(57)【要約】  心臓組織コンストラクト形成のための方法及びデバイスが提供される。いくつかの実施形態において、心筋細胞、非筋細胞及び細胞外マトリックスを含み、健常心臓組織と関連付けられる特性を示す、心臓組織コンストラクトを形成するための方法が提供される。いくつかの実施形態において、心臓に見出される塩基性微小環境を模倣する心臓微小組織コンストラクトを形成できるように、動的電気機械力の伝達を助けるためのマイクロファブリケーションプラットフォームが提供される。マイクロファブリケーションプラットフォームは、形成中の微小組織コンストラクトの位置を安定化するための保持フィーチャを含んでいてもよく、マイクロファブリケーションプラットフォームは、リングジオメトリーを有する組織コンストラクトをもたらすよう構成される傾斜支持体を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、マイクロファブリケーションプラットフォームは、点電気刺激の適用のため、及び/又は可視変位への力の伝達を増幅するために構成されてもよい。【選択図】図２２（ａ）
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材、及び
基材により支持される2つ以上の保持構造、ここで前記2つ以上の保持構造は、組織コンストラクトの形成中に前記基材上に播種された組織コンストラクトに張力を加えるように配置されている、
を含み、
少なくとも1つの保持構造が、形成中の組織コンストラクトの位置を安定化するための安定化フィーチャを含み、
前記安定化フィーチャが、前記基材と前記保持構造の遠位端との間の中間の位置で設けられている、
組織コンストラクトを形成するためのマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項２】
前記安定化フィーチャが溝又は突起である、請求項1に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項３】
前記安定化フィーチャが傾斜プロファイルを含む、請求項1に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項４】
前記傾斜プロファイルが、外側に上に向かって広がる上部傾斜部、外側に下に向かって広がる下部傾斜部、および前記上部傾斜部と前記下部傾斜部との間の最小位置を含み、それにより組織コンストラクトの位置が上部傾斜部と下部傾斜部との間で安定化される、請求項3に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項５】
2つ以上の前記保持構造がそれぞれ安定化フィーチャを含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項６】
前記2つ以上の保持構造のうちの2つが異なる安定化フィーチャを含む、請求項5に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項７】
遮断構造が前記2つ以上の保持構造の一部の間に設けられており、前記遮断構造が、組織コンストラクトの形成中に2つ以上の保持構造間の組織の形成を防止するように構成されている、請求項1から3のいずれか一項に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項８】
1つ以上の前記保持構造がカンチレバーとして構成され、前記カンチレバーの偏向が、保持構造により支持される組織コンストラクトにおける張力の量と関連付けられる、請求項1から7のいずれか一項に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項９】
前記カンチレバーの遠位端が、組織コンストラクトが前記安定化フィーチャにより安定化される位置を越えて伸長し、前記遠位端の偏向が増幅される、請求項8に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項１０】
前記2つ以上の保持構造が、形成中の組織コンストラクト内に実質的に1軸張力をもたらすように位置する、請求項1から9のいずれか一項に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項１１】
各保持構造の表面がポロキサマーでコーティングされ、前記ポロキサマーが、組織コンストラクトの形成中に組織コンストラクトと保持構造との間の相対移動を維持するために好適である、請求項1から10のいずれか一項に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項１２】
前記基材により支持され、組織コンストラクトの点刺激に好適な相対スペーシングを有する一対の電極をさらに含む、請求項1から11のいずれか一項に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項１３】
前記一対の電極が、前記保持構造のうちの1つと隣接して位置する、請求項12に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項１４】
前記一対の電極が、前記保持構造のうちの1つとして機能するよう位置する、請求項12に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項１５】
前記保持構造が、組織コンストラクトが病態を示すように適合している、請求項1から14のいずれか一項に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項１６】
前記基材に形成されるマイクロウェルをさらに含み、前記保持構造が前記マイクロウェルの底部により支持される、請求項1から15のいずれか一項に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項１７】
複数の前記マイクロウェルを含む、請求項16に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項１８】
基材、
組織コンストラクトの形成中に前記基材上に播種された組織コンストラクトに張力を加えるように位置する、前記基材により支持される2つ以上の保持構造、及び
前記基材により支持され、組織コンストラクトの点刺激に好適な相対スペーシングを有する一対の電極、
を含む、組織コンストラクトを形成するためのマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項１９】
基材、及び
組織コンストラクトの形成中に前記基材上に播種された組織コンストラクトに張力を加えるように位置する、前記基材により支持される2つ以上の保持構造
を含み、
少なくとも1つの保持構造が、形成中の組織コンストラクトの位置を安定化するための安定化フィーチャを含み、
前記保持構造が、組織コンストラクトが病態を示すように適合している、
組織コンストラクトを形成するためのマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項２０】
足場の非存在下で心筋細胞及び線維芽細胞を含み、細胞総数に対する心筋細胞比が、心臓組織コンストラクトが健常ヒト心臓組織の伝導速度特性を示すようになされる、心臓組織コンストラクト。
【請求項２１】
伝導速度がおよそ35cm/sから60cm/sの間である、請求項20に記載の心臓組織コンストラクト。
【請求項２２】
伝導速度がおよそ44cm/sから49cm/sの間である、請求項20又は21に記載の心臓組織コンストラクト。
【請求項２３】
細胞総数に対する心筋細胞の比が、およそ55%から95%の間である、請求項20から22のいずれか一項に記載の心臓組織コンストラクト。
【請求項２４】
細胞総数に対する心筋細胞の比が、およそ60%から90%の間である、請求項20から22のいずれか一項に記載の心臓組織コンストラクト。
【請求項２５】
細胞総数に対する心筋細胞の比が、およそ65%から85%の間である、請求項20から22のいずれか一項に記載の心臓組織コンストラクト。
【請求項２６】
細胞総数に対する心筋細胞の比が、およそ70%から80%の間である、請求項20から22のいずれか一項に記載の心臓組織コンストラクト。
【請求項２７】
マイクロファブリケーションプラットフォームが、
基材、及び
組織コンストラクトの形成中に前記基材上に播種された組織コンストラクトに張力を加えるように位置する、前記基材により支持される2つ以上の保持構造
を含み、
基材上に、コラーゲンマスターミックス、心筋細胞及び線維芽細胞を含む混合物を、少なくとも2つの保持構造が混合物に囲まれるように分注する工程、並びに
心臓組織コンストラクトが張力下で少なくとも2つの保持構造間に維持されるよう、混合物が心臓組織コンストラクトへとリモデリングするのに好適な一定時間、基材をインキュベートする工程、
を含み、
細胞総数に対する心筋細胞の比が、心臓組織コンストラクトが健常ヒト心臓組織の伝導速度特性を示すようになされる、
マイクロファブリケーションプラットフォームを使用した心臓組織コンストラクトの形成方法。
【請求項２８】
伝導速度がおよそ35cm/sから60cm/sの間である、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
伝導速度がおよそ44cm/sから49cm/sの間である、請求項27又は28に記載の方法。
【請求項３０】
細胞総数がおよそ細胞25,000個から100,000個の間である、請求項27から29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも1つの保持構造が、形成中の組織コンストラクトの位置を安定化するための安定化フィーチャを含む、請求項27から30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
点刺激を介して電場が形成中の心臓組織コンストラクトに印加される、請求項27から31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
細胞総数に対する心筋細胞の比が、およそ55%から95%の間である、請求項27から32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
細胞総数に対する心筋細胞の比が、およそ60%から90%の間である、請求項27から32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
細胞総数に対する心筋細胞の比が、およそ65%から85%の間である、請求項27から32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
細胞総数に対する心筋細胞の比が、およそ70%から80%の間である、請求項27から32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記保持構造が、心臓組織コンストラクトが拡散限界閾値未満の半径を特徴とする断面を有するように適合して、心臓組織コンストラクトが拡散障壁なしに形成される、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
マイクロウェル、
前記マイクロウェルの底部から上方に伸長する、前記マイクロウェル内に設けられている傾斜支持構造、及び
組織コンストラクトの形成中に前記マイクロウェル内に播種された組織コンストラクトに張力を加えるように位置する、前記傾斜支持構造上に設けられている1つ以上の保持構造、
を含む、組織コンストラクトを形成するためのマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項３９】
前記1つ以上の保持構造が、組織コンストラクトの形成中に前記マイクロウェル内に播種された組織コンストラクトに張力を加えるために好適な相対的距離をもって設けられている、2つの保持構造を含む、請求項38に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項４０】
前記1つ以上の保持構造が、リング状組織コンストラクトを保持するための単一の保持構造を含む、請求項38に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項４１】
少なくとも1つの保持構造が、形成中の組織コンストラクトの位置を安定化するための安定化フィーチャを含む、請求項38に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項４２】
前記安定化フィーチャが、前記傾斜支持構造の上部と前記保持構造の遠位端との間の中間の位置に設けられている、請求項41に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項４３】
1つ以上の前記保持構造がカンチレバーとして構成され、前記カンチレバーの偏向が、保持構造により支持される組織コンストラクトにおける張力の量と関連付けられる、請求項41又は42に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項４４】
前記カンチレバーの遠位端が、組織コンストラクトが安定化フィーチャにより安定化される位置を越えて伸長し、前記遠位端の偏向が増幅される、請求項43に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項４５】
前記傾斜支持構造が前記マイクロウェルと一体形成されている、請求項38から44のいずれか一項に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項４６】
前記傾斜支持構造が円錐形状を有する側壁を含む、請求項38から45のいずれか一項に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項４７】
前記傾斜支持構造が曲線状の側壁を含む、請求項38から45のいずれか一項に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項４８】
前記傾斜支持構造が、組織リモデリングプロセス中に前記マイクロウェル内で形成される組織コンストラクトの上方への移動を誘導するよう構成される、請求項38から47のいずれか一項に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項４９】
前記傾斜支持構造を囲む前記マイクロウェルの容積が、組織コンストラクトの形成に好適な一定量の未重合マトリックスを含有する程度に十分に大きく、初期には前記傾斜支持構造の上部が未重合マトリックスで被覆されていない、請求項38から48のいずれか一項に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項５０】
前記傾斜支持構造が前記マイクロウェルの前記底部の上に配置される上部プラットフォームを含み、前記1つ以上の保持構造が前記上部プラットフォームにより支持される、請求項38から49のいずれか一項に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項５１】
前記1つ以上の保持構造が前記傾斜支持構造と一体形成されている、請求項50に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項５２】
前記マイクロウェルが側壁を含み、前記側壁の少なくとも一部が、前記傾斜支持構造を囲む前記マイクロウェルの一部内へと液体を導くよう構成される、請求項38から51のいずれか一項に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項５３】
前記側壁が下部及び上部を含み、前記上部が、液体を前記傾斜支持構造を囲む前記マイクロウェルの前記一部内へと導くように構成される曲線形状を有している、請求項52に記載のマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項５４】
請求項38から53のいずれか一項により提供される複数のマイクロファブリケーションプラットフォームを含む、マイクロプレート。
【請求項５５】
マイクロウェル、
前記マイクロウェルの底部から上方に伸長する、前記マイクロウェル内に設けられている支持構造、及び
組織コンストラクトの形成中に前記マイクロウェル内に播種された組織コンストラクトに張力を加えるように構成される、前記支持構造により支持される2つ以上の保持構造、
を含み、
前記支持構造が、組織リモデリングプロセス中に前記保持構造間の組織形成を防止するように構成される形状を有する、
組織コンストラクトを形成するためのマイクロファブリケーションプラットフォーム。
【請求項５６】
マイクロファブリケーションプラットフォームが、
マイクロウェル、
マイクロウェルの底部から上方に伸長する、マイクロウェル内に設けられている傾斜支持構造、及び
組織コンストラクトの形成中にマイクロウェル内に播種された組織コンストラクトに張力を加えるように構成される、傾斜支持構造上に設けられている1つ以上の保持構造、
を含み、
マイクロウェル中に、リモデリングプロセスにより組織コンストラクトを形成するよう構成される前重合マトリックスを、1つ以上の保持構造と接触させることなしに傾斜支持構造を囲む領域へと分注する工程、及び
組織コンストラクトが、リモデリングプロセス中に傾斜支持構造に沿って上方に移動し、保持構造によるリングジオメトリー内に制約されるよう、前重合マトリックスが組織コンストラクトへとリモデリングするのに好適な一定時間、マイクロウェルをインキュベートする工程、
を含む、
マイクロファブリケーションプラットフォームを使用した組織コンストラクトの形成方法。
【請求項５７】
マイクロウェルが下部及び上部を含む側壁を含み、上部が、液体を前記傾斜支持構造を囲む前記マイクロウェルの前記一部内へと導くように構成される曲線形状を有しており、前重合マトリックスをマイクロウェル内へと分注する工程が、
前重合マトリックスが側壁の上部に接触し、前重合マトリックスが遠心なしに傾斜支持構造を囲む領域に流れ込むように、前重合マトリックスを分注する工程、
を含む、請求項56に記載の方法。
【請求項５８】
組織コンストラクトの形成中又は形成後に、1つ以上の薬剤候補物質をマイクロウェルに添加する工程、及び
薬剤候補物質に対する組織コンストラクトの応答を測定する工程、
をさらに含む、請求項56に記載の方法。
【請求項５９】
応答が光学マッピングを介して測定される、請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
1つ以上の保持構造がカンチレバーとして構成され、前記カンチレバーの偏向が、保持構造により支持される組織コンストラクトにおける張力の量と関連付けられ、
カンチレバーとして構成される1つ以上の保持構造の偏向の測定を介して応答を検出する工程、
をさらに含む、請求項58に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、その内容全体が本明細書に参照により組み込まれる「心臓組織コンストラクト及びその製造方法」を名称とする2012年12月7日出願の米国仮出願第61/734,859号、及び、その内容全体が本明細書に参照により組み込まれる「心臓組織コンストラクト及びその製造方法」を名称とする2013年7月5日出願の米国仮出願第61/843,285号に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
本開示は、組織コンストラクト及びその製造のためのマイクロスケールプラットフォームに関する。より詳細には、本開示は、心臓組織コンストラクト、及びスクリーニングにおけるその適用に関する。
【背景技術】
【０００３】
心臓疾患、たとえば心筋梗塞のための薬剤及び細胞ベースの治療方略は、臨床現場に至るまでの道のりで重大な障害に直面し、主要な障害の1つは、情報に富んだインビトロヒトモデル系の欠如である。従来のモデル系は、1)インプット細胞集団のために特に設計された成熟インビボ様微小環境の欠如、2)比較的低スループットのアッセイ、及び3)アウトプットパラメータの低含有量性を含む、3つの根本的限界のうちの少なくとも1つが障害となっている。
【０００４】
スケールアップされた量のヒト多能性幹細胞(hPSC)由来心筋細胞を生成及び保存するための分化誘導方略は、90%超の効率で可能である[1〜7]。加えて、心筋細胞のための複数の細胞表面マーカーが発見され、適切な抗体の組合せを使用して、目的の精製集団を選別するために使用することができる[8、9]。誘導多能性幹細胞(iPSC)技術の近年の進歩と共に、患者特異的な心筋細胞をオンデマンドで細胞量の不足なしに誘導することが今や可能である。心筋細胞産生のスケールアップにおけるこれらの進歩並びに精製及び保存方法の改善にもかかわらず、臨床的に有用な様式でこれらの標的細胞を効果的に使用する好適な方法の開発における研究がなされることが切望されている。
【０００５】
そのような価値ある分野の1つは、心毒性及び薬剤スクリーニングのための生理的に妥当なインビトロモデルプラットフォームを開発するものである。収縮心筋細胞へと分化させるためのhPSCの誘導は、確立された手法であるとはいえ、これらの細胞の成熟段階は、成人心筋細胞と比較して著しく乏しい[5]。従来、分化の初期段階のhPSC由来心筋細胞が、使用され、支持細胞なしに、1)ネイティブの心臓微小環境を模倣せず、2)心臓生理と関連付けられうる適切なパラメータ(たとえば、活動電位伝播、伝導速度及び収縮力)を測定しにくい、2次元剛性表面上で培養される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Elliott, D., et al., NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nature methods, 2011. 8(12): p. 1037-1040.
【非特許文献２】Burridge, P., et al., Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell stem cell, 2012. 10(1): p. 16-28.
【非特許文献３】Zhang, J., et al., Extracellular Matrix Promotes Highly Efficient Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells: The Matrix Sandwich Method. Circulation research, 2012.
【非特許文献４】Xu, C., et al., Efficient generation and cryopreservation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Regenerative medicine, 2011. 6(1): p. 53-66.
【非特許文献５】Zhu, W.-Z., B. Van Biber, and M. Laflamme, Methods for the derivation and use of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 2011. 767: p. 419-431.
【非特許文献６】Lian, X., et al., Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012.
【非特許文献７】Kattman, S., et al., Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell stem cell, 2011. 8(2): p. 228-240.
【非特許文献８】Uosaki, H., et al., Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PloS one, 2011. 6(8).
【非特許文献９】Dubois, N., et al., SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature biotechnology, 2011. 29(11): p. 1011-1018.
