(57)【要約】  本発明は、免疫エフェクター細胞に特異的に結合し、同時にＩＬ２３Ｒを担持する標的細胞に結合する、二重特異性構築物、並びに核酸、ベクター、宿主細胞、医薬組成物、並びに、それらの製造、並びに炎症性及び／又は自己免疫性疾患及び／又は癌の治療におけるそのような二重特異性構築物の使用を含む、それらの使用方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重特異性構築物であって、１つ以上の第一の結合部分と、１つ以上の第二の結合部分を含み、ＩＬ２３Ｒを発現する腫瘍細胞を含有する癌の治療に使用され、当該第一の結合部分が、細胞傷害性エフェクターＴ（Ｔｃ）細胞上に存在する第一の抗原に特異的に結合し、当該第二の結合部分が、ＩＬ−２３受容体特異的サブユニット（ＩＬ２３Ｒ）に特異的に結合する、二重特異性構築物。
【請求項２】
二重特異性構築物であって、１つ以上の第一の結合部分と、１つ以上の第二の結合部分を含み、ＩＬ２３Ｒを発現する腫瘍細胞を含有する癌の治療に使用され、当該第一の結合部分が、細胞傷害性エフェクターＴ（Ｔｃ）細胞上に存在する第一の抗原に特異的に結合し、当該第二の結合部分が、標的細胞の表面上に存在するＩＬ−２３受容体特異的サブユニット（ＩＬ２３Ｒ）に特異的に結合し、具体的には、当該標的細胞が病原性細胞、具体的には、ＩＬ−１７を生産するＴ細胞（Ｔｈ１７細胞）、γδＴ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、不変ナチュラルキラー（ｉＮＫ）細胞及びＩＬ２３Ｒを発現する腫瘍細胞から成る群から選択される細胞、より具体的にはＴｈ１７細胞、又はγδＴ細胞又はＩＬ２３Ｒを発現する腫瘍細胞である、二重特異性構築物。
【請求項３】
前記第一の結合部分が、ＣＤ３及びＣＤ２８から選択される抗原に特異的に結合する、請求項１又は２のいずれか１項に記載の二重特異性構築物。
【請求項４】
前記第一の結合部分がＣＤ３に、具体的にはＣＤ３のイプシロン鎖（ＣＤ３ε）に、より具体的にはＣＤ３εのアゴニストエピトープに、特異的に結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の二重特異性構築物。
【請求項５】
前記構築物がＴｃ細胞による標的細胞の効率的な殺傷を可能とし、当該Ｔｃ細胞が、刺激又は非刺激Ｔｃ細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の二重特異性構築物。
【請求項６】
前記第一及び第二の結合部分が、第一の結合部分の中の第一の抗原を認識する部分と、第二の結合部分中のＩＬ２３Ｒを認識する部分とが、当該二重特異性構築物の中心から本質的に反対方向に外側に突き出すように配置されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の二重特異性構築物。
【請求項７】
前記第一の結合部分及び／又は前記第二の結合部分が、抗体ベースの結合部分であって、具体的には、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）又はその結合断片を含む抗体ベースの結合部分であって、より具体的には、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）又はその結合断片、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）又はその結合断片を含む抗体ベースの結合部分である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の二重特異性構築物。
【請求項８】
単鎖二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）（ｓｃＤｂ）、タンデムｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）、直鎖ダイマーｓｃＤｂ（ＬＤ−ｓｃＤｂ）、環状ダイマーｓｃＤｂ（ＣＤ−ｓｃＤｂ）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ；ｔａｎｄｅｍ  ｄｉ−ｓｃＦｖ）、タンデムｔｒｉ−ｓｃＦｖ、三重特異性抗体（ｔｒｉ（ａ）ｂｏｄｙ）、二重特異性Ｆａｂ２、ジ−ミニ抗体、四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ融合体、ジ−二重特異性抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＩｇＧ−ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ、Ｆｖ２−Ｆｃ、ｂｓＡｂ、Ｂｓ１Ａｂ、Ｂｓ２Ａｂ、Ｂｓ３Ａｂ、Ｔｓ１Ａｂ、Ｔｓ２Ａｂ及びＫｎｏｂ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅｓ（ＫｉＨｓ）を含むＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体、並びにＤｕｏＢｏｄｉｅｓから成る群から選択される抗体フォーマットである、具体的には単鎖二重特異性抗体（ｓｃＤｂ）、より具体的には二重特異性モノマーｓｃＤｂである、請求項７に記載の二重特異性構築物。
【請求項９】
前記二重特異性ｓｃＤｂが、２つの可変重鎖ドメイン（ＶＨ）又はその断片と、２つの可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）又はその断片とが、リンカーＬ１、Ｌ２及びＬ３によって、ＶＨＡ−Ｌ１−ＶＬＢ−Ｌ２−ＶＨＢ−Ｌ３−ＶＬＡ、ＶＨＡ−Ｌ１−ＶＨＢ−Ｌ２−ＶＬＢ−Ｌ３−ＶＬＡ、ＶＬＡ−Ｌ１−ＶＬＢ−Ｌ２−ＶＨＢ−Ｌ３−ＶＨＡ、ＶＬＡ−Ｌ１−ＶＨＢ−Ｌ２−ＶＬＢ−Ｌ３−ＶＨＡ、ＶＨＢ−Ｌ１−ＶＬＡ−Ｌ２−ＶＨＡ−Ｌ３−ＶＬＢ、ＶＨＢ−Ｌ１−ＶＨＡ−Ｌ２−ＶＬＡ−Ｌ３−ＶＬＢ、ＶＬＢ−Ｌ１−ＶＬＡ−Ｌ２−ＶＨＡ−Ｌ３−ＶＨＢ又はＶＬＢ−Ｌ１−ＶＨＡ−Ｌ２−ＶＬＡ−Ｌ３−ＶＨＢの順番で連結されたものを含み、ここで、ＶＬＡ及びＶＨＡドメインが共同で第一の抗原に対する結合部位を形成し、ＶＬＢ及びＶＨＢドメインが共同でＩＬ２３Ｒに対する抗原結合部位を形成し、具体的には、当該リンカーＬ１が、２〜１０アミノ酸のペプチドであり、リンカーＬ３が１〜１０アミノ酸のペプチドであり、リンカーＬ２が１０〜４０アミノ酸のペプチドである、請求項８に記載の二重特異性構築物。
【請求項１０】
前記二重特異性構築物がＰＲＯ１６５（配列番号：７）、又はＰＲＯ１６５の機能的に活性な変異体である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の二重特異性構築物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の二重特異性構築物をコードする核酸。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１３】
請求項１２のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の二重特異性構築物を生産する方法であって、（ｉ）請求項１１に記載の核酸、又は請求項１２に記載のベクターを提供する工程、当該核酸又はベクターを発現させる工程、及び発現系から当該二重特異性構築物を回収する工程、又は（ｉｉ）請求項１３に記載の宿主細胞を提供する工程、当該宿主細胞を培養する工程、及び当該細胞培養物から当該二重特異性構築物を回収する工程、を含む、方法。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の二重特異性構築物、及び医薬として許容される担体を含有する、医薬組成物。
【請求項１６】
炎症及び／又は自己免疫疾患の治療に、具体的にはヒト患者の治療に使用される請求項２〜１０のいずれか１項に記載の二重特異性構築物であって、特に、当該炎症及び／又は自己免疫疾患が、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬、乾癬性関節炎、潰瘍性結腸炎、クローン症、全身性エリテマトーデス、若年性糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、及び多発性硬化症、パーキンソン症、アルツハイマー症、及び虚血再かん流傷害から成る群から選択される、二重特異性構築物。
【請求項１７】
ヒト患者の治療に使用される請求項１に記載の二重特異性構築物であって、特に、前記癌が、直腸結腸癌、肺癌、乳癌、鼻咽腔癌、口腔癌、食道癌、膵臓癌、Ｂ細胞リンパ腫、並びに成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＬＣ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、小児性急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、Ｔ細胞／ナチュラルキラー細胞リンパ腫、及び末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）を含むＴ細胞リンパ腫から成る群から選択される、二重特異性構築物。
【請求項１８】
前記ヒト患者が、高いＴｈ１７応答性を有する患者である、請求項１７に記載の二重特異性構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫エフェクター細胞に特異的に結合し、同時にＩＬ２３Ｒを担持する標的細胞に結合する、二重特異性構築物、並びに核酸、ベクター、宿主細胞、医薬組成物、並びに、それらの製造、並びに炎症性及び／又は自己免疫性疾患及び／又は癌の治療におけるそのような二重特異性構築物の使用を含む、それらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン（ＩＬ）−２３は、それらの推定分子量に基づいてｐ４０及びｐ１９と称される２つのタンパク質サブユニットからなるヘテロダイマーサイトカインである。ｐ４０タンパク質はＩＬ−１２及びＩＬ−２３で共通しているが、ｐ１９タンパク質サブユニットは、ＩＬ−２３に特有である。ＩＬ−２３は、ｐ４０に結合するＩＬ−１２受容体β−１（ＩＬ−１２Ｒ１）鎖と、ＩＬ−２３特異的細胞内シグナリングをもたらす特有のＩＬ−２３受容体鎖（ＩＬ２３Ｒ）からなる、二本鎖受容体複合体を通じて信号を伝達する。
【０００３】
ＩＬ−２３は、単純なＣＤ４＋Ｔ細胞の、病原性のＩＬ−１７を生産するヘルパーＴ（Ｔｈ１７又はＴＨＩＬ−１７）細胞への分化を誘導する。この別異のヘルパーＴ細胞サブセットによって分泌されるＩＬ−１７は、炎症における重要なエフェクターサイトカインである。ＩＬ−１７レベルの増大は、関節リウマチ、炎症性腸疾患（即ちクローン症及び潰瘍性結腸炎及び乾癬等の様々な自己免疫疾患や炎症性症状の標的組織において観察されている。従って、ＩＬ−２３は、炎症性症状及び自己免疫介在性の疾患における重要な因子と考えられている。
【０００４】
ＩＬ−２３／ＩＬ−１７シグナリングを標的とする幾つかのアプローチが試みられており、例えば、ＩＬ−２３又はＩＬ−２３受容体に対する抗体が、炎症性及び自己免疫性疾患に対する潜在的な治療的アプローチとして試験されている。潜在的な薬理学的介入における標的としてのＩＬ−２３の使用に関して、ＩＬ−２３のｐ４０サブユニットに対する様々な中和抗体が、自己免疫によって引き起こされる疾患の治療における潜在的な使用のために開発されている。例えば、ウステキヌマブ（Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ）として知られるモノクローナル抗体は、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３の共通のｐ４０サブユニットを標的とする抗体である。この抗体は、乾癬及び乾癬性関節炎の治療に有効であることが示されている。ＩＬ−２３の小さい方のｐ１９サブユニットを標的とする他のモノクローナル抗体は、ＥＰ  ２  ５４８  ５７７に記載されている。
【０００５】
ＩＬ−２３受容体を標的とする抗体によってＩＬ−２３受容体をブロックすることを目的とする方策に関して、ＷＯ  ２００４／０４２００９は、ＩＬ−１７の発現増大に関連する炎症性疾患の治療のための、モノクローナル抗ＩＬ−２３受容体抗体又はその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２）の使用を開示している。更に、ＷＯ  ２００８／１０６１３４は、炎症性及び自己免疫性障害の治療に使用されるのに適した、ヒトＩＬ−２３受容体のＩＬ２３Ｒ鎖を認識するヒト化抗体の生産を開示している。これらの抗ＩＬ２３Ｒ抗体は、特に、免疫治療において細胞表面にＩＬ２３Ｒを発現している細胞を選択的に標的化及び殺傷するために使用できる細胞傷害性ペイロードをコンジュゲートした抗体を含む。
【０００６】
様々な癌疾患の抗体ベースの治療における確実なアプローチは、二重特異性抗体を用いて標的細胞を特異的に溶解するための免疫エフェクター細胞のリダイレクションである。二重特異性抗体は、標的細胞の表面上の特定の抗原を認識し、同時に、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞や細胞傷害性Ｔ（Ｔｃ）細胞等の免疫エフェクター細胞の表面分子を活性化して、標的細胞を殺傷する。
【０００７】
二重特異性抗体の概念は例えば癌治療において使用され、その場合、二重特異性抗体は、癌細胞上の癌抗原に結合して、同時に、例えば細胞傷害性Ｔ細胞の表面に存在するＣＤ３のイプシロン鎖に結合するものが採用される。そのような二重特異性抗体構築物の周知の例はブリナツモマブで、この抗体は、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）で、非ホジキン性リンパ腫及び急性リンパ芽球性白血病の治療に用いられる。ブリナツモマブは、Ｍｉｃｒｏｍｅｔにより開発され、細胞傷害性Ｔ細胞の表面上の癌抗原ＣＤ１９及びＣＤ３に同時に結合することによって、これらの２種類の細胞を連結して、細胞傷害性Ｔ細胞が標的細胞を溶解する能力を活性化する。
【０００８】
