクター構築物を形成する。重鎖及び軽鎖発現構築物は、１つのベクターに合わせられても、宿主細胞内に同時トランスフェクトされても、連続的トランスフェクトされても、又は別個にトランスフェクトされてもよく、次いで、両鎖を発現する宿主細胞を形成するために融合される。別の局面において、ヒト抗ＡＴβＨ抗体の構造特徴が、ＡＴβに結合する機能を保持する構造的に関連するヒト抗ＡＴβＨ抗体を作製するために使用される。例えば、モノクローナル抗体の特異的に同定された重鎖及び軽鎖領域の１以上のＣＤＲは、公地のヒトフレームワーク領域及びＣＤＲと組換え的に合わせられて、さらなる、組換え的に操作されたヒト抗ＡＴβＨ抗体を作製してもよい。
【００７５】
抗ＡＴβＨ  ｍＡｂの凝固促進効力
抗ＡＴβＨ  ｍＡｂの凝固促進効力を、種々のアッセイを用いて調査した。
【００７６】
表４は、ＦＸａ活性化凝固アッセイにおける、種々の動物種由来の抗ＡＴβＨ  ｍＡｂ  ＴＰＰ２００９及びＴＰＰ２８０３の血漿中における凝固促進効力を示す。
【表７】
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【００７７】
抗ＡＴβＨ  ｍＡｂ  ＴＰＰ２００９及びＴＰＰ２８０３は、両方とも、ＦＸａ活性化凝固アッセイにおいて、ヒト正常血漿及び血友病血漿における凝固促進効力を示す。具体的には、ＴＰＰ２００９は、ＦＸａ活性化凝固アッセイにおいて、ヒト正常血漿及び血友病Ａ血漿における、それぞれ１０．５ｎＭ及び４．７ｎＭのＥＣ５０の凝固促進効力を示す。ＴＰＰ２８０３は、ＦＸａ活性化凝固アッセイにおいて、ヒト正常血漿及び血友病Ａ血漿における、それぞれ２．４及び２．７ｎＭのＥＣ５０の凝固促進効力を示す。
【００７８】
加えて、抗ＡＴβＨ  ｍＡｂ  ＴＰＰ２８０３は、図１２に示されるように、ＦＸａ活性化凝固アッセイにおいて、正常ヒト血漿及び血友病患者血漿の両方において、凝固時間の用量依存型短縮を示す。ＣＴ：凝固時間、ＨＥＭ−Ａ：血友病Ａ血漿。
【００７９】
図１３において概説したヘパリン化ウサギ出血モデルを用いて、抗ＡＴβＨ  ｍＡｂ  ＴＰＰ２８０３の凝固促進効力をインビボで実証した。図１４は、ヘパリン化ウサギ出血モデルにおけるＬＭＷＨ及び化合物投与の前後の、出血時間に対する対照及びＴＰＰ２８０３の効果を示す。ＬＭＷＨ及び試験物品（３ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇ  ＴＰＰ２８０３のいずれか）の投与後の出血時間は、ＰＢＳ中のＬＭＷＨ後の出血時間と比較して、有意に短縮された。試験物品（３ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇ  ＴＰＰ２８０３のいずれか）、又は陽性対照の投与後のデルタ出血時間は、図１５に示すように、ＰＢＳとは有意に異なった（ｐ＜０．０５；＊Ｔ検定により有意）。図１６は、ＬＭＷＨ及び抗体投与の前後の、失血に対する対照及びＴＰＰ２８０３の効果を示す。ＴＰＰ２８０３（３ｍｇ／ｋｇ）及び陽性対照である硫酸プロタミンの両方は、ＬＭＷＨの投与後に、失血に有意な変化を示した（＊Ｔ検定によって有意）。
【００８０】
医薬組成物
また、治療有効量の抗ＡＴβＨモノクローナル抗体及び製薬的に許容可能なキャリアを含む製薬組成物が、提供される。「製薬的に許容可能なキャリア」は、本書中で使用される場合、調製物を処方又は安定化を助けるために、活性成分に加えられ得、患者に有害な毒物学的効果をもたらさない物質をいう。このようなキャリアの例は、当業者に周知であり、これらとしては、水、マルトース若しくはショ糖などの糖、アルブミン、塩化ナトリウムなどの塩などが挙げられる。他のキャリアは、例えば、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載される。このような組成物は、治療有効量の少なくとも１つのモノクローナル抗体を含む。
【００８１】
製薬的に許容可能なキャリアは、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射可能溶液若しくは分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む。製薬的に活性な物質についてのこのような培地及び薬剤の使用は、当該分野で公知である。この組成物は、幾つかの実施形態において、非経口注射のために処方される。この組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高い薬物濃度に好適な他の要求される構造として、処方され得る。このキャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）及びこれらの好適な混合物を含む溶媒又は分散媒体であってもよい。幾つかの場合、このキャリアの組成は、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、又は塩化ナトリウムを含む。
