(57)【要約】本発明は、止血効能評価用動物モデル及びその用途に関し、より詳細には、総頚動脈（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ａｒｔｅｒｙ（ＣＣＡ））または上矢状静脈洞（Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  Ｓａｇｉｔｔａｌ  Ｓｉｎｕｓ（ＳＳＳ））に出血が誘導された止血効能評価用動物モデル及び前記効能評価動物モデルを利用した止血剤のスクリーニング方法及び効能評価方法に関する。本発明に係る止血効能評価用動物モデルは、止血剤に対する止血効果を副作用なしに迅速かつ持続的に観察できて、止血剤のスクリーニング及び効能評価に有用である。
2016513952.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
総頚動脈（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ａｒｔｅｒｙ（ＣＣＡ））に出血が誘導されている止血効能評価用動物モデル。
【請求項２】
前記止血効能評価用動物モデルは、下記の工程を経て製造されたことを特徴とする請求項１に記載の止血効能評価用動物モデル：
（ａ）動物の動脈手術部位を確保する工程；及び
（ｂ）前記動物の総頚動脈（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ａｒｔｅｒｙ（ＣＣＡ））に出血を誘発させる工程。
【請求項３】
前記動物は、ラットであることを特徴とする請求項２に記載の止血効能評価用動物モデル。
【請求項４】
前記工程（ｂ）は、手術部位を確保するために血管の周囲の結合組織を除去した後、注射器を利用して総頚動脈（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ａｒｔｅｒｙ（ＣＣＡ））に出血を誘導することを特徴とする請求項２に記載の止血効能評価用動物モデル。
【請求項５】
上矢状静脈洞（Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  Ｓａｇｉｔｔａｌ  Ｓｉｎｕｓ（ＳＳＳ））に出血が誘導されている止血効能評価用動物モデル。
【請求項６】
前記動物モデルは、下記の工程を経て製造されたことを特徴とする請求項５に記載の止血効能評価用動物モデル：
（ａ）動物の静脈手術部位を確保する工程；及び
（ｂ’）前記動物の上矢状静脈洞（Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  Ｓａｇｉｔｔａｌ  Ｓｉｎｕｓ（ＳＳＳ））に出血を誘発させる工程。
【請求項７】
前記動物は、ラットであることを特徴とする請求項６に記載の止血効能評価用動物モデル。
【請求項８】
前記工程（ｂ）は、２０Ｇ医療用ナイフを利用して動物の上矢状静脈洞（Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  Ｓａｇｉｔｔａｌ  Ｓｉｎｕｓ（ＳＳＳ））に損傷を与えて出血を誘導させることを特徴とする請求項６に記載の止血効能評価用動物モデル。
【請求項９】
請求項１から請求項４のいずれかに記載の止血効能評価用動物モデルを利用して、止血剤候補物質から止血剤をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
前記止血効能評価用動物モデルの出血部位に止血剤候補物質を塗布及び圧迫後、止血の有無を確認することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項５から請求項８のいずれかに記載の止血効能評価用動物モデルを利用して、止血剤候補物質から止血剤をスクリーニングする方法。
【請求項１２】
前記止血効能評価用動物モデルの出血部位に止血剤候補物質を塗布及び圧迫後、止血の有無を確認することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１から請求項８のいずれかに記載の止血効能評価用動物モデルを利用した止血剤の効能評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、止血性能評価動物モデル及びその用途に関し、より詳細には動物の総頚動脈（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ａｒｔｅｒｙ（ＣＣＡ））または上矢状静脈洞（Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  Ｓａｇｉｔｔａｌ  Ｓｉｎｕｓ（ＳＳＳ））に出血が誘発されている止血剤性能評価動物モデル及び前記動物モデルを利用した止血剤スクリーニング方法及び止血剤効能評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
