(57)【要約】  患者に投与可能な、組織の再生または創傷の治癒のための新規製剤であって、血清および生理学的pHで不溶性であるグロビンを含み、生理学的pHで不溶性である前記グロビンに前記血清を添加することにより得られる製剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者に投与可能な、組織の再生または創傷の治癒のための新規製剤であって、
血清および生理学的pHで不溶性であるグロビンを含み、生理学的pHで不溶性である前記グロビンに前記血清を添加することにより得られる前記製剤。
【請求項２】
前記血清は自家血清である、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記グロビンは自家グロビンである、請求項１または２に記載の製剤。
【請求項４】
前記血清および前記グロビンは、前記患者の同じ血液試料から得られる、請求項１に記載の製剤。
【請求項５】
ペーストまたはゲルの形態、あるいは粉末、顆粒、包帯、フィルム、または成形したインプラント等の固体材料である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項６】
ペーストの重量当たりのグロビンの重量は、少なくとも12%、より好ましくは少なくとも15%、さらにより好ましくは少なくとも18%やさらには20%である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項７】
場合により、
組織充填または増強物質、例えばコラーゲン、ゼラチン、架橋ヒアルロン酸、合成充填ポリマー、セラミック粒子、ヒドロキシアパタイト、骨粒子；
例えば酸化セルロースなどの治癒ポリマー剤を含む創傷剤；
合成または天然接着ポリマー剤の中から選択される接着剤；
ヘモグロビン、好ましくは自家ヘモグロビン；
他の細胞成長因子；および/または、
幹細胞、芽球、例えば、線維芽細胞、骨芽細胞、もしくは軟骨芽細胞など、または細胞、例えば、線維細胞、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞などを含む細胞；
を含む他の成分を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項８】
しわまたは他の皮膚欠陥を充填するため；ならびに/あるいは、単独または他の増強材料と組み合わせもしくは混合させて、欠損括約筋、声帯、歯周組織を含む組織を増強するため、または、唇、頬、または他の身体部分を増強する整形または美容整形するため；ならびに/あるいは、糖尿病患者または手足の血管新生が局所的に貧弱な動脈もしくは静脈の疾患に罹患した患者、または創傷を有する患者における場合を含む内部の外科創傷、器官の一部分、もしくは皮膚組織の慢性創傷を治癒するため；ならびに/あるいは、壊死組織の切除後の深い熱傷創傷における肉芽組織の再生を促進するためを含む、組織を再生する治療方法において使用するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の製剤の調製方法であって、以下の工程を含む方法：
いかなる抗凝固剤も用いずに全血を取得する工程；
前記全血試料を凝固させる工程；
前記凝固物から得た血清を分離する工程；および、
前記血清と生理的pHで不溶性であるグロビン含有する製剤を添加する工程。
【請求項１０】
以下の工程を含む、請求項９に記載の方法：
まず、抗凝固剤を用いずに、滅菌全血を凝固させる工程；
血清を取り出す工程；
場合により、生理食塩水で前記凝固物を洗浄する工程；
滅菌水を添加し、攪拌またはホモジナイズして該凝固物を分離し、ヘモグロビンを放出させる工程；
ヘモグロビンを、例えば遠心分離工程により、清澄化する工程；
好ましくは亜硝酸ナトリウムを添加することにより、好ましくはヘモグロビンをメトヘモグロビンへ酸化させる工程；
好ましくは酸性pHで、アセトンを含有する薬剤により、ヘモグロビンからヘム部分を抽出する工程；
好ましくは濾過工程により、液体から沈殿したグロビンを分離する工程；
滅菌水中において酸性pH下で、沈殿したグロビンを溶解する工程；並びに、
pHを、グロビンが沈殿する中性に調整する工程。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の製剤の有効量を、それを必要とする患者の再生すべき組織内または表面、あるいは治癒すべき創傷内または表面に投与する工程を含む、組織を再生するまたは創傷を治癒する方法。
【請求項１２】
しわまたは他の皮膚欠陥を充填するため、あるいは創傷を治癒するための、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の製剤の有効量を、単独または他の増強材料と組み合わせもしくは混合させて、それを必要とする患者の増強すべき組織内または表面に投与する工程を含む、欠損括約筋、声帯、歯周組織を含む組織を増強するため、または、唇、頬、もしくは他の身体部分を増強する整形または美容整形するための方法。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の製剤の有効量を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、内部の外科創傷、器官の一部分、もしくは皮膚組織の慢性創傷を治癒するための方法。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の製剤の有効量を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、壊死組織の切除後の深い熱傷創傷における肉芽組織の再生を促進するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
組織の再生および創傷の治療のための植え込み型製剤、それらの製剤化方法、および該植え込み型製剤を用いる患者の治療方法に関する。
【０００２】
また、本発明は、組織の再生および創傷の治療のためを含む、動物およびヒトに投与可能な新規製剤に関する。
【０００３】
