(57)【要約】本発明は、成分又は生理活性物質の捕捉に適合させたミリメートルスケールの大きさを有するハイブリッドシリカビーズであって、ハイブリッドアルギン酸シリカを含む多孔性のコア（１）、並びにシリカ及びシリカ濃縮剤を含む外側の多孔性層（２）から形成されるビーズに関する。本発明はまた、これらのハイブリッドビーズの調製のためのワンポット法、及び本発明によるビーズの使用に関する。
2016528883.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性物質を捕捉する、ミリメートルスケールの大きさを有するビーズであって、
−  細胞、細胞オルガネラ、酵素、薬物、プロドラッグ、又はその混合物からなる群から選択される生理活性物質、
−  多孔性のコア、及び
−  多孔性のシェル
を含み、多孔性のコアは、ハイブリッドアルギン酸シリカ（１）を含み、多孔性シェルは、シリカ及びシリカ濃縮剤（２）を含むビーズ。
【請求項２】
シリカ濃縮剤（２）が、長鎖ポリアミンである、請求項１記載のハイブリッドアルギン酸−シリカビーズ。
【請求項３】
シリカ濃縮剤（２）が、ポリカチオンＰＤＡＤＭＡＣである、請求項２記載のハイブリッドアルギン酸−シリカビーズ。
【請求項４】
外側の多孔性層が、その大きさが１nm〜５００nmの間である孔を含む、上記請求項１〜３のいずれか一項記載のハイブリッドアルギン酸−シリカビーズ。
【請求項５】
外側の多孔性層の厚さが、１μm〜１０μmの間である、上記請求項１〜４のいずれか一項記載のハイブリッドアルギン酸−シリカビーズ。
【請求項６】
ハイブリッドアルギン酸カルシウム−シリカ（３）の中間層が、コア及び多孔性シェルの間に形成される、上記請求項１〜５のいずれか一項記載のハイブリッドアルギン酸−シリカビーズ。
【請求項７】
細胞が、光合成的に活性な細胞（微細藻類など）、細菌、動物細胞、又は真菌（酵母細胞を含む）からなる群から選択される、上記請求項１〜６のいずれか一項記載のハイブリッドアルギン酸−シリカビーズ。
【請求項８】
上記請求項１〜７のいずれか一項記載のハイブリッドアルギン酸−シリカビーズの調製方法であって、
−  １又はそれ以上のシリカ前駆体、及びアルギン酸溶液（溶液のpHは、２〜１０の間である）、及び該ビーズに被包される生理活性物質と混合する工程；
−  混合物を、シリカ濃縮剤の水溶液に滴下する工程；
−  得られたビーズを１分〜２４時間の間の期間インキュベーションする工程；
を含む方法。
【請求項９】
シリカ濃縮剤が、長鎖ポリアミンである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
長鎖ポリアミンが、ポリカチオンＰＤＡＤＭＡＣである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
シリカ濃縮剤の水溶液が、更にカチオン塩、好ましくはＣａＣｌ２を含む、上記請求項８〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
シリカ前駆体が、ポリケイ酸（Ｈ２ＳｉＯ３）ｎ、トリメトキシメチルシラン、ジメトキシジメチルシラン、オルモシル（有機改質シリカ）、テトラメトキシシラン（ＴＭＯＳ）、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）、ジグリセリラン（ＤＧＳ）、及びケイ酸ナトリウム（Ｎａ２ＳｉＯ３）、又はその混合物からなる群から選択される、上記請求項８〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
シリカ前駆体の濃度が、０．１M〜２Mの間である、上記請求項８〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
シリカコロイド、シリカ補助前駆体（co-precursor）、又はシリカのナノ粒子からなる群から選択される添加剤が、シリカ前駆体溶液に添加される、上記請求項８〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
上記請求項１〜７のいずれか一項記載のビーズ、又は上記請求項８〜１４のいずれか一項記載の方法により得られたビーズの、
−  目的の分子の生産のためのバイオリアクターにおける、
−  ヒトを含む動物の生きている器官における目的の分子の送達における、又は
−  精製及び／又は分離方法及び装置、好ましくはクロマトグラフ用カラムにおける、
