(57)【要約】  本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで心不全を評価するための方法であって、試料において、マーカーＣＲＹＡＢの濃度を測定し、試料において、ナトリウム利尿ペプチドマーカー、心臓トロポニンマーカー、及び炎症マーカーからなる群より選択される１以上の他の心不全マーカーの濃度を測定してもよく、そしてＣＲＹＡＢに関して測定した濃度及び１以上のマーカーに関して測定してもよい濃度を、参照集団において確立されるようなこのマーカー又はこれらのマーカーの濃度と比較することによって、心不全を評価する工程を含む、前記方法に関する。さらに開示するのは、心不全の評価における、マーカータンパク質としてのＣＲＹＡＢの使用、ＣＲＡＢを含むマーカー組み合わせ、及びＣＲＹＡＢを測定するためのキットである。
2016525693.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体において心不全を評価するための方法であって、
ａ）個体から得た試料において、マーカーＣＲＹＡＢの濃度を測定し、
ｂ）試料において、１以上の他の心不全マーカーの濃度を測定してもよく、そして
ｃ）工程（ａ）において測定した濃度及び工程（ｂ）において測定してもよい濃度を、対照試料において確立されるようなこのマーカー又はこれらのマーカーの濃度と比較することによって心不全を評価する、
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
前記試料が、血清、血漿、及び全血からなる群より選択されることでさらに特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の１以上の他のマーカーが、ナトリウム利尿ペプチドマーカー、心臓トロポニンマーカー、及び炎症マーカーからなる群より選択されることでさらに特徴付けられる、請求項１及び２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記の１以上の他のマーカーがＮＴ−プロＢＮＰであることでさらに特徴付けられる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記の１以上の他のマーカーがトロポニンＴであることでさらに特徴付けられる、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
心不全の評価における、マーカー分子としてのタンパク質ＣＲＹＡＢの使用。
【請求項７】
心不全の評価における、ＣＲＹＡＢ及び１以上の他の心不全マーカーを含む、マーカー組み合わせの使用。
【請求項８】
前記の１以上の他のマーカーが、ナトリウム利尿ペプチドマーカー、心臓トロポニンマーカー、及び炎症マーカーからなる群より選択される、請求項７に記載のマーカー組み合わせの使用。
【請求項９】
少なくともＣＲＹＡＢ及びＮＴ−プロＢＮＰを含む、請求項８に記載のマーカ組み合わせの使用。
【請求項１０】
ＣＲＹＡＢ及びあってもよい１以上の他の心不全マーカーを特異的に測定するために必要とされる試薬を含む、請求項１に記載の方法を実行するためのキット。
【請求項１１】
前記マーカーＣＲＹＡＢを、心不全のリスクがある個体から得た試料において測定する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個体において心不全を評価するための方法であって、ａ）個体から得た試料において、マーカータンパク質、アルファ−クリスタリンＢ（ＣＲＹＡＢ）の濃度を測定し、ｂ）試料において、１以上の他の心不全マーカーの濃度を測定してもよい、そして工程（ａ）において測定した濃度及び工程（ｂ）において測定してもよい濃度（単数又は複数）を、対照試料において確立されるようなこのマーカー又はこれらのマーカーの濃度と比較することによって、心不全を評価する工程を含む、前記方法に関する。さらに開示するのは、心不全の評価における、マーカータンパク質としてのアルファ−クリスタリンＢ（ＣＲＹＡＢ）の使用、ＣＲＹＡＢを含むマーカー組み合わせ、及びＣＲＹＡＢを測定するためのキットである。
【発明の概要】
【０００２】
心不全（ＨＦ）は、主要なそして増大しつつある公衆衛生上の問題である。例えば、米国では、およそ５００万人の患者がＨＦを有し、そして毎年、５５万人を超える患者が初めてＨＦと診断される（米国心臓協会、心疾患及び脳卒中統計:２００８年改訂、テキサス州ダラス、米国心臓協会（２００８）中）。同様に、米国統計は、ＨＦが、毎年、１２００〜１５００万の来診及び６５０万の入院日数の主因となっていることを示す。１９９０年から１９９９年で、年間入院数は、一次診断としてＨＦに関しておよそ８１万から１００万以上に、そして一次又は二次診断としてＨＦに関して２４０万から３６０万に増加した。２００１年、５３０００人近い患者が主因としてＨＦで死亡した。心不全は、主に、高齢者の状態であり、そしてしたがって、広く認識される「集団の加齢」もまた、ＨＦ発生率の増加に寄与する。ＨＦ発生率は、６５歳以後の集団においては、１０００のうち１０に到達する。米国のみで、ＨＦに関する直接及び間接的な総コストは、２００５年にはほぼ２７９億ドルであり、そして毎年およそ２９億ドルがＨＦの治療薬剤に費やされる（上記に引用するＡＨＡ統計を参照されたい）。
【０００３】
心不全
心不全は、体が必要とするだけ多くの血液をポンピングする心臓の能力の喪失によって特徴付けられる。不全は、心臓がポンピングを停止したことを意味せず、そうであるべきほど有効に血液をポンピングすることができないことを意味する。
【０００４】
ＮＹＨＡ（ニューヨーク心臓協会）及びＡＣＣ／ＡＨＡ（米国心臓学協会／米国心臓協会）は、どちらも、疾患の進行を計測する、ＨＦの機能的クラスを確立してきている。ＮＹＨＡ分類スキームは、４つの疾患状態クラスを有する：クラス１は、労作のいかなるレベルでも無症候性である。クラス２は重度の労作で症候性であり、そしてクラスＩＩＩ及びＩＶは、それぞれ、軽い労作及び労作のない状態で症候性である。
【０００５】
ＡＣＣ／ＡＨＡスキームの４つの病期において、病期Ａは無症候性であるが、ＨＦを発展させるリスクがある。病期Ｂでは、症状を伴わない心臓機能不全の証拠がある。病期Ｃでは、症状を伴う心臓機能不全の証拠がある。病期Ｄでは、被験体は最大限の療法にもかかわらずＨＦの症状を有する。
【０００６】
ＨＦの病因
医学的には、心不全（ＨＦ）は、複合疾患であると認識されなければならない。該疾患は、心筋梗塞（心臓発作）などの誘発事象の発生によって引き起こされる可能性もあるし、あるいは高血圧、糖尿病又は心臓形成不全、例えば弁膜症などの他の原因に続発性である可能性もある。心筋梗塞又はＨＦの他の原因は、例えば心筋を損傷することによる、心臓のポンピング能の最初の低下を生じる。このポンピング能の低下は、１以上の代償機構の活性化のため、直ちには認識可能でない可能性もある。しかし、ＨＦの進行は、患者の血行動態状態からは独立であることが見出されてきている。したがって、疾患によって引き起こされる損傷を与える変化は存在し、そして患者が無症候性であり続ける間であっても進行する。実際、早期のＨＦ中、正常な心臓血管機能を維持する代償機構は、実際に、例えば心臓及び循環中の血流を十分なレベルに維持するその能力に有害な影響を発揮することによって、長期的に疾患進行に寄与する可能性もある。
【０００７】
ＨＦ中に起こるより重要な病理生理学的変化のいくつかは、（ｉ）視床下部−下垂体−副腎軸の活性化、（ｉｉ）全身性内皮機能不全、及び（ｉｉｉ）心筋リモデリングである。
【０００８】
（ｉ）視床下部−下垂体−副腎軸の活性化に対抗することに特に向けられる療法には、ベータ−アドレナリン作用遮断剤（Ｂ遮断剤）、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、特定のカルシウムチャネル遮断剤、硝酸及びエンドセリン−１遮断剤が含まれる。カルシウムチャネル遮断剤及び硝酸は、臨床的改善を生じながらも、生存を延長させることは明らかには示されておらず、一方、Ｂ遮断剤及びＡＣＥ阻害剤は、有意に寿命を延長することが示されてきており、アルドステロン・アンタゴニストも同様である。エンドセリン−１遮断剤を用いた実験研究は、有益な効果を示してきている。
【０００９】
（ｉｉ）全身性内皮機能不全は、ＨＦのよく認識された特徴であり、そして左心室機能不全の徴候が存在するころまでには、明らかに存在する。内皮機能不全は、心筋細胞と心筋微小循環の緊密な関係に関して重要である。証拠によって、微小血管機能不全は、進行性心筋不全を導く筋細胞機能不全及び形態変化に有意に寄与する。
【００１０】
根底にある病理生理学に関して、証拠によって、内皮機能不全が、ＮＡＤＨ依存性オキシダーゼによる血管Ｏ２形成の増加、及びそれに続くＮＯの過剰な除去に起因しうるＮＯの相対的な欠如によって引き起こされる可能性があることが示唆されている。Ｏ２産生増加に対する潜在的な寄与因子には、交感神経緊張増加、ノルエピネフリン、アンギオテンシンＩＩ、エンドセリン−１及びＴＮＦ−αが含まれる。さらに、重要な抗炎症サイトカインであるＩＬ−１０のレベルが、ＴＮＦ−αレベルに対して不適切に低い。現在、ＩＬ−６を含む関連炎症促進性サイトカインを伴うＴＮＦ−αレベルの上昇、及び可溶性ＴＮＦ−α受容体は、心筋収縮減少、二心室拡張、及び低血圧を引き起こすことによって、ＨＦの発展に重要な役割を果たし、そしておそらく内皮活性化及び機能不全に関与すると考えられている。また、ＴＮＦ−αは、重度のＨＦ患者において起こる、これまでは説明されていなかった筋肉消耗にも役割を果たしうるとも考えられている。可溶性ＴＮＦ受容体療法を用いた、少数の患者での予備研究は、寿命指数の品質によって測定されるような、ＮＹＨＡ機能分類及び患者の福利の改善を示してきている。
【００１１】
（ｉｉｉ）心筋リモデリングは、無症候性から症候性心不全への遷移を伴う複雑なプロセスであり、そして心室形状、質量及び体積の改変のような心筋内の一連の適応変化として記載可能である（Ｐｉａｎｏ，  Ｍ．Ｒ．ら，  Ｊ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｎｕｒｓ．  １４（２０００）１−２３；  Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎ，  Ｊ．Ｄ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ６３（２００１）３９１−４２６）。心筋リモデリングの主な構成要素は、筋細胞生物学の改変、例えば筋細胞肥大、壊死又はアポトーシスによる筋細胞喪失、細胞外マトリックスの改変及び左心室形状の改変である。心筋リモデリングが、単純に、長期神経ホルモン刺激の毒性効果に曝露された何年か後に起こる、末端器官反応であるのか、又は心筋リモデリングが独立に心不全の進行に寄与するのかどうかは、明らかでない。今日までの証拠は、適切な療法が心筋リモデリングの進行を遅延させるか又は停止させることが可能であることを示唆する。
【００１２】
マーカー及び疾患状態
上に示すように、筋細胞肥大は、ＨＦへと向かう最初の工程の１つに相当するようである。筋細胞肥大は、収縮タンパク質をコードするいくつかの遺伝子、例えばｐ−ミオシン重鎖及びトロポニンＴ（ＴｎＴ）、ならびにいくつかの非収縮性タンパク質、例えばＡ型及びＢ型ナトリウム利尿ペプチドの発現増加によって、細胞サイズ増加によって、そして細胞骨格改変によって特徴付けられる（Ｐｉａｎｏ，  Ｍ．Ｒ．ら，  Ｊ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｎｕｒｓ．  １４（２０００）１−２３；  Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎ，  Ｊ．Ｄ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ６３（２００１）３９１−４２６）。
【００１３】
心不全のヒト及び動物モデルの研究によって、心不全のより後期の病期での筋細胞機能抑制が示唆される。筋細胞機能不全の根底にある機構がカルシウム取り扱いネットワーク、筋フィラメント及び細胞骨格の改変を伴うことが示唆されてきている（ｄｅ  Ｔｏｍｂｅ，  Ｐ．Ｐ．，  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｒｅｓ．  ３７（１９９８）３６７−３８０）。例えば、心不全のヒト及び動物モデルにおいて、筋小胞体カルシウム−ＡＴＰアーゼ酵素活性が減少し、一方で、筋細胞膜Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換体のｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの両方が増加する。さらに、心不全のヒト及び動物モデルの両方において、ＴｎＴのアイソフォーム−スイッチング、トロポニンＩ（ＴｎＩ）のリン酸化減少、筋原線維アクトミオシンＡＴＰアーゼ活性の減少及び微小管形成増進がある。
【００１４】
最初に、心臓に対する変化があり、これが心筋リモデリングを導いて、酸素及び栄養素に対する体の要求に持ちこたえるため、心筋の疾患部分に対して代償しようとする。しかし、心不全の代償期は限定されており、そして最終的に、不全に陥りつつある心臓は、体の要求を満たすために適切な心臓出力を維持することができなくなる。したがって、代償期から非代償期への遷移がある。非代償期においては、心臓変化のカスケードが続くが、もはや有益ではなく、患者の心不全は進行し続け、慢性状態及び最終的には死につながる。
【００１５】
「ＡＣＣ／ＡＨＡ  ２００５  成人における慢性心不全の診断及び管理のための指針改訂版」（Ｓ．  Ｈｕｎｔら，  ｗｗｗ．ａｃｃ．ｏｒｇ＝ＡＣＣ／ＡＨＡ診療指針）によれば、心不全領域における疾患連続体は、今日、上に記載する４つの病期に分類される。病期Ａ及びＢでは、心不全を発展させるリスクがある個体が見出され、一方、病期Ｃ及びＤは、心不全の徴候及び症状を示す患者群に相当する。上記参考文献に提供されるような、異なる病期Ａ〜Ｄを定義するための詳細は、本明細書に援用される。
【００１６】
心不全の診断法
ＨＦ患者評価における単一の最も有用な診断試験は、ドップラー血流研究とカップリングされた包括的二次元心エコーであり、これは心筋、心臓弁、又は心膜の異常が存在するかどうか、そしてどの心室が関与しているかを決定する。３つの基本的な問題に取り組まなければならない：１）ＬＶＥＦは保持されているか又は減少しているか、２）ＬＶの構造は正常か又は異常か、そして３）臨床的提示の主因となりうる他の構造異常、例えば弁、心膜、又は右心室異常があるか。この情報は、ＥＦの数値概算、心室寸法及び／又は体積の測定、壁の厚さの測定、ならびに心室形状及び局所壁運動の評価を用いて定量化されなければならない。右心室サイズ及び収縮期性能を評価しなければならない。心房サイズもまた、半定量的に決定しなければならず、そして左心房寸法及び／又は体積も測定しなければならない。
【００１７】
心エコー時に獲得される非侵襲性血行動態データは、ＥＦ保持又は減少を伴う患者にとって重要なさらなる相関要因である。僧帽弁流入パターン、肺静脈血流入パターン、及び僧帽弁輪速度を組み合わせた定量化は、ＬＶ充填及び左心房圧の特性に関するデータを提供する。下大静脈寸法の測定とカップリングされた三尖弁逆流勾配の評価、及び呼吸中のその反応は、収縮性肺動脈圧及び中心静脈圧の概算を提供する。
【００１８】
