(57)【要約】本明細書において、造血幹細胞の誘導のための、または細胞を造血幹細胞の複能性状態へと初期化するための、組成物、方法、およびキットを提供する。いくつかの態様において、該組成物は、少なくとも1つのHSC誘導因子を含む。このような組成物、方法およびキットは、本明細書に記載のように、造血幹細胞をインビトロで、エクスビボで、またはインビボで誘導するために使用することができ、これらの誘導造血幹細胞を、再生医療適用および療法に使用することができる。2016513974.tif 000147
2016513974.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CDKN1C、DNMT3B、EGR1、ETV6、EVI1、GATA2、GFI1B、GLIS2、HLF、HMGA2、HOXA5、HOXA9、HOXB3、HOXB4、HOXB5、IGF2BP2、IKZF2、KLF12、KLF4、KLF9、LMO2、MEIS1、MSI2、MYCN、NAP1L3、NDN、NFIX、NKX2-3、NR3C2、PBX1、PRDM16、PRDM5、RARB、RBBP6、RBPMS、RUNX1、RUNX1T1、SMAD6、TAL1、TCF15、VDR、ZFP37、ZFP467、ZFP521、ZFP532、ZFP612、およびZPF467から選択される4つ以上の造血幹細胞（HSC）誘導因子をコードする1つまたは複数の発現ベクターを含む、HSC誘導組成物。
【請求項２】
4つ以上のHSC誘導因子が、HLF、RUNX1T1、PBX1、LMO2、PRDM5、ZFP37、MYCN、MSI2、NKX2-3、MEIS1、およびRBPMSである、請求項1に記載のHSC誘導組成物。
【請求項３】
4つ以上のHSC誘導因子が、HLF、RUNX1T1、ZFP37、PBX1、LMO2、およびPRDM5である、請求項1に記載のHSC誘導組成物。
【請求項４】
a．HLFをコードする核酸配列；
b．RUNX1T1をコードする核酸配列；
c．ZFP37をコードする核酸配列；
d．PBX1をコードする核酸配列；
e．LMO2をコードする核酸配列；および
f．PRDM5をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物。
【請求項５】
a．PRDM16をコードする核酸配列；
b．ZFP467をコードする核酸配列；および
c．VDRをコードする核酸配列
のうちの1つまたは複数をさらに含む、請求項4に記載のHSC誘導組成物。
【請求項６】
a．HLFをコードする核酸配列；
b．RUNX1T1をコードする核酸配列；
c．PBX1をコードする核酸配列；
d．LMO2をコードする核酸配列；
e．PRDM5をコードする核酸配列；
f．ZFP37をコードする核酸配列；
g．MYCNをコードする核酸配列；
h．MSI2をコードする核酸配列；
i．NKX2-3をコードする核酸配列；
j．MEIS1をコードする核酸配列；および
k．RBPMSをコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物。
【請求項７】
a．ZFP467をコードする核酸配列；
b．PBX1をコードする核酸配列；
c．HOXB4をコードする核酸配列；および
d．MSI2をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物。
【請求項８】
a．HLFをコードする核酸配列；
b．LMO2をコードする核酸配列；
c．PRDM16をコードする核酸配列；および
d．ZFP37をコードする核酸配列
のうちの1つまたは複数をさらに含む、請求項7に記載のHSC誘導組成物。
【請求項９】
a．MYCNをコードする核酸配列；
b．MSI2をコードする核酸配列；
c．NKX2-3をコードする核酸配列；および
d．RUNX1T1をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物。
【請求項１０】
a．HOXB5をコードする核酸配列；
b．HLFをコードする核酸配列；
c．ZFP467をコードする核酸配列；
d．HOXB3をコードする核酸配列；
e．LMO2をコードする核酸配列；
f．PBX1をコードする核酸配列；
g．ZFP37をコードする核酸配列；および
h．ZFP521をコードする核酸配列
のうちの1つまたは複数をさらに含む、請求項9に記載のHSC誘導組成物。
【請求項１１】
a．HOXB4をコードする核酸配列；
b．PBX1をコードする核酸配列；
c．LMO2をコードする核酸配列；
d．ZFP467をコードする核酸配列；および
e．ZFP521をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクター組成物を含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物。
【請求項１２】
a．KLF12をコードする核酸配列；
b．HLFをコードする核酸配列；および
c．EGR1をコードする核酸配列
のうちの1つまたは複数をさらに含む、請求項11に記載のHSC誘導組成物。
【請求項１３】
a．MEIS1をコードする核酸配列；
b．RBPMSをコードする核酸配列；
c．ZFP37をコードする核酸配列；
d．RUNX1T1をコードする核酸配列；および
e．LMO2をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物。
【請求項１４】
a．KLF12をコードする配列；および
b．HLFをコードする配列
のうちの1つまたは複数をさらに含む、請求項13に記載のHSC誘導組成物。
【請求項１５】
a．ZFP37をコードする核酸配列；
b．HOXB4をコードする核酸配列；
c．LMO2をコードする核酸配列；および
d．HLFをコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物。
【請求項１６】
a．MYCNをコードする核酸配列；
b．ZPF467をコードする核酸配列；
c．NKX2-3をコードする核酸配列；
d．PBX1をコードする核酸配列；および
e．KLF4をコードする核酸配列
のうちの1つまたは複数をさらに含む、請求項15に記載のHSC誘導組成物。
【請求項１７】
1つまたは複数の発現ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項4〜16のいずれか一項に記載のHSC誘導組成物。
【請求項１８】
1つまたは複数の発現ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項4〜16のいずれか一項に記載のHSC誘導組成物。
【請求項１９】
レンチウイルスベクターが誘導性レンチウイルスベクターである、請求項18に記載のHSC誘導組成物。
【請求項２０】
以下の工程を含む、体細胞から誘導造血幹細胞（iHSC）を調製するための方法：
a．HLFをコードする核酸配列、RUNX1T1をコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；およびPRDM5をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これによりiHSCを調製する工程。
【請求項２１】
工程（a）の形質導入が、PRDM16をコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；およびVDRをコードする核酸配列のうちの1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
以下の工程を含む、体細胞から誘導造血幹細胞（iHSC）を調製するための方法：
a．HLFをコードする核酸配列；RUNX1T1をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；PRDM5をコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；MYCNをコードする核酸配列；MSI2をコードする核酸配列；NKX2-3をコードする核酸配列；MEIS1をコードする核酸配列；およびRBPMSをコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これによりiHSCを調製する工程。
【請求項２３】
以下の工程を含む、体細胞から誘導造血幹細胞（iHSC）を調製するための方法：
a．ZFP467をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；HOXB4をコードする核酸配列；およびMSI2をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これによりiHSCを調製する工程。
【請求項２４】
工程（a）の形質導入が、HLFをコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；PRDM16をコードする核酸配列；およびZFP37をコードする核酸配列のうちの1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
以下の工程を含む、体細胞から誘導造血幹細胞（iHSC）を調製するための方法：
a．MYCNをコードする核酸配列；MSI2をコードする核酸配列；NKX2-3をコードする核酸配列；およびRUNX1T1をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これによりiHSCを調製する工程。
【請求項２６】
工程（a）の形質導入が、HOXB5をコードする核酸配列；HLFをコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；HOXB3をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；およびZFP521をコードする核酸配列のうちの1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
以下の工程を含む、体細胞から誘導造血幹細胞（iHSC）を調製するための方法：
a．HOXB4をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；およびZFP521をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これによりiHSCを調製する工程。
【請求項２８】
工程（a）の形質導入が、KLF12をコードする核酸配列；HLFをコードする核酸配列；およびEGR1をコードする核酸配列のうちの1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
以下の工程を含む、体細胞から誘導造血幹細胞（iHSC）を調製するための方法：
a．MEIS1をコードする核酸配列；RBPMSをコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；RUNX1T1をコードする核酸配列；およびLMO2をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これによりiHSCを調製する工程。
【請求項３０】
工程（a）の形質導入が、KLF12をコードする核酸配列；およびHLFをコードする核酸配列のうちの1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
以下の工程を含む、体細胞から誘導造血幹細胞（iHSC）を調製するための方法：
a．ZFP37をコードする核酸配列；HOXB4をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；およびHLFをコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これによりiHSCを調製する工程。
【請求項３２】
工程（a）の形質導入が、KLF12をコードする核酸配列；およびHLFをコードする核酸配列のうちの1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
以下の工程を含む、体細胞から誘導造血幹細胞（iHSC）を調製するための方法：
a．ZFP37をコードする核酸配列；HOXB4をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；およびHLFをコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これによりiHSCを調製する工程。
【請求項３４】
工程（a）の形質導入が、MYCNをコードする核酸配列；ZPF467をコードする核酸配列；NKX2-3をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；およびKLF4をコードする核酸配列のうちの1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
体細胞が線維芽細胞である、請求項20〜34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
体細胞が造血系列細胞である、請求項20〜34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
造血系列細胞が、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、網状赤血球、赤血球、肥満細胞、破骨細胞、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、リンパ球、NK細胞、NKT細胞、自然リンパ球、複能性造血前駆細胞、少能性造血前駆細胞、および系列の限定された造血前駆細胞から選択される、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
造血系列細胞が、複能性前駆細胞（MPP）、骨髄球系共通前駆細胞（CMP）、顆粒球・単球系前駆細胞（GMP）、リンパ球系共通前駆細胞（CLP）、およびプレ巨核球・赤血球系前駆細胞から選択される、請求項36に記載の方法。
【請求項３９】
造血系列細胞が、巨核球・赤血球系前駆細胞（MEP）、プロB細胞、プレB細胞、プレプロB細胞、プロT細胞、ダブルネガティブT細胞、プロNK細胞、プロ樹状細胞（プロDC）、プレ顆粒球/マクロファージ細胞、顆粒球/マクロファージ前駆（GMP）細胞、およびプロ肥満細胞（プロMC）から選択される、請求項36に記載の方法。
【請求項４０】
以下の工程を含む、骨髄球系列へのプロプレB細胞の分化転換を促進する方法：
a．ZFP467をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；HOXB4をコードする核酸配列；およびMSI2をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターをプロプレB細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入されたプロプレB細胞を、骨髄球系列細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これによりプロプレB細胞を骨髄球系列へと分化転換する工程。
【請求項４１】
工程（a）の形質導入が、HLFをコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；PRDM16をコードする核酸配列；およびZFP37をコードする核酸配列のうちの1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
以下の工程を含む、プロプレB細胞の生存および/または増殖を高める方法：
a．HOXB4をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；およびZFP521をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターをプロプレB細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入されたプロプレB細胞を、プロプレB細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これによりプロプレB細胞の生存および/または増殖を高める工程。
【請求項４３】
工程（a）の形質導入が、KLF12をコードする核酸配列；HLFをコードする核酸配列；およびEGR1をコードする核酸配列のうちの1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
請求項20〜39のいずれか一項に記載の方法によって産生された、単離された誘導造血幹細胞（iHSC）。
【請求項４５】
請求項44に記載の複数の誘導造血幹細胞（iHSC）を含む細胞クローン。
【請求項４６】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項45に記載の細胞クローン。
【請求項４７】
請求項1〜19のいずれか一項に記載の1つまたは複数の発現ベクター構成要素を含むHSC誘導組成物を含む、誘導造血幹細胞（iHSC）を作製するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2013年3月14日に出願された米国仮特許出願第61/782,037号の米国特許法第119（e）条の下での恩典を主張し、その内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。2014年3月14日に作製された該ASCIIコピーは701039-076171-PCT1_SL.txtと命名され、506,202バイトのサイズである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、造血系列を初期化し、かつ造血幹細胞を誘導するための組成物、方法、およびキットに関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
造血幹細胞（HSC）は、骨髄において適切な数の幹細胞を維持しつつ、生涯にわたり造血を持続し、かつ継続的に無数の様々な血液細胞型を生成する能力を担う、複能性幹細胞のサブセットである。造血幹細胞は、単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球/血小板、樹状細胞、T細胞、B細胞、NKT細胞、およびNK細胞を含む、全ての血液細胞型または免疫細胞型を生じさせる。造血組織は、長期および短期の再生能を有する細胞、ならびに、方向付けられた複能性、少能性および単能性前駆細胞を含む。
【０００５】
造血幹細胞移植（HSCT）は、造血系の確定的な先天的もしくは後天的な障害を有する、または化学療法、放射線療法もしくは免疫療法に感受性の悪性病変を有する多くの患者にとっての標準治療となっている。過去20年間を通して、HSCTでは、技術的使用における急速な普及および着実な発展が見られた（Gratwohl A, et al., (2010). Hematopoietic stem cell transplantation A Global Perspective. JAMA. 303(16):1617-24（非特許文献1））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Gratwohl A, et al., (2010). Hematopoietic stem cell transplantation A Global Perspective. JAMA. 303(16):1617-24
【発明の概要】
【０００７】
概要
本発明者らは、驚くべきことに、方向付けられた細胞および血液細胞を造血幹細胞に戻して初期化することのできる重要な転写因子を同定した。
【０００８】
造血幹細胞（HSC）は、最も良く特徴付けられた組織特異的幹細胞であるが、HSCの実験研究は、それらが非常に稀であり、それらを精製する方法が厄介であり、かつ種々の研究室間で異なるという事実のために、依然として困難なものとなっている。さらに、HSC生物学に関連した問題に具体的に対処するための遺伝子的ツールが不足している。幅広い臨床使用にも関わらず、HSCの移植は依然としてハイリスクの手技であり、移植に利用可能な幹細胞の数が、移植の成功の最も強力な予測因子である。HSC移植の核心的な臨床的課題の1つは、HSCが非常に稀な細胞であり、20,000個の骨髄細胞中、僅か1個の出現頻度で存在し、移植に十分な細胞を得ることが困難であるという事実から生じる。したがって、移植前にHSCの数を増殖させることができれば、限定されたHSCの数の問題を克服することもできる。移植前にエクスビボにおける培養によってHSCを増殖させる努力は困難であることが判明し、このような努力はまだ臨床には実現されていない。したがって、既存のHSCの数を増殖させるか、または、より大量に存在する細胞型から新規にHSCを生成するかのいずれかのための代替的な戦略を発見する臨床的な必要性が依然としてある。
【０００９】
本発明の態様は、研究用途のためのキットおよび血液疾病について小分子の検査を実施するのに有用な細胞の生成法を含む、多くの適用を提供する。さらに、本発明は、自家造血幹細胞を産生し、必要とする患者にゲノムを編集してまたは編集せずにそれらを戻すための商業的かつ医学的に有用な方法を提供する。造血幹細胞の移植は非常に重要な手技であるが、様々な理由のために現在制限されている。
【００１０】
本明細書において、一部には、より分化した細胞を造血幹細胞状態へと脱分化および初期化することを可能とする本明細書に記載の転写因子の新規な組合せの発見に基づく、造血幹細胞の誘導のための、または細胞を造血幹細胞の複能性状態へと初期化するための、組成物、方法、およびキットを提供する。このような組成物、核酸構築物、方法、およびキットは、本明細書に記載のように、造血幹細胞をインビトロで、エクスビボで、またはインビボで誘導するために使用することができ、これらの誘導造血幹細胞を、再生医療適用および療法に使用することができる。
【００１１】
例えば、本明細書に記載の方法を使用して、白血病、リンパ腫、固形腫瘍、再生不良性貧血、先天性骨髄不全症候群、免疫不全、鎌状赤血球症、地中海貧血症、および代謝疾患/蓄積症、例えばアミロイドーシスをはじめとする疾病を処置するためのHSC細胞を産生することができる。
【００１２】
したがって、本明細書において、いくつかの局面において、CDKN1C、DNMT3B、EGR1、ETV6、EVI1、GATA2、GFI1B、GLIS2、HLF、HMGA2、HOXA5、HOXA9、HOXB3、HOXB4、HOXB5、IGF2BP2、IKZF2、KLF12、KLF4、KLF9、LMO2、MEIS1、MSI2、MYCN、NAP1L3、NDN、NFIX、NKX2-3、NR3C2、PBX1、PRDM16、PRDM5、RARB、RBBP6、RBPMS、RUNX1、RUNX1T1、SMAD6、TAL1、TCF15、VDR、ZFP37、ZFP467、ZFP521、ZFP532、およびZFP612から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、またはそれ以上の造血幹細胞（HSC）誘導因子をコードする1つまたは複数の発現ベクターを含むHSC誘導組成物を提供する。
【００１３】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、PBX1、LMO2、PRDM5、ZFP37、MYCN、MSI2、NKX2-3、MEIS1、およびRBPMSである。
【００１４】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、ZFP37、PBX1、LMO2、およびPRDM5である。
【００１５】
また、本明細書において、いくつかの局面において、
a．HLFをコードする核酸配列；
b．RUNX1T1をコードする核酸配列；
c．ZFP37をコードする核酸配列；
d．PBX1をコードする核酸配列；
e．LMO2をコードする核酸配列；および
f．PRDM5をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供する。
【００１６】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、組成物は、
a．PRDM16をコードする核酸配列；
b．ZFP467をコードする核酸配列；および
c．VDRをコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターをさらに含む。
【００１７】
本明細書において、いくつかの局面において、
a．HLFをコードする核酸配列；
b．RUNX1T1をコードする核酸配列；
c．PBX1をコードする核酸配列；
d．LMO2をコードする核酸配列；
e．PRDM5をコードする核酸配列；
f．ZFP37をコードする核酸配列；
g．MYCNをコードする核酸配列；
h．MSI2をコードする核酸配列；
i．NKX2-3をコードする核酸配列；
j．MEIS1をコードする核酸配列；および
k．RBPMSをコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供する。
【００１８】
本明細書において、いくつかの局面において、
a．ZFP467をコードする核酸配列；
b．PBX1をコードする核酸配列；
c．HOXB4をコードする核酸配列；および
d．MSI2をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供する。
【００１９】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、組成物は、
a．HLFをコードする核酸配列；
b．LMO2をコードする核酸配列；
c．PRDM16をコードする核酸配列；および
d．ZFP37をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターをさらに含む。
【００２０】
本明細書において、いくつかの局面において、
a．MYCNをコードする核酸配列；
b．MSI2をコードする核酸配列；
c．NKX2-3をコードする核酸配列；および
d．RUNX1T1をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供する。
【００２１】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、組成物は、
a．HOXB5をコードする核酸配列；
b．HLFをコードする核酸配列；
c．ZFP467をコードする核酸配列；
d．HOXB3をコードする核酸配列；
e．LMO2をコードする核酸配列；
f．PBX1をコードする核酸配列；
g．ZFP37をコードする核酸配列；および
h．ZFP521をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターをさらに含む。
【００２２】
本明細書において、いくつかの局面において、
a．HOXB4をコードする核酸配列；
b．PBX1をコードする核酸配列；
c．LMO2をコードする核酸配列；
d．ZFP467をコードする核酸配列；および
e．ZFP521をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供する。
【００２３】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、組成物は、
a．KLF12をコードする核酸配列；
b．HLFをコードする核酸配列；および
c．EGR1をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターをさらに含む。
【００２４】
本明細書において、いくつかの局面において、
a．MEIS1をコードする核酸配列；
b．RBPMSをコードする核酸配列；
c．ZFP37をコードする核酸配列；
d．RUNX1T1をコードする核酸配列；および
e．LMO2をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供する。
【００２５】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、組成物は、
a．KLF12をコードする配列；および
b．HLFをコードする配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターをさらに含む。
【００２６】
本明細書において、いくつかの局面において、
a．ZFP37をコードする核酸配列；
b．HOXB4をコードする核酸配列；
c．LMO2をコードする核酸配列；および
d．HLFをコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供する。
【００２７】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、組成物は、
a．MYCNをコードする核酸配列；
b．ZFP467をコードする核酸配列；
c．NKX2-3をコードする核酸配列；
d．PBX1をコードする核酸配列；および
e．KLF4をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターをさらに含む。
【００２８】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、1つまたは複数の発現ベクターはレトロウイルスベクターである。
【００２９】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、1つまたは複数の発現ベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの態様において、レンチウイルスベクターは誘導性レンチウイルスベクターである。
【００３０】
また、本明細書において、いくつかの局面において、CDKN1C、DNMT3B、EGR1、ETV6、EVI1、GATA2、GFI1B、GLIS2、HLF、HMGA2、HOXA5、HOXA9、HOXB3、HOXB4、HOXB5、IGF2BP2、IKZF2、KLF12、KLF4、KLF9、LMO2、MEIS1、MSI2、MYCN、NAP1L3、NDN、NFIX、NKX2-3、NR3C2、PBX1、PRDM16、PRDM5、RARB、RBBP6、RBPMS、RUNX1、RUNX1T1、SMAD6、TAL1、TCF15、VDR、ZFP37、ZFP467、ZFP521、ZFP532、およびZFP612から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、またはそれ以上の造血幹細胞（HSC）誘導因子をコードする改変されたmRNA配列を含むHSC誘導組成物を提供し、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【００３１】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、PBX1、LMO2、PRDM5、ZFP37、MYCN、MSI2、NKX2-3、MEIS1、およびRBPMSである。
【００３２】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、ZFP37、PBX1、LMO2、およびPRDM5である。
【００３３】
本明細書において、いくつかの局面において、
a．HLFをコードする改変されたmRNA配列；
b．RUNX1T1をコードする改変されたmRNA配列；
c．ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；
d．PBX1をコードする改変されたmRNA配列；
e．LMO2をコードする改変されたmRNA配列；および
f．PRDM5をコードする改変されたmRNA配列
を含む造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供し、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【００３４】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、組成物はさらに
a．PRDM16をコードする改変されたmRNA配列；
b．ZFP467をコードする改変されたmRNA配列；および
c．VDRをコードする改変されたmRNA配列
のうちの1つまたは複数を含み、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【００３５】
本明細書において、いくつかの局面において、
a．HLFをコードする改変されたmRNA配列；
b．RUNX1T1をコードする改変されたmRNA配列；
c．PBX1をコードする改変されたmRNA配列；
d．LMO2をコードする改変されたmRNA配列； 
e．PRDM5をコードする改変されたmRNA配列；
f．ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；
g．MYCNをコードする改変されたmRNA配列；
h．MSI2をコードする改変されたmRNA配列；
i．NKX2-3をコードする改変されたmRNA配列；
j．MEIS1をコードする改変されたmRNA配列；および
k．RBPMSをコードする改変されたmRNA配列
を含む造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供し、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【００３６】
本明細書において、いくつかの局面において、
a．ZFP467をコードする改変されたmRNA配列；
b．PBX1をコードする改変されたmRNA配列；
c．HOXB4をコードする改変されたmRNA配列；および
d．MSI2をコードする改変されたmRNA配列
を含む造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供し、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【００３７】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、組成物はさらに
a．HLFをコードする改変されたmRNA配列；
b．LMO2をコードする改変されたmRNA配列；
c．PRDM16をコードする改変されたmRNA配列；および
d．ZFP37をコードする改変されたmRNA配列
のうちの1つまたは複数を含み、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【００３８】
本明細書において、いくつかの局面において、
a．MYCNをコードする改変されたmRNA配列；
b．MSI2をコードする改変されたmRNA配列；
c．NKX2-3をコードする改変されたmRNA配列；および
d．RUNX1T1をコードする改変されたmRNA配列
を含む造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供し、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【００３９】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、組成物はさらに
a．HOXB5をコードする改変されたmRNA配列；
b．HLFをコードする改変されたmRNA配列；
c．ZFP467をコードする改変されたmRNA配列；
d．HOXB3をコードする改変されたmRNA配列；
e．LMO2をコードする改変されたmRNA配列；
f．PBX1をコードする改変されたmRNA配列；
g．ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；および
h．ZFP521をコードする改変されたmRNA配列
のうちの1つまたは複数を含み、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【００４０】
本明細書において、いくつかの局面において、
a．HOXB4をコードする改変されたmRNA配列；
b．PBX1をコードする改変されたmRNA配列；
c．LMO2をコードする改変されたmRNA配列；
d．ZFP467をコードする改変されたmRNA配列；および
e．ZFP521をコードする改変されたmRNA配列
を含む造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供し、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【００４１】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、組成物はさらに
a．KLF12をコードする改変されたmRNA配列；
b．HLFをコードする改変されたmRNA配列；および
c．EGRをコードする改変されたmRNA配列
のうちの1つまたは複数を含み、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【００４２】
本明細書において、いくつかの局面において、
a．MEIS1をコードする改変されたmRNA配列；
b．RBPMSをコードする改変されたmRNA配列；
c．ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；
d．RUNX1T1をコードする改変されたmRNA配列；および
e．LMO2をコードする改変されたmRNA配列
を含む造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供し、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【００４３】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、組成物はさらに
a．KLF12をコードする改変されたmRNA配列；および
b．HLFをコードする改変されたmRNA配列
のうちの1つまたは複数を含み、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【００４４】
本明細書において、いくつかの局面において、
a．ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；
b．HOXB4をコードする改変されたmRNA配列；
c．LMO2をコードする改変されたmRNA配列；および
d．HLFをコードする改変されたmRNA配列
を含む造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供し、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【００４５】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、組成物はさらに
a．MYCNをコードする改変されたmRNA配列；
b．ZFP467をコードする改変されたmRNA配列；
c．NKX2-3をコードする改変されたmRNA配列；
d．PBX1をコードする改変されたmRNA配列；および
e．KLF4をコードする改変されたmRNA配列
のうちの1つまたは複数を含み、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【００４６】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、改変されたシトシンは5-メチルシトシンであり、改変されたウラシルはプソイドウラシルである。
【００４７】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、改変されたmRNA配列は、ピリジン-4-オンリボヌクレオシド、5-アザ-ウリジン、2-チオ-5-アザ-ウリジン、2-チオウリジン、4-チオ-プソイドウリジン、2-チオ-プソイドウリジン、5-ヒドロキシウリジン、3-メチルウリジン、5-カルボキシメチル-ウリジン、1-カルボキシメチル-プソイドウリジン、5-プロピニル-ウリジン、1-プロピニル-プソイドウリジン、5-タウリノメチルウリジン、1-タウリノメチル-プソイドウリジン、5-タウリノメチル-2-チオ-ウリジン、1-タウリノメチル-4-チオ-ウリジン、5-メチル-ウリジン、1-メチル-プソイドウリジン、4-チオ-1-メチル-プソイドウリジン、2-チオ-1-メチル-プソイドウリジン、1-メチル-1-デアザ-プソイドウリジン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、2-チオ-ジヒドロウリジン、2-チオ-ジヒドロプソイドウリジン、2-メトキシウリジン、2-メトキシ-4-チオ-ウリジン、4-メトキシ-プソイドウリジン、4-メトキシ-2-チオ-プソイドウリジン、5-アザ-シチジン、プソイドイソシチジン、3-メチル-シチジン、N4-アセチルシチジン、5-ホルミルシチジン、N4-メチルシチジン、5-ヒドロキシメチルシチジン、1-メチル-プソイドイソシチジン、ピロロ-シチジン、ピロロ-プソイドイソシチジン、2-チオ-シチジン、2-チオ-5-メチル-シチジン、4-チオ-プソイドイソシチジン、4-チオ-1-メチル-プソイドイソシチジン、4-チオ-1-メチル-1-デアザ-プソイドイソシチジン、1-メチル-1-デアザ-プソイドイソシチジン、ゼブラリン、5-アザ-ゼブラリン、5-メチル-ゼブラリン、5-アザ-2-チオ-ゼブラリン、2-チオ-ゼブラリン、2-メトキシ-シチジン、2-メトキシ-5-メチル-シチジン、4-メトキシ-プソイドイソシチジン、4-メトキシ-1-メチル-プソイドイソシチジン、2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、7-デアザ-アデニン、7-デアザ-8-アザ-アデニン、7-デアザ-2-アミノプリン、7-デアザ-8-アザ-2-アミノプリン、7-デアザ-2,6-ジアミノプリン、7-デアザ-8-アザ-2,6-ジアミノプリン、1-メチルアデノシン、N6-メチルアデノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、2-メチルチオ-N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、N6-グリシニルカルバモイルアデノシン、N6-トレオニルカルバモイルアデノシン、2-メチルチオ-N6-トレオニルカルバモイルアデノシン、N6,N6-ジメチルアデノシン、7-メチルアデニン、2-メチルチオ-アデニン、および2-メトキシ-アデニン、イノシン、1-メチル-イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、7-デアザ-グアノシン、7-デアザ-8-アザ-グアノシン、6-チオ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-8-アザ-グアノシン、7-メチル-グアノシン、6-チオ-7-メチル-グアノシン、7-メチルイノシン、6-メトキシ-グアノシン、1-メチルグアノシン、N2-メチルグアノシン、N2,N2-ジメチルグアノシン、8-オキソ-グアノシン、7-メチル-8-オキソ-グアノシン、1-メチル-6-チオ-グアノシン、N2-メチル-6-チオ-グアノシン、およびN2,N2-ジメチル-6-チオ-グアノシン、およびその組合せからなる群より選択される、1つまたは複数のヌクレオシドの改変を含む。
【００４８】
また、本明細書において、いくつかの局面において、
a．HLFをコードする核酸配列、RUNX1T1をコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；およびPRDM5をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【００４９】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、工程（a）の形質導入は、PRDM16をコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；およびVDRをコードする核酸配列のうちの1つまたは複数を含む、1つまたは複数のベクターをさらに含む。
【００５０】
本明細書において、いくつかの局面において、
a．HLFをコードする核酸配列；RUNX1T1をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；PRDM5をコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；MYCNをコードする核酸配列；MSI2をコードする核酸配列；NKX2-3をコードする核酸配列；MEIS1をコードする核酸配列；およびRBPMSをコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【００５１】
本明細書において、いくつかの局面において、
a．ZFP467をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；HOXB4をコードする核酸配列；およびMSI2をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【００５２】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、工程（a）の形質導入は、HLFをコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；PRDM16をコードする核酸配列；およびZFP37をコードする核酸配列のうちの1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む。
【００５３】
本明細書において、いくつかの局面において、
a．MYCNをコードする核酸配列；MSI2をコードする核酸配列；NKX2-3をコードする核酸配列；およびRUNX1T1をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【００５４】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、工程（a）の形質導入は、HOXB5をコードする核酸配列；HLFをコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；HOXB3をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；およびZFP521をコードする核酸配列のうちの1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む。
【００５５】
本明細書において、いくつかの局面において、
a．HOXB4をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；およびZFP521をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【００５６】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、工程（a）の形質導入は、KLF12をコードする核酸配列；HLFをコードする核酸配列；およびEGR1をコードする核酸配列のうちの1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む。
【００５７】
本明細書において、いくつかの局面において、
a．MEIS1をコードする核酸配列；RBPMSをコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；RUNX1T1をコードする核酸配列；およびLMO2をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【００５８】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、工程（a）の形質導入は、KLF12をコードする核酸配列；およびHLFをコードする核酸配列のうちの1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む。
【００５９】
本明細書において、いくつかの局面において、
a．ZFP37をコードする核酸配列；HOXB4をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；およびHLFをコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【００６０】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、工程（a）の形質導入は、KLF12をコードする核酸配列；およびHLFをコードする核酸配列のうちの1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む。
【００６１】
本明細書において、いくつかの局面において、
a．ZFP37をコードする核酸配列；HOXB4をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；およびHLFをコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【００６２】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、工程（a）の形質導入は、MYCNをコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；NKX2-3をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；およびKLF4をコードする核酸配列のうちの1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む。
【００６３】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、体細胞は線維芽細胞である。
【００６４】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、体細胞は造血系列細胞である。
【００６５】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、造血系列細胞は、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、網状赤血球、赤血球、肥満細胞、破骨細胞、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、リンパ球、NK細胞、NKT細胞、自然リンパ球、複能性造血前駆細胞、少能性造血前駆細胞、および系列の制限された造血前駆細胞から選択される。
【００６６】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、造血系列細胞は、複能性前駆細胞（MPP）、骨髄球系共通前駆細胞（CMP）、顆粒球・単球系前駆細胞（GMP）、リンパ球系共通前駆細胞（CLP）、およびプレ巨核球・赤血球系前駆細胞から選択される。
【００６７】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、造血系列細胞は、巨核球・赤血球系前駆細胞（MEP）、プロB細胞、プレB細胞、プレプロB細胞、プロT細胞、ダブルネガティブT細胞、プロNK細胞、プロ樹状細胞（プロDC）、プレ顆粒球/マクロファージ細胞、顆粒球/マクロファージ前駆（GMP）細胞、およびプロ肥満細胞（プロMC）から選択される。
【００６８】
また、本明細書において、いくつかの局面において、
a．ZFP467をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；HOXB4をコードする核酸配列；およびMSI2をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターをプロプレB細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入されたプロプレB細胞を、骨髄球系列細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これによりプロプレB細胞を骨髄球系列へと分化転換する工程
を含む、骨髄球系列へのプロプレB細胞の分化転換を促進する方法を提供する。
【００６９】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、工程（a）の形質導入は、HLFをコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；PRDM16をコードする核酸配列；およびZFP37をコードする核酸配列のうちの1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む。
【００７０】
また、本明細書において、いくつかの局面において、
a．HOXB4をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；およびZFP521をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターをプロプレB細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入されたプロプレB細胞を、プロプレB細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これによりプロプレB細胞の生存および/または増殖を高める工程
を含む、プロプレB細胞の生存および/または増殖を高める方法を提供する。
【００７１】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、工程（a）の形質導入は、KLF12をコードする核酸配列；HLFをコードする核酸配列；およびEGR1をコードする核酸配列のうちの1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む。
【００７２】
また、本明細書において、いくつかの局面において、本明細書に記載の任意のHSC誘導組成物または方法を使用して産生された、単離された誘導造血幹細胞（iHSC）を提供する。
【００７３】
いくつかの局面において、本明細書に記載の任意のHSC誘導組成物または方法を使用して産生された複数の誘導造血幹細胞（iHSC）を含む細胞クローンを提供する。本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、細胞クローンは、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【００７４】
また、本明細書において、いくつかの局面において、誘導造血幹細胞（iHSC）を作製するためのキットであって、本明細書に記載の1つまたは複数の発現ベクター構成要素を含む任意のHSC誘導組成物を含むキットを提供する。
【００７５】
本明細書において、いくつかの局面において、誘導造血幹細胞（iHSC）を作製するためのキットであって、本明細書に記載の改変されたmRNA配列構成要素を含む任意のHSC誘導組成物を含むキットを提供する。
【００７６】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、PBX1、LMO2、PRDM5、ZFP37、MYCN、およびMEIS1である。
【００７７】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、ZFP37、PBX1、およびLMO2である。
【００７８】
本明細書において、いくつかの局面において、
HLFをコードする核酸配列；
RUNX1T1をコードする核酸配列；
ZFP37をコードする核酸配列；
PBX1をコードする核酸配列；
LMO2をコードする核酸配列；
PRDM5をコードする核酸配列；
MYCNをコードする核酸配列；および
MEIS1をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供する。
【００７９】
本明細書において、いくつかの局面において、
HLFをコードする核酸配列；
RUNX1T1をコードする核酸配列；
ZFP37をコードする核酸配列；
PBX1をコードする核酸配列；および
LMO2をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供する。
【００８０】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、1つまたは複数の発現ベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの態様において、レンチウイルスベクターは誘導性レンチウイルスベクターである。いくつかの態様において、レンチウイルスベクターはポリシストロン性誘導性レンチウイルスベクターである。いくつかの態様において、ポリシストロン性誘導性レンチウイルスベクターは、3つ以上の核酸配列を発現する。いくつかの態様において、ポリシストロン性誘導性レンチウイルスベクターの各核酸配列は、2Aペプチド配列によって分断される。
【００８１】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、PBX1、LMO2、PRDM5、ZFP37、MYCN、およびMEIS1である。
【００８２】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、ZFP37、PBX1、およびLMO2である。
【００８３】
本明細書において、いくつかの局面において、HLFをコードする改変されたmRNA配列；RUNX1T1をコードする改変されたmRNA配列；ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；PBX1をコードする改変されたmRNA配列；LMO2をコードする改変されたmRNA配列；PRDM5をコードする改変されたmRNA配列；MEIS1コードする改変されたmRNA配列；およびMYCNをコードする改変されたmRNA配列を含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供し、ここで、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【００８４】
本明細書において、いくつかの局面において、HLFをコードする改変されたmRNA配列；RUNX1T1をコードする改変されたmRNA配列；ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；PBX1をコードする改変されたmRNA配列；およびLMO2をコードする改変されたmRNA配列を含む造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供し、ここで、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【００８５】
本明細書において、いくつかの局面において、
HLFをコードする核酸配列；RUNX1T1をコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；およびPRDM5をコードする核酸配列；MEIS1コードする核酸配列；およびMYCNをコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【００８６】
本明細書において、いくつかの局面において、
HLFをコードする核酸配列；RUNX1T1をコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；およびLMO2をコードする核酸配列；およびPRDM5をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【００８７】
本明細書において実証されているように、ポリシストロン性ウイルス発現系の使用は、体細胞からiHSCへのインビボにおける初期化効率を高めることができる。したがって、本明細書に記載の局面のいくつかの態様において、ポリシストロン性レンチウイルスベクターを使用する。このような態様において、本明細書に記載の2つ以上のHSC誘導因子をコードする配列は、単一のプロモーターからポリシストロン性転写物として発現される。本発明者らは、ポリシストロン性ベクターを作製するために2Aペプチド戦略を使用した（例えばExpert Opin Biol Ther. 2005 May;5(5):627-38を参照のこと）。ポリシストロン性発現ベクター系はまた、多重遺伝子メッセージまたはポリシストロン性メッセージを作製するために、配列内リボソーム進入部位（IRES）要素を使用することができる。IRES要素は、5'-メチル化キャップ依存性リボソームスキャン翻訳モデルを迂回し、配列内部の部位で翻訳を開始することができる（PelletierおよびSonenberg, 1988）。IRES要素を、異種オープンリーディングフレームに連結させることができる。IRESによって各々が隔てられた複数のオープンリーディングフレームは一緒に転写されることができ、よって、ポリシストロン性メッセージが作成される。IRES要素によって、各々のオープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームにとってアクセス可能となる。複数の遺伝子を単一のプロモーター/エンハンサーを使用して効率的に発現させて、単一のメッセージを転写することができる。例えば、米国特許第4,980,285号；第5,925,565号；第5,631,150号；第5,707,828号；第5,759,828号；第5,888,783号；第5,919,670号；および第5,935,819号；ならびにSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press (1989)を参照されたい。
【００８８】
定義
便宜のために、ここで、明細書、実施例および添付の特許請求の範囲に使用される特定の用語をここに集める。特記しない限りまたは内容から暗黙ではない場合、以下の用語および語句は、以下に与えられた意味を含む。明確に特記しない限りまたは内容から明らかでない場合、以下の用語および語句は、該用語または語句がそれが属する技術分野において獲得した意味を排除しない。定義は、特定の態様を説明することを助けるために提供され、特許請求した本発明を限定する意図はない。なぜなら、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるからである。別に定義しない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の技術者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００８９】
本明細書において使用する「HSC誘導因子」という用語は、その用語が本明細書において定義される場合には、発生能改変因子、例えばタンパク質、RNAまたは小分子を指し、その発現は、細胞、例えば体細胞の、HSC状態への初期化に寄与する。HSC誘導因子は、例えば、細胞をHSC状態へと初期化することのできる転写因子、例えば、HLF、RUNX1T1、PBX1、LMO2、PRDM5、ZFP37、MYCN、MSI2、NKX2-3、MEIS1、およびRBPMSなどであることができ、これには、インビトロにおけるiHSC作製法におけるこれらの1つまたは複数の因子の代わりとなり得る任意の遺伝子、タンパク質、RNA、または小分子が含まれる。いくつかの態様において、HSC誘導因子の外因的発現は、1つまたは複数のHSC誘導因子の内因的発現を誘導し、よって、1つまたは複数のHSC誘導因子の外因的発現は、iHSC状態に細胞を安定に維持するためにもはや必要とされない。
【００９０】
本明細書において使用する「発生能」または「発生能力」という用語は、分化時に所与の細胞によって成し遂げられることができる全ての発生細胞運命または細胞型の全体を指す。したがって、より大きなまたはより高い発生能を有する細胞は、より低いまたは減少した発生能を有する細胞よりも多種多様な異なる細胞型へと分化することができる。細胞の発生能は、生物の全ての細胞を生じることができることに加えて、胚体外組織を生じることのできる全能性細胞の最も高い発生能から；ただ一つの組織型または細胞型へと分化する能力を有するが本明細書に記載のような自己複製の特性を有する「単能性細胞」まで；最も低い発生能を有する「最終分化型細胞」までに及び得る。「親発生能」を有する細胞とは、それを生じた親細胞の発生能を有する細胞を指す。
【００９１】
「複能性細胞」に言及して使用される場合の「複能性」という用語は、1つまたは複数の胚葉（しかし3つ全ての胚葉ではない）の細胞へと分化する発生能を有する細胞を指す。したがって、複能性細胞はまた、「部分的に分化した細胞」とも呼ばれることができる。複能性細胞は当技術分野において周知であり、複能性細胞の例には、成体幹細胞、例えば、造血幹細胞および神経幹細胞が挙げられる。「複能性」は、細胞が、所与の系列の多くの細胞型を形成し得るが、他の系列の細胞は形成し得ないことを示す。例えば、複能性造血細胞は、多くの異なる血液細胞型の全てを形成することができるが（赤血球、白血球、血小板など）、それは神経を形成することはできない。したがって、「複能性」という用語は、全能性および多能性よりも低い発生能の程度を有する細胞の状態を指す。
【００９２】
本明細書において使用する「幹細胞」または「未分化細胞」という用語は、自己複製の特性を有し、かつ複数の細胞型へと分化する発生能を有する（発生能（すなわち、全能性、多能性、複能性など）に関して特に意味は含蓄されていない）未分化または部分的に分化した状態の細胞を指す。幹細胞は、その発生能を維持しつつ、増殖してより多くのこのような幹細胞を生じることができる。理論的には、自己複製は、2つの主な機序のいずれかによって起こることができる。幹細胞は非対称的に分裂することができ、これは偏性の非対称分化として知られ、一方の娘細胞は親幹細胞の発生能を保持し、もう一方の娘細胞は、親細胞とはいくつかの明確に異なる他の特異的な機能、表現型および/または発生能を発現する。娘細胞それ自体を、親発生能を有する1つまたは複数の細胞を維持しつつも、その後1つまたは複数の成熟細胞型へと分化する後代を増殖および産生するように誘導することができる。分化した細胞は、複能性細胞から導かれ得、この複能性細胞自体は複能性細胞から導かれる、など続く。これらの各々の複能性細胞は幹細胞と考えることができるが、各々のこのような幹細胞が生じ得る細胞型の範囲、すなわちその発生能はかなり異なることができる。あるいは、集団におけるいくつかの幹細胞は、2つの幹細胞へと対称的に分裂することができ、これは確率論的な分化として知られ、したがって、全体として集団におけるいくつかの幹細胞が維持され、一方、集団における他の細胞は分化した後代のみを生じる。したがって、「幹細胞」という用語は、特定の環境下で、より特定化されたまたは分化された表現型へと分化する発生能を有し、かつ、特定の環境下で、実質的に分化することなく増殖する能力を保持する、細胞の任意のサブセットを指す。いくつかの態様において、幹細胞という用語は、一般的に、天然の親細胞を指し、その子孫（後代細胞）は、分化によって、例えば胚細胞および組織の進行的な多様化において起こるような完全に個々の特徴を獲得することによって、しばしば異なる方向へと特定化する。いくつかの分化した細胞はまた、より大きな発生能の細胞を生じる能力を有する。このような能力は天然であり得るか、または、様々な因子を用いての処理時に人工的に誘導され得る。幹細胞として始まる細胞は、分化した表現型へと向かって進行し得るが、その後、これを誘導して幹細胞表現型へと「元に戻す」および再発現させることができ、この用語はしばしば当業者によっておよび本明細書において使用されるように「脱分化」または「初期化」または「逆分化」と呼ばれる。
