(57)【要約】本発明は、生物試料のガラス化冷凍担体、および快速で簡易な生物試料の閉鎖式無菌冷凍方法を提供する。具体的に、前記の担体は、本体と密封キャップとを含み、前記本体の近端と密封キャップの底部が互いに密封して密閉の冷凍試料設置領域を形成し、前記の冷凍試料設置領域に冷凍試料設置台が設けられ、かつ前記の本体に冷凍液体流通通路が設けられ、そして生物試料を冷凍する時、前記通路内を流通する冷凍液体が前記の冷凍試料設置領域の外表面と接触し、かつ冷凍試料設置領域における生物試料を冷却するように、前記密封キャップに前記冷凍液体流通通路に相応する導流孔が設けられる。本発明の生物試料のガラス化冷凍担体および方法は安全で、無毒で、ガラス化冷凍および解凍の操作の効率が高いといった利点があり、生物試料の冷凍の分野で幅広い応用の将来性がある。
2016519682.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本体と密封キャップとを含み、前記本体の近端と密封キャップの底部が互いに密封して密閉の冷凍試料設置領域を形成し、前記の冷凍試料設置領域に冷凍試料設置台が設けられ、
かつ前記の本体に冷却剤流通通路が設けられ、そして生物試料を冷凍する時、前記通路内を流通する冷却剤が前記の冷凍試料設置領域の外表面と接触し、かつ冷凍試料設置領域における生物試料を冷却するように、前記密封キャップに前記冷却剤流通通路に相応する導流孔が設けられる、
ことを特徴とする生物試料のガラス化冷凍担体。
【請求項２】
前記の冷凍試料設置台は、試料の大きさに合う平坦の表面で、
かつ（a）前記本体の近端の頂部に設置され、または前記本体の近端の頂部に固定され、
あるいは（b）前記密封キャップの底部（特に内底面）に設置され、または前記密封キャップの底部に固定される、
ことを特徴とする請求項1に記載の担体。
【請求項３】
前記の本体は、さらに、本体の遠端の掴み部および本体の近端と遠端の間に位置する、密封キャップとの密封噛み合いのための噛み合い部を含むことを特徴とする請求項1に記載の担体。
【請求項４】
前記の通路は、前記掴み部にある遠端開口および前記本体の側壁に設けられる側開口を含み、かつ前記の遠端開口と前記の側開口が連通していることを特徴とする請求項1または3に記載の担体。
【請求項５】
前記の噛み合い部の表面に、密封キャップとの密封噛み合いのための活動締結部品が設けられることを特徴とする請求項1または3に記載の担体。
【請求項６】
前記の台の直径は、1〜15mm、好ましくは、3〜12mm、より好ましくは、5〜10mm、最も好ましくは、6〜8mmで、および/または、
前記の台の厚さは、0.06〜0.15mm、好ましくは、0.07〜0.12mm、より好ましくは、0.08〜0.10mmで、および/または、
前記生物試料設置領域の高さは、0.5〜5mm、好ましくは1〜4mm、より好ましくは2〜3mmである、
ことを特徴とする請求項1に記載の担体。
【請求項７】
前記の担体は、生物試料が設置された後の冷凍速度は、少なくとも10000〜20000℃/分、好ましくは、30000〜50000℃/分、より好ましくは、60000〜100000℃/分であることを特徴とする請求項1に記載の担体。
【請求項８】
前記の本体および密封キャップの材料は、同じか異なり、かつ高分子材料、金属からなる群から選ばれ、および/または、
前記の担体の台の材料は、高分子材料、金属からなる群から選ばれる、
ことを特徴とする請求項1に記載の担体。
【請求項９】
前記の掴み部の直径は6〜15mmで、前記遠端開口の直径は2〜10mmで、および/または、
前記の本体の側開口の大きさは1〜3mm×1〜3mmで、および/または、
前記の密封キャップ導流孔の大きさは2〜5mm×2〜5mmである、
ことを特徴とする請求項4に記載の担体。
【請求項１０】
前記本体の側開口は、少なくとも2個、好ましくは、4個で、前記の密封キャップの導流孔は、少なくとも2個、好ましくは、4〜6個であることを特徴とする請求項1に記載の担体。
【請求項１１】
a）請求項1に係る生物試料のガラス化冷凍担体を提供し、前記の担体は本体と密封キャップとを含み、かつ前記の生物試料を前記生物試料のガラス化冷凍担体の冷凍試料設置台に置き、生物試料を含む担体の本体を形成する工程と、
