(57)【要約】操作された細胞株が本明細書で提供される。一部の実施形態では、操作された細胞株の細胞は、変更された遺伝子の発現及び／又は変更されたｍｉＲＮＡの発現を有し、この変更された発現により、ウイルスの産生が増加又は低下する。このウイルスは、ピコルナウイルス、例えば、ポリオウイルス又はエンテロウイルス７１である。また、操作された細胞株を使用してウイルスを産生する方法、及びウイルス感染している対象又はウイルス感染のリスクのある対象を治療する方法も本明細書で提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
操作された細胞株であって、前記操作された細胞株の細胞が、対照細胞株と比較した、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現の低下を有し、前記コーディング領域が、ＺＮＦ２０５、ＣＮＴＤ２、ＳＥＣ６１Ｇ、ＥＴＳ１、ＴＡＦ１Ｌ、ＭＣＣＤ１、ＬＹ６Ｇ６Ｃ、ＢＴＮ２Ａ１、ＧＬＸＰ３、ＧＣＧＲ、ＥＰ３００から選択される、操作された細胞株。
【請求項２】
操作された細胞株であって、前記操作された細胞株の細胞が、対照細胞株と比較した、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現の低下を有する、操作された細胞株。
【請求項３】
前記低下が、前記対照細胞株と比較すると少なくとも５％である、請求項１又は２に記載の操作された細胞株。
【請求項４】
前記発現の低下が、前記コーディング領域にコードされたポリペプチド又はｍＲＮＡの前記細胞における量を測定することによって決定される、請求項１又は２に記載の操作された細胞株。
【請求項５】
前記細胞が、前記コーディング領域又は前記コーディング領域に機能的に連結された調節領域に突然変異を有する、請求項１又は２に記載の操作された細胞株。
【請求項６】
前記細胞が、前記コーディング領域の発現を低下させる外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項１又は２に記載の操作された細胞株。
【請求項７】
前記外来性ポリヌクレオチドがＲＮＡポリヌクレオチドである、請求項５に記載の操作された細胞株。
【請求項８】
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項７に記載の操作された細胞株。
【請求項９】
前記細胞が、発現を低下させる編集されたゲノムを含む、請求項１又は２に記載の操作された細胞株。
【請求項１０】
前記ゲノムが、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、又は転写活性化因子様エフェクターによって編集される、請求項９に記載の操作された細胞株。
【請求項１１】
前記細胞が、表Ｉから選択される少なくとも１つの追加のコーディング領域の発現の低下、対照細胞株と比較した、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９から選択されるｍｉＲＮＡの発現の増加、表ＩＶから選択される内在性ｍｉＲＮＡの発現の低下、又はこれらの組み合わせをさらに有する、請求項１又は２に記載の操作された細胞株。
【請求項１２】
前記細胞が、表Ｉから選択される少なくとも５つのコーディング領域の発現の低下を有する、請求項１１に記載の操作された細胞株。
【請求項１３】
前記細胞が、少なくとも２つのコーディング領域の組み合わせの発現の低下さらに有し、前記コーディング領域の組み合わせが表ＶＩから選択される、請求項１又は２に記載の操作された細胞株。
【請求項１４】
操作された細胞株であって、前記操作された細胞株の細胞が、対照細胞株と比較した、表ＩＩから選択されるコーディング領域の発現の増加を有する、操作された細胞株。
【請求項１５】
前記発現の増加が、前記コーディング領域によってコードされるポリペプチド又はｍＲＮＡの前記細胞における量を測定することによって決定される、請求項１４に記載の操作された細胞株。
【請求項１６】
前記細胞が、表ＩＩから選択される少なくとも１つの追加のコーディング領域の発現の増加、対照細胞株と比較した、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９から選択される内在性ｍｉＲＮＡの発現の低下、表ＩＶから選択される内在性ｍｉＲＮＡの発現の低下、又はこれらの組み合わせをさらに有する、請求項１４に記載の操作された細胞株。
【請求項１７】
前記細胞は、表ＩＩから選択される少なくとも５つのコーディング領域の発現の増加を有する、請求項１４に記載の操作された細胞株。
【請求項１８】
前記増加が、前記対照細胞株と比較すると少なくとも５％である、請求項１４に記載の操作された細胞株。
【請求項１９】
操作された細胞株であって、前記操作された細胞株の細胞が、対照細胞株と比較した、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９から選択されるｍｉＲＮＡの発現の増加を有する、操作された細胞株。
【請求項２０】
前記細胞が、前記ｍｉＲＮＡの１つのように挙動するｍｉＲＮＡ模倣体を含む、請求項１９に記載の操作された細胞株。
【請求項２１】
前記細胞が、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの発現の増加をさらに有する、請求項１に記載の操作された細胞株。
【請求項２２】
前記増加が、前記対照細胞株と比較すると少なくとも５％である、請求項１９に記載の操作された細胞株。
【請求項２３】
操作された細胞株であって、前記操作された細胞株の細胞が、対照細胞株と比較した、表ＩＶから選択される内在性ｍｉＲＮＡの発現の低下を有する、操作された細胞株。
【請求項２４】
前記細胞が、前記内在性ｍｉＲＮＡをコードするコーディング領域又は前記コーディング領域に機能的に連結された調節領域に突然変異を有する、請求項２３に記載の操作された細胞株。
【請求項２５】
前記細胞が、前記内在性ｍｉＲＮＡの活性を阻害するｍｉＲＮＡインヒビターを含む、請求項２３に記載の操作された細胞株。
【請求項２６】
前記細胞がピコルナウイルスを含む、請求項１、２、１４、１９、又は２３の何れか一項に記載の操作された細胞株。
【請求項２７】
前記ピコルナウイルスがポリオウイルスである、請求項２６に記載の操作された細胞株。
【請求項２８】
前記ポリオウイルスが、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ２、又はＳａｂｉｎ３のいずれかから選択される、請求項２７に記載の操作された細胞株。
【請求項２９】
前記ポリオウイルスが、Ｍａｈｏｎｅｙ又はＢｒｕｎｈｉｌｄｅから選択される、請求項２７に記載の操作された細胞株。
【請求項３０】
前記ポリオウイルスがＭＥＦ−１である、請求項２７に記載の操作された細胞株。
【請求項３１】
前記ポリオウイルスがＳａｕｋｅｔｔである、請求項２７に記載の操作された細胞株。
【請求項３２】
前記細胞株の細胞が、２つ又は３つのポリオウイルスを含む、請求項２８に記載の操作された細胞株。
【請求項３３】
前記ピコルナウイルスがエンテロウイルス７１である、請求項２６に記載の操作された細胞株。
【請求項３５】
前記細胞株が、哺乳動物細胞株、トリ細胞株、又は昆虫細胞株である、請求項１、２、１４、１９、又は２３の何れか一項に記載の操作された細胞株。
【請求項３６】
前記哺乳動物細胞株が、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、イヌ細胞株、又はハムスター細胞株から選択される、請求項３５に記載の操作された細胞株。
【請求項３７】
前記哺乳動物細胞株が、ＨＥｐ−２又はＶｅｒｏＰである、請求項３６に記載の操作された細胞株。
【請求項３８】
前記トリ細胞株が、ニワトリ細胞株又はアヒル細胞株である、請求項３５に記載の操作された細胞株。
【請求項３９】
前記発現の変化が、前記ｍｉＲＮＡの細胞での量を測定することによって決定される、請求項１９又は２３に記載の操作された細胞株。
【請求項４０】
請求項１、２、１４、１９、又は２３の何れか一項に記載の操作された細胞株の溶解物。
【請求項４１】
ウイルスを産生する方法であって：
請求項１、２、１４、１９、又は２３に記載の操作された細胞株を用意するステップであって、前記細胞株の細胞がウイルスを含む、ステップ；
前記操作された細胞株を、前記細胞による前記ウイルスの産生に適した条件下でインキュベートするステップ；及び
前記細胞によって産生されたウイルスを収集するステップを含む、方法。
【請求項４２】
ウイルスを産生する方法であって：
細胞株を用意するステップであって、前記細胞株の細胞がウイルスを含む、ステップ；
前記細胞株を、前記細胞による前記ウイルスの産生に適した条件下でインキュベートするステップであって、培地が、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現を阻害するＲＮＡポリヌクレオチドを含む、ステップ；及び
前記細胞によって産生されたウイルスを収集するステップを含む、方法。
【請求項４３】
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はアンチセンスポリヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９から選択される）、表ＩＶから選択される内在性ｍｉＲＮＡの活性を阻害するｍＲＮＡインヒビター、又はこれらの組み合わせである、請求項４２に記載の細胞株。
【請求項４４】
ウイルスの産生する方法であって：
細胞株を用意するステップであって、前記細胞株の細胞がウイルスを含み、前記細胞が、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現を低下させる編集されたゲノムを含む、ステップ；
前記細胞株を、前記細胞による前記ウイルスの産生に適した条件下でインキュベートするステップ；及び
前記細胞によって産生されたウイルスを収集するステップを含む、方法。
【請求項４５】
前記ゲノムが、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、又は転写活性化因子様エフェクターによって編集される、請求項４３に記載の操作された細胞株。
【請求項４６】
ウイルスを産生する方法であって：
細胞株を用意するステップであって、前記細胞株の細胞がウイルスを含む、ステップ；
前記細胞株を、前記細胞による前記ウイルスの産生に適した条件下でインキュベートするステップであって、培地が、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現を阻害する小分子を含む、ステップ；及び
前記細胞によって産生されたウイルスを収集するステップを含む、方法。
【請求項４７】
前記ウイルスがピコルナウイルスである、請求項３４、３５、３７、又は３９の何れか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ピコルナウイルスがポリオウイルスである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ポリオウイルスが、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ２、又はＳａｂｉｎ３のいずれかから選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ポリオウイルスが、Ｍａｈｏｎｅｙ又はＢｒｕｎｈｉｌｄｅから選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記ポリオウイルスがＭＥＦ−１である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記ポリオウイルスがＳａｕｋｅｔｔである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞株の細胞が、２つ又は３つのポリオウイルスを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記ピコルナウイルスがエンテロウイルス７１である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞株が、哺乳動物細胞株、トリ細胞株、又は昆虫細胞株である、請求項３４、３５、３７、又は３９の何れか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記哺乳動物細胞株が、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、イヌ細胞株、又はハムスター細胞株から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記哺乳動物細胞株が、ＨＥｐ−２又はＶｅｒｏＰである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記トリ細胞株が、ニワトリ細胞株又はアヒル細胞株である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
操作された細胞を作製する方法であって：細胞のゲノムを編集するために前記細胞に分子を導入するステップ；分子を含む前記細胞を、ゲノムの編集が行われるのに適した条件下でインキュベートするステップ；編集されたゲノムを含む操作された細胞を得るステップであって、前記編集により、対照細胞株と比較すると表Ｉから選択されるコーディング領域の発現が低下する、ステップを含む、方法。
【請求項６０】
前記細胞のゲノムを編集するための分子が、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、又は転写活性化因子様エフェクターである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６１】
ウイルスに感染している、又はウイルスに感染するリスクのある対象を治療する方法であって、前記対象の細胞での、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現を増加させるステップを含む、方法。
【請求項６２】
ウイルスに感染している、又はウイルスに感染するリスクのある対象を治療する方法であって、前記対象の細胞での、表ＩＩから選択されるコーディング領域の発現を阻害するステップを含む、方法。
【請求項６３】
ウイルスに感染している、又はウイルスに感染するリスクのある対象を治療する方法であって、前記対象の細胞での、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９から選択される内在性ｍｉＲＮＡの発現を阻害するステップを含む、方法。
【請求項６４】
ウイルスに感染している、又はウイルスに感染するリスクのある対象を治療する方法であって、前記対象の細胞での、表ＩＶから選択されるｍｉＲＮＡの発現を増加させるステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる、２０１３年２月５日出願の米国仮特許出願第６１／７６０，８９５号明細書及び２０１３年１０月１日出願の同第６１／８８５，３５７号明細書の利益を請求するものである。
【０００２】
政府の資金提供
本発明は、米国連邦政府の予算案５６１４Ａ１１１０１「新興感染症」の下、政府支援を受けた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、ウイルスの産生を増大させるための組成物及び方法に関する。具体的には、このような組成物は、遺伝子（遺伝子標的）、前記遺伝子標的のエフェクター、並びに遺伝子標的がウイルスの産生を増大させるように変更された細胞株及び細胞溶解物を含み得る。
【背景技術】
【０００４】
ワクチンは、ヒトの疾患を防止するために利用される主な戦略の１つである。現在、２ダースを超えるワクチンが、ウイルス（例えば、水痘、Ｂ型肝炎、麻疹、ポリオ）によって引き起こされる疾患及び細菌による伝染病（例えば、コレラ、破傷風、腸チフス、ジフテリア）の治療に利用可能である。同様に、ワクチンは、限定されるものではないが、家禽、ウマ、ブタ、及び他の動物を含む家畜における多数の疾患を防止するために使用される。
【０００５】
いくつかのワクチン（インフルエンザワクチンを含む）は、今なお受精鶏卵（ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ））で産生されるが、遥かに多くのワクチンが細胞培養で産生されている。一例として、十分に特徴付けられた細胞株（例えば、ベロ細胞）が、まず生ウイルス又は弱毒化生ウイルスに感染させられる。次に、後に集団の中に分散させることができる高免疫原生用量のワクチンを産生させるために、子孫ウイルス粒子を含む上清が収集されて処理される。
【０００６】
実証されたワクチンの成功にもかかわらず、疾患の発生を根絶又は管理する能力は、ワクチンの産生のコスト及び製造上の制約によって繰り返し阻害されている。これは、ポリオワクチンで最も良く例証されている。ポリオウイルスは、ヒトエンテロウイルスであり、灰白髄炎、この神経変性物質の糞口感染によって生じる急性麻痺の原因病原体である。このとき、ワクチンが、ポリオの拡散を制限するために産生され、このようなワクチンには、効果の高い（かつかなり高価な）不活化ポリオワクチン（ＩＰＶ）、それほど効果が高くない（かつ経済的な）経口ポリオワクチン（ＯＰＶ）が含まれる。弱毒化ＯＰＶウイルス粒子の高感染性神経毒性ポリオウイルスへの逆戻りに関連した技術的な理由により、ポリオの完全な根絶は、ＩＰＶの製造コストを著しく低減する新たな技術の進展によって助けられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ＯＰＶ及びＩＰＶワクチンの生産コストを著しく低減するためにポリオワクチンの製造で使用することができる一群の遺伝子、試薬、及び細胞株が本明細書で提供される。本発明は、調節されると（下方制御又は過剰発現）ポリオの複製を増大させる宿主遺伝子（タンパク質をコードする遺伝子及び非コーディングＲＮＡ）のリストを提供する。従って、同定された遺伝子を、ポリオウイルスワクチンの産生を増加させるために調節することができる。さらに、本発明者らは、ポリオウイルスの産生を増大させるように作製することができる一連の細胞株を説明する。上記の全ては、ポリオ及び他のピコルナウイルスの感染と戦うために使用されるワクチンの産生を増大させるために個別に又は組み合わせて使用することができる。最後に、本発明者らは、ポリオウイルスの産生を制限するために様々な手段（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、小分子）によって調節することができる一連の遺伝子を説明する。
【０００８】
操作された細胞株が本明細書に記載される。一実施形態では、操作された細胞株の細胞は、対照細胞株と比較した、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現の低下を有し、このコーディング領域は、ＺＮＦ２０５、ＣＮＴＤ２、ＳＥＣ６１Ｇ、ＥＴＳ１、ＴＡＦ１Ｌ、ＭＣＣＤ１、ＬＹ６Ｇ６Ｃ、ＢＴＮ２Ａ１、ＧＬＸＰ３、ＧＣＧＲ、ＥＰ３００から選択される。一実施形態では、操作された細胞株の細胞は、対照細胞株と比較した、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現の低下を有する。この低下は、対照細胞株と比較すると少なくとも５％であり得る。この発現の低下は、コーディング領域にコードされたポリペプチド又はｍＲＮＡの細胞における量を測定することによって決定され得る。一実施形態では、この細胞は、コーディング領域に、又はこのコーディング領域に機能的に連結された調節領域に突然変異を有する。一実施形態では、この細胞は、コーディング領域の発現を低下させる外来性ポリヌクレオチドを含む。この外来性ポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はアンチセンスポリヌクレオチドであり得る。一実施形態では、細胞は、発現を低下させる編集されたゲノムを含む。例えば、このゲノムは、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、又は転写活性化因子様エフェクターによって編集することができる。
【０００９】
一実施形態では、この細胞は、表Ｉから選択される少なくとも１つの追加のコーディング領域の発現の低下、対照細胞株と比較した、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９から選択されるｍｉＲＮＡの発現の増加、表ＩＶから選択されるｍｉＲＮＡの発現の低下、又はこれらの組み合わせをさらに有する。一実施形態では、細胞は、表Ｉから選択される少なくとも５つのコーディング領域の発現の低下を有する。一実施形態では、細胞は、少なくとも２つのコーディング領域の組み合わせの発現の低下をさらに有し、このコーディング領域の組み合わせが表ＶＩから選択される。一実施形態では、細胞は、対照細胞株と比較した、表ＩＩから選択されるコーディング領域の発現の増加を有する。一実施形態では、細胞は、表ＩＩから選択される少なくとも１つの追加のコーディング領域の発現の増加、対照細胞株と比較した、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９から選択されるｍｉＲＮＡの発現の低下、表ＩＶから選択されるｍｉＲＮＡの発現の低下、又はこれらの組み合わせをさらに有する。一実施形態では、細胞は、表ＩＩから選択される少なくとも５つのコーディング領域の発現の増加を有する。
【００１０】
一実施形態では、操作された細胞株の細胞は、対照細胞株と比較した、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９から選択されるｍｉＲＮＡの発現の増加を有する。この細胞は、ｍｉＲＮＡの１つのように挙動するｍｉＲＮＡ模倣体を含み得る。一実施形態では、細胞は、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの発現の増加をさらに有する。
【００１１】
