(57)【要約】【課題】生体サンプル中、特に尿サンプル中でのバクテリア類の同定を可能とすること。【解決手段】生体サンプル、特に尿サンプル中のバクテリア類を同定する方法であって、前記方法は、特有なバクテリア類のグラフプロットでの特徴を同定するために、前記サンプル中の代謝生成物及び異化産物などの揮発成分のガスクロマトグラフ質量分析法(ＧＣ／ＭＳ）による分析を実行することを提供する方法である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプル、特に尿サンプル中のバクテリア類を特定する方法であって、
前記方法は、培養培地又は液中における生体サンプルに播くことと、特有なバクテリア類のグラフプロットでの特徴を同定するために、前記生体サンプル中の代謝生成物及び異化産物などの揮発成分のガスクロマトグラフ質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）による分析を実行することと、を提供するものであり、
前記ガスクロマトグラフ質量分析法を、各バクテリア類についての代謝マーカ及び異化マーカの存在を同定するためと、前記マーカを同定することで、同定される各バクテリア類に関連する、特有なメタボロミックプロファイル、及び、特有なメタボロミックプロファイルを構成するためとに使用することと、
生体サンプル中に存在する特有なバクテリア類を、ＧＣ／ＭＳ分析によって得られる特有なプロットを、生体サンプルのない特有な培養培地に関連するプロットと比較することで同定することと、を有する、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
分析される生体サンプルが、閉塞及び封止された試験管又は瓶中に挿入され、その後、その揮発成分が、生体サンプル上の空間又は静的ヘッドスペース（ＳＨＳ）から採取され、ＧＣ／ＭＳ分析が行われる、ことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記生体サンプルが、未処理の生体サンプルから構成される、ことを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記未処理の生体サンプルが、未処理の尿である、ことを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記生体サンプルが、培養液を豊富に有する生体サンプルである、ことを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
前記生体サンプルが、ペトリ皿から採取されたコロニー由来の生体サンプルである、ことを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項７】
前記特有なバクテリア類を、感染した未処理の尿サンプルと、非感染の未処理の尿サンプルとからそれぞれ得られた各ＧＣ／ＭＳデータを比較することで同定する、ことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記代謝ピークを、バクテリア類がその複製のための栄養として消費した培養培地中に存在する物質を同定する前記ＧＣ／ＭＳプロットのピークであるＧＣ／ＭＳ分析によって決定し、前記異化ピークを、前記バクテリア種によって生産された物質を同定するＧＣ／ＭＳプロットのピークによって決定する、ことを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記生体サンプルの前記代謝ピーク（ＭＰＰ）の同定と、前記生体サンプルの異化ピーク（ＣＰＰ）の同定とを、引き続くＧＣ／ＭＳ分析のためのバクテリアの力価の最適値を同定するために、マクファーランド比濁法の異なるレベルによって実行する、ことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルを、固相ミクロ抽出（ＳＰＭＥ）手法によって、ヘッドスペース中で採取する、ことを特徴とする請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガスクロマトグラフ質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）に基づく手法により、生体サンプル中、限定されないが特に尿サンプル中でのバクテリア類を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体サンプル中での迅速かつ正確な微生物の識別は、感染性疾患の診断、及び、その後の正しい抗生物質治療の策定にあたって重要となるものである。
【０００３】
患者の生体サンプルに含まれる病原バクテリアの同定の技術水準として、直接的方法及び間接的方法の両方を含む様々な方法が知られている。
【０００４】
現在「ゴールドスタンダート」と考えられている主要な直接的方法には、特定の媒体中での培養により得られたバクテリアコロニーの生化学的及び形態学的試験を通じた同定が必須である。
【０００５】
培養手法は、使用される培地に依存し（例えば、従来からの培養培地で行われ）、完全に汎用なもの（例えば、Ｃｌｅｄと呼ばれる手法）であるか、あるいは、別の方法としては、同定されるコロニーの特性を幾分か完全な形で選択することが可能なものである。
【０００６】
これらの中には、グルコース及びラクトースの発酵（例えば、ＭａｃＣｏｎｋｅｙ培養培地を参照のこと）、並びに、赤血球の部分的又は全体的溶血の程度（例えば、血液寒天プレートを使用する方法）を利用した手法が知られている。ある群、又は、バクテリア類又は種はこれらの特性まで遡ることができる。
【０００７】
多様な種類のバクテリアの類を異なった色に着色することが可能な発色酵素基質培地を含むペトリ皿上にサンプルを播くことによる仮の同定手法が、変法として挙げられる。これらの場合では、培養中で成長するコロニーの異なる色に基づく視覚型で識別されている。
【０００８】
サンプルの同定は、従来、（上記した多様な種類のコロニーとは無関係に、）予めペトリ皿上で単離することで得られた標準化バクテリア懸濁液（０．５マクファーランド濃度）を接種することで試験された生物学的試験の適切なパターンを、手動で又は自動化されたシステムで分析することで行われていた。
【０００９】
最近では、バクテリア細胞同定の精確性と迅速性を改善するために、様々な分析手法が開発されてきている。これらの手法では、脂質、リン脂質、リポ多糖類、オリゴ糖類、タンパク質、又は、核酸などのバクテリア細胞の生物学的化合物が、各バクテリアに特有な分類上のマーカを判定するために調査されている。
【００１０】
増幅、ハイブリダイゼーション、及び、核酸のシーケンス処理などの分子生物学上の手法によって、結果の特異性、感受性、及び、迅速性の特性が両立し、微生物学の実験に対してより一層の関心が持たれている。しかしながら、今日に至るまで、それらには依然として十分に標準化された方法が存在せず、しかも、依然として非常に高価なままである。
【００１１】
フローサイトメトリが、生体サンプル中のバクテリアを同定するための手法として提案されているが、特異性及び陽性的中率（Ｔｕｅｓｔａ、ＥＣＣＭＩＤ２００９）の観点からパフォーマンスに乏しいことが実験で裏付けられている。その他に提案されたルミネセンス手法もまた、純然たるコロニーの研究に限定されているか、免疫学的手法に関連付けられることが必須となっている。
【００１２】
生物学的基質上のバクテリアを同定するための最も近代的な手法の中で、分子振動に基づくラマン分光分析の利用につながる応用手法が進展している。これは、高度な特異性及び振動スペクトルの解像度と、生態系に典型的な水環境からの微弱なバックグランド信号とによって、統合バクテリアが含まれる生体物質を分析するための非破壊的かつ無侵襲的な分析手法となっている。しかしながら、ラマン信号は相対的に微弱であり、特殊な金属共鳴体（銀、金及び銅）（カナダ国特許第２６６８２５９号明細書を参照）上での被分析物の吸収を利用するＳＥＲＳ手法を用いて増幅されている。
【００１３】
近年、例えば、ガスクロマトグラフや熱分解的方法と関連付けられた多様な組み合わせを有する質量分析法が、高い感度及び特異性を有する、バクテリアの迅速な同定のための方法の進展のために最も有望な手法のように思われる。そのような手法が記述されたものとして、脂質プロファイル（米国特許出願第２０１１／０８６３８４号、国際公開第２００８／０５８０２４号）、又は、遺伝子プロファイル（米国特許第５６０５７９８号明細書）又はメタボロミックプロファイル（国際公開第２０１１／０６４０００号）よりもむしろ、例えば、プロテオミック・プロファイル（国際公開第２００９／０６５５８０号）の研究に供される特許文献中において報告されている。