【００９３】
細胞個体発生の脈絡において、「分化する」または「分化している」という用語は、発生過程を指す相対的な用語であり、この発生過程により細胞は、その直近の前駆細胞よりも発生経路をさらに下って進行する。したがって、いくつかの態様において、初期化された細胞は、この用語が本明細書において定義されている場合には、これは系列の限定された前駆細胞（例えばリンパ球系共通前駆細胞）へと分化することができ、これは次いで経路をさらに下って他の型の前駆細胞（例えばプロBプレB細胞）に分化することができ、これはその後、最終段階の分化細胞へと分化することができ、これは特定の組織型において特徴的な役割を果たし、これはさらに増殖する能力を保持している場合もあり保持していない場合もある。
【００９４】
本明細書において使用する「分化転換」は、複能性中間細胞を形成することなく、細胞の表現型を別の細胞型の表現型へと切り替えることができる過程を指す。したがって、分化転換法が使用される場合、細胞をまず複能性細胞へと脱分化（または初期化）させてから別の造血系列細胞へと分化させるということを必要とせず；むしろ、細胞型は、例えば最初に複能性iHSC表現型を形成することなく、ある細胞型から別の細胞型へと単に「切り替え」られる。
【００９５】
本明細書において使用する「複能性または多能性中間細胞を形成することなく」という用語は、好ましくは1工程での、ある細胞型から別の細胞型への分化転換を指し；したがって、複能性または多能性中間細胞を形成することなく細胞の分化した表現型または発生能を改変させる方法は、細胞をまず複能性状態へと脱分化（または初期化）させてから別の細胞型へと分化させるということを必要としない。
【００９６】
「発現」という用語は、RNAおよびタンパク質の産生ならびに適宜タンパク質の分泌に関与する細胞過程を指し、これには、適用可能な場合には、例えば、転写、翻訳、フォールディング、修飾、およびプロセシングが含まれるがそれらに限定されるわけではない。「発現産物」は、遺伝子から転写されたRNA、および遺伝子から転写されたmRNAの翻訳によって得られたポリペプチドを含む。いくつかの態様において、発現産物は、ポリペプチドをコードしない配列、例えばマイクロRNAから転写される。
【００９７】
本明細書において使用する「転写因子」すなわち「TF」という用語は、DNA結合ドメインを使用してDNAの特定の部分に結合するタンパク質を指し、これはDNAからRNAへの遺伝子情報の転写を制御するシステムの一部である。
【００９８】
本明細書において使用する「小分子」という用語は、ペプチド、ペプチド模倣体、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、アプタマー、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、約10,000g/モル未満の分子量を有する有機または無機化合物（例えば、ヘテロ有機化合物および有機金属化合物を含む）、約5,000g/モル未満の分子量を有する有機または無機化合物、約1,000g/モル未満の分子量を有する有機または無機化合物、約500g/モル未満の分子量を有する有機または無機化合物、ならびにこのような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に許容される形を含むことができるがそれらに限定されるわけではない、化学作用物質を指す。
【００９９】
本明細書において使用する「外因的」という用語は、人の手を含む過程によって、核酸（例えば転写因子をコードする合成の、改変されたRNA）もしくはタンパク質（例えば転写因子）が通常見られないかまたは少量でしか見られない細胞または生物などの生物学的系に導入された、核酸またはタンパク質を指す。因子（例えば、転写因子をコードする合成の、改変されたRNA、またはタンパク質、例えばポリペプチド）は、それが直前の前駆細胞または該物質を受け継ぐ後代細胞に導入された場合に外因的と考えられる。対照的には、「内因的」という用語は、生物学的系または細胞に対して天然である因子または発現産物を指す（例えば、遺伝子、例えばHLFの内因的発現は、細胞内における内因的な遺伝子によるHLFポリペプチドの産生を指す）。
【０１００】
本明細書において使用する「単離された」または「部分的に精製された」という用語は、核酸もしくはポリペプチドの場合には、その天然源に見られる核酸もしくはポリペプチドと共に存在する、および/または細胞によって発現されるかもしくは分泌ポリペプチドの場合には分泌される場合には核酸もしくはポリペプチドと共に存在する、少なくとも1つの他の構成要素（例えば核酸またはポリペプチド）から分離された核酸もしくはポリペプチドを指す。化学的に合成された核酸もしくはポリペプチドまたはインビトロでの転写/翻訳を使用して合成されたものは、「単離された」とみなされる。
【０１０１】
本明細書において使用する「単離された細胞」という用語は、それが元来見られた生物から取り出された細胞、またはこのような細胞の子孫を指す。任意で、該細胞は、例えば他の細胞の存在下でインビトロにおいて培養される。任意で、該細胞は後に、第二の生物に導入されるか、または該細胞（または該細胞の後代である細胞または細胞集団）が単離された生物に再導入される。
【０１０２】
本明細書において使用する単離された細胞集団に関する「単離された集団」という用語は、混合細胞集団または異種細胞集団から取り出され分離された細胞の集団を指す。いくつかの態様において、単離された集団は、細胞が単離または濃縮される前の異種集団と比較して、「実質的に純粋な」細胞集団である。いくつかの態様において、単離された集団は、複能性細胞が由来する異種の体細胞集団と比較して、実質的に純粋な複能性細胞集団を含む、単離された複能性細胞集団である。
【０１０３】
「直近の前駆細胞」という用語は、そこから娘細胞が細胞分裂によって生じた親細胞を指すために本明細書において使用される。
【０１０４】
細胞を1つもしくは複数の構築物、ウイルスベクター、または合成の改変されたRNAと接触させることに関連した本明細書において使用する「接触する」または「接触」という用語は、細胞を、1つもしくは複数の構築物、ウイルスベクター、または合成の改変されたRNAを含む培養培地に少なくとも1回、または複数回晒すか、あるいは、このような構築物、ウイルスベクター、または合成の改変されたRNAを少なくとも1回または複数回、細胞と接触させるようにした方法、すなわち形質導入システムまたはトランスフェクションシステムに晒すことを含む。このような細胞がインビボである場合、細胞を、構築物、ウイルスベクター、または合成の改変されたRNAと接触させるということは、薬学的組成物などの組成物中の構築物、ウイルスベクター、または合成の改変されたRNAを、適切な投与経路を介して対象に投与し、よって化合物をインビボで該細胞に接触させることを含む。
【０１０５】
本明細書において使用する「トランスフェクション」という用語は、外因的な核酸、例えば合成の改変されたRNAを細胞に、好ましくは真核細胞に導入するための方法、例えば化学的な方法の使用を指す。本明細書において使用するトランスフェクションという用語は、外因的な核酸を細胞に導入するウイルスに基づいた方法を包含しない。トランスフェクション法は、物理的処理（電気穿孔法、ナノ粒子、マグネトフェクション）、および化学に基づいたトランスフェクション法を含む。化学に基づいたトランスフェクション法は、シクロデキストリン、ポリマー、リポソーム、およびナノ粒子を含むがそれらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、陽イオン性脂質またはその混合物、例えばDOPA、リポフェクタミン、およびUptiFectinを使用して、本明細書に記載の合成の改変されたRNAを、細胞にトランスフェクトすることができる。いくつかの態様において、陽イオン性ポリマー、例えばDEAE-デキストランまたはポリエチレンイミンを使用して、本明細書に記載の合成の改変されたRNAをトランスフェクトすることができる。
【０１０６】
本明細書において使用する「形質導入」という用語は、外因的な核酸、例えばHSC誘導因子をコードする核酸配列を細胞に導入するための、ウイルス粒子またはウイルスの使用を指す。
【０１０７】
本明細書において使用する「トランスフェクション試薬」という用語は、宿主細胞への核酸の取り込みを誘導する任意の作用物質を指す。また、このような試薬の非存在下で投与された核酸配列と比較して、例えば少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも25倍、少なくとも500倍、少なくとも100倍、少なくとも1000倍、またはそれ以上取り込みを増強する作用物質も包含される。いくつかの態様において、組成物を調製するのに、または合成の改変されたRNAと共投与するのに有用である陽イオン性または非陽イオン性脂質分子をトランスフェクション試薬として使用する。他の態様において、合成の改変されたRNAは、例えば、リガンド、ペプチド基、親油性基、標的指向部分などに付着するための化学結合を含む。他の態様において、トランスフェクション試薬は、当技術分野において公知または本明細書において記載されているような、荷電した脂質、エマルション、リポソーム、陽イオン性もしくは非陽イオン性脂質、陰イオン性脂質、または浸透増強剤を含む。
【０１０８】
本明細書において使用する「反復トランスフェクション」という用語は、合成の改変されたRNAなどの核酸を用いての、同じ細胞培養液の複数回（例えば1回超または少なくとも2回）の反復トランスフェクションを指す。いくつかの態様において、細胞培養液を、少なくとも2回、少なくとも3回、少なくとも4回、少なくとも5回、少なくとも6回、少なくとも7回、少なくとも8回、少なくとも9回、少なくとも10回、少なくとも11回、少なくとも12回、少なくとも13回、少なくとも14回、少なくとも15回、少なくとも16回、少なくとも17回、少なくとも18回、少なくとも19回、少なくとも20回、少なくとも25回、少なくとも30回、少なくとも35回、少なくとも40回、少なくとも45回、少なくとも50回、またはそれ以上トランスフェクトする。細胞の所望の表現型が達成されるまで、トランスフェクションを反復することができる。
【０１０９】
各々の反復トランスフェクションの時間間隔は、本明細書において、「トランスフェクションの頻度」と称される。いくつかの態様において、トランスフェクションの頻度は、任意の発生能改変計画における所与の期間の間に、6時間毎、12時間毎、24時間毎、36時間毎、48時間毎、60時間毎、72時間毎、96時間毎、108時間毎、5日間毎、7日間毎、10日間毎、14日間毎、3週間毎、またはそれ以上空けた間隔である。頻度はまた変更することができ、よって各投与間の間隔は異なる（例えば最初の間隔は36時間、2回目の間隔は48時間、3回目の間隔は72時間など）。反復トランスフェクションのスケジュールおよび期間に依存して、トランスフェクション計画の間に過増殖を防ぎかつ栄養分を補充するために、細胞を分割もしくは継代させるか、または培地を変更もしくは交換することが多くの場合必要であることが理解されるべきである。本明細書に記載の方法の目的のために、以前にトランスフェクトされた培養液の継代から生じた培養液のトランスフェクションは、特記しない限り、「反復トランスフェクション」、「反復接触」または「複数回の接触」と判断される。
【０１１０】
本明細書において使用する「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、一般的に、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリ-デオキシリボヌクレオチドを指し、これらには改変されていないRNA、改変されていないDNA、改変されたRNA、および改変されたDNAを含む。ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖DNAおよびRNAポリヌクレオチドを含むがそれらに限定されるわけではない。ポリヌクレオチドという用語は、本明細書において使用される場合、化学的、酵素的または代謝的に改変された形態のポリヌクレオチド、ならびに、ウイルスおよび細胞（例えば単純な（原核）および複雑な（真核）細胞を含む）に見られるまたはそれに特徴的である天然に存在する化学的形態のDNAおよびRNAを包含する。本明細書に記載の核酸ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、その同族の相補鎖にハイブリダイズする能力を保持している。
【０１１１】
したがって、本明細書において使用する「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、プライマーおよびプローブ、ならびにオリゴヌクレオチドフラグメントを包含し、ポリデオキシリボヌクレオチド（2-デオキシ-D-リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（D-リボースを含有する）、およびプリンもしくはピリミジン塩基または改変されたプリンもしくはピリミジン塩基（塩基脱落部位を含むがそれらに限定されるわけではない）のN-グリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチドの総称である。「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語の間には長さの区別は意図されておらず、これらの用語は互換的に使用される。これらの用語は、分子の一次構造のみを指す。オリゴヌクレオチドは、任意の既存のまたは天然の配列から物理的に必ずしも導かれているわけではなく、化学的合成、DNA複製、DNA増幅、インビトロでの転写、逆転写、または任意のその組合せをはじめとする任意の方法で作製されることができる。
【０１１２】
本明細書において使用する「ヌクレオチド」または「モノヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシドのリン酸エステル、例えば一リン酸エステル、二リン酸エステル、三リン酸エステル、および四リン酸エステルを指し、エステル化の最も一般的な部位は、ペントースのC-5位（またはペントースではない「糖部分」の等価な位置）に付着したヒドロキシル基である。「ヌクレオチド」という用語は、通常のヌクレオチドおよび非通常のヌクレオチドの両方を含み、これは、ホスホロチオエート、亜リン酸、環原子の改変された誘導体などを含むがそれらに限定されるわけではない。
【０１１３】
本明細書において使用する「通常のヌクレオチド」という用語は、dATP、dTTP（またはTTP）、dCTP、dGTP、dUTPおよびdITPを含む、「天然に存在する」デオキシヌクレオチド（dNTP）の1つを指す。
【０１１４】
本明細書において使用する「非通常のヌクレオチド」という用語は、天然に存在するヌクレオチドではないヌクレオチドを指す。「天然に存在する」という用語は、ヒトの介入を伴わない自然に存在するヌクレオチドを指す。対照的に、「非通常のヌクレオチド」という用語は、ヒトの介入によってのみ存在するヌクレオチド、すなわち、「人工ヌクレオチド」を指す。「非通常のヌクレオチド」は、ペントース糖および/または1つもしくは複数のリン酸エステルがそれぞれの類似体で置き換えられているヌクレオチドを含むことができる。例示的なリン酸エステル類似体には、アルキルホスホネート、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilothioates）、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ボロノホスフェートなど（存在する場合には、任意の関連する対イオンを含む）が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。非通常のヌクレオチドは、通常のヌクレオチドを上回る、別の非通常のヌクレオチドまたは「人工」ヌクレオチドとの塩基対形成の優先性を示すことができる（例えば、Ohtsuki et al. 2001, Proc. Natl. Acad. Sci., 98: 4922-4925に記載されており、これは参照により本明細書に組み入れられる）。塩基対形成能は、Ohtsukiら（前記）に記載のようなT7転写アッセイによって測定され得る。「非通常」または「人工」ヌクレオチドの他の非限定的な例は、Lutz et al. (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett., 8: 1149-1152); Voegel and Benner (1996) Helv. Chim. Acta 76, 1863-1880; Horlacher et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 6329-6333; Switzer et al. (1993), Biochemistry 32:10489-10496; Tor and Dervan (1993) J. Am. Chem. Soc. 115: 4461-4467; Piccirilli et al. (1991) Biochemistry 30: 10350-10356; Switzer et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 8322-8323に見い出すことができ、その全てが参照により本明細書に組み入れられる。「非通常のヌクレオチド」はまた、変性ヌクレオチドまたは内在的に蛍光を有するヌクレオチドであることができる。
【０１１５】
本明細書において使用する「改変されたリボヌクレオシド」という用語は、標準的なグアニン（G）、アデニン（A）、シトシン（C）、およびウラシル（U）ヌクレオシドに対する改変を包含するリボヌクレオシドを指す。このような改変は、例えば、当業者には公知のように、哺乳動物細胞mRNAに転写後に通常導入された改変、および人工的な化学的改変を含むことができる。
【０１１６】
本明細書において使用する「合成の改変されたRNA」または「改変されたRNA」または「改変されたmRNA」という用語は、少なくとも1つの改変されたヌクレオシド（この用語は本明細書において以下に定義されている）を含むインビトロにおいて産生されたRNA分子を指す。改変されたmRNAは、そのような改変を有する、細胞、組織、器官などのような天然源から単離されたmRNAを包含せずに、むしろ、本明細書に記載のように、インビトロの技術を使用して合成された合成の改変されたRNAのみを包含する。「合成の改変されたRNA」または「改変されたRNA」という用語に適用された「組成物」という用語は、複数の異なる合成の改変されたRNA分子を包含する（例えば、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも75個、少なくとも90個、少なくとも100個またはそれ以上の合成の改変されたRNA分子）。いくつかの態様において、合成の改変されたRNA組成物は、さらに他の作用物質（例えば、インターフェロン発現または活性の阻害剤、トランスフェクション試薬など）を含むことができる。このような複合物は、異なる配列の合成の改変されたRNA（例えば異なるポリペプチドをコードする）、異なる改変を有する同じ配列の合成の改変されたRNA、またはその任意の組合せを含むことができる。
【０１１７】
本明細書において使用する「改変されたヌクレオシド」という用語は、標準的なグアニン（G）、アデニン（A）、シチジン（C）、およびウリジン（U）ヌクレオシドに対する改変を包含するリボヌクレオシドを指す。このような改変は、例えば、当業者には公知のように、哺乳動物細胞mRNAに転写後に通常導入された改変、および人工的な化学的改変を含み得る。
【０１１８】
本明細書において使用する「ポリペプチド」という用語は、少なくとも2個のアミノ酸（例えば、少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個、少なくとも100個、少なくとも125個、少なくとも150個、少なくとも175個、少なくとも200個、少なくとも225個、少なくとも250個、少なくとも275個、少なくとも300個、少なくとも350個、少なくとも400個、少なくとも450個、少なくとも500個、少なくとも600個、少なくとも700個、少なくとも800個、少なくとも900個、少なくとも1000個、少なくとも2000個、少なくとも3000個、少なくとも4000個、少なくとも5000個、少なくとも6000個、少なくとも7000個、少なくとも8000個、少なくとも9000個、少なくとも10,000個またはそれ以上のアミノ酸）を含むアミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において互換的に使用される。本明細書において使用する「ペプチド」という用語は、典型的には約2〜60アミノ酸長の、比較的短いポリペプチドを指す。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】マイクロアレイデータが作成された血球分化提示集団（ボックス）の図を示す。本明細書において作成されたデータは薄い線のボックスで示され、他のグループによるものは濃い線のボックスで示されている。血球分化は、通常、HSCから、分化した血液エフェクター細胞へと進行するが、本明細書に記載の結果は、HSCにおいて増強されている転写因子を利用して、方向付けられた造血細胞をHSCへと戻して初期化（大きな矢印）することを目的とする。この提案を通して、HSCは、ストリンジェントな細胞表面基準（例えば、ckit+Sca1+系列-CD48-flk2-CD150+CD34-）によって精製されるだけでなく、胎仔肝HSC（例えば、ckit+Sca1+系列-CD48-CD150+Mac1low）についても精製される。
【図２】方向付けられた造血細胞をHSCへと戻して初期化することのできる因子を同定するための、本明細書に記載のアプローチの概観を示す。
【図３】血球発現データベースを使用する遺伝子の発見を示す。6個の異なる血球集団において増強されている遺伝子の発現の色分け地図。各縦列は、血球サブセット（40個の集団が示されている）からのマイクロアレイデータを示す。赤血球前駆細胞は、MEP、プレCFU-EおよびCFU-Eを含む。発現されたものを赤色として可視化し；発現されていないものを青色として可視化した。＊アステリスクは、示された細胞型の運命および/または機能の特定化において公知の役割を有する遺伝子を示す。
【図４Ａ】実験的なアプローチおよび実験的な集団の概観を示す。図4Aは、インビトロおよびインビボでの方法によって、HSCにおいて増強されている複数の重要な転写因子の発現を通して誘導されたHSC（iHSC）をスクリーニングするための実験アプローチを示す。CD45.2トランスジェニック（rtTA）マウスを、レシピエントCD45.1宿主マウスを使用する移植実験におけるコンジェニックドナー細胞の同定のために使用する。骨髄球系共通前駆細胞（CMP）およびプロ/プレB細胞を、CD45.2トランスジェニックマウスの骨髄から選別して取り出した。選別された細胞を、ZsGreen対照（VC）またはHSC特異的因子のウイルス混液と共に14時間インキュベートした。ZsGr+細胞を、ドキシサイクリンの添加から2日後に再度選別した。再度選別されたZsGr+CMPおよびプロプレB細胞を、CFC骨髄球系コロニー形成アッセイにかけるか（20日後にコロニー数および形態について評価）または条件付けしたIR CD45.1+レシピエントマウスに移植した。末梢からの採血を、細胞の短期間および長期間の再構築能を定めるために16週間まで行った。適切な多系列再構築を有すると同定されたマウスを安楽死させ、ドナーから得られた細胞を、条件付けされた第二のCD45.1レシピエントに移植するために骨髄から選別し；また、骨髄、脾臓、および胸腺の全分析も実施した。
【図４Ｂ】実験的なアプローチおよび実験的な集団の概観を示す。図4Bは、本発明者らの出発集団として優先的に選択されたCMPおよびプレプロB細胞を示し、よって、本発明者らは、B細胞系列および骨髄球系列の両方における最初に規定された方向付けられた血液細胞からの実験的な初期化を実証することができた。これらの細胞集団は、列挙された表現型マーカーを使用して同定された。
【図５Ａ】HSCにおいて増強されている転写因子の色分け地図を示す。Rossi研究所らは、248個を超える規定された前駆細胞およびエフェクターサブ集団についてのmRNA発現プロファイルを含む詳細なデータベースを編集した。図5Aは、HSCにおいて増強されている37個の初期化因子についての発現プロファイル色分け地図を示す。縦列は、40個の明確に異なるFACSによって選別された集団についてのマイクロアレイデータを示す。＊は、発生上の重要性から選択された因子を示す。発現されたものを赤色として可視化し；発現されていないものを青色として可視化した。
【図５Ｂ】HSCにおいて増強されている転写因子の色分け地図を示す。Rossi研究所らは、248個を超える規定された前駆細胞およびエフェクターサブ集団についてのmRNA発現プロファイルを含む詳細なデータベースを編集した。図5Bは、HSCにおいて増強されている全ての因子が、pHAGE2レンチウイルスベクターをベースとするドキシサイクリン誘導性tet-onシステムに配置されたことを示す。addgene製のこのベクター地図の唯一の例外は、CMVプロモーターが、本明細書に記載の系に使用されていることである。HSCにおいて増強されている同定された転写因子の増大したセットの色分け地図。
【図５Ｃ−１】HSCにおいて増強されている転写因子の色分け地図を示す。Rossi研究所らは、248個を超える規定された前駆細胞およびエフェクターサブ集団についてのmRNA発現プロファイルを含む詳細なデータベースを編集した。図5Cは、HSCにおいて増強されている46個の推定初期化因子についての発現プロファイル色分け地図を示す。縦列は、40個の明確に異なるFACSにより選別された集団についてのマイクロアレイデータを表す。＊発現されたものを赤色として可視化し；発現されていないものを青色として可視化した。
【図５Ｃ−２】HSCにおいて増強されている転写因子の色分け地図を示す。Rossi研究所らは、248個を超える規定された前駆細胞およびエフェクターサブ集団についてのmRNA発現プロファイルを含む詳細なデータベースを編集した。図5Cは、HSCにおいて増強されている46個の推定初期化因子についての発現プロファイル色分け地図を示す。縦列は、40個の明確に異なるFACSにより選別された集団についてのマイクロアレイデータを表す。＊発現されたものを赤色として可視化し；発現されていないものを青色として可視化した。
【図６Ａ】プロおよびプレB細胞についての単離戦略を示す。図6Aは、全骨髄を磁気B220濃縮カラムにかけることによって骨髄から選別されたプロプレB細胞を示す。濃縮は、そのそれぞれの集団におけるB220+CD19+ B細胞を15％から85％まで増加させ；Aria細胞選別を通して、試料の純度はさらに99〜100％まで増加する。（RTは、カラムからのB220-のランスルー液を意味する）。
【図６Ｂ】プロおよびプレB細胞についての単離戦略を示す。図6Bは、フローヒストグラムによって示されるプロプレB細胞を得るための選別戦略を示す。
【図６Ｃ】プロおよびプレB細胞についての単離戦略を示す。図6Cは、以下の各々の試料についての全純度を示す：B220について濃縮されたもの全部（上のパネル）、再分析され選別されたプロB細胞（中央のパネル）、および再分析され選別されたプレB細胞（下のパネル）。CD25発現対B220発現を示すことによって、本発明者らは、プロおよびプレB細胞を効果的に選別できることだけでなく、それらを表現型マーカーおよび選別を介して識別できることも実証する。
【図６Ｄ】プロおよびプレB細胞についての単離戦略を示す。図6Dは、回収された各集団におけるプレB細胞およびプロB細胞の全体的な選別純度を示し；プロプレB細胞の有能な選別を示す（RTは、カラムからのB220-のランスルー液を意味する）。
【図７Ａ】CMPについての単離戦略を示す。図7Aは、全骨髄を磁気c-kit濃縮カラムにかけることによって骨髄から選別されたCMP細胞を示す。示されたゲーティング戦略は、シングレット、生細胞、系列陰性の造血前駆細胞を単離した。
【図７Ｂ】CMPについての単離戦略を示す。図7Bは、濃縮がCMPレベルを増加させ、さらに、Aria細胞選別を使用して99〜100％の純度が達成されることを示す。
【図８Ａ】HSCにおいて増強されている転写因子（TF）の、造血前駆細胞への形質導入および誘導性発現を実証する。図8Aは、8個の異なるTFを有するレンチウイルス（LV1〜LV8）を用いての複能性前駆細胞（MPP）への形質導入を示す。細胞を、ドキシサイクリン（Dox）の存在下で5日間培養し、その後、フローサイトメトリーにかけた。
【図８Ｂ】HSCにおいて増強されている転写因子（TF）の、造血前駆細胞への形質導入および誘導性発現を実証する。図8Bは、TFを形質導入されたMPPが移植され、ドキシサイクリン上で4週間維持され（左パネル）、続いて2週間ドキシサイクリンを除去して維持された（右パネル）、レシピエントの末梢血を示す。
【図８Ｃ】HSCにおいて増強されている転写因子（TF）の、造血前駆細胞への形質導入および誘導性発現を実証する。図8Cは、インビトロにおけるウイルスにより媒介される推定初期化因子の発現を示す。初代造血幹細胞（HSC）または複能性前駆細胞（MPP）内における、および示された因子をコードするLVを用いて形質導入されかつ1週間培養された初代細胞における、その相対的発現を示す、示された遺伝子についての定量RT-PCR。過剰発現細胞におけるmRNAレベルは、初代HSCにおける発現レベルで割ることによって計算された。結果は、内因性レベルを、Hlfでは8倍、Nap1l3では110倍、Rbpmsでは20倍、およびRunx1'では40倍上回ることを示す。
【図９】プロ/プレB細胞およびCMPに対して、ドキシサイクリン誘導性ウイルス混液を用いて形質導入を行うことができることを実証する。図9Aは、骨髄から選別されたB220+CD19+B細胞を示し；細胞を、なし（形質導入せず）、対照ZsGrウイルス（VC）、またはHSCにおいて増強されている28個の因子を発現するウイルス混液（VM）と共に14時間インキュベートした。ドキシサイクリン（dox）を、24時間加えた。非形質導入細胞と比較して、VMを細胞に対して使用した場合に、ZsGr+細胞の増加が観察される。図9Bは、3つの独立した試験においてドキシサイクリンの存在下および非存在下でさらに分析されたB220+CD19+B細胞を示す。ドキシサイクリンの非存在下では僅かなZsGr+細胞しか観察されないが、VCまたはVMの使用に関わらず、ドキシサイクリンの添加は、集団におけるZsGrの発現を増加させる。ドキシサイクリンの添加は、ZsGrの発現およびその中の遺伝子発現を堅固に調節する。図9Cは、骨髄から選別し取り出され、VCまたはVMと共に14時間インキュベートされ、分析前に2日間ドキシサイクリンと共に放置された、プレB細胞、プロB細胞、およびCMPを示す。プロプレB細胞およびCMPに対してウイルス混液を用いて形質導入を行い、HSCにおいて増強されている因子を発現させることができる。
【図１０Ａ】組合せTF発現がプロプレBおよびCMPのCFCコロニー数を増加させ、系列能を変化させることを実証する。プロプレB細胞およびCMPを、Aria選別機で表現型マーカーを使用して選別した。細胞を、ZsGr対照ウイルス（VC）またはウイルス混液（VM）と共に、SCF、TPOおよびIL-12（プロプレB細胞の場合には、IL-7およびFlk3）を含有するS-クローン培地中で14時間インキュベートした。ドキシサイクリンを24時間加え、細胞をZsGr+細胞について再度選別した。ZsGr+細胞を、SCF、TPOおよびIL-12（プロプレB細胞ではIL-7およびFlk3）を含有する6ウェルプレートフォーマット中のメチルセルロース培地中に配置した。コロニー形成能を、20日目にアッセイした。図10Aは、コロニー形態の決定中に観察された細胞型の例を示す。
【図１０Ｂ】組合せTF発現がプロプレBおよびCMPのCFCコロニー数を増加させ、系列能を変化させることを実証する。プロプレB細胞およびCMPを、Aria選別機で表現型マーカーを使用して選別した。細胞を、ZsGr対照ウイルス（VC）またはウイルス混液（VM）と共に、SCF、TPOおよびIL-12（プロプレB細胞の場合には、IL-7およびFlk3）を含有するS-クローン培地中で14時間インキュベートした。ドキシサイクリンを24時間加え、細胞をZsGr+細胞について再度選別した。ZsGr+細胞を、SCF、TPOおよびIL-12（プロプレB細胞ではIL-7およびFlk3）を含有する6ウェルプレートフォーマット中のメチルセルロース培地中に配置した。コロニー形成能を、20日目にアッセイした。図10Bは、形質導入されたプロプレB ZsGreen対照（VC）および37個の因子のウイルス混合物（VM）のCFCプレートを撮影した代表的な写真を示す。
【図１０Ｃ】組合せTF発現がプロプレBおよびCMPのCFCコロニー数を増加させ、系列能を変化させることを実証する。プロプレB細胞およびCMPを、Aria選別機で表現型マーカーを使用して選別した。細胞を、ZsGr対照ウイルス（VC）またはウイルス混液（VM）と共に、SCF、TPOおよびIL-12（プロプレB細胞の場合には、IL-7およびFlk3）を含有するS-クローン培地中で14時間インキュベートした。ドキシサイクリンを24時間加え、細胞をZsGr+細胞について再度選別した。ZsGr+細胞を、SCF、TPOおよびIL-12（プロプレB細胞ではIL-7およびFlk3）を含有する6ウェルプレートフォーマット中のメチルセルロース培地中に配置した。コロニー形成能を、20日目にアッセイした。図10Cは、プロプレB細胞およびCMPの両方の効果的なプレーティング密度を見つけるために蒔かれた漸増数の細胞を示す。2×105個のプロプレB細胞および1×104個のCMPをさらなる実験に使用した。実験は2回の個々の試験において反復された。
【図１０Ｄ】組合せTF発現がプロプレBおよびCMPのCFCコロニー数を増加させ、系列能を変化させることを実証する。プロプレB細胞およびCMPを、Aria選別機で表現型マーカーを使用して選別した。細胞を、ZsGr対照ウイルス（VC）またはウイルス混液（VM）と共に、SCF、TPOおよびIL-12（プロプレB細胞の場合には、IL-7およびFlk3）を含有するS-クローン培地中で14時間インキュベートした。ドキシサイクリンを24時間加え、細胞をZsGr+細胞について再度選別した。ZsGr+細胞を、SCF、TPOおよびIL-12（プロプレB細胞ではIL-7およびFlk3）を含有する6ウェルプレートフォーマット中のメチルセルロース培地中に配置した。コロニー形成能を、20日目にアッセイした。図10Dは、全てのコロニーについて決定され認められたコロニー数および組成を示す。プロプレB細胞およびCMPに対して37個の因子の混液を用いて形質導入を行った場合には、ZsGreen対照（VC）と比較して増加したコロニー数が観察される。実験は4つの試験について二重に実施された。
【図１１】18個の推定初期化因子への曝露が、複能性前駆細胞に、インビボにおいて確固たる長期の多系列生着能を植え付けることを実証する。複能性前駆細胞（MPP=系列-Sca1+ckit+CD150-）を選別し、対照ウイルスまたはHlf、MycN、Meis1、Irf6、Cdkn1c、Nfix、Dnmt3b、Zfp612、Prdm5、HoxB4、Lmo2、Nkx2-3、RarB、Ndn、Nap1l3、Runx1t1、Zfp467、Zfp532を含有するレンチウイルス混合物のいずれかを用いて形質導入を行った。形質導入された細胞を、競合WBMと共に放射線照射されたコンジェニックレシピエントに移植した。末梢血のキメラ化が移植後の時点で示され、これらの因子への曝露が、長期のドナーへの生着を大いに改善したことを示す。
【図１２】9個の推定初期化因子への曝露が、複能性前駆細胞に、インビボにおいて確固たる長期の多系列生着能を植え付けることを実証する。CD45.2またはコンジェニックCD45.1ドナーからのMPPはLSKCD34+flk2+として選別され、等しい数の細胞に対して、対照ウイルス（CD45.1細胞に）または9個の因子（Evi-1、Glis2、HoxB5、HoxA9、HLF、Meis1、MycN、Prdm16、Runx1を含む）を含有するレンチウイルス混合物（CD45.2細胞に）のいずれかを用いて形質導入を行った。細胞を、CD45.1/CD45.2競合骨髄（2×105個の細胞）と共に、放射線照射されたCD45.1/CD45.2 F1レシピエントに移植した。導入遺伝子の発現を、ドキシサイクリンを用いて18週間維持し（doxオン）（上のパネル）、その後、残りの実験においてはドキシサイクリンを除去した（doxオフ）。末梢血のキメラ化を20および25週目に測定し（下のパネル）、これは、対照の形質導入MPP（CD45.1）とは対照的に、9個の因子を形質導入されたMPPは、確固たる長期の再増殖活性を保持していたことを示す。右下のパネル：9個の因子の形質導入に由来する生着は多系列である。ドナー由来の細胞を、Mac1、Gr-1、CD3、CD8およびB220について染色し、これにより、ドナー由来のマクロファージ/単球、顆粒球、T細胞およびB細胞の存在が判明した。
【図１３Ａ】HSCにおいて増強されている転写因子（TF）を形質導入された複能性前駆細胞（MPP）の長期間の多系列の再構築を実証する。図13A。対照ウイルス（上のパネル）または17個の異なるTFの混液（下のパネル）を用いて形質導入されたMPP（ckit+Sca1+系列-CD150-flk2+CD34+）を移植されたレシピエントの、移植後20週目の末梢血のフローサイトメトリー。同じ初回の選別に由来する等しい数のMPPが移植された。
【図１３Ｂ】HSCにおいて増強されている転写因子（TF）を形質導入された複能性前駆細胞（MPP）の長期間の多系列の再構築を実証する。図13B。（図13A）に記載のマウスの、移植後20週目のドナーのキメラ化。結果は、TFを形質導入されたMPPのみが、長期間のT細胞、B細胞および骨髄球系細胞の多系列再構築を生じ、一方、対照細胞は予想された通りリンパ球系細胞しか生じなかったことを示す。TFを形質導入された細胞を受けた全てのレシピエントが、多系列において再構築され、このことは、初期化が稀な事象ではなかったことを示唆する。対照および17-TFの各々についてn=4のレシピエント。この実験における17個の因子は、Hlf、MycN、Meis1、Irf6、Nfix、Dnmt3b、Zfp612、Prdm5、HoxB4、Lmo2、Nkx2-3、RarB、Ndn、Nap1l3、Runx1t1、Zfp467、Zfp532を含んでいた。
【図１４】8個の推定初期化因子への曝露が、複能性前駆細胞に、インビボにおいて確固たる長期間の多系列生着能を植え付けることを実証する。複能性前駆細胞（MPP=系列-Sca1+ckit+CD150-flk2+CD34+）を選別し、対照ウイルスまたはRunx1t1、HLF、Zfp467、Rbpms、hoxb5、nap1l3、msi2、Irf6を含有するレンチウイルス混合物のいずれかを用いて形質導入を行った。形質導入された細胞を、競合WBMと共に、放射線照射されたコンジェニックレシピエントに移植した。末梢血のキメラ化が、移植後16週目に示され、このことは、これらの因子（下のパネル）への曝露が、対照の形質導入細胞（上のパネル）とは対照的に長期間のドナー多系列生着をもたらしたことを示す。ドキシサイクリンを、移植後2週間維持し、その後、ドキシサイクリンを除去した。
【図１５】ドナー由来のキメラ化を試験するための、末梢からの採血の使用を示す。ここに示されているのは、37個の転写因子の発現を個々にコードするウイルスの混液を用いて形質導入されたプロプレB細胞を移植されたマウスに対して8週目に実施された末梢からの採血に関するゲーティング戦略の例である。
【図１６Ａ】プロプレB細胞の移植は、因子を組換え発現させた場合に、多系列の末梢における再構築を付与することを実証する。対照またはVMを用いて形質導入されたCD45.2+プロプレB細胞およびCMPを、IR CD45.1+レシピエントに競合的に移植した。末梢からの採血を4、8、12および16週目に実施した。図16A。フローヒストグラムは、対照（VC−上のパネル）および37個の因子の混合物を発現している細胞（VM−下のパネル）についての、プロプレB細胞（左）およびCMP（右）について実証された、16週目の末梢からの採血を示す。
【図１６Ｂ】プロプレB細胞の移植は、因子を組換え発現させた場合に、多系列の末梢における再構築を付与することを実証する。対照またはVMを用いて形質導入されたCD45.2+プロプレB細胞およびCMPを、IR CD45.1+レシピエントに競合的に移植した。末梢からの採血を4、8、12および16週目に実施した。図16B。プロプレB細胞およびCMPについて、各々の末梢からの採血血液についての定量的な結果を示す。1.0％を超えるキメラ化が、プロプレB細胞を移植された5/14匹のマウスに、CMPを移植された3/8匹のマウスに観察された。
【図１６Ｃ】プロプレB細胞の移植は、因子を組換え発現させた場合に、多系列の末梢における再構築を付与することを実証する。対照またはVMを用いて形質導入されたCD45.2+プロプレB細胞およびCMPを、IR CD45.1+レシピエントに競合的に移植した。末梢からの採血を4、8、12および16週目に実施した。図16C。プロプレB細胞およびCMPを移植されたマウスについて、1.0％を超えるキメラ化を有するマウスの末梢からの採血の細胞組成を示す。
【図１７−１】末梢リンパ器官および骨髄の再構築が、組合せ因子を発現しているCMPおよびプロプレB細胞から観察されることを実証する。対照（VC）ウイルス混液（VM）を用いて形質導入されたプロプレB細胞/CMPを移植されたマウスから、骨髄、脾臓、および胸腺を収集した。3種のプロプレB細胞の移植されたマウス（VC、VM4、VM14）および2種のCMPの移植されたマウス（VCおよびVM6）の代表的なヒストグラム − VM#は、図15において観察されたのと同じである。様々な程度のドナー由来のキメラ化を、各リンパ球系区画において観察することができ；一貫してVM発現細胞が、対照と比較して全てのリンパ球系区画においてより高い再構築を有していた。
【図１７−２】末梢リンパ器官および骨髄の再構築が、組合せ因子を発現しているCMPおよびプロプレB細胞から観察されることを実証する。対照（VC）ウイルス混液（VM）を用いて形質導入されたプロプレB細胞/CMPを移植されたマウスから、骨髄、脾臓、および胸腺を収集した。3種のプロプレB細胞の移植されたマウス（VC、VM4、VM14）および2種のCMPの移植されたマウス（VCおよびVM6）の代表的なヒストグラム − VM#は、図15において観察されたのと同じである。様々な程度のドナー由来のキメラ化を、各リンパ球系区画において観察することができ；一貫してVM発現細胞が、対照と比較して全てのリンパ球系区画においてより高い再構築を有していた。
【図１８Ａ】多系列の再構築が、組合せ因子の発現と共に移植時に末梢リンパ器官において観察されることを実証する。図18A。骨髄、脾臓、および胸腺を、形質導入されたプロプレB細胞およびCMPを移植されたマウスから収集した。データの定量化がグラフに要約されている。1.0％を超える末梢血のキメラ化を有する全てのプロプレB細胞移植マウスにおいて、対照レベルを上回るドナー由来のキメラ化が、分析された全てのリンパ球系区画において観察された。
【図１８Ｂ】多系列の再構築が、組合せ因子の発現と共に移植時に末梢リンパ器官において観察されることを実証する。図18B。1％を超える末梢血のキメラ化と分析された全ての対照マウスまたは実験マウスについての骨髄の組成。
【図１８Ｃ】多系列の再構築が、組合せ因子の発現と共に移植時に末梢リンパ器官において観察されることを実証する。図18C。1％を超える末梢血のキメラ化と分析された全ての対照マウスまたは実験マウスについての脾臓の組成。
【図１８Ｄ】多系列の再構築が、組合せ因子の発現と共に移植時に末梢リンパ器官において観察されることを実証する。図18D。1％を超える末梢血のキメラ化と分析された全ての対照マウスまたは実験マウスについての胸腺の組成。
【図１９Ａ】因子の混液を発現しているプロプレB細胞およびCMPが、原始造血前駆細胞を生じることを実証する。図19A。フロープロットは予め、骨髄前駆細胞（上のパネル）または原始造血前駆細胞（LSK（Lin-Sca+ c-kit+）細胞）（下のパネル）についてゲーティングされていた。ウイルス混液を用いて形質導入された細胞を受けたマウスのみが、ドナー（CD45.2+）由来細胞の造血前駆細胞または骨髄前駆細胞を生じる。骨髄前駆細胞ゲート（上のパネル）および造血前駆細胞（下のパネル）ゲートのさらなる分析は、多様な前駆細胞集団を明らかとする。
【図１９Ｂ】因子の混液を発現しているプロプレB細胞およびCMPが、原始造血前駆細胞を生じることを実証する。図19B。1.0％を上回る末梢血キメラ化を有する移植されたVC（5匹のマウスの平均）およびVMマウスの各々における、骨髄前駆細胞および造血前駆細胞の総数の定量化。全ての場合において、対照と比べて細胞数が増加している。
【図１９Ｃ】因子の混液を発現しているプロプレB細胞およびCMPが、原始造血前駆細胞を生じることを実証する。図19C。区画の組成を分析し、定量した。各棒グラフは、1匹のマウスを示し、かつ骨髄前駆細胞区画のそれぞれの組成を示す。
【図１９Ｄ】因子の混液を発現しているプロプレB細胞およびCMPが、原始造血前駆細胞を生じることを実証する。図19D。区画の組成を分析し、定量した。各棒グラフは、1匹のマウスを示し、かつ造血前駆細胞区画のそれぞれの組成を示す。
【図２０Ａ−１】プロプレB細胞およびCMPは、組合せの因子が発現された場合にのみ、連続的な移植能を有することを実証する。1000個のLSK CD45.2+細胞を選別し、これを2×105個のCD45.1+競合細胞と競合してコンピテントなCD45.1+宿主へと移植した。図20A。4週目に、全ての第二の移植は、識別可能なドナー由来の多系列集団を有していた。それらの各々の第二の移植を示すフローグラフが示されている。
【図２０Ａ−２】プロプレB細胞およびCMPは、組合せの因子が発現された場合にのみ、連続的な移植能を有することを実証する。1000個のLSK CD45.2+細胞を選別し、これを2×105個のCD45.1+競合細胞と競合してコンピテントなCD45.1+宿主へと移植した。図20A。4週目に、全ての第二の移植は、識別可能なドナー由来の多系列集団を有していた。それらの各々の第二の移植を示すフローグラフが示されている。
【図２０Ａ−３】プロプレB細胞およびCMPは、組合せの因子が発現された場合にのみ、連続的な移植能を有することを実証する。1000個のLSK CD45.2+細胞を選別し、これを2×105個のCD45.1+競合細胞と競合してコンピテントなCD45.1+宿主へと移植した。図20A。4週目に、全ての第二の移植は、識別可能なドナー由来の多系列集団を有していた。それらの各々の第二の移植を示すフローグラフが示されている。
【図２０Ｂ】プロプレB細胞およびCMPは、組合せの因子が発現された場合にのみ、連続的な移植能を有することを実証する。1000個のLSK CD45.2+細胞を選別し、これを2×105個のCD45.1+競合細胞と競合してコンピテントなCD45.1+宿主へと移植した。図20B。これらの結果の定量化を計算し、ここに全末梢血に対するCD45.2+の％として報告された。プロプレB細胞VM#14だけが、16週目でさえ持続可能な（0.1％超）長期間の多系列の再構築を有していた。
【図２０Ｃ】プロプレB細胞およびCMPは、組合せの因子が発現された場合にのみ、連続的な移植能を有することを実証する。1000個のLSK CD45.2+細胞を選別し、これを2×105個のCD45.1+競合細胞と競合してコンピテントなCD45.1+宿主へと移植した。図20C。PPBC#14についての4週目および16週目の上記に言及された全マウスについての末梢血の組成。多系列の再構築が全ての採血について観察される。
【図２１Ａ】PCRに基づいた戦略を使用して、B細胞前駆細胞におけるVDJの再構成を同定することができる。図21A。B細胞前駆細胞を、この図に示された表現型マーカーに基づいて単離することができる。
【図２１Ｂ】PCRに基づいた戦略を使用して、B細胞前駆細胞におけるVDJの再構成を同定することができる。図21B。画分A、B、CおよびDならびにIgM陽性成熟B細胞を選別し、重鎖および軽鎖のV-D-Jの組換えについてPCRにかけた。重鎖再構成は画分Bと同じくらい早くに始まり、画分Cを通して起こり続ける。λおよびκ軽鎖再構成は、画分Cと同じくらい早くに起こり、成熟B細胞を通して進行することができる。CD45.2を全ての試料に対するPCRローディング対照として使用した。本明細書に記載の実験は、本発明者らが、PCRによる再構成の検出によって、本発明者らのシステムにおいて、プロプレB細胞（画分B〜D）における再構成を効果的に検出することができることを実証する。プライマーは、Cobaledaら、Nature 2007から適応させたプライマーであった。
【図２２Ａ】VDJの再構成が、初期化細胞のB系列起源を確認することを実証する。細胞集団およびコロニーがVDJ組換え細胞を起源とするかどうかを決定するために、本発明者らは、PCRを使用して組換え事象についてアッセイした。図22A。B細胞（B220+）、造血前駆細胞（生細胞、Lin-、c-kit+、Sca+）および骨髄球系前駆細胞（生細胞、Lin-、c-kit+、Sca-）の骨髄細胞をFACSにより細胞選別し、重鎖VDJ組換えについてPCRによって分析した。これらの集団は、1つの正の対照および2つの負の対照を提供する。TFの混合物を発現しているプロプレB細胞から生じたコロニーを試験した（GEMMコロニー）；骨髄球系コロニーは対照プレートから採取した。
【図２２Ｂ】VDJの再構成が、初期化細胞のB系列起源を確認することを実証する。細胞集団およびコロニーがVDJ組換え細胞を起源とするかどうかを決定するために、本発明者らは、PCRを使用して組換え事象についてアッセイした。図22B。CD45.2+ドナーおよびCD45.1+レシピエントのMac1+細胞をFACSにより選別した。PCRを実施して、重鎖（JH558）、κ軽鎖（JLｋ）、λ軽鎖（JLl）；ローディング対照としてのゲノムCD45を試験した。これは、ウイルス混液を用いて形質導入されたプロプレB細胞を移植されたマウス（プロプレB #4）から単離されたMac+細胞における再構成を実証する。
【図２２Ｃ】VDJの再構成が、初期化細胞のB系列起源を確認することを実証する。細胞集団およびコロニーがVDJ組換え細胞を起源とするかどうかを決定するために、本発明者らは、PCRを使用して組換え事象についてアッセイした。図22C。組換え分析を実施し、1.0％を超えるCD45.2+キメラ化を有するマウスについて表形式で要約する。ウイルス混液を用いて形質導入されたプロプレB細胞を移植されかつドナー由来のキメラ化を有する全てのマウスが、重鎖遺伝子座での初期化の証拠を有しており；大半が、λまたはκ軽鎖のいずれかの再構成を有していた。全ての組換え事象が、ポリクローナルであるようであり、それゆえ、再構築は複数のクローンから起こった。
【図２３Ａ】VDJの再構成が、初期化細胞の起源を確認することを実証する。図22Cにおいて要約されているが、ウイルス混液を用いて形質導入されたプロプレB細胞によって再構築されたマウスの末梢血中の組換え事象のさらなるpcrによる試験。図23A。ウイルス混液によって初期化されたプレ/プロB細胞を用いて再構築されたマウス（マウス#3、7、14）から単離されたMac1+細胞を試験する再構成PCR。B220+細胞を陽性対照として使用し、原始造血前駆細胞（再構成されていないLSK細胞）を陰性対照として使用した。最後のレーンには、重鎖および軽鎖の両方の再構成について試験された混合された骨髄球系列CFCコロニー（GEMM）がある。
【図２３Ｂ】VDJの再構成が、初期化細胞の起源を確認することを実証する。図22Cにおいて要約されているが、ウイルス混液を用いて形質導入されたプロプレB細胞によって再構築されたマウスの末梢血中の組換え事象のさらなるpcrによる試験。図23B。初期化されたプレ/プロB細胞を用いて再構築されたマウス（VM#5）の末梢血から選別されたMac1+細胞の再構成。骨髄（BM）および末梢血（PB）から単離されたB220+細胞を陽性対照として使用し；原始造血前駆細胞（再構成されていないLSK+細胞）を陰性対照として使用する。最後のレーンには、重鎖および軽鎖の両方の再構成について試験された混合された骨髄球系列CFCコロニー（GEMM）がある。
【図２４】VDJ再構成が、末梢血液細胞の起源を確認することを実証する。再構成は末梢血に由来するMac+陽性細胞において観察されたが、ウイルス混液を用いて形質導入された移植されたプロプレB細胞から再構築されたマウス（#3および#4）に由来する他の集団に対してさらなる分析を実施した。これらの2匹のマウスから、以下のドナー（CD45.2+）集団が選別された：CD4/8+T細胞（T）、B220+B細胞（B）、Mac1+骨髄球系細胞（M）、およびそうしたマーカーを全く有さない全ての他の細胞（N）。各集団は、B細胞組換え事象の証拠を示した。
【図２５Ａ】VDJの再構成が、末梢リンパ球系細胞および骨髄集団の起源を確認することを実証する。提案されたiHSC細胞によって部分的に再構築されたマウスにおけるB細胞のVDJ再構成の追跡を一歩前進させた。マウスの骨髄を、ウイルス混液を用いて形質導入されたプロプレB細胞から再構築させた場合に、ドナー由来の造血前駆細胞［CD45.2+LSK細胞（LSK）］、B細胞［B220+（B細胞）］、骨髄球系細胞［Mac1+（Mac）］、骨髄前駆細胞［Lin-Sca-c-kit+（MylPro）］、およびT細胞［CD4+/8+/3+T細胞（T細胞）］の50個の細胞のアリコートを採取した。DNAを試料から抽出し、PCRを実施して組換えについてアッセイした。図25A。ウイルス混合物を用いて形質導入されたプロプレB細胞から再構築されたマウス（#4）のPCR組換え試験。PCR試験を、重鎖（JH588）、κ軽鎖（Jk）およびλ軽鎖（Jl）について実施した。
【図２５Ｂ】VDJの再構成が、末梢リンパ球系細胞および骨髄集団の起源を確認することを実証する。提案されたiHSC細胞によって部分的に再構築されたマウスにおけるB細胞のVDJ再構成の追跡を一歩前進させた。マウスの骨髄を、ウイルス混液を用いて形質導入されたプロプレB細胞から再構築させた場合に、ドナー由来の造血前駆細胞［CD45.2+LSK細胞（LSK）］、B細胞［B220+（B細胞）］、骨髄球系細胞［Mac1+（Mac）］、骨髄前駆細胞［Lin-Sca-c-kit+（MylPro）］、およびT細胞［CD4+/8+/3+T細胞（T細胞）］の50個の細胞のアリコートを採取した。DNAを試料から抽出し、PCRを実施して組換えについてアッセイした。図25B。ウイルス混合物を用いて形質導入されたプロプレB細胞から再構築されたマウス（#3）のPCR組換え試験。PCR試験を、重鎖（JH588）について実施した。
【図２５Ｃ】VDJの再構成が、末梢リンパ球系細胞および骨髄集団の起源を確認することを実証する。提案されたiHSC細胞によって部分的に再構築されたマウスにおけるB細胞のVDJ再構成の追跡を一歩前進させた。マウスの骨髄を、ウイルス混液を用いて形質導入されたプロプレB細胞から再構築させた場合に、ドナー由来の造血前駆細胞［CD45.2+LSK細胞（LSK）］、B細胞［B220+（B細胞）］、骨髄球系細胞［Mac1+（Mac）］、骨髄前駆細胞［Lin-Sca-c-kit+（MylPro）］、およびT細胞［CD4+/8+/3+T細胞（T細胞）］の50個の細胞のアリコートを採取した。DNAを試料から抽出し、PCRを実施して組換えについてアッセイした。図25C。ウイルス混合物を用いて形質導入されたプロプレB細胞から再構築されたマウス（#14および#7）のPCR組換え試験。PCR試験を、重鎖（JH588）について実施した。高いドナー由来のキメラ化を有したマウス#14について、追加の分析を、脾臓からの同じ集団に対して実施した。レシピエントCD45.1+細胞を陰性対照として含めた。
【図２５Ｄ】VDJの再構成が、末梢リンパ球系細胞および骨髄集団の起源を確認することを実証する。提案されたiHSC細胞によって部分的に再構築されたマウスにおけるB細胞のVDJ再構成の追跡を一歩前進させた。マウスの骨髄を、ウイルス混液を用いて形質導入されたプロプレB細胞から再構築させた場合に、ドナー由来の造血前駆細胞［CD45.2+LSK細胞（LSK）］、B細胞［B220+（B細胞）］、骨髄球系細胞［Mac1+（Mac）］、骨髄前駆細胞［Lin-Sca-c-kit+（MylPro）］、およびT細胞［CD4+/8+/3+T細胞（T細胞）］の50個の細胞のアリコートを採取した。DNAを試料から抽出し、PCRを実施して組換えについてアッセイした。図25D。ウイルス混合物を用いて形質導入されたプロプレB細胞から再構築されたマウス（#7）のPCR組換え試験。PCR試験を、重鎖（JH588）について実施した。胸腺からのCD3/CD4/CD8+T細胞の分析。左のレーンは、CD45.1+対照T細胞であり、右はCD45.2+ドナー細胞である。ドナー細胞のみが、B細胞組換え事象を発現した。
【図２６】内因性遺伝子座（上のパネル）と組み込まれた初期化因子との区別を可能にする初期化因子のリバースクローニングのための戦略を示す。プライマーをイントロン/エキソンの境界にまたがるように設計し、よってウイルスにより導入された転写因子を、PCRによる同定により、内因性遺伝子から容易に分離することができ、初期化因子は全ての場合においてより小さなPCR産物を生じることができた。全ての初期化因子のリバースクローニングのために使用されたプライマー配列については表5を参照されたい。
【図２７】転写因子のリバースクローニングによる同定を実証する。プロプレB細胞を選別し、ZsGr対照ウイルス（VC）、列挙された単一ウイルス（ベクター単独）、37個の異なる因子から列挙されたウイルスを差し引いたウイルス混合物（VMベクター）、または37個の因子のウイルス混液（VM）を用いて14時間形質導入を行った。ドキシサイクリンを24時間加え、その後、細胞を収集し、DNAを単離し、示されたプライマーを使用してPCR分析を実施した。
【図２８】転写因子のリバースクローニングによる同定を実証する。プロプレB細胞を選別し、ZsGr対照ウイルス（VC）、列挙された単一ウイルス（ベクター単独）、37個の異なる因子から列挙されたウイルスを差し引いたウイルス混合物（VMベクター）、または37個の因子のウイルス混液（VM）を用いて14時間形質導入を行った。ドキシサイクリンを24時間加え、その後、細胞を収集し、DNAを単離し、示されたプライマーを使用してPCR分析を実施した。
【図２９】初期化されたプレ/プロB細胞に由来する骨髄球系（マクロファージおよび顆粒球）コロニーからの初期化因子のリバースクローニングを示す。混液中に存在する37個の異なる因子のうちの30個に着目したゲル泳動例。Evil、Msi2、Rux1t1、Hoxb3およびPbx1は全て、あらゆる検査に存在する内因性遺伝子産物を有することを注記する。白い四角は、列挙された因子の組込みを示す、正しいサイズの産物を強調する。
【図３０】初期化されたプレ/プロB細胞に由来する骨髄球系（GEMMおよびB細胞）コロニーからの初期化因子のリバースクローニングを示す。混液中に存在する37個の異なる因子のうちの30個に着目したゲル泳動例。Evil、Msi2、Rux1t1、Hoxb3およびPbx1は全て、あらゆる検査に存在する内因性遺伝子産物を有することを注記する。白い四角は、列挙された因子の組込みを示す、正しいサイズの産物を強調する。
【図３１】初期化されたプレ/プロB細胞に由来する骨髄球系（BFU）コロニーからの初期化因子のリバースクローニングを示す。混液中に存在する37個の異なる因子のうちの30個に着目したゲル泳動例。Evil、Msi2、Rux1t1、Hoxb3およびPbx1は全て、あらゆる検査に存在する内因性遺伝子産物を有することを注記する。白い四角は、列挙された因子の組込みを示す、正しいサイズの産物を強調する。
【図３２】転写因子の組合せがインビトロ（CFCコロニー）およびインビボ（ドナー由来骨髄球系細胞）の両方の初期化細胞においてリバースクローニングされた頻度の決定を示す。TF混合物の効果に寄与する個々の因子を決定するために、組込みプライマーを開発した。B細胞（B細胞）、マクロファージ（Mac）、顆粒球（Gran）、顆粒球・マクロファージ（GM）、芽球（blast）形成単位（BFU）、GEMM、および形態学的に明らかではないコロニー（Not Det）を生じたプロプレB細胞を回収し、指定されたn個の数について試験した。同様に、末梢血集団（B細胞、マクロファージ、T細胞、および他の細胞）を組込みについて試験し、インビボの縦列に分類した。結果を色分け地図で要約する。試験された集団における高い出現率を赤色で可視化し、集団における低い出現率を青色で可視化した。
【図３３】因子の組合せを発現しているプロプレB細胞から再構築されたマウスの末梢血からの初期化因子のリバースクローニングを示す。因子の組合せを発現しているプロプレB細胞から再構築された示されたマウス（#4および#5）からのドナー由来の末梢血を選別し、PCR分析を、単離されたDNAに対して実施した。混液中に存在する37個の異なる因子のうちの30個に着目した2つのゲルの泳動例。Evil、Msi2、Rux1t1、Hoxb3およびPbx1は全て、あらゆる検査に存在する内因性遺伝子産物を有することを注記する。白い四角は、列挙された因子の組込みを示す、正しいサイズの産物を強調する。
【図３４Ａ】ウイルス混液を用いて形質導入されたプロプレB細胞およびCMPを用いて再構築されたマウスからの末梢血集団に組み込まれた因子の組合せの実体を実証する。1.0％を超える末梢血キメラ化を有していた3匹の移植されたマウスについて（2匹は形質転換されたプロプレB細胞を起源とし、1匹はCMPを起源とする）、末梢血をさらにB220+（B細胞）、Mac+（Mac）およびCD3+（T細胞）に選別した。図34A。初期化されたプロプレB細胞またはCMPを起源とするドナー由来細胞のどの末梢からの採血液も、Hlf、Zfp37、Runx1t1、Pbx1およびLmo2を含んでいた。
【図３４Ｂ】ウイルス混液を用いて形質導入されたプロプレB細胞およびCMPを用いて再構築されたマウスからの末梢血集団に組み込まれた因子の組合せの実体を実証する。1.0％を超える末梢血キメラ化を有していた3匹の移植されたマウスについて（2匹は形質転換されたプロプレB細胞を起源とし、1匹はCMPを起源とする）、末梢血をさらにB220+（B細胞）、Mac+（Mac）およびCD3+（T細胞）に選別した。図34B。そうした集団において同定された追加の因子をここに列挙する。Prdm5は、Mac1+細胞から回収された試料を除いて全ての試料に存在することを注記する。一方でGlis2は、Mac+集団にのみ見られた。
【図３４Ｃ】ウイルス混液を用いて形質導入されたプロプレB細胞およびCMPを用いて再構築されたマウスからの末梢血集団に組み込まれた因子の組合せの実体を実証する。1.0％を超える末梢血キメラ化を有していた3匹の移植されたマウスについて（2匹は形質転換されたプロプレB細胞を起源とし、1匹はCMPを起源とする）、末梢血をさらにB220+（B細胞）、Mac+（Mac）およびCD3+（T細胞）に選別した。図34C。末梢血集団（B細胞、マクロファージ、T細胞、および他の細胞）を、組込みについて試験し、n個の数の試料についてインビボの縦列に分類した。結果を色分け地図で要約する。試験された集団における高い出現率を赤色で可視化し、集団における低い出現率を青色で可視化した。
【図３５】転写因子の組合せのリストを示す。4〜6個の因子の6通りの組合せ（C1〜C6）を組込み試験に基づいて作った（75％を超える出現率）。各組合せに、試料中で50％〜75％の出現率であった追加の因子を、追加の因子として加えた（++）。各組合せは、特定のコロニーまたは集団から得られた。C1：プロプレB細胞からMac/Gran/GM；C2：プロプレB細胞からGEMM/BFU、C3：プロプレB細胞からB細胞；C4：CMPからGEMM；C5：全てをインビトロで；C6：全てをインビボで。
【図３６】プロプレB細胞における因子の組合せ発現が、コロニー形成を増加させることを示す。プロプレB細胞およびCMPを、Aria選別機で表現型マーカーを使用して選別した。細胞を、ZsGr対照ウイルス（VC）またはウイルス混液と共に、SCF、TPOおよびIL-12（プロプレB細胞の場合、IL-7およびFlk3）を含有するS-クローン培地中において14時間インキュベートした。ドキシサイクリンを24時間加え、細胞をZsGr+細胞について再度選別した。ZsGr+細胞を、SCF、TPOおよびIL-12（プロプレB細胞についてはIL-7およびFlk3）を含有する6ウェルプレートフォーマット中のメチルセルロース培地中に配置した。コロニー形成能を、20日目にアッセイした。図36A。組合せにおける全ての因子が必要であることを確認するために、因子を組合せから個々に差し引いた。ウェルの代表的な写真を示す。図36B。データの定量化をここに実証する。ZsGreen対照（VC）および全ての組合せ群を、4回の独立した実験において二重に実施した。
【図３７】転写因子の規定の組合せが、細胞を異なる運命へと初期化することができることを実証する。プロプレB細胞およびCMPを、Aria選別機で表現型マーカーを使用して選別した。細胞を、ZsGr対照ウイルス（VC）またはウイルス混液と共に、SCF、TPOおよびIL-12（プロプレB細胞についてはIL-7およびFlk3）を含有するS-クローン培地中において14時間インキュベートした。ドキシサイクリンを24時間加え、細胞をZsGr+細胞について再度選別した。ZsGr+細胞を、SCF、TPOおよびIL-12（プロプレB細胞についてはIL-7およびFlk3）を含有する6ウェルプレートフォーマット中のメチルセルロース培地中に配置した。コロニー形成能を、20日目にアッセイした。図37A。各組合せの形態をここに示す。これも、4回の独立した実験における2つの試料の平均である。図37B。組合せおよび対照についての形質導入プロプレB細胞のCFCウェルの代表的な写真が、各組合せについて円グラフで組成を分析して示されている（4回の実験の平均）。骨髄球系を促進する組合せC1が主に骨髄球系細胞を生じたことを注記する。一方、B細胞を促進する組合せ（C3）は主にB細胞コロニーを促進した。
【図３８】初期化のための個々の因子の必要性を決定するための、因子の組合せから1つの因子を差し引いた実験を示す。プロプレB細胞およびCMPを、Aria選別機で表現型マーカーを使用して選別した。細胞を、ZsGr対照ウイルス（VC）またはウイルス混液と共に、SCF、TPOおよびIL-12（プロプレB細胞の場合、IL-7およびFlk3）を含有するS-クローン培地中において14時間インキュベートした。ドキシサイクリンを24時間加え、細胞をZsGr+細胞について再度選別した。ZsGr+細胞を、SCF、TPOおよびIL-12（プロプレB細胞についてはIL-7およびFlk3）を含有する6ウェルプレートフォーマット中のメチルセルロース培地中に配置した。コロニー形成能を、20日目にアッセイした。組合せ中の全ての因子が必要であることを確認するために、因子を組合せから個々に差し引いた。太文字で列挙された各組合せについて、因子を一つずつ差し引いた。対照としてPbx1（必要とされる組合せには入っていない因子を対照として含め、予期された通り、この追加の因子はC2には必要とされる因子ではなかった）。絶えず全ての他の組合せは必要とされる因子だけに狭められていくようであった。単一の因子の対照を最後の図に列挙する。棒グラフは、2回の実験で実施された2つの試料の平均を示す。
