(57)【要約】  ドナーから腎移植を受けた患者において、慢性同種移植片腎症（ＣＡＮ）を発展させるリスクを同定するための方法であって、ドナーの人種を同定し；移植後のあらかじめ決定された時点で、患者から得た腎臓生検標本において、ＳＨＲＯＯＭ３発現レベルを決定し；対照におけるＳＨＲＯＯＭ３発現レベルと、生検標本におけるＳＨＲＯＯＭ３発現レベルを比較し；同種移植片におけるＳＨＲＯＯＭ３発現レベルが対照におけるよりも有意により高いかどうかを決定し、そして標本におけるＳＨＲＯＯＭ３発現レベルが対照におけるよりも有意により高い場合、ＣＡＮに関するリスクがあると患者を診断する工程を含む、前記方法。【選択図】図１
2016512424.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドナーから腎移植を受けた患者において、慢性同種移植片腎症（ＣＡＮ）を発展させるリスクを同定するための方法であって：
ドナーの人種を同定し；
移植後のあらかじめ決定された時点で、患者から得た腎臓生検標本において、ＳＨＲＯＯＭ３発現レベルを決定し；
対照におけるＳＨＲＯＯＭ３発現レベルと、生検標本におけるＳＨＲＯＯＭ３発現レベルを比較し；
同種移植片におけるＳＨＲＯＯＭ３発現レベルが対照におけるよりも有意により高いかどうかを決定し、そして
標本におけるＳＨＲＯＯＭ３発現レベルが対照におけるよりも有意により高い場合、ＣＡＮに関するリスクがあると患者を診断する
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
ドナーが白人である場合、ＣＡＮに関するリスクがあると患者が診断される、請求項１の方法。
【請求項３】
前記標本におけるＳＨＲＯＯＭ３発現レベルが対照におけるよりも有意により高い場合、ＣＡＮに関するリスクがあると患者に告げる工程を含む、請求項１の方法。
【請求項４】
ＣＡＮに関する治療を、ＣＡＮに関するリスクがあると診断された患者に投与する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項５】
前記治療が、患者に免疫抑制剤を投与する工程を含む、請求項４の方法。
【請求項６】
前記免疫抑制剤がシクロスポリンである、請求項５の方法。
【請求項７】
前記治療が、前記患者にアンギオテンシン変換酵素阻害剤を投与する工程を含む、請求項４の方法。
【請求項８】
Ｓｈｒｏｏｍ３発現の前記レベルを、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によって決定する、請求項１の方法。
【請求項９】
ドナーから腎臓を受けた患者において、ＣＡＮを発展させるリスクを同定するための方法であって：
腎臓ドナーの人種を同定し；
患者から腎同種移植片生検試料を得て；
前記生検において、ＳＨＲＯＯＭ３発現レベルを決定し；
対照におけるＳＨＲＯＯＭ３発現レベルと、前記生検におけるＳＨＲＯＯＭ３発現レベルを比較し；そして
試料におけるＳＨＲＯＯＭ３レベルが対照におけるよりも有意により高く、そして腎臓ドナーが白人である場合、ＣＡＮを発展させるリスクがあると患者に助言する
工程を含む、前記方法。
【請求項１０】
ドナーから腎臓同種移植片を受けた白人患者において、腎疾患を発展させるリスクを同定するための方法であって：
前記同種移植片が、ｒｓ１７３１９７２１  ＳＮＰリスクアレルを発現しているかどうかを決定し、そして前記ドナーが前記リスクアレルに関してホモ接合体であるかどうかを決定する遺伝子分析を行う工程を含む
ここで前記ドナーが前記リスクアレルに関してホモ接合体である場合、前記患者には腎疾患を発展させるリスクがある
前記方法。
【請求項１１】
閉塞性尿路疾患、ＨＩＶ関連腎症および糖尿病腎症からなる群より選択されるＣＡＮまたはＣＫＤを発展させるためのリスクがある患者を同定するためのキットであって、別個の容器中に、ＲＴ−ＰＣＲ  ＳＨＲＯＯＭ３発現アッセイのためのプライマー、遺伝子発現分析のためのマイクロアレイ、およびｒｓ１７３１９７２１リスクアレルのＲＴ−ＰＣＲ分析のためのプライマー、緩衝剤、ならびに使用説明書を含む、前記キット。
【請求項１２】
白人患者において、慢性同種移植片腎症（ＣＡＮ）、慢性腎疾患、閉塞性尿路疾患、ＨＩＶ関連腎症、糖尿病腎症、高血圧性腎硬化症、原発性糸球体疾患からなる群より選択される腎疾患を発展させるリスクを同定するための方法であって：
あらかじめ決定された時点で、患者から得た腎臓生検標本において、ＳＨＲＯＯＭ３発現レベルを決定し；
対照におけるＳＨＲＯＯＭ３発現レベルと、生検標本におけるＳＨＲＯＯＭ３発現レベルを比較し；
標本におけるＳＨＲＯＯＭ３発現レベルが対照におけるよりも有意により高いかどうかを決定し、そして
標本におけるＳＨＲＯＯＭ３発現レベルが対照におけるよりも有意により高い場合、前記疾患に関するリスクがあると患者を診断する
工程を含む、前記方法。
【請求項１３】
ＣＡＮ、ＣＫＤ、閉塞性尿路疾患、ＨＩＶ関連腎症、糖尿病腎症、高血圧性腎硬化症、および原発性糸球体疾患からなる群より選択される腎疾患に罹患した患者を治療するために有用な化合物を同定するための方法であって
検出可能なマーカーを含むＳｈｒｏｏｍ３遺伝子にトランスフェクションされた第一の細胞を提供し、
前記Ｓｈｒｏｏｍ３遺伝子発現の第一のレベルを決定し、
前記細胞を試験化合物と接触させ、そして前記Ｓｈｒｏｏｍ３遺伝子発現の第二のレベルを決定する
工程を含む、
ここで、前記Ｓｈｒｏｏｍ３遺伝子発現の前記の第二のレベルが、前記Ｓｈｒｏｏｍ３遺伝子発現の前記の第一のレベルより有意により低い場合、前記化合物は、前記疾患を治療するために有用である
前記方法。
【請求項１４】
前記細胞がヒト胚性腎細胞である、請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記検出可能マーカーがルシフェラーゼである、請求項１３の方法。
【請求項１６】
前記Ｓｈｒｏｏｍ３遺伝子発現の前記の第一のレベルを決定する前に、前記細胞をトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）と接触させる、請求項１４の方法。
【請求項１７】
白人腎臓ドナーにおいて、線維症を発展させるリスクを同定するための方法であって：
前記ドナーがｒｓ１７３１９７２１  ＳＮＰリスクアレルを発現するかどうかを決定し；
前記ドナーが前記リスクアレルに関してホモ接合体であるかどうかを決定する遺伝子分析を行う
工程を含む；
ここで、前記ドナーが前記リスクアレルに関してホモ接合体である場合、前記ドナーには線維症のリスクがある
前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
米国衛生研究所から助成金第ＩＵ０１ＡＩ０７０１０７−０１より受領した資金のため、米国政府は本発明に対して特定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、腎疾患に罹患した患者を同定し、そして腎同種移植片レシピエントにおける腎線維症の発展および進行を予測する方法に関する。本発明には、腎疾患に罹患した患者を同定するための、そして腎同種移植片レシピエントにおける腎疾患および尿細管間質線維症の発展および進行を予測するためのキットが含まれる。
【背景技術】
【０００３】
慢性腎疾患（ＣＫＤ）は、米国成人の１０％に影響を及ぼし、世界中で発生率および蔓延が上昇しつつある（Ｃｏｒｅｓｈ  Ｊ、２００７）。末期腎疾患（ＥＳＲＤ）は、腎置換療法（ＲＲＴ）を必要とし、そして現在、５０万人を超える米国成人に影響を及ぼしている。末期腎疾患（ＥＳＲＤ）に対するリスクを与えることに加えて、ＣＫＤは、心臓血管疾患のリスクおよび全死因死亡率を増加させる（Ｗｅｉｎｅｒ  Ｄ、２００４）。尿細管間質線維症（ＴＩＦ）は、ＥＳＲＤの発展を導く多様な病因によるＣＫＤの最終的な共通の病因プロセスである。ＴＩＦはまた、慢性同種移植片腎症（ＣＡＮ）の主な構成要素であり、そして腎同種移植片における概算糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）の進行性減少と関連する（Ｃｈａｐｍａｎ  Ｊ、２００５）（Ｎａｎｋｉｖｅｌｌ  ＢＪ、２００３）。ＣＡＮは、死亡打ち切り長期移植片喪失の最も一般的な原因に相当し、そして慢性同種移植片機能不全指標スコア（ＣＡＤＩスコア）によって組織学的に測定される（Ｉｓｏｎｉｅｍｉ  Ｈ、１９９２）（Ｙｉｌｍａｚ  Ｓ、２００７）。今日まで、ＣＫＤまたはＣＡＮの進行を防止する有効な抗線維症療法はない。現在、ＣＫＤまたはＣＡＮの患者のあるものは、最終的にＥＳＲＤに進行し、そしてＲＲＴを必要とするであろう。例えば、２００５年、腎同種移植片レシピエントは、腎移植待ちリスト上の患者の１３．５％、および実行されたすべての移植の１５％に相当する（Ｍａｇｅｅ  ＪＣ、２００７）。腎同種移植片レシピエントは、１０年間でＲＲＴまたは再移植を必要とする確率を３０％有する（ＵＳＲＤＳ  ２０１２）。ＲＲＴおよびＥＳＲＤケアは、Ｍｅｄｉｃａｒｅに対する、不釣り合いでそして急成長する財政上の重荷である（Ｉｇｌｅｈａｒｔ、２０１１）。したがって、腎線維症発展を予測する新規の高感度バイオマーカーを同定することが非常に重要である。さらに、これらのマーカーは、初期段階でＴＩＦの発展を防止し、それによってＥＳＲＤへの進行を防止する、療法介入のターゲットに相当しうる。
【０００４】
同種移植片生検に基づく研究（正当な理由（ｆｏｒ−ｃａｕｓｅ）およびプロトコル両方）は、初期同種移植片変化が長期同種移植片転帰とどのように相関するかの洞察を提供してきている（Ｇａｇｏ  Ｍ、２０１２）（Ｒｕｓｈ  Ｄ、１９９４）（Ｓｅｒｏｎ  Ｄ、１９９７）（Ｃｏｓｉｏ  Ｆ、２００５）（Ｐａｒｋ  Ｗ、２０１０）。より最近、別個の生検および血液遺伝子発現プロファイル（トランスクリプトーム）シグニチャーは、急性拒絶、慢性拒絶を伴う患者、免疫抑制にある患者、および手術耐性患者を分類することを示してきている（Ａｋａｌｉｎ  Ｅ、２０１０）（Ａｋａｌｉｎ  Ｅ、２００１）（Ｆｌｅｃｈｎｅｒ  Ｓ、２００４）（Ｄｏｎａｕｅｒ  Ｊ、２００３）（Ｓａｒｗａｌ  Ｍ、２００３）（Ｒｅｅｖｅ  Ｊ、２００９）（Ｓｃｈｅｒｅｒ  Ａ、２００３）（Ｓａｇｏｏ  Ｐ、２０１０）（Ｎｅｗｅｌｌ  Ｋ、２０１０）。これらの遺伝子パネルは、単独の組織学的分類指標を改善することも可能であった（Ｓａｒｗａｌ  Ｍ、２００３）（Ｒｅｅｖｅ  Ｊ、２００９）。ゲノム全体の関連研究はまた、欧州起源の集団に基づくコホートにおいて、Ｓｈｒｏｏｍ３遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）（ｒｓ１７３１９７２１）とｅＧＦＲによるＣＫＤの発生率および蔓延を強く関連づけてきている（Ｋｏｔｔｇｅｎ  Ａ、２００９）（Ｂｏｇｅｒ  Ｃ、２０１１）。Ｓｈｒｏｏｍ３遺伝子は、ＰＤＺドメイン含有タンパク質をコードし、これはＦ−アクチンに直接結合して、そして細胞におけるその細胞内分布を制御することも可能である。Ｓｈｒｏｏｍ３の完全な非存在または機能不全Ｓｈｒｏｏｍ３は、マウスにおいて、神経管開放欠陥および新生死亡を引き起こす（Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ  Ｊ、１９９９）。ＭＤＣＫ腎細胞株において、Ｓｈｒｏｏｍ３は、頂端および接合部複合体に局在し、そして正常上皮細胞表現型の維持に非常に重要である（Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ  Ｊ、２００５）。Ｓｈｒｏｏｍ３のＣ末端ドメインは、Ｒｈｏ−キナーゼ（ＲＯＣＫ）と相互作用して、ミオシンリン酸化およびアクチン収縮を促進することもまた知られる（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ、２００８）。しかし、Ｓｈｒｏｏｍ３がＣＫＤまたはＣＡＮにおける腎線維症に役割を果たすかどうかはまだ知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｏｒｅｓｈ  Ｊ、２００７