【００８２】
滅菌注射可能溶液は、活性化合物を、所望の量で、上に列挙した成分の１つ又は組み合わせを含む適切な溶媒に、必要な場合、滅菌マイクロフィルター法の後に組み込むことによって、調製され得る。一般に、分散液は、活性成分を、基本的分散媒体及び上に列挙したものから所望の他の成分を含む滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の幾つかの方法は、真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）であり、活性成分に、事前に滅菌濾過した溶液由来の任意のさらなる所望の成分を加えた粉末を生じる。
【００８３】
製薬用途
モノクローナル抗体は、凝固における遺伝的及び後天的な欠損又は不全を処置するための治療目的のために使用され得る。例えば、上述の実施形態において、モノクローナル抗体は、第Ｘａ因子又は第ＩＩａ因子を含み得る基質と共に、ＡＴβＨの相互作用をブロックするために使用され得る。このモノクローナル抗体は、血小板減少症、血小板障害及び出血障害などの止血の障害（例えば、血友病Ａ、血友病Ｂ及び血友病Ｃ）の処置における治療的用途を有する。このような障害は、治療有効量の抗ＡＴβＨモノクローナル抗体を、それを必要とする患者に投与することによって処置され得る。モノクローナル抗体はまた、外傷及び出血性卒中などの制御不能な出血の処置においても、治療的用途を有する。従って、また、必要とする患者に、治療有効量の抗ＡＴβＨモノクローナル抗体を投与することを含む、出血時間を短くするための方法も、提供される。
【００８４】
別の実施形態において、抗ＡＴβＨ抗体は、例えば、敗血症又は出血障害の処置としてＡＴを使用された患者を含めて、ＡＴ処置を受けた患者のための解毒剤として有用であり得る。
【００８５】
抗体は、単剤療法として、又は止血障害を指向する他の治療と組み合わせて、使用され得る。例えば、１以上の抗体と第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子などの凝固因子との同時投与は、血友病を処置するために有用であると考えられる。少なくとも幾つかの実施形態において、凝固における遺伝的及び後天的な欠損又は不全の処置のための方法は、以下を含む：（ａ）ヒト組織因子経路インヒビターに結合するモノクローナル抗体の第１量；及び（ｂ）第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子の第２量、ここで、上記第１量及び第２量は、上記欠損及び不全を処置するために、共に有効である。少なくとも幾つかの実施形態において、凝固における遺伝的及び後天的な欠損又は不全の処置のための方法は、以下を含む：（ａ）ヒト組織因子経路インヒビターに結合するモノクローナル抗体の第１量；及び（ｂ）第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子の第２量、ここで、上記第１量及び第２量は、上記欠損及び不全を処置するために、共に有効であり、さらに、第ＶＩＩ因子は、同時投与されない。また、治療有効量のモノクローナル抗体と第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子との組み合わせを含む製薬組成物も提供され、上記組成物は、第ＶＩＩ因子は含まない。「第ＶＩＩ因子」は、第ＶＩＩ因子及び第ＶＩＩａ因子を含む。これらの併用治療は、凝固因子の必要な注入頻度を減らす傾向がある。同時投与又は併用療法は、別個に処方されたか、又は１組成物中に共に処方された２つの治療用薬物の投与を意味し、別個に処方された場合、およそ同時に投与されるか、又は異なる時であるが同じ治療期間にわたって投与されるかのいずれかである。
【００８６】
幾つかの実施形態において、本書中で記載される１以上の抗体は、止血障害を指向するために、組み合わせて使用され得る。例えば、本書中で記載される２以上の抗体の同時投与は、血友病又は他の止血障害を処置するために有用であると考えられる。