使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリッドアルギン酸シリカビーズ、及びそれらハイブリッドビーズの調製のためのワンポット法に関する。
【０００２】
本発明はまた、本発明によるビーズの使用にも関する。本発明のビーズは、広範囲の分野、例えばバイオリアクター、生体触媒、バイオセンサー、クロマトカラムなどにおける生物学的に活性な実体の捕捉のために用いられる。特に、本発明による新規ビーズは、酵素、チラコイドなどのオルガネラ、液胞、葉緑体、小胞の捕捉、又は微細藻類、細菌、酵母、動物若しくは植物細胞などの細胞全体の捕捉に用いられる。このような捕捉は、カロテノイド、ホルモン、タンパク質、（加工された）プロドラッグなどの高価値の代謝物又はそれらの混合物を生産することを目的とする。
【０００３】
技術水準
アルギン酸カルシウムカプセルは、アルギン酸ナトリウム溶液を、塩化カルシウム水溶液に押し出すことにより容易に合成することができ、捕捉された生きている微生物の生物学的活性を維持することができる。しかし、これらのアルギン酸カルシウムカプセルは、機械的安定性をほとんど示さない。アルギン酸は、捕捉された成分（その後放出されることができ、外部の媒質中で増殖しうる生きている細胞を含む）を経時的に漏出する膨潤性の成分であることが知られている。実際、ビーズ容積全体で破断が観察され、カプセルの強度は、表面からコアへと低下していく。したがって、アルギン酸カプセルは、生きている細胞を含む成分のカプセル封入のための適当なホストマトリックスではないように考えられよう。
【０００４】
限られた機械的耐性を示すハイブリッドアルギン酸シリカカプセルの合成は、既に報告されている。最も多い方法は、多工程法又は多層法（layer-by-layer process）のいずれかを含む。２工程法によるハイブリッドアルギン酸シリカミネラル化ビーズの合成は、Dandoy et al. (P. Dandoy, C. F. Meunier, C. Michiels, B.-L. Su, Plos One, 2011, 6, 1-12)によって開示されている。２層、すなわちアルギン酸シリカ複合コア及びＣａ−アルギン酸層から構成される得られたビーズは、活性な哺乳動物細胞を捕捉するために使用される。しかし、シリカの溶解は、経時的に起こる現象であり、外部媒体へのビーズ内容物の放出をもたらす。
【０００５】
特許出願FR 2842438 A1には、架橋ミネラルマトリックスを含むビーズを調製する方法が開示されている。この方法は、ゾルゲル法によるアルミナ又はシリカに基づくミリメートルスケールのビーズの調製に適している。これらのビーズの製造には、無機マトリックスの前駆体とアルギン酸を含む懸濁液を、pH３未満の多価カチオン塩の溶液に滴下により注ぐことによりゲル化したビーズを調製する工程が含まれる。多価カチオンと媒質の酸性度の変動の作用が組み合わさって、アルギン酸のゲル化と、滴が「ソフト」ビーズとして凝結することに寄与する。したがって、ミネラルマトリックスは、ビーズ全体に均質に分布する。しかし、Dandoy et al (2011)が観察したように、シリカの溶解は、調製されたこれらのハイブリッドアルギン酸シリカビーズにおいて経時的に起こる。
【０００６】
Chen et al. (Process biochemistry vol 42, No. 6, pp.934-942, 2007)は、アゾ染料（反応性Red 22）の脱色のための、Pseudomonus Puteola細胞を含むアルギン酸ケイ酸ビーズを開示している。これらのビーズは、改善された機械的安定性を有するマクロ多孔性(macroporous)アルギン酸ケイ酸コアを被覆した高密度のケイ酸ゲル層から作られている。
【０００７】
Coradin et al. (Applied microbiology and biotechnology, Vol. 61, No. 5-6, pp. 429-434, 2003)は、シリカ−アルギン酸複合体ミクロカプセルが示す膜特性の最適化により、それらの機械的、温度的、及び拡散特性が増強されうることを開示している。
【０００８】
US 4,797,358は、アルギン酸及びシリカゾルの混合物による微生物又は酵素の固定を開示している。この混合物を、水溶液の形のゲル化剤と接触させて、この微生物又は酵素を含むゲルを得る。
【０００９】
