(57)【要約】  走査手段（１０、８Ａ、８８）を用いてサンプルの蛍光点（９、１１）を走査し、それにより、走査された蛍光点を取得する工程と、走査された蛍光点を表示手段に画像形成する工程と、を含む蛍光サンプルの画像形成方法であって、当該走査は、走査可能な蛍光点（９、１１）の集合を含む、サンプルの走査野を予め決定する工程と、照射手段（４、８Ａ、８Ｂ）を用いて、当該点の集合の少なくとも１つの第１の部分集合及び当該点の集合の少なくとも１つの第2の部分集合を、順次に、照射する工程と、含む蛍光サンプルの画像形成方法である。ここで、当該第1の部分集合は当該点の集合を補完する。第１の部分集合及び第2の部分集合は、異なる焦点照射距離（Ｐ１、Ｐ２）で、照射可能である。【選択図】  図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出手段（１０，８Ａ，８Ｂ）によって前記サンプルの蛍光点（９，１１）を検出し、検出された蛍光点をそこから取得する工程と、
前記検出された蛍光点の画像を表示手段（１２）に形成する工程と、を含む蛍光サンプルの画像形成方法であって、
前記検出は、
蛍光の検出可能な点（９，１１）の集合(set)を含む前記サンプルの走査野（２）を事前に定義する工程と、
第１の初期工程において、照射装置（１０）によって生成された第１の照射手段（８Ａ）によって前記検出可能な点の集合の第１の点（９）の少なくとも第１の部分集合を静的に照射する工程と、
前記照射装置（１０）をリセットして、前記第１の照射手段（８Ａ）とは異なる第２の照射手段（８Ｂ）を生成する工程と、
後続の照射工程において、前記第１の点（９）とは異なり、前記第１の部分集合に追加されると前記検出可能な点の集合を形成する、前記リセットされた照射装置（１０）によって生成された前記第２の照射手段（８Ｂ）によって前記検出可能な点の集合の第２の点（１１）の少なくとも第２の部分集合に静的に照射し、
検出点の前記第１の部分集合及び第２の部分集合を相互に補足することによって前記表示手段（１２）上に画像を完成させる工程と、を含むことを特徴とする蛍光サンプルの画像形成方法。
【請求項２】
前記第１の照射手段は、前記第１の部分集合の点を含む第１の検出ネット(detecting net)を画定するレーザー光線の第１の光束（８Ａ）を含み、かつ、前記第２の照射手段は、前記第２の部分集合の点を含む第２の検出ネットを画定する検出レーザー光線の少なくとも第２の光束（８Ｂ）を含み、レーザー光線の前記第１の光束（８Ａ）と第２の光束（８Ｂ）が前記照射装置（１０）によって生成される、請求項１に記載の蛍光サンプルの画像形成方法。
【請求項３】
前記照射装置は空間光変調器(spatial light modulator)（１０）を含む請求項１に記載の蛍光サンプルの画像形成方法。
【請求項４】
前記照射は、前記サンプルに関して第１の焦点照射距離（Ｐ１）における前記第１の部分集合を照射すること、及び、前記サンプルに関して前記第１の距離（Ｐ１）とは異なる第２の焦点照射距離（Ｐ２）において前記第２の部分集合を照射すること、を含む請求項１に記載の蛍光サンプルの画像形成方法。
【請求項５】
前記第１の部分集合及び第２の部分集合は、前記検出可能な点の集合に関して相互に補足する、請求項１から４までのいずれか１つに記載の蛍光サンプルの画像形成方法。
【請求項６】
検出光線手段（４）の光源（５）と、
前記検出光線手段（４）の位相を、前記サンプルの検出可能な点（９）の第１の部分集合の検出サブ光線の少なくとも第１の光束（８Ａ）及び検出可能な点（１１）の第２の部分集合の検出サブ光線の第２の光束（８Ｂ）に変更を加えるように設計された位相変調手段を備えた空間光変調器８１０）と、を含むことを特徴とする蛍光サンプルの画像作成装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出された表面の画像を生成するために一般に使用可能な二光子蛍光顕微鏡(two-photon fluorescence microscopy)検査法として知られる技術を使用して蛍光サンプルを撮像する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光走査は、そのエッジおよび表面点、すなわち検出面における周囲長コンフォーメーション(perimeter conformation)の検出を可能とする蛍光体を搭載したサンプルを検出可能な顕微鏡に搭載された走査ヘッドを用いて実行されることが多い。
【０００３】
より詳細に述べると、この種類の走査は走査対象の立方ミクロン程度の微量のサンプルに対して合焦されるパルス赤外レーザー光束の使用を必要とする。
【０００４】
蛍光色素がこの微量のサンプル中に存在する場合、蛍光を発し、それがカメラなどによって感知され、例えば表示画面などに蛍光信号を表示する装置に送信される。
【０００５】
典型的に、撮像対象の表面はレーザー光束が合焦される表面領域よりも通常非常に大きいため、顕微鏡の走査ヘッドを形成する追加装置であって、撮像対象の表面全体が走査されるまで、所定の方向、典型的に平行な重複行に沿って、レーザー光束を動かすことが可能であり、それによって蛍光体の個別蛍光発光をとらえることによって最終的な画像を得る追加装置を提供することによってのみ、サンプルの表面全体は撮像可能である。
