(57)【要約】  本明細書では、ＮＡＤＨの場合のＫＭが増大するグリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）酵素、ならびにＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して実質的に同じ親和性を有し、かつ／またはグリセロール−３−ホスフェートによってフィードバック阻害されるＧＰＤ酵素が提供される。本明細書ではまた、ＧＰＤをコードする異種遺伝子とＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損とを含む組換え微生物が提供される。また、ＧＰＤをコードする異種遺伝子とブタノール生合成経路とを含む組換え微生物も提供される。さらに、本明細書に記載の組換え微生物を用意するステップと、ブタノールが産生される条件下で組換え微生物を少なくとも１種の発酵性炭素物質と接触させるステップとを含むブタノールの製造方法が提供される。
2016511010.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え微生物であって、
（ａ）前記組換え微生物とは非相同である少なくとも１種のポリペプチドを含むブタノール生合成経路と、
（ｂ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、前記微生物の内在性ＧＰＤのＫＭと比べて高いＮＡＤＨの場合のＫＭを有する異種性ＧＰＤと、
（ｃ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損と
を含む組換え微生物において、
前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてブタノール産生が向上する、組換え微生物。
【請求項２】
前記ブタノール生合成経路が、
（ａ）１−ブタノール生合成経路、
（ｂ）２−ブタノール生合成経路、および
（ｃ）イソブタノール生合成経路
からなる群から選択される、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
前記１−ブタノール生合成経路が、
（ａ）アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡ（アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼによって触媒される）、
（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ（３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒される）、
（ｃ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡ（クロトナーゼによって触媒される）、
（ｄ）クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡ（ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒される）、
（ｅ）ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒド（ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒される）、および
（ｆ）ブチルアルデヒドから１−ブタノール（１−ブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒される）
のうちの少なくとも１つの基質から生成物への変換を行うポリペプチドをコードする少なくとも１種の遺伝子を含む、請求項２に記載の組換え微生物。
【請求項４】
前記２−ブタノール生合成経路が、
（ａ）ピルベートからアルファ−アセト乳酸（アセト乳酸合成酵素によって触媒される）、
（ｂ）アルファ−アセト乳酸からアセトイン（アセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒される）、
（ｃ）アセトインから２，３−ブタンジオール（ブタンジオールデヒドロゲナーゼによって触媒される）、
（ｄ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノン（ブタンジオールデヒドラターゼによって触媒される）、および
（ｅ）２−ブタノンから２−ブタノール（２−ブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒される）
のうちの少なくとも１つの基質から生成物への変換を行うポリペプチドをコードする少なくとも１種の遺伝子を含む、請求項２に記載の組換え微生物。
【請求項５】
前記イソブタノール生合成経路が、
（ａ）ピルベートからアセト乳酸（アセト乳酸合成酵素によって触媒される）、
（ｂ）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソバレレート（アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼによって触媒される）、
（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソ吉草酸（ジヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒される）、
（ｄ）α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒド（分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒される）、および
（ｅ）イソブチルアルデヒドからイソブタノール（分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒される）
のうちの少なくとも１の基質から生成物への変換を行うポリペプチドをコードする少なくとも１種の遺伝子を含む、請求項２に記載の組換え微生物。
【請求項６】
前記微生物が、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ジモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルトロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ザイゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デバリオミケス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ブレタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、ヤマダザイマ属（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）、およびサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される属のものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項７】
前記微生物が前記サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のものである、請求項６に記載の組換え微生物。
【請求項８】
前記異種性ＧＰＤが自然界に存在するＧＰＤである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項９】
前記異種性ＧＰＤが、メキシコリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ）、ドナリエラ・ヴィリディス（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ）、オオミユビトビネズミ（Ｊａｃｕｌｕｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、アーキオグロブス・フルジダス（Ａｒｃｈｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、ベギアトア・アルバ（Ｂｅｇｇｉａｔｏａ  ａｌｂａ）、カンジエラ・コレニス（Ｋａｎｇｉｅｌｌａ  ｋｏｒｅｅｎｉｓ）、アスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、カンジダ・バーサチルス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、およびアナウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕ）からなる群から選択される生物からのＧＰＤの配列を含む、請求項８に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
前記異種性ＧＰＤが改変ＧＰＤである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１１】
前記改変ＧＰＤは、配列番号１９５の位置４２、４４、４５、７１、７３、７５、９５、１２４、１２６、１２９、１５１、１５２、１８３、１８４、１８５、２４６、３１０、３３６、３３７、または３３９に対応する残基に少なくとも１つの置換を含む、請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
前記改変ＧＰＤは、配列番号１９５の位置７３に対応する残基に少なくとも１つの置換を含む、請求項１１に記載の組換え微生物。
【請求項１３】
前記改変ＧＰＤは、配列番号１９５の位置１２９に対応する残基に少なくとも１つの置換を含む、請求項１１に記載の組換え微生物。
【請求項１４】
前記改変ＧＰＤは、配列番号１９５の位置７３に対応する残基に置換を含み、配列番号１９５の位置１２９に対応する残基に置換を含む、請求項１１に記載の組換え微生物。
【請求項１５】
前記微生物が、ＮＡＤＨを利用するケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）を含む、請求項５〜１４のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１６】
配列番号１９５との少なくとも８５％の同一性を有する改変グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）酵素。
【請求項１７】
前記酵素が、配列番号１９５の位置４２、４４、４５、７１、７３、７５、９５、１２４、１２６、１２９、１５１、１５２、１８３、１８４、１８５、２４６、３１０、３３６、３３７、または３３９に対応する残基に少なくとも１つの置換を含む、請求項１５に記載の改変ＧＰＤ酵素。
【請求項１８】
前記酵素が、配列番号１９５の位置７３に対応する少なくとも１つの置換を含む、請求項１７に記載の改変ＧＰＤ酵素。
【請求項１９】
前記酵素が、配列番号１９５の位置１２９に対応する少なくとも１つの置換を含む、請求項１７に記載の改変ＧＰＤ酵素。
【請求項２０】
前記酵素が、配列番号１９５の位置７３に対応する置換および配列番号１９５の位置１２９に対応する置換を含む、請求項１７に記載の改変ＧＰＤ酵素。
【請求項２１】
ＮＡＤＨの場合の前記ＫＭが約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭである、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の改変ＧＰＤ酵素。
【請求項２２】
請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の改変ＧＰＤ酵素を含む組換え微生物。
【請求項２３】
前記微生物が、前記組換え微生物とは非相同である少なくとも１種の遺伝子を含むブタノール生合成経路を含み、前記微生物が、ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損を含み、前記組換え微生物が、前記改変ＧＰＤ酵素のない微生物と比べてブタノール産生が向上する、請求項２２に記載の組換え微生物。
【請求項２４】
前記ブタノール生合成経路が、
（ａ）１−ブタノール生合成経路、
（ｂ）２−ブタノール生合成経路、および
（ｃ）イソブタノール生合成経路
からなる群から選択される、請求項２３に記載の組換え微生物。
【請求項２５】
前記１−ブタノール生合成経路が、
（ａ）アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡ（アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼによって触媒される）、
（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ（３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒される）、
（ｃ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡ（クロトナーゼによって触媒される）、
（ｄ）クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡ（ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒される）、
（ｅ）ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒド（ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒される）、および
（ｆ）ブチルアルデヒドから１−ブタノール（１−ブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒される）
のうちの少なくとも１つの基質から生成物への変換を行うポリペプチドをコードする少なくとも１種の遺伝子を含む、請求項２４に記載の組換え微生物。
【請求項２６】
前記２−ブタノール生合成経路が、
（ａ）ピルベートからアルファ−アセト乳酸（アセト乳酸合成酵素によって触媒される）、
（ｂ）アルファ−アセト乳酸からアセトイン（アセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒される）、
（ｃ）アセトインから２，３−ブタンジオール（ブタンジオールデヒドロゲナーゼによって触媒される）、
（ｄ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノン（ブタンジオールデヒドラターゼによって触媒される）、および
（ｅ）２−ブタノンから２−ブタノール（２−ブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒される）
のうちの少なくとも１つの基質から生成物への変換を行うポリペプチドをコードする少なくとも１種の遺伝子を含む、請求項２４に記載の組換え微生物。
【請求項２７】
前記イソブタノール生合成経路が、
（ａ）ピルベートからアセト乳酸（アセト乳酸合成酵素によって触媒される）、
（ｂ）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソバレレート（アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼによって触媒される）、
（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソ吉草酸（ジヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒される）、
（ｄ）α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒド（分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒される）、および
（ｅ）イソブチルアルデヒドからイソブタノール（分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒される）
のうちの少なくとも１つの基質から生成物への変換を行うポリペプチドをコードする少なくとも１種の遺伝子を含む、請求項２４に記載の組換え微生物。
【請求項２８】
前記微生物が、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ジモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルトロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ザイゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デバリオミケス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ブレタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、ヤマダザイマ属（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）、およびサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される属のものである、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２９】
前記微生物が前記サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のものである、請求項２８に記載の組換え微生物。
【請求項３０】
前記微生物が、ＮＡＤＨを利用するケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）を含む、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項３１】
（ａ）
ｉ．改変イソブタノール生合成経路と、
ｉｉ．ＧＰＤ１をコードする内在性遺伝子の欠失または破損と、
ｉｉｉ．
ａ．請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の前記改変ＧＰＤ酵素；または
ｂ．異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、前記微生物の内在性ＧＰＤのＫＭと比べて高いＮＡＤＨの場合のＫＭを有する異種性ＧＰＤの少なくとも１種と
を含む組換え微生物を用意するステップと、
（ｂ）イソブタノールが産生される条件下で、前記組換え微生物を少なくとも１種の発酵性炭素物質と接触させるステップと
を含む、イソブタノールを製造するための方法。
【請求項３２】
前記組換え微生物が嫌気条件下で成長する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記改変ＧＰＤが、配列番号１９５の４２、４４、４５、７１、７３、７５、９５、１２４、１２６、１２９、１５１、１５２、１８３、１８４、１８５、２４６、３１０、３３６、３３７、または３３９に対応する残基に少なくとも１つの置換を含む、請求項３１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＧＰＤのＮＡＤＨの場合のＫＭが約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭである、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
組換え微生物であって、
（ａ）前記組換え微生物とは非相同である少なくとも１種のポリペプチドを含むブタノール生合成経路と、
（ｂ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、前記微生物の内在性ＧＰＤのＫｍと比べて高いＮＡＤＨの場合のＫＭを有する異種性ＧＰ
Ｄと、
（ｃ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損と
を含む組換え微生物であって、
前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてグリセロール産生が減少する、組換え微生物。
【請求項３６】
組換え微生物であって、
（ａ）前記組換え微生物とは非相同である少なくとも１種のポリペプチドを含むブタノール生合成経路と、
（ｂ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、前記微生物の内在性ＧＰＤのＫＭと比べて高いＮＡＤＨの場合のＫＭを有する異種性ＧＰＤと、
（ｃ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損と
を含む組換え微生物において、
前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてブタノールとグリセロールとのモル比が増大する、組換え微生物。
【請求項３７】
組換え微生物であって、
（ａ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、前記微生物の内在性ＧＰＤのＫＭと比べて高いＮＡＤＨの場合のＫＭを有する異種性ＧＰＤと、
（ｂ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損と
を含む組換え微生物において、
前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてグリセロール産生が減少する、組換え微生物。
【請求項３８】
組換え微生物であって、
（ａ）前記組換え微生物とは非相同である少なくとも１種のポリペプチドを含む改変ブタノール生合成経路と、
（ｂ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して実質的に同じ親和性を有する異種性ＧＰＤと、
（ｃ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損と
を含む組換え微生物において、
前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてブタノール産生が向上する、組換え微生物。
【請求項３９】
組換え微生物であって、
（ａ）前記組換え微生物とは非相同である少なくとも１種のポリペプチドを含む改変ブタノール生合成経路と、
（ｂ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して実質的に同じ親和性を有する異種性ＧＰＤと、
（ｃ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損と
を含む組換え微生物において、
前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてグリセロール産生が減少する、組換え微生物。
【請求項４０】
組換え微生物であって、
（ａ）前記組換え微生物とは非相同である少なくとも１種のポリペプチドを含む改変ブタノール生合成経路と、
（ｂ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、
ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して実質的に同じ親和性を有する異種性ＧＰＤと、
（ｃ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損と
を含む組換え微生物において、
前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてブタノールとグリセロールとのモル比が増大する、組換え微生物。
【請求項４１】
前記改変ブタノール生合成経路が、
（ａ）１−ブタノール生合成経路、
（ｂ）２−ブタノール生合成経路、および
（ｃ）イソブタノール生合成経路
からなる群から選択される、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項４２】
前記微生物が、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ジモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルトロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ザイゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デバリオミケス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ブレタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、ヤマダザイマ属（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）、およびサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される属のものである、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項４３】
前記微生物が前記サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のものである、請求項４２に記載の組換え微生物。
【請求項４４】
前記異種性ＧＰＤが、ＥＣ番号１．１．１．９４を有するＧＰＤである、請求項３８〜４３のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項４５】
前記異種性ＧＰＤが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＰＤ、カンジダ・バーサチルス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）ＧＰＤ、およびアスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＧＰＤから選択される、請求項４４に記載の組換え微生物。
【請求項４６】
（ａ）請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の組換え微生物を用意するステップと、
（ｂ）ブタノールが産生される条件下で、前記組換え微生物を少なくとも１種の発酵性炭素物質と接触させるステップと
を含む、ブタノールを製造するための方法。
【請求項４７】
前記改変ブタノール生合成経路が、
（ａ）１−ブタノール生合成経路、
（ｂ）２−ブタノール生合成経路、および
（ｃ）イソブタノール生合成経路
からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項４８】
前記微生物が、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ジモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルトロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ザイゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デバリオミケス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ブレタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、ヤマダザイマ属（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）、およびサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される属のものである、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記微生物が前記サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のものである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記異種性ＧＰＤが、ＥＣ番号１．１．１．９４を有するＧＰＤである、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記異種性ＧＰＤが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＰＤ、カンジダ・バーサチルス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）ＧＰＤ、およびアスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＧＰＤから選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
（ａ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して実質的に同じ親和性を有する異種性ＧＰＤと、
（ｂ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損と
を含む組換え微生物であって、
前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてグリセロール産生が減少する、組換え微生物。
【請求項５３】
異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）を含む組換え微生物であって、前記異種性ＧＰＤがＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに対して実質的に同じ親和性を有し、かつ前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてグリセロール産生が減少する、組換え微生物。
【請求項５４】
組換え微生物であって、
（ａ）前記組換え微生物とは非相同である少なくとも１種のポリペプチドを含む改変ブタノール生合成経路と、
（ｂ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、
グリセロール−３−ホスフェートによって抑制される異種性ＧＰＤと、
（ｃ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損と
を含む組換え微生物において、
前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてブタノール産生が向上する、組換え微生物。
【請求項５５】
組換え微生物であって、
（ａ）前記組換え微生物とは非相同である少なくとも１種のポリペプチドを含む改変ブタノール生合成経路と、
（ｂ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、グリセロール−３−ホスフェートによって抑制される異種性ＧＰＤと、
（ｃ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損と
を含む組換え微生物において、
前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてグリセロール産生が減少する、組換え微生物。
【請求項５６】
組換え微生物であって、
（ａ）前記組換え微生物とは非相同である少なくとも１種のポリペプチドを含む改変ブタノール生合成経路と、
（ｂ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、グリセロール−３−ホスフェートによって抑制される異種性ＧＰＤと、
（ｃ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損と
を含む組換え微生物において、
前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてブタノールとグリセロールとのモル比が増大する、組換え微生物。
【請求項５７】
前記改変ブタノール生合成経路が、
（ａ）１−ブタノール生合成経路、
（ｂ）２−ブタノール生合成経路、および
（ｃ）イソブタノール生合成経路
からなる群から選択される、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項５８】
前記微生物が、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ジモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルトロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ザイゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デバリオミケス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ブレタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、ヤマダザイマ属（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）、およびサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される属のものである、請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項５９】
前記異種性ＧＰＤが、ＥＣ番号１．１．１．９４を有するＧＰＤである、請求項５４〜５８のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項６０】
前記異種性ＧＰＤが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＰＤ、カンジダ・バーサチルス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）ＧＰＤ、およびアスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＧＰＤから選択される、請求項５９に記載の組換え微生物。
【請求項６１】
（ａ）請求項５４〜６０のいずれか一項に記載の組換え微生物を用意するステップと、
（ｂ）ブタノールが産生される条件下で、前記組換え微生物を少なくとも１種の発酵性炭素物質と接触させるステップと
を含む、ブタノールを製造するための方法。
【請求項６２】
（ａ）グリセロール−３−ホスフェートによって抑制される異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）と、
（ｂ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損と
を含む組換え微生物であって、
前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてグリセロール産生が減少する、組換え微生物。
【請求項６３】
異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）を含む組換え微生物であって、前記異種性ＧＰＤがグリセロール−３−ホスフェートによって抑制され、前記組換え微生物では、前記異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてグリセロール産生が減少する、異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）を含む組換え微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１４日に出願された米国仮出願第６１／７８２，６５１号明細書および２０１４年１月３１日に出願された米国仮出願第６１／９３４，０９６号明細書の優先権を主張するものであり、これらの各々についてその全体を本明細書に援用する。
【０００２】
本発明は、工業微生物学の分野およびブタノールとその異性体の発酵生産に関する。さらに具体的には、本発明は、ＮＡＤＨの場合のＫＭが大きい（ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対する親和性が実質的に同じである）グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）酵素及び／またはフィードバック阻害されるＧＰＤ酵素、そうした酵素を含む組換え微生物、およびそうした酵素を用いてブタノールを製造する方法に関する。
【０００３】
電子的手段で提出された配列リストについての記載
本出願と一緒に提出した電子提出ＡＳＣＩＩテキストファイルの配列リストの内容（名前：２０１４０３１４＿ＣＬ５７０７ＵＳＮＰ＿配列リスト；サイズ：４０１，４０８バイト、作成日：２０１４年３月１２日）は、その全体を本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００４】
ブタノールは、燃料添加物、プラスチック工業における原料化学物質、また食品香料工業（ｆｏｏｄ  ａｎｄ  ｆｌａｖｏｒ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ）における食品用エクストラクタントとして役立つ、重要な工業化学物質である。毎年、１００億〜１２０億ポンドのブタノールが石油化学的手段で製造され、この汎用化学物質は、将来おそらく、ますます必要とされるであろう。
【０００５】
イソブタノールを化学合成するための方法は周知であり、オキソ合成、一酸化炭素の接触水素化（非特許文献１）およびメタノールとｎ−プロパノールとのＧｕｅｒｂｅｔ縮合（非特許文献２）などがある。こうしたプロセスでは、石油化学製品から得られる出発物質を使用し、一般に高価であり、環境に優しくない。植物由来の原料からイソブタノールを製造するなら、温室効果ガス排出が最小限にされるであろうし、当該技術分野における進歩となるであろう。
【０００６】
イソブタノールは、酵母発酵の副生成物として生物学的に製造されるか、またはブタノールを産生するためのブタノール生合成経路を発現するよう修飾された組換え改変（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）微生物によって製造される。例えば、特許文献１（その全体を本明細書に援用する）を参照されたい。真菌類によるアミノ酸代謝が不完全であるために形成される「フーゼル油」の成分として、イソブタノールはＬ−バリンの異化反応によって特に産生される。Ｌ−バリンのアミン基が窒素源として集められた後、得られたα−ケト酸は、いわゆるＥｈｒｌｉｃｈ経路の酵素によって脱炭酸され、イソブタノールに還元される（非特許文献３）。
【０００７】
酵母菌によるブタノール産生の重要な収率損失メカニズムの１つは、ジヒドロキシアセトンホスフェートからグリセロールへの変換により、解糖作用からそれる炭素および還元性同等物が損失することである。この変換における第１ステップは、グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）と呼ばれる酵素によって触媒される。ブタノールを産生する酵母菌内のＧＰＤを除去すること（したがって、グリセロール産生をなくすこと）は、以前から提案されてきた。しかし、グリセロールは成長に必要であり、浸透圧保護剤である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第７，８５１，１８８号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｖｏｌ．５，ｐｐ．７１６−７１９
【非特許文献２】Ｃａｒｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌｅｃ．Ｃａｔａｌ．Ａ．Ｃｈｅｍ．２２０：２１５−２２０，２００４
【非特許文献３】Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２５７５２−２５７５６，１９９８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、ブタノール収率を増大させ、かつグリセロール産生を減少させる方法は、当該技術分野における進歩となる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書では、ＧＰＤ酵素、組換え微生物、およびブタノールを製造するための方法が提供される。
【００１２】
本明細書では、組換え微生物であって、（ａ）組換え微生物とは非相同である少なくとも１種のポリペプチドを含む改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ブタノール生合成経路と、（ｂ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、微生物の内在性ＧＰＤのＫＭと比べて高いＮＡＤＨの場合のＫＭを有する異種性ＧＰＤと、（ｃ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損とを含む、組換え微生物が提供される。実施形態によっては、組換え微生物は、異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてブタノール産生が向上または増大する。実施形態によっては、組換え微生物は、異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてグリセロール産生が低下または減少する。実施形態によっては、組換え微生物は、異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてブタノールとグリセロールとのモル比が増大する。実施形態によっては、組換え微生物は、異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べて有効収率が増大する。
【００１３】
本明細書ではまた、組換え微生物であって、（ａ）組換え微生物とは非相同である少なくとも１種のポリペプチドを含む改変ブタノール生合成経路と、（ｂ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して実質的に同じ親和性を有しかつ／またはフィードバック阻害される異種性ＧＰＤと、（ｃ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損とを含む、組換え微生物も提供される。実施形態によっては、組換え微生物は、異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてブタノール産生が向上する。任意であるが、異種性ＧＰＤは、グリセロール−３−ホスフェートによってフィードバック阻害される。実施形態によっては、組換え微生物は、異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてグリセロール産生が低下または減少する。実施形態によっては、組換え微生物は、異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてブタノールとグリセロールとのモル比が増大する。実施形態によっては、組換え微生物は、異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べて有効収率が増大する。
【００１４】
ある特定の実施形態では、異種性ＧＰＤは自然界に存在するＧＰＤである。ある特定の実施形態では、自然界に存在するＧＰＤは、ＥＣ番号の１．１．１．８，１．１．５．３、または１．１．１．９４から選択される。自然界に存在するＧＰＤは、メキシコリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ）、ドナリエラ・ヴィリディス（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ）、オオミユビトビネズミ（Ｊａｃｕｌｕｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、アーキオグロブス・フルジダス（Ａｒｃｈｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、ベギアトア・アルバ（Ｂｅｇｇｉａｔｏａ  ａｌｂａ）、カンジエラ・コレニス（Ｋａｎｇｉｅｌｌａ  ｋｏｒｅｅｎｉｓ）、アスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、カンジダ・バーサチルス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、およびアナウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕ）からなる群から選択される生物からのＧＰＤであってよい。
【００１５】
ある特定の実施形態では、異種性ＧＰＤは改変ＧＰＤである。改変ＧＰＤは、配列番号１９５の位置４２、４４、４５、７１、７３、７５、９５、１２４、１２６、１２９、１５１、１５２、１８３、１８４、１８５、２４６、３１０、３３６、３３７、または３３９に対応する、少なくとも１つの置換を含みうる。ある特定の実施形態では、改変ＧＰＤは、配列番号１９５の位置７３に対応する残基に少なくとも１つの置換を含む。ある特定の実施形態では、改変ＧＰＤは、配列番号１９５の位置１２９に対応する残基に少なくとも１つの置換を含む。ある特定の実施形態では、改変ＧＰＤは、配列番号１９５の位置７３に対応する残基に少なくとも１つの置換を含み、配列番号１９５の位置１２９に対応する残基に置換を含む。
【００１６】
改変グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）酵素も提供される。ある特定の実施形態では、改変ＧＰＤ酵素は、配列番号１９５との少なくとも８５％の同一性を有する。ある特定の実施形態では、改変ＧＰＤ酵素は、配列番号１９５の位置４２、４４、４５、７１、７３、７５、９５、１２４、１２６、１２９、１５１、１５２、１８３、１８４、１８５、２４６、３１０、３３６、３３７、または３３９に対応する残基に少なくとも１つの置換を含む。ある特定の実施形態では、改変ＧＰＤ酵素は、配列番号１９５の位置７３に対応する少なくとも１つの置換を含む。ある特定の実施形態では、改変ＧＰＤ酵素は、配列番号１９５の位置１２９に対応する少なくとも１つの置換を含む。ある特定の実施形態では、改変ＧＰＤ酵素は、配列番号１９５の位置７３に対応する少なくとも１つの置換および配列番号１２９の位置１２９に対応する置換を含む。ある特定の実施形態では、改変ＧＰＤ酵素は、ＮＡＤＨの場合のＫＭが約０．０１ｍＭ〜１ｍＭである。
【００１７】
本明細書に開示されている改変ＧＰＤ酵素のいずれかを含む組換え微生物も提供される。必要に応じて、組換え微生物は、組換え微生物とは非相同である少なくとも１種の遺伝子を含んでおり、改変ブタノール生合成経路を含むことができる。組換え微生物は、例えば、ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損を含みうる。ある特定の実施形態では、組換え微生物は、改変ＧＰＤ酵素のない微生物と比べてブタノール産生が向上または増大する。実施形態によっては、組換え微生物は、改変ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてグリセロール産生が低下または減少する。実施形態によっては、組換え微生物は、改変ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてブタノールとグリセロールとのモル比が増大する。実施形態によっては、組換え微生物は、改変ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べて有効収率が増大する。