「医療用瞬間接着剤」は、広い意味では絆創膏で代表される粘着剤から医療用具の包装、外科用接着剤及び止血剤などを含み、狭い意味では皮膚、血管、消化器、整形外科など医療分野に直接的に用いられる接着剤を意味する。従って、医療用瞬間接着剤は皮膚に接触するので、生体適合性が求められ、生体内で毒性と危害性がなく、生分解性及び止血効果があり、水分がある所でも瞬間的に接着が終結できて、生体の治癒の妨げなってはならない。
【０００３】
現在実用化されている医療用接着素材としては、シアノアクリレート系、フィブリン糊系、ゼラチン糊系、ポリウレタン系などがあって、米国のＣｌｏｓｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ社はＤｅｒｍａｂｏｎｄというオクチルシアノアクリレートの医療用組織接着剤を商品化して、１９９７年８月ヨーロッパ共同体の販売承認を得たのに続き、１９９８年米国ＦＤＡから承認を受けた。Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎの系列会社であるＥｔｈｉｃｏｎ社は、この商品に対して独占販売権を持って、米国、ヨーロッパ、日本など５０ヶ国で同時に販売に入り、全世界的に裂傷と整形手術及び再建外科手術後、切開部分の皮膚を縫合する医療用途に適用範囲を拡大している。また、生体適合性及び生分解性を考慮して、１，２−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｉｄｅｎｅｇｌｙｃｅｒｙｌ  ２−ｃｙａｎｏａｃｒｙｌａｔｅｓ、ａｌｋｙｌ  ２−ｃｙａｎｏａｃｒｙｌｏｙｌ  ｇｌｙｃｏｌａｔｅｓ及びｐｏｌｙ（ｔｒｉｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅｏｘａｌａｔｅ）を含有したｍｅｔｈｏｘｙｐｒｏｐｙｌ  ｃｙａｎｏａｃｒｙｌａｔｅｓなどを利用した組織接着剤研究が活発に進行している。
【０００４】
接着素材であるフィブリンに機能性を付与するために、タンパク質分解酵素基質及び特定細胞と結合できるリガンド用ペプチドの生体活性物質をフィブリンに適用する研究を進めている。米国のＣｏｈｅｓｉｏｎ社は、患者自身の血漿と結合させたトロンビンと牛のコラーゲンを含有したフィブリン−コラーゲン複合組織接着剤であるＣｏＳｔａｓｉｓＴＭを開発して止血剤として応用している。１９９８年米国ＦＤＡからティシール（Ｔｉｓｓｅｌ）との手術用グル（ｇｌｕｅ）が初めて心臓迂迴路手術、大腸手術、外傷などに用いられるように許可されて、他の種々の製品がＦＤＡ承認を待っている。
【０００５】
実際、実験動物を利用した医療用接着剤動物モデル研究が次の通り報告された。Ｂｉｊａｎ  Ｓ．はウサギを利用した動物モデルで大動脈に損傷を与えて、医療用接着剤であるＧｅｌｆｏａｍ、Ａｖｉｔｅｎｅ、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ、ＦｌｏＳｅａｌの止血効果を測定した（Ｂｉｊａｎ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０６：９９−１０７，２００２）。また、Ｈａｓａｎ  Ｂｉｌｇｉｌｉは、豚出血動物モデルを利用して、皮膚、肝と脾臓、そして静脈と動脈に出血を誘導した後、止血効果を評価した（Ｈａｓａｎ  Ｂｉｌｇｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄ  Ｐｒｉｎｃ  Ｐｒａｃｔ，１８：１６５−１６９  ２００９）。その他にもＯｚｅｒ  Ｋａｎｄｅｍｉｒ等は、ラット（ｒａｔ）の大動脈出血モデルを利用して新しい止血有効性分の効能を病理学的、そして免疫組織学的な所見を調べることでその効能を調べた（Ｏｚｅｒ  Ｋａｎｄｅｍｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ、５：１１０，２０１０）。
【０００６】
既存動物モデルとは異なり、血が湧き上がるように出てくる血液噴出型のように自然止血が困難な場合、血液が噴出する状況で止血剤に対する止血効果を立証するモデルはない実情である。それと共に、動脈出血のような最も激しい出血形態、即ち傷から相当な高さの血が湧き上がる状態では、血が速い速度で流れ出て多量の血を失うと凝固もほとんどできなくなるので、このような状況での止血剤性能を評価することは容易ではない。