b）工程a）の生物試料を含む担体の本体を前記密封キャップと継手接合で締めつけ、生物試料を含む密封担体を形成する工程と、
c）工程b）の生物試料を含む密封担体に対し、標識領域に試料の情報標識を行う工程と、
d）工程c）で生物試料の情報が標識された密封担体を冷却剤に入れて保存する工程と、
を含むことを特徴とする生物試料の閉鎖式ガラス化冷凍方法。
【請求項１２】
i）一つまたは複数の請求項1に記載の担体と、ii）液体窒素と、iii）液体窒素貯蔵装置を含むことを特徴とする生物試料の冷凍保存の組み合わせ装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物試料の冷凍装置の分野に関し、具体的に、生殖補助技術の分野において無菌ガラス化冷凍の胚または卵細胞のために、安全で有効で、操作が簡易な閉鎖式冷凍担体を提供することを含む。
【背景技術】
【０００２】
人工生殖補助技術において、体外受精後得られた複数の胚あるいは女性の体内から取られた複数の卵子を-196℃の液体窒素に入れて冷凍保存し、短期または長期の胚の適期移植に供することは、体外受精、胚移植の成功率を向上させる通常の方法になっている。ガラス化冷凍の生物試料の臨床における意味は、冷却剤、例えば液体窒素の中で長期間に貯蔵することができ、冷却剤で冷凍保存された胚または細胞は発育が停止し、数十年も保存することが可能で、また冷凍保存の生物試料は解凍後、一つまたは複数の生物学上の生存細胞が回復することもできることにある。
【０００３】
常温材料の冷凍保存時、常温材料が極低温の冷却剤、例えば液体窒素と接触する時に生じるライデンフロスト効果によって、冷凍保存材料の表面に熱伝達を阻むガス膜が形成し、かつ必要な冷凍保存材料の温度降下速度を低下させ、通常、冷凍保護剤の濃度を増加することによって生物試料の冷凍過程における氷結晶化の発生を防止することが必要になるが、高濃度の冷凍保護剤は生物試料に毒害性があり、解凍後の細胞の品質の低下につながるため、快速冷凍が求められるガラス化冷凍技術が発展してきた。
【０００４】
現在、冷凍速度を上げるため、国内外ではガラス化冷凍担体は、通常、開放式が使用され、オープンプルドストロー法、石英キャピラリー法、Cryoloop法、Cryotip法などがある。2005年に、Kuwayamaは、溶液の体積の最小化によって冷却速度を上げる新規な方法であるCryotop法など、すなわち、試料を載せた冷凍担体を直接液体窒素に浸ける方法を提出した。
【０００５】
しかし、生物試料が液体窒素と直接接触すると、生物試料を貯蔵する無菌環境を提供できず、交差汚染のリスクがあり、かつ液体窒素の細胞への直接の毒性作用も予測できず（Covo A,Domingo J, Perez Sら, Vitrification:an effective new approach to oocyte banking and preserving fertility in cancer patients [J].Clin Transl Oncol, 2008,10(5):268-273; 閉鎖式ストローガラス化冷凍法によるヒト早期胚胎の冷凍効果の観察、「山東医薬」、2010年末50巻第15期）、最近の研究によって、液体窒素における低分子化合物が生物試料に毒性があることも示された（Y Panagiotidis, P Vanderzwalmen, Y Prapas, E kasapiら，Open versus closed vitrification of blastocysts from an oocyte-donation programme: a prospective randomized study. Reproductive BioMedicine Online, In Press, Uncorrected Proof, Mar 2013）。特許出願（200710192245.9）では、外因の病原性物質による生物試料の汚染を阻止する閉鎖型ガラス化冷凍装置が公開されたが、冷却剤と隔離する閉鎖系としたが、溶融封止などの様々な工程が必要で、この種類の冷凍担体はまだ操作が複雑である。
