(57)【要約】  本開示は一般にＴ細胞活性化及び特異的標的細胞への再指向のための新規な二重特異性抗原結合分子に関する。また、本発明は、そのような二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本開示は更に、本発明の二重特異性抗原結合分子を生産するための方法、及び疾患の治療にこれら二重特異性抗原結合分子を使用する方法に関する。
2016512421.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一方が活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子であり、他方が標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第一及び第二の抗原結合部分と、安定な結合が可能な第一及び第二のサブユニットからなるＩｇＧ４のＦｃドメインとを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって；
第一の抗原結合部分が、
（ａ）Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖がペプチドリンカーによって連結されている単鎖Ｆａｂ分子、又は
（ｂ）Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変又は定常領域の何れかが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子
である、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２】
活性化Ｔ細胞抗原への特異的結合が可能な一以下の抗原結合部分を含む、請求項１に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３】
第一及び第二の抗原結合部分が、任意でペプチドリンカーを介して、互いに融合される、請求項１又は２に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４】
第二の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第一の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合している、請求項１から３の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項５】
第一の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第二の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合している、請求項１から３の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項６】
第一の抗原結合部分がクロスオーバーＦａｂ分子であり、第一の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖と第二の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖が、任意でペプチドリンカーを介して、互いに融合している、請求項４又は５に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項７】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の第二の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖のＣ末端で、第一の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖のＮ末端へ融合している、請求項１から３の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項８】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の第二の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第一又は第二サブユニットのＮ末端へ融合している、請求項１から３、５又は７の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項９】
第一の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第一又は第二サブユニットのＮ末端へ融合している、請求項１から４の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１０】
第一及び第二の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの一方のサブユニットのＮ末端へ各々融合している、請求項１又は２に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１】
標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第三の抗原結合部分を含む、請求項１から１０の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２】
第三の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第一又は第二サブユニットのＮ末端へ融合している、請求項１１に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３】
第二及び第三の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に各々融合され、第一の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第二の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合している、請求項１１又は１２に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４】
第一及び第三の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に各々融合され、第二の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第一の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合している、請求項１１又は１２に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５】
ＩｇＧ４のＦｃドメインがヒトＩｇＧ４のＦｃドメインである、請求項１から１４の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６】
ＩｇＧ４のＦｃドメインが、位置Ｓ２２８（Ｋａｂａｔ番号付け）にアミノ酸置換を含む、請求項１から１５の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１７】
前記アミノ酸置換がＳ２２８Ｐである、請求項１６に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１８】
ＦｃドメインがＦｃドメインの第一及び第二のサブユニットの結合を促進する修飾を含む、請求項１から１７の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項１９】
Ｆｃドメインの第一サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がより大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第二のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内に配置可能である突起を第一サブユニットのＣＨ３ドメイン内に生成し、及びＦｃドメインの第二のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それにより第一のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が配置可能である第二のサブユニット内のＣＨ３ドメイン内の空洞を生成する、請求項１８に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２０】
天然型ＩｇＧ４のＦｃドメインと比較して、ＦｃドメインがＦｃ受容体への結合親和性の低下、及び／又はエフェクター機能の低下を示す、請求項１から１９の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２１】
ＦｃドメインがＦｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含む、請求項１から２０の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２２】
前記一又は複数のアミノ酸置換がＬ２３５及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ番号付け）の群から選択される一又は複数の位置においてである、請求項２１に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２３】
位置Ｌ２３５における前記アミノ酸置換がＬ２３５Ｅであり、位置Ｐ３２９における前記アミノ酸置換がＰ３２９Ｇである、請求項２２に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２４】
ＩｇＧ４のＦｃドメインの各サブユニットがアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐを含む、請求項１から２３の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２５】
ＩｇＧ４のＦｃドメインの各サブユニットがアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ、Ｓ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇを含む、請求項１から２４の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２６】
Ｆｃ受容体がＦｃγ受容体である、請求項２１から２３の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２７】
エフェクター機能が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である、請求項２１から２３の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２８】
活性化Ｔ細胞抗原がＣＤ３である、請求項１から２７の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項２９】
第一の抗原結合部分が、配列番号：２７０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号：２７１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号：２７２の重鎖ＣＤＲ３、配列番号：２７４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号：２７５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号：２７６の軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項２８に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３０】
第一の抗原結合部分が、配列番号：２６９に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号：２７３に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む、請求項２８又は２９に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３１】
標的細胞抗原が、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）からなる群から選択される、請求項１から３０の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３２】
標的細胞抗原が癌胎児性抗原（ＣＥＡ）である、請求項１から３１の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３３】
第二の抗原結合部分が、配列番号：２９０のの重鎖ＣＤＲ１、配列番号：２９１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号：２９２の重鎖ＣＤＲ３、配列番号：２９４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号：２９５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号：２９６の軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項３２に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３４】
第二の抗原結合部分が、配列番号：２８９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号：２９３のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む、請求項３２又は３３に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３５】
標的細胞抗原がメラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）である、請求項１から３１の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３６】
第二の抗原結合部分が、配列番号：２８０のの重鎖ＣＤＲ１、配列番号：２８１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号：２８２の重鎖ＣＤＲ３、配列番号：２８４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号：２８５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号：２８６の軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項３５に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３７】
第二の抗原結合部分が、配列番号：２７９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号：２８３のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む、請求項３５又は３６に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項３８】
ＣＤ３に特異的に結合することができる第一の抗原結合部分、ＭＣＳＰに結合することができる第二の抗原結合部分、及びＩｇＧ４のＦｃドメインを含む、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、配列番号２７８、３１９、３６９及び３７０のアミノ酸配列を含む抗原結合分子。
【請求項３９】
ＣＤ３に特異的に結合することができる第一の抗原結合部分、ＭＣＳＰに結合することができる第二の抗原結合部分、及びＩｇＧ４のＦｃドメインを含む、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、配列番号２７８、３１９、３７１及び３７２のアミノ酸配列を含む抗原結合分子。
【請求項４０】
請求項１から３９の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４１】
請求項４０に記載の単離されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
【請求項４２】
請求項４０に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター、特に発現ベクター。
【請求項４３】
請求項４０に記載の単離されたポリヌクレオチド又は請求項４２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４４】
ａ）Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で請求項４３に記載の宿主細胞を培養する工程と、ｂ）Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収する工程を含む、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を生産する方法。
【請求項４５】
請求項４４の方法により生産されたＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
【請求項４６】
請求項１から３９又は４５の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物。
【請求項４７】
医薬としての使用のための、請求項１から３９又は４５の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は請求項４６に記載の薬学的組成物。
【請求項４８】
必要としている個体における疾患の治療において使用するための、請求項１から３９又は４５の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は請求項４６に記載の薬学的組成物。
【請求項４９】
疾患ががんである、請求項４８に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物。
【請求項５０】
必要としている個体における疾患の治療のための医薬の製造のための、請求項１から３９又は４５の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用。
【請求項５１】
個体における疾患を治療する方法において、請求項１から３９又は４５の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を薬学的に許容される形態で含む組成物の治療的有効量を前記個体に投与することを含む、方法。
【請求項５２】
前記疾患ががんである、請求項５０に記載の使用又は請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
Ｔ細胞の存在下で請求項１から３９又は４５の何れか一項に記載のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と標的細胞を接触させることを含む、標的細胞の溶解を誘導する方法。
【請求項５４】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、Ｔ細胞を活性化するための二重特異性抗原結合分子に関する。また、本発明は、そのような二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドと、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明は更に本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するため方法と、疾患治療においてこれら二重特異性抗原結合分子を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
個々の細胞又は特定の細胞型の選択的破壊は、様々な臨床設定において望ましい場合が多い。例えば、健常細胞及び組織を完全なままで損傷を受けない状態にしつつ、腫瘍細胞を特異的に破壊することは癌治療の主要な目標である。
これを達成する魅力的な方法は、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などの免疫エフェクター細胞に腫瘍細胞を攻撃させる、腫瘍に対する免疫応答を誘導することによる。ＣＴＬは、免疫系の最も強力なエフェクター細胞を構成するが、しかしそれらは従来の治療抗体のＦｃドメインによって媒介されるエフェクター機構によって活性化することができない。
【０００３】
この点で、一つの「アーム」で標的細胞上の表面抗原に、第二の「アーム」でＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性化インバリアント成分に結合するように設計された二重特異性抗体は近年の関心となっている。その標的の両方に対するこのような抗体の同時結合は、任意の細胞傷害性Ｔ細胞の活性化と標的細胞のその後の溶解を引き起こす、標的細胞とＴ細胞との間の一時的な相互作用を強制する。従って、免疫応答は、標的細胞へと向け直され、ＣＴＬの通常のＭＨＣ制限性活性化に関連しているようなＴ細胞の特異性又は標的細胞によるペプチド抗原提示とは無関係である。これに関連して、ＣＴＬは、標的細胞がそれらに二重特異性抗体を提示しているとき、すなわち免疫シナプスが模倣されるときにおいてのみ活性化されることは重要である。特に望ましいのは、標的細胞の効率的な溶解を誘発するために、リンパ球の前処理又は同時刺激を必要としない二重特異性抗体である。
【０００４】
幾つかの二重特異性抗体フォーマットが開発されており、Ｔ細胞媒介性免疫療法のためのそれらの適合性が研究されている。これらのうち、いわゆるＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞結合体(engager)）分子は非常によく特徴づけられ、既にクリニックで幾つかの有望なものが示されてきた（Nagorsen及びBaeuerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)に概説）。２のｓｃＦｖ分子が柔軟なリンカーによって融合されるＢｉＴＥは、タンデムｓｃＦｖ分子である。Ｔ細胞の係合のために評価される更なる二重特異性のフォーマットは、ダイアボディ（Holliger等, Prot Eng 9, 299-305 (1996)）及びタンデムダイアボディなどその誘導体（Kipriyanov等, J Mol Biol 293, 41-66 (1999)）が挙げられる。より最近の開発は、ダイアボディフォーマットに基づいているが、更なる安定化のためのＣ末端ジスルフィド架橋を特徴としているいわゆるＤＡＲＴ（二重親和性再標的化）分子である（Moore等, Blood 117, 4542-51 (2011)）。全ハイブリッドマウス／ラットＩｇＧ分子であり、また現在臨床試験において評価されつつあるいわゆるトリオマブ（triomab）はより大きなサイズのフォーマットを表している (Seimetz等, Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)に概説）。
【０００５】
開発下にある様々なフォーマットは、免疫療法におけるＴ細胞再指向(re-direction)及び活性化に起因する大きな可能性を示している。しかしながら、それに適した二重特異性抗体を作製することは、決して些細なことでなく、抗体の有効性、毒性、適用性及び作製可能性に関連して満たさなければならない多くの課題を伴う。
例えば、ＢｉＴＥ分子などの小さなコンストラクトは、−効率的にエフェクターと標的細胞を架橋できる一方−非常に短い血清半減期を有し、連続注入によって患者に投与することを必要とする。他方でＩｇＧ様フォーマットは、−長い半減期という大きな利点を持つものの−ＩｇＧ分子に固有の天然エフェクター機能に付随する毒性に悩まされる。それらの免疫原性の可能性は、成功裏の治療薬開発のためには、ＩｇＧ様二重特異性抗体（特に非ヒト型）の別の望ましくない特徴を構成する。最後に、二重特異性抗体の一般的な開発における主要な課題は、正確に構築されたコンストラクトの収率を低下させ、それから所望の二重特異性抗体を分離することが困難な場合がある多くの非機能的副産物を生じる、同時発現の際の異なる特異性の抗体重鎖及び軽鎖のミスペアリングのため、臨床的に十分な量及び純度での二重特異性抗体コンストラクトの生産であった。
【０００６】
Ｔ細胞媒介免疫療法に現在利用可能な二重特異性抗体に関連した困難や欠点を考えると、そのような分子の新規で改良されたフォーマットに対する必要性が残っている。本発明は、良好な有効性及び作製可能性を低毒性及び好ましい薬物動態特性と組み合わせたＴ細胞活性化及び再指向のために設計された二重特異性抗原結合分子を提供する。
【発明の概要】
【０００７】
第一の態様では、本発明は、その一方は活性化Ｔ細胞抗原への特異的結合が可能であるＦａｂ分子で、その他方は標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子である、第一及び第二の抗原結合部分、及び安定な結合が可能な第一及び第二のサブユニットからなるＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含み；第一の抗原結合部分は、（ａ）Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖がペプチドリンカーによって連結された単鎖のＦａｂ分子、又は（ｂ）Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変又は定常領域の何れかが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０００８】
特定の実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合することが可能な一以下の結合部分がＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に存在する（すなわち、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が活性化Ｔ細胞抗原に対する一価結合を提供する）。特定の実施態様では、第一の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子である。更により特定の実施態様では、第一の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である。
【０００９】
幾つかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の第一及び第二抗原結合部分は、必要に応じてペプチドリンカーを介して互いに融合されている。このような一実施態様では、第二の抗原結合部分は、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、第一の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合される。別のこのような実施態様では、第一の抗原結合部分は、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、第二の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合される。更に他のこのような実施態様では、第二の抗原結合部分は、そのＦａｂ軽鎖のＣ末端で、第一の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖のＮ末端へ融合される。一実施態様では第一の抗原結合部分はクロスオーバーのＦａｂ分子とであることを特徴とし、ここで（ｉ）第二の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第一の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合され、又は（ｉｉ）第一の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第二の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合されているかの何れかであり、更に第一の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖及び第二の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は必要に応じてペプチドリンカーを介して互いに融合されてもよい。
【００１０】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の第二の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第一又は第二のサブユニットのＮ末端へ融合される。別の実施態様では、第一の抗原結合部分は、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第一又は第二のサブユニットのＮ末端へ融合される。
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の第一及び第二の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端へ各々融合される。
【００１１】
ある実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第三の抗原結合部分を含む。そのような一実施態様では、第三の抗原結合部分は、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第一又は第二のサブユニットのＮ末端へ融合される。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化抗原結合分子の第二及び第三の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に各々融合され、第一の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第二の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合されている。その他の特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化抗原結合分子の第一及び第三の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に各々融合され、第二の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第一の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合されている。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分は、直接又は適当なペプチドリンカーを介して融合され得る。一実施態様では、第二及び第三の抗原結合部分及びＦｃドメインは免疫グロブリン分子の一部である。
【００１２】
特定の実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４のＦｃドメインである。特定の実施態様では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ４のＦｃドメインである。
特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、第一及び第二のＦｃドメインサブユニットの会合を促進する修飾を含む。特定のこのような実施形態において、Ｆｃドメインの第一サブユニットのＣＨ３ドメインのアミノ酸残基は、大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内に配置可能である第一サブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起を生成し、及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインのアミノ酸残基は、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それにより第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内突起が配置可能である第２のサブユニット内のＣＨ３ドメイン内に空洞を生成する。
【００１３】
特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、天然のＩｇＧ４のＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示す。ある実施形態では、Ｆｃドメインは、非操作型Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を低下させ及び／又はエフェクター機能を低下させるように操作される。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体に対する結合及び／又はエフェクター機能を減少させる一以上のアミノ酸変異を含む。一実施態様では、Ｆｃ受容体に対する結合及び／又はエフェクター機能を減少させるＦｃドメイン中の一以上のアミノ酸置換は、Ｌ２３５、Ｓ２２８、及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ番号付け）の群から選択される一以上の位置にてである。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ（ＳＰＬＥ）を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特的抗原結合分子のＦｃドメインはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇを含む。
【００１４】
一実施態様では、結合が減少させられるＦｃ受容体はＦｃγ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩ、及び／又はＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様では、エフェクター機能は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。
特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子が結合可能である活性化Ｔ細胞抗原はＣＤ３である。他の実施態様では、二重特異性抗原結合分子が結合可能である標的細胞抗原は腫瘍細胞抗原である。一実施態様では、腫瘍細胞抗原は、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３３からなる群から選択される。
【００１５】
他の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ３に特異的に結合可能な第一抗原結合部分、ＭＣＳＰに結合可能な第二抗原結合部分、及びＩｇＧ４のＦｃドメインを含む。このような一実施態様では、抗原結合分子は配列番号２７８、３１９、３６９、及び３７０のアミノ酸配列を含むか又は配列番号２７８、３１９、３７１、及び３７２のアミノ酸配列を含む。
本発明の別の態様によれば、本発明のＴ細胞を活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドを包含する。本発明は更に、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び本発明の単離されたポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。幾つかの実施態様では、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞である。
別の態様では、ａ）Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養し、ｂ）Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収する工程を含む、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を製造する方法が提供される。本発明はまた、本発明の方法により製造されたＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を包含する。
【００１６】
本発明は更に、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。
また、本発明に包含されるのは、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び薬学的組成物を使用する方法である。一態様では、本発明は、医薬として使用するための本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物を提供する。一態様では、それを必要とする個体における疾患の治療において使用のための本発明に係るＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物が提供される。特定の実施態様では、疾患は癌である。
また、それを必要とする個体における疾患を治療するための医薬の製造のための本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用、並びに薬学的に許容される形態の本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物の治療上有効な量を該個体に投与することを含む個体における疾患を治療する方法が提供される。特定の実施態様では、疾患は癌である。上記実施態様の何れかにおいて、個体は好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
本発明はまた、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の存在下で、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と標的細胞を接触させることを含む、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ−Ｇ】本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の例示的な構成。（Ａ）「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム型」、及び（Ｂ）「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム反転型（inverted）」分子の図。「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム型」分子では、Ｔ細胞ターゲティングＦａｂの軽鎖がリンカーにより重鎖へ融合される一方、「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム反転型」分子は腫瘍ターゲティングＦａｂ中にリンカーを有する。（Ｃ）「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」分子の図。（Ｄ）「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」分子の図。（Ｅ）「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｆ）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｇ）Ｃｒｏｓｓｆａｂが別の順番の「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子とＦａｂ成分（反転型）。
【図１Ｈ−Ｍ】本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の例示的な構成。（Ｈ）「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ軽鎖（ＬＣ）融合」分子の図。（Ｉ）「１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ」分子の図。（Ｊ）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、連結した軽鎖」分子の図。（Ｋ）「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、連結した軽鎖」分子の図。（Ｌ）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、反転型、連結した軽鎖」分子の図。（Ｍ）「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、反転型、連結した軽鎖」分子の図。黒点：ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン中の任意の修飾。
【図２】「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム型」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号１、３、５を参照）、非還元型（Ａ）及び還元型（Ｂ）、及び「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム反転型」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号７、９、１１を参照）、非還元型（Ｃ）及び還元型（Ｄ）のＳＤＳ ＰＡＧＥ（４−１２％ ビス／トリス，ＮｕＰａｇｅ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，クーマシー染色）。
【図３】「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム型」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号１、３、５を参照）（Ａ）及び「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム反転型」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号７、９、１１を参照）（Ｂ）の分析用サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；２ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．３，１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ；５０μｇのサンプルを注入）。
【図４】「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム型」（抗ＥＧＦＲ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号４３、４５、５７を参照）、非還元型（Ａ）及び還元型（Ｂ）、及び「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム反転型」（抗ＥＧＦＲ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号１１、４９、５１を参照）、非還元型（Ｃ）及び還元型（Ｄ）のＳＤＳ ＰＡＧＥ（４−１２％ビス／トリス，ＮｕＰａｇｅ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，クーマシー染色）。
【図５】「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム型」（抗ＥＧＦＲ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号４３、４５、４７を参照）（Ａ）及び「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム反転型」（抗ＥＧＦＲ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号１１、４９、５１を参照）（Ｂ）の分析用サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；２ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．３，１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ；５０μｇのサンプルを注入）。
【図６】（Ａ、Ｂ）「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム反転型」（抗ＦＡＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号１１、５１、５５を参照）、非還元型（Ａ）及び還元型（Ｂ）のＳＤＳ ＰＡＧＥ（４−１２％ ビス／トリス，ＮｕＰａｇｅ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，クーマシー染色）。（Ｃ）「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム反転型」（抗ＦＡＰ／抗ｈｕＣＤ３）の分析用サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；２ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．３，１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ） ＮａＣｌ；；５０μｇのサンプルを注入）。
【図７】（Ａ）「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号５、２１、２３を参照）、非還元型（レーン２）及び還元型（レーン３）；（Ｂ）「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）は（配列番号５、１７、１９を参照）、非還元型（レーン２）、還元型（レーン３）；（Ｃ）「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，ｗｔ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号５、１３、１５を参照）、非還元型（レーン２）及び還元型（レーン３）；及び（Ｄ）「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ Ｎ２９７Ｄ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号５、２５、２７を参照）、非還元型（レーン２）及び還元型（レーン３）のＳＤＳ ＰＡＧＥ（１２％ビス／トリス、ＮｕＰａｇｅ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、クーマシー染色）。
【図８Ａ−Ｂ】（Ａ）「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）は（配列番号５、２１、２３を参照）；（Ｂ）「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）は（配列番号５、１７、１９を参照）。
【図８Ｃ−Ｄ】（Ｃ）「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，ｗｔ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）は（配列番号５、１３、１５を参照）；（Ｄ）は「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ Ｎ２９７Ｄ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）は（配列番号５、２５、２７を参照）の分析用サイズ排除クロマトグラフィー（スーパーデックス２００ １０／３００ ＧＬ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；２ｍＭのＭＯＰＳ ｐＨ７．３、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ；５０μｇのサンプルを注入）。
【図９】（Ａ、Ｂ）「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」（抗ＥＧＦＲ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号４５、４７、５３を参照）、非還元型（Ａ）及び還元型（Ｂ）のＳＤＳ ＰＡＧＥ（４−１２％ ビス／トリス，ＮｕＰａｇｅ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，クーマシー染色）。（Ｃ）「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」（抗ＥＧＦＲ／抗ｈｕＣＤ３）の分析用サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００１０／３００ ＧＬ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；２ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．３，１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ；５０ μｇのサンプルを注入）。
【図１０】（Ａ、Ｂ）「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」（抗ＦＡＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号５７、５９、６１を参照）、非還元型（Ａ）及び還元型（Ｂ）のＳＤＳ ＰＡＧＥ（４−１２％ ビス／トリス，ＮｕＰａｇｅ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，クーマシー染色） 。（Ｃ）「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」（抗ＦＡＰ／抗ｈｕＣＤ３）の分析用サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；２ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．３， １５０ ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ；；５０μｇのサンプルを注入）。
【図１１】（Ａ、Ｂ）「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，Ｆｃ（ホール）Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ／Ｆｃ（ノブ）ｗｔ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号５、２９、３１、３３を参照）、非還元型（Ａ）及び還元型（Ｂ）のＳＤＳ ＰＡＧＥ（４−１２％ トリス−酢酸（Ａ）又は４−１２％のビス／トリス（Ｂ）、ＮｕＰａｇｅ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，クーマシー染色）。（Ｃ）「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，Ｆｃ（ホール） Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ／Ｆｃ（ノブ）ｗｔ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）の分析用サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；１ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．３，１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ；；５０μｇのサンプルを注入）。
【図１２】（Ａ、Ｂ）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号３、５、２９、３３を参照）、非還元型（Ａ）及び還元型（Ｂ）のＳＤＳ ＰＡＧＥ（４−１２％ビス／トリス，ＮｕＰａｇｅ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，クーマシー染色）。（Ｃ）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）の分析用サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；２ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．３，１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ；；５０μｇのサンプルを注入）。
【図１３】（Ａ、Ｂ）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｃｙＣＤ３）（配列番号３、５、３５、３７を参照）、非還元型（Ａ）及び還元型（Ｂ）のＳＤＳ ＰＡＧＥ（４−１２％ビス／トリス，ＮｕＰａｇｅ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，クーマシー染色）。（Ｃ）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｃｙＣＤ３）の分析用サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；２ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．３，１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ；；５０μｇのサンプルを注入）。
【図１４】（Ａ、Ｂ）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、反転型」（抗ＣＥＡ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号３３、６３、６５、６７を参照）、非還元型（Ａ）及び還元型（Ｂ）のＳＤＳ ＰＡＧＥ（４−１２％ ビス／トリス，ＮｕＰａｇｅ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，クーマシー染色）。（Ｃ）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、反転型」（抗ＣＥＡ／抗ｈｕＣＤ３）の分析用サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；２ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．３，１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ；；５０μｇのサンプルを注入）。
【図１５】（Ａ）「（ｓｃＦｖ）２−Ｆｃ」及び「（ｄｓｓｃＦｖ）２−Ｆｃ」（抗ＭＣＳＰ（ＬＣ００７）／抗ｈｕＣＤ３（Ｖ９））の熱安定性。０．０５℃／分で２５−７５℃からの温度勾配で測定した動的光散乱。黒色曲線：「（ｓｃＦｖ）２−Ｆｃ」；灰色曲線：「（ｄｓｓｃＦｖ）２−Ｆｃ」。（Ｂ）「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」（配列番号５、２１、２３を参照）及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号３、５、２９、３３を参照）の熱安定性。０．０５℃／分で２５−７５℃からの温度勾配で測定した動的光散乱。黒色曲線：「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」；灰色曲線：「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」。
【図１６】（Ａ）ヒトのＦｃγＲＩＩＩａを有する種々のＦｃ変異体との相互作用の測定、及び（Ｂ）腫瘍標的及びヒトＣＤ３γ（Ｇ４Ｓ）５ＣＤ３ε−ＡｃＴｅｖ−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／Ｆｃ（ホール）を有するＴ細胞二重特異性コンストラクトの同時結合についてのＢｉａｃｏｒｅアッセイの設定。
【図１７】ヒトＭＣＳＰのＤ３ドメイン及びヒトＣＤ３γ（Ｇ４Ｓ）５ＣＤ３ε−ＡｃＴｅｖ−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／Ｆｃ（ホール）へのＴ細胞二重特異性コンストラクトの同時結合。（Ａ）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３を参照）、（Ｂ）「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」（配列番号５、２１、２３を参照）。
【図１８Ａ−Ｂ】ヒトＥＧＦＲ及びヒトＣＤ３γ（Ｇ４Ｓ）５ＣＤ３ε−ＡｃＴｅｖ−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／Ｆｃ（ホール）へのＴ細胞二重特異性コンストラクトの同時結合。（Ａ）「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」（配列番号４５、４７、５３）、及び（Ｂ）「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，一アーム型」（配列番号４３、４５、４７）。
【図１８Ｃ−Ｄ】ヒトＥＧＦＲ及びヒトＣＤ３γ（Ｇ４Ｓ）５ＣＤ３ε−ＡｃＴｅｖ−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／Ｆｃ（ホール）へのＴ細胞二重特異性コンストラクトの同時結合。（Ｃ）「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，一アーム反転型」（配列番号１１、４９、５１を参照）、及び（Ｄ）「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」（配列番号４７、５３、２１３を参照）。
【図１９】ＦＡＣＳによって測定される、「（ｓｃＦｖ）２」分子（５０ｎＭ）のＪｕｒｋａｔ細胞上に発現したＣＤ３（Ａ）への、又はＣｏｌｏ−３８細胞上のＭＣＳＰ（Ｂ）への結合。未処理細胞と二次抗体のみで染色された細胞と比較した平均蛍光強度が示される。
【図２０】ＦＡＣＳによって測定される、「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５、１７、１９）コンストラクト（５０ｎＭ）のＪｕｒｋａｔ細胞上に発現したＣＤ３（Ａ）への、又はＣｏｌｏ−３８細胞上のＭＣＳＰ（Ｂ）への結合。参照の抗ＣＤ３ ＩｇＧで処理された細胞（示されるように）、未処理細胞及び二次抗体のみで染色された細胞と比較した平均蛍光強度が示される。
【図２１Ａ】ＦＡＣＳによって測定される、「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，一アーム型」（配列番号１、３、５を参照）及び「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，一アーム反転型」（配列番号７、９、１１を参照）コンストラクト（５０ｎＭ）のＪｕｒｋａｔ細胞上に発現したＣＤ３（Ａ）への結合。参照の抗ＣＤ３又は抗ＭＣＳＰ ＩｇＧで処理された細胞（示されるように）、未処理細胞及び二次抗体のみで染色された細胞と比較した平均蛍光強度が示される。
【図２１Ｂ】ＦＡＣＳによって測定される、「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，一アーム型」（配列番号１、３、５を参照）及び「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，一アーム反転型」（配列番号７、９、１１を参照）コンストラクト（５０ｎＭ）のＣｏｌｏ−３８細胞上のＭＣＳＰ（Ｂ）への結合。参照の抗ＣＤ３又は抗ＭＣＳＰ ＩｇＧで処理された細胞（示されるように）、未処理細胞及び二次抗体のみで染色された細胞と比較した平均蛍光強度が示される。
【図２２】ＦＡＣＳによって測定される、「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５、１７、１９）二重特異性コンストラクト及び対応する抗ＭＣＳＰ ＩｇＧの、Ｃｏｌｏ−３８細胞上のＭＣＳＰへの用量依存性結合。
【図２３Ａ】Ｃｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞の存在下又は非存在下で、指定されるように（腫瘍細胞に対するＰＢＭＣのＥ：Ｔ比＝１０：１）、１ｎＭの「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５、１７、１９）又は「（ｓｃＦｖ）２」とともにインキュベーション後の、ヒトＴ細胞上の異なる活性化マーカーの表面発現レベル。示されるのは、ＣＤ８＋Ｔ細胞上での初期活性化マーカーＣＤ６９（Ａ）のそれぞれ１５時間、又は２４時間のインキュベーション後の発現レベルである。
【図２３Ｂ】Ｃｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞の存在下又は非存在下で、指定されるように（腫瘍細胞に対するＰＢＭＣのＥ：Ｔ比＝１０：１）、１ｎＭの「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５、１７、１９）又は「（ｓｃＦｖ）２」とともにインキュベーション後の、ヒトＴ細胞上の異なる活性化マーカーの表面発現レベル。示されるのは、ＣＤ８＋Ｔ細胞上での後期活性化マーカーＣＤ２５（Ｂ）のそれぞれ１５時間、又は２４時間のインキュベーション後の発現レベルである。
【図２４Ａ】Ｃｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞の存在下又は非存在下で、指定されるように（Ｅ：Ｔ比＝５：１）、１ｎＭの「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５、１７、１９）又は「（ｓｃＦｖ）２」とともにインキュベーション後の、ヒトＴ細胞上の後期活性化マーカーＣＤ２５の表面発現レベル。示されるのは、５日間のインキュベーション後のＣＤ８＋Ｔ細胞（Ａ）上の後期活性化マーカーＣＤ２５の発現レベルである。
【図２４Ｂ】Ｃｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞の存在下又は非存在下で、指定されるように（Ｅ：Ｔ比＝５：１）、１ｎＭの「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５、１７、１９）又は「（ｓｃＦｖ）２」とともにインキュベーション後の、ヒトＴ細胞上の後期活性化マーカーＣＤ２５の表面発現レベル。示されるのは、５日間のインキュベーション後のＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｂ）上の後期活性化マーカーＣＤ２５の発現レベルである。
【図２５】ヒトのＭＣＳＰを発現するＭＶ−３腫瘍標的細胞の存在下又は非存在下で（Ｅ：Ｔ比＝３：１）、「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」二重特異性コンストラクト（カニクイザルＣＤ３及びヒトＭＣＳＰを標的とする：配列番号３、５、３５、３７を参照）を示された濃度で４３時間インキュベートした後の、二つの異なる動物（カニクイザルネストル(cyno Nestor)、カニクイザルノブ(cyno Nobu））由来のカニクイザルＣＤ８＋Ｔ細胞上の後期活性化マーカーＣＤ２５の表面発現レベル。コントロールとして、参照のＩｇＧ（抗カニクイザルＣＤ３ ＩｇＧ、抗ヒトＩｇＧのＭＣＳＰ）又は非生理的な刺激であるＰＨＡ−Ｍを使用した。
【図２６】Ｕ８７ＭＧ腫瘍細胞の存在下で（Ｅ：Ｔ比＝５：１）、「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」ＣＤ３−ＭＣＳＰの二重特異性コンストラクト（配列番号５、１７、１９を参照）により１８．５時間活性化されたヒトｐａｎＴ細胞によって分泌されるＩＦＮ−γレベル。コントロールとして、対応する抗ＣＤ３ ＩｇＧ及び抗ＭＣＳＰ ＩｇＧが投与される。
【図２７】ヒトｐａｎＴ細胞との共培養（Ｅ：Ｔ比＝５：１）、及び「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」（配列番号５、２１、２３を参照）、「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３を参照）及び「（ｓｃＦｖ）２」二重特異性分子及び対応するＩｇＧの、異なる濃度による２０時間の活性化に際してのＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。
【図２８】ヒトｐａｎＴ細胞との共培養（Ｅ：Ｔ比＝５：１）、及び二重特異性コンストラクト及び対応するＩｇＧの、異なる濃度による２０時間の活性化に際してのＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。Ｆｃドメインが異なる（野生型Ｆｃドメイン（配列番号５、１３、１５を参照）又は（ＮＫ）エフェクター細胞機能を無効にするように変異されたＦｃドメインの何れかを有する）「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクト：Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ（配列番号５、２１、２３を参照）、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ Ｎ２９７Ｄ（配列番号５、２５、２７）を参照）及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３を参照）コンストラクトが比較された。
【図２９】ＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５、１７、１９を参照）コンストラクト、「（ｓｃＦｖ）２」分子又は対応するＩｇＧにより１８．５時間処置されたヒトｐａｎＴ細胞との共培養（Ｅ：Ｔ比＝５：１）に際してのＣｏｌｏ−３８腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。
【図３０】ＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５、１７、１９を参照）コンストラクト、「（ｓｃＦｖ）２」分子又は対応するＩｇＧにより１８時間処置されたヒトｐａｎＴ細胞との共培養（Ｅ：Ｔ比＝５：１）に際してのＣｏｌｏ−３８腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。
【図３１】ヒトｐａｎＴ細胞との共培養（Ｅ：Ｔ比＝５：１）、及びＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５、１７、１９を参照）コンストラクト、「（ｓｃＦｖ）２」分子又は対応するＩｇＧの異なる濃度による２３．５時間の活性化に際してのＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。
【図３２】ヒトｐａｎＴ細胞との共培養（Ｅ：Ｔ比＝５：１）、及びＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，一アーム型」（配列番号１、３、５を参照）、「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，一アーム反転型」（配列番号７、９、１１を参照）又は「（ｓｃＦｖ）２」コンストラクト又は対応するＩｇＧの異なる濃度による１９時間の活性化に際してのＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。
【図３３】「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」ＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性コンストラクト（配列番号５、２１、２１３を参照）、又は「（ｓｃＦｖ）２」分子により２０時間処置されたヒトｐａｎＴ細胞との共培養（Ｅ：Ｔ比＝５：１）に際してのＣｏｌｏ−３８腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。
【図３４】ヒトｐａｎＴ細胞との共培養（Ｅ：Ｔ比＝５：１）、及び二重特異性コンストラクト及び対応するＩｇＧの、異なる濃度による２１時間の活性化に際してのＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。ＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３を参照）及び「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号５、２９、３１、３３を参照）コンストラクト、「（ｓｃＦｖ）２」分子及び対応するＩｇＧが比較された。
【図３５】「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」ＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性コンストラクト（配列番号３、５、２９、３３）の１３５ｎｇ／ｍｌ又は１．３５ｎｇ／ｍｌによるヒトＴ細胞の活性化（Ｅ：Ｔ比＝２５：１）により誘導される異なる標的細胞（ＭＣＳＰ陽性結腸３８腫瘍標的細胞、骨髄又は脂肪組織に由来する間葉系幹細胞、又は胎盤由来の周皮細胞；示される通り）の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。
【図３６Ａ】ヒトＰＢＭＣ及び異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性コンストラクト（「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５、１７、１９を参照）及び「（ｓｃＦｖ）２」）又は糖鎖操作型ＭＣＳＰ ＩｇＧ（ＧｌｙｃｏＭａｂ）との共培養に際して、２１時間の一晩のインキュベーション後に測定されたＣｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。エフェクターの標的細胞に対する比率は２５：１で固定（Ａ）させた。ＰＢＭＣを、新鮮血（Ａ）から単離した。
【図３６Ｂ】ヒトＰＢＭＣ及び異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性コンストラクト（「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５、１７、１９を参照）及び「（ｓｃＦｖ）２」）又は糖鎖操作型ＭＣＳＰ ＩｇＧ（ＧｌｙｃｏＭａｂ）との共培養に際して、２１時間の一晩のインキュベーション後に測定されたＣｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。エフェクターの標的細胞に対する比率は示されるように変動させた（Ｂ）。ＰＢＭＣを、バフィーコート（Ｂ）から単離した。
【図３７】カニクイザルＣＤ３及びヒトＭＣＳＰ（配列番号３、５、３５、３７）を標的とする「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」コンストラクトの時間依存細胞傷害作用。示されるのは、初代カニクイザルＰＢＭＣとの２４時間又は４３時間の共培養（Ｅ：Ｔ比＝３：１）に際してのヒトＭＣＳＰを発現するＭＶ−３細胞からのＬＤＨ放出である。コントロールとして、参照のＩｇＧ（抗カニクイザルＣＤ３ ＩｇＧ及び抗ヒトＭＣＳＰ ＩｇＧ）を同じモル濃度で使用した。ＰＨＡ−Ｍは、（非生理的な）Ｔ細胞活性化のためのコントロールとして機能した。
【図３８】異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性コンストラクト（「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３を参照）及び「（ｓｃＦｖ）２」）で〜２６時間処置した、ヒトＰＢＭＣとの共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）に際してのｈｕＭＣＳＰ陽性ＭＶ−３メラノーマ細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。
【図３９】異なるＣＤ３−ＥＧＦＲ二重特異性コンストラクト（「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」（配列番号４５、４７、５３を参照）、「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」（配列番号４７、５３、２１３を参照）及び「（ｓｃＦｖ）２」）又は参照のＩｇＧで１８時間処置された、ヒトｐａｎＴ細胞との共培養（Ｅ：Ｔ比＝５：１）に際してのＥＧＦＲ陽性ＬＳ−１７４Ｔ腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。
【図４０】異なるＣＤ３−ＥＧＦＲ二重特異性コンストラクト（「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム型」（配列番号４３、４５、４７を参照）、「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム反転型」（配列番号１１、 ４９、 ５１を参照）、「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」（配列番号４７、５３、２１３を参照）及び「（ｓｃＦｖ）２」）又は参照のＩｇＧで２１時間処置された、ヒトｐａｎＴ細胞との共培養（Ｅ：Ｔ比＝５：１）に際しての、ＥＧＦＲ陽性ＬＳ−１７４Ｔ腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。