【０００７】
それと共に、止血剤効能評価のための止血剤動物モデル製作時、動脈及び静脈の特性により血管選定が困って、その製作に制限がある。
【０００８】
一方、上矢状静脈洞の出血は、副鼻腔手術（Ｓｉｎｕｓ  ｓｕｒｇｅｒｙ）において避けられなく、よく起きる出血であるが、周辺が硬組織で構成されて、効果的な止血剤の選別が難しく、出血抑制組成物を選定するための効果的な動物モデルも存在しないため、軟組織から選別された止血剤を使っているのが現状である。
そこで、本発明者等は、新しく、効果的な止血性能評価動物モデル及びこれを利用した止血剤の効能評価方法を開発するために努力を継続した結果、動物の総頚動脈（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ａｒｔｅｒｙ（ＣＣＡ））または上矢状静脈洞（Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  Ｓａｇｉｔｔａｌ  Ｓｉｎｕｓ（ＳＳＳ））に出血が誘発された動物モデルを製作して、前記動物モデルが止血剤の効能をテストするのに有用であることを確認することによって、本発明を完成することになった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｉｊａｎ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０６：９９−１０７，２００２
【非特許文献２】Ｈａｓａｎ  Ｂｉｌｇｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄ  Ｐｒｉｎｃ  Ｐｒａｃｔ，１８：１６５−１６９  ２００９
【非特許文献３】Ｏｚｅｒ  Ｋａｎｄｅｍｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ、５：１１０，２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、止血剤性能評価用動物モデルを提供するところにある。
本発明の他の目的は、前記動物モデルを利用した止血剤のスクリーニング方法を提供するところにある。
本発明のさらに他の目的は、前記動物モデルを利用した止血剤の効能評価方法を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成するために、本発明は、総頚動脈（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ａｒｔｅｒｙ（ＣＣＡ））に出血が誘導されている止血効能評価用動物モデルまたは上矢状静脈洞（Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  Ｓａｇｉｔｔａｌ  Ｓｉｎｕｓ（ＳＳＳ））に出血が誘導されている止血効能評価用動物モデルを提供する。
本発明はまた、前記止血効能評価用動物モデルを利用して、止血剤候補物質から止血剤をスクリーニングする方法を提供する。
本発明はまた、前記止血効能評価用動物モデルを利用した止血剤の効能評価方法を提供する。
【００１２】
本発明の他の特徴及び具現例は、以下の詳細な説明及び添付された特許請求範囲からより一層明白になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実験動物の麻酔をかける工程を示す図面である。
【図２】実験動物を麻酔した後、手術する部位を除毛して、実験台（Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  ｆｒａｍｅ）に頭を固定した状態を示した図面である。
【図３】温度センサーに潤滑剤を塗って、実験動物の尻尾を捉え上げた後、肛門に温度センサーを挿入する工程を示す図面である。
【図４】動脈モデルの手術部位を切開して、動脈を露出するために結合組織を除去する様子を示す図面である。
【図５】動脈モデルの手術部位である総頚動脈（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ａｒｔｅｒｙ（ＣＣＡ））を示す図面である。
【図６】出血誘導後、止血のために止血剤を綿に塗布した様子を示す図面である。
【図７】静脈モデルにおいて、頭の頭皮を切開する様子を示す図面である。