一実施形態では、操作された細胞株の細胞は、対照細胞株と比較した、表ＩＶから選択される内在性ｍｉＲＮＡの発現の低下を有する。一実施形態では、細胞は、ｍｉＲＮＡをコードするコーディング領域に、又はこのコーディング領域に機能的に連結された調節領域に突然変異を有する。一実施形態では、細胞は、内在性ｍｉＲＮＡの活性を阻害するｍｉＲＮＡインヒビターを含む。
【００１２】
操作された細胞株の細胞は、ピコルナウイルスを含み得る。一実施形態では、ピコルナウイルスは、ポリオウイルス、例えば、弱毒化ポリオウイルス、例えば、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ２、Ｓａｂｉｎ３である。一実施形態では、ポリオウイルスは、Ｍａｈｏｎｅｙ、Ｂｒｕｎｈｉｌｄｅ、ＭＥＦ−１、Ｓａｕｋｅｔｔ、又はこれらの組み合わせから選択される。一実施形態では、細胞株の細胞は、２つ又は３つのポリオウイルスを含む。一実施形態では、ピコルナウイルスはエンテロウイルス７１である。
【００１３】
操作された細胞株は、哺乳動物細胞株、トリ細胞株、又は昆虫細胞株とすることができる。一実施形態では、哺乳動物細胞株は、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、イヌ細胞株、又はハムスター細胞株から選択される。一実施形態では、哺乳動物細胞株は、ＨＥｐ−２又はＶｅｒｏＰである。一実施形態では、トリ細胞株は、ニワトリ細胞株又はアヒル細胞株である。
【００１４】
本明細書では、操作された細胞株の溶解物がさらに提供される。
【００１５】
本明細書では、ウイルスを産生する方法が提供される。一実施形態では、この方法は、操作された細胞株を用意するステップであって、この細胞株の細胞がウイルスを含む、ステップ、この操作された細胞株を、細胞によるウイルスの産生に適した条件下でインキュベートするステップ、任意選択で、細胞によって産生されたウイルスを収集するステップを含む。一実施形態では、この方法は、細胞株を用意するステップであって、この細胞株の細胞がウイルスを含む、ステップ；この細胞株を、細胞によるウイルスの産生に適した条件下でインキュベートするステップであって、培地が、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現を阻害するＲＮＡポリヌクレオチドを含む、ステップ；及び、任意選択で、細胞によって産生されたウイルスを収集するステップを含む。一実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はアンチセンスポリヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９から選択される）、表ＩＶから選択されるｍｉＲＮＡの活性を阻害するｍＲＮＡインヒビター、又はこれらの組み合わせであり得る。
【００１６】
一実施形態では、この方法は、細胞株を用意するステップであって、この細胞株の細胞がウイルスを含み、この細胞が、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現を低下させる編集されたゲノムを含む、ステップ、細胞株を、細胞によるウイルスの産生に適した条件下でインキュベートするステップ、及び、任意選択で、細胞によって産生されたウイルスを収集するステップを含む。一実施形態では、ゲノムは、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、又は転写活性化因子様エフェクターによって編集される。一実施形態では、この方法は、細胞株を用意するステップであって、この細胞株の細胞がウイルスを含む、ステップ、この細胞株を、細胞によるウイルスの産生に適した条件下でインキュベートするステップであって、培地が、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現を阻害する小分子を含む、ステップ、及び、任意選択で、細胞によって産生されたウイルスを収集するステップを含む。
【００１７】
方法に使用される細胞は、ピコルナウイルスを含み得る。一実施形態では、ピコルナウイルスは、ポリオウイルス、例えば、弱毒化ポリオウイルス、例えば、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ２、Ｓａｂｉｎ３である。一実施形態では、ポリオウイルスは、Ｍａｈｏｎｅｙ、Ｂｒｕｎｈｉｌｄｅ、ＭＥＦ−１、Ｓａｕｋｅｔｔ、又はこれらの組み合わせから選択される。一実施形態では、使用される細胞は、２つ又は３つのポリオウイルスを含む。一実施形態では、ピコルナウイルスはエンテロウイルス７１である。
【００１８】
方法に使用される細胞は、哺乳動物細胞株、トリ細胞株、又は昆虫細胞株であり得る。一実施形態では、哺乳動物細胞株は、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、イヌ細胞株、又はハムスター細胞株から選択される。一実施形態では、哺乳動物細胞株は、ＨＥｐ−２又はＶｅｒｏＰである。一実施形態では、トリ細胞株は、ニワトリ細胞株又はアヒル細胞株である。
【００１９】
ウイルス感染している又はウイルス感染のリスクのある対象を治療する方法が提供される。一実施形態では、この方法は、この対象の細胞での、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現を増加させるステップを含む。一実施形態では、この方法は、この対象の細胞での、表ＩＩから選択されるコーディング領域の発現を阻害するステップを含む。一実施形態では、この方法は、この対象の細胞での、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９から選択される内在性ｍｉＲＮＡの発現を阻害するステップを含む。一実施形態では、この方法は、この対象の細胞での、表ＩＶから選択されるｍｉＲＮＡの発現を増加させるステップを含む。
【００２０】
「及び／又は」という語は、列記された要素の１つもしくは全て、又は列記された要素のいずれか２つ以上の組み合わせを意味する。
【００２１】
「好ましい」及び「好ましくは」という語は、特定の状況下で、特定の利益を提供することができる本発明の実施形態を指す。しかしながら、他の実施形態は、同じ又は他の状況下で好ましい場合もあり得る。さらに、１つ以上の好ましい実施形態の記述は、他の実施形態が有用ではないことを示唆するものでも、他の実施形態が本発明の範囲から除外されることを意図するものでもない。
【００２２】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語及びその変形は、説明及び特許請求の範囲でこれらの用語が使用されている部分を制限する意味を有するものではない。
【００２３】
特段の記載がない限り、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、及び「少なくとも１つ」は、互換的に使用され、１つ又は１つ以上を意味する。
【００２４】
本明細書ではまた、終点による数値範囲の記述は、その範囲内に含まれる全ての数値を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５など）。
【００２５】
個々のステップを含む本明細書で開示されるどの方法でも、これらのステップは、任意の可能な順序で行うことができる。そして、必要に応じて、２つ以上のステップの任意の組み合わせを同時に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】全ゲノムｓｉＲＮＡの一次スクリーニングの結果を示している。グラフは、ポリオウイルス特異的ＥＬＩＳＡを用いた１８，２００を超える遺伝子のスクリーニングの結果を示している。これらのスクリーニングに使用されたウイルスはＳａｂｉｎ２であった。Ｙ軸は、正規化Ｚスコアを示している。Ｘ軸は、スクリーニングされた遺伝子を示している。
【図２】ＣＣＩＤ５０アッセイの結果を示している。グラフは、ベロ細胞における一群の例示的な個々の遺伝子のノックダウンがウイルス力価にどのように影響を与えるかを示している。Ｙ軸は、非標的対照（ＮＴＣ）に対して正規化されたウイルス力価である。これらのスクリーニングに使用されたウイルスはＳａｂｉｎ２であった。Ｘ軸は遺伝子名を示している。
【図３】プラークアッセイの結果を示している。（Ａ）の図は、一次スクリーニングで同定された標的遺伝子のノックダウンが全プラーク数（ウイルス力価、即ち、ウイルスの量）をどのように増加させるかの例を示している。対照＝非標的対照ｓｉＲＮＡ。上清の希釈範囲は、１０−４〜１０−６である。（Ｂ）のグラフは、一次ＥＬＩＳＡスクリーニングで同定された一群のヒットからの結果を示している。ＮＴＣ＝非標的対照。ｓｉＰｏｌｉｏ＝ポリオウイルスゲノムを標的とするｓｉＲＮＡ。これらのスクリーニングに使用されたウイルスはＳａｂｉｎ２であった。
【図４】抗原当量試験の結果を示している。抗原当量試験は、特定の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡで改変された、又は改変されていないベロ細胞で産生されたウイルスに対して行った。数値は、所与の遺伝子ノックダウンに由来するウイルスの感染性を中和する正規化ヒト血清プールの希釈を示している。
【図５Ａ】図５。ポリオウイルス１型及びポリオウイルス３型（Ｓａｂｉｎ株）の結果を示している。一次（Ｓａｂｉｎ２）スクリーニングで同定された遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたベロ細胞を、次に（Ａ）ポリオウイルス１型（Ｓａｂｉｎ株）又は（Ｂ）ポリオウイルス３型（Ｓａｂｉｎ）に感染させた。その後の上清を、実施例１に説明されているポリオウイルスＥＬＩＳＡを用いて評価した。一次スクリーニングで同定された遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡしたベロ細胞を、次に（Ｃ）ポリオウイルス１型（Ｓａｂｉｎ株）又は（Ｄ）ポリオウイルス３型（Ｓａｂｉｎ）に感染させた。その後の上清を、実施例１で説明されるプラークアッセイを用いて評価した。
【図５Ｂ】図５。ポリオウイルス１型及びポリオウイルス３型（Ｓａｂｉｎ株）の結果を示している。一次（Ｓａｂｉｎ２）スクリーニングで同定された遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたベロ細胞を、次に（Ａ）ポリオウイルス１型（Ｓａｂｉｎ株）又は（Ｂ）ポリオウイルス３型（Ｓａｂｉｎ）に感染させた。その後の上清を、実施例１に説明されているポリオウイルスＥＬＩＳＡを用いて評価した。一次スクリーニングで同定された遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡしたベロ細胞を、次に（Ｃ）ポリオウイルス１型（Ｓａｂｉｎ株）又は（Ｄ）ポリオウイルス３型（Ｓａｂｉｎ）に感染させた。その後の上清を、実施例１で説明されるプラークアッセイを用いて評価した。
【図５Ｃ】図５。ポリオウイルス１型及びポリオウイルス３型（Ｓａｂｉｎ株）の結果を示している。一次（Ｓａｂｉｎ２）スクリーニングで同定された遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたベロ細胞を、次に（Ａ）ポリオウイルス１型（Ｓａｂｉｎ株）又は（Ｂ）ポリオウイルス３型（Ｓａｂｉｎ）に感染させた。その後の上清を、実施例１に説明されているポリオウイルスＥＬＩＳＡを用いて評価した。一次スクリーニングで同定された遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡしたベロ細胞を、次に（Ｃ）ポリオウイルス１型（Ｓａｂｉｎ株）又は（Ｄ）ポリオウイルス３型（Ｓａｂｉｎ）に感染させた。その後の上清を、実施例１で説明されるプラークアッセイを用いて評価した。
【図５Ｄ】図５。ポリオウイルス１型及びポリオウイルス３型（Ｓａｂｉｎ株）の結果を示している。一次（Ｓａｂｉｎ２）スクリーニングで同定された遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたベロ細胞を、次に（Ａ）ポリオウイルス１型（Ｓａｂｉｎ株）又は（Ｂ）ポリオウイルス３型（Ｓａｂｉｎ）に感染させた。その後の上清を、実施例１に説明されているポリオウイルスＥＬＩＳＡを用いて評価した。一次スクリーニングで同定された遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡしたベロ細胞を、次に（Ｃ）ポリオウイルス１型（Ｓａｂｉｎ株）又は（Ｄ）ポリオウイルス３型（Ｓａｂｉｎ）に感染させた。その後の上清を、実施例１で説明されるプラークアッセイを用いて評価した。
【図６】ｍｉＲＮＡ模倣体のスクリーニングの概要を示している。ポリオウイルス抗原を増加させた遺伝子及び低下させた遺伝子を同定するために一次ＥＬＩＳＡスクリーニングで１，２００を超えるｍｉＲＮＡ模倣体を試験した。
【図７】ＣＣＩＤ５０アッセイにおける個々のｍｉＲＮＡ模倣体の性能を示している。一次スクリーニングで同定された１１のｍｉＲＮＡは、ウイルス力価の２倍以上の増加をもたらしている。
【図８Ａ】図８。（Ａ）は、例示的な遺伝子ノックダウン（ＫＤ）のデータを示している。個々のｓｉＲＮＡのベロ細胞への感染後の標的遺伝子ノックダウンのレベルを評価するためにｑ−ＲＴ−ＰＣＲを使用した。９回の遺伝子サイレンシング実験（ＺＮＦ２０５、ＳＥＣ６１Ｇ、ＥＴＳ１、ＥＰ３００、ＢＴＮ２１Ａ、ＧＬＲＸＰ３、ＴＡＦ１、ＭＣＣＤ１、及びＧＣＧＲ）の結果は、７０％ＫＤ以上が通常は観察されることを示している。（Ｂ）のグラフは、１つの遺伝子ノックダウン事象の７つの異なるポリオウイルスに対する効果を示している。２９の別個の遺伝子を、ベロ細胞で個々にサイレンシングした。次に、細胞を、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ２、Ｓａｂｉｎ３、Ｍａｈｏｎｅｙ（野生型１）、Ｂｒｕｎｈｉｌｄｅ（野生型１）、ＭＥＦ（野生型２）、及びＳａｕｋｅｔｔ（野生型３）を含む７つの異なるポリオ株のうちの１つに感染させた。記録された力価は、非標的対照ｓｉＲＮＡ（ＮＴＣ）が細胞にトランスフェクトされるときに観察される力価に対してのものである。追加の対照は、（１）ポリオウイルスを標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＰｏｌｉｏ）のプール、偽感染（Ｍｏｃｋ）、及びｓｉＲＮＡの非存在下、脂質トランスフェクション試薬で処置された細胞（−ｓｉＲＮＡ）を含む。実線は、ウイルス力価の４倍の増加を示している。点線は、ウイルス力価の８倍（以上）の増加を示している。このデータは、一次スクリーニングで同定された遺伝子標的のノックダウンがポリオウイルスの産生を増大させることをさらに裏付けている。
【図８Ｂ】図８。（Ａ）は、例示的な遺伝子ノックダウン（ＫＤ）のデータを示している。個々のｓｉＲＮＡのベロ細胞への感染後の標的遺伝子ノックダウンのレベルを評価するためにｑ−ＲＴ−ＰＣＲを使用した。９回の遺伝子サイレンシング実験（ＺＮＦ２０５、ＳＥＣ６１Ｇ、ＥＴＳ１、ＥＰ３００、ＢＴＮ２１Ａ、ＧＬＲＸＰ３、ＴＡＦ１、ＭＣＣＤ１、及びＧＣＧＲ）の結果は、７０％ＫＤ以上が通常は観察されることを示している。（Ｂ）のグラフは、１つの遺伝子ノックダウン事象の７つの異なるポリオウイルスに対する効果を示している。２９の別個の遺伝子を、ベロ細胞で個々にサイレンシングした。次に、細胞を、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ２、Ｓａｂｉｎ３、Ｍａｈｏｎｅｙ（野生型１）、Ｂｒｕｎｈｉｌｄｅ（野生型１）、ＭＥＦ（野生型２）、及びＳａｕｋｅｔｔ（野生型３）を含む７つの異なるポリオ株のうちの１つに感染させた。記録された力価は、非標的対照ｓｉＲＮＡ（ＮＴＣ）が細胞にトランスフェクトされるときに観察される力価に対してのものである。追加の対照は、（１）ポリオウイルスを標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＰｏｌｉｏ）のプール、偽感染（Ｍｏｃｋ）、及びｓｉＲＮＡの非存在下、脂質トランスフェクション試薬で処置された細胞（−ｓｉＲＮＡ）を含む。実線は、ウイルス力価の４倍の増加を示している。点線は、ウイルス力価の８倍（以上）の増加を示している。このデータは、一次スクリーニングで同定された遺伝子標的のノックダウンがポリオウイルスの産生を増大させることをさらに裏付けている。
【図９Ａ】図９ＡおよびＢ。複数のポリオウイルス株の力価に対する二重遺伝子ノックダウンの効果の例示的なデータを示している。濃い灰色のバーは、両方の遺伝子が同時にサイレンシングされたときに観察されたウイルス力価の実際の増加を示している。薄い灰色は、個々の遺伝子がサイレンシングされたときに観察された変化の合計に基づいた予想力価を示している。「＊」は、観察された力価の増加が個々の事象の合計よりも大きい場合を示している（Ｐ＜０．０５）。
【図９Ｂ】図９ＡおよびＢ。複数のポリオウイルス株の力価に対する二重遺伝子ノックダウンの効果の例示的なデータを示している。濃い灰色のバーは、両方の遺伝子が同時にサイレンシングされたときに観察されたウイルス力価の実際の増加を示している。薄い灰色は、個々の遺伝子がサイレンシングされたときに観察された変化の合計に基づいた予想力価を示している。「＊」は、観察された力価の増加が個々の事象の合計よりも大きい場合を示している（Ｐ＜０．０５）。
【図１０Ａ】図１０。（Ａ）は、ＥＶ７１ウイルスの産生に対する遺伝子サイレンシングの効果を示している。ベロ細胞を、ポリオウイルスＲＮＡｉのスクリーニング中に同定された、いくつかの遺伝子のうちの１つを標的とするｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトした。遺伝子サイレンシングに適切な期間が経過してから、ＥＶ７１を培地に添加した。次に、相対力価を、細胞変性効果（ＣＰＥ）を検査することによって評価した。（Ｂ）は、３つの異なる遺伝子（ＺＮＦ２０５、ＣＮＴＤ２、及びＭＣＣＤ１）のサイレンシングが、ＥＶ７１の力価にどのように影響を与えるかを実証するプラークアッセイの結果を示している。「ＲＤ細胞」＝横紋筋肉腫細胞。（Ｃ）は、プラークアッセイの結果を定量している棒グラフである。実験は、３連で行い、非標的対照ｓｉＲＮＡ（ＮＴＣ）及びＥＶ７１ゲノムを標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＥＶ７１）を含んでいた。
【図１０Ｂ】図１０。（Ａ）は、ＥＶ７１ウイルスの産生に対する遺伝子サイレンシングの効果を示している。ベロ細胞を、ポリオウイルスＲＮＡｉのスクリーニング中に同定された、いくつかの遺伝子のうちの１つを標的とするｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトした。遺伝子サイレンシングに適切な期間が経過してから、ＥＶ７１を培地に添加した。次に、相対力価を、細胞変性効果（ＣＰＥ）を検査することによって評価した。（Ｂ）は、３つの異なる遺伝子（ＺＮＦ２０５、ＣＮＴＤ２、及びＭＣＣＤ１）のサイレンシングが、ＥＶ７１の力価にどのように影響を与えるかを実証するプラークアッセイの結果を示している。「ＲＤ細胞」＝横紋筋肉腫細胞。（Ｃ）は、プラークアッセイの結果を定量している棒グラフである。実験は、３連で行い、非標的対照ｓｉＲＮＡ（ＮＴＣ）及びＥＶ７１ゲノムを標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＥＶ７１）を含んでいた。
【図１０Ｃ】図１０。（Ａ）は、ＥＶ７１ウイルスの産生に対する遺伝子サイレンシングの効果を示している。ベロ細胞を、ポリオウイルスＲＮＡｉのスクリーニング中に同定された、いくつかの遺伝子のうちの１つを標的とするｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトした。遺伝子サイレンシングに適切な期間が経過してから、ＥＶ７１を培地に添加した。次に、相対力価を、細胞変性効果（ＣＰＥ）を検査することによって評価した。（Ｂ）は、３つの異なる遺伝子（ＺＮＦ２０５、ＣＮＴＤ２、及びＭＣＣＤ１）のサイレンシングが、ＥＶ７１の力価にどのように影響を与えるかを実証するプラークアッセイの結果を示している。「ＲＤ細胞」＝横紋筋肉腫細胞。（Ｃ）は、プラークアッセイの結果を定量している棒グラフである。実験は、３連で行い、非標的対照ｓｉＲＮＡ（ＮＴＣ）及びＥＶ７１ゲノムを標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＥＶ７１）を含んでいた。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
表Ｉは、ポリオウイルス抗原及び複製を増加させる１２４の遺伝子のリストを示している。表は、遺伝子名、ＫＥＧＧ換算数、及び一次ポリオ特異的ＥＬＩＳＡからのＺスコア値を示している。
【００２８】
表ＩＩは、サイレンシングされるとポリオウイルス抗原及びウイルスの産生を大幅に低下させる１００を超える遺伝子のリストを示している。
【００２９】
表ＩＩＩは、ポリオウイルス抗原及びウイルスの産生を増加させた２つ以上のｓｉＲＮＡを有する（表Ｉに示された１２４のヒットからの）６８の遺伝子のリストを示している。表は、遺伝子名、及び表現型を誘導したｓｉＲＮＡの数を示している。
【００３０】
表ＩＶは、サイレンシングされるとポリオウイルス抗原及びウイルスの産生を大幅に低下させる、宿主によってコードされるｍｉＲＮＡのリストを示している。
【００３１】
表Ｖは、図８のデータを作成するために使用された遺伝子、アクセッション番号、及びｓｉＲＮＡ配列のリストを示している。
【００３２】
表ＶＩは、相加作用的又は相乗作用的にポリオウイルスの産生を増大させる４９の遺伝子の組み合わせを示している。
【００３３】
ここで、本開示を、好ましい実施形態に関連して説明する。これらの実施形態は、本開示の理解の助けとなるように示され、いかなる場合も本開示を限定するものでも、限定すると解釈されるべきものでもない。本開示を読めば、当業者には明らかになり得る全ての代替物、変更物、及び等価物は、本開示の概念及び範囲内に含まれる。
【００３４】
