(57)【要約】  本発明は、血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶形、結晶形から得られる結晶構造情報、当該結晶形を調製する方法、血液凝固因子ＸＩＩＩａ活性の阻害剤の同定および／または設計のためのそれらの使用、並びに血液凝固因子ＸＩＩＩａと相互作用する、または血液凝固因子ＸＩＩＩａを阻害する能力を有するべき化合物を同定する、最適化する、および設計するための方法に関する。
2016506243.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
空間群Ｐ１、非対称単位における凝固因子ＸＩＩＩａの二つの単量体、並びに、ａ１＝５６±３Å、ｂ１＝８０±３Å、ｃ１＝１０３±３Å、α１＝８８±３゜、β１＝７７±３゜、およびγ１＝８２±３゜の単位胞寸法を有する、または空間群Ｐ１、非対称単位における凝固因子ＸＩＩＩａの二つの単量体、並びに、ａ２＝５７±３Å、ｂ２＝６４±３Å、ｃ２＝６７±３Å、α２＝７６±３゜、β２＝７２±３゜、およびγ２＝８３±３゜の単位胞寸法を有する、または空間群Ｃ２、非対称単位における凝固因子ＸＩＩＩａの二つの単量体、並びに、ａ３＝９０±３Å、ｂ３＝６５±３Å、ｃ３＝７０±３Å、α３＝９０±３゜、β３＝９６±３゜、およびγ３＝９０±３゜の単位胞寸法を有する、と特徴づけられる血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶形。
【請求項２】
図６の原子構造座標によって特徴づけられる、請求項１に記載の血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶形。
【請求項３】
触媒中心および／または前記触媒中心に隣接するポケットを含み、
前記触媒中心は、アミノ酸Ｔｒｐ２７９、Ｃｙｓ３１４、Ｔｒｐ３７０、Ｈｉｓ３７３、およびＡｓｐ３９６を含み、並びに前記触媒中心に隣接するポケットは、アミノ酸Ｔｙｒ２１４、Ｇｌｙ２１５、Ｇｌｕ２１６、Ａｓｐ２１９、Ｌｙｓ２２１、Ａｒｇ２２３、Ａｓｎ２８１、Ｔｙｒ２８３、Ｐｒｏ２８８、Ｐｒｏ２８９、Ｇｌｎ３１３、Ｔｒｐ３１５、Ａｓｎ３７１、およびＴｙｒ３７２を含む、請求項１または請求項２に記載の血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶形。
【請求項４】
疎水性ポケット、並びに前記触媒中心および前記疎水性ポケットの間の表面を含み、
前記疎水性ポケットは、アミノ酸Ａｌａ３４１、Ｍｅｔ３５０、Ａｓｐ３５１、Ｉｌｅ３５２、Ｖａｌ３６０、Ｔｙｒ３６５、Ａｓｐ３６７、Ｓｅｒ３６８、Ｖａｌ３６９、Ｌｅｕ４３９、Ｈｉｓ４５９、およびＩｌｅ４６０を含み、前記触媒中心および前記疎水性ポケットとの間の表面は、アミノ酸Ｐｈｅ３３９、Ｈｉｓ３４２、Ｓｅｒ３６８、Ｖａｌ３６９、Ｔｒｐ３７０、Ａｓｎ３７１、およびＨｉｓ４５９を含む、請求項３に記載の血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶形。
【請求項５】
血液凝固因子ＸＩＩＩａを結晶化する方法であって、次のステップ：
（ａ）０．０４ｍＭ以下の血液凝固因子ＸＩＩＩを含む水溶液を提供すること；および、（ｂ）血液凝固因子ＸＩＩＩに対する阻害剤のモル比率が１０：１〜５０：１になるように、活性剤および阻害剤をステップ（ａ）の水溶液と混合すること；および、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）の溶液を濃縮すること；および、
（ｄ）１０重量％〜２０重量％の少なくとも一つの有機両親媒性小分子、および／または５０ｍＭ〜２００ｍＭの少なくとも一つの無機塩、および／または２０重量％〜３０重量％の沈殿剤を含む緩衝沈殿剤溶液を用いて前記ステップ（ｃ）の濃縮溶液を希釈し、阻害される活性化血液凝固因子ＸＩＩＩａの最終濃度を１．０ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲にすること、
を含む、方法。
【請求項６】
前記ステップ（ａ）における水溶液は、ｐＨが７．０〜９．５の範囲の緩衝水溶液である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ステップ（ｂ）における活性剤は、少なくとも５０ｍＭの濃度のＣａ２＋である、または前記ステップ（ｂ）における活性剤は、少なくとも５ｍＭの濃度のＣａ２＋および少なくとも５００ＮＩＨ  Ｕｎｉｔｓ／ｍＬの濃度のトロンビンの組み合わせである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ステップ（ｄ）における沈殿剤は、ＰＥＧである、請求項５に記載の方法
。
【請求項９】
請求項５〜請求項８のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶形。
【請求項１０】
血液凝固因子ＸＩＩＩａの三次元構造の決定のための、並びに血液凝固因子ＸＩＩＩａの阻害剤の同定および／または設計のための、請求項１〜請求項４、および請求項９のいずれか一項に記載の結晶形の使用。
【請求項１１】
血液凝固因子ＸＩＩＩａと相互作用する、または血液凝固因子ＸＩＩＩａを阻害する化合物を設計する方法であって、次のステップ
（ａ）図６に列挙されるような構造座標を用いて血液凝固因子ＸＩＩＩａの三次元モデルを作り出すこと；および、
（ｂ）血液凝固因子ＸＩＩＩａと相互作用する、または血液凝固因子ＸＩＩＩａを阻害する能力を有するべき化合物を設計するために、前記三次元モデルを用いること、
を含む、方法。
【請求項１２】
次のステップ
（ｃ）設計化合物を得ること；および、
（ｄ）得られた前記設計化合物を、血液凝固因子ＸＩＩＩａに対する阻害効果を決定するために血液凝固因子ＸＩＩＩａと接触させること、
をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
血液凝固因子ＸＩＩＩａを阻害する化合物を同定および／または最適化する方法であって、次のステップ
（ａ）図６に列挙されるような構造座標を用いて血液凝固因子ＸＩＩＩａの三次元モデルを作り出すこと；および、
（ｂ）血液凝固因子ＸＩＩＩａを阻害する能力を有するべき化合物を同定し、または最適化するために、前記三次元モデルを用いること、
を含む、方法。
【請求項１４】
次のステップ
（ｃ）前記同定される化合物、または前記最適化される化合物を得ること；および、
（ｄ）前記同定される化合物、または前記最適化される化合物を、血液凝固因子ＸＩＩＩａに対する阻害効果を決定するために血液凝固因子ＸＩＩＩａと接触させること、
をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１１、または請求項１３に記載の方法であって、
前記血液凝固因子ＸＩＩＩａにおける触媒中心、および／または前記触媒中心に隣接するポケット、および／または疎水性ポケット、および／または前記触媒中心と前記疎水性ポケットとの間の表面の前記三次元モデルは、図６に列挙されるような構造座標を用いて作り出され、前記三次元モデルは、前記触媒中心、前記触媒中心に隣接するポケット、前記疎水性ポケット、および／または、前記触媒中心と前記疎水性ポケットとの間の各表面と相互作用する、または結合する能力を有するべき化合物を設計する、同定する、または最適化するために使用される、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶形、結晶形から得られる結晶構造情報、当該結晶形を調製する方法、血液凝固因子ＸＩＩＩａ活性の阻害剤の同定および／または設計のためのそれらの使用、並びに血液凝固因子ＸＩＩＩａと相互作用する、または血液凝固因子ＸＩＩＩａを阻害する能力を有するべき化合物を同定する、最適化する、および設計するための方法に関する。
［発明の背景］
血栓性事象は、罹患、および死亡の主な原因である。したがって、血栓性事象を予防するための、もしくは治療するための凝固因子又は血小板活性化を標的とする薬物を発展させるために、並外れた努力が行われている。新規の直接作用する経口抗凝固剤は、凝固カスケードにおいて、新規の治療選択を提供する因子ＩＩａ（トロンビン）または因子Ｘａのような中心プロテアーゼに個別に取り組んでいる。
【０００２】
対照的に、凝固因子ＸＩＩＩ（ＥＣ  ２．３．２．１３）は、血漿トランスグルタミナーゼ、またはフィブリン安定化因子（ＦＳＦ）とも呼ばれ、今までのところ、ほんの少しだけ関心を集めている。ヒトトランスグルタミナーゼファミリーは、異なる基質タンパク質間で「クロスリンク」またはイソペプチド結合の特異的形成を触媒する、８つのメンバーからなる。凝固因子ＸＩＩＩは、凝固成熟および付着に影響を及ぼす主要な因子であるので、さらにより低い投与量の凝固溶解剤で、より安全に、より効果的に血栓溶解に潜在的に達するために、さらに血栓予防のためにも、当該酵素は適切な標的と考えられる。
【０００３】
特異的阻害剤は、血栓性事象の高い危険性を有する患者にとって有益であり、またはアテローム性動脈硬化症を予防することになり得る。当該治療的手段は、トロンビンのような上流因子と、または血小板活性化、および血小板活性と明らかに干渉しないだろう。
【０００４】
血漿凝固因子ＸＩＩＩ（ｐＦＸＩＩＩ）は、トランスグルタミナーゼ活性を提供する２つのＡ−サブユニットおよび２つの担体／調節Ｂ−サブユニットからなるヘテロ４量体酵素前駆体である。血小板、または巨核球に由来する因子ＸＩＩＩは、細胞因子ＸＩＩＩ（ｃＦＸＩＩＩ）とも呼ばれ、ホモ二量体Ａ−サブユニットのみからなる。組換え体の細胞性ＦＸＩＩＩ  Ａ−サブユニットは、トランスグルタミナーゼファミリーの初期メンバーであり、不活性酵素前駆体（チモーゲン）として結晶化されており、後に、当該構造は、二量体に崩壊する。  ＦＸＩＩＩａは、ＦＸＩＩＩの任意の触媒活性形を表す。ＦＸＩＩＩは、高カルシウム濃度、すなわち非タンパク質分解性によって（ＦＸＩＩＩａ゜）、またはトロンビンおよびペプチド前駆体のカルシウム（Ｃａ２＋）によるタンパク質分解性開裂によって（ＦＸＩＩＩａ＊）活性化されることができる。
【０００５】
不活性凝固因子ＸＩＩＩの構造は、Ｘ線結晶学によって解決されたトランスグルタミナーゼファミリーの初期メンバーであったとしても、多くの問題が残っている。活性部位は、埋め込まれており、触媒部位への接近は、活性ぺプチドによって隠されている。トロンビン、およびカルシウムによって活性化されるＦＸＩＩＩの結晶化を試みた。しかしながら、開かれた活性部位を有する完全に活性化された配座（ＦＸＩＩＩａ＊）の結晶構造を提供することもできず、配座変化していない不活性な開裂されたＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａ’）の結晶構造が得られたのみであった。全ての実験的試みは、これまで活性配座を明らかにすることができていない。トロンビンによるタンパク質分解活性とカルシウムの付加のどちらも、触媒作用に必須の予期される重大な配座変化につながらない［Ｗｅｉｓｓ
ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９８），４２３，２９１−２９６；Ｆｏｘ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（１９９９），２７４（８），４９１７−４
９２３］。
【０００６】
これまでのところ、因子ＸＩＩＩａのごくわずかな阻害剤が述べられている。例えば、ジャイアント  アマゾン  リーチ（ｇｉａｎｔ  Ａｍａｚｏｎ  ｌｅｅｃｈ）  Ｈａｅｍｅｎｔｅｒｉａ  ｇｈｉｌｉａｎｉｉの唾液線由来の６６アミノ酸ペプチドが、報告されている［Ｆｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９７，３２４，ｐｐ．７９７−８０５］。そのペプチドは、１３を意味するウェールズ語「ｔｒｉａｒｄｄｅｇ」にしたがって、トリデジン（Ｔｒｉｄｅｇｉｎ）と名付けられた。さらに、製薬会社メルク  シャープ  アンド  ドーム（Ｍｅｒｃｈ  Ｓｈａｒｐ  ａｎｄ  Ｄｏｈｍｅ）は、因子ＸＩＩＩを標的にする一連の小分子チオイミダゾール阻害薬を開発した［Ｆｒｅｕｎｄ
ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （１９９４），  ３３，  １０１０９―１０１１９］。しかしながら、選択的手法において因子ＸＩＩＩａを阻害する薬物の開発に成功するために（すなわち、かなり低い程度で他のトランスグルタミナーゼに対処する）、結晶構造に基づくインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）スクリーニング方法が望まれる。
【０００７】
今まで、タンパク質加水分解性、または非タンパク質加水分解性によって活性化される因子ＸＩＩＩａの結晶構造を得ることができないでいる。なぜなら、活性化ＦＸＩＩＩａは固定化されることができず、結晶化条件下、十分に安定でなかったからである。通常、ＦＸＩＩＩの低濃度において、活性化ＦＸＩＩＩａは、活性配座において露出されるチオールの酸化に起因して、容易に当該触媒活性を失う（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９７４，１４１，６８３−６９１）。
【０００８】
ＦＸＩＩＩａの結晶構造を得ることができなかったので、ＦＸＩＩＩａの三次元構造は、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２０１１，９，９−２０に開示されているように、トランスグルタミナーゼ−２およびＦＸＩＩＩとの間の構造的類似性および機能的類似性に単に基づかれる分子モデリングによって開発された。ＦＸＩＩＩａの計算されたモデリング構造は、ＦＸＩＩＩａの正しい構造とはいくつか異なるので、活性化ＦＸＩＩＩａの阻害剤の開発に対して限定的に使用することができる。したがって、タンパク質加水分解性、または非タンパク質加水分解性によって活性化されるＦＸＩＩＩａの結晶構造を得ることは必須である。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶構造座標、血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶形を得る方法、並びに、結晶構造および結晶構造座標に基く血液凝固因子ＸＩＩＩａの阻害剤としての化合物を、設計する、同定する、および最適化する方法を提供することである。
【００１０】
本発明の目的は、独立請求項の教示によって解決される。本発明のさらなる有利な特徴、態様、および詳細は、本出願の独立請求項、明細書、図面、および実施例から明らかである。
［発明の簡単な説明］
本発明は、因子ＸＩＩＩａの阻害剤を同定する方法、並びに血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶形を調製する方法、および血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶構造情報を提供する。本発明は、活性型配座におけるＦＸＩＩＩａの一次のＸ線結晶構造にも関する。これは、活性型配座を捕獲する阻害剤を用いてＦＸＩＩＩを阻害し、結合様式を露出させることによって達成される。活性型配座は、接近可能な活性部位を裂くβバレルドメインの構造的再配列によって更に特徴づけられる。活性部位は、当該構造データの使用に基づく合理的な薬物設計を可能にするデータを提供する。
【００１１】
血液凝固因子ＸＩＩＩは、血漿トランスグルタミナーゼとも呼ばれ、フィブリンクロットを安定化させる特異的な機能を有する。フィブリンのγ鎖間、続いてα鎖間での共有結
合性のクロスリンクの導入は、機械的安定性を提供し、粘弾性特性を調節する。さらに、血漿トランスグルタミナーゼは、抗線維素溶解因子、特にα２−抗プラスミンでクロットを装飾する。何十年にもわたって、因子ＸＩＩＩａは、特異的な作用様式のために特定の危険性の高い患者において、抗凝結のための適切な標的と考えられている。直接作用する阻害薬を用いて因子ＸＩＩＩａを標的にすることは、トロンビンレベル、または血小板活性を障害することなく、重大な出血症状を回避するであろう。
【００１２】
本発明は、血液凝固因子ＸＩＩＩａの阻害剤を同定するおよび／または設計する可能性を提供し、並びに、血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶形、当該結晶形から得られる結晶構造情報、当該結晶形を調製する方法、血液凝固因子ＸＩＩＩａの阻害剤の同定および／または設計のための当該使用、およびこれらの方法によって同定される血液凝固因子ＸＩＩＩａの阻害剤の診断的使用および／または薬学的使用に関する。
［発明の詳細な説明］
本発明は、本願において血液凝固ＦＸＩＩＩａ、または単にＦＸＩＩＩａとも名付けられる血液凝固因子ＸＩＩＩａの活性型配座に関する。
