(57)【要約】【課題】生物細胞の電気穿孔装置を提供する。【解決手段】上記装置は、細胞を保つ絶縁性チャンバを有するサンプル容器を含む。サンプル容器は、電気穿孔用の電気的接続を提供する第一電極と、第二電極を有する。絶縁性チャンバは、少なくとも一つの細胞単層を有するように構成される。該装置はまた、細胞の電気穿孔に所定のパルスを生成するパルス発生器を有する。
2016506751.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物細胞の電気穿孔装置であり、
バッファにある細胞サンプルを収容する絶縁性チャンバと、第一電極と、第二電極とを有するサンプル容器であって、
前記絶縁性チャンバと前記電極は前記細胞サンプルを収容するための密封箱を形成し、
前記電極は前記細胞サンプルに電気的接続を提供し、
前記電極の間において、前記細胞サンプルが少なくとも一つの細胞単層を形成することを可能とする、サンプル容器と、
前記サンプル容器中の細胞サンプルの電気穿孔に所定のパルスを生成するパルス発生器と、
を有する、生物細胞の電気穿孔装置。
【請求項２】
前記細胞単層の緻密度は少なくとも５０％である、ことを特徴とする請求項１に記載の電気穿孔装置。
【請求項３】
記絶縁性チャンバは、さらに前記電極の一つと接触する第一導電性媒質層を含むように構成され、
前記細胞サンプルは、前記第一導電性媒質層の表面に少なくとも一つの前記細胞単層を形成する、
ことを特徴とする請求項１又は請求項２のいずれかに記載の電気穿孔装置。
【請求項４】
前記第一導電性媒質層は、前記サンプル容器の中に形成される、
ことを特徴とする請求項３に記載の電気穿孔装置。
【請求項５】
少なくとも一つの前記電極は可動であり、封止カバーとして機能する、
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の電気穿孔装置。
【請求項６】
余剰の液体を受け入れるために、
前記絶縁性チャンバは、前記絶縁性チャンバのチャンバ壁に溝を有する、
ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の電気穿孔装置。
【請求項７】
遠心分離法による前記細胞単層の形成を促進可能にするための遠心分離機をさらに有する、
ことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の電気穿孔装置。
【請求項８】
前記遠心分離機は、電気穿孔において、所定の電気パルスを前記サンプル容器に輸送するための前記パルス発生器と一体化される、
ことを特徴とする請求項７に記載の電気穿孔装置。
【請求項９】
細胞数を測定し、電気穿孔のための細胞サンプルに所定数の細胞を含ませるための計数装置をさらに有する、
ことを特徴とする請求項１乃至請求項８のいずれか一項に記載の電気穿孔装置。
【請求項１０】
生物細胞の電気穿孔装置であって、
電気穿孔に生物細胞のサンプルを収容するためのサンプル容器であって、前記生物細胞を収容するために、容器の本体を形成する絶縁性チャンバを有するサンプル容器と、
前記絶縁性チャンバは複数の側面と、第一電極と、第二電極を有し、
前記第一電極と前記第二電極は、電気パルス発生器から電気パルスを受け、細胞を電気穿孔させるものであり、
前記絶縁性チャンバと前記第一、第二電極により、前記サンプル容器中の生物細胞のサンプルを封止可能に構成する、電気穿孔装置。
【請求項１１】
前記絶縁性チャンバは、前記第一、第二電極のうちの一つと接触する第一導電性媒質層を有する、
ことを特徴とする請求項１０に記載の電気穿孔装置。
【請求項１２】
前記第一、第二電極の少なくとも一つが可動であり、封止の機能を有する、
ことを特徴とする請求項１０又は請求項１１に記載の電気穿孔装置。
【請求項１３】
前記絶縁性チャンバの一つの側面が可動であり、封止の機能を有する、
ことを特徴とする請求項１０又は請求項１１に記載の電気穿孔装置。
【請求項１４】
余剰の液体を受け入れるために、前記絶縁性チャンバは、絶縁性チャンバのチャンバ壁に溝を有する、
ことを特徴とする請求項１０乃至請求項１３のいずれか一項に記載の電気穿孔装置。
【請求項１５】
前記第一、第二電極を介して、前記サンプル容器にある生物細胞を電気穿孔するための電気パルス発生器をさらに有する、
ことを特徴とする請求項１０乃至請求項１４のいずれか一項に記載の電気穿孔装置。
【請求項１６】
前記電気パルス発生器は、超高電圧パルスを生成するように構成される、
ことを特徴とする請求項１５に記載の電気穿孔装置。
【請求項１７】
電気エネルギーを蓄積し、電気穿孔のために、コードレス機能を容易にするエネルギー貯蔵装置をさらに含む、
ことを特徴とする請求項１５又は請求項１６に記載の電気穿孔装置。
【請求項１８】
電気穿孔されるの細胞と共に使用される人工の絶縁性粒子を有する、
ことを特徴とする請求項１０乃至請求項１７のいずれか一項に記載の電気穿孔装置。
【請求項１９】
サンプル容器の絶縁性チャンバに少なくとも一つの細胞単層を形成するために細胞を配置するステップであって、
前記サンプル容器は、電気穿孔に電気的接続を提供する第一電極と、第二電極を有するステップと、
所定の電気パルスで前記細胞単層の細胞を処理するステップであって、
前記所定の電気パルスはパルス発生器により生成されるステップと、
を有する生物細胞の電気穿孔方法。
【請求項２０】
第一導電性媒質層により表面を形成するステップであって、
第一導電性媒質層に前記細胞単層を形成するステップ、
をさらに含む、ことを特徴とする請求項２０に記載の生物細胞の電気穿孔方法。
【請求項２１】
前記細胞の濃度を測定し、前記細胞単層を形成するために使用される所定数の細胞を提供するステップ、
をさらに含む、ことを特徴とする請求項２０又は請求項２１に記載の生物細胞の電気穿孔方法。
【請求項２２】
前記細胞は自然な重力により、前記細胞単層に配置される、
ことを特徴とする請求項１９乃至請求項２１のいずれか一項に記載の生物細胞の電気穿孔方法。
【請求項２３】
前記細胞は遠心分離法により、前記細胞単層に配置される、
ことを特徴とする請求項１９乃至請求項２１のいずれか一項に記載の生物細胞の電気穿孔方法。
【請求項２４】
前記細胞が遠心分離中に所定の電気パルスで処理される、
ことを特徴とする請求項２３に記載の生物細胞の電気穿孔方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主に細胞を電気的刺激することに関し、特に細胞の電気穿孔方法及び装置に関連するものである。
【背景技術】
【０００２】
電気穿孔は電気的刺激により、膜細孔を一時的に生成し、細胞膜の膜透過処理を行うことに広く用いられる方法である。
電気穿孔の応用として、様々な細胞、例えば哺乳類細胞、植物細胞、酵母、他の真核細胞、バクテリア、他の微生物細胞及びヒト患者からの細胞にＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ペプチド、蛋白質、抗体、ドラッグ、又は他の物質を導入することがある。
さらに、電気的刺激はハイブリドーマ、或いは他の融合細胞の製造における細胞融合に用いられる。
電気的細胞融合は電気穿孔の特殊な形式と見なすことができる。
【０００３】
一般的に細胞は、電気穿孔の過程で、細胞の生存に好ましいバッファ、又は、媒質に懸濁される。
【０００４】
バクテリア細胞の電気穿孔に関して、水のような低導電性媒質は、一時的な高電流による熱発生を減少するのに使用されることが多い。さらに、細胞懸濁液は放電のために、二つの平坦な電極が埋め込まれる長方形のキュベットに置かれる。
例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）のＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒシリーズでは、キュベット中の細胞が電気穿孔される構成としている。従来の電気穿孔では高電界強度が必要とされる。
【０００５】
電気穿孔のプロセスは細胞に有害である。
まず第一に、電界強度が高すぎると、細胞膜は不可逆的にダメージを受ける可能性がある。
第二に、電気的に誘発される膜細孔は、対象物質が細胞に導入される際に、細孔からの細胞内含量の流出と、細胞の生存性に悪影響を与える他の意図しない物質の流入を許容する可能性がある。
第三に、電流により発生した熱は、細胞に害を及ぼす可能性がある。
最後に、電気化学的に生成された有害因子、例えば、電極の近くにある遊離基、ガス及び金属イオンは細胞に有害である。
【０００６】
細胞の特性のバラつき、即ち、電気穿孔における細胞の不均一性は、電気穿孔の高効率性や、低有害の電気穿孔の実現において、いまだ大きな課題として残っている。
不均一性に影響する要因の一つとして知られるものは細胞のサイズである。より大きい細胞はより簡単に電気穿孔される。異なるサイズの細胞混合物では、大細胞はある電圧の下で効率的に電気穿孔される一方、その電圧は、小細胞を効率的に電気穿孔するには、十分ではない場合が多い。小細胞が効率的に電気穿孔される電界強度では、その電圧が大細胞の生存にとって高すぎるため、通常、大細胞は不可逆的なダメージを受ける。また、細胞膜の異なる組成、又は細胞の成熟状態といった他の要素は、細胞の不均一性に影響を与えてしまう。
【０００７】
細胞の電気穿孔の効率を改善するための多くの試みがなされたが、細胞の不均一性の重要な課題は未解決のままである。電気穿孔方法における効率、細胞の生存の可能性、及び費用の有効性はさらなる改善が期待される。以下に開示される装置と方法は、上記の一つ、又はより多くの課題、及び他の課題を解決するのに用いられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、生物細胞の電気穿孔装置を提供する。
上記装置は、細胞を収容する絶縁性チャンバを有するサンプル容器を有する。サンプル容器は、電気穿孔用の電気的接続を提供する第一電極、及び第二電極を有する。絶縁性チャンバは、少なくとも一つの細胞単層を含むように構成される。当該装置はまた、細胞の電気穿孔に必要なパルスを生成するパルス発生器を有する。
【０００９】
本発明は、他の生物細胞の電気穿孔装置も提供する。当該装置は電気穿孔用の生物細胞のサンプルを収容するサンプル容器を有する。サンプル容器は細胞を収容するための容器の本体を形成する絶縁性チャンバを有する。絶縁性チャンバには複数の側面を有する。また、当該サンプル容器は、電気パルス発生器から電気パルスを受け取り、細胞を電気穿孔するための第一電極と第二電極を有する。絶縁性チャンバと電極は、サンプル容器中の生物細胞のサンプルを封止することができる。
【００１０】
本発明は、また、生物細胞の電気穿孔の方法を提供する。
その方法は以下のステップを含む。
サンプル容器の絶縁性チャンバに、少なくとも一つの細胞単層を形成するために、細胞を配置する。
サンプル容器には、電気穿孔用の電気的接続を提供する第一電極、及び第二電極がある。
パルス発生器により生成される所定の電気パルスで、細胞単層の細胞の電気穿孔をする。
【００１１】
本発明の他の実施例は、本発明における明細書、請求項、図面に照らして、当該分野の技術者に明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
図１Ａは、本発明の実施例に対応する例示的な生物細胞の電気穿孔装置を示す図である。