【図３９】インビボでの初期化および骨髄球系コロニー形成アッセイにおいてのGEMM形成を生じると同定された既定のセットの因子が、コロニー形成を増加ことができること、かつプロプレB細胞およびCMPの両方の系列能を変化させることができることを実証する。プロプレB細胞およびCMPを、Aria選別機で表現型マーカーを使用して選別した。細胞を、ZsGr対照ウイルス（VC）または規定の組合せC7（C7）と共に、SCF、TPOおよびIL-12（プロプレB細胞の場合、IL-7およびFlk3）を含有するS-クローン培地中において14時間インキュベートした。ドキシサイクリンを24時間加え、細胞をZsGr+細胞について再選別した。ZsGr+細胞を、SCF、TPOおよびIL-12（プロプレB細胞についてはIL-7およびFlk3）を含有する6ウェルプレートフォーマット中のメチルセルロース培地中に配置した。コロニー形成能を、20日目にアッセイした。
【図４０】組合せ6が、プレ-プロB細胞の、インビボで多系列ドナー由来のキメラ化を生じることのできる細胞への初期化をもたらすことを実証する。プロプレB細胞およびCMPを、CD45.2rtTAトランスジェニック骨髄から選別した。その後、細胞を、等しい濃度の示された因子組合せ発現ウイルスと共にインキュベートした。その後、10,000個の細胞をコンジェニックCD45.1+マウスに移植した。その後、マウスから4、8、12、および16週目に採血した。組合せ6だけが、予備試験において1.0％を超えるドナー由来のキメラ化を示した。
【図４１Ａ−１】規定の因子のセットを発現しているプロプレB細胞からの、ドナー由来の多系列の再構築を実証する。C6、C6および同定された追加の因子、ZsGr対照（VC）を発現するようにプロプレB細胞に形質導入を行った。細胞をマウスに競合的に移植し、末梢からの採血を4、8および12週目に実施した。図41A。C6を用いて形質導入されたプロプレB細胞を移植され、4、8および12週目に採血されたマウスのゲーティング戦略。ドナー由来細胞は各回の採血時に対照レベルを上回ることが観察され、そしてこれは多系列である。
【図４１Ａ−２】規定の因子のセットを発現しているプロプレB細胞からの、ドナー由来の多系列の再構築を実証する。C6、C6および同定された追加の因子、ZsGr対照（VC）を発現するようにプロプレB細胞に形質導入を行った。細胞をマウスに競合的に移植し、末梢からの採血を4、8および12週目に実施した。図41A。C6を用いて形質導入されたプロプレB細胞を移植され、4、8および12週目に採血されたマウスのゲーティング戦略。ドナー由来細胞は各回の採血時に対照レベルを上回ることが観察され、そしてこれは多系列である。
【図４１Ｂ】規定の因子のセットを発現しているプロプレB細胞からの、ドナー由来の多系列の再構築を実証する。C6、C6および同定された追加の因子、ZsGr対照（VC）を発現するようにプロプレB細胞に形質導入を行った。細胞をマウスに競合的に移植し、末梢からの採血を4、8および12週目に実施した。図41B。プロプレB細胞についての全ての採血についての定量化が示されている。追加の因子の利点は全く観察されなかった。
【図４１Ｃ】規定の因子のセットを発現しているプロプレB細胞からの、ドナー由来の多系列の再構築を実証する。C6、C6および同定された追加の因子、ZsGr対照（VC）を発現するようにプロプレB細胞に形質導入を行った。細胞をマウスに競合的に移植し、末梢からの採血を4、8および12週目に実施した。図41C。プロプレB細胞についての12週目の採血の細胞組成がグラフに示されている。
【図４２】規定の因子のセット（C6）により初期化されたB細胞前駆細胞の多系列能は、組換え事象を受け、かつB細胞起源に由来することが確認されることを実証する。C6、C6および同定された追加の因子、ZsGr対照（VC）を発現するようにプロプレB細胞に形質導入を行った。細胞をマウスに競合的に移植し、再構築はB細胞を起源とする細胞に起因したことを実証するために、PCR分析を、末梢血において長期に再構築されたマウスからの末梢血に対して実施した。CD45.2+ドナーMac1+細胞は、組換え事象の証拠を有したが、レシピエント（CD45.1+）Mac1+細胞もB細胞の画分A（B細胞前駆細胞）も初期化の証拠を有さなかった。
【図４３】規定の因子のセット（C6）が、初期化されたプロプレB細胞から得られた末梢血において発現されることを実証する。C6、C6および同定された追加の因子、ZsGr対照（VC）を発現するようにプロプレB細胞に形質導入を行った。細胞をマウスに競合的に移植し、末梢からの採血を16週目に実施した。ウイルス混合物に存在した全ての因子が、ドナー由来の末梢血に組み込まれたことが判明した。
【図４４Ａ】規定の因子のセットを発現しているCMPからの、ドナー由来の多系列の再構築を実証する。図44A。C6、C6および同定された追加の因子、ZsGr対照（VC）を発現するようにCMP細胞に形質導入を行った。細胞をマウスに競合的に移植し、末梢からの採血を4、8および12週目に実施した。各マウスについての系列の分析が以下のフロー図によって示されている。
【図４４Ｂ】規定の因子のセットを発現しているCMPからの、ドナー由来の多系列の再構築を実証する。図44B。両方のCMPに由来する再構築マウスについての全ての採血についての定量化が示されている。追加の因子の利点は全く観察されなかった。
【図４４Ｃ】規定の因子のセットを発現しているCMPからの、ドナー由来の多系列の再構築を実証する。図44C。プロプレB細胞についての12週目の採血の細胞組成がグラフに示されている。
【図４５】リバースクローニングが、C6によって初期化されたCMPを起源とするドナー由来末梢血が組合せ6の因子を含むこと確認することを示す。C6、C6および同定された追加の因子、ZsGr対照（VC）を発現するようにCMP細胞に形質導入を行った。細胞をマウスに競合的に移植し、末梢からの採血を12週目に実施した。末梢血を、両方のCMPを起源とするiHSC再構築マウスから採取し、集団に対して組込みについての研究を実施した。1匹のマウスは、ウイルス混合物に使用された全ての因子を含んでいたが、もう一方のマウスはHlfのみを欠失していた。
【図４６Ａ−１】規定の因子のセットが、初期化されたB細胞から多系列の再構築を生じることを実証する。5つの追加の因子がC6に添加され、これはプロプレB細胞またはCMPのいずれかからGEMMコロニーを生じた。この組合せは造語C7とした。B220濃縮細胞を、CD45.2rtTAマウスの骨髄から磁気的に分離した。細胞に対してZsGr対照（VC）またはC7を用いて14時間形質導入を行い、ドキシサイクリンと共に24時間保持し、その後、1×105個の全骨髄細胞と共に競合的にCD45.1+レシピエントに移植した。採血を4、8、12および16週目に実施した。図46A。8週目の、VCおよびC7を用いて形質導入され移植されたレシピエントについてのフロープロットが示されている。
【図４６Ａ−２】規定の因子のセットが、初期化されたB細胞から多系列の再構築を生じることを実証する。5つの追加の因子がC6に添加され、これはプロプレB細胞またはCMPのいずれかからGEMMコロニーを生じた。この組合せは造語C7とした。B220濃縮細胞を、CD45.2rtTAマウスの骨髄から磁気的に分離した。細胞に対してZsGr対照（VC）またはC7を用いて14時間形質導入を行い、ドキシサイクリンと共に24時間保持し、その後、1×105個の全骨髄細胞と共に競合的にCD45.1+レシピエントに移植した。採血を4、8、12および16週目に実施した。図46A。8週目の、VCおよびC7を用いて形質導入され移植されたレシピエントについてのフロープロットが示されている。
【図４６Ｂ】規定の因子のセットが、初期化されたB細胞から多系列の再構築を生じることを実証する。5つの追加の因子がC6に添加され、これはプロプレB細胞またはCMPのいずれかからGEMMコロニーを生じた。この組合せは造語C7とした。B220濃縮細胞を、CD45.2rtTAマウスの骨髄から磁気的に分離した。細胞に対してZsGr対照（VC）またはC7を用いて14時間形質導入を行い、ドキシサイクリンと共に24時間保持し、その後、1×105個の全骨髄細胞と共に競合的にCD45.1+レシピエントに移植した。採血を4、8、12および16週目に実施した。図46B。4、8、12および16週目の、ZsGr対照（VC）またはC7を用いて形質導入されたB220濃縮細胞についての末梢血の定量化。1つの外れ値を除いて、C7を用いて形質導入され移植された全てのマウスが、VCを用いて形質導入され移植されたマウスよりも上回る。
【図４６Ｃ】規定の因子のセットが、初期化されたB細胞から多系列の再構築を生じることを実証する。5つの追加の因子がC6に添加され、これはプロプレB細胞またはCMPのいずれかからGEMMコロニーを生じた。この組合せは造語C7とした。B220濃縮細胞を、CD45.2rtTAマウスの骨髄から磁気的に分離した。細胞に対してZsGr対照（VC）またはC7を用いて14時間形質導入を行い、ドキシサイクリンと共に24時間保持し、その後、1×105個の全骨髄細胞と共に競合的にCD45.1+レシピエントに移植した。採血を4、8、12および16週目に実施した。図46C。4、8、12および16週目における末梢血の平均組成。
【図４７】初期化されたB220濃縮細胞による多系列の再構築が、5匹中2匹のマウスにおいてB細胞組換えの証拠を有することを示す。5つの追加の因子をC6に加え、これはプロプレB細胞またはCMPのいずれかからGEMMコロニーを生じた。この組合せは造語C7とした。B220濃縮細胞を、CD45.2rtTAマウスの骨髄から磁気的に分離した。細胞に対して、ZsGr対照（VC）またはC7を用いて14時間形質導入を行い、ドキシサイクリンと共に24時間保持し、その後、1×105個の全骨髄細胞と共に競合的にCD45.1+レシピエントに移植した。採血を16週目に実施した。どの再構築された動物がB細胞起源から導かれたかを決定するために、末梢血を単離し、Mac1+細胞を選別し、B細胞の組換えについてpcr分析によって試験した。2匹のマウスが、形質転換されたB細胞に起因する末梢血のキメラ化を有することが判明した。そうしたマウスを、オレンジ色で強調することによって図40Aに示す。
【図４８】リバースクローニングが、C7によって初期化されたCMPを起源とするドナー由来末梢血が組合せ7の因子を含むことを確認することを示す。5つの追加の因子がC6に添加され、これはプロプレB細胞またはCMPのいずれかからGEMMコロニーを生じた。この組合せは造語C7とした。B220濃縮細胞を、CD45.2rtTAマウスの骨髄から磁気的に分離した。細胞に対して、ZsGr対照（VC）またはC7を用いて14時間形質導入を行い、ドキシサイクリンと共に24時間保持し、その後、1×105個の全骨髄細胞と共に競合的にCD45.1+レシピエントに移植した。採血を16週目に実施した。2匹のB細胞組換えマウスからの末梢血を単離し、C7の因子の組込みについてpcr分析によって試験した。RbpmsおよびMsi2が両方の分析から欠落していた。
【図４９Ａ】末梢リンパ器官および骨髄の再構築が、規定の因子のセットである組合せ6を発現しているCMPおよびプロプレB細胞から観察されることを示す。図49A。C6を用いて形質導入されたプロプレB細胞およびCMPを移植されたマウスから、骨髄、脾臓および胸腺を収集した。データの定量化はグラフで要約されている。1.0％を超える末梢血キメラ化を有する全てのプロプレB細胞移植マウスにおいて、対照レベルを上回るドナー由来キメラ化が、分析された全てのリンパ球系区画において観察された。
【図４９Ｂ】末梢リンパ器官および骨髄の再構築が、規定の因子のセットである組合せ6を発現しているCMPおよびプロプレB細胞から観察されることを示す。図49B〜49D。1％を超える末梢血キメラ化を有すると分析された全ての対照マウスまたは実験マウスについての骨髄、脾臓および胸腺の組成。
【図４９Ｃ】末梢リンパ器官および骨髄の再構築が、規定の因子のセットである組合せ6を発現しているCMPおよびプロプレB細胞から観察されることを示す。図49B〜49D。1％を超える末梢血キメラ化を有すると分析された全ての対照マウスまたは実験マウスについての骨髄、脾臓および胸腺の組成。
【図４９Ｄ】末梢リンパ器官および骨髄の再構築が、規定の因子のセットである組合せ6を発現しているCMPおよびプロプレB細胞から観察されることを示す。図49B〜49D。1％を超える末梢血キメラ化を有すると分析された全ての対照マウスまたは実験マウスについての骨髄、脾臓および胸腺の組成。
【図５０】規定の因子のセットである組合せ6を発現しているCMPおよびプロプレB細胞が移植されると、造血前駆細胞区画および骨髄前駆細胞区画の骨髄再構築が観察されることを実証する。対照（VC）または規定のウイルス混液（C6）を用いて形質導入されたプロプレB細胞/CMPを移植されたマウスから、骨髄を収集した。C6を用いて初期化された集団（2種のCMPの移植されたマウス（CMP1およびCMP2）および1種のプロプレB細胞の移植されたマウス（プロプレB 1細胞））の代表的なヒストグラムが示されている。細胞を予め、シングレット、生細胞、系列陰性の細胞についてゲーティングした。様々な程度のドナー由来キメラ化を観察することができる。c-kitおよびscaグラフは、ドナー由来造血前駆細胞（LSK；c-kit+Sca+）および骨髄前駆細胞（Myl Pro；c-kit+Sca-）が存在することを示す。
【図５１】規定の因子のセット（C6）を発現しているプロプレB細胞およびCMPが原始造血前駆細胞を生じることを実証する。対照（VC）または規定のウイルス混液（C6）を用いて形質導入されたプロプレB細胞/CMPを移植されたマウスから、骨髄を収集した。C6を用いて初期化された集団（2種のCMPの移植されたマウス（CMP1およびCMP2）および1種のプロプレB細胞の移植されたマウス（プロプレB 1細胞））の代表的なヒストグラムが示されている。グラフは、ドナー（CD45.2+）由来造血前駆細胞（LSK；c-kit+Sca+）および骨髄前駆細胞（Myl Pro；c-kit+Sca-）を示す。図51A。1.0％を超える末梢血キメラ化を有するVC（5匹のマウスの平均）およびC6を移植された各マウスにおける骨髄前駆細胞および造血前駆細胞の総数の定量化。全ての場合において、対照と比較して細胞の数が増加している。図51B〜51C。区画の組成を分析し、定量した。各棒グラフは、1匹のマウスを示し、かつ骨髄前駆細胞区画（図51B）または造血前駆細胞区画（図51C）のそれぞれの組成を示す。
【図５２−１】規定の因子によって初期化されたCMPが、連続的な移植能を有することを実証する。16週間の骨髄分析を実施し、第二の移植を設定した。ドナー由来キメラ化を有する2種のCMPに由来するマウスは、5匹のマウス各々への500万個のドナー細胞の全骨髄移植を受けた。C6を用いて形質導入されたプロプレB細胞を起源とするドナー由来キメラ化を有するマウスの場合、100万個の全ドナー骨髄細胞を、2×105個のCD45.1+全骨髄細胞と共に競合的に2匹のマウスに移植した。これらの各マウスからのドナー由来細胞のフローグラフが示されている。ドナー細胞を4週目に観察する。
【図５２−２】規定の因子によって初期化されたCMPが、連続的な移植能を有することを実証する。16週間の骨髄分析を実施し、第二の移植を設定した。ドナー由来キメラ化を有する2種のCMPに由来するマウスは、5匹のマウス各々への500万個のドナー細胞の全骨髄移植を受けた。C6を用いて形質導入されたプロプレB細胞を起源とするドナー由来キメラ化を有するマウスの場合、100万個の全ドナー骨髄細胞を、2×105個のCD45.1+全骨髄細胞と共に競合的に2匹のマウスに移植した。これらの各マウスからのドナー由来細胞のフローグラフが示されている。ドナー細胞を4週目に観察する。
【図５３】規定の因子によって初期化されたCMPは、連続的な長期におよぶ移植能を有することを実証する。16週間の骨髄分析を実施し、第二の移植を設定した。ドナー由来キメラ化を有する2種のCMPに由来するマウスは、5匹のマウス各々への500万個のドナー細胞の全骨髄移植を受けた。C6を用いて形質導入されたプロプレB細胞を起源とするドナー由来キメラ化を有するマウスの場合、100万個の全ドナー骨髄細胞を、2×105個のCD45.1+全骨髄細胞と共に競合的に2匹のマウスに移植した。これらの各マウスからのドナー由来細胞のフローグラフが示されている。ドナー細胞を4週目に観察する。図53A。第二の移植の末梢血における4週目の多系列ドナーキメラ化の例。図53B。4および8週目の末梢血におけるCD45.2+ドナーの寄与の定量化。C6を用いて形質導入されたCMPは、第一レシピエントにおいて多系列のキメラ化を生じ、第二の移植において全てのマウスがドナー細胞を有した。図53C。第二レシピエントにおける末梢血液細胞の組成の定量化。
【図５４】CMP C6を用いて再構築されたマウスから得られた末梢血を初期化して、インビトロにおけるコロニー形成能を生じることができることを実証する。連続移植されたC6を形質導入されたCMP細胞からの末梢血が回収された。B220+およびCD3+およびMac1+細胞を選別し、ドキシサイクリンと共に48時間インキュベートした。その後、細胞を、SCF、TPO、IL-12、Flk3、およびIL-7を含有するメチルセルロース培地中に入れた。20日後に、CFCアッセイにおけるコロニーを計数し、形態を特徴付けた。第一VCレシピエントから選別された対照細胞はブランクであったが、細胞が、C6を用いて予め形質導入されたCMPに由来するものであった場合にはコロニーが観察された。
【図５５】C7を発現しているB220濃縮細胞を移植された再構築されたマウスから得られた末梢血は、第二の初期化を受けて、インビトロにおけるコロニー形成能を生じることができることを実証する。組合せC7を発現しているB220濃縮細胞を移植されたマウスからの末梢血を16週目に回収した。B220+およびCD3+およびMac1+細胞を選別し、ドキシサイクリンと共に48時間インキュベートした。その後、細胞を、SCF、TPO、IL-12、Flk3、およびIL-7を含有するメチルセルロース培地中に入れた。20日後に、CFCアッセイにおけるコロニーを計数し、形態を特徴付けた。第一VCレシピエントから選別された対照細胞はブランクであったが、細胞が、C7を発現している初期化されたB220濃縮細胞から再構築されたいずれかのマウスの末梢血に由来するものであった場合には、コロニーが観察された。
【図５６】様々な集団における規定の因子の発現は、インビトロにおいて、コロニー形成を促進することができ、系列の方向付けを変化させたことを実証する。様々な示された集団を、マウスの骨髄（図56A）、脾臓（図56B）、胸腺（図56C）、および末梢血（図56C）から選別した。集団は、B220+（B）；Mac1+/Gr-1+(M/G)；CD3+/CD4+/CD8+(T)；NK1.1+(NK)；対照としてのプロプレB細胞を含む。末梢血（PB）の場合、B、T、およびM/Gを全て1つの集団に分類した。これらの集団に対して、対照（VC）またはC7ウイルスを用いて14時間形質導入を行い、ドキシサイクリンを24時間加え、その後、CFCアッセイにかけた。20日後に、コロニーを計数し、形態を決定した。殆ど全ての場合における対照レベルを上回るコロニー数。方向付けられた血液細胞からiHSC様の細胞への形質転換は、複数の区画から、および複数の細胞型において起こることができたことを示す。
【図５７Ａ】ヒトJurkat細胞における規定の因子の発現は、インビトロにおいて、コロニー形成を促進することができ、かつ系列の方向付けを変化させたことを実証する。図57A。ヒトJurkat細胞を培養し、形質導入を行わないまま放置するか、ZsGr対照ウイルス（VC）またはC6を用いて14時間形質導入を行った。ドキシサイクリンを24時間加え、細胞をCFCアッセイにかけた。20日目に、コロニーを計数し、形態を決定した。C6を用いて形質導入されたJurkat細胞のみが、コロニーを生じた。
【図５７Ｂ】ヒトJurkat細胞における規定の因子の発現は、インビトロにおいて、コロニー形成を促進することができ、かつ系列の方向付けを変化させたことを実証する。図57B。C6を用いて形質導入されたJurkat細胞により生じたコロニーが撮影されている。それらは、赤血球様コロニー、顆粒球、および単球を含んでいた。
【図５７Ｃ】ヒトJurkat細胞における規定の因子の発現は、インビトロにおいて、コロニー形成を促進することができ、かつ系列の方向付けを変化させたことを実証する。図57C。形質転換された細胞をさらに区別するために、Ter119、Mac1、CD71およびGr1を含む表現型マーカーについてのフロー分析を、新たに培養したJurkat細胞に対して実施し、C6を用いて形質導入された場合にJurkat細胞コロニーが観察された。C6を用いて形質導入されたJurkatコロニーは、未熟赤血球細胞（CD71+Ter119-）、顆粒球（Gr1+Mac1+）および単球（Mac1+）集団の明らかな増加を有していた。
【図５８Ａ】インビトロにおいて代替の系列能を付与することができる因子の同定を示す。（図58A）示された細胞型においてHSC特異的であると同定された36個の調節遺伝子の相対的発現（緑色（高い）から紫色（低い）まで）を示す色分け地図。
【図５８Ｂ】インビトロにおいて代替の系列能を付与することができる因子の同定を示す。（図58B）レンチウイルス導入遺伝子発現カセット（上）、および、プロ/プレB細胞+/-ドキシサイクリン誘導におけるレポーターカセット（ZsGr）発現（48時間後）を示すフローサイトメトリープロットの図。
【図５８Ｃ】インビトロにおいて代替の系列能を付与することができる因子の同定を示す。（図58C）細胞運命の変換についてのインビトロスクリーニング戦略の図。
【図５８Ｄ】インビトロにおいて代替の系列能を付与することができる因子の同定を示す。（図58D）ZsGrまたは36個の因子の混液を用いて形質導入されたプロ/プレB細胞からメチルセルロース中に生じたコロニーを示したウェルの代表的な画像。
【図５８Ｅ】インビトロにおいて代替の系列能を付与することができる因子の同定を示す。（図58E）ZsGrまたは36個の因子の混液を用いて形質導入されたプロ/プレB細胞からメチルセルロース中に生じたコロニーの数および型。4回の独立した実験が示され、各条件を3回実施した。
【図５９Ａ】インビボにおいて方向付けられた前駆細胞に多系列生着能を付与することのできる因子の同定を示す。（図59A）インビボにおいて方向付けられた前駆細胞に多系列生着能を付与することのできる因子を同定するための実験戦略の図。
【図５９Ｂ】インビボにおいて方向付けられた前駆細胞に多系列生着能を付与することのできる因子の同定を示す。（図59B）対照（ZsGr）または36個の因子を用いて形質導入されたプロ/プレB細胞またはCMPを移植されたマウスの、移植後16週目のドナー（CD45.2）再構築を示す代表的なフローサイトメトリープロット。
【図５９Ｃ】インビボにおいて方向付けられた前駆細胞に多系列生着能を付与することのできる因子の同定を示す。（図59C）ZsGrまたは36個の因子を用いて形質導入されたプロ/プレB細胞またはCMPを移植されたマウスの、移植後の指定された時点におけるドナー再構築。1％を超えるドナーキメラ化（点線）を有するマウスのみを再構築されたと判断した。レシピエントは以下を移植された：プロ/プレB細胞；ZsGr n=15、プロ/プレB細胞；36個の因子 n=15、CMP;ZsGr n=8、およびCMP；36個の因子 n=8。
【図５９Ｄ】インビボにおいて方向付けられた前駆細胞に多系列生着能を付与することのできる因子の同定を示す。（図59D）ドナーに対する％として提示された、1％を超えるドナーキメラ化を示す個々のレシピエントの示された末梢血液細胞系列の再構築。
【図５９Ｅ】インビボにおいて方向付けられた前駆細胞に多系列生着能を付与することのできる因子の同定を示す。（図59E）プロ/プレB細胞；36個の因子の実験を起源とする、骨髄（BM）細胞（B細胞（B220+）、幹細胞/前駆細胞（LSK）、骨髄前駆細胞（Myl Pro）を含む）、および末梢血（PB）細胞（B細胞（B220+）、レシピエント骨髄球系細胞（Mac1+Rec）、およびドナー骨髄球系細胞（Mac1+ドナー）を含む）における重鎖（JH）および軽鎖（JLλ、JLκ）を示す免疫グロブリン再構成のPCR分析。ローディング対照；CD45についてのゲノムのPCR。
【図５９Ｆ】インビボにおいて方向付けられた前駆細胞に多系列生着能を付与することのできる因子の同定を示す。（図59F）ウイルスにより組み込まれた因子を同定するためおよび内因性遺伝子から区別するための、PCRに基づいた戦略。
【図５９Ｇ】インビボにおいて方向付けられた前駆細胞に多系列生着能を付与することのできる因子の同定を示す。（図59G）（図59C）に示された各々の再構築マウスにおけるドナーB細胞、T細胞および骨髄球系細胞における示された各因子の存在（灰色）または非存在（黒色）を示すデータの要約。
【図６０Ａ】方向付けられた前駆細胞における6個の転写因子の一過性の異所的発現が、インビトロにおいて系列能を変化させるのに十分であり、インビボにおいて方向付けられた前駆細胞に対して長期におよぶ生着能を付与することを示す。（図60A）ZsGrまたは6-TF混液を用いて形質導入されたプロ/プレB細胞からメチルセルロース中に生じたコロニーを示すウェルの代表的な画像。
【図６０Ｂ】方向付けられた前駆細胞における6個の転写因子の一過性の異所的発現が、インビトロにおいて系列能を変化させるのに十分であり、インビボにおいて方向付けられた前駆細胞に対して長期におよぶ生着能を付与することを示す。（図60B）ZsGrまたは6-TF混液を用いて形質導入されたプロ/プレB細胞からメチルセルロース中に生じたコロニーの数および示されたコロニーの型。3つの独立した実験が、3回実施された各条件と共に示されている。
【図６０Ｃ】方向付けられた前駆細胞における6個の転写因子の一過性の異所的発現が、インビトロにおいて系列能を変化させるのに十分であり、インビボにおいて方向付けられた前駆細胞に対して長期におよぶ生着能を付与することを示す。（図60C）ZsGr、6-TF混液、または6-TFから示された因子を差し引いたものを用いて形質導入されたプロ/プレB細胞からメチルセルロース中に生じたコロニーの数および型。各条件は3回実施された。
【図６０Ｄ】方向付けられた前駆細胞における6個の転写因子の一過性の異所的発現が、インビトロにおいて系列能を変化させるのに十分であり、インビボにおいて方向付けられた前駆細胞に対して長期におよぶ生着能を付与することを示す。（図60D）ZsGrまたは6-TFを用いて形質導入されたプロ/プレB細胞またはCMPを移植されたマウスの、移植後の示された時点におけるドナー再構築。1％を超えるドナーキメラ化（点線）を有するマウスのみを再構築されたと判断した。レシピエントは以下を移植された：プロ/プレB細胞；ZsGr n=10、プロ/プレB細胞；6-TF n=12、CMP;ZsGr n=9、およびCMP；6-TF n=9。
【図６０Ｅ】方向付けられた前駆細胞における6個の転写因子の一過性の異所的発現が、インビトロにおいて系列能を変化させるのに十分であり、インビボにおいて方向付けられた前駆細胞に対して長期におよぶ生着能を付与することを示す。（図60E）対照（ZsGr）または6-TFを用いて形質導入されたプロ/プレB細胞またはCMPを移植されたマウスの、移植後16週目のドナー再構築および系列組成を示す代表的なフローサイトメトリープロット。Mac1+骨髄球系細胞、B220+B細胞、およびCD3/4/8+T細胞への系列の寄与が示されている。
【図６０Ｆ】方向付けられた前駆細胞における6個の転写因子の一過性の異所的発現が、インビトロにおいて系列能を変化させるのに十分であり、インビボにおいて方向付けられた前駆細胞に対して長期におよぶ生着能を付与することを示す。（図60F）ドナーに対する％として提示された、1％を超えるドナーキメラ化を示す個々のレシピエントの示された末梢血細胞系列の再構築。
【図６０Ｇ】方向付けられた前駆細胞における6個の転写因子の一過性の異所的発現が、インビトロにおいて系列能を変化させるのに十分であり、インビボにおいて方向付けられた前駆細胞に対して長期におよぶ生着能を付与することを示す。（図60G）プロ/プレB細胞；6-TF実験を起源とする、レシピエント骨髄球系細胞（Mac1+Rec）およびドナー骨髄球系細胞（Mac1+ドナー）における免疫グロブリン重鎖（JH）再構成のPCR分析。ローディング対照；CD45についてのゲノムPCR。
【図６１Ａ】Meis1およびMycnの組入れならびにポリシストロン性ウイルスの使用はインビボにおける初期化効率を向上させることを示す。（図61A）RHL（Runxt1t1、Hlf、Lmo2）およびPZP（Pbx1、Zfp37、Prdm5）ポリシストロン性ウイルス構築物、ならびにMeis1およびMycnの単一因子ウイルス構築物の図。
【図６１Ｂ】Meis1およびMycnの組入れならびにポリシストロン性ウイルスの使用はインビボにおける初期化効率を向上させることを示す。（図61B）ZsGr、8-TF（8個の単一因子ウイルス）、または8-TFポリ（RHL、PZPポリシストロン性ウイルス＋Meis1およびMycnウイルス）を用いて形質導入されたプロ/プレB細胞を移植されたマウスの、移植後の示された時点におけるドナー再構築。1％を超えるドナーキメラ化を有するマウスのみを再構築されたと判断した。レシピエントは以下を移植された；ZsGr；n=12、8-TF；n=6、8TFポリ；n=14。
【図６１Ｃ】Meis1およびMycnの組入れならびにポリシストロン性ウイルスの使用はインビボにおける初期化効率を向上させることを示す。（図61C）対照（ZsGr）、8-TF、または8TFポリを用いて形質導入されたプロ/プレB細胞を移植されたマウスの、移植後16週目のドナー再構築および系列寄与を示す代表的なフローサイトメトリープロット。Mac1+GR1-骨髄球系細胞、Mac+GR1+顆粒球、B220+B細胞、およびCD3/4/8+T細胞への系列の寄与が示されている。
【図６１Ｄ】Meis1およびMycnの組入れならびにポリシストロン性ウイルスの使用はインビボにおける初期化効率を向上させることを示す。（図61D）ドナーに対する％として提示された、1％を超えるドナーキメラ化を示す個々のレシピエントの示された末梢血液細胞の系列の再構築。
【図６１Ｅ】Meis1およびMycnの組入れならびにポリシストロン性ウイルスの使用はインビボにおける初期化効率を向上させることを示す。（図61E）レシピエントおよびドナー骨髄球系細胞における免疫グロブリン重鎖（JH）再構成のPCR分析。ローディング対照；CD45についてのゲノムPCR。
【図６２Ａ】初期化された細胞が、第二の造血器官、骨髄前駆細胞区画に生着し、第二のレシピエントを再構築することを示す。（図62A）8-TFまたは8-TFポリを形質導入されたプロ/プレB細胞を移植されたマウスの、移植後18〜20週目の末梢血（PB）、骨髄（BM）、脾臓および胸腺のドナー再構築。
【図６２Ｂ】初期化された細胞が、第二の造血器官、骨髄前駆細胞区画に生着し、第二のレシピエントを再構築することを示す。（図62B）レシピエント（R）細胞およびドナー（D）細胞における免疫グロブリン重鎖（JH）再構成のPCR分析。分析された細胞型は、Mac1+骨髄球系細胞（M）、Mac1+GR1+顆粒球（G）、およびT細胞（T）を含む。ローディング対照；CD45についてのゲノムPCR。
【図６２Ｃ】初期化された細胞が、第二の造血器官、骨髄前駆細胞区画に生着し、第二のレシピエントを再構築することを示す。（図62C）8-TFポリを用いて形質導入されたプロ/プレB細胞を移植されたレシピエントの、移植後18週目の代表的な骨髄幹細胞および前駆細胞の分析が、骨髄前駆細胞（Myl Pro）、巨核球/赤血球系前駆細胞（MEP）、顆粒球/単球前駆細胞（GMP）、骨髄球系共通前駆細胞（CMP）、巨核球前駆細胞（MkP）、赤血球系前駆細胞（EP）、リンパ球系共通前駆細胞（CLP）、系列陰性Sca1+ckit+複能性前駆細胞（LSK）、複能性前駆細胞（MPP1、MPP2）、および造血幹細胞（HSC）のドナー再構築を示す。全ての細胞を、ダブレットで識別され、生細胞（ヨウ化プロピジウム陰性）、かつ系列陰性の細胞によってプレゲーティングした。
【図６２Ｄ】初期化された細胞が、第二の造血器官、骨髄前駆細胞区画に生着し、第二のレシピエントを再構築することを示す。（図62D）（図62A）において分析されたマウスの示された集団の全ドナー再構築。
【図６２Ｅ】初期化された細胞が、第二の造血器官、骨髄前駆細胞区画に生着し、第二のレシピエントを再構築することを示す。（図62E）ドナーに対する％として提示された、（A）において分析されたマウスにおける示された骨髄前駆細胞集団の再構築。
【図６２Ｆ】初期化された細胞が、第二の造血器官、骨髄前駆細胞区画に生着し、第二のレシピエントを再構築することを示す。（図62F）ドナーに対する％として提示された、（A）において分析されたマウスにおける示された原始複能性および幹細胞集団の再構築。
【図６２Ｇ】初期化された細胞が、第二の造血器官、骨髄前駆細胞区画に生着し、第二のレシピエントを再構築することを示す。（図62G）示されたレシピエントおよびドナー集団における免疫グロブリン重鎖（JH）再構成のPCR分析。ローディング対照；CD45についてのゲノムPCR。
【図６２Ｈ】初期化された細胞が、第二の造血器官、骨髄前駆細胞区画に生着し、第二のレシピエントを再構築することを示す。（図62H）それぞれ12および8週目に分析された、8-TFを用いて形質導入されたプロ/プレB細胞の第一の移植から得られた全骨髄（WBM）またはc-Kit陽性骨髄細胞を移植された第二レシピエントマウスのドナー再構築。移植されたレシピエントの数；WBM；n=5、c-Kit+；n=4。
【図６２Ｉ】初期化された細胞が、第二の造血器官、骨髄前駆細胞区画に生着し、第二のレシピエントを再構築することを示す。（図62I）ドナーに対する％として提示された、個々のレシピエントの示された末梢血細胞系列の再構築。
【図６３Ａ】骨髄球系エフェクター細胞における規定の転写因子の一過性発現は、インビトロにおいてはそれらに前駆細胞活性を、およびインビボにおいては長期におよぶ多系列の移植能を植え付けるのに十分であることを示す。（図63A）8-TFを用いて形質導入された末梢血液細胞のコロニー形成能をアッセイするための実験戦略の図。
【図６３Ｂ】骨髄球系エフェクター細胞における規定の転写因子の一過性発現は、インビトロにおいてはそれらに前駆細胞活性を、およびインビボにおいては長期におよぶ多系列の移植能を植え付けるのに十分であることを示す。（図63B）レシピエントからの末梢血液細胞（最も左のレーン）から、あるいは、8-TFまたは8-TFポリ混液を用いて形質導入され、ドキシサイクリンに曝露された（+）または曝露されていない（-）プロ/プレB細胞を移植されたレシピエントから得られたドナー細胞から、メチルセルロース中において生じたコロニーの数および型。3回実施された個々のマウスからの結果が示されている。
【図６３Ｃ】骨髄球系エフェクター細胞における規定の転写因子の一過性発現は、インビトロにおいてはそれらに前駆細胞活性を、およびインビボにおいては長期におよぶ多系列の移植能を植え付けるのに十分であることを示す。（図63C）8-TFポリ混液を用いて形質導入され、ドキシサイクリンに曝露された（+）または曝露されていない（-）プロ/プレB細胞を移植された細胞プールレシピエントの末梢血から精製された、メチルセルロース中に蒔かれた顆粒球、マクロファージ/単球（Myl）、B細胞およびT細胞から生じたコロニーの数および型。
【図６３Ｄ】骨髄球系エフェクター細胞における規定の転写因子の一過性発現は、インビトロにおいてはそれらに前駆細胞活性を、およびインビボにおいては長期におよぶ多系列の移植能を植え付けるのに十分であることを示す。（図63D）（図63C）で得られたコロニーの代表的なコロニーの型およびメイグリュンワルド（May Grunwald）を用いてのサイトスピン染色。
【図６３Ｅ】骨髄球系エフェクター細胞における規定の転写因子の一過性発現は、インビトロにおいてはそれらに前駆細胞活性を、およびインビボにおいては長期におよぶ多系列の移植能を植え付けるのに十分であることを示す。（図63E）ZsGr、6-TFポリ、8-TFまたは8-TFポリを形質導入されたMac1+cKit-骨髄球系エフェクター細胞を移植されたマウスの、移植後の示された時点におけるドナー再構築。1％を超えるドナーキメラ化を有するマウスのみを、再構築されたと判断した。レシピエントは以下を移植された；ZsGr；n=6、6-TFポリ；n=7、8-TF；n=6、および8-TFポリ；n=8。
【図６３Ｆ】骨髄球系エフェクター細胞における規定の転写因子の一過性発現は、インビトロにおいてはそれらに前駆細胞活性を、およびインビボにおいては長期におよぶ多系列の移植能を植え付けるのに十分であることを示す。（図63F）ドナーに対する％として提示された、1％を超えるドナーキメラ化を示すマウスの示された末梢血液細胞系列の再構築。
【図６３Ｇ】骨髄球系エフェクター細胞における規定の転写因子の一過性発現は、インビトロにおいてはそれらに前駆細胞活性を、およびインビボにおいては長期におよぶ多系列の移植能を植え付けるのに十分であることを示す。（図63G）6-TFポリ、8-TFまたは8-TFポリを形質導入されたMac1+cKit-骨髄球系エフェクター細胞の第一レシピエントから得られた5×106個のドナー由来（CD45.2+）骨髄細胞を用いて非競合的に移植された第二のレシピエントマウスの、移植後12週目のドナー再構築。個々の第一ドナーマウスからの細胞（IDによって示される）を、各々N=5の第二のレシピエントに移植した。
【図６３Ｈ】骨髄球系エフェクター細胞における規定の転写因子の一過性発現は、インビトロにおいてはそれらに前駆細胞活性を、およびインビボにおいては長期におよぶ多系列の移植能を植え付けるのに十分であることを示す。（図63H）ドナーに対する％として提示された、示された末梢血細胞系列の平均的な再構築。1群あたりN=5のレシピエント。
【図６４Ａ】8つの転写因子を介して初期化されたiHSCは、分子レベルで内因性HSCにかなり似ていることを示す。図64Aは、HSCの表現型（ダブレットで識別され、生細胞、系列陰性、c-kit+、Sca1+、CD34-、flk2-およびCD150+）を、8-TF（マウス#1）および8-TFポリ（マウス#10）ウイルス混液を用いて形質導入されたプロ/プレB細胞を用いて再構築されたマウスの骨髄からFACSで選別したことを示す。細胞を1細胞ずつ96ウェルプレートに選別し、一連の転写因子についてqPCRによって分析した。個々の細胞の発現レベルを、主成分分析を使用して3次元空間に投影した。レシピエントHSC（HSC宿主）および8-TF（iHSC 8-TF）または8-TFポリ（iHSC 8-TFポリ）を用いて形質導入されたプロ/プレB細胞から得られたiHSCを、以前にプロファイリングし表現型的に特徴付けられた前駆細胞（HSC、MPP、CMP、GMP、MEPおよびCLP）と共に提示する。さらに、プロ/プレB細胞を、対照細胞型として加えた。
【図６４Ｂ】8つの転写因子を介して初期化されたiHSCは、分子レベルで内因性HSCにかなり似ていることを示す。図64B〜Cは、8-TF（iHSC 8-TF）および8-TFポリ（iHSC 8-TFポリ）を用いて形質導入されたプロ/プレB細胞から再構築された骨髄から単離されたHSCの表現型を、その後、qPCR転写因子アレイに関して階層的にクラスター化したことを示す。樹上図の各々の葉は、パネルAの説明文に示された単一細胞を示す。
【図６４Ｃ】8つの転写因子を介して初期化されたiHSCは、分子レベルで内因性HSCにかなり似ていることを示す。図64B〜Cは、8-TF（iHSC 8-TF）および8-TFポリ（iHSC 8-TFポリ）を用いて形質導入されたプロ/プレB細胞から再構築された骨髄から単離されたHSCの表現型を、その後、qPCR転写因子アレイに関して階層的にクラスター化したことを示す。樹上図の各々の葉は、パネルAの説明文に示された単一細胞を示す。
【図６４Ｄ】8つの転写因子を介して初期化されたiHSCは、分子レベルで内因性HSCにかなり似ていることを示す。図64Dは、示された遺伝子の分析が、表現型対照HSC（HSC）、移植された宿主HSC（HSC宿主）、8-TF（iHSC 8-TF）および8-TFポリ（iHSC 8-TFポリ）を用いて形質導入されたプロ/プレB細胞および対照プロ/プレB細胞から得られたiHSCについて示されていることを示す。示された細胞型における発現レベルについての色分け地図が示されている（高い発現を赤色として可視化し；低い発現を青色として可視化した）。バイオリンプロットは、1つの細胞型における上記の各々の転写因子の分布パターンを示す。発現レベルはy軸である。
【図６５】rtTAトランスジェニックマウスの骨髄からのプロ/プレB細胞（図65A）およびCMP（図65B）の選別戦略を示す。ダブレットで識別されかつPI（ヨウ化プロピジウム）陰性の細胞をプレゲーティングし、示されているようにプロ/プレB細胞をゲーティングした：B220+CD19+、AA4.1+およびIgM-。図65Bは、予め、ダブレットで識別されかつPI陰性の細胞をプレゲーティングし、示されているようにCMPをゲーティングした：系列陰性（Gr1-、Mac1-、B220-、CD3-、CD4-、CD8-、Ter119-)、c-kit+、Sca1-、Fc□R3MIDおよびCD34+。
【図６６】プロ/プレB細胞およびCMPに対して、36-TFのウイルス混液を用いて形質導入を行ったことを示す。16時間後にドキシサイクリンを48時間の間加え、その後、細胞をメチルセルロースに移した。20日後、コロニーを計数し、図59A〜59Gに示されているように形態によって特徴付けた。コロニーを回収し、DNAを単離した。列挙されている36個の各々の因子についてのプラスミドの組込みの同定を図60A〜60Gに示されているように実施した。因子の発現を、GEMMの最も高い発現によってクラスター化した。
【図６７】Mac1+骨髄細胞をトランスジェニックrtTAマウスから単離したことを示す。細胞に対して、RHL+PZP（6-TFポリ）、Runx1t1+Hlf+Lmo2+Pbx1+Zfp37+Prdm5+Mycn+Meis1（8-TF）およびRHL+PZP+Mycn+Meis1（8-TFポリ）を用いて16時間形質導入を行った。ドキシサイクリンを、24時間培養液中に加え、5.0×106個の細胞を1×105個のSca1枯渇支持細胞と共に条件付けられた宿主に移植した。末梢血分析を6週目に実施した。16週目の末梢からの採血液のCD45.1+（ドナー）のゲーティングを示す代表的なフローが、各群について示されている。
【図６８Ａ】ZsGr対照、6-TF、8-TF、または8-TFポリウイルスを用いて形質導入されたMac1+骨髄細胞をFACSで選別したことを示す。（図68A）移植を示されているように実施し、移植後18週目に骨髄、脾臓、胸腺、および末梢血液を、5.0％を超える末梢血液の再構築を有するマウスから収集した。1匹の6-TFポリマウス、1匹の8-TFマウスおよび4匹の8-TFポリマウスについて末梢血（PB）、骨髄（BM）、脾臓および胸腺におけるドナーの寄与をグラフで示す。y軸の割れ目は、1.0％のドナーの再構築を示す。
【図６８Ｂ】ZsGr対照、6-TF、8-TF、または8-TFポリウイルスを用いて形質導入されたMac1+骨髄細胞をFACSで選別したことを示す。図68Bは、骨髄、脾臓および胸腺におけるドナー由来細胞についての組成の分析を示す。B細胞（B）、顆粒球（G）、骨髄球系（M）およびT細胞（T）は以前に記載されているように表現型により規定された。
【図６８Ｃ】ZsGr対照、6-TF、8-TF、または8-TFポリウイルスを用いて形質導入されたMac1+骨髄細胞をFACSで選別したことを示す。図68Cは、各々の前駆細胞区画のドナー％は、以前に示されているようにしかし最後はドナーによってゲーティングすることによって計算されたことを示す。これらの結果の定量化は、6-TFポリ（1匹のマウス）、8-TF（1匹のマウス）および8-TFポリ（4匹のマウス）を用いて形質導入されたMac1+骨髄細胞から再構築されたマウスについて示される。割れ目は、1.0％のドナー組成を示す。
【図６８Ｄ】ZsGr対照、6-TF、8-TF、または8-TFポリウイルスを用いて形質導入されたMac1+骨髄細胞をFACSで選別したことを示す。図68Dは、6-TFポリ（1匹のマウス）、8-TF（1匹のマウス）および8-TFポリ（4匹のマウス）を用いて形質導入されたMac1+骨髄細胞から再構築された各マウスについての造血前駆細胞区画の組成の分析を示す。集団を、まずドナーによって、その後、以前に規定された表現型マーカーによってゲーティングした。
【図６９−１】HSC表現型（ダブレットで識別され、生細胞、系列陰性、c-kit+、Sca1+、CD34-、flk2-およびCD150+）が、8-TFおよび8-TFポリウイルス混液を用いて形質導入されたプロ/プレB細胞を用いて再構築されたマウスの骨髄からFACSにより選別されたことを示す。細胞を96ウェルプレートに1細胞ずつ選別し、一連の転写因子についてqPCRによって分析した。色分け地図は、以前にプロファイリングされ表現型で選別された前駆細胞の対照細胞型（HSC、MPP、MEP、CMP、GMP、CLP）、対照プロ/プレB細胞、レシピエント由来HSC（宿主HSC）、ならびに8-TF（iHSC 8-TF）および8-TFポリ（iHSC 8-TFポリ）のウイルス混合物を用いて形質導入されたプロ/プレB細胞から再構築されたマウスから単離されたiHSC細胞を含む、示された細胞型（横列）についての転写因子発現（縦列）を示す。高い発現を赤色で可視化し；低い発現を青色で可視化した。
【図６９−２】HSC表現型（ダブレットで識別され、生細胞、系列陰性、c-kit+、Sca1+、CD34-、flk2-およびCD150+）が、8-TFおよび8-TFポリウイルス混液を用いて形質導入されたプロ/プレB細胞を用いて再構築されたマウスの骨髄からFACSにより選別されたことを示す。細胞を96ウェルプレートに1細胞ずつ選別し、一連の転写因子についてqPCRによって分析した。色分け地図は、以前にプロファイリングされ表現型で選別された前駆細胞の対照細胞型（HSC、MPP、MEP、CMP、GMP、CLP）、対照プロ/プレB細胞、レシピエント由来HSC（宿主HSC）、ならびに8-TF（iHSC 8-TF）および8-TFポリ（iHSC 8-TFポリ）のウイルス混合物を用いて形質導入されたプロ/プレB細胞から再構築されたマウスから単離されたiHSC細胞を含む、示された細胞型（横列）についての転写因子発現（縦列）を示す。高い発現を赤色で可視化し；低い発現を青色で可視化した。
【図６９−３】HSC表現型（ダブレットで識別され、生細胞、系列陰性、c-kit+、Sca1+、CD34-、flk2-およびCD150+）が、8-TFおよび8-TFポリウイルス混液を用いて形質導入されたプロ/プレB細胞を用いて再構築されたマウスの骨髄からFACSにより選別されたことを示す。細胞を96ウェルプレートに1細胞ずつ選別し、一連の転写因子についてqPCRによって分析した。色分け地図は、以前にプロファイリングされ表現型で選別された前駆細胞の対照細胞型（HSC、MPP、MEP、CMP、GMP、CLP）、対照プロ/プレB細胞、レシピエント由来HSC（宿主HSC）、ならびに8-TF（iHSC 8-TF）および8-TFポリ（iHSC 8-TFポリ）のウイルス混合物を用いて形質導入されたプロ/プレB細胞から再構築されたマウスから単離されたiHSC細胞を含む、示された細胞型（横列）についての転写因子発現（縦列）を示す。高い発現を赤色で可視化し；低い発現を青色で可視化した。
【図６９−４】HSC表現型（ダブレットで識別され、生細胞、系列陰性、c-kit+、Sca1+、CD34-、flk2-およびCD150+）が、8-TFおよび8-TFポリウイルス混液を用いて形質導入されたプロ/プレB細胞を用いて再構築されたマウスの骨髄からFACSにより選別されたことを示す。細胞を96ウェルプレートに1細胞ずつ選別し、一連の転写因子についてqPCRによって分析した。色分け地図は、以前にプロファイリングされ表現型で選別された前駆細胞の対照細胞型（HSC、MPP、MEP、CMP、GMP、CLP）、対照プロ/プレB細胞、レシピエント由来HSC（宿主HSC）、ならびに8-TF（iHSC 8-TF）および8-TFポリ（iHSC 8-TFポリ）のウイルス混合物を用いて形質導入されたプロ/プレB細胞から再構築されたマウスから単離されたiHSC細胞を含む、示された細胞型（横列）についての転写因子発現（縦列）を示す。高い発現を赤色で可視化し；低い発現を青色で可視化した。
【図６９−５】HSC表現型（ダブレットで識別され、生細胞、系列陰性、c-kit+、Sca1+、CD34-、flk2-およびCD150+）が、8-TFおよび8-TFポリウイルス混液を用いて形質導入されたプロ/プレB細胞を用いて再構築されたマウスの骨髄からFACSにより選別されたことを示す。細胞を96ウェルプレートに1細胞ずつ選別し、一連の転写因子についてqPCRによって分析した。色分け地図は、以前にプロファイリングされ表現型で選別された前駆細胞の対照細胞型（HSC、MPP、MEP、CMP、GMP、CLP）、対照プロ/プレB細胞、レシピエント由来HSC（宿主HSC）、ならびに8-TF（iHSC 8-TF）および8-TFポリ（iHSC 8-TFポリ）のウイルス混合物を用いて形質導入されたプロ/プレB細胞から再構築されたマウスから単離されたiHSC細胞を含む、示された細胞型（横列）についての転写因子発現（縦列）を示す。高い発現を赤色で可視化し；低い発現を青色で可視化した。
【図６９−６】HSC表現型（ダブレットで識別され、生細胞、系列陰性、c-kit+、Sca1+、CD34-、flk2-およびCD150+）が、8-TFおよび8-TFポリウイルス混液を用いて形質導入されたプロ/プレB細胞を用いて再構築されたマウスの骨髄からFACSにより選別されたことを示す。細胞を96ウェルプレートに1細胞ずつ選別し、一連の転写因子についてqPCRによって分析した。色分け地図は、以前にプロファイリングされ表現型で選別された前駆細胞の対照細胞型（HSC、MPP、MEP、CMP、GMP、CLP）、対照プロ/プレB細胞、レシピエント由来HSC（宿主HSC）、ならびに8-TF（iHSC 8-TF）および8-TFポリ（iHSC 8-TFポリ）のウイルス混合物を用いて形質導入されたプロ/プレB細胞から再構築されたマウスから単離されたiHSC細胞を含む、示された細胞型（横列）についての転写因子発現（縦列）を示す。高い発現を赤色で可視化し；低い発現を青色で可視化した。
【図７０Ａ】最終分化型骨髄球系細胞の、生着可能なHSC様細胞への初期化を示す。（図70A）第二の初期化実験についての図。8-TFのウイルス混合物を用いて形質導入されたプロプレB細胞から再構築されたマウスからの16週後の末梢血を単離した。末梢血液細胞からFACSにより選別されたCD45.1+（ドナー）、または磁気カラムでB220+（B細胞）、Mac1+（Myl）、Gran（Mac1+Gr1+）およびT細胞（CD3+）についてさらに精製した。その後、細胞を、ドキシサイクリンの存在下または非存在下においてF12培地中に蒔いた。ドキシサイクリン投与後3日目に、細胞をメチルセルロースに移した。20日後に、コロニーを計数し、評価した。
【図７０Ｂ】最終分化型骨髄球系細胞の、生着可能なHSC様細胞への初期化を示す。（図70B）8-TFまたは8-TFポリのウイルス混液を用いて形質導入されたプロプレB細胞を用いて再構築されたマウスから16〜20週目に採血し、CD45.1+（ドナー）およびCD45.2+（レシピエント）細胞をFACSにより選別し（8-TF）または選別せず（8-TFポリ）、ドキシサイクリンの存在下/非存在下においてF12培地中に3日間蒔き、メチルセルロースに移し、20日目に計数/評価した。コロニーの数および組成の定量化が、ドキシサイクリンの存在下および非存在下における細胞について示されている。各カラムは、マウス1匹あたり1または3回の反復実験を示す。ドキシサイクリンの存在下においてドナーから選別された細胞についての、代表的なGEMMコロニーおよびGM（顆粒球・骨髄球系）コロニーが右に示されている。
【図７０Ｃ】最終分化型骨髄球系細胞の、生着可能なHSC様細胞への初期化を示す。（図70C）8-TFポリを用いて形質導入されたプロプレB細胞を用いて再構築されたマウスから16週目に採血し、CD45.1+（ドナー）およびCD45.2+（レシピエント）細胞をプールし、B220+（B細胞）、Mac1+（骨髄球系）、Mac1+Gr1+（Gran）およびCD3+（T細胞）について磁気カラムを使用してさらに濃縮した。細胞集団を、ドキシサイクリンの存在下/非存在下においてF12培地中に3日間蒔き、メチルセルロースに移し、20日目に計数/評価した。ドキシサイクリンの存在下および非存在下における細胞についてのコロニーの数および組成の定量化が示されている。
【図７０Ｄ】最終分化型骨髄球系細胞の、生着可能なHSC様細胞への初期化を示す。（図70D）ドナー細胞から得られた代表的な10倍拡大図のコロニー［GEMM、GM、顆粒球（G）および骨髄球系（M）］が示されている。サイトスピンを各コロニーに対して実施し、右に顕著な細胞型を標識して示した。
【図７０Ｅ】最終分化型骨髄球系細胞の、生着可能なHSC様細胞への初期化を示す。（図70E）Mac1+骨髄細胞をトランスジェニックrtTAマウスから単離した。細胞に対して、RHL+PZP（6-TFポリ）、Runx1t1+Hlf+Lmo2+Pbx1+Zfp37+Prdm5+Mycn+Meis1（8-TF）およびRHL+PZP+Mycn+Meis1（8-TFポリ）を用いて16時間形質導入を行った。ドキシサイクリンを24時間培養液中に加え、5.0×106個の細胞を、1×105個のSca1枯渇支持細胞と共に条件付けした宿主に移植した。末梢血の分析を4、8、12および16週目に実施し；ドナーの寄与をグラフに要約する。各々の円は1匹のマウスを示し、1％ドナーキメラ化の印が軸の割れ目によって示されている。
【図７０Ｆ】最終分化型骨髄球系細胞の、生着可能なHSC様細胞への初期化を示す。（図70F）1％を超えて再構築されたマウスの組成が示され、以前に定義されているようなB細胞、骨髄球系細胞、顆粒球、およびT細胞に分けられる。
【図７０Ｇ】最終分化型骨髄球系細胞の、生着可能なHSC様細胞への初期化を示す。（図70G）第二の移植を、5％を超えるドナー再構築を有する第一マウスを安楽死させ、そのマウスから骨髄を収集することによって実施した。500万個のFACSにより選別されたドナー（CD45.2+）の全骨髄細胞を、予め条件付けされた5匹のレシピエントマウスに非競合的に移植した。各々の第二のレシピエント（各々の円）についての、16週目の末梢血キメラ化が示されている。
【図７０Ｈ】最終分化型骨髄球系細胞の、生着可能なHSC様細胞への初期化を示す。（図70H）第二の移植におけるドナー由来細胞の平均組成を計算し、16週目の採血データについてグラフで示した。
【図７１Ａ】形質転換されたプロ/プレB細胞を起源とするドナーから得られた骨髄を、2匹の第一の再構築された動物および1匹の第二の動物から単離したことを示す。B220+（B細胞）、CD3+（T細胞）、Mac1+Gr1-（骨髄球系）およびMac1+Gr1+（Gran）細胞をFACSにより選別した。VDJ分析を各系列に対して実施し、類似のサイズのバンドを選択し、個々のVDJアンプリコンをシークエンスして、各系列における個々の組換え事象に関する情報を得た。各々の示されたドナー/細胞型についてのシークエンスデータが示されている。IgBlast（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）を使用して、VDJ組換え事象を同定し（VDJ ID）、配列が対応するVH、DHまたはJHセグメントに従って列挙した。（図71A）ドナー1°-1の配列が、縦列の左から右へと読むSEQ ID NO: 168〜169、168〜169、176、176、176、176、181、181、181および181として開示されている。ドナー1°-8の配列が、縦列の左から右へと読むSEQ ID NO: 170、170、170、170、177、177、177、177、182、182、182および182として開示されている。
【図７１Ｂ】形質転換されたプロ/プレB細胞を起源とするドナーから得られた骨髄を、2匹の第一の再構築された動物および1匹の第二の動物から単離したことを示す。B220+（B細胞）、CD3+（T細胞）、Mac1+Gr1-（骨髄球系）およびMac1+Gr1+（Gran）細胞をFACSにより選別した。VDJ分析を各系列に対して実施し、類似のサイズのバンドを選択し、個々のVDJアンプリコンをシークエンスして、各系列における個々の組換え事象に関する情報を得た。各々の示されたドナー/細胞型についてのシークエンスデータが示されている。IgBlast（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）を使用して、VDJ組換え事象を同定し（VDJ ID）、配列が対応するVH、DHまたはJHセグメントに従って列挙した。（図71B）ドナー2°-1の配列が、縦列の左から右へと読むSEQ ID NO: 168、168、168、171〜175、176、176、176、178〜180、180、183、183、183〜185、185〜186および186として開示されている。
【図７２】ドナーから得られたMEP細胞（生細胞、Lin-、c-kit+、Sca1-、CD34-、FcgR3-）を、形質転換されたプロ/プレB細胞から再構築された第一レシピエント（マウスID6）の骨髄からFACSにより選別した。MEP細胞を、3匹の放射線照射されたレシピエントに移植した（50,000個の細胞/レシピエント）。対照は放射線照射されたが移植されなかった。（図72A）これらのマウスの生存率を、移植後の時間経過に対してグラフに示す。移植後20日目、残りのマウスの末梢血を、赤血球数（RBC数、図72B）および血小板数（血小板数、図72C）について試験した。
【発明を実施するための形態】
【０１２０】
詳細な説明
本明細書において、より分化した細胞の脱分化および造血幹細胞状態への初期化を可能とする本明細書に記載された転写因子の新規な組合せの発見に一部基づいた、造血幹細胞の誘導のための、または細胞を造血幹細胞複能性状態へと初期化するための、組成物、核酸構築物、方法およびそのキットを提供する。このような組成物、核酸構築物、方法およびキットは、インビトロ、エクスビボまたはインビボにおいて造血幹細胞を誘導するために使用することができ、これらの誘導造血幹細胞を、再生医療適用に使用することができる。
【０１２１】
造血幹細胞（HSC）は、最も良く特徴付けられ、かつ最も実験的に扱いやすい組織特異的幹細胞の1つである。HSCは造血階層の頂点にあり、一連の次第に方向付けられる下流前駆細胞を経て分化することによって高度に特定化されたエフェクター細胞の大きなレパートリーを生じる（図1）。HSCは、全ての血液系列に分化する能力および生涯にわたって自己複製する能力の両方を有する造血系における唯一の細胞である。これらの特性は、静脈内移植時に条件付けされたレシピエントに生着することができるHSCの能力と共に、再生医療における幹細胞の使用の臨床実例を確立した。同種および自家HSC移植は、生命を脅かす様々な障害を有する患者の処置に慣用的に使用されている。幅広い臨床使用にも関わらず、HSCの移植は依然としてハイリスクの手技であり、移植に利用可能な幹細胞の数が、移植の成功の最も強力な予測因子である。G-CSF単独または他の薬物との組合せを用いての幹細胞の動員は、移植のための造血幹細胞の収量を増加させるが、本明細書に記載のような患者特異的HSCを新規で誘導、増殖または生成する能力は、多くの臨床設定において有用であることもできるか、あるいは、エクスビボでまたは異種移植モデルにおいて造血疾病をモデル化するために使用されることもできる。
【０１２２】
分化した細胞型がより原始的な前駆細胞から生じる発生過程は、一部には、進行的なエピジェネティックな変化によって導かれる。一般的には、系列の特定化は分化した細胞型について一方向性かつ不可逆的であり、中間の前駆細胞でさえ、その細胞実体および発生能に関して著しく固定されている。Gurdonらによる研究は、分化した細胞型の核を原始的な除核卵母細胞の細胞環境に曝すと全能性へと初期化することができることを示す実験において、分化の過程は逆行することができることを実証した。「体細胞核移植」として公知のこの過程は、続いて、分化した哺乳動物細胞由来の核を多能性へと戻して初期化することができることが示された。既定の転写因子の異所的発現が細胞運命を変換させるに十分であったことが、MyoDの強制的発現が線維芽細胞を筋原性系列へと初期化できるという実証を用いて1987年に初めて示された。この分野における莫大な進展が過去40年間かけてなされ、例えば米国特許第7964401号；米国特許第8048999号；米国特許第8058065号；米国特許第8129187号；米国特許第8211697号にも記載されている、4つの転写因子（c-Myc、Oct4、Klf4、Sox2、いわゆる「山中因子」）の異所的発現が、マウスおよびヒトからの成体線維芽細胞を、胚性幹（ES）細胞の発生能を有するiPS（人工多能性幹）細胞と呼ばれる細胞へと初期化することができるという山中氏および同僚らによる目覚ましい実証に至った。これらの発見は、大量に存在する体細胞から患者特異的な多能性細胞を生成する可能性を開拓し、これは、疾病のモデル化または自己細胞補充療法のために使用することもできる。
【０１２３】
しかしながら、これらの因子は、出発細胞が造血系列由来の細胞である場合にはこの過程を再現しない。
【０１２４】
その大いなる有望性にも関わらず、iPSに基づいた細胞療法が臨床に入る前にはかなりのハードルを克服しなければならない。また、iPS細胞を臨床に直接使用することができないことが認識されなければならない。なぜなら、ES細胞と同様に、有用な細胞型をまず定方向の分化によって生成しなければならないからである。
【０１２５】
したがって、誘導HSCを作製するための本明細書に記載のような、大量に存在する細胞型が多能性状態へとまず戻ることなく代替的な運命へと直接初期化されるという代替的なアプローチは、臨床的に有用な細胞型を生成するためのより直接的かつ効率的な方法であり得る。例えば、OCT4を造血サイトカインと組み合わせて使用した近年の報告もまた、ヒト線維芽細胞から骨髄球系列の造血細胞（HSCではないが）を生成することができたことを示した。
【０１２６】
完全に分化した血液細胞へのHSCの分化は、通常の生理学的条件下においては不可逆的な過程であると考えられている。造血系列の特定化は、厳密に直系の関係の範囲内で起こる：例えば、巨核球前駆細胞は巨核球および最終的には血小板を生じるが、他のどの血液系列も生じない。しかしながら、いくつかの研究は、造血細胞は、実験的な操作の下で代替的な運命への初期化を受け入れられることを実証した。
【０１２７】
造血系の中で、初期化によって生成することが目指される臨床的に最も有用な細胞型は、HSCである。なぜなら、それらは生涯にわたり全ての血液細胞型を生成する能力を有する唯一の細胞であり、その臨床使用のための移植プロトコールはすでに確立されているからである。現在までに、初期化によるHSCの生成を記載した報告は刊行されていない。なぜなら、HSCへの初期化に必要とされる因子が依然として決定されていなかったからである。この点は、HSCの運命および機能を特定化するために重要である転写活性化因子をまず同定およびクローニングし、その後このような因子を利用して、方向付けられた血液細胞を、本明細書において実証されているような誘導HSCの運命（図2）へと戻して初期化するように設計された、本明細書に記載の実験理論および戦略にとって核心的である。
【０１２８】
造血組織は、長期および短期の再生能を有する細胞、ならびに、方向付けられた複能性、少能性、および単能性前駆細胞を含む。内因性HSCは、様々な組織源に、例えば成体の骨髄（大腿、臀部、肋骨、胸骨および他の骨を含む）、ならびに、臍帯血および胎盤、および動員末梢血に見ることができる。内因性HSCは、例えば、針およびシリンジを使用して臀部から、または、細胞が骨髄区画から遊離するように誘導するG-CSF（顆粒球コロニー刺激因子）などのサイトカインを用いての前処理後に血液から取り出すことによって直接得ることができる。しかしながら、このような方法で得られるHSCの量は可変的で、これは処置選択肢に使用するには十分ではないことが多い。
【０１２９】
したがって、「造血幹細胞」すなわち「HSC」はこの用語が本明細書において使用される場合、造血系の全ての血液細胞型または免疫細胞型（これは、骨髄球系細胞（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球/血小板、樹状細胞）、およびリンパ球系列（T細胞、B細胞、NKT細胞、NK細胞）を含むがそれらに限定されるわけではない）へと分化することができ、かつ多系列血球分化能および持続的な自己複製活性を有する、全ての複能性細胞を包含する。
【０１３０】
本明細書において使用する「幹細胞」という用語は、有糸細胞分裂を通して自身を複製する能力を保持し、かつ様々な特定化細胞型へと分化することのできる細胞を指す。哺乳動物幹細胞の2つの大きなタイプは：胚盤胞に見られる胚性幹（ES）細胞、および成体組織に見られる成体幹細胞である。発生中の胚においては、幹細胞は、特定化された胚組織の全てに分化することができる。成体生物においては、幹細胞および前駆細胞は、特定化された細胞を補充することで、生体のための修復システムとして作用するが、血液、皮膚または腸組織などの再生器官の正常なターンオーバーも維持する。多能性幹細胞は、3つ全ての胚葉から導かれる細胞へと分化することができる。
【０１３１】
幹細胞は、一般的に、その発生能によって、（1）全ての胚細胞型および胚外細胞型を生じることができることを意味する「全能性」；（2）全ての胚細胞型を生じることができることを意味する「多能性」；（3）細胞系列のサブセット、（ただし、全て特定の組織、器官、または生理学的系内）を生じることができることを意味する「複能性」（例えば、造血幹細胞（HSC）は、HSC（自己複製）、血液細胞に限定された少能性前駆細胞、および血液の通常の構成要素である細胞型および要素（例えば血小板）を含む後代を産生することができる）；（4）複能性幹細胞よりも限定された細胞系列のサブセットを生じることができることを意味する「少能性」；および（5）単一の細胞系列（例えば精子形成幹細胞）を生じることができることを意味する「単能性」、として分類される。
【０１３２】
「自己複製」は、細胞が、分裂して親細胞と同一の（例えば自己複製）特徴を有する少なくとも1つの娘細胞を生成することができることを指す。第二の娘細胞は、特定の分化経路に方向付けられ得る。例えば、自己複製造血幹細胞は、分裂して、1つの娘幹細胞、および骨髄球系またはリンパ球系経路の分化へと方向付けられた別の娘細胞を形成する。対照的に、方向付けられた前駆細胞は、典型的には、自己複製能を失い、細胞分裂時により分化した（すなわち限定された）表現型を示す2つの娘細胞を産生する。真の造血幹細胞は、本明細書に記載のような、骨髄移植または臍帯血移植を受けた個体において、長期の多系列造血（例えば「長期の生着」）を再生する能力を有する。
【０１３３】