【非特許文献２】Ｗｅｉｎｅｒ  Ｄ、２００４
【非特許文献３】Ｃｈａｐｍａｎ  Ｊ、２００５
【非特許文献４】Ｎａｎｋｉｖｅｌｌ  ＢＪ、２００３
【非特許文献５】Ｉｓｏｎｉｅｍｉ  Ｈ、１９９２
【非特許文献６】Ｙｉｌｍａｚ  Ｓ、２００７
【非特許文献７】Ｍａｇｅｅ  ＪＣ、２００７
【非特許文献８】ＵＳＲＤＳ  ２０１２
【非特許文献９】Ｉｇｌｅｈａｒｔ、２０１１
【非特許文献１０】Ｇａｇｏ  Ｍ、２０１２
【非特許文献１１】Ｒｕｓｈ  Ｄ、１９９４
【非特許文献１２】Ｓｅｒｏｎ  Ｄ、１９９７
【非特許文献１３】Ｃｏｓｉｏ  Ｆ、２００５
【非特許文献１４】Ｐａｒｋ  Ｗ、２０１０
【非特許文献１５】Ａｋａｌｉｎ  Ｅ、２０１０
【非特許文献１６】Ａｋａｌｉｎ  Ｅ、２００１
【非特許文献１７】Ｆｌｅｃｈｎｅｒ  Ｓ、２００４
【非特許文献１８】Ｄｏｎａｕｅｒ  Ｊ、２００３
【非特許文献１９】Ｓａｒｗａｌ  Ｍ、２００３
【非特許文献２０】Ｒｅｅｖｅ  Ｊ、２００９
【非特許文献２１】Ｓｃｈｅｒｅｒ  Ａ、２００３
【非特許文献２２】Ｓａｇｏｏ  Ｐ、２０１０
【非特許文献２３】Ｎｅｗｅｌｌ  Ｋ、２０１０
【非特許文献２４】Ｋｏｔｔｇｅｎ  Ａ、２００９
【非特許文献２５】Ｂｏｇｅｒ  Ｃ、２０１１
【非特許文献２６】Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ  Ｊ、１９９９
【非特許文献２７】Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ  Ｊ、２００５
【非特許文献２８】Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ、２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
当該技術分野に必要であるのは、腎疾患に罹患している患者を同定し、そして腎線維症の発展を予測するために、その発現を使用可能なマーカーである。さらに、ＣＡＮを発展させるリスクがある腎同種移植片レシピエントを同定し、そして早期段階でＴＩＦの発展を防止し、それによってＥＳＲＤへの進行を防止する療法介入のターゲットに相当するマーカーが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
Ｓｈｒｏｏｍ３は、腎同種移植片におけるその発現が、腎機能減少およびＴＩＦに先行し、そしてこれを予測する、新規候補遺伝子である。より高い同種移植片Ｓｈｒｏｏｍ３レベルは、ＣＡＮの組織学的進行を予測する。これらの関係が、白人ドナー腎臓のレシピエントにおいて最もよく相関することもまた見出されてきている。該知見は、以前記載された慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）関連Ｓｈｒｏｏｍ３遺伝子座（ｒｓ１７３１９７２１）（Ｋｏｔｔｇｅｎ  Ａ、２００９）（Ｂｏｇｅｒ  Ｃ、２０１１）が、Ｓｈｒｏｏｍ３発現増加を通じてその効果を仲介することを初めて確認する。さらに、Ｓｈｒｏｏｍ３が古典的なＴＧＦ−ベータ・シグナル伝達およびコラーゲン−１産生において有益な役割を有することが発見されてきている。
【０００８】
１つの側面において、本発明は、ドナーから腎移植を受けた患者において、慢性同種移植片腎症（ＣＡＮ）を発展させるリスクを同定するための方法であって、腎臓ドナーの人種を同定し；移植後のあらかじめ決定された時点で、患者から得た腎臓生検標本において、ＳＨＲＯＯＭ３発現レベルを決定し；対照におけるＳＨＲＯＯＭ発現レベルと、生検標本におけるＳＨＲＯＯＭ３発現レベルを比較し；同種移植片におけるＳＨＲＯＯＭ３発現レベルが対照におけるよりも有意により高いかどうかを決定し、そして標本におけるＳＨＲＯＯＭ３発現レベルが対照におけるよりも有意により高い場合、ＣＡＮに関するリスクがあると患者を診断する工程を含む、前記方法を提供する。
【０００９】
さらなる側面において、本発明は、ドナーから腎臓を受けた患者において、慢性同種移植片腎症（ＣＡＮ）を発展させるリスクを同定するための方法であって、腎臓ドナーの人種を同定し；患者から腎同種移植片生検試料を得て；前記生検において、ＳＨＲＯＯＭ３発現レベルを決定し；対照におけるＳＨＲＯＯＭ３発現レベルと、前記生検におけるＳＨＲＯＯＭ３発現レベルを比較し、そして試料におけるＳＨＲＯＯＭ３レベルが対照におけるよりも有意により高く、そして腎臓ドナーが白人である場合、ＣＡＮを発展させるリスクがあると患者に助言する工程を含む、前記方法を提供する。
【００１０】
さらにさらなる側面において、本発明は、ドナーから腎臓を受けた白人患者において、腎疾患を発展させるリスクを同定するための方法であって、前記ドナーが、ｒｓ１７３１９７２１  ＳＮＰリスクアレルを発現しているかどうかを決定し、そして前記ドナーが前記リスクアレルに関してホモ接合体であるかどうかを決定する遺伝子分析を行う工程を含む、ここで前記ドナーが前記リスクアレルに関してホモ接合体である場合、前記患者には腎疾患を発展させるリスクがある、前記方法を提供する。
【００１１】
さらにさらなる側面において、本発明は、白人腎臓ドナーにおいて、線維症を発展させるリスクを同定するための方法であって、前記ドナーが、ｒｓ１７３１９７２１  ＳＮＰリスクアレルを発現しているかどうかを決定し、そして前記ドナーが前記リスクアレルに関してホモ接合体であるかどうかを決定する遺伝子分析を行う工程を含む；ここで前記ドナーが前記リスクアレルに関してホモ接合体である場合、前記ドナーには線維症に関するリスクがある、前記方法を提供する。
【００１２】
さらにさらなる側面において、本発明は、白人患者の慢性同種移植片腎症（ＣＡＮ）および慢性腎疾患（ＣＫＤ）からなる群より選択される進行性腎疾患を発展させるリスクを同定するための方法であって：あらかじめ決定された時点で、患者から得た腎臓生検標本において、ＳＨＲＯＯＭ３発現レベルを決定し、対照におけるＳＨＲＯＯＭ３発現レベルと、生検標本におけるＳＨＲＯＯＭ３発現レベルを比較し、標本におけるＳＨＲＯＯＭ３発現レベルが対照におけるよりも有意により高いかどうかを決定し、そして標本におけるＳＨＲＯＯＭ３発現レベルが対照におけるよりも有意により高い場合、ＣＡＮに関するリスクがあると患者を診断する工程を含む、前記方法を提供する。
【００１３】
さらにさらなる側面において、本発明は、腎疾患に罹患し、そしてＣＡＮまたはＣＫＤを発展させるリスクがある患者を同定するためのキットであって、別個の容器中に、ＳＨＲＯＯＭ３に関するＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて使用するためのプライマー、ｒｓ１７３１９７２１  ＳＮＰリスクアレルを検出するためのＲＴ−ＰＣＲ、陽性対照、緩衝剤、および使用説明書を含む、前記キットを提供する。
【００１４】
本発明のこれらのおよび他の側面は、本明細書、請求項および図面を踏まえて、一般の当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本明細書に報告する研究における参加者数を示し、そして１６０人の参加者がマイクロアレイのために抽出された３ヶ月の同種移植片生検ＲＮＡを有したことを示す図。これらの１６０人の患者のうち、移植１２ヶ月後に、１４７人がｅＧＦＲ−クレアチニン、１０１人がＣＡＤＩ−１２、そして８５人がＣＡＤＩ−３および−１２を報告された。
【図２】図２Ａ〜２Ｄ：（２Ａ）３ヶ月の同種移植片ｌｏｇ  Ｓｈｒｏｏｍ３発現（マイクロアレイ）および１２ヶ月のｅＧＦＲクレアチニンの相関（ｒ＝−０．２０；ｐ＝０．００７）；（２Ｂ）３ヶ月の同種移植片ｌｏｇ  Ｓｈｒｏｏｍ３発現（マイクロアレイ）およびＣＡＤＩ−１２ヶ月の相関（ピアソンＲ−０．２２；ｐ＝０．０２７）；（２Ｃ）有意な進行を伴わない（デルタＣＡＤＩ＜２；ｎ＝６８）ものに対して、進行性線維症を有するすべてのドナー（デルタＣＡＤＩ＝２またはそれより多い；ｎ＝１７）において、Ｓｈｒｏｏｍ３発現がより高く、そして（２Ｄ）３ヶ月のＳｈｒｏｏｍ３発現間の相関は、死亡ドナー腎臓および１２ヶ月のＣＡＤＩにおいて、最強であった（ｒ＝０．３４；ｐ＝０．００８８）ことを示すグラフ［直線は平均に相当する；ウィスカー＝ＳＤ］。
【図３】図３Ａ〜３Ｄ：（３Ａ）３ヶ月の倍変化Ｓｈｒｏｏｍ３発現（ＲＴ−ＰＣＲ）およびＣＡＤＩ−１２ヶ月の相関（ピアソンｒ＝０．４１６９；ｐ＝０．０１０３）；（３Ｂ）３ヶ月の倍変化Ｓｈｒｏｏｍ３発現（ＲＴ−ＰＣＲ）および１２ヶ月のｅＧＦＲクレアチニンの相関（ｒ＝０．３２３０；ｐ＝）（３Ｃ）３ヶ月の同種移植片ｌｏｇ  Ｓｈｒｏｏｍ３発現（マイクロアレイ）および３ヶ月の倍変化Ｓｈｒｏｏｍ３発現（ＲＴ  ＰＣＲ）の間の相関（ピアソンｒ＝０．５６１３；ｐ＝０．０００８）；ならびに（３Ｄ）３ヶ月のｌｏｇ  Ｓｈｒｏｏｍ３発現および同時のＣＡＤＩスコアの間の関係の回帰直線−いかなる関係も同定不能を示すグラフ。
【図４】図４Ａ〜４Ｃ：（４Ａ）白人ドナー腎臓のレシピエントにおける３ヶ月の同種移植片ｌｏｇ  Ｓｈｒｏｏｍ３発現およびＣＡＤＩ−１２ヶ月の相関（ｒ＝０．２５３８；ｐ＝０．０２）；（４Ｂ）白人ドナー腎臓のレシピエントにおけるｅＧＦＲ−クレアチニンに対する同種移植片ｌｏｇ  Ｓｈｒｏｏｍ３発現の相関（ｒ＝−０．２５；ｐ＝０．００８）；ならびに（４Ｃ）Ｌｏｇ  Ｓｈｒｏｏｍ３発現が、有意な進行を伴わないもの（デルタＣＡＤＩ＜２；ｎ＝５６）に対するよりも、線維症進行を有するＷＤＫＲ（デルタＣＡＤＩ≧２；ｎ＝１４）においてより高かったことを示すグラフ。
【図５】図５Ａ〜５Ｃ：（５Ａ）生体ドナーレシピエント（ＬＤＲ）において；および（５Ｂ）非ＷＤＫＲにおいて、３ヶ月および１２ヶ月ＣＡＤＩで、同種移植片ｌｏｇ  Ｓｈｒｏｏｍ３発現（マイクロアレイ）の間に相関がなく；（５Ｃ）非ＷＤＫＲにおいて、３ヶ月Ｓｈｒｏｏｍ３およびｅＧＦＲ−１２ｍの間に相関がないことを示すグラフ。
【図６】図６Ａ〜６Ｂ：（６Ａ）Ｓｈｒｏｏｍ３  ＳＮＰ（ｒｓ１７３１９７２１）が、白人および非白人（ドナーおよびレシピエント両方）間で異なって分布していることを例示するグラフ。白人は、影響アレルのより高い蔓延を有する（ｐ＜０．０００１）（６Ｂ）：ドナー腎臓におけるリスクアレルに関するホモ接合性は、有意に増加する同種移植片Ｓｈｒｏｏｍ３発現と関連する（ｐ＝０．０３３）。ウィスカー：５〜９５パーセンタイル；直線、中央値；ｐ＝０．０１８３）［＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１］。
【図７】図７Ａ〜７Ｃ：（それぞれ、７Ａ、７Ｂ）Ｓｈｒｏｏｍ３発現は、ドナーに影響アレル（Ａ）が存在すると、ＷＤＫＲおよび非ＷＤＫＲの両方で増加し、そして（７Ｃ）Ｓｈｒｏｏｍ３発現は、レシピエントＳＮＰ型には有意に影響を受けなかった（ウィスカー：最小値−最大値；直線、中央値；ｐ＝０．０３０９）［＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１］。
【図８】図８Ａ〜８Ｂ：（８Ａ）ＥＳＲＤ病因にしたがって３５４人の白人レシピエント（％として）におけるＳｈｒｏｏｍ３  ＳＮＰのアレル蔓延を例示するグラフ。糖尿病によるＥＳＲＤを伴うレシピエント（４９％）は、非血縁ドナーに比較して、有意により大きいリスクアレル蔓延を有した。（８Ｂ）：研究の３２４７人の患者における、Ｓｈｒｏｏｍ３  ＳＮＰのアレル蔓延。リスクアレル蔓延は、ＣＫＤを伴う糖尿病において最高であった（５１％）［＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１］。
