(57)【要約】ポリヌクレオチドサンプルの1つまたは複数のヌクレオチド位置における1つまたは複数のヌクレオチドを決定するための方法であって、該ポリヌクレオチドサンプルが該ヌクレオチド位置において異なるヌクレオチドを有する異種のポリヌクレオチドを含む、方法を開示する。開示される方法は、ポリヌクレオチドサンプルのシーケンシングの際に、シーケンシングバイアスを制御するために利用され得る。好適なサンプルには、患者の診断、予後判定、および治療における使用のための患者サンプルが含まれ得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドサンプルのあるヌクレオチド位置におけるヌクレオチドを決定するための方法であって、該ポリヌクレオチドサンプルが該ヌクレオチド位置において異なるヌクレオチドを有する異種のポリヌクレオチドを含み、方法が、
(a)該ヌクレオチド位置にまたがるポリヌクレオチドサンプルの標的領域をシーケンシングする工程；および
(b)ポリヌクレオチド断片のセットをシーケンシングする工程であって、ポリヌクレオチド断片がポリヌクレオチドサンプルの標的領域に対応するポリヌクレオチド配列を含み、ポリヌクレオチド断片がポリヌクレオチド断片と標的領域とを区別するためのヌクレオチドタグをさらに含み、かつ、ポリヌクレオチド断片のセットが該ポリヌクレオチドサンプルの該ヌクレオチド位置において異なるヌクレオチドを有する2種またはそれ以上の異なるポリヌクレオチド断片を含む、工程
を含む、方法。
【請求項２】
同じ反応混合物中において、ポリヌクレオチドサンプルをシーケンシングし、かつポリヌクレオチド断片のセットをシーケンシングする工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ポリヌクレオチドサンプルおよびポリヌクレオチド断片が、同じ反応混合物中に等モル量で存在する、請求項2記載の方法。
【請求項４】
シーケンシングを行うことが、ディープシーケンシングを行うことを含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記ヌクレオチド位置におけるヌクレオチドを検出するために必要とされるシーケンシングの深度を決定する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記ヌクレオチド位置における異なるヌクレオチドについてのシーケンシングバイアスを決定する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
ポリヌクレオチド断片のセットが、ポリヌクレオチドサンプルの前記ヌクレオチド位置においてシトシンまたはチミンを有する2種またはそれ以上の異なるポリヌクレオチド断片を含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
ポリヌクレオチド断片のセットが、ポリヌクレオチドサンプルの前記ヌクレオチド位置においてシトシンまたはチミンを有する等モル量の2種の異なるポリヌクレオチド断片を含む、請求項7記載の方法。
【請求項９】
ポリヌクレオチドサンプルの前記ヌクレオチド位置におけるシトシンまたはチミンについての偽発見率を決定する工程をさらに含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
ポリヌクレオチド断片のセットが、ポリヌクレオチドサンプルの前記ヌクレオチド位置においてアデニン、グアニン、シトシン、またはチミンを有する4種またはそれ以上の異なるポリヌクレオチド断片を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
ポリヌクレオチド断片のセットが、ポリヌクレオチドサンプルの前記ヌクレオチド位置においてアデニン、グアニン、シトシン、またはチミンを有する等モル量の4種の異なるポリヌクレオチド断片を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドサンプルの前記ヌクレオチド位置におけるアデニン、グアニン、シトシン、またはチミンについての偽発見率を決定する工程をさらに含む、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドサンプルがゲノムDNAを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
ゲノムDNAが、DNA中の非メチル化シトシン残基を選択的に修飾して検出可能な修飾残基を生じさせるがメチル化シトシン残基を修飾しない試薬で、シーケンシング前に処理されている、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
ポリヌクレオチドサンプルの前記ヌクレオチド位置におけるヌクレオチドが、メチル化シトシンまたは修飾残基であり、ポリヌクレオチド断片のセットが、該ポリヌクレオチドサンプルの該ヌクレオチド位置においてシトシンまたはチミンを有する2種またはそれ以上の異なるポリヌクレオチド断片を含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
非メチル化シトシンを有するポリヌクレオチドサンプルの異種のポリヌクレオチドに対するメチル化シトシンを有するポリヌクレオチドサンプルの異種のポリヌクレオチドの比率を計算する工程をさらに含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
ヌクレオチドタグが、ポリヌクレオチドサンプルの標的領域中に存在しない少なくとも約2ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、ポリヌクレオチド断片のセットをシーケンシングする工程が、ヌクレオチドタグを含むポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプライマーを利用する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
ポリヌクレオチドサンプルが2つまたはそれ以上の異なるヌクレオチド位置において異なるヌクレオチドを有する異種のポリヌクレオチドを含み、方法が、該ポリヌクレオチドサンプルの該2つまたはそれ以上の異なるヌクレオチド位置における2つまたはそれ以上のヌクレオチドを決定する工程を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法であって：
(a)該2つまたはそれ以上の異なるヌクレオチド位置にまたがるポリヌクレオチドサンプルの標的領域をシーケンシングする工程；および
(b)ポリヌクレオチド断片のセットをシーケンシングする工程であって、ポリヌクレオチド断片のセットがポリヌクレオチドサンプルの標的領域に対応するポリヌクレオチド配列を含み、ポリヌクレオチド断片がポリヌクレオチド断片と標的領域とを区別するためのヌクレオチドタグをさらに含み、かつ、ポリヌクレオチド断片のセットが該ポリヌクレオチドサンプルの該2つまたはそれ以上の異なるヌクレオチド位置において2つまたはそれ以上の異なるヌクレオチドを有する2種またはそれ以上の異なるポリヌクレオチド断片を含む、工程
を含む、方法。
【請求項１９】
ポリヌクレオチド断片のセットが、前記ポリヌクレオチドサンプルの前記2つまたはそれ以上のヌクレオチド位置においてシトシンまたはチミジンを有する異なるポリヌクレオチド断片を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
ポリヌクレオチド断片のセットが、前記ポリヌクレオチドサンプルの前記2つまたはそれ以上のヌクレオチド位置においてシトシンまたはチミジンを有するポリヌクレオチド断片の全ての可能な異なる組み合わせを含む、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
ポリヌクレオチド断片のセットが、前記ポリヌクレオチドサンプルの前記2つまたはそれ以上のヌクレオチド位置においてシトシンまたはチミジンを有するポリヌクレオチド断片の全ての可能な異なる組み合わせを等モル量で含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
ポリヌクレオチド断片のセットが、前記ポリヌクレオチドサンプルの前記2つまたはそれ以上のヌクレオチド位置においてアデニン、グアニン、シトシン、またはチミンを有する異なるポリヌクレオチド断片を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２３】
ポリヌクレオチド断片のセットが、前記ポリヌクレオチドサンプルの前記2つまたはそれ以上のヌクレオチド位置においてアデニン、グアニン、シトシン、またはチミンを有するポリヌクレオチド断片の全ての可能な異なる組み合わせを含む、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
ポリヌクレオチド断片のセットが、前記ポリヌクレオチドサンプルの前記2つまたはそれ以上のヌクレオチド位置においてアデニン、グアニン、シトシン、またはチミンを有するポリヌクレオチド断片の全ての可能な異なる組み合わせを等モル量で含む、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