［血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶形］
本発明は、空間群Ｐ１、非対称単位における凝固因子ＸＩＩＩａの二つの単量体、並びにａ１＝５６±３Å、ｂ１＝８０±３Å、ｃ１＝１０３±３Å、α１＝８８±３゜、β１＝７７±３゜、およびγ１＝８２±３゜の単位胞寸法を有する、または空間群Ｐ１、非対称単位における凝固因子ＸＩＩＩａの二つの単量体、並びにａ２＝５７±３Å、ｂ２＝６４±３Å、ｃ２＝６７±３Å、α２＝７６±３゜、β２＝７２±３゜、およびγ２＝８３±３゜の単位胞寸法を有する、または空間群Ｃ２、非対称単位における凝固因子ＸＩＩＩａの二つの単量体、並びにａ３＝９０±３Å、ｂ３＝６５±３Å、ｃ３＝７０±３Å、α３＝９０±３゜、β３＝９６±３゜、およびγ３＝９０±３゜の単位胞寸法を有すると特徴づけられる血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶形に関する。
【００１３】
したがって、今までのところ、凝固因子ＸＩＩＩａの２つの単量体は、常に一つの単位胞に存在しているが、血液凝固因子ＸＩＩＩａの３つの結晶構造を、３つの異なる単位胞で得ることが可能である。
【００１４】
空間群Ｐ１、非対称単位における凝固因子ＸＩＩＩａの二つの単量体、並びにａ１＝５６±３Å、ｂ１＝８０±３Å、ｃ１＝１０３±３Å、α１＝８８±３゜、β１＝７７±３゜、およびγ１＝８２±３゜の単位胞寸法を有する血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶形は、図６における原子構造座標によって更に特徴付けられる。
【００１５】
本願で使用される用語「結晶形」は、血液凝固因子ＸＩＩＩａに結合する阻害剤を用いる、もしくは用いない、および／または界面活性剤を用いる、もしくは用いない、および／または脂質を用いる、もしくは用いない、血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶形に関する。
【００１６】
血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶形は、次の通り特徴付けることもできる。本発明は、空間群Ｐ１、非対称単位における凝固因子ＸＩＩＩａの二つの単量体、並びにａ１＝５６Å±５％、ｂ１＝８０Å±５％、ｃ１＝１０３Å±５％、α１＝８８゜±５％、β１＝７７゜±５％、およびγ１＝８２゜±５％の単位胞寸法を有する、または空間群Ｐ１、非対称単位における凝固因子ＸＩＩＩａの二つの単量体、並びにａ２＝５７Å±５％、ｂ２＝６４Å±５％、ｃ２＝６７Å±５％、α２＝７６゜±５％、β２＝７２゜±５％、およびγ２＝８３゜±５％の単位胞寸法を有する、または空間群Ｃ２、非対称単位における凝固因子ＸＩＩＩａの二つの単量体、並びにａ３＝９０Å±５％、ｂ３＝６５Å±５％、ｃ３＝７０Å±５％、α３＝９０゜±５％、β３＝９６゜±５％、およびγ３＝９０゜±５％の単位胞寸法を有する血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶形に関する。
【００１７】
言い換えると、本発明は、空間群Ｐ１、非対称単位における凝固因子ＸＩＩＩａの二つの単量体、並びにａ１＝５３Å−５９Å、ｂ１＝７６Å−８４Å、ｃ１＝９８Å−１０８Å、α１＝８４゜−９２゜、β１＝７３゜−８１゜、およびγ１＝７８゜−８６゜の単位胞寸法を有する、
または空間群Ｐ１、非対称単位における凝固因子ＸＩＩＩａの二つの単量体、並びにａ２＝５３Å−５９Å、ｂ２＝６１Å−６７Å、ｃ２＝６４Å−７０Å、α２＝７２゜−８０゜、β２＝６８゜−７６゜、およびγ２＝７９゜−８７゜の単位胞寸法を有する、
または空間群Ｃ２、非対称単位における凝固因子ＸＩＩＩａの二つの単量体、並びにａ３＝８６Å−９４Å、ｂ３＝６２Å−６８Å、ｃ３＝６６Å−７４Å、α３＝８６゜−９４゜、β３＝９２゜−１００゜、およびγ３＝８６゜−９４゜の単位胞寸法を有する、と特徴付けられる血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶形を対象とする。
【００１８】
本願で使用される用語「単位胞」は、並進操作のみで結晶を作成することができる最小の繰り返し単位に関する。単位胞は、結晶の構造的情報および対称性情報の全てを含む最小の容量の単位であり、並進によって全ての空間内にパターンを再生することができる。したがって、構造的情報は、全ての周囲空間に加えてパターン（原子）であり、対称性情報は、鏡映、グライド（ｇｌｉｄｅｓ）、軸、反転中心を意味する。並進は、格子端にそって、格子端の長さを動く動作に関する。非対称単位は、結晶学的対称性によって許容される対称演算子のみを用いて一つの単位胞を作り出すために回転され、並進されることができる最小単位である。非対称単位は、多量体タンパク質の一分子、または一サブユニットであってもよいが、二つ以上であることもできる。したがって、非対称単位は、構造的情報の全てを含む容量の最小単位であり、対称操作の適用によって単位胞を再生することができる。単位胞の形は、群を作り出す対称要素の集まりに制約される。空間群は、７つの格子形：三斜、単斜晶系、斜方晶系、四角形、六角形、菱形、立方晶系が可能である。結晶学において、空間群は、結晶群、またはフェドロフ（Ｆｅｄｏｒｏｖ）群とも呼ばれる。
【００１９】
単位胞の端は、一連の単位ベクトル軸ａ、ｂ、およびｃを定義し、それぞれ長さａ、ｂ、およびｃのような単位胞寸法を有する（図７）。これらベクトルは、直角である必要はなく、軸間の角度は、ｂｃ軸間ではα、ａｃ軸間ではβ、およびａｂ軸間ではγとして示される。異なる形は、３つの端（ａ、ｂ、およびｃ）の長さ、および３つの角度（α、β、およびγ）の値に課せられている制約に依存して生じる。
［血液凝固因子ＸＩＩＩａの活性部位］
本発明において、血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶形は、様々な相互作用部位を含む。活性部位は、一般的に酵素反応が起こる部位に関する。対応する受容体または酵素の活性部位と、リガンドまたは基質との関連性は、多くの生物学的機構の基礎である。同様に、多くの薬物は、受容体および酵素の活性部位との関連性を通じて生物学的効果を発揮する。当該関連性は、全ての活性部位、または一部の活性部位で起こり得る。当該関連性の理解は、受容体または酵素とより有利な関連性を有する薬物の設計に基づく構造につながるので、改善された生物学的効果につながるだろう。したがって、この情報は、重要な標的における潜在的な阻害剤の合理的な設計に役立つ。薬物設計に使用されることができる血液凝固因子ＸＩＩＩａの活性部位は、図２〜図５に示され、次の通り分類されることができる。
ａ）触媒中心
ｂ）疎水性ポケット
ｃ）前記触媒中心および疎水性ポケット間の表面
ｄ）触媒中心に隣接するポケット
これらの場所の全て、またはいくつかは、有効性および選択性を標的にする合理的な薬物設計に使用される可能性がある。
【００２０】
したがって、本発明の重大な特徴は、特に４つの主な活性部位、すなわち：
ａ）触媒中心
ｂ）疎水性ポケット
ｃ）前記触媒中心および疎水性ポケット間の表面
ｄ）触媒中心に隣接するポケット
を含み、いくらかの重要なアミノ酸を含む、血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶形にある。
【００２１】
触媒中心は、配列ＩＤ  ＮＯ：１にしたがって、アミノ酸Ｔｒｐ２７９、Ｃｙｓ３１４、Ｔｒｐ３７０、Ｈｉｓ３７３、およびＡｓｐ３９６を含む。これらの残基を、シビル（Ｓｙｂｙｌ）プログラムを用いて同定する。上述のアミノ酸は、阻害剤および基質との相互作用に関して重大であるかもしれない。
【００２２】
疎水性ポケットは、配列ＩＤ  ＮＯ：１にしたがって、アミノ酸Ａｌａ３４１、Ｍｅｔ３５０、Ａｓｐ３５１、Ｉｌｅ３５２、Ｖａｌ３６０、Ｔｙｒ３６５、Ａｓｐ３６７、Ｓｅｒ３６８、Ｖａｌ３６９、Ｌｅｕ４３９、Ｈｉｓ４５９、およびＩｌｅ４６０を含む。疎水性ポケットの詳細は、図３に示されている。上述のアミノ酸は、阻害剤および基質との相互作用に関して重大であるかもしれない。
【００２３】
前記触媒中心および前記疎水性ポケットの間の表面は、配列ＩＤ  ＮＯ：１にしたがって、アミノ酸Ｐｈｅ３３９、Ｈｉｓ３４２、Ｓｅｒ３６８、Ｖａｌ３６９、Ｔｒｐ３７０、Ａｓｎ３７１、およびＨｉｓ４５９を含む。図４は、前記触媒中心および前記疎水性ポケットの間の表面を示す。図２は触媒中心を示す。上述のアミノ酸は、阻害剤および基質との相互作用に関して重大であるかもしれない。
【００２４】
触媒中心に隣接するポケットは、配列ＩＤ  ＮＯ：１にしたがって、アミノ酸Ｔｙｒ２１４、Ｇｌｙ２１５、Ｇｌｕ２１６、Ａｓｐ２１９、Ｌｙｓ２２１、Ａｒｇ２２３、Ａｓｎ２８１、Ｔｙｒ２８３、Ｐｒｏ２８８、Ｐｒｏ２８９、Ｇｌｎ３１３、Ｔｒｐ３１５、Ａｓｎ３７１、およびＴｙｒ３７２を含む。図５は、
触媒中心に隣接するポケットを詳細に示す。上述のアミノ酸は、阻害剤および基質との相互作用に関して重大であるかもしれない。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態において、血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶形は、触媒中心および／または触媒中心に隣接するポケットを含み、当該触媒中心は、アミノ酸Ｔｒｐ２７９、Ｃｙｓ３１４、Ｔｒｐ３７０、Ｈｉｓ３７３、およびＡｓｐ３９６を含み、当該触媒中心に隣接するポケットは、アミノ酸Ｔｙｒ２１４、Ｇｌｙ２１５、Ｇｌｕ２１６、Ａｓｐ２１９、Ｌｙｓ２２１、Ａｒｇ２２３、Ａｓｎ２８１、Ｔｙｒ２８３、Ｐｒｏ２８８、Ｐｒｏ２８９、Ｇｌｎ３１３、Ｔｒｐ３１５、Ａｓｎ３７１、およびＴｙｒ３７２を含む。
【００２６】
本発明の他の好ましい実施形態において、血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶形は疎水性ポケット、並びに触媒中心および前記疎水性ポケットの間の表面を含み、または更に含み、当該疎水性ポケットは、アミノ酸Ａｌａ３４１、Ｍｅｔ３５０、Ａｓｐ３５１、Ｉｌｅ３５２、Ｖａｌ３６０、Ｔｙｒ３６５、Ａｓｐ３６７、Ｓｅｒ３６８、Ｖａｌ３６９、Ｌｅｕ４３９、Ｈｉｓ４５９、およびＩｌｅ４６０を含み、当該触媒中心および疎水性ポケットの間の表面は、アミノ酸Ｐｈｅ３３９、Ｈｉｓ３４２、Ｓｅｒ３６８、Ｖａｌ３６９、Ｔｒｐ３７０、Ａｓｎ３７１、およびＨｉｓ４５９を含む。
【００２７】
血液凝固因子ＸＩＩＩａの潜在的な阻害剤は、血液凝固因子ＸＩＩＩａの活性を低下させるために、これら４つの活性部位の一つ以上に結合することが可能である。したがって、血液凝固因子ＸＩＩＩａに結合する能力を有し得る化合物を設計する、同定する、およ
び／または最適化する方法は、１つ、２つ、３つ、または４つの活性部位の結晶構造座標に、または結晶全体の結晶構造座標に基づくことが可能である。
［血液凝固因子ＸＩＩＩａを結晶化する方法］
本願に開示される血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶形を、次の結晶化方法によって得ることができる。
【００２８】
したがって、本発明の血液凝固因子ＸＩＩＩａを結晶化する方法は、次のステップ：
（ａ）０．０４ｍＭ以下の血液凝固因子ＸＩＩＩを含む水溶液を提供すること；および、（ｂ）血液凝固因子ＸＩＩＩに対する阻害剤のモル比率が１０：１〜５０：１になるように、活性剤および阻害剤をステップ（ａ）の水溶液と混合すること；および、
（ｃ）ステップ（ｂ）の溶液を濃縮すること；および、
（ｄ）１０重量％〜２０重量％の少なくとも一つの有機両親媒性小分子、および／または５０ｍＭ〜２００ｍＭの少なくとも一つの無機塩、および／または２０重量％〜３０重量％の沈殿剤を含む緩衝沈殿剤溶液を用いてステップ（ｃ）の濃縮溶液を希釈し、阻害される活性化血液凝固因子ＸＩＩＩａの最終濃度を１．０ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲にすること、を含む。
【００２９】
結晶化方法は、ＦＸＩＩＩの水溶液を用いて始める。ＦＸＩＩＩの水溶液は、ｐＨが６．５〜１０．０、好ましくは７．０〜９．５、より好ましくは７．５〜９．０、さらにより好ましくは７．８〜８．８、最も好ましくは８．０〜８．６の範囲の緩衝水溶液が好ましい。適切な緩衝液を以下に開示する。血液凝固因子ＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩ）の濃度は、ステップ（ａ）の溶液において、０．０４ｍＭ、好ましくは０．０２ｍＭ、より好ましくは０．０１ｍＭ、さらにより好ましくは０．００５ｍＭを超えるべきではなく、最も好ましくは０．００２ｍＭを超えるべきではない。ＦＸＩＩＩの適切な濃度範囲は、０．００５μＭ〜０．０４ｍＭ、好ましくは０．０１μＭ〜０．０２ｍＭ、より好ましくは０．０５μＭ〜０．０１ｍＭ、さらにより好ましくは０．１μＭ〜５．０μＭ、最も好ましくは０．５μＭ〜２．０μＭである。血液凝固因子ＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩ）の単量体は、約８４１０２ダルトンの分子量を有し、ステップ（ａ）の溶液においてＦＸＩＩＩの当量濃度範囲は、好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ〜０．３ｍｇ／ｍＬである。ＦＸＩＩＩは、不活性化型の血液凝固因子ＸＩＩＩに関し二量体として溶液中に存在し、一方、ＦＸＩＩＩａは、活性型の血液凝固因子ＸＩＩＩに関する。
【００３０】
したがって、本願に開示される結晶化方法におけるステップ（ａ）は、次のように解釈することも可能である：
（ａ）０．００５μＭ〜０．０４ｍＭの血液凝固因子ＸＩＩＩを含む水溶液を提供すること；または、
（ａ）０．０４ｍＭ以下の血液凝固因子ＸＩＩＩを含むｐＨが７．０〜９．５の範囲の緩衝水溶液を提供すること；または、
（ａ）０．００５μＭ〜０．０４ｍＭの血液凝固因子ＸＩＩＩを含むｐＨが７．０〜９．５の範囲の緩衝水溶液を提供すること。
【００３１】
ステップ（ｂ）において、活性剤および阻害剤をステップ（ａ）の水溶液と混合し、好ましくは活性剤の溶液、より好ましくは活性剤の緩衝溶液と阻害剤の水溶液または阻害剤の有機溶液とをステップ（ａ）の溶液と混合させる。
【００３２】
活性剤は、好ましくは完全に解離するカルシウム塩であり、または、好ましくは完全に解離するカルシウム塩の混合物であり、ＦＸＩＩＩａを含むステップ（ｂ）の溶液において、Ｃａ２＋の濃度は、２５ｍＭ〜５００ｍＭ、より好ましくは４０ｍＭ〜３００ｍＭ、さらにより好ましくは４５ｍＭ〜２００ｍＭ、さらにより好ましくは５０ｍＭ〜１５０ｍＭのＣａ２＋イオンの範囲で得られるようにする。Ｃａ２＋イオン濃度の上限値は、重要
、または必須ではないので、ステップ（ｂ）の溶液において、Ｃａ２＋イオンの濃度は、少なくとも２５ｍＭ、好ましくは少なくとも４０ｍＭ、より好ましくは少なくとも４５ｍＭ、さらにより好ましくは少なくとも５０ｍＭであるべきである。
【００３３】
Ｃａ２＋イオンの代わりに、トロンビンおよびＣａ２＋イオンの混合物を、血液凝固因子ＸＩＩＩを活性化するために活性剤として使用することができる。当該組み合わせを使用する場合、ステップ（ｂ）の溶液におけるトロンビンの濃度は、好ましくは５００〜２．０００ＮＩＨ  Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、より好ましくは７５０〜１５００ＮＩＨ  Ｕｎｉｔｓ／ｍＬであり、またはステップ（ｂ）の溶液におけるトロンビンの濃度は、好ましくは少なくとも５００ＮＩＨ  Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも７５０ＮＩＨ  Ｕｎｉｔｓ／ｍＬであり、Ｃａ２＋イオンの濃度は、少なくとも１ｍＭ、好ましくは少なくとも５ｍＭ、より好ましくは少なくとも１０ｍＭ、さらにより好ましくは少なくとも２０ｍＭ、さらにより好ましくは少なくとも３０ｍＭであり、言い換えるとＣａ２＋イオンの濃度は、１ｍＭ〜２５０、好ましくは３ｍＭ〜１００ｍＭ、より好ましくは５ｍＭ〜３０ｍＭの範囲であるべきである。ＮＩＨ  Ｕｎｉｔｓとして定義されるトロンビンの濃度は、ＮＩＨトロンビン参照基準に従っている。
【００３４】
適切なカルシウム塩は、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＢｒ２、水酸化カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、乳酸カルシウム、リンゴ酸カルシウム、フマル酸カルシウム、またはそれらの混合物である。好ましくはＣａＣｌ２の使用である。
【００３５】