【００１８】
ブタノールを製造するための方法も提供される。その方法は、（ｉ）改変ブタノール生合成経路と、（ｉｉ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損と、（ｉｉｉ）（ａ）改変ＧＰＤ酵素；（ｂ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、微生物の内在性ＧＰＤのＫＭと比べて高いＮＡＤＨの場合のＫＭを有する異種性ＧＰＤ；または（ｃ）異種性ＧＰＤであって、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して実質的に同じ親和性を有しかつ／またはフィードバック阻害される異種性ＧＰＤのうちの少なくとも１つとを含む組換え微生物を用意するステップと；組換え微生物を、ブタノールが産生される条件下で少なくとも１種の発酵性炭素物質と接触させるステップとを含む。任意であるが、異種性ＧＰＤは、グリセロール−３−ホスフェートによってフィードバック阻害される。ある特定の実施形態では、組換え微生物は嫌気条件下で成長する。
【００１９】
組換え微生物は、（ａ）１−ブタノール生合成経路；（ｂ）２−ブタノール生合成経路；および（ｃ）イソブタノール生合成経路からなる群から選択される改変ブタノール生合成経路を含むことができる。
【００２０】
必要に応じて、１−ブタノール生合成経路は、以下の基質から生成物への変換の１つを実行する少なくとも１種のポリペプチドを含む：（ａ）アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡ（アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼによって触媒される）；（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ（３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒される）；（ｃ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡ（クロトナーゼによって触媒される）；（ｄ）クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡ（ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒される）；（ｅ）ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒド（ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒される）；および（ｆ）ブチルアルデヒドから１−ブタノール（１−ブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒される）。
【００２１】
必要に応じて、２−ブタノール生合成経路は、以下の基質から生成物への変換の１つを実行する少なくとも１種のポリペプチドを含む：（ａ）ピルベートからアルファ−アセト乳酸（アセト乳酸合成酵素によって触媒される）；（ｂ）アルファ−アセト乳酸からアセトイン（アセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒される）；（ｃ）アセトインから２，３−ブタンジオール（ブタンジオールデヒドロゲナーゼによって触媒される）；（ｄ）２，３−ブタンジオールから２−ブタノン（ブタンジオールデヒドラターゼによって触媒される）；および（ｅ）２−ブタノンから２−ブタノール（２−ブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒される）。
【００２２】
必要に応じて、イソブタノール生合成経路は、以下の基質から生成物への変換の１つを実行する少なくとも１種のポリペプチドを含む：（ａ）ピルベートからアセト乳酸（アセト乳酸合成酵素によって触媒される）；（ｂ）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソバレレート（ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ｋｅｔｏｌ−ａｃｉｄ  ｒｅｄｕｃｔｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ）によって触媒される）；（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソ吉草酸（ジヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒される）；（ｄ）α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒド（分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒される）；および（ｅ）イソブチルアルデヒドからイソブタノール（分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒される）。
【００２３】
ある特定の実施形態では、組換え微生物は、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ジモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルトロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ザイゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デバリオミケス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ブレタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、ヤマダザイマ属（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）、およびサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される属のものである。
【００２４】
また、（ａ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、微生物の内在性ＧＰＤのＫＭと比べて高いＮＡＤＨの場合のＫＭを有する異種性ＧＰＤと、（ｂ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損とを含む組換え微生物も提供される。実施形態によっては、微生物は、異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてグリセロール産生が減少する。
【００２５】
また、（ａ）異種性グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）であって、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して実質的に同じ親和性を有しかつ／またはフィードバック阻害される異種性ＧＰＤと、（ｂ）ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損とを含む、組換え微生物も提供される。必要に応じて、異種性ＧＰＤは、グリセロール−３−ホスフェートによってフィードバック阻害される。実施形態によっては、微生物は、異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてグリセロール産生が減少する。
【００２６】
また、異種性ＧＰＤを含む組換え微生物であって、異種性ＧＰＤが、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して実質的に同じ親和性を有しかつ／またはフィードバック阻害され、組換え微生物が、異種性ＧＰＤのない対照組換え微生物と比べてグリセロール産生が減少する、組換え微生物も提供される。必要に応じて、異種性ＧＰＤは、グリセロール−３−ホスフェートによってフィードバック阻害される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で変種ＧＰＤタンパク質を発現させるのに用いられるプラスミドのマップを示す。
【図２】切り取られたヒトのＧＰＤ配列の部分アラインメント（配列番号１９０）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧＰＤ１）（配列番号１９１）、発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）（配列番号１９２）、ベギアトア・アルバ（Ｂｅｇｇｉａｔｏａ  ａｌｂａ）（配列番号１９３）、およびカンジエラ・コレンシス（Ｋａｎｇｉｅｌｌａ  ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）（配列番号１９４）を示す。アステリスク（＊）は、ヒトの切り取られた配列におけるｐｈｅ４１およびｐｈｅ９７の位置を示す。
【図３】は、示されているＧＰＤ１変種および対照細胞培養物についての２０時間産生データを示すグラフを示す。それぞれの変種の２種類のクローンを２回試験した。２１４５：ＷＴ  ＧＰＤを有するイソブタノロゲン（ｉｓｏｂｕｔａｎｏｌｏｇｅｎ）対照菌株（ｐＬＭＨ１１−ＪＭ４４で形質転換されたＰＮＹ２１４５である）。ＥＣ＿ｌおよびＥＣ＿２：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）最適化ＧＰＤ。Ｅ３およびＥ８：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）最適化ＧＰＤ１変種。Ｎ３およびＮ８：酵母菌の天然コドン使用頻度（ｎａｔｉｖｅ  ｃｏｄｏｎ−ｕｓａｇｅ）のＧＰＤ変種。Ｍ３およびＭ８：酵母菌コドン最適化ＧＰＤ変種。変種であるＥ３、Ｎ３、およびＭ３は、Ｆ７３置換を有し、変種であるＥ８、Ｎ８、およびＭ８はＦ７３Ｇ／Ｆ１２９Ｇ置換を有する。
【図４】イソブタノール（ｉＢｕＯＨ）／グリセロール（Ｇｌｙ）比と、測定されたＧＰＤ活性（Ｕ／ｍｇ）との比較を示したグラフを示す。ｉＢｕＯＨ／Ｇｌｙ比の回帰方程式は、２．９３−２３４ＧＰＤ（Ｕ／ｍｇ）と等しい（Ｒ−Ｓｑ＝６０．１％；Ｒ−Ｓｑ（ｐｒｅｄ）＝２５．０４％）。
【図５】測定されたイソブタノール濃度（ｉｓｏｂｕｔａｎｏｌ  ｔｉｔｅｒ）と、線形回帰方程式で計算された値（ＦＩＴ＿２）との比較を示したグラフを示す（Ｓ＝０．１５９２７７；Ｒ−Ｓｑ＝９８．６％；Ｒ−Ｓｑ（ａｄｊ）＝９７．６％；ＰＲＥＳＳ＝０．４１５５７５；Ｒ−Ｓｑ（ｐｒｅｄ）＝９４．３２％）。回帰方程式の定数および係数を表１２に示す。
【図６】イソブタノールの収率（イソブタノール（ｇ）／消費されたグルコース（ｇ））と、線形回帰方程式で計算された値（ＦＩＴ＿４）との比較を示したグラフを示す（Ｓ＝０．０１０１０７１；Ｒ−Ｓｑ＝９３．９％；Ｒ−Ｓｑ（ａｄｊ）＝９１．４％；ＰＲＥＳＳ＝０．００１９７８７８；Ｒ−Ｓｑ（ｐｒｅｄ）＝７６．３０％）。回帰方程式の定数および係数を表１３に示す。
【図７】ＣＰＮ９７およびＰＮＹ２３１０のイソブタノロゲン菌株の場合の、２８および４２時間でのイソブタノールの収率（消費されるグルコース１グラム当たりの産生イソブタノールのグラム数）のグラフを示す。
【図８】ＣＰＮ９７およびＰＮＹ２３１０のイソブタノロゲン菌株の場合の、２８および４２時間でのイソブタノール／グリセロール比のグラフを示す。
【図９】ＣＰＮ９７およびＰＮＹ２３１０のイソブタノロゲン菌株について時間との関係で示した消費グルコースのグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
特に定義されていない限り、本明細書に用いられている技術用語および科学用語はすべて、本発明が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。相反する場合には、定義を含んでいる本出願が優先されることになる。また、文脈から明らかでない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。本明細書に述べられている出版物、特許および他の文献はすべて、それぞれ個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照によって組み込まれている場合と同様に、あらゆる目的のためにその全体を援用する。ただし、特許または特許公報の特定の節のみが参照によって組み込まれることが示されている場合は除く。
【００２９】
本発明をさらに明確にするために、以下の用語、略語および定義を示す。
【００３０】
本明細書に開示されているポリペプチドに関連した「得られる」には、示されている生物体に存在するＧＰＤ（または他の酵素）のアミノ酸配列に基づいて合成される配列ならびに生物の遺伝物質から直接クローン化されたものが包含されると理解されるであろう。
【００３１】
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」または「含んでいる（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語あるいはそれらの他の任意の変形は、示されている実体（ｉｎｔｅｇｅｒ）または実体群を含むことを意味するが、他の実体または実体群を除外することを意味しないと理解され、非排他的または限定的ではないことを意図している。例えば、列挙された要素を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもそうした要素に限定されるわけではなく、明確に列挙されていない他の要素あるいはそうした組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有の他の要素も含みうる。さらに、逆のことを特に述べていない限り、「または」は、包含的な「または」であり、排他的な「または」ではない。例えば、ＡまたはＢという条件は、以下のいずれによっても満たされる：Ａが正しく（または存在し）かつＢが誤りである（または存在しない）、Ａが誤りであり（または存在せず）かつＢが正しい（または存在する）、さらにＡおよびＢの両方が正しい（または存在する）。
【００３２】
本明細書で使用される「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」という用語、または本明細書全体および請求項を通じて使用されている「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」などの変形は、挙げられている任意の実体または実体群を含むことを示すが、さらなる実体または実体群を、明記されている方法、構造、または組成物に加えることができないことを示す。
【００３３】
本明細書で使用される「から基本的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語、あるいは本明細書全体および請求項を通じて使用される「から基本的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「から基本的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などの変形は、挙げられている任意の実体または実体群を含むこと、ならびに明記されている方法、構造、または組成物の基本的特性または新規の特性を実質的に変えることのない、挙げられている任意の実体または実体群を任意選択的に含むことを示す。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．§２１１１．０３を参照されたい。
【００３４】
また、本発明の要素または成分の前に付いている不定冠詞の「ある（ａ）」および「ある（ａｎ）」は、実例の数、すなわち要素または成分の出現に関して非制限的であることを意図している。したがって「ある（ａ）」または「ある（ａｎ）」は、１つまたは少なくとも１つを含むと理解すべきであり、さらに要素または成分を示す語の単数形も、数が明らかに単数を意味するのでない限り、複数を含む。
【００３５】
本明細書で使用される「発明」または「本発明」という用語は、非制限的用語であり、特定の発明のいずれかの１つの実施形態を指すことを意図するものではなく、提示されているか、または後日補正および補足される請求項に、または本明細書に記載された可能な実施形態すべてを包含する。
【００３６】
使用される本発明の成分または反応物の量を修飾する、本明細書で使用される「約」という用語は、起こりうる数値的量の変動を表し、そうした変動は、例えば、現実の世界で濃縮物または溶液を作るために使用する普通の測定手順および液体処理手順によって；そうした手順における不注意による間違いによって；組成物を作るかまたは方法を実施するために用いる成分の製造、供給源、または純度の違いなどによって、起こりうる。「約」という用語は、特定の初期混合物から得られる組成物の種々の平衡状態のせいで違ってくる量も包含する。「約」という用語で修飾されているかどうかにかかわりなく、請求項は量に相当するものを含む。ある実施形態では、「約」という用語は、報告されている数値の１０％以内、または報告されている数値の５％以内を意味する。
【００３７】
本明細書で使用される「ブタノール生合成経路」という用語、１−ブタノール、２−ブタノール、またはイソブタノールを生み出す酵素経路を表す。
【００３８】
「１−ブタノール生合成経路」という用語は、１−ブタノールを生み出す酵素経路を表す。「１−ブタノール生合成経路」は、アセチル−補酵素Ａ（アセチル−ＣｏＡ）から１−ブタノールを生み出す酵素経路を表しうる。例えば、１−ブタノール生合成経路は、米国特許出願公開第２００８／０１８２３０８号明細書および国際公開第２００７／０４１２６９号パンフレット（これらについては、その全体を本明細書に援用する）に開示されている。
【００３９】
「２−ブタノール生合成経路」という用語は、２−ブタノールを生み出す酵素経路を表す。「２−ブタノール生合成経路」は、ピルベートから２−ブタノールを生み出す酵素経路を表しうる。例えば、２−ブタノール生合成経路は、米国特許第８，２０６，９７０号明細書、米国特許出願公開第２００７／０２９２９２７号明細書、国際公開第２００７／１３０５１８号パンフレットおよび国際公開第２００７／１３０５２１号パンフレット（これらについては、その全体を本明細書に援用する）に開示されている。
【００４０】
「イソブタノール生合成経路」という用語は、イソブタノールを生み出す酵素経路を表す。「イソブタノール生合成経路」という用語は、ピルベートからイソブタノールを生み出す酵素経路を表しうる。例えば、イソブタノール生合成経路は、米国特許第７，８５１，１８８号明細書、米国特許出願公開第２００７／００９２９５７号明細書、および国際公開第２００７／０５０６７１号パンフレット（これらについては、その全体を本明細書に援用する）に開示されている。時々、「イソブタノール生合成経路」は、「イソブタノール産生経路」と同じ意味で使用される。
【００４１】
本明細書で使用される「ブタノール」という用語は、ブタノール異性体である１−ブタノール（１−ＢｕＯＨ）、２−ブタノール（２−ＢｕＯＨ）、ｔｅｒｔ−ブタノール（ｔ−ＢｕＯＨ）、及び／またはイソブタノール（ｉＢｕＯＨまたはｉ−ＢｕＯＨ。これは２−メチル−１−プロパノールとしても知られる）のいずれか、またはこれらの混合物を表す。時々、本明細書で使用される「バイオブタノール」および「生物産生（ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｅｄ）ブタノール」という用語は、「ブタノール」と同じ意味で使用されることがある。
【００４２】
ブタノールの用途としては、燃料（例えば、バイオ燃料）、燃料添加物、アルコール（ディーゼルまたはバイオディーゼル燃料として使用できるエステルの製造に使用されるもの）、プラスチック工業における化学物質、配合製品（化粧品など）の成分、および化学中間体を挙げることができるが、これらに限定されない。ブタノールは、ペイント、コーティング、ワニス、樹脂、ガム、染料、脂肪、ワックス、樹脂、シェラック、ゴム、およびアルカロイドといったものの溶剤として使用することもできる。
【００４３】
本明細書で使用される「生物産生」という用語は、分子（例えば、ブタノール）が再生可能資源から作られることを意味する（例えば、分子は、発酵プロセスの間に、再生可能な供給原料から作ることができる）。したがって、例えば、生物産生イソブタノールは、再生可能な供給原料から発酵プロセスによって生み出されるイソブタノールでありうる。再生可能資源から生み出される分子は、１４Ｃ／１２Ｃ同位体比によってさらに定義できる。１：０〜０：１の範囲を超える１４Ｃ／１２Ｃ同位体比は、生物産生分子であることを示すが、０：１の比率は、分子が化石由来であることを示す。
【００４４】
「改変アルコール産生経路」（改変ブタノールまたはイソブタノール産生経路など）を含む組換え宿主細胞は、宿主細胞内に通常存在するものとは異なる仕方でアルコールを生み出す修飾経路を含む宿主細胞を表す。そのような異なる点としては、宿主細胞が普通は産生しないアルコールの産生、あるいは産生の増大あるいは効率化がある。
【００４５】
本明細書で使用される「異種性生合成経路」という用語は、少なくとも１種の酵素が、生合成経路を含んでいる宿主細胞の内からのものではない生成物を生み出す酵素経路を表す。
【００４６】
本明細書で使用される「エクストラクタント」という用語は、発酵ブロスからアルコール（例えば、ブタノール）を抽出するのに使用できる１種または複数種の有機溶剤を表す。
【００４７】
本明細書で使用される「有効イソブタノール生産性」という用語は、細胞１グラム当たりの産生イソブタノールの総グラム数を表す。
【００４８】
本明細書で使用される「有効濃度（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｔｅｒ）」という用語は、発酵培地１リットル当たりの発酵によって産生される特定のアルコール（例えば、ブタノール）の総量を表す。ブタノールの総量には、（ｉ）発酵培地中のブタノールの量；（ｉｉ）有機エクストラクタントから回収されたブタノールの量；および（ｉｉｉ）気相から回収されたブタノールの量（ガスストリッピングを使用する場合）が含まれる。
【００４９】
本明細書で使用される「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｒａｔｅ）」という用語は、１時間の発酵で、発酵培地１リットルにつき発酵で産生されるアルコール（例えば、ブタノール）の総量を表す。
【００５０】
本明細書で使用される「有効収率」という用語、生体触媒が消費する発酵性炭素物質１単位当たりの産生アルコール（例えば、ブタノール）の量を表す。
【００５１】
本明細書で使用される「分離」という用語は、「回収」と同じ意味であり、初期混合物から化合物を取り出して、初期混合物中の化合物の純度または濃度よりも高い純度または濃度で化合物を得ることを表す。
【００５２】
本明細書で使用される「水性相」という用語は、発酵ブロスを水不混和性有機エクストラクタントと接触させることにより得られる二相性混合物の水性相を表す。発酵抽出を含む本明細書で述べるプロセスの一実施形態では、「発酵ブロス」という用語は、特に、二相性発酵抽出における水性相を表す。
【００５３】
本明細書で使用される「有機相」という用語は、発酵ブロスを水不混和性有機エクストラクタントと接触させることにより得られる二相性混合物の非水相を表す。
【００５４】
「炭素物質」または「発酵性炭素物質」という用語は、本発明の宿主生物が代謝できる炭素源を表し、特に単糖類、オリゴ糖類、多糖類、および炭素が１個の物質またはそれらの混合物よりなる群から選択される炭素源を表す。炭素物質の非限定的な例は、本明細書に記載されており、それには、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、エタノール、ラクテート、スクシネート、グリセロール、二酸化炭素、メタノール、グルコース、フルクトース、乳糖、スクロース、キシロース、アラビノース、デキストロース、セルロース、メタン、アミノ酸、またはそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書で使用される「発酵ブロス」は、水、糖質類（発酵性炭素源）、溶解固体（存在する場合）、アルコールを産生する微生物、生成物アルコールおよび（生成物アルコールが、存在する微生物により、糖質類からアルコール、水および二酸化炭素（Ｃ０２）への反応によって作られている）物質の他のすべての成分からなる混合物を意味する。時々、本明細書で使用される「発酵培地」および「発酵混合物」という用語は、「発酵ブロス」と同じ意味で使用できる。
【００５６】
本明細書で使用される「発酵槽」は、物質の発酵に使用される任意の容器、容器類、または装置を表す。発酵槽は、発酵培地および発酵を行うことができる微生物を含むことができる。「発酵容器」という用語は、発酵反応が行われ、それによってアルコール（ブタノールなど）が作られる容器を表す。「発酵槽」は、本明細書では「発酵容器」と同義語的に使用できる。
【００５７】
「発酵生成物」という用語は、注目している任意の所望の生成物を含み、それには１−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノールなどがあるが、それらに限定されない。
【００５８】
本明細書で使用される「バイオマス」は、発酵性糖を生じる加水分解性デンプンを含む天然物を表し、その天然物には、任意のセルロース物質またはリグノセルロース物質およびセルロース含有物質（必要に応じて、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖類、二糖類、及び／または単糖類をさらに含む）も含まれる。バイオマスはまた、タンパク質及び／または脂質などの更なる成分を含みうる。バイオマスは、単一供給源から得ることができるか、またはバイオマスは、２種類以上の供給源から得られる混合物を含みうる。例えば、バイオマスは、トウモロコシの穂軸とトウモロコシのわらの混合物、または草と葉の混合物を含むことができる。バイオマスとしては、バイオエネルギー作物、農業残渣、固形都市廃棄物、固形産業廃棄物、紙製造のスラッジ、庭ゴミ、木屑および林業廃棄物があるが、これらに限定されない。バイオマスの例としては、トウモロコシ殻粒、トウモロコシの穂軸、穀物残渣（トウモロコシの皮など）、トウモロコシのわら、草、小麦、ライ麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、干し草、稲わら、スイッチグラス、紙くず、サトウキビバガス、モロコシ、大豆、（穀物、木、枝、根、葉、木片、おがくず、低木および灌木の）粉砕によって得られる成分、野菜、果物、花、家畜ふん尿、およびそれらの混合物があるが、これらに限定されない。
【００５９】
本明細書で使用される「供給原料」は、発酵性炭素源を含んでいる生産物を意味する。好適な供給原料としては、ライ麦、小麦、トウモロコシ、トウモロコシのマッシュ、サトウキビ、大麦、セルロース物質、リグノセルロース物質、およびそれらの混合物があるが、これらに限定されない。
【００６０】
本明細書で使用される「バイオマス」という用語は、場合によっては、培養物のかたまり、例えば、組換え微生物の量（典型的には、乾燥菌体重量（ｄｃｗ）（グラム）／リットル（ｇ／ｌ）の単位で示される）を表す。
【００６１】
本明細書で使用される「好気条件」という用語は、酸素が存在する成長条件を意味する。
【００６２】
本明細書で使用される「微好気的条件」という用語は、酸素レベルが低い（すなわち、標準大気酸素レベルより低い）成長条件を表す。
【００６３】
本明細書で使用される「嫌気条件」という用語は、酸素が存在しない成長条件を意味する。
【００６４】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単一の核酸ならびに複数の核酸を包含することを意図しており、核酸分子または構築物（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ））を表す。ポリヌクレオチドは、完全長のｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列（またはそのフラグメント）（非翻訳の５’および３’配列およびコード配列を含む）を含むことができる。ポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチド（無修飾ＲＮＡまたはＤＮＡあるいは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであってよい）から構成されうる。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域とが混じり合っているＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、および一本鎖領域と二本鎖領域とが混じり合っているＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡ（一本鎖であってよく、より一般的には、二本鎖または一本鎖領域と二本鎖領域とが混ざり合っているものであってよい）を含むハイブリッド分子から構成されうる。「ポリヌクレオチド」は、化学的に修飾、酵素的に修飾、あるいは代謝的に修飾された形態を包含する。
【００６５】
ポリヌクレオチド配列は、その天然環境から取り出された場合、「分離された」と言うことができる。例えば、ベクターに含まれている、ＡＬＳ活性を有するポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントをコードする異種性ポリヌクレオチドは、本発明においては分離されていると考えられる。分離ポリヌクレオチドの更なる例としては、異種性宿主細胞内に維持される組換えポリヌクレオチドまたは溶液中にある（部分的または実質的に）精製されたポリヌクレオチドがある。本発明による分離されたポリヌクレオチドまたは核酸としてはさらに、合成によって作り出されたそうした分子がある。ＤＮＡポリマーの形の分離されたポリヌクレオチドフラグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたは複数の断片から構成されうる。
【００６６】
本明細書で使用される、「活性低下」は、ポリペプチドの知られている生物活性の測定可能な減少を表し、活性低下をもたらす変更が行われる前のポリペプチドの同じ生物活性と比較した場合の活性低下を表す。そのような変更としては、本明細書に記載しているポリペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾を挙げることができる。本明細書に開示されているポリペプチドの活性低下は、当該技術分野において周知でありかつ本明細書に開示されている方法によって測定できる。酵素の活性低下は、野生型酵素の活性と比べた場合の（部分的または全体的な）酵素活性のダウンレギュレーションを表す。天然遺伝子（ｎａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ）に「破損」または「修飾」（その遺伝子の一部の中の挿入、欠失、または目的とした変異を表す）がある場合、ダウンレギュレーションが起こりうる。それによって、例えば、完全な遺伝子ノックアウトが行われ、その結果として遺伝子がゲノムから欠失し、タンパク質が翻訳されないか、あるいは挿入、欠失、アミノ酸置換または他の目的とした突然変異を有する翻訳された副単位タンパク質がもたらされる。タンパク質における修飾の位置は、例えば、タンパク質のＮ末端部分またはタンパク質のＣ末端部分内にあることがある。修飾タンパク質は、破損していないタンパク質と比べて活性が損なわれるであろう。また、非機能性でありうる。上流の制御領域の操作、あるいはセンス、アンチセンスまたはＲＮＡｉ技術などの使用により、酵素の活性低下も起こりうる。酵素の活性低下の別のメカニズムは、酵素の速度的特性を変える（例えば、基質に対する親和性の低下、ｋｃａｔの低下など）変異の導入である。
【００６７】
本明細書で使用される「活性除去」は、活性除去を引き起こした変更の前のポリペプチドの同じ生物活性と比較した場合に、ポリペプチドの周知の生物活性が完全になくなることを表す。そのような変更として、本明細書で述べているようなポリペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾を挙げることができる。活性除去には、活性の除去をもたらした変更の前のポリペプチドのその生物活性と比較した場合に、測定不能であるポリペプチドの生物活性が含まれる。本明細書に開示されているポリペプチドの活性除去は、当該技術分野において周知でありかつ本明細書に開示されている方法で判定することができる。
【００６８】
本明細書で使用される「ＰＤＣ−」、「ＰＤＣノックアウト」、または「ＰＤＣ−ＫＯ」という用語は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）をコードする遺伝子の発現を不活性化するかまたは低下させる遺伝子修飾を有する細胞を表し、その修飾の結果、その細胞は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ酵素活性が実質的にまたは完全になくなる。複数の発現（活性）ＰＤＣ遺伝子が細胞にある場合、活性ＰＤＣ遺伝子のそれぞれを不活性化することができるか、あるいは発現が最小になるようしてＰＤＣ細胞が作られるようにすることができる。
【００６９】
本明細書で使用される「比活性」という用語は、所与の量のタンパク質における活性の単位と定義される。それゆえに、比活性は、直接測定されることはないが、１）酵素試料の活性（単位／ｍｌ）を、２）その試料中のタンパク質濃度で割って計算される。したがって、比活性は、単位／ｍｇ（ここで、酵素単位は、形成される生成物（モル）／分と定義される）で表される。純粋な完全活性酵素の試料の比活性は、その酵素の特徴となる。タンパク質混合物の試料の比活性は、注目している活性酵素からなる試料中のタンパク質の相対フラクションの尺度である。
【００７０】
「ｋｃａｔ」および「ＫＭ」という用語は、当業者に知られており、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，２ｎｄ  ｅｄ．（Ｆｅｒｓｔ；Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８５；ｐｐ９８−１２０）に記載されている。ＫＭ（ミカエリス定数）は、最大速度の半分となるような基質の濃度である。「ｋｃａｔ」という用語（「代謝回転数」と呼ばれることが多い）は、単位時間当たりの、生成物に変換される基質分子の最大数／活性部位、または単位時間当たりの酵素の代謝回転の数として定義される。ｋｃａｔ＝Ｖｍａｘ／［Ｅ］（ここで、［Ｅ］は酵素濃度である）（Ｆｅｒｓｔ，ｓｕｐｒａ）。「全代謝回転」および「全代謝回転数」という用語は、本明細書では、酵素と基質との反応によって形成される生成物の量を表す。
【００７１】
「触媒効率」という用語は、酵素のｋｃａｔ／ＫＭで定義される。触媒効率は、基質に対する酵素の特異性を数量化するのに使用される。
【００７２】
「分離された核酸分子」、「分離された核酸フラグメント」および「遺伝的構成体」という用語は同義語として用いられ、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを意味し、必要に応じて、合成された、自然のものでない、または変更されたヌクレオチド塩基を含んでいる。ＤＮＡポリマーの形の分離された核酸フラグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたは複数のセグメントから構成されうる。
【００７３】
「アミノ酸」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの基本的な化学構造単位を表す。本明細書では、表１の略号を用いて特定のアミノ酸を識別する。
【００７４】
【表１】
2016511010.tif 000003
【００７５】
「遺伝子」という用語は、特定のタンパク質として発現可能な核酸フラグメントを表し、これは必要に応じてコード配列の前にくる制御配列（５’非コード配列）および後にくる制御配列（３’非コード配列）を含む。「天然遺伝子」は、独自の制御配列を有する自然に存在する遺伝子を表す。「キメラ遺伝子」は、自然には一緒に見出されない制御配列およびコード配列を含む、天然遺伝子ではない任意の遺伝子を表す。したがってキメラ遺伝子は、異なる源から得られる制御配列およびコード配列、または同じ源から得られるが、自然に見出されるものとは違った仕方で配置されている制御配列およびコード配列を含みうる。「内在性遺伝子」は、微生物のゲノム内で自然の位置にある天然遺伝子を表す。「外来遺伝子」は、通常は宿主微生物に存在しないが、遺伝子導入によって宿主微生物に導入される遺伝子を表す。外来遺伝子は、天然でない微生物に挿入された天然遺伝子、つまりキメラ遺伝子を含みうる。「導入遺伝子」は、形質転換法によってゲノムに導入された遺伝子である。
【００７６】
本明細書で使用される「天然」とは、独自の制御配列を持つ（存在する場合）天然に見出される形のポリヌクレオチド、遺伝子、またはポリペプチドを表す。
【００７７】
本明細書で使用される「コード配列」または「コード領域」という用語は、特定アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を表す。
【００７８】
本明細書で使用される「内在性」とは、生物または生物のゲノム中の生来の位置にある天然の形のポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドを表す。「内在性ポリヌクレオチド」は、生物のゲノム内で生来の位置にある天然ポリヌクレオチドを含む。「内在性遺伝子」は、生物体のゲノム内で生来の位置にある天然遺伝子を含む。「内在性ポリペプチド」は、生物のゲノムにおいて生来の位置にある天然ポリヌクレオチドまたは天然遺伝子から転写および翻訳される、生物の生来の位置にある天然ポリペプチドを含む。
【００７９】
ポリヌクレオチド、遺伝子、またはポリペプチドに関連して使用される「異種性」という用語は、宿主生物中に通常は見出されないポリヌクレオチド、遺伝子、またはポリペプチドを表す。「異種性」は、対応する天然遺伝子とは異なる形（例えば、生物のゲノム内の生来の位置にない）で元の生物に再導入される天然コード領域（またはその一部）も含む。異種性のポリヌクレオチドまたは遺伝子は、例えば、遺伝子導入によって宿主生物に導入できる。異種遺伝子は、天然宿主に再導入される非天然制御領域と一緒に、天然コード領域を含むことができる。例えば、異種遺伝子は、キメラ遺伝子の一部（天然宿主に再導入される非天然制御領域を含む）である天然コード領域を含むことができる。「異種性ポリペプチド」は、対応する天然ポリペプチドとは異なる形で元の生物に再導入される天然ポリペプチドを含む。「異種性」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとしては、「天然」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとは相違点のある改変ポリペプチドまたはポリヌクレオチドも挙げることができる（例えば、内在性ポリヌクレオチド内の点突然変異により「異種性」ポリペプチドが生み出されうる）。本明細書で使用される「キメラ遺伝子」、「外来遺伝子」、および「導入遺伝子」はすべて、「異種性」遺伝子の例でありうる。
【００８０】
「導入遺伝子」は、形質転換法によってゲノムに導入された遺伝子である。
【００８１】
本明細書で使用される「修飾」という用語は、本明細書に開示されているポリヌクレオチドの変更（ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの活性の低下または消失をもたらす）、ならびに本明細書に開示されているポリペプチドの変更（ポリペプチドの活性の減少または消失をもたらす）を表す。そのような変更は、当該技術分野において周知である方法によって行うことができ、それには、欠失、突然変異（例えば、自然突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、変異誘発遺伝子によって引き起こされる突然変異誘発、またはトランスポゾン突然変異）、置換、挿入、ダウンレギュレート、細胞部位の変更、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの状態の変更（例えば、メチル化、リン酸化またはユビキチン結合）、補助因子の除去、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡの導入、妨害ＲＮＡ／ＤＮＡの導入、化学修飾、共有結合修飾、ＵＶまたはＸ線による照射、相同組換え、有糸分裂組換え、プロモーター置換の各方法、および／またはこれらの組合せがあるが、それらに限定されない。どのヌクレオチドまたはアミノ酸残基を修飾できるかを判断する際の手引きは、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を、相同ポリヌクレオチドまたはポリペプチド（例えば、酵母菌または細菌性）の配列と比較し、高度な相同性の領域（保存領域）または共通配列の領域で行われる修飾の数を最大化することにより、得られる。
【００８２】
「組換え遺伝発現要素（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」という用語は、１種または複数種の特定のタンパク質を発現する核酸フラグメント（タンパク質のコード配列の前にくる制御配列（５’非コード配列）およびその後にくる制御配列（３’終止配列）を含む）を表す。キメラ遺伝子は組換え遺伝発現要素である。オペロンのコード領域は、作動的に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）プロモーターおよび終止領域と一緒になって、組換え遺伝発現要素を形成することができる。
【００８３】
「制御配列」は、コード配列の上流に位置するヌクレオチド配列（５’非コード配列）、コード配列内に位置するヌクレオチド配列、あるいはコード配列の下流に位置するヌクレオチド配列（３’非コード配列）を表し、転写、ＲＮＡのプロセシングまたは安定性、または関連したコード配列の翻訳に影響を与えるものである。制御配列としては、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、転写終結シグナル、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を挙げることができる。
【００８４】
「プロモーター」という用語は、コード配列または機能ＲＮＡの発現を制御できる核酸配列を表す。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’に位置する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子から誘導されうるか、または天然に見出される種々のプロモーターから得られる種々の要素から構成されうるか、または合成核酸セグメントを含むことさえできる。種々のプロモーターは、種々の組織または細胞型内で、または発育の種々の段階で、または種々の環境条件または生理学的条件に応じて遺伝子の発現を指示できる、と当業者は理解している。ほとんどの細胞型でほとんどの場合に遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般的に、「常時発現プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）」と呼ばれる。一方、「誘導性プロモーター」では、プロモーターがプロモーター特有のシグナルまたは分子によって誘起または活性化されると、遺伝子の発現が引き起こされる。さらに、大抵の場合、制御配列の正確な境界が完全には定まっていないので、様々な長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有しているであろうと理解される。例えば、「ＦＢＡ１プロモーター」を用いて、ＦＢＡ１遺伝子のプロモーター領域から得られるフラグメントを表すことができると理解されるであろう。
【００８５】
本明細書で使用される「ターミネーター」という用語は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を表す。これには、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を与えることのできる調節シグナルをコードする他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは普通、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸領域（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｒａｃｔｓ）の追加に影響を与えるという特徴がある。３’領域は、転写、ＲＮＡのプロセシングまたは安定性、あるいは関連するコード配列の翻訳に影響を及ぼしうる。大抵の場合、制御配列の正確な境界が完全には定まっていないので、様々な長さのＤＮＡフラグメントが同一のターミネーター活性を有しているであろうと理解される。例えば、ＣＹＣ１遺伝子のターミネーター領域から得られるフラグメントを表すのに「ＣＹＣ１ターミネーター」を使用できることが理解されるであろう。
【００８６】
「作動的に連結された」という用語は、単一の核酸フラグメント上の核酸配列の結合であって、一方の機能が他方によって影響されるようなものを表す。例えば、プロモーターが、あるコード配列の発現に影響を与えることができる場合、プロモーターはそのコード配列と作動的に連結されている（すなわち、そのコード配列はそのプロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向に向かって制御配列に作動的に連結されうる。
【００８７】
本明細書で使用される「発現」という用語は、本発明の核酸フラグメントから得られるセンスＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した集積を表す。発現は、ｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳することを指す場合もある。
【００８８】
本明細書で使用される「過剰発現」という用語は、同じかまたは関連した遺伝子の内在性発現よりも多くの発現を表す。異種遺伝子は、その発現が同等の内在性遺伝子の発現よりも多い場合に過剰発現される。
【００８９】
過剰発現という用語は、宿主細胞中の核酸またはタンパク質のレベルの増大を表す。したがって、過剰発現は、宿主細胞内の内在性配列の転写または翻訳レベルの増大から起こりうるか、あるいは異種性配列を宿主細胞へ導入することで起こりうる。過剰発現は、核酸またはタンパク質配列の安定性が増大することからも起こりうる。
【００９０】
本明細書で使用される「形質転換」という用語は、宿主微生物のゲノムへの核酸フラグメントの導入を指し、その結果として遺伝的に安定した遺伝形質が生じる。形質転換された核酸フラグメントを含む宿主微生物は、「トランスジェニック」微生物または「組換え」微生物または「形質転換」微生物と呼ばれる。