Lu et al (Catalysis today, Vol. 115, No. 1-4, pp. 263 - 268, 2006)は、アルギン酸シリカハイブリッドゲル及びアルギン酸シリカゲルビーズに被包された酵素を開示している。
【００１０】
本発明の目的
本発明の主な目的は、新規なハイブリッドアルギン酸シリカビーズ、及びそれらを得るための方法を提供することであり、いずれも技術水準の欠点を示すものではない。
【００１１】
特に本発明は、新規で、好ましくは透明であり、好ましくは球形のビーズ、更にはそれらを得るための簡単で、環境に優しく、効率の良いワンポット法を提供することを目的とし、これらのビーズは、良好な機械的及び化学的安定性特徴を有し、シリカ種の溶解速度は、経時的に低下し、又は防止されている。
【００１２】
本発明の更なる目的は、各種分野、特に酵素などの成分又は生理活性物質、チラコイドなどの細胞オルガネラ、液胞、葉緑体、小胞の捕捉、更には微細藻類、細菌、酵母、植物若しくは動物細胞などの細胞全体の捕捉に用いることができるこのようなビーズを提供することである。
【００１３】
本発明の主な技術的特徴
本発明は、成分又は生理活性物質の捕捉（と、好ましくは包含と）に適合させたミリメートルスケールの大きさを有する（ハイブリッドシリカ）ビーズであって、ここでビーズは、多孔性のコア及び多孔性のシェルを含み、多孔性のコアは、ハイブリッドアルギン酸シリカを含み、外側の多孔性シェルは、シリカ及びシリカ濃縮剤（concentrator）（ポリカチオン性有機ポリマーなど）を含むビーズに関する。
【００１４】
好ましくは、ミリメートルスケールの大きさの直径は、(約)０．５mm〜（約）５mmの範囲である。多孔性シェルの厚さは、好ましくは（約）１μm〜（約）１０μmの間である。シェルは、（約）１nm〜（約）５００nmの範囲の大きさを有する孔を含む。
【００１５】
本発明では、アルギン酸は、褐藻類の細胞壁に広く分布するアニオン性多糖類として定義される。アルギン酸は、それぞれ（１−４）−結合のβ−Ｄ−マンヌロン酸（mannuronate）（Ｍ）及びそのＣ−５エピマーであるα−Ｌ−グルクロン酸（Ｇ）残基のホモポリマーブロックの直鎖状コポリマーである（異なる配列又はブロックで一緒に共有結合している）。化合物であるアルギン酸ナトリウムは、アルギン酸のナトリウム塩である。その実験式は、ＮａＣ６Ｈ７Ｏ６である。アルギン酸ナトリウムは、褐藻類の細胞壁から抽出されるガム状物である。
【００１６】
本発明による（ハイブリッド）ビーズは、１若しくはそれ以上のシリカ前駆体及びアルギン酸溶液を含むハイブリッドゾルの溶解性をシリカ濃縮剤（ポリカチオン性有機ポリマーなど）の添加により低下させることによるコアセルベーション法により調製するのが好都合である。事実、アルギン酸は、テンプレートとして作用し、シリカ濃縮剤は、ケイ酸の濃縮剤としての役割と、ビーズの末端において、シリカ前駆体の加水分解と重縮合を促進する触媒の役割の両方を果たし、それにより多孔性のクラスト（シェル）が形成される。ビーズのコアは、アルギン酸ナトリウム−シリカ複合体から構成されており、そこに酵素などの成分又は生理活性物質、チラコイドなどのオルガネラ、液胞、葉緑体、小胞、又は生きている細胞が被包（捕捉）される。得られるビーズの外側の層（シェル）は、シリカ濃縮剤によって濃縮されたシリカの多孔性層から形成されている。
【００１７】
好ましい態様によると、ハイブリッドシリカビーズは、１又はそれ以上の以下の技術的特徴によって更に限定される：
−  ビーズを調製するために使用されるシリカ前駆体は、ポリケイ酸（Ｈ２ＳｉＯ３）ｎ（好ましくはメタケイ酸Ｈ２ＳｉＯ３）、オルモシル（有機改質シリカ）、水酸化シリカ（silica hydroxide）、シリカアルコキシド（オルトケイ酸テトラメチル（ＴＭＯＳ）、オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）、オルトケイ酸テトラプロピル（ＴＰＯＳ）、オルトケイ酸テトラキス（２−ヒドロキシエチル）（ＥＧＭＳ）、オルトケイ酸テトラキス（２−ヒドロキシプロピル）（ＰＧＭＳ）、及びオルトケイ酸テトラキス（２，３−ジヒドロキシプロピル）（ＧＬＭＳ）など）；ケイ酸塩（ケイ酸ナトリウム（Ｎａ２ＳｉＯ３）、又はケイ酸カリウムなど）、シリカナノ粒子、ソルビチルシラン（sorbitylsilane）、トリメトキシメチルシラン、ジメトキシジメチルシラン、ＴＭＯＳ（テトラメトキシシラン）ＤＧＳ（ジグリセリルシラン）、又はその混合物からなる群から選択される；