１回拍出量は、ＬＶ流出路における寸法測定及びパルス化ドップラーの組み合わせで測定可能である。しかし、異常は、ＨＦの非存在下でもこれらのパラメーターのいずれにも存在しうる。これらのいずれも、必ずしもＨＦに特異的に相関しない；しかし、全体的に正常な充填パターンは、臨床的ＨＦと相反する。
【００１９】
臨床的観点から、疾患は、代償期及び初期非代償期には臨床的に無症候性である（病期Ａの完全な無症候期、ならびに病期Ｂの構造的心疾患を伴うがＨＦの徴候及び症状がない時期。ＡＣＣ／ＡＨＡ診療指針を参照されたい）。疾患の外的徴候（例えば息切れ）は、非代償期がかなり進む（すなわちＡＣＣ／ＡＨＡ指針にしたがった病期Ｃ及びＤ）まで現れない。現在の診断は、病期Ｃ及びＤにある患者の外的徴候に基づく。
【００２０】
典型的には、心不全患者は、心不全に関与する特異的機構と相互作用する薬剤での標準治療を受ける。これらの特異的機構を信頼性をもって反映し、そして正しい患者に対する正しい薬剤（例えばＡＣＥ阻害剤、ＡＴ  ＩＩ、β遮断剤等）（及び用量）を医師が選択することを補助する診断試験はない。
【００２１】
マーカーを用いた、ＨＦの以前の診断法
心不全のリスクがある患者の早期評価は、生化学マーカーによってのみ可能であるようであり、これはその段階で心不全を発展させるリスクがある個体がなお、臨床的ＨＦ症状を持たないままであるためである。該疾患の症状が出る前の信頼性がある評価に現在利用可能である確立された生化学マーカーはない。今日、ＨＦの診断が確立されるころには、疾患はかなり進行している。
【００２２】
ナトリウム利尿ペプチドファミリー、特に心房性ナトリウム利尿ペプチドファミリー及び脳ナトリウム利尿ペプチドファミリーは、近年、ＨＦの評価において有意な値であることが立証されてきている。
【００２３】
ＨＦ予後及び必要性
少なくとも部分的に診断が遅いため、ＨＦ患者の５０％は診断２年以内に死亡する。５年生存率は３０％未満である。心不全の早期診断を補助する新規生化学マーカーに関する重大な必要性がある。
【００２４】
心不全のリスクがある個体、すなわち心不全に関して臨床的に無症候性である個体の早期評価の改善が正当である。
近年、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチドマーカーが、ＨＦ患者における疾患進行を監視し、そして心臓発作のような心臓血管合併症のリスクを評価する、優れたツールに相当することが確立されてきている。
【００２５】
しかし、他の多くの診断領域と同様に、単一マーカーでは十分ではない。
ＨＦ又はＬＶＤを排除するために、ＮＴ−プロＢＮＰの低い値は、非常に高い負の予測値である一方、上記及び他の研究（Ｔｒｉｅｐｅｌｓ，  Ｒ．Ｈ．ら，  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ４９，  Ｓｕｐｐｌ．  Ａ（２００３）Ａ３７−Ａ３８）における心不全に関する陽性予測値は、５０〜６０％の範囲であることが見出されてきている。したがって、それ自体、例えばＨＦに関する高い予測値を有するか、又はＮＴ−プロＢＮＰと組み合わせて、そしてＮＴ−プロＢＮＰのみと比較した際に、改善された陽性予測値を有する、心不全のリスクがある個体を評価する際に有用であるマーカーは、高い臨床的／診療上の重要性がある。
【００２６】
心不全患者の評価を補助するマーカーはまた、この臨床的に非常に重要で、そして強く要求される診断領域において、さらなる技術的進歩を達成するために非常に重要である。
発明の概要
マーカー、アルファ−クリスタリンＢ（ＣＲＹＡＢ）が心不全の評価を補助しうることが現在、見出され、そして確立されてきている。１つの態様において、これは、個体が心不全を発展させるリスクがあるかどうかを評価することを補助しうる。さらなる側面において、これは、疾患進行の評価を補助しうる。別の態様において、これは、心不全開始の予測を補助しうる。別の態様において、これは、心不全を防止するか又は治療するために適した治療措置を評価し、そして選択する際に補助しうる。
【００２７】
本明細書に開示するのは、個体において、心不全を評価するための方法であって、個体から得た試料において、マーカー、アルファ−クリスタリンＢ（ＣＲＹＡＢ）の濃度を測定し、試料において、１以上の他の心不全マーカーの濃度を測定してもよく、そしてＣＲＹＡＢの濃度及びあってもよい１以上のマーカーの濃度を、対照試料において確立されるようなこのマーカー又はこれらのマーカーの濃度と比較することによって、心不全を評価する工程を含む、前記方法に関する。
【００２８】
本発明はまた、心不全の評価におけるマーカー分子としてのタンパク質ＣＲＹＡＢの使用にも関する。
さらに開示するのは、心不全の評価における、ＣＲＹＡＢ及び１以上の他の心不全マーカーを含むマーカー組み合わせの使用である。
【００２９】
やはり提供するのは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで心不全を評価するための方法であって、試料において、マーカーＣＲＹＡＢの濃度を測定し、試料において、１以上の他の心不全マーカーの濃度を測定してもよく、そしてＣＲＹＡＢの濃度及びあってもよい１以上のマーカーの濃度を、参照集団において確立されるようなこのマーカー又はこれらのマーカーの濃度と比較することによって、心不全を評価する工程を含む、前記方法を実行するためのキットであって、ＣＲＹＡＢ及びあってもよい１以上の他の心不全マーカーを特異的に測定するために必要な試薬を含む、前記キットである。
【００３０】
本発明のさらなる側面及び利点は、以下の説明を考慮して明らかであろう。しかし、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の好ましい態様を示すものの、例示目的のためにのみ提供されることを理解すべきであり、これは、この詳細な説明から、当業者には、本発明の精神及び範囲内の多様な変化及び修飾が明らかとなるであろうためである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】野生型及びＲ９Ｃマウスの表現型分析。（Ａ）２４週間の期間の後に、野生型マウス（ｎ＝７９）及びＲ９Ｃマウス（ｎ＝４４）の生存曲線を生成する。（Ｂ）心エコーによって評価される心臓短縮率（＝短縮率）。早くも８週齢で、Ｒ９Ｃトランスジェニック動物において、有意な機能損傷が始まる。
【図２】野生型及びＡＢマウスにおける心エコー及び血行動態パラメータ。（Ａ）術後２週、４週及び８週でのｍｍＨｇでの最大圧の変化。（Ｂ）術後２週、４週及び８週での％左心室駆出率（ＬＶＥＦ）の変化。（黒塗りの円は偽手術マウス由来のデータを示し、そして白抜きの円は大動脈結紮（ＡＢ）マウス由来のデータである）。
【図３】それぞれ、臨床的ルーチン由来のＨＦ試料及び対照パネルにおいて検出されるようなＣＲＹＡＢ値。それぞれ、（ＨＦ）と示す、心不全の５０人の患者由来の試料において、そして正常ヒト血清＝ＮＨＳと示す、健康な対照由来の試料（３０試料）において測定されるような、ＣＲＹＡＢに関する計算濃度を提供する。箱ひげプロットは、下位四分位及び上位四分位（箱）ならびに最高値及び最低値（ひげ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
第一の態様において、本発明は、個体において心不全を評価するための方法であって、ａ）個体から得た試料において、マーカータンパク質、アルファ−クリスタリンＢ（ＣＲＹＡＢ）の濃度を測定し、ｂ）試料において、１以上の他の心不全マーカーの濃度を測定してもよく、そしてｃ）工程（ａ）において測定した濃度及び工程（ｂ）において測定してもよい濃度（単数又は複数）を、対照試料において確立されるようなこのマーカー又はこれらのマーカーの濃度と比較することによって心不全を評価する工程を含む、前記方法に関する。
【００３３】
本明細書において、以下の用語は、各々、このセクションにおいて、それに関連する意味を有する。
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書において、冠詞の文法的対象の１又は１より多く（すなわち少なくとも１つ）を指す。例えば「抗体（ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、１つの抗体又は１より多い抗体を意味する。
【００３４】
表現「１以上の」は、１〜５０、好ましくは１〜２０を示し、また好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、又は１５である。
用語「マーカー」又は「生化学的マーカー」は、本明細書において、患者の試験試料を分析するためのターゲットとして用いられようとする分子を指す。１つの態様において、こうした分子ターゲットの例は、タンパク質又はポリペプチドである。本発明においてマーカーとして用いるタンパク質又はポリペプチドは、前記タンパク質の天然存在断片、特に免疫学的に検出可能な断片を含むよう意図される。免疫学的に検出可能な断片は、好ましくは、前記マーカーポリペプチドの少なくとも６、７、８、１０、１２、１５又は２０連続アミノ酸を含む。当業者は、細胞によって放出されるか又は細胞外マトリックス中に存在するタンパク質が、例えば炎症中に、損傷を受けている可能性もあり、そしてこうした断片に分解されるか又は切断されるようになりうることを認識するであろう。特定のマーカーは、不活性型で合成され、これが続いてタンパク質分解によって活性化される可能性もある。当業者が認識するであろうように、タンパク質又はその断片もまた、複合体の一部として存在することも可能である。こうした複合体もまた、本発明の意味において、マーカーとして使用可能である。さらに、又はあるいは、マーカーポリペプチドは、翻訳後修飾を所持することも可能である。翻訳後修飾の例は、とりわけ、グリコシル化、アシル化及び／又はリン酸化である。
【００３５】
用語「心不全の評価」は、本発明記載の方法が、個体が心不全を発展させるリスクを有するかどうかを医師が評価するのを補助するか、あるいはＨＦの診断妥当性の１又はいくつかの他の領域において、医師がＨＦ患者を評価するのを補助するであろうことを示すよう用いられる。ＨＦ個体を評価する際の診断妥当性の好ましい領域は、心不全の病期決定、急性及び慢性心不全の示差診断、疾患進行リスクの判定、適切な薬剤選択の指針、療法に対する反応の監視、そしてＨＦ患者の追跡調査である。
【００３６】
「心不全マーカー」は、本発明の意味において、マーカーＣＲＹＡＢと組み合わせた際、検査中の診断課題に対して、ＨＦ評価において適切な情報を加えるマーカーである。情報は、すでにマーカーＣＲＹＡＢを含むマーカー組み合わせに前記マーカーを含めることによって、ＨＦ評価に、それぞれ、所定の特異性で感度を、又は所定の感度で特異性を、改善可能である場合、関連があるか又は付加的価値があると見なされる。好ましくは、感度又は特異性の改善は、それぞれ、ｐ＝０．０５、０．０２、０．０１又はそれ未満の有意性レベルで、統計的に有意である。好ましくは、１以上の他の心不全マーカーは、ナトリウム利尿ペプチドマーカー、心臓トロポニンマーカー、及び炎症マーカーからなる群より選択される。
【００３７】
用語「試料」は、本明細書において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの評価の目的のために得た生物学的試料を指す。本発明の方法において、試料又は患者試料は、好ましくは、任意の体液を含むことも可能である。好ましい試験試料には、血液、血清、血漿、尿、唾液、及び滑液が含まれる。好ましい試料は、全血、血清、血漿又は滑液であり、血漿又は血清が、最も好適な試料タイプに相当する。当業者は、任意のこうした評価がｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われることを認識するであろう。患者試料は、その後、廃棄される。患者試料は、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法のためにもっぱら用いられ、そして患者試料の成分は、患者体内に移し戻されることはない。典型的には、試料は液体試料、例えば全血、血清、又は血漿である。
【００３８】
表現「濃度を、対照試料において確立されるような濃度と比較する」は、単に、当業者にいずれにしても明白であることをさらに例示するために用いられる。対照試料は、内部又は外部対照試料であることも可能である。１つの態様において、内部対照試料を用い、すなわち、マーカーレベル（単数又は複数）を、試験試料ならびに同じ被験体から採取された１以上の他の試料において評価して、前記マーカー（単数又は複数）のレベル（単数又は複数）の変化があるか決定する。別の態様において、外部対照試料を用いる。外部対照試料に関して、個体から得た試料において、マーカーの存在又は量を、所定の状態を患っていることが知られるか又はそのリスクがあることが知られる個体；あるいは所定の状態を持たないことが知られる個体、すなわち「正常個体」から得た試料におけるその存在又は量と比較する。例えば、患者試料におけるマーカーレベルを、ＨＦにおける疾患の特定の経過と関連することが知られるレベルと比較することも可能である。通常、試料のマーカーレベルは、診断と直接又は間接的に相関し、そしてマーカーレベルは、例えば、個体がＨＦのリスクを有するかどうかを決定するために用いられる。あるいは、試料のマーカーレベルを、例えば、ＨＦ患者における療法に対する反応、急性及び慢性心不全の示差診断、疾患進行リスクの判定における、又はＨＦ患者の追跡調査における、ＨＦを治療するための適切な薬剤選択の指針と関連することが知られるマーカーレベルと比較することも可能である。意図する診断使用に応じて、適切な対照試料を選択し、そしてマーカーに関する対照又は参照値を確立する。当業者には、こうした対照試料が、１つの態様において、年齢をマッチさせ、そして交絡疾患を持たない参照集団から得られることが認識されるであろう。やはり当業者に明らかであるように、対照試料において確立される絶対マーカー値は、用いるアッセイに応じるであろう。好ましくは、適切な参照集団由来の１００のよく特徴付けされた個体を用いて、対照（参照）値を確立する。やはり好ましくは、２０、３０、５０、２００、５００又は１０００の個体からなるように参照集団を選択してもよい。健康な個体は、対照値を確立するために、好ましい参照集団に相当する。
【００３９】
１つの態様において、本発明は、個体において、ＨＦを診断するための方法であって、ａ）個体由来の試料において、ＣＲＹＡＢのタンパク質レベルを測定し、そしてｂ）（ａ）において測定したＣＲＹＡＢのレベルを、対照レベルと比較する、ここで、対照レベルを超えるＣＲＹＡＢレベルは、個体がＨＦを有することを示す工程を含む、前記方法に関する。
【００４０】
１つの態様において、本発明は、個体において、ＨＦを診断するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、ａ）ＣＲＹＡＢに結合する剤と試料を接触させ、それによって剤及びＣＲＹＡＢ間で複合体を形成し、形成された複合体の量を検出し、それによってＣＲＹＡＢのレベルを測定することによって、個体由来の試料において、ＣＲＹＡＢのタンパク質レベルを測定し、ｂ）（ａ）において測定したＣＲＹＡＢのレベルを、対照レベルに比較して、そしてｃ）個体由来の試料において、ＣＲＹＡＢのレベルが対照レベルを超えている際、ＨＦの診断を提供する工程を含む、前記方法に関する。
【００４１】
アルファ−クリスタリンＢ（ＣＲＹＡＢ）
