(57)【要約】１以上のＤＮＡ配列が連結されるＤＮＡデンドリマーを含む組成物であって、このＤＮＡ配列が、ポリペプチドをコードするＲＮＡを生成させるために、または制御ＲＮＡを生成させるために、ポリペプチドまたは制御ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の発現を制御するＤＮＡ配列に連結されるポリペプチドまたは制御ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む、組成物が開示される。デンドリマーを細胞に送達し、続いてコードされるポリペプチドまたは制御ＲＮＡを発現させることによって、疾患および細胞の状態を処置するための方法もまた開示される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡデンドリマーを含む組成物であって、遺伝子転写を制御するＤＮＡ配列に操作可能に連結される、ポリペプチドまたは制御ＲＮＡをコードする１以上のＤＮＡ配列が前記ＤＮＡデンドリマーに連結される、組成物。
【請求項２】
前記ＤＮＡデンドリマーがＤＮＡの３から２１６のハイブリッド形成１本鎖を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＤＮＡデンドリマーに連結されるＤＮＡ配列が、ウイルス感染細胞、子宮頸部扁平円柱上皮移行部細胞、罹患もしくは損傷細胞または腫瘍細胞において特異的な転写活性を有するプロモーターを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記プロモーターが、ＨＰＶ感染細胞、膵臓癌細胞または前立腺癌細胞において特異的な転写活性を有する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＤＮＡデンドリマーに連結されるＤＮＡ配列が細胞毒をコードする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記細胞毒がジフテリア毒素Ａ鎖である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＤＮＡデンドリマーに連結されるＤＮＡ配列が免疫調節性タンパク質をコードする、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＤＮＡデンドリマーに連結されるＤＮＡ配列が蛍光タンパク質をコードする、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記蛍光タンパク質がＧＦＰまたはＣＦＰである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
制御ＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列をさらに含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
複数の連結ＤＮＡ配列を含み、前記複数の連結ＤＮＡ配列が複数のポリペプチドまたは制御ＲＮＡまたはそれらの組み合わせをコードする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＤＮＡデンドリマーに連結される細胞内部移行部分をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記内部移行部分が、細胞表面タンパク質に結合する抗体、細胞表面タンパク質に結合するペプチドまたは細胞表面受容体に結合するリガンドである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記内部移行部分が、トランスフェリン受容体に結合する、抗体またはペプチドである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１に記載のＤＮＡデンドリマーと、医薬的に許容可能な担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
前記医薬的に許容可能な担体が粘膜付着性の複合物である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記医薬的に許容可能な担体が、全身投与のための担体である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記ＤＮＡデンドリマーが細胞内部移行部分に連結される、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１から１２の何れか１項に記載のＤＮＡデンドリマーを含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記粘膜付着性の複合物がデキストランアルデヒド（ＰＥＧ：デキストラン）粘膜付着性複合物である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
患者の罹患細胞を処置するための方法であって、前記罹患細胞を処置するのに有効な量の請求項１または請求項３に記載のＤＮＡデンドリマーを前記患者に投与することを含み、前記遺伝子転写を制御するＤＮＡ配列が、前記罹患細胞において転写的に活性であり、前記ポリペプチドまたは制御ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列が前記罹患細胞に対して毒性である、方法。
【請求項２２】
遺伝子転写を制御する前記ＤＮＡ配列が、ＨＰＶ感染細胞、膵臓癌細胞または前立腺癌細胞において特異的に転写的に活性である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１６に記載の医薬組成物をＨＰＶ感染上皮細胞に局所適用することを含み、遺伝子転写を制御する前記ＤＮＡ配列が、ＨＰＶ感染上皮細胞においてまたはＳＣ移行部細胞において特異的に転写的に活性であり、コードされるポリペプチドまたは制御ＲＮＡがＨＰＶ感染上皮細胞にとって毒性である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記上皮細胞が鼻咽頭または子宮頸部細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記上皮細胞が癌性である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＨＰＶ感染細胞が性器疣贅として現れる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
ＨＰＶ感染上皮細胞の識別および／または可視化のための方法であって、前記ＨＰＶ感染上皮細胞に請求項１６に記載の医薬組成物を局所適用することを含み、遺伝子転写を制御する前記ＤＮＡ配列が前記ＨＰＶ感染上皮細胞において特異的に転写的に活性であり、コードされるポリペプチドが前記ＨＰＶ感染細胞において検出可能である、方法。
【請求項２８】
罹患細胞または細胞の状態を処置するための請求項１または請求項３に記載のＤＮＡデンドリマーの使用であって、遺伝子転写を制御する前記ＤＮＡ配列が前記細胞において転写的に活性であり、前記ポリペプチドまたは制御ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡ配列が前記細胞にとって毒性である、デンドリマーの使用。
【請求項２９】
ＨＰＶ感染上皮細胞の識別および／または可視化のための請求項１または請求項３に記載のＤＮＡデンドリマーの使用であって、遺伝子転写を制御する前記ＤＮＡ配列が前記ＨＰＶ感染上皮細胞において特異的に転写的に活性であり、コードされるポリペプチドが前記ＨＰＶ感染細胞において検出可能である、ＤＮＡデンドリマーの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞への遺伝子の送達のための機能性ＤＮＡデンドリマーの分野およびその細胞における遺伝子の発現に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療は、治療用ＤＮＡの送達によって罹患細胞の直接的処置が可能となるので、様々な細胞の異常、疾患および状態に対する有望な処置である。理論的には、所望の細胞へのＤＮＡ送達の標的化能およびＤＮＡが一旦細胞により取り込まれた際の発現調節能によって、従来の治療を用いて達成し難い治療効果および特異性のレベルが向上するはずである。しかし、実際のところ、ＤＮＡ治療の潜在力は完全には実現されていない。課題の１つは、細胞へのＤＮＡの送達のための適切なベクターの選択である。ウイルスベクターは、重篤な副次的影響を伴っている。結果として、非ウイルスベクターが求められてきた。陽イオン性リポソームは、細胞への遺伝子の移入に対して研究されてきたが、満足な結果は得られていない。
【０００３】
最近、コードＤＮＡを陽イオン性ポリマーと複合化することによって形成されるナノ粒子が、特に送達および治療効果を向上させるために機能性（例えば、細胞特異性および蓄積を向上させるための標的化部分および細胞取り込みを向上させるための膜−浸透部分および分解を妨げるための特性）が付加される場合に、遺伝子治療に対して有望であることが分かった。これらの機能性の多くは、遺伝子を含め、治療用の生物学的物質の細胞への送達に必要と考えられる。残念ながら、これらはまた、遺伝子治療の複雑性を高め、それを作製するコストを上昇させる。さらに、分子量、大きさ、ＤＮＡ凝縮後の電荷および末端基終結の選択は、ナノ粒子の遺伝子移入の実現性に大きな予想外の影響を有し得る。さらに、陽イオン性ポリマーナノ粒子は、それらの特異性を向上させるはずの標的化部分への抱合反応時にそれらのＤＮＡ送達能を喪失することが多い。しかし、細胞へのＤＮＡの送達のための陽イオン性ポリマー性ナノ粒子の長所の１つは、それらが大量のＤＮＡを送達することができることである。