【図４１Ａ】異なるＣＤ３−ＥＧＦＲ二重特異性コンストラクト（「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム型」（配列番号４３、４５、４７を参照）、「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム反転型」（配列番号１１、 ４９、 ５１を参照）及び「（ｓｃＦｖ）２」）又は参照のＩｇＧで１６時間処置された、ヒトｐａｎＴ細胞（Ａ）との共培養（Ｅ：Ｔ比＝５：１）に際してのＥＧＦＲ陽性ＬＳ−１７４Ｔ腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。標的細胞に対するエフェクター比は５：１であった。
【図４１Ｂ】異なるＣＤ３−ＥＧＦＲ二重特異性コンストラクト（「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム型」（配列番号４３、４５、４７を参照）、「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム反転型」（配列番号１１、 ４９、 ５１を参照）及び「（ｓｃＦｖ）２」）又は参照のＩｇＧで１６時間処置された、ヒトナイーブＴ細胞（Ｂ）との共培養（Ｅ：Ｔ比＝５：１）に際してのＥＧＦＲ陽性ＬＳ−１７４Ｔ腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。標的細胞に対するエフェクター比は５：１であった。
【図４２】異なるＣＤ３−ＦＡＰ二重特異性コンストラクト（「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム反転型」（配列番号１１、５１、５５を参照）、「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム型」（配列番号５７、６１、２１３を参照）、「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」（配列番号５７、５９、６１を参照）及び「（ｓｃＦｖ）２」）で〜１８時間処置された、ヒトｐａｎＴ細胞との共培養（Ｅ：Ｔ比＝５：１）に際しての、ＦＡＰ陽性ＧＭ０５３８９繊維芽細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。
【図４３Ａ】６時間、標的細胞の存在下（Ａ）での、異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性コンストラクト（「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５、１７、１９を参照）及び「（ｓｃＦｖ）２」）又は対応するコントロールのＩｇＧで処置されたＣＤ８＋Ｔ細胞のパーフォリンレベル並びにＣＤ１０７ａ／ｂの発現レベルのフローサイトメトリー分析。ヒトｐａｎＴ細胞は、Ｃｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞の存在下又は非存在下でエフェクター対標的の比が５：１で異なる分子９．４３ｎＭとインキュベートした。モネンシンは、タンパク質輸送を妨げることによって細胞内のタンパク質レベルを増加させるため、インキュベーションの最初の一時間後に添加した。示すように、ゲートは、全てのＣＤ１０７ａ／ｂ陽性細胞、パーフォリン陽性細胞又は二重陽性細胞の何れかで設定された。
【図４３Ｂ】６時間、標的細胞の非存在下（Ｂ）での、異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性コンストラクト（「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５、１７、１９を参照）及び「（ｓｃＦｖ）２」）又は対応するコントロールのＩｇＧで処置されたＣＤ８＋Ｔ細胞のパーフォリンレベル並びにＣＤ１０７ａ／ｂの発現レベルのフローサイトメトリー分析。ヒトｐａｎＴ細胞は、Ｃｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞の存在下又は非存在下でエフェクター対標的の比が５：１で異なる分子９．４３ｎＭとインキュベートした。モネンシンは、タンパク質輸送を妨げることによって細胞内のタンパク質レベルを増加させるため、インキュベーションの最初の一時間後に添加した。示すように、ゲートは、全てのＣＤ１０７ａ／ｂ陽性細胞、パーフォリン陽性細胞又は二重陽性細胞の何れかで設定された。
【図４４Ａ】Ｃｏｌｏ−３８腫瘍細胞の存在下又は非存在下でエフェクター対標的細胞の比が５：１で、１ｎＭの異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性コンストラクト（「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５、１７、１９を参照）又は「（ｓｃＦｖ）２」）又は対応するコントロールのＩｇＧとのインキュベーションに際のＣＤ８＋（Ａ）ヒトＴ細胞の相対的増殖。ＣＦＳＥ標識ヒトｐａｎＴ細胞はＦＡＣＳによって特徴付けられた。相対的増殖レベルは、非増殖細胞の周りにゲートを設定し、そして参照として測定された全細胞数と比較してこのゲートの細胞数を用いて決定した。
【図４４Ｂ】Ｃｏｌｏ−３８腫瘍細胞の存在下又は非存在下でエフェクター対標的細胞の比が５：１で、１ｎＭの異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性コンストラクト（「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５、１７、１９を参照）又は「（ｓｃＦｖ）２」）又は対応するコントロールのＩｇＧとのインキュベーションに際のＣＤ４＋（Ｂ）ヒトＴ細胞の相対的増殖。ＣＦＳＥ標識ヒトｐａｎＴ細胞はＦＡＣＳによって特徴付けられた。相対的増殖レベルは、非増殖細胞の周りにゲートを設定し、そして参照として測定された全細胞数と比較してこのゲートの細胞数を用いて決定した。
【図４５Ａ】２４時間、Ｃｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞の存在下又は非存在下で、１ｎＭの異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性コンストラクト（「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５、１７、１９）又は「（ｓｃＦｖ）２」）又は対応するＩｇＧで処置後の、ヒトＰＢＭＣの上清で測定された異なるサイトカインのレベル。標的細胞に対するエフェクター比は１０：１であった。
【図４５Ｂ】２４時間、Ｃｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞の存在下又は非存在下で、１ｎＭの異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性コンストラクト（「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，ＬＡＬＡ」（配列番号５、１７、１９）又は「（ｓｃＦｖ）２」）又は対応するＩｇＧで処置後の、ヒトＰＢＭＣの上清で測定された異なるサイトカインのレベル。標的細胞に対するエフェクター比は１０：１であった。
【図４６Ａ】２４時間、Ｃｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞の存在下又は非存在下で、１ｎＭの異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性コンストラクト「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」、「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３を参照）又は「（ｓｃＦｖ）２」）又は対応するＩｇＧで処置後の、ヒトＰＢＭＣの上清で測定された異なるサイトカインのレベル。異なる二重特異性コンストラクトの中には、野生型Ｆｃドメイン（配列番号５、１３、１５を参照）又は（ＮＫ）エフェクター細胞機能を無効にするように変異されたＦｃドメイン（ＬＡＬＡ（配列番号５、１７、１９を参照）、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ（配列番号５、２、２３を参照）及びＰ３２９Ｇ ＬＡＬＡ Ｎ２９７Ｄ（配列番号５、２５、２７を参照））の何れかを有する異なる「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクトが存在した。
【図４６Ｂ】２４時間、Ｃｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞の存在下又は非存在下で、１ｎＭの異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性コンストラクト「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」、「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３を参照）又は「（ｓｃＦｖ）２」）又は対応するＩｇＧで処置後の、ヒトＰＢＭＣの上清で測定された異なるサイトカインのレベル。異なる二重特異性コンストラクトの中には、野生型Ｆｃドメイン（配列番号５、１３、１５を参照）又は（ＮＫ）エフェクター細胞機能を無効にするように変異されたＦｃドメイン（ＬＡＬＡ（配列番号５、１７、１９を参照）、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ（配列番号５、２、２３を参照）及びＰ３２９Ｇ ＬＡＬＡ Ｎ２９７Ｄ（配列番号５、２５、２７を参照））の何れかを有する異なる「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクトが存在した。
【図４６Ｃ】２４時間、Ｃｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞の存在下又は非存在下で、１ｎＭの異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性コンストラクト「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」、「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３を参照）又は「（ｓｃＦｖ）２」）又は対応するＩｇＧで処置後の、ヒトＰＢＭＣの上清で測定された異なるサイトカインのレベル。異なる二重特異性コンストラクトの中には、野生型Ｆｃドメイン（配列番号５、１３、１５を参照）又は（ＮＫ）エフェクター細胞機能を無効にするように変異されたＦｃドメイン（ＬＡＬＡ（配列番号５、１７、１９を参照）、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ（配列番号５、２、２３を参照）及びＰ３２９Ｇ ＬＡＬＡ Ｎ２９７Ｄ（配列番号５、２５、２７を参照））の何れかを有する異なる「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクトが存在した。
【図４６Ｄ】２４時間、Ｃｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞の存在下又は非存在下で、１ｎＭの異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性コンストラクト「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」、「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３を参照）又は「（ｓｃＦｖ）２」）又は対応するＩｇＧで処置後の、ヒトＰＢＭＣの上清で測定された異なるサイトカインのレベル。異なる二重特異性コンストラクトの中には、野生型Ｆｃドメイン（配列番号５、１３、１５を参照）又は（ＮＫ）エフェクター細胞機能を無効にするように変異されたＦｃドメイン（ＬＡＬＡ（配列番号５、１７、１９を参照）、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ（配列番号５、２、２３を参照）及びＰ３２９Ｇ ＬＡＬＡ Ｎ２９７Ｄ（配列番号５、２５、２７を参照））の何れかを有する異なる「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクトが存在した。
【図４７】ＣＥ−ＳＤＳ分析「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、連結した軽鎖」（配列番号３、５、２９、１７９を参照）のＳＤＳ ＰＡＧＥとして示される電気泳動。（レーン１：還元型、レーン２：非還元型）。
【図４８】「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、連結した軽鎖」（配列番号３、５、２９、１７９を参照）の分析用サイズ排除クロマトグラフィー。２０μｇのサンプルを注入した。
【図４９】異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性コンストラクトで〜４４時間処置した、ヒトＰＢＭＣによる共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）に際してのＭＣＳＰ陽性ＭＶ−３腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅（「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３を参照）及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，連結したＬＣ」（配列番号３、５、２９、１７９）を参照）。ヒトＰＢＭＣを、健常ボランティアの新鮮血から単離した。
【図５０】異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性コンストラクトで〜２２時間処置した、ヒトＰＢＭＣによる共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）に際してのＭＣＳＰ陽性Ｃｏｌｏ−３８腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅（「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３を参照）及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，連結したＬＣ」（配列番号３、 ５、 ２９、 １７９）を参照）。ヒトＰＢＭＣを、健常ボランティアの新鮮血から単離した。
【図５１】異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性コンストラクトで〜２２時間処置した、ヒトＰＢＭＣによる共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）に際してのＭＣＳＰ陽性Ｃｏｌｏ−３８腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅（「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３を参照）及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，連結したＬＣ」（配列番号３、 ５、 ２９、 １７９）を参照）。ヒトＰＢＭＣを、健常ボランティアの新鮮血から単離した。
【図５２】異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性コンストラクトで〜２２時間処置した、ヒトＰＢＭＣによる共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）に際してのＭＣＳＰ陽性ＷＭ２６６−４細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅（「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３を参照）及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，連結したＬＣ」（配列番号３、５、２９、１７９）を参照）。ヒトＰＢＭＣを、健常ボランティアの新鮮血から単離した。
【図５３Ａ】ヒトＭＣＳＰを発現するＣｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞の存在下又は非存在下での１０ｎＭ、８０ｐＭ又は３ｐＭの異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性コンストラクト（「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３を参照）及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，連結したＬＣ」（配列番号３、５、２９、１７９を参照）と２２時間インキュベート後の初期活性化マーカーＣＤ６９（Ａ）の表面発現レベル。
【図５３Ｂ】ヒトＭＣＳＰを発現するＣｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞の存在下又は非存在下での１０ｎＭ、８０ｐＭ又は３ｐＭの異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性コンストラクト（「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３を参照）及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，連結したＬＣ」（配列番号３、５、２９、１７９を参照）と２２時間インキュベート後の後期活性化マーカーＣＤ２５（Ｂ）の表面発現レベル。
【図５４Ａ−Ｃ】ＣＥ−ＳＤＳ分析（Ａ）１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ；ＶＬ／ＶＨ交換（ＬＣ００７／Ｖ９）（配列番号５、２９、３３、１８１を参照）のＳＤＳ−ＰＡＧＥとして示される電気泳動；ａ）非還元型、ｂ）還元型。（Ｂ）１＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＭａｂ；ＣＬ／ＣＨ１交換（ＬＣ００７／Ｖ９）（配列番号５、２３、１８３、１８５を参照）のＳＤＳ−ＰＡＧＥとして示される電気泳動；ａ）還元型、ｂ）非還元型。（Ｃ）２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、反転型；ＣＬ／ＣＨ１交換（ＬＣ００７／Ｖ９）（配列番号５、２３、１８３、１８７を参照）のＳＤＳ−ＰＡＧＥとして示される電気泳動；ａ）還元型、ｂ）非還元型。
【図５４Ｄ−Ｆ】（Ｄ）２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ；ＶＬ／ＶＨ交換（Ｍ４−３ ＭＬ２／Ｖ９）（配列番号３３、１８９、１９１、１９３を参照）のＳＤＳ−ＰＡＧＥとして示される電気泳動；ａ）還元型、ｂ）非還元型。（Ｅ）２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ；ＣＬ／ＣＨ１交換（Ｍ４−３ ＭＬ２／Ｖ９）（配列番号１８３、１８９、１９３、１９５を参照）のＳＤＳ−ＰＡＧＥとして示される電気泳動；ａ）還元型、ｂ）非還元型。（Ｆ）２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、反転型；ＣＬ／ＣＨ１交換（ＣＨ１Ａ１Ａ／Ｖ９）（配列番号６５、６７、１８３、１９７を参照）のＳＤＳ−ＰＡＧＥとして示される電気泳動；ａ）還元型、ｂ）非還元型。
【図５４Ｇ−Ｉ】（Ｇ）２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ；ＣＬ／ＣＨ１交換（Ｍ４−３ ＭＬ２／Ｈ２Ｃ）（配列番号１８９、１９３、１９９、２０１を参照）のＳＤＳ−ＰＡＧＥとして示される電気泳動；ａ）還元型、ｂ）非還元型。（Ｈ）２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、反転型；ＣＬ／ＣＨ１交換（４３１／２６／Ｖ９）（配列番号１８３、２０３、２０５、２０７を参照）のＳＤＳ−ＰＡＧＥとして示される電気泳動；ａ）還元型、ｂ）非還元型。（Ｉ）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、軽鎖融合」（ＣＨ１Ａ１Ａ／Ｖ９）（配列番号１８３、２０９、２１１、２１３を参照）のＳＤＳ−ＰＡＧＥとして示される電気泳動；ａ）還元型、ｂ）非還元型。
【図５４Ｊ−Ｋ】（Ｊ）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号５、２３、２１５、２１７を参照）、ＳＤＳ ＰＡＧＥ（４−１２％ビス／トリス，ＮｕＰａｇｅ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，クーマシー染色）、非還元型（左）及び還元型（右）。（Ｋ）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、反転型」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号５、２３、２１５、２１９を参照）のＳＤＳ−ＰＡＧＥとして示される電気泳動；ａ）還元型、ｂ）非還元型。
【図５４Ｌ−Ｍ】（Ｌ）「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（抗ＣＤ３３／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号３３、２１３、２２１、２２３を参照）、ＳＤＳ ＰＡＧＥ（４−１２％ビス／トリス，ＮｕＰａｇｅ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，クーマシー染色）、還元型（左）及び非還元型（右）。（Ｍ）「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（抗ＣＤ３３／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号３３、２２１、２２３、２２５を参照）、ＳＤＳ ＰＡＧＥ（４−１２％ビス／トリス，ＮｕＰａｇｅ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，クーマシー染色）、還元型（左）及び非還元型（右）。
【図５４Ｎ】（Ｎ）「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（抗ＣＤ２０／抗ｈｕＣＤ３）（配列番号３３、２２７、２２９、２３１を参照）、ＳＤＳ ＰＡＧＥ（４−１２％ビス／トリス，ＮｕＰａｇｅ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，クーマシー染色）、非還元型。
【図５５Ａ】二重特異性コンストラクト（ＣＥＡ／ＣＤ３ 「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，反転型（ＶＬ／ＶＨ）」（配列番号３３、６３、６５、６７を参照）及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，反転型（ＣＬ／ＣＨ１）」（配列番号６５、６７、１８３、１９７を参照）のＪｕｒｋａｔ細胞により発現されるヒトＣＤ３に対する（Ａ）結合。コントロールとして、参照のＩｇＧの同等の最大濃度及び標識した２次抗体（ヤギ抗ヒトＦＩＴＣコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ ＃１０９−０９６−０９８）に起因するバックグラウンド染色も同様に評価した。
【図５５Ｂ】二重特異性コンストラクト（ＣＥＡ／ＣＤ３ 「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，反転型（ＶＬ／ＶＨ）」（配列番号３３、６３、６５、６７を参照）及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，反転型（ＣＬ／ＣＨ１）」（配列番号６５、６７、１８３、１９７を参照）のＬＳ−１７４Ｔ細胞により発現されるヒトＣＥＡに対する（Ｂ）結合。コントロールとして、参照のＩｇＧの同等の最大濃度及び標識した２次抗体（ヤギ抗ヒトＦＩＴＣコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ ＃１０９−０９６−０９８）に起因するバックグラウンド染色も同様に評価した。
【図５６Ａ】ＦＡＣＳにより決定される、Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ａ）により発現されるヒトＣＤ３に対する、二重特異性コンストラクト（ＭＣＳＰ／ＣＤ３「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３を参照）及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，反転型」（配列番号５、２３、１８３、１８７を参照））の結合。
【図５６Ｂ】ＦＡＣＳにより決定される、ＷＭ２６６−４細胞（Ｂ）により発現されるヒトＭＣＳＰに対する、二重特異性コンストラクト（ＭＣＳＰ／ＣＤ３「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３を参照）及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，反転型」（配列番号５、２３、１８３、１８７を参照））の結合。
【図５７Ａ】ＦＡＣＳにより決定される、更なる実験において、Ｊｕｒｋａｔ細胞により発現されるヒトＣＤ３に対する（Ａ）、「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ軽鎖融合」（配列番号１８３、２０９、２１１、２１３）の結合。
【図５７Ｂ】ＦＡＣＳにより決定される、更なる実験において、ＬＳ−１７４Ｔ細胞により発現されるヒトＣＥＡに対する（Ｂ）、「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ軽鎖融合」（配列番号１８３、２０９、２１１、２１３）の結合。
【図５８Ａ】ＦＡＣＳにより決定される、Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ａ）により発現されるヒトＣＤ５に対する、「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号５、２３、２１５、２１７を参照）及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，反転型」（配列番号５、２３、２１５、２１９を参照）コンストラクトの結合。
【図５８Ｂ】ＦＡＣＳにより決定される、ＷＭ２６６−４細胞（Ｂ）により発現されるヒトＭＣＳＰに対する、「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号５、２３、２１５、２１７を参照）及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，反転型」（配列番号５、２３、２１５、２１９を参照）コンストラクトの結合。
【図５９Ａ】指定された濃度のＣＤ３／ＭＣＳＰ「１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ」（配列番号５、２３、１８３、１８５を参照）、「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号５、２９、３３、１８１を参照）及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３を参照）コンストラクトで２４時間インキュベーション後のヒトＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞上での初期活性化マーカーＣＤ６９（Ａ）の表面発現レベル。アッセイは、示されているように、ＭＶ−３標的細胞の存在下又は非存在下で行った。
【図５９Ｂ】指定された濃度のＣＤ３／ＭＣＳＰ「１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ」（配列番号５、２３、１８３、１８５を参照）、「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号５、２９、３３、１８１を参照）及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３を参照）コンストラクトで２４時間インキュベーション後のヒトＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞上での後期活性化マーカーＣＤ２５（Ｂ）の表面発現レベル。アッセイは、示されているように、ＭＶ−３標的細胞の存在下又は非存在下で行った。
【図６０Ａ】ｈｕＭＣＳＰ陽性ＭＶ−３腫瘍細胞の存在下又は非存在下で、〜４１時間、「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号５、２３、２１５、２１７）及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，反転型」（配列番号５、２３、２１５、２１９を参照）で処置したカニクイザルＰＢＭＣとの共培養の際の（ＥＴ比＝３：１、ＣＤ３＋の数に正規化）、２匹の異なるカニクイザルからのＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞上の初期活性化マーカーＣＤ２５の表面発現レベル。
【図６０Ｂ】ｈｕＭＣＳＰ陽性ＭＶ−３腫瘍細胞の存在下又は非存在下で、〜４１時間、「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号５、２３、２１５、２１７）及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，反転型」（配列番号５、２３、２１５、２１９を参照）で処置したカニクイザルＰＢＭＣとの共培養の際の（ＥＴ比＝３：１、ＣＤ３＋の数に正規化）、２匹の異なるカニクイザルからのＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞上の初期活性化マーカーＣＤ２５の表面発現レベル。
【図６１Ａ】ヒトＰＢＭＣとの共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）及び、「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，反転型（ＶＬ／ＶＨ）」（配列番号３３、６３、６５、６７を参照）対「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，反転型（ＣＬ／ＣＨ１）」（配列番号６５、６７、１８３、１９７を参照）コンストラクトの異なる濃度による２８時間の活性化の際のＭＫＮ−４５（Ａ）腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。
【図６１Ｂ】ヒトＰＢＭＣとの共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）及び、「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，反転型（ＶＬ／ＶＨ）」（配列番号３３、６３、６５、６７を参照）対「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，反転型（ＣＬ／ＣＨ１）」（配列番号６５、６７、１８３、１９７を参照）コンストラクトの異なる濃度による２８時間の活性化の際のＬＳ−１７４Ｔ（Ｂ）腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。
【図６２】ヒトＰＢＭＣとの共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）及び、「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＶＬ／ＶＨ）」（配列番号３３、６３、６５、６７を参照）対「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ （ＣＬ／ＣＨ１）」（配列番号６５、６７、１８３、１９７を参照）コンストラクトの異なる濃度による２８時間の活性化の際のＷＭ２６６−４腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。
【図６３】ヒトＰＢＭＣとの共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）及び、「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ （ＶＨ／ＶＬ）」（配列番号３３、６３、６５、６７を参照）対「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＬ／ＣＨ１）」（配列番号６５、６７、１８３、１９７を参照）コンストラクトの異なる濃度による２７時間の活性化の際のＭＶ−３腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。
【図６４Ａ】示されるように、ヒトＰＢＭＣとの共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）及び異なる濃度の「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３を参照）、「１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ」（配列番号５、２３、１８３、１８５）、及び「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号５、２９、３３、１８１を参照）による２１時間の活性化に際して、ヒトＭＣＳＰ−陽性ＷＭ２６６−４（Ａ）腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。
【図６４Ｂ】示されるように、ヒトＰＢＭＣとの共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）及び異なる濃度の「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３を参照）、「１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ」（配列番号５、２３、１８３、１８５）、及び「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号５、２９、３３、１８１を参照）による２１時間の活性化に際して、ヒトＭＣＳＰ−陽性ＭＶ−３（Ｂ）腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。
【図６５Ａ】ヒトＰＢＭＣとの共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）及び、「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ ＬＣ融合」（配列番号１８３、２０９、２１１、２１３）の異なる濃度による２８時間の活性化の際のＭＫＮ−４５（Ａ）腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。
【図６５Ｂ】ヒトＰＢＭＣとの共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）及び、「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ ＬＣ融合」（配列番号１８３、２０９、２１１、２１３）の異なる濃度による２８時間の活性化の際のＬＳ−１７４Ｔ（Ｂ）腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。
【図６６】ヒトＰＢＭＣとの共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）及び、「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ ＬＣ融合」（配列番号１８３、２０９、２１１、２１３を参照）対非標的化「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」参照の異なる濃度による２４時間の活性化の際の、ＭＣ３８−ｈｕＣＥＡ腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。
【図６７Ａ】「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ（Ｖ９）」（配列番号３、５、２９、３３を参照）及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，反転型（Ｖ９）」（配列番号５、２３、１８３、１８７を参照）、「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ（抗ＣＤ３）」（配列番号５、２３、２１５、２１７を参照）及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，反転型（抗ＣＤ３）」（配列番号５、２３、２１５、２１９を参照）コンストラクトで処置された、ヒトＰＢＭＣとの共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）に際して、ヒトＭＣＳＰ−陽性ＭＶ−３（Ａ）腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。
【図６７Ｂ】「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ（Ｖ９）」（配列番号３、５、２９、３３を参照）及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，反転型（Ｖ９）」（配列番号５、２３、１８３、１８７を参照）、「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ（抗ＣＤ３）」（配列番号５、２３、２１５、２１７を参照）及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，反転型（抗ＣＤ３）」（配列番号５、２３、２１５、２１９を参照）コンストラクトで処置された、ヒトＰＢＭＣとの共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）に際して、ヒトＭＣＳＰ−陽性ＷＭ２６６−４（Ｂ）腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。
【図６８】非成熟親クローン（Ｍ４−３ ＭＬ２）と比較した親和性成熟抗ＭＣＳＰクローンのアラインメント。
【図６９】ＭＣＳＰ ＴＣＢ（２＋１ Ｃｒｏｓｓｆａｂ−ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ反転型）分子の模式図。
【図７０】ＴＣＢ（２＋１ Ｃｒｏｓｓｆａｂ−ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ反転型，配列番号：２７８、３１９、３２０及び３２１）のＣＥ−ＳＤＳ分析。ＭＣＳＰ ＴＣＢのＳＤＳ−ＰＡＧＥとして示された電気泳動図：Ａ）非還元、Ｂ）還元。
【図７１】ＣＥＡ ＴＣＢ（２＋１ Ｃｒｏｓｓｆａｂ−ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ反転型）分子の模式図。
【図７２】ＣＥＡ ＴＣＢ（２＋１ Ｃｒｏｓｓｆａｂ−ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ反転型，配列番号：２８８、３２２、３２３及び３２４）分子のＣＥ−ＳＤＳ分析。ＣＥＡ ＴＣＢのＳＤＳ−Ｐａｇｅとして示された電気泳動図：Ａ）非還元、Ｂ）還元。
【図７３】Ａ３７５細胞（ＭＣＳＰ＋）（Ａ）及びＪｕｒｋａｔ（ＣＤ３＋細胞）（Ｂ）へのＭＣＳＰ ＴＣＢ（配列番号：２７８、３１９、３２０及び３２１）の結合。「非標的化ＴＣＢ」：ＣＤ３に結合するが第二抗原（配列番号：３２５、３２６、３２７及び３２８）には結合しない二重特異性抗体。
【図７４Ａ−Ｂ】Ａ３７５（高ＭＣＳＰ）（Ａ）、ＭＶ−３（中ＭＣＳＰ）（Ｂ）標的細胞（Ｅ：Ｔ＝１０：１、エフェクターヒトＰＢＭＣ、４時間のインキュベーション時間）の、ＭＣＳＰ ＴＣＢ抗体（配列番号：２７８、３１９、３２０及び３２１）によって誘導されたＴ細胞死滅。「非標的化ＴＣＢ」：ＣＤ３に結合するが第二抗原（配列番号：３２５、３２６、３２７及び３２８）には結合しない二重特異性抗体。
【図７４Ｃ−Ｄ】ＨＣＴ−１１６（低ＭＣＳＰ）（Ｃ）及びＬＳ１８０（ＭＣＳＰ陰性）（Ｄ）標的細胞（Ｅ：Ｔ＝１０：１、エフェクターヒトＰＢＭＣ、４時間のインキュベーション時間）の、ＭＣＳＰ ＴＣＢ抗体（配列番号：２７８、３１９、３２０及び３２１）によって誘導されたＴ細胞死滅。「非標的化ＴＣＢ」：ＣＤ３に結合するが第二抗原（配列番号：３２５、３２６、３２７及び３２８）には結合しない二重特異性抗体。
【図７５Ａ−Ｂ】ＭＣＳＰ ＴＣＢ抗体（配列番号：２７８、３１９、３２０及び３２１）によって誘導されたＭＶ３メラノーマ細胞（Ｅ：Ｔ＝１０：１、２４時間のインキュベーション）のＴ細胞媒介死滅後のヒトＣＤ８＋（Ａ、Ｂ）Ｔ細胞上の上方制御。「非標的化ＴＣＢ」：ＣＤ３に結合するが第二抗原（配列番号：３２５、３２６、３２７及び３２８）には結合しない二重特異性抗体。
【図７５Ｃ−Ｄ】ＭＣＳＰ ＴＣＢ抗体（配列番号：２７８、３１９、３２０及び３２１）によって誘導されたＭＶ３メラノーマ細胞（Ｅ：Ｔ＝１０：１、２４時間のインキュベーション）のＴ細胞媒介死滅後のヒトＣＤ４＋（Ｃ、Ｄ）Ｔ細胞上の上方制御。「非標的化ＴＣＢ」：ＣＤ３に結合するが第二抗原（配列番号：３２５、３２６、３２７及び３２８）には結合しない二重特異性抗体。
【図７６Ａ−Ｃ】ＭＣＳＰ ＴＣＢ抗体（配列番号：２７８、３１９、３２０及び３２１）によって誘導されたＭＶ３メラノーマ細胞（Ｅ：Ｔ＝１０：１、２４時間のインキュベーション）のＴ細胞媒介死滅後のヒトＰＢＭＣによるＩＬ−２（Ａ）、ＩＦＮ−γ（Ｂ）、ＴＮＦα（Ｃ）の分泌。「非標的化ＴＣＢ」：ＣＤ３に結合するが第二抗原（配列番号：３２５、３２６、３２７及び３２８）には結合しない二重特異性抗体。
【図７６Ｄ−Ｆ】ＭＣＳＰ ＴＣＢ抗体（配列番号：２７８、３１９、３２０及び３２１）によって誘導されたＭＶ３メラノーマ細胞（Ｅ：Ｔ＝１０：１、２４時間のインキュベーション）のＴ細胞媒介死滅後のヒトＰＢＭＣによるＩＬ−４（Ｄ）、ＩＬ−１０（Ｅ）及びグランザイムＢ（Ｆ）の分泌。「非標的化ＴＣＢ」：ＣＤ３に結合するが第二抗原（配列番号：３２５、３２６、３２７及び３２８）には結合しない二重特異性抗体。
【図７７】ＣＥＡ発現Ａ５４９肺腺がん細胞（Ａ）及びＣＤ３発現不死化ヒト及びカニクイザルＴリンパ細胞株（それぞれＪｕｒｋａｔ（Ｂ）及びＨＳＣ−Ｆ（Ｃ））へのＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号：２８８、３２２、３２３及び３２４）の結合。
【図７８Ａ−Ｄ】ＨＰＡＦＩＩ（高ＣＥＡ）（Ａ）、ＢｘＰＣ−３（中ＣＥＡ）（Ｂ）、ＡＳＰＣ−１（低ＣＥＡ）（Ｃ）及びＨＣＴ−１１６細胞（ＣＥＡ陰性）（Ｄ）ＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号：２８８、３２２、３２３及び３２４）によって誘導されたＴ細胞死滅。Ｅ：Ｔ＝１０：１、エフェクターヒトＰＢＭＣ、２４時間（Ａ−Ｄ）のインキュベーション時間。非標的化ＴＣＢ」：ＣＤ３に結合するが第二抗原（配列番号：３２５、３２６、３２７及び３２８）には結合しない二重特異性抗体。
【図７８Ｅ−Ｈ】ＨＰＡＦＩＩ（高ＣＥＡ）（Ｅ）、ＢｘＰＣ−３（中ＣＥＡ）（Ｆ）、ＡＳＰＣ−１（低ＣＥＡ）（Ｇ）及びＨＣＴ−１１６細胞（ＣＥＡ陰性）（Ｈ）ＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号：２８８、３２２、３２３及び３２４）によって誘導されたＴ細胞死滅。Ｅ：Ｔ＝１０：１、エフェクターヒトＰＢＭＣ、４８時間（Ｅ−Ｈ）のインキュベーション時間。非標的化ＴＣＢ」：ＣＤ３に結合するが第二抗原（配列番号：３２５、３２６、３２７及び３２８）には結合しない二重特異性抗体。
【図７９Ａ−Ｄ】ＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号：２８８、３２２、３２３及び３２４）によって誘導されたＨＰＡＦＩＩ（高ＣＥＡ）（Ａ）、ＢｘＰＣ−３（中ＣＥＡ）（Ｂ）、ＡＳＰＣ−１（低ＣＥＡ）（Ｃ）及びＨＣＴ−１１６細胞（ＣＥＡ陰性）（Ｄ）のＴ細胞媒介死滅から５日後のヒトＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞増殖（Ａ−Ｄ）。「ＤＰ４７ ＴＣＢ」：ＣＤ３に結合するが第二抗原（配列番号：３２５、３２６、３２７及び３２８）には結合しない二重特異性抗体。
【図７９Ｅ−Ｈ】ＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号：２８８、３２２、３２３及び３２４）によって誘導されたＨＰＡＦＩＩ（高ＣＥＡ）（Ｅ）、ＢｘＰＣ−３（中ＣＥＡ）（Ｆ）、ＡＳＰＣ−１（低ＣＥＡ）（Ｇ）及びＨＣＴ−１１６細胞（ＣＥＡ陰性）（Ｈ）のＴ細胞媒介死滅から５日後のヒトＣＤ８＋及びＣＤ４ Ｔ細胞上のＣＤ２５の上方制御（Ｅ−Ｈ）。「ＤＰ４７ ＴＣＢ」：ＣＤ３に結合するが第二抗原（配列番号：３２５、３２６、３２７及び３２８）には結合しない二重特異性抗体。
【図８０Ａ−Ｃ】ＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号：２８８、３２２、３２３及び３２４）によって誘導されたＭＫＮ４５腫瘍細胞（Ｅ：Ｔ＝１０：１、４８時間のインキュベーション）のＴ細胞媒介死滅後のＩＦＮ−γ（Ａ）、ＴＮＦα（Ｂ）、グランザイムＢ（Ｃ）の分泌。「非標的化ＴＣＢ」：ＣＤ３に結合するが第二抗原（配列番号：３２５、３２６、３２７及び３２８）には結合しない二重特異性抗体。
【図８０Ｄ−Ｆ】ＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号：２８８、３２２、３２３及び３２４）によって誘導されたＭＫＮ４５腫瘍細胞（Ｅ：Ｔ＝１０：１、４８時間のインキュベーション）のＴ細胞媒介死滅後のＩＬ−２（Ｄ）、ＩＬ−６（Ｅ）及びＩＬ−１０（Ｆ）の分泌。「非標的化ＴＣＢ」：ＣＤ３に結合するが第二抗原（配列番号：３２５、３２６、３２７及び３２８）には結合しない二重特異性抗体。
【図８１】ＣＥＡ ＴＣＢ及びｓＣＥＡとのインキュベーションの２４時間（Ａ）又は４８時間（Ｂ）後に検出された、増加濃度のｓｈｅｄＣＥＡ（ｓＣＥＡ）の存在下でＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号：２８８、３２２、３２３及び３２４）によって誘導されたＣＥＡ発現ＬＳ１８０腫瘍標的細胞のＴ細胞媒介死滅。
【図８２】ＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号：２８８、３２２、３２３及び３２４）及びヒトＰＢＭＣ（Ａ、Ｃ）又はカニクイザルＰＢＭＣ（Ｂ、Ｄ）をエフェクター細胞として伴ったインキュベーションの２１時間（Ａ、Ｂ）及び４０時間（Ｃ、Ｄ）後に評価されたヒトＣＥＡ過剰発現Ａ５４９（肺腺がん）細胞（Ａ５４９−ｈＣＥＡ）のＴ細胞媒介死滅。
【図８３Ａ】０．８ｎＭ（Ａ）のＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号：２８８、３２２、３２３及び３２４）によって誘導されたＣＥＡ発現ヒト結腸直腸がん細胞株のＴ細胞媒介死滅。
【図８３Ｂ】４ｎＭ（Ｂ）のＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号：２８８、３２２、３２３及び３２４）によって誘導されたＣＥＡ発現ヒト結腸直腸がん細胞株のＴ細胞媒介死滅。
【図８３Ｃ】２０ｎＭ（Ｃ）のＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号：２８８、３２２、３２３及び３２４）によって誘導されたＣＥＡ発現ヒト結腸直腸がん細胞株のＴ細胞媒介死滅。
【図８３Ｄ−Ｅ】（Ｄ）２０ｎＭのＣＥＡ ＴＣＢでのＣＥＡ発現と特異的溶解％間の相関、（Ｅ）ＣＥＡ発現とＣＥＡ ＴＣＢのＥＣ５０間の相関。
【図８４Ａ−Ｂ】ヒトＰＢＭＣが共移植（Ｅ：Ｔ比 ５：１）されたＬＳ１７４Ｔ−ｆｌｕｃ２ヒト結腸がんにおけるＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号：２８８、３２２、３２３及び３２４）のインビボでの抗腫瘍効果。結果は、異なった研究群におけるノギス（Ａ）及びバイオルミネセンス（全フラックス、Ｂ）によって測定した腫瘍体積の１２匹のマウスの平均及びＳＥＭを示す。（Ａ、Ｂ）１日目での早期の処置開始。ＭＣＳＰ ＴＣＢ（配列番号：２７８、３１９、３２０及び３２１）をネガティブコントロールとして使用した。
【図８４Ｃ−Ｄ】ヒトＰＢＭＣが共移植（Ｅ：Ｔ比 ５：１）されたＬＳ１７４Ｔ−ｆｌｕｃ２ヒト結腸がんにおけるＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号：２８８、３２２、３２３及び３２４）のインビボでの抗腫瘍効果。結果は、異なった研究群におけるノギス（Ｃ）及びバイオルミネセンス（全フラックス、Ｄ）によって測定した腫瘍体積の１２匹のマウスの平均及びＳＥＭを示す。（Ｃ、Ｄ）７日目で開始の遅らせた処置。ＭＣＳＰ ＴＣＢ（配列番号：２７８、３１９、３２０及び３２１）をネガティブコントロールとして使用した。
【図８５】ヒトＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ比 １：１）が共移植されたＬＳ１７４Ｔ−ｆｌｕｃ２ヒト結腸がんにおけるＣＥＡ ＴＣＢ（配列番号：２８８、３２２、３２３及び３２４）のインビボでの抗腫瘍効果。結果は、異なった研究群におけるノギス（Ａ）及びバイオルミネセンス（全フラックス、Ｂ）によって測定した腫瘍体積の１０匹のマウスの平均及びＳＥＭを示す。ＭＣＳＰ ＴＣＢ（配列番号：２７８、３１９、３２０及び３２１）をネガティブコントロールとして使用した。
【図８６】免疫適格性ｈｕＣＤ３ε／ｈｕＣＥＡトランスジェニックマウスのＰａｎｃｏ２−ｈｕＣＥＡ同所性腫瘍モデルにおけるマウス化ＣＥＡ ＴＣＢのインビボでの効果。
【図８７】ＣＥＡ ＴＣＢの熱安定性。０．０５℃／分で２５−７５℃の温度勾配で測定した動的光散乱。複製は灰色で示される。
【図８８】ＭＣＳＰ ＴＣＢの熱安定性。０．０５℃／分で２５−７５℃の温度勾配で測定した動的光散乱。複製は灰色のラインで示される。
【図８９Ａ−Ｄ】（Ａ）Ａ３７５（高ＭＣＳＰ）、（Ｂ）ＭＶ−３（中ＭＣＳＰ）及び（Ｃ）ＨＣＴ−１１６（低ＭＣＳＰ）腫瘍標的細胞のＭＣＳＰ ＴＣＢ（配列番号：２７８、３１９、３２０及び３２１）及びＭＣＳＰ１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ ＴＣＢ抗体によって誘導されたＴ細胞媒介死滅。（Ｄ）ＬＳ１８０（ＭＣＳＰ陰性腫瘍細胞株）をネガティブコントロールとして使用した。抗体及びエフェクター細胞（ヒトＰＢＭＣ）との標的細胞のインキュベーション後、２４時間（Ａ−Ｄ）で腫瘍細胞死滅を評価した。
【図８９Ｅ−Ｈ】（Ａ）Ａ３７５（高ＭＣＳＰ）、（Ｂ）ＭＶ−３（中ＭＣＳＰ）及び（Ｃ）ＨＣＴ−１１６（低ＭＣＳＰ）腫瘍標的細胞のＭＣＳＰ ＴＣＢ（配列番号：２７８、３１９、３２０及び３２１）及びＭＣＳＰ１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ ＴＣＢ抗体によって誘導されたＴ細胞媒介死滅。（Ｄ）ＬＳ１８０（ＭＣＳＰ陰性腫瘍細胞株）をネガティブコントロールとして使用した。抗体及びエフェクター細胞（ヒトＰＢＭＣ）との標的細胞のインキュベーション後、４８時間（Ｅ−Ｈ）で腫瘍細胞死滅を評価した。
【図９０Ａ−Ｄ】ＭＣＳＰ ＴＣＢ（配列番号：２７８、３１９、３２０及び３２１）及びＭＣＳＰ１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ ＴＣＢ抗体によって媒介されたＭＣＳＰ発現腫瘍細胞（Ａ３７５、Ａ−Ｄ）のＴ細胞死滅後のＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔ細胞上のＣＤ２５及びＣＤ６９上方制御。
【図９０Ｅ−Ｈ】ＭＣＳＰ ＴＣＢ（配列番号：２７８、３１９、３２０及び３２１）及びＭＣＳＰ１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ ＴＣＢ抗体によって媒介されたＭＣＳＰ発現腫瘍細胞（ＭＶ−３、Ｅ−Ｈ）のＴ細胞死滅後のＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔ細胞上のＣＤ２５及びＣＤ６９上方制御。
【図９１】非結合抗体としてＤＰ４７ ＧＳと抗ＣＤ３抗体としてヒト化ＣＨ２５２７を含むＤＰ４７ ＧＳ ＴＣＢ（２＋１ Ｃｒｏｓｓｆａｂ−ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ反転型＝「非標的化ＴＣＢ」配列番号：３２５、３２６、３２７及び３２８）のＣＥ−ＳＤＳ分析。ＤＰ４７ ＧＳ ＴＣＢのＳＤＳ−ＰＡＧＥとして示された電気泳動図：Ａ）非還元、Ｂ）還元。
【図９２】ＭＣＳＰ ＴＣＢ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ／Ｌ３２５Ｅ分子の模式図。
【図９３】ＭＣＳＰ ＴＣＢ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ／Ｌ３２５Ｅ分子（配列番号：２７８、３１９、３６９及び３７０）のＣＥ−ＳＤＳ分析。ＭＣＳＰ ＴＣＢ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ／Ｌ３２５ＥのＳＤＳ−ＰＡＧＥとして示された電気泳動図：（Ａ）非還元、（Ｂ）還元。
【図９４】ＭＶ−３細胞（ＭＣＳＰ＋；ＥＣ５０＝２０２９ｐＭ）（Ａ）及びＪｕｒｋａｔ（ＣＤ３＋）（Ｂ）へのＭＣＳＰ ＴＣＢ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ／Ｌ３２５Ｅ（配列番号：２７８、３１９、３６９及び３７０）の結合。
【図９５】２４時間（ＥＣ５０＝１４．９ｐＭ）（Ａ）及び４８時間（ＥＣ５０＝０．２４ｐＭ）（Ｂ）のインキュベーション時間のＭＶ−３標的細胞のＭＣＳＰ ＴＣＢ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ／Ｌ３２５Ｅ（配列番号：２７８、３１９、３６９及び３７０）により誘導されたＴ細胞死滅（Ｅ：Ｔ＝１０：１、エフェクターヒトＰＢＭＣ）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義
用語は、次に他の定義がなされていない限り、当該技術分野で一般的に使用されている通りにここで使用される。
ここで使用される場合、「抗原結合分子」という用語は、その最も広い意味では抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、免疫グロブリン及びその誘導体、例えば断片である。
【００１９】
「二重特異性」という用語は、抗原結合分子が少なくとも二つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は、二つの抗原結合部位を含み、その各々は異なる抗原決定基に特異的である。ある実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基、特に２つの別個の細胞上に発現された２つの抗原決定基に同時に結合することができる。
ここで使用される「価」という用語は、抗原結合分子中に特定された数の抗原結合部位が存在することを示す。而して、「抗原への一価結合」という用語は、抗原結合分子中の抗原に特異的な一つの（そして一つを越えない）抗原結合部位が存在することを示す。
「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を提供する抗原結合分子の部位、すなわち一又は複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含む。天然免疫グロブリン分子は典型的には二つの抗原結合部位を有し、Ｆａｂ分子は典型的には単一の抗原結合部位を有する。
【００２０】
ここで使用される場合、「抗原結合部分」という用語は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施態様では、抗原結合部分は、標的部位、例えば抗原決定基を持つ特定のタイプの腫瘍細胞又は腫瘍間質に付着される実体（例えば第二抗原結合部分）を指向することが可能である。別の実施態様では、抗原結合部分は、例えばＴ細胞受容体複合体抗原などその標的抗原を介するシグナル伝達を活性化することができる。更にここで定義される通り、抗原結合部分には抗体とその断片が含まれる。特定の抗原結合部分は、抗体重鎖可変領域と抗体軽鎖可変領域を含む抗体の抗原結合ドメインを含む。所定の実施態様では、抗原結合部分は、ここで更に定義され、当該技術分野で知られている抗体定常領域を含みうる。有用な重鎖定常領域は、５のアイソタイプ：α、δ、ε、γ又はμの何れかを含む。有用な軽鎖定常領域は、２のアイソタイプ：κ及びλの何れかを含む。
【００２１】
ここで使用される場合、「抗原決定基」という用語は、「抗原」及び「エピトープ」と同義で、抗原結合部分が結合するポリペプチド高分子上の部位（例えばアミノ酸の隣接するストレッチ又は非連続アミノ酸の異なる領域から構成される立体配置）を指し、抗原結合部分−抗原複合体を形成する。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上、ウイルス感染細胞の表面上、他の疾患細胞の表面上、免疫細胞の表面上、血清中に遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に見出されうる。ここで抗原と称されるタンパク質（例えば、ＭＣＳＰ、ＦＡＰ、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＣＤ３３、ＣＤ３）は、他に示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）などの哺乳類及び齧歯類（例えばマウス及びラット）を含む任意の脊椎動物供給源からのタンパク質の任意の天然型とすることができる。特定の実施態様では、抗原はヒトタンパク質である。ここで特定のタンパク質に言及される場合、この用語は、「完全長」、未処理タンパク質並びに細胞におけるプロセシングから生じるタンパク質の任意の形態を包含する。その用語はまた、天然に生じるタンパク質変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。抗原として有用な例示的なヒトタンパク質は、限定されないが、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４としても知られているメラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）（ＣＳＰＧ４；ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ６ＵＶＫ１（バージョン７０），ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００１８８８．２）；セプラーゼとしても知られている線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）（Ｕｎｉ Ｐｒｏｔ番号Ｑ１２８８４，Ｑ８６Ｚ２９，Ｑ９９９９８，ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００４４５１）；癌胎児性抗原関連細胞接着分子５としても知られている癌胎児性抗原（ＣＥＡ）（ＣＥＡＣＡＭ５；ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０６７３１（バージョン１１９），ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００４３５４．２）；ｇｐ６７又はＳｉｇｌｅｃ−３としても知られているＣＤ３３（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ２０１３８，ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１０７６０８７，ＮＰ＿００１１７１０７９）；ＥｒｂＢ−１又はＨｅｒ１としても知られている上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ００５３，ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿９５８４３９，ＮＰ＿９５８４４０）、及びＣＤ３、特にＣＤ３のイプシロンサブユニット（ヒト配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０７７６６（バージョン１３０），ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿０００７２４．１，配列番号２６５を；又はカニクイザル［Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９５ＬＩ５（バージョン４９），ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＢ７１８４９．１，配列番号２６６を参照）を含む。所定の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、異なる種からの活性化Ｔ細胞抗原又は標的抗原間で保存されている活性化Ｔ細胞抗原又は標的細胞抗原のエピトープに結合する。
【００２２】
所定の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子はＣＤ３及びＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）に結合するが、ＣＥＡＣＡＭ１又はＣＥＡＣＡＭ６には結合しない。
【００２３】
「特異的結合」とは、結合が抗原に対して選択的であり、望まれない又は非特異的相互作用とは区別できることを意味する。特定の抗原決定基に結合する抗原結合部分の能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ機器で解析）（Liljeblad等, Glyco J 17, 323-329(2000)）及び伝統的な結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229(2002))の何れかによって測定することができる。一実施態様では、無関係のタンパク質への抗原結合部分の結合の程度は、例えばＳＰＲにより測定される場合、抗原に対する抗原結合部分の結合の約１０％未満である。所定の実施態様では、抗原へ結合する抗原結合部分、又はその抗原結合部分を含む抗原結合分子は、解離定数（ＫＤ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）である。
【００２４】
「親和性」とは、分子（例えば、受容体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、リガンド）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。ここで使用される場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗原結合部分と抗原、又は受容体とそのリガンド）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離及び結合速度定数（それぞれｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である解離定数（ＫＤ）によって表すことができる。従って、等価な親和性は、速度定数の比が同じままである限り、別の速度定数を含み得る。親和性は、ここに記載されるものを含む、当該技術分野で良く確立された方法によって測定することができる。親和性を測定するための特別な方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
「減少した結合」、例えばＦｃ受容体に対する減少した結合とは、例えばＳＰＲにより測定される場合、それぞれの相互作用の親和性の減少を指す。明確にするために、この用語はまた親和性がゼロ（又は分析法の検出限界以下）への低下、すなわち、相互作用の完全な撤廃をも含む。逆に、「増加した結合」は、それぞれの相互作用に対する結合親和性の増加を指す。
【００２５】
ここで使用される「活性化Ｔ細胞抗原」は、抗原結合分子との相互作用時にＴ細胞活性化を誘導することができる、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の表面に発現される抗原決定基を意味する。具体的には、活性化Ｔ細胞抗原との抗原結合分子の相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達カスケードを惹起させることにより、Ｔ細胞活性化を誘導することができる。特定の実施態様では、活性化Ｔ細胞はＣＤ３である。
ここで使用される「Ｔ細胞活性化」は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害活性、及び活性化マーカーの発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の一又は複数の細胞応答を指す。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化を誘導することができる。Ｔ細胞活性化を測定するための適切なアッセイは、ここに記載の当該技術分野で知られている。
ここで使用される「標的細胞抗原」とは、例えば、がん細胞などの腫瘍の細胞又は腫瘍間質の細胞など、標的細胞の表面上に提示される抗原決定基を意味する。
【００２６】
ここで使用される場合、抗原結合部分などに関する「第一」及び「第二」という用語は、一より多くのタイプの部分がある場合に、便宜上区別するために使用される。これらの用語の使用は、特記しない限り、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の順番又は配向を与えることを意図するものではない。
「Ｆａｂ分子」は、免疫グロブリンの重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメイン（「Ｆａｂ重鎖」）と軽鎖のＶＬ及びＣＬドメイン（「Ｆａｂ軽鎖」）からなるタンパク質を指す。
「融合」とは、その成分（例えば、Ｆａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）が、直接又は一又は複数のペプチドリンカーを介してペプチド結合によって連結されることを意味する。
【００２７】
ここで使用される場合、「単鎖」という用語は、ペプチド結合によって線形に結合されるアミノ酸モノマーを含む分子を指す。ある実施態様では、抗原結合部分の一つは、一本鎖Ｆａｂ分子、すなわちＦａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖がペプチドリンカーによって連結されて単一のペプチド鎖を形成しているＦａｂ分子である。特定のそのような実施態様では、Ｆａｂ軽鎖のＣ末端は、一本鎖Ｆａｂ分子中のＦａｂ重鎖のＮ末端に連結されている。
「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも称す）とは、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換されているＦａｂ分子を意味し、すなわちクロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域及び重鎖定常領域からなるペプチド鎖と重鎖可変領域及び軽鎖定常領域からなるペプチド鎖とを含む。明確にするために、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子においては、重鎖定常領域を含むペプチド鎖は、クロスオーバーＦａｂ分子の「重鎖」とここでは称す。逆に、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子においては、重鎖可変領域を含むペプチド鎖は、クロスオーバーＦａｂ分子の「重鎖」とここでは称す。
【００２８】
「免疫グロブリン分子」という用語は、天然に生じる抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している２つの軽鎖と２つの重鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端へ向けて、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、続いて重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）がある。同様に、Ｎ末端からＣ末端へ向けて、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインがある。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つのタイプの一つに割り当てることができ、そのうち幾つかは更にγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）などのサブタイプに分割されうる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプの一つに割り当てることができる。免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して連結された２つのＦａｂ分子及びＦｃドメインから本質的になる。
【００２９】
「抗体」という用語は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体を含む。所定の抗体断片の総説については、 Hudson等, Nat Med 9, 129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第１１３巻， Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, p269-315(1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の検討については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。ダイアボディは２価又は二重特異性でありうる２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許出願公開第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号； Hudson等, Nat Med 9, 129-134 (2003)；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもまたHudson等, Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。ある実施態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第６２４８５１６Ｂ１号を参照）。抗体断片は様々な技術で作製することができ、限定されないが、ここに記載されるように、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
【００３０】
「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全体に相補的であり特異的に結合する領域を含む抗体の一部を指す。抗原結合ドメインは、例えば、一又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により与えられうる。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。例えば、Kindt等 Kuby Immunology, 6版, W.H. Freeman and Co., 91頁 (2007)を参照。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。
【００３１】
ここで使用される「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般に、天然型４鎖抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの、６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは一般に、超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最も高い配列可変性であり、及び／又は抗原認識に関与している。ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（ＨＶＲ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分への参照においてここでは互換的に使用される。この特定の領域は、Kabat等, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)及びChothia等, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)に記述されており、その定義は、相互に対して比較するときにアミノ酸残基の重複又はサブセットを含む。にも関わらず、抗体又はその変異体のＣＤＲに言及するための何れかの定義の適用は、ここで定義され使用される用語の範囲内であることが意図される。上記の引用文献の各々によって定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として以下の表１に記載される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列や大きさによって異なる。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられれば、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを常套的に決定することができる。