また、本発明は、ヒト用に、これらの製剤を自家血液等の血液から製造する方法にも関する。
【０００４】
また、本発明は、これらの製剤を投与することにより動物およびヒトを治療する方法にも関する。
【背景技術】
【０００５】
再生医療の分野では、治療または形成外科（皮膚のしわ治療を含む）を含むいずれかの目的で、細胞成長因子、主に血小板または血小板由来成長因子を目的箇所に投与するという原理が現在採用されている。
【０００６】
これらの因子を、組織充填、増強、再生、または創傷治癒のための植え込み型製剤、例えば、ヒアルロン酸製剤、コラーゲン製剤、グロビンおよび他の有機材料製剤、セラミック、およびポリラクチドやポリラクチドグリコリドポリマーを含む合成ポリマーに添加することは、既に提案されている。
【０００７】
米国特許第6949625号は、生理学的pHで不溶性であるグロビン、好ましくは同種グロビン、より好ましくは自家グロビン、を含んでなる注入可能な組織充填、増強、および治癒用の製剤等の植え込み型製剤で、場合により、治癒物質または細胞増殖物質または細胞を含み得る製剤を開示している。
【０００８】
米国特許第7709017号は、可溶性グロビンまたはグロビン誘導体から得られる製剤で、場合により治癒物質またはBMP型成長因子を含み得る製剤を開示している。
【０００９】
米国特許出願第20090312239号は、生理学的pHで不溶性であるグロビンの製剤で、接着剤、充填剤、増強剤、または治癒剤を含み得る製剤を開示している。
【００１０】
米国特許出願第20120183501号は、生理学的pHで不溶性であるグロビンの製剤であって、血小板、または多血小板血漿(platelet-rich plasma, PRP)の血小板から得たPDGF型成長因子、または組換え産物、または細胞成長成長因子(EGF、FGF等)を更に含み得る製剤を、それを必要とする患者に投与する工程を含む新規な治癒方法を開示している。
【００１１】
これらの製剤では、例えば、全血から赤血球を分離する方法、赤血球の溶血を誘発する方法、およびヘモグロビンにヘム分離工程を施す方法、等の方法によって生理的pHにおいて不溶性なグロビン成分を調製する。ここで、赤血球は、輸血パウチから得られるかまたはドナー（好ましくは患者）の血液試料から分離して得られる。
【００１２】
米国特許出願第20090074736号は、ヘムは抽出または溶解するが、本作用を施したグロビンおよび他のタンパク質成分は実質的に溶解していない状態のままである、例えば、アセトン含有溶剤などの溶剤において、赤血球および血漿を含有する全血に脱色工程を施すことによって得られる生理学的pHで不溶性であるグロビンの製剤を開示する。グロビン製剤に加える血小板が血液から最初に分離されていない実施形態では、他のタンパク質成分には、アルブミン、α-、β-、およびγ-グロブリンのみでなく、血液凝固因子ならびに血小板因子も含む。米国特許出願第20090074736号によると、全ての血液タンパク質、血小板その他の細胞にアセトン工程を施すが、この工程で、特定のタンパク質ではある種の変性が誘導される可能性があり、最終製剤においてこれらの元の構造が保持されるという保証はできない。
【００１３】
組織再生のために血液成分を使用することについての技術常識は、Jun Araki et al: 2012による近年の論文(1)によくまとめられている。この論文の序論(参考科学文献を含む）の全文を以下に引用する。
【００１４】
「多血小板血漿(PRP)製剤は、もともと、輸血血液中の全血（WB）から赤血球（RBC）および血漿を分離する方法として開発された(2)。PRPは、最初、いくつかの血小板減少性疾患のための外科手術や血小板輸血の際の止血のために使用された(3)。血小板が破壊され活性化されると、血小板由来成長因子（PDGF）、形質転換成長因子ベータ（TGF-β）および上皮成長因子（EGF）などを含む種々の生理活性物質が、血小板のアルファ顆粒から血漿中へ排出されることが多くの研究を通じて明らかにされた(4-5)。これらの成長因子は、損傷した皮下組織から出る創傷滲出液中に含まれ、創傷治癒プロセスの初期段階において重要である(6)。具体的には、間質幹細胞の増殖および血管新生を促し、組織の修復/再生のカギとなる信号であると考えられている(7-9)。
【００１５】
自家PRPは、細胞ベースの再生治療よりも安全性の懸念が少ない。このように、PRPは、組織工学と再生医療のために多岐にわたる研究対象である(10-11)。PRPは、1998年以来、歯科における創傷治癒および組織修復を促進するために治療的に使用されており(12)、PRPの臨床応用は、近年、心臓外科(13)、眼科(14)、口腔外科(15)、整形外科(16)、美容整形外科(17-18)、スポーツ医学(19)、および美容医療(20-21)を含む他の分野に拡大している。治療目的では、１回目の遠心分離によりWB（全血）からPRPを抽出し、2回目の遠心分離により濃縮することが多い。１回目の遠心分離は低速なので血小板をスピンダウンできないが、一方、2回目の回転は高速なので血小板がスピンダウンされる。本研究では、PRPと区別するために、2回目の遠心によるこの濃縮PRPを血小板濃縮血漿（platelet-concentrated plasma, PCP）と呼ぶ。
【００１６】
PRPまたはPCPの治療への使用が増加しているが、報告による臨床効果は非常に様々である(22)。実際、それらが無効であると結論づける報告もある(23)。PRP/PCPを臨床的に調製するために商品化されたデバイスは、現在多くが利用可能であるが、PRP/PCPを調製するための標準化されたプロトコルがない。さらに、ヒトPRP/PCPの調製を最適化する方法については驚くほど少数の科学的研究しか行われていない。例えば、一般的な実験器具においてWBに加わる遠心力がPRP/PCP収量にどのように影響するかについての包括的な研究はされていない。このような研究を欠いているのは、十分な量の新鮮なヒトWB試料を得ることが明らかに難しいこと以外にも、多くの理由がある。多くの理由のうちの一つには、血液凝固（フィブリン重合）および血小板凝集が複雑なことがある。フィブリノーゲンおよび血小板の正確かつ一定に制御することが非常に困難なので、良好な設計による研究を、計画および実行するのは困難である。もう一つの理由は、PRP/PCP製品(24-25)の評価方法が、これまでの研究において一貫していないことである。最後に、血液成分および物理的性質が患者試料毎に様々なので、標準化が困難ということがある。」
