(57)【要約】  細菌汚染を制御するために、二酸化塩素が一般的に使用されるが、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が二酸化塩素に対して感受性であるにもかかわらず、生体触媒として細菌ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）を使用する発酵中に汚染を制御するのに、安定化二酸化塩素（ＳＣＤ）を使用できるようにする方法が開発された。ＳＣＤ添加に続いて一定時間経過後に、発酵のための組成物に、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞を接種するためのパラメータが同定された。
2016504032.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）細菌種によって汚染されている可能性を有する増殖培地を提供するステップと；
ｂ）安定化二酸化塩素の有効量を（ａ）の増殖培地に添加して、温度が約３３℃を超える安定化二酸化塩素混合物を形成するステップと；
ｃ）ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞が接種ブロスを産生するのに適した温度で、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞をｂ）の混合物に接種するステップと；
ｄ）前記ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の増殖に適した条件下で、前記接種ブロスを発酵させるステップと
を含んでなり、発酵中に細菌汚染が制御される、
ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）生体触媒を含んでなる発酵工程において細菌汚染を制御するための発酵方法。
【請求項２】
前記増殖培地が、セルロース性バイオマス加水分解物を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞が、エタノール産生菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップｂ）における第１の安定化二酸化塩素の有効量の添加から、ステップｃ）におけるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞接種までの時間が、少なくとも６時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップｂ）における第１の安定化二酸化塩素の有効量の添加から、ステップｃ）におけるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞接種までの時間が、少なくとも８時間である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ステップｂ）における第１の安定化二酸化塩素の有効量の添加から、ステップｃ）におけるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞接種までの時間が、少なくとも１６時間である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記増殖培地が、少なくとも１種のセルラーゼを含んでなる糖化反応スラリーである、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記増殖培地がセルロース性バイオマス加水分解物を欠いて、ｉ）規定培地、ｉｉ）非セルロース系生体材料糖原料を含有する培地、およびｉｉｉ）清澄化セルロース性バイオマス加水分解物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記接種ブロスの温度が、約４０℃未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
（ｂ）の混合物のｐＨが、約７未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記加水分解物が、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ苞葉、トウモロコシ茎葉、牧草、小麦、麦藁、大麦藁、乾草、稲藁、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、ソルガム、および木本セルロース成分からなる群から選択される、セルロース性バイオマスに由来する、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
ステップｄ）の接種ブロスが、前記ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の増殖期間中に、約５ｇ／Ｌ未満の乳酸を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細菌汚染の原因が、乳酸産生菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ステップｂ）の増殖培地中の安定化二酸化塩素濃度が、最初に少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ａ）ｉ）規定培地、ｉｉ）非セルロース系生体材料糖原料を含有する培地、およびｉｉｉ）清澄化セルロース性バイオマス加水分解物からなる群から選択される、セルロース性バイオマス加水分解物を欠く種培地を提供するステップと；
ｂ）ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）エタノール産生菌細胞をａ）の種培地に接種して、種培養を形成するステップと；
ｃ）前記ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞をｂ）の種培養中で培養するステップと；
ｄ）ｃ）の種培養を発酵培地に接種して、接種発酵培地を生成するステップと；
ｅ）糖化反応スラリーを提供するステップと；
ｆ）前記接種発酵培地を前記糖化反応スラリーに混合して、発酵ビールを形成するステップと； 
ｇ）エタノールが生成する条件下で、前記ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）エタノール産生菌細胞を前記発酵ビール中で培養するステップと
を含んでなり、
前記発酵ビールおよび前記糖化反応スラリーのいずれか１つが、セルロース性バイオマス加水分解物を含有し；
安定化二酸化塩素が、ｉ）ステップａ）の種培地、ｉｉ）ステップｅ）の糖化反応スラリー、またはｉｉｉ）ステップｄ）の発酵培地の少なくとも１つに添加され、
前記安定化二酸化塩素がステップａ）の種培地に添加される場合、前記種培地が、前記ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）エタノール産生菌の接種前に、少なくとも約６時間にわたり少なくとも約３３℃の温度に維持され；
前記安定化二酸化塩素がステップｅ）の糖化反応スラリーに添加される場合、前記糖化反応スラリーが、前記接種発酵培地との混合前に、少なくとも約８時間にわたり少なくとも約３３℃の温度に維持され；
前記安定化二酸化塩素がステップｄ）の発酵培地に添加される場合、前記発酵培地が、前記糖化反応スラリーとの混合前に、少なくとも約８時間にわたり少なくとも約３３℃の温度に維持され；
ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞を含んでなる前記種培養、前記接種発酵培地または前記発酵ビールのいずれか１つが、前記ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の増殖期間中に、約５ｇ／Ｌ未満の乳酸を含有する、
ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）生体触媒を含んでなる発酵工程において細菌汚染を制御するための発酵方法。
【請求項１６】
前記種培養、前記接種発酵培地、および前記発酵ビールが、約４０℃未満の温度に維持される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記糖化反応スラリーが、少なくとも１種のセルラーゼを含んでなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記細菌汚染の原因が、乳酸産生菌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記セルロース性バイオマスが、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ苞葉、トウモロコシ茎葉、草本、小麦、麦藁、大麦藁、乾草、稲藁、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、ソルガム、および木本セルロース成分からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
ステップａ）の種培地、ステップｄ）の糖化反応スラリー、またはステップｅ）の発酵培地中の安定化二酸化塩素の濃度が、最初に少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記安定化二酸化塩素を含んでなる、ステップｄ）の糖化反応スラリーまたはステップｅ）の発酵培地が、バイオマス乾燥重量を基準にして、混合物総重量に対して少なくとも約２０％固形分の固形分を含有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
ａ）セルロース性バイオマス加水分解物を含んでなる発酵培地組成物；および
ｂ）安定化二酸化塩素
を含んでなる、発酵培地組成物。
【請求項２３】
ａ）セルロース性バイオマス；
ｂ）少なくとも１種のセルラーゼ酵素；および
ｃ）安定化二酸化塩素
を含んでなる、糖化反応スラリー組成物。
【請求項２４】
安定化二酸化塩素の濃度が、最初に少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇであり、安定化二酸化塩素の量が、酸による安定化二酸化塩素の完全な活性化に際して放出され得る、二酸化塩素の量に関して示される、請求項２２または２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物が、バイオマス乾燥重量を基準にして、組成物総重量に対して少なくとも約２０％固形分の固形分を含有する、請求項２２または２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記セルロース性バイオマスが、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ苞葉、トウモロコシ茎葉、草本、小麦、麦藁、大麦藁、乾草、稲藁、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、ソルガム、および木本セルロース成分からなる群から選択される、請求項２２または２３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物学および発酵の分野に関する。より正確には、加水分解物培地中で生体触媒としてザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）を使用する場合に、安定化二酸化塩素を使用して、発酵中で細菌汚染を制御するための方法が開発された。
【背景技術】
【０００２】
再生可能資源から生成される燃料エタノールは、世界的な化石燃料不足、エネルギーコスト上昇、および大気二酸化炭素増大に関連している地球温暖化効果の長期解決策の１つである。再生可能資源由来の燃料エタノールは、生体触媒を使用する糖類発酵によって生産される。目下、酵母が、エタノール生産のために最も広く使用されている生体触媒である。発酵性糖類は、最も典型的には、トウモロコシ穀粒、甜菜、およびサトウキビをはじめとする、加工生体材料から得られる。代案の豊富な生体材料糖原料は、セルロース系またはリグノセルロース系バイオマスである。物理的、化学的、および／または酵素的処理を使用して、セルロース系およびリグノセルロース系バイオマスを加工し、発酵性糖類を生産する方法が開発されている。
【０００３】
大規模発酵過程において、特に炭水化物源として生体材料を使用する場合、無菌性を維持することは困難である。大規模発酵工程は、典型的に、加工生体材料、装置、プロセス水またはその他の起源に由来し得る、細菌によって汚染される。典型的に、汚染細菌は、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の種などの乳酸菌（ＬＡＢ）である。汚染細菌は、糖類を使用して、一次産物生体触媒の有効性を低下させることで、発酵産物の収率を低下させる。汚染細菌は、酢酸および乳酸などの望まれない産物を産生し、それは培養中のストレス状態を増大させて、生体触媒増殖の劣化および／または生体触媒産物生産の低下につながる。
【０００４】
主に乳酸菌である汚染細菌は、典型的に、燃料用または醸造用双方のエタノールを生産するために、炭水化物源としてマッシュまたは糖蜜を使用する、生体触媒として酵母を利用する発酵で問題となっている。酵母および汚染細菌は、抗菌剤によっては感受性に差があるので、酵母発酵中の細菌を制御するために、いくつかの抗菌剤を使用し得る。ＬＡＢ汚染を制御するために酵母発酵で成功裏に使用される抗菌剤としては、ペニシリン（非特許文献１）、バージニアマイシン（非特許文献２；非特許文献３；特許文献１）、ホップ酸（特許文献２）、エリスロマイシン、タイロシン、テトラサイクリン、および二酸化塩素（ＦｅｒｍａＳｕｒｅ（登録商標）；Ｄｕｐｏｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ  ＤＥ；非特許文献４）が挙げられる。
【０００５】
発酵性炭水化物および酵母を含んでなる水性ストリームをＣｌＯ２ガスで処理して、有害な微生物濃度を低下させることは、特許文献３で開示される。酵母エタノール生産工程からの酵母スラリーを二酸化塩素で処理して、酵母の生存度を保ちながら微生物汚染物質を破壊することは、特許文献４で開示される。発酵性糖、種菌（酵母）、および細菌増殖を実質的に防止するのに使用される安定化二酸化塩素を含んでなる発酵工程が、特許文献５で開示される。炭水化物溶液を微生物から保護するための安定化二酸化塩素の使用が、特許文献６で開示される。
【０００６】
グルコース利用に加えたキシロースおよびアラビノース利用、そして競合代謝経路の不活性化をはじめとする株の改善を設計することで、エタノールを生産する効果的な生体触媒として、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が開発されている。さらにザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）は、セルロース系バイオマス加水分解物中に存在する阻害物質に対する耐性を増大させることにより、加水分解物発酵培地中における使用のために適応されている。しかしこの生体触媒は細菌であり、優勢な汚染物質もまた細菌であることから、エタノール発酵のための生体触媒としてザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）を使用することには、汚染制御における追加的な難題がある。したがって酵母および細菌に対する抗菌剤の差異的活性は、酵母生体触媒を使用してエタノールを生産する工程では、活用し得ない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００７１４５８５７
【特許文献２】米国特許第２００９００４２２７６号明細書
【特許文献３】国際公開第２００７／０９７８７４号パンフレット
【特許文献４】米国特許第２００９／００６１４９０号明細書
【特許文献５】国際公開第２００７／１４９４５０号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２０１１０３８３１７号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９５４）Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２：２５２−２５８
【非特許文献２】Ｈｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：２８４−２９１
【非特許文献３】Ｂｉｓｃｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０３：１１７−１２２