【図８】頭蓋骨を切開して手術部位の確保及び上矢状静脈洞（Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  Ｓａｇｉｔｔａｌ  Ｓｉｎｕｓ（ＳＳＳ））の位置を示す図面である。
【図９】動脈動物モデルを利用して止血剤候補物質の止血効能テスト結果を示す図面である。
【図１０】静脈動物モデルを利用して止血剤候補物質の止血効能テスト結果を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する實驗方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００１５】
従って、一観点において、本発明は、総頚動脈（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ａｒｔｅｒｙ（ＣＣＡ））及び上矢状静脈洞（Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  Ｓａｇｉｔｔａｌ  Ｓｉｎｕｓ（ＳＳＳ））に出血が誘導されている止血効能評価用動物モデルに関する。
【００１６】
一実施例で、本発明に係る止血効能評価用動物モデルは、下記の工程を経て製作することができる：（ａ）動物の動脈手術部位を確保する工程；及び（ｂ）前記動物の総頚動脈（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ａｒｔｅｒｙ（ＣＣＡ））に出血を誘発させる工程。
【００１７】
他の実施例で、本発明に係る止血効能評価用動物モデルは、下記の工程を経て製作することができる：（ａ’）動物の静脈手術部位を確保する工程；及び（ｂ’）前記動物の上矢状静脈洞（Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  Ｓａｇｉｔｔａｌ  Ｓｉｎｕｓ（ＳＳＳ））に出血を誘発させる工程。
【００１８】
本発明において、前記工程（ａ）以前に、実験動物を麻酔させる工程を追加で含むことができる。
【００１９】
このような麻酔は、当業界で当業者が通常行う方法により行われ、その方法に限定があるのではないか、ゾレチル／ロムプンを投与して麻酔する方法（Ｚｏｌｅｔｉｌ／Ｒｏｍｐｕｎ）；ケタミン／キシラジン／アセプロマジン（ｋｅｔａｍｉｎｅ／ｘｙｌａｚｉｎｅ／ａｃｅｐｒｏｍａｚｉｎｅ）を投与して麻酔する方法；ペントバルビタールナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ）単独投与で麻酔する方法；またはイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）を利用して麻酔する方法を利用することが好ましい。
【００２０】
本発明の一例として、前記麻酔法は、ゾレチル／ロムプン（Ｚｏｌｅｔｉｌ／Ｒｏｍｐｕｎ）で維持して、手術中には輸液（Ｌａｃｔａｔｅｄリンゲル液など）を投与して、手術後には抗生剤と鎮痛剤を投与することでなされる。
【００２１】
前記（ａ）及び（ａ’）工程での実験動物は、出血が誘発可能なすべての動物を含むことができ、好ましくは哺乳類、より好ましくはマウス、ギニアピッグ、ハムスター、ネズミなどのげっ歯類、猫、犬、豚、ウサギ、羊、ヤギ、鹿、馬、牛、ヒヒ、チンパンジー及び猿のような非人間霊長類を含むことができる。
【００２２】
前記（ｂ）及び（ｂ’）工程での総頚動脈及び上矢状静脈洞は、実験動物の種類と関係ない部位的な特性を有することを特徴とする。
【００２３】
一例として、動物は７〜１５週齢のげっ歯類が用いられ、好ましくはラットであり、１０週齢、３５０〜５００ｇの個体を用いることがさらに好ましい。
【００２４】
本発明において、動脈（Ａｒｔｅｒｙ）は、血の量（出血量）が多くて、出血時間と部位を定量化する基準になって、静脈（Ｖｅｉｎ）は、頭蓋骨切開の標準化及び静脈を選択する基準になる。
【００２５】
本発明において、前記総頚動脈（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ａｒｔｅｒｙ（ＣＣＡ））は、心臓から脳と頭に血液を供給する頚動脈で、損傷時血液が噴出する特性を持つので、総頚動脈（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ａｒｔｅｒｙ（ＣＣＡ））に出血を誘発させる場合、止血剤の効能をテストできる効果的な動物モデルを製作することができる。
【００２６】
以下、総頚動脈（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ａｒｔｅｒｙ（ＣＣＡ））に出血が誘発された動物モデルを製作する工程を具体的に説明する。