クリスタリンは、アルファ、ベータ、及びガンマファミリーに分けられる。アルファ及びベータファミリーのメンバーは、それぞれ、さらに酸性及び塩基性群に分けられる。
【００４２】
アルファ−クリスタリンＢ（ＣＲＹＡＢ；配列番号１を参照されたい）はまた、ＣＭＤ１ＩＩ、ＣＲＹＡ２、ＣＴＰＰ２、熱ショック２０ｋＤ様タンパク質、腎癌抗原ＮＹ−ＲＥＮ−２７、ローゼンタール線維構成要素及びＨＳＰＢ５としてもまた知られる。
【００４３】
ＣＲＹＡＢは、目のレンズ及び筋肉において恒常的に発現される小分子熱ショックタンパク質ファミリーのメンバーであり、そして脳傷害において誘導される。クリスタリン中には、７つのタンパク質領域が存在する：４つの相同モチーフ、連結ペプチド、ならびにＮ及びＣ末端伸長である。
【００４４】
ＣＲＹＡＢの生物学的役割は、なお明らかに確立されていない。クリスタリンは、約７０の血漿タンパク質に結合することが示されたが、これらのタンパク質の半分以上が急性期、凝血、及び補体経路のメンバーである。熱ショックタンパク質５は、明白な選択性をもって炎症促進タンパク質に結合し、そして炎症を調節する（Ｒｏｔｈｂａｒｄら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０１２，  “結合炎症促進性血漿タンパク質と関連するシャペロンαＢ−クリスタリンの全身投与の療法効果”，  ２８７（１３）：９７０８）。ＣＲＹＡＢは、自然免疫活性化のマーカーであると提唱される。
【００４５】
ＣＲＹＡＢ及び／又はＨＳＰＢ２は、ノックアウトマウスモデルにおける正常心臓機能に必須であることが見出された（Ｋｕｍａｒａｐｅｌｉら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００８  “ａＢ−クリスタリンは、圧負荷心臓肥大を抑制する”，  １０３（１２），  １４７３−１４８２）。
【００４６】
さらに、ＣＲＹＡＢ及びＨＳＰＢ２欠損は、カルシウム依存性代謝／呼吸の減少を誘導することが見出された（Ｉｖｏｒら，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．  Ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２００７，  “ＣＲＹＡＢ及びＨＳＰＢ２欠損は、心臓代謝を改変し、そして逆説的に加齢マウスにおける心筋虚血に対する保護を与える”，  ６２（５），  ３９）。
【００４７】
ＣＲＹＡＢの突然変異は、ミスフォールディングしたタンパク質の集積によって特徴付けられる、いくつかのヒト疾患と関連することが見出された。多くの神経学的疾患でＣＲＹＡＢの発現上昇が起こる。ミスセンス突然変異は、デスミン関連筋疾患を有する家族において共分離した（Ｔａｎｎｏｕｓら，  ＰＮＡＳ  ２００８，  “自食作用は、デスミン関連心筋症における適応反応である”，  １０５（２８）９７４５−５０；  Ｚｈａｎｇら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００９，  “タンパク質凝集に対するＨｓｐ２５の分子特徴は、ヒト疾患を引き起こすＣｒｙＡＢ突然変異の中の、多数の病原性結果を示唆する”，  １０５，  （７）２９  Ｐ９７）。
【００４８】
いくつかのタイプの癌（口腔、乳房、頭部、頸部）で、ＣＲＹＡＢの役割が関連づけられてきている（Ｓｕ  ＣＨ，  Ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＆  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２０１１，  “台湾における乳癌感受性とアルファＢ−クリスタリン（ＣＲＹＡＢ）遺伝子型の関連”，  ８（５），  ２５１−４）。
【００４９】
さらなる証拠によって、ミスフォールディングされたタンパク質及び細胞内凝集物が、心疾患及び心不全に寄与することが示唆されている。デスミン関連心筋症のアルファＢ−クリスタリンＲ１２０Ｇ突然変異（ＣｒｙＡＢ（Ｒ１２０Ｇ））モデルを含む、いくつかの心筋症では、プレアミロイド・オリゴマー及びアグリソームの形で、細胞毒性ミスフォールディングタンパク質が集積する（Ｐａｔｔｉｓｏｎら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２０１１，  １０９（２），  １５１−６０）。
【００５０】
ＣＲＹＡＢは、炎症領域の多発性硬化症病変において、最も豊富に誘導される転写物であることが見出された（Ｃｈａｂａｓら，  ２００１，  “炎症促進性サイトカイン、オステオポンチンの自己免疫脱ミエリン疾患に対する影響”，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９４：１７３１−１７３５）。
【００５１】
循環ＣＲＹＡＢの免疫学的決定は、近年になってようやく行われた。
多発性硬化症の患者においては、正常個体と比較した際、増加した血漿レベルが見られた（Ｒｏｔｈｂａｒｄら，  ２０１２，  “結合炎症促進性血漿タンパク質と関連するシャペロンαＢ−クリスタリンの全身投与の療法効果”，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２８７（１３）：９７０８）。
【００５２】
さらに、ＣＲＹＡＢの血漿レベルの増加が、炎症性肺疾患患者で見られた（Ｃｈｅｒｎｅｖａら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃｈｒｏｎ．  Ｏｂｓｔｒｕｃｔ．  Ｐｕｌｍｏｎ．  Ｄｉｓ．，  ２０１２，  ７：６３３：“ＣＯＰＤ病因形成における小分子熱ショックタンパク質αＢ−クリスタリン（ＨｓｐＢ５）の役割”。）
ＣＲＹＡＢの療法使用は、多発性硬化症、心筋虚血、及びギラン・バレー症候群のような多様な疾患において調べられてきている。例えば、ＣＲＹＡＢの投与は、催不整脈性の影響を防止することが見出された（Ｐａｒｋら，  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２０１３，  “アルファＢ−クリスタリンは、酸化ストレスを減弱させることによって、外気から単離される粒子状物質の催不整脈性の影響を防止する”，  ２６６（２），  ２６７−２７５）。
【００５３】
先行技術において、体液中のタンパク質ＣＲＹＡＢの存在又はレベルは、心不全評価において、診断有用性を有することが知られることも又は有すると示唆されることもなかったようである。
【００５４】
本発明の発明者らは、現在、個体由来の体液試料から測定されるようなＣＲＹＡＢ値の増加が、心不全の指標であることを見出し、そして確立可能であった。
対照群又は対照集団において測定されるようなＣＲＹＡＢの値は、例えば、カットオフ値又は参照範囲を確立するために用いられる。こうしたカットオフ値より高いか又は参照範囲のより高い端の外側である値は、上昇していると見なされる。
【００５５】
１つの態様において、固定カットオフ値を確立する。こうしたカットオフ値は、関心対象の診断課題にマッチするように選択される。
１つの態様において、対照群又は対照集団において測定されるようなＣＲＹＡＢの値は、参照範囲を確立するために用いられる。好ましい態様において、ＣＲＹＡＢ濃度は、測定した値が参照範囲の９０％パーセンタイルより高い場合に、上昇していると見なされる。さらに好ましい態様において、ＣＲＹＡＢ濃度は、測定した値が、参照範囲の９５％パーセンタイル、９６％パーセンタイル、９７％パーセンタイル又は９７．５％パーセンタイルより高い場合、上昇していると見なされる。
【００５６】
１つの態様において、対照試料は、内部対照試料であろう。この態様において、検査中の個体から連続試料を得て、そしてマーカーレベルを比較する。これは、例えば、療法有効性を評価する際に有用でありうる。
【００５７】
本発明にしたがった方法は、個体から得られている液体試料に、そしてこうした試料におけるＣＲＹＡＢの測定に基づく。「個体」は、本明細書において、単一ヒト又は非ヒト生物を指す。したがって、本明細書に記載する方法及び組成物は、ヒト及び獣医学的疾患に適用可能である。好ましくは、個体は、ヒトである。
【００５８】
好ましくは、マーカーＣＲＹＡＢは、特異的結合剤（＝ＣＲＹＡＢに結合する剤）の使用によって、液体試料から特異的に測定される。
特異的結合剤は、例えば、ＣＲＹＡＢの受容体、ＣＲＹＡＢに結合するレクチン又はＣＲＹＡＢに対する抗体である。特異的結合剤は、対応するターゲット分子に対して、少なくとも１０７ｌ／ｍｏｌのアフィニティを有する。特異的結合剤は、ターゲット分子に対して、好ましくは１０８ｌ／ｍｏｌのアフィニティを有し、又はさらにより好ましくは１０９ｌ／ｍｏｌのアフィニティを有する。当業者が認識するであろうように、用語、特異的は、試料中に存在する他の生体分子が、ＣＲＹＡＢに特異的な結合剤に有意には結合しないことを示す。好ましくは、ターゲット分子以外の生体分子への結合レベルは、それぞれ、ターゲット分子に対するアフィニティのわずか１０％又はそれ未満、より好ましくはわずか５％又はそれ未満である結合アフィニティを生じる。好ましい特異的結合剤は、アフィニティに関する、ならびに特異性に関する上記最低基準を両方満たすであろう。
【００５９】
特異的結合剤は、好ましくは、ＣＲＹＡＢに結合する抗体である。用語、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、こうした抗体の抗原結合断片、一本鎖抗体、ならびに抗体の結合ドメインを含む遺伝子構築物を指す。
【００６０】
特異的結合剤の上記基準を保持する任意の抗体断片が使用可能である。抗体は、従来技術の方法によって生成され、例えばＴｉｊｓｓｅｎ（Ｔｉｊｓｓｅｎ，  Ｐ．，  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９０）、書籍全体、特に４３−７８ページ）に記載されるように生成される。さらに、当業者は、抗体の特異的単離に使用可能な免疫吸着剤に基づく方法をよく知っている。これらの手段によって、ポリクローナル抗体の品質及びしたがってイムノアッセイにおけるその性能を増進させることも可能である（Ｔｉｊｓｓｅｎ，  Ｐ．、上記、１０８−１１５ページ）。
【００６１】
本発明に開示するような達成のため、ヤギで作製したポリクローナル抗体が使用可能である。しかし、明らかにまた、異なる種、例えばラット、ウサギ又はモルモット由来のポリクローナル抗体、ならびにモノクローナル抗体が使用可能である。モノクローナル抗体は、一定の特性を持つために必要な任意の量で産生可能であるため、これらは、臨床的ルーチンのためのアッセイ開発において理想的なツールに相当する。
【００６２】
本発明にしたがった方法において、ＣＲＹＡＢに対するモノクローナル抗体の生成及び使用は、それぞれ、さらに他の好ましい態様に相当する。１つの態様において、本発明は、ＨＦを評価するためのＣＲＹＡＢに結合する剤のｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用に関連し、ここで、対照レベルを超えるＣＲＹＡＢレベルは、ＨＦ存在の指標である。
【００６３】
天然供給源からＣＲＹＡＢを精製することは容易ではない。ＣＲＹＡＢの組換え産生は、より多量のＣＲＹＡＢを得るために選択される方法である。好ましい態様において、ＣＲＹＡＢは、真核発現系を用いた組換え発現によって産生される。真核発現系の例は、バキュロウイルス発現、酵母における発現及び哺乳動物発現系における発現である。１つの好ましい態様において、ＣＲＹＡＢの発現は、哺乳動物発現系において実行されるであろう。哺乳動物発現系の例は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、骨髄腫細胞等である。さらに好ましい態様において、組換え産生されるＣＲＹＡＢは、ＣＲＹＡＢに対するポリ又はモノクローナル抗体の産生において、抗原として用いられる。上記のような組換え的に産生されたＣＲＹＡＢを利用して、ＣＲＹＡＢ免疫吸着剤上での免疫吸着によってポリクローナル抗体を精製することもまた好ましい可能性もある。
【００６４】
当業者がここで認識するであろうように、ＣＲＹＡＢがＨＦ評価に有用なマーカーとして同定されてきており、別の方法を用いて、本発明の達成に匹敵する結果に到達することが可能である。例えば、抗体を生成する別の戦略を用いてもよい。こうした戦略は、とりわけ、免疫のためのＣＲＹＡＢの臨床的に適切なエピトープに相当する、合成又は組換えペプチドの使用を含む。あるいは、ＤＮＡワクチン接種としてもまた知られるＤＮＡ免疫を用いてもよい。
【００６５】
測定のため、個体から得た液体試料を、結合剤・ＣＲＹＡＢ複合体の形成に適した条件下で、ＣＲＹＡＢに対する特異的結合剤とインキュベーションする。こうした条件を特定する必要はなく、これは当業者はいかなる独創的な努力も伴わずに、容易にこうした適切なインキュベーション条件を同定可能であるためである。結合剤・ＣＲＹＡＢ複合体の量を測定し、そしてＨＦの評価に用いる。当業者が認識するであろうように、特異的結合剤・ＣＲＹＡＢ複合体の量を測定する多くの方法があり、これらはすべて詳細に適切な教科書に記載される（例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ  Ｐ．、上記、又はＤｉａｍａｎｄｉｓ，  Ｅ．Ｐ．及びＣｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ，  Ｔ．Ｋ．（監修），  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ボストン（１９９６）を参照されたい）。
【００６６】
好ましくは、ＣＲＹＡＢは、サンドイッチ型アッセイ形式で検出される。こうしたアッセイにおいて、第一の特異的結合剤を用いて、一方でＣＲＹＡＢを捕捉し、そして直接又は間接的に検出可能であるように標識した第二の特異的結合剤をもう一方で用いる。好ましくは、ＣＲＹＡＢに対する抗体を定性的（ＣＲＹＡＢが存在するか又は存在しないか）又は定量的（ＣＲＹＡＢの量を決定する）イムノアッセイで用いる。
【００６７】
実施例セクションにおいて詳細に記載するように、２つのマウスモデルを用いて、高度マイクロアレイ及びプロテオミクス法によって、実験動物の心臓組織において見られるｍＲＮＡ及びポリペプチドを同定してきている。しかし、これらのモデルは、少なくとも部分的に矛盾するデータを生じ、そしてもちろん、ｍＲＮＡ又はそれぞれのポリペプチドに関する組織データは、循環中のこれらのポリペプチドの存在又は非存在を示さない。１つのモデルで示差的に発現されることが見出されたマーカーは、第二のモデルにおいて示差的に発現されていない可能性もあり、又はさらに、さらにさらなるモデルにおいて、矛盾するデータを示す可能性もある。示差的に発現されるｍＲＮＡは、循環中のそれぞれのポリペプチドのレベル増進と相関しないことも見出される可能性もある。タンパク質が組織中で示差的に発現されている可能性がある場合であっても、このタンパク質は、大部分の場合、体液から測定された場合、いかなる診断関連性も持たず、これは、該タンパク質が循環に放出されない可能性もあり、例えば細胞又は組織から放出された際に、断片化されたか又は修飾されている可能性もあり、循環中で安定でない可能性もあり、循環中で測定可能でない可能性もあり、所定の疾患に関して特異的でない可能性もあるためなどである。