【非特許文献４】Ｆａｔｋａ，Ｆｅｅｄｓｔｕｆｆｓ（Ｎｏｖ．３，２００８）ｐ１８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
細菌ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）生体触媒を利用する発酵において、細菌汚染物質を制御する方法に対する必要性がなおもある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が生体触媒である発酵中の細菌汚染を制御するための、組成物および方法を提供する。
【００１１】
したがって本発明は、
ａ）細菌種によって汚染されている可能性を有する増殖培地を提供するステップと；
ｂ）安定化二酸化塩素の有効量を（ａ）の増殖培地に添加して、温度が約３３℃を超える安定化二酸化塩素混合物を形成するステップと；
ｃ）ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞が接種ブロスを生成するのに適した温度で、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞をｂ）の混合物に接種するステップと；
ｄ）ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の増殖に適した条件下で、接種ブロスを発酵させるステップと
を含んでなり、発酵中に細菌汚染が制御される、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）生体触媒を含んでなる発酵工程において細菌汚染を制御するための発酵方法を提供する。
【００１２】
一実施形態では、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）はエタノール産生菌であり、方法の発酵ブロス中にエタノールが生成する。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、
ａ）セルロース性バイオマス加水分解物発酵培地；および
ｂ）安定化二酸化塩素
を含んでなる発酵培地混合組成物を提供する。
【００１４】
さらに別の実施形態では、本発明は、
ａ）セルロース性バイオマス；
ｂ）少なくとも１種のセルラーゼ酵素；および
ｃ）安定化二酸化塩素
を含んでなる、糖化反応スラリー混合組成物を提供する。
【００１５】
本発明の別の態様では、
ａ）ｉ）規定培地、ｉｉ）非セルロース系生体材料糖原料を含有する培地、およびｉｉｉ）清澄化セルロース性バイオマス加水分解物からなる群から選択される、セルロース性バイオマス加水分解物を欠く種培地を提供するステップと；
ｂ）ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）エタノール産生菌細胞を種培地に接種して、種培養を形成するステップと；
ｃ）ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞をｂ）の種培養中で培養するステップと；
ｄ）ｃ）の種培養を糖化反応スラリーに接種して、接種糖化スラリーを生成するステップと；
ｅ）接種糖化スラリーを発酵培地に混合して、発酵ビールを生成するステップと；
ｆ）エタノールが生成する条件下で、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）エタノール産生菌細胞を発酵ビール中で培養するステップと
を含んでなり、
安定化二酸化塩素が、ｉ）ステップａ）の種培地、ｉｉ）ステップｄ）の糖化反応スラリー、またはｉｉｉ）ステップｅ）の発酵培地の少なくとも１つに添加され；
安定化二酸化塩素がステップａ）の種培地に添加される場合、種培地が、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）エタノール産生菌の接種前に、少なくとも約６時間にわたり少なくとも約３３℃の温度に維持され；
安定化二酸化塩素がステップｄ）の糖化反応スラリーに添加される場合、糖化反応スラリーが、種培養の接種前に、少なくとも約８時間にわたり少なくとも約３３℃の温度に維持され； 
安定化二酸化塩素がステップｅ）の発酵培地に添加される場合、発酵培地が、糖化反応スラリーとの混合前に、少なくとも約８時間にわたり少なくとも約３３℃の温度に維持され；
ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞を含んでなる種培養、接種糖化スラリーまたは発酵ビールのいずれか１つが、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の増殖期間中に、約５ｇ／Ｌ未満の乳酸を含有する、
ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）生体触媒を含んでなる発酵工程における細菌汚染を制御するための発酵方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】キシロース利用のために遺伝子操作された、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中のエタノール発酵経路の略図を示す。
【図２】異なる量の安定化二酸化塩素（ＳＣＤ）を含有するＭＲＭ３Ｇ１０培地中における、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の増殖を示すグラフである。
【図３】３３℃でのザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞接種の６時間前に、２９８ｍｇ／ｋｇまたは皆無のＳＣＤが添加され、３３℃または４７℃のどちらかに維持された加水分解物培地中における、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞によるエタノール生成量を示すグラフである。
【図４】１５１ｍｇ／ｋｇまたは３０１ｍｇ／ｋｇの二酸化塩素が添加され、４（Ａ）即座に接種された；または４（Ｂ）４７℃で２４または４８時間後に３３℃で接種された、加水分解物培地中のザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞によるエタノール生成量のグラフを示す。
【図５】様々な量のＳＣＤが糖化開始時に添加された糖化反応から生成する加水分解物に接種された、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞による（Ａ）乳酸生成量、および（Ｂ）エタノール生成量のグラフを示し、接種は初期ｐＨ５．３、４７℃で４８時間後に、３３℃で実施した。追加的なサンプルでは、２４時間の糖化後に３１６ｍｇ／ｋｇのＳＣＤが添加され、４７℃で４８時間後に、３３℃での接種が続いた。
【図６】３０１ｍｇ／ｋｇの二酸化塩素が添加されて３３℃に維持され、次に１９．５時間または２３時間後に接種された、ＭＲＭ３Ｇ６培地中のザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞によるエタノール生成量グラフを示す。
【図７】３０１ｍｇ／ｋｇの二酸化塩素が添加されて４７℃に維持され、次に８、１６、２４または４８時間後に３３℃で接種された、培地中のザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞によるエタノール生成量のグラフを示し、（Ａ）は加水分解物培地であり、（Ｂ）はＭＲＭ３Ｇ６培地である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、エタノール生産などのために、生体触媒としてザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）を利用する発酵中で、汚染細菌を制御するための抗細菌剤としての安定化二酸化塩素（ＳＣＤ）の使用に関する。炭水化物溶液またはスラリー中に存在する汚染細菌はＳＣＤによって制御されるが、ＳＣＤは、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の増殖および産生に有害であることが、本明細書で分かった。安定化二酸化塩素を利用して、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）発酵中の汚染を制御する方法が開発された。特に、安定化二酸化塩素は、増殖培地（発酵培地または糖化反応スラリーを含んでもよい）に添加され、それは必要ならば、発酵に適した温度に温度を低下させる前に、３３℃を超える温度に一定時間維持され、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞が接種されて発酵ブロスが形成する。ＳＣＤ混合物が維持される温度が、発酵に適する温度より高い場合、温度を低下させる必要がある。ＳＣＤの添加とザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞接種の間に、高温で時間経過させることで、ＳＣＤの有害な影響が緩和されるので、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は効果的に増殖し、エタノールを産生し得る。必要な時間の長さに影響を及ぼす一要因は、それにＳＣＤが添加される増殖培地または発酵培地のタイプ、またはＳＣＤが糖化反応スラリーに添加されるかどうか、およびスラリーのタイプである。
【００１８】
燃料添加剤として使用するための、再生可能資源からの効率的なエタノール生産のために、この方法を使用して、化石燃料不足に対処し、エネルギーコストを低下させて、地球温暖化に影響を及ぼしてもよい。
【００１９】
以下の定義と略語を特許請求の範囲と明細書の説明で使用する。
【００２０】
本明細書の用法では、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含んでなる）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含んでなる）」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、「ｈａｓ（有する）」、「ｈａｖｉｎｇ（有する）」、「ｃｏｎｔａｉｎｓ（含有する）」、または「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有する）」という用語、またはそれらのあらゆるその他のバリエーションは、非排他的包含をカバーすることが意図される。例えば要素の一覧を構成する組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもこれらの要素のみに限定されず、明示的に列挙されない、またはこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有のその他の要素を含んでもよい。さらに特に断りのない限り、「ｏｒ」は排他的ｏｒでなく包括的ｏｒを指す。例えば条件ＡまたはＢは、以下のいずれかによって満たされる：Ａが真で（または存在し）Ｂが偽であり（または存在せず）、Ａが偽で（または存在せず）Ｂが真であり（または存在する）、ＡおよびＢの双方が真である（または存在する）。
【００２１】
さらに本発明の構成要件または構成要素に先立つ不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、構成要件または構成要素の事例数（すなわち発生率）に関して、非制限的であることが意図される。したがって「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと解釈すべきであり、構成要件または構成要素の単数語形は、数が単数であることを明らかに意味する場合を除いて、複数もまた含む。
【００２２】
「発明」または「本発明」という用語は、本明細書の用法では非限定的用語であり、特定の発明の任意の単一実施形態を指すことは意図されず、本明細書および特許請求の範囲に記載される全ての可能な実施形態を包含する。
【００２３】
本明細書の用法では、使用される本発明の成分または反応物質の量を修飾する「約」という用語は、例えば濃縮物または溶液を実際に作成するのに使用される、典型的な測定および液体取り扱い手順を通じて；これらの手順における不注意による誤りを通じて；組成物を作成しまたは方法を実施するのに用いられる成分の製造、起源または純度の違いを通じて、生じ得る数量の変動を指す。「約」という用語はまた、特定の最初の混合物から生じる組成物の異なる平衡条件のために、異なる量も包含する。「約」という用語によって修飾されるか否かを問わず、特許請求の範囲には量の同等物が含まれる。一実施形態では、「約」という用語は、報告された数値の１０％以内、好ましくは報告された数値の５％以内を意味する。
【００２４】
「エタノール産生菌」という用語は、炭水化物源の代謝を通じて、エタノールを産生する生物を指す。
【００２５】
「発酵性糖」という用語は、発酵過程において、微生物が炭素源として使用し得るオリゴ糖類および単糖類を指す。
【００２６】
「同時糖化発酵（ＳＳＦ）」という用語は、バイオマスが糖化され、糖化から生じる発酵性糖類が生体触媒によって使用され、全て同時に、典型的に、同一反応容器内で、生成物が生じる過程を指す。
【００２７】
「セルロース系」という用語は、セルロースと、ヘミセルロースおよびリグニンをはじめとする追加的な成分とを含んでなる、組成物を指す。
【００２８】
「リグノセルロース系」という用語は、リグニンとセルロースの双方を含んでなる組成物を指す。リグノセルロース系物質はまた、ヘミセルロースを含んでなってもよい。
【００２９】
「糖化」という用語は、多糖類からの発酵性糖類の生成を指す。
【００３０】
「生体材料」という用語は、生体触媒による発酵で使用されてもよい炭水化物源である、あらゆる生物由来材料を指す。生体材料としては、セルロース系バイオマス、ならびに穀物、マッシュ、糖蜜、および（甜菜やサトウキビなどからの）粗汁などの炭水化物源として使用される、その他の植物材料と植物由来材料が挙げられる。
【００３１】
「スラリー」という用語は、不溶性物質と液体の混合物を指す。
【００３２】
「セルロース性バイオマス糖化反応スラリー」という用語は、反応中にセルロースおよびその他の多糖類が加水分解されて発酵性糖類が生成する、セルロース性バイオマスと少なくとも１種のセルラーゼ酵素とを含んでなる混合物を指す。バイオマスはまた、糖化反応スラリーに含める前に、前処理されてもよい。混合物は不溶性物質と液体を含有し、したがってスラリーである。
【００３３】
「前処理バイオマス」という用語は、糖化に先だって処理を受けたバイオマスを意味する。
【００３４】
「セルロース系バイオマス」という用語は、セルロースを含んでなり、任意選択的に、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖類および／または単糖類をさらに含んでなる材料をはじめとする、あらゆるセルロース系またはリグノセルロース系材料を指す。セルロース系バイオマスはまた、タンパク質および／または脂質などの追加的な成分を含んでなってもよい。セルロース系バイオマスは、単一起源に由来してもよく、または２つ以上の起源に由来する混合物を含んでなり得る；例えば、セルロース系バイオマスは、トウモロコシ穂軸とトウモロコシ茎葉の混合物、または草と葉の混合物を含んでなることもあり得る。セルロース系バイオマスとしては、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙業汚泥、庭ごみ、木材および林業廃棄物が挙げられるが、これに限定されるものではない。セルロース系バイオマスの例としては、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ苞葉などの作物残渣、トウモロコシ茎葉、草本、小麦、麦藁、大麦藁、乾草、稲藁、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、ソルガムまたは大豆セルロース系植物材料、穀物製粉から得られるセルロース成分、樹木、枝、根、葉、木片、おがくず、灌木および低木（木本植物セルロース系成分）、野菜、果物、花卉、および家畜糞尿が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３５】
「セルロース系バイオマス加水分解物」という用語は、セルロース系またはリグノセルロース系バイオマスの糖化から生じる生成物を指す。バイオマスはまた、糖化に先だって前処理されてもよい。セルロース系バイオマス加水分解物は、バイオマス固形物を含有する生成物である。
【００３６】
「清澄化セルロース系バイオマス加水分解物」または「清澄セルロース系バイオマス加水分解物」という用語は、処理されて固形分が除去されたセルロース系バイオマス加水分解物を指し、それはセルロース系バイオマス加水分解物とは見なされない。さらに、