これまでに最も成功した炎症性及び／又は自己免疫性疾患を治療するための抗体ベースのアプローチは、サイトカインとその受容体との相互作用を阻害してサイトカイン受容体を通じたシグナリングを阻害する作用機序を利用している。例えば、ＴＮＦαの阻害（例えばインフリキシマブ及びアダリムマブ）、ｐ４０の阻害（例えばウステキヌマブ）、又はＩＬ６Ｒの阻害（例えばトシリズマブ）である。しかしながら、これらの抗体は、しばしば冗長経路を通じたシグナリングを可能とする。その結果、多くの患者が効果的に治療され得ない。例えば、患者の４０％が、ＴＮＦα阻害抗体を用いた治療に不応性である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、炎症性及び／又は自己免疫性疾患及び癌等の様々な疾患の治療における、新規かつ改善された治療の方策における需要が尚も存在する。具体的には、そのような治療に使用される、安定で、生産が容器で、所望の標的抗原に対して高度に特異的で、かつ免疫原性が低い、二重特異性分子が要求される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、免疫エフェクター細胞、即ち細胞傷害性エフェクターＴ（Ｔｃ）細胞に特異的に結合し、同時にＩＬ−２３受容体を発現する標的細胞、例えば病原性ＩＬ−１７を生産するヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１７細胞）に結合することによって、ＩＬ＝２３受容体を発現する標的細胞を殺傷する、二重特異性構築物を提供することによって、上記需要を充たす。
【００１１】
第一の側面において、本発明は、二重特異性構築物を提供し、当該構築物は、１つ以上の第一の結合部分と、１つ以上の第二の結合部分を含み、ＩＬ２３Ｒを発現する腫瘍細胞を含有する癌の治療に使用され、当該第一の結合部分が、細胞傷害性エフェクターＴ（Ｔｃ）細胞上に存在する第一の抗原に特異的に結合し、当該第二の結合部分が、ＩＬ−２３受容体特異的サブユニット（ＩＬ２３Ｒ）に特異的に結合する。
【００１２】
第二の側面において、本発明は、二重特異性構築物を提供し、当該構築物は、１つ以上の第一の結合部分と、１つ以上の第二の結合部分を含み、ＩＬ２３Ｒを発現する腫瘍細胞を含有する癌の治療に使用され、当該第一の結合部分が、細胞傷害性エフェクターＴ（Ｔｃ）細胞上に存在する第一の抗原に特異的に結合し、当該第二の結合部分が、標的細胞の表面上に存在するＩＬ−２３受容体特異的サブユニット（ＩＬ２３Ｒ）に特異的に結合する。
【００１３】
また、本発明は、更なる側面において、本発明の二重特異性構築物をコードする核酸、及び当該核酸を含むベクター、及び当該ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１４】
本発明の他の側面は、本発明の二重特異性構築物を生産する方法に関し、当該方法は、（ｉ）本発明の核酸、又は本発明のベクターを提供する工程、当該核酸又はベクターを発現させる工程、及び発現系から当該二重特異性構築物を回収する工程、又は（ｉｉ）本発明の宿主細胞を提供する工程、当該宿主細胞を培養する工程、及び当該細胞培養物から当該二重特異性構築物を回収する工程、を含む。
【００１５】
本発明の尚も他の側面は、本発明の二重特異性構築物、及び医薬として許容される担体を含有する、医薬組成物に関する。
【００１６】
尚も他の側面において、本発明は、炎症及び／又は自己免疫疾患の治療における、又は炎症及び／又は自己免疫疾患の治療方法における、本発明の二重特異性構築物の使用に関し、当該方法は、治療有効量の本発明の二重特異性構築物を対象に投与することを含む。例示的な炎症性及び／又は自己免疫性疾患として、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬、乾癬性関節炎、潰瘍性結腸炎、クローン症、全身性エリテマトーデス、若年性糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、及び多発性硬化症、パーキンソン症、アルツハイマー症、及び虚血再かん流傷害が挙げられる。
【００１７】
本発明の具体的態様は、付随する従属項に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１ＡはＴｈ１抗腫瘍応答；図１Ｂは二重特異性抗ＩＬ２３ＲｘＣＤ３ε抗体相互作用の予想されるメカニズムを示す。
【００１９】
【図２】図２は、結腸癌細胞株上のＩＬ２３Ｒの発現を示す。ＩＬ２３Ｒ発現は、ヤギポリクローナル抗ＩＬ２３Ｒ一次抗体、及びＰＥ標識抗ヤギ抗体によって検出された。実線はＩＬ２３Ｒ発現、点線はアイソタイプ対照の発現を示す。Ｘ軸はＰＥ強度、Ｙ軸は細胞カウントを示す。
【００２０】
【図３】図３は、肺腺癌細胞株上のＩＬ２３Ｒ発現を示す。ＩＬ２３Ｒ発現は、ヤギポリクローナル抗ＩＬ２３Ｒ一次抗体、及びＰＥ標識抗ヤギ抗体によって検出された。実線はＩＬ２３Ｒ発現、点線はアイソタイプ対照の発現を示す。Ｘ軸はＰＥ強度、Ｙ軸は細胞カウントを示す。
【００２１】
【図４】図４は、リンパ腫／白血病細胞株上のＩＬ２３Ｒ発現を示す。ＩＬ２３Ｒ発現は、ヤギポリクローナル抗ＩＬ２３Ｒ一次抗体、及びＰＥ標識抗ヤギ抗体によって検出された。実線はＩＬ２３Ｒ発現、点線はアイソタイプ対照の発現を示す。Ｘ軸はＰＥ強度、Ｙ軸は細胞カウントを示す。
【００２２】
【図５】図５は、ＣＯＢＡＬＴのＮｅｉｇｈｂｏｒ  Ｊｏｉｎｉｎｇアルゴリズムを用いてユニークＣＤＲセットをアラインメントすることによって生成した系統樹を示す。
【００２３】
【図６】図６は、示差走査フルオロメトリーによるＰＲＯ１６５の熱展開を示す。二重に温度測定を行って、タンパク質を展開する正規化した蛍光シグナルを示した。
【００２４】
【図７】図７は、ＰＲＯ１６５により誘導されたＤＬＤ−１結腸癌腫細胞のＴ細胞誘導性の溶解を示す。早期のアポトーシス及びネクローシスを起こしたＤＬＤ−１細胞を定量している。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
第一の側面において、本発明は、二重特異性構築物を提供し、当該構築物は、１つ以上の第一の結合部分と、１つ以上の第二の結合部分を含み、ＩＬ２３Ｒを発現する腫瘍細胞を含有する癌の治療に使用され、当該第一の結合部分が、細胞傷害性エフェクターＴ（Ｔｃ）細胞上に存在する第一の抗原に特異的に結合し、当該第二の結合部分が、ＩＬ−２３受容体特異的サブユニット（ＩＬ２３Ｒ）に特異的に結合する。
【００２６】
本発明において、「構築物」は、所望の結合活性を有する限りにおける任意の化学的実体を意味する。故に、「構築物」は、最も広い意味で使用され、具体的には、タンパク質ベースの分子、例えば組換え抗体及びその断片であって、１つ以上の抗体ベースのドメイン又はその結合断片を含む。具体例としては、限定されないが、モノクローナルキメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖二重特異性抗体等が挙げられる。更に「含む」は、本明細書中、例えば「からなる」と共に使用され、「含む」及び「からなる」の両方を意図する。
【００２７】
本明細書中、「二重特異性」は、２つの異なる抗原特異性を有し、任意で、それぞれの結合パートナーと結合する他の結合部分、例えばＦｃ受容体又は検出及び／又は精製用のタグに結合する部分等を有する。故に、二重特異性構築物は、少なくとも１つの抗原Ａと少なくとも１つの抗原Ｂに同時に結合可能で、ここでＡ及びＢは同一ではない。故に、異なる２つの抗原特異性を有していても、本発明の二重特異性構築物は必ずしも２つの結合部分しか有していないわけではなく、３つ以上の結合部分を有してもよい。更に、本明細書中、「抗原」は、最も広い意味で使用され、本発明の二重特異性構築物の結合部分が結合するいずれかの標的部分を含むものを意味する。
【００２８】
本発明において、「特異的」又は「特異的に」は、第一及び第二の結合部分が、それらの各標的分子、及び／又は１つ以上の参照分子を、区別できることを意味することを意図する。故に、その最も広い意味で、「特異的結合」又は「特異的に結合する」は、第一及び第二の結合部分が、Ｔｃ細胞の表面上の第一の抗原と、標的細胞の表面上の第二の抗原ＩＬ２３Ｒとの間、及び／又は第一の抗原及び／又は第二の抗原（即ちＩＬ２３Ｒ）に関連する又は関連しない他の標的分子との間を区別する能力を意味する。
【００２９】
特異的結合部分の結合特異性は、例えば、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）、ウエスタンブロット、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ又はＩＲＭＡ）、強化化学発光（ＥＣＬ）、及びペプチド走査解析等の、当該技術分野において既知の技術を使用して決定され得る。
【００３０】
ＥＬＩＳＡアッセイを使用する場合、標準的な発色反応を用いて評価が行われてもよく、例えば、ＨＲＰ中のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−コンジュゲート二次抗体、Ｈ２０２、テトラメチルベンジジン系が使用され得る。所定の波長での反応ベセル（例えばウェル）中での発色の光学密度は、結合特性の尺度である。典型的なバックグラウンドシグナル（陰性反応）は、約０．１ＯＤで、陽性反応における典型的なシグナルや約１．０以上であり、シグナルとノイズの比率は１０：１以上である。典型的には、結合特異性の決定は、無関係の生体分子、例えば粉乳、ＢＳＡ、トランスフェリン等が、１つだけよりもむしろ３〜５つのセットで使用されて実施される。
【００３１】
特に、本発明は、ＩＬ２３Ｒを発現する腫瘍細胞を含む癌を治療する方法に関し、当該方法は、対象、特にヒト患者に、治療有効量の本発明の二重特異性構築物を投与する工程を含む。
【００３２】
「治療有効量」は、下記段落［００８５］に設定されるように定義される。典型的には、治療有効量の本発明の二重特異性構築物は、上記医薬組成物の形態で投与される。適切な投与経路は、限定されないが、局所及び非経口投与、特に皮下及び静脈内注射を含む。投与計画は特に限定されないが、例えば、１週間、２週間又は４週間の継続的吸入である。
【００３３】
治療される癌は、限定されないが、直腸結腸癌、肺癌、乳癌、鼻咽腔癌、口腔癌、食道癌、膵臓癌、Ｂ細胞リンパ腫、並びに成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＬＣ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、小児性急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、Ｔ細胞／ナチュラルキラー細胞リンパ腫、及び末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）を含むＴ細胞リンパ腫を含む。特定の態様において、前記癌は、直腸結腸癌、肺癌、乳癌、鼻咽頭癌、口腔癌、食道癌、Ｂ細胞リンパ腫、並びに成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、Ｔ細胞／ナチュラルキラー細胞リンパ腫、及び末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）を含むＴ細胞リンパ腫を含む。
【００３４】
インターロイキン（ＩＬ）−２３及びＩＬ−１２の間のバランスは、抗腫瘍免疫応答の制御に重要な役割を果たす。ＩＬ−２３及びＩＬ−１２は、ｐ４０ドメインが共通するヘテロダイマーサイトカインである。ＩＬ−１２はｐ３５及びｐ４０の２つのサブユニットから成り、抗腫瘍作用を有することが見出されていた。一方、ｐ４０及びｐ１９からなるＩＬ−２３は、腫瘍に対する直接的な効果により、及び腫瘍を支持する炎症性微小環境を形成する間接的なメカニズムにより、幾つかの腫瘍の成長を促進することが示唆されていた。ＩＬ−１２は、ＩＦＮ−γを生産するＴｈ１細胞の発生を促進し、斯かる作用は抗腫瘍免疫に重要である（Ｄｕｎｎ，  Ｇ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  ２００６．  Ｎａｔ．  ｒｅｖ．  ｌｍｍｕｎｏｌ：６；８３６−８４８；  Ｃｏｌｏｍｂｏ，  ＭＰ．  ａｎｄ  Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，  Ｇ．２００２．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ；１３：１５５−１６８）。ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γは、Ｔｈ１細胞の活性をアンタゴナイズする腫瘍内Ｔ制御細胞（Ｔｒｅｇｓ）の増殖及び腫瘍微小環境中の血管新生を阻害し、腫瘍抑制を促進する（Ｃａｏ，  Ｘ  ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；６９：８７００−８７０９）。主要微小環境中のＩＬ−２３の逆作用に従って、ＩＬ−２３は、ＩＬ−１２依存的なＴ細胞中のＩＦＮ−γの分泌を抑制する（Ｓｉｅｖｅ，  Ａ．Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．  ２０１  Ｏ．Ｅｕｒ．  Ｊ．  ｌｍｍｕｎｏｌ；４０；２２３６−２２４７）。腸において、微生物産物、細胞ストレス及び細胞死に応答した樹状細胞（ＤＣ）により生産されるＩＬ−２３は、抗腫瘍Ｔｈ１応答に代えてＴｈ１７細胞の形成を駆動し得る。これらのＴｈ１７細胞はＩＬ−２３を生産し、それは、腫瘍内に侵入する（Ｎｇｉｏｗ，  Ｓ．Ｆ．２０１３．Ｔｒｅｎｄ  ｉｎ  ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；３４：５４８−５５５）、及びＮＫ細胞の抗転移機能及び抗腫瘍機能を制御する（Ｔｅｎｇ，  Ｍ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０ＰＮＡＳ；１０７：８３２８−８３３３）、細胞傷害性Ｔ細胞の能力を潜在的に阻害することによって、細胞傷害性Ｔ細胞が介在する免疫学的監視活性を阻害し得る。ＩＬ−２３シグナリングが幾つかの腫瘍における腫瘍形成及び／又は成長を支持する効果を有し得るという知見に従って、ＩＬ−１２シグナリングのみ欠損したマウスは腫瘍増殖の増大を示し、一方、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３シグナリングの両方を欠損したマウスは、腫瘍発生のリスクの増大を示さない（Ｓｔｒｅｅｔ，  Ｓ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．