(57)【要約】  アズレン含有精油から青色を除去する方法であって、油のｐＨ３〜７．５に緩衝された水への添加およびそれに続くラッカーゼ酵素−メディエータ系による処置を含み、ラッカーゼが、メディエータの存在下でホウロクタケ種およびMyceliophthora thermophila由来のものから選択される、前記方法。脱色された油は、それらの色が以前は主な欠点であった香水において使用してもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アズレン含有精油から青色を除去する方法であって、油のｐＨ３〜７．５に緩衝された水への添加およびそれに続くラッカーゼ酵素−メディエータ系による処置を含み、ラッカーゼが、メディエータの存在下でホウロクタケ種およびMyceliophthora thermophila由来のものから選択される、前記方法。
【請求項２】
メディエータが、シナピン酸、メチルシリンゲート、アルブチン、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ＴＥＭＰＯ、フェノチアジン、フェノールレッド、４−ヒドロキシ安息香酸、チロソール、エチルバニリンおよびメシトールから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
メディエータ−ラッカーゼ系が、ホウロクタケ種−１−ヒドロキシベンゾトリアゾールである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
メディエータ−ラッカーゼ系が、メディエータを添加していないホウロクタケ種由来のラッカーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
メディエータ−ラッカーゼ系が、メチルシリンゲートを伴うMyceliophthora thermophile由来のラッカーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
メディエータ濃度が、０．０５〜１００ｍＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
方法が、ｐＨ４．５〜５．５で行われる、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、精油の脱色に関する。
【背景技術】
【０００２】
ある精油、中でもシカギク(Chamomilla)、シカギク(Matricaria)、カミツレモドキ(Anthemis)属（カモミール類）、ヨモギ(Artemisia)属（ニガヨモギ、オオヨモギ、ヨモギ、駆虫草など）およびノコギリソウ(Achillea)属（ノコギリソウ）に属するものは、青緑から非常に深い青色までの範囲の青い色をしている。これは、それらにおける様々なアズレン、中でもアズレン、カマズレン、ジヒドロカマズレンおよびグアイアズレンの存在の結果である。（本明細書において、用語「アズレン」は、この特徴的な色を有する全てのアズレンをカバーするために使用される）。そうでなければ香水において望ましい油であるそれらの有用性を制限することから、この色は望ましくないが、現在に至るまで、除去するのが困難であるかまたは実用的でない。
【発明の概要】
【０００３】
かかる油を、単純な手法の適用により本質的に完全に脱色することができることが、今や見出された。したがって、アズレン含有精油から青色を除去する方法であって、油のｐＨ３〜７．５に緩衝された水への添加およびそれに続くラッカーゼ酵素−メディエータ系による処置を含み、ラッカーゼが、ホウロクタケ(Trametes)種およびMyceliophthora thermophila由来のものから選択される、前記方法を開示する。
【０００４】
多くのラッカーゼ酵素が、知られており、それらは、フレグランスおよびフレーバーの分野における望ましい分子の合成など様々な目的のために使用されてきた。しかしながら、ホウロクタケ種またはMyceliophthora thermophila由来のものを、精油を脱色するために使用することができることは、以前に知られていなかった。
【０００５】
この方法において有用な市販のラッカーゼ酵素の例は、ラッカーゼC（ASA Spezialenzyme GmbH）およびラッカーゼNS 42035（Novozymes A/S）を含むが、これらに限定されない。
【０００６】