図１Ｂは、本発明の実施例に対応する例示的なサンプル容器中の細胞単層の形成を示す図である。
図１Ｃは、本発明の実施例に対応する例示的なサンプル容器中の細胞単層の形成を示す図である。
図２Ａは、球状の絶縁体細胞による電流フローの遮断及び分流の効果を示す図である。
図２Ｂは、細胞における電気穿孔の有効表面を示す図である。
図３は、有効な電気穿孔の表面における細胞のサイズの効果を示す図である。
図４は、示された電流方向における三つの代表的な細胞の隣接している位置を示す図である。
図５は、細胞単層を通って流れる電流の分布を示す図である。
図６は、模擬細胞の人工の絶縁性粒子を使用し、総細胞数を増やすことを示す図である。
図７は、本発明の実施例に対応する例示的なサンプル容器を示す図である。
図８は、本発明の実施例に対応する例示的なサンプル容器を示す図である。
図９Ａは、本発明の実施例に対応する例示的なサンプル容器を示す図である。
図９Ｂは、本発明の実施例に対応する例示的なサンプル容器を示す図である。
図１０は、本発明の実施例に対応する電気穿孔、又は電気細胞融合に用いるため、例示的な遠心分離法を使用し、緻密な細胞単層、又は複数の細胞単層を造る、ことを示す図である。
図１１Ａは、本発明の実施例に対応する例示的なサンプル容器を示す図である。
図１１Ｂは、本発明の実施例に対応する例示的なサンプル容器を示す図である。
図１２Ａは、本発明の実施例に対応する例示的なサンプル容器を示す図である。
図１２Ｂは、本発明の実施例に対応する例示的なサンプル容器を示す図である。
図１３は、本発明の実施例に対応する例示的な電気穿孔のプロセスを示す図である。
図１４Ａは、本発明の実施例に対応する例示的な装置を示す図である。
図１４Ｂは、本発明の実施例に対応する電気穿孔のために、例示的な下側媒質層の使用を示す図である。
図１５は、例示的な細管補助の電気穿孔を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
添付の図に示される本発明の実施例を参考にして詳細に説明する。同一又は類似する構成部分を表すため、できるだけ各図面に同一の参照番号を付される。
【００１４】
図１Ａは、本発明の実施例に対応する例示的な電気穿孔装置１００を示す図である。上記装置１００はサンプル容器１０を有する。サンプル容器１０は、絶縁性チャンバ１４、第一電極１５ａ、及び第二電極１５ｂを有する。サンプル容器１０の中において、下側媒質層１２の表面、及び上側媒質層１３の下面の間にインタフェースが形成される。電流場を横切る細胞単層１１はインタフェース上に形成される。本開示に使用される細胞単層は、単一で、且つ緻密に詰まる細胞層を指す。従って、細胞単層は時に緻密な細胞単層、又は、緻密な単層とも称される。装置１００は、パルス発生器１８も有する。サンプル容器１０は、パルス発生器１８内に設置することができ、電気パルスは、第一電極１５ａと第二電極１５ｂの間で輸送される。
図１Ｂは、絶縁性チャンバ１４にある細胞単層１１の断面図を示す。図１Ｂに示されるように、単層１１は、絶縁性チャンバ１４の断面エリアを占めている。
【００１５】
装置１００は、細胞の電気穿孔をモデリングするために、一定のコンセプトを使用して実施することができる。図２Ａでは、電流上、或いは、もともと一定であった電流フロー、又は電界上における半径Ｒの球状細胞の効果が例示される。
細胞にＤＮＡ、ＲＮＡ、又は蛋白質を導入するといった典型的な電気穿孔では、媒質、又は他の緩衝塩溶液の中で電撃が行われる。
細胞外の溶液や細胞内の細胞質と比較すると、脂質二重層ベースの細胞膜はかなり低い電導度を有し、電流の大部分が細胞の内部をバイパスする。従って、細胞は絶縁物体に似たものとなる。
【００１６】
細胞膜の絶縁効果は電気穿孔する際に、強電場の短時間の照射から細胞内部を保護する。
図２Ａに示されるように、絶縁体に似た球状細胞による電流の遮断と分流により、もともと均一な電場が細胞の周囲が隆起する電場に変えられる。
【００１７】
半径角度θの細胞膜上の局所点は、一般的に電流の方向からの、その半径角度θによって指定することができる。導電性媒質中のＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質などの陰性荷電分子は、電流の方向と逆方向に移動する。
【００１８】
もともと均一な電場に置かれる半径Ｒの単一細胞について、半径角度θにおける膜上の所定点の経膜電位は、次式によりおおよそモデル化される
Ｖθ＝１．５・Ｅｏ・Ｒ・ｃｏｓθ          （Ｉ）
ここで、Ｅｏはもともと均一な電場の電界強度である。
全体的な電界の方向に対する二つの局所点のθが０°、又は１８０°に等しい時に、ｃｏｓθは１、又は−１に等しく、経膜電位値は最も高くなる。
電流の上流（θ＝１８０°）ではなく、電流の下流（θ＝０°）の局所点において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質などの陰性荷電分子は、最大電位下で細胞膜を通過する。反対に、θが９０°に等しいときは、細胞膜点の外の電流は最も強いが、細胞膜の点における経膜電位はゼロとなる。
【００１９】
θが０°の時は、経膜電位は最も大きく、θが９０°の時には、経膜電位はゼロ電位まで低下する。細胞膜の局所点における経膜電位が大きければ大きいほどより大きな分子を輸送する力を作り出すことができる。
物質を導入するためには、最小量の経膜電位Ｖｍｉｎが必要である。
θの最大値、又はθｍａｘは、０°と９０°の間で到達でき、そこで、経膜電位がＶｍｉｎになる。
同時に、θがより小さい細胞膜上の経膜電位は、細胞に不可逆的なダメージをもたらす電位を超えることができない。θｍａｘは、最も効果の高い電気穿孔表面を定義する。
【００２０】
図２Ｂは、球状細胞上の有効電気穿孔表面（影の部分で表示される）を例示する。
本発明において使用される有効電気穿孔表面、又は細胞の電気穿孔のための有効表面は、十分な経膜電位を有し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質などの外部の物質を細胞に導入する細胞表面の部分のことをいう。
ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質などの大分子を細胞に導入する電気穿孔において、細胞は特定の経膜電位よりも低い場合にのみ生存可能である。
【００２１】
図２Ｂにおいて、Ｖｍａｘは細胞が耐えられる最大の経膜電位を表し、それを超えると、細胞は不可逆的なダメージを受ける。
Ｖｍｉｎは有効な電気穿孔が可能となる最小の透過可能な経膜電位を表し、それを下回ると、外部の物質は細胞に導入されることができない。
ＶｍａｘとＶｍｉｎの値は細胞膜の特性により決定される。
Ｖｍａｘは、導入する対象物質の種類を問わず同じである。一方、Ｖｍｉｎはサイズや電荷など対象物質の分子の特性に関係する。
大分子を導入する時のＶｍｉｎは大きくなる。
ＶｍａｘとＶｍｉｎの間の範囲は、細胞を電気穿孔する経膜電位の有効範囲であり、特に大分子を導入する時には、その範囲は小さくなる。
【００２２】
図２Ｂに示されるように、細胞の局所点のみが最高経膜電位、即ち、Ｖｍａｘに到達することができる。
影がつけられた有効電気穿孔表面の外縁部にＶｍｉｎの経膜電位が存在し、その半径角度はθｍａｘである。ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質などの陰性荷電分子については、有効電気穿孔表面は電流の下流側に配置される。
θ＝０°  及び  ｃｏｓθ＝１  である局所点において、
Ｖｍａｘ＝１．５・Ｅｏ・Ｒ
が付与される。
θｍａｘにおいては、経膜電位がＶｍｉｎまで減少し、
Ｖｍｉｎ＝１．５・Ｅｏ・Ｒ・ｃｏｓθｍａｘ＝Ｖｍａｘ・ｃｏｓθｍａｘ
となる。
従って、θｍａｘは以下の公式により確定できる。
ｃｏｓθｍａｘ＝Ｖｍｉｎ／Ｖｍａｘ
【００２３】
以上のモデルリングにより、細胞の局所点では、有効な分子導入が最高速度となる。ある点の分子導入の速度については、θの増加に伴って減少し、θｍａｘにおいてゼロになる。
【００２４】
異なる半径の各細胞が均一な電場に置かれる際に、各細胞は異なる経膜電位プロファイルを有する。
ＶｍｉｎとＶｍａｘの絶対値は状況に応じたある変化に従う。
例えば、指数関数的な減衰波や方形波などの異なる電気パルス形状が使用される場合、ＶｍｉｎとＶｍａｘの値は異なることになる。
しかし、Ｖｍｉｎ／Ｖｍａｘの比率は、これらのタイプの変化と同じように敏感とはならない。
【００２５】
図３は、細胞のサイズが有効電気穿孔表面にどのように影響するかを示す。
細胞膜は、本質的に膜蛋白が分布しており、いくつかのチャンネルを有する脂質二重層である。
細胞のサイズがある程度異なっても、同じタイプの細胞は、同様の膜構成を有する。
従って、同一の細胞の異なる位置、或いは、同じタイプの異なるサイズの細胞においては、その膜電気特性、例えば、ＶｍａｘやＶｍｉｎなどは、同じであると考えられる。細胞のタイプが異なるものでさえも、多くの哺乳動物細胞は、ＶｍａｘとＶｍｉｎを含む同様の膜電気特性を有するといえる。細胞膜は、本質的には、異なる蛋白質が同じように分布された脂質二重層であるからである。
【００２６】
図３において、左の半径Ｒの大細胞と、中央の半径ｒの中細胞と、右の小細胞の三つの単独遊離細胞について分析する。
円形により物理細胞や経膜電位プロファイルを表すために、三つの細胞の中心は一直線上に配置される。
電界強度は、大細胞が局所点においてＶｍａｘに達するように設定され、Ｖｍａｘである局所点とＶｍｉｎである外縁部の間における有効電気穿孔表面に影がつけられる。
大細胞が最適な電気穿孔を得られる際には、
Ｖｍａｘ＝１．５・Ｅｏ・Ｒ
となり、
Ｅｏ＝Ｖｍａｘ／（１．５・Ｒ）
となる。
中細胞（半径ｒ＜Ｒ）での局所点における経膜電位はより低くなる。
局所点における経膜電位Ｖｔｏｐは以下のように示される。
Ｖｔｏｐ＝１．５・Ｅｏ・ｒ＝Ｖｍａｘ・ｒ／Ｒ
【００２７】
経膜電位がＶｍｉｎより大きい中細胞の有効表面は、以下を満足する外縁の角度θｒにより決められ、
Ｖｍｉｎ＝１．５・Ｅｏ・ｒ・ｃｏｓθｒ＝Ｖｔｏｐ・ｃｏｓθｒ＝（Ｖｍａｘ・ｒ／Ｒ）・ｃｏｓθｒ
これにより、以下のようになる。
ｃｏｓθｒ＝（Ｖｍｉｎ／Ｖｍａｘ）・（Ｒ／ｒ）
中細胞上の有効電気穿孔表面は大細胞の有効電気穿孔表面より小さく、Ｖｔｏｐである局所点とＶｍｉｎである外縁部の間に影がつけられる。
ｒ／Ｒ＝Ｖｍｉｎ／Ｖｍａｘである時に、ｃｏｓθｒは１になり、有効表面はゼロまで減少する。
従って、有効な電気穿孔を得るための最小半径は、以下となる。
ｒｍｉｎ＝（Ｖｍｉｎ／Ｖｍａｘ）・Ｒ
【００２８】
半径がｒｍｉｎ以下となる右側に示される小細胞は、Ｖｍｉｎに達する点がなく、有効電気穿孔表面が存在しない。
【００２９】
従って、細胞のサイズは電気穿孔の重要な要素である。
大細胞は局所点における経膜電位が高いだけではなく、有効表面も大きくなる。
小細胞の経膜電位をＶｍａｘに到達させるために高い電流場が適用されると、大細胞は生存することができなくなる。
