(57)【要約】【課題】【解決手段】薬学的に許容される形態のＰ２Ｙ１２阻害剤と共に、薬学的に許容される形態の（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸を用いて、糖尿病患者における心血管リスクを治療する方法を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病患者における心血管イベントのリスクを軽減する方法であって、薬学的有効量の薬学的に許容される形態のＰ２Ｙ１２阻害剤を前記患者に投与すると共に、治療有効量の薬学的に許容される形態の化合物（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項２】
前記Ｐ２Ｙ１２阻害剤が、カングレロール、プラスグレル、チカグレロール、エリノグレル、クロピドグレル、またはチクロピジン、およびそれらの組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸および前記Ｐ２Ｙ１２阻害剤を同時に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸および前記Ｐ２Ｙ１２阻害剤を順次投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記治療有効量の（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸が、１日当たり、前記患者の体重１ｋｇにつき、約０．０００１ｍｇ〜約２０ｍｇの用量の（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記治療有効量の（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸が、１日当たり、前記患者の体重１ｋｇにつき、約０．００１ｍｇ〜約１ｍｇの用量の（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記心血管イベントが、心筋梗塞、血栓症、血栓性疾患、ステント誘発血栓形成、ステント誘発再狭窄、ステント誘発過形成、肺高血圧症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、網膜症、糖尿病性網膜症、末梢動脈疾患、下肢循環、肺塞栓症、血栓形成、過形成、敗血症性ショック、子癇前症、喘息、鼻炎、アレルギー性鼻炎、腫瘍血管新生または腫瘍転移である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
糖尿病患者における血管炎症を治療する方法であって、薬学的有効量の薬学的に許容される形態のＰ２Ｙ１２阻害剤を前記患者に投与すると共に、治療有効量の薬学的に許容される形態の化合物（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項９】
糖尿病患者における血管炎症を軽減する方法であって、薬学的有効量の薬学的に許容される形態のＰ２Ｙ１２阻害剤を前記患者に投与すると共に、治療有効量の薬学的に許容される形態の化合物（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項１０】
糖尿病患者における血小板反応性を低下させる方法であって、薬学的有効量の薬学的に許容される形態のＰ２Ｙ１２阻害剤を前記患者に投与すると共に、治療有効量の薬学的に許容される形態の化合物（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項１１】
糖尿病患者における血管機能を向上させる方法であって、薬学的有効量の薬学的に許容される形態のＰ２Ｙ１２阻害剤を前記患者に投与すると共に、治療有効量の薬学的に許容される形態の化合物（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項１２】
糖尿病患者における血管酸化ストレスを軽減する方法であって、薬学的有効量の薬学的に許容される形態のＰ２Ｙ１２阻害剤を前記患者に投与すると共に、治療有効量の薬学的に許容される形態の化合物（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸を前記患者に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１３年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７８１，９５３号明細書および２０１２年１２月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／７３８，６１９号明細書の利益を主張するものであり、その双方の開示事項の全内容を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
［技術分野］
本発明は、治療有効量の薬学的に許容される形態のＰ２Ｙ１２阻害剤を糖尿病患者に投与すると共に、治療有効量の薬学的に許容される形態の化合物（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸（(Z)-6-((2S,4S,5R)-2-(2-chlorophenyl)-4-(2-hydroxyphenyl)-1,3-dioxan-5-yl)hex-4-enoic acid）を前記糖尿病患者に投与することを含む、糖尿病患者における心血管リスクを治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
世界保健機構（ＷＨＯ）によると、全糖尿病人口は、２０００年に１億７１００万人であったが、２０３０年には３億６６００万人に増加すると予想されている。２型糖尿病は、最も一般的なタイプの糖尿病である。糖尿病合併症は、一生涯の間に全糖尿病患者の８０％以上に発症する全身性疾患の症状である。糖尿病を有する期間が長いほど、これら合併症の一つを個別に発症する可能性のみならず、これらが組み合わさって発症する可能性が高くなり、その場合、それら自体が緊急の治療を要することになる。糖尿病合併症は、微小血管性、大血管性または神経障害性に大きく分けられる。微小血管性合併症としては、神経障害（神経損傷）、腎障害（腎疾患）および視覚障害（例えば、網膜症、緑内障、白内障および角膜疾患）が挙げられる。大血管性合併症としては、心疾患、脳卒中および末梢血管疾患（これは、潰瘍、壊疽および切断につながり得る）が挙げられる。神経障害性合併症としては、自律神経性および末梢神経性のものを挙げることができ、足または下腿の変形および切断が含まれる。これらの症状は全て治療が困難である。
【０００４】
糖尿病合併症の実際の有病率を確定するのは困難であり、これら合併症の治療は更に困難である。
【０００５】
現行の糖尿病の治療および予防法は、糖尿病に伴って起こる合併症に重点を置いていない、すなわち、対象としていない。アテローム血栓症は、糖尿病疾患に伴って起こる深刻な合併症である。抗血小板薬、シクロオキシゲナーゼ阻害薬およびＰ２Ｙ１２レセプターアンタゴニストなどのアテローム血栓症の単剤療法治療および予防は、プロスタノイドの作用や、イソプロスタンなどの非酵素的に形成された物質の作用を緩和するのには全く役立たない。
【０００６】
相当数の糖尿病患者は、心臓、脳および腎臓を含む様々な臓器において血管合併症を発症する危険性が高いため、糖尿病患者および糖尿病疾患に対処する上で現行の治療手段は緊急に必要とされている。
【０００７】
よって、糖尿病および糖尿病合併症の予防、急性治療および慢性治療のための療法または複数療法の併用に対する需要が引き続き存在している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記背景に鑑みて、本発明は、先行技術に対し、特定の利点を提供し発展させるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書に記載の本発明は、特定の利点または機能性に限定されるものではないが、本発明は、いくつかの実施形態において、糖尿病患者における心血管イベントのリスクを軽減する方法であって、薬学的有効量の薬学的に許容される形態のＰ２Ｙ１２阻害剤を患者に投与すると共に、治療有効量の薬学的に許容される形態の化合物（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸を患者に投与することを含む方法を提供するものである。
【００１０】
前記化合物（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸は、二重性のトロンボキサンレセプター（ＴＰ）アンタゴニストおよびトロンボキサンシンターゼ（ＴＳ）阻害剤である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、炎症または酸化マーカーをコードする目的の遺伝子のｍＲＮＡ発現に対する化合物３の効力を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、炎症または酸化マーカーをコードする目的の遺伝子のｍＲＮＡ発現に対する化合物３の効力を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、６時間のインキュベーション後ＨＵＶＥＣにおいてＴＮＦαにより誘発したＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１タンパク質発現に対する化合物３の効力を示す。Ｂ）全タンパク質抽出物を回収し、ウエスタンブロットにより分析する。β−アクチンは、ローディングコントロールの役割を果たす。
【図２Ｃ】図２Ｃは、６時間のインキュベーション後ＨＵＶＥＣにおいてＴＮＦαにより誘発したＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１タンパク質発現に対する化合物３の効力を示す。Ｃ）各バンドの光学濃度の定量化。結果は、ＶＣＡＭ−１またはＩＣＡＭ−１の光学濃度とβ−アクチンの光学濃度との比として表す。