造血幹細胞は、伝統的には、系列マーカー陰性、Sca1陽性、cKit陽性（またはLSK細胞）、CD34陰性、Flk2陰性、CD48陰性、およびCD150陽性として同定される。HSCは、「複能性前駆細胞」または「造血前駆細胞」を生じ、この用語が本明細書において使用される場合には、これは、造血細胞系列に方向付けられているが、一般的には自己複製しない、より分化した複能性幹細胞のサブセットを指す。「造血前駆細胞」または「複能性前駆細胞」（MPP）という用語は、短期造血幹細胞（ST-HSCとしても知られ、これは系列マーカー陰性、Sca1陽性、cKit陽性、CD34陽性、およびFlk2陰性である）；骨髄球系共通前駆細胞（CMP）；リンパ球系前駆細胞（LMPP）、顆粒球・単球系前駆細胞（GMP）、および巨核球・赤血球系前駆細胞（MEP）を包含する。造血幹細胞のサブセットは、時にまた、追加の細胞表面マーカー表現型に基づいて、例えばSLAMファミリーのメンバーの組合せを使用することなどによって、すなわち「SLAM表現型」に基づいて、同定および識別される。例えば、長期におよぶ多系列の再増殖性および自己複製性の造血幹細胞（HSC）：CD150+CD48-CD244-；MPPs；CD150-CD48-CD244+；系列の限定された前駆細胞（LRP）：CD150-CD48+CD244+；骨髄球系共通前駆細胞（CMP）：lin-SCA-1-c-kit+CD34+CD16/32mid；顆粒球・マクロファージ前駆細胞（GMP）：lin-SCA-1-c-kit+CD34+CD16/32hi；および巨核球・赤血球系前駆細胞（MEP）：lin-SCA-1-c-kit+CD34+CD16/32low。
【０１３４】
したがって、本明細書に記載のHSC初期化因子またはHSC誘導因子を含む組成物、構築物、方法およびキットを使用して、複能性であり、かつ、造血系の全ての血液細胞型または免疫細胞型（骨髄球系細胞（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球/血小板、樹状細胞）およびリンパ球系列（T細胞、B細胞、NKT細胞、NK細胞）を含むがそれらに限定されるわけではない）へと分化することができ、かつ、多系列血球分化能および持続的な自己複製活性を有する、誘導造血幹細胞すなわちiHSCを生成することができる。本明細書に記載のHSC初期化因子またはHSC誘導因子を含む組成物、構築物、方法およびキットのいくつかの態様において、細胞は、1つまたは複数の他の造血前駆細胞型、例えば短期造血幹細胞、骨髄球系共通前駆細胞、リンパ球系共通前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、顆粒球・単球系前駆細胞、および巨核球・赤血球系前駆細胞へと脱分化される。
【０１３５】
本明細書に記載のような、方向付けられた血液細胞を誘導HSCへと初期化することのできるHSC誘導因子の成功裡の同定は、多くの方法でHSC生物学の基本的な理解を向上させ得る。HSCは最も良く特徴付けられた組織特異的幹細胞であるという事実にも関わらず、驚くべきことに自己複製および複能性というその核心的な特性の調節に関与する分子機序に関しては殆ど知られていない。本明細書に記載のような、自己複製能および多系列能を、さもなければ非自己複製性の系列の限定された細胞に付与することのできる因子の同定は、これらの基本的な特質の分子基盤に重要な洞察を与え、いかに最善にHSCを治療に役立つよう操作するかの戦略を与える。さらに、成熟した血液細胞の産生は、徹底的な恒常性制御機序を必要とする持続的な過程であり、その初期レベルはHSCにある。造血悪性病変は恒常性制御機序の脱調節を通して生じるので、本明細書に記載のHSC誘導因子のような、HSC機能を特定化するのに関与する調節因子の同定はまた、どのように恒常性が幹細胞によって調節されるか、次いで、このような過程の脱調節が疾病にどのように現れるのかに関する重要な洞察を与えることができる。種間の初期化因子の機能的保存は文書で十分に裏付けられており、それは、本明細書に記載の方法および組成物が、本明細書に記載のマウス初期化因子の相同体を使用して、ヒト血液細胞を誘導HSCに初期化するために適用可能であることを示す。このような方法で機能的なヒト誘導HSCを得ることができることは、臨床的に実現することができるかまたは造血疾病のモデル化に使用することができる、これらの重要な細胞を得るための新規な実験実例を示す。系列の特定化が起こることが示された1つの機序は、核心的なHSC特性の再確立に関与する因子を同定することによる、代替的な運命の活発な抑制によるので、分化プログラムを抑制することによって機能する因子も同定することができる。そうであるならば、このような因子の同定は、造血系列の特定化への基本的な洞察も与えることができる。転写因子は、発生中の全ての細胞型の特定化において重要な役割を果たす。転写因子により媒介される細胞の脱分化を使用した初期化戦略の成功は、このような因子を使用して、多能性ES/iPS細胞の分化を特定の運命へと方向付けることも同様にありえそうであることを示す。したがって、本明細書において同定されたHSC誘導因子を使用して、HSCにおいて増強されている転写因子の発現によって、ES/iPS細胞の、規定のHSC運命への定方向分化を達成することができる。
【０１３６】
HSCにおいて増強されているTFの組合せの下流前駆細胞への導入、およびインビボにおけるこれらの方向付けられた細胞への幹細胞特性の導入についてのスクリーニングは、方向付けられた細胞を、誘導造血幹細胞（iHSC）状態へと戻して初期化するのを媒介することのできる「HSC誘導因子」または「HSC初期化因子」として本明細書において言及される、核心的なTFセットを同定した。本明細書に記載のアプローチを用いて、HSCは、移植アッセイにおいて長期の（4カ月間を超える）多系列再構築を生じることのできる造血系における唯一の細胞であるという事実を活用することができ、一方で、方向付けられた前駆細胞は、その分化段階に依存して限定された系列能を有するレシピエントマウスを一過性にしか再構築しない。本明細書に記載の組成物、方法およびキットを使用して、誘導造血幹細胞状態へと成功裡に初期化された前駆細胞のみが、移植レシピエントにおいて長期の多系列再構築を生じることができる。
【０１３７】
造血系内のHSCにおいて特異的に発現される転写因子を同定するという目標を実現するために、大半の造血幹細胞、前駆細胞およびエフェクター細胞を代表する、40個のFACSにより精製された造血細胞型の発現プロファイルを作製して編集するという、包括的な系全体におよぶアプローチを採用した（図1）。本明細書に記載の結果の成功は、HSCの分子特質の詳細な知識を必要とするので、定常状態の造血から様々な個体発生段階（胎仔発生から高齢まで）までに至る多様な状況の精製HSCを発現プロファイリングすることによってこれらを規定することに焦点が置かれた。本明細書に記載の研究全体を通して、HSCは、ストリンジェントな細胞表面表現型によって蛍光活性化細胞選別（FACS）により精製され、機能的な基準を通して規定される（図1〜2）。HSCについて合計46個の発現プロファイルが作製され、これは本明細書に記載の分析に多大な検出力を与える。造血集団の合計248個の発現プロファイルが作製され、単一のデータベース（「造血発現データベース」と称される）に標準化された（図3）。
【０１３８】
本明細書に記載のデータベースを使用して、HSCにおいて増強された発現を有する転写因子（TF）が同定された。本明細書に記載の局面のいくつかの態様において、厳密にHSCにおいて増強された発現を有する因子に加えて、胎仔発生中に造血運命を特定化することに関与するTF、例えばSCL/TAL1、RUNX1、HOXB4およびLMO2を、それらは成体において特にHSC特異的発現を示さないけれども、HSC誘導因子として使用することができる。本明細書に記載のように、様々な組合せで「HSC誘導因子」（この用語が本明細書において使用されている）として使用されることができる合計で40個を超えるTFが同定され、各々の発現プロファイルはqRT-PCRによって確認された。
【０１３９】
増加した発生能を有する細胞（例えばiHSC）の産生は、一般的に、本明細書において「HSC誘導因子」として同定された遺伝子をコードする核酸配列を、成体の体細胞に、好ましくはいくつかの態様において、より分化した造血系列の細胞に導入することによって達成される。典型的には、HSC誘導因子をコードする核酸、例えばDNAもしくはRNA、またはその構築物を、ウイルスベクターを使用してまたはウイルスベクターを使用せずに、1回または反復トランスフェクションを介して細胞に導入し、遺伝子産物の発現および/またはRNA分子の翻訳により、本明細書に記載したような形態学的、生化学的、および機能的にHSCに類似した細胞が得られる。本明細書において使用する「初期化」は、細胞を、より高度な発生能を有する状態へと向かわせる、すなわちより分化の少ない状態へと戻す過程を指す。本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、初期化は、分化した状態を、複能性状態を有する細胞の状態へと完全にまたは部分的に戻すことを包含する。本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、初期化は、分化した状態を、CMP、CLPなどのような造血前駆細胞の状態を有する細胞の状態へと完全にまたは部分的に戻すことを包含する。本明細書に記載の組成物、方法およびキットによって誘導された造血幹細胞は、本明細書において、「誘導造血幹細胞」、「iHS細胞」または「iHSC」と称される。これらのHSC誘導因子をコードするアミノ酸または核酸またはその発現ベクターを含む組成物は、本明細書において「HSC誘導組成物」と称される。
【０１４０】
本明細書において実証されているように、様々な組合せで「HSC誘導因子」として細胞に導入して、複能性で、かつ、造血系の全てのまたは大半の血液細胞型または免疫細胞型（骨髄球系細胞（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球/血小板、樹状細胞）、およびリンパ球系列（T細胞、B細胞、NKT細胞、NK細胞）を含むがそれらに限定されるわけではない）へと分化することができ、かつ多系列血球分化能および持続的な自己複製活性を有する、誘導造血幹細胞すなわちiHSCを生成することのできる、40個を超える転写因子が同定された。したがって、本明細書において、いくつかの局面において、表1に列挙された遺伝子を含むHSC誘導因子またはその組合せが提供され、それはまた、同定されたタンパク質を作製するための例示的な配列も提供する。
【０１４１】
（表１）HSC誘導因子
2016513974.tif 000003
2016513974.tif 000004
【０１４２】
いくつかの態様において、表1に提供された配列によってコードされる参照ポリペプチドと同じまたは類似した活性を有するポリペプチド変異体またはファミリーメンバーを、本明細書に記載の組成物、方法およびキットに使用することができる。一般的に、本明細書に記載の組成物、方法およびキットに使用するためのHSC誘導因子をコードする特定のポリペプチドの変異体は、本明細書に記載のおよび当業者に公知の配列アラインメントプログラムおよびパラメーターによって決定したところ、その特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約99％またはそれ以上の配列同一性を有する。
【０１４３】
したがって、いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物、方法およびキットに使用するためのHSC誘導因子は、CDKN1C、DNMT3B、EGR1、ETV6、EVI1、GATA2、GFI1B、GLIS2、HLF、HMGA2、HOXA5、HOXA9、HOXB3、HOXB4、HOXB5、IGF2BP2、IKZF2、KLF12、KLF4、KLF9、LMO2、MEIS1、MSI2、MYCN、NAP1L3、NDN、NFIX、NKX2-3、NR3C2、PBX1、PRDM16、PRDM5、RARB、RBBP6、RBPMS、RUNX1、RUNX1T1、SMAD6、TAL1、TCF15、VDR、ZFP37、ZFP467、ZFP521、ZFP532およびZFP612（SEQ ID NO:1〜46）からなる群より選択される。
【０１４４】
本明細書において例えば図11に実証されているように、表1に列挙された遺伝子に由来する18個の転写因子への曝露は、MPP細胞に、インビボにおいて、HSCの特徴である確固たる長期の多系列生着特性を与えた。したがって、本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、HSC誘導因子は、HLF、MYCN、MEIS1、IRF6、CDKN1C、NFIX、DNMT3B、ZFP612、PRDM5、HOXB4、LMO2、NKX2-3、RARB、NDN、NAP1L3、RUNX1T1、ZFP467およびZFP532から選択される。別のグループは、核心的な6個の因子（Runx1t1、HLF、PRDM5、PBX1、LMO2およびZFP37）および8個の因子（6個の因子に加えてMEIS1、MYCN）である。
【０１４５】
本明細書において例えば図13A〜13Bに実証されているように、表1に列挙された遺伝子に由来する17個の転写因子への曝露は、MPP細胞に、インビボにおいて、HSCの特徴である確固たる長期の多系列生着特性を与えた。したがって、本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、HSC誘導因子は、HLF、MYCN、MEIS1、IRF6、NFIX、DNMT3B、ZFP612、PRDM5、HOXB4、LMO2、NKX2-3、RARB、NDN、NAP1L3、RUNX1T1、ZFP467およびZFP532から選択される。
【０１４６】
本明細書において例えば図12に実証されているように、表1に列挙された遺伝子に由来する9個の転写因子への曝露は、MPP細胞に、インビボにおいて、HSCの特徴である確固たる長期の多系列生着特性を与えた。したがって、本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、HSC誘導因子は、EVI-1、GLIS2、HOXB5、HOXA9、HLF、MEIS1、MYCN、PRDM16およびRUNX1から選択される。
【０１４７】
本明細書において例えば図14に実証されているように、表1に列挙された遺伝子に由来する8個の転写因子への曝露は、MPP細胞に、インビボにおいて、HSCの特徴である確固たる長期の多系列生着特性を与えた。本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、HSC誘導因子は、RUNX1T1、HLF、ZFP467、RBPMS、HOXB5、NAP1L3、MSI2およびIRF6から選択される。
【０１４８】
本明細書に記載の局面のいくつかの態様において、組成物、方法およびキットと共に使用するためのHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、PBX1、LMO2、PRDM5、ZFP37、MYCN、MSI2、NKX2-3、MEIS1およびRBPMSを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる。本明細書において実証されているように、これらの11個のHSC誘導因子を一緒に使用することは、本明細書においては「組合せ7」または「C7」とも称され、これにより、CMP細胞またはプロプレB細胞から、増加したコロニー形成、変化した系列能、およびインビボにおける多系列再構築がもたらされた。加えて、この組合せは、インビボにおいて連続的な長期の移植能を有することが示された。したがって、本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、HSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、PBX1、LMO2、PRDM5、ZFP37、MYCN、MSI2、NKX2-3、MEIS1およびRBPMSから選択される。
【０１４９】
本明細書に記載の局面のいくつかの態様において、組成物、方法およびキットと共に使用するためのHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、ZFP37、PBX1、LMO2およびPRDM5を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる。本明細書において実証されているように、これらの6個のHSC誘導因子を一緒に使用することは、本明細書においては「組合せ6」または「C6」とも称され、これはプロプレB細胞またはCMP細胞を、インビボにおいて多系列再構築を生じることのできる細胞へと初期化することができた。したがって、本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、HSC誘導因子は、HLF、ZFP37、RUNX1T1、PBX1、LMO2およびPRDM5から選択される。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物、方法およびキットはさらに、HSC誘導因子PRDM16、ZFP467およびVDRの1つまたは複数を含むことができる。
【０１５０】
本明細書に記載の局面のいくつかの態様において、組成物、方法およびキットと共に使用するためのHSC誘導因子は、ZFP467、PBX1、HOXB4およびMSI2を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる。本明細書において実証されているように、これらのHSC誘導因子を一緒に使用することは、本明細書においては「組合せ1」または「C1」とも称され、これはプロプレB細胞を骨髄球系細胞へと初期化することができた。したがって、本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、HSC誘導因子は、ZFP467、PBX1、HOXB4およびMSI2から選択される。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物、方法およびキットはさらに、HSC誘導因子HLF、LMO2、PRDM16およびZFP37の1つまたは複数を含むことができる。
【０１５１】
本明細書に記載の局面のいくつかの態様において、組成物、方法およびキットと共に使用するためのHSC誘導因子は、MYCN、MSI2、NKX2-3およびRUNX1T1を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる。本明細書において実証されているように、これらのHSC誘導因子を一緒に使用することは、本明細書においては「組合せ2」または「C2」とも称され、これはプロプレB細胞をiHSC細胞へと初期化することができた。したがって、本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、HSC誘導因子は、MYCN、MSI2、NKX2-3およびRUNX1T1から選択される。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物、方法およびキットはさらに、HSC誘導因子HOBX5、HLF、ZFP467、HOXB3、LMO2、PBX1、ZFP37およびZFP521の1つまたは複数を含むことができる。
【０１５２】
本明細書に記載の局面のいくつかの態様において、組成物、方法およびキットと共に使用するためのHSC誘導因子は、HOXB4、PBX1、LMO2、ZFP612およびZFP521を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる。本明細書において実証されているように、これらのHSC誘導因子を一緒に使用することは、本明細書においては「組合せ3」または「C3」とも称され、これはプロプレB細胞の増殖および生存を促進することができた。したがって、本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、HSC誘導因子は、HOXB4、PBX1、LMO2、ZFP612およびZFP521から選択される。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物、方法およびキットはさらに、HSC誘導因子KLF12、HLFおよびEGR1の1つまたは複数を含むことができる。
【０１５３】
本明細書に記載の局面のいくつかの態様において、組成物、方法およびキットと共に使用するためのHSC誘導因子は、MEIS1、RBPMS、ZFP37、RUNX1T1およびLMO2を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる。本明細書において実証されているように、これらのHSC誘導因子を一緒に使用することは、本明細書においては「組合せ4」または「C4」とも称され、これはCMP細胞をiHSCに初期化することができた。したがって、本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、HSC誘導因子は、MEIS1、RBPMS、ZFP37、RUNX1T1およびLMO2から選択される。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物、方法およびキットはさらに、HSC誘導因子KLF12およびHLFの1つまたは複数を含むことができる。
【０１５４】
本明細書に記載の局面のいくつかの態様において、組成物、方法およびキットと共に使用するためのHSC誘導因子は、ZFP37、HOXB4、LMO2およびHLFを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる。本明細書において実証されているように、これらのHSC誘導因子を一緒に使用することは、本明細書においては「組合せ5」または「C5」とも称され、これはCMPおよびプロプレB細胞の運命を初期化することができた。したがって、本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、HSC誘導因子は、ZFP37、HOXB4、LMO2およびHLFから選択される。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物、方法およびキットはさらに、HSC誘導因子MYCN、ZFP467、NKX2-3、PBX1およびKLF12ZFP37の1つまたは複数を含むことができる。
【０１５５】
本明細書において提供された組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、出発体細胞、例えば線維芽細胞または造血系列細胞からiHSCを生成するために使用または選択されたHSC誘導因子の数は、少なくとも3つである。いくつかの態様において、使用または選択されたHSC誘導因子の数は、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、またはそれ以上である。
【０１５６】
また、本明細書において、組成物、方法およびキットの様々な局面において、iHSCの作製に使用するための1つまたは複数のHSC誘導因子をコードする単離されたアミノ酸配列、および単離されたDNAまたはRNA核酸配列が提供される。
【０１５７】
本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、HSC誘導因子、例えばHLF、RUNX1T1、PBX1、LMO2、PRDM5、ZFP37、MYCN、MSI2、NKX2-3、MEIS1およびRBPMSをコードする核酸配列または構築物を、標準的な分子生物学技術を使用して、細胞のトランスフェクションに適した発現ベクターに挿入するかまたは機能的に連結する。本明細書において使用する「ベクター」は、有用な生物学的または生化学的特性を、挿入されたヌクレオチド配列に、例えば本明細書に記載の核酸構築物または置換カセットに提供する、核酸分子、例えばdsDNA分子を指す。例には、インビトロでもしくは宿主細胞内で複製するもしくは複製されることができるか、または所望の核酸セグメントを宿主細胞内の所望の場所に運ぶことのできる、プラスミド、ファージ、自己複製配列（ARS）、セントロメア、および他の配列が挙げられる。ベクターは、1つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（I型か、II型かまたはIIs型）を有することができ、その部位で配列をベクターの不可欠な生物学的機能を失うことなく決定可能な様式で切り出し、その部位に核酸フラグメントをスプライシングまたは挿入して、その複製およびクローニングをもたらすことができる。ベクターはまた、2つの核酸分子間の核酸配列の交換を可能とする、1つまたは複数の組換え部位を含むことができる。ベクターはさらに、例えばPCRのためのプライマー部位、転写開始部位および/または翻訳開始部位および/または調節部位、組換えシグナル、レプリコン、追加の選択マーカーなどを備えることができる。ベクターはさらに、ベクターを用いて形質転換された細胞の同定に使用するのに適した1つまたは複数の選択マーカーを含むことができる。
【０１５８】
したがって、いくつかの局面において、本明細書において、CDKN1C、DNMT3B、EGR1、ETV6、EVI1、GATA2、GFI1B、GLIS2、HLF、HMGA2、HOXA5、HOXA9、HOXB3、HOXB4、HOXB5、IGF2BP2、IKZF2、KLF12、KLF4、KLF9、LMO2、MEIS1、MSI2、MYCN、NAP1L3、NDN、NFIX、NKX2-3、NR3C2、PBX1、PRDM16、PRDM5、RARB、RBBP6、RBPMS、RUNX1、RUNX1T1、SMAD6、TAL1、TCF15、VDR、ZFP37、ZFP467、ZFP521、ZFP532およびZFP612から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個またはそれ以上の造血幹細胞（HSC）誘導因子をコードする1つまたは複数の発現ベクターを含むHSC誘導組成物が提供される。
【０１５９】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、少なくとも1個、2個、3個、4個またはそれ以上のHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、PBX1、LMO2、PRDM5、ZFP37、MYCN、MSI2、NKX2-3、MEIS1およびRBPMSである。
【０１６０】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、少なくとも1個、2個、3個、4個またはそれ以上のHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、ZFP37、PBX1、LMO2およびPRDM5である。
【０１６１】
また、本明細書において、いくつかの局面において、HLFをコードする核酸配列；RUNX1T1をコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；およびPRDM5をコードする核酸配列を含む、1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物が提供される。
【０１６２】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、HSC誘導組成物はさらに、PRDM16をコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；およびVDRをコードする核酸配列の1つまたは複数を含む。
【０１６３】
また、本明細書において、いくつかの局面において、HLFをコードする核酸配列；RUNX1T1をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；PRDM5をコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；MYCNをコードする核酸配列；MSI2をコードする核酸配列；NKX2-3をコードする核酸配列；MEIS1をコードする核酸配列；およびRBPMSをコードする核酸配列を含む、1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物が提供される。
【０１６４】
いくつかの局面において、本明細書において、ZFP467をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；HOXB4をコードする核酸配列；およびMSI2をコードする核酸配列を含む、1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物が提供される。
【０１６５】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、HSC誘導組成物はさらに、HLFをコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；PRDM16をコードする核酸配列；およびZFP37をコードする核酸配列の1つまたは複数を含む。
【０１６６】
また、本明細書において、いくつかの局面において、MYCNをコードする核酸配列；MSI2をコードする核酸配列；NKX2-3をコードする核酸配列；およびRUNX1T1をコードする核酸配列を含む、1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物が提供される。
【０１６７】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、HSC誘導組成物はさらに、HOXB5をコードする核酸配列；HLFをコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；HOXB3をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；およびZFP521をコードする核酸配列を含む。
【０１６８】
他の局面において、本明細書において、HOXB4をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；およびZFP521をコードする核酸配列を含む、1つまたは複数の発現ベクター組成物を含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物が提供される。
【０１６９】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、HSC誘導組成物はさらに、KLF12をコードする核酸配列；HLFをコードする核酸配列；およびEGR1をコードする核酸配列の1つまたは複数を含む。
【０１７０】
また、本明細書において、いくつかの局面において、MEIS1をコードする核酸配列；RBPMSをコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；RUNX1T1をコードする核酸配列；およびLMO2をコードする核酸配列を含む、1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物が提供される。
【０１７１】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、HSC誘導組成物はさらに、KLF12をコードする配列；およびHLFをコードする配列の1つまたは複数を含む。
【０１７２】
また、本明細書において、いくつかの局面において、ZFP37をコードする核酸配列；HOXB4をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；およびHLFをコードする核酸配列を含む、1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物が提供される。
【０１７３】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、HSC誘導組成物はさらに、MYCNをコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；NKX2-3をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；およびKLF4をコードする核酸配列の1つまたは複数を含む。
【０１７４】
本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、発現ベクターはウイルスベクターである。ウイルスにより媒介されるいくつかの発現法は、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを使用し、このような発現法は、遺伝子送達に使用され、当技術分野において周知である。
【０１７５】
本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、ウイルスベクターはレトロウイルスである。レトロウイルスは、遺伝子送達のための簡便なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子をベクターに挿入し、当技術分野において公知の技術を使用してレトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。その後、組換えウイルスを単離し、インビボまたはエクスビボのいずれかで対象の標的細胞に送達することができる。多くのレトロウイルス系が記載されている。例えば、米国特許第5,219,740号; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-90; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-52; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-37; Boris-Lawrie and Temin (1993) Curr. Opin. Genet. Develop. 3:102-09を参照されたい。本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、レトロウイルスは複製欠損である。レトロウイルスベクター系は、5'および3'LTRならびにパッケージングシグナルを含有する最小ベクターが、ベクターへのパッケージング、標的細胞への感染および組込みを可能とするのに十分であるという事実を活用し、ただし、ウイルス構造タンパク質は、パッケージング細胞系においてトランスで供給される。遺伝子導入のためのレトロウイルスベクターの基本的な利点には、殆どの細胞型における効率的な感染および遺伝子発現、標的細胞染色体DNAへの正確な1コピーのベクターの組込み、ならびにレトロウイルスゲノムの操作し易さが挙げられる。
【０１７６】
本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、ウイルスベクターは、アデノウイルスに基づいた発現ベクターである。宿主ゲノムに組み込まれるレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは染色体外に存続し、したがって、挿入突然変異に伴うリスクは最小限となる（Haj-Ahmad and Graham (1986) J. Virol. 57:267-74; Bett et al. (1993) J. Virol. 67:5911-21; Mittereder et al. (1994) Human Gene Therapy 5:717-29; Seth et al. (1994) J. Virol. 68:933-40; Barr et al. (1994) Gene Therapy 1:51-58; Berkner, K. L. (1988) BioTechniques 6:616-29; and Rich et al. (1993) Human Gene Therapy 4:461-76）。アデノウイルスベクターは、多種多様な細胞に感染し、広宿主域を有し、高い感染効率を示し、高いレベルで異種遺伝子の発現を指令し、インビボでそうした遺伝子の長期発現を達成する。ウイルスは、無細胞ビリオンとして完全に感染性であり、よって産生細胞株の注射は必要とされない。安全性に関して、アデノウイルスは深刻なヒトの病気を併発せず、ウイルス由来の組換えベクターは、ウイルスゲノムの初期領域1（「E1」）の欠失によって複製欠損とさせることができる。アデノウイルスはまた、比較的簡単に大量に産生されることができる。本明細書に記載の組成物、方法およびキットに使用するためのアデノウイルスベクターは、40個を超える血清型のアデノウイルス株のいずれか、例えば血清型2、5、12、40および41を含むがそれらに限定されるわけではない、様々なアデノウイルス血清型のいずれかから得ることができる。本明細書において使用されるアデノウイルスベクターは、好ましくは、複製欠損であり、適切なプロモーターに機能的に連結された関心対象のHSC誘導因子を含有する。
【０１７７】
本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、HSC誘導因子、例えばHLF、RUNX1T1、PBX1、LMO2、PRDM5、ZFP37、MYCN、MSI2、NKX2-3、MEIS1およびRBPMSをコードする核酸配列は、1つまたは複数の誘導性レンチウイルスベクターを使用して導入または送達される。1つまたは複数の誘導性レンチウイルスベクターを使用して送達されたHSC誘導因子の発現の制御は、いくつかの態様において、誘導性プロモーターの制御下または誘導性プロモーターに機能的に連結された発現ベクターにおいて少なくとも1つのHSC誘導因子を有する細胞を、調節物質（例えばドキシサイクリン）または他の誘導物質と接触させることによって達成することができる。いくつかの種類の誘導性レンチウイルスベクターを使用した場合、このような細胞と誘導物質との接触は、HSC誘導因子の発現を誘導するが、一方で、調節物質の停止は発現を阻害する。他の種類の誘導性レンチウイルスベクターを使用した場合、調節物質の存在は発現を阻害するが、一方で、調節物質の除去は、発現を可能とする。本明細書において使用する「発現の誘導」という用語は、例えば誘導物質の存在下での、または細胞内の遺伝子の内因性発現を引き起こす1つまたは複数の作用物質または因子の存在下での、誘導性ウイルスベクターによってコードされるHSC誘導因子のような遺伝子の発現を指す。
【０１７８】
本明細書に記載の局面のいくつかの態様において、ドキシサイクリン（Dox）誘導性レンチウイルス系が使用される。レトロウイルスと異なり、レンチウイルスは静止状態の細胞を形質導入することができ、このことから多種多様な造血細胞型の形質導入を受け入れることができる。例えば、pHAGE2レンチウイルス系は、高い効率で初代造血前駆細胞を形質導入することが示された。このベクターはまた、ウイルスによる形質導入の効率の評価およびFACSによる形質導入された細胞の精製を可能とするレポーターカセット（IRES Zs-Green）を有する。本明細書において実証されているように、導入された転写因子を誘導的にオフにする能力は重要である。なぜなら、HSCにおいて増強されたこれらのTFの発現パターンは、誘導HSCにおける持続的な強制発現が全ての系列への分化を損なう可能性があることを示すからである。誘導系を有することはまた、初期化状態の安定性の確認を可能とし、かつ、一旦初期化因子の強制発現が解除されれば、HSC転写プログラムおよびエピジェネティックマークの確立および忠実度を評価することを可能とする。
【０１７９】
本明細書に記載の方法のいくつかの態様において、HSC誘導因子、例えばHLF、RUNX1T1、PBX1、LMO2、PRDM5、ZFP37、MYCN、MSI2、NKX2-3、MEIS1およびRBPMSをコードする核酸配列は、非組込みベクター（例えばアデノウイルス）を使用して導入または送達される。レトロウイルスベクターなどの組込みベクターは宿主細胞ゲノムに取り込まれ、正常な遺伝子機能を破壊する可能性があり得るが、非組込みベクターは、染色体外転写によって遺伝子産物の発現を制御する。非組込みベクターは宿主ゲノムの一部とはならないので、非組込みベクターは、細胞集団において一過性に核酸を発現する傾向がある。これは、一部には、非組込みベクターをしばしば複製欠損とさせているという事実に起因する。したがって、非組込みベクターは、以下を含むがそれらに限定されるわけではない、レトロウイルスベクターを上回るいくつかの利点を有する：（1）宿主ゲノムが破壊されない、および（2）一過性発現、および（3）ウイルス組込み産物が残存しない。本明細書に記載の方法と共に使用するための非組込みベクターのいくつかの非限定的な例には、アデノウイルス、バキュロウイルス、アルファウイルス、ピコルナウイルス、およびワクシニアウイルスが挙げられる。本明細書に記載の方法のいくつかの態様において、非組込みウイルスベクターはアデノウイルスである。非組込みウイルスベクターの他の利点には、高い力価でそれらを産生することができること、インビボにおけるその安定性、および宿主細胞へのその効率的な感染が挙げられる。
【０１８０】
「機能的に（operably）連結されている」、「機能的に位置する」、「機能的に（operatively）連結されている」、「制御下」および「転写制御下」という語句は、核酸配列、例えばHSC誘導因子をコードする配列が、プロモーターおよび/または内因性調節配列がその配列の転写開始および/または発現を制御するように、プロモーターおよび/または内因性調節配列に対して正しい機能的位置および/または向きにあることを示す。
【０１８１】
本明細書において使用する「プロモーター」または「プロモーター配列」という用語は、核酸配列（これはHSC誘導因子をコードする配列などの異種標的遺伝子であることができる）のRNAポリメラーゼにより媒介される転写を駆動することによって、別の核酸配列の発現を調節する核酸配列を指す。プロモーターは、核酸配列の制御領域であり、そこで残りの核酸配列の転写の開始および速度が制御される。プロモーターはまた、調節タンパク質および分子が結合することのできる1つまたは複数の遺伝学的要素を含むことができる。このような調節タンパク質にはRNAポリメラーゼおよび他の転写因子が挙げられる。したがって、プロモーターは、それが調節する核酸配列、例えばHSC誘導因子をコードする配列の「発現を駆動する」または「転写を駆動する」と言うことができる。
【０１８２】
本明細書に記載の組成物、方法およびキット中のiHSCの生成に使用するための核酸構築物およびベクターはさらに、いくつかの態様において、細胞の陽性および陰性選択のための選択マーカーをコードする1つまたは複数の配列を含むことができる。このような選択マーカー配列は、典型的には、核酸構築物の導入がなされていない細胞において通常見られない抗生物質に対する耐性または感受性の特性を与えることができる。選択マーカーは、挿入された核酸構築物を発現している細胞について培養液中で選択するための、選択物質、例えば抗生物質と併用して使用され得る。陽性選択マーカーをコードする配列は、典型的には、抗生物質耐性を与え、すなわち、陽性選択マーカー配列が細胞のゲノムに存在する場合には、細胞は、抗生物質または薬剤に対して感受性である。陰性選択マーカーをコードする配列は、典型的には、抗生物質または薬剤に対する感受性を与え、すなわち、陰性選択マーカーが細胞のゲノムに存在する場合には、細胞は抗生物質または薬剤に対して感受性である。
【０１８３】
本明細書に記載の組成物、方法およびキット中のiHSCの生成に使用するための核酸構築物およびベクターはさらに、いくつかの態様において、構築物の、または他のベクター遺伝学的要素（例えば、当業者には公知であるようなプロモーター、エンハンサー、TATAボックス、リボソーム結合部位、IRES）の、調節、発現、安定化のための他の核酸配列を含むことができる。
【０１８４】
本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、HSC誘導因子、例えばHLF、RUNX1T1、PBX1、LMO2、PRDM5、ZFP37、MYCN、MSI2、NKX2-3、MEIS1およびRBPMSは、合成の改変されたRNAとして提供されるか、または、米国特許公開公報第2012-0046346-A1号（その内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載のような合成の改変されたRNAとして細胞中に導入もしくは送達される。合成の改変されたRNAが本明細書に記載の方法に従って細胞をiHSCへと初期化するために使用されるそのような態様において、該方法は、細胞の反復接触を含むことができるか、または、HSC誘導因子をコードする合成の改変されたRNAの反復トランスフェクション、例えば、少なくとも2回、少なくとも3回、少なくとも4回、少なくとも5回、少なくとも6回、少なくとも7回、少なくとも8回、少なくとも9回、少なくとも10回、少なくとも11回、少なくとも12回、少なくとも13回、少なくとも14回、少なくとも15回、少なくとも16回、少なくとも17回、少なくとも18回、少なくとも19回、少なくとも20回、少なくとも25回、少なくとも30回、またはそれ以上のトランスフェクションを含むことができる。
【０１８５】
1つまたは複数の改変されたヌクレオシドに加えて、本明細書に記載の組成物、方法およびキットに使用するための改変されたmRNAは、当業者に公知であり、かつ米国特許公開公報第2012-0046346-A1号および第20120251618A1号、ならびにPCT公開公報第WO 2012/019168号に記載のような任意の追加の改変を含むことができる。このような他の構成要素は、例えば、5'キャップ（例えば、5'-5'-三リン酸グアニン-グアニン結合（1つのグアニンはN7メチル基を含む）ならびに3'-O-メチル基を含む、アンチリバースキャップアナログ（ARCA）キャップ；mRNAの5'最末端ヌクレオチドとグアニンヌクレオチド（該グアニンはN7メチル化を含み、5'最末端ヌクレオチドはCap1構造を生成する2'-O-メチルを含む）との間に古典的な5'-5'-三リン酸結合を作ることができる、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素および組換え2'-O-メチルトランスフェラーゼ酵素を使用して作製されたキャップ）；ポリ（A）テイル（例えば、30ヌクレオチド長を超える、35ヌクレオチド長を超える、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも45ヌクレオチド、少なくとも55ヌクレオチド、少なくとも60ヌクレオチド、少なくとも70ヌクレオチド、少なくとも80ヌクレオチド、少なくとも90ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、少なくとも500ヌクレオチド、少なくとも600ヌクレオチド、少なくとも700ヌクレオチド、少なくとも800ヌクレオチド、少なくとも900ヌクレオチド、少なくとも1000ヌクレオチド、またはそれ以上のポリAテイル）（SEQ ID NO: 93）；コザック配列；3'非翻訳領域（3'UTR）；5'非翻訳領域（5'UTR）；核酸から切り出すことができる1つまたは複数のイントロンヌクレオチド配列、またはその組合せを含む。
【０１８６】
本明細書に記載の組成物、方法およびキットに使用するための改変されたmRNAはさらに、配列内リボソーム進入部位（IRES）を含むことができる。IRESは、唯一のリボソーム結合部位として作用することができるか、または、mRNAの複数のリボソーム結合部位の1つとしての役目を果たすことができる。1つを超える機能的なリボソーム結合部位を含有するmRNAは、リボソームによって独立的に翻訳される、いくつかのペプチドまたはポリペプチド、例えば本明細書に記載のHSC誘導因子をコードすることができる（「マルチシストロン性mRNA」）。核酸にIRESが与えられると、さらに任意で第二の翻訳可能な領域が与えられる。本発明に従って使用されることができるIRES配列の例には、ピコルナウイルス（例えばFMDV）、ペストウイルス（CFFV）、ポリオウイルス（PV）、脳心筋炎ウイルス（ECMV）、口蹄疫ウイルス（FMDV）、C型肝炎ウイルス（HCV）、ブタコレラウイルス（CSFV）、マウス白血病ウイルス（MLV）、サル免疫不全ウイルス（SIV）、またはコオロギ麻痺ウイルス（CrPV）が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。
【０１８７】
本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、合成の改変されたRNA分子は、少なくとも1つの改変されたヌクレオシドを含む。本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、合成の改変されたRNA分子は少なくとも2つの改変されたヌクレオシドを含む。
【０１８８】
本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、改変されたヌクレオシドは、5-メチルシトシン（5mC）、N6-メチルアデノシン（m6A）、3,2'-O-ジメチルウリジン（m4U）、2-チオウリジン（s2U）、2'フルオロウリジン、プソイドウリジン、2'-O-メチルウリジン（Um）、2'デオキシウリジン（2'dU）、4-チオウリジン（s4U）、5-メチルウリジン（m5U）、2'-O-メチルアデノシン（m6A）、N6,2'-O-ジメチルアデノシン（m6Am）、N6,N6,2'-O-トリメチルアデノシン（m62Am）、2'-O-メチルシチジン（Cm）、7-メチルグアノシン（m7G）、2'-O-メチルグアノシン（Gm）、N2,7-ジメチルグアノシン（m2,7G）、N2,N2,7-トリメチルグアノシン（m2,2,7G）、およびイノシン（I）からなる群より選択される。いくつかの態様において、改変されたヌクレオシドは、5-メチルシトシン（5mC）、プソイドウラシル、またはその組合せである。
【０１８９】
改変されたmRNAは、分子の全長に沿って均一に改変されている必要はない。種々のヌクレオチド改変および/または骨格構造が、核酸中の様々な位置に存在することができる。当業者は、ヌクレオチド類似体または他の改変が、核酸の機能が実質的に低下しないような、核酸の任意の位置に位置することができることを理解しているだろう。改変はまた、5'または3'末端改変であることができる。核酸は、最小で1％および最大で100％の改変されたヌクレオチド、またはその中間のあらゆる比率、例えば少なくとも50％の改変されたヌクレオチド、少なくとも80％改変されたヌクレオチド、または少なくとも90％改変されたヌクレオチドを含むことができる。
【０１９０】
いくつかの態様において、分子中の所与のヌクレオシドの各々の存在が改変されていることが好ましいが絶対に必要ではない（例えば、各シトシンは改変されたシトシン、例えば5-メチルシトシンであり、各ウラシルは改変されたウラシル、例えばプソイドウラシルであるなど）。例えば、改変されたmRNAは、改変されたピリミジン、例えばウラシルまたはシトシンを含むことができる。いくつかの態様において、核酸中のウラシルの少なくとも25％、少なくとも50％、少なくとも80％、少なくとも90％、または100％が、改変されたウラシルを用いて置換されている。また、所与の合成の改変されたRNA分子における、同じヌクレオシドの種々の存在を、違った風に改変できることが企図される。改変されたウラシルは、単一の独特な構造を有する化合物によって置換されることができるか、または、種々の構造（例えば2個、3個、4個またはそれ以上の独特な構造）を有する複数の化合物によって置換されることができる。いくつかの態様において、核酸中のシトシンの少なくとも25％、少なくとも50％、少なくとも80％、少なくとも90％、または100％が、改変されたシトシンで置換され得る。改変されたシトシンは、単一の独特な構造を有する化合物によって置換されることができるか、または、種々の構造（例えば2個、3個、4個またはそれ以上の独特な構造）を有する複数の化合物によって置換されることができる（例えば、いくつかのシトシンは5mCとして改変され、他は2'-O-メチルシトシンまたは他のシトシン類似体として改変される）。RNA分子が合成される際に、HSC誘導因子をコードする結果として生じるRNA分子に、所望の改変されたヌクレオシドのみが取り込まれるように、全ての所望の改変されたヌクレオシドを含むリボヌクレオシドブレンドまたは混合物を使用することによって、このような多数改変された合成RNA分子が産生されることができる。
【０１９１】
本明細書において使用する「改変されていない」または「天然」ヌクレオシドまたは核酸塩基は、プリン塩基のアデニン（A）およびグアニン（G）、ならびにピリミジン塩基のチミン（T）、シトシン（C）およびウラシル（U）を含む。改変されたヌクレオシドは、他の合成および天然の核酸塩基、例えばイノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン（nubularine）、イソグアニシン（isoguanisine）、ツベルシジン、2-(ハロ)アデニン、2-(アルキル)アデニン、2-(プロピル)アデニン、2(アミノ)アデニン、2-(アミノアルキル)アデニン、2(アミノプロピル)アデニン、2(メチルチオ)N6(イソペンテニル)アデニン、6(アルキル)アデニン、6(メチル)アデニン、7(デアザ)アデニン、8(アルケニル)アデニン、8-(アルキル)アデニン、8(アルキニル)アデニン、8(アミノ)アデニン、8-(ハロ)アデニン、8-(ヒドロキシル)アデニン、8(チオアルキル)アデニン、8-(チオール)アデニン、N6-(イソペンチル)アデニン、N6(メチル)アデニン、N6,N6(ジメチル)アデニン、2-(アルキル)グアニン、2(プロピル)グアニン、6-(アルキル)グアニン、6(メチル)グアニン、7(アルキル)グアニン、7(メチル)グアニン、7(デアザ)グアニン、8(アルキル)グアニン、8-(アルケニル)グアニン、8(アルキニル)グアニン、8-(アミノ)グアニン、8(ハロ)グアニン、8-(ヒドロキシル)グアニン、8(チオアルキル)グアニン、8-(チオール)グアニン、N(メチル)グアニン、2-(チオ)シトシン、3(デアザ)5(アザ)シトシン、3-(アルキル)シトシン、3(メチル)シトシン、5-(アルキル)シトシン、5-(アルキニル)シトシン、5(ハロ)シトシン、5(メチル)シトシン、5(プロピニル)シトシン、5(プロピニル)シトシン、5(トリフルオロメチル)シトシン、6-(アゾ)シトシン、N4(アセチル)シトシン、3(3アミノ-3カルボキシプロピル)ウラシル、2-(チオ)ウラシル、5(メチル)2(チオ)ウラシル、5(メチルアミノメチル)-2(チオ)ウラシル、4-(チオ)ウラシル、5(メチル)4(チオ)ウラシル、5(メチルアミノメチル)-4(チオ)ウラシル、5(メチル)2,4(ジチオ)ウラシル、5(メチルアミノメチル)-2,4(ジチオ)ウラシル、5(2-アミノプロピル)ウラシル、5-(アルキル)ウラシル、5-(アルキニル)ウラシル、5-(アリルアミノ)ウラシル、5(アミノアリル)ウラシル、5(アミノアルキル)ウラシル、5(グアニジニウムアルキル)ウラシル、5(1,3-ジアゾール-1-アルキル)ウラシル、5-(シアノアルキル)ウラシル、5-(ジアルキルアミノアルキル)ウラシル、5(ジメチルアミノアルキル)ウラシル、5-(ハロ)ウラシル、5-(メトキシ)ウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸、5(メトキシカルボニルメチル)-2-(チオ)ウラシル、5(メトキシカルボニル-メチル)ウラシル、5(プロピニル)ウラシル、5(プロピニル)ウラシル、5(トリフルオロメチル)ウラシル、6(アゾ)ウラシル、ジヒドロウラシル、N3(メチル)ウラシル、5-ウラシル（すなわちプソイドウラシル）、2(チオ)プソイドウラシル、4(チオ)プソイドウラシル、2,4-(ジチオ)プソイドウラシル、5-(アルキル)プソイドウラシル、5-(メチル)プソイドウラシル、5-(アルキル)-2-(チオ)プソイドウラシル、5-(メチル)-2-(チオ)プソイドウラシル、5-(アルキル)-4-(チオ)プソイドウラシル、5-(メチル)-4(チオ)プソイドウラシル、5-(アルキル)-2,4(ジチオ)プソイドウラシル、5-(メチル)-2,4(ジチオ)プソイドウラシル、1置換プソイドウラシル、1置換2(チオ)-プソイドウラシル、1置換4(チオ)プソイドウラシル、1置��2,4-(ジチオ)プソイドウラシル、1(アミノカルボニルエチレニル)-プソイドウラシル、1(アミノカルボニルエチレニル)-2(チオ)-プソイドウラシル、1(アミノカルボニルエチレニル)-4(チオ)プソイドウラシル、1(アミノカルボニルエチレニル)-2,4-(ジチオ)プソイドウラシル、1(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)-プソイドウラシル、1(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)-2(チオ)-プソイドウラシル、1(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)-4(チオ)プソイドウラシル、1(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)-2,4-(ジチオ)プソイドウラシル、1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェンチアジン-1-イル、1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェンチアジン-1-イル、7-置換1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-置換1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、7-置換1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェンチアジン-1-イル、7-置換1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェンチアジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェンチアジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェンチアジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキル-ヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェンチアジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェンチアジン-1-イル、1,3,5-(トリアザ)-2,6-(ジオキサ)-ナフタレン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、イノシニル、2-アザ-イノシニル、7-デアザ-イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、3-(メチル)イソカルボスチリリル、5-(メチル)イソカルボスチリリル、3-(メチル)-7-(プロピニル)イソカルボスチリリル、7-(アザ)インドリル、6-(メチル)-7-(アザ)インドリル、イミジゾピリジニル、9-(メチル)-イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、7-(プロピニル)イソカルボスチリリル、プロピニル-7-(アザ)インドリル、2,4,5-(トリメチル)フェニル、4-(メチル)インドリル、4,6-(ジメチル)インドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニル、ジフルオロトリル、4-(フルオロ)-6-(メチル)ベンゾイミダゾール、4-(メチル)ベンゾイミダゾール、6-(アゾ)チミン、2-ピリジノン、5ニトロインドール、3ニトロピロール、6-(アザ)ピリミジン、2(アミノ)プリン、2,6-(ジアミノ)プリン、5置換ピリミジン、N2置換プリン、N6置換プリン、O6置換プリン、置換1,2,4-トリアゾール、ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、パラ置換-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、オルト置換-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、ビス-オルト置換-6-フェニル-ピロロ-���リミジン-2-オン-3-イル、パラ-(アミノアルキルヒドロキシ)-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、オルト-(アミノアルキルヒドロキシ)-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、ビス-オルト-(アミノアルキルヒドロキシ)-6-フェニル-ピロロ-ピリミジン-2-オン-3-イル、ピリドピリミジン-3-イル、2-オキソ-7-アミノ-ピリドピリミジン-3-イル、2-オキソ-ピリドピリミジン-3-イル、または任意のそのO-アルキル化またはN-アルキル化誘導体を含む。
【０１９２】
本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、改変されたヌクレオシドは、5-アザ-シチジン、プソイドイソシチジン、3-メチル-シチジン、N4-アセチルシチジン、5-ホルミルシチジン、N4-メチルシチジン、5-ヒドロキシメチルシチジン、1-メチル-プソイドイソシチジン、ピロロ-シチジン、ピロロ-プソイドイソシチジン、2-チオ-シチジン、2-チオ-5-メチル-シチジン、4-チオ-プソイドイソシチジン、4-チオ-1-メチル-プソイドイソシチジン、4-チオ-1-メチル-1-デアザ-プソイドイソシチジン、1-メチル-1-デアザ-プソイドイソシチジン、ゼブラリン、5-アザ-ゼブラリン、5-メチル-ゼブラリン、5-アザ-2-チオ-ゼブラリン、2-チオ-ゼブラリン、2-メトキシ-シチジン、2-メトキシ-5-メチル-シチジン、4-メトキシ-プソイドイソシチジン、および4-メトキシ-1メチル-プソイドイソシチジンを含む。
【０１９３】
本明細書に記載の組成物、方法およびキットの他の態様において、改変されたヌクレオシドは、2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、7-デアザ-アデニン、7-デアザ-8-アザ-アデニン、7-デアザ-2-アミノプリン、7-デアザ-8-アザ-2-アミノプリン、7-デアザ-2,6-ジアミノプリン、7-デアザ-8-アザ-2,6-ジアミノプリン、1-メチルアデノシン、N6-メチルアデノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、2-メチルチオ-N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、N6-グリシニルカルバモイルアデノシン、N6-トレオニルカルバモイルアデノシン、2-メチルチオ-N6-トレオニルカルバモイルアデノシン、N6,N6-ジメチルアデノシン、7-メチルアデニン、2-メチルチオ-アデニン、および2-メトキシ-アデニンを含む。
【０１９４】
本明細書に記載の組成物、方法およびキットの他の態様において、改変されたヌクレオシドは、イノシン、1-メチル-イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、7-デアザ-グアノシン、7-デアザ-8-アザ-グアノシン、6-チオ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-8-アザ-グアノシン、7-メチル-グアノシン、6-チオ-7-メチル-グアノシン、7-メチルイノシン、6-メトキシ-グアノシン、1-メチルグアノシン、N2-メチルグアノシン、N2,N2-ジメチルグアノシン、8-オキソ-グアノシン、7-メチル-8-オキソ-グアノシン、1-メチル-6-チオ-グアノシン、N2-メチル-6-チオ-グアノシン、およびN2,N2-ジメチル-6-チオ-グアノシンを含む。
【０１９５】
特定の態様において、例えば、タンパク質産生の正確なタイミングが望まれる場合には、細胞に導入された改変された核酸を細胞内で分解することが望ましい。したがって、本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、本明細書において、細胞内で直接的に作用することのできる、分解ドメインを含む、改変された核酸を提供する。
【０１９６】
改変されたヌクレオシドはまた、コンジュゲートした部分、例えばリガンドを含む、天然塩基を含む。本明細書において上記に考察されているように、改変されたヌクレオシドを含有するRNAは、宿主細胞内で翻訳可能でなければならない（すなわち、改変されたRNAによってコードされるポリペプチドの翻訳を妨げない）。例えば、s2Uおよびm6Aを含有する転写物は、ウサギ網状赤血球溶解液中では不十分にしか翻訳されないが、一方でプソイドウリジン、m5Uおよびm5Cは、効率的な翻訳と適合性がある。さらに、転写物のヌクレアーゼ抵抗性を高めるのに有用である2'-フルオロの修飾された塩基は、非常に非効率的な翻訳をもたらすことが当技術分野において知られている。翻訳は、例えばウサギ網状赤血球溶解液翻訳アッセイを使用して当業者によってアッセイされることができる。
【０１９７】
したがって、本明細書において、いくつかの局面において、CDKN1C、DNMT3B、EGR1、ETV6、EVI1、GATA2、GFI1B、GLIS2、HLF、HMGA2、HOXA5、HOXA9、HOXB3、HOXB4、HOXB5、IGF2BP2、IKZF2、KLF12、KLF4、KLF9、LMO2、MEIS1、MSI2、MYCN、NAP1L3、NDN、NFIX、NKX2-3、NR3C2、PBX1、PRDM16、PRDM5、RARB、RBBP6、RBPMS、RUNX1、RUNX1T1、SMAD6、TAL1、TCF15、VDR、ZFP37、ZFP467、ZFP521、ZFP532およびZFP612から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個またはそれ以上の造血幹細胞（HSC）誘導因子をコードする改変されたmRNA配列を含む、HSC誘導組成物を提供し、各々の改変mRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の改変mRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０１９８】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、PBX1、LMO2、PRDM5、ZFP37、MYCN、MSI2、NKX2-3、MEIS1およびRBPMSである。
【０１９９】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、ZFP37、PBX1、LMO2およびPRDM5である。
【０２００】