【発明の概要】
【０００７】
心臓組織コンストラクト（構築物）形成のための方法及びデバイスが提供される。いくつかの実施形態において、健常心臓組織と関連付けられる特性を示す、心筋細胞、非筋細胞及び細胞外マトリックスを含む心臓組織コンストラクトを形成するための方法が提供される。いくつかの実施形態において、心臓に見出される塩基性微小環境を模倣する心臓微小組織コンストラクトを形成できるように、動的電気機械力の伝達を助けるためのマイクロファブリケーションプラットフォームが提供される。マイクロファブリケーションプラットフォームは、微小組織コンストラクトの位置をその形成中に安定化するための保持フィーチャ（形状構成）を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、マイクロファブリケーションプラットフォームは、点電気刺激の適用のため及び/又は可視変位(visible displacement)への力の変換を増幅するために構成されてもよい。
【０００８】
したがって、一態様において、
基材、及び
組織コンストラクトの形成中に前記基材上に播種された組織コンストラクトに張力を加えるように位置する、前記基材により支持される2つ以上の保持構造
を含み、
少なくとも1つの保持構造が、組織コンストラクトの位置をその形成中に安定化するための安定化フィーチャ（形状構成）を含み、
前記安定化フィーチャが、前記基材と前記保持構造の遠位端との間の中間の位置で設けられている、
組織コンストラクトを形成するためのマイクロファブリケーションプラットフォームが提供される。
【０００９】
別の態様において、
基材、
組織コンストラクトの形成中に前記基材上に播種された組織コンストラクトに張力を加えるように位置する、前記基材により支持される2つ以上の保持構造、及び
前記基材により支持され、組織コンストラクトの点刺激に好適な相対スペーシングを有する一対の電極、
を含む、
組織コンストラクトを形成するためのマイクロファブリケーションプラットフォームが提供される。
【００１０】
別の態様において、
基材、及び
組織コンストラクトの形成中に前記基材上に播種された組織コンストラクトに張力を加えるように位置する、前記基材により支持される2つ以上の保持構造
を含み、
少なくとも1つの保持構造が、組織コンストラクトの位置をその形成中に安定化するための安定化フィーチャを含み、
前記保持構造が、組織コンストラクトが病態を示すように適合している、
組織コンストラクトを形成するためのマイクロファブリケーションプラットフォームが提供される。
【００１１】
別の態様において、
マイクロファブリケーションプラットフォームが、
基材、及び
組織コンストラクトの形成中に前記基材上に播種された組織コンストラクトに張力を加えるように位置する、前記基材により支持される2つ以上の保持構造
を含み、
基材上に、コラーゲンマスターミックス、心筋細胞及び線維芽細胞を含む混合物を、少なくとも2つの保持構造が混合物に囲まれるように分注する工程、並びに
心臓組織コンストラクトが張力下で少なくとも2つの保持構造間に維持されるよう、混合物が心臓組織コンストラクトへとリモデリングするのに好適な一定時間、基材をインキュベートする工程、
を含み、
細胞総数に対する心筋細胞の比が、心臓組織コンストラクトが健常ヒト心臓組織の伝導速度特性を示すようになされる、
マイクロファブリケーションプラットフォームを使用した心臓組織コンストラクトの形成方法が提供される。
【００１２】
別の態様において、
マイクロウェル、
前記マイクロウェルの底部から上方に伸長する、前記マイクロウェル内に設けられている傾斜支持構造、及び
組織コンストラクトの形成中に前記マイクロウェル内に播種された組織コンストラクトに張力を加えるように位置する、前記傾斜支持構造上に設けられている1つ以上の保持構造、
を含む、
組織コンストラクトを形成するためのマイクロファブリケーションプラットフォームが提供される。
【００１３】
別の態様において、
マイクロウェル、
前記マイクロウェルの底部から上方に伸長する、前記マイクロウェル内に設けられている支持構造、及び
組織コンストラクトの形成中に前記マイクロウェル内に播種された組織コンストラクトに張力を加えるように構成される、前記支持構造により支持される2つ以上の保持構造、
を含み、
前記支持構造が、組織リモデリングプロセス中に前記保持構造間の組織形成を防止するように構成される形状を有する、
組織コンストラクトを形成するためのマイクロファブリケーションプラットフォームが提供される。
【００１４】
別の態様において、
マイクロファブリケーションプラットフォームが、
マイクロウェル、
マイクロウェルの底部から上方に伸長する、マイクロウェル内に設けられている傾斜支持構造、及び
組織コンストラクトの形成中にマイクロウェル内に播種された組織コンストラクトに張力を加えるように構成される、傾斜支持構造上に設けられている1つ以上の保持構造、
を含み、
マイクロウェル中に、リモデリングプロセスにより組織コンストラクトを形成するよう構成される前重合マトリックスを、1つ以上の保持構造と接触させることなしに傾斜支持構造を囲む領域へと分注する工程、及び
組織コンストラクトが、リモデリングプロセス中に傾斜支持構造に沿って上方に移動し、保持構造によるリング幾何（ジオメトリー）内に制約されるよう、前重合マトリックスが組織コンストラクトへとリモデリングするのに好適な一定時間、マイクロウェルをインキュベートする工程、
を含む、
マイクロファブリケーションプラットフォームを使用した組織コンストラクトの形成方法が提供される。
【００１５】
本開示の機能的側面及び有利な側面のさらなる理解が、以下の詳細な説明及び図面の参照により実現されうる。
【００１６】
ここで、あくまで例として、図面を参照しつつ、実施形態を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１（ａ）】マイクロファブリケートされたマスターからPDMS基材を複製し、次にテーパーヘッドで改変する工程を示す図である。ネガポリウレタン系マスター(ネガティブポリウレタン系マスター)を生成し、最終マスターとして使用する。次に基材を、24ウェルプレート内で調製し、滅菌する。細胞含有コラーゲンをマイクロウェルのくぼみ内へと遠心し、高密度に充填された組織へとリモデルする。
【図１（ｂ）】有限要素ベースの計算モデルを使用してシミュレートされた、2つの微小組織ジオメトリーを示す図である。一方は2軸組織内張力(biaxial intratissue tension force)(BITF)を伴い、他方は1軸張力を伴い、以下「心臓マイクロワイヤー」と呼ぶ。シミュレーションは、有限要素メッシュにおけるあらゆる方向へのサルコメアアルファ-アクチニン形成を可能にする。代表体積要素(RVE)の図を例示のために提供する。
【図１（ｃ）】1軸微小組織幅における実験及びシミュレーションの時間変化をプロットする図である。シミュレーション結果は、kv=1.5, 1.25, 1.0について示す。実験結果は、平均±SEM.として示す。挿入図:心臓微小組織リモデリングの64時間にわたる時間経過。
【図１（ｄ）】シミュレーション結果を示す図である。辺縁領域に共局在するBITF微小組織ジオメトリーにおける(i)応力(無次元有効応力
【００１８】
【数１】
2016504022.tif 000003
により表される)、及び(ii)サルコメアアルファ-アクチニン発現(Πにより表される)をプロットする。比較のための染色組織試料の画像を併せて示す。図1(d)(iii)〜(viii)は、BITF微小組織のサルコメアアルファ-アクチニンの染色(左側((iii)、(v)、(vii))の明視野及び右側(iv)、(vi)、(viii)のアルファ-アクチニン染色)を示す。サルコメアアルファ-アクチニンの染色(矢印で示す白色フィラメント)は、辺縁領域での発現を確証する。DAPI染色核は、丸い白色の点として示される。
【図１（ｅ）】(i)及び(ii)は、シミュレーション結果を示す図である。長手軸に沿ったあらゆる領域の心臓マイクロワイヤージオメトリーにおける(i)応力及び(ii)サルコメアアルファ-アクチニン発現をプロットする。比較のための染色組織試料の画像を併せて示す。図(iii)〜(viii)は、心臓マイクロワイヤーの心筋トロポニンT(cTnT)染色(左側((iii)、(v)、(vii))の明視野及び右側((iv)、(vi)、(viii))の心筋トロポニンT染色)を示す。図1(e)(ix)〜(xii)は、心臓マイクロワイヤーのサルコメアアルファ-アクチニンの染色(左側((ix)、(xi))の明視野及び右側(x)、(xii)のサルコメアアルファ-アクチニン染色)を示す。心筋トロポニンT(パネルの第1のカラムの白い矢印)及びサルコメアアルファ-アクチニン(パネルの第2のカラムの白い矢印)の免疫染色は、長手軸に沿ったすべての領域におけるサルコメア発現を確証する。
【図１（ｆ）】定量複屈折イメージングシステムで測定される、心臓マイクロワイヤーの原線維コラーゲン含有量の画像を示す図である。画素色調は、心臓マイクロワイヤーにおける複屈折原線維コラーゲンの角度に対応する。緊張させた心臓マイクロワイヤーは、1方向にアラインしたコラーゲン(i)〜(iv)を示す。緊縮させた心臓マイクロワイヤーは、カールの方向の原線維コラーゲンアラインメント(v)〜(viii)を維持する。
【図１（ｇ）】擬似3Dのアラインした及びアラインしていないコラーゲン基材上のラット新生仔(rN)-心筋細胞の(i)細胞伸長及び(ii)配向をプロットする図である。細胞伸長の尺度は、細胞の長軸の短軸に対する比である。細胞配向の尺度は、パターニングされたコラーゲンのアラインメントの方向に対するものである。
【図１（ｈ）】心臓マイクロワイヤーにおけるrN-心筋細胞の(i)細胞伸長及び(ii)配向をプロットする図である。細胞伸長の尺度は、細胞の長軸の短軸に対する比である。細胞配向の尺度は、心臓マイクロワイヤーの長手軸の方向に対するものである。データを、平均±SEM.、P<0.05(マン-ホイットニーU検定)として報告する。
【図２（ａ）−（ｂ）】心臓マイクロワイヤーの電気生理学的評価をプロットする図である。非分離ヒト胚性幹細胞(hESC)-心筋細胞凝集体、未刺激心臓マイクロワイヤー、及び刺激心臓マイクロワイヤーの(a)興奮閾値及び(b)最大捕捉率(maximum capture rate)をそれぞれ示す。
【図２（ｃ）−（ｄ）】経膜活動電位及び細胞内カルシウム移行を記録するために用いられた光学マッピングの結果を示す図である。心臓マイクロワイヤーは予想どおり、既知の効果を有する薬剤に反応した。図2(c)は、ベースライン対照(i)に対する、活性化率を増加させたアドレナリン作動性神経伝達物質であるエピネフリン(ii)、及び活性化率を減少させた抗不整脈薬であるリドカイン(iii、iv)の結果を示す。図2(d)は、ベースライン対照(i)に対する、心臓マイクロワイヤーにおけるカルシウム波の振幅を低下させたL型Ca2+チャネル遮断剤であるベラパミル(ii)、及びカルシウム移行速度を増加させたエピネフリンを追加した場合(iii)の結果を示す。
【図２（ｅ）】各パネルが心臓マイクロワイヤーの長手軸に沿ったAP伝播((ii)に図示)の時間経過を描写する、正常心臓マイクロワイヤーの活動電位(AP)伝播を示す画像の第1のセット(i)、及び、リエントラント波様システムをもたらす、伝導ブロックにより妨害されることが観察された心臓マイクロワイヤーのAP伝播((iv)に図示)を示す画像の第2のセット(iii)を含む図である。
【図２（ｆ）】正常心臓マイクロワイヤーの自発性AP伝播((ii)に図示)の方向を示す画像の第1のセット(i)、及び、電気点刺激を使用してどのように方向を逆転できるか((iv)に図示)を示す画像の第2のセット(iii)を含む図である。記録の位置トレース及びタイムスケールを示す。
【図２（ｇ）】原線維形成中のリエントラント波((i)に図示)を模倣する組織のリングを生み出すために設計された円形基材を使用して生成された心臓マイクロワイヤーの画像を示す図である。電気生理学的評価により、リングを旋回するAP伝播の自発性無限ループ様サイクルが明らかになった。1サイクルを示す。データを、平均±SEM.、P<0.05(マン-ホイットニーU検定)として報告する。
【図３（ａ）】自己組織化して組織形態形成を決定する、NKX2-5+及びCD90+細胞の異なるインプット集団で得られる組成に関する図である。図3(a)は、どのようにNKX2-5-GFP+細胞(心筋細胞)及びCD90+細胞(FB)がhESC-心筋細胞から選別され、心臓マイクロワイヤー(CMW)及び凝集体(Agg)において特定の比で混合されたのかを示す。示されたパーセンテージは、コンストラクト又は凝集体を形成する細胞総数に対する所定の細胞タイプのパーセンテージを示す。非分離及び非選別対照もまた使用された。
【図３（ｂ）−（ｃ）】図3(b)は、純粋NKX2-5-GFP+細胞から構成される心臓マイクロワイヤー(条件「A」)を示し、これは心筋細胞の非統合的なコロニーを伴う球状形態を形成した。図3(b)(i)〜(iii)は、NKX2-5-GFP+の明視野画像を示し、一方で対応する免疫蛍光画像を図3(b)(iv)〜(vi)に示す。左(画像3(b)(i)及び3(b)(iv))から右(画像3(b)(iii)及び3(b)(vi))へと順に、徐々により高い倍率を示す。図3(c)は、NKX2-5-GFP+細胞75%及びCD90+細胞25%から構成される心臓マイクロワイヤー(条件「B」)を示す。これは、強固な構造を有する良好に統合された組織をもたらした。NKX2-5-GFP+細胞は、免疫蛍光画像において白く見える(図3(c)(iv)〜(vi))。図3(c)(i)〜(iii)は、細胞の明視野画像を示し、一方で図3(c)(iv)〜(vi)は、NKX2-5-GFP+の対応する免疫蛍光画像を示す。左(画像3(c)(i)及び3(c)(iv))から右(画像3(c)(iii)及び3(c)(vi))へと順に、徐々により高い倍率を示す。
【図３（ｄ）】図3(d)〜(f)は、(d)非分離凝集体、(e)条件「B」の凝集体、及び(f)条件「B」の心臓マイクロワイヤーの免疫蛍光顕微鏡写真を示す(DAPI染色核は丸く白い点として現れ(iv及びix)、NKX2-5-GFP+細胞は白で示され(iii及びviii)、ビメンチン発現は白で示される(ii及びvii))。対応する明視野画像を、図3(d)(v)及び(x)、図3(e)(v)及び(x)、並びに図3(f)(v)及び(x)に示す。
【図３（ｅ）】図3(d)〜(f)は、(d)非分離凝集体、(e)条件「B」の凝集体、及び(f)条件「B」の心臓マイクロワイヤーの免疫蛍光顕微鏡写真を示す(DAPI染色核は丸く白い点として現れ(iv及びix)、NKX2-5-GFP+細胞は白で示され(iii及びviii)、ビメンチン発現は白で示される(ii及びvii))。対応する明視野画像を、図3(d)(v)及び(x)、図3(e)(v)及び(x)、並びに図3(f)(v)及び(x)に示す。
【図３（ｆ）】図3(d)〜(f)は、(d)非分離凝集体、(e)条件「B」の凝集体、及び(f)条件「B」の心臓マイクロワイヤーの免疫蛍光顕微鏡写真を示す(DAPI染色核は丸く白い点として現れ(iv及びix)、NKX2-5-GFP+細胞は白で示され(iii及びviii)、ビメンチン発現は白で示される(ii及びvii))。対応する明視野画像を、図3(d)(v)及び(x)、図3(e)(v)及び(x)、並びに図3(f)(v)及び(x)に示す。
【図４（ａ）−（ｂ）】心筋細胞対照及び成熟マーカーの遺伝子発現解析が、心臓マイクロワイヤーにおけるインプット細胞組成の希釈濃度及び成熟効果を示す結果を示す図である。A、B、C、Dはそれぞれ、NKX2-5-GFP+細胞100、75、50及び25パーセントがCD90+細胞からなる残りのパーセンテージを伴うものに相当する。NKX2.5(図4(a))及びDDR2(図4(b))の相対発現を、バルク組織集団の対照マーカーとして用いた。
【図４（ｃ）−（ｄ）】図4(c)は、心筋細胞及びFBの両方に発現したCx43の相対発現を示す。図4(d)〜(l)において、すべての心臓特異的マーカー(cTnT、SIRPA、ANF、BNP、MYL2、MYL7、MYH6、MYH7)は、混合組織集団における心筋細胞数を考慮して、NKX2.5発現レベルに標準化されている。データを、平均±SEM.、P<0.05(マン-ホイットニーU検定)として報告する。
【図４（ｅ）−（ｆ）】図4(d)〜(l)において、すべての心臓特異的マーカー(cTnT、SIRPA、ANF、BNP、MYL2、MYL7、MYH6、MYH7)は、混合組織集団における心筋細胞数を考慮して、NKX2.5発現レベルに標準化されている。データを、平均±SEM.、P<0.05(マン-ホイットニーU検定)として報告する。
【図４（ｇ）−（ｈ）】図4(d)〜(l)において、すべての心臓特異的マーカー(cTnT、SIRPA、ANF、BNP、MYL2、MYL7、MYH6、MYH7)は、混合組織集団における心筋細胞数を考慮して、NKX2.5発現レベルに標準化されている。データを、平均±SEM.、P<0.05(マン-ホイットニーU検定)として報告する。
【図４（ｉ）−（ｊ）】図4(d)〜(l)において、すべての心臓特異的マーカー(cTnT、SIRPA、ANF、BNP、MYL2、MYL7、MYH6、MYH7)は、混合組織集団における心筋細胞数を考慮して、NKX2.5発現レベルに標準化されている。データを、平均±SEM.、P<0.05(マン-ホイットニーU検定)として報告する。
【図４（ｋ）−（ｌ）】図4(d)〜(l)において、すべての心臓特異的マーカー(cTnT、SIRPA、ANF、BNP、MYL2、MYL7、MYH6、MYH7)は、混合組織集団における心筋細胞数を考慮して、NKX2.5発現レベルに標準化されている。データを、平均±SEM.、P<0.05(マン-ホイットニーU検定)として報告する。
【図５】ネイティブヒト心臓組織及び心臓マイクロワイヤー系の伝導速度の比較を示す表である。文献から得られるヒト心臓の正常及び病態生理の伝導速度の値を示す。心臓マイクロワイヤーの値は、3つの別個の実験から光学マッピング技術を介して測定された。マイクロエンジニアリングにより製造された心臓マイクロワイヤーは、健常ヒト心臓の心外膜と同等の伝導速度を示すことが見出された。データを平均±SEM.として報告する。
【図６（ａ）】マイクロファブリケートされたプラットフォームにおける微小組織形成を示す図である。図6(a)は、細胞が播種され、くぼみ内に遠心され、ノードジオメトリーに基づいて微小組織を形成するようリモデルされる、組織形成のプロセスを示す画像(1〜6)を示す。
【図６（ｂ）−（ｃ）】図6(b)は、組織により及ぼされる力を測定し、また、様々な度合いで組織リモデリングを制約するために使用できる偏向ポストを有するプラットフォームを示す画像である。図6(c)は、1ウェル当たりの試料を増やすためにどのように微小組織を通常表面上に配列できるかを示す画像を示す。
【図６（ｄ）−（ｅ）】図6(d)(明視野)及び(e)(ファロイジン染色アクチンフィラメント及びcTnTの共免疫蛍光)は、どのように微小組織が微小組織播種基材内にインサイチューで固定され、透過処理され、染色され、撮影されうるかを示す画像を示す。より明るいコントラストのエリアは、細胞におけるアクチン及びcTnTの共局在を示す。
【図６（ｆ）】組織マイクロファブリケーションプラットフォームが内部に一体形成されたマイクロウェルを有するマイクロプレートのマイクロファブリケーションのための例示的3D印刷法を示す図である。
【図６（ｇ）】本明細書に開示の例示的マイクロファブリケーションプラットフォームにおける単位長当たりの力を決定するために使用される方程式を示す図である。
【図６（ｈ）】3D印刷を介して形成されたマスターマイクロプレート鋳型に基づく複製マイクロプレートの例示的製造方法を示す図である。
【図６（ｉ）】24マイクロウェル及び96マイクロウェルマイクロプレートの例示的設計を示す図である。
【図６（ｊ）】24マイクロウェル及び96マイクロウェルマイクロプレートの例示的設計を示す図である。
【図７（ａ）−（ｂ）】シグナル開始後複数の時点、すなわちt/θ=0:(a)t/θ=0.8、(b)t/θ=1.4、(c)t/θ=1.9、(d)t/θ=2.5、(e)t/θ=3.1、(f)t/θ=4.2、(g)t/θ=5.9、(h)t/θ=10.0での、2軸組織におけるサルコメアの算出された分布及びアラインメントを示す図である。
【００１９】
【数２】
2016504022.tif 000004
の量が、ベクトル色調及びベクトル長により示される。ベクトル配向は、組織においてすべての点でηmaxの配向(優位なサルコメア形成の方向)を示す。上部プロット(top plot)における白一色の輪郭は、初期の未変形組織ジオメトリーを示す。
【図７（ｃ）−（ｄ）】図７（ａ）の続きである。
【図７（ｅ）−（ｆ）】図７（ａ）の続きである。
【図７（ｇ）−（ｈ）】図７（ａ）の続きである。
【図８（ａ）−（ｂ）】シグナル開始後複数の時点、すなわちt/θ=0:(a)t/θ=0.8、(b)t/θ=1.4、(c)t/θ=1.9、(d)t/θ=2.5、(e)t/θ=3.1、(f)t/θ=4.2、(g)t/θ=5.9、(h)t/θ=10.0での、2軸組織における無次元有効応力
【００２０】
【数３】
2016504022.tif 000005
の算出された分布を示す図である。
【００２１】
【数４】
2016504022.tif 000006
式中、
【００２２】
【数５】
2016504022.tif 000007
及び
【００２３】
【数６】
2016504022.tif 000008
はそれぞれ、最大及び最小主応力である。
【００２４】
【数７】
2016504022.tif 000009
の大きさが、ベクトル色調及びベクトル長により示される。ベクトル配向は、最大主方向、すなわち
【００２５】
【数８】
2016504022.tif 000010
の配向を示す。上部プロットにおける白一色の輪郭は、初期の未変形組織ジオメトリーを示す。
【図８（ｃ）−（ｄ）】図８（ａ）の続きである。
【図８（ｅ）−（ｆ）】図８（ａ）の続きである。
【図８（ｇ）−（ｈ）】図８（ａ）の続きである。
【図９（ａ）−（ｂ）】シグナル開始後複数の時点、すなわちt/θ=0:(a)t/θ=0.6、(b)t/θ=1.2、(c)t/θ=2.9、(d)t/θ=4.6、(e)t/θ=5.8、(f)t/θ=10.0での、1軸組織におけるサルコメアの算出された分布及びアラインメントを示す図である。
【００２６】
【数９】
2016504022.tif 000011
の量が、ベクトル色調及びベクトル長により示される。ベクトル配向は、組織においてすべての点でηmaxの配向(優位なサルコメア形成の方向)を示す。上部プロットにおける白一色の輪郭は、初期の未変形組織ジオメトリーを示す。
【図９（ｃ）−（ｄ）】図９（ａ）の続きである。
【図９（ｅ）−（ｆ）】図９（ａ）の続きである。
【図１０（ａ）−（ｂ）】シグナル開始後複数の時点、すなわちt/θ=0:(a)t/θ=0.6、(b)t/θ=1.2、(c)t/θ=2.9、(d)t/θ=4.6、(e)t/θ=5.8、(f)t/θ=10.0での、2軸組織における無次元有効応力
【００２７】
【数１０】
2016504022.tif 000012
の算出された分布を示す図である。
【００２８】
【数１１】
2016504022.tif 000013
式中、
【００２９】
【数１２】
2016504022.tif 000014
及び
【００３０】
【数１３】
2016504022.tif 000015
はそれぞれ、最大及び最小主応力である。
【００３１】
【数１４】
2016504022.tif 000016
の大きさが、ベクトル色調及びベクトル長により示される。ベクトル配向は、最大主方向、すなわち
【００３２】
【数１５】
2016504022.tif 000017
の配向を示す。上部プロットにおける白一色の輪郭は、初期の未変形組織ジオメトリーを示す。
【図１０（ｃ）−（ｄ）】図１０（ａ）の続きである。
【図１０（ｅ）−（ｆ）】図１０（ａ）の続きである。
【図１１（ａ）】微小組織の生成、培養、及びアッセイのためのマイクロファブリケートされたプラットフォームの設計を示す図である。図11(a)は、1軸張力微小組織(UNITF)(ii)が、2軸張力微小組織(BITF)(i)及びCMW(iii)と比較して、細胞伸長及び細胞アラインメントの増加を示す、微小組織播種プラットフォームのための基材寸法を示す。
【図１１（ｂ）−（ｃ）】図11(b)(単一ウェルのクローズアップ)及び(c)(24ウェルプレートの部分的画像)は、マイクロファブリケートされた基材に埋め込まれた白金ワイヤー電極から構成される、24ウェル心臓バイオリアクタープラットフォームが、播種から培養、アッセイの点へと心臓マイクロワイヤーを含有するよう使用されることを示す。