【００９１】
「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」という用語は、細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を持っていることが多い、余分の染色体要素（普通は、環状二本鎖ＤＮＡフラグメントの形である）を指す。そのような要素は、任意の源から誘導される一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの、自己複製配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列（線状または環状）であってよく、それらにおいては、幾つものヌクレオチド配列が固有の構成体に結合されるかまたは再結合されており、その構成体は、選択された遺伝子産物のプロモーターフラグメントおよびＤＮＡ配列を、適切な３’非翻訳配列と一緒に細胞に導入することができる。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含みかつ（外来遺伝子に加えて）特定宿主細胞の形質転換を促進する要素を有している特定ベクターを表す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含みかつ（外来遺伝子に加えて）外来宿主（ｆｏｒｅｉｇｎ  ｈｏｓｔ）のその遺伝子の発現を増強させることができる要素を有している特定のベクターを表す。
【００９２】
本明細書で使用される「コドン縮重」という用語は、コード化ポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えることなく、ヌクレオチド配列が変化するのを許すという遺伝暗号の性質を表す。当業者は、ある特定のアミノ酸を指定するためのヌクレオチドコドンの使用の際に特定の宿主細胞が示す「コドンバイアス」についてよく知っている。それゆえに、宿主細胞内での発現を向上させるために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用の頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度に近づくように遺伝子を設計するのが望ましい。
【００９３】
「コドン最適化」という用語は、様々な宿主の形質転換を行うための核酸分子の遺伝子またはコード領域と関係している場合、ＤＮＡがコードするポリペプチドを変化させることなく、核酸分子の遺伝子またはコード領域におけるコドンを変更して宿主生物の典型的なコドン使用頻度を反映させることを表す。そのような最適化には、少なくとも１、または２つ以上、またはかなりの数のコドンを、その生物の遺伝子でもっと頻用される１つまたは複数のコドンと置き換えることが含まれる。
【００９４】
任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列が多様であることにより、遺伝子をコードする配列において変化が可能となる。各コドンは、３個のヌクレオチドからなり、ＤＮＡを含むヌクレオチドは、４つの特定の塩基に限定されるので、ヌクレオチドの可能な組合せは６４個あることになり、そのうちの６１個がアミノ酸をコードする（残りの３つのコドンは、翻訳終了のシグナルを送る）。どのコドンがどのアミノ酸をコードするかを示す「遺伝暗号」が、本明細書では表２Ａとして複製されている。その結果として、多数のアミノ酸が複数のコドンによって指定される。例えば、アミノ酸であるアラニンおよびプロリンは、４個のトリプレットによってコードされ、セリンおよびアルギニンは６個によってコードされるが、トリプトファンおよびメチオニンはただ１つのトリプレットによってコードされる。この縮重により、ＤＮＡ塩基組成物は、ＤＮＡによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変更することなく、広範囲にわたって変化することが可能になる。
【００９５】
【表２】
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【００９６】
多数の生物体には、増大するペプチド鎖への特定アミノ酸の挿入をコードする特定コドンが使用される偏った傾向がある。生物体の間でのコドン使用頻度のコドン優先性（ｃｏｄｏｎ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）（つまりコドン偏向（ｃｏｄｏｎ  ｂｉａｓ））の相違は、遺伝暗号の縮重によってもたらされ、多数の生物体の間において十分に実証されている。コドン偏向は、多くの場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関があり、それは、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞中の選択されるｔＲＮＡの優性は一般に、ペプチド合成にもっとも頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物中での最適な遺伝子発現に合わせて調整できる。
【００９７】
多種多様な動物、植物および微生物種に利用できる多数の遺伝子配列があるならば、コドンの相対使用頻度を計算することが可能である。コドン使用頻度表は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｎ／（２００８年３月２０日にアクセス）から入手できる「コドン使用頻度データベース（Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）」から容易に手に入れることができ、こうした表は、多くの仕方で転用することができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ，Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。ＧｅｎＢａｎｋ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １２８．０［２００２年２月１５日］から計算された酵母菌のコドン使用頻度表を、以下の表２Ｂとして再現する。この表では、ｍＲＮＡ命名法を使用しており、そのためＤＮＡに見出されるチミン（Ｔ）の代わりに、表では、ＲＮＡに見出されるウラシル（Ｕ）を使用している。表２Ｂは、６４個のコドンすべてではなく、各アミノ酸について頻度が計算されており、作り替えられている。
【００９８】
【表３】
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【００９９】
【表４】
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【０１００】
【表５】
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【０１０１】
この表または同様の表を利用することにより、当業者はその頻度を任意の所与のポリペプチド配列に当てはめて、（ポリペプチドをコードするが、所与の種にとって最適なコドンを使用する）コドン最適化コード領域の核酸フラグメントを作り出すことができる。
【０１０２】
最適化頻度で、所与のポリペプチド配列をコードするコドンをランダムに割り当てることは、アミノ酸ごとにコドン頻度を計算し、その後コドンをポリペプチド配列にランダムに割り当てることにより、手作業で行うことができる。さらに、当業者は、様々なアルゴリズムおよびコンピューターソフトウェアプログラムを容易に入手できる。例えば、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の「ＥｄｉｔＳｅｑ」機能、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ（ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから入手可能）の逆翻訳機能、およびＧＣＧ−Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能）の「逆翻訳」機能がある。さらに、様々なリソースが、コドン最適化コード領域配列に公に利用できる。例えば、「逆翻訳」機能（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ．ｃｏｍ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｐｈｐ？ｌａｎｇ＝ｅｎｇ（２００８年４月１５日にアクセス）および「ｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ」機能（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｐｂｉ．ｎｒｃ．ｃａ：８０９０／ＥＭＢＯＳＳ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで利用可能）（２００２年７月９日にアクセス）がある。所与の頻度に基づいてコドンを割り当てる基本的なアルゴリズムを構成することも、基礎的な数学関数を用いて当業者が容易に達成できる。
【０１０３】
コドン最適化コード領域は、当業者に知られている様々な方法で設計でき、その方法には、「合成遺伝子デザイナー（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｄｅｓｉｇｎｅｒ）」などのソフトウェアパッケージ（ｕｓｅｒｐａｇｅｓ．ｕｍｂｃ．ｅｄｕ／〜ｗｕｇ１／ｃｏｄｏｎ／ｓｇｄ／（２０１２年３月１９日にアクセス））がある。
【０１０４】
温度および溶液イオン強度の適切な条件下で、一本鎖の形の核酸フラグメントが他の核酸フラグメントにアニールしうる場合、ポリヌクレオチドまたは核酸フラグメントは、別の核酸フラグメント（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ分子など）と「ハイブリッド形成可能」である。ハイブリッド形成および洗浄の条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に、特に、その中の第１１章および表１１．１（全体を本明細書に援用する）に例示されている。温度およびイオン強度の条件により、ハイブリッド形成の「緊縮性（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」が決まる。緊縮性の条件は、類似性が中程度のフラグメント（遠縁関係にある生物からの相同配列など）を探すため、また類似性の高いフラグメント（近縁関係にある生物からの機能酵素を複製する遺伝子など）を探すために調整できる。ハイブリッド形成後の洗浄により、緊縮性条件が決まる。一式の条件では、６Ｘ  ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、室温、１５ｍｉｎから開始し、次いで２Ｘ  ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、４５℃、３０ｍｉｎを繰り返し、その後、０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５０℃、３０ｍｉｎを２回繰り返すという一連の洗浄を使用する。別の一式の緊縮条件では、もっと高い温度を使用し、その場合、０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中での最後の２回の３０ｍｉｎの洗浄の温度を６０℃まで増大させたこと以外は、洗浄が上記と同じである。別の一式の高緊縮条件では、０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃での２回の最終洗浄を使用する。更なる一式の緊縮条件は、例えば、０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でのハイブリッド形成、２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄、その後に０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む。
【０１０５】
ハイブリッド形成では、２個の核酸が相補的配列を含んでいることが必要であるが、ハイブリッド形成の緊縮性によっては、塩基間のミスマッチが起こりうる。核酸のハイブリッド形成のための適切な緊縮性は、核酸の長さおよび相補性の度合い、当該技術分野において周知である変数によって異なる。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の度合いが大きいほど、そうした配列を有する核酸のハイブリッドのＴｍ値は大きくなる。核酸ハイブリッド形成の相対的安定性（Ｔｍが大きくなることに対応する）は、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡの順序で減少する。長さが１００個より長いヌクレオチドのハイブリッドの場合、Ｔｍの計算式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（上記参照），９．５０−９．５１を参照）。短い核酸（すなわち、オリゴヌクレオチド）とのハイブリッド形成では、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さによってその特異性が決まる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（上記参照），１１．７−１１．８を参照）。１つの実施形態では、ハイブリッド形成可能な核酸の長さは、少なくとも約１０個のヌクレオチドである。１つの実施形態では、ハイブリッド形成可能な核酸の最小長さは、少なくとも約１５個のヌクレオチドであり、少なくとも約２０個のヌクレオチド、またはその長さは少なくとも約３０個のヌクレオチドである。さらに、当業者であれば、必要な場合に、プローブの長さなどの因子に応じて、温度および洗浄溶液の塩濃度を調節できることを認めるであろう。
【０１０６】
本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、単一の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含することを意図しており、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）で直線的に結合したモノマー（アミノ酸）からなる分子を表す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上アミノ酸からなる任意の鎖（１つまたは複数）を表し、特定長の生成物を表すわけではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸の鎖（１本または複数本）を表すのに使用される他の任意の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれ、さらに「ポリペプチド」という用語は、そうした他の任意の用語の代わりに、あるいは同義語的に使用できる。ポリペプチドは、自然の生物源から得ることができるか、または組換え技術によって作り出すことができる。ただし、必ずしも指定された核酸配列から翻訳する必要はない。化学合成を含め、任意の仕方で作り出すことができる。
【０１０７】
「分離された」ポリペプチドまたはフラグメント、変種、またはそれらの誘導体とは、自然環境には存在しないポリペプチドを意図している。特定レベルの精製が必要とされるわけではない。例えば、分離ポリペプチドは、その天然環境または自然環境から取り出すことができる。宿主細胞内で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、本発明においては分離されたと見なされ、任意の好適な手法によって分離、分別、あるいは部分的または実質的に精製された天然または組換えポリペプチドもそのようにみなされる。
【０１０８】
本明細書で使用される「変種（ｖａｒｉａｎｔ）」および「変異体（ｍｕｔａｎｔ）」という用語は同義語であり、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、変異、および置換の点で、具体的に列挙されているポリペプチドとは異なり、例えば、組換えＤＮＡ技術（突然変異誘発など）を用いて作成されたポリペプチドを表す。注目している活性を消失させることなく、どのアミノ酸残基を交換、追加、または削除できるかを判別する際の手引きは、特定ポリペプチドの配列を、相同ポリペプチド（例えば、酵母菌または細菌性）の配列と比較し、高度な相同性の領域（保存領域）で行われるアミノ酸配列の変更数を最小限にする（またはアミノ酸を共通配列で置き換える）ことにより、得ることができる。
【０１０９】
本明細書で使用される「改変ポリペプチド」は、合成のポリペプチド、すなわち、自然に見出されるポリペプチドとは何らかが違っているポリペプチドを表す。
【０１１０】
あるいは、こうした同じ（または類似の）ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド変種は、遺伝暗号における「重複性」を利用して合成または選択することができる。様々なコドン置換（様々な制限酵素部位を作り出す目立たない変更など）を導入して、発現用のプラスミドまたはウイルスベクターへのクローニングを最適化する。ポリヌクレオチド配列の変異は、ポリペプチドまたはポリペプチドに追加された他のペプチドの領域に反映されて、ポリペプチドの任意の部分の特性を変更することができる。例えば、変異は、標的タンパク質の発現を低下またはなくすのに使用でき、それには、遺伝子全体または遺伝子の一部の欠失、（プロモーターまたはコード領域のいずれかの）遺伝子へのＤＮＡフラグメントの挿入（その結果、タンパク質は発現されないか、または低レベルでしか発現されない）、コード領域への変異の導入（停止コドンまたはフレームシフトが加わり、その結果、機能性タンパク質が発現されない）、およびコード領域への１つまたは複数の変異の導入（アミノ酸が変更され、その結果、非機能性かまたは酵素活性の低下したタンパク質が発現される）があるが、これらに限定されない。
【０１１１】
アミノ酸「置換」は、１つのアミノ酸を、類似の構造及び／または化学的性質を有する別のアミノ酸で置き換えることの結果であっても（すなわち、保存アミノ酸置換）か、あるいは１つのアミノ酸を異なる構造及び／または化学的性質を有するアミノ酸と置き換えることの結果であってもよい（すなわち、非保存アミノ酸置換）。「保存」アミノ酸置換は、関係する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、または両親媒性といったものの類似性に基づいて行われうる。例えば、非極性（疎水性の）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ、極性の中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ、正電荷を帯びた（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれ、さらに負電荷を帯びた（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。あるいは、「非保存」アミノ酸置換は、そうしたアミノ酸のいずれかの極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、または両親媒性といったものの相違を選択することにより行われうる。「挿入」または「欠失」が、組換えタンパク質によって構造的または機能的に許容される変化の範囲内であることがある。組換えＤＮＡ技術を用いて、ポリペプチド分子におけるアミノ酸の挿入、欠失、または置換を体系的に行い、得られた組換え変種の活性を分析することにより、許容される変化を実験的に求めることができる。
【０１１２】
アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の「実質的部分」とは、当業者による配列の手作業での評価か、またはＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９３））などのアルゴリズムを使用したコンピュータによる自動配列比較・同定のいずれかによって、そのポリペプチドまたは遺伝子の推定的同定を行うための、十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含んでいる部分である。一般に、ポリペプチド配列または核酸配列を、既知のタンパク質または遺伝子と相同であるという推定的同定を行うためには、１０個以上の連続アミノ酸の配列または３０個以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、２０〜３０個の連続ヌクレオチドを含んでいる遺伝子特有のオリゴヌクレオチドプローブを、遺伝子同定（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および分離（例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージ・プラークのインサイツハイブリダイゼーション）といった配列依存法で使用できる。加えて、１２から１５個の塩基の短いオリゴヌクレオチドは、プライマーを含む特定の核酸フラグメントを得るために、ＰＣＲで増幅プライマーとして使用できる。したがって、ヌクレオチド配列の「実質的部分」は、その配列を含む核酸フラグメントを明確に同定し、かつ／または分離するのに十分な配列を含む。本明細書は、特定のタンパク質をコードする完全なアミノ酸・ヌクレオチド配列を教示するものである。本明細書で報告している配列の恩恵を受ける当業者は、開示されている配列の全部または実質的部分を、当業者に知られている目的のためにこれから使用することができるであろう。したがって本発明は、添付の配列リストで報告されている完全な配列、ならびに上に記載したそうした配列の実質的部分を含む。
【０１１３】
「相補的」という用語は、互いにハイブリッド形成することができるヌクレオチド塩基間の関係を記述するのに用いられる。例えば、ＤＮＡに関して、アデニンはチミンと相補的であり、シトシンはグアニンと相補的である。またＲＮＡに関しては、アデニンはウラシルと相補的であり、シトシンはグアニンと相補的である。
【０１１４】
当該技術分野において知られている「同一性パーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」という用語は、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係であり、それらの配列を比較することによって求められる。当技術分野においては、「同一性」は、場合によっては、ポリペプチド配列間またはポリヌクレオチド配列間の配列の類似度をも意味し、場合によっては、そのような配列の列と列との間での突き合わせによって求められる。「同一性」および「類似性」は、次に記載する方法（これらに限定されない）を含む周知の方法で容易に計算できる：１．）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；２．）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；３．）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｇｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ  （Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）；４．）Ｓｅｇｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；および５．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）。
【０１１５】
同一性を求める方法は、試験する配列間で最高の一致をもたらすように設計される。同一性および類似性を求める方法は、一般に入手可能なコンピュータプログラムに基づいて分類される。配列アラインメントおよび同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スーツのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて実施できる。配列のマルチプルアラインメントは、「Ｃｌｕｓｔａｌアラインメント方法」を用いて実施されるが、その方法は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖと名付けられたアラインメント方法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１（１９９２）に記載）に対応する「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖアラインメント方法」を含め、アルゴリズムの幾つかの種類を包含する。またそのアラインメント方法は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スーツのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）の中に見出されるものである。マルチプルアラインメントの場合、デフォルト値は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いたペアワイズアラインメントおよびタンパク質配列の同一性パーセントの計算でのデフォルト・パラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸の場合、これらのパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖプログラムを用いて配列のアラインメントを行った後、同じプログラムの「配列距離（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｉｓｔａｎｃｅｓ）」表を見て「同一性パーセント」を得ることが可能である。さらに「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法」が入手可能であるが、これは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗと名付けられたアラインメント法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１（１９９２）に対応しており、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スーツのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１  プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）の中にある。マルチプルアラインメントのデフォルト・パラメーター（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ  ）。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを用いて配列のアラインメントを行った後、同じプログラムの「配列距離」表を見て「同一性パーセント」を得ることが可能である。
【０１１６】
多数のレベルの配列同一性が、他の種からのものなどのポリペプチド（そのようなポリペプチドは、同一または類似の機能または活性を有する）を同定するのに、あるいは対応するポリヌクレオチドを記述するのに役立つことを、当業者はよく理解している。有用な同一性パーセントの例には、５５％，６０％，６５％、７０％、７５％、８０％，８５％，９０％、または９５％があるが、これらに限定されない。あるいは５５％〜１００％の任意の整数パーセントが、本発明を説明するのに役立ちうるが、それには、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％，６２％，６３％、６４％，６５％，６６％，６７％，６８％，６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％、９６％、９７％、９８％または９９％がある。好適なポリヌクレオチドフラグメントは、上記の相同性を有するだけでなく、典型的には、少なくとも５０個のヌクレオチド、少なくとも１００個のヌクレオチド、少なくとも１５０個のヌクレオチド、少なくとも２００個のヌクレオチド、または少なくとも２５０個のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含む。さらに、上記の相同性を有する好適なポリヌクレオチドフラグメントは、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、少なくとも１５０個のアミノ酸、少なくとも２００個のアミノ酸、または少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチ
ドをコードする。
【０１１７】
「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に役立つ任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでも、独自に開発したものでもよい。典型的な配列分析ソフトウェアとしては次のものがあるであろうが、それらに限定されない：１．）ＧＣＧプログラムスーツ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；２．）ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））；３．）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）；および５．）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んでいるＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。本出願との関連においては、配列分析ソフトウェアを分析に用いる場合、特に明記されていない限り、分析の結果は、参照されているプログラムの「デフォルト値」に基づくものであることが理解されるであろう。本明細書で使用される「デフォルト値」とは、最初の初期設定時に、ソフトウェアと一緒に初めにロードされる値またはパラメーターの任意のセットを意味する。
【０１１８】
ここで用いている標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（以下、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；およびＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）に記載されている。ここで用いられる更なる方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ  Ａ，２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｇｅｒａｌｄ  Ｒ．  Ｆｉｎｋ（Ｅｄｓ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にある。他の分子ツールおよび技術は当該技術分野において知られており、それには、延長ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のオーバーラップによるスプライシング（Ｙｕ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．４１：９７３−９８１）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＵＲＡ３位置での変異のポジティブ選択（Ｂｏｅｋｅ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９７，３４５−３４６；Ｍ  Ａ  Ｒｏｍａｎｏｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９１  Ｊａｎｕａｒｙ  １１；１９（１）：１８７）、ｃｒｅ−ｌｏｘ部位特異的組換え系ならびに変異体ｌｏｘ部位およびＦＬＰ基質変異体（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．（１９８７）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７：２０８７−２０９６；Ｓｅｎｅｃｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１，Ｉｓｓｕｅ  ２，Ｐａｇｅｓ  ４０５−４２１；Ａｌｂｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ．Ｖｏｌｕｍｅ  ７，Ｉｓｓｕｅ  ４，ｐａｇｅｓ  ６４９−６５９）、「シームレス」遺伝子欠失（Ａｋａｄａ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｙｅａｓｔ；２３（５）：３９９−４０５）、およびギャップ修復法（ｇａｐ  ｒｅｐａｉｒ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５８：２０１−２１６；１９８１）がある。
【０１１９】
ＧＰＤ活性を有するポリペプチド
内在性ＮＡＤ依存性の「グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ」または「ＧＰＤ」は、ジヒドロキシアセトンホスフェート（ＤＨＡＰ）からグリセロール−３−ホスフェートへの変換を行う、グリセロール合成における重要な酵素である。「グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ」および「ＧＰＤ」という用語は、ＧＰＤの生物学的機能を有する任意のポリペプチド（または複数のポリペプチド）を表す。そのようなポリペプチドとしては、ジヒドロキシアセトンホスフェートからグリセロール−３−ホスフェートへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチドがある。ＧＰＤは自然に広く見られるものであり、３つのカテゴリーに分けることができる。第１のカテゴリー（ＥＣ１．１．１．８）では、ＧＰＤは、酸化還元補助因子がＮＡＤ／ＮＡＤＨの対である可溶性細胞質酵素であり、ＥＣ１．１．１．８カテゴリーのＧＰＤは、ＮＡＤＨ特有として述べられるが、そのことは、いくらかのＧＰＤがＮＡＤＰＨで測定可能な活性を有しうることを除外するものではない。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＤ１は、このタイプのＧＰＤの一例である（Ａｌｂｅｒｔｙｎ  ｅｔ．ＡＩ，１９９２，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３０８：１３０−１３２；Ｖａｌａｄｉ，ｅｔ  ａｌ，２００４，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：３９６７７−３９６８５）。別の例はヒトＧＰＤ１であり、これに関しては複数の三次元構造の研究が行われている（Ｏｕ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５７：８５８−８６９）。このカテゴリーの酵素の分析法では、ＤＨＡＰおよびＧＰＤ酵素の存在下でＮＡＤＨ酸化の分光光度測定を利用できる（Ｎｉｅｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９８２  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ８９：２９６−３０１）。第２のカテゴリー（ＥＣ１．１．５．３）のＧＰＤ酵素は、ミトコンドリア内膜の内在性膜タンパク質であり、フラビン補助因子を含み、還元性同等物は、ミトコンドリア内のキノン／キノール対に移される。ＧＰＤの３番目の小カテゴリー（ＥＣ１．１．１．９４）があり、これは、実質的に同じ親和性を有するＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのいずれかを利用する。この３番目の小カテゴリーのＧＰＤはまた、グリセロール−３−ホスフェートによってフィードバック阻害されうる。
【０１２０】
組換え微生物（酵母菌など）は、グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）をコードする１つまたは複数の内在性遺伝子を有することができる。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、およびＰ．スティピティス（Ｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ）などの一部の酵母菌では、ＧＰＤ１およびＧＰＤ２は機能性相同体である。酵母菌のＧＰＤ酵素をコードする遺伝子はいずれも破損して、酵母菌細胞のＧＰＤ活性を低下させうる。
【０１２１】
酵母菌によるブタノール産生の重要な収率損失メカニズムの１つは、ジヒドロキシアセトンホスフェートからグリセロールへの変換により、解糖作用からそれる炭素および還元性同等物が損失することである。ＧＰＤは、ジヒドロキシアセトンホスフェートからグリセロールへのこの変換の第１ステップを触媒するので、ＧＰＤの活性は、グリセロールの産生およびブタノール収率の損失に影響しうる。その結果、ブタノールを産生する酵母菌におけるＧＰＤの機能を（例えば、ＧＰＤタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることにより）なくすことを考えた人々がいる。しかし、グリセロールは成長にとって必要であり、重要な浸透圧保護剤である。したがって、いくらかのグリセロールを作る能力を維持することには、ある特定の利点がある。
【０１２２】
グリセロールを作る能力を維持するだけでなく、生成物アルコールの産生を向上させるための１つの方法は、ＧＰＤの補助因子特異性を変えることである。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＤ１は一般に、酵母菌細胞においてジヒドロキシアセトンホスフェートからグリセロールへの変換の第１ステップを触媒する際に、補助因子のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（「ＮＡＤＨ」）を好む。しかし、本明細書に示されているように、ＧＰＤ酵素は、補助因子であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（「ＮＡＤＰＨ」）を使用することもできる。
【０１２３】
ＮＡＤＨよりもＮＡＤＰＨを好むＧＰＤ酵素を使用すると、ＮＡＤＨを好む酵素と比べた場合に、宿主細胞は、様々な代謝条件下でグリセロールを産生する能力を維持することができる。しかし、このグリセロール産生は、ＮＡＤＰＨの産生が限られる場合、嫌気条件下ではうまい具合に制限することができる。
【０１２４】
同時に、ＮＡＤＨを好むＧＰＤの傾向を減少させると、宿主細胞内のＮＡＤＨをいっそう利用可能にすることができる。ＮＡＤＨは、生成物アルコール産生経路内で他の酵素によっても使用される。例えば、イソブタノール製造経路では、ＫＡＲＩおよびアルコールデヒドロゲナーゼは、利用可能なＮＡＤＨを使用することができる。したがって、ＮＡＤＨに対するＧＰＤの親和性を減少させると、生成物アルコール（例えば、イソブタノール）の産生を増大させることができる。それゆえに、実施形態によっては、異種性及び／または改変ＧＰＤは、ＮＡＤＨを利用する酵素（例えば、イソブタノール製造経路で働くＮＡＤＨを利用する酵素（ＫＡＲＩおよびアルコールデヒドロゲナーゼなど））も発現する組換え微生物で発現される。
【０１２５】
生成物アルコール（例えば、ブタノール）の産生を向上させる更なるやり方は、ＧＰＤを変えてＮＡＤＰＨの場合のＫＭを減少させることである。ＧＰＤを変えてＮＡＤＰＨの場合のＫＭを減少させると、ＧＰＤが触媒するＮＡＤＰＨ酸化の速度を増大させることができ、それによって宿主細胞内でＮＡＤＨがいっそう利用可能になる。利用可能なＮＡＤＨは、生成物アルコール産生経路内で他の酵素が使用できる。例えば、イソブタノール産生経路内で、利用可能なＮＡＤＨをＫＡＲＩおよびアルコールデヒドロゲナーゼが利用できる。したがって、ＮＡＤＰＨに対するＧＰＤの親和性を増大させると、生成物アルコール（例えば、イソブタノール）の産生を増大させることができる。それゆえに、実施形態によっては、異種性及び／または改変ＧＰＤは、ＮＡＤＨを利用する他の酵素（例えば、イソブタノール製造経路で働くＮＡＤＨを利用する酵素（ＫＡＲＩおよびアルコールデヒドロゲナーゼなど））も発現する組換え微生物で発現される。
【０１２６】
いくらかのグリセロールを作る能力を維持させ、かつ生成物アルコールの産生を向上させるための別のやり方は、内在性ＧＰＤ酵素が産生する量と比べて、産生されるグリセロールの量を低下させることのできる異種性ＧＰＤ酵素を使用することである。異種性酵素の例に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｐｓＡがある。グリセロールの産生を少なくする能力に寄与しうる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｐｓＡの２つのメカニズム的特徴としては、（１）ｇｐｓＡは、グリセロール−３−ホスフェートによって抑制される生成物であるという点、また（２）ｇｐｓＡは、実質的に同じ親和性を有する補助因子ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨを利用し（Ｅｄｇａｒ  ａｎｄ  Ｂｅｌｌ，ＪＢＣ  ２５５：３４９２−７（１９８０））、ある条件下では、これによってＮＡＤＰＨを使用したグリセロールが産生されるようにもなり、こうして宿主細胞内でＮＡＤＨが利用できるようになるという点がある。サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）でのグリセロール−３−ホスフェートによる生成物阻害により、グリセロール産生が低下することがある。それは特に、グリセロール−３−ホスフェートフォスファターゼの酵素反応がＧＰＤの酵素反応よりも遅い場合に起こる。サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のフォスファターゼＧＰＰ１およびＧＰＰ２の公表されているミカエリス定数は、それぞれ３．１および３．９である（Ｎｏｒｂｅｃｋ，ＪＢＣ  ２７１：１３８７５−８１（１９９６）。それは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｐｓＡでのグリセロール−３−ホスフェートの阻害定数（Ｋｉ）のほぼ１０００倍大きい（Ｅｄｇａｒ  ａｎｄ  Ｂｅｌｌ，ＪＢＣ２５３：６３４５−６３（１９７８））。ほどんとの条件は、グリセロール−３−ホスフェートによる生成物の阻害につながる。
【０１２７】
ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを利用でき、かつ／またはグリセロール−３−ホスフェートによってフィードバック阻害されるＧＰＤ酵素としては、自然界に存在するタンパク質および改変タンパク質の両方を挙げることができる。例えば、ＮＡＤＨを利用するかまたはＮＡＤＰＨを利用するＧＰＤ酵素は、ＥＣ１．１．１．９４によって記述されており、アスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、カンジダ・バーサチルス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、およびカイウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）に見出されてきた。
【０１２８】
実施形態によっては、ここで使用される異種性ＧＰＤは、メキシコリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ）、ドナリエラ・ヴィリディス（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｖｉｒｉｄｉｓ）、オオミユビトビネズミ（Ｊａｃｕｌｕｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、アーキオグロブス・フルジダス（Ａｒｃｈｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、ベギアトア・アルバ（Ｂｅｇｇｉａｔｏａ  ａｌｂａ）、カンジエラ・コレニス（Ｋａｎｇｉｅｌｌａ  ｋｏｒｅｅｎｉｓ）、アスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、カンジダ・バーサチルス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、またはアナウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕ）のＧＰＤである。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのいずれかを利用でき、かつ／またはグリセロール−３−ホスフェートによってフィードバック阻害される他のＧＰＤ酵素の配列は、文献で特定することができ、候補は、本明細書に開示されていて当該技術分野において入手可能な配列を用いて、当業者によく知られているバイオインフォマティクスデータベースで特定できる。例えば、そのような配列は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列をコードする周知のＧＰＤに関して、公に利用可能なデータベースのＢＬＡＳＴ検索によって特定できる。そのような方法では、同一性は、デフォルト・パラメーターのＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ  ２５０  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘを用いたＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づいたものであってよい。
【０１３０】
さらに、本明細書に開示されているかまたは当該技術分野において知られているＧＰＤポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を使用して、自然界にある他の候補ＧＰＤ相同体を同定できる。例えば、本明細書に開示されているかまたは当該技術分野において知られているＧＰＤをコードする核酸配列を使用して、相同タンパク質をコードする遺伝子を分離することができる。配列に依存するプロトコルを用いた相同遺伝子の分離には、（１）核酸ハイブリダイゼーションの方法；（２）ＤＮＡおよびＲＮＡ増幅の方法で、核酸増幅技術のいろいろな使用によって例示されているもの（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，６８３，２０２号明細書；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｔａｂｏｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８２：１０７４（１９８５）；または鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ），Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：３９２（１９９２）］；および（３）ライブラリー構築および相補性によるスクリーニングの方法があるが、これらに限定されない。