【００８７】
この製薬組成物は、出血発症の重症度によって、又は予防治療においては、患者の凝固不全の重症度によって、変動し得る投薬量及び頻度で、血友病Ａ又はＢを罹患する被検体に、非経口投与され得る。
【００８８】
この組成物は、必要とする患者に、ボーラスで、又は連続的注入によって、投与され得る。例えば、Ｆａｂ断片である抗体のボーラス投与は、約０．００２５〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０２５〜約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１０〜約０．１０ｍｇ／ｋｇ又は約０．１０〜約０．５０ｍｇ／ｋｇの量であってもよい。連続的注入のために、Ｆａｂ断片である本発明の抗体は、約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／分、約０．０１２５〜約１．２５ｍｇ／ｋｇ／分、約０．０１０〜約０．７５ｍｇ／ｋｇ／分、約０．０１０〜約１．０ｍｇ／ｋｇ／分、又は約０．１０〜約０．５０ｍｇ／ｋｇ／分で、約１〜２４時間、約１〜１２時間、約２〜１２時間、約６〜１２時間、約２〜８時間、又は約１〜２時間の時間にわたって投与され得る。完全長抗体（定常領域全体を有する）である本発明の抗体の投与のための投薬量は、約１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、約２〜８ｍｇ／ｋｇ、又は約５〜６ｍｇ／ｋｇである。このような完全長抗体は、代表的に、３０分間〜３時間の時間に及ぶ注入によって投与される。投与の頻度は、病状の重症度に依存する。頻度は、１週間に３回から、２週間〜６ヶ月に１回の範囲に及び得る。
【００８９】
さらに、この組成物は、皮下注射を介して患者に投与され得る。例えば、約１０〜約１００ｍｇの用量の抗ＡＴβＨ抗体が、１週間に１度、２週間に１度又は１ヶ月に１度、皮下注射を介して患者に投与され得る。本書中で使用される場合、「治療有効量」は、必要とする患者においてインビボの凝固時間を有効に延長するための、又はさもなければ、インビボで測定可能な利益をもたらすための、抗ＡＴβＨモノクローナル抗体又はこのような抗体と第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子との組み合わせの量を意味する。正確な量は、治療組成物の構成要素及び物理的特徴、意図する患者集団、患者個人の考慮などを含めた、多くの因子に依存し、当業者によって容易に決定され得る。
【００９０】
本開示の局面は、以下の実施例の観点から、さらに理解され得る。この実施例は、決して本教示の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００９１】
［実施例］
［実施例１］
ヒト及びウサギのＡＴα及びＡＴβの精製
ＡＴα及びＡＴβを、ヒト及びウサギの血漿から、以前に記載された方法に従うヘパリン−セファロース上の親和性クロマトグラフィー（Ｃａｒｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｔｅｎｃｉｏ  １９８２；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  １９８５）によって、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｓｏｕｔｈ  Ｂｅｎｄ，ＩＮ）において精製した。簡潔には、硫酸デキストラン／塩化カルシウムからの上清を、ヘパリン−セファロース親和性カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。ＡＴα及びＡＴβを、ＮａＣｌ勾配によって分離した：ＡＴα及びＡＴβを、それぞれ０．８Ｍ及び１．３Ｍ  ＮａＣｌにて溶出した。アニオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ−Ｑ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、ＡＴβのさらなる精製のために使用した。ＡＴα及びＡＴβの純度及びグリカンプロフィールを、タンパク質ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＬＣ−ＭＳによって評価した。
【００９２】
［実施例２］