【００２７】
本発明において、前記動物は、麻酔及び固定した後、手術部位を除毛及びベタジンで消毒して、ラットの胸の線から首部分の中央線（ｍｉｄｌｉｎｅ）を１〜５ｃｍ程度切開した後（はさみ）、綿棒で結合組織を除去することが好ましく、さらに好ましくは胸の線から首部分の中央線（ｍｉｄｌｉｎｅ）を３〜４ｃｍ程度切開する。
【００２８】
前記切開部位の血管上側を通る筋肉（Ｏｍｏｈｙｏｉｄ  ｍｕｓｃｌｅ）を綿棒で切って、顕微鏡で観察して、鉗子で血管の周囲の結合組織を除去して、総頚動脈（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ａｒｔｅｒｙ（ＣＣＡ））を確保して、圧迫しやすいように十分な空間を上下に確保することが好ましい。
【００２９】
確保した総頚動脈（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ａｒｔｅｒｙ（ＣＣＡ））を１０〜４０ＧのＮｅｅｄｌｅで一定角度に傾けて刺して、損傷を与えて出血を誘導する。この時、３１Ｇの注射器で角度は３０度程度に傾けて刺して出血を誘導することが好ましい。
【００３０】
本発明において、上矢状静脈洞（Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  Ｓａｇｉｔｔａｌ  Ｓｉｎｕｓ（ＳＳＳ））は、損傷時自然止血が難しく、閉塞など副作用が誘発されやすいので、ここに出血を誘発させる場合、止血剤の効能をテストできる効果的な動物モデルを製作することができる。
【００３１】
次に、上矢状静脈洞（Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  Ｓａｇｉｔｔａｌ  Ｓｉｎｕｓ（ＳＳＳ））に出血が誘発された動物モデルを製作する工程を具体的に説明する。
【００３２】
まず、動物の眉間から耳がある部分まで中央線（Ｍｉｄｌｉｎｅ）をメス（１０号）を利用して切開時１〜５ｃｍ程度、好ましくは２〜３ｃｍ程度切開した部分を広げて鉗子で固定させて、綿棒を利用して結合組織を除去した後、頭蓋骨が露出されるようにする。
【００３３】
次に、露出された頭蓋骨のＬａｍｂｄａとＢｒｅｇｍａの中央をグラインダーを利用して１〜１０ｍｍ程度で削り、好ましくはダイヤモンドグラインダーを用いて、５ｍｍ程度削って、最大限薄く削った後、先が鋭い鉗子またはメスを利用して骨がそっと露出されるようにする。
【００３４】
頭蓋骨除去後、露出した静脈を１０〜４０Ｇ手術用刃物（ｍｅｄｉｃｕｔ）を利用して損傷を与えて出血を誘導させる。
【００３５】
本発明に係る総頚動脈（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ａｒｔｅｒｙ（ＣＣＡ））または上矢状静脈洞（Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  Ｓａｇｉｔｔａｌ  Ｓｉｎｕｓ（ＳＳＳ））に出血が誘導されている動物モデルは、止血剤候補物質の効能を評価したり、止血剤候補物質から止血剤をスクリーニングするのに利用することができる。
【００３６】
出血を誘導させた後、総頚動脈（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ａｒｔｅｒｙ（ＣＣＡ））に出血が誘発された部位を綿で圧迫したり、止血剤候補物質を塗布した綿で覆って１〜１０分後圧迫した綿を除去して止血されたかを確認する。前記止血剤候補物質を塗布（０．５ｍｌ）した綿で出血部位に塗布及び圧迫後、２分に止血の有無を確認することが好ましい。
【００３７】
前記止血効能評価用動物モデルの出血部位に止血剤候補物質を塗布及び圧迫後、止血の有無を確認することを特徴とする。
【００３８】
出血を誘発させた後、上矢状静脈洞（Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  Ｓａｇｉｔｔａｌ  Ｓｉｎｕｓ（ＳＳＳ））に出血が誘発された部位に止血剤候補物質０．１〜１ｍｌを出血部位に塗布した後、２分に止血の有無を確認することが好ましい。
【００３９】
本発明において、前記止血剤候補物質は、溶媒に懸濁させた後、前記動物モデルの手術部位に用いることが好ましい。
【００４０】
従って、他の観点において、本発明は、止血効能評価用動物モデルを利用して、止血剤候補物質から止血剤をスクリーニングする方法に関する。
【００４１】