あるヌクレオチド位置において異なるヌクレオチドを有する異種のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドサンプルの該ヌクレオチド位置におけるヌクレオチドを決定するためのキットであって：
(a)以下のオリゴヌクレオチドプライマー：
(i)該ヌクレオチド位置にまたがる該ポリヌクレオチドサンプルの標的領域をシーケンシングするためのオリゴヌクレオチドプライマー；および
(ii)ポリヌクレオチド断片のセットをシーケンシングするためのオリゴヌクレオチドプライマー；ならびに
(b)ポリヌクレオチド断片のセットであって、ポリヌクレオチド断片が該ポリヌクレオチドサンプルの標的領域に対応するポリヌクレオチド配列を含み、ポリヌクレオチド断片がポリヌクレオチド断片と標的領域とを区別するためのヌクレオチドタグをさらに含み、かつ、ポリヌクレオチド断片のセットが該ポリヌクレオチドサンプルの該ヌクレオチド位置において異なるヌクレオチドを有する2種またはそれ以上の異なるポリヌクレオチド断片を含む、ポリヌクレオチド断片のセットを含む、キット。
【請求項２６】
ポリヌクレオチド断片のセットが、前記ポリヌクレオチドサンプルの前記ヌクレオチド位置においてシトシンまたはチミンを有する2種またはそれ以上の異なるポリヌクレオチド断片を含む、請求項25記載のキット。
【請求項２７】
ポリヌクレオチド断片のセットが、前記ポリヌクレオチドサンプルの前記ヌクレオチド位置においてシトシンまたはチミンを有する等モル量の2種の異なるポリヌクレオチド断片を含む、請求項26記載のキット。
【請求項２８】
ポリヌクレオチド断片のセットが、前記ポリヌクレオチドサンプルの前記ヌクレオチド位置においてアデニン、グアニン、シトシン、またはチミンを有する4種またはそれ以上の異なるポリヌクレオチド断片を含む、請求項25記載のキット。
【請求項２９】
ポリヌクレオチドのセットが、前記ポリヌクレオチドサンプルの前記ヌクレオチド位置においてアデニン、グアニン、シトシン、またはチミンを有する等モル量の4種の異なるポリヌクレオチド断片を含む、請求項28記載のキット。
【請求項３０】
標的領域が、前記ヌクレオチド位置に対して5'側にあるポリヌクレオチドサンプルの少なくとも約20ヌクレオチドを含み、かつ標的領域が、前記ヌクレオチド位置に対して3'側にあるポリヌクレオチドサンプルの少なくとも約20ヌクレオチドを含む、請求項27記載のキット。
【請求項３１】
標的領域が、前記ヌクレオチド位置に対して5'側にあるポリヌクレオチドサンプルの少なくとも約50ヌクレオチドを含み、かつ標的領域が、前記ヌクレオチド位置に対して3'側にあるポリヌクレオチドサンプルの少なくとも約50ヌクレオチドを含む、請求項27記載のキット。
【請求項３２】
ヌクレオチドタグが、ポリヌクレオチドサンプルの標的領域中に存在しない少なくとも約2ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、請求項27〜33のいずれか一項記載のキット。
【請求項３３】
ポリヌクレオチドサンプルのシーケンシングを行うための1つまたは複数の試薬をさらに含む、請求項27記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、ポリヌクレオチドサンプルをシーケンシングするための方法に関する。特に、本発明の分野は、ポリヌクレオチドサンプルのシーケンシングにおけるバイアスを同定するための方法に関する。方法は、疾患または障害を有する患者を診断、予後判定、および治療するために利用されるシーケンシング法におけるバイアスを同定および調節するのに適し得る。
【背景技術】
【０００２】
過去30年で、遺伝子突然変異およびエピジェネティックな修飾の検出は、医学における重要な臨床ツールとなった。突然変異およびエピジェネティックな変化、例えばメチル化は、制限酵素を利用する方法（例えば、メチル化特異的デジタル核型分析（MSDK）およびCOBRA（combined bisulfite restriction analysis））、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を利用する方法（例えば、メチル化特異的PCR（MSP）、heavy methyl PCR、およびmethylight PCR）、ハイブリダイゼーションを利用する方法（例えば、エピ-マイクロアレイ、およびビーズ-アレイ）、ならびにDNAシーケンシングを利用する方法（例えば、クローナル（パイロ／サンガー）シーケンシング、または合成型シーケンシング）を用いて検出されてきた。特に、DNAシーケンシングのコストを削減するDNAシーケンシング技術の進歩によって、疾患の遺伝学およびエピジェネティックスの包括的な研究が可能となった。
【０００３】
しかし、様々な課題のために、濃縮シーケンシングを使用する全ゲノムシーケンシングは、主に研究の場においてのみ行われており、臨床診断法に適していなかった。例えば、全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（BSS）についての課題の一部は、臨床サンプルが非常に不均一であり、様々な程度のメチル化を有する対立遺伝子を含有するという事実を含む。十分な程度の感度および特異性で所定の位置におけるメチル化（または所定の位置におけるメチル化の欠如）を検出するためには、比較的大きなサンプルサイズが必要である。従って、比較的小さなサンプルサイズを用いたエピジェネティックな修飾および遺伝子突然変異の検出の感度および特異性を改善する新しいDNAシーケンシング法が望ましい。特に、これらの新しいDNAシーケンシング法は、臨床診断法におけるツールとして全ゲノムシーケンシングを利用する際の課題に取り組むべきである。
【発明の概要】
【０００４】
概要
ポリヌクレオチドサンプルのあるヌクレオチド位置におけるヌクレオチドを決定するための方法であって、該ポリヌクレオチドサンプルが該ヌクレオチド位置において異なるヌクレオチドを有する異種のポリヌクレオチドを含む、方法を開示する。方法は、異種のポリヌクレオチドの該ヌクレオチド位置における複数の異なるヌクレオチドの存在を同定するために利用され得る。
【０００５】
方法は、以下の工程：(a)該ヌクレオチド位置にまたがるポリヌクレオチドサンプルの標的領域をシーケンシングする工程；ならびに(b)ポリヌクレオチド断片のセットをシーケンシングする工程を含み得、ポリヌクレオチド断片は、(i)ポリヌクレオチドサンプルの標的領域に対応するポリヌクレオチド配列；および(ii)ヌクレオチドタグを含み得る、ポリヌクレオチド断片と標的領域とを区別するためのタグを含む。ポリヌクレオチド断片のセットは、典型的に、ポリヌクレオチドサンプルの該ヌクレオチド位置において異なるヌクレオチドを有する2種またはそれ以上の異なるポリヌクレオチド断片を含む。
【０００６】
方法において、標的領域およびポリヌクレオチド断片のセットは、同じまたは異なる反応混合物中においてシーケンシングされ得る。標的領域およびポリヌクレオチド断片のセットをシーケンシングするための反応混合物は、標的領域に特異的にハイブリダイズする1種または複数種のプライマー、およびポリヌクレオチド断片のセットに特異的にハイブリダイズする1種または複数種のプライマーを含み得る。例えば、ポリヌクレオチド断片のセットに特異的にハイブリダイズするプライマーは、ポリヌクレオチド断片のセット中に存在するヌクレオチドタグに特異的にハイブリダイズする配列を含み得る。
【０００７】
方法は、ディープシーケンシングを行うことを含み得る。いくつかの態様において、方法は、異種のポリヌクレオチドのヌクレオチド位置におけるヌクレオチドを検出するために必要とされるシーケンシングの深度を決定する工程を含み得る。他の態様において、方法は、異種のポリヌクレオチドのヌクレオチド位置における異なるヌクレオチドについてのシーケンシングバイアスを決定する工程を含み得る。
【０００８】
方法において利用されるポリヌクレオチド断片のセットは、典型的に、ポリヌクレオチドサンプルの該ヌクレオチド位置において異なるヌクレオチドを有する2種またはそれ以上の異なるポリヌクレオチド断片を含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド断片のセットは、ポリヌクレオチドサンプルの該ヌクレオチド位置においてシトシンまたはチミンを有する2種またはそれ以上の異なるポリヌクレオチド断片を含む。例えば、ポリヌクレオチド断片のセットは、一方のヌクレオチド断片中のヌクレオチド位置においてシトシンでありかつ他方のヌクレオチド断片中の該ヌクレオチド位置においてチミジンである、決定される該ヌクレオチド位置を除いて同一のヌクレオチド配列を有する2種の異なるポリヌクレオチド断片を含み得るまたはからなり得る。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド断片のセットは、ポリヌクレオチドサンプルの該ヌクレオチド位置においてシトシンまたはチミンを有する等モル量の2種の異なるポリヌクレオチド断片を含み得る。方法は、ポリヌクレオチドサンプルの該ヌクレオチド位置においてシトシンまたはチミンを有する等モル量の2種の異なるポリヌクレオチド断片を含むポリヌクレオチド断片のセットをシーケンシングする工程、および該ポリヌクレオチドサンプルの該ヌクレオチド位置におけるシトシンまたはチミンについての偽発見率を決定する工程を含み得る。