２００２．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ；  １９６：  １２９−１３４；  Ａｉｒｏｌｄｉ，  Ｉ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００５．Ｂｌｏｏｄ；１０６：３８４６−３８５３）。更に、ＩＬ−２３のみ特異的に欠損してＩＬ−１２シグナリングが欠損していないマウスは、腫瘍形成の殆ど完全な耐性及び弱体化した腫瘍増殖を示した（Ｌａｎｇｏｗｓｋｉ，  Ｊ．Ｌ．  ｅｔａｌ．２００８．  Ｎａｔｕｒｅ；４４２：４６１−４６５；  Ｔｅｎｇ，  Ｍ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  ２０１  ＯＰＮＡＳ；  １０７：８３２８−８３３３）。近年の研究において、Ｔｈ１７応答を弱体化する抗ＩＬ−２３抗体と共に、Ｔ−細胞を刺激する抗ＣＤ４０抗体を投与す��と、いずれかの抗体を単独で投与した場合よりも良好な効率を示したことが更に見出されている（ｖｏｎ  Ｓｃｈｅｌｄｔ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；ＤＯＩ：１０．１１５８／０００８−５４７２．  ＣＡＮ−１３−１６４６）。これは、Ｔｈ１７とＴｈ１のバランスが崩れるためと思われる。ヒトの場合、癌患者のＩＬ−２３の血清濃度が健康な個人と比較して増大するという独立した臨床的研究が報告されている（Ｌｉ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．２０１２．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ；７：ｅ４６２６４；  Ｇａｎｇｅｍｉ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．２０１２．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ；  １１３：２１２２−２１２５；  Ｌｊｕｊｉｃ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．２０１０．  Ａｒｃｈ．  Ｍｅｄ．  Ｒｅｓ；  ４１  ：１８２−１８９；  Ｈｅ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｓｃｉ；  １２：７４２４−７４３７；  Ｆｕｋｕｄａ，  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．２０１０．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｏｎｃｏｌ；  ３６：１３５５−１３６５）。例えば膵臓癌において、ＩＬ−２３レベルの増大が疾患のステージと関連しており、また乳癌において、予後不良と関連する（Ｈｅ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｓｃｉ；  １２：７４２４−７４３７）。原発性肝細胞癌腫（ＨＣＣ）において、癌微小環境中の高いレベルのＩＬ−２３は、予後不良と関連していた。また、直腸結腸癌において、血清ＩＬ−２３レベルが、健康なドナーと比較して、患者において増大していた（Ｓｔａｎｉｌｏｖ，  Ｎ．Ｓ．２００９．Ｌａｂｍｅｄｉｃｉｎｅ；４１  ：１５９−  １６３）。更に、直腸結腸癌組織試料におけるＴｈ１７遺伝子発現プロフィール及びＴｈ１７細胞の進入は、大幅な予後の悪化と相関しており、Ｔｈ１遺伝子発現又はＴｈ１細胞侵入とは対照的であった（Ｔｏｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１１  ；７１  ：１２６３−１２７１）。総合して、これらのデータは、ＩＬ−２３が原癌性炎症を引き起こすことによる腫瘍形成を促進して、抗腫瘍性エフェクター細胞を抑制することを示唆する。
【００３５】
ヒトＩＬ２３Ｒは、主に活性化したメモリーＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び自然リンパ球（ＩＬＣ）、及び低レベルで単球、マクロファージ及び樹状細胞（ＤＣ）で見られる。近年、インターロイキンＩＬ−２３の腫瘍細胞に対する直接的な効果が報告されており、幾つかの腫瘍においてもＩＬ２３Ｒが発現していることが示唆されている。例えば、ＩＬ−２３は、ヒト口腔扁平上皮癌（ＳＳＣ）細胞系（Ｆｕｋｕｄａ，  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．２０１０．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｏｎｃｏｌ；３６：  １３５５−  ３６５；  Ｆｕｋｕｄａ，  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．２０１０．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  Ｒｅｐ，；３：８９−９３）及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）細胞系（Ｂａｉｒｄ，  Ａ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．２０１３．  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ；７９：８３−９０）における増殖促進効果を有することが示された。ゲノムワイドの関連性研究を用いて、２つのＩＬ２３Ｒの配列変異体が幾つかの固形癌のリスクと関連しており、同一の多形が、個人における急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）のリスク増大の素因であることが見出された（Ｘｕ，  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ；４８：  １２５−１３１  ；  Ｃｈｕ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．２０１２．ｌｎｔ．  Ｊ．  ｃａｎｃｅｒ；  １３０：  ０９３−１０９７；  Ｃｈｅｎ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．２０１０．  ｍｏｌ．  Ｃａｒｃｉｎｏｇ；４９：８６２−８６８；  Ｑｉａｎ，  Ｘ．  ｅｔ  ａｌ．２０１３．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ；８：ｅ５５４７３）。ＩＬ２３Ｒ発現は、更に、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）の原発腫瘍組織、肺腺癌（Ｌｉ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．２０１３．  Ｃａｒｃｉｎｏｇ；３４：６５８−６６６）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）（Ｃｏｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１２：２６：  １３６５−１３７４）、小児性Ｂ−ＡＬＬ（Ｃｏｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１０；  １１６：３８８７−３８９８）、及び直腸結腸癌（ＣＲＣ）（Ｌａｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｄｉｓ  ２０１１  ；２６：１５１１−１５１８；  Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０１２；４：１９９−  ２０４）において上方制御されることが見出された。ＣＲＣにおいて、発現レベルと重症度／転移との間の関連性が見出された（Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１２；１０６：５１７−５２４）。
【００３６】
総合して、ＩＬ−２３は、一方で腫瘍形成、成長及び転移を支持し、他方でＴｈ１抗腫瘍応答を無効化することによって腫瘍免疫応答を支持する、炎症性微小環境を形成するようである（図１Ａ）。抗ＣＤ４０及び抗ＩＬ−２３抗体の共投与における前臨床研究は、このような「押し」（Ｔ細胞の抗ＣＤ４０駆動活性化）及び「引き」（Ｔｈ１７細胞の抗ＩＬ−２３駆動無効化）は、幾つかの腫瘍モデルで効果的であることを実証している。しかしながら、このアプローチは、癌細胞を特異的に標的化しない。従って、幾つかの癌細胞は、亢進したＴｈ１応答を尚も免れる筈である。そして更に、Ｔｈ１細胞の全身性の活性化は、炎症プロセス亢進等の副作用をもたらし得る。Ｔ細胞に癌細胞を溶解させる二重特異性抗体を使用した他のアプローチは、様々な種類の腫瘍モデルにおいて、直腸結腸癌等の固形癌においても、有効であることが実証された（Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．２０１０．ＰＮＡＳ；  １０７：１２６０５−１２６１０；  Ｏｓａｄａ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０；Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ；  １０２：  １２４−  １３３）。
【００３７】
ここで、発明者らは、一方で癌細胞を特異的に標的化し、他方で抗腫瘍免疫応答を局所的に刺激することにより、効率と安全性を最適のバランスで備えるための新しいアプローチを提示する。これを達成するために、図１Ｂに示すようなメカニズムを通じて作用する、二重特異性抗ＩＬ２３ＲｘＣＤ３ε抗体が採用される。
ａ）ＩＬ２３Ｒを発現する腫瘍をＣＤ３＋細胞傷害性Ｔ細胞溶解に向かわせ；
ｂ）腫瘍微小環境中で特異的にＣＤ３＋Ｔｈ１細胞を刺激し、Ｔ細胞刺激に、標的細胞との結合、及びＣＤ３ε結合ドメインの最終的な架橋が必要であり；
ｃ）ＣＤ３＋細胞傷害性Ｔ細胞をＩＬ２３Ｒ発現Ｔｈ１７細胞溶解に向かわせ、それによりＴｈ１阻害サイトカインの主要な供給源を死滅させ；
ｄ）ＣＤ３＋細胞傷害性Ｔ細胞を、Ｔｈ１抗腫瘍応答を阻害するＩＬ２３Ｒ発現制御Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞溶解に向かわせ；及び
ｅ）任意で：ＩＬ−２３とその受容体ＩＬ２３Ｒとの結合を競合してＩＬ２３シグナリングをブロックする。
【００３８】
特定の態様において、前記ヒト患者は、高いＴｈ１７応答を有する患者である。
【００３９】
本発明の文脈において、「高いＴｈ１７応答」は、患者のＴｈ１７遺伝子発現又はＴｈ１７細胞のカウントのいずれかが増大している状況を意味する。Ｔｈ１７遺伝子発現の増大は、正常な遠隔の対照組織と比較して、Ｔｈ１７遺伝子の組織中のｍＲＮＡのレベルが増大していることによって示され得る。直腸結腸癌において、そのような増大は、腫瘍組織と、正常な遠隔の粘膜との間で、ＩＬ１７Ａ及びＲＯＲＣ遺伝子において、少なくとも２倍、具体的には４倍、最も具体的には５〜６倍である（Ｔｏｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１１  ；７１  ：１２６３−１２７１を参照されたい）。ＴＨ１７細胞のカウントの増大は、遠隔の対照組織と比較して、腫瘍組織又は腫瘍隣接組織において見られ得る。直腸結腸癌において、そのようなカウントの増大が、腫瘍の中央又は侵襲的辺縁（ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｍａｒｇｉｎ）において、具体的には中央及び侵襲的辺縁の両方で観察され得る（Ｔｏｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ｌｏｃ．  ｃｉｔ．を参照されたい）。
【００４０】
第二の側面において、本発明は、少なくとも１つの第一の結合部分及び少なくとも１つの第二の結合部分を有する二重特異性構築物に関する。第一及び第二の結合部分は、それぞれ第一及び第二の抗原に特異的に結合する。第一の抗原は、免疫エフェクター細胞、即ち細胞傷害性エフェクターＴ（Ｔｃ）細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）又はＴキラー細胞ともいう）の表面上に存在する抗原である。第二の抗原は、標的細胞の表面上に存在する、ＩＬ−２３受容体ＩＬ２３Ｒの特異的サブユニットである。
【００４１】
本発明において、１つの標的細胞の種類は、典型的には病原性細胞、具体的には病原性Ｔ細胞、より具体的にはＲＯＲγ（ｔ）転写因子を発現する病原性Ｔ細胞である。ＲＯＲγ（ｔ）は、胸腺細胞の炎症性Ｔｈ１７細胞への分化を促進し、未分化Ｔ細胞のアポトーシスの阻害及びそれらのＴｈ１７細胞への分化促進において、恐らくＦａｓリガンド及びＩＬ−２の発現をそれぞれ下方制御することにより、一定の役割を果たす。具体的な態様において、前記細胞は、ＩＬ−１７を生産するＴ細胞（Ｔｈ１７細胞）、γδＴ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞及び不変ナチュラルキラー（ｉＮＫ）細胞から成る群から選択される。最も具体的には、本発明における標的細胞は、Ｔｈ１７細胞及びγδＴ細胞から選択される。
【００４２】
本発明の他の標的細胞の種類は、腫瘍細胞、具体的には、ＩＬ２３Ｒを発現する腫瘍細胞である。ＩＬ２３Ｒの発現は、例えば、直腸癌（ＣＲＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、肺の腺癌（ＡＣ）、並びに様々なＢ及びＴ細胞腫瘍、例えばびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＬＣ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）等の、上皮性癌において示されている。
【００４３】
そのような具体的態様において、前記二重特異性構築物は、免疫エフェクター細胞、即ち細胞傷害性エフェクターＴ（Ｔｃ）細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）又はＴキラー細胞ともいう）の表面上に存在する抗原に対する１つ以上の第一の結合部分、及び腫瘍細胞の表面上に存在する、ＩＬ−２３受容体の特異的サブユニットＩＬ２３Ｒに対する１つ以上の第二の結合部分を有し、当該二重特異性構築物は、Ｔｈ１７細胞を死滅させ、Ｔｈ１応答を刺激することも出来る。特にそのような態様において、前記第一の抗原はＣＤ３、特にＣＤ３εである。