【００１４】
１９９６年に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析―飛行時間）と呼ばれる、ある特別な質量分析手法に基づいて、バクテリアの同定が完成をみている。
【００１５】
全ての質量分析手法によって、サンプル中に存在する分子の分子量を計測することが可能であるが、他の手法と異なり、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によれば、複雑な基質からなるサンプルを分析することが可能である。この手法を用いることで、バクテリア細胞を分析することが初めて可能となった。この分析法の結果、細胞壁に弱く結合したタンパク質成分と、さらに分析過程で生じた分子の部分分解に追従して解放された分子とから発生する信号に由来する質量スペクトルが得られている。これらのタンパク質成分の分子量は、種ごとに変化し、バクテリア細胞を分析することで得られる質量スペクトルが、分析されるバクテリア類に密接に関連付けられ、極端に特定された明瞭な特徴を表す。
【００１６】
その手法は、ペトリ皿からある数のコロニーを採取するためと、測定器において、レーザー照射される小皿が収容される適当な容器上にそれらを配置するためと、に使用される。
【００１７】
引き続いて、レーザー照射、及び、測定器による質量スペクトルの登録の前に、適切な基質が添加され、小皿が３７℃の恒温とされることで乾燥される。
【００１８】
上述の方法の変法（Ｂｒｕｃｋｅｒによる国際特許第２００９／０６５５８０号）は、陽性血液培養フラスコ上での応用を提供し、その物質は遠心分離され、得られたペレットは、測定器の小皿をサンプル運搬する適当な容器上に配置される。そして、その方法では、上述したとおりの内容が連続して行われる。
【００１９】
公知の特許文献には、メタボロミック、脂質、又は、バクテリアの単離されたコロニーの遺伝子プロファイルの分析、又は、遠心分離された生体サンプル材料から得られるあらゆるバクテリアのペレットの分析について開示されている。
【００２０】
国際公開第２０１１／０６４０００号文献には、ＧＣ／ＴＯＦ／ＭＳシステムを用いた、制御サンプルに対する代謝プロファイルのサンプルの対比分析を用い、動物（ラット）の生体サンプル中でのバクテリアによって引き起こされた感染症の検出、同定又は診断のための方法について記載されている。
【００２１】
分析され記述された動物試験体では、総合的な代謝プロファイルは、メタボロミックとも呼ばれ、感染した対象の健康状態を監視するための多数の生体マーカ中におけるバラツキを検出するために使用された。
【００２２】
上記と同じ文献において、低分子量成分のリンパ液から溶媒抽出した後、ＧＣ／ＴＯＦ／ＭＳシステムを用いる分析に基づくバクテリア感染の検出、同定又は診断のための方法が提案されている。しかしながら、得られたデータによっては、バクテリア株の特有な代謝生成物を同定することが可能とならず、リンパ液に存在する代謝生成物を過小又は過大表現することが可能となる。データの多様な分析によって、これらの変化がバクテリア株に関連付けられることが可能なことの重要性が示されるに過ぎない。
【００２３】
さらに最近では、固相ミクロ抽出（ＳＰＭＥ）支持体上の適当な培養液中で成長し、その後にＧＣ／ＭＳで分析されたバクテリアの揮発性な代謝生成物／異化産物の濃度に基づく新たな分析的アプローチが完成をみた。このシステムによれば、異なるバクテリアがどのようにして異なる代謝／異化マーカプロファイルまで結び付けられることが示され、そしてそれらを生物学的な物質中で同定されることが可能となるという、満足される結果が得られた。このシステムの欠点のひとつは、本質的に、時間とＳＰＭＥ濃縮ステップとのために必要とされるコストに関係するものである。
【００２４】
２０１２年５月３０日に出版された、Ｈｅａｔｈｅｒ Ｄ．Ｂｅａｎらによる著作：「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖｏｌａｔｉｌｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｓｏｌｄ  ｐｈａｓｅ  ｍｉｃｒｏｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」には、遠心分離（浮遊物は、濾過の後でＳＰＭＥを用いて分析されている。）を用いた培養液からの抽出の後のバクテリアの異化産物のプロファイルの研究について記載されている。
【００２５】
２０１１年に出版された、Ｋｈａｌｉｄ Ｍｕｚａｆｆａｒ Ｂａｎｄａｙらによる著作：「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｕｒｉｎｅ  ｖｏｌａｔｉｌｅ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｔｏ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｐａｔｉｅｎｔｓ」には、肺結核に感染した患者と健康な患者との間の識別を得ることを可能とする方法について記載されている。尿中で発見されたマーカは、尿レベルに関わるバクテリアの代謝／異化作用による生産物ではなく、肺結核の進展による全身的なレベル上に関わる非代謝生成物である。
【００２６】
２０１１年に出版された、Ｔ．Ｊ．Ｄａｖｉｅｓらによる著作：「ＶＯＬＡＴＩＬＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ  ＦＲＯＭ  ＡＣＥＴＹＬＣＨＯＬＩＮＥ  ＡＳ  ＭＡＲＫＥＲＳ  ＩＮ  ＴＨＥ  ＲＡＰＩＤ  ＵＲＩＮＥ  ＴＥＳＴ  ＵＳＩＮＧ  ＨＥＡＤ−ＳＰＡＣＥ  ＧＡＳ−ＬＩＱＵＩＤ  ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ」には、尿バクテリアの代謝生成物／異化産物の分析はされていないが、アセチルコリンが生体サンプル中に導入され、この材料の、バクテリアの代謝による生産物の研究がなされた方法について記述されている。
【００２７】
２００４年に出版された、国際公開第２００４／０８１５２７号には、質量分析ではなく、イオン移動度に基づく方法、「Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｏｎ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ（差分イオン移動度分析のためのシステム）」について記述されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
既存の手法で得られる結果と比較して、一層重要、正確、及び、迅速な結果を得るために、ヘッドスペース（ＳＨＳ）ガスクロマトグラフ質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）と組み合わされた手法を利用し、生体サンプル、特に尿サンプル中のバクテリアを同定するための新たな手法を開発する必要性が生じ、そしてそれが本発明の目的とするところである。
【００２９】
本発明の別の目的は、未処理の尿サンプルを用いたバクテリア類の同定を可能とすることである。
【００３０】
別の目的は、増幅及び集積培地を用いることなく感染した尿サンプルにさえも存在するバクテリア株の同定を実現することである。
【００３１】
別の目的は、生体サンプル中に存在する混合バクテリアコロニーの共存に関する情報が、共存による同定の信頼性への影響を受けることがないようにすることである。
【００３２】
本願出願人は、本発明に工夫を加え、試験を行い、具体化することで、上記技術水準での欠点を克服し、これら及びその他の目的、及び、優位点を得るに至ったものである。
【００３３】
本願明細書で使用される用語について予め定義を与えることが必要である。
＜液体増幅培地のグラフ＞：これは、液プロット（ＢＰ）とも呼ばれる、培養液のガスクロマトグラフ質量分析システム（以下、ＧＣ／ＭＳと省略する。）によって検出可能な物質の多様なピークを有するグラフを意味する。