【００１７】
この序論は、PRPとPCPを調製するために改善した標準化遠心分離プロセスを公開するという著者の目的の記載をもって終了する。この技術は、複雑で、時間がかかり、医師又はアシスタントによって行われなければならない。特別な環境で作業しない限り、プロセスの終了時に、PRPが無菌状態のままであることを保証できない。しかし、このような特別な環境は、医師やアシスタントにとって利用可能なことが少ない。なぜなら血小板が存在するため、濾過膜を用いたPRPの最終滅菌が不可能だからである。
【００１８】
A.P. Sclafani, S.A Mc Cormick: 2011(26)は、以下の記載により自らの論文を紹介している。
【００１９】
「パレの時代以来、近代的な外科治療は、妨げられることなく創傷が治癒できるように組織条件を局所的に最適化することによるものである。局所的な成長因子の効果をより良く理解するにつれ、外科医らは、より迅速かつ効果的な治癒を促すために創傷環境を制御することを始めている。単離成長因子の局所的な適用は、ある程度成功しているが（糖尿病性足部潰瘍用のベカプレルミンおよび放射線誘導性の粘膜炎用のパリフェルミン）、ここ10年で、多血小板血漿（PRP）が、より自然でより強力な創傷の治癒方法として進められている。しかし、このプロセスは時間がかかり、結果がはっきりしないこともある(27-28)。」
【００２０】
そして、彼らはPRFM（多血小板フィブリンマトリックス、platelet-rich fibrin matrix）についての経験について記載している。PRFMは、外科医またはアシスタントが商品名「Selphyl」というキットを用いて、PRPから調製しなければならない。採血から最後に注入するまでの滅菌操作は、キットにより容易になるものの、厳格な注意を要する。これには半時間かかる。PRPを臨床的に使用する際、PRP中のフィブリノゲンにより、凝固および血小板の活性化が制御不能になりがちになる。フィブリンゲルが、成長因子の制御放出担体として (29)または充填注入用として(30)有用であり得るが、形成されたフィブリンゲルは、生理的線維素溶解によって迅速に分解される。線維素溶解は、フィブリンネットワークの酵素切断に関与するプラスミンの放出源において、組織プラスミノーゲン活性化因子により引き起こされる。グロビンインプラントは、線維素溶解反応の影響を受けにくい、そして、他のいかなる血液タンパク質よりも驚くほど局所的な生分解に耐えうる。これはおそらく不溶性であるという性質および局所濃度が非常に高いことによるだろう。また、形成されたフィブリンゲルは、最終生成物の量が少なく、PRPが容易に注入できず、多くの臨床状況において好ましくない。いずれの場合も、シリンジ内に送るカルシウムを含む血漿の完全な凝固を避けるために、活性化PRPまたはPRFMを数分以内に注入しなくてはならず、これにより注入の時間が制限され、あるいは例え大きな針を用いてる注入ができなくなる。様々なキットが市販されているが、同様の操作を要する。
【００２１】
Jun Araki et al: (2012)およびA.P. Sclafani, S.A Mc Cormick: (2011)の上記引用の論文は、組織再生に関する最新技術の代表的なものと考えられている。これらのすべては、組織再生用のPRPまたは派生製品を、実際に使用するための血液成分としてのみ説明するものである。PRPは液体なので、創傷に保持するために、および/または可溶性成長因子および他の可溶性活性成分の局所的な拡散を遅延させるために、注入の前に、トロンビンおよび/またはカルシウムカチオン（Ca++）を添加して固体ゲルを生成することによって「活性化」しなければならない。このPRPの固体化は、トロンビンおよび/またはCa++を添加することにより、血漿またはPRPに存在するフィブリノゲンおよび他の凝固因子を活性化することにより可能になる。
【発明の概要】
【００２２】
本発明は、組織の再生および創傷の治療を改善するために、これらの欠点を克服し、より信頼性の高い方法で、血小板由来因子を送達可能な新規製剤を提供することを提案する。本発明の更なる目的は、かかる製剤を、完全に自家由来にすることである。別の目的は、初めから重要な組織充填または増強効果を有するかかる製剤を提供することである。本発明の更に別の目的は、滅菌製剤を容易に調製することである。更なる目的は、調製、保存、および提供がより容易なかかる製剤を提供することである。最後にもう一つの目的は、医師またはアシスタントによる特別な準備を回避することである。
【００２３】
本発明の目的は、血清、好ましくは自家血清、および生理学的pHで不溶性であるグロビンを含み、患者に投与可能な新規製剤である。上記製剤は、生理学的pHで不溶性である上記グロビンに上記血清を添加することにより得られる。グロビンは、血漿または血清から分離した後の赤血球から得ることができる。
【００２４】
好ましくは、この新規製剤は、しわ（wrinkles）または他の皮膚欠陥（other cutaneous flaws）を充填するため；ならびに/あるいは、単独または他の増強材料と組み合わせもしくは混合させて、欠損括約筋、声帯、歯周組織を含む組織を増強するため、または、唇、頬、もしくは他の身体部分を増強する整形または美容整形するため；ならびに/あるいは、糖尿病患者または手足の血管新生が局所的に貧弱な動脈もしくは静脈の疾患に罹患した患者、または創傷を有する患者における場合を含む内部の外科創傷、器官の一部分、もしくは皮膚組織の慢性創傷を治癒するため；ならびに/あるいは、壊死組織の切除後の深い熱傷創傷における肉芽組織の再生を促進するためを含む、組織を再生する治療方法において使用するための製剤である。
【００２５】
本製剤において、血清を水性ビヒクルで希釈、または逆に、天然血清よりも濃縮することが可能であるものの、製剤中の血清成分は、患者の天然血清の10%〜120%の濃度、より好ましくは実質的に同じ濃度であることが好ましい。