【図３Ａ】図３Ａは、６時間のインキュベーション後のＨＵＶＥＣによる６−ケトＰＧＦ１α分泌に対する化合物３およびＴＮＦαの効力を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、６時間のインキュベーション後のＨＵＶＥＣにおける、ＰＴＸ３の分泌に対する化合物３およびＴＮＦαの効力を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、６時間のインキュベーション後のＨＵＶＥＣにおけるＴＮＦαにより誘発されたＰＡＲＰ切断に対する化合物（Ｃｏｍｐｕｎｄ）３の効力を示す。Ｃ）全タンパク質抽出物を回収し、ウエスタンブロットにより分析する。β−アクチンは、ローディングコントロールとしての役割を果たす。
【図３Ｄ】図３Ｄは、６時間のインキュベーション後のＨＵＶＥＣにおけるＴＮＦαにより誘発されたＰＡＲＰ切断に対する化合物（Ｃｏｍｐｕｎｄ）３の効力を示す。Ｄ）各バンドの光学濃度の定量化およびＰＡＲＰ切断の光学濃度とＰＡＲＰ総量の比の表示。
【図４】図４は、６時間のインキュベーション後のＨＵＶＥＣにおけるトロンビン生成に対する化合物３およびＴＮＦαの効力を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、６時間のインキュベーション後のＨＵＶＥＣにおけるトロンビン生成に対する化合物３およびＴＮＦαの効力を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＷＳＴ−１試薬により評価したヒト冠状動脈平滑筋細胞の増殖に対するＴＰレセプターアゴニストＵ４６６１９の効力を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、ＷＳＴ−１試薬により評価した、Ｕ４６６１９により誘発されたヒト冠状動脈平滑筋細胞の増殖に対する、二重性のＴＰレセプターアンタゴニストおよびトロンボキサンシンターゼ阻害剤である化合物３の効力を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、化合物３を使用しておよび使用することなくアスピリン治療を受けた患者のクエン酸抗凝固処理ＰＲＰ（ＬＴＡ）における血小板凝集の比較を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、化合物３を使用しておよび使用することなくクロピドグレル治療を受けた患者のクエン酸抗凝固処理ＰＲＰ（ＬＴＡ）における血小板凝集の比較を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、化合物３とアスピリンまたはクロピドグレルのいずれかとを用いて治療したクエン酸抗凝固処理ＰＲＰ（ＬＴＡ）患者における血小板凝集の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
他の実施形態において、前記Ｐ２Ｙ１２阻害剤は、カングレロール（cangrelor）、プラスグレル（prasugrel）、チカグレロール（ticagrelor）、エリノグレル（elinogrel）、クロピドグレル（clopidogrel）（プラビックス（Ｐｌａｖｉｘ）（登録商標））またはチクロピジン（ticlopidine）、およびそれらの組合せ、ならびに、一定量の薬学的に許容される形態の化合物（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸から選択される。
【００１３】
他の実施形態においては、（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸およびＰ２Ｙ１２阻害剤を同時に投与する。
【００１４】
他の実施形態においては、（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸およびＰ２Ｙ１２阻害剤を順次投与する。
【００１５】
他の実施形態において、前記治療有効量の（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸とは、１日当たり、患者の体重１ｋｇにつき、約０．０００１ｍｇ〜約２０ｍｇの用量の（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸である。
【００１６】
他の実施形態において、前記治療有効量の（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸とは、１日当たり、患者の体重１ｋｇにつき、約０．００１ｍｇ〜約１ｍｇの用量の（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸である。
【００１７】
いくつかの実施形態において、前記心血管イベントとは、心筋梗塞、血栓症、血栓性疾患、ステント誘発血栓形成、ステント誘発再狭窄、ステント誘発過形成、肺高血圧症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、網膜症、糖尿病性網膜症、末梢動脈疾患、下肢循環、肺塞栓症、血栓形成、過形成、敗血症性ショック、子癇前症、喘息、鼻炎、アレルギー性鼻炎、腫瘍血管新生または腫瘍転移である。
【００１８】
他の実施形態は、糖尿病患者における血管炎症を治療する方法であって、薬学的有効量の薬学的に許容される形態のＰ２Ｙ１２阻害剤を前記患者に投与すると共に、治療有効量の薬学的に許容される形態の化合物（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸を前記患者に投与することを含む方法を開示する。
【００１９】
他の実施形態は、糖尿病患者における血管炎症を軽減する方法であって、薬学的有効量の薬学的に許容される形態のＰ２Ｙ１２阻害剤を前記患者に投与すると共に、治療有効量の薬学的に許容される形態の化合物（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸を前記患者に投与することを含む方法を開示する。
【００２０】
他の実施形態は、糖尿病患者における血小板反応性を低下させる方法であって、薬学的有効量の薬学的に許容される形態のＰ２Ｙ１２阻害剤を前記患者に投与すると共に、治療有効量の薬学的に許容される形態の化合物（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸を前記患者に投与することを含む方法を開示する。
【００２１】
他の実施形態は、糖尿病患者における血管機能を向上させる方法であって、薬学的有効量の薬学的に許容される形態のＰ２Ｙ１２阻害剤を前記患者に投与すると共に、治療有効量の薬学的に許容される形態の化合物（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸を前記患者に投与することを含む方法を開示する。
【００２２】
他の実施形態は、糖尿病患者における血管炎症および酸化ストレスを軽減する方法であって、薬学的有効量の薬学的に許容される形態のＰ２Ｙ１２阻害剤を前記患者に投与すると共に、治療有効量の薬学的に許容される形態の化合物（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸を前記患者に投与することを含む方法を開示する。
【００２３】
本発明のこれらおよびその他の特徴および利点は、添付の図面および特許請求の範囲と共に、本発明に関する以下の詳細な説明により更によく理解される。特許請求の範囲は、特許請求の範囲における記載により定義されるものであって、本明細書に記載した特徴および利点の特定の説明によって定義されるものではない。
【００２４】
本開示において、以下の略語を使用する。
ＰＤは、薬力学を意味する。
ＴＢＳは、ｔｅｒｔ-ブチルアミン塩を意味する。
ＴＰは、トロンボキサンレセプターを意味する。
ＴＳは、トロンボキサンシンターゼを意味する。
ＴｘＡ2は、トロンボキサンＡ２を意味する。
ＴｘＢ2は、トロンボキサンＢ２を意味する。
ＣＶＤは、脳血管疾患を意味する。
ＴＩＡは、一過性脳虚血発作を意味する。
ＡＡは、アラキドン酸を意味する。
ＰＲＰは、多血小板血漿を意味する。
ＰＰＰは、乏血小板血漿を意味する。
ＭＥＡは、マルチプレートアナライザを意味する。
ＬＴＡは、光透過凝集測定を意味する。
ｈｓ−ＣＲＰは、Ｃ反応性タンパク質を意味する。
ＦＰＡは、フィブリンペプチドＡを意味する。
ＡＤＰは、アデノシン二リン酸を意味する。
【００２５】
［図面の簡単な説明］
［図１および図２Ａ］図１および図２Ａは、炎症または酸化マーカーをコードする目的の遺伝子のｍＲＮＡ発現に対する化合物３の効力を示す。ｍＲＮＡ発現は、ＴＮＦα刺激の６時間後ＨＵＶＥＣにおける定量ＲＴ-ＰＣＲによって評価する。データは、平均値±標準偏差（ｎ＝３）である。統計解析：一元配置分散分析後ボンフェローニ法、対ＣＴＬ  ＮＳ  ｐ＞０，０５、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１；対ＴＮＦα  ＄ｐ＜０．０５、＄＄ｐ＜０．０１、＄＄＄ｐ＜０．００１。
【００２６】
［図２Ｂおよび図２Ｃ］図２Ｂおよび図２Ｃは、６時間のインキュベーション後ＨＵＶＥＣにおいてＴＮＦαにより誘発したＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１タンパク質発現に対する化合物３の効力を示す。Ｂ）全タンパク質抽出物を回収し、ウエスタンブロットにより分析する。β−アクチンは、ローディングコントロールの役割を果たす。Ｃ）各バンドの光学濃度の定量化。結果は、ＶＣＡＭ−１またはＩＣＡＭ−１の光学濃度とβ−アクチンの光学濃度との比として表す。
【００２７】