活性剤および／または阻害剤を、乾燥固体物質としてステップ（ａ）における溶液に添加することができるが、活性剤および阻害剤を含む好ましくは水溶液として、より好ましくは緩衝水溶液として添加する。阻害剤を、溶液に添加する、好ましくは活性剤および溶液との緩衝溶液に添加することが可能であり、好ましくは、ＦＸＩＩＩの緩衝溶液を、続いて活性剤および阻害剤との溶液に添加することは明らかである。ステップ（ｂ）の溶液において最終的に存在する成分の添加の順序は重要ではない。しかしながら、水と混合できる少量の有機溶媒中に溶解される、または水／有機溶媒混合物中に溶解される阻害剤を、活性剤の溶液に添加し、その後、この溶液にＦＸＩＩＩの溶液を添加することが好ましい。これらの溶液の適切な緩衝液は、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、およびトリエタノールアミン緩衝液がある。好ましくは、ステップ（ａ）の溶液と同じ緩衝液を、ステップ（ｂ）に使用する。所望のｐＨ値が得られない場合、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、または水酸化カリウムのような弱塩基もしくは希塩基、または弱酸もしくは希酸の添加によってｐＨ調節を行うことができる。活性剤および阻害剤との溶液をステップ（ａ）の溶液と混合することによって、ステップ（ｂ）の溶液の濃度を得る。したがって、上記のようなＣａ２＋イオンの濃度は、活性剤、阻害剤、およびＦＸＩＩＩ／ＦＸＩＩＩａを含む溶液における濃度である。
【００３６】
本願に開示される結晶化方法におけるステップ（ｂ）は、次の通り解釈することも可能である：
（ｂ）Ｃａ２＋イオンの濃度が５０ｍＭ〜１５０ｍＭ、および血液凝固因子ＸＩＩＩに対する阻害剤のモル比が１０：１〜５０：１となるように、阻害剤と、活性剤としてカルシウム塩またはカルシウム塩の混合物と、をステップ（ａ）における水溶液と混合すること、または、Ｃａ２＋イオンの濃度が５ｍＭ〜３０ｍＭ、トロンビンの濃度が５００〜２．０００ＮＩＨ  Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、および血液凝固因子ＸＩＩＩに対する阻害剤のモル比が１０：１〜５０：１となるように、阻害剤と、活性剤としてカルシウム塩またはカルシウム塩の混合物およびトロンビンと、をステップ（ａ）における水溶液と混合すること、または、
（ｂ）Ｃａ２＋イオンの濃度が少なくとも５０ｍＭ、および血液凝固因子ＸＩＩＩに対す
る阻害剤のモル比が１０：１〜５０：１となるように、阻害剤と、活性剤としてカルシウム塩またはカルシウム塩の混合物と、をステップ（ａ）における水溶液と混合すること、または、Ｃａ２＋イオンの濃度が少なくとも５ｍＭ、トロンビンの濃度が少なくとも５００ＮＩＨ  Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、および血液凝固因子ＸＩＩＩに対する阻害剤のモル比が１０：１〜５０：１となるように、阻害剤と、活性剤としてカルシウム塩またはカルシウム塩の混合物およびトロンビンと、をステップ（ａ）における水溶液と混合すること。
【００３７】
したがって、本発明の更なる態様は、次のステップを含む血液凝固因子ＸＩＩＩａを結晶化する方法に関する：
（ａ）０．０４ｍＭ以下の血液凝固因子ＸＩＩＩを含むｐＨが７．０〜９．５の範囲の緩衝水溶液を提供すること；および、
（ｂ）５０ｍＭ〜１５０ｍＭのＣａ２＋イオンの濃度、および１０：１〜５０：１の血液凝固因子ＸＩＩＩに対する阻害剤のモル比を得るために、阻害剤と、活性剤として少なくとも一つのカルシウム塩と、をステップ（ａ）における水溶液と混合すること；
または、
５ｍＭ〜３０ｍＭのＣａ２＋イオンの濃度、５００〜２．０００ＮＩＨ  Ｕｎｉｔｓ／ｍＬのトロンビンの濃度、および１０：１〜５０：１の血液凝固因子ＸＩＩＩに対する阻害剤のモル比を得るために、阻害剤と、活性剤として少なくとも一つのカルシウム塩およびトロンビンと、をステップ（ａ）における水溶液と混合すること；および、
（ｃ）ステップ（ｂ）の溶液を濃縮すること；および、
（ｄ）１０重量％〜２０重量％の少なくとも一つの有機両親媒性小分子、および／または５０ｍＭ〜２００ｍＭの少なくとも一つの無機塩、および／または２０重量％〜３０重量％の沈殿剤を含む緩衝沈殿剤溶液を用いてステップ（ｃ）の濃縮溶液を希釈し、阻害される活性化血液凝固因子ＸＩＩＩａの最終濃度を１．０ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲にすること。
【００３８】
言い換えると、本発明の更なる態様は、次のステップを含む血液凝固因子ＸＩＩＩａを結晶化する方法に関する：
（ａ）０．０４ｍＭ以下の血液凝固因子ＸＩＩＩを含むｐＨが７．０〜９．５の範囲の緩衝水溶液を提供すること；および、
（ｂ）少なくとも５０ｍＭのＣａ２＋イオンの濃度、および少なくとも１０：１の血液凝固因子ＸＩＩＩに対する阻害剤のモル比を得るために、阻害剤と、活性剤として少なくとも一つのカルシウム塩と、をステップ（ａ）における水溶液と混合すること；
または、少なくとも５ｍＭのＣａ２＋イオン濃度、少なくとも５００ＮＩＨ  Ｕｎｉｔｓ／ｍＬのトロンビン濃度、および少なくとも１０：１の血液凝固因子ＸＩＩＩに対する阻害剤のモル比を得るために、阻害剤と、活性剤として少なくとも一つのカルシウム塩およびトロンビンと、をステップ（ａ）における水溶液と混合すること；および、
（ｃ）ステップ（ｂ）の溶液を濃縮すること；および、
（ｄ）１０重量％〜２０重量％の少なくとも一つの有機両親媒性小分子、および／または５０ｍＭ〜２００ｍＭの少なくとも一つの無機塩、および／または２０重量％〜３０重量％の沈殿剤を含む緩衝沈殿剤溶液を用いてステップ（ｃ）の濃縮溶液を希釈し、阻害される活性化血液凝固因子ＸＩＩＩａの最終濃度を１．０ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲にすること。
【００３９】
阻害剤は、ステップ（ｂ）の溶液において得られる血液凝固因子ＸＩＩＩ（不活性形）に対する阻害剤のモル比が、２：１〜１００：１、好ましくは、５：１〜７５：１、より好ましくは１０：１〜５０：１の範囲になる量でステップ（ａ）における溶液に添加される。
【００４０】
好ましくは９０％を超える純度を有する単一の十分に純粋な阻害剤を用いるべきである
。阻害剤の混合物の使用は好ましくない。さらに、阻害剤の溶液をステップ（ａ）における緩衝水溶液に添加する場合、血液凝固因子ＸＩＩＩおよびＣａ２＋イオンの定義された濃度が、定義された範囲内になるように相対的に少量のみを添加するべきである。阻害剤のための適切な溶媒は、水、ＤＭＳＯ、アセトン、ＴＨＦ、ＤＭＦ、メタノール、エタノール、またはそれらの混合物である。有機溶媒を使用する場合、ステップ（ｂ）において得られる溶液１ｍＬにつき１μＬ〜２０μＬとなるように、少量のみを使用するべきである。ＦＸＩＩＩ／ＦＸＩＩＩａ、阻害剤、および活性剤を含むステップ（ｂ）における溶液のｐＨは、６．５〜１０．０、好ましくは、７．０〜９．５、より好ましくは７．５〜９．０、さらにより好ましくは７．８〜８．８、最も好ましくは８．０〜８．６の範囲である。
【００４１】
活性剤および阻害剤をステップ（ａ）における水溶液と混合後、または好ましくは活性剤の溶液および阻害剤の溶液をステップ（ａ）における水溶液と混合後、ステップ（ｂ）において得られる溶液を、室温、大気圧、数時間または一晩、好ましくは光を遮断して、円滑に撹拌すると好ましい。
【００４２】
ステップ（ｂ）において使用される阻害剤に関して、血液凝固因子ＸＩＩＩａの可逆的なまたは不可逆的な阻害につながる可逆的阻害剤、または不可逆的阻害剤を使用することが可能である。本願に述べられるようなほとんど知られていない阻害剤を使用すること可能である。適切な阻害剤の更なる例は、血液凝固因子ＸＩＩＩａにおけるアミノ酸のチオール基と共有結合を形成することができる官能基を有する化合物である。当該化合物は、不可逆的阻害剤であり、通常、共有結合することにより、酵素を永久に修飾するので、阻害を無効にすることはできない。可逆的阻害剤は、酵素活性の阻害を有し、阻害する分子実体が、タンパク質の活性部位と結合し、タンパク質の活性部位から解離することができる。共有結合性の可逆的阻害剤は、おそらく活性部位のシステインチオールと反応することによって血液凝固因子ＸＩＩＩａを不活性化し、結果的に、ヘミ−チオアセタール、ケタール、または類似の４面体中間体の形成をもたらし、共有結合性の可逆的阻害剤の特性は、その弾頭（ｗａｒｈｅａｄ）に依存する。血液凝固因子ＸＩＩＩａの可逆的阻害剤は、アルデヒド、ケトン、α−ケトケトン、α−ケトエステル、α−ケトアミド、イミン、およびヒドラゾンのような反応性官能基を含む。血液凝固因子ＸＩＩＩａの不可逆的阻害剤は、ナイトロジェンマスタード、ハロアルカン、アルケン、マイケル受容体、フェニルスルホネート、またはフルオロホスホネートのような反応性官能基を含む。これらの求電子基は、共有結合性付加物を形成するためにアミノ酸側鎖と反応する。修飾残基は、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、またはスルフヒドリル基（−ＳＨ）のような求核性基を含む側鎖を有する残基である。残基は、アミノ酸セリン、システイン、スレオニン、またはチロシンを含む。本発明において開示される血液凝固因子ＸＩＩＩａの好ましい阻害剤は、α，β−不飽和カルボニル部分のようなマイケル受容体を有する。血液凝固因子ＸＩＩＩａは、触媒中心において、マイケル受容体に共有結合的に付加することが可能なシステイン（Ｃｙｓ３１４）を有する。当該不可逆的阻害剤は、血液凝固因子ＸＩＩＩａの少なくとも一つの活性部位および側鎖で認識するためのペプチド骨格、またはペプチド模倣性骨格を好ましくは含み、、血液凝固因子ＸＩＩＩａの少なくとも一つの活性部位および側鎖は、マイケル受容体部分を有するペプチド骨格またはペプチド模倣性骨格のアミノ酸またはアミノ酸類似体のα炭素原子に好ましくは結合する。
【００４３】
当該阻害剤の実施例は、一般式（Ｉ）の化合物であり、
【００４４】
【化１】
2016506243.tif 000003
【００４５】
式中、
Ｒ１はＡｃ−Ａｓｐ、または４−オキソピロリジン−２−カルボキシルを表し、
Ｒ２は、
【００４６】
【化２】
2016506243.tif 000004
【００４７】
を表し、および、
Ｒ３はＮｌｅ、またはＩｌｅを表す。
本発明の好ましい実施形態において、阻害剤１（化合物４）を使用し、式中、Ｒ１はＡｃ−Ａｓｐ、およびＲ３はＮｌｅである。血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶形は、空間群Ｐ１、非対称単位における凝固因子ＸＩＩＩａの二つの単量体、並びに、ａ＝５６．８Å、ｂ＝８０．５Å、ｃ＝１０２．８Å、α＝８８．１゜、β＝７６．７゜、およびγ＝８２．０゜の単位胞寸法を有する、または空間群Ｐ１、非対称単位における凝固因子ＸＩＩＩａの二つの単量体、並びに、ａ＝５６．６Å、ｂ＝６４．２Å、ｃ＝６７．１Å、α＝７６．４゜、β＝７１．７゜、およびγ＝８２．８゜の単位胞寸法を有する、と特徴付けられる。
【００４８】
本発明の他の好ましい実施形態において、阻害剤２（化合物７）を使用し、式中、Ｒ１は４−オキソピロリジン−２−カルボキシル、およびＲ３はＩｌｅである。血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶形は、空間群Ｃ２、非対称単位における凝固因子ＸＩＩＩａの二つの単量体、並びに、ａ＝９０．２Å、ｂ＝６４．８Å、ｃ＝７０．４Å、α＝９０．０゜、β＝９５．８゜、およびγ＝９０．０゜の単位胞寸法を有すると特徴付けられる。
【００４９】
血液凝固因子ＸＩＩＩａの一つの結晶形は、下記の図６の原子構造座標によって特徴付けられる。
本発明の結晶形を、バッチ法、液架橋（ｌｉｑｕｉｄ  ｂｒｉｄｇｅ）法、自由界面拡散法、透析法、蒸気拡散法、ハンギングドロップ法、またはシッティングドロップ法を含む、タンパク質結晶学の技術分野で周知の技術によって得ることができる。
【００５０】
本発明の他の態様は、血液凝固因子ＸＩＩＩａを結晶化する方法に関し、次のステップ、
（ａ）０．００５μＭ〜０．０４ｍＭの血液凝固因子ＸＩＩＩを含む水溶液を提供すること；および、
（ｂ）血液凝固因子ＸＩＩＩを活性化し、１０：１〜５０：１の血液凝固因子ＸＩＩＩに対する阻害剤のモル比で、阻害剤をステップ（ａ）における水溶液と混合すること；および、
（ｃ）ステップ（ｂ）の溶液を、阻害される活性化血液凝固因子ＸＩＩＩａが２．０ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように濃縮すること；および、
（ｄ）１０重量％〜２０重量％の少なくとも一つの有機両親媒性小分子、および／または５０ｍＭ〜２００ｍＭの少なくとも一つの無機塩、および／または２０重量％〜３０重量
％の沈殿剤を含む緩衝沈殿剤溶液を用いてステップ（ｃ）の濃縮溶液を希釈し、阻害される活性化血液凝固因子ＸＩＩＩａの最終濃度を１．０ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲にすること、
を含む。
【００５１】
ＦＸＩＩＩの活性化は、Ｃａ２＋イオンを用いることによって、またはトロンビンをＣａ２＋イオンと組み合わせて用いることによって達成されることができる。
本発明の更なる態様は、血液凝固因子ＸＩＩＩａを結晶化する方法に関し、次のステップ、
（ａ）０．０４ｍＭ以下の血液凝固因子ＸＩＩＩを含み、ｐＨが７．０〜９．５の範囲の緩衝水溶液を提供すること；および、
（ｂ）１０：１〜５０：１の血液凝固因子ＸＩＩＩに対する阻害剤のモル比を得るために、阻害剤と、活性剤としてカルシウム塩の溶液またはカルシウム塩およびトロンビンの溶液とをステップ（ａ）における水溶液と混合すること；および、
（ｃ）ステップ（ｂ）の溶液を、阻害される活性化血液凝固因子ＸＩＩＩａが２．０ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように濃縮すること；および、
（ｄ）１０重量％〜２０重量％の少なくとも一つの有機両親媒性小分子、および／または５０ｍＭ〜２００ｍＭの少なくとも一つの無機塩、および／または２０重量％〜３０重量％の沈殿剤を含む緩衝沈殿剤溶液を用いてステップ（ｃ）の濃縮溶液を希釈し、阻害される活性化血液凝固因子ＸＩＩＩａの最終濃度を１．０ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲にすること、
を含む。
【００５２】
ステップ（ｂ）は、好ましくは次のとおり解釈する。
（ｂ）阻害剤と、活性剤としてカルシウム塩の緩衝溶液またはカルシウム塩およびトロンビンの緩衝溶液とをステップ（ａ）における水溶液と混合し、１０：１〜５０：１の血液凝固因子ＸＩＩＩに対する阻害剤のモル比を得る。
【００５３】
ステップ（ｂ）において、ＦＸＩＩＩからＦＸＩＩＩａへの活性化、およびＦＸＩＩＩａの阻害後、ステップ（ｂ）において得られる溶液を、続いて水の蒸発によって好ましくは濃縮する。ステップ（ｃ）において溶液の濃縮後、精製ステップを有利に含めることができる。したがって、ステップ（ｃ）は、実際は２つのステップ、すなわち、溶液の濃縮、および濃縮溶液の精製、からなってもよい。精製は、過剰のトロンビン（使用する場合）、および／または阻害剤を除去するために好まれるであろう。クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィーなどのような適切な精製法は、当業者に公知である。さらに、精製ステップ後、阻害されたＦＸＩＩＩａを含む精製溶液の希釈は、緩衝沈殿剤溶液が加えられる前に、希釈緩衝液を用いて精製溶液を希釈するので必須になり得る。
【００５４】
したがって、本願に開示される全ての結晶化方法において、ステップ（ｃ）は、次の通り解釈する。
（ｃ）ステップ（ｂ）における溶液を濃縮し、および濃縮溶液の精製する、
または、
（ｃ）ステップ（ｂ）における溶液を濃縮し、および濃縮溶液を精製し、阻害される活性化血液凝固因子ＸＩＩＩａの濃度を２．０ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬにする、
または、
（ｃ）ステップ（ｂ）における溶液を濃縮し、濃縮溶液を精製し、および水、または水性緩衝溶液を用いて精製溶液を希釈する、
または、
（ｃ）ステップ（ｂ）における溶液を濃縮し、阻害される活性化血液凝固因子ＸＩＩＩａの濃度が２．０ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬになるように濃縮溶液を精製し、および水、
または水性緩衝溶液を用いて精製溶液を希釈する。
【００５５】
希釈用の水性緩衝溶液は、本願に開示される緩衝剤の一つを含み、好ましくはＴｒｉｓ−ＨＣｌであり、好ましくはｐＨが７．０〜９．０、より好ましくはｐＨが７．５〜８．５である。
【００５６】