【０１３１】
生成物アルコールの産生を向上させる別のやり方は、ＧＰＤを変えてＮＡＤＨの場合のＫＭを増大させることである。ＧＰＤを変えてＮＡＤＨの場合のＫＭを増大させると、ＧＰＤが触媒するＮＡＤＨの酸化の速度を減少させることができ、それによって宿主細胞内でのＮＡＤＨがいっそう利用可能になる。利用可能なＮＡＤＨは、生成物アルコール産生経路内で他の酵素が使用できる。例えば、イソブタノール産生経路内で、利用可能なＮＡＤＨをＫＡＲＩおよびアルコールデヒドロゲナーゼが利用できる。したがって、ＮＡＤＨに対するＧＰＤの親和性を減少させると、生成物アルコール（例えば、イソブタノール）の産生を増大させることができる。したがって実施形態によっては、異種性及び／または改変ＧＰＤは、ＮＡＤＨを利用する他の酵素（例えば、ＫＡＲＩおよびアルコールデヒドロゲナーゼなど、イソブタノール産生経路で働くＮＡＤＨを利用する酵素）も発現する組換え微生物で発現される。
【０１３２】
ＮＡＤＨの場合のＫＭが大きいＧＤＤ酵素は、タンパク質工学によっても製造できる。実施形態によっては、ＧＰＤは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＤ１（配列番号１９５）との同一性が、少なくとも５０％，５５％，６０％，６５％、７０％、７５％，８０％，８５％，９０％または９５％であるが、配列番号１９５と１００％同一ではない。実施形態によっては、ＧＰＤは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＤ１（配列番号１９５）の位置４２，４４，４５、７１、７３、７５、９５、１２４、１２６、１２９、１５１，１５２，１８３，１８４，１８５，２４６，３１０，３３６，３３７、または３３９に対応する残基に少なくとも１つの置換を含む。
【０１３３】
例えば、実施形態によっては、ＧＰＤは、配列番号１９５の位置４４に対応する残基（配列番号１９５のＡｓｎ）が、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸に置換される。
【０１３４】
実施形態によっては、ＧＰＤは、配列番号１９５の位置４５に対応する残基（配列番号１９５のＴｒｐ）が、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸に置換される。
【０１３５】
実施形態によっては、ＧＰＤは、配列番号１９５の位置７３に対応する残基（配列番号１９５のＰｈｅ）が、Ｇ、Ａ、Ｒ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸に置換される。
【０１３６】
実施形態によっては、ＧＰＤは、配列番号１９５の位置１２９に対応する残基（配列番号１９５のＰｈｅ）が、Ｇ、Ａ、Ｒ、およびＫからなる群から選択されるアミノ酸に置換される。
【０１３７】
実施形態によっては、ＧＰＤは、配列番号１９５の位置３３７に対応する残基（配列番号１９５のＳｅｒ）が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸に置換される。
【０１３８】
実施形態によっては、ＧＰＤは、配列番号１９５の位置３３９に対応する残基（配列番号１９５のＧｌｎ）が、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸に置換される。
【０１３９】
実施形態によっては、ＧＰＤは、配列番号１９５の位置４２、７１、７５、９５、１２４、１２６、１５１、１５２、１８３、１８４、１８５、２４６、３１０、及び／または３３６に対応する残基（配列番号１９５のそれぞれ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ）が、１９種の自然界に存在するアミノ酸から選択される他のいずれかのアミノ酸に置換される。
【０１４０】
実施形態によっては、ＧＰＤは、ＮＡＤＨの場合のＫＭが約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭである。実施形態によっては、ＧＰＤは、ＮＡＤＨの場合のＫＭが約０．０５ｍＭ〜約１ｍＭである。実施形態によっては、ＧＰＤは、ＮＡＤＨの場合のＫＭが約０．１０ｍＭ〜約１ｍＭである。実施形態によっては、ＧＰＤは、ＮＡＤＨの場合のＫＭが約０．１５ｍＭ〜約１ｍＭである。実施形態によっては、ＧＰＤは、ＮＡＤＨの場合のＫＭが約０．２０ｍＭ〜約１ｍＭである。実施形態によっては、ＧＰＤは、ＮＡＤＨの場合のＫＭが約０．３０ｍＭ〜約１ｍＭである。実施形態によっては、ＧＰＤは、ＮＡＤＨの場合のＫＭが約０．４０ｍＭ〜約１ｍＭである。実施形態によっては、ＧＰＤは、ＮＡＤＨの場合のＫＭが約０．５０ｍＭ〜約１ｍＭである。ＮＡＤＨの場合のＧＰＤのＫＭを測定するための分析法は、以下の実施例１に開示されており、当該技術分野において知られている。例えば、Ｎｉｅｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．８９：２９６−３０１（１９８２）を参照されたい。ある特定の分析法は、「ＮＡＤＨ消費分析法（ＮＡＤＨ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ）」と呼ぶことができ、それは、ＧＰＤ酵素の比活性を求めるための酵素試験法を表し、酵素反応からのＧＰＤ補助因子であるＮＡＤＨの消失を測定することが関係する。
【０１４１】
実施形態によっては、ＧＰＤは、ＮＡＤＰＨの場合のＫＭが約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭである。実施形態によっては、ＧＰＤは、ＮＡＤＰＨの場合のＫＭが約０．０５ｍＭ〜約１ｍＭである。実施形態によっては、ＧＰＤは、ＮＡＤＰＨの場合のＫＭが約０．１０ｍＭ〜約１ｍＭである。実施形態によっては、ＧＰＤは、ＮＡＤＰＨの場合のＫＭが約０．１５ｍＭ〜約１ｍＭである。実施形態によっては、ＧＰＤは、ＮＡＤＰＨの場合のＫＭが約０．２０ｍＭ〜約１ｍＭである。実施形態によっては、ＧＰＤは、ＮＡＤＰＨの場合のＫＭが約０．３０ｍＭ〜約１ｍＭである。実施形態によっては、ＧＰＤは、ＮＡＤＰＨの場合のＫＭが約０．４０ｍＭ〜約１ｍＭである。実施形態によっては、ＧＰＤは、ＮＡＤＰＨの場合のＫＭが約０．５０ｍＭ〜約１ｍＭである。実施例１で以下に明らかにしているＮＡＤＨ分析法は、ＮＡＤＨをＮＡＤＰＨで置き換えることにより、ＮＡＤＰＨの場合のＧＰＤのＫＭが測定されるように適応させることができる。ＮＡＤＰＨの場合のＧＰＤのＫＭを測定するための更なる分析法は、当該技術分野において知られている。例えば、Ｎｉｅｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．８９：２９６−３０１（１９８２）を参照されたい。ある特定の分析法は、「ＮＡＤＰＨ消費分析法」と呼ぶことができ、それは、ＧＰＤ酵素の比活性を求めるための酵素試験法を表し、酵素反応からのＧＰＤ補助因子であるＮＡＤＨの消失を測定することが関係する。
【０１４２】
実施形態によっては、異種性及び／または改変ＧＰＤは、異種性及び／または改変ＧＰＤを含まない組換え微生物と比べた場合、異種性及び／または改変ＧＰＤを含む組換え微生物の成長を増大させることができる。
【０１４３】
実施形態によっては、異種性及び／または改変ＧＰＤは、異種性及び／または改変ＧＰＤを含まない組換え微生物と比べた場合、異種性及び／または改変ＧＰＤを含む組換え微生物の生成物アルコール（例えば、イソブタノール）の産生を増大させることができる。
【０１４４】
実施形態によっては、異種性及び／または改変ＧＰＤは、異種性及び／または改変ＧＰＤを含まない組換え微生物と比べた場合に、ＧＰＤを含む組換え微生物のグリセロール産生を減少させることができる。
【０１４５】
実施形態によっては、異種性及び／または改変ＧＰＤは、異種性及び／または改変ＧＰＤを含まない組換え微生物と比べた場合、異種性及び／または改変ＧＰＤを含む組換え微生物が産生する生成物アルコール（例えば、イソブタノール）とグリセロールとの比率を増大させることができる。
【０１４６】
実施形態によっては、異種性及び／または改変ＧＰＤは、異種性及び／または改変ＧＰＤを含まない組換え微生物と比べた場合、異種性及び／または改変ＧＰＤを含む組換え微生物の収率（例えば、消費される基質１グラム当たりの産生イソブタノールのグラム数）を増大させることができる。
【０１４７】
したがって、ブタノール生合成経路、微生物の内在性ＧＰＤよりも高いＮＡＤＨの場合のＫＭを有する異種性及び／または改変ＧＰＤ、およびＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損を含む組換え微生物では、「ブタノール産生の向上」は、異種性及び／または改変ＧＰＤのない微生物と比べて、ブタノールの産生が増大すること、グリセロールの産生が減少すること、またはその両方に関連しうる。
【０１４８】
微生物の内在性ＧＰＤよりも高いＮＡＤＨの場合のＫＭを有する異種性及び／または改変ＧＰＤおよびＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損を含む組換え微生物では、「アルコール産生の向上」は、異種性及び／または改変ＧＰＤのない微生物と比べて、アルコールの産生が増大すること、グリセロールの産生が減少すること、またはその両方に関連しうる。
【０１４９】
したがって、ブタノール生合成経路、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対して実質的に同じ親和性を有しかつ／またはグリセロール−３−ホスフェートによってフィードバック阻害される異種性ＧＰＤ、およびＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損を含む組換え微生物では、「ブタノール産生の向上」は、異種性ＧＰＤのない微生物と比べて、ブタノールの産生が増大すること、グリセロールの産生が減少すること、またはその両方に関連しうる。
【０１５０】
ＮＡＤＨおよびＮＡＰＤＨに対して実質的に同じ親和性を有しかつ／またはグリセロール−３−ホスフェートによってフィードバック阻害される異種性ＧＰＤ、およびＧＰＤをコードする内在性遺伝子の欠失または破損を含む組換え微生物では、「アルコール産生の向上」は、異種性ＧＰＤのない微生物と比べて、アルコールの産生が増大すること、グリセロールの産生が減少すること、あるいはその両方に関連しうる。
【０１５１】
組換え微生物
理論に縛られることは望まないが、本明細書に記載のプロセスは、任意のアルコール産生微生物（特にアルコールを産生する組換え微生物）と組み合わせると有用であると考えられる。
【０１５２】
アルコールを産生する組換え微生物は、当該技術分野においても知られている（例えば、Ｏｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：８９３−９００（１９９１）；Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｒｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：１０７１−８１（２００２）；Ｓｈｅｎ  ａｎｄ  Ｌｉａｏ，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．１０：３１２−２０（２００８）；Ｈａｈｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．７３：７８１４−８（２００７）；米国特許第５，５１４，５８３号明細書；米国特許第５，７１２，１３３号明細書；国際公開第１９９５／０２８４７６号パンフレット；Ｆｅｌｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：３５４−６１（１９９２）；  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：２４０−３（１９９５）；米国特許出願公開第２００７／００３１９１８Ａ１号明細書；米国特許第７，２２３，５７５号明細書；米国特許第７，７４１，１１９号明細書；米国特許出願公開第２００９／０２０３０９９Ａ１号明細書；米国特許出願公開第２００９／０２４６８４６Ａ１号明細書；および国際公開第２０１０／０７５２４１号パンフレット（これらを本明細書に援用する））。
【０１５３】
例えば、微生物の代謝経路は、ブタノールを産生するように遺伝子修飾することができる。こうした経路は、望ましくない代謝産物が少なくなるかまたはなくなるように変更し、それによって生成物アルコールの収率が向上するようすることもできる。微生物によるブタノールの産生については、例えば、米国特許第７，８５１，１８８号明細書；米国特許第７，９９３，８８９号明細書；米国特許第８，１７８，３２８号明細書、米国特許第８，２０６，９７０号明細書、米国特許出願公開第２００７／０２９２９２７号明細書、米国特許出願公開第２００８／０１８２３０８号明細書、米国特許出願公開第２００８／０２７４５２５号明細書、米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書、米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０２５０６１０号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０３１３２０６号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０１１１４７２号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０２５８８７３号明細書、および米国特許出願公開第２０１３／００７１８９８号明細書に開示されており、それぞれについてその内容全体を本明細書に援用する。ある特定の実施形態では、微生物は、ブタノール生合成経路またはブタノール異性体（１−ブタノール、２−ブタノール、またはイソブタノールなど）の生合成経路を含むように遺伝子修飾される。ある特定の実施形態では、ブタノール生合成経路において基質から生成物への変換を触媒する少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、または少なくとも５種のポリペプチドは、微生物の異種性ポリヌクレオチドによってコードされる。ある特定の実施形態では、ブタノール生合成経路の基質から生成物への変換を触媒するすべてのポリペプチドが、微生物の異種性ポリヌクレオチドによってコードされる。ブタノール生合成経路を含む微生物は、米国特許出願公開第２０１３／００７１８９８号明細書（その全体を本明細書に援用する）に開示されている１つまたは複数の更なる遺伝子修飾をさらに含んでもよいことが理解されるであろう。
【０１５４】
実施形態によっては、微生物は、バクテリア、藍色細菌、糸状菌、または酵母であってよい。生合成経路によって生成物アルコール（例えば、ブタノール）を産生できる好適な微生物としては、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ジモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルトロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ザイゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デバリオミケス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ブレタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、ヤマダザイマ属（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）、またはサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のものがある。１つの実施形態では、組換え微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス・ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｎｎｉｓ）、パエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）、ロドコッカス・エリスポリス（Ｒｈｏｄｏｃｕｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナラム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、カンジダ・ソノレンシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、カンジダ・メタノソルボーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・マルキアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クルイベロミセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、イサチェンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、デバリオミセス・ハンゼニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からなる群から選択されてよい。１つの実施形態では、遺伝子修飾される微生物は酵母菌である。１つの実施形態では、遺伝子修飾される微生物は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ザイゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デッケラ属（Ｄｅｋｋｅｒａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ブレタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、および一部の種のカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）から選択されるクラブツリー正酵母（ｃｒａｂｔｒｅｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｙｅａｓｔ）である。クラブツリー正酵母の種には、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、サッカロミセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロミセス・ミキタエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｋｉｔａｅ）、サッカロミセス・パラドクサス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、サッカロミセス・ウバラム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ）、サッカロミセス・カステリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｓｔｅｌｌｉ）、ザイゴサッカロミセス・ロキシ−（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）、ザイゴサッカロミセス・ベイリイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｌｉ）、およびカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５５】
実施形態によっては、宿主細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、当該技術分野において知られており、様々な供給源から得ることができる。その供給源としては、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、ＬｅＳａｆｆｒｅ、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ＡＢ、Ｆｅｒｍ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｍａｒｔｒｅｘ、およびＬａｌｌｅｍａｎｄがあるが、これらに限定されない。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）としては、ＢＹ４７４１、ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ、Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ（登録商標）酵母菌、Ｆｅｒｍ  Ｐｒｏ（商標）酵母菌、Ｂｉｏ−Ｆｅｒｍ（登録商標）ＸＲ酵母菌、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｐｒｅｓｔｉｇｅ  Ｂａｔｃｈ  Ｔｕｒｂｏアルコール酵母菌、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｐｏｔ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ酵母菌、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  Ｔｕｒｂｏ酵母菌、ＦｅｒＭａｘ（商標）Ｇｒｅｅｎ酵母菌、ＦｅｒＭａｘ（商標）Ｇｏｌｄ酵母菌、Ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃ（登録商標）酵母菌、ＢＧ−１、ＰＥ−２、ＣＡＴ−１、ＣＢＳ７９５９、ＣＢＳ７９６０、およびＣＢＳ７９６１があるが、これらに限定されない。
【０１５６】
実施形態によっては、微生物は、固定化されていてもカプセル化されていてもよい。例えば、微生物は、アルギナート、アルギン酸カルシウム、またはポリアクリルアミドゲルを用いて、あるいは様々な高表面積支持マトリックス（珪藻土、セライト、けいそう土、シリカゲル、プラスチック、または樹脂など）上でのバイオフィルム形成の誘発により、固定化またはカプセル化することができる。実施形態によっては、ＩＳＰＲは、固定化またはカプセル化微生物と組み合わせて使用してよい。この組合せにより、生産性（比容積生産性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）など）、代謝率、生成物アルコール収率、生成物アルコール耐性を向上させることができる。さらに、固定化およびカプセル化により、微生物に対するプロセス条件（せん断など）の影響を最小限に抑えることができる。
【０１５７】
イソブタノールを産生させるための使用できる生合成経路には、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．により米国特許第７，８５１，１８８号明細書；米国特許第７，９９３，３８８号明細書；および国際公開第２００７／０５０６７１号パンフレットに記載されているものがある（これらを本明細書に援用する）。１つの実施形態では、イソブタノール生合成経路は、以下の基質から生成物への変換を含む：
ａ）ピルベートからアセト乳酸（これは、例えば、アセト乳酸合成酵素よって触媒されうる）；
ｂ）ステップａ）からのアセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソバレレート（これは、例えば、ケトール酸レダクトイソメラーゼよって触媒されうる）；
ｃ）ステップｂ）からの２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソ吉草酸（これは、例えば、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼよって触媒されうる）；
ｄ）ステップｃ）からのα−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒド（これは、例えば、分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼよって触媒されうる）；および
ｅ）ステップｄ）からのイソブチルアルデヒドからイソブタノール（これは、例えば、分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されうる）。
【０１５８】
別の実施形態では、イソブタノール生合成経路は、以下の基質から生成物への変換を含む：
ａ）ピルベートからアセト乳酸（これは、例えば、アセト乳酸合成酵素よって触媒されうる）；
ｂ）ステップａ）からのアセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソバレレート（これは、例えば、ケトール酸レダクトイソメラーゼよって触媒されうる）；
ｃ）ステップｂ）からの２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソ吉草酸（これは、例えば、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼよって触媒されうる）；
ｄ）ステップｃ）からのα−ケトイソ吉草酸からバリン（これは、例えば、トランスアミナーゼまたはバリンデヒドロゲナーゼよって触媒されうる）；
ｅ）ステップｄ）からのバリンからイソブチルアミン（これは、例えば、バリンデカルボキシラーゼよって触媒されうる）；
ｆ）ステップｅ）からのイソブチルアミンからイソブチルアルデヒド（これは、例えば、オメガトランスアミナーゼよって触媒されうる）；および
ｇ）ステップｆ）からのイソブチルアルデヒドからイソブタノール（これは、例えば、分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されうる）。
【０１５９】
別の実施形態では、イソブタノール生合成経路は、以下の基質から生成物への変換を含む：
ａ）ピルベートからアセト乳酸（これは、例えば、アセト乳酸合成酵素によって触媒されうる）；
ｂ）ステップａ）からのアセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソバレレート（これは、例えば、ケトール酸レダクトイソメラーゼによって触媒されうる）；
ｃ）ステップｂ）からの２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソ吉草酸（これは、例えば、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒されうる）；
ｄ）ステップｃ）からのα−ケトイソ吉草酸からイソブチリル−ＣｏＡ（これは、例えば、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼによって触媒されうる）；
ｅ）ステップｄ）からのイソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒド（これは、例えば、アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒されうる）；および
ｆ）ステップｅ）からのイソブチルアルデヒドからイソブタノール（これは、例えば、分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されうる）。
【０１６０】
１−ブタノールを産生させるための使用できる生合成経路には、米国特許出願公開第２００８／０１８２３０８号明細書および国際公開公報第２００７／０４１２６９号パンフレット（これらを本明細書に援用する）に記載されているものがある。１つの実施形態では、１−ブタノール生合成経路は、以下の基質から生成物への変換を含む：
ａ）アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡ（これは、例えば、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼによって触媒されうる）；
ｂ）ステップａ）からのアセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ（これは、例えば、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒されうる）；
ｃ）ステップｂ）からの３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡ（これは、例えば、クロトナーゼによって触媒されうる）；
ｄ）ステップｃ）からのクロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡ（これは、例えば、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒されうる）；
ｅ）ステップｄ）からのブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒド（これは、例えば、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒されうる）；および
ｆ）ステップｅ）からのブチルアルデヒドから１−ブタノール（これは、例えば、ブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒されうる）。
【０１６１】
２−ブタノールを産生させるための使用できる生合成経路には、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．により米国特許第８，２０６，９７０号明細書、米国特許出願公開第２００７／０２９２９２７号明細書、米国特許出願公開第２００９／０１５５８７０号明細書、国際公開第２００７／１３０５１８号パンフレット、および国際公開第２００７／１３０５２１号パンフレット（これらすべてを本明細書に援用する）に記載されているものが含まれる。１つの実施形態では、２−ブタノール生合成経路は、以下の基質から生成物への変換を含む：
ａ）ピルベートからアルファ−アセト乳酸（これは、例えば、アセト乳酸合成酵素によって触媒されうる）；
ｂ）ステップａ）からのアルファ−アセト乳酸からアセトイン（これは、例えば、アセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒されうる）；
ｃ）ステップｂ）からのアセトインから３−アミノ−２−ブタノール（これは、例えば、アセトインアミナーゼ（ａｃｅｔｏｉｎ  ａｍｉｎａｓｅ）によって触媒されうる）；
ｄ）ステップｃ）からの３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールホスフェート（これは、例えば、アミノブタノールキナーゼ（ａｍｉｎｏｂｕｔａｎｏｌ  ｋｉｎａｓｅ）によって触媒されうる）；
ｅ）ステップｄ）からの３−アミノ−２−ブタノールホスフェートから２−ブタノン（これは、例えば、アミノブタノール（ａｍｉｎｏｂｕｔａｎｏｌ）ホスフェートホスホリラーゼによって触媒されうる）；および
ｆ）ステップｅ）からの２−ブタノンから２−ブタノール（これは、例えば、ブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒されうる）。
【０１６２】
別の実施形態では、２−ブタノール生合成経路は、以下の基質から生成物への変換を含む：
ａ）ピルベートからアルファ−アセト乳酸（これは、例えば、アセト乳酸合成酵素によって触媒されうる）；
ｂ）ステップａ）からのアルファ−アセト乳酸からアセトイン（これは、例えば、アセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒されうる）；
ｃ）アセトインからステップｂ）の２，３−ブタンジオールへ（これは、例えば、ブタンジオールデヒドロゲナーゼによって触媒されうる）；
ｄ）ステップｃ）からの２，３−ブタンジオールから２−ブタノン（これは、例えば、ジオールデヒドラターゼによって触媒されうる）；および
ｅ）ステップｄ）からの２−ブタノンから２−ブタノール（これは、例えば、ブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒されうる）。
【０１６３】
２−ブタノンを産生させるための使用できる生合成経路としては、米国特許第８，２０６，９７０号明細書、米国特許出願公開第２００７／０２９２９２７号明細書、および米国特許出願公開第２００９／０１５５８７０号明細書（これらを本明細書に援用する）に記載されているものがある。１つの実施形態では、２−ブタノン生合成経路は、以下の基質から生成物への変換を含む：
ａ）ピルベートからアルファ−アセト乳酸（これは、例えば、アセト乳酸合成酵素によって触媒されうる）；
ｂ）ステップａ）からのアルファ−アセト乳酸からアセトイン（これは、例えば、アセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒されうる）；
ｃ）ステップｂ）からのアセトインから３−アミノ−２−ブタノール（これは、例えば、アセトインアミナーゼによって触媒されうる）；
ｄ）ステップｃ）からの３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールホスフェート（これは、例えば、アミノブタノールキナーゼによって触媒されうる）；および
ｅ）ステップｄ）からの３−アミノ−２−ブタノールホスフェートから２−ブタノン（これは、例えば、アミノブタノールホスフェートホスホリラーゼによって触媒されうる）。
【０１６４】
別の実施形態では、２−ブタノン生合成経路は、以下の基質から生成物への変換を含む：
ａ）ピルベートからアルファ−アセト乳酸（これは、例えば、アセト乳酸合成酵素によって触媒されうる）；
ｂ）ステップａ）からのアルファ−アセト乳酸からアセトイン（これは、例えば、アセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒されうる）；
ｃ）ステップｂ）からのアセトインから２，３−ブタンジオール（これは、例えば、ブタンジオールデヒドロゲナーゼによって触媒されうる）；
ｄ）ステップｃ）からの２，３−ブタンジオールから２−ブタノン（これは、例えば、ジオールデヒドラターゼによって触媒されうる）。
【０１６５】
「アセトヒドロキシ酸シンターゼ」、「アセト乳酸合成酵素」および「アセト乳酸シンセターゼ」（「ＡＬＳ」と省略）という用語は、本明細書では同義語的に使用され、ピルベートからアセトラクテートおよびＣＯ２への変換を触媒する酵素を表す。例示的なアセト乳酸合成酵素は、酵素番号２．２．１．６（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）で知られている。これらの酵素は、多数の産生源から得ることができ、その産生源としては、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク番号：ＣＡＢ０７８０２．１、Ｚ９９１２２で、これらはそれぞれＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）アミノ酸配列、ＮＣＢＩヌクレオチド配列である）、ＣＡＢ１５６１８、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ジェンバンク番号：ＡＡＡ２５０７９、Ｍ７３８４２）、および乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ジェンバンク番号：ＡＡＡ２５１６１、Ｌ１６９７５）があるが、これらに限定されない。
【０１６６】
「ケトール酸レダクトイソメラーゼ」（「ＫＡＲＩ」）、「アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙ  ａｃｉｄ  ｉｓｏｍｅｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）」および「アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ」という用語は、同義的に使用されるであろう。またこれらは、（Ｓ）−アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの反応を触媒できる酵素を表す。例示的なＫＡＲＩ酵素は、酵素番号ＥＣ１．１．１．８６に分類することができ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、無数の微生物から得ることができる。その微生物としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿４１８２２２、ＮＣ＿０００９１３）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿０１３４５９、ＮＣ＿００１１４４）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）（ジェンバンク番号：ＣＡＦ３０２１０、ＢＸ９５７２２０）、およびバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク番号：ＣＡＢ１４７８９、Ｚ９９１１８）があるが、これらに限定されない。ＫＡＲＩとしては、アナエロスティペス・カカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ）のＫＡＲＩ変種「Ｋ９Ｇ９」（配列番号８５）、「Ｋ９Ｄ３」（配列番号８６）、および「Ｋ９ＪＢ４Ｐ」（配列番号８７）がある。ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）酵素については、米国特許第７，９１０，３４２号明細書および米国特許第８，１２９，１６２号明細書、米国特許出願公開第２００８／０２６１２３０号明細書、米国特許出願公開第２００９／０１６３３７６号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０１９７５１９号明細書、ＰＣＴの国際公開公報第２０１１／０４１４１５号パンフレット、ＰＣＴの国際公開公報第２０１２／１２９５５５号パンフレット、および米国特許出願第１４／０３８，４５５号明細書（２０１３年９月２６日出願）に記載されており、これらすべてを本明細書に援用する。それらに開示されているＫＡＲＩの例には、乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１、および蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５変異体からのものがある。実施形態によっては、ＫＡＲＩはＮＡＤＨを利用する。実施形態によっては、ＫＡＲＩはＮＡＤＰＨを利用する。実施形態によっては、ＫＡＲＩはＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを利用する。
【０１６７】
「アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ」および「ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ」（「ＤＨＡＤ」）という用語は、２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソ吉草酸への変換を触媒する酵素を表す。例示的なアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼは、酵素番号４．２．１．９で知られている。そのような酵素は、無数の微生物から得ることができ、そうした微生物としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ジェンバンク番号：ＹＰ＿０２６２４８、ＮＣ０００９１３）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿０１２５５０、ＮＣ  ００１１４２）、Ｍ．マリパルディス（Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）（ジェンバンク番号：ＣＡＦ２９８７４、ＢＸ９５７２１９）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク番号：ＣＡＢ１４１０５、Ｚ９９１１５）、Ｌ．ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）（配列番号８８）、およびＮ．クラサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）があるが、これらに限定されない。米国特許出願公開第２０１０／００８１１５４号明細書、米国特許第７，８５１，１８８号明細書、および米国特許第８，２４１，８７８号明細書（これらについては、その全体を援用する）は、ジヒドロキシ酸デヒドロターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）（ＤＨＡＤ）（ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）（配列番号８９）およびその変種からのＤＨＡＤを含む）について記載している。
【０１６８】
「分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ」、「α−ケト酸デカルボキシラーゼ」、「α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（α−ｋｅｔｏｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）」、または「２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ」（「ＫＩＶＤ」）という用語は、α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドおよびＣＯ２への変換を触媒する酵素を表す。例示的な分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼは、酵素番号４．１．１．７２で知られており、乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ジェンバンク番号：ＡＡＳ４９１６６、ＡＹ５４８７６０；ＣＡＧ３４２２６、ＡＪ７４６３６４）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿４６１３４６、ＮＣ＿００３１９７）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿１４９１８９、ＮＣ＿００１９８８）、Ｍ．カゼオリチカス（Ｍ．ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）、およびＬ．グレイ（Ｌ．ｇｒａｙｉ）を含む（ただし、これらに限定されない）多数の産生源から得ることができる。好適な分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼは、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）からの配列番号９０およびリステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）からの配列番号９１を含みうる。
【０１６９】
「分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼ」（「ＡＤＨ」）という用語は、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒する酵素を表す。例示的な分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼは、酵素番号１．１．１．２６５で知られているが、他のアルコールデヒドロゲナーゼ（特に、ＥＣ１．１．１．１または１．１．１．２）に分類することもできる。アルコールデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＰＨ依存性またはＮＡＤＨ依存性であってよい。そのような酵素は、多数の産生源から得ることができ、その産生源としては、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿０１０６５６、ＮＣ＿００１１３６、ＮＰ＿０１４０５１、ＮＣ＿００１１４５）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿４１７４８４、ＮＣ＿０００９１３）、Ｃ．アセトブチリウム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿３４９８９２、ＮＣ＿００３０３０；ＮＰ＿３４９８９１、ＮＣ＿００３０３０）があるが、これらに限定されない。米国特許出願公開第２００９／０２６９８２３号明細書は、ＳａｄＢ（アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）からのアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（配列番号９２））を記載している。アルコールデヒドロゲナーゼは、ウマの肝臓のＡＤＨ（配列番号９３）およびベイジェリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｋｉａ  ｉｎｄｉｃａ）のＡＤＨ（配列番号９４）（米国特許出願公開第２０１１／０２６９１９９号明細書に記載されており、これを本明細書に援用する）も含む。
【０１７０】
「ブタノールデヒドロゲナーゼ」という用語は、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換または２−ブタノンおよび２−ブタノールの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（１種または複数種）を表す。ブタノールデヒドロゲナーゼは、アルコールデヒドロゲナーゼの広範なファミリーの中のサブセットである。ブタノールデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤ依存性またはＮＡＤＰ依存性でありうる。ＮＡＤ依存性酵素はＥＣ１．１．１．１として知られており、例えば、ロドコッカス・ルベル（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）（ジェンバンク番号：ＣＡＤ３６４７５、ＡＪ４９１３０７）から得ることができる。ＮＡＤＰ依存性酵素はＥＣ１．１．１．２として知られており、例えば、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（ジェンバンク番号：ＡＡＣ２５５５６、ＡＦ０１３１６９）から得ることができる。さらに、ブタノールデヒドロゲナーゼは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ジェンバンク番号：ＮＰ４１７４８４、ＮＣ＿０００９１３）から得ることができ、シクロヘキサノールデヒドロゲナーゼは、アシネトバクター種（ジェンバンク番号：ＡＡＧ１００２６、ＡＦ２８２２４０）から得ることができる。「ブタノールデヒドロゲナーゼ」という用語はまた、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのいずれかを補助因子として用いて、ブチルアルデヒドから１−ブタノールへの変換を触媒する酵素も表す。ブタノールデヒドロゲナーゼは、例えば、Ｃ．アセトブチリウム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿１４９３２５、ＮＣ＿００１９８８（注：この酵素は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性およびアルコールデヒドロゲナーゼ活性の両方を有する）；ＮＰ＿３４９８９１、ＮＣ＿００３０３０；およびＮＰ＿３４９８９２、ＮＣ＿００３０３０）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿４１７−４８４、ＮＣ＿０００９１３）から得ることができる。