細胞のサイズが相違することは避けられず、電気穿孔中の細胞特性は不均一であると考えられる。例えば、細胞群の９５％は、正規分布（ガウス分布）分布により約２０％の半径偏差があり、Ｖｍｉｎ／Ｖｍａｘ（即ち、ｒｍｉｎ／Ｒ）が約９０％であれば、半径偏差が約１０％である範囲内の細胞だけが有効に電気穿孔される。ガウス分布に基づいて、中細胞が電気穿孔される時に、理論上の最も高い電気穿孔効率は約６７．３％に達する。大細胞については、Ｖｍｉｎ／Ｖｍａｘ（例えば、ｒｍｉｎ／Ｒ）が約９５％であり、理論上の最も高い電気穿孔効率は約３７．６％になる。
【００３０】
さらに、細胞のサイズの問題は異なる細胞のタイプにまで広がる。
多くのタイプの哺乳動物細胞には同様のＶｍｉｎとＶｍａｘがあるため、小さなサイズの細胞がＶｍｉｎに到達するには、より高い電流場強度を必要とし、高電流になるにつれて有害物がもたらされる。例えば、熱、遊離基、ガス及び金属イオンは、細胞に対して有効的な電気穿孔がなされる前に、不可逆的にダメージを与えることがある。
細胞のサイズは容易に変えることができないため、細胞のサイズのバラつきに適応する電気穿孔の方法が望まれるが、現在では利用可能ではない。
【００３１】
個々の理想的な細胞の経膜電位の上記の分析は、細胞の電気穿孔を理解するための基礎となる。
電気穿孔においては、１０６〜１０７のオーダーで多数の細胞を使用することが望ましい場合がしばしばある。
また、細胞が体積の小さい容器の中に置かれる二つの主な理由は以下である。
ｉ）高濃度の対象物質の輸送を実現すること。
ｉｉ）より小さなサンプル体積はより少ないエネルギーを必要とするため、パルス発生器の製造が容易であること。
【００３２】
０．２ｍｌの媒質に懸濁される１０００万個の細胞の典型的な電気穿孔において、各細胞は２０，０００立方ミクロン（μｍ３）の平均媒質体積を占有する。
各細胞は、側面の長さが約２７μｍの立方体と等しいスペースを占有し、典型的な哺乳動物細胞の直径よりは大きくない。従って、典型的な電気穿孔においては、細胞間の平均距離はほとんどの哺乳動物細胞の細胞直径と同等である。即ち、細胞は互いに非常に接近している。
【００３３】
単一の遊離細胞が均一な電場に置かれるときにだけ、計算式（Ｉ）は有効である。
計算式（Ｉ）は、少数の細胞が均一な電場に置かれ、細胞間の距離が細胞直径よりもはるかに大きい場合に適用できる。細胞が密集しているときの電気穿孔では、各細胞を取り囲む電場は、この細胞自体と接近する他の細胞により変化する。細胞膜内の固有の特性であるＶｍｉｎとＶｍａｘが同じ場合でも、所定点における経膜電位を計算するためには、計算式（Ｉ）はもはや適用できないものとなる。このため、電場プロファイルは複雑となり、予測が困難となる。
細胞のサイズが完全に等しい場合でも、細胞がランダムに配置されると、細胞の電気穿孔効率が不均一な別の層を構成することになる。
【００３４】
以上のことから、電場をより良く理解し、電気穿孔と電気細胞融合の改良方法の設計を促進するために、複雑な電場の分析を以下に提示する。
【００３５】
図４は、等しいサイズの細胞の三つのタイプの代表的な配置（ボジショニング）を例示する。
一番目のタイプは、周囲の細胞の影響を受けない遊離細胞（Ｆ）である。二番目と三番目のタイプは、隣接する細胞の位置を決める二つの特別な方法を表す。
一番目の特別な配置では、一般的な電流流動の方向に沿って、二つ或いは多数の細胞が密接に縦方向に並ぶ。このボジショニングは細胞Ｓ１、Ｓ２及びＳ３により表される。
二番目の特別な配置では、細胞は密接に、一般的な電流流動の方向に対して、略垂直な断面において横に配置される。この配置は細胞Ｅ１、Ｅ２及びＥ３により表される。
これらの細胞上における経膜電位の正確な計算式を導出するのはより困難であるが、電気穿孔の改良方法を開発するためには、関連する定性的な分析がなされる。
【００３６】
図４に示されるように、Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は密接に一直線に並べられ、遊離細胞Ｆよりもさらに顕著に、電流フローを遮断せず、分流させない。従って、Ｓ１、およびＳ３だけが、局所表面における経膜電位プロファイルが遊離細胞Ｆの経膜電位プロファイルと同様となる。さらに、電流（図４の影の部分）下流のＳ１細胞の局所表面だけが、陰性荷電分子の電気穿孔に有効である。
もし電流の方向が逆の場合には、Ｓ３細胞もＳ１細胞のように、有効に陰性荷電分子の電気穿孔をすることができる。Ｓ１とＳ３の細胞のシールド効果により、Ｓ２細胞はより低い経膜電位を有することになる。
前側に配置される細胞による、後ろ側の細胞を電気穿孔の取得からシールドする効果は、縦方向のシールド効果と定義される。
細胞間の距離が大きくなる、又は、配列が厳密な縦方向から逸脱すると、縦方向のシールド効果は顕著ではなくなる。
縦方向の配列は、多数の細胞をシールドし、電気穿孔効率を低下させため、電気穿孔において望まれないバラつきのレベルに至ることになる。
【００３７】
一方で、細胞Ｅ１、Ｅ２及びＥ３は電流フローを遮断、制限するように、全体としてかなり大きな効果を発揮する。
その結果、超大型の単一細胞を形成するかのように、Ｅ１、Ｅ２及びＥ３の経膜電位は細胞Ｆの経膜電位より高くなる。横に配置される細胞は経膜電位計算式（Ｉ）にもはや従うものではない。
細胞の平面の近くでは、電流の総量が少ないため、このような細胞の局所点付近の経膜電位は、遊離の単一細胞の経膜電位よりも減ることになる。
定性的には、有効表面の形状は若干不規則になるが、各Ｅ１、Ｅ２及びＥ３細胞は、Ｆ細胞と比較して、Ｖｍａｘ点とＶｍｉｎ点の間において電気穿孔の効果が強化されるため、より大きな有効電気穿孔表面を有することになる。
【００３８】
三次元等高線マップにより、Ｅ１、Ｅ２及びＥ３の実際の有効電気穿孔表面がより正確に説明され、図４に使用される二次元の影の部分において増加した有効表面の領域が十分に表現される。
横に配置される細胞が互いの電気穿孔の実施容易性を高める効果は、横方向の増強効果と定義される。
細胞間の距離が増える、又は、細胞が断面位置から逸脱すると、横方向の増強効果は顕著ではなくなる。
まとめると、上述した電流方向において、これらの細胞の電気穿孔の実施容易性は、以下のように並べることができる。
Ｅ２，Ｅ１，Ｅ３＞Ｓ１，Ｆ＞Ｓ２，Ｓ３
【００３９】
細胞懸濁液の中で行われる典型的な電気穿孔において、細胞と細胞の間の複雑な電気的な相互作用は３つの主なカテゴリにて特徴づけられる。
縦方向のシールド効果と、横方向の増強効果と、及び、縦方向のシールド効果と横方向の増強効果の組み合わせ相互作用である。
主に縦ではなく、また主に横ではない位置において隣接する細胞の間には、組み合わせ相互作用があり、これらの相互作用はより小さなシールド効果と増強効果を有する。
定性的な分析により、高効率な電気穿孔を実現するためには、縦方向のシールドは望まれないことが明らかになった。
しかし、細胞懸濁液中においては縦方向のシールド効果は回避し難い。
電流方向を変更することにより、縦配列の細胞の両側の局所表面における電気穿孔の効率を向上させることが可能となる。
横方向の増強効果は、電気穿孔に有益であり、特に、Ｖｍｉｎに達する破壊的に高い電界強度を要求するタイプである小サイズの細胞型にとって有用である。
【００４０】
これらの理解に基づけば、電気穿孔においては、望まれない縦方向のシールド効果を除去又は減少し、横方向の増強効果を最大化することが望ましいということになる。
【００４１】
図１Ａを再び参照すると、細胞が電流場を横切る緻密な単層１１に存在する場合に、縦方向のシールド効果は幾何学的に排除され、細胞間において横方向の増強効果は増大する。
【００４２】
図１Ａに示されるように、サンプルが漏れないように、絶縁性チャンバ１４、第一電極１５ａ、及び第二電極１５ｂにより、上側媒質層１３、サンプル容器１０の中の下側媒質層１２を封止する。容器１０は異なる形状であってもよい。例えば、容器１０は円柱形、又は非円柱形とすることができる。
【００４３】
サンプル容器１０の中で使用される絶縁性チャンバ１４は、プラスチック、ゴム、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル、ポリイミド、ポリジメチルシロキサン、環状オレフィン共重合体、可塑性ポリエステルエラストマ、ガラス、クォーツ及びシリコンなどの非導電性材料により作られる。絶縁性チャンバ１４は、強固となり、また、電極とタイトにフィットし得るように、１種、又は１種以上の材料により作られる。
【００４４】
第一電極１５ａと第二電極１５ｂはアルミニウム、鉄、鉄鋼、ニッケル、チタニウム、亜鉛、銅、スズ、銀、グラファイト及び合金などの導電性材料により作ることができる。
また、ギルドメタル、表面改良合金、又は、導電性材料で被覆、混合されたゴム又はプラスチックなどの非導電性材料により作ることができる。
第一電極１５ａと第二電極１５ｂは、インジウム‐すず酸化物、アルミニウム添加酸化亜鉛、及びアンチモン添加酸化錫などの材料を使用し、細胞の顕微鏡観察のために、透明に作られる。
第一電極と第二電極は、異なる材料や、異なる形状で作ることができる。
【００４５】
電極１５ａは上部電極とし、電極１５ｂは下部電極とする。
両電極１５ａ，１５ｂの間の距離は、液体の取り扱いを容易にするために、１ｍｍより大きく、対象物質に過剰に消費されて導入されるのを避けるために、５０ｍｍより小さくすることが好ましい。１つの実施例において、両電極１５ａ，１５ｂの間の距離は、簡単な取り扱い及び反応剤の保存のために、１ｍｍ〜３０ｍｍの範囲とされる。電極板１５ａ，１５ｂの形状および寸法は、容器１０の形状および寸法により決定され得る。電極１５ａ，１５ｂを製造するためには、通常、金又は白金のような貴金属を使用する必要がない。
しかし、電極１５ａ，１５ｂを製造するためには、コストが問題とならない時や、あるいは、容器が再使用の必要がある時に、金及び白金のような貴重な不活性の金属を使用することができる。
【００４６】
パルス発生器１８は、生物細胞の電気穿孔のために、電気パルスを生成する。
発生器１８は、指数関数的な減衰波、方形波、又は矩形波、高周波、波形の結合などの一つ、又はいくつかの異なるパルスフォームを生成することができる。
電気穿孔のパルスフォームは細胞型、容器のタイプ、及び／又は他のデータに基づいて、予め決定されることができる。
その結果、パルス発生器１８は、電気穿孔のために、所定のパルスフォームを供給するようにプログラムされることができる。本開示において、一つのパルス、又は一つのパルスフォームとは、単一のパルス、又は、多数のパルスやパルスフォームにより構成された結合パルスのことをいう。
【００４７】
緻密な細胞単層１１は、電極の表面上、又は両電極の間のいずれの位置にも形成され得る。電極の上に直接細胞単層１１を形成しないために、両導電性媒質層１２，１３の間に、細胞を停滞させるインタフェースを作ることができる。インタフェースは導電性媒質層の表面といえる。適切な数の細胞を含む細胞懸濁液が、下側媒質層１２の表面に置かれる。細胞懸濁液は、媒質やバッファ中の細胞を懸濁することで形成され、上側媒質層１３、又は他の適切な媒質やバッファを形成するのに使用される。細胞は、自然な重力、又は人工の遠心力により下側媒質層１２と上側媒質層１３の間のインタフェースに沈降することができる。パルス発生器１８は、第一電極１５ａと第二電極１５ｂの間の細胞単層にあるフォームの電気パルスを供給するものであり、細胞単層が形成された後に、パルシングが行われる。
【００４８】
電気穿孔が行われる際に、上側媒質層１３と下側媒質層１２の間に、安定したインタフェースが維持されることが必要である。