【００６８】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、体液試料において、タンパク質ＣＲＹＡＢを検出可能である。さらにより驚くべきことに、本発明者らは、個体から得たこうした液体試料におけるＣＲＹＡＢの存在が、ＨＦに相関しうることを立証可能である。ＨＦ評価において、マーカーＣＲＹＡＢを利用するために、組織及び生検試料はまったく必要とされない。タンパク質ＣＲＹＡＢのレベル測定は、ＨＦ分野において非常に好適であると見なされる。
【００６９】
１つの好ましい態様において、本発明は、個体において心不全を評価するための方法であって、（ａ）個体から得た試料において、マーカーＣＲＹＡＢの濃度を測定し、ここで前記試料は体液試料であり、ｂ）試料において、ナトリウム利尿ペプチドマーカー、心臓トロポニンマーカー、及び炎症マーカーからなる群より選択される１以上の他の心不全マーカーの濃度を測定してもよく、そしてｃ）工程（ａ）において測定した濃度及び工程（ｂ）において測定してもよい濃度（単数又は複数）を、対照試料において確立されるようなこのマーカー又はこれらのマーカーの濃度と比較することによって心不全を評価する、ここでＣＲＹＡＢ濃度の増加が心不全の指標である工程を含む、前記方法に関する。
【００７０】
好ましい態様において、本発明記載の方法を、全血、血清及び血漿からなる群より選択される、液体又は体液試料材料で実施する。好ましい態様において、本発明記載の方法は、液体試料材料として血清を用いて実施される。さらに好ましい態様において、本発明記載の方法は、液体試料材料として血漿を用いて実施される。さらに好ましい態様において、本発明記載の方法は、液体試料材料として全血を用いて実施される。
【００７１】
さらに好ましい態様において、本発明は、個体から得た液体試料からの心不全の評価における、マーカー分子としてのタンパク質ＣＲＹＡＢの使用に関する。
診断のための理想的なシナリオは、例えば感染性疾患におけるように、単一の事象又はプロセスが、それぞれの疾患を引き起こす状況であろう。すべての他の症例では、正しい診断は非常に困難である可能性があり、特に、ＨＦの場合のように、疾患の病因が完全には理解されていない場合には、非常に困難でありうる。当業者が認識するであろうように、ＨＦの分野において、特定の診断課題に関して、１００％の特異性及び同時に１００％の感受性を持って診断する生化学的マーカーはない。むしろ、生化学的マーカーを用いて、根底にある診断課題を、特定の尤度又は予測値で評価する。当業者は、評価しようとする診断課題に関する相対的リスク又は尤度を計算するためにルーチンに用いられる数学的／統計的方法を完全に知っている。ルーチンの臨床診断において、根底にある疾患の診断、治療、及び管理において、一般的に、医師によって、多様な臨床的症状及び生物学的マーカーが、ともに考慮される。
【００７２】
好ましくは、本発明のさらなる好ましい態様において、ＨＦを評価するための方法は、ＣＲＹＡＢ及び１以上の他のマーカーの濃度を測定することによって、そしてＣＲＹＡＢ及び１以上の他のマーカーの濃度を、ＨＦ評価において用いることによって、実行される。
【００７３】
ＨＦ評価において、マーカーＣＲＹＡＢは、１以上の以下の側面において、医師を補助するであろう：心不全の存在に関してスクリーニングするため；個体が心不全を発展させるリスクを評価するため；又は例えば心不全の病期を同定し、急性及び慢性心不全の間を区別し、疾患進行のリスクを判定し、適切な療法を選択する際の指針を提供し、療法に対する患者の反応を監視し、そして疾患経過を監視する意図で、すなわちＨＦ患者の追跡調査において、心不全を有する患者を評価するため。
【００７４】
個体が心不全を発展させるリスクを有するかどうかの評価
好ましい態様において、本発明は、個体が心不全を発展させるリスクを有するかどうか評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、試料において、マーカーＣＲＹＡＢの濃度を測定し、試料において、１以上の他の心不全マーカーの濃度を測定してもよく、そしてＣＲＹＡＢに関する濃度及び１以上の他のマーカーに関して測定してもよい濃度を、その又はそれらの参照値に対するこのマーカー又はこれらのマーカーの濃度と比較することによって、前記個体が心不全を発展させるリスクを評価する工程を含む、前記方法に関する。
【００７５】
本発明の意味におけるスクリーニングは、心不全を発展させるリスクに関する、個体の不偏性の評価に関する。こうしたスクリーニングは、理論的には、いかなる試料に対して実行してもよい一方、臨床診断において、こうしたスクリーニング・オプションは、通常、心不全の発展に関するリスクが幾分かはある個体に対して与えられるであろう。上に論じるように、こうした個体は、臨床的には無症候性である可能性もあり、すなわち彼らは、ＨＦの徴候又は症状を持たない。１つの好ましい態様において、ＨＦに関するスクリーニングは、心不全を発展させるリスクを有する、例えばＡＣＣ／ＡＨＡ診断指針によって定義されるような病期Ａ又はＢに属する個体に与えられるであろう。
【００７６】
上述のように、心不全は、先進国において、最も蔓延し、コストが掛かり、そして生命を脅かす疾患の１つである。広く蔓延し、そして無症候期が長いため、ＨＦを発展させるリスクが高い個体の同定は、疾患経過に介入するために、そして可能であれば疾患経過を中断するために非常に重要であろう。非常に早期にリスク評価ができなければ、ＨＦの無症候状態から症候期への疾患進行を防止することは不可能であるようである。
【００７７】
当業者に完全に知られ、そして理解される数学的／統計的方法によって、心不全のリスクを評価する。好ましくは、心不全に対する個体のリスクは、相対的な用語で示され、そしていわゆる相対リスク（＝ＲＲ）として提供される。心不全に関するこうしたＲＲを計算するため、ＣＲＹＡＢに対する個々の値を、参照集団、好ましくは心不全を発展させていない健康な個体においてＣＲＹＡＢに関して確立した値と比較する。やはり好ましくは、心不全に関するこうしたＲＲの評価は、研究期間内、好ましくは１年以内又はやはり好ましくは２年以内に心不全を発展させた個体群、及び同じ研究期間中に心不全を発展させなかった個体群に基づく。
【００７８】
心不全に関するスクリーニング
別の好ましい態様において、本発明は、心不全のスクリーニングにおけるマーカーＣＲＹＡＢの使用に関する。当業者が知るように、用語「マーカーとしての使用」は、適切な手段によってマーカー分子の濃度を定量化し、そして次いで、こうしたマーカーに関して測定した値を用いて、疾患又は臨床的状態の存在又は非存在を示す、すなわちマークをつけることを示す。定量化のための適切な手段は、例えば、抗体のような特異的結合剤である。
【００７９】
好ましくは、将来の心不全のリスクがあることが推測される個体において、ＨＦに関するスクリーニングを行うであろう。この意味で、将来の心不全のリスクがある患者は、高血圧、動脈硬化性疾患、糖尿病、肥満及びメタボリックシンドロームと診断された患者である。好ましくは、将来の心不全に関するリスクを、高血圧、動脈硬化性疾患、糖尿病、肥満及び／又はメタボリックシンドロームを患う個体で評価する。
【００８０】
やはり好ましいのは、ＡＣＣ／ＡＨＡ診断指針にしたがって、病期Ｂである個体、すなわち心臓に構造的な変化を示すが、心不全の症状を示さない個体に関して、将来の心不全のリスクを評価する際のマーカーＣＲＹＡＢの使用である。
【００８１】
さらに好ましい態様において、本発明は、ＨＦスクリーニング目的のための、ＨＦマーカー組み合わせの１つのマーカーとしてのＣＲＹＡＢの使用に関する。
スクリーニング設定において、ＣＲＹＡＢのレベル上昇は、個体が心不全を発展させるリスクが増加している正の指標である。
【００８２】
患者の病期決定
好ましい態様において、本発明は、心不全患者の病期決定を補助するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、ａ）試料において、マーカーＣＲＹＡＢの濃度を測定し、ｂ）試料において、１以上の他の心不全マーカーの濃度を測定してもよく、そして工程（ａ）において測定した濃度及び工程（ｂ）において測定してもよい濃度（単数又は複数）を、その又はそれらの参照値に対するこのマーカー又はこれらのマーカーの濃度と比較することによって、心不全を病期決定する工程を含む、前記方法に関する。好ましくは、検査中の個体を、臨床的に「正常」である個体群（すなわちＡＣＡ／ＡＣＣ分類にしたがった病期Ａ）、構造的心疾患を有する無症候性患者（ＡＣＡ／ＡＣＣ分類にしたがった病期Ｂ）、及び心不全を有する患者群（すなわちＡＣＡ／ＡＣＣ分類にしたがった病期Ｃ又は病期Ｄの患者）に分類する際の補助として、マーカーＣＲＹＡＢのレベルを用いる。
【００８３】
急性心臓事象及び慢性心疾患の間の区別
好ましい態様において、本発明は、急性心臓事象及び慢性心疾患の間の示差的診断を補助するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、試料において、マーカーＣＲＹＡＢの濃度を測定し、試料において、１以上の他の心不全マーカーの濃度を測定してもよく、そして工程（ａ）において測定した濃度及び工程（ｂ）において測定してもよい濃度（単数又は複数）を、その又はそれらの参照値に対するこのマーカー又はこれらのマーカーの濃度と比較することによって、急性心臓事象及び慢性心疾患の間の示差的診断を確立する工程を含む、前記方法に関する。
【００８４】
当業者は、「急性心臓事象」及び「慢性心疾患」の意味をよく知っている。
好ましくは「急性心臓事象」は、心臓の急性状態、疾患又は機能不全、特に急性心不全、例えば心筋梗塞（ＭＩ）又は不整脈に関する。ＭＩの度合いに応じて、これにはＬＶＤ及びＣＨＦが続く可能性もある。
【００８５】
好ましくは、「慢性心疾患」は、例えば心臓虚血、冠状動脈疾患、又は以前の特に小規模の心筋梗塞（単数又は複数）（おそらく進行性ＬＶＤが続く）による、心機能の減退である。これはまた、炎症性疾患、心臓弁異常（例えば僧帽弁異常）、拡張型心筋症、肥大性心筋症、心拍リズム異常（不整脈）、及び慢性閉塞性肺疾患のための減退であることも可能である。したがって、慢性心疾患にはまた、急性冠状動脈症候群、例えばＭＩに罹患しているが、急性心臓事象に現在罹患していない患者も含まれうることが明らかである。
【００８６】
急性心臓事象及び慢性心疾患は、まったく異なる治療措置を必要とする可能性もあるため、急性心臓事象及び慢性心疾患の間を区別することが重要である。例えば、急性心筋梗塞を提示する患者には、再灌流のための早期治療が非常に重要である可能性もある。一方、慢性心不全の患者に対して行われる再灌流治療は、せいぜい患者に対してまったく又はほとんど害がない程度である。
【００８７】
本発明にしたがったさらなる好ましい態様において、マーカーＣＲＹＡＢを急性及び慢性心不全の示差診断に用いる。
疾患進行のリスクの評価
好ましい態様において、本発明は、疾患進行に関するＨＦ患者のリスクを評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、試料において、マーカーＣＲＹＡＢの濃度を測定し、試料において、１以上の他の心不全マーカーの濃度を測定してもよく、そしてＣＲＹＡＢに関する濃度、及び１以上の他のマーカーに関して測定してもよい濃度を、その又はそれらの参照値に対するこのマーカー又はこれらのマーカーの濃度と比較することによって、疾患進行に関する前記個体のリスクを確立する工程を含む、前記方法に関する。
【００８８】
現在、ＨＦと診断された患者が多かれ少なかれ安定な状態を有するかどうか、あるいは疾患が進行し、そしてその結果として患者の健康状態が悪化するかどうかを評価すること、又は妥当な尤度で予測することさえ非常に困難である。心不全の重症度及び進行は、、通常、臨床症状を評価することによって、又は心エコーなどの画像化技術を用いることによる不都合な変化の同定によって、臨床的に確立される。１つの態様において、心不全の悪化は、左心室駆出率（ＬＶＥＦ）を監視することによって確立される。５％又はそれより多いＬＶＥＦの悪化は、疾患進行と見なされる。
【００８９】
さらに好ましい態様において、本発明はしたがって、ＨＦに罹患した患者に関する疾患進行のリスクを評価する際の、マーカーＣＲＹＡＢの使用に関する。ＨＦに罹患した患者に関する疾患進行の評価において、ＣＲＹＡＢレベルの上昇は、疾患進行リスク増加に関する指標となる。
【００９０】
適切なＨＦ療法を選択する際の指針
好ましい態様において、本発明は、適切なＨＦ療法の選択を補助するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、試料において、マーカーＣＲＹＡＢの濃度を測定し、試料において、１以上の他の心不全マーカーの濃度を測定してもよく、そしてＣＲＹＡＢに関する濃度及び１以上の他のマーカーに関して測定してもよい濃度を、その又はそれらの参照値に対するこのマーカー又はこれらのマーカーの濃度と比較することによって、適切な療法を選択する工程を含む、前記方法に関する。
【００９１】
マーカーＣＲＹＡＢは、心不全領域において、利用可能である多様な治療措置から、最も適切な治療措置を医師が選択することを補助する際の助けとなるであろうと予期される。さらに好ましい態様において、したがって、本発明は、ＨＦに罹患した患者に関する治療措置を選択する際のマーカーＣＲＹＡＢの使用に関する。
【００９２】
療法に対する患者の反応を監視する
好ましい態様において、本発明は、ＨＦ療法に対する患者反応を監視するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、ａ）試料において、マーカーＣＲＹＡＢの濃度を測定し、ｂ）試料において、１以上の他の心不全マーカーの濃度を測定してもよく、そして工程（ａ）において測定した濃度及び工程（ｂ）において測定してもよい濃度（単数又は複数）を、その又はそれらの参照値に対するこのマーカー又はこれらのマーカーの濃度と比較することによって、ＨＦ療法に対する患者の反応を監視する工程を含む、前記方法に関する。
【００９３】
あるいは、療法に対する患者の反応を監視するための上記方法は、ＣＲＹＡＢの療法前及び療法後のマーカーレベル、及びあってもよい１以上の他のマーカーの療法前及び療法後のレベルを確立することによって、そして療法前及び療法後のマーカーレベル（単数又は複数）を比較することによって、実施可能である。
【００９４】
心不全の診断は、臨床的に確立される。本発明にしたがって、ＨＦは、患者が、ＡＣＣ／ＡＨＡ診断指針によって定義されるような病期Ｃ又はＤの基準を満たすならば、臨床的に確立されると見なされる。これらの指針にしたがって、病期Ｃは構造的心疾患を有し、そして以前、又は現在、心不全の症状を有する患者を指す。病期Ｄの患者は、専門的な介入を要する難治性心疾患を有する患者である。
【００９５】
さらに上に示すように、ＮＴ−プロＢＮＰに関して測定される値は、心不全の重症度に非常に相関する。しかし、ＢＮＰ及びＮＴ−プロＢＮＰはどちらも、療法に対する患者の反応を監視する際に理想的ではないようである。例えばＢｅｃｋ−ｄａ−Ｓｉｌｖａ，  Ｌ．ら，  Ｃｏｎｇｅｓｔ．  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌ．  １１（２００５）２４８−２５３，  ｑｕｉｚ  ２５４−２５５を参照されたい。
【００９６】
マーカーＣＲＹＡＢは、療法に対する患者の反応を監視するために適切であるようである。本発明はしたがって、また、療法に対する患者の反応を監視する際のＣＲＹＡＢの使用にも関する。診断領域において、マーカーＣＲＹＡＢはまた、療法前のベースライン値を確立するため、そして療法後の一時点又はいくつかの時点でＣＲＹＡＢを測定するために使用可能である。ＨＦ患者の追跡調査において、ＣＲＹＡＢレベルの減少は、ＨＦの有効な治療に関する正の指標である。