−  シリカ濃縮剤は、ポリカチオン性有機ポリマー、好ましくは長鎖ポリアミンであり、好ましくはポリカチオンポリ（ジアリルジメチルアンモニウム）クロリド（ＰＤＡＤＭＡＣ）；スペルミン；コレステリルスペルミン；スペルミジン；スペルミジントリヒドロクロリド；スペルミジンホスファート６水和物；Ｌ−アルギニル−３，４−スペルミジン；１−４−ブタンジアミンＮ−（３−アミノプロピル）−モノヒドロクロリド；プトレシン（１，４−ジアミノ−ブタン）；１，３−ジアミノ−プロパン；１，７−ジアミノ−ヘプタン；１，８−ジアミノ−オクタン；ポリ（アリルアミン）ヒドロクロリド；ポリ（エチレンイミン）；ポリ（Ｎ−メチルエチレンイミン）；ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）；ポリ（２−（ジメチル−アミノ）エチルメタクリラート； キトサン；ポリ（ビニルアミン）ヒドロクロリド；ポリ（プロピレンイミン）；ポリ（Ｎ−メチルプロピレンイミン）；ポリ（アクリルアミド−co−ジアリルジメチルアンモニウム）クロリド；ポリ−Ｌ−リシン；ポリ−Ｌ−アルギニン、及びポリ−Ｌ−ヒスチジン、又はその混合物からなる群から選択される。
−  好ましい長鎖ポリアミンは、ＰＤＡＤＭＡＣである；
−  ビーズの形成において使用されるアルギン酸塩は、アルカリ金属のアルギン酸塩、好ましくはアルギン酸ナトリウムである；
−  （外側の）多孔性シェルは、（約）１〜（約）５００nmの範囲の大きさを有する孔を含む；
−  （外側の）多孔性シェルの厚さは、（約）１〜（約）１０μmの間である；
−  （外側の）多孔性シェルのシリカの含有量は、（約）０．１〜（約）１Mの間、好ましくは（約）０．５〜（約）０．８Mの間である；
−  ハイブリッドアルギン酸カルシウムシリカの中間層は、多孔性コア及び（外側の）多孔性シェルの間に形成される；
−  ビーズに捕捉又は被包される成分又は生理活性物質は、好ましくは細胞、組織、器官、又は生物学的物質（好ましくは、植物又は動物、より好ましくは哺乳動物（ヒトを含む）の細胞、組織又は器官）に対して生理活性作用（治療的、栄養学的（neutraceutic）、化粧的、又は生化学的（同化又は異化）活性など）を有する、あるいは細胞である生物学的又は有機物質であり、好ましくはこの生理活性物質は、酵素、（モノクローナル）抗体、（モノクローナル）抗体の抗原結合部分、ホルモン、ビタミン、活性薬物（すなわち、インスリン）若しくはプロドラッグ、又は細胞全体（微細藻類、細菌、酵母を含む真菌、植物若しくは動物細胞、又は細胞のオルガネラなど）からなる群から選択され、好ましくは光合成的に活性な細胞（微細藻類、又は植物細胞）又はその混合物である。
【００１８】
本発明はまた、本発明による（ハイブリッドシリカ）ビーズの調製のためのワンポット法であって、以下：
−  １又はそれ以上のシリカ前駆体を、アルギン酸溶液（溶液のpHは、（約）２〜（約）１０の間、好ましくは（約）４〜（約）６の間、より好ましくは（約）５である）、及び該ビーズに被包（又は捕捉）される上記で定義した１又はそれ以上の成分又は生理活性物質（好ましくは微細藻類などの細胞）と混合する工程；
−  混合物を、シリカ濃縮剤の水溶液に滴下する工程；
−  得られたビーズを（約）１分〜（約）２４時間の間の期間、好ましくは（約）３０分間〜（約）１８０分間の間の期間、より好ましくは約３時間の期間インキュベーションする工程；
−  可能であれば、得られたビーズを適当な培地に移す工程；
を含む方法に関する。
【００１９】
本発明の方法は、（約）１０℃〜（約）６０℃の間の温度、好ましくは室温で行う。
【００２０】
本発明の方法は、１又はそれ以上の以下の技術的特徴により更に限定されるのが好都合である：
−  シリカ濃縮剤の水溶液は、更にカチオン塩（ＣａＣｌ２など）を含む。カチオン塩の使用により、得られるビーズの光透過性が改善され、その凝結が避けられる。
−  ビーズを調製するために使用されるシリカ前駆体は、好ましくはポリケイ酸（Ｈ２ＳｉＯ３）ｎ（好ましくはメタケイ酸Ｈ２ＳｉＯ３）、オルモシル（有機改質シリカ）、水酸化シリカ、シリカアルコキシド（オルトケイ酸テトラメチル（ＴＭＯＳ）、オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）、オルトケイ酸テトラプロピル（ＴＰＯＳ）、オルトケイ酸テトラキス（２−ヒドロキシエチル）（ＥＧＭＳ）、オルトケイ酸テトラキス（２−ヒドロキシプロピル）（ＰＧＭＳ）、及びオルトケイ酸テトラキス（２，３−ジヒドロキシプロピル）（ＧＬＭＳ）など）、ケイ酸塩（ケイ酸ナトリウム（Ｎａ２ＳｉＯ３）、又はケイ酸カリウムなど）、シリカナノ粒子、ソルビチルシラン）、トリメトキシメチルシラン、ジメトキシジメチルシラン、ＴＭＯＳ（テトラメトキシシラン）、ＤＧＳ（ジグリセリルシラン）、又はその混合物である。より好ましくは、シリカ前駆体は、ポリケイ酸（Ｈ２ＳｉＯ３）ｎ、トリメトキシメチルシラン、ジメトキシジメチルシラン、又はその混合物である。