通常、上側媒質やバッファ層１３は、細胞懸濁液、或いは他のあらゆる適切な媒質、又はバッファを作成するのに用いられる媒質、又はバッファにて構成される。
上側媒質層１３に使用される媒質やバッファは、任意の適切な媒質やバッファであってもよく、例えば、ＭＥＭ，ＤＭＥＭ，ＩＭＤＭ，ＲＰＭＩ，Ｈａｎｋｓ’，ＰＢＳ及びリンガー液などである。
下側媒質やバッファ層１２は、高濃度の溶液にて構成され、例えば、糖類、グリセリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびフィコールを含む溶液とすることができる。
下側媒質層１２に使用される媒質やバッファは、上側媒質層１３に使用される媒質やバッファと同じ、又は同じではない任意の適切な媒質やバッファであってもよく、例えば、ＭＥＭ，ＤＭＥＭ，ＩＭＤＭ，ＲＰＭＩ，Ｈａｎｋｓ’，ＰＢＳ及びリンガー液などである。
また、下側媒質層１２は半固体ゲルにより形成されることができる。例えば、寒天、又はアガロースベースのゲル、シリコンゲル、ポリアクリルアミドゲル、コラーゲン又はゼラチンゲル、マトリゲル、ヒアルロン酸ゲル、アルギン酸ゲル、ポリエチレングリコールゲル、メチルセルロース、又は他の変性セルロースベースのゲル、アクリラートゲル、ポリグリコールゲル及びプロピレングリコールゲルである。
【００４９】
さらに、下側媒質層１２は、媒質やバッファに浸される多孔性固体マトリクスにより形成することができる。
固体マトリクスは多孔性であり、望ましくは親水性とし、下側媒質層１２の導電性が維持される。
固体マトリクスは、シリコン、樹脂類、グラスファイバー、ポリメタクリレート、シリケイト、変性セルロース、ポリビニル、ポリリジン、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド及び共重合体などの材料により作ることができる。
下側媒質層１２を形成するある材料は、液体と半固体の間、又は、半固体と固体の間、又は、液体と固体の間の物理状態となる。
このような下側媒質層１２の物理状態は、安定的なインタフェースが上側媒質層１３と下側媒質層１２の間に形成され、維持される限り、電気穿孔に影響を及ぼさない。導入される対象分子は上側媒質層１３、又は、下側媒質層１２、或いは両方にあってもよい。
【００５０】
半固体、又は、固体である下側媒質層１２は、サンプル容器１０の中で予め形成されることができる。例えば、ＲＰＭＩ媒質のような、適切な媒質中のアガロースゲルは、下側媒質層１２を形成することができ、サンプル容器１０の中において予め形成させることができる。下側媒質層を予め形成するために、凝固する又はゲルになることができる液体が使用される、或いは、下側媒質層が所定の寸法で作製され、サンプル容器に設置される。
【００５１】
通常、二つの媒質層、上側媒質層１３及び下側媒質層１２は、電気穿孔のための細胞単層１１を形成するのに十分である。
しかし、ある実施例において、細胞が存在するための少なくとも一つの媒質インタフェースがある限り、二つ以上の導電性媒質層を使用することができる。
異なる断面積のサンプル容器を用いて異なるサイズのインタフェースを形成することができ、これにより、異なる数の細胞に対応することができる。
【００５２】
図１Ｃは、開示される実施例に対応する例示的なサンプル容器を示す図である。
図１Ｃに示されるように、細胞単層１１は電極１５ｂ上に直接形成される。
単層１１を形成するために、媒質やバッファの細胞の数が適切な細胞懸濁液が、サンプル容器中に放置される。
細胞は、単層１１を形成するために、自然な重力、又は遠心分離法で電極１５ｂに沈降する。このことは、必要とされる電界強度が低い時、及び／又は、細胞が有害物を許容できる場合には、適切なものとなる。
【００５３】
ほとんどの真核細胞の電気穿孔に関し、通常、両媒質層１２，１３を形成する媒質、又はバッファは、適当な浸透圧を維持するために塩類を含有する。
また、媒質、又はバッファ中の塩類は、媒質層１２，１３を導電させる。
バクテリアなどの非常に小さな原核細胞の電気穿孔には、時に水が低導電性媒質として使用され、極めて高い電界強度を許容する。
このような場合、導入される荷電分子は、水をベースとする媒質について、液体ベースの細胞膜よりもさらに導電性を与えることができ、特に細胞膜と比較すると、水をベースとする媒質は大まかにいって導電性があると考えられる。
【００５４】
単層１１を形成するために使用される細胞数は、単層１１が配置される表面の領域、及び平均サイズの細胞に占有される領域により決定される。使用される細胞濃度は、周知分野の別の透明容器中での顕微鏡を用いた単層１１に対する観測や、電気抵抗測定、或いは異なる細胞数の場合の電気穿孔効率の試験により、経験的に決定される。バッファ中の細胞濃度は、血球計、画像ベース又は流量ベースの計算機などの計数装置により、決定されることができる。平均占有面積や、好ましい電界強度などの細胞によって異なる特性は、容易に参照できるようにデータベースに保存することができる。異なるインタフェース領域のサンプル容器は、異なる細胞数に対応するために作ることができる。
【００５５】
２つ、又はそれ以上の細胞単層は、媒質インタフェース上で緻密に積み重ねることができ、得られた細胞ペレットはなおも電気穿孔することができる。この状況の電気穿孔では、細胞間分子輸送の変化が増加し、細胞が二重層である場合を除き、より不均一になる。二重の細胞単層において、交流パルシングスキームが使用される際には、各細胞単層は、依然として極めて均一な電気穿孔が可能である。本発明で使用されるペレットは、一つよりも多く、且つ緻密に詰め込まれた層を形成する細胞群を指す。ペレット中の細胞は、識別可能の層を形成してもよく、しなくてもよい。
【００５６】
複数細胞単層、或いは、細胞ペレットとも称されるが、これは、極めて大量の細胞が必要とされ、且つ細胞間分子輸送の変化が大きな問題とならない場合に好適に用いられる。複数細胞単層の電気穿孔は、細胞単層の電気穿孔方法の特別な形式、又は拡張であるといえる。細胞懸濁液がある従来の電気穿孔と比べて、複数細胞単層の電気穿孔方法は、依然として効率、細胞の生存可能性、及びコスト性において有効である。細胞単層に対する電気穿孔の方法と装置は、複数細胞単層或いはペレットに対しすべて適用可能である。
【００５７】
細胞単層の電気穿孔方法では、必要とする全体的な電界強度は実質的に減少する。図５は、細胞単層１１を通って流れる電流の分布を示す。図５において、細胞単層周辺の電流の三次元分布は、簡易化された二次元表示により示される。
【００５８】
細胞が絶縁体と同様であるため、緻密な細胞単層１１を通過する大部分の電流は、細胞間の隙間を通過する。細胞間の隙間内の電流場強度だけは、従来の懸濁液中の電気穿孔に必要な電流場強度と同等である。その他の位置では、電流が拡散され非常に低いレベルになる。
【００５９】
細胞単層１１のすぐ外側では、電流密度又は電界強度が非常に低いレベルに分散され、その結果、細胞の局所表面の近くでは拡散された低電界（Ｌ−Ｆ）の領域が作り出される。（Ｌ−Ｆ）領域では、単層が緻密であり、且つ隙間が比較的小さければ、細胞のサイズや隙間サイズのバリエーションに関わらず、電位変化は非常に小さくなる。
影が付された部分は、特定の電流方向における陰性荷電分子の有効電気穿孔表面を表す。
【００６０】
隙間のスペースが小さいと、細胞の生存に有利になり、また、より強い電流の小領域での効果が素早くに消散する。細胞間の隙間は、不規則な形状を有するため、隙間の幅や領域は一定でない。
隙間の幅はおよそ、有効電気穿孔表面の下の電流パスの平均幅として定義され得る。
【００６１】
例えば、単層１１中で細胞がスペースの８０％を占有し、細胞間の総隙間スペースが約２０％残る場合に、全電流は、同じ容器中におけるこれらの細胞の懸濁液に対し同様の経膜電位を生成するために必要な電流の約２０％となる。
単層１１の抵抗は、約５つの細胞の媒質深度（２０％の逆数が５である）であり、それに、これは通常の電極間距離と比べて小さいので、電気抵抗の全体的な増加は少なくなる。
これは、従来の同様の容器での電気穿孔と比較すると、必要な電圧が約２０％であり、また、必要なパワーは約４％（２０％×２０％）だけになることを意味する。
この簡易計算によれば、同様の電気穿孔を達成するためには、細胞単層が懸濁液中の細胞よりも、かなり低い電気エネルギーを必要とすることが示される。
【００６２】
本開示に使用される用語「緻密」は、細胞が単層領域を占有する程度のことをいう。用語「緻密度」は、細胞単層領域において細胞が占有する割合のことをいう。
単層１１について使用される合理的な最小の緻密度は、横方向の増強効果を利用するために約５０％とすることができる。
層の緻密度が増加するのに従って、横方向の増強効果はより顕著になり、有利になる。
特定の重力や遠心力では、単層内にそれ以上の細胞を含ませることができなくなったときに、完全な緻密度に達することになる。
緻密度が完全となった状況は、細胞の間のトータルの空間は小さくなるが、完全になくなるわけではない。
細胞が緻密に配置される場合では、細胞は可塑性を有するため、円形や球状には見えない。
単層の完全な緻密度を簡易に検査する際には、細胞の小部分が互いの上部に重なり、多少の望まれない縦方向のシールド効果を発揮するため、電気穿孔の効率は僅かに低下することになる。
【００６３】
懸濁液中の遊離の単一細胞と比べると、緻密な単層１１中の各細胞は、より大きな有効表面を有することになる。
有効表面の経膜電位は、遊離の単一細胞のように、局所点から急に落下することがない。
従来の懸濁液中の電気穿孔では、細胞は、経膜電位及び有効な輸送表面積の両方が不均一であった。
しかし、多様なサイズの細胞は、緻密な単層では、同様の経膜電位を有することになる。
これは、単層の両側付近での全電流が小さく、電位が単層のすぐ外側における電位が実質的に等しいためである。
単層１１中の小細胞は、より小さな有効な輸送表面のみを有することになるが、大細胞と比較すると、ほとんど等しい経膜電位を有することになる。
【００６４】
細胞単層による電気穿孔を利用することで、各細胞に導入される対象分子の量のバラつきはより少なくなる。
例えば、細胞直径の１０％のバラつきは、従来の電気穿孔では、物質の導入において１０倍よりも大きなバラつきが生じることになる。
これに対し、緻密な細胞単層の電気穿孔では、物質の導入におけるバラつきは、約１０％だけとなる。
【００６５】
局所表面上では電位分布はよりフラットであるため、従来方法における同様のパルシングスキームと比べて、使用電圧範囲（百分率％）はより拡大する。
【００６６】
単層電気穿孔ではより低電圧が使用されるため、電流や電極に関連する多くの細胞有害物が減少することになる。電極１５ｂの上に直接に緻密な単層１１を配置することは、比較的簡単であり、特定のバッファにおいて非常に小さな電界強度を必要とする細胞や、有害物を許容できる細胞にとっては好適である。
細胞を電極１５ａ，１５ｂから物理的に離れることは、電気化学的に有害な物質が細胞に導入されるのを避けるために非常に有効な方法であるため、導電性媒質層１２，１３の間にインタフェースを使用することは有効である。
導電性媒質やバッファは、溶質イオンで導電することができ、これは自由電子で導電する典型的な電極とはまったく異なる。
【００６７】