【０００４】
ＤＮＡデンドリマーは、相互接続された天然または合成核酸単量体サブユニットから組み立てられる複雑な分岐状分子である。各単量体は、各鎖の中央部分に位置する配列相補性の領域を共有する２本のＤＮＡ鎖から構成される。この２本鎖は、アニーリングして単量体を形成し、その結果、中央の２本鎖「ウエスト」が４本の１本鎖「アーム」により縁取られる構造が得られる。異なる単量体タイプの末端の１本鎖「アーム」は、相補的単量体タイプの「アーム」と塩基対形成するように設計されている。これによって、１個のイニシエーター単量体で開始して、段階的な一連の単量体層としてデンドリマーが直接組み立てられるようになる。単量体の最後の層の付加によって、分子の表面上で１本鎖「アーム」が対形成しないままであることは、デンドリマーの有用な特性である。表面層１本鎖「アーム」の数は、層の数とともに増加する。表面上の１本鎖「アーム」は、特定の適用に特異的な標識または分子を含め、様々な分子を付着させてデンドリマーに対して機能性を提供するために利用可能である。機能性分子は、デンドリマーアームに直接複合化され得るか、またはデンドリマーアームにハイブリッド形成を介して付着させられ得る。利用可能な１本鎖「アーム」の多様性ゆえに、デンドリマーに複数の異なる機能性、例えば標的化部分および標識、が付着させられ得る。デンドリマーは、様々なアッセイにおいて、検出特異性および感度を向上させるものとして認識されている。
【０００５】
特異的な細胞におけるジフテリア毒素（ＤＴ）遺伝子の標的化発現の結果、これらの細胞が死滅する。ジフテリア毒素は、その作用機序が周知であり、その遺伝子がクローニングされ、配列決定され、哺乳動物細胞での発現のために適応化されているので、細胞消失に対する最適な毒素の１つである。コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）により分泌される前駆体ポリペプチドは、続いてＡ鎖およびＢ鎖断片に酵素切断される。Ｂ鎖は真核細胞の表面に結合し、Ａ鎖を細胞質に送達する。ＤＴ−Ａは、細胞の内側でタンパク質合成を阻害し、非常に毒性が強く；細胞を死滅させるのに１個の分子で十分である。ＤＴ−Ａサブユニットに対するコード配列が、発現を駆動するために細胞特異的なｃｉｓ−作用性転写制御エレメントの調節下でＤＴ−Ｂサブユニットとは独立にクローニングされた。ＤＴ−Ａサブユニットが細胞を死滅させた後、これは死細胞から放出され得るが；ＤＴ−Ａは近辺の細胞に入ることはできない。
【０００６】
したがって、予想可能で特異的であり、遺伝子を内部移行させる細胞数において実質的に効率化する、細胞への発現可能な遺伝子の標的化送達のための組成物および方法が必要とされている。本発明は、これらの要望に対処する。
【発明の概要】
【０００７】
第一の態様において、本発明は、ポリペプチドをコードするＲＮＡを生成させるために、または制御ＲＮＡを生成させるために、ポリペプチドまたは制御ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の発現を制御するＤＮＡ配列に連結されるポリペプチドまたは制御ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む１以上のＤＮＡ配列が連結されるＤＮＡデンドリマーを含む組成物に関する。このようなＤＮＡデンドリマーを本明細書中で「機能性」ＤＮＡデンドリマーと呼ぶ。
【０００８】
ＤＮＡデンドリマーに連結される１以上のＤＮＡ配列を有するＤＮＡデンドリマーの具体的な実施形態において、発現を制御するＤＮＡ配列は、プロモーターを含む。
【０００９】
前述のもののさらに具体的な実施形態において、プロモーターは、特異的な細胞タイプ、例えば上皮細胞、ウイルス感染細胞、罹患もしくは損傷細胞または腫瘍細胞でのみ実質的に転写的に活性である。特異的な腫瘍細胞でのみ実質的に転写的に活性であるプロモーターは、例えば膵臓癌に関連するプロモーター（例えばメソセリン（ＭＳＬＮ）プロモーター）または前立腺癌に関連するプロモーター（例えばサイトケラチン５（Ｋ５）プロモーター）であり得る。ウイルス感染細胞でのみ実質的に転写的に活性であるプロモーターは、例えば、ＨＰＶ１６ゲノムの主要初期プロモーターｐ９７の制御配列であり得る。あるいは、特異的な細胞タイプにおいて実質的に転写的に活性であるプロモーターは、子宮頸部の扁平円柱上皮（ＳＣ）移行部細胞でのみ実質的に転写的に活性であるプロモーター、例えばＡＲＧ２遺伝子プロモーターなどである。このアプローチは、本明細書中で、「標的化遺伝子発現」と呼ばれ得る。膵臓癌関連プロモーターはＭＳＬＮプロモーターであり得る。前立腺癌関連プロモーターはＫ５であり得る。
【００１０】
前述の実施形態の何れかにおいて、ポリペプチドまたは制御ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、細胞毒をコードし得る。具体的な例において、細胞毒はジフテリア毒素Ａである。
【００１１】
前述の実施形態の何れかにおいて、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、免疫調節性タンパク質をコードし得る。具体的な例において、免疫調節性タンパク質は、サイトカインまたはケモカインである。サイトカインおよびケモカインのさらなる非限定例としては、ＩＬ−２、ＩＬ−６およびＲＡＮＴＥＳが挙げられる。
【００１２】
前述の実施形態の何れかにおいて、ポリペプチドまたは制御ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、蛍光タンパク質をコードし得る。具体的な例において、蛍光タンパク質は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）である。
【００１３】
前述の実施形態の何れかにおいて、ポリペプチドまたは制御ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、制御ＲＮＡをコードし得る。具体的な例において、制御ＲＮＡは、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである。さらなる具体例において、制御ＲＮＡは、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）に対するｓｈＲＮＡである。
【００１４】
前述の実施形態の何れかにおいて、ＤＮＡデンドリマーに連結される１以上のＤＮＡ配列は、複数のポリペプチドまたは複数の制御ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含み得る。具体的な実施形態において、ＤＮＡ配列は、複数のポリペプチド、複数の制御ＲＮＡまたはポリペプチドおよび制御ＲＮＡの組み合わせをコードする。
【００１５】
前述の実施形態の何れかにおいて、ＤＮＡデンドリマーは、ＤＮＡデンドリマーに連結される細胞内部移行部分をさらに含み得る。具体的な実施形態において、細胞内部移行部分は、細胞表面タンパク質に結合する抗体、細胞表面タンパク質に結合するペプチドまたは細胞表面受容体に結合するリガンドである。特定の実施形態において、細胞内部移行部分は、トランスフェリン受容体に結合する抗体またはペプチドである。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、ポリペプチドまたは制御ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の発現を制御するＤＮＡ配列に連結されるポリペプチドまたは制御ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む１以上のＤＮＡ配列が連結されるＤＮＡデンドリマーと、医薬的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物を提供する。本医薬組成物のＤＮＡデンドリマーは、上記で論じた実施形態の何れかによる機能性ＤＮＡデンドリマーであり得る。具体的な実施形態において、ポリペプチドまたは制御ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、細胞または組織にとって毒性であるポリペプチドまたは制御ＲＮＡをコードする。毒性ポリペプチドは、例えばジフテリア毒素Ａなどの細胞毒であり得る。
【００１７】
本医薬組成物の具体的な実施形態において、機能性ＤＮＡデンドリマーのための医薬的に許容可能な担体は、機能性ＤＮＡデンドリマーへの細胞の直接的曝露を促進することによって、細胞への局所送達のために組成物を目標に向ける物質である。例えば、機能性ＤＮＡデンドリマーのための担体として局所送達ビヒクルが使用され得、細胞によるＤＮＡデンドリマーの取り込みを促進するために所望の位置に直接適用され得る。具体的な実施形態において、局所送達ビヒクルは、粘膜付着性の複合物質（例えば、デキストランアルデヒドポリマー粘膜付着性物質）を含む、複合物質であり得る。さらに具体的な実施形態において、本医薬組成物は、ＨＰＶ１６感染細胞の処置のために子宮頸部扁平円柱上皮移行部細胞に局所適用され得る。