【００３２】
2016512421.tif 000003
【００３３】
Ｋａｂａｔ等はまた任意の抗体に適用可能である可変領域配列に対する番号付けシステムを定義した。当業者は、配列それ自体を超えて如何なる実験データにも頼ることなく、任意の可変領域配列に対してこのＫａｂａｔの番号付けシステムを一義的に割り当てることができる。ここで使用される場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」とは、Kabat等, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)に記載されている番号付けシステムを指す。特記されない限り、抗体可変領域内の特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う。
配列表のポリペプチド配列はＫａｂａｔの番号付けシステムに従って番号付けされてはいない。しかし、配列表の配列の番号をＫａｂａｔの番号付けに変換することは当業者の通常の技術の範囲内である。
【００３４】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメインで構成される：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の次の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００３５】
ここでの「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界は、若干異なるかもしれないが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６から又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端へ伸展するように定義される。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しているか、又は存在していない場合がある。ここに明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。ここで使用されるＦｃドメインの「サブユニット」は、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドの一つ、すなわち、安定な自己結合が可能な免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧのＦｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧのＨＣ２及びＩｇＧのＣＨ３定常ドメインを含む。
【００３６】
「Ｆｃドメインの第一及び第二のサブユニットの結合を促進する修飾」とは、ホモ二量体を形成する同一のポリペプチドとのＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドの結合を減少させ又は防止するペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。ここで使用される結合を促進する修飾は、結合が望まれる２つのＦｃドメインサブユニット（すなわちＦｃドメインの第一及び第２サブユニット）のそれぞれに対して行われた別々の修飾を特に含み、ここで、該修飾は２つのＦｃドメインのサブユニットの結合を促進するように互いに相補的である。例えば、結合を促進する修飾は、その結合をそれぞれ立体的又は静電気的に好ましくするために、Ｆｃドメインの一方又は双方の構造又は電荷を改変しうる。従って、（ヘテロ）二量体化が、サブユニットの各々に融合した更なる成分（例えば抗原結合部分）が同一ではないという意味で非同一であるかもしれない、第一Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと第二Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドの間に生じる。幾つかの実施態様では、結合を促進する修飾は、Ｆｃドメイン中にアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、結合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々における別々のアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。
【００３７】
「エフェクター機能」という用語は、抗体のＦｃ領域に起因するその生物学的活性を指し、抗体アイソタイプによって異なる。抗体エフェクター機能の例は、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞活性化を含む。
ここで使用される場合、「操作する、操作された、操作(engineer, engineered, engineering)」という用語は、天然に生じるか又は組換えのポリペプチド又はその断片のペプチド骨格の何らかの修飾又は翻訳後修飾を含むと考えられる。操作は、アミノ酸配列の、糖鎖付加パターン、又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、並びにこれらのアプローチの組合せを含む。
【００３８】
ここで使用される「アミノ酸変異」という用語は、アミノ酸置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意味する。最終コンストラクトが所望の特徴、例えばＦｃ受容体への減少した結合又は別のペプチドとの増加した結合を有することを条件として、置換、欠失、挿入、及び修飾の何れかの組合せが最終コンストラクトに到達するためになすことができる。アミノ酸配列欠失及び挿入は、アミノ酸のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端欠失及び挿入を含む。特定のアミノ酸変異はアミノ酸置換である。例えば、Ｆｃ領域の結合特性を変更する目的のために、非保存的アミノ酸置換、すなわち一のアミノ酸を、異なる構造的及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸と置換することが特に所望される。アミノ酸置換は、２０の標準的アミノ酸の非天然に生じるアミノ酸又は天然に生じるアミノ酸誘導体による置換を含む（例えば４−ヒドロキシプロリン、３−メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５−ヒドロキシリジン）。アミノ酸変異は、当該分野でよく知られた遺伝学的又は化学的方法を使用して生成されうる。遺伝学的方法は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等を含みうる。化学的修飾など、遺伝子工学以外の方法によるアミノ酸の側鎖基の改変方法がまた有用でありうることが意図される。ここでは同一のアミノ酸変異を示すために様々な命名法が使用されてもよい。例えば、Ｆｃドメインの位置３２９のプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ、又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙとして示すことができる。
【００３９】
ここで使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって線形に結合される単量体（アミノ酸）からなる分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２以上のアミノ酸の何れかの鎖を指し、特定長の産物を指すものではない。このように、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は２以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される何れかの他の用語が、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語はこれらの何れかの用語の代わりに又は互換的に使用されうる。「ポリペプチド」という用語は、限定するものではないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、又は非天然に生じるアミノ酸による修飾を含む、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指す。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来するか又は組換え技術によって生産され得るが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳される必要はない。それは化学合成を含む任意の方法において作製されうる。本発明のポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１０００以上、又は２０００以上のアミノ酸のサイズでありうる。ポリペプチドは定められた三次元構造を有しうるが、それらは必ずしもそのような構造を有する必要はない。定められた三次元構造を有するポリペプチドはフォールドしたと言及され、定められた三次元構造を持たないが多数の異なるコンホメーションをとりうるポリペプチドはアンフォールドと言及される。
【００４０】
「単離された」ポリペプチド又は変異体、又はその誘導体は、その天然環境中にはないポリペプチドを意図する。特定レベルの精製は必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然又は自然環境から除去することができる。何れかの好適な技術によって分離、分画、又は部分的又は実質的に精製された天然又は組換えポリペプチドのように、宿主細胞において発現された組換え生産されたポリペプチド及びタンパク質は、本発明の目的のために単離されたと考えられる。
【００４１】
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって著作され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２もまた、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（これは、別には、与えられたアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する所定の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一と一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、ここで使用される全ての％アミノ酸配列同一性値が、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したようにして得られる。
【００４２】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウィルス由来ＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、通常のホスホジエステル結合又は非一般的な結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含みうる。「核酸分子」という用語は、ポリヌクレオチドに存在する何れかの一又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドとは、それの天然環境から除去された核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意図する。例えば、ベクターに含まれるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されたと考えられる。単離されたポリヌクレオチドの更なる例は、異種性宿主細胞に維持された組換えポリヌクレオチド又は溶液中における（部分的又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドを含む。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、ポリヌクレオチド分子は染色体外に、又はそれの染色体上の位置と異なる染色体上の位置に存在する。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のインビボ又はインビトロＲＮＡ転写物、並びにプラス及びマイナス鎖形態、及び二本鎖形態を含む。本発明による単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成的に生産されたこのような分子を更に含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーター等の調節要素であるか又はそれを含みうる。
【００４３】
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列のそれぞれ１００ヌクレオチドにつき最大で５つの点変異を含みうることを除けば、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意図している。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレオチドの５％までが欠失されたり、又は別のヌクレオチド置換され得、又は参照配列中の全ヌクレオチドの最大５％までの多数のヌクレオチドが参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変化は参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端位置又はそれらの位置の間のどこでも起こり得、参照配列中の残基中に個別に散在するか又は参照配列内における一以上の隣接グループ中に散在している。実際問題として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、常套的に、ポリペプチドに対して上で検討したもの（例えばＡＬＩＧＮ−２）ような既知のコンピュータプログラムを用いて決定することができる。
「発現カセット」という用語は、標的細胞において特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸要素を伴う、組換え又は合成によって生成されるポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片に組み込まれうる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、他の配列の中でもとりわけ、転写される核酸配列及びプロモーターを含む。ある実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
【００４４】
「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は、「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞において作用可能に関連した特定の遺伝子の発現を導入し及び指向するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、多量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。一旦発現ベクターが標的細胞内に入ると、遺伝子にコードされたリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞の転写及び／又は翻訳機構によって生産される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
【００４５】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」という用語は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、一次形質転換細胞及び継代の数に関係なくそれに由来する子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫がここで含まれる。宿主細胞は、本発明で使用される二重特異性抗原結合分子を産生するために使用することができる任意のタイプの細胞系である。宿主細胞は、培養細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞などの哺乳類培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞、僅かな例を挙げると、しかしまた、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織中に含まれる細胞も含む。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインによる結合後に、エフェクター機能を遂行させるために受容体を持つ細胞を刺激するシグナル伝達イベントを誘発させるＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体はＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）を含む。
【００４６】
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクター細胞による抗体被覆標的細胞の溶解をもたらす免疫機構である。標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体又はその誘導体が、Ｎ末端にあるタンパク質部分を一般に介してＦｃ領域に特異的に結合する細胞である。ここで使用される場合、「減少したＡＤＣＣ」という用語は、標的細胞を取り囲む培地中で、上に定義されたＡＤＣＣのメカニズムによって、所定の時間内に、抗体の所定の濃度で溶解される標的細胞の数の減少、及び／又はＡＤＣＣのメカニズムによって、所定の時間内に、所定の数の標的細胞の溶解を達成するために必要とされる、標的細胞を取り囲む培地中の抗体の濃度の増加の何れかとして定義される。ＡＤＣＣの減少は、同じ標準的な産生、精製、製剤、及び保存の方法（当業者に知られている）を使用して、同じ型の宿主細胞によって産生されるが、操作されていない、同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣに関連している。例えば、そのＦｃドメインにＡＤＣＣを減少させるアミノ酸置換を含む抗体により媒介されるＡＤＣＣの減少は、Ｆｃドメインのアミノ酸置換を持たない同一抗体により媒介されるＡＤＣＣに関連する。ＡＤＣＣを測定するための好適なアッセイは、当該分野で周知である（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００６／０８２５１５又はＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１を参照）。
【００４７】
「有効な量」の薬剤とは、投与される細胞又は組織において生理学的変化をもたらすために必要な量を指す。
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療的に有効な量の薬剤は例えば、疾患の有害作用を除去、低下、遅延、最小化又は防止させる。
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。特に、個体又は対象はヒトである。
【００４８】
「薬学的組成物」という用語は、その中に含まれる活性成分の生物学的活性が有効であるようにする形態であって、製剤が投与される対象にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」は、対象に非毒性である、有効成分以外の薬学的組成物中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤（バッファー）、賦形剤、安定剤、又は保存料を含む。
【００４９】
ここで使用される場合、「治療」（及び「治療する(treat)」又は「治療している(treating)」など文法上の変形）は、治療されている個体における疾患の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程においての何れかで実施されうる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
「パッケージ挿入物」という用語は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含められる説明書（指示書）を指すために使用される。
【００５０】
実施態様の詳細な説明
本発明の第一の態様では、一方が活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子であり、他方が標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第一及び第二の抗原結合部分、及び安定な結合が可能な第一及び第二のサブユニットからなるＩｇＧ４のＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供され；ここで第一の抗原結合部分は、
（ａ）Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖がペプチドリンカーによって連結されている前記単鎖Ｆａｂ分子、又は
（ｂ）Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変又は定常領域の何れかが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である。
【００５１】
幾つかの実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原はＣＤ３である。
特定の実施態様では、第一の抗原結合部分は、配列番号：２７０、配列番号：２７１及び配列番号：２７２からなる群から選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と配列番号：２７４、配列番号：２７５、及び配列番号：２７６の群から選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲを含む、ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である。
【００５２】
一実施態様では、第一の抗原結合部分は、配列番号：２６９、配列番号：２９８及び配列番号：２９９の群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：２７３及び配列番号：２９７の群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である。
一実施態様では、第一の抗原結合部分は、配列番号：２６９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：２７３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である。
【００５３】
特定の実施態様では、第二の抗原結合部分は、ＣＥＡに特異的に結合することができ、配列番号：２９０、配列番号：２９１及び配列番号：２９２からなる群から選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と配列番号：２９４、配列番号：２９５及び配列番号：２９６の群から選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲを含む。
他の特定の実施態様では、第二の抗原結合部分は、ＣＥＡに特異的に結合することができ、配列番号：２８９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：２９３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００５４】
他の特定の実施態様では、第二の抗原結合部分は、ＭＣＳＰに特異的に結合することができ、配列番号：２８０、配列番号：２８１、配列番号：２８２、配列番号：３０１、配列番号：３０３、配列番号：３０４及び配列番号：３０６からなる群から選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と配列番号：２８４、配列番号：２８５、配列番号：２８６、配列番号：３１０、配列番号：３１１、配列番号：３１４、配列番号：３１５及び配列番号：３１６の群から選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
他の特定の実施態様では、第二の抗原結合部分は、ＭＣＳＰに特異的に結合することができ、配列番号：２８０、配列番号：２８１及び配列番号：２８２からなる群から選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と配列番号：２８４、配列番号：２８５及び配列番号：２８６の群から選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【００５５】
他の特定の実施態様では、第二の抗原結合部分は、ＭＣＳＰに特異的に結合することができ、配列番号：２７９、配列番号：３００、配列番号：３０２、配列番号：３０５及び配列番号：３０７の群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号：２８３、配列番号：３０９、配列番号：３１２、配列番号：３１３及び配列番号：３１７の群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
他の特定の実施態様では、第二の抗原結合部分は、ＭＣＳＰに特異的に結合することができ、配列番号：２７９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号：２８３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００５６】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）配列番号：２７０、配列番号：２７１及び配列番号：２７２からなる群から選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と配列番号：２７４、配列番号：２７５、及び配列番号：２７６の群から選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む、ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第一の抗原結合部分と；
（ｉｉ）配列番号：２９０、配列番号：２９１及び配列番号：２９２からなる群から選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と配列番号：２９４、配列番号：２９５及び配列番号：２９６の群から選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む、ＣＥＡに特異的に結合することができるＦａｂ分子である第二の抗原結合部分と
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００５７】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）配列番号：２６９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号：２７３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第一の抗原結合部分と；
（ｉｉ）配列番号：２８９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号：２９３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＣＥＡに特異的に結合することができるＦａｂ分子である第二の抗原結合部分と
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００５８】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）配列番号：２７０、配列番号：２７１及び配列番号：２７２からなる群から選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と配列番号：２７４、配列番号：２７５、及び配列番号：２７６の群から選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む、ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第一の抗原結合部分と；
（ｉｉ）配列番号：２８０、配列番号：２８１及び配列番号：２８２からなる群から選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と配列番号：２８４、配列番号：２８５及び配列番号：２８６の群から選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む、ＭＣＳＰに特異的に結合することができるＦａｂ分子である第二の抗原結合部分と
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００５９】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）配列番号：２６９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号：２７３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第一の抗原結合部分と；
（ｉｉ）配列番号：２７９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号：２８３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＭＣＳＰに特異的に結合することができるＦａｂ分子である第二の抗原結合部分と
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００６０】
特定の実施態様では、第一の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変又は定常領域の何れかが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である。更により特定の実施態様では、第一の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である。
一実施態様では、第二の抗原結合部分は一般的なＦａｂ分子である。
更に特定の実施態様では、ＣＤ３に特異的に結合することができる一以下の抗原結合部分がＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子中に存在する（つまり、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子はＣＤ３に対して一価の結合をもたらす）。
【００６１】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）配列番号：２７０の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号：２７１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号：２７２の重鎖ＣＤＲ３、配列番号：２７４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号：２７５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号：２７６の軽鎖ＣＤＲ３を含む、ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第一の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変又は定常領域の何れか、特に定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である第一の抗原結合部分；
（ｉｉ）それぞれが、配列番号：２９０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号：２９１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号：２９２の重鎖ＣＤＲ３、配列番号：２９４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号：２９５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号：２９６の軽鎖ＣＤＲ３を含む、ＣＥＡに特異的に結合することができるＦａｂ分子である第二及び第三の抗原結合部分；及び
（ｉｉｉ）安定な結合を可能にする第一及び第二サブユニットからなるＩｇＧ４のＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００６２】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）配列番号：２６９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号：２７３のアミノ酸に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第一の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変又は定常領域の何れか、特に定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である第一の抗原結合部分；
（ｉｉ）それぞれが、配列番号：２８９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号：２９３のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸を含む軽鎖可変領域とを含む、ＣＥＡに特異的に結合することができるＦａｂ分子である第二及び第三の抗原結合部分；及び
（ｉｉｉ）安定な結合を可能にする第一及び第二サブユニットからなるＩｇＧ４のＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００６３】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）配列番号：２７０の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号：２７１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号：２７２の重鎖ＣＤＲ３、配列番号：２７４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号：２７５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号：２７６の軽鎖ＣＤＲ３を含む、ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第一の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変又は定常領域の何れか、特に定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である第一の抗原結合部分；
（ｉｉ）それぞれが、配列番号：２８０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号：２８１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号：２８２の重鎖ＣＤＲ３、配列番号：２８４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号：２８５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号：２８６の軽鎖ＣＤＲ３を含む、ＭＣＳＰに特異的に結合することができるＦａｂ分子である第二及び第三の抗原結合部分；及び
（ｉｉｉ）安定な結合を可能にする第一及び第二サブユニットからなるＩｇＧ４のＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００６４】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）配列番号：２６９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号：２７３のアミノ酸に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＣＤ３に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第一の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変又は定常領域の何れか、特に定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である第一の抗原結合部分；
（ｉｉ）それぞれが、配列番号：２７９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号：２８３のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸を含む軽鎖可変領域とを含む、ＭＣＳＰに特異的に結合することができるＦａｂ分子である第二及び第三の抗原結合部分；及び
（ｉｉｉ）安定な結合を可能にする第一及び第二サブユニットからなるＩｇＧ４のＦｃドメイン
を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００６５】
上記四実施態様の何れかに係るＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子において、好ましくは、第二の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端で第一の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端と融合され、第一の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端でＩｇＧ４のＦｃドメインの第一サブユニットのＮ末端に融合され、 第三の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端でＩｇＧ４のＦｃドメインの第二サブユニットのＮ末端に融合される。
【００６６】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子フォーマット
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の構成要素は、様々な立体配置で相互に融合することができる。例示的な立体配置を図１に示す。
幾つかの実施態様では、第一の抗原結合部分は、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第一又は第二のサブユニットのＮ末端へ融合される。
【００６７】
特定の実施態様では、第一の抗原結合部分は、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、第二の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合される。特定のこのような実施形態において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第一及び第二の抗原結合部分、第一及び第二のサブユニットからなるＦｃドメイン、及び任意で一又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、ここで第一の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端で第二の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第二の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第一又は第二のサブユニットのＮ末端へ融合されている。更により具体的な実施態様では、第一の抗原結合部分は、単鎖Ｆａｂ分子である。あるいは、特定の実施態様では、第一の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子である。場合によっては、第一抗原結合部分がクロスオーバーＦａｂ分子である場合、第一の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖及び第二の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は更に互いに融合されてもよい。
【００６８】
別のそのような一実施態様では、第一の抗原結合部分は、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第一又は第二のサブユニットのＮ末端へ融合される。具体的なこのような実施形態において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第一及び第二の抗原結合部分、第一及び第二のサブユニットからなるＦｃドメイン、及び任意で一又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、ここで第一及び第二の抗原結合部分の各はＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端へ融合される。更により具体的な実施態様では、第一の抗原結合部分は、単鎖Ｆａｂ分子である。あるいは、特定の実施態様では、第一の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子である。
【００６９】
更に他のこのような実施態様では、第二の抗原結合部分は、そのＦａｂ軽鎖のＣ末端で、第一の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖のＮ末端へ融合される。特定のこのような実施形態において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第一及び第二の抗原結合部分、第一及び第二のサブユニットからなるＦｃドメイン、及び任意で一又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、ここで第一の抗原結合部分はＦａｂ軽鎖のＮ末端で第二の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖のＣ末端に融合され、第二の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第一又は第二のサブユニットのＮ末端へ融合されている。更により具体的な実施態様では、第一の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子である。
他の実施態様では、第一の抗原結合部分は、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第一又は第二のサブユニットのＮ末端へ融合される。
【００７０】
具体的なそのような実施態様では、第二の抗原結合部分は、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、第一の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合される。特定のこのような実施形態において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第一及び第二の抗原結合部分、第一及び第二のサブユニットからなるＦｃドメイン、及び任意で一又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、ここで第二の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端で第一の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第一の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第一又は第二のサブユニットのＮ末端へ融合されている。更により具体的な実施態様では、第一の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子である。場合によっては、第一の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖及び第二の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は更に互いに融合されてもよい。
特にこれらの実施態様のうち、第一の抗原結合部分は活性化Ｔ細胞抗原への特異的結合が可能である。他の実施態様では、第一の抗原結合部分は標的細胞抗原への特異的結合が可能である。
【００７１】
抗原結合部分は、直接又は一又は複数のアミノ酸、典型的には約２−２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して、Ｆｃドメインへ又は互いに融合され得る。ペプチドリンカーは、当該技術分野で知られ、ここに記載されている。適切な、非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが挙げられる。「ｎ」は一般には１と１０の間、典型的には２から４の間の数である。互いに第一及び第二の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖を融合するために特に好適なペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２である。第一及び第二の抗原結合部分のＦａｂの重鎖を連結するのに適した典型的なペプチドリンカーは、ＥＰＫＳＣ（Ｄ）−（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１５０及び１５１）である。更に、リンカーは免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含んでもよい。特に、抗原結合部分がＦｃドメインのサブユニットのＮ末端に融合される場合、それは、免疫グロブリンのヒンジ領域又はその一部（追加のペプチドリンカーの有無にかかわらず）を介して融合されてもよい。
【００７２】
標的細胞の抗原への特異的結合が可能である単一抗原結合部分を持つＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（例えば図１Ａ、１Ｂ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｈ、１Ｉ、１Ｋ又は１Ｍ）は、特に高親和性の抗原結合部分の結合後に標的細胞抗原の内在化が予想される場合には有用である。このような場合には、標的細胞抗原に特異的な一以上の抗原結合部分の存在は、標的細胞抗原の内在化を強化することができ、それによってその利用可能性を低減することができる。
他の多くの場合では、しかしながら、例えば、標的部位への標的化を最適化するために又は標的細胞抗原の架橋を可能にするために、標的細胞抗原に特異的な一又は複数の抗原結合部分を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を有することが有利であろう（図１Ｃ、１Ｆ、１Ｇ、１Ｊ又は１Ｌに示す例を参照）。
【００７３】
従って、ある実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に特異的に結合することができるＦａｂ分子である第三の抗原結合部分を更に含む。一実施態様では、第三の抗原結合部分は、第一又は第二の抗原結合部分と同一の標的細胞抗原に特異的に結合することが可能である。具体的な実施態様では、第一の抗原結合部分は、活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合することが可能であり、かつ第二及び第三抗原結合部分は標的細胞抗原に特異的に結合することが可能である。
【００７４】
一実施態様では、第三の抗原結合部分は、そのＦａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第一又は第二のサブユニットのＮ末端へ融合される。特定の実施態様では、第二及び第三の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に各々融合され、第一の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第二の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合されている。そのような一つの実施態様では、第一の抗原結合部分は、単鎖Ｆａｂ分子である。特定のそのような実施態様では、第一の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子である。場合によっては、第一抗原結合部分がクロスオーバーＦａｂ分子である場合、第一の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖及び第二の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は更に互いに融合されてもよい。
【００７５】
第二及び第三の抗原結合部分は、Ｆｃドメインに直接又はペプチドリンカーを介して融合させることができる。特定の実施態様では、第二及び第三の抗原結合部分は、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦｃドメインへ各々融合される。具体的な実施形態において、免疫グロブリンヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。一実施態様では、第二及び第三の抗原結合部分及びＦｃドメインは免疫グロブリン分子の一部である。特定の実施態様では、免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。更により特定の実施態様では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施態様では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。更に特定の実施態様では、免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。別の実施態様では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子及び活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合することが可能な抗原結合部分から本質的になり、ここで抗原結合部分は、単鎖のＦａｂ分子又はクロスオーバーＦａｂ分子、特に免疫グロブリン重鎖の一方のＮ末端に必要に応じてペプチドリンカーを介して融合したクロスオーバーＦａｂ分子である。
【００７６】
代替的な実施態様では、第一及び第三の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端へ各々融合され、第二の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第一の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へ融合されている。特定のこのような実施形態において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第一第二及び第三の抗原結合部分、第一及び第二のサブユニットからなるＦｃドメイン、及び任意で一又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、ここで第二の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端で第一の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第一の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第一サブユニットのＮ末端へ融合され、第三の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第二サブユニットのＮ末端へ融合される。特定のそのような実施態様では、第一の抗原結合部分は、クロスオーバーＦａｂ分子である。場合によっては、第一の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖及び第二の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は更に互いに融合されてもよい。
【００７７】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一部において、第一の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖、及び第二の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は、任意でリンカーペプチドを介して互いに融合される。第一及び第二の抗原結合部分の立体配置に応じて、第一の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は第二の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖のＮ−末端にそのＣ−末端で融合されてもよく、又は第二の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は第一の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖のＮ末端にそのＣ−末端で融合されてもよい。第一及び第二の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖の融合は非対応のＦａｂ重鎖と軽鎖の誤対合を更に減少させ、また、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一部の発現に必要なプラスミドの数を減少させる。
【００７８】
ある実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第一のＦａｂ軽鎖がカルボキシ末端ペプチド結合をペプチドリンカーと共有し、それが同様に第一のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ２（−ＣＨ４））、及び第二のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。幾つかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は第二のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ−ＣＬ）を更に含む。ある実施態様では、ポリペプチドは、共有結合、例えばジスルフィド結合により連結されている。
【００７９】
幾つかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第一のＦａｂ軽鎖がカルボキシ末端ペプチド結合をペプチドリンカーと共有し、それが同様に第一のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様に第二のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。実施態様の一つにおいて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は第二のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ−ＣＬ）を更に含む。これらの実施態様によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットポリペプチド（ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第三のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、及び第三のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ−ＣＬ）を更に含みうる。ある実施態様では、ポリペプチドは、共有結合、例えばジスルフィド結合により連結されている。
【００８０】
ある実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第一のＦａｂ軽鎖可変領域が第一のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、重鎖可変領域が軽鎖可変領域で置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖）、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ２（−ＣＨ４））、及び第二のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。幾つかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆａｂ重鎖可変領域がＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＬ）、及びＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ−ＣＬ）を含む。ある実施態様では、ポリペプチドは、共有結合、例えばジスルフィド結合により連結されている。
【００８１】
ある実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第一のＦａｂ重鎖可変領域が第一のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、重鎖定常領域が軽鎖定常領域で置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖）、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ２（−ＣＨ４））、及び第二のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。幾つかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆａｂ軽鎖可変領域がＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＨ１）、及びＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ−ＣＬ）を含む。ある実施態様では、ポリペプチドは、共有結合、例えばジスルフィド結合により連結されている。
【００８２】
幾つかの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第一のＦａｂ軽鎖可変領域が第一のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、重鎖可変領域が軽鎖可変領域で置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖）、それが同様に第二のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。他の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第一のＦａｂ重鎖可変領域が第一のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、重鎖定常領域が軽鎖定常領域で置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖）、それが同様に第二のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＬ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。更に他の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第二のＦａｂ重鎖が第一のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様に第一のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、重鎖可変領域が軽鎖可変領域で置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖）、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。他の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第二のＦａｂ重鎖が第一のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様に第一のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、重鎖定常領域が軽鎖定常領域で置換されているクロスオーバーＦａｂ重鎖）、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。
【００８３】
これらの実施態様の幾つかにおいて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆａｂ重鎖可変領域がＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＨ−ＣＬ）、及びＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ−ＣＬ）を含む。その他のこれらの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆａｂ軽鎖可変領域がＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ−ＣＨ１）、及びＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ−ＣＬ）を含む。更に他のこれらの実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆａｂ軽鎖可変領域がＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するペプチド（ＶＬ−ＣＨ１−ＶＬ−ＣＬ）、Ｆａｂ重鎖可変領域がＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＬ−ＶＬ−ＣＬ）、Ｆａｂ軽鎖ポリペプチドがＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＬ−ＶＬ−ＣＨ１）、又はＦａｂ軽鎖ポリペプチドがＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＬ−ＶＨ−ＣＬ）を更に含む。
【００８４】
これらの実施態様によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットポリペプチド（ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第三のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、及び第三のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ−ＣＬ）を更に含みうる。ある実施態様では、ポリペプチドは、共有結合、例えばジスルフィド結合により連結されている。
【００８５】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第二のＦａｂ軽鎖が第一のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様に第一のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（すなわち、軽鎖定常領域が重鎖定常領域で置換されているクロスオーバーＦａｂ軽鎖）（ＶＬ−ＣＬ−ＶＬ−ＣＨ１）、第二のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、及び第一の重鎖可変領域が第一のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＬ）を含む。別の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第二のＦａｂ軽鎖が第一のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様に第一のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（すなわち、軽鎖可変領域が重鎖可変領域で置換されているクロスオーバーＦａｂ軽鎖）（ＶＬ−ＣＬ−ＶＨ−ＣＬ）、第二のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、及び第一の軽鎖可変領域が第一のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＨ１）を含む。これらの実施態様によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットポリペプチド（ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第三のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、及び第三のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ−ＣＬ）を更に含みうる。ある実施態様では、ポリペプチドは、共有結合、例えばジスルフィド結合により連結されている。
【００８６】
上記実施態様の何れかによれば、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の構成要素（例えば、エフェクター部分、抗原結合部分、Ｆｃドメイン）は、直接又は様々なリンカー、特に、一以上のアミノ酸を含み、典型的には、ここに記載されているか、又は当該技術分野で知られている約２−２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを融合されていてもよい。適切な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーを含み、ｎは一般に、１と１０の間、典型的には２と４の数である。
【００８７】
Ｆｃドメイン
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含むポリペプチド鎖の対からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは、二量体であり、その各サブユニットは、ＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定な会合が可能である。一実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、一又は複数のＦｃドメインを含む。
【００８８】
本発明に係る一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧのＦｃドメインである。特定の実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメインである。ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の例示的配列は配列番号：１４９に与えられる。
【００８９】
別の実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４のＦｃドメインである。一実施態様では、Ｆｃドメインは位置Ｓ２２８（Ｋａｂａｔ番号付け）にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４のＦｃドメインである。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ４抗体のインビボでのＦａｂアームの交換を減少させる（Stubenrauch等, Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)を参照）。更なる特定の実施態様では、Ｆｃドメインはヒトである。他の実施態様では、Ｆｃドメインは位置Ｌ２３５（Ｋａｂａｔ番号付け）にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含むＩｇＧ４のＦｃドメインである。別の実施態様では、Ｆｃドメインはアミノ酸置換Ｓ２２８ＰとＬ２３５Ｅ（ＳＰＬＥ）の双方を含むＩｇＧ４のＦｃドメインである。別の実施態様では、Ｆｃドメインはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ番号付け）を含むＩｇＧ４のＦｃドメインである。別の実施態様では、Ｆｃドメインはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ４のＦｃドメインである。
【００９０】
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインの修飾
本発明に係るＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合した異なる抗原結合部分を含み、よってＦｃドメインの２つのサブユニットは典型的には２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組換え共発現及び続く二量体化は、２つのポリペプチドの複数の可能な組合せをもたらす。よって組換え発現でＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の収率と純度を向上させるために、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインへ所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することは有利であろう。
【００９１】
従って、具体的な実施態様では、本発明に係るＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインはＦｃドメインの第一及び第二のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧのＦｃドメインの２つのサブユニット間の最も広範なタンパク質−タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。従って、一実施態様では、前記修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。
【００９２】
特定の実施態様では、前記修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一つにおけるノブ修飾及びＦｃドメインの２つのサブユニットの他方におけるホール修飾を含む、いわゆるノブ・イントゥ・ホール(knob-into-hole)修飾である。
ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば米国特許第５７３１１６８号；米国特許第７６９５９３６号； Ridgway等, Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載される。一般に、本方法は、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように、突起が空洞内に配置することができるように、第一のポリペプチドの界面での突起（「ノブ」）及び第二ポリペプチドの界面における対応する空洞（「ホール」）を導入することを含む。突起は、第一のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置換することによって構築される。突起と同一又はより小さい大きさの相補的な空洞が、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置換することによって第二ポリペプチドの界面に作成される。
【００９３】
従って、特定の実施形態では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第一サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより、第二のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内に配置可能である第一サブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、及びＦｃドメインの第二のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基はより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それにより第一のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が配置可能である第二のサブユニット内のＣＨ３ドメイン内の空洞を生成する。
突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を改変することにより、例えば部位特異的突然変異誘発により、又はペプチド合成により作製することができる。
【００９４】