濃縮ステップ（ｃ）、または濃縮および精製ステップ（ｃ）の後、阻害される活性化血液凝固因子ＸＩＩＩａの濃度は、２．０ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬの範囲であるべきである。この濃度は、ステップ（ｄ）における緩衝沈殿剤溶液での希釈の前に、および水性緩衝液での希釈の前に、ステップ（ｃ）の最後で活性化され、阻害されるＦＸＩＩＩａの濃度である。ステップ（ｃ）の濃縮溶液における、またはステップ（ｃ）の濃縮中の、または、濃縮および精製ステップ（ｃ）後の活性化され阻害されるＦＸＩＩＩａの濃度を、例えば実施例１３に述べられるブラッドフォードタンパク質アッセイによって決定することが可能である。
【００５７】
ステップ（ｄ）において、少なくとも一つの有機両親媒性小分子、および／または少なくとも一つの無機塩、および／または少なくとも一つの沈殿剤（沈殿剤（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔ）とも呼ばれる）の緩衝沈殿剤溶液を、ステップ（ｃ）の混合物に加える。ステップ（ｃ）における濃縮および任意に精製された溶液、またはステップ（ｃ）における濃縮、精製、希釈された溶液の好ましくは２μＬは、緩衝沈殿剤溶液１．０〜３．０μＬ、好ましくは１．４〜２．６μＬ、より好ましくは１．８〜２．２μＬ用いて希釈される。
【００５８】
好ましくは、有機両親媒性小分子は、次を含む群、または次からなる群から選択される。グリセロール、エチレングリコール、ブチルエーテル、ベンズアミジン、ジオキサン、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、メチルペンタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタントリオール、ジチオスレイトール、ＭＥＳ、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、イミダゾール、ビシン、トリメチルアミンＮ−オキシド、コハク酸、ＤＬ−リンゴ酸、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、グリシン、ＣＡＰＳＯ、ＡＤＡ、ＭＯＰＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＳＰＧ、ＭＩＢ、ＰＣＢ、ＭＭＴ、Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）、ＴＲＩＳ、およびスクロース。
【００５９】
有機両親媒性小分子として好ましくは、グリセロールである。
用語「少なくとも一つの有機両親媒性小分子」は、上記有機両親媒性小分子の混合物が使用される可能性があることを意味する。有機両親媒性小分子の混合物が使用される場合、使用される量は、全ての有機両親媒性小分子を総合した全量に関する。緩衝沈殿剤溶液中、全ての有機両親媒性小分子を総合した使用量は、緩衝沈殿剤溶液の全重量に対して、有機両親媒性小分子または有機両親媒性小分子の混合物が１重量％〜５０重量％、好ましくは、５重量％〜３０重量％、より好ましくは１０重量％〜２０重量％である。
【００６０】
さらに、少なくとも一つの無機塩は、１０ｍＭ〜６００ｍＭ、好ましくは２０ｍＭ〜５００ｍＭ、より好ましくは３０ｍＭ〜４００ｍＭ、より好ましくは４０ｍＭ〜３００ｍＭ、最も好ましくは５０ｍＭ〜２００ｍＭの量で使用される。二つ以上の無機塩を使用する場合、上記濃度は、無機塩を総合した濃度であり、無機塩の混合物において使用される一つ一つの塩の濃度ではない。
【００６１】
好ましくは、無機塩は、次を含む群、または次からなる群から選択される。塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、フッ化アンモニウム、臭化アンモニウム、ヨウ化アンモニウム、窒化アンモニウム、塩化カドミウム、硫酸カドミウム、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、塩化セシウム、硫酸セシウム、塩化コバルト、塩化鉄、酢酸リ
チウム、塩化リチウム、硝酸リチウム、硫酸リチウム、酢酸マグネシウム、ギ酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩化ニッケル、酢酸カリウム、臭化カリウム、フッ化カリウム、ギ酸カリウム、ヨウ化カリウム、硝酸カリウム、チオシアン酸カリウム、酒石酸カリウム／ナトリウム、酢酸ナトリウム、臭化ナトリウム、フッ化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、酢酸亜鉛、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、カコジル酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、塩化カリウム、水酸化カリウム、硫酸カリウム、酢酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、ギ酸アンモニウム、酒石酸ジアンモニウム、マロン酸ナトリウム、酒石酸ジナトリウム、コハク酸ナトリウム、およびコハク酸ナトリウム。好ましい無機塩は、硫酸アンモニウム、またはカコジル酸ナトリウム、またはそれらの混合物である。
【００６２】
理論的には、少なくとも一つの沈殿剤は、タンパク質溶質と水をめぐって競合するので、タンパク質の過飽和につながる。結晶は、通常、単に過飽和状態から成長することができ、したがって、結晶は、沈殿剤から成長することができる。塩、ポリマー、および有機溶媒は、適切な沈殿剤であり、緩衝沈殿剤溶液の全重量に対して、沈殿剤または沈殿剤の混合物が５重量％〜５０重量％、好ましくは１０重量％〜４０重量％、より好ましくは１５重量％〜３５重量％、最も好ましくは２０重量％〜３０重量％の量で使用される。
【００６３】
ステップ（ｄ）の緩衝沈殿剤溶液において使用される沈殿剤は、次からなる群、または次を含む群から好ましくは選択されてもよい：２−メチル−２，４−ペンタンジオール、グリセロール、フッ化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸アンモニウム、硫酸リチウム、硫酸ナトリウム、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、セチルトリメチルアンモニウム塩、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ジェファーミン（ｊｅｆｆａｍｉｎｅ）、ＭＰＤ、ペンタエリストリトールプロポキシレート、ペンタエリストリトールエトキシレート、ポリアクリル酸ナトリウム、ヘキサンジオール、イソプロパノール、エタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ジオキサン、エチレンイミンポリマー、エチレングリコール、プロパンジオール、ポリアクリル酸、ポリビニルピロリドン、２−エトキシエタノール、ブタンジール、またはそれらの混合物。ＰＥＧは、ＨＯ−ＣＨ２−（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−）ｎ−ＣＨ２−ＯＨの構造を有するポリエーテル化合物である。ＰＥＧは、２０，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有するオリゴマーおよびポリマーに関する傾向がある。本発明の結晶化のための方法において使用される沈殿剤として最も好ましくは、ＰＥＧであり、好ましくはＰＥＧ２００〜ＰＥＧ２０，０００の範囲の分子量を有し、より好ましくはＰＥＧ１，０００〜ＰＥＧ１８，０００の範囲の分子量を有し、さらにより好ましくはＰＥＧ５，０００〜ＰＥＧ１５，０００の範囲の分子量を有し、最も好ましくはＰＥＧ７，０００〜ＰＥＧ１０，０００の範囲の分子量を有する。イソプロパノール、または１，３−プロパンジオールのような有機溶媒は、貯蔵溶液の一部であってもよい。ＰＥＧは、非常に好ましい沈殿剤であり、緩衝沈殿剤溶液の２０〜３０重量％の量で好ましくは使用される。
【００６４】
ハンギングドロップ法、またはシッティングドロップ法を結晶化のために使用する。「ハンギングドロップ蒸気拡散」技術は、高分子の結晶化のために最も一般的な方法である。蒸気拡散の原理は容易である。試料および試薬の混合物から構成されるドロップを、試薬の液体容器を用いて蒸気平衡になるまで留置する。典型的にドロップは、容器内の液体より低い濃度の試薬を含む。平衡に達すると、水蒸気はドロップから出て、最終的に容器内に落ちる。水がドロップから出るので、試料は相対的に過飽和度が増加する。水がドロップから容器に出るので、試料及び試薬の両方の濃度は増加する。ドロップ中の試薬濃度が、容器内の試薬濃度とおおよそ同じになる時に平衡に達する。
【００６５】
したがって、本発明の他の態様は、血液凝固因子ＸＩＩＩａを結晶化する方法に関し、次のステップ：
（ａ）０．０４ｍＭ以下の血液凝固因子ＸＩＩＩを含みｐＨが７．０〜９．５の範囲の緩衝水溶液を提供すること；および、
（ｂ）少なくとも５０ｍＭのＣａ２＋イオンの濃度、および少なくとも１０：１の血液凝固因子ＸＩＩＩに対する阻害剤のモル比を得るために、阻害剤と、活性剤として少なくとも一つのカルシウム塩と、をステップ（ａ）における水溶液と混合すること；
または、少なくとも５ｍＭのＣａ２＋イオン濃度、および少なくとも５００ＮＩＨ  Ｕｎｉｔｓ／ｍＬのトロンビン濃度、および少なくとも１０：１の血液凝固因子ＸＩＩＩに対する阻害剤のモル比を得るために、阻害剤と、活性剤として少なくとも一つのカルシウム塩およびトロンビンの溶液とをステップ（ａ）における水溶液と混合すること；および、（ｃ）ステップ（ｂ）の溶液を、阻害される活性化血液凝固因子ＸＩＩＩａが２．０ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように濃縮すること；および、
（ｄ）１０重量％〜２０重量％の少なくとも一つの有機両親媒性小分子、および／または５０ｍＭ〜２００ｍＭの少なくとも一つの無機塩、および／または２０重量％〜３０重量％のＰＥＧを含む緩衝沈殿剤溶液を用いてステップ（ｃ）の濃縮溶液を希釈し、阻害される活性化血液凝固因子ＸＩＩＩａの最終濃度を１．０ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲にすること、
を含む。
【００６６】
ステップ（ｃ）は、精製および任意に希釈ステップも含んでもよい。水性緩衝溶液が、ステップ（ｃ）における濃縮溶液および精製溶液を希釈するために使用される場合、好ましくは、ステップ（ａ）および／または（ｂ）において使用されたのと同じ緩衝液を再び使用し、緩衝液は、好ましくはｐＨが７．０〜９．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液である。緩衝沈殿剤溶液は、好ましくは、室温、大気圧下で調製され、その後、ステップ（ｃ）における濃縮溶液、または濃縮、精製溶液、または濃縮、精製、希釈溶液に添加される。
【００６７】
次の緩衝液を、緩衝水溶液を調製するためにステップ（ａ）において、並びに阻害剤および／または活性剤を緩衝水溶液として加える場合、ステップ（ｂ）において、並びに緩衝沈殿剤溶液を調製するためにステップ（ｄ）において、使用する可能性がある。
【００６８】
【表１】
2016506243.tif 000005
【００６９】
好ましくは、ｐＨが６．０〜９．５、より好ましくはｐＨが７．０〜８．５の効果的なｐＨ範囲を有する緩衝液である。各緩衝液の効果的なｐＨ範囲を、ｐＫａ−１〜ｐＫａ＋１として定義することができ、Ｋａは、緩衝液において弱酸のイオン化定数であり、ｐＫａ＝−ｌｏｇＫである。したがって、緩衝液は、ｐＫａが７．０〜８．０であると好ましい。
【００７０】
結晶化方法におけるステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｄ）の緩衝水溶液は、室温、大気圧下で好ましくは調製される。
好ましくは、これらの水溶液は、血液凝固因子ＸＩＩＩ又は当該活性化され阻害された形を変性する物質、を含むべきではない。
【００７１】
ステップ（ａ）、および（ｂ）における溶液は、カルシウムと複合体を形成する物質、またはわずかに水溶性のカルシウム塩を形成する物質を含むべきではない。したがって、これらの水溶液は、例えば、錯化剤、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、スルフィド、クエン酸塩、リン酸塩、炭酸塩、過酸化水素、アクリルアミド、アクリル酸塩、メタクリレート、のような、血液凝固因子ＸＩＩＩａもしくは当該活性化され阻害された形に作用し、もしくは変性し得る物質を含むべきではなく、、または水溶性のカルシウム塩をほとんど形成し得ることはない。
【００７２】
しかしながら、複数の界面活性剤、または少なくとも一つの界面活性剤はこれらの溶液中に存在し得る。好ましい界面活性剤は、例えば、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（β−ＯＧ）、ｎ−オクタノイルスクロース、ＤＤＭ（ドデシルマルトシド）、アルキルオリゴオキシエチレン、Ｃ８Ｅ５、ポリディスパース（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｅ）ポリオキシエチレン、およびトリトンのような非イオン性界面活性剤または糖含有界面活性剤、両性洗浄剤のようなスルホベタイン、およびベタインを含む両性イオン界面活性剤（両性界面活性剤）、ラウリルジメチルアミンオキシド（ＬＤＡＯ）のようなアルキルジメチルアミンオキシドを含むカチオン性界面活性剤、ＣＨＡＰＳのようなＣＨＡＰＳシリーズ、を含む群から選択される。好ましくは、界面活性剤はカチオン性界面活性剤である。より好ましくは、界面活性剤はＣＨＡＰＳである。
【００７３】
用語「少なくとも一つの界面活性剤」は、上記界面活性剤の混合物を使用する可能性があることを意味する。界面活性剤の混合物が使用される場合、使用される量は、全ての界面活性剤を合わせた全量に関する。緩衝トロンビン溶液において全ての界面活性剤を合わせた使用量は、緩衝トロンビン溶液の全量に対して界面活性剤、または界面活性剤の混合物が１ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは１ｍＭ〜３０ｍＭ、より好ましくは１ｍＭ〜１０ｍＭであると好ましい。
【００７４】
結晶化方法全体は、室温、大気圧下で行われる。光の遮断は有利になる可能性がある。
本発明の他の重要な態様は、本発明において開示される血液凝固因子ＸＩＩＩａを結晶化する方法のいずれか一つの方法によって得ることができる血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶形に関する。
【００７５】
血液凝固因子ＸＩＩＩａの当該結晶形は、好ましくは、空間群Ｐ１、非対称単位における凝固因子ＸＩＩＩａの二つの単量体、並びに、ａ１＝５６±３Å、ｂ１＝８０±３Å、ｃ１＝１０３±３Å、α１＝８８±３゜、β１＝７７±３゜、およびγ１＝８２±３゜の単位胞寸法、または
空間群Ｐ１、非対称単位における凝固因子ＸＩＩＩａの二つの単量体、並びに、ａ２＝５７±３Å、ｂ２＝６４±３Å、ｃ２＝６７±３Å、α２＝７６±３゜、β２＝７２±３゜、およびγ２＝８３±３゜の単位胞寸法、または
空間群Ｃ２、非対称単位における凝固因子ＸＩＩＩａの二つの単量体、並びに、ａ３＝９０±３Å、ｂ３＝６５±３Å、ｃ３＝７０±３Å、α３＝９０±３゜、β３＝９６±３゜、およびγ３＝９０±３゜の単位胞寸法、によって特徴づけられる。
【００７６】
しかしながら、結晶中のタンパク質分子の全体のパッキングに影響しない固体状態においてのタンパク質分子の空間パッキングのわずかな再配置のため、結晶対称は、変化し得、他の空間群および逸脱する格子定数は、保存されたパッキングと一致することができる
。
【００７７】
血液凝固因子ＸＩＩＩａの当該逸脱された結晶構造は、本発明の主題でもある。これらの逸脱された結晶構造は、異なる空間群を有する（Ｐ１とは異なる）が、非対称単位における凝固因子ＸＩＩＩａの二つの単量体を好ましくは有し、
ａ１＝５６±９Å、ｂ１＝８０±９Å、ｃ１＝１０３±９Å、α１＝８８±９゜、β１＝７７±９゜、およびγ１＝８２±９゜、または
ａ２＝５７±９Å、ｂ２＝６４±９Å、ｃ２＝６７±９Å、α２＝７６±９゜、β２＝７２±９゜、およびγ２＝８３±９゜、または
ａ３＝９０±９Å、ｂ３＝６５±９Å、ｃ３＝７０±９Å、α３＝９０±９゜、β３＝９６±９゜、およびγ３＝９０±９゜
の単位胞寸法を好ましくは有し、
より好ましくは、
ａ１＝５６±６Å、ｂ１＝８０±６Å、ｃ１＝１０３±６Å、α１＝８８±６゜、β１＝７７±６゜、およびγ１＝８２±６゜、または
ａ２＝５７±６Å、ｂ２＝６４±６Å、ｃ２＝６７±６Å、α２＝７６±６゜、β２＝７２±６゜、およびγ２＝８３±６゜、または