［図３Ａ］図３Ａは、６時間のインキュベーション後のＨＵＶＥＣによる６−ケトＰＧＦ１α分泌に対する化合物３およびＴＮＦαの効力を示す。６−ケトＰＧＦ１α分泌は、特異的ＥＩＡアッセイにより評価する。結果は、細胞可溶化物に関してフォリン法により測定したマイクログラムのタンパク質に対し報告された６−ケトＰＧＦ１αをピコグラムで示している。データは、平均値±標準偏差（ｎ＝３）である。統計解析：一元配置分散分析後ボンフェローニ法、対ＣＴＬ、*ｐ＜０．０５。
【００２８】
［図３Ｂ］図３Ｂは、６時間のインキュベーション後のＨＵＶＥＣにおける、ＰＴＸ３の分泌に対する化合物３およびＴＮＦαの効力を示す。ＰＴＸ３の分泌は、特異的ＥＬＩＳＡにより評価する。結果は、細胞可溶化物に関してフォリン法により測定したマイクログラムのタンパク質に対し報告されたＰＴＸ３をピコグラムで示している。データは、平均値±標準偏差（ｎ＝３）である。統計解析：一元配置分散分析後ボンフェローニ法、対ＣＴＬ、ＮＳ  ｐ＞０．０５。
【００２９】
［図３Ｃおよび図３Ｄ］図３Ｃおよび図３Ｄは、６時間のインキュベーション後のＨＵＶＥＣにおけるＴＮＦαにより誘発されたＰＡＲＰ切断に対する化合物（Ｃｏｍｐｕｎｄ）３の効力を示す。Ｃ）全タンパク質抽出物を回収し、ウエスタンブロットにより分析する。β−アクチンは、ローディングコントロールとしての役割を果たす。Ｄ）各バンドの光学濃度の定量化およびＰＡＲＰ切断の光学濃度とＰＡＲＰ総量の比の表示。
【００３０】
［図４および図５Ａ］図４および図５Ａは、６時間のインキュベーション後のＨＵＶＥＣにおけるトロンビン生成に対する化合物３およびＴＮＦαの効力を示す。トロンビン生成は、ＣＡＴアッセイ法により評価する。結果は、Ａ）５ｐＭのＴＦ（組織因子）および４μＭのＰＬ（リン脂質）、Ｂ）１ｐＭのＴＦおよび４μＭのＰＬ、Ｃ）４μＭのＰＬによって凝固が誘発される場合の経時的（分）な活性トロンビン濃度（ｎＭ）を示す。Ｄ）およびＥ）は、４μＭのＰＬによって凝固が誘発される場合の遅延時間および活性トロンビン濃度に関する別個のグラフ。データは、平均値±１標準偏差（ｎ＝３）として示す。
【００３１】
［図５Ｂ］図５Ｂは、ＷＳＴ−１試薬により評価したヒト冠状動脈平滑筋細胞の増殖に対するＴＰレセプターアゴニストＵ４６６１９の効力を示す。実験は、ＦＣＳ（２％）の存在下か、ＦＣＳ（５％）、ＦＧＦ（２ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（０．５ｎｇ／ｍｌ）、およびインスリン（５μｇ／ｍｌ）の存在下かのいずれかで行われる。結果は、各濃度におけるｎ＝３〜７での観察に対し平均値±標準誤差として示す。前記の２つのグループを比較すると、全ての点において、有意差（Ｐ＜０．０５）がある。
【００３２】
［図６Ａ］図６Ａは、ＷＳＴ−１試薬により評価した、Ｕ４６６１９により誘発されたヒト冠状動脈平滑筋細胞の増殖に対する、二重性のＴＰレセプターアンタゴニストおよびトロンボキサンシンターゼ阻害剤である化合物３の効力を示す。全実験は、ＦＣＳ（５％）、ＦＧＦ（２ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（０．５ｎｇ／ｍｌ）およびインスリン（５μｇ／ｍｌ）の存在下で行った。結果（平均値±標準誤差）は、ビヒクル処理細胞（Ｕ４６６１９の不在下）と比較し、倍率変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）で表す（ｎ＝７）。各濃度での*Ｐ＜０．０５対コントロール。
【００３３】
［図６Ｂ］図６Ｂは、化合物３を使用しておよび使用することなくアスピリン治療を受けた患者のクエン酸抗凝固処理ＰＲＰ（ＬＴＡ）における血小板凝集の比較を示す。
【００３４】
［図７Ａ］図７Ａは、化合物３を使用しておよび使用することなくクロピドグレル治療を受けた患者のクエン酸抗凝固処理ＰＲＰ（ＬＴＡ）における血小板凝集の比較を示す。
【００３５】
［図７Ｂ］図７Ｂは、化合物３とアスピリンまたはクロピドグレルのいずれかとを用いて治療したクエン酸抗凝固処理ＰＲＰ（ＬＴＡ）患者における血小板凝集の比較を示す。
【００３６】
本明細書に記載の全ての出版物、特許および特許出願は、あらゆる目的のために参照により本明細書に明示的に援用する。
【００３７】
本発明を詳細に記述する前に、幾つかの用語を定義する。本明細書において、単数形（「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」）は、文脈により別段の明確な規定がない限り、複数の指示対象を含む。
【００３８】
なお、「好ましくは」、「一般に」および「典型的に」といった用語は、本明細書において、請求項に係る発明の範囲を限定するために、または、ある特徴が請求項に係る発明の構成または機能にとって必須、不可欠、さらには重要であることを意味するために使用されるものではない。むしろ、これらの用語は、本発明の特定の実施形態において使用される場合もあれば使用されない場合もある選択的または付加的な特徴を強調することを単に意図するものである。
【００３９】
「任意の」および「任意に」とは、その後に記載された主要な（ｍａｙｏｒ）事象または状況が生じない場合もあること、並びに、その説明が、その事象または状況が生じる場合と生じない場合とを含むことを意味する。例えば、任意の医薬品賦形剤とは、医薬品賦形剤と記載された製剤が、その存在が具体的に記載されたもの以外の医薬品賦形剤を含む場合もあれば含まない場合もあること、並びに、医薬品賦形剤と記載された製剤が、任意の賦形剤が存在する場合と存在しない場合とを含むことを示すものである。
【００４０】
「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、哺乳類、特に人間における疾病または疾病から生じる合併症のあらゆる治療のことを指し、下記を含む：
（ｉ）疾病にかかりやすいかもしれないが、まだかかっていると診断されていない患者において疾病および／または合併症が生じることを予防すること；
（ｉｉ）疾病または合併症を抑制すること、すなわち、その発症、進行または蔓延を阻止すること；或いは
（ｉｉｉ）疾病または合併症を軽減すること、すなわち、疾病または合併症を退行させること。
【００４１】
ある態様において、「治療すること」とは、哺乳類、特に人間における疾病または疾病から生じる合併症のあらゆる治療のことを指し、下記を含む：
（ｉｉ）疾病または合併症を抑制すること、すなわち、その発症、進行または蔓延を阻止すること；或いは
（ｉｉｉ）疾病または合併症を軽減すること、すなわち、疾病または合併症を退行させること。
【００４２】
本明細書において、「治療有効量」とは、研究者、獣医師、医師または他の臨床医が、組織、系、動物、個人または人間において求めている生物学的または医薬的反応を誘発する活性化合物または医薬品の量のことである。
【００４３】
本明細書で用いる放出調節製剤とは、即時放出性製剤とは異なる方法で薬物または製薬を放出するようデザインされた医薬製剤のことである。よって、放出調節製剤は、放出制御製剤、徐放性製剤、持続放出性製剤、または遅延放出性製剤であり得る。本発明における使用に適した特定の放出調節製剤は、長時間に渡って体内で薬物または化合物を放出する持続放出性製剤である。
【００４４】
化合物１は、国際公開第２００８／０８９４６１号に記載の（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸と（Ｚ）−６−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸のラセミ混合物である。化合物１の合成は、国際公開第２００８／０８９４６１号の実施例１に記載されている；スキーム２、構造２−１４参照。
【００４５】
化合物２は、（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸であり、化合物１の単一エナンチオマーである。そのエナンチオマーからの化合物２の分離は、国際公開第２００８／０８９４６１号の実施例３０に記載されている。
【００４６】
化合物３は、国際公開第２００８／０８９４６１号に記載のｔｅｒｔ−ブチルアンモニウム（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エノエート（化合物２のｔｅｒｔ-ブチルアミン塩（ＴＢＳ））である。化合物３は、二重性のトロンボキサンレセプター（ＴＰ）アンタゴニストおよびトロンボキサンシンターゼ（ＴＳ）阻害剤である。化合物３の調製は、国際公開第２００８／０８９４６１号の実施例３６に記載されている。
【００４７】
化合物２は、高活性ＴＰアンタゴニストおよびトロンボキサンシンターゼ（ＴＳ）阻害剤であるが、医薬品としてのその使用は、難溶性および低バイオアベイラビリティにより制限されていた。化合物３は、化合物２の溶解性の高い結晶塩であり、且つ、化合物２を送達するための極めて有効なビヒクルである。
【００４８】
化合物３は、０．１２５〜２．５ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度において、生体内でＴＰレセプター活性化に拮抗することが分かっている。Ａｎｇｉｏｌｉｌｌｏ，Ｄ．Ｊ．らの血栓症および血栓溶解ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ）２０１２  ３４（３）：２９７−９．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ１１２３９−０１２−０７９５−６およびＳｏｒｅｎｓｅｎ，Ａ．Ｓ．らのＥｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１３  ６９（３）：４５９−６５．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ００２２８−０１２−１３４８−９を参照のこと。両論文の開示事項の全内容を参照により本明細書に援用する。
【００４９】