【０００９】
方法において利用されるポリヌクレオチド断片のセットは、ポリヌクレオチドサンプルのあるヌクレオチド位置において、それぞれ、アデニン、グアニン、シトシン、またはチミンを有する4種またはそれ以上の異なるポリヌクレオチド断片を含み得る。例えば、ポリヌクレオチド断片のセットは、あるヌクレオチド断片中のあるヌクレオチド位置においてアデニン；別のヌクレオチド断片中の該ヌクレオチド位置においてグアニン；別のヌクレオチド断片中の該ヌクレオチド位置においてシトシン；かつ別のヌクレオチド断片中の該ヌクレオチド位置においてチミジンである、決定される該ヌクレオチド位置を除いて同一のヌクレオチド配列を有する4種の異なるポリヌクレオチド断片を含み得るまたはからなり得る。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド断片のセットは、ポリヌクレオチドサンプルのあるヌクレオチド位置において、それぞれ、アデニン、グアニン、シトシン、またはチミンを有する等モル量の4種の異なるポリヌクレオチド断片を含み得る。方法は、ポリヌクレオチドサンプルの該ヌクレオチド位置において、それぞれ、アデニン、グアニン、シトシン、またはチミンを有する等モル量の4種の異なるポリヌクレオチド断片を含むポリヌクレオチド断片のセットをシーケンシングする工程、および該ポリヌクレオチドサンプルの該ヌクレオチド位置におけるアデニン、グアニン、シトシン、またはチミンについての偽発見率を決定する工程を含み得る。
【００１０】
開示される方法は、DNAおよびRNAを含み得る、任意の供給源由来の核酸を利用し得る。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドサンプルはゲノムDNAを含む。さらなる態様において、ゲノムDNAは、DNA中の非メチル化シトシン残基を選択的に修飾して検出可能な修飾残基を生じさせるがメチル化シトシン残基を修飾しない試薬で、シーケンシング前に処理されている。なおさらなる態様において、ポリヌクレオチドサンプルのあるヌクレオチド位置におけるヌクレオチドは、メチル化シトシンまたは修飾残基であり、ポリヌクレオチド断片のセットは、該ポリヌクレオチドサンプルの該ヌクレオチド位置においてシトシンまたはチミンを有する2種またはそれ以上の異なるポリヌクレオチド断片を含む。方法は、(2)該ヌクレオチド位置において非メチル化シトシンを有するポリヌクレオチドサンプルの異種のポリヌクレオチドの数に対する(1)該ヌクレオチド位置においてメチル化シトシンを有するポリヌクレオチドサンプルの異種のポリヌクレオチドの数の比率を計算する工程を含み得る。
【００１１】
方法は、典型的に、決定されるヌクレオチド位置にまたがるポリヌクレオチドサンプルの標的領域をシーケンシングする工程を含む。いくつかの態様において、標的領域は、該ヌクレオチド位置に対して5'側にあるポリヌクレオチドサンプルの少なくとも約10ヌクレオチドを含み、かつ／または標的領域は、該ヌクレオチド位置に対して3'側にあるポリヌクレオチドサンプルの少なくとも約10ヌクレオチドを含む。他の態様において、標的領域は、該ヌクレオチド位置に対して5'側にあるポリヌクレオチドサンプルの少なくとも約20、30、40、50、もしくはそれ以上のヌクレオチドを含み、かつ／または標的領域は、該ヌクレオチド位置に対して3'側にあるポリヌクレオチドサンプルの少なくとも約20、30、40、50、もしくはそれ以上のヌクレオチドを含む。従って、標的領域は、少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、またはそれ以上のヌクレオチドを含み得る。
【００１２】
ポリヌクレオチド断片のセットのポリヌクレオチド断片は、典型的に以下を含む：(i)ポリヌクレオチドサンプルの標的領域に対応するポリヌクレオチド配列；および(ii)ポリヌクレオチド断片と標的領域とを区別するためのタグ、例えば、ヌクレオチドタグ。いくつかの態様において、ヌクレオチドタグは、ポリヌクレオチドサンプルの標的領域中に存在しない少なくとも約2、3、4、または5ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。例えば、ヌクレオチドタグは、（例えば、ヌクレオチドタグを含むポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプライマーおよび／またはプローブを利用することによって、）例えば、DNAシーケンシングが行われた後にまたはDNAシーケンシングが行われている間に、標的配列とポリヌクレオチド断片とを区別するために利用され得る。
【００１３】
方法は、さらに、ポリヌクレオチドサンプルの2つまたはそれ以上の異なるヌクレオチド位置における2つまたはそれ以上のヌクレオチドを決定するために利用され得る。いくつかの態様において、方法は、以下を含み得る：(a)該2つまたはそれ以上のヌクレオチド位置にまたがるポリヌクレオチドサンプルの標的領域をシーケンシングする工程；ならびに(b)ポリヌクレオチド断片のセットをシーケンシングする工程、ここで、ポリヌクレオチド断片は、(i)ポリヌクレオチドサンプルの標的領域に対応するポリヌクレオチド配列；および(ii)ポリヌクレオチド断片と標的領域とを区別するためのタグ、例えば、ヌクレオチドタグを含む。ポリヌクレオチド断片のセットは、異なるポリヌクレオチド断片を含み得、各々は、該2つまたはそれ以上のヌクレオチド位置において2つまたはそれ以上のヌクレオチドの異なる可能な組み合わせを有し、該2つまたはそれ以上のヌクレオチド位置において2つまたはそれ以上のヌクレオチドの全ての異なる可能な組み合わせを示す。
【００１４】
ポリヌクレオチド断片のセットが、ポリヌクレオチドサンプルの2つまたはそれ以上の異なるヌクレオチド位置において2つまたはそれ以上の異なるヌクレオチドを有する2種またはそれ以上の異なるポリヌクレオチド断片を含むいくつかの態様において、ポリヌクレオチド断片のセットは、該ポリヌクレオチドサンプルの該2つまたはそれ以上のヌクレオチド位置においてシトシンまたはチミジンを有する異なるポリヌクレオチド断片を含み得る。さらなる態様において、ポリヌクレオチド断片のセットは、異なるポリヌクレオチド断片を含み得、各々は、ポリヌクレオチドサンプルの2つまたはそれ以上のヌクレオチド位置においてシトシンまたはチミジンの異なる可能な組み合わせを有し、該2つまたはそれ以上のヌクレオチド位置においてシトシンまたはチミジンの全ての異なる可能な組み合わせを示す。この場合、ポリヌクレオチド断片のセットにおけるポリヌクレオチド断片の異なる組み合わせの総数（#）は、式 # = 2Nによって表され得、式中、Nは、異なるヌクレオチド位置の総数を表し、「2」は、異なるヌクレオチド位置におけるヌクレオチドについての2つの異なる可能性を表す（即ち、シトシンまたはチミジン）。なおさらなる態様において、ポリヌクレオチド断片のセットは、等モル量の異なるポリヌクレオチド断片を含み得、各々は、ポリヌクレオチドサンプルの2つまたはそれ以上のヌクレオチド位置においてシトシンまたはチミジンの異なる可能な組み合わせを有し、該2つまたはそれ以上のヌクレオチド位置においてシトシンまたはチミジンの全ての異なる可能な組み合わせを示す。
【００１５】
他の態様において、ポリヌクレオチド断片のセットは、ポリヌクレオチドサンプルの2つまたはそれ以上のヌクレオチド位置においてアデニン、グアニン、シトシン、またはチミンを有する異なるポリヌクレオチド断片を含み得る。さらなる態様において、ポリヌクレオチド断片のセットは、異なるポリヌクレオチド断片を含み得、各々は、該ポリヌクレオチドサンプルの該2つまたはそれ以上のヌクレオチド位置においてアデニン、グアニン、シトシン、またはチミジンの異なる可能な組み合わせを有し、該2つまたはそれ以上のヌクレオチド位置においてアデニン、グアニン、シトシン、またはチミジンの全ての異なる可能な組み合わせを示す。この場合、ポリヌクレオチド断片のセットにおけるポリヌクレオチド断片の異なる組み合わせの総数（#）は、式 # = 4Nによって表され得、式中、Nは、異なるヌクレオチド位置の総数を表し、「4」は、異なるヌクレオチド位置におけるヌクレオチドについての4つの異なる可能性を表す（即ち、アデニン、グアニン、シトシン、またはチミジン）。なおさらなる態様において、ポリヌクレオチド断片のセットは、等モル量の異なるポリヌクレオチド断片を含み得、各々は、ポリヌクレオチドサンプルの該2つまたはそれ以上のヌクレオチド位置においてアデニン、グアニン、シトシン、またはチミジンの異なる可能な組み合わせを有し、該2つまたはそれ以上のヌクレオチド位置においてアデニン、グアニン、シトシン、またはチミジンの全ての異なる可能な組み合わせを示す。
【００１６】
開示される方法はまた、エピジェネティック座（epigenetic locus）または遺伝子座の特定の対立遺伝子についてのシーケンシングバイアスを決定する工程を含み得る。方法は、以下を含み得る：(a)特定の対立遺伝子を含む対立遺伝子のセットをシーケンシングし、配列のセットを得る工程であって、ここで、対立遺伝子のセットが、1つまたは複数のヌクレオチド位置において変性している、工程；(b)配列のセット中の対立遺伝子の配列を同定する工程；および(c)対立遺伝子の配列についての予想された発生頻度に対する対立遺伝子の配列についての観察された発生頻度を計算する工程。続いて、決定されたシーケンシングバイアスは、特定の対立遺伝子を検出するためのシーケンシング法において行われるシーケンシングの深度を変えるために利用され得る。