ａ３＝９０±６Å、ｂ３＝６５±６Å、ｃ３＝７０±６Å、α３＝９０±６゜、β３＝９６±６゜、およびγ３＝９０±６゜の単位胞寸法を有し、
さらにより好ましくは、
ａ１＝５６±３Å、ｂ１＝８０±３Å、ｃ１＝１０３±３Å、α１＝８８±３゜、β１＝７７±３゜、およびγ１＝８２±３゜、または
ａ２＝５７±３Å、ｂ２＝６４±３Å、ｃ２＝６７±３Å、α２＝７６±３゜、β２＝７２±３゜、およびγ２＝８３±３゜、または
ａ３＝９０±３Å、ｂ３＝６５±３Å、ｃ３＝７０±３Å、α３＝９０±３゜、β３＝９６±３゜、およびγ３＝９０±３゜の単位胞寸法を有する。
［血液凝固因子ＸＩＩＩａの構造を用いることによる合理的な薬物設計］
本発明の更なる重要な態様は、血液凝固因子ＸＩＩＩａの三次元構造の決定のための、並びに血液凝固因子ＸＩＩＩａにおける阻害剤の同定、最適化、および／または設計のための血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶形の使用に関する。
【００７８】
活性部位の、特に触媒中心のアミノ酸原子の正確な位置を知ることは、適切な阻害剤を設計する、例えば化合物ライブラリーから適切な阻害剤を同定する、または阻害の可能性を増大させることによって、公知の適切な阻害剤を最適化するための可能性を提供する。適切な阻害剤の設計、同定、最適化を、当技術分野で公知の標準のコンピュータを利用した方法、およびソフトウェアプログラムを用いて行うことができる。
【００７９】
種々の商業的に利用可能なソフトウェアプログラムは、コンピュータを利用したシステムにおけるデータの分析および比較を行うために利用可能である。当業者は、コンピュータ分析を行うための利用可能なアルゴリズム、または実行するソフトウェアパッケージを、コンピュータを利用したシステムにおける使用のために利用し、または適合させることができることを容易に認識するだろう。標的構造モチーフ、または標的モチーフは、任意の合理的に選択された配列、または配列の組み合わせに関し、配列は三次元配置、または標的モチーフの折り畳まれた状態で形成される電子密度マップに基づいて選択される。当技術分野で公知の種々の標的モチーフがある。タンパク質標的モチーフは、酵素活性部位、構造的サブドメイン、エピトープ、機能的ドメイン、およびシグナル配列を含むが制限されない。インプットおよびアウトプット手段のための種々の構造形式を、本発明のコンピュータを利用したシステムにおいて情報をインプット、およびアウトプットするために使用することができる。
【００８０】
種々の比較手段は、原子座標／ｘ線回析データから部分的に由来する構造モチーフを同定するために、または電子密度マップを解釈するために、データ記憶手段を用いて標的配列、または標的モチーフを比較するために使用されることができる。当業者は、使用することができる公的に入手可能なコンピュータモデリングプログラムのうちのいずれかを容易に認識することができる。
【００８１】
タンパク質を見る、分析する、設計する、および／またはモデル化するために使用することができる適切なソフトウェアは、ＭＯＬＯＣ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ），１９８５）、ＦＲＥＤ、ＭＡＩＮ、フレックス（Ｆｌｅｘ）Ｘ、ゴールド（Ｇｏｌｄ）、ＸｔａｌＶｉｅｗ、アルケミー（Ａｌｃｈｅｍｙ）（商標）、ラブビジョン（ＬａｂＶｉｓｉｏｎ）（商標）、シビル（Ｓｙｂｙｌ）（商標）、Ｍｏｌｃａｄｄ（商標）、リープフロッグ（Ｌｅａｐｆｒｏｇ）（商標）、マッチメーカー（Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ）（商標）、ジェンフォールド（Ｇｅｎｅｆｏｌｄ）（商標）、およびシテル（Ｓｉｔｅｌ）（商標）（トリポス社（Ｔｒｉｐｏｓ  Ｉｎｃ．）、セントルイス（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ）、ミズーリ州から入手できる）；クアンタ（Ｑｕａｎｔａ）（商標）、セリウス（Ｃｅｒｉｕｓ）２（商標）、Ｘ−Ｐｌｏｒ（商標）、ＣＮＳ（商標）、キャタリスト（Ｃａｔａｌｙｓｔ）（商標）、モデラー（Ｍｏｄｅｌｌｅｒ）（商標）、ケム（Ｃｈｅｍ）Ｘ（商標）、ルディ（Ｌｕｄｉ）（商標）、インサイト（Ｉｎｓｉｇｈｔ）（商標）、ディスカバー（Ｄｉｓｃｏｖｅｒ）（商標）、キャメロン（Ｃａｍｅｌｅｏｎ）（商標）、およびイディティス（Ｉｄｉｔｉｓ）（商標）（アクセルリス社（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．）、プリンストン  ニュージャージー州から入手できる）；ラスモル（Ｒａｓｍｏｌ）（商標）（グラクソ  リサーチ  アンド  ディベロップメント（Ｇｌａｘｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、グリーンフォード、ミドルセックス、英国から入試できる）；ＭＯＥ（商標）（ケミカルコンピューティンググループ、モントリオール、ケベック州、カナダから入手できる）；マエストロ（Ｍａｅｓｔｒｏ）（商標）  （シュレディンガー社（Ｓｈｒｏｄｉｎｇｅｒ  Ｉｎｃ．）から入手できる）；ＣＯＯＴ／ＣＣＰ４；マイダス／マイダスプラス（Ｍｉｄａｓ／ＭｉｄａｓＰｌｕｓ）（商標）（ＵＣＳＦ、サンフランシスコ、カリフォルニア州から入手できる）；ＪｙＭｏｌ、パイモル（Ｐｙｍｏｌ）（シュレディンガー（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ）合同会社（ＬＬＣ）；Ｊｍｏｌ（インターネットでフリーフェア（ｆｒｅｅｗａｒｅ））；ＶＲＭＬ，（インターネットでウェブビューア（ｗｅｂｖｉｅｗｅｒ）−フリーフェア（ｆｒｅｅｗａｒｅ））；Ｃｈｉｍｅ（ＭＤＬ−インターネットでフリーフェア（ｆｒｅｅｗａｒｅ））；オートドック（ＡｕｔｏＤｏｃｋ）（スクリプス研究所（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から入手できる）；ＭＯＩＬ（イリノイ大学  アーバナ−シャンペーン校（Ｕｒｂａｎａ−Ｃｈａｍｐａｉｇｎ），イリノイ州から入手できる）；マクロモデル（ＭａｃｒｏＭｏｄｅｌ）（商標）、およびＧＲＡＳＰ（商標）（コロンビア大学、ニューヨーク、ニューヨーク州から入手できる）；リボン（Ｒｉｂｂｏｎ）（商標）（アラバマ大学、タスカルーサ（Ｔｕｓｃａｌｏｏｓａ）、アラバマ州から入手できる）；ＮＡＯＭＩ（商標）（オックスフォード大学、オックスフォード、英国から入手できる）；エクスプローラー  アイケム（Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  Ｅｙｅｃｈｅｍ）（商標）（シリコン  グラフィックス社（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｉｎｃ．）、マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ）、カリフォルニア州）；ユニビジョン（Ｕｎｉｖｉｓｉｏｎ）（商標）（クレイリサーチ社（Ｃｒａｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）、シアトル、ワシントン州）；モルスクリプト（Ｍｏｌｓｃｒｉｐｔ）（商標）、およびＯ（ウプサラ大学、ウプサラ、スウェーデン）；ケム（Ｃｈｅｍ）  ３Ｄ（商標）、およびタンパク質エキスパート（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｅｒｔ）（商標）（ケンブリッジ科学（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から入手できる）、およびそれらの改良型（ｕｐｇｒａｄｅｄ  ｖｅｒｓｉｏｎｓ）を含む。
【００８２】
したがって、本発明の更なる態様は、コンピュータを使用した方法を用いて、またはソ
フトウェアプログラムを用いて、阻害剤を設計し、同定し、または最適化するために、結晶形を適用することによって、および結晶形または少なくとも一つの活性部位の関連する構造座標を適用することによって、血液凝固因子   ＸＩＩＩａの阻害剤を設計し、同定し、最適化する方法に関する。
【００８３】
原子座標／ｘ線回析データは、物理的モデルを作り出すために使用されてもよく、物理的モデルを、後に、触媒中心、疎水性ポケット、触媒中心と疎水性ポケットとの間の表面、および／または触媒中心に隣接するポケットのような血液凝固因子ＸＩＩＩａの決定された活性部位、または他の構造的もしくは機能的ドメイン、またはサブドメインを阻害するおよび／または相互作用するための能力または特性を有すべき化合物の分子モデルを設計するために使用することができる。代替的に、複合体の原子座標／ｘ線回析データは、コンピュータ可読媒体における原子モデルアウトプットデータとして表されてもよく、原子モデルアウトプットデータは、血液凝固因子ＸＩＩＩａの決定された活性部位、または他の構造的もしくは機能的ドメイン、またはサブドメインを阻害するおよび／または相互作用すると期待される異なる分子を計算するためのコンピュータモデリングシステムにおいて使用することができる。例えば、データのコンピュータ分析は、血液凝固因子ＸＩＩＩａおよび化合物の三次元相互作用を計算できるようにし、化合物が血液凝固因子ＸＩＩＩａに結合し、または血液凝固因子ＸＩＩＩａの構造、特に血液凝固因子ＸＩＩＩａのドメインもしくはサブドメインの構造を変化させることを確認する。物理的モデルまたはコンピュータモデルの分析から同定される化合物を、後に合成することができ、適切なアッセイを用いて生物学的活性を試験することができる。
【００８４】
したがって、本発明は、血液凝固因子ＸＩＩＩａと相互作用する、または血液凝固因子ＸＩＩＩａを阻害する化合物を設計する方法にも関し、次のステップ、
（ａ）図６において列挙される構造座標を用いて血液凝固因子ＸＩＩＩａの三次元モデルを生成すること；および
（ｂ）血液凝固因子ＸＩＩＩａと相互作用する、または血液凝固因子ＸＩＩＩａを阻害する能力を有すべき化合物を設計するために前記三次元モデルを利用すること、を含む。
【００８５】
前記方法におけるステップ（ａ）に従って、血液凝固因子ＸＩＩＩａの三次元モデルの生成は、標準偏差の適用も含むことが可能であり、好ましい方法は、次のステップ：
（ａ）図６に列挙される構造座標と、前記アミノ酸の骨格原子からの、または前記アミノ酸のα炭素骨格原子からの標準偏差が３．０Å以下である標準偏差と、を用いて血液凝固因子ＸＩＩＩａの三次元モデルを生成すること；および
（ｂ）血液凝固因子ＸＩＩＩａと相互作用する、または血液凝固因子ＸＩＩＩａを阻害する能力を有すべき化合物を設計するために前記三次元モデルを利用すること、を含む。
【００８６】
用語「標準偏差」は、平均値からの偏差の二乗の算術平均の平方根を意味する。標準偏差は、トレンド、またはオブジェクトからの偏差、または差異を表す方法である。本発明の目的のために、「標準偏差」は、本願に記述されるＦＸＩＩＩａの構造座標によって定義されるように、ＦＸＩＩＩａ、活性部位、結合ポケット、またはタンパク質それ自体の骨格からタンパク質骨格の差異を定義する。標準偏差の計算は、標準誤差を含むことは当業者にとって明らかであるだろう。
【００８７】
本発明の好ましい実施形態は、本願に開示される方法に関し、前記アミノ酸の骨格原子からの標準偏差は、２．０Å以下、より好ましくは１．０Å以下である。選択される化合物の血液凝固因子ＸＩＩＩａとの相互作用は、最も好ましくは阻害につながる。
【００８８】
本願に使用される用語「化合物」は、小さい化学分子に関するが、抗体の断片のような分子の断片に関する可能性もある。
前記方法は、ＦＸＩＩＩａの結晶形の結晶構造座標に基づく化合物の設計に関し、化合物は、血液凝固因子ＸＩＩＩａと相互作用する、または好ましくは阻害する能力を有すべきである。当該設計された化合物は完全に新規な化合物である可能性があるので、本願前には存在しておらず、例えば骨格ホッピングによって由来される公知の化合物の誘導体である可能性はない。化合物の阻害活性を検証するために、化合物の実際の合成が望まれ、続いてＦＸＩＩＩａの阻害活性を決定するために適切なアッセイにおいて化合物を試験する。実施例１０は、ＦＸＩＩＩａの潜在的な阻害剤の阻害効果を試験するための適切なアッセイを提供する。
【００８９】
したがって、上記方法は、好ましくは次のステップ
（ｃ）設計化合物を得ること；および、
（ｄ）血液凝固因子ＸＩＩＩａに対する阻害効果を決定するために得られた設計化合物を、血液凝固因子ＸＩＩＩａと接触させること、を含む。
【００９０】
ＦＸＩＩＩａの阻害剤を同定するための化合物ライブラリーをスクリーニングするために、または公知の阻害剤の阻害可能性を増加させるための公知のＦＸＩＩＩａの阻害剤を最適化するために、血液凝固因子ＸＩＩＩａを阻害する、または阻害すべき化合物を同定するおよび／または最適化する方法を提供し、次のステップ
（ａ）図６に列挙される構造座標を用いて血液凝固因子ＸＩＩＩａの三次元モデルを生成すること；および
（ｂ）ＦＸＩＩＩａを阻害する能力を有すべき化合物を同定する、または最適化するために上記三次元モデルを使用すること、を含む。
【００９１】
上記ステップ（ｃ）に従って得られた化合物、または化合物ライブラリーの化合物は、血液凝固因子ＸＩＩＩａの少なくとも一つの活性部位を認識するための好ましくは、ペプチド骨格またはペプチド模倣性骨格を含み、ペプチド骨格、もしくはペプチド模倣性骨格におけるアミノ酸側鎖、もしくはアミノ酸類似体の側鎖のカルボキシ基を好ましくは置換し、またはペプチド骨格、もしくはペプチド模倣性骨格におけるアミノ酸側鎖、もしくはアミノ酸類似体の側鎖のカルボキシ基に由来する弾頭（ｗａｒｈｅａｄ）を含む。弾頭（ｗａｒｈｅａｄ）を含む側鎖は、ペプチド骨格、またはペプチド模倣性骨格におけるアミノ酸側鎖、またはアミノ酸類似体のα炭素原子に好ましくは結合される。弾頭（ｗａｒｈｅａｄ）は、Ｃｙｓ３１４のチオール基と反応することができ、可逆的または不可逆的共有結合を形成することができる官能基である。
【００９２】
ペプチド骨格は、アミド結合を介して連結される少なくとも二つのアミノ酸からなり、アミド結合を介して連結される２〜２０個のアミノ酸、好ましくは３〜１０個のアミノ酸を有する。ペプチド模倣性骨格は、少なくとも一つのアミノ酸、および少なくとも一つのアミノ酸類似体からなり、または１〜１６個のアミノ酸および１〜４個のアミノ酸類似体、好ましくは１〜１０個のアミノ酸および１〜３個のアミノ酸類似体、より好ましくは１〜８個のアミノ酸および１〜２個のアミノ酸類似体を有する。ペプチド骨格は、ペプチド骨格またはペプチド模倣性骨格において少なくとも一つのアミド結合を含み、またはペプチド骨格もしくはペプチド模倣性骨格において１〜１８個、好ましくは１〜１４個、より好ましくは２〜１０個のアミド結合を有する。
【００９３】
これらの化合物は、Ｃｙｓ３４の硫黄原子（ＳＧ）と可逆的または不可逆的共有結合、Ｔｒｐ２７９のアミン基（Ｈ−Ｎ（Ｈ）−）（すなわち、Ｔｒｐ２７９のインドール環におけるアミン（Ｈ−Ｎ−）の水素）に対して、および／もしくはＣｙｓ３１４の骨格アミド基（すなわち、Ｃｙｓ３１４のアミド基の水素）に対して、へテロ原子Ａ１（好ましくはＮまたはＯ）を介する１つまたは２つの水素結合、並びに／またはＨｉｓ３７３（すなわち、Ｈｉｓ３７３におけるイミダゾール環のアミン（Ｈ−Ｎ−）水素）に対して、ヘテ
ロ原子Ａ２（好ましくはＮまたはＯ）を介する他の水素結合、並びに／またはＡｓｐ３９６の側鎖カルボキシル基（すなわち、Ａｓｐ３９６のカルボキシレート（−Ｏ２Ｃ−））に対する水素原子Ａ３（好ましくはＨ−ＮまたはＨ−Ｏ）を介する他の水素結合、並びに／またはＴｒｐ２７９およびＴｒｐ３７０との疎水性相互作用（すなわち、Ｔｒｐ２７９およびＴｒｐ３７０によって形成される疎水性トンネル）、並びに／またはＧｌｕ２１６、Ａｓｐ２１９、およびＴｙｒ３７２によって形成される負の電荷を帯びたポケットとの親水性相互作用、並びに／または表面残基Ａｒｇ２２３、Ｔｙｒ２８３、Ｇｌｎ３１３、Ａｓｎ３７１、およびＴｙｒ３７２間の強い水素結合における強力なネットワークを形成し、Ｔｒｐ２７９およびＴｙｐ３７０との疎水性相互作用のために、好ましくはアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはｃｙｃｌｏａｌｋｄｉｅｎｙｌ基を含む。重要であり好ましいのは、ＦＸＩＩＩａにおけるＴｒｐ２７９のアミノ基の水素と、Ｎ原子またはＯ原子を介して化合物の少なくとも一つの水素結合であり、ＦＸＩＩＩａにおけるＨｉｓ３７３のイミダゾール部分の窒素原子上の水素と、Ｎ原子またはＯ原子を介して化合物の水素結合であり、ＦＸＩＩＩａにおけるＡｓｐ３９６の側鎖のカルボキシル基と、アミノ基またはヒドロキシ基を介して化合物の水素結合である。
【００９４】