【００１８】
さらなる態様において、ウイルス感染細胞、癌性細胞または前癌細胞などの細胞の疾患および状態を処置するための方法において、前出の実施形態の何れかによる機能性ＤＮＡデンドリマーが使用され得る。本方法の具体的な実施形態において、機能性ＤＮＡデンドリマーは、疾患または状態を処置するのに有効な量でそれを必要とする患者に投与される。具体的な実施形態において、ＤＮＡデンドリマーは、細胞内部移行部分によって細胞に標的化される。あるいはまたはさらに、ＤＮＡデンドリマーは、上述のような医薬組成物の担体によって細胞に標的化される。ポリペプチドまたは制御ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、一般に所望の細胞に対する毒性に対して選択される。ポリペプチドまたは制御ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の発現を制御する連結されるＤＮＡ配列は、一般に所望の細胞でのみ実質的に転写的に活性であるように選択されるが；制御配列が所望の細胞タイプに十分に転写的に特異的でないとみなされる場合、所望の細胞への機能性ＤＮＡデンドリマーの送達の特異性を向上させるために、医薬的に許容可能な担体の選択が使用され得る。あるいは、ポリペプチドまたは制御ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に連結される非転写的に特異的な配列を含むＤＮＡデンドリマーは、組成物の局所送達に適切な医薬的に許容可能な担体を用いて所望の細胞に標的化され得る。したがって、この態様はまた、ウイルス感染細胞、癌性細胞または前癌細胞などの細胞の疾患および状態を処置するための機能性デンドリマーの使用にも関し、ここで遺伝子転写を制御するＤＮＡ配列は、その細胞において転写的に活性であり、ポリペプチドまたは制御ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、その細胞にとって毒性である。
【００１９】
さらなる態様において、前出の実施形態の何れかによる機能性ＤＮＡデンドリマーは、ＨＰＶ感染上皮細胞に請求項１６に記載の医薬組成物を局所適用することを含み、遺伝子転写を制御するＤＮＡ配列がＨＰＶ感染上皮細胞において特異的に転写的に活性であり、コードされるポリペプチドがＨＰＶ感染ＨＰＶ細胞において検出可能である、ＨＰＶ感染上皮細胞の識別および／または可視化のための方法において使用され得る。したがって、この態様はまた、遺伝子転写を制御するＤＮＡ配列がＨＰＶ感染上皮細胞において特異的に転写的に活性であり、コードされるポリペプチドがＨＰＶ感染細胞において検出可能である、インビボ、エクスビボまたはインビトロの何れかでのＨＰＶ感染上皮細胞の識別および／または可視化のための機能性デンドリマーの使用にも関する。
【００２０】
特許または出願書類は、少なくとも１つのカラー図面を含有する。カラー図面付きのこの特許または特許出願公開のコピーは、必要な料金の請求および支払時に特許庁により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】図１Ａは、機能性ＤＮＡデンドリマーの構造のカラーの説明図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、実施例１に記載のインビトロ実験の結果を示すカラー写真である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、実施例１に記載のインビボ実験の結果を示すカラー写真である。
【図２】図２は、実施例２に記載のインビボ実験の結果を示す一連のカラー写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明のいくつかの代表的な実施形態を記載する前に、本発明が、次の記述で示される構築または処理段階の詳細に限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施または遂行可能である。
【００２３】
この明細書全体にわたる「一実施形態」、「ある一定の実施形態」、「１以上の実施形態」または「ある実施形態」に対する言及は、実施形態と関連して記載される特定の特性、構造、物質または特徴が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本願全体にわたる様々な場所での「１以上の実施形態において」、「ある一定の実施形態において」、「一実施形態において」または「ある実施形態において」などの句の出現は、本発明の同じ実施形態を必ずしも指していない。さらに、特定の特性、構造、物質または特徴は、１以上の実施形態において何らかの適切な方式で組み合わせられ得る。
【００２４】
「機能性ＤＮＡデンドリマー」という句および関連する句は、本明細書中で使用される場合、１以上の機能的に活性のある部分がその表面に付着されているＤＮＡデンドリマーを指す。機能的に活性のある部分としては、特定の細胞タイプにＤＮＡデンドリマーを標的化する部分、治療的に活性のある部分、ＤＮＡデンドリマーに対して検出可能性を提供する部分および細胞内で生物学的または生化学的活性を変化させるために細胞内で作用する部分が挙げられるが限定されない。制御ＲＮＡは機能的に活性のある部分の例であり、細胞における生物学的過程において制御的効果を発揮する非コードＲＮＡである。このようなＲＮＡとしては、ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡが挙げられる。機能性ＤＮＡデンドリマーはまた、本明細書中で、「ナノＤＮＡ」、「ＤＮＡナノ粒子」、「デンドリマーナノ粒子」などとも呼ばれ得る。
【００２５】
「毒性がある」、「毒性」という用語および同様の用語は、機能性ＤＮＡデンドリマーの細胞への送達に関連して本明細書中で使用される場合、デンドリマーに付着させられる機能的に活性のある部分の細胞殺滅能を指す。
【００２６】
特定の細胞タイプでのみ「実質的に転写的に活性である」、特異的な細胞タイプに対して「転写的に特異的な」または「特異的に転写的に活性である」という句および関連する句は、本明細書中で使用される場合、他の（非標的）細胞タイプと比較して特定の（標的）細胞タイプで選択的に発現される遺伝子コンストラクトを指す。発現の１００％特異性が所望される一方、非標的細胞における低レベルでの発現は除外されない。その一方で、「非転写的に特異的な」とは、全てまたは殆どの細胞タイプで実質的に等しく発現される遺伝子コンストラクトを指す。
【００２７】
「処置する」、「処置すること」または「処置される」などの用語は、本明細書中で使用される場合、疾患または状態を緩和するかまたは消失させること；疾患または状態の少なくとも１つの症状を緩和するかまたは消失させることまたは；疾患、状態もしくは症状を予防することを指す。
【００２８】
「医薬的に許容可能な担体」という句は、治療結果を達成するための患者への投与のためのＤＮＡデンドリマーを処方するために使用され得る何らかの適切なビヒクルを指す。医薬的に許容可能な担体それ自身は一般にさらなる治療効果を提供しない。担体は、静脈内製剤、局所製剤、経口製剤などでの使用に適合させ得る。
【００２９】
「プロモーター」という用語は、本明細書中で、コード配列に相補的なＲＮＡを生成させるために（遺伝子発現）下流ＤＮＡコード配列の転写を促進、誘導または制御する何らかの制御配列を指すためにその最も広い意味で使用される。
【００３０】
今回、ＤＮＡデンドリマーに付着させられた発現可能な遺伝子コンストラクトが、大量の遺伝子コンストラクトを細胞に運ぶ遺伝子治療のための有用な送達ビヒクルであることが分かった。ＤＮＡデンドリマーおよび付着された遺伝子コンストラクトが細胞表面との接触時に細胞によって効果的に内部移行されることおよび遺伝子コンストラクトのポリペプチドまたは制御ＲＮＡ（すなわち遺伝子産物）が細胞内で効果的に発現されることが分かった。遺伝子産物が毒性分子である場合、その発現により細胞が死滅する。ＤＮＡデンドリマーは、ＤＮＡデンドリマーに付着させられる細胞特異的な標的化部分によって細胞への遺伝子コンストラクト送達のために細胞特異性をさらに促進させることが可能である。さらに、特異的な細胞タイプでのみ実質的に転写的に活性である遺伝子コンストラクトにおけるプロモーターの使用は、さらなるレベルの細胞特異性をもたらし、さらなる治療効果向上をもたらす。
【００３１】
本発明の第一の態様は、ポリペプチドをコードするＲＮＡを生成させるために、または制御ＲＮＡ（例えばプロモーター）を生成させるために、コード配列の転写を制御するＤＮＡ配列に操作可能に連結されるポリペプチドまたは制御ＲＮＡをコードする１以上のＤＮＡ配列（すなわちコード配列）がＤＮＡデンドリマーに連結されているＤＮＡデンドリマーを提供する。コード配列の転写を制御するＤＮＡ配列および一緒に操作可能に連結されるコード配列は、本明細書中で、「遺伝子コンストラクト」と呼ばれる。ＤＮＡデンドリマーは、場合によっては、ＤＮＡデンドリマーを特異的な細胞タイプに向かわせ、特異的な細胞タイプの表面へのＤＮＡデンドリマーの結合を引き起こす標的化部分をそれにさらに連結していてもよい。このタイプのＤＮＡデンドリマーは、特異的な細胞タイプへの遺伝子コンストラクトの標的化送達に適しており、この場合このＤＮＡデンドリマーはコード配列の発現のために内部移行させられ得る。
【００３２】