本明細書においては、例えば、血栓性疾患、血管炎症、血管酸化ストレス、動脈血栓性イベント、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、末梢動脈疾患の合併症、高血糖症、低血糖症、ケトンの増加、心筋梗塞を含む心血管疾患、急性冠症候群、狭心症、経皮的冠動脈インターベンション、脳卒中および一過性脳虚血発作（ＴＩＡｓ）などの脳血管疾患（ＣＶＤ）、頸動脈狭窄症、末梢血管虚血、末梢動脈疾患、動脈血栓症、間欠性跛行、糖尿病性潰瘍および足部潰瘍を含む糖尿病性大血管症および糖尿病性細小血管症、糖尿病関連皮膚障害、非増殖網膜症および増殖網膜症を含む糖尿病性網膜症、ミクロタンパク尿症およびマクロタンパク尿症を含む糖尿病性腎症、ネフローゼ症候群、ＧＦＲの減少、クレアチニン増加およびクリアランスの低下といった腎炎症候群による腎機能障害、末期腎不全、レイノー病および／または症候群、並びに抹消部切断につながる足部潰瘍および足部障害を含む糖尿病微小循環などの心血管イベントを治療する方法を開示する。
【００５０】
開示している本発明は、糖尿病患者における心血管イベントのリスクを軽減する方法であって、薬学的有効量の薬学的に許容される形態のＰ２Ｙ１２阻害剤を患者に投与すると共に、治療有効量の薬学的に許容される形態の化合物（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸を患者に投与することを含む方法を提供する。
【００５１】
他の実施形態において、前記Ｐ２Ｙ１２阻害剤は、カングレロール、プラスグレル、チカグレロール、エリノグレル、クロピドグレル（プラビックスR）またはチクロピジン、およびそれらの組合せ、ならびに、一定量の薬学的に許容される形態の化合物（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸から選択される。
【００５２】
他の実施形態においては、（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸および前記Ｐ２Ｙ１２阻害剤を同時に投与する。
【００５３】
他の実施形態においては、（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸および前記Ｐ２Ｙ１２阻害剤を順次投与する。
【００５４】
他の実施形態において、前記治療ｙ有効量の（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸とは、１日当たり、患者の体重１ｋｇにつき、約０．０００１ｍｇ〜約２０ｍｇの用量の（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸である。
【００５５】
他の実施形態において、前記治療ｙ有効量の（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸とは、１日当たり、患者の体重１ｋｇにつき、約０．００１ｍｇ〜約１ｍｇの用量の（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸である。
【００５６】
いくつかの実施形態において、前記心血管イベントとは、心筋梗塞、血栓症、血栓性疾患、ステント誘発血栓形成、ステント誘発再狭窄、ステント誘発過形成、肺高血圧症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、網膜症、糖尿病性網膜症、末梢動脈疾患、下肢循環、肺塞栓症、血栓形成、過形成、敗血症性ショック、子癇前症、喘息、鼻炎、アレルギー性鼻炎，腫瘍血管新生または腫瘍転移である。
【００５７】
他の実施形態は、糖尿病患者における血管炎症を治療する方法であって、薬学的有効量の薬学的に許容される形態のＰ２Ｙ１２阻害剤を前記患者に投与すると共に、治療有効量の薬学的に許容される形態の化合物（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸を前記患者に投与することを含む方法を開示する。
【００５８】
他の実施形態は、糖尿病患者における血管炎症を軽減する方法であって、薬学的有効量の薬学的に許容される形態のＰ２Ｙ１２阻害剤を前記患者に投与すると共に、治療有効量の薬学的に許容される形態の化合物（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸を前記患者に投与することを含む方法を開示する。
【００５９】
他の実施形態は、糖尿病患者における血小板反応性を低下させる方法であって、薬学的有効量の薬学的に許容される形態のＰ２Ｙ１２阻害剤を前記患者に投与すると共に、治療有効量の薬学的に許容される形態の化合物（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸を前記患者に投与することを含む方法を開示する。
【００６０】
他の実施形態は、糖尿病患者における血管機能を向上させる方法であって、薬学的有効量の薬学的に許容される形態のＰ２Ｙ１２阻害剤を前記患者に投与すると共に、治療有効量の薬学的に許容される形態の化合物（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸を前記患者に投与することを含む方法を開示する。
【００６１】
他の実施形態は、糖尿病患者における血管酸化ストレスを軽減する方法であって、薬学的有効量の薬学的に許容される形態のＰ２Ｙ１２阻害剤を前記患者に投与すると共に、治療有効量の薬学的に許容される形態の化合物（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸を前記患者に投与することを含む方法を開示する。
【００６２】
開示している方法において、前記薬学的に許容される形態の（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸は、非晶質形態、結晶性形態、塩、多形体、共結晶、溶媒和化合物、またはプロドラッグである。
【００６３】
ある態様においては、本発明において有用な薬学的に許容される形態としては、化合物２（酸として）が含まれる。
【００６４】
開示している本発明の方法のある態様において、薬学的に許容される形態とは、例えば、ｔｅｒｔ-ブチルアミン塩、ナトリウム塩、カリウム塩、アルギニン塩、リジン塩、カルシウム塩、亜鉛塩、マグネシウム塩、コリン塩、エチレンジアミン塩、エタノールアミン塩、アンモニウム塩、ヒドロキシエチルピロリジン塩、ジメチルアミノエタノール塩、ヒドロキシエチルモルホリン塩、Ｎ−エチルグルカミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、トロメタミン塩、イミダゾール塩から選択される化合物２の結晶塩または非晶質塩であってもよく、あるいは、例えば、二ナトリウムおよび二カリウム塩など、カルボン酸部分およびフェノール部分の両方の二塩である化合物２の結晶塩または非晶質塩であってもよい。
【００６５】
開示している方法において、更には、前記共結晶は、化合物３の塩の水和物、化合物３のエタノール、１−ブタノール、イソプロパノール、およびジオキサンの溶媒和化合物、グリセロールを有する化合物３の共結晶、化合物３のメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）溶媒和化合物、並びに（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−メトキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸および（Ｚ）−６−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−メトキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸のラセミ混合物のｔｅｒｔ-ブチルアミン塩から選択される。
【００６６】
開示している本発明の方法のある態様においては、薬学的に許容される形態は、プロドラッグであってもよい。「プロドラッグ」とは、活性薬物を放出するために、体内などの使用条件下で変化する活性化合物（薬物）の誘導体のことである。プロドラッグは、活性薬物に変換されるまで薬理学的に不活性であることが多いが、必ずしもそうであるとは限らない。プロドラッグは、典型的には、「プログループ」により、活性に部分的に必要であると考えられる薬物中の官能基をマスクすることにより得られる。プログループは、典型的には、特定の使用条件下で切断可能な結合を介して薬物の官能基に結合する。プログループの切断は、加水分解反応によるなど、自発的に進行させてもよいし、あるいは、酵素によって、光によって、酸によって、または温度の変更など、物理若しくは環境パラメータの変更または物理若しくは環境パラメータへの露出によって、あるいはそれらの組合せによるなど、別の作用因子により触媒するかまたは誘発してもよい。前記作用因子は、プロドラッグを投与する細胞内に存在する酵素若しくは胃の酸性条件など、使用条件に対し内因性のものであってもよいし、あるいは外因的に供給してもよい。
【００６７】
化合物２または化合物３に加えてまたはその代わりに、前記化合物は、式Ｉの化合物から選択される、二重性のトロンボキサンレセプター（ＴＰ）アンタゴニストおよびトロンボキサンシンターゼ（ＴＳ）阻害剤である：
【化１】
2016504994.tif 000002
【００６８】
式中、
Ｘは、フルオロ、クロロ、ブロモ、トリフルオロメチル、置換フェニル、シアノ、メトキシ、ニトロ、ヒドロキシルおよび−Ｈから成る群より選択され；Ｙは、フルオロ、クロロ、ブロモ、トリフルオロメチル、置換フェニル、シアノ、メトキシ、ニトロ、ヒドロキシル、−Ｃ（Ｏ）−糖類および−Ｈから成る群より選択され；ならびにＲｄは、−ＮＨ−Ｃ1-6−アルキル（分岐状または直鎖状、好ましくは直鎖状）、−Ｏ−Ｃ1-6−アルキル（分岐状または直鎖状、好ましくは直鎖状）、糖類または−ＯＨである。
【００６９】
化合物２または化合物３に加えてまたはその代わりに、前記二重性のトロンボキサンレセプター（ＴＰ）アンタゴニストおよびトロンボキサンシンターゼ（ＴＳ）阻害剤は、更に式ＩＩの化合物から選択してもよい：
【化２】
2016504994.tif 000003