【００１７】
さらに、ポリヌクレオチドサンプルのあるヌクレオチド位置におけるヌクレオチドを決定するための開示の方法を実施するためのキットであって、該ポリヌクレオチドサンプルが該ヌクレオチド位置において異なるヌクレオチドを有する異種のポリヌクレオチドを含む、キットを本明細書に開示する。キットは、(i)該ヌクレオチド位置にまたがるポリヌクレオチドサンプルの標的領域をシーケンシングするためのオリゴヌクレオチドプライマー；および(ii)本明細書において意図されるポリヌクレオチド断片のセットをシーケンシングするためのオリゴヌクレオチドプライマーを含み得る。キットは、さらに、ポリヌクレオチド断片のセットを含み得る。本明細書において意図される場合、ポリヌクレオチド断片は、ポリヌクレオチドサンプルの標的領域に対応するポリヌクレオチド配列を含み得、ポリヌクレオチド断片は、（例えば、ヌクレオチドタグを含むポリヌクレオチド断片に特異的にハイブリダイズするプライマーおよび／またはプローブを利用することによって）、例えば、DNAシーケンシングの後またはDNAシーケンシングの間、ポリヌクレオチド断片と標的領域とを区別するためのタグ（例えば、ヌクレオチドタグ）をさらに含み得る。ポリヌクレオチド断片のセットは、該ポリヌクレオチドサンプルの該ヌクレオチド位置において異なるヌクレオチドを有する2種またはそれ以上の異なるポリヌクレオチド断片を含み得る。異なるポリヌクレオチド断片は、等モル量でポリヌクレオチド断片のセット中に存在し得る。キットは、ポリヌクレオチドサンプルのシーケンシングを行うための1つまたは複数の試薬、例えば、酵素およびバッファーをさらに含み得る。
【００１８】
開示される方法およびキットは、疾患または障害を有するかまたは有する疑いがある患者など、その必要がある患者を診断する、予後判定する、および治療するために利用され得る。開示される方法は、その必要がある患者を診断するおよび／または予後判定する工程を含み得、続いて、患者の診断および／または予後判定の後に、その必要がある患者へ治療を施す工程をさらに含み得る。本明細書において意図される方法は、(a)患者DNAサンプル中の標的配列のDNA配列を提供する解析を要求する工程であって、ここで、解析が本明細書に開示されるDNAシーケンシング法を利用する工程：および(2)続いて、解析の結果に基づいて患者へ治療を施す工程を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本明細書において意図される方法の一態様を示す。
【図２】SEQ-C-YR内部対照のポリヌクレオチドメンバーについてのシーケンシングバイアスを示す。
【図３】メチル化特異的PCRによって行われた11個の患者サンプルについてのメチル化解析の相関性を示す。
【図４】6つのバイサルファイト処理サンプル（3つの陽性、3つの陰性）のディープシーケンシングによる24個の位置におけるメチル化解析を示す。
【図５】11個のバイサルファイト処理サンプルのディープシーケンシングによる24個の位置におけるメチル化解析を示す。
【図６】GSTP1を対照としてのアクチンβで割った比率に対する図2に示されるシーケンシングバイアスを補正するメチル化パーセンテージの対数グラフを提供する。
【図７】実施例2の実験において得られたアンプリコンの長さの箱髭図を提供する。
【図８】アンプリコンの各ヌクレオチド位置についてのコンセンサスヌクレオチド（即ち、最も頻繁に発生するヌクレオチド）の発生頻度のプロットを提供する。
【図９】実施例2のアンプリコンについての変性位置におけるCおよびTの総カウントに対する各変性位置におけるTのカウント（即ち、C + Tに対するTの頻度）のプロットを提供する。
【図１０】対立遺伝子中のCの数に対する対立遺伝子が観察された回数の箱髭図を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な説明
下記および本出願の全体にわたって記載される、いくつかの定義を用いて、本発明をここで説明する。
【００２１】
文脈によって特に指定または指示されない限り、用語「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、「1つまたは複数の」を意味する。例えば、「ポリヌクレオチド」は、「1つまたは複数のポリヌクレオチド」を意味すると解釈されるべきである。句「ヌクレオチド位置」は、「1つまたは複数のヌクレオチド位置」を意味すると解釈されるべきである。
【００２２】
本明細書で用いられる場合、「約」、「およそ」、「実質的に」、および「有意に」は、当業者によって理解され、それらが使用される文脈においてある程度変わる。使用される文脈を考えて当業者に明らかでないこれらの用語の使用がある場合、「約」および「およそ」は、特定の用語のプラスまたはマイナス≦10％を意味し、「実質的に」および「有意に」は、特定の用語のプラスまたはマイナス＞10％を意味する。
【００２３】
本明細書で用いられる場合、用語「包含する（include）」および「包含すること」は、用語「含む（comprise）」および「含むこと」と同じ意味を有する。例えば、「工程を包含する方法」は、「工程を含む方法」を意味するように解釈されるべきである。用語「含む」および「含むこと」は、添付の特許請求の範囲に記載の成分への追加の成分の包含を許容する「非限定的な(open)」移行語であると解釈されるべきである。用語「なる」および「からなる」は、特許請求の範囲に記載の成分以外の追加の成分の包含を許容しない「限定的な(closed)」移行語であると解釈されるべきである。用語「から本質的になる」は、部分的に限定的であると解釈されるべきであり、特許請求される事項の本質を基本的には変更させない追加の成分の包含のみを許容する。
【００２４】
本明細書で用いられる場合、用語「対象」または「個体」と交換可能に用いられ得る用語「患者」は、医学的なケア、手当または処置を受けるものを指し、ヒト患者を包含し得る。本明細書で用いられる場合、用語「患者」は、疾患または障害と関連する1つまたは複数の遺伝子のメチル化状態を特徴とするか、または疾患または障害と関連する遺伝子突然変異を特徴とする、疾患または障害を発症する危険性がある人を包含するように意図される。遺伝子の「メチル化状態」は、例えば、対照遺伝子と比べての、遺伝子のプロモーターの「メチル化状態」を含み得る。遺伝子突然変異は、疾患または障害と関連する遺伝子内にあり得る。
【００２５】
本明細書で用いられる場合、その必要がある患者は、細胞増殖性疾患または障害（例えば、乳癌、前立腺癌、結腸癌、肺癌、胆嚢癌、脳腫瘍、子宮癌、卵巣癌、頭頸部癌、胃癌、肝臓癌、白血病、およびリンパ腫などの癌）、神経変性疾患または障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病）、精神疾患または障害（例えば、統合失調症およびうつ病）、代謝性疾患または障害（例えば、1型または2型糖尿病）、心血管疾患または障害（例えば、心筋梗塞または発作）、炎症性疾患または障害（例えば、関節炎）、ならびに免疫疾患または障害を含むが、これらに限定されない、疾患または障害を有するかまたは発症する危険性がある患者を含み得る。
【００２６】
開示される方法は、疾患または障害と関連する1つまたは複数の突然変異を特徴とするか、または疾患または障害と関連する1つまたは複数の遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態に基づいて、その必要がある患者を診断するまたは予後判定するために利用され得る。本明細書において用いられる場合、用語「診断する」または「診断」または「診断すること」は、疾患、症候群もしくは状態を区別もしくは同定すること、または特定の疾患、症候群もしくは状態を有するかもしくは発症する危険性がある患者を区別もしくは同定することを指す。本明細書において用いられる場合、用語「予後判定する」または「予後判定」または「予後判定すること」は、患者における疾患、症候群、状態、もしくは治療レジメンの結果を予測することを指す。
【００２７】
開示される方法は、その必要がある患者を治療するために利用され得る。例えば、開示される方法は、疾患または障害と関連する1つまたは複数の突然変異を特徴とするか、または疾患または障害と関連する1つまたは複数の遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態に基づいて、その必要がある患者を診断するまたは予後判定するために利用され得る。診断または予後判定に続いて、患者は、疾患または障害の診断または予後判定に基づいて好適な治療を施され得る。
【００２８】
開示される方法は、患者サンプル中の核酸を特徴づけるために利用され得る。用語「サンプル」または「患者サンプル」は、生体サンプル、例えば、組織（例えば、生検材料から得られた組織）および体液を含むように意図される。「体液」は、血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、胸膜液、涙、乳び管液（lactal duct fluid）、リンパ液、痰、および精液を含み得るが、これらに限定されない。サンプルは、核酸、タンパク質、または両方を含み得る。