【００４４】
第一及び第二の結合部分は、所望の第一及び第二の抗原に特異的に結合する限り構造的に限定されない。しかしながら、第一及び第二の結合部分は、一般に、１つ以上のオリゴ若しくはポリペプチド又はそれらの部分からなり、又は構成される。具体的には、第一及び第二の結合部分は、抗体ベースの結合部分であって、典型的には、１つ以上の抗体可変ドメイン又はその結合断片を含む。
【００４５】
本発明の具体的な態様において、第一の結合部分はＣＤ３及びＣＤ２８から選択される第一の抗原に特異的に結合する。ＣＤ３タンパク質はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と連結しており、Ｔ細胞活性化に必要である。ＣＤ３は、１つのＣＤ３γ、１つのＣＤ３δ及び２つのＣＤ３εの複合体であり、ＴＣＲ及びζ鎖と共にＴＣＲ受容体複合体を形成する。ＣＤ２８は、Ｔ細胞活性化に必要な共刺激シグナルを提供するＴ細胞上に発現される分子の一つである。ＣＤ２８を通じた刺激は、Ｔ細胞に対する強力な共刺激シグナルを提供し得る。
【００４６】
本発明の特定の態様において、第一の結合部分はＣＤ３、より具体的にはＣＤ３のイプシロン鎖（ＣＤ３ε）、及び最も具体的にはＣＤ３εのアゴニストエピトープに結合する。本明細書中、「アゴニストエピトープ」は、（ａ）本発明の二重特異性構築物の結合時、任意で同一の細胞上の幾つかの二重特異性構築物の結合時、当該二重特異性構築物が、ＴＣＲシグナリングを活性化し、Ｔ細胞活性化を誘導することを可能とすること、及び／又は（ｂ）ＣＤ３のイプシロン鎖のアミノ酸残基のみで構成され、Ｔｃ細胞上の天然の構成中に存在する（即ちＴＣＲ、ＣＤ３γ鎖に包含されている）場合、本発明の二重特異性構築物による結合が可能であること、及び／又は（ｃ）本発明の二重特異性構築物が結合したとき、エピトープが、ＣＤ３εのＣＤ３γに対する空間的位置の安定化をもたらさないこと、を意味する。
【００４７】
本発明の他の具体的態様において、Ｔｃ細胞への結合に代わり、第一の結合部分は、Ｃ１ｑ等の補体系の成分に特異的に結合する。Ｃ１ｑは、血清補体系を活性化するＣ１酵素複合体のサブユニットである。
【００４８】
他の態様において、本発明は、Ｆｃ受容体、具体的にはＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に特異的に結合する第一の結合部分の使用も想定する。ＦｃγＲは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面上に存在するＦｃγＲＩＩＩ、又はマクロファージ、単球、好中球及び／又は樹状細胞の表面上に存在する、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢＩ、ＦｃγＲＩＩＢ２及びＦｃγＲＩＩＩＢであってもよい。
【００４９】
そのような態様において、第一の結合部分は、特にＦｃ領域又はその機能的断片である。本発明において、「機能的断片」は、ＦｃＲ、特にＲｃγＲに対して、十分な特異性及び親和性で結合することが可能で、ＦｃγＲを担持するエフェクター細胞、特にマクロファージ、単球、好中球及び／又は樹状細胞を標的細胞として、細胞傷害性溶解又はファゴサイト―シスによって殺傷できる、抗体Ｆｃ領域の断片を意味する。具体的には、機能的Ｆｃ断片は、本来の全長Ｆｃ部分の、ＦｃＲ、例えば活性ＦｃγＲＩに対する結合を競合的に阻害できる。具体的には、Ｆｃ断片は、その活性ＦｃγＲに対する親和性を、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％保持している。
【００５０】
本発明のそのような態様において、Ｆｃ領域又はその機能的断片は、具体的には、強化Ｆｃ領域又はその機能的断片である。本明細書中、「強化Ｆｃ領域」は、Ｆｃ受容体介在的エフェクター機能、具体的には抗体依存的細胞介在的細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存的細胞傷害（ＣＤＣ）、及び抗体介在的ファゴサイト―シスを強化するように改変されたＦｃ領域を意味する。これは、当該技術分野で公知であるように、例えば活性化受容体（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上に発現するＦｃγＲＩＩＩＡ  （ＣＤ１６Ａ））に対する親和性の増大、及び／又は阻害性受容体（例えばＦｃγＲＩＩＢ１／Ｂ２  （ＣＤ３２Ｂ））への結合の低下をもたらすようにＦｃ領域を改変することにより達成され得る。
【００５１】
本発明における適切な改変は、糖化パターンの改変、具体的にはアフコシル化（「脱フコシル化」ともいう）、突然変異（点突然変異、欠失、挿入）及びオリゴ又はポリペプチドとの融合を含む。糖化パターンを改変する公知の技術は、抗体産生細胞中での異種β１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩの過剰発現（Ｇｌｙｃａｒｔ−Ｒｏｃｈｅ法）、及び抗体産生細胞中のα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）をコードする遺伝子のノックアウト（共和発酵キリン社のＰｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ法）を含む。Ｆｃ部分の強化突然変異の具体例はＳｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：６５９１−６６０４  （２００１）に記載されており、当該文献は全て本明細書中に参照により援用される。
【００５２】
本発明において、二重特性構築物は、Ｔｃ細胞が高度に効率的（ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）であることにより、ＩＬ２３Ｒを発現する標的細胞を殺傷するように特に設計される。そのような効率的な殺傷は、一般に、二重特異性構築物がＴｃ細胞をＩＬ２３Ｒを発現する標的細胞を溶解するように仕向ける能力に関連する。本明細書中、「効率的」とは、本発明の二重特異性構築物のインビトロＥＣ５０の範囲が、典型的に、１０〜５００ｎｇ／ｍｌであり、Ｔｃ細胞と標的細胞の比率が１：１〜５０：１、具体的には１：１〜１５：１、より具体的には２：１〜１０：１で、Ｔｃ細胞によって標的細胞の約５０％が溶解に誘導され得ることを意味する。本明細書中、「約」及び「およそ」は、表示した数値又は範囲の±１０％を意味する。
【００５３】
更に、本発明の二重特異性構築物は、特に、刺激された又は（さもなければ）刺激されていないＴｃ細胞と標的細胞を架橋して、当該標的細胞を溶解することが出来る。これは、二重特異性構築物がその所望の活性を発揮するために、標的特異的Ｔ細胞クローンの産生又は樹状細胞による共通の抗原提示を要しないという利点を有する。実際に、本発明の二重特異性構築物は、特に、他の活性化シグナル無しに、Ｔｃ細胞に標的細胞を溶解させることが出来る。より具体的には、二重特異性構築物の第一の結合部分がＣＤ３、具体的にはＣＤ３εと特異的に結合する場合、ＣＤ２８及び／又はＩＬ−２によるシグナリングは、Ｔｃ細胞が標的細胞を溶解するのに必要ではない。非標的特異的及び／又は無刺激Ｔｃ細胞を活性化する高い能力は、本発明の二重特異性構築物の重要な特徴と考えられ、標的細胞の効率的な殺傷に貢献すると考えられる。
【００５４】
更に本発明は、第一及び第二の結合部分が、特に、互いに、当該二重特異性構築物がＴｃ細胞上に存在する第一の抗原に、同時に標的細胞上に存在する第二の抗原（即ちＩＬ２３Ｒ）に結合しつつ、第一の抗原及びＩＬ２３Ｒが両方とも共発現している単一の細胞（例えばＩＬ−１７発現細胞傷害性（Ｔｃ１７）細胞）に同時に結合することは本質的に出来ないように設計される。
【００５５】
前記二重特異性高徳物が同時に２つの細胞に結合する選好を測定する方法は、当業者の通常の能力の範囲内である。例えば、本発明の二重特異性構築物は、ＣＤ３＋／ＩＬ２３Ｒ−細胞及びＣＤ３＋／ＩＬ２３Ｒ＋細胞の混合物と、又はＣＤ３＋／ＩＬ２３Ｒ−細胞及びＣＤ３−／ＩＬ２３Ｒ＋細胞の混合物と接触させられても良い。二重特異性構築物陽性細胞の数及び二重特異性構築物によって架橋された細胞の数を、当該技術分野で公知の蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）又は顕微鏡によって評価し得る。両方のセットアップにおいておよそ同数の二重特異性架橋細胞が観察される場合、本発明の二重特異性構築物が、表面にＣＤ３及びＩＬ２３Ｒ抗原の両方を提示している単一の標的細胞に結合しない、又は本質的に結合しないことを示唆する。あるいは、見掛けの結合活性の親和性が判定され得る。単一の標的細胞に対して同時に結合しない、又は本質的にしない場合、一方のＣＤ３＋／ＩＬ２３Ｒ−細胞又はＣＤ３−／ＩＬ２３Ｒ＋細胞と、他方のＣＤ３＋／ＩＬ２３Ｒ＋細胞に対する二重特異性構築物の見掛けの結合活性が概ね同一であり得る。しかしながら、もし単一の標的細胞に対して同時に結合することが可能であったら、ＣＤ３＋／ＩＬ２３Ｒ＋細胞に対する二重特異性構築物の見掛けの結合活性は、親和性効果によって、ＣＤ３＋／ＩＬ２３Ｒ−細胞及びＣＤ３−／ＩＬ２３Ｒ＋細胞の場合よりも高くなり得る。
【００５６】
本発明の特定の態様において、二重特異性構築物は、第一及び第二の結合部分が、互いに対して、第一の抗原を認識する第一の結合部分の一部と第二の抗原を認識する第二の結合部分の一部とが、当該二重特異性構築物の中心から本質的に反対方向に外側に突き出すように配置されている。「中心」は、具体的には形状中心（ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｇｅｏｍｅｔｒｙ）（ＣＯＧ）に関係する。理論に拘束されず、本発明の二重特異性構築物のこの構造は、上記のような単一の標的細胞に対する望ましくない二重結合を回避できる。「本質的」は、本願において、第一の結合部分及び第二の結合部分が、当該二重特異性構築物の中心に対して１３５°又は最大で１８０°の角度で配置される。
【００５７】
二重特異性構築物の構造は、特に、二重特異性構築物の形状中心（ＣＯＧ）から第一の結合部分の第一のパラトープのＣＯＧまでの第一のベクターｖ１と、二重特異性構築物の形状中心（ＣＯＧ）から第二の結合部分の第二のパラトープのＣＯＧまでの第一のベクターｖ２との間の角度がおよそ１３５°＜ａ＜１８０°、より具体的には１５０°＜ａ＜１８０°、最も具体的には１６０°＜ａ＜１８０°の範囲内であることも特徴である。本明細書中、「パラトープ」は、第一及び第二の抗原と直接相互作用する第一及び第二の結合部分の一部を意味する。
【００５８】
本発明において、第一の結合部分及び／又は第二の結合部分は抗体ベースの結合部分であって、具体的には、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）又はその結合断片を含む抗体ベースの結合部分であって、より具体的には、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）又はその結合断片、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）又はその結合断片を含む抗体ベースの結合部分である。「結合断片」は、本明細書中、尚も機能性を有する、即ち（単独で、又は他のドメイン、領域又はその部分との組み合わせで）二重特異性構築物に認識される第一又は第二の抗原に結合できる、所定のドメイン、領域又は部分を意味する。
【００５９】
典型的には、本発明における結合断片は、本発明の二重特異性構築物中に在るとき、その元の抗原結合活性（即ち単一特異性構築物としてのその抗原結合活性）の１０％以上を保持している。具体的には、結合断片は、元の抗原結合活性の２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％以上を保持しており、又はその完全な元の抗原結合活性を維持し、又は超える場合もあり、しかしながら、所望の生物活性（即ちＴｃ細胞による標的細胞の溶解／殺傷）を引き起こすために十分な親和性を有する任意の断片が利用できる。本発明において、「結合断片」は、上記の水準で結合活性を保持しつつ、特にそれらの結合又は生物活性を実質的に変化させない、保存的アミノ酸置換を有する変異体を含むことも意図される。
【００６０】
本発明の他の態様において、二重特異性構築物は、単鎖二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）（ｓｃＤｂ）、タンデムｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）、直鎖ダイマーｓｃＤｂ（ＬＤ−ｓｃＤｂ）、環状ダイマーｓｃＤｂ（ＣＤ−ｓｃＤｂ）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ；ｔａｎｄｅｍ  ｄｉ−ｓｃＦｖ）、タンデムｔｒｉ−ｓｃＦｖ、三重特異性抗体（ｔｒｉ（ａ）ｂｏｄｙ）、二重特異性Ｆａｂ２、ジ−ミニ抗体、四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ融合体、ジ−二重特異性抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＩｇＧ−ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ、Ｆｖ２−Ｆｃ、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体、例えばｂｓＡｂ（軽鎖のＣ末端に連結したｓｃＦｖ）、Ｂｓ１Ａｂ（軽鎖のＮ末端に連結したｓｃＦｖ）、Ｂｓ２Ａｂ（重鎖のＮ末端に連結したｓｃＦｖ）、Ｂｓ３Ａｂ（重鎖のＣ末端に連結したｓｃＦｖ）、Ｔｓ１Ａｂ（重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端に連結したｓｃＦｖ）、Ｔｓ２Ａｂ（重鎖のＣ末端に連結したｄｓｓｃＦｖ）及びＫｎｏｂ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅｓ（ＫｉＨｓ）（ＫｉＨ法によって調製された二重特異性ＩｇＧ）、並びにＤｕｏＢｏｄｉｅｓ（Ｄｕｏｂｏｄｙ法によって調製された二重特異性ＩｇＧ）から成る群から選択される抗体フォーマットである。本発明において特に適しているのは、単鎖二重特異性抗体（ｓｃＤｂ）、具体的には二重特異性モノマーｓｃＤｂである。