【００７０】
式中、
Ｘは、フルオロ、クロロ、ブロモ、トリフルオロメチル、置換フェニル、シアノ、メトキシ、ニトロ、ヒドロキシルおよび−Ｈからなる群より選択され；Ｙは、フルオロ、クロロ、ブロモ、トリフルオロメチル、置換フェニル、シアノ、メトキシ、ニトロ、ヒドロキシル、−Ｃ（Ｏ）−糖類および−Ｈからなる群より選択され；ならにび、Ｒｄは、−ＮＨ−Ｃ1-6−アルキル（分岐状または直鎖状、好ましくは直鎖状）、−Ｏ−Ｃ1-6−アルキル（分岐状または直鎖状、好ましくは直鎖状）、糖類または−ＯＨである。
【００７１】
化合物２または化合物３に加えてまたはその代わりに、前記二重性のトロンボキサンレセプター（ＴＰ）アンタゴニストおよびトロンボキサンシンターゼ（ＴＳ）阻害剤は、更に式ＩＩＩの化合物から選択してもよい：
【化３】
2016504994.tif 000004
【００７２】
式中、
Ｘは、フルオロ、クロロ、ブロモ、トリフルオロメチル、任意に置換されたフェニル、シアノ、メトキシおよびニトロから選択され；Ｒｃは、Ｃ1-6−アルキル（分岐状または直鎖状、好ましくは直鎖状）、−Ｃ（Ｏ）−Ｃｉ-6−アルキル（分岐状または直鎖状、好ましくは直鎖状）、−ＣＨ（Ｏ）、糖類または−Ｈであり；ならびにＲｄは、−ＮＨ−Ｃ1-6−アルキル（分岐状または直鎖状、好ましくは直鎖状）、−Ｏ−Ｃ1-6−アルキル（分岐状または直鎖状、好ましくは直鎖状）、グリコシルまたは−ＯＨである。
【００７３】
化合物２または化合物３に加えてまたはその代わりに、前記二重性のトロンボキサンレセプター（ＴＰ）アンタゴニストおよびトロンボキサンシンターゼ（ＴＳ）阻害剤は、更に式ＩＶの化合物から選択してもよい：
【化４】
2016504994.tif 000005
【００７４】
式中、
Ｘ、ＺおよびＹは、式Ｉの化合物に関して本明細書において上記のごとく特定した通りであり、好ましくは、Ｘはハロゲンであり、より好ましくは、Ｘはクロロであり、ここで、Ｘは、オルト、メタおよび／またはパラ位、好ましくは、オルト位にあってもよく、また、好ましくはＺおよびＹは、いずれも−Ｈであり；Ｒｃは、Ｃ1-6−アルキル（分岐状または直鎖状、好ましくは直鎖状）、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ1-6−アルキル（分岐状または直鎖状、好ましくは直鎖状）、−ＣＨ（Ｏ）、糖類（好ましくは、単糖類若しくは二糖類、より好ましくは、単糖類、更により好ましくは、グリコシル）または−Ｈ、好ましくは、Ｒｃはメトキシ、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ3または−Ｈであり；ならびに、Ｒｄは、−ＮＨ−Ｃ1-6−アルキル（分岐状または直鎖状、好ましくは直鎖状）、−Ｏ−Ｃ1-6−アルキル（分岐状または直鎖状、好ましくは直鎖状）、糖類（好ましくは、単糖類若しくは二糖類、より好ましくは、単糖類、更により好ましくは、グリコシル）または−ＯＨ、好ましくは、Ｒｄは、−ＯＨ、グリコシルまたは−Ｏ−ＣＨ3、より好ましくは、Ｒｄは、−Ｈまたは−Ｏ−ＣＨ3である。
【００７５】
化合物２または化合物３に加えてまたはその代わりに、前記二重性のトロンボキサンレセプター（ＴＰ）アンタゴニストおよびトロンボキサンシンターゼ（ＴＳ）阻害剤は、更に式Ｖの化合物から選択してもよい：
【化５】
2016504994.tif 000006
【００７６】
式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシルまたはアルキルであり得；Ｒ２は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、または１つ以上の置換基で任意に置換されたＣ３−３０環状若しくは複素環であり得；Ｘは、ＣＨまたはＮであり得；ｎは、０、１、２、３、４、または５であり得；また、Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、アルコキシ、アルキルまたはハロゲンであり得る。前記置換基は、Ｈ、−Ｒａ、ハロ、−Ｏ−、＝Ｏ、−ＯＲｂ、−ＳＲｂ、−Ｓ−、＝Ｓ、−ＮＲｃＲｃ、＝ＮＲｂ、＝Ｎ−ＯＲｂ、トリハロメチル、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＯ、−ＮＯ２、＝Ｎ２、−Ｎ３、−Ｓ（Ｏ）２Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−（ＣＨ２）０−４Ｓ（Ｏ）２ＯＲｂ、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒｂ、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２ＯＲｂ、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｂ）（Ｏ−）、−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｂ）（ＯＲｂ）、−Ｃ（Ｏ）Ｒｂ、−Ｃ（Ｓ）Ｒｂ、−Ｃ（ＮＲｂ）Ｒｂ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＯＲｂ、−Ｃ（Ｓ）ＯＲｂ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲｃＲｃ、−Ｃ（ＮＲｂ）ＮＲｃＲｃ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒｂ、−ＯＣ（Ｓ）Ｒｂ、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲｂ、−ＯＣ（Ｓ）ＯＲｂ、−ＮＲｂＣ（Ｏ）Ｒｂ、−ＮＲｂＣ（Ｓ）Ｒｂ、−ＮＲｂＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲｂＣ（Ｏ）ＯＲｂ、−ＮＲｂＣ（Ｓ）ＯＲｂ、−ＮＲｂＣ（Ｏ）ＮＲｃＲｃ、−ＮＲｂＣ（ＮＲｂ）Ｒｂおよび−ＮＲｂＣ（ＮＲｂ）ＮＲｃＲｃであり得、ここで、Ｒａは、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロへテロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群より選択され；Ｒｂは、それぞれ独立に、水素またはＲａであり；並びに、Ｒｃは、それぞれ独立にＲｂであるか、または、２つのＲｃ基は、それらが結合している窒素原子と共に、Ｏ、ＮおよびＳから成る群より選択される同一または異なる付加的ヘテロ原子を１〜４個任意に含んでいてもよい５員環、６員環または７員環シクロへテロアルキルを形成する。前記Ｃ３−３０環状または複素環は、非置換、単一置換または多重置換したアセナフテン、ベンゾチオフェン、クロマノン、インドール、ジュロリジン、ナフタレン、キノリンなどであり得る。
【００７７】
本明細書に記載している化合物は、プロドラッグを作るためプログループでマスクすることのできる官能基を含んでいてもよい。当該プロドラッグは、それらの活性薬物形態に変換されるまで薬理学的に不活性であるのが普通であるが、そうである必要はない。本発明のプロドラッグにおいては、あらゆる利用可能な官能部分をプログループでマスクすることによりプロドラッグを得てもよい。所望の使用条件下で切断可能なプログループは、本技術分野において公知である。
【００７８】
開示している方法において、前記二重性のトロンボキサンレセプター（ＴＰ）アンタゴニストおよびトロンボキサンシンターゼ（ＴＳ）阻害剤は、式ＶＩのエナンチオマーのいずれか一方またはそれらの混合物のプロドラッグであってもよい：
【化６】
2016504994.tif 000007
【００７９】
式中、
Ｘは、水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、ハロアルキル、アルキルまたはＯ−Ｒであり得、ここで、Ｒは、低級アルキル基であり；ｎは、０、１、２、３、４、または５であり得；Ｚ1およびＺ2は、それぞれ独立にＯ、ＮまたはＳであるように選択することができ、また、Ｒpは、独立に、Ｈ、低級アルキルまたはプログループから選択される。よって、前記プロドラッグは、Ｚ1およびＺ2の双方がＯであり得、少なくとも１つのＲpは、低級アルキル、エステル、アミドなどといったプログループである化合物であり得る。前記プログループＲpは、生体内で代謝することにより、薬物を含む活性ジアリール１，３−ジオキサン部分を生成する。
【００８０】
フェノール基、カルボキシル基、チオール基などの官能基を含む化合物は、プロドラッグを合成するためプログループにより誘導体化することができる。活性化合物において官能基をマスクしプロドラッグを生成するのに適した多種多様なプログループが、本技術分野において周知となっている。例えば、ヒドロキシル官能基は、典型的には、生体内で加水分解されることによりヒドロキシル基を提供し得る、スルホン酸塩、エステルまたは炭酸塩プログループとしてマスクされてもよい。アミノ官能基は、生体内で加水分解されることにより、アミノ基を提供し得る、アミド、イミン、ホスフィニル、ホスホニル、ホスホリルまたはスルホニルプログループとしてマスクされてもよい。カルボキシル基は、生体内で加水分解されることにより、カルボキシル基を提供し得る、エステル（シリルエステルおよびチオエステルを含む）、アミドまたはヒドラジドプログループとしてマスクされてもよい。適切なプログループの他の具体例は、当技術分野における当業者にとっては自明である。
【００８１】