具体的な実施態様では、Ｆｃドメインの第一サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６でトレオニン残基がトリプトファン残基と置換され（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第二サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、位置４０７でチロシン残基がバリン残基と置換される（Ｙ４０７Ｖ）。一実施態様では、Ｆｃドメインの第二サブユニットにおいて、更に位置３６６でトレオニン残基がセリン残基と置換され（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８でロイシン残基がアラニン残基で置換される（Ｌ３６８Ａ）。
【００９５】
更なる実施態様では、Ｆｃドメインの第一サブユニットにおいて、位置３５４でセリン残基がシステイン残基と置換され（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第二サブユニットにおいて、位置３４９でチロシン残基がシステイン残基と置換される（Ｙ３４９Ｃ）。これらの２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、更に二量体を安定化させる(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001))。
【００９６】
特定の実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原に結合可能な抗原結合部分は、（「ノブ」修飾を含む）Ｆｃドメインの第一サブユニットへ（場合によっては標的細胞抗原へ結合可能な抗原結合部分を介して）融合される。理論に縛られることを望まないが、活性化Ｔ細胞抗原に結合しうる抗原結合部分の、Ｆｃドメインのノブを含むサブユニットへの融合は、活性化Ｔ細胞抗原に結合することができる二つの抗原結合部分を含む抗原結合分子の生成（２つのノブ含有ポリペプチドの立体的な衝突）を（更に）最小限に抑えるであろう。
【００９７】
別の実施態様では、Ｆｃドメインの第一及び第二サブユニットの結合を促進する修飾は、ＰＣＴ出願公開ＷＯ２００９／０８９００４に記載されるように、静電的ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法は、ホモ二量体形成は静電的に不利になるが、ヘテロ二量体は静電的に有利になるように、２つのＦｃドメインサブユニットの界面にて、荷電したアミノ酸残基による一又は複数のアミノ酸残基の置換を含む。
【００９８】
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメインの修飾
Ｆｃドメインは、その標的組織における良好な蓄積及び好ましい組織−血液分配比率に寄与する長い血清半減期を含む好ましい薬物動態学的特性をＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に付与する。しかし、同時期に、好適な抗原保有細胞に対するよりもむしろＦｃ受容体を発現する細胞に対するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の所望されない標的化を導く。更に、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の同時活性化はサイトカイン放出につながる可能性があり、抗原結合部分の長い半減期とＴ細胞活性化特性が組み合わさって、サイトカイン受容体の過剰な活性化及び全身投与の際に重篤な副作用をもたらす。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体を持つ）免疫細胞は、例えばＮＫ細胞によるＴ細胞の潜在的破壊に起因してＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効性を低下させうる。
【００９９】
従って、特定の実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインと比べた場合、Ｆｃ受容体への結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示す。そのような一実施態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）は、天然型ＩｇＧ１のＦｃドメイン（又は天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）と比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性が５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満を示し、及び／又は天然型ＩｇＧ１のＦｃドメイン（又は天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満のエフェクター機能を示す。一実施態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）はＦｃ受容体に実質的に結合しない及び／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃγ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も特異的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びサイトカイン分泌からなる群から選択される一又は複数である。特定の実施態様では、エフェクター機能とはＡＤＣＣである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインと比較した場合、新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対して実質的に類似の結合親和性を示す。ＦｃＲｎに対する実質的に類似の結合親和性は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）が、天然型ＩｇＧ１のＦｃドメイン（又は天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）の、ＦｃＲｎに対しての約７０％を超える、特に約８０％を超える、より具体的には約９０％を超える結合親和性を示すときに達成される。
【０１００】
ある実施形態では、Ｆｃドメインは、非操作型Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を低下させ及び／又はエフェクター機能を低下させるように操作される。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインはＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる一以上のアミノ酸変異を含む。典型的には、同一の一以上のアミノ酸置換がＦｃドメインの２つのサブユニットの各々に存在する。一実施態様では、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を減少させる。一実施態様では、アミノ酸置換は、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍減少させる。Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を減少させる複数のアミノ酸変異が存在する実施態様では、これらのアミノ酸変異は、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、又は更に少なくとも５０倍減少させ得る。一実施態様では、操作されたＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、非操作型Ｆｃドメインを含んでなるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と比較した場合、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の２０％未満、具体的には１０％未満、より具体的には５％未満の結合親和性を示す。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃγ受容体である。幾つかの実施態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。幾つかの実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も特異的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの受容体の各々に対する結合が減少する。幾つかの実施態様では、補体成分に対する結合親和性、具体的にはＣ１ｑに対する結合親和性もまた減少する。一実施態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合親和性は低下しない。ＦｃＲｎへの実質的に類似な結合、すなわち、前記受容体への免疫グロブリンの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含んでなるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）が、ＦｃＲｎに対し、非操作型形態のＦｃドメイン（又は前記非操作型形態のＦｃドメインを含んでなるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）の約７０％より大きな結合親和性を呈する場合に達成される。Ｆｃドメイン又は前記Ｆｃドメインを含む本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、約８０％を越える、又は更に約９０％を越えるそのような活性を示す場合がある。ある実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、非操作型Ｆｃドメインと比較して低下したエフェクター機能を有するように操作される。エフェクター機能の増加は、限定されないが、以下の一つ又は複数を含み得る：抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増加、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の増加、サイトカイン分泌の増加、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性の抗原取り込みの増加、ＮＫ細胞への結合の増加、マクロファージへの結合の増加、単球への結合の増加、多形核細胞への結合の増加、直接的シグナル伝達誘導性アポトーシスの増加、標的結合抗体の架橋の増加、樹状細胞成熟の増加、又はＴ細胞プライミングの増加。一実施態様では、エフェクター機能の低下は、ＣＤＣの低下、ＡＤＣＣの低下、ＡＤＣＰの低下、及びサイトカイン分泌の低下から選択される一又は複数である。特定の実施態様では、エフェクター機能の低下とはＡＤＣＣの低下である。一実施態様では、ＡＤＣＣの低下は、非操作型Ｆｃドメイン（又は非操作型Ｆｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子）により誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。
【０１０１】
一実施態様では、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させるアミノ酸変異はアミノ酸置換である。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９からなる群から選択される位置でアミノ酸置換を含む。より特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９からなる群から選択される位置でアミノ酸置換を含む。幾つかの実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む。そのような一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメインであり、特にヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。一実施態様では、Ｆｃドメインは位置Ｐ３２９でのアミノ酸置換を含む。より特異的な実施態様では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９でのアミノ酸置換、及びＥ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置に更なるアミノ酸置換を含む。より特異的な実施態様では、更なるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５にアミノ酸置換を含む。更に特定の実施態様では、Ｆｃドメインはアミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」）を含む。そのような一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメインであり、特にヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１に記載され、その全体が参照により本明細書に援用されるように、アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせは、ＩｇＧ１のＦｃドメインのＦｃγ受容体結合を殆ど完全に消滅させる。ＷＯ２０１２／１３０８３１はまた、このような変異体Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能などその特性を決定するための方法を記載する。
【０１０２】
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低下及びエフェクター機能の減少を呈示する。従って、幾つかの実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ４のＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。一実施態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８でアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む。Ｆｃ受容体に対する結合親和性及び／又はそのエフェクター機能を更に低下させるために、一実施態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、位置Ｌ２３５でアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む。その他の実施態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、位置Ｐ２３９でアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む。特定の実施態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＰ３２９でアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含む。このようなＩｇＧ４のＦｃドメイン変異体とそのＦｃγ受容体結合特性はＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５３９３に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０３】
特定の実施態様では、天然型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能を低下を示すＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ及び必要に応じてＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及び必要に応じてＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。
【０１０４】
ある実施態様では、ＦｃドメインのＮ−グリコシル化は除かれている。そのような一つの実施態様では、Ｆｃドメインは位置Ｎ２９７でのアミノ酸変異、とりわけアラニンでアスパラギンを置換するアミノ酸置換（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸でアスパラギンを置換するアミノ酸置換（Ｎ２９７Ｄ）を含む。
【０１０５】
本明細書中及びＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１に記述されたＦｃドメインに加えて、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能の減少を伴うＦｃドメインはまた、一以上のＦｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の置換を持つものを含む（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５と２９７のアラニンへの置換を持ついわゆる「ＮＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、二以上のアミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７で置換を持つＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１）。
【０１０６】
変異型Ｆｃドメインは、当該技術分野で知られている遺伝子的又は化学的方法を用いて、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾によって調製することができる。遺伝的方法は、コードするＤＮＡ配列、ＰＣＲ、遺伝子合成等の部位特異的変異誘発を含むことができる。正しいヌクレオチド変化は、例えば配列決定によって検証することができる。
【０１０７】
Ｆｃ受容体への結合は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（GE Healthcare）など標準的な計測機器を使用してＥＬＩＳＡによって又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって容易に決定することができ、そのようなＦｃ受容体は、組換え発現によって得ることができる。適切なこのような結合アッセイがここに記載されている。代わりに、Ｆｃドメイン又はＦｃ受容体に対するＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するＮＫ細胞などを使用して評価することができる。
【０１０８】
Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のエフェクター機能は、当該技術分野で公知の方法によって測定することができる。ＡＤＣＣを測定するのに適したアッセイがここに記載されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの他の例は、米国特許第５５００３６２号：Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)及びHellstrom等, Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); U.S. Patent No. 5,821,337; Bruggemann等, J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)に記述されている。あるいは、非放射性アッセイ法（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞毒性アッセイ(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ(Promega, Madison, WI)を参照）を用いることができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等, Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)に開示される動物モデルにおいてインビボで評価することができる。
【０１０９】
幾つかの実施態様では、補体成分に対する、具体的にはＣ１ｑに対するＦｃドメインの結合が低下する。従って、Ｆｃドメインがエフェクター機能が低下するように操作される幾つかの実施態様では、前記低下たエフェクター機能は低下したＣＤＣを含む。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子がＣ１ｑに結合することができ、それ故にＣＤＣ活性を有するかを決定するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを実施することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro等, J Immunol Methods 202, 163 (1996)；Cragg等, Blood 101, 1045-1052 (2003)；及びCragg及びGlennie, Blood 103, 2738-2743 (2004))。
【０１１０】
抗原結合部分
本発明の抗原結合分子は二重特異性であり、すなわちそれは、２つの異なる抗原決定基に特異的に結合することが可能な少なくとも２つの結合部分を含む。本発明によれば、抗原結合部分はＦａｂ分子である（すなわち、各々が可変及び定常領域を含む重鎖及び軽鎖からなる抗原結合ドメイン）。一実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒトである。別の実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒト化されている。また別の実施態様では、前記Ｆａｂ分子は、ヒト重鎖及び軽鎖定常領域を含む。
【０１１１】
抗原結合部分の少なくとも一つは、単鎖のＦａｂ分子とクロスオーバーＦａｂ分子である。このような修飾は、異なるＦａｂ分子からの重鎖及び軽鎖の誤対合を防ぎ、それによって組換え生産における本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を向上させることができる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に有用な特定の単鎖Ｆａｂ分子において、Ｆａｂ軽鎖のＣ末端は、ペプチドリンカーによりＦａｂ重鎖のＮ末端に連結されている。機能的抗原結合部分を形成するために、ペプチドリンカーはＦａｂ重鎖及び軽鎖の配置を可能とする。Ｆａｂ重及び軽鎖を連結するための適切なペプチドリンカーとしては、例えば、（Ｇ４Ｓ）６−ＧＧ（配列番号１５２）又は（ＳＧ３）２−（ＳＥＧ３）４−（ＳＧ３）−ＳＧ（配列番号１５３）を含む。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に有用な特定のクロスオーバーＦａｂ分子において、Ｆａｂ軽鎖の定常領域とＦａｂ重鎖は交換されている。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に有用な別のクロスオーバーＦａｂ分子において、Ｆａｂ軽鎖の可変領域とＦａｂ重鎖は交換されている。
【０１１２】
本発明に係る特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原、特に腫瘍細胞抗原、及び活性化Ｔ細胞抗原に同時に結合することが可能である。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原及び活性化Ｔ細胞抗原に同時に結合することによって、Ｔ細胞及び標的細胞を架橋することができる。更により特定の実施態様では、このような同時結合は標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解をもたらす。一実施態様では、このような同時結合はＴ細胞の活性化をもたらす。他の実施態様では、そのような同時結合は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害活性、及び活性化マーカーの発現の群から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞応答をもたらす。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の活性化Ｔ細胞抗原への結合は、標的細胞抗原への同時結合を伴わず、Ｔ細胞活性化をもたらさない。
【０１１３】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞へのＴ細胞の細胞傷害活性を再指向し得る。特定の実施態様では、前記再指向は、標的細胞及び／又はＴ細胞の特異性によって媒介されるＭＨＣ−ペプチド抗原提示とは無関係である。
特に、本発明の実施態様の何れかに記載のＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。幾つかの実施態様では、Ｔ細胞はＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０１１４】
活性化Ｔ細胞抗原結合部分
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、活性化Ｔ細胞抗原（本明細書では「活性化Ｔ細胞抗原結合部分」と称す）に結合可能な少なくとも一の抗原結合部分を含む。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は活性化Ｔ細胞抗原に特異的に結合可能な一以下の抗原結合部分を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は活性化Ｔ細胞抗原への一価結合を提供する。活性化Ｔ細胞抗原結合部分は通常のＦａｂ分子又は修飾型Ｆａｂ分子の何れか、すなわち単鎖又はクロスオーバーＦａｂ分子の何れかである。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる標的細胞抗原に特異的に結合可能な一以上の抗原結合部分が存在する一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に特異的に結合可能な抗原結合部分は好ましくは修飾型Ｆａｂ分子である。
【０１１５】
特定の実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原はＣＤ３、特にヒトＣＤ３（配列番号２６５）又はカニクイザルＣＤ３（配列番号２６６）、最も具体的にはヒトＣＤ３である。特定の実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原結合部分はヒト又はカニクイザルＣＤ３に対して交差反応性である（すなわち特異的に結合する）。幾つかの実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原はＣＤ３のイプシロンサブユニットである。
【０１１６】
一実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原結合部分はＣＤ３のエピトープの結合についてモノクローナル抗体Ｈ２Ｃ（ＰＣＴ公報ＷＯ２００８／１１９５６７に記載）と競合可能である。別の実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原結合部分はＣＤ３のエピトープの結合についてモノクローナル抗体Ｖ９(Rodrigues等, Int J Cancer Suppl 7, 45-50 (1992)及び米国特許第６０５４２９７号に記載）と競合可能である。更に別の実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原結合部分はＣＤ３のエピトープの結合についてモノクローナル抗体ＦＮ１８(Eur J Immunol 19, 981-984 (1986)に記載）と競合可能である。特定の実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原結合部分はＣＤ３のエピトープの結合についてモノクローナル抗体ＳＰ３４(Pessano等, EMBO J 4, 337-340 (1985)に記載）と競合可能である。一実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原結合部分はモノクローナル抗体ＳＰ３４と同じＣＤ３のエピトープに結合する。一実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原結合部分は、配列番号１６３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１６７の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１７１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７５の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更なる実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原結合部分は、配列番号１６９に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号１７７に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。
【０１１７】
特定の実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原結合部分は、配列番号２４９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２５１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２５３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２５７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６１の軽鎖ＣＤＲ３を含む。一実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原結合部分は、配列番号２４９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２５１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２５３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２５７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６１の軽鎖ＣＤＲ３を含む抗原結合部分とＣＤ３のエピトープへの結合を競合することができる。一実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原結合部分は、配列番号２４９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２５１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２５３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２５７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６１の軽鎖ＣＤＲ３を含む抗原結合部分と同じＣＤ３のエピトープへ結合する。更なる実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原結合部分は、配列番号２５５に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号２６３に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原結合部分は、配列番号２５５の重鎖可変領域配列及び配列番号２６３の軽鎖可変領域配列を含む抗原結合部分とＣＤ３のエピトープへの結合を競合することができる。一実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原結合部分は、配列番号２５５の重鎖可変領域配列及び配列番号２６３の軽鎖可変領域配列を含む抗原結合部分と同じＣＤ３のエピトープへ結合を競合する。別の実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原結合部分は、配列番号２５５の重鎖可変領域配列のヒト化バージョン、及び配列番号２６３の軽鎖可変領域配列のヒト化バージョンを含む。一実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原結合部分は、配列番号２４９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２５１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２５３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２５７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６１の軽鎖ＣＤＲ３、及びヒト重鎖及び軽鎖可変領域フレームワーク配列を含む。
【０１１８】
一実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号：２７０、配列番号：２７１及び配列番号：２７２からなる群から選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と配列番号：２７４、配列番号：２７５及び配列番号：２７６の群から選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
一実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号：２７０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号：２７１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号：２７２の重鎖ＣＤＲ３、配列番号：２７４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号：２７５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号：２７６の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０１１９】
一実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号：２６９、配列番号：２９８及び配列番号：２９９の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号：２７３及び配列番号：２９７の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列を含む。
一実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号：２６９、配列番号：２９８及び配列番号：２９９の群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号：２７３及び配列番号：２９７の群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１２０】
一実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号：２６９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号：２７３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
一実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号：２６９の重鎖可変領域配列と配列番号：２７３の軽鎖可変領域配列を含む。
一実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号：２６９に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と配列番号：２７３に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。
【０１２１】
標的細胞抗原結合部分
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞の抗原（本明細書では「標的細胞抗原結合部分」と称す）に結合可能な少なくとも一の抗原結合部分を含む。ある実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に結合することができる２つの抗原結合部分を含む。特定のそのような実施態様では、これらの抗原結合部分の各々は同じ抗原決定基に特異的に結合する。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に結合することができる２つ以下の抗原結合部分を含む。
【０１２２】
標的細胞抗原結合部分は一般に、特定の抗原決定基に結合し、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を標的部位へ、例えば抗原決定基を持つ特定の型の腫瘍細胞へと指向することができるＦａｂ分子である。
ある実施態様では、標的細胞抗原結合部分は、腫瘍細胞又はウイルス感染細胞上に提示された抗原など、病状と関連した抗原を指向する。適切な抗原は、例えば、細胞表面抗原であるが、細胞表面受容体に限定されるものではない。特定の実施態様では、抗原はヒト抗原である。特定の実施態様では、腫瘍細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３３からなる群から選択される。
【０１２３】
特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的である少なくとも一つの抗原結合部分を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＭＣＳＰのエピトープへの結合に対してモノクローナル抗体ＬＣ００７（配列番号７５及び８３、及び全体が参照により本明細書に組み入れられる欧州特許出願番号ＥＰ１１１７８３９３．２を参照）と競合可能な少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。一実施態様では、ＭＣＳＰに特異的である抗原結合部分は、配列番号６９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号７１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号７３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号７７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号８１の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更なる実施態様では、ＭＣＳＰに特異的である抗原結合部分は、配列番号７５に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号８３に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＭＣＳＰのエピトープへの結合に対してモノクローナル抗体Ｍ４−３ ＭＬ２（配列番号２３９及び２４７、及び全体が参照により本明細書に組み入れられる欧州特許出願番号ＥＰ１１１７８３９３．２を参照）と競合可能な少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。一実施態様では、ＭＣＳＰに特異的な抗原結合部分は、モノクローナル抗体Ｍ４−３ ＭＬ２と同じＭＣＳＰのエピトープに結合する。一実施態様では、ＭＣＳＰに特異的である抗原結合部分は、配列番号２３３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２３７の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２４１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２４３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４５の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更なる実施態様では、ＭＣＳＰに特異的である抗原結合部分は、配列番号２３９に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、特に約９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号２４７に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、特に約９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様では、ＭＣＳＰに特異的な抗原結合部分は、モノクローナル抗体Ｍ４−３ ＭＬ２の親和性成熟型の重鎖及び軽鎖可変領域配列（配列番号：２３９及び２４７）を含む。一実施態様では、ＭＣＳＰに対して特異的である抗原結合部分は、≦５×１０−９Ｍ、≦２×１０−９Ｍ、≦１×１０−９Ｍ、≦５×１０−１０Ｍ、≦２×１０−９Ｍ、≦１×１０−１０Ｍ、≦５×１０−１１Ｍ、≦１×１０−１１Ｍ、≦５×１０−１２Ｍ、≦１×１０−１２Ｍ又はこれ未満のＫＤで、ＭＣＳＰに結合する。一実施態様では、ＭＣＳＰに対して特異的である抗原結合部分は、抗ＭＣＳＰ抗体Ｍ４−３／ＭＬ２と比較して少���くとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍又はそれを越える増加した親和性を有する。
【０１２４】
一実施態様では、ＭＣＳＰに特異的な抗原結合部分は、一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ又は七つ、特に二つ、三つ、四つ、五つのアミノ酸置換を有する配列番号２３９の重鎖可変領域配列；及び一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ又は七つ、特に二つ、三つ、四つ、五つのアミノ酸置換を有する配列番号２４７の軽鎖可変領域配列を含む。ＭＣＳＰ、特にヒトＭＣＳＰへの結合が保存されていることを条件として、可変領域配列内の任意のアミノ酸残基は、ＣＤＲ領域内のアミノ酸残基を含む異なるアミノ酸で置換されていてもよい。好ましい変異体は、無置換の可変領域配列を含む抗原結合部分の結合親和性と少なくとも同等（又は強い）ＭＣＳＰに対する結合親和性を有するものである。
【０１２５】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号１のポリペプチド配列、配列番号３のポリペプチド配列、及び配列番号５のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。更なる実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号７のポリペプチド配列、配列番号９のポリペプチド配列、及び配列番号１１のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。別の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号１３のポリペプチド配列、配列番号１５のポリペプチド配列、及び配列番号５のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。更に別の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号１７のポリペプチド配列、配列番号１９のポリペプチド配列、及び配列番号５のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。別の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２１のポリペプチド配列、配列番号２３のポリペプチド配列、及び配列番号５のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。別の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２５のポリペプチド配列、配列番号２７のポリペプチド配列、及び配列番号５のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。別の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２９のポリペプチド配列、配列番号３１のポリペプチド配列、配列番号３３のポリペプチド配列、及び配列番号５のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。別の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２９のポリペプチド配列、配列番号３のポリペプチド配列、配列番号３３のポリペプチド配列、及び配列番号５のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。別の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３５のポリペプチド配列、配列番号３のポリペプチド配列、配列番号３７のポリペプチド配列、及び配列番号５のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。別の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３９のポリペプチド配列、配列番号３のポリペプチド配列、配列番号４１のポリペプチド配列、及び配列番号５のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。更に別の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号２９のポリペプチド配列、配列番号３のポリペプチド配列、配列番号５のポリペプチド配列、及び配列番号１７９のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号５のポリペプチド配列、配列番号２９のポリペプチド配列、配列番号３３のポリペプチド配列、及び配列番号１８１のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号５のポリペプチド配列、配列番号２３のポリペプチド配列、配列番号１８３のポリペプチド配列、及び配列番号１８５のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号５のポリペプチド配列、配列番号２３のポリペプチド配列、配列番号１８３のポリペプチド配列、及び配列番号１８７のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３３のポリペプチド配列、配列番号１８９のポリペプチド配列、配列番号１９１のポリペプチド配列、及び配列番号１９３のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号１８３のポリペプチド配列、配列番号１８９のポリペプチド配列、配列番号１９３のポリペプチド配列、及び配列番号１９５のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号１８９のポリペプチド配列、配列番号１９３のポリペプチド配列、配列番号１９９のポリペプチド配列、及び配列番号２０１のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号５のポリペプチド配列、配列番号２３のポリペプチド配列、配列番号２１５のポリペプチド配列、及び配列番号２１７のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号５のポリペプチド配列、配列番号２３のポリペプチド配列、配列番号２１５のポリペプチド配列、及び配列番号２１９のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。
【０１２６】
一実施態様では、ＭＣＳＰに対して特異的である抗原結合部分は、配列番号：２８０、配列番号：２８１、配列番号：２８２、配列番号：３０１、配列番号：３０３、配列番号：３０４及び配列番号：３０６からなる群から選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号：２８４、配列番号：２８５、配列番号：２８６、配列番号：３１０、配列番号：３１１、配列番号：３１４、配列番号：３１５、及び配列番号：３１６からなる群から選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲを含む。
一実施態様では、ＭＣＳＰに対して特異的である抗原結合部分は、配列番号：２８０、配列番号：２８１及び配列番号：２８２からなる群から選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号：２８４、配列番号：２８５及び配列番号：２８６からなる群から選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲを含む。
【０１２７】
一実施態様では、ＭＣＳＰに対して特異的である抗原結合部分は、配列番号：２８０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号：２８１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号：２８２の重鎖ＣＤＲ３、配列番号：２８４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号：２８５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号：２８６の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
更なる実施態様では、ＭＣＳＰに対して特異的である抗原結合部分は、配列番号：２７９、配列番号：３００、配列番号：３０２、配列番号：３０５及び配列番号：３０７の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号：２８３、配列番号：３０９、配列番号：３１２、配列番号：３１３及び配列番号：３１７の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列を含む。
【０１２８】
更なる実施態様では、ＭＣＳＰに対して特異的である抗原結合部分は、配列番号：２７９、配列番号：３００、配列番号：３０２、配列番号：３０５及び配列番号：３０７の群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：２８３、配列番号：３０９、配列番号：３１２、配列番号：３１３及び配列番号：３１７の群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
一実施態様では、ＭＣＳＰに対して特異的である抗原結合部分は、配列番号：２７９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：２８３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１２９】
一実施態様では、ＭＣＳＰに対して特異的である抗原結合部分は、配列番号：２７９の重鎖可変領域配列と、配列番号：２８３の軽鎖可変領域配列とを含む。
更なる実施態様では、ＭＣＳＰに対して特異的である抗原結合部分は、配列番号：２７９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列及び配列番号：２８３のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。
【０１３０】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号：２７８に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号：３１９に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号：３２０に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、及び配列番号：３２１に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号：２７８に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号：３１９に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号：３６９に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、及び配列番号：３７０に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号：２７８に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号：３１９に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号：３７１に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、及び配列番号：３７２に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。
【０１３１】
特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２１６、配列番号２１８及び配列番号２２０の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。
【０１３２】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的である少なくとも一の抗原結合部分を含む。別の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＥＧＦＲのエピトープに対する結合をモノクローナル抗体ＧＡ２０１と競合することができる、少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。例えば、参照によりその全体が援用されるＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０８２５１５を参照。一実施態様では、ＥＧＦＲに特異的である抗原結合部分は、配列番号８５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号８７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号８９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号９３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号９７の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更なる実施態様では、ＥＧＦＲに特異的である抗原結合部分は、配列番号９１に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号９９に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。
【０１３３】
更に別の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号４３のポリペプチド配列、配列番号４５のポリペプチド配列、及び配列番号４７のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。更なる実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号４９のポリペプチド配列、配列番号５１のポリペプチド配列、及び配列番号１１のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。更に別の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号５３のポリペプチド配列、配列番号４５のポリペプチド配列、及び配列番号４７のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。
【０１３４】
特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４及び配列番号１２の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。
【０１３５】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的である少なくとも一の抗原結合部分を含む。別の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＦＡＰのエピトープに対する結合をモノクローナル抗体３Ｆ２と競合することができる、少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。例えば、参照によりその全体が援用されるＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／０２０００６を参照。一実施態様では、ＦＡＰに特異的である抗原結合部分は、配列番号１０１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０３の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１０５の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１０９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１１の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１１３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更なる実施態様では、ＦＡＰに特異的である抗原結合部分は、配列番号１０７に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号１１５に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。
更に別の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号５５のポリペプチド配列、配列番号５１のポリペプチド配列、及び配列番号１１のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。更なる実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号５７のポリペプチド配列、配列番号５９のポリペプチド配列、及び配列番号６１のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。
【０１３６】
特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号５２及び配列番号１２の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。
【０１３７】
特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的である少なくとも一の抗原結合部分を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＣＥＡのエピトープに対する結合をモノクローナル抗体ＢＷ４３１／２６（ＥＰ１６０８９７、及びBosslet等, Int J Cancer 36, 75-84 (1985)に記載）と競合可能な少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＣＥＡのエピトープに対する結合をモノクローナル抗体ＣＨ１Ａ１Ａ（配列番号１２３及び１３１を参照）と競合することができる、少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。参照によりその全体が援用されるＰＣＴ特許公開番号ＷＯ２０１１／０２３７８７を参照。一実施態様では、ＣＥＡに特異的な抗原結合部分は、モノクローナル抗体ＣＨ１Ａ１Ａと同じＣＥＡのエピトープに結合する。一実施態様では、ＣＥＡに特異的である抗原結合部分は、配列番号１１７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１９の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１２１の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１２５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２７の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２９の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更なる実施態様では、ＣＥＡに特異的である抗原結合部分は、配列番号１２３に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、特に約９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号１３１に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、特に約９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様では、ＣＥＡに特異的な抗原結合部分は、モノクローナル抗体ＣＨ１Ａ１Ａの親和性成熟バージョンの重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む。一実施態様では、ＣＥＡに特異的な抗原結合部分は、一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ又は七つ、特に二つ、三つ、四つ、五つのアミノ酸置換を有する配列番号１２３の重鎖可変領域配列；及び一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ又は七つ、特に二つ、三つ、四つ、五つのアミノ酸置換を有する配列番号１３１の軽鎖可変領域配列を含む。ＣＥＡ、特にヒトＣＥＡへの結合が保存されていることを条件として、可変領域配列内の任意のアミノ酸残基は、ＣＤＲ領域内のアミノ酸残基を含む異なるアミノ酸で置換されていてもよい。好ましい変異体は、無置換の可変領域配列を含む抗原結合部分の結合親和性と少なくとも同等（又は強い）ＣＥＡに対する結合親和性を有するものである。
【０１３８】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号６３のポリペプチド配列、配列番号６５のポリペプチド配列、配列番号６７のポリペプチド配列、及び配列番号３３のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５のポリペプチド配列、配列番号６７のポリペプチド配列、配列番号１８３のポリペプチド配列、及び配列番号１９７のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号１８３のポリペプチド配列、配列番号２０３のポリペプチド配列、配列番号２０５のポリペプチド配列、及び配列番号２０７のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号１８３のポリペプチド配列、配列番号２０９のポリペプチド配列、配列番号２１１のポリペプチド配列、及び配列番号２１３のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。
【０１３９】
特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号３４、配列番号１８４、配列番号１９８、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２及び配列番号２１４の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。
【０１４０】
一実施態様では、ＣＥＡに対して特異的である抗原結合部分は、配列番号：２９０、配列番号：２９１及び配列番号：２９２からなる群から選択される少なくとも一つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と配列番号：２９４、配列番号：２９５及び配列番号：２９６の群から選択される少なくとも一つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
一実施態様では、ＣＥＡに対して特異的である抗原結合部分は、配列番号：２９０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号：２９１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号：２９２の重鎖ＣＤＲ３、配列番号：２９４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号：２９５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号：２９６の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
一実施態様では、ＣＥＡに対して特異的である抗原結合部分は、配列番号：２８９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号：２９３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
一実施態様では、ＣＥＡに対して特異的である抗原結合部分は、配列番号：２８９の重鎖可変領域配列と配列番号：２９３の軽鎖可変領域配列とを含む。
【０１４１】
更なる実施態様では、ＣＥＡに対して特異的である抗原結合部分は、配列番号：２８９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号：２９３のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号：２８８に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号：３２２に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、配列番号：３２３に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、及び配列番号：３２４に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。
【０１４２】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ３３に特異的である少なくとも一の抗原結合部分を含む。一実施態様では、ＣＤ３３に特異的である抗原結合部分は、配列番号１３３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１３５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１３７の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１４１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４３の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４５の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更なる実施態様では、ＣＤ３３に特異的である抗原結合部分は、配列番号１３９に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号１４７に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。
【０１４３】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３３のポリペプチド配列、配列番号２１３のポリペプチド配列、配列番号２２１のポリペプチド配列、及び配列番号２２３のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号３３のポリペプチド配列、配列番号２２１のポリペプチド配列、配列番号２２３のポリペプチド配列、及び配列番号２２５のポリペプチド配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。
特定の実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号３４、配列番号２１４、配列番号２２２、配列番号２２４及び配列番号２２６の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。
【０１４４】
ポリヌクレオチド
本発明は、ここに記載されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを更に提供する。一実施態様では、前記断片は抗原結合断片である。
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３７３、及び３７４に記載される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるものを、その機能性断片又は変異体を含んで、含む。
【０１４５】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は共発現される複数（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現され得る。共発現されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、例えばジスルフィド結合又は別の手段を介して会合することができ、機能性Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を形成しうる。例えば、抗原結合部分の軽鎖部分は、抗原結合部分、Ｆｃドメインサブユニット及び任意で別の抗原結合部分（の一部）の重鎖部分を含んでなるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分に由来する別々のポリヌクレオチドによりコードされ得る。共発現されたとき、重鎖ポリペプチドが軽鎖ポリペプチドと会合し、抗原結合部分を形成する。別の実施例では、２つのＦｃドメインサブユニットの一方、及び場合によっては一以上の抗原結合部分（の一部）を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分は、２つのＦｃドメインサブユニットの他方、及び場合によっては抗原結合部分（の一部）を含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分に由来する別々のポリヌクレオチドによりコードされ得る。共発現されると、Ｆｃドメインのサブユニットが会合しＦｃドメインを形成する。
【０１４６】
ある実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、第一及び第二の抗原結合部分、及び２つのサブユニットからなるＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の断片をコードし、ここで第一の抗原結合部分は、一本鎖のＦａｂ分子であることを特徴とする。一実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、第一の抗原結合部分、及びＦｃドメインのサブユニットをコードしている。より具体的な実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、単鎖Ｆａｂ分子がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。別の実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、第二の抗原結合部分の重鎖、及びＦｃドメインのサブユニットをコードしている。更に具体的な実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。更に別の実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、第一の抗原結合部分、第二の抗原結合部分の重鎖、及びＦｃドメインのサブユニットをコードしている。より特定の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、単鎖Ｆａｂ分子がＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。
【０１４７】