【００２９】
本明細書に開示される方法は、ポリヌクレオチドサンプルのDNA配列解析を行う場合に適用され得る。特に、本明細書に開示される方法は、不均一ポリヌクレオチドサンプルのDNA配列解析を行う場合に適用され得、ここで、不均一ポリヌクレオチドサンプルのポリヌクレオチドメンバーは、1つまたは複数の位置において異なるヌクレオチドを有する。好適な不均一ポリヌクレオチドサンプルは、野生型ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、および野生型ポリヌクレオチドと比較して1つまたは複数の位置において1つまたは複数の突然変異を有するポリヌクレオチドを含み得る。
【００３０】
本明細書に開示される方法は、特に、メチル化解析を行う場合に適用され得る。例えば、本明細書に開示される方法は、非メチル化シトシン残基を選択的に修飾しかつメチル化シトシン残基を修飾しない薬剤でサンプルが処理された後に、ポリヌクレオチドサンプルをシーケンシングする場合に適用され得る。バイサルファイト処理は、一般に、ポリヌクレオチドサンプル中の非メチル化シトシン残基をウラシル残基へ変換するために行われる。処理されたポリヌクレオチドサンプルは、次いで、DNA合成のためのテンプレートとして利用され得（例えば、PCR増幅においてまたはシーケンシング反応において）、ここで、ウラシル残基は最終的にチミジン残基へ変換される。処理されたポリヌクレオチドサンプルのシーケンシングを行うことによって、シトシン残基に対する所定の位置におけるチミジン残基の検出は、それぞれ、もとのサンプル中のメチル化シトシンまたはもとのサンプル中の非メチル化シトシンを示す。
【００３１】
本明細書に開示される方法は、ハイスループットまたはウルトラハイスループットシーケンシング法を含み得る多種多様なシーケンシング法へ適用され得る。本明細書に開示される方法は、ポリヌクレオチドサンプルのあるヌクレオチド位置におけるヌクレオチドを決定するために、標的領域をシーケンシングする前に、ポリヌクレオチドサンプルへ内部対照を添加する工程を含み得る。内部対照は、典型的に、ポリヌクレオチド断片のセットを含む。セットのポリヌクレオチド断片の各々は、ポリヌクレオチドサンプルの標的領域に対応するポリヌクレオチド配列、およびポリヌクレオチド断片と標的領域とを区別するためのヌクレオチドタグを含む。ポリヌクレオチド断片のセットは異なるポリヌクレオチド断片を含み得、各々は、あるヌクレオチド位置において異なるヌクレオチドを有し、該ヌクレオチド位置において異なるヌクレオチドの全ての異なる可能な組み合わせを示す。従って、ポリヌクレオチド断片は変性セットを示すと考えられ得る。内部対照としての使用のためのポリヌクレオチドのセットの例を図1に示す。
【００３２】
本明細書で用いられる場合、「ポリヌクレオチドサンプルの標的領域に対応するポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド断片」は、ポリヌクレオチドサンプルの標的領域と同一の配列を有するポリヌクレオチド断片、または本明細書に開示される方法のシーケンシング工程を行うことによって決定されるポリヌクレオチドサンプルの標的領域のうちの1つまたは複数のヌクレオチド位置においてのみ異なる配列を有するポリヌクレオチド断片を意味する。例えば、標的領域が、配列：
2016506755.tif 000002
を有する場合、
セットのポリヌクレオチド断片は、以下のような配列を有し得る：
2016506755.tif 000003
。
標的配列がN個の位置においてC/T変性（degeneracy）を有する場合、セットのポリヌクレオチド断片の総数（#）は2Nであり、ここで、各変性位置は、2つの異なるヌクレオチドのうちの1つ（即ち、CまたはT）であり得る。別の例として、標的領域が、配列：
2016506755.tif 000004
を有する場合、
ポリヌクレオチド断片は、以下のような配列を有し得る：
2016506755.tif 000005
。
標的配列がN個の位置においてA/C/G/T変性を有する場合、セットのポリヌクレオチド断片の総数（#）は4Nであり、ここで、各変性位置は、4つの異なるヌクレオチドのうちの1つ（即ち、A、C、GまたはT）であり得る。
【００３３】
セットのポリヌクレオチド断片は、1つまたは複数の位置において変性を有し得、ここで、ポリヌクレオチドサンプルは、1つまたは複数のヌクレオチド位置において配列の可変性を示す。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド断片のセットは、1つまたは複数のヌクレオチド位置における変性に基づく全ての可能なポリヌクレオチド断片を包含する。さらなる態様において、ポリヌクレオチド断片のセットは、ヌクレオチド位置において異なるヌクレオチドを有する等モル濃度の異なるポリヌクレオチド断片の各々を含む。
【００３４】
本方法のいくつかの態様において、ポリヌクレオチドサンプルおよびポリヌクレオチド断片のセットを同じ反応混合物中においてシーケンシングしてもよい。そのような態様において、ポリヌクレオチドサンプルおよびポリヌクレオチド断片は、反応混合物中に等モル濃度で存在し得る。
【００３５】
本明細書で用いられる場合、「SEQ_C_YR」合成物は、1つまたは複数の位置においてC/T変性を示すテンプレートの合成セットを指す。チミジンへの非メチル化シトシンの最終的な変換に基づいて1つまたは複数の位置において異種性を示すポリヌクレオチドサンプルをシーケンシングする場合に、SEQ_C_YR合成遺伝子は内部対照または外部対照として使用され得る。
【００３６】
ポリヌクレオチド配列において、記号「Y」は、任意のピリミジン（例えば、CまたはT）を意味するように本明細書において意図される。記号「X」は、本明細書で用いられる場合、任意のヌクレオチド（例えば、A、C、G、またはT）を示すために用いられ得る。
【００３７】
本明細書に開示されるセットのポリヌクレオチド断片は、典型的に、ポリヌクレオチド識別タグを含み得るがこれに限定されない、タグ。例えば、ポリヌクレオチド識別タグは、ポリヌクレオチド識別タグを含むポリヌクレオチド断片に特異的にハイブリダイズするプライマーおよび／またはプローブを利用することによって、例えば、DNAシーケンシングの後またはDNAシーケンシングの間、ポリヌクレオチド断片とポリヌクレオチドサンプルのポリヌクレオチドとを区別するために利用され得る。好適なポリヌクレオチド識別タグは、ポリヌクレオチドサンプルのポリヌクレオチドに対するヌクレオチド置換、挿入、または欠失を含み得る。2、3、4、5またはそれ以上のヌクレオチドの置換が、好適なポリヌクレオチド識別タグを提供し得る。
【００３８】
開示される方法は、当技術分野において公知の様々なDNAシーケンシング法へ適用され得る。開示される方法について好適なまたは適応可能なDNAシーケンシング法は、合成によるシーケンシング(sequencing by synthesis)、1分子リアルタイムシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、パイロシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング(sequencing by ligation)、チェーンターミネーションシーケンシング、大規模並列処理シグネチャーシーケンシング（massively parallel signature sequencing）、Polonyシーケンシング、DNAナノボールシーケンシング、Heliscope 1分子シーケンシング、Nanopore DNAシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング(sequencing by hybridization)、質量分析を用いるシーケンシング、マイクロ流体Sangerシーケンシング、および顕微鏡検査に基づくシーケンシング技法を含み得るが、これらに限定されない。従って、開示される方法は、いわゆる「第一世代」DNAシーケンシング技法である、サンガーシーケンシング法またはマクサム・ギルバートシーケンシング法に基づく伝統的なDNAシーケンシング法、ならびに、いわゆる「第二世代」および「第三世代」DNAシーケンシング技法である、ハイスループット解析により適している方法に適用され得る。（例えば、Mardis, Ann. Rev. Genomics and Human Genetics, Vol. 9: 387-402 (2008); Metzker, Genome Research, (2005) 15: 1767-1776; Moorthie et al., Hugo J. v. 5(1-4), Dec. (2011); およびSchadt et al., Human Molecular, Genetics, Vol. 19, No. R2, pp. R227-2490, September 21, 2010; およびShendure et al., Nature Biotechnology 26, 1135-1145 (2008)を参照のこと）。
【実施例】
【００３９】
以下の実施例は、説明のためであり、特許請求される事項の範囲を限定する意図はない。