また、本明細書において、いくつかの局面において、HLFをコードする改変されたmRNA配列；RUNX1T1をコードする改変されたmRNA配列；ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；PBX1をコードする改変されたmRNA配列；LMO2をコードする改変されたmRNA配列；およびPRDM5をコードする改変されたmRNA配列を含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供し、各々の改変mRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の改変mRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０２０１】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、HSC誘導組成物はさらに、PRDM16をコードする改変されたmRNA配列；ZFP467をコードする改変されたmRNA配列；およびVDRをコードする改変されたmRNA配列の1つまたは複数を含み、各々の改変mRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の改変mRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０２０２】
本明細書において、いくつかの局面において、HLFをコードする改変されたmRNA配列；RUNX1T1をコードする改変されたmRNA配列；PBX1をコードする改変されたmRNA配列；LMO2をコードする改変されたmRNA配列；PRDM5をコードする改変されたmRNA配列；ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；MYCNをコードする改変されたmRNA配列；MSI2をコードする改変されたmRNA配列；NKX2-3をコードする改変されたmRNA配列；MEIS1をコードする改変されたmRNA配列；およびRBPMSをコードする改変されたmRNA配列を含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供し、各々の改変mRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の改変mRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０２０３】
また、本明細書において、ZFP467をコードする改変されたmRNA配列；PBX1をコードする改変されたmRNA配列；HOXB4をコードする改変されたmRNA配列；およびMSI2をコードする改変されたmRNA配列を含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供し、各々の改変mRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の改変mRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０２０４】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、HSC誘導組成物はさらに、HLFをコードする改変されたmRNA配列；LMO2をコードする改変されたmRNA配列；PRDM16をコードする改変されたmRNA配列；およびZFP37をコードする改変されたmRNA配列の1つまたは複数を含み、各々の改変mRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の改変mRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０２０５】
本明細書において、いくつかの局面において、MYCNをコードする改変されたmRNA配列；MSI2をコードする改変されたmRNA配列；NKX2-3をコードする改変されたmRNA配列；およびRUNX1T1をコードする改変されたmRNA配列を含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供し、各々の改変mRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の改変mRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０２０６】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、HSC誘導組成物はさらに、HOXB5をコードする改変されたmRNA配列；HLFをコードする改変されたmRNA配列；ZFP467をコードする改変されたmRNA配列；HOXB3をコードする改変されたmRNA配列；LMO2をコードする改変されたmRNA配列；PBX1をコードする改変されたmRNA配列；ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；およびZFP521をコードする改変されたmRNA配列の1つまたは複数を含み、各々の改変mRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の改変mRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０２０７】
本明細書において、いくつかの局面において、HOXB4をコードする改変されたmRNA配列；PBX1をコードする改変されたmRNA配列；LMO2をコードする改変されたmRNA配列；ZFP467をコードする改変されたmRNA配列；およびZFP521をコードする改変されたmRNA配列を含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供し、各々の改変mRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の改変mRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０２０８】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、HSC誘導組成物はさらに、KLF12をコードする改変されたmRNA配列；HLFをコードする改変されたmRNA配列；およびEGRをコードする改変されたmRNA配列の1つまたは複数を含み、各々の改変mRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の改変mRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０２０９】
また、本明細書において、MEIS1をコードする改変されたmRNA配列；RBPMSをコードする改変されたmRNA配列；ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；RUNX1T1をコードする改変されたmRNA配列；およびLMO2をコードする改変されたmRNA配列を含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供し、各々の改変mRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の改変mRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０２１０】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、HSC誘導組成物はさらに、KLF12をコードする改変されたmRNA配列；およびHLFをコードする改変されたmRNA配列の1つまたは複数を含み、各々の改変mRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の改変mRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０２１１】
また、本明細書において、ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；HOXB4をコードする改変されたmRNA配列；LMO2をコードする改変されたmRNA配列；およびHLFをコードする改変されたmRNA配列を含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供し、各々の改変mRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の改変mRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０２１２】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、HSC誘導組成物はさらに、MYCNをコードする改変されたmRNA配列；ZFP467をコードする改変されたmRNA配列；NKX2-3をコードする改変されたmRNA配列；PBX1をコードする改変されたmRNA配列；およびKLF4をコードする改変されたmRNA配列の1つまたは複数を含み、各々の改変mRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の改変mRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０２１３】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、改変されたシトシンは5-メチルシトシンであり、改変されたウラシルはプソイドウリジンである。
【０２１４】
本明細書に記載のHSC誘導因子をコードする改変されたmRNAは、"Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry," Beaucage, S.L. et al. (編), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA（これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載のような、当技術分野において十分に確立された方法によって合成および/または改変されることができる。本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、HSC誘導因子、例えばHLF、RUNX1T1、PBX1、LMO2、PRDM5、ZFP37、MYCN、MSI2、NKX2-3、MEIS1およびRBPMSをコードする改変されたmRNAは、2012年11月9日に出願されたPCT出願第PCT/US12/64359号に記載の、および米国特許第20120251618 A1号（その各々の内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載のような合成RNAを迅速かつ効率的に生成するための、IVT鋳型および構築物、ならびにその方法を使用して生成される。本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、HSC誘導因子、例えばHLF、RUNX1T1、PBX1、LMO2、PRDM5、ZFP37、MYCN、MSI2、NKX2-3、MEIS1およびRBPMSをコードする合成の改変されたRNAは、米国特許第20120251618 A1号に記載のように送達および製剤化される。
【０２１５】
当業者は、例えばウェスタンブロット技術または免疫細胞化学技術を使用して、合成の改変されたRNAによってコードされるポリペプチドの発現レベルを容易にモニタリングすることができる。合成の改変されたRNAは、該ポリペプチドの所望の発現レベルを可能とする頻度および用量で投与されることができる。各々の異なる改変mRNAを、適切な発現を可能とするその独自の用量および頻度で投与することができる。加えて、細胞に投与された改変RNAは一過性の性質であるので（すなわち経時的に分解される）、当業者は、さらなるトランスフェクションを止めること、および細胞が改変RNAを経時的に分解することを可能とすることによって、改変RNAの発現を容易に除去または停止させることができる。改変RNAは、細胞性mRNAと同じような様式で分解されるだろう。
【０２１６】
したがって、本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、HSC誘導因子をコードする複数の合成の改変されたRNAを、細胞、細胞集団、または細胞培養液に同時に接触させることができるか、あるいはそれに導入することができる。他の態様において、HSC誘導因子をコードする複数の合成の改変されたRNAを、細胞、細胞集団、または細胞培養液に別々に接触させることができるか、あるいはそれに導入することができる。加えて、HSC誘導因子をコードする各々の改変RNAを、その独自の投与計画に従って投与することができる。
【０２１７】
本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、HSC誘導因子をコードする改変されたRNAを、トランスフェクションまたはリポフェクションによって標的細胞に導入することができる。トランスフェクションまたはリポフェクションに適した作用物質には、例えば、リン酸カルシウム、DEAEデキストラン、リポフェクチン、リポフェクタミン、DIMRIE C（商標）、Superfect（商標）、およびEffectin（商標）（Qiagen（商標））、unifectin（商標）、maxifectin（商標）、DOTMA、DOGS（商標）（トランスフェクタム；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）、DOPE（1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）、DOTAP（1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン）、DDAB（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、DHDEAB（N,N-ジ-n-ヘキサデシル-N,N-ジヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、HDEAB（N-n-ヘキサデシル-N,N-ジヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ポリブレン、ポリ(エチレンイミン)（PEI）などが挙げられる（例えば、Banerjee et al., Med. Chem. 42:4292-99 (1999); Godbey et al., Gene Ther. 6:1380-88 (1999); Kichler et al., Gene Ther. 5:855-60 (1998); Birchaa et al., J. Pharm. 183:195-207 (1999)を参照のこと）。
【０２１８】
いくつかの態様において、改変されたRNAは、陽イオン性脂質担体（例えばOLIGOFECTAMINE（商標））または非陽イオン性脂質に基づいた担体（例えばTransit-TKOTM（商標）, Mirus Bio LLC, Madison, WI）との複合体として標的細胞にトランスフェクトすることができる。
【０２１９】
本明細書に記載の局面のいくつかの態様において、合成の改変されたRNAは、トランスフェクション試薬を使用して細胞に導入される。いくつかの例示的なトランスフェクション試薬には、例えば、陽イオン性脂質、例えばリポフェクチン（Junichi et al, 米国特許第5,705,188号）、陽イオン性グリセロール誘導体、およびポリカチオン性分子、例えばポリリジン（Lollo et al.、PCT出願第WO 97/30731号）が挙げられる。市販のトランスフェクション試薬の例は当業者には公知である。
【０２２０】
他の態様において、「デンドリマー」と呼ばれる高度に分岐した有機化合物を使用して、外来性核酸、例えば本明細書に記載の合成の改変されたRNAに結合させ、それを細胞内に導入することができる。
【０２２１】
本明細書に記載の局面の他の態様において、非化学的なトランスフェクション法が考えられる。このような方法には、当業者には公知であるような、電気穿孔法、ソノポレーション、遺伝子銃の使用、マグネトフェクション、およびインペールフェクションなどが挙げられるがそれらに限定されるわけではない。他の作用物質、例えばグリコール、例えばエチレングリコールおよびプロピレングリコール、ピロール、例えば2-ピロール、アゾン、およびテルペン、例えばリモネンおよびメントンを使用して、投与された核酸の浸透を増強させ得る。
【０２２２】
本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、HSC誘導因子をコードする改変されたRNAは、1つまたは複数の浸透増強剤、界面活性剤および/またはキレート剤と共に製剤化される。適切な界面活性剤には、脂肪酸および/またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸および/またはその塩が挙げられる。いくつかの態様において、例えば胆汁酸/塩と脂肪酸/塩の組合せなどの、浸透増強剤の組合せが使用される。1つの例示的な組合せは、ラウリン酸のナトリウム塩、カプリン酸、およびUDCAである。さらなる浸透増強剤には、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン-20-セチルエーテルが挙げられる。
【０２２３】
本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、HSC誘導因子をコードする改変されたRNAは、持続放出剤形をはじめとする多くの可能な投与剤形のいずれかへと製剤化される。本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、HSC誘導因子をコードする複数の異なる合成の改変されたRNAを含む製剤は、まず複数の異なる合成の改変されたRNAの全てのメンバーを混合し、その後、複数の異なる合成の改変されたRNAを含む混合物を、所望のリガンドまたは標的指向部分、例えば脂質と複合体化させることによって調製される。該組成物は、水性媒体、非水性媒体または混合媒体中の懸濁液として製剤化されることができる。水性懸濁液はさらに、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび/またはデキストランを含むことができる。該懸濁液はまた、安定化剤も含むことができる。
【０２２４】
本明細書に記載の組成物は、合成の改変されたRNAの送達のためにエマルションとして調製および製剤化されることができる。エマルションは、分散相、および活性薬物（すなわち合成の改変されたRNA）（これは水相もしくは油相中の溶液として、またはそれ自体別個の相として存在し得る）に加え、さらなる構成要素を含み得る。薬学的賦形剤、例えば乳化剤、安定化剤、色素、および抗酸化剤も、必要に応じてエマルションに存在することができる。エマルションはまた、例えば油中水中油滴型（o/w/o）および水中油中水滴型（w/o/w）エマルションの場合、2つを超える相を含む多重エマルションであることができる。乳化剤は、広く4つのカテゴリーに分類され得る：合成界面活性剤、天然の乳化剤、吸着基剤、および微分散された固体（例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199を参照のこと）。
【０２２５】
本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、HSC誘導因子をコードする改変されたRNAは、ナノ粒子に封入されることができる。ナノ粒子パッケージング法は、当技術分野において周知であり、例えば、Bose S, et al (Role of Nucleolin in Human Parainfluenza Virus Type 3 Infection of Human Lung Epithelial Cells. J. Virol. 78:8146. 2004); Dong Y et al. Poly(d,l-lactide-co-glycolide)/montmorillonite nanoparticles for oral delivery of anticancer drugs. Biomaterials 26:6068. 2005); Lobenberg R. et al (Improved body distribution of 14C-labelled AZT bound to nanoparticles in rats determined by radioluminography. J Drug Target 5:171.1998); Sakuma S R et al (Mucoadhesion of polystyrene nanoparticles having surface hydrophilic polymeric chains in the gastrointestinal tract. Int J Pharm 177:161. 1999); Virovic L et al. Novel delivery methods for treatment of viral hepatitis: an update. Expert Opin Drug Deliv 2:707.2005);およびZimmermann E et al, Electrolyte- and pH-stabilities of aqueous solid lipid nanoparticle (SLN) dispersions in artificial gastrointestinal media. Eur J Pharm Biopharm 52:203. 2001)（この内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。
【０２２６】
iHSCは、核酸（DNAまたはRNA）またはアミノ酸配列の形態でのHSC誘導因子の送達によって生成され得ることが理解されているが、本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、iHSC誘導は、他の方法、例えば、1つまたは複数のHSC誘導因子の発現を誘導する小分子または小分子混液などの作用物質を用いた細胞の処理などを使用して誘導されることができる。
【０２２７】
本明細書において使用する「作用物質」という用語は、例えば、小分子、核酸、ポリペプチド、ペプチド、薬物、イオンなどであるがそれらに限定されるわけではない、任意の化合物または物質を意味する。「作用物質」は、合成および天然のタンパク質性および非タンパク質性実体を含むがそれらに限定されるわけではない、任意の化学物質、実体、または部分であることができる。いくつかの態様において、作用物質は、核酸、核酸類似体、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマー、核酸のオリゴマー、アミノ酸、または炭水化物（例えば、タンパク質を含むがそれらに限定されるわけではない）、オリゴヌクレオチド、リボザイム、DNAザイム、糖タンパク質、siRNA、リポタンパク質、アプタマー、ならびにその改変物および組合せなどである。いくつかの態様において、核酸はDNAまたはRNA、および核酸類似体であり、例えばPNA、pcPNAおよびLNAであることができる。核酸は一本鎖または二本鎖であることができ、関心対象のタンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、PNAなどを含む群から選択されることができる。このような核酸配列は、例えば、転写リプレッサー、アンチセンス分子、リボザイムとして作用するタンパク質をコードする核酸配列、低分子阻害性核酸配列（例えば、RNAi、shRNAi、siRNA、マイクロRNAi（mRNAi）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどであるがそれらに限定されるわけではない）を含むがそれらに限定されるわけではない。タンパク質および/またはペプチド作用物質またはそのフラグメントは、例えば突然変異タンパク質；治療用タンパク質；切断短縮タンパク質であるがそれらに限定されるわけではない、関心対象の任意のタンパク質であることができ、該タンパク質は、通常、細胞内に存在しないか、または低レベルで発現されている。関心対象のタンパク質は、突然変異タンパク質、遺伝子操作されたタンパク質、ペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、キメラタンパク質、抗体、ヒト化タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、改変タンパク質およびそのフラグメントを含む群から選択されることができる。
【０２２８】
また、本明細書において、いくつかの局面において、本明細書に記載のHSC誘導因子の特定の組合せ、例えばCDKN1C、DNMT3B、EGR1、ETV6、EVI1、GATA2、GFI1B、GLIS2、HLF、HMGA2、HOXA5、HOXA9、HOXB3、HOXB4、HOXB5、IGF2BP2、IKZF2、KLF12、KLF4、KLF9、LMO2、MEIS1、MSI2、MYCN、NAP1L3、NDN、NFIX、NKX2-3、NR3C2、PBX1、PRDM16、PRDM5、RARB、RBBP6、RBPMS、RUNX1、RUNX1T1、SMAD6、TAL1、TCF15、VDR、ZFP37、ZFP467、ZFP521、ZFP532およびZFP612から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、またはそれ以上のHSC誘導因子をコードする1つもしくは複数の発現ベクターまたは1つもしくは複数の改変mRNA配列を使用して、誘導造血幹細胞を作製、調製、または生成する方法を提供する。
【０２２９】
したがって、本明細書において、いくつかの局面において、
a．HLFをコードする核酸配列；RUNX1T1をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；およびPRDM5をコードする核酸配列を含む1つもしくは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程（各々の該核酸配列はプロモーターに機能的に連結されている）；および
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、それにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【０２３０】
本明細書に記載のこれらの方法および全てのこのような方法のいくつかの態様において、工程（a）の形質導入はさらに、PRDM16をコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；およびVDRをコードする核酸配列の1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターを含む。
【０２３１】
また、本明細書において、いくつかの局面において、
a．HLFをコードする核酸配列；RUNX1T1をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；PRDM5をコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；MYCNをコードする核酸配列；MSI2をコードする核酸配列；NKX2-3をコードする核酸配列；MEIS1をコードする核酸配列；およびRBPMSをコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程（各々の該核酸配列はプロモーターに機能的に連結されている）；および
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、それにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【０２３２】
また、本明細書において、いくつかの局面において、
a．ZFP467をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；HOXB4をコードする核酸配列；およびMSI2をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程（各々の該核酸配列はプロモーターに機能的に連結されている）；および
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、それにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【０２３３】
本明細書に記載のこれらの方法および全てのこのような方法のいくつかの態様において、工程（a）の形質導入はさらに、HLFをコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；PRDM16をコードする核酸配列；およびZFP37をコードする核酸配列の1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターを含む。
【０２３４】
また、本明細書において、いくつかの局面において、
a．MYCNをコードする核酸配列；MSI2をコードする核酸配列；NKX2-3をコードする核酸配列；およびRUNX1T1をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程（各々の該核酸配列はプロモーターに機能的に連結されている）；および
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、それにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【０２３５】
本明細書に記載のこれらの方法および全てのこのような方法のいくつかの態様において、工程（a）の形質導入はさらに、HOXB5をコードする核酸配列；HLFをコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；HOXB3をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；およびZFP521をコードする核酸配列の1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターを含む。
【０２３６】
また、本明細書において、いくつかの局面において、
a．HOXB4をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；およびZFP521をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程（各々の該核酸配列はプロモーターに機能的に連結されている）；および
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、それにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【０２３７】
本明細書に記載のこれらの方法および全てのこのような方法のいくつかの態様において、工程（a）の形質導入はさらに、KLF12をコードする核酸配列；HLFをコードする核酸配列；およびEGR1をコードする核酸配列の1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターを含む。
【０２３８】
また、本明細書において、いくつかの局面において、
a．MEIS1をコードする核酸配列；RBPMSをコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；RUNX1T1をコードする核酸配列；およびLMO2をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程（各々の該核酸配列はプロモーターに機能的に連結されている）；および
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、それにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【０２３９】
本明細書に記載のこれらの方法および全てのこのような方法のいくつかの態様において、工程（a）の形質導入はさらに、KLF12をコードする核酸配列；およびHLFをコードする核酸配列の1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターを含む。
【０２４０】
本明細書において、いくつかの局面において、
a．ZFP37をコードする核酸配列；HOXB4をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；およびHLFをコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程（各々の該核酸配列はプロモーターに機能的に連結されている）；および
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、それにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【０２４１】
本明細書に記載のこれらの方法および全てのこのような方法のいくつかの態様において、工程（a）の形質導入はさらに、KLF12をコードする核酸配列；およびHLFをコードする核酸配列の1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターを含む。
【０２４２】
また、本明細書において、いくつかの局面において、
a．ZFP37をコードする核酸配列；HOXB4をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；およびHLFをコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程（各々の該核酸配列はプロモーターに機能的に連結されている）；および
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、それにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【０２４３】
本明細書に記載のこれらの方法および全てのこのような方法のいくつかの態様において、工程（a）の形質導入はさらに、MYCNをコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；NKX2-3をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；およびKLFをコードする核酸配列の1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターを含む。
【０２４４】
また、本明細書において、いくつかの局面において、
a．CDKN1C、DNMT3B、EGR1、ETV6、EVI1、GATA2、GFI1B、GLIS2、HLF、HMGA2、HOXA5、HOXA9、HOXB3、HOXB4、HOXB5、IGF2BP2、IKZF2、KLF12、KLF4、KLF9、LMO2、MEIS1、MSI2、MYCN、NAP1L3、NDN、NFIX、NKX2-3、NR3C2、PBX1、PRDM16、PRDM5、RARB、RBBP6、RBPMS、RUNX1、RUNX1T1、SMAD6、TAL1、TCF15、VDR、ZFP37、ZFP467、ZFP521、ZFP532およびZFP612から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、またはそれ以上のHSC誘導因子をコードする1つまたは複数の改変mRNAを体細胞に繰り返しトランスフェクトする工程であって、各々の改変mRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の改変mRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである、工程
b．トランスフェクトされた体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、それにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【０２４５】
本明細書に記載のこれらの方法および全てのこのような方法のいくつかの態様において、工程（a）の少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、PBX1、LMO2、PRDM5、ZFP37、MYCN、MSI2、NKX2-3、MEIS1およびRBPMSである。
【０２４６】
本明細書に記載のこれらの方法および全てのこのような方法のいくつかの態様において、工程（a）の少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、ZFP37、PBX1、LMO2およびPRDM5である。いくつかのこのような態様において、工程（a）の少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子はさらに、PRDM16；ZFP467；およびVDRの1つまたは複数を含む。
【０２４７】
本明細書に記載のこれらの方法および全てのこのような方法のいくつかの態様において、工程（a）の少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、HLF；RUNX1T1；PBX1；LMO2；PRDM5；ZFP37；MYCN；MSI2；NKX2-3；MEIS1；およびRBPMSである。
【０２４８】
本明細書に記載のこれらの方法および全てのこのような方法のいくつかの態様において、工程（a）の少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、ZFP467；PBX1；HOXB4；およびMSI2である。いくつかのこのような態様において、工程（a）の少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子はさらに、HLF；LMO2；PRDM16；およびZFP37の1つまたは複数を含む。
【０２４９】
本明細書に記載のこれらの方法および全てのこのような方法のいくつかの態様において、工程（a）の少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、MYCN；MSI2；NKX2-3；およびRUNX1T1である。いくつかのこのような態様において、工程（a）の少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子はさらに、HOXB5；HLF；ZFP467；HOXB3；LMO2；PBX1；ZFP37；およびZFP521の1つまたは複数を含む。
【０２５０】
本明細書に記載のこれらの方法および全てのこのような方法のいくつかの態様において、工程（a）の少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、HOXB4；PBX1；LMO2；ZFP467；およびZFP521である。いくつかのこのような態様において、工程（a）の少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子はさらに、KLF12；HLF；およびEGRの1つまたは複数を含む。
【０２５１】
本明細書に記載のこれらの方法および全てのこのような方法のいくつかの態様において、工程（a）の少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、MEIS1；RBPMS；ZFP37；RUNX1T1；およびLMO2である。いくつかのこのような態様において、工程（a）の少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子はさらに、KLF12；およびHLFの1つまたは複数を含む。
【０２５２】
本明細書に記載のこれらの方法および全てのこのような方法のいくつかの態様において、工程（a）の少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、ZFP37；HOXB4；LMO2；およびHLFである。いくつかのこのような態様において、工程（a）の少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子はさらに、MYCN；ZFP467；NKX2-3；PBX1；およびKLF4の1つまたは複数を含む。
【０２５３】
本明細書に記載の組成物、方法およびキットを使用して、細胞に導入されたかまたは細胞集団に誘導されたHSC誘導因子の発現の検出は、例えば、ウェスタンブロット分析、免疫細胞化学法、および蛍光により媒介される検出を含む、当業者に公知のいくつかの技術のいずれかによって達成されることができる。
【０２５４】
HSC誘導因子の所与の組合せがiHSCまたは他の方向付けられた前駆細胞を生成したかどうかを識別するために、1つまたは複数のHSC活性またはパラメーター、例えばいくつかの態様において、表面抗原の差次的発現を測定することができる。本明細書に記載の組成物、方法およびキットを使用した誘導HSCの生成は、好ましくは、内因性HSCに特徴的な細胞表面表現型の出現、例えば、系列マーカー陰性、Sca1陰性、cKit陽性（またはLSK細胞）、CD34陰性、Flk2陰性、CD48陰性、およびCD150陽性、またはCD150+CD48-CD244-などを引き起こす。
【０２５５】
HSCは、方向付けられた前駆細胞から、その機能的な挙動によって最も確実に識別される。HSC表現型の機能的局面、または造血幹細胞の活性、例えばHSCがレシピエントにおいて長期の多系列の再構築を生じることができる能力は、当技術分野において公知の慣用的な方法を使用して、本明細書において例えば実施例および図面、すなわち図1〜57Cに記載のように、当業者によって容易に決定されることができる。本明細書に記載の局面のいくつかの態様において、初期化因子を同定するための機能的アッセイを使用することができる。例えば、いくつかの態様において、メチルセルロース中のコロニー形成細胞（CFC）活性を使用して、該組成物、方法およびそのキットを使用して生成されたiHSCの多系列（顆粒球、マクロファージ、巨核球、および赤血球）能を確認することができる。連続的なプレーティングを使用して、本明細書に記載の組成物、方法およびキットを使用して生成されたiHSCの自己複製能を確認することができる。本明細書に記載の組成物、方法およびキットを使用して生成されたiHSCのリンパ球系能は、OP9およびOP9デルタ間質細胞上で形質導入された細胞を培養し、その後、14日目にそれぞれB細胞およびT細胞について免疫染色することによって評価されることができる。
【０２５６】
本明細書において使用する「細胞パラメーター」、「HSCパラメーター」または「造血幹細胞活性」は、内因性または天然のHSCの測定可能な構成要素または品質、特に正確に測定することのできる構成要素を指す。細胞パラメーターは、細胞の表現型、機能または挙動に関連した任意の測定可能なパラメーターであることができる。このような細胞パラメーターは、HSCまたはHSC集団の特徴およびマーカーの変化を含み、これには、生存の変化、細胞増殖の変化、マーカー（例えば細胞表面決定基、例えばレセプター）の1つもしくは複数または組合せの発現の変化、タンパク質（その構造的修飾または翻訳後修飾を含む）、脂質、糖鎖、有機もしくは無機分子、核酸、例えばmRNA、DNAの発現の変化、全体的な遺伝子発現パターンの変化などが含まれるがそれらに限定されるわけではない。このような細胞パラメーターは、当業者に公知の様々なアッセイのいずれかを使用して測定されることができる。例えば、生存および細胞増殖は、トリパンブルー色素排除、CFSE希釈法、および3H取り込みなどのアッセイによって測定されることができる。タンパク質またはポリペプチドマーカーの発現は、例えば、フローサイトメトリーアッセイ、ウェスタンブロット技術、または顕微鏡法を使用して測定されることができる。遺伝子発現プロファイルは、例えば、マイクロアレイ法および定量的または半定量的なリアルタイムPCRアッセイを使用してアッセイされることができる。細胞パラメーターはまた、機能的パラメーターまたは機能的活性も指すことができる。殆どの細胞パラメーターが、定量的な解読値を与えるが、いくつかの場合においては、半定量的または定性的な結果が許容されることができる。解読値は単一の決定値を含むことができ、または、平均値、中央値もしくは分散値などを含むことができる。特徴的には、同じアッセイの多様性から各パラメーターについてパラメーター解読値の範囲を得ることができる。ばらつきが予想され、単一の値を与えるために使用される一般的な統計学的方法と共に標準的な統計学的方法を使用して、各組の試験パラメーターについて数値の範囲が得られる。
【０２５７】
本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、追加の因子を使用して、HSC初期化を増強することができる。例えば、エピジェネティックな経路を改変する作用物質を使用して、iHSCへの初期化を促進することができる。
【０２５８】
本質的には、今回記載された組成物、方法およびキットに従って、iHSCを産生するためにまたは体細胞をiHSCに初期化するために任意の初代体細胞型を使用することができる。このような初代体細胞型はまた、他の幹細胞型、例えば多能性幹細胞、例えば人工多能性幹細胞（iPS細胞）；他の複能性幹細胞；少能性幹細胞；および（5）単能性幹細胞も含む。本明細書に記載の方法の様々な局面および態様において有用である初代体細胞のいくつかの非限定的な例には、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、脂肪細胞、心臓細胞、骨格筋細胞、造血細胞または免疫細胞、肝細胞、脾臓細胞、肺細胞、循環血液細胞、消化管細胞、腎細胞、骨髄細胞、および膵臓細胞、並びに、そのような細胞が由来する幹細胞が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。該細胞は、脾臓、骨髄、血液、脳、肝臓、肺、腸管、胃、腸、脂肪、筋肉、子宮、皮膚、脾臓、内分泌器官、骨などを含むがそれらに限定されるわけではない、あらゆる体細胞組織から単離された初代細胞であることができる。「体細胞」という用語はさらに、いくつかの態様において、培養液中において増殖された初代細胞を包含し、ただし該体細胞は不死化されていない。該細胞がインビトロの条件下で維持される場合、慣用的な組織培養条件および方法を使用することができ、これは当業者には公知である。様々な初代体細胞のための単離法および培養法は、十分に当業者の能力範囲内である。
【０２５９】
本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、iHSC細胞に初期化されるまたはiHSC細胞にされる体細胞は、造血系起源の細胞である。本明細書において使用する「造血系由来細胞」、「造血系由来分化細胞」、「造血系列細胞」、および「造血系起源の細胞」という用語は、複能性の造血幹細胞（HSC）から得られたまたは分化された細胞を指す。したがって、本明細書に記載の組成物、方法およびキットと共に使用するための造血系列細胞は、複能性、少能性および系列の限定された造血前駆細胞、顆粒球（例えば前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球）、赤血球（例えば網状赤血球、赤血球）、血小板（thrombocyte）（例えば巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板（platelet））、単球（例えば単球、マクロファージ）、樹状細胞、およびリンパ球（例えばT細胞レセプター（TCR）を有するTリンパ球、免疫グロブリンを発現し抗体を産生するBリンパ球またはB細胞、NK細胞、NKT細胞、および自然リンパ球））を含む。本明細書において使用する「造血前駆細胞」という用語は、顆粒球、単球、赤血球、巨核球、ならびにリンパ球B細胞およびT細胞を含むがそれらに限定されるわけではない、造血系の2つ以上の細胞型へと分化することのできる、複能性、少能性、および系列の限定された造血細胞を指す。造血前駆細胞は、複能性前駆細胞（MPP）、骨髄球系共通前駆細胞（CMP）、リンパ球系共通前駆細胞（CLP）、顆粒球・単球前駆細胞（GMP）、およびプレ巨核球・赤血球系前駆細胞を包含する。系列の限定された造血前駆細胞は、巨核球・赤血球系前駆細胞（MEP）、プロB細胞、プレB細胞、プレプロB細胞、プロT細胞、ダブルネガティブT細胞、プロNK細胞、プロ樹状細胞（プロDC）、プレ顆粒球/マクロファージ細胞、顆粒球/マクロファージ前駆（GMP）細胞、およびプロ肥満細胞（プロMC）を含む。造血系列の分化チャートを図1に提供する。
【０２６０】
本明細書に記載の組成物、方法およびキットに使用するための造血系起源の細胞は、これらの細胞を含むことが知られる任意の起源、例えば胎仔組織、臍帯血、骨髄、末梢血、動員末梢血、脾臓、肝臓、胸腺、リンパなどから得ることができる。これらの起源から得られた細胞を、本明細書に記載のiHSCを作製するための組成物、方法およびキットと共に使用する前に、エクスビボにおいて当業者に許容される任意の方法を使用して増殖させることができる。例えば、細胞を、選別、分画、処理して、特定の細胞型を除去することができるか、または別様に操作して、当業者に許容される任意の手順を使用して本明細書に記載の方法に使用するための細胞集団を得ることができる。単核リンパ球は、例えば、米国特許第4,690,915号に記載の連続フローセル分離機を使用した反復リンパ球フェレーシスによって回収され得るか、あるいは、リンパ球系共通前駆細胞（CLP）r法のアフィニティ精製工程、例えばサイトメーターを使用したフローサイトメトリー、抗体もしくはタンパク質コーティングビーズを使用した磁気分離、アフィニティクロマトグラフィー、または固相支持体アフィニティ分離（細胞は、特定のタンパク質またはタンパク質の型のその発現または発現の欠失に応じて基剤に保持される）、または関心対象の細胞型によって特異的に発現される1つもしくは複数の表面抗原に対する1つまたは複数の抗体を使用したバッチ精製を使用して単離され得る。造血系起源の細胞はまた、末梢血からも得ることができる。末梢血から細胞を収集する前に、対象を、サイトカイン、例えば顆粒球・コロニー刺激因子を用いて処理し、骨髄から血液区画への細胞遊走を促進することができる、ならびに/または関心対象の集団の活性化および/もしくは増殖を促進することができる。例えば表面タンパク質を同定するのに適した任意の方法を使用して、異種集団から造血系起源の細胞を単離することができる。いくつかの態様において、造血系起源の細胞のクローン集団、例えばリンパ球が得られる。いくつかの態様において、造血系起源の細胞はクローン集団ではない。
【０２６１】
さらに、本明細書に記載の組成物、方法およびキットの様々な局面および態様に関して、体細胞は、あらゆる哺乳動物種から得ることができ、その非限定的な例には、マウス、ウシ、サル、ブタ、ウマ、ヒツジ、またはヒトの細胞が挙げられる。いくつかの態様において、体細胞はヒト細胞である。いくつかの態様において、該細胞は非ヒト生物、例えば非ヒト哺乳動物に由来する。
【０２６２】
一般的に、本明細書に記載のiHSCを作製するための方法は、当業者に利用可能でかつ周知である任意の培養培地中において、体細胞、例えば造血系起源の細胞を培養または増殖させることを含む。このような培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（登録商標）（DMEM）、DMEM F12培地（登録商標）、イーグル最小必須培地（登録商標）、F-12K培地（登録商標）、イスコフ改変ダルベッコ培地（登録商標）、RPMI-1640培地（登録商標）、ならびに前駆細胞の培養および増殖のための無血清培地SFEM（登録商標）が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。多くの培地がまた、ナトリウムを含むまたは含まない低グルコース調合物として利用可能である。本明細書に記載の方法と共に使用される培地には、いくつかの態様において、1つまたは複数の増殖因子が補充されることができる。一般的に使用される増殖因子には、骨形態形成タンパク質、塩基性線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子および上皮増殖因子、幹細胞因子、およびトロンボポエチンが挙げられるがそれらに限定されるわけではない。例えば、米国特許第7,169,610号；第7,109,032号；第7,037,721号；第6,617,161号；第6,617,159号；第6,372,210号；第6,224,860号；第6,037,174号；第5,908,782号；第5,766,951号；第5,397,706号；および第4,657,866号（これらは全て、無血清培地中における細胞の増殖を教義するために、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）を参照のこと。
【０２６３】
例えば、本明細書に記載のように、マウス造血細胞の初代培養液を、形質導入過程の間、エクスビボで合計で3日間保持した。細胞を、5％CO2 37℃インキュベーター中の、20ng/μLのIL-12、TPO、SCF、5ng/μLのIL-7、2ng/μLのFLK-3、および100ng/mlのペニシリン/ストレプトマイシンの補充された最小増殖S-クローン培地中に維持した。濃縮され力価測定されたウイルスを用いての形質導入をいくつかの態様において16時間実施し、その後、いくつかの態様においてドキシサイクリンと共に24時間のインキュベーションを実施した。この時点でZsGr+細胞を再度選別し、CFCアッセイまたはインビボでの移植にかけた。ドキシサイクリンによる誘導は、いくつかの態様において、移植後2週間の間維持されることができる。いくつかの態様において、誘導性発現ベクターを使用する場合、ドキシサイクリンなどの誘導物質を、誘導されたiHSC集団の対象への移植後、少なくとも1日間、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間、少なくとも7日間、または1週間、少なくとも10日間、少なくとも2週間、またはそれ以上維持することができる。
【０２６４】
培養液中の細胞は、例えば、懸濁液中において、または固相支持体（例えば細胞外マトリックス構成要素）に付着させてもしくはフィーダー細胞上にプレーティングさせて維持することができる。本明細書に記載の方法に使用される細胞は、いくつかの態様において、固相支持体へのその付着を助ける追加の因子、例えば、I型およびII型コラーゲン、硫酸コンドロイチン、フィブロネクチン、「スーパーフィブロネクチン」、ならびにフィブロネクチン様ポリマー、ゼラチン、ポリ-Dおよびポリ-L-リジン、トロンボスポンジン、ならびにビトロネクチンを必要とすることができる。いくつかの態様において、該細胞は、懸濁培養液中における増殖に適している。懸濁液に適格な宿主細胞は、一般的に、単分散されているか、または、実質的に凝集することなく緩い凝集体で増殖する。懸濁液に適格な宿主細胞は、適合化または操作することなく懸濁液中での培養に適した細胞（例えば、造血系起源の細胞、例えばリンパ球系細胞）、および、付着依存性細胞の改変または適応によって懸濁液に適格となった細胞（例えば上皮細胞、線維芽細胞）を含む。
【０２６５】
また、本明細書において、いくつかの局面において、本明細書に記載のHSC誘導組成物のいずれかまたはiHSC調製法を使用して産生された、単離された誘導造血幹細胞（iHSC）を提供する。
【０２６６】
また、本明細書において、いくつかの局面において、本明細書に記載のHSC誘導組成物のいずれかまたはiHSC調製法を使用して産生された、複数の誘導造血幹細胞（iHSC）を含む細胞クローンを提供する。
【０２６７】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、単離された誘導造血幹細胞（iHSC）またはその細胞クローンはさらに、それを必要とする対象への投与のための薬学的に許容される担体を含む。
【０２６８】
また、本明細書において、いくつかの局面において、1つまたは複数の造血細胞系列が欠損しているまたは欠陥のある疾病または障害のための処置を必要とする対象を処置する方法であって、本明細書に記載のHSC誘導組成物およびiHSC調製法を使用するか、または、本明細書に記載の任意のHSC誘導因子の組合せ、HSC誘導組成物、もしくはiHSC調製法を使用して産生された単離された誘導造血幹細胞（iHSC）およびその細胞クローンを使用する方法を提供する。このような処置法において、体細胞、例えば線維芽細胞または造血系列細胞をまず、対象から単離することができ、単離された細胞を、本明細書に記載のように、それぞれ発現ベクターまたは合成mRNAを含むHSC誘導組成物を用いて形質導入またはトランスフェクトすることができる。本明細書に記載の任意のHSC誘導因子の組合せ、HSC誘導組成物、もしくはiHSC調製法を使用して産生された、単離された誘導造血幹細胞（iHSC）およびその細胞クローンを、その後、対象に、例えば対象へのiHSCの全身注射を介して投与することができる。
【０２６９】
本明細書に記載の組成物、方法およびキットを使用して生成された初期化されたiHSCを、本明細書に記載の処置法のいくつかの態様において、細胞療法もしくは再生医療適用を必要とする対象において直接使用または投与することができるか、あるいは、他の態様において、細胞療法もしくは再生医療適用を必要とする対象に使用または投与するための他の造血細胞型へと再分化させることができる。したがって、本明細書に記載の方法の様々な態様は、本明細書に記載の任意の組成物、方法およびキットを使用して生成されたiHSCまたはiHSC集団の有効量を、細胞療法を必要とする個体または対象に投与することを含む。投与される細胞または細胞集団は、自己集団であり得るか、または1つもしくは複数の異種起源から得ることができる。さらに、このようなiHSCまたはiHSCから分化した細胞を、目的の組織部位への移植を可能とし、かつ機能的に欠陥のある領域を再構築または再生することを可能とする様式で、投与することができる。いくつかのこのような態様において、iHSCを、足場または例えば組織をエクスビボで生成する他の構造に導入して、その後それを患者に導入することができる。
【０２７０】
細胞を対象に投与するための様々な手段が当業者には公知である。このような方法は、全身注射、例えば静脈内注射、または、対象の標的部位への細胞の移植を含むことができる。細胞を、対象への注射または移植による導入を促進する送達装置に挿入し得る。このような送達装置は、レシピエント対象の身体への細胞および液体の注射のための、チューブ、例えばカテーテルを含むことができる。1つの好ましい態様において、チューブはさらに例えば針を有し、それを通して該細胞を、対象の所望の場所に導入することができる。該細胞は、様々な異なる形態での送達のために調製されることができる。例えば、該細胞は、溶液もしくはゲル中に懸濁されることができるか、または、このような送達装置に含まれる場合には支持体マトリックスに包埋されることができる。細胞を、細胞がその中で生存可能な状態のままでいる薬学的に許容される担体または希釈剤と混合することができる。
【０２７１】
したがって、本明細書に記載の方法によって産生される細胞を使用して、造血幹細胞の移植が1つの効果的な処置法であることが判明した少なくとも以下の疾病および病態を処置または軽減するための細胞を調製することができる：白血病、例えば急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、骨髄異形成／骨髄増殖性症候群、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、および他の白血病；リンパ増殖性疾患、例えば形質細胞障害、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、および他のリンパ腫；固形腫瘍、例えば神経芽細胞腫、胚細胞癌、乳癌、およびユーイング肉腫；非悪性障害、例えば骨髄不全、異常ヘモグロビン症、免疫不全、遺伝性代謝障害、および自己免疫疾患。
【０２７２】
上記に加えて、本発明の方法は、以下の疾病および病態の処置に使用することができる：特発性骨髄化生（骨髄線維症）；再生不良性貧血；後天性赤血球ろう；アスパルチルグルコサミン症；毛細血管拡張性運動失調症；絨毛癌；慢性リンパ性白血病（CLL）；慢性骨髄性白血病（CML）；分類不能型免疫不全症：慢性閉塞性肺疾患；線維形成性小円細胞腫瘍；ダイヤモンド・ブラックファン貧血；ディジョージ症候群；本態性血小板血症；血液学的ユーイング肉腫；フコシドーシス；ゴーシェ病；Griscelli症候群；血球貪食性リンパ組織球症（HLH）；ホジキン病；ヒト免疫不全ウイルス（HIV）；ヒトT細胞白血球ウイルス（HTLV）；ハンター症候群（MPS II、硫酸イズロニダーゼ欠損症）；ハーラー症候群（MPS I H、α-L-イズロニダーゼ欠損症）；小児性神経セロイドリポフスチン沈着症（INCL、サンタヴォリ病）；ヤンスキー・ビールショースキー病（遅発型小児性神経セロイドリポフスチン沈着症）；若年性骨髄単球性白血病（JMML）；コストマン症候群；クラッベ病（グロボイド細胞白質ジストロフィー）；マトロー・ラミー症候群（MPS VI）；異染性白質ジストロフィー；モルキオ症候群（MPS IV）；ムコリピドーシスII（I細胞病）；多発性骨髄腫；脊髄形成異常症；神経芽細胞腫；NF-κ-B必須モジュレーター（NEMO）欠損症；ニーマン・ピック病；非ホジキンリンパ腫；発作性夜間血色素尿症（PNH）；形質細胞性白血病；真性多血症；放射能中毒；サンフィリポ症候群（MPS III）；全ての型の重症複合免疫不全症（SCID）；シュワックマン・ダイヤモンド症候群；鎌状赤血球症；スライ症候群（MPS VII）；地中海貧血症；ウィルムス腫瘍；ウィスコット・アルドリッチ症候群；ウォルマン病（酸性リパーゼ欠損症）；およびX連鎖リンパ増殖性疾患。
【０２７３】
薬学的に許容される担体および希釈剤には、食塩水、水性緩衝液、溶媒および/または分散媒体が挙げられる。このような担体および希釈剤の使用は、当技術分野において周知である。溶液は、好ましくは、無菌かつ液体である。好ましくは、細胞の導入前の該溶液は、製造および保存の条件下で安定であり、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの使用を通して細菌および真菌などの微生物の汚染作用から防御されている。
【０２７４】
細胞投与形態は、例えば、静脈内注射、吸入を通しての肺内送達、局所投与、または鼻腔内投与により、比較的非侵襲的であることが好ましい。しかしながら、細胞投与経路は、処置しようとする組織に依存し、これは移植を含み得る。細胞送達法は、当業者には公知であり、本明細書に記載の方法および組成物と共に使用するための医学分野の専門家によって推定されることができる。
【０２７５】
また、iHSCの細胞内投与のための直接的な注射技術を使用して、全脈管構造または特定の器官の脈管構造を通した細胞の遊出を刺激することもできる。これは、脈管構造の非特異的標的化を含む。特定の注射部位、例えば肝臓門脈を選択することによって任意の器官を標的とすることができる。あるいは、注射は、身体の任意の静脈内に全身的に実施することができる。この方法は、高齢患者において幹細胞数を増強するのに有用である。さらに、細胞は、空の幹細胞ニッチに定植するように、または新たな幹細胞を作製して、例えば化学療法または例えば放射線処置などを通して失われた幹細胞を補充するように機能することができる。所望であれば、哺乳動物または対象を、作用物質を用いて前処置することができ、例えば作用物質を投与して組織への細胞標的指向化を増強させ（例えばホーミング因子）、細胞が所望の組織を標的とすることを促進するために作用物質をその部位に配置することができる。例えば、ホーミング因子の組織への直接注射は、リガンドを標的とする細胞の全身送達前に実施されることができる。
【０２７６】
1つまたは複数の血液細胞集団が欠損しているまたは欠陥のある多種多様な疾病は、HSCで処置可能であると認識されている。したがって、また、本明細書において、細胞療法、例えば幹細胞療法に使用するための、iHSCを含む組成物および方法を提供する。本明細書に記載の組成物および方法を使用して処置することのできる病態または障害の非限定的な例には、再生不良性貧血、ファンコニー貧血、発作性夜間血色素尿症（PNH）；急性白血病、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、急性混合白血病および急性未分化型白血病；慢性白血病、例えば慢性骨髄性白血病（CML）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、若年性慢性骨髄性白血病（JCML）および若年性骨髄単球性白血病（JMML）；骨髄増殖性疾患、例えば急性骨髄線維症、特発性骨髄化成（骨髄線維症）、真性多血症、および本態性血小板血症；遺伝性血小板異常、例えば無巨核球性/先天性血小板減少症；形質細胞障害、例えば多発性骨髄腫、形質細胞白血病、およびワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症；肺疾患、例えばCOPDおよび気管支喘息；先天性免疫疾患、例えば毛細血管拡張性運動失調症、コストマン症候群、白血球粘着不全症、ディジョージ症候群、裸リンパ球症候群、オーメン症候群、重症複合免疫不全症（SCID）、アデノシンデアミナーゼ欠損症を有するSCID、T細胞およびB細胞の存在しないSCID、T細胞が存在せずB細胞が正常であるSCID、分類不能型免疫不全症、およびX連鎖リンパ増殖性疾患、およびHIV（ヒト免疫不全ウイルス）およびAIDS（後天性免疫不全症候群）が挙げられる。
【０２７７】
処置の効力は、当業者には公知であるような、標的となる疾病または障害の1つまたは複数の兆候の統計学的に有意な変化によって決定される。例えば、本明細書に記載の組成物、方法およびキットを使用して生成されたiHSCを用いて処置される対象の全血を、全血球計算（CBC）を使用して分析することができる。CBC試験は、以下の1つまたは複数を含むことができる：
a．白血球（WBC）の計数値：血液の単位容積あたりの白血球の実際の数の計数値。
b．白血球分類：血中に存在する白血球の型の計数値：好中球、リンパ球、単球、好酸球、および好塩基球。
c．赤血球（RBC）の計数値：血液の単位容積あたりの赤血球の実際の数の計数値。
d．ヘモグロビン値：血中の酸素運搬タンパク質の量の測定値。
e．ヘマトクリット値：所与の全血液容積中の赤血球の比率の測定値。
f．血小板の計数値：所与の血液容積中の血小板数の計数値。
g．平均血小板容積（MPV）：平均サイズの血小板の測定値。新たに産生された血小板はより大きく、骨髄において増加した数の血小板が産生されると、MPVの増加が起こる。
h．平均赤血球容積（MCV）：平均サイズのRBCの測定値（例えば、RBCが正常よりも大きいか（大球性）、またはRBCが正常よりも小さいか（小球性）どうか）。
i．平均赤血球血色素量（MCH）：赤血球内の酸素運搬ヘモグロビンの平均量の計算値。
j．平均赤血球血色素濃度（MCHC）：赤血球内のヘモグロビンの平均濃度の計算値（例えば、低下したMCHC値（血色素減少症）または上昇したMCHC値（血色素増加症））。