【０００６】
また、サンプル表面のより大きな走査は、回折光学素子（ＤＯＥ）として知られる装置を使用して実現される。ＤＯＥは、レーザー光束の適切な位相変調を提供して、サンプルの複数の蛍光点を同時に照明する平行サブ光束の１つの光束にレーザー光束を分割し、それによって実験者が使用可能な点の固定分布が可能となる。
【０００７】
照明された点が蛍光の場合、蛍光信号が生成され、表示装置に送られる。
【０００８】
その場合でも、先行技術の装置はある欠点を有する。
【０００９】
第１の欠点は、サンプルの点をすべて走査するためにレーザー光束を変位させることが可能な顕微鏡走査ヘッドは、その複雑な構造のためコストが非常に高いことである。
【００１０】
第２の欠点は、ＤＯＥ装置の使用は、サブ光束の固定分布のみを提供できるため、十分な解像度を有する最終的な画像を得るために光束変位装置(a beam displacing apparatus)と関連付けられなければならないことである。
【００１１】
なお、理論上、走査点に関して高解像度を有する走査は、レーザー光束の位相を変えてレーザー光束が入射する点の数を著しく増加させることによって実現してもよい。
【００１２】
その場合も、点の増加によって、サンプルを照らすために必要な電力も比例して増加するが、現在のところ既知のレーザー源のいずれにおいても利用可能ではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の１つの目的は先行技術を改良することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、蛍光点検出のために撮像が求められるサンプル表面上で走査光束を変位させるための追加の装置を有さない顕微鏡を使用してサンプルの画像を提供できる蛍光サンプル撮像方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一態様において、本発明は請求項１の特徴によって定義されるような蛍光サンプル撮像方法を提供する。
【００１６】
本発明の別の態様において、本発明は請求項６の特徴によって定義されるような蛍光サンプル撮像装置を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によって以下の利点が達成される。
・  サンプル要素の二光子蛍光顕微鏡検査法撮像のために顕微鏡に搭載される走査ヘッドの構造を著しく単純化する。
・  より複雑かつ高価な構造を有する先行技術の装置を用いて得られる解像度がほぼ備わる画像を得る。
【００１８】
本発明のさらなる特徴および利点は、以下に示す添付図面によって非限定的な例として示される蛍光サンプルを撮像する方法の好適な非排他的実施形態の詳細な説明を読むことにより理解が深まる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】走査野の概略図の第１の概略的な例であり、走査光束の第１の分布によって照射される点の第１の部分集合(subset)を示す。
【図２】走査野の概略図の第２の概略的な例であり、第１の部分集合を補い走査光束の第２の分布によって照射される点の第２の部分集合を示す。
【図３】走査可能な蛍光点の集合(set)の全体図の概略的な例である。
【図４】走査野の概略図の第３の概略的な例であり、走査光束の第３の分布によって照射される点の第３の部分集合を示す。
【図５】走査野の概略図の第４の概略的な例であり、走査光束の第４の分布によって照射される点の第４の部分集合を示す。
【図６】走査野の概略図の第５の概略的な例であり、走査光束の第５の分布によって照射される点の第５の部分集合を示す。
【図７】走査可能な蛍光点の追加集合の全体図の概略的な例である。
【図８】本発明の方法を実現するスキャナ装置の全体的な概略図である。
【図９】本発明の方法の工程のフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
図１〜図３において、１は走査野２を一般的に形成する、例えば行「Ｆ１〜Ｆ７」および列「Ｃ１〜Ｃ７」を有する格子によって表されるサンプル要素を示し、ここでは平面図で示す。
【００２１】
図示した格子はあらゆる周囲長および構成を有してもよく、上述したように、分析対象サンプルの概略的かつ非限定的な例に過ぎないことを当業者は理解するであろう。
【００２２】
図３に示すように、走査野２は、蛍光であるという共通の特徴を有するため光源５によって射出され図８において点線で示すレーザー光束４などの走査光束が入射すると検出可能な検出可能点の集合を含む。
【００２３】
走査野２に照射する前に、レーザー光束４は１０で示す既知のＳＬＭ（空間光変調器）装置によって変調され、走査レーザーサブ光束の第１の光束を形成する第１の所定数のサブ光束８Ａに分割される。
【００２４】