【００３７】
「糖化酵素」という用語は、バイオマス成分の発酵性糖類への変換を触媒し得る酵素を指す。典型的に、酵素は、バイオマスが前処理された場合に、より効果的である。
【００３８】
「実質的汚染」という用語は、抗菌剤なしで発酵ブロスを約４０時間培養すると、乳酸の５ｇ／Ｌよりも多く生成する、発酵ブロス中の乳酸菌汚染のレベルを指す。
【００３９】
「乳酸菌」という用語は、炭水化物発酵の主な代謝最終産物として乳酸を産生する細菌を指す。乳酸菌（ＬＡＢ）はグラム陽性細菌乳酸桿菌目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）に属し、例えば、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、および腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）が挙げられる。
【００４０】
「増殖培地」という用語は、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）生体触媒の増殖を支持する能力のある、液体培地を意味する。本発明で有用な典型的な増殖培地としては、セルロース性バイオマス加水分解物を含んでなってもよい、発酵培地および糖化反応スラリーが挙げられる。
【００４１】
「発酵培地」という用語は、生体触媒として使用される微生物の増殖を支持する、栄養素などの成分を含んでなる組成物を指す。発酵培地は、小規模培養および大規模生産発酵をはじめとする、任意の規模で使用してもよい。
【００４２】
「発酵ブロス」という用語は、その中で発酵が起きているまたは起きた、発酵培地および生体触媒細胞を含んでなる組成物を指す。発酵ブロス中における生体触媒の培養期間次第で、このブロスはまた、エタノールなどの生体触媒によって生成される生成物も含んでもよい。
【００４３】
「種培養」という用語は、発酵ブロスを生成するより多量の発酵培地に接種するのに使用される、生体触媒細胞の培養である。典型的に、種培養は、発酵ブロスの最終容積の約０．０１％〜２０％ｖ／ｖである。
【００４４】
「汚染」という用語は、意図的に添加されたのではない微生物の存在を指す。典型的に、所望の生体触媒が、発酵ブロスを生成する増殖培地に導入される。発酵ブロス中に存在する、導入された生体触媒以外の微生物は、汚染と見なされる。
【００４５】
本方法は、エタノール生産のための発酵などのザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細菌が生体触媒である、培養中の望まれない細菌の制御を提供する。望まれない汚染細菌は、典型的に、大規模工程中に、特に加工生体材料を含有する培地中に、存在する。培地で使用される加工生体材料としては、トウモロコシまたは小麦マッシュ、甜菜またはサトウキビ糖蜜、およびリグノセルロース系バイオマス加水分解物などの炭水化物源が挙げられる。汚染細菌は、生体材料、加工装置、接種培養物、プロセス水、空気、またはその他の起源から、発酵過程に取り込まれることもある。生産発酵における汚染の制御は、典型的に、生体触媒が増殖して、汚染細菌存在下で得られるよりも高いレベルで生成物を産生できるようにして、より効率的で経済的な発酵過程を提供する。
【００４６】
細菌汚染を制御するために二酸化塩素が一般的に使用されるが、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が二酸化塩素に対して感受性であるにもかかわらず、生体触媒として細菌ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）を使用する発酵中に汚染を制御するのに、安定化二酸化塩素（ＳＣＤ）を使用できるようにする方法が開発された。バイオマス由来炭水化物源を使用する大規模発酵中の優勢な汚染細菌は、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）株などの乳酸菌（ＬＡＢ）である。汚染細菌は、発酵性糖類について生体触媒と競合し、および／または乳酸などの、生体触媒の増殖および産生を阻害する物質を産生する。本方法では、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）発酵のための発酵性糖類を提供するのに使用される潜在的に汚染された発酵培地または糖化反応スラリーにＳＣＤを添加して、時間を通過させ、次にＳＣＤ含有混合物にザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞を接種する。典型的な汚染細菌を制御するのに効果的なＳＣＤレベルは、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の増殖とエタノール産生に対しても阻害性であるが、ＳＣＤ添加とザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞接種の間に時間を経過させれば、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、発酵中にＳＣＤ処理なしのものと同等の増殖および産物生成レベルを示す一方で、汚染は低いままであることが、本明細書で分かった。
【００４７】
安定化二酸化塩素
本明細書において、さもなければ「ＳＣＤ」と称される「安定化二酸化塩素」という用語は、１つまたは複数の二酸化塩素含有亜塩素酸塩複合体、１つまたは複数の亜塩素酸塩含有化合物、酸への曝露時に二酸化塩素を形成できる１つまたは複数のその他の実体、およびそれらの組み合わせを意味する。したがって安定化二酸化塩素は、二酸化塩素含有亜塩素酸塩複合体、亜塩素酸塩含有化合物、または酸への曝露時に液体培地中に二酸化塩素を形成できる実体の少なくとも１つを含んでなる。
【００４８】
好ましい二酸化塩素含有亜塩素酸塩複合体の例は、二酸化塩素と炭酸塩の複合体、二酸化塩素と炭酸水素塩の複合体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。亜塩素酸塩含有化合物の例としては、金属亜塩素酸塩、特にアルカリ金属およびアルカリ土類金属亜塩素酸塩が挙げられる。二酸化塩素前駆体として有用な亜塩素酸塩含有化合物の具体例は、工業等級亜塩素酸ナトリウムとして使用し得る、亜塩素酸ナトリウムである。
【００４９】
ＳＣＤは、好ましくは、アルカリ金属またはアルカリ土類金属亜塩素酸塩、典型的には、亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ２）の水溶液である。溶液中の亜塩素酸ナトリウムは、一般に、７を超えるｐＨで安定していが、中性（ｐＨ７）未満にｐＨが低下すると、活性二酸化塩素（ＣｌＯ２）を放出する。ＳＣＤの活性化速度、すなわち、活性ＣｌＯ２が安定形態から遊離される速度は、ｐＨ低下と共に増大する。
【００５０】
ＳＣＤ組成物の多く、特に二酸化塩素含有亜塩素酸塩複合体の正確な化学組成は、完全に理解されていない。特定の二酸化塩素前駆体の製造または生産は、Ｇｏｒｄｏｎに付与された米国特許第３，５８５，１４７号明細書、およびＬｏｖｅｌｙに付与された米国特許第３，５９１，５１５号明細書に記載される。市販の有用な安定化二酸化塩素調製物の特定例としては、例えば、Ｅ．Ｉ．ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）から入手できるＡｎｔｈｉｕｍ  Ｄｉｏｘｃｉｄｅ（登録商標）およびＦｅｒｍａＳｕｒｅ（登録商標）；およびＢｉｏ−Ｃｉｄｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｍａｎ，ＯＫ）から入手できるＯｘｉｎｅ（登録商標）およびＰｕｒｏｇｅｎｅ（登録商標）が挙げられる。
【００５１】
ＳＣＤは、１つまたは複数の二酸化塩素含有オキシ−塩素複合体、１つまたは複数の亜塩素酸塩含有化合物、酸への曝露時に二酸化塩素を形成できる１つまたは複数のその他の実体、およびそれらの組み合わせの溶液として提供されてもよい。溶液は、ＳＣＤを、利用可能な二酸化塩素（ＣｌＯ２）として、所定の活性種濃度で液体中に提供する。好ましくは、液体培地は、二酸化塩素含有亜塩素酸塩複合体、亜塩素酸塩含有化合物、酸への曝露時に二酸化塩素を形成できるその他の実体、およびそれらの組み合わせをはじめとする、液体培地総重量を基準にして、重量基準で約０．００２％〜約４０％の範囲、好ましくは重量基準で約２％〜約２５％の範囲、より好ましくは重量基準で約５％〜約１５％の範囲の利用可能二酸化塩素濃度を有するのに、十分なＳＣＤを有する。
【００５２】
ＳＣＤは、アルカリ性またはアルカリ土類金属亜塩素酸塩粉末、不活性成分、および任意選択的に乾燥酸などの乾燥活性化剤を含んでなる組成物などの固形物質として、提供されてもよい。
【００５３】
ＳＣＤはまた、アルカリ性またはアルカリ土類金属亜塩素酸塩粉末と、追加的な固体アルカリ性またはアルカリ土類金属亜塩素酸塩粉末との飽和溶液を含んでなる混合物（またはスラリー）として提供されてもよい。このようなスラリーは、溶液形態で得られるよりも、より高い活性成分レベルを液体ＳＣＤに提供する。
【００５４】
一実施形態では、ＳＣＤは、安定化アルカリ金属亜塩素酸塩、より具体的には亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ２）であり、それは最も一般的な市販されるアルカリ金属亜塩素酸塩である。安定化アルカリ金属亜塩素酸塩とは、ｐＨ７を超え、好ましくはｐＨ９〜１０の亜塩素酸塩の緩衝溶液を意味する。溶液は、典型的に、水中に５〜２２％ｗ／ｗの亜塩素酸ナトリウムを含んでなるが、亜塩素酸ナトリウム濃度はまた、より高くてもまたはより低くてもよい。
【００５５】
典型的に、亜塩素酸ナトリウムは、溶液重量を基準にして、水中に５〜２２重量％の亜塩素酸ナトリウムを含んでなる水溶液として、使用される。ＳＣＤ濃度は、亜塩素酸塩が二酸化塩素に化学量論的に変換されると利用可能になる二酸化塩素（ＣｌＯ２）の濃度、「利用可能ＣｌＯ２」に関して記述されてもよい。１ｇの亜塩素酸ナトリウム中の潜在的二酸化塩素含有量は、０．５９７ｇである。亜塩素酸ナトリウム溶液は、５〜２２重量％の亜塩素酸ナトリウムを含んでなり、したがって２．９８〜１３．１３％の利用可能二酸化塩素を含有する。ＣｌＯ２の生成は、以下の式（１）によって例証される：
５ＮａＣｌＯ２＋４Ｈ＋→４ＣｌＯ２（ｇ）＋２Ｈ２Ｏ＋Ｃｌ−＋５Ｎａ＋（１）
式中、１個のＮａＣｌＯ２分子が、０．８個のＣｌＯ２分子を提供する。
【００５６】
ＳＣＤ濃度は、典型的に、酸による完全な活性化に際して、ＳＣＤ調製物から放出され得る、二酸化塩素の量として規定される。これは、異なるｐＨの組成物で使用される、異なるＳＣＤ調製物で提供される二酸化塩素濃度を標準化する。
【００５７】
ＳＣＤが亜塩素酸ナトリウムの水溶液である場合、ＳＣＤは、ｐＨ７を超えるｐＨを有する。亜塩素酸ナトリウム溶液は、ｐＨの低下につれて、活性二酸化塩素を放出する。ＳＣＤ水溶液からの二酸化塩素放出速度は、ｐＨがｐＨ約５〜６．６から２．６に低下するのにつれて増大する。この速度は、いくつかの要因次第で変動してもよい。例えば、異なるＣｌＯ２前駆体が、同一または同様のｐＨにおいて異なる速度で、ＣｌＯ２を放出してもよい。溶液の緩衝能力などのその他の要因は、ＳＣＤ溶液からのＣｌＯ２放出速度に影響を及ぼしてもよい。これらの要因は、当業者に良く知られている。
【００５８】
ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）発酵のための安定化二酸化塩素混合物
本方法では、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞生体触媒を混合物に接種する前に、発酵培地または糖化反応スラリーなどの発酵のための組成物にＳＣＤを添加して、安定化二酸化塩素混合物を形成する。したがってＳＣＤは、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞発酵のための発酵性糖類源である発酵培地または糖化反応スラリーに添加される。ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、二酸化塩素に対して感受性であるが、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の接種前に時間が経過すれば、ＳＣＤをザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞発酵の糖供給源組成物に添加してもよいことが、本明細書で分かった。
【００５９】
ＳＣＤは、生体触媒としてザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）を用いる発酵中に、増殖および産生を支持するあらゆるタイプの増殖培地に添加してもよい。当業者は、以下の情報を考慮して、記載されるタイプの培地のいずれでも調製する方法を理解するであろう。一実施形態では、増殖培地は規定培地である。この培地は、グルコースなどの炭水化物源と、アミノ酸源と、酵母エキスなどのその他の栄養素と、微量成分、窒素、ＫＨ２ＰＯ４などのリン、およびＭｇＳＯ４を含んでもよいその他の成分とをはじめとする、典型的な購入された成分を含有する。規定培地は、実験室規模培養ならびに大規模発酵種菌として使用される種培養を培養するのに使用されることが多い。
【００６０】
別の実施形態では、増殖培地は、マッシュ、粗汁、または糖蜜などの非セルロース系材料から得られる糖類を含有する。これらの糖類は、穀類（トウモロコシ、小麦、大麦、およびライ麦など）、および甜菜およびサトウキビなどの糖料作物などの生体材料から調製される。発酵のために使用される加水分解マッシュは、糊化温度を超える温度に加熱して、アルファアミラーゼで処理して液化し、グルコアミラーゼなどの酵素を使用して糖化することで、典型的に、穀類から製造される。発酵培地中では、甜菜およびサトウキビからの糖蜜または粗汁を糖原料として使用してもよい。糖原料は主にデンプンまたは糖汁であるので、この種の糖原料は、非セルロース系生体材料糖原料（リグノセルロース系をはじめとするセルロース系）である。この種の糖原料は、典型的に、種培養で、および生体触媒として酵母を使用するエタノール生産で、およびその他の非セルロース系大規模発酵中で使用される。
【００６１】
非セルロース系起源からの糖を有する合成培地および培地には、（リグノセルロース系をはじめとする）セルロース系バイオマス加水分解物が欠如している。さらに、セルロース系バイオマスから得られて、高度に精製され固形物などのその他のセルロース成分が除去された、糖原料を含有する培地は、セルロース系バイオマス加水分解物が欠如した培地と見なされる。この種の培地は、清澄化セルロース系バイオマス加水分解物を含有する。
【００６２】
さらに別の実施形態では、増殖培地は、（リグノセルロース系をはじめとする）セルロース系生体材料から調製された、セルロース系バイオマス加水分解物を含有する。セルロース系バイオマス加水分解物は、バイオマス固形物を含有する。セルロース系バイオマス加水分解物は、（リグノセルロース系をはじめとする）セルロース系バイオマスの糖化によって生成される。典型的に、バイオマスは、糖化に先だって前処理される。バイオマスは、当業者に知られているあらゆる方法によって処理され、加水分解物中に発酵性糖類を生じてもよい。典型的に、バイオマスは、物理的および／または化学的処理を使用して前処理され、酵素的に糖化される。物理的および化学的処理としては、粉砕、製粉、切断、アンモニアまたはＮａＯＨなどの塩基処理、および／または酸処理が挙げられる。特に有用なのは、アンモニアを含んでなる水溶液に、バイオマスを接触させて、バイオマス−水性アンモニア混合物を生成する低アンモニア前処理であり、参照によって本明細書に援用する同一譲受人米国特許第７，９３２，０６３号明細書で開示されるように、アンモニア濃度は、バイオマス−水性アンモニア混合物のアルカリｐＨを維持するのに十分であるが、バイオマス乾燥重量に対して約１２重量％未満であり、バイオマスの乾燥重量は、バイオマス−水性アンモニア混合物重量に対して少なくとも約１５重量％固形分である。
【００６３】