また、単層電気穿孔では低電力が使用されるため、単層ベースの電気穿孔方法においてパルス発生器１８を製造することは、従来の電気穿孔方法においてパルス発生器を作ること場合と比較してより簡単である。
出力電力がより低い時において、異なるパルスフォームを生成することはより簡単である。
あるタイプの基本パルスフォームは指数関数的な減衰波であり、通常、帯電したコンデンサをサンプルに対し放電することにより作られる。
指数関数的な減衰波は、インダクタとサンプルをリンクさせることでより緩慢に形成することができ、初期のピーク電流を減衰させることができる。基本パルスフォームの別のタイプは、方形波や矩形波である。
必要であれば、高周波などの他の波形も容易に生成することができる。
シーケンスにおいて、単一又は複数の波形をサンプルに適用することができる。
【００６８】
特定のシーケンスにおいて複数の波形が使用される場合には、波形は同一方向（直流）、又は異なる方向（交流）とすることができる。
交流を用いることは、分子導入において細胞の一側の局所表面にのみ有効ではなく、細胞の両側の局所表面に対して有効となる。
特に、複数細胞単層（ペレット）に詰め込まれる細胞の電気穿孔には、交流パルシングスキームは、図４の説明で説明されるように、縦方向のシールド効果を軽減することができる。
パルス発生器はディジタルやアナログパネルにより制御することができる。
さらに、パルス発生器は、再充電可能バッテリ、又はコンデンサなどのエネルギー貯蔵装置を含むことができる。その結果、ユニットを電力線から取り外すことができ、必要であればコードレスにすることができる。
【００６９】
単層方法は異なるサイズの細胞に有益である。
小サイズの細胞は、従来の電気穿孔では、高い電界強度を要求するため、より有利である。
単層方法は、造血細胞系、リンパ球細胞系、血液由来細胞などの懸濁液で通常成長する細胞への適用について便利である。
【００７０】
通常、何らかの支持物質や構造の上で成長する付着性細胞は、電気穿孔を実施するために一時的に懸濁される。
付着性細胞は、機械的分散、又はトリプシン処理などの一般的な手段により、支持物質から取り除くことができる。
さらに、付着性細胞は、適切な媒質やバッファに懸濁されて、電気穿孔のための単層を形成することができる。
【００７１】
また、付着性細胞は、サンプル容器１０中の両媒質層１２，１３間のインタフェースで培養することができる。
サンプル容器１０中で培養される付着性細胞は、電気穿孔を直接行うことができる。
しかしながら、いくつかの理由によりそのような電気穿孔の品質を制御することは、より困難なものとなる。
第一に、付着性細胞の細胞表面領域の変化は、懸濁細胞よりもかなり大きく、細胞の電気的性質のバラつきが大きいことがある。
第二に、付着性細胞が一律に単層１１をカバーすることが困難ということがある。細胞はある空き領域は存在せず、ある密集領域では重なって存在することもある。空き領域に近い細胞には、電気的な有害性が増加しやすい。密集領域では、ある細胞が他の細胞の上に重なるため、電気穿孔効率が低下することになる。
第３に、電気穿孔は、細胞の成長過程ではなく、十分に成長した特定の時点においてにも電気穿孔は実行される、ということである。このため、電気穿孔を実行する時間は制限されている。
第４に、細胞の培養に必要な時間はサンプルのバラつきを増加させるため、結果の再現性の精度がより低下するということである。
【００７２】
細胞数が少なければ、適切な直径の模擬細胞の人工の絶縁性粒子、或いは人工細胞を、総細胞数を増やすために使用することができる。
図６は、少数の細胞の電気穿孔における人工の絶縁性粒子の使用を示す。
絶縁性粒子１６（影で示される）は、実際の細胞１７（白丸）と任意に混合される。
混合される細胞単層１１は、両導電性媒質層１２，１３のインタフェース上に形成される。
媒質と細胞は絶縁性チャンバ１４内に入れられ、電極１５ａ，１５ｂの間に電気パルスが輸送される。
【００７３】
絶縁性粒子１６は、緻密な単層１１を形成することを助け、実際の細胞１７と同じように、電流フローを制限することができる。
使用される絶縁性粒子１６の数が細胞１７の数を大きく超える場合には、細胞１７の正確な数は重要ではなくなり、同じ数の絶縁性粒子１６を異なる数の細胞１７を含むサンプルと一緒に使用することで、実験の操作を容易にすることができる。
【００７４】
絶縁性粒子１６のサイズは細胞１７と同様であってもよい。絶縁性粒子１６と細胞１７の平均直径差は１０倍以内であることが好ましい。
【００７５】
絶縁性粒子１６は、ある特定の生物特性の材料により作られ、又はコーティングされることができるため、電気穿孔後に細胞１７と分離される。また、絶縁性粒子１６は磁性材料により、作製することができ、磁気的方法で分離することもできる。絶縁性粒子１６を細胞１７から分離する他の方法としては、沈降の速度差、又は密度差を利用するものがある。ある実施例では、人工の絶縁性粒子１６は他のタイプの実際の細胞とすることができ、例えば、電気穿孔後に簡単に分離できる細胞、或いは成長を停止させる照射又は薬品処理により生存が停止され、或いは、成長が停止した細胞などとすることができる。
【００７６】
図１Ａに示されるサンプル容器１０は、本発明の実施例に対応する一つの容器の例である。他のタイプのサンプル容器も使用することができる。
【００７７】
図７は、本発明の実施例に対応するサンプル容器２０の例を示す図である。
サンプル容器２０は、固定電極２５、封止カバーとして機能する可動電極２６、円柱形絶縁性チャンバ２１、漏液受溝２４を有する。
【００７８】
チャンバ２１の底端には、電極２５を固定する開口溝があり、チャンバ壁の頂部には、可動電極２６を受ける別の開口溝がある。
電極２５の直径は、絶縁性チャンバ２１の底端の溝の直径より少し大きく、絶縁性チャンバ２１の底端に発生する張力により、電極２５を密に取り付けることができる。
或いは、容器の底端を封止するために、接着剤又は他の適切な方法により、電極２５を絶縁性チャンバ２１に固定することができる。
【００７９】
可動電極２６は、弾性接続部材２３を介して、メイン絶縁性チャンバ２１に接続される開口絶縁性カバー２２に埋め込まれる。
カバー２２は、メイン絶縁性チャンバ２１のチャンバ壁における頂部の溝にタイトに嵌合され、これにより、電極２６はメイン絶縁性チャンバ２１の内縁をカバーし、サンプルを封止する。細胞単層１１を含む媒質層１２，１３を空気泡がない状態で確実に封止するために、添加される細胞懸濁液の量を密封容器２０の許容量より少し多くすることにより、少量の余剰な液体を存在させ、完全な封止を実現させる。電極カバー２６を閉鎖するで押し出される余剰な液体は、メイン絶縁性チャンバ２１のチャンバ壁の頂部に蝕刻された漏液受溝２４に流出させることができる。電気穿孔後、余剰の液体中の細胞は、電気穿孔されないため廃棄してもよい。
【００８０】
空気泡なしで容器中のサンプルを封止することは優れた方法であるが、単層１１又は複数細胞単層における細胞の電気穿孔において、実際には若干の小空気泡は許容できる。媒質中の全体的な電界強度が極めて低いため、電極２６に近い空気泡による電界の妨害は、媒質のインタフェース上の細胞に近い電界にわずかな影響を与えることになる。従来の開口キュベットと比較すると、密封容器は、電極の近くで発生した空気泡が圧縮され、細胞サンプルに及ぼす害は少ないため、有利なものとなる。一般に、密封容器とは、開口側がなくサンプルが封入され、容器を異なる方向に回転しても中の液体サンプルが流れ出ない容器のことをいう。
【００８１】
円柱形チャンバの製造は比較的容易であり、密封接着剤を使用しなくても円形の電極板を容易に確実に嵌合されることができる。円柱形容器２０は変更や、更なる特徴を有することができる。容器２０の内側スペースは円柱形であるため、容器内側の形状が維持される限り、容器の外部は他の形状であってもよい。円柱形容器２０は異なる寸法で作ることができる。１つの実施例として、電極２５，２６の間の距離は、１ｍｍから５０ｍｍの間とすることができる。別の実施例において、電極２５，２６の間の距離は、１ｍｍから３０ｍｍの間とすることができる。メイン絶縁性チャンバ２１の内径は、１ｍｍと１００ｍｍの間とすることができる。
【００８２】
円柱形容器は製造及び使用に便利であるが、媒質インタフェース、又は電極２５の上に細胞が単層を形成することができる限り、単層電気穿孔のために、容器２０は適切な形状を使用してもよい。例えば、矩形容器、又は他の形状の容器が適切であろう。矩形容器においてスナップクロージング機構や他のクロージング機構を使用することができる。
【００８３】
図７に示されるように、電極２６を含む封止カバーは絶縁性カバー２２により被覆される。また、他のタイプの封止カバーを使用してもよい。例えば、封止カバーは、スナップ、又はネジクロージング機構を有する適切に形成された導電性電極２６とすることができる。
【００８４】
絶縁性カバー２２は、サンプル容器２０を閉じるためにスナップされることができる。ロック構造は、密な閉止を保証するために使用できる。他の手段、例えば、ネジタイプのクロージング機構を使用できる。例えば、ねじ山は密な閉止を実現するために、開口絶縁性カバー２２、及びメイン絶縁性チャンバ２１上に設け作ることができる。図７に示すように、カバー２２はメインチャンバ２１の内縁に堅固に固定され、又はメインチャンバ２１の外縁に固定されることができる。このほか必要に応じ、弾性接続部材２３を、カバー２２を利用し易いように設けてもよい。
【００８５】
例示的なサンプル容器２０の各構成物品には、便利に取り扱うために、標識、又はハンドルが設けることができる。絶縁性チャンバ２１は絶縁性チャンバ１４と同様の材料で作ることができる。電極２５，２６は、電極１５ａ，１５ｂと、同様の材料で作ることができる。
【００８６】
本発明は開放した形態のサンプル容器を用いることも想定される。
図８は、本発明の実施例に対応する例示的なサンプル容器３０を示す図である。図８に示すように、サンプル容器３０は絶縁性チャンバ３４、下部電極３５、整合金属コネクタ３７付きのメッシュ型電極３６、封止カバー３９を有する。
【００８７】
図８に示すように、下側媒質層１２と上側媒質層１３の間のインタフェースには、細胞は単層１１、又は複数の単層を形成する。媒質と細胞は容器３０の絶縁性チャンバ３４に配置される。下部電極３５は、絶縁性チャンバ３４底端の溝に固定される。容器３０は矩形などの、あらゆる適当な形状とすることができる。容器は複数のサンプルを処理するために、列をなすように配置することができる。
【００８８】
整合金属コネクタ３７付きのメッシュ型電極３６は、絶縁性チャンバ３４チャンバ壁の頂部の溝に挿入される。メッシュ電極３６は細胞を自由に通過させ、細胞の電気穿孔のために上側媒質層１３に浸漬される。メッシュ電極３６は、細胞懸濁液の添加前に、あるいは添加後に挿入することができる。また、メッシュ電極３６は、容器３０に固定され、あるいは取外し可能な形で容器３０に取り付ることができる。メッシュ電極３６は、容器３０に適するように容器３０と同じ形状とされる。例えば、容器３０が矩形である場合には、メッシュ電極３６は矩形となる。
【００８９】
必要であれば、開放した形態の容器３０は、頂部の封止カバー３９によりさらに保護されることができる。封止カバー３９は、プラスチックで作ることができる。細胞は、メッシュ電極３６を取り除いた後、或いはメッシュ電極３６の存在下のいずれかにおいて容器から取り出すことができる。