【図９】以下の実施例５で用いるルシフェラーゼ−レポータープラスミドの構築マップ。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂ：図１０Ａは、Ａアレルエンハンサー要素を持つルシフェラーゼ−レポータープラスミドが、Ｇアレルおよびプロモーターのみのプラスミドよりもより高い活性を示したことを示すグラフであり；図１０Ｂは、２９３−Ｔ細胞から抽出された核タンパク質が、Ｇアレルを含有するオリゴヌクレオチド配列への増進された結合を示したことを例示するウェスタンブロットである。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｂ：図１１Ａは、ＰＲＣＥＣにおいて、ＴＧＦ−β処理が、用量依存性に（５ｎｇ/ｍｌまで）、そして時間依存性方式で、Ｓｈｒｏｏｍ３を増加させたことを、ＲＴ−ＰＣＲによって例示するグラフである（エラーバー：平均±ＳＥＭ）［＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１］。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＴＧＦ−β処理が、時間依存性方式で、Ｓｈｒｏｏｍ３を増加させることを例示するウェスタンブロットである。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｂ：図１２Ａは、ＴＧＦ−ベータが、ベータ−カテニン／ＴＣＦ７ｌ２依存性方式で、Ｓｈｒｏｏｍ３発現を増加させることを示す、実施例６の結果を示すグラフである。ケルセチン（ベータ−カテニン阻害剤）およびＢＣ−２１（ＴＣＦ７Ｌ２阻害剤）は、ＴＧＦ−ベータによって誘導されたＳｈｒｏｏｍ３発現の増加を阻害した（ＲＴ−ＰＣＲ）。１２Ｂは、ベータ−カテニン／ＴＧＦ−β依存性方式のＳｈｒｏｏｍ３タンパク質増加を示すウェスタンブロットである。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｂ：ＰＣ−ＳＨＲＯＯＭ３トランスフェクションを伴うＰＲＣＥＣにおけるＳｈｒｏｏｍ３過剰発現を示す図であり、それぞれ、図１３Ａは、ＲＴ−ＰＣＲによって確認され、そして図１３Ｂは、ウェスタンブロットによって確認される（平均±ＳＥＭ）［＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１］。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｃ：図１４Ａは、実施例７の結果を示し、そしてＲＴ−ＰＣＲによって、ＴＧＦ−ベータが誘導する線維症促進性マトリックスマーカーの発現に対する影響を示すグラフである。Ｓｈｒｏｏｍ３過剰発現は、単独で、コラーゲン−１およびフィブロネクチン産生を増加させ、一方、ノックダウンはこれらのマトリックスマーカーを抑制した（平均±ＳＥＭ）［＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１］；
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、Ｓｈｒｏｏｍ３過剰発現が、１５分の時点で、ＰＲＣＥＣにおいて、ＴＧＦ−ベータに反応して、Ｓｍａｄ−３のリン酸化を増進したことを示すウェスタンブロットである（右）；
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、ＳＨＲＯＯＭ３が過剰発現されたＰＲＣＥＣのＴＧＦ−β１処理がまた、ＳＨＲＯＯＭ３過剰発現を伴わないＴＧＦβ１処理細胞に比較して、より顕著なＦ−アクチン束を発展させたことを示す写真である（図１４Ｃ−上部および下部パネル）。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜１５Ｂ：それぞれ、ＲＴ−ＰＣＲ（図１５Ａ）およびウェスタンブロット（図１５Ｂ）によって確認される、ＰＣ−ＳＨＲＯＯＭ３トランスフェクションを伴うＰＲＣＥＣにおいて、Ｓｈｒｏｏｍ３が過剰発現されることを確立する実施例７の結果を示すグラフである（平均±ＳＥＭ）［＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１］。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜１５Ｂ：それぞれ、ＲＴ−ＰＣＲ（図１５Ａ）およびウェスタンブロット（図１５Ｂ）によって確認される、ＰＣ−ＳＨＲＯＯＭ３トランスフェクションを伴うＰＲＣＥＣにおいて、Ｓｈｒｏｏｍ３が過剰発現されることを確立する実施例７の結果を示すグラフである（平均±ＳＥＭ）［＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１］。
【図１６−１】図１６Ａ〜１６Ｄ：（１６Ａ）ＲＯＳＡ−ＲＴＴＡ（上部）およびＣＯＬＴＧＭ（下部）に関する代表的な遺伝子型決定結果を示す。（１６Ｂ）非Ｄｏｘ供給対Ｄｏｘ供給マウスのＵＵＯ腎臓由来のマウス腎臓皮質溶解物からの、ホスホ−ＳＭＡＤ３（ｐ−ＳＭＡＤ３）、総ＳＭＡＤ３（ＳＭＡＤ３）、Ｓｈｒｏｏｍ３およびβ−アクチンのウェスタンブロットを示す（ｎ＝２）。
【図１６−２】（１６Ｃ）左から右に−対照腎臓および非Ｄｏｘ供給動物のＵＵＯ腎臓、およびＤｏｘ供給動物のＵＵＯ腎臓からの、代表的な低解像度（１０ｘ）画像を示す写真を示す。上列−過ヨウ素酸シッフ染色、中列−ピクロシリウスレッド染色。下列−ＣＯＬ１Ａ１（ＴＲＩＴＣ−Ａｌｅｘａ蛍光）に関する免疫標識を、スナップ凍結腎臓皮質切片に対して行った。代表的な画像を示す。グラフは、動物あたり５つのランダムな高解像度視野において、ＣＯＬ１Ａ１染色面積／総面積（％）の形態計測定量化に相当する。
【図１６−３】（１６Ｄ）対照、ならびにＤＯＸおよび非ＤＯＸ供給動物のＵＵＯ腎臓における、ＲＴ−ＰＣＲによるＳＨＲＯＯＭ３およびＣＯＬ１Ａ１  ｍＲＮＡ発現を示す棒グラフ（ＧＡＰＤＨに対して規準化；ｎ＝５；平均±ＳＥＭ；事後ボンフェローニ比較を伴うＡＮＯＶＡ；＊Ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
定義
用語「約」または「およそ」は、通常、値のタイプおよび測定の方法に関する許容されうる誤差範囲内を意味する。例えば、これは、所定の値または範囲の２０％以内、より好ましくは１０％以内、そして最も好ましくはなお５％以内を意味しうる。あるいは、特に生物学的系において、用語「約」は、ほぼ１対数（すなわち一桁）以内、好ましくは所定の値の２の係数以内を意味する。
【００１７】
用語「Ｓｈｒｏｏｍ３発現の有意により高いレベル」は、本明細書において、対照におけるよりも、約１．４〜約５倍の間で高いと定義される。
【００１８】
本発明は、正常被験体から得られる対照生検に比較した際、ＣＡＮを発展させるリスクが高い腎臓同種移植片レシピエントにおいて、ＳＨＲＯＯＭ３発現レベルが有意により高いという発見に基づく。本発明にしたがって、当該技術分野に周知の、例えば免疫染色などの技術を用いて、しかし好ましくはリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、腎臓同種移植片レシピエントから得られる生検からＳＨＲＯＯＭ３発現レベルを決定し、そして生体ドナーベースライン生検試料などの正常腎臓試料、または腎摘出術由来の腎臓試料である対照から得られる生検に比較する。
【００１９】
慢性同種移植片拒絶研究プロトコルのゲノミクスにおいて、生検は、異なる時点で、すべての登録された患者から得られた（以下の実施例を参照されたい）。３ヶ月の同種移植片生検に対して行われたＤＮＡマイクロアレイから、その示差発現が、１２ヶ月のＣＡＤＩスコアおよび腎機能と相関した遺伝子を同定し、そしてランク付けした。このリストにおいて、上位にランク付けされた遺伝子がＳＨＲＯＯＭ３であった（非公表データ）。
【００２０】
ゲノム全体の関連研究はまた、欧州起源の集団に基づくコホートにおいて、ＳＨＲＯＯＭ３遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）（ｒｓ１７３１９７２１）とｅＧＦＲによるＣＫＤの発生率および蔓延を強く関連づけてきている（Ｋｏｔｔｇｅｎ  Ａ、２００９）（Ｂｏｇｅｒ  Ｃ、２０１１）。ＳＨＲＯＯＭ３遺伝子は、ＰＤＺドメイン含有タンパク質をコードし、これはＦ−アクチンに直接結合して、そして細胞におけるその細胞内分布を制御することも可能である。ＳＨＲＯＯＭ３の完全な非存在または機能不全ＳＨＲＯＯＭ３は、マウスにおいて、神経管開放欠陥および新生死亡を引き起こす（Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ  Ｊ、１９９９）。ＭＤＣＫ腎細胞株において、ＳＨＲＯＯＭ３は、頂端および接合部複合体に局在し、そして正常上皮細胞表現型の維持に非常に重要である（Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ  Ｊ、２００５）。ＳＨＲＯＯＭ３のＣ末端ドメインは、Ｒｈｏ−キナーゼ（ＲＯＣＫ）と相互作用して、ミオシンリン酸化およびアクチン収縮を促進することもまた知られる（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ、２００８）。
【００２１】
本明細書に報告する研究において、５８９人の患者が登録された。同種移植片生検は、コア研究室から報告される慢性同種移植片機能不全指標スコア（ＣＡＤＩ）とともに、移植０、３、１２、および２４ヶ月後に得られた。遺伝子発現マイクロアレイ分析を３ヶ月生検に対して実行し（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ：ヒト・エクソン−１チップ）、そして１２ヶ月ＣＡＤＩおよびｅＧＦＲに対する相関を分析した（ｎ＝１６０）。ヒト初代尿細管細胞（ＲＰＴＥ）に対して、過剰発現およびレンチウイルス抑制研究を行った。ＳＨＲＯＯＭ３遺伝子発現は、１年の時点で、線維症と線形に、そしてｅＧＦＲと負に相関することが見出された（ｎ＝１０１；ｐ＜０．０５）。これはＲＴ−ＰＣＲによって独立に確認された（ｎ＝３６）。ＳＨＲＯＯＭ３発現および３ヶ月ＣＡＤＩの間に相関は見られなかった（ｎ＝１３７）。
【００２２】
ＳＨＲＯＯＭ３におけるＳＮＰ（ｒｓ１７３１９７２１）は、全ゲノム関連研究において、ＣＫＤと関連づけられてきている。本明細書に開示するように、ドナーＤＮＡにおいて、リスクアレルの少なくとも１コピーが存在すると（すなわちＡ／ＧまたはＡ／Ａ）、３ヶ月のより高い移植片内ＳＨＲＯＯＭ３発現と関連することが見出されてきている（ｎ＝１３６；ｐ＝０．０２）。リスクアレルは、非白人ドナーに対して、白人において、より蔓延していた。以下の実施例４に示すように、ＳＮＰリスクアレルは、腎疾患を伴う白人糖尿病においてより頻繁である。したがって、本発明は、ドナーから腎臓を受けた、腎疾患に罹患している糖尿病白人患者において、ＣＡＮを発展させるリスクを同定するための方法であって、ベースラインでドナーから血液試料を得て、そしてドナーがリスクアレルに関してホモ接合性であるかどうかを決定する遺伝子分析を実行する工程を含む、前記方法を提供する。以下の実施例９に示すように、方法を非糖尿病白人患者で実施してもよい。ドナーがリスクアレルに関してホモ接合性である場合、患者にはＣＫＤまたはＣＡＮのリスクがある。この方法はドナーが入手可能である場合にのみ実施可能であり、常に当てはまるわけではない。ドナーが入手可能でない場合、患者におけるＳＨＲＯＯＭ３発現レベルを調べてもよい。白人ドナー腎臓のレシピエントにおいて、ＳＨＲＯＯＭ３発現は１２ヶ月のＣＡＤＩを予測するが、これは非白人または生体ドナーレシピエントには当てはまらなかった。