さらなる実施形態において、ポリペプチドまたは制御ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、ＤＮＡデンドリマーを介して細胞に送達された際にコードされるポリペプチドまたは制御ＲＮＡが細胞にとって毒性となるように選択される。例えば、ＤＴ−Ａまたは別の細胞毒性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、転写を制御するＤＮＡ配列に操作可能に連結され得る。さらなる例において、ＤＮＡデンドリマーを介した細胞への送達時の細胞における選択遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、転写を制御するＤＮＡ配列に操作可能に連結され得る。
【００３３】
具体的な実施形態において、コード配列の転写を制御するＤＮＡ配列はプロモーターである。デンドリマーの内部移行時に細胞において発現を得るために適切なあらゆるプロモーターが本発明において有用である。プロモーターは、特異的な細胞タイプでのみ実質的に転写的に活性であり得るか、またはこれは非転写的に特異的であり得る。プロモーターのタイプは、遺伝子コンストラクトの発現のための細胞タイプおよび転写特異性の所望の度合いに基づき選択される。一般に、転写的に非常に活性が高いプロモーターは、コード配列の発現を最大化するのに好ましい。比較的非転写的に特異的なプロモーターの例としては、ＨＰＶ１６  Ｌｏｎｇ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｇｉｏｎ（ＬＣＲ）およびＲＧ４Ｘ（ＨＰＶ１６感染細胞および非感染細胞の両方で転写を活性化する。）およびＣＡＧ（ユビキタスに発現される強力なプロモーター配列）が挙げられる。特異的な細胞タイプでのみ実質的に転写的に活性であるプロモーターの例としては、ＡＧＲ２プロモーター（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２、これは、ＳＣ移行部の細胞で発現される。）、Ｋ５プロモーター（アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞で発現される。）およびメソセリンプロモーター（膵臓癌細胞で発現される。）が挙げられる。
【００３４】
ポリペプチドまたは制御ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、ＤＮＡデンドリマーが内部移行させられた際に細胞において機能的に活性となるポリペプチドまたは制御ＲＮＡをコードするあらゆるＤＮＡ配列であり得る。例えば、コード配列は、細胞にとって毒性であるポリペプチド（ＤＴ−Ａなど）、細胞での遺伝子発現を抑制または促進する制御ペプチドまたは細胞内で機能的である酵素をコードし得る。コード配列はまた、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡなど、細胞において遺伝子発現を抑える制御ＲＮＡもコードし得る。具体例において、これらの制御ＲＮＡは、ＲＮＡ輸送タンパク質ＨｕＲを標的とし得る。あるいは、コード配列は、細胞において遺伝子発現を促進する制御ＲＮＡをコードし得る。さらなる例において、制御ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ  ｌｅｔ７など、細胞内での発生過程に影響を与え得る。
【００３５】
ある一定の実施形態において、ＤＮＡデンドリマーは、１本鎖アームに連結される標的化部分をさらに含む。標的化部分は、デンドリマーの送達に対して選択された細胞において細胞表面マーカー（リガンドまたは受容体など）に結合するあらゆるタンパク質、ポリペプチドまたはリガンドであり得る。標的化部分は、細胞表面へのデンドリマーの結合を向上させ、それによりデンドリマーの効果的な全身投与を促進する。例えば、標的化部分は、抗体、ホルモン、受容体リガンドまたは毒素であり得る。有用な標的化部分の具体例としては、病的細胞の表面上でまたは特定のクラス、タイプ、臓器または組織の細胞の表面上で排他的にまたはほぼ排他的に発現される細胞表面マーカーに結合するものが挙げられる。これらの標的化部分は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ある種の乳癌タイプ）、アシアロフェチュイン受容体（肝細胞）、ウイルス抗原（ウイルス感染細胞）またはスカベンジャー受容体（マクロファージ）に結合し得る。
【００３６】
あるいは、有用な標的化部分としては、病的細胞の表面上または特定のクラス、タイプ、臓器または組織の細胞の表面上で過剰発現される細胞表面マーカーに結合するものが挙げられる。これらの標的化部分は、ＰＤＧＦ受容体、ＥＧＦＲファミリー受容体、ＩＣＡＭ、ＣＤ受容体、ＭＭＰ−９、インターロイキン受容体、トランスフェリン受容体、葉酸受容体および当技術分野で公知の他のものに結合し得る。
【００３７】
ＤＮＡデンドリマーが標的化部分を含む場合、標的化部分は、共有または非共有結合によってデンドリマーに連結され得る。非共有結合において、標的化部分は、標的化部分が間接的にデンドリマーとハイブリッド形成されるように、デンドリマーの１本鎖「アーム」上の配列に相補的であるオリゴヌクレオチドに連結され得る。代表的な共有結合は、当技術分野で公知であり、二官能性架橋剤およびヘテロ二官能性架橋剤により、または「クリック化学」を使用して形成される結合などである。
【００３８】
さらなる態様において、本発明は、前出のＤＮＡデンドリマーの何れかを含む医薬組成物を提供する。これらの組成物は、所望の投与経路に適切な処方物中にＤＮＡデンドリマーと、少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体と、を含む。ＤＮＡデンドリマーは、デンドリマーが標的細胞により内部移行させられる場合に特定の疾患または状態を処置するために十分な遺伝子コンストラクトを細胞に送達するのに十分な量で医薬組成物中に存在する。組成物中のデンドリマーの量は、医薬組成物の総重量に基づいて０．１から２５重量％の範囲であり得る。医薬的に許容可能な担体の例としては、水、安定化剤、濃厚剤、潤滑剤、ワックス、キレート剤、界面活性剤、希釈剤、抗酸化剤、結合剤、保存剤、着色剤（顔料または色素など）、乳化剤または製剤処方物の他の従来の成分が挙げられる。本医薬組成物は、当技術分野で公知であるような静脈内投与、局所投与、注射、点滴または経口投与のために処方され得る。本医薬組成物は、一般的には、当技術分野で公知の方法を用いて適切な条件下で全成分を合わせることによって調製される。
【００３９】
さらなる態様において、本発明は、ＤＮＡデンドリマーを使用する方法およびＤＮＡデンドリマーの使用および、疾患および／または状態を処置することを必要とする患者において疾患および／または状態を処置するためのデンドリマーを含む医薬組成物を提供する。一般に、２種類の方法の何れかで所望の細胞への遺伝子コンストラクトの標的化が達成され得る。第一に、プロモーターが非転写的に特異的であり、ＤＮＡデンドリマーが標的化部分を含まない場合、ＤＮＡデンドリマーを含む医薬組成物は、処置に対して特定された細胞に局所的に投与され得る。例として、ＤＮＡデンドリマーを含む医薬組成物は、罹患細胞もしくはその状態を有する細胞が見られる組織に局所的に適用され得るか、または罹患細胞もしくはその状態を有する細胞が見られる組織への注射によって局所的に投与され得る。これは、「標的化送達」と呼ばれる。標的化送達はまた、標的化部分が疾患または状態を有する細胞タイプに結合するが正常細胞に実質的に結合されない場合、ＤＮＡデンドリマーに連結される標的化部分によっても達成され得る。
【００４０】
第二に、遺伝子コンストラクトのプロモーターが、疾患または状態を呈する細胞でのみ実質的に転写的に活性である場合、ＤＮＡデンドリマーが正常細胞により内部移行されても遺伝子産物が健康な細胞において顕著に発現されないので、全身投与のさらなる選択肢がある。これは、「標的化発現」と呼ばれる。医薬組成物の全身送達の向上は、ＤＮＡデンドリマーにおいて上記で論じられるような標的化送達および標的化発現特性の両方を含むことによって達成され得る。
【００４１】
さらなる態様において、本発明は、上記で論じられるＤＮＡデンドリマーを作製するための方法を提供する。ポリヌクレオチド単量体からのＤＮＡデンドリマーのアセンブリーのための方法は、当技術分野で公知であり、例えば米国特許第５，４８７，９７３号およびＴ．Ｎｉｌｓｅｎら（Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）１８７：２７３−２８４）に記載されており、これらの開示はそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる。標的化部分は、存在するならば、当技術分野で公知の様々な適切な方法を使用してデンドリマーに共有または非共有結合され得る。このような方法としては、例えば、ジスルフィド結合、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル依存性縮合反応、二官能性架橋、電荷−電荷相互作用を介してデンドリマーへその部分を架橋するためのポリカチオン性化合物の使用、またはＷＯ２０１０／０１７５４４で開示されるようなデンドリマーアームへの直接的もしくは間接的ハイブリッド形成を介した結合が挙げられる。同様に、遺伝子コンストラクトは、これらの方法を用いてデンドリマーのアームに共有または非共有結合され得る。ハイブリッド形成によりデンドリマーへ分子を連結させるための捕捉配列の使用もまた全般的にＲ．Ｓｔｅａｒｓら（Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（２０００）３：９３−９９）により記載されている。水素結合（ハイブリッド形成）によりデンドリマーに分子を付着させるための方法を開示する他の参考文献としては、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１２）１５７：３１−４０，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２００８）４４：８１５−８１８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２００５）４３（７）：３２５５−３２５９およびＳｍａｌｌ（２００９）５（１５）：１７８４−９０が挙げられる。