【００９７】
マーカー組み合わせ
生化学的マーカーを個々に測定してもよいし、又は本発明の好ましい態様において、チップ又はビーズに基づくアレイ技術を用いて、これらを同時に測定してもよい。次いで、各マーカーに関する個々のカットオフを用いて、バイオマーカー濃度を独立に解釈するか、又は解釈のためにこれらを組み合わせ、すなわちこれらでマーカー組み合わせを形成する。
【００９８】
当業者が認識するであろうように、異なる方式で、マーカーレベルを特定の尤度又はリスクに相関させる工程を行って、そして達成することも可能である。好ましくは、マーカーＣＲＹＡＢ及び１以上の他のマーカー（単数又は複数）に関して測定される値を数学的に組み合わせて、そして組み合わせた値を根底にある診断課題に相関させる。当該技術分野の任意の適切な数学的方法によって、マーカー値をＣＲＹＡＢの測定と組み合わせてもよい。
【００９９】
好ましくは、マーカーの組み合わせに適用される数学的アルゴリズムは、ロジスティック関数である。こうした数学的アルゴリズム又はこうしたロジスティック関数を適用した結果は、好ましくは単一の値である。根底にある診断課題に応じて、こうした値は、容易に、例えば心不全に関する個体のリスクに、又はＨＦ患者の評価に有用である他の意図される診断使用に相関させうる。好ましい方法において、こうしたロジスティック関数は、ａ）個体の群への、例えば正常、心不全のリスクがある個体、急性又は慢性心不全の患者などへの分類、ｂ）単変数分析による、これらの群間で有意に異なるマーカーの同定、ｃ）これらの異なる群を評価する際に有用なマーカーの独立の識別値を評価するロジスティック回帰分析、及びｄ）独立識別値を組み合わせるロジスティック関数の構築によって得られる。このタイプの分析において、マーカーはもはや独立ではなく、マーカー組み合わせに相当する。
【０１００】
好ましい態様において、ＣＲＹＡＢの値及び少なくとも１つのさらなるマーカーの値を組み合わせるために用いられるロジスティック関数は、ａ）個体の、それぞれ、正常群及び心不全のリスクがある個体群への分類、ｂ）ＣＲＹＡＢに関する値及び少なくとも１つのさらなるマーカーの値の確立、ｃ）ロジスティック回帰分析の実行、ならびにｄ）ＣＲＹＡＢに関するマーカー値及び少なくとも１つのさらなるマーカーの値を組み合わせるロジスティック関数の構築によって得られる。
【０１０１】
マーカー組み合わせを疾患に相関させるロジスティック関数は、好ましくは、統計法を適用することによって発展され、そして得られるアルゴリズムを使用する。適切な統計法は、例えば、判別分析（ＤＡ）（すなわち線形、二次、正規化ＤＡ）、カーネル法（すなわちＳＶＭ）、ノンパラメトリック法（すなわちｋ−最近傍分類子）、ＰＬＳ（部分最小二乗）、ツリーに基づく方法（すなわちロジック回帰、ＣＡＲＴ、ランダムフォレスト法、ブースティング／バギング法）、一般化線型モデル（すなわちロジスティック回帰）、主成分に基づく方法（すなわちＳＩＭＣＡ）、一般化加法モデル、ファジー論理に基づく方法、神経ネットワーク及び遺伝子アルゴリズムに基づく方法である。当業者には、本発明のマーカー組み合わせを評価し、そしてそれによって適切な数学的アルゴリズムを得るために適切な統計法を選択する際に何の支障もないであろう。好ましくは、心不全の評価に用いる数学的アルゴリズムを得るために使用する統計法は、ＤＡ（すなわち線形、二次、正規化判別分析）、カーネル法（すなわちＳＶＭ）、ノンパラメトリック法（すなわちｋ−最近傍分類子）、ＰＬＳ（部分最小二乗）、ツリーに基づく方法（すなわちロジック回帰、ＣＡＲＴ、ランダムフォレスト法、ブースティング法）又は一般化線型モデル（すなわちロジスティック回帰）より選択される。これらの統計法に関する詳細は、以下の参考文献に見出される：Ｒｕｃｚｉｎｓｋｉ，  Ｉ．ら，  Ｊ．  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｇｒａｐｈｉｃａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  １２（２００３）４７５−５１１；  Ｆｒｉｅｄｍａｎ，  Ｊ．Ｈ．，  Ｊ．  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ８４（１９８９）１６５−１７５；  Ｈａｓｔｉｅ，  Ｔ．ら，  Ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（２００１）；  Ｂｒｅｉｍａｎ，  Ｌ．ら，  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｒｅｅｓ，  Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９８４）；  Ｂｒｅｉｍａｎ，  Ｌ．，  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  ４５（２００１）５−３２；  Ｐｅｐｅ，  Ｍ．Ｓ．，  Ｔｈｅ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｅｒｉｅｓ，  ２８，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００３）；  ａｎｄ  Ｄｕｄａ，  Ｒ．Ｏ．ら，  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  第２版（２００１）。
【０１０２】
本発明の好ましい態様は、生物学的マーカーの根底にある組み合わせに関して、最適化された多変数カットオフを用いて、そして状態Ｂから状態Ａを、例えば、それぞれ、正常個体及び心不全のリスクがある個体、療法に対して反応性であるＨＦ患者及び療法に失敗する患者、急性心不全を有する患者及び慢性心不全を有するＨＦ患者、疾患進行を示すＨＦ患者及び疾患進行を示さないＨＦ患者を区別することである。
【０１０３】
受信者動作特性曲線下面積（＝ＡＵＣ）は、診断法の性能又は精度の指標である。診断法の精度は、受診者動作特性（ＲＯＣ）によって最適に記載される（特に、Ｚｗｅｉｇ，  Ｍ．Ｈ．，及びＣａｍｐｂｅｌｌ，  Ｇ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ３９（１９９３）５６１−５７７を参照されたい）。ＲＯＣグラフは、観察されるデータの全範囲に渡って、決定閾値を連続して変化させることから生じる、感受性／特異性対すべてのプロットである。
【０１０４】
実験室試験の臨床性能は、その診断精度、又は臨床的に適切な下位群に被験体を正しく分類する能力に応じる。診断精度は、試験が、検査する被験体の２つの異なる状態を正確に区別する能力を測定する。こうした状態は、例えば、健康及び疾患又は疾患進行対疾患進行なしである。
【０１０５】
各場合で、ＲＯＣプロットは、決定閾値の全範囲に関して、１−特異性に対して感受性をプロットすることによって、２つの分布の間の重複を示す。ｙ軸上は感受性であるか、又は真の陽性の率［（真の陽性の試験結果数）／（真の陽性の数＋偽陰性試験結果数）と定義される］である。これはまた、疾患又は状態の存在下での正値性を指してきている。これは、罹患下位群のみから計算される。ｘ軸上は偽陽性率、又は１−特異性［（偽陽性の結果数）／（真の陰性数＋偽陽性結果数）と定義される］である。これは特異性の指標であり、そして完全に非罹患下位群から計算される。２つの異なる下位群からの試験結果を用いることによって、真及び偽陽性率は、完全に別個に計算されるため、ＲＯＣプロットは、試料中の疾患の有病率とは独立である。ＲＯＣプロット上の各点は、特定の決定閾値に対応する感受性／１−特異性対に相当する。完全な区別（結果の２つの分布に重複がない）を伴う試験は、上部左隅を通って通過するＲＯＣプロットを有し、真の陽性率は１．０、又は１００％（完全感度）であり、そして偽陽性率が０である（完全特異性）。区別がない試験（２つの群に関する結果が同一分布である）に関する理論的プロットは、下部左隅から上部右隅への４５°の対角線である。大部分のプロットはこれらの２つの極値の間に属する。（ＲＯＣプロットが４５°対角線の完全に下に属する場合、これは「陽性」の基準を「より大きい」から「未満」に反転させることによって、又はその逆によって、容易に訂正される）。定性的には、プロットが上部左隅に近ければ近いほど、試験の全体の精度がより高い。
【０１０６】
１つの慣用的な目的は、実験室試験の診断精度を定量化し、単一の数字によってその性能を表すことである。最も一般的な全体の測定値は、ＲＯＣプロット下の面積（ＡＵＣ）である。慣例により、この面積は、常に≧０．５である（そうでないならば、そうなるように決定規則を反転させることが可能である）。値の範囲は１．０（２つの群の試験値の完全な分離）及び０．５（試験値の２つの群間に明らかな分布相違がない）の間にある。面積は、対角線に最も近い点又は９０％特異性の感度などのプロットの特定の部分のみに依存せず、全プロットに依存する。これは定量的であり、ＲＯＣプロットが完全なもの（面積＝１．０）にどのくらい近いかを記述する表現である。
【０１０７】
全体のアッセイ感度は、本明細書に開示する方法を実施するために必要な特異性に応じるであろう。特定の好ましい設定において、７５％の特異性が十分であり、そして統計法及び生じるアルゴリズムは、この特異性の必要性に基づくことも可能である。１つの好ましい態様において、心不全のリスクがある個体を評価するために用いられる方法は、８０％、８５％の特異性に基づき、あるいはまた、９０％又は９５％が好ましい。
【０１０８】
上に論じるように、マーカーＣＲＹＡＢは、心不全を発展させる個体のリスクの評価を補助するとともに、心不全を有する患者のさらなるｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断評価を補助する。したがって、好ましい態様は、心不全評価におけるマーカー分子としてのＣＲＹＡＢの使用である。
【０１０９】
ＣＲＹＡＢ及び１以上の他のＨＦマーカーを含むマーカー組み合わせの、ＨＦ患者評価における又はＨＦのリスクに関する個体の評価における使用は、本発明のさらに好ましい態様に相当する。こうしたマーカー組み合わせにおいて、１以上の他のマーカーは、好ましくは、ナトリウム利尿ペプチドマーカー、心臓トロポニンマーカー、及び炎症マーカーからなる群より選択される。
【０１１０】
ＣＲＹＡＢの測定と組み合わせることが可能な、１以上の好ましい選択される他のＨＦマーカーは、好ましくは、ナトリウム利尿ペプチドマーカー、心臓トロポニンマーカー、及び炎症マーカーからなる群より選択される。その測定値（単数又は複数）が、ＣＲＹＡＢの測定値と好ましくは組み合わせられる、又はそれらがＣＲＹＡＢを含むＨＦマーカー組み合わせの一部を形成する、これらの好ましい他のマーカーを、それぞれ、以下により詳細に論じる。
【０１１１】
ナトリウム利尿ペプチドマーカー
ナトリウム利尿ペプチドマーカーは、本発明の意味において、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）ファミリーより選択されるマーカー又は脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）ファミリーより選択されるマーカーのいずれかである。
【０１１２】
心房性ナトリウム利尿ペプチドファミリー又は脳ナトリウム利尿ペプチドファミリーのいずれかのポリペプチドマーカーは、対応する活性ホルモンのプレプロ型に由来する。
本発明にしたがって好ましいナトリウム利尿ペプチドは、ＮＴ−プロＡＮＰ、ＡＮＰ、ＮＴ−プロＢＮＰ、ＢＮＰ、及びその免疫学的に検出可能な生理学的断片である。当業者が容易に認識するであろうように、免疫学的に検出可能な断片は、こうした生理学的断片の特異的検出を可能にする、少なくとも１つのエピトープを含まなければならない。生理学的断片は、個体の循環中に天然に存在するような断片である。
【０１１３】
両方のナトリウム利尿ペプチドファミリー中のマーカーは、対応するプロホルモン、すなわちそれぞれプロＡＮＰ及びプロＢＮＰの断片に相当する。両方のファミリーに類似の考慮が当てはまるため、ＢＮＰマーカーファミリーのみをある程度詳細に記載するものとする。ＢＮＰファミリーのプロホルモン、すなわちプロＢＮＰは１０８アミノ酸からなる。プロＢＮＰは、生物学的活性ホルモンＢＮＰに相当する３２のＣ末端アミノ酸（７７〜１０８）、及びＮ末端プロＢＮＰ（又はＮＴ−プロＢＮＰ）と称されるＮ末端アミノ酸１〜７６に切断される。ＢＮＰ、Ｎ−末端プロＢＮＰ（１〜７６）ならびにさらなる分解産物（Ｈｕｎｔ，  Ｐ．Ｊ．ら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍ．  ２１４（１９９５）１１７５−１１８３）は、血液中を循環する。完全前駆体分子（プロＢＮＰ  １〜１０８）もまた、血漿中に存在するかどうかは完全には解明されていない。しかし、血漿中の低放出のプロＢＮＰ（１〜１０８）が検出可能であるが、Ｎ末端で非常に迅速に部分的に分解されるため、いくつかのアミノ酸が存在しないことが記載されている（Ｈｕｎｔ，  Ｐ．Ｊ．ら，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １８（１９９７）１４７５−１４８１）。今日、一般的に、例えばＮＴ−プロＢＮＰに関して、アミノ酸１０〜５０の間にある分子の中央部分が生理学的にむしろ安定な部分に相当すると認められている。ＮＴ−プロＢＮＰのこの中央部分を含むＮＴ−プロＢＮＰ分子は、体液から信頼可能に測定可能である。ＮＴ−プロＢＮＰ分子のこの中央部分の免疫学的検出に基づく方法に関連する詳細な開示がＷＯ  ００／４５１７６に提供されており、そして詳細は該文献を参照されたい。用語、天然ＮＴ−プロＢＮＰが提唱されている、ＮＴ−プロＢＮＰの特定のサブフラクションのみを測定することがさらに好適でありうる。ＮＴ−プロＢＮＰのこのサブフラクションに関する詳細な開示が、ＷＯ  ２００４／０９９２５３に見出される。当業者は、すべての必要な指示を該文献に見出すであろう。好ましくは、測定するプロ−ＢＮＰは、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ由来のＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ＮＴ−プロＢＮＰアッセイで測定されるようなＮＴ−プロＢＮＰであるか又はこれに対応する。
【０１１４】
前分析は、ＮＴ−プロＢＮＰでロバストであり、試料を中央実験室に容易に輸送可能である（Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｔ．ら，  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌａｂ．  Ｍｅｄ．  ４２（２００４）９４２−９４４）。血液試料は、室温で数日間保存可能であるか、あるいは回収ロスなしに郵送又は輸送可能である。対照的に、ＢＮＰを室温又は４℃で４８時間保存すると、少なくとも２０％の濃度ロスを生じる（Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｔら、上記；  Ｗｕ，  Ａ．Ｈ．ら，  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ５０（２００４）８６７−８７３）。
【０１１５】