【００２３】
ＲＰＴＥにおけるＳＨＲＯＯＭ３の過剰発現は、１型コラーゲン産生を増加させる一方、レンチウイルス抑制はこれを顕著に減少させた（ｐ＜０．０１）。ホスホ−Ｓｍａｄ３および線維症促進性マーカー産生によって立証されるように、ＳＨＲＯＯＭ３過剰は、古典的ＴＧＦ−βシグナル伝達を促進する一方、抑制はこれを阻害した。さらに、ＣＫＤのＦＶＢ／Ｎマウス（ＨＩＶ腎症および片側性尿管閉塞）において、ＳＨＲＯＯＭ３発現は、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した際、対照に比較して増加した。したがって、本発明はＣＡＮには限定されず、閉塞性尿路疾患、ＨＩＶ関連腎症および糖尿病腎症などの他のＣＫＤに関しても有用である。
【００２４】
理論によって束縛されることは望ましくないが、Ｓｈｒｏｏｍ３は、肝臓線維症および肺線維症などの線維症を伴ういかなる疾患にも関与すると考えられる。したがって、本明細書記載の材料および方法は、こうした疾患の進行を監視するために有用であろう。以下の実施例１０に示すように、腎間質線維症は、マウスモデルにおけるＳｈｒｏｏｍ３ノックダウン動物において、有意に抑止された。これらの結果は、これらの疾患におけるＳＨＲＯＯＭ３の役割を確証する。
【００２５】
本発明はまた、本明細書に開示する方法において使用するためのキットも提供する。該キットは、別個の容器中に、以下の構成要素を含む：ＲＴ−ＰＣＲ  ＳＨＲＯＯＭ３発現アッセイのためのプライマー、遺伝子発現分析のためのマイクロアレイ、およびｒｓ１７３１９７２１リスクアレルのＲＴ−ＰＣＲ分析のためのプライマー、緩衝剤ならびに使用説明書。キットにおいて使用するためのプライマーの限定されないリストを表５に示す。陽性対照は、ＳＨＲＯＯＭ３を過剰発現している細胞、または高レベルのＳＨＲＯＯＭ３発現を有することが知られる脳組織、例えば神経上皮を含む（Ｓｈｒｏｏｍ３が仲介する頂端細胞接合部へのＲｈｏキナーゼ補充は、上皮および神経上皮平面リモデリングを制御する−Ｔａｍａｋｏ  ＮｉｓｈｉｍｕｒａおよびＭａｓａｔｏｓｈｉ  Ｔａｋｅｉｃｈｉ，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３５，  １４９３−１５０２（２００８）ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｅｖ.０１９６４６）。
【００２６】
本発明は、ＣＡＮまたはＣＫＤなどの腎臓疾患を発展させるリスクがある腎臓同種移植片レシピエントを同定するための方法に関する。こうした患者が同定されている場合、本発明には、こうした患者を治療するための方法も含まれる。こうした方法には、限定なしに、免疫抑制薬剤、すなわちカルシニューリン阻害剤（ＣＮＩ）、例えばシクロスポリンまたはタクロリムス、あるいはより線維形成性でない免疫抑制薬剤、例えばミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）またはシロリムスの投与が含まれる。ＣＡＮまたはＣＫＤを発展させるリスクがあると同定される患者は損なわれた腎機能を有し、そしてしばしば高血圧を患うため、こうした患者へのアンギオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥＩ）、例えばリシノプリルまたはアンギオテンシンＩＩ受容体遮断剤、例えばロサルタンの投与が本発明の範囲内である。
【００２７】
本発明はまた、ＣＡＮおよびＣＫＤの治療に有用な薬剤に関してスクリーニングするターゲットとしてＳＨＲＯＯＭ３を用いる方法も提供する。実施例５に記載する、ＳＨＲＯＯＭ３  Ａアレル／ルシフェラーゼ構築物でトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞をスクリーニングアッセイで用いて、ＳＨＲＯＯＭ３によって仲介される線維症疾患の治療のための薬剤を同定することも可能である。細胞を９６ウェルマイクロプレートに植え付け、薬剤候補と接触させ、そしてルシフェラーゼ活性における変化に関してアッセイすることも可能である。ベースラインでのＳＨＲＯＯＭ３活性（すなわちルシフェラーゼ）を測定し、そして阻害剤ケルセチンおよび／またはＢＣ−２１を陽性対照として用いてもよい。
【００２８】
代替法として、２９３Ｔ細胞を、既知のＳＨＲＯＯＭ３発現上方制御剤であるＴＧＦＢ１（５〜１０ｎｇ／ｍｌ）で処理し、そしてこれらの細胞（ＳＨＲＯＯＭ３発現ベースラインがより高い）をスクリーニングアッセイに用いる。これらのアッセイをハイスループット形式で発展させてもよい。
【００２９】
Ａアレルに関するＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて使用するためのプライマー、およびルシフェラーゼレポーター構築物を生成するためのプライマーを表５に示す。
【００３０】
要約すると、本発明にしたがって、ＳＨＲＯＯＭ３は、腎同種移植片におけるその発現が、ＣＡＮにおける腎機能撹乱およびＴＩＦに先行し、そしてこれを予測する、新規候補遺伝子と同定されてきている。有意により高い同種移植片ＳＨＲＯＯＭ３レベルを用いて、ＣＡＮの組織学的進行を予測することも可能である。さらに、これらの関係が、白人ドナー腎臓レシピエントにおいて最も予測性であることが発見されてきている。これらの知見は、以前記載されるＣＫＤ関連ＳＨＲＯＯＭ３遺伝子座（ｒｓ１７３１９７２１）（Ｋｏｔｔｇｅｎ  Ａ、２００９）（Ｂｏｇｅｒ  Ｃ、２０１１）が、ＳＨＲＯＯＭ３発現増加を通じてその効果を仲介することを初めて確認する。最後に、本明細書記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究によって、腎臓尿細管細胞における古典的なＴＧＦ−ベータ・シグナル伝達およびコラーゲン−１産生において、ＳＨＲＯＯＭ３が有益な役割を有することを示差する。総合すると、これらの知見は、ＳＨＲＯＯＭ３がＣＡＮおよびＣＫＤ両方における療法ターゲットであり、そしてそのレベルの抑制を用いて、ＴＩＦの進行を阻害し、そしてＥＳＲＤを遅延させることも可能であることを立証する。
【００３１】
本発明は、以下の実施例に記載され、これらはその範囲を限定することなく、本発明をさらに記載するよう意図される。
【００３２】
以下の実施例において、以下の材料および方法を用いた。
【００３３】
生検およびＲＮＡ抽出：リアルタイム、超音波誘導、腎臓同種移植片生検を、移植０、３、１２、および２４ヶ月後に、５つの臨床現場の３つから得た。可能な場合、１８Ｇバネ装填生検針を用いて、２つのコアを抽出した。単一のコアを得た場合、３ヶ月診察ではＲＮＡ抽出（ＱＩＡＧＥＮ−ＡＬＬｐｒｅｐキット、米国カリフォルニア州バレンシア）を、そして１２ヶ月では組織学的分析を優先した。遺伝子発現研究用の組織を、ＲＮＡ−ｌａｔｅｒ中に直ちに保存し、そして−２０℃でゲノミクスコア施設に輸送した。
【００３４】
逆転写：Ｓｅｎｓｉｃｒｉｐｔ一段階ＲＴ（Ｑｉａｇｅｎ）およびオリゴ−ＤＴプライマー（Ｑｉａｇｅｎ）と５５ｎｇの出発総ＲＮＡ量を用いて、抽出された生検ＲＮＡを逆転写した。ナノドロップによる＜５ｎｇ／ｍｃｌのＲＮＡ濃度の抽出試料は用いなかった。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究のため、本発明者らは、５００〜１０００ｎｇの出発総ＲＮＡで、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ−ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）を用いた。
【００３５】
ＲＴ−ＰＣＲ：プライマー−ＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）を用いて、イントロンに渡るプライマーセットをＳｈｒｏｏｍ３に関して設計し、そしてＰＣＲアンプリコンを融解曲線分析およびアガロースゲル電気泳動の両方によって確認した。Ｓｈｒｏｏｍ３発現を、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００サイクラー）によって、患者の内部および外部コホートにおいてアッセイした。
【００３６】
Ｓｈｒｏｏｍ３  ＳＮＰ分析：Ｔａｑｍａｎ  ＳＮＰ分析アッセイ（カタログ番号：４３５１３７９  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて、Ｓｈｒｏｏｍ３  ＳＮＰ（ｒｓ１７３１９７２１）に関して、ターゲティング遺伝子型決定を行った。ドナーＳＮＰに関して、移植前生検または血液から、そしてレシピエントＳＮＰアッセイのため末梢血から、ＤＮＡを抽出した（ＱＩＡＧＥＮ−ＡＬＬｐｒｅｐキット、米国カリフォルニア州バレンシア）。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの遺伝子型決定ソフトウェアを用いた自動化分析を行った（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００サイクラー）。
【００３７】
Ｓｈｒｏｏｍ３プロモーター−エンハンサー構築物およびルシフェラーゼ−レポーターアッセイ：２つのアレル（Ａまたは１．Ｇ）のいずれかを含有するｒｓ１７３１９７２１部位を含む、ＳＨＲＯＯＭ３のイントロン−１の２４塩基対配列を場合によって含むプライマーセットを用いて、ＳＨＲＯＯＭ３の翻訳開始部位の５’の−３０００塩基に渡るプロモーター断片をＰＣＲ増幅した（表１）。ＫｐｎＩの制限部位がすべての順方向プライマーに導入され、そしてＨｉｎｄＩＩＩが逆方向プライマーに導入された。次いで、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いて、ルシフェラーゼレポーターベクター−ｐＧＬ３  ベーシック（Ｅ−１７５１、Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州）内に、ＰＣＲ産物をクローニングした。これによって、３つのレポータープラスミド−プロモーターのみ、イントロン性ＡまたはＧ配列のいずれかを含むプロモーターが生成された。
【００３８】
レニラ属（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼレポータープラスミド−ｐＴＬ−ＴＫ（２００ｎｇ）を伴うこれらの構築物（各１ｍｃｇ）の一過性トランスフェクションを、８０％集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）で６ウェルプレート上にプレーティングしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において実行した（Ｐｏｌｙｊｅｔ試薬、ＳｉｇｎａＧｅｎ  Ｌａｂｓ、メリーランド州ロックビル）。２４時間後、細胞を溶解し、そしてタンパク質を抽出した。製造者のプロトコルにしたがって、マイクロプレート読み取り装置上、二重ルシフェラーゼアッセイ系（ＰＪＫ  ドイツ）を用いて、溶解物におけるレニラ属およびルシフェラーゼ活性を測定した。結果をルシフェラーゼ：レニラ属比として表した。
【００３９】