【０００６】
そのため、本分野では、ガラス化冷凍の効率が高く、操作が簡単で、安全で無毒の生物試料の閉鎖式冷凍装置の開発が切望されている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ガラス化冷凍が効率的で、かつ操作が簡単な生物試料の閉鎖式保存装置を提供する。
【０００８】
本発明は、本体と密封キャップとを含み、前記本体の近端と密封キャップの底部が互いに密封して密閉の冷凍試料設置領域を形成し、前記の冷凍試料設置領域に冷凍試料設置台が設けられ、
かつ前記の本体に冷却剤流通通路が設けられ、そして生物試料を冷凍する時、前記通路内を流通する冷却剤が前記の冷凍試料設置領域の外表面と接触し、かつ冷凍試料設置領域における生物試料を冷却するように、前記密封キャップに前記冷却剤流通通路に相応する導流孔が設けられる、
生物試料のガラス化冷凍担体を提供する。
【０００９】
もう一つの好適な例において、前記通路内を流通する冷凍液体が前記の冷凍試料設置台の外表面と直接接触することで、前記冷凍試料設置台の上に置かれた生物試料を冷却する。
もう一つの好適な例において、生物試料のガラス化冷凍担体で生物試料を冷凍する時、前記のガラス化冷凍担体の外で流れる冷凍剤は、前記の冷凍試料設置台の外表面と直接接触することで、前記冷凍試料設置台の上に置かれた生物試料を冷却する。
もう一つの好適な例において、前記の本体の近端と密封キャップの間に、さらに密封ワッシャーが設けられる。
【００１０】
もう一つの好適な例において、前記の冷凍試料設置台は、試料の大きさに合う平坦の表面で、
かつ（a）前記本体の近端の頂部に設置され、または前記本体の近端の頂部に固定され、
あるいは（b）前記密封キャップの底部（特に内底面）に設置され、または前記密封キャップの底部に固定される。
【００１１】
もう一つの好適な例において、前記の冷凍試料設置台は、前記本体の近端の頂部の表面と同じ水平面、あるいは前記本体の近端の頂部の表面よりも低い水平面に位置する。
もう一つの好適な例において、前記の冷凍試料設置領域の高さは、0.5〜5mmである。
もう一つの好適な例において、前記の設置台の成形方式は、担体の本体または密封キャップとの一体成形、粘着成形、継手接合成形を含む。
もう一つの好適な例において、前記の生物試料は、細胞、組織、器官を含む。
もう一つの好適な例において、前記の細胞は、卵細胞、胚細胞を含む。
【００１２】
もう一つの好適な例において、前記の本体は、さらに、本体の遠端の掴み部および本体の近端と遠端の間に位置する、密封キャップとの密封噛み合いのための噛み合い部を含む。
もう一つの好適な例において、前記の通路は、前記掴み部にある遠端開口および前記本体の側壁に設けられる側開口を含み、かつ前記の遠端開口と前記の側開口が連通している。
【００１３】
もう一つの好適な例において、前記の遠端開口は、前記掴み部から前記本体の中心内部に向かって前記本体の近端まで伸び、冷凍試料設置台といっしょに遠端に開口が設けられる中空の前記本体を構成する。
もう一つの好適な例において、前記本体の側壁の側開口は、前記冷凍試料設置領域と前記噛み合い部の間に位置し、好ましくは、前記冷凍試料設置領域に密接している。
もう一つの好適な例において、前記本体の側壁の側開口は、少なくとも2個、好ましくは、4〜6個である。
【００１４】
もう一つの好適な例において、前記の噛み合い部の表面に、密封キャップとの密封噛み合いのための活動締結部品が設けられる。
もう一つの好適な例において、前記の活動締結部品は、ネジ締結部品、ソケット締結部品、継手締結部品を含む。
もう一つの好適な例において、前記の密封キャップの頂部外面または側面に試料情報標識領域が設けられる。
もう一つの好適な例において、前記の密封キャップは、異なる発育周期の胚胎、異なる種類の細胞または組織が区別できるように、異なる色を有する。
【００１５】
もう一つの好適な例において、前記の台の直径は、1〜15mm、好ましくは、3〜12mm、より好ましくは、5〜10mm、最も好ましくは、6〜8mmで、および/または、