メディエータの存在は、当該方法に必須である。「メディエータ」とは、ラッカーゼ酵素の基質であり、ラッカーゼおよびアズレン間の反応を媒介する、低分子量の有機化合物を意味する。「反応を媒介する」とは、（ａ）それが酵素により酸化され、（ｂ）それが順にアズレンを酸化し、および（ｃ）それがさらなる反応のために酵素により再活性化されることを意味する。ラッカーゼ系におけるメディエータの使用は、当該技術分野において周知であり、多くのかかるメディエータが既知である。例は、例えば、Camarero et al（Appl Env Microbiol 71, 1775-1784, 2005）、Fabbrini et al（J Mol Cat B: Enz 16, 231-240, 2002）、Gonzalez Arzola et al（Electrochemica Acta 54, 2621-2629, 2009）に記載されている。
【０００７】
いくつかの非限定の具体例は、シナピン酸、メチルシリンゲート、アルブチン、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ＴＥＭＰＯ、フェノチアジン、フェノールレッド、４−ヒドロキシ安息香酸、チロソール、エチルバニリンおよびメシトールを含む。加えて、市販のラッカーゼ−メディエータ系があり、１つのかかる系は、Denilite（商標）II Sであり、この場合におけるメディエータは、メチルシリンゲートである。
【０００８】
Myceliophthora thermophila由来のラッカーゼ酵素の使用は通常、効果的な脱色のための添加メディエータを必要とする一方、ホウロクタケ種のある種のラッカーゼ酵素は、添加メディエータの非存在下である油の脱色をすることができることが分かった。かかる油の例は、オーストラリアンブルーサイプレス(Australian blue Cypress)オイル（Callitris intratropica）、ワームウッドオイル（Artemisia absinthum）、ブルーカモミールオイル（Matricaria chamomilla）およびチバ(Chiba)オイル（Artemisia arborescens）を含む。決して開示を制限することなく、これらの油にメディエータとして作用する能力のある化合物、例えば、チモール（ヨモギ属の油に）、が存在すると信じられている。しかしながら、本開示の目的のために、ホウロクタケ種由来のラッカーゼ酵素単独での使用は、上に定義した「ラッカーゼ酵素−メディエータ系」の範囲内に含まれると考えられる。
【０００９】
いずれの場合でも、メディエータの添加は、ホウロクタケ種由来のラッカーゼ酵素の脱色性能を著しく増強することが認められる。いくつかの場合、例えば、ケープカモミールオイル（Eriocephalus punctulatus）およびローマンカモミールオイル（Anthemis nobilis）の場合、メディエータは、許容できる脱色のために必要である。好適なメディエータ／酵素／油の組合せは、ルーチンの、独創性のない実験によって見出され得る。特定のラッカーゼ−メディエータ系は、ホウロクタケ種−１−ヒドロキシベンゾトリアゾールである。
【００１０】
市販のラッカーゼ調製物は一般的に、特定の活性を有する乾燥粉末として提供される。この活性が時間と共に、時々相当（１０より大きい因数は珍しくない）減少することは周知であるから、使用前に、適当な量を使用することができるようラッカーゼ調製物中に活性ラッカーゼがどのくらい残っているのか決定することが必要不可欠である。これは、酵素を扱う仕事をする全ての人にとって標準的技法である。
【００１１】
特定の脱色に必要であろう酵素の量は、ラッカーゼの比活性度に依存するであろう。「ラッカーゼ比活性度」は、活性ラッカーゼ単位の数／ｍｇのラッカーゼ調製物を意味する。ラッカーゼ調製物における（ラッカーゼ単位における）比活性度の決定は、周知のおよびよく使用される生化学的手順、無作為に選択された量のラッカーゼ調製物から始める試行錯誤の反復サイクルに従い行われる。
典型的な例は、以下の段落に記載されている。この場合、シリンガルダジンを基質として、および本明細書における全ての活性は、この基準と相対的である。
【００１２】
４０ｍＭのＭＥＳ緩衝液ｐＨ５．３中１ｍｌの反応物に、一定量の正確に調製したラッカーゼ調製物の水溶液を添加した。反応を、シリンガルダジン（Sigma S7896）をエタノール中で作った貯蔵溶液から３３μＭ最終濃度まで添加することにより開始した。吸光度の増加（ピンク色の形成）を、Cary 1 UV-VIS分光光度計（Varian）内で１０分間２２℃で５２５ｎｍで記録した。測定を、ＭＥＳ緩衝液からなるブランクに対して行った。比活性度を、単位で測定したが、ここで１単位は上記条件下で１分あたり１ナノモルのシリンガルダジンの酸化を触媒するラッカーゼ調製物の量と定義される。