【００４２】
実施例１：サイトケラチン５（Ｋ５）プロモーター制御ジフテリア毒素（ＤＴ）自殺遺伝子のＤＮＡデンドリマー送達
２層ＤＮＡデンドリマー（２ｎ  ３ＤＮＡ）調製：既に開示されるようにＤＮＡデンドリマーを作製した（例えば、特許５，１７５，２７０、５，４８４，９０４、５，４８７，９７３、６，１１０，６８７および６，２７４，７２３号を参照。これらはそれぞれ、その全体において参照により組み込まれる。）。簡潔に述べると、それぞれが各鎖の中央部に相補的に位置する配列領域を共有する２本のＤＮＡ鎖から作製されるＤＮＡ単量体からＤＮＡデンドリマーを構築した。２本の鎖がアニーリングして単量体を形成し、得られる構造は、中央の２本鎖「ウエスト」が４本の１本鎖「アーム」により縁取られているものとして記載され得る。このウエスト＋アーム構造は、基本的な３ＤＮＡ（登録商標）単量体を含む。５つの単量体タイプのそれぞれの末端の１本鎖アームは、正確で特異的なように互いに相互作用するように設計される。相補的単量体のアーム間の塩基対形成によって、単量体層の連続的付加を通じたデンドリマーの定方向のアセンブリーが可能になる。デンドリマーの各層のアセンブリーは、ＤＮＡの鎖が互いに共有結合される架橋プロセスを含み、それによって変性状態になりにくい完全に共有結合性の分子が形成されるが、さもなくばデンドリマー構造の変形が引き起こされる。さらに、次のように、相補的捕捉オリゴとなる３８塩基オリゴヌクレオチドは、単純なＴ４  ＤＮＡリガーゼ依存性核酸連結反応を介して利用可能なデンドリマーアームの５’末端に核酸連結される：
【００４３】
捕捉配列のＤＮＡデンドリマーへの付着：トランスフェリン受容体（ＴｆＲ／ＣＤ７１）標的化ペプチドＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（配列番号１）を付着させるために、１０から１５％のデンドリマーアームに捕捉オリゴヌクレオチドを核酸連結させた。捕捉オリゴヌクレオチドと相補的なオリゴヌクレオチドをＴｆＲペプチド（Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ｗｗｗ．ｂｉｏｓｙｎ．ｃｏｍ）に、または抗ＣＤ７１抗体に複合化させ、利用可能な捕捉配列の全てを占有するためのモル比でハイブリッド形成させた。およそ２から５個のペプチドまたは抗ＣＤ７１抗体を下記で要約されるようにデンドリマー分子ごとに付着させた。
【００４４】
デンドリマーアームおよび捕捉オリゴヌクレオチドの隣接部分と重複する架橋オリゴヌクレオチドを利用して、単純な核酸連結反応を介して小型の（１５から１００個のヌクレオチド）ＤＮＡまたはＲＮＡ捕捉オリゴヌクレオチド（または他の生化学的類似体）をデンドリマーアームの末端に共有結合させ、それによってデンドリマーアームの末端に捕捉オリゴヌクレオチドを架橋させた。架橋オリゴヌクレオチドは、核酸リガーゼ酵素（好ましくはＴ４  ＤＮＡリガーゼ酵素）の核酸連結活性を促進するために隣接デンドリマーアームおよび捕捉オリゴヌクレオチド配列のそれぞれの少なくとも５塩基と重複したが、各配列の少なくとも７塩基の重複が好ましい。架橋オリゴヌクレオチドはまた、非デンドリマー核酸または他の分子の特異的な標的化に対してデンドリマーが使用される場合、その相補的配列のための核酸ブロッカーにもなり得る。
【００４５】
微量遠心管チューブに対して次の成分を添加した：
１．１ＸＴＥ緩衝液５．４μＬ中の２層ＤＮＡデンドリマー（５００ｎｇ／μＬ）（２６８０ｎｇ）
２．（−）ＬＩＧ−ＢＲ７架橋オリゴ（１４マー）（５０ｎｇ／μＬ）２．７μＬ（１３４ｎｇ）
３．１０Ｘリガーゼ緩衝液１０．２μＬ
４．１０Ｘリガーゼ緩衝液１０．２μＬ
５．Ｃａｐ０３捕捉オリゴ（３８マー）（５０ｎｇ／μＬ）４．０μＬ（２００ｎｇ）
６．Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（１Ｕ／μＬ）１０．０μＬ（１０単位）
【００４６】
最初の４つの反応物を一緒に添加し、６５℃に加熱し、室温に冷却した。次いで第５および第６の反応物を添加し、４５分間温置した。２．８μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ溶液を添加することによって、核酸連結反応を停止させた。１００ｋカットオフ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）の使用を介して核酸連結されなかったオリゴヌクレオチドを除去し、精製洗浄中に緩衝液を１ｘ滅菌ＰＢＳ、ｐＨ７．４に変更した。捕捉オリゴヌクレオチドをデンドリマーの第一の１本鎖表面アームに連結させる。
【００４７】
細胞表面を標的とし、内部移行を開始させるために、ＴｆＲに結合する抗体またはペプチドをＤＮＡデンドリマーにカップリングさせた。トランスフェリン受容体（ＴｆＲ／ＣＤ７１）に対する抗体またはＴｆＲ標的化ペプチドＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（配列番号１）の何れかを、デンドリマー（上記参照）に既に核酸連結された捕捉オリゴヌクレオチドに相補的であったオリゴヌクレオチドに共有結合させた。簡潔に述べると、３’末端によって抗ＣＤ７１抗体（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）またはＴｆＲ標的化ペプチド（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）に対して市販の化学物質を用いて捕捉オリゴヌクレオチド相補体（ｃｐｌＣａｐ０３）、５’−ＴＴＣＴＣＧＴＧＴＴＣＣＧＴＴＴＧＴＡＣＴＣＴＡＡＧＧＴＧＧＡＴＴＴＴＴ−３’（配列番号２）を共有カップリングさせ、ＨＰＬＣにより精製して過剰な試薬を除去した。次いで、試薬の最終アセンブリー中（下記の３ＤＮＡ調製セクションを指す。）にこれらの複合物をデンドリマー捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリッド形成させた。
【００４８】
Ｋ５／ＣＦＰおよびＫ５／ＸＸ  ３ＤＮＡ調製：７００μｇのｐＫ５／ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）のコード配列に操作可能に連結されるサイトケラチン５遺伝子（Ｋｒｔ５）のプロモーターを含有するプラスミド）および３５０μｇのｐＫ５／ＸＸ（サイトケラチン５遺伝子のプロモーターのみを含有するプラスミド（即ち非コード配列））をＫｐｎＩ−ＨＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で制限処理して、プラスミドを直線状にし、次いでこれを３７℃で２時間にわたり、それぞれ７ｍＬおよび３．５ｍＬの最終体積でエビアルカリホスファターゼ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で脱リン酸化した。その後、１０分間８０℃に加熱することによってこの反応を停止させた。それぞれのアリコートをゲル分析のために採取し、プラスミドの消化を確認した。次に、上記のような市販の化学物質を用いて、デンドリマーの第二の１本鎖表面アームに相補的なオリゴヌクレオチドを直線化プラスミドに共有結合させた。具体的に、第二の１本鎖デンドリマーアームに相補的なハイブリッド形成オリゴヌクレオチド、１０Ｘ核酸連結緩衝液およびＴ４  ＤＮＡリガーゼを直線化プラスミドに添加して、Ｋ５／ＣＦＰの場合は８．４ｍＬの最終体積、Ｋ５／ＸＸの場合は４．２ｍＬの最終体積にした。室温のビーカー水浴中で核酸連結を開始させ、次いで４℃に入れてゆっくりと冷却し、一晩継続した。翌朝、アリコートをそれぞれからゲル分析のために採取した。Ｌｏｎｚａ  １．２％アガロースゲルを泳動して、各プラスミドへのハイブリッド形成オリゴヌクレオチドの核酸連結が成功したことを判断した。ＤＮＡデンドリマーおよび各核酸連結済みプラスミドの組み合わせの結果、ＤＮＡデンドリマーがあるウェルへの核酸連結済みプラスミドのシフトが起こり、このことから、プラスミドの核酸連結の成功が示された。次に、Ａｍｉｃｏｎ  １００Ｋカラムを用いて、核酸連結済みプラスミドを精製して、過剰なハイブリッド形成オリゴを除去した。ナノドロップ（ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いて各精製核酸連結済みプラスミドの最終収率を決定した。
【００４９】
当技術分野で公知の方法を用いて、デンドリマーの第三の１本鎖表面アームに相補的なオリゴヌクレオチドへのＣｙ３の付着によって標識済みオリゴヌクレオチドを調製した。