−  シリカ濃縮剤は、ポリカチオン性有機ポリマー、好ましくは長鎖ポリアミン、好ましくはポリカチオンポリ（ジアリルジメチルアンモニウム）クロリド（ＰＤＡＤＭＡＣ）；スペルミン；コレステリルスペルミン；スペルミジン；スペルミジントリヒドロクロリド；スペルミジンホスファート６水和物；Ｌ−アルギニル−３，４−スペルミジン；１−４−ブタンジアミンＮ−（３−アミノプロピル）−モノヒドロクロリド；プトレシン（１，４−ジアミノ−ブタン）；１，３−ジアミノ−プロパン；１，７−ジアミノ−ヘプタン；１，８−ジアミノ−オクタン；ポリ（アリルアミン）ヒドロクロリド；ポリ（エチレンイミン）；ポリ（Ｎ−メチルエチレンイミン）；ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）；ポリ（２−（ジメチル−アミノ）エチルメタクリラート； キトサン；ポリ（ビニルアミン）ヒドロクロリド；ポリ（プロピレンイミン）；ポリ（Ｎ−メチルプロピレンイミン）；ポリ（アクリルアミド−co−ジアリルジメチルアンモニウム）クロリド；ポリ−Ｌ−リシン；ポリ−Ｌ−アルギニン；ポリ−Ｌ−ヒスチジン、又はその混合物からなる群から選択される。
【００２１】
好ましくは、本発明のいずれかによる方法では、シリカ前駆体の濃度は、（約）０．１M〜（約）２Mの間であり、アルギン酸の濃度は、好ましくは（約）０．５％wt〜（約）５％wtの間であり、シリカ濃縮剤の濃度、好ましくはシリカ濃度、好ましくはポリカチオンＰＤＡＤＭＡＣは、（約）０．４％wt〜（約）１０％wtの間である。
【００２２】
ビーズの（外側の）シェル上の孔の大きさに影響を及ぼす化学的因子には、シリカ前駆体の濃度、シリカ前駆体及びアルギン酸溶液の間の容積比、アルギン酸のパーセント（質量で）、コアセルベーション溶液中でのインキュベーション時間、ポリカチオン性有機ポリマーのパーセント（質量で）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
ビーズの直径は、ゾルであるシリカ／アルギン酸を押し出すのに用いる針の直径、ゾルであるシリカ／アルギン酸が直鎖ポリアミン溶液に滴下される高さ、ゾルであるシリカ／アルギン酸がポリカチオン性有機ポリマー溶液に滴下される速さ、又はコアセルベーション溶液中でのビーズのインキュベーション時間などの幾つかの物理的因子により調節することができる。
【００２４】
更に、ビーズの物理的耐性は、コアセルベーション溶液中でのビーズのインキュベーション時間を含む幾つかの物理的因子により調節することができるが、これらに限定されるものではなく、インキュベーション時間が長ければ、ビーズのヤング率が上昇した。
【００２５】
更に、本発明のハイブリッドシリカ−アルギン酸ビーズの機械的耐性は、シリカコロイド（例えば、LUDOX（登録商標））、シリカ補助前駆体（co-precursor）、又はシリカのナノ粒子などの添加剤をシリカ前駆体溶液に加えることによって、改善することができる。これらの添加剤は、更なるシリカ源として機能する。
【００２６】
簡単（操作しやすく、低コストの技術）で迅速、環境に優しく、かつ効率的なこの方法が好都合である。環境や、ビーズ中で、長期間（数か月まで）生きたまま保持され、分割することができる捕捉された細胞のいずれにとっても有毒ではないからである。ビーズは、その容積全体で多孔性の構造を有するため、ビーズ内での細胞から細胞への栄養素及び代謝物の優れた拡散が可能となる。
【００２７】
この方法により、捕捉された細胞を透明で、堅ろうな、球状のビーズにすることが可能となり、これによりこれらの細胞の寿命及び生物学的活性が改善され、各種用途でそれらを用いることが可能となろう。このような用途としては、高収率で生産する（例えば、反応物質としてＣＯ２を、エネルギー源として光照射を用いるグリーンケミストリー）ために、目的の分子（医薬分子（（モノクローナル）抗体又はその部分（又はナノ抗体若しくはアルファ体などの同様の生成物）を含む）、栄養学的、又は化粧的分子（カロテノイド（ベータ−カロテン）、ビタミン、ホルモン、又は酵素など）など）（これらはすべて、細胞を殺すことなく外部媒体から容易に回収することができる）を、バイオセンサー、生物燃料電池、又は（光）バイオリアクターに導入することが含まれる。