【００１３】
必要なメディエータの割合は、油およびメディエータの性質に依存し、広範囲にわたる可能性がある。典型的に、メディエータ濃度は、０．０５〜１００ｍＭである。ただし、この範囲外の濃度が許容し得る結果をもたらす場合もある。
【００１４】
方法は典型的に、連続攪拌下で油をｐＨ３〜７．５（特に４．５〜５．５）に緩衝された水に添加することにより行われる。できるだけ多くの油を添加してもよい（典型的に５０重量％まで、いくつかの場合、それより多くが可能である）。そして、ラッカーゼ−メディエータ系を、液体または粉末の形状で添加する。反応を、２０〜８０℃、特に約３５〜４５℃で行う。使用する油およびラッカーゼ−メディエータ系に依存して、脱色を通常３．５〜７時間で完了する。ただし、いくつかの油は２４時間まで必要であり得る。いくつかの場合、より多量のラッカーゼ−メディエータ系の添加は、より速い脱色をもたらすであろう。しかしながら、これはいつでも事実であるというわけではないが、日常実験によってこれが機能する場合と機能しない場合を容易に区別することができる。
【００１５】
脱色された油を、デカンテーションおよび溶媒抽出などの標準的手法により回収してもよい。
結果物は、香水に有用な無色の油である。したがって、上記の方法により調製可能な脱色されたアズレン含有精油を開示する。
本開示をさらに、以下の非限定例を参照に説明する。
【００１６】
例１
反応物（最終量５００マイクロリットル）を、以下のとおり準備した。０．２５％のTweenTM 80界面活性剤を補充し、２．２ｍｇのホウロクタケ種ラッカーゼC（１７１単位に相当、単位は上述のとおり）を含有する４３０μｌの０．１Ｍクエン酸リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０を、３ｍｌガラスバイアル内に入れた。そして、５０μｌのディープブルーカモミールベリーヘビーブルーオイル(deep blue chamomile very heavy blue oil)（Frith Farm）を、添加した。反応を、２０μｌの、エタノール中５０ｍＭの貯蔵溶液として調製したメディエータである１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの添加により開始した。ガラスバイアルにふたをし、オービタルシェーカーで２５０ｒｐｍでの一定の攪拌を伴い、４０℃でインキュベートした。脱色の進行は、反応の停止およびイソプロパノールでの抽出により、３．５および７時間のインキュベーション後に当初の色と比較して評価した。微粒子および沈殿した材料を、分析前に遠心分離により除去した。７時間の反応後、青色は完全に消え、フレグランスにおける使用に好適な黄色から薄い茶色の油が残ったので、２４時間目の提案された更なる評価は不要であった。脱色を、吸光度の測定（例５）およびガスクロマトグラフィ（ＧＣ−ＦＩＤ）分析（例６）により評価した。ブランクの反応物を調製し、ラッカーゼを添加しないかまたはメディエータを添加しないか、あるいはラッカーゼおよびメディエータを添加しないことを除いて同じ手法で行った。
【００１７】
例２
反応物（最終量５００マイクロリットル）を、以下のとおり準備した。０．２５％のTweenTM 80界面活性剤を補充し、４．４μｌのNS42035ラッカーゼ（２単位に相当、単位は上述のとおり）を含有する４３０μｌの０．１Ｍクエン酸リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０を、３ｍｌガラスバイアル内に入れた。そして、５０μｌのディープブルーオーストラリアンブルーサイプレスオイル(deep blue Australian blue cypress oil)（Callitris intratropica）を、添加した。反応を、２０μｌの、エタノール中５０ｍＭの貯蔵溶液として調製したメディエータであるメチルシリンゲートの添加により開始した。ガラスバイアルにふたをし、オービタルシェーカーで２５０ｒｐｍでの一定の攪拌を伴い、４０℃でインキュベートした。脱色の進行は、反応の停止およびイソプロパノールでの抽出により、３．５、７および２４時間のインキュベーション後に当初の色と比較して評価した。微粒子および沈殿した材料を、分析前に遠心分離により除去した。２４時間の反応後、青色は完全に消え、フレグランスにおける使用に好適な黄色から薄い茶色の油が残った。脱色を、吸光度の測定（例５）およびガスクロマトグラフィ（ＧＣ−ＦＩＤ）分析（例６）により評価した。ブランク反応物を調製し、ラッカーゼを添加しないかまたはメディエータを添加しないか、あるいはラッカーゼおよびメディエータを添加しないことを除いて同じ手法で行った。