【００４０】
実施例1−SEQ-C-YR対照を用いる標的化ディープバイサルファイト処理シーケンシング
材料および方法
DNAプライマーおよびサンプル
グルタチオン-S-トランスフェラーゼ遺伝子（GSTP1）のメチル化を、開示される方法を用いて解析した。GSTP1遺伝子プロモーター領域に対応する第11染色体上の遺伝子位置67351027から67351365までの配列は、以下に下線で示されるように解析された：
2016506755.tif 000006
。
【００４１】
従って、解析した領域は以下の配列を有した：
2016506755.tif 000007
。
【００４２】
メチル化DNAを特異的に増幅するために、以下の通りGSTP1遺伝子のこれらの領域についてのメチル化特異的プライマーを利用した：
GSTP1 MSP確認アッセイ
2016506755.tif 000008
。
【００４３】
MSPプライマーによって増幅される領域の上流および下流の約200 bp領域をシーケンシングするように設計されたフランキングプライマーを、以下の通り選択した：
標的化ディープBTシーケンシング
2016506755.tif 000009
。
【００４４】
SEQ-C-YRテンプレートとして、本発明者らは、約195 bpの標的化ディープBTシーケンシング領域と同じ領域をカバーする合成変性DNA断片のセットを設計した。しかし、本発明者らは、合成変性DNA断片によって得られる配列リードと患者サンプルによって得られる配列リードとを見分けるために、合成変性DNA断片へ特有のポリヌクレオチド識別（ID）タグを付加した。
【００４５】
第11染色体上の67351068から67351263までの、バイサルファイトで変換されるDNA配列は、以下の通りである：
2016506755.tif 000010
。
【００４６】
メチル化または非メチル化シトシンを有する可能性がある位置における変性（Y）を組み込んだ後の、第11染色体上の67351068から67351263までの、バイサルファイトで変換されるDNA配列は、以下の通りである：
2016506755.tif 000011
。この標的領域にはC/T変性を有する9個の位置が存在する。従って、SEQ-C-YRテンプレートは、29 = 512種類のメンバーを有する合成変性DNA断片のセットを包含した。
【００４７】
合成変性DNA断片についてのIDタグとして、ジシトシン配列を以下のように標的配列内に挿入した：
2016506755.tif 000012
。
【００４８】
IDタグを含むDNAを特異的に増幅し、従って、合成変性DNA断片と患者サンプルとを区別するために使用することができる、プライマーを以下のように設計した：
IDタグを含有するアンプリコンを区別するためのプライマー
2016506755.tif 000013
。
【００４９】
以下のサンプルリストから、11人の患者の生検材料からのコア由来のサンプルを選択し、メチル化解析のために調製した：
2016506755.tif 000014
。11個のサンプルのうちの8個を「陽性対照」状態に割り当て、11個のサンプルのうちの3個を「陰性対照」状態に割り当てた。
【００５０】
メチル化解析
対照として、インビトロ(IV)メチル化DNA（S7821, Chemicon Inc.）、およびヒト結腸癌細胞株HCT116 DKO由来のDNAを利用した。以下のキットおよび試薬も利用した：EZ DNA Methylation（商標）Kit, D5001, Zymo Research; FastStart High Fidelity PCR System, 03553400001, Roche; High Pure PCR Cleanup Micro Kit, 04983912001, Roche; Quant-iT（商標）PicoGreen（登録商標）dsDNA Assay Kit, P7589, Life Technologies; TruSeq DNA HT Sample Prep Kit A, FC-121-2001, Illumina; TruSeq DNA HT Sample Prep Kit B, FC-121-2002, Illumina;およびMiSeq Reagent Kit v2, 15034097, Illumina。
【００５１】
全てのサンプルおよびIVメチル化DNAについて、1000 ngを、製造業者のプロトコールに従ってEZ DNA Methylation（商標）Kitを用いてバイサルファイト処理によって変換した。変換されたDNAのアンプリコンを、次いで、製造業者のプロトコールに従ってFast Start High Fidelity PCR Systemを使用しておよび以下のマスターミックスを使用して、作製した：
マスターミックスの調製
2016506755.tif 000015
。
プライマーおよびサンプルを上述のように使用した。
【００５２】
PCR反応を、下記のサイクリングプロフィールを使用して製造業者のプロトコールに従ってP9700機器（Applied Biosystems）において行った：
PCR ThermaCyclerプロフィール
2016506755.tif 000016
。
【００５３】
全てのアンプリコンの長さをBio-analyzer(Agilent)において確認した。作製されたアンプリコンを、次いで、製造業者のプロトコールに従ってQuant-iT（商標）PicoGreen（登録商標）dsDNA Assay Kitを使用して定量化し、次いで、製造業者のプロトコールに従ってHigh Pure PCR Cleanup Micro Kitを使用して精製した。全てのアンプリコンの特徴づけおよび精製後、患者サンプル由来のアンプリコンおよび合成遺伝子由来のアンプリコンの両方を、等モル量で一緒にプールした。
【００５４】
次いで、患者サンプルのアンプリコンと合成遺伝子のアンプリコンとの等モル混合物を使用し、シーケンス・レディ（sequence ready）TruSeqライブラリーを作製し、これをIlluminaのMiSEQ機器においてシーケンシングした。シーケンシング後に全てのシーケンシングされたテンプレートを見分けるために、全ての混合物に異なる多重識別子(multiplex identifier （MID）)を加えた。製造業者のプロトコールに従って、MiSEQ Reagent Kit v2を使用してシーケンシングを行った。
【００５５】
結果
図1は、本実施例において行った方法を大まかに説明する。図2において、テンプレート中のCの数に対するSEQ-C-YRテンプレートのメンバーについてのリードの数を比較することによって、シーケンシングバイアスを解析した。図2に示されるように、所定の位置においてシトシンではなくより多くの数のチミジンを有するSEQ-C-YRテンプレートのメンバーは、より多くの数のリードを示し、これは、これらのメンバーがより容易にシーケンシングされたことを示している。シトシンに対するチミジンについてのシーケンシングバイアスはおよそ5であると決定された。およそ1 x 104のシーケンス深度で、所定の位置において全てチミジンを有するテンプレートはおよそ2000リードを生じ、一方、およそ1 x 106のシーケンス深度で、所定の位置において全てシトシンを有するテンプレートはおよそ400リードを生じた。
【００５６】
図3は、メチル化特異的PCRの実施に基づいた、11個の患者サンプルについてのメチル化の相関性を示す。メチル化パーセンテージを、メチル化特異的プライマーを使用して7つの位置において決定し、次いで、メチル化／非メチル化のパーセンテージ（M/U(%)）を、GSTP1を対照としてのアクチンβで割ったものに対してプロットした。「陽性」と特徴づけられた8個のサンプルのうちの7個が、指定のカットオフを上回った。「陽性」と特徴づけられたサンプルのうちの1個ならびに「陰性」と特徴づけられた3個のサンプルが、指定のカットオフを下回った。
【００５７】
次に、3つの陽性サンプル（番号45409、45399、および45266）ならびに3つの陰性サンプル（番号45214、45257、および45260）を、24個のCpGをカバーする領域によって完全にシーケンシングした。所定の数のC（即ち、0〜24）を有する対立遺伝子についてのリードの数を図4にプロットした。示されるように、陽性サンプルは、高メチル化（即ち、>約7位置において）を示す対立遺伝子を多数含有し、一方、陰性サンプルは、そのような高メチル化を示す対立遺伝子を少数含有した。
【００５８】
11個のサンプル全てを、図5に示されるような全対立遺伝子解析へ供した。低い検出可能閾値を有する陰性サンプルについてさえ、患者サンプル中に高度にメチル化された対立遺伝子を検出することが可能であった。
【００５９】
図6は、GSTP1を対照としてのアクチンβで割った比率に対する図2に示されるシーケンシングバイアスを補正するメチル化パーセンテージの対数グラフを提供する。示されるように、3個の陰性サンプルがカットオフレベルを下回り、8個の陽性サンプルがカットオフレベルを上回った。
【００６０】
実施例2−SEQ-C-YR：合成遺伝子を使用する次世代シーケンシングDNAメチル化データについての補正法
課題表示および目的