【００９０】
絶縁性チャンバ３４は、絶縁性チャンバ１１と同様の材料で作ることができる。電極３５、３６とコネクタ３７は、電極１５ａ，１５ｂと、同様な材料で作ることができる。また、本発明は固定電極、及び、別の付加的なカバーがあるサンプル容器が想定される。図９Ａは、本発明の実施例に対応する例示的なサンプル容器４０を示す図である。図９Ａに示されるように、容器４０は絶縁性チャンバ４４、第一固定電極４５ａ、第二固定電極４５ｂ、及び容器４０内の予め形成された半固体、又は、浸される固体の下側媒質層１２を有する。
【００９１】
絶縁性チャンバ４４は絶縁性チャンバ１４と同様の材料で作ることができる。電極４５ａと４５ｂは、電極１５ａ，１５ｂと、同様な材料で作ることができる。
【００９２】
図９Ａに示すように、容器は垂直に置かれる、即ち、媒質インタフェースを垂直にするようにして、細胞懸濁液を下側媒質層１２と第一電極４５ａの間の隙間を埋めるように注ぐ。次いで、容器４０を直ちに水平に変化させると、媒質インタフェースが水平となり、細胞により、下側媒質層１２と上側媒質層１３の間のインタフェースに定着する単層１１が形成される。細胞懸濁液は液体の自然な表面張力により開放された容器４０中に閉じこめられ、細胞は強い遠心力によらず、重力によって沈降することができる。
【００９３】
図９Ｂは、可動式の絶縁性カバーを有する容器４０を示す。絶縁性カバー４８は、容器４０中の下側媒質層１２と上側媒質層１３の開口側を封止する。固定電極、及び可動式の絶縁性カバーを有する容器４０は、遠心力が加えられる時に有用である。本発明において、可動式のカバーは、カバーとして機能する可動電極、或いはサンプル容器の絶縁性チャンバの可動部分のことをいう。
【００９４】
細胞を緻密な単層とするために、望ましくは、適切な数の細胞を含む細胞懸濁液が下側媒質層１２の頂部に置かれる。細胞は、自然な重力、又は人工の遠心力により、下側媒質層１２と上側媒質層１３の間のインタフェースに定着する。なお、高濃度の下側媒質を細胞懸濁液に加えてもよい。
下側媒質層１２、上側媒質層１３、及び細胞単層１１は、自然な重力、又は人工の遠心力により、形成されることができる。
細胞を自然な重力によりインタフェースに沈殿させることは、簡単で、低コストである。
一方、人工の遠心力は重力より強いため、細胞単層、又は複数細胞単層ペレットをより早く、より緻密に形成することができる。
【００９５】
図１０は、緻密な細胞単層、又は細胞のペレットを作るための遠心分離法の使用について示す。両電極１５ａ、１５ｂ及び絶縁性チャンバ１４を有する例示的なサンプル容器１０は、両媒質層１２、１３及び細胞単層１１を保持するために使用することができる。
一つ、又は一つ以上のサンプル容器１０は、適切なバランスで一つのローターに設置される。容器２０、３０、又は４０などの他の例示的なサンプル容器も、同様に遠心分離法において使用され得る。
【００９６】
本発明の実施例に対応する例示的な遠心分離機５０が図１０に示される。
遠心分離機５０は、第一金属支持体５５、第二金属片５６、回転軸線５８、電気ブラシ５９ａ，５９ｂ、及び適切なローター内配線を有する。
図１０に示される破線は、各実験で電気穿孔されるサンプルの数、及び配線の代替的な方法の選択を配慮し、実際の配線における柔軟性を反映するものである。
図１０に示される複数のサンプル容器は、ローター中の複数のサンプル容器、或いは移動中のサンプル容器を表す。
電気パルス発生器５４は、所定のパルスを生成し、パルスをサンプル容器に輸送する。パルス発生器５４は、固定ユニット、又は、ローターとともに回転し、回転中にパルスを生成するローター内の回路で構成することができる。
【００９７】
第一金属支持体５５は、容器をローター内に保持しつつ、下部電極１５ｂと電気的に接触される。
第二金属片５６は、電気的中な接触を作るために、遠心力により上部電極１５ａに押し付けられる。
金属片５５、５６とサンプル容器１０が接触するところの二つの接点は、回転軸線５８上の電気ブラシ５９ａ，５９ｂを介して、グループとして又は、単一のものとして、回転軸線５８に配線されることができる。
ローター内回路５４が使用される際には、金属片５５、５６はローター内回路５４に配線されることができる。その結果、二つの金属片５５及び５６は、導体として機能し、電気パルスをサンプル容器１０に輸送する。
【００９８】
遠心分離機５０は、スイングバケット遠心分離機、又は固定ローター遠心分離機である。遠心分離がされる際に、媒質インタフェース、又は細胞単層１０は、回転アーム、又は、矢印５７で示される遠心力の方向に対し、実質的に垂直である。
電気穿孔容器中において媒質インタフェースを回転アームにほぼ垂直な配置させる自動調整スイングバケットローター、又は固定角ローター内において、適切な角度は容易に実現できる。
固定角ローターの回転軸線５８は垂直、又は水平のいずれかである。回転軸線５８が水平な場合には、媒質インタフェースは、回転アームに実質的に垂直である必要がある。
【００９９】
遠心力は、回転半径及び角速度の二乗に比例する。
数センチメートルないしは数デシメートルの代表的な回転半径の場合、ほとんどの真核細胞が細胞単層を形成するために、数百ｒｐｍ（回転／分）ないしは数千ｒｐｍの回転速度で十分である。また、他のｒｐｍ数も使用され得る。
バクテリアなどの小原核細胞では、数千ｒｐｍの回転速度が必要となる。。
遠心分離に必要な時間は数秒ないし数分である。また、他の時間も使用され得る。
細胞が容器中の媒質インタフェースにおいて側方へ移動しないように、回転の加速を緩やかにすることができる。
媒質インタフェースを垂直に配置する固定角ローターの場合では、懸濁液中の細胞が、細胞分布における不均一性の原因になる片側への沈積を消磁させないように、回転を速やかに開始させる必要がある。
【０１００】
図１０に示すように、遠心分離の際に、金属片５５，５６は回転軸線５８に配線され、細胞単層１１上の細胞を電気穿孔するために、電気パルスが提供される。
【０１０１】
細胞が単層１１、又は複数細胞単層ペレットに移動した後に、電気パルスを輸送されることができる。
遠心分離機５０が使用される場合では、遠心分離後又は遠心分離中に、電気パルスは輸送されることができる。
遠心分離後にパルスを輸送するために、ローター内電気配線がない普通の実験遠心分離機は、ローター内で電気穿孔容器を保持するに、適当なアダプターと共に使用されることができる。
ただし、サンプル容器１０は、パルシング前に細胞単層１０又はペレットが乱れるのを避けるために、遠心分離機５０から非常に慎重に取り出される必要がある。
他方、遠心分離中に電気パルスを輸送する場合は、パルシング条件がより信頼できるという利点がある。
【０１０２】
電気パルスの輸送後に、細胞はサンプル容器１０から取り出ことができる、或いは、電気穿孔の媒質が細胞を維持するのに適している場合には、容器１０に残ることができる。遠心分離機とパルス発生器を１台のマシンに統合することができ、これにより、容易な持ち運びが可能となり、コントロールが便利になる。
【０１０３】
カーボンブラシ、又は電気ブラシ５９ａ，５９ｂは、固定パルス発生器５４でパルス発生器から遠心分離ローターのサンプルまで、電気パルスを供給するために使用することができる。
別の法として、サンプルのための最終的な電気パルスは、電気ブラシ５９ａ，５９ｂからのあらゆる信号ノイズを避けるために、ローター内回路５４にて生成することができる。
回転軸線５８の近くのローター内回路５４は、強い遠心力を受けないように構成することができる。
ローター内回路５４が使用される場合、電気ブラシ５９ａ，５９ｂは、電気エネルギー及び制御命令を受けるのに使用されるが、これらは最終的なパルス輸送ループに存在しない。
コンタクトレスの電力輸送は、磁気エネルギーの転移を用いて実現でき、この方法は電気ブラシ５９ａ，５９ｂからの信号ノイズを避けるために利用できる。
ローター内回路５４が使用される場合には、無線の電波信号は、ローター内のパルシングを制御するために使用することができる。
【０１０４】
図１１Ａは、本実施例に対応する例示的な容器６０を示す。
図１１Ａに示されるように、下部電極６５は、絶縁性チャンバ６１に封入される。絶縁金属線６７は下部電極６５に接続される。開口カバー６２により被覆される上部電極６６は、メイン絶縁性チャンバ６１の上を閉じ、両媒質層１２、１３及び細胞単層１１を封止する。カバー６２は接続部材６３により、主絶縁性チャンバと連結される。
溝６４がメイン絶縁性チャンバの中に形成されることができ、あらゆる余剰のサンプルを保持できる。電極６６，６７の間で電気パルスが輸送される。このような構成は、遠心分離の際にサンプル漏れを防止するのに有効である。
【０１０５】
図１１Ｂは例示の容器６０の他の構成を示す。
絶縁性チャンバ６１は、開放底を有するように変更され、支持構造及び電気コネクタとして機能する拡大された下部電極６５に設置される。
上部電極６６は、絶縁性チャンバ６１に取り付けられ、絶縁性チャンバ６１により、電極６５と電気的に絶縁される。
容器６０のこのような代替形状も、遠心分離中のサンプル漏れを防止するのに有効である。
【０１０６】
理論上、ローター内の平坦な媒質インタフェースは、回転半径が異なるため、少し不均一な遠心力を生成する。
遠心分離の時間が長大でなければ、これは重要な影響をもたらすことがない。より長い回転アームを用いることや、側方への細胞移動を減少するための媒質インタフェースを用い遠心分離前に休止時間を設けることで、実質的に均一な細胞分布を実現できる。
曲線状電極を有するサンプル容器は作ることができる。
曲線状媒質インタフェースは、全てのポイントにおいて等しい回転半径がある容器中に形成され得る。
自らの軸を中心として回転するフルサークル円柱形媒質インタフェースがある容器は、全てのインタフェースポイントにおいて、理想的に等しい回転半径を提供し、また、側方への細胞移動の問題がなく、あらゆる加速設定を使用することができる。
【０１０７】
図１２Ａは、本発明に対応する例示的な容器７０を示す。
容器７０は、細胞サンプルの電気穿孔のために、内部空間を密封する一つの曲線状絶縁体本体と二つの曲線状電極を有するリング状の形を想定することができる。
両電極７５，７６の間の円柱形表面に、細胞単層１１は配置され得る。
図１２Ａは、重心軸に垂直な容器７０の断面図である。
容器７０が自らの重心軸に沿って、遠心分離機で回転する際に、単層１１の細胞は、等しく外側への遠心力を受けることができる。
遠心分離の過程において、単層１１の細胞は、遠心分離機の加速が終了し、単層が形成された後に、支持表面において安定状態が維持される。
図１２Ｂはリングを切断する断面における容器７０の別の図である。絶縁性チャンバ７１及び両電極７５，７６により容器７０の本体が形成される。
【０１０８】
細胞単層１１は、遠心力の下で、外部電極７５の表面に直接に配置されることができる。
あるいは、導電性媒質層１２は、細胞単層１１が直接電極に接触することを防止するために使用できる。
遠心分離前に、細胞は媒質１３でまず懸濁されることができる。
図１０で説明される遠心分離機５０のような適切なローター内配線を有する構造は、遠心分離の際に、電気穿孔を実行するために使用できる。
ローター内配線及び電気ブラシにより、電極７５，７６はパルス発生器に接続できる。
適切な収納絶縁性チャンバを備える容器７０のリングセグメントも、使用することができる。