【図１２】NKX2-5及びCD90混合実験のフローサイトメトリー細胞選別プロットを示す図である。(a)は、20日目の胚性幹細胞由来胚様体(EB、EBはNKX2-5-GFP+及びCD90+画分について分離され選別された)の蛍光活性化細胞選別を示し、(b)は、NKX2-5-GFP+及びCD90+選別画分の純度制御を示す。
【図１３】[NKX2-5+ 100%]細胞(a〜c)並びに[NKX2-5 75%及びCD90+ 25%]細胞(d〜e)から構成される心臓マイクロワイヤーの形態(14日目)を示す図である。
【図１４】定常状態での1軸組織におけるサルコメアの分布及びアラインメント(a)を示す図である(t/θ=10.0)。
【００３３】
【数１６】
2016504022.tif 000018
の量が、ベクトル色調及びベクトル長により示される。ベクトル配向は、組織においてすべての点でηmaxの配向(優位なサルコメア形成の方向)を示す。[短いベクトルが、低い値のΠを示し、アラインしたサルコメアの有意な形成が生じることを意味することに留意せよ。他方、長いベクトルは、アラインしたサルコメアの有意な形成が、ベクトル配向により示される優位な方向に生じることを意味する。]上部プロットにおける白一色の輪郭は、初期の未変形組織ジオメトリーを示す。破線は、下部プロット(bottom plot)において明瞭さのため拡大された領域を示す。このモデルは、心筋細胞約75〜80%及び線維芽細胞約20〜25%からなる典型的な新生仔ラットCM単離集団に基づいた。（ｂ）は定常状態での1軸組織における無次元有効応力
【００３４】
【数１７】
2016504022.tif 000019
の分布を示す図である(t/θ=10.0)。
【００３５】
【数１８】
2016504022.tif 000020
式中、
【００３６】
【数１９】
2016504022.tif 000021
及び
【００３７】
【数２０】
2016504022.tif 000022
はそれぞれ、最大及び最小主応力である。
【００３８】
【数２１】
2016504022.tif 000023
の大きさが、ベクトル色調及びベクトル長により示される。ベクトル配向は、最大主方向、すなわち
【００３９】
【数２２】
2016504022.tif 000024
の配向を示す。[短いベクトルが、低い値の
【００４０】
【数２３】
2016504022.tif 000025
を示し、応力状態が大部分本質的に2軸であることを意味することに留意せよ(完全な2軸応力状態は
【００４１】
【数２４】
2016504022.tif 000026
であり、結果として
【００４２】
【数２５】
2016504022.tif 000027
となる)。他方、長いベクトルは、高い値の
【００４３】
【数２６】
2016504022.tif 000028
を意味し、応力状態が本質的にまったく2軸でなく、むしろそれが1軸応力状態へと傾いていることを意味する。もし
【００４４】
【数２７】
2016504022.tif 000029
であれば、応力状態は完全に1軸であり、
【００４５】
【数２８】
2016504022.tif 000030
である。最小主応力は、ECMの受動的圧縮変形により負となりうることに留意せよ。したがって、
【００４６】
【数２９】
2016504022.tif 000031
の値を計算できる。しかしながら、そのような受動的圧縮応力は、細胞により生成される能動的応力と比較して小さく、それゆえ組織において計算される最高値の
【００４７】
【数３０】
2016504022.tif 000032
は、1を大きく超えることはない(約1.2)。]上部プロットにおける白一色の輪郭は、初期の未変形組織ジオメトリーを示す。破線は、下部プロットにおいて明瞭さのため拡大された領域を示す。
【図１５】（ａ）定常状態での2軸組織におけるサルコメアの分布及びアラインメントを示す図である(t/θ=10.0)。
【００４８】
【数３１】
2016504022.tif 000033
の量が、ベクトル色調及びベクトル長により示される。ベクトル配向は、組織においてすべての点でηmaxの配向(優位なサルコメア形成の方向)を示す。[短いベクトルが、低い値のΠを示し、アラインしたサルコメアの有意な形成が生じることを意味することに留意せよ。他方、長いベクトルは、アラインしたサルコメアの有意な形成が、ベクトル配向により示される優位な方向に生じることを意味する。]上部プロットにおける白一色の輪郭は、初期の未変形組織ジオメトリーを示す。破線は、下部プロットにおいて明瞭さのため拡大された領域を示す。    
（ｂ）定常状態での2軸組織における無次元有効応力
【００４９】
【数３２】
2016504022.tif 000034
の分布を示す図である(t/θ=10.0)。
【００５０】
【数３３】
2016504022.tif 000035
式中、
【００５１】
【数３４】
2016504022.tif 000036
及び
【００５２】
【数３５】
2016504022.tif 000037
はそれぞれ、最大及び最小主応力である。
【００５３】
【数３６】
2016504022.tif 000038
の大きさが、ベクトル色調及びベクトル長により示される。ベクトル配向は、最大主方向、すなわち
【００５４】
【数３７】
2016504022.tif 000039
の配向を示す。[短いベクトルが、低い値の
【００５５】
【数３８】
2016504022.tif 000040
を示し、応力状態が大部分本質的に2軸であることを意味することに留意せよ(完全な2軸応力状態は
【００５６】
【数３９】
2016504022.tif 000041
であり、結果として
【００５７】
【数４０】
2016504022.tif 000042
となる)。他方、長いベクトルは、高い値の
【００５８】
【数４１】
2016504022.tif 000043
を意味し、応力状態が本質的にまったく2軸でなく、むしろそれが1軸応力状態へと傾いていることを意味する。もし
【００５９】
【数４２】
2016504022.tif 000044
であれば、応力状態は完全に1軸であり、
【００６０】
【数４３】
2016504022.tif 000045
である。最小主応力は、ECMの受動的圧縮変形により負となりうることに留意せよ。したがって、
【００６１】
【数４４】
2016504022.tif 000046
の値を計算できる。しかしながら、そのような受動的圧縮応力は、細胞により生成される能動的応力と比較して小さく、それゆえ組織において計算される最高値の
【００６２】
【数４５】
2016504022.tif 000047
は、1を大きく超えることはない(約1.2)。]上部プロットにおける白一色の輪郭は、初期の未変形組織ジオメトリーを示す。破線は、下部プロットにおいて明瞭さのため拡大された領域を示す。
【図１６】ウェル内のデュアルポストという一般的レイアウトを有する、様々な例示的カンチレバー設計を示す図である。
【図１７】様々なポストジオメトリーを使用した微小組織形成の実施形態を示す図である。
【図１８】ビデオファイルからの静止画像において捉えられたポスト偏向を示す図である。(a)は、偏向前のポストに結合された心臓組織のフィールドビューを示し、(b)は、偏向後の(a)におけるのと同じフィールドビューを示し、(c)及び(d)はそれぞれ、(a)及び(b)におけるポストのクローズアップを示す。矢印は、(c)及び(d)の両方において、フィールド画像における同じ位置にある。
【図１９】例示的カンチレバーデュアルポスト実施形態の図解である。両方のポストが突起を有する。一体化された電極を有する1本のポストが屈曲せずに維持され、一方で第2のポストは屈曲可能である。
【図２０】例示的カンチレバーデュアルポスト実施形態の図解である。1本のポストが突起を有し、第2のポストが溝を有する。両方のポストが屈曲可能である。
【図２１】突起含有及び溝含有フィーチャを組み合わせた、例示的カンチレバーマルチポスト実施形態の図解である。この保持フィーチャの組合せは、組織形成の制御のために使用される。
【図２２（ａ）】例示的カンチレバーデュアルポスト実施形態の図解である。両方のポストが突起を有するが、1本のポストは直線状である一方で、第2のポストは傾斜している。
【図２２（ｂ）−（ｃ）】2つの保持構造を支持する傾斜支持構造を含むマイクロファブリケーションプラットフォームを有するマイクロウェルのアレイの図解である。
【図２２（ｄ）】2つの保持構造を支持する傾斜支持構造を含むマイクロファブリケーションプラットフォームを有するマイクロウェル内での組織コンストラクトの例示的形成方法の図解である。
【図２２（ｅ）】組織マイクロリング生成の例示的プロセスフローを示す一連の写真である(A〜F)。
【図２２（ｆ）−（ｇ）】（ｆ）（ｉ）〜（ｉｖ）は細胞播種に用いられる細胞数の効果を示す一連の写真及び顕微鏡画像を含む図である。（ｇ）（ｉ）〜（ｉｉ）は系内での自発性収縮心臓微小組織の顕微鏡写真を示す図である。(i)は、明視野下での1ウェル当たり細胞100,000個を示し、(ii)は、GFP発現hPSC由来CMを示す488nm光下での同じ微小組織を示す。
【図２２（ｈ）−（ｉ）】（ｈ）はヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)及びhPSC細胞由来肝細胞から構成される微小組織を示す画像である。hPSC由来肝細胞の凝集体及びHUVECの単一細胞を、1組織当たり細胞100,000個で混合した。組織は1〜2日以内にリモデルする。（ｉ）は、筋管へと分化するマウス筋芽細胞から構成される微小組織を示す画像である。筋細胞を1組織当たり細胞100,000個で播種した。組織は3〜4日以内にリモデルする。組織は、3〜4日以内に自発的に収縮する(分化後)ことが観察された。
【図２３】（ａ）は例示的カンチレバーデュアルポスト実施形態の図解である。両方のポストが突起を有する。模式図は、偏向前の両方のポストを示す。（ｂ）は、両方のポストが偏向したことを示す図である。
【図２４】例示的カンチレバーデュアルポスト実施形態の図解である。両方のポストが突起を有する。模式図は、偏向前の両方のポストを示す。
【図２５】例示的隣接カンチレバーデュアルポスト実施形態の図解である。点刺激電極として作用する。
【図２６（ａ）】例示的カンチレバーデュアルポスト実施形態の図解である。両方のポストが突起を有し、(a)細胞がウェル内へと突起のレベル未満で播種され、(b)組織リモデリングが生じ、突起の周囲に組織のバンドが形成され、(c)第2の細胞タイプがウェルに添加され、(d)第2の組織タイプの存在下でさらなる組織リモデリングが生じる。
【図２６（ｂ）】図２６（ａ）の続きである。
【図２６（ｃ）】図２６（ａ）の続きである。
【図２６（ｄ）】図２６（ａ）の続きである。
【図２７（ａ）】マイクロウェル内に傾斜支持体を有するマイクロファブリケーションプラットフォームを使用して形成される複合組織構造の例示的形成方法の図解を示す図である。
【図２７（ｂ）−（ｃ）】（ｂ）は、2段階リモデリングプロセスを介して複合組織コンストラクトを形成するために用いられた2つの細胞タイプ(GFPタグ化)及びCell tracker dye Redの蛍光顕微鏡画像を示す図である。（ｃ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）は、低倍率での複合組織コンストラクトの蛍光顕微鏡画像を示す図である。(i)細胞タイプ1からの蛍光、(ii)細胞タイプ2からの蛍光、及び(iii)両方の細胞タイプからの蛍光を示す。各図で、各細胞タイプと関連付けられる領域は、外側の白い周縁で強調されている。
【図２８】指数関数的関係性を示す、4日間のC2C12細胞株の細胞集団をプロットする図である。
【図２９】組織コンストラクトの特性の研究中に用いられた細胞/コラーゲンマトリックス条件を示す表である。
【図３０】組織均一性研究の結果を提示する表である。
【図３１】実験の第1日の6つの条件それぞれの各組織リングの4つのコーナーについて、組織厚の均一性を示すプロットである。
【図３２】3日間、6つすべての条件について時間の関数として組織厚をプロットする図である。
【図３３（ａ）】第1日及び第2日の6つの条件それぞれからのC2C12組織の(a)生存及び(b)死滅染色からの画像を提示する図である。
【図３３（ｂ）】図３３（ａ）の続きである。
【図３４】予備スクリーニングにおいて特定の濃度で使用される成長因子を列挙する表である。
【図３５】成長因子に応答する関数値をプロットする図である。興奮閾値を左に示し、最大捕捉率を右に示す。
【図３６】不整脈中のリエントラント波を模倣する組織のリングを作り出すために設計された円形基材を使用して生成された、心臓組織コンストラクトのシグナルトレーシングを示す図である。(a)は不整脈を示し、(b)は正常リズムを示す。
【図３７】2週間の相対収縮力の変化をプロットする図である。
【図３８】測定された心臓組織コンストラクトの収縮力に対する、選択された薬剤の効果を示すプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
本開示の様々な実施形態及び態様が、下に論じる詳細を参照して説明される。以下の説明及び図面は、本開示を例証するものであり、本開示を限定するものとして解釈されるべきではない。本開示の様々な実施形態の十全な理解を提供するため、数多くの具体的な詳細が説明される。しかしながら、本開示の実施形態についての簡潔な議論を提供するため、いくつかの例において、周知の又は従来の詳細は説明されない。本明細書に開示の方法の工程の順序は、方法が実行可能である限り重要ではないことが理解されるべきである。さらに、特に指定しない限り、2つ以上の工程が同時に、又は本明細書に記載のものとは異なる順序で実行されてもよい。
【００６４】
本明細書において使用される「含む(comprises)」及び「含んでいる(comprising)」という用語は、包括的で範囲を限定せず、排他的でないものとして解釈されるべきである。具体的には、本明細書及び特許請求の範囲において使用されるとき、「含む」及び「含んでいる」という用語並びにそれらの変化形は、特定された特徴、工程又は構成要素が含まれることを意味する。これらの用語は、他の特徴、工程又は構成要素の存在を排除するものとして解釈されるべきでない。
【００６５】
本明細書において使用される「例示的」という用語は、「例(example)、例(instance)、例示(illustration)として役立つこと」を意味し、本明細書に開示の他の構成よりも好ましい又は有利なものとして解釈されるべきではない。
【００６６】
本明細書において使用される「約」及び「およそ」という用語は、粒子、混合物の組成又は他の物理的性質若しくは特徴の大きさ(dimensions)の範囲と併せて使用されるとき、平均してほとんどの大きさが満たされるが、統計的に大きさがこの領域外に存在しうる場合に実施形態を排除しないように、大きさの範囲の上下限に存在しうるわずかの変動を包含することが意図されている。これらのような実施形態を本開示から排除することを意図するものではない。
【００６７】
心筋の形成は、好適な機能を達成するための制御環境を必要とする複雑なプロセスである。発生中の胚の心臓において、分子の勾配が、中胚葉に沿った分化を駆動し、ネイティブの心臓に見出される細胞タイプを生成するよう心血管系統を駆動する。心臓細胞は、高度に構造化された細胞外マトリックス(ECM)においてタンパク質との結合により、可溶性因子の受容により、また、すべてが合わさって興奮収縮連関機能組織の自己組織化を編成する電気機械的キューに応答して、成熟する。後になって、成人心臓は、高度に秩序立ったECM内に心筋細胞、心臓線維芽細胞、平滑筋細胞及び内皮細胞バランスのとれた組成を動的に維持することが可能である。心臓が恒常性を維持し、限定的な範囲で虚血性傷害に応答して修復するのは、複雑な細胞-細胞及び細胞-ECM相互作用を通じてのことである[10]。
【００６８】
このネイティブ微小環境とは対照的に、薬剤スクリーニング及び毒性試験のための従来のインビトロモデルプラットフォームは、基底膜でコーティングされた組織培養物処置ポリスチレン表面を使用する。これら2次元基材は、組織分布的キューを欠き、多くの場合標的化細胞タイプのネイティブ基材より数桁大きい弾性係数を有する。加えて、これらのアッセイにおいて心筋細胞は、それ自体で、間質細胞に由来する馴化培地を伴って、又は、生理学的に不正確な割合の支持細胞タイプを伴って培養される。支持細胞、たとえば心臓線維芽細胞は、心筋細胞生存及び増殖に影響するパラクリン因子を提供し、それゆえ、この構成要素を欠くモデルは、試験化合物に対して不正確な応答を提供する可能性が高い。
【００６９】
加えて、電気的[11]及び動的機械力[12]の勾配は、発生及び成熟を通じて、並びに、疾患、傷害及び修復後に、きわめて重要な電気的及び機械的伝達シグナリングを提供する。細胞形態[13]、増殖率、移動[14]、分化能[15]、薬剤応答性[16]、及びジャクスタクリン(juxtracrine)シグナリング[17]はすべて、ECM媒介機械的伝達により影響を受ける。試験化合物の影響を正確に決定するため、標的細胞集団のニッチが厳密に再現され制御されるべきである。いくつかの系は、心臓組織コンストラクトの収縮及び形成中に張力を加えるための機械的支持及び/又はセンサーを含むように発達したにもかかわらず、これらの系のいずれも、健常成人心臓組織の特性を模倣する人工心臓組織の製造の成功をこれまで報告してこなかった。
【００７０】
本明細書に開示の実施形態は、心臓ニッチの重要な構成要素を組み込み、それゆえハイコンテントスクリーニング等の用途に用いられうる生理的に妥当な系である、心臓コンストラクトを提供する。本開示の選択された実施形態は、人工心臓組織コンストラクトを提供し、以下これを「心臓マイクロワイヤー」構造と呼ぶ。これは、心筋細胞、非筋細胞、及び細胞外マトリックスを含み、心臓に見出される塩基性微小環境を模倣する心臓マイクロワイヤーを形成できるように、動的電気機械力の伝達を助けるために形成できる。心臓マイクロワイヤー構造の数多くの形成方法が下に開示される。いくつかの実施形態において、たとえば好適な又は事前に選択されたジオメトリー及び/又はサルコメア発現空間プロファイルを有する心臓マイクロワイヤーの設計及び形成のための統合計算及び製造方法が提供される。いくつかの実施形態において、1つ以上の心臓マイクロワイヤーは、たとえばマイクロプレートのマイクロウェル内で、ハイコンテントスクリーニングのためにマイクロファブリケートされてもよい。
【００７１】
いくつかの例示的な実施形態において、正常な電気生理学的応答性を示すよう適合されうる、高密度で、アラインした、維持された3-D細胞外マトリックスにおいて高心臓サルコメアタンパク質発現が維持されるように、形態学的に再現可能な形態の心臓マイクロワイヤーを形成するための方法が提供される。心臓マイクロワイヤーは、遊離懸濁コラーゲン系マトリックス中の、高密度のアラインした心筋細胞、及び非筋細胞を電気機械力下で組み込み、さらに成熟させ、したがって、ハイコンテントスクリーニングにおいて生理学的に正確な応答を測定するための心臓ニッチの重要な側面を構築することにより形成されてもよい。
【００７２】
たとえば、下に詳細に説明するように、ヒト多能性幹細胞由来心筋細胞から構成され、急速(7日)成熟法で形成される心臓マイクロワイヤーは、足場の非存在下で、健常ヒト心臓組織と同等の47.4±12.4cm/sの伝導速度を有する心臓マイクロワイヤーをもたらした。加えて、下に説明するように、心臓マイクロワイヤー(75%のNKX2-5-GFP+及び25%のCD90+細胞から構成される)の遺伝子発現研究は、MYL2、MYL7、及びMYH7を含む重要な心臓成熟マーカーの有意な増加を明らかにした。これらの結果は、hPSC由来心筋細胞の成熟及び心臓再生治療に向けた小分子のスクリーニングのためのツールとしての、本心臓マイクロワイヤープラットフォームの好適さを示す。
【００７３】
人工心筋組織は、心筋の基礎的な生物学的特徴を解明することと、器官型インビトロモデル系を開発することの両方のために使用できる。本明細書に開示の心臓マイクロワイヤーは、選択された実施形態において、現在のアプローチに対する顕著な利点を提供できる。本明細書において提供される実施形態のいくつかの潜在的利点には、1)心筋ニッチの再現、2)複数の機能的パラメータを報告する能力、3)小型化、4)バルク製造の性能、及び5)心筋細胞構成要素の成熟が含まれうる。下の例に示されるように、本明細書において教示される実施形態の例示的実施は、これらの基準を満たすことが示され、表現型及び機能の特性解析を通じて実験的に確証された。たとえば、ECM組織分布の役割は、アラインした細胞形態及び機能を促進するために重要であると初めて確証された。
【００７４】
さらに、適切な微小組織ジオメトリーを同定するために、応力及び心臓タンパク質発現が高いエリアを予測及び評価する微小組織収縮性のコンピューターシミュレーションが用いられてもよい。応力の高いエリアを高心臓タンパク質発現及び細胞アラインメントと関連付けることにより、心臓タンパク質発現の増加の予測が、1軸応力の増加のエリアにおいて実験的に確証され、1軸組織内張力から主になる微小組織構成を選択した。
【００７５】
心臓マイクロワイヤープラットフォームの小型化により、血管新生の必要がなくなった。なぜなら、微小組織は、拡散限界閾値である150μm未満の半径を特徴とする断面を有するからである。拡散障壁の欠如はまた、インサイチューでの従来の免疫蛍光及び画像化技術の利用を可能にする。加えて、アッセイに必要とされるインプット細胞集団は、従来の3次元インビトロモデルと比較して最小限である。
【００７６】
電気機械的刺激を系に組み込む能力が、点刺激電極でのペーシング及び受動機械的伸展を介して提供されてもよい。この形状因子は、他とは異なり、心臓組織の様々な構造を設計し、インプット細胞集団の混合を制御して自己組織化を誘導し、伝導速度及び遺伝子発現を単一微小組織のqPCR介して測定する能力を提供する。下の例はまた、成人様インビトロモデルの開発のための重要な焦点となる分野である心臓成熟の文脈における、組織形態及び遺伝子発現に対するインプット細胞集団比の効果を示す。
【００７７】
本開示の以下の節は、心臓マイクロワイヤー組織構造及びその製造方法のいくつかの例示的実施を示す。これらの例示的実施はまた、下の実施例の節においてさらに詳細に説明する。
【００７８】
微小組織プラットフォームを使用した心臓マイクロワイヤー形成
一実施形態において、正確な心臓細胞ニッチを設計するため、3-D細胞カプセル化ECMジオメトリーを提供する。これを達成するため、成長及び増殖期中の柔軟なECMをリモデルする細胞の能力を利用する。細胞牽引力によるゲル圧縮を通じて、ゲル中にカプセル化された分離心臓細胞が、以下を含む複数の段階の変化を経る。すなわち、
1)アクチンフィラメントの回復及び糸状仮足の伸長、
2)細胞接着分子、ギャップ結合及び収縮タンパク質の蓄積及び集合、並びに
3)心臓組織が活動電位を伝播させ、一斉に収縮することを可能にする興奮収縮連関[18]。
【００７９】
いくつかの実施形態において、3次元組織コンストラクトは、サルコメアの形成及びアラインメントを達成するために、リモデリングプロセス中に組織コンストラクトを保持し、コンストラクト内に好適な張力の分布を加えるための2つ以上の保持構造を含む、マイクロファブリケーションプラットフォームを使用する前述の工程により形成されてもよい。そのようなマイクロファブリケーションプラットフォームは、一般に、細胞及びコラーゲンマスターミックスを受け入れるためのマイクロウェル(たとえば、ミリメートル又はサブミリメートルのスケールの寸法を有する)、並びに、リモデリングプロセス中に組織コンストラクトを事前に選択されたジオメトリーへと制約するためのウェル内の少なくとも2つの保持構造を含む。いくつかの実施形態において、保持構造は、マイクロウェルの底部から垂直方向に伸長していてもよい。
【００８０】
下のいくつかの実施形態において、保持構造は、「ノード」及び/又は「ポスト」と呼ばれる。たとえば、1つ以上の保持構造が、実質的に円柱状のポストであってもよいが、保持構造は、その収縮中に組織コンストラクトを保持するために好適であり、リモデリングプロセス中に張力が組織コンストラクト内に加えられるように保持構造が設けられている限り、他の幾何学的形状をとりうることが理解されるべきである。いくつかの実施形態において、リモデリング中及びリモデリング後に組織コンストラクト内に生成された張力が、実質的に1軸であるように構造フィーチャが設けられてもよい。他の実施形態において、下でさらに詳細に論じるように、保持構造は、リモデリングを通じた形成中に組織コンストラクトに増負荷性負荷が適用されるよう、弾性特性を有していてもよい。他の実施形態において、下でさらに説明するように、点刺激を提供するために、電極が微小組織プラットフォーム内に組み込まれてもよい。
【００８１】