【００５０】
次に、ＴｆＲペプチド／捕捉相補体（「ＴｆＲペプチド−ｃｐｌＣａｐ０３複合物」）または抗ＣＤ７１／捕捉相補体（「抗ＣＤ７１−ｃｐｌＣａｐ０３複合物」）、第二の１本鎖デンドリマーアームの相補体に核酸連結されるプラスミド（「核酸連結プラスミド」）および第三の１本鎖デンドリマーアームに相補的な標識済みオリゴヌクレオチド（「Ｃｙ３標識オリゴ」）をデンドリマーに対してハイブリッド形成させることによって、各完全修飾３ＤＮＡデンドリマーを調製した。これは、それらが列挙される順序で次の試薬を組み合わせることによって行った。２ｎ−Ｃｙ３  ３ＤＮＡ−抗ＣＤ７１−Ｋ５／ＣＦＰの場合、次のように、４５０μＬを１０ｎｇ／μＬ  ２ｎ  ３ＤＮＡおよび４８９．８ｎｇ／μＬプラスミドＤＮＡの最終濃度に調製した：４５００ｎｇ  ２ｎ（−）３ＤＮＡ、４４５ｎｇ  ｃ（＋）Ｃｙ３標識オリゴ、１９２．３ｎｇ抗ＣＤ７１−ｃｐｌＣａｐ０３複合物、３２８．９μＬ滅菌１ＸＰＢＳおよび２２０．４μｇ核酸連結済みＫ５／ＣＦＰ。２ｎ−Ｃｙ３  ３ＤＮＡ−ＴｆＲペプチド−Ｋ５／ＣＦＰの場合、次のように、４５０μＬを１０ｎｇ／μＬ  ２ｎ  ３ＤＮＡおよび４８９．８ｎｇ／μＬプラスミドＤＮＡの最終濃度に調製した：４５００ｎｇ  ２ｎ（−）３ＤＮＡ、４４５ｎｇ  ｃ（＋）Ｃｙ３標識オリゴ、１９２．３ｎｇ  ＴｆＲペプチド−ｃｐｌＣａｐ０３複合物、３４７．７μＬ滅菌１ＸＰＢＳおよび２２０．４μｇ核酸連結済みＫ５／ＣＦＰ。２ｎ−Ｃｙ３  ３ＤＮＡ−ＴｆＲペプチド−Ｋ５／ＸＸの場合、次のように、４５０μＬを１０ｎｇ／μＬ  ２ｎ  ３ＤＮＡおよび４８９．８ｎｇ／μＬプラスミドＤＮＡの最終濃度に調製した：４５００ｎｇ  ２ｎ（−）３ＤＮＡ、４４５ｎｇ  ｃ（＋）Ｃｙ３標識オリゴ、１９２．３ｎｇ  ＴｆＲペプチド−ｃｐｌＣａｐ０３複合物、３４７．７μＬ滅菌１ＸＰＢＳおよび２２０．４μｇ核酸連結済みＫ５／ＸＸ。各３ＤＮＡデンドリマーを３７℃で３０分間温置し、次いで使用まで４℃で保存した。コンストラクトの図は図１Ａで示す。
【００５１】
インビトロおよびインビボ前立腺腫瘍研究：
【００５２】
インビトロ：インビトロ結合および送達を確認するために、１Ｘ１０５個のＬＡＰＣ４−ＡＳ細胞（アンドロゲン感受性ヒト前立腺癌細胞）を２４ウェルプレートに入れ、３７℃、５％ＣＯ２（バランス空気）で２日間培養した。十（１０）μＬのＫ５／ＣＦＰ−ＴＦＲ（１０ｎｇ／ｍＬ  ３ＤＮＡ、５００ｎｇ／ｍＬ  ＤＮＡ）またはＫ５／ＸＸ−ＴＦＲデンドリマー（１０ｎｇ／ｍＬ  ３ＤＮＡ、４４４ｎｇ／ｍＬ  ＤＮＡ）を１００μＬのＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）と混合した。２４ウェル培養プレートから培地を除去し、デンドリマー混合物を添加し、３７℃で４時間温置した。一（１）ｍＬの完全培地を添加し、２日間にわたり培養を継続した。抗ＥＧＦＰ抗体（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  １：１０００）を用いて細胞を免疫染色し、倒立蛍光顕微鏡を用いて写真撮影した（図１Ｂ）。
【００５３】
インビボ：デンドリマーコンストラクトのインビボ試験の場合、２０％マトリゲル入りの１００μＬ  ＰＢＳ中の５Ｘ１０５個のＰＣ−３ＭＬ／Ｌｕｃ細胞（ホタルルシフェラーゼを安定的に発現するアンドロゲン非依存性ヒト前立腺癌細胞）をＮＯＧマウスに皮下注射（ｓ．ｃ．）した。７週間後、マウスの後眼窩に上記で調製されたような１００μＬデンドリマー調製物を注射した。デンドリマーコンストラクトの注射から二十四（２４）時間後、マウスを屠殺し、腫瘍、脾臓、肝臓、皮膚、脾臓、腎臓、脳、肺および正常な前立腺を１０％ホルマリン中で２時間にわたり固定し、パラフィン中に包埋した。抗ＧＦＰ抗体（抗ＧＦＰ抗体はＣＦＰも認識する。）を用いて、包埋された切片を免疫染色し、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）発現のレベルを決定し、蛍光顕微鏡で写真を撮影した。結果は図１Ｃでまとめる。様々な組織を分析した後、腫瘍のみが顕著なＣＦＰの発現を呈したことが観察され、このことから、腫瘍細胞においてデンドリマーＫ５／ＣＦＰコンストラクトが選択的に発現されたことが示される。
実施例２：膵臓腫瘍標的化
【００５４】
２層ＤＮＡデンドリマー調製：既に開示されるようにＤＮＡデンドリマーを作製した（例えば、特許５，１７５，２７０、５，４８４，９０４、５，４８７，９７３、６，１１０，６８７および６，２７４，７２３号を参照。これらはそれぞれ、その全体において参照により組み込まれる。）。簡潔に述べると、それぞれが各鎖の中央部に相補的に位置する配列領域を共有する２本のＤＮＡ鎖から作製されるＤＮＡ単量体からＤＮＡデンドリマーを構築する。２本の鎖がアニーリングして単量体を形成し、得られる構造は、中央の２本鎖「ウエスト」が４本の１本鎖「アーム」により縁取られているものとして記載され得る。このウエスト＋アーム構造は、基本的な３ＤＮＡ（登録商標）単量体を含む。５つの単量体タイプのそれぞれの末端の１本鎖アームは、正確で特異的なように互いに相互作用するように設計される。相補的単量体のアーム間の塩基対形成によって、単量体層の連続的付加を通じたデンドリマーの定方向のアセンブリーが可能になる。デンドリマーの各層のアセンブリーは、ＤＮＡの鎖が互いに共有結合される架橋プロセスを含み、それによって変性状態になりにくい完全に共有結合性の分子が形成されるが、さもなくばデンドリマー構造の変形が引き起こされる。さらに、次のように、相補的捕捉オリゴとなる３８塩基オリゴヌクレオチドは、単純なＴ４  ＤＮＡリガーゼ依存性核酸連結反応を介して利用可能なデンドリマーアームの５’末端に核酸連結される：
【００５５】
ＤＮＡデンドリマーへの捕捉配列の付着：トランスフェリン受容体（ＴｆＲ／ＣＤ７１）標的化ペプチドＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（配列番号１）を付着させるために、デンドリマーアームの１０から１５％に捕捉配列を核酸連結した。この捕捉配列に対する相補的オリゴヌクレオチドをＴｆＲペプチド（Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ｗｗｗ．ｂｉｏｓｙｎ．ｃｏｍ）と複合化し、利用可能な捕捉配列の全てを占有するためのモル比でハイブリッド形成させた。下記でまとめるようにデンドリマー分子ごとにおよそ２から５個のペプチドを付着させた。
【００５６】
デンドリマーアームおよび捕捉オリゴヌクレオチドの隣接部分と重複する架橋オリゴヌクレオチドを利用して、単純な核酸連結反応を介して小型の（１５から１００個のヌクレオチド）ＤＮＡまたはＲＮＡ捕捉オリゴヌクレオチド（または他の生化学的類似体）をデンドリマーアームの末端に共有結合させ、それによってデンドリマーアームの末端に捕捉オリゴヌクレオチドを架橋させる。架橋オリゴヌクレオチドは、核酸リガーゼ酵素（好ましくはＴ４  ＤＮＡリガーゼ酵素）の核酸連結活性を促進するために隣接デンドリマーアームおよび捕捉オリゴヌクレオチド配列のそれぞれの少なくとも５塩基と重複するが、各配列の少なくとも７塩基の重複が好ましい。架橋オリゴヌクレオチドはまた、非デンドリマー核酸または他の分子の特異的な標的化に対してデンドリマーが使用される場合、その相補的配列のための核酸ブロッカーにもなり得る。
【００５７】
次の成分を微量遠心管に添加した：
１．１ＸＴＥ緩衝液５．４μＬ中の２層ＤＮＡデンドリマー（５００ｎｇ／μＬ）（２６８０ｎｇ）
２．（−）ＬＩＧ−ＢＲ７架橋オリゴ（１４マー）（５０ｎｇ／μＬ）２．７μＬ（１３４ｎｇ）
３．１０Ｘリガーゼ緩衝液１０．２μＬ
４．ヌクレアーゼ不含水８１．７μＬ
５．Ｃａｐ０３捕捉オリゴ（３８マー）（５０ｎｇ／Ｌ）４．０μＬ（２００ｎｇ）
６．Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（１Ｕ／μＬ）１０．０μＬ、（１０単位）
【００５８】
最初の４つの反応物を一緒に添加し、６５℃に加熱し、室温に冷却した。次いで第５および第６の反応物を添加し、４５分間温置した。２．８μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ溶液を添加することによって、核酸連結反応を停止させた。１００ｋカットオフ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）の使用を介して核酸連結されなかったオリゴヌクレオチドを除去し、精製洗浄中に緩衝液を１ｘ滅菌ＰＢＳ、ｐＨ７．４に変更した。捕捉オリゴヌクレオチドをデンドリマーの第一の１本鎖表面アームに連結させる。
【００５９】
細胞表面を標的とし、内部移行を開始させるために、ＴｆＲに結合するペプチドを、ＤＮＡデンドリマーにカップリングさせた。標的化ペプチドＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（配列番号１）を、デンドリマーに既に核酸連結された捕捉配列に相補的であるオリゴヌクレオチドに共有結合させた。簡潔に述べると、３’末端によってＴｆＲ標的化ペプチド（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）に対して市販の化学物質を用いて捕捉配列相補体（ｃｐｌＣａｐ０３）、５’−ＴＴＣＴＣＧＴＧＴＴＣＣＧＴＴＴＧＴＡＣＴＣＴＡＡＧＧＴＧＧＡＴＴＴＴＴ−３’（配列番号２）を共有結合させ、ＨＰＬＣにより精製して過剰な試薬を除去した。次いで、試薬の最終アセンブリー（下記の３ＤＮＡ調製セクションを指す。）中にこれらの複合物をデンドリマー捕捉配列に対してハイブリッド形成させた。