【０１７１】
「分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ」という用語は、α−ケトイソ吉草酸からイソブチリル−ＣｏＡ（イソブチリル−補酵素Ａ）への変換を、典型的にはＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を電子受容体として用いて触媒する酵素を表す。例示的な分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼは、酵素番号１．２．４．４で知られている。そのような分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼは、４つのサブユニットから構成され、すべてのサブユニットの配列は、膨大な数の微生物から得ることができる。その微生物としては、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク番号：ＣＡＢ１４３３６、Ｚ９９１１６；ＣＡＢ１４３３５、Ｚ９９１１６；ＣＡＢ１４３３４、Ｚ９９１１６；およびＣＡＢ１４３３７、Ｚ９９１１６）およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）（ジェンバンク番号：ＡＡＡ６５６１４、Ｍ５７６１３；ＡＡＡ６５６１５、Ｍ５７６１３；ＡＡＡ６５６１７、Ｍ５７６１３；およびＡＡＡ６５６１８、Ｍ５７６１３）があるが、これらに限定されない。
【０１７２】
「アセチル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ」という用語は、イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒドへの変換を、典型的にはＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのいずれかを電子供与体として用いて触媒する酵素を表す。例示的なアセチル化アルデヒドデヒドロゲナーゼは、酵素番号１．２．１．１０および１．２．１．５７で知られている。そのような酵素は、多数の産生源から得ることができ、その産生源としては、クロストリジウム・ベエイジェリンキー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）（ジェンバンク番号：ＡＡＤ３１８４１、ＡＦ１５７３０６）、Ｃ．アセトブチリウム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿１４９３２５、ＮＣ＿００１９８８；ＮＰ＿１４９１９９、ＮＣ＿００１９８８）、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）（ジェンバンク番号：ＡＡＡ８９１０６、Ｕ１３２３２）、およびサーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ジェンバンク番号：ＹＰ＿１４５４８６、ＮＣ＿００６４６１）があるが、これらに限定されない。
【０１７３】
「トランスアミナーゼ」という用語は、アラニンまたはグルタメートのいずれかをアミン供与体として用いて、α−ケトイソ吉草酸からＬ−バリンへの変換を触媒する酵素を表す。例示的なトランスアミナーゼは、酵素番号２．６．１．４２および２．６．１．６６で知られている。そのような酵素は数多くの産生源から得ることができる。アラニン依存性酵素の産生源の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ジェンバンク番号：ＹＰ＿０２６２３１、ＮＣ＿０００９１３）およびバシラス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ジェンバンク番号：ＹＰ＿０９３７４３、ＮＣ＿００６３２２）があるが、これらに限定されない。グルタメート依存性酵素の産生源の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ジェンバンク番号：ＹＰ＿０２６２４７、ＮＣ＿０００９１３）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿０１２６８２、ＮＣ＿００１１４２）およびメタノバクテリウム・テルモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿２７６５４６、ＮＣ＿０００９１６）があるが、これらに限定されない。
【０１７４】
「バリンデヒドロゲナーゼ」という用語は、α−ケトイソ吉草酸からＬ−バリンへの変換を、典型的にはＮＡＤ（Ｐ）Ｈを電子供与体として用いかつアンモニアをアミン供与体として用いて、触媒する酵素を表す。例示的なバリンデヒドロゲナーゼは、酵素番号１．４．１．８および１．４．１．９で知られており、そのような酵素は、多数の産生源から得ることができる。その産生源としては、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿６２８２７０、ＮＣ＿００３８８８）およびＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク番号：ＣＡＢ１４３３９、Ｚ９９１１６）があるが、これらに限定されない。
【０１７５】
「バリンデカルボキシラーゼ」という用語は、Ｌ−バリンからイソブチルアミンおよびＣＯ２への変換を触媒する酵素を表す。例示的なバリンデカルボキシラーゼは、酵素番号４．１．１．１４で知られている。そのような酵素は、例えば、ストレプトマイセス・ビリジファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）（ジェンバンク番号：ＡＡＮ１０２４２、ＡＹ１１６６４４）などのストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）などに見いだされる。
【０１７６】
「オメガ−トランスアミナーゼ」という用語は、好適なアミノ酸をアミン供与体として用いてイソブチルアミンからイソブチルアルデヒドへの変換を触媒する酵素を表す。例示的なオメガ−トランスアミナーゼは、酵素番号２．６．１．１８で知られており、多数の産生源から得ることができる。その産生源としては、アルカリゲネス・デニトリフィカンス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）（ＡＡＰ９２６７２、ＡＹ３３０２２０）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）（ジェンバンク番号：ＹＰ＿２９４４７４、ＮＣ＿００７３４７）、シェワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿７１９０４６、ＮＣ＿００４３４７）、およびＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）（ジェンバンク番号：ＡＡＮ６６２２３、ＡＥ０１６７７６）があるが、これらに限定されない。
【０１７７】
「アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ」という用語は、２分子のアセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡおよび補酵素Ａ（ＣｏＡ）への変換を触媒する酵素を表す。例示的なアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼは、短鎖アシル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡに対して基質選択性（順方向の反応）を有するアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼであり、Ｅ．Ｃ．２．３．１．９［Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ］として分類されている。ただし、基質範囲の広い酵素（Ｅ．Ｃ．２．３．１．１６）も機能するであろう。アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼは、多数の産生源から入手可能であり、その産生源は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿４１６７２８、ＮＣ＿０００９１３；ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）アミノ酸配列、ＮＣＢＩヌクレオチド配列）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿３４９４７６．１、ＮＣ＿００３０３０；ＮＰ＿１４９２４２、ＮＣ＿００１９８８、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿３９０２９７、ＮＣ＿０００９６４）、およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿０１５２９７、ＮＣ＿００１１４８）である。
【０１７８】
「３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ」という用語は、アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの変換を触媒する酵素を表す。例示的な３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡまたは（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに対する基質選択性のある、還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）依存性のものであってよい。これらの例はそれぞれ、Ｅ．Ｃ．１．１．１．３５およびＥ．Ｃ．１．１．１．３０に分類できる。さらに、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）依存性であってよく、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡまたは（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに対する基質選択性がある。それらは、それぞれＥ．Ｃ．１．１．１．１５７およびＥ．Ｃ．１．１．１．３６として分類される。３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、多数の産生源から得ることができ、それらの産生源は、例えば、Ｃ．アセトブチリウム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿３４９３１４、ＮＣ＿００３０３０）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク番号：ＡＡＢ０９６１４、Ｕ２９０８４）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）（ジェンバンク番号：ＹＰ＿２９４４８１、ＮＣ＿００７３４７）、およびアルカリゲネス・ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）（ジェンバンク番号：ＡＡＡ２１９７３、Ｊ０４９８７）である。
【０１７９】
「クロトナーゼ」という用語は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡおよびＨ２Ｏへの変換を触媒する酵素を表す。例示的なクロトナーゼは、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡまたは（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに対する基質選択性を有しうるもので、それぞれＥ．Ｃ．４．２．１．１７およびＥ．Ｃ．４．２．１．５５に分類されうる。クロトナーゼは多数の産生源から得ることができ、それらの産生源は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿４１５９１１、ＮＣ＿０００９１３）、Ｃ．アセトブチリウム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿３４９３１８、ＮＣ＿００３０３０）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク番号：ＣＡＢ１３７０５、Ｚ９９１１３）、およびエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）（ジェンバンク番号：ＢＡＡ２１８１６、Ｄ８８８２５）である。
【０１８０】
「ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ」という用語は、クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡへの変換を触媒する酵素を表す。例示的なブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＨ依存性、ＮＡＤＰＨ依存性、またはフラビン依存性であってよく、それぞれ、Ｅ．Ｃ．１．３．１．４４、Ｅ．Ｃ．１．３．１．３８、およびＥ．Ｃ．１．３．９９．２に分類されうる。ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、多数の産生源から得ることができ、それらの産生源は、例えば、Ｃ．アセトブチリウム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿３４７１０２、ＮＣ＿００３０３０）、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）（ジェンバンク番号：Ｑ５ＥＵ９０）、ＡＹ７４１５８２）、ストレプトマイセス・コリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｃｏｌｌｉｎｕｓ）（ジェンバンク番号：ＡＡＡ９２８９０、Ｕ３７１３５）、およびストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）
（ジェンバンク番号：ＣＡＡ２２７２１、ＡＬ９３９１２７）である。
【０１８１】
「ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ」という用語は、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを補助因子として用いて、ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒドへの変換を触媒する酵素を表す。ＮＡＤＨを優先するブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼは、Ｅ．Ｃ．１．２．１．５７として知られており、例えば、クロストリジウム・ベエイジェリンキー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）（ジェンバンク番号：ＡＡＤ３１８４１、ＡＦ１５７３０６）およびＣ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿１４９３２５、ＮＣ＿００１９８８）から得ることができる。
【０１８２】
「イソブチリル−ＣｏＡムターゼ」という用語は、ブチリル−ＣｏＡからイソブチリル−ＣｏＡへの変換を触媒する酵素を表す。この酵素は補酵素Ｂ１２を補助因子として用いる。例示的なイソブチリル−ＣｏＡムターゼは、酵素番号５．４．９９．１３で知られる。こうした酵素は、ストレプトマイセス・シンナモネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）（ジェンバンク番号：ＡＡＣ０８７１３、Ｕ６７６１２；ＣＡＢ５９６３３、ＡＪ２４６００５）、Ｓ．セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（ジェンバンク番号：ＣＡＢ７０６４５、ＡＬ９３９１２３；ＣＡＢ９２６６３、ＡＬ９３９１２１）、およびストレプトミセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク番号：ＮＰ＿８２４００８、ＮＣ＿００３１５５；ＮＰ＿８２４６３７、ＮＣ＿００３１５５）を含む（ただし、これらに限定されない）、多数のストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に見いだされる。
【０１８３】
「アセト乳酸デカルボキシラーゼ」という用語は、アルファ−アセトラクテートからアセトインへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（１種または複数種）を表す。例示的なアセト乳酸デカルボキシラーゼは、ＥＣ４．１．１．５として知られており、例えば、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク番号：ＡＡＡ２２２２３、Ｌ０４４７０）、クレブシエラ・テリゲナ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｔｅｒｒｉｇｅｎａ）（ジェンバンク番号：ＡＡＡ２５０５４、Ｌ０４５０７）およびクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ジェンバンク番号：ＡＡＵ４３７７４、ＡＹ７２２０５６）から得ることができる。
【０１８４】
「アセトインアミナーゼ」または「アセトイントランスアミナーゼ」という用語は、アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（１種または複数種）を表す。アセトインアミナーゼは、補助因子であるピリドキサール５’−ホスフェートまたはＮＡＤＨ（還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）またはＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を利用することができる。得られる生成物は、３位で（Ｒ）または（Ｓ）立体配置を有しうる。ピリドキサールホスフェート依存性酵素は、アミノ供与体としてアラニンまたはグルタメートなどのアミノ酸を使用することができる。ＮＡＤＨ依存性およびＮＡＤＰＨ依存性の酵素は、別の基質としてアンモニアを使用できる。ＮＡＤＨ依存性アセトインアミナーゼ（アミノアルコールデヒドロゲナーゼとしても知られている）の好適な例は、Ｉｔｏ，ｅｔ  ａｌ．（米国特許第６，４３２，６８８号明細書を参照）によって記載されている。ピリドキサール依存性アセトインアミナーゼの例には、Ｓｈｉｎ  ａｎｄ  Ｋｉｍ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：２８４８−２８５３，２００２）が記載している、アミン：ピルベートアミノトランスフェラーゼ（アミン：ピルベートトランスアミナーゼとも呼ばれる）がある。
【０１８５】
「アセトインキナーゼ」という用語は、アセトインからホスホアセトイン（ｐｈｏｓｐｈｏａｃｅｔｏｉｎ）への変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（１種または複数種）を表す。アセトインキナーゼは、反応において、ホスフェート供与体としてＡＴＰ（アデノシン三リン酸）またはホスホエノールピルビン酸を利用することができる。似たような基質であるジヒドロキシアセトンに対する類似の反応を触媒する酵素には、例えば、ＥＣ２．７．１．２９と知られる酵素（Ｇａｒｃｉａ−Ａｌｌｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：１３０３７−１３０４６，２００４）がある。
【０１８６】
「アセトインホスフェートアミナーゼ（ａｃｅｔｏｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｍｉｎａｓｅ）」という用語は、ホスホアセトインから３−アミノ−２−ブタノールＯ−ホスフェート（３−ａｍｉｎｏ−２−  ｂｕｔａｎｏｌ  Ｏ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）への変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（１種または複数種）を表す。アセトインホスフェートアミナーゼは、補助因子であるピリドキサール５’−ホスフェート、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを使用できる。得られる生成物は、３位で（Ｒ）または（Ｓ）立体配置を有しうる。ピリドキサールホスフェート依存性酵素は、アラニンまたはグルタメートなどのアミノ酸を使用することができる。ＮＡＤＨ依存性およびＮＡＤＰＨ依存性の酵素は、別の基質としてアンモニアを使用できる。ホスホアセトインでのこの反応を触媒する酵素に関する報告はないが、似たような基質であるセリノールホスフェート（ｓｅｒｉｎｏｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に対する類似反応を行わせるために提案されているピリドキサールホスフェート依存性酵素がある（Ｙａｓｕｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．６７：４９９９−５００９，２００１）。
【０１８７】
「アミノブタノールホスフェートホスホリアーゼ（ａｍｉｎｏｂｕｔａｎｏｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｙａｓｅ）」（「アミノアルコールＯ−ホスフェートリアーゼ（ａｍｉｎｏ  ａｌｃｏｈｏｌ  Ｏ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）」とも呼ばれる）という用語は、３−アミノ−２−ブタノールＯ−ホスフェートから２−ブタノンへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（１種または複数種）を表す。アミノブタノールホスフェートホスホ−リアーゼは、補助因子のピリドキサール５’−ホスフェートを利用することができる。似たような基質である１−アミノ−２−プロパノールホスフェートでの類似反応を触媒する酵素に関する報告がある（Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１３４：１６７−１８２，１９７３）。米国特許出願公開第２００７／０２５９４１０号明細書は、生物であるエルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）からのアミノブタノールホスフェートホスホリアーゼを記載している。
【０１８８】
「アミノブタノールキナーゼ（ａｍｉｎｏｂｕｔａｎｏｌ  ｋｉｎａｓｅ）」という用語は、３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールＯ−ホスフェート（３−ａｍｉｎｏ−２−ｂｕｔａｎｏｌ  Ｏ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）への変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（１種または複数種）を表す。アミノブタノールキナーゼは、ホスフェート供与体としてＡＴＰを利用することができる。３−アミノ−２−ブタノールでのこの反応を触媒する酵素に関する報告はないが、似たような基質であるエタノールアミンおよび１−アミノ−２−プロパノールでの類似反応を触媒する酵素に関する報告はある（Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（上記を参照））。米国特許出願公開第２００９／０１５５８７０号明細書は、実施例１４で、エルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）の亜種アトロセプティカ（Ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ）のアミノアルコールキナーゼについて記載している。
【０１８９】
「ブタンジオールデヒドロゲナーゼ」（「アセトインレダクターゼ」としても知られる）という用語は、アセトインから２，３−ブタンジオールへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（１種または複数種）を表す。ブタンジアールデヒドロゲナーゼ（Ｂｕｔａｎｅｄｉａｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ）は、アルコールデヒドロゲナーゼの広範なファミリーのサブセットである。ブタンジオールデヒドロゲナーゼ酵素は、アルコール生成物において（Ｒ）または（Ｓ）立体配置の生成特異性を有しうる。（Ｓ）特異性ブタンジオールデヒドロゲナーゼは、ＥＣ１．１．１．７６として知られており、例えば、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ジェンバンク番号：ＢＢＡ１３０８５、Ｄ８６４１２）から得ることができる。（Ｒ）特異性ブタンジオールデヒドロゲナーゼは、ＥＣ１．１．１．４として知られており、例えば、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）（ジェンバンク番号ＮＰ８３０４８１、ＮＣ＿００４７２２；ＡＡＰ０７６８２、ＡＥ０１７０００）、およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ジェンバンク番号ＡＡＫ０４９９５、ＡＥ００６３２３）から得ることができる。
【０１９０】
「ブタンジオールデヒドラターゼ」（「ジアールデヒドラターゼ（ｄｉａｌ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）」または「プロパンジオールデヒドラターゼ」としても知られる）という用語は、２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（１種または複数種）を表す。ブタンジオールデヒドラターゼは、補助因子のアデノシルコバラミン（補酵素ＢｗまたはビタミンＢ１２としても知られる。ただし、ビタミンＢ１２は、補酵素Ｂ１２ではない他の形態のコバラミンを表すこともある）を利用することができる。アデノシルコバラミン依存性酵素は、ＥＣ４．２．１．２８として知られており、例えば、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）（ジェンバンク番号：ＡＡ０８０９９（アルファサブユニット）、Ｄ４５０７１；ＢＡＡ０８１００（ベータサブユニット）、Ｄ４５０７１；およびＢＢＡ０８１０１（ガンマサブユニット）、Ｄ４５０７１（３つのサブユニットはすべて活性に必要とされることに注目）、およびクレブシエラ肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）（ジェンバンク番号：ＡＡＣ９８３８４（アルファサブユニット）、ＡＦ１０２０６４；ジェンバンク番号：ＡＡＣ９８３８５（ベータサブユニット）、ＡＦ１０２０６４、ジェンバンク番号：ＡＡＣ９８３８６（ガンマサブユニット）、ＡＦ１０２０６４）から得ることができる。他の好適なジアールデヒドラターゼとしては、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（ジェンバンク番号：ＡＡＢ８４１０２（大きなサブユニット）、ＡＦ０２６２７０；ジェンバンク番号：ＡＡＢ８４１０３（中くらいのサブユニット）、ＡＦ０２６２７０；ジェンバンク番号：ＡＡＢ８４１０４（小さなサブユニット）、ＡＦ０２６２７０）；およびラクトバチルス・コリノイデス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ）（ジェンバンク番号：ＣＡＣ８２５４１（大きなサブユニット）、ＡＪ２９７７２３；ジェンバンク番号：ＣＡＣ８２５４２（中くらいのサブユニット）；ＡＪ２９７７２３；ジェンバンク番号：ＣＡＤ０１０９１（小さなサブユニット）、ＡＪ２９７７２３）から得ることができるＢ１２依存性ジアールデヒドラターゼ；およびラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）（特に、菌株ＣＮＲＺ７３４およびＣＮＲＺ７３５。Ｓｐｅｒａｎｚａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４５：３４７６−３４８０，１９９７）からの酵素、および対応する酵素をコードするヌクレオチド配列があるが、これらに限定されない。ジオールデヒドラターゼ遺伝子の分離方法は、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第５，６８６，２７６号明細書）。
【０１９１】
「ピルビン酸デカルボキシラーゼ」という用語は、ピルビン酸の脱炭酸を触媒してアセトアルデヒドおよび二酸化炭素にする酵素を表す。ピルビン酸デカルボキシラーゼは、酵素番号４．１．１．１で知られている。こうした酵素は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ジェンバンク番号：ＣＡＡ９７５７５、ＣＡＡ９７７０５、ＣＡＡ９７０９１）を含め、多数の酵母菌に見出される。
【０１９２】
本明細書に記載のイソブタノール生合成経路を含む宿主細胞は、１つまたは複数の更なる修飾をさらに含みうることが理解されるであろう。米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書（これを援用する）は、サイトゾルに局在化するアセト乳酸合成酵素を発現しかつピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が実質的になくなるよう酵母菌を操作することにより、ピルベートからアセトラクテートへの変換が増大することを開示している。実施形態によっては、宿主細胞は、グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ活性を低下させる修飾、及び／またはピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１種の遺伝子の破損、またはピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子発現を制御する調節エレメントをコードする少なくとも１種の遺伝子の破損（米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書（本明細書に援用する）に記載）、エントナー・ドゥドロフ経路によって炭素フラックスが増大するようにさせるかまたは等価物バランス（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ  ｂａｌａｎｃｅ）を減少させる宿主細胞の修飾（米国特許出願公開第２０１０／０１２０１０５号明細書（本明細書に援用する）に記載）を含む。他の修飾としては、ピルベートを利用する生合成経路中のステップを触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドの組み込みがある。
【０１９３】
更なる修飾としては、アセト乳酸レダクターゼ（ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ）活性を有するポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチドにおける少なくとも１つの欠失、変異、及び／または置換がある。本明細書で使用される「アセト乳酸レダクターゼ活性」は、アセト乳酸からＤＨＭＢへの変換を触媒することができる任意のポリペプチドの活性を表す。そのようなポリペプチドは、当該技術分野において周知でありかつ本明細書に開示されている方法で特定できる。本明細書で使用される「ＤＨＭＢ」は、２，３−ジヒドロキシ−２−メチルブチレートを表す。ＤＨＭＢには、「ファースト（ｆａｓｔ）ＤＨＭＢ」（２Ｓ、３Ｓ配置を有する）および「スロー（ｓｌｏｗ）ＤＨＭＢ」（２Ｓ、３Ｒ配置（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｅ）を有する）がある。Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：１１５−１２０（１９９５）（その全体を本明細書に援用する）を参照されたい。それは、ファーストＤＨＭＢをアングリセリン酸（ａｎｇｌｙｃｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）と呼び、スローＤＨＭＢを取りグリセリン酸（ｔｉｇｌｙｃｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）と呼んでいる。複数の実施形態において、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＹＭＲ２２６Ｃまたはそのホモログである。
【０１９４】
更なる修飾としては、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性及び／またはアルデヒドオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチドにおける欠失、変異、及び／または置換がある。本明細書で使用される「アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性」は、アルデヒドデヒドロゲナーゼの生物学的機能を有する任意のポリペプチドに関係している。そのようなポリペプチドとしては、アルデヒドの酸化（脱水素）を触媒するポリペプチドがある。そのようなポリペプチドとしては、イソブチルアルデヒドからイソ酪酸への変換を触媒するポリペプチドがある。そのようなポリペプチドには、酵素番号ＥＣ１．２．１．３、ＥＣ１．２．１．４またはＥＣ１．２．１．５．に対応するポリペプチドも含まれる。そのようなポリペプチドは、当該技術分野において周知でありかつ本明細書に開示されている方法によって特定することができる。本明細書で使用される「アルデヒドオキシダーゼ活性」は、アルデヒドオキシダーゼの生物学的機能を有する任意のポリペプチドに関係している。そのようなポリペプチドとしては、アルデヒドからのカルボン酸の生成を触媒するポリペプチドがある。そのようなポリペプチドとしては、イソブチルアルデヒドからイソ酪酸への変換を触媒するポリペプチドがある。そのようなポリペプチドには、酵素番号ＥＣ１．２．３．１に対応するポリペプチドも含まれる。そのようなポリペプチドは、当該技術分野において周知でありかつ本明細書に開示されている方法によって特定できる。実施形態によっては、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＡＬＤ６またはそのホモログである。
【０１９５】
グルコース発現を少なくする効果を有する遺伝子修飾（酵母産生宿主（ｙｅａｓｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）がｐｄｃ−である）が、米国特許出願公開第２０１１／０１２４０６０号明細書（これを本明細書に援用する）に記載されている。実施形態によっては、欠失するかまたはダウンレギュレーションされるピルビン酸デカルボキシラーゼは、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６、およびこれらの組合せからなる群から選択される。実施形態によっては、ピルビン酸デカルボキシラーゼは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＰＤＣ１ピルビン酸デカルボキシラーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＰＤＣ５ピルビン酸デカルボキシラーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＰＤＣ６ピルビン酸デカルボキシラーゼ、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）からのピルビン酸デカルボキシラーゼ、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）からのＰＤＣ１ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）からのＰＤＣ２ピルビン酸デカルボキシラーゼ、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）からのピルビン酸デカルボキシラーゼ、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からのピルビン酸デカルボキシラーゼ、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）からのピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびザイゴサッカロミセス・ロキシ−（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）からのピルビン酸デカルボキシラーゼから選択される。実施形態によっては、宿主細胞は、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートからグリセラート１，３，ビスホスフェート（ｇｌｙｃｅｒａｔｅ  １，３，  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの欠失またはダウンレギュレーションを含む。実施形態によっては、この反応を触媒する酵素はグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼである。
【０１９６】
ＷＩＰＯの国際公開第２０１１／１０３３００号パンフレットは、（ａ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種性ポリヌクレオチド；（ｂ）（ｉ）Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響するポリペプチドをコードする内在性遺伝子における少なくとも１つの欠失、変異、及び／または置換；及び／または（ｉｉ）Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響するポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種性ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞を開示している。複数の実施形態において、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響するポリペプチドは、ＡＦＴｌ、ＡＦＴ２、ＦＲＡ２、ＧＲＸ３、またはＣＣＣｌによってコードされる。複数の実施形態において、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響するポリペプチドは、構成型変異体（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｍｕｔａｎｔ）であるＡＦＴ１  Ｌ９９Ａ、ＡＦＴ１  Ｌ１０２Ａ、ＡＦＴ１  Ｃ２９１Ｆ、またはＡＦＴ１  Ｃ２９３Ｆである。
【０１９７】
さらに、宿主細胞は、米国特許出願第２０１２／０１５６７３５号明細書（本明細書に援用する）に記載されているように、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種性ポリヌクレオチド、及び／またホスホトランスアセチラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種性ポリヌクレオチドを含みうる。
【０１９８】
実施形態によっては、任意の特定の核酸分子またはポリペプチドは、本明細書に記載したヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％だけ同じものであってよい。当該技術分野において知られている「同一性パーセント」という用語は、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係であり、それらの配列を比較することによって求められる。当技術分野においては、「同一性」は、場合によっては、ポリペプチド配列間またはポリヌクレオチド配列間の配列の関連度をも意味し、そのような配列の列と列との間での突き合わせによって求められる。「同一性」および「類似性」は、以下に開示されている方法（これらに限定されない）を含む周知の方法で容易に計算できる：  １．）  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；  ２．）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；  ３．）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）；  ４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；および５．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）。
【０１９９】
標準組換えＤＮＡおよび分子クローニングの技術は当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９（ここでは、Ｍａｎｉａｔｉｓと呼ぶ）およびＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂ．ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７）によって記載されている。ブタノール生合成経路を含む微生物を構築するための方法の例は、例えば、米国特許第７，８５１，１８８号明細書、および米国特許出願公開第２００７／００９２９５７号明細書；米国特許出願公開第２００７／０２５９４１０号明細書；米国特許出願公開第２００７／０２９２９２７号明細書；米国特許出願公開第２００８／０１８２３０８号明細書；米国特許出願公開第２００８／０２７４５２５号明細書；米国特許出願公開第２００９／０１５５８７０号明細書；米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書；および米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書に開示されており、それぞれの内容全体を本明細書に援用する。
【０２００】
サッカロマイセス・セレビシエ（ＳＡＣＣＨＡＲＯＭＹＣＥＳ  ＣＥＲＥＶＩＳＩＡＥ）でのブタノール生合成経路の発現
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での遺伝子発現方法は、当該技術分野において知られている（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐａｒｔ  Ａ，２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｇｅｒａｌｄ  Ｒ．Ｆｉｎｋ  Ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。酵母菌内での遺伝子の発現には、典型的には、プロモーター（注目している遺伝子が後に続いている）および転写ターミネーターが必要とされる。イソブタノール生合成経路をコードする遺伝子の発現カセットを構築するのに、本明細書の実施例で使用されるものも含め幾種類もの酵母菌プロモーター（構成的プロモーターであるＦＢＡ、ＧＰＤ、ＡＤＨ１、およびＧＰＭ、および誘導性プロモーターであるＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、およびＣＵＰ１があるが、これらに限定されない）を使用できる。好適な転写ターミネーターとしては、ＦＢＡｔ、ＧＰＤｔ、ＧＰＭｔ、ＥＲＧ１０ｔ、ＧＡＬ１ｔ、ＣＹＣ１、およびＡＤＨ１があるが、これらに限定されない。例えば、好適なプロモーター、転写ターミネーター、およびイソブタノール生合成経路の遺伝子は、米国特許出願公開第２０１０／０１２９８８６号明細書に記載されているように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−酵母菌シャトルベクター内にクローン化し、酵母細胞に入れて形質転換することができる。こうしたベクターにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および酵母菌株の両方で菌株増殖が可能になる。典型的にはベクターは、選択マーカーおよび配列を含み、所望の宿主内での自律増殖または染色体の組込みが可能である。典型的には、酵母菌内の使用プラスミドは、シャトルベクターｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２５、およびｐＲＳ４２６（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）であり、これらは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製開始点（例えば、ｐＭＢ１）、酵母菌の２μ複製開始点、および栄養選択（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）用マーカーを含む。これら４つのベクター用の選択マーカーは、Ｈｉｓ３（ベクターｐＲＳ４２３）、Ｔｒｐ１（ベクターｐＲＳ４２４）、Ｌｅｕ２（ベクターｐＲＳ４２５）およびＵｒａ３（ベクターｐＲＳ４２６）である。注目しているポリペプチドをコードする遺伝子を有する発現ベクターの構築は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での標準分子クローニング技術、または酵母菌内でのギャップ修復組換え（ｇａｐ  ｒｅｐａｉｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）法のいずれかによって実施できる。