あるいは、曲線状電極、及び／又は、曲線状媒質表面は、容器１０、２０、３０、４０又は６０などの容器のために使用され得る。
本発明において、電極の表面、又は、導電性媒質層は平坦であってもよく、平坦ではなくてもよい。
【０１０９】
さらに、本発明は電気細胞融合に使用することができる。
電気細胞融合が電気穿孔の目的である場合、およそ２つの細胞単層を有する二重単層構成は、例示的なサンプル容器１０、２０、３０、４０、６０又は７０などの、電気穿孔のために使用されるサンプル容器と同様のサンプル容器において使用することができる。
望ましくは、各層は一種の細胞を含む。ただし、二種の細胞を混合することも、融合の効率が低が許容され得る。
【０１１０】
二重単層は、沈降速度差を利用することにより、順次に又は同時に形成される。即ち、一種の細胞がまず沈降して、もう一種がその後に続く。
メッシュ型電極がある容器は、異なる細胞の二つの単層を作るのに便利である。
１番目の細胞懸濁液がメッシュ電極の表面にちょうど至るまで容器に加えられ、細胞は下側媒質インタフェースの表面に集まる。
そして、２番目の細胞懸濁液は、最初の細胞単層の上に均等に配置されるように、メッシュ電極の上に添加される。
２つの単層を順次形成する別方法は、インタフェースを形成できる二つの異なる媒質と、二つの細胞懸濁液を使用し、２番目の細胞懸濁液を一番目の細胞懸濁液が単層を形成した後に加える方法である。
【０１１１】
適当なバッファ中の二重単層は、細胞融合を促進するために、適切な電気パルスにより処理されることができる。
遠心分離の過程において、電気パルスが輸送される。電気細胞融合のでは細胞に導入される対象物質が存在しないため、反応剤を節約することは目的ではない。従って、細胞融合のためのサンプル容器は、異なる細胞の二つの単層を順次に作ることをより簡単にするために、両電極の間により大きい距離を有することができる。
さらに、二種の細胞単層は、遠心分離媒質を取り除く工程を繰り返すこと、及び、より多くの細胞懸濁液を加えることにより、電気細胞融合に三つ、又はそれ以上の細胞層がある細胞層が交互するサンドイッチを形成することができる。
【０１１２】
図１３は、本発明の実施例に対応する例示的な単層電気穿孔のプロセス２００を示す。
ます細胞が懸濁液に分散される（２０２）。
付着性細胞については、まず付着したものから離脱させ、懸濁液に分散させる。必要であれば、細胞は洗浄される。
また、細胞濃度は計数法により決定されることができる（２０４）。
次に、適切な数の細胞が単層、又は複数の単層を形成するために採取される。
次に、細胞懸濁液はサンプル容器に応じて、適切なボリュームに調整される（２０６）。
導入される対象物質は、サンプル容器に細胞懸濁液を入れる前に、細胞懸濁液に含ませることができる。
次いで、細胞懸濁液はサンプル容器中に入れられる（２０８）。
【０１１３】
細胞懸濁液をサンプル容器中に入れた後に、細胞単層は形成される（２１０）。
細胞単層を重力による自然な沈降により形成する場合には、サンプル容器はある程度の時間水平面に設置する必要がある。
単層を形成するための必要な時間は、経験的に決定され得る。
例えば、単層の生成は顕微鏡により観察することができる。
細胞単層を遠心分離法により形成する場合には、サンプル容器は遠心分離機に設置される。細胞単層の形成後に、細胞は電気パルスにより処理される（２１２）。
細胞単層の形成に遠心分離機が使用される場合には、電気パルス処理は、遠心分離後又は遠心分離中に実行され得る。
細胞の電気パルス処理後に、細胞はサンプル容器から取り出される（２１４）。
電気パルス処理が遠心分離中に行われる場合には、細胞の取り出し前に遠心分離機は停止される。
電気細胞融合については、二重の細胞単層を作る工程が追加され、バッファ及び電気パルスは、物質導入の目的に通常使用されるバッファ及び電気パルスと異なるものとしてもよい。
【０１１４】
また、本発明は細胞懸濁液中の電気穿孔にも適用可能である。
図１４Ａは、本発明の実施例に対応する例示的な細胞懸濁液の電気穿孔に使用できるサンプル容器８０を示す。
図１４Ａに示すように、容器８０は、円柱形絶縁性チャンバ８１、固定電極８５、封止カバーとしても機能する可動電極８６、開口絶縁性カバー８２、漏液受溝８４を有する。
絶縁性チャンバ８１は、底端に電極８５を固定する開口溝があり、箱８１のチャンバ壁の頂部に、可動電極８６を受ける別の開口溝がある。
電極８５の直径は、絶縁性チャンバ８１の底端にある溝の直径より少し大きいため、絶縁性チャンバ８１の底端に発生する多少の張力により、電極８５が締め付けられる。
あるいは、容器底端を封止する目的で電極８５を絶縁性チャンバ８１に固定するために、接着剤又は他の適切な方法で封止してもよい。
【０１１５】
可動電極８６は、弾性接続部材８３を介して、メイン絶縁性チャンバ８１に接続される開口絶縁性カバー８２に嵌め込むことができる。
カバー８２はメイン絶縁性チャンバ８１のチャンバ壁における頂部の溝に堅固に嵌合することができ、それにより、電極８６は、メイン絶縁性チャンバ８１中の内縁をカバーし、サンプルを封止できる。
細胞懸濁液８７を空気泡なしに確実に封止するため、完全な密封を確保するための少量の余剰な液体を生じさせるために、添加される細胞懸濁液の量は密封容器の許容量より少し多い。
電極カバー８６を閉鎖することにより、押し出された余剰の液体は、メイン絶縁性チャンバ８１のチャンバ壁の頂部に蝕刻される漏液受溝８４に流出させることができる。電気穿孔後、余剰の液体中の細胞は、電気穿孔されないため廃棄してもよい。
【０１１６】
空気泡なしで容器８０中の細胞懸濁液を封止することは優れた方法であるが、小さい空気泡が電極表面のとても小さな部分を占有する限りであれば、若干の小さな空気泡は実際には許容できる。
【０１１７】
また、縦方向のシールド効果と横方向の増強効果の理解は、懸濁液中の細胞の電気穿孔効率を改善するのに役立つ。
大型細胞については、有効な電気穿孔を実現するために低電界強度が必要とされ、隣接する細胞間の電気的な相互作用により引き起こされる細胞の不均一性は、電気穿孔効率に不利な影響をもたらす。
しかし、より一般的な小サイズの細胞では、有効な電気穿孔について高電界強度を必要とし、隣接する細胞間の電気的な相互作用により引き起こされる細胞の不均一性は、かえって細胞の電気穿孔に非常に有益なものとなる。
【０１１８】
小細胞について、懸濁液中の細胞濃度を高めることで、横方向の増強効果を高めることができる。同時に、縦方向のシールド効果も高められる。高められた縦方向のシールド効果は、高められた横方向の増強効果にとって、価値あるトレードオフとなり得る。縦方向のシールド効果は、交流パルシングスキームにより軽減できる。
【０１１９】
細胞懸濁液中の全細胞容積の好ましい割合は、異なるタイプの細胞間で変化し得る。約５％又は５％より大きい全細胞容積の割合は多くの細胞型に好ましい。
十分な細胞がない場合には、細胞単層において説明されたものと同様の人工の絶縁性粒子を使用できる。
【０１２０】
改善された細胞懸濁液の電気穿孔について、例示のサンプル容器８０、或いは細胞単層において説明されたものと同様の他のサンプル容器を使用できる。
細胞懸濁液の電気穿孔のために提供される容器８０は、電極８５，８６の間に一般により長い距離が確保されるため、電極のすぐ近くの細胞はより少なくなり、細胞への電気化学的な有害物を減少させる。電極８５，８６の間の距離は３ｍｍから１００ｍｍまでが好ましく、５ｍｍから５０ｍｍまでが更に好ましい。
【０１２１】
容器８０は円筒の形状とすることができる。容器８０の断面図直径は１ｍｍより大きくする。ある実施例では、容器８０の断面図直径を１〜２０ｍｍの範囲とすることができる。また、他の直径値も使用されることができる。容器８０は円筒形以外の形状でもよい。
【０１２２】
容器８０中の電極８６などの可動電極は、絶縁性チャンバの両端で使用することができ、特に、容器の内径が小さく、又は電極間の距離が非常に長い場合に使用できる。このような容器８０では、一つの可動電極のみ搭載するサンプル容器については不便である。
電極近くの細胞は重大な電気化学的な有害作用を受けるため、絶縁性チャンバ８１上に、害された細胞が取り除かれるべきであるといった指標をいくつか表記してもよい。
また、容器８０は、容器に細胞懸濁液のサンプルを連続して流入させて連続処理を可能にするサンプル注入システムに接続することもできる。
【０１２３】
容器８０は電極８５，８６の間に比較的に長い距離がある場合に、比較可能な電界強度を維持するのに高電圧が必要となる。
パルス発生器がより高い電圧を輸送することを要求する外観上の不利は、それほど問題とはならない。
【０１２４】
例えば、ヒト細胞株の懸濁液を電気穿孔するために、コンデンサから約１０００μＦ指数の放電がある４ｍｍ隙間キュベットにおける０．２ｍｌのサンプルについては、２００ボルトが必要とされる。
同じ０．２ｍｌの細胞懸濁液が２ｃｍの電極間隔がある長い容器に置かれる場合（キュベット隙間距離の５倍）、必要な電圧は１０００ボルトとなるが、コンデンサからの電気エネルギーが以下の方程式に従うため、４０μＦ（１０００μＦの１／２５）のコンデンサだけで足りる。
Ｅ＝０．５Ｕ２Ｃ
Ｅは電気エネルギーであり、Ｕは電圧であり、Ｃは容量である。
従って、高圧パルス発生器は、同様の量のエネルギーを蓄積するために、非常に小さなコンデンサで対応できるため、実際に容易に製造できる。
【０１２５】
同じく、高電圧の他の波形を作り出すことは困難ではない。
バクテリアなどの非常に小さい細胞は、水などの低導電性液体において、２０，０００Ｖ／ｃｍなどの高電界強度で電気穿孔される必要がある。
従来では、１ｍｍ、又は２ｍｍの短い電極間隔があるキュベットの中でバクテリアの電気穿孔は実行されるため、通常、３，０００Ｖ未満の電圧が必要とされる。
容器８０の中において、バクテリアなどの非常に小さい細胞を電気穿孔するためには、超高電圧を必要とする。
本発明で使用される超高電圧は、５，０００Ｖより高く、非常に小さい細胞の電気穿孔に通常使用される１０，０００Ｖから３０，０００Ｖまでの範囲にある電圧のことをいう。
数万ボルトを輸送可能なパルス発生器は、超高電圧の下ではエネルギーを蓄積するのに極めて低い容量が必要とされるため、製造が困難ではない。
パルス発生器は再充電可能バッテリ、又はコンデンサなどのエネルギー貯蔵装置を備えることができ、またコードレスとなって移動がより簡単になる。
【０１２６】
より長い電極間隔がある密封容器８０は、電気アークを効果的に防止できる。
従来のキュベットでは、不均一に分布されるイオン性溶質は、小さな電流の漏れ領域を形成し、二つの電極の付近で短絡を生じさせる。
より長い電極間隔を有する密封容器内では、小さな電流の漏れ領域が形成される場合でも、１つの電極と他の電極で短絡が発生しないように電極が離れている。
電極の近くで停滞する小空気泡がある場合でも、１つの電極から他の電極まで到達しないため、電気アークが引き起こされることがない。
従って、より長い密封容器８０は、電気アークの生成を抑えるのに有利である。
【０１２７】
より長い容器８０の別の利点は、高精度の容器８０を製造することがより容易であることである。
１ｍｍのキュベットの場合では５０μｍの距離の誤差が５％となるが、２ｃｍの長容器では０．２５％だけとなる。
【０１２８】
図１４Ｂは、本発明の実施例に対応する細胞懸濁液の電気穿孔のための、容器８０中の例示的な下側媒質層８８ａの使用について示すものである。