遺伝子の呼称に関して、単一遺伝子は、複数の記号で示される場合が多い。例えば、文献では、ペプチジルプロリルイソメラーゼＢをコードするシクロフィリンＢ遺伝子は、ＰＰＩＢ及びＣＹＰＢとして示されている。この文献に関連して、遺伝子記号は、ヒト又は非ヒトにかかわらず、大文字又は小文字で示すことができる。１つの特定の記号の使用も、小文字又は大文字の利用も、これらの発明の文脈における遺伝子の範囲を限定するものではない。本明細書に示される全ての遺伝子識別番号（ＧｅｎｅＩＤ）は、特段の記載がない限り、全米バイオテクノロジー情報センターの「Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ」又はＫＥＧＧウェブサイトからのものである。
【００３５】
本明細書で使用される「遺伝子」という語は、転写単位、及びこの転写単位に近接し（例えば、転写単位の上流及び下流に位置する）、この転写単位に機能的に連結された調節領域を指す。転写単位は、ＲＮＡ分子に転写される一連のヌクレオチドである。転写単位は、コーディング領域を含み得る。「コーディング領域」は、後にｍＲＮＡにプロセシングされるプロセシング前のｐｒｅＲＮＡ（即ち、エキソン及びイントロンの両方を含むＲＮＡ分子）をコードするヌクレオチド配列である。転写単位は、非コーディングＲＮＡをコードし得る。非コーディングＲＮＡは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ分子である。非コーディングＲＮＡの例には、ｍｉｃｒｏＲＮＡが含まれる。転写単位の境界は、一般に、その５’末端の開始部位及びその３’末端の転写ターミネーターによって決定される。「調節領域」は、この調節領域が機能的に連結されている、転写単位の発現を調節するヌクレオチド配列である。調節配列の非限定の例として、プロモーター、エンハンサー、転写開始部位、翻訳開始部位、翻訳終結部位、転写ターミネーター、及びポリ（Ａ）シグナルが挙げられる。転写単位の上流に位置する調節領域は、５’ＵＴＲと呼ぶことができ、転写単位の下流に位置する調節領域は、３’ＵＴＲと呼ぶことができる。調節領域は、転写することができ、プロセッシング前のｐｒｅＲＮＡの一部であり得る。「機能的に連結された」という語は、要素同士が意図するように機能することができる関係にあるような要素の並置を指す。
【００３６】
本明細書で使用される「コーディング領域の発現の低下」及び「コーディング領域の発現の増加」という語は、コーディング領域の転写の変化、コーディング領域によってコードされるｍＲＮＡの転写の変化、又はコーディング領域によってコードされるポリペプチドの活性の変化を指す。
【００３７】
本明細書の文脈において、「ワクチン」という語は、限定されるものではないが、例えば、感染性病原体から保護するために動物又はヒトの免疫系を刺激するために使用される、ペプチドもしくは改変ペプチド、タンパク質もしくは改変タンパク質、生ウイルス、弱毒化生ウイルス、不活化もしくは死滅ウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、又はこれらの任意の組み合わせを含む作用物質を指す。ワクチンは、このような治療を受ける対象における抗体、抗体様分子の産生、又は細胞免疫応答を刺激することによってよく作用する。
【００３８】
「ウイルスの産生」という語は、生ウイルス、弱毒化ウイルス、及び／又はＶＬＰの産生を指し得る。産生は、（１）生物（例えば、卵）、培養細胞（例えば、ベロ細胞）、又はインビトロ（例えば、細胞溶解物によって）での産生を含むルーチンの方法で行うことができる。
【００３９】
「細胞株」という語は、分裂し続けることができ、かつ老化しない細胞のクローン集団を指す。
【００４０】
「ワクチン細胞株」という語は、ワクチンを産生するために使用される全ての細胞もしくは改変された細胞、又はワクチンを産生するために使用される１つ以上の細胞に部分的又は完全に由来する全ての細胞溶解物もしくは改変細胞溶解物を指す。細胞は、哺乳動物（限定されるものではないが、ヒト、非ヒト霊長類、ハムスター、イヌ）、トリ（例えば、ニワトリ、アヒル）、及び昆虫などを含むあらゆる供給源から得ることができる。ワクチンを産生するために使用される細胞溶解物は、同様にあらゆる細胞型から得ることができる。ある場合には、「宿主細胞」及び「ワクチン細胞株」という語は、同義であり、（１）病原体（例えば、ウイルス）による感染の標的である任意の細胞、（２）ウイルスもしくはワクチンのサブユニット（例えば、免疫原性タンパク質）の産生に使用される任意の細胞、及び／又は（３）生体分子の産生に使用される任意の細胞を含む。
【００４１】
「増強ワクチン細胞株」、「増強細胞株」、「操作されたワクチン細胞株」、又は「操作された細胞株」という語は全て、ワクチン又は生体分子の産生又は特性を促進するよう、内因性に発現される１つ以上の遺伝子の発現又は特性を調節するように１つ以上の手段によって改変された細胞株又は細胞溶解物を指す。
【００４２】
本明細書で使用される「対照細胞株」及び「対照細胞」という語は、操作された細胞株に遺伝子的に類似しているが、同じ方式では操作されていない細胞株を指す。例えば、操作された細胞株は、同じ方式では操作されていない対照細胞株と比較した、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現の低下を有し得る。
【００４３】
遺伝子発現を調節するために使用できる方法としては、限定されるものではないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンス分子、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬ（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ、トリプレックス、改変トリプレックス、小分子、及び読み取り枠（ＯＲＦ）又はクローンＤＮＡの発現の変更などが挙げられる。
【００４４】
本明細書の文脈において、「標的」もしくは「標的遺伝子」又は「ヒット」という語は、（調節されると）ウイルス又は生体分子の産生の一部の態様を正又は負に変更する、タンパク質をコードする遺伝子及び非コーディングＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）を含むあらゆる遺伝子を指す。標的遺伝子としては、内因性宿主遺伝子、病原体（例えば、ウイルス）遺伝子、及び導入遺伝子が挙げられる。
【００４５】
「調節する」又は「調節」という語は、遺伝子の制御、発現、又は活性の変更を指す。一般に、「調節」という語が、遺伝子の発現又は活性を増大させること、遺伝子の発現又は活性を低下させること、及び遺伝子の特異性又は機能を変更することを含むことを当業者には理解されよう。遺伝子の発現又は活性の調節は、次の１つ以上の変更を含む多数の手段によって達成することができる：（１）遺伝子のコピー数、（２）遺伝子の転写又は翻訳、（３）転写物の安定性又は寿命、（４）ｍＲＮＡ又はｍｉＲＮＡのコピー数、（５）非コーディングＲＮＡ又は非コーディングＲＮＡ標的部位の利用可能性、（６）タンパク質の翻訳後修飾の位置又は程度、（７）タンパク質の活性、及び他の機序。調節により、標的遺伝子の活性の著しい低下（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、又はそれ以上の低下）又は標的遺伝子の活性の増大（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、又はそれ以上の増大）が起こり得る。さらに、１つ以上の遺伝子の調節は、後に複数の遺伝子（例えば、ｍｉＲＮＡ）の調節をもたらし得ることを当業者には理解されよう。
【００４６】
「ｍｉｃｒｏＲＮＡ」という語は、その通常の明らかな意味で使用され、ＲＮＡベースの遺伝子制御に関与する、真核生物に見られるｍｉｃｒｏＲＮＡ分子を指す（例えば、Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０１：３３６−３３８を参照）。個々のｍｉＲＮＡは、異なる生物で同定されて配列決定され、ｍｉＲＮＡ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙへの提出に基づいて命名されている（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ，２００４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３２（Ｓｕｐｐｌ  １）：Ｄ１０９−Ｄ１１１、及びｍｉＲＢａｓｅ．ｏｒｇを参照）。ｍｉＲＮＡの名称は、本明細書に示され、それらの配列は、ｍｉＲＢａｓｅ．ｏｒｇから容易に入手可能である。加えて、他のｍｉＲＮＡは、当業者に周知であり、本明細書で説明される実施形態で容易に実施することができる。本方法及び本組成物は、例として示されるものであり、本明細書で説明される実施形態の制限として必要ではないため、本出願で同定されるｍｉＲＮＡに限定されるべきものではない。天然のｍｉＲＮＡ領域との同一性が１００％未満であるｍｉＲＮＡ領域を有するｍｉＲＮＡは、「ｍｉｍｉｃ  ｍｉＲＮＡ」と呼ばれることもある。前記分子は、改変されても良いし、又は改変されなくても良い。
【００４７】
「バイオプロセシング」又は「生物学的生産」という語は、（１）細胞株、（２）細胞溶解物、又は（３）インビボプラットフォームでのモデル（例えば、卵）における生物学的産物（例えば、生物学的治療薬、ワクチン）の実験室及び工業規模の生産を指す。
【００４８】
「ピコルナウイルス」という語は、ピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのメンバーを指す。ピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのメンバーの例には、エンテロウイルス属が含まれる。エンテロウイルス属のメンバーの例には、Ａ群エンテロウイルスが含まれる。Ａ群エンテロウイルスの一例として、本明細書ではＥＶ７１とも呼ばれるエンテロウイルス７１が挙げられる。エンテロウイルス属の例には、Ｃ群エンテロウイルスが含まれる。Ｃ群エンテロウイルスの一例としては、ポリオウイルスが挙げられる。野生型毒性ポリオウイルス株の例には、Ｍａｈｏｎｅｙ、Ｂｒｕｎｈｉｌｄｅ、ＭＥＦ−１、及びＳａｕｋｅｔｔが含まれる。弱毒化ポリオウイルス株の例には、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ２、及びＳａｂｉｎ３が含まれる。ポリオウイルスは、血清型１（例えば、Ｓａｂｉｎ１、Ｍａｈｏｎｅｙ、及びＢｒｕｎｈｉｌｄｅ）、血清型２（例えば、Ｓａｂｉｎ２及びＭＥＦ−１）、又は血清型３（例えば、Ｓａｂｉｎ３及びＳａｕｋｅｔｔ）であり得る。「ピコルナウイルス」という語は、ワクチンの産生に使用できる現在又は将来のあらゆるピコルナウイルスを含むものとする。これらには、全ての野生型株、親株、弱毒化株（例えば、ポリオウイルス血清型１、２、及び３のＳａｂｉｎ株）、ＶＬＰ、３つの既知のポリオウイルス以外のピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのあらゆるメンバー、及び現在又は将来の組み換え又は操作された株が含まれる。
【００４９】
発生する事象、例えば、ウイルスの産生に「適した」条件、又は「適した」条件は、このような事象の発生を防止しない条件である。従って、これらの条件は、事象を許容する、増大させる、促進する、かつ／又は事象に寄与する。
【００５０】
ピコルナウイルス産生の増大
本開示は、ワクチンを産生するための組成物及び方法に関する。好ましい一適用例では、本組成物及び本方法は、ポリオワクチンの産生に関する。本開示の使用により、ワクチンの産生を改善する改変細胞株、細胞溶解物、及び／又はインビボ系（例えば、卵内）に関連した組成物及び方法が考えられ得る。
【００５１】
ワクチンは、様々な手段によって産生させることができる。一例として、限定されるものではないが、ヒト、非ヒト霊長、イヌ、及びトリを含むあらゆる供給源に由来する細胞を、まず適切な環境（例えば、細胞もしくは組織の培養プレート又はフラスコ）で所望の密度になるまで培養する。次に、種ウイルスストック（例えば、Ｓａｂｉｎ２ポリオウイルス）を培地に添加し、そこで細胞に感染する。次いで、感染した細胞を生物反応器（例えば、１つの生物反応器のみを使用）に移し、そこでウイルスが複製し、数を増やす。適切な期間が経過したら、細胞及び細胞粒子を、新たに放出されたウイルス粒子から分離し、ワクチンとして使用される材料をさらに調製するために追加のステップ（例えば、精製、不活化、濃縮）を行う。
【００５２】
ウイルスの増殖に関連して、宿主細胞は、ウイルスの複製に重大な貢献をする。例として、宿主によってコードされる細胞表面タンパク質は、ウイルスが細胞内に侵入するためにウイルスによってよく使用される（Ｒａｍｏｓ，Ｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：１１７）。同様に、宿主区画（例えば、エンドサイトーシス小胞）は、しばしば、病原体関連遺伝子プロセスにとって必須の機能を有する細胞内領域に移送するために病原体によって使用される（Ｋａｒｌａｓ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  ４６３：８１８）。病原体の増殖に必須の機能の欠落は、病原体の複製に悪影響を与え得る。逆に、病原体の複製に悪影響を与える機能の欠落、又は病原体の増殖に必須の機能の過剰発現は、場合によっては、例えば、ウイルスの産生を大幅に増大させ得る（Ｋｏｌｏｋｏｌｔｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：７７８６）。
【００５３】
以前の研究により、ウイルス感染を促進する、宿主によってコードされる遺伝子のノックダウン及び過剰発現の事象が確認されたが、これらの発見が、たとえ近縁系でもあまり複製されないことが十分に文書に記されている。例として、Ｂｒａｓｓら（Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００８）３１９：９２１）及びＫｏｎｉｇら（Ｃｅｌｌ（２００８）１３５：４９）を含むいくつかのグループが、ＲＮＡｉ技術を使用して、ＨＩＶの複製で役割を果たす宿主によってコードされる遺伝子を同定した。これらの研究の間に、各グループが、調節されるとＨＩＶの複製の１つ以上の特徴を変更する２００を超える宿主によってコードされる遺伝子を同定した。各グループによって作成された遺伝子ヒットのリストを比較すると、遺伝子の１０％未満が、両方のデータセットで共通であった。当該分野の専門家は、これらの結果を、ウイルス株、細胞系、及び各試験で利用されるアッセイを含む多数の因子における僅かな差によるものであるとした。発明者らは、これらの発見がそれほど重要でないことが分かったため、彼らの現在の研究を、ワクチンの産生に現在利用されているウイルス及び細胞系に集中させた。
【００５４】
一実施形態では、本明細書に、（個々に又は一緒に）調節されると細胞、細胞株、又は細胞溶解物におけるポリオウイルス又はポリオウイルス抗原を含むピコルナウイルス又はピコルナウイルス抗原の産生を促進する、タンパク質をコードする遺伝子のリストが示されている（表Ｉ）。好ましくは、示されているリストにある遺伝子の調節により、ポリオウイルスのＳａｂｉｎ−２ワクチン株の産生が増大する。より好ましくは、示されているリストにある遺伝子の調節により、ポリオウイルスワクチンの製造に使用される細胞、細胞株、又は細胞溶解物におけるＳａｂｉｎ−１、Ｓａｂｉｎ２、及び／又はＳａｂｉｎ３ポリオウイルス又はポリオウイルス抗原の産生が増大する。
【００５５】
【表１】
2016506734.tif 000002
【００５６】
【表２】
2016506734.tif 000003
【００５７】
【表３】
2016506734.tif 000004
【００５８】
【表４】
2016506734.tif 000005
【００５９】
このリストは、限定されるものではないが、キナーゼ、プロテアーゼ、ユビキチン化、先天性免疫、及びアポトーシスなどを含む複数のクラス／ファミリー及び機能に分類される遺伝子を含む。実施例に示されているように、特定の遺伝子の下方制御は、ウイルスタンパク質の産生及び／又は感染性の生ピコルナウイルスの全力価を著しく増大させる。同時に、この研究で使用されるスクリーニングは、サイレンシングされるとポリオウイルスの複製を減少させる一群の遺伝子も同定した（表ＩＩ、実施例）。遺伝子のこの後者のクラスが、ポリオ及び他のウイルス疾患の治療にとって潜在的な治療標的の有用な一群を表していることに気付いた。このリストはまた、これらの遺伝子の過剰発現がピコルナウイルスの産生を増大させるはずであるという点で、ワクチンの製造の展望から有用である。
【００６０】
【表５】
2016506734.tif 000006
【００６１】
【表６】
2016506734.tif 000007
【００６２】
【表７】
2016506734.tif 000008
【００６３】
【表８】
2016506734.tif 000009
【００６４】
【表９】
2016506734.tif 000010
【００６５】
【表１０】
2016506734.tif 000011
【００６６】
【表１１】
2016506734.tif 000012
【００６７】
【表１２】
2016506734.tif 000013
【００６８】
【表１３】
2016506734.tif 000014
【００６９】
ピコルナウイルスの産生が増大される機序は、多様である可能性が高い。ある場合には、スクリーニングで同定された遺伝子は、ウイルスの１つ以上の成分と直接的な負の相互作用をした。例えば、宿主遺伝子産物は、細胞の先天性免疫の直接的なメディエーターであり得、従って、例えば、ウイルスゲノムを検出し、後にアポトーシス状態を誘導することによって抗ウイルス特性を有する。他の場合には、遺伝子の作用は間接的であり得、遺伝子産物の調節が、例えば、複製の際にウイルスが依存する経路、区画、又は細胞の状態を変更することによってウイルス複製に良い影響を及ぼす。例えば、特定の調節事象が、宿主タンパク質の翻訳後修飾を増大させ、こうすることにより、ウイルス複製に必須の１つ以上の宿主細胞の分泌経路を確実に強化すると考えられる。あるいは、１つ以上の遺伝子調節は、細胞の生存率を高めることができ、これにより、ウイルス複製を補助することができる細胞の数が増加する。なお他のシナリオでは、１つ以上の遺伝子調節は、ウイルスの増殖をより促す細胞周期の段階に細胞を留めることができる。これらの場合には、発明者らは、本発明の利益がポリオウイルスワクチンの産生に限定され得るのではなく、他のピコルナウイルス又は生体分子（例えば、治療抗体）まで拡大可能であり得ると予測する。
【００７０】
本明細書で確認された遺伝子の調節は、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャー及び／もしくは非コーディングＲＮＡ、並びに／又はタンパク質を操作する技術を含む複数の方法によって達成することができる。従って、目的の遺伝子を調節するために利用することができる技術又は機序は、限定されるものではないが、（１）編集されたゲノムとなるゲノムＤＮＡを標的とする技術及び試薬（例えば、欠失などの突然変異を遺伝子に誘導する相同組換え、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター（例えば、ＴＡＬＥＮ）、トリプレックス、後成的修飾のメディエーター、並びにＣＲＩＳＰＲ及びｒＡＡＶ技術）、（２）ＲＮＡを標的とする技術及び試薬（例えば、ＲＮＡｉ経路を介して作用する試薬、アンチセンス技術、リボザイム技術）、及び（３）タンパク質を標的とする技術（例えば、小分子、アプタマー、ペプチド、オーキシン又はＦＫＢＰによって媒介される不安定ドメイン、抗体）を含む。
【００７１】
ＤＮＡを標的とする一実施形態では、遺伝子調節は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用いて達成される。合成ＺＦＮは、例えば、ＦｏｋＩ  ＤＮＡ切断ドメインに融合する特注設計の亜鉛フィンガー結合ドメインからなる。これらの試薬は、限定されるものではないが、様々な生物における遺伝子発現のノックアウト又はノックインを含む、細胞のゲノムの編集のために設計／操作することができるため、安定的に操作された所望の形質を有する細胞株を開発するための標準の１つと考えられる。メガヌクレアーゼ、トリプレックス、ＣＲＩＳＰＲ、及び組換えアデノ随伴ウイルスは、同様に、多様な細胞型におけるゲノム操作に使用されており、ＺＦＮの実行可能な代替物である。説明された試薬は、プロモーター、タンパク質をコードする領域（エキソン）、イントロン、並びに５’及び３’ＵＴＲなどを標的とするために使用することができる。
【００７２】
遺伝子機能を調節するための他の実施形態は、細胞の内因性ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を利用して細胞のメッセンジャーＲＮＡを標的とする。このアプローチでは、遺伝子を標的とする試薬として、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げることができる。これらの試薬は、様々な化学修飾、目的の標的転写物に対する相補性のレベル、並びに安定性、細胞送達性、特異性、及び機能性を高めるための設計（例えば、米国特許第８，１８８，０６０号明細書を参照）を含み得る。加えて、このような試薬は、遺伝子の多様な領域（ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ、読み取り枠、３’ＵＴＲを含む）、又は（場合によっては）目的の遺伝子をコードするゲノムＤＮＡのプロモーター／エンハンサー領域を標的とするように設計することができる。遺伝子調節（例えば、ノックダウン）は、同じｍＲＮＡ転写物の異なる領域を標的とする１つのｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ又は複数のｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ（即ち、プール）を（細胞に）導入することによって達成することができる。合成ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡの送達は、限定されるものではないが、（１）自己送達（米国特許出願第２００９／０２８０５６７Ａ１号明細書）、（２）脂質媒介送達、（３）エレクトロポレーション、又は（４）ベクター／プラスミドベースの発現系を含むあらゆる方法によって達成することができる。導入されたＲＮＡ分子は、外因性ヌクレオチド配列又はポリヌクレオチドと呼ぶことができる。