【００６１】
二重特異性ｓｃＤｂ、特に二重特異性モノマーｓｃＤｂは、具体的には、２つの可変重鎖ドメイン（ＶＨ）又はその断片と、２つの可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）又はその断片とが、リンカーＬ１、Ｌ２及びＬ３によって、ＶＨＡ−Ｌ１−ＶＬＢ−Ｌ２−ＶＨＢ−Ｌ３−ＶＬＡ、ＶＨＡ−Ｌ１−ＶＨＢ−Ｌ２−ＶＬＢ−Ｌ３−ＶＬＡ、ＶＬＡ−Ｌ１−ＶＬＢ−Ｌ２−ＶＨＢ−Ｌ３−ＶＨＡ、ＶＬＡ−Ｌ１−ＶＨＢ−Ｌ２−ＶＬＢ−Ｌ３−ＶＨＡ、ＶＨＢ−Ｌ１−ＶＬＡ−Ｌ２−ＶＨＡ−Ｌ３−ＶＬＢ、ＶＨＢ−Ｌ１−ＶＨＡ−Ｌ２−ＶＬＡ−Ｌ３−ＶＬＢ、ＶＬＢ−Ｌ１−ＶＬＡ−Ｌ２−ＶＨＡ−Ｌ３−ＶＨＢ又はＶＬＢ−Ｌ１−ＶＨＡ−Ｌ２−ＶＬＡ−Ｌ３−ＶＨＢの順番で連結されたものを含み、ここで、ＶＬＡ及び  ＶＨＡドメインが共同で第一の抗原に対する結合部位を形成し、ＶＬＢ及び  ＶＨＢドメインが共同でＩＬ２３Ｒに対する抗原結合部位を形成する。
【００６２】
具体的には、当該リンカーＬ１が、２〜１０アミノ酸、より具体的には３〜７アミノ酸、最も具体的には５アミノ酸のペプチドであり、リンカーＬ３が１〜１０アミノ酸、より具体的には２〜７アミノ酸、最も具体的には５アミノ酸のペプチドである。ミドルリンカーＬ２は、１０〜４０アミノ酸、より具体的には１５〜３０アミノ酸、そして最も具体的には２０〜２５アミノ酸のペプチドである。
【００６３】
本発明の具体的態様において、二重特異性構築物の第一及び第二の抗体ベース結合部分のＶＨドメインは、ヒト重鎖フレームワーク（ＦＷ）領域に埋め込まれたウサギ重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、二重特異性構築物の第一及び第二の抗体ベース結合部分のＶＬドメインは、ヒト軽鎖フレームワーク（ＦＷ）領域に埋め込まれたウサギ軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００６４】
第一の抗体ベース結合部分の重鎖及び軽鎖ＣＤＲは、具体的には、ヒトＣＤ３の全長イプシロン鎖、全長ＣＤ２８又は全長Ｃ１ｑで免疫化して得られたウサギ抗体由来である。ＣＤ３ε、ＣＤ２８又はＣ１ｑの全長鎖による免疫化は、適切には、ヒトＣＤ３ε、ＣＤ２８又はＣ１ｑの全長鎖をコードするプラスミドを用いてウサギをＤＮＡ免疫化することにより実施され、又はＣＤ３のイプシロン鎖の精製した細胞外ドメインを用いて、又はＣＤ２８の精製した細胞外鎖、又は精製したＣ１ｑを用いて実施される。更に、第二の抗体ベース結合部分の重鎖及び軽鎖ＣＤＲは、具体的には、ＩＬ２３Ｒの精製した細胞外ドメインか、又は全長ＩＬ２３Ｒを発現するプラスミドのいずれかを用いてウサギを免疫化することによって得られたウサギ抗体に由来する。
【００６５】
本発明の二重特異性構築物は、当該技術分野で公知の任意の簡便な抗体製造方法（例えば二重特異性構築物の製造に関してＦｉｓｃｈｅｒ，  Ｎ．  ＆  Ｌｅｇｅｒ，  Ｏ．，  Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７４：３−１４  （２００７）；二重特異性抗体及びタンデムｓｃＦｖに関してＨｏｒｎｉｇ，  Ｎ．  ＆  Ｆａｒｂｅｒ−Ｓｃｈｗａｒｚ，  Ａ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ９０７：７１３−７２７，  ２０１２及びＷＯ  ９９／５７１５０  Ａ２を参照されたい）を使用して生産され得る。加えて、抗ＩＬ２３Ｒ及び抗ＣＤ３ε抗体の配列の例が、それぞれＥＰ  ２  ３９５  ０２５及びＥＰ  １  ３４８  ７１５に開示されている。更に、本発明の二重特異性構築物の適切な調製方法の具体例として、Ｇｅｎｍａｂ  （Ｌａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １１０：５１４５−５１５０  （２０１３））及びＭｅｒｕｓ（ｄｅ  Ｋｒｕｉｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  １０６：７４１−７５０  （２０１０））法が挙げられる。機能的抗体Ｆｃ部分を含む二重特異性抗体の製造方法も当該技術分野で公知である（例えばＺｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．  ８６：１２７−  １３４  （１９９４））；及びＳｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １２１  ：２１０−２２８  （１９８６））。
【００６６】
これらの方法は典型的には、ハイブリドーマ法を使用して所望の抗原で免疫化したマウスの脾臓細胞をミエローマ細胞と融合することにより（例えばＹｏｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，  Ｕｎｉｔ  ２．５，  ２００６）、又は組換え抗体法（レパートリークローニング又はファージディスプレイ／イーストディスプレイ）を使用して（例えばＣｈａｍｅｓ  ＆  Ｂａｔｙ，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １８９：１−８  （２０００））、モノクローナル抗体を生産すること、並びに２つの異なるモノクローナル抗体の抗原結合断片又は断片又はその部分を公知の分子クローニング技術を用いて組み合わせて二重特異性構築物を提供することを含む。
【００６７】
本発明の二重特異性構築物は、具体的には、免疫原性を低下させるため、及び／又は安定性を改善するため、ヒト化される。抗体のヒト化技術は当該技術分野で公知である。例えば、一つの方法は、ヒトアクセプターフレームワークの可変軽鎖ＶＬ及び可変重鎖ＶＨ上に異種抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を埋め込むことに基づく（例えばＪｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１  ：５２２−５２５  （１９８６）；  ａｎｄ  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６  （１９８８））。他の方法において、異種抗体のフレームワークをヒトフレームワーク寄りに変異させる。いずれの場合も、抗原結合部分の機能性の保持は必須である（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７：１７０９−１７１９  （１９９１））。
【００６８】
本発明の二重特異性構築物は、あるいは、非抗体ベースの結合ドメインに基づく１つ以上の結合部分を有しても良い。本発明の二重特異性構築物の適切な製造方法の具体例は、更に、ＤＡＲＰｉｎ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ  ＡＧ）、アドネキシン法（Ａｄｎｅｘｕｓ）、アンチカリン法（Ｐｉｅｒｉｓ）及びＦｙｎｏｍｅｒ法（Ｃｏｖａｇｅｎ  ＡＧ）を含む。
【００６９】
本発明の具体的態様において、二重特異性構築物は、ＰＲＯ１６５（配列番号：７）、又はＰＲＯ１６５の機能的に活性な変異体である。
【００７０】
本発明において、「ＰＲＯ１６５の機能的に活性な変異体」は、ＰＲＯ１６５のＶＬ及びＶＨ領域に基づく二重特異性構築物を意味し、ここで（ｉ）当該二重特異性構築物はＰＲＯ１６５の機能的活性を保持しており、即ち、第一のＶＨ  ＶＬペアがＣＤ３εに特異的に結合し、第二のＶＨ／ＶＬペアがＩＬ−２３受容体特異的サブユニット（ＩＬ２３Ｒ）に特異的に結合し、そして（ｉｉ）ＶＬ及びＶＨ領域が、ＰＲＯ１６５のＶＬ及びＶＨ領域と比較して１つ以上の配列変異を有する。特定の態様において、機能的に活性な変異体のＣＤＲ配列は、７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上の、ＰＲＯ１６５のＶＬ及びＶＨ領域のＣＤＲ配列に対する同一性を有する。最も具体的には、機能的に活性な変異体のＣＤＲ配列は、ＰＲＯ１６５のＶＬ及びＶＨ領域のＣＤＲ配列に対して、９０％以上同一で、９５％以上の同一性を有する。そのような態様の具体例において、前記機能的変異体のＶＨ領域のＣＤＲ３領域の１つ以上は、ＰＲＯ１６５の対応するＣＤＲ３領域と同一である。より具体的な態様において、前記機能的変異体の全てのＣＤＲ領域は、ＰＲＯ１６５の対応するＣＤＲ領域と同一である。
【００７１】
他の側面において、本発明は１つ又は複数（２つ以上）の、本発明の二重特異性構築物をコードする核酸に関する。二重特異性構築物が単鎖構築物、例えばポリペプチド又はタンパク質である場合、単一の核酸が、当該二重特異性構築物をコードする。しかしながら、二重特異性構築物が２つ以上のポリペプチドを含む場合、本発明の二重特異性構築物は、２つ以上の別個の核酸によってコードされてもよい。本発明の核酸分子は、任意の核酸分子、具体的にはＤＮＡ又はＲＮＡ分子、例えばｃＤＮＡ又はｍＲＮＡであってもよい。それらは天然に存在する分子であっても、遺伝子操作又は化学合成によって生産されてもよい。それらは単鎖分子であてもよく、コード又は非コード鎖のいずれを含んでもよく、又は二本鎖分子であってもよい。
【００７２】
本発明の具体的態様において、前記核酸は、二重特異性構築物ＰＲＯ１６５（配列番号７）、又はその機能的に活性な変異体をコードするものであってもよい。
【００７３】
本発明の核酸は、当該技術分野で公知の適切な方法によって生産されてもよい。本発明の核酸は、例えば、ホスホロアミダイト法等によって合成されてもよく、又は特定のプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応によって生産されてもよい。更に、所望の変異を特定の核酸配列に導入するための方法、例えば部位指向性変異形成法は、当業者に周知である。
【００７４】
更なる側面において、本発明は、本発明の核酸を含有するベクターに関する。ベクター、特にプラスミド中に含有される場合、核酸は具体的にはＤＮＡである。本発明で使用されるベクターの種類は、具体的に限定されない。例えば、当該ベクターは、自律的に複製するプラスミド等のベクターであってもよく、又は宿主細胞中に導入されたとき宿主細胞のゲノム内に組み込まれ、染色体と共に複製されるベクターであってもよい。好ましくは、本発明で使用されるベクターは、発現プラスミド等の発現ベクターである。発現ベクター中で、プロモーター等の転写に必要なエレメントが、本発明のＤＮＡ核酸と操作可能に連結している。
【００７５】
細菌細胞中で操作可能なプロモーターの例として、ラムダファージのＰＲ又はＰＬプロモーター、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのｌａｃ、ｔｒｐ又はｔａｃプロモーター等が挙げられる。哺乳類プロモーターの例として、ＳＶ４０プロモーター、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター、アデノウイルス２主要後期プロモーター等が挙げられる。更に、昆虫細胞で使用されるプロモーターの例として、ポリへドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター、バキュロウイルス前初期遺伝子１プロモーター等が挙げられる。更に、酵母宿主細胞に適したプロモーターとして、酵母解糖系遺伝子由来のプロモーター、ＴＰＩ１プロモーター等が挙げられる。様々な発現系に適した他のプロモーターも、当該技術分野で公知である。
【００７６】
更に、必要な場合、本発明のＤＮＡは、適切なターミネーター、例えばヒト成長ホルモンターミネーター又はＴＰＩ１  ＡＤＨ３真菌宿主ターミネーター等と操作可能に連結し得る。本発明の組換えベクターは、ポリアデニル化シグナル（例えばＳＶ４０由来）、転写エンハンサー配列（例えばＳＶ４０エンハンサー）、又は翻訳エンハンサー配列（例えばアデノウイルスＶＡ  ＲＮＡをコードする）等のエレメントも有し得る。
【００７７】
本発明の組換えベクターは、宿主細胞内でベクターが複製することを可能とするＤＮＡ配列が与えられ、例えば哺乳類細胞における一例は、ＳＶ４０の複製起点である。更に、本発明の組換えベクターは、選択可能なマーカーを含む。選択可能なマーカーの例として、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン及びハイグロマイシン等の抗生物質耐性遺伝子を含む。本発明の核酸をプロモーターと、そして必要な場合他の制御配列、例えばターミネーター及び／又は分泌シグナル配列と連結するための方法や、それらを適切なベクター中に挿入する方法は、当業者に周知である。
【００７８】
本発明の具体的態様において、前記ベクターは、二重特異性構築物ＰＲＯ１６５（配列番号：７）又はその機能的に活性な変異体をコードする核酸を含む。
【００７９】
尚も他の側面において、本発明は、本発明のベクターを含む、宿主細胞、又は同一でない複数の宿主細胞に関する。本発明の組換えベクターを内部に導入された宿主細胞は、特に限定されず、本発明のベクターを発現し得る任意の真核及び原核細胞を含む。適切な宿主細胞の例は、細菌（例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、哺乳類細胞（例えばＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、ＣＨＬ、及びＣＨＯ細胞）、昆虫細胞（例えばバキュロウイルス発現系）、酵母細胞（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．又はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）及び他の真菌細胞（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，  Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）を含む。具体的には、前記細胞は最近細胞、特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞である。
【００８０】