セルロース系またはリグノセルロース系バイオマスの酵素的糖化は、典型的に、酵素組成物または配合物を利用して、セルロースおよび／またはヘミセルロースを分解し、例えば、グルコース、キシロース、およびアラビノースなどの糖類を含有する加水分解物を生成する。糖化酵素は、Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６６：５０６−５７７，２００２）で概説される。少なくとも１つの酵素が使用され、典型的に、１つまたは複数のグリコシダーゼを含む糖化酵素配合物が使用される。グリコシダーゼは、二糖類、オリゴ糖類、および多糖類のエーテル結合を加水分解し、一般群「ヒドロラーゼ」（ＥＣ３．）の酵素分類ＥＣ  ３．２．１．ｘ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡと、付録１（１９９３）、付録２（１９９４）、付録３（１９９５）、付録４（１９９７）、および付録５［それぞれＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２３：１−５，１９９４；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３２：１−６，１９９５；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３７：１−５，１９９６；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０：１−６，１９９７；およびＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６４：６１０−６５０  １９９９］）にある。本方法で有用なグリコシダーゼは、それらが加水分解するバイオマス構成要素によって分類し得る。本方法で有用なグリコシダーゼとしては、セルロース加水分解グリコシダーゼ（例えば、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ）、ヘミセルロース加水分解グリコシダーゼ（例えば、キシラナーゼ、エンドキシラナーゼ、エキソキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、アラビノキシラナーゼ、マンナーゼ、ガラクターゼ、ペクチナーゼ、グルクロニダーゼ）、およびデンプン加水分解グリコシダーゼ（例えば、アミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ）が挙げられる。さらに、ペプチダーゼ（ＥＣ３．４．ｘ．ｙ）、リパーゼ（ＥＣ３．１．１．ｘおよび３．１．４．ｘ）、リグニナーゼ（ＥＣ１．１１．１．ｘ）、またはフェルロイルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．７３）などのその他の活性を糖化酵素共同体に添加して、バイオマスのその他の成分からの多糖類の放出を促進することが有用なこともある。多糖類加水分解酵素を産生する微生物が、異なる基質特異性を有するいくつかの酵素または一群の酵素によって触媒される、セルロース分解能力などの活性を往々にして示すことは、当該技術分野で公知である。したがって微生物からの「セルラーゼ」は、一群の酵素を含んでなってもよく、その１つまたは複数またはその全てが、セルロース分解活性に貢献してもよい。セルラーゼなどの商業的または非商業的酵素製剤は、酵素を得るのに利用される精製スキーム次第で、多数の酵素を含んでなってもよい。糖化で有用な多数のグリコシルヒドロラーゼ酵素およびその組成物が、国際公開第２０１１／０３８０１９号パンフレットで開示される。
【００６４】
糖化酵素は、商業的に入手されてもよい。このような酵素としては、例えばＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰセルラーゼ、Ｍｕｌｔｉｆｅｃ（登録商標）キシラナーゼ、Ａｃｃｅｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００、およびＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＤＵＥＴ（Ｄａｎｉｓｃｏ  Ｕ．Ｓ．Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、およびＮｏｖｏｓｙｍｅ−１８８（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，２８８０  Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）が挙げられる。さらに糖化酵素は、未精製であってもよく、細胞抽出物またはホールセル調製物として提供されてもよい。酵素は、１つまたは複数の糖化酵素を発現するように改変された組換え微生物を使用して生成されてもよい。例えば、前処理セルロース系バイオマス糖化のために本明細書で使用されるＨ３Ａタンパク質調製物は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）遺伝子改変株によって産生される酵素の未精製調製物であり、セルラーゼおよびヘミセルラーゼの組み合わせを含み、参照によって本明細書に援用する、国際公開第２０１１／０３８０１９号パンフレットに記載される。
【００６５】
さらに糖化のための酵素としては、例えば、ＧＨ３、ＧＨ３９、ＧＨ４３、ＧＨ５５、ＧＨ１０、およびＧＨ１１ファミリーメンバーなどのグリコシルヒドロラーゼが挙げられる。ＧＨは、２つ以上の炭水化物間の、または炭水化物と非炭水化物部分間のグリコシド結合を加水分解する、一群の酵素である。ＧＨファミリーは、配列類似性に基づいて分類されており、分類は、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅ（ＣＡＺｙ）ｄａｔａｂａｓｅ（Ｃａｎｔａｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）Ｄ２３３−２３８）中で利用できる。これらの酵素のいくつかは、様々な基質に作用でき、糖化酵素としての効力を実証した。グリコシドヒドロラーゼファミリー３（「ＧＨ３」酵素は、例えば、β−グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．２１）；β−キシロシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．３７）；Ｎ−アセチルβ−グルコサミニダーゼ（ＥＣ：３．２．１．５２）；グルカン−１，３−グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．５８）；セロデキストリナーゼ（ＥＣ：３．２．１．７４）；エキソ−１，３−１，４−グルカナーゼ（ＥＣ：３．２．１）；および／またはβ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）活性をはじめとする、いくつかの既知の活性を有する。グリコシドヒドロラーゼファミリー３９（「ＧＨ３９」）酵素はまた、例えば、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＥＣ：３．２．１．７６）および／またはβ−キシロシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．３７）活性をはじめとする、いくつかの既知の活性を有する。グリコシドヒドロラーゼファミリー４３（「ＧＨ４３」）酵素は、例えば、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．５５）；β−キシロシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３７）；エンドアラビナナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９９）；および／またはガラクタン１，３−β−ガラクトシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１４５）活性をはじめとする、いくつかの既知の活性を有する。グリコシドヒドロラーゼファミリー５１（「ＧＨ５１」）酵素は、例えば、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．５５）および／またはエンドグルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）活性を有することが知られている。グリコシドヒドロラーゼファミリー１０（「ＧＨ１０」）は、Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：２４０３−２４１２、およびＬｏ  Ｌｅｇｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５０９  ３０３−３０８）で詳細に記載され、グリコシドヒドロラーゼファミリー１１（「Ｈ１１」）は、Ｈａｋｏｕｖａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：９６１７−２４に記載されている。
【００６６】
本発酵培地混合組成物は、セルロース性バイオマス加水分解物発酵培地とＳＣＤとを含んでなる。「有効量」のＳＣＤは、生体触媒を損傷することなく、汚染細菌種を殺滅するのに効果的なあらゆる量である。ＳＣＤの有効量は、使用される増殖培地のタイプに応じて変動する。一実施形態では、下でさらに詳しく説明するように、ＳＣＤの濃度は、最初に少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇであり、安定化二酸化塩素の量は、酸による安定化二酸化塩素の完全な活性化に際して放出され得る、二酸化塩素の量に関して示される。下述するように、バイオマス加水分解物を含有する発酵培地は、１つまたは複数の追加的な糖類および／またはその他の添加成分がある、特定百分率の加水分解物を含有してもよく、または培地は、ソルビトールなどの微量添加がある、９０％以上の加水分解物を含有してもよい。様々な実施形態では、セルロース系バイオマス加水分解物は、発酵ブロスの最終容積の少なくとも約５０％、６０％、７９％、８０％、９０％または９５％である。典型的に、発酵ブロスの最終容積の約１０％は、種菌である。
【００６７】
バイオマス加水分解物の固形分含量は、用いられる前処理および糖化方法次第で、典型的に、約１０％〜４０％である。より典型的に、は、固形分は約２５％であり、９０％のセルロース系バイオマス加水分解物を含有する培地は、約２３％の固形分を有する。一実施形態では、セルロース性バイオマス加水分解物発酵培地とＳＣＤの混合物は、バイオマス乾燥重量を基準にして、混合物総重量に対して少なくとも約２０％の固形分を含有する。
【００６８】
一実施形態では、ＳＣＤは、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞発酵の発酵性糖類源である糖化反応スラリーに添加される。糖化反応スラリーは、穀類（トウモロコシ、小麦、大麦、およびライ麦など）およびセルロース系（またはリグノセルロース系）バイオマスなどの、反応に不溶性固形分を寄与して反応スラリーを生じる、あらゆる生体材料を含有してもよい。さらに糖化反応スラリーは、上述したように、デンプン含有生体材料で使用されるグルコアミラーゼなどの少なくとも１種の糖生成酵素、またはセルロース性バイオマスで使用される少なくとも１種のセルラーゼを含有する。
【００６９】
一実施形態では、本糖化反応スラリー混合組成物は、セルロース性バイオマス、少なくとも１種のセルラーゼ酵素、および安定化二酸化塩素を含んでなる。一実施形態では、下でさらに詳しく説明するように、ＳＣＤの濃度は、最初に少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇであり、安定化二酸化塩素の量は、酸による安定化二酸化塩素の完全な活性化に際して放出され得る、二酸化塩素の量に関して示される。一実施形態では、混合物は、バイオマス乾燥重量を基準にして、混合物総重量に対して、少なくとも約２０％の固形分を含有する。
【００７０】
ＳＣＤは、反応開始時、反応終了時、または反応中のいずれかの時点などの、糖化反応中のあらゆる時点で糖化反応スラリーに添加してもよい。ＳＣＤは、ハイブリッド糖化発酵（ＨＳＦ）が実施される場合、糖化反応スラリーに添加されてもよい。ＨＳＦ工程では、生体触媒の添加に先だって、部分的糖化が達成され、その後、糖化および発酵が同時に起こる。ＨＳＦが実施される場合、ＳＣＤは、下述するザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞接種に先だつ時間を得るのに十分な時点で、糖化中に添加される。
【００７１】
ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）発酵においてＳＣＤを使用する方法
ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は二酸化塩素に対して感受性であるが、発酵組成物へのＳＣＤ添加と、得られたＳＣＤ混合物へのザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞接種の間に時間を経過させれば、細胞は、ＳＣＤ未添加培地に接種された細胞と同様に増殖してエタノールを産生し得ることが、本明細書で分かった。ＳＣＤ添加とザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞接種の間に経過させる時間は、ＳＣＤ混合物のｐＨおよび温度、ＳＣＤが添加される組成物のタイプ、および添加されるＳＣＤの量をはじめとする、複数の要因に左右される。
【００７２】
上述したように、ＳＣＤ混合物のｐＨは７未満であり、二酸化塩素の放出を支持する。典型的に、ＳＣＤ混合物は、約６未満のｐＨを有する。例えばセルロース性バイオマス糖化反応は、典型的に約５〜６のｐＨで実施され、加水分解物培地は、典型的に約５〜６のｐＨでザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）発酵で使用される。したがってこれらの組成物は、さらなるｐＨ調整なしに、ＳＣＤと共に直接使用してもよい。
【００７３】
ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞接種前のＳＣＤ混合物の温度は、３３℃以上に維持される。温度は、約３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０℃以上に維持されてもよい。温度は、発酵に必要な栄養素に有害なレベル未満に保たれる。様々な実施形態で、ＳＣＤ混合物の温度は、３５℃以上、４０℃以上、または約４７℃に維持される。ＳＣＤ混合物が、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞に適するよりも高い温度である場合、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞接種に先だって、温度をザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞に適した温度に低下させる。ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞に適した温度は、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞が生存する温度であり、発酵に最適でなくてもよい。ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、発酵最適温度よりも高い温度で、混合物に接種してもよく、その後、得られた発酵ブロスを発酵温度に冷却する。一実施形態では、接種時のＳＣＤ混合物の温度は、４０℃未満である。別の実施形態では、温度は３７℃以下、３５℃以下、または３３℃以下である。
【００７４】
ＳＣＤが、セルロース性バイオマス加水分解物を含んでなる発酵培地組成物、または糖化反応スラリーに添加される場合，ＳＣＤ添加とザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞接種の間の時間は、６時間を超える。様々な実施形態で、時間は、７、８、９、１０、１１、または１２時間、またはそれ以上であってもよい。特定タイプのセルロース性バイオマス加水分解物培地または糖化反応スラリー、ＳＣＤの特定使用量、および特定温度で使用される特定の時間は、本明細書の実施例で例示されるように、接種に続くザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の能力に基づいて、当業者によって容易に判定されてもよい。
【００７５】
セルロース性バイオマス加水分解物を欠く発酵培地にＳＣＤが添加される場合、ＳＣＤ添加とザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞接種の間の時間は、８時間を超える。様々な実施形態で、時間は、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０時間、またはそれ以上であってもよい。セルロース性バイオマス加水分解物を欠く特定タイプの培地、ＳＣＤの特定使用量、および特定温度で使用される特定の時間は、本明細書の実施例で例示されるように、接種に続くザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の能力に基づいて、当業者によって容易に判定されてもよい。