【００６０】
ＭＳＬＮ／ＤＴおよびＭＳＬＮ／ＸＸ  ３ＤＮＡ調製：１ｍｇの２種類のそれぞれのプラスミド（ＭＳＬＮ／ＤＴ、ジフテリア毒素Ａ鎖のコード配列に操作可能に連結されるヒトメソセリン遺伝子（ＭＳＬＮ）のプロモーターを含有；ＭＳＬＮ／ＸＸ、コード配列なくＭＳＬＮプロモーターを含有）をＫｐｎＩ−ＨＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で制限処理して、プラスミドを直線状にし、３７℃で２時間にわたり、１０ｍＬの最終体積でエビアルカリホスファターゼ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で脱リン酸化した。その後、１０分間８０℃に加熱することによってこの反応を停止させた。それぞれのアリコートをゲル分析のために採取して、プラスミドの消化を確認した。次に、上記のような市販の化学物質を用いて、デンドリマーの第二の１本鎖表面アームに相補的なオリゴヌクレオチドを直線化プラスミドに共有結合させた。具体的に、第二の１本鎖デンドリマーアームに相補的なハイブリッド形成オリゴヌクレオチド、１０Ｘ核酸連結緩衝液およびＴ４  ＤＮＡリガーゼを直線化プラスミドに添加して、１２ｍＬの最終体積にした。室温のビーカー水浴中で核酸連結を開始させ、次いで４℃に入れてゆっくりと冷却し、一晩継続した。翌朝、アリコートをそれぞれからゲル分析のために採取した。Ｌｏｎｚａ  １．２％アガロースゲルを泳動して、プラスミドへのハイブリッド形成オリゴヌクレオチドの核酸連結が成功したことを判断した。ＤＮＡデンドリマーおよび各核酸連結済みプラスミドの組み合わせの結果、ＤＮＡデンドリマーがあるウェルへの核酸連結済みプラスミドのシフトが起こり、このことから、プラスミドの核酸連結の成功が示された。次に、Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｎｄｏ−ｆｒｅｅプラスミドＭａｘｉキットおよびＱｉａｇｅｎ  ｔｉｐ−５００を用いて、核酸連結済みプラスミドを精製した。これらのチップの最大容量は５００μｇであったため、各プラスミドに対して２本のチップを使用した。Ｑｉａｇｅｎ  ｔｉｐ−５００からの溶出後、エタノール沈殿の最終段階があった。ペレットを滅菌１ＸＰＢＳで再懸濁し、ナノドロップ（ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いて各精製核酸連結済みプラスミドの最終収率を決定した。
【００６１】
当技術分野で公知の方法を用いて、デンドリマーの第三の１本鎖表面アームに相補的なオリゴヌクレオチドへのＣｙ３の付着によって、標識化オリゴヌクレオチドを調製した。
【００６２】
次に、ＴｆＲペプチド／捕捉相補体（「ＴｆＲペプチド−ｃｐｌＣａｐ０３複合物」）、第二の１本鎖デンドリマーアームの相補体に核酸連結されたプラスミド（「核酸連結済みプラスミド」）および第三の１本鎖デンドリマーアームに相補的な標識化オリゴヌクレオチド（「Ｃｙ３標識オリゴ」）をデンドリマーに対してハイブリッド形成させることによって、各完全修飾３ＤＮＡ試薬を調製した。これは、それらが列挙される順序で次の試薬を組み合わせることによって行った。２ｎ（−）Ｃｙ３  ３ＤＮＡ−ＴｆＲペプチド−ＭＳＬＮ／ＤＴの場合、次のように、６００μＬを１０ｎｇ／μＬ  ２ｎ  ３ＤＮＡおよび３１７ｎｇ／μＬプラスミドＤＮＡの最終濃度に調製した：６０００ｎｇ  ２ｎ（−）３ＤＮＡ、６００ｎｇ  ｃ（＋）Ｃｙ３標識オリゴ、２５６．４ｎｇ  ＴｆＲペプチド−ｃｐｌＣａｐ０３複合物、３８５．２μＬ滅菌１ＸＰＢＳおよび１９０．２μｇ核酸連結済みＭＳＬＮ／ＤＴ。２ｎ（−）Ｃｙ３  ３ＤＮＡ−ＴｆＲペプチド−ＭＳＬＮ／ＸＸの場合、次のように、６００μＬを１０ｎｇ／μＬ  ２ｎ  ３ＤＮＡおよび２２９ｎｇ／μＬプラスミドＤＮＡの最終濃度に調製した：６０００ｎｇ  ２ｎ（−）３ＤＮＡ、６００ｎｇ  ｃ（＋）Ｃｙ３標識オリゴ、２５６．４ｎｇ  ＴｆＲペプチド−ｃｐｌＣａｐ０３複合物、４２５．２μＬ滅菌１ＸＰＢＳおよび１３７．４μｇ核酸連結済みＭＳＬＮ／ＸＸ。次に、各３ＤＮＡデンドリマー混合物を３７℃で３０分間温置し、次いで使用まで４℃で保存した。
【００６３】
インビボマウス試験：マウスにおいて腫瘍形成を誘導するために、Ｂ６マウスの膵臓に２０ｍＬマトリゲル中の２Ｘ１０５個のＰＡＮ０２−Ｌｕｃ細胞（ホタルルシフェラーゼを安定して発現するマウス膵臓癌細胞）を直接注射した。４週間後、マウスの後眼窩に１００μＬの１ＸＰＢＳ（陰性対照）、ＭＳＬＮ／ＤＴデンドリマー（１０ｎｇ／ｍＬ  ３ＤＮＡ、３１１ｎｇ／ｍＬ  ＤＮＡ）を、またはＭＳＬＮ／ＸＸ（１０ｎｇ／ｍＬ  ３ＤＮＡ、２２９ｎｇ／ｍＬ  ＤＮＡ）を注射した。２週間にわたり週に２回、合計４回、注射を行った。最後の投与から３日後にマウスを屠殺し、腫瘍、肝臓、脾臓を１０％ホルマリン中で２時間固定し、パラフィン包埋した切片を調製し、さらなる試験のためにスライド上に載せた。処置の結果としての細胞死のレベルを決定するために、インシトゥ細胞死検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＴＵＮＥＬアッセイを行った。結果は図２でまとめ、状態を比較したところ、ＭＳＬＮ／ＤＴデンドリマーコンストラクトは、ＰＢＳ緩衝液対照またはＭＳＬＮ／ＸＸ（毒素遺伝子なし）対照の何れよりも顕著に多くの細胞死を呈した。
結論
【００６４】
遺伝子移入データは、全身投与後、機能性ＤＮＡデンドリマーがインビトロでＫ５／ＣＦＰ  ＤＮＡをＬＡＰＣ−４ＡＳ細胞および異種移植片に送達することを示す。Ｋ５／ＤＴは、インビトロでＬＡＰＣ−４ＡＩ細胞を死滅させる。ＬＡＰＣ−４ＡＩ細胞はアンドロゲン枯渇培地（すなわちアンドロゲン枯渇療法（ＡＤＴ）を模倣）でそれらを増殖させることによりＬＡＰＣ−４ＡＳ細胞由来であったので、Ｋ５／ＤＴ  ＤＮＡデンドリマーでの処置時の細胞死は、ＡＤＴおよびナノＤＮＡ−Ｋ５／ＤＴが一緒に作用することの証拠である。ＴｆＲを標的とすることによって、ＴｆＲ−発現ＬＡＰＣ−４細胞へのＴｆＲペプチド−誘導体化デンドリマーの結合が促進され、インビトロでのこれらの細胞のＤＮＡ遺伝子移入が促進され、全身送達時のＴｆＲ−発現異種移植片でのＤＮＡ発現が促進される。非ＴｆＲ組織は結合に対して陰性である。
実施例３：子宮頸部前癌病変に対する標的化ＤＮＡデンドリマーに基づく遺伝子治療
【００６５】
隣接する扁平上皮および円柱細胞と比較した場合に子宮頸部の扁平円柱上皮（ＳＣ）移行部細胞で２５倍高いレベルで発現されるバイオマーカーとして、Ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（ＡＧＲ２）が最近同定された。ＡＧＲ２遺伝子の以前同定されたプロモーターの配列が同定され、ＳＣ移行部細胞に対して遺伝子発現を標的化するための適切な生理学的活性を有することが示された。
【００６６】
２層ＤＮＡデンドリマー調製：既に開示されるようにＤＮＡデンドリマーを作製する（例えば、それぞれがその全体において参照により組み込まれる特許５，１７５，２７０、５，４８４，９０４、５，４８７，９７３、６，１１０，６８７および６，２７４，７２３）。簡潔に述べると、それぞれが、各鎖の中心部分に位置する配列相補性の領域を共有する２本のＤＮＡ鎖から作製されるＤＮＡ単量体からＤＮＡデンドリマーを構築した。この２本の鎖は、アニーリングして、単量体を形成させ、得られた構造は、中央部の２本鎖「ウエスト」が４本の１本鎖「アーム」により縁取られているものとして記載され得る。このウエスト−＋−アーム構造は、基本的な３ＤＮＡ（登録商標）単量体を含む。５つの単量体タイプのそれぞれの末端での１本鎖アームは、正確で特異的なように互いに相互作用するように設計される。相補的単量体のアーム間の塩基対形成によって、単量体層の連続的付加を通じてデンドリマーの定方向のアセンブリーを可能にする。デンドリマーの各層のアセンブリーはＤＮＡの鎖が互いに共有結合される架橋過程を含み、それによって変性状態になりにくい完全に共有結合性の分子が形成されるが、さもなくばデンドリマー構造の変形が引き起こされる。さらに、相補的捕捉オリゴとなる３８塩基のオリゴヌクレオチドは、単純なＴ４  ＤＮＡリガーゼ依存性核酸連結反応を介して利用可能なデンドリマーアームの５’末端に核酸連結される。
【００６７】
ＤＮＡデンドリマーへの捕捉配列の付着：トランスフェリン受容体（ＴｆＲ／ＣＤ７１）標的化ペプチドＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（配列番号１）を付着させるために、１０から１５％のデンドリマーアームに捕捉オリゴヌクレオチドを核酸連結させる。この捕捉配列に対する相補的オリゴヌクレオチドをＴｆＲペプチド（Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ｗｗｗ．ｂｉｏｓｙｎ．ｃｏｍ）と複合化し、利用可能な捕捉配列の全てを占有するためのモル比でハイブリッド形成させる。下記でまとめるようにデンドリマー分子ごとにおよそ２から５個のペプチドを付着させる。
【００６８】