【００２８】
ビーズに捕捉されたこれらの生きている細胞は、ヒトの体を含む動物の生きている器官へ活性な化合物（インスリン、薬物若しくはプロドラッグ、（モノクローナル）抗体若しくはその部分（又はナノ体若しくはアルファ体などの同様の生成物）など）を送達するためにも用いることができる。
【００２９】
特定の特性（制御された直径及び孔径）を有する本発明によるビーズは、精製及び／又は分離の装置及び方法（例えば、クロマトグラフ用カラム）においてそのまま（捕捉した元素又は細胞なしで）でも用いることができる。
【００３０】
本発明の最後の局面は、本発明によるビーズ、又は本発明による方法により得られたビーズの、目的の分子の生産のためのバイオリアクター中における、ヒトを含む動物の生きている器官における目的の分子の送達における、及び／又は精製及び／又は分離方法及び装置、好ましくはクロマトグラフ用カラムにおける使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、本発明の（ハイブリッドアルギン酸シリカ）ビーズの形成のメカニズムを開示している。（１）は、ハイブリッドアルギン酸ナトリウム−ＳｉＯ２の層を表し、（２）は、ＰＤＡＤＭＡＣを表し、（３）は、ハイブリッドアルギン酸カルシウム−ＳｉＯ２の層を表す。
【図２】図２は、本発明によるハイブリッドアルギン酸−シリカビーズ内に捕捉された微細藻類による酸素の光化学的産生を表す。
【図３】図３は、アルギン酸カプセルと対比してのハイブリッドアルギン酸−シリカビーズの機械的耐性を表す。
【図４】図４は、ＰＤＡＤＭＡＣ／ＣａＣｌ２溶液中でのインキュベーション時間の関数としてのハイブリッドアルギン酸−シリカビーズの平均直径を表す。
【図５】図５は、ＰＤＡＤＭＡＣ／ＣａＣｌ２溶液中でのインキュベーション時間による、ハイブリッドアルギン酸−シリカビーズ内に捕捉された微細藻類による酸素の光化学的産生を表す。
【００３２】
本発明の好ましい態様の記載
本発明を、以下の非限定的な実施例において添付の図面を参照することにより詳細に説明する。
【００３３】
図１は、本発明の（ハイブリッドアルギン酸−シリカ）ビーズの形成のメカニズムを示す。この形成は、ポリカチオン性有機ポリマー（例えば、ＰＤＡＤＭＡＣ）の添加により、シリカ前駆体及びアルギン酸ナトリウムを含有するハイブリッド溶液の溶解性が低下するコアセルベーションの過程に依存する。事実、アルギン酸は、テンプレートとして作用し、ＰＤＡＤＭＡＣは、シリカ濃縮剤の役割を果たす。ビーズのコア部分は、ハイブリッドアルギン酸ナトリウム−シリカ１を含有し、中間層３は、ハイブリッドアルギン酸カルシウム−シリカから構成され、外側の層（シェル）２は、シリカ、及びシリカ濃縮剤ＰＤＡＤＭＡＣを含む。ＰＤＡＤＭＡＣ含有層は、シリカ種がビーズの外側へ漏出するのを減少又は防止する。
【００３４】
実施例１：ハイブリッドアルギン酸−シリカビーズ内に捕捉された微細藻類による酸素の光化学的産生
微細藻類の培養
Dunaliella tertiolecta（ＡＴＣＣ−３０９２９）液体保存培養株を、蛍光灯による照明下、周囲温度でフラスコ中に維持し、１月に１回、新鮮な培地に移した。ＡＴＣＣ−３０９２９を、JOHNSONS培地を充填した無菌フラスコ中で増殖させた。
【００３５】
微細藻類を捕捉するハイブリッドアルギン酸シリカビーズ
ワンポット法によりハイブリッドアルギン酸シリカビーズの合成を成功させることが確立されている実験法には、ＮａＯＨ ０．１Mにより約４〜約６の間にpHが調整されているポリケイ酸（Ｈ２ＳｉＯ３）（５mL、０．１〜２M）を、アルギン酸ナトリウムの溶液（５mL、０．５〜５％wt）及びDunaliella tertiolecta （ＡＴＣＣ−３０９２９）の生きている細胞の懸濁液と混合することにより、ハイブリッドアルギン酸−シリカ溶液を調製することが含まれる。次いで、この混合物を、ＣａＣｌ２（５〜１００mM）を含有するポリカチオンポリ（ジアリルジメチルアンモニウム）クロリド（ＰＤＡＤＭＡＣ）の水溶液（０．４〜１０％wt）に滴下した。この混合物中での約３時間のインキュベーション後、微細藻類を捕捉したハイブリッドアルギン酸−シリカビーズを新鮮な培地で洗浄してから、JOHNSONS培地の存在下、無菌フラスコへ移した。