例えば、本発明の化合物が、カルボン酸官能基を含む場合、プロドラッグは、例えば（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、（Ｃ2−Ｃ12）アルカノイルオキシメチル、４〜９個の炭素原子を有する１−（アルカノイルオキシ）エチル、５〜１０個の炭素原子を有する１−メチル−１−（アルカノイルオキシ）−エチル、３〜６個の炭素原子を有するアルコキシカルボニルオキシメチル、４〜７個の炭素原子を有する１−（アルコキシカルボニルオキシ）エチル、５〜８個の炭素原子を有する１−メチル−１−（アルコキシカルボニルオキシ）エチル、３〜９個の炭素原子を有するＮ−（アルコキシカルボニル）アミノメチル、４〜１０個の炭素原子を有する１−（Ｎ（アルコキシカルボニル）アミノ）エチル、３−フタリジル、４−クロトノラクトニル、ガンマ-ブチロラクトン-４-イル、ジ−Ｎ，Ｎ−（Ｃ1−Ｃ2）アルキルアミノ（Ｃ2−Ｃ3）アルキル、カルバモイル−（Ｃ1−Ｃ2）アルキル、Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ1−Ｃ2）アルキルカルバモイル−（Ｃ1−Ｃ2）アルキルおよびピペリジノ−、ピロリジノ−またはモルホリノ（Ｃ2−Ｃ3）アルキルなどの基をはじめとする（しかし、これらに限定されない）基で前記酸基の水素原子を置換することにより形成されるエステルを含み得る。プロドラッグはまた、−ＣＯＯＨ基が糖類と反応しエステルを形成しており、前記糖類が好ましくは単糖類または二糖類、より好ましくは単糖類、さらにより好ましくはグルコースである、化合物であってもよい。特に、フェノール基は、下に図示するように、リン酸エステルまたはアルキルエステルに変換するか、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルキルオキシカルボニルオキシメチル（ａｌｋｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｋｌｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）（ＡＯＣＯＭ）を用いて、もしくは立体障害アルコキシカルボニルオキシメチルとして誘導体化し得る。
【表１】
2016504994.tif 000008
【００８２】
プログループは、目的とする水溶性、投与方法および／または活性２，４−ジアリール−１，３−ジオキサン化合物に対し目的とする代謝の機構もしくは部位をプロドラッグに提供するように選択することができる。例えば、プログループは、親油性または親水性であり得、親油性基は水溶性を低下させるのに使用でき、親水性基は水溶性を向上させるのに使用できる。このようにして、選択した投与方法用に特別に調製したプロドラッグを得ることができる。前記プログループはまた、例えば、改善された受動的腸吸収、改善された輸送媒介腸吸収、急速な代謝に対する保護（徐放性プロドラッグ）、組織選択的送達、標的組織における受動的濃縮、特定の輸送体のターゲティングなど、他の特性をプロドラッグに付与するようデザインすることもできる。
【００８３】
本発明の方法の有用な代表的プロドラッグには、以下のものが挙げられる：
【化７】
2016504994.tif 000009
【化８】
2016504994.tif 000010
【００８４】
開示している方法において、プロドラッグは、（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−メトキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸および（Ｚ）−６−（（２Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−メトキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸のラセミ混合物、（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−メトキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸、（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−４−（２−アセトキシフェニル）−２−（２−クロロフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸、（Ｚ）−メチル６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エノエート、（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸のアルキル、アリールまたはヘテロアリールエステル、アミドもしくはスルホンアミド誘導体、または（Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エン酸のアルキル、アリールおよびヘテロアリールフェノールエーテル、あるいは薬学的に許容されるそれらの塩である。これらの発明が、多種多様な組合せまたはこれらの明示した特性の全てを含む実施形態も提供するものであることを認識されたい。
【００８５】
以下の実施例は、本発明の具体的な実施形態およびその様々な用途の実例である。それらは、説明のみを目的として記載するものであり、本発明を限定するものとみなされるべきではない。
【実施例】
【００８６】
［実施例１：ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＴＮＦα誘発炎症に対する化合物３の効力］
【００８７】
＜ＰＴＸ３のＥＬＩＳＡおよび６−ケトＰＧＦ１αのＥＩＡ＞
ＥＧＭにおいてゼラチンコート２４ウェルプレート（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ））に２５，０００細胞／ウェルでＨＵＶＥＣを播種する。４８時間後、細胞培地を、異なる濃度で化合物３を含むまたは含まないＥＢＭに置換する。プレインキュベーションの１時間後、１ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを、ウェルに添加するかまたは添加しない。ＴＮＦα添加の６時間後、各ウェルの培地を採取し、０．５ＮのＮａＯＨにおいて３０分間細胞溶解する。サプライヤー規定の手順に従い、特異的ＥＬＩＳＡ（＃ＤＰＴＸ３０、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、米国）を用いて、インキュベーション培地におけるＰＴＸ３の分泌を分析する。競合アッセイ（＃５１５２１１、Ｃａｙｍａｎ、米国）を用いて、細胞培養培地における６−ケトＰＧＦ１αのレベルを求める。結果は、細胞可溶化物中、フォリン法（フォーリン・チオカルトフェノール試薬、メルク（Ｍｅｒｃｋ）、ドイツ）により測定したマイクログラムのタンパク質に対して報告されたＰＴＸ３または６−ケトＰＧＦ１αのピコグラムで示す。
【００８８】
＜ウエスタンブロット分析＞
ＥＧＭにおいてゼラチンコートＴ７５に１８７，５００細胞／フラスコでＨＵＶＥＣを播種する。４日後、細胞培地を、異なる濃度で化合物３を含むまたは含まないＥＢＭに置換する。プレインキュベーションの１時間後、１ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを、Ｔ７５フラスコに添加するかまたは添加しない。６時間後、細胞培地を採取し、５００ｇを５分間遠心分離することにより、付着細胞と共に浮遊細胞をペレット化しプールする。付着細胞は、冷たいＰＢＳで２回洗浄し、１．５ｍｌのＰＢＳ中で採取する。そして、回収した細胞は、５００ｇを４℃で５分間遠心分離する。細胞は、５０μｌのＳＤＳ溶解緩衝液中で溶解する（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７，５；０．１ｍＭのＥＤＴＡ；０．１ｍＭのＥＧＴＡ、０．５％ＳＤＳ；０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）、ドイツ）；ホスファターゼ阻害剤緩衝液（２５ｍＭのＮａ3ＶＯ4、２５０ｍＭのＰＮＰＰ、２５０ｍＭのβ-グリセロホスフェート、１２５ｍＭのＮａＦ））。タンパク質濃度は、ＩＤＣＲ試薬（Ｉｏｎｉｃ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ、サーモサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、米国）を用いて、ピアス法（Ｐｉｅｒｃｅ  ｍｅｔｈｏｄ）（ピアス６６０ｎｍタンパク質分析、サーモサイエンティフィック、米国）により測定する。１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で等量のタンパク質分離し、ＰＶＤＦ膜（イモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）−ＦＬ、ミリポアコーポレーション（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、米国）に移す。膜は、緩やかに撹拌しながら室温で１時間ＬＩ−ＣＯＲブロッキングバッファー（バイオサイエンシーズ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、米国）中でブロッキングする。一次抗体（抗ＰＡＲＰ１（ＢＤファーミンジェン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、＃５５１０２５、１：１０００）、抗ＶＣＡＭ１（サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、＃ｓｃ−１５０４、１：５００）、抗ＩＣＡＭ１（サンタクルーズ、＃ｓｃ−７８９１、１：５００）および抗β−アクチン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、＃Ａ５４４１、１：２００００））を、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を添加したＬＩ−ＣＯＲブロッキングバッファーにおいて希釈し、４℃で一晩インキュベートする。そして、膜を０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳにおいて５分間ずつ４回洗浄し、蛍光二次抗体と共に１時間ＲＴで暗中インキュベートし、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＬＩ−ＣＯＲブロッキングバッファーにおいて１：７５００に希釈する。スキャナーであるオデッセイ・イメージ・システム（Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｉ−ＣＯＲ、バイオサイエンシーズ、米国）およびオデッセイ（Ｏｄｙｓｓｅｙ）Ｖ３．０ソフトウエアを用いて抗体結合を分析する。このソフトウエアを用いて、各バンドの光学濃度も求める。