【００７６】
ＳＣＤは、組成物へのザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞接種から生じる発酵ブロス中の汚染を制御するのに有効な量で、発酵のための組成物に添加される。上述したように、ＳＣＤ濃度は、典型的に、酸による完全な活性化に際して、ＳＣＤ調製物から放出され得る二酸化塩素（ＣｌＯ２）の量として規定される。ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）発酵ブロス中で汚染制御を提供するのに必要なＣｌＯ２の濃度は、使用されるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株の増殖および産生特性、（上述の）ＳＣＤが添加される発酵組成物のタイプ、温度、およびｐＨ、そして初期汚染レベルなどの要因次第で変動する。汚染細菌の制御は、発酵ブロス中の乳酸レベルを測定することで評価してもよく、約４０時間の発酵後でさえ約５ｇ／Ｌ未満の乳酸の存在は、汚染が制御されていることを意味する。汚染は、発酵ブロス中で約５ｇ／Ｌ未満の乳酸、または４ｇ／Ｌまたは３ｇ／Ｌまたは２ｇ／Ｌまたは１ｇ／Ｌ未満の乳酸に制御されてもよい。発酵ブロス中の乳酸の量は、典型的に、当業者に知られているように、ＨＰＬＣによってアッセイされる。有効量のＳＣＤは、少なくとも約１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、２７５、３００、３５０ｍｇ／ｋｇ、またはそれ以上であってもよい。規定条件下における発酵のために、特定組成物で使用されるＣｌＯ２の有効量は、本明細書の実施例に記載される実験に基づいて、当業者によって容易に判定されてもよい。例えば約１５０ｍｇ／ｋｇの濃度のＣｌＯ２が、本明細書の実施例４に記載される条件下で、約２のＯＤ６００のＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）培養物の５または１０容積％の加水分解物培地への接種を制御するのに使用される有効量である。
【００７７】
ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞種菌
本方法では、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞を接種することで、発酵ブロスが生成する。接種は、増殖培養を開始するのに効果的な、あらゆるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞源を使用してもよい。典型的に、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は冷凍保存株として貯蔵され、細胞は、規定培地中の小規模培養で培養して復活させる。小規模培養は、発酵ブロスまたは培養物を生成するための発酵培地に添加される種菌として使用される。小規模培養はまた、種培養に接種するのに使用してもよい。ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、種培養中で培養され、それは次に種菌として、大規模発酵に添加される。種菌として使用される種培養は、無菌培地を含有してもよく、汚染制御のための抗菌剤を必要としない。代案としては、上述したように、種菌として使用される種培養は、加工装置または生体材料などによって汚染されていてもよいあらゆる発酵培地を含有してもよく、上述したようなザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞接種前に、ＳＣＤが使用されて汚染が制御される。接種は、典型的に、接種される培地の最終容積の１％〜１０％を使用する。
【００７８】
ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞
あらゆるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞株が、本方法で使用されてもよく、使用される培地タイプや所望の発酵過程の結果をはじめとする要因に基づいて、選択される。所望の生産工程の効果的生体触媒である、あらゆるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を使用してもよい。例えばザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、グルコース、フルクトースおよび／またはスクロースを発酵基質として利用して、エタノールを自然に産生するが、キシロースは代謝しない。一実施形態では、本方法および組成物で使用されるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、キシロース利用のために改変されており、それは発酵培地としてキシロースを含有するセルロース系バイオマス加水分解物を使用する場合に、特に所望される。
【００７９】
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）などのエタノール産生ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株が、キシロースを発酵してエタノールにするために改変されている。米国特許第５，５１４，５８３号明細書、米国特許第５，７１２，１３３号明細書、米国特許第６，５６６，１０７号明細書、国際公開第９５／２８４７６号パンフレット、Ｆｅｌｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（（１９９２）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３８  ３５４−３６１）、およびＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：２４０−２４３）に記載されるようにして、キシロース代謝に関与する酵素発現のために、典型的に、４つの遺伝子をＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）に導入して、キシロース利用代謝経路（図１）を作成する。これらとしては、キシロースのキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼをコードする遺伝子、およびキシルロースをリン酸化してキシルロース−５−リン酸を形成するキシルロキナーゼとをコードする遺伝子が挙げられる。ペントースリン酸経路の２つの酵素であるトランスケトラーゼとトランスアルドラーゼもさらに発現され、これらはキシルロース−５−リン酸を中間体に変換し、それはペントース代謝を解糖エントナー・ドウドロフ（Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｅｒｏｆｆ）経路に連結して、キシロースのエタノールへの代謝を可能にする（図１を参照されたい）。これらの酵素をコードするＤＮＡ配列は、腸内細菌、およびある種の酵母や真菌などのキシロースを代謝できる多数の微生物のいずれかから得られてもよい。コード領域の起源としては、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ）、およびザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が挙げられる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコード領域が、典型的に、使用される。
【００８０】
コードＤＮＡ配列は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰプロモーター）、およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）エノラーゼ（ＥＮＯプロモーター）プロモーターなどの、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞中で発現されるプロモーターと、作動可能に連結する。参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，９８９，２０６号明細書で開示される、発現が増大した変異ＧＡＰプロモーターもまた、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中での発現に有用である。コード領域は、プロモーターから個別に発現されてもよく、または２つ以上のコード領域がオペロン中で連結して、同一プロモーターから発現されてもよい。結果として生じるキメラ遺伝子は、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞に導入してプラスミド上に保ってもよく、または例えば、相同的組換え、部位特異的組み込み、またはランダム組み込みを使用して、ゲノムに組み込んでもよい。キシロース利用代謝経路を発現するように改変された株の例としては、ＣＰ４（ｐＺＢ５）（米国特許第５，５１４，５８３号明細書）、ＡＴＣＣ３１８２１／ｐＺＢ５（米国特許第６，５６６，１０７号明細書）、８ｂ（米国特許２００３／０１６２２７１第号明細書；Ｍｏｈａｇｈｅｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２５；３２１−３２５）、およびＺＷ６５８（ＡＴＴＣＣ＃ＰＴＡ−７８５８）が挙げられる。キシロース利用代謝経路の発現のために改変されたザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、唯一の糖としてキシロースを含有する培地中で増殖できるようになる前に、一般に、キシロー含有培地中における適応期間を要する。
【００８１】
追加的な実施形態では、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、成長速度および／または細胞量を増大させ、キシロース利用を増大させ、および／またはアラビノースなどのその他の糖類の使用を可能にし、酢酸などの化合物に対する阻害耐性を増大させ、またはエタノール生産を増大させる修飾などの、株を改善する１つまたは複数の追加的な遺伝子修飾を有する。
【００８２】
一実施形態では、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，８４３，７６０号明細書に記載されるアラビノース利用のために、さらに改変されてもよい。アラビノース利用を可能にするために、キシロース利用経路の遺伝子に加えて発現される遺伝子としては、１）Ｌ−アラビノースをＬ−リブロースに変換するＬ−アラビノースイソメラーゼ、２）Ｌ−リブロースをＬ−リブロース−５−リン酸に変換するＬ−リブロキナーゼ、および３）−リブロース−５−リン酸をＤ−キシルロースに変換するＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼ（米国特許第５，８４３，７６０号明細書）が挙げられる。参照によって本明細書に援用する、米国特許第２０１１／０１４３４０８号明細書で開示されるように、アラビノース利用の改善は、ａｒａＥ遺伝子からのコード領域の発現などによって、アラビノースプロトン共輸送体をさらに発現することで達成されてもよい。
【００８３】
別の実施形態では、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，８９７，３９６号明細書に記載されるように、組み込み宿主因子のサブユニットをコードする内在性ｈｉｍＡ遺伝子を遺伝子改変してその発現を低下させ、それは酢酸含有培地中の増殖を改善する。酢酸はバイオマス加水分解物中に存在し、したがってバイオマス加水分解物を含有する培地を使用する場合、この成分に対する耐性を増大させることが所望される。
【００８４】
別の実施形態では、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，７４１，１１９号明細書に記載されるように、グルコースフルクトース酸化還元酵素（ＧＦＯＲ）活性を低下させる遺伝子修飾を施す。ＧＦＯＲならびにｈｉｍＡ遺伝子の発現低下は、アルドース還元酵素活性の低下について上で記載されるものなどのあらゆる方法によってもよい。
【００８５】
別の実施形態では、参照によって本明細書に援用する、同一譲受人同時係属米国特許出願公開第１３／１６１７３４号明細書で開示されるように、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ＲＰＩ）活性を増大させる遺伝子修飾が施される。ＲＰＩの発現増大は、天然プロモーターよりも高活性のプロモーターなどによって、内在性ＲＰＩをコードする遺伝子の発現を増大させることで、またはザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中のリボース−５−リン酸イソメラーゼ活性によって、任意選択のタンパク質またはポリペプチドをコードする異種遺伝子を発現させることで、達成されてもよい。米国特許出願第１３／１６１７３４号明細書に記載されるように、ＲＰＩ−ＡおよびＲＰＩ−Ｂと称される２つのリボース−５−リン酸イソメラーゼ酵素群があり、そのどちらが発現されてもよい。
【００８６】
別の実施形態では、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，９８９，２０６号明細書および米国特許第７，９９８，７２２号明細書で開示される、高活性の変異プロモーターを使用して、キシロース利用代謝経路の一部として発現されるキシロースイソメラーゼが発現される。その中で開示される変異プロモーターは、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド‐３‐リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターである。
【００８７】
別の実施形態では、キシロース利用代謝経路の一部として発現されるキシロースイソメラーゼは、同一譲受人同時係属米国特許出願公開第１３／１６１７４９号明細書で開示されるように、ＥＣ  ５．３．１．５によって同定される酵素クラスに含まれる、Ｉ群キシロースイソメラーゼである。その中では、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中において、２群キシロースイソメラーゼよりも活性が高い、アクチノプラネス・ミズリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）（ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）のコドン最適化コード領域：配列番号１３）から単離されたコード領域から発現されるものなどのＩ群キシロースイソメラーゼが開示されている。その中で、Ｉ群キシロースイソメラーゼは、（ＰＨＹＬＩＰ（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  パッケージ  バージョン  ３．５ｃ；Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ（１９８９）Ｃｌａｄｉｓｔｉｃｓ  ５：１６４−１６６）中で実装されるＰＨＹＬＩＰ近隣結合アルゴリズム、ＧｒｏｕｐＳｉｍ解析（Ｃａｐｒａ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｈ（２００８）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２４  １４７３−１４８０）、およびプロファイル隠れマルコフモデル（ＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージのｈｍｍｓｅａｒｃｈアルゴリズム；Ｊａｎｅｌｉａ  Ｆａｒｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃａｍｐｕｓ，Ａｓｈｂｕｒｎ，ＶＡを使用する）を使用して、分子系統バイオインフォマティクス解析によって、定義される。
【００８８】
別の実施形態では、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１１−００１４６７０−Ａ１号明細書で開示されるように、エタノールおよび酢酸アンモニウムを含有するストレス培養中での増殖に適応されている。酢酸耐性が改善されたこれらのザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株は、酢酸を含有するセルロース系バイオマス加水分解物を含有する発酵培地を使用する場合に、特に有用である。
【００８９】