【００２６】
前記製剤は、植え込み型であることが好ましい。これは、前記製剤がそれを必要とする患者の組織内または表面に、非経口注入により、または移植により、または例えば創傷等の開口した組織上に載置することにより投与可能で、かつかなりの時間そのまま残しておくことが可能であることを意味する。
【００２７】
本発明において、血清は、一度凝固した血液試料の液体部分を意味する。
【００２８】
グロビンは、同種グロビン、つまり、同じ種由来であることが好ましく、ヒトでは、特に、グロビンは、自家グロビン、つまり、同じ患者の血液試料から調製されることが好ましい。
【００２９】
最も好ましい実施形態では、両方の成分、つまり血清およびグロビンは、患者の同じ血液試料から得られる。
【００３０】
これらの植え込み型の可溶性または不溶性グロビン製剤は、好ましくは、ペーストまたはゲルの形態、あるいは粉末、顆粒、包帯、またはフィルム、成形したインプラント状の固体材料である。
【００３１】
血清に対するグロビンの体積比率は、それぞれ広範に様々だが、少なくともペースト状またはゲルの形態で、グロビン/血清（ペーストの重量あたりグロビンの重量）の比率が、好ましくは少なくとも14%、より好ましくは少なくとも15%、さらにより好ましくは少なくとも18%、さらに好ましくは20%である、ペースト状製剤だと非常に細い注射針を介して送達できる。
【００３２】
本発明に係る製剤は、場合により、
組織充填または増強物質、例えばコラーゲン、ゼラチン、架橋ヒアルロン酸、合成充填ポリマー、セラミック粒子、ヒドロキシアパタイト、骨粒子、かかる物質が存在する場合、その割合はグロビンの割合よりも低いことが好ましい；
例えば酸化セルロースなどの治癒ポリマー剤を含む創傷剤；
合成または天然接着ポリマー剤の中から選択される接着剤；
ヘモグロビン、好ましくは自家ヘモグロビン；
他の細胞成長因子；および/または、
幹細胞、芽球、例えば、線維芽細胞、骨芽細胞、もしくは軟骨芽細胞、または分化した細胞、例えば、線維細胞、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞などを含む細胞；
含む他の成分を含む。
【００３３】
細胞は、培養細胞または単離細胞であり得るが、患者から得た骨組織または脂肪組織等の自家組織を、自家移植用に例えば、ホモジナイズまたは粉砕といった通常の方法で処理したものを、本発明の製剤に加えることも可能である。
【００３４】
本発明の別の目的は、以下の工程を含む、本発明に係る製剤の製造方法である：
いかなる抗凝固剤も用いずに全血を取得する工程；
前記全血試料を凝固させる工程；
前記凝固物(clot)から得た血清を分離する工程；
場合により、前記血清の一定量に感染症マーカーの検査を施す工程；および、
生理的pHで不溶性であるグロビン含有する製剤に前記血清を添加する工程。
【００３５】
血清は、同種血清、つまり、治療対象の動物と同じ種の血液試料から得られることが好ましく、ヒトでは特に、血清は、自家血清、つまり、同じ患者の血液から得られることが好ましい。
【００３６】
また、グロビン成分は、同種グロビンであることが好ましく、ヒトでは特に、グロビンは、自家由来であることが更に好ましい。
【００３７】
好ましくは、血清およびグロビンの両方が同種、より好ましくは血清が自家由来、そして好ましくは血清およびグロビンの両方が自家由来である。
【００３８】
グロビン成分は、参照により本明細書に組み込まれ、当業者が参照可能な米国特許第6949625号、第7709017号、第20090312239号、および第20120183501号に開示された方法に従って、調製することができる。
【００３９】
しかし、グロビン成分は、血液凝固物(blood clot)、好ましくは自家の血液凝固物から調製することが好ましい。
【００４０】
グロビンは、血液の血漿から分離した後の赤血球から得ることもできる。
【００４１】
一の実施形態では、本方法は、以下の工程を含む：
まず、抗凝固剤を用いずに、滅菌全血を凝固させる工程；
血清を取り出す工程；
場合により、生理食塩水で前記凝固物を洗浄する工程；
滅菌水を添加し、攪拌またはホモジナイズして該凝固物を分離し、ヘモグロビンを放出させる工程；
ヘモグロビンを、例えば遠心分離工程により、清澄化する工程；
好ましくは亜硝酸ナトリウムを添加することにより、好ましくはヘモグロビンをメトヘモグロビンへ酸化させる工程；
好ましくは酸性pHで、アセトンを含有する薬剤により、ヘモグロビンからヘム部分を抽出する工程；
好ましくは濾過工程により、液体から沈殿したグロビンを分離する工程；
滅菌水中において酸性pH下で、沈殿したグロビンを溶解する工程；
pHを、グロビンが沈殿する中性に調整する工程；
場合により、沈殿物を洗浄する工程；
ペースト状のグロビンを回収する工程；並びに、
場合により、グロビンを乾燥させる工程。
【００４２】
製剤のグロビン成分は、滅菌環境において調製するのみで容易に滅菌形態で得ることができ、血清成分は滅菌濾過工程に容易に施すことができるので、即使用可能な(ready for use)滅菌製剤を直接得ることができる。
【００４３】
次に、ペースト状グロビンまたは乾燥グロビン粉末を血清に混合し、本発明に係る製剤を形成してもよく、あるいはペースト状グロビンまたは乾燥グロビン粉末と血清を別個に保存し、後で混合してもよい。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態によれば、グロビンを得るためのこの方法は、血清を分離したのと同じ血液凝固物を使用できるので、同じ全血、例えば、患者自身から得た20mLの血液試料から血清およびグロビン成分の両方を調製することができる。
【００４５】
本発明の別の目的は、本発明に係る製剤の有効量をそれを必要とする患者の再生すべき組織内または表面に投与する工程を含む、組織の再生方法である。
【００４６】
好ましくは、前記製剤は、前記組織内または表面に移植される。
【００４７】