【００８９】
＜リアルタイムＲＴ-ＰＣＲ＞
ＥＧＭにおいてゼラチンコートＴ２５に６７，５００細胞／フラスコでＨＵＶＥＣを播種する。４日後、細胞培地を、異なる濃度で化合物３を含むまたは含まないＥＢＭに置換する。プレインキュベーションの１時間後、１ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを、Ｔ２５フラスコに添加するかまたは添加しない。６時間後、細胞培地を廃棄し、細胞をＰＢＳで２回洗浄する。キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）ＲＮイージーミニキット（ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ）を使用し、製造者（キアゲン）が提供しているプロトコールに従って、全ＲＮＡ抽出を行う。超微量分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）ＮＤ−１００（ＩＳＯＧＥＮ、ライフサイエンス（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ））により、各サンプルのＲＮＡ濃度を求める。トランスクリプター・ファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）ロシュ（ロシュ・アプライド・サイエンス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ））を用いて、逆転写を行った。定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により、転写レベルを求める。全ＲＮＡの逆転写により得られたｃＤＮＡを、１００倍に希釈し、その５μｌを、１２．５μｌのファストスタートユニバーサルＳＹＢＲＧｒｅｅｎマスター（Ｆａｓｔ  ｓｔａｒｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ）（ロシュ）、２．５μｌのミリＱ水（ＭｉｌｌｉＱ  ｗａｔｅｒ）、２．５μｌの希釈したフォワードプライマーおよび２．５μｌの希釈したリバースプライマーと混合することにより、最適な終濃度の３００ｎＭまたは９００ｎＭとする。リアルタイムＰＣＲサイクラー（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｃｙｃｌｅｒ）（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）７９００ＨＴ  ファストリアルタイムＰＣＲシステム（Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ））でＰＣＲを行う：９５℃５分間のホットスタート後、９５℃１５秒間および６５℃１分間のサイクルを４０サイクル行う。サンプルは、相対的サイクル数（Ｃｔ）法（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｃｙｃｌｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  （Ｃｔ）  ｍｅｔｈｏｄ）により比較する。各サンプルのｃＤＮＡの量を標準化するため、ＲＰＬ１３を内因性標準として使用する。プライマー配列を下に列挙する。
【００９０】
【表２】
2016504994.tif 000011
【００９１】
ＥＧＭにおいてゼラチンコート２４ウェルプレート（コーニング）に２５，０００細胞／ウェルでＨＵＶＥＣを播種する。４８時間後、細胞培地を、異なる濃度で化合物３を含むまたは含まないＭ１９９（ＥＢＭではない、ＥＢＭ中に抗凝固分子が存在するため）に置換する。プレインキュベーションの１時間後、１ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを、ウェルに添加するかまたは添加しない。ＴＮＦαの添加６時間後、各ウェルの培地を採取する。
【００９２】
トロンビン活性を測定するため、８０μＬのＮＰＰ（正常プール血漿）と２０μＬのサンプルを、９６ウェルマイクロタイタープレート（サーモ・イミュロン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｉｍｍｕｌｏｎ）２ＨＢ、サーモラボシステムズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）、オランダ）において混合し、３７℃で５分間インキュベートする。分析に際し、３つの凝固誘導物質を使用し、トロンビン生成に関し、外因性経路、内因性経路、または同時にその両方を調べる。４μＭのＰＬ（リン脂質）を使用することにより、内因性経路を誘発し、４μＭのＰＬと５ｐＭのＴＦ（組織因子）の組合せにより、外因性経路を誘発する一方で、４μＭのＰＬと１ｐＭのＴＦとの組合せにより両経路を誘発する。サンプルへの誘導物質の添加直後、３７℃で２０μＬの蛍光発生基質／塩化カルシウム緩衝液を添加することにより血漿凝固が誘発される。３７℃で８０μＬのＮＰＰ、１０μＬのＰＢＳ、２０μＬのトロンビン標準物質（ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）および２０μＬの基質／塩化カルシウム緩衝液を用いて検量線も同時に行う。Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅソフトウエア（ｖ３．０、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  ＢＶ）を使用し、３９０／４６０ｎｍフィルターセットを備えた蛍光マイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）フルオロスキャンアセントＦＬ（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＦＬ）（サーモラボシステムズ、オランダ）により、トロンビン基質のフルオロフォアへの加水分解を６０分間モニターする。遅延時間（トロンビン生成のための時間、分）およびＣmax（生成されたトロンビンの最大濃度、ｎＭ）のパラメータを測定する。
【００９３】
＜ＴＮＦαにより誘発されるＣＯＸ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＰＴＸ３、ＭＣＰ−１のｍＲＮＡ発現に対する化合物３の効力＞
ＴＮＦα刺激に際し、増加が顕著でないＩＬ−６を除き、全ての目的の遺伝子のｍＲＮＡ発現における統計的増加を観察する。また、化合物３は最高濃度では、これら全遺伝子のｍＲＮＡ発現に対し効力がないことに注意されたい。ＩＣＡＭ−１およびＰＴＸ３の二つの遺伝子のみが、濃度１００ｎＭ以上（１０ｎＭでは効力はない）の化合物３により、それらのｍＲＮＡ発現が顕著に減少するという興味深い結果を示す。この効力は、高濃度（３００ｎＭおよび６００ｎＭ）では増強されない（図１および図２Ａ）。
【００９４】
＜ＴＮＦαにより誘発されるＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１のタンパク質発現に対する化合物３の効力＞
ＴＮＦαにより誘発されるＩＣＡＭ−１のｍＲＮＡ発現における減少が観察されたため、ＩＣＡＭ−１のタンパク質レベルをウエスタンブロット分析により調べる。ｍＲＮＡレベルでは修飾がないがタンパク質レベルである場合は、ＶＣＡＭ−１に関しても同様に行う。各バンドの光学濃度を定量化し、β−アクチン発現によりＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１の発現を標準化する。結果は、細胞をＴＮＦαで６時間刺激した場合、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１の発現は増加するが、化合物３の効力は検出できなかったことを示している（図２Ｂおよび図２Ｃ）。
【００９５】
＜６−ケトＰＧＦ１α分泌に対する化合物３およびＴＮＦαの効力＞
プロスタサイクリン（ＰＩＧ2、プロスタグランジンＩ2）は、血管内皮によりアラキドン酸から形成される、強力な局所性血管拡張剤および血小板凝集阻害剤である。ＰＩＧ2は、内皮細胞において６−ケトＰＧＦ１αに非酵素的に水和される。凝固における興味深い役割に関して、特異的ＥＩＡを用いて、化合物３でインキュベートし、ＴＮＦαにより刺激したＨＵＶＥＣによる６−ケトＰＧＦ１α分泌を調べる。結果は、化合物３およびＴＮＦαが、互いに独立しては、６−ケトＰＧＦ１α分泌を増加させないことを示している。しかし、細胞を化合物３およびＴＮＦαで同時にインキュベートする場合、分泌は増加するようであり、６００ｎＭ（３−６００＋ＴＮＦα）において著しい増加が見られる（図３Ａ）。
【００９６】
＜ＰＴＸ３の分泌に対する化合物３の効力＞
化合物３をインキュベーションする場合において、ＴＮＦα誘発ＰＴＸ３によるｍＲＮＡ発現に減少が観察されたため、特異的ＥＬＩＳＡによりＰＴＸ３の分泌を分析した。ｍＲＮＡ発現結果とは対照的に、６時間ＴＮＦαにより刺激された細胞から、ＰＴＸ３の分泌における増加は、培地において検出されない。しかし、分泌されたＰＴＸ３のレベルが非常に低く、空試料のレベルのわずか上であるため、これらの結果を判断するのは困難である。６時間のインキュベーションでは、分泌されるＰＴＸ３を測定可能な量蓄積する上で、およびｍＲＮＡ発現における変化を反映する上で、恐らく時間が十分ではない。本実験は、インキュベーションの２４時間後に再度実施すべきである（図３Ｂ）。