第１の初期検出工程において光束８の第１の分布がサンプル１を照射すると、第１の垂直な走査面、典型的に走査野２が存在する面「Ｐ１」上に第１の検出点の第１の部分集合を生成する。この第１の部分集合は慣習的に図１〜３で小円９として示され、以下第１の点９とも呼ぶ。
【００２５】
この第１の走査点の第１の部分集合は、画像（画素単位）の第１の部分を提供し、それが表示装置に送信され（図８において概略的に１２で示す）、撮像された全体的な画像の第１の部分を再構成する。
【００２６】
本発明のＳＬＭ装置１０によって射出されたレーザー光束を空間的に構成および組織するプログラムに変更を加えることによって、検出レーザーサブ光束８Ｂの第２の光束が得られる。検出レーザーサブ光束８Ｂの第２の光束は第１の光束８Ａとは空間的に異なり、後の検出工程においてサンプル１を照射すると、第２の検出蛍光点の第２の部分集合を生成する。第２の検出蛍光点の第２の部分集合は図面において慣例的に×印１１で示され、以下第２の点１１とも呼ぶ。
【００２７】
図３を参照して上述したように、この例示の場合において、第２の部分集合の第２の点１１の数は、走査野２の検出可能点の集合を形成する点の総数に達するように、第１の点９の数を補完する。
【００２８】
第２の部分集合の第２の画像部分は表示装置１２にも送信され、表示装置１２はそれを前に撮像した第１の部分と統合して、サンプル１の走査野２の画像全体を形成する。
【００２９】
なお、本発明によると、三次元画像は、光束８Ａおよび８Ｂが通過するＳＬＭ装置の下流に配置される集束装置２０のレンズ１３の焦点を調節することによって撮像および再成が可能である。
【００３０】
この場合、走査点１１の第２の部分集合は、面「Ｐ１」とは異なる、通常それに平行な第２の面「Ｐ２」上で検出される。
【００３１】
焦点を変えて複数の面に対して走査を繰り返すことによって、表示装置１２に対して送信され三次元の画像を再構成する画像の撮像が可能となる。
【００３２】
なお、「ＳＬＭ装置のプログラムに変更を加える」という表現は、レーザー光束８Ｂの位相分布が第２の検出を実行するために選択され、実験者によって選択され第１の検出のために使用された光束８Ａとは異なる照度分布が分析対象のサンプル面で得られるようにすることを意味することを意図することに留意されたい。
【００３３】
図９において、本発明によるサンプル撮像方法の一連の工程を例示するフローチャートを示す。
【００３４】
特に、工程１００は画像撮像／取得方法の開始を示し、その後に走査野２の第１の検出可能点９の第１の部分集合の検出を選択する工程１０１が続く。
【００３５】
工程１０１の実行後、工程１０２において、ＳＬＭ装置１０が第１の選択点９の第１の部分集合におけるサンプルを照射することによってホログラム・テンプレートを使用してレーザーサブ光束の第１の光束８Ａが生成される工程が開始される。
【００３６】
次の工程１０３において、検出点９の第１の部分集合は、選択工程１１０からの流れ線１０４に沿って表示手段１２に送信されて、工程１０５に進む。工程１０５において、構成及び表示対象の画像の再構成が開始する。
【００３７】
次の工程１０６において、表示手段１２において構成される画像の第１の部分が開かれ、後続の工程１０７において画素輝度がこの第１の部分に対して割り当てられる。
【００３８】
選択工程１１０からの流れ線１０８によって示されるように、流れ線１０４の代替として、本発明の検出方法の第１の部分は検出可能点１１の少なくとも１つの第２の部分集合の検出のための後続の工程において繰り返され、それによって構成される画像の第２の部分が定義され、上述したように、工程１０５とさらに後続の１０６、１０７に送られる。
【００３９】
この工程１０７の後、検出された画像部分の少なくとも両方に対して画素輝度が割り当てられると、選択工程１１が実行され、検出点のさらなる部分集合に対して本方法が工程１０６から繰り返される。
【００４０】
検出可能点のすべての部分集合が検出されると、流れ線１１２の後、本発明の方法は画像再構成工程１１３を含み、その後、検出点９及び１１の部分集合を結合することによって再構成された画像の特定の関心点を選択する工程１１４、関心点のホログラム・テンプレートを作成する工程１１５、ホログラム・テンプレートを用いてＳＬＭ装置１０をプログラミングする工程１１６、さらにカメラによってその画像を撮像する工程１１７が実行される。
【００４１】
本発明は意図した目的を達成することがわかる。
【００４２】
そのように考えると、本発明は本発明の概念の範囲内において変更及び変形が可能である。
【００４３】
また、上述の詳細のすべては技術的に等価の要素によって置き換えられてもよい。
【００４４】
実用的な実施形態において、以下の特許請求の範囲によって定義される範囲から逸脱せずに必要に応じてあらゆる材料、形状及び寸法が使用されてもよい。
【符号の説明】
【００４５】
２  走査野
４  検出光線手段
５  光源
８Ａ，８Ｂ  照射手段
９，１１  蛍光点
１０  照射装置
１２  表示手段
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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