また他の観点において、本発明は、  前記止血効能評価用動物モデルを利用した止血剤の効能評価方法に関する。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
実施例１．止血効能評価用動物モデルの製造（Ａｒｔｅｒｙ）
止血効能評価用動物モデルを製作するために、ラットの後足の筋肉に０．１ｍｌ／１００ｇ（ゾレチル５ｍｌ＋ロムプン２．５ｍｌ）を筋肉注射（Ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）して麻酔後、２０分後から施術を始めた（図１）。
【００４３】
本実施例で用いられた動物は、１０週齢ＳＤ／Ｒａｔで３５０〜４５０ｇ程度である。
また、施術する部位を広く除毛して、実験台（Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  ｆｒａｍｅ）に固定させて（図２）、一定の体温維持のために保温パッド（Ｗａｒｍ  ｐａｄ）の体温計をラットの肛門に挿入して固定して（図３）、前記動物の除毛した部分にベタジンを塗って消毒したした後、ラットの胸の線から首部分の中央線（ｍｉｄｌｉｎｅ）を３〜４ｃｍ程度切開した後、図４に示した通り、綿棒で結合組織を除去した後、血管上側を通る筋肉（Ｏｍｏｈｙｏｉｄ  ｍｕｓｃｌｅ）を綿棒で切る（図４）。
【００４４】
また、前記手術部位を顕微鏡で観察して、鉗子で血管の周囲の結合組織を除去して、総頚動脈（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ａｒｔｅｒｙ（ＣＣＡ））を圧迫しやすいように十分な空間を上下に確保した。
【００４５】
前記確保した血管に出血を誘導するために、３１Ｇの注射器の傾斜面に上にいくようにして３０度角度程度で傾けて刺して出血を誘導して止血効能評価用動物モデルを製作した（図５）。
【００４６】
実施例２．止血効能評価用動物モデルの製造  （Ｖｅｉｎ）
止血効能評価用動物モデルを製作するために、ラットの後足の筋肉に０．１ｍｌ／１００ｇ（ゾレチル５ｍｌ＋ロムプン２．５ｍｌ）を筋肉注射して麻酔した後、２０分以後から施術を始めた（図１）。
【００４７】
本実施例で用いられた動物は、１０週齢ＳＤ／Ｒａｔで３５０〜４５０ｇ程度である。
また、施術する部位を広く除毛して、実験台（Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  ｆｒａｍｅ）に固定させて（図２）、一定の体温維持のために保温パッド（Ｗａｒｍ  ｐａｄ）の体温計をラットの肛門に挿入及び固定して（図３）、前記動物の除毛した部分にベタジンを塗って消毒した後、眉間から耳がある部分まで中央線（Ｍｉｄｌｉｎｅ）をメス（１０号）を利用して２〜３ｃｍ程度切開して、切開した部分を広げて鉗子で固定させて、綿棒を利用して結合組織を除去して頭蓋骨が露出されるようにした（図７）。
【００４８】
図８に示された通り、前記頭蓋骨のラムダ（Ｌａｍｂｄａ）とブレグマ（Ｂｒｅｇｍａ）の中央をダイヤモンドグラインダーを利用して今５ｍｍ程度削る。最大限薄く削った後、先が鋭い鉗子またはメスを利用してそっと削った後骨を露出した後、上矢状静脈洞（Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  Ｓａｇｉｔｔａｌ  Ｓｉｎｕｓ（ＳＳＳ））（ＬａｍｂｄａとＢｒｅｇｍａ中央）を２０Ｇ手術用刃物（斜めの部分が上にくるように）で出血を誘導して止血効能評価用動物モデルを製作した。
【００４９】
実施例３．止血効能評価用動物モデルの製造  （Ｌｉｖｅｒ）
止血効能評価用動物モデルを製作するために、ウサギの後足の筋肉に０．５ｍｌ／ｋｇ（ゾレチル５ｍｌ＋ロムプン２．５ｍｌ）を皮下注射して麻酔後、２０分後から施術を始めた。
【００５０】
本実施例で用いられた動物は、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ  ｒａｂｂｉｔで、２．３〜３．０ｋｇ程度である。
また、施術する部位を広く除毛して、ｌｉｄｏｃａｉｎｅで局所麻酔して、ｈｙｐｅｒｈｙｐｏ  ｔｈｅｒｍｉａを設置した手術台の上に固定させた。
胸部を切開して開腹した後、滅菌生理食塩水を濡らした滅菌ガーゼ上に肝（ｃｅｎｔｒａｌ  ｌｏｂｅ）を露出させた。肝（ｃｅｎｔｒａｌ  ｌｏｂｅ）の中間部位にｂｉｏｐｓｙ  ｐｕｎｃｈ（ｄ＝６ｍｍ）を利用して深さ２〜３ｍｍ程度で出血を誘導して動物モデルを製作した。
【００５１】
実施例４．止血効能評価用動物モデルの製造（Ｆｅｍｏｒａｌ  ａｒｔｅｒｙ）
止血効能評価用動物モデルを製作するために、ウサギの後足の筋肉に０．５ｍｌ／ｋｇ（ゾレチル５ｍｌ＋ロムプン２．５ｍｌ）を皮下注射して麻酔後２０分後から手術を始めた。