さらに前記化合物は、１０〜１２０個、好ましくは２０〜１００個、より好ましくは３０〜８０個の炭素原子、および好ましくは１〜１０個の窒素原子、および好ましくは５〜１５個の酸素原子を含む。さらに、前記化合物は、弾頭（ｗａｒｈｅａｄ）として、Ｃｙｓ３１４のチオール基と反応する官能基を含む。
【００９５】
前記弾頭（ｗａｒｈｅａｄ）は、窒素原子、α−ハロケトン、オキシラン、ヒドラゾン、セミカルバゾン、α，β−不飽和ケトン／エステル／アミドのような環状または非環状マイケル受容体、ビニルスルホン、およびマレイン酸イミドを少なくとも一つ含むアルデヒド、ヘミアセタール、ニトリル、アジド、ケトン、α−ケトアルデヒド、α−ケトエステル、α−ケトアミド、ケト−ヘテロ環からなる群から選択され、前記弾頭（ｗａｒｈｅａｄ）は、Ｃｙｓ３１４におけるチオール基と可逆的、または不可逆的共有結合を形成することができる。
【００９６】
ＦＸＩＩＩａの結晶構造における結晶構造座標に基づいて設計される化合物は、血液凝固因子ＸＩＩＩａと相互作用する能力、好ましくは血液凝固因子ＸＩＩＩａを阻害する能力を有すべきである。したがって、ＦＸＩＩＩａ関連疾患の治療に適している。
【００９７】
さらに、当該方法において、ステップ（ａ）は、標準偏差を含むことが可能であるので次の通り解釈する：
（ａ）図６に列挙される構造座標を用いて血液凝固因子ＸＩＩＩａの三次元モデルを生成すること、ここで血液凝固因子ＸＩＩＩａのアミノ酸残基における骨格原子の標準偏差は、３Å以下である。
【００９８】
阻害剤が、化合物ライブラリーから同定される場合、または公知の阻害剤を理論的な化学修飾によって最適化する場合、実際の化合物を試験することは、阻害効果を検証するために、および最適化工程を続けるために望まれる。したがって、化合物を同定し、および／または最適化する上記方法は、好ましくは次のステップ
（ｃ）同定される、または最適化される化合物を得ること；および
（ｄ）血液凝固因子ＸＩＩＩａに対する阻害効果を決定するために、同定される、または最適化される化合物を血液凝固因子ＸＩＩＩａと接触させること、
をさらに含む。
【００９９】
図６に列挙される構造座標の全てを使用することは必須ではなく、図６に表される一連
の構造座標を選択して使用すれば十分でもあり得る。したがって、触媒中心、疎水性ポケット、前記触媒中心および疎水性ポケットとの間の表面、および／または触媒中心に隣接するポケットの構造座標のみを使用することが可能である。さらに、血液凝固因子ＸＩＩＩａの完全な三次元モデルを生成することも必須ではないかもしれない。ＦＸＩＩＩａの１つ、２つ、３つ、または４つ全ての活性部位のモデル、より好ましくは、ＦＸＩＩＩａにおける触媒中心のモデルを生成すれば十分でもあり得る。
【０１００】
したがって、本発明の他の態様は、ＦＸＩＩＩａを阻害する能力を有すべき化合物を設計し、同定し、または最適化するための方法に関し、血液凝固因子ＸＩＩＩａにおける触媒中心、並びに／または触媒中心に隣接するポケット、並びに／または疎水性ポケット、並びに／または触媒中心および疎水性ポケットとの間の表面の三次元モデルは、図６において列挙される構造座標を用いることによって生成され、前記三次元モデルは、触媒中心、触媒中心に隣接するポケット、疎水性ポケット、および／または触媒中心および疎水性ポケットとの間の各表面と相互作用する、または結合する能力を有すべき化合物を設計し、同定し、最適化するために使用される。当該化合物は、ＦＸＩＩＩａを阻害する能力を有するべきである。
【０１０１】
場合によっては、天然の因子ＸＩＩＩに対してアミノ酸、または完全なドメインでさえも削除し、および／または交換し、および／または付加することは特に有利であり得る。少なくとも一つのβバレルドメインに関して特に関連があってもよい。しかしながら、触媒ドメインは、本発明の中心要素であるので、活性部位の構造は、構造に基づく薬物設計における重要な主張であり、必要条件である。基本的に、我々は、活性部位を少なくとも形成するために必要なのアミノ酸を含む因子ＦＸＩＩＩａのより短い変異体も主張する。［血液凝固因子ＸＩＩＩａ阻害剤の生物学的活性］
市販の蛍光アッセイキットＦ００１（ゼディラ（Ｚｅｄｉｒａ））を用いて、阻害剤１（化合物４）および阻害剤２（化合物７）の動的データは、それぞれ約０．１１μＭおよび０．０８μＭのＩＣ５０を示す。
【０１０２】
続いて、活性部位システインの阻害薬における選択性を確認した。凝固因子ＸＩＩＩは、サブユニットにつき９個のシステイン残基を有し、それらの全てはジスルフィド結合を形成しない。阻害された因子ＸＩＩＩａを、トリプシンによって分解し、断片を、質量分析を用いて分析した。予期された通り、活性部位のチオールは、触媒三残基のために最も求核的であるので、Ｃｙｓ３１４のみが阻害剤と反応する。
【０１０３】
次の略語を、本願で言及される一般的な、および修飾されたアミノ酸に使用する。
【０１０４】
【表２】
2016506243.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】化合物４と同一である阻害剤１を有する血液凝固因子ＸＩＩＩａの全折り畳みのリボン図。次の略語が使用される：「原子型（ａｔｏｍ  ｔｙｐｅ）」は、座標が測定される要素に関する。列の最初の文字は、要素を定義する。「Ｒｅｓｉｄ」は、分子モデルにおけるアミノ酸残基一致度に関する。「＃」は、アミノ酸残基の配列番号に関する。「Ｘ、Ｙ、Ｚ」は、測定された要素の原子位置を定義する。「Ｂ」は、当該原子中心の周りの原子の動きを測定する温度因子である。「Ｏｃｃ」は、分子の断片に関する占有因子であり、各原子は、座標によって特定される位置を占有する。値「１」は、各原子が分子中で同じ配座、すなわち同じ位置であることを示す。「Ｍｏｌ」は、非対称単位における分子に関する。
【図２】必須アミノ酸Ｔｒｐ２７９、Ｃｙｓ３１４、Ｔｒｐ３７０、Ｈｉｓ３７３、Ａｓｐ３９６を示す血液凝固因子ＸＩＩＩａにおける触媒部位の詳細な表示。
【図３】必須アミノ酸Ａｌａ３４１、Ｍｅｔ３５０、Ａｓｐ３５１、Ｉｌｅ３５２、Ｖａｌ３６０、Ｔｙｒ３６５、Ａｓｐ３６７、Ｓｅｒ３６８、Ｖａｌ３６９、Ｌｅｕ４３９、Ｈｉｓ４５９、Ｉｌｅ４６０を示す血液凝固因子ＸＩＩＩａにおける疎水性ポケットの詳細な表示。
【図４】必須アミノ酸Ｐｈｅ３３９、Ｈｉｓ３４２、Ｓｅｒ３６８、Ｖａｌ３６９、Ｔｒｐ３７０、Ａｓｎ３７１、Ｈｉｓ４５９を示す血液凝固因子ＸＩＩＩａにおける触媒中心に隣接するポケットの詳細な表示。
【図５】必須アミノ酸Ｔｙｒ２１４、Ｇｌｙ２１５、Ｇｌｕ２１６、Ａｓｐ２１９、Ｌｙｓ２２１、Ａｒｇ２２３、Ａｓｎ２８１、Ｔｙｒ２８３、Ｐｒｏ２８８、Ｐｒｏ２８９、Ｇｌｎ３１３、Ｔｒｐ３１５、Ａｓｎ３７１、Ｔｙｒ３７２を示す血液凝固因子ＸＩＩＩａにおける触媒部位および疎水性ポケットとの間の表面の詳細な表示。
【図６】空間群Ｐ１、非対称単位における凝固因子ＸＩＩＩａの二つの単量体、並びにａ＝５６．８Å、ｂ＝８０．５Å、ｃ＝１０２．８Å、α＝８８．１゜、β＝７６．７゜、およびγ＝８２．０゜の単位胞寸法を有する血液凝固因子ＸＩＩＩａの原子構造座標（ａｔｏｍｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）。
【図７】（ａ）結晶の成分。非対称単位は、対称性を示さない結晶の一部分である。対称演算子（例えば、Ｃ２軸）は、格子モチーフを生成する。並進によってこのモチーフの繰り返しは、単位胞の角を生成し、結晶格子の基本的な繰り返し単位となる；（ｂ）単位胞寸法。
【発明を実施するための形態】
【０１０６】
次の実施例を、本発明の好ましい実施形態を明らかにするために含む。発明の実施において十分に機能するために発明者によって発見された代表的な技術に従う実施例における開示された技術を、したがって、当該実施のための好ましい方法を構成するために考慮することができることを、当業者に十分に理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本発明の開示を考慮すると、いくつかの変更は、開示される特定の実施形態においてされることができ、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、同様のまたは類似の結果をさらに得ることができることを理解する。
【０１０７】
本発明の種々の態様における更なる修飾および代替的実施形態は、この明細書を考慮して当業者に明らかになるだろう。したがって、この明細書は、実例と見なされるだけであるべきであり、当業者に教示する目的のために本発明を実行する一般的な手法である。本願に示される、および記述される発明の形態は、実施形態の実施例とされるべきであることを理解するべきである。要素および物質は、本願に説明される、および記述されるものに置換されてもよく、部分および工程は置き換えられてもよく、本発明の特定の特徴は、独立して利用されてもよく、全ては本発明の明細書に記載の利益を有することが当業者に明らかであるだろう。変更は、次のクレームに記述される本発明の精神および範囲から逸脱することなく本願に記述される要素において行われてもよい。
［実施例］
本明細書において使用される略語は、次の意味を有する：
２ＣＴ  ２−クロロトリチル
ＡＣＮ  アセトニトリル
Ｂｏｃ  ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＩＰＥＡ  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ  ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ  ジメチルスルホキシド
Ｆｍｏｃ  フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＨＡＴＵ  ２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＢｔ  ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＭＡＰ  マイケル受容体活性基
ＯｔＢｕ  ｔｅｒｔ−ブチルエステル
ＴＢＴＵ  Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＨＦ  テトラヒドロフラン
［調製実施例］
全般的な考察
ＮＭＲスペクトルをブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）ＤＲＸ５００（ＤＭＳＯ−ｄ６、５００ＭＨｚ）に記録した。次の略語を多重度を説明するために使用した：ｓ）シングレット、ｄ）ダブレット、ｔ）トリプレット、ｍ）マルチプレット、ｂｓ）ブロードシングレット。ＥＳＩマススペクトルを島津（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）ＬＣＭＳ−２０２０に記録した。ＬＣ−分析による化合物の純度の特性評価：メルク−日立（Ｍｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉ）社製  ＬａＣｈｒｏｍ  Ｌ−７１００、フェメネクス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）社製  キネテクス（Ｋｉｎｅｔｅｘ）  Ｃ１８カラム（２．６μｍ、３．０×１００ｍｍ）、グラジエント  ４％／分、０．６ｍｌ／分で１６％Ｂ〜７６％Ｂ、（Ａ−溶出溶媒：水中０．０１％ＴＦＡ、Ｂ−溶出溶媒：ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ  ９／１中０．０１％ＴＦＡ、４０℃）、２１４ｎｍでのＵＶ検出。分取ＨＰＬＣをバリアン（Ｖａｒｉａｎ）社製  プロスター（ＰｒｏＳｔａｒ）システムで行った：フェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）社製  シナジー（Ｓｙｎｅｒｇｉ）  Ｍａｘ−ＲＰ  ８０Ａ  カラム（４μｍ、２１．２×２５０ｍｍ）、８ｍｌ／分、変動グラジエント（Ａ−溶出溶媒：水中０．０１％ＴＦＡ、Ｂ−溶出溶媒：ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ  ９／１中０．０１％ＴＦＡ、室温）、種々の波長でのＵＶ検出。カラムクロマトグラフィーを、マッハライ−ナーゲル（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）社製のシリカゲル６０（０．０４−０．０６３ｍｍ）を用いて行った。シリカゲル６０  Ｆ２５４を用いて被覆されたメルク（Ｍｅｒｃｋ）社製アルミナシートを、可視化剤としてＵＶライト、およびニンヒドリン染色をそれぞれ用いる薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）のために使用した。
【０１０８】
全ての試薬を供給者から得て使用した。全ての反応をアルゴン雰囲気下または窒素雰囲気下で行った。
固相反応を、ガラスフリット（ｐｏｒ．１）、および真空連結を有する受けフラスコを装備した２５０ｍｌフラスコ中で室温で行った。ペプチド配列を、標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成（ＤＭＦ中で反応、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＰＥＡとのカップリング、ピペリジンを用いて脱保護）によって形成した。樹脂からの切断を、９５％ＴＦＡ／２．５％水／２．５％トリイロプロピルシランを用いて達成した。第一級アミンへのカップリング反応を、カイザーテスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）、第二級アミンへのカップリング反応を、クロラニルテスト（ｃｈｌｏｒａｎｉｌ  ｔｅｓｔ）によって観察した。［１］出発物質としてＨ−Ｐｒｏ−２ＣＴ樹脂を、アイリス（Ｉｒｉｓ）  バイオテック（Ｂｉｏｔｅｃｈ）  ＧｍｂＨ社から購入した。全てのアミノ酸およびカップリング試薬を、Ａｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（バッケム（Ｂａｃｈｅｍ）社）を除いて、ＧＬ  バイオケム（Ｂｉｏｃｈｅｍ）社から購入した。
実施例０１：（Ｓ，Ｅ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−７−メトキシ−７−オキソヘプト−５−エン酸，Ｂｏｃ−ＭＡＰ−ＯＨ（化合物１）の調製
【０１０９】
【化３】
2016506243.tif 000007
【０１１０】
化合物１の合成は、以前に報告した。
実施例０２：（Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−１−（（８Ｓ，１１Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ，Ｅ）−８−アミノ−１１，１４−ジブチル−１７−イソブチル−３，９，１２，１５−テトラオキソ−２−オキサ−１０，１３，１６−トリアザオクタデク−４−エン）ピロリジン−２−カルボキサミド）−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）プロパノイル）ピロリジン−２−カルボン酸トリフルオロアセテート（化合物２）の調製
【０１１１】
【化４】
2016506243.tif 000008
【０１１２】
化合物２を、２．００ｇ（１．５０ｍｍｏｌ）のＨ−Ｐｒｏ−２ＣＴ−樹脂（０．７５ｍｍｏｌ／ｇ）、および２．３７ｇ（４．５０ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、１．５２ｇ（４．５０ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、１．５９ｇ（４．５０ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、１．５９ｇ（４．５０ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ（２度（ｔｗｉｃｅ））、０．８６ｇ（３．００ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−ＭＡＰ−ＯＨ（１）を用いて、上記のように、標準的なＦｍｏｃ−固相ペプチド合成によって合成した。各カップリングステップに、ＴＢＴＵ（２．９４ｅｑまたは１．９６ｅｑ）、ＨＯＢｔ（３ｅｑまたは２ｅｑ）、およびＤＩＰＥＡ（７ｅｑまたは５ｅｑ）を、使用されるアミノ酸の量に依存して使用した。
【０１１３】
化合物２を淡黄色固体（１．２４ｇ、１．２１ｍｍｏｌ、８１％）として得て、更なる精製なしで使用した。
実施例０３：（Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−１−（（６Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｓ，１８Ｓ）−６−アセトアミド−１２，１５−ジブチル−９−（（Ｅ）−５−メトキシ