＜代謝ピーク＞：これらは、バクテリア類が、その複製の為の栄養として消費される培養液中に存在する物質を同定するＧＣ／ＭＳプロットにおけるピークである（ＭＰＰ）。
＜異化ピーク＞：これらは、バクテリア類によって生産される物質を同定するＧＣ／ＭＳプロットにおけるピークである（ＣＰＰ）。
＜メタブロミックライブラリ＞：これは、その代謝又は増幅のために消費される物質に関連して、多様に特有な各バクテリア類のピークを含むＧＣ／ＭＳプロットの組み合わせのことである（ＭＬ）。
＜カタブロミックライブラリ＞：これは、その異化作用によって生産される物質に関連して、多様に特有な各バクテリア類のピークを含むＧＣ／ＭＳプロットの組み合わせのことである（ＣＬ）。
＜選択固体培地＞：選択活動物質（ＳＳＭ）が添加された固体増幅培地のことである。
＜選択液体培地＞：選択活動物質（ＳＬＭ）が添加された液体増幅培地のことである。
＜非感染の未処理の尿のグラフ＞：培養培地のいずれもが存在しない状態で、ＧＣ／ＭＳシステムによって検出可能な、非感染の未処理の尿における物質の多様なピークの組み合わせのことである（ＮＵＰ）。
＜感染した未処理の尿のグラフ＞：培養培地が存在するか又は存在しない状態で、感染した尿中で、ＧＣ／ＭＳシステムによって検出可能な、物質の多様なピークの組み合わせのことである（ＣＮＵＰ）。
＜静的ヘッドスペース＞：バクテリア培養の上方に存在する、容器（瓶）中の気体のことである（ＳＨＳ）。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
本発明は、独立請求項に記載され、かつ特徴づけられる一方で、従属請求項では、本発明の他の特徴、又は、主要な発明思想に対する変法が記述されている。
【００３５】
本発明は、異化作用及び／又は代謝に伴いバクテリアによって形成された揮発性物質の、ＳＨＳ／ＧＣ／ＭＳ検出及び分析システムを使用した、生体サンプル中でのバクテリア類を検出及び同定する方法を提供するものである。
【００３６】
好ましい一実施形態では、生体サンプルは、例えば、それに限られないが、未処理の尿、又は、液体培養基質が添加された未処理の尿が、十分に封止された瓶中に注入され、そして、生体サンプルの上方（ヘッドスペース）にある気体中から、適当なピックアップシステムを用いて、ＧＣ／ＭＳ分析に供される揮発性物質がサンプルとして採取される。
【００３７】
好ましい実施形態では、揮発性を有するサンプル気体中における一定量が、ＧＣ／ＭＳ分析用のガスクロマトグラフのインジェクターに送られる。
【００３８】
別の好ましい実施形態では、揮発性物質を取り出すために、瓶の蓋に穴を開ける針システムが使用され、その内部でバクテリアによって形成される揮発性物質が存在する生体サンプルの上方で、ガスクロマトグラフ質量分析に必要な量が採取される。
【００３９】
本発明は、増幅（代謝生成物）及び生産物（異化産物）の原料として使用された物質の固有な代謝及び異化作用を、生きたバクテリアが備えるという原理に基づいたものである。
【００４０】
本発明によれば、揮発性な代謝生成物及び異化産物が、バクテリア培養の上方にある気体中で採取され、分析される生体サンプル、特には尿が、導入、予め接種、又は、播かれた瓶の内部に配置される一つのステップが提供される。
【００４１】
変法によれば、上述の揮発性な代謝生成物及び異化産物は、固相ミクロ抽出（ＳＰＭＥ）手法を用いて取り出される。
【００４２】
本発明は、ＧＣ／ＭＳを用いて揮発性を有する代謝生成物／異化産物が分析される少なくとも一つのステップを提供する。
【００４３】
この分析の目的は、特有なメタボロミックプロファイル（ＭＰＰ）、及び、特有なカタブロミックプロファイル（ＣＰＰ）を構築するために、各バクテリア類の代謝マーカ及び異化マーカの存在を同定することにある。メタボロミック及びカタブロミックプロファイルは、培養培地又は液のみ（ＢＰ）に関係するプロットと比較することで、多様なバクテリア株に関係する、特有なライブラリの構成が可能となり、さらに、そこに存在するバクテリア感染の有無を調査することで、生体サンプルの分析による同定が可能となる。
【００４４】
この方法を用いることで、分析された生体サンプルに存在するバクテリア類を、比較的短時間（例えば、サンプルあたり５分の範囲）で同定することが可能となり、それにより、目標とされる抗生物質治療を開始することが可能となる。
【００４５】
本発明は、微生物学上の自動化に適した結果を得るために、その他の自動化されたシステムに組み込むことも容易に行えるようになる。
【００４６】
ここで提案されたケースでは、それぞれに関してではないが、その他の実験室手法と比較して、以下に示す操作上の利点がある。
【００４７】
バクテリアの同定のために、公知のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦシステムにおいては、バクテリアにより単離された材料から準備されるペレットが必要となる。このＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法の限界は、全ての当業者に知られているように、ペレット中に存在する一つのコロニーを超える、混合されたコロニーが出現するときの検知限界で与えられる。
【００４８】
本発明の方法によれば、検査対象のサンプルが予め接種された封止瓶中で、ヘッドスペースの検査が直接実行されることから、ペレットを準備することが必要とされない。このように取り出された揮発性物質の分析によって、各バクテリア類のために特有なクロマトグラフプロットが得られるとともに、同じサンプル中に存在する一つ以上のバクテリアの存在によって影響されることもさらに少ない。
【００４９】
実際のところ、全てのバクテリア類は、その他の株の共存にかかわらず、そのメタボロミック／カタブロミックな成分を示すことから、本発明によれば、混合されたコロニーの存在についても情報が得られ、上述した公知の手法によって、得ることが不可能、又は、極端に困難な情報をも得られるようになる。
【００５０】
本発明は、上述したように、いかなる特有なペレットの準備を必要とするものではない。即ち、上述のペレットを得るために、サンプルの操作、及び、対応する遠心分離を何ら必要としないものである。
【００５１】
本発明によれば、同定された全ての単一のバクテリア類の、引き続く特定の耐性記録の可能性とともに、バクテリアの同定のための、全体として自動化されたシステムを提供することが可能となる。
【００５２】
分析されるサンプルのヘッドスペースの分析は、未処理状態のサンプル、液体増幅培地が添加された未処理状態のサンプル、又は、液体培地中で希釈されたペトリ皿から単離されたコロニーによって可能となる。
【００５３】
１）液体培地中での尿サンプルの処理手順及び準備
ＡＴＣＣ（アメリカ型の培養保存）微生物の公知の株が健康な患者から未処理の尿サンプルに添加され、液体培地液を含む瓶中に注入される。そして、そのサンプルは、マクファーランド比濁法の多様なレベルで検出され、ＧＣ／ＭＳ手法を用いて、引き続き分析される。
その分析の結果、添加したＡＴＣＣ株に特徴的なカタブロミックプロファイル（ＣＰＰ）が示された。
その結果、また、ＢＰグラフと比較して異なるものとして添加されたＡＴＣＣ株に特徴的なメタボロミックプロファイル（ＭＰＰ）をも示された。
【００５４】
２）ペトリ皿中の尿サンプルの処理手順及び準備
ＡＴＣＣ微生物の公知の株が、健康な患者から未処理の尿サンプルに添加された。こうして得られたサンプルは、ペトリ皿上に播かれた。そして、そのサンプルは、単離されたコロニーのために校正されたループを有する培養培地から取り出され、液体培地上で希釈された。引き続いて、そのサンプルは、マクファーランド比濁法の多様なレベルで検出され、さらに引き続いて、ＳＨＳ／ＧＣ／ＭＳ手法を用いて読み取られた。
【００５５】
このケースにおいては、また、分析結果によって、ＢＰグラフと比較して異なるものとして、添加されたＡＴＣＣ株に特徴的なカタブロミックプロファイル（ＣＰＰ）と、添加されたＡＴＣＣ株に特徴的なメタボロミックプロファイル（ＭＰＰ）との両方が示された。
【００５６】
３）未処理の尿サンプルの処理手順及び準備
ＡＴＣＣ微生物の公知の株は、健康な患者から未処理の尿サンプルに添加され、そして、そのサンプルは、マクファーランド比濁法の多様なレベルで検出され、引き続いて、ＧＣ／ＭＳ手法を用いて読み取られた。その分析の結果、添加されたＡＴＣＣ株に特徴的なカタブロミックプロファイル（ＣＰＰ）が示された。