前記の台の厚さは、0.06〜0.15mm、好ましくは、0.07〜0.12mm、より好ましくは、0.08〜0.10mmで、および/または、
前記生物試料設置領域の高さは、0.5〜5mm、好ましくは1〜4mm、より好ましくは2〜3mmである。
【００１６】
もう一つの好適な例において、前記の担体は、生物試料が設置された後の冷凍速度は、少なくとも10000〜20000℃/分、好ましくは、30000〜50000℃/分、より好ましくは、60000〜100000℃/分である。
もう一つの好適な例において、前記の本体および密封キャップの材料は、同じか異なり、かつ高分子材料、金属からなる群から選ばれ、および/または、
前記の担体の台の材料は、高分子材料、金属からなる群から選ばれる。
【００１７】
もう一つの好適な例において、前記の高分子材料は、PE（ポリエチレン）、HDPE（高密度ポリエチレン）、PP（ポリプロピレン）、PET（ポリエチレンテレフタレート）を含む。
もう一つの好適な例において、前記の金属は、ステンレス鋼、チタン合金を含む。
もう一つの好適な例において、前記の高分子材料または金属は、医用高分子材料または医用金属である。
【００１８】
もう一つの好適な例において、前記の掴み部の直径は6〜15mmで、前記遠端開口の直径は2〜10mmで、および/または、
前記の本体の側開口の大きさは1〜3mm×1〜3mmで、および/または、
前記の密封キャップ導流孔の大きさは2〜5mm×2〜5mmである。
【００１９】
もう一つの好適な例において、前記の冷凍液体流通通路は、階段状、無頂円柱状である。
もう一つの好適な例において、前記の本体の側開口は、円形孔、楕円孔、異形孔または扁平孔でもよい。
もう一つの好適な例において、前記本体の側開口は、少なくとも2個、好ましくは、4〜6個で、前記の密封キャップの導流孔は、少なくとも2個、好ましくは、4〜6個である。
【００２０】
本発明の第二は、
a）本発明の第一に係る生物試料のガラス化冷凍担体を提供し、前記の担体は本体と密封キャップとを含み、かつ前記の生物試料を前記生物試料のガラス化冷凍担体の冷凍試料設置台に置き、生物試料を含む担体の本体を形成する工程と、
b）工程a）の生物試料を含む担体の本体を前記密封キャップと噛み合わせて締めつけ、生物試料を含む密封担体を形成する工程と、
c）工程b）の生物試料を含む密封担体に対し、標識領域に試料の情報標識を行う工程と、
d）工程c）で生物試料の情報が標識された密封担体を冷却剤に入れて保存する工程と、
を含む生物試料の閉鎖式ガラス化冷凍方法を提供する。
【００２１】
もう一つの好適な例において、前記の生物試料の閉鎖式ガラス化冷凍方法は、さらに、生物試料を含む密封担体を標識すること、および/または冷凍担体を標識した後、生物試料を設置して密封し、標識された生物試料の密封担体を得ることを含む。
本発明の第三は、i）一つまたは複数の本発明の第一に係る担体と、ii）液体窒素と、iii）液体窒素貯蔵装置を含む、生物試料の冷凍保存の組み合わせ装置を提供する。
【００２２】
もう一つの好適な例において、前記の液体窒素貯蔵装置の内部に、さらに、前記液体窒素貯蔵装置と活動可能に連接する前記担体を収納するためのホルダーが設けられる。
もう一つの好適な例において、前記のホルダーは、一層または複数層の構造で、かつ前記のホルダーは各層に前記の担体を5〜200個、好ましくは10〜100個、より好ましくは20〜80個収納することができる。
もう一つの好適な例において、前記のホルダーの大きさは、前記液体窒素貯蔵装置の内容積によって変わる。
また、本発明は、生物試料に対して閉鎖式冷凍保存を行うための本発明の第一に係る生物試料の閉鎖式ガラス化冷凍担体の使用を提供する。
【００２３】
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（例えば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好ましい技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図1は、本発明の生物試料のガラス化冷凍担体の第1様態の組立概要図を示す。