複数のポリペプチド鎖からなる二重特異性構築物が、単一の宿主細胞発現系中で生産されてもよく、ここで、当該宿主細胞は、当該二重特異性構築物の各鎖を生産し、かつそれらのポリペプチド鎖をマルチマー構造に組み立てて二重特異性構築物を形成して、然る後に宿主細胞から二重特性構築物が回収される。あるいは、所望の二重特異性構築物は、別個の発現宿主細胞中で生産されて、各宿主細胞から個別に回収され、そして、マルチサブユニット二重特異性構築物の形成が可能な条件下、インビトロで混合され得る。
【００８１】
本発明のベクターを適切な宿主細胞に導入する方法は当業者に公知であって、コンピーテント細胞法（細菌宿主細胞用）、プロトプラスト法、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、リポフェクション（哺乳類細胞用、又は昆虫細胞／バキュロウイルス系用）、エレクトロポレーション、スフェロプラスト法、及び酢酸リチウム法（酵母及び他の真菌宿主細胞用）を含む。
【００８２】
尚も更なる側面において、本発明は、本発明の二重特異性構築物を製造する方法に関し、本発明の宿主細胞を提供する工程、当該宿主細胞を培養する工程、及び当該細胞培養物から当該二重特異性構築物を回収する工程を含む。培養工程において、本発明の宿主細胞は、本発明の二重特異性構築物の発現が可能な条件下、適切な培養培地中で培養される。当該細胞の培養に用いられる培地は、宿主細胞の増殖に適した公知の任意のものであってもよく、例えば適切な添加物を含有する最少又は複合培地であってもよい。あるいは、本発明は、本発明の二重特異性構築物を製造する方法に関し、本発明の核酸又はベクターを提供する工程、当該核酸又はベクターを、特にインビトロ転写／翻訳系で（例えばＹｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｂｓ  ２０１２  Ｍａｒ  １  ；４（２）  ２１７−２５）発現させる工程、及び発現系から当該二重特異性構築物を回収する工程を含む。
【００８３】
細胞培養物から二重特異性構築物を回収する工程において、生産された二重特異性構築物は、タンパク質を単離及び精製する公知の方法によって回収されてもよく、当該方法は、遠心又は濾過によって培地から宿主細胞を分離する工程、塩、例えば硫酸アンモニウム等によって上澄又は濾液中のタンパク質成分を沈殿させる工程、及び様々なクロマトグラフィー手順、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、あふぃにティークロマトグラフィー等によって精製する工程を含む。Ｅ．  ｃｏｌｉを宿主細胞として使用した場合等、二重特異性複合体が不溶性の封入体を形成する場合、当該封入体が変性剤中で可溶化され、然る後に、当業者に周知の手順に従い再フォールディング工程が行われる。
【００８４】
尚も他の態様において、本発明は、本発明の二重特異性構築物、及び医薬として許容される担体を含有する、医薬組成物に関する。本明細書中、「医薬として許容されるとは、化合物又は物質が、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激又はアレルギー反応、及び他の複合的な問題を生じずに、哺乳類、特にヒトの組織と接触するのに適していることを意味する。本明細書中「担体」は、有効成分を投与するための希釈剤、助剤、賦形剤又はビヒクルに関する。医薬として許容される担体は、本発明において、例えば、滅菌した液体又は分散剤であってもよい。具体的な担体は、静脈内、皮下又は局所投与に適したものであって、滅菌水溶液若しくは非水溶液又は非経口投与用懸濁物を含み、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （２０００）に議論されている。
【００８５】
一般に、前記医薬組成物は、本発明の二重特異性抗体を有効量で含有する。本発明において、「有効量」は、有益な又は所望の治療的結果を発揮するのに十分な化合物の量を意味する。治療有効量は、１回以上の投与、適用又は用量で投与されてもよく、特定の剤形又は投与経路に限定されることを意図しない。また、医薬組成物は、本発明の二重特異性構築物と共投与される１つ以上の追加の活性物質を含有してもよい。加えて、前記医薬組成物は、医薬として許容される助剤、例えば可溶化剤、界面活性剤、表面張力調整剤等の、追加の医薬として許容される物質を含有してもよい。
【００８６】
更に、本発明の医薬組成物の剤形は具体的に限定されないが、具体的には、注射又は吸引用の水溶液又は非水溶液又は分散剤等の非経口製剤、又は局所投与に適した製剤である。他の具体的な剤形は、調整又は持続又は遅延放出マトリックス中に製剤化された本発明の二重特異性構築物を含有する製剤である。更に、前記医薬組成物は、一定期間二重特異性構築物を放出する移植デバイス中に含有されてもよい。
【００８７】
尚も他の態様において、本発明は、炎症及び／又は自己免疫疾患の治療における本発明の二重特異性構築物の使用に関する。具体的には、本発明は、炎症及び／又は自己免疫疾患の治療方法であって、対象、特にヒト患者に、有効量の本発明の二重特異性構築物を投与することを含む。「有効量」の意味は上記の通りである。典型的には、本発明の有効量の二重特異性構築物は、上記医薬組成物の形態で投与される。適切な投与経路は、限定されないが、局所及び非経口投与、特に吸引、皮下注射、静脈内注射及び脳脊髄液への注射である。投与計画は具体的に限定されず、例えば二週間毎、毎月、二か月毎、三か月毎、六か月又は九か月毎、年一回、又は単発適用投与スキームを含む。
【００８８】
炎症及び／又は自己免疫疾患は、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬、乾癬性関節炎、潰瘍性結腸炎、クローン症、全身性エリテマトーデス、若年性糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、及び多発性硬化症、パーキンソン症、アルツハイマー症、及び虚血再かん流傷害であってもよい。
【実施例】
【００８９】
実施例１：二重特異性抗体構築物のクローニング
二重特異性構築物ＶＨＡ−Ｌ１−ＶＬＢ−Ｌ２−ＶＨＢ−Ｌ３−ＶＬＡ（ＶＬＡ及びＶＨＡドメインは共同でＣＤ３εの抗原結合部位を形成し、ＶＬＢ及びＶＨＢドメインは共同でＩＬ２３Ｒの抗原結合部位を形成する）は、抗体ｂｓｃＣＤ１９ｘＣＤ３に含まれるヒト化抗ＣＤ３ε抗体ドメイン由来のＶＬＡ及びＶＨＡ（それぞれＥＰ  １  ３４８  ７１５  Ａ２、Ｆｉｇ．  ８、ヌクレオチド１２５８−１５７５及びヌクレオチド８４７−１２０３）、並びにヒト化抗ＩＬ２３Ｒ抗体２０Ｄ７由来のＶＬＢ及びＶＨＢ（それぞれＥＰ  ２  ３９５  ０２５  Ａ１、配列番号９及び４）を、それぞれアミノ酸配列ＧＧＧＧＳ  （Ｇ４Ｓ）からなるリンカーＬ１及びＬ３、並びにアミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ  （Ｇ４Ｓ）４からなるミドルリンカーＬ２と連結し、これをＥ．ｃｏｌｉ中での発現に適した発現ベクター中にクローニングし、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８  （１９９３），  Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９３：４１−５６  （１９９９）及びＢｒｕｓｓｅｌｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｕｍｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ４：１１５−１２３  （１９９９）に記載されている技術を用いて、二重特異性構築物がＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞Ｔのペリプラズム中に分泌されるためのＮ末端シグナル配列を加えた。
【００９０】
実施例２：癌細胞系におけるＩＬ２３Ｒの発現レベル
公共に利用可能なデータは、ＩＬ２３Ｒは幾つかの腫瘍で上方制御され得ることが示唆されている。しかしながら当該情報は、絶対的な発現レベル、発現の特異性、異なる腫瘍試料間でのＩＬ２３Ｒ上方制御の浸透度が不明であり、ＩＬ２３Ｒが二重特異性抗ＩＬ２３ＲｘＣＤ３ε抗体フォーマットによって標的癌細胞に対する適切なマーカーとして利用できることを確証するのに充分ではない。更にＩＬ２３Ｒが腫瘍細胞の標的化された溶解のラベルとして適していることを検証するため、発明者らは、原発性癌組織及び広範な腫瘍細胞系のコレクションにおけるＩＬ２３Ｒの発現レベルを評価した。驚くべきことにＩＬ２３Ｒ  ｍＲＮＡ発現レベルは直腸結腸癌由来の殆どの原発性組織試料において増大していた。同様に、全ての１２９種類の試験したＣＲＣ細胞系においてＩＬ２３Ｒ  ｍＲＮＡ発現の増大が認められた。これらの知見と一致して、ＩＬ２３Ｒは、試験した６種類全ての直腸結腸癌系、及びＡ５４９肺腺腫細胞系において、タンパク質レベルで、及びフローサイトメトリーによる評価で、高度に上方制御されていた（図２及び図３）。細胞あたりのＩＬ２３Ｒコピーの定量により、ＣＲＣ細胞あたり約１００００〜８８０００コピーの発現レベルが明らかになった（表１）。顕著なことに、発明者らは、ＩＬ２３Ｒの強力な発現が、既知の腫瘍マーカーＣＥＡ及びＥＧＦＲに陰性であることが報告された細胞系においても認められた。ＣＥＡ及びＥＧＦＲに対する二重特異性Ｔ細胞リダイレクト抗体治療は、現在開発中である（Ｏｓａｄａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．２０１０．  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ；  １０１  ：  １２４−１３３；  Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．２０１０．ＰＮＡＳ；１０７：１２６０５−１２６１０）。発明者らのデータは、ＩＬ２３Ｒが殆どの直腸結腸癌で特異的に上方制御され、ＣＲＣ細胞を標的化溶解する二重特異性抗ＩＬ２３ＲｘＣＤ３ε抗体が、抗ＣＥＡや抗ＥＧＦＲ治療に不応の患者にも有効であることを示唆する。興味深いことに、発明者らは、様々な白血病及びリンパ腫細胞系でも類似のＩＬ２３Ｒ  ｍＲＮＡ発現レベルを認め、試験された全ての細胞系においてＩＬ２３Ｒタンパク質発現の増大を確認した（図４）。
表１：
癌細胞系の表面で発現するＩＬ２３Ｒ分子。ΔＭＦＩは、平均蛍光強度の差を意味し、Ｓ／Ｎは抗ＩＬ２３Ｒ抗体及びアイソタイプ対照の間のシグナル対バックグラウンド比を意味する。抗原結合容量ＡＢＣは、参照標準ビーズへの退行によって決定した。
【表１】
2016519135.tif 000003
【００９１】
実施例３：ヒトインターロイキン（ＩＬ）−２３受容体に結合するものクローナル抗体の同定
インターロイキン−２３受容体に特異的に結合する抗体を生産する全部で４７５個のモノクローナルＢ細胞を、フローサイトメトリーベースの単一細胞ソーティングを使用して、免疫化ラビットから単離した。この方法の原理は当業者に周知であり、例えばＬａｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２；２２．３００１  −２０１１に記載されている。モノクローナルＢ細胞培養物の上澄をＥＬＩＳＡに供し、ヒトＩＬ２３Ｒ  ＥＣＤに結合するものをスクリーニングした。第二の工程において、マウス及びカニクイザルからのＩＬ２３Ｒに対して、交差反応性を評価した。更に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を使用して、ヒト及びカニクイザルＩＬ２３Ｒに対する親和性を評価した（表２）。ヒトＩＬ２３Ｒに対するこれらの４７５種類のモノクローナル抗体の平衡解離定数（ＫＤ）の中央値は、６．３Ｅ−１１Ｍであった。これらの抗体の５％は、ＫＤの推定値が４．３Ｅ−１３Ｍを下回った。合計で９２個のクローンが、高度な親和性又はカニクイザル及び／又はマウスに対する交差反応性によって選択され、それらはＰＣＲ増幅され、それらの可変ドメインがシークエンシングされた。
【００９２】
取得されたウサギＩｇＧクローンのシークエンシングで、６８セットの軽鎖及び重鎖可変ドメイン（ＶＬ及びＶＨ）が取得された。これらのウサギ可変ドメインのセットは、特有のクローンを同定するため、また配列同一性に基づくクラスターに配列をグループ化するために、配列アラインメントによって解析された。このＶＬ及びＶＨドメインのアラインメントは、両ドメインの接続アミノ酸配列に基づいて実施された。当該解析によって、５８個の特有のクローンの同定を達成した。可変ドメインのアラインメントに加え、各ウサギＩｇＧクローンの６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列のセットを、他のクローンと比較して、ＣＤＲの特有のセットを同定した。５８個の独立したクローンに対応する全部で５８個のウサギＣＤＲの特有のセットが同定された。これらの５８個のＣＤＲセットは、多数アラインメントツールＣＯＢＡＬＴを使用してアラインメントされ、図５に示すように、Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ｊｏｉｎｉｎｇアルゴリズムを使用して系統樹を作成した。異なるクラスターから２３個のクローンが、それらのヒト、カニクイザル及びマウスにおける親和性に基づいて選択され、高度な配列多様性を進めるため、それらが組換え及び更なる特徴付けに供された。
【００９３】
実施例４：モノクローナルウサギ抗体の異種的生産
上記クローンの選択に続いて、ウサギ抗体が発現させられ、更なる特徴付けのために精製された。対応する軽鎖及び重鎖可変ドメインのクローニングに続いて、これらのＤＮＡ断片をインビトロでライゲーションして適切な哺乳類発現ベクターを形成した。これらの発現ベクターは、共発現したときに完全に機能的なウサギモノクローナルＩｇＧを組み立てて分泌することが可能なように、ウサギＩｇＧ軽鎖及び重鎖の定常ドメインの共通配列を含む。ベクター構築の後、得られた構築物の配列が再確認され、プラスミドＤＮＡが増幅され、哺乳類細胞トランスフェクションのために精製された。ウサギ抗体重鎖及び軽鎖の発現ベクターは、脂質ベースのトランスフェクション試薬によってトランジエント異種発現のための哺乳類懸濁細胞系にトランスフェクションされた。重鎖軽鎖ベクターの比率等の条件は、分泌されたモノクローナルＩｇＧが確実に発現するように最適化された。培養系は振盪インキュベーター中で７日間培養された。異種発現の期間の終わりに、細胞培養上澄を遠心及びデカンティングによって回収した。続いて分泌されたウサギＩｇＧをＰｒｏｔｅｉｎ  Ａビーズでアフィニティー精製した。ＩｇＧを担持したビーズを洗浄し、ｐＨシフトによって精製抗体を溶出した。溶出分画をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって、ＵＶ吸光度２８０ｎｍで解析し、サイズ排除高性能液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によって、同一性、内容及び純度を評価した。