いくつかの実施形態において、保持構造は、リモデリング中に組織コンストラクトを物理的に制約すること、及び、構造フィーチャの張力依存変位により力変換体(force transducer)として作用すること、という二重の役割を提供してもよい。そのような実施形態において、保持構造は、マイクロカンチレバーと呼ばれてもよい。これらの前述の実施形態の数多くの変形形態が、本開示により想定されていることが理解されるべきである。たとえば、マイクロウェル内のカンチレバーの数は、組織コンストラクトに必要とされる「2軸性」に応じて変化しうる。いくつかの実施形態において、細胞及び組織アラインメントを可能にするために(たとえば、心臓、骨格筋、脈管構造)、組織コンストラクトを1軸の力で製造することが所望されてもよい。他の実施形態において、いくつかの組織コンストラクトは、アラインメントを要しなくてもよい(たとえば肝臓又は腸)。
【００８２】
いくつかの実施形態において、微小組織は、ポストへの組織接着を防止するようにマイクロウェル内に維持される。マイクロウェルの表面及び保持構造は、細胞/ECM/タンパク質の接着を防止するコーティングで処理されていてもよい。好適なコーティング物質には、Pluronic(商標)酸(又は別の好適なポロキサマー)及びBSAが含まれ、これらは、コンストラクトのリモデリング中に微小組織に対し非接着性であるような、十分な濃度及び/又は量で提供されてもよい。実施の一例において、コーティング物質は、Pluronic(商標)酸およそ5%であってもよい。しかしながら、いくつかの場合において、異なるコンストラクト間で様々な程度の接着を実現することが所望されてもよい。リモデリング量が大きい場合、低濃度のPluronic(商標)を使用でき(たとえばおよそ0.5〜2%)、一方でリモデリングが非常に少ない場合、高パーセンテージ(たとえばおよそ4〜6%)を使用できる。たとえば、純線維芽細胞の培養物において、Pluronic(商標)およそ0.5〜2%を使用でき、心筋細胞組織については、Pluronic(商標)およそ4〜6%を使用できる(保持フィーチャが両方の場合において有効である限り)。
【００８３】
組織内の心筋細胞の連続的収縮はまた、細胞が任意の露出表面に接着するのを防止してもよい。結果として、組織は硬いポストの丸い端に沿って滑りがちである。組織のこの柔軟性は、破断又は全組織の切断の危険なしに、一層伸展することを可能にする。
【００８４】
たとえば、1軸又は2軸組織コンストラクト形成の場合には、組織の滑り及び保持構造からの分離を得るため、Pluronic(商標)酸F-127の好適な濃度は、組織組成に応じて、およそ2〜8%である(たとえばより多くの線維芽細胞により生じうる、より大きな収縮性は、低濃度を必要とする)。低濃度では、微小組織は、保持構造に結合されうるが、一部の組織工学用途では、これは望ましい場合がある。
【００８５】
目的の組織タイプを生成するために、多くの異なる接着細胞タイプが、好適なECM組成と組み合わされてもよいことが理解されるべきである。たとえば、生成できる組織には、心臓微小組織、骨格筋組織、血管組織、肝臓組織、腸組織、神経組織、脂肪組織、及び軟骨組織が含まれる(しかし、これに限定されるものではない)。
【００８６】
いくつかの実施形態において、マイクロファブリケーション技術は、図1(a)に示されるように、マイクロウェルのくぼみ内に細胞含有コラーゲンの局所化ポケットのリモデリングを制限するため、特定のノードジオメトリーを含有する、様々なサイズの単離マイクロウェルのアレイを作り出すために用いられてもよい。
【００８７】
実施の一例によれば、マイクロファブリケーションプラットフォームは、以下のとおり提供されてもよい。まず、図1(a)(i)にあるように、フォトレジストがガラス基材上にパターニングされる。簡潔に述べると、ピラニア洗浄された3×5''清浄スライドガラス(Corning Inc.、Corning、NY、USA)をアセトン中で簡単に洗浄し、清浄な窒素ガス流下でブロー乾燥する。SU-8-5のシード層(Microchem、Newton、MA、USA)(高さ7μm)を、表面上にスピンコートし、フィーチャ層結合を可能にする。摂氏100度のホットプレート上での20分の脱水ベーク後、スライドガラスを摂氏65度まで冷却し、次に、ホットプレートからを除去し、室温に戻した。シード層をUVに曝露し、前と同様にポストベークを開始した。次に、シード層を有するスライドガラスを得て、2つのスピンコート層SU-8-50(Microchem)を連続的に適用し(プリベーク及びポストベークを含める)、フィーチャ層の高さを300μmに到達させる。次に、設計されたマスクを300μmの高さのフィーチャ層を有するマスター上へとUV曝露する工程を実施する。ポストベークを実施して、十分な時間冷却した。追加の層を追加でき(マスク設計を改変し、SU-8の連続層を適用することによる突起及び溝を含む)、ボトムアップから構造を構築する。
【００８８】
次に、スライドガラスを超音波処理器又はオービタルシェーカー上で十分な時間、現像液(Microchem)に浸漬し、非架橋SU-8を洗い落とす。マスターを3日間、摂氏75度でオーブンベークし、フィーチャ層のスライドガラスへの適切な結合を可能にする。次に、マスターをデシケーター内で一晩シラン処理する。
【００８９】
図1a(ii)に示すとおり、SU-8マスター上でポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS、Dow Corning)を、摂氏65度で一晩成形することにより、一次複製物を製造する。図1a(iii)に示すように、複製された鋳型を、実体顕微鏡下で各ポスト上の急速硬化する角度をつけたPDMSの液滴により改変し、図1a(iv)に示すように、ポリウレタン(SmoothCast)を使用してネガマスターを成形する。次に、図1a(v-vii)に示すように、最終基材をこれらのネガマスターからPDMS成形し、24ウェル組織培養プレート内に入れる。
【００９０】
エタノールを使用してこれらの基材を滅菌し、次にPluronic(商標)酸で24時間コーティングする。次に、24ウェル含有基材を洗浄する。次に、図1a(viii)に示すように、コラーゲンを基材に添加し、次に300gで遠心する。次に、図1a(ix)に示すように、細胞含有コラーゲンマスターミックス(コラーゲンマスターミックス中に懸濁された心筋細胞及び線維芽細胞を含有する細胞ミックス)を、泡沫の形成を回避するように混入する。次に、図1a(x)に示すように、プレート全体を200gで遠心し、細胞含有コラーゲンをくぼんだウェル内へと入れ込む。図1a(xi)に示すように、過剰な細胞含有コラーゲンを基材から吸引し、プレート全体を摂氏37度で15分間インキュベーター内に置き、コラーゲンを重合させた。最後に、図1a(xii)に示すように、15分の重合後、細胞培養培地を(コラーゲンが妨げられないように)それぞれのウェルの隅にゆっくり添加し、細胞含有コラーゲンをリモデルさせる。前述の方法は、マイクロファブリケーションプラットフォームを製造するための実施の一例にすぎないことが理解されるべきである。さらに、組織コンストラクトを形成するとき、他の物質が用いられてもよい。たとえば、フィブリン、PEG系ヒドロゲル及びMatrigel(商標)を含むがこれに限られない他の重合可能なヒドロゲルが、この系と共に代わりに用いられてもよい。代替的な例において、たとえば、ラミニン、ビトロネクチン及びフィブロネクチンを含む基底膜/ECM構成要素の組合せもまた、ネイティブ組織ECMを模倣するために組み合わされうる。
【００９１】
他の実施形態において、基材剛性と相関するヒドロゲルの濃度もまた変化させうる。たとえば、ヒドロゲル濃度は、ネイティブ筋組織に見出される弾性係数内に収まる範囲から選択されてもよい。心臓微小組織の例示的なケースでは、この弾性係数は、およそ10kPa(1kPaから20kPaまでの範囲)である。細胞密度もまた、好適な特性を有する組織コンストラクトを得るために変化させうる因子であるが、組織コンストラクトの特性は、収縮して適切なパラクリンシグナリングを供給する細胞の能力に依存する。
【００９２】
たとえば、いくつかの実施形態において、細胞濃度は、およそ5μLの容積を有する例示的マイクロファブリケーションプラットフォームジオメトリーについて、1組織当たり細胞およそ25,000〜100,000個の間であってもよい(細胞5×106個/mL〜細胞20×106個/mLの細胞密度)。プレートされる細胞の量は、組織タイプに依存することが理解されるべきである。いくつかの例において、細胞およそ25,000個が最適細胞数及び機能維持のために必要な細胞スペーシングを提供する。プレートされる細胞が少なすぎる場合、コラーゲンリモデリングを達成するのに十分な数がない。逆に、細胞が多すぎる場合、細胞は密に詰め込まれすぎ、細胞機能及び生存性を損なう。
【００９３】
組織コンストラクトを形成するために用いられる細胞タイプの相対的比率はまた、組織コンストラクトの特性を制御する又は変化させるために選択されてもよい。たとえば、細胞タイプの相対的比率における変動は、構造的にも機能的にも組織コンストラクトの結果の大きな相違をもたらしうる。本明細書に開示されるように、いくつかの実施形態において、構造的及び機能的に健全な組織を生成するために、線維芽細胞及び心筋細胞の相対的比率を制御することが重要である。
【００９４】
非限定的な一例において、CD90+細胞(線維芽細胞)およそ25%及びNKX-2-5-GFP+細胞(心筋細胞)およそ75%の組成が、ヒト健常心臓を近似的に模倣する特性を有する心臓組織コンストラクトの製造のために好適であることが見出された。実際、ネイティブ心臓において、線維芽細胞は、構造的統合性及びパラクリンシグナリングを提供するために働き、これらは本心臓マイクロワイヤープラットフォームにおける組織の再現において重要な2つの要因である。
【００９５】
本明細書に開示の実施形態及び例は、75%のNKX2-5及び25%のCD90+の心臓マイクロワイヤーにおける改善した機能的構築及び優れた成熟遺伝子発現を示すことにより、組織組成の重要性を強調する。下に説明するように、サルコメア構造関連遺伝子を、器官形成開始時の胎児性心臓遺伝子プログラム中に増加するANF及びBNPと共に含む、重要な心臓成熟マーカーの遺伝子発現レベルの増加が観察される。理論により限定されることを意図しないが、成熟を促進するCD90+細胞により提供される、一定程度のパラクリンシグナリングが存在しうると考えられる。線維芽細胞と推定されるこれらのCD90+細胞は、成長因子、たとえばbFGF及びVEGFを分泌しうる。加えて、CD90+細胞は、ECMリモデリングの大部分に貢献し、直接的結果として、細胞-細胞接触を促進し、これは成熟促進シグナリングを促進しうる。加えて、リモデリングは、高張力を含めた機械伝達キュー、ひいてはCM伸長及びアラインメントを提供しうる。
【００９６】
心臓マイクロワイヤーの組成範囲が、上に提示したものに限定されないことが理解されるべきである。たとえば、CMおよそ75%及び非CM25%の細胞含有量を伴う組成が、健常ヒト心臓に特徴的な特性(たとえば伝導速度)を有する心臓コンストラクトを達成するために好適であることが見出された一方で、他の組成も可能である。いくつかの実施形態において、心臓微小組織コンストラクトは、構造的統合性並びに構造及び機能の成熟を可能にするために、少なくとも低いパーセンテージの非筋細胞(たとえば主にCD90+FB)を含む組成を有する。たとえば、いくつかの実施形態において、心臓組織コンストラクトは、CMおよそ70〜80%及び非筋細胞(たとえばCD90+FB)およそ20〜30%の相対細胞含有量を有していてもよい。他の実施形態において、心臓組織コンストラクトは、CMおよそ65〜85%及び非筋細胞およそ15〜35%の相対細胞含有量を有していてもよい。他の実施形態において、心臓組織コンストラクトは、CMおよそ60〜90%及び非筋細胞およそ10〜40%の相対細胞含有量を有していてもよい。他の実施形態において、心臓組織コンストラクトは、CMおよそ55〜95%及び非筋細胞およそ5〜45%の相対細胞含有量を有していてもよい。
【００９７】
微小組織プラットフォームの代替物には、(PDMSの代わりに)ポリスチレン、アガロース、及びポリエチレングリコール(PEG)が含まれるが、これに限られるものではない。細胞培養に好適な他の成形可能物質が、PDMSと置き換えられてもよい。成形の必要なしに基材を直接印刷するために使用できる3-Dプリンター物質が、また有用である。加えて、導電性、弾性及び透明性物質を含む2つ以上のタイプの物質が一度に印刷できる。
【００９８】
多くの実施形態において、微小組織プラットフォームの全般的レイアウトは、デュアルポストを含有するアレイウェルからなる。しかしながら、組織マイクロワイヤー形成をもたらすこれらの配置を変化させることは可能である。具体的には、所望の組織ジオメトリーを生成するようにポストの配置を変化させることができる。図11(a)は、2軸(i)及び1軸(ii)及び(iii)組織構成を形成するための様々な例示的ジオメトリー及び寸法を示す。
【００９９】
下の例において適用された追加の基準は、微小組織は、qPCR解析及びインサイチュー電気生理解析(直接活動電位伝播、電気点刺激、及び伝導速度を含む)のために回収されるくらい十分大きい必要があるというものだった。しかしながら、これは、組織コンストラクトに対して実施される任意の試験、解析又は他の後処理の性質に応じて、他の用途とは関連しない、非限定的基準であると理解されるべきである。
【０１００】
増負荷性負荷
増負荷性負荷は、収縮期中に非静的弾性抵抗を微小組織に提供し、収縮するCMと共に伸展する弾性ECMから構成される弾性境界領域をシミュレートすることにより、インビトロでシミュレートできる。増負荷性負荷の効果は、微小組織の構造的及び機能的改善をもたらす。本明細書に記載の実施形態において、組織は、(固定ポスト(anchoring post)により提供される抵抗に応じて)増負荷性負荷の範囲を経験するように設計できる。
【０１０１】
増負荷性負荷は、カンチレバー(ポスト)により提供される抵抗を変化させることにより(様々な程度で)シミュレートできる。これはたとえば、カンチレバーの直径をそれらの軸長(axial extent)に沿って変化させることにより行うことができる。組織が収縮するとき、カンチレバーにより提供される抵抗は、(カンチレバー物質、たとえばPMDSの弾性特性のために)非線形的に増加する。一実施形態において、カンチレバーは、それらの弾性抵抗が、選択された組織、たとえば心臓ECMの弾性特性と一致するか、又はほぼ等しくなるように形成される。これは、健常(成熟及び非成熟)及び疾患組織を模倣するために、様々な程度で達成できる。PDMSは、この場合の使用に好適な物質である。一実施形態において、カンチレバーの直径は、前述のとおり、およそ50μmから300μmの範囲であり得る。
【０１０２】
安定化フィーチャを有する微小組織プラットフォーム
いくつかの場合において、収縮/リモデリングプロセス中(及びその後)に、組織コンストラクトを安定化又は局在化することが重要又は有用でありうる。したがって、いくつかの実施形態において、少なくとも1つの保持構造が、形成中の組織コンストラクトの位置を安定化するための安定化フィーチャを含む。そのような安定化フィーチャは、たとえば、マイクロウェルの底部に対して事前選択された位置に、再現可能な仕方で、組織コンストラクトを形成することが重要又は有用である用途のために用いられてもよい。
【０１０３】
たとえば、組織コンストラクトのあるセット(たとえば、マルチマイクロウェルキャリア、たとえばマイクロプレート内にマウントされているもの)において、マイクロカンチレバーを使用して収縮力を測定するとき、すべての組織コンストラクトについて一貫性のある、収縮により及ぼされる力の尺度を提供するために、各組織コンストラクトの位置を、それぞれが結び付けられるマイクロウェル底部に対して所定のマイクロカンチレバー上に局在化又は安定化することが重要でありうる。
【０１０４】
別の例において、事前選択された位置での組織コンストラクトの位置の安定化は、光学イメージングが、組織コンストラクトのその形成中及び/又は形成後の評価のために用いられる用途において、有用でありうる。具体的には、光学イメージングシステムの焦点面内又はその近傍に(すなわち近接して)組織コンストラクトの形成を安定化することは有益でありうる。そのような実施形態は、(たとえばマイクロプレートリーダーにおいて)マイクロウェル及び光学システムの相対的平行移動により、連続的に光学撮影される複数のマイクロウェルを伴う用途において有用でありうる。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、安定化フィーチャは、所定の保持構造の遠位端に位置するキャップ又は他の構造として形成されてもよい。他の実施形態において、安定化フィーチャは、マイクロウェルの底部と保持構造の遠位端との間の中間の位置で設けられてもよい。
【０１０６】
図16(a)は一般に、2つのポスト210を有するマイクロウェル200を示す。図16(b)〜(e)は、マイクロウェルの底部と保持構造の遠位端との間の中間の位置に位置する安定化フィーチャを有する保持構造の複数の非限定的な例を示す。
【０１０７】
図16(b)において、マイクロウェルの底部230と保持構造220の遠位端235との間の位置に設けられている局所的突起225を含む保持構造220を示す。組織コンストラクトは形成中に、突起225の位置を越えた垂直方向の移動を防止される。
【０１０８】
図16(c)は、保持構造240が、溝(又はノッチ)245を、収縮プロセス中に組織コンストラクトの垂直位置が溝245により固定されるように含む、別の実施形態を示す。図16(b)の突起225及び図16(c)の溝245は、直線状の側端を有するものとして示されているが、突起225及び/又は溝245の任意の1つ以上の端又は他の表面が、曲線状の表面を有していてもよいことが理解されるべきである。
【０１０９】
図16(d)及び(e)は、形成中に所定の位置で平衡化するよう組織コンストラクトを誘導するために、傾斜又は先細りしたプロファイルが用いられる、中間安定化フィーチャの2つの例示的実施形態を示す。たとえば、図16(d)において、保持構造250は、傾斜255の存在及び組織コンストラクトにおける張力が、コンストラクトが傾斜255に接触するときにコンストラクトに加えられる垂直力を引き起こすように設けられており、そのことにより組織コンストラクトが突起260に接触し、それにより位置が安定化されるまで、組織コンストラクトの上方への移動を誘導する。
【０１１０】
同様に、図16(e)において、中間安定化フィーチャが、下部傾斜部275、上部傾斜部280(外側に上に向かって広がる)、及び最小位置285を有する二重傾斜構造を含む、保持構造270が示される。形成及び収縮中に、組織コンストラクトは、最小位置285に到達するまで下部傾斜部275を上方に移動し、最小位置285を越える移動は上部傾斜部280により防止される。傾斜したフィーチャのジオメトリー及び/又は湾曲は、正確に図16(d)及び(e)に示されるとおりである必要はないことが理解されるべきである。たとえば、傾斜したフィーチャは、頂点で終わる必要はなく、代わりに滑らかな曲線で終わってもよい。たとえば、図16(e)において、最小位置285は、V型フィーチャ(すなわち、頂点)の代わりに、U型フィーチャの形態をとっていてもよい。さらに、上部傾斜部280及び下部傾斜部275が、対称である必要はない。たとえば、上部傾斜部280が、下部傾斜部275と比較してさらに高い湾曲又は勾配を有することは、最小位置285での組織コンストラクトの位置の安定化をさらに補助するために有益でありうる。
【０１１１】
図16(f)に示す別の実施形態において、保持構造300は、保持構造の遠位部310に向かって伸長する傾斜部305を伴って設けられてもよく、遠位部310は、安定化フィーチャ、たとえばキャップ315又は小球を含む。傾斜部305は、組織コンストラクトの位置を、保持構造300の遠位部310の方へと偏らせるのを補助し、組織コンストラクトの位置がキャップ315により安定化する。
【０１１２】
図16(g)は、突起325を、保持構造の偏向を増幅するための偏向後増幅延長部330と共に有する、保持構造320を示す。
【０１１３】
組織マイクロワイヤーの寸法は、出発条件による。より高いECM濃度及びより高い細胞密度は、一般に、より大きな直径の微小組織をもたらし、一方で、より低いECM濃度及びより低い細胞密度は、より小さい直径の組織をもたらす。平均して、微小組織は、80〜250μmの直径へとリモデルすることが見出された。この長さは、ポストのスペーシングに基づいて変化しうる。デュアルポスト設計の一例において、この長さは、およそ0.5から5mmの間で変化しうる。
【０１１４】
図17(a)〜(f)は、様々なポストジオメトリーを使用した微小組織形成の例示的実施形態を示し、ポストが、形成中の組織コンストラクトに張力を加えるよう位置している。(a)は、基本的なデュアルポスト設計の変形形態を示す。ポスト間の距離は、たとえば、(i)およそ0.5〜2.5mm、(ii)およそ2.5〜5mm、(iii)およそ5〜10mm、(iv)およそ2.5〜5mm、及び(v)およそ2.5〜5mmである。図17(b)は、設計同士を接続するグリッドパターンを示す。ポスト間の距離は、およそ2.5〜5mmである。図17(c)は、放射状パターンレイアウトを示す。ポスト間の距離は、およそ2.5〜5mmである。図17(d)は、円周状パターンレイアウトを示す。ポスト間の距離は、およそ2.5〜5mmである。
【０１１５】
図17(e)は、同じ基本的なデュアルポスト(保持構造)レイアウトを示すが、組織はストリップではなくリングを形成する。これは、たとえば、保持構造の側部から伸長しうる傾斜か、又は保持構造の下に設けられる傾斜(下でさらに説明する)を設けることにより達成されうる。別の実施形態において、保持構造の長さの少なくとも一部に沿って、ポスト間に遮断又は接続構造が、その間での組織形成を防止するために設けられてもよい。いくつかの実施形態において、遮断構造は、初期リモデリング期中の保持構造間の組織の相互接続を回避するために、保持構造の下部に設けられてもよい。例示的な遮断構造には、保持構造間に伸長する接続フィーチャ、たとえば長方形構造又は楕円形構造が含まれる。ポスト間の距離は、たとえば、(i)およそ0.5〜2.5mm、(ii)およそ2.5〜5mm、(iii)およそ5〜10mm、及び(iv)およそ2.5〜5mmであってもよい。
【０１１６】
図17(f)は、大きな円周状組織設計を示す。組織を周囲でリモデルするための、直径およそ1〜4mmの1つの大きなポストが示されている。
【０１１７】
上に示し説明されている寸法は、さらにスケールアップ又はダウンでき、与えられた範囲は単なる例にすぎないことが理解されるべきである。加えて、ポストは、電気刺激/記録を可能にするために、電極又は導電体で置き換えることができる。いくつかの実施形態において、ウェルの深さは、およそ200μmから1mmの範囲であってもよい。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、カンチレバーポストの直径は、所望の偏向の範囲に応じて、50μmから300μmの範囲である。示された実施形態を、組織培養のため、マルチウェルプレート(たとえば、6ウェル、12ウェル、24ウェル、48ウェル、96ウェル等)に配列できる。加えて、ポストは、電気刺激/記録を可能にするために、電極又は導電体で置き換えることができる。
【０１１９】
図18(a)〜(d)は、ビデオファイルからの静止画像において捉えられたポスト偏向を示す。(a)は、偏向前のポストに結合された心臓組織のフィールドビューを示し、(b)は、偏向後の(a)におけるのと同じフィールドビューを示す。図18(c)及び(d)はそれぞれ、(a)及び(b)におけるポストのクローズアップを示す。矢印は、(c)及び(d)の両方において、フィールド画像における同じ位置にある。
【０１２０】
図19は、カンチレバーデュアルポスト設計の例示的実施形態を示し、ポスト410及び420はそれぞれ、微小組織コンストラクト400を保持するための突起415及び425を有する。第1のポスト410は、一体化された電極430を有し、屈曲せずに維持され、一方で第2のポスト420は屈曲可能である。
【０１２１】
所定のマイクロファブリケーションプラットフォーム内の異なる保持構造が、同一の安定化フィーチャを有する必要はないこともまた理解されるべきである。たとえば、図20に示すように、所定のマイクロファブリケーションプラットフォームの2つの保持構造が、その安定化フィーチャの異なる構成を有していてもよい(たとえば、一方は溝440を有する保持構造であり、他方は突起445を有する)。
【０１２２】