【図２】図2は、本発明の生物試料のガラス化冷凍担体の第2様態の組立概要図を示す。
【図３】図3は、本発明の生物試料のガラス化冷凍担体の第3様態の組立概要図を示す。
【図４】図4は、本発明の生物試料の冷凍保存の組み合わせ装置におけるホルダーの写真を示す。
【００２５】
ここで、図面の標識に相応する担体の各部品の名称および機能は以下の通りである。
1  冷凍液体流通通路、2  導流孔、4  側開口、5  遠端開口、10  密封キャップ、11  試料標識領域、12  掴み部、13  遠端、20  冷凍試料設置台、22  密封ワッシャー、23  冷凍試料設置領域、24  近端。
【００２６】
具体的な実施形態
本発明者は、幅広く深く研究したところ、初めて、生物試料の閉鎖式冷凍保存に使用される担体および装置を提供することに成功した。試験によって、本発明の担体に設計される冷却剤流通通路、冷却剤導流孔および生物試料冷凍台は、生物試料と冷凍液を密閉隔離すると同時に、効率的なガラス化冷凍効果が実現され、解凍後の胚胎生存率が高く、かつ操作が簡単であることが証明された。これに基づき、本発明を完成させた。
【００２７】
冷凍試料設置台および設置領域
本発明の本体の近端と本発明の密封キャップの内底面が互いに密封して密閉の冷凍試料設置領域を形成し、かつ前記の冷凍試料設置領域に冷凍試料設置台が設けられる。
【００２８】
前記の台は、前記本体の近端の頂部表面に固定して連接し、前記本体の近端といっしょに近端が閉鎖の中空状の本体構造を構成してもよい。ここで、前記台の平面は、前記本体の近端の頂部の表面と同じ水平面、あるいは本体の近端の頂部の表面よりも低い水平面に位置してもよい。そして、前記台は様々な通常の固定連接方式によって本体の近端の頂部表面に固定することができ、通常、本体とのダイプレス成形、高分子粘着物質による本体の近端との連接、または継手による本体の近端への接合でもよい。好適な連接方式は、本体とのダイプレス成形である。
【００２９】
前記の台は、前記密封キャップの内底面に固定連接されている。前記台と前記密封キャップが連接した後、前記の本体を逆さまに密封キャップに嵌め、かつ本体の近端が台と嵌め合い、密閉の冷凍試料設置領域を形成する。
通常、前記の冷凍試料設置領域の周径に沿い、全部密封ワッシャーが設けられ、本体の近端と密封キャップの間の隙間を密閉し、冷凍試料設置領域の密閉を保証し、生物試料と冷却剤の接触を有効に隔離することで、冷凍剤における未知の病原体などの毒性物質の生物試料への交差汚染と毒害を防止する。
【００３０】
本発明の冷凍試料設置台の材料は、毒性がなく、かつ急激な冷熱の温度変化に耐えられる医用高分子材料、金属である。通常、本発明の冷凍試料設置台に使用できる材料は、PE、HDPE、PET、PP、医用ステンレス鋼、医用チタン合金を含む。
本発明の冷凍試料設置台の特徴は、前記の台の直径は、1〜15mm、好ましくは、3〜12mm、より好ましくは、5〜10mm、最も好ましくは、6〜8mmで、かつ/または、担体の台の厚さは、0.06〜0.15mm、好ましくは、0.07〜0.12mm、より好ましくは、0.08〜0.10mmであることにある。
【００３１】
また、本発明の生物試料のガラス化冷凍担体のサイズは、冷凍しようとする生物試料の具体的な大きさおよび過剰の冷凍保護剤の除去の操作によって変わる。通常、冷凍担体の台は、直径が1〜15mmで、高さが0.5〜5mmでもよい。
【００３２】
冷凍液流通通路
本発明に使用できる冷却剤流通通路は、以下のものを含む。
（a）本体の遠端に位置する遠端開口、
（b）本体の近端に位置する側開口、
（c）密封キャップの側壁に位置する、本体の近端の側開口の位置に相応する導流孔。
【００３３】
ここで、前記の遠端開口、側開口は本体の中心の内部を介して互いに連通し、かつ前記の密封キャップの側壁に位置する導流孔に相応する。前記の側開口は、本体の近端に位置し、好ましくは、冷凍試料設置台に密接している。
通常、前記の側開口および導流孔は、それぞれ少なくとも2個で、好ましくは4個またはそれ以上である。
【００３４】