k．赤血球分布幅（RDW）：RBCのサイズのばらつきの計算値（例えば、RBCサイズのばらつき（赤血球大小不同症）および/または形状のばらつき（変形赤血球症）の量は、RDWの増加を引き起こし得る）。
【０２７８】
本明細書に記載の組成物、方法およびキットのいくつかの態様において、追加の因子、例えば、米国特許第5,582,823号に記載のG-CSF；AMD3100（1,1[1,4-フェニレン-ビス(メチレン)]-ビス-1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターロイキン-1（IL-I）、インターロイキン-3（IL-3）、インターロイキン-8（IL-8）、PIXY-321（GM-CSF/IL-3融合タンパク質）、マクロファージ炎症タンパク質、幹細胞因子（SCF）、トロンボポエチン、flt3、ミエロポエチン、抗VLA-4抗体、抗VCAM-1抗体および増殖関連発癌遺伝子（GRO）を使用して、本明細書に記載のiHSCを使用した処置法を増強させることができる。
【０２７９】
本明細書において、いくつかの局面において、CDKN1C、DNMT3B、EGR1、ETV6、EVI1、GATA2、GFI1B、GLIS2、HLF、HMGA2、HOXA5、HOXA9、HOXB3、HOXB4、HOXB5、IGF2BP2、IKZF2、KLF12、KLF4、KLF9、LMO2、MEIS1、MSI2、MYCN、NAP1L3、NDN、NFIX、NKX2-3、NR3C2、PBX1、PRDM16、PRDM5、RARB、RBBP6、RBPMS、RUNX1、RUNX1T1、SMAD6、TAL1、TCF15、VDR、ZFP37、ZFP467、ZFP521、ZFP532およびZFP612から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、またはそれ以上の造血幹細胞（HSC）誘導因子をコードする1つまたは複数の発現ベクターを含む、HSC誘導組成物を提供する。
【０２８０】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、PBX1、LMO2、PRDM5、ZFP37、MYCN、MSI2、NKX2-3、MEIS1およびRBPMSである。
【０２８１】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、PBX1、LMO2、PRDM5、ZFP37、MYCNおよびMEIS1である。
【０２８２】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、ZFP37、PBX1、LMO2およびPRDM5である。
【０２８３】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、ZFP37、PBX1およびLMO2である。
【０２８４】
また、本明細書において、いくつかの局面において、
HLFをコードする核酸配列；
RUNX1T1をコードする核酸配列；
ZFP37をコードする核酸配列；
PBX1をコードする核酸配列；
LMO2をコードする核酸配列；および
PRDM5をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供する。
【０２８５】
本明細書において、いくつかの局面において、
HLFをコードする核酸配列；
RUNX1T1をコードする核酸配列；
ZFP37をコードする核酸配列；
PBX1をコードする核酸配列；
LMO2をコードする核酸配列；
PRDM5をコードする核酸配列；
MYCNをコードする核酸配列；および
MEIS1をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供する。
【０２８６】
本明細書において、いくつかの局面において、
HLFをコードする核酸配列；
RUNX1T1をコードする核酸配列；
ZFP37をコードする核酸配列；
PBX1をコードする核酸配列；および
LMO2をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供する。
【０２８７】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、組成物はさらに、
PRDM16をコードする核酸配列；
ZFP467をコードする核酸配列；および
VDRをコードする核酸配列
を含む、1つまたは複数の発現ベクターを含む。
【０２８８】
本明細書において、いくつかの局面において、
HLFをコードする核酸配列；
RUNX1T1をコードする核酸配列；
PBX1をコードする核酸配列；
LMO2をコードする核酸配列；
PRDM5をコードする核酸配列；
ZFP37をコードする核酸配列；
MYCNをコードする核酸配列；
MSI2をコードする核酸配列；
NKX2-3をコードする核酸配列；
MEIS1をコードする核酸配列；および
RBPMSをコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供する。
【０２８９】
本明細書において、いくつかの局面において、
ZFP467をコードする核酸配列；
PBX1をコードする核酸配列；
HOXB4をコードする核酸配列；および
MSI2をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供する。
【０２９０】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、組成物はさらに、
HLFをコードする核酸配列；
LMO2をコードする核酸配列；
PRDM16をコードする核酸配列；および
ZFP37をコードする核酸配列
を含む、1つまたは複数の発現ベクターを含む。
【０２９１】
本明細書において、いくつかの局面において、
MYCNをコードする核酸配列；
MSI2をコードする核酸配列；
NKX2-3をコードする核酸配列；および
RUNX1T1をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供する。
【０２９２】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、組成物はさらに、
HOXB5をコードする核酸配列；
HLFをコードする核酸配列；
ZFP467をコードする核酸配列；
HOXB3をコードする核酸配列；
LMO2をコードする核酸配列；
PBX1をコードする核酸配列；
ZFP37をコードする核酸配列；および
ZFP521をコードする核酸配列
を含む、1つまたは複数の発現ベクターを含む。
【０２９３】
本明細書において、いくつかの局面において、
HOXB4をコードする核酸配列；
PBX1をコードする核酸配列；
LMO2をコードする核酸配列；
ZFP467をコードする核酸配列；および
ZFP521をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供する。
【０２９４】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、組成物はさらに、
KLF12をコードする核酸配列；
HLFをコードする核酸配列；および
EGR1をコードする核酸配列
を含む、1つまたは複数の発現ベクターを含む。
【０２９５】
本明細書において、いくつかの局面において、
MEIS1をコードする核酸配列；
RBPMSをコードする核酸配列；
ZFP37をコードする核酸配列；
RUNX1T1をコードする核酸配列；および
LMO2をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供する。
【０２９６】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、組成物はさらに、
KLF12をコードする配列；および
HLFをコードする配列
を含む、1つまたは複数の発現ベクターを含む。
【０２９７】
本明細書において、いくつかの局面において、
ZFP37をコードする核酸配列；
HOXB4をコードする核酸配列；
LMO2をコードする核酸配列；および
HLFをコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供する。
【０２９８】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、組成物はさらに、
MYCNをコードする核酸配列；
ZFP467をコードする核酸配列；
NKX2-3をコードする核酸配列；
PBX1をコードする核酸配列；および
KLF4をコードする核酸配列
を含む、1つまたは複数の発現ベクターを含む。
【０２９９】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、1つまたは複数の発現ベクターはレトロウイルスベクターである。
【０３００】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、1つまたは複数の発現ベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの態様において、レンチウイルスベクターは誘導性レンチウイルスベクターである。いくつかの態様において、レンチウイルスベクターはポリシストロン性誘導性レンチウイルスベクターである。いくつかの態様において、ポリシストロン性誘導性レンチウイルスベクターは、3つ以上の核酸配列を発現する。いくつかの態様において、ポリシストロン性誘導性レンチウイルスベクターの各核酸配列は、2Aペプチド配列だけ離れている。
【０３０１】
また、本明細書において、いくつかの局面において、CDKN1C、DNMT3B、EGR1、ETV6、EVI1、GATA2、GFI1B、GLIS2、HLF、HMGA2、HOXA5、HOXA9、HOXB3、HOXB4、HOXB5、IGF2BP2、IKZF2、KLF12、KLF4、KLF9、LMO2、MEIS1、MSI2、MYCN、NAP1L3、NDN、NFIX、NKX2-3、NR3C2、PBX1、PRDM16、PRDM5、RARB、RBBP6、RBPMS、RUNX1、RUNX1T1、SMAD6、TAL1、TCF15、VDR、ZFP37、ZFP467、ZFP521、ZFP532、ZFP612およびZFP467から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、またはそれ以上の造血幹細胞（HSC）誘導因子をコードする改変されたmRNA配列を含む、HSC誘導組成物を提供し、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０３０２】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、PBX1、LMO2、PRDM5、ZFP37、MYCN、MSI2、NKX2-3、MEIS1およびRBPMSである。
【０３０３】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、PBX1、LMO2、PRDM5、ZFP37、MYCNおよびMEIS1である。
【０３０４】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、ZFP37、PBX1、LMO2およびPRDM5である。
【０３０５】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、ZFP37、PBX1およびLMO2である。
【０３０６】
本明細書において、いくつかの局面において、
HLFをコードする改変されたmRNA配列；
RUNX1T1をコードする改変されたmRNA配列；
ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；
PBX1をコードする改変されたmRNA配列；
LMO2をコードする改変されたmRNA配列；および
PRDM5をコードする改変されたmRNA配列
を含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供し、
各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０３０７】
本明細書において、いくつかの局面において、
HLFをコードする改変されたmRNA配列；
RUNX1T1をコードする改変されたmRNA配列；
ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；
PBX1をコードする改変されたmRNA配列；
LMO2をコードする改変されたmRNA配列； 
PRDM5をコードする改変されたmRNA配列；
MEIS1をコードする改変されたmRNA配列；および
MYCNをコードする改変されたmRNA配列
を含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供し、
各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０３０８】
本明細書において、いくつかの局面において、
HLFをコードする改変されたmRNA配列；
RUNX1T1をコードする改変されたmRNA配列；
ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；
PBX1をコードする改変されたmRNA配列；および
LMO2をコードする改変されたmRNA配列
を含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供し、
各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０３０９】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、組成物はさらに、
PRDM16をコードする改変されたmRNA配列；
ZFP467をコードする改変されたmRNA配列；および
VDRをコードする改変されたmRNA配列
の1つまたは複数を含み、
各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０３１０】
本明細書において、いくつかの局面において、
HLFをコードする改変されたmRNA配列；
RUNX1T1をコードする改変されたmRNA配列；
PBX1をコードする改変されたmRNA配列；
LMO2をコードする改変されたmRNA配列；
PRDM5をコードする改変されたmRNA配列；
ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；
MYCNをコードする改変されたmRNA配列；
MSI2をコードする改変されたmRNA配列；
NKX2-3をコードする改変されたmRNA配列；
MEIS1をコードする改変されたmRNA配列；および
RBPMSをコードする改変されたmRNA配列
を含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供し、
各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０３１１】
本明細書において、いくつかの局面において、
ZFP467をコードする改変されたmRNA配列；
PBX1をコードする改変されたmRNA配列；
HOXB4をコードする改変されたmRNA配列；および
MSI2をコードする改変されたmRNA配列
を含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供し、
各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０３１２】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、組成物はさらに、
HLFをコードする改変されたmRNA配列；
LMO2をコードする改変されたmRNA配列；
PRDM16をコードする改変されたmRNA配列；および
ZFP37をコードする改変されたmRNA配列
の1つまたは複数を含み、
各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０３１３】
本明細書において、いくつかの局面において、
MYCNをコードする改変されたmRNA配列；
MSI2をコードする改変されたmRNA配列；
NKX2-3をコードする改変されたmRNA配列；および
RUNX1T1をコードする改変されたmRNA配列
を含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供し、
各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０３１４】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、組成物はさらに、
HOXB5をコードする改変されたmRNA配列；
HLFをコードする改変されたmRNA配列；
ZFP467をコードする改変されたmRNA配列；
HOXB3をコードする改変されたmRNA配列；
LMO2をコードする改変されたmRNA配列；
PBX1をコードする改変されたmRNA配列；
ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；および
ZFP521をコードする改変されたmRNA配列
の1つまたは複数を含み、
各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０３１５】
本明細書において、いくつかの局面において、
HOXB4をコードする改変されたmRNA配列；
PBX1をコードする改変されたmRNA配列；
LMO2をコードする改変されたmRNA配列；
ZFP467をコードする改変されたmRNA配列；および
ZFP521をコードする改変されたmRNA配列
を含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供し、
各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０３１６】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、組成物はさらに、
KLF12をコードする改変されたmRNA配列；
HLFをコードする改変されたmRNA配列；および
EGRをコードする改変されたmRNA配列
の1つまたは複数を含み、
各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０３１７】
本明細書において、いくつかの局面において、
MEIS1をコードする改変されたmRNA配列；
RBPMSをコードする改変されたmRNA配列；
ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；
RUNX1T1をコードする改変されたmRNA配列；および
LMO2をコードする改変されたmRNA配列
を含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供し、
各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０３１８】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、組成物はさらに、
KLF12をコードする改変されたmRNA配列；および
HLFをコードする改変されたmRNA配列
の1つまたは複数を含み、
各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０３１９】
本明細書において、いくつかの局面において、
ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；
HOXB4をコードする改変されたmRNA配列；
LMO2をコードする改変されたmRNA配列；および
HLFをコードする改変されたmRNA配列
を含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物を提供し、
各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０３２０】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、組成物はさらに、
MYCNをコードする改変されたmRNA配列；
ZFP467をコードする改変されたmRNA配列；
NKX2-3をコードする改変されたmRNA配列；
PBX1をコードする改変されたmRNA配列；および
KLF4をコードする改変されたmRNA配列
の1つまたは複数を含み、
各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０３２１】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、改変されたシトシンは5-メチルシトシンであり、改変されたウラシルはプソイドウラシルである。
【０３２２】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、改変されたmRNA配列は、ピリジン-4-オンリボヌクレオシド、5-アザ-ウリジン、2-チオ-5-アザ-ウリジン、2-チオウリジン、4-チオ-プソイドウリジン、2-チオ-プソイドウリジン、5-ヒドロキシウリジン、3-メチルウリジン、5-カルボキシメチル-ウリジン、1-カルボキシメチル-プソイドウリジン、5-プロピニル-ウリジン、1-プロピニル-プソイドウリジン、5-タウリノメチルウリジン、1-タウリノメチル-プソイドウリジン、5-タウリノメチル-2-チオ-ウリジン、1-タウリノメチル-4-チオ-ウリジン、5-メチル-ウリジン、1-メチル-プソイドウリジン、4-チオ-1-メチル-プソイドウリジン、2-チオ-1-メチル-プソイドウリジン、1-メチル-1-デアザ-プソイドウリジン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、2-チオ-ジヒドロウリジン、2-チオ-ジヒドロプソイドウリジン、2-メトキシウリジン、2-メトキシ-4-チオ-ウリジン、4-メトキシ-プソイドウリジン、4-メトキシ-2-チオ-プソイドウリジン、5-アザ-シチジン、プソイドイソシチジン、3-メチル-シチジン、N4-アセチルシチジン、5-ホルミルシチジン、N4-メチルシチジン、5-ヒドロキシメチルシチジン、1-メチル-プソイドイソシチジン、ピロロ-シチジン、ピロロ-プソイドイソシチジン、2-チオ-シチジン、2-チオ-5-メチル-シチジン、4-チオ-プソイドイソシチジン、4-チオ-1-メチル-プソイドイソシチジン、4-チオ-1-メチル-1-デアザ-プソイドイソシチジン、1-メチル-1-デアザ-プソイドイソシチジン、ゼブラリン、5-アザ-ゼブラリン、5-メチル-ゼブラリン、5-アザ-2-チオ-ゼブラリン、2-チオ-ゼブラリン、2-メトキシ-シチジン、2-メトキシ-5-メチル-シチジン、4-メトキシ-プソイドイソシチジン、4-メトキシ-1-メチル-プソイドイソシチジン、2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、7-デアザ-アデニン、7-デアザ-8-アザ-アデニン、7-デアザ-2-アミノプリン、7-デアザ-8-アザ-2-アミノプリン、7-デアザ-2,6-ジアミノプリン、7-デアザ-8-アザ-2,6-ジアミノプリン、1-メチルアデノシン、N6-メチルアデノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、2-メチルチオ-N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、N6-グリシニルカルバモイルアデノシン、N6-トレオニルカルバモイルアデノシン、2-メチルチオ-N6-トレオニルカルバモイルアデノシン、N6,N6-ジメチルアデノシン、7-メチルアデニン、2-メチルチオ-アデニン、および2-メトキシ-アデニン、イノシン、1-メチル-イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、7-デアザ-グアノシン、7-デアザ-8-アザ-グアノシン、6-チオ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-8-アザ-グアノシン、7-メチル-グアノシン、6-チオ-7-メチル-グアノシン、7-メチルイノシン、6-メトキシ-グアノシン、1-メチルグアノシン、N2-メチルグアノシン、N2,N2-ジメチルグアノシン、8-オキソ-グアノシン、7-メチル-8-オキソ-グアノシン、1-メチル-6-チオ-グアノシン、N2-メチル-6-チオ-グアノシン、およびN2,N2-ジメチル-6-チオ-グアノシン、およびその組合せからなる群より選択される、1つまたは複数のヌクレオシドの修飾を含む。
【０３２３】
また、本明細書において、いくつかの局面において、
HLFをコードする核酸配列、RUNX1T1をコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；およびPRDM5をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程（ここで、各々の該核酸配列は、プロモーターに機能的に連結されている）；および
形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【０３２４】
本明細書において、いくつかの局面において、
HLFをコードする核酸配列；RUNX1T1をコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；およびPRDM5をコードする核酸配列；MEIS1をコードする核酸配列；およびMYCNをコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程（ここで、各々の該核酸配列は、プロモーターに機能的に連結されている）；および
形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【０３２５】
本明細書において、いくつかの局面において、
HLFをコードする核酸配列；RUNX1T1をコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；およびLMO2をコードする核酸配列；およびPRDM5をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程（ここで、各々の該核酸配列は、プロモーターに機能的に連結されている）；および
形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【０３２６】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、工程（a）の形質導入は、PRDM16をコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；およびVDRをコードする核酸配列の1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む。
【０３２７】
本明細書において、いくつかの局面において、
HLFをコードする核酸配列；RUNX1T1をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；PRDM5をコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；MYCNをコードする核酸配列；MSI2をコードする核酸配列；NKX2-3をコードする核酸配列；MEIS1をコードする核酸配列；およびRBPMSをコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程（ここで、各々の該核酸配列は、プロモーターに機能的に連結されている）；および
形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【０３２８】
本明細書において、いくつかの局面において、
ZFP467をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；HOXB4をコードする核酸配列；およびMSI2をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程（ここで、各々の該核酸配列は、プロモーターに機能的に連結されている）；および
形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【０３２９】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、工程（a）の形質導入は、HLFをコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；PRDM16をコードする核酸配列；およびZFP37コードする核酸配列の1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む。
【０３３０】
本明細書において、いくつかの局面において、
MYCNをコードする核酸配列；MSI2をコードする核酸配列；NKX2-3をコードする核酸配列；およびRUNX1T1をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程（ここで、各々の該核酸配列は、プロモーターに機能的に連結されている）；および
形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【０３３１】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、工程（a）の形質導入は、HOXB5をコードする核酸配列；HLFをコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；HOXB3をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；およびZFP521をコードする核酸配列の1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む。
【０３３２】
本明細書において、いくつかの局面において、
HOXB4をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；およびZFP521をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程（ここで、各々の該核酸配列は、プロモーターに機能的に連結されている）；および
形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【０３３３】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、工程（a）の形質導入は、KLF12をコードする核酸配列；HLFをコードする核酸配列；およびEGR1をコードする核酸配列の1つまたは複数を含む、1つまたは複数のベクターをさらに含む。
【０３３４】
本明細書において、いくつかの局面において、
MEIS1をコードする核酸配列；RBPMSをコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；RUNX1T1をコードする核酸配列；およびLMO2をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程（ここで、各々の該核酸配列は、プロモーターに機能的に連結されている）；および
形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【０３３５】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、工程（a）の形質導入は、KLF12をコードする核酸配列；およびHLFをコードする核酸配列の1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む。
【０３３６】
本明細書において、いくつかの局面において、
ZFP37をコードする核酸配列；HOXB4をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；およびHLFをコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程（ここで、各々の該核酸配列は、プロモーターに機能的に連結されている）；および
形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【０３３７】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、工程（a）の形質導入は、KLF12をコードする核酸配列；およびHLFをコードする核酸配列の1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む。
【０３３８】
本明細書において、いくつかの局面において、
ZFP37をコードする核酸配列；HOXB4をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；およびHLFをコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程（ここで、各々の該核酸配列は、プロモーターに機能的に連結されている）；および
形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これにより誘導造血幹細胞（iHSC）を調製する工程
を含む、体細胞からiHSCを調製するための方法を提供する。
【０３３９】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、工程（a）の形質導入は、MYCNをコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；NKX2-3をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；およびKLF4をコードする核酸配列の1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む。
【０３４０】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、体細胞は線維芽細胞である。
【０３４１】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、体細胞は造血系列細胞である。
【０３４２】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、造血系列細胞は、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、網状赤血球、赤血球、肥満細胞、破骨細胞、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、リンパ球、NK細胞、NKT細胞、自然リンパ球、複能性造血前駆細胞、少能性造血前駆細胞、および系列の限定された造血前駆細胞から選択される。
【０３４３】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、造血系列細胞は、複能性前駆細胞（MPP）、骨髄球系共通前駆細胞（CMP）、顆粒球・単球系前駆細胞（GMP）、リンパ球系共通前駆細胞（CLP）、およびプレ巨核球・赤血球系前駆細胞から選択される。
【０３４４】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、造血系列細胞は、巨核球・赤血球系前駆細胞（MEP）、プロB細胞、プレB細胞、プレプロB細胞、プロT細胞、ダブルネガティブT細胞、プロNK細胞、プロ樹状細胞（プロDC）、プレ顆粒球/マクロファージ細胞、顆粒球/マクロファージ前駆（GMP）細胞、およびプロ肥満細胞（プロMC）から選択される。
【０３４５】
また、本明細書において、いくつかの局面において、
ZFP467をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；HOXB4をコードする核酸配列；およびMSI2をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターをプロプレB細胞に形質導入する工程（ここで、各々の該核酸配列は、プロモーターに機能的に連結されている）；および
形質導入されたプロプレB細胞を、骨髄球系列細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これによりプロプレB細胞を骨髄球系列へと分化転換する工程
を含む、プロプレB細胞の骨髄球系列への分化転換を促進する方法を提供する。
【０３４６】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、工程（a）の形質導入は、HLFをコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；PRDM16をコードする核酸配列；およびZFP37をコードする核酸配列の1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む。
【０３４７】
また、本明細書において、いくつかの局面において、
HOXB4をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；およびZFP521をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターをプロプレB細胞に形質導入する工程（ここで、各々の該核酸配列は、プロモーターに機能的に連結されている）；および
形質導入されたプロプレB細胞を、プロプレB細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これによりプロプレB細胞の生存および/または増殖を高める工程
を含む、プロプレB細胞の生存および/または増殖を高める方法を提供する。
【０３４８】
本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、工程（a）の形質導入は、KLF12をコードする核酸配列；HLFをコードする核酸配列；およびEGR1をコードする核酸配列の1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む。
【０３４９】
また、本明細書において、いくつかの局面において、本明細書に記載の任意のHSC誘導組成物または方法を使用して産生された、単離された誘導造血幹細胞（iHSC）を提供する。
【０３５０】
いくつかの局面において、本明細書において、本明細書に記載の任意のHSC誘導組成物または方法を使用して産生された、複数の誘導造血幹細胞（iHSC）を含む細胞クローンを提供する。本明細書に記載のこれらの局面および全てのこのような局面のいくつかの態様において、細胞クローンは、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【０３５１】
また、本明細書において、いくつかの局面において、誘導造血幹細胞（iHSC）を作製するためのキットであって、本明細書に記載の1つまたは複数の発現ベクター構成要素を含む任意のHSC誘導組成物を含むキットを提供する。
【０３５２】
本明細書において、いくつかの局面において、誘導造血幹細胞（iHSC）を作製するためのキットであって、本明細書に記載の改変されたmRNA配列構成要素を含む任意のHSC誘導組成物を含むキットを提供する。
【０３５３】
また、本明細書において、いくつかの局面において、本明細書に記載の誘導造血幹細胞の作製法のための構成要素としての、本明細書に記載の1つまたは複数のHSC誘導因子を含むキットを提供する。
【０３５４】
したがって、いくつかの局面において、本明細書において、以下の構成要素：（a）CDKN1C、DNMT3B、EGR1、ETV6、EVI1、GATA2、GFI1B、GLIS2、HLF、HMGA2、HOXA5、HOXA9、HOXB3、HOXB4、HOXB5、IGF2BP2、IKZF2、KLF12、KLF4、KLF9、LMO2、MEIS1、MSI2、MYCN、NAP1L3、NDN、NFIX、NKX2-3、NR3C2、PBX1、PRDM16、PRDM5、RARB、RBBP6、RBPMS、RUNX1、RUNX1T1、SMAD6、TAL1、TCF15、VDR、ZFP37、ZFP467、ZFP521、ZFP532、ZFP612およびZFP467から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、またはそれ以上のHSC誘導因子をコードする1つまたは複数の発現ベクター；ならびに（b）そのパッケージングおよび説明書を含む、誘導造血幹細胞を調製するためのキットを提供する。
【０３５５】
本明細書に記載のこれらのキットおよび全てのこのようなキットのいくつかの態様において、少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、PBX1、LMO2、PRDM5、ZFP37、MYCN、MSI2、NKX2-3、MEIS1およびRBPMSである。
【０３５６】
本明細書に記載のこれらのキットおよび全てのこのようなキットのいくつかの態様において、少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、ZFP37、PBX1、LMO2およびPRDM5である。
【０３５７】
いくつかの局面において、本明細書において、以下の構成要素：（a）HLFをコードする核酸配列；RUNX1T1をコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；およびPRDM5をコードする核酸配列を含む1つまたは複数の発現ベクター；ならびに（b）そのパッケージングおよび説明書を含む、誘導造血幹細胞を調製するためのキットを提供する。
【０３５８】
本明細書に記載のこれらのキットおよび全てのこのようなキットのいくつかの態様において、キットは、PRDM16をコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；およびVDRをコードする核酸配列の1つまたは複数をさらに含む。
【０３５９】
いくつかの局面において、本明細書において、以下の構成要素：（a）HLFをコードする核酸配列；RUNX1T1をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；PRDM5をコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；MYCNをコードする核酸配列；MSI2をコードする核酸配列；NKX2-3をコードする核酸配列；MEIS1をコードする核酸配列；およびRBPMSをコードする核酸配列を含む1つまたは複数の発現ベクター；ならびに（b）そのパッケージングおよび説明書を含む、誘導造血幹細胞を調製するためのキットを提供する。
【０３６０】
いくつかの局面において、本明細書において、以下の構成要素：（a）ZFP467をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；HOXB4をコードする核酸配列；およびMSI2をコードする核酸配列を含む1つまたは複数の発現ベクター；ならびに（b）そのパッケージングおよび説明書を含む、誘導造血幹細胞を調製するためのキットを提供する。
【０３６１】
本明細書に記載のこれらのキットおよび全てのこのようなキットのいくつかの態様において、キットは、HLFをコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；PRDM16をコードする核酸配列；およびZFP37をコードする核酸配列の1つまたは複数をさらに含む。
【０３６２】
いくつかの局面において、本明細書において、以下の構成要素：（a）MYCNをコードする核酸配列；MSI2をコードする核酸配列；NKX2-3をコードする核酸配列；およびRUNX1T1をコードする核酸配列を含む1つまたは複数の発現ベクター；ならびに（b）そのパッケージングおよび説明書を含む、誘導造血幹細胞を調製するためのキットを提供する。
【０３６３】
本明細書に記載のこれらのキットおよび全てのこのようなキットのいくつかの態様において、キットは、HOXB5をコードする核酸配列；HLFをコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；HOXB3をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；およびZFP521をコードする核酸配列をさらに含む。
【０３６４】
いくつかの局面において、本明細書において、以下の構成要素：（a）HOXB4をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；およびZFP521をコードする核酸配列を含む1つまたは複数の発現ベクター組成物；ならびに（b）そのパッケージングおよび説明書を含む、誘導造血幹細胞を調製するためのキットを提供する。
【０３６５】
本明細書に記載のこれらのキットおよび全てのこのようなキットのいくつかの態様において、キットは、KLF12をコードする核酸配列；HLFをコードする核酸配列；およびEGR1をコードする核酸配列の1つまたは複数をさらに含む。
【０３６６】
いくつかの局面において、本明細書において、以下の構成要素：（a）MEIS1をコードする核酸配列；RBPMSをコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；RUNX1T1をコードする核酸配列；およびLMO2をコードする核酸配列を含む1つまたは複数の発現ベクター；ならびに（b）そのパッケージングおよび説明書を含む、誘導造血幹細胞を調製するためのキットを提供する。
【０３６７】
本明細書に記載のこれらのキットおよび全てのこのようなキットのいくつかの態様において、キットは、KLF12をコードする配列；およびHLFをコードする配列の1つまたは複数をさらに含む。
【０３６８】
いくつかの局面において、本明細書において、以下の構成要素：（a）ZFP37をコードする核酸配列；HOXB4をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；およびHLFをコードする核酸配列を含む1つまたは複数の発現ベクター；ならびに（b）そのパッケージングおよび説明書を含む、誘導造血幹細胞を調製するためのキットを提供する。
【０３６９】
本明細書に記載のこれらのキットおよび全てのこのようなキットのいくつかの態様において、キットは、MYCNをコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；NKX2-3をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；およびKLF4をコードする核酸配列の1つまたは複数をさらに含む。
【０３７０】
これらのキットのいくつかの態様において、発現ベクターはウイルスベクターである。これらのキットのいくつかの態様において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。いくつかの態様において、発現ベクターは誘導性である。
【０３７１】
また、本明細書において、いくつかの局面において、以下の構成要素：（a）CDKN1C、DNMT3B、EGR1、ETV6、EVI1、GATA2、GFI1B、GLIS2、HLF、HMGA2、HOXA5、HOXA9、HOXB3、HOXB4、HOXB5、IGF2BP2、IKZF2、KLF12、KLF4、KLF9、LMO2、MEIS1、MSI2、MYCN、NAP1L3、NDN、NFIX、NKX2-3、NR3C2、PBX1、PRDM16、PRDM5、RARB、RBBP6、RBPMS、RUNX1、RUNX1T1、SMAD6、TAL1、TCF15、VDR、ZFP37、ZFP467、ZFP521、ZFP532およびZFP612から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、またはそれ以上のHSC誘導因子をコードする改変されたmRNA配列を含む、誘導造血幹細胞を調製するためのキットを提供し、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０３７２】
本明細書に記載のこれらのキットおよび全てのこのようなキットのいくつかの態様において、少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、PBX1、LMO2、PRDM5、ZFP37、MYCN、MSI2、NKX2-3、MEIS1およびRBPMSである。
【０３７３】
本明細書に記載のこれらのキットおよび全てのこのようなキットのいくつかの態様において、少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子は、HLF、RUNX1T1、ZFP37、PBX1、LMO2およびPRDM5である。
【０３７４】
いくつかの局面において、本明細書において、以下の構成要素：（a）HLFをコードする改変されたmRNA配列；RUNX1T1をコードする改変されたmRNA配列；ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；PBX1をコードする改変されたmRNA配列；LMO2をコードする改変されたmRNA配列；およびPRDM5をコードする改変されたmRNA配列（各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである）；ならびに（b）そのパッケージングおよび説明書を含む、誘導造血幹細胞を調製するためのキットを提供する。
【０３７５】
本明細書に記載のこれらのキットおよび全てのこのようなキットのいくつかの態様において、キットはさらに、PRDM16をコードする改変されたmRNA配列；ZFP467をコードする改変されたmRNA配列；およびVDRをコードする改変されたmRNA配列の1つまたは複数を含み、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０３７６】
いくつかの局面において、本明細書において、以下の構成要素：（a）HLFをコードする改変されたmRNA配列；RUNX1T1をコードする改変されたmRNA配列；PBX1をコードする改変されたmRNA配列；LMO2をコードする改変されたmRNA配列；PRDM5をコードする改変されたmRNA配列；ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；MYCNをコードする改変されたmRNA配列；MSI2をコードする改変されたmRNA配列；NKX2-3をコードする改変されたmRNA配列；MEIS1をコードする改変されたmRNA配列；およびRBPMSをコードする改変されたmRNA配列（各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである）；ならびに（b）そのパッケージングおよび説明書を含む、誘導造血幹細胞を調製するためのキットを提供する。
【０３７７】
いくつかの局面において、本明細書において、以下の構成要素：（a）ZFP467をコードする改変されたmRNA配列；PBX1をコードする改変されたmRNA配列；HOXB4をコードする改変されたmRNA配列；およびMSI2をコードする改変されたmRNA配列（各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである）；ならびに（b）そのパッケージングおよび説明書を含む、誘導造血幹細胞を調製するためのキットを提供する。
【０３７８】
本明細書に記載のこれらのキットおよび全てのこのようなキットのいくつかの態様において、キットは、HLFをコードする改変されたmRNA配列；LMO2をコードする改変されたmRNA配列；PRDM16をコードする改変されたmRNA配列；およびZFP37をコードする改変されたmRNA配列の1つまたは複数をさらに含み、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０３７９】
いくつかの局面において、本明細書において、以下の構成要素：（a）MYCNをコードする改変されたmRNA配列；MSI2をコードする改変されたmRNA配列；NKX2-3をコードする改変されたmRNA配列；およびRUNX1T1をコードする改変されたmRNA配列（各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである）；ならびに（b）そのパッケージングおよび説明書を含む、誘導造血幹細胞を調製するためのキットを提供する。
【０３８０】
本明細書に記載のこれらのキットおよび全てのこのようなキットのいくつかの態様において、キットは、HOXB5をコードする改変されたmRNA配列；HLFをコードする改変されたmRNA配列；ZFP467をコードする改変されたmRNA配列；HOXB3をコードする改変されたmRNA配列；LMO2をコードする改変されたmRNA配列；PBX1をコードする改変されたmRNA配列；ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；およびZFP521をコードする改変されたmRNA配列の1つまたは複数をさらに含み、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０３８１】
いくつかの局面において、本明細書において、以下の構成要素：（a）HOXB4をコードする改変されたmRNA配列；PBX1をコードする改変されたmRNA配列；LMO2をコードする改変されたmRNA配列；ZFP467をコードする改変されたmRNA配列；およびZFP521をコードする改変されたmRNA配列（各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである）；ならびに（b）そのパッケージングおよび説明書を含む、誘導造血幹細胞を調製するためのキットを提供する。
【０３８２】
本明細書に記載のこれらのキットおよび全てのこのようなキットのいくつかの態様において、キットは、KLF12をコードする改変されたmRNA配列；HLFをコードする改変されたmRNA配列；およびEGRをコードする改変されたmRNA配列の1つまたは複数をさらに含み、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０３８３】
いくつかの局面において、本明細書において、以下の構成要素：（a）MEIS1をコードする改変されたmRNA配列；RBPMSをコードする改変されたmRNA配列；ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；RUNX1T1をコードする改変されたmRNA配列；およびLMO2をコードする改変されたmRNA配列（各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである）；ならびに（b）そのパッケージングおよび説明書を含む、誘導造血幹細胞を調製するためのキットを提供する。
【０３８４】
本明細書に記載のこれらのキットおよび全てのこのようなキットのいくつかの態様において、キットは、KLF12をコードする改変されたmRNA配列；およびHLFをコードする改変されたmRNA配列の1つまたは複数をさらに含み、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０３８５】
いくつかの局面において、本明細書において、以下の構成要素：（a）ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；HOXB4をコードする改変されたmRNA配列；LMO2をコードする改変されたmRNA配列；およびHLFをコードする改変されたmRNA配列（各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである）；ならびに（b）そのパッケージングおよび説明書を含む、誘導造血幹細胞を調製するためのキットを提供する。
【０３８６】
本明細書に記載のこれらのキットおよび全てのこのようなキットのいくつかの態様において、キットは、MYCNをコードする改変されたmRNA配列；ZFP467をコードする改変されたmRNA配列；NKX2-3をコードする改変されたmRNA配列；PBX1をコードする改変されたmRNA配列；およびKLF4をコードする改変されたmRNA配列の1つまたは複数をさらに含み、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである。
【０３８７】
本明細書に記載のこれらのキットおよび全てのこのようなキットのいくつかの態様において、改変されたシトシンは5-メチルシトシンであり、改変されたウラシルはプソイドウリジンである。
【０３８８】
本明細書に記載のこれらのキットおよび全てのこのようなキットのいくつかの態様において、1つまたは複数の合成の改変されたmRNAはさらに、ポリ（A）テイル、コザック配列、3'非翻訳領域、5'非翻訳領域、および5'キャップ、例えば5'キャップアナログ、例えば5'ジグアノシンキャップ、メチレン-ビス(ホスホネート)部分を有する四リン酸キャップアナログ、架橋していない酸素が硫黄で置換されているキャップアナログ、N7-ベンジル化ジヌクレオシド四リン酸アナログ、またはアンチリバースキャップアナログの1つもしくは複数をさらに含むことができる。キットはまた、5'キャップアナログを含み得る。キットはまた、RNA改変手順の最中に5'三リン酸を除去するためのホスファターゼ酵素（例えば仔ウシ腸ホスファターゼ）を含むことができる。任意で、キットは、1つまたは複数の対照の合成mRNA、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP）または他のマーカー分子をコードする合成の改変されたRNAを含むことができる。
【０３８９】
他の態様において、キットは、細胞の自然免疫応答をさらに低下させるための材料をさらに含むことができる。例えば、キットは、可溶性インターフェロンレセプター、例えばB18Rをさらに含むことができる。いくつかの態様において、キットは複数の異なる合成の改変されたRNA分子を含むことができる。
【０３９０】
本明細書に記載のキットはまた、いくつかの局面において、本明細書に記載のHSC誘導因子をコードする合成mRNAの生成のための、1つまたは複数の直鎖状DNA鋳型を含むことができる。
【０３９１】
本明細書に記載のキットは、いくつかの態様において、混合物としてまたは別々のアリコートとして、HSC誘導因子をコードする合成mRNAまたは1つもしくは複数の発現ベクターをさらに提供することができる。
【０３９２】
いくつかの態様において、キットは、初期化の効率を増強させるための作用物質をさらに含むことができる。いくつかの態様において、キットは、造血幹細胞状態に誘導された細胞を同定するための細胞型特異的マーカーを検出するための、1つまたは複数の抗体またはプライマー試薬をさらに含むことができる。
【０３９３】
いくつかの態様において、キットは、緩衝液をさらに含むことができる。いくつかのこのような態様において、該緩衝液は、pH7.0のリボヌクレアーゼフリーのTE緩衝液である。いくつかの態様において、キットは、細胞培養培地を含む容器をさらに含む。
【０３９４】
本明細書に記載の全てのキットは、緩衝液、細胞培養培地、形質導入もしくはトランスフェクション培地および/または培地補助物質をさらに含むことができる。好ましい態様において、緩衝液、細胞培養培地、トランスフェクション培地、および/または培地補助物質は、DNAアーゼおよびリボヌクレアーゼを含まない。いくつかの態様において、キットに提供された合成の改変されたRNAは、特定の量または質量の、例えば20μgの非溶液形態、例えば凍結乾燥粉末形態でありることができ、よって、エンドユーザーは適切な量の緩衝液または培地を加えて、当該構成要素を所望の濃度（例えば100ng/μl）とする。
【０３９５】
本明細書に記載の全てのキットは、本明細書に記載のキット構成要素を使用して生成された細胞の1回投与または反復もしくは頻回注入を促進する装置、例えば移植不可能な送達装置、例えば針、シリンジ、ペン装置、または移植可能な送達装置、例えばポンプ、半永久的なステント（例えば静脈内、腹腔内、嚢内または関節内）、またはレザバーをさらに含むことができる。いくつかのこのような態様において、送達装置は、iHSCクローンを含む単位投与量の薬学的組成物を分注するメカニズムを含むことができる。いくつかの態様において、装置は、例えば拡散によって持続的に該組成物を放出する。いくつかの態様において、装置は、対象内のパラメーターをモニタリングするセンサーを含むことができる。例えば、装置は、例えばポンプおよび任意で関連する電子機器を含むことができる。
【０３９６】
本発明の全ての態様のいくつかの局面における誘導造血幹細胞は、機能的特徴において類似しているが、その遺伝子発現パターンまたはメチル化パターンにおいて天然の内因性造血幹細胞とは有意に異なる。例えば、内因性HSC遺伝子発現パターン（その例示的な遺伝子は表2および3に示されている）と比較して、誘導造血幹細胞は、内因性HSCにおける遺伝子、例えば表2および3に示された遺伝子の約1〜5％、2〜5％、3〜5％、50％以下、40％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、または10％以下が、約1〜5％、5〜10％、5〜15％、または5〜20％増加した発現を示すことによって異なる。具体的には、iHSCにおける遺伝子の発現（その発現は天然のHSCにおいて減少しているかまたは有意ではない）（表2の選択された例を参照されたい）は増加しているか、または遺伝子の発現（その発現は、天然のHSCにおいては有意である）（表3の単離されたHSCにおいて高度に発現された遺伝子の選択された例を参照されたい）はiHSCにおいて減少している。
【０３９７】
本発明の全ての態様のいくつかの局面において、人工多能性幹細胞は、機能的特徴において類似しているが、そのメチル化パターンにおいて天然または内因性HSCとは有意に異なる。例えば、表4に例示された遺伝子の内因性メチル化パターンと比較して、iHSCは、表4に例示されている、天然のHSCのメチル化部位の約1〜5％、1〜10％、5〜10％、50％以下、40％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、または10％以下のメチル化において、約1〜5％、いくつかの局面において1〜10％、いくつかの局面において5〜10％の差異を示すことによって異なる。差異は、内因性HSCと比較して増加または減少したメチル化であり得る。いくつかの局面において、表4に例示されているように、内因性HSCメチル化部位と比較して、iHSCにおいて、いくつかのメチル化部位はメチル化され、いくつかはメチル化されていない。
【０３９８】
表4は、天然または内因性のHSCにプロファイリングされているような、各染色体（1〜19、xおよびy）からの35個の例示的プロファイルを含む。各群から100個を採取し、最も多いメチル化部位および最も少ないメチル化部位（すなわち上/下20％）を無作為化することによってスクリーニングした（非常に少数の部位を有していたY染色体を除いて、僅か35個の無作為部位を選択した）。中間の（20〜80％）パーセンタイルの中で、3000個のメチル化部位を無作為に選択した。この3000個の部位のプールから、35個のメチル化部位を無作為に選択した。これらの例は、全染色体のメチル化状態を示すために、しかし、理論によって束縛されるものではないが、天然のHSCにとってより特徴的であり得る、そうした中程度のメチル化部位を増やすために選択された。
【０３９９】
HSC発現分析
ゲノム全域にわたる遺伝子発現分析を、Affymetrix GeneChip Mouse Genome 430 2.0アレイプラットフォームを使用して精製LSKCD34-Flk2-に対して実施した。RNAを、TRIzol (Life Technologies)を使用して単離し、精製されたRNAを、Affymetrixに従って増幅、標識、ハイブリダイズ、および走査した。生データを、383個の他の造血細胞型と一緒にgcRMAを使用して標準化した。これらのデータをlog変換し、その4回の生物学的反復実験の平均を発現レベルとして提示する。
【０４００】
HSCのDNAメチル化分析
DNAメチル化分析のためのRRBSライブラリーを、刊行されているプロトコール（Gu et al Nat. Protoc, 6 (2011), pp. 468-481）に従って、LSKCD34-FLk2- HSCの1回の生物学的反復実験あたり30ngのインプットDNAから調製し、IlluminaゲノムアナライザーIIまたはHiSeq 2000機械でBroad Instituteのゲノムシークエンスプラットフォームによって配列決定した。生物情報学データ処理および品質制御を、Bock et al (Cell, 144 (2011), pp. 439-452)に記載のように実施した。生のシークエンス解読値を、Maqバイサルファイトアラインメントモードを使用してアラインさせ、DNAメチル化呼び出しを、カスタムソフトウェア（Gu et al, Nat Methods 7(2010) 133-136）を使用して実施した。DNAメチル化レベルを、ゲノム全体におよぶ1キロ塩基のタイル領域について、個々のCpGのDNAメチル化レベルの加重平均範囲として計算した。少なくとも2つのCpGを有する領域のみを（1つのCpGあたり少なくとも5回独立したDNAメチル化測定を行う）保持し、高い信頼度のDNAメチル化測定結果を有するゲノム領域のリストを作成した。最初のフィルター工程で、2回の生物学的反復実験で互いに十分な一貫性がなかった全ての1kbタイルのDNAメチル化を除外した。生物学的反復実験間の絶対的相違が0.2を超える場合、および生物学的反復実験間の相対的相違が0.05を超える場合には、あらゆる測定結果を除外した。これらの絶対的閾値は、RRBSデータ分析と本発明者らの以前の経験に基づいて選択され、相対的閾値は、絶対的閾値および相対的閾値が、範囲の中心、すなわちおよそ0.5に近い数値に等価になるように計算された。有意な差次的メチル化領域の同定は、2つの細胞型の生物学的反復実験間の平均的なDNAメチル化の差に基づき、1kbのタイルについては0.1の最小の絶対的な差を、および単一のCpGについてはよりストリンジェントな0.2の閾値を必要とする。相対的な差の閾値は、上記されているような絶対的な差の閾値から計算された。相対的および絶対的な差の閾値の併用は、高い、中間の、および低いDNAメチル化を有する遺伝子領域およびゲノム領域の全体におよぶ、関連性のある差異の確固たる同定をもたらした。
【０４０１】
（表２）内因性HSCにおいて低下した/有意ではない発現を示す転写物の例
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【０４０２】
（表３）内因性HSCにおいて発現/有意な発現を示す転写物の例
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【０４０３】
（表４）単離された/内因性のHSCにおける例示的なメチル化部位
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【０４０４】