別の実施形態において、1つ以上の保持構造が安定化フィーチャを含み、1つ以上の他の保持構造が安定化フィーチャを含まない、マイクロファブリケーションプラットフォームが提供されてもよい。そのような実施形態は、異なる目的のためにカスタマイズされた保持構造を有する微小組織プラットフォームを提供する際に有用でありうる。たとえば、1つ以上の保持構造が、マイクロウェルの底部に対する組織コンストラクトの高さを安定化するための安定化フィーチャを伴って設けられてもよい。そのような保持構造は、安定化フィーチャの存在により、加えられる張力下で低い偏向を示しうる(たとえば、傾斜したフィーチャ又は突起の存在による保持構造の直径の増加)。1つ以上の保持構造が、加えられる張力下でより大きな偏向が得られるように、安定化フィーチャなしで設けられてもよい。したがって、1つ以上の保持構造は、マイクロウェル底部に対する組織コンストラクトの高さを安定化するために構成されていてもよく、1つ以上の他の保持構造は、形成中の組織コンストラクトにより加えられる張力による測定可能な偏向をもたらすために構成されていてもよい。
【０１２３】
加えて、このコンセプトは、ポストにより提供される抵抗の調節による一定の範囲の組織内応力を経験する微小組織を作り出すために使用できる。加えて、微小組織の位置を「z」軸上(垂直方向)で変化させ始める3Dジオメトリーを設計できる。おそらくこれは、可溶性因子シグナリング源(たとえば共培養セットアップにおける二次的細胞タイプ、又はマイクロウェルフロア上に供給された拡散性因子)からの、組織の構成要素の距離を操作しようとするときに有用でありうる。このタイプの設計は、胚における初期組織形態形成中に生じる、勾配に基づく成長因子シグナリングのいくつかを再現する際に役立ちうる。
【０１２４】
図21は、突起含有(450、455、460)及び溝含有(465)フィーチャを組み合わせた、カンチレバーマルチプルポスト設計を示す。この保持フィーチャの組合せは、組織形成を制御するために使用される。
【０１２５】
傾斜した構造を有する微小組織プラットフォーム
いくつかの実施形態によれば、マイクロファブリケーションプラットフォームは、再成形プロセス(remolding process)中に組織コンストラクトをウェル底部から持ち上げ、且つ/又はリングジオメトリー/トポロジーにおいて組織コンストラクトの形成を誘導するように構成された1つ以上の構造フィーチャを含んでいてもよい。
【０１２６】
組織コンストラクトをマイクロウェルのフロア又は底部から持ち上げることは、多くの利点を提供しうる。たとえば、下でさらに説明するように、マイクロファブリケーションプラットフォームは、リモデリングプロセス中に組織コンストラクトがポストに早期に接触するのを防止し、ポストとの接触が、リモデリングプロセスがすでに開始された後に達成されるようにする構造フィーチャ、たとえば傾斜又は斜面を含んでいてもよい。これは、組織接続がポスト間で生じることなしに、リング構造を有する組織コンストラクトの形成を促進する。
【０１２７】
傾斜した構造の別の潜在的利点は、ウェルの底面に沈殿する死細胞及びデブリが、リモデリングプロセス中に組織コンストラクトから分離され、したがって死細胞及びデブリを、培地交換中に容易に洗い流せることである。加えて、リモデリングプロセス中に組織が張力下でウェルのフロアから引き離されるとき、組織の全側面上で培地へのアクセスの増加がある。この点についてさらに、組織を(たとえば固定/透過処理後に)インサイチューで抗体で染色するとき、抗体が組織内に浸透することを可能にするようにウェルのフロアの上方に維持されていると、組織はよりアクセスしやすい。さらに、センサー/刺激物(電極を含む)をウェルの底部に設置又は製造できる。
【０１２８】
傾斜した構成の別の利点は、細胞の表面への長期的接触と関連する問題が回避されうることである。そのような接触は、タンパク質接着により、(コーティングによる表面のコーティングにもかかわらず)最終的に細胞を接着させうる。そのようなものとして、組織を持ち上げて、フロアから離すことは、これが起こることを防止する。さらに、上述のように、組織を、ポストの最上部ではなく、中間の位置に位置させることは、(最上部からでなく)底面からの組織のイメージングを依然として可能にする。組織コンストラクトがポストをあまり高く登りすぎることが許されると、顕微鏡の作動距離により、組織の焦点合わせが可能でないことがありうる。
【０１２９】
したがって、実施の一例において、マイクロファブリケーションプラットフォームは、2つの保持構造を伴って提供されてもよく、一方の保持構造は溝、突起を含み、他方の保持構造は、傾斜したフィーチャを含む。図22(a)に示すように、傾斜したフィーチャは、他方の保持構造の突起の高さとおよそ同じ高さで終わるように、上方に伸長していてもよい。或いは、傾斜したフィーチャは、この高さより下で終わってもよい。図22(a)に示すように、傾斜したフィーチャを有する保持構造はまた、安定化突起を含んでいてもよい。保持構造の一方又は両方が、傾斜したフィーチャ及び/又は安定化フィーチャを含んでいてもよいことが理解される。図22(a)に示される例示的実施形態において、保持構造470は突起475を含む一方で、保持構造480は、突起485及び傾斜490の両方を含む。
【０１３０】
溝又は突起は、組織コンストラクトの位置を事前選択された高さに安定化するために有用でありうる一方で、傾斜したフィーチャは、その後の組織コンストラクト除去を、組織コンストラクトの局所損傷のリスクを冒すことなしに可能にする。これは、まず、(任意選択で保持構造を内側に屈曲させることにより)組織コンストラクトを傾斜したフィーチャを有する保持構造から除去し、そのことにより、組織コンストラクトにおける張力を解放することにより達成されうるのであり、その後、組織コンストラクトは、突起又は溝を有する保持構造から容易に除去できる。
【０１３１】
他の実施形態において、マイクロファブリケーションプラットフォームのマイクロウェルは、マイクロウェル底部から上方及び内側に向かって伸長して、保持構造を支持する上部プラットフォームを形成する傾斜した底部構造、たとえば円錐台状構造を含んでいてもよい。そのような実施形態は、図22(b)に示されており、これは、ウェルの底面(底部)705をそれぞれ含むマイクロウェル700のアレイを示し、ウェル底面の上には円錐台状支持体710が設けられ、保持構造715を支持する。保持構造715に安定化フィーチャは存在しないように示されているが、本明細書に開示の任意の安定化フィーチャが、保持構造715上に含まれるか、又はそれに組み込まれてもよいことが理解されるべきである。下でさらに説明するように、そのような傾斜底部支持体が、保持構造がデュアルポストであり、傾斜支持体の非存在下で、デュアルポスト間で結合する組織構造をもたらすときでも、リングジオメトリーを有する組織構造を形成するために用いられうる。
【０１３２】
図22(c)(i)〜(v)は、傾斜支持構造(円錐状支持体)を含むマイクロウェルのアレイの実施の一例を示し、マイクロウェルは、96ウェルマイクロプレートの形態で提供される。マイクロプレートは、その内部に一体に成形されている円錐台状支持体710及び保持構造715を有するウェル700を含む。円錐台状支持体710は、円錐状/傾斜した表面712及び上部プラットフォーム714を含む。円錐状支持体710が、マイクロウェルの底面にくぼんだ表面として形成されるが、円錐状支持体710が代替的に、固形物質として設けられてもよいことが理解されるべきである。さらに、円錐状表面712が、単一の円錐角により定義される直線状表面として示されているとはいえ、表面712のプロファイルは、様々な形状、たとえば曲線状プロファイル(たとえば放物曲線)又は階段状プロファイル等をとってもよい。示されている直線状プロファイルは、形成中の組織コンストラクトの光学観察を、比較的小さい光学的歪みで可能にする際に有益でありうる。
【０１３３】
図に示すように、例示的マイクロウェル700はまた、細胞/コラーゲン前重合マスターミックスを含有するのに好適な高さ(深さ)を有する下部壁部724、及び、下部に向かって小さくなる直径を有する上部壁部726を含む側壁を含む。したがって上部壁部726は、前重合マスターミックス又はウェル700に提供される他の試薬が、ウェルの中心部に向かって下方に向けられ、円錐状支持体710を囲む領域725内に受け取られるように構成される。上部壁部726は、実施の一例において曲線状のものとして示されているとはいえ、他の形状、たとえば直線状プロファイル(たとえば下向き円錐台状形状)が可能であることが理解される。
【０１３４】
図22(d)(1〜4)を参照しつつ、例示的な播種及びリモデリングプロセスにおける工程を示す。図のパネル1において、コラーゲンゲルは心筋細胞で播種される。得られた未重合混合物を領域725内に入れ、上部プラットフォーム714が被覆されないようにする。
【０１３５】
上部プラットフォーム714が未重合混合物により被覆されないままにして、保持構造715が未重合混合物に接触されないように、マイクロウェルを充填することにより、組織コンストラクトがまず円錐状表面712を囲むリングへと形成される。したがって、傾斜支持体を囲むマイクロウェルの容積は、組織コンストラクトを形成するのに好適な一定量の未重合マトリックスを含有するのに十分な程度大きく、この容積はまた、傾斜支持構造の上部プラットフォームが未重合マトリックスに被覆されない程度に十分大きい。これは、初期の及びそれに続く、保持構造間の組織形成を防止し、リング状組織コンストラクトをもたらす。
【０１３６】
リモデリングプロセスを続けると、パネル2に示すようにリング状組織コンストラクトが円錐状表面712を滑り上がり、培養培地がさらなるリモデリングを支持するために添加される。続いて、パネル3(a)及び3(b)に示すように、組織コンストラクトは保持構造715により結合及び保持され、上述のとおり、安定化フィーチャにより任意選択で制約される。パネル4に示すように、保持構造715は、機械力伝達手段を提供するために、リモデリングプロセス中の組織コンストラクトによりもたらされる張力下で屈曲するように構成されていてもよい。
【０１３７】
たとえば、本実施形態は、収縮細胞タイプのための機能的アッセイを実施するよう用いられてもよく、これは薬剤スクリーニング用途等の用途のために使用できる。実施の一例において、心臓組織コンストラクトは、以下のプロトコルにより得られた。すなわち、パネル1に示すように、およそ9μlの細胞含有マトリックスを各ウェルのトラフにピペットする。マトリックスをインキュベーター内でおよそ20分間重合する。パネル2に示すように、150〜200μLの細胞培養培地を各ウェル内に重合コラーゲンゲルの上からゆっくりと添加し、マイクロウェルをインキュベーターに戻す。その後、細胞が組織を形成し始めるにしたがい、2つのポストの周囲にリモデルする。細胞タイプに応じて播種およそ2〜5日後に生じることが観察されたように、細胞が2つのポストの周囲に3D組織を形成するとき、パネル3(a)及び(b)に示すように、組織リモデリングが頭打ちになる。応答性組織タイプ(心筋細胞)に電気刺激が適用されるとき、ポストの偏向を測定でき、これは組織の収縮強度を決定するために使用できる。
【０１３８】
前述のマルチマイクロウェルマイクロファブリケーション実施形態(組織マイクロリング設計と呼ばれてもよい)は、下でさらに説明するように、ユニボディ(unibody)系における複数細胞タイプを含む、多様な細胞タイプ及び構成のリング状組織を生成するために使用できる。これは、製造及び減菌の容易さ、漏出がないこと、酸素透過性の増加、及び播種効率の増加を含むが、これに限られるものではない、複数の理由で有利でありうる。下で述べるように、(たとえばマイクロプレートフォーマットの)マイクロウェルのアレイを有する装置は、PDMS(シリコーンエラストマー)を3D印刷されたマスター鋳型へと流し込むことにより製造できる。硬化すると、PDMS鋳型は鋳型から抜き出すことができ、使用の準備ができる。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、傾斜した構造は、複数のポストを支持する必要はなく、リング状組織コンストラクトを保持するための単一の保持構造を支持するか、又はその形態で終わりうる。そのような実施形態の実施の一例は、図22(e)に示され、一連の写真は、マイクロウェルフォーマットにおいてリング状組織コンストラクトを形成するプロセスフローを示す。ここで、各マイクロウェルは、円錐状底部の形態の傾斜支持体、及び傾斜支持体と接続された又は一体形成された円盤状柱(保持構造)を有する、一体形成されたマイクロファブリケーションプラットフォームを含有する。基材は、3D印刷された鋳型を使用して構築され、PDMSで成形された。オートクレーブし、Pluronic(商標)酸で一晩コーティングすると、20μLの細胞含有コラーゲンを円形容器内にピペットした。組織は、ウェルの中心の単一の柱の周囲にリモデルし、不整脈モデル心臓微小組織を形成した。
【０１４０】
図22(f)(i)〜(iv)において、1ウェル当たりの細胞数の効果が示される。各ウェル(i)〜(iv)は、増加していく細胞密度から構成される心臓微小組織を示す。増加していく細胞密度は、より大きな断面積を有する組織をもたらす。
【０１４１】
図22(g)(i)〜(ii)において、系内での心臓微小組織の顕微鏡写真を示す。(i)は、明視野下での1ウェル当たり細胞100,000個を示し、(ii)は、GFP発現hPSC由来CMを示す488nm光下での同じ微小組織を示す。
【０１４２】
図22(h)において、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)及びhPSC由来肝細胞から構成される微小組織を示す画像が提供される。hPSC由来肝細胞の凝集体及びHUVECの単一細胞を、1組織当たり細胞100,000個で混合した。組織は1〜2日以内にリモデルする。
【０１４３】
図22(i)において、筋管へと分化するマウス筋芽細胞から構成される微小組織を示す画像が提供される。筋細胞を1組織当たり細胞100,000個で播種した。組織は3〜4日以内にリモデルする。組織は、3〜4日以内に自発的に収縮する(分化後)ことが観察された。
【０１４４】
細胞が単一細胞懸濁液に単離され、未重合マトリックスに混入されると、細胞含有未重合マトリックスが各ウェルにピペットされ、ピペットチップが外側のリング(たとえば、設計の実施の一例において、厚さ1.5mm、内径2.5mm及び外径5.5の寸法を有する)に沿って辿る際に混合物がゆっくりと放出されうる。このプロトコルが、手作業で、又は自動化された形式で、たとえばロボットピペット(液体分注)システムを介して実施できることに留意されたい。細胞播種数時間後、細胞は中央ポストの周囲の組織へとリモデルする(設計の一反復において、直径2.5mm及び高さ3.0mm)。播種プロセス中にプレートを遠心する必要はない。なぜなら、側壁の湾曲が、未重合細胞含有コラーゲンを各ウェルの底面のリモデリング容器内へとガイドするからである。数多くの細胞株を、組織を生成するために使用でき、デジタル顕微鏡下で画像化できる。本開示の別の箇所に示すように、組織の生存性、組織の均一性及びリモデリング時間を試験するため、複数の実験を実施した。組織は、非常に均一な(平均から約12%ほどの低さの偏差を有する)厚さを示し、それらの最終的な厚さに2日未満でリモデルした。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、マイクロファブリケーションプラットフォームは、たとえば本明細書に記載の3D印刷及び成形法を介して、マイクロウェルに一体形成されている。そのような一体型/モノリシック実施形態の2つの異なる特徴/利点は、以下のとおりである。すなわち、(i)マイクロウェル基材/底部が、マイクロファブリケーションプラットフォームと一体形成されているので、マイクロウェルの底面に何も接着する必要がなく、したがって一切の漏出の可能性を消去する。また、(ii)細胞播種プロセス中の細胞損失がほとんど又はまったくない場合がある。なぜなら、すべての細胞が、生成する組織の形成に貢献するようにマイクロウェルに提供されうるからである。
【０１４６】
安定化フィーチャの高さに基づく増幅応答を伴う力センサーを有する微小組織プラットフォーム
形成中及び/又は形成後の微小組織により及ぼされる収縮力を測定することが望ましい場合又は重要である場合がある。上述のとおり、これは、組織コンストラクトにより加えられる張力に応じて偏向するよう構成された保持構造を用いることにより達成されうる。
【０１４７】
安定化フィーチャがマイクロウェルの底部と保持構造の遠位端との間に設けられている前述の実施形態は、加えられる張力に応じた保持構造の偏向の増幅を提供するために用いられうる。そのような実施形態は、たとえば、力測定の感度を増加させるため、及び/又は力測定のダイナミックレンジを増加させるために用いられうる。
【０１４８】
たとえば、一実施形態において、力増幅マイクロファブリケーションプラットフォームは、少なくとも2つの保持構造を含んでいてもよく、2つの保持構造の少なくとも1つは、安定化フィーチャを含むマイクロカンチレバーであり、安定化フィーチャは、マイクロウェルの底部と保持構造の遠位端との間に位置する。そのような実施形態において、組織コンストラクトの高さでの保持構造の局所的偏向は、この高さを越える垂直方向への保持構造の伸長により増幅される。
【０１４９】
図23は、のそのような実施形態の実施の一例を示す。図23(a)は、マイクロウェル510並びにそれぞれ安定化フィーチャ525及び535を有する2つのマイクロカンチレバー保持構造520及び530を含む、マイクロファブリケーションプラットフォーム500を示す。各安定化フィーチャは、マイクロウェル底部に対して高さh1で組織コンストラクトを安定化するよう構成され、カンチレバー全体は、高さh1を越えて追加の高さh2まで伸長し、カンチレバー全高は、hT=h1+h2となる。
【０１５０】
図23(b)において、マイクロカンチレバー520及び525が組織コンストラクト400の収縮により偏向しているマイクロファブリケーションプラットフォーム500が示される。図からわかるとおり、各マイクロカンチレバーは、組織コンストラクトからの張力により偏向し、偏向は、組織コンストラクトの安定化の点及びマイクロカンチレバーの遠位部でそれぞれ、d1及びd2である。結果として、変位d2に基づく組織コンストラクトにおける張力の測定は、d1に基づく測定に対して、増幅された変位(シグナル)をもたらし、増幅はおよそ(h1+h2)/h1(相似三角形に基づく)により与えられる。
【０１５１】
本実施形態は、力伝達増幅を示すマイクロファブリケーションプラットフォームの一例にすぎず、他の多くの変形形態が可能であることが理解されるべきである。たとえば、図24は、縮退力測定(degenerate force measurement)を提供することがわかり(保持フィーチャ550及び555の等しい屈曲を示す)、代替的実施形態においては、2つの保持構造のうち1つのみがマイクロカンチレバーとして機能する必要がある。
【０１５２】
様々な実施形態により、中間安定化フィーチャを有する保持構造が、2軸の形式又は1軸の形式で配置されうることが理解されるべきである。一般にカンチレバーの数が多いほど、保持構造の偏向は小さくなる(最大偏向は1軸構成においてである)。そのようなものとして、本質的に大きな偏向をもたらさない前述の増幅実施形態を構成、たとえばマルチポスト2軸構成に組み込むことは有益でありうる。
【０１５３】
安定化フィーチャは、微小組織の位置を安定化可能であるべきであり、したがって、屈曲性の弱い保持構造での実施において、安定化フィーチャを保持構造の遠位端から離れた位置に位置させることが好ましい場合があることが理解されるべきである。他方、安定化フィーチャが保持構造上の低すぎる位置に(たとえば、ウェルの底面に近接して)設けられる場合、及び保持構造がマイクロカンチレバーとして機能すべき場合、保持構造の偏向のダイナミックレンジは、(保持構造の剛性に応じて)減少させられうる。したがって、実施のいくつかの例において、安定化フィーチャは、マイクロウェルの底部からおよそ250μmから500μmの範囲の高さで設けられうる。
【０１５４】
微小組織プラットフォームのアレイフォーマット
上述のように、いくつかの実施形態において、その中に設けられ又は形成されるマイクロファブリケーションプラットフォームを有するマイクロウェルが、アレイフォーマット、たとえばマイクロプレート(たとえば24、96、384又は1536ウェルマイクロプレート)で提供されうる。そのようなレイアウトの例は、下でマイクロファブリケーション方法を説明する節で提供される。
【０１５５】
アレイフォーマットでの様々なジオメトリーの小型化心臓微小組織の形成の一例は、図6(a)〜(e)に示される。ハイコンテント及びハイスループットスクリーニングを実行するとき、研究における試料の量を最大化することが重要でありうる。アレイフォーマットは、単一のウェル内でより多くの複製が生成されることを可能にする。これは、任意の単一のマイクロウェルにおける組織形成の欠如の課題又は問題に取り組む際に有益でありうる。多くのアレイウェルの平均が、信頼性のあるアウトプットをもたらすために用いられうる。HCSを可能にするため、微小組織は、機能的に測定される能力を保持すべきである。小型化と機能的心臓組織の特徴の維持との間の最適バランスが基準となる。
【０１５６】
いくつかの実施において、マイクロファブリケーションプラットフォーム(及びそのようなプラットフォームを含有するマイクロウェル)は、細胞培養培地及び薬剤の連続的灌流を容易にするため、一方向フォーマットで配列されうる。このタイプの系は、はるかに生理的であり、マイクロ流体システムに適合可能である。
【０１５７】
マイクロファブリケーション方法
上の実施形態による安定化フィーチャを含む保持構造を有するマイクロファブリケーションプラットフォームは、以下のとおり製造されうる。実施の一例において、上述及び図1(a)に示したものと類似の仕方で、マイクロファブリケーションアプローチに従うことができる。層フィーチャを生成するために、最初から最後までいずれかのフォトリソグラフィを適用でき、そのことによりフィーチャが連続的に加えられることが可能になり(前述のSU-8マイクロファブリケーションプロトコルを参照のこと)、又は、後処理法を適用でき、標準的フォトリソグラフィ法を使用して高く直線状の壁が設計され、保持フィーチャは後で手作業で加えられる。後処理法が用いられてもよく、基本的な直線状の垂直ポストが、従来のSU-8ベースの手段を通じてマイクロファブリケートされ、次に、溝、突起及び傾斜が実体顕微鏡下で手作業で加えられる。これは、突起のための少量の硬化物質(エポキシ)を適用するか、又は溝のために物質を摩砕することにより行われる。
【０１５８】
しかしながら、これらの構造を生成する代替的方法は、高解像度3D印刷を通じてである。3D印刷アプローチが用いられうるのであり、設計の1つ以上の工程(様々な保持フィーチャを含む)が、3Dモデリングソフトウェアを使用して生成され、高解像度3Dプリンターを使用して印刷される。一実施形態において、最終ファイルタイプは、標準的3Dモデリングソフトウェア、たとえばAutoCad又はSolidEdgeを使用して高再現性「.stl」ファイルでエクスポートされる。
【０１５９】
図6(f)は、組織マイクロファブリケーションプラットフォームが内部に一体形成されたマイクロウェルを有するマイクロプレートのマイクロファブリケーションのための例示的3D印刷法を示す。まず、ポジ鋳型(positive mold)を3D計算モデルから3D印刷する(この場合、PROTO3000製Objet24 3Dプリンターを使用した)。マスターを印刷するために使用された物質は、VeroWhiteだった。鋳型を印刷して、たとえば摂氏60度で24時間後硬化させ、任意の残留物を重合させうる。次に、この印刷されたマスターを、所望の安定化フィーチャを含有する所望のプラットフォームジオメトリーの複製を成形するために使用する。次に、この鋳型をPDMSでネガを作るために使用する。PDMSを鋳型の上に流し込み、24時間、摂氏60度で硬化させる。ネガPDMS鋳型をシランでコーティングし、次に、PDMSで再び成形し、ポジを作り出す。耐久性があり容易に離型可能なマスター鋳型を生成するため、ポリウレタンをポジPDMS鋳型から鋳型を作り出すために使用する。このポリウレタンネガ鋳型から、ポジPDMS基材を不定数生成できる。すなわち、左側のプロセスの最終結果は、ポリウレタンマスター鋳型であり、これは、左側のボックスに示されるすべての工程を迂回し、図6(f)の最下部のボックスに示される迅速なマイクロファブリケーション手順に従うことを可能にする。これは、マスター鋳型を作り出すことに成功する限り、ユーザーが必要なのは、この単純化された手順に従うことだけであることを意味する。最後に、鋳型をポリウレタンマスターから取り出し、オートクレーブバッグに挿入し、使用前にオートクレーブする。洗浄並びに細胞及びECMの播種前に、基材をPluronic(商標)酸でコーティングする。