【０２０１】
ギャップ修復クローニングの取り組み方は、酵母菌内での高効率な相同組換えを利用している。典型的には、酵母菌ベクターＤＮＡは（例えば、その複数のクローニング部位で）消化されて、その配列内に「ギャップ」が作られる。５’末端と３’末端の両方に２１ｂｐ以上の配列を含む、注目している幾つかの挿入ＤＮＡが生成され、それらの末端は、互いに順次に重なり、またベクターＤＮＡの５’および３’終端と順次に重なる。例えば、「遺伝子Ｘ」用の酵母菌発現ベクターを構築するために、酵母菌プロモーターおよび酵母菌ターミネーターを発現カセット用として選択する。プロモーターおよびターミネーターは酵母菌のゲノムＤＮＡから増幅し、遺伝子Ｘは、その元の生物からＰＣＲ増幅するか、または遺伝子Ｘ配列を含むクローニングベクターから得る。線状にしたベクターの５’末端とプロモーター配列との間、プロモーターと遺伝子Ｘとの間、遺伝子Ｘとターミネーター配列との間、およびターミネーターと線状にしたベクターの３’末端との間に、少なくとも２１ｂｐのオーバーラップ配列がある。その後、「ギャップ」ベクターおよび挿入ＤＮＡを一緒に酵母菌株に入れて形質転換し、プラスミド上での栄養選択マーカー（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒｓ）の相補を可能にする適切な化合物混合物を含む培地で平板培養する。正しい挿入物の組合せが存在することは、選択した細胞から調製したプラスミドＤＮＡを用いて、ＰＣＲマッピングにより確認できる。次いで、酵母菌から分離されたプラスミドＤＮＡ（普通は低濃度）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株（例えば、ＴＯＰ１０）に入れて形質転換し、続いてミニプレップおよび制限酵素マッピングを行ってプラスミド構築物をさらに検証する。最後に、構築物は配列分析で検証できる。
【０２０２】
ギャップ修復技術のように、酵母菌ゲノムへの組み込みでは、酵母菌での相同組換え系も利用する。典型的には、コード領域および調節領域（プロモーターおよびターミネーター）と栄養要求性マーカーとを含むカセットは、高忠実度のＤＮＡポリメラーゼでＰＣＲ増幅するが、その際に、カセットとハイブリッド形成し、かつ挿入の望まれるゲノム領域の領域５’および３’と配列相同性のある４０から７０個の塩基対を含んでいるプライマーを用いて行う。その後、ＰＣＲ産物を酵母菌内に入れて形質転換し、組み込まれた栄養要求性マーカーの選択が行われるようなふさわしい化合物混合物を含む培地で平板培養する。例えば、「遺伝子Ｘ」を染色体の位置「Ｙ」に組み込むために、プロモーターとコード領域Ｘとターミネーターとの構築物をプラスミドＤＮＡ構築物からＰＣＲ増幅し、独立栄養性マーカー（ＵＲＡ３など）に結合させるが、これは、ＳＯＥ  ＰＣＲか、または一般の制限消化とクローニングのいずれかで行う。プロモーターとコード領域ＸとターミネーターとＵＲＡ３領域とを含む完全カセットを、プライマー配列と一緒にＰＣＲ増幅するが、そのプライマー配列は、酵母菌染色体上の場所「Ｙ」の領域５’および３’との相同性のある４０〜７０ｂｐを含む。ＰＣＲ生成物を酵母菌に入れて形質転換し、ウラシルを欠いている増殖培地上で選択する。形質転換体は、コロニーＰＣＲかまたは染色体ＤＮＡの直接シークエンシングのいずれかで確認できる。
【０２０３】
産生させるための成長
本明細書に開示されている組換え宿主細胞は、（典型的には、発酵培地中の）好適な炭素物質と接触させる。更なる炭素物質としては、単糖類（フルクトースなど）、オリゴ糖類（乳糖、マルトース、ガラクトース、またはスクロースなど）、多糖類（デンプンまたはセルロースなど）またはそれらの混合物、および再生可能な供給原料（チーズホエーの透過物、コーンスティープリカー、テンサイ糖密、および大麦の麦芽など）からの未精製混合物があるが、これらに限定されない。他の炭素物質としては、エタノール、ラクテート、スクシネート、またはグリセロールを挙げることができる。
【０２０４】
さらに、炭素物質は、重要な生化学的中間体への代謝変換が実証されている炭素１個の物質（二酸化炭素、またはメタノールなど）であってもよい。炭素１個および２個の物質に加えて、メチローフ生物は、メチルアミン、グルコサミンおよび様々なアミノ酸など他の幾つもの種類の炭素含有化合物を、代謝活性に利用することも知られている。例えば、メチロトローフ酵母は、メチルアミンの炭素を利用してトレハロースまたはグリセロールを生じることが知られている（Ｂｅｌｌｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｄ．，［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］，７ｔｈ（１９９３），４１５−３２，Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ，Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ  Ｐ．；Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）。同様に、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）の様々な種がアラニンまたはオレイン酸を代謝する（Ｓｕｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：４８５−４８９（１９９０））。それゆえに、本発明に利用する炭素源は多種多様な炭素含有物質を包含することができ、またそれは生物の選択によって限定されるのみであることが企図される。
【０２０５】
本発明においては上述の炭素物質およびそれらの混合物はすべて適すると考えられるが、実施形態によっては、炭素物質は、グルコース、フルクトース、およびスクロース、あるいはこれらと、キシロース及び／またはアラビノースなどＣ５の糖類（Ｃ５の糖類を利用するよう修飾された酵母細胞のためのもの）との混合物である。スクロースは、サトウキビ、サトウダイコン、カッサバ、サトウモロコシ、およびそれらの混合物などの再生可能な砂糖源から得ることができる。グルコースおよびデキストロースは、穀物（トウモロコシ、小麦、ライ麦、大麦、オートムギ、およびそれらの混合物など）を含むデンプン系の供給原料を糖化させることによって、再生可能な穀物源から得ることができる。さらに、発酵性糖類は、例えば、米国特許出願公開第２００７／００３１９１８Ａ１号明細書（本明細書に援用する）に記載されている前処理および糖化のプロセスによって、再生可能なセルロース質バイオマスまたはリグノセルロースバイオマスから得ることができる。バイオマスは（炭素基質に関連して使用される場合）、任意のセルロース系物質またはリグノセルロース系物質を指し、それには、セルロースを含む物質、および任意選択的に、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖類及び／または単糖類をさらに含む物質がある。バイオマスはまた、タンパク質及び／または脂質などの更なる成分を含みうる。バイオマスは単一の源から得ることができるか、またはバイオマスは複数の源から得た混合物を含むことができる。例えば、バイオマスは、トウモロコシの穂軸とトウモロコシのわらの混合物、または草と葉の混合物を含むことができる。バイオマスとしては、バイオエネルギー作物、農業残渣、固形都市廃棄物、固形産業廃棄物、紙製造のスラッジ、庭ゴミ、木屑および林業廃棄物があるが、これらに限定されない。バイオマスの例としては、トウモロコシ殻粒、トウモロコシの穂軸、穀物残渣（トウモロコシの皮など）、トウモロコシのわら、草、小麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、干し草、稲わら、スイッチグラス、紙くず、サトウキビバガス、モロコシ、大豆、（穀物、木、枝、根、葉、木片、おがくず、低木および灌木の）粉砕によって得られる成分、野菜、果物、花、家畜ふん尿、およびそれらの混合物があるが、これらに限定されない。
【０２０６】
ふさわしい炭素源に加えて、発酵培地は、好適な無機質、塩類、共同因子、緩衝液および当業者に知られている他の成分（培養物を成長させ、本明細書で述べた酵素経路を促進するのに適したもの）を含まなければならない。
【０２０７】
培養条件
典型的には、細胞は、約２０℃〜約４０℃の範囲の温度において、ふさわしい培地中で成長する。本発明における好適な増殖培地は、一般の商業生産された培地であり、それにはＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地、サブローデキストロース（ＳＤ）培地またはＹｅａｓｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＹＭ）培地（つまり、酵母菌窒素塩基、硫酸アンモニウム、および（炭素／エネルギー源として）デキストロースを含む培地）あるいはＹＰＤ培地（ほとんどのサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株を成長させるのに最適な割合の、ペプトンと酵母菌抽出物とデキストロースとのブレンド）などがある。他の定められた増殖培地または合成増殖培地を使用してもよく、特定の微生物の成長に適した培地は、微生物学または発酵科学の当業者に知られているであろう。カタボライトリプレッションを直接または間接的に調整することで知られている試薬を使用すること、例えば、環状アデノシン２’，３’−モノホスフェート（ｃＡＭＰ）を発酵培地に含めることもできる。
【０２０８】
発酵に適したｐＨ範囲は、ｐＨ５．０〜ｐＨ９．０の間であり、初期条件としてはｐＨ６．０〜ｐＨ８．０が好ましい。酵母菌の発酵にとって好適なｐＨ範囲は、典型的には約ｐＨ３．０〜約ｐＨ９．０の間である。１つの実施形態では、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ８．０が初期条件に使用される。他の微生物の発酵にとって好適なｐＨ範囲は、約ｐＨ３．０〜約ｐＨ７．５の間である。１つの実施形態では、約ｐＨ４．５〜約ｐＨ６．５が初期条件に使用される。
【０２０９】
発酵は、好気条件または嫌気条件下で実施できる。１つの実施形態では、嫌気条件または微好気的条件が発酵に使用される。
【０２１０】
工業におけるバッチ発酵および連続発酵
ブタノール（または他の生成物）は、バッチ発酵法を用いて産生させることができる。古典的なバッチ発酵は、培地の組成を発酵の開始時に設定し、発酵の間に人為的な変更を実施しない閉鎖系である。標準バッチ方式の変形形態が、供給バッチ方式（ｆｅｄ  ｂａｔｃｈ  ｓｙｓｔｅｍ）である。供給バッチ発酵プロセスも本発明では好適であり、発酵の進行に伴い物質を徐々に添加することを除いて、これは典型的なバッチ方式を含む。カタボライトリプレッションが細胞の代謝を妨げる傾向があるとき、また培地における物質の量を限定することが望ましい場合に、供給バッチ方式は有用である。バッチ式発酵および供給バッチ式発酵は、一般的かつ当該技術分野において周知のものであり、その例は、Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．，またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６：２２７，（１９９２）（本明細書に援用する）に見出すことができる。
【０２１１】
ブタノール（または他の生成物）は、連続発酵法を用いて産生させることもできる。連続式発酵は、定められた発酵培地が連続的にバイオリアクターに添加され、同時に、同量の馴化培地が処理のために除去される開放系である。連続発酵では一般に、細胞が主に対数期増殖（ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ  ｇｒｏｗｔｈ）の状態にある一定の高密度に培養物を保つ。連続式発酵では、細胞成長または最終産物濃度に影響を及ぼす１つの因子または任意の数の因子を調節することが可能である。連続式発酵プロセスでの栄養素および成長因子の調節方法ならびに産物形成の速度を最大にする技術は、工業微生物学の技術分野において周知であり、様々な方法がＢｒｏｃｋ（上記を参照）によって詳述されている。
【０２１２】
ブタノール（または他の生成物）の製造は、バッチプロセス、供給バッチプロセスまたは連続プロセスを用いて実施できること、また知られている任意の発酵方式が適しているであろうことが考えられる。さらに、細胞は、全細胞触媒としての物質上に固定化し、ブタノール産生のための発酵条件にさらしてよいと考えられる。
【０２１３】
発酵培地からブタノールを分離する方法
生物産生ブタノールは、ＡＢＥ発酵に関して当該技術分野において知られている方法を用いて、発酵培地から分離することができる（例えば、Ｄｕｒｒｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：６３９−６４８（１９９８），Ｇｒｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：６１−７５（１９９２）、およびその中の文献を参照）。例えば、固形分は、遠心分離、濾過、デカンテーションなどによって発酵培地から除去できる。ブタノールは、蒸留、共沸蒸留、液−液抽出、吸着、気体ストリッピング、膜蒸発（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）、または透析蒸発などの方法を用いて、発酵培地から分離できる。
【０２１４】
ブタノールは、低沸点の、水との共沸混合物を生じるので、蒸留を用いて、混合物をその共沸組成になるまで分離することができる。蒸留は、本明細書で述べたプロセスと組み合わせて用いて、共沸混合物とならないようにして分離を行うことができる。蒸留と併用してブタノールを分離および精製する方法には、デカンテーション、液−液抽出、吸着、および膜に基づく技法があるが、これらに限定されない。さらに、ブタノールは共留剤を用いた共沸蒸留を使用して分離できる（例えば、Ｄｏｈｅｒｔｙ  ａｎｄ  Ｍａｌｏｎｅ，Ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１を参照）。
【０２１５】
ブタノール−水の混合物は、不均一な共沸混合物を生じるので、蒸留をデカンテーションと併用してイソブタノールを分離および精製することができる。この方法では、ブタノールを含んでいる発酵ブロスを蒸留して共沸組成に近づけることができる。その後、共沸混合物を濃縮し、ブタノールをデカンテーションで発酵培地から分離する。デカンテーションで取られた水性相は、還流液として第１蒸留塔に、あるいは別個の回収塔に戻すことができる。ブタノールを多量に含んでいる、デカンテーションで取られた有機相は、第２蒸留塔において蒸留でさらに精製することができる。
【０２１６】
ブタノールは、液−液抽出を蒸留と併用して発酵培地から分離することもできる。この方法では、ブタノールは、好適な溶剤による液−液抽出を用いて発酵ブロスから抽出される。次いで、ブタノールを含んでいる有機相を蒸留して、ブタノールを溶剤から分離する。
【０２１７】
吸着と組み合わせた蒸留も、ブタノールを発酵培地から分離するのに使用できる。この方法では、ブタノールを含んでいる発酵ブロスを蒸留して共沸組成に近づけ、その後、残っている水を、モレキュラーシーブなどの吸着剤を使用して除去する（Ａｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  Ｂｉｏｍａｓｓ  ｔｏ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  Ｃｏ−Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｉｌｕｔｅ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｒｎ  Ｓｔｏｖｅｒ，Ｒｅｐｏｒｔ  ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−３２４３８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｊｕｎｅ  ２００２）。
【０２１８】
さらに、透析蒸発と組み合わせた蒸留を用いて、ブタノールを発酵培地から分離し、精製することができる。この方法では、ブタノールを含んでいる発酵ブロスを蒸留して共沸組成に近づけ、その後、残っている水を親水性膜に通して透析蒸発によって除去する（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．２４５，１９９−２１０（２００４））。
【０２１９】
現場での生成物取り出し（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｒｅｍｏｖａｌ）（ＩＳＰＲ）（抽出発酵とも呼ぶ）は、発酵容器からブタノール（または他の発酵アルコール）を、それが産生されるにつれて取り出すことができ、それによって、微生物がブタノールを高い収率で産生できるようにする。当該技術分野において述べられてきた発酵アルコールを取り出すためのＩＳＰＲの１つの方法は、液−液抽出である。一般に、例えば、ブタノール発酵に関しては、（微生物を含む）発酵培地を、ブタノール濃度が毒性レベルに達する前の時点で有機エクストラクタントと接触させる。有機エクストラクタントおよび発酵培地は二相性混合物を形成する。ブタノールは有機エクストラクタント相に分配され、微生物を含んでいる水性相における濃度が減少し、それにより阻害的なブタノールに微生物をさらすのが抑制される。
【０２２０】
液−液抽出は、例えば、米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書および米国特許出願公開第２０１１／００９７７７３号明細書（これらの開示については、その全体を本明細書に援用する）に記載されているプロセスにしたがって実施できる。米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書および米国特許出願公開第２０１１／００９７７７３号明細書は、液−液抽出を用いて発酵ブロスからブタノールを製造し回収するための方法を記載しており、その方法は、発酵ブロスを水不混和性エクストラクタントと接触させて、二相混合物（水性相と有機相を含む）を形成させるステップを含む。典型的には、エクストラクタントは、飽和、一不飽和、多価不飽和（およびそれらの組合せ）のＣ１２〜Ｃ２２脂肪アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される有機エクストラントであってよい。ＩＳＰＲ用のエクストラクタントは、非アルコール性エクストラクタントであってよい。ＩＳＰＲエクストラクタントは、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、１−ウンデカノール、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、メチルミリステート、オレイン酸メチル、ウンデカナール、ラウリンアルデヒド、２０−メチルウンデカナール（ｍｅｔｈｙｌｕｎｄｅｃａｎａｌ）、およびそれらの混合物などの外部（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）有機エクストラクタントであってよい。
【０２２１】
実施形態によっては、発酵培地中のアルコールを、有機酸（例えば、脂肪酸）および触媒（アルコールと有機酸とのエステル化を行わせることができるもの）と接触させることにより、アルコールエステルを形成させることができる。そのような実施形態では、有機酸は、アルコールエステルが分配されるＩＳＰＲエクストラクタントとして働くことができる。有機酸は、発酵容器に供給することができ、かつ／または発酵容器に送られる発酵性炭素を供給するバイオマスから得ることができる。供給原料中に存在する脂質は、触媒作用により有機酸に加水分解することができ、その同じ触媒（例えば、酵素）は、有機酸とアルコールとのエステル化を行わせることができる。ある特定の実施形態では、供給原料中に存在する脂質は、上述の触媒（例えば、酵素）を利用して、脂肪酸とグリセロールとに変換できる。グリセロールは、例えば、発酵容器に供給して、本明細書で述べたグリセロール産生の低下した微生物に補充することができる。微生物への補充は、例えば、バイオマス生産および微生物細胞の健康を向上させることができる。グリセロールは、発酵条件下で酵素によって産生される量を十分に超える量が供給されるであろう。発酵時に生じるカルボン酸は、同じ触媒または異なる触媒によって産生されるアルコールと、さらにエステル化されうる。触媒は、発酵の前に供給原料に供給できるか、または供給原料の供給の前またはその供給と同時に発酵容器に供給できる。触媒を発酵容器に供給すると、脂質が加水分解されて有機酸になり、さらに実質的に同時に、発酵容器中に存在するブタノールと有機酸とのエステル化が行われて、アルコールエステルを得ることができる。有機酸及び／または（供給原料から得られない）自然の油も発酵容器へ供給することができ、自然の油は加水分解されて有機酸になる。アルコールとのエステル化を行わない有機酸はすべて、ＩＳＰＲエクストラクタントの一部として働くことができる。アルコールエステルを含んでいるエクストラクタントは、発酵培地から分離することができ、アルコールをエクストラクタントから回収できる。エクストラクタントは発酵容器へ送って再利用できる。したがって、例えば、ブタノール製造の場合、ブタノールからエステルへの変換により、発酵培地中の遊離ブタノールの濃度は低下し、ブタノール濃度の増大による毒性作用から微生物が保護される。さらに、分別されていない穀物は、その中に含まれている脂質を分離せずに供給原料として使用することができる。というのは、脂質は触媒作用により加水分解されて有機酸になり、それによってＩＳＰＲエクストラクタント中での脂質の蓄積速度は減少するからである。
【０２２２】
現場での生成物取り出しは、バッチ方式でも連続方式でも実施できる。現場での生成物取り出しの連続方式では、生成物を反応器から連続的に取り出す。現場での生成物取り出しのバッチ方式では、ある量の有機エクストラクタントを発酵容器に加え、エクストラクタントはそのプロセスの間取り除かない。現場での生成物取り出しでは、発酵の開始時に有機エクストラクタントは発酵培地と接触しうるので、二相性発酵培地が形成される。あるいは、微生物が所望の量だけ成長を成し遂げた後（これは、培養物の光学濃度を測定することにより判断できる）、有機エクストラクタントは発酵培地と接触できる。さらに、発酵培地中の生成物アルコールレベルが、予め選んだレベルに達した時点で、有機エクストラクタントは発酵培地と接触できる。本発明の一部の実施形態にしたがったブタノール産生の場合、ブタノール濃度が毒性レベルに達する前の時点で有機酸エクストラクタントが発酵培地と接触できる。これは、ブタノールを有機酸とエステル化させてブタノールエステルを生じさせ、その結果として、発酵容器中のブタノールの濃度が低下するようにさせるためである。その後、エステルを含んでいる有機相は、ブタノールエステルの所望の有効滴定濃度が達成された後に、発酵容器から取り出すこと（さらに水性相を構成する発酵ブロスから分離すること）ができる。実施形態によっては、発酵容器中での利用可能な発酵性糖の発酵が実質的に完了した後に、エステルを含んでいる有機相を水性相から分離する。
【０２２３】
イソブタノール産生の確認
培地中のイソブタノールの存在及び／または濃度は、当該技術分野において知られている幾つもの方法で明らかにすることができる（例えば、米国特許第７，８５１，１８８号明細書（これを援用する）を参照）。例えば、特定の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法では、Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＨ−１０１１  カラムとＳｈｏｄｅｘ  ＳＨＧガードカラム（どちらもＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入できる）を一緒に使用し、屈折率（ＲＩ）検出を用いる。クロマトグラフ分離は、０．０１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を移動相として用い、０．５ｍＬ／ｍｉｎの流量および５０℃のカラム温度で実施する。イソブタノールは、使用される条件下では保持時間が４６．６ｍｉｎである。
【０２２４】
あるいはまた、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法を利用できる。例えば、特定のＧＣ法では、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えた、ＨＰ−ＩＮＮＯＷａｘカラム（３０ｍ×０．５３ｍｍ（内径）、１μの膜厚、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を使用する。キャリヤーガスは、４．５ｍＬ／ｍｉｎの流量（１５０℃において一定の頭部圧力で測定した場合）のヘリウムであり、注入器のスプリット（ｓｐｌｉｔ）は２００℃で１：２５であり、オーブン温度は、１ｍｉｎの間４５℃、１０℃／ｍｉｎでは４５〜２２０℃、５ｍｉｎの間２２０℃であり、さらにＦＩＤ検出（２４０℃、２６ｍＬ／ｍｉｎのヘリウムメイクアップガス（ｈｅｌｉｕｍ  ｍａｋｅｕｐ  ｇａｓ））を使用した。イソブタノールの保持時間は４．５ｍｉｎである。
【０２２５】
本発明の様々な実施形態を本明細書に記載したが、それらは単なる例として示したものであり、限定するものではないことを理解すべきである。本発明の意図および範囲を逸脱しない限り、それらに対して形態および詳細に関する様々な変更を行うことができることは、当業者にとって明らかであろう。したがって、本発明の領域や範囲は、上述の例示的実施形態のいずれによっても限定されるものではなく、請求項およびそれらに相当するものにしたがってのみ定義されるべきである。
【０２２６】
本明細書で挙げた刊行物、特許、および特許出願はすべて、本発明が関係する当業者の技術レベルを示しており、またそれらを援用するが、それぞれの個別の刊行物、特許または特許出願を本明細書に援用することを具体的かつ個別に示しているのと同程度に援用する。
【実施例】
【０２２７】
本発明を、以下の実施例でさらに明確に示す。そうした実施例は、本発明の実施形態を示すものだが、単なる例として示すものであることを理解すべきである。上記の説明およびこうした実施例から、当業者は本発明の本質的な特徴を見定めることができ、本発明の意図および範囲を逸脱しない限り、本発明に様々な変更および修正を加えて様々な用途および条件に適合させることができる。
【０２２８】
一般的方法
実施例に使用されている標準組換えＤＮＡ、分子クローニングの技術および形質転換プロトコルは当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９（本明細書では、Ｍａｎｉａｔｉｓと呼ぶ），Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂ．ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７）およびＡｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ（Ａｍｂｅｒｇ，Ｄ．Ｃ．，Ｂｕｒｋｅ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｈｅｍ，Ｊ．Ｎ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ａ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，２００５）によって記載されている。細菌培養の維持および成長に適した物質および方法は、当該技術分野において周知である。以下の実施例で用いるのに適した技法は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．，１９９４）で述べられているか、またはＴｈｏｍａｓ  Ｄ．  Ｂｒｏｃｋ（Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９））が述べており、見出だすことができる。バクテリア細胞の成長および維持に用いられた試薬、制限酵素および物質はすべて、特に明記されていない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ），ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ），ＨｉＭｅｄｉａ（Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａ），ＳＤ  Ｆｉｎｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａ）、またはタカラバイオ株式会社（滋賀県、日本）から得た。
【０２２９】
略号の意味は以下のとおりである：「ｓｅｃ」は秒（単数または複数）を意味し、「ｍｉｎ」は分（単数または複数）を意味し、「ｈ」は時間（単数または複数）を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｕＬ」はマイクロリットル（単数または複数）を意味し、「ｍＬ」はミリリットル（単数または複数）を意味し、「ｍｇ／ｍＬ」はミリグラム／ミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットル（単数または複数）を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「Ｍ」はモルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモル（単数または複数）を意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモル（単数または複数）を意味し、「ｋｇ」はキログラムを意味し、「ｇ」はグラム（単数または複数）を意味し、「μｇ」はマイクログラム（単数または複数）を意味し、「ｎｇ」はナノグラム（単数または複数）を意味し、「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ＯＤ」は光学濃度を意味し、「ＯＤ６００」は６００ｎｍの波長で測定された光学濃度を意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、「ｇ」は引力定数も意味し、「ｂｐ」は塩基対（単数または複数）を意味し、「ｋｂｐ」はキロ塩基対（単数または複数）を意味し、「ｋｂ」はキロベースを意味し、「％」はパーセントを意味し、「％ｗ／ｖ」は重量／体積パーセントを意味し、「％ｖ／ｖ」は体積／体積パーセントを意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを意味し、「ｇ／Ｌ」はグラム／リットルを意味し、「μｇ／Ｌ」はマイクログラム／リットルを意味し、「ｎｇ／μＬ」はマイクログラム／マイクロリットルを意味し、「ｐｍｏｌ／μＬ」はピコモル／マイクロリットルを意味し、「ＲＰＭ」は回転／分を意味し、「μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ」はマイクロモル／分／ミリグラムを意味し、「ｗ／ｖ」は重量／体積を意味し、「ｖ／ｖ」は体積／体積を意味する。
【０２３０】
菌株の作成
菌株ＰＮＹ２１１５の作成
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株ＰＮＹ０８２７を、ＰＮＹ２１１５の更なる遺伝子操作のための宿主細胞として用いる。ＰＮＹ０８２７は、ブダペスト条約に基づき２０１１年９月２２日に、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９）に寄託されており、かつ特許寄託指定（ｐａｔｅｎｔ  ｄｅｐｏｓｉｔ  ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）ＰＴＡ−１２１０５を有するサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から得られる菌株を表す。
【０２３１】
ＵＲＡ３の欠失および一倍体への胞子形成
内在性ＵＲＡ３コード領域を欠失させるために、欠失カセットをｐＬＡ５４（配列番号９５）からＰＣＲ増幅した。そのｐＬＡ５４は、（生体内での相同組換えおよびその後のＫＡＮＭＸ４マーカーの欠失を行えるようにするための）ｌｏｘＰ部位が隣接したＰＴＥＦ１−ｋａｎＭＸ４−ＴＥＦ１ｔカセットを含んでいた。ＰＣＲは、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびプライマーＢＫ５０５（配列番号９６）およびＢＫ５０６（配列番号９７）を用いて行った。各プライマーのＵＲＡ３部分は、ｋａｎＭＸ４カセットの組み込みによってＵＲＡ３コード領域が置換されるように、ＵＲＡ３  ＡＴＧの上流にある５’領域の１８０ｂｐおよびコード領域の下流にある３’領域の７８ｂｐから得た。標準遺伝子操作（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いてＰＣＲ産物をＰＮＹ０８２７に入れて形質転換し、形質転換体は、３０℃において、２％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌジェネテシンで補われたＹＥＰ培地で選択した。形質転換体は、組み込みカセットが存在することを確かめるために、プライマーＬＡ４６８（配列番号９８）およびＬＡ４９２（配列番号９９）を用いてコロニーＰＣＲによって選別した。遺伝子型ＭＡＴａ／αＵＲＡ３／ｕｒａ３：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰを有するヘテロ接合性の二倍体を得た（ＮＹＬＡ９８）。一倍体を得るために、標準的方法を用いてＮＹＬＡ９８を胞子形成させた（Ｃｏｄｏｎ  ＡＣ，Ｇａｓｅｎｔ−Ｒａｍｉｒｅｚ  ＪＭ，Ｂｅｎｉｔｅｚ  Ｔ．。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のパン酵母における胞子形成および四分子形成の頻度および影響する因子。Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９５  ＰＭＩＤ：７５７４６０１）。四分子はマイクロマニピュレーターを用いて離断し、２％グルコースで補われた富栄養ＹＰＥ培地で成長させた。４つの生存可能な胞子を含んでいる四分子を、ウラシルを欠いている２％グルコースで補われた完全合成培地に斑点状に付着させ、プライマーＡＫ１０９−１（配列番号１００）、ＡＫ１０９−２（配列番号１０１）、およびＡＫ１０９−３（配列番号１０２）を用いて、多重コロニーＰＣＲ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｃｏｌｏｎｙ  ＰＣＲ）によって接合型を確かめた。ＮＹＬＡ１０３と呼ばれる得られた特定された一倍体菌株は、遺伝子型：ＭＡＴαｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰを有し、ＰＮＹＬＡ１０６と呼ばれるものは、遺伝子型：ＭＡＴａｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰを有する。
【０２３２】
Ｈｉｓ３の欠失
内在性ＨＩＳ３コード領域を欠失させるために、損傷のない欠失カセットを使用した。損傷のないＨＩＳ３欠失用のＰＣＲカセットの４つのフラグメントは、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  （Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびテンプレートとしてのＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡ（Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で調製されたもの）を用いて増幅した。ＨＩＳ３フラグメントＡは、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号１０３）およびプライマーｏＢＰ４５３（配列番号１０４）（ＨＩＳ３フラグメントＢの５’末端と相同性のある５’尾部（ｔａｉｌ）を含んでいる）で増幅した。ＨＩＳ３フラグメントＢは、ＨＩＳ３フラグメントＡの３’末端と相同性のある５’尾部を含んでいるプライマーｏＢＰ４５４（配列番号１０５）、およびＨＩＳ３フラグメントＵの５’末端と相同性のある５’尾部を含んでいるプライマーｏＢＰ４５５（配列番号１０６）で、増幅した。ＨＩＳ３フラグメントＵは、ＨＩＳ３フラグメントＢの３’末端と相同性のある５’尾部を含んでいるプライマーｏＢＰ４５６（配列番号１０７）、およびＨＩＳ３フラグメントＣの５’末端と相同性のある５’尾部を含んでいるプライマーｏＢＰ４５７（配列番号１０８）で、増幅した。ＨＩＳ３フラグメントＣは、ＨＩＳ３フラグメントＵの３’末端と相同性のある５’尾部を含んでいるプライマーｏＢＰ４５８（配列番号１０９）、およびプライマーｏＢＰ４５９（配列番号１１０）で、増幅した。ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＨＩＳ３フラグメントＡＢは、ＨＩＳ３フラグメントＡとＨＩＳ３フラグメントＢとを混合し、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号１０３）およびｏＢＰ４５５（配列番号１０６）で増幅することにより、オーバーラップＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ＰＣＲ）で作成した。ＨＩＳ３フラグメントＵＣは、ＨＩＳ３フラグメントＵとＨＩＳ３フラグメントＣとを混合し、プライマーｏＢＰ４５６（配列番号１０７）およびｏＢＰ４５９（配列番号１１０）で増幅することにより、オーバーラップＰＣＲで作成した。得られたＰＣＲ産物は、アガロースゲルで精製し、その後、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用した。ＨＩＳ３  ＡＢＵＣカセットは、ＨＩＳ３フラグメントＡＢとＨＩＳ３フラグメントＵＣとを混合し、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号１０３）およびｏＢＰ４５９（配列番号１１０）で増幅することにより、オーバーラップＰＣＲで作成した。ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＮＹＬＡ１０６のコンピテント細胞を、ＨＩＳ３  ＡＢＵＣ  ＰＣＲカセットで形質転換し、３０℃において、ウラシルを欠いている２％グルコースで補われた完全合成培地で平板培養した。形質転換体は、正しく組み込まれていることを確かめるために、３０℃において、ヒスチジンを欠いている２％グルコースで補われた完全合成培地でのレプリカ平板法によって選別した。組み込まれたことを確かめるため、プライマーｏＢＰ４６０（配列番号１１１）およびＬＡ１３５（配列番号１１２）（５’末端用）およびプライマーｏＢＰ４６１（配列番号１１３）およびＬＡ９２（配列番号１１４）（３’末端用）を用いて、ＰＣＲによってゲノムＤＮＡを調製した。ＵＲＡ３マーカーは、標準プロトコルにしたがって、３０℃において、２％グルコースおよび５−ＦＯＡで補われた完全合成培地で平板培養することにより再利用した。マーカーの除去は、５−ＦＯＡプレートからＳＤ−ＵＲＡ培地へコロニーを斑点状に付着させて成長がないことを確かめることにより、確認した。得られた特定された菌株（ＰＮＹ２００３と呼ぶ）は、次のような遺伝子型を有する：ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ。
【０２３３】
ＰＤＣ１の欠失
内在性ＰＤＣ１コード領域を欠失させるため、欠失カセットをｐＬＡ５９（配列番号１１５）（生体内での相同組換えおよびその後のＵＲＡ３マーカーの除去が行えるように、縮重ｌｏｘＰ部位が隣接したＵＲＡ３マーカーを含んでいる）からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびプライマーＬＡ６７８（配列番号１１６）およびＬＡ６７９（配列番号１１７）を用いて行った。ＵＲＡ３カセットの組み込みによってＰＤＣｌコード領域が置換されても、コード領域の最初の５０ｂｐと最後の５０ｂｐは残されるように、各プライマーのＰＤＣ１部分は、ＰＤＣ１開始コドンの下流にある５’領域および停止コドンの上流にある３’領域５０ｂｐから得た。ＰＣＲ産物は、標準遺伝子操作を用いてＰＮＹ２００３に入れて形質転換し、形質転換体は、３０℃において、ウラシルを欠いている２％グルコースで補われた完全合成培地で選択した。形質転換体は、正しく組み込まれたことを確かめるために、プライマーＬＡ３３７（配列番号１１８）（５’コード領域の外側にある）およびＬＡ１３５（配列番号１１２）（ＵＲＡ３の内側にあるプライマー）を用いてコロニーＰＣＲによって選別した。その後、ポジティブ形質転換体（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ）を、プライマーＬＡ６９２（配列番号１１９）およびＬＡ６９３（配列番号１２０）（ＰＤＣ１コード領域の内部にあるもの）を用いて、コロニーＰＣＲによって選別した。ＵＲＡ３マーカーは、ＧＡＬｌプロモーターの制御を受けるＣＲＥリコンビナーゼを含んでいるｐＬＡ３４（配列番号１２１）による形質転換によって再利用し、３０℃において、ヒスチジンを欠いている２％グルコースで補われた完全合成培地で平板培養した。形質転換体を、０．５％ガラクトースで補われた富栄養培地で平板培養し、リコンビナーゼを誘発させた。マーカーの除去は、ウラシルを欠いている２％グルコースで補われた完全合成培地にコロニーを斑点状に付着させて成長がないことを確かめることにより確認した。得られた特定された菌株（ＰＮＹ２００８と呼ぶ）は、次のような遺伝子型を有する：ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６。
【０２３４】
ＰＤＣ５の欠失
内在性ＰＤＣ５コード領域を欠失させるため、欠失カセットをｐＬＡ５９（配列番号１１５）（生体内での相同組換えおよびその後のＵＲＡ３マーカーの除去が行えるように、縮重ｌｏｘＰ部位が隣接したＵＲＡ３マーカーを含んでいる）からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびプライマーＬＡ７２２（配列番号１２２）およびＬＡ７３３（配列番号１２３）を用いて行った。各プライマーのＰＤＣ５部分は、ＵＲＡ３カセットの組み込みによってＰＤＣ５コード領域全体が置換されるように、ＰＤＣ５開始コドンの上流にある５’領域の５０ｂｐおよび停止コドンの下流にある３’領域の５０ｂｐから得た。ＰＣＲ産物は、標準遺伝子操作を用いてＰＮＹ２００８に入れて形質転換し、形質転換体は、３０℃において、ウラシルを欠いている１％エタノールで補われた完全合成培地で選択した。形質転換体は、正しく組み込まれたことを確かめるために、プライマーＬＡ４５３（配列番号１２４）（５’コード領域の外側にある）およびＬＡ１３５（配列番号１１２）（ＵＲＡ３の内側にあるプライマー）を用いてコロニーＰＣＲによって選別した。その後、ポジティブ形質転換体を、プライマーＬＡ６９４（配列番号１２５）およびＬＡ６９５（配列番号１２６）（ＰＤＣ５コード領域の内側にあるもの）を用いて、コロニーＰＣＲによって選別した。ＵＲＡ３マーカーは、ＧＡＬｌプロモーターの制御を受けるＣＲＥリコンビナーゼを含んでいるｐＬＡ３４（配列番号１２１）による形質転換によって再利用し、３０℃において、ヒスチジンを欠いている１％エタノールで補われた完全合成培地で平板培養した。形質転換体を、１％エタノールおよび０．５％ガラクトースで補われた富栄養ＹＥＰ培地で平板培養して、リコンビナーゼを誘発させた。マーカーの除去は、ウラシルを欠いている１％エタノールで補われた完全合成培地にコロニーを斑点状に付着させて成長がないことを確かめることにより確認した。得られた特定された菌株（ＰＮＹ２００９と呼ぶ）は次のような遺伝子型を有する：ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６。
【０２３５】
ＦＲＡ２の欠失
ＦＲＡ２の欠失は、コード配列の３’末端から２５０個のヌクレオチドを削除して、ＦＲＡ２コード配列の最初の１１３個のヌクレオチドが無損傷のままとなるように設計した。インフレームの停止コドンは、欠失の下流のヌクレオチド７個のところにあった。損傷のないＦＲＡ２の欠失用のＰＣＲカセットの４つのフラグメントは、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびテンプレートとしてのＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡ（Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅ  ｇｅｎｅ  Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で調製されたもの）を用いて増幅した。ＦＲＡ２フラグメントＡは、プライマーｏＢＰ５９４（配列番号１２７）およびプライマーｏＢＰ５９５（配列番号１２８）（ＦＲＡ２フラグメントＢの５’末端と相同性のある５’尾部を含んでいる）で増幅した。ＦＲＡ２フラグメントＢは、ＦＲＡ２フラグメントＡの３’末端と相同性のある５’尾部を含んでいるプライマーｏＢＰ５９６（配列番号１２９）、およびＦＲＡ２フラグメントＵの５’末端と相同性のある５’尾部を含んでいるプライマーｏＢＰ５９７配列番号１３０）で、増幅した。ＦＲＡ２フラグメントＵは、ＦＲＡ２フラグメントＢの３’末端と相同性のある５’尾部を含んでいるプライマーｏＢＰ５９８（配列番号１３１）およびＦＲＡ２フラグメントＣの５’末端と相同性のある５’尾部を含んでいるプライマーｏＢＰ５９９（配列番号１３２）によって増幅した。ＦＲＡ２フラグメントＣは、ＦＲＡ２フラグメントＵの３’末端と相同性のある５’尾部を含んでいるプライマーｏＢＰ６００（配列番号１３３）、およびプライマーｏＢＰ６０１（配列番号１３４）によって増幅した。ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＦＲＡ２フラグメントＡＢは、ＦＲＡ２フラグメントＡとＦＲＡ２フラグメントＢとを混合し、プライマーｏＢＰ５９４（配列番号１２７）およびｏＢＰ５９７（配列番号１３０）で増幅することにより、オーバーラップＰＣＲで作成した。ＦＲＡ２フラグメントＵＣは、ＦＲＡ２フラグメントＵとＦＲＡ２フラグメントＣとを混合し、プライマーｏＢＰ５９８（配列番号１３１）およびｏＢＰ６０１（配列番号１３４）で増幅することにより、オーバーラップＰＣＲによって作成した。得られたＰＣＲ産物は、アガロースゲルで精製し、その後、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用した。ＦＲＡ２  ＡＢＵＣカセットは、ＦＲＡ２フラグメントＡＢとＦＲＡ２フラグメントＵＣとを混合し、プライマーｏＢＰ５９４（配列番号１２７）およびｏＢＰ６０１（配列番号１３４）で増幅することにより、オーバーラップＰＣＲによって作成した。ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
【０２３６】