本発明において、密封キャップと本体が互いに密閉した後、冷凍液体に置くと、冷凍液体が冷凍液流通通路を経て遠端開口-側開口-導流孔を介して循環交流し、これによって、冷却剤が流れる過程で、生物試料担体の台の表面を予め冷却し、担体の台が十分に薄いため、ライデンフロスト効果を軽減し、冷凍設置台に位置する組織試料を迅速に冷却させる。
【００３５】
本発明において、前記本体の側開口は直径1〜3mm、または2×3mmの楕円横向き孔で、前記の密封キャップの導流孔は直径2〜5mm×2〜5mmの楕円横向き孔である。
本発明に使用できる遠端開口または本体の側開口または導流孔の立体形状は、特に限定されないが、冷凍剤の流通に有利で、互いにマッチする任意の形状でもよく、通常、本発明における各開口または導流孔の立体形状は階段状、無頂円柱状である。
【００３６】
生物試料を快速冷凍する方法
本発明における生物試料を快速冷凍する方法は、
a）請求項1に係る生物試料のガラス化冷凍担体を提供し、前記の担体は本体と密封キャップとを含み、かつ前記の生物試料を前記生物試料のガラス化冷凍担体の冷凍試料設置台に置き、生物試料を含む担体の本体を形成する工程と、
b）工程a）の生物試料を含む担体の本体を前記密封キャップと噛み合わせて締めつけ、生物試料を含む密封担体を形成する工程と、
c）工程b）の生物試料を含む密封担体に対し、標識領域に試料の情報標識を行う工程と、
d）工程c）で生物試料の情報が標識された密封担体を冷却剤に入れて保存する工程と、
を含む。
【００３７】
通常、前記の生物試料の閉鎖式ガラス化冷凍方法は、さらに、生物試料を含む密封担体を標識すること、および/または冷凍担体を標識した後、標本を設置して密封し、標識された密封担体を得ることを含む。
本発明のガラス化冷凍担体および生物試料を快速冷凍する方法を使用すると、20000℃/分の冷却速度、好ましくは40000〜100000℃/分の冷却速度に達し、担体の台の材料または大きさによって、異なる冷却速度および生物試料ガラス化効果が得られる。
また、本発明における担体は、実験または診療の時、無菌化処理してから使用し、かつ操作の過程で無菌環境を維持する必要がある。
【００３８】
材料と外観
本発明の生物試料のガラス化冷凍担体の製造に使用できる材料は、毒性がなく、無菌処理がされ、かつ急激な冷熱の温度変化に耐えられる高分子材料または金属である。
もう一つの好適な例において、前記の高分子材料は、PE（ポリエチレン）、HDPE（高密度ポリエチレン）、PP（ポリプロピレン）、PET（ポリエチレンテレフタレート）を含む。
もう一つの好適な例において、前記の金属は、ステンレス鋼、チタン合金を含む。
もう一つの好適な例において、前記の高分子材料または金属は、医用高分子材料または医用金属である。
【００３９】
本発明において、本体と密封キャップが互いに継手接合またはネジ接合などの様々な活動可能な接合方式によって接合して密封される。通常、前記の継手接合またはネジ接合の装置は様々な通常の方法によって密封の効果が実現でき、例えば急激な冷熱の温度変化に耐えられる密封ワッシャーを増加し、あるいはネジ山の形態または角度などを変えることによって、密閉装置の急激な熱履歴の過程における閉鎖を保証することができる。
【００４０】
本発明における本体および密封キャップの外観形状は、特に限定されないが、互いにマッチする任意の柱形状の外観、例えば円柱形、六角柱形でもよく、これによって、操作者の掴み取りに便利で、かつ胚胎、卵子などの生物試料を設置する時の担体の安定性に有利である。また、本発明の本体および密封キャップは、様々な異なる色を使用し、担体を区分して異なる生物試料、組織、細胞などの冷凍保存の標識に使用する。
【００４１】
本発明の有益な効果は以下の通りである。
1．生物試料を密封して保存し、安全で無毒である。本発明の担体および方法は、生物試料と冷凍液体の隔離、密閉保存に使用され、安全で無汚染で、冷凍液体の生物試料への潜在の毒性の危険を減らす。
2．冷凍速度が速く、効率的なガラス化冷凍が実現する。本発明の担体および方法を使用すると、10000〜100000℃/分の冷凍速度に達し、担体の台の材料または大きさによって、異なる冷却速度および生物試料ガラス化効果が得られる。よって、快速ガラス化冷凍が実現し、かつ生物試料の冷凍過程における氷結晶による破壊の影響を避ける。