【発明の効果】
【００５７】
＜結果の定義＞
この手法を使用すれば、本発明により、固相培地、ペトリ皿、もしくは液体増幅培地中に播かれたＡＴＣＣバクテリア株を含む尿サンプル、又は、未処理の尿サンプルに特有な異化ピーク（ＣＰＰ）及び代謝ピーク（ＭＰＰ）を検出することが可能となることは明らかである。
【００５８】
本発明によれば、ＧＣ／ＭＳ測定器中で読み取りを行う前であれば、如何なる予備処理も行わないサンプルを用い、バクテリアの濃縮ペレットを得るためのサンプルの遠心分離を必要とせず、尿サンプル中に存在するバクテリア類を同定することも可能となる。
【００５９】
そのため、本発明によれば、自動化されたフローシステムでの応答が得られるバクテリアの同定が可能となる。
【００６０】
本発明によれば、それぞれ個別のバクテリア類についての代謝ピーク（ＭＰＰ）及び異化的なピークを同定することが可能となり、各バクテリア類について特有な代謝ライブラリ（ＬＢ）及び異化マーカライブラリ（ＣＬ）の構成を可能とする特異的なＧＣ／ＭＳプロットが得られる。
【００６１】
その代謝ピーク（ＭＰＰ）によって、バクテリアの栄養としての「液体培地グラフ（ＢＰ）」のプロットと比較することで、バクテリア株によって消費される物質のプロットが得られるようになる。
【００６２】
そのため、本発明によれば、固相増幅培地（ペトリ皿）及び液体培地の両方を使用し、さらに培養培地を伴わない未処理のサンプルから、各バクテリア類について特有なライブラリを用いることが可能となる。
【００６３】
尿中に存在するバクテリア株によって、代謝生成物（ＭＬ）に固有なライブラリが示され、さらに異化産物（ＬＢ）に固有なライブラリが示される。
【００６４】
引き続くＧＣ／ＭＳ分析のためのバクテリアの力価の最適値を同定するために、尿サンプルの代謝ピーク（ＭＰＰ）、及び、尿サンプルの異化ピーク（ＣＰＰ）が、マクファーランド比濁法の異なるレベルで検出される。
【００６５】
本発明は、上述のとおり、増幅培地を伴わない未処理の尿サンプル中でのバクテリアの同定を行うことも可能となる。
【００６６】
＜分析手順＞
以上説明したように、本発明による方法は、培養バクテリアが収容された、例えば、瓶などの封止容器のヘッドスペースである上方にある気体中に存在する揮発性を有する代謝生成物／異化産物の分析に基づいている。その揮発性分子種は、ＳＨＳシステムを用いて採取されるか、又は、変法によれば、サンプルの何らの処理を要することなく、ＧＣ／ＭＳの手法による直接分析を可能とするＳＰＭＥを用いて採取される。
【００６７】
分析時間を劇的に減少させるには、ＳＨＳシステムの正確なパラメーター表現が行われ、高速度クロマトグラフ（Ｆａｓｔ ＧＣ）が使用される。ＳＰＭＥ／ＧＣ／ＭＳシステムのために、通常３０〜３５分間を要するクロマトグラフ分析時間が、７〜１０分間まで短縮された。
【００６８】
ブランクを得るために、培養液に関するサンプルが分析された第一ステップで、さらに、異なるマクファーランド値で、培地＋バクテリア株のサンプルが分析された。
【００６９】
全てのバクテリア株について固有なＧＣ／ＭＳプロットの分析によって、全ての単体のバクテリア（異化産物）の特徴的な分子種を同定することが可能となり、培養液（代謝生成物）に固有な、多数の種の中での相当な絞り込みを実現することが可能となる。
【００７０】
優先される溶液中では、精確なクロマトグラフ保持時間及び質量／負荷比率によって特徴づけられる、全ての単体のバクテリア（異化産物）に特徴的な種の検出が、「再構成イオンクロマトグラム」（ＲＩＣ）として知られている手法を用いて実行された。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
添付の図面は、限定されない例を示すものであり、いくつかの図表を示している：
【図１】図１は、バクテリア株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを含む液のＧＣ／ＭＳプロットと比較した液体増幅培地のＧＣ／ＭＳプロットを示すものである。
【図２】図２は、代謝栄養物の効果としての、栄養又は代謝ピークの減少を示す一連のＲＩＣプロットを示すものである。
【図３】図３は、異化作用の生産物としてのＡＴＣＣバクテリア株中に存在する特有な物質の異化ピークのプロットの例を示すものである。
【図４】図４は、異化作用の生産物としてのＡＴＣＣバクテリア株中に存在する特有な物質の異化ピークのプロットの例を示すものである。
【図５】図５は、異化作用の生産物としてのＡＴＣＣバクテリア株中に存在する特有な物質の異化ピークのプロットの例を示すものである。
【図６】図６は、異化作用の生産物としてのＡＴＣＣバクテリア株中に存在する特有な物質の異化ピークのプロットの例を示すものである。
【図７】図７は、ｍ／ｚ１０８（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに固有なもの）、ｍ／ｚ８８（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓに固有なもの）、ｍ／ｚ１６２（Ｅ．ｃｏｌｉに固有なもの）の種に関連するＲＩＣプロットを示すものである。
【図８】図８は、ｍ／ｚ１０８（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに固有なもの）、ｍ／ｚ８８（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓに固有なもの）、ｍ／ｚ１６２（Ｅ．ｃｏｌｉに固有なもの）の種に関連するＲＩＣプロットを示すものである。
【図９】図９は、ｍ／ｚ１０８（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに固有なもの）、ｍ／ｚ８８（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓに固有なもの）、ｍ／ｚ１６２（Ｅ．ｃｏｌｉに固有なもの）の種に関連するＲＩＣプロットを示すものである。
【図１０】図１０は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ及びＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの各バクテリア株にそれぞれ感染した未処理の尿について得られたプロットである。
【図１１】図１１は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ及びＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの各バクテリア株にそれぞれ感染した未処理の尿について得られたプロットである。
【図１２】図１２は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ及びＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの各バクテリア株にそれぞれ感染した未処理の尿について得られたプロットである。
【図１３】図１３は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ及びＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの各バクテリア株にそれぞれ感染した未処理の尿について得られたプロットである。
【図１４】図１４は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ及びＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの各バクテリア株にそれぞれ感染した未処理の尿について得られたプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
以下、例示として、増幅培地中で増幅（予め接種）されたバクテリア株の分析の例を何点か挙げることにする。そして、図面では、得られた分析結果について示す。
【００７３】
ＡＴＣＣ株からの公知のバクテリア株が、バクテリアの複製を作成しうるペプトンの混合物を含む液状の培養培地において再編成及び培養された。
【００７４】
増幅のレベルを知るために、マクファーランド比濁のレベルを測定することでバクテリアの増幅が検査された。