次世代シーケンシング（NGS）を、1つまたは複数の遺伝子のDNAメチル化状態を決定するためにメチル化特異的PCR（MSP）に代わるものとして使用することができた。2つの主な利点がNGSと関連している。第一に、それはMSPと比較してより容易な多重化およびより大きなパネルの遺伝子を可能にすることである。何故ならば、後者は、異なるフルオロフォアのスペクトル分離に依存し、4つの遺伝子のパネルに限定されることが多いためである。第二に、NGSで得られる情報量は遥かにより多いことである。何故ならば、それは、各個々のヌクレオチドおよびユニークな対立遺伝子の頻度に関する情報を含有するためである。しかし、MSPでは、メチル化遺伝子のコピーは、標準曲線、および多くの場合対照遺伝子を使用して決定することができる。この目的を達成するために、メチル化対立遺伝子のみを検出し、しかし非メチル化変異体を検出しない、メチル化特異的プライマーが設計される必要がある。しかし、これらのプライマーは、メチル化変異体について完全に特異的であるとは限らず、特定の場所における揺らぎ（wobble）を許容する（即ち、ローカルミスマッチ）。
【００６１】
事例研究概要
ヒト遺伝子MGMTは、多形性膠芽腫（GBM）においておよび潜在的にはさらに低悪性度脳腫瘍についても、一般に予後バイオマーカーとして、およびアルキル化剤に関する予測バイオマーカーとして適用されている。この遺伝子がメチル化されている場合、これは、テモゾロミドなどのアルキル化剤を使用する化学療法、および放射線療法に対する有利な反応に起因するより良い予後を示している。NGSがない頃は、DNAメチル化状態は、MSPを用いて、MGMTのコピーおよびACTB対照遺伝子を測定しそして比率を得ることによって、典型的に決定された。より高い比率は、メチル化MGMTコピーの数がより多いこと、およびMGMT遺伝子がメチル化によってサイレンシングされている可能性がより高いことを示している。多くの場合、解釈可能にするためにこの比率に係数1000を乗じるが、2以上の比率は、MGMTがメチル化されていることを示すと考えられる。
【００６２】
Linkoping University (Sweden)からの合計121個のGBMサンプルを、上述のMSP法およびNGSを使用して解析した。NGSについて、MSPアンプリコン全体を包含するプライマーを開発し、166塩基長である最終配列を得た。NGSデータの最終解析は、1つもしくは複数のCヌクレオチドのメチル化頻度もしくはカウント、または1つもしくは複数の特定の対立遺伝子の頻度もしくは数に基づき得る。NGSアンプリコンは、合計19個のCpGジヌクレオチド（即ち、メチル化され得るC）を含有する。MSPアンプリコンに対して、これは、5'→3'の相対順序で以下からなる：MSPアンプリコンの部分でない4個のC；フォワードMSPプライマーの部分である5個のC；MSPアンプリコンの内部部分中の7個のC；およびリバースMSPプライマー中の3個のC。約100000Xのシーケンシング深度を各サンプルについて想定する。
【００６３】
合成遺伝子セット
関心対象のCの位置において変性ヌクレオチド（即ち、関心対象の位置においてCまたはTのいずれか）を有する合成遺伝子セットを作製し、これは、別名「SEQ_C_YR合成遺伝子」と呼ばれる。関心対象のCは全て、メチル化され得るCpGジヌクレオチドの部分であり、かつMSPアンプリコンの部分である。従って、4個の先頭のCのみが、合成遺伝子セット中において変性されておらず、合計15個の変性Cが残る。変性ヌクレオチドを有する等モル濃度の全ての可能な合成遺伝子を有するアンプリコン混合物を作製し、これは215 = 32768種類のユニークな対立遺伝子を含んだ。このアンプリコン混合物を、臨床サンプルと同じ方法でシーケンシングした。技術的な再現を実行し、結果を確認した。
【００６４】
139665リードの総シーケンシング深度が得られた。最初の品質管理として、各アンプリコンの長さを決定した。図7中の箱髭図は、中央値、25%および75%四分位点が全て、予想された長さ166塩基のものであることを示している。実際には、シーケンシングされた対立遺伝子のうちの95.45%が、正確に166塩基対（bp）長であり、一方、1.08%が167 bp長であり、3.48%が166 bpよりも短かった。これは予想外であり、何故ならば、シーケンシングの品質とリードの長さとの間で公知の関係が存在するためである。全ての配列が完全なアンプリコンの長さの少なくとも90%であることが、注意されるべきである。
【００６５】
次に、アンプリコンの各位置について、観察されたヌクレオチドを決定し、各位置について139665コールが生じた。これらのコールは、ヌクレオチド（A、C、TもしくはG）、未決定ヌクレオチド（N、塩基コール無し）、または切断された配列の場合はヌクレオチドの非存在のいずれか1つであった。各位置について、コンセンサスヌクレオチド（即ち、観察された最も多いもの）の頻度を、分母として全ての可能性あるヌクレオチドを用いて決定し、それによって、正確な塩基コールを有さない対立遺伝子または切断された対立遺伝子を除外した（図8を参照のこと）。全体的な高頻度（即ち> 98%）が、15個の変性Cを除くヌクレオチドの圧倒的多数について観察された。非変性Cについて、コンセンサス頻度は最小で98.91%であった。変性Cについては、約50%の頻度がCおよびTコールの混合物で予想される（即ち、バイアスがないと仮定する）。しかし、シーケンシングバイアスが観察され（即ち、> 0.5）、大部分の変性位置についてメチル化Cよりも非メチル化C（即ち、バイサルファイト処理後はT）が検出される頻度が高かった。図9は、CおよびTの両方のカウントと比べてのTのカウントを示すことによって、このバイアスをさらに説明している。バイアスは位置134、139および151におけるヌクレオチドについてより少なく見える一方、Tの平均頻度は58.37%であり、予想された0.5よりも有意に大きい（p < 0.0001；t-検定）。切断された配列および非コールヌクレオチドをコンセンサス頻度の決定において考慮に入れた場合、同様の結果が得られた。この方法で決定された最小コンセンサス頻度は93.87%であった。
【００６６】
最後に、非コンセンサスヌクレオチドを調べた。コールされたヌクレオチドを考慮するだけの場合、15個の変性Cのみが、少なくとも50000リードの、しかし67013を決して超えない高カバレッジ（coverage）に達する。全ての他のヌクレオチドについて観察された最も高いカバレッジは、1417リード、または1.01%の頻度であった。切断されたおよびコールされなかったヌクレオチドも考慮に入れた場合、非コンセンサスコールの頻度は、非変性Cについて6.07%にまで達したが、全ての他の非コンセンサスコールは3.5%未満の頻度を有した。
【００６７】
対立遺伝子バイアス
次に、詳細な対立遺伝子分析を行い、これは、NGSデータの最大の可能性を説明した。全ての非変性Cは高コンセンサスでコールされたので、この段階では、変性Cのみを解析した。20個(0.01%)の配列が切断され、位置151における15番目かつ最後の変性Cに関する情報を含有しなかった。等モル濃度の全ての可能な合成遺伝子を有するアンプリコン混合物は、215 = 32768種類のユニークな対立遺伝子を含有した。全ての不完全な対立遺伝子（即ち、15個の変性C位置のいずれかにおいて未決定ヌクレオチドを有する対立遺伝子）をフィルタリングによって除去した後、合計125500(89.86%)のリードが保持された（125500/139665）。フィルタリング後、26717(81.53%)のユニークな対立遺伝子を同定することができ（26717/32768）、これは、全ての可能な合成遺伝子の対立遺伝子のほぼ20%がこのリード深度では検出されなかったことを示している。図10は、対立遺伝子中のCの数（X軸）の関数としての対立遺伝子が観察された回数（Y軸）を含む箱髭図を示す。
【００６８】
各位置において、より高いリード深度を有する外れ値が存在した。しかし、シーケンシングされた対立遺伝子中に存在するCの数と観察されたリード深度との間に明らかかつ全体的な逆相関がある。図4中のloess回帰線はこの傾向を確認する（曲線）。いかなるシーケンシングバイアスもないならば分布は均一であると仮定すると、予想されるリード深度はユニークな対立遺伝子当たり3.83である（平らな線）。全ての対立遺伝子が含まれるコールされなかった塩基を含んだ場合、予想されるリード深度は4.26へ増加する。従って、個々のヌクレオチドレベルおよびさらにいっそう対立遺伝子レベルの両方で、明らかなシーケンシングバイアスが存在する。特に、完全に非メチル化された対立遺伝子（即ち、変性位置において全てT）は73回シーケンシングされ、一方、完全にメチル化された対立遺伝子（即ち、変性位置において全てC）は2回観察されただけであった。従って、完全にメチル化された対立遺伝子は、完全に非メチル化された対立遺伝子と比べて約35倍さらに低い深度を示す。loess回帰解析は、大きな不一致を平滑化したが、完全にメチル化された対立遺伝子と比べて完全に非メチル化された対立遺伝子について17.5倍増加の配列バイアスを依然として示した。
【００６９】
最終的に、アンプリコン混合物中の全てのユニークな対立遺伝子が検出されるとは限らなかった。上記で観察されたシーケンシングバイアスの観察を考慮すると、シーケンシングされずかつ検出されなかった対立遺伝子は、Tと比べてより多くのCを優先的に含んだだろう。実際に、表1は、Tと比べてより多くのCを含有する対立遺伝子はシーケンシングおよび検出される可能性がより低かったという全体的な傾向を示している。