【００３６】
適切であれば、生きている細胞の懸濁液を省略して調製を行い、その他の点では上述のようにしてハイブリッドアルギン酸−シリカビーズを合成した。
【００３７】
光合成活性
HansaTech (Norfolk, England)から購入したClark細胞容器内での酸素産生を介して、微細藻類を含有するハイブリッドビーズの光合成活性を試験し、観察した。操作には、２〜１５の間、好ましくは２〜８の間、好ましくは約３のビーズを、ＮａＨＣＯ３と混合したJOHNSONS培地（１０μL、０．６M）１mLに含む懸濁液に入れることが含まれた。
【００３８】
アルギン酸−シリカビーズ内に捕捉された微細藻類は、図２に報告したように９か月にわたり酸素を産生することができる。時間ゼロは、微細藻類がハイブリッドビーズ内に捕捉された時間に対応する。
【００３９】
実施例２：アルギン酸カプセルと対比してのハイブリッドアルギン酸−シリカビーズの機械的耐性
生きている細胞と共に、又はなしに、実施例１に示すように実験を行った。アルギン酸及びハイブリッドアルギン酸−シリカビーズの比較安定性研究を行った。この目的のために、合成後、ビーズを生物学的培地に移した。その機械的耐性を評価するために、ビーズを、培地中、約２５０rpmでの撹拌条件下に約１時間〜約１０時間の間、好ましくは約２時間置き、ビーズを除去し、割れたビーズを計数した。本明細書中の以下の図３及び表１に示すように、アルギン酸−シリカビーズは、アルギン酸ビーズよりも多数の無傷のビーズを示す。ＰＤＡＤＭＡＣ／ＣａＣｌ２溶液中でのインキュベーション時間を長くすることにより、機械的耐性もまた増大した。したがって、シリカとアルギン酸との組み合わせにより、ハイブリッドビーズの機械的耐性が増大した。
【００４０】
表１：
各種組成のビーズの機械的耐性。アルギン酸／ＰＤＡＤＭＡＣ及びアルギン酸／ＰＤＡＤＭＡＣ／シリカビーズを、ＰＤＡＤＭＡＣ／ＣａＣｌ２溶液中で約１時間インキュベーションした。アルギン酸／シリカビーズを、ＣａＣｌ２溶液中で約１時間インキュベーションした。その耐性を、ヤング率の値として示した。値は、標準偏差と共に平均値として示す（ｎ＝３）。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
実施例３：ハイブリッドアルギン酸−シリカビーズの平均直径に対するインキュベーション時間の影響に関する研究
実験は、実施例１に述べたように行った。ＰＤＡＤＭＡＣ／ＣａＣｌ２溶液中でのインキュベーション時間を、１分〜４８時間（２８８０分）まで変化させた。更に、ビーズの収縮現象を経時的に観察したが、これは、ＰＤＡＤＭＡＣ／ＣａＣｌ２溶液中でのシリカの重合工程（時間がたつにつれてより効率的になり、したがってより小さい大きさのビーズとなる）により説明することができる。ビーズの収縮の動力学を図４において図示した。収縮は、２４時間後（１４４０分）後に安定な大きさに到達するまでの当初の時間の間、かなり顕著であると考えられる。
【００４３】
実施例４：インキュベーション時間による、ハイブリッドアルギン酸−シリカビーズ内に捕捉された微細藻類による酸素の光化学的産生
実験は、実施例１に述べたように行った。ＰＤＡＤＭＡＣ／ＣａＣｌ２溶液中でのインキュベーション時間を、１５分〜２４時間（１４４０分）まで変化させた。結果を図５に報告するが、ここでは、微細藻類の酸素産生を、被包後０、１、４、及び７日目に分析した。したがって、図５に示すように、ＰＤＡＤＭＡＣ／ＣａＣｌ２溶液中でのビーズのインキュベーション時間は、捕捉された微細藻類の代謝活性に対して影響を及ぼさなかった。
【００４４】
本発明は、以下の利点を提供する：
−  ワンポットの、環境に優しく、低コストの方法により合成された、数ミリメートルのハイブリッドアルギン酸−シリカビーズは、良好な球形を示し、更に非常に良好な機械的及び化学的安定性を示す。調製方法の物理的及び化学的パラメーターを変化させることによりビーズ及び孔（シェル内及びコア内）の大きさを調節することが可能である。選択された直径及び選択された孔径を有する得られたビーズは、各種精製法及び装置、特にクロマトグラフ用カラムにおいてそのまま用いることができる。
−  栄養素及び代謝物の優れた拡散を可能とするビーズ容積全体での高度に多孔性の構造のため、細胞の大きいバイオマスを、破断や漏出が出現することなくビーズ内に被包することができる。したがって、培地中では、生きている細胞の増殖が認められない。細胞はビーズ内で増殖することができるにもかかわらず、膨潤現象は起きない；