脳由来ナトリウム利尿ペプチドファミリー（特にＢＮＰ及びＮＴ−プロＢＮＰ）は、ＨＦの特定の集団のスクリーニングにおいて、完全に調べられてきている。これらのマーカー、特にＮＴ−プロＢＮＰでの知見は、非常に有望である。無症候性「患者」においてさえ、ＮＴ−プロＢＮＰ値の上昇は、「心臓の問題」の明らかな指標である（Ｇｒｅｍｍｌｅｒ，  Ｂ．ら，  Ｅｘｐ．  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ８（２００３）９１−９４）。これらの著者は、ＮＴ−プロＢＮＰ上昇が、「心臓腎臓損傷」の存在を示し、そしてさらなる検査の照会を促すべきであることを示した。研究者のいくつかの他のグループと一致して、Ｇｒｅｍｍｌｅｒらはまた、集団においてＨＦの排除のために、そして息切れがする被験体において左心室機能不全（＝ＬＶＤ）を排除する際の両方で、異常なＮＴ−プロＢＮＰ濃度が正確な診断試験であることも見出した。ＨＦ又はＬＶＤを排除する際の負のＢＮＰ又はＮＴ−プロＢＮＰ値の役割は、他の研究者のグループによって裏付けられている。例えば、ＭｃＤｏｎａｇｈ，  Ｔ．Ａ．ら，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌ．  ６（２００４）２６９−２７３；及びＧｕｓｔａｆｓｓｏｎ，  Ｆら，  Ｊ．  Ｃａｒｄ．  Ｆａｉｌ．  １１，  Ｓｕｐｐｌ．  ５（２００５）Ｓ１５−２０を参照されたい。
【０１１６】
ＢＮＰは、主に（しかし排他的ではない）心室で産生され、そして壁張力増加に際して放出される。したがって、放出されるＢＮＰの増加は、主に、心室の機能不全、あるいは心房で生じるが、例えば損なわれた流入又は血液体積負荷を通じて、心室に影響を及ぼす機能不全を反映する。ＢＮＰと対照的に、ＡＮＰは主に心房で産生され、そして放出される。ＡＮＰレベルは、したがって、主に心房機能を反映する可能性もある。
【０１１７】
ＡＮＰ及びＢＮＰは活性ホルモンであり、そしてそれぞれの不活性対応物ＮＴ−プロＡＮＰ及びＮＴ−プロＢＮＰよりも短い半減期を有する。ＢＮＰは、血液中で代謝され、一方、ＮＴ−プロＢＮＰは、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）分子として血液中を循環し、それ自体として腎臓で排出される。ＮＴ−プロＢＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は、２０分であるＢＮＰのものより１２０分長い（Ｓｍｉｔｈ，  Ｍ．Ｗ．ら，  Ｊ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １６７（２０００）２３９−２４６）。
【０１１８】
したがって、時間経過又は関心対象の特性に応じて、ナトリウム利尿ペプチドの活性又は不活性型いずれかの測定は好適でありうる。
心不全のリスクがある個体の評価において、ＣＲＹＡＢに関して測定された値を、好ましくはＮＴ−プロＡＮＰ及び／又はＮＴ−プロＢＮＰに関する値と組み合わせる。好ましくは、ＮＴ−プロＢＮＰに関する値を、ＣＲＹＡＢに関する値と組み合わせる。類似の考慮は、適切な療法を選択し、疾患進行のリスクを判断し、そして疾患経過を監視するためにも当てはまる。
【０１１９】
ＣＲＹＡＢを、療法に対する患者の反応を評価する際に用いる場合、測定を、好ましくは、ＡＮＰ又はＢＮＰの測定と組み合わせる。
ＣＲＹＡＢを用いて、急性及び慢性心不全間を区別する場合、好ましいマーカー組み合わせは、ＣＲＹＡＢ、ＡＮＰ又はプロＡＮＰ及びＢＮＰ又はプロＢＮＰを含む。
【０１２０】
心臓トロポニンマーカー
用語、心臓トロポニンは、トロポニンＩ及びトロポニンＴの心臓アイソフォームに関する。上記にすでに示すように、用語、マーカーはまた、生理学的断片又は複合体のようなマーカー分子の生理学的変異体にも関する。心臓トロポニンマーカーに関して、その生理学的に存在する複合体は診断に適切であることが知られ、そして本明細書に完全に含まれる。
【０１２１】
トロポニンＴは、約３７．０００Ｄａの分子量を有する。心臓組織に見られるトロポニンＴアイソフォーム（ｃＴｎＴ）は、骨格筋ＴｎＴとは十分に異なり、これらのＴｎＴアイソフォームの両方を区別する抗体の産生が可能である。ＴｎＴは、急性心筋損傷のマーカーと見なされる；Ｋａｔｕｓ，  Ｈ．Ａ．ら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ２１（１９８９）１３４９−１３５３；  Ｈａｍｍ，  Ｃ．Ｗ．ら，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３２７（１９９２）１４６−１５０；  Ｏｈｍａｎ，  Ｅ．Ｍ．ら，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３３５（１９９６）１３３３−１３４１；  Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｏｎ，  Ｒ．Ｈ．ら，  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ４４（１９９８）４９４−５０１；及びＥＰ  ０  ３９４  ８１９を参照されたい。
【０１２２】
トロポニンＩ（ＴｎＩ）は、筋肉組織に見られる、トロポニン複合体の２５ｋＤａ阻害性要素である。ＴｎＩは、Ｃａ２＋の非存在化でアクチンに結合し、アクトミオシンのＡＴＰアーゼ活性を阻害する。心臓組織に見られるＴｎＩアイソフォーム（ｃＴｎＩ）は、骨格筋ＴｎＩと４０％異なり、両方のアイソフォームを免疫学的に区別することが可能となる。ｃＴｎＩの正常血漿濃度は＜０．１ｎｇ／ｍｌ（４ｐＭ）である。ｃＴｎＩは、心臓細胞死の後、血流内に放出され；したがって、血漿ｃＴｎＩ濃度は、急性心筋梗塞患者で上昇する（Ｂｅｎａｍｅｒ，  Ｈ．ら，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ８２（１９９８）８４５−８５０）。
【０１２３】
トロポニンＩ及びＴのユニークな心臓アイソフォームは、これらを骨格筋の他のトロポニンから免疫学的に区別することを可能にする。したがって、損傷を受けた心筋からのトロポニンＩ及びＴの血液内への放出は、心臓組織の損傷に特に関連しうる。今日、また、当業者には、心臓トロポニンは遊離型で又は複合体の一部としてのいずれかで循環から検出可能であることも認識される（例えば、ＵＳ  ６，３３３，３９７、ＵＳ  ６，３７６，２０６及びＵＳ  ６，１７４，  ６８６を参照されたい）。
【０１２４】
心不全のリスクがある個体の評価において、ならびに心不全に罹患している患者の評価において、ＣＲＹＡＢに関して測定される値を、好ましくは、トロポニンＴ及び／又はトロポニンＩの心臓アイソフォームに関する値と組み合わせる。マーカーＣＲＹＡＢと組み合わせて用いられる好ましい心臓トロポニンは、心臓トロポニンＴである。
【０１２５】
炎症マーカー
当業者は、用語、炎症マーカーをよく知っている。好ましい炎症マーカーは、インターロイキン−６、Ｃ反応性タンパク質、血清アミロイドＡ及びＳ１００タンパク質である。
【０１２６】
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、多くの生物学的活性を有する２１ｋＤａ分泌タンパク質であり、該活性は、造血に関与するもの及び生得的免疫反応の活性化に関与するものに分けられうる。ＩＬ−６は、急性期反応物であり、そして接着分子を含む多様なタンパク質の合成を刺激する。その主な機能は、肝臓タンパク質の急性期産生を仲介することであり、そしてその合成は、サイトカインＩＬ−１及びＴＮＦ−αによって誘導される。ＩＬ−６は通常、マクロファージ及びＴリンパ球によって産生される。ＩＬ−６の正常血清濃度は＜５ｐｇ／ｍｌである。
【０１２７】
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、宿主防御に関与する２１ｋＤａサブユニットを持つ、ホモ五量体Ｃａ２＋結合性急性期タンパク質である。ＣＲＰ合成は、ＩＬ−６によって、そして間接的にＩＬ−１によって誘導され、これは、ＩＬ−１が肝臓類洞中のクッパー細胞によるＩＬ−６合成を誘発可能であるためである。ＣＲＰの正常血漿濃度は、健康な集団の９０％で＜３μｇ／ｍｌ（３０ｎＭ）であり、そして健康な個体の９９％で＜１０μｇ／ｍｌ（１００ｎＭ）である。血漿ＣＲＰ濃度は、例えばＥＬＩＳＡによって測定可能である。これは主に、ＩＬ−１、ＩＬ−６又はＴＮＦ−α刺激に反応して肝臓によって合成され、そしてＴ細胞依存性免疫反応の制御に関与する。急性事象に際して、ＳＡＡ濃度は、最大１０００倍増加し、ミリリットルあたり１ミリグラムに到達する。これは、膿疱性線維症、腎移植拒絶、外傷又は感染と非常に広い疾患における炎症を監視するために用いられる。関節リウマチにおいて、特定の場合には、ＳＡＡはＣＲＰの代替物として使用されるが、なお広く認められてはいない。
【０１２８】
Ｓ１００タンパク質は、Ｃａ２＋結合タンパク質の一定して増加し続けているファミリーを形成し、今日では２０を超えるメンバーが含まれる。Ｓ１００タンパク質の生理学的に適切な構造は、ホモ二量体であるが、いくつか、例えばＳ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９はまた、互いにヘテロ二量体を形成することも可能である。細胞内機能は、タンパク質リン酸化、酵素活性、細胞骨格の動力学の制御から、細胞増殖及び分化における関与までに渡る。いくつかのＳ１００タンパク質はまた、細胞から放出されるため、細胞外機能もまた記載されてきており、例えば神経生存、星状細胞増殖、アポトーシスの誘導及び炎症プロセスの制御がある。Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ヘテロ二量体Ｓ１００Ａ８／Ａ９及びＳ１００Ａ１２は、炎症において見出され、Ｓ１００Ａ８は慢性炎症に反応し、一方、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ８／Ａ９及びＳ１００Ａ１２は急性炎症で増加する。Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ８／Ａ９及びＳ１００Ａ１２は、いくつかの癌、腎同種移植片拒絶、大腸炎及び最も重要にはＲＡを含む、炎症性構成要素を伴う異なる疾患に結びつけられてきている（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ，  Ｇ．及びＧａｌｌａｃｃｈｉ，  Ｇ．，  Ｉｎｆｌａｍｍｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３（１９９５）２２１−２３０；  Ｆｏｅｌｌ，  Ｄ．ら，  Ｒｈｅｕｍａｔｈｏｌｏｇｙ  ４２（２００３）１３８３−１３８９）。ＨＦに対するリスクがある個体又はＨＦを有する患者を評価するために、例えば本発明にしたがったマーカー組み合わせで使用するために最も好ましいＳ１００マーカーは、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ８／Ａ９ヘテロ二量体及びＳ１００Ａ１２である。
【０１２９】
ｓＥ−セレクチン（可溶性内皮白血球接着分子−１、ＥＬＡＭ−１）は、１１５ｋＤａ、Ｉ型膜貫通糖タンパク質であり、内皮細胞上でのみ、そして炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α）又は内毒素による活性化の後にのみ、発現される。細胞表面Ｅーセレクチンは、炎症部位での白血球の血管外漏出に必須の工程である、内皮への白血球の回転付着の仲介因子であり、それによって、局所炎症反応における重要な役割を演じる。可溶性Ｅ−セレクチンは、健康な個体の血中に見られ、これはおそらく、表面発現分子のタンパク質分解切断から生じる。血清中のｓＥ−セレクチンレベルの上昇は、多様な生理学的条件下で報告されてきている（Ｇｅａｒｉｎｇ，  Ａ．Ｊ．及びＨｅｍｉｎｇｗａｙ，  Ｉ．，  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ６６７（１９９２）３２４−３３１）。
【０１３０】
好ましい態様において、本発明は、個体から得た液体試料由来のＨＦの評価における、ＨＦに関する１以上のマーカー分子と組み合わせた、ＨＦに関するマーカー分子としてのＣＲＹＡＢの使用に関する。
【０１３１】
上に示すように、本発明記載の好ましい態様において、ＣＲＹＡＢに関して測定される値を、ナトリウム利尿ペプチドマーカー、心臓トロポニンマーカー、及び炎症マーカーからなる群より選択される少なくとも１つのさらなるマーカーの値と少なくとも組み合わせる。
【０１３２】
１つの態様において、本発明は、心不全の評価における、ＣＲＹＡＢ、ならびにナトリウム利尿ペプチドマーカー、心臓トロポニンマーカー、及び炎症マーカーからなる群より選択される１以上の他の心不全マーカーを含むマーカー組み合わせの使用に関する。
【０１３３】
好ましい態様において、本発明は、心不全の評価におけるＣＲＹＡＢ及びＮＴ−プロＢＮＰのマーカー組み合わせの使用に関する。
好ましい態様において、本発明は、心不全の評価におけるＣＲＹＡＢ及びトロポニンＴのマーカー組み合わせの使用に関する。
【０１３４】
好ましい態様において、本発明は、心不全の評価におけるＣＲＹＡＢ及びＣＲＰのマーカー組み合わせの使用に関する。
さらなる好ましい態様において、本発明は、マーカー、ＣＲＹＡＢ、トロポニンＴ、ＮＴ−プロＢＮＰ及びＣＲＰを含むマーカー組み合わせに関する。
【０１３５】
さらにさらなる好ましい態様において、本発明は、生化学マーカーによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＦを評価する方法であって、試料においてＣＲＹＡＢ及び１以上の他のＨＦマーカーの濃度を測定し、そしてＨＦの評価において、測定された濃度を用いる工程を含む、前記方法において用いるマーカーパネルに関する。
【０１３６】
本発明にしたがったマーカーパネルは、好ましくは、タンパク質アレイ技術を用いて測定される。アレイは、アドレス可能な個々のマーカーのコレクションである。こうしたマーカーは、空間的にアドレス可能であり、例えば、マイクロタイタープレート内に含有されるか、又は平面表面上にプリントされるアレイであり、ここで各マーカーは、別個のＸ及びＹ座標で存在する。あるいは、マーカーは、タグ、ビーズ、ナノ粒子、又は物理特性に基づいてアドレス可能であることも可能である。一般の当業者に知られる方法にしたがって、マイクロアレイを調製することも可能である（例えば、ＵＳ  ５，８０７，５２２；  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｗ．Ｈ．ら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ８（２００２）２９５−３０１；  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｗ．Ｈ．ら，  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ４６（２００２）８８５−８９３を参照されたい）。本明細書記載のアレイは、多数のアドレス可能マーカーを含むいかなる免疫学的アッセイも指す。１つの態様において、アドレス可能マーカーは抗原である。別の態様において、アドレス可能要素は自己抗体である。マイクロアレイは、アレイを小型化したものである。