ある実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、第一及び第二の抗原結合部分、及び２つのサブユニットからなるＦｃドメインを含むＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の断片をコードし、ここで第一の抗原結合部分はクロスオーバーＦａｂ分子であることを特徴とする。一実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、第一の抗原結合部分の重鎖、及びＦｃドメインのサブユニットをコードしている。より特定の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ軽鎖可変領域がＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。別の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ重鎖可変領域がＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。別の実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、第二の抗原結合部分の重鎖、及びＦｃドメインのサブユニットをコードしている。更に具体的な実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。更に別の実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、第一の抗原結合部分の重鎖、第二の抗原結合部分の重鎖、及びＦｃドメインのサブユニットをコードしている。より特定の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ軽鎖可変領域がＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。別の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ重鎖可変領域がＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。更に別の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ重鎖がＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。更に別の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ重鎖がＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。
【０１４８】
更なる実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、第三の抗原結合部分の重鎖、及びＦｃドメインのサブユニットをコードしている。更に具体的な実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。
更なる実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、抗原結合部分の軽鎖をコードする。幾つかの実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ軽鎖可変領域がＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。他の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ重鎖可変領域がＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。更に他の実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、第一の抗原結合部分の軽鎖、第二の抗原結合部分の軽鎖をコードしている。より特定の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ重鎖可変領域がＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦａｂ軽鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。別の特定の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ軽鎖がＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。更に別の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ軽鎖可変領域がＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦａｂ軽鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。更に別の特定の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ軽鎖がＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、それが同様にＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。
【０１４９】
別の実施態様では、本発明は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を指向し、ここで該ポリヌクレオチドは配列番号７５、８３、９１、９９、１０７、１１５、１２３、１３１、１３９、１４７、１６９、１７７、２３９、２４７、２５５及び２６３に示される可変領域配列をコードする配列を含む。別の実施態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを指向し、ここで該ポリヌクレオチドは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９及び２３１に示されるポリペプチド配列をコードする配列を含む。別の実施態様では、本発明は本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを更に指向し、ここで該ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２又は２６４に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である配列を含む。別の実施態様では、本発明は本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とし、ここで該ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２又は２６４に示される核酸配列を含む。別の実施態様では、本発明は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を指向し、ここで該ポリヌクレオチドは配列番号７５、８３、９１、９９、１０７、１１５、１２３、１３１、１３９、１４７、１６９、１７７、２３９、２４７、２５５及び２６３のアミノ酸配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である可変領域配列をコードする配列を含む。別の実施態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを指向し、ここで該ポリヌクレオチドは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９又は２３１のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド配列をコードする配列を含む。本発明は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を包含し、ここで該ポリヌクレオチドは、保存的アミノ酸置換を有する配列番号７５、８３、９１、９９、１０７、１１５、１２３、１３１、１３９、１４７、１６９、１７７、２３９、２４７、２５５又は２６３の可変領域配列をコードする配列を含む。
【０１５０】
他の実施態様では、本発明は本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここで、該ポリヌクレオチドは、配列番号２６９、２７３、２７９、２８３、２８９、２９３、２９７、２９８、２９９、３００、３０２、３０５、３０７、３０９、３１２、３１３又は３１７に示される可変領域配列をコードする配列を含む。他の実施態様では、本発明はＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここで、該ポリヌクレオチドは、配列番号２８８、３２２、３２３、３２４、２７８、３１９、３２０、３２１、３６９、３７０、３７１又は３７２に示されるポリペプチド配列をコードする配列を含む。他の実施態様では、本発明は本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドに更に関し、ここで、該ポリヌクレオチドは、配列番号３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６４、３６４、３７３又は３７４に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である配列を含む。他の実施態様では、本発明は本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここで、該ポリヌクレオチドは、配列番号３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３７３又は３７４に示された核酸配列を含む。他の実施態様では、本発明は本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここで、該ポリヌクレオチドは配列番号２６９、２７３、２７９、２８３、２８９、２９３、２９７、２９８、２９９、３００、３０２、３０５、３０７、３０９、３１２、３１３又は３１７のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である可変領域配列をコードする配列を含む。他の実施態様では、本発明はＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここで、該ポリヌクレオチドは配列番号２８８、３２２、３２３、３２４、２７８、３１９、３２０、３２１、３６９、３７０、３７１又は３７２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列をコードする配列を含む。
【０１５１】
本発明は本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを包含し、ここで、該ポリヌクレオチドは保存的アミノ酸置換を伴う配列番号２６９、２７３、２７９、２８３、２８９、２９３、２９７、２９８、２９９、３００、３０２、３０５、３０７、３０９、３１２、３１３又は３１７の可変領域配列をコードする配列を含む。本発明はまた本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを包含し、ここで、該ポリヌクレオチドは保存的アミノ酸置換を伴う配列番号２８８、３２２、３２３、３２４、２７８、３１９、３２０又は３２１のポリペプチド配列をコードする配列を含む。
【０１５２】
本発明はまた本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを包含し、ここで、該ポリヌクレオチドは保存的アミノ酸置換を伴う配列番号２７８、３１９、３６９又は３７０のポリペプチド配列をコードする配列を含む。
本発明はまた本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを包含し、ここで、該ポリヌクレオチドは保存的アミノ酸置換を伴う配列番号２７８、３１９、３７１又は３７２のポリペプチド配列をコードする配列を含む。
【０１５３】
本発明はまた本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを包含し、ここで該ポリヌクレオチドは、保存的アミノ酸置換を伴う配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６４、３６４、３７３又は３７４のポリペプチド配列をコードする配列を含む。
ある実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態の、ＲＮＡである。本発明のＲＮＡは一本鎖又は二本鎖であってもよい。
【０１５４】
組換え方法
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成（例えばメリフィールド固相合成）又は組換え産生によって得ることができる。組換え生産のために、例えば上述したように、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）をコードする一又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定されうる。一実施態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含んでなるベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法は、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、インビトロでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボでの組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatis等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)；及びAusubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載される技術を参照。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部でもよく、核酸断片でありうる。発現ベクターは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）をコードするポリヌクレオチド（すなわちコーディング領域）がプロモーター及び／又は他の転写又は翻訳コントロール要素と作動可能に関連してクローン化される発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コーディング領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンから成る核酸の一部である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在するならばそれはコーディング領域として考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム、結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコーディング領域の一部ではない。二以上のコーディング領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中、例えば単一ベクター上に、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクト中、例えば別個の（異なる）ベクター上に存在してもよい。更に、何れかのベクターは単一のコーディング領域を有し得、又は二以上のコーディング領域を有し得、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解切断により最終タンパク質へ翻訳後的又は共翻訳的に分けられる一又は複数のポリタンパク質をコードしうる。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）、又は変異体又はその誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合又は非融合された異種性コーディング領域をコードしうる。異種性コーディング領域は、限定するものではないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種性機能ドメインを含む。作動的関係とは、遺伝子産物の発現を制御性配列の影響又はコントロール下に置かれるように、遺伝子産物、例えばポリペプチドのコーディング領域が一又は複数の制御性配列と関連する場合である。２つのＤＮＡ断片（例えばポリペプチドコーディング領域及びそれと関連するプロモーター）は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらし、２つのＤＮＡ断片間の連鎖の性質が遺伝子産物の発現を指示する発現制御性配列の能力を干渉しないか又は転写されるＤＮＡ鋳型の能力を干渉しない場合に「作動的に関連」する。このように、プロモーターがその核酸の転写に影響できる場合に、プロモーター領域はポリペプチドをコードする核酸と作動的に関連するだろう。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターでありうる。プロモーターに加えて、他の転写コントロール要素、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を支持するためにポリヌクレオチドと作動的に関連していてもよい。好適なプロモーター及び他の転写コントロール領域がここに開示される。様々な転写コントロール領域が当業者に知られている。これらは、限定するものではないが、脊椎動物細胞において機能する転写コントロール領域、例えば限定するものではないがサイトメガロウイルスからのプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えば、イントロン−Ａと併せて前初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）を含む。他の転写コントロール領域は、脊椎動物遺伝子由来のもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ−グロビン、並びに真核生物細胞における遺伝子発現をコントロールできる他の配列を含む。更なる好適な転写コントロール領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えばプロモーター誘導性テトラサイクリン）を含む。同様に、様々な転写コントロール要素が当業者に知られている。これらは、限定するものではないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終止コドン、及びウィルス系由来の要素（特に、内部リボソーム進入部位、又はＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列としても知られる）を含む。発現カセットはまた、他の特性、例えば複製起源、及び／又は染色体組込み要素、例えばレトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位配列（ＩＴＲ）を含みうる。
【０１５５】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コーディング領域は、本発明のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌又はシグナルペプチドをコードする更なるコーディング領域を伴い得る。例えば、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする核酸の上流に配置されうる。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、これは一旦粗面小胞体を横切って成長するタンパク質鎖の排出が開始すると成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドはポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを一般的に有し、それはポリペプチドの分泌又は「成熟」形態を生産するために翻訳ポリペプチドから切断されることを認識しているだろう。ある実施態様では、天然シグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用され、又はその配列の機能的誘導体であって、それに作動的に関連したポリペプチドの分泌を指示する能力を保持した機能的誘導体が使用される。あるいは、異種性哺乳類シグナルペプチド、又はその機能性誘導体が使用されうる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列と置換されうる。分泌シグナルペプチドの例示的なアミノ酸及びポリヌクレオチド配列を、配列番号１５４−１６２に示す。
【０１５６】
後の精製を容易にし又はＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の標識化における補助のために使用されうる短タンパク質配列（例えば、ヒスチジンタグ）をコードするＤＮＡは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（断片）をコードするポリヌクレオチドの中又は末端に含まれうる。
【０１５７】
更なる実施態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞が提供される。ある実施態様では、本発明の一又は複数のベクターを含んでなる宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、単独で又は組合せにおいて、それぞれポリヌクレオチド及びベクターに関してここに記載されている特徴の何れかを組み込みうる。一つのそのような実施態様では、宿主細胞は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば該ベクターで形質転換又はトランスフェクトされる）。ここで使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片を生成するよう操作できる何れかの種類の細胞システムを指す。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の複製及び発現の補助に好適な宿主細胞は当分野でよく知られている。このような細胞は特定の発現ベクターで適切にトランスフェクト又は形質導入され得、大量のベクター含有細胞が、臨床利用のための十分な量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を得るため大規模発酵槽での播種により増殖されうる。好適な宿主細胞は、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などを含む。例えば、ポリペプチドは、特に糖鎖付加が必要でない場合、細菌において生産されうる。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、更に精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含むポリペプチドをコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路が、「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生成をもたらす。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)、及びLi等, Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適応された哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株 (Graham等, J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３Ｔ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞(Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、（例えばMather等, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載される）ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki及びWu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。宿主細胞は、培養細胞、例えば、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞、また、トランスジェニック生物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞を含む。一実施態様では、宿主細胞は真核生物細胞、好ましくは哺乳類細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ球系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
【０１５８】
これらのシステムにおいて外来遺伝子を発現させるための標準的な技術は当分野で知られている。抗体等の抗原結合ドメインの重又は軽鎖のどちらかを含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された生成物が重及び軽鎖の両方を有する抗体であるように、抗体鎖の他方をまた発現するように操作されうる。
【０１５９】
一実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を生産する方法が提供され、該方法は、ここに提供されるように、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養し、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）からＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収することを含む。
【０１６０】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の構成要素は一般に互いに融合される。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、その成分が、お互いに直接的に又はリンカー配列を介して互いに間接的に融合されるように設計することができる。リンカーの組成及び長さは、当該技術分野において周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験され得る。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の別々の構成要素間のリンカー配列の例は、本明細書に与えられる配列中に見いだされる。さらなる配列はまた、所望であれば、融合体の個々の成分を分離するための切断部位、例えばエンドペプチダーゼ認識配列を組み込むことが含まれていてもよい。
【０１６１】
ある実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一又は複数の抗原結合部分は、抗原決定基に結合できる抗体可変領域を少なくとも含む。可変領域が、天然に又は非天然に生じる抗体及びその断片の一部を形成し、及びそれに由来しうる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生産する方法は、当分野でよく知られている（例えばHarlow及びLane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照）。非天然に生じる抗体は、固相−ペプチド合成を使用して構築されるか、組換え的に生産されるか（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載）、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含んでなるコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５９６９１０８号を参照）によって得られうる。
【０１６２】
何れかの動物種の抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域が、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子で用いることができる。本発明において有用な非限定的抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域は、マウス、霊長類、又はヒト起源のものでありうる。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子がヒトでの使用を意図する場合、抗体の定常領域はヒトに由来するキメラ形態の抗体が使用され得る。ヒト化又は完全ヒト形態の抗体がまた、当分野でよく知られている方法に従って調製されうる（例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５５６５３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、限定するものではないが（ａ）非ヒト（例えばドナー抗体）ＣＤＲの、ヒト（例えば、レシピエント抗体）フレームワーク及び定常領域への、決定的なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を保つのに重要なもの）の有無におけるグラフティング、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に決定的な残基）のみの、ヒトフレームワーク及び定常領域へのグラフティング、又は（ｃ）全非ヒト可変ドメインの移植（ただし、表面残基の置換によりヒト様セクションでそれらを「覆う」）を含む。ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro及びFransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988)；Queen等, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；米国特許第５５８２１３３７号、第７５２７７９１号、第６９８２３２１号及び第７０８７４０９号；Jones等, Nature 321:522-525 (1986)；Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855 (1984)；Morrison及びOi, Adv. Immunol. 44:65-92 (1988)；Verhoeyen等, Science 239:1534-1536 (1988)；Padlan, Molec. Immun. 31(3):169-217 (1994)；Kashmiri等, Methods 36:25-34 (2005) (ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記述）； Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) （「リサーフェシング」を記述）； Dall'Acqua等, Methods 36:43-60 (2005) （「ＦＲシャッフリング」を記述）；及びOsbourn等, Methods 36:61-68 (2005) 及びKlimka等, Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) （ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当該技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk及びvan de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって生成されるヒトモノクローナル抗体の部分を形成し、それから得られることができる（例えばMonoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、抗原チャレンジに応答してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を生産するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製されうる（例えばLonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変領域配列を単離することによって生成されうる（例えば、Hoogenboom等 in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien等編, Human Press, Totowa, NJ, 2001)；及びMcCafferty等, Nature 348, 552-554; Clackson等, Nature 352, 624-628 (1991)を参照）。ファージは典型的には、抗体断片を短鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として又はＦａｂ断片としてディスプレイする。
【０１６３】
ある実施態様では、本発明に有用な抗原結合部分は、例えば米国特許出願公開番号２００４／０１３２０６６（この全内容を出典明示によってここに援用する）に開示される方法に従い、増強された結合親和性を有するように操作される。特定の抗原決定基に結合する本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅＴ１００システムで解析される）（Liljeblad等, Glyco.J.17:323-329 (2000)）及び伝統的な結合アッセイ（Heeley,R.P., Endocr.Res.28:217-229 (2002)）の何れかによって測定することができる。競合アッセイは、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変ドメイン、例えばＣＤ３への結合についてＶ９抗体と競合する抗体を同定するために使用されうる。ある実施態様では、このような競合する抗体は、参照抗体によって結合される同じエピトープ（例えば線状又はコンホメーションエピトープ）に結合する抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。典型的な競合アッセイにおいて、固定化抗原（例えばＣＤ３）は、抗原（例えばＶ９抗体）に結合する第一の標識された抗体、及び抗原へ結合について第一の抗体と競合するその能力について試験されている第二の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化抗原が、第二の未標識の抗体でなく、第一の標識された抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第一の抗体の抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の未結合の抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。もし、固定化抗原に結合した標識の量が、コントロールサンプルと比較して試験サンプル中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体が、抗原への結合に対して、第一の抗体と競合していることを示している。Harlow及びLane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。
【０１６４】
本明細書で記載のように調製されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、当分野で知られている技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等によって精製されうる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性等の要因に依存し、当業者に明瞭であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用されうる。例えば、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを伴うマトリックスが使用されうる。逐次的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーが、実施例に本質的に記載されるようにＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を単離するために使用されうる。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー等を含む様々なよく知られた分析方法の何れかによって決定されうる。例えば、実施例に記載されるように発現される重鎖融合タンパク質は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで実証されるようにインタクトで、正しく会合していると示された（例えば図２を参照）。３つのバンドはおよそ分子量２５０００、分子量５００００及び分子量７５０００で分離され、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の軽鎖、重鎖及び重鎖／軽鎖融合タンパク質の予測された分子量に対応する。
【０１６５】
アッセイ
本明細書で提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、同定され、当該技術分野で公知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、又は特徴づけることができる。
【０１６６】
親和性アッセイ
Ｆｃ受容体又は標的抗原に対するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の親和性は、実施例に記載の方法に従って、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（GE Healthcare）のような標準的な器具類を使用して決定することができ、そしてそのような受容体又は標的タンパク質は、組換え発現によって得ることができる。代替的に、異なる受容体又は標的抗原に対するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合を、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えば、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により評価することができる。結合親和性を測定するための具体的な実例であり、例示的な実施態様は、以下及び下記実施例に記載されている。
【０１６７】
一実施態様によれば、ＫＤは２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００装置（GE Healthcare）を使用して表面プラズモン共鳴によって測定される。
【０１６８】
Ｆｃ部分とＦｃ受容体との相互作用を分析するために、Ｈｉｓタグ付組換えＦｃ受容体が、ＣＭ５チップ上に固定化された抗ペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ社）によって捕捉され、二重特異性コンストラクトは分析物として使用される。簡単に述べると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＧＥヘルスケア）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化する。Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ抗体を１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０で４０μｇ／ｍｌに希釈し、結合したタンパク質の応答単位（ＲＵ）がおよそ６５００になるように５μｌ／分の流量で注入した。リガンドの注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。続いて、Ｆｃ受容体は６０秒間４又は１０ｎＭで捕捉される。動力学測定のために、二重特異性コンストラクトの４倍段階希釈（５００ｎＭから４０００ｎＭ）が、ＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥヘルスケア、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）中で２５℃で約３０μｌ／分の流量で１２０秒間注入される。
【０１６９】
標的抗原に対する親和性を決定するため、二重特異性コンストラクトは、抗ペンタＨｉｓ抗体について記載したように活性化ＣＭ５センサーチップ表面に固定化されている抗ヒトＦａｂ特異的抗体（GE Healthcare）に捕捉される。結合したタンパク質の最終的な量は約１２０００ＲＵである。二重特異性コンストラクトは３００ｎＭで９０秒間で捕捉される。標的抗原は、３０μｌ／分の流量で２５０〜１０００ｎＭの濃度範囲で１８０秒間フローセルを通過する。解離は１８０秒間モニターされる。
【０１７０】
バルクの屈折率の差は、参照フローセル上で得られた応答を差し引くことにより補正される。定常状態応答を用いて、ラングミュア結合等温線の非線形曲線フィッティングによって解離定数ＫＤを導出した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) （ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）エバリュエーションソフトウェアバージョン１．１．１）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出される。例えば、Chen等, J Mol Biol 293, 865-881 (1999)を参照。
【０１７１】
活性アッセイ
実施例に記載のように、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の生物学的活性は、様々なアッセイによって測定することができる。生物学的活性は、例えばＴ細胞の増殖の誘導、Ｔ細胞におけるシグナル伝達の誘導、Ｔ細胞における活性化マーカーの発現の誘導、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の誘導、腫瘍細胞などの標的細胞の溶解の誘導、及び腫瘍退縮及び／又は生存の改善の誘導を含み得る。
【０１７２】
組成物、製剤、及び投与経路
更なる態様では、本発明は、例えば下記の治療方法の何れかにおける使用のための、本明細書に提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の何れかを含んでなる薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び薬学的に許容される担体を含む。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書に提供されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の何れか及び少なくとも一つの更なる治療剤、例えば下記のものを含む。
【０１７３】
更に提供されるのは、インビトロでの投与に適した形態の本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を生成する方法であり、該方法は（ａ）本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を得て、（ｂ）Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を少なくとも一の薬学的に許容される担体と処方し、それによりＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子がインビボでの投与用に処方される。
【０１７４】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体中に溶解又は分散された治療的に有効な量の一又は複数のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む。「薬学的に又は薬理学的許容可能な」なる語句は、用いられる投与量及び濃度ではレシピエントに一般的に非毒性であり、すなわち、例えばヒトなどの動物に適宜投与された時に、有害な、アレルギー性の又は他の望まない応答をもたらさない分子実体及び組成物を指す。少なくとも一つのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び場合によっては更なる活性成分を含有する薬学的組成物の調製は、本開示に照らして当業者によく知られており、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990に例示され、出典明示によってここに援用する。更に、動物（例えばヒト）投与では、調製物が、生物学的基準のＦＤＡオフィス(FDA Office of Biological Standards)又は他の国において対応する当局によって要求される無菌性、発熱性、一般的な安全性及び純度標準を満たすべきであることが理解されるだろう。好ましい組成物は凍結乾燥製剤又は水溶液である。ここで使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」は、当業者に知られているありとあらゆる溶剤、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存料（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存料、抗酸化剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、同様な物質及びその組合せを含む（例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照（出典明示によってここに援用する））。何れかの一般的な担体が活性成分と不適合である場合を除き、治療的又は薬学的組成物におけるその使用が意図される。
【０１７５】
組成物は、それが固体、液体又はエアロゾル形態で投与されるか、またそれが注射などの投与経路のために無菌である必要があるかに依存して、異なるタイプの担体を含みうる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（及び何れかの追加の治療剤）は、当業者に知られているように、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、脾臓内に、腎内に、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、腟内に、直腸内に、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、結膜下に、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍内に、眼球内に、経口で、局所的に、局在的に、吸入によって（例えば、エアロゾル吸入）、注射によって、注入によって、持続注入によって、標的細胞を浸す限局灌流によって直接、カテーテルによって、洗浄(lavage)によって、クリームにおいて、液体組成物（例えばリポソーム）において、又は他の方法によって、又は前述の何れかの組合せによって投与されうる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990を参照（出典明示によってここに援用する））。非経口投与、特に静脈内注射が、発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子などのポリペプチド分子の投与に最も一般的に使用される。
【０１７６】
非経口組成物は、注射、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、くも膜下腔内又は腹腔内注射による投与のために設計されたものを含む。注射では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、水溶液中、好ましくは生理学的適合したバッファー、例えばＨａｎｋｓ液、Ｒｉｎｇｅｒ液、又は生理学的緩衝生理食塩水中に処方されうる。溶液は、懸濁、安定及び／又は分散剤などのフォーミュラトリー剤を含みうる。あるいは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、使用前は、適切なビヒクル、例えば滅菌発熱性物質除去蒸留水の構成用に粉末形態でありうる。滅菌注射溶液は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を、必要に応じて下に挙げる様々な他の成分を伴う適切な溶媒中に必要量で組み入れることによって調製される。滅菌は、例えば滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成されうる。一般的に分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基礎分散培地及び他の成分を含有する無菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。滅菌注射溶液、懸濁液又はエマルションの調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分＋任意の追加の所望成分の粉末を、先に滅菌−濾過されたその液体培地から得る真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液体培地は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤は注射の前に十分な生理食塩水又はグルコースでまず等張にされるべきである。組成物は、製造及び保管の条件下で安定でなければならなく、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。内毒素汚染は安全なレベル、例えば０．５ｎｇ／ｍｇ未満のタンパク質で最小限に保たれるべきであることが理解されるだろう。適な薬学的に許容可能な担体は、限定するものではないが；リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシルメチル・セルロース・ナトリウム、ソルビトール、デキストランなど、懸濁液の粘度を増加させる化合物を含有しうる。場合によっては、懸濁液は、高濃縮液の調製を可能にするために、適切な安定剤又は化合物の溶解度を増加させる薬剤をまた含有しうる。更に、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製されうる。適切な親油性溶媒又はビヒクルは、脂肪油、例えばゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えばエチルクリート(ethyl cleats)又はトリグリセリド、又はリポソームを含む。
【０１７７】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ−粒子及びナノカプセル）に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。これらの技術は、上掲のRemington's Pharmaceutical Sciences 18th editionに開示されている。徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の適切な例は、ポリペプチドを含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン又はその組合せの組成物における使用によって実施されうる。
【０１７８】
前述の組成物に加えて、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子はまた、デポー調製物として処方されうる。そのように長く作用する製剤は、インプラント術（例えば皮下又は筋肉内）又は筋肉内注射によって投与されうる。従って、例えば、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、適切なポリマー又は疎水性材料（例えば許容可能な油中のエマルションとして）又はイオン交換樹脂とともに、又は難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として製剤化されうる。
【０１７９】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含んでなる薬学的組成物は、慣習的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、凍結乾燥プロセスによって製造されうる。薬学的組成物は、薬剤的使用可能な調製物へのタンパク質の加工を容易にする一又は複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤又は補助剤を使用して、一般的な方法において製剤化されうる。適切な製剤は、選択された投与経路に依存する。
【０１８０】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、遊離酸又は塩基、中性又は塩形態の組成物に製剤化されうる。薬学的に許容可能な塩は、遊離酸又は塩基の生物学的活性を実質的に保った塩である。これらは酸付加塩、例えばタンパク質組成物の遊離アミノ基で形成されるもの、又は塩酸又はリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸又はマンデル酸などの有機酸で形成されるものを含む。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化第二鉄などの無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン又はプロカインなどの有機塩基から得られうる。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態よりも水性及び他のプロトン性溶媒中において溶けやすい傾向がある。
【０１８１】
治療方法及び組成物
本明細書に与えられるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の何れかは治療的方法で用いることができる。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、免疫治療剤として、例えば癌の治療において使用することができる。
治療的方法において使用のために、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は良好な医療行為に合致した方法で処方され、投与され、投薬される。この観点において考慮すべき要因は、治療すべき特定の障害、治療すべき特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。
【０１８２】
一態様では、医薬として使用のための本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。更なる態様では、医薬として使用のための本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。ある実施態様では、治療の方法において使用のための本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。一実施態様では、本発明は、それを必要としている個体において、疾患の治療に使用のために、ここに記載されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。ある実施態様では、本発明は、個体にＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的有効量を投与することを含む、疾患を有する個体を治療する方法に使用のためのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。ある実施態様では、治療すべき疾患は、増殖性疾患である。特定の実施態様では、疾患は癌である。ある実施態様では、本方法は、少なくとも一の更なる治療剤、例えば、治療すべき疾患が癌である場合には抗癌剤の治療的有効量を個体に投与することを更に含む。一実施態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解の誘導に使用するため、ここに記載されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。ある実施態様では、本発明は、標的細胞の溶解を誘導するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効量を個体に投与することを含む、個体において標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法において使用のためのＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
【０１８３】
更なる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における本明細書に報告されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用を提供する。一実施態様では、医薬は、それを必要とする個体における疾患の治療のためである。更なる実施態様では、本医薬は、疾患を有する個体に、医薬の治療的有効量を投与することを含む、疾患を治療する方法で使用するためのものである。ある実施態様では、治療すべき疾患は、増殖性疾患である。特定の実施態様では、疾患は癌である。一実施態様では、本方法は、少なくとも一の更なる治療剤、例えば、治療すべき疾患が癌である場合には抗癌剤の治療的有効量を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様では、本医薬は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するためである。更に別の実施態様では、本医薬は、標的細胞の溶解を誘導するために本医薬の有効量を個体に投与することを含む、個体における標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法で使用するためである。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、哺乳動物であり、好ましくはヒトであり得る。
【０１８４】
更なる態様では、本発明は、疾患を治療するための方法を提供する。一実施態様では、本方法は、このような疾患を有する個体に対して、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的有効量を投与することを含む。一実施態様では、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を薬学的に許容される形態で含む組成物が前記個体に投与される。ある実施態様では、治療すべき疾患は、増殖性疾患である。特定の実施態様では、疾患は癌である。ある実施態様では、本方法は、少なくとも一の更なる治療剤、例えば、治療すべき疾患が癌である場合には抗癌剤の治療的有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、哺乳動物であり、好ましくはヒトであり得る。
【０１８５】
更なる態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法を提供する。本発明はまた、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の存在下で、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子と標的細胞を接触させることを含む。更なる態様では、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法が提供される。一つのそのような実施態様では、本方法は、標的細胞の溶解を誘導するＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効量を個体に投与することを含む。一実施態様では、「個体」はヒトである。
【０１８６】
ある実施態様では、治療すべき疾患は、増殖性疾患、特にがんである。がんの非限定的例は、膀胱がん、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨がん、及び腎臓がんを含む。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を使用して治療できる他の細胞増殖障害は、限定するものではないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟部組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系の新生物を含む。また含まれるのは、前がん性の状態又は病変及びがん転移を含む。ある実施態様では、がんは、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳がん、頭頸部がんから成る群から選択される。当業者は、多くの場合において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が治癒ではなく、部分的恩恵のみをもたらしうることを認識するだろう。幾つかの実施態様では、何らかの利益を有する生理学的変化がまた治療的に有益であると考えら得る。従って、幾つかの実施態様では、生理学的変化をもたらすＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の量が、「有効な量」又は「治療的に有効な量」と考えられる。治療を必要とする被験体、患者、又は個体は典型的には哺乳動物、より具体的にはヒトである。
【０１８７】
幾つかの実施態様では、有効量の本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が細胞に投与される。他の実施態様では、治療的に有効な量の本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、疾患の治療のために個体に投与される。
【０１８８】
疾患の予防又は治療のためには、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の適切な用量（単独で使用されるか、又は、一以上の更なる治療的薬剤との組み合わされる場合）は治療すべき疾患の種類、投与の経路、患者の体重、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の種類、疾患の重症度及び経過、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を予防又は治療目的のいずれにおいて投与するか、前の又は同時の治療介入、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子に対する患者の臨床的履歴及び応答性、及び担当医の判断に依存する。何れの場合も、投与に責任のある実践者が、個々の被験体に対し、組成物中の活性成分の濃度及び適切な用量を決定するだろう。限定するものではないが、単回又は様々な時間点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む様々な投与スケジュールが、ここで考えられる。
【０１８９】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、患者に対して、単回、又は一連の治療に渡って適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な一日当たり用量は上記した要因に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日間以上にわたる反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続するであろう。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の１つの例示される用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の非限定的な例では、用量はまた、投与あたり約１マイクログラム／ｋｇ／体重から、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重まで又はそれ以上、及びその中で導きだされる何れかの範囲を含む。ここで挙げた数値から導きだされる範囲の非限定的な例は、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲が、上記の数値に基づき投与されうる。このように、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数（又はその何れかの組合せ）の用量が、患者に投与されうる。このような用量は、間欠的に、例えば毎週又は３週間毎に投与されうる（例えば、患者は約２〜約２０、又は例えば約６用量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を受ける）。初期の高負荷投与量の後に一以上の低投与量が投与され得る。しかしながら、他の投与量レジメンも有益であり得る。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターされる。
【０１９０】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は一般的に、意図した目的を達成するために有効な量において使用されるだろう。疾患状態を治療又は防止するための使用では、発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその薬学的組成物は、治療的に有効な量において投与又は適用される。治療的に有効な量の決定は、特にここに提供される詳細な開示の考慮のもと、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１９１】
全身性投与では、治療的に有効な用量は最初に、細胞培養アッセイなどのインビトロアッセイから推定されうる。次いで用量は、細胞培養において決定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲を得るために、動物モデルにおいて組み立てられうる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用されうる。
最初の投与量はまた、当分野においてよく知られている技術を使用して、インビボデータ、例えば動物モデルから推定されうる。当業者は、動物データに基づいてヒトへの投与を容易に最適化できるだろう。
【０１９２】
投与量及び間隔は、治療効果を維持するのに十分なＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の血漿レベルを提供するために、個々に調整されうる。注射による投与のための通常の患者の投与量は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日である。治療的に有効な血漿レベルは、毎日の複数回投与によって達成されうる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣによって測定されうる。
【０１９３】
局所投与又は選択的取込みの場合、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効な局所濃度は血漿濃度と関連しない場合がある。当業者は、過度な実験をすることなく、治療的に有効な局所投与量を最適化できるだろう。
【０１９４】
治療的に有効な用量のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は一般的に、実質的な毒性をもたらすことなく治療効果を提供するだろう。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物において標準的な手順によって決定できる。細胞培養アッセイ及び動物研究は、ＬＤ５０（集団の５０％に致死性である用量）及びＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効である用量）を決定するために使用できる。毒性及び治療効果間の用量比は、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現される治療指数である。高い治療指数を示すＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が望ましい。一実施態様では、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用に好適な投与量の範囲の策定に使用されうる。投与量は好ましくは、殆どあるいは全く毒性の無いＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、様々な要因、例えば採用される剤形、利用される投与経路、被験体の状態などに応じて、この範囲内において変わりうる。正確な処方、投与の経路及び投与量は、患者の状態を考慮してそれぞれの医師によって選択されうる。（例えばFingl等, 1975, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1（出典明示によってその全体をここに援用する）を参照）。
【０１９５】
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子で治療される患者の主治医は、毒性、臓器不全などに対し、どのように及びいつ投与を終了、中断、調整するかを知っているだろう。逆に、主治医はまた、臨床反応が十分でない場合、治療を高レベルに調整することを知っているだろう（毒性を除く）。目的の障害の管理における投与量の程度は、治療される状態の重症度、投与の経路などによって様々だろう。状態の重症度は、例えば標準的な予後評価方法によって一部には評価されうる。更に、用量及びおそらくは投与頻度はまた、個々の患者の年齢、体重及び反応によって様々だろう。
【０１９６】
他の薬剤及び治療
本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、治療において一又は複数の他の薬剤との組合せにおいて投与されうる。例えば、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子が少なくとも１つのさらなる治療剤と同時投与することができる。「治療剤」という用語は、治療を必要としている個体における症状又は疾患を治療するために投与される何れかの薬剤を包含する。このような追加の治療剤は、治療されている特定の徴候に好適な何れかの活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補活性を伴うものを含みうる。ある実施態様では、追加の治療剤は、免疫調節剤、細胞分裂阻害剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害剤、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘導物質に対する細胞の感受性を増加させる薬剤である。特定の実施態様では、追加の薬剤は、抗癌剤、例えば微小管撹乱物質、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤、又は抗血管新生剤である。
【０１９７】
このような他の薬剤は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。そのような他の薬剤の有効量は、使用されるＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の量、障害又は治療の種類及び上記した他の要因に依存する。Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は一般的にはここに記載されるのと同じ用量及び投与経路において、又は、ここに記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。
【０１９８】
上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一又は別々の組成物に含まれている）、及び、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又はその後に起きうる分離投与を包含する。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は放射線療法と組み合わせても使用することができる。
【０１９９】
製造品
本発明の他の実施態様では、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器と容器上ないしは容器に付随するラベルないしはパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、ＩＶ液バッグ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、症状を治療、予防及び／又は診断するために有効な組成物単独又は他の組成物と組み合わせる組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる（例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含有する組成物を中に収容する第一の容器と（ｂ）更なる細胞障害剤又は別の治療薬を含有する組成物を中に収容する第二の容器とを含みうる。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示すパッケージ挿入物を更に含んでいてもよい。別法として、又は加えて、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器を更に含んでもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【実施例】
【０２００】
以下は本発明の方法及び組成物の例である。上で提供された一般的な説明があるので、他の様々な実施態様を実施しうることが理解される。
【０２０１】
一般的方法