デンドリマーアームおよび捕捉オリゴヌクレオチドの隣接部分と重複する架橋オリゴヌクレオチドを利用して、単純な核酸連結反応を介して小型の（１５から１００個のヌクレオチド）ＤＮＡまたはＲＮＡ捕捉オリゴヌクレオチド（または他の生化学的類似体）をデンドリマーアームの末端に共有結合させ、それによってデンドリマーアームの末端に捕捉オリゴヌクレオチドを架橋させる。架橋オリゴヌクレオチドは、核酸リガーゼ酵素（好ましくはＴ４  ＤＮＡリガーゼ酵素）の核酸連結活性を促進するために隣接デンドリマーアームおよび捕捉オリゴヌクレオチド配列のそれぞれの少なくとも５塩基と重複するが、各配列の少なくとも７塩基の重複が好ましい。架橋オリゴはまた、非デンドリマー核酸または他の分子の特異的な標的化に対してデンドリマーが使用される場合、その相補的配列のための核酸ブロッカーにもなり得る。
【００６９】
次の成分を微量遠心管に添加する：
１．１ＸＴＥ緩衝液５．４μＬ中の２層ＤＮＡデンドリマー（５００ｎｇ／μＬ）（２６８０ｎｇ）
２．（−）ＬＩＧ−ＢＲ７架橋オリゴ（１４マー）（５０ｎｇ／μＬ）２．７μＬ（１３４ｎｇ）
３．１０Ｘリガーゼ緩衝液１０．２μＬ
４．ヌクレアーゼ不含水８１．７μＬ
５．Ｃａｐ０３捕捉オリゴ（３８マー）（５０ｎｇ／Ｌ）４．０μＬ（２００ｎｇ）
６．Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（１Ｕ／μＬ）１０．０μＬ、（１０単位）
【００７０】
最初の４つの反応物を一緒に添加し、６５℃に加熱し、室温に冷却する。次いで第５および第６の反応物を添加し、４５分間温置する。２．８μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ溶液を添加することによって、核酸連結反応を停止させる。１００ｋカットオフ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）の使用を介して核酸連結されなかったオリゴヌクレオチドを除去し、精製洗浄中に緩衝液を１ｘ滅菌ＰＢＳ、ｐＨ７．４に変更する。捕捉オリゴヌクレオチドをデンドリマーの第一の１本鎖表面アームに連結させる。
【００７１】
細胞表面を標的とし、内部移行を開始させるために、ＴｆＲに結合する抗体またはペプチドをＤＮＡデンドリマーにカップリングさせる。トランスフェリン受容体（ＴｆＲ／ＣＤ７１）に対する抗体またはＴｆＲ標的化ペプチドＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（配列番号１）を、デンドリマーに核酸連結された捕捉オリゴヌクレオチドに相補的であるオリゴヌクレオチドに共有結合させる。簡潔に述べると、３’末端によって抗ＣＤ７１抗体（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）またはＴｆＲ標的化ペプチド（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）に対して市販の化学物質を用いて捕捉オリゴヌクレオチド相補体（ｃｐｌＣａｐ０３）、５’−ＴＴＣＴＣＧＴＧＴＴＣＣＧＴＴＴＧＴ  ＡＣＴＣＴＡＡＧＧＴＧＧＡＴＴＴＴＴ−３’（配列番号２）を共有結合させ、ＨＰＬＣにより精製して過剰な試薬を除去する。次いで、試薬の最終アセンブリー（下記の３ＤＮＡ調製セクションを指す。）中にこれらの複合物をデンドリマー捕捉配列に対してハイブリッド形成させる。
【００７２】
ＡＧＲ２／ＤＴおよびＡＧＲ２／ＸＸ  ３ＤＮＡ調製：１ｍｇの２種類のそれぞれのプラスミド（ＡＧＲ２／ＤＴ、ジフテリア毒素Ａ鎖のコード配列に操作可能に連結されるヒトａｎｔｅｒｉｏｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ２（ＡＧＲ２）遺伝子のプロモーターを含有；およびＡＧＲ２／ＸＸ、コード配列なくＡＧＲ２プロモーターを含有）を制限酵素で制限処理して、それを直線状にし、３７℃で２時間にわたり、１０ｍＬの最終体積でエビアルカリホスファターゼ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で脱リン酸化する。その後、１０分間８０℃に加熱することによってこの反応を停止させる。それぞれのアリコートをゲル分析のために採取して、プラスミドの消化を確認する。次に、上記のような市販の化学物質を用いて、デンドリマーの第二の１本鎖表面アームに相補的なオリゴヌクレオチドを直線化プラスミドに共有結合させる。具体的に、第二の１本鎖デンドリマーアームに相補的なハイブリッド形成オリゴヌクレオチド、１０Ｘ核酸連結緩衝液およびＴ４  ＤＮＡリガーゼを直線化プラスミドに添加して、１２ｍＬの最終体積にする。室温のビーカー水浴中で核酸連結を開始させ、次いで４℃に入れてゆっくりと冷却し、一晩継続する。翌朝、アリコートをそれぞれからゲル分析のために採取する。Ｌｏｎｚａ  １．２％アガロースゲルを泳動して、へのハイブリッド形成オリゴヌクレオチドの核酸連結が成功であることを判定する。ＤＮＡデンドリマーおよび各核酸連結済みプラスミドの組み合わせの結果、ＤＮＡデンドリマーがあるウェルへの核酸連結済みプラスミドのシフトが起こり、このことから、プラスミドの核酸連結の成功が示される。次に、Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｎｄｏ−ｆｒｅｅプラスミドＭａｘｉキットおよびＱｉａｇｅｎ  ｔｉｐ−５００を用いて、核酸連結済みプラスミドを精製する。これらのチップの最大容量は５００μｇであるため、各プラスミドに対して２本のチップを使用する。Ｑｉａｇｅｎ  ｔｉｐ−５００からの溶出後、エタノール沈殿の最終段階がある。ペレットを滅菌１ＸＰＢＳで再懸濁し、ナノドロップ（ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いて各精製核酸連結済みプラスミドの最終収率を決定する。
【００７３】
当技術分野で公知の方法を用いて、デンドリマーの第三の１本鎖表面アームに相補的なオリゴヌクレオチドへのＣｙ３の付着によって、標識化オリゴヌクレオチドを調製する。
【００７４】
次に、ＴｆＲペプチド／捕捉相補体（「ＴｆＲペプチド−ｃｐｌＣａｐ０３複合物」）、第二の１本鎖デンドリマーアームの相補体に核酸連結されたプラスミド（「核酸連結済みプラスミド」）および第三の１本鎖デンドリマーアームに相補的な標識化オリゴヌクレオチド（「Ｃｙ３標識オリゴ」）をデンドリマーに対してハイブリッド形成させることによって、各完全修飾３ＤＮＡ試薬を調製する。これは、それらが列挙される順序で次の試薬を組み合わせることによって行った。２ｎ（−）Ｃｙ３  ３ＤＮＡ−ＴｆＲペプチド−ＡＧＲ２／ＤＴの場合、次のように、６００μＬを１０ｎｇ／μＬ  ２ｎ  ３ＤＮＡおよび３１７ｎｇ／μＬプラスミドＤＮＡの最終濃度に調製する：６０００ｎｇ  ２ｎ（−）３ＤＮＡ、６００ｎｇ  ｃ（＋）Ｃｙ３標識オリゴ、２５６．４ｎｇ  ＴｆＲペプチド−ｃｐｌＣａｐ０３複合物、３８５．２μＬ滅菌１ＸＰＢＳおよび１９０．２μｇ核酸連結済みＡＧＲ２／ＤＴ。２ｎ（−）Ｃｙ３  ３ＤＮＡ−ＴｆＲペプチド−ＡＧＲ２／ＸＸの場合、次のように、６００μＬを１０ｎｇ／μＬ  ２ｎ  ３ＤＮＡおよび２２９ｎｇ／μＬプラスミドＤＮＡの最終濃度に調製する：６０００ｎｇ  ２ｎ（−）３ＤＮＡ、６００ｎｇ  ｃ（＋）Ｃｙ３標識オリゴ、２５６．４ｎｇ  ＴｆＲペプチド−ｃｐｌＣａｏ０３複合物、４２５．２μＬ滅菌１ＸＰＢＳおよび１３７．４μｇ核酸連結済みＡＧＲ２／ＸＸ。次に各３ＤＮＡデンドリマー混合物を３７℃で３０分間温置し、次いで使用まで４℃で保存する。
【００７５】
エクスビボ試験：ＤＮＡデンドリマーと組み合わせた粘膜付着性物質でのヒト前癌子宮頸部組織のエクスビボ処置後、ＡＧＲ２／ＤＴおよびＡＧＲ２／ＸＸ  ３ＤＮＡ遺伝子発現および細胞死を試験する。粘膜付着性物質は、ＰＥＧ：デキストラン複合物および／または熱可逆特性のある複合物、例えばＬｕｔｒｏｌ  Ｆ１２７などであり得る。ＡＧＲ２／ＤＴおよびＡＧＲ２／ＸＸをコードするＤＮＡデンドリマーを含有する粘着性物質と重ねた２４ウェル培養皿のウェル中に各試料を置き、２４時間温置する。ルシフェラーゼ生体発光を検出するための光学イメージングおよびアポトーシス細胞を検出するためのＴＵＮＥＬアッセイを行う。
【００７６】
発明者らは、ＡＧＲ２／ＤＴ  ＤＮＡデンドリマーに載せられた粘着性物質とともに温置した試料中で生体発光が観察されるが、ＡＧＲ２／ＸＸ  ＤＮＡデンドリマーで処置した対照試料では観察されないことを予想する。同様に、発明者らは、ＡＧＲ２／ＤＴデンドリマーとともに温置した試料中で多くのアポトーシス細胞が観察され、対照デンドリマーで処置した組織中ではアポトーシス細胞はあまり観察されないことを予想する。
【００７７】
本発明は本明細書中で特定の実施形態を参照して説明するが、これらの実施形態は、本発明の原理および適用の単なる例示であることを理解されたい。当業者にとって当然のことながら、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の方法および装置に対して様々な修飾および変更がなされ得る。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲およびそれらの同等物の範囲内である修飾および変更を含むものとする。
【図１】
2016513089.tif 000003
【図２】
2016513089.tif 000004
【国際調査報告】
2016513089.tif 000005
2016513089.tif 000006
2016513089.tif 000007