ウェスタンブロッティング：１％Ｔｒｉｔｏｎ、プロテアーゼ阻害剤混合物、ならびにチロシンおよびセリン／スレオニンリン酸化およびホスファターゼ阻害剤を含有する緩衝液で細胞を溶解した。ウサギ抗Ｓｈｒｏｏｍ３（Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ博士、ピッツバーグより寄贈）、抗Ｖ５タグ抗体（Ｒ９６０−２５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ホスホ−Ｓｍａｄ３抗体（ウサギポリクローナル−ｐＳ４２３／４２５）およびＳｍａｄ−３（ウサギモノクローナルＳｍａｄ−３、＃９５２３、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ、カリフォルニア州バーリンゲームより）を用いて、溶解物をイムノブロット分析に供した。先に記載されるように（Ｇａｓｓｍａｎ  ２００９）、濃度計測を行った。
【００４０】
過剰発現研究：ヒトＳｈｒｏｏｍ３構築物（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、コロラド州ラファイエット）を、Ｃｌｏｎａｓｅ−ＩＩレコンビナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｃ末端Ｖ５およびヒスチジンタグを含む哺乳動物発現ベクターＰＣ−ＤＥＳＴ４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）内にクローニングした。Ｌｏｎｚａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ技術（初代哺乳動物上皮細胞用の基本的Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット、プログラムＴ２０）を用いて、以前記載されるように（Ｊｉｎ  Ｙ、２０１２）、初代腎皮質上皮細胞（ＰＲＣＥＣ）をトランスフェクションした。対照として空の目的地ベクタートランスフェクションを用いて、ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットによって、ＰＲＣＥＣにおける強制発現を確認した。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、ＰＲＣＥＣにおいて、線維症促進性細胞外マトリックスマーカーを分析した。Ｓｈｒｏｏｍ３トランスフェクション細胞におけるマトリックスマーカー産生に対するＴＧＦ−β処理の影響を、栄養飢餓培地中でトランスフェクションの３６時間後にアッセイした。Ｓｍａｄ−３のリン酸化を、ＴＧＦ−ベータ処理の５、１５および３０分後に測定した。
【００４１】
Ｓｈｒｏｏｍ３  ＳＩＲＮＡ抑制研究：２９３Ｔ細胞において、ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットによって、Ｓｈｒｏｏｍ３抑制に関して、ヒトＳｈｒｏｏｍ３低分子ヘアピンクローン（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、コロラド州ラファイエット）を試験した。選択したＧＦＰタグ化ヘアピンをエンベローププラスミド（Ｐｏｌｙｊｅｔ試薬）とともに、２９３−Ｔ細胞にトランスフェクションして、哺乳動物ＶＳＶ偽型レンチウイルス発現構築物を生成した。このレンチウイルス構築物を用いてＰＲＣＥＣを感染させ、そしてＳｈｒｏｏｍ３抑制を確認した。マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｓｈｒｏｏｍ３抑制のため、精巧なｓｈＲＮＡライブラリーを解読することが可能なセンサー・ピンポンアッセイ（Ｍｉｒｉｍｕｓ  ｉｎｃ、ニューヨーク州ロングアイランド）を用いて、強力な抑制性ヘアピン配列を最終選考した。マウス有足細胞に、Ｍｉｒ３０レンチウイルス主鎖上のこれらの配列を形質導入し、そしてＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットを用いて、Ｓｈｒｏｏｍ３抑制に関して試験した。マウスへの胚性幹細胞注射のために２つの配列を選択して、テトラサイクリン誘導性Ｓｈｒｏｏｍ３−ＳｈＲＮＡマウスモデルを発展させた。
【００４２】
参加者の特徴付け
本研究のため、登録終了時に、５つの施設から、研究において５８９人のレシピエントが登録された。コホート中のドナーおよびレシピエントの人口統計的および臨床的特性を表１に列挙する。マイクロアレイ研究に含まれる患者の人口統計的および臨床的特性を、表２に詳述する。
【実施例１】
【００４３】
実施例１：ＳＨＲＯＯＭ３は上方制御され、そしてＣＡＮの進行に関連する
ＣＡＮの発展に潜在的に寄与しうる遺伝子を同定するため、本発明者らは、３ヶ月同種移植片生検由来の遺伝子発現マイクロアレイデータならびにｅＧＦＲ＿１２およびＣＡＤＩ＿１２を有したコホートの最初の６６人の被験体に関する、中間分析を行った。ＣＡＮ進行に関与する候補遺伝子のリスト、すなわち３ヶ月の同種移植片試料におけるその発現が、低いｅＧＦＲ＿１２ならびに高いＣＡＤＩ＿１２と相関する遺伝子を同定し、そしてランク付けした。ＳＨＲＯＯＭ３は、リスト上の上位にランク付けされる遺伝子の１つであった（表３）。中間分析のため、本発明者らはさらなる試料を収集し、そして分析した。本出願の調製時点で、３ヶ月同種移植片遺伝子発現プロファイルを、１６０の同種移植片に対して行ってきており、そしてそのうち、１２ヶ月ｅＧＦＲ（ｅＧＦＲ＿１２）は、１４７人の被験体で入手可能であり、そして１２ヶ月のＣＡＤＩ（ＣＡＤＩ＿１２）は１０１人の被験体で入手可能であった（図１）。本発明者らが、ｅＧＦＲ＿１２が入手可能である１４７人の被験体において、３ヶ月の同種移植片ＳＨＲＯＯＭ３発現の相関を再度調べた際、３ヶ月同種移植片ＳＨＲＯＯＭ３発現は、ｅＧＦＲ＿１２に逆に相関した（ｒ＝−０．２１９２、Ｐ＜０．０１、図２Ａ）。ＣＡＤＩ＿１２を有した１０１人の被験体のうち、遺伝子発現マイクロアレイ分析上の３ヶ月同種移植片ＳＨＲＯＯＭ３発現は、ＣＡＤＩ＿１２と線形に相関し（Ｐ＝０．０３、図２Ｂ）、これは分析から同種移植片試料の２つ、ＢＫウイルス腎症を有するものおよび皮質瘢痕を有する別のものを排除した際、有意なままであった（Ｐ＝０．０２）。しかし、３ヶ月同種移植片ＳＨＲＯＯＭ３発現および同時の３ヶ月ＣＡＤＩの間には相関は同定されなかった（ｎ＝１３５；ｒ＝−０．１２７３、ｐ＝０．１４）（図３Ｄ）。ＣＡＤＩ＿１２およびｅＧＦＲ＿１２に対する３ヶ月のＳＨＲＯＯＭ３発現の関係は、３２人の被験体の内部コホートにおいて、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴＰＣＲ）分析によってさらに検証された（ｅＧＦＲ＿１２に関してｒ＝−０．３８７３、Ｐ＝０．０２、そしてＣＡＤＩ＿１２に関してｒ＝０．３７７４、Ｐ＝０．０３）（図３Ｃおよび３Ｄ）。本発明者らはまた、マイクロアレイおよびｑＲＴＰＣＲ  ＳＨＲＯＯＭ３発現の間にロバストな相関も見出した（ｎ＝３２、ｒ＝０．５６１３；ｐ＝０．０００８）（図２Ｂおよび２Ｃ）。Ｌｏｇ−ＳＨＲＯＯＭ３発現および１２ｍ−ＣＡＤＩの間の関係はＤＤＲにおいて最強であった（ｐ＜０．０１）（図２Ｄ）。多変量分析において、冷虚血時間および急性拒絶の存在のみが、ＣＡＤＩ＿１２に有意な影響を有した。ＳＨＲＯＯＭ３発現は、死亡ドナーにおいて有意なままであった（ｐ＝０．０２）。３ヶ月の同種移植片ＳＨＲＯＯＭ３発現をマイクロアレイによって調べた１６０人の被験体のうち、８５人は３ヶ月および１２ヶ月両方のＣＡＤＩスコアが入手可能であった。ＳＨＲＯＯＭ３発現がＣＡＮの進行と関連することをさらに実証するため、本発明者らは、３ヶ月および１２ヶ月生検の間で、ＣＡＤＩスコアの≧２の増加を有する同種移植片（ｎ＝１７；進行者）と、＜２の増分未満であるもの（ｎ＝６８；非進行者）���間でＳＨＲＯＯＭ３発現を比較した。ＳＨＲＯＯＭ３発現は、非進行者に比較して、進行者において有意により高かった（ｐ＝０．０４）。
【実施例２】
【００４４】
実施例２：白人ドナー同種移植片において、ＳＨＲＯＯＭ３およびＣＡＮ進行の関連が存在する
ＳＨＲＯＯＭ３の遺伝子変異体（ＳＮＰ変異体ｒｓ１７３１９７２１）は、主に白人コホートにおいて研究された際（Ｋｏｔｔｇｅｎ  Ａ、２００９）、ＣＫＤに関連するため、本発明者らは、ＳＨＲＯＯＭ３およびＣＡＮの間で観察される関係が、人種親和性（ｐｒｅｄｉｌｅｃｔｉｏｎ）にしたがうかどうかを決定することを試みた。入手可能なｅＧＦＲ＿１２を伴う１４７の同種移植片のうち、１０９は白人ドナーに由来し、そしてそのＳＨＲＯＯＭ３発現は、ｅＧＦＲ＿１２に逆に相関した（ｒ＝−０．２７１２、Ｐ＝＜０．０１、図４Ａ）。入手可能なＣＡＤＩ＿１２を伴う１０１の同種移植片のうち、８０は白人ドナーに由来し、そしてこれらの同種移植片におけるＳＨＲＯＯＭ３発現は、ＣＡＤＩ＿１２に有意に相関した（Ｐ＝０．０２、図４Ｂ）。非白人同種移植片において、ＳＨＲＯＯＭ３発現は、ｅＧＦＲ＿１２（ｎ＝３８）またはＣＡＤＩ＿１２（ｎ＝２１）のいずれにも有意に相関しなかった（図５Ｂ、５Ｃ）。ＣＡＤＩ＿３およびＣＡＤＩ＿１２を伴う８５人の患者のうち、７０人は白人ドナー腎臓を受けた。これらのうち、本発明者らは、進行者および非進行者の間のＳｈｒｏｏｍ３発現を比較した。ＣＡＤＩにおいて≧２増分を発展させた１４の同種移植片に関するＳＨＲＯＯＭ３発現は、ＣＡＤＩにおける＜２の変化を伴うものより有意に高かった（ｎ＝５６）（図３Ｃ）。３ヶ月の同種移植片生検におけるＳＨＲＯＯＭ３発現はまた、ＣＡＤＩ＿１２に基づくＣＡＮの多様な重症度を伴う同種移植片間で有意に異なった：低（ＣＡＤＩ  ０〜１；ｎ＝４９）、中程度（ＣＡＤＩ  ２〜５；ｎ＝２４）、高（ＣＡＤＩ＞５；ｎ＝７）（Ｐ＝０．０３、図３Ｃ）。
【実施例３】
【００４５】
実施例３：ドナーにおける非コードＳＨＲＯＯＭ３変異体は、ＳＨＲＯＯＭ３発現増加と関連する
ｒｓ１７３１９７２１での非コードＳＨＲＯＯＭ３  ＳＮＰのＡアレル（マイナーアレル）は、ｅＧＦＲ−クレアチニンによる慢性腎疾患と強く関連づけられてきている（Ｋｏｔｔｇｅｎ  Ａ、２００９；Ｂｏｇｅｒ  Ｃ、２０１１）。本発明者らは、５４０の同種移植片レシピエントおよび４６８のドナー試料において、ｒｓ１７３１９７２１変異体に関するターゲティングＳＮＰ遺伝子型決定を行った。リスクアレル（Ａ）のアレル蔓延は、レシピエントの間で３６．６６％であり、そしてドナーの間で４０．０２％であった。レシピエントおよびドナーの両方において、本発明者らは、非白人に比較して、白人において、リスクアレル蔓延が有意により高いことを観察した（Ｐ＜０．０００１）（図６Ａ）。より高いＳＨＲＯＯＭ３発現は、ＣＡＮ進行と相関し、そしてＳＨＲＯＯＭ３のリスクアレルは主に白人コホートにおいてＣＫＤと関連するため、ここで、本発明者らは、同種移植片ＳＨＲＯＯＭ３発現がリスクアレルの存在と相関するかどうかを調べた。ＳＨＲＯＯＭ３発現が入手可能な１６０の同種移植片のうち、ドナー血液試料または灌流前同種移植片生検試料のいずれかが入手可能である１３６例において、ｒｓ１７３１９７２１変異体のターゲティングＳＮＰ遺伝子型決定を実行した。ＳＨＲＯＯＭ３発現は、Ｇアレルに関してホモ接合体である同種移植片（Ｇ／Ｇ、ｎ＝５２、Ｐ＝０．０１、図６Ｂ）に比較して、リスクアレル（Ａ／Ａ、ｎ＝１４）に関してホモ接合性である同種移植片において、有意により高かった。Ａ／Ｇ同種移植片（ｎ＝７０）のＳＨＲＯＯＭ３発現は、Ａ／ＡまたはＧ／Ｇと有意に異ならなかった。しかし、少なくとも１つのリスクアレルを有するドナー由来の同種移植片（Ａ／ＡまたはＡ／Ｇ；ｎ＝８４）において、リスクアレルを伴わないドナー（Ｇ／Ｇ；ｎ＝５２、ｐ＝０．０２）に比較して、ＳＨＲＯＯＭ３発現は有意により高かった。特に、１０３の白人ドナー同種移植片および３３の非白人ドナー同種移植片において調べた際、同種移植片におけるＳＨＲＯＯＭ３発現およびリスクアレルの間の関係は、一定のままであったが、統計的有意性を達成しなかった（白人ドナーにおいてＰ＝０．０５、それぞれ、図７Ａおよび７Ｂ）。興味深いことに、ドナーではなくレシピエント遺伝子型に対するＳＨＲＯＯＭ３発現の関係を調べた際、１４７人のレシピエントにおいて、リスクアレルおよび発現の間に有意な相関はなかった（図７Ｃ）。