【０１３７】
本明細書において、抗原は、抗体に特異的に結合可能な任意の分子を指す。用語、自己抗体は、当該技術分野において、よく定義されている。
好ましい態様において、本発明は、マーカーＣＲＹＡＢ及びあってもよい１以上の他のＨＦマーカーを含むタンパク質アレイに関する。
【０１３８】
好ましい態様において、本発明は、マーカーＣＲＹＡＢ及びＮＴ−プロＢＮＰを含むタンパク質アレイに関する。
好ましい態様において、本発明は、マーカーＣＲＹＡＢ及びトロポニンＴを含むタンパク質アレイに関する。
【０１３９】
好ましい態様において、本発明は、マーカーＣＲＹＡＢ及びＣＲＰを含むタンパク質アレイに関する。
好ましい態様において、本発明は、マーカーＣＲＹＡＢ、トロポニンＴ、ＮＴ−プロＢＮＰ及びＣＲＰを含むタンパク質アレイに関する。
【０１４０】
さらにさらなる好ましい態様において、本発明は、ＣＲＹＡＢを特異的に測定するために必要な試薬を含むキットに関する。やはり好ましいのは、ＣＲＹＡＢを特異的に測定するために必要な試薬、及びＨＦマーカー組み合わせでともに用いられる１以上の他の心不全マーカーを測定するために必要な試薬を含む、キットである。
【０１４１】
１つの好ましい態様において、本発明は、ＣＲＹＡＢ、ならびにナトリウム利尿ペプチドマーカー、心臓トロポニンマーカー、及び炎症マーカーからなる群より選択される１以上の他の心不全マーカーを特異的に測定するために必要な試薬を含む、キットに関する。
【０１４２】
以下の実施例、配列表及び図は、その真の範囲を、付随する請求項に示す本発明の理解を補助するために提供される。本発明の精神から逸脱することなく、示す方法において、修飾を作製可能であることが理解される。
【実施例】
【０１４３】
実施例１
心不全のマウスモデル
１．１  Ｒ９Ｃマウスモデル
遺伝性ヒト拡張型心筋症が、ヒト・ホスホランバン（ＰＬＮ）遺伝子におけるＡｒｇ９からＣｙｓへの変換（ＰＬＮ−Ｒ９Ｃ）から生じることが報告されてきている（Ｓｃｈｍｉｔｔ，  Ｊ．Ｐ．ら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９（２００３）１４１０−１４１３）。罹患した患者における拡張型心筋症の開始は、典型的には、青年期に始まり、心機能の進行性の悪化が続き、発作及び死亡につながる。この突然変異のトランスジェニックマウスモデルは、罹患した患者と類似の心臓表現型を示し、そして拡張型心筋症、心臓収縮性減少、及び成熟前の死亡を提示した（Ｓｃｈｍｉｔｔら、２００３、上記）。
【０１４４】
本発明者らは、トランスジェニックマウスの生存曲線を確立した。ＰＬＮ−Ｒ９Ｃマウスは、わずか〜２０週の中央値生存を示し、２４週後に残るのは１５％未満であった（図１Ａ）。ＰＬＮ−Ｒ９Ｃ系統の最初に記録される死亡は、１２週齢で観察され、一方、２４週の期間に渡って野生型対照マウスは１匹しか死亡しなかった。最初に記録された死亡の前の「早」期疾患の代表的な時点として、８週を選択し、一方、８週及び２４週の中点であるため、１６週を選択する（古典的ＤＣＭ）。単離された心臓の病理の詳細な分析によって、ＰＬＮ−Ｒ９Ｃマウスでは、８週齢であっても、心室及び心房肥大の証拠を示す。単離された心筋（野生型及びＰＬＮ−Ｒ９Ｃマウスの両方から得た後、ヘマトキシリン及びエオジン染色）の横断面もまた、左心室拡張、又は心室壁の薄化の証拠を示し、トランスジェニック動物において、８週で始まり、拡張は年齢とともに連続して進行する。
【０１４５】
８週、１６週及び２４週齢の雄マウスに対して、心エコーによって機能的心測定を行う（表１に要約）。前部及び後部壁の厚さの心エコー測定によって、Ｒ９Ｃマウスが８週で有意な拡張を有し、これはマウスの一生を通じて悪化し続けることが示される。心短縮によって評価されるような収縮性（図１Ｂ）もまた、８週で、わずかに、しかし有意に減少し、一方、１６週には、より顕著な減少が明白に明らかである。分析した雌マウスは、雄と同一の知見を示す（データ未提示）。
【０１４６】
表１：
雄マウスでの、８週、１６週及び２４週での野生型及びＲ９Ｃマウスにおける、心エコー及び血行動態パラメータ
【０１４７】
【表１】
2016525693.tif 000003
【０１４８】
表１中の値は平均±ＳＥＭである。表１に用いる記号：ＨＲ＝心拍数；ＡＷ、ＰＷ=前部及び後部壁厚（左心室）；ＬＶＥＤＤ、ＬＶＥＳＤ＝それぞれ、左心室拡張終期寸法及び収縮期寸法；ＦＳ＝短縮率＝（ＬＶＥＤＤ−ＬＶＥＳＤ）／ＬＶＥＤＤｘ１００％；ＥＴＣ＝ＨＲに関して修正した駆出時間；ＶＣＦＣ＝ＨＲに関して修正した周囲短縮速度＝ＦＳ／ＥＴＣ；ＰＡＶＣ＝ＨＲに関して修正したピーク大動脈速度；Ｅ波＝早期充填経僧帽弁拡張波；ＬＶＥＳＰ、ＬＶＥＤＰ＝左心室収縮末期及び拡張期圧；＋ｄＰ／ｄｔｍａｘ＝左心室圧の最大陽性一次導関数；−ｄＰ／ｄｔｍａｘ＝左心室圧の最大陰性一次導関数；ＡＶＡ＝大動脈速度加速（ＰＡＶｃ／加速時間）；＊ＷＴに比較してＰ＜０．０５。
【０１４９】
１．２  大動脈結紮（ＡＢ）マウスモデル
このマウスモデルにおいては、大動脈結紮（ＡＢ）によって引き起こされた圧負荷が心肥大及び心不全を誘導する。
【０１５０】
外科的介入によって、Ｃ５７ＢＬマウスにおいて圧負荷を行う。上行大動脈の狭窄（ｃｏａｒｃｔｉｏｎ）（大動脈結紮として知られる）は、大動脈狭窄に対する一次反応として、特に左心室において、心肥大及び心筋増殖を誘導する。このマウスモデルのより後期の段階で、心臓は肥大し、そして最終的に拡張する。このモデルは、よく特徴付けられており、そして経験に基づいて、１０〜１５％又はそれ未満の低い死亡率で非常に再現性があることが証明されてきている。狭窄後、この動物モデルは、血行動態ストレスに反応した左心室肥大及び心不全の発展進行を評価することを可能にする。
【０１５１】
簡潔には、Ｃ５７ＢＬマウスをケタミン（９０ｍｇ／ｋｇ）及びロンプン（１０ｍｇ／ｋｇ）混合で麻酔し、そして２５ゲージ針を用いて大動脈を結紮する。結紮を針に対して締めないことを除いて、偽手術マウスに同じ外科処置を行う。
【０１５２】
実験時点
肥大反応を調べるため、結紮動物及び偽手術対照を介入１週間、２週間、４週間、及び８週間後に屠殺する。心エコー分析によって心機能及び肥大の発展を評価し、そして死後、組織学検査によって確認する。表２は、心エコーによる、多様な時点で評価される心機能に関する概観を示す。表２に提供する心エコーパラメータに関する詳細は、当業者に知られ、そして例えばＡｓａｈｉ，  Ｍ．ら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１（２００４）９１９９−９２０４、及びＯｕｄｉｔ，  Ｇ．Ｙ．ら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９（２００３）１１８７−１１９４に見られる。
【０１５３】
表２
【０１５４】
【表２】
2016525693.tif 000004
【０１５５】
機能的パラメータに加えて、２週、４週、及び８週のＡＢマウス及び対照マウス由来の心臓組織に、ヘマトキシリン／エオジン（ＨＥ）染色による組織学を行う。組織学は、ＡＢマウスに関して、予期された壊死及びリモデリングプロセスを確認し、一方、偽手術マウスにおいて、心組織がいかなる重大な変化も示さないことを確認する。手術２週間後、結紮マウスの心室は、有意な左心室肥大を示し、これは４週後、さらに進行し、そして術後８週では、末期拡張型心筋症に非常に似ている。
【０１５６】
実施例２
マイクロアレイ分析
未精製組織調製物を、さらなる細胞内小器官の単離なしに、マイクロアレイ分析に用いる。マイクロアレイデータ分析方法論は、文献に記載される（例えば、ＵＳ  ５，８０７，５２２；  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｗ．Ｈ．ら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ８（２００２）２９５−３０１；  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｗ．Ｈ．ら，  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ４６（２００２）８８５−８９３を参照されたい）。
【０１５７】
試料調製及び質量分析
心臓ホモジナイズ及び細胞内小器官単離
心臓を単離し、心房を除去し、心室をカミソリで注意深く刻み、そして氷冷ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で徹底的にリンスして、過剰な血液を除去する。緩いハンドヘルドガラスホモジナイザーを用いて、１０ｍｌ溶解緩衝液（２５０ｍＭスクロース、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＤＴ（ジチオスレイトール）、及び１ｍＭ  ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフロリド））中で、組織を３０秒間ホモジナイズする。すべての続く工程を４℃で行う。ベンチトップ遠心分離機中で溶解物を８００ｘｇで１５分間遠心分離し；上清は、細胞質ゾル、ミトコンドリア、及びミクロソーム分画の供給源として利用される。核を含有するペレットを８ｍｌの溶解緩衝液中に希釈し、そして４ｍｌの０．９Ｍスクロース緩衝液（０．９Ｍスクロース、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＤＴ、及び１ｍＭ  ＰＭＳＦ）上に重層し、そして１０００ｘｇ、４℃で２０分間遠心分離する。生じたペレットを、８ｍｌの２Ｍスクロース緩衝液（２Ｍスクロース、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、及び１ｍＭ  ＰＭＳＦ）中に再懸濁し、４ｍｌの２Ｍスクロース緩衝液上に重層し、そして１５０，０００ｘｇの超遠心で１時間ペレットにする（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ４０．１ローター）。核をペレットとして回収する。７５００ｘｇ、４℃で２０分間の再遠心分離によって、ミトコンドリアを上清から単離し；生じたペレットを溶解緩衝液中で２回洗浄する。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ４１ローター中、１００，０００ｘｇで１時間のミトコンドリア後細胞質超遠心によって、ミクロソームをペレットにする。上清は、細胞質ゾル分画（＝細胞）として利用される。
【０１５８】
細胞内小器官抽出
低張溶解緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）中、氷上で３０分間、ミトコンドリアをインキュベーションすることによって、可溶性ミトコンドリアタンパク質を抽出する。懸濁物を短時間超音波処理し、そして１３，０００ｘｇ、３０分間の遠心分離によって破片を除去する。上清は「ミト１」分画として利用される。生じた不溶性ペレットを膜界面活性剤抽出緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、０．４Ｍ  ＮａＣｌ、１５％グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）中に再懸濁し、そして穏やかに３０分間振盪した後、１３，０００ｘｇで３０分間遠心分離し；上清は「ミト２」分画として利用される。
【０１５９】
膜界面活性剤抽出緩衝液中にミクロソームを再懸濁することによって、膜会合タンパク質を抽出する。懸濁物を穏やかに振盪しながら１時間インキュベーションし、そして不溶性破片を１３，０００ｘｇで３０分間遠心分離することによって除去する。上清は「ミクロ」分画として利用される。
【０１６０】
細胞内小器官抽出物の消化及びＭｕｄＰＩＴ分析
各分画から約１００μｇの総タンパク質（ブラッドフォードアッセイによって決定）のアリコットを、５体積の氷冷アセトンを用いて、約２０℃で一晩沈殿させ、その後、１３，０００ｘｇで１５分間遠心分離する。タンパク質ペレットを少量の８Ｍ尿素、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１ｍＭ  ＤＴＴ中、３７℃で１時間、可溶化した後、暗所中、３７℃で１時間、５ｍＭヨードアセトアミドを用いて、カルボキシアミドメチル化する。次いで、等体積の１００ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ８．５で試料を４Ｍ尿素に希釈し、そして１：１５０倍比のエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カナダ・ケベック州ラバル）で、３７℃で一晩消化する。翌日、１ｍＭの最終濃度までＣａＣｌ２を補充した、等体積の５０ｍＭ重炭酸アンモニウム  ｐＨ８．５で、試料を２Ｍ尿素まで希釈し、そしてＰｏｒｏｓｚｙｍｅトリプシンビーズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カナダ・オンタリオ州ストリーツビル）と回転させながら３０℃で一晩インキュベーションする。製造者の指示にしたがって、生じたペプチド混合物をＳＰＥＣ−Ｐｌｕｓ  ＰＴ  Ｃ１８カートリッジ（Ａｎｓｙｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カリフォルニア州レイクフォレスト）で固相抽出し、そしてさらに使用するまで、−８０℃で保存する。完全に自動化された２０時間の１２工程多周期ＭｕｄＰＩＴ法を記載されるように設定する（Ｋｉｓｌｉｎｇｅｒ，  Ｔ．ら，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍ．  ２（２００３）９６−１０６）。簡潔には、ＨＰＬＣクォータナリーポンプを、ＬＣＱ  ＤＥＣＡ  ＸＰイオン捕捉質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｎｇａｎ、カリフォルニア州サンノゼ）とつなぐ。Ｐ−２０００レーザープラー（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カリフォルニア州ナバト）を用いて、１００μｍ内径の融合シリカキャピラリーマイクロカラム（Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、アリゾナ州フェニックス）を細い先端になるように引き、そして８ｃｍの５μｍ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８樹脂（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カナダ・オンタリオ州ミシサーガ）を充填し、その後、６ｃｍの５μｍ  Ｐａｒｔｉｓｐｈｅｒｅ強陽イオン交換樹脂（Ｗｈａｔｍａｎ、ニュージャージー州クリフトン）を充填する。圧力容器を用いて、個々の試料を手動で別個のカラム上に装填する。クロマトグラフィ溶媒条件は、Ｋｉｓｌｉｎｇｅｒ，  Ｔ．ら，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍ．  ２（２００３）９６−１０６に記載されるものと正確に同じである。
【０１６１】
タンパク質同定及び検証