【００７３】
ＲＮＡｉ経路を使用する他の遺伝子標的試薬には、ｓｈＲＮＡとも呼ばれる低分子ヘアピンＲＮＡが含まれる。例えば、発現構築物（例えば、プラスミド、レンチウイルス）を介して細胞に送達されるｓｈＲＮＡは、利用されるプロモーターの種類によって構成的又は調節的に長期の遺伝子ノックダウンを実現する能力を有する。好ましい一実施形態では、レンチウイルス粒子のゲノムは、目的の遺伝子（又は複数の遺伝子）を標的とする１つ以上のｓｈＲＮＡ発現カセットを含むように改変される。このようなレンチウイルスは、ワクチン産生用の細胞を感染させ、それらのウイルスゲノムを宿主ゲノムに安定に組み込み、（１）構成的に、（２）調節的に、又は（複数のｓｈＲＮＡが発現される場合は）後成的かつ調節的にｓｈＲＮＡを発現させることができる。このようにして、ピコルナウイルス産生能力が増大された細胞株を作製することができる。ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを使用するこのアプローチは、１つの遺伝子又は複数の近縁遺伝子ファミリーメンバーの個々の変異体を標的とするように設計することができるという点でさらなる利益を有することに留意されたい。このようにして、個々の試薬を使用して、同様又は重複した機能又は配列モチーフを有する大群の標的を調節することができる。当業者であれば、レンチウイルス構築物がクローンＤＮＡ、又はＯＲＦ発現構築物も取り込み得ることを理解されよう。
【００７４】
他の実施形態では、タンパク質レベルで調節が行われる。例として、タンパク質レベルでの遺伝子機能のノックダウンは、限定されるものではないが、小分子、ペプチド、アプタマー、不安定化ドメインを用いてタンパク質を標的とすることを含む多数の手段によって、又は、例えば、遺伝子産物の活性を下方制御する、もしくは遺伝子産物の変性速度を速めることができる他の方法によって達成することができる。好ましい一例では、例えば、活性部位に結合して標的タンパク質の機能を阻害する小分子を、例えば、細胞培地に添加し、これにより細胞に導入することができる。あるいは、標的タンパク質の機能を、例えば、（例えば）タンパク質とタンパク質との相互作用を防止するペプチドを細胞に導入することによって調節することができる（例えば、Ｓｈａｎｇａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ４９：２２３を参照されたい）。このようなペプチドは、トランスフェクションもしくはエレクトロポレーションによって細胞に導入しても良いし、又は発現構築物を介して細胞に導入しても良い。あるいは、ペプチドは、（１）細胞への送達を促進する１つ以上の成分を（例えば、結合によって）添加することによって、又は（２）分子を過度に供給して自己送達を促進することによって細胞に導入することができる（Ｃｒｏｎｉｃａｎ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５（８）：７４７−５２）。ペプチドを発現させる技術には、限定されるものではないが、（１）ペプチドの足場への融合、又は（２）ペプチドを目的の位置又は区画に対して安定させる、もしくは案内するためのシグナル配列の付着がそれぞれ含まれる。
【００７５】
本明細書で示される遺伝子は、Ｓａｂｉｎ−２カプシド抗原及びポリオウイルスの産生を増大させる遺伝子ノックダウン事象を特定するように設計されたスクリーニングで同定されたが、実施例の部分に記載される研究により、これらの遺伝子の調節はまた、ポリオウイルスの他の血清型（例えば、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ３）及びエンテロウイルス７１の産生も増大させることを実証する。これは、現行のポリオウイルスワクチンが３つ全ての血清型（例えば、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ２、及びＳａｂｉｎ３、又はこの３つの血清型のそれぞれの野生型株）を含むため、ワクチンの製造の観点から特に重要である。このため、追加の実施形態は、限定されるものではないが、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ３、他のポリオウイルス株、及びエンテロウイルス７１に由来するウイルス及び抗原を含む、Ｓａｂｉｎ２ポリオウイルス又はＳａｂｉｎ２ポリオウイルス抗原以外のピコルナウイルス又はピコルナウイルス抗原の産生を、調節されると増大させる遺伝子のリストを含む。
【００７６】
ポリオウイルスの産生を増大させた遺伝子の最初のスクリーニングは、ＨＥｐ−２Ｃ細胞株で行われた。ＨＥｐ−２Ｃ細胞は、ヒトに由来し、このため、最初のスクリーニングは、調節されるとポリオウイルスの産生を増大させるヒト遺伝子を同定した。以下の実施例の部分で説明されるように、有効性確認試験は、アフリカミドリザルの腎臓に由来するベロ細胞を利用した。一次スクリーニングで同定されたヒットも、ベロ細胞におけるポリオウイルス力価を高めるため、追加の実施形態は、一次スクリーニングで同定された遺伝子の相同分子種である遺伝子のリストを含む（表Ｉ）。このような相同分子種は、ヒト細胞もしくは非ヒト細胞、細胞株、又は細胞溶解物で調節して、ポリオウイルス又はポリオウイルス抗原の産生を含む、ピコルナウイルス又はピコルナウイルス抗原の産生を増大させることができる。本明細書で説明される方法に有用な細胞及び細胞株の例には、ピコルナウイルスの複製を助けることが知られている霊長類の細胞が含まれる。このような細胞は、ヒト、チンパンジー、及びサルの細胞であり得る。特定の例として、限定されるものではないが、ＷＩ−３８、ＭＲＣ−５、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲＣ６、ＨｅＬａ、及びアフリカミドリザルの腎細胞、例えば、ベロ細胞が挙げられる。
【００７７】
これとは別に、本発明らは、表Ｉに示されている遺伝子のリストが、ポリオウイルスの複製を増加させる潜在的な薬物標的でもあることを認識する。このため、他の実施形態では、表Ｉに列記されている遺伝子を調節してピコルナウイルスの複製を増加させ、これによりポリオウイルスを含むピコルナウイルスの産生を増大させることができる。ポリオウイルスの複製を増加せるために使用できる小分子の例として、限定されるものではないが、ＳＵ１４８９、ＰＤ９８０５９、レチノイン酸、クルクミン、ｌｙ２９４００２、ＤＬ−ＴＢＯＡ（ＤＬ−トレオ−β−ベンジルオキシアスパラギン酸）、及びＤＬ−トレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸を挙げることができる。
【００７８】
他の実施形態は、ピコルナウイルスの複製を増大又は減少させるように改変された以下の表に示されている１つ以上の遺伝子を有するノックアウト動物（例えば、ノックアウトマウス）を含む。
【００７９】
他の実施形態は、ピコルナウイルス抗原及びピコルナウイルスの産生を増大させるｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のリストを含む。実施例の部分に示されているように、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）模倣体のスクリーニングを、（上方制御されると）ポリオウイルスの産生を増大させるｍｉＲＮＡを同定するために行った。ｍｉＲＮＡ模倣体のスクリーニングにより、Ｓａｂｉｎ２ポリオウイルスの産生を促進した、宿主によってコードされる複数のｍｉＲＮＡが同定された。同定されたプロウイルスｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９であった。複数のｍｉＲＮＡ、即ち、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、及びｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐは、対照細胞と比較するとポリオウイルス抗原及びウイルスの産生を２倍〜４倍増加させる。複数のｍｉＲＮＡ、即ち、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９は、生ポリオウイルスの産生を４倍〜１２倍増加させる。これらのｍｉＲＮＡは、個別に、他のｍｉＲＮＡと組み合わせて、又は１つ以上のタンパク質をコードする遺伝子と組み合わせて調節して、ピコルナウイルス又はピコルナウイルス抗原の産生を押し上げることができる。この群のｍｉＲＮＡは、ポリオウイルスの産生を押し上げるため、ｍｉｃｒｏＲＮＡインヒビターの添加は、内因性ｍｉＲＮＡが存在する細胞におけるピコルナウイルスの産生を大幅に低下させると予想される。従って、他の実施形態は、ポリオに対する潜在的な治療薬として使用できるプロウイルスｍｉＲＮＡのリストを標的とするように設計されたｍｉｃｒｏＲＮＡインヒビターのリストを含む。
【００８０】
ｍｉＲＮＡインヒビター（当該分野では、ａｎｔｉ−ｍｉＲ、アンタゴｍｉｒ、及び／又はブロックｍｉｒとも呼ばれる）は、細胞に導入されると内因性ｍｉＲＮＡをサイレンシングする操作されたヌクレオチド配列である。ｍｉＲＮＡインヒビターの産生、同定、及び使用は、当業者には公知であり、かつルーチンである。ｍｉＲＮＡインヒビターの例示的な設計には、限定されるものではないが、（１）Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００４，ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．，２：Ｅ９８、（２）Ｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００４，ＲＮＡ  １０：５４４−５５０、及び（３）Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００７，ＲＮＡ，１３：７２３−７３０に記載されているｍｉＲＮＡインヒビターの設計が含まれる。
【００８１】
重要なことに、スクリーニングは、ポリオウイルス抗原及び／又はウイルスの産生を低下させるｍｉＲＮＡ模倣体も同定した（実施例及び表ＩＶを参照）。従って、別実施形態は、ポリオ感染を治療するための潜在的な治療薬として抗ウイルスｍｉＲＮＡのリストを含む。さらに、（例えば、ｍｉＲＮＡインヒビターによる）これらの抗ウイルスｍｉＲＮＡの阻害は、ピコルナウイルス抗原及びウイルスの産生を増加させると予想される。従って、他の実施形態は、ピコルナウイルス抗原及びウイルスの産生を促進するために抗ウイルスｍｉＲＮＡのリストを標的とするインヒビターのリストを含む。ｍｉＲＮＡインヒビターを（治療又はワクチンの産生のために）実施できる場合は、限定されるものではないが、改変及び非改変単一部位線状分子、ヘアピン構造を含む改変又は非改変分子、及び全て又は一部のｍｉＲＮＡ標的部位のコンカテマーを有する改変又は非改変設計を含め、様々な設計を利用することができる。
【００８２】
ポリオウイルスの産生を増大したｍｉＲＮＡの最初のスクリーニングは、ＨＥｐ−２Ｃ細胞株で行われた。ＨＥｐ−２Ｃ細胞は、ヒトに由来し、このため、最初のスクリーニングは、調節されるとポリオウイルスの産生を増大させるヒトｍｉＲＮＡを同定した。ある種で見出されたｍｉＲＮＡは、同一又は密接に関連した形態で他の種でも存在する場合が多いため、追加の実施形態は、ヒト又は非ヒトの細胞、細胞株、又は細胞溶解物で調節して、ピコルナウイルス又はピコルナウイルス抗原の産生を増加させることができる一次スクリーニングで同定されたｍｉＲＮＡの相同分子種であるｍｉＲＮＡのリストを含む。
【００８３】
他の実施形態は、ピコルナウイルス又はピコルナウイルス抗原の産生を増大させるために改変された実施例で同定された１つ以上の遺伝子（又は実施例で同定された遺伝子の相同分子種）を有する（ヒト又は非ヒト）細胞株を提供する。細胞株は、（ｉ）コーディング領域の発現に低下が存在するように表Ｉに示されている遺伝子（又はその相同分子種）に存在する少なくとも１つのコーディング領域の改変、（ｉｉ）コーディング領域の発現に増加が存在するように表ＩＩに示されている遺伝子（又はその相同分子種）に存在する少なくとも１つのコーディング領域の改変、（ｉｉｉ）ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現の増加、（ｉｖ）表ＩＶに示されている抗ウイルスｍｉＲＮＡを標的とするインヒビター、又は（ｖ）これらの組み合わせを含む。表Ｉに示されている遺伝子に存在する少なくとも１つのコーディング領域の改変は、細胞のゲノム中の遺伝子の変更、又は細胞におけるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、もしくはアンチセンスＲＮＡの存在によって達成することができる。遺伝子の変更には、限定されるものではないが、コーディング領域又はコーディング領域に機能的に連結された調節領域の突然変異が含まれる。一実施形態では、改変遺伝子は、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ２、及び／もしくはＳａｂｉｎ３の産生、又はＩＰＶの産生に使用される野生型ポリオウイルス株の産生を増大させる。一実施形態では、改変遺伝子はＥＶ７１の産生を増大させる。好ましくは、細胞株及びポリオウイルス又はポリオ抗原は、ポリオウイルスワクチンの産生に利用される。本発明者らは、細胞株を真核細胞又は操作された原核細胞とすることができることを認識している。あるいは、細胞は、天然で合成され得る（即ち、人工的に作製される）（Ｇｉｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９：５２−５６）。細胞が真核細胞又は改変された真核細胞である場合、前記細胞は、初代細胞、継代細胞、不死化細胞（細胞株）、又は幹細胞とすることができる。細胞は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ハムスター、及び昆虫などに由来し得る。一実施形態では、細胞は、ＨＥｐ−２Ｃ又はその誘導体とすることができる。一実施形態では、細胞は、ベロ又はその誘導体とすることができる。
【００８４】
他の実施形態は、本明細書で説明される細胞株に由来する細胞溶解物（ヒト又は非ヒト）を提供する。例えば、一実施形態では、細胞溶解物は、ウイルス又はウイルス抗原の産生を増大させるために改変された、実施例で同定された１つ以上の遺伝子（又は実施例で同定された遺伝子の相同分子種）を有する。好ましくは、改変された遺伝子は、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ２、及び／もしくはＳａｂｉｎ３ウイルスもしくはウイルス抗原の産生、又はＩＰＶの産生に使用される野生型ポリオウイルス株の産生を増大させる。好ましくは、細胞溶解物が、ポリオウイルスワクチンの産生に利用される。
【００８５】
他の実施形態では、標的遺伝子調節のタイミングは様々にすることができる。ある場合には、遺伝子調節は、ピコルナウイルスの感染の前に行うことができると考えられる。例えば、選択された遺伝子標的が、ピコルナウイルスの複製又はピコルナウイルス抗原の産生において非常に産生性の高い細胞周期の特定の段階に細胞を留める場合は、ウイルス感染の前に遺伝子調節を開始することは有益であろう。他の場合には、目的の標的遺伝子を調節する前に開始されるピコルナウイルスの感染／複製又は抗原の産生が有益であろう。例えば、特定の宿主の遺伝子調節事象が、ウイルスの複製又は抗原の産生の後期で必須であるが、初期では有害である場合は、本発明者らは、感染後に遺伝子調節が開始され得ることを想定する。２つ以上の遺伝子調節事象が、最適化されたピコルナウイルス又はピコルナウイルス抗原の産生に必要な場合は、一部の遺伝子をウイルス感染の前に改変することができるが、他の遺伝子は、ウイルス感染後に改変される。遺伝子調節のタイミングにかかわらず、複数の方法（例えば、制御可能な（Ｔｅｔ感受性）プロモーターと一緒のｓｈＲＮＡの適用を含む）を利用して、遺伝子調節の発現の時期を調整することができる。
【００８６】
ポリオウイルスのスクリーニングから有効性が確認されたヒットに対して行われた経路解析試験により、同じ経路に存在する遺伝子が同定された。同時に、これらの試験は、非重複又は非関連経路に存在する遺伝子も同定した。ある場合には、１つの経路で２つ以上の遺伝子を標的にすることにより、相加効果又は相乗効果を得ることができる。他の場合には、非関連経路からの２つ以上の遺伝子を標的にすることは、ウイルスタンパク質及び／又はウイルスの産生を、どの単一遺伝子（又は経路）の調節によって達成される産生を超えて、著しく増加させることができる。さらに、一部が同じ経路に存在するが他が非関連経路に存在する遺伝子の組み合わせを調節することにより、ウイルス及び／又はウイルスタンパク質の産生を増大させることができる。このため、他の実施形態では、本明細書で同定された２つ以上の遺伝子を調節して、ピコルナウイルス又はピコルナウイルス抗原の産生に相加効果又は相乗効果をもたらすことができる。このような場合、上記説明された、又は現在もしくは将来に生命科学者によって利用される任意の方法／技術を利用して２つ以上の遺伝子を調節することができる。
【００８７】
スクリーニングの間に、特定の宿主によってコードされる遺伝子のノックダウンがポリウイルスの複製の減少をもたらすことが観察されたことに留意されたい（表ＩＩ）。従って、一実施形態では、本発明者らは、表ＩＩに列記されている１つ以上の遺伝子の過剰発現もピコルナウイルス又はピコルナウイルス抗原の産生を増大させる得ることを想定する。表ＩＩに列記されている遺伝子の過剰発現は、限定されるものではないが、遺伝子のコピー数の増加（即ち、クローンＤＮＡ又はＯＲＦ発現構築物の導入）、プロモーター強度の増大、後成的改変の変更、ｍＲＮＡの変性の低減、タンパク質機能の増大、又は細胞へのｍＲＮＡ、タンパク質、タンパク質ドメイン、もしくはペプチドの導入を含む様々な方法によって達成することができる。重要なことに、表ＩＩに列記されている任意の遺伝子の過剰発現を、表Ｉに列記されている１つ以上の遺伝子を下方制御すると同時に行うことができる。
【００８８】
他の実施形態では、本発明は、調節された１つ以上の遺伝子又は遺伝子産物を有する細胞溶解物が利用される、ピコルナウイルスワクチン、例えば、ポリオウイルスワクチンを産生する方法を提供する。
【００８９】
これとは別に、本発明者らは、表ＩＩに示されている遺伝子のリストが、ポリオウイルス感染を含むピコルナウイルス感染と戦う潜在的な治療薬標的でもあることを認識している。このため、他の実施形態では、表ＩＩに列記されている遺伝子を調節してピコルナウイルスの複製を減少させ、これにより感染及びピコルナウイルス感染に関連した症状を軽減することができる。表ＩＩの遺伝子の標的化は、当該分野で認められている送達技術を用いて小分子、ＲＮＡｉ技術、及びリボザイム（など）を含む様々な方法によって達成することができる。
【００９０】
ポリオウイルスの複製を阻害するために使用できる小分子の例として、限定されるものではないが、リルゾール塩酸塩、セフトリアキソンジナトリウム塩ヘミ（七水和物）、パシレオチド、ランレオチド、オクトレオチド、ＡＢＴ−０８９、ＡＢＴ４１８、イソフルラン、メカミラミン、スクシニルコリン、ロクロニウム、ドキサクリウム、ミバクリウム、ピペロクロニウム、  ラパロクロニウム、メトクリン、アトラクリウム、シサトラクリウム、アセチルコリン、ニコチン、Ｄ−ツボクラリン、アレコリン、エンフルラン、パンクロニウム、ベクロニウム、ドロトレコギンアルファ、オクトレオチド、タフルプロスト、トラボプロスト、イソプロピルウノブロストン、ビマトプロスト、ラタノプロスト、ジゴキシン、オメプラゾール、エタクリン酸、ペルフェナジン、ヘキサ−Ｄ−アルギニン、ノナ−Ｄ−アルギニンアミド、デキストロメトルファン／グアイフェネシン、モルヒネ／デキストロメトルファン、ネラメキサン、ビシファジン、デルセミン、ＣＲ２２４９、ベソンプロジル、ＵＫ−２４０４５５、ケタミン、フェルバメート、メマンチン、オルフェナドリン、サイクロセリン、Ｎ−（２−インダニル）グリシンアミド、デキストロメトルファン、ブロムフェニラミン／デキストロメトルファン／偽エフェドリン、クロルフェニラミン／デキストロメトルファン／フェニレフリン、カルビノキサミン／デキストロメトルファン／偽エフェドリン、デキストロメトルファン／プロメタジン、１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸、エルサミトルシン、Ｔ０１２８、ＣＴ−２１０６、ＢＮ８０９２７、タフルポシド、ＴＡＳ−１０３、β−ラパコン、イリノテカン、トポテカン、９−アミノ−２０−カンプトセシン、ルビテカン、ジャイマテカン、カレニテシン、オブリメルセン、（−）−ゴシポール、カルシポトリエン、ビタミンＤ２、ＩＬＸ−２３−７５５３、アレンドロネート／コレカルシフェロール、２−（３−ヒドロキシプロポキシ）カルシトリオール、ジプロピオン酸ベタメタゾン／カルシポトリエン、パリカルシトール、ドキセルカルシフェロール、コレカルシフェロール、１−ａｌｐｈａ、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、Ｎ−ブチルデオキシガラクトノジリマイシン、Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシン、リルゾール、ＨｕＨＭＦＧ１、ラドスチギル、１−エチルフェノキサチイン１０，１０−ジオキシド、モクロベミド、デキストロアンフェタミン、プロカインアミド、トラニルシプロミン、フェネルジン、イプロニアジド、イソカルボキサジド、ベンズフェタミン、Ｎ−（２−インダニル）グリシンアミドが挙げられる。
【００９１】