【０１６０】
矢印は、移行工程を示す(注:いくつかの移行には、鋳型をオーブンに入れる等の中間プロセスが伴う)。
【０１６１】
物質特性及び/又は物質寸法は、リモデリングプロセス中の力伝達測定に好適な力学的特性を有する保持構造を得るために選択されうることが理解される。たとえば、図6(g)に示す方程式は、本明細書において示される例示的マイクロファブリケーションプラットフォームにおける単位長当たりの力を決定するために使用される式を示し、式中、q=単位長当たりの力、d=ポストの最上部の変位、E=PDMSのヤング率、I=シリンダーのモーメント、a=ポストに接触する組織の長さ、L=ポストの高さである。
【０１６２】
図6(h)は、3D印刷を介して形成されたマスターマイクロプレート鋳型に基づく複製マイクロプレートの例示的製造方法を示す。図に示す工程は、以下のとおりである。工程(i)において、たとえば上記図6(f)に記載の方法を使用して、3D印刷された鋳型(ポジ)が製造される。工程(ii)において、PDMSネガがオリジナル鋳型から鋳造される。工程(iii)において、PDMSポジがネガPDMS鋳型から鋳造される。工程(iv)において、ネガポリウレタン鋳型がポジPDMS基材から作り出される。工程(v)において、PDMS基材がポリウレタンマスター鋳型から成形され、次にオートクレーブされる。工程(vi)において、Pluronic(商標)酸コーティングされたPDMS基材に細胞含有コラーゲンが播種される。工程(vii)において、細胞含有コラーゲンの液滴がウェルの内端で形成される。工程(viii)において、平らな表面上でプレートをやさしく叩いた後、細胞含有コラーゲンの液滴がリング状容器の中に落ちる。最後に、工程(ix)において、インキュベーターでの20分間の重合後、培地を各ウェルに添加する。
【０１６３】
図6(i)及び6(j)は、(i)不整脈モデル24ウェルプレートの、及び(j)96ウェル収縮力プラットフォームの、3D印刷された鋳型のオリジナル3D AutoCADモデルである。
【０１６４】
微小組織プラットフォームにおける電極の包含
実施の一例において、心臓マイクロワイヤーマイクロウェル内の2つの側方にあるポストが、白金ワイヤー電極と一体化され、電気点刺激能力を提供する(図11(b))。電極は、様々な方法により組み込まれうる。実施の一例において、保持構造は、電極を内蔵して形成されてもよい。たとえば、弾性の導電性ポリマーを、刺激及び記録用電極としても役立ちうる偏向ポストを製造するために使用できる。より発達した3D印刷技術において、導電体を含む複数の物質を同時に設計及び印刷できる。非導電性弾性ポスト内で絶縁された弾性ポストに埋め込まれた導電性点源(電極として機能する導電体)を有する実施形態を、点源電気刺激を組織に送るために使用できる。
【０１６５】
別の実施形態において、金属電極をマイクロウェルのフロア上又はその内部に一体化して、刺激及び記録を可能にできる。これは、たとえば、導電体をポスト自体ではなく基材フロアへと設計するのに3Dプリンターを利用することにより達成できる。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、刺激用電極は、場刺激ではなく「点刺激」を可能にするために、互いに近接して置かれてもよい。点刺激は、場刺激よりもはるかによく生理的条件を再現する。
【０１６７】
点刺激のためにかなり小さな電位を使用でき、これは、電場誘導細胞損傷及び細胞死を限定しうる、より生理的な範囲を可能にする。これらの点刺激法では、1V未満の刺激を使用できる。電極のスペーシングは、およそ0.2mmから2mmの範囲であってもよい。加えて、伝導速度を操作するため、1つの組織内に複数の点源を設置できる。たとえば、点刺激源は、活動電位伝播の方向を調節するために、遠位端の組織のどちらかの側に配置できる。
【０１６８】
例示的な電極物質は、白金、炭素、インジウムスズ酸化物、及び適切な導電性ポリマー(3D印刷に適したもの)を含みうる。
【０１６９】
実施の一例において、好適な電極寸法は、直径およそ50〜100μmである。電極表面と組織との間の高さは、組織の興奮性に依存しうる。一例示的実施形態において、電極表面と組織との間の高さは、およそ0.25〜0.5mmの間の範囲でありうる。
【０１７０】
実施の一例において、保持構造の少なくとも1つが、一対の隣接構造であってもよく、各隣接構造は電極を含み、隣接構造が、保持構造として作用することと、点刺激を適用するための一対の電極を提供することとの二重の役割を果たす。そのような実施形態は図25に示され、第1の保持構造がポスト560及び565を含み、第2の保持構造がポスト570及び575を含む。
【０１７１】
複数の細胞タイプを有する微小組織コンストラクト
一実施形態において、内皮細胞(細胞タイプ1)を播種された微小組織を生成でき、次に、別の細胞及びECMの層を上から播種することにより、その周囲に心臓細胞(細胞タイプ2)から構成される組織を生成できる(図26)。これは、リモデリングが完了すると、血管コア(内皮細胞に基づく)を、外側の機能的心臓細胞に基づく組織と共に有する組織をもたらす。これらの細胞の境界領域での相互作用も同時に観察できる。各タイプの細胞密度は、それぞれの細胞株に関連付けられる特定の成長率について最適化される。加えて、細胞培養培地は、各細胞タイプが必要とする2つのタイプの培地の組合せである。
【０１７２】
そのような複数細胞デュアルコンストラクトの例示的形成方法は、図26(a)〜(d)に示される。図26(a)及び(b)において、第1の播種混合物600が、マイクロファブリケーションプラットフォームに提供され、第1の組織コンストラクト610へとリモデルされる。続いて、図26(c)及び(d)に示すように、第2の播種混合物620が、(組織コンストラクト610が存在する)マイクロファブリケーションプラットフォームに添加され、第1の組織コンストラクト610の周囲に形成される第2の組織コンストラクト630へとリモデルされる。
【０１７３】
このプロセスは、図22(b)〜(d)にも示されている傾斜したマイクロウェル構造の文脈で、図27(a)(i)〜(iv)において示される。パネル(i)及び(ii)において、初期組織コンストラクト形成プロセスが示され、第1のタイプの細胞を含む組織コンストラクト750が、保持構造715の周囲に形成される。パネル(iii)及び(iv)において、このプロセスを第2の細胞タイプについて繰り返し、形成された組織コンストラクトは両方の細胞タイプを含む。
【０１７４】
図27(b)(i)及び(ii)は、そのような実施形態により形成されたデュアル細胞タイプ組織コンストラクトの2つの異なる領域の蛍光顕微鏡画像を示し、異なる色素でタグ化された2つの異なる細胞タイプを示している(タイプ1がGFPでタグ化され、タイプ2がcell tracker dye redでタグ化される)。両方の細胞タイプが、不死化マウス線維芽細胞株のものである。
【０１７５】
図27(c)(i)〜(iii)は、低倍率での複合組織コンストラクトの蛍光顕微鏡画像を示す。(i)細胞タイプ1からの蛍光、(ii)細胞タイプ2からの蛍光、及び(iii)両方の細胞タイプからの蛍光を示す。細胞タイプ1を播種し、3〜4日間リモデルさせた。リモデルしたら、第2の細胞タイプ(タイプ2)を容器内に添加し、第1の組織タイプの周囲にリモデルさせた。層状微小組織が得られた。このモデルはまた、2層を超える層状組織タイプのために反復できる。
【０１７６】
心臓マイクロワイヤーにおける応力及び収縮性サルコメアのモデリング
上述のマイクロファブリケーションアプローチを、小型化3-D微小組織プラットフォームの合理的設計及び製造を助ける計算モデリング法で補足しうる。モデリングは、たとえば、細胞が高サルコメア発現を維持することを保証するため、張力によりアラインした微小組織構築物を予測するため、及び統合された電気機械的刺激をモデリングするために実施されうる。
【０１７７】
したがって、いくつかの実施形態において、心臓マイクロワイヤーの製造方法は、様々な3-D組織ジオメトリー内に分布するパターン化された機械的応力を空間的に予測及び/又は評価するための、インシリコモデリングの使用を含む。そのようなモデリングの役割及び有用性を示すため、2つの単純な微小組織ジオメトリーを、微小組織収縮性の有限要素ベースシミュレーションを使用したモデル化のために選択した(図2(b))。すなわち、1)2軸及び2)1軸組織内張力(それぞれBITF及びUNITF)下での微小組織ジオメトリーである。
【０１７８】
非筋細胞におけるストレスファイバーの形成を予測するためのモデルに基づく現存のインシリコ方法とは異なり、本モデルは、形成中の心臓組織におけるサルコメア形成及びアラインメントを予測するために考案された。微小組織におけるサルコメアフィラメントの展開及び収縮性は、以前に提案されたフレームワーク(Deshpandeら、2006年)を、心臓組織形成のモデリングに適合させることによりシミュレートした。このフレームワークは以前に様々な細胞表現型におけるストレスファイバー収縮性のモデリングのために実施されている(Deshpandeら、2007年、Pathakら、2008年、McGarryら、2009年、Legantら、2009年)一方で、以前の応用は非筋細胞に関するか、又はサルコメア形成及びアラインメントの予測を伴わなかった。したがって、本実施形態において、モデルは、ストレスファイバー及びサルコメアフィラメントの両方がアクチン-ミオシン相互作用から構成され、それを介して作動することに基づいて、心筋細胞におけるサルコメアフィラメントのシミュレーションのために適合されている。
【０１７９】
実施の一例によれば、組織における各点でのアラインした収縮性サルコメアの形成は、アウトプットパラメータΠにより予測され、これは最大及び平均サルコメア活性化レベルの間の差
【数４６】
2016504022.tif 000048
として定義される。高度に活性化した、アラインしたサルコメアの優位な方向への形成が、1に近いΠの値により予測される。対照的に、0に近いΠの値は、その点で優位なサルコメアが形成されていないことを予測する。
【０１８０】
下に示すように、Πの予測される分布を、心筋トロポニンT及びアルファ-アクチニンについて染色された蛍光顕微鏡画像と直接的に比較可能であり、そのことにより、バックグラウンド蛍光の除去が優位なサルコメア形成の分布を明らかにする。
【０１８１】
組織のサルコメア形成と応力状態との間の関係性を研究するために、無次元有効応力
【数４７】
2016504022.tif 000049
が定義され、式中
【数４８】
2016504022.tif 000050
及び
【数４９】
2016504022.tif 000051
はそれぞれ、最大及び最小主応力である。モデルパラメータは、実験的に観察された1軸組織コンストラクトの幅の変化に基づいて較正した。
【０１８２】
モデルの実施の一例において、微小組織は、図1(b)の挿入図に示すように、サルコメアフィラメントが組織のすべての点で、全方向に自由に形成される連続体としてモデリングされる。無次元サルコメア活性化レベルη(Φ)は、全方向(Φ)で計算される。一次動態方程式がサルコメアフィラメントの展開を支配し、それによれば、フィラメント形成は、時間と共に指数関数的に減衰するシグナルにより駆動される(方程式1のRHSの初項)。
【０１８３】
【数５０】
2016504022.tif 000052
サルコメア収縮性は、ヒル型方程式を使用してモデリングされ、それによれば、サルコメアフィラメントにより生成される張力は、短縮速度の増加と共に減少する。したがって、サルコメアフィラメントが短縮すると、張力の減少が生じる。等尺性値未満へのそのような張力の減少は、方程式1のRHSの第2項により捉えられるように、サルコメアフィラメントの部分的分離をもたらす。
【０１８４】
サルコメア形成は、指数関数的に減衰するシグナルにより駆動されるものと仮定され、組織におけるシグナル強度Cは、
【数５１】
2016504022.tif 000053
として与えられる。
【０１８５】
シグナルは、カルシウム又はRhoの濃度として考えられてもよい。θは、シグナルの減衰率を制御する定数であり、tはシグナル開始から経過した時間である。
【０１８６】
方向Φへと配向したサルコメアフィラメントの収縮性挙動は、骨格筋のそれと同様に、ヒル型張力-ひずみ速度関係に従うと仮定される(骨格筋及び心筋細胞サルコメアフィラメントの両方が、アクチン-ミオシン相互作用により張力をもたらす)。サルコメアフィラメントにおける張力σ(Φ)は、アクチン-ミオシン対の架橋サイクルにより生成され、
【数５２】
2016504022.tif 000054
として与えられ、式中、σ(Φ)はサルコメア張力であり、σ0(Φ)は等尺性張力である。モデルパラメータkvは、ヒル曲線の勾配を決定し、短縮ひずみ速度
【数５３】
2016504022.tif 000055
の、
【数５４】
2016504022.tif 000056
での増加の際の応力の減少を表す。サルコメアの等尺性張力は、サルコメアの活性化レベルη(Φ)に依存し、それによれば、
【数５５】
2016504022.tif 000057
である。モデルパラメータ
【数５６】
2016504022.tif 000058
は、十分に活性化したサルコメアにおける最大張力である。
【０１８７】
一次動態方程式がサルコメアフィラメントの展開を支配し、それによれば、フィラメント形成は、時間と共に指数関数的に減衰するシグナルにより駆動される(方程式A3のRHSの初項)。
【０１８８】
【数５７】
2016504022.tif 000059
【０１８９】
方程式A2で概括したように、サルコメアフィラメントが短縮すると、張力の減少が生じる。等尺性値未満へのそのような張力の減少は、方程式A3のRHSの第2項により捉えられるように、サルコメアフィラメントの部分的分離をもたらす。
【０１９０】
前述のとおり、本研究において実施したシミュレーションは十分に予測力があり、サルコメアフィラメントは2次元組織において全方向に形成可能である。方程式A2において、角度Φでのサルコメアフィラメントにおける軸ひずみ速度
【数５８】
2016504022.tif 000060
は、
【数５９】
2016504022.tif 000061
となるように、各積分点での2次元ひずみ速度テンソルから決定される。
【０１９１】
各積分点での活性サルコメアの応力テンソルへの貢献は、
【数６０】
2016504022.tif 000062
として与えられる。
【０１９２】
コラーゲンマトリックス及び心筋細胞の非収縮性構成要素を表す受動的弾性貢献を加えることにより、構成的定式化を完了する。受動的応力は、
【数６１】
2016504022.tif 000063
として与えられ、総応力が
【数６２】
2016504022.tif 000064
として与えられることになる。
【０１９３】
この構成的フレームワークを、ABAQUS(Dassault Systemes)において、ユーザー定義マテリアルサブルーチンとして実行した。微小組織ジオメトリーを、4ノード化平面応力要素(four noded plane stress elements)(CPS4)を使用してメッシュ化(mesh)した。結果の後処理をソフトウェアParaviewを使用して実施した。
【０１９４】
図1(b)に示すように、「2軸」及び「1軸」微小組織の両方について、有限要素(FE)モデルを作り出した。未変形FEジオメトリーは、心筋細胞収縮性及びリモデリングによる変形前の初期微小組織ジオメトリーに基づく。微小組織を制約するために使用される円形ポスト(たとえば上述のPMDSポスト)を、剛性表面としてモデル化した。なぜなら、これら支持体は、周囲の微小組織より桁違いに硬いからである。2軸FEモデルの場合には、微小組織は、接着剤での各ポストのインビトロコーティングを反映して、8つの支持円形ポストに結合されていると仮定する。1軸微小組織の場合には、そのような接着剤は使用せず、したがって、1軸FEモデルにおいては、2つの円形剛性ポストと周囲の微小組織との間のハードコンタクトを仮定し、組織がポストから滑ること及び分離することを可能にする。初期メッシュ感度研究後のすべての解析について、4241個の平面応力完全積分要素(plane stress full integration element)を1軸ジオメトリーのために使用し、一方で37603個のそのような要素を2軸ジオメトリーのために使用した。
【０１９５】
図14(a)は、70時間後(定常状態)の1軸組織における予測されるサルコメア分布のプロットを示す。組織は、その初期ジオメトリーから有意に変形し(図9にも示す)、幅の有意な減少を経ている(図1Cも参照のこと)。加えて、組織は、サルコメアの収縮性作用により円形支持体の内表面から分離する。
【０１９６】
高度にアラインしたサルコメアの形成が、組織の中心領域を通じて高い程度であることが計算され、サルコメアは組織の長軸に沿ってアラインする。加えて、高度にアラインしたサルコメアの形成が、組織が支持体から分離するところに形成される細いストリップにおいて高い程度であることが計算される。これらの細いストリップが出会う局在化した「接合」領域において、低いサルコメア形成が予測される。予測される組織の変形及び予測されるサルコメアの分布及びアラインメントは、実験観察と非常に密接に相関する。組織変形の展開及びサルコメア形成は、複数の別々の時点で図9(a)〜(f)に示される。
【０１９７】
図14(b)は、組織における応力状態を示し、ベクトル方向は、最大主応力の方向を示す。無次元有効応力
【数６３】
2016504022.tif 000065
は、組織を通じて1に近く、応力状態が高度に1軸であることを示す。そのような1軸応力の領域において、サルコメア形成が高い程度であることが予測される。対照的に、局在化「接合」領域においては
【数６４】
2016504022.tif 000066
であり、低サルコメア形成が予測される。最大主応力の方向が、組織を通じてサルコメア形成の予測された方向と強く相関することを述べる価値はある。組織変形の展開及び無次元有効応力
【数６５】
2016504022.tif 000067
は、複数の別々の時点で図10(a)〜(f)に示される。
【０１９８】
図15(a)は、70時間後(定常状態)の2軸組織における予測されるサルコメア分布のプロットを示す。組織は、その初期ジオメトリーから有意に変形し、組織境界の有意な湾曲が観察された。この場合、上で論じたように、円形支持体からの組織の分離は許されない。予測された組織変形は、実験観察と密接に対応する。アラインしたサルコメアの形成が、組織の周縁領域において高い程度であることが予測され、サルコメアは組織境界と平行にアラインすることが予測される。加えて、4つの隅の支持体の近傍で、中程度のサルコメア形成が予測される。組織の中心部において、サルコメア形成が非常に少ないことが予測される。予測される組織の変形及び予測されるサルコメアの分布及びアラインメントは、実験観察と非常に密接に相関する。組織変形の展開及びサルコメア形成は、複数の別々の時点で図7(a)〜(h)に示される。
【０１９９】
図15(b)は、組織における応力状態を示し、やはりベクトル方向は、最大主応力の方向を示す。無次元有効応力
【数６６】
2016504022.tif 000068
は組織周縁の近傍で1に近く、1軸応力状態を示す。やはり、これは、サルコメア形成と1軸応力の領域との間の強い相関を示し、サルコメアは最大主応力の方向にアラインする。組織の中心部において、
【数６７】
2016504022.tif 000069
であり、2軸応力状態を示す。この2軸応力の領域において、サルコメア形成は予測されない。組織変形の展開及び無次元有効応力
【数６８】
2016504022.tif 000070
は、複数の別々の時点で図8(a)〜(f)に示される。
【０２００】
図1(c)に示すように、組織変形の合理的な予測が1から1.5の間のkvの値について得られ、(σmax/E)=25の比率及び
【数６９】
2016504022.tif 000071
である。これは、コラーゲン1.75mg/mlから構築された微小組織について(σmax/E)=16である以前の研究[19]で検討されたNIH 3T3細胞よりも高い値の等尺性張力を心筋細胞が有することを示唆する。加えて、本研究における心筋細胞のために較正されたkvの低い値(<1.5)は、ヒル曲線の勾配がこの細胞タイプ張力については、3T3細胞(kv=2)と比べて低いことを示す。これは、心筋細胞が、所定の短縮ひずみ速度について3T3細胞よりも等尺性値に近い張力をもたらすことを示す。kv=1.25の値が、本研究における以降のすべてのシミュレーションのために使用される。
【０２０１】
70時間後に定常状態組織幅が観察され、組織の時間的挙動を、方程式1(上を参照のこと)におけるシグナルCの減衰時間及び反応速度定数kf及びkbを調整することにより任意で捉えた。たとえば、図1(c)において、シグナル減衰定数θ=25200s(7時間)が選択され、kf/θ=0.14及びkf/θ=0.014である。
【０２０２】
モデルが提供する重要な洞察は、細胞牽引力を介して組織内張力によりもたらされる機械的応力は、組織内の細胞骨格及びECMタンパク質構造の強力なモジュレーターであるということである[19]。本系について、モデルはBITF及びUNITF微小組織の両方において応力のエリアを、アラインした組織及びサルコメア発現のエリアと共に予測した。本モデルシミュレーションは、BITF微小組織の境界領域が、最も高い応力を経験することを決定した(図1(d))。最も低い応力は、BITF微小組織の中心部にあることが予測され、これらの最小の点と最大の点との間で機械的応力の段階的連続があった。
【０２０３】
UNITF微小組織においては、長軸方向の長さを通じて高い応力を示し、組織内張力の均一に高い領域をもたらした(図1(e))。上述のように、両方のジオメトリーについて、組織変形の展開及び無次元有効応力
【数７０】
2016504022.tif 000072
が、複数の別々の時点で示されている(図8及び図10)。モデルはさらに、2軸及び1軸組織内張力下にある両方の微小組織ジオメトリーについて、心臓サルコメアタンパク質発現が、高1軸応力のエリアにアラインメントでパターン化されることを予測した(図1(d)及び(e))。
【０２０４】
上述のように、両方のジオメトリーについて、組織変形の展開及びサルコメア形成が、複数の別々の時点で示されている(図8(a)〜(f)及び図10(a)〜(f))。高度にアラインしたサルコメアの形成は、局所的応力状態の2軸性に依存する。アラインしたサルコメアの形成は、応力状態が本質的に1軸である領域において生じる。対照的に、応力状態が本質的に2軸である領域において、サルコメア構造は生じない。加えて、計算された最大主応力方向は、計算されたサルコメアアラインメントの方向と密接に相関する。
【０２０５】
本実施形態により提示された設計プロセス及び結果は、計算的アプローチを、組織設計及び表面マーカーで描写された心臓細胞集団を使用したhPSC由来心臓組織の「ボトムアップ」構築と組み合わせる、独特の方法を構成する。したがって、本開示の実施形態は、アクチニンベースのモデルから人工心臓組織に特化したサルコメアベースのモデルへと移行することにより、以前の微小組織収縮性モデルを進展させる。
【０２０６】
上述のフレームワークは、人工心臓微小組織応答の設計及び研究に応用可能である。たとえば、モデルからの結果は、リモデルした微小組織において1軸張力を誘導するポストジオメトリーを作り出すことに利益があることを示す。具体的には、これは、力の軸に沿ってアラインした応力から得られた応力から生じる。サルコメアアルファ-アクチニンの発現もまた、微小組織内の応力のエリア及び程度に対して均一に現れ(またそれと相関し)ていた。
【０２０７】
一般に、均質で高度にアラインしたサルコメアアルファ-アクチニン構造で心臓組織コンストラクトを製造するためには、最大1軸張力を促進するジオメトリーを選択することが好ましい。段階的レベルの病態組織を設計するためには、低1軸応力の領域における線維性成長を促進することを意図して、2軸張力をますます促進するジオメトリーを設計することができる。
【０２０８】