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法をSambrook等, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているように使用してＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造元の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Kabat, E.A.等, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版, NIH Publication No. 91-3242に与えられている。
【０２０２】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列を二本鎖配列決定により決定した。
【０２０３】
遺伝子合成
必要な場合、所望の遺伝子は、適切な鋳型を使用してＰＣＲによって生成するか、又は自動遺伝子合成により合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物からＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Regensburg, Germany）によって合成された。正確な遺伝子配列が入手可能でなかった場合、オリゴヌクレオチドプライマーを最も近いホモログ由来の配列に基づいて設計し、遺伝子を適切な組織に由来するＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって単離した。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを標準のクローニング／シークエンシングベクターにクローン化した。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、濃度をＵＶ分光法により決定した。サブクローン化遺伝子断片のＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローン化を可能にする適切な制限部位を伴って設計された。全てのコンストラクトは、タンパク質を真核細胞内での分泌の標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を含めて設計した。配列番号１５４−１６２は、それぞれ例示的なリーダーペプチド及びそれらをコードするポリヌクレオチド配列を与える。
【０２０４】
ＰＢＭＣからの初代ヒトｐａｎＴ細胞の単離
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、地方血液銀行から、又は健康なヒトのドナーからの新鮮血から得られた濃縮リンパ球調製物（バフィーコート）からヒストパック（Histopaque）密度遠心分離によって調製した。簡単に説明すると、血液を滅菌ＰＢＳで希釈し、慎重にヒストパック勾配上で層にした（Sigma, H8889）。室温で４５０×ｇで３０分間遠心分離した後（ブレーキをオフに切り替え）、ＰＢＭＣを含む界面相上の血漿の一部を廃棄した。ＰＢＭＣを、新しい５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに移し、チューブをＰＢＳで５０ｍｌの総体積になるまで充填した。混合物を４００×ｇで１０分間室温で遠心分離した（ブレーキをオンに切り替え）。上清を廃棄し、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（３５０×ｇで１０分間４℃での遠心分離工程）。得られたＰＢＭＣ集団を自動的に計数し（ViCell）、アッセイが開始されるまで、インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ２で１０％のＦＣＳ及び１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Biochrom, K0302）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に保存した。
ＰＢＭＣからのＴ細胞濃縮を、製造者の指示に従って、ｐａｎＴ細胞単離キットＩＩ（Miltenyi Biotec #130-091-156）を使用して実施した。簡単に述べると、細胞ペレットを１千万細胞当たり４０μｌの冷緩衝液（０．５％ＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ、滅菌濾過）で希釈し、４℃で１０分間、１千万細胞当たり１０μｌのビオチン抗体カクテルと共にインキュベートした。３０μｌの冷緩衝液と１千万細胞当たり２０μｌの抗ビオチン磁気ビーズを添加し、その混合物を４℃で更に１５分間インキュベートした。細胞を、そのときの体積の１０−２０倍を添加し、続く１０分間３００×ｇでの遠心分離工程により洗浄した。最大１億個の細胞を５００μｌの緩衝液中に再懸濁させた。非標識ヒトｐａｎＴ細胞の磁気分離を、製造者の指示に従ってＬＳカラム（Miltenyi Biotec #130-042-401）を使用して実施した。得られたＴ細胞群を自動的に計数し（ViCell）、アッセイ開始まで（２４時間より長くはない）、インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ２でＡＩＭ−Ｖ培地中に保存した。
【０２０５】
ＰＢＭＣからの初代ヒト天然型Ｔ細胞の単離
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、地方血液銀行から、又は健康なヒトのドナーからの新鮮血から得られた濃縮リンパ球調製物（バフィーコート）からヒストパック密度遠心分離によって調製した。ＰＢＭＣからのＴ細胞の濃縮は、製造者の指示に従って、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃからのナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（#130-093-244）を使用して実施したが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の最後の単離工程をスキップした（初代ヒトｐａｎＴ細胞の単離についての説明も参照のこと）。
【０２０６】
脾細胞からのマウスｐａｎＴ細胞の単離
脾臓を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離し、ＭＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋０．５％のＢＳＡ＋２ｍＭのＥＤＴＡ）を含むＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｃチューブ（Miltenyi Biotech #130-093-237）に移し、製造者の指示に従ってＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒを用いて破砕分散して単細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液は、破砕分散されていない残った組織粒子を除去するために、プリセパレーションフィルターに通した。４℃で４分間、４００×ｇで遠心分離した後、赤血球を溶解するためにＡＣＫ溶解緩衝液を添加した（室温で５分間のインキュベーション）。残りの細胞を、ＭＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、計数し、マウスｐａｎＴ細胞の単離のために使用した。陰性（磁気）選択を、製造者の指示に従って、ｐａｎＴ細胞単離キット（Miltenyi Biotec #130-090-861）を使用して実施した。得られたＴ細胞群を自動的に計数し（ViCell）、更なるアッセイに直ぐに使用した。
【０２０７】
ヘパリン処理血液からの初代カニクイザルＰＢＭＣの単離
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を健常なカニクイザルドナーからの新鮮血から密度遠心分離により以下のようにして調製した：ヘパリン処理血液を滅菌ＰＢＳで１：３に希釈し、リンホプレップ培地（Axon Lab #1114545）を、滅菌ＰＢＳで９０％に希釈した。希釈した血液の２ボリュームを、希釈した密度勾配の１ボリューム上に層化し、ＰＢＭＣ画分を、室温で、ブレーキなしで、５２０×ｇで３０分間遠心分離した。ＰＢＭＣバンドを新しい５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに移し、滅菌ＰＢＳで４℃で４００×ｇで１０分間の遠心分離によって洗浄した。血小板を除去するために、１回の低速遠心分離を実施し（１５０×ｇで１５分間、４℃）、得られたＰＢＭＣ群を自動的に計数し（ViCell）、直ちに更なるアッセイに使用した。
【０２０８】
標的細胞
ＭＣＳＰ標的化二重特異性抗原結合分子の評価のため、次の腫瘍細胞を使用した：悪性メラノーマの転移部位由来でヒトＭＣＳＰを高レベルで発現するヒトメラノーマ細胞株ＷＭ２６６−４（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６７６）；中程度のレベルのヒトＭＣＳＰを発現するヒトメラノーマ細胞株ＭＶ−３（Radboud大学Nijimegen医療センターから贈られた物）；高レベルのＭＣＳＰを発現するヒト悪性メラノーマ（原発腫瘍）細胞株Ａ３７５（ＥＣＡＣＣ番号８８１１３００５）；ＭＣＳＰを発現しないヒト結腸がん細胞株ＨＣＴ−１１６（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２４７）；及びＭＣＳＰを発現しないヒト白人結腸腺がん細胞株ＬＳ１８０（ＥＣＡＣＣ番号８７０２１２０２）。
ＣＥＡ標的化二重特異性抗原結合分子の評価のため、以下の腫瘍細胞を使用した：非常に高いレベルのヒトＣＥＡを発現するヒト胃がん細胞株ＭＫＮ４５（ＤＳＭＺ ＡＣＣ番号４０９）；高レベルのヒトＣＥＡを発現するヒト膵臓腺がん細胞株ＨＰＡＦ−ＩＩ（Roche Nutleyからの親切な贈り物)；中レベルのヒトＣＥＡを発現するヒト原発膵臓腺がん細胞株ＢｘＰＣ−３（ＥＣＡＣＣ番号９３１２０８１６）；中レベルのヒトＣＥＡを発現するヒトの女性の白人結腸腺がん細胞株ＬＳ−１７４Ｔ（ＥＣＡＣＣ番号８７０６０４０１）；低レベルのヒトＣＥＡを発現するヒト膵臓腺がん細胞株ＡＳＰＣ−１（ＥＣＡＣＣ番号９６０２０９３０）；（非常に）低いレベルのヒトＣＥＡを発現するヒト上皮膵臓がん細胞株Ｐａｎｃ−１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４６９）；ＣＥＡを発現しないヒト結腸がん細胞株ＨＣＴ−１１６（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２４７）；ヒトＣＥＡを発現するように社内で安定的にトランスフェクトされたヒト腺がん肺胞基底上皮細胞株Ａ５４９−ｈｕＣＥＡ；及びヒトＣＥＡを安定的に発現するように社内で設計されたマウス結腸がん細胞株ＭＣ３８−ｈｕＣＥＡ。
加えて、ヒトＴ細胞白血病細胞株、Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−１５２）を、異なる二重特異性コンストラクトの細胞上のヒトＣＤ３への結合を評価するために使用した。
【０２０９】
実施例１
二重特異性抗原結合分子の調製、精製及び特性評価
重鎖及び軽鎖の可変領域配列を、各レシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入された定常重鎖又は定常軽鎖の何れかと共にインフレームでサブクローニングした。抗体の発現はＭＰＳＶプロモーターによって駆動され、合成ポリＡシグナル配列は、ＣＤＳの３’末端に位置する。加えて、各ベクターは、ＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含んでいた。
【０２１０】
分子を、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞に哺乳動物の発現ベクターをコトランスフェクトすることにより産生した。指数関数的に増殖しているＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、リン酸カルシウム法を用いてトランスフェクトした。あるいは、懸濁液中で増殖しているＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用してトランスフェクトした。「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム型／一アーム反転型」コンストラクトの調製のために、細胞に、対応する発現ベクターを１：１：１（「ベクター重鎖」：「ベクター軽鎖」：「ベクター重鎖−ｓｃＦａｂ」）の比でトランスフェクトした。「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクトの調製のために、細胞に、対応する発現ベクターを１：２：１（「ベクター重鎖」：「ベクター軽鎖」：「ベクター重鎖−ｓｃＦａｂ」）の比でトランスフェクトした。「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」コンストラクトの調製のために、細胞に、対応する発現ベクターを１：１：１：１（「ベクター第二重鎖」：「ベクター第一軽鎖」：「ベクター軽鎖ＣｒｏｓｓＦａｂ」：「ベクター第一重鎖−重鎖Ｃｒｏｓｓｆａｂ」）の比でトランスフェクトした。「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」コンストラクトの調製のために、細胞に、対応する発現ベクターを１：１：１：１（「ベクター第二重鎖」：「ベクター軽鎖」：「ベクター第一重鎖−重鎖Ｃｒｏｓｓｆａｂ」：「ベクター軽鎖Ｃｒｏｓｓｆａｂ」）の比でトランスフェクトした。「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、連結軽鎖」コンストラクトの調製のために、細胞に、対応する発現ベクターを１：１：１：１（「ベクター重鎖」：「ベクター軽鎖」：「ベクター重鎖（ＣｒｏｓｓＦａｂ−Ｆａｂ−Ｆｃ）」：「ベクター連結軽鎖」）の比でトランスフェクトした。「１＋１ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」コンストラクトの調製のために、細胞に、対応する発現ベクターを１：１：１：１（「ベクター第一重鎖」：「ベクター第二重鎖」：「ベクター第一軽鎖」：「ベクター第二軽鎖」）の比でトランスフェクトした。「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ軽鎖融合」コンストラクトの調製のために、細胞に、対応する発現ベクターを１：１：１：１（「ベクター第一重鎖」：「ベクター第二重鎖」：「ベクター軽鎖Ｃｒｏｓｓｆａｂ」：「ベクター第二軽鎖」）の比でトランスフェクトした。
【０２１１】
リン酸カルシウムを使用するトランスフェクションのため、細胞を、１０％（ｖ／ｖ）のＦＣＳを補填したＤＭＥＭ培養培地を使用してＴフラスコ中で付着単層培養として増殖させ、それらが５０から８０％の間で集密になったときにトランスフェクトした。Ｔ１５０フラスコのトランスフェクションでは、ＦＣＳ（最終１０％ｖ／ｖ）を補填した２５ｍｌのＤＭＥＭ培養培地にトランスフェクションの２４時間前に１５００万細胞を播種し、細胞を５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター中に３７℃で一晩配した。トランスフェクトされる各Ｔ１５０フラスコに対して、ＤＮＡ、ＣａＣｌ２及び水の溶液を、対応する比率で分けられた９４μｇの全プラスミドベクターＤＮＡ、４６９μｌの最終容量までの水及び４６９μｌの１ＭのＣａＣｌ２溶液を混合することによって調製した。この溶液に、９３８μｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４溶液（ｐＨ７．０５）を加え、直ぐに１０秒間混合し、室温で２０秒間静置した。懸濁液を、２％（ｖ／ｖ）のＦＣＳを補填した１０ｍｌのＤＭＥＭで希釈し、既存の培地の代わりにＴ１５０に加えた。続いて、更なる１３ｍｌのトランスフェクション培地を加えた。細胞を約１７から２０時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、ついで培地を２５ｍｌのＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳに置換した。条件培養培地を２１０×ｇでの１５分の遠心分離によって培地交換から約７日後に収集し、滅菌濾過（０．２２μｍフィルター）し、０．０１％ｗ／ｖの最終濃度までアジ化ナトリウムを補填し、４℃に維持した。
【０２１２】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用するトランスフェクションのため、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、無血清ＣＤ ＣＨＯ培養培地中で懸濁培養した。５００ｍｌの振盪フラスコ中での生成のため、４億のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのため、細胞を、２１０×ｇで５分間遠心分離し、上清を２０ｍｌの予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地で置換した。発現ベクターを２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地中で最終的に２００μｇのＤＮＡの量まで混合した。５４０μｌのＰＥＩを加えた後、混合物を１５秒間ボルテックスし、続いて室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気を含むインキュベーター中、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション時間後、１６０ｍｌのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ１（Lonza）を添加した。７日間の培養後、上清を精製のために２１０×ｇで１５分間遠心分離することにより収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、アジ化ナトリウムを０．０１％ｗ／ｗの最終濃度まで補充し、４℃で保存した。
分泌タンパク質は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーと、続くサイズ排除クロマトグラフィー工程によって、細胞培養上清から精製した。
【０２１３】
アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、２５ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、又は４０ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐプロテインＡ ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍｌ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に添加した。非結合タンパク質は、少なくとも１０カラム体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）で洗浄し、続いて６カラム体積の１０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ５．４５）を使用する洗浄工程により除去した。ついで、カラムを２０ｍｌの１０ｍＭのＭＥＳ、１００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ５．０）で洗浄し、標的タンパク質を、６カラム体積の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン（ｐＨ３．０）で溶出させた。あるいは、標的タンパク質を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）から２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ２．５）までの２０カラム体積にわたる勾配を用いて溶出させた。タンパク質溶液を、０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８）を１／１０加えて中和させた。標的タンパク質を濃縮し、濾過した後、２５ｍＭリン酸カリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン溶液（ｐＨ６．７）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（GE Healthcare）へ添加した。１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂの精製のために、カラムをｐＨ６．０の２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム溶液で平衡化した。
【０２１４】
精製されたタンパク質サンプルのタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されるモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することによって決定した。二重特異性コンストラクトの純度と分子量は、還元剤（５ｍＭの１，４−ジチオスレイトール）の存在下及び非存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、クマシー（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅＴＭ ＳａｆｅＳｔａｉｎ）による染色をＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Invitrogen, 米国）を使用して、製造者の指示（４−１２％トリス−アセテートゲル又は４−１２％のビス−トリス）に従って使用した。あるいは、分子の純度と分子量は、製造者の指示に従ってＣａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステム（Caliper Lifescience）を使用して還元剤の存在下及び非存在下でＣＥ−ＳＤＳ分析によって分析した。
【０２１５】
タンパク質サンプルの凝集体含有量は、スーパーデックス２００１０／３００ＧＬ分析用サイズ排除クロマトグラフィーカラム（GE Healthcare）を用いて、２５℃で、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ３、ｐＨ７．３のランニング緩衝液（ｗ／ｖ）中で分析した。あるいは、抗体のサンプルの凝集体含有量は、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析用サイズ排除カラム（東ソー）を用いて、２５℃で、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５のＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％のＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニング緩衝液（ｗ／ｖで）中で分析した。
【０２１６】
図２−１４は、ＳＤＳ ＰＡＧＥ及び分析用サイズ排除クロマトグラフィーの結果を示し、表２Ａは、異なる二重特異性コンストラクト調製物のプロテインＡ後の収量、凝集体含有量、及び最終モノマー含有量を示している。
図４７は、抗ＣＤ３／抗ＭＣＳＰ二重特異性「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、連結軽鎖」コンストラクトのＣＥ−ＳＤＳ分析の結果を示す（配列番号３、５、２９、及び１７９を参照）。２μｇのサンプルを分析のために使用した。図４８は、最終生成物（２０μｇのサンプルが注入された）の分析用サイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す。
図５４は、様々なコンストラクトのＣＥ−ＳＤＳ及びＳＤＳ ＰＡＧＥ分析の結果を示し、表２Ａは、異なる二重特異性コンストラクト調製物のプロテインＡ後の収量、凝集体含有量、及び最終モノマー含有量を示している。
【０２１７】
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【０２１８】
コントロールとして、二重特異性抗原結合分子を、従来技術のタンデムｓｃＦｖ形態（「（ｓｃＦｖ）２」）で、ＦｃドメインへタンデムｓｃＦｖを融合させる（「（ｓｃＦｖ）２−Ｆｃ」）ことによって、作製した。分子を、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞中で産生させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーと、続くサイズ排除クロマトグラフィー工程によって、本発明の二重特異性抗原結合分子について上に記載したのと類似の方法で精製した。高い凝集体形成に起因して、一部のサンプルは、高モノマー含有量のタンパク質を得るために、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ６．７）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（GE Healthcare）から溶出して濃縮したサンプルをＳｕｐｅｒｄｅｘ１０／３００ＧＬカラム（GE Healthcare）に適用することによって更に精製しなければならなかった。続いて、タンパク質濃度、純度及び分子量、及び凝集体含有量を上記のようにして決定した。
コントロール分子の最初の精製工程の後の収量、凝集体含有量、及び最終的な単量体の含有量を表２Ｂに示す。最初の精製工程（プロテインＡ）の後の凝集体含有量の比較は、「（ｓｃＦｖ）２−Ｆｃ」及びジスルフィド結合安定化「（ｄｓｓｃＦｖ）２−Ｆｃ」分子と比較したときの、ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ及びＩｇＧ ｓｃＦａｂコンストラクトの優れた安定性を示している。
【０２１９】
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【０２２０】
タンパク質の熱安定性を動的光散乱（ＤＬＳ）によりモニターした。１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を含む３０ｇの濾過タンパク質サンプルをＤｙｎａｐｒｏプレートリーダー（Wyatt Technology Corporation; USA）へ二組適用した。温度は、０．０５℃／分で２５から７５℃へと上昇させ、半径と全散乱強度を収集した。結果を図１５及び表２Ｃに示す。「（ｓｃＦｖ）２−Ｆｃ」（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）分子では、２つの凝集点が４９℃と６８℃で観察された。「（ｄｓｓｃＦｖ）２−Ｆｃ」コンストラクトは、導入されたジスルフィド架橋の結果として、凝集温度が上昇した（５７℃）（図１５Ａ、表２Ｃ）。「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」コンストラクトの両方共、６０℃より高い温度で凝集しており、「（ｓｃＦｖ）２−Ｆｃ」及び「（ｄｓｓｃＦｖ）２−Ｆｃ」形態と比較して優れた熱安定性を実証している（図１５Ｂ、表２Ｃ）。
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【０２２１】
実施例２
Ｆｃ受容体及び標的抗原結合の表面プラズモン共鳴分析
方法
全ての表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を、２５℃でＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００上で、ＨＢＳ−ＥＰをランニング緩衝液として（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、フライブルグ／ドイツ）実施した。
【０２２２】
異なるＦｃ変異体のＦｃＲ結合の解析
アッセイの設定を図１６Ａに示す。ヒトＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８及びマウスＦｃγＲＩＶとの異なるＦｃ変異体の相互作用を分析するため、抗ペンタＨｉｓ抗体（Qiagen）の約６５００共鳴単位（ＲＵ）の直接カップリングを、標準のアミンカップリングキット（Biacore, フライブルグ／ドイツ）を使用して、ｐＨ５．０でＣＭ５チップ上で実施する。ＨｕＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８−Ｋ６Ｈ６及びｍｕＦｃγＲＩＶ−ａｖｉＨｉｓ−ビオチンはそれぞれ４又は１０ｎＭで６０秒間捕捉される。
異なるＦｃ変異体を含むコンストラクトは、３０μｌ／分の流量で１０００ｎＭの濃度で１２０秒間フローセルを通過させられる。解離は２２０秒間モニターされる。バルクの屈折率の差は、参照フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正される。ここで、Ｆｃ変異体は固定化抗ペンタＨｉｓ抗体を持つ表面上を流されるが、その上にはＨｕＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８−Ｋ６Ｈ６又はｍｕＦｃγＲＩＶ−ａｖｉＨｉｓ−ビオチンよりむしろＨＢＳ−ＥＰが注入されている。ヒトＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８及びマウスＦｃγＲＩＶの親和性は５００−４０００ｎＭの濃度範囲を使用して野生型Ｆｃに対して決定された。
定常状態応答を使用して、ラングミュア結合等温線の非線形曲線フィッティングによって解離定数ＫＤを導出した。速度定数は、数値積分により１：１ラングミュア結合に反応速度式を適合させるＢｉａｃｏｒｅＴ１００評価ソフトウェア（ｖＡＡ、Biacore AB, ウプサラ／スウェーデン）を使用して導出された。
【０２２３】
結果
Ｆｃ変異体のヒトＦｃγＲＩＩＩａ及びマウスＦｃγＲＩＶとの相互作用を、表面プラズモン共鳴によってモニターした。捕捉したｈｕＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８−Ｋ６Ｈ６及びｍｕＦｃγＲＩＶ−ａｖｉＨｉｓビオチンへの結合は、野生型（ｗｔ）Ｆｃドメインを持つコンストラクトと比較した場合、全ての分析されたＦｃ変異体で有意に減少している。
ヒトＦｃγ受容体への結合が最小であるＦｃ変異体は、Ｐ３２９Ｇ Ｌ２３４Ａ Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）及びＰ３２９Ｇ ＬＡＬＡ Ｎ２９７Ｄであった。ＬＡＬＡ変異だけがｈｕＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８−Ｋ６Ｈ６への結合を抑制するのに十分ではなかった。ＬＡＬＡ変異だけを有するＦｃ変異体はヒトＦｃγＲＩＩＩａに対して２．１００ｎＭの残留結合親和性を有していたが、一方ｗｔＦｃはヒトＦｃγＲＩＩＩａ受容体に６００ｎＭの親和性で結合した（表３）。両方のＫＤ値は、単一濃度を使用して、１：１結合モデルによって誘導した。
ヒトＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８及びマウスＦｃγＲＩＶへの親和性は、ｗｔＦｃについてのみ分析することができた。ＫＤ値を表３に列挙する。マウスＦｃγＲＩＶへの結合は、分析された全てのＦｃ変異体に対してほぼ完全に排除された。
【０２２４】
2016512421.tif 000008
【０２２５】
腫瘍抗原とＣＤ３に対する同時結合の分析
Ｔ細胞活性化二重特異性コンストラクトの腫瘍抗原及びヒトＣＤ３εへの同時結合の分析を、標準的カップリング手順を用いて、センサーチップＳＡ上でＭＣＳＰのビオチン化Ｄ３ドメインの１６５０共鳴単位（ＲＵ）の直接カップリングによって実施した。ヒトＥＧＦＲを、標準的なアミノ酸カップリング手順を使用して固定化した。８０００ＲＵを、ｐＨ５．５でＣＭ５センサーチップ上に固定化した。アッセイの設定を図１６Ｂに示す。
異なるＴ細胞の二重特異性コンストラクトを２００ｎＭで６０秒間、捕捉させた。続いて、ヒトＣＤ３γ（Ｇ４Ｓ）５ＣＤ３ε−ＡｃＴｅｖ−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／Ｆｃ（ホール）を２０００ｎＭの濃度で６０秒間４０μｌ／分の流量で通過させた。組換えＣＤ３εが、捕捉Ｔ細胞二重特異性コンストラクトなしにＭＣＳＰ又はＥＧＦＲの固定化Ｄ３ドメインを持つ表面上に流された参照フローセル上で得られる応答を減算することにより、バルクの屈折率の差を補正した。
【０２２６】
結果
腫瘍抗原及びヒトＣＤ３εの両方への同時結合を、表面プラズモン共鳴によって分析した（図１７、図１８）。全てのコンストラクトは、腫瘍抗原及びＣＤ３に同時に結合することができた。大部分のコンストラクトにおいて、ヒトＣＤ３εの注入後の結合レベル（ＲＵ）は、コンストラクトだけを注射した後に達成された結合レベルよりも高く、腫瘍抗原及びヒトＣＤ３εの両方がコンストラクトに結合したことを反映している。
【０２２７】
実施例３
細胞上の各標的抗原への二重特異性コンストラクトの結合
異なる二重特異性コンストラクトの、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−１５２）上のＣＤ３、及び標的細胞上のそれぞれの腫瘍抗原への結合を、ＦＡＣＳにより決定した。簡単に述べると、細胞を回収し、計数し、生存率を調べた。ウェル（０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中；９０μｌ）当たり０．１５−０．２百万細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、示された濃度の二重特異性コンストラクト及び対応するＩｇＧコントロール（１０μｌ）と共に４℃で３０分間インキュベートした。より良い比較のために、全てのコンストラクト及びＩｇＧコントロールを同じモル濃度に標準化した。インキュベーション後、細胞を遠心分離し（５分間、３５０×ｇ）、０．１％ＢＳＡを含む１５０μｌのＰＢＳで洗浄し、再懸濁させ、１２μＬ／ウェルのＦＩＴＣ又はＰＥ結合二次抗体と共に４℃で更に３０分間インキュベートした。結合したコンストラクトを、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（Software FACS Diva）を使用して検出した。「（ｓｃＦｖ）２」分子を、ＦＩＴＣ結合抗Ｈｉｓ抗体を使用して検出した（Lucerna, #RHIS-45F-Z）。他の全ての分子について、ＦＴＩＣ又はＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２Ｆｒａｇｍｅｎｔヤギ抗ヒトＩｇＧ ＦｃγＦｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（それぞれ、Jackson Immuno Research Lab #109-096-098／作業溶液１：２０、又は#109-116-170／作業溶液１：８０）を使用した。細胞を、０．１％のＢＳＡを含む１２０μｌ／ウェルのＰＢＳの添加と、５分間の３５０×ｇでの遠心分離により洗浄した。第二の洗浄工程を、０．１％のＢＳＡを含む１５０μｌ／ウェルのＰＢＳで実施した。特に断らない限り、細胞を、暗所で４℃で１５分間、１００μｌ／ウェルの固定緩衝液（BD #554655）を用いて固定し、４００×ｇで６分間遠心分離し、サンプルをＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩで測定するまで、０．１％ＢＳＡを含む２００μｌ／ウェルのＰＢＳ中に維持した。ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算した。
【０２２８】
第一の実験では、ヒトＭＣＳＰ及びヒトＣＤ３を標的とする異なる二重特異性コンストラクトを、Ｊｕｒｋａｔ、ヒトＴ細胞白血病細胞に発現したヒトＣＤ３へ、又はＣｏｌｏ３８ヒトメラノーマ細胞上のヒトＭＣＳＰへの結合についてフローサイトメトリーにより分析した。
結果は、二重特異性分子、コントロールＩｇＧ、二次抗体のみと共にインキュベートした、又は未処理のままの細胞の平均蛍光強度を示す図１９−２１に示す。
図１９に示されるように、「（ｓｃＦｖ）２」分子の両方の抗原結合部分、すなわち、ＣＤ３（図１９１Ａ）及びＭＣＳＰ（図１９Ｂ）において、明確な結合シグナルがコントロールサンプルと比較して観察される。
「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」分子（配列番号５、１７、１９）はＣｏｌｏ−３８細胞上のｈｕＭＳＣＰへ良好な結合を示している（図２０Ａ）。ＣＤ３部分は、参照の抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧをより僅かに良好にＣＤ３に結合する（図２０Ｂ）。
図２１Ａに示されるように、２つの「１＋１」コンストラクトは、細胞上のヒトＣＤ３に匹敵する結合シグナルを示す。参照抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧは若干弱いシグナルを与える。加えて、試験された両方のコンストラクト（「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム型」（配列番号１、３、５）及び「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム反転型」（配列番号７、９、１１））は細胞上のヒトＭＣＳＰに匹敵する結合を示している（図２１Ｂ）。参照抗ヒトＭＣＳＰ ＩｇＧで得られた結合シグナルは僅かに弱い。
【０２２９】
別の実験では、精製された「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」二重特異性コンストラクト（配列番号５、１７、１９）と対応する抗ヒトＭＣＳＰ ＩｇＧを、二重特異性コンストラクトがその「アーム」の一つ又は両方を介してＭＣＳＰへ結合するのかどうかを決定するために、Ｃｏｌｏ−３８ヒトメラノーマ細胞上のヒトＭＣＳＰへの用量依存性結合についてフローサイトメトリーによって分析した。図２２に示されるように、「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクトはＭＣＳＰ ＩｇＧと同じ結合パターンを示している。
【０２３０】
更に別の実験では、Ｊｕｒｋａｔ細胞により発現されるヒトＣＤ３に対して、又はＬＳ−１７４Ｔ細胞により発現されるヒトＣＥＡに対して、Ｃｒｏｓｓｆａｂ断片において、ＶＬ／ＶＨ（配列番号３３、６３、６５、６７を参照）又はＣＬ／ＣＨ１交換（配列番号６６、６７、１８３、１９７を参照）の何れかを有するＣＤ３／ＣＥＡ「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、反転型」二重特異性コンストラクトの結合を評価した。コントロールとして、同等の最大濃度の対応するＩｇＧと標識２次抗体（ヤギ抗ヒトＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ特異的，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ ＃１０９−０９６−０９８）に起因するバックグラウンド染色も同様に評価した。図５５に示されるように、両方のコンストラクトは、細胞上のヒトＣＥＡ並びにヒトＣＤ３に良好な結合を示している。計算されたＥＣ５０値は、「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、反転型（ＶＬ／ＶＨ）」コンストラクト及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、反転型（ＣＬ／ＣＨ１）」コンストラクトについてそれぞれ４．６及び３．９ｎＭ（ＣＤ３）、及び９．３及び６．７ｎＭ（ＣＥＡ）であった。
【０２３１】
別の実験では、Ｊｕｒｋａｔ細胞により発現されるヒトＣＤ３に対しての、又はＷＭ２６６−４細胞により発現されるヒトＭＣＳＰに対しての、ＣＤ３／ＭＣＳＰ「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３を参照）コンストラクト及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，反転型」（配列番号５、２３、１８３、１８７を参照）コンストラクトの結合を評価した。図５６は、細胞上のＭＣＳＰへの両方のコンストラクトの結合は比較的良かったが、ＣＤ３に対しての「反転型」コンストラクトの結合は、他のコンストラクトに比べて減少したことを示している。計算されたＥＣ５０値は、「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、反転型」コンストラクト及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」コンストラクトについてそれぞれ６．１及び１．６６ｎＭ（ＣＤ３）、及び０．５７及び０．９５ｎＭ（ＭＣＳＰ）であった。
【０２３２】
更なる実験では、Ｊｕｒｋａｔ細胞により発現されるヒトＣＤ３に対して、及びＬＳ−１７４Ｔ細胞により発現されるヒトＣＥＡに対して、「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ軽鎖（ＬＣ）融合」コンストラクト（配列番号１８３、２０９、２１１、２１３）の結合を評価した。コントロールとして、同等の最大濃度の対応する抗ＣＤ３及び抗ＣＥＡ ＩｇＧと標識２次抗体（ヤギ抗ヒトＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ特異的，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ ＃１０９−０９６−０９８）に起因するバックグラウンド染色も同様に評価した。図５７に示されるように、ＣＥＡに対する「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ ＬＣ融合体」の結合は大きく減少しているように見えるが、ＣＤ３への結合は参照のＩｇＧに少なくとも匹敵した。
【０２３３】
最後の実験では、Ｊｕｒｋａｔ細胞により発現されるヒトＣＤ３に対して、又はＷＭ２６６−４腫瘍細胞により発現されるヒトＭＣＳＰに対して、「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号５、２３、２１５、２１７を参照）コンストラクト及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，反転型」（配列番号５、２３、２１５、２１９を参照）コンストラクトの結合を決定した。図５８に示されるように、ヒトＣＤ３への結合は、他のコンストラクトと比較して「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、反転型」では減少したが、ヒトＭＣＳＰへの結合は同等に良好であった。計算されたＥＣ５０値は、「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」コンストラクト及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、反転型」コンストラクトについてそれぞれ１０．３及び３２．０ｎＭ（ＣＤ３）、及び３．１及び３．４ｎＭ（ＭＣＳＰ）であった。
【０２３４】
実施例４
二重特異性コンストラクトの結合時の初代ヒトＴ細胞上の表面活性化マーカーのＦＡＣＳ分析
精製ｈｕＭＣＳＰ−ｈｕＣＤ３標的化二重特異性「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」（配列番号５、１７、１９）及び「（ｓｃＦｖ）２」分子を、ヒトＭＣＳＰ発現腫瘍細胞の存在下でＣＤ８＋Ｔ細胞上の初期表面活性化マーカーＣＤ６９又は後期活性化マーカーＣＤ２５を上方制御するその潜在能力についてフローサイトメトリーによって試験した。
簡単に述べると、ＭＣＳＰ陽性Ｃｏｌｏ−３８細胞を細胞解離緩衝液で回収し、計数し、生存率についてチェックした。細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中で１ｍｌ当たり０．３×１０６（生存）細胞へ調整し、１ウェル当たり１００μｌの細胞懸濁液を、（示されるように）丸底９６ウェルプレートにピペットで入れた。５０μｌの（希釈した）二重特異性コンストラクトを、細胞を含むウェルに加えて、最終濃度１ｎＭを得た。ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞を健常ドナーの新鮮血から単離し、ＡＩＭ−Ｖ培地中で１ｍｌ当たり６×１０６（生存）細胞へと調整した。この細胞懸濁液５０μｌをアッセイプレート（上記参照）の各ウェルに添加し、１０：１の最終Ｅ：Ｔ比を得た。二重特異性コンストラクトが腫瘍抗原ｈｕＭＣＳＰを発現する標的細胞の存在下で排他的にＴ細胞を活性化できるかどうかを分析するために、１ｎＭのそれぞれの二重特異性分子、並びに標的細胞は無いがＰＢＭＣを含んでいるウェルを含めた。
３７℃、５％ＣＯ２で１５時間（ＣＤ６９）又は２４時間（ＣＤ２５）インキュベートした後、細胞を遠心分離し（５分間、３５０×ｇ）、０．１％ＢＳＡを含む１５０μＬ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄した。ＣＤ８（マウスＩｇＧ１、κ、クローンＨＩＴ８ａ；ＢＤ ＃５５５６３５）、ＣＤ６９（マウスＩｇＧ１、クローンＬ７８；ＢＤ ＃３４０５６０）及びＣＤ２５（マウスＩｇＧ１、κ、クローンＭ−Ａ２５１、ＢＤ＃５５５４３４）のための表面染色を、供給者の提案に従って、３０分間、４℃で実施した。細胞を、０．１％ＢＳＡを含む１５０μｌ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの固定緩衝液（BD #554655）を使用して、４℃で１５分間固定した。遠心分離後、サンプルを、０．１％ＢＳＡを含む２００μｌ／ウェルのＰＢＳに再懸濁させ、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ装置（Software FACS Diva）を使用して分析した。
【０２３５】
図２３は、ＣＤ８＋Ｔ細胞上での初期活性化マーカーＣＤ６９（Ａ）又は後期活性化マーカーＣＤ２５（Ｂ）の、それぞれ１５時間又は２４時間のインキュベーション後の発現レベルを示す。両方のコンストラクトが、標的細胞の存在下で排他的に両方の活性化マーカーの上方制御を誘導する。「（ｓｃＦｖ）２」分子は、このアッセイでは、「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクトよりも僅かにより活性であるようである。
精製ｈｕＭＣＳＰ−ｈｕＣＤ３標的化二重特異性「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」及び「（ｓｃＦｖ）２」分子を、ヒトＭＣＳＰ発現腫瘍細胞の存在下で、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞上の後期活性化マーカーＣＤ２５を上方制御するその潜在能力についてフローサイトメトリーによって更に試験した。実験手順は、上述の通りであり、５：１のＥ：Ｔ比のヒトｐａｎＴエフェクター細胞と５日間のインキュベーション時間を使用した。
図２４は、両方のコンストラクトが、ＣＤ８＋（Ａ）並びにＣＤ４＋（Ｂ）Ｔ細胞の双方の標的細胞の存在下で排他的にＣＤ２５の上方制御を誘導することを示している。「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクトは、「（ｓｃＦｖ）２」分子と比較して、このアッセイでは、ＣＤ２５の上方制御をあまり誘導しないようである。一般に、ＣＤ２５の上方制御はＣＤ４＋Ｔ細胞上よりもＣＤ８＋上でより顕著である。
【０２３６】
別の実験では、カニクイザルＣＤ３及びヒトＭＣＳＰを標的とする精製「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、３５、３７）を、腫瘍標的細胞の存在下でＣＤ８＋Ｔ細胞の表面活性化マーカーＣＤ２５を上方制御するその潜在能力について分析した。簡単に述べると、ヒトＭＣＳＰを発現するＭＶ−３腫瘍標的細胞を、細胞解離緩衝液で回収し、洗浄し、２％ＦＣＳ及び１％ＧｌｕｔａＭａｘを含むＤＭＥＭに再懸濁した。１ウェル当たり３００００細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、各抗体希釈物を指示された濃度で添加した（図２５）。二重特異性コンストラクトと異なるＩｇＧコントロールを同じモル濃度に調整した。２匹の健常動物の血液から単離したカニクイザルＰＢＭＣエフェクター細胞を、３：１の最終Ｅ：Ｔ比を得るために添加した。３７℃、５％ＣＯ２で４３時間インキュベートした後、細胞を５分間、３５０×ｇで遠心分離し、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２回洗浄した。ＣＤ８（Miltenyi Biotech #130-080-601）及びＣＤ２５（BD #557138）の表面染色を、供給者の提案に従って実施した。細胞を、０．１％ＢＳＡを含む１５０μｌ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの固定緩衝液（BD #554655）を使用して、４℃で１５分間固定した。遠心分離後、サンプルを０．１％ＢＳＡを含む２００μｌ／ウェルのＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ装置（Software FACS Diva）を使用して分析した。
図２５に示されるように、二重特異性コンストラクトは、標的細胞の存在下でのみＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５の濃度依存性の上方制御を誘導する。抗カニクイザルＣＤ３ ＩｇＧ（クローンＦＮ−１８）はまた架橋されずにＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５の上方制御を誘導することができる（カニクイザルネストル(cyno Nestor)で得られたデータを参照）。最大濃度の二重特異性コンストラクトで（標的細胞の非存在下で）カニクイザルＴ細胞の過剰活性化はない。
【０２３７】
別の実験では、ＣＤ３−ＭＣＳＰ「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，連結軽鎖」（配列番号３、５、２９、１７９）を、腫瘍標的細胞の存在下でＣＤ８＋Ｔ細胞上の初期活性化マーカーＣＤ６９又は後期活性化マーカーＣＤ２５を上方制御するその潜在能力についてＣＤ３−ＭＣＳＰ「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３）と比較した。（上記のようにして単離された）初代ヒトＰＢＭＣを、ＭＣＳＰ陽性Ｃｏｌｏ３８標的細胞の存在下又は非存在下で少なくとも２２時間、示された濃度の二重特異性コンストラクトと共にインキュベートした。簡単に述べると、０．３百万の初代ヒトＰＢＭＣを、ＭＣＳＰ陽性標的細胞（又は培地）を含む平底９６ウェルプレートのウェル毎に蒔いた。標的細胞に対する最終的なエフェクター比（Ｅ：Ｔ）は１０：１であった。細胞を３７℃、５％のＣＯ２で示されたインキュベーション時間、示された濃度の二重特異性コンストラクト及びコントロールと共にインキュベートした。エフェクター細胞は、ＣＤ８、及びＣＤ６９又はＣＤ２５について染色し、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩにより分析した。
図５３は、この実験の結果を示す。（連結した軽鎖の有無にかかわらず）２つの２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子間で、ＣＤ６９（Ａ）又はＣＤ２５の上方制御（Ｂ）について有意差は検出されなかった。
【０２３８】
更に別の実験では、ＣＤ３／ＭＣＳＰ「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」コンストラクト（配列番号３、５、２９、３３を参照）及び「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号５、２９、３３、１８１を参照）コンストラクトを、腫瘍標的細胞の存在下で、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ６９又はＣＤ２５を上方制御するそれらの潜在能力について、「１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ」コンストラクト（配列番号５、２３、１８３、１８５を参照）と比較した。アッセイは、上記のように、ヒトＭＣＳＰを発現するＭＶ−３腫瘍細胞の存在下又は非存在下、２４時間のインキュベーション時間で実施した。
図５９に示されるように、「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」コンストラクトは、「１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ」分子よりもより顕著な活性化マーカーの上方調節を誘導した。
【０２３９】
最終実験では、ＣＤ３／ＭＣＳＰ「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号５、２３、２１５、２１７を参照）及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、反転型」（配列番号５、２３、２１５、２１９を参照）コンストラクトを、腫瘍標的細胞の存在下で、二匹の異なるカニクイザル由来のＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５を上方制御するそれらの潜在能力について評価した。アッセイは、上記のように、ヒトＭＣＳＰを発現するＭＶ−３腫瘍細胞の存在下又は非存在下、Ｅ：Ｔ比が３：１で４１時間のインキュベーション時間で実施した。
図６０に示されるように、両方のコンストラクトは、二つの形態間に有意差を伴わず、濃度依存的に、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞上でＣＤ２５を上方制御することができた。抗体を含まずかつ標的細胞を含まないコントロールサンプルは、標的はないが抗体を含むサンプルに匹敵するシグナルを与えた（示さず）。
【０２４０】
実施例５
ＣＤ３二重特異性コンストラクトによるヒトｐａｎＴ細胞の活性化の際のインターフェロン−γの分泌
精製「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」標的化ヒトＭＣＳＰ及びヒトＣＤ３（配列番号５、１７、１９）を、上清中へのヒトインターフェロン（ＩＦＮ）−γの放出により測定される、ヒトＭＣＳＰ陽性Ｕ−８７ＭＧ細胞の存在下でＴ細胞活性化を誘導するその潜在能力について分析した。コントロールとして、同じモル濃度に調整した抗ヒトＭＣＳＰ及び抗ヒトＣＤ３ ＩｇＧを使用した。簡単に述べると、ｈｕＭＣＳＰ発現Ｕ−８７ＭＧ神経膠芽腫、星状細胞腫の標的細胞（ECACC89081402）を、細胞解離緩衝液で回収し、洗浄し、ＡＩＭ−Ｖ培地（Invitrogen #12055-091）中に再懸濁させた。１ウェル当たり２００００細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、各抗体希釈物を加えて、最終濃度１ｎＭを得た。バフィーコートから単離されたヒトｐａｎＴエフェクター細胞を、最終Ｅ：Ｔ比が５：１となるように添加した。３７℃、５％ＣＯ２で１８．５時間の一晩のインキュベーション後、アッセイプレートを３５０×ｇで５分間遠心分離し、上清を新しい９６ウェルプレートに移した。上清中のヒトＩＦＮ−γのレベルを、製造者の説明書（Becton DickinsonからのＢＤ ＯｐｔＥＩＡヒトＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキットＩＩ、#550612）に従いＥＬＩＳＡにより測定した。
図２６に示されるように、参照ＩｇＧは、ＩＦＮ−γ分泌の誘導が弱いか全く示さないが、「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクトは、ＩＦＮ−γを分泌するようにヒトＴ細胞を活性化することができる。
【０２４１】
実施例６
Ｔ細胞上のＣＤ３及び腫瘍細胞上のＭＣＳＰ又はＥＧＦＲを標的とした架橋二重特異性コンストラクトによって媒介される再指向されたＴ細胞の細胞傷害性（ＬＤＨ放出アッセイ）
最初の一連の実験において、抗原結合部分の細胞上のそれぞれの標的抗原への結合を介したコンストラクトの架橋時に、腫瘍標的細胞におけるＴ細胞媒介性アポトーシスを誘導するその潜在能力について、ＣＤ３及びＭＣＳＰを標的とする二重特異性コンストラクトを分析した（図２７−３８）。
【０２４２】
一実験では、ヒトＣＤ３及びヒトＭＣＳＰを標的とする精製「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」（配列番号５、２１、２３）及び「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３）コンストラクトと、対応する「（ｓｃＦｖ）２」分子を比較した。簡単に述べると、ｈｕＭＣＳＰを発現するＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒトメラノーマ標的細胞を、細胞解離緩衝液で回収し、洗浄し、ＡＩＭ−Ｖ培地（Invitrogen #12055-091）中に再懸濁させた。１ウェル当たり３００００細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、コンストラクトの各々の希釈物を示された濃度で添加した。全てのコンストラクトとそれに対応するコントロールＩｇＧを、同じモル濃度に調整した。ヒトｐａｎＴエフェクター細胞を、最終Ｅ：Ｔ比が５：１となるように添加した。ヒトｐａｎＴ細胞の活性化の陽性コントロールとして、１μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｍ（Sigma #L8902、インゲンマメから単離されたイソレクチンの混合物）を用いた。正規化のために、標的細胞の最大溶解（＝１００％）を、１％トリトンＸ−１００の最終濃度の標的細胞のインキュベーションによって決定した。最小限の溶解（＝０％）は、如何なるコンストラクトも抗体も含めないでエフェクター細胞と共に同時インキュベートされた標的細胞を指す。３７℃、５％ＣＯ２で２０時間の一晩のインキュベーション後、製造者の指示に従ってＬＤＨ検出キット（Roche Applied Science, #11644793001）により、アポトーシス／壊死性標的細胞の上清へのＬＤＨ放出を測定した。
図２７に示されるように、両方の「２＋１」コンストラクトは、「（ｓｃＦｖ）２」分子に匹敵し、標的細胞のアポトーシスを誘導する。
【０２４３】
更に、精製された「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３）及び「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクト（それらはＦｃドメインが異なる）、並びに「（ｓｃＦｖ）２」分子を比較した。Ｆｃドメイン内の異なる変異（示されるように、Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）、Ｐ３２９Ｇ及び／又はＮ２９７Ｄ）は、野生型（ｗｔ）Ｆｃドメインを含むコンストラクトにより誘導される（ＮＫ）エフェクター細胞機能を低減又は消失させる。実験手順は上記の通りであった。
図２８は、全てのコンストラクトが、「（ｓｃＦｖ）２」分子に匹敵し、標的細胞のアポトーシスを誘導することを示す。
図２９は、腫瘍標的細胞においてＴ細胞誘導アポトーシスを誘導するその潜在能力について、精製「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」（配列番号５、１７、１９）及び「（ｓｃＦｖ）２」分子の比較の結果を示す。実験手順は上述の通りであり、ｈｕＭＣＳＰ発現Ｃｏｌｏ−３８ヒトメラノーマ標的細胞をＥ：Ｔの比率が５：１で使用し、１８．５時間の一晩のインキュベーションを用いた。図に示されるように、「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクトは「（ｓｃＦｖ）２」分子に匹敵する細胞傷害活性を示す。
【０２４４】
同様に、図３０は、ｈｕＭＣＳＰを発現するＣｏｌｏ−３８ヒトメラノーマ標的細胞をＥ：Ｔ比を５：１で用い、及び１８時間のインキュベーション時間を用いた、精製された「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクト（配列番号５、１７、１９）及び「（ｓｃＦｖ）２」分子の比較の結果を示す。図に示されるように、「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクトは「（ｓｃＦｖ）２」分子に匹敵する細胞傷害活性を示している。
図３１は、ｈｕＭＣＳＰを発現するＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒトメラノーマ標的細胞をＥ：Ｔ比を５：１で用い、２３．５時間の一晩のインキュベーションを用いた、精製「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクト（配列番号５、１７、１９）及び「（ｓｃＦｖ）２」分子の比較の結果を示す。図に示されるように、該コンストラクトは「（ｓｃＦｖ）２」分子に匹敵し、標的細胞におけるアポトーシスを誘導する。「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクトは最高濃度で減少した効果を示している。
【０２４５】
更に、ヒトＣＤ３及びヒトＭＣＳＰの両方の標的に対して一価である異なる二重特異性コンストラクト、並びに対応する「（ｓｃＦｖ）２」分子を、Ｔ細胞媒介性アポトーシスを誘導するそれらの潜在能力について分析した。図３２は、ｈｕＭＣＳＰを発現するＣｏｌｏ−３８ヒトメラノーマ標的細胞を５：１のＥ：Ｔ比で用い、１９時間のインキュベーション時間を用いた、「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム型」（配列番号１、３、５）及び「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム反転型」（配列番号７、９、１１）コンストラクトの結果を示す。図に示されるように、このアッセイでは、両方の「１＋１」コンストラクトは「（ｓｃＦｖ）２」分子よりも活性が弱いが、「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム型」分子は「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム反転型」分子よりも優れている。
図３３は、ｈｕＭＣＳＰを発現するＣｏｌｏ−３８ヒトメラノーマ標的細胞を５：１のＥ：Ｔ比で用い、２０時間のインキュベーション時間を用いた、「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクト（配列番号５、２１、２１３）の結果を示す。図に示されるように、「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクトは「（ｓｃＦｖ）２」分子よりも細胞傷害活性が弱い。
【０２４６】
更なる実験では、精製「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３）、「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号５、２９、３１、３３）及び「（ｓｃＦｖ）２」分子を、細胞上の両方の標的抗原ＣＤ３及びＭＣＳＰの結合を介したコンストラクトの架橋の際、腫瘍標的細胞のＴ細胞誘導アポトーシスを誘導するそれらの潜在能力について分析した。ｈｕＭＣＳＰを発現するＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒトメラノーマ標的細胞を標的細胞として用い、Ｅ：Ｔ比は５：１で、インキュベーション時間は２０時間であった。結果を図３４に示す。「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」コンストラクトは、「（ｓｃＦｖ）２」分子に匹敵し、標的細胞のアポトーシスを誘導する。一価と二価の「ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」形態の比較では、二価のものがより強力であることを明らかに示している。
【０２４７】
更に別の実験では、精製「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３）コンストラクトを、異なる（腫瘍）標的細胞のＴ細胞誘導アポトーシスを誘導するその潜在能力について分析した。簡単に述べると、ＭＣＳＰ陽性Ｃｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞、間葉系幹細胞（骨髄由来、Lonza #PT-2501又は脂肪組織、Invitrogen #R7788-115）又は周皮細胞（胎盤由来；PromoCell #C-12980）を、示されているように、細胞解離バッファーで回収し、洗浄し、ＡＩＭ−Ｖ培地（Invitrogen #12055-091）に再懸濁させた。１ウェル当たり３００００細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、各抗体希釈物を示された濃度で添加した。健常ドナーの新鮮血から単離したヒトＰＢＭＣエフェクター細胞は、２５：１の最終Ｅ：Ｔ比を得るように添加した。３７℃、５％ＣＯ２で４時間のインキュベーション後、製造者の指示に従ってＬＤＨ検出キット（Roche Applied Science, #11644793001）により、アポトーシス／壊死性標的細胞の上清へのＬＤＨ放出を測定した。
図３５に示されるように、有意なＴ細胞媒介性細胞傷害はＣｏｌｏ−３８細胞のみで観察された。この結果は、有意なレベルのＭＣＳＰを発現するＣｏｌｏ−３８細胞と一致しているが、間葉系幹細胞及び周皮細胞は非常に弱くＭＣＳＰを発現する。
【０２４８】
精製された「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」（配列番号５、１７、１９）コンストラクト及び「（ｓｃＦｖ）２」分子をまたそのＦｃドメインのフコシル化Ｎグリカンの割合が低下している糖鎖操作型抗ヒトＭＣＳＰ ＩｇＧ抗体（ＭＣＳＰ ＧｌｙｃｏＭａｂ）とも比較した。この実験では、ｈｕＭＣＳＰを発現するＣｏｌｏ−３８ヒトメラノーマ標的細胞及びヒトＰＢＭＣエフェクター細胞を、Ｅ：Ｔ比を２５：１で固定して（図３６Ａ）、又は２０：１から１：１０の異なるＥ：Ｔ比での何れかで使用した（図３６Ｂ）。異なる分子を、図３６Ａに示された濃度で、又は１６６７ｐＭの固定濃度で使用した（図３６Ｂ）。読み出しは、２１時間のインキュベーション後に行った。図３６Ａ及びＢに示されるように、両方の二重特異性コンストラクトは、ＭＳＣＰ ＧｌｙｃｏＭａｂよりも高い効力を示している。
【０２４９】
別の実験では、精製「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」標的化カニクイザルＣＤ３及びヒトＭＣＳＰ（配列番号３、５、３５、３７）を分析した。簡単に述べると、ヒトＭＣＳＰを発現するＭＶ−３腫瘍標的細胞を、細胞解離緩衝液で回収し、洗浄し、２％ＦＣＳ及び１％ＧｌｕｔａＭａｘを含むＤＭＥＭに再懸濁させた。１ウェル当たり３００００細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、コンストラクト又は参照ＩｇＧの各々の希釈物を示された濃度で添加した。二重特異性コンストラクト及び異なるＩｇＧコントロールを同じモル濃度に調整した。健常なカニクイザルの血液から単離したカニクイザルＰＢＭＣエフェクター細胞を、最終Ｅ：Ｔ比が３：１となるように添加した。３７℃、５％ＣＯ２で２４時間又は４３時間のインキュベーション後、製造者の指示に従ってＬＤＨ検出キット（Roche Applied Science,＃１１６４４７９３００１）により、アポトーシス／壊死性標的細胞の上清へのＬＤＨ放出を測定した。
図３７に示されるように、二重特異性コンストラクトは、標的細胞から濃度依存的なＬＤＨの放出を誘導する。効果は２４時間後より４３時間後に強い。抗ｃｙｎｏＣＤ３のＩｇＧ（クローンＦＮ−１８）もまた、架橋されることなく、標的細胞のＬＤＨ放出を誘導することができる。
図３８は、標的細胞としてＭＣＳＰを発現するヒトメラノーマ標的細胞を、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを、Ｅ：Ｔ比を１０：１で用い、２６時間のインキュベーション時間を用いた、精製「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」コンストラクト（配列番号３、５、２９、３３）及び「（ｓｃＦｖ）２」コンストラクトの比較の結果を示す。図に示されるように、「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」コンストラクトは「（ｓｃＦｖ）２」分子よりもＥＣ５０の観点でより強力である。
【０２５０】
第２の一連の実験では、抗原結合部分の細胞上のそれぞれの標的抗原への結合を介したコンストラクトの架橋時に、腫瘍標的細胞においてＴ細胞媒介性アポトーシスを誘導するその潜在能力について、ＣＤ３及びＥＧＦＲを標的とする二重特異性コンストラクトを分析した（図３９−４１）。
一実験では、ヒトＣＤ４７及びヒトＭＣＳＰを標的とする精製「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」（配列番号４５、４７、５３）及び「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」（配列番号４７、５３、２１３）コンストラクトと、対応する「（ｓｃＦｖ）２」分子を比較した。簡単に述べると、ヒトＥＧＦＲを発現するＬＳ−１７４Ｔ腫瘍標的細胞を、トリプシンで回収し、洗浄し、ＡＩＭ−Ｖ培地（Invitrogen #12055-091）中に再懸濁した。１ウェル当たり３００００細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、各抗体希釈物を示された濃度で添加した。全てのコンストラクトとコントロールを同じモル濃度に調整した。ヒトｐａｎＴエフェクター細胞を、最終Ｅ：Ｔ比が５：１となるように添加した。ヒトｐａｎＴ細胞の活性化の陽性コントロールとして、１μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｍ（Sigma #L8902）を使用した。正規化のために、標的細胞の最大溶解（＝１００％）を、最終濃度１％のトリトンＸ−１００と共に標的細胞をインキュベートすることによって決定した。最小溶解（＝０％）は、如何なるコンストラクトも抗体も含めないでエフェクター細胞と共に同時インキュベートした標的細胞を指す。３７℃、５％ＣＯ２で１８時間の一晩のインキュベーション後、製造者の指示に従ってＬＤＨ検出キット（Roche Applied Science,＃１１６４４７９３００１）により、アポトーシス／壊死性標的細胞の上清へのＬＤＨ放出を測定した。
図３９に示されるように、「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクトは、「（ｓｃＦｖ）２」分子に匹敵する細胞毒性活性を示すが、「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクトは活性が弱い。
【０２５１】
別の実験では、精製「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム型」（配列番号４３、４５、４７）、「「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム反転型」（配列番号１１、４９、５１）、「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」（配列番号４７、５３、２１３）及び「（ｓｃＦｖ）２」分子を比較した。実験条件は、インキュベーション時間が２１時間であることを除いて、上述の通りであった。
図４０に示されるように、このアッセイにおいて「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクトは、「（ｓｃＦｖ）２」分子よりも僅かに低い細胞傷害活性を示している。両方の「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，一アーム型（反転型）」コンストラクトは「（ｓｃＦｖ）２」分子よりも明らかに活性が低い。
【０２５２】
更なる実験では、精製「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム型」（配列番号４３、４５、４７）、及び「「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ、一アーム反転型」（配列番号１１、４９、５１）コンストラクト及び「（ｓｃＦｖ）２」分子を比較した。この実験のインキュベーション時間は１６時間で、その結果は図４１に示される。ヒトｐａｎＴ細胞と共にインキュベートすると、両方の「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，一アーム型（反転型）」コンストラクトは「（ｓｃＦｖ）２」分子よりも活性が弱いが、標的細胞から濃度依存的なＬＤＨの放出を示す（図４１Ａ）。ＬＳ−１７４Ｔ腫瘍細胞のＰＢＭＣから単離されたナイーブＴ細胞との共培養の際、コンストラクトは基本活性のみ有しており、そのうちで最も活性なものは「（ｓｃＦｖ）２」分子であった（図４１Ｂ）。
【０２５３】