上記参考文献で開示される株および本明細書に記載の株は、本方法で使用されてもよい株の例を提供し、ＡＴＣＣ３１８２１／ｐＺＢ５、ＺＷ６５８（ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−７８５８）、ＺＷ８００、ＺＷ８０１−４、ＺＷ８０１−４：：ΔｈｉｍＡ、ＡｃＲ＃３、ＺＷ７０５、ＡＲ３  ７−３２１、およびＺＷ１−ＸＡ１１１が挙げられる。
【００９０】
ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）発酵
本方法では、あらかじめＳＣＤで処理されて、次に一定時間後にザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞が接種された、したがって発酵ブロスである発酵培地または糖化反応スラリーを、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の増殖に適した条件下に維持する。一実施形態では、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞は、発酵で使用される条件下におけるエタノール生産の効果的生体触媒であるザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株細胞であり、発酵ブロス中にエタノールが生成される。増殖が阻害される程度に発酵培地中の糖類濃度が高い場合、培地は、参照によって本明細書に援用する、同一譲受人の米国特許第７，６２９，１５６号明細書で開示されるように、ソルビトール、マンニトール、またはその混合物を含む。典型的に、ソルビトールまたはマンニトールが、約５ｍＭの最終濃度で培地中に存在する。
【００９１】
典型的に、約３０℃〜約３７℃の温度と、約４．５〜約６．５のｐＨの条件が使用される。典型的に、（嫌気的、微好気的、または微好気性発酵などの条件を含んでもよい）培養物は、空気、酸素、またはその他の気体の補給なしで、少なくとも約２０時間培養され、そして約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０時間以上培養されてもよい。典型的に、種培養が約２０時間培養されるのに対し、発酵生産培養物は、約４０時間以上培養される。起泡を最小化するために、消泡剤（シリコーンベース、有機ベースなどの任意の種類）を必要に応じて培地に添加してもよい。
【００９２】
商業的生産発酵培養物では、多様な培養手順を応用してもよい。例えば大規模生産は、バッチおよび連続培養手順の双方を使用してもよい。古典的バッチ培養法は、培地組成が培養開始時に設定されて、培養工程において人為的変更を受けない閉鎖系である。したがって所望の生物を培養工程開始時に培地に接種し、系に何も添加せずに、増殖または代謝活性を生じさせる。しかし典型的に、「バッチ」培養は、炭素源添加に関してバッチであり、ｐＨおよび酸素濃度などの要素を制御する試みが頻繁になされる。バッチ系では、系の代謝産物組成とバイオマス組成は、培養を停止させる時点まで常に変化する。バッチ培養内では、細胞は、静的な遅滞期から高い対数増殖期へ、そして最後に、増殖速度が減退または停止する静止期へと減速する。処置を施さない場合、静止期にある細胞はやがて死滅する。対数期にある細胞は、往々にしてエタノール生産の大半に関与する。
【００９３】
標準バッチ系の変法が、流加系である。流加培養工程もまた、本方法および組成物に適し、培養の進行と共に基質が徐々に添加されることを除いては、典型的なバッチ系を構成する。流加バッチ系の実際の基質濃度の測定は困難であるので、ｐＨ、およびＣＯ２のような排ガスの分圧などの測定可能要素の変化に基づいて推定する。バッチおよび流加培養法は、一般的で当該技術分野で周知であり、例は、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，ａｎｄ  Ｂｒｏｃｋ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６，２２７，（１９９２）にある。
【００９４】
本方法はまた、連続培養工程を使用してもよい。連続培養は、バイオリアクターに培養液が継続的に添加される開放系であり、同時に等量の馴化培地が、加工のために取り出される。連続培養は、概して、細胞が主に対数増殖期にある、一定の高い液相密度に細胞を維持する。代案としては、固定化細胞を用いて連続培養を実施してもよく、その中では炭素および栄養素が継続的に添加されて、有価生成物、副産物または老廃物が、細胞集団から継続的に取り出される。細胞固定化は、当業者に知られているように、天然および／または合成材料から構成される幅広い固体支持体を使用して、実施してもよい。
【００９５】
生産工程では、生産発酵培養は、典型的に、システムの掃除が必要になるまで相次いで実施される。
【００９６】
本方法および組成物はまた、ハイブリッド糖発酵（ＨＳＦ）工程で使用してもよく、その中では、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞の添加に先だって、部分的糖化が実施され、次にさらなる糖化および発酵が同時に起こる。第２段階同時糖化発酵は、参照によって本明細書に援用する、国特許出願公開第２０１１−０３１８８０３号明細書に記載されるようであってもよい。この工程では、高濃度のエタノール生産のための同時糖化発酵反応において、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞が、低いインペラ撹拌、および糖化発酵混合物中の高濃度の不溶性固形分の条件下で、培養される。
【実施例】
【００９７】
以下の実施例で、本発明をさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しながら、例証としてのみ提供されるものと理解すべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的特性を見極めることができ、その精神と範囲を逸脱することなく、本発明に様々な変更と修正を加えて、それを様々な用途と条件に適応させ得る。
【００９８】
略語の意味は、次の通りである。「ｈｒ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｇ／Ｌ」は１リットルあたりグラムを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｐｍｏｌ」はピコモルを意味し、「ＯＤ６００」は６００ｎｍで評価された光学濃度を意味し、「ＥＦＴ」は経過発酵時間を意味し、「ｐｐｍ」は百万分率を意味し、「Ｇ＋Ｘ」はセルロース系バイオマスサンプル中のグルカンおよびキシロースの総量を意味する。
【００９９】
一般方法
ＺＷ７０５株の説明
ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５株は、ＺＷ８０４−１株から作成した。ＺＷ８０１−４は、参照によって本明細書に援用する、同一譲受人の米国特許第７，７４１，１１９号明細書に記載される、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の組換えキシロース利用株である。ＺＷ８０１−４株はＺＷ８００株に由来して、それはＺＷ６５８株に由来し、これらは全て米国特許第７，７４１，１１９号明細書に記載される。ＺＷ６５８は、逐次遺伝子転位事象によって、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼ、およびトランスケトラーゼをコードする、４つのキシロース利用遺伝子を含有する２つのオペロン、ＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｇａｐｔａｌｔｋｔをＺＷ１（ＡＴＣＣ３１８２１）をゲノムに組み込み、続いてキシロース含有選択培地上で適応させて構築した（米国特許第７，６２９，１５６号明細書）。ＺＷ６５８は、ＡＴＣＣＰＴＡ−７８５８として寄託した。ＺＷ６５８中で、宿主媒介二重交差相同的組換えを使用して、グルコースフルクトース酸化還元酵素（ｇｆｏｒ）をコードする遺伝子を挿入的に不活性化し、スペクチノマイシン耐性を選択可能なマーカーとして、ＺＷ８００を作り出した（米国特許第７，７４１，１１９号明細書）。Ｃｒｅリコンビナーゼを使用した部位特異的組換えによって、ｌｏｘＰ部位と境を接するスペクチノマイシン耐性マーカーを除去し、ＺＷ８０１−４を作成した。
【０１００】
参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１１−００１４６７０号明細書に記載されるようにして、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ８０１−４株の培養物を酢酸アンモニウムを含有する培地のストレス条件下での増殖に適応させ、ＺＷ７０５を作成した。２５０ｍｌの撹拌されるｐＨおよび温度制御発酵槽（Ｓｉｘｆｏｒｓ；Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）内で、ＺＷ８０１−４の連続培養を実施した。発酵のための基礎培地は、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１５ｍＭのリン酸アンモニウム、１ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、１０ｍＭのソルビトール、５０ｇ／Ｌのキシロース、および５０ｇ／Ｌのグルコースであった。高濃度の酢酸およびアンモニアの存在下における増殖への適応は、９７日間にわたり、比希釈率によって測定される確立成長速度を維持しながら、上記連続培養培地に添加する酢酸アンモニウムの濃度を少しずつ増大させてもたらされた。酢酸アンモニウムは、１６０ｍＭの濃度に増大された。アンモニウムイオン濃度のさらなる増大は、１３９日間の連続培養の終わりまでに、リン酸アンモニウムを２１０ｍＭの最終総アンモニウムイオン濃度に添加することで達成される。ＺＷ７０５株は、単一コロニーへの播種と１個の選択コロニーの増幅によって、適応集団から単離された。
【０１０１】
ＡＲ３  ７−３１株の説明
ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ＡＲ３  ７−３１株は、参照によって本明細書に援用する、同一譲受人同時係属米国特許出願公開第１３／３１６５９７号明細書に記載されるようにして、タービドスタット中のＺＷ７０５株の増殖に続いて単離された（その中ではＡｄａｐｔｅｄ７−３１とも称される）。この連続流動培養装置内では、加水分解物培地中の酢酸アンモニウムおよびエタノールの濃度が、経時的に増大した。ＡＲ３  ７−３１の全ゲノムは配列決定され、ＺＷ７０５ゲノムの配列と比較された。ＡＲ３  ７−３１株は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムのｚｍｏ１４３２読み取り枠（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿００６５２６．２）に、遺伝子修飾を有することが分かり、その中でｚｍｏ１４３２は、「フザリン酸耐性タンパク質」をコードするとして注釈される。具体的には、ＡＲ３  ７−３１変異は、ｚｍｏ１４３２コード領域の３５０位にあり、その位置でＣからＴに変化している。この変異は、１１７位アミノ酸ＴＣＴからＴＴＴへのコドン変化をもたらし、１１７位アミノ酸のセリンからフェニルアラニンへの変化をもたらした。この変異の影響は、加水分解物培地中の株の挙動を改善するポリペプチドの発現であり、加水分解物中で様々な増殖インヒビターに対する株の耐性を増大させ、エタノール収率を増大させる。
【０１０２】
ＺＷ１−ＸＡ１１１株
ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ１−ＸＡ１１１株は、ＺＷ１（ＡＴＣＣ３１８２１）株から作成された。ＺＷ１は、ＺＷ７０５について上述したように、ｘｙｌＡ、ｘｙｌＢ、ｔｋｔ、およびｔａｌの４つのキシロース利用経路遺伝子を発現するように、遺伝子操作された。ｘｙｌＡコード領域は、アクチノプラネス・ミズリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）（参照によって本明細書に援用する、米国特許第２０１１／０３１８８０１号明細書で開示される）に由来して、変種高活性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，９８９，２０６号明細書で開示される）を使用して、ｘｙｌＡおよびａｔａｌ／ｔｋｔオペロンを発現した。ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子の組み込みは、ｇｆｏｒ遺伝子座を不活性化した（参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，７４１，１１９号明細書）。株は、参照によって本明細書に援用する、同一譲受人同時係属米国特許出願公開第１３／１６１７３４号明細書で開示されるようなリボース−５−リン酸イソメラーゼ（Ｒｐｉ）と、参照によって本明細書に援用する、同一譲受人同時係属米国特許出願公開第６１／５７７８７１号明細書で開示されるようなリブロース−リン酸３−エピメラーゼ（Ｒｐｅ）の発現を増大させるために、遺伝子操作された。参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，６２９，１５６号明細書に記載されるようにして、得られた株を適応のためにキシロース培地中で継代して４回倍加させ、その間に、キシロースをキシリトールに変換できるＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素活性を有する酵素をコードする、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムのｚｍｏ０９７６読み取り枠（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿００６５２６．２）に遺伝子修飾が起こった（Ａｇｒａｗａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．；オンライン出版７／０１／２０１１）。参照によって本明細書に援用する、米国特許出願第６１／５７７８７９号明細書で開示されるように、ｚｍｏ０９７６の妨害は、ＮＡＤＰＨ依存性キシロース還元酵素活性を９０％を超えて低下させ、キシロース含有培地上の増殖を改善する。
【０１０３】
株は、キシロース利用のために導入されたトランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ活性と併せて、アラビノース同化作用経路を提供する、Ｌ−リブロースキナーゼ、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、およびＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼをそれぞれコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｒａＢＡＤオペロンを発現するように、遺伝子操作された（参照によって本明細書に援用する米国特許第５，８４３，７６０号明細書）。参照によって本明細書に援用する、同一譲受人同時係属米国特許出願公開第６１／５７７８７１号明細書で開示されるように、ａｒａＢＡＤオペロンの組み込みは、ポリヌクレオチドホスホリラーゼをコードするｐｎｐ遺伝子を不活性化し、それによってキシロース利用およびエタノール産生の改善を提供した。米国特許第７，６２９，１５６号明細書に記載されるようにして、得られた株を適応のために、キシロース培地中で継代して１０回倍加させた。
【０１０４】
キシロース利用をさらに改良するために、参照によって本明細書に援用する、米国特許第２０１１／１４３４０８号明細書で開示されるように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のａｒａＥ遺伝子によってコードされる異種アラビノース−プロトン共輸送体を発現するように、株を遺伝子操作した。このステップで使用されたクロラムフェニコール耐性標識は、ＺＷ１−ＸＡ１１１株を生成するゲノムから除去された。
【０１０５】
穂軸組成物
国立再生可能エネルギー研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｇｏｒａｔｏｒｙ）（Ｇｏｌｄｅｎ，ＣＯ）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−４２６１８（２００８年４月改訂）で詳述されるように、ＡＳＴＭ  Ｅ１７５８−０１「Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ｂｙ  ＨＰＬＣ（ＨＰＬＣによる炭水化物測定標準法）」を使用して、出発トウモロコシ穂軸中のセルロースおよびキシランの量を測定した。組成物は、乾燥重量を基準にして、３４．８％セルロース、２９．２％キシラン、１２．８％リグニンと判定された。