【実施例４】
【００４６】
実施例４：ＳＨＲＯＯＭ３のリスクアレルは、白人において、ＥＳＲＤおよびＣＫＤの原因としての糖尿病と関連する
ＳＨＲＯＯＭ３のリスク変異体がＣＫＤに関連づけられてきているため、本発明者らは、リスクアレルが、レシピエントの本発明者らのコホートにおいて、特定の病因のＥＳＲＤと関連するかどうかを調べた。ＳＨＲＯＯＭ３のリスクアレルは、異なる人種間で異なって分布するため（表４ａおよび４ｂ）、本発明者らは、ドナーおよびレシピエント間のすべての続く比較を、同じ人種に限定した。本発明者らは、リスクアレルのアレル頻度が、白人ドナーおよびレシピエント間で有意に異ならないことを観察した（それぞれ、４２．８７％対４３．０７％）。４６８人のドナーのうち１１４人のみが非白人であったため、各非白人（すなわち、ＡＡ、アジア系、スペイン系およびその他）における被験体の数は、ＳＨＲＯＯＭ３遺伝子型、およびＥＳＲＤ病因に対するその関係に関する推定を有効にするには不十分であった。本発明者らが、文書化されたＥＳＲＤ診断（以前移植を受けたか、先天的な疾患を有するか、またはＥＳＲＤの未知の病因を有するレシピエントを除く）にしたがって、白人レシピエントの間でアレル蔓延を分析した際、本発明者らは、原発性ＥＳＲＤ診断として糖尿病を有する白人レシピエントにおいて、リスクアレルが最も蔓延していることに気づいた（４７．２５％；ｎ＝１２６）。本発明者らは、両方を、レシピエントと血縁がないすべての白人ドナーに比較した際、高血圧を伴わず、糖尿病のみを伴う白人レシピエントが、リスクアレルを有する、１．４１８の未補正オッズ比を有する（９５％ＣＩ＝１．０００〜２．１１；ｐ＝０．０４）一方、高血圧とともに糖尿病を伴う患者が、オッズ比１．３６を有する（９５％ＣＩ＝１．０３１〜１．８１４；ｐ＝０．０２９）ことを見出した（図８Ａ）。さらに、ＥＳＲＤの原因として糖尿病およびＨＴＮ以外の診断を伴う患者において、リスクアレルに関するアレル蔓延は３８．３６％（ｎ＝１５９）であり、これは非血縁同種移植片ドナーにおけるアレル頻度（３９．６４％）とは有意に異ならなかった。糖尿病腎疾患とリスクアレルの関連の外部検証のため、本発明者らは、被験体の独立コホートを分析した。研究の白人参加者（ｎ＝３７８２）の中で、７６３人がＣＫＤを有すると同定された。再び、アレル蔓延は、糖尿病およびＣＫＤを有するもの（ｎ＝１３８）において、ＣＫＤを持たないもの（ｎ＝３０１９）およびＣＫＤも糖尿病も持たないもの（ｎ＝２６９１）に比較して、有意により高かった（５０．４％対４０．４％対３９．３、Ｐ＜０．０１）（図８Ｂ）。共変数として、年齢、ＢＭＩ、高血圧、糖尿病、糖尿病または腎疾患の家族歴を用いた、白人コホート内の多変量分析において、糖尿病に関する補正は、転帰としてのＣＫＤに対するリスクアレルのいかなる影響も無効にした。アレル蔓延はまた、ＣＫＤを伴うおよび伴わない非糖尿病においても類似であった（それぞれ、３８．６％対３９．２６％）。ＣＫＤコホート内で、ＣＫＤを有するＡＡ（ｎ＝７２１）、およびＣＫＤを伴う糖尿病（ｎ＝２０４）は、ＣＫＤを伴わないもの（ｎ＝２７２９）と類似のアレル分布を有し（それぞれ、２０．５９％対１８．４６％対２１．７８％；Ｐ＝０．８１５９）、ＳＨＲＯＯＭ３  ＳＮＰが、この群において、糖尿病／非���尿病腎疾患において、有意な役割を果たさないことが示唆された。
【実施例５】
【００４７】
実施例５：ｒｓ１７３１９７２１のリスクアレルは、ＴＣＦ４仲介性転写活性化を通じてＳＨＲＯＯＭ３発現を増進する。ｒｓ１７３１９７２１は、ＳＨＲＯＯＭ３の最初のイントロン内に位置する。Ａアレルは、ＳＨＲＯＯＭ３のより高い発現に関連するため、本発明者らは、ＳＨＲＯＯＭ３の転写制御に対するＧからＡへの置換の影響を理解するよう試みた。本発明者らがｒｓ１７３１９７２１を含有するＳＨＲＯＯＭ３のイントロン領域を調べた際、本発明者らは、ＧからＡへの置換が、コンセンサス結合配列５’−（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）ＣＡＡＡＧ−３’を含む高移動度群（ＨＭＧ）ボックス含有転写の、転写因子４（ＴＣＦ４／ＴＣＦ７Ｌ２）に対する潜在的なコンセンサス結合配列を生じることを見出した。ＴＣＦ４は、Ｗｎｔ／β−カテニン・シグナル伝達経路に関与する（Ｗｏｒｔｍａｎ  Ｂ、２００２：Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ＬＪ、２０１２）。さらに、本発明者らのマイクロアレイ分析において、Ｓｈｒｏｏｍ３発現の最高の四分位にある患者はまた、有意に上方制御されたＴＣＦ７Ｌ２およびベータ−カテニンを有意に上方制御した（ｐ＜０．０００１）。ｒｓ１７３１９７２１  ＳＮＰを含有するこのイントロン領域が、ＳＨＲＯＯＭ３転写のエンハンサーとしての何らかの機能を所持するかどうかをさらに調べるため、本発明者らは、３Ｋｂ  ＳＨＲＯＯＭ３プロモーター領域、およびＳＨＲＯＯＭ３の第一のイントロンに由来するｒｓ１７３１９７２１のＡアレルまたはＧアレルのいずれかを含有する、１００ｂｐ配列を生成した（図９構築マップ）。Ａアレルを含むＳＨＲＯＯＭ３レポーター構築物は、ＴＧＦβ刺激を伴わない、および活性に増加があるＴＧＦβ刺激を伴うＧアレルに比較して、ルシフェラーゼ対レニラ属レポーター活性において、より高い増加を有した。ＴＣＦ４阻害剤、ＢＣ２１、またはβ−カテニン阻害剤ケルセチンのいずれかでの処理は、ＡアレルおよびＧアレルレポーター構築物間のレポーター活性の相違を抑止し（図１０Ａ）、これはＴＣＦ４−エンハンサー配列が、Ａ対Ｇアレルレポーター構築物の発現における相違に関与することをさらに確認した。１００ｂｐ  ＳＨＲＯＯＭ３イントロン領域へのＴＣＦ４結合をさらに確認するため、本発明者らはＥＭＳＡを実行した。Ａアレルを含有するイントロン配列へのＴＣＦ４結合は、Ｇアレルより大きく、これは過剰なコールドオリゴで試料において抑止された（図１０Ｂ）。
【実施例６】
【００４８】
実施例６：ＴＧＦβ１は、β−カテニン／ＴＣＦ４依存性方式で、ＳＨＲＯＯＭ３発現を増進する
ＳＨＲＯＯＭ３は、ＨＫ−２細胞において、ＴＧＦβ１によって制御され（Ｂｒｅｎｎａｎ  ＥＰ、２０１２）、そしてＴＧＦβ１は腎傷害および線維症を仲介する重要な成長因子である（Ｉａｎ  ＨＹ  ２０１２）ため、本発明者らはさらに、ＴＧＦβ１が仲介するＳＨＲＯＯＭ３の制御を性質決定した。本発明者らは、ＰＲＣＥＣをＴＧＦβ１で処理すると、５ｎｇ／ｍｌで最大にＳＨＲＯＯＭ３  ｍＲＮＡ発現が（図１１Ａ）、そして４８時間でタンパク質発現が（図１１Ｂ）増加することを見出した。転写因子結合モチーフ予測プログラム（ＴＲＡＮＳＦＡＣ）を用いた、転写開始部位から最大−１０ｋｂまでのＳＨＲＯＯＭ３プロモーター配列の分析によって、いかなるＳｍａｄ結合配列も明らかにならず、ＴＧＦβ１が誘導するＳＨＲＯＯＭ３発現の増加は、古典的なＴＧＦβ１／ＳＭＡＤシグナル伝達によるものではないことが示唆された。ＴＧＦβ１は、Ｗｎｔ／β−カテニン／ＴＣＦ４経路とクロストークすることが知られており、そしてＴＣＦ４はＳＨＲＯＯＭ３発現を制御するため、本発明者らは、ＴＧＦβ１が誘導するＳＨＲＯＯＭ３発現が、β−カテニン／ＴＣＦ４相互作用に依存するかどうかを試験した。本発明者らは、ＢＣ−２１およびケルセチンの両方が、ＴＧＦβ１が誘導するＳＨＲＯＯＭ３タンパク質（図１２Ａ）およびｍＲＮＡ（図１２Ｂ）発現増加を抑止することを見出し、したがって、ＴＧＦβ１が誘導するＳＨＲＯＯＭ３発現がβ−カテニン／ＴＣＦ−４依存性であることが確認された。
【実施例７】
【００４９】
実施例７：ＳＨＲＯＯＭ３は、古典的ＴＧＦβ１／ＳＭＡＤ３シグナル伝達および線維症促進性遺伝子発現を促進する
本発明者らは、ＣＫＤならびにＣＡＮにおいて腎線維症のよく性質決定された駆動因子である、ＴＧＦβ１が仲介する線維症促進性遺伝子プログラムに、ＳＨＲＯＯＭ３が何らかの影響を有するかどうかを調べた（Ｌａｎ  ＨＹ  ２０１２；Ｃａｍｐｉｓｔｏｌ  ＪＭ  ２００１）。最初に、本発明者らは、ＴＧＦβ１またはビヒクルのいずれかで処理した、ＳＨＲＯＯＭ３過剰発現を伴うまたは伴わない、ＰＲＣＥＣにおける組織線維症に関連するＴＧＦβ１ターゲット遺伝子の発現を比較した。ＳＨＲＯＯＭ３過剰発現を、ＲＴＰＣＲ（図１３Ａ）およびウェスタンブロット（図１３Ｂ）によって確認した。ＣＯＬ１Ａ１およびＦＮ１を含む、線維症促進性ＴＧＦβ１ターゲット遺伝子の発現は、ＴＧＦβ１処理単独で、ならびにＳＨＲＯＯＭ３過剰発現単独で増加した（図１４Ａ）。ＴＧＦβ１が誘導するＣＯＬ１Ａ１の発現は、ＳＨＲＯＯＭ３過剰発現を伴わないもの（ベクター＋ＴＧＦ）に比較して、ＳＨＲＯＯＭ３過剰発現を伴う細胞において、さらに増加した。ＳＨＲＯＯＭ３がどのようにＴＧＦβ１シグナル伝達を促進するかをさらに性質決定するため、本発明者らは、ＰＲＣＥＣにおける古典的ＴＧＦβ１／ＳＭＡＤシグナル伝達の活性化を示す、ＳＭＡＤ−３のリン酸化を調べた。ＳＨＲＯＯＭ３過剰発現を伴うまたは伴わない細胞を、ＴＧＦβ１またはビヒクルのいずれかで処理した。ＴＧＦβ１処理細胞におけるＳｍａｄ３のリン酸化は、ベクタートランスフェクション細胞に比較して、ＳＨＲＯＯＭ３過剰発現によって増進した（図１４Ｂ）。ＳＨＲＯＯＭ３過剰発現ＰＲＣＥＣのＴＧＦβ１処理はまた、ＳＨＲＯＯＭ３過剰発現を伴わないＴＧＦβ１処理細胞に比較して、より顕著なＦ−アクチン束を発展させた（図１４Ｃ−上部および下部パネル）。次に、本発明者らは、ＴＧＦβ１が誘導する線維症促進性遺伝子プログラムがＳＨＲＯＯＭ３に依存するかどうかを決定することを試みた。ＰＲＣＥＣにおけるＳＨＲＯＯＭ３ノックダウンは、ＣＯＬ１Ａ１およびＦＮ１転写物を有意に減少させた（図１５Ａ）。ＴＧＦβ１が誘導するＣＯＬ１Ａ１の発現もまた、空レンチベクターで形質導入された細胞に比較して、ＳＨＲＯＯＭ３ノックダウン細胞において、有意に減弱された。しかし、ＴＧＦβ１が誘導するＦＮ１の発現は、ＳＨＲＯＯＭ３ノックダウンによっては影響を受けなかった。ＳＨＲＯＯＭ３ノックダウン細胞におけるＳＭＡＤ３のリン酸化は、ＳＨＲＯＯＭ３ノックダウンを伴わない細胞に比較して、ＴＧＦβ１刺激後、３０分で有意に減少したが、１５分では減少しなかった（図１５Ｂ）。総合すると、これらの結果によって、ＳＨＲＯＯＭ３は、ＴＧＦβ１／ＳＭＡＤ３誘導性線維症促進性遺伝子発現プログラムを促進することが示唆される。これをさらに支持するのは、ＳＨＲＯＯＭ３発現の最高四分位にある患者において、ＣＴＧＦのマイクロアレイコホート中、ビメンチン、コラーゲン−ＩＶ（ＴＧＦ／ＳＭＡＤ３シグナル伝達の下流）が、有意に上方制御される遺伝子の中にあるという、本発明者らの知見であった。
【実施例８】
【００５０】
実施例８：ドナーにおけるｒｓ１７３１９７２１のＡアレルは、３ヶ月でのより高い同種移植片ＳＨＲＯＯＭ３発現と関連する。
【００５１】
多数の研究によって、現在、ｒｓ１７３１９７２１  ＳＨＲＯＯＭ３  ＳＮＰがＣＤＫ２０−２２に関連づけられてきている。リスクアレルが、腎実質における改変されたＳＨＲＯＯＭ３発現と関連するかどうか、またはＣＡＮに関連するかどうかは知られていない。２０１３年１月１日現在で、５８９人のレシピエントが親研究に登録されている。本発明者らは、本発明者らのコホート内の５４０の同種移植片レシピエントおよび５１７のドナーに対して、この遺伝子座に関するターゲティング遺伝子型決定を行った。ＣＫＤ関連Ａアレルのアレル蔓延は、レシピエントの間で３６．６６％であり、そしてドナーの間で３９．９４％であった。総合すると、Ａアレルの蔓延は、白人ドナーおよびレシピエントに関して同様であった（それぞれ、４２．８７％対４２．５６％）。各非白人（すなわち、ＡＡ、アジア系、スペイン系およびその他）における被験体の数は、ｒｓ１７３１９７２１分布に関する推定を有効にするには不十分であった。レシピエントおよびドナーの両方において、本発明者らは、Ａアレルの蔓延が、非白人に比較して、白人において有意により高いことを観察した（Ｐ＜０．０００１）。