−５−オキソペント−３−エニル）−２，２，２０−トリメチル−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキソ−３−オキサ−８，１１，１４，１７−テトラアザヘニコサンカルボニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）プロパノイル）ピロリジン−２−カルボン酸（化合物３）の調製
【０１１４】
【化５】
2016506243.tif 000009
【０１１５】
１．２４ｇ（１．２１ｍｍｏｌ）の２を１０ｍｌＤＭＦ中に溶解した。この溶液に対して、１０ｍｌＤＭＦ中に２８０ｍｇ（１．２１ｍｍｏｌ）のＡｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、４６０ｍｇ（１．２１ｍｍｏｌ）のＨＡＴＵ、および６１７μｌ（３．６３ｍｍｏｌ）のＤＩＰＥＡを加えた。結果として生じる溶液を、ｐＨ８．０（ＤＩＰＥＡ）に合わし、室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を分取ＨＰＬＣ（１％／分、２２０ｎｍでグラジエント５０％Ｂ〜９０％Ｂ）によって精製した。
【０１１６】
化合物３を淡黄色固体（３８７ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ、２８％）として得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：１１２０．９［Ｍ＋Ｈ］＋
実施例０４：（Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−１−（（４Ｒ，７Ｓ，１０Ｓ，１３Ｓ，１６Ｓ）−１０，１３−ジブチル−４−（カルボキシメチル）−７−（（Ｅ）−５−メトキシ−５−オキソペント−３−エニル）−１８−メチル−２，５，８，１１，１４−ペンタオキソ−３，６，９，１２，１５−ペンタアザノナデカンカルボニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）プロパノイル）ピロリジン−２−カルボン酸（化合物４）の調製
【０１１７】
【化６】
2016506243.tif 000010
【０１１８】
２２４ｍｇ（０．２０ｍｍｏｌ）の３、および３００μｌのトリイソプロピルシランを３０ｍｌのジクロロメタン中に溶解した。１５ｍｌのＴＦＡを加えた。結果として生じる溶液を３時間室温で撹拌し、溶媒を減圧下で除去した。残渣を分取ＨＰＬＣ（１％／分、２５４ｎｍでグラジエント４０％Ｂ〜７５％Ｂ）によって精製した。
【０１１９】
化合物４を無色固体（１５４ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、７２％）として得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：１０６４．８［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，５００  ＭＨｚ）：δ［ｐｐｍ］＝０．８２（ｍ，２ｘＮｌｅ−ＣＨ３），０．８３，０．８６（ｍ，Ｌｅｕ−ＣＨ３），１．２２（ｍ，２ｘＮｌｅ−χ−ＣＨ２），１．２２（ｍ，２ｘＮｌｅ−δ−ＣＨ２），１．３６，１．４０（ｍ，Ｌｅｕ−β−ＣＨ２），１．４４，１．５９（ｍ，２ｘＮｌｅ−β−ＣＨ２），１．５８（ｍ，Ｌｅｕ−χ−ＣＨ），１．６０，１．８０（ｍ，ＭＡＰ−β−ＣＨ２），１．７７，１．８０，１．９４，２．１０（ｍ，２ｘＰｒｏ−β―ＣＨ２），１．８０（ｍ，２ｘＰｒｏ−χ−ＣＨ２），１．８４（ｓ，アセチル−３Ｈ），２．１７（ｍ，ＭＡＰ−χ−ＣＨ），２．４８，２．６４（ｍ，Ａｓｐ−ＣＨ２），２．９０，３．１０（ｍ，Ｔｒｐ−β−ＣＨ２），３．２６，３．４２，３．５３，３．５９（ｍ，２ｘＰｒｏ−δ−ＣＨ３），３．６４（ｍ，ＭＡＰ−ＣＨ３），４．１９，４．２３（ｍ，２ｘＮｌｅ−ＣＨ），４．２２（ｍ，ＭＡＰ−α−ＣＨ），４．２２，４．３３（ｍ，２ｘＰｒｏ−ＣＨ），４．４９（ｍ，Ｌｅｕ−α−ＣＨ），４．５３（ｍ，Ａｓｐ−ＣＨ，３ＪαＨ−βＨ１＝５．５９Ｈｚ，３ＪαＨ−βＨ２＝８．０２Ｈｚ），４．６９（ｍ，Ｔｒｐ−ＣＨ），５．８３（ｄ，ＭＡＰ−ε−ＣＨ，Ｊ＝１５．５７Ｈｚ），６．８７（ｄｔ，ＭＡＰ−δ−ＣＨ，Ｊ＝６．９０，１５．７５Ｈｚ），６．９５−７．５７（５ｘＴｒｐ−Ａｒ−ＣＨ），７．７２，７．９４（ｄ，２ｘＮｌｅ−ＮＨ，Ｊ＝８．１２，８．８２Ｈｚ），７．８７（ｄ，ＭＡＰ−ＮＨ，Ｊ＝８．００Ｈｚ），７．８７（ｄ，Ｌｅｕ−ＮＨ，Ｊ＝８．００Ｈｚ），７．９６（ｄ，Ｔｒｐ−ＮＨ，Ｊ＝８．４７Ｈｚ），８．１８（ｄ，Ａｓｐ−ＮＨ，Ｊ＝７．６９Ｈｚ），１２．３４（ｂｓ，Ａｓｐ−ＣＯＯＨ）。
実施例０５：（Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−１−（（８Ｓ，１１Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ，Ｅ）−８−アミノ−１４−ｓｅｃ−ブチル−１１−ブチル−１７−イソブチル−３，９，１２，１５−テトラオキソ−２−オキサ−１０，１３，１６−トリアザオクタデク−４−エン）ピロリジン−２−カルボキサミド）−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）プロパノイル）ピロリジン−２−カルボン酸トリフルオロアセテート（化合物５）の調製
【０１２０】
【化７】
2016506243.tif 000011
【０１２１】
化合物５を、５００ｍｇ（０．３０ｍｍｏｌ）のＨ−Ｐｒｏ−２ＣＴ−樹脂（０．７５ｍｍｏｌ／ｇ）、および４７４ｍｇ（０．９０ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、３０４ｍｇ（０．９０ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、３１８ｍｇ（０．９０ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、３１８ｍｇ（０．９０ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、３１８ｍｇ（０．９０ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ、１７２ｍｇ（０．６０ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−ＭＡＰ−ＯＨ（１）を用いて、上記のように、標準的なＦｍｏｃ−固相ペプチド合成によって合成した。各カップリングステップに、ＴＢＴＵ（２．９４ｅｑまたは１．９６ｅｑ）、ＨＯＢｔ（３ｅｑまたは２ｅｑ）、およびＤＩＰＥＡ（７ｅｑまたは５ｅｑ）を、使用されるアミノ酸の量に依存して使用した。
【０１２２】
化合物５を白色固体（２２１ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、７２％）として得て、更なる精製なしで使用した。
実施例０６：（Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−１−（（８Ｓ，１１Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ，Ｅ）−８−（（Ｓ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−オキソピロリジン−２−カルボキサミド）−１４−ｓｅｃ−ブチル−１１−ブチル−１７−イソブチル−３，９，１２，１５−テトラオキソ−２−オキサ−１０，１３，１６−トリアザオクタデク−４−エン）ピロリジン−２−カルボキサミド）−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）プロパノイル）ピロリジン−２−カルボン酸（化合物６）の調製
【０１２３】
【化８】
2016506243.tif 000012
【０１２４】
３５．４ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）のＮ−Ｂｏｃ−４−オキソ−Ｌ−プロリン、５７ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）のＨＡＴＵ、および５１μｌ（０．３０ｍｍｏｌ）のＤＩＰＥＡを１．５ｍｌのＤＭＦ中に溶解した。この溶液に対して、１．５ｍｌＤＭＦ中に１５３ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）の５を加えた。結果として生じる溶液を、ｐＨ８．０（ＤＩＰＥＡ）に合わし、室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を分取ＨＰＬＣ（１％／分、２２０ｎｍでグラジエント５０％Ｂ〜９０％Ｂ）によって精製した。
【０１２５】
化合物６を白色固体（１００ｍｇ、８９μｍｏｌ、６０％）として得た。
実施例０７：（Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−１−（（８Ｓ，１１Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ，Ｅ）−１４−ｓｅｃ−ブチル−１１−ブチル−１７−イソブチル−３，９，１２，１５−テトラオキソ−８−（（Ｓ）−４−オキソピロリジン−２−カルボキサミド）−２−オキサ−１０，１３，１６−トリアザオクタデク−４−エン）ピロリジン−２−カルボキサミド）−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）プロパノイル）ピロリジン−２−カルボン酸トリフルオロアセテート（化合物７）の調製
【０１２６】
【化９】
2016506243.tif 000013
【０１２７】
１００ｍｇ（８９μｍｏｌ）の６を５ｍｌのジクロロメタン中に溶解した。５ｍｌのＴＦＡを加えた。結果として生じる溶液を３時間室温で撹拌し、溶媒を減圧下で除去した。残渣を分取ＨＰＬＣ（１％／分、２３０ｎｍでグラジエント３０％Ｂ〜９０％Ｂ）によって精製した。
【０１２８】
化合物７を白色固体（５６ｍｇ、４９μｍｏｌ、５６％）として得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：１０４０．８［Ｍ＋Ｎａ］＋
［生化学実験］
実施例０８：トロンビン非存在下での血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶化
本願に使用されるように、用語「ＦＸＩＩＩ−Ａ２」は、二量体（二量体形）の活性化されていない血液凝固因子ＸＩＩＩに関する。二量体形の血液凝固因子ＸＩＩＩは、生理学的条件下で安定な構造であることは当業者に公知である。
［タンパク質生成および精製］
血液凝固因子ＸＩＩＩ（Ａサブユニット）のコード配列を、ｃＤＮＡクローンＭＧＣ：３４２６０  ＩＭＡＧＥ：５２２２９６２（ジェンバンク  ＢＣ０２７９６３）からＰＣＲによって増幅し、ｐＦＡＳＴＢａｃ（商標）ベクターにクローン化した。Ｈｉｓ６−ＦＸＩＩＩ−Ａ２の組換え体の生成を、製造業者にしたがって、バキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）システム（Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ、インビトロジェン社）を用いて行
った。組換え体ＦＸＩＩＩ−Ａ２を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、続いてアニオン交換クロマトグラフィーによって精製した。精製され、濃縮されたＨｉｓ６−ＦＸＩＩＩ−Ａ２（７．４ｍｇ／ｍｌ）を、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５％（ｖ／ｖ）グリセロール中で保存した。［因子ＸＩＩＩＡ活性化および阻害］
血液凝固因子ＸＩＩＩの活性化を、トロンビンのかわりに高濃度のカルシウムによって行った。しかしながら、トロンビンによる活性化も実行可能であり、従ってトロンビンによる活性化も主張される。１００ｍＭのＣａ２＋を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５％（ｖ／ｖ）グリセロール中に精製されたＨｉｓ６−ＦＸＩＩＩ−Ａ２（０．２ｍｇ／ｍｌ）を有する溶液を、１：２５のモル比率で阻害剤１（化合物４）または阻害剤２（化合物）７と混合した。混合物をわずかに撹拌し、室温で１時間インキュベートした。阻害されたＨｉｓ６−ＦＸＩＩＩａ［阻害剤１または２］複合体を、遠心濃縮器（ビバスピン（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）（登録商標）２０、３０ｋＤａカットオフ）を用いて濃縮した。この溶液を、３ｍＭのＣａＣｌ２を含む１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５％（ｖ／ｖ）グリセロールを用いて平衡化されたスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５ｐｇ  ハイロード（ＨｉＬｏａｄ）カラムに適用した。溶出されたタンパク質を続いて、上記遠心濃縮器を再び用いて９．７ｍｇ／ｍＬに濃縮した。阻害された血液凝固因子ＸＩＩＩａを結晶化の前に−８０℃で保存した。
［Ｈｉｓ６−ＦＸＩＩＩａ［阻害剤１］結晶化］
タンパク質結晶を、ハンギングドロップ蒸気拡散法を用いて室温で成長させた。結晶化は、２μｌのタンパク質溶液を２μｌの沈殿剤溶液（１７０ｍＭ硫酸アンモニウム、８５ｍＭカコジル酸ナトリウム  ｐＨ６．５、２５．５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８，０００、１５％（ｖ／ｖ）グリセロール）と混合させることによって達成された。結晶は、１週間〜２週間後に現れた。
実施例０９：トロンビンの存在下での血液凝固因子ＸＩＩＩａの結晶化
［タンパク質生成および精製］
組換え体ＦＸＩＩＩ−Ａ２を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、続いてアニオン交換クロマトグラフィーによって精製した。精製されたＨｉｓ６−ＦＸＩＩＩ−Ａ２（３０ｍｌ、１．６５ｍｇ／ｍｌ）を、活性化まで５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液  ｐＨ７．４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５％（ｖ／ｖ）グリセロール中で保存した。
［トロンビンによる因子ＸＩＩＩＡ活性化、続いて阻害］
３０ｍｌの上記組換え体凝固因子ＸＩＩＩの活性化を、トロンビンによって行った。Ｈｉｓ６−ＦＸＩＩＩ−Ａ２溶液を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液  ｐＨ７．４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５％（ｖ／ｖ）グリセロール、３ｍＭ塩化カルシウム、および２．５ｍＭ  ＣＨＡＰＳを有する溶液の２２０ｍｌを用いて希釈した。
【０１２９】
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液  ｐＨ７．４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５％（ｖ／ｖ）グリセロール、３ｍＭ塩化カルシウム、および２．５ｍＭ  ＣＨＡＰＳを有する溶液の１．２５ｍｌ中にトロンビン（１，２５０  ＮＩＨ  Ｕｎｉｔｓ）を加えて、混合物を２５℃で１５０分間インキュベートした。
【０１３０】
トロンビンを、１．３３ｍｇ／ｍｌの濃度を有する１０μｌのＰＰＡＣＫ（Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン）を加えることによって不活性化した。活性化されたＦＸＩＩＩａを、続いて阻害剤１（２００μｌのＤＭＳＯ中に１０ｍｇ）を加えて阻害し、２５℃で４５分間反応させた。
【０１３１】
ＦＸＩＩＩａ［阻害剤１］複合体を、遠心濃縮器（ビバスピン（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）（登録商標）２０、３０ｋＤａカットオフ）を用いて濃縮した。この溶液を、３ｍＭのＣａ
Ｃｌ２を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５％（ｖ／ｖ）グリセロールを用いて平衡化されたスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５ｐｇ  ハイロード（ＨｉＬｏａｄ）カラムに適用した。溶出されたタンパク質を続いて、上記遠心濃縮器を再び用いて１０．７ｍｇ／ｍＬに濃縮した。阻害された血液凝固因子ＸＩＩＩａを結晶化の前に−８０℃で保存した。タンパク質結晶は、実施例０８において上述された方法によって成長させた。