一実施形態において、事前選択されたリモデルジオメトリー及び事前選択されたサルコメアの分布のものと密接に類似する、又はそれと近似する、サルコメアの分布及びアラインメントを有する心臓組織コンストラクトが形成される条件を決定するための方法において、以前のモデルが用いられてもよい。この方法は、マイクロファブリケーションプラットフォームと関連付けられるジオメトリー境界条件(たとえばマイクロファブリケーションプラットフォーム内に提供されるポストの初期ジオメトリー特性)の初期セット、並びに、心臓組織コンストラクトが形成される構成要素の特性及び相対量(たとえばコラーゲン、心筋細胞及び線維芽細胞の初期量、及び粘弾性特性)を提供することを含む。次に、これらの初期条件は、第1の反復(first iteration)として、リモデルジオメトリーの定常状態推定、及び、得られたリモデル心臓組織コンストラクトにおけるサルコメア分布を計算するために用いられる。この推定は、推定と事前選択されたジオメトリーとの間のミスマッチを評価するために、事前選択されたサルコメアのジオメトリー及び分布と比較される。次に、1つ以上のパラメータを、任意選択でミスマッチに依存する量で、さらに変化させ、新しい推定及びミスマッチを計算する。このプロセスを、十分な程度の収束が達成されるまで反復する。収束を達成するためにパラメータを変化させるプロセスは、既知の方法、たとえば「Numerical Recipes in C」[Brian Flannery、Saul Teukolsky、及びWilliam Vetterling、Numerical Recipes in C:The Art of Scientific Computing、William Press、Cambridge University Press(1992年10月)]に開示のものに基づく方法により実施されてもよい。
【０２０９】
十分な収束の達成後に、得られたパラメータが、好適なマイクロファブリケーションプラットフォームを製造するため、及び構成要素の適切な量を選択するために用いられてもよい。次に、マイクロファブリケーションプラットフォームは、事前選択された基準に類似するジオメトリー及びサルコメア分布を有する心臓組織コンストラクトを製造するために用いられてもよい。
【０２１０】
マトリックス中の複数細胞の自己組織化を予測する本計算的アプローチを用いることにより、組織間相互作用を研究するために、心臓組織、又は血管組織だけでなく、1つの系の組織の組合せのますます複雑な構造を設計することができる。
【０２１１】
心臓マイクロワイヤーにおいて1軸応力媒介性サルコメアアラインメントを誘導する自己組織化心臓細胞の実験的検証
前述のモデルの予測を経験的に検証するために、前述のとおりであるが図11(a)にモデリングされたジオメトリーの基材を生成した。くぼんだアレイマイクロウェルを含有する円盤状インサート(24ウェルプレートのウェル内にはめ込むために成形された基材シートからの円形切抜き)を設計し、ユニバーサル24ウェルTCTPマルチウェルプレート内部に置いた(図11(b)及び(c))。rR心臓細胞を、十分に定義された未重合コラーゲンマトリックス中に懸濁し、マイクロファブリケートされた基材上に適用し、遠心して細胞をくぼんだマイクロウェル内に入れた。過剰なコラーゲンを除去し、残りのポケットの細胞含有コラーゲンを重合した。
【０２１２】
細胞が糸状仮足を伸長し始め、周囲のコラーゲンマトリックスをリモデルするのを観察し、3日以内に微小組織が形成され、形態の変化が止んだ。培養時間の経過と共に、インプット細胞密度を低下させることがやはりそうであったように、より高い濃度(2.2mg/mL〜3mg/mL)のコラーゲンが、微小組織リモデリングの時間及び範囲を延長することが観察された。
【０２１３】
前述のモデルにより予測されたように、心臓マイクロワイヤー微小組織におけるサルコメア発現全体が、心臓サルコメアタンパク質アルファ-アクチニン及びcTnTの免疫染色(図1(e))により明らかにされたように、BITF微小組織(図1(d))と比較して高発現であり空間的に均質であることが観察された。またモデルにより判定されたように、高度にアラインしたサルコメアの発現は、高応力のエリアと相関していた。加えて、モデルが高い1軸応力による張力誘導アラインメントを予測したエリアでは、モデル化された局所的張力ラインと並行に、伸長し配向された細胞アラインメントが観察された。細胞伸長全体が、リモデルされアラインしたコラーゲン構造物に加えられた細胞に作用する1軸張力により、心臓マイクロワイヤー系において有意に高かった(図1(h))。加えて、心臓マイクロワイヤーにおける細胞は、BITF微小組織における細胞と比較してより高いアラインメントを示した(図1(h))。これらの結果は、2-Dコラーゲン付着ガラス基材に関する初期研究の形態プロファイルと密接に類似する(図1(g))。
【０２１４】
次の段階として、hESC由来心臓細胞から構成される心臓マイクロワイヤーを生成し、類似するリモデリング特性及びタンパク質発現を観察した。リモデリング3日後に細胞がコラーゲンベースのECMをアラインしていることを保証するため、LC-PolScope定量複屈折イメージングシステムを使用して心臓マイクロワイヤーを評価した。PolScope画像(図1(f))において、画素の色調が原線維コラーゲンの配向角を決定する。心臓マイクロワイヤー内の原線維コラーゲンが、実際にリモデルされ、心臓マイクロワイヤーの長手軸に平行にアラインされていることが確認された。
【０２１５】
心臓マイクロワイヤーの機能的成熟
hESC由来心臓細胞がその元の凝集体から分離され、心臓マイクロワイヤーとして培養されるとき、興奮閾値(ET)及び最大捕捉率(MCR)が有意に改善することが示された(図2(a)及び図2(b))。心臓マイクロワイヤーが2相矩形波パルスで3日間電気点刺激されたときに、MCRはさらに一層改善した。これは、上述のように(また図11(a)及び(b)に示すように)心臓マイクロワイヤーマイクロウェル内の2つの側方にあるポストを、白金ワイヤー電極と一体化し、電気点刺激能力を提供することにより達成された。
【０２１６】
心臓マイクロワイヤーは、約1Hzの内因性自発性拍動周波数を有しており、これはヒト心筋細胞について期待されるベースラインである。既知の効果を有する薬剤を使用して、心臓マイクロワイヤーを撹乱し、その反応(経膜AP及び細胞内カルシウム移行)を、電位及びカルシウム感受性色素をそれぞれ使用して光学マッピングした。
【０２１７】
アドレナリン作動性神経伝達物質であるエピネフリン(0.1μg/mL)の心臓マイクロワイヤーへの添加は、ベースラインに対するAP活性化率を増加させた一方で、抗不整脈薬であるリドカイン(2μg/mL及び4μg/mL)の添加濃度を増加させると、活性化を減少させほとんど消滅させた(図2(c))。L型Ca2+チャネル遮断剤であるベラパミル(0.25μg/mL)を添加することは、心臓マイクロワイヤーにおけるカルシウム波の振幅をベースラインに対し減少させ、続いてエピネフリン(0.1μg/mL)を追加すると、カルシウム移行速度が増加した(図2(d))。
【０２１８】
CM約75%(条件Bと同等)で生成された心臓マイクロワイヤーの伝導速度を、足場の非存在下で記録し、健常及び疾患ヒト心臓伝導速度と比較した(図5)。心臓マイクロワイヤー伝導速度(47.4±12.4cm/s)は、健常ヒト心臓のそれ(46.4±2.7cm/s)に匹敵することが見出された。CM25%及びCM50%から構成される他の心臓マイクロワイヤーは、非同期性の及び/又は弱い活動電位を示した。加えて、より高い非筋細胞パーセンテージ(たとえばおよそ25%より高い)から構成される心臓マイクロワイヤーは、大きくリモデルし、過度の負荷により破断した。CM100%から構成されるCMWは、よく統合された組織を可能にするようリモデルせず、それゆえまた同調して収縮しなかった。活動電位は、組織長を横断しきることができなかった。CM75%及び非CM(FB)25%から構成される心臓マイクロワイヤーが、最も構造的に健全な組織を生成し、結果として、電気生理学(伝導速度)の観点から最も機能的であることが見出された。
【０２１９】
心臓マイクロワイヤーにおけるAP伝播の動態をまた、研究して操作した。心臓マイクロワイヤーにおける正常AP伝播は、一方の側のループにおいて開始し、収束し、ワイヤー長を横断し、次に反対側のループのネックで分岐する(図2(e)(上側のセット))。いくつかの場合において、瘢痕形成により引き起こされる不整脈におけるリエントラント波と類似する物理的変形により撹乱されるAP伝播動態を観察することが可能だった。この伝導遮断は、図2(e)(下側のセット)に見られるように、ループのネックで観察された。
【０２２０】
心臓マイクロワイヤーにおけるAP伝播指向性が、電気点刺激を使用して操作されうることもまた判定された。左から右に横断する自発性APを有する心臓マイクロワイヤーに始まり、AP方向は右側からの電気的ペーシングにより逆転した(図2(f))。
【０２２１】
リエントラント波は、微小組織のジオメトリーを操作することにより、原線維形成心臓上にモデリングされた。心臓マイクロワイヤーを、原線維形成中のリエントラント波を模倣する組織のリングを生み出すための円形基材を使用して生成した(図2(g))。電気生理学的評価により、リングを旋回するAP伝播の自発性無限ループ様サイクルが明らかになった。生成された全心臓マイクロワイヤーリングのおよそ3分の1が、リモデリング1週後に自発的にそのようなリエントラント波を経験し、維持することが可能であることが観察された。
【０２２２】
本開示の実施の例によれば、健常成人心臓の伝導速度と同等であることが測定される伝導速度を有し、サルコメア構造関連遺伝子を、器官形成開始時の胎児性心臓遺伝子プログラム中に増加するANF及びBNPと共に含む、重要な心臓成熟マーカーの遺伝子発現レベルが増加した心臓マイクロワイヤーが形成されうる[20]。したがって、本明細書に開示の例示的実施形態は、バルク3-D組織における自己組織化細胞並びに線維芽細胞、1型コラーゲン、及び心筋細胞間のECM相互作用を通じた、hPSC由来心筋細胞の成熟を示す。
【０２２３】
心臓マイクロワイヤーで病態研究をするための代替的コンストラクトジオメトリー
他の有用な疾患組織ジオメトリー、たとえば、心室細動中のリエントラント波を設計、シミュレート及び試験することは、治療法への見通しを提供しうる。動的な収縮力により駆動されるイオンチャンルベースの電気活性と関連する生化学的シグナリングを統合できる、生物-化学-電気-機械的モデルへとさらに拡張することもまた挑戦的でありうる。現在、生化学的シグナリング、電気生理学的活性、及び機械出力を一緒に結び付ける計算モデルは存在しない。これらのタイプのHCSプラットフォームについて、これらのタイプのモデルに情報を与え始めるデータを作り出すことが可能である。インプット化合物の一群をスクリーニングし、それらの電気生理及び収縮性に対する効果を決定することにより、これらのタイプのモデルのための基礎を構築できる。具体的には、既知の様々なリガンド-レセプター相互作用について用量曲線を生成することにより、及び、心臓機能に対する得られた効果を観察することにより、機能的応答に対する成長因子刺激の効果をマッピングできる。次に、心筋細胞に特異的な一定の経路を操作することにより、いかにしてこれらの機能的変化のいくつかが調節できるのかについてのモデルを開発できる。
【０２２４】
リングタイプフォーマットで生成された心臓微小組織は、リエントラント波の代替物でありうるのであり、不整脈をモデリングするために使用できる。本明細書において提供される例は、不整脈の特徴である自発性リエントラント波を開始する能力、及びそのような不整脈を電気刺激又は生化学因子で消滅させる能力を示す。いくつかの実施形態において、伝導遮断を促進するため、低レベルの局所的CM発達を促進するために、2軸心臓組織コンストラクトを生成できる。他の実施形態において、伝導を防止するために、局所的切断、たとえばレーザー切断がまた、正常心臓微小組織の局所的領域を除去して、小領域における細胞を殺傷するために使用されうる。
【０２２５】
心臓組織コンストラクトにおける合成的病態の生成を伴う前述の実施形態(たとえばリエントラント波ベースの不整脈モデル)が、たとえば、薬剤候補物質、又は目的の他の化合物若しくは治療剤のスクリーニングの際に用いられうる。たとえば、そのような心臓組織コンストラクトは、一群の因子、たとえば活性化伝播を遅滞させ、それゆえ伝導のリエントラント性を潜在的に消滅させる助けとなりうる因子をスクリーニングするために用いられうる。この例示的実施形態が抗不整脈剤の開発及び/又はスクリーニングに関する一方で、合成的病態を示す心臓組織コンストラクトが、薬剤スクリーニングを含むがこれに限られない、広範な使用のために用いられうることが理解されるべきである。
【０２２６】
NKX2-5+及びCD90+細胞のインプット集団の心臓マイクロワイヤーにおける組織形態形成への依存性
心筋細胞及び線維芽細胞からなる特定のインプット集団を有する組織を生成するために、hESC由来心臓細胞が選別された。心臓分化プロトコルを、HES3 hESCのNKX2-5-GFP遺伝子座内に挿入されたEGFP cDNAを含有する、NKX2-5-GFPリポーターhESC株に適用した[1、9]。第20日の分化プロトコルの最後に、凝集体を分離し(図13(a)及び(b))、フロー活性化細胞選別(Flow Activated Cell Sorting)(FACS)を使用して選別した(図16(a)及び(b))。
【０２２７】
特定の心筋細胞対線維芽細胞比の心臓マイクロワイヤー及び同じ比の対照凝集体を生成した(図3(a))。非分離hESC-心筋細胞凝集体の対照セットもまた維持した。心臓マイクロワイヤーを前述のとおり生成し、AggreWell系において微小組織凝集体を生成した。
【０２２８】
心臓マイクロワイヤー及び凝集体微小組織の両方を、7日間を超えて培養した。本明細書に記載の他の実験と比較して、よく似たリモデリング動態が観察されたが、組織組成条件間の組織形態に明確な相違があった。CD90+(FB)の組成パーセンテージが増加するに従い、より密接で、より統合された高張力下の組織形態が観察された。CD90+細胞75%からなる心臓マイクロワイヤーの多くが、cFBにより及ぼされる高張力による失敗から破断した。加えて、CD90+75%の心臓マイクロワイヤーの大部分が同時収縮を示さず、示したものも、非常に低い自発的活性化率(1Hz未満)を示した。
【０２２９】
NKX2-5+細胞100%での条件において、心臓マイクロワイヤーは、最小限の細胞-細胞及び細胞-ECM統合を有する不安定な組織を形成し、非同期収縮を起こしていた(図3(b)及び図13(a〜c))。おそらく増殖性心筋細胞のクローン集団であり、コラーゲンのパッチにより分離された、球状収縮凝集体が、心臓マイクロワイヤー全体を通じて観察された。
【０２３０】
しかしながら、CD90+細胞のパーセンテージが25%に減少すると、心臓マイクロワイヤーは、インビボ様組織形態に類似した同時収縮を伴うより強固な構築物を呈した(図3(c)、図13(d、e))。
【０２３１】
組織生成前後の組織内での線維芽細胞集団の空間的局在を決定するため、組織を染色し、Vimentinで画像化した。非分離hESC-心筋細胞凝集体における線維芽細胞(図3(d))は、多くの場合、心筋細胞の間で空間的不均質性を示した。しかしながら、人工凝集体及び心臓マイクロワイヤーにおいては、線維芽細胞及び心筋細胞は、空間的均質性を示した。心筋細胞内での線維芽細胞の均質な空間分布を示す75%のNKX2-5+及び25%のCD90+細胞から構成される人工凝集体及び心臓マイクロワイヤーは図3(e)及び(f)に示される。
【０２３２】
心筋細胞対照及び成熟マーカーの遺伝子発現は、心臓マイクロワイヤーにおけるインプット細胞組成の希釈濃度及び成熟効果を示す
組織組成の組織発生に対するさらなる効果を決定するために、重要な心臓成熟マーカーの遺伝子発現を培養7日後に人工組織において調べた。対照心筋細胞マーカーをまず、インプット細胞組成の希釈濃度を決定するために調べた。図3(a)のとおり、条件「A」、「B」、「C」、「D」はそれぞれ、NKX2-5-GFP+細胞100、75、50及び25パーセントにCD90+細胞からなる残りを伴うものに相当する。
【０２３３】
NKX2-5遺伝子は、初期心筋細胞選別の基礎であり、対照及び測定される心臓特異的遺伝子の正規化因子の両方として使用された。NKX2-5は心臓転写因子であるので、心筋細胞集団内での無視できるmRNAレベルの変動が仮定された。期待どおり、NKX2-5発現は、人工組織における心筋細胞の希釈の増加にしたがって減少する傾向を示した(図4(a))。線維芽細胞のマーカーであるDDR2は、線維芽細胞の濃度が増加するにしたがって増加する傾向を示した(図4(b))。心筋細胞及び線維芽細胞の両方の一般的マーカーであるCx43は、一貫して変化のない傾向を示した。凝集体及び心臓マイクロワイヤーの両方における心筋細胞マーカー発現(SIRPA及びcTnT)もまた、NKX2-5での正規化後、一貫して変化のないままだった(図4(d)及び(e))。
【０２３４】
次に、健常心筋細胞成熟の指標となるマーカーを含む一群の遺伝子を介して成熟の効果を調べた。心房から分泌される心房性ナトリウム利尿因子(ANF)及び心室から分泌される脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)は、正常及び疾患心臓生理に関与する心臓ホルモンである[21、22]。対照凝集体に対する心臓マイクロワイヤーにおけるANF発現の増加傾向が、とりわけ「B」条件において観察された(図4(f))。条件「A」及び「B」の両方において心臓マイクロワイヤーにおけるBNP発現の有意な増加が観察された(図4(g))。
【０２３５】
サルコメア構造に特異的な遺伝子であるMYL2(MLC2v)及びMYL7(MLC2a)の発現レベルはまた両方とも、心臓マイクロワイヤーについて「B」条件においてより高いことが観察された。MYH6(α-MHC)発現において条件間での有意差はなかったが、MYH7(β-MHC)発現は「B」及び「C」条件の両方について有意に高かった。MYH7/MYH6の比は、心臓マイクロワイヤーにおいて「A」以外のすべての条件について増加することが見出された。
【０２３６】
前述の遺伝子発現結果は、成熟レベルの最大の増加が、CM75%及びFB25%から構成されるCMWにおいて生じたことを示し、成人様組織を生成する第1の工程には、同様の組成比を有する心臓組織コンストラクトが含まれうることを示唆する。上述のように、他の組成比、たとえばCMおよそ55〜95%及び非CM細胞5〜45%がまた、成熟(又は健常心臓機能)と関連付けられる特性も示す心臓組織コンストラクトを生成するために選択されうる。
【０２３７】
心臓マイクロワイヤーを使用したハイコンテントスクリーニング
上述のように、本開示のいくつかの実施形態は、ハイコンテントスクリーニングにおける用途によく適していてもよい。実施の一例において、スクリーニングプラットフォームは、1つ以上の心臓微小組織を各ウェル内に有する96ウェルプレートフットプリントを用いうる(いくつかの実施において、1ウェル当たり2つ以上の心臓組織コンストラクトを含むことが有用又は有益でありうる)。いくつかの実施において、細胞は、廃棄細胞が限定されるように播種されうる。
【０２３８】
CMWからの測定可能なアウトプットは、電気生理学的測定、収縮力測定を、たとえば共焦点顕微鏡で捉えられうる一般的な免疫染色アウトプットと共に含む。
【０２３９】
加えて、スクリーニング中に分泌される因子を観察するために、培地試料(細胞馴化培地の上清)が得られうる。一般に、本開示の実施形態は、従来のプラットフォームには見出されない複数のアウトプット(タンパク質発現、収縮力、伝導速度、興奮閾値、最大捕捉率、活動電位持続時間、収縮率、収縮持続時間、遺伝子発現及び分泌可溶性因子)を有する真のHCSプラットフォームを提供し、一方で必要とされる細胞数は低いままであり、従来の単層プラットフォームの細胞数と同様である(1組織/ウェル当たり細胞25,000〜100,000個であり、96ウェルプレート1つ当たり細胞約2.5×106〜10×106個ということになる)。
【０２４０】
スクリーニング用途の実施の一例において、播種はマルチチャネルピペットで実施できる。心臓組織コンストラクトの細胞組成の相対濃度は、健常ヒト心臓の挙動を模倣するのに好適であると見出されるのと類似した条件に選択できる(たとえば、CMおよそ75%及び非CM25%、又は上述の他の好適な比等)。組織は、好適な持続時間、たとえば1週間(数日後から始めて、電気刺激有り又はなしで)リモデルさせられる。最後に、リモデリング後(たとえば7日後)に試験因子が適用され、効果を生じさせられると考えられる。アッセイは、好適な時間後、たとえば4日後に行われる。ベースラインの読みを決定し、化合物を適用し、次に組織応答における変化を測定することにより、化合物の即効もまた試験できる。生存細胞測定を行った後、組織を固定し、透過処理し、画像化のため免疫染色することができる。馴化培地試料もまた、分泌因子解析のために毎日採取できる。たとえば、ANF、BNP、又はcTnTのレベルを、心臓疾患のバイオマーカーとして検出できる。プロセス全体(播種及び画像化の両方)が、系をロボットハンドラーに適合させることにより自動化されうる。
【０２４１】
（実施例）
[実施例1]
材料及び方法
以下の実施例は、当業者が本開示の実施形態を理解及び実施することを可能にするために提示される。それらは、本実施形態の範囲の限定と考えられるべきでなく、単にその例示で代表にすぎないと考えられるべきである。
【０２４２】
コラーゲン付着スライドの原子間力顕微鏡検査
データをNanoscope IIIA Bioscope AFM上に収集した。駆動周波数約320KHzでTESPカンチレバーを使用して空気中でのタッピングモード画像化を使用し、1Hzのスキャン速度(512×512画素画像として)でNanoscopeソフトウェアバージョン5.30Aを使用した。
【０２４３】
コラーゲン付着ガラス基材の調製及び播種
FibrAling Corporationの協力者から、把持する側にコーティングされていないガラス境界を有する試験管にロードされた試料を受領した。清浄なピンセット/鉗子を使用して、最上部の把持する側の端よりガラスチップを除去した。光反射率を使用してコラーゲンコーティングされている側を選択し、ガラスチップを滅菌組織培養プレートに置き、原線維(コーティング)方向はコラーゲン-ガラス境界と平行とメモ書きをする。
【０２４４】
ガラスチップをダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)中に20秒間浸す(Sigma D8537)。次にそれらをすぐにDI水中で、やさしく回転する動きを使用しながら5〜10秒間すすぐ。次にそれらを、清浄で乾燥した窒素又は空気でやさしくブロー乾燥し、次に70%エタノールに最小限1時間浸漬して滅菌する。試料をDPBSですすいだ後、スライドガラスを細胞で播種する前に培養培地中に15分間静置しておく。細胞を培養培地中に所望の密度で懸濁させ、組織培養プレート内のスライドガラス上にピペットする。培養物を新しい培地に交換する前に、2日間細胞を接着させる。
【０２４５】
ラット新生仔心筋細胞の単離
ラット新生仔心筋細胞を以前に報告されたとおり単離した(Denglerら、2011年)。簡潔に述べると、トロント大学動物ケア委員会により承認されたプロトコルを使用して、生後1から2日の新生仔Sprague Dawleyラットから心臓を単離した。およそ13匹/同腹仔のうちの1から2同腹仔のラット心臓を無菌で切除し、冷たいハンクス液(HBSS、Sigma)中に置き、複数回HBSSで洗浄し、四等分した。
【０２４６】
次に、四等分した心臓を、一晩4℃で、オービタルシェーカー(Labent Orbit LS、Mandel)上のHBSS中のトリプシン(Gibco)0.06%w/v溶液中で、50RPMでインキュベートした。14〜16時間後、心筋細胞培養培地(10%胎仔ウシ血清(FBS、Gibco)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco)及び1%N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-2-エタンスルホン酸(HEPES、Gibco)を添加した、L-グルタミン(Gibco)を有する高グルコース[4.5g/L]ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM))で心臓を洗浄し、HBSS中のII型コラゲナーゼ(Worthington)の0.1%(w/v)溶液中で一連の5回の消化(8分、37℃、70rpm)にかけた。各消化物の上清を回収し、遠心し(5分、750 rpm)、心筋細胞培地中に再懸濁した。細胞を組織培養ポリスチレン(TCP)T75フラスコ(BD Flacon)上に60分間事前にプレートし、心筋細胞(非接着細胞)を濃縮する。上清を回収し、トリパンブルー(Gibco)排除を介して細胞数を決定した。
【０２４７】
ヒト胚性幹細胞の心臓分化