本明細書に記載の操作された細胞株を含むキットも本明細書で説明される。一実施形態では、操作された細胞株の細胞は、少なくとも１つのピコルナウイルスによって感染される宿主細胞として使用することができる。一実施形態では、操作された細胞株の細胞は、少なくとも１つのピコルナウイルスを含む。細胞は、ウイルスの産生に使用することができる。操作された細胞株は、少なくとも１回の使用に十分な量の適切なパッケージング材料の中に含めることができる。任意選択で、他の試薬、例えば、培地を含めることができる。操作された細胞株の使用についての取扱説明書も含めることができる。
【００９２】
本明細書で使用される「パッケージング材料」という語句は、キットの内容物を収容するために使用される１つ以上の物理的な構造を指す。パッケージング材料は、好ましくは、滅菌された汚染されていない環境を提供するために既知の方法で形成され、かつ容器、例えば、チューブ、ボトル、バイアル、シリンジ、又は他の適切な容器手段を含み得る。パッケージング材料には、操作された細胞株をどのように使用できるかを示すラベルが貼られている。
【００９３】
例示的な実施形態
実施形態１．操作された細胞株であって、この操作された細胞株の細胞が、対照細胞株と比較した、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現の低下を有し、このコーディング領域は、ＺＮＦ２０５、ＣＮＴＤ２、ＳＥＣ６１Ｇ、ＥＴＳ１、ＴＡＦ１Ｌ、ＭＣＣＤ１、ＬＹ６Ｇ６Ｃ、ＢＴＮ２Ａ１、ＧＬＸＰ３、ＧＣＧＲ、ＥＰ３００から選択される、操作された細胞株。
【００９４】
実施形態２．操作された細胞株であって、この操作された細胞株の細胞が、対照細胞株と比較した、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現の低下を有する、操作された細胞株。
【００９５】
実施形態３．この低下が、対照細胞株と比較すると少なくとも５％である、実施形態１又は２に記載の操作された細胞株。
【００９６】
実施形態４．この発現の低下が、コーディング領域によってコードされたポリペプチド又はｍＲＮＡの細胞における量を測定することによって決定される、実施形態１又は２に記載の操作された細胞株。
【００９７】
実施形態５．この細胞が、コーディング領域に、又はこのコーディング領域に機能的に連結された調節領域に突然変異を有する、実施形態１又は２に記載の操作された細胞株。
【００９８】
実施形態６．この細胞が、コーディング領域の発現を低下させる外来性ポリヌクレオチドを含む、実施形態１又は２に記載の操作された細胞株。
【００９９】
実施形態７．外来性ポリヌクレオチドがＲＮＡポリヌクレオチドである、実施形態５に記載の操作された細胞。
【０１００】
実施形態８．このＲＮＡポリヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はアンチセンスポリヌクレオチドである、実施形態７に記載の操作された細胞株。
【０１０１】
実施形態９．この細胞が、発現を低下させる編集されたゲノムを含む、実施形態１又は２に記載の操作された細胞株。
【０１０２】
実施形態１０．このゲノムが、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、又は転写活性化因子様エフェクターによって編集される、実施形態９に記載の操作された細胞株。
【０１０３】
実施形態１１．この細胞が、表Ｉから選択される少なくとも１つの追加のコーディング領域の発現の低下、対照細胞株と比較した、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９から選択されるｍｉＲＮＡの発現の増加、表ＩＶから選択されるｍｉＲＮＡの発現の低下、又はこれらの組み合わせをさらに有する、実施形態１又は２に記載の操作された細胞株。
【０１０４】
実施形態１２．この細胞が、表Ｉから選択される少なくとも５つのコーディング領域の発現の低下を有する、実施形態１１に記載の操作された細胞株。
【０１０５】
実施形態１３．この細胞が、少なくとも２つのコーディング領域の組み合わせの発現の低下さらに有し、このコーディング領域の組み合わせが表ＶＩから選択される、実施形態１又は２に記載の操作された細胞株。
【０１０６】
実施形態１４．操作された細胞株であって、この操作された細胞株の細胞が、対照細胞株と比較した、表ＩＩから選択されるコーディング領域の発現の増加を有する、操作された細胞株。
【０１０７】
実施形態１５．この発現の増加が、コーディング領域によってコードされるポリペプチド又はｍＲＮＡの細胞における量を測定することによって決定される、実施形態１４に記載の操作された細胞株。
【０１０８】
実施形態１６．この細胞が、表ＩＩから選択される少なくとも１つの追加のコーディング領域の発現の増加、対照細胞株と比較した、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９から選択されるｍｉＲＮＡの発現の低下、表ＩＶから選択されるｍｉＲＮＡの発現の低下、又はこれらの組み合わせをさらに有する、実施形態１４に記載の操作された細胞株。
【０１０９】
実施形態１７．この細胞は、表ＩＩから選択される少なくとも５つのコーディング領域の発現の増加を有する、実施形態１４に記載の操作された細胞株。
【０１１０】
実施形態１８．この増加が、対照細胞株と比較すると少なくとも５％である、実施形態１４に記載の操作された細胞株。
【０１１１】
実施形態１９．操作された細胞株であって、この操作された細胞株の細胞が、対照細胞株と比較した、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９から選択されるｍｉＲＮＡの発現の増加を有する、操作された細胞株。
【０１１２】
実施形態２０．この細胞が、内在性ｍｉＲＮＡの１つのように挙動するｍｉＲＮＡ模倣体を含む、実施形態１９に記載の操作された細胞株。
【０１１３】
実施形態２１．この細胞が、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの発現の増加をさらに有する、実施形態１に記載の操作された細胞株。
【０１１４】
実施形態２２．この増加が、対照細胞株と比較すると少なくとも５％である、実施形態１９に記載の操作された細胞株。
【０１１５】
実施形態２３．操作された細胞株であって、この操作された細胞株の細胞が、対照細胞株と比較した、表ＩＶから選択される内在性ｍｉＲＮＡの発現の低下を有する、操作された細胞株。
【０１１６】
実施形態２４．この細胞が、内在性ｍｉＲＮＡをコードするコーディング領域に、又はこのコーディング領域に機能的に連結された調節領域に突然変異を有する、実施形態２３に記載の操作された細胞株。
【０１１７】
実施形態２５．この細胞が、内在性ｍｉＲＮＡの活性を阻害するｍｉＲＮＡインヒビターを含む、実施形態２３に記載の操作された細胞株。
【０１１８】
実施形態２６．この細胞がピコルナウイルスを含む、実施形態１、２、１４、１９、又は２３に記載の操作された細胞株。
【０１１９】
実施形態２７．このピコルナウイルスがポリオウイルスである、実施形態２６に記載の操作された細胞株。
【０１２０】
実施形態２８．このポリオウイルスが、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ２、又はＳａｂｉｎ３のいずれかから選択される、実施形態２７に記載の操作された細胞株。
【０１２１】
実施形態２９．このポリオウイルスが、Ｍａｈｏｎｅｙ又はＢｒｕｎｈｉｌｄｅから選択される、実施形態２７に記載の操作された細胞株。
【０１２２】
実施形態３０．このポリオウイルスがＭＥＦ−１である、実施形態２７に記載の操作された細胞株。
【０１２３】
実施形態３１．このポリオウイルスがＳａｕｋｅｔｔである、実施形態２７に記載の操作された細胞株。
【０１２４】
実施形態３２．この細胞株の細胞が、２つ又は３つのポリオウイルスを含む、実施形態２８に記載の操作された細胞株。
【０１２５】
実施形態３３．ピコルナウイルスがエンテロウイルス７１である、実施形態２６に記載の操作された細胞株。
【０１２６】
実施形態３５．この細胞株が、哺乳動物細胞株、トリ細胞株、又は昆虫細胞株である、実施形態１、２、１４、１９、又は２３に記載の操作された細胞株。
【０１２７】
実施形態３６．この哺乳動物細胞株が、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、イヌ細胞株、又はハムスター細胞株から選択される、実施形態３５に記載の操作された細胞株。
【０１２８】
実施形態３７．この哺乳動物細胞株が、ＨＥｐ−２又はＶｅｒｏＰである、実施形態３６に記載の操作された細胞株。
【０１２９】
実施形態３８．このトリ細胞株が、ニワトリ細胞株又はアヒル細胞株である、実施形態３５に記載の操作された細胞株。
【０１３０】
実施形態３９．発現の変化が、ｍｉＲＮＡの細胞での量を測定することによって決定される、実施形態１９又は２３に記載の操作された細胞株。
【０１３１】
実施形態４０．実施形態１、２、１４、１９、又は２３に記載の操作された細胞株の溶解物。
【０１３２】
実施形態４１．ウイルスを産生する方法であって：実施形態１、２、１４、１９、又は２３に記載の操作された細胞株を用意するステップであって、この細胞株の細胞がウイルスを含む、ステップ；この操作された細胞株を、この細胞によるこのウイルスの産生に適した条件下でインキュベートするステップ；及びこの細胞によって産生されたウイルスを収集するステップを含む、方法。
【０１３３】
実施形態４２．ウイルスを産生する方法であって：細胞株を用意するステップであって、この細胞株の細胞がウイルスを含む、ステップ；この細胞株を、この細胞によるこのウイルスの産生に適した条件下でインキュベートするステップであって、培地が、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現を阻害するＲＮＡポリヌクレオチドを含む、ステップ；及びこの細胞によって産生されたウイルスを収集するステップを含む、方法。
【０１３４】
実施形態４３．このＲＮＡポリヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はアンチセンスポリヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９から選択される）、表ＩＶから選択される内在性ｍｉＲＮＡの活性を阻害するｍＲＮＡインヒビター、又はこれらの組み合わせである、実施形態４２に記載の細胞株。
【０１３５】
実施形態４４．ウイルスを産生する方法であって：細胞株を用意するステップであって、この細胞株の細胞がウイルスを含み、この細胞が、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現を低下させる編集されたゲノムを含む、ステップ；この細胞株を、この細胞によるこのウイルスの産生に適した条件下でインキュベートするステップ；及びこの細胞によって産生されたウイルスを収集するステップを含む、方法。
【０１３６】
実施形態４５．ゲノムが、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、又は転写活性化因子様エフェクターによって編集される、実施形態４３に記載の操作された細胞株。
【０１３７】
実施形態４６．ウイルスを産生する方法であって：細胞株を用意するステップであって、この細胞株の細胞がウイルスを含む、ステップ；この細胞株を、この細胞によるこのウイルスの産生に適した条件下でインキュベートするステップであって、培地が、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現を阻害する小分子を含む、ステップ；及びこの細胞によって産生されたウイルスを収集するステップを含む、方法。
【０１３８】
実施形態４７．このウイルスがピコルナウイルスである、実施形態３４、３５、３７、又は３９に記載の方法。
【０１３９】
実施形態４８．このピコルナウイルスがポリオウイルスである、実施形態４７に記載の方法。
【０１４０】
実施形態４９．このポリオウイルスが、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ２、又はＳａｂｉｎ３のいずれかから選択される、実施形態４８に記載の方法。
【０１４１】
実施形態５０．このポリオウイルスが、Ｍａｈｏｎｅｙ又はＢｒｕｎｈｉｌｄｅから選択される、実施形態４８に記載の方法。
【０１４２】
実施形態５１．このポリオウイルスがＭＥＦ−１である、実施形態４８に記載の方法。
【０１４３】
実施形態５２．このポリオウイルスがＳａｕｋｅｔｔである、実施形態４８に記載の方法。
【０１４４】
実施形態５３．この細胞株の細胞が、２つ又は３つのポリオウイルスを含む、実施形態４９に記載の方法。
【０１４５】
実施形態５４．このピコルナウイルスがエンテロウイルス７１である、実施形態４７に記載の方法。
【０１４６】
実施形態５５．この細胞株が、哺乳動物細胞株、トリ細胞株、又は昆虫細胞株である、実施形態３４、３５、３７、又は３９に記載の方法。
【０１４７】
実施形態５６．この哺乳動物細胞株が、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、イヌ細胞株、又はハムスター細胞株から選択される、実施形態５５に記載の方法。
【０１４８】
実施形態５７．この哺乳動物細胞株が、ＨＥｐ−２又はＶｅｒｏＰである、実施形態５６に記載の方法。
【０１４９】
実施形態５８．このトリ細胞株が、ニワトリ細胞株又はアヒル細胞株である、実施形態５５に記載の方法。
【０１５０】
実施形態５９．操作された細胞を作製する方法であって：細胞のゲノムを編集するためにこの細胞に分子を導入するステップ；分子を含むこの細胞を、ゲノムの編集が行われるのに適した条件下でインキュベートするステップ；編集されたゲノムを含む操作された細胞を得るステップであって、この編集により、対照細胞株と比較すると表Ｉから選択されるコーディング領域の発現が低下する、ステップを含む、方法。
【０１５１】
実施形態６０．細胞のゲノムを編集するための分子が、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、又は転写活性化因子様エフェクターである、実施形態６０に記載の方法。
【０１５２】
実施形態６１．ウイルスに感染している、又はウイルスに感染するリスクのある対象を治療する方法であって、この対象の細胞での、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現を増加させるステップを含む、方法。
【０１５３】
実施形態６２．ウイルスに感染している、又はウイルスに感染するリスクのある対象を治療する方法であって、この対象の細胞での、表ＩＩから選択されるコーディング領域の発現を阻害するステップを含む、方法。
【０１５４】
実施形態６３．ウイルスに感染している、又はウイルスに感染するリスクのある対象を治療する方法であって、この対象の細胞での、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９から選択される内在性ｍｉＲＮＡの発現を阻害するステップを含む、方法。
【０１５５】
実施形態６４．ウイルスに感染している、又はウイルスに感染するリスクのある対象を治療する方法であって、この対象の細胞での、表ＩＶから選択されるｍｉＲＮＡの発現を増加させるステップを含む、方法。
【０１５６】
本発明は、以下の実施例によって説明される。特定の実施例、材料、量、及び手順は、本明細書に説明される本発明の範囲及び概念に従って広義に解釈されることを理解されたい。
【実施例】
【０１５７】
実施例１
一般的な方法
ＨＥｐ−２Ｃ（本明細書では「ＨＥｐ−２」細胞とも呼ばれる）及びＶｅｒｏＰ細胞の両方を、増殖の際に、１０％のウシ血清（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｃａｔ．＃Ｓｈ３０３９６．０３）が添加された、１％のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｃａｔ．＃３０−００４−ＣＩ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．＃Ｓｈ３０２４３．０１）に維持した。一次スクリーニングに使用されたヒト類表皮細胞株、ＨＥｐ−２Ｃが、継代１６６における１つのバッチから得られた。ベロ細胞（アフリカミドリザルの腎細胞）を、米国疾病対策センター、アトランタ（１２頁）から得た。
【０１５８】
一次スクリーニングにおけるＨＴＳ  ｓｉＲＮＡのトランスフェクションでは、Ｏｎ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ（ＯＴＰ）−ｓｉＲＮＡｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を、９６ウェルプレートにおいて、７，５００ＨＥｐ−２Ｃ細胞／ウェル、０．３％のＤｈａｒｍａＦＥＣＴ４（ＤＦ４，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｔ−２００４−０１ｓ）中、５０ｎＭの最終ｓｉＲＮＡ濃度でＨＥｐ−２Ｃ細胞に逆トランスフェクトした。これを達成するために、ＤＦ４を最初に無血清培地（ＯＰＴＩ−ＭＥＭ）で５分間希釈した。次いで、この材料を、５μｌの１μＭ  ｓｉＲＮＡ溶液を含む９６ウェル培養プレートに添加した。次いで、ＤＦ４−ｓｉＲＮＡ混合物を２０分間（室温）でインキュベートしてから、１０％ウシ血清が添加されたダルベッコ変法イーグル培地に細胞を加えた。次いで、トランスフェクト細胞を５％ＣＯ２、３７℃で４８時間培養した。次に、培地を除去し、２％ウシ血清及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭで希釈されたＳａｂｉｎ２ポリオウイルスワクチン株を用いて、０．０５のＭＯＩで細胞を感染させた。一次スクリーニングでは、ウイルス感染したＨＥｐ−２Ｃ細胞を含むプレートをウイルス感染から２４時間後に培養インキュベーターから取り出し、−８０℃で保存した。各プレートは、（１）ｓｉＴｏｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．＃Ｄ−００１５００−０１−０５）、（２）ｓｉＮｏｎ−標的対照（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ−００１８１０−１０−５０）、（３）ＶＰ１及び３Ｄ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を標的とする正の対照としてのポリオウイルス特異的ｓｉＲＮＡ、並びに（４）偽対照を含む複数の対照も含んでいた。
【０１５９】
有効性確認実験のために、ＶｅｒｏＰ細胞を利用した同様のプロトコルに従った。簡単に述べると、ＯＴＰ−ｓｉＲＮＡを、７，５００細胞／ウェル、０．３％ＤＦ４中、５０ｎＭの最終ｓｉＲＮＡ濃度でＶｅｒｏＰ細胞に逆トランスフェクトした。上記説明されたように、ＤＦ４を無血清ＯＰＴＩ−ＭＥＭで５分間希釈してから、５μｌの１μＭ  ｓｉＲＮＡ溶液を含む９６ウェル培養プレートにトランスフェクション試薬を添加した。次いで、ＤＦ４−ｓｉＲＮＡカクテルを室温で２０分間インキュベートしてから、１０％ウシ血清が添加されたＤＭＥＭにＶｅｒｏＰ細胞を添加した。次いで、トランスフェクト細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した。次いで、培地を除去し、２％ウシ血清及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭで希釈されたＳａｂｉｎ２ポリオウイルスワクチン株を用いて、０．０５のＭＯＩで細胞を感染させた。ウイルス感染したＶｅｒｏＰ細胞を含むプレートを４８時間後に培地から取り出し、ＥＬＩＳＡ実験まで−８０℃で保存した。
【０１６０】
サイレンシング試薬
ｓｉＲＮＡ
ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ＋ｓｉＲＮＡ（ＯＴＰ−ｓｉＲＮＡ）ライブラリー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を一次ＲＮＡｉスクリーニングに使用した。ＯＴＰサイレンシング試薬を、各遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡのプールとして用意した。各プールは、読み取り枠（ＯＲＦ）の異なる領域を標的とする４つの個々のｓｉＲＮＡを含む。
【０１６１】
有効性確認実験のために、ＯＴＰプールを含む個々のｓｉＲＮＡをそれぞれ個別に試験して、２つ以上のｓｉＲＮＡが観察された表現型を形成したかを決定した。同様に、ｓｉＧＥＮＯＭＥの群（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）に由来する個々の非改変ｓｉＲＮＡ及び一次スクリーニングで同定された標的遺伝子のヒットも、所望の表現型を誘導する能力について試験した。この試験に使用された非標的対照は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した（ｓｉＧｅｎｏｍｅ  ＮＴＣ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ−００１２１０−１０−０１−０５）。
【０１６２】
ｍｉＲＮＡ模倣体及びインヒビター
ｍｉＲＮＡ模倣体のｍｉＲＮＡライブリー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を利用して、ポリオウイルス感染を調節した宿主によってコードされるｍｉＲＮＡを同定した。模倣体は、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ４を用いたトランスフェクションによってＨＥｐ−２Ｃに導入した。
【０１６３】
細胞生存アッセイ及び細胞増殖アッセイ