内在性ＦＲＡ２コード領域を欠失させるため、上で得られた損傷のない欠失カセットを、標準的手法を用いてＰＮＹ２００９に入れて形質転換し、ウラシルを欠いている１％エタノールで補われた完全合成培地で平板培養した。組み込まれたことを確かめるため、プライマーｏＢＰ６０２（配列番号１３５）およびＬＡ１３５（配列番号１１２）（５’末端用）、およびプライマーｏＢＰ６０２（配列番号１３５）およびｏＢＰ６０３（配列番号１３６）を用いて座全体を増幅して、ＰＣＲによってゲノムＤＮＡを調製した。ＵＲＡ３マーカーは、標準プロトコルにしたがって、３０℃において、１％エタノールおよび５−ＦＯＡ（５−フルオロオロチン酸）で補われた完全合成培地で平板培養して再利用した。マーカーの除去は、ウラシルを欠いている１％エタノールで補われた完全合成培地に、５−ＦＯＡプレートからのコロニーを斑点状に付着させて成長がないことを確かめることにより確認した。得られた特定された菌株（ＰＮＹ２０３７）は次の遺伝子型を有している：ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６ｆｒａ２Δ。
【０２３７】
２ミクロンの天然プラスミドの追加
ｌｏｘＰ７１−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ６６マーカーは、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いて、ｐＬＡ５９（配列番号１１５）からＰＣＲ増幅し、３０℃においてＳＥ−ＵＲＡプレート上で、ＬＡ８１１ｘ８１７（配列番号１３７、１３８）およびＬＡ８１２ｘ８１８（配列番号１３９、１４０）の２−ミクロンプラスミドフラグメント（ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄからの２−ミクロンの天然プラスミドから増幅されたもの。Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ）と一緒に、菌株ＰＮＹ２０３７に入れて形質転換した。得られた菌株ＰＮＹ２０３７（２μ：：ｌｏｘＰ７１−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ６６）は、ｐＬＡ３４（ｐＲＳ４２３：：ｃｒｅ）（ｐＬＡ３４とも呼ばれる）（配列番号１２１）で形質転換し、３０℃においてＳＥ−ＨＩＳ−ＵＲＡプレート上で選択した。形質転換体は、ＹＰ−１％ガラクトースプレート上に斑点状に付着させて、３０℃において４８ｈｒｓ成長するようにさせて、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現を誘発させた。その後、個々のコロニーをＳＥ−ＵＲＡ、ＳＥ−ＨＩＳ、およびＹＰＥのプレート上に斑点状に付着させて、ＵＲＡ３マーカーが除去されたことを確認した。得られた特定された菌株（ＰＮＹ２０５０）は次のような遺伝子型を有する：ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ４−ｌｏｘＰ，ｈｉｓ３Δｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６ｆｒａ２Δ  ２ミクロン。
【０２３８】
ＰＮＹ２０５０からのＰＮＹ２１１５の作成
ＰＮＹ２０５０からのＰＮＹ２１１５［ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ６６／７１  ｆｒａ２Δ  ２−ミクロンプラスミド（ＣＥＮ．ＰＫ２）ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣｌ］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈｌΔ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＩＬＶ５］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６］の作成は以下の通りであった。
【０２３９】
Ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ  Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６
内在性ＰＤＣ１プロモーターを用いてａｌｓＳをＰＮＹ２０５０のｐｄｃｌΔ：：ｌｏｘＰ６６／７座に組み込むために、組み込みカセットをｐＬＡ７１（配列番号１４６）からＰＣＲ増幅した。そのｐＬＡ７１は、ＦＢＡ１プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーターを有する、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）種からのアセト乳酸合成酵素遺伝子、および（生体内での相同組換えおよびその後のＵＲＡ３マーカーの除去が行えるようにするための）縮重したｌｏｘＰ部位が隣接しているＵＲＡ３マーカーを含んでいた。ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉおよびプライマー８９５（配列番号１４９）および６７９（配列番号１５０）を用いてＰＣＲを行った。各プライマーのＰＤＣ１部分は、コード配列の上流の６０ｂｐおよび停止コドンの上流にある５３ｂｐである５０ｂｐから得た。ＰＣＲ産物は、標準遺伝子操作を用いてＰＮＹ２０５０に入れて形質転換し、形質転換体は、３０℃において、ウラシルを欠いている１％エタノールで補われた完全合成培地で選択した。形質転換体は、正しく組み込まれたことを確かめるために、プライマー６８１（配列番号１５１）（３’コード領域の外側にある）および９２（配列番号１５２）（ＵＲＡ３遺伝子の内側にある）を用いてコロニーＰＣＲによって選別した。その後、ポジティブ形質転換体をゲノムＤＮＡのために準備し、プライマーＮ２４５（配列番号１５３）およびＮ２４６（配列番号１５４）を用いてＰＣＲによって選別した。ＵＲＡ３マーカーは、ＧＡＬｌプロモーターの制御を受けるＣＲＥリコンビナーゼを含んでいるｐＬＡ３４（配列番号１２１）による形質転換により再利用し、３０℃において、ヒスチジンを欠いている１％エタノールで補われた完全合成培地で平板培養した。形質転換体を、１％エタノールおよび０．５％ガラクトースで補われた富栄養培地で平板培養して、リコンビナーゼを誘発させた。マーカーの除去は、ウラシルを欠いている１％エタノールで補われた完全合成培地にコロニーを斑点状に付着させて、成長がないことを確かめることにより確認した。得られた特定された菌株（ＰＮＹ２０９０と呼ぶ）は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ，ｈｉｓ３Δ，ｐｄｃ１Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６，ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２−ミクロンｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６を有している。
【０２４０】
Ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡｌ］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６
内在性ＰＤＣ６コード領域を欠失させるために、組み込みカセットをｐＬＡ７８（配列番号１４７）からＰＣＲ増幅した。そのｐＬＡ７８は、ハイブリッドＦＢＡ１プロモーターおよびＴＤＨ３ターミネーターを有する、リステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）種からのｋｉｖＤ遺伝子、および（生体内での相同組換えおよびその後のＵＲＡ３マーカーの除去が行えるようにするための）縮重したｌｏｘＰ部位が隣接したＵＲＡ３マーカーを含んでいた。ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉおよびプライマー８９６（配列番号１５５）および８９７（配列番号１５６）を用いてＰＣＲを行った。各プライマーのＰＤＣ６部分は、コード配列の上流の６０ｂｐおよびコード領域の下流の５９ｂｐから得た。ＰＣＲ産物は、標準遺伝子操作を用いてＰＮＹ２０９０に入れて形質転換し、形質転換体は、３０℃において、ウラシルを欠いている１％エタノールで補われた完全合成培地で選択した。形質転換体は、正しく組み込まれたことを確かめるために、プライマー３６５（配列番号１５７）および３６６（配列番号１５８）（これらは、ＰＤＣ６遺伝子の内側にあるプライマーである）を用いてコロニーＰＣＲによって選別した。その後、生成物の存在しない形質転換体を、Ｎ６３８（配列番号１５９）（遺伝子の５’末端の外側にある）および７４０（配列番号１６０）（ＦＢＡ１プロモーターの内側にある）を用いて、コロニーＰＣＲによって選別した。その後、ゲノムＤＮＡのためにポジティブ形質転換体を準備し、ＰＤＣ６コード配列の外側にある２つのプライマーでＰＣＲにより選別した。ポジティブ組込体（ｉｎｔｅｇｒａｎｔｓ）では、４７２０ｂｐの生成物が生じるであろうが、ＰＤＣ６野生型形質転換体では、２１３０ｂｐの生成物が生じるであろう。ＵＲＡ３マーカーは、ＧＡＬ１プロモーターの制御を受けるＣＲＥリコンビナーゼを含んでいるｐＬＡ３４による形質転換によって再利用し、３０℃において、ヒスチジンを欠いている１％エタノールで補われた完全合成培地で平板培養した。形質転換体を、１％エタノールおよび０．５％ガラクトースで補われた富栄養培地で平板培養し、リコンビナーゼを誘発させた。マーカーの除去は、ウラシルを欠いている１％エタノールで補われた完全合成培地にコロニーを斑点状に付着させて、成長がないことを確かめることにより確認した。得られた特定された菌株はＰＮＹ２０９３と呼ばれ、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２−ミクロンｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６を有している。
【０２４１】
Ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６
内在性ＡＤＨ１コード領域を欠失させ、内在性ＡＤＨ１プロモーターを用いてＢｉＡＤＨを組み込むために、組み込みカセットをｐＬＡ６５（配列番号１４８）からＰＣＲ増幅した。そのｐＬＡ６５は、ＩＬＶ５プロモーターおよびＡＤＨ１ターミネーターを有する、ベイジェリンキ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）種からのアルコールデヒドロゲナーゼ、および（生体内での相同組換えおよびその後のＵＲＡ３マーカーの除去が行えるようにするための）縮重したｌｏｘＰ部位が隣接したＵＲＡ３マーカーを含んでいた。ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉおよびプライマー８５６（配列番号１６１）および８５７（配列番号１６２）を用いてＰＣＲを行った。各プライマーのＡＤＨ１部分は、ＡＤＨ１開始コドンの上流にある５’領域の５０ｂｐおよびコード領域の最後の５０ｂｐから得た。ＰＣＲ産物は、標準遺伝子操作を用いてＰＮＹ２０９３に入れて形質転換し、形質転換体は、３０℃において、ウラシルを欠いている１％エタノールで補われた完全合成培地で選択した。形質転換体は、正しく組み込まれたことを確かめるために、プライマーＢＫ４１５（配列番号１６３）（５’コード領域の外側にある）およびＮ１０９２（配列番号１６４）（ＢｉＡＤＨ遺伝子の内側にある）を用いてコロニーＰＣＲによって選別した。その後、ポジティブ形質転換体は、プライマー４１３（配列番号１６９）（３’コード領域の外側にある）および９２（配列番号１５２）（ＵＲＡ３マーカーの内側にある）を用いてコロニーＰＣＲによって選別した。ＵＲＡ３マーカーは、ＧＡＬ１プロモーターの制御を受けるＣＲＥリコンビナーゼを含んでいるｐＬＡ３４（配列番号１２１）による形質転換によって再利用し、３０℃において、ヒスチジンを欠いている１％エタノールで補われた完全合成培地で平板培養した。形質転換体を、１％エタノールおよび０．５％ガラクトースで補われた富栄養培地で平板培養し、リコンビナーゼを誘発させた。マーカーの除去は、ウラシルを欠いている１％エタノールで補われた完全合成培地にコロニーを斑点状に付着させて、成長がないことを確かめることにより確認した。得られた特定された菌株（ＰＮＹ２１０１と呼ぶ）は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ  ２−ミクロンｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６を有している。
【０２４２】
Ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＩＬＶ５］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６
ＢｉＡＤＨをＰＮＹ２１０１のｆｒａ２Δ座に組み込むために、組み込みカセットをｐＬＡ６５（配列番号１４８）からＰＣＲ増幅した。そのｐＬＡ６５は、ＩＬＶ５プロモーターおよびＡＤＨ１ターミネーターを有する、ベイジェリンキ・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ｉｎｄｉｃａ）種からのアルコールデヒドロゲナーゼ、および（生体内での相同組換えおよびその後のＵＲＡ３マーカーの除去を行えるようにするための）縮重したｌｏｘＰ部位が隣接したＵＲＡ３マーカーを含んでいた。ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉおよびプライマー９０６（配列番号１６５）および９０７（配列番号１６６）を用いてＰＣＲを行った。各プライマーのＦＲＡ２部分は、ＡＴＧから始まるコード配列の最初の６０ｂｐおよび停止コドンの下流の５６ｂｐから得た。ＰＣＲ産物は、標準遺伝子操作を用いてＰＮＹ２１０１に入れて形質転換し、形質転換体は、３０℃において、ウラシルを欠いている１％エタノールで補われた完全合成培地で選択した。形質転換体は、正しく組み込まれたことを確かめるために、プライマー６６７（配列番号１６７）（５’コード領域の外側にある）および７４９（配列番号１６８）（ＩＬＶ５プロモーターの内側にある）を用いてコロニーＰＣＲによって選別した。ＵＲＡ３マーカーは、ＧＡＬ１プロモーターの制御を受けるＣＲＥリコンビナーゼを含んでいるｐＬＡ３４（配列番号１２１）による形質転換によって再利用し、３０℃において、ヒスチジンを欠いている１％エタノールで補われた完全合成培地で平板培養した。形質転換体を、１％エタノールおよび０．５％ガラクトースで補われた富栄養培地で平板培養して、リコンビナーゼを誘発させた。マーカーの除去は、ウラシルを欠いている１％エタノールで補われた完全合成培地にコロニーを斑点状に付着させて、成長がないことを確かめることにより確認した。得られた特定された菌株（ＰＮＹ２１１０と呼ぶ）は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ６６／７１  ２−ミクロンｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＩＬＶ５］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６を有している。
【０２４３】
ＧＰＤ２の欠失
内在性ＧＰＤ２コード領域を欠失させるため、欠失カセットをｐＬＡ５９（配列番号１１５）からＰＣＲ増幅した。そのｐＬＡ５９は、生体内での相同組換えおよびその後のＵＲＡ３マーカーの除去を行えるようにする、縮重ｌｏｘＰ部位が隣接したＵＲＡ３マーカーを含んでいた。ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉおよびプライマーＬＡ５１２（配列番号１４１）およびＬＡ５１３（配列番号１４２）を用いてＰＣＲを行った。ＵＲＡ３カセットの組み込みによってＧＰＤ２コード領域全体が置換されるように、各プライマーのＧＰＤ２部分は、ＧＰＤ２開始コドンの上流にある５’領域の５０ｂｐおよび停止コドンの下流にある３’領域の５０ｂｐから得た。ＰＣＲ産物は、標準遺伝子操作を用いてＰＮＹ２１１０に入れて形質転換し、形質転換体は、３０℃において、ウラシルを欠いている１％エタノールで補われた完全合成培地で選択した。形質転換体は、正しく組み込まれたことを確かめるために、プライマーＬＡ５１６（配列番号１４３）（５’コード領域の外側にある）およびＬＡ１３５（配列番号１１２）（ＵＲＡ３の内側にある）を用いてコロニーＰＣＲによって選別した。その後、ポジティブ形質転換体を、プライマーＬＡ５１４（配列番号１４４）およびＬＡ５１５（配列番号１４５）（ＧＰＤ２コード領域の内側にあるもの）を用いて、コロニーＰＣＲによって選別した。ＵＲＡ３マーカーは、ＧＡＬ１プロモーターの制御を受けるＣＲＥリコンビナーゼを含んでいるｐＬＡ３４（配列番号１２１）による形質転換によって再利用し、３０℃において、ヒスチジンを欠いている１％エタノールで補われた完全合成培地で平板培養した。形質転換体を、１％エタノールおよび０．５％ガラクトースで補われた富栄養培地で平板培養して、リコンビナーゼを誘発させた。マーカーの除去は、ウラシルを欠いている１％エタノールで補われた完全合成培地にコロニーを斑点状に付着させて、成長がないことを確かめることにより確認した。得られた特定された菌株（ＰＮＹ２１１５と呼ぶ）は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：ｌｏｘＰ６６／７１  ｆｒａ２Δ  ２−ミクロンｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＩＬＶ５］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６を有している。
【０２４４】
ＰＮＹ２１１５からのＰＮＹ２１４５の作成
ｐｄｃ５Δ座にホスホケトラーゼ遺伝子カセットを更に組み込み、かつ天然ＡＭＮ１遺伝子を、ＣＥＮ．ＰＫからの相同分子種をコドン最適化型（ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｖｅｒｓｉｏｎ）と置換することにより、ＰＮＹ２１４５をＰＮＹ２１１５から作成した。組み込み作成物について以下にさらに説明する。
【０２４５】
ｐｄｃ５Δ：：ＦＢＡ（Ｌ８）−ｘｐｋ１−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６
ｐＲＳ４２３：：ＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋｌ＋ＥＮＯｌ−ｅｕｔＤからのＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１−ＣＹＣ１ｔ遺伝子（配列番号１７０）を、プライマーＮ１３４１およびＮ１３３８（配列番号１７１および１７２）を用いてＰＣＲ増幅して、３．１ｋｂの生成物を生じさせた。ｐＬＡ５９（配列番号１１５）からのｌｏｘＰ隣接ＵＲＡ３遺伝子カセットを、プライマーＮ１０３３ｃおよびＮ１３４２（配列番号１７３および１７４）を用いて増幅して、１．６ｋｂの生成物を生じさせた。ｘｐｋ１およびＵＲＡ３のＰＣＲ産物は、ＰＣＲの更なる１０サイクルのために、プライマーなしで、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼを用いてそれらを結合させることにより融合させた。その後、得られた反応混合物を、ＫＡＰＡ  Ｈｉ  ＦｉおよびプライマーＮ１３４２およびＮ１３６４（配列番号１７４および１７５）を用いたＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。電気泳動アガロースゲル（Ｚｙｍｏキット）による精製によって、４．２ｋｂのＰＣＲ産物を回収した。プライマーＮ１３６６およびＮ１３６８（配列番号１７７および１７８）を用いて、ＦＢＡプロモーター変種Ｌ８（配列番号１７６）を増幅した。ＰＣＲをさらに繰り返して、ｘｐｋ１：：ＵＲＡ３のＰＣＲ産物をＦＢＡプロモーターと結合させた。得られた生成物をポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、ＥｃｏＲＶで消化し子ウシの腸のフォスファターゼで処理したｐＢＲ３２２に連結した。連結反応物（ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（インビトロゲンからのＳｔｂ１３コンピテント細胞）に入れて形質転換した。組み込みカセットは、シークエンシングによって確認した。組み込み用ＤＮＡを調製するために、プラスミドは、Ｋａｐａ  ＨｉＦｉおよびプライマーＮ１３７１およびＮ１３７２（配列番号１７９および１８０）によるＰＣＲ反応においてテンプレートして使用した。ＰＣＲ産物は、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿（標準法を使用。例えば、Ｍａｎｉａｔａｓ，ｅｔ  ａｌ．）によって分離した。５マイクログラムのＤＮＡを用いて、菌株ＰＮＹ２１１５を形質転換した。ウラシルを欠いている培地（ウラシルのない、炭素源として１％エタノールを含む完全合成培地）で形質転換体を選択した。組み込みのために、プライマーＢＫ９３およびＮ１１１４（配列番号１８１および１８２）によるＰＣＲ（ＪｕｍｐＳｔａｒｔ）を用いて、コロニーを選別した。２種類のクローンを選択して進めた。ＵＲＡ３マーカーは、ＧＡＬ１プロモーターの制御を受けるＣＲＥリコンビナーゼを含んでいるｐＪＴ２５４（配列番号１８３）による形質転換によって再利用し、３０℃において、ヒスチジンの欠けている１％エタノールで補われた完全合成培地で平板培養した。形質転換体を、１％エタノールで補われた富栄養培地で成長させて、リコンビナーゼを抑制解除した。マーカーの除去は、単一のコロニー分離物に関して、ウラシルを欠いている１％エタノールで補われた完全合成培地に斑点状に付着させて、成長がないことを確かめることにより確認した。リコンビナーゼプラスミド（ｐＪＴ２５４）の消失は、ヒスチジンを欠いている１％エタノールで補われた完全合成培地にコロニーを斑点状に付着させて確認した。マーカーが適切に除去されたことは、ＰＣＲ（プライマーＮ１６０ＳｅｑＦ５（配列番号１８４）およびＢＫ３８０によって確認した。得られた１つのクローンをＰＮＹ２２９３と命名した。
【０２４６】
ａｍｎ１Δ：：ＡＭＮ１（ｙ）−ｌｏｘＰ７１／６６
内在性ＡＭＮ１のコピーをＣＥＮ．ＰＫ２からのＡＭＮ１遺伝子のコドン最適化型と置き換えるために、ＣＥＮ．ＰＫ  ＡＭＮ１プロモーター、ＡＭＮ１（ｙ）遺伝子（核酸配列番号１８５；アミノ酸配列番号１８６）、およびＣＥＮ．ＰＫ  ＡＭＮ１ターミネーターを含んでいる組み込みカセットを、ＳＯＥ  ＰＣＲで組み立て、シャトルベクターｐＬＡ５９内にサブクローン化した。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）用にコドン最適化されたＡＭＮ１（ｙ）遺伝子をＤＮＡ２．０に注文した。完成されたｐＬＡ６７プラスミド（配列番号１８７）は、以下のものを含んでいた：１）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製オリジンとアンピシリン耐性遺伝子とを含むｐＵＣ１９ベクター骨格配列（ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）；２）ｌｏｘＰ７１およびｌｏｘＰ６６部位が隣接したＵＲＡ３選択マーカー；および３）ＰＡＭＮ１（ＣＥＮ．ＰＫ）−ＡＭＮ１（ｙ）−ｔｅｒｍＡＭＮｌ（ＣＥＮ．ＰＫ）発現カセット。ＡＭＮ１（ｙ）−ｌｏｘＰ７１−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ６６カセットのＰＣＲ増幅は、ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡからのもの）およびプライマーＬＡ７１２（配列番号１８８）およびＬＡ７４６（配列番号１８９）を用いて行った。ＰＣＲ産物は、標準遺伝子操作を用いてＰＮＹ２２９３に入れて形質転換し、形質転換体は、３０℃において、ウラシルを欠いている１％エタノールで補われた完全合成培地で選択した。対照（ＰＮＹ２２９３）に関連してクランピング（ｃｌｕｍｐｉｎｇ）表現型がないかどうかを、形質転換体を拡大して観察した。上述したように、ｐＪＴ２５４  Ｃｒｅリコンビナーゼプラスミドを用いてＵＲＡ３マーカーを再利用した。マーカー再利用後に、クランピング表現型がないことを確認するために、再びクローンを拡大して観察した。得られた特定された菌株（ＰＮＹ２１４５）は、次の遺伝子型を有している：ＭＡＴａ  ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ  ｈｉｓ３Δ  ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＦＢＡ（Ｌ８）］−ＸＰＫ｜ｘｐｋ１＿Ｌｐ−ＣＹＣｔ−ｌｏｘＰ６６／７１  ｆｒａ２Δ  ２−ミクロンプラスミド（ＣＥＮ．ＰＫ２）ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｐｄｃ６Δ：：（ＵＡＳ）ＰＧＫ１−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＫＩＶＤ｜Ｌｇ（ｙ）−ＴＤＨ３ｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ａｄｈ１Δ：：Ｐ［ＡＤＨ１］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＩＬＶ５］−ＡＤＨ｜Ｂｉ（ｙ）−ＡＤＨｔ−ｌｏｘＰ７１／６６  ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ７１／６６  ａｍｎ１Δ：：ＡＭＮ１（ｙ）。
【０２４７】
ＰＮＹ２１４５からのＰＮ２３１０の作成
プラスミドｐＬＨ８０４−Ｌ２Ｖ４およびｐＲＳ４１３：：ＢｉＡＤＨ−ｋｉｖＤで菌株ＰＮＹ２１４５を形質転換することにより、ＰＮＹ２３１０を作り出した。プラスミドｐＬＨ８０４−Ｌ２Ｖ４（配列番号１２）は、ｐＨＲ８１（ＡＴＣＣ番号８７５４１）に基づいた酵母菌−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターである。これは、ＫＡＲＩ変異種Ｋ９ＪＢ４ＰおよびＤＨＡＤ変異種Ｌ２Ｖ４を発現するための遺伝子を含んでいる。プラスミドｐＲＳ４１３：：ＢｉＡＤＨ−ｋｉｖＤ（配列番号１３）は、ｐＲＳ４１３（ＡＴＣＣ番号８７５１８）に基づいた酵母菌−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターである。これは、ＢｉＡＤＨおよびｋｉｖＤを発現するための遺伝子を含んでいる。両方のプラスミドにおける関連した遺伝子特徴（ｇｅｎｅ  ｆｅａｔｕｒｅｓ）の位置を表３および４にリストしてある。炭素源として１％（ｖ／ｖ）エタノールを含みウラシルおよびヒスチジンを欠いている完全合成培地で平板培養することにより、プラスミド形質転換体を選択した。コロニーは、斑点状に付着させて、新鮮なプレートに移した。２日後に、斑点からの細胞を、炭素源として２％（ｗ／ｖ）グルコースを有する（ウラシルおよびヒスチジンのない）完全合成培地を含んだプレートに移した。得られた菌株をＰＮＹ２３１０と名付けた。
【０２４８】
【表６】
2016511010.tif 000008
【０２４９】
【表７】
2016511010.tif 000009
【０２５０】
ＰＮＹ２１４５からのＣＰＮ９７の作成
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の内在性ＧＰＤ１を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｐｓＡと置き換えるために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｐｓＡのオープンリーディングフレームを増幅して、ＡＴＧ開始コドンの上流にある領域および内在性サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＤ１停止コドン維持する染色体位置を、内在性ＧＰＤ１に挿入するように、プライマーを設計した。オーバーラップＰＣＲを使用して、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＤ１の上流にある組換え用の５０個の塩基対、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｐｓ遺伝子、ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰカセット、およびＰＮＹ２１４５のサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＤ１の下流にある組換え用５０個の塩基対を含んでいるＰＣＲ産物を得た。テンプレートとして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１染色体ＤＮＡを利用して、プライマーＦｌ（配列番号２３４）およびＲｌ（配列番号２３５）で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｐｓＡ  ＯＲＦ（ＰＣＲ産物１）を増幅した。テンプレートとしてｐＬＡ５９（配列番号２７）を利用して、プライマーＦ２（配列番号２３６）およびＲ２（配列番号２３７）を用いて、ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰカセット（ＰＣＲ産物２）を増幅した。テンプレートとしてのＰＣＲ産物１および２およびプライマーＦｌ（配列番号２３４）およびＲ２（配列番号２３７）を利用して、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＤ１の上流にある５０個の塩基対、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｐｓ遺伝子、ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰカセットおよびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＤ１の下流にある５０個の塩基対を含むＰＣＲ産物（ＰＣＲ産物３）を増幅した。ＰＣＲ反応はすべて、製造業者の条件にしたがって酵素Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ；Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いて行わせた。
【０２５１】
ＰＣＲ産物３は、精製によって回収し、酵母菌形質転換キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いてＰＮＹ２１４５に入れて形質転換した。１％エタノールを含んでいるがウラシルを含んでいない酵母菌合成培地で、コロニーを選択した。酵母菌合成培地：６．７ｇ／Ｌの酵母菌窒素塩基（アミノ酸を含まない）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ）、１．８５ｇ／ＬのＫａｉｓｅｒのドロップアウトＨｉｓ−Ｕｒａ（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ；Ｎｏｒｆｏｌｋ，ＵＫ）。必要とされた場合、ヒスチジンまたはウラシルを７６ｍｇ／Ｌだけ加えた。
【０２５２】
ＵＲＡ３マーカーを再利用するために、１つのコロニーを選択し、ＧＡＬ１プロモーターの制御を受けるＣＲＥリコンビナーゼを含んでいるプラスミドｐＪＴ２５４（配列番号１８３）で形質転換し、さらに１％エタノールを含みヒスチジンを含まない酵母菌合成培地で平板培養した。１つのコロニーを選択し、ＹＰＥ培地（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌエタノール）で一晩成長させ、ＹＰＥプレート（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌエタノール、１５ｇ／Ｌ寒天）上で再び画線培養した。コロニーを選択し、酵母菌合成培地のプレート（１％エタノールを含みウラシルを含まないもの、１％エタノールを含みヒスチジンを含まないもの）およびＹＰＥプレートに、斑点状に付着させた。ウラシルおよびヒスチジンを欠いているプレートでは成長できないコロニーを選択し、マーカーの除去および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｐｓＡの挿入のためにＰＣＲで選別した。そのコロニーをＣＰＮ８２と名付けた。
【０２５３】
イソブタノール産生経路を有する菌株を作るために、上述のようにして、ＣＰＮ８２を、ｐＬＨ８０４：：Ｌ２Ｖ４（配列番号１２）およびｐＲＳ４１３：：ＢｉＡＤＨ−ｋｉｖＤ（配列番号１３）で形質転換した。ウラシルおよびヒスチジンを欠いている１％エタノールを含んだ酵母菌合成培地で形質転換体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を平板培養し、３つのコロニーを選び、ヒスチジンおよびウラシルを欠いている３ｇ／Ｌグルコースおよび３ｇ／Ｌエタノールを含んだ酵母菌合成培地上で再び画線培養した。イソブタノール産生されるかどうかについてコロニーを試験し、１つのコロニーを選んでＣＰＮ９７と名付けた。
【０２５４】
ＰＮＹ２１４５からの酵母菌コドン最適化ＧＰＤ１のＭ、Ｍ３、およびＭ８変種菌株の作成
酵母菌コドン最適化ＧＰＤ１変種の組み込み
宿主サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株のＧＰＤ１変異体を試験するために、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）コドン使用頻度を用いて、天然ＧＰＤ１をＤＮＡ  ２．０によって合成されたＧＰＤ１のコドン最適化型と交換した。
【０２５５】
組み込みカセットの調製
プロモーターおよびターミネーターを伴うＵＲＡ３マーカー遺伝子と、ＵＲＡ３マーカー遺伝子の下流のクローン化ＧＰＤ下流相同性領域とを含んでいるベクターｐＢＰ３５１８（配列番号９）内に、２つのフラグメント（上流ＧＰＤ１上流相同性領域およびコドン最適化酵母菌ＧＰＤ１フラグメント）をクローン化することにより、遺伝子交換カセット（ｇｅｎｅ  ｓｗａｐ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）を調製した。
【０２５６】
Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、プライマーｏＢＰ１３２９（配列番号１）およびｏＢＰ１３３３（配列番号２）および（ＹｅａＳｔａｒ  ＴＭ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて調製されたテンプレートとしての）ＰＮＹ２１４５ゲノムＤＮＡを用いて、組み込みカセット用のフラグメント１を増幅した。プライマーｏＢＰ１３３４（配列番号３）およびｏＢＰ１３３５（配列番号４）および（テンプレートとしての）合成コドン最適化酵母菌ＧＰＤ１または適切なＧＰＤ１変種を用いて、フラグメント２を増幅した。プライマーｏＢＰ１３３３（配列番号２）は、フラグメント２（合成コドン最適化ＧＰＤ１）の５’領域と相同性のある５’尾部を有しており、プライマーｏＢＰ１３３４（配列番号３）は、フラグメント１（ＧＰＤ上流領域）の３’末端と相同性のある５’尾部を有している。プライマーｏＢＰ１３２９（配列番号１）およびｏＢＰ１３３５（配列番号４）を用いたオーバーラップＰＣＲによって、２つのフラグメントを結合させた。この結合フラグメントは、ベクターｐＢＰ３５１８（配列番号９）内のＡｓｃＩおよびＰｍｅＩ部位にクローン化し、得られたベクター（ｐＢＰ３５１８ＧＰＤ*で表す）（配列番号１０）を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＸＬ１Ｂｌｕｅコンピテント細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）に入れて形質転換した。
【０２５７】
ＰＮＹ２１４５での組み込みカセットの形質転換
プラスミドｏＢＰ３５１８ＧＰＤ＊（配列番号１０）は、ＱＩＡｐｒｅｐ  ＳｐｉｎミニプレップＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，ＧｍｂＨ）を用いて分離し、ＳａｃＩおよびＰａｃＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いて制限した。得られた４．２ｋｂのフラグメント（組み込みカセット全体、ＧＰＤ上流相同性領域、コドン最適化ＧＰＤ（Ｃｏｄｏｎ  Ｏｐｔ  ＧＰＤ）、ＵＲＡ３マーカー遺伝子および下流ＧＰＤ領域を含んでいる）を、Ｆｒｏｚｅｎ  ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、ＰＮＹ２１４５に入れて形質転換した。形質転換混合物を、３０℃において、ウラシルを欠いている０．５％エタノールを含んでいる完全合成で４８時間平板培養した。組み込み部位を確認するため、２組のプライマーｏＢＰ１３４２（配列番号６）およびｏＢＰ１３４４（配列番号７）およびｏＢＰ１３４１（配列番号５）およびｏＢＰ１３４５（配列番号８）（両端での組み込みを確認するため）を用いて、形質転換体を選別した。プライマーｏＢＰ１３４２（配列番号６）およびｏＢＰ１３４５（配列番号８）は、右側の組み込みを確認するため、カセットの外側の領域から設計した。
【０２５８】
ＵＲＡ３マーカーの除去
確認された形質転換体（菌株ＰＮＹ２１４５  ＧＰＤ１Δ：：ＣＯ  ＧＰＤ１  ＵＲＡ３）は、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いて、ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅで形質転換し、ヒスチジンおよびウラシルを欠いている０．５％エタノールで補われた完全合成培地に蒔き、３０℃で４８時間培養した。形質転換体は、ヒスチジンを欠いている０．５％エタノールを含んだ完全合成培地で一晩成長させ、マーカーのために、０．５％エタノールおよび０．１％５ＦＯＡを含んでいる完全合成培地で平板培養した。マーカーの除去は、プライマーｏＢＰ１３４１（配列番号５）およびｏＢＰ１３４５（配列番号８）を用いて、コロニーＰＣＲによって確認した。
【０２５９】
経路プラスミドの形質転換
その後、菌株ＰＮＹ２１４５  ＧＰＤ１Δ：：ＣＯ  ＧＰＤ１は、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いて、プラスミドｐＬＭＨ１１−ＪＭ４４（配列番号２４０）で形質転換し、ウラシルを含まない０．５％エタノールを有する完全合成培地で平板培養した。得られた菌株は、Ｍ、Ｍ３（Ｆ７３Ａ）、およびＭ８（Ｆ７３Ｇ／Ｆ１２９Ｇ）と名付けた。
【０２６０】
ＰＮＹ２１４５からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコドン最適化酵母菌ＧＰＤ１のＥＣ１、Ｅ３、およびＥ８菌株の作成
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）用に最適化された酵母菌ＧＰＤ１コドンの組み込み
宿主サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株のＧＰＤ１変異体を試験するために、天然ＧＰＤ１を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン使用頻度を用いてＤＮＡ  ２．０によって合成されたＧＰＤ１の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化型と交換した。
【０２６１】
組み込みカセットの調製
プロモーターおよびターミネーターを伴うＵＲＡ３マーカー遺伝子と、ＵＲＡ３マーカー遺伝子の下流のクローン化ＧＰＤ下流相同性領域とを含んでいるベクターｐＢＰ３５１８（配列番号９）内に、２つのフラグメント（上流ＧＰＤ１上流相同性領域およびコドン最適化酵母菌ＧＰＤ１フラグメント）をクローン化することにより、遺伝子交換カセットを調製した。
【０２６２】
Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  （Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．；Ｉｐｓｗｉｃｈ，  ＭＡ）、プライマーｏＢＰ１３２９（配列番号１）およびｏＢＰ１３５０（配列番号２４１）および（ＹｅａＳｔａｒ  ＴＭ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて作成されたテンプレートとしての）ＰＮＹ２１４５ゲノムＤＮＡを用いて、組み込みカセット用のフラグメント１を増幅した。プライマーｏＢＰ１３５１（配列番号２４２）およびｏＢＰ１３５２（配列番号２４３）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の合成コドン酵母菌最適化ＧＰＤ１遺伝子および（テンプレートとしての）Ｅ３およびＥ８変種を用いて、フラグメント２を増幅した。プライマーｏＢＰ１３５０（配列番号２４１）は、フラグメント２（合成コドン最適化ＧＰＤ１）の５’領域と相同性のある５’尾部を有しており、プライマーｏＢＰ１３５１（配列番号２４２）は、フラグメント１（ＧＰＤ上流領域）の３’末端と相同性のある５’尾部を有している。プライマーｏＢＰ１３２９（配列番号１）およびｏＢＰ１３５２（配列番号２４３）を用いたオーバーラップＰＣＲによって、２つのフラグメントを結合させた。この結合フラグメントは、ベクターｐＢＰ３５１８（配列番号９）のＡｓｃＩおよびＰｍｅＩ部位においてクローン化し、得られたベクター（ｐＢＰ３５１８ＧＰＤ１＿ＥｃＯｐｔで表す）（配列番号２４９）を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＸＬ  １Ｂｌｕｅコンピテント細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）に入れて形質転換した。
【０２６３】
ＰＮＹ２１４５における組み込みカセットの形質転換
プラスミドｐＢＰ３５１８ＧＰＤ１＿ＥｃＯｐｔ（配列番号２４９）は、ＱＩＡｐｒｅｐ  ＳｐｉｎミニプレップＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，ＧｍｂＨ）を用いて分離し、ＳａｃＩおよびＰａｃＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いて制限した。得られた４．２ｋｂのフラグメント（組み込みカセット全体、ＧＰＤ上流相同性領域、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ＧＰＤ１、ＵＲＡ３マーカー遺伝子および下流ＧＰＤ領域を含んでいる）を、Ｆｒｏｚｅｎ  ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、ＰＮＹ２１４５に入れて形質転換した。形質転換混合物を、３０℃において、ウラシルを欠いている０．５％エタノールを含んだ完全合成培地で４８時間平板培養した。組み込み部位を確認するため、２組のプライマーｏＢＰ１３４２（配列番号６）およびｏＢＰ１３５２（配列番号２４３）およびｏＢＰ１３５７（配列番号２４８）およびｏＢＰ１３４５（配列番号８）（両端での組み込みを確認するため）を用いて、形質転換体を選別した。プライマーｏＢＰ１３４２（配列番号６）およびｏＢＰ１３４５（配列番号８）は、右側の組み込みを確認するため、カセットの外側の領域から設計した。
【０２６４】
ＵＲＡ３マーカーの除去
確認された形質転換体（菌株ＰＮＹ２１４５  ＧＰＤ１Δ：：ＥＣ  ＣＯ  ＧＰＤ１  
ＵＲＡ３）は、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いてｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬｌ−ｃｒｅで形質転換し、ヒスチジンおよびウラシルを欠いている０．５％エタノールで補われた完全合成培地に蒔き、３０℃で４８時間培養した。形質転換体は、ヒスチジンを欠いている０．５％エタノールを含んだ完全合成培地で一晩成長させ、ＵＲＡ３マーカーのために、０．５％エタノールおよび０．１％５ＦＯＡを含んでいる完全合成培地で平板培養した。マーカーの除去は、プライマーｏＢＰ１３５７（配列番号２４８）およびｏＢＰ１３４５（配列番号８）を用いて、コロニーＰＣＲによって確認した。
【０２６５】
経路プラスミドの形質転換
その後、菌株ＰＮＹ２１４５ＧＰＤ１Δ：：ＥＣ  ＣＯ  ＧＰＤ１は、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いて、プラスミドｐＬＭＨ１１−ＪＭ４４（配列番号２４０）で形質転換し、ウラシルを含まない０．５％エタノールを有する完全合成培地で平板培養した。得られた菌株は、ＥＣ１、Ｅ３（Ｆ７３Ａ）、およびＥ８（Ｆ７３Ｇ／Ｆ１２９Ｇ）と名付けた。
【０２６６】
ＰＮＹ２１４５からの天然酵母菌ＧＰＤ１のＮ、Ｎ３、およびＮ８菌株の作成
酵母菌天然ＧＰＤ１変種の組み込み
宿主サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の酵母菌天然ＧＰＤ１変異体を試験するために、酵母菌コドン最適化ＧＰＤ１を、菌株ＰＮＹ２１４５  ＧＰＤ１Δ：：ＣＯ  ＧＰＤ１の酵母菌天然型ＧＰＤ１と交換した。
【０２６７】
組み込みカセットの調製
プロモーターおよびターミネーターを伴うＵＲＡ３マーカー遺伝子と、ＵＲＡ３マーカー遺伝子の下流のクローン化ＧＰＤ下流相同性領域とを含んでいるベクターｐＢＰ３５１８（配列番号９）内に、２つのフラグメント（上流ＧＰＤ１上流相同性領域および酵母菌天然ＧＰＤ１フラグメント）をクローン化することにより、遺伝子交換カセットを調製した。
【０２６８】
Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、プライマーｏＢＰ１３２９（配列番号１）およびｏＢＰ１３５３（配列番号２４４）および（ＹｅａＳｔａｒ  ＴＭ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて調製されたテンプレートとしての）ＰＮＹ２１４５ゲノムＤＮＡを用いて、組み込みカセット用のフラグメント１を増幅した。プライマーｏＢＰ１３５４（配列番号２４５）およびｏＢＰ１３５５（配列番号２４６）およびＰＮＹ２１４５ゲノムＤＮＡおよび（テンプレートとしての）適切な変種を用いて、フラグメント２を増幅した。プライマーｏＢＰ１３５３（配列番号２４４）は、フラグメント２（酵母菌天然ＧＰＤ１）の５’領域と相同性のある５’尾部を有しており、プライマーｏＢＰ１３５４（配列番号２４５）は、フラグメント１（ＧＰＤ上流領域）の３’末端と相同性のある５’尾部を有している。プライマーｏＢＰ１３２９（配列番号１）およびｏＢＰ１３５５（配列番号２４６）を用いたオーバーラップＰＣＲによって、２つのフラグメントを結合させた。この結合フラグメントは、ベクターｐＢＰ３５１８（配列番号９）のＡｓｃＩおよびＰｍｅＩ部位にクローン化し、得られたベクター（ｐＢＰ３５１８ＧＰＤ１＿Ｎａｔｉｖｅで表す）（配列番号２５０）を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＸＬ１Ｂｌｕｅコンピテント細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）に入れて形質転換した。
【０２６９】
ＰＮＹ２１４５での組み込みカセットの形質転換