質量分析による、ＡＴα及びＡＴβにおけるグリカンの数及び位置の決定
異なる数のグリカンに起因して、ｄｕｏ−ＥＳＩ（又はｎａｎｏ  ＣｈｉｐＣｕｂｅ）供給源、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ獲得ソフトウェア及びＢｉｏｃｏｎｆｉｒｍを含む定性分析ソフトウェアを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ６５２０  ＬＣ−ＭＳシステムにより、ＡＴα及びＡＴβを、その質量に基づいて分類した。トリプシン及びＡｒｇ−ｃによりタンパク質が消化されるボトムアップ法、及びその後の、グリコシル化及びモノグリコシル化ペプチド配列を同定するための標的ＭＳＭＳにより、グリコシル化部位を決定した。データを、２つの実験において収集した：断片化電圧１７５ｖ及び４３０ｖ。
【００９３】
［実施例３］
ＡＴ抗原ビオチン化
ヒト及びウサギのＡＴα及びＡＴβを、ＮＨＳ−ビオチンにより、表面リシン残基にてビオチンで標識した。リシンビオチン化のために、タンパク質を、まずＰＢＳ／Ｃａ＋＋緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で脱塩し、ビオチン化反応に対して阻害性であり得る何らかのアミンを除去した。脱塩タンパク質の濃度を、ＯＤ２８０により、ＮａｎｏＤｒｏｐにて決定した。ついで、タンパク質を、１時間にわたって室温（ＲＴ）にて、１：５及び／又は１：３のモル比のＡＴ：ＮＨＳ−ビオチン（すなわち、過剰量のビオチン）にてスルホ−ＮＨＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と共に、インキュベートした。遊離のビオチンを、一晩のＰＢＳ／Ｃａ＋＋緩衝液中への透析によって除去した。ビオチン化タンパク質におけるビオチオンの量を、Ｂｉｏｔｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて定量した。ビオチン化ＡＴα及びＡＴβを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、ビオチン化を、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）をプローブとして用いるウェスタンブロット分析によって確認した。ビオチン化ＡＴの機能的活性を、ＦＸａ阻害アッセイによって評価した。ビオチン化ＡＴα及びＡＴβと非ビオチン化ＡＴα及びＡＴβとの比較において、ビオチン化後のＡＴ阻害活性には、わずかな低下しか観察されなかった。このことは、このようにして調製されたビオチン化ＡＴβ及びＡＴαは、選択的抗凝固ブロッカーを代表し、選択的抗凝固ブロッカーとしてＡＴβＨ結合剤についてのパニングにおいて使用され得る。
【００９４】
［実施例４］
ファージディスプレイ及びパニングによる、ヒトモノクローナル抗体発見
ヒトＦａｂライブラリー（Ｄｙａｘ  Ｆａｂ３１０）からＡＴβＨに対して特異的なＦａｂを発見するために、四腕パニング戦略を設計した。このライブラリーを、まず、ビオチン化ヘパリン／フォンダパリヌクス結合ＡＴα及びビオチン化ＡＴαで枯渇させ、次いで、ヘパリン／フォンダパリヌクス結合ＡＴβ及びビオチン化ＡＴβに対して、それぞれストレプトアビジンビーズ上でパニングした。パニングの各回それぞれについて、ヘパリン結合ＡＴα（ＡＴαＨ）を、競合相手として結合緩衝液中に含めた。活性型立体構造（ヘパリン結合形態）にｈＡＴβを保つため、３回のパニングの全ての回において、ヘパリンを、洗浄緩衝液に加えた。パニングの後、プールしたクローンを、ｈＡＴβ及びｈＡＴβＨ特異的結合についてスクリーニングし、ｈＡＴαについてＥＬＩＳＡによって逆スクリーニングした。これらのクローンをまた、ウサギＡＴαを上回るウサギＡＴβに対する差次的結合について試験した。ｈＡＴβＨ及びｒＡＴβＨの両方に対して、ｈＡＴα及びｒＡＴαへのそれを上回る差次的結合を示すクローンを、さらにｈＡＴβを加えたＦＸａ脱阻害アッセイに供した。陽性のヒット（Ｆａｂ）を、ＩｇＧ１に再フォーマットし、ＨＥＫ２９３細胞中で発現させ、プロテインＡカラムによって精製した。これらの精製ＩｇＧ１を、ＴＧＡアッセイ（トロンビン産生アッセイ）及びｄＰＴ（希釈プロトロンビン時間）アッセイについてＡＴ枯渇ヒト血漿及びｈｅｍＡ患者血漿において広く試験し、凝固時間を測定した。
【００９５】
［実施例５］