一の実施形態では、本方法は、しわまたは他の皮膚欠陥を充填するための方法である。本製剤は、該製剤におけるグロビンの濃度が、好ましくは少なくとも12%、より好ましくはそれより高く、細い注射針を用いて注入可能なペーストの形態で使用できる。
【００４８】
別の実施形態では、本発明は、例えば、単独または他の増強材料と組み合わせもしくは混合させて、欠損括約筋、声帯、歯周組織を含む組織を増強するため、または、唇、頬、または他の身体部分を増強する整形または美容整形するための方法を提供する。かかる用途において、本製剤は、ペーストの形態で、好ましくは注入により、使用するのが好ましい。
【００４９】
別の実施形態では、本発明は、例えば手足の血管新生が局所的に貧弱な糖尿病患者または動脈もしくは静脈の疾患に罹患した患者、または創傷を有する患者における体内内部の外科創傷、器官の一部分、もしくは皮膚組織の慢性創傷を治癒するための方法を提供する。
【００５０】
別の実施形態では、本製剤は、壊死組織の切除後の深い熱傷創傷における肉芽組織の再生を促進するために使用することも可能である。この工程は、インビトロで培養した上皮シートの移植に重要である。
【００５１】
従って、本発明は、自家血清を使用することを可能にし、自家血漿由来物を使用する必要がない。本発明に係る製剤は、血漿由来物(31)よりも、成長因子の含有量が高いことが確実なので、再生特性の点から決定的になり得る。これにより、簡単な方法で最終製剤の滅菌性を確保できる。血小板が存在しないので、膜濾過による血清の最終滅菌が可能になる。更に、本発明に係る製剤は、液体またはフィブリンベースのゲルを含む血小板に比べ、グロビン成分および血清成分の安定性が優れているので、長期間保存できる。血清は、4℃で数日間安定であり、その最終的な使用のために解凍するまで、凍結状態で数年間保存し得る。
【００５２】
血漿とは対照的に、血清には凝固系の活性成分が存在しないため、血清自体はこれ以上固化できない。血清は、明らかに、注入部位から速やかに拡散する液体である。血清とコラーゲン粒子を混合する試みは全て成功しなかった。滅菌コラーゲン粒子またはゲルは、生理的pHで血清と混合した場合、しかるべき期間、膨潤しない。インキュベーション期間の後であっても、得られた混合物は、均質ではなく、適当な大きさの針で注入できない。ヒアルロン酸ベースの粒子又はゲルのような他の親水性ポリマーは、血清と接触しても膨潤し得る。しかし、それらは電気的に陰性という性質を有するため、細胞が、接触、成長、および分化して新しい組織を再生できなくなるので、組織再生のための使用は好ましくない(32)。驚くべきことに、自家血清を不溶性グロビン粉末と混合すると、15〜20%（ペーストの重量あたりのグロビンの重量）という非常に高濃度のペーストを調製することが可能になる。このように15%以上という高濃度は、Tayotの米国特許第6949625号に従うと調製できず、調整できたとしても細い皮下用の針(30g)を用いて確実な注入ができなかった。血清と15〜20%のグロビンとの新規な混合物（「セログロビン(seroglobin)」）は、層流下で滅菌状態で調製できる。また、シリンジに分注して、使用前は冷凍庫に保存し、後に、何年か後であっても、解凍可能にすることもできる。医師または外科医は、いかなる中間作業行わずに即使用できる。驚くべきことに、凍結および融解後であっても、セログロビンペーストは、高濃度にもかかわらず非常に細い皮下注射針を使用して容易に注入でき、皮膚充填剤として、または再生医療用途に使用できる。
【００５３】
更に、本発明は、血清と添加物との最終混合物の「自家」状態を維持することができる。自家とは、いかなる外来添加物も用いず、注入用材料のすべての成分が患者自身から得られたことを意味する。これは、安全性の点、患者の受容度の点、そして、この新規な生体材料が規制当局の承認を得やすくなる点から、非常に重要である。例えば、血清は、いかなる添加物も有さず、凝固血液から容易に分離される天然の液体生成物である。対照的に、PRP（これも自家由来である）は、使用前に、患者にとって外来の成分であるカルシウム塩および/またはトロンビンと混合しなくてはならない。従って、注入PRP由来製品は、この点で完全に自家由来ではなく、規制当局の承認を得るのに複雑な問題が生じるおそれがある。グロビンが、血清との混合物に高粘度性を与えるために、同じ患者の血液から調製可能な唯一の添加物であることが見出された。グロビン粉末中には、不純物やグロビン以外の他の成分は存在しない。よって、グロビン粉末は、患者自身の血液から調製される場合、本当に自家由来物とみなすことができる。このことは、実施例２に例示されており、実施例２では、血清が第１の血液試料から調製され、グロビンが第２の血液試料から調製される。
【００５４】
本発明の好ましい実施形態は、驚くべきことに、患者の血清を非血縁ドナーから調製されたグロビンと混合することも可能である。他の血液型を有するレシピエントにとって望ましくない抗体を含有する血清とは対照的に、グロビンは、抗体または感染物質を含有しないので、レシピエントが同じでなくても安全に使用することができる。
【００５５】
我々は、本発明の別の態様において、同じ凝固血液試料から血清およびグロビンを調製することができることを発見した。これまでに、グロビンを調製するための工程はいずれも、クエン酸ナトリウム、EDTAまたはヘパリンのような抗凝固剤を用いて、採取した血液から出発していた。これは、遠心分離工程によって血漿から赤血球を分離した後に、赤血球を水中で溶血させて精製ヘモグロビンを調製するのに最も簡単な方法として知られていた。驚くべきことに、他の血液タンパク質をも含みうる血液細胞およびフィブリンの凝塊から出発し、高純度のグロビンを調製することが可能である。かかる場合、血清を凝固血液の上清画分から直接入手可能できる。その後、赤色の血液凝固物を食塩水で洗浄した後、そこからグロビンを抽出できる。この方法の例が、実施例３に開示されている。工程の最後に、単一の血液試料から調製した各量の血清およびグロビン粉末より、15%以上の適切な濃度の「セログロビン」ペーストが調製できる。これは、実施例２および３において示すように、2倍量の因子を有するように、患者から採取した血液の容量を例えば40mLから20mLにできるので、患者にとって重要な利点である。
【００５６】