【００７５】
濁りを計測することで、多様な適正なマクファーランドレベルを分類することが可能であった。
【００７６】
一旦、培養液中でバクテリアの増幅の進行が検出されると、バクテリア株を含む培養液の一定量が、試験対象の各バクテリア類ごとに採取された。
【００７７】
ヘッドスペース中に存在する揮発成分がＳＨＳによって採取され、ＧＣ／ＭＳ測定器中に自動的に注入された。
【００７８】
図１の上方部位に、液体増幅培地から得られたＧＣ／ＭＳプロットが示されている。この液体増幅培地から放出された揮発性物質は、ＧＣ／ＭＳを用いて分析され、その結果として得られたプロットから、特有な物質の多様なピークが明示された。それは、「増幅培地グラフ」、「液プロット」（ＢＰ）、又は「ブランクプロット」と定義される。下方部位には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（１ マクファーランド）の存在下、同じ試料液のヘッドスペース中で採取された物質から得られたプロットを示している。
【００７９】
＜代謝ピークのグラフ＞
公知のＡＴＣＣバクテリア株が、液体増幅培地中に注入され（播かれ）、多様なマクファーランド値で、ヘッドスペース中に存在する揮発性物質がＧＣ／ＭＳ測定器に注入された。
【００８０】
存在するバクテリアによって、代謝された物質の特有なピークを有するクロマトグラフプロットが示された。それは即ち、栄養源としての液体増幅培地から取り去った物質である。
【００８１】
上記プロット中で示された栄養又は代謝ピークによって、「液プロット」（ＢＰ）から、それらの代謝栄養物の効果としてピークが小さくなり、液から取り去った物質の特異性が明確に示された。このポイントで、図２に示す比較プロットを参照することが必要である。図２では、グラフの上部が培地培養培地だけに関係するプロットを示す一方、その下部が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株の培地で播かれた場合でのプロットを示している。
【００８２】
それらのピークは、培養液のみの場合に関するグラフと比較して、「バクテリアのメタボロミックなグラフ」と定義することも、例えば９．５０分から１０．００分までの時間間隔に示されているように、培養液中でのみ検出可能な多様なピークの、消費、又はむしろ減少を示す「液プロット」と定義することもできる。
【００８３】
換言すれば、ＧＣ／ＭＳで測定することで、特有なピークによって、上記バクテリアの代謝が示され、そして、培養液のみと比較することで、液のみに対する、特有なピークの相対的な減少によって、バクテリアの餌である物質の検出をも可能となる。
【００８４】
栄養バクテリアの代謝生成物の分析が、各バクテリア類に特徴的であることが示され、特有なピークの検出によって、各バクテリア類に関する「代謝ライブラリ」を記述することが可能となる。
【００８５】
＜異化ピークのグラフ＞
同じ分析及び比較が、ＡＴＣＣバクテリア株についても行われ、それにより、図３−８のプロットに見られるように、それらの異化作用の生産物である、特有な物質の異化ピークが得られた。
【００８６】
以上と同様に、図には、質量／バクテリアの質量電荷比（ｍ／ｚ）（図３：ｍ／ｚ＝４５；図４：ｍ／ｚ＝６０；図５：ｍ／ｚ＝７０；図６：ｍ／ｚ＝１１２）の多様な値で、液のみ（上方部位）、及び、バクテリア株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が存在する液から得られたＧＣ／ＭＳプロットの進行状態が示されている。
【００８７】
このケースにおいてもまた、特有なピークの存在により、各バクテリア類に特有なバクテリアの異化産物の分析によって、各バクテリア類の「異化ライブラリ」を記述することが可能となった。
【００８８】
結論として、ＧＣ／ＭＳ測定器を使用することで、各バクテリア類について、「メタブロミックライブラリ」及び「カタブロミックライブラリ」の取得が可能となり、探索されるバクテリア類の同定に際して、比較用測定器として使用することができた。
【００８９】
本発明によれば、いずれせよ、２つのライブラリを個別に用いることをも可能となった。：例えば、それによればバクテリア株の明確な識別がなされ、かつ、未処理の尿又はペトリ皿から直接サンプルを採取することで使用できるので、「カタブロミックライブラリ」のみで、バクテリア類の同定が十分賄えるようになる。
【００９０】
この手法を有効にするために、例えば、３０の異なるバクテリア株が分析された。
【００９１】
特異的なグラフが得られたＧＣ／ＭＳで分析された各バクテリア類は、代謝ピーク及び異化ピークに関するプロットに特徴的である。
【００９２】
そのプロットによれば、上述したように、各バクテリア類に特有なライブラリを作成することが可能となる。
【００９３】
各バクテリア類に特有なピークの同定が終了し、分析時間が最終プロットに必要な時間まで減少され、特徴的なピークの検出が可能となった。このような方法で、ルーチンワークとなし得るほど短い分析時間が実現された。
【００９４】
以上から、本発明によれば、ＧＣ／ＭＳ計測ダイナミクスで、全ての独立した種の異化産物を参照するピークを有する特有なグラフを有し、それと同時に、培養液から取り除かれた物質を参照するピークを有する特有なグラフを有するバクテリア株のサンプルについて、各種の、及び、その異化作用のバクテリアの代謝の動的挙動によって、異なるバクテリア類の分析及び同定がどのようにして可能となったかが明らかである。
【００９５】
各バクテリア類に関するグラフプロットに、生産された代謝生成物と、増幅のためにバクテリアが予め播かれた培養液によって消費された物質との両方に特徴的なピークが含まれることが見出された。
【００９６】
消費された代謝生成物の検出と、生産された異化産物の検出との両方についての各バクテリア類のプロットは、各バクテリア類に特有なものである。そして、それにより、データに帰属されるべき相対的なグラフを分析すること、即ち、各バクテリア類のライブラリに含まれる参照データと比較すること、によって同定が可能となった。
【００９７】
「異化ライブラリ」を用いる独立したバクテリア類の動的分析を可能とするために、望ましいが、限定されない解決方法が、液体増幅培地を用いることである。
【００９８】
以上より、本発明は、ＧＣ／ＭＳ計測中でのその動的挙動において、バクテリア類が餌とする物質、即ち、バクテリアの代謝、その異化作用、及び、その特有な異化作用によって検出される物質のクロマトグラフを用いた比較及び検出を示すものである。
【００９９】
以上と同様な手法が、３０の異なるバクテリア株によって、感染した尿を含む液を分析するために用いられた。培養液のみが存在した場合に観察されたときと比較してやや異なるメタボロミック及びカタブロミックプロファイルが観察されたが、このケースにおいても、尿の存在下、バクテリアの異化作用に由来する分子種を同定することが可能であった。
【０１００】
それらの種には、各バクテリア株に特有なものが存在するため、尿を含む液中でのバクテリアの増幅に関するデータを含むライブラリを作成することが可能となる。このライブラリは、感染した尿サンプル中に存在する特有なバクテリア類を同定するために用いることができる。
【０１０１】
例えば、図７−図９は、非感染の尿を含む液サンプルから得られたものと比較して、ｍ／ｚ１０８（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに特有）、ｍ／ｚ８８（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓに特有）、ｍ／ｚ１６２（Ｅ．ｃｏｌｉに特有）を有する種に関連するＲＩＣプロットを示している。
【０１０２】
上記した方法の有効性が、培養培地が存在しない場合の未処理の尿サンプルでも試験された。
【０１０３】
得られた結果から、それら条件の下では、各バクテリア株に特有な揮発性を有する異化産物をもまた検出できることが示された。
【０１０４】
図１０−図１４には、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ及びＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのバクテリア株それぞれについて、感染した未処理の尿について得られたプロットの例が示されている。
【０１０５】