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）
ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌのビオチン化ＡＴ抗原を、ストレプトアビジンマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，７８１９９７）上に、ヘパリン（５０ｕｇ／ｍｌ，ヘパリン−ナトリウム−５０００，Ａｐｏｔｈｅｋｅ，Ｆａ．Ｒａｔｉｏｐｈａｒｍ）含有又は非含有でコーティングした。４℃で一晩の抗原コーティング後、プレートを、ＰＢＳＴ＋／−ヘパリンで洗浄し、ＰＢＳＴ＋／−ヘパリン中５％乳にて３７℃で１時間にわたってブロックした。ブロック緩衝液の除去後、次いで、ブロッキング緩衝液中（ＰＢＳＴ＋／−ヘパリン中５％乳）２０ｕｇ／ｍｌ  Ｆａｂ又は４ｕｇ／ｍｌ  ＩｇＧをプレートに加え、プレートを、室温で１時間にわたってインキュベートした。次いで、プレートを３回洗浄した。ブロック緩衝液中抗ヒトＩｇＧ  ＰＯＤ（Ｓｉｇｍａ，Ａ０１７０）をプレートに加え、次いでプレートを、室温で３０分間にわたってインキュベートした。Ａｍｐｌｅｘ  ｒｅｄ（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ＃Ａ２２１７０）を、検出のために、１：１０００にてＨ２Ｏ２と共に用いた。３０分間のインキュベーション後、プレートを、Ｅｘ５３５、Ｅｍ  ５９０で、蛍光プレートリーダーにおいて読み取った。
【００９６】
［実施例６］
ＦＸａ脱阻害アッセイ−ヘパリン含有ＡＴ
ヘパリンを、ＡＴβ又はＡＴαと共にインキュベートし、安定なＡＴＨ  複合体を形成した。次いで、抗体を、ＡＴβＨ又はＡＴαＨ複合体に加えた。その間に、１０μｌの２００ｎｇ／ｍｌ  ＦＸａ（ＨＴＩ）及び２０μｌの５０μｇ／ｍｌ  Ｆｌｕｏｐｈｅｎ  ＦＸａ蛍光発生基質（Ｈｙｐｈｅｎ  Ｂｉｏｍｅｄ）を、別個のプレートにおいて混合した。抗体−ＡＴＨ混合物を、ＦＸａ／基質溶液に迅速に加え、蛍光運動測定を、Ｅｘ３６０ｎｍ及びＥｍ４６５ｎｍにて直ちに開始した。全ての必要な希釈を、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０，１％  ＢＳＡ、０，１％  ＰＥＧ８０００中で行う。
【００９７】
［実施例７］
ＦＶＩＩＩ不全ヒト血漿におけるトロンビン産生アッセイ（ＴＧＡ）
ＡＴβＨ抗体の１：２連続希釈を、１ｕＭから開始し、０．０１５ｕＭの終濃度まで、ＨｅｍＡヒト血漿中で作製した。ヘパリンを、各抗体溶液中に、５０ｎＭの終濃度にて加えた。次いで、８０ｕｌの抗体−ヘパリン−血漿混合物を、各ウェルに２０ｕｌの  再構成ＰＰＰ試薬及びキャリブレーターを含む９６ウェルＴＧＡプレートに加えた。プレートを、ＴＧＡ装置内に配置し、この機械は、自動的に、各ウェル中に２０ｕｌのＦｌｕＣａ（Ｆｌｕｏ基質＋ＣａＣｌ２）を分配した。この反応を、６０分間行わせた。血漿のみを、陰性対照として使用した。
【００９８】
［実施例８］
それぞれＡＴα及びＡＴβを加えたＡＴ枯渇ヒト血漿中でのトロンビン産生アッセイ（ＴＧＡ）
抗体を、１５ｎｍのＡＴα又はＡＴβを加えたヒトＡＴ欠損血漿に加えた。次いで、ヘパリンを、各反応液中に、５０ｎＭの終濃度にてピペットで加えた。ＡＴＨ特定基抗体、ヘパリン及びＡＴα又はＡＴβを含む８０ｕｌの血漿サンプルを、２０ｕｌのＰＰＰ試薬又はキャリブレーターを含む９６ウェルＴＧＡプレートのウェル内に加えた。プレートを、ＴＧＡ装置内に配置し、次いで、各ウェル中に２０ｕｌのＦｌｕＣａ（Ｆｌｕｏ基質＋ＣａＣｌ２）を分配した。反応を、６０分間にわたって行わせ、続けた。
【００９９】
［実施例９］
ヒトｈｅｍＡ血漿及びＡＴ不全血漿における希釈プロトロンビン時間アッセイ（ｄＰＴ）
抗ＡＴβＨ  ｈｍＡｂの連続希釈を、ｈｅｍＡ血漿中で、２５０ｎＭにて開始し、０．１Ｕ／ｍＬのヘパリンを加えて作製した。抗体、血漿及びヘパリンの混合物を、室温で２０〜３０分間にわたってインキュベートした。次いで、５０ｕＬのこの混合物を、５０ｕＬの希釈したＩｎｎｏｖｉｎ（１／２０００）（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）に加え、４分間３７℃にてインキュベートし、その後、５０ｕＬの２５ｍＭ  ＣａＣｌ２（ＨｅｍＳｉｌ）を添加した。ｄＰＴ試験プログラムを、ＡＣＬ  Ｔｏｐ凝固計において、３６０秒の獲得時間で設定した。ＡＴ不全血漿におけるｄＴＰについて、ＡＴ−ＤＰに、ＡＴα又はＡＴβのいずれかを、０．２ｕＭの終濃度になるように、０．１Ｕ／ｍｌのヘパリンと共に加えた。抗ＡＴβＨ  ｍＡｂを、ＡＴ−ＤＰ／ヘパリン／ＡＴα又はＡＴ−ＤＰ／ヘパリン／ＡＴβ混合物に、０．２５ｕＭの終濃度になるように加え、室温で２０〜３０分間にわたってインキュベートした。各反応物について、５０ｕＬの血漿／抗体／ヘパリン混合物を、５０ｕＬの希釈したＩｎｎｏｖｉｎに加え（１／４０００）、４分間３７℃にてインキュベートし、その後、５０ｕＬの２５ｍＭ  ＣａＣｌ２（ＨｅｍＳｉｌ）を、上述のように加えた。