本発明の実施形態を、以下の実施例において、図面と関連させて非限定的に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、血液凝固物から調製したグロビンのSDS-PAGE電気泳動の写真である。
【００５８】
【図２】図２は、顕微鏡写真１である。皮下組織の界面では、浸潤食細胞（マクロファージおよび巨細胞）は中程度の線維増殖が活性であり、線維芽細胞は線維増殖の活性はわずかであることが示された（マッソンのトリクローム染色、グロビンは赤色になる）。
【００５９】
【図３】図３は、顕微鏡写真２である。ある領域では、物質が元々存在していた対象の皮膚コラーゲンと直接接触して、組織反応がないことが示される。この最終的な特徴は、この物質が完全に局所耐性であることを示す（マッソンのトリクローム染色、グロビンは赤色になる）。
【００６０】
【図４】図４は、顕微鏡写真３である。コラーゲン沈着は、物質内でIII型コラーゲンや主要なI型コラーゲン沈着が認められた。線維症があるという証拠は、この段階では認められなかった（コラーゲンマトリックスの組織形態計測的定量化用のピクロシリウスレッド染色）。
【００６１】
【図５】図５は、顕微鏡写真４である。物質を取り囲むようにまたは物質内部で新たに形成され成長した組織内で、中程度の新生血管が形成された（血管マーカーであるアルファ平滑筋アクチンによる染色）。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００６２】
実施例１：凝固血液由来の自家血清製剤
20mLのヒト血液を患者から静脈穿刺により採取し、いかなる抗凝固剤も含まない５本の乾燥Vacutainer（登録商標）チューブに回収する。これらのチューブは、血液が凝固するまで室温で30分間保存した後、4℃で保存する。1日以上経過した後、全ての血液チューブの内容物を100mLの容器に注ぐ。25mLの滅菌ピペットで血清を回収し、20mLのルアーシリンジに導入する。この20mLシリンジを、0.2μm膜を備える滅菌シリンジフィルターに連結する。血清溶液をろ過し、約11mLの滅菌血清を別の20mLの滅菌シリンジに回収する。血清シリンジをシリンジのキャップで閉鎖し、その後すぐ4℃で使用するまで保存する。
【００６３】
実施例２：同じ患者由来の異なる血液試料から得た自家ヒトグロビン粉末の製剤
20mLのヒト血液を患者から静脈穿刺により採取し、EDTAまたはクエン酸塩を含む５本の乾燥Vacutainer（登録商標）チューブに回収する。その後これらのチューブは4℃で保存し、２週間保存できる。血液は、２つの50mLの遠心バケット内に入れ、生理食塩水で希釈する。3分間2000rpmで遠心分離した後、上澄み血漿を除き、新しい生理食塩水に置換する。2回洗浄した後、赤血球ペレットを回収し30mlの水を用いて溶血を誘導する。5分かけて溶血を完了する。１つの遠心バケットにヘモグロビン懸濁液を移す。20℃、3000rpmで１０分間の遠心分離工程を１回行うことによってヘモグロビン溶液を清澄化する。清澄化ヘモグロビン溶液に、0.9mLの1Mグリシン、次いで0.45mLの1M亜硝酸ナトリウムを添加する。ヘモグロビンがメトヘモグロビンへと酸化されると赤色から黒色になる。次いで、12N濃塩酸5mlを含む500mlのアセトンを激しく撹拌しながら、上記酸化血液溶液を滴下により添加する。ヘムの黒色色素をアセトンで抽出しつつ、白っぽいグロビンを直ちに全ての残留血液タンパク質と共に沈殿させる。懸濁液を、その後、約1ミクロンの空隙率を有する長方形の繊維ろ過膜を用いてろ過する。このろ過膜は、チューブを形成するように長さ方向に沿って巻かれており、膜の両側は互いに結合されている(例えば:SEFAR NITEX 03-1/1 fabric社の超音波結合による20mmの内径を有するチューブ）。チューブの一端は、懸濁液をろ過するための漏斗に連結されており、他端はクリップで閉じられている。グロビン沈殿物をチューブ内に蓄積しつつ、着色アセトン溶液をすみやかに濾過する。アセトンを再利用するために、アセトン溶液は、排出する前に保持容器へ移してもよい。ろ過の終わりに、酸沈殿物を200mlのアセトンに再懸濁し、次いで、同一のチューブを使用して再びろ過し残留している微量の色素を除去した。酸グロビン沈殿物を100 mLの滅菌蒸留水に溶解し、溶液を滅菌0.45μmまたは/および0.2μm多孔性膜を用いてろ過する。酸性のpH（=2.5）を、1N NaOHの添加により中性値に調整する（pH7.0±0.2）。グロビンは重いので下方に沈殿する一方、他の残留タンパク質は可溶状態のまま上清内に残留する。精製グロビンの中性沈殿物を、先に使用した同じろ過メッシュ上で洗浄する。最後に、不溶性グロビンペーストをアセトンにより洗浄して水分を除去し、次いで空気流または真空下で乾燥し、中性の不溶性グロビン粉末を調製する。グロビン粉末は、2.05gの重量があり、5mLのルアーシリンジに分注する（シリンジあたり500mg）。残った量の粉末は、培養培地に接種して無菌性を検査するために使用する。層流下で調製する場合、この粉末を直接滅菌してもよい。必要であれば、不溶性グロビン粉末を、5〜30kGrayの線量でベータ又はガンマ線照射によって滅菌してもよい。
【００６４】
実施例３：血清製剤に使用する同じ凝固血液から得た自家ヒトグロビン粉末の製剤
実施例１に続き以下の操作を行った。つまり、実施例２とは逆に、別の血液試料を必要としないという意味である。血清除去後に残った血液凝固物を、滅菌生理食塩水（9g/LのNaCl溶液）で洗浄した。穏やかに攪拌しながら2分間インキュベートし、ピペットを用いて洗浄用の生理食塩水を除去する。生理食塩水で再び容器を満たし、同し操作を3回繰り返す。1本の30mLシリンジに血液凝固物を導入する。約20mLの滅菌水でシリンジを充填する。血液凝固物を分離させ、カプラを用いてシリンジの内容物を別の30mLシリンジに移すことによりホモジナイズする。溶血を5分間で完了し、正確に実施例２と同様に進める。
【００６５】