【００９７】
＜ＰＡＲＰ−１の切断により評価したアポトーシスレベルに対する化合物３およびＴＮＦαの効力＞
ＰＡＲＰ−１は、アポトーシスが生じている細胞において活性型カスパーゼにより切断されるタンパク質である。ＰＡＲＰ切断を、ウエスタンブロット法により評価する。結果から、ＴＮＦαは、６時間後ＰＡＲＰ切断をわずかに増加させ（ＷＢスキャンおよび定量化）、ＴＮＦα刺激に際し、細胞のごく一部においてアポトーシスが生じていることを示していることが分かる。化合物３は、ＴＮＦαにより誘発されるこの切断を減少させない、つまり、化合物３は、ＴＮＦαにより誘発されるアポトーシスから細胞を保護しない。更に、化合物３は、単独でアポトーシスを誘発することはない（図３Ｃおよび図３Ｄ）。
【００９８】
＜トロンビン生成に対する化合物３およびＴＮＦαの効力＞
自動較正トロンボグラム（ＣＡＴ）は、溶液の凝血原としての潜在性、すなわち、異なる条件で細胞が放出する可能性のある粒子の基本的な凝血原活性を正確に評価する。Ｍ１９９培地において化合物３＋／−ＴＮＦαでインキュベートしたＨＵＶＥＣから、６時間後、馴化培地を採取する。この分析では３つの凝固誘導物質を使用し、トロンビン生成に関し、外因性経路、内因性経路、または同時にその両方を調べる。４μＭのＰＬ（リン脂質）を使用することにより、内因性経路を誘発し、４μＭのＰＬと５ｐＭのＴＦ（組織因子）との組合せにより、外因性経路を誘発する一方で、４μＭのＰＬと１ｐＭのＴＦとの組合せにより両経路を誘発する。遅延時間（トロンビン生成のための時間、分）およびＣmax（生成されたトロンビン最大濃度、ｎＭ）のパラメータを測定する。結果は、化合物３およびＴＮＦαは、凝固（外因性および内因性経路）に対し効力がないことを示している（図４および５Ａ）。
【００９９】
［実施例２：ヒト冠状動脈平滑筋細胞増殖に対する化合物３の効力］
ヒト冠状動脈ＳＭＣを、ＳｍＧＭ２キット培地で培養する。８０％コンフルエンスで、ＳＭＣをトリプシン処理し、２％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ（「低血清培地」）か、または５％ＦＣＳ、２ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ、０．５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、５μｇ／ｍｌのインスリンを含有するＳｍＧＭ２キット培地（「増殖因子培地」）のいずれかにおいて再懸濁する。続いて、２００μＬ中５０００細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、一晩放置し付着させた。ビヒクルか化合物３（５０ｎＭ、５００ｎＭ、５μＭ）のいずれかを、異なる濃度（０．１ｎＭ〜１０μＭ）でＵ４６６１９の１時間前にウェルに添加し、更に４８時間インキュベートする。全ての実験は、各実験条件につき３〜５回繰り返す。
【０１００】
製造者の使用説明書に従ってＷＳＴ−１試薬を使用し、細胞増殖を評価する。要約すると、培地を含むフェノールレッドを、２００μＬの透明な血清添加ＤＭＥＭで置換した後、１０μＬの希釈されたＷＳＴ−１試薬を、４８時間のインキュベーション時間の終わりに各ウェルに添加する。３７℃で１時間インキュベーションした後、マイクロプレートリーダーを使用し、形成されたホルマザン色素の吸光度を４４０ｎｍで測定する。
【０１０１】
全ての結果は、平均値±標準誤差として示す。多重比較を目的として、一元配置分散分析に続き、ホルム−シダックポストホックテスト（Ｈｏｌｍ-Ｓｉｄａｋ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）により、シグマスタット（Ｓｉｇｍａ  Ｓｔａｔ）ソフトウェアを使用し、統計的に有意な差を求める。０．０５未満のＰ値を有意とみなす。
【０１０２】
増殖因子培地の存在下、トロンボキサンミメティックＵ４６６１９は、ＷＳＴ−１により評価した細胞数においてベル形の濃度依存的増加を誘発する（図５Ｂ）。最大反応は、Ｕ４６６１９濃度１ｎＭで観察され、濃度０．１μＭ以上では、Ｕ４６６１９処理細胞とビヒクル処理細胞とでは、吸光度には有意な差はない（図５Ｂ）。これらの知見とは対照的に、実験を低血清培地で行った場合、Ｕ４６６１９はＳＭＣ増殖を有意に変化させることはなかった（図５Ｂ）。
【０１０３】
増殖因子培地の存在の下、二重性のＴＰレセプターアンタゴニストおよびトロンボキサンシンターゼ阻害剤である化合物３は、Ｕ４６６１９により誘発されるＳＭＣ増殖を、有意且つ濃度依存的に阻害する（図６Ａ）。
【０１０４】
［実施例３：クロピドグレルを摂取している２型糖尿病患者の血液における化合物３を用いた血小板凝集のインビトロ抑制］
患者集団：８１ｍｇのアスピリン（腸溶性のアセチルサリチル酸、カーディオアスピリン（Ｃａｒｄｉｏａｓｐｉｒｉｎ）、バイエル（Ｂａｙｅｒ）、ドイツ）で慢性的に毎日治療をしている２型糖尿病およびＣＡＤ（冠動脈疾患）を発症している１０人の患者は、実験前７〜１０日間クロピドグレル（７５ｍｇ／日）単剤治療に切り換える。アスピリン（８１ｍｇ）単剤治療およびクロピドグレル（７５ｍｇ）単剤治療を受けている間、薬力学的評価を行う。
【０１０５】
＜採血と血小板凝集−光透過凝集測定法＞
止血帯を使用することなく１９ゲージ針またはそれより大きいものを用いて採血。採血の最初の血液２ｍｌは廃棄した。静脈血サンプルを、クエン酸三ナトリウムを充填した管（ＢＤバキュテイナ（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）０．１０９Ｍ．Ｒｅｆ．３６３０４８）にＬＴＡ用に採取する。血液サンプルの抗凝固処理に使用するクエン酸三ナトリウムは全て、血小板、赤血球および白血球に取り込まれなかったため、血漿相のままである。クエン酸塩血漿濃度および血小板凝集に必要な得られた遊離血漿Ｃａ２＋を、それぞれのヘマトクリットにより直接求める。よって、血漿クエン酸塩濃度と得られた遊離血漿Ｃａ２＋濃度は、量１０８ｍＭのクエン酸三ナトリウムの濃度により最終血漿濃度２０ｍＭまで下記の式に従い調整しなければならない。
Ｖｃ＝Ｖ（９．２−０．１８％Ｈｃｔ）／８８
式中、
Ｖｃ＝１０９ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸三ナトリウムの１／１０の量で抗凝固処理をした血液サンプルに添加した１０９ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸三ナトリウムの量
Ｖ＝抗凝固処理をした血液サンプルの量
％Ｈｃｔ＝ヘマトクリット。
【０１０６】
多血小板血漿（ＰＲＰ）を、室温下１２０ｘｇで１０分間遠心分離することにより調製する。自己乏血小板血漿（ＰＰＰ）は、室温下２３００ｘｇで１５分間遠心分離することにより調製する。ＰＲＰ血小板数は、自己ＰＰＰにより２５０．０００／ｕｌに調整する。血小板凝集テストのための安定性は、室温で２時間である。ＬＴＡ［２−５］を用いて血小板凝集を行う。血液を、クエン酸塩添加管に採取する。クエン酸塩濃度は、エボルバ（Ｅｖｏｌｖａ）化合物を用いて先のＬＴＡ実験に従い、それぞれのヘマトクリットレベルに応じて調整する。ＬＴＡは、２チャンネル血小板凝集計（クロノ−ログ（Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ）モデル４９０、クロノ−ログコーポレーション（Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ  Ｃｏｒｐ．）、ヘイバータウン（Ｈａｖｅｒｔｏｗｎ））において、製造者の使用説明書に従い、比濁法によりＰＲＰを用いて評価する。光透過率は、各測定に際し、ＰＲＰは０％に、ＰＰＰは１００％に調節する。６分間、分布曲線を記録する。６分の時点での最終血小板凝集と共に、規準としてＰＰＰを使用しベースラインからの光線透過率における最大の増減率として血小板凝集を判定する。血小板アゴニストは、Ｕ−４６６１９（７ｕＭ）、アラキドン酸（１ｍＭ）、コラーゲン（３ｕｇ／ｍｌ）およびＡＤＰ（２０μＭおよび５μＭ）を含む。１００ｎＭ化合物３を使用しておよび１００ｎＭ化合物３を使用することなく（プラシーボ）ＰＲＰを３７℃で１０分間インビトロインキュベーションした後、薬力学テストを行う。
【０１０７】
患者一人につき、各時点で、合計１０回ＬＴＡ分析；全体で２時点＝２０回判定。表１および図６Ｂは、アスピリンとアスピリン＋化合物３とを比較し、表２と図７Ａは、クロピドグレルとクロピジグレル（ｃｌｏｐｉｄｉｇｒｅｌ）＋化合物（Ｃｏｍｐｐｏｕｎｄ）３とを比較し、表３および図７Ｂは、アスピリン＋化合物３とクロピドグレル＋化合物（Ｃｏｍｏｕｎｄ）３とを比較する。
【表３】
2016504994.tif 000012
【表４】
2016504994.tif 000013
【表５】
2016504994.tif 000014
【図１】
2016504994.tif 000015
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
2016504994.tif 000018
【図３Ａ】
2016504994.tif 000019
【図３Ｂ】
2016504994.tif 000020
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
2016504994.tif 000023
【図５Ａ】
2016504994.tif 000024
【図５Ｂ】
2016504994.tif 000025
【図６Ａ】
2016504994.tif 000026
【図６Ｂ】
2016504994.tif 000027
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際調査報告】
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