【０１０６】
茎葉組成物
出発茎葉中のセルロースおよびキシランの量は、Ｍｉｃｒｏｂａｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）によって測定された。組成は、乾燥重量を基準にして、３４．８％セルロース、２１．８％キシラン、１６．９％リグニンと判定された。
【０１０７】
糖化酵素
Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＴＲＩＯ（Ｄａｎｉｓｃｏ  Ｕ．Ｓ．Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）
セルラーゼおよびヘミセルラーゼ産生株Ｈ３Ａ
Ｈ３Ａ株は、以下のように作成された、組換えトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株である。米国特許第７，６６６，６４８号明細書に記載された四重欠損株１Ａ５２の誘導体である、米国特許第２００８／０２６３７６号明細書に記載された四重欠損Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株（いずれの参考文献も参照によって本明細書に援用する）を、電気穿孔を使用して、β−グルコシダーゼ発現カセット（ＣＢＨ１プロモーター、β−グルコシダーゼ１コード領域、ＣＢＨ１ターミネーター、およびａｍｄＳ遺伝子）、およびエンドキシラナーゼ発現カセット（ＣＢＨ１プロモーター、エンドキシラナーゼコード領域、およびＣＢＨ１ターミネーター）で同時形質転換した。１つの形質転換体は、＃２２９株と称される。＃２２９株は、電気穿孔を使用して、β−キシロシダーゼＦｖ３Ａ発現カセット（ｃｂｈ１プロモーター、β−キシロシダーゼコード領域、ｃｂｈ１ターミネーター、およびａｌｓ遺伝子）、β−キシロシダーゼＦｖ４３Ｄ発現カセット（ｅｇ１プロモーター、β−キシロシダーゼコード領域、天然ターミネーター）、およびＦｖ５１Ａα−アラビノフラノシダーゼ発現カセット（ｅｇ１プロモーター、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼコード領域、天然ターミネーター）で同時形質転換した。Ｈ３Ａ株は、この形質転換から単離された。
【０１０８】
Ｈ３Ａ株の発酵中に生成される細胞外タンパク質を遠心分離によって細胞集団から分離し、分子量カットオフ１０ｋＤのＭｉｌｌｉｐｏｒｅメンブレンを通過させて膜限外濾過によって濃縮し、ｐＨを４．８に調節した。総タンパク質は、較正物質としてウシ血清アルブミンを使用して、ＷｅｉｃｈｓｅｌｂａｕｍおよびＧｏｒｎａｌｌによる修正ビウレット法を使用して測定した（Ｗｅｉｃｈｓｅｌｂａｕｍ，１９６０，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．１６：４０；Ｇｏｒｎａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９４９  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  １７７：７５２）。本明細書でＨ３Ａタンパク質と称されるこのＨ３Ａ細胞外タンパク質調製物を、セルラーゼおよびヘミセルラーゼ併用調製物として使用して、複合糖質加水分解をもたらした。
【０１０９】
穂軸加水分解物ＦＲＦ１０
前処理
トウモロコシ穂軸は、酵素加水分解前に、米国特許第７，９３２，０６３号明細書に記載される低アンモニア法を使用して前処理した。容器本体周囲に蒸気を通過させるためのジャケットを含む、水平Ｌｉｔｔｌｅｆｏｒｄ  Ｄａｙ  １３０Ｌ反応器（Ｌｉｔｔｌｅｆｏｒｄ  Ｄａｙ，Ｉｎｃ．，Ｆｌｏｒｅｎｃｅ，ＫＹ）を前処理のために使用して、ＳＳＬ２４と命名される前処理穂軸を生成した。湿潤穂軸ベースで４４容積％の反応器充填に達するまで、種トウモロコシ加工からの穂軸（サイズ１ｍｍ未満）を容器に装入した（５０．２ポンド；２２．７７ｋｇ）。穂軸は、１．０ｍｍの篩付き大型微粉砕機（型番号１ＳＨ、シリアル番号１００１９；Ｐｕｌｖｅｒｉｚｉｎｇ  Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ  Ｃｏ．，Ｓｕｍｍｉｔ，ＮＪ）を使用して、１ｍｍ未満のサイズにした。必要に応じて、粉砕前に穂軸にドライアイスを添加して、機器が加熱するのを防止した。微粉砕機の主要駆動部分は、最大ローター速度９，６００ＲＰＭの５ｈ．ｐ．のモーターである。それは６個の回転ハンマーと、シェルとを有し、対向する衝撃縁で被覆される。
【０１１０】
穂軸は、０．３９６ｇ／ｃｍ３の湿潤蒿密度と、８重量％の水分を有した。容器上部近くへの２８．９重量％の水酸化アンモニウム溶液（９．７ポンド；４．４ｋｇ）および水（１７．２ポンド；７．８ｋｇ）の装入に先だって、０．１気圧に達するまで容器を真空にして、容器内に、乾燥重量バイオマスに対して６重量％のＮＨ３と６０重量％固形分を得た。ＳＳＬ２５およびＳＳＬ２６と命名される第２および第３の前処理バッチを同一様式で実施して、引き続く糖化のために十分な材料を生成した。全てのバッチ中で、反応器撹拌器を７０ｒｐｍに設定し、容器のジャケットに蒸気を通過させた。容器が８０℃の内部温度に達したら、容器の上部近くに蒸気を装入して、容器内部温度を１４５℃に上昇させた。この温度を２０分間保った。この保持時間で１５分目に、ジャケットを通過する蒸気を停止させた。前処理の終了時に、ベントコンデンサを通じて、大気圧に達するまで反応器を減圧させた。引き続いて、１５分間にわたり真空（およそ１気圧未満；１０１．３キロパスカル）にして、温度を６０℃未満に低下させ、容器の底弁開放に先だって、前処理穂軸から追加的なアンモニアおよび水を除去し、前処理バイオマスを回収した。前処理穂軸バッチＳＳＬ２４、ＳＳＬ２５、およびＳＳＬ２６の固形分の最終重量％は、それぞれ６１．１％、６６．７％、および６７．８％であった。
【０１１１】
糖化
ＦＲＦ１０加水分解物は、ＳＳＬ２４、ＳＳＬ２５、およびＳＳＬ２６調製物からの前処理トウモロコシ穂軸の混合物を使用して、上述のＨ３Ａ酵素系を用いて糖化させることで、２００Ｌ発酵槽内で生成された。水の残留分（１２４．０ｋｇ）を発酵槽に添加して、ジャケットを１２１℃に加熱し、２０分間滅菌した。水を４７℃に冷却し、タンク上部のポートを通じて前処理穂軸混合物を添加し；この時点で２１．０ｋｇを添加した。１ＮのＨ２ＳＯ４によってｐＨを５．３に調節し、酵素を添加した。酵素の投入量は４．７３ｋｇであり、それは反応器に添加された全穂軸中の１ｇのグルカン＋キシランあたり１４ｍｇのタンパク質に相当した。続く１２時間にわたり、３時間毎に４回、１５．５ｋｇの穂軸を反応器に添加して、各添加後に、１ＮのＨ２ＳＯ４でｐＨを５．３に調節した。この操作の標的固形物装入量は、２５重量％であった。発酵槽は、およそ７２時間にわたり４７℃およびｐＨ５．３に制御した。この期間の終了時に、２０リットルを抜き取ってこれらの実験で使用し、容器の残留内容物を発酵させた。加水分解物サンプルを分析し、残りは使用時まで冷蔵した。サンプル分析の結果は、表１に示される。
【０１１２】
【表１】
2016504032.tif 000003
【０１１３】
穂軸加水分解物ＦＲＦ１９
前処理
５０容積％（６０．１ポンド；２７．３ｋｇ）に達するまで容器に装入したこと以外は、穂軸加水分解物ＦＲＦ１０について上述したように、トウモロコシ穂軸を酵素加水分解前に前処理した。穂軸は、０．４２０ｇ／ｃｍ３の湿潤蒿密度と、１０．９重量％の水分を有した。９．８ポンド（４．４ｋｇ）の２８．９重量％水酸化アンモニウム溶液、および１８．１ポンドの水を添加した。最初のサンプルは、ＳＳＬ５２であり、５つの追加的なサンプルＳＳＬ５３〜ＳＳＬ５７を同一様式で調製して合わせた。前処理穂軸バッチＳＳＬ５２、ＳＳＬ５３、ＳＳＬ５４、ＳＳＬ５５、ＳＳＬ５６、およびＳＳＬ２７の固形分の最終重量％は、それぞれ７０．３％、６９．４％、６８．８％、６９．６％、６８．７％、および７０．６％であった。
【０１１４】
糖化
ＳＳＬ５２〜ＳＳＬ５７の調製物からの前処理トウモロコシ穂軸の混合物を使用して、ＦＲＦ１９加水分解物を２００Ｌの発酵槽内で生成し、上で説明したＨ３Ａ酵素系で処理した。糖化は、水残留分が１１１．０ｋｇであり、最初に２０．０ｋｇの前処理穂軸が発酵槽に添加され、酵素用量が６．８６ｋｇ（反応器に添加される全穂軸中の１ｇのグルカン＋キシランあたり１６ｍｇのタンパク質に相当する）であったこと以外は、上述したようであった。続く１２時間にわたり、反応器に、１６．０ｋｇの穂軸を３時間毎に４回添加した。この試行の標的固形分装入は、２７．５重量％であった。サンプル加水分解物分析は、表２に記載される。
【０１１５】
【表２】
2016504032.tif 000004
【０１１６】
茎葉加水分解物Ｙ０１８
前処理
トウモロコシ茎葉は、酵素加水分解前に、米国特許第７，９３２，０６３号明細書に記載される低アンモニア法を使用して前処理した。容器本体周囲に蒸気を通過させるためのジャケットを含む水平Ｅｉｒｉｃｈ３４０Ｌ反応器を前処理のために使用して、Ｙ０１８と命名される前処理穂軸を生成した。容器に、６０容積％（４０．８ｋｇ）に達するまで、茎葉を装入した。茎葉を１／３２インチ（０．８ｍｍ）未満に縮小した。
【０１１７】
茎葉は、０．２００ｇ／ｃｍ３の湿潤蒿密度と、８．０重量％の水分を有した。茎葉を装入した後、水酸化アンモニウム溶液の装入に先だって、−０．９バールｇ（−９０キロパスカルｇ）に達するまで容器を真空にして、容器内に、乾燥重量バイオマスに対して８重量％のＮＨ３と、６５重量％の固形分を得た。全てのバッチにおいて、反応器撹拌器は４０Ｈｚ（４２ｒｐｍ）に設定され、ジャケット上の蒸気圧力は３．２バールｇであった。ひとたびアンモニア溶液を添加したら、１６バールｇ（１６００キロパスカルｇ）の蒸気を容器に添加して、容器内部温を１４０℃に上昇させて維持した。この温度を３０分間保った。前処理の終了時、ベントコンデンサを通じて、大気圧に達するまで反応器を減圧させた。引き続いて、−０．９バールｇ（−９０キロパスカルｇ）に達するまで真空にして、温度を低下させ、前処理茎葉から追加的なアンモニアおよび水を除去してから、容器の底弁を開放して前処理バイオマスを回収した。記載するように調製された前処理茎葉バッチＹ０１８−Ｘ、Ｙ０１８−５、およびＹ０１８−１０の固形分の最終重量％は、それぞれ５５．５％、６７．０％、および６４．４％であった。
【０１１８】
糖化
上で説明したバッチからの前処理トウモロコシ茎葉の混合物を使用して、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＴＲＩＯで処理し、１０００Ｌ発酵槽内でＹ０１８加水分解物を生成した。水の残留分を発酵槽に添加し、ジャケットを１２１℃に加熱して２０分間滅菌した。水を４７℃に冷却して、タンク上部のポートを通じて前処理茎葉混合物を添加し；スラリーは、この時点でおよそ８重量％の固形分であった。５重量％のＨ２ＳＯ４によってｐＨを５．３に調節し、酵素を添加した。酵素の投入量は、反応器に添加された全茎葉中の１ｇのグルカン＋キシランあたり１４ｍｇのタンパク質に相当した。続く２４時間にわたり、２５重量％固形分を目標として残りの茎葉を添加し、５重量％Ｈ２ＳＯ４によってｐＨを５．３に調節した。発酵槽は、およそ７２時間にわたり４７℃およびｐＨ５．３に制御した。この期間の終了時に、２０リットルを抜き取ってこれらの実験で使用し、容器の残留内容物を発酵させた。加水分解物サンプルを分析し、残りは使用時まで冷蔵した。サンプル分析の結果は、表３に示される。
【０１１９】
【表３】
2016504032.tif 000005
【０１２０】
ＨＰ１９６前処理トウモロコシ茎葉
トウモロコシ茎葉は、酵素加水分解前に、米国特許第７，９３２，０６３号明細書に記載される低アンモニア法を使用して前処理した。容器本体周囲に蒸気を通過させるためのジャケットを含む水平Ｅｉｒｉｃｈ６．７Ｌ反応器を前処理のために使用して、Ｙ１９６と命名される前処理穂軸を生成した。湿潤茎葉ベースで、７０重量％の反応器充填に達するまで、容器に茎葉を装入した（７９７．５ｇ）。茎葉を１／３２インチ（０．８ｍｍ）未満に縮小した。
【０１２１】
茎葉は、０．１７０ｇ／ｃｍ３の湿潤蒿密度と、９．４３重量％の水分を有した。茎葉を装入した後、水酸化アンモニウム溶液の装入に先だって、−０．９バールｇ（−９０キロパスカルｇ）に達するまで容器を真空にして、容器内に、乾燥重量バイオマスに対して８重量％のＮＨ３と、６０重量％の固形分を得た。全てのバッチにおいて、反応器撹拌器は２０ｒｐｍに設定され、ジャケット上の蒸気圧力は４．１バールｇ（４１０キロパスカルｇ）であった。ひとたびアンモニア溶液を添加したら、４．５バールｇ（４５０キロパスカルｇ）の蒸気を容器に添加して、容器内に５０重量％の固形分を得た。ジャケット蒸気圧力を上昇させ、次に容器内部温を１４０℃に維持するように調節した。この温度を２０分間保った。前処理の終了時、ベントコンデンサを通じて、大気圧に達するまで反応器を減圧させた。引き続いて、−０．７バールｇ（−７０キロパスカルｇ）に達するまで真空にして、温度を低下させ、前処理茎葉から追加的なアンモニアおよび水を除去してから、容器の底弁を開放して前処理バイオマスを回収した。前処理茎葉バッチＨＰ１９６の固形分の最終重量％は、６３．５５％であった。
【０１２２】
培養液
ＭＲＳ＝１０ｇ／Ｌのペプトン、８ｇ／Ｌの肉エキス、４ｇ／Ｌの酵母エキス、２０ｇ／Ｌのグルコース、５ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム三水和物、１ｇ／Ｌのツイーン８０、２ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、２ｇ／Ｌのクエン酸三アンモニウム、０．２ｇ／ＬのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、０．０５ｇ／ＬのＭｎＳＯ４＊４Ｈ２Ｏ、ｐＨ６．２
【０１２３】
ＭＲＭ３Ｇ１０は、１リットルあたり次を含有する：酵母抽出物（１０ｇ）、ＫＨ２ＰＯ  （２ｇ）、およびＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、グルコース（１００ｇ）、ｐＨ５．５
ＭＲＭ３Ｇ６は、１リットルあたり次を含有する：酵母抽出物（１０ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（２ｇ）、およびＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、グルコース（６０ｇ）、ｐＨ５．５
【０１２４】
分析的
エタノール、乳酸のＨＰＬＣ分析
発酵サンプルを設定間隔で収集し、Ｗａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｌｌｉａｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）、またはＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＬＣのいずれかを使用して、条件＝０．６ｍＬ／分の０．０１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４、注入容積＝５μＬ、オートサンプラー温度＝１０℃、カラム温度＝５５℃、稼働時間＝２５分間、屈折率による検出（４０℃保持）で、ＥｔＯＨと、残留糖類と、酢酸、乳酸、およびグリセロールなどのその他の代謝産物とについて分析した。ＨＰＬＣカラムは、ＢｉｏＲａｄ（Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ，ＢｉｏＲａｄ  Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）から購入された。分析物を屈折率検出によって定量化し、既知の標準物質と比較した。
【０１２５】
実施例１
安定化二酸化塩素に対するザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）の感受性