最後に、不溶性グロビンペーストもアセトンにより洗浄して水分を除去し、次いで空気流または真空下で乾燥し、中性の不溶性グロビン粉末を調製する。グロビン粉末は、2.15gの重量があり、5mLのルアーシリンジに分注する（シリンジあたり500mg）。残った量の粉末は、培養培地に接種して無菌性を検査するために使用する。滅菌層流下で調製する場合、この粉末を直接滅菌してもよい。必要であれば、不溶性グロビン粉末を、5〜30kGrayの線量でベータ又はガンマ線照射によって滅菌してもよい。実施例２および３により調製したグロビン粉末の純度をSDS PAGE電気泳動によって比較した。いずれの製剤も、16kdのモノマー、いくつかの32kdダイマー、および目に見えない不純物という同じプロファイルを示した（写真１参照）。実施例３のグロビンは血液凝固物から調製されたという事実にもかかわらず、驚くべきことに、その純度は、精製度の高いヘモグロビン溶液から調製された実施例２のグロビンの純度と同等であったと結論できる。
【００６６】
実施例４：最終「セログロビン」ペーストを調製するための同じ患者から得た自家血清及び自家グロビン粉末の混合
液体と粉末を混合する際、粉末に含まれる空気を排出することが好ましい。ペースト内に加圧空気がある場合、シリンジを開口し、針による滅菌注入をできなくするかまたは少なくとも注入しにくくすると、ペーストから自然に排出させることができる。滅菌三方ルアー栓（Cole Parmer参照番号＃S-31200-80）を、粉末から空気を排出させるために使用できる。また、標準栓も、同じ操作手順で使用できる。三方栓により、２つの方向を手動で連結し３つ目を閉鎖することが３種類の組み合わせで可能になる。500mgのグロビン粉末を含む、実施例２または３のいずれかの5mLシリンジは、滅菌層流下で、栓の一方向のルアーアダプタに連結されている。血清を含むシリンジは、反対側のチャンネルに連結され、栓内の気泡は、垂直チャネルを介して血清滴を排出することによって除去される。１つの30mLの空の滅菌シリンジは垂直チャンネルに連結されている。粉末シリンジ内に含まれる空気の排出は、30mLシリンジのピストンを引いて、粉末粒子の周囲を十分に真空にすることによって可能となる。粉末と血清とが直ちに接触するようになる。血清は、粉末内に吸引され、ピストン内に目に見える全ての空間を充填する。加圧空気は、シリンジ内に導入されない。シリンジを開口すると、全グロビンペーストがシリンジ内に残る。ルアーの連結により、シリンジから材料が出ず清潔なまま残る。残りの血清を含むシリンジと粉末を含むシリンジを直接連結した後に、ペーストを再構成およびホモジナイズしてもよい。得られたペーストのホモジナイズは、一方のシリンジの内容物を他方のシリンジに移しかえることを10回繰り返すことによって行われる。その後、小口径（0.2mm）のコネクタにより、最終ペーストが非常に細い30ｇの皮下注射針を用いて容易に注入可能であることを確認できる。
【００６７】
同量の血清または生理食塩水を、500mgの粉末と混合する試験に供した。2.5mLの血清では、ペースト中のグロビンの最終濃度は、16.7% w/wとなる(500mg/2500mg+500mg)。その後、ダイナモメータを使って、30gの針を用いた注入を行った。ペーストを注入するために必要な圧力は一定して25ニュートン未満であった。同容量（2.5mL）の生理食塩水をだと、得られたペーストのホモジナイズが困難で、30gの針を用いた注入ができなかった。2.5mLの代わりに、3.5mlの生理食塩水を500mgのグロビンの粉末に加えると、ペースト中のグロビンの濃度が12.5% w/w(500mg/3500mg+500mg)となる。この場合、30gの針を用いた注入するのに記録された圧力は、十分であり25ニュートン未満であった。
【００６８】
このバッチの5mLシリンジ内の血清とグロビン混合物を全て、20mLのシリンジに収集する。グローバルペーストをホモジナイズしてから、1mLのBDシリンジ（シリンジあたり0.8mL）に分注し、患者に注入するまで、-20℃で凍結保存する。16個の同一の「セログロビン」のシリンジは、実施例２と同様にして40mLの血液試料から調製してもよいし、実施例３のように１つの20mL凝固血液試料から調製してもよい。室温で1mLシリンジを解凍した後でも、セログロビンペーストは、最初の状態と同じ状態にあり注入可能である。医師は、シリンジの自然解凍以外の中間操作を必要としない。
【００６９】
実施例５：自家「セログロビン」のシリンジを調製するのに好ましい操作手順及びその医学的応用
患者は、特定の診断実験室で20mLの自家血液を採血するよう医師により勧められる。
【００７０】
血液は、抗凝固剤を含まない乾燥チューブ内に吸引され、個別にラベルし、室温で30分間インキュベートし、パッケージに入れ、特定の製造先に送付するまで、4℃で冷蔵する。血液チューブは、必要に応じ、1〜2週間4℃で保存できる。
【００７１】
追加血清試料で必要な全てのウイルスマーカーについて検査するので、対応する血液試料が不要になり、患者に別の代替を提供する。
【００７２】
凝固した血液は、好ましくは、実施例１および３に従って処理する。
【００７３】
次いで、20mLの凝固血液から調製した自家グロビン粉末と自家血清を、実施例４に従って混合し、シリンジあたり0.8mLのペーストを含むシリンジを約16個調製する。ペーストにおけるグロビンの濃度は、12〜20%(w/w)の間で異なり得る。
【００７４】
一人の患者から得た全シリンジを個別にラベルし、ラベルした滅菌袋に包装し、これをラベルした１つの大きな袋に収集する。全ロットは、その後最大5年間、-20℃で凍結する。各ロット毎に１つのシリンジを、滅菌性を管理するのに使用する。
【００７５】
シリンジのリストは、安全かつ個人毎のインターネット回線を介し各患者および医師にアクセス可能である。
【００７６】
医師の要求に応じて、適切な数のシリンジを4℃で出荷し、数日以内（4℃なら一週間以内）に注入しなくてはならない。
【００７７】
治療対象の患者から得た自家血清を、その患者とは無関係の血液ドナーから得たグロビン粉末と混合することによって、同様のシリンジを製造できる。
【００７８】
セログロビンの主な適応は、反復注入による皮膚の折り目（folds）やしわ（wrinkles）の補正、唇、頬、胸、筋肉のような軟組織の増強、並びに急性および慢性創傷の治癒である。