【００４２】
3．操作が便利である。本発明の担体はネジ締結またはソケット接合、継手接合式締結などの密封方式を使用し、操作時生物試料を台に設置して密封キャップを締めつければよく、すなわち、伝統の溶融密封の複雑なプロセスの代わりに、液体窒素を入れたままで貯蔵することができる。
4．安全で有効である。本装置の特集な構造および操作が簡単なため、試料の昇温後の取り出しは試料の設置と同じように便利で、昇温後、生物試料の欠失が生じにくい。
【００４３】
実施例1：密封性能テスト
第1様態（図1）および第3様態（図3）の閉鎖式ガラス化冷凍担体をそれぞれ50セット用意し、滅菌後、それぞれ液体窒素に1日、1週間、30日、60日、90日入れた後、液体窒素から取り出し、迅速に37℃の水に投入し、10分間置き、取り出した後ろ紙に数秒立たせ、密封キャップを開け、クリーンなろ紙で設置台を拭き、顕微鏡でろ紙に水跡があるか観察し、結果を表1に示す。
【００４４】
【表１】
2016519682.tif 000003
結果から、当該装置の密閉性能が100％に達したことがわかる。
【００４５】
実施例2：卵または胚胎の生存率
1．実験対象
実験動物は、クリーングレードの昆明マウス（上海生物製品研究所から購入）で、メスは9週齢で、29〜33g/匹で、計80匹で、
オスは9週齢で、体重38〜45g/匹で、計20匹で、照明は明暗12h交替であった。
【００４６】
2．実験方法：
1）卵母細胞の収集：卵巣過剰刺激で性成熟させたメスの昆明マウスを頚椎脱臼で殺処分し、輸卵管を分離し、完全の透明帯を持ち、細胞間質の屈折率が優れた卵母細胞を取った（透明帯および細胞膜に損傷がなく、囲卵腔がはっきりし、細胞質の漏出または卵細胞の萎縮がなく、大きさが正常で、細胞質が均質で、屈折がよい）。
2）精子の収集：受精の当日に、健康のオスマウスを頚椎脱臼で殺処分し、精液を得た。
【００４７】
3）体外受精：2×106/mlの濃度で精液を卵子とインキュベートし、5時間後取り出し、卵子を37℃、5％CO2のインキュベーターで24時間培養した後、2前核細胞の形成を観察した。
4）担体の冷凍：滅菌された本発明の冷凍担体の第1様態（図1）、第2様態（図2）、第3様態（図3）をそれぞれ80セット用意し、選ばれた合格の前核胚を設置した後、液体窒素で冷凍し、3日後、取り出し、解凍し、培養し、その胚胎の分裂状況を観察した。
【００４８】
ここで、2細胞胚数は受精細胞を1日培養して得られた生存の2分裂細胞胚の数で、4細胞数は受精細胞を48時間培養して得られた生存の4分裂細胞胚の数で、嚢胚数は受精細胞を96時間培養して得られた嚢胚期に入った細胞の数である。
3．本発明の装置のマウス前核胚に対する冷凍の結果を表2に示す。
【００４９】
【表２】
2016519682.tif 000004
【００５０】
5．結論
本分野において、開放または閉鎖式冷凍担体で生物試料（胚胎）に対してガラス化冷凍を行う場合、嚢胚率は約50％〜70％である。本実施例の結果から、本発明の担体で胚胎のガラス化冷凍を行う場合、嚢胚率はそれぞれ51.67％、66.15％および73.13％で、その結果は本分野のほかの装置および方法の嚢胚率と同等、ひいてはより優れていることがわかる。また、本発明の担体は、操作が簡単で、安全性が高いという利点もあるため、従来の装置および方法に代わって、幅広く応用することができる。
【００５１】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、この分野の技術者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【図１】
2016519682.tif 000005
【図２】
2016519682.tif 000006
【図３】
2016519682.tif 000007
【図４】
2016519682.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成27年10月9日(2015.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本体と密封キャップとを含み、前記本体の近端と密封キャップの底部が互いに密封して密閉の冷凍試料設置領域を形成し、前記の冷凍試料設置領域に冷凍試料設置台が設けられ、