【００９４】
実施例５：精製モノクローナルウサギ抗ＩＬ２３Ｒ抗体の特定
２３個の精製ウサギモノクローナル抗体の、ヒト、カニクイザル及びマウス起源のＩＬ２３Ｒに対する親和性を、ＳＰＲ測定によって決定した。各結果を下記表２に示す。
表２：
【表２】
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【００９５】
実施例６：ヒト化単鎖Ｆｖ断片の作製及び特定
ウサギ抗体クローン１４−１１−Ｄ０７のヒト化は、Ｖｋ１／ＶＨ３型のＮｕｍａｂが独占するｓｃＦｖアクセプターフレームワークにウサギＣＤＲを導入することを含む。このプロセスで、６個のＣＤＲ領域のアミノ酸配列をウサギ抗体ドナー配列上で上記に記載するように（Ｂｏｒｒａｓ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０．  ＪＢＣ；２８５：９０５４−９０６６）同定し、Ｎｕｍａｂアクセプター足場配列に埋め込んだ。２つの変異体が作製され、変異体ｓｃ０１は、ヒトアクセプター可変ドメイン足場に相補性決定領域（ＣＤＲ）を埋め込んで作製したもので、変異体ｓｃ０２は、ヒトフレームワーク配列にも更に変異を含む。２つの得られたヒト化ｓｃＦｖは、それらのヒト、カニクイザル及びマウス由来ＩＬ２３Ｒに対する結合親和性において特徴付けられた（表３）。２つの変異体において顕著な親和性の差は検出できなかったため、ｓｃＤｂフォーマットにおける作製のために１４−１１−Ｄ０７−ｓｃ０１が選択された。この変異体には、ウサギドナーフレームワーク配列からヒトアクセプター配列にウサギアミノ酸が埋め込まれておらず、適用後にヒトにおいて抗薬剤免疫応答を引き起こすリスクを最適化できるからである。
表３：
【表３】
2016519135.tif 000005
【００９６】
実施例７：二重特異性単鎖二重特異性抗体（ｓｃＤｂ）の作製及び特定
ＣＤ３ε＋Ｔ細胞にＩＬ２３Ｒ発現標的細胞の溶解を誘導するために、所謂単鎖二重特異性抗体（ｓｃＤｂ）フォーマットの二重特異性抗体断片が作製された。この構築物ＰＲＯ１６５は、抗ＩＬ２３Ｒ  ｓｃＦｖ  １４−１１−Ｄ０７−ｓｃ０１のＶＨ及びＶＬ、並びにヒト化ウサギ抗ＣＤ３ε抗体（クローン６）のＶＨ及びＶＬを含む。抗ＣＤ３ε結合ドメインは、ａ）ヒトＣＤ３に対する高度な親和性、ｂ）カニクイザル起源のＣＤ３に対する優れた交差反応、ｃ）優れた安定性及び凝集に対する耐性、及びｄ）ＣＤ３εの結合がＴ細胞を標的細胞と特異的に架橋し、Ｔ細胞の非特異的な活性化による副作用の可能性のリスクを最小にするため、選択された。
【００９７】
抗ＩＬ２３Ｒ及び抗ＣＤ３ε結合部分の、それぞれヒト、カニクイザル及びマウスＩＬ２３Ｒ、並びにヒト及びマウスＣＤ３εに対する親和性を、ＳＰＲによって測定した（表４）。
表４：
【表４】
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【００９８】
試験された構築物の熱変性の転移の中点は、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ  （ＤＳＦ）によって、基本的にＮｉｅｓｅｎによって記載されるように決定された（Ｎｉｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．  ２  （２００７）  ２２１２−２１）。ＤＳＦアッセイはｑＰＣＲ装置中で実施される（例えばＭＸ３００５ｐ，  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。試料は、２５μｌの合計体積の最終濃度の５ｘＳＹＰＲＯオレンジを含有する緩衝剤（クエン酸−リン酸ｐＨ６．４、０．２５Ｍ  ＮａＣｌ）中で希釈された。試料は２回測定され、温度は２５〜９６℃で傾斜するようにプログラムされた。蛍光シグナルが取得され、データがで解析された（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  （ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．；結果は表５）。
表５：全ての構築物において、熱変性における転移の中点は、ディファレンシャルスキャニングフルオリメトリーによって決定された。
【表５】
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【００９９】
実施例８：ＩＬ２３Ｒ発現細胞の標的化溶解
ｓｃＤｂｓが標的細胞の特異的溶解を誘導する能力を試験するために、ＩＬ２３Ｒ発現細胞を、各ｓｃＤｂの存在下でヒトＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養した。ｓｃＤｂ濃度に依存した細胞の溶解が、ＤＮＡ中に挿入されたｃｅｌｌｔｏｘ−ｇｒｅｅｎの蛍光強度を測定することによって評価された。各細胞系におけるＰＲＯ１６５のＥＣ５０を、表６に示す。
表６：
【表６】
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【０１００】
方法
１．細胞系におけるＩＬ２３Ｒ発現レベルの評価
細胞膜上のＩＬ２３Ｒの検出のため、生きた細胞を５ｐｇ／ｍｌのビオチン化ポリクローナルヤギ抗ＩＬ２３Ｒ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．ＢＡＦ１４００）で染色した。バックグラウンド対照として、ポリクローナルヤギＩｇＧアイソタイプ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．ＢＡＦ１０８）を使用した。細胞へのヤギポリクローナル抗体の結合は、フィコエリトリン（ＰＥ）標識ストレプトアビジン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ７１００−  ０９Ｓ）によって検出した。染色した細胞のＰＥ蛍光強度は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  ａｒｉａ  ＩＩＩ，  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により測定した。細胞あたりのＩＬ２３Ｒ分子を定量するため、参照標準として、ヒトＩＬ−２３ＲＦｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．１４００−ＩＲ−０５０）を担持した抗ヒトＩｇＧ  Ｑｕａｎｔｕｍ（商標）Ｓｉｍｐｌｙ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ（登録商標）（ＱＳＣ）微小スフィア（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ８１６）を使用した。幾何平均でのシグナル強度を反映する平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ヤギＩｇＧアイソタイプ対照と、ヤギ抗−ＩＬ２３Ｒ抗体の両方において測定した。特異的抗体のＭＦＩとアイソタイプ対照の抗体（ＡＭＦＩ）との間の差が計算された。抗ＩＬ２３Ｒ抗体を用いて取得されたＭＦＩをアイソタイプ対照のＭＦＩで割って、正規化ＭＦＩが計算された。細胞表面上のＩＬ２３Ｒ抗体を定量するため、細胞の特異的な抗体結合容量（ＡＢＣ）が、Ｑｕａｎｔｕｍ（商標）Ｓｉｍｐｌｙ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ（登録商標）（ＱＳＣ）微小スフィアを使用して作成した標準曲線に各ＭＦＩを回帰することによって計算された。計算は、ロット特異的ＱｕｉｃｋＣａｌ（登録商標）テンプレート中で実行された。非特異的結合を比較するために、陰性対照抗体で染色した細胞のＡＢＣ値を、特異的抗体で染色した細胞のＡＢＣ値から差し引いた。
【０１０１】
２．培養上澄中のモノクローナル抗体の結合キネティクス及び種間交差反応性を決定するためのＳＰＲアッセイ
分離上澄中のモノクローナルウサギ抗ＩＬ２３Ｒ抗体の結合親和性を、ＭＡＳＳ−１  ＳＰＲ装置（Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。親和性測定のため（０．０５％  Ｔｗｅｅｎを含有するＤＰＢＳ中）、ウサギＩｇＧのＦｃ領域に特異的な抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ａ１２０−１１１Ａ）を、標準的なアミンカップリング手法を用いてセンサーチップ（ＳＰＲ−２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｅｎｓｏｒ，  Ａｍｉｎｅ，  Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）上に不動化した。不動化後、培養上澄中のウサギモノクローナル抗体は抗ウサギＩｇＧ抗体で捕捉され、対照と見做す第二の不動化チャンネルにおいて、捕捉は陰性の上澄（分離された細胞を含まない培養培地）によって置き換えられた。９０ｎＭのヒトＩＬ２３Ｒ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（Ｔｒｅｎｚｙｍｅ，  Ｇｅｒｍａｎｙが依頼により生産）を両浮遊細胞に注入し、センサーチップ上の捕捉されたＩｇＧからタンパク質を５分間解離させた。同様に、カニクイザル及びマウスＩＬ２３Ｒ  ＥＣＤ（いずれも９０ｎＭ、Ｔｒｅｎｚｙｍｅが依頼により生産）における親和性も測定された。見掛けの解離（ｋｄ）及び結合（ｋａ）速度定数及び見掛けの解離平衡定数（ＫＤ）が、一対一Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを使用するＭＡＳＳ−１解析ソフトウエア（Ａｎａｌｙｚｅｒ，  Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）を使用して計算された。
【０１０２】
３．精製モノクローナル抗体の結合キネティクス及び種間交差反応の決定のためのＳＰＲアッセイ
精製モノクローナル抗ＩＬ２３Ｒ抗体の結合親和性が、分離上澄が精製ＩｇＧによって置き換えられたことを除いて、分離上澄と同じ設定で測定された。センサーチップが同一の手順で不動化され、濃度０．５ｇ／ｍｌ（ＨＥＰＥＳ泳動緩衝剤：０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎで希釈）の精製モノクローナル抗体を、抗ウサギＩｇＧ抗体で捕捉した。不動化対照チャンネルでは、捕捉は行われなかった。９０〜２．８１ｎＭの範囲のヒトＩＬ２３Ｒ細胞外ドメインの２倍連続希釈を浮遊細胞中に３分間注入し、センサーチップ上の捕捉されたＩｇＧからタンパク質を５分間解離させた。各注入サイクルにおいて、表面が１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ  ｐＨ１．５を１回１分間注入して再生された。同様に、カニクイザル及びマウスＩＬ２３Ｒ  ＥＣＤ（いずれも９０ｎＭ、Ｔｒｅｎｚｙｍｅが依頼により生産）における親和性も測定された。見掛けの解離（ｋｄ）及び結合（ｋａ）速度定数及び見掛けの解離平衡定数（ＫＤ）が、一対一Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを使用するＭＡＳＳ−１解析ソフトウエア（Ａｎａｌｙｚｅｒ，  Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）を使用して計算された。
【０１０３】
４．抗ＩＬ２３Ｒ  ｓｃＦｖｓの結合キネティクス及び種間交差反応性の決定のためのＳＰＲアッセイ
抗ＩＬ２３Ｒ  ｓｃＦｖｓの結合親和性は、ＭＡＳＳ−１ＳＰＲ装置（Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定された。親和性測定（ＨＥＰＥＳ泳動緩衝剤：０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ中で実施）のため、ヒトＩｇＧのＦｃ領域（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ａ８０−１０４Ａ）を、標準的なアミンカップリング手法を用いてセンサーチップ（ＳＰＲ−２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｅｎｓｏｒ，  Ａｍｉｎｅ，  Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）上に不動化した。不動化後、１μｇ／ｍｌ組換えＩｌ２３Ｒ  Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  １４００−ＩＲ−０５０）は抗ヒトＩｇＧ抗体で捕捉され、対照と見做す第二の不動化チャンネルにおいて、捕捉は上澄によって置き換えられた。１８０〜２．８１ｎＭの範囲のヒトｓｃＦｖｓの２倍連続希釈を浮遊細胞中に３分間注入し、センサーチップ上のキメラからｓｃＦｖｓを７００秒間解離させた。各注入サイクルにおいて、表面が１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ  ｐＨ１．５を２回１分間注入して再生された。同様に、カニクイザル及びマウスＩＬ２３Ｒ  Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  １６８６−ＭＲ−０５０）における親和性も測定された。見掛けの解離（ｋｄ）及び結合（ｋａ）速度定数及び見掛けの解離平衡定数（ＫＤ）が、一対一Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを使用するＭＡＳＳ−１解析ソフトウエア（Ａｎａｌｙｚｅｒ，  Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）を使用して計算された。