【００７９】
セログロビンは、線維芽細胞、角化細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、幹細胞のような細胞や、脂肪吸引から得た脂肪組織のような組織抽出物、または骨の断片と混合して、移植前後の生存率を改善するために使用できる。
【００８０】
実施例６：同じヒトドナーにおける自家セログロビンの皮内移植の再生特性に関するインビボでの実証
2gの自家グロビン粉末を10mLの自家血清と混合した。これらは、両方とも、実施例４に従って20mLの凝固血液から調製した。自家セログロビンペーストの最終体積は14mLであった。試料は、滅菌性および注入可能性について品質管理するために使用した。14個の残りのBD Luer Lok 1mLシリンジは、シリンジあたりそれぞれ0.8mLのペーストを含有しており、2013年3月26日に-20℃で凍結保存した。ペーストのグロビン濃度は16.6%(w/w)であった。このロットの１つのシリンジは30分間室温で放置した。このシリンジを用いて、各回0.2mLずつ、30gの針により対象の左上腕の皮内に3回注入した。1、2、3、7、16、23、30、40、51および58日後に写真を連続的に撮影した。第一の生検は、30日後に、外科医によって採取した。第二の生検は、58日後に採取した。２つの生検は、委託専門会社に受注し、サンプリング後24時間、10%(w/v)中性緩衝ホルマリン溶液内に投入した。製剤化する前にマクロの写真を撮影した。固定後、それぞれ個々の生検を、長手方向に等分して切断した。2つの部分の生検は、アルコール溶液に浸潤しその濃度を増加させながら脱水し、キシレンで透徹し、パラフィンブロックに包埋した。１つのブロックは、さらなる分析のために保存し、もう１つは、ミクロトームで切片化した(切片厚：5μm±0.5μm)。４つの連続切片をミクロトーム（MICROM（登録商標）、フランス）を用いて調製した。
【００８１】
１つの切片は、一般的な形態および細胞外マトリックスを評価するためにマッソントリクローム染色をした。
【００８２】
１つの切片は、炎症反応分析のためにサフラニン・ヘマトキシリン・エオシンで染色した。
【００８３】
１つの切片は、コラーゲンマトリックスの組織形態学的定量のためにピクロシリウスレッドで染色した。
【００８４】
１つの切片は、α-SMA血管マーカーの免疫組織化学的特性（IHC）を決定するために使用した。
【００８５】
切片は、2倍、10倍、20倍、及び40倍の対物レンズを取り付けたNikon Eclipse 80iの顕微鏡にデジタルカメラNikonを装着して評価した。局所的な効果についての半定量的評価は、炎症反応（多形核細胞のPMN、リンパ球、形質細胞、マクロファージ、および巨大細胞/破骨細胞）、フィブリン、壊死、新生血管、劣化、および材料堆積の評価を含め、0〜４段階の評価尺度で行った。
【００８６】
関心領域の顕微鏡写真を撮影した。セクション全体のデジタル化も行った。
【００８７】
切片を、カラー画像分析システムを用いて評価した。関心領域の組織形態学的な測定には、インプラント材料と各々の残留物質の内部および周囲に形成された新しいコラーゲンマトリックスが含まれる。定量的な組織形態学的分析を行い、残留インプラントの表面積量、コラーゲン含有量の合計、およびＩ型コラーゲン/III型コラーゲンの比率を決定した。
【００８８】
以下の段落は、独立機関により実施された試験の公式報告書からの引用である。
【００８９】
「移植の2カ月後に採取した皮膚生検では、3つの閉じた部分に断片化され周囲の皮内組織に良好に組み込まれている試験品の存在が大きく示された。試験品の１つの部分は、皮下組織の界面に位置していた。皮下組織の界面では、浸潤食細胞（マクロファージおよび巨細胞）では中程度の線維増殖が活性であり、線維芽細胞での線維増殖の活性はわずかであることが示された（顕微鏡写真１）。物質材料の他の表面では、同様の組織応答をわずかに低い程度で示した。リモデリングは、皮下組織の界面でより強烈であることが示された。ある領域では、物質が元々存在していた対象の皮膚コラーゲンと直接接触して、組織反応がないことが示される（顕微鏡写真２）。この最終的な特徴は、この物質が完全に局所耐性であることを示す。コラーゲン沈着は、物質内でIII型コラーゲンや主要なI型コラーゲン沈着が認められた（顕微鏡写真３）。線維症があるという証拠は、この段階では認められなかった。物質を取り囲むようにまたは物質内部で新たに形成され成長した組織内で、中程度の新生血管が形成された（顕微鏡写真４）。」
【００９０】
我々の知る限りにおいて、本明細書のような特徴を有するセログロビン材料以外に、いかなる炎症反応も引き起こさず、細胞の遊走および定着による局所的な組織再生を誘導することが可能な、このように十分許容可能な材料については、これまでに記載されていない。
【００９１】
実施例７：セログロビン混合物を使用する主な治療適応
この新規製剤は、しわまたは他の皮膚欠陥を充填するため；ならびに/あるいは、単独または他の増強材料と組み合わせもしくは混合させて、欠損括約筋、声帯、歯周組織を含む組織を増強するため、または、唇、頬、もしくは他の身体部分を増強する整形または美容整形のため；を含む、組織を再生する治療方法において、好ましくは注入により使用するための製剤である。また、この新規製剤は、糖尿病患者または手足の血管新生が局所的に貧弱な動脈もしくは静脈の疾患に罹患した患者、または創傷を有する患者における内部の外科創傷、器官の一部分、もしくは皮膚組織の慢性創傷を治癒するため；ならびに/あるいは、壊死組織の切除後の深い熱傷創傷における肉芽組織の再生を促進するために使用できる。創傷の治療用に、セログロビンは、粉末またはペーストとして直接使用、または多孔性または非多孔性のシートや繊維と共に使用できる。また、多孔性メッシュと共に使用してもよい。部分的または完全に治癒した後で、傷口からはがれるのを避けるために、関連するすべての材料は、好ましくは、必要に応じ生体吸収性であるべきである。
【００９２】
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