【００７０】
（表１）
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【００７１】
結論
合成遺伝子の混合物を使用して、大きなシーケンシングバイアスが観察された。「メチル化」対「非メチル化」として対立遺伝子を分類するために使用される実際のアルゴリズムに依存して、混合物をシーケンシングすることによって得られた情報は、特定の対立遺伝子がシーケンシングの深度に基づいて検出される可能性を決定するために使用され得る。従って、合成遺伝子の混合物は、患者のメチル化状態が正確に分類されることを確実にするために正確なシーケンシング深度を決定するためのツールとして使用され得る。
【００７２】
適用A−完全にメチル化された対立遺伝子を同定するために必要とされる最小リード深度の決定
一例として、完全にメチル化された対立遺伝子が患者サンプルのシーケンシングにおいて観察された場合にのみ、患者のメチル化状態は「メチル化」と分類され得る（即ち、状態を「メチル化」と分類するために頻繁かつ密なメチル化を必要とする）。15個の位置の全てにおいて変性Cを有する合成遺伝子の混合物を作製およびシーケンシングすることによって、完全にメチル化された対立遺伝子のたった2個のリードが観察された（即ち、変性位置において全てC）。しかし、いかなるバイアスもないならば3〜4個のリードが予想されただろう。（図4を参照のこと）。最多で観察された非コンセンサスヌクレオチドは、ほぼ1500のリード深度を有した。しかし、これは総カバレッジの関数である。
【００７３】
一般に、特定の対立遺伝子を同定するために必要とされる最小シーケンシング深度は、二項検定を使用して決定され得る。非変性ヌクレオチドに対して行われた解析に基づいて、観察される配列がシーケンシングエラーに由来しないこと（即ち、コンセンサスコール）を確実にするために、少なくとも約2%の頻度が必要とされる。この2%頻度を最小としておよび1%をシーケンシングエラーに起因するバックグラウンドとして考えると、10個の対立遺伝子が合計500のリードで検出され次第、二項検定は有意となる（p=0.0377）。特定の対立遺伝子についての最小リード深度に達するために、既に100,000を超えている、全体的な総カバレッジは、完全にメチル化された対立遺伝子の全体的な予想された頻度および観察された頻度に基づいて、2.6〜5倍増加されるべきである。
【００７４】
適用B−NGSプラットフォームへのMSPアッセイの移行
MSPアッセイは2つのプライマーを利用する：5個のCにまたがる部位にアニールするフォワードプライマー；および、3個のCにまたがる部位にアニールするリバースプライマー。両方のプライマーの間にある7個のCは最終アンプリコンの部分であるが、MSPを使用する最終結果に影響を与えない（即ち、プライマー間の増幅された配列は、MSPにおける成功した増幅と大部分は無関係である）。アニーリング部位において、完全にメチル化されたリバース相補体に結合するように、プライマーが設計されるが、別名「ウォブル（wobble）」と呼ばれる、不完全なマッチの増幅が生じ得る。このいわゆる「ウォブル」は、増幅が生じるために完全にマッチする必要があるプライマーの3'末端におけるCを除いて、プライマー位置中のCのいずれにおいても生じ得る。従って、「ウォブル」は、プライマー位置中の6個のCにおいて生じ得る。
【００７５】
これは、合計27 * 15、即ち、1920種類の対立遺伝子を生じさせ、これは、MSP結果を適応する場合に考慮されるべきである。27は、プライマー間の7個のCについての関連のない状態を反映する因子であり、一方、15は、「ウォブル」を考慮した場合の、プライマー部位における関連する対立遺伝子の数を反映する因子である。139665の総カバレッジに基づいて、総カバレッジまたは完全な配列（即ち、コールされない塩基無し、など）のみを考慮するかどうかに依存して、それらの1920種類の対立遺伝子は7353〜8184回観察されるべきであると計算することができる。しかし、全てのこれらの対立遺伝子は、まとめて、3072回、即ち、予想される頻度の37.5%〜41.8%、観察されるだけである。患者をメチル化とコールするためにはカバレッジ200が最小と考える場合、カバレッジは、1サンプル当たり約10000（即ち、9093）リードの深度へ低下させることができる。この解析を個々のCヌクレオチドへ用いると、リバースプライマー中のメチル化Cの予想される頻度は、(10/15)*200/9093、即ち、1.47%となり、ここで、「10/15」は、MSPによる全ての増幅可能な対立遺伝子のうちのリバースプライマー中の「ウォブル」ヌクレオチド位置（予想200）の1つにおけるCの数を反映しており、全ての可能性が一律に存在すると仮定している。バックグラウンドを含めて、これらは、合計9093個のリードで検出される。二項検定は、これは、観察された約1%のシーケンシングエラーと比べて依然として有意により大きいことを示している（p=0.0008）。同様の計算を対立遺伝子レベルで行うことができ、ここで、98個の非メチル化細胞のバックグラウンド中約2個のメチル化細胞が検出され得る。
【００７６】
適用C−検出感度の決定
実際の感度は2%よりも著しく大きく、何故ならば、これは検出限界ではないためである。シーケンシングエラーがランダムであり互いに独立していると考え、かつ、カバレッジが十分に大きい場合、個々のヌクレオチドレベルでのエラーは掛け合わせられ得、即ち、検出限界は、1%*1%*1%*1%*1%*1%*1%*1%、即ち、1e16個の対立遺伝子のうちたったの1つと計算され得る。後者のカバレッジは現実的には得ることができないが、多数のエラーが、全く同一の対立遺伝子に生じる運命にある。エラーを評価するために、フォワードおよびリバースプライマー由来の全ての8個のC位置が調べられ得る。AまたはGが位置において観察される場合、または位置がコールされない場合、シーケンシングエラーは特徴づけされ得る。これは、C→TまたはT→Cシーケンシングエラーを観察できないことに起因して、感度のわずかな過大評価または実際の検出限界の過小評価を生じさせ得る。合計で139665リードのうち115のみが、2以上のそのようなエラーを含有する（即ち、2つのシーケンシングエラーが同一の対立遺伝子において生じる観察可能性）。MSPアンプリコンに基づくNGSアッセイを使用して、1214個の細胞のバックグラウンドにおいて1個の細胞を検出する感度が得られ得る（即ち、その検出レベル未満では、観察された対立遺伝子頻度がシーケンシングエラーに起因しないと確信することができない、検出レベル）。この検出感度は、MSPアッセイと比べて著しくより良い場合があり、ここで、固定比率が、サンプルがメチル化されているか否かを決定するために適用され、998個の非メチル化細胞のバックグラウンドにおける2個の細胞の検出限界、即ち、NGSアッセイについてのものと比べてほぼ2.5さらに高い検出限界が得られる。しかし、MSPアッセイについての固定比率は、サンプルの大きなシリーズにわたるメチル化比率の二峰性分布に基づく。
【００７７】
要約
SEQ_C_YR合成遺伝子はシーケンシング法において以下のためのキャリブレーターとして利用され得る：(1)アッセイで同定される必要がある対立遺伝子の提示不足をもたらすことが多いシーケンシングバイアスを決定するため；(2)特定の対立遺伝子を検出するために必要とされる最小カバレッジを決定するため；(3)感度（診断の意味で）および特異性（診断およびDNA配列の意味で）の点で性能特性を検証するため；ならびに(4)ある対立遺伝子は検出が困難であり得るという知識を持って適切なNGSアッセイの構築を補助するため。
【００７８】
前述の説明において、様々な置換および改変が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書に開示される本発明に対して行われ得ることが、当業者に容易に明らかになるであろう。本明細書に例示的に記載した本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素、限定なしに、適切に実施することができる。用いられた用語および表現は、説明のためであって限定のためではない用語として使用され、そのような用語および表現の使用において、表示および記載される特徴またはそれらの部分の均等物を排除する意図はなく、しかし、様々な改変が本発明の範囲内で可能であることが認識される。従って、本発明を具体的な態様および任意の特徴によって説明したが、本明細書に開示される概念の改変および／または変更は当業者に委ねられ得ること、ならびにそのような改変および変更は本発明の範囲内にあると考えられることが、理解されるべきである。
【００７９】
いくつかの特許および非特許文献を本明細書において引用する。引用文献は参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。引用文献中の用語の定義と比較した場合に本明細書中の用語の定義との間で矛盾が存在する場合、用語は、本明細書中の定義に基づくと解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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