ｓｉＲＮＡのトランスフェクションが、細胞毒性を導入することによってスクリーニングの結果に悪影響を与えるかを試験するために、ＴｏｘｉＬｉｇｈｔ（商標）バイオアッセイ（ＬＯＮＺＡ  Ｉｎｃ．）を一次スクリーニング及びヒット有効性確認試験の両方に含めた。ＴｏｘｉＬｉｇｈｔ（商標）は、培養哺乳動物細胞及び細胞株における毒性を測定するように設計された非破壊性生物発光細胞毒性アッセイである。損傷した細胞からのアデニル酸キナーゼ（ＡＫ）の放出を定量的に測定する方法を、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションの４８時間後に細胞上清を評価することによって利用した。同定された標的遺伝子のノックダウンが細胞増殖に影響を与えたか否かを検査するために、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）アッセイ（ＰＲＯＭＥＧＡ  Ｉｎｃ．，Ｋｉｔ  ｃａｔ．＃Ｇ３５８０）を利用して生細胞数を決定した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）アッセイは、他のＭＴＴアッセイと比較すると、高い信号感受性及び安定性を実現することが示された。我々の研究では、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションの４８時間後又は７２時間後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）アッセイの基質を培養プレートに直接添加した。３７℃での４時間のインキュベーション後、培地の吸光度を、ＯＤ４９５ｍｍで測定した。
【０１６４】
ポリオウイルス２型ＥＬＩＳＡ
ポリオウイルス２型抗原−収集ＥＬＩＳＡを、「サンドイッチ」アッセイ形式を用いて真正のポリオウイルス抗原（Ｄ−抗原）を検出するように設計した。簡単に述べると、ポリオウイルス２型特異的マウスモノクローナル抗体（ＨＹＢ２９４−０６，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｐｉｅｒｃｅ）を、ｐＨ９．６の０．０５Ｍ炭酸水素塩緩衝液で１：５００に希釈した。次いで、５０μｌの希釈抗体を、Ｉｍｍｕｎｌｏｎ  ２ＨＢ高結合９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ，Ｉｎｃ．）に分注し、これを湿室で、４℃で１６時間（一晩）インキュベートした。次いで、抗体がコーティングされたプレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）が添加されたｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水で４回洗浄し、次いで、１００μｌのブロッキング緩衝液（０．５％ゼラチン及び０．２５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ、３７℃で６０分間）でインキュベートした。次いで、このプレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。サンプルをｓｉＲＮＡで処理し、次にポリオウイルスに２４時間感染させるｓｉＲＮＡ  Ｈｅｐ−２Ｃのスクリーニングでは、５０μｌの上清を抗体がコーティングされたプレートの各ウェルに添加し、湿室で、３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、次いで、５０μｌのＨＲＰ結合モノクローナル抗体（ＨＹＢ  ２９３−０６、１：１０００の希釈）と共に湿室で、３７℃で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔでの４回の追加の洗浄の後に、５０μｌの基質（ＳｕｒｅＢｌｕｅ  Ｒｅｓｅｒｖｅ，Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，５０−８５−３１）を各ウェルに添加した。次いで、プレートを室温で１５分間インキュベートし、５０μｌのＴＭＢ  ＢｌｕｅＳＴＯＰ溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，５０−８５−３１）の添加によって反応を停止させた。次いで、プレートを分光光度計で、６２０ｎｍの波長で評価した。
【０１６５】
Ｓａｂｉｎ１及びＳａｂｉｎ３の試験のために、様々な遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたベロ細胞を、Ｓａｂｉｎ１ウイルス又はＳａｂｉｎ３ウイルスに感染させた。次に、収集ステップ及び結合ステップにおいて、必要に応じて２型特異的抗体の代わりに、ポリオウイルス１型に特異的なモノクローナル抗体（ＮＢＰ１−０５１０１，Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）又はポリオウイルス３型特異的モノクローナル抗体（ＨＹＢ  ３００−０６，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて上記のようにＥＬＩＳＡによって上清を試験した。
【０１６６】
ＨＴＳスクリーニングに使用されるデータ解析方法
品質管理を、０．５〜１．０のＺ因子のスコアが高度にロバストなアッセイを示し、０〜０．５のスコアが許容範囲と見なされるＺ因子を使用して評価した（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  ４（２）：６７−７３を参照）。データの平均（μ）を０、標準偏差（ＳＤ）を１に設定できるように全プレートに亘ってデータを正規化した。一次スクリーニングでの正のヒットをＺスコアによって記録した。
【０１６７】
プラークアッセイ及び細胞培養感染量（ＣＣＩＤ５０）アッセイ
ＣＣＩＤ５０アッセイ及びプラークアッセイを、生ウイルスの産生に対する遺伝子ノックダウンの影響を評価するために行った。これを達成するために、ベロ細胞（アフリカミドリザルの腎細胞）を、一次スクリーニングで同定された遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡに感染させた。次いで、培養物をＳａｂｉｎ２ポリオウイルスに感染させ、得られた上清を、ＨＥｐ−２Ｃ細胞を用いてＣＣＩＤ５０アッセイ又はプラークアッセイのいずれかで評価した。感染性ウイルス粒子の量に対する遺伝子サイレンシング事象の影響を調べるために、５０％細胞培養感染量（ＣＣＩＤ５０）を、終点希釈法によってｓｉＲＮＡトランスフェクトベロ細胞で産生されるＳａｂｉｎ−２ウイルスについて決定した。９６ウェル型では、ウイルス含有上清の１０倍段階希釈（希釈：１０−２〜１０−９、希釈毎に１１の複製）を、ＨＥｐ−２Ｃ（７，５００／ウェル）と共にインキュベートした。各プレートに、８つのウイルス陰性細胞対照を含めた。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートしてから、残りの生細胞を、細胞培養培地を除去してクリスタルバイオレット試薬で染色することによって可視化した。Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ（Ｋａｒｂｅｒ  Ｇ（１９３１）Ｂｅｉｔｒａｇ  ｚｕｒ  ｋｏｌｌｅｋｔｉｖｅｎ  ｂｅｈａｎｄｌｕｎｇ  ｐｈａｒｍａｋｏｌｏｇｉｓｃｈｅｒ  ｒｅｉｈｅｎｖｅｒｓｕｃｈｅ．Ａｒｃｈｉｖ  ｆｕｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓｃｈｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ  ｕｎｄ  Ｐｈａｒｍａｋｏｌｏｇｉｅ  １６２：４８０−４８３）を用いてＣＣＩＤ５０を計算した。産生された感染性ウイルス粒子の量に対するヒット遺伝子のサイレンシングの効果を決定するためにプラークアッセイを行った。６ウェル型では、単層のＨＥｐ−２Ｃ細胞（８０〜９０％コンフルエンス）を、ｓｉＲＮＡトランスフェクトベロ細胞からのＳａｂｉｎ２ウイルス含有上清の１０倍段階希釈物（１０−４〜１０−９希釈物）と共に３７℃で１時間インキュベートした。非標的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞からのウイルス含有上清、及びポリオウイルス標的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞からのウイルス含有上清をそれぞれ、陰性対照及び陽性対照として含めた。次に、細胞をアガロースで覆って、５％ＣＯ２中、３７℃で４８時間インキュベートした。プラークを、アガロースを除去してクリスタルバイオレット試薬を含むホルマリンで生細胞を染色することによって可視化した。プラークを計数し、これを用いて、選択された上清１ｍｌ当たりのプラーク形成単位について感染性ウイルス粒子の量を計算した。プラークの数及びサイズを、非標的対照及びＳａｂｉｎ２標的ｓｉＲＮＡを含む対照のプラークと比較して分析した。
【０１６８】
抗原当量
産生されたウイルスの抗原性に対するヒット遺伝子の発現をサイレンシングする効果を調べるために、マイクロ中和アッセイを、選択され遺伝子に対するｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたベロ細胞からのＳａｂｉｎ２ウイルス、及びポリオウイルスワクチンに予め曝露された個人から収集したヒト血清のプールを用いて行った。９６ウェル型では、選択された細胞上清からのＳａｂｉｎ２ウイルスの１００  ＣＣＩＤ５０を、１：８の希釈から１：１０２４までの抗ポリオ血清の２倍段階希釈物と組み合わせた。いずれのｓｉＲＮＡでもトランスフェクトされていない細胞からのＳａｂｉｎ２ウイルスを対照として含めた。ウイルス及び血清を３時間インキュベートしてから、ＨＥｐ−２Ｃ細胞を添加した。５％ＣＯ２中、３７℃での５日間のインキュベーション後、細胞を、クリスタルバイオレットで染色して、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ公式（Ｋａｒｂｅｒ  Ｇ（１９３１）Ｂｅｉｔｒａｇ  ｚｕｒ  ｋｏｌｌｅｋｔｉｖｅｎ  ｂｅｈａｎｄｌｕｎｇ  ｐｈａｒｍａｋｏｌｏｇｉｓｃｈｅｒ  ｒｅｉｈｅｎｖｅｒｓｕｃｈｅ．Ａｒｃｈｉｖ  ｆｕｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓｃｈｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ  ｕｎｄ  Ｐｈａｒｍａｋｏｌｏｇｉｅ  １６２：４８０−４８３）によって終点血清中和力価を計算した。
【０１６９】
実施例２
一次スクリーニングの結果
上記説明された技術を用いて、プロテアーゼ、イオンチャネル、ユビキチン、キナーゼ、ホスファターゼ、ＧＰＣＲ、及び薬物標的の群由来の遺伝子を含む、ヒトゲノム由来の１８，２００を超える遺伝子をスクリーニングして（３連で）、ポリオウイルスの複製を増大した遺伝子ノックダウン事象を確認した。図１は、一次スクリーニングで得られたＺスコアのプロットを示している。示されているように、全遺伝子ノックダウン事象の一部のみが、平均からの標準偏差（ＳＤ）が３．０以上のスコアであった（１２４遺伝子、スクリーニングされた遺伝子の総数の０．６８％）。この群に含まれる遺伝子は、複数の機能的ファミリー（キナーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼなど）に亘って分布し、以前に「抗ウイルス」として同定されていない相当数の遺伝子を含んでいた。加えて、ポリオウイルスの複製を大幅に低減した１００を超える遺伝子サイレンシング事象が確認された。これらの遺伝子は、将来の抗ウイルス薬送達の取り組みにおいて潜在的に有益な治療標的の群を表す。
【０１７０】
表Ｉは、１２８の遺伝子ノックダウン事象を示している。合計１２４の遺伝子ノックダウン事象は、ＥＬＩＳＡスコアが平均から３以上高い標準偏差であった。これらの遺伝子のうちの２８は、ＳＤ値が４．０を超え、１つの遺伝子は、ＳＤ値が５．０以上であった。これらのうちの遺伝子の４つは、ＳＤ値が２〜３であった。表Ｉは、ＫＥＧＧ遺伝子アクセッション番号（ＮＭ＿）、及びＺスコア値も示している。表ＩＩは、ＥＬＩＳＡスコアが平均から２以上低いＳＤ値である遺伝子ノックダウン事象のリストを示している。
【０１７１】
実施例３
プールデコンボリューション有効性確認試験
一次スクリーニングで同定された遺伝子標的の有効性確認の最初のステップでは、（非同一のシード配列、即ち、アンチセンス鎖のヌクレオチドの２〜７を有するが）同じ遺伝子を標的とする２つ以上の個々のｓｉＲＮＡが同じ表現型を形成したことを実証した。この試験を行うために、一次スクリーニングで使用されたＯＴＰプールを構成する４つのｓｉＲＮＡを個々に試験した。これとは別に、ｓｉＧＥＮＯＭＥ  ｓｉＲＮＡの群（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に由来する、同じ遺伝子を標的とする非関連ｓｉＲＮＡ試薬の群も試験した。
【０１７２】
有効性確認試験の結果が、表ＩＩＩに示され、この結果は、一次スクリーニングのヒットの５４％（６８の遺伝子）で、ＳＤ値が３．０以上であり、所与の遺伝子を標的とする２つ以上のｓｉＲＮＡが、元のＯＴＰプールと同じ表現型を誘導したことを示している。これらの発見は、このリストの標的遺伝子のノックダウンがポリオウイルス抗原及びウイルスの産生を増大させるという結論を強く裏付ける。１つのｓｉＲＮＡのみが残りの遺伝子に対して所望の表現型を誘導したが、この結果は、同定された遺伝子がポリオウイルスの感染の際に抗ウイルス作用を果たす可能性を排除するものではないことに留意されたい。
【０１７３】
【表１４】
2016506734.tif 000015
【０１７４】
実施例４
ベロ細胞における生ポリオウイルスの産生に対する遺伝子ノックダウンの効果
一次スクリーニングで同定されたヒットのさらなる有効性確認として、ＣＣＩＤ５０及びプラークアッセイを行った。これらの試験の結果の例が図２及び図３に示されている。ＣＣＩＤ５０の結果（図２）は、一次スクリーニングで同定されたヒットのいくつかが、生ポリオウイルス力価を４倍〜２７倍（４〜２７×）に大幅に増加させることを示した。これらの結果は、以前のデコンボリューション試験を立証するだけではなく、（１）確認された遺伝子のノックダウン事象が生ウイルスの産生を増加させること、及び（２）遺伝子ノックダウン事象が、ポリオウイルスワクチンの製造に現在使用されている非ヒト（ベロ）細胞株での生ウイルスの産生を増加させることをも示している。
【０１７５】
プラークアッセイは、ＣＣＩＤ５０の結果を裏付ける。図３Ａに例示されているように、限定されるものではないが、ＳＬＣ１Ａ２、ＥＴＳ１、ＥＰ３００、及びＰＫＩＧを含む複数の遺伝子のノックダウンにより、ウイルスプラークの数によって測定されるウイルス産生が劇的に増加している。図３Ｂは、１ダースを超える遺伝子の結果を示している。６つの遺伝子（ＢＣＬ９、ＧＬＲＸＰ３、ＬＹ６Ｇ６Ｃ、ＥＴＳ１、ＧＰＲ３０、及びＰＡＴＥ２）のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンは、生ウイルス力価を５倍〜１０倍（５〜１０×）に増加させた。ＢＴＮ２Ａ１、ＳＥＣ６１Ａ１、Ｃｏｌｌｅｃ１１、Ｓｉｎ３Ｂ、及びＳＬＣ１Ａ２を含む５つの他の遺伝子のサイレンシングは、ベロ細胞における生ウイルス力価を１０倍〜２０倍（１０〜２０×）に増加させた。驚くべきことに、２つの遺伝子ノックダウン事象（ＰＫＩＧ及びＥＰ３００）が、プラークアッセイにおいてウイルス力価を、２０倍を超えて（＞２０×）増大させた。既に説明されたように、遺伝子機能は、ヒストンアセチラーゼ（ＥＰ３００）、プロテインキナーゼインヒビター（ＰＫＩＧ）、及び溶質キャリア（ＳＬＣ１Ａ２）などを含む複数のファミリー／機能に分類される。全体として、これらの結果は、報告されたデコンボリューション試験と共に、１つの遺伝子ノックダウン／ノックアウト事象が、ポリオウイルス抗原及び複製を著しく増加させることができるという結論を強く裏付けている。
【０１７６】
実施例５
抗原当量
産生されたウイルスの抗原性に対するヒット遺伝子の発現をサイレンシングする効果を調べるために、マイクロ中和アッセイを、選択され遺伝子に対するｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたベロ細胞からのＳａｂｉｎ２ウイルス、及びポリオウイルスワクチンに予め曝露された個人から収集したヒト血清のプールを用いて行った。９６ウェル型では、選択された細胞上清からのＳａｂｉｎ２ウイルスの１００  ＣＣＩＤ５０を、１：８の希釈から１：１０２４までの抗ポリオ血清の２倍段階希釈物と組み合わせた。いずれのｓｉＲＮＡでもトランスフェクトされていない細胞からのＳａｂｉｎ２ウイルスを対照として含めた。ウイルス及び血清を３時間インキュベートしてから、ＨＥｐ−２Ｃ細胞を添加した。５％ＣＯ２中、３７℃での５日間のインキュベーション後、細胞を、クリスタルバイオレットで染色して、Ｋａｒｂｅｒ公式（Ｋａｒｂｅｒ  Ｇ（１９３１）Ｂｅｉｔｒａｇ  ｚｕｒ  ｋｏｌｌｅｋｔｉｖｅｎ  ｂｅｈａｎｄｌｕｎｇ  ｐｈａｒｍａｋｏｌｏｇｉｓｃｈｅｒ  ｒｅｉｈｅｎｖｅｒｓｕｃｈｅ．Ａｒｃｈｉｖ  ｆｕｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓｃｈｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ  ｕｎｄ  Ｐｈａｒｍａｋｏｌｏｇｉｅ  １６２：４８０−４８３）によって終点血清中和力価を計算した。
【０１７７】
図４に示されているように、試験した１８の遺伝子標的のうちの全てが、当量以上の交差反応性を実証している。これらの結果は、ポリオウイルスの産生を増大させるようにｓｉＲＮＡで改変されたワクチン細胞株が、ポリオウイルスに予め曝露された個人から採取された血清中の抗体によって認識されるウイルス粒子（即ち、抗原当量）を産生するという考えを裏付けている。
【０１７８】
実施例６
Ｓａｂｉｎ１及びＳａｂｉｎ３の試験
３つのポリオウイルスワクチン（Ｓａｂｉｎ）株の毒性親株は、ＬＳｃ／２ａｂ（血清型１）、Ｐ７１２（血清型２）、及びＬｅｏｎ（血清型３）である。Ｓａｂｉｎ１は、このＳａｂｉｎ１を親ＬＳｃ／２ａｂウイルスと区別する５７のヌクレオチド置換を有する。同様に、Ｓａｂｉｎ２及びＳａｂｉｎ３はそれぞれ、これらのＳａｂｉｎ２及びＳａｂｉｎ３をＰ７１２株及びＬｅｏｎ株と区別する２つのヌクレオチド置換及び１０のヌクレオチド置換を（それぞれ）有する。
【０１７９】
現在のワクチンは、３つ全ての弱毒化表現型（Ｓａｂｉｎ１、２、及び３）を含むため、我々のＳａｂｉｎ２の一次スクリーニングで同定された標的遺伝子が、Ｓａｂｉｎ１及び３にどのように影響を与えるかを試験した。これを達成するために、（１）Ｓａｂｉｎ２のスクリーニングで同定され、かつ（２）有効性が確認された、２１の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡをベロ細胞に導入した。次いで、これらの細胞をＳａｂｉｎ−１又はＳａｂｉｎ−３ウイルスのいずれかに感染させ、次に上清をＥＬＩＳＡを用いて評価した。これらの試験の結果は、Ｓａｂｉｎ１及びＳａｂｉｎ３の両方について、試験した２１の遺伝のうちの１４の遺伝子が、ＥＬＩＳＡ吸光度スコアを２倍以上増加させたことを示した（図５Ａ、図５Ｂ）。最も高い吸光度は、ＺＮＦ２０５のノックダウンから得られた両方のウイルス（Ｓａｂｉｎ１及びＳａｂｉｎ３でそれぞれ、７倍及び５倍）で増加する。全体として、３つ全ての血清型に対してウイルスの産生を増加させた遺伝子標的のリスト間に相当な重複が存在するため、これらの試験結果は、Ｓａｂｉｎ２ウイルスのスクリーニングで同定されたヒットを他のピコルナウイルスまで拡張できることを示している。
【０１８０】
既に説明された技術を用いて、Ｓａｂｉｎ１及びＳａｂｉｎ３ウイルスを使用してプラークアッセイも行った。この結果は、ＥＬＩＳＡアッセイでの試験結果を裏付け、Ｓａｂｉｎ２のスクリーニングで同定されたヒットのいくつかもＳａｂｉｎ１及びＳａｂｉｎ３の産生（それぞれ図５ｃ及び図５ｄ）を高めたことを実証している。
【０１８１】
上記説明された技術を用いて、Ｓａｂｉｎ２の一次スクリーニングで同定された遺伝子を標的とするｓｉｒＮＡで改変された細胞で産生されたＳａｂｉｎ１及びＳａｂｉｎ３ウイルスに対して抗原当量試験を行った。Ｓａｂｉｎ２の抗原当量試験で観察されたように、遺伝子ノックダウンは、Ｓａｂｉｎ１及びＳａｂｉｎ３の抗体力価に対して殆ど又は全く影響を与えず（データ未掲載）、目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡで改変された細胞で産生されたウイルスが、対照細胞で産生されたウイルスと区別がつかないという結論を裏付ける。
【０１８２】
実施例７
ｍｉＲＮＡ模倣体のスクリーニング
ポリオウイルスの産生を増大させる宿主によってコードされるｍｉＲＮＡを同定するために、ＨＥｐ−２Ｃ細胞を、１，２００を超える異なるｍｉＲＮＡ模倣体に感染させ、次にＳａｂｉｎ２ウイルスに感染させた。次いで、得られた上清を、実施例１で説明されたポリオウイルス特異的ＥＬＩＳＡで分析した。
【０１８３】
ｓｉＲＮＡのスクリーニング（実施例２）の場合と同様に、全ｍｉＲＮＡ集団のほんの一部しかウイルスの産生を増大させなかった（図６）。生ウイルスの産生におけるｍｉＲＮＡ模倣体の価値をさらに評価するために、ＣＣＩＤ５０有効性確認試験をベロ細胞で行った。この群では、１１のｍｉＲＮＡが、ポリオウイルスの産生を２倍以上増大させた（図７）。ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、及びｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐを含む５つの遺伝子が、ポリオウイルス抗原及びウイルスの産生を２倍〜４倍増大させる。６つのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９）は、生ポリオウイルスの産生を４倍〜１２倍（４〜１２×）増加させることを示した。これらのｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列は、ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇで利用可能なｍｉｃｒｏＲＮＡデータベース、ｍｉＲ  Ｂａｓｅから入手可能である。これらのｍｉＲＮＡは、個別に使用しても良いし、又はポリオウイルスタンパク質及び／もしくはウイルスの産生を増加させるために、他のｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡインヒビター、遺伝子をコードするタンパク質を標的とするｓｉＲＮＡ、及び／もしくはクローンＤＮＡもしくはＯＲＦの発現構築物と組み合わせて使用しても良い。