誘導造血幹細胞は、例えば、本明細書において開示された体細胞、多能性細胞、前駆細胞もしくは幹細胞の因子の少なくとも1つの遺伝子発現を改変することによって、または、これらの細胞型のいずれか1つを、本明細書において開示された少なくとも1つのタンパク質もしくは少なくとも1つのタンパク質を産生するRNAに曝すことによって、ヒトの手によって作製される。細胞はさらに、それらを、本明細書において開示された少なくとも1つの因子を作動させる小分子に曝すことによって作製されることができる。いくつかの局面において、少なくとも2個、3個、4個、5個、6個、7個、または8個の因子を使用して、誘導造血幹細胞を作製する。
【０４０５】
本明細書に記載の誘導造血幹細胞は、その翻訳後修飾シグネチャーおよびその遺伝子発現シグネチャーの両方において天然の造血幹細胞とは異なる。これらの差異は、その後代へと伝えられる。それゆえ、その後代も、クローン性のものであれまたは分化したものであれ、天然の分化した細胞とは異なる。
【０４０６】
誘導造血幹細胞は、本発明の全ての態様のいくつかの局面において定義されているように、これは機能的に自身をコピーすることができるだけでなく、造血系列の様々な細胞へと分化することのできる細胞を含むか、そのような細胞から実質的になるか、またはそのような細胞からなる。換言すれば、それらは、多系列能を有すると定義されることができる。
【０４０７】
誘導造血幹細胞はまた、天然の造血幹細胞とは異なる遺伝子発現シグネチャーを含むと定義される。天然の造血幹細胞の遺伝子発現パターンを、誘導造血幹細胞の遺伝子発現パターンと比較することによってその差を実験的に示すことができる。例えば、遺伝子発現シグネチャーは、表2または3に示されるような遺伝子に関して異なり得る。それゆえ、本発明の全ての態様のいくつかの局面において、誘導造血幹細胞は、表2または3の遺伝子の約1〜5％、2〜5％、3〜5％、50％以下、40％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、または10％以下の発現シグネチャーとは、約1〜5％、5〜10％、5〜15％、または5〜20％異なる発現シグネチャーを含む。
【０４０８】
誘導造血幹細胞はさらに、天然の造血幹細胞とは異なる翻訳後修飾シグネチャーを含むと定義される。いくつかの態様において、翻訳後修飾はメチル化である。例えば、誘導造血幹細胞のメチル化パターンは、表4に示されたメチル化部位の約1〜5％、1〜10％、5〜10％、50％以下、40％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、または10％以下におけるメチル化パターンとは、いくつかの局面において約1〜5％、いくつかの局面において1〜10％、いくつかの局面において5〜10％異なる。いくつかの局面において、iHSCにおけるメチル化の量は、例えば表4に列挙された遺伝子座の例におけるメチル化の量と比較して、1％。2％、3％、4％、または5％以下だけ、単離されたまたは内因性のHSCとは異なる。他のメチル化部位も当然、iHSCとHSCとを区別するためのあらゆる比較において同様に使用されることができる。
【０４０９】
本発明は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコール、および試薬などに限定されず、したがって変更し得ることが理解されるべきである。本明細書において使用された用語は、特定の態様を説明する目的のためだけのものであり、本発明の範囲を限定する意図はなく、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ規定される。
【０４１０】
本明細書および特許請求の範囲において使用されているように、文脈が明らかに別途示さない限り、単数形は複数の指示対象を含み、逆もしかりである。「または」という用語は、例えば「のいずれか」によって修飾されていなければ包括的である。作業実施例以外において、または特記されない限り、本明細書において使用された成分または反応条件の量を表現する数は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。
【０４１１】
特定された全ての特許および他の刊行物は、本発明に関連して使用されるであろうこのような刊行物に記載の例えば方法を説明および開示する目的で、参照により本明細書に明確に組み入れられる。これらの刊行物は、本出願の出願日前のその開示についてのみ提供される。これに関して、本発明者らが先行発明によってまたは任意の他の理由のためにこのような開示に先んじる権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。これらの文書の内容に関する日付または表示に関する全ての記載は、出願人に利用可能な情報に基づき、これらの文書の日付または内容の正確さに関するいかなる承認も構成するものではない。
【０４１２】
特記しない限り、本明細書において使用された全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の専門家によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。あらゆる公知の方法、装置および材料を、本発明の実践または試験に使用し得るが、これに関する方法、装置および材料が本明細書に記載されている。
【０４１３】
本発明のいくつかの態様を以下の項目に記載する：
1．CDKN1C、DNMT3B、EGR1、ETV6、EVI1、GATA2、GFI1B、GLIS2、HLF、HMGA2、HOXA5、HOXA9、HOXB3、HOXB4、HOXB5、IGF2BP2、IKZF2、KLF12、KLF4、KLF9、LMO2、MEIS1、MSI2、MYCN、NAP1L3、NDN、NFIX、NKX2-3、NR3C2、PBX1、PRDM16、PRDM5、RARB、RBBP6、RBPMS、RUNX1、RUNX1T1、SMAD6、TAL1、TCF15、VDR、ZFP37、ZFP467、ZFP521、ZFP532、およびZFP612から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、またはそれ以上の造血幹細胞（HSC）誘導因子をコードする1つまたは複数の発現ベクターを含む、HSC誘導組成物。
2．少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子が、HLF、RUNX1T1、PBX1、LMO2、PRDM5、ZFP37、MYCN、MSI2、NKX2-3、MEIS1、およびRBPMSである、項目1のHSC誘導組成物。
3．少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子が、HLF、RUNX1T1、ZFP37、PBX1、LMO2、およびPRDM5である、項目1のHSC誘導組成物。
4．a．HLFをコードする核酸配列；
b．RUNX1T1をコードする核酸配列；
c．ZFP37をコードする核酸配列；
d．PBX1をコードする核酸配列；
e．LMO2をコードする核酸配列；および
f．PRDM5をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物。
5．a．PRDM16をコードする核酸配列；
b．ZFP467をコードする核酸配列；および
c．VDRをコードする核酸配列
のうちの1つまたは複数をさらに含む、項目4のHSC誘導組成物。
6．a．HLFをコードする核酸配列；
b．RUNX1T1をコードする核酸配列；
c．PBX1をコードする核酸配列；
d．LMO2をコードする核酸配列；
e．PRDM5をコードする核酸配列；
f．ZFP37をコードする核酸配列；
g．MYCNをコードする核酸配列；
h．MSI2をコードする核酸配列；
i．NKX2-3をコードする核酸配列；
j．MEIS1をコードする核酸配列；および
k．RBPMSをコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物。
7．a．ZFP467をコードする核酸配列；
b．PBX1をコードする核酸配列；
c．HOXB4をコードする核酸配列；および
d．MSI2をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物。
8．a．HLFをコードする核酸配列；
b．LMO2をコードする核酸配列；
c．PRDM16をコードする核酸配列；および
d．ZFP37をコードする核酸配列
のうちの1つまたは複数をさらに含む、項目7のHSC誘導組成物。
9．a．MYCNをコードする核酸配列；
b．MSI2をコードする核酸配列；
c．NKX2-3をコードする核酸配列；および
d．RUNX1T1をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物。
10．a．HOXB5をコードする核酸配列；
b．HLFをコードする核酸配列；
c．ZFP467をコードする核酸配列；
d．HOXB3をコードする核酸配列；
e．LMO2をコードする核酸配列；
f．PBX1をコードする核酸配列；
g．ZFP37をコードする核酸配列；および
h．ZFP521をコードする核酸配列
のうちの1つまたは複数をさらに含む、項目9のHSC誘導組成物。
11．a．HOXB4をコードする核酸配列；
b．PBX1をコードする核酸配列；
c．LMO2をコードする核酸配列；
d．ZFP467をコードする核酸配列；および
e．ZFP521をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクター組成物を含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物。
12．a．KLF12をコードする核酸配列；
b．HLFをコードする核酸配列；および
c．EGR1をコードする核酸配列
のうちの1つまたは複数をさらに含む、項目11のHSC誘導組成物。
13．a．MEIS1をコードする核酸配列；
b．RBPMSをコードする核酸配列；
c．ZFP37をコードする核酸配列；
d．RUNX1T1をコードする核酸配列；および
e．LMO2をコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物。
14．a．KLF12をコードする配列；および
b．HLFをコードする配列
のうちの1つまたは複数をさらに含む、項目13のHSC誘導組成物。
15．a．ZFP37をコードする核酸配列；
b．HOXB4をコードする核酸配列；
c．LMO2をコードする核酸配列；および
d．HLFをコードする核酸配列
を含む1つまたは複数の発現ベクターを含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物。
16．a．MYCNをコードする核酸配列；
b．ZFP467をコードする核酸配列；
c．NKX2-3をコードする核酸配列；
d．PBX1をコードする核酸配列；および
e．KLF4をコードする核酸配列
のうちの1つまたは複数をさらに含む、項目15のHSC誘導組成物。
17．1つまたは複数の発現ベクターがレトロウイルスベクターである、項目4〜16のいずれか一項のHSC誘導組成物。
18．1つまたは複数の発現ベクターがレンチウイルスベクターである、項目4〜16のいずれか一項のHSC誘導組成物。
19．レンチウイルスベクターが誘導性レンチウイルスベクターである、項目18のHSC誘導組成物。
20．以下の工程を含む、体細胞から誘導造血幹細胞（iHSC）を調製するための方法：
a．HLFをコードする核酸配列、RUNX1T1をコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；およびPRDM5をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これによりiHSCを調製する工程。
21．工程（a）の形質導入が、PRDM16をコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；およびVDRをコードする核酸配列のうちの1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む、項目20の方法。
22．以下の工程を含む、体細胞から誘導造血幹細胞（iHSC）を調製するための方法：
a．HLFをコードする核酸配列；RUNX1T1をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；PRDM5をコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；MYCNをコードする核酸配列；MSI2をコードする核酸配列；NKX2-3をコードする核酸配列；MEIS1をコードする核酸配列；およびRBPMSをコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これによりiHSCを調製する工程。
23．以下の工程を含む、体細胞から誘導造血幹細胞（iHSC）を調製するための方法：
a．ZFP467をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；HOXB4をコードする核酸配列；およびMSI2をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これによりiHSCを調製する工程。
24．工程（a）の形質導入が、HLFをコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；PRDM16をコードする核酸配列；およびZFP37をコードする核酸配列のうちの1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む、項目23の方法。
25．以下の工程を含む、体細胞から誘導造血幹細胞（iHSC）を調製するための方法：
a．MYCNをコードする核酸配列；MSI2をコードする核酸配列；NKX2-3をコードする核酸配列；およびRUNX1T1をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これによりiHSCを調製する工程。
26．工程（a）の形質導入が、HOXB5をコードする核酸配列；HLFをコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；HOXB3をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；およびZFP521をコードする核酸配列のうちの1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む、項目25の方法。
27．以下の工程を含む、体細胞から誘導造血幹細胞（iHSC）を調製するための方法：
a．HOXB4をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；およびZFP521をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これによりiHSCを調製する工程。
28．工程（a）の形質導入が、KLF12をコードする核酸配列；HLFをコードする核酸配列；およびEGR1をコードする核酸配列のうちの1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む、項目27の方法。
29．以下の工程を含む、体細胞から誘導造血幹細胞（iHSC）を調製するための方法：
a．MEIS1をコードする核酸配列；RBPMSをコードする核酸配列；ZFP37をコードする核酸配列；RUNX1T1をコードする核酸配列；およびLMO2をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これによりiHSCを調製する工程。
30．工程（a）の形質導入が、KLF12をコードする核酸配列；およびHLFをコードする核酸配列のうちの1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む、項目29の方法。
31．以下の工程を含む、体細胞から誘導造血幹細胞（iHSC）を調製するための方法：
a．ZFP37をコードする核酸配列；HOXB4をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；およびHLFをコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これによりiHSCを調製する工程。
32．工程（a）の形質導入が、KLF12をコードする核酸配列；およびHLFをコードする核酸配列のうちの1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む、項目31の方法。
33．以下の工程を含む、体細胞から誘導造血幹細胞（iHSC）を調製するための方法：
a．ZFP37をコードする核酸配列；HOXB4をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；およびHLFをコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターを体細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入された体細胞を、造血幹細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これによりiHSCを調製する工程。
34．工程（a）の形質導入が、MYCNをコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；NKX2-3をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；およびKLF4をコードする核酸配列のうちの1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む、項目33の方法。
35．体細胞が線維芽細胞である、項目20〜34のいずれか一項の方法。
36．体細胞が造血系列細胞である、項目20〜34のいずれか一項の方法。
37．造血系列細胞が、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、網状赤血球、赤血球、肥満細胞、破骨細胞、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、リンパ球、NK細胞、NKT細胞、自然リンパ球、複能性造血前駆細胞、少能性造血前駆細胞、および系列の限定された造血前駆細胞から選択される、項目36の方法。
38．造血系列細胞が、複能性前駆細胞（MPP）、骨髄球系共通前駆細胞（CMP）、顆粒球・単球系前駆細胞（GMP）、リンパ球系共通前駆細胞（CLP）、およびプレ巨核球・赤血球系前駆細胞から選択される、項目36の方法。
39．造血系列細胞が、巨核球・赤血球系前駆細胞（MEP）、プロB細胞、プレB細胞、プレプロB細胞、プロT細胞、ダブルネガティブT細胞、プロNK細胞、プロ樹状細胞（プロDC）、プレ顆粒球/マクロファージ細胞、顆粒球/マクロファージ前駆（GMP）細胞、およびプロ肥満細胞（プロMC）から選択される、項目36の方法。
40．以下の工程を含む、骨髄球系列へのプロプレB細胞の分化転換を促進する方法：
a．ZFP467をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；HOXB4をコードする核酸配列；およびMSI2をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターをプロプレB細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入されたプロプレB細胞を、骨髄球系列細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これによりプロプレB細胞を骨髄球系列へと分化転換する工程。
41．工程（a）の形質導入が、HLFをコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；PRDM16をコードする核酸配列；およびZFP37をコードする核酸配列のうちの1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む、項目40の方法。
42．以下の工程を含む、プロプレB細胞の生存および/または増殖を高める方法：
a．HOXB4をコードする核酸配列；PBX1をコードする核酸配列；LMO2をコードする核酸配列；ZFP467をコードする核酸配列；およびZFP521をコードする核酸配列を含む1つまたは複数のベクターをプロプレB細胞に形質導入する工程であって、各々の該核酸配列が、プロモーターに機能的に連結されている、工程；ならびに
b．形質導入されたプロプレB細胞を、プロプレB細胞の増殖を支持する細胞培地中において培養し、これによりプロプレB細胞の生存および/または増殖を高める工程。
43．工程（a）の形質導入が、KLF12をコードする核酸配列；HLFをコードする核酸配列；およびEGR1をコードする核酸配列のうちの1つまたは複数を含む1つまたは複数のベクターをさらに含む、項目42の方法。
44．項目20〜39のいずれか一項の方法によって産生された、単離された誘導造血幹細胞（iHSC）。
45．項目44の複数の誘導造血幹細胞（iHSC）を含む細胞クローン。
46．薬学的に許容される担体をさらに含む、項目45の細胞クローン。
47．項目1〜19のいずれか一項の1つまたは複数の発現ベクター構成要素を含むHSC誘導組成物を含む、誘導造血幹細胞（iHSC）を作製するためのキット。
48．人工多能性幹細胞。
49．体細胞、多能性細胞、前駆細胞または幹細胞を、CDKN1C、DNMT3B、EGR1、ETV6、EVI1、GATA2、GFI1B、GLIS2、HLF、HMGA2、HOXA5、HOXA9、HOXB3、HOXB4、HOXB5、IGF2BP2、IKZF2、KLF12、KLF4、KLF9、LMO2、MEIS1、MSI2、MYCN、NAP1L3、NDN、NFIX、NKX2-3、NR3C2、PBX1、PRDM16、PRDM5、RARB、RBBP6、RBPMS、RUNX1、RUNX1T1、SMAD6、TAL1、TCF15、VDR、ZFP37、ZFP467、ZFP521、ZFP532、およびZFP612をコードする遺伝子をコードする核酸またはこのような遺伝子によってコードされるタンパク質からなる群より選択される少なくとも1個の因子と接触させることによって誘導された、誘導造血幹細胞。
50．少なくとも1個の因子が、HLF、RUNX1T1、PBX1、LMO2、PRDM5、ZFP37、MYCN、MSI2、NKX2-3、MEIS1、およびRBPMSからなる群より選択される、項目49の誘導造血幹細胞。
51．少なくとも1個の因子が、HLF、RUNX1T1、ZFP37、PBX1、LMO2、およびPRDM5からなる群より選択される、項目49の誘導造血幹細胞。
52．体細胞、多能性細胞、前駆細胞または幹細胞を、少なくとも2個の因子と接触させる、項目49〜51のいずれか一項の誘導造血幹細胞。
53．体細胞、多能性細胞、前駆細胞または幹細胞を、少なくとも3個の因子と接触させる、項目49〜51のいずれか一項の誘導造血幹細胞。
54．体細胞、多能性細胞、前駆細胞または幹細胞を、少なくとも3個の因子と接触させる、項目49〜51のいずれか一項の誘導造血幹細胞。
55．体細胞、多能性細胞、前駆細胞または幹細胞を、少なくとも4個の因子と接触させる、項目49〜51のいずれか一項の誘導造血幹細胞。
56．体細胞、多能性細胞、前駆細胞または幹細胞を、少なくとも5個の因子と接触させる、項目49〜51のいずれか一項の誘導造血幹細胞。
57．体細胞、多能性細胞、前駆細胞または幹細胞を、少なくとも6個の因子と接触させる、項目49〜51のいずれか一項の誘導造血幹細胞。
58．体細胞、多能性細胞、前駆細胞または幹細胞を、少なくとも7個の因子と接触させる、項目49〜51のいずれか一項の誘導造血幹細胞。
59．体細胞、多能性細胞、前駆細胞または幹細胞を、少なくとも8個の因子と接触させる、項目49〜51のいずれか一項の誘導造血幹細胞。
60．少なくとも1個のベクターを含む、項目49〜59のいずれか一項の誘導造血幹細胞。
61．ベクターが幹細胞のゲノムに組み込まれる、項目60の誘導造血幹細胞。
62．体細胞が線維芽細胞である、項目49〜61のいずれか一項の誘導造血幹細胞。
63．体細胞が造血系列細胞である、項目49〜61のいずれか一項の誘導造血幹細胞。
64．造血系列細胞が、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球、網状赤血球、赤血球、肥満細胞、破骨細胞、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板、単球、マクロファージ、樹状細胞、リンパ球、NK細胞、NKT細胞、自然リンパ球、複能性造血前駆細胞、少能性造血前駆細胞、および系列の限定された造血前駆細胞から選択される、項目63の誘導造血幹細胞。
65．造血系列細胞が、複能性前駆細胞（MPP）、骨髄球系共通前駆細胞（CMP）、顆粒球・単球系前駆細胞（GMP）、リンパ球系共通前駆細胞（CLP）、およびプレ巨核球・赤血球系前駆細胞から選択される、項目63の誘導造血幹細胞。
66．造血系列細胞が、巨核球・赤血球系前駆細胞（MEP）、プロB細胞、プレB細胞、プレプロB細胞、プロT細胞、ダブルネガティブT細胞、プロNK細胞、プロ樹状細胞（プロDC）、プレ顆粒球/マクロファージ細胞、顆粒球/マクロファージ前駆（GMP）細胞、およびプロ肥満細胞（プロMC）から選択される、項目63の誘導造血幹細胞。
67．幹細胞が、胚性幹細胞またはその後代である、項目49〜61のいずれか一項の誘導造血幹細胞。
68．幹細胞が、人工多能性幹細胞またはその後代である、項目49〜61のいずれか一項の誘導造血幹細胞。
69．体細胞、多能性細胞、前駆細胞または幹細胞において、CDKN1C、DNMT3B、EGR1、ETV6、EVI1、GATA2、GFI1B、GLIS2、HLF、HMGA2、HOXA5、HOXA9、HOXB3、HOXB4、HOXB5、IGF2BP2、IKZF2、KLF12、KLF4、KLF9、LMO2、MEIS1、MSI2、MYCN、NAP1L3、NDN、NFIX、NKX2-3、NR3C2、PBX1、PRDM16、PRDM5、RARB、RBBP6、RBPMS、RUNX1、RUNX1T1、SMAD6、TAL1、TCF15、VDR、ZFP37、ZFP467、ZFP521、ZFP532、およびZFP612をコードする遺伝子をコードする核酸からなる群より選択される少なくとも1個の因子の発現を増加または誘導することによって誘導された、誘導造血幹細胞。
70．増加または誘導することが、体細胞、多能性細胞、前駆細胞または幹細胞を、項目69の少なくとも1個の因子の発現を増加または誘導することのできる少なくとも1つの小分子と接触させることによって実施される、項目69の誘導造血幹細胞。
71．項目20〜43の方法のいずれか1つによって作製された誘導造血幹細胞。
72．項目48〜71のいずれかの誘導造血幹細胞のクローンまたは後代。
73．項目48〜72のいずれかの誘導造血幹細胞から分化した分化後代細胞。
74．CDKN1C、DNMT3B、EGR1、ETV6、EVI1、GATA2、GFI1B、GLIS2、HLF、HMGA2、HOXA5、HOXA9、HOXB3、HOXB4、HOXB5、IGF2BP2、IKZF2、KLF12、KLF4、KLF9、LMO2、MEIS1、MSI2、MYCN、NAP1L3、NDN、NFIX、NKX2-3、NR3C2、PBX1、PRDM16、PRDM5、RARB、RBBP6、RBPMS、RUNX1、RUNX1T1、SMAD6、TAL1、TCF15、VDR、ZFP37、ZFP467、ZFP521、ZFP532、およびZFP612から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、またはそれ以上の造血幹細胞（HSC）誘導因子をコードする改変されたmRNA配列を含む、HSC誘導組成物であって、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである、HSC誘導組成物。
75．少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子が、HLF、RUNX1T1、PBX1、LMO2、PRDM5、ZFP37、MYCN、MSI2、NKX2-3、MEIS1、およびRBPMSである、項目74のHSC誘導組成物。
76．少なくとも1個、2個、3個、4個、またはそれ以上のHSC誘導因子が、HLF、RUNX1T1、ZFP37、PBX1、LMO2、およびPRDM5である、項目74のHSC誘導組成物。
77．a．HLFをコードする改変されたmRNA配列；
b．RUNX1T1をコードする改変されたmRNA配列；
c．ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；
d．PBX1をコードする改変されたmRNA配列；
e．LMO2をコードする改変されたmRNA配列；および
f．PRDM5をコードする改変されたmRNA配列
を含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物であって、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである、HSC誘導組成物。
78．a．PRDM16をコードする改変されたmRNA配列；
b．ZFP467をコードする改変されたmRNA配列；および
c．VDRをコードする改変されたmRNA配列
のうちの1つまたは複数をさらに含む、HSC誘導組成物であって、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである、項目77のHSC誘導組成物。
79．a．HLFをコードする改変されたmRNA配列；
b．RUNX1T1をコードする改変されたmRNA配列；
c．PBX1をコードする改変されたmRNA配列；
d．LMO2をコードする改変されたmRNA配列；
e．PRDM5をコードする改変されたmRNA配列；
f．ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；
g．MYCNをコードする改変されたmRNA配列；
h．MSI2をコードする改変されたmRNA配列；
i．NKX2-3をコードする改変されたmRNA配列；
j．MEIS1をコードする改変されたmRNA配列；および
k．RBPMSをコードする改変されたmRNA配列
を含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物であって、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである、HSC誘導組成物。
80．a．ZFP467をコードする改変されたmRNA配列；
b．PBX1をコードする改変されたmRNA配列；
c．HOXB4をコードする改変されたmRNA配列；および
d．MSI2をコードする改変されたmRNA配列
を含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物であって、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである、HSC誘導組成物。
81．a．HLFをコードする改変されたmRNA配列；
b．LMO2をコードする改変されたmRNA配列；
c．PRDM16をコードする改変されたmRNA配列；および
d．ZFP37をコードする改変されたmRNA配列
のうちの1つまたは複数をさらに含む、HSC誘導組成物であって、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである、項目80のHSC誘導組成物。
82．a．MYCNをコードする改変されたmRNA配列；
b．MSI2をコードする改変されたmRNA配列；
c．NKX2-3をコードする改変されたmRNA配列；および
d．RUNX1T1をコードする改変されたmRNA配列
を含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物であって、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである、HSC誘導組成物。
83．a．HOXB5をコードする改変されたmRNA配列；
b．HLFをコードする改変されたmRNA配列；
c．ZFP467をコードする改変されたmRNA配列；
d．HOXB3をコードする改変されたmRNA配列；
e．LMO2をコードする改変されたmRNA配列；
f．PBX1をコードする改変されたmRNA配列；
g．ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；および
h．ZFP521をコードする改変されたmRNA配列
のうちの1つまたは複数をさらに含む、HSC誘導組成物であって、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである、項目82のHSC誘導組成物。
84．a．HOXB4をコードする改変されたmRNA配列；
b．PBX1をコードする改変されたmRNA配列；
c．LMO2をコードする改変されたmRNA配列；
d．ZFP467をコードする改変されたmRNA配列；および
e．ZFP521をコードする改変されたmRNA配列
を含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物であって、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである、HSC誘導組成物。
85．a．KLF12をコードする改変されたmRNA配列；
b．HLFをコードする改変されたmRNA配列；および
c．EGRをコードする改変されたmRNA配列
のうちの1つまたは複数をさらに含む、HSC誘導組成物であって、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである、項目84のHSC誘導組成物。
86．a．MEIS1をコードする改変されたmRNA配列；
b．RBPMSをコードする改変されたmRNA配列；
c．ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；
d．RUNX1T1をコードする改変されたmRNA配列；および
e．LMO2をコードする改変されたmRNA配列
を含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物であって、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである、HSC誘導組成物。
87．a．KLF12をコードする改変されたmRNA配列；および
b．HLFをコードする改変されたmRNA配列
のうちの1つまたは複数をさらに含む、HSC誘導組成物であって、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである、項目86のHSC誘導組成物。
88．a．ZFP37をコードする改変されたmRNA配列；
b．HOXB4をコードする改変されたmRNA配列；
c．LMO2をコードする改変されたmRNA配列；および
d．HLFをコードする改変されたmRNA配列
を含む、造血幹細胞（HSC）誘導組成物であって、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである、HSC誘導組成物。
89．a．MYCNをコードする改変されたmRNA配列；
b．ZFP467をコードする改変されたmRNA配列；
c．NKX2-3をコードする改変されたmRNA配列；
d．PBX1をコードする改変されたmRNA配列；および
e．KLF4をコードする改変されたmRNA配列
のうちの1つまたは複数をさらに含む、HSC誘導組成物であって、各々の該改変されたmRNA配列の各シトシンが改変されたシトシンであるか、各々の該改変されたmRNA配列の各ウラシルが改変されたウラシルであるか、またはその組合せである、項目88のHSC誘導組成物。
90．改変されたシトシンが5-メチルシトシンであり、改変されたウラシルがプソイドウラシルである、項目74〜89のいずれか一項のHSC誘導組成物。
91．改変されたmRNA配列が、ピリジン-4-オンリボヌクレオシド、5-アザ-ウリジン、2-チオ-5-アザ-ウリジン、2-チオウリジン、4-チオ-プソイドウリジン、2-チオ-プソイドウリジン、5-ヒドロキシウリジン、3-メチルウリジン、5-カルボキシメチル-ウリジン、1-カルボキシメチル-プソイドウリジン、5-プロピニル-ウリジン、1-プロピニル-プソイドウリジン、5-タウリノメチルウリジン、1-タウリノメチル-プソイドウリジン、5-タウリノメチル-2-チオ-ウリジン、1-タウリノメチル-4-チオ-ウリジン、5-メチル-ウリジン、1-メチル-プソイドウリジン、4-チオ-1-メチル-プソイドウリジン、2-チオ-1-メチル-プソイドウリジン、1-メチル-1-デアザ-プソイドウリジン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、2-チオ-ジヒドロウリジン、2-チオ-ジヒドロプソイドウリジン、2-メトキシウリジン、2-メトキシ-4-チオ-ウリジン、4-メトキシ-プソイドウリジン、4-メトキシ-2-チオ-プソイドウリジン、5-アザ-シチジン、プソイドイソシチジン、3-メチル-シチジン、N4-アセチルシチジン、5-ホルミルシチジン、N4-メチルシチジン、5-ヒドロキシメチルシチジン、1-メチル-プソイドイソシチジン、ピロロ-シチジン、ピロロ-プソイドイソシチジン、2-チオ-シチジン、2-チオ-5-メチル-シチジン、4-チオ-プソイドイソシチジン、4-チオ-1-メチル-プソイドイソシチジン、4-チオ-1-メチル-1-デアザ-プソイドイソシチジン、1-メチル-1-デアザ-プソイドイソシチジン、ゼブラリン、5-アザ-ゼブラリン、5-メチル-ゼブラリン、5-アザ-2-チオ-ゼブラリン、2-チオ-ゼブラリン、2-メトキシ-シチジン、2-メトキシ-5-メチル-シチジン、4-メトキシ-プソイドイソシチジン、4-メトキシ-1-メチル-プソイドイソシチジン、2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、7-デアザ-アデニン、7-デアザ-8-アザ-アデニン、7-デアザ-2-アミノプリン、7-デアザ-8-アザ-2-アミノプリン、7-デアザ-2,6-ジアミノプリン、7-デアザ-8-アザ-2,6-ジアミノプリン、1-メチルアデノシン、N6-メチルアデノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、2-メチルチオ-N6-(シス-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、N6-グリシニルカルバモイルアデノシン、N6-トレオニルカルバモイルアデノシン、2-メチルチオ-N6-トレオニルカルバモイルアデノシン、N6,N6-ジメチルアデノシン、7-メチルアデニン、2-メチルチオ-アデニン、および2-メトキシ-アデニン、イノシン、1-メチル-イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、7-デアザ-グアノシン、7-デアザ-8-アザ-グアノシン、6-チオ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-8-アザ-グアノシン、7-メチル-グアノシン、6-チオ-7-メチル-グアノシン、7-メチルイノシン、6-メトキシ-グアノシン、1-メチルグアノシン、N2-メチルグアノシン、N2,N2-ジメチルグアノシン、8-オキソ-グアノシン、7-メチル-8-オキソ-グアノシン、1-メチル-6-チオ-グアノシン、N2-メチル-6-チオ-グアノシン、およびN2,N2-ジメチル-6-チオ-グアノシン、およびその組合せからなる群より選択される、1つまたは複数のヌクレオシドの改変を含む、項目74〜90のいずれか一項のHSC誘導組成物。
92．項目74〜91のいずれか一項の改変されたmRNA配列構成要素を含むHSC誘導組成物を含む、誘導造血幹細胞（iHSC）を作製するためのキット。
【実施例】
【０４１４】
HSCの初期化では、そうでなければ非自己複製である系列制限細胞に対して自己複製能および多系列能の両方を付与することが必要になる。誘導HSCは、また、生産的な造血を持続するために、幹細胞ニッチと相互作用することができ、長い休止（静止）期間を調節し、サイクル中に動員された場合、下流の前駆細胞を生成する能力を依然として保持することができなければならない。本明細書に記載するアプローチは、複数の転写因子を持つレンチウイルスの混液を用いて、方向付けられた細胞に形質導入を行うことを可能にし、これらの因子の数千の組合せの効率的なコンビナトリアルスクリーニングを可能にする。さらに、本明細書に記載するインビボでの移植アプローチでは、下流の前駆細胞に付与される幹細胞の機能的な潜在能をスクリーニングし、稀な初期化事象でさえ、アッセイ系の固有の自己選択的性質に起因して同定することが可能になる：機能的なHSCに初期化された細胞だけが長期の多系列再構築に寄与することができるのに対し、初期化されていない細胞は、移植時に特定系列の一過性の再構築に寄与するだけである（いずれの前駆細胞が使用されるのかに依存する）。成熟細胞が本来安定であることが、成熟細胞を初期化する課題の1つとして認識されている。これは、しかし、分化の過程において多能性、少能性、系列制限前駆細胞を含む、本発明者らが最初に初期化することを試みる集団には必ずしも当てはまらない。さらに、発生的にHSCの近くにある前駆細胞は、誘導幹細胞の運命にエピジェネティックにより関連し、したがって、それへの初期化により許容的である可能性が高い。同時に、HSCへの血液細胞の初期化の臨床への橋渡しは、患者の末梢血から容易に得ることができる分化した細胞型を初期化する能力から最も利益を得る場合がある。
【０４１５】
HSCの初期化を媒介する候補遺伝子の同定は、HSCの遺伝子発現プロファイルだけでなく、全ての下流の造血前駆細胞およびエフェクター細胞の詳細な知識を必要とする。これに対して、本発明者らは、高度に精製されたHSCの発現プロファイルを、造血分化に含まれる下流の細胞型の大部分と比較するマイクロアレイ発現プロファイリングアプローチに着手している（図1）。マイクロアレイ分析を、以前に記載された通りに実施した。合計では、40の集団からの248の発現プロファイルを、利用可能なデータベースから慎重に精選されたデータセットに加えて、未公開および公開データを含めて生成し、コンパイルした（図1）。全てのデータセットは、R/BioconductorのArrayQualityMetricsパッケージを使用したストリンジェントな品質管理に供し、これらの基準を満たしていないデータは破棄した。正規化データの教師なし階層的クラスター分析では、直系関係および造血階層の階層構造が繰り返されることもできるが、データの生物学的な頑強性を確認していることが示された。
【０４１６】
選択された造血集団の発現データセットが公開されているが、本発明者らが生成し、本明細書に記載するデータセットは、幹細胞から利用可能なエフェクター細胞までの造血の分子属性の最も包括的なデータベースを示す。このデータベースを使用し、本発明者らは、任意の造血細胞型において特異的に発現される遺伝子を容易に同定することができる（図3）。そのような細胞型に特異的な遺伝子リストの分析は、機能的に重要な遺伝子を同定することができることを示す。
【０４１７】
HSCにおいて増強されているTFをクローニングするために、本発明者らが、FACS精製HSCから生成したcDNAライブラリーを使用し、それによって、HSCにおいて特有に動作するスプライシング変異体のクローニングが可能になる。これと一致して、本発明者らは、マイナーな変異体である、または以前に報告されていないかのいずれかのNkx2-3、Msi2、Runx1、ならびにPrdm16およびZfp467についてのスプライシング変異体をクローニングした。今日まで、本発明者らは、これらのTFを成功裏にクローニングし、配列決定により、それらの完全性を確認してきた。
【０４１８】
HSCの初期化因子を同定するための、本明細書に記載するアプローチの実行可能性を試験するために、実験を行い、それにおいて、前駆細胞は、22個の個々のTFを形質導入し、上に詳述する表現型および機能アッセイにより評価した。1例を示すと、MPP（ckit+Sca1+lin-flk2+CD34+CD150-CD48+）または骨髄球系前駆細胞（ckit+Sca1-lin-CD150-CD48+）におけるHLFの強制発現は、エクスビボでの培養の時間経過にわたり、原始CD150+lin-表面表現型（原始幹/前駆細胞と一致する）を伴う形質導入細胞の有意な画分を与えることができた。Doxの存在下での培養の30日後、細胞をサイトスピンし、染色し、それは、HLF形質導入培養物が、巨核球、マクロファージ、顆粒球、および前駆細胞を含む複数の細胞型を含むことを明らかにしたのに対し、対照培養物は、マクロファージだけを含んでいた。連続CFCアッセイにおける機能評価では、HLFが、試験された全ての前駆細胞に対して広範な自己複製能を与えることが示された。各々の連続播種でのコロニー組成物の検討では、HLF発現が、原始CFU-GEMMを含む多様なコロニー型をもたらすことが明らかになった。重要なことには、Doxの中止は、自己複製能および多系列能の両方の喪失をもたらし、HLF（挿入変異誘発ではない）が機能的活性に関与することを示した。複数の独立実験によって、これらの結果が確認された。インビボでのアッセイを次に実施し、移植アッセイにおいて、HLFが、そうでなければ短期再構築のMPPに対して長期多系列能を与えることができることが実証された。
【０４１９】
Rosa26-rtTAドナーからのFACS選別された前駆細胞に対して、個々の細胞に複数の異なるウイルスを送達することを意図した感染の多重度のTF保有レンチウイルスの混液を用いて形質導入を行う。ウイルス力価の等価性、感染の独立性、および各ウイルスにより細胞の20％を感染させるために十分なウイルス力価を仮定し、本発明者らは、少なくとも3つの異なるウイルス（28の因子形質導入のための3,276の並べ替え）を用いて各細胞に形質導入を行うことを合理的に確信するために、4×104個の細胞の形質導入が要求されると計算している。この計算は、3を上回るウイルスで感染されている細胞は考慮に入れないが、より多くのウイルスを用いて形質導入された細胞が生じる可能性があり、初期化のために要求され得る。下流の何万または何十万もの造血前駆細胞を、単一のドナーマウスから容易に選別することができるため、幹細胞状態を再確立することが可能な因子の組み合わせを用いて1つまたは複数の細胞が形質導入される可能性を最大にする目的で、多数の細胞に形質導入を行うことができる。
【０４２０】
異なる前駆細胞集団は、それらのエピジェネティックな状態およびHSCへの発生的な近接性に依存し、初期化を多かれ少なかれ受けやすい可能性がある。これを説明し、本発明者らの成功の可能性を最大にするために、MPPflk2-、MPPflk2+、CLP、プロB細胞、プロT細胞、CMP、MEP、およびGMPを含む、造血階層の全ての枝からのFACS精製された多能性、少能性の系列制限前駆細胞が、異なる実験において使用されてきた。形質導入された前駆細胞（CD45.2）が、照射されたコンジェニック（CD45.1）レシピエント中に、レシピエントの生存を確実にするために、放射線防御用量のCD45.1骨髄細胞と共に移植される。前述のように、使用されているレンチウイルス系はDox誘導性であり、ドキシサイクリンは、移植後1〜4週間の期間にわたり移植マウスに投与される。なぜなら、これは、HSCに対して最も遠い血液細胞を初期化するのに十分な長さにすべきであるからである。対照的に、誘導多能性への血液細胞の初期化には、3〜4週間を要する。
【０４２１】
移植レシピエントを、ドナー由来のB細胞、T細胞、および顆粒球/単球についての末梢血液分析染色により、24週間にわたり4週間間隔で評価した。対照を用いて形質導入された、または初期化が不成功であった前駆細胞は、特定の系列を一過性に再構築することが予測されるのに対し、誘導幹細胞の状態に成功裏に初期化された細胞は、第一レシピエントにおける長期の多系列再構築を支持するそれらの能力により同定される。この方法において、本明細書に記載するアプローチは、初期化因子を同定するための強い選択基準を有する。重要なことには、本明細書に記載する組成物および方法を使用して生成された誘導HSCが、内因性HSCと同様に機能する場合、少数の誘導HSCの存在でさえ、このアッセイ系において読み出されるはずである。なぜなら、単一のHSCが、移植アッセイにおいて読み出され、検出されることができるからである。このように、初期化の効率が低い場合でさえ、誘導HSCを依然として同定することができる。
【０４２２】
偽陽性として同定される本発明者らの前駆細胞選別からの混入HSCの意図しない移植を制御するために、選別された前駆細胞に対して対照ウイルスを用いて形質導入を行い、試験レシピエントと並べて移植した。下流の細胞がHSCに初期化され得る最終的な証明は、本明細書に記載するように、プロB細胞のようなV（D）J組換えを受けた前駆細胞が出発細胞型として使用される場合に達成され得る。なぜなら、そのような誘導HSCに由来する全ての血液細胞を、組換え遺伝子座についてスクリーニングすることができ、これは、iHSCを同定するための「バーコード」としての役割を果たすことができるからである。
【０４２３】
本明細書に記載するインビボでの戦略を、初期化に影響を与える能力について、数千のTFの組み合わせの潜在能をスクリーニングするために設計する。しかし、複数のウイルスでトランスフェクトされた細胞がスクリーニングされているため、いずれのTFが、成功裏の初期化実験において活性を媒介したかを決定するために追加の工程が必要である。これを達成するために、安定的な長期の多系列再構築を示すレシピエントからのドナー由来の顆粒球を、FACSで選別し、DNAを抽出し、本明細書で実証するように、TFを因子特異的なPCRによりクローニングすることが行われ得る。顆粒球を使用する。なぜなら、それらは短命であり、それらの継続的な産生が、進行中の幹細胞活性からもたらされるからである。各TFについてのプライマー対が、本明細書に記載するように、設計され、試験されてきた。
【０４２４】
本明細書に記載するように、初期化のために要求されるTFの最小限の補完物を決定するために実験を実施した。本明細書に示すように、その後の形質導入/移植実験から個々のTFを除去し、次に、初期化能力について喪失をアッセイすることで、これが達成される。ひとたび所与の前駆細胞を初期化することが可能なTFの最小セットが決定された場合、同じセットの因子が、また、異なる血液系列の初期化を媒介することができるか否かを、本明細書に記載するように、試験することができる。実験は、異なる少能性の前駆細胞を使用して行われており、これらの実験での成功に依存して、B細胞、T細胞、および単球/マクロファージを含む末端のエフェクター血液細胞が試験される。
【０４２５】
全ての初期化研究に関連する重要な問題は、初期化に影響を与えることができる効率である。これを決定するために、限界希釈移植実験を、検証された初期化因子を形質導入された血液細胞を用いて実施した。これを効果的に行うために、初期化因子のコア補完物を含むポリシストロン性レンチウイルスを構築する。そのようなポリシストロン性ウイルスの使用は、全ての細胞に全ての因子が形質導入され、それにより限界希釈頻度、および、延長により、初期化効率の正確な決定が可能になることを確実にすることが重要である。初代精製HSCを、これらの実験において対照として使用する。
【０４２６】
本明細書に記載する組成物、方法、およびキットのいくつかの態様において、HSC誘導因子、例えばHLF、RUNX1T1、PBX1、LMO2、PRDM5、ZFP37、MYCN、MSI2、NKX2-3、MEIS1、およびRBPMSなどをコードする核酸配列を、1つまたは複数の誘導性レンチウイルスベクターを使用して導入または送達する。1つまたは複数の誘導性レンチウイルスベクターを使用して送達されたHSC誘導因子の発現の制御は、いくつかの態様において、誘導性プロモーターの制御下で、またはそれに機能的に連結された発現ベクター中の少なくとも1つのHSC誘導因子を有する細胞を、調節剤（例、ドキシサイクリン）または他の誘導剤と接触させることにより達成することができる。誘導性レンチウイルスベクターの一部の型を使用する場合、そのような細胞を誘導剤と接触させることによって、HSC誘導因子の発現が誘導され、一方で、調節剤の中止によって発現が阻害される。誘導性レンチウイルスベクターの他の型を使用する場合、調節剤の存在によって発現が阻害され、調節剤の除去によって発現が可能になる。本明細書で使用する場合、用語「発現の誘導」は、誘導剤の存在における、例えば、または細胞において遺伝子の内因性発現を起こす1つまたは複数の薬剤もしくは因子の存在における遺伝子（例えば誘導性ウイルスベクターによりコードされるHSC誘導因子）の発現を指す。
【０４２７】
本明細書に記載する局面のいくつかの態様において、ドキシサイクリン（Dox）誘導性レンチウイルス系が使用される。レトロウイルスとは異なり、レンチウイルスは、静止状態の細胞に形質導入することができ、細胞がより多様な造血細胞型の形質導入を受け入れやすいようにする。例えば、pHAGE2レンチウイルス系は、高効率で初代造血前駆細胞に形質導入することが示されている。このベクターは、また、ウイルス形質導入効率の評価およびFACSによる形質導入細胞の精製を可能にするレポーターカセット（IRES Zs-Green）を保有する。導入された転写因子を誘導的にオフにする能力は、本明細書で実証するように重要である。なぜなら、これらのTFのHSCにおいて増強された発現パターンは、誘導HSCにおける継続的な強制発現が、全ての系列への分化を損なう可能性があることを示すためである。誘導系を有することはまた、初期化状態の安定性の確認を可能とし、一旦初期化因子の強制発現が解かれれば、HSC転写プログラムおよびエピジェネティックマークの確立および忠実度の評価を可能とする。
【０４２８】
本明細書において実証するように、ポリシストロン性ウイルス発現系の使用によって、体細胞からiHSCへのインビボでの初期化効率を増加させることができる。したがって、本明細書に記載する局面のいくつかの態様において、ポリシストロン性レンチウイルスベクターが使用される。そのような態様において、本明細書に記載するHSC誘導因子の2つまたはそれ以上をコードする配列は、ポリシストロン性転写物として、単一のプロモーターから発現される。ポリシストロン性発現ベクター系は、内部リボソーム侵入部位（IRES）要素を使用して、多重遺伝子またはポリシストロン性メッセージを作製する。IRES要素は、5'-メチル化キャップ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回し、内部部位で翻訳を開始することができる（Pelletier and Sonenberg, 1988）。IRES要素は、異種オープンリーディングフレームに連結させることができる。複数のオープンリーディングフレームは、一緒に転写されることができ、各々がIRESにより分離され、このように、ポリシストロン性メッセージを作製する。IRES要素によって、各々のオープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームにとってアクセス可能となる。複数の遺伝子が、単一のプロモーター/エンハンサーを使用して効率的に発現され、単一のメッセージを転写することができる。例えば、米国特許第4,980,285号；第5,925,565号；第5,631,150号；第5,707,828号；第5,759,828号；第5,888,783号；第5,919,670号；および第5,935,819号；ならびにSambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press (1989)を参照のこと。
【０４２９】
本明細書に記載する実験は、本明細書に記載するアプローチが、HSC初期化に影響を与えるための実行可能なアプローチであることを示す。本明細書に記載するように、対照、または17個の異なるTFウイルスのプールを用いて形質導入された精製MPP（ckit+Sca1+lin-flk2+CD34+CD150-）を、照射されたコンジェニックレシピエント中に移植した。予測通り、対照ウイルスを用いて形質導入されたMPPは、長寿命のBおよびT細胞を生じたが、それらの骨髄球系列の潜在能は、移植後8週目までに急速に消滅し、MPPが自己複製しないという事実と一致した。しかし、17個の因子の混液を用いて形質導入されたMPPは、レシピエントマウスにおいて長期の骨髄球系BおよびT細胞再構築を生じ、誘導HSCの運命へのこれらの前駆細胞の成功裏の初期化を示す。この実験における全ての移植レシピエントが、再構築された多系列であったという事実は、初期化が稀な事象ではなかったことを示す。
【０４３０】
多能性および自己複製を厳密に試験するために、誘導HSCは、本明細書に記載するように、ストリンジェントな細胞表面基準により、移植後4ヶ月目の第一移植レシピエントの骨髄（BM）からFACS精製される。これらの細胞は、内因性の非操作HSCとの比較で、それらの機能的な潜在能を計測するために、第二（2°）のレシピエント中に変動用量（10、50、250個細胞）で（放射防御BM細胞と一緒に）連続的に移植する。レシピエントの末梢血分析は、多能性および長期自己複製を評価するために、4ヶ月間にわたり毎月の間隔で実施する。加えて、3°および4°移植は、誘導HSCの絶対的な複製能力を確立するために実施することができる。1°および2°レシピエントの移植後4ヶ月目のBM分析は、誘導HSCが原始幹細胞区画を再構築する範囲を決定するために行われる。同時に、ドナー由来の骨髄球系、栓球-赤血球系、およびリンパ球系前駆細胞区画を定量化して、異なる前駆細胞区画を生じさせる誘導HSCの能力を評価する。
【０４３１】
厳密に精製された単一HSCは、移植レシピエントの約40％の頻度で照射レシピエントを再構築することができる。誘導HSCをクローン的に評価するために、単一の初期化されたHSCは、第一レシピエントのBMから選別され、本明細書に記載するように、放射線防御BM細胞と一緒に照射第二レシピエント中に移植された。ドナーキメラ化の末梢血分析を上に記載するように行い、個々のクローンの機能的能力を評価する。メチルセルロースにおけるCFC活性も、誘導HSCのクローン性能力を評価するために使用される。精製された未操作HSCは、これらのアッセイにおける対照として使用する。
【０４３２】
分子レベルでの初期化の忠実度を検討するために、ドナー由来の誘導HSCを、本明細書に記載するように、移植後4ヶ月目のレシピエントマウスのBMからFACS精製し、RNA抽出し、マイクロアレイ分析を記載するように実施することができる。結果として得られるデータを、本発明者らの造血発現データベースに正規化し、教師なし階層的クラスター分析を、本明細書中に記載するように、誘導HSCが、内因性HSCの分子シグネチャーを再現する程度を決定するために実施する。qRT-PCR分析は、記載するように、マイクロアレイデータの完全性を確認するために実施される。
【０４３３】
最後に、分子レベルでの初期化のストリンジェントな評価が、エピジェネティックなマークがどの程度まで忠実に再確立されているかを決定することにより、最善に達成される。これを検討するために、選別された誘導HSCおよび内因性HSCを、減少表現バイサルファイトディープシーケンシングを使用するゲノムワイドなメチル化分析に供し、これは、ゲノムスケールでのCpGメチル化状態のヌクレオチドレベルの解像度を提供する。
【０４３４】
本明細書に記載するように、本発明者らは、qRT-PCR、およびレポーター活性により測定されるように、個々のTFの比較的高い発現レベルを達成するためにドキシサイクリンを用いる。しかし、成功裏の初期化は、一定の範囲内の発現レベルを要求することがある。これを考慮して、ドキシサイクリンは、異なる発現レベルを達成するために調整され得る。レンチウイルス組込みが、初期化に寄与する遺伝子を偶発的に活性化し、そのような方法において、導入されたTFの初期化活性に関する解釈を混乱させる可能性がある。しかし、その後の検証実験は、これについて制御するように設計することができる。
【０４３５】
本明細書に記載する組成物および方法についての重要な考慮は、誘導HSCが、長期多系列再構築を媒介するための適切なニッチへのホーミングおよび占有が可能でなければならないということである。致死量で放射線照射されたレシピエント中へ導入前駆細胞を移植することによって、このホーミングを可能にすることができる。なぜなら、放射線照射は、少なくとも部分的に、それらの骨髄ニッチから内因性HSCを一掃するように作用し、移植HSCによる占有を促進するからである。さらに、HSCは、それらの生物学の通常の経過において、それらのニッチを出る、循環する、次に、ニッチへ再ホーミングする能力を有するため、誘導HSCは、生産的なニッチへホーミングし、生産的なニッチにおいて常在を確立することが可能であるべきである。しかし、誘導HSCが骨髄内で適切に生着しない場合、直接的な大腿内注射の代替戦略を適用し、照射されたレシピエントの骨髄中に、形質導入された前駆細胞を直接的に入れることができる。あるいは、重要なHSCホーミング受容体であるCxcr4を用いた同時形質導入を使用し、誘導HSCの適切なホーミングを促進することができる。
【０４３６】
本明細書に記載する系における誘導性TF発現は、ドキシサイクリン（Dox）およびtetトランスアクチベーター（rtTA）の存在を要求する。これに向けて、TFを含むウイルスを用いて同時形質導入され得るrtTAレンチウイルスがクローニングされてきた。本発明者らは、また、rtTAがRosa26遺伝子座から構成的に発現されるトランスジェニック株を得ている。これらのマウスから単離された細胞を使用することによって、rtTAの同時形質導入についての必要性が取り除かれる。全てのウイルスは、Jurkat細胞を使用して力価測定される。実験は、高効率（50〜90％）でルーチン的に精製された造血前駆細胞に形質導入することができる高力価ウイルスを生成することができること、および本系がインビボで厳密にDox誘導性であることを示す。
【０４３７】
HSC状態に前駆細胞を初期化することが可能なHSC誘導因子は、継続的な強制発現を介して、形質導入された前駆細胞へHSCの表現型特性を導入することが可能であることができる。これを評価するために、TF形質導入前駆細胞を、フローサイトメトリーによりエクスビボでの培養の間にHSCと関連付けられるマーカーについてモニターした。実験は、最初に、単一のTF形質導入を使用して行うことができ、TFが同時形質導入される実験が続く。これらの実験のために、FACS精製された前駆細胞に対して、ウイルスを用いて2日間にわたり形質導入を行い、その後、形質導入細胞（Zs-Green陽性）を再選別する。200〜500個の細胞を、HSC支持培地中で培養するためにウェル中に播種する。フローサイトメトリーを、1ヶ月にわたり1週間の間隔で実施する。細胞の免疫染色は、CD150、および系列マーカー用の抗体（分化細胞に対する抗体の混液）を用いて実施することができる。なぜなら、これらは、多様な条件下でのHSC同定のために信頼できることが示されているからである。これらのマーカーで評価が陽性の転写因子を、Sca1、CD48、CD105、およびCD20127を含む追加のHSCマーカーを使用して検討することができる。30日目に、培養物を、サイトスピンし、染色（メイグリュンワルド）し、細胞型を評価する。
【０４３８】
どの出発細胞が初期化されるかに依存して、いくつかの態様においては、例えば、B系列に方向付けられた細胞を使用する場合など、下流の前駆細胞を誘導HSCの運命に戻すために、系列特異的因子をノックダウンすることが要求され得る。
【０４３９】
（表５）HSC誘導因子のリバースクローニングのために使用されるプライマー配列
2016513974.tif 000047
2016513974.tif 000048
2016513974.tif 000049
【０４４０】
ヒト肝白血病因子（HLF）、mRNA（SEQ ID NO: 9）および最適化されたコドン、または同じアミノ酸をコードする異なるコドンもまた、本明細書に示す核酸を参照することにより必然的に包含されることが企図される。
【０４４１】
ヒトLIMドメインオンリー2（rhombotin様1）（LMO2）、転写産物変異体1、mRNA（SEQ ID NO: 21）および最適化されたコドン、または同じアミノ酸をコードする異なるコドンもまた、本明細書に示す核酸を参照することにより必然的に包含されることが企図される。
【０４４２】
ヒトMeisホメオボックス1（MEIS1）、mRNA（SEQ ID NO: 22）および最適化されたコドン、または同じアミノ酸をコードする異なるコドンもまた、本明細書に示す核酸を参照することにより必然的に包含されることが企図される。
【０４４３】
ヒトmusashi RNA結合タンパク質2（MSI2）、転写産物変異体1、mRNA（SEQ ID NO: 23）および最適化されたコドン、または同じアミノ酸をコードする異なるコドンもまた、本明細書に示す核酸を参照することにより必然的に包含されることが企図される。
【０４４４】
ヒトv-myc骨髄球腫症ウイルス関連癌遺伝子、神経芽細胞腫由来（鳥）（MYCN）、mRNA（SEQ ID NO: 24）および最適化されたコドン、または同じアミノ酸をコードする異なるコドンもまた、本明細書に示す核酸を参照することにより必然的に包含されることが企図される。
【０４４５】
ヒトNK2ホメオボックス3（NKX2-3）、mRNA（SEQ ID NO: 28）および最適化されたコドン、または同じアミノ酸をコードする異なるコドンもまた、本明細書に示す核酸を参照することにより必然的に包含されることが企図される。
【０４４６】
ヒトプレB細胞白血病ホメオボックス1（PBX1）、転写物変異体2、mRNA（SEQ ID NO: 30）および最適化されたコドン、または同じアミノ酸をコードする異なるコドンもまた、本明細書に示す核酸を参照することにより必然的に包含されることが企図される。
【０４４７】
ヒトPRドメイン含有5（PRDM5）、mRNA（SEQ ID NO: 32）および最適化されたコドン、または同じアミノ酸をコードする異なるコドンもまた、本明細書に示す核酸を参照することにより必然的に包含されることが企図される。
【０４４８】
複数のスプライシングを伴うヒトRNA結合タンパク質（RBPMS）、転写産物変異体3、mRNA（SEQ ID NO: 35）および最適化されたコドン、または同じアミノ酸をコードする異なるコドンもまた、本明細書に示す核酸を参照することにより必然的に包含されることが企図される。
【０４４９】
ヒトrunt関連転写因子1；転座1（サイクリンD関連）（RUNX1T1）、転写産物変異体5、mRNA（SEQ ID NO: 37）および最適化されたコドン、または同じアミノ酸をコードする異なるコドンもまた、本明細書に示す核酸を参照することにより必然的に包含されることが企図される。
【０４５０】
ヒトZFP37ジンクフィンガータンパク質（ZFP37）、mRNA（SEQ ID NO: 42）および最適化されたコドン、または同じアミノ酸をコードする異なるコドンもまた、本明細書に示す核酸を参照することにより必然的に包含されることが企図される。
【０４５１】
実施例2
インビトロでの代替の系列能およびインビボでの方向付けられた前駆細胞に対する多系列生着能を付与することができる因子の同定