【０１０４】
５．抗ＣＤ３ｘＩＬ２３Ｒ  ｓｃＤｂｓの結合キネティクス及び種間交差反応性の決定のためのＳＰＲアッセイ
抗ＣＤ３ｘＩＬ２３Ｒ  ｓｃＤｂｓの結合親和性は、ＭＡＳＳ−１ＳＰＲ装置（Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定された。親和性測定（ＨＥＰＥＳ泳動緩衝剤：０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ中で実施）のため、ヒトヘテロダイマー単鎖ＣＤ３γδ細胞外ドメイン（自家製）を、標準的なアミンカップリング手法を用いてセンサーチップ（ＳＰＲ−２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｅｎｓｏｒ，  Ａｍｉｎｅ，  Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）上に不動化した。不動化後、９０〜０．１２３ｎＭの範囲のｓｃＤｂｓの３倍連続希釈を浮遊細胞中に３分間注入し、センサーチップ上のＣＤ３γδからタンパク質を７００秒間解離させた。各注入サイクル後、表面が１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ  ｐＨ２．０を１分間注入して再生された。同様に、カニクイザルＣＤ３γδ（自家製）及びマウスＣＤ３δε（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ＣＴ０３３−Ｍ２５０８Ｈ）への結合も測定された。
【０１０５】
ＩＬ２３Ｒに対する親和性測定のため、ヒトＩＬ２３Ｒ細胞外ドメイン（Ｔｒｅｎｚｙｍｅが依頼により生産）を、標準的なアミンカップリング手法を用いてセンサーチップ（ＳＰＲ−２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｅｎｓｏｒ，  Ａｍｉｎｅ，  Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）上に不動化した。９０〜５．６ｎＭの範囲のｓｃＤｂｓの２倍連続希釈を浮遊細胞中に３分間注入し、センサーチップ上の不動化ＩＬ２３Ｒからタンパク質を７２０秒間解離させた。各注入サイクル後、表面が１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ  ｐＨ２．０を１分間注入して再生された。見掛けの解離（ｋｄ）及び結合（ｋａ）速度定数及び見掛けの解離平衡定数（ＫＤ）が、一対一Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを使用するＭＡＳＳ−１解析ソフトウエア（Ａｎａｌｙｚｅｒ，  Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）を使用して計算された。
【０１０６】
６．細胞傷害性Ｔ細胞によるＩＬ−２３Ｒ発現細胞のｓｃＤｂ介在性の溶解
二重特異性抗ＣＤ３ｘＩＬ−２３Ｒ  ｓｃＤｂｓが標的細胞の溶解を誘導する能力を評価するため、ヒトＩＬ−２３Ｒ発現細胞系を使用した。標的細胞系として結腸癌ＤＬＤ−１又はＳＷ４８０、及び赤白血病ＴＦ−１を使用し、上記のように単離された無刺激ヒトＣＤ８＋Ｔ−細胞を、エフェクター細胞として使用した。標的細胞を、説明書に従いｃｅｌｌ  ｔｏｘ緑色色素（Ｐｒｏｍｅｇａ）でラベルした。細胞溶解は、ＣｅｌｌＴｏｘ（商標）緑色細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によってモニタリングした。当該アッセイは、細胞死によって生じる膜の完全性の変化を測定する。当該アッセイは、生きた細胞から排出され死んだ細胞のＤＮＡを優先に染める非対称シアニン色素を使用する。所定の細胞中のＤＮＡに色素が結合した場合、その蛍光特性が実質的に亢進する。生きた細胞は見掛け上蛍光が増大しない。従って、死んだ細胞のＤＮＡとの結合相互作用によってもたらされる蛍光シグナルは、細胞傷害性と比例する。上記と同様に、ラベルされたＩＬ−２３Ｒ細胞（５０００細胞／ウェル）が、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞と、エフェクター：標的比率４０：１で、３倍連続希釈ｓｃＤｂｓ（出発濃度１８０ｎＭ）存在下、９６ウェルマイクロタイタープレート中でインキュベーションされた。標的抗原を発現していない細胞の非特異的な溶解を評価するため、Ｔ細胞をラベルした野生型ＣＨＯ細胞と共にインキュベーションした。インキュベーション４８時間後、マルチモードマイクロプレートリーダー（ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ  ３，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、蛍光強度を解析した。データは、ＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏデータ解析ソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用する４パラメーターロジスティック曲線適合を使用して解析され、最大値の半分の標的細胞の溶解を誘導するのに必要なｓｃＤｂのモル濃度（ＥＣ５０）を、用量応答曲線から求めた。
【０１０７】
標的細胞の運命を特異的に追跡するために、標的細胞を、説明書に従い、５ｎＭの濃度のＣｅｌｌＶｕｅ（登録商標）Ｃｌａｒｅｔ  Ｆａｒ  Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＩＮＣＬＡＲＥＴ−１  ＫＴ）で染色した。アポトーシス／ネクローシスは、説明書に従い、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＦＩＴＣ  （ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｃａｔ．Ｎｏ．８８−８００５−７４）を使用してモニタリングした（色素濃度：  １００  ｐＬ／ｍＬ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ及び２  ｐｇ／ｍＬプロビジウムヨーダイド）。染色したＩＬ−２３Ｒ細胞（５０００細胞／ウェル）を、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞と共に、エフェクター：標的比率４０：１で、連続希釈ｓｃＤｂｓ（出発濃度１８０ｎＭ）の存在下、９６ウェルマイクロタイタープレート中でインキュベーションされた。標的抗原を発現していない細胞の非特異的な溶解を評価するため、Ｔ細胞をラベルした野生型ＣＨＯ細胞と共にインキュベーションした。インキュベーション４８時間後、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ  ａｒｉａ  ＩＩＩ，  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、蛍光強度を解析した。データは、遠赤色蛍光色素（ＣｅｌｌＶｕｅ（登録商標）Ｃｌａｒｅｔ  Ｆａｒ  Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）を使用して、標的をエフェクター細胞から区別することにより解析された。標的細胞は、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ及びＰＩ蛍光によって、生細胞及び早期／後期アポトーシス、ネクローシス細胞に峻別される。取得されたデータは、ＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏデータ解析ソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用する４パラメーターロジスティック曲線適合を使用して解析され、最大値の半分の標的細胞の溶解を誘導するのに必要なｓｃＤｂのモル濃度（ＥＣ５０）を、用量応答曲線から求めた。
【０１０８】
７．ｓｃＤＢ構築物の構築デザイン及び製造
単鎖二重特異性抗体構築物は、ＶＬＡ−Ｌ１−ＶＨＢ−Ｌ２−ＶＬＢ−Ｌ３−ＶＨＡ構造中に可変ドメインを配置することにより設計された。これらの構築物中で、ＶＬＡ及びＶＨＡは、共同でＩＬ２３Ｒの結合部位を形成し、一方ＶＬＢ及びＶＨＢは、共同でＣＤ３εの結合部位を形成する。可変領域を連結するペプチドリンカーＬ１〜Ｌ３は、グリシン／セリンリピートで構成される。２つの短いリンカーＬ１及びＬ３は、単一のＧ４Ｓリピートからなり、一方長いリンカーＬ２は、配列（Ｇ４Ｓ）４からなる。様々な抗ＩＬ２３ＲｘＣＤＥ３  ｓｃＤｂ構築物をコードするヌクレオチド配列は、デノボで合成され、ｐＥＴ２６ｂ（＋）骨格（Ｎｏｖａｇｅｎ）に基づくＥ．ｃｏｌｉ発現用の適合されたベクターにクローニングされた。
【０１０９】
当該発現構築物はＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ１２  （ＤＥ３）  （Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換され、細胞が、出発培養物として、２ＹＴ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）中で培養された。発現培養物が播種され、３７℃２００ｒｐｍの撹拌フラスコ中でインキュベーションされた。ＯＤ６００ｎｍが１に達したら、最終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加して、タンパク質発現を誘導した。一昼夜の発現後、細胞を４０００ｇで遠心分離して回収した。封入体の調製のため、細胞ペレットをＩＢ  Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  （５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５，  １００  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ５  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中に再懸濁した。細胞スラリーに１  ｍＭ  ＤＴＴ、０．１  ｍｇ／ｍＬ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、１０  ｍＭ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１００  μΜ  ＰＭＳＦ及び１  μΜ  Ｐｅｐｓｔａｔｉｎを添加した。細胞を氷冷しながら３サイクル超音波ホモジナイズにより破砕した。続いて０．０１  ｍｇ／ｍＬ  ＤＮＡｓｅを添加し、ホモジネートを室温で２０分間インキュベーションした。封入体を４℃１５０００ｇで遠心分離した。当該ＩＢをＩＢ  Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ中に再懸濁し、ソニケーションしてからもう一度遠心分離した。合計で３回以上ＩＢ  Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒによる洗浄工程を実施し、その後２回ＩＢ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  （５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５，  １００  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ５  ｍＭ  ＥＤＴＡ）による洗浄を実施して、最終的なＩＢを取得した。
【０１１０】
タンパク質のリフォールディングのため、単離されたＩＢを、湿ったＩＢ１ｇあたり５ｍＬの割合でＳｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  （１００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０，  ６  Ｍ  Ｇｄｎ−ＨＣｌ，  ２  ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で再懸濁した。当該可溶化混合物を、室温で３０分間インキュベーションして、最終濃度２０ｍＭのＤＴＴを添加し、更に３０分間インキュベーションを続行した。可溶化の終了後、溶液を４℃２１５００ｇで１０分間遠心分離して清澄化した。リフォールディングは、Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（典型的には：１００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０，  ５．０  Ｍ  Ｕｒｅａ，  ５  ｍＭ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ，  １  ｍＭ  Ｃｙｓｔｉｎｅ）中に可溶化タンパク質０．３ｇ／Ｌのタンパク質最終濃度で迅速に希釈して実施された。リフォールディング反応は、１４時間以上ルーティンでインキュベーションして実施された。得られたタンパク質溶液を４℃８５００ｇで１０分間遠心分離して清澄化した。リフォールディングしたタンパク質をＣａｐｔｏ  Ｌ  ｒｅｓｉｎ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）アフィニティークロマトグラフィー及びＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。タンパク質は、ネイティブ緩衝剤（５０  ｍＭ  Ｃｉｔｒａｔｅ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐＨ  ６．４，  １５０  ｍＭ  ＮａＣｌ）中で製剤化された。単離されたモノマー分画を、サイズ排除ＨＰＬＣ、純度のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びタンパク質構成のためのＵＶ／Ｖｉｓ分光法によって解析した。
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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