スタータカルチャとして、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ７０５株（一般方法を参照されたい）をＭＲＭ３Ｇ１０中で増殖させた（一般方法を参照されたい）。ＦｅｒｍａＳｕｒｅ（登録商標）ＸＬ（Ｅ．Ｉ．ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥから入手できる）原液を使用して、ＭＲＭ３Ｇ１０培地サンプルに、安定化二酸化塩素（ＳＣＤ）を０、７．５、１５または２２４ｍｇ／ｋｇの二酸化塩素濃度で添加した。二酸化塩素は、酸による完全な活性化に際してＦｅｒｍａＳｕｒｅ（登録商標）ＸＬ溶液中でＳＣＤから放出され得る、二酸化塩素の量に関して記載される。ＺＷ７０５スタータカルチャを使用して、０．１のＯＤ６００に１％の最終容積で、ＳＣＤ含有培地サンプル、ならびにＳＣＤ非含有対照サンプルに接種した。培養物を３２℃でインキュベートして、ＯＤ６００で増殖をモニターした。図２に示されるように、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞増殖は、全ての二酸化塩素レベルで大幅に阻害された。７．５ｍｇ／ｋｇの二酸化塩素では、約２７時間後に細胞がそれから回復する長い遅滞期があり、次にＳＣＤが添加されない対照と同様に増殖した。Ｐより多くの二酸化塩素が添加されたサンプル中の細胞は、実験中に回復しなかった。
【０１２６】
実施例２
遅延接種後における安定化二酸化塩素に対するザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）の感受性
実験を実施して、ＳＣＤ添加に続くＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞接種前の遅滞期が、細胞に対する二酸化塩素毒性を低下し得るかどうかを判定した。ＦｅｒｍａＳｕｒｅ（登録商標）ＸＬ（Ｅ．Ｉ．ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥから入手できる）原液を使用して、１１ｍＬのＦＲＦ１０トウモロコシ穂軸加水分解物（ｐＨ５．３；一般方法を参照されたい）に、二酸化塩素を２９８ｍｇ／ｋｇの濃度で添加した。二酸化塩素は、酸による完全な活性化に際してＦｅｒｍａＳｕｒｅ（登録商標）ＸＬ溶液中でＳＣＤから放出され得る、二酸化塩素の量に関して示される。対照サンプルでは、ＦＲＦ１０トウモロコシ穂軸加水分解物に、ＦｅｒｍａＳｕｒｅ（登録商標）ＸＬの代わりに水を添加した。次に加水分解物を３３℃または４７℃で６時間インキュベートした。次にサンプルを３３℃に維持して、１０ｇ／ＬのＢＢＬ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１０ｍＭのソルビトール、１５０ｇ／Ｌのグルコース、３３℃でｐＨ５．５およびｐＨ５．５（ｐＨ調節のための４ＮのＮＨ４ＯＨ）中で約１０のＯＤ６００に増殖させた、１０容積％（最終容積）のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＡＲ３  ７−３１（一般方法を参照されたい）細胞培養物（Ｆ０８２０）を、約１の開始ＯＤ６００に接種した。エタノール生成量は、ＨＰＬＣによって培養物中でモニターした（一般方法を参照されたい）。図３は、対照サンプルが成功裏に発酵して、約５０ｇ／Ｌのエタノールを含有した一方で、３５７ｍｇ／ｋｇの二酸化塩素を含有するサンプルが、わずか約１５ｇ／Ｌのエタノールを含有したことを示す。したがってこれらの条件下では、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞から正常なエタノール生成レベルを得るのに、６時間の遅滞期は十分でなかった。
【０１２７】
実施例３
長期遅延接種後における安定化二酸化塩素に対するザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）の感受性
ＳＣＤと細胞添加の間のより長い遅延時間の影響を調べるために、ＦｅｒｍａＳｕｒｅ（登録商標）ＸＬ（Ｅ．Ｉ．ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥから入手できる）原液を使用して、１５１ｍｇ／ｋｇまたは３０１ｍｇ／ｋｇの二酸化塩素をＦＲＦ１９トウモロコシ穂軸加水分解物（一般方法を参照されたい）＋１０ｍＭソルビトール、ｐＨ５．８に添加した。二酸化塩素は、酸による完全な活性化に際してＦｅｒｍａＳｕｒｅ（登録商標）ＸＬ溶液中でＳＣＤから放出され得る、二酸化塩素の量に関して示される。サンプルは、４７℃で、２４または４８時間インキュベートした。次にサンプルを３３℃に維持して、１０ｇ／ＬのＢＢＬ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１０ｍＭのソルビトール、１５０ｇ／Ｌのグルコース、３３℃でｐＨ５．５（ｐＨ調節のための４ＮのＮＨ４ＯＨ）中で約１０のＯＤ６００に増殖させた、１０容積％（最終容積）のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＡＲ３  ７−３１（一般方法を参照されたい）培養物（Ｆ１１５３）を、約１の開始ＯＤ６００に接種した。並行対照実験では、ＦＲＦ１９トウモロコシ穂軸加水分解物＋１０ｍＭソルビトール、ｐＨ５．８に、０．１５１ｍｇ／ｋｇまたは３０１ｍｇ／ｋｇの二酸化塩素を添加して、即座にそれに、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＡＲ３  ７−３１を同一様式で接種した。エタノール生成量は、ＨＰＬＣによって培養物中でモニターした（一般方法を参照されたい）。
【０１２８】
図４Ａは、ＳＣＤの投入直後にＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を接種した培養物では、いずれの使用量でもエタノール生成が排除された一方で、未添加対照サンプルは、約８０ｇ／Ｌのエタノールを含有したことを示す。図４Ｂは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の接種に先だって、１５１ｍｇ／ｋｇまたは３０１ｍｇ／ｋｇの二酸化塩素のどちらかを含有する培地を２４または４８時間インキュベーションした後に、エタノール量が、二酸化塩素を欠く対照中の量と同様であったことを示す。したがってｐＨ５．５の加水分解物培地中における４７℃で２４時間は、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）発酵中に正常なエタノール生成を可能にするのに十分な、ＳＣＤ添加とザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞接種の間の時間であった。
【０１２９】
実施例４
安定化二酸化塩素を使用した加水分解物培地中のＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の制御
典型的なＬＡＢ汚染菌としてＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＴＣＣ８０１４株を使用して、ＳＣＤが、セルロース性バイオマス加水分解物に混入した乳酸菌（ＬＡＢ）を制御する能力を試験した。ＳＣＤは、ＦｅｒｍａＳｕｒｅ（登録商標）ＸＬ原液を使用して、Ｙ０１８トウモロコシ茎葉加水分解物＋１０ｍＭソルビトール、ｐＨ５．８に、１５１ｍｇ／ｋｇまたは３０１ｍｇ／ｋｇの二酸化塩素の濃度で添加した。二酸化塩素は、酸による完全な活性化に際してＦｅｒｍａＳｕｒｅ（登録商標）ＸＬ溶液中でＳＣＤから放出され得る、二酸化塩素の量に関して示される。次にこれらの培地サンプルを３３℃に維持して、３３℃でＭＲＳ培地中で増殖させた培養物から採取された、１０または５容積％（最終容積）のＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＴＣＣ８０１４を、約２のＯＤ６００に接種した。いずれのサンプルでも、接種前の遅延はなかった。経過発酵時間０、２４、および４８時間目に、ＨＰＬＣによって、培地を乳酸含有量についてアッセイした（一般方法を参照されたい）。結果は、表４に示される。４８時間後、ＳＣＤを添加した培養物は、いずれの接種量でも１ｇ／Ｌ以下の乳酸形成を有した一方で、ＳＣＤ未添加照培養物は＞７ｇ／Ｌの乳酸を生成した。これらの結果は、二酸化塩素が、一般的な汚染菌による、セルロース系加水分解物中の乳酸形成を阻止できることを示す。
【０１３０】
【表４】
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【０１３１】
実施例５
糖化とそれに続くＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）発酵中におけるＳＣＤ処理の効果
発酵で使用される加水分解物を生成する糖化中のＳＣＤ添加によって、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）発酵中にＳＣＤを使用して汚染を制御することの有効性を試験した。前処理トウモロコシ茎葉（サンプルＨＰ１９６；一般方法を参照されたい）を高圧蒸気滅菌した。次に未加工トウモロコシ茎葉を高圧蒸気滅菌前処理茎葉に、前処理茎葉総重量の１％で添加した。
【０１３２】
糖化は、以下の条件を使用して実施した：４７℃、初期ｐＨ５．３、２５％固形分への流加、１２ｍｇのＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＴＲＩＯ／ｇＧ＋Ｘ。１％の未加工茎葉バイオマスを含有する、２つの糖化を実行した。未加工茎葉は、天然汚染菌を含有する。１つの試行ではＳＣＤを糖化開始時に添加し、別の試行ではＳＣＤを添加しなかった。ＳＣＤは、ＦｅｒｍａＳｕｒｅ（登録商標）ＸＬ原液を使用して、糖化混合物に３１６ｍｇ／ｋｇの二酸化塩素濃度で添加した。二酸化塩素は、酸による完全な活性化に際してＦｅｒｍａＳｕｒｅ（登録商標）ＸＬ溶液中でＳＣＤから放出され得る、二酸化塩素の量に関して示される。
【０１３３】
後４８時間の糖化後、双方の糖化実験から生成した加水分解物のサンプルを乳酸分析のために採取し、次に加水分解物のｐＨを５．８に調節して、温度を３３℃に低下させて、１０容積％（最終容積）のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ１−Ｘ１１１株（一般方法を参照されたい）培養物を添加した。接種のために使用されたＺＷ１−Ｘ１１１培養物は、１０ｇ／ＬのＢＢＬ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１０ｍＭのソルビトール、１５０ｇ／Ｌのグルコース、３３℃でｐＨ５．５およびｐＨ５．５（ｐＨ調節のための４ＮのＮＨ４ＯＨ）中で、約１２．９のＯＤ６００に増殖させた。発酵を３３℃で継続し、２４時間後に、培地をエタノールについてアッセイした。
【０１３４】
糖化終了時（４８時間糖化サンプル）、ＳＣＤ添加のない糖化試行からの加水分解物は、１．６ｇ／Ｌの乳酸を含有した。ＳＣＤを添加した糖化試行からの加水分解物は、検出可能な乳酸を有さず、汚染細菌の制御が示唆された。ＳＣＤが添加された加水分解物中の発酵は、２４時間後に、約３６．０９ｇ／Ｌのエタノールに達し、好ましい発酵が示唆された。ＳＣＤが添加されない加水分解物中の発酵は、約３４．９５ｇ／Ｌのエタノールを含有した。
【０１３５】
実施例６
糖化とそれに続くＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）発酵中におけるより低用量のＳＣＤ処理
糖化は、１％未加工トウモロコシ茎葉と混合された前処理トウモロコシ茎葉（サンプルＹＴ０８−Ｐ−２；一般方法を参照されたい）を使用して、実施例５と同様に実施した。ＳＣＤは、別の糖化実験開始時に、ＦｅｒｍａＳｕｒｅ（登録商標）ＸＬ原液を使用して、０、４０、７９、１１９、１５８、または３１６ｍｇ／ｋｇの二酸化塩素濃度で添加した。二酸化塩素は、酸による完全な活性化に際してＦｅｒｍａＳｕｒｅ（登録商標）ＸＬ溶液中でＳＣＤから放出され得る、二酸化塩素の量に関して示される。別の糖化試行では、糖化開始から２４時間後に、３１６ｍｇ／ｋｇの二酸化塩素を添加した。４８時間の糖化後、生成した加水分解物のｐＨを５．８に調節し、温度を３３℃に低下させて、１０ｇ／ＬのＢＢＬ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１０ｍＭのソルビトール、１５０ｇ／Ｌのグルコース，３３℃でｐＨ５．５およびｐＨ５．５（ｐＨ調節のための４ＮのＮＨ４ＯＨ）中で約１．４のＯＤ６００に増殖させた、１０容積％（最終容積）のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＡＲ３  ７−３１培養物を添加した。次に乳酸分析のために、発酵０時間サンプルである、生成した加水分解物のサンプルを採取した（図５中）。発酵および糖化を３３℃で継続し、２４時間後に、培地をエタノールについてアッセイした。
【０１３６】
図５Ａに示されるように、発酵０時間目（４８時間の糖化後）に、ＳＣＤ未添加加水分解物は、およそ６ｇ／Ｌの乳酸を含有した。同時点で、１５８ｍｇ／ｋｇ以下の二酸化塩素を添加した加水分解物は、全て、乳酸形成にわずかな低下を有し；４〜５ｇ／Ｌが生成された。３１６ｍｇ／ｋｇの二酸化塩素が添加された加水分解物中では、乳酸の形成が０時間目に＜１ｇ／Ｌに低下して、発酵全体にわたり１ｇ／Ｌ未満のままであった。ＳＣＤ処理は、糖化開始時または２４時間の糖化後のどちらかに添加した場合（図５ＡおよびＢの０／３１６ｍｇ／ｋｇサンプル）、３１６ｍｇ／ｋｇの二酸化塩素レベルで効果的であった。これらの発酵のどちらも、４５時間後に＞５０ｇ／Ｌエタノールを含有した（図５Ｂ）。より少量のＳＣＤを糖化に添加して生成された加水分解物を使用した発酵では、エタノール生成量が低下した（図５Ｂ）。
【０１３７】
実施例７
長期遅延接種後における安定化二酸化塩素に対するザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）の感受性
ＳＣＤと細胞添加の間のより長い遅延時間の影響を調べるために、ＦｅｒｍａＳｕｒｅ（登録商標）ＸＬ（Ｅ．Ｉ．ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥから入手できる）原液を使用して、Ｙ０１８トウモロコシ茎葉加水分解物（一般方法を参照されたい）＋１０ｍＭソルビトール、ｐＨ５．８に、またはＭＲＭ３Ｇ６培地に、３０１ｍｇ／ｋｇの二酸化塩素を添加した。二酸化塩素は、酸による完全な活性化に際してＦｅｒｍａＳｕｒｅ（登録商標）ＸＬ溶液中でＳＣＤから放出され得る、二酸化塩素の量に関して示される。サンプルは、３３℃または４７℃で、様々な時間にわたりインキュベートした。次にサンプルを３３℃にして、１０ｇ／ＬのＢＢＬ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１０ｍＭのソルビトール、１５０ｇ／Ｌのグルコース、３３℃でｐＨ５．５（ｐＨ調節のための４ＮのＮＨ４ＯＨ）中で約１０のＯＤ６００に増殖させた、１０容積％（最終容積）のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ１−ＸＡ１１１（一般方法を参照されたい）培養物（Ｆ１３６０）を約１の開始ＯＤ６００（３３℃インキュベーション実験用）で接種し、あるいは１０ｇ／ＬのＢＢＬ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、６０ｇ／Ｌのグルコース、３３℃でｐＨ５．５中で約２．５のＯＤ６００に増殖させた、１０容積％（最終容積）Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＡＲ３
７−３１を約０．３の開始ＯＤ６００（４７℃インキュベーション実験用）で接種した。エタノール生成量は、ＨＰＬＣによって培養物中でモニターした（一般方法を参照されたい）。
【０１３８】
図６は、ＳＣＤを添加して３３℃で１９．５および２３時間インキュベーションした後に接種されたＭＲＭ３Ｇ６培地中では、エタノール生成の完全な阻害がもたらされた一方で、未添加対照は、２０時間目に３０ｇ／Ｌ以上を含有したことを示す。
【０１３９】
図７Ａは、４７℃では、Ｙ０１８トウモロコシ茎葉加水分解物中で、ＳＣＤを添加して８時間のインキュベーション後の接種が、未添加対照中、および接種に先だつより長いインキュベーション時間のサンプル中の生成レベルと同様のエタノール生成レベルを可能にしたことを示し、培地がＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）発酵に許容されるようにするのに、４７℃で８時間が十分な遅延時間であったことが示唆される。ＭＲＭ３Ｇ６培地を使用する場合、ＳＣＤを添加して４７℃で１６時間のインキュベーション後の接種が、エタノール生成レベルを未添加対照中および接種に先だつより長いインキュベーション時間のサンプル中の生成レベルと同様にするのに十分であった（図７Ｂ）。８時間および０時間（即時投入）のインキュベーション後に接種したサンプルは、いかなるエタノールも含有しなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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