それらの図面において、特有なイオン種のＲＩＣダイヤグラム（再構成イオンクロマトグラム）が、非感染の尿のＲＩＣダイヤグラムと比較されている。
【０１０６】
ｍ／ｚ１１７と２４．９０分の保持時間とを有する種は、Ｅ．ｃｏｌｉにのみ存在しており、それに対して、ｍ／ｚ６０と８．０７分の保持時間とを有する種は、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓに特徴的であった。これと同様に、ｍ／ｚ６０及び７．８０分の保持時間を有するイオンと、ｍ／ｚ４２及び５．６０分の保持時間を有するイオンとは、それぞれ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＰ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓに特徴的であった。７．４５分の保持時間を有するＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓについて特定されたｍ／ｚ７９を有するイオンは、その他の株中にも存在しているが、保持時間が異なっており、そのため、それが異なる種によるものであることが示されている。
【０１０７】
本発明には、特許請求の範囲で規定されるような、属する分野及び範囲から離れない限り、変形及び種々の変更が可能である。
【図１】
2016513259.tif 000003
【図２】
2016513259.tif 000004
【図３】
2016513259.tif 000005
【図４】
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【図５】
2016513259.tif 000007
【図６】
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【図７】
2016513259.tif 000009
【図８】
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【図９】
2016513259.tif 000011
【図１０】
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【図１１】
2016513259.tif 000013
【図１２】
2016513259.tif 000014
【図１３】
2016513259.tif 000015
【図１４】
2016513259.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成27年10月22日(2015.10.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガスクロマトグラフ質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）に基づく手法により、生体サンプル中、限定されないが特に尿サンプル中でのバクテリア種を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体サンプル中での迅速かつ正確な微生物の識別は、感染性疾患の診断、及び、その後の正しい抗生物質治療の策定にあたって重要となるものである。
【０００３】
患者の生体サンプルに含まれる病原バクテリアの同定の技術水準として、直接的方法及び間接的方法の両方を含む様々な方法が知られている。
【０００４】
現在「ゴールドスタンダート」と考えられている主要な直接的方法には、特定の媒体中での培養により得られたバクテリアコロニーの生化学的及び形態学的試験を通じた同定が必須である。
【０００５】
培養手法は、使用される培地に依存し（例えば、従来からの培養培地で行われ）、完全に汎用なもの（例えば、Ｃｌｅｄと呼ばれる手法）であるか、あるいは、別の方法としては、同定されるコロニーの特性を幾分か完全な形で選択することが可能なものである。
【０００６】
これらの中には、グルコース及びラクトースの発酵（例えば、ＭａｃＣｏｎｋｅｙ培養培地を参照のこと）、並びに、赤血球の部分的又は全体的溶血の程度（例えば、血液寒天プレートを使用する方法）を利用した手法が知られている。ある群、又は、バクテリア種はこれらの特性まで遡ることができる。
【０００７】
多様な種類のバクテリアの類又は種を異なった色に着色することが可能な発色酵素基質培地を含むペトリ皿上にサンプルを播くことによる仮の同定手法が、変法として挙げられる。これらの場合では、培養中で成長するコロニーの異なる色に基づく視覚型で識別されている。
【０００８】
サンプルの同定は、従来、（上記した多様な種類のコロニーとは無関係に、）予めペトリ皿上で単離することで得られた標準化バクテリア懸濁液（０．５マクファーランド濃度）を接種することで試験された生物学的試験の適切なパターンを、手動で又は自動化されたシステムで分析することで行われていた。
【０００９】
最近では、バクテリア細胞同定の精確性と迅速性を改善するために、様々な分析手法が開発されてきている。これらの手法では、脂質、リン脂質、リポ多糖類、オリゴ糖類、タンパク質、又は、核酸などのバクテリア細胞の生物学的化合物が、各バクテリアに特有な分類上のマーカを判定するために調査されている。
【００１０】
増幅、ハイブリダイゼーション、及び、核酸のシーケンス処理などの分子生物学上の手法によって、結果の特異性、感受性、及び、迅速性の特性が両立し、微生物学の実験に対してより一層の関心が持たれている。しかしながら、今日に至るまで、それらには依然として十分に標準化された方法が存在せず、しかも、依然として非常に高価なままである。
【００１１】
フローサイトメトリが、生体サンプル中のバクテリアを同定するための手法として提案されているが、特異性及び陽性的中率（Ｔｕｅｓｔａ、ＥＣＣＭＩＤ２００９）の観点からパフォーマンスに乏しいことが実験で裏付けられている。その他に提案されたルミネセンス手法もまた、純然たるコロニーの研究に限定されているか、免疫学的手法に関連付けられることが必須となっている。
【００１２】
生物学的基質上のバクテリアを同定するための最も近代的な手法の中で、分子振動に基づくラマン分光分析の利用につながる応用手法が進展している。これは、高度な特異性及び振動スペクトルの解像度と、生態系に典型的な水環境からの微弱なバックグランド信号とによって、統合バクテリアが含まれる生体物質を分析するための非破壊的かつ無侵襲的な分析手法となっている。しかしながら、ラマン信号は相対的に微弱であり、特殊な金属共鳴体（銀、金及び銅）（カナダ国特許第２６６８２５９号明細書を参照）上での被分析物の吸収を利用するＳＥＲＳ手法を用いて増幅されている。
【００１３】
近年、例えば、ガスクロマトグラフや熱分解的方法と関連付けられた多様な組み合わせを有する質量分析法が、高い感度及び特異性を有する、バクテリアの迅速な同定のための方法の進展のために最も有望な手法のように思われる。そのような手法が記述されたものとして、脂質プロファイル（米国特許出願第２０１１／０８６３８４号、国際公開第２００８／０５８０２４号）、又は、遺伝子プロファイル（米国特許第５６０５７９８号明細書）又はメタボロミックプロファイル（国際公開第２０１１／０６４０００号）よりもむしろ、例えば、プロテオミック・プロファイル（国際公開第２００９／０６５５８０号）の研究に供される特許文献中において報告されている。
【００１４】
１９９６年に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析―飛行時間）と呼ばれる、ある特別な質量分析手法に基づいて、バクテリアの同定が完成をみている。
【００１５】
全ての質量分析手法によって、サンプル中に存在する分子の分子量を計測することが可能であるが、他の手法と異なり、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によれば、複雑な基質からなるサンプルを分析することが可能である。この手法を用いることで、バクテリア細胞を分析することが初めて可能となった。この分析法の結果、細胞壁に弱く結合したタンパク質成分と、さらに分析過程で生じた分子の部分分解に追従して解放された分子とから発生する信号に由来する質量スペクトルが得られている。これらのタンパク質成分の分子量は、種ごとに変化し、バクテリア細胞を分析することで得られる質量スペクトルが、分析されるバクテリア種に密接に関連付けられ、極端に特定された明瞭な特徴を表す。