【００５２】
次に、本発明者らは、３ヶ月の同種移植片ＳＨＲＯＯＭ３発現（ＳＨＲＯＯＭ３−３Ｍ）が、Ａアレルの存在と相関するかどうかを調べた。本研究において、３ヶ月プロトコル生検からの同種移植片遺伝子発現マイクロアレイ分析を、全５８９人の登録者のうち、１５９人に対して行った。これらの患者は、順序により、移植３ヶ月後に生検を行われた最初の１５９人の登録者に相当する。腎同種移植片由来のｒｓ１７３１９７２１に関するターゲティング遺伝子型決定結果およびＳＨＲＯＯＭ３転写物レベルの両方が、１３６人のドナーおよび１４５人のレシピエントから入手可能であった。本発明者らは、ＳＨＲＯＯＭ３−３Ｍが、ＣＫＤリスクアレルに関してホモ接合体である同種移植片（Ａ／Ａ、ｎ＝１４）において、Ｇアレルに関してホモ接合体である同種移植片（Ｇ／Ｇ、ｎ＝５２、Ｐ＝０．０１）に比較して、有意により高いことを観察した。ＳＨＲＯＯＭ３−３Ｍはまた、少なくとも１つのリスクアレルを持つドナ−由来の同種移植片（Ａ／ＡまたはＡ／Ｇ；ｎ＝８４）において、リスクアレルを持たないドナー（Ｇ／Ｇ；ｎ＝５２、Ｐ＝０．０２）に比較して、有意により高かった。興味深いことに、ドナーではなく、レシピエントの遺伝子型に関して、ＳＨＲＯＯＭ３−３Ｍの関係を調べた際、ＡアレルおよびＳＨＲＯＯＭ３−３Ｍの間に有意な相関はなかった（ｎ＝１４５）。
【実施例９】
【００５３】
実施例９：３ヶ月の同種移植片ＳＨＲＯＯＭ３発現およびｒｓ１７３１９７２１のＡアレルは、腎同種移植片レシピエントにおけるＣＡＮのより高いリスクと関連する。
【００５４】
本発明者らは、ｒｓ１７３１９７２１のＡアレルがＳＨＲＯＯＭ３転写活性化と関連し、そしてＳＨＲＯＯＭ−３発現増加がＰＲＣＥＣにおいてＴＧＦ−β１シグナル伝達を促進することを観察したため、ＳＨＲＯＯＭ３−３Ｍおよび／またはドナーリスク遺伝子型が、１２ヶ月の同種移植片機能不全の指標（ＣＡＮ）と相関するかどうかを調べた。
【００５５】
本研究において、３ヶ月プロトコル生検からの同種移植片遺伝子発現マイクロアレイ分析を、全５８９人の登録者のうち、１５９人に対して行った。このファイリング時点で、ｅＧＦＲ−１２は、サブグループから１４７人の被験体において入手可能であり、そしてＣＡＤＩ−１２は、１０１人の被験体において入手可能であった。このサブグループにおいて、１２ヶ月生検を行っていない理由には、移植片喪失（ｎ＝８）、死亡（ｎ＝１）、追跡不能（ｎ＝９）、腎同種移植片生検を得ることが禁忌または不可能であること（ｎ＝４０）が含まれた。
【００５６】
ＳＨＲＯＯＭ３−３Ｍは、ｅＧＦＲ−１２と逆に相関し（ｒ＝−０．２１９２、Ｐ＜０．０１）、そしてＣＡＤＩ−１２と正に相関した（ｒ＝０．２４５８、Ｐ＝０．０３）。この相関は、（ＢＫウイルス腎症および皮質瘢痕）の診断を有する２つの生検を排除した後、有意なままであった（Ｐ＝０．０１）。ＳＨＲＯＯＭ３−３ＭおよびＣＡＤＩ−１２の間の関係は、死亡ドナー同種移植片においてより強かった（ｐ＜０．０１）。ＣＡＤＩ−１２およびｅＧＦＲ−１２に対するＳＨＲＯＯＭ３−３Ｍの関係は、３２人の被験体の内部コホートにおいて、ｑＲＴＰＣＲによってさらに検証された（ｅＧＦＲ−１２に関してｒ＝−０．３９、Ｐ＝０．０２、そしてＣＡＤＩ−１２に関してｒ＝０．３８、Ｐ＝０．０３）。マイクロアレイ由来のＳＨＲＯＯＭ３発現およびｑＲＴＰＣＲ（Ｐ＝０．０００８）の間でロバストな相関が存在した。しかし、ＳＨＲＯＯＭ３−３Ｍおよび同時の３ヶ月ＣＡＤＩの間には相関は存在しなかった（ｎ＝１３５）。ＳＨＲＯＯＭ３−３Ｍは、多変量分析において、２より大きいＣＡＤＩ−１２（ＣＡＤＩ−１２≧２）を予測し、そしてｅＧＦＲ−１２と逆に関連した。分析中に含まれる共変数の間で、３ヶ月より前の急性拒絶は、ＣＡＤＩ−１２およびｅＧＦＲ−１２に対して有意に独立の影響を有した（Ｐ＜０．０５）。
【００５７】
ＳＨＲＯＯＭ３−３ＭがＣＡＮの進行と関連することを裏付けるため、本発明者らは、３ヶ月および１２ヶ月生検の間で、ＣＡＤＩスコアに≧２の増加を有する同種移植片（ΔＣＡＤＩ≧２、ｎ＝１７、進行者として知られる）とＣＡＤＩスコアに＜２の変化未満を有するもの（ΔＣＡＤＩ＜２、ｎ＝６８、非進行者として知られる）の間のＳＨＲＯＯＭ３−３Ｍを比較した。続く組織学的進行に対するベースライン疾患の影響を最小限にするため、本発明者らは、ＣＡＤＩ−３＞２の同種移植片をこの分析から排除した。ＳＨＲＯＯＭ３−３Ｍは、非進行者に比較して進行者において有意に高かった（Ｐ＝０．０４）。
【００５８】
次に、本発明者らは、ドナーリスク遺伝子型およびそのＣＡＮとの関係を調べた。分析時点で、コホートの２０３人の被験体は、１２ヶ月で報告されたＣＡＤＩスコアを有し、１０１はマイクロアレイコホートからであり、そして１０２は非マイクロアレイコホートからであった。この群において、ドナーにおけるＡアレルの存在は、すべての同種移植片において、ＣＡＤＩ−１２≧２の有意により高いリスクと関連し、リスクアレルでのＣＡＮのより高いリスクが示された。
【実施例１０】
【００５９】
実施例１０：ＳＨＲＯＯＭ３は、ｉｎ  ｖｉｖｏのネズミモデルにおける、古典的ＴＧＦ−β１／ＳＭＡＤ３シグナル伝達および線維症促進性遺伝子発現を促進する：
方法
ＳＨＲＯＯＭ３による線維症の促進の機構を調べるため、本発明者らは、誘導性ｓｈＲＮＡが仲介するＳＨＲＯＯＭ３ノックダウンのネズミモデルを発展させた。本発明者らのモデルにおいて、すべての細胞タイプでのＲＴＴＡ発現のため、逆テトラサイクリン調節トランス活性化因子（ＲＴＴＡ）要素をユニバーサルＲＯＳＡｍ２６プロモーターに連結した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ検証後、２つのＳＨＲＯＯＭ３特異的ｓｈＲＮＡヘアピンをドキシサイクリン−ＲＴＴＡ−反応性要素に連結し、そしてコラーゲン−１遺伝子の３’に配置した。Ｒｏｓａ−ＲＴＴＡ要素およびｓｈＲＮＡ（ＣＯＬＴＧＭ）配列に関する試料遺伝子型決定およびサザンブロットゲル電気泳動を示す（図１６Ａ）。ＵＵＯ手術の３週間前に、遺伝子型決定したマウスにおいて、Ｓｈｒｏｏｍ３ノックダウンを誘導するため、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）供給を開始し、そして１０日後の屠殺日まで続けた。腎間質線維症発展を研究するため、本発明者らは、ＤＯＸ供給３週間後、８〜１０週齢の動物に対して、片側性尿管閉塞術（ＵＵＯ）を行った（各ｓｈＲＮＡクローンにおいて、ｎ＝５）。マウスはＵＵＯの１０日後に屠殺された。ＤＯＸを供給されない同じ年齢のＳＨＲＯＯＭ３−ｓｈＲＮＡ動物を対照として用いた。独立ｔ検定によって結果を定量的に分析した。
【００６０】
結果
本発明者らは、上記ＤＯＸ誘導性ｓｈＲＮＡマウス株における、ＴＧＦ−β１／ＳＭＡＤ３シグナル伝達および腎線維症に対するｓｈＲＮＡ仲介性ＳＨＲＯＯＭ３ノックダウンの影響を調べた。これらの動物のドキシサイクリン（ＤＯＸ）供給は、３週までのＳＨＲＯＯＭ３ノックダウン（〜７５％）を確認した（腎皮質溶解物からのリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）およびウェスタンブロット（ＷＢ））（図１６Ｂおよび１６Ｄ）。ＤＯＸ供給動物は、ウェスタンブロットによって、ＵＵＯ腎臓において、ＳＭＡＤ３のリン酸化を有意に阻害することが示された（図１６Ｂ）。ＵＵＯ腎臓におけるＣＯＬ１Ａ１産生は、腎臓溶解物のＲＴＰＣＲによって、そして組織切片における免疫蛍光（ＩＦ）によって示されるように、Ｓｈｒｏｏｍ３ノックダウンで阻害された（図１６Ｃ−下部パネルおよびグラフ；ならびに１６Ｄ）。ピクロシリウスレッド染色によって測定されるような腎間質線維症（図１６Ｃ−中央パネル）は、Ｓｈｒｏｏｍ３ノックダウン動物において有意に抑止された。これらの結果は、古典的ＴＧＦ−β１シグナル伝達において、ＳＨＲＯＯＭ３の役割を検証する。
【００６１】
考察
慢性同種移植片腎症は、同種移植片不全およびＲＲＴの実質的な原因であり続けている（Ｐａｕｌ  ＬＣ、１９９９）（Ｃｈａｐｍａｎ  ＪＲ、２００５）（Ｒａｃｕｓｅｎ  ＬＣ、２０１０）（ＵＳＲＤＳ  ２０１２）。現代の免疫抑制戦略は、短期同種移植片転帰に有意な影響を有するが、長期転帰では改善ははるかにより少ない（Ｈａｒｉｈａｒａｎ  Ｓ、２０００）（Ｍｅｉｅｒ−Ｋｒｉｅｓｃｈｅ  ＨＵ、２００４）（Ｌａｍｂ  ＫＥ、２０１１）。さらに、ＣＡＮは、報告する病理学者間で、恣意的な段階および可変性を伴う組織学的実体であり続けている（Ｓｏｌｅｚ  Ｋ、２００８）（Ａｋａｌｉｎ  Ｅ、２０１０）（Ｙｉｎｇ  Ｌ、２００９）（Ｈａｌｌｏｒａｎ  Ｐ、２００２）。したがって、ＣＡＮの潜在的な早期診断および療法に関するより新規のマーカーの同定は、必要不可欠である。ＧｏＣＡＲ研究において、本発明者らは、３ヶ月のプロトコル生検からの同種移植片遺伝子発現プロファイルが、１２ヶ月のＣＡＮおよびＴＩＦの発展を予測する能力を調べている。本発明者らは、こうして、Ｓｈｒｏｏｍ３を、同種移植片におけるその発現が、腎機能撹乱およびＴＩＦ進行に先行し、そしてこれを予測する、新規候補遺伝子と同定した。
【００６２】
先行研究において、発展したＣＡＮが特徴的な転写シグニチャーを示してきている（Ｆｌｅｃｈｎｅｒ  Ｓ、２００４）（Ｄｏｎａｕｅｒ  Ｊ、２００３）が、その解釈および一般化可能性に関しては問題が生じてきている。バイオマーカーおよび／または療法戦略の発展は、遺伝子パネルサイズが大規模であり、試料サイズが小さく、生検が一時点であり、用いる遺伝子チップアッセイが不均一であり、そしてアレイ前の増幅技術の忠実性が低いことによって遅れてきている（Ｙｉｎｇ  Ｌ、２００９）（Ａｋａｌｉｎ  Ｅ、２０１０）。正当な理由の生検転写プロファイルに基づく研究は、生検時点での、病理に依存する遺伝子多様性のため、ＣＡＮに関する予測パネルまたは療法剤を発展させるには、より信頼性がない。ＣＡＮの発展を予測するであろう遺伝子シグニチャーを決定するため、Ｓｃｈｅｒｅｒらは、患者のうち１２人がＣＡＮを発展させた１７人の患者の６ヶ月プロトコル生検から増幅されたＲＮＡ（Ａｆｆｙ  ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２チップ）をプロファイリングした。Ｓｃｈｅｒｅｒらは、１０遺伝子クラスターを発展させ、これらは１２ヶ月での慢性拒絶発展を８８％予測した。しかし、この関係は、単一遺伝子を分析した場合には有意でなかった（Ｓｃｈｅｒｅｒ  Ａ、２００３）。本発明者らは、３ヶ月生検由来の増幅されないＲＮＡおよび全エクソン遺伝子チップアレイ（〜４プローブ／エクソン、〜４０プローブ／遺伝子）を用いて、本発明者らの患者のより大きなコホートにおいて、１２ヶ月でのｅＧＦＲおよびＣＡＮと示唆的に発現される遺伝子を相関させた。さらに、本発明者らの研究において、Ｓｈｒｏｏｍ３発現は、全コホートにおいて、単独で分析した際、有意性を保持し、ＤＤＲおよびＷＤＫＲのサブセットにおいて、よりよく相関した。これは、ＲＴ−ＰＣＲによる患者のより小さい内部−外部コホートにおいて検証された。重要なことに、平均Ｓｈｒｏｏｍ３転写物レベルは、比較的安定な組織学的スコアを持つものに比較して、３ヶ月および１２ヶ月の間でＣＡＤＩスコアが進行した患者（デルタＣＡＤＩ≧２）において有意により高かった。これは、線維症およびＣＡＮの進行における、Ｓｈｒｏｏｍ３の役割を暗示する。
【００６３】