図１４Ｂに示されるように、下側媒質層８８ａは電極８５上に形成される。細胞懸濁液８７は、下側媒質層８８ａの上に入れられる。細胞懸濁液８７中の細胞はペレット８９の中に導入されるる。
【０１２９】
下側媒質層８８ａは、図１Ａの下側媒質層１２などの電気穿孔の単層方法に使用されたものと同様である。
下側媒質層８８ａは電極８５から細胞を物理的に離れさせる。
特に容器が細胞懸濁液の電気穿孔を意図するものである場合に、他の媒質層８８ｂも上部電極上で使用されるため、細胞懸濁液の両端は電極からの直接照射から保護される。
細胞懸濁液８７は直接にこの容器中で電気穿孔されることができ、あるいは、細胞濃度を高めるために、懸濁液中の細胞はペレット８９中に導入されることができる。
細胞懸濁液の電気穿孔のための容器８０は、電極８５，８６の間により長い距離を有することになるが、細胞ペレット８９の電気穿孔に用いられる容器８０は、電極８５，８６の間の距離をより短くすることができる。
自然な重力、又は遠心分離法により、ペレット８９を作ることができる。
遠心分離機が使用される場合、遠心分離後又は遠心分離中に、細胞ペレット８９のパルシングを行うことができ、これは、遠心分離機５０の単層及び複数単層電気穿孔に説明された方法と同様である。
ペレット８９は高効率及び細胞に低有害で電気穿孔することができ、懸濁液中の同じ細胞の電気穿孔に必要な電圧よりも低い。
パルス発生器は、エネルギー貯蔵装置を備えることができ、コードレスの移動に便利である。
パルス発生器、又は単層ベースの電気穿孔において説明されたパルスフォームの変化は、懸濁液やペレット中の細胞の電気穿孔にも適用され得る。
また、人工の絶縁性粒子は、細胞ペレットを作るために実際の細胞と共に使用することができる。
【０１３０】
本発明の有害電気穿孔の装置、及び方法により、高効率と低有害の電気穿孔が実現できる。
本発明による装置と方法は、他の方法と装置より利点を有する。
例えば、本開示による装置と方法では、細管式電気穿孔と比較して一定の利点がある。
【０１３１】
図１５は、例示的な細管補助の電気穿孔を示す。
図１５に示されるように、２０μｍの内径がある細管の中で電気穿孔が実施される。
二つの細胞、細胞Ａと細胞Ｂが、細管の中に配置される。
細胞Ａは１８μｍの直径を有し、細胞Ｂは１６μｍの直径を有する。
図１５に示されるように、細胞Ａと細管壁の間の最小距離は１μｍであり、細胞Ｂと細管壁の間の最小距離は２μｍである。
細管壁は絶縁体であるため、電流は細胞と細管壁の隙間隙間に制限される。
その全電流は細胞Ａと細胞Ｂの周りの隙間隙間を流れる。
【０１３２】
細胞Ｂの周りの隙間の断面領域は細胞Ａの周りの隙間の断面領域の二倍であるので、細胞Ｂの周りの隙間の電界強度は細胞Ａの周りの隙間の電界強度の半分となる。従って、Ａの直径はＢの直径より１／８（１２．５％）だけ大きいものの、隙間領域を超える細胞Ａの経膜電位は細胞Ｂの経膜電位の二倍（２００％）となる。細管においては、細胞Ａは、細管壁からの横方向の増強効果により有利になる。
しかし、Ｂについては、ほんのわずか小さいものの、Ｂを電気穿孔することは非常に困難である。
交流パルシングスキームによるとしても、細胞Ｂは細胞Ａの経膜電位の約半分となる。その結果、細胞Ｂは依然として有効に電気穿孔できない。
仮に、Ａの直径が１９μｍになり、且その隙間が０．５μｍになると、Ａの経膜電位はＢの約４００％になり、細管における電気穿孔効率において多大な細胞の不均一性をもたらすということが証明される。
【０１３３】
したがって、細管は細管壁からの横方向の増強効果を利用する場合に有効に用いられる。
小細管の場合には細胞の高い部分が細管壁のすぐ近くに位置付けられるため、内径がより小さい場合に細管はうまく機能する。
緻密な単層ベースの電気穿孔方法は、電気穿孔における細胞の不均一を減少させる。
これに対し、細管式の電気穿孔の方法は、電気穿孔における細胞の不均一性を強め、限界がある。
本発明で説明されるように、懸濁液やペレット中の濃縮細胞自身の横方向の増強効果を主として利用することは、電気穿孔効率及びコスト性の両方に有利である。
容器８０の他の構成などのサンプル容器は、直径又は断面領域を制限しない点において、細管と異なる。
所望の直径が使用して、大容量の細胞サンプルを容器８０にて処理することができる。
【０１３４】
様々な実施例、及び添付図面が開示され、説明されたが、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年10月29日(2015.10.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物細胞の電気穿孔装置であって、
電気穿孔に生物細胞のサンプルを収容するためのサンプル容器を有し、
前記サンプル容器は、
前記生物細胞を収容するための容器の本体を形成する絶縁性チャンバであって、複数の側面を有する絶縁性チャンバと、
第一電極と、
第二電極を有し、
前記絶縁性チャンバと前記第一、第二電極は前記細胞サンプルを収容するための密封箱を構成し、
前記絶縁性チャンバと前記第一、第二電極により、前記サンプル容器中の生物細胞のサンプルを封止可能となるように構成され、
前記第一電極と前記第二電極は、電気パルス発生器から電気パルスを受け、細胞を電気穿孔させるように構成される、
電気穿孔装置。
【請求項２】
前記第一電極は、前記絶縁性チャンバの頂部の溝に取り外し可能なカバーに構成され、
前記第一電極と前記絶縁性チャンバは、前記カバーが前記絶縁性チャンバの頂部の溝に取り付けられた際に、前記サンプル容器中に前記生物細胞のサンプルを封止する、
ことを特徴とする請求項１に記載の電気穿孔装置。
【請求項３】
前記第一、第二電極は、前記絶縁性チャンバに取り付けられ、
前記絶縁性チャンバの一つの側面が可動であり、前記絶縁性チャンバの頂部の溝に取り外し可能なカバーに構成されて可動式の封止の機能を有し、
前記第一、第二電極と前記絶縁性チャンバは、前記カバーが前記絶縁性チャンバの頂部の溝に取り付けられた際に、前記サンプル容器中に前記生物細胞のサンプルを封止する、
ことを特徴とする請求項１に記載の電気穿孔装置。
【請求項４】
前記カバーは、スナップクロージング機構、又は、ネジクロージング機構により、前記絶縁性チャンバの頂部の溝に対しタイトにフィットし、
前記電極と絶縁性チャンバによって、前記サンプル容器中に前記生物細胞のサンプルを封止することとする、
ことを特徴とする請求項２又は請求項３に記載の電気穿孔装置。
【請求項５】
前記絶縁性チャンバの頂部の溝は、前記カバーを前記頂部の溝に取り付けることで前記生物細胞のサンプルが満たされて漏れ出す余剰の液体を受け入れるための漏液受溝を有する、
ことを特徴とする請求項２乃至請求項４のいずれか一項に記載の電気穿孔装置。
【請求項６】
前記カバーと、前記絶縁性チャンバを接続するための弾性接続部材を有する、
ことを特徴とする請求項２乃至請求項５のいずれか一項に記載の電気穿孔装置。
【請求項７】
電気パルスを発生させるための超高電圧パルス発生器であって、５０００Ｖよりも高い超高電圧のパルスを生成可能に構成される超高電圧パルス発生器をさらに有する、
ことを特徴とする請求項１乃至請求項６のいずれか一項に記載の電気穿孔装置。
【請求項８】
前記超高電圧パルス発生器は、８０００Ｖよりも高い超高電圧のパルスを生成可能に構成される、
ことを特徴とする請求項７に記載の電気穿孔装置。
【請求項９】
前記超高電圧パルス発生器は、１００００Ｖよりも高い超高電圧のパルスを生成可能に構成される、
ことを特徴とする請求項８に記載の電気穿孔装置。
【請求項１０】
前記絶縁性チャンバは、
前記第一、第二電極のうちの一つと接触する第一の表面と、
前記第一、第二電極の間にインタフェースを形成する第二の表面と、
を有する第一導電性媒質層を形成するように構成され、
前記第一導電性媒質層は、少なくとも一つの細胞単層を前記インタフェース上に配置させるように構成され、前記細胞単層を前記第一、第二電極と分離させ、
前記第一導電性媒質層は、溶質イオンを含む溶液を含み、
前記インタフェースは導電性を有し、
前記電気パルスが、前記第一導電性媒質層の前記溶質イオンを通じて導電される、
ことを特徴とする請求項１乃至請求項６に記載の電気穿孔装置。
【請求項１１】
前記第一導電性媒質層は、
溶質イオン、
媒質イオンに浸される多孔性固体マトリクス、
又は、半固体と固体の間の物理状態の媒質イオンを含む導電性層、
にて構成される、
ことを特徴とする請求項１０に記載の電気穿孔装置。
【請求項１２】
前記第一導電性媒質層のインタフェース上において、生物細胞により少なくとも一つの前記細胞単層を形成することを促進するための遠心分離機をさらに有する、
ことを特徴とする請求項１０又は請求項１１に記載の電気穿孔装置。
【請求項１３】
遠心分離の際に、前記サンプル容器の生物細胞を電気穿孔するための電気パルスを生成するためのパルス発生器をさらに有する、
ことを特徴とする請求項１２に記載の電気穿孔装置。
【請求項１４】
電気穿孔される細胞に添加される複数の人工の絶縁性粒子であって、
前記生物細胞と前記絶縁性粒子からなる全体数を増加させるための人工の絶縁性粒子を、
さらに含む、
ことを特徴とする請求項１乃至請求項１３のいずれか一項に記載の電気穿孔装置。
【請求項１５】
生物細胞の電気穿孔方法であって、
電気穿孔される生物細胞のサンプルを収容するアンプル容器を準備するステップを含み、
前記サンプル容器は、
前記生物細胞を収容するための容器の本体を形成する絶縁性チャンバであって、複数の側面を有する絶縁性チャンバと、
第一電極と、
第二電極を有し、
前記絶縁性チャンバと前記第一、第二電極は前記細胞サンプルを収容するための密封箱を構成し、
前記絶縁性チャンバと前記第一、第二電極により、前記サンプル容器中の生物細胞のサンプルを封止可能となるように構成され、
前記第一電極と前記第二電極は、電気パルス発生器から電気パルスを受け、細胞を電気穿孔させるように構成される、
生物細胞の電気穿孔方法。
【請求項１６】
第一導電性媒質層を前記サンプル容器内に準備して配置するステップを含み、
前記第一導電性媒質層は、
前記第一、第二電極のうちの一つと接触する第一の表面と、
前記第一、第二電極の間にインタフェースを形成する第二の表面とを有し、
前記第一導電性媒質層は、少なくとも一つの細胞単層を前記インタフェース上に配置させるように構成され、前記細胞単層を前記第一、第二電極と分離させ、
前記第一導電性媒質層は、溶質イオンを含む溶液を含み、
前記インタフェースは導電性を有し、
前記電気パルスが、前記第一導電性媒質層の前記溶質イオンを通じて導電される、
ことを特徴とする請求項１５に記載の生物細胞の電気穿孔方法。
【請求項１７】
前記第一導電性媒質層のインタフェース上において、生物細胞により少なくとも一つの前記細胞単層を形成することを促進するための遠心分離を提供するステップを含む、
ことを特徴とする請求項１６に記載の生物細胞の電気穿孔方法。
【請求項１８】
遠心分離の際に、前記サンプル容器の生物細胞を電気穿孔するために、パルス発生器にて発生させる電気パルスを供給する、
ことを特徴とする請求項１７に記載の生物細胞の電気穿孔方法。
【国際調査報告】
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