ヒト胚性幹細胞の心臓分化を以前報告されているとおり実施した(Celine L Bauwensら、2011年)。本研究において、HES2(ES Cell International)hESC株を使用した。hESCを維持し、以前記載のとおり拡張した[23]。簡潔に述べると、HES2細胞をマウス胚フィーダー(MEF)上で6日間、HES2維持培地(80% DMEM/F12、20%KOSR、bFGF20ng/mL、0.5%P/S、1%NEAA、1%BME)中で継代接種(5回まで)し、培地は毎日交換した。細胞を37℃で5.0%CO2大気中に酸素正常状態で維持する。次に、細胞をMEFと共にトリプシン処理し、Matrigel(商標)(1:30で希釈)コーティングされたプレート上に1:3の分割比でMEF枯渇のためプレートした。MEF枯渇の2日後、HES2細胞を再びトリプシン処理し、インハウスで製造されたAggreWells中に播種し、hEBを形成した。シリコンマスター鋳型から鋳造した400μmマイクロウェルPDMSインサートを使用してhEBを生成した。インサートを切断し、24ウェル組織培養プレート中に接着し、次にエタノールを使用して滅菌した。次にマイクロウェルを5%Pluronic(商標)酸で少なくとも1時間コーティングし、細胞播種前にPBSで洗浄した。
【０２４８】
次に、基本培地及びROCK阻害剤Y-27632を添加されたT0サイトカインを含有する凝集培地の単一細胞懸濁液を、ウェル内に播種し、200gで遠心した後に一晩凝集させた。細胞を37℃で5.0%CO2及び5.0%O2大気中に低酸素状態で維持する。24時間後、hEBを形成し、凝集培地をT1培地と交換した。第4日に、hEBをAggreWellsから取り出し、低クラスター6ウェルプレート(NUNC)中に置いた。T4、T8、T12に対応する培地を新たに作り、交換した。T12で、細胞を37℃で5.0%CO2大気中の酸素正常状態に戻した。培地を以後8日毎に交換した。
【０２４９】
心臓微小組織の生成、培養、及び画像化
コラーゲンマスターミックス中に懸濁されたラット新生仔心筋細胞又はhESC由来心筋細胞を、0.5×106細胞/mLの密度で心臓微小組織ウェル中に播種した。マイクロウェル基材をエタノールで滅菌し、洗浄し、5%Pluronic(商標)酸で少なくともそれぞれ1時間コーティングすることにより調製した。コーティング中、ラット新生仔心筋細胞及び/又はhESC由来心筋細胞を調製する。hESC-心筋細胞分化からの凝集体を、インキュベーター内でDNAseと共にコラゲナーゼ中に1時間置く。次に凝集体をDNAseと共に0.25%トリプシン中に5〜10分間浸漬する。次に、凝集体をSTOP溶液(50%FBS及び50%DMEM F12)中に浸漬し、20ゲージシリンジで10回粉砕する。凝集体が単一細胞になったら、それらをSTAIN溶液(10%FBS及び90%DMEM F12)中に浸漬し、計数する。コラーゲンマスターミックスを以下のものを組み合わせることにより調製する。すなわち、所望のコラーゲン濃度のための適切な比の10×M199(GIBCO)、Glutamax(GIBCO)、コラーゲン1(3.66mg/mL)(BD)、グルコース(0.3g/mL)(GIBCO)、NaOH(SIGMA)、NaHCO3(0.075g/mL)(SIGMA)、ヘペス(GIBCO)、GFR Matrigel(商標)(BD)、ddH20。コラーゲンマスターミックスは、絶えず氷上で摂氏4度未満に保たれ、未成熟架橋を防止する。最後に、500μLのマスターミックスを(24ウェルプレートの)各ウェル内にピペットし、高速(300g)で遠心し、泡沫を除去する。氷冷温度で遠心を維持する。細胞含有コラーゲン(追加の1ウェル当たり250μL)を調製し、ウェル内にピペット/混合し、1ウェル当たり細胞500,000個の最終細胞密度をもたらす(各ウェルの最終容積は750μLであるべきである)。プレート全体を遠心し(200g)、細胞をマイクロウェルのくぼみの中に入れる。注意深くゆっくりと各ウェルの過剰な細胞含有コラーゲンを吸引し、各マイクロウェルに細胞含有コラーゲンのポケットを残す。酸素正常状態のインキュベーターに15分間プレート全体を置く。15分後、1mLの細胞培養培地を、重合コラーゲン微小組織を撹乱しないようにゆっくりと添加する。培地を4日毎に交換する。微小組織は、インプット細胞組成に応じて1〜3日の間にリモデルするはずである。微小組織の画像化はインサイチューでなされうる。試料もまた、マイクロウェル内で固定、透過処理及び染色し、蛍光顕微鏡を使用して画像化することができる。
【０２５０】
心臓マイクロワイヤーの電気刺激及び機能解析
電気点刺激のため、マイクロウェルに0.005''白金ワイヤー(純度99.99%、A-M Systems Inc.)が埋め込まれ、市販の刺激装置(Model S88X Grass、Astro-Med(登録商標) Inc.)につながれた。電気刺激なしで培養72時間後、刺激すべき微小組織を2相の矩形波パルス、持続時間1ms、6Vの閾値振幅(6V/cmの場強度)及び1Hzの周波数で、培養の残り期間(4日間)刺激した。刺激電圧は、同時コンストラクト収縮を誘導するよう選択された。コンストラクトは、PDMS基材内に置かれた。0.1mmステンレス鋼Minutiensピン(Austerlitz)を、微小組織が滑り出さないことを保証するために使用した。
【０２５１】
興奮閾値(ET)、組織を同時にペーシングするのに必要な最小電位、及び最大捕捉率(MCR)、コンストラクトが同時に拍動するよう誘導できる最大刺激率を、細胞播種後第7日に測定することにより、組織機能を確立した。組織コンストラクト又は心筋細胞凝集体を個別に、刺激チャンバー内の一対の炭素電極(使用前にオートクレーブした)の間に置いた。2msパルス幅の矩形波パルスで1又は2Hzの周波数で組織を刺激することによりET(V/cm)を測定し、>80%の組織が刺激装置アウトプットと同調して拍動するまで刺激装置のアウトプット電圧を徐々に増加させた。アウトプット電圧を12Vに設定することによりMCRを測定し、>80%の組織が駆動シグナルともはや同調して拍動しなくなるまで周波数を増加させた。すべての測定は、37℃の温度で維持され、Retigaカメラ(QImaging)を備えた環境チャンバー(SolentScientific)に内蔵のOlympus 1X2-UCB反転蛍光顕微鏡を使用して行った。
【０２５２】
フローサイトメトリー
コラゲナーゼ処理及びトリプシンを使用して凝集体を分離し、すぐに4%パラホルムアルデヒド(PFA)で一晩、摂氏4度で固定する。次に、それらを室温で100%メタノールで2分間透過処理する。2%HF洗浄後に一次抗体を添加する。次にそれを室温で20分間インキュベートする。次に、試料をHFで洗浄し、さらに20分間、室温で二次抗体を添加する。最後に、試料を再び洗浄し、フローサイトメトリー解析の準備が整う。フローサイトメーターでの測定前は、試料を常に氷上に保った。
【０２５３】
心臓マイクロワイヤーの免疫染色及び画像解析
微小組織をPBSで洗浄し、24時間4% PFAで摂氏4度で固定した。次にそれらをブロッキング溶液中の0.1%Triton X(Normal Donkey Serum)中で透過処理した。次に、一次抗体を3日間、摂氏4度で添加した。最後に、微小組織を3回洗浄し、適切な二次抗体(AlexaFluorシリーズ)及び核染色のためのDAPIで、1日間一晩冷蔵庫内で染色した。各インキュベーション工程を、ロッカーテーブル上で実施した。画像化の前に、試料を3回洗浄し、2%HF中に再懸濁した。共焦点顕微鏡検査(FV1000レーザースキャニング共焦点、Olympus)を使用して試料を画像化した。すべての画像解析は、ImageJにビルトインされているカスタムマクロを使用して行った(細胞アラインメント及び伸長解析、及び総細胞マーカー発現計数)。
【０２５４】
心臓マイクロワイヤーの光学マッピング
光学的測定のため、微小組織を5mMのDi-4-ANEPPS(Invitrogen、Carlsbad California)電位感受性色素で20分間染色し、その後pH7.4に調節された新鮮で温かいタイロード液(Sigma-Aldrich)で3回洗浄した。ブロックインキュベーターを使用して温度を37℃で一定に維持した。顕微鏡マッピングシステム(Ultima、Scimedia、Tokyo Japan)を使用して色素蛍光を記録した。このシステムは、PLAN APO対物及び集光レンズ(Leica Microsystems GmbH、Wetzlar Germany)を使用するカスタムビルト顕微鏡に接続された1cmセンサー(100×100画素)を備えるCMOSカメラを含んでいたのであり、1.5倍の倍率を与える。空間分解能は63μm/画素だった。蛍光はキセノン光源(Moritek Corp. Japan)及び530nm緑色フィルター(Semrock, Rochester NY)を使用して励起され、発光シグナルは610nm赤色フィルターを使用してロングパスフィルターされた。組織コンストラクトを、1000-msサイクル長で、マイクロマニピュレーター上にマウントされた大きなステンレス鋼ニードルに挿入された2つの純銀ワイヤー(AWG#32)で作られた双極電極を使用して点刺激した。1から5Hzの周波数掃引に対する応答に加えて、自発性組織拍動もまた記録した。各画素についてdF/dTのピークで局所的活性化時間を測定した。選択された拍動について活性化マップを構築した。
【０２５５】
9つの隣接部位の活性化時間を使用して各位置で伝導速度を算出した。すべての部位からの伝導速度値をコンストラクト表面全体の平均伝導速度を算出するために使用した。最小及び最大値もまた記録した。光学マッピング前に微小組織表面の位相差画像を撮影し、組織構築物ジオメトリーを伝導速度と相関させた。使用された薬剤の濃度を示したように適用した。保存溶液をベンダーに推奨されているとおり調製した。すなわち、エピネフリン1:1000(Hospira)、リドカイン1:1000(Hospira)、及びベラパミル1:1000(Sandoz)。
【０２５６】
[実施例2]
マイクロウェルベースの傾斜した底部を有する微小組織プラットフォーム内に形成される組織コンストラクトの実験研究
マウス筋芽細胞を使用した組織厚、均一性、リモデリング時間及び組織生存率の研究
C2C12と呼ばれるマウス筋芽細胞株を使用して、以下のパラメータを研究した。すなわち、組織厚均一性、リモデリング時間及び組織の生存率。C2C12細胞株を使用する理由は、それらが比較的速く増殖し、また、電気刺激に応答する収縮性筋管へと分化する能力を有するからである。C2C12細胞株のよりよい理解を得るため、3つの別個の培養物を4日間毎日数えた。結果を図28に示す。
【０２５７】
6つの異なる濃度の40μLの細胞/コラーゲンマトリックスを播種することにより、リモデリング時間及び組織厚均一性を3日間マッピングした。図29の表は、6つの異なる細胞/コラーゲンマトリックス条件を概括する。図30に示される表において、平均厚からの最も大きな偏差は、パーセンテージ値で毎日各条件において報告される。
【０２５８】
図30に示される表から、すべての条件における組織均一性が、平均から有意なレベルで逸脱していないようであることが明らかである。異なる見方を提供するため、第1日の測定値についてプロットを作り上げ、各条件のすべての4つの隅について厚みプロットし、図31に示す。
【０２５９】
異なる条件についての組織のリモデリング時間がまた研究され、データを下の図32に示す。一般に、より低いコラーゲン濃度及びより高い細胞密度がより速いリモデリング時間をもたらした。
【０２６０】
加えて、組織内の細胞が生存していたかどうか、もし生存していたなら、どれだけ長くかを評価する研究を実施した。各条件について第1日及び第2日に生存/死滅染色を実施した。画像を下の図33(a)及び(b)に示し、これらは(a)生存及び(b)死滅染色画像を示す。
【０２６１】
図33に示される画像から、有意な細胞死が第1日と第2日との間で生じたことは明らかである。理論により限定されることを意図しないが、これが起こったのは、組織が300マイクロメートル超の厚みであり、したがって栄養分の適切な拡散を組織全体にできず、細胞死をもたらしたからであるという仮説が立てられる。この問題を克服するための潜在的解決策の1つは、各ウェル内に播種される細胞の量を減少させることである(非常に速い速度で増殖するC2C12細胞が使用されており、それゆえ細胞の過密に貢献することに留意すべきである)。
【０２６２】
成長因子の成熟効果を決定するために、予備スクリーニングもまた実施した。7つの成長因子(図34の表に列挙)の2つの電気生理学的パラメータ(ET及びMCR)に対する効果を試験した。これらの研究の結果を図35に示す。IGF1及びHRGがETを対照条件と比較して減少させることが観察された。インビトロモデルの有するより高いレベルの関数値に伴う課題は、作用機序を決定するためにさらなる解析がなされる必要がある点である。IGF1及びHRGの機構を決定するために、経時的な他の関数パラメータが分子値と共に研究される。
【０２６３】
図36(a)及び(b)に示されるように、円形状基材を使用して不整脈モデルを作り出すことができる。目的は、インビトロ瘢痕形成を模倣することにより頻拍を模倣することであった。以前と同じように細胞を播種し、リモデルさせてリング状組織を作り出した。評価により、リングを旋回する活性化伝播の自発性無限ループ様サイクルが明らかになった。1サイクルを示す。シグナルトレーシングは、複数のサイクルを示す。(E)CMWcircにおいて除細動後に正常リズムが観察された。CMW円形ジオメトリーにおいて不整脈を除細動して正常なリズムにするために、10Vの電場刺激を使用した。シグナルトレーシングは、複数のサイクルを示す。青色の初発部位(I*)は、活動電位伝播の出発位置を示し、青色の終了部位(T*)は、活動電位伝播の最終位置を示す。
【０２６４】
心臓マイクロリング系での収縮力の測定-薬剤応答
本実施例において、その上に設けられている保持構造を有する傾斜支持構造を有するマイクロウェルは、上述のように、2.0mg/mLのコラーゲン1中の1組織当たり細胞0.1×106個で播種される。組織は、2週間、系においてマイクロカンチレバーを使用して測定される収縮力と共にリモデルした。2週間後、組織に100%DMSO媒体中の薬剤を導入した。組織に適用される最終濃縮物は、非毒性効果を保証するため、0.01%DMSO未満であることが保証された。濃縮物は、96ウェルプレート中に別々に混合し、組織に適用した。測定を、薬剤を伴う摂氏37度での15分のインキュベーション後に行った。
【０２６５】
図37及び38は、最大収縮力対照(図37)又は非薬剤対照(図38)に対する、測定された相対収縮力(相対倍数変化)を示す。およそ10秒のビデオを記録し、オフラインでImageJを使用して各条件について解析した。図37に見られるように、収縮力が2週間で増加し、およそ1.5週で変化が止まることが観察された。収縮力アッセイは、組織リモデリングによる収縮力の変化がないことを保証するため、収縮力の変化が止まった後に実施した。図38に示すように、ニフェジピン及びテルフェナジンが、濃度の増加と共に(対照に対して)収縮力を減少させることが観察された。
【０２６６】
[実施例3]
96ウェル組織マイクロファブリケーション系の例示的設計
本実施例は、96ウェル組織培養プレートと、図22(b)〜(d)に示される傾斜支持体実施形態に基づく各ウェルの底面の特定の設計の態様を一つのものにする例示的設計を提供する(例示的直径はおよそ5.0〜8.0mmに等しく、深さはおよそ9.0〜14.0mmに等しい)。この特定の設計は、中心部の円錐(底部直径およそ2.0〜3.0mmに等しく、及び最上部直径およそ1.0〜2.0mm及び高さおよそ0.5〜2.0mm)を有するくぼんだウェル(たとえば、直径およそ3.0〜6.0mm、深さおよそ0.5〜2.0mm)を包含する。円錐の最上部には、(中心から中心まで)2mm離れた2つの円柱状のポスト(直径およそ0.1〜0.6mm)がある。
【０２６７】
上述のように、円錐の目的は、リモデリング組織に支持を提供すると共に、ポストの底部へ組織を補助することである。この円錐は、組織がポスト間で融合するのを防止し、したがってリング状組織が形成される。
【０２６８】
いくつかの例示的実施形態において、ポストは、高さおよそ1.8〜2.2mmを有しうる一方で、他の実施形態において、高さ1.25〜1.8mmを有しうる。別の例示的実施形態において、ポストは高さおよそ0.5〜1.0mmを有しうるのであり、各ポストは、外側に面した安定化突起(たとえば、底面が長方形の角柱、たとえば、高さ0.3mm、長さ0.5mm、幅0.3mmにおよそ等しい寸法を有する)を有しうる。後者の設計は、組織コンストラクトのさらなる移動を阻害し、組織コンストラクトが保持構造の最上部を越えることができないようにするフック機構を提供する、安定化フィーチャの存在により有利でありうる。高いポストもまた、組織収縮中のポスト偏向の増幅法として役立つ。
【０２６９】
ポストは、組織リモデリング中に検出可能なレベルで変形が生じるように製造されてもよい。上述のように、ポストの好適な特性及び寸法を選択するために、ポストの機械的モデルを用いることができる。
【０２７０】
上述の特定の実施形態は、例として示されたものであり、これらの実施形態は、様々な修正及び代替的形態を容易に受け付けうることが理解されるべきである。特許請求の範囲は、開示される特定の形態に限定されることを意図しておらず、むしろ、本開示の趣旨及び範囲内に収まるすべての修正、均等物及び代替物を包含することを意図することがさらに理解されるべきである。
【０２７１】
参考文献
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【符号の説明】
【０２７２】
200  マイクロウェル
210  ポスト
220  保持構造
225  局所的突起
230  底部
235  遠位端
240  保持構造
245  溝(又はノッチ)
250  保持構造
255  傾斜
260  突起
270  保持構造
275  下部傾斜部
280  上部傾斜部
285  最小位置
300  保持構造
305  傾斜部
310  遠位部
315  キャップ
320  保持構造
325  突起
330  偏向後増幅延長部
400  微小組織コンストラクト
410  第1のポスト
415  突起
420  第2のポスト
425  突起
430  電極
440  溝
445  突起
450  突起
455  突起
460  突起
465  溝
470  保持構造
475  突起
480  保持構造
485  突起
490  傾斜
500  マイクロファブリケーションプラットフォーム
510  マイクロウェル
520  マイクロカンチレバー保持構造
525  安定化フィーチャ
530  マイクロカンチレバー保持構造
535  安定化フィーチャ
550  保持フィーチャ
555  保持フィーチャ
560  ポスト
565  ポスト
570  ポスト
575  ポスト
600  第1の播種混合物
610  第1の組織コンストラクト
620  第2の播種混合物
630  第2の組織コンストラクト
700  マイクロウェル
705  ウェルの底(底部)
710  円錐台状支持体
712  円錐状/傾斜した表面
714  上部プラットフォーム
715  保持構造
724  下部壁部
725  領域
726  上部壁部
750  第1のタイプの細胞を含む組織コンストラクト
【図１（ａ）】
2016504022.tif 000073
【図１（ｂ）】
2016504022.tif 000074
【図１（ｃ）】
2016504022.tif 000075
【図１（ｄ）】
2016504022.tif 000076
【図１（ｅ）】
2016504022.tif 000077
【図１（ｆ）】
2016504022.tif 000078
【図１（ｇ）】
2016504022.tif 000079
【図１（ｈ）】
2016504022.tif 000080
【図２（ａ）−（ｂ）】
2016504022.tif 000081
【図２（ｃ）−（ｄ）】
2016504022.tif 000082
【図２（ｅ）】
2016504022.tif 000083
【図２（ｆ）】
2016504022.tif 000084
【図２（ｇ）】
2016504022.tif 000085
【図３（ａ）】
2016504022.tif 000086
【図３（ｂ）−（ｃ）】
2016504022.tif 000087
【図３（ｄ）】
2016504022.tif 000088
【図３（ｅ）】
2016504022.tif 000089
【図３（ｆ）】
2016504022.tif 000090
【図４（ａ）−（ｂ）】
2016504022.tif 000091
【図４（ｃ）−（ｄ）】
2016504022.tif 000092
【図４（ｅ）−（ｆ）】
2016504022.tif 000093
【図４（ｇ）−（ｈ）】
2016504022.tif 000094
【図４（ｉ）−（ｊ）】
2016504022.tif 000095
【図４（ｋ）−（ｌ）】
2016504022.tif 000096
【図５】
2016504022.tif 000097
【図６（ａ）】
2016504022.tif 000098
【図６（ｂ）−（ｃ）】
2016504022.tif 000099
【図６（ｄ）−（ｅ）】
2016504022.tif 000100
【図６（ｆ）】
2016504022.tif 000101
【図６（ｇ）】
2016504022.tif 000102
【図６（ｈ）】
2016504022.tif 000103
【図６（ｉ）】
2016504022.tif 000104
【図６（ｊ）】
2016504022.tif 000105
【図７（ａ）−（ｂ）】
2016504022.tif 000106
【図７（ｃ）−（ｄ）】
2016504022.tif 000107
【図７（ｅ）−（ｆ）】
2016504022.tif 000108
【図７（ｇ）−（ｈ）】
2016504022.tif 000109
【図８（ａ）−（ｂ）】
2016504022.tif 000110
【図８（ｃ）−（ｄ）】
2016504022.tif 000111
【図８（ｅ）−（ｆ）】
2016504022.tif 000112
【図８（ｇ）−（ｈ）】
2016504022.tif 000113
【図９（ａ）−（ｂ）】
2016504022.tif 000114
【図９（ｃ）−（ｄ）】
2016504022.tif 000115
【図９（ｅ）−（ｆ）】
2016504022.tif 000116
【図１０（ａ）−（ｂ）】
2016504022.tif 000117
【図１０（ｃ）−（ｄ）】
2016504022.tif 000118
【図１０（ｅ）−（ｆ）】
2016504022.tif 000119
【図１１（ａ）】
2016504022.tif 000120
【図１１（ｂ）−（ｃ）】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２（ａ）】
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【図２２（ｂ）−（ｃ）】
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【図２２（ｄ）】
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【図２２（ｅ）】
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【図２２（ｆ）−（ｇ）】
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【図２２（ｈ）−（ｉ）】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６（ａ）】
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【図２６（ｂ）】
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【図２６（ｃ）】
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【図２６（ｄ）】
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【図２７（ａ）】
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【図２７（ｂ）−（ｃ）】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３（ａ）】
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【図３３（ｂ）】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【国際調査報告】
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