【０１００】
［実施例１０］
抗体精製
事前洗浄したプロテインＡアガロースビーズを、結合緩衝液中の抗体（容量比：１：１）と共に回転させながら４℃で一晩インキュベートした。次いで、ビーズを、カラム内に詰め、１×ＰＢＳにてＯ．Ｄ．２８０＜０．０５まで洗浄した。残った溶液を捨てた。抗体を、溶出緩衝液で溶出し、中性化緩衝液を含むチューブ内に収集した。溶出した画分を、１×ＰＢＳに対して、少なくとも２回緩衝液交換を行って、一晩、４℃にて透析した。ＩｇＧ濃度を、２８０ｎｍにて、ｎａｎｏｄｒｏｐによって測定した。この抗体純度を、ＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はＳＳＣのいずれかによって試験した。
【０１０１】
［実施例１１］
Ｂｉａｃｏｒｅによる抗体結合親和性研究
抗体親和性測定を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００又はＴ２００処理ユニットにおいて行った。抗ヒトＦｃ  抗体又はストレプトアビジンを、ＣＭ５チップ上に固定化した。ｈＡＴβＨ又はビオチン化ｈｍＡｂ抗体を、チップ上に注入し、捕捉した。ヘパリン含有／非含有の種々の濃度のＡＴβ又はＡＴαを、注入した。ＡＴ及びＡＴＨの抗体への結合のみが、結合定数を生じる。結合結果を、平衡解離定数（ＫＤ）として、ナノモルで報告する。ＡＴ／ヘパリン複合体を分析した場合、１ｕＭのヘパリンが、ランニング緩衝液に含まれる。
【０１０２】
［実施例１２］
ヘパリン化ウサギ出血モデル
ヘパリン化ウサギ出血モデルの試験計画を、図１３に概説する。ウサギ頸静脈（右静脈：静脈うっ血；左静脈：カニューレ挿入）の調製後、ＰＢＳ中の低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）を、０時点でウサギにＩＶ投与（１８００Ｕ／ｋｇ）した。１０分間後、試験物質を投与した。実験群は、以下を含む：ビヒクル、ＰＢＳ；陽性対照、硫酸プロタミン、（２８ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ）；陰性対照、Ｍ１４  ＩｇＧ２；処置：３０ｍｇ／ｋｇ；ＴＰＰ２８０３，３ｍｇ／ｋｇ；ＴＰＰ２８０３，３０ｍｇ／ｋｇ。試験物質の投与の５分間後、耳穿刺（３〜５ｍＭ）を実施し、インサイチュの血栓形成（うっ血）を、３０分間にわたってモニタリングした。切開からの血液を、出血が止まるまで、濾紙によって１５秒毎に除去した。
【０１０３】
上の開示及び実施例は、特許請求の範囲を狭めることを全く意図しない。上の実施形態及び教示に対し、添付の特許請求の範囲の真の精神及び範囲を逸脱することなく、種々の改変及び変更が成され得、均等物が置き換えられ得ることが、理解されるべきである。本明細書及び実施例は、従って、制限的な意味よりもむしろ例示的なものとみなされる。さらに、本書において挙げられた全ての記事、本、特許出願、特許、及び他の資料は、その全体が本書中に参考によって組み込まれる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
2016519081.tif 000037
【図８Ａ】
2016519081.tif 000038
【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
2016519081.tif 000041
【図１０Ｂ】
2016519081.tif 000042
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
2016519081.tif 000045
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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