【００１８】
例３
６種の精油を、例１および例２に記載の手順に従いラッカーゼ−メディエータ系で処置した：オーストラリアンブルーサイプレス（Callitris intratropica）、Eriocephalus punctulatus（South Africa）、ワームウッドエッセンス、カモミールベリーヘビーブルー(Chamomile very heavy blue)（Frith Farm）、カモミールネパールおよびチバオイルモロッコ（ヨモギ属の種）。唯一の変更は、反応物に２％油のみを負荷し、反応を２４時間実行したことである。目視観察された油の脱色を、４種の化合物、アズレン、カマズレン、グアイアズレンおよびジヒドロカマズレンの標的検出を伴うＧＧ−ＭＳ分析により確認した。この目的のために、反応物を１ｍｌのＭＴＢＥで抽出した。上清を蒸発させた。残渣を９０μｌエタノール中に懸濁しおよびＧＣ−ＭＳ分析のために１００倍に希釈した。１μｌを30m×0.25mm×0.25mm VF-Wax Column（Varian）にスプリットレス注入し、HP5890 GC装置で以下の温度勾配で展開した：３５℃で２分、１０℃／分で５０℃まで、２．５℃／分で２４０℃まで、２４０℃で５分。ＭＳ機器SSQ7000は、Thermo Finniganからのものであった。ＧＣ−ＭＳ分析により、脱色はカマズレン、グアイアズレンおよび／またはジヒドロカマズレンの消失によるものであったことを確認した。
【００１９】
例４
チバオイルを、油の負荷がたったの１％であった以外は、例１に記載されたとおりの反応で脱色した。以下の化合物をメディエータとして使用した：シナピン酸、チロソール、エチルバニリン、メチルシリンゲート、アルブチン、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ＴＥＭＰＯ、フェノチアジン、フェノールレッド、４−ヒドロキシ安息香酸、メシトール。例１に記載されたとおり、反応を、２０マイクロリットルのエタノール中５０ｍＭメディエータ貯蔵溶液を添加することにより開始した。ラッカーゼメディエータ系無しのあるいはラッカーゼ有りだがメディエータ無しの対照反応を行った。ブランク反応をラッカーゼおよびメディエータを含有しない反応物に入れた油について行った。反応を例１に記載されたとおり０、２および７時間の反応後にイソプロパノールを用いた抽出により停止させ、例６に記載されたとおりＧＣ−ＦＩＤを用いて分析した。処置後の油の外観検査は、青色が消失したことを示し、これは、以下の表にまとめたＧＣ−ＦＩＤ分析から得られた結果により確認された。例５に記載されたとおり記録された吸光度スペクトルの変化もまた、青色の消失を確認した。
【００２０】
【表１】
2016511631.tif 000002
【００２１】
例５
１ｍｌの、全反応体積のイソプロパノール抽出から生じる上清を、Cary 1 UV-VIS分光光度計（Varian）を使用して吸収スペクトル（５００〜８００ｎｍ）を記録するために使用した。反応開始および反応終了の間の記録した吸収スペクトルにおける変化は、外観検査によって観察された脱色を確認した。
【００２２】
例６
０．２ｍｌのイソプロパノール抽出物に、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ−ＦＩＤ）分析のために０．４ｍｌのヘキサンを補充した。サンプルについて、５メートルのガードカラムを搭載したZebronキャピラリーカラムZB-Waxplus（３０ｍ×０．３２ｍｍ×０．２５μｍ）上でクロマトグラフィを行った。１μｌをスプリットレス注入し、カラムを以下の温度プログラムを用いてFocusGC装置内で展開した：６０℃で３分、８℃／分で２４０℃まで、２４０℃で１０分。標準材料から作られたカマズレンおよびグアイアズレン溶液は、クロマトグラムにおける対応するピークの位置確認のための参照としての役割を果たした。脱色された油のサンプルにクロマトグラフィを行ったときに得られたクロマトグラムからのこれらのピークの消失により、青色の喪失がアズレンの除去によるものであったことを確認した。
【国際調査報告】
2016511631.tif 000003
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