ＳＥＱＵＥＳＴデータベース検索アルゴリズムを用いて、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬ及びＩＰＩデータベースから得たマウス及びヒトタンパク質配列を投入した局所維持最小冗長性ＦＡＳＴＡ形式データベースにおいて、ペプチドタンデム質量スペクトルをペプチド配列にマッチさせる。経験的偽発見率を統計的に評価して、偽陽性同定に関して調整し、そしてしたがってこれらを最小限にするため、すべてのスペクトルを正常（順方向）及び逆転（逆方向）アミノ酸配向の両方で、タンパク質配列に対して検索する（Ｋｉｓｌｉｎｇｅｒ，  Ｔ．ら，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍ．  ２（２００３）９６−１０６）。次いで、ＳＴＡＴＱＵＥＳＴフィルタリングアルゴリズムをすべての推定上の検索結果に適用し、各候補同定に関する統計的な信頼性の測定値（信頼性スコア）を得る（カットオフｐ値≦．１５、正しいマッチである８５％又はそれより大きい尤度に対応する）。高信頼性マッチは、Ｐｅｒｌに基づくスクリプトを用いる社内ＳＱＬ型データベースへと解析する。データベースは、試料名、実験番号、ＭｕｄＰＩＴ工程、細胞内小器官供給源、アミノ酸配列、分子量、等電点、電荷、及び信頼性レベルに関する情報とともに、所定のタンパク質に対する多数のペプチドマッチングに関して、データベース検索結果及びスペクトル情報（スキャンヘッダー）を収容するよう設計される。信頼性ｐ値が９５％又はそれより高く、そして少なくとも２つのスペクトルが集合的に検出されるタンパク質のみが、さらなる分析のため保持される。
【０１６２】
実施例３
モデル系において得られるデータの統計評価
３．１  Ｒ９Ｃマウスモデルに関する示差発現のｐ値を生成するために用いられる統計法
実施例２に記載するような方法で得られる生データは、１３７の異なる実験実行各々に関して、タンパク質と関連するすべてのスペクトルの合計、スペクトルカウントを含む各６１９０のタンパク質からなる。生データ、タンパク質の６１９０サブセットを全体的な規準化に供し、これはまず、各実行内のデータを等しい数の群に分け、本発明者らの解析に関してはスペクトルカウントに基づいて、１００に設定する。次いで、各群（１〜１００）に対して、類似のスペクトルカウントを持つ遺伝子セットに渡って、スペクトルカウントの相違に関して調節して、ＬＯＥＳＳ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，  Ｗ．Ｓ．及びＤｅｖｌｉｎ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ８３（１９８８）５９６−６１０）を行う。
【０１６３】
本発明者らの生データに基づき、本発明者らは、２つの線形モデルを構築し、第一のモデルは、因数として、対照／疾患、時間（８Ｗ、１６Ｗ、最終）及び位置（細胞、ミクロ、ミトＩ、ミトＩＩ）を用い、そして：
実行カウント＝β０＋β１時間＋β２時間２＋β３位置＋β４対照（１）
を用いて記載される。
【０１６４】
第二のモデルは、因数として、時間（８Ｗ、１６Ｗ、最終）及び位置（細胞、ミクロ、ミトＩ、ミトＩＩ）のみを用い、そして：
実行カウント＝β０＋β１時間＋β２時間２＋β３位置（２）
を用いて記載され、式中、β０は切片項であり、そしてβ１、β２、β３、及びβ４は、変数、時間、時間平方、位置、及び対照／疾患に関する傾斜概算である。
【０１６５】
Ａｎｏｖａを用いて、２つのモデル間に相違は全くないというヌル仮説で、２つのモデルを比較する。次いで、低いｐ値は、２つのモデルが同じであるというために十分な証拠がないことを示す。過剰な情報によって、状態（すなわち対照／疾患）がモデルの有意な構成要素であるようであることが示される。本発明者らの対照及び疾患モデル間の相対的タンパク質存在量に有意な変化を有するタンパク質を抽出するため、計算されたｐ値に基づいて、６１９０タンパク質の本発明者らのリストをランク付けする。これは、ｐ値＜０．０５の５９３のタンパク質セットを生成する。
【０１６６】
上記モデルから試験中の多数の仮説を考慮するため、次いで、偽発見率（ＦＤＲ）修正、特にベンジャミン−ホッホバーグＦＤＲ修正を用いて、ｐ値を修正する（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ，  Ｙ．，及びＨｏｃｈｂｅｒｇ，  Ｙ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｂ．  ５７（１９９５）２８９−３００）。これは、Ｒ９Ｃマウスモデルに関して、修正ｐ値＜０．０５を伴う４０タンパク質のセットを生成する。
【０１６７】
３．２  大動脈結紮マウスモデルに関する示差発現のｐ値を生成するために用いられる統計法
大動脈結紮マウスモデルにおける６８回の実験実行から、スペクトルカウントを伴う３１５２のタンパク質が同定される。同じデータ分析を、Ｒ９Ｃマウスモデルに関して上述するような大動脈結紮マウスモデルに関して、データベースに適用する。
【０１６８】
実施例４
４．１．  ヒト血清及び血漿試料におけるＣＲＹＡＢの測定のためのＥＬＩＳＡ
ヒト血清又は血漿においてＣＲＹＡＢを検出するため、Ｃｕｓａｂｉｏ、中国・武漢より購入したサンドイッチＥＬＩＳＡを用いた。このアッセイは、定量的サンドイッチ酵素イムノアッセイ技術を使用する。製造者によって提供されるプロトコルにしたがって、アッセイを行った。簡潔には；マイクロタイタープレートのウェルにあらかじめコーティングされたＣＲＹＡＢに特異的な第一の抗体を提供する。標準及び試料をウェル内にピペッティングし、そして試料中に存在するＣＲＹＡＢが、この最初の工程で、固定抗体によって結合される。いかなる未結合物質も除去した後、ビオチンコンジュゲート化された、ＣＲＹＡＢに特異的な第二の抗体をウェルに添加する。洗浄後、アビジンコンジュゲート化セイヨウワサビ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をウェルに添加する。いかなる未結合アビジン−酵素試薬も除去する、さらなる洗浄工程に続き、基質溶液をウェルに添加し、そして最初の工程で結合したＣＲＹＡＢの量に比例して発色が起こる。発色を停止し、そして色の強度を測定する。
【０１６９】
４．２．  それぞれ、ＨＦ患者及び見かけ上健康なドナーの血清におけるＣＲＹＡＢの測定のためのＥＬＩＳＡ
マーカーＣＲＹＡＢの有用性をさらに評価するため、ＨＦ患者（ｎ＝５０）由来の血清及び明らかに健康な対照患者３０人の血清のパネルを調べた。表３は、これらのパネルの結果を示す：
表３：ＣＲＹＡＢ  ＥＬＩＳＡ結果
【０１７０】
【表３】
2016525693.tif 000005
【０１７１】
表３に要約するデータはまた、図３に示すボックスプロットを計算するためにも用いられてきている。図３は、明らかに健康な対照個体由来の血清において測定されるようなＣＲＹＡＢ値に比較した際、心不全を有する患者由来の血清中で測定されるような平均ＣＲＹＡＢ値に、かなりの相違があることを立証する。ＣＲＹＡＢ値の増加は心不全の指標である。心不全患者由来の血清試料の８２％において、９６．７％の特異性で、マーカーＣＲＹＡＢは陽性であり、すなわちカットオフより高かった。
【０１７２】
実施例５
心不全評価におけるマーカーＣＲＹＡＢを含むマーカー組み合わせ
実施例５．１．  マーカー組み合わせＮＴ−プロＢＮＰ及びＣＲＹＡＢ
マーカー組み合わせＮＴ−プロＢＮＰ及びＣＲＹＡＢを、それぞれ、病期Ｂ及び病期Ｃ＋Ｄの患者の区別のために評価する。よく特徴付けられた個体群、すなわちＨＦ分類に関するＡＣＡ／ＡＣＣ基準にしたがった病期Ｂにある５０人の個体、及びＨＦに罹患し、そしてＨＦ分類に関するＡＣＡ／ＡＣＣ基準にしたがった病期Ｃにある５０人の患者から得た個々の液体試料を分析することによって、診断精度を評価する。商業的に入手可能なアッセイ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＮＴ−プロＢＮＰアッセイ（Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍｓイムノアッセイ分析装置に関するカタログ番号０３  １２１  ６４０  １６０））によって測定するようなＮＴ−プロＢＮＰ、及び上述のように測定するＣＲＹＡＢを、これらの個体各々から得た血清試料において定量化する。Ｚｗｅｉｇ，  Ｍ．Ｈ．及びＣａｍｐｂｅｌｌ，  Ｇ．、上記にしたがって、ＲＯＣ分析を行う。確立されたマーカーＮＴ−プロＢＮＰとＣＲＹＡＢの組み合わせに関する、病期Ｂの個体から病期Ｃの患者を区別する識別能を、正規化識別分析によって計算する（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，  Ｊ．  Ｈ．，  Ｒｅｇｕｌａｒｉｚｅｄ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ８４（１９８９）１６５−１７５）。
【０１７３】
実施例５．２．  マーカー組み合わせトロポニンＴ及びＣＲＹＡＢ
マーカー組み合わせトロポニンＴ及びＣＲＹＡＢを、それぞれ、慢性心疾患に罹患した患者から、急性心臓事象に罹患した患者を区別するために評価する。よく特徴付けられた個体群、すなわち急性心臓事象を有すると診断される５０人の個体、及び慢性心疾患を有すると診断される５０人の個体から得た個々の液体試料を分析することによって、診断精度を評価する。商業的に入手可能なアッセイ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、トロポニンＴアッセイ（Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍｓイムノアッセイ分析装置に関するカタログ番号２０１  ７６  ４４））によって測定するようなトロポニンＴ、及び上述のように測定するＣＲＹＡＢを、これらの個体各々から得た血清試料において定量化する。Ｚｗｅｉｇ，  Ｍ．Ｈ．及びＣａｍｐｂｅｌｌ，  Ｇ．、上記にしたがって、ＲＯＣ分析を行う。確立されたマーカー、トロポニンＴとＣＲＹＡＢの組み合わせに関する、病期Ｂの個体から病期Ｃの患者を区別する識別能を、正規化識別分析によって計算する（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，  Ｊ．  Ｈ．，  Ｊ．  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ８４（１９８９）１６５−１７５）。
【０１７４】
実施例５．３．  マーカー組み合わせＣＲＹＡＢ及びＣＲＰ
マーカー組み合わせＣ反応性タンパク質及びＣＲＹＡＢを、それぞれ、心筋症を有すると診断された患者対いかなる交絡する心疾患にも罹患していない対照の区別のために評価する。よく特徴付けられた心筋症を有する５０人の個体群、及び５０人の健康な対照群から得た個々の液体試料を分析することによって、診断精度を評価する。商業的に入手可能なアッセイ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＣＲＰアッセイ（Ｔｉｎａ−ｑｕａｎｔ  Ｃ反応性タンパク質（ラテックス）高感度アッセイ−Ｒｏｃｈｅカタログ番号１１９７２８５５  ２１６）によって測定するようなＣＲＰ、及び上述のように測定するＣＲＹＡＢを、これらの個体各々から得た血清試料において定量化する。Ｚｗｅｉｇ，  Ｍ．Ｈ．及びＣａｍｐｂｅｌｌ，  Ｇ．、上記にしたがって、ＲＯＣ分析を行う。確立されたマーカーＣＲＰとＣＲＹＡＢの組み合わせに関する、病期Ｂの個体から病期Ｃの患者を区別する識別能を、正規化識別分析によって計算する（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，  Ｊ．  Ｈ．，  Ｊ．  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ８４（１９８９）１６５−１７５）。
【０１７５】
前述の発明は、明確さ及び理解の目的のため、ある程度詳細に記載されてきているが、当業者は、付随する請求項における本発明の真の範囲から逸脱することなく、型及び詳細の多様な変化を作製可能であることを、開示を読むことで認識するであろう。
【０１７６】
すべての刊行物、特許及び出願は、各々のこうした参考文献が特に、そして個々に、その全体が本明細書に援用されると示されているのと同じ度合いまで、その全体が本明細書に援用される。
【図１】
2016525693.tif 000006
【図２】
2016525693.tif 000007
【図３】
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【配列表】
2016525693000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年5月21日(2015.5.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体において心不全を評価するための方法であって、
ａ）個体から得た試料において、マーカーＣＲＹＡＢの濃度を測定し、
ｂ）試料において、１以上の他の心不全マーカーの濃度を測定してもよく、そして
ｃ）工程（ａ）において測定した濃度及び工程（ｂ）において測定してもよい濃度を、対照試料において確立されるようなこのマーカー又はこれらのマーカーの濃度に比較することによって心不全を評価する、ここで試料中のＣＲＹＡＢ濃度の増加が心不全の指標である、
工程を含み、
前記試料が、血清、血漿、及び全血からなる群より選択されることでさらに特徴付けられる、
前記方法。
【請求項２】
前記の１以上の他のマーカーが、ナトリウム利尿ペプチドマーカー、心臓トロポニンマーカー、及び炎症マーカーからなる群より選択されることでさらに特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の１以上の他のマーカーがＮＴ−プロＢＮＰであることでさらに特徴付けられる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記の１以上の他のマーカーがトロポニンＴであることでさらに特徴付けられる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
心不全の評価における、マーカー分子としてのタンパク質ＣＲＹＡＢの使用であって、対照試料と比較した際の個体から得た試料におけるＣＲＹＡＢのレベル増加の検出が、心不全の指標であり、前記試料が、血清、血漿及び全血からなる群より選択されることでさらに特徴付けられる、前記使用。
【請求項６】
心不全の評価における、ＣＲＹＡＢ及び１以上の他の心不全マーカーを含む、マーカー組み合わせの使用であって、対照試料と比較した際の個体から得た試料におけるＣＲＹＡＢのレベル増加の検出が、心不全の指標であり、前記試料が、血清、血漿及び全血からなる群より選択されることでさらに特徴付けられる、前記使用。
【請求項７】
前記の１以上の他のマーカーが、ナトリウム利尿ペプチドマーカー、心臓トロポニンマーカー、及び炎症マーカーからなる群より選択される、請求項６に記載のマーカー組み合わせの使用。
【請求項８】
少なくともＣＲＹＡＢ及びＮＴ−プロＢＮＰを含む、請求項７に記載のマーカ組み合わせの使用。
【請求項９】
前記マーカーＣＲＹＡＢを、心不全のリスクがある個体から得た試料において測定する、請求項１に記載の方法。
【国際調査報告】
2016525693.tif 000009
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2016525693.tif 000011