［実施例１０：結晶の測定］
Ｘ線回析測定のために、血液凝固因子ＸＩＩＩａ複合体の単結晶を、表面上の小さな付随体（ｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ）の除去後に選択し、液体窒素で凍結した。０．５度回転および０．９１８４１Åの波長を有する４００イメージからなるデータセットを、ＢＥＳＳＹＩＩ電子貯蔵リングで作動されたＢＬ１４．２で集め、プログラムＨＫＬ２０００を用いてＰ１対称性において１．９８Åの分解能で処理した。構造を、ＣＣＰ４プログラム  フェイザー（Ｐｈａｓｅｒ）を用いて分子置換によって決定した。分子置換モデルを４つのサブユニットに分けた。因子ＸＩＩＩの不活性形のβ−サンドイッチドメイン、および２つのβ−バレルドメイン（ＰＤＢ  ＩＤ：１Ｆ１３）を使用した。触媒ドメインのために、トランスグルタミナーゼ２の活性形（ＰＤＢ  ＩＤ：２Ｑ３Ｚ）に基づくホモロジーモデルを、プログラム  モデラー（Ｍｏｄｅｌｌｅｒ）を用いて生成した。適切な配列アラインメントを、ＰＲＯＭＡＬＳを用いて二次構造部分を考慮することによって行った。
【０１３２】
続いて、得られた出発モデルの著しい改善を、ＡＲＰ／ｗＡＲＰにより実行される自動化法によって達成した。モデルは、Ｃｏｏｔを用いて手動でさらに改善され、Ｐｈｅｎｉｘを用いて精密化された。精密化の初めに模擬アニーリングステップを行った。構造を、座標、個々のＢ因子、占有率、ＴＬＳ群、最適化されたＸ線／立体化学重量、および最適化されたＸ線／ＡＤＰ重量を用いて精密化した。リガンドを、シビル（Ｓｙｂｙｌ）により実行されるトリポス力場（Ｔｒｉｐｏｓ  Ｆｏｒｓｅ  Ｆｉｅｌｄ）を用いることによって最小化した。リガンド拘束（ｒｅｓｔｒａｉｎｔｓ）を、ＣＣＰ４プログラムスウィート（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｓｕｉｔｅ）により実行されるモノマーライブラリスケッチャー（Ｍｏｎｏｍｅｒ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｓｋｅｔｃｈｅｒ）を用いて作成した。
【０１３３】
【表３−１】
2016506243.tif 000014
【０１３４】
【表３−２】
2016506243.tif 000015
【０１３５】
【表３−３】
2016506243.tif 000016
【０１３６】
［実施例１１：蛍光アッセイＦ００１］
蛍光アッセイキットＦ００１（ゼディラ（Ｚｅｄｉｒａ）社）を使用する用意をする。簡潔に、組換え体因子ＸＩＩＩ（ゼディラ（Ｚｅｄｉｒａ）社）、製品番号Ｔ０２７）またはヒト血液由来因子ＸＩＩＩ（Ｔ００７）を水中で再構成する。酵素活性を、トロンビンによる活性化後に、適切な緩衝液（例えば、塩化カルシウムを含むＴＲＩＳ緩衝液ｐＨ７．５、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グリシンメチルエステル、クロット阻害剤ペプチドＧＰＲＰ−アミドなど）中で測定する。因子ＸＩＩＩａは、グリシンメチルエステルを含む修飾ペプチドの側鎖からダーククエンチング（ｄａｒｋ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）分子を開裂する（イソペプチダーゼ活性とも呼ばれる）。続いて、Ｎ末端結合染色の蛍光を増加させ、オンラインで観察することができる（励起波長３１３ｎｍ；発光波長４１８ｎｍ）。関係する阻害剤を、トロンビンによる因子ＸＩＩＩの活性化の完結後に加えることができる。ＩＣ５０値は、ＦＸＩＩＩａ活性の５０％阻害につながる阻害濃度を表す。
［実施例１２：薬物設計において血液凝固因子ＸＩＩＩａ座標の使用］
ドッキングのようなコンピュータ法に基づいて、二つの選択肢が、潜在的に改善するリガンドと同定されている。一つの選択肢は、リガンドの疎水性表面を高めるためにインドール部分へメチル基を導入すること、またはピリジンのような環系を導入することにより剛性を高めることであるだろう。
［実施例１３：ブラッドフォードタンパク質アッセイ］
１．１部の染色試薬濃縮液を４部の脱イオン水（１８．２ＭΩ＊ｃｍ）を用いて希釈することにより染色試薬を調製する。
【０１３７】
粒子を除去するためにワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）＃１フィルタ（または同等のもの）を通してろ過する。この希釈試薬を、室温で保持して約１週間使用してもよい。
２．１．０ｍＬの希釈染色試薬を各チューブに加える。全てのステップにおいて、低結合（ｌｏｗ  ｂｉｎｄ）試験管（エッペンドルフタンパク質ＬｏＢｉｎｄ（登録商標）チューブ  Ｎｒ．：００３０  ０７９．２２１）を使用する。
３．ＢＳＡ標準タンパク質の５つの希釈液を調製する。ＢＳＡのアッセイにおける線形範囲は、０．０５〜０．５ｍｇ／ｍＬである。
４．１ｍＬの染色試薬に、２０μＬの標準溶液および試料溶液をそれぞれピペットでとり、ボルテックスする。タンパク質溶液は、通常、２回アッセイされる。対照として緩衝液または水を使用する。
５．室温で少なくとも１５分間インキュベートする。吸光度は経時的に増加するだろう；試料は、室温で１時間以下インキュベートするべきである。
６．５９５ｎｍで吸光度を測定する。
【図６−１】
2016506243.tif 000017
【図６−２】
2016506243.tif 000018
【図６−３】
2016506243.tif 000019
【図６−４】
2016506243.tif 000020
【図６−５】
2016506243.tif 000021
【図６−６】
2016506243.tif 000022
【図６−７】
2016506243.tif 000023
【図６−８】
2016506243.tif 000024
【図６−９】
2016506243.tif 000025
【図６−１０】
2016506243.tif 000026
【図６−１１】
2016506243.tif 000027
【図６−１２】
2016506243.tif 000028
【図６−１３】
2016506243.tif 000029
【図６−１４】
2016506243.tif 000030
【図６−１５】
2016506243.tif 000031
【図６−１６】
2016506243.tif 000032
【図６−１７】
2016506243.tif 000033
【図６−１８】
2016506243.tif 000034
【図６−１９】
2016506243.tif 000035
【図６−２０】
2016506243.tif 000036
【図６−２１】
2016506243.tif 000037
【図６−２２】
2016506243.tif 000038
【図６−２３】
2016506243.tif 000039
【図６−２４】
2016506243.tif 000040
【図６−２５】
2016506243.tif 000041
【図６−２６】
2016506243.tif 000042
【図６−２７】
2016506243.tif 000043
【図６−２８】
2016506243.tif 000044
【図６−２９】
2016506243.tif 000045
【図６−３０】
2016506243.tif 000046
【図６−３１】
2016506243.tif 000047
【図６−３２】
2016506243.tif 000048
【図６−３３】
2016506243.tif 000049
【図６−３４】
2016506243.tif 000050
【図６−３５】
2016506243.tif 000051
【図６−３６】
2016506243.tif 000052
【図６−３７】
2016506243.tif 000053
【図６−３８】
2016506243.tif 000054
【図６−３９】
2016506243.tif 000055
【図６−４０】
2016506243.tif 000056
【図６−４１】
2016506243.tif 000057
【図６−４２】
2016506243.tif 000058
【図６−４３】
2016506243.tif 000059
【図６−４４】
2016506243.tif 000060
【図６−４５】
2016506243.tif 000061
【図６−４６】
2016506243.tif 000062
【図６−４７】
2016506243.tif 000063
【図６−４８】
2016506243.tif 000064
【図６−４９】
2016506243.tif 000065
【図６−５０】
2016506243.tif 000066
【図６−５１】
2016506243.tif 000067
【図６−５２】
2016506243.tif 000068
【図６−５３】
2016506243.tif 000069
【図６−５４】
2016506243.tif 000070
【図６−５５】
2016506243.tif 000071
【図６−５６】
2016506243.tif 000072
【図６−５７】
2016506243.tif 000073
【図６−５８】
2016506243.tif 000074
【図６−５９】
2016506243.tif 000075
【図６−６０】
2016506243.tif 000076
【図６−６１】
2016506243.tif 000077
【図６−６２】
2016506243.tif 000078
【図６−６３】
2016506243.tif 000079
【図６−６４】
2016506243.tif 000080
【図６−６５】
2016506243.tif 000081
【図６−６６】
2016506243.tif 000082
【図６−６７】
2016506243.tif 000083
【図６−６８】
2016506243.tif 000084
【図６−６９】
2016506243.tif 000085
【図６−７０】
2016506243.tif 000086
【図６−７１】
2016506243.tif 000087
【図６−７２】
2016506243.tif 000088
【図６−７３】
2016506243.tif 000089
【図６−７４】
2016506243.tif 000090
【図６−７５】
2016506243.tif 000091
【図６−７６】
2016506243.tif 000092
【図６−７７】
2016506243.tif 000093
【図６−７８】
2016506243.tif 000094
【図６−７９】
2016506243.tif 000095
【図６−８０】
2016506243.tif 000096
【図６−８１】
2016506243.tif 000097
【図６−８２】
2016506243.tif 000098
【図６−８３】
2016506243.tif 000099
【図６−８４】
2016506243.tif 000100
【図６−８５】
2016506243.tif 000101
【図６−８６】
2016506243.tif 000102
【図６−８７】
2016506243.tif 000103
【図６−８８】
2016506243.tif 000104
【図６−８９】
2016506243.tif 000105
【図６−９０】
2016506243.tif 000106
【図６−９１】
2016506243.tif 000107
【図６−９２】
2016506243.tif 000108
【図６−９３】
2016506243.tif 000109
【図６−９４】
2016506243.tif 000110
【図６−９５】
2016506243.tif 000111
【図６−９６】
2016506243.tif 000112
【図６−９７】
2016506243.tif 000113
【図６−９８】
2016506243.tif 000114
【図６−９９】
2016506243.tif 000115
【図６−１００】
2016506243.tif 000116
【図６−１０１】
2016506243.tif 000117
【図６−１０２】
2016506243.tif 000118
【図６−１０３】
2016506243.tif 000119
【図６−１０４】
2016506243.tif 000120
【図６−１０５】
2016506243.tif 000121
【図６−１０６】
2016506243.tif 000122
【図６−１０７】
2016506243.tif 000123
【図６−１０８】
2016506243.tif 000124
【図６−１０９】
2016506243.tif 000125
【図６−１１０】
2016506243.tif 000126
【図６−１１１】
2016506243.tif 000127
【図６−１１２】
2016506243.tif 000128
【図６−１１３】
2016506243.tif 000129
【図６−１１４】
2016506243.tif 000130
【図６−１１５】
2016506243.tif 000131
【図６−１１６】
2016506243.tif 000132
【図６−１１７】
2016506243.tif 000133
【図６−１１８】
2016506243.tif 000134
【図６−１１９】
2016506243.tif 000135
【図６−１２０】
2016506243.tif 000136
【図６−１２１】
2016506243.tif 000137
【図６−１２２】
2016506243.tif 000138
【図６−１２３】
2016506243.tif 000139
【図６−１２４】
2016506243.tif 000140
【図６−１２５】
2016506243.tif 000141
【図６−１２６】
2016506243.tif 000142
【図６−１２７】
2016506243.tif 000143
【図６−１２８】
2016506243.tif 000144
【図６−１２９】
2016506243.tif 000145
【図６−１３０】
2016506243.tif 000146
【図６−１３１】
2016506243.tif 000147
【図６−１３２】
2016506243.tif 000148
【図６−１３３】
2016506243.tif 000149
【図６−１３４】
2016506243.tif 000150
【図６−１３５】
2016506243.tif 000151
【図６−１３６】
2016506243.tif 000152
【図６−１３７】
2016506243.tif 000153
【図６−１３８】
2016506243.tif 000154
【図６−１３９】
2016506243.tif 000155
【図６−１４０】
2016506243.tif 000156
【図６−１４１】
2016506243.tif 000157
【図６−１４２】
2016506243.tif 000158
【図６−１４３】
2016506243.tif 000159
【図６−１４４】
2016506243.tif 000160
【図６−１４５】
2016506243.tif 000161
【図６−１４６】
2016506243.tif 000162
【図６−１４７】
2016506243.tif 000163
【図６−１４８】
2016506243.tif 000164
【図６−１４９】
2016506243.tif 000165
【図６−１５０】
2016506243.tif 000166
【図６−１５１】
2016506243.tif 000167
【図６−１５２】
2016506243.tif 000168
【図６−１５３】
2016506243.tif 000169
【図６−１５４】
2016506243.tif 000170
【図６−１５５】
2016506243.tif 000171
【図６−１５６】
2016506243.tif 000172
【図６−１５７】
2016506243.tif 000173
【図６−１５８】
2016506243.tif 000174
【図１】
2016506243.tif 000175
【図２】
2016506243.tif 000176
【図３】
2016506243.tif 000177
【図４】
2016506243.tif 000178
【図５】
2016506243.tif 000179
【図７】
2016506243.tif 000180
【配列表】
2016506243000001.app
【国際調査報告】
2016506243.tif 000181
2016506243.tif 000182
2016506243.tif 000183
2016506243.tif 000184