更なる実験では、ＣＤ３及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする精製「「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，一アーム反転型」（配列番号１１、５１、５５）、「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」（５７、６１、２１３）及び「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」（５７、５９、６１）と対応する「（ｓｃＦｖ）２」分子を、細胞上のそれぞれの標的抗原への両方の標的化部分の結合を介したコンストラクトの架橋の際、ヒトＦＡＰ発現性線維芽細胞ＧＭ０５３８９細胞中でＴ細胞媒介性アポトーシスを誘導するその潜在能力について分析した。簡単に述べると、ヒトＧＭ０５３８９標的細胞を前の日にトリプシンにより回収し、洗浄し、ＡＩＭ−Ｖ培地（Invitrogen #12055-091）中に再懸濁した。１ウェル当たり３００００細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、細胞が回復して付着することを可能になるように、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、細胞を遠心分離し、上清を廃棄し、新鮮培地、並びにコンストラクト又は参照ＩｇＧのそれぞれの希釈物を示された濃度で添加した。全てのコンストラクトとコントロールを同じモル濃度に調整した。ヒトｐａｎＴエフェクター細胞を、最終Ｅ：Ｔ比が５：１となるように添加した。ヒトｐａｎＴ細胞の活性化の陽性コントロールとして、５μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｍ（Sigma #L8902）を使用した。正規化のために、標的細胞の最大溶解（＝１００％）を、最終濃度１％のトリトンＸ−１００と共に標的細胞をインキュベートすることによって決定した。最小溶解（＝０％）は、如何なるコンストラクトも抗体も含めないでエフェクター細胞と共に同時インキュベートした標的細胞を指す。３７℃、５％ＣＯ２で１８時間の更なる一晩のインキュベーション後、製造者の指示に従ってＬＤＨ検出キット（Roche Applied Science, #11644793001）により、アポトーシス／壊死性標的細胞の上清へのＬＤＨ放出を測定した。
図４２に示されるように、「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクトは、ＥＣ５０値の点から「（ｓｃＦｖ）２」分子に匹敵する細胞傷害活性を示している。このアッセイにおいて、「１＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ，一アーム反転型」コンストラクトは他のコンストラクトよりも活性が低い。
【０２５４】
別の組の実験では、ＣＤ３／ＭＣＳＰ「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、連結軽鎖」（配列番号３、５、２９、１７９）をＣＤ３／ＭＣＳＰ「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３を参照）と比較した。簡単に述べると、標的細胞（ヒトＣｏｌｏ−３８、ヒトＭＶ−３又はＷＭ２６６−４メラノーマ細胞）を、アッセイの日に細胞解離緩衝液で（又はアッセイが開始された１日前にトリプシンで）回収し、洗浄し、適切な細胞培養培地（２％ＦＣＳ及び１％ＧｌｕｔａＭａｘを含むＲＰＭＩ１６４０）中に再懸濁した。１ウェル当たり２００００−３００００細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、各抗体希釈物を示されたように（三通り）添加した。エフェクター細胞としてのＰＢＭＣを、最終エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比が１０：１となるように添加した。全てのコンストラクトとコントロールを同じモル濃度に調整し、インキュベーション時間は２２時間であった。ＬＤＨ放出の検出と正規化は上述のように行った。
図４９から５２は、ＭＶ−３メラノーマ細胞（図４９）、Ｃｏｌｏ−３８細胞（図５０及び５１）又はＷＭ２６６−４細胞（図５２）で実施された４つのアッセイの結果を示す。図４９に示されるように、連結軽鎖を有するコンストラクトは、標的細胞としてＭＶ−３細胞を用いたアッセイにおいて連結軽鎖のないものに比較して弱かった。図５０及び５１に示されるように、連結軽鎖を有するコンストラクトは、標的細胞として高ＭＣＳＰ発現性Ｃｏｌｏ−３８細胞を用いたアッセイにおいて連結軽鎖の無いものに比較して強かった。最後に、図５２に示されるように、高ＭＣＳＰ発現ＷＭ２６６−４細胞を標的細胞として使用したとき２つのコンストラクト間に有意な差はなかった。
【０２５５】
別の実験では、Ｃｒｏｓｓｆａｂ断片においてＶ領域（ＶＬ／ＶＨ、配列番号３３、６３、６５、６７を参照）又はＣ領域（ＣＬ／ＣＨ１、配列番号６５、６７、１８３、１９７を参照）の何れかが交換された、２つのＣＥＡ標的化「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、反転型」コンストラクトを比較した。エフェクター細胞としてのヒトＰＢＭＣと、ヒトＣＥＡを発現する標的細胞を用いて上記のようにアッセイを実施した。標的細胞（ＭＫＮ−４５又はＬＳ−１７４Ｔ腫瘍細胞）を、トリプシン−ＥＤＴＡ（LuBiosciences #25300-096）で回収し、洗浄し、１％のＧｌｕｔａＭａｘ（LuBiosciences #35050087）及び２％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Invitrogen #42404042）中に再懸濁させた。１ウェル当たり３００００細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、二重特異性コンストラクトを示された濃度で添加した。全てのコンストラクトとコントロールを同じモル濃度に調整した。ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞を、１０：１の最終Ｅ：Ｔ比を得るように添加し、インキュベーション時間は２８時間であった。ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアを使用して計算した。
図６１に示されるように、ＣＬ／ＣＨ１交換を有するコンストラクトは、ＶＬ／ＶＨ交換を有するコンストラクトよりも、両方の標的細胞株に対して僅かに良好な活性を示す。ＥＣ５０計算値は、それぞれＣＬ／ＣＨ１−交換コンストラクト及びＶＬ／ＶＨ交換コンストラクトについて、それぞれＭＫＮ−４５細胞上で１１５及び２４３ｐＭ、ＬＳ−１７４Ｔ細胞で６７３及び９５５ｐＭであった。
【０２５６】
同様に、Ｃｒｏｓｓｆａｂ断片においてＶ領域（ＶＬ／ＶＨ、配列番号３３、１８９、１９１、１９３を参照）又はＣ領域（ＣＬ／ＣＨ１、配列番号１８３、１８９、１９３、１９５を参照）の何れかが交換された、２つのＭＣＳＰ標的化「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ、反転型」コンストラクトを比較した。エフェクター細胞としてのヒトＰＢＭＣとヒトＭＣＳＰを発現する標的細胞を用いて上記のようにアッセイを実施した。標的細胞（WM266-4）を、細胞解離緩衝液（LuBiosciences #13151014）で回収し、洗浄し、１％のＧｌｕｔａＭａｘ（LuBiosciences #35050087）、２％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０（Invitrogen #42404042）中に再懸濁した。１ウェル当たり３００００細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、コンストラクトを示された濃度で添加した。全てのコンストラクトとコントロールを同じモル濃度に調整した。ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞を、最終のＥ：Ｔ比が１０：１となるように添加し、インキュベーション時間は２６時間であった。ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアを使用して計算した。
図６２に示されるように、２つのコンストラクトは同等の活性を示し、ＣＬ／ＣＨ１交換を持つコンストラクトは僅かに低いＥＣ５０値を有する（ＶＬ／ＶＨ交換のコンストラクトに対する１６．８ｐＭに比べ、ＣＬ／ＣＨ１交換のコンストラクトでは１２．９ｐＭ）。
図６３は、ヒトＭＣＳＰを発現するＭＶ−３標的細胞を用いて実施した類似のアッセイの結果を示す。また、両方コンストラクトは同等の活性を示し、ＣＬ／ＣＨ１交換を持つコンストラクトは僅かに低いＥＣ５０値を有する（ＶＬ／ＶＨ交換のコンストラクトのおよそ８２．２ｐＭに比べ、ＣＬ／ＣＨ１交換のコンストラクトはおよそ１１．７ｐＭ）。死滅曲線が化合物の高い濃度でプラトーに達しなかったため、正確なＥＣ５０値を計算することができなかった。
【０２５７】
更なる実験では、ＣＤ３／ＭＣＳＰ「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号３、５、２９、３３を参照）及び「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」（配列番号５、２９、３３、１８１を参照）コンストラクトを、ＣＤ３／ＭＣＳＰ「１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ」（配列番号５、２３、１８３、１８５を参照）と比較した。アッセイは、上記のように、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣ、ＷＭ２６６−４又はＭＶ−３標的細胞（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）を用い、２１時間のインキュベーション時間で実施した。
図６４に示されるように、このアッセイにおいて「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」コンストラクトは最も強力な分子であり、「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」及び「１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ」が続く。このランキングは、高ＭＣＳＰ発現性ＷＭ２６６−４細胞に比べ、中程度のレベルのＭＣＳＰを発現する、ＭＶ−３細胞で更にいっそう顕著である。計算されたＥＣ５０値は、「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」、「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」及び「１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ」のぞれぞれについて、ＭＶ−３では９．２、４０．９及び８８．４ｐＭ、ＷＭ２６６−４細胞では、３３．１、２８．４及び５３．９ｐＭであった。
【０２５８】
更なる実験では、異なる濃度の「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ ＬＣ融合体」コンストラクト（配列番号１８３、２０９、２１１、２１３）を、ＭＫＮ−４５又はＬＳ−１７４Ｔ腫瘍標的細胞及びヒトＰＢＭＣエフェクター細胞を１０：１のＥＴ比で用い、２８時間のインキュベーション時間で、試験した。図６５に示されるように、「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ ＬＣ融合体」コンストラクトは、ＭＫＮ−４５標的細胞において計算ＥＣ５０が２１３ｐＭでアポトーシスを誘導したが、ＬＳ−１７４Ｔ細胞では計算ＥＣ５０は１．５６ｎＭであり、これは所定時間内における二重特異性コンストラクトの効力に対する異なる腫瘍抗原発現レベルの影響を示している。
【０２５９】
更に別の実験では、「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ ＬＣ融合体」コンストラクト（配列番号１８３、２０９、２１１、２１３）を非標的化「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子と比較した。ＭＣ３８−ｈｕＣＥＡ腫瘍細胞とヒトＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）及び２４時間のインキュベーション時間を用いた。図６６に示されるように、「１＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓｆａｂＬＣ融合体」コンストラクトは標的細胞のアポトーシスを、濃度依存的に誘導し、算出ＥＣ５０値はおよそ３．２ｎＭであった。これに対して、非標的化「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」は、最高濃度においてのみ標的細胞の抗原非依存性Ｔ細胞媒介性殺傷を示した。
【０２６０】
最後の実験では、「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ（Ｖ９）」（配列番号３、５、２９、３３）、「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，反転型（Ｖ９）」（配列番号５、２３、１８３、１８７）、「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ（抗ＣＤ３）」（配列番号５、２３、２１５、２１７）、「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，反転型（抗ＣＤ３）」（配列番号５、２３、２１５、２１９）を、ヒトＭＣＳＰ陽性ＭＶ−３又はＷＭ２６６−４腫瘍細胞、及びヒトＰＢＭＣを用いて（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）、約２４時間のインキュベーション時間で比較した。図６７に示されるように、「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ，反転型」コンストラクトのＴ細胞媒介性殺傷は、両方のＣＤ３バインダーに対して「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂｔ」コンストラクトによって誘導されたものより僅かに強いか又は少なくとも等しいようである。算出ＥＣ５０値は以下の通りであった：
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【０２６１】
実施例７
ＣＤ１０７ａ／ｂアッセイ
双方ともヒトＭＣＳＰ及びヒトＣＤ３を標的とする、精製「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクト（配列番号５、１７、１９）及び「（ｓｃＦｖ）２」分子を、ヒトＭＣＳＰ発現腫瘍細胞の存在下又は非存在下でＣＤ１０７ａ及び細胞内パーフォリンレベルを上方制御するその潜在能力について、フローサイトメトリーによって試験した。
簡単に述べると、１日目に、１ウェル当たり３００００のＣｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞を、丸底９６ウェルプレートに播種し、それらを付着させるために３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。記載されたように、初代ヒトｐａｎＴ細胞を、バフィーコートから１日目又は２日目に単離した。
２日目に、１ウェル当たり１５万エフェクター細胞を、最終Ｅ：Ｔ比が５：１となるように添加した。ＦＩＴＣ結合ＣＤ１０７ａ／ｂ抗体、並びに異なる二重特異性コンストラクト及びコントロールを添加した。異なる二重特異性分子及び抗体を最終濃度９．４３ｎＭを得るように同モル濃度に調整した。３７℃、５％ＣＯ２での１時間のインキュベーション工程後に、モネンシンを、分泌を阻害するだけでなく、エンドソーム及びリソソーム内のｐＨを中和させるために添加した。５時間の追加のインキュベーション時間の後、細胞を表面ＣＤ８発現のために、３０分間、４℃で染色した。細胞を、染色緩衝液（ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ）で洗浄し、固定し、ＢＤ Ｇｏｌｇｉストップを含むＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／ Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｐｌｕｓキット（BD Biosciences #554715）を使用して２０分間透過処理した。細胞を１×ＢＤ Ｐｅｒｍ／洗浄緩衝液を用いて２回洗浄し、パーフォリンのための細胞内染色を、３０分間、４℃で実施した。１×ＢＤ Ｐｅｒｍ／洗浄緩衝液での最終洗浄工程後、細胞をＰＢＳ／０．１％ＢＳＡに再懸濁し、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩで分析した（全ての抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ又はＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した）。
【０２６２】
示されるように（図４３）、ゲートは、全てのＣＤ１０７ａ／ｂ陽性細胞、パーフォリン陽性細胞又は二重陽性細胞の何れかで設定された。「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクトはＴ細胞を活性化し、標的細胞の存在下でのみＣＤ１０７ａ／ｂ及び細胞内のパーフォリンレベルを上方制御することができたが（図４３Ａ）、「（ｓｃＦｖ）２」分子は標的細胞の存在下でもまたＴ細胞の活性化の（弱い）誘導を示している（図４３Ｂ）。二価の参照抗ＣＤ３ ＩｇＧは、「（ｓｃＦｖ）２」分子又は他の二重特異性コンストラクトと比較して低いレベルの活性化をもたらす。
【０２６３】
実施例８
増殖アッセイ
双方ともヒトＣＤ３及びヒトＭＣＳＰを標的とする、精製「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」（配列番号５、１７、１９）及び「（ｓｃＦｖ）２」分子を、ヒトＭＣＳＰ発現腫瘍細胞の存在下又は非存在下でＣＤ８＋又はＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を誘導するその潜在能力について、フローサイトメトリーによって試験した。
簡単に述べると、新たに単離したヒトｐａｎＴ細胞を温かいＰＢＳ１ｍｌ当たり１００万個の細胞に調整し、室温で１０分間、１μＭのＣＦＳＥで染色した。染色液を、１０％ＦＣＳ及び１％ＧｌｕｔａＭａｘを含むＲＰＭＩ１６４０培地を添加することによって倍増させた。更に２０分間、室温でインキュベートした後、細胞を予め温めた培地で３回洗浄し、残りのＣＦＳＥを除去した。ＭＣＳＰ陽性Ｃｏｌｏ−３８細胞を細胞解離緩衝液で回収し、計数し、生存率についてチェックした。細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中で１ｍｌ当たり０．２×１０６（生存）細胞へと調整し、１ウェル当たりこの細胞懸濁液の１００μｌを、（示されるように）丸底９６ウェルプレートにピペットで入れた。５０μｌの（希釈した）二重特異性コンストラクトを、細胞を含むウェルに加え、最終濃度１ｎＭとした。ＣＦＳＥ染色したヒトｐａｎＴエフェクター細胞を、ＡＩＭ−Ｖ培地１ｍｌ当たり２×１０６（生存）細胞へと調整した。この細胞懸濁液５０μｌをアッセイプレート（上記参照）の各ウェルに添加し、５：１の最終Ｅ：Ｔ比を得た。二重特異性コンストラクトが腫瘍抗原ｈｕＭＣＳＰを発現する標的細胞の存在下でのみＴ細胞を活性化できるかどうかを分析するために、ウェルに、１ｎＭのそれぞれの二重特異性分子、並びにＰＢＭＣを含めたが、標的細胞は含めなかった。３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートした後、細胞を遠心分離し（５分間、３５０×ｇ）、０．１％ＢＳＡを含む１５０μＬ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄した。ＣＤ８（マウスＩｇＧ１、κ；クローンＨＩＴ８ａ；BD #555635）、ＣＤ４（マウスＩｇＧ１、κ；ＲＰＡ−Ｔ４；BD #560649）又はＣＤ２５（マウスＩｇＧ１、κ；クローンＭ−Ａ２５１；BD #555434）のための表面染色を、供給業者の提案に従って、３０分間、４℃で実施した。細胞を、０．１％ＢＳＡを含む１５０μｌ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄し、０．１％ＢＳＡを含む２００μｌ／ウェルのＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ装置（Software FACS Diva）を使用して分析した。相対的増殖レベルを、非増殖細胞の周りにゲートを設定し、参照として測定された全細胞数と比較してこのゲートの細胞数を用いて決定した。
図４４は、全てのコンストラクトが、「（ｓｃＦｖ）２」分子に匹敵して、標的細胞のみの存在下でのみ、ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ａ）又はＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｂ）の増殖を誘導することを示す。一般に、このアッセイでは活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞は活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞よりも増殖する。
【０２６４】
実施例９
サイトカイン放出アッセイ
双方ともヒトＭＣＳＰ及びヒトＣＤ３を標的とする、精製「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクト（配列番号５、１７、１９）及び「（ｓｃＦｖ）２」分子を、腫瘍標的細胞の存在下又は非存在下でサイトカインのＴ細胞媒介デノボ分泌を誘導するそれらの能力について分析した。
簡単に述べると、ヒトＰＢＭＣをバフィーコートから単離し、０．３×百万個の細胞を丸底９６ウェルプレートに播いた。ヒトＭＣＳＰを発現するＣｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞を、最終的なＥＴ比が１０：１となるように添加した。二重特異性コンストラクト及びＩｇＧコントロールを１ｎＭ最終濃度で添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。翌日、細胞を３５０×ｇで５分間遠心分離し、上清をその後の分析のため新しい深型ウェル９６ウェルプレートに移した。ＣＢＡ分析を、ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩ（BD #551809）を使用して、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩのため製造者の指示に従って実施した。
図４５は、上清中の測定された様々なサイトカインのレベルを示す。標的細胞の存在下でＴ細胞活性化の際に分泌される主要なサイトカインはＩＦＮ−γである。「（ｓｃＦｖ）２」分子は「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクトよりも僅かに高いレベルのＩＦＮ−γを誘導する。同様の傾向は、ヒトＴＮＦで見出される可能性があるが、このサイトカインの全体的なレベルは、ＩＦＮ−γに比べてはるかに低かった。標的細胞の存在（又は非存在）下でのＴ細胞の活性化の際に、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−１０及びＩＬ−４）の有意な分泌はなかった。Ｃｏｌｏ−３８標的細胞の非存在下で、ＴＮＦ分泌の非常に弱い誘導が観察され、「（ｓｃＦｖ）２」分子で処理したサンプルで最高であった。
【０２６５】
第二の実験では、ヒトＭＣＳＰ及びヒトＣＤ３を標的とする以下の精製二重特異性コンストラクトを分析した：「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」コンストラクト（配列番号３、５、２９、３３）、「（ｓｃＦｖ）２」分子、並びに野生型又は変異型（示されているようにＬＡＬＡ、Ｐ３２９Ｇ及び／又はＮ２９７Ｄ）Ｆｃドメインの何れかを含む異なる「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」分子。簡単に述べると、健康なドナーからの２８０μｌの全血を、深型ウェルの９６ウェルプレートの各ウェルに播いた。ヒトＭＣＳＰを発現する３００００のＣｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞、並びに様々な二重特異性コンストラクト及びＩｇＧコントロールを１ｎＭの最終濃度で添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートし、ついで、３５０×ｇで５分間遠心分離した。その後の分析のために上清を新しい深型ウェルの９６ウェルプレートに移した。ＣＢＡ分析を、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩについての製造者の指示に従って、以下のＣＢＡフレックスセット(Flex Set)：ヒトグランザイムＢ（BD #560304）、ヒトＩＦＮ−γフレックスセット（BD #558269）、ヒトＴＮＦフレックスセット（BD #558273）、ヒトＩＬ−１０フレックスセット（BD#558274）、ヒトＩＬ−６フレックスセット（BD #558276）、ヒトＩＬ−４フレックスセット（BD #558272）、ヒトＩＬ−２フレックスセット（BD#558270）の組み合わせを使用して実施した。
図４６は、上清中の測定された様々なサイトカインのレベルを示す。Ｃｏｌｏ−３８腫瘍細胞の存在下で分泌された主要なサイトカインは、ＩＬ−６と、続いてＩＦＮ−γであった。加えて、標的細胞の存在下でのＴ細胞活性化の際に、グランザイムＢのレベルが非常に増加した。一般に、「（ｓｃＦｖ）２」分子は、標的細胞の存在下で高いレベルのサイトカインの分泌を誘導した（図４６、Ａ及びＢ）。標的細胞の存在（又は非存在）下でのＴ細胞活性化の際に、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−１０及びＩＬ−４）の有意な分泌はなかった。
このアッセイでは、標的細胞の非存在下でさえも、異なる「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクトにより誘導されるＩＦＮ−γの弱い分泌があった（図４６、Ｃ及びＤ）。これらの条件下で、野生型又は変異Ｆｃドメインを有する「２＋１ ＩｇＧ ｓｃＦａｂ」コンストラクトの間で有意な差は観察できなかった。
【０２６６】
実施例１０
抗ＭＣＳＰ抗体Ｍ４−３／ＭＬ２の親和性成熟
オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発手順を介して親和性成熟が行われた。このために、重鎖変異体Ｍ４−３及び軽鎖変異体ＭＬ２を、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍにより記載されたものと同様、ファージミドベクター中にクローニングした（Hoogenboom等, Nucleic Acids Res. 1991, 19, 4133-4137）。ランダム化される残基は、先ず古典的なホモロジーモデリングによるその抗体の３Ｄモデルを作製し、ついで重鎖及び軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）の溶媒接近可能残基を同定することにより同定した。表４に示すトリヌクレオチド合成に基づくランダム化を伴うオリゴヌクレオチドを、Ｅｌｌａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Munich, Germany）から購入した。古典的ＰＣＲにより三つの独立のサブライブラリーが作製され、それらはＣＤＲ−Ｈ２と共にＣＤＲ−Ｈ１に、又はＣＤＲ−Ｌ２と共にＣＤＲ−Ｌ１に、ランダム化を含んでいた。ＣＤＲ−Ｌ３は別の手法でランダム化した。これらライブラリーのＤＮＡ断片を、制限消化及びライゲーションを介してファージミド中にクローニングし、その後ＴＧ１細菌中に電気穿孔した。
【０２６７】
ライブラリー選択
こうして作製された抗体変異体を、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合体として、繊維状ファージ粒子から一価型でディスプレイさせた。ついで、ファージディスプレイされた変異体を、それらの生物活性（ここでは結合親和性）についてスクリーニングし、一又は複数の改善活性を有する候補を更なる開発に使用した。ファージディスプレイライブラリーの作製方法は、Lee等, J. Mol. Biol. (2004) 340, 1073-1093に見出すことができる。
全ての親和性成熟ライブラリーでの選択は、次の手順に従って液中で実施した：１．各親和性成熟ライブラリーの〜１０１２個のファージミド粒子を１００ｎＭのビオチン化ｈｕ−ＭＣＳＰ（Ｄ３ドメイン）−ａｖｉ−ｈｉｓ（配列番号：３７６）に０．５時間、１ｍｌの総体積で結合させ、２．ビオチン化ｈｕ−ＭＣＳＰ（Ｄ３ドメイン）−ａｖｉ−ｈｉｓ及び特異的に結合したファージ粒子を、５．４×１０７個のストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズを１０分間加えることにより捕捉し、３．ビーズを、５−１０×１ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０及び５−１０×１ｍｌのＰＢＳを使用して洗浄し、４．ファージ粒子を、１ｍｌの１００ｍＭ ＴＥＡ（トリエチルアミン）を１０分間加えることにより溶出させ、５００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を加えることにより中和させ、５．指数関数的に増殖する大腸菌ＴＧ１細菌を再感染させ、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３で感染させ、その後、次の選択ラウンドで使用されるファージミド粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌ沈降させる。選択は、一定濃度又は減少濃度（１０−７Ｍから２×１０−９Ｍへ）の抗原を使用して、３〜５ラウンドにわたって実施した。２ラウンド目では、ストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラアビジンプレートを使用して、抗原ファージ複合体の捕捉を実施した。ＥＬＩＳＡにより、以下のようにして特異的結合剤を同定した：１ウェルあたり、１００μｌの１０ｎＭビオチン化ｈｕ−ＭＣＳＰ（Ｄ３ドメイン）−ａｖｉ−ｈｉｓをニュートラアビジンプレートにコートした。Ｆａｂ含有細菌の上清を加え、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を使用することにより、結合するＦａｂをそれらのＦｌａｇタグにより検出した。ＥＬＩＳＡ陽性クローンが、９６ウェルフォーマットにおいて可溶型Ｆａｂ断片として細菌により発現され、上清には、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（ＢｉｏＲａｄ）を使用するＳＰＲ分析による動態スクリーニング実験を行った。最も高い親和性定数でＦａｂを発現するクローンを同定し、対応するファージミドを配列決定した。
【０２６８】
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図６８は、非成熟親クローンと比較した親和性成熟抗ＭＣＳＰクローンのアラインメントを示す（Ｍ４−３ ＭＬ２）。重鎖ランダム化はＣＤＲ１及び２のみで実施された。軽鎖ランダム化はＣＤＲ１及び２で、そして独立してＣＤＲ３で実施された。
選択の間、フレームワーク内でクローンＧ３におけるＦ７１Ｙ又はクローンＥ１０におけるＹ８７Ｈのような幾つかの突然変異が起こった。
【０２６９】
ヒトＩｇＧ１の生産及び精製
親和性成熟した変異体の重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、各レシピエント哺乳動物発現ベクター中に予め挿入された定常重鎖又は定常軽鎖の何れかとインフレームでサブクローニングした。抗体発現はＭＰＳＶプロモーターによって駆動され、ＣＤＳの３’末端に合成ポリＡシグナル配列を有する。加えて、各ベクターはＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含んでいた。
分子を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用してＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に哺乳動物発現ベクターをコトランスフェクトすることにより作製した。細胞を、１：１の比で対応発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションのために、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、ＣＤ ＣＨＯ培養培地において血清を含めないで懸濁培養した。５００ｍｌの振盪フラスコ内での生成のために、４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０×ｇで５分間遠心分離し、予め温めた２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地により上清を置き換えた。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μｌのＰＥＩ溶液を加えた後、混合物を１５秒間ボルテックスし、その後室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート時間の後、１６０ｍｌのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの一日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ１（Lonza）を加えた。７日後、２１０×ｇで１５分間の遠心分離によって培養物の上清を精製のために収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、最終濃度０．０１％ｗ／ｖのアジ化ナトリウムを加えて４℃に維持した。
【０２７０】
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを使用するアフィニティクロマトグラフィーにより細胞培養物の上清から精製した。上清を、４０ｍｌの２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐプロテインＡ ＨＰカラムに充填した（ＣＶ＝５ｍＬ，GE Healthcare）。結合していないタンパク質を、少なくとも１０カラム体積の２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。標的タンパク質を、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）から２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ２．５）の２０カラム体積にわたる勾配中に溶出させた。タンパク質溶液を、１／１０の０．５Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ８）を加えることにより中和させた。標的タンパク質を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（GE Healthcare）に充填した。
精製されたタンパク質試料のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。分子の純度及び分子量は、還元剤の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳ分析により分析した。Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステム（Caliper life Sciences）を、製造元の指示書に従って使用した。２μｇの試料を分析に使用した。抗体試料の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３（ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー）中において、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析的サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を使用して分析した。
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【０２７１】
親和性決定
ＰｒｏｔｅＯｎ分析
ＫＤを、２５℃で、ＣＭ５チップ上へのアミン結合によって抗ヒトＦ（ａｂ’）２断片特異的捕捉抗体（Jackson ImmunoResearch #109-005-006）を固定し、続いて細菌上清又は精製Ｆａｂ調製物からＦａｂを捕捉して、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６機器（ＢｉｏＲａｄ）を使用する表面プラズモン共鳴により測定した。簡単に述べると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（CM5, GE Healthcare）を、供給元の指示に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化させた。抗ヒトＦ（ａｂ’）２断片特異的捕捉抗体を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で５０μｇ／ｍｌに希釈した後、１０μｌ／分の流量で注入して、およそ１００００反応単位（ＲＵ）の結合捕捉抗体を達成した。捕捉抗体の注入後、未反応群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。反応速度の測定のため、細菌の上清由来のＦａｂ又は精製されたＦａｂを、１０μｌ／分の流量で３００秒間、捕捉ベースラインの安定のために３００秒の解離で注入した。捕捉レベルは１００−５００ＲＵの範囲内であった。次の工程において、ヒトＭＣＳＰ（Ｄ３ドメイン）−ａｖｉ−ｈｉｓ被分析物を、単一濃度として、又はＨＢＳ−ＥＰ＋（GE Healthcare,１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％の界面活性剤Ｐ２０，ｐＨ７．４）中に希釈した（１００ｎＭから２５０ｐＭの範囲のクローン親和性に応じて）一連の濃度として、２５℃において５０μｌ／分の流量で注入した。センサーチップの表面を、グリシン（ｐＨ１．５）を３０秒間９０μｌ／分で注入し、それに続いてＮａＯＨを２０秒間同じ流量で注入することにより再生した。結合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を、単純な一対一ラングミュア結合モデル（ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６評価ソフトウェア又はＳｃｒｕｂｂｅｒソフトウェア（BioLogic））を使用して、結合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィットさせることにより算出した。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。このデータを使用して、親和性成熟変異体の親抗体との比較結合親和性を決定した。表６ａは、これらのアッセイから得られたデータを示す。
【０２７２】
軽鎖に対してＧ３、Ｅ１０、Ｃ５を、重鎖に対してＤ６、Ａ７、Ｂ７、Ｂ８、Ｃ１を、ヒトＩｇＧ１フォーマットへの変換のために選択した。軽鎖のＣＤＲ１及び２を、ＣＤＲ３とは独立にランダム化し、得られたＣＤＲをＩｇＧ変換の間に組み合わせた。
ＩｇＧフォーマットにおいて、ヒトＭＣＳＰ抗原（配列番号：３７６）に対する親和性と、更にはカニクイザル相同体（配列番号：３７５）に対する親和性をまた測定した。
使用した方法は、哺乳動物産出物由来の精製ＩｇＧだけを用いて、Ｆａｂ断片について記載された通りとした。
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【０２７３】
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による親和性決定
親和性成熟ＩｇＧの親和性及び結合活性を決定するための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４，０．１５ＭのＮａＣｌ、ｍＭのＥＤＴＡ、．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Biacore, Freiburg/Germany）を用い、２５℃で、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で実施した。
ヒト及びカニクイザルＭＣＳＰ Ｄ３に対する様々な抗ＭＣＳＰ ＩｇＧの相互作用の結合活性を分析するために、約９５００共鳴単位（ＲＵ）の抗Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）の直接結合を、標準のアミン結合キット（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してｐＨ５．０でＣＭ５チップ上で実施した。抗原はそれぞれ３０ｎＭで６０秒間１０μｌ／分で捕捉された。ＩｇＧは、濃度０．００６４−１００ｎＭ、流量３０μｌ／分で、２８０秒間にわたりフローセルに通した。解離は１８０秒間モニターした。バルク屈折率の差を、基準フローセルにおいて得られた応答を差し引くことにより修正した。ここで、ＩｇＧは、固定化された抗Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ抗体を有する表面上に流したが、その上にはヒトＭＣＳＰ Ｄ３又はカニクイザルＭＣＳＰ Ｄ３ではなくＨＢＳ−ＥＰが注入されていた。
親和性測定のために、固定化された抗ヒトＦｃを有するＣＭ５センサーチップ表面上にＩｇＧを捕捉した。捕捉ＩｇＧは、標準のアミン結合キット（Biacore, Freiburg/Germany）を使用するｐＨ５．０における約９５００共鳴単位（ＲＵ）の直接的固定化により、センサーチップの表面に結合させた。ＩｇＧは、１０ｎＭを３０μｌ／分で、２５秒間捕捉される。ヒト及びカニクイザルＭＣＳＰ Ｄ３は、濃度２−５００ｎＭ、流量３０μｌ／分で、１２０秒間にわたりフローセルに通した。解離は６０秒間モニターした。１６６から５００ｎＭの濃度について、それぞれ１２００及び６００秒間、結合及び解離をモニターした。バルク屈折率の差は、基準フローセルで取得される応答差し引くことにより修正された。ここで、抗原は、固定化された抗ヒトＦｃ抗体を有する表面上に流したが、その上には抗ＭＣＳＰ ＩｇＧではなくＨＢＳ−ＥＰが注入されていた。
【０２７４】
速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（vAA, Biacore AB, Uppsala/Sweden）を使用して導出し、数値積分法により、１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめた。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を使用する表面プラズモン共鳴測定により、ヒト及びカニクイザルＭＣＳＰ Ｄ３に対するより高い親和性が確認された。加えて、結合活性測定値により、二価の結合に最大３倍の上昇が示された（表６ｂ）。
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【０２７５】
実施例１１
抗ＭＣＳＰ抗体としてＭ４−３（Ｃ１）ＭＬ２（Ｇ３）を、抗ＣＤ３抗体としてヒト化ＣＨ２５２７を含むＭＣＳＰ ＴＣＢ（２＋１ Ｃｒｏｓｓｆａｂ−ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ反転型）の調製
重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、各レシピエント哺乳動物発現ベクター中に予め挿入された定常重鎖又は定常軽鎖の何れかとインフレームでサブクローニングした。抗体発現はＭＰＳＶプロモーターによって駆動され、ＣＤＳの３’末端に合成ポリＡシグナル配列を有する。加えて、各ベクターはＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
分子を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用してＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に哺乳動物発現ベクターをコトランスフェクトすることにより作製した。細胞を、１：２：１：１の比（「ベクター重鎖Ｆｃ（ホール）」：「ベクター軽鎖」：「ベクター軽鎖Ｃｒｏｓｓｆａｂ」：「ベクター重鎖Ｆｃ（ノブ）−ＦａｂＣｒｏｓｓｆａｂ」）で対応発現ベクターでトランスフェクトした。
トランスフェクションのために、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、ＣＤ ＣＨＯ培地において血清を含めないで懸濁培養した。５００ｍｌの振盪フラスコ内での生成のために、４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０×ｇで５分間遠心分離し、予め温めた２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地により上清を置き換えた。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μｌのＰＥＩ溶液を加えた後、混合物を１５秒間ボルテックスし、その後室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート時間の後、１６０ｍｌのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの一日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ１（Lonza）を加えた。７日後、２１０×ｇで１５分間の遠心分離によって培養物の上清を精製のために収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、最終濃度０．０１％ｗ／ｖのアジ化ナトリウムを加えて４℃に維持した。
【０２７６】
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより細胞培養物の上清から精製した。上清を、４０ｍｌの２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐプロテインＡ ＨＰカラムに充填した（ＣＶ＝５ｍＬ，GE Healthcare）。結合していないタンパク質を、少なくとも１０カラム体積の２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。標的タンパク質を、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）から２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ２．５）の２０カラム体積にわたる勾配中に溶出させた。タンパク質溶液を、１／１０の０．５Ｍのリン酸ナトリウム、リン酸エステル、リン酸塩又はリン酸エステル（ｐＨ８）を加えることにより中和させた。標的タンパク質を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（GE Healthcare）に充填した。
【０２７７】
精製されたタンパク質試料のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。
分子の純度及び分子量は、還元剤の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳ分析により分析した。Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステム（Caliper lifescience）を、製造元の指示書に従って使用した。２μｇの試料を分析に使用した。
抗体試料の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３（ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー）中において、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析的サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を使用して分析した。
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図６９は、ＭＣＳＰ ＴＣＢ（２＋１ Ｃｒｏｓｓｆａｂ−ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ反転型）分子の模式図である。
図７０及び表７ｂは、ＭＣＳＰ ＴＣＢ（２＋１ Ｃｒｏｓｓｆａｂ−ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ反転型）分子（配列番号：２７８、３１９、３２０及び３２１）のＣＥ−ＳＤＳ分析を示している。
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【０２７８】
実施例１２
抗ＣＥＡ抗体としてＣＨ１Ａ１Ａ９８／９９ ２Ｆ１を、抗ＣＤ３抗体としてヒト化ＣＨ２５２７を含むＣＥＡ ＴＣＢ（２＋１ Ｃｒｏｓｓｆａｂ−ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ反転型）の調製
重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、各レシピエント哺乳動物発現ベクター中に予め挿入された定常重鎖又は定常軽鎖の何れかとインフレームでサブクローニングした。抗体発現はＭＰＳＶプロモーターによって駆動され、ＣＤＳの３’末端に合成ポリＡシグナル配列を有する。加えて、各ベクターはＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
分子を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用してＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に哺乳動物発現ベクターをコトランスフェクトすることにより作製した。細胞を、１：２：１：１の比（「ベクター重鎖Ｆｃ（ホール）」：「ベクター軽鎖」：「ベクター軽鎖Ｃｒｏｓｓｆａｂ」：「ベクター重鎖Ｆｃ（ノブ）−ＦａｂＣｒｏｓｓｆａｂ」）で対応発現ベクターでトランスフェクトした。
トランスフェクションのために、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、ＣＤ ＣＨＯ培地において血清を含めないで懸濁培養した。５００ｍｌの振盪フラスコ内での生成のために、４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０×ｇで５分間遠心分離し、予め温めた２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地により上清を置き換えた。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μｌのＰＥＩ溶液を加えた後、混合物を１５秒間ボルテックスし、その後室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート時間の後、１６０ｍｌのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの一日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ１（Lonza）を加えた。７日後、２１０×ｇで１５分間の遠心分離によって培養物の上清を精製のために収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、最終濃度０．０１％ｗ／ｖのアジ化ナトリウムを加えて４℃に維持した。
【０２７９】
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを使用するアフィニティクロマトグラフィーにより細胞培養物の上清から精製した。上清を、４０ｍｌの２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰカラムに充填した（ＣＶ＝５ｍＬ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。結合していないタンパク質を、少なくとも１０カラム体積の２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。標的タンパク質を、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）から２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ２．５）の２０カラム体積にわたる勾配中に溶出させた。タンパク質溶液を、１／１０の０．５Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ８）を加えることにより中和させた。標的タンパク質を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（GE Healthcare）に充填した。
【０２８０】
精製されたタンパク質試料のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。
分子の純度及び分子量は、還元剤の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳ分析により分析した。Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステム（Caliper lifescience）を、製造元の指示書に従って使用した。２μｇの試料を分析に使用した。
抗体試料の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３（ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー）中において、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析的サイズ除外カラム（Tosoh）を使用して分析した。
2016512421.tif 000017
図７１は、ＣＥＡ ＴＣＢ（２＋１ Ｃｒｏｓｓｆａｂ−ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ反転型）分子の模式図である。
図７２び表９は、ＣＥＡ ＴＣＢ（２＋１ Ｃｒｏｓｓｆａｂ−ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ反転型）分子（配列番号：２８８、３２２、３２３及び３２４）のＣＥ−ＳＤＳ分析を示している。
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【０２８１】
代替的な精製方法では、ＣＥＡ ＴＣＢを、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ）により、回収及び清澄化した発酵上清から捕捉した。ついで、プロテインＡ溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィー（Ｐｏｒｏｓ ５０ＨＳ）に供し、その後プロテインＡ溶出液を分画してＳＥ−ＨＰＬＣ及びキャピラリー電気泳動により分析した。生成物を含む画分をプールし、結合−溶出モードにおいて室温で疎水性相互作用クロマトグラフィー（Butyl-Sepharose 4FF）に供した。ついで、その溶出液を分画し、ＳＥ−ＨＰＬＣ及びキャピラリー電気泳動により分析した。生成物を含む画分をプールし、その後流水モードにおいて陰イオン交換クロマトグラフィー（Q-Sepharose FF）を実施した。この精製方法を使用して得られた物質のモノマー含有量は＞９８％であった。
【０２８２】
実施例１３
ＭＣＳＰ発現及びＣＤ３発現細胞へのＭＣＳＰ ＴＣＢの結合
ＭＣＳＰ ＴＣＢの結合を、ＭＣＳＰ発現ヒトメラノーマ細胞株（Ａ３７５）及びＣＤ３発現不死化Ｔリンパ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）で試験した。簡単に述べると、細胞を収集し、計数し、生存率について調べ、ＦＡＣＳバッファー（１００μｌ ＰＢＳ ０．１％ ＢＳＡ）中に２×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させた。１００μｌの細胞懸濁液（０．２×１０６細胞を含む）を、増加濃度のＭＣＳＰ ＴＣＢ（２．６ｐＭ−２００ｎＭ）と共に４℃で３０分間、丸底９６ウェルプレート中でインキュベートし、冷ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、ＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的二次抗体（Jackson Immuno Research Lab PE #109-116-170）と共に４℃で更に３０分間、再インキュベートし、冷ＰＢＳ ０．１％ ＢＳＡで２回洗浄し、ＤＡＰＩ陰性の生細胞をゲーティングすることにより、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（ソフトウェアＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を使用してＦＡＣＳによって直ぐに分析した。結合曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５を使用して得た（図７３Ａ，Ａ３７５細胞への結合，ＥＣ５０＝３３８１ｐＭ；図７３Ｂ，Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合）。
【０２８３】
実施例１４
ＭＣＳＰ ＴＣＢ抗体により誘導されるＴ細胞死滅
ＭＣＳＰ ＴＣＢ抗体によって媒介されるＴ細胞死滅を、異なるレベルのＭＣＳＰを発現する腫瘍細胞株のパネル（Ａ３７５＝高ＭＣＳＰ、ＭＶ−３＝中ＭＳＣＰ、ＨＣＴ−１１６＝低ＭＣＳＰ、ＬＳ１８０＝ＭＣＳＰ陰性）を使用して評価した。簡単に述べると、標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡで収集し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを使用して２５０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を一晩放置して付着させた。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、健常なヒトドナーから得た濃縮リンパ球調製物（バフィーコート）のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により調製した。新鮮血を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅグラジエント（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ８８８９）上に層状に重ねた。遠心分離（４５０×ｇ，３０分、室温）後、ＰＢＭＣを含む界面相上の血漿を棄て、ＰＢＭＣを新しいｆａｌｃｏｎチューブに移し、その後５０ｍｌのＰＢＳを満たした。混合物を遠心分離（４００×ｇ，１０分間、室温）し、上清を棄て、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（遠心分離工程：３５０×ｇ，１０分間）。得られたＰＢＭＣ群を自動カウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、細胞インキュベーター内において、３７℃、５％ＣＯ２で１０％のＦＣＳ及び１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Biochrom, K0302）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中に、更に使用するまで（２４時間以内）保存した。死滅アッセイでは、抗体を示された濃度（１ｐＭ−１０ｎＭの範囲の３通り）で加えた。ＰＢＭＣを、最終的なエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）の比が１０：１となるように標的細胞に加えた。標的細胞の死滅を、３７℃、５％ＣＯ２での２４時間のインキュベーション後に、アポトーシス／壊死細胞により細胞上清中に放出されたＬＤＨの定量化（ＬＤＨ検出キット、Roche Applied Science, #11644793001）により評価した。標的細胞の最大溶解（＝１００％）が、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と共になされた標的細胞のインキュベーションにより達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性コンストラクトなしでエフェクター細胞と共にコインキュベートした標的細胞を指す。結果は、ＭＣＳＰ ＴＣＢが、ＭＣＳＰ陰性細胞株を死滅させずに、強力且つ標的特異的なＭＣＳＰ陽性標的細胞株の死滅を誘導したことを示すものである（図７４Ａ−Ｄ）。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５を使用して計算した死滅アッセイに関するＥＣ５０値を表１０に示す。
2016512421.tif 000019
【０２８４】
実施例１５
ＭＣＳＰ ＴＣＢ抗体によって誘導されるＭＣＳＰ発現腫瘍細胞のＴ細胞死滅後の、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋エフェクター細胞上におけるＣＤ２５及びＣＤ６９のアップレギュレーション
ＭＣＳＰ ＴＣＢ抗体によって媒介されるＭＣＳＰ発現ＭＶ−３腫瘍細胞のＴ細胞死滅後の、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５（後期活性化マーカー）及びＣＤ６９（初期活性化マーカー）を認識する抗体を使用してＦＡＣＳ解析により評価した。抗体及び死滅アッセイの条件は、基本的に上述した通り（実施例１４）であり、同じ抗体濃度範囲（１ｐＭ−１０ｎＭ、３通り）、Ｅ：Ｔ比１０：１、及びインキュベーション時間２４時間を使用した。
インキュベーション後、ＰＢＭＣを丸底９６ウェルプレートに移し、３５０×ｇで５分間遠心分離し、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２回洗浄した。ＣＤ８（ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ８，BD #555634）、ＣＤ４（ＰＥＣｙ７抗ヒトＣＤ４，BD #557852）、ＣＤ６９（ＰＥ抗ヒトＣＤ６９，Biolegend #310906）及びＣＤ２５（ＡＰＣ抗ヒトＣＤ２５，BD #555434）の表面染色を、供給者の指示に従って実施した。細胞を、０．１％ＢＳＡを含む１５０μｌ／ウェルのＰＢＳを用いて２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの固定化バッファー（ＢＤ ＃５５４６５５）を使用して４℃で１５分間固定した。遠心分離後、試料を２００μｌ／ウェルのＤＡＰＩ含有ＰＢＳ０．１％ ＢＳＡに再懸濁し、ＦＡＣＳ測定のために死細胞を除いた。試料をＢＤ ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析した。結果は、ＭＣＳＰ ＴＣＢが、死滅後にＣＤ８＋Ｔ細胞（図７５Ａ，Ｂ）及びＣＤ４＋Ｔ細胞（図７５Ｃ，Ｄ）上において強力且つ標的特異的な活性化マーカー（ＣＤ２５，ＣＤ６９）のアップレギュレーションを誘導したことを示している。
【０２８５】
実施例１６
ＭＣＳＰ ＴＣＢ抗体によって誘導されるＭＣＳＰ発現腫瘍細胞のＴ細胞死滅後の、ヒトエフェクター細胞によるサイトカイン分泌
ＭＣＳＰ ＴＣＢ抗体によって誘導されるＭＣＳＰ発現ＭＶ−３腫瘍細胞のＴ細胞死滅後のヒトＰＢＭＣによるサイトカイン分泌を、死滅アッセイ後に細胞上清のＦＡＣＳ解析により評価した。
同じ抗体を使用し、１０：１のＥ：Ｔ比及び２４時間のインキュベーション時間を使用し、基本的に上述した通りに（実施例１４及び１５）死滅アッセイを実施した。
インキュベーション時間の終わりに、プレートを３５０×ｇで５分間遠心分離し、上清を新しい９６ウェルプレートに移し、−２０℃でその後の分析まで保存した。細胞上清中に分泌されたグランザイムＢ、ＴＮＦα、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＬ−１０を、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩにおいて製造元の指示に従い、ＢＤ ＣＢＡヒト可溶型タンパク質Ｆｌｅｘ Ｓｅｔを使用して検出した。次のキットを使用した：ＢＤ ＣＢＡヒトグランザイムＢ ＢＤ ＣＢＡヒトグランザイムＢ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ ＃ＢＤ５６０３０４；ＢＤ ＣＢＡヒトＴＮＦ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ ＃ＢＤ５５８２７３；ＢＤ ＣＢＡヒトＩＦＮ−γ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ ＃ＢＤ５５８２６９；ＢＤ ＣＢＡヒトＩＬ−２ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ ＃ＢＤ５５８２７０；ＢＤ ＣＢＡヒトＩＬ−４ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ ＃ＢＤ５５８２７２；ＢＤ ＣＢＡヒトＩＬ−１０ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ ＃ＢＤ５５８２７４。
結果は、ＭＣＳＰ ＴＣＢが、死滅時にＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、グランザイムＢ及びＩＬ−１０（但しＩＬ−４はなし）の分泌を誘導したことを示している（図７６Ａ−Ｆ）。
【０２８６】
まとめると、これらの実施例は、ＭＣＳＰ ＣＤ３二重特異性抗体が、
・ＭＣＳＰ陽性Ａ３７５細胞に対して良好な結合を示したこと、
・ＭＣＳＰ陽性標的細胞株の強力且つ標的特異的な死滅を誘導したが、ＭＣＳＰ陰性細胞株の死滅は誘導しなかったこと、
・死滅後、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞上に活性化マーカー（ＣＤ２５，Ｃｄ６９）の強力且つ標的特異的なアップレギュレーションを誘導したこと、
・死滅時に、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、グランザイムＢ及びＩＬ−１０（Ｉｌ−４はなし）の分泌を誘導したこと
を示すものである。
【０２８７】
実施例１７
ＣＥＡ発現及びＣＤ３発現細胞へのＣＥＡ ＴＣＢの結合
ＣＥＡ ＴＣＢの結合を、トランスフェクトされたＣＥＡ発現肺腺がん細胞（Ａ５４９−ｈｕＣＥＡ）並びにＣＤ３発現不死化ヒト及びカニクイザルＴリンパ細胞株（それぞれＪｕｒｋａｔ及びＨＳＣ−Ｆ）で試験した。非標的化ＴＣＢ（配列番号：３２５、３２６，３２７及び３２８；実施例３３参照）をコントロールとして使用した。簡単に述べると、細胞を収集し、計数し、生存率について調べ、ＦＡＣＳバッファー（１００μｌ ＰＢＳ ０．１％ ＢＳＡ）中に２×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させた。１００μｌの細胞懸濁液（０．２×１０６細胞を含む）を、増加濃度のＣＥＡ ＴＣＢ（６１ｐＭ−１０００ｎＭ）と共に４℃で３０分間、丸底９６ウェルプレート中でインキュベートし、冷ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、ＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片特異的二次抗体（Jackson Immuno Research Lab FITC #109-096-097）と共に４℃で更に３０分間、再インキュベートし、冷ＰＢＳ ０．１％ ＢＳＡで２回洗浄し、ＰＩ陰性の生細胞をゲーティングすることにより、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ又はＦｏｒｔｅｓｓａ（ソフトウェアＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を使用してＦＡＣＳによって直ぐに分析した。結合曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５を使用して得た（図７７Ａ，Ａ５４９細胞への結合（ＥＣ５０ ６．６ｎＭ）；図７７Ｂ，Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合；図７７Ｃ，ＨＳＣ−Ｆ細胞への結合）。
【０２８８】
実施例１８
ＣＥＡ ＴＣＢ抗体によって誘導されるＣＥＡ発現腫瘍標的細胞のＴ細胞媒介性死滅
ＣＥＡ ＴＣＢ抗体によって誘導される標的細胞のＴ細胞媒介性死滅を、ＨＰＡＦＩＩ（高ＣＥＡ）、ＢｘＰＣ−３（中ＣＥＡ）及びＡＳＰＣ−１（低ＣＥＡ）ヒト腫瘍細胞において評価した。ＨＣＴ−１１６（ＣＥＡ陰性腫瘍細胞株）及び非標的化ＴＣＢをネガティブコントロールとして使用した。ヒトＰＢＭＣをエフェクターとして使用し、二重特異性抗体と共になされたインキュベートションの２４時間後及び４８時間後に死滅を検出した。簡単に述べると、標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡで収集し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを使用して２５０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を一晩放置して付着させた。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、健常なヒトドナーから得た濃縮リンパ球調製物（バフィーコート）のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により調製した。新鮮血を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅグラジエント（Sigma, #H8889）上に層状に重ねた。遠心分離（４５０×ｇ，３０分、室温）後、ＰＢＭＣを含む界面相上の血漿を棄て、ＰＢＭＣを新しいｆａｌｃｏｎチューブに移し、その後５０ｍｌのＰＢＳを満たした。混合物を遠心分離（４００×ｇ，１０分間、室温）し、上清を棄て、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（遠心分離工程：３５０×ｇ，１０分間）。得られたＰＢＭＣ群を自動カウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、細胞インキュベーター内において、３７℃、５％ＣＯ２で１０％のＦＣＳ及び１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｋ０３０２）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中に、更に使用するまで（２４時間以内）保存した。死滅アッセイでは、抗体を示された濃度（６ｐＭ−１０ｎＭの範囲の３通り）で加えた。ＰＢＭＣを、最終的なＥ：Ｔの比が１０：１となるように標的細胞に加えた。標的細胞の死滅を、２４時間及び４８時間のインキュベーション後に、アポトーシス／壊死細胞により細胞上清中に放出されたＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）の定量化（ＬＤＨ検出キット、Roche Applied Science, #11644793001）により評価した。標的細胞の最大溶解（＝１００％）が、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と共になされた標的細胞のインキュベーションにより達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性抗体なしでエフェクター細胞と共にコインキュベートした標的細胞を指す。結果は、ＣＥＡ ＴＣＢが、ＣＥＡ陽性標的細胞の強力且つ標的特異的な死滅を誘導したことを示すものである（図７８Ａ−Ｈ）。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５を使用して計算した死滅アッセイに関するＥＣ５０値を表１１に示す。
2016512421.tif 000020
【０２８９】
実施例１９
ＣＥＡ発現腫瘍標的細胞のＣＥＡ ＴＣＢ媒介性死滅の５日後の、Ｔ細胞増殖及び活性化
ＨＰＡＦＩＩ（高ＣＥＡ）、ＢｘＰＣ−３（中ＣＥＡ）及びＡＳＰＣ−１（低ＣＥＡ）細胞で評価されたＣＥＡ発現腫瘍標的細胞のＣＥＡ ＴＣＢ媒介性死滅の５日後に、Ｔ細胞増殖及び活性化を検出した。ＨＣＴ−１１６（ＣＥＡ陰性腫瘍細胞株）及び非標的化ＴＣＢをネガティブコントロールとして使用した。増殖アッセイの実験条件は、実施例１８において記載したものと同様であったが、標的細胞は、９６平底プレートの１ウェル当たり１００００個のみ撒いた。Ｔ細胞増殖を評価するために、新しく単離されたＰＢＭＣを、ＣＦＳＥ（Ｓｉｇｍａ ＃２１８８８）を使用して標識した。簡単に述べると、ＣＦＳＥ原液を希釈して１００μＭの作業溶液を得た。予め温めた９０ｍｌのＰＢＳに９０×１０６個のＰＢＭＣ細胞を再懸濁させ、９０μｌのＣＦＳＥ作業溶液を補充した。直ちに細胞を混合し、３７℃で１５分間インキュベートした。予め温めた１０ｍｌのＦＣＳを細胞に加えて反応を止めた。細胞を４００ｇで１０分間遠心分離し、５０ｍｌの培養液に再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を温かい培養液で１回洗浄し、計数し、培養液中に再懸濁し、標的細胞に加え、死滅アッセイと、続く１０：１のＥ：Ｔでの細胞増殖及び活性化の測定とを行った。増殖は、ＣＤ４及びＣＤ８陽性Ｔ細胞上において、ＣＦＳＥ色素希釈の定量化により死滅の５日後に評価した。ＣＤ２５の発現を、抗ヒトＣＤ２５抗体を使用して同じＴ細胞サブセット上で評価した。簡単に述べると、遠心分離（４００×ｇで４分間）後、細胞を再懸濁させ、ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、２５μｌの希釈したＣＤ４／ＣＤ８／ＣＤ２５抗体混合物と共に４℃で３０分間インキュベートした（ＡＰＣ／Ｃｙ７抗ヒトＣＤ４ ＃３１７４１８，ＡＰＣ抗ヒトＣＤ８ ＃３０１０１４，ＰＥ／Ｃｙ７抗ヒトＣＤ２５ ＃３０２６１２）。ついで、細胞を３回洗浄して未結合の抗体を除去し、最後にヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含む２００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁させて、ＦＡＣＳ測定のために死細胞を除いた。ＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩを使用して蛍光性を測定した。結果は、ＣＥＡ ＴＣＢがＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の強力且つ標的特異的な増殖（図７９Ａ−Ｄ）と、ＣＤ２５活性化マーカーのアップレギュレーションにより検出されるそれらの活性化（図７９Ｅ−Ｈ）とを誘導したことを示すものであった。