−  ビーズ内に捕捉された細胞の生物学的活性及び長期生存性の維持については、細胞は、少なくとも９か月以上にわたり生存し続ける。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年4月20日(2015.4.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性物質を捕捉する、ミリメートルスケールの大きさを有するビーズであって、
−  細胞、細胞オルガネラ、酵素、薬物、プロドラッグ、又はその混合物からなる群から選択される生理活性物質、
−  多孔性のコア、及び
−  多孔性のシェル
を含み、多孔性のコアは、ハイブリッドアルギン酸シリカ（１）を含み、多孔性シェルは、シリカ及びシリカ濃縮剤（２）を含み、
該シリカ濃縮剤（２）は長鎖ポリアミンである、
ビーズ。
【請求項２】
シリカ濃縮剤（２）が、ポリカチオンＰＤＡＤＭＡＣである、請求項１記載のハイブリッドアルギン酸−シリカビーズ。
【請求項３】
外側の多孔性層が、その大きさが１nm〜５００nmの間である孔を含む、上記請求項１又は２記載のハイブリッドアルギン酸−シリカビーズ。
【請求項４】
外側の多孔性層の厚さが、１μm〜１０μmの間である、上記請求項１〜３のいずれか一項記載のハイブリッドアルギン酸−シリカビーズ。
【請求項５】
ハイブリッドアルギン酸カルシウム−シリカ（３）の中間層が、コア及び多孔性シェルの間に形成される、上記請求項１〜４のいずれか一項記載のハイブリッドアルギン酸−シリカビーズ。
【請求項６】
細胞が、光合成的に活性な細胞、細菌、動物細胞、又は真菌（酵母細胞を含む）からなる群から選択される、上記請求項１〜５のいずれか一項記載のハイブリッドアルギン酸−シリカビーズ。
【請求項７】
細胞が微細藻類である、上記請求項１〜６のいずれか一項記載のハイブリッドアルギン酸−シリカビーズ。
【請求項８】
上記請求項１〜７のいずれか一項記載のハイブリッドアルギン酸−シリカビーズの調製方法であって、
−  １又はそれ以上のシリカ前駆体、及び、溶液のpHは、２〜１０の間であるアルギン酸溶液、及び該ビーズに被包される生理活性物質と混合する工程；
−  混合物を、長鎖ポリアミンであるシリカ濃縮剤の水溶液に滴下する工程；
−  得られたビーズを１分〜２４時間の間の期間インキュベーションする工程；
を含む方法。
【請求項９】
シリカ濃縮剤が、ポリカチオンＰＤＡＤＭＡＣである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
シリカ濃縮剤の水溶液が、更にカチオン塩を含む、上記請求項８又は９記載の方法。
【請求項１１】
カチオン塩がＣａＣｌ２である、上記請求項８〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
シリカ前駆体が、ポリケイ酸（Ｈ２ＳｉＯ３）ｎ、トリメトキシメチルシラン、ジメトキシジメチルシラン、オルモシル（有機改質シリカ）、テトラメトキシシラン（ＴＭＯＳ）、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）、ジグリセリラン（ＤＧＳ）、及びケイ酸ナトリウム（Ｎａ２ＳｉＯ３）、又はその混合物からなる群から選択される、上記請求項８〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
シリカ前駆体の濃度が、０．１M〜２Mの間である、上記請求項８〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
シリカコロイド、シリカ補助前駆体（co-precursor）、又はシリカのナノ粒子からなる群から選択される添加剤が、シリカ前駆体溶液に添加される、上記請求項８〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
上記請求項１〜７のいずれか一項記載のビーズ、又は上記請求項８〜１４のいずれか一項記載の方法により得られたビーズの、
−  目的の分子の生産のためのバイオリアクター、
−  ヒトを含む動物の生きている器官における目的の分子の送達、又は
−  精製及び／又は分離方法及び装置、好ましくはクロマトグラフ用カラムにおける、
使用。
【国際調査報告】
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