プラスミドｐＢＰ３５１８ＧＰＤ１＿Ｎａｔｉｖｅ（配列番号２５０）は、ＱＩＡｐｒｅｐ  ＳｐｉｎミニプレップＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，ＧｍｂＨ）を用いて分離し、ＳａｃＩおよびＰａｃＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いて制限した。得られた４．２ｋｂのフラグメント（組み込みカセット全体、ＧＰＤ上流相同性領域、酵母菌天然ＧＰＤ１、ＵＲＡ３マーカー遺伝子および下流ＧＰＤ領域を含んでいる）を、Ｆｒｏｚｅｎ  ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、ＰＮＹ２１４５  ＧＰＤ１Δ：：ＣＯ  ＧＰＤ１に入れて形質転換した。形質転換混合物を、３０℃において、ウラシルを欠いている０．５％エタノールを含んだ完全合成培地で４８時間平板培養した。組み込み部位を確認するため、２組のプライマーｏＢＰ１３４２（配列番号６）およびｏＢＰ１３５５（配列番号２４６）、ならびにｏＢＰ１３５６（配列番号２４７）およびｏＢＰ１３４５（配列番号８）（両端での組み込みを確認するため）を用いて、形質転換体を選別した。
【０２７０】
ＵＲＡ３マーカーの除去
確認された形質転換体（菌株ＰＮＹ２１４５  ＣＯ  ＧＰＤ１Δ：：Ｎａｔｉｖｅ  ＧＰＤ１  ＵＲＡ３）は、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いてｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅで形質転換し、ヒスチジンおよびウラシルを欠いている０．５％エタノールで補われた完全合成培地に蒔き、３０℃で４８時間培養した。形質転換体は、ヒスチジンを欠いている０．５％エタノールを含んだ完全合成培地で一晩成長させ、ＵＲＡ３マーカーのために、０．５％エタノールおよび０．１％５ＦＯＡを含んでいる完全合成培地で平板培養した。マーカーの除去は、プライマーｏＢＰ１３５６（配列番号２４７）およびｏＢＰ１３４５（配列番号８）を用いて、コロニーＰＣＲによって確認した。
【０２７１】
経路プラスミドの形質転換
その後、菌株ＰＮＹ２１４５  ＣＯ  ＧＰＤ１Δ：：Ｎａｔｉｖｅ  ＧＰＤ１は、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いて、プラスミドｐＬＭＨ１１−ＪＭ４４（配列番号２４０）で形質転換し、ウラシルを含まない０．５％エタノールを有する完全合成培地で平板培養した。得られた菌株は、Ｎ、Ｎ３（Ｆ７３Ａ）、およびＮ８（Ｆ７３Ｇ／Ｆ１２９Ｇ）と名付けた。
【０２７２】
ＧＰＤ１変種の組み込み
各ＧＰＤ１変種についてフラグメント２の増幅に用いたテンプレートが、表５にリストした変異を含む対応コード配列であること以外は、コドン最適化ＧＰＤ１交換について上述したのと同じ方法でＧＰＤ１変種用の組み込みカセットを調製した。
【０２７３】
【表８】
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【０２７４】
異種性ＧＰＤの組み込み
異種性ＧＰＤ用の組み込みカセットは、組み込みカセットが適切に組み立てられるように挿入される異種性ＧＰＤ１に基づいて、当業者がプライマーを再設計するであろうこと以外は、コドン最適化ＧＰＤ１に関して上で述べたのと同じようにして調製できる。
【０２７５】
実施例１：変種ＧＰＤ１酵素
この実施例では、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ＧＰＤ１の変種型（ｖａｒｉａｎｔ  ｖｅｒｓｉｏｎｓ）を作成し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現によって試験し、その後、未精製細胞抽出物で酵素分析を行った。
【０２７６】
ＧＰＤ１突然変異誘発
酵素の他の速度論的パラメーターに影響を与えることなく、ＮＡＤＨの場合のＫＭを増大させたいという願いから、酵母菌ＧＰＤ１の突然変異誘発を行わせることになった。突然変異誘発に対する取り組みは、ヒトＧＰＤ１の高解像度の結晶構造に基づくもとであり（Ｏｕ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５７：８５８−８６９）、それによると、補助因子結合ポケット中のＮＡＤの一定距離内のアミノ酸を決定できる。アミノ酸残基と実際の接触のタイプとを分析することにより、アミノ酸変更の数を制限して、ＮＡＤＨの場合のＫＭ値を増大させることが可能となった。表６は、この分析の結果を示している。その中で、結合ＮＡＤの５オングストローム以内のアミノ酸残基が数えられており、ＮＡＤ結合における役割が説明された。結合ＮＡＤのパイ−スタッキング安定化（ｐｉ−ｓｔａｃｋｉｎｇ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）におけるその役割ゆえに、最初の焦点は、切り取られたヒトＧＰＤ１のｐｈｅ４１およびｐｈｅ９７（配列番号８４）（酵母菌ＧＰＤ１のｐｈｅ７３およびｐｈｅ１２９）と一致する位置の突然変異誘発に合わせた。
【０２７７】
【表９】
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【０２７８】
【表１０】
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【０２７９】
菌株および培地
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．（カタログ番号Ｃ４０４００３。Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から得た。発現プラスミドｐＢＡＤは前述のものである（米国特許第７，９１０，３４２号明細書）。合成酵母菌ＧＰＤ１遺伝子（酵母菌での発現用に最適化されている）を、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）から得た。細胞は、３７℃において、０．０２％  Ｌ−（＋）−アラビノース（カタログ番号Ａ３２５６。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および１００μｇ／ｍＬアンピシリン（カタログ番号Ａ１０６６。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含んだＭｉｌｌｅｒのＬＢブロス（カタログ番号４６−０５０−ＣＭ。Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）中で成長させた。細胞は、１００μｇ／ｍＬアンピシリン（カタログ番号Ｌ１００４。Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）を含んでいるＬＢ寒天平板で平板培養した。
【０２８０】
ＧＰＤ１変種の作成
変異は、表７にしたがって４つの異なるアミノ酸位置に導入した。突然変異誘発は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（カタログ番号２１０５１９。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用い、製造業者の指示にしたがって実施した。突然変異誘発プライマーは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）から得た。Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ９７００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）において、反応に対してヒートサイクルを実施した。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０は、製造業者の指示にしたがって、１μｌのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ反応生成物で形質転換し、形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天平板で選択した。所望の変異を含むものを識別するために、各形質転換から複数の分離物のＤＮＡ配列を得た。
【０２８１】
突然変異誘発反応におけるテンプレートがすでに変異の１つを含んでいたこと、また適切なプライマーを使用して第２変異を導入したこと以外は、二重変異体を同じ方法で作成した。
【０２８２】
【表１１】
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【０２８３】
ＧＰＤ１の分析
Ｍｉｎｉ−Ｂｅａｄ−ｂｅａｔｅｒ（カタログ番号３１１０ＢＸ。Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ）において、１００ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中でビーズビーティング（ｂｅａｄ  ｂｅａｔｉｎｇ）（２×１０秒）を行って、可溶性分画の細胞抽出物を培養液５ｍｌから調製した。細胞抽出物タンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡアッセイ（カタログ番号２３２２４および２３２２８。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で求めた。
【０２８４】
１００ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭグルコース−６−ホスフェート、３ｍＵ／μｌのグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（カタログ番号Ｇ８４０４。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１ｍＭのジヒドロキシアセトンホスフェート（カタログ番号Ｄ７１３７。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、様々な濃度のＮＡＤＨ、および様々な濃度の細胞抽出物が含まれている１００μｌの量で、分析を行った。水（Ｏｍｎｉｓｏｌｖ，♯ＷＸ０００１−１，ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）中に０．１％ギ酸（Ｓｕｐｒａｐｕｒ，♯１１６７−１，ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）を含む液に入れて４倍に希釈して、反応を終了させた。グリセロール−３−ホスフェートの産生は、ＬＣ／ＭＳで測定した。
【０２８５】
ＬＣ／ＭＳ法
３０℃の温度で、ＨＳＳ  Ｔ３カラム（２．１×１００ｍｍ、１．８μｍ、♯１８６００３５３９（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ））を使用して、２μｌの各試料を、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ／ＳＱＤ  Ｓｙｓｔｅｍに注入した。ＵＰＬＣ移動相は、０．１％ギ酸水溶液（移動Ａ）および０．１％ギ酸のアセトニトリル溶液（Ｏｍｎｉｓｏｌｖ，♯ＡＸ０１５６−１，ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）（移動Ｂ）からなっており、０．３ｍＬ／ｍｉｎの一定流量だった。最初の１分間は９９％Ａであり、その後、０．５分間の直線の傾斜があり７５％Ｂで終わり、その後、０．５分間の直線の傾斜が９９％Ａに戻る（次の試料を注入する前）という傾斜だった。ＭＳ分析は、３０Ｖのコーン電圧およびｍ／ｚ＝１７１においてエレクトロスプレー負イオン化（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）で行った。保持時間およびピーク強度は、ＭａｓｓＬｙｎｘ４．１ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて求めた。外部標準（グリセロール−３−ホスフェート、カタログ番号Ｇ７８８６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、定量化の場合と同様にして分析した。
【０２８６】
ＧＰＤ１変種の分析
ＧＰＤ１変種の活性は、最初に、２種類のＮＡＤＨ濃度（３０および３００μＭ）で、グリセロール３ホスフェート（Ｇ３Ｐ）の初期形成速度を測定することにより、調べた。これは、ＮＡＤＨの場合の変種のＫＭを示す測定値の代わりになる。３０μＭよりかなり小さいＫＭの場合、比率は１．０となり、３００μＭよりかなり大きいＫＭの場合、比率は１０となるであろう。個々の単一変異体の結果を表８に示す。
【０２８７】
【表１２】
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【０２８８】
このデータは、１．６（３つの対照測定値の平均値＋標準偏差）より大きい比率を有する変種は、野生型ＧＰＤ１より大きいＮＡＤＨ  ＫＭを有することを示していると解釈できる。ＫＭが大きい個々の単一変異体の二重変異体を、上記のようにして作成した。二重変異体および単一変異体を選択するための、ＮＡＤＨ  ＫＭ値の徹底的な分析を表９に示す。
【０２８９】
【表１３】
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【０２９０】
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＤの残基４４、４５、７３、および１２９（単独または組合せ）に対応するアミノ酸の変異により、ＮＡＤＨの場合のＧＰＤのＫＭを増大させることができることを、このデータは示している。図２に示すように、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＤのアミノ酸７３および１２９はそれぞれヒトＧＰＤのアミノ酸４１および９７に相当する。
【０２９１】
実施例２：Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＤよりもＮＡＤＨの場合のＫＭが大きい異種性ＧＰＤ酵素
この実施例では、ＮＡＤＨの場合のミカエリス定数（ＫＭ）が酵母菌ＧＰＤ１よりも大きいほかのグリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ酵素を特定した。
【０２９２】
ＮＡＤＨ  ＫＭの大きい酵素を特定するための１つの方法は、以前に特定された酵素について文献に公開されている値を使用することである。表１０は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ＧＰＤ１に関して報告されたものよりもＫＡＤＨ  ＫＭが大きい刊行物を挙げている。
【０２９３】
【表１４】
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【０２９４】
上記で引用したキイロショウジョウバ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の文献の酵素は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の飛行筋から来ている「ＧＰＤＨ１」と特定していた。しかし、その文献は、その酵素をコードする遺伝子に関する配列情報より前のものである。その後、この酵素の配列は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のゲノム配列からのアイソフォームＣであるグリセロール３ホスフェートデヒドロゲナーゼと特定された（ｇｉ：２２９４５７０８）（Ｃａｒｍｏｎ  ＆  ＭａｃＩｎｔｙｒｅ，２０１０，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｒｅｄｉｔｙ  １０１：２２５−２３４）。実施例１に略述した技法を用いて、この酵素を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現させた。ＫＭ値は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が発現したサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ＧＰＤ１を測定するために用いたその条件と類似の仕方で、また同じ条件下で測定した。１つの実験では、ＮＡＤＨ  ＫＭは、測定すると、どちらの酵素についても５μＭであった。すなわち、大きな違いはなかった。
【０２９５】
ＮＡＤＨの場合のＫＭが大きい自然界に存在するＧＰＤを特定するための別の方法は、酵素委員会命名（ｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）のＥＣ１．１．１．９４で定義されたＧＰＤに含まれているもの評価することである。それらの酵素には、ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨの両方を同様にうまく用いるものもあるが（例えば、Ｅｄｇａｒ  ＆  Ｂｅｌｌ，１９８０，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５５：３４９２−３４−９７）、ＮＡＤＰＨに対する選択性を有することを特徴としたものもある（Ｆｒｏｈｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ，２０１０，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏ  １９２：４２８１−４２８８；Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ，２００８，Ｙｅａｓｔ  ２５：１０７−１１６；Ｓａｋａｓｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ，２００４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １３：１３６１−１３７１；Ｒｕｉｊｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００４，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５０：１０９５−１１０１）。こうした選択性は、（同じ酵素のＮＡＤＰＨの場合のＫＭと比べて）ＮＡＤＨの場合のＫＭが大きいものとして示される可能性がある。実施例１に略述した技法を使用して、以下のＧＰＤ酵素についてのｐＢａｄ発現ベクターの合成遺伝子を調製した：（ａ）アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）ＤＳＭ４３０４（ｇｉ｜１１４９７６２１：ｃ７７５８８９−７７４８８２）（配列番号１４）；（ｂ）グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼのためのカンジダ・バーサチルス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）ＣｖＧＰＤ１遺伝子（ｇｉ｜１５７０６０２１４｜ｄｂｊ｜ＡＢ２９６３８５．１）（配列番号１５）；および（ｃ）発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）株ＢｕＶ６７−ＣＷＰＰ染色体（ｇｉ｜３８３４９９２５６：５３９９３０−５４０８８０）（配列番号１６）。
【０２９６】
実施例１の場合のように、これらのタンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させ、未精製細胞抽出物を用いてＮＡＤＨ  ＫＭ値を測定した。カンジダ・バーサチルス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）ＧＰＤは、測定できるほど大きな活性を生み出さなかった。アーキオグロブス・フルジダス（Ａｒｃｈｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）の酵素は、測定可能な活性があり、ＮＡＤＰＨについてはＫＭ＝７μＭ、ＮＡＤＨについては５μＭであった。また発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）の酵素も測定可能な活性があり、ＮＡＤＰＨについてはＫＭ＝４μＭ、ＮＡＤＨについては６６４μＭであった。
【０２９７】
発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）の酵素のＮＡＤＨの場合のＫＭは、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の場合のＫＭより大きかった。酵素のどの側面がＮＡＤＨに対する親和性のこの減少に寄与するかをさらに評価するために、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）の酵素の配列を、結合部位にＮＡＤ＋のあるヒト酵素の結晶構造と比較した。ヒト酵素の注目すべき特徴として、ＮＡＤ複合体が、ＮＡＤ＋のアデニン環の回りに挟まれたｐｈｅ４１およびｐｈｅ９７のパイ−スタッキングであるという点がある（ｐｄｂ：１Ｘ０Ｘ；Ｏｕ  ｅｔ  ａｌ，２００６  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３５７：８５８−８６９）。パイ−スタッキングは、非常に安定した構造であり、配列アラインメントは、相同の位置（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）が酵母菌ＧＰＤ１配列に維持されることを明らかにしている（ｐｈｅ７３、ｐｈｅ１２９）。しかし、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）では、アラインメントの相同の位置は、ａｒｇ３５およびａｌａ８５である（図２を参照）。これらのアミノ酸は、ＮＡＤＨ結合を不安定化させるであろうと予想され、ＮＡＤＨ  ＫＭの増大につながる。このことは、実施例１のこれらの位置での突然変異誘発によって確認された。
【０２９８】
ＮＡＤＨ  ＫＭの増大におけるこうしたアミノ酸の位置の役割をさらに確証するものとして、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）に含まれないもっとも密接に関連したＧＰＤ配列のうちの２つが、ＮＣＢＩデータベースのＢＬＡＳＴ検索によって特定された。もっとも密接に関連した配列のうちの２つは、ベギアトア・アルバ（Ｂｅｇｇｉａｔｏａ  ａｌｂａ）からのもの（ＢＬＡＳＴ  Ｅ値＝２ｅ−５１、３７％の配列同一性；配列番号１７）およびカンジエラ・コレンシス（Ｋａｎｇｉｅｌｌａ  ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）からのもの（ＢＬＡＳＴ  Ｅ値＝２ｅ−５０、３７％の配列同一性；配列番号１８）である。これらのタンパク質は、前述のようにして合成し、検査した。
【０２９９】
こうした酵素の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現レベルは低かったが、ベギアトア属（Ｂｅｇｇｉａｔｏａ）の酵素で測定された値は、ＮＡＤＰＨについてはＫＭ＝６μＭであり、ＮＡＤＨについては１０１μＭであった。一方、カンジエラ属（Ｋａｎｇｉｅｌｌａ）の酵素の値は、ＮＡＤＰＨについてはＫＭ＝１μＭであり、ＮＡＤＨについては２０１８μＭであった。ヒト酵素内でパイ−スタッキングを形成する２個のフェニルアラニンと相同の位置にあるアミノ酸は、ベギアトア属（Ｂｅｇｇｉａｔｏａ）の酵素のｌｙｓ８５およびｇｌｙ８６であり、カンジエラ属（Ｋａｎｇｉｅｌｌａ）の酵素のａｒｇ３５およびａｌａ８６である（図２を参照）。
【０３００】
こうした結果は、他の生物体からのある特定ＧＰＤは、ＮＡＤＨの場合のＫＭが高いことを確証しており、さらに、（例えば、パイ−スタッキングのフェニルアラニンの対に関係するアミノ酸を修飾することで）ＧＰＤ酵素を改変することにより、ＮＡＤＨの場合のＫＭを上昇させることができることも支持している。
【０３０１】
実施例３：ＧＤ１酵素変種を含む酵母菌株でのイソブタノールおよびグリセロールの産生  この実施例では、上で説明した変種のＧＰＤ１酵素が作り出される酵母菌株を、イソブタノールおよびグリセロールの産生について試験した。
【０３０２】
イソブタノール経路プラスミドを有するＰＮＹ２１４５のＧＰＤおよびＧＰＤ変種株を、完全合成寒天平板［アミノ酸を含まない１Ｘ酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ）、２％寒天（Ｄｉｆｃｏ）を含みウラシルを含まない１Ｘアミノ酸ドロップアウト（ｄｒｏｐ−ｏｕｔ）（Ｃｌｏｎｅ−ｔｅｃｈ）、０．２％エタノール］に蒔き、３００Ｃの培養器（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）で７２時間培養した。
【０３０３】
細胞を、完全合成培地［アミノ酸を含まない１Ｘ酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ）、２％寒天（Ｄｉｆｃｏ）を含みウラシルを含まない１Ｘアミノ酸ドロップアウト（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、１％グルコース（Ｓｉｇｍａ）、０．２％エタノール］に斑点状に付着させ、３０℃の培養器（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）で７２時間培養した。３０日間にわたって、３日ごとに同じ培地で繰り返し平板培養することにより細胞を適応させた。
【０３０４】
適応させた細胞の斑点を、初代培養である１２５ｍｌフラスコ（ＢＤ）中の１０ｍｌの完全合成液状培地［アミノ酸を含まない１Ｘ酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ）、ウラシル（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を含まず２％寒天（Ｄｉｆｃｏ）を含む１Ｘアミノ酸ドロップアウト、１％グルコース（Ｓｉｇｍａ）、０．２％エタノール］に接種し、培養器シェーカー（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）内で３０℃において２４時間、２５０ｒｐｍで培養した。初代培養物からの二次培養物を同じ培地（初期ＯＤが０．５）に接種し、さらに２４時間成長させた。２４時間後に、三次培養物を二次培養物（初期Ｏ．Ｄが０．５）からの同じ培地に接種し、さらに２４時間成長させた。その後、これらの細胞をＧＰＤ変種の評価研究に使用した。
【０３０５】
遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で遠心分離（３６００ｒｐｍ、５分間、室温）により細胞を回収し、１５ｍｌのファルコンチューブ（ｆａｌｃｏｎ  ｔｕｂｅｓ）内の産生培地（アミノ酸を含まない１Ｘ酵母窒素原基礎培地（Ｄｉｆｃｏ）、ウラシルを含まない１Ｘアミノ酸ドロップアウト（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、３５ｇ／Ｌグルコース（Ｓｉｇｍａ）、２ｇ／Ｌエタノール、１００ｍＭ  ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ）１Ｘペプトン（Ｄｉｆｃｏ）、１Ｘ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、１Ｍ  ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ）（ｐＨ５．２））（初期ＯＤが２）に懸濁させた。その後、培養物を、３０℃において培養器シェーカー（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）（２２５ｒｐｍ）で２０時間培養した。２０時間で試料を回収し、ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した（図３）。
【０３０６】
試料調製
２０時間で産生の終わりに培養物を回収し、１Ｘプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含んでいる１００ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ６．８）に各細胞ペレットを再び懸濁させた。細胞に対して３０秒間のビーズビーティング（Ｍｉｎｉ−Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ−１６，Ｂｉｏｓｐｅｃ）を５サイクル行って溶解させた。各サイクルの間に２ｍｉｎの間隔をあけた。溶解試料を、４０℃において、遠心分離機で遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ）にかけた。上澄みを注意深く別のチューブに移した。タンパク質の評価は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬（カタログ番号５００−０２０５、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて行った。凍結融解ステップは行わずに、新しい試料に対して直ちにＧＰＤ試験を行った。
【０３０７】
分析条件
グリセロール−３−ホスフェート（ＧＰＤ）の分析は、Ｃａｒｙ  １００  紫外可視分光光度計を使用し、１００ｍＭ  ＭＯＰＳ（Ｓｉｇｍａ）（ｐＨ６．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭのグルコース−６−ホスフェート、３ｍＵ／μｌのグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（カタログ番号Ｇ８４０４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１ｍＭのジヒドロキシアセトンホスフェート（カタログ番号Ｄ５１２６９，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、０．３ｍＭ  ＮＡＤＨ、および様々な濃度の細胞抽出物を含んでいる１ｍｌの量で行った。反応速度は、３４０ｎｍでのＮＡＤＨ濃度の減少に関して最初の１ｍｉｎの傾斜を取って、計算した。ＮＡＤＨの吸光係数は、６．２２ｍＭ−１ｃｍ−１と見なした。変種Ｎ８＿１、Ｅ８＿１およびＭ８＿１（すなわち、二重変異体Ｆ７３Ｇ／Ｆ１２９Ｇを有するもの）の場合、ＮＡＤＨ濃度は０．４５ｍＭまで増大した。これは、これらの変種にとってＮＡＤＨの飽和に達していないレベルである。
【０３０８】
結果の回帰分析
この部で用いたデータを表１１に示す。そのデータは、代謝産物の測定値および上述したＧＰＤの生体外の測定値を含んでいる。上昇する測定ＧＰＤ活性が、飽和に達していない量のＮＡＤＨでの測定と異なることを考慮に入れるため、Ｖｍａｘでの全活性を、速度に関するＧＰＤ（Ｕ／ｍｇ）および表９で求めたＫＭ値を用いて、Ｖｍａｘに関する単一基質のＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎ方程式を解くことにより計算した。
【０３０９】
【表１５】
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【０３１０】
最初、変更のないＧＰＤと変種ＧＰＤの両方の組み込みを上記の方法にしたがって行うと、ＧＰＤ活性の量（イソブタノール産生の後の酵母菌細胞抽出物で分析）が変わることが観察された。ＧＰＤの比活性は、１０倍も変化しうる。イソブタノール／グリセロールの比率も、図４に示すように、検出されたＧＰＤ活性のレベルとは逆相関を示した。その図に示されるように、この関係の線形回帰のＲ２値は、６０．１％であったが、交差検証されたＲ−Ｓｑ（ｐｒｅｄ）値（イソブタノール／グリセロール比率の未知の値を、ＧＰＤ活性データが予測できる力を示す）は、たった２５．０４％だった。この結果は、相関はあっても、ＧＰＤ活性だけは、この比率の良好な予測因子とはならないことを示した。
【０３１１】
この因子により、グリセロールおよびイソブタノールの産生に対する、ＫＭの大きいＧＰＤ変種の寄与の変化を検出するのが困難になった。というのは、ＮＡＤＨ  ＫＭの増大による有益な効果が、予測不能な活性レベルによって覆われたからである。こうした効果をさらに理解するために、表１１のデータに多重線形回帰分析を適用して、変種の特性がいっそう明確に定量化できるかどうかを判断した。Ｍｉｎｉｔａｂ（Ｍｉｎｉｔａｂ  Ｖ１６．２．１，Ｍｉｎｉｔａｂ  Ｉｎｃ．；Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，ＰＡ）を用いて、モデル化パラメーターに対して複数回の線形回帰（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｏｕｎｄｓ  ｏｆ  ｌｉｎｅａｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）を行い、残りの係数のＰ値がすべて０．０５未満になるまで、手作業で最大Ｐ値の寄与パラメーターを取り除いた。これにより、最大Ｒ−ｓｑ（ｐｒｅｄ）値の回帰方程式が得られた。これは、新しい観測値をそのモデルが予測できることを示した。表１１中の代謝測定値の２つにより、生理学的に解釈されうる独立した寄与パラメーターを持つモデルが生み出された。
【０３１２】
イソブタノール濃度は、表１１からの以下のパラメーターを用いてモデル化した：消費されたグルコース、エタノール、グリセロール、収率、ＧＰＤ  ＫＭ、およびＧＰＤ  Ｖｍａｘ。もっとも重要性の低いパラメーターを除去すると、３個のパラメーター（予測因子）（消費されたグルコース、ＧＰＤ  ＫＭ、およびＧＰＤ  Ｖｍａｘ）を有する回帰モデルが得られた（図５および表１２に示す）。このモデルのＲ−Ｓｑ値は９８．６％である。このモデルのＲ−Ｓｑ（ｐｒｅｄ）値は、９４．３２％であり、この回帰方程式により、高度の予測値が与えられることを示している。回帰モデルを生理学的に解釈すると、イソブタノール濃度は、消費されたグルコースおよびＧＰＤ  ＫＭ値からのプラスの寄与、およびＧＰＤ  Ｖｍａｘ値からのマイナスの寄与によって予測されることが示唆される。したがって、消費されるグルコースがどんな量でも、ＧＰＤ  ＫＭが高くなると、イソブタノール濃度が増大することになる。同様に、（Ｖｍａｘ値として）測定されるＧＰＤ酵素の活性のレベルが増大すると、イソブタノール濃度は減少することになる。
【０３１３】
【表１６】
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【０３１４】
回帰モデルでは、これらの効果の大きさを評価できた。３０ｇ／Ｌのグルコース消費レベルおよび０．００２６Ｕ／ｍｇのＧＰＤ  Ｖｍａｘでは、ＫＭを１１μＭ（野生型）から５５０μＭに増大させると、イソブタノール濃度が１４％増大した。しかし、３０ｇ／Ｌのグルコース消費レベル、１１μＭのＫＭでは、ＧＰＤレベルが０．００１５Ｕ／ｍｇから０．０１９Ｕ／ｍｇに増大すると（表１１からの活性の最大の変化）、イソブタノール濃度が２５％減少する。したがってこの回帰モデルは、ＮＡＤＨに対するＧＰＤ親和性を減少させると（ＫＭの増大）、ここに示した試料のイソブタノール濃度が増大することを示した。
【０３１５】
イソブタノールの収率（イソブタノール（グラム）／消費されたグルコース（グラム））は、表１２からのパラメーター（消費されたグルコース、エタノール、グリセロール、イソブタノール、ＧＰＤ  ＫＭ、およびＧＰＤ  Ｖｍａｘ）を用いて同様にモデル化した。もっとも重要性の低いパラメーターを除去すると、２つのパラメーター（ＧＰＤ  ＫＭ、およびＧＰＤＶｍａｘ）を用いた回帰モデルが得られる（図６および表１３を参照）。この回帰モデルは、Ｒ−Ｓｑ値が９３．９％であった。この回帰モデルは、Ｒ−Ｓｑ（ｐｒｅｄ）値が７６．３％である収率を予測した。注目すべき点として、このモデルは、ＧＰＤ酵素の活性レベルおよびＫＭだけに依存するものである。イソブタノール濃度回帰モデルと同様に、ＧＰＤ  Ｖｍａｘは収率に対しては好ましくない影響を及ぼす。この回帰モデルでは、観察された最低のＧＰＤ活性レベルである０．００１５Ｕ／ｍｇで、ＧＰＤのＫＭが１１μＭ（野生型）から５５０μＭに増大すると、収率が２８％向上した。ここで観察された最大のＧＰＤ活性レベル（０．０１９Ｕ／ｍｇ）では、収率の向上は７８％
だった。
【０３１６】
【表１７】
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【０３１７】
実施例４：予測（Ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ）
この実施例では、上述の異種性ＧＰＤ１酵母菌組み込み体を、イソブタノールおよびグリセロールの産生に関して試験する。
【０３１８】
増殖培地および手順
酵母菌株の成長が進行する間、２種類の培地（好気性の培養前の培地および嫌気性の培地）を使用する。薬品はすべて、特に記載のない限り、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得ている。
【０３１９】
好気性の培養前培地（ＳＥ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ）：６．７ｇ／Ｌ酵母窒素原基礎培地（アミノ酸を含まない）（Ｄｉｆｃｏ，２９１９４０，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、１．４ｇ／Ｌ酵母菌合成ドロップアウトサプリメント（ヒスチジン、ロイシン、トリプトファンおよびウラシルを含まない）、０．２％エタノール、０．２％グルコース、０．０１％（ｗ／ｖ）ロイシンおよび０．００２％（ｗ／ｖ）トリプトファン。
【０３２０】
嫌気性の培地（ＳＥＧ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ）：５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．５）、６．７ｇ／Ｌ酵母窒素原基礎培地（アミノ酸を含まない）（Ｄｉｆｃｏ，２９１９４０，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、１．４ｇ／Ｌ酵母菌合成ドロップアウトサプリメント（ヒスチジン、ロイシン、トリプトファンおよびウラシルを含まない）、０．１％エタノール、３％グルコース、０．０１％ロイシン、０．００２％トリプトファン、３０ｍｇ／Ｌニコチン酸、３０ｍｇ／Ｌチアミンおよび１０ｍｇ／Ｌエルゴステロール（５０／５０（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ／エタノール溶液中に含まれる）。
【０３２１】
斑点状の細胞を２５ｍＬのＳＥＧ−Ｕｒａ、Ｈｉｓ培地（０．２％グルコースおよび０．２％エタノールを含む）に接種し、蓋が閉じられた状態で漸進的に酸素が制限される条件下で、３０℃においておよそ４８時間、振盪させながら成長させる。これは、目的とするＯＤ６００値であるおよそ１．５〜２が達成されるまで行う。ＯＤ６００の値を記録する。細胞は遠心分離でペレット化し、上澄みを廃棄する。細胞ペレットをＣｏｙ  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  Ｂａｇ（Ｇｒａｓｓ  Ｌａｋｅ，ＭＩ）に移し、その中で、ペレットを１．０ｍＬの嫌気性増殖培地（ＳＥＧ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ）中に再懸濁させる。再懸濁細胞ペレットを用いて、５０ｍＬ血清瓶（Ｗｈｅａｔｏｎ，２２３７４８，Ｍｉｌｌｖｉｌｌｅ，ＮＪ）内の３０ｍＬのＳＥＧ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ培地に接種して、目的の初期ＯＤ６００値である０．２にする。接種の前に、嫌気性培地、血清バイアル、栓およびクリンプはすべて、少なくとも２４時間、嫌気性バッグの中でガスが抜けるようにする。血清瓶に栓をし、クリンプし、嫌気性バッグから取り出して、２４０ｒｐｍで振盪させながら３０℃で成長させる。嫌気性培養物は、ＯＤ６００値が少なくとも１．２となるように２４〜７２時間成長させる。更なる嫌気性成長ステップでは、前の嫌気性培養ステップからの細胞を接種材料として用いた。それぞれの変種について３種類の形質転換体を評価した。
【０３２２】
変種および異種性酵母菌ＧＰＤ１菌株のＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣ分析のため、またＯＤ６００値を得るために、嫌気性成長期間の終わりに試料を採取する。Ｓｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ  ＳＨ−ＧｐプレカラムおよびＳｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ  ＳＨ１０１１分離カラム（Ｓｈｏｄｅｘ，ＪＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）と一緒に、Ｗａｔｅｒｓ２６９５分離装置、２９９６フォトダイオードアレイ検出器、および２４１４屈折率検出器（Ｗａｔｅｒｓ，  Ｍｉｌｆｏｒｄ，  ＭＡ）を用いて、ＨＰＬＣ分析を実施した。０．５ｍＬ／ｍｉｎの流量で、０．０１Ｎ硫酸での定組成溶離で化合物を分離する。Ｗａｔｅｒｓ  Ｅｍｐｏｗｅｒ  Ｐｒｏソフトウェアを用いて、クロマトグラムを分析した。グリセロール、イソブタノールのモル収率およびイソブタノール／グリセロール比率を求める。それぞれの変種および異種性ＧＰＤについて３回分析して、平均偏差および標準偏差を計算した。コドン最適化ＧＰＤ１対照値との値の違いが、統計学的に有意かどうかスチューデントｔ検定を使用して判定した。
【０３２３】
実施例５：イソブタノール産生に対するｇｐｓＡの影響
１００ｍＭ  ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、３ｇ／Ｌのグルコースおよび３ｇ／Ｌのエタノールを含みヒスチジンおよびウラシルが欠けている酵母菌合成培地で、菌株ＣＰＮ９７およびＰＮＹ２３１０を成長させた。各菌株からのコロニーを選択し、１０ｇ／Ｌのグルコースおよび１００ｍＭ  ＭＥＳを含みヒスチジンおよびウラシルを含まない１０ｍｌの酵母菌合成培地に接種し、３０℃において２００ｒｐｍで一晩培養した。一晩中培養した後、２０ｇ／Ｌのグルコースおよび１００ｍＭ  ＭＥＳを含みヒスチジンおよびウラシルを含まない１０ｍＬの酵母菌合成培地中に、ＯＤ６００＝０．４になるまで、細胞を再懸濁し、３０℃において２００ｒｐｍで４時間培養した。その後、細胞を回収し、２０ｍｌの血清バイアル（Ｗｈｅａｔｏｎ；Ｍｉｌｌｖｉｌｌｅ，ＮＪ）中の２０ｇ／Ｌのグルコースおよび１００ｍＭ  ＭＥＳを含みヒスチジンおよびウラシルを含まない１０ｍＬの酵母菌合成培地に、ＯＤ６００＝０．２になるまで再懸濁し、ブチルゴム栓で蓋をし、密閉した。バイアルを３０℃の培養器に入れ、２００ｒｐｍで回転させ、２８時間および４２．５時間培養した。試験する菌株ごとに２つのバイアルを用意した。
【０３２４】
２８時間および４２．５時間後に、１つのバイアルの蓋を開け、ＯＤ６００を測定し、ブロスをＨＰＬＣで分析した。３００ｍｍ×７．８ｍｍ  ＢｉｏＲａｄ−Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ排除カラム（ＢｉｏＲａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）（５０℃で保温され、ＢｉｏＲａｄ−Ｍｉｃｒｏｇｕａｒｄ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｈスペア（３０ｍｍ×４．６ｍｍ）が装備されている）を用いて、屈折率検出器を備えているＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣシステムでＨＰＬＣ分析を実施した。０．６ｍｌ／ｍｉｎの流量で、０．０１Ｎ硫酸の流動緩衝液で試料を流した。ＨＰＬＣ分析から、イソブタノール収率（図７）およびイソブタノール／グリセロール比率（図８）は、ＣＰＮ９７ではＰＮＹ２３１０と比べて増大し、グルコース消費は、ＣＰＮ９７ではＰＮＹ２３１０と比べて減少する（図９）ことが、観察された。好気条件で成長する一方、時間との関係での光学濃度（ＯＤ）は類似していた。
【０３２５】
実施例６：フィードバック抵抗性ｇｐｓＡの生成
予測
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５染色体ＤＮＡおよびプライマーＰｔｒｃ−ｇｐｓＡ  Ｎｃｏｌ  Ｆ（配列番号２３８）およびＰｔｒｃ−ｇｐｓＡ  ＰｓｔＩ  Ｒ（配列番号２３９）を用いて、ｇｐｓＡ対立遺伝子を増幅した。ＧｅｎｅＡｒｔシームレスクローニング・アセンブリキット（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、ｇｐｓＡ対立遺伝子を、ＮｃｏＩｌＰｓｔＩ消化ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；  Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内にクローン化して、ｐＣＰＮ１２４を形成させた。
【０３２６】
Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）のＧｅｎｅＭｏｒｐｈＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットを用いて、ｐＣＰＮ１２４に、誤りが生じやすい突然変異誘発を行わせる。得たプラスミドを菌株ＢＢ２６−３６（Ｂｅｌｌ、Ｊ．Ｂａｃｔ．１１７：１０６５−１０７６（１９７４））に入れて形質転換する。菌株ＢＢ２６−３６はｐｌｓＢ遺伝子に変異を含む。さらに、菌株は、親株ＢＢ２６のグリセロール−３−ホスフェート栄養素要求性を有していない。これは、フルクトース−１，６−ジホスフェート（ｆｒｕ−１，６−ｄｉＰ）によるグリセロールキナーゼ（ＧｌｐＫ）の抑制を失っているからであり、そのため、ＢＢ２６−３６はグリセロール−３−ホスフェートを産生することができ、最少培地Ｍ９にグリセロール（３ｇ／Ｌ）およびグルコース（３ｇ／Ｌ）を加えたもので成長する（Ｍ９は、１リットル当たり、１２．８ｇのりん酸水素ナトリウム７水和物、３ｇの第一りん酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｍｏｎｏｂａｓｉｃ）、０．５ｇの塩化ナトリウム、１ｇの塩化アンモニウム、０．２４ｇの硫酸マグネシウム、および１１．１ｍｇの塩化カルシウムを含む）。
【０３２７】
形質転換反応物（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を、５ｇ／Ｌのグルコースおよび５０ｍｇ／Ｌのカーベニシリンを含んでいるＭ９培地で平板培養した。こうしたプレート上で成長するコロニーからプラスミドを抽出し、ｇｐｓ遺伝子の配列を決定する。突然変異タンパク質のＧｐｓＡ活性を測定した。またグリセロール−３−ホスフェートのＫｉを測定する。その後、野生型タンパク質と比べてＫｉの大きいタンパク質を用いて酵母菌染色体のＧＰＤ１と置き換え、イソブタノールおよびグリセロールの産生量を測定する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2016511010.tif 000030
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