【０２９０】
実施例２０
ＣＥＡ ＴＣＢによって誘導されるＣＥＡ発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介性の死滅後の、ヒトエフェクター細胞によるサイトカイン分泌
ＣＥＡ ＴＣＢによって誘導されるＣＥＡ発現ＭＫＮ４５腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅後のヒトＰＢＭＣによるサイトカイン分泌を、死滅の４８時間後に細胞上清のＦＡＣＳ解析（ＣＢＡキット）により評価した。
実験条件は、実施例１８に記載したものと同一であった。インキュベーション時間の終わりに、プレートを３５０×ｇで５分間遠心分離し、上清を新しい９６ウェルプレートに移し、−２０℃でその後の分析まで保存した。細胞上清中に分泌された（Ａ）ＩＦＮ−γ、（Ｂ）ＴＮＦα、（Ｃ）グランザイムＢ、（Ｄ）ＩＬ−２、（Ｅ）ＩＬ−６及び（Ｆ）ＩＬ−１０を、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩにおいて製造元の指示に従い、ＢＤ ＣＢＡヒト可溶型タンパク質Ｆｌｅｘ Ｓｅｔを使用して検出した。次のキットが使用された：ＢＤ ＣＢＡヒトＩＬ−２ ＢＤ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ ＃ＢＤ５５８２７０；ＢＤ ＣＢＡヒトグランザイムＢ ＢＤ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ ＃ＢＤ５６０３０４；ＢＤ ＣＢＡヒトＴＮＦ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ ＃ＢＤ５５８２７３；ＢＤ ＣＢＡヒトＩＦＮ−γ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ ＃ＢＤ５５８２６９；ＢＤ ＣＢＡヒトＩＬ−４ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ ＃ＢＤ５５８２７２；ＢＤ ＣＢＡヒトＩＬ−１０ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ ＃ＢＤ５５８２７４。
結果は、ＣＥＡ ＴＣＢ媒介性の死滅がＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、グランザイムＢ、ＩＬ−２、ＩＬ−６及びＩＬ−１０の分泌を誘導したことを示す（図１４Ａ−Ｆ）ものである（非標的化ＴＣＢコントロールは死滅を媒介しなかった）。
【０２９１】
実施例２１
増加濃度のｓｈｅｄ ＣＥＡ（ｓＣＥＡ）の存在下における標的細胞のＴ細胞媒介性死滅
増加濃度のｓｈｅｄ ＣＥＡ（ｓＣＥＡ ２．５ｎｇ／ｍｌ−５μｇ／ｍｌ）の存在下においてＣＥＡ ＴＣＢ抗体によって誘導されるＣＥＡ発現腫瘍標的細胞（ＬＳ１８０）のＴ細胞媒介性死滅を評価した。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用し、二重特異性抗体及びｓＣＥＡと共になされたインキュベーションの２４時間後及び４８時間後に死滅を検出した。簡単に述べると、標的細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで収集し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを使用して２５０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を一晩放置して付着させた。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、健常なヒトドナーから得た濃縮リンパ球調製物（バフィーコート）のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により調製した。新鮮血を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅグラジエント（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ８８８９）上に層状に重ねた。遠心分離（４５０×ｇ，３０分、室温）後、ＰＢＭＣを含む界面相上の血漿を棄て、ＰＢＭＣを新しいｆａｌｃｏｎチューブに移し、その後５０ｍｌのＰＢＳを満たした。混合物を遠心分離（４００×ｇ，１０分間、室温）し、上清を棄て、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（遠心分離工程：３５０×ｇ，１０分間）。得られたＰＢＭＣ群を自動カウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内において、１０％のＦＣＳ及び１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｋ０３０２）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中に、更に使用するまで（２４時間以内）維持した。死滅アッセイでは、ＣＥＡ ＴＣＢ抗体を１ｎＭの固定濃度で使用し、ｓＣＥＡを２．５ｎｇ−５μｇ／ｍｌの濃度範囲で実験に添加した。ＰＢＭＣを標的細胞に、最終的なＥ：Ｔの比が１０：１となるように加えた。標的細胞の死滅を、インキュベーションの２４時間後及び４８時間後に、アポトーシス／壊死細胞により細胞上清中に放出されたＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）の定量化（ＬＤＨ検出キット、Roche Applied Science, #11644793001）により評価した。標的細胞の最大溶解（＝１００％）が、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と共になされた標的細胞のインキュベーションにより達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性抗体なしでエフェクター細胞と共にコインキュベートした標的細胞を指す。ｓＣＥＡの非存在下においてＣＥＡ ＴＣＢによって媒介された死滅を１００％に設定し、増加濃度のｓＣＥＡの存在下で得られた死滅をそれに正規化した。結果は、ｓＣＥＡがＣＥＡ発現標的細胞のＣＥＡ ＴＣＢ媒介性死滅に小さな影響しか与えなかったことを示すものである（図８１Ａ，Ｂ）。０．２μｇ／ｍｌまでのｓＣＥＡではＴ細胞死滅に対する影響は検出されなかった。０．２μｇ／ｍｌを上回るｓＣＥＡ濃度も、全体の死滅に小さな影響しか持たなかった（１０−５０％の低減）。
【０２９２】
実施例２２
ヒト及びカニクイザルのＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用する標的細胞のＴ細胞媒介性死滅
ＣＥＡ ＴＣＢ抗体とエフェクター細胞としてのヒトＰＢＭＣ又はカニクイザルＰＢＭＣと共になされたインキュベーションの２１時間後及び４０時間後に評価されたヒトＣＥＡを過剰発現するＡ５４９（肺腺がん）細胞（Ａ５４９−ｈＣＥＡ）のＴ細胞媒介性死滅を評価した。簡単に述べると、標的細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで収集し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを使用して２５０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を数時間放置して付着させた。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、健常なヒトドナー又は健常なカニクイザルから得た濃縮リンパ球調製物（バフィーコート）のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により調製した。以降は、９０％のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−ＰＢＳ密度グラジエントを使用した。新鮮血を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅグラジエント（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ８８８９）上に層状に重ねた。遠心分離（ヒトＰＢＭＣの場合は４５０×ｇ，３０分間、室温で、カニクイザルＰＢＭＣの場合は５２０×ｇ，３０分間，室温）後、ＰＢＭＣを含む界面相上の血漿を棄て、ＰＢＭＣを新しいｆａｌｃｏｎチューブに移し、その後５０ｍｌのＰＢＳを満たした。混合物を遠心分離（４００×ｇ，１０分間，室温）し、上清を棄て、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（遠心分離工程：３５０×ｇ，１０分間）。カニクイザルＰＢＭＣの調製では、追加の低速遠心分離工程を１５０×ｇで１５分間実施した。得られたＰＢＭＣ群を自動カウントし（ViCell）、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内において、１０％のＦＣＳ及び１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Biochrom,K0302）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中に、更に使用するまで（４時間以内）維持した。死滅アッセイでは、抗体を示された濃度（６ｐＭ−１００ｎＭの範囲で３通り）で加えた。ＰＢＭＣを標的細胞に、最終的なＥ：Ｔの比が１０：１となるように加えた。標的細胞の死滅を、インキュベーションの２１時間後及び４０時間後に、アポトーシス／壊死細胞により細胞上清中に放出されたＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）の定量化（ＬＤＨ検出キット、Roche Applied Science, #11644793001）により評価した。標的細胞の最大溶解（＝１００％）が、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と共になされた標的細胞のインキュベーションにより達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性抗体なしでエフェクター細胞と共にコインキュベートした標的細胞を指す。結果は、ＣＥＡ ＴＣＢが、ヒト（図８２Ａ，Ｃ）及びカニクイザル（図８２Ｂ，Ｄ）エフェクター細胞（ＰＢＭＣ）の両方を使用して、ＣＥＡ陽性標的細胞の標的特異的な死滅を媒介したことを示すものである。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５を使用して算出された、４０時間の死滅に関するＥＣ５０値は、ヒトＰＢＭＣの場合は３０６ｐＭであり、カニクイザルＰＢＭＣの場合は１０２ｐＭである。
【０２９３】
実施例２３
ＣＥＡ ＴＣＢ抗体によって誘導されるＣＥＡ発現ヒト結腸直腸がん細胞株のＴ細胞媒介性死滅
ヒトＰＢＭＣと、０．８ｎＭ、４ｎＭ及び２０ｎＭのＣＥＡ ＴＣＢ抗体とのインキュベーションの４８時間後の、ＣＥＡ発現ヒト結腸直腸がん細胞株のＴ細胞媒介性死滅を評価した。簡単に述べると、ＰＢＭＣを、単一の健常ドナーから得た白血球コーンから単離した。細胞をＰＢＳ（１：１０）で希釈し、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ内でＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ上に重ねた。遠心分離（１８００ｒｐｍで２５分間）後、ＰＢＭＣ層を界面から取り除き、ＰＢＳで４回洗浄した。ＰＢＭＣを計数し、４０×１０６細胞／ｍＬでに制御された速度の凍結条件下でＦＣＳ中において１０％のＤＭＳＯで凍結させ、更なる使用まで液体窒素中に保存した。Ｔ細胞死滅アッセイのために、凍結したストックから腫瘍細胞を直接９６ウェルプレートに播種した。細胞を速やかに温め、直ぐに予め温めた培地中に移し、遠心分離し、完全培地（ＤＭＥＭ，Ｉｓｃｏｖｅｓ又はＲＰＭＩ−１６４０，全て１０％のＦＣＳ及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンが補充）中に再懸濁させ、２．５×１０４細胞／ウェルの密度で播種した。ついでプレートを、加湿した１０％ＣＯ２インキュベーター内において３７℃でインキュベートし、培地を翌日１％グルタミン及び５０μＬ ＣＥＡ ＴＣＢを含む１００μＬのＲＰＭＩ２％ＦＣＳ（６．４から２００００ｐＭの範囲の最終濃度、１：５の滴定工程、各条件につき二つのウェル）によって置き換えた。アッセイには新しく解凍したＰＢＭＣを使用し（アッセイ開始前２時間以内に凍結したバイアルから解凍）、各ウェルに５０μＬ（３×１０５）を加え、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比を１０：１にした。トリトンＸ１００（４％を５０μＬ）を１５０μＬの標的細胞に加え、最大放出値を得た。プレートを３７℃で４８時間インキュベートし、死滅活性を、製造元の指示に従いラクトースデヒドロゲナーゼ細胞傷害性検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して検出した。特異的細胞溶解割合を、［試料放出−自然放出］／［最大放出−自然放出］×１００で計算した。図８３Ａ−Ｃは、ＣＥＡ発現（ＱＩＦＩＫＩＴを使用して定量化した受容体コピー数、以下を参照）と３１の結腸直腸がん細胞株（ｘ軸上に列挙）の％死滅との相関を示している。図８３Ｄは、ＣＥＡ発現とＣＥＡ ＴＣＢ ２０ｎＭにおける％特異的溶解との相関（スピアマンの相関＝０．７２８９，ｐ＜０．０００１，ｎ＝３１）を示しており、大きなＣＥＡ受容体コピー数（＞５００００）を呈する腫瘍細胞がＣＥＡ ＴＣＢにより効率的に溶解させられる一方、小さなＣＥＡ受容体コピー数（＜１００００）を呈する細胞のクラスターが同じ実験条件下でＣＥＡ ＴＣＢにより溶解されないことが示されている。図８３Ｅは、ＣＥＡ発現とＣＥＡ ＴＣＢのＥＣ５０との相関を示している。相関は統計的には有意でないが（スピアマンの相関＝−０．３９９４，ｐ＝０．１００６，Ｒ２＝０．１３５８）、グラフは、大きなＣＥＡ受容体コピー数を発現する腫瘍細胞株ほど良好なＣＥＡ ＴＣＢ効力（すなわち、ＥＣ５０値が低い）を有するというパターンを明らかに示している。
【０２９４】
がん細胞株におけるＣＥＡ表面発現の分析のために、Ｑｉｆｉｋｉｔ（Dako Cytomation, Glostrup, Denmark）を使用して蛍光性シグナルを較正し、細胞毎の結合部位の数を決定した。細胞を、マウス抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５モノクローナル抗体（５×１０５細胞について０．５μｇ、クローン：CI-P83-1, sc-23928, Santa Cruz）と共に氷上で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ１Ｘ−ＢＳＡ０．１％で２回洗浄した後、Ｑｉｆｉｋｉｔで提供されたポリクローナルフルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗マウス抗体と共に４５分間インキュベートした。死細胞を、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色を使用して分析から除いた。試料をＣｙＡｎTM ＡＤＰ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Beckman Coulter）で分析した。全ての平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、Ｓｕｍｍｉｔ４．３ソフトウェアを使用するデータ解析後に得られた。これらＭＦＩは、較正曲線（Ｑｉｆｉｋｉｔキャリブレーションビーズ）から得られた等式を使用して細胞株上の抗体結合部位の相対数（結果的ＣＥＡコピー数と呼ぶ）を決定するために使用した。
Ｔ細胞死滅アッセイ及びＣＥＡ表面発現定量化に使用された結腸直腸がんの細胞株は、クリオバイアル（cryovial）から播種した。凍結ストックを維持するために使用される方法は、Bracht等（Bracht等 (2010), Br J Cancer 103, 340-346）に記載された通りであった。
【０２９５】
実施例２４
ヒトＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ比５：１）を共移植したＬＳ１７４Ｔ−ｆｌｕｃ２ヒト結腸がんにおけるＣＥＡ ＴＣＢのインビボでの抗腫瘍効果
ＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ）マウス（ｎ＝１２）に対し、ＰＢＳ中総体積１００μｌ、Ｅ：Ｔ比５：１の、予めヒトＰＢＭＣと混合した、１×１０６個のＬＳ１７４Ｔ−ｆｌｕｃ２細胞を皮下注射した。ＬＳ１７４Ｔ−ｆｌｕｃ２細胞は、ルシフェラーゼを発現するように改変されており、バイオルミネセンス（ＢＬＩ）により非侵襲的且つ高度に感受性に腫瘍進行をモニタすることができた。早期及び遅延治療効果を評価するために、マウスは、腫瘍細胞／ＰＢＭＳの皮下共移植後１日目（早期治療）又は７日目（遅延治療）を開始日として、２週間に１回０．５又は２．５ｍｇ／ｋｇのＣＥＡ ＴＣＢを静脈内注入された。コントロールとして、１グループのマウスは、２週間に１回ＣＥＡ ＴＣＢと同じフォーマットを有する２．５ｍｇ／ｋｇのコントロールＴＣＢを静脈内注入され（この場合、ＬＳ１７４Ｔ−ｆｌｕｃ２細胞はＭＣＳＰを発現しないため、ＭＣＳＰ ＴＣＢは非標的コントロールの役割を果たした）、もう１つのコントロールグループは１日目を開始日としてＰＢＳ（ビヒクル）のみを投与された。腫瘍体積はデジタルノギスにより週に一度測定した。更に、マウスにはＤ−ルシフェリンを週に一度腹腔内注入し、生腫瘍細胞のバイオルミネセンス光の発光をＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で測定した。治療は腫瘍細胞接種の１９日後まで行われ、その日に試験を終了した。実験結果を図８４Ａ−Ｄに示す。結果は、異なる試験グループ（（Ａ，Ｂ）早期治療、（Ｃ，Ｄ）遅延治療）における、ノギスにより（Ａ及びＣ）、及びバイオルミネセンスにより（全光束、Ｂ及びＤ）測定した１２匹のマウスの腫瘍体積の平均及びＳＥＭを示している。
【０２９６】
実施例２５
ヒトＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ比１：１）を共移植したＬＳ１７４Ｔ−ｆｌｕｃ２ヒト結腸がんにおけるＣＥＡ ＴＣＢのインビボでの抗腫瘍効果
ＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ）マウス（ｎ＝１０）に対し、ＰＢＳ中総体積１００μｌ、Ｅ：Ｔ比１：１の、ヒトＰＢＭＣと予め混合した、１×１０６個のＬＳ１７４Ｔ−ｆｌｕｃ２細胞を皮下注射した（実施例２４参照）。早期及び遅延治療効果を評価するために、マウスは、腫瘍細胞インキュベーション後１日目（早期治療）又は７日目（遅延治療）を開始日として、２週間に１回２．５ｍｇ／ｋｇのＣＥＡ ＴＣＢを静脈内注入された。コントロールとして、１グループのマウスは２週間に１回２．５ｍｇ／ｋｇのＭＣＳＰ ＴＣＢを静脈内注入され（実施例２４参照）、もう一つのコントロールグループは１日目からＰＢＳ（ビヒクル）のみを投与された。腫瘍体積はデジタルノギスにより週に一度測定した。更に、マウスにはＤ−ルシフェリンを週に一度腹腔内注入し、生腫瘍細胞のバイオルミネセンス光の発光をＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Perkin Elmer）で測定した。治療は腫瘍細胞接種の２３日後まで行われ、この日に試験を終了した。実験の結果を図８５に示す。結果は、異なる試験群（ｎ＝１０）における、ノギス（Ａ）及びバイオルミネセンス（Ｂ）により測定された腫瘍体積の平均及びＳＥＭを示している。
【０２９７】
実施例２６
免疫担当性ｈｕＣＤ３ε／ｈｕＣＥＡトランスジェニックマウスのＰａｎｃｏ２−ｈｕＣＥＡ同所性腫瘍モデルにおけるマウス化ＣＥＡ ＴＣＢのインビボでの有効性
ｈｕＣＤ３ε／ｈｕＣＥＡトランスジェニックマウス（ｎ＝１０）に対し、ＰＢＳ中総体積１０μｌの、２×１０５個のＰａｎｃｏ２−ｈｕＣＥＡ細胞を脾臓内注入した。マウス細胞はＣＥＡを発現しないので、マウスの膵臓がん細胞株Ｐａｎｃｏ２を、ＣＥＡ ＴＣＢの標的抗原としてヒトＣＥＡを過剰発現するように改変した。マウスには、１週間に２度、０．５ｍｇ／ｋｇのマウス化ＣＥＡ ＴＣＢを、又はコントロールグループとしてＰＢＳ（ビヒクル）を静脈内注入し、生存率をモニターした。動物は、臨床症状及び有害作用の検出について毎日管理された。動物の終了基準は、視認できる病気、すなわち汚い毛皮、曲がった背中、呼吸不全、運動障害であった。全生存としての結果を図８６に示す。結果は、各時点の生存動物の割合を示している。対応スチューデントｔ検定を使用して（ｐ＝０．０７８）、ＰＢＳコントロール群に対する治療群の有意性を比較した。
【０２９８】
実施例２７
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＣＥＡ及びＣＤ３に対するＣＥＡ ＴＣＢの親和性
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４，０．１５ＭのＮａＣｌ，３ｍＭのＥＤＴＡ，０．００５％の界面活性剤Ｐ２０，Biacore, Freiburg/Germany）を用いて２５℃で実施した。
親和性測定のために、ＣＥＡ ＴＣＢを、固定化された抗ヒトＦａｂ（GE Healthcare #28-9583-25）を用いてＣＭ５センサーチップ表面に捕捉させた。捕捉ＩｇＧは、標準のアミン結合キット（Biacore, Freiburg/Germany）を使用するｐＨ５．０での約１００００共鳴単位（ＲＵ）の直接的固定化により、センサーチップの表面に結合させた。
【０２９９】
ヒトＣＤ３ε ｓｔａｌｋ−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／ＣＤ３δ−ｓｔａｌｋ−Ｆｃ（ホール）（それぞれ、配列番号３７８及び３７９）への相互作用を分析するために、５０ｎＭのＣＥＡ ＴＣＢを１０μｌ／分で３０秒間捕捉した。ＣＤ３ε／ＣＤ３δは、濃度０．６８−５００ｎＭ、流量３０μｌ／分で、３６０秒間にわたりフローセルに通した。解離を３６０秒間モニターした。
ＣＥＡ ＴＣＢと組換え腫瘍標的抗原ヒトＮＡＢＡ−ａｖｉ−ｈｉｓ（Ｃ末端ａｖｉ ６ｈｉｓタグを有するヒトＣＥＡＣＡＭ１のＮ、Ａ１及びＡ２ドメインによって取り囲まれたヒトＣＥＡのＢ３ドメイン（ＣＥＡＣＡＭ５）を含む；配列番号３７７参照）との間の相互作用のＫＤ値を、１０μｌ／分で４０秒間ＴＣＢ分子を捕捉することにより決定した。抗原を０．６８から５００ｎＭの濃度範囲、流量３０μｌ／分でフローセルに２４０秒間流した。解離を２４０秒間モニターした。
【０３００】
バルク屈折率の差は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより修正された。ここで、抗原は、固定化された抗ヒトＦａｂ抗体を有する表面に流したが、その上には、ＣＥＡではなく、ＨＢＳ−ＥＰが注入されていた。
速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（vAA, Biacore AB, Uppsala/Sweden）を用いて導出し、数値積分法により、１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめた。相互作用の半減期（ｔ１／２）を、式：ｔ１／２＝ｌｎ２／ｋｏｆｆを使用して計算した。
ＣＥＡ ＴＣＢは、ｎＭ範囲で腫瘍標的及びＣＤ３ε／ＣＤ３δに結合し、ＫＤ値はヒトＮＡＢＡについては６２ｎＭ、ヒトＣＤ３ε／ＣＤ３δについては７５．３ｎＭであった。ＮＡＢＡへの一価結合の半減期は５．３分であり、ＣＤ３ε／ＣＤ３δに対する結合の半減期は５．７分である。動態値を表１２にまとめる。
2016512421.tif 000021
【０３０１】
実施例２８
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＭＣＳＰ及びＣＤ３に対するＭＳＣＰ ＴＣＢの親和性
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４，０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Biacore, Freiburg/Germany）を用いて２５℃で実施した。
親和性測定のために、固定化された抗ヒトＦａｂ（GE Healthcare #28-9583-25）を用いてＭＣＳＰ ＴＣＢをＣＭ５センサーチップ表面に捕捉した。捕捉ＩｇＧは、標準のアミン結合キット（Biacore, Freiburg/Germany）を使用するｐＨ５．０での約７５００共鳴単位（ＲＵ）の直接的固定化により、センサーチップの表面に結合させた。ＭＳＣＰ ＴＣＢは、３０ｎＭを１０μｌ／分で６０秒間捕捉した。ヒト及びカニクイザルＭＣＳＰ Ｄ３（それぞれ、配列番号３７６及び３７５）は、濃度０．０２４−５０ｎＭ、流量３０μｌ／分で、９０秒間にわたりフローセルに通した。ヒト及びカニクイザルのＣＤ３ε ｓｔａｌｋ−Ｆｃ（ノブ）−Ａｖｉ／ＣＤ３δ−ｓｔａｌｋ−Ｆｃ（ホール）の濃度範囲は１．１７−６００ｎＭであった。マウスＭＣＳＰ Ｄ３（配列番号：３８０）との相互作用は弱いと思われたため、この抗原の濃度範囲を３．９から５００ｎＭの間に選択した。全ての相互作用の解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差を、基準フローセルで得られる応答を差し引くことにより修正した。ここで、抗原は、固定化された抗ヒトＦａｂ抗体を有する表面に流したが、その上には、ＭＣＳＰ ＴＣＢではなく、ＨＢＳ−ＥＰが注入された。
【０３０２】
速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（vAA, Biacore AB, Uppsala/Sweden）を用いて導出し、数値積分法により、１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめた。ＭＣＳＰ ＴＣＢのマウスＭＣＳＰ Ｄ３との相互作用を定常状態において決定した。相互作用の半減期（ｔ１／２）は、式：ｔ１／２＝ｌｎ２／ｋｏｆｆを使用して計算した。
ＭＣＳＰ ＴＣＢは、ｐＭ範囲で腫瘍標的に結合し、ＫＤ値はヒトについては０．１５ｎＭ、カニクイザル抗原については０．１２ｎＭであった。組換えＣＤ３ε／ＣＤ３δには、７８ｎＭ（ヒト）及び１０４ｎＭ（カニクイザル）のＫＤ値でＭＣＳＰ ＴＣＢが結合する。一価結合の半減期は、腫瘍標的については最大２６０分、ＣＤ３ｅ／ＣＤ３ｄについては２．９分である。親和性成熟すると、ＭＣＳＰ抗体は組換えマウスＭＣＳＰ Ｄ３に幾らか結合した。この相互作用のＫＤ値はｍＭ範囲（１．６ｍＭ）である。動態値を表１３にまとめる。
2016512421.tif 000022
【０３０３】
実施例２９
ＣＥＡ ＴＣＢの熱的安定性
ＣＥＡ ＴＣＢの熱的安定性を、Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＤＬＳ）によりモニターした。タンパク質濃度０．５ｍｇ／ｍｌの３０μｇの濾過済みタンパク質試料を２組、Ｄｙｎａｐｒｏプレートリーダー（Wyatt Technology Corporation;USA）に適用した。温度勾配は、０．０５℃／分で２５から７５℃であり、半径及び総散乱強度が収集された。
結果を図８７に示す。ＣＥＡ ＴＣＢの凝集温度は５５℃で測定された。
【０３０４】
実施例３０
ＭＣＳＰ ＴＣＢの熱的安定性
ＭＣＳＰ ＴＣＢの熱的安定性を、Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＤＬＳ）によりモニターした。タンパク質濃度０．５ｍｇ／ｍｌの３０μｇの濾過済みタンパク質試料を２組、Ｄｙｎａｐｒｏプレートリーダー（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ＵＳＡ）に適用した。温度勾配は、０．０５℃／分で２５から７５℃であり、半径及び総散乱強度が収集された。
結果を図８８に示す。ＭＣＳＰ ＴＣＢの凝集温度は５５℃で測定された。
【０３０５】
実施例３１
ＭＣＳＰ ＴＣＢ及びＭＣＳＰ １＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体によって誘導されるＭＣＳＰ発現腫瘍標的細胞のＴ細胞媒介性死滅
ＭＣＳＰ ＴＣＢ及びＭＣＳＰ １＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ ＴＣＢ（ＭＣＳＰ ＴＣＢと同じＣＤ３及びＭＣＳＰ結合配列を有し、分子フォーマットが図１Ｄに示されるＴ細胞活性化二重特異性抗体）抗体によって誘導される標的細胞のＴ細胞媒介性死滅を、Ａ３７５（高ＭＣＳＰ）、ＭＶ−３（中ＭＣＳＰ）及びＨＣＴ−１１６（低ＭＣＳＰ）腫瘍標的細胞において評価した。ＬＳ１８０（ＭＣＳＰ陰性腫瘍細胞株）をネガティブコントロールとして使用した。腫瘍細胞の死滅を、抗体及びエフェクター細胞（ヒトＰＢＭＣ）を用いた標的細胞のインキュベーションの２４時間後及び４８時間後に評価した。簡単に述べると、標的細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで収集し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを使用して２５０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を一晩放置して付着させた。
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、健常なヒトドナーから得た濃縮リンパ球調製物（バフィーコート）のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により調製した。新鮮血を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅグラジエント（Sigma, #H8889）上に層状に重ねた。遠心分離（４５０×ｇ，３０分、室温）後、ＰＢＭＣを含む界面相上の血漿を棄て、ＰＢＭＣを新しいｆａｌｃｏｎチューブに移し、その後５０ｍｌのＰＢＳを満たした。混合物を遠心分離（４００×ｇ，１０分間、室温）し、上清を棄て、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（遠心分離工程：３５０×ｇ，１０分間）。得られたＰＢＭＣ群を自動カウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、細胞インキュベーター内（３７℃、５％ＣＯ２）において、１０％のＦＣＳ及び１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Biochrom, K0302）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中に、更に使用するまで（２４時間以内）保存した。死滅アッセイでは、抗体を示された濃度（０．０１ｐＭ−１０ｎＭの範囲の３通り）で加えた。ＰＢＭＣを、最終的なＥ：Ｔの比が１０：１となるように標的細胞に加えた。標的細胞の死滅を、インキュベーションの２４時間後及び４８時間後に、アポトーシス／壊死細胞により細胞上清中に放出されたＬＤＨの定量化（ＬＤＨ検出キット、Roche Applied Science, #11644793001）により評価した。標的細胞の最大溶解（＝１００％）が、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と共になされた標的細胞のインキュベーションにより達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性抗体なしでエフェクター細胞と共にコインキュベートした標的細胞を指す。結果は、ＭＣＳＰ ＴＣＢ抗体は、それが両時点で全ての腫瘍標的細胞に対してより強力なＭＣＳＰ陽性標的細胞の死滅を誘導することから、ＭＣＳＰ １＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ ＴＣＢより強力であることを示している（図８９Ａ−Ｈ）。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５を使用して計算した死滅アッセイに関するＥＣ５０値を表１４に示す。
2016512421.tif 000023
【０３０６】
実施例３２
ＭＣＳＰ ＴＣＢ抗体及びＭＣＳＰ １＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体によって誘導されるＭＣＳＰ発現腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅後の、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋エフェクター細胞上におけるＣＤ２５及びＣＤ６９のアップレギュレーション
ＭＣＳＰ ＴＣＢ及びＭＣＳＰ １＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体によって媒介されるＭＣＳＰ発現腫瘍細胞（Ａ３７５及びＭＶ−３）のＴ細胞死滅後の、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５（後期活性化マーカー）及びＣＤ６９（初期活性化マーカー）を認識する抗体を使用するＦＡＣＳ解析により評価した。抗体及び死滅アッセイの条件は、基本的に上述した通り（実施例３１）であり、同じ抗体濃度範囲（０．０１ｐＭ−１０ｎＭ、３通り）、Ｅ：Ｔ比１０：１、及び４８時間のインキュベーション時間を用いた。
インキュベーション後、ＰＢＭＣを丸底９６ウェルプレートに移し、３５０×ｇで５分間遠心分離し、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳで２回洗浄した。ＣＤ８（ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ８，BD #555634）、ＣＤ４（ＰＥＣｙ７抗ヒトＣＤ４，BD #557852）、ＣＤ６９（ＰＥ抗ヒトＣＤ６９，Biolegend #310906）及びＣＤ２５（ＡＰＣ抗ヒトＣＤ２５，BD #555434）の表面染色を、供給者の指示に従って実施した。細胞を、０．１％のＢＳＡを含む１５０μｌ／ウェルのＰＢＳを用いて２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの固定バッファー（BD #554655）を使用して４℃で１５分間固定した。遠心分離後、試料を２００μｌ／ウェルのＤＡＰＩ含有ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡに再懸濁し、ＦＡＣＳ測定のために死細胞を除いた。試料をＢＤ ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析した。結果は、ＭＣＳＰ ＴＣＢが、死滅後にＣＤ８＋Ｔ細胞（図９０Ａ，Ｂ（Ａ３７５細胞）及びＥ，Ｆ（ＭＶ−３細胞））上、並びにＣＤ４＋Ｔ細胞（図９０Ｃ，Ｄ（Ａ３７５細胞）及びＧ，Ｈ（ＭＶ−３細胞））上において活性化マーカー（ＣＤ２５，ＣＤ６９）の強力且つ標的特異的なアップレギュレーションを誘導したことを示している。死滅の結果に関して、Ｔ細胞の活性化は、ＭＣＳＰ ＴＣＢの方がＭＣＳＰ １＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂより強力であった。
【０３０７】
実施例３３
非結合抗体としてＤＰ４７ ＧＳを、抗ＣＤ３抗体としてヒト化ＣＨ２５２７を含む、ＤＰ４７ ＧＳ ＴＣＢ（２＋１ Ｃｒｏｓｓｆａｂ−ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ反転型＝「非標的化ＴＣＢ」）の調製
上記実験では「非標的化ＴＣＢ」をコントロールとして使用した。二重特異性抗体は、ＣＤ３εに結合するが、他の何れの抗原にも結合しないので、Ｔ細胞を何れの標的細胞にも架橋させることができない（且つその後死滅を全く誘導することができない）。従って、それを、任意の非特異的Ｔ細胞活性化をモニターするためのアッセイにおいてネガティブコントロールとして使用した。
重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、各レシピエント哺乳動物発現ベクター中に予め挿入された定常重鎖又は定常軽鎖の何れかとインフレームでサブクローニングした。抗体発現はＭＰＳＶプロモーターにより駆動され、ＣＤＳの３’末端に合成ポリＡシグナル配列を有する。加えて、各ベクターはＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
分子を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して哺乳動物発現ベクターを用いてＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をコトランスフェクトすることにより生成させた。細胞を、１：２：１：１の比の（「ベクター重鎖Ｆｃ（ホール）」：「ベクター軽鎖」：「ベクター軽鎖Ｃｒｏｓｓｆａｂ」：「ベクター重鎖Ｆｃ（ノブ）−ＦａｂＣｒｏｓｓｆａｂ」）対応する発現ベクターでトランスフェクトさせた。
トランスフェクションのために、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、ＣＤ ＣＨＯ培地において血清を含めないで懸濁培養した。５００ｍｌの振盪フラスコ内での生成のために、４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０×ｇで５分間遠心分離し、予め温めた２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地により上清を置き換えた。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μｌのＰＥＩ溶液を加えた後、混合物を１５秒間ボルテックスし、その後室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート時間の後、１６０ｍｌのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの一日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ１（Lonza）を加えた。７日後、２１０×ｇで１５分間の遠心分離によって培養物の上清を精製のために収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、最終濃度０．０１％ｗ／ｖのアジ化ナトリウムを加えて４℃に維持した。
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを使用するアフィニティクロマトグラフィーにより細胞培養物の上清から精製した。上清を、４０ｍｌの２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐプロテインＡ ＨＰカラムに充填した（ＣＶ＝５ｍＬ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。結合していないタンパク質を、少なくとも１０カラム体積の２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。標的タンパク質を、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）から２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ２．５）の２０カラム体積にわたる勾配中に溶出させた。タンパク質溶液を、１／１０の０．５Ｍのリン酸ナトリウム、リン酸エステル、リン酸塩又はリン酸エステル（ｐＨ８）を加えることにより中和させた。標的タンパク質を濃縮し、濾過した後、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。
【０３０８】
精製されたタンパク質試料のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。
分子の純度及び分子量は、還元剤の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳ分析により分析した。Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）を、製造元の指示書に従って使用した。２μｇの試料を分析に使用した。
【０３０９】
抗体試料の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３（ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー）中において、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析的サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を使用して分析した。
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図９１及び表１６は、非結合抗体としてＤＰ４７ ＧＳを、抗ＣＤ３抗体としてヒト化ＣＨ２５２７を含むＤＰ４７ ＧＳ ＴＣＢ（２＋１ Ｃｒｏｓｓｆａｂ−ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ反転型）のＣＥ−ＳＤＳ分析を示している。（配列番号：３２５、３２６、３２７及び３２８）。
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【０３１０】
実施例３４
抗ＭＣＳＰ抗体としてＭ４−３（Ｃ１）ＭＬ２（Ｇ３）を、抗ＣＤ３抗体としてヒト化ＣＨ２５２７を含むノブ−イン−ホールＭＣＳＰ ＴＣＢ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ／Ｌ３２５Ｅの調製
変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ３２５Ｅ（ＳＰＬＥ）を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域を持つノブ−イン−ホールＴＣＢを構築した。このＴＣＢは抗ＭＣＳＰ抗体としてＭ４−３（Ｃ１）ＭＬ２（Ｇ３）と抗ＣＤ３抗体としてヒト化ＣＨ２５２７を有している。
重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を各レシピエント哺乳動物発現ベクター中に予め挿入された定常重鎖又は定常軽鎖の何れかとインフレームでサブクローニングした。抗体発現はＭＰＳＶプロモーターによって駆動され、ＣＤＳの３’末端に合成ポリＡシグナル配列を有する。加えて、各ベクターはＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
【０３１１】
分子を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用してＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に哺乳動物の発現ベクターをコトランスフェクトすることにより生成した。細胞を、１：１：２：１の比（「ベクター重鎖Ｆｃ（ホール）」：「ベクター軽鎖Ｃｒｏｓｓｆａｂ」：「ベクター軽鎖」：「ベクター重鎖Ｆｃ（ノブ）−ＦａｂＣｒｏｓｓｆａｂ」）の対応する発現ベクターでトランスフェクトした。
トランスフェクションのために、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、ＣＤ ＣＨＯ培地において血清を含めないで懸濁培養した。５００ｍｌの振盪フラスコ内での生成のために、４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０×ｇで５分間遠心分離し、予め温めた２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地により上清を置き換えた。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μになるまで２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μのＰＥＩ溶液を加えた後、混合物を１５秒間ボルテックスし、その後室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート時間の後、１６０ｍｌのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの一日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ１（Ｌｏｎｚａ）を加えた。７日後、２１０×ｇで１５分間の遠心分離によって培養物の上清を精製のために収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、最終濃度０．０１％ｗ／ｖのアジ化ナトリウムを加えて４℃に維持した。
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを使用するアフィニティクロマトグラフィーによって細胞培養物上清から精製した。上清を、３６ｍｌの２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．０１％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ−２０，ｐＨ７．５で平衡化させたＰＯＲＯＳ（登録商標）ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ（商標）Ａパーフュージョンクロマトグラフィー（登録商標）媒体（ＣＶ＝４ｍＬ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を充填した４ｍｌカラムに充填した。標的タンパク質を、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ７．５から２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．０１％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ−２０，ｐＨ２．５まで２０カラム体積にわたる勾配中に溶出させた。タンパク質溶液を、１／１０の０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８）を加えることにより中和させた。標的タンパク質を濃縮し、濾過した後、２０ｍＭのヒチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム溶液、０．０１％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ−２０溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。
精製されたタンパク質試料のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することにより決定した。分子の純度及び分子量は、還元剤の存在下及び非存在下においてＣＥ−ＳＤＳ分析によって分析した。Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）を製造者の指示書に従って使用した。２μｇの試料を分析のために使用した。抗体試料の凝集物含有量を、２５℃での２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファー中で、ＴＳＫゲルＧ３０００ ＳＷ ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を使用して分析した。
ホール中にノブを持ちＳＰＬＥ変異を有するヒトＩｇＧ４を使用して、良好な品質と高収率を持つヘテロ二量体Ｔ細胞二重特異性分子を作製することができる。ｈＩｇＧ１ノブイントゥホールＰ３２９Ｇ ＬＡＬＡに基づくＴ細胞二重特異性体と比較すると、これらの分子は、表１７に示される第一の精製工程後の高収率と低凝集体含有量に反映されるようにより安定していると思われた。
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図９２はＭＣＳＰ ＴＣＢ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ／Ｌ３２５Ｅ（配列番号：２７８、３１９、３６９及び３７０）分子の模式図を示す。
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図９３及び表１８はＭＣＳＰ ＴＣＢ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ／Ｌ３２５Ｅ分子（配列番号：２７８、３１９、３６９、及び３７０）のＣＥ−ＳＤＳ分析を示す。
【０３１２】
実施例３５
ＭＣＳＰ発現及びＣＤ３発現細胞へのＭＣＳＰ ＴＣＢ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ／Ｌ３２５Ｅの結合
ＭＣＳＰ ＴＣＢ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ／Ｌ３２５Ｅの結合を、ＭＣＳＰ発現ヒトメラノーマ細胞株（ＭＶ−３）及びＣＤ３発現不死化Ｔリンパ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）で試験した。簡単に述べると、細胞を収集し、計数し、生存率について調べ、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ０．１％ ＢＳＡ）中に２×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させた。１００μｌの細胞懸濁液（０．２×１０６細胞を含む）を、増加濃度のｈＩｇＧ４ ＳＰＬＥ ＴＣＢ（３ｐＭ−２００ｎＭ）と共に４℃で３０分間、丸底９６ウェルプレート中でインキュベートし、冷ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、ＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ ＰＥ ＃１０９−１１６−１７０）と共に４℃で更に３０分間、再インキュベートし、冷ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（ソフトウェアＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を使用してＦＡＣＳによって直ぐに分析した。結合曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５を使用して得た（図９４Ａ，ＭＶ−３細胞への結合，ＥＣ５０＝２０２９ｐＭ；図９４Ｂ，Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合）。
【０３１３】
実施例３６
ＭＣＳＰ ＴＣＢ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ／Ｌ３２５Ｅにより誘導されたＴ細胞死滅
ＭＣＳＰ ＴＣＢ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ／Ｌ３２５Ｅによって媒介されるＴ細胞死滅が、２４時間及び４８時間のインキュベーションのＭＣＳＰ発現ヒトメラノーマ腫瘍細胞（ＭＶ−３）及びヒトＰＢＭＣを使用して評価された。簡単に述べると、標的細胞がトリプシン／ＥＤＴＡで収集され、洗浄され、平底９６ウェルプレートを使用して２５０００細胞／ウェルの密度で播種された。細胞は一晩放置して付着させられた。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、健常なヒトドナーから得た濃縮リンパ球調製物のヒストパック密度遠心分離によって調製された（バフィーコート）。新鮮血が滅菌ＰＢＳで希釈され、ヒストパックグラジエント（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ８８８９）上に層状に重ねられた。遠心分離（４５０ｘｇ，３０分，室温）後、ＰＢＭＣ含有内相上の血漿が捨てられ、ＰＢＭＣが新しいＦａｌｃｏｎチューブに移され、ついで５０ｍｌのＰＢＳが満たされた。混合物が遠心分離（４００ｘｇ，１０分，室温）され、上清が捨てられ、ＰＢＭＣペレットが滅菌ＰＢＳで２回洗浄された（遠心分離工程３５０ｘｇ，１０分）。得られたＰＢＭＣ群が自動的に計数され（ＶｉＣｅｌｌ）、更なる使用まで（２４時間以内）細胞インキュベーター中、５％ＣＯ２、３７℃で１０％ＦＣＳと１％Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｋ０３０２）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で保存された。死滅アッセイでは、抗体が示された濃度（０．０２ｐＭ−２０ｎＭの範囲の３通り）で添加された。ＰＢＭＣは１０：１の最終Ｅ：Ｔ比で標的細胞に加えられた。標的細胞死滅は、アポトーシス／壊死細胞により細胞上清中に放出されたＬＤＨの定量（ＬＤＨ検出キット，Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，＃１１６４４７９３００１）によって、３７℃、５％ＣＯ２での２４時間及び４８時間のインキュベーション後に評価された。標的細胞の最大の溶解（＝１００％）は１％のトリトンＸ−１００を用いた標的細胞のインキュベーションによって達成された。最小の溶解（＝０％）は二重特異性コンストラクトなしでエフェクター細胞と共にコインキュベートされた標的細胞を意味する。結果は、ｈＩｇＧ４ ＳＰＬＥ ＴＣＢがＭＣＳＰ陽性標的細胞株の強い標的特異的死滅を誘導したことを示している（図９５Ａ，Ｂ）。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５を使用して計算された死滅アッセイに関するＥＣ５０値は表１９に与えられる。
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【０３１４】
実施例３７
抗ＭＣＳＰ抗体としてＭ４−３（Ｃ１）ＭＬ２（Ｇ３）を、抗ＣＤ３抗体としてヒト化ＣＨ２５２７を含むノブ−イン−ホール型ＭＣＳＰ ＴＣＢ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ／Ｌ３２５Ｅ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡの調製
変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ３２５Ｅ（ＳＰＬＥ）を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域とＰ３２９Ｇ ＬＡＬＡを含むノブ−イン−ホール型ＴＣＢが構築される。このＴＣＢは抗ＭＣＳＰ抗体としてＭ４−３（Ｃ１）ＭＬ２（Ｇ３）を、抗ＣＤ３抗体としてヒト化ＣＨ２５２７を有する。
重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、各レシピエント哺乳動物発現ベクター中に予め挿入された定常重鎖又は定常軽鎖の何れかとインフレームでサブクローニングする。抗体発現はＭＰＳＶプロモーターによって駆動され、ＣＤＳの３’末端に合成ポリＡシグナル配列を有する。加えて、各ベクターはＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
分子を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用してＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に哺乳動物発現ベクターをコトランスフェクトすることにより生成する。細胞を、１：１：２：１の比（「ベクター重鎖Ｆｃ（ホール）」：「ベクター軽鎖Ｃｒｏｓｓｆａｂ」：「ベクター軽鎖」：「ベクター重鎖Ｆｃ（ノブ）ＦａｂＣｒｏｓｓｆａｂ」）の対応発現ベクターでトランスフェクトする。
【０３１５】
トランスフェクションのために、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、ＣＤ ＣＨＯ培地において血清を含めないで懸濁培養する。５００ｍｌの振盪フラスコ内での生成のために、４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種する。トランスフェクションのために、細胞を２１０×ｇで５分間遠心分離し、予め温めた２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地により上清を置き換える。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に２００μｇになるまで２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地中で混合する。５４０μｌのＰＥＩ溶液を加えた後、混合物を１５秒間ボルテックスし、その後室温で１０分間インキュベートする。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートする。インキュベート時間の後、１６０ｍｌのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養する。トランスフェクションの一日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄ１（Lonza）を加える。７日後、２１０×ｇで１５分間の遠心分離によって培養物の上清を精製のために収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、最終濃度０．０１％ｗ／ｖのアジ化ナトリウムを加えて４℃に維持する。
【０３１６】
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを使用するアフィニティクロマトグラフィーにより細胞培養物の上清から精製する。上清を、３６ｍｌの２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．０１％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ−２０，ｐＨ７．５で平衡化したＰＯＲＯＳ（登録商標）ＭａｂＣａｐｔｕｒｅＴＭＡパーフュージョンクロマトグラフィー（登録商標）媒体を充填した４ｍｌカラムに充填する（ＣＶ＝４ｍＬ，Applied Biosystems）。結合していないタンパク質を、少なくとも１０カラム体積の２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．０１％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ−２０，ｐＨ７．５で洗浄することにより除去する。標的タンパク質を、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）から２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．０１％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ−２０（ｐＨ２．５）の２０カラム体積にわたる勾配中に溶出させる。タンパク質溶液を、１／１０の０．５Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ８）を加えることにより中和させる。標的タンパク質を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム溶液、０．０１％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ−２０（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（GE Healthcare）に充填する。
【０３１７】
精製されたタンパク質試料のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定する。分子の純度及び分子量は、還元剤の存在下及び非存在下において、ＣＥ−ＳＤＳ分析により分析する。Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステム（Caliper lifescience）を、製造元の指示書に従って使用する。２μｇの試料を分析に使用する。抗体試料の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３（ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー）中において、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析的サイズ除外カラム（Tosoh）を使用して分析した。
【０３１８】
実施例３８
ＭＣＳＰ発現及びＣＤ３発現細胞へのＭＣＳＰ ＴＣＢ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ／Ｌ３２５Ｅ Ｐ３２９Ｇの結合
ＭＣＳＰ ＴＣＢ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ／Ｌ３２５Ｅ Ｐ３２９Ｇの結合を、ＭＣＳＰ発現ヒトメラノーマ細胞株（ＭＶ−３）及びＣＤ３発現不死化Ｔリンパ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）で試験する。簡単に述べると、細胞を収集し、計数し、生存率について調べ、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡ）中に２×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させる。１００μｌの細胞懸濁液（０．２×１０６細胞を含む）を、増加濃度のｈＩｇＧ４ ＳＰＬＥ ＰＧ ＴＣＢ（３ｐＭ−２００ｎＭ）と共に４℃で３０分間、丸底９６ウェルプレート中でインキュベートし、冷ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、ＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的二次抗体（Jackson Immuno Research Lab PE #109-116-170）と共に４℃で更に３０分間、再インキュベートし、冷ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（ソフトウェアＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を使用してＦＡＣＳによって直ぐに分析する。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５を使用して結合曲線を得る。
【０３１９】
実施例３９
ＭＣＳＰ ＴＣＢ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ／Ｌ３２５Ｅ Ｐ３２９Ｇにより誘導されたＴ細胞死滅
ＭＣＳＰ ＴＣＢ ｈＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ／Ｌ３２５Ｅによって媒介されるＴ細胞死滅が、２４時間及び４８時間のインキュベーションのＭＣＳＰ発現ヒトメラノーマ腫瘍細胞（ＭＶ−３）及びヒトＰＢＭＣを使用して評価される。簡単に述べると、標的細胞がトリプシン／ＥＤＴＡで収集され、洗浄され、平底９６ウェルプレートを使用して２５０００細胞／ウェルの密度で播種される。細胞は一晩放置して付着させられる。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、健常なヒトドナーから得た濃縮リンパ球調製物のヒストパック密度遠心分離によって調製される（バフィーコート）。新鮮血が滅菌ＰＢＳで希釈され、ヒストパックグラジエント（Sigma, #H8889）上に層状に重ねられる。遠心分離（４５０ｘｇ，３０分，室温）後、ＰＢＭＣ含有内相上の血漿が捨てられ、ＰＢＭＣが新しいＦａｌｃｏｎチューブに移され、ついで５０ｍｌのＰＢＳが満たされる。混合物が遠心分離（４００ｘｇ，１０分，室温）され、上清が捨てられ、ＰＢＭＣペレットが滅菌ＰＢＳで２回洗浄される（遠心分離工程３５０ｘｇ，１０分）。得られたＰＢＭＣ群が自動的に計数され（ＶｉＣｅｌｌ）、更なる使用まで（２４時間以内）細胞インキュベーター中、５％ＣＯ２、３７℃で１０％ＦＣＳと１％Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｋ０３０２）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で保存される。死滅アッセイでは、抗体が示された濃度（０．０２ｐＭ−２０ｎＭの範囲の３通り）で添加される。ＰＢＭＣは１０：１の最終Ｅ：Ｔ比で標的細胞に加えられる。標的細胞死滅は、アポトーシス／壊死細胞により細胞上清中に放出されたＬＤＨの定量（ＬＤＨ検出キット，Roche Applied Science, #11644793001）によって、３７℃、５％ＣＯ２での２４時間及び４８時間のインキュベーション後に評価される。標的細胞の最大の溶解（＝１００％）は１％のトリトンＸ−１００を用いた標的細胞のインキュベーションによって達成される。最小の溶解（＝０％）は二重特異性コンストラクトなしでエフェクター細胞と共にコインキュベートされた標的細胞を意味する。
配列番号：３７１及び３７２はＩｇＧ４ ＳＰＬＥ ＰＧ重鎖のものであり、配列番号：２７８及び３１９は軽鎖のものである。
【０３２０】
前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示及び実施例によってある程度詳細に説明してきたが、説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。全ての特許及び本明細書に引用される科学文献の開示は、参照によりその全体が援用される。
【図１Ａ−Ｇ】
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【図１Ｈ−Ｍ】
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【図３】
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【図５】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図８Ｃ−Ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ−Ｂ】
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【図１８Ｃ−Ｄ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４２】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４６Ｄ】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５５Ａ】
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【図５５Ｂ】
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【図５６Ａ】
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【図５６Ｂ】
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【図５７Ａ】
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【図５７Ｂ】
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【図５８Ａ】
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【図５８Ｂ】
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【図５９Ａ】
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【図５９Ｂ】
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【図６０Ａ】
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【図６０Ｂ】
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【図６１Ａ】
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【図６１Ｂ】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４Ａ】
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【図６４Ｂ】
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【図６５Ａ】
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【図６５Ｂ】
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【図６６】
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【図６７Ａ】
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【図６７Ｂ】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４Ａ−Ｂ】
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【図７４Ｃ−Ｄ】
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【図７５Ａ−Ｂ】
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【図７５Ｃ−Ｄ】
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【図７６Ａ−Ｃ】
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【図７６Ｄ−Ｆ】
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【図７７】
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【図７８Ａ−Ｄ】
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【図７８Ｅ−Ｈ】
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【図７９Ａ−Ｄ】
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【図７９Ｅ−Ｈ】
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【図８０Ａ−Ｃ】
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【図８０Ｄ−Ｆ】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３Ａ】
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【図８３Ｂ】
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【図８３Ｃ】
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【図８３Ｄ−Ｅ】
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【図８４Ａ−Ｂ】
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【図８４Ｃ−Ｄ】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９Ａ−Ｄ】
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【図８９Ｅ−Ｈ】
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【図９０Ａ−Ｄ】
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【図９０Ｅ−Ｈ】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2016512421.tif 000155
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図４７】
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【図５４Ａ−Ｃ】
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【図５４Ｄ−Ｆ】
2016512421.tif 000161
【図５４Ｇ−Ｉ】
2016512421.tif 000162
【図５４Ｊ−Ｋ】
2016512421.tif 000163
【図５４Ｌ−Ｍ】
2016512421.tif 000164
【図５４Ｎ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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