【００５２】
本実施例で用いられた動物はＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ  ｒａｂｂｉｔで、２．３〜３．０ｋｇ程度である。
また、施術する部位を広く除毛して、ｈｙｐｅｒｈｙｐｏ  ｔｈｅｒｍｉａを設置した手術台の上に固定させた。Ｈｅｐａｒｉｎ  ｓｏｄｉｕｍ（韓国中外製薬、２５，０００Ｉ．Ｕ．／５ｍＬ）原液０．４ｍＬを注射用水（韓国中外製薬）３．６ｍＬに混ぜて、この溶液０．４ｍＬを注射した後手術部位をベタジンで消毒した。１５分以内に手術部の皮膚を切開した後、筋膜、筋肉を切開しながらｆｅｍｏｒａｌ  ａｒｔｅｒｙを露出させて、１５分以後に露出したｆｅｍｏｒａｌ  ａｒｔｅｒｙに２３Ｇ  ｎｅｅｄｌｅで出血を誘導して動物モデルを製作した。
【００５３】
実施例５．総頚動脈（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ａｒｔｅｒｙ（ＣＣＡ））に出血が誘導されている動物モデルを利用した止血効能評価
実施例１で製作された総頚動脈に出血が誘発された動物モデルの出血部位に適切な溶媒に懸濁された止血剤候補物質０．５ｍｌを塗布した（図６）。
【００５４】
前記出血部位を綿を利用して圧迫したり、綿に止血剤を塗布して圧迫する時、気道が圧迫されないように上から下方向でなく横から押して圧迫した。
呼吸し続けているかを確認して圧迫して、２分後綿を除去して止血されたかを確認し、綿を除去する時には凝塊（Ｃｌｏｔ）に影響が及ぼさないように注意しながら除去した。
本実施例では、実施例１で製作された動物モデルを４グループ（５匹／グループ当たり）に分けて、止血剤候補物質ＩｎｎｏＳＥＡＬＴＭ−２及びＩｎｎｏＳＥＡＬＴＭ−３の止血性能を評価した。
その結果、図９に示された通り、ＩｎｎｏＳＥＡＬＴＭ−２、ＩｎｎｏＳＥＡＬＴＭ−３は市販中のＦｌｏｓｅａｌ（登録商標）（Ｐｏｓｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）より優れた止血効能を示した。図９で対照群（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）は、何の処理もしないものである。
前記動物モデルの安定性評価のための個体に対しは、２週間モニタリングして、生き残りの有無と、体重の増減などを観察した。
【００５５】
実施例６．上矢状静脈洞（Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  Ｓａｇｉｔｔａｌ  Ｓｉｎｕｓ（ＳＳＳ））に出血が誘導されている動物モデルを利用した止血効能評価
実施例２で製作された上矢状静脈洞に出血が誘発された動物モデルの出血部位に適切な溶媒に懸濁された止血剤候補物質０．１ｍｌを塗布した。
【００５６】
塗布後、出血誘導から２分が過ぎた後、流れた血を拭い取って、止血されたか確認し、実験が終了すると、４−０ポリアミド（Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ）糸を利用して皮膚を縫合して、ベタジンで消毒して、抗生剤（セパメジン（株）製）を０．１ｍｌ投与した。
本実施例では、実施例１で製作された動物モデルを４グループ（３匹／グループ当たり）に分けて、止血剤候補物質ＩｎｎｏＳＥＡＬＴＭ−２及びＩｎｎｏＳＥＡＬＴＭ−３の止血効能を評価した。
その結果、図１０に示された通り、ＩｎｎｏＳＥＡＬＴＭ−３は、市販中のＦｌｏｓｅａｌ（登録商標）（Ｐｏｓｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）と類似の止血効能を示した。図１０で対照群（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）は何の処理もしないものである。
２週間前記動物をモニタリングして、生き残りの有無と、体重の増減などを観察して、実験が終了すると安楽死させた。
前記動物モデルの安定性評価のための個体に対しは、３日、７日、１４日、２８日に対して、犠牲後（Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）、脳を露出させた後、止血剤と接触した部分に対して組織学的所見を確認した。
【００５７】
実施例７．肝組織（Ｃｅｎｔｒａｌ  ｌｏｂｅ）に出血が誘導されている動物モデルを利用した止血効能評価