多様な細胞型の初期化のための実験的戦略は、一般的に、異なる細胞型に対して、1つの細胞型の細胞特性および分子特性を付与することができる1つまたは複数の遺伝子の作用に頼る。本発明者らは、HSCの下流の造血後代に関連してHSCにおいて比較的制限された発現を伴う調節因子が、自己複製能および多系列分化能を含む基本的なHSC特性の基礎となる遺伝子ネットワークの調節を通じて、HSCの機能的同一性を定義することに含まれる可能性が高いとの仮説を立てた。したがって、本発明者らは、方向付けられた血液細胞におけるそのような因子の一過性の異所性発現がHSCの機能的特性をそれらに植え付け、それらをHSC様状態に戻すように、潜在的に、安定的に初期化し得ると推論した。そのような因子を同定するために、本発明者らは、HSCに加えて、造血前駆細胞およびエフェクター細胞の大部分を含む、本発明者らが生成した40の異なる精製された造血細胞型のマイクロアレイデータを分析した。これらのデータセット（合計142アレイ）を、幹細胞からエフェクター細胞までの造血の包括的な分子概要を提供する単一のデータベース中に一緒に標準化した。このデータベースを使用し、本発明者らは、それらの下流の後代に関連してHSCにおいて比較的制限された発現を伴う36個の調節因子を同定した。これらは、転写因子をコードする33個の遺伝子、および翻訳調節因子をコードする3つの遺伝子を含んだ（図58A）。本発明者らの仮説と一致して、HSCのコア特性を調節する際での公知の役割を伴う複数の遺伝子が同定され、それらは、Ndn（Kubota et al., 2009）、Evi1（Yuasa et al., 2005）、Meis1（Hisa et al., 2004）、HLF（Gazit et al.）、Egr1（Min et al., 2008）を含んだ。本発明者らは、また、HSC生物学において未研究のままである複数の調節タンパク質を同定した。36個の因子の各々を、次に、レポーターカセット（Zs-Green）（Mostoslavsky et al., 2005）を持つドキシサイクリン誘導性レンチウイルスにクローニングし、高力価ウイルスを産生した（図58B）。
【０４５２】
成熟細胞が本来安定であることが、成熟細胞の初期化への課題の1つと認識されている（Zhou and Melton, 2008）。これは、分化の過程における一過性の細胞型である、少能性および系列の方向付けられた造血前駆細胞には必ずしも当てはまらない。さらにHSCの近くの前駆細胞は、よりエピジェネティックにHSCに関連しているため（Bock et al., 2012）、本発明者らは、これらが、HSC様状態に戻す初期化をより受けやすいであろうと推論した。このように、本発明者らは、最初に、本発明者らが、コロニー形成アッセイにおいて、そうでなければB細胞に制限される前駆細胞へと、骨髄球系列の潜在能を植え付ける36個の因子の能力をアッセイすることにより、系列制限前駆細胞に代替系列の潜在能を付与することができるか否かを決定しようとした。本発明者らは、Rosa26遺伝子座（Rosa26rtTA）からのリバーステトラサイクリン制御トランスアクチベーター（rtTA）を発現するマウスからプロ/プレB細胞（CD19+B220+AA4.1+IgM-）を精製し（図65）、対照ウイルス（Zs-green）、または36-因子ウイルス混液を用いてそれらに形質導入を行った。形質導入細胞を、次に、ドキシサイクリンに曝露し、その後、骨髄球促進サイトカインの存在下でメチルセルロース中へ播種した（図58C）。これらの実験では、対照形質導入プロ/プレB細胞が、予測通り、骨髄球系コロニーを形成することができなかったのに対し、36-因子混液を用いて形質導入した細胞は、顆粒球、赤血球、巨核球、およびマクロファージを含む多様な骨髄球系列を保有するコロニーを容易に生じることが示された（図58D〜E）。
【０４５３】
本発明者らは、次に、36-因子混液の一過性の異所性発現が、インビボで系列制限リンパ球系または骨髄球系前駆細胞へとHSC様の潜在能を付与するか否かを決定した。本発明者らは、HSCが、移植時に骨髄破壊レシピエントにおける長期多系列再構築が可能である造血細胞だけであるのに対し、下流の前駆細胞は、それらの分化の段階に依存して制限された系列能を伴うレシピエントマウスを一過性にだけ再構築するとの事実を利用した（図59A）。さらに、本発明者らは、移植アッセイの感度によって、単一のHSCだけでも、検出可能な多系列生着を生じさせることができ、稀な初期化事象でさえ検出を可能にし得ると推論した。このように、長期的な再構築能でそれらを植え付けることが可能な因子の組み合わせを用いて形質導入された前駆細胞だけが、このアッセイにおいて読み出され得る。これに向けて、本発明者らは、Rosa26rtTAマウス（CD45.2）からプロ/プレB細胞または骨髄球系共通前駆細胞（CMP: lin-c-kit+Sca1-Fc□rlowCD34+）を精製し、ドキシサイクリンの存在下での対照（Zs-green）または36個の因子を持つウイルスでの2日間の形質導入プロトコールに続き、本発明者らは、それらを、放射線防御骨髄細胞（CD45.1）と共に、致死量の放射線を照射したコンジェニックレシピエント（CD45.1）中に移植した（図59A）。ドキシサイクリンを移植後2週間にわたり飲用水で維持し、導入された因子の異所性発現を維持し、その後、ドキシサイクリンを中止した。実験の16週間の経過にわたる再構築マウスの末梢血液分析では、予測通り、対照を用いて形質導入されたプロ/プレB細胞またはCMPがドナー由来の長期生着を生じないことが明らかになった（図59B〜C）。対照的に、36-因子形質導入B細胞前駆細胞（3/15）またはCMP（2/8）を用いて移植されたレシピエントの少数が、長期的なドナー由来の再構築を示した（図59B〜C）。再構築マウスの1匹を除く全てが、B、T、および骨髄球系細胞の多系列生着を示したが、各系列の生着の程度は、異なるレシピエントの間で変動した（図59D）。実験のプロ/プレB細胞群からの選別されたドナー由来の骨髄球系細胞のV（D）J組み換えの分析では、IG遺伝子座の重鎖の組換えにより証明される通り、再構築細胞のB系列起源が確認された（図59E）。ゲル中の複数の重鎖バンドの観察は、再構築細胞がポリクローナルであることを示した。
【０４５４】
これらの実験では、36-因子混液からの1つまたは複数の因子が、そうでなければ方向付けられているリンパ球系および骨髄球系前駆細胞に、長期多系列再構築能を植え付けることができることが示された。この潜在能の付与において含まれ得る因子を決定するために、本発明者らは、ドナー由来の骨髄球系B細胞、およびT細胞を選別し、PCRベースの戦略を使用して36個の因子の各々の存在について試験した（図59F、表5）。この分析では、複数の因子を、再構築マウスの各々からのドナー由来細胞において特定することができたのに対し、6つの転写因子、Hlf、Runx1t1、Pbx1、Lmo2、Zfp37、およびPrdm5が、複数の系列における再構築されたレシピエントの全てにおいて一貫して検出されることが明らかになった（図59G）。
【０４５５】
6つの転写因子（Hlf、Runx1t1、Pbx1、Lmo2、Zfp37、およびPrdm5）は、インビトロで前駆細胞能を初期化し、インビボで長期多系列生着能を付与するのに十分である
本発明者らは、次に、本発明者らが、本発明者らのインビボでのスクリーニングにおいて同定した6つの転写因子が、メチルセルロース中で骨髄球系コロニー形成能をプロ/プレB細胞へ与えるのに十分であるか否かを評価した。本発明者らが36-因子混液を用いて観察した通り（図58D〜E）、Hlf、Runx1t1、Pbx1、Lmo2、Zfp37、およびPrdm5のウイルスの組み合わせを用いた形質導入は、これらのアッセイにおいて骨髄球系列の潜在能を伴う系列制限B細胞前駆細胞を植え付けることができた（図60A〜B）。6つの転写因子（6-TF）の各々についての要求性を試験するために、本発明者らは、因子の各々を形質導入混液から順次除く「Nマイナス1」実験を用いた（図60C）。これらの実験では、Hlf、Runx1t1、Pbx1、Lmo2、およびZfp37が、全て、インビトロでプロ/プレB細胞へと骨髄球系コロニー形成能を植え付けるために要求されるのに対し、5因子混液マイナスPrdm5は、依然として、6-TFの組み合わせよりも低い数であるが、骨髄球系コロニーを生じることが明らかになった（図60C）。
【０４５６】
本発明者らは、次に、6-TF混液が、移植アッセイにおいて方向付けられた骨髄球またはB細胞前駆細胞への長期的な多系列再構築能を付与するために十分であるか否かを試験した。精製されたプロ/プレB細胞（CD45.2）に対して、対照（Zs-green）ウイルスまたは6-TF混液を用いて形質導入を行い、その後、コンジェニックレシピエント（CD45.1）中に移植した。対照形質導入細胞とは対照的に、長期的な多系列再構築は、6-TFを形質導入したプロ/プレ細胞またはCMP細胞をそれぞれ移植した1/13および2/12のレシピエントにおいて観察された（図60D）。実験の経過を通したレシピエントマウスの末梢血液分析は、全ての場合において、再構築されたレシピエントからのドナー由来細胞が、多系列生着を示すことを明らかにした（図60D〜F）。重鎖の再構成は、プロ/プレB細胞再構築マウスから選別されたドナー由来骨髄球系細胞で観察され、再構築細胞のB細胞起源が確認された（図60G）。これらの結果は、Hlf、Runx1t1、Pbx1、Lmo2、およびZfp37、およびPrdm5の一過性の異所性発現が、そうでなければ方向付けられている骨髄球系およびリンパ球系前駆細胞に長期的な多系列移植能を付与するのに十分であることを示す。
【０４５７】
Meis1およびMycnの包含ならびにポリシストロン性ウイルスの使用は、インビボでの初期化効率を改善する
本発明者らの6-TF移植実験におけるレシピエントマウスの多くにおけるドナー由来の再構築の非存在は（図60D）、方向付けられた前駆細胞へこの長期多系列能を付与する効率が低いことを示唆した。これを改善することを試みるために、本発明者らは、2Aペプチド配列（Runx1T1・Hlf・Lmo2（RHL）、Pbx1・Zfp37・Prdm5（PZP））により各々が分離された、3つの転写因子を持つポリシストロン性ドキシサイクリン誘導性レンチウイルスを開発した。本発明者らは、また、本発明者らが、インビトロコロニー形成実験において生成された原始的なコロニーから繰り返し同定した2つの追加の転写因子（MycnおよびMeis1）を含めた（図61A、66、データは示さず）。これらの戦略の有用性を試験するために、本発明者らは、対照ウイルスまたは個々のウイルスとしての8転写因子混液（8-TF）を用いて、あるいはMycnおよびMeis1を持つウイルスと共にRHLおよびPZPポリシストロン性ウイルス（8-TFポリ）を使用して、精製プロ/プレB細胞に形質導入を行い、以前の実験よりも大きな数字で照射コンジェニックレシピエント中にそれらを移植した。16週間の経過にわたる移植マウスの末梢血液分析では、ドナー由来キメラ化を示さない対照形質導入細胞（0/12）とは対照的に、8-TF（3/6）または8-TFポリ（9/14）のいずれかの形質導入細胞を用いて移植された複数のレシピエントが、ドナー由来キメラ化を示すことが明らかになった（図61B）。全てのレシピエントが、移植後18〜22週間で多系列再構築を示したが、ここでも、B細胞、T細胞、および骨髄球系キメラの程度はレシピエントの間で変動した（図61C〜D）。再構築細胞のB細胞起源が、ドナー由来の骨髄球系細胞におけるIG重鎖再構成の証拠によって確認され、多くのバンドの存在が、再構築細胞がポリクローナルであることを示した（図61E）。
【０４５８】
初期化細胞は、骨髄前駆細胞区画に生着し、かつ第二のレシピエントを再構築することができる
末梢血を再構築することに加えて、HSCは、移植時に第二の造血臓器および骨髄前駆細胞区画に効率的に生着する。8-TFまたは8 TFポリ混液を用いて形質導入されたB細胞前駆細胞が、この能力を保有していたか否かを判断するために、再構築マウスを屠殺し、移植後18〜20週目に分析し、これにより全てのマウスが、骨髄、脾臓、および胸腺のドナー由来キメラ化を有することが示されたが、そのレベルは、本発明者らが末梢において観察したように、レシピエント間で変動した（図62A）。生着細胞のプロ/プレB細胞起源が、骨髄および脾臓から精製された顆粒球および骨髄球系細胞、ならびに胸腺に由来するT細胞から単離されたDNAからのIG再構成の分析によって確認された（図62B）。骨髄細胞の免疫表現型検査では、リンパ球系共通前駆細胞（CLP: lin-Flk2+IL7R□+ckitlowSca1low）、CMP、顆粒球/単球前駆細胞（GMP: lin-ckit+Sca1-Fc□rhighCD34+）、巨核球/赤血球前駆細胞（MEP: lin-ckit+Sca1-Fc□r-CD34-）、原始LSK前駆細胞（lin-Sca1+ckit+) へのドナーの寄与が明らかになった（図62C〜F）。重要なことには、本発明者らは、また、巨核球前駆細胞（MkP: lin-c-kit+Sca1-CD41+）および赤血球前駆細胞（EP: lin-ckit+Sca1-Endoglin+）に対するドナーの寄与を観察し、再構築細胞が、本発明者らが使用したコンジェニックCD45ベースの移植系の末梢血中で追跡することができなかった系列である血小板および赤血球の前駆細胞を生じることができることを示唆する。LSK区画のサブ画分は、多能性の前駆細胞（MPP1: lin-ckit+Sca1+CD34+Flk2-、MPP2: lin-c-kit+Sca1+CD34+Flk2+）およびHSC（lin-c-kit+Sca1+CD34-Flk2-）区画のドナー由来の再構築を明らかにした（図62C〜62F）。ドナーマーク付き前駆細胞およびHSCでは、重鎖が再構成されていることが見出され、それらのB細胞起源が確認された（図62G）。
【０４５９】
HSC特性の定義は、それらの自己複製する能力であり、連続移植時に第二レシピエントを再構築する能力により証明することができる潜在能である。本発明者らの実験において生成された細胞が、この潜在能を保有するか否かを試験するために、本発明者らは、移植後18週目に第一レシピエントマウスを屠殺し、骨髄全体またはドナー由来のc-kit+細胞を第二コンジェニックレシピエント中に移植した。移植後4、8、および12週目の末梢血液分析では、全ての第二レシピエントマウス中のB、T、および骨髄球系細胞の頑強なドナー再構築が明らかになった（図62H〜I）。まとめると、これらの結果は、8つの転写因子の一過性の異所性発現が、多系列を再構築する潜在能を付与し、骨髄前駆細胞区画を再構築し、かつ長期的な自己複製の潜在能 −HSCの機能特徴− を系列制限B細胞前駆細胞に与えることを示す。
【０４６０】
移植可能なHSC細胞様細胞への、最終分化型骨髄球系細胞の初期化
HSCを誘導する血液細胞の初期化の最終的な臨床への橋渡しは、末梢血から容易におよび非侵襲的に得ることができる細胞型を初期化する能力から利益を得る可能性が高い。したがって、本発明者らは、多系列前駆細胞の活性を、本発明者らが同定した転写因子を使用して、最終分化型血液細胞に与えることができたか否かを決定しようとした。レシピエントおよびドナー由来の末梢血は、8-因子混液（8-TFまたは8TFポリ）を用いて形質導入されたプロ/プレB細胞を用いて移植されたマウスから、移植後16〜22週目（即ち、ドキシサイクリン誘導後14〜20週目）に選別した。次いで選別された細胞は、ドキシサイクリンの非存在および存在下で培養し（後者の条件は、形質導入因子の再発現をもたらすことを意図している）、その後、メチルセルロース中に細胞を播種した（図63A）。予測通り、ドキシサイクリンの非存在下で培養されかつ播種されたレシピエントマーク付き細胞またドナー由来細胞のいずれもコロニーを生じず、マウスの末梢血中での低レベルの前駆細胞活性と一致した（図63B）。対照的に、ドキシサイクリンへの曝露により8つの転写因子の再活性化が見られたドナー細胞を播種したプレートは、原始GEMMコロニーを含む混合骨髄球系コロニーを生じた（図63B）。末梢血中のいずれの系列が、転写因子の再発現時にこれらのコロニーを生じる潜在能があるのかを決定するために、本発明者らは、8-TF再構築マウスからドナー由来のB細胞、T細胞、骨髄球系細胞、および顆粒球を選別し、ドキシサイクリンの非存在または存在下での培養および播種に続き、それらのコロニー形成能を試験した。これらの実験では、本質的に全てのコロニー形成能が、骨髄球系細胞画分および顆粒細胞画分に由来することが明らかになった（図63C〜63D）。興味深いことに、選別された骨髄球系細胞から生成されたコロニーは、顆粒球に由来するコロニーよりもずっと大きかったが、より多数のコロニーは後者から生じた。
【０４６１】
これらの結果により後押しされ、本発明者らは、次に、本発明者らが特定した転写因子が、移植アッセイにおいて最終分化型骨髄球系細胞に多系列再構築能を付与するか否かを決定した。本発明者らは、Rosa26rtTAマウスからMac1+c-kit-骨髄球系エフェクター細胞を選別し、6-因子（6-TFポリ）、または8-因子混液（8-TFおよび8TFポリ）のいずれかを用いてそれらに形質導入を行い、照射されたコンジェニックレシピエント中にそれらを移植した。月間隔での末梢血液分析では、対照ウイルスを用いて形質導入された細胞を移植したマウスのいずれも再構築されなかったのに対し、6-TFポリ（4/7）、8-TF（3/6）、および8-TFポリ（7/8）を用いて形質導入された細胞を移植された複数のレシピエントは、長期的なドナー由来の生着を示すことが明らかになった（図63F、66）。再構築マウスの系列分析では、レシピエントの間で変動する各系列への寄与を伴うB細胞、T細胞、骨髄球、および顆粒球系列へのドナー由来の寄与が明らかになった（図63F）。第二の造血器官および骨髄前駆細胞区画へのドナー由来の寄与が、屠殺したマウスにおいて観察され、移植後20週目に分析された（図68A〜D）。ドナー由来の骨髄細胞の連続移植では、6-TFまたは8-TF形質導入骨髄球系エフェクターが、移植後12週目に、全ての系列において第二のレシピエントに生着することができることが実証された（図63G〜63H）。
【０４６２】
図58〜63に提示する機能データに基づき、本発明者らは、6つ（Hlf、Runx1t1、Pbx1、Lmo2、Zfp37、およびPrdm5）のまたは8つ（Hlf、Runx1t1、Pbx1、Lmo2、and Zfp37、Prdm5、Mycn、およびMeis1）の転写因子の一過性の異所性発現によって、分化造血前駆細胞およびエフェクター細胞が、HSCの機能的特性を持つ細胞へ初期化された。本発明者らは、これらの初期化細胞を誘導HSC（iHSC）と呼ぶ。
【０４６３】
iHSCの単一細胞発現プロファイリングは、部分的および完全な初期化の証拠を明らかにする
初期化されたiHSCが、内因性HSCの分子特性を再現する程度を評価するために、本発明者らは、152個の系列特異的転写因子、エピジェネティック修飾因子、細胞表面分子、および細胞周期調節因子の発現の同時定量を介して造血幹細胞および前駆細胞の同一性を正確に定義する、最近開発された単一細胞遺伝子発現プロファイリング方法を用いた（Guo et al., 2013）。本発明者らは、プロ/プレB細胞が、単一ウイルスとしての8-TF混液（8-TF）を用いて、またはポリシストロン性ウイルス（8-TFポリ）を用いて形質導入された2つの異なる実験から、免疫表現型（CD45.2+系列-ckit+Sca1+Fk2-CD34-/lowCD150+）によりドナー由来iHSCを選別し、分析した（図61）。両方の設定において、長期多系列ドナー由来の再構築を示すマウスを、移植後18週目に屠殺した。本発明者らは、また、対照としての役割を果たす、同じマウスからの宿主由来HSC（CD45.1+系列-ckit+Sca1+Fk2-CD34-/lowCD150+）を選別し、分析した。iHSCおよび宿主HSCから生成された単一細胞の発現データは、プロ/プレB細胞（出発細胞型）から生成されたデータとの、また、定常状態で精製されたHSC、MPP、CLP、CMP、GMP、およびMEPから以前に生成されたデータとの比較で分析された（Guo et al., 2013）。生データの分析では、対照および試験細胞型の大部分について、遺伝子発現の間での高い相関が明らかになった（図69、表6〜8）。分析された全ての細胞型間での転写関係をさらに調べるために、本発明者らは、主成分分析（PCA）を実施し、細胞間での転写距離を定義した。予測通り、定常状態のHSCおよび前駆細胞が、確立された直系関係と一致して大部分が位置付けられ（HSCは明確に定義されたクラスターを形成する）、MPPがHSCの近くに位置付けられ、少能性前駆細胞（MEP、GMP、CLP）がHSCからより遠くに位置付けられた（図64A）。プロ/プレB細胞が、これらの細胞型の間の直系関係と一致して、CLPの近くに位置付けられ、一方で、宿主由来のHSCが、予測通り、定常状態のHSCクラスター内に位置付けられた（図64A）。興味深いことに、2つの実験（8-TFまたは8-TFポリ）に由来するiHSCは、非常に異なる発現パターンを示し、8-TF単一ウイルス実験に由来するiHSCは、8-TFポリ形質導入細胞に由来するiHSCよりも不均一である（図64A、69、表6〜8）。結果として、これらの細胞のPCA分析では、iHSC 8-TFの一部が、HSCクラスターの近くに、またはその内に位置付けられ、他はMPP近くにマッピングされ、一方で、他は、まだ、プロ/プレBクラスターの近くに位置付けられることが示された（図64A）。対照的に、ポリシストロン性ウイルス（iHSC 8-TFポリ）を使用して誘導されたiHSCの全てが、HSCノード内で均一にクラスター化した（図64A）。教師なし階層的クラスタリング分析では、単一のウイルスを使用して誘導されたほぼ等しい数のiHSCが、HSCの近くにマッピングされた（7/23）のに対し、他は、MPPの近くにマッピングされ（7/23）、残りは、プロ/プレB細胞のより近くにマッピングされた（10/23）ことが確認された（図64B）。対照的に、ポリシストロン性アプローチを使用して誘導されたiHSCの全てが、宿主HSCおよび対照HSCと非常に高い類似性を示した（35/35）。
【０４６４】
これらの実験において分析された152個の遺伝子の中で、8つの初期化因子のうちの5つ（Mycn、Hlf、Lmo2、Meis1、およびPbx1）の包含によって、本発明者らが、これらの因子の内因性レベルが、初期化後のiHSCにおいてどのように再確立されたかについて取り組むことを可能にした。HSCの調節におけるそれらの公知の役割と一致して、MycN、Hlf、Lmo2、およびMeis1の各々の高レベルが、定常HSCにおいて観察され、プロ/プレB細胞において観察された低レベルとは対照的であった（図64D）。Pbx1発現が、HSCの大部分においてより低く、プロ/プレB細胞中では存在しなかった。逆に、Ebf1およびPax5は、B細胞の発生のための重要な転写因子であり、プロ/プレB細胞において高レベルで、HSCにおいて無視できるレベルで発現された。iHSCにおけるこれらの遺伝子の発現の分析によって、再び、単一またはポリシストロン性のウイルスが、それらの誘導のために使用されたか否かに依存し、明確な差が明らかになった。高レベルの内因性MycN、Hlf、Lmo2、Meis1および中レベルのPbx1が、単一のウイルスを使用して誘導されたiHSCの多くにおいて再確立されたのに対し、低レベルのこれらの遺伝子ならびに高レベルのEbf1およびPax5が、依然として細胞のかなりの割合において観察された（図64D）。対照的に、ポリシストロン性ウイルスを使用して誘導されたiHSCにおけるこれらの遺伝子の各々の発現は、対照HSCにおいて観察された発現パターンを完全に再現した（図64D）。HSCの機能のために重要であることが公知である転写因子Gfi1b、Gata2、およびNdnならびにサイトカイン受容体Mplおよびc-kitを含む分析された全ての他の遺伝子の発現が分析された（図64D、表6〜8）。まとめると、これらの結果は、単一のウイルスを使用したプロ/プレBの8-TF初期化が、完全または部分的のいずれかの初期化と一致する転写特性を伴うiHSCを生成するのに対し、最適なポリシストロン性ウイルス条件下で誘導されたiHSCは、HSCと同義の発現プロファイルを示すことを実証する。
【０４６５】
考察
造血系内では、HSCは、全ての血液系列に分化し、かつ生命のために自己複製する機能的能力を伴う唯一の細胞である。これらの特性は、移植時に条件付けられたレシピエントに生着するHSCの能力との組み合わせで、再生医療における幹細胞の使用のためのパラダイムを確立している。同種および自家HSC移植は、先天性および後天性の造血疾病ならびに他の悪性腫瘍のために、約50,000人患者/年の処置において使用される（Gratwohl et al., 2010）。移植治療への現在の課題は、組織適合ドナー細胞の利用可能性および関連する移植片対宿主疾病を含む。患者由来の細胞からの同質遺伝子HSCのデノボ生成は、これらの問題を解消し、組織適合ドナーを識別することができるものとは対照的に、全ての患者への移植を延長する。代替細胞型に由来するHSCは、このように、再生医療において長期間求められてきた目標となっている。本明細書において、本発明者らは、方向付けられた造血前駆細胞およびエフェクター細胞からの初期化を介した誘導HSCの生成を報告する。HSCにおいて増強されている36個の因子の同定および機能スクリーニングを介して、本発明者らは、その一過性異所性発現が、方向付けられた血液細胞にHSCの機能的な潜在能を付与するのに十分である6つの転写因子Hlf、Runx1t1、Pbx1、Lmo2、Zfp37、およびPrdm5因子を同定した。2つの追加の転写因子MycnおよびMeis1の包含、およびポリシストロン性ウイルスの使用によって、初期化の有効性が増加した。これらの知見は、方向付けられた血液細胞中の定義された転写因子の少数の異所性発現が、HSCの機能的な同一性を支配する遺伝子調節ネットワークを活性化するために十分であることを実証する。したがって、iHSCの誘導は、基本的なHSCの特性（例えば自己複製能および多系列分化能）の確立と維持の基本となる機構を探索するための新規な細胞ベースの系を示す。さらに、本発明者らの結果は、血液細胞の初期化が、最終的な臨床適用のためのパラダイムとしての役割を果たすこともできる移植可能な幹細胞の誘導のための実行可能な戦略であることを実証する。
【０４６６】
HSCは最も十分に特徴付けされている組織特異的幹細胞であるという事実にもかかわらず、それらの中心となる特性の調節に含まれる分子機構について驚くほどわずかしか知られていない。自己複製能および多系列分化能を、本来であれば非自己複製の系列制限細胞に安定的に付与することが可能な転写因子の定義されたセットの同定は、これらの因子が、HSCの機能的な同一性の基礎となる転写ネットワークの調節に決定的に含まれていることを実証する。これと一致して、本発明者らが同定した因子のいくつかが、以前にHSC生物学の多様な局面を調節するために重要であることが以前に示されている。例えば、PBX1およびMEIS1は、HOXタンパク質と相互作用し、かつHOXタンパク質とヘテロ二量体およびヘテロ三量体の複合体を形成することができ、両方とも、HSCの静止状態を維持することにより、HSCの自己複製を調節することが示されてきた（Ficara et al., 2008; Kocabas et al., 2012; Unnisa et al., 2012）。LMO2は、造血のために要求され、その非存在下では、原始または最終的な血液細胞のいずれも形成しない(Warren et al., 1994; Yamada et al., 1998)。ならびに、MYCNは、MYCの機能的冗長性に起因するHSC活性のために不可欠であるが、MycおよびMycNの両方の組み合わせアブレーションは、HSCの自己複製能および分化能を重度に破壊する（Laurenti et al., 2008）。これらの十分に特徴付けられた遺伝子とは対照的に、Prdm5およびZfp37は、HSCの生物学において未研究のままであり、急性骨髄性白血病におけるRUNX1との融合パートナーとしてのRUNX1T1（ETOとして公知である）の役割は十分に確立されているが、正常な造血におけるその役割は不明のままである。初期化因子の各々が正常HSC生物学において果たす役割を定義することは、血液細胞の初期化におけるそれらの機能を理解するために重要であろう。
【０４６７】
初期化因子が、初期化の間に、他の細胞型においてHSC機能の同一性の基礎となる転写ネットワークをどのように活性化および維持するかを解明することも、前進させる際に重要である。本発明者らが同定した8つの因子のうちの6つ、Hlf（Inaba et al., 1992）、Meis1（Moskow et al., 1995）、Lmo2（Boehm et al., 1991）、Mycn（Brodeur et al., 1984; Marx, 1984）、Pbx1（Kamps et al., 1991）、およびRunx1t1（Erickson et al., 1992）がプロトオンコジーンであることを考えると、iHSCへの血液細胞の初期化は、幹細胞および形質転換細胞に共通する遺伝子ネットワークの活性化および/または抑制を含む可能性が高いことを示唆する。これは、また、HSC形成、維持、または系列の方向付けのために要求される実質的に全ての転写因子が、ヘム悪性腫瘍における体細胞変異または転座により標的とされるとの知見と一致する{Orkin, 2008 #5327}。個々の初期化因子がその活性をどのように媒介するかについての一部の洞察が、最近の研究により提供されてきた。例えば、方向付けられたT細胞前駆細胞におけるLMO2過剰発現は、T細胞分化能を遮断することなく、持続性の自己複製活性により特徴付けられる前白血病状態をもたらし、これは、原始造血幹細胞および前駆細胞（HSPC）により通常発現される遺伝子集団の上方調節と関連付けられた（McCormack et al., 2010）。同様に、下流の多能性および少能性の骨髄球系前駆細胞におけるHLFの異所性発現は、その分化能を遮断することなく強力な自己複製活性をエクスビボでそれらに植え付け（CD150の発現に関連付けられる）、系列方向付けマーカーの抑制を持続させた（HSCと一致する表現型）（Gazit et al.）。HLF発現単独は、それにもかかわらず、下流の前駆細胞へHSC移植能を付与するために不十分であった（RG、BG、DJR未発表）。これらの研究は、HLFまたはLMO2の異所性発現が、方向付けられた血液細胞へHSCの機能的および分子的特性の少なくとも一部を植え付けることができるが、それらは、単独では、HSC機能を確立しかつ維持するために必要な転写プログラムの完全なレパートリーにアクセスできないことを示す。これらの点において、ポリシストロン性ウイルスを使用して生成されたiHSCの全てが、対照HSCとは区別できない発現プロファイルを示したのに対し、モノシストロンウイルスを使用して生成されたiHSCは、分析された細胞の多くで、分子レベルで不均一であり、部分的な初期化の明確な証拠を示すことは興味深い。これらの部分的初期化細胞の一部が、それらが由来するプロ/プレB細胞と密接にクラスター化されたことは、これらの細胞が、HSCと一致する免疫表現型により精製されているにもかかわらず、それらの起源細胞のエピジェネティックな記憶を保持していたことを示唆する。8-TFの単一ウイルス実験における部分的初期化iHSCは、初期化因子の完全な補完を受けなかった可能性が高い。仮にそうである場合、完全初期化細胞対部分的初期化細胞でのさらなる研究は、初期化因子がどのように協調し、HSCの機能的な同一性の基礎となる遺伝子調節ネットワークを活性化させるかに関する機械的な洞察を提供し得る。
【０４６８】
最適な8-TFポリシストロン性条件下で誘導されたiHSCの転写特性は、内因性HSCと区別できなかったが、さらなる分析が、これらの細胞のエピジェネティックな背景が、HSCのものに完全にリセットされたか否かを判断するために要求される。この点において、iHSCで再構築されたマウスにおける本発明者らの実験において観察された系列の潜在能は、常にではないが、時折、移植後の時間にわたり進化し、ドナー由来のキメラ化が、移植後の初期時点で系列のゆがみ、および後の時点でよりバランスのとれたアウトプットを示すことは興味深かった。これらの結果は、iHSCが、iPS細胞の継続的な継代で観察されるエピジェネティックな記憶の消去と同様の様式において、バランスのとれたHSCの潜在能を達成するための、それらのエピジェネティックな背景の完全なリセットに時間が必要であり得ることを示唆する（Polo et al., 2010）。細胞継代が、iHSC誘導の間にエピジェネティックな再設定に影響を及ぼすか否かは、この時点では不明である。iHSCが、完全なHSCの潜在能を達成するために、幹細胞ニッチにおける「成熟」の期間を要求し得ることは妥当である。本発明者らが分析した、部分的に初期化されたiHSCの一部が、MPLまたはKIT受容体を適切には上方制御しておらず、ニッチから発せられるTPOまたはSCFに応答してシグナルを伝達することができないことを示唆していることは注目に値する。
【０４６９】
転写因子は、発生の間に、異なる系列の特異化において重要な役割を果たし、したがって、HSCの機能的な同一性の基礎となる遺伝子調節ネットワークを活性化することが可能である転写因子のセットの発見は、最終的なHSCの生成を促進するために、多能性幹細胞に由来する細胞にこれらの因子を使用することが可能であり得ることを示唆する。これらのラインに沿って、最近の研究では、5つの転写因子HOXA9、RORA、ERG、SOX4、およびMYBの発現が、iPS由来の血液前駆細胞に一過性の骨髄赤血球生着の潜在能を付与することができたが、これらの因子は、細胞にHSCの潜在能を植え付けることはできないことが示された（Doulatov et al., 2013）。本発明者らが同定した初期化因子は、多様な系列の細胞に多能性を与える山中因子の能力と同様の様式で、造血系外の細胞型をiHSC運命に変換するために使用することができるか否かを試験することが重要であろうが、本発明者らが定義した因子を使用したiHSC誘導が、血液系に限定される可能性が残っている。それにもかかわらず、血液細胞の初期化を介したiHSCの生成は、最終的には臨床的な潜在能を伴う移植可能な幹細胞の誘導をもたらし得る、HSCの同一性の基礎となる基本的な機構を研究するための強力な新たな実験パラダイムを示す。
【０４７０】
材料および方法
マイクロアレイ：マイクロアレイデータは、Affymetrix 430 2.0プラットフォーム上で生成され、GEOからキュレーションされたデータセットに加えて、本発明者らの実験室で生成され、以前に公開されたデータを含んだ。全体的なデータベースは、公知の細胞表面表現型に基づく、40のFACS精製された造血細胞集団からの142の発現プロファイルからなる。全てのデータセットを、R/Bioconductor（http://www.bioconductor.org）のArrayQualityMetricsパッケージにおいて提供される品質管理（QC）対策に供した。データセットは、R/Bioconductorを使用して標準化（gcRMA）した。HSCの潜在的な調節因子を同定するために、本発明者らは、他の全てに対するHSC中での発現の比率が2.5倍よりも大きくなる必要のあるフィルターを適用した。潜在的な調節因子のリストは、公知の転写/翻訳調節の役割を伴う因子を同定するために、文献を相互参照することにより確定した。
【０４７１】
マウス：B6.SJL-Ptprca/BoyAiTac1（Taconic Farms; Hudson, NY）およびC57BL/6N（Charles River Laboratories; Cambridge, MA）レシピエントマウスならびにB6.CgGt（ROSA）26Sortm1（rtTA*M2）Jae/Jドナーマウス（Jackson, Bar Harbor, ME）を使用した。一部の実験については、CD45.1バックグラウンドと交配されたB6.CgGt（ROSA）26Sortm1（rtTA*M2）Jae/Jマウスを使用した。全てのマウスは、Harvard Medical School Animal Facilityにより承認されたプロトコールに従って維持し、全ての手順が、地域の倫理委員会から同意を得て実施された。
【０４７２】
プロ/プレB細胞、CMP、およびHSC精製：FACS精製において使用される抗体は、以下を含む：eBioscience（San Diego, CA）からのCD34、Sca1、c-kit、AA4.1；BD Bioscience（San Jose, CA）からのFc□R；IgM Sigma Aldrich（St. Louis, MO）；BioLegend（San Diego, CA）からのIL-7R□、Ter119、CD45.1、CD45.2、Mac1、CD3、CD4、CD8、Gr1、CD150、CD19、CD25、およびB220。6〜12週齢のB6 CD45.2+ rtTAヘテロ接合マウスを屠殺し、骨髄を、以前に記載された通りに収集した（Rossi et al. PNAS 2005）。プロ/プレB細胞を得るために、B220濃縮を、ビオチンB220（BD Bioscience）、ストレプトアビジン磁気ビーズ、および磁気カラム（Milteny Biotec）を使用して実施した。濃縮は、公開されたプロトコールに従って実施した。CMPを得るために、直接的にコンジュゲートされた磁気ビーズ（BD Bioscience）を使用したc-kit濃縮を、全骨髄細胞で実施した。細胞を、2％ FBSを含む試料培地中に直接的に選別した。全ての細胞を、FACS Aria II（Becton Dickinson）で選別した。
【０４７３】
ウイルス産生：因子は、以前に記載された通り（Gazit et al. 2013）、制限部位方向性（Not1およびBamH1）クローニングを使用して、TREレポーター下でpHage2 dox誘導性の系中にクローニングした。重要なことには、多数のこれらの構築物を、FACS選別されたHSCから作製されたcDNAライブラリーからクローニングした。全ての構築物を制限診断によりチェックし、完全に配列決定した。構築物（図58B）は、ZsGrレポーター発現を可能にするIRESを含む。ポリシストロン性（図61A）では個々のウイルスを組み合わせて、RHLおよびPZPを作製した。個々の因子（RUNX1T1、HLF、およびLMO2）および（PBX1、ZFP37、およびPRDM5）を、2A配列により分離されたそれぞれの制限部位Sal1、Spe1、BamH1中への非方向性クローニングおよび段階的挿入を使用して連結した。全ての構築物を制限消化診断によりチェックし、配列決定した。全ての36個の因子についてのウイルスが、以前に確立されたプロトコールに従って産生された（Mostoslavsky et al., 2005）。全てのウイルスは、Jurkat細胞で近似作業MOI約5.0まで調整される。
【０４７４】
プロ/プレBおよびCMPのCFCアッセイ：選別されたプロ/プレB細胞およびCMPを、rtTAトランスジェニックCD45.2+ドナー、および、示された場合、CD45.1+ドナーから単離した。60,000個細胞/200μL培地を、16時間、示したウイルスと共にインキュベートする。使用培地は、10ng/mL SCF、10ng/ml IL-12、10ng/ml TPO、5ng/mL Flk-3、および5ng/mL IL-7を添加したScloneである。形質導入後、1.0mg/mlのドキシサイクリン（Doxacycline）を48時間加え、次にメチルセルロースに移すか、または移植した。図4〜6の場合において、24時間のエクスビボでのdox誘導を実施した。なぜなら、より多くの細胞がこの時点で生存可能に見えたためである。
【０４７５】
CFCアッセイにおいて、10,000個のプロ/プレB細胞または1,000個のCMP細胞を、dox含有培地から移し、1.75mL/ウェルのM3630メチルセルロース（Stem Cell Technology）で希釈し、かつ混合し、6ウェルディッシュ中に播種した。20日後、コロニーをカウントし、形態により特徴付けた。
【０４７６】
エクスビボでのCFCの第二の初期化は、60,000個のドナー由来のFACS選別細胞を、10ng/mL SCF、10ng/ml IL-12、10ng/ml TPO、5ng/mL Flk-3、および5ng/mL IL-7を添加した500μLのF12培地を伴う12ウェルプレート中に播種することにより達成された。示した場合、1.0mg/mlのdoxを72時間加えた。10,000個の細胞を、次に、12ウェルフォーマット中の1.0mLのメチルセルロースに直接的に移した。20日後、コロニーをカウントし、古典的に定義された形態により特徴付けた。
【０４７７】
プロ/プレB細胞移植：移植は、10,000個のZsGr+選別された細胞または2.0×106個の選別されていないプロ/プレB/CMP細胞を、2×105個のB6 CD45.1+競合細胞と組み合わせることにより実施し、IR B6 CD45.1+レシピエント中に静脈内移植した。あるいは、選別され、形質導入されたプロ/プレB細胞およびCMPを、2×105個のSca1枯渇骨髄細胞（枯渇は、製造者の指示に従い、以前に記載されたMacs磁気枯渇カラムを用いて実施）を用いて非競合的に注射した。末梢採血は、4、8、12、および16週目に実施した。16週後、末梢血と同じ分析を、骨髄、脾臓、および胸腺で実施した。
【０４７８】
連続移植は、CD45.1+プロ/プレB細胞（>1.0％）またはCD45.2+Mac1+骨髄細胞（>5.0％）のいずれかからの再構築を伴う第一マウスから骨髄を単離することにより実施した。プロ/プレB細胞の場合において、全骨髄をカウントし、107個の細胞を、CD45.2+レシピエント中に非競合的に移植した。あるいは（c-kit二次）、10,000個の、FACS選別され、ダブレットで識別され、生細胞、系列陰性のc-kit+ドナーCD45.1+細胞を、2×105個のSca1枯渇細胞と共に、IRレシピエントおよび条件付けレシピエント中に非競合的に移植した。Mac1+骨髄再構築された全骨髄細胞を、ドナー（CD45.2+）についてFACS選別した。一般的に、5.0×106個のドナー由来のFACS選別細胞を、条件付けレシピエントおよびIRレシピエント中に非競合的に移植した。末梢採血は、4、8、および12週目に実施した。
【０４７９】
末梢血分析および骨髄分析：Flk2、CD34、c-kit、およびSca1抗体をeBioscience（San Diego, CA）から購入した。FcgR3（CD16）をBD Bioscience（San Jose, CA）から購入した。IL-7R□、SLAM（CD150）、Ter119、CD45.1、CD45.2、B220、Mac1、CD3、CD4、CD8、Gr1（Ly-6G/ Ly-6C）をBiolegend（San Diego, CA）から購入した。
【０４８０】
末梢血区画および前駆細胞区画の両方についての染色を、以前に記載されたように行った（Beerman, Rossi, Bryder）。細胞染色およびゲーティング戦略の例は、末梢血（図59B、60E、61C、および63G）および骨髄分析（図62A〜62Iおよび67）について記載されている。一般的には、末梢血集団は、B細胞（B220+）、骨髄球系細胞（Mac1+およびGr1-）、顆粒球（Mac1+およびGr1+）、T細胞（CD3+/CD4+/CD8+）を含む。
【０４８１】
前駆細胞集団は、例えば以下の通りに定義される：全てが、ダブレットで識別され、生細胞（PI陰性）および系列陰性（Gr1-、Mac1-、B220-、CD3-、CD4-、CD8-、Ter119--）である。造血前駆細胞（HSC、MPP1、およびMPP2）をゲーティングし（c-kit+Sca1+）、次にflk2およびCD34発現により定義した。リンパ球系共通前駆細胞（CLP）をゲーティングし（flk2+ IL-7R+）、次にc-kitおよびSca1状態により定義した。骨髄球系前駆細胞（GMP、CMP、およびMEP）をゲーティングし（c-kit+ Sca1-）、Fc□R3およびCD34発現により定義した。赤血球前駆細胞（EP）および巨核球前駆体（MkP）は両方ともc-kit+Sca1-でゲーティングしたが、それぞれエンドグリン発現およびCD41発現により定義した。
【０４８２】
VDJ再構成 − 重鎖および軽鎖（κおよびλ）の組換え事象を、Brisco et al.（British Journal of Hematology 1990; 75: 163-167）およびBusslinger et al.（Nature 2007; 449: 473-481）により確立されたPCRベースのアッセイを使用して試験した。概要において、戦略はVH2からJH4の領域に及び、したがって、重鎖再構成の主な組換え事象をカバーしている。全てのPCRベースの戦略が、骨髄および末梢血の陽性対照および陰性対照の両方で確認された。
【０４８３】
転写因子の組込み − 発現されるべき因子のウイルス組込みについて試験するために、プライマーを、イントロン-エキソン境界にわたり産物を生成するように設計した（図59F）。内因性産物は、それらのより大きなサイズ、またはプライマーがイントロンにわたり伸長しないことにより排除される。厳格な対照を実施して、偽陽性が検出されないことを確実にした。全てのプライマーが、因子を個々に36-因子混合物から差し引いた場合、およびZsGr対照ウイルスを使用した場合に陰性であると証明され、因子が存在する場合だけ、バンドが現れる。プライマーを補足表1に列挙する。PCR条件は、製造者の指示（Kappa Biosystems）に従って実施した。
【０４８４】
ハイスループット単一細胞qPCRおよびコンピュータ分析：個々のプライマーセットを、各プライマーについて最終濃度0.1μMでプールした。個々の細胞を、各ウェル中に5μLのRT-PCRマスターミックス（2.5μL CellsDirect反応混合物、Invitrogen；0.5μLプライマープール；0.1μL RT/Taq酵素、Invitrogen；1.9μLヌクレアーゼ不含水）を添加した96ウェルPCRプレート中で直接的に選別した。選別されたプレートを、直ちにドライアイスで凍結させた。4℃での短時間の遠心分離後、プレートを直ちにPCR機に置いた。細胞を溶解し、配列特異的な逆転写を50℃で60分間にわたり実施した。次に、逆転写不活化およびTaqポリメラーゼ活性化を、3分間にわたり95℃まで加熱することにより達成した。その後、同じチューブ中で、cDNAを、95℃で15秒間にわたる変性、60℃で15分間にわたるアニーリングおよび伸長による、20サイクルの配列特異的増幅にかけた。前増幅後、PCRプレートを、-80℃で保存し、蒸発を避けた。前増幅産物を、分析に先立ち5倍希釈した。増幅された単一細胞試料を、BioMark System（Fluidigm）での96.96 Dynamic Arrayを使用して、Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）、EvaGreen Binding Dye（Biotium）、および個々のqPCRプライマーを用いて分析した。Ct値を、BioMarkリアルタイムPCR分析ソフトウェア（Fluidigm）を使用して計算した。
【０４８５】
遺伝子発現レベルを、バックグラウンドレベル28を差し引くことによりCtレベルによって推定し、およそのLog2遺伝子発現レベルを示す。主成分分析（PCA）をMatlabにおいて実施し、三次元空間上にすべての対照細胞および実験細胞を投影し、視覚化を補助した。教師なし階層的クラスタリングを使用し、代表的な対照細胞および全てのiHSC 8-TF細胞またはiHSC 8-TFポリ細胞をクラスター化した。分析は、平均連結法および相関ベースの距離を使用して、Rを用いて行った。代表的な対照細胞を、その発現レベルが、ユークリッド距離に基づく中央値に最も近い細胞として選択した。8つのHSC細胞、8つのHSC宿主細胞、全てで6つのプロ/プレB細胞、および残りの対照細胞型の各々からの4つを選択した。デンドログラムの枝を、PCA分析における通り、細胞型によりカラーコード化した。バイオリンプロットおよび相関色分け地図を、Matlabを用いて生成した。全ての生データのマスター色分け地図（図64A〜64Dの補足）を、デフォルト設定を使用したMultiExperiment Viewer（MeV）プログラム（http://www.tm4.org/mev.html）を用いて生成した。
【０４８６】
（表６−１）単一細胞の発現データ（縮約リスト）---対照
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【０４８７】
（表６−２）単一細胞の発現データ（縮約リスト）---対照
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【０４８８】
（表６−３）単一細胞の発現データ（縮約リスト）---対照
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【０４８９】
（表６−４）単一細胞の発現データ（縮約リスト）---対照
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【０４９０】
（表６−５）単一細胞の発現データ（縮約リスト）---対照
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【０４９１】
（表６−６）単一細胞の発現データ（縮約リスト）---対照
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【０４９２】
（表６−７）単一細胞の発現データ（縮約リスト）---対照
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【０４９３】
（表６−８）単一細胞の発現データ（縮約リスト）---対照
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【０４９４】
（表６−９）単一細胞の発現データ（縮約リスト）---対照
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【０４９５】
（表６−１０）単一細胞の発現データ（縮約リスト）---対照
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【０４９６】
（表６−１１）単一細胞の発現データ（縮約リスト）---対照
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【０４９７】
（表６−１２）単一細胞の発現データ（縮約リスト）---対照
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【０４９８】
（表７−１）単一細胞の発現データ（縮約リスト）---iHSC-8-TF
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【０４９９】
（表７−２）単一細胞の発現データ（縮約リスト）---iHSC-8-TF
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【０５００】
（表７−３）単一細胞の発現データ（縮約リスト）---iHSC-8-TF
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【０５０１】
（表７−４）単一細胞の発現データ（縮約リスト）---iHSC-8-TF
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【０５０２】
（表８−１）単一細胞の発現データ（縮約リスト）---iHSC-8-TF-ポリ
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【０５０３】
（表８−２）単一細胞の発現データ（縮約リスト）---iHSC-8-TF-ポリ
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【０５０４】
（表８−３）単一細胞の発現データ（縮約リスト）---iHSC-8-TF-ポリ
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【０５０５】
（表８−４）単一細胞の発現データ（縮約リスト）---iHSC-8-TF-ポリ
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【０５０６】
（表８−５）単一細胞の発現データ（縮約リスト）---iHSC-8-TF-ポリ
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【０５０７】
（表８−６）単一細胞の発現データ（縮約リスト）---iHSC-8-TF-ポリ
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【０５０８】
実施例2についての参考文献
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【０５０９】
実施例3
ドナー由来のMEPを使用して実施された放射線防御移植アッセイでは（Na Nakorn, J Clin Invest. 2002, 109(12), 1579-85）、インビボで血小板および赤血球に与える頑強な能力が確認された（図72B〜C）。
【０５１０】
持続的な自己複製能に加えて、HSCの特徴的な特性は、クローンレベルでの多系列分化を生じるそれらの能力である。本発明者らは、本発明者らの因子の誘導後、インビトロでクローン性多系列分化能を観察していたが（図60B〜C）、本発明者らのインビボ移植実験は、集団レベルで行われ、本発明者らはインビボでのクローン性分化能を結論付けることができなかった。本発明者らは、プロ/プレB細胞において生じるIg重鎖の再構成を、系列追跡ツールとして使用することができ、本発明者らの移植実験において、異なるドナー由来系列における共通のV（D）J再構成の存在が、クローン多系列分化能の証拠を提供することができると推論した。本発明者らは、したがって、8-TFポリウイルス混液を用いて形質導入されたプロ/プレB細胞に由来する長期多系列再構築を示す第一レシピエントからの、選別されたドナー由来のBおよびT細胞、顆粒球、ならびにマクロファージ/単球からDNAを単離した。次にV（D）J接合に及ぶIg重鎖特異的PCRを実施し、全ての系列でサイズが共通である、選択された産物をゲル精製し、クローニングし、配列決定した。この分析では、本発明者らが2つの独立した実験から分析したドナー由来系列の全てに共通のV（D）J再構成の存在が明らかになり、クローン性の初期化プロ/プレB細胞からの多系列分化能を示す（図71A）。その単一の初期化細胞は、インビボでの多系列分化能を持ち、LAM-PCRベースのアプローチを使用してさらに確認され、選別されたドナー由来のB、T、および骨髄球系細胞における共通のウイルス組込み部位が明らかになった（図示せず）。初期化細胞が、連続移植時に多系列分化能を維持しているか否かを試験するために、本発明者らは、第一の移植の間にこれらのアプローチにより分析されたマウスからの初期化細胞を移植された第二レシピエントからの選別されたドナー由来B、T、および骨髄球系細胞で、LAM-PCRによって、V（D）J接合およびウイルス組込みを分析した。これらの実験では、共有されるV（D）J再構成および共通のウイルス組込み部位の両方を、第一および第二の両方のレシピエントにおける複数の系列において同定することができることが明らかになり（図71B〜71C）、単一の初期化細胞が、多系列分化能および長期的な自己複製能の両方を持つことを示した。
【０５１１】
末梢血中のいずれの系列が、転写因子の再発現時にこれらのコロニーを生じさせる潜在能を有したのかを決定するために、本発明者らは、8-TFポリ再構築マウスからB細胞、T細胞、骨髄球系細胞、および顆粒球を精製し、ドキシサイクリンの非存在下または存在下での培養および播種に続き、それらのコロニー形成能を試験した。これらの実験では、これらの系列の各々からの細胞が、因子の再誘導時に前駆細胞活性を植え付けられていたことが明らかになった。これらの内、顆粒球が最も少ないコロニーを生じたのに対し、Mac1+マクロファージ/単球コロニーは最大数のコロニーおよび最大数の原始GEMMコロニーをもたらした（図70C〜D）。
【０５１２】
本発明者らは、分化した骨髄球系細胞に焦点を当てた。なぜなら、再構成したTCR（T細胞）またはIG（B細胞）遺伝子座を有する分化リンパ球系細胞とは異なり、骨髄球系細胞の初期化を介して誘導された多系列再構築細胞は、分化時にリンパ球系エフェクター細胞の完全なレパートリーを生じる潜在能を有することが予測されるからである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ−１】
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【図５Ｃ−２】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ−１】
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【図２０Ａ−２】
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【図２０Ａ−３】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１Ａ−１】
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【図４１Ａ−２】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４５】
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【図４６Ａ−１】
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【図４６Ａ−２】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図４９Ｃ】
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【図４９Ｄ】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２−１】
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【図５２−２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７Ａ】
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【図５７Ｂ】
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【図５７Ｃ】
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【図５８Ａ】
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【図５８Ｂ】
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【図５８Ｃ】
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【図５８Ｄ】
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【図５８Ｅ】
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【図５９Ａ】
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【図５９Ｂ】
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【図５９Ｃ】
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【図５９Ｄ】
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【図５９Ｅ】
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【図５９Ｆ】
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【図５９Ｇ】
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【図６０Ａ】
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【図６０Ｂ】
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【図６０Ｃ】
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【図６０Ｄ】
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【図６０Ｅ】
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【図６０Ｆ】
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【図６０Ｇ】
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【図６１Ａ】
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【図６１Ｂ】
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【図６１Ｃ】
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【図６１Ｄ】
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【図６１Ｅ】
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【図６２Ａ】
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【図６２Ｂ】
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【図６２Ｃ】
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【図６２Ｄ】
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【図６２Ｅ】
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【図６２Ｆ】
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【図６２Ｇ】
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【図６２Ｈ】
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【図６２Ｉ】
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【図６３Ａ】
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【図６３Ｂ】
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【図６３Ｃ】
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【図６３Ｄ】
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【図６３Ｅ】
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【図６３Ｆ】
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【図６３Ｇ】
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【図６３Ｈ】
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【図６４Ａ】
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【図６４Ｂ】
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【図６４Ｃ】
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【図６４Ｄ】
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【図６５】
2016513974.tif 000300
【図６６】
2016513974.tif 000301
【図６７】
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【図６８Ａ】
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【図６８Ｂ】
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【図６８Ｃ】
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【図６８Ｄ】
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【図６９−１】
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【図６９−２】
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【図６９−３】
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【図６９−４】
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【図６９−５】
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【図６９−６】
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【図７０Ａ】
2016513974.tif 000313
【図７０Ｂ】
2016513974.tif 000314
【図７０Ｃ】
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【図７０Ｄ】
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【図７０Ｅ】
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【図７０Ｆ】
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【図７０Ｇ】
2016513974.tif 000319
【図７０Ｈ】
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【図７１Ａ】
2016513974.tif 000321
【図７１Ｂ】
2016513974.tif 000322
【図７２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2016513974.tif 000325
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