【００１６】
その手法は、ペトリ皿からある数のコロニーを採取するためと、測定器において、レーザー照射される小皿が収容される適当な容器上にそれらを配置するためと、に使用される。
【００１７】
引き続いて、レーザー照射、及び、測定器による質量スペクトルの登録の前に、適切な基質が添加され、小皿が３７℃の恒温とされることで乾燥される。
【００１８】
上述の方法の変法（Ｂｒｕｃｋｅｒによる国際特許第２００９／０６５５８０号）は、陽性血液培養フラスコ上での応用を提供し、その物質は遠心分離され、得られたペレットは、測定器の小皿をサンプル運搬する適当な容器上に配置される。そして、その方法では、上述したとおりの内容が連続して行われる。
【００１９】
公知の特許文献には、メタボロミック、脂質、又は、バクテリアの単離されたコロニーの遺伝子プロファイルの分析、又は、遠心分離された生体サンプル材料から得られるあらゆるバクテリアのペレットの分析について開示されている。
【００２０】
国際公開第２０１１／０６４０００号文献には、ＧＣ／ＴＯＦ／ＭＳシステムを用いた、制御サンプルに対する代謝プロファイルのサンプルの対比分析を用い、動物（ラット）の生体サンプル中でのバクテリアによって引き起こされた感染症の検出、同定又は診断のための方法について記載されている。
【００２１】
分析され記述された動物試験体では、総合的な代謝プロファイルは、メタボロミックとも呼ばれ、感染した対象の健康状態を監視するための多数の生体マーカ中におけるバラツキを検出するために使用された。
【００２２】
上記と同じ文献において、低分子量成分のリンパ液から溶媒抽出した後、ＧＣ／ＴＯＦ／ＭＳシステムを用いる分析に基づくバクテリア感染の検出、同定又は診断のための方法が提案されている。しかしながら、得られたデータによっては、バクテリア株の特有な代謝生成物を同定することが可能とならず、リンパ液に存在する代謝生成物を過小又は過大表現することが可能となる。データの多様な分析によって、これらの変化がバクテリア株に関連付けられることが可能なことの重要性が示されるに過ぎない。
【００２３】
さらに最近では、固相ミクロ抽出（ＳＰＭＥ）支持体上の適当な培養液中で成長し、その後にＧＣ／ＭＳで分析されたバクテリアの揮発性な代謝生成物／異化産物の濃度に基づく新たな分析的アプローチが完成をみた。このシステムによれば、異なるバクテリアがどのようにして異なる代謝／異化マーカプロファイルまで結び付けられることが示され、そしてそれらを生物学的な物質中で同定されることが可能となるという、満足される結果が得られた。このシステムの欠点のひとつは、本質的に、時間とＳＰＭＥ濃縮ステップとのために必要とされるコストに関係するものである。
【００２４】
２０１２年５月３０日に出版された、Ｈｅａｔｈｅｒ Ｄ．Ｂｅａｎらによる著作：「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖｏｌａｔｉｌｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｓｏｌｄ  ｐｈａｓｅ  ｍｉｃｒｏｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」には、遠心分離（浮遊物は、濾過の後でＳＰＭＥを用いて分析されている。）を用いた培養液からの抽出の後のバクテリアの異化産物のプロファイルの研究について記載されている。
【００２５】
２０１１年に出版された、Ｋｈａｌｉｄ Ｍｕｚａｆｆａｒ Ｂａｎｄａｙらによる著作：「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｕｒｉｎｅ  ｖｏｌａｔｉｌｅ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｔｏ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｐａｔｉｅｎｔｓ」には、肺結核に感染した患者と健康な患者との間の識別を得ることを可能とする方法について記載されている。尿中で発見されたマーカは、尿レベルに関わるバクテリアの代謝／異化作用による生産物ではなく、肺結核の進展による全身的なレベル上に関わる非代謝生成物である。
【００２６】
２０１１年に出版された、Ｔ．Ｊ．Ｄａｖｉｅｓらによる著作：「ＶＯＬＡＴＩＬＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ  ＦＲＯＭ  ＡＣＥＴＹＬＣＨＯＬＩＮＥ  ＡＳ  ＭＡＲＫＥＲＳ  ＩＮ  ＴＨＥ  ＲＡＰＩＤ  ＵＲＩＮＥ  ＴＥＳＴ  ＵＳＩＮＧ  ＨＥＡＤ−ＳＰＡＣＥ  ＧＡＳ−ＬＩＱＵＩＤ  ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ」には、尿バクテリアの代謝生成物／異化産物の分析はされていないが、アセチルコリンが生体サンプル中に導入され、この材料の、バクテリアの代謝による生産物の研究がなされた方法について記述されている。
【００２７】
２００４年に出版された、国際公開第２００４／０８１５２７号には、質量分析ではなく、イオン移動度に基づく方法、「Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｏｎ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ（差分イオン移動度分析のためのシステム）」について記述されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
既存の手法で得られる結果と比較して、一層重要、正確、及び、迅速な結果を得るために、ヘッドスペース（ＳＨＳ）ガスクロマトグラフ質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）と組み合わされた手法を利用し、生体サンプル、特に尿サンプル中のバクテリアを同定するための新たな手法を開発する必要性が生じ、そしてそれが本発明の目的とするところである。
【００２９】
本発明の別の目的は、未処理の尿サンプルを用いたバクテリア種の同定を可能とすることである。
【００３０】
別の目的は、増幅及び集積培地を用いることなく感染した尿サンプルにさえも存在するバクテリア株の同定を実現することである。
【００３１】
別の目的は、生体サンプル中に存在する混合バクテリアコロニーの共存に関する情報が、共存による同定の信頼性への影響を受けることがないようにすることである。
【００３２】
本願出願人は、本発明に工夫を加え、試験を行い、具体化することで、上記技術水準での欠点を克服し、これら及びその他の目的、及び、優位点を得るに至ったものである。
【００３３】
＜定義＞
本願明細書で使用される用語について予め定義を与えることが必要である。
＜液体増幅培地のグラフ＞：これは、液プロット（ＢＰ）とも呼ばれる、培養液のガスクロマトグラフ質量分析システム（以下、ＧＣ／ＭＳと省略する。）によって検出可能な物質の多様なピークを有するグラフを意味する。
＜代謝ピーク＞：これらは、バクテリア種が、その複製の為の栄養として消費される培養液中に存在する物質を同定するＧＣ／ＭＳプロットにおけるピークである（ＭＰＰ）。
＜異化ピーク＞：これらは、バクテリア種によって生産される物質を同定するＧＣ／ＭＳプロットにおけるピークである（ＣＰＰ）。
＜メタブロミックライブラリ＞：これは、その代謝又は増幅のために消費される物質に関連して、多様に特有な各バクテリア種のピークを含むＧＣ／ＭＳプロットの組み合わせのことである（ＭＬ）。
＜カタブロミックライブラリ＞：これは、その異化作用によって生産される物質に関連して、多様に特有な各バクテリア種のピークを含むＧＣ／ＭＳプロットの組み合わせのことである（ＣＬ）。
＜選択固体培地＞：選択活動物質（ＳＳＭ）が添加された固体増幅培地のことである。
＜選択液体培地＞：選択活動物質（ＳＬＭ）が添加された液体増幅培地のことである。
＜非感染の未処理の尿のグラフ＞：培養培地のいずれもが存在しない状態で、ＧＣ／ＭＳシステムによって検出可能な、非感染の未処理の尿における物質の多様なピークの組み合わせのことである（ＮＵＰ）。
＜感染した未処理の尿のグラフ＞：培養培地が存在するか又は存在しない状態で、感染した尿中で、ＧＣ／ＭＳシステムによって検出可能な、物質の多様なピークの組み合わせのことである（ＣＮＵＰ）。