実施例３で製作された肝組織に出血が誘発された動物モデルの出血部位に適切な溶媒に懸濁された止血剤候補物質を塗布した。出血後１０秒に出血抑制組成物を塗布して、４分内に止血の有無を実験者の目で評価した。実験群１（Ｇｒｏｕｐ  １）は、陰性対照群（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として何の処理もせず、実験群２（Ｇｒｏｕｐ  ２）は陽性対照群（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として出血部位を全部覆えるようにＦｌｏｓｅａｌ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ）を塗布した。実験群３（Ｇｒｏｕｐ  ３）は、出血部位を全部覆えるようにＩｎｎｏＳＥＡＬ  ｈｙｄｒｏｇｅｌを塗布した。実験群２及び３は、出血量が多い場合、出血抑制組成物を最大４ｍｌまで追加塗布した。実験群４（Ｇｒｏｕｐ  ４）は、ＩｎｎｏＳＥＡＬ  ｓｐｏｎｇｅを出血部位を全部覆う方式で肝の上に最大２枚まで載せた。ＩｎｎｏＳＥＡＬ  ｈｙｄｒｏｇｅｌは、４分、ＩｎｎｏＳＥＡＬ  ｓｐｏｎｇｅは４分後除去して、止血の有無を評価した。
【００５８】
評価が終わったＲａｂｂｉｔは、施術部をｓｕｔｕｒｅして、０．５ｍＬ  Ｍｅｌｏｘｉｃａｍ（鎮痛剤；Ｍｅｌｏｘｉｃａｍ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）及び０．４ｍＬ  Ｃｅｆａｚｏｌｉｎ  ｓｏｄｉｕｍ（抗生剤；ＣｈｏｎｇＫｕｎＤａｎｇ製）を注射して２４時間生存の有無を確認した。
その結果、表１に示した通り、ＩｎｎｏＳＥＡＬは、ｈｙｄｒｏｇｅｌ及びｓｐｏｎｇｅ共に市販中のＦｌｏｓｅａｌ（登録商標）より優れた止血能力を持つのを確認することができた。
特にＩｎｎｏＳＥＡＬ  ｓｐｏｎｇｅは、４分内止血達成率が１００％で肝組織の出血を非常に効果的に止血することが明らかになった。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
実施例８．大腿動脈（Ｆｅｍｏｒａｌ  Ａｒｔｅｒｙ）に出血が誘導されている動物モデルを利用した止血効能評価
実施例４で製作された肝組織に出血が誘発された動物モデルの出血部位に適切な溶媒に懸濁された止血剤候補物質を塗布した。実験群１（Ｇｒｏｕｐ  １）は、陰性対照群（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として何の処理もしなかった綿を出血部位に覆って一定の圧迫を加えて止血させ、実験群２（Ｇｒｏｕｐ  ２）は、陽性対照群（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）としてＦｌｏｓｅａｌ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ）１ｍＬを塗布した綿を出血部位に覆って一定の圧迫で止血させた。実験群３（Ｇｒｏｕｐ  ３）は、ＩｎｎｏＳＥＡＬ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  １ｍＬを塗布した綿を出血部位に覆って一定の圧迫で止血させた。実験群４（Ｇｒｏｕｐ  ４）は、ＩｎｎｏＳＥＡＬ  ｓｐｏｎｇｅ  ２個を載せた綿を出血部位に覆って一定の圧迫を加えて止血させた。
【００６１】
止血中、１分３０秒、２分３０秒、３分３０秒、５分及び７分に注意しながら綿を引き離して、止血の有無を実験者の目で評価して、評価が終わった実験動物は、鎮痛剤（Ｍｅｌｏｘｉｃａｍ）及び抗生剤（セパメジン（株）製、Ｃｅｆａｚｏｌｉｎ＿ｓｏｄｉｕｍ）を筋肉注射して、２４時間生存の有無を確認した。
その結果、表２に示した通り、市販中のＦｌｏｓｅａｌ（登録商標）は１分３０秒内に止血を全く達成できない反面、ＩｎｎｏＳＥＡＬは全て止血能力を示した。特に、ＩｎｎｏＳＥＡＬ  ｓｐｏｎｇｅは、止血達成度が８０％であり、他のグループに比べて非常に優れた大腿動脈止血効果を示し、平均止血時間も１分４２秒と非常に短いのを確認した。
【００６２】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明に係る動物モデルは、止血剤の効果を副作用なしに迅速かつ正確に観察できて、止血剤のスクリーニング及び効能評価に有用である。
【００６４】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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