ＴＩＦは、ＣＡＮおよびＣＫＤの共通の組織学的終点である。その結果、線維化およびＥＣマトリックス産生に関連する、特にＴＧＦ−ベータ・シグナル伝達に関連する遺伝子が、ＣＡＮの患者およびＣＫＤの動物モデルにおける転写研究から示差的に制御されるように現れてきている（Ｆｌｅｃｈｎｅｒ  Ｓ、２００４）（Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ  Ｈ、２００６）（Ｍａｓ  Ｖ、２００７）（Ｊｕ  Ｗ、２００９）。Ｓｈｒｏｏｍ３におけるＳＮＰは、独立に、白人が主であるコホートにおいて、ＣＫＤの発生率および蔓延に独立に関連して現れてきている（Ｋｏｔｔｇｅｎ  Ａ、２００９）（Ｂｏｇｅｒ  Ｃ、２０１１）。しかし、Ｓｈｒｏｏｍ３遺伝子機能、ならびにｅＧＦＲおよびＴＩＦ喪失に対するその関係はこれまでのところ未知である。ＰＲＣＥＣにおいて、本発明者らのＲＴ−ＰＣＲ研究は、Ｓｈｒｏｏｍ３過剰発現による、ＥＣ−マトリックスマーカー（コラーゲン−１およびフィブロネクチン）の小さいが有意な過剰産生、およびＳｉＲＮＡ仲介性Ｓｈｒｏｏｍ３阻害でのこれらのマーカーの顕著な抑制を示唆する。さらに、Ｓｈｒｏｏｍ３過剰発現は、ＰＲＣＥＣにおいて、Ｓｍａｄ−３リン酸化増進によって明らかであるように、古典的ＴＧＦ−ベータ・シグナル伝達を促進するようである。これと一致するのは、対照に比較したＳｈｒｏｏｍ３トランスフェクション細胞における、ＴＧＦ−ベータ処理に際しての、線維症マーカー産生（ＳＮＡＩＬ、ＭＭＰ−２、コラーゲン−１）の増幅反応である。やはりこれらの観察と一致するのは、ＴＧＦ処理細胞におけるＳｈｒｏｏｍ３  ＳｉＲＮＡで本発明者らが観察した、Ｐ−Ｓｍａｄ３およびコラーゲン−１レベルの抑制である。ＴＧＦ−ベータはまた、ＰＲＣＥＣにおいてＳｈｒｏｏｍ３発現を増加させた。他のグループが、ＲＮＡ配列決定を用いて、ＨＫ−２細胞において、この観察を行ってきている（Ｂｒｅｎｎａｎ  ＥＰ）。これは、ＴＧＦ−ベータ・シグナル伝達に対するＳｈｒｏｏｍ３増加の有益な効果とともに、Ｓｈｒｏｏｍ３およびＴＧＦの間の正のフィードバックループを示しうる。総合すると、これらは、より高いＳｈｒｏｏｍ３発現が、腎上皮細胞における線維症促進効果を有しうることを示唆する。興味深いことに、本発明者らの生検データから、ドナーにおける１または２コピーのリスクアレル（Ａ）の存在は、生検組織において、Ｓｈｒｏｏｍ３転写物レベルを有意に増加させるようである（〜１．４倍）。レシピエント−ＳＮＰおよびＳｈｒｏｏｍ３発現の間には一貫した関連はなく、浸潤するレシピエント細胞からの同種移植片Ｓｈｒｏｏｍ３発現の寄与はほとんどないことが示唆された。要約すると、これは、先のＧＷＡＳ研究におけるＳＮＰおよびＣＫＤの間の関連が、リスクアレルを有することと同調する、腎臓Ｓｈｒｏｏｍ３レベル増加、およびそれに続く線維症促進性反応によって説明可能であることを暗示する。
【００６４】
単変量分析において、Ｓｈｒｏｏｍ３発現およびｅＧＦＲ／ＣＡＤＩの間の関連は、ＷＤＫＲおよびＤＤＲにおいて有意であったが、非ＷＤＫＲまたはＬＤＲにおいて有意ではなかった。顕著なことに、ＤＤＲのうち、５１／５９がＷＤＫＲであった。影響アレル蔓延はまた、本発明者らの分析において、非白人に比較して、白人において、有意により高かった。Ｓｈｒｏｏｍ３を同定した以前のＧＷＡＳ研究は、白人が主であるコホートを含んだ（Ｋｏｔｔｇｅｎ  Ａ、２００９）（Ｂｏｇｅｒ  Ｃ、２０１１）。尿−アルブミン・クレアチニン比（ＵＡＣＲ）に関する感受性遺伝子座を同定する研究において、Ｓｈｒｏｏｍ３  ＳＮＰは、白人において、ｅＧＦＲおよびＵＡＣＲに対する関連を保持したが、アフリカ系アメリカ人において、有意性を獲得しなかった（Ｅｌｌｉｓ  ＪＷ、２０１１）。非白人において、Ｓｈｒｏｏｍ３発現およびｅＧＦＲ／ＣＡＤＩの間の関係が欠如しているという本発明者らの観察は、これらの公表された結果と同様である。しかし、ドナーにおけるＡアレルの存在を伴うＳｈｒｏｏｍ３発現の増加は、非ＷＤＫＲにおいても観察された。さらに、マイクロアレイによる平均Ｓｈｒｏｏｍ３発現は、ＷＤＫＲおよび非ＷＤＫＲの間で有意には異ならなかった（データ未提示）。したがって、非白人におけるｅＧＦＲ／ＣＡＤＩに対するＳｈｒｏｏｍ３の有意でない影響は明らかでない。マイクロアレイ（ｎ＝２１）およびＲＴ−ＰＣＲ（ｎ＝５）における非ＷＤＫＲは、ＷＤＫＲよりも少なかった。より推測的には、本発明者らが分析しなかった非ＷＤＫＲにおいて、同種移植片転帰に対するより大きな影響を有する多型が、このコホート内で異なって分布している可能性もある。本明細書に報告するコホートにおいて、それぞれ糖尿病性ＥＳＲＤおよびＣＫＤを有するヨーロッパ系アメリカ人は、ｒｓ１７３１９７２１のリスクアレルの最高の蔓延を有した。しかし、腎症および糖尿病の家族調査（ＦＩＮＤ）研究は、白人における染色体４上の遺伝子座および糖尿病腎症の間の関連を報告しなかった（Ｉｇｏ  ＲＰ、２０１１）。これらの結果の不一致は、血縁がない腎臓ドナーのみを含む本発明者らの比較群に由来する可能性もある。
【００６５】
３ヶ月のマイクロアレイにおいて、すべての患者が、１２ヶ月で、転帰評価のための生検を有したわけではなかった（１７の同種移植片喪失、４２の追跡不能または１２ヶ月生検の拒絶）。１０１の患者のサンプルサイズは、それでもなお、同種移植片レシピエントにおける以前の転写研究に比較してロバストである（Ｆｌｅｃｈｎｅｒ  Ｓ、２００４）（Ｄｏｎａｕｅｒ  Ｊ、２００３）（Ｓａｒｗａｌ  Ｍ、２００３）（Ｒｅｅｖｅ  Ｊ、２００９）。マイクロアレイ後、ＲＴ−ＰＣＲ検証のための十分に高品質のＲＮＡを有したのは３６人の患者のみであったが、このサンプル内で、関係は有意であった。Ｓｈｒｏｏｍ３過剰によるＴＧＦ−ベータ・シグナル伝達の促進は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察され、この相互作用の機構は未知である。Ｓｈｒｏｏｍ３のＣ末端ＡＳＤ−２ドメインは、Ｒｈｏ−キナーゼ１および２（ＲＯＣＫ）補充、ならびに陥入神経管における機能に必須であることが示されてきている。このドメインの突然変異は、ＲＯＣＫ機能の喪失につながる（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ、２００８）。軟骨細胞において、ＲＯＣＫは、ＴＧＦ−ベータ処理でのＳｍａｄ３−リン酸化を促進し、そしてＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２）はこれを阻害した（Ｘｕ  Ｔ、２０１２）。さらに、片側性尿管閉塞の動物モデルにおいて、ＲＯＣＫ阻害剤は、腎間質性線維症およびＧＦＲ減少を遅延させた（Ｓａｔｏｈ  Ｓ、２００２）（Ｎａｇａｔｏｙａ  Ｋ、２００２）（Ｔａｋｅｄａ  Ｙ、２０１０）。本発明者らはこれを試験しなかったが、ＴＧＦ−ベータとの相互作用の機構は、部分的に、Ｓｈｒｏｏｍ３仲介性ＲＯＣＫ促進を通じてでありうる。最後に、Ｓｈｒｏｏｍ３遺伝子上のｒｓ１７３１９７２１遺伝子座は、イントロン性であり、エクソン１および２の間である。この領域に見かけ上の制御効果がある理由は本発明者らの観察からはより明らかでない。最近、ヒトゲノム内のイントロン性遺伝子座に付随した制御機構を記載する、ＤＮＡ要素のエンサイクロペディア（ＥＮＣＯＤＥ）コンソーシアムからの結果が相次いで公表されてきている（Ｄｕｎｈａｍ  Ｉ、２０１２）（Ｎｅｐｈ  Ｓ、２０１２）（Ｇｅｒｓｔｅｉｎ  Ｍ、２０１２）。ヒストンメチル化マッピングを用いた研究によって、Ｓｈｒｏｏｍ３  ＳＮＰがエンハンサー機能を有すると予測される領域に位置すると示唆されてきている（Ｄｒ  Ｋａｔａｌｉｎａ  Ｓｕｓｚｔａｋ、ＡＳＮ  ２０１２）。これは本発明者らの知見と一致する。
【００６６】
要約すると、Ｓｈｒｏｏｍ３は、腎同種移植片におけるその発現が、ＣＡＮにおける腎機能の撹乱およびＴＩＦに先行し、そしてこれを予測する、新規候補遺伝子である。より高い同種移植片Ｓｈｒｏｏｍ３レベルは、ＣＡＮの組織学的進行を予測するようである。本発明者らはまた、これらの関係が、白人ドナー腎臓および死亡ドナー腎臓のレシピエントにおいて最高であることも示す。本発明者らの知見は、以前記載されたＣＫＤ関連Ｓｈｒｏｏｍ３遺伝子座（ｒｓ１７３１９７２１）（Ｋｏｔｔｇｅｎ  Ａ、２００９）（Ｂｏｇｅｒ  Ｃ、２０１１）が、Ｓｈｒｏｏｍ３発現増加を通じて、その影響を仲介することを最初に確認する。最後に、本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究によって、古典的ＴＧＦ−ベータ・シグナル伝達およびＩ型コラーゲン産生におけるＳｈｒｏｏｍ３の有益な役割が、ＣＡＮおよびＣＫＤ両方において、ＴＩＦの進行を減少させ、そしてＥＳＲＤを遅延させる療法ターゲットとして有望であることが示唆される。
【００６７】
本発明にはまた、腎臓疾患に罹患した患者を同定する際に使用するための、そして腎同種移植片レシピエントにおいて、腎臓線維症およびＴＩＦの進行を予測するためのキットも含まれる。該キットは、Ｓｈｒｏｏｍ３発現のＲＴ−ＰＣＲ分析のための試薬、およびｒｓ１７３１９７２１  ＳＮＰリスクアレルを検出するためのマイクロアレイ、ＲＴ−ＰＣＲアッセイのための陽性対照、緩衝剤、ならびに使用説明書からなる。該キットは、ドナーから腎臓移植片を受けた患者から腎生検を得て、Ｓｈｒｏｏｍ３発現を決定し、そしてすべてＲＴ−ＰＣＲによって、キットにおける陽性対照中のＳｈｒｏｏｍ３発現レベルと、生検標本におけるＳｈｒｏｏｍ３発現レベルを比較することによって用いられる。マイクロアレイを用いて、Ｓｈｒｏｏｍ３  Ａアレルに関してホモ接合体である腎臓ドナーを同定する。
【００６８】
参考文献：
【００６９】
【化１−１】
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【００７０】
【化１−２】
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【００７１】
【化１−３】
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【００７２】
【化１−４】
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【００７３】
【化１−５】
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【００７４】
【化１−６】
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【００７５】
【化１−７】
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【００７６】
本発明は、本明細書記載の特定の態様によって、その範囲が限定されない。実際、本明細書記載のものに加えて、本発明の多様な修飾が、前述の説明および付随する図から当業者には明らかとなるであろう。こうした修飾は、付随する請求項の範囲内に属すると意図される。
【００７７】
すべての値はおおよそであり、そして説明のために提供されることがさらに理解されるものとする。特許、特許出願、刊行物、産物説明、およびプロトコルが、本出願全体に引用され、これらの開示は、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１Ａ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１６−３】
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【図１０】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【国際調査報告】
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