【０１８４】
ポリオウイルス抗原及びウイルスの産生を増大させた複数のｍｉＲＮＡを同定するのに加えて、ｍｉＲＮＡの一次スクリーニングにより、ポリオウイルスの産生を低下させた複数のｍｉＲＮＡが同定された（表ＩＶを参照）。これらのｍｉＲＮＡは、個別に使用しても良いし、又は（１）治療現場でポリオウイルスの複製を減少させるため、もしくは（２）治療標的を同定してポリオウイルス感染と戦うために、他のｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡインヒビター、遺伝子をコードするタンパク質を標的とするｓｉＲＮＡ、及び／もしくはクローンＤＮＡもしくはＯＲＦの発現構築物と組み合わせて使用しても良い。
【０１８５】
【表１５】
2016506734.tif 000016
【０１８６】
実施例８
ベロ細胞における有効性が確認された標的の広範な試験
ＨＥｐ−２Ｃ細胞におけるポリオウイルス力価を高めた上位２９の遺伝子サイレンシング事象を、３つの弱毒化ワクチン株（Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ２、及びＳａｂｉｎ３）、Ｍａｈｏｎｅｙ（野生型１）、Ｂｒｕｎｈｉｌｄｅ（野生型１）、ＭＥＦ（野生型２）、及びＳａｕｋｅｔｔ（野生型３）を含む７つの異なるポリオ株を用いてベロ細胞でさらに有効性を確認した。これを達成するために、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ）が５０ｎＭの最終濃度で添加されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｈｙｃｌｏｎｅ）における選択された遺伝子を標的とする個々のｓｉＲＮＡをベロ細胞に逆トランスフェクトした（６，０００細胞／ウェル、９６ウェル型）。遺伝子標的及びｓｉＲＮＡ配列が表Ｖに示されている。ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ４トランスフェクション試薬（０．３５％）を用いてトランスフェクションを行った。全てのトランスフェクションを３連で行った。定量的ＰＣＲ実験を、これらの実験で使用されるｓｉＲＮＡのそれぞれについて遺伝子サイレンシングのレベルを推定するために行った。これらの実験の対照試験は、（１）ポリオウイルスカプシドをコードする領域を標的とするポリオウイルス特異的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞、及び（２）非標的対照ｓｉＲＮＡ（ＮＴＣ）を含んでいた。次いで、細胞を５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートし、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションから１６〜２４時間後に、細胞培地をリフレッシュした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を、２％ＦＣＳが添加された１５０μｌのＤＭＥＭ中、６０  ＣＣＩＤ５０のＳａｂｉｎ−１ウイルスストック（１０８．６  ＣＣＩＤ５０／ｍｌ）、３０  ＣＣＩＤ５０のＳａｂｉｎ−２（１０７．３  ＣＣＩＤ５０／ｍｌ）、９．５  ＣＣＩＤ５０のＳａｂｉｎ−３（１０６．８  ＣＣＩＤ５０／ｍｌ）、８．４  ＣＣＩＤ５０の野生型１  Ｍａｈｏｎｅｙウイルス（１０７．７５  ＣＣＩＤ５０／ｍｌ）、１  ＣＣＩＤ５０の野生型１  Ｂｒｕｎｈｉｌｄｅウイルス（１０７．８４  ＣＣＩＤ５０／ｍｌ）、６．４の野生型２  ＭＥＦウイルス（１０７．６３  ＣＣＩＤ５０／ｍｌ）、又は３．８  ＣＣＩＤ５０の野生型３  Ｓａｕｋｅｔｔウイルス（１０７．４  ＣＣＩＤ５０／ｍｌ）で感染させた。非感染細胞を負の対照として含めた。次いで、細胞を、ウイルスの種類によって２１〜３６時間、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートし、次に−８０℃で凍結させた。上清を使用して、終点希釈法によってウイルス力価を決定した。簡単に述べると、９６ウェル型において、ウイルス上清の１０倍段階希釈物（１０−２から最大１０−９まで希釈）をＨＥｐ−２Ｃ細胞（７，５００／ウェル、１つのウイルス希釈物当たり１１の複製）と共に５％ＣＯ２、３７℃で５日間インキュベートした。細胞をクリスタルバイオレットで染色し、ＣＣＩＤ５０を、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ公式を用いて全てのウェルの細胞変性効果（ＣＰＥ）を採点することによって計算した。複製実験におけるＣＣＩＤ５０値の中で観察された、一般に許容される０．５  ｌｏｇ１０の変化に合わせて、ヒットを同定するためのカットオフ値を、ＮＴＣと比較してウイルス力価の３．１６倍の増大に設定し���。
【０１８７】
【表１６】
2016506734.tif 000017
【０１８８】
これらの実験の結果が図８に示されている。図８ａは、定量的ＰＣＲ試験の例示的な結果を示している。試験結果は、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションが、典型的には、約７０％以上の標的遺伝子の発現のノックダウンを誘導することを示している。図８ｂは、サイレンシングされると、上位ヒットのいくつか（例えば、ＺＮＦ２０５、ＣＮＴＤ２（ＦＬＪ１３２６５とも呼ばれる）、ＳＥＣ６１Ｇ、ＥＴＳ１、ＭＣＣＤ１（ＬＯＣ４０１２５０とも呼ばれる）、ＬＹ６Ｇ６Ｃ、ＥＰ３００、ＢＴＮ２Ａ１、ＧＬＲＸＰ３（ＧＬＲＸＬとしても知られている）、ＧＣＧＲ、ＫＲＴＡＰ４−４、ＴＡＦ１）が、１つ以上のポリオ株の力価を著しく高めることを示している。
【０１８９】
実施例９
ポリオウイルス力価に対する複数のノックダウンの効果を確認する
実施例８の複数の遺伝子を、２つの別個の遺伝子の同時ノックダウンがウイルス力価をさらに増大させるか否かを決定する次の試験のために選択した。これを達成するために、ｓｉＲＮＡの対（２つの別個の遺伝子を標的とする）を、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ４試薬（０．３５％）を用いて５０ｎＭ（２５ｎＭの個々のｓｉＲＮＡ）の最終濃度でベロ細胞（７，２５０細胞／ウェル）に逆トランスフェクトした。次いで、ｓｉＲＮＡの各組み合わせでトランスフェクトされた細胞を、７つのウイルス（Ｓａｂｉｎ１（ワクチン）、Ｓａｂｉｎ２（ワクチン）、Ｓａｂｉｎ３（ワクチン）、Ｍａｈｏｎｅｙ（野生型１）、Ｂｒｕｎｈｉｌｄｅ（野生型１）、ＭＥＦ（野生型２）、及びＳａｕｋｅｔｔ（野生型３））のそれぞれを用いて（３連で）試験した。内部実験対照として、各遺伝子を標的とする個々のｓｉＲＮＡも、二重の遺伝子ノックダウンの効果の正確な評価を容易にするために各プレートで逆トランスフェクトした（３連で、２５ｎＭ）。
【０１９０】
これらの試験の結果が、図９及び表ＶＩに示されている。図９Ａ及び図９Ｂは、我々の二重の遺伝子ノックダウン実験の例示的なデータを示し、相加作用又は相乗作用（「＊」を参照）的に１つ以上のポリオウイルス株の産生を著しく増大させる複数の組み合わせを示している。表ＶＩは、同時にサイレンシングされると、（１）相乗効果（即ち、両方の個々の遺伝子ノックダウンの結果が組み合わせられた／加算された場合に予測されるウイルス力価の増大よりも大きくウイルス力価を増大させる）、又は（２）試験された７つのウイルスの少なくとも１つの相加効果（個々の遺伝子の効果が組み合わせられた場合に予想され得るウイルス力価の増加と同等又はほぼ同等にウイルス力価を増大させる）をもたらした４９の遺伝子の組み合わせを示している。例えば、二重のノックダウン検査と共に行われた個々のノックダウン実験に基づいて、ＺＮＦ２０５とＥＰ３００との同時サイレンシングが、効果が相加的である場合は約２８倍、ＭＥＦの力価が増加すると予想される。代わりに、これらの２つの遺伝子の同時ノックダウンにより、ＭＥＦの力価が（平均して）６５倍の増加となる。同様に、個々のノックダウン実験に基づいて、ＥＰ３００＋ＧＣＧＲのサイレンシングは、相加効果が起きた場合はＳａｕｋｅｔｔの力価の１８倍の増大となると予想される。代わりに、これらの２つの遺伝子が同時にサイレンシングされた場合は、（平均して）４０〜４５倍の増大が観察された。これらの実験結果及び他の実験結果は、（サイレンシングされると）ポリオウイルスの産生をさらに増大させる、以前は未知であった遺伝子の組み合わせを示す。本発明者らは、このリストの３つ又は４つの遺伝子をサイレンシングすると、ポリオウイルスの産生がさらに増大され得ると予想する。例えば、［ＺＮＦ２０５＋ＥＰ３００＋ＧＬＲＸＰ３］又は［ＺＮＦ２０５＋ＥＰ３００＋ＥＴＳ］の組み合わせは、ポリオウイルスの力価をさらに増大させると予想される。
【０１９１】
【表１７】
2016506734.tif 000018
【０１９２】
実施例１０
ポリオウイルスは、ピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのメンバーである。我々のポリオウイルスのスクリーニングで同定されたヒットが、ピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーに属する他のウイルスにどのような影響を与えるかを試験するために、エンテロウイルス７１（Ｅ７１）を用いて実験を行った。これを達成するために、ＰＶ  ＲＮＡｉのスクリーニング中に同定された、いくつかの遺伝子のうちの１つを標的とするｓｉＲＮＡを、５０ｎＭの最終濃度でベロ細胞（７，２００／ウェル、９６ウェル型）に逆トランスフェクトした。遺伝子サイレンシングを可能にするために６４〜７２時間後に、細胞を、２％ウシ胎仔血清が添加された１５０μｌのＤＭＥＭ中の３９８１  ＣＣＩＤ５０（５０％細胞培養感染量）のＥＶ７１、遺伝子亜型Ｃ２（ストック１０６．４５  ＣＣＩＤ５０／ｍｌ）を用いて感染させた。次いで、細胞を５％ＣＯ２、３７℃で６６時間インキュベートし、次に、各培養物における細胞変性効果（ＣＰＥ）のレベルを決定するために培養物を検査してから凍結させた（−８０℃）。実験は、３連で行い、非標的対照ｓｉＲＮＡ（ＮＴＣ）、ＥＶ７１ゲノムを標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＥＶ７１）、及びモックトランスフェクション対照（−ｓｉＲＮＡ）を含んでいた。
【０１９３】
これらの試験の結果は、ポリオウイルスのスクリーニング中に同定されたヒットもＥＶ７１の産生を増大させることを実証している。図１０Ａに示されているように、限定されるものではないが、ＭＣＣＤ１、ＺＮＦ２０５、及びＧＣＧＲなどを含むいくつかの遺伝子ノックダウン事象は、細胞変性効果を大幅に高め、遺伝子サイレンシングがＥＶ７１ウイルスの産生を著しく増加させたという結論を立証している。感染から６６時間後の時点での追加の実験は、これらの結論（データ未掲載）を裏付けている。観察されたＥＶ７１の力価の増加を定量するためにプラークアッセイも行った。これらの実験からのウイルス上清の１×１０５倍（即ち、１／１００，０００）の希釈物で示されるように、ＺＮＦ２０５、ＣＮＴＤ２、及びＭＣＣＤ１のノックダウンは、ＥＶ７１ウイルス粒子の数を著しく増加させた（図１０Ｂを参照）。図１０Ｃに示されている棒グラフは、ＣＮＴＤ２及びＭＣＣＤ１のノックダウンがウイルスの力価を約１０倍（１０×）増加させているが、ＺＮＦ２０５のノックダウンは力価を約６０倍増加させたことを示している。ポリオウイルスでの結果に基づいて、本発明者らは、これらの遺伝子ノックダウン事象の組み合わせがＥＶ７１の力価をさらに増大させ得ると考えている。
【０１９４】
本明細書で言及される全ての特許、特許出願、及び刊行物、並びに電子的に利用可能な資料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑなどにおけるヌクレオチド配列サブミッション、及び、例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢにおけるアミノ酸配列サブミッション、並びにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおける注釈付きコーディング領域からの翻訳物を含む）の全開示は、参照によりそれらの全開示内容が本明細書に組み入れられる。刊行物中の参照された補足的な資料（例えば、補足的な表、補足的な図、補足的な資料及び方法、並びに／又は補足的な実験データ）も同様に、参照によりそれらの全開示内容が本明細書に組み入れられる。本出願の開示と参照により本明細書に組み入れられるあらゆる文献の開示との間にいかなる矛盾が存在する場合も、本出願の開示が優先されるものとする。前述の詳細な説明及び実施例は、単に理解しやすくするために記載された。これらにより、不必要な制限が課されるものではない。本発明は、図示及び記載された正確な詳細に限定されるものではないため、当業者に明らかなバリエーションは、特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲に含まれるものとする。
【０１９５】
特段の記載がない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される成分や分子量などの量を表す全ての数字は、いかなる場合も「約」という語によって修正されると理解されるべきである。従って、反対を意味する記載がない限り、本明細書及び特許請求の範囲に表記された数値パラメータは、本発明で得られるように試みられる所望の特性に応じて変化し得る近似である。少なくとも、特許請求の範囲に均等論を限定しようとするものではなく、各数値パラメータは、報告された有効数字の数を踏まえて、通常の四捨五入法の適用によって少なくとも考慮すべきである。
【０１９６】
本発明の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメータは近似であるが、特定の実施例に記載される数値は、可能な限り正確に報告される。しかしながら、全ての数値は、それぞれの試験測定値に存在する標準偏差から必然的に生じる範囲を本質的に含むものである。
【０１９７】
全ての見出しは、読者の便宜のためであり、特段の記載がない限り、見出しに続く文章の意味を限定するために使用されるべきではない。
【図１】
2016506734.tif 000019
【図２】
2016506734.tif 000020
【図３】
2016506734.tif 000021
【図４】
2016506734.tif 000022
【図５Ａ】
2016506734.tif 000023
【図５Ｂ】
2016506734.tif 000024
【図５Ｃ】
2016506734.tif 000025
【図５Ｄ】
2016506734.tif 000026
【図６】
2016506734.tif 000027
【図７】
2016506734.tif 000028
【図８Ａ】
2016506734.tif 000029
【図８Ｂ】
2016506734.tif 000030
【図９Ａ】
2016506734.tif 000031
【図９Ｂ】
2016506734.tif 000032
【図１０Ａ】
2016506734.tif 000033
【図１０Ｂ】
2016506734.tif 000034
【図１０Ｃ】
2016506734.tif 000035
【配列表】
2016506734000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年8月6日(2015.8.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
操作された細胞株であって、前記操作された細胞株の細胞が、対照細胞株と比較した、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現の低下を有し、前記コーディング領域が、ＺＮＦ２０５、ＣＮＴＤ２、ＳＥＣ６１Ｇ、ＥＴＳ１、ＴＡＦ１Ｌ、ＭＣＣＤ１、ＬＹ６Ｇ６Ｃ、ＢＴＮ２Ａ１、ＧＬＸＰ３、ＧＣＧＲ、ＥＰ３００から選択される、操作された細胞株。
【請求項２】
操作された細胞株であって、前記操作された細胞株の細胞が、対照細胞株と比較した、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現の低下を有する、操作された細胞株。
【請求項３】
前記低下が、前記対照細胞株と比較すると少なくとも５％である、請求項１又は２に記載の操作された細胞株。
【請求項４】
前記発現の低下が、前記コーディング領域にコードされたポリペプチド又はｍＲＮＡの前記細胞における量を測定することによって決定される、請求項１又は２に記載の操作された細胞株。
【請求項５】
前記細胞が、前記コーディング領域又は前記コーディング領域に機能的に連結された調節領域に突然変異を有する、請求項１又は２に記載の操作された細胞株。
【請求項６】
前記細胞が、前記コーディング領域の発現を低下させる外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項１又は２に記載の操作された細胞株。
【請求項７】
前記外来性ポリヌクレオチドがＲＮＡポリヌクレオチドである、請求項６に記載の操作された細胞株。
【請求項８】
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項７に記載の操作された細胞株。
【請求項９】
前記細胞が、発現を低下させる編集されたゲノムを含む、請求項１又は２に記載の操作された細胞株。
【請求項１０】
前記ゲノムが、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、又は転写活性化因子様エフェクターによって編集される、請求項９に記載の操作された細胞株。
【請求項１１】
前記細胞が、表Ｉから選択される少なくとも１つの追加のコーディング領域の発現の低下、対照細胞株と比較した、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９から選択されるｍｉＲＮＡの発現の増加、表ＩＶから選択される内在性ｍｉＲＮＡの発現の低下、又はこれらの組み合わせをさらに有する、請求項１又は２に記載の操作された細胞株。
【請求項１２】
前記細胞が、表Ｉから選択される少なくとも５つのコーディング領域の発現の低下を有する、請求項１１に記載の操作された細胞株。
【請求項１３】
前記細胞が、少なくとも２つのコーディング領域の組み合わせの発現の低下さらに有し、前記コーディング領域の組み合わせが表ＶＩから選択される、請求項１又は２に記載の操作された細胞株。
【請求項１４】
操作された細胞株であって、前記操作された細胞株の細胞が、対照細胞株と比較した、表ＩＩから選択されるコーディング領域の発現の増加を有する、操作された細胞株。
【請求項１５】
前記発現の増加が、前記コーディング領域によってコードされるポリペプチド又はｍＲＮＡの前記細胞における量を測定することによって決定される、請求項１４に記載の操作された細胞株。
【請求項１６】
前記細胞が、表ＩＩから選択される少なくとも１つの追加のコーディング領域の発現の増加、対照細胞株と比較した、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９から選択される内在性ｍｉＲＮＡの発現の低下、表ＩＶから選択される内在性ｍｉＲＮＡの発現の低下、又はこれらの組み合わせをさらに有する、請求項１４に記載の操作された細胞株。
【請求項１７】
前記細胞は、表ＩＩから選択される少なくとも５つのコーディング領域の発現の増加を有する、請求項１４に記載の操作された細胞株。
【請求項１８】
前記増加が、前記対照細胞株と比較すると少なくとも５％である、請求項１４に記載の操作された細胞株。
【請求項１９】
操作された細胞株であって、前記操作された細胞株の細胞が、対照細胞株と比較した、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９から選択されるｍｉＲＮＡの発現の増加を有する、操作された細胞株。
【請求項２０】
前記細胞が、前記ｍｉＲＮＡの１つのように挙動するｍｉＲＮＡ模倣体を含む、請求項１９に記載の操作された細胞株。
【請求項２１】
前記細胞が、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの発現の増加をさらに有する、請求項１に記載の操作された細胞株。
【請求項２２】
前記増加が、前記対照細胞株と比較すると少なくとも５％である、請求項１９に記載の操作された細胞株。
【請求項２３】
操作された細胞株であって、前記操作された細胞株の細胞が、対照細胞株と比較した、表ＩＶから選択される内在性ｍｉＲＮＡの発現の低下を有する、操作された細胞株。
【請求項２４】
前記細胞が、前記内在性ｍｉＲＮＡをコードするコーディング領域又は前記コーディング領域に機能的に連結された調節領域に突然変異を有する、請求項２３に記載の操作された細胞株。
【請求項２５】
前記細胞が、前記内在性ｍｉＲＮＡの活性を阻害するｍｉＲＮＡインヒビターを含む、請求項２３に記載の操作された細胞株。
【請求項２６】
前記細胞がピコルナウイルスを含む、請求項１、２、１４、１９、又は２３の何れか一項に記載の操作された細胞株。
【請求項２７】
前記ピコルナウイルスがポリオウイルス又はエンテロウイルス７１である、請求項２６に記載の操作された細胞株。
【請求項２８】
前記ポリオウイルスが、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ２、Ｓａｂｉｎ３、Ｍａｈｏｎｅｙ、Ｂｒｕｎｈｉｌｄｅ、ＭＥＦ−１又はＳａｕｋｅｔｔのいずれかから選択される、請求項２７に記載の操作された細胞株。
【請求項２９】
前記ポリオウイルスが、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ２、Ｓａｂｉｎ３、Ｍａｈｏｎｅｙ、Ｂｒｕｎｈｉｌｄｅ、ＭＥＦ−１又はＳａｕｋｅｔｔのいずれかから選択され、前記細胞株の細胞が、２つ又は３つのポリオウイルスを含む、請求項２７に記載の操作された細胞株。