かつ前記の本体に冷却剤流通通路が設けられ、そして生物試料を冷凍する時、前記通路内を流通する冷却剤が前記の冷凍試料設置領域の外表面と接触し、かつ冷凍試料設置領域における生物試料を冷却するように、前記密封キャップに前記冷却剤流通通路に相応する導流孔が設けられる、
ことを特徴とする生物試料のガラス化冷凍担体。
【請求項２】
前記の冷凍試料設置台は、試料の大きさに合う平坦の表面で、
かつ（a）前記本体の近端の頂部に設置され、または前記本体の近端の頂部に固定され、
あるいは（b）前記密封キャップの底部（特に内底面）に設置され、または前記密封キャップの底部に固定される、
ことを特徴とする請求項１に記載の担体。
【請求項３】
前記の本体は、さらに、本体の遠端の掴み部および本体の近端と遠端の間に位置する、密封キャップとの密封噛み合いのための噛み合い部を含むことを特徴とする請求項１に記載の担体。
【請求項４】
前記の通路は、前記掴み部にある遠端開口および前記本体の側壁に設けられる側開口を含み、かつ前記の遠端開口と前記の側開口が連通していることを特徴とする請求項１または３に記載の担体。
【請求項５】
前記の噛み合い部の表面に、密封キャップとの密封噛み合いのための活動締結部品が設けられることを特徴とする請求項１または３に記載の担体。
【請求項６】
前記の台の直径は、1〜15mm、好ましくは、3〜12mm、より好ましくは、5〜10mm、最も好ましくは、6〜8mmで、および/または、
前記の台の厚さは、0.06〜0.15mm、好ましくは、0.07〜0.12mm、より好ましくは、0.08〜0.10mmで、および/または、
前記冷凍試料設置領域の高さは、0.5〜5mm、好ましくは1〜4mm、より好ましくは2〜3mmである、
ことを特徴とする請求項１に記載の担体。
【請求項７】
前記の担体は、生物試料が設置された後の冷凍速度は、少なくとも10000〜20000℃/分、好ましくは、30000〜50000℃/分、より好ましくは、60000〜100000℃/分であることを特徴とする請求項１に記載の担体。
【請求項８】
前記の本体および密封キャップの材料は、同じか異なり、かつ高分子材料、金属からなる群から選ばれ、および/または、
前記の担体の台の材料は、高分子材料、金属からなる群から選ばれる、
ことを特徴とする請求項１に記載の担体。
【請求項９】
前記の掴み部の直径は6〜15mmで、前記遠端開口の直径は2〜10mmで、および/または、
前記の本体の側開口の大きさは1〜3mm×1〜3mmで、および/または、
前記の密封キャップ導流孔の大きさは2〜5mm×2〜5mmである、
ことを特徴とする請求項４に記載の担体。
【請求項１０】
前記本体の側開口は、少なくとも2個、好ましくは、4個で、前記の密封キャップの導流孔は、少なくとも2個、好ましくは、4〜6個であることを特徴とする請求項４に記載の担体。
【請求項１１】
a）請求項１に係る生物試料のガラス化冷凍担体を提供し、前記の担体は本体と密封キャップとを含み、かつ前記の生物試料を前記生物試料のガラス化冷凍担体の冷凍試料設置台に置き、生物試料を含む担体の本体を形成する工程と、
b）工程a）の生物試料を含む担体の本体を前記密封キャップと継手接合で締めつけ、生物試料を含む密封担体を形成する工程と、
c）工程b）の生物試料を含む密封担体に対し、標識領域に試料の情報標識を行う工程と、
d）工程c）で生物試料の情報が標識された密封担体を冷却剤に入れて保存する工程と、
を含むことを特徴とする生物試料の閉鎖式ガラス化冷凍方法。
【請求項１２】
i）一つまたは複数の請求項１に記載の担体と、ii）液体窒素と、iii）液体窒素貯蔵装置を含むことを特徴とする生物試料の冷凍保存の組み合わせ装置。
【国際調査報告】
2016519682.tif 000009
2016519682.tif 000010
2016519682.tif 000011
2016519682.tif 000012
2016519682.tif 000013
2016519682.tif 000014