【請求項３０】
前記細胞株が、哺乳動物細胞株、トリ細胞株、又は昆虫細胞株である、請求項１、２、１４、１９、又は２３の何れか一項に記載の操作された細胞株。
【請求項３１】
前記哺乳動物細胞株が、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、イヌ細胞株、又はハムスター細胞株から選択される、請求項３０に記載の操作された細胞株。
【請求項３２】
前記哺乳動物細胞株が、ＨＥｐ−２又はＶｅｒｏＰである、請求項３１に記載の操作された細胞株。
【請求項３３】
前記トリ細胞株が、ニワトリ細胞株又はアヒル細胞株である、請求項３０に記載の操作された細胞株。
【請求項３４】
前記発現の変化が、前記ｍｉＲＮＡの細胞での量を測定することによって決定される、請求項１９又は２３に記載の操作された細胞株。
【請求項３５】
請求項１、２、１４、１９、又は２３の何れか一項に記載の操作された細胞株の溶解物。
【請求項３６】
ウイルスを産生する方法であって：
請求項１、２、１４、１９、又は２３に記載の操作された細胞株を用意するステップであって、前記細胞株の細胞がウイルスを含む、ステップ；
前記操作された細胞株を、前記細胞による前記ウイルスの産生に適した条件下でインキュベートするステップ；及び
前記細胞によって産生されたウイルスを収集するステップを含む、方法。
【請求項３７】
ウイルスを産生する方法であって：
細胞株を用意するステップであって、前記細胞株の細胞がウイルスを含む、ステップ；
前記細胞株を、前記細胞による前記ウイルスの産生に適した条件下でインキュベートするステップであって、培地が、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現を阻害するＲＮＡポリヌクレオチドを含む、ステップ；及び
前記細胞によって産生されたウイルスを収集するステップを含む、方法。
【請求項３８】
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はアンチセンスポリヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９から選択される）、表ＩＶから選択される内在性ｍｉＲＮＡの活性を阻害するｍＲＮＡインヒビター、又はこれらの組み合わせである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ウイルスの産生する方法であって：
細胞株を用意するステップであって、前記細胞株の細胞がウイルスを含み、前記細胞が、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現を低下させる編集されたゲノムを含む、ステップ；
前記細胞株を、前記細胞による前記ウイルスの産生に適した条件下でインキュベートするステップ；及び
前記細胞によって産生されたウイルスを収集するステップを含む、方法。
【請求項４０】
前記ゲノムが、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、又は転写活性化因子様エフェクターによって編集される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
ウイルスを産生する方法であって：
細胞株を用意するステップであって、前記細胞株の細胞がウイルスを含む、ステップ；
前記細胞株を、前記細胞による前記ウイルスの産生に適した条件下でインキュベートするステップであって、培地が、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現を阻害する小分子を含む、ステップ；及び
前記細胞によって産生されたウイルスを収集するステップを含む、方法。
【請求項４２】
前記ウイルスがピコルナウイルスである、請求項３６から４１の何れか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ピコルナウイルスがポリオウイルス又はエンテロウイルス７１である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ポリオウイルスが、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ２、Ｓａｂｉｎ３、Ｍａｈｏｎｅｙ、Ｂｒｕｎｈｉｌｄｅ、ＭＥＦ−１又はＳａｕｋｅｔｔのいずれかから選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ポリオウイルスが、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ２、Ｓａｂｉｎ３、Ｍａｈｏｎｅｙ、Ｂｒｕｎｈｉｌｄｅ、ＭＥＦ−１又はＳａｕｋｅｔｔのいずれかから選択され、前記細胞株の細胞が、２つ又は３つのポリオウイルスを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞株が、哺乳動物細胞株、トリ細胞株、又は昆虫細胞株である、請求項３６から４１の何れか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記哺乳動物細胞株が、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、イヌ細胞株、又はハムスター細胞株から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記哺乳動物細胞株が、ＨＥｐ−２又はＶｅｒｏＰである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記トリ細胞株が、ニワトリ細胞株又はアヒル細胞株である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
操作された細胞を作製する方法であって：細胞のゲノムを編集するために前記細胞に分子を導入するステップ；分子を含む前記細胞を、ゲノムの編集が行われるのに適した条件下でインキュベートするステップ；編集されたゲノムを含む操作された細胞を得るステップであって、前記編集により、対照細胞株と比較すると表Ｉから選択されるコーディング領域の発現が低下する、ステップを含む、方法。
【請求項５１】
前記細胞のゲノムを編集するための分子が、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、又は転写活性化因子様エフェクターである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ウイルスに感染している、又はウイルスに感染するリスクのある対象を治療するためのキットであって、前記対象の細胞での、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現を増加させるための手段を含む、キット。
【請求項５３】
ウイルスに感染している、又はウイルスに感染するリスクのある対象を治療するためのキットであって、前記対象の細胞での、表ＩＩから選択されるコーディング領域の発現を阻害するための手段を含む、キット。
【請求項５４】
ウイルスに感染している、又はウイルスに感染するリスクのある対象を治療するためのキットであって、前記対象の細胞での、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９から選択される内在性ｍｉＲＮＡの発現を阻害するための手段を含む、キット。
【請求項５５】
ウイルスに感染している、又はウイルスに感染するリスクのある対象を治療するためのキットであって、前記対象の細胞での、表ＩＶから選択されるｍｉＲＮＡの発現を増加させるための手段を含む、キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
個々のステップを含む本明細書で開示されるどの方法でも、これらのステップは、任意の可能な順序で行うことができる。そして、必要に応じて、２つ以上のステップの任意の組み合わせを同時に行うことができる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
操作された細胞株であって、前記操作された細胞株の細胞が、対照細胞株と比較した、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現の低下を有し、前記コーディング領域が、ＺＮＦ２０５、ＣＮＴＤ２、ＳＥＣ６１Ｇ、ＥＴＳ１、ＴＡＦ１Ｌ、ＭＣＣＤ１、ＬＹ６Ｇ６Ｃ、ＢＴＮ２Ａ１、ＧＬＸＰ３、ＧＣＧＲ、ＥＰ３００から選択される、操作された細胞株。
（項目２）
操作された細胞株であって、前記操作された細胞株の細胞が、対照細胞株と比較した、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現の低下を有する、操作された細胞株。
（項目３）
前記低下が、前記対照細胞株と比較すると少なくとも５％である、項目１又は２に記載の操作された細胞株。
（項目４）
前記発現の低下が、前記コーディング領域にコードされたポリペプチド又はｍＲＮＡの前記細胞における量を測定することによって決定される、項目１又は２に記載の操作された細胞株。
（項目５）
前記細胞が、前記コーディング領域又は前記コーディング領域に機能的に連結された調節領域に突然変異を有する、項目１又は２に記載の操作された細胞株。
（項目６）
前記細胞が、前記コーディング領域の発現を低下させる外来性ポリヌクレオチドを含む、項目１又は２に記載の操作された細胞株。
（項目７）
前記外来性ポリヌクレオチドがＲＮＡポリヌクレオチドである、項目５に記載の操作された細胞株。
（項目８）
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はアンチセンスポリヌクレオチドである、項目７に記載の操作された細胞株。
（項目９）
前記細胞が、発現を低下させる編集されたゲノムを含む、項目１又は２に記載の操作された細胞株。
（項目１０）
前記ゲノムが、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、又は転写活性化因子様エフェクターによって編集される、項目９に記載の操作された細胞株。
（項目１１）
前記細胞が、表Ｉから選択される少なくとも１つの追加のコーディング領域の発現の低下、対照細胞株と比較した、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９から選択されるｍｉＲＮＡの発現の増加、表ＩＶから選択される内在性ｍｉＲＮＡの発現の低下、又はこれらの組み合わせをさらに有する、項目１又は２に記載の操作された細胞株。
（項目１２）
前記細胞が、表Ｉから選択される少なくとも５つのコーディング領域の発現の低下を有する、項目１１に記載の操作された細胞株。
（項目１３）
前記細胞が、少なくとも２つのコーディング領域の組み合わせの発現の低下さらに有し、前記コーディング領域の組み合わせが表ＶＩから選択される、項目１又は２に記載の操作された細胞株。
（項目１４）
操作された細胞株であって、前記操作された細胞株の細胞が、対照細胞株と比較した、表ＩＩから選択されるコーディング領域の発現の増加を有する、操作された細胞株。
（項目１５）
前記発現の増加が、前記コーディング領域によってコードされるポリペプチド又はｍＲＮＡの前記細胞における量を測定することによって決定される、項目１４に記載の操作された細胞株。
（項目１６）
前記細胞が、表ＩＩから選択される少なくとも１つの追加のコーディング領域の発現の増加、対照細胞株と比較した、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９から選択される内在性ｍｉＲＮＡの発現の低下、表ＩＶから選択される内在性ｍｉＲＮＡの発現の低下、又はこれらの組み合わせをさらに有する、項目１４に記載の操作された細胞株。
（項目１７）
前記細胞は、表ＩＩから選択される少なくとも５つのコーディング領域の発現の増加を有する、項目１４に記載の操作された細胞株。
（項目１８）
前記増加が、前記対照細胞株と比較すると少なくとも５％である、項目１４に記載の操作された細胞株。
（項目１９）
操作された細胞株であって、前記操作された細胞株の細胞が、対照細胞株と比較した、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９から選択されるｍｉＲＮＡの発現の増加を有する、操作された細胞株。
（項目２０）
前記細胞が、前記ｍｉＲＮＡの１つのように挙動するｍｉＲＮＡ模倣体を含む、項目１９に記載の操作された細胞株。
（項目２１）
前記細胞が、少なくとも２つのｍｉＲＮＡの発現の増加をさらに有する、項目１に記載の操作された細胞株。
（項目２２）
前記増加が、前記対照細胞株と比較すると少なくとも５％である、項目１９に記載の操作された細胞株。
（項目２３）
操作された細胞株であって、前記操作された細胞株の細胞が、対照細胞株と比較した、表ＩＶから選択される内在性ｍｉＲＮＡの発現の低下を有する、操作された細胞株。
（項目２４）
前記細胞が、前記内在性ｍｉＲＮＡをコードするコーディング領域又は前記コーディング領域に機能的に連結された調節領域に突然変異を有する、項目２３に記載の操作された細胞株。
（項目２５）
前記細胞が、前記内在性ｍｉＲＮＡの活性を阻害するｍｉＲＮＡインヒビターを含む、項目２３に記載の操作された細胞株。
（項目２６）
前記細胞がピコルナウイルスを含む、項目１、２、１４、１９、又は２３の何れか一項に記載の操作された細胞株。
（項目２７）
前記ピコルナウイルスがポリオウイルスである、項目２６に記載の操作された細胞株。
（項目２８）
前記ポリオウイルスが、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ２、又はＳａｂｉｎ３のいずれかから選択される、項目２７に記載の操作された細胞株。
（項目２９）
前記ポリオウイルスが、Ｍａｈｏｎｅｙ又はＢｒｕｎｈｉｌｄｅから選択される、項目２７に記載の操作された細胞株。
（項目３０）
前記ポリオウイルスがＭＥＦ−１である、項目２７に記載の操作された細胞株。
（項目３１）
前記ポリオウイルスがＳａｕｋｅｔｔである、項目２７に記載の操作された細胞株。
（項目３２）
前記細胞株の細胞が、２つ又は３つのポリオウイルスを含む、項目２８に記載の操作された細胞株。
（項目３３）
前記ピコルナウイルスがエンテロウイルス７１である、項目２６に記載の操作された細胞株。
（項目３５）
前記細胞株が、哺乳動物細胞株、トリ細胞株、又は昆虫細胞株である、項目１、２、１４、１９、又は２３の何れか一項に記載の操作された細胞株。
（項目３６）
前記哺乳動物細胞株が、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、イヌ細胞株、又はハムスター細胞株から選択される、項目３５に記載の操作された細胞株。
（項目３７）
前記哺乳動物細胞株が、ＨＥｐ−２又はＶｅｒｏＰである、項目３６に記載の操作された細胞株。
（項目３８）
前記トリ細胞株が、ニワトリ細胞株又はアヒル細胞株である、項目３５に記載の操作された細胞株。
（項目３９）
前記発現の変化が、前記ｍｉＲＮＡの細胞での量を測定することによって決定される、項目１９又は２３に記載の操作された細胞株。
（項目４０）
項目１、２、１４、１９、又は２３の何れか一項に記載の操作された細胞株の溶解物。
（項目４１）
ウイルスを産生する方法であって：
項目１、２、１４、１９、又は２３に記載の操作された細胞株を用意するステップであって、前記細胞株の細胞がウイルスを含む、ステップ；
前記操作された細胞株を、前記細胞による前記ウイルスの産生に適した条件下でインキュベートするステップ；及び
前記細胞によって産生されたウイルスを収集するステップを含む、方法。
（項目４２）
ウイルスを産生する方法であって：
細胞株を用意するステップであって、前記細胞株の細胞がウイルスを含む、ステップ；
前記細胞株を、前記細胞による前記ウイルスの産生に適した条件下でインキュベートするステップであって、培地が、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現を阻害するＲＮＡポリヌクレオチドを含む、ステップ；及び
前記細胞によって産生されたウイルスを収集するステップを含む、方法。
（項目４３）
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はアンチセンスポリヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９から選択される）、表ＩＶから選択される内在性ｍｉＲＮＡの活性を阻害するｍＲＮＡインヒビター、又はこれらの組み合わせである、項目４２に記載の細胞株。
（項目４４）
ウイルスの産生する方法であって：
細胞株を用意するステップであって、前記細胞株の細胞がウイルスを含み、前記細胞が、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現を低下させる編集されたゲノムを含む、ステップ；
前記細胞株を、前記細胞による前記ウイルスの産生に適した条件下でインキュベートするステップ；及び
前記細胞によって産生されたウイルスを収集するステップを含む、方法。
（項目４５）
前記ゲノムが、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、又は転写活性化因子様エフェクターによって編集される、項目４３に記載の操作された細胞株。
（項目４６）
ウイルスを産生する方法であって：
細胞株を用意するステップであって、前記細胞株の細胞がウイルスを含む、ステップ；
前記細胞株を、前記細胞による前記ウイルスの産生に適した条件下でインキュベートするステップであって、培地が、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現を阻害する小分子を含む、ステップ；及び
前記細胞によって産生されたウイルスを収集するステップを含む、方法。
（項目４７）
前記ウイルスがピコルナウイルスである、項目３４、３５、３７、又は３９の何れか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記ピコルナウイルスがポリオウイルスである、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記ポリオウイルスが、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ２、又はＳａｂｉｎ３のいずれかから選択される、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記ポリオウイルスが、Ｍａｈｏｎｅｙ又はＢｒｕｎｈｉｌｄｅから選択される、項目４８に記載の方法。
（項目５１）
前記ポリオウイルスがＭＥＦ−１である、項目４８に記載の方法。
（項目５２）
前記ポリオウイルスがＳａｕｋｅｔｔである、項目４８に記載の方法。
（項目５３）
前記細胞株の細胞が、２つ又は３つのポリオウイルスを含む、項目４９に記載の方法。
（項目５４）
前記ピコルナウイルスがエンテロウイルス７１である、項目４７に記載の方法。
（項目５５）
前記細胞株が、哺乳動物細胞株、トリ細胞株、又は昆虫細胞株である、項目３４、３５、３７、又は３９の何れか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記哺乳動物細胞株が、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、イヌ細胞株、又はハムスター細胞株から選択される、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記哺乳動物細胞株が、ＨＥｐ−２又はＶｅｒｏＰである、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記トリ細胞株が、ニワトリ細胞株又はアヒル細胞株である、項目５５に記載の方法。
（項目５９）
操作された細胞を作製する方法であって：細胞のゲノムを編集するために前記細胞に分子を導入するステップ；分子を含む前記細胞を、ゲノムの編集が行われるのに適した条件下でインキュベートするステップ；編集されたゲノムを含む操作された細胞を得るステップであって、前記編集により、対照細胞株と比較すると表Ｉから選択されるコーディング領域の発現が低下する、ステップを含む、方法。
（項目６０）
前記細胞のゲノムを編集するための分子が、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、又は転写活性化因子様エフェクターである、項目６０に記載の方法。
（項目６１）
ウイルスに感染している、又はウイルスに感染するリスクのある対象を治療する方法であって、前記対象の細胞での、表Ｉから選択されるコーディング領域の発現を増加させるステップを含む、方法。
（項目６２）
ウイルスに感染している、又はウイルスに感染するリスクのある対象を治療する方法であって、前記対象の細胞での、表ＩＩから選択されるコーディング領域の発現を阻害するステップを含む、方法。
（項目６３）
ウイルスに感染している、又はウイルスに感染するリスクのある対象を治療する方法であって、前記対象の細胞での、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−１２５６、ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７０−２、ｍｉＲ−３１８７、ｍｉＲ−５７６３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−９から選択される内在性ｍｉＲＮＡの発現を阻害するステップを含む、方法。
（項目６４）
ウイルスに感染している、又はウイルスに感染するリスクのある対象を治療する方法であって、前記対象の細胞での、表ＩＶから選択されるｍｉＲＮＡの発現を増加させるステップを含む、方法。
【国際調査報告】
2016506734.tif 000036
2016506734.tif 000037
2016506734.tif 000038
2016506734.tif 000039
2016506734.tif 000040