＜静的ヘッドスペース＞：バクテリア培養の上方に存在する、容器（瓶）中の気体のことである（ＳＨＳ）。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
本発明は、独立請求項に記載され、かつ特徴づけられる一方で、従属請求項では、本発明の他の特徴、又は、主要な発明思想に対する変法が記述されている。
【００３５】
本発明は、異化作用及び／又は代謝に伴いバクテリアによって形成された揮発性物質の、ＳＨＳ／ＧＣ／ＭＳ検出及び分析システムを使用した、生体サンプル中でのバクテリア種を検出及び同定する方法を提供するものである。
【００３６】
好ましい一実施形態では、生体サンプルは、例えば、それに限られないが、未処理の尿、又は、液体培養基質が添加された未処理の尿が、十分に封止された瓶中に注入され、そして、生体サンプルの上方（ヘッドスペース）にある気体中から、適当なピックアップシステムを用いて、ＧＣ／ＭＳ分析に供される揮発性物質がサンプルとして採取される。
【００３７】
好ましい実施形態では、揮発性を有するサンプル気体中における一定量が、ＧＣ／ＭＳ分析用のガスクロマトグラフのインジェクターに送られる。
【００３８】
別の好ましい実施形態では、揮発性物質を取り出すために、瓶の蓋に穴を開ける針システムが使用され、その内部でバクテリアによって形成される揮発性物質が存在する生体サンプルの上方で、ガスクロマトグラフ質量分析に必要な量が採取される。
【００３９】
本発明は、増幅（代謝生成物）及び生産物（異化産物）の原料として使用された物質の固有な代謝及び異化作用を、生きたバクテリアが備えるという原理に基づいたものである。
【００４０】
本発明によれば、揮発性な代謝生成物及び異化産物が、バクテリア培養の上方にある気体中で採取され、分析される生体サンプル、特には尿が、導入、予め接種、又は、播かれた瓶の内部に配置される一つのステップが提供される。
【００４１】
変法によれば、上述の揮発性な代謝生成物及び異化産物は、固相ミクロ抽出（ＳＰＭＥ）手法を用いて取り出される。
【００４２】
本発明は、ＧＣ／ＭＳを用いて揮発性を有する代謝生成物／異化産物が分析される少なくとも一つのステップを提供する。
【００４３】
この分析の目的は、特有なメタボロミックプロファイル（ＭＰＰ）、及び、特有なカタブロミックプロファイル（ＣＰＰ）を構築するために、各バクテリア種の代謝マーカ及び異化マーカの存在を同定することにある。メタボロミック及びカタブロミックプロファイルは、培養培地又は液のみ（ＢＰ）に関係するプロットと比較することで、多様なバクテリア株に関係する、特有なライブラリの構成が可能となり、さらに、そこに存在するバクテリア感染の有無を調査することで、生体サンプルの分析による同定が可能となる。
【００４４】
この方法を用いることで、分析された生体サンプルに存在するバクテリア種を、比較的短時間（例えば、サンプルあたり５分の範囲）で同定することが可能となり、それにより、目標とされる抗生物質治療を開始することが可能となる。
【００４５】
本発明は、微生物学上の自動化に適した結果を得るために、その他の自動化されたシステムに組み込むことも容易に行えるようになる。
【００４６】
ここで提案されたケースでは、それぞれに関してではないが、その他の実験室手法と比較して、以下に示す操作上の利点がある。
【００４７】
バクテリアの同定のために、公知のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦシステムにおいては、バクテリアにより単離された材料から準備されるペレットが必要となる。このＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法の限界は、全ての当業者に知られているように、ペレット中に存在する一つのコロニーを超える、混合されたコロニーが出現するときの検知限界で与えられる。
【００４８】
本発明の方法によれば、検査対象のサンプルが予め接種された封止瓶中で、ヘッドスペースの検査が直接実行されることから、ペレットを準備することが必要とされない。このように取り出された揮発性物質の分析によって、各バクテリア種のために特有なクロマトグラフプロットが得られるとともに、同じサンプル中に存在する一つ以上のバクテリアの存在によって影響されることもさらに少ない。
【００４９】
実際のところ、全てのバクテリア種は、その他の株の共存にかかわらず、そのメタボロミック／カタブロミックな成分を示すことから、本発明によれば、混合されたコロニーの存在についても情報が得られ、上述した公知の手法によって、得ることが不可能、又は、極端に困難な情報をも得られるようになる。
【００５０】
本発明は、上述したように、いかなる特有なペレットの準備を必要とするものではない。即ち、上述のペレットを得るために、サンプルの操作、及び、対応する遠心分離を何ら必要としないものである。
【００５１】
本発明によれば、同定された全ての単一のバクテリア種の、引き続く特定の耐性記録の可能性とともに、バクテリアの同定のための、全体として自動化されたシステムを提供することが可能となる。
【００５２】
分析されるサンプルのヘッドスペースの分析は、未処理状態のサンプル、液体増幅培地が添加された未処理状態のサンプル、又は、液体培地中で希釈されたペトリ皿から単離されたコロニーによって可能となる。
【００５３】
１）液体培地中での尿サンプルの処理手順及び準備
ＡＴＣＣ（アメリカ型の培養保存）微生物の公知の株が健康な患者から未処理の尿サンプルに添加され、液体培地液を含む瓶中に注入される。そして、そのサンプルは、マクファーランド比濁法の多様なレベルで検出され、ＧＣ／ＭＳ手法を用いて、引き続き分析される。
その分析の結果、添加したＡＴＣＣ株に特徴的なカタブロミックプロファイル（ＣＰＰ）が示された。
その結果、また、ＢＰグラフと比較して異なるものとして添加されたＡＴＣＣ株に特徴的なメタボロミックプロファイル（ＭＰＰ）をも示された。
【００５４】
２）ペトリ皿中の尿サンプルの処理手順及び準備
ＡＴＣＣ微生物の公知の株が、健康な患者から未処理の尿サンプルに添加された。こうして得られたサンプルは、ペトリ皿上に播かれた。そして、そのサンプルは、単離されたコロニーのために校正されたループを有する培養培地から取り出され、液体培地上で希釈された。引き続いて、そのサンプルは、マクファーランド比濁法の多様なレベルで検出され、さらに引き続いて、ＳＨＳ／ＧＣ／ＭＳ手法を用いて読み取られた。
【００５５】
このケースにおいては、また、分析結果によって、ＢＰグラフと比較して異なるものとして、添加されたＡＴＣＣ株に特徴的なカタブロミックプロファイル（ＣＰＰ）と、添加されたＡＴＣＣ株に特徴的なメタボロミックプロファイル（ＭＰＰ）との両方が示された。
【００５６】
３）未処理の尿サンプルの処理手順及び準備
ＡＴＣＣ微生物の公知の株は、健康な患者から未処理の尿サンプルに添加され、そして、そのサンプルは、マクファーランド比濁法の多様なレベルで検出され、引き続いて、ＧＣ／ＭＳ手法を用いて読み取られた。その分析の結果、添加されたＡＴＣＣ株に特徴的なカタブロミックプロファイル（ＣＰＰ）が示された。
【発明の効果】
【００５７】
＜結果の定義＞
この手法を使用すれば、本発明により、固相培地、ペトリ皿、もしくは液体増幅培地中に播かれたＡＴＣＣバクテリア株を含む尿サンプル、又は、未処理の尿サンプルに特有な異化ピーク（ＣＰＰ）及び代謝ピーク（ＭＰＰ）を検出することが可能となることは明らかである。
【００５８】
本発明によれば、ＧＣ／ＭＳ測定器中で読み取りを行う前であれば、如何なる予備処理も行わないサンプルを用い、バクテリアの濃縮ペレットを得るためのサンプルの遠心分離を必要とせず、尿サンプル中に存在するバクテリア種を同定することも可能となる。
【００５９】
そのため、本発明によれば、自動化されたフローシステムでの応答が得られるバクテリアの同定が可能となる。
【００６０】
本発明によれば、それぞれ個別のバクテリア種についての代謝ピーク（ＭＰＰ）及び異化的なピークを同定することが可能となり、各バクテリア種について特有な代謝ライブラリ（ＬＢ）及び異化マーカライブラリ（ＣＬ）の構成を可能とする特異的なＧＣ／ＭＳプロットが得られる。
【００６１】
その代謝ピーク（ＭＰＰ）によって、バクテリアの栄養としての「液体培地グラフ（ＢＰ）」のプロットと比較することで、バクテリア株によって消費される物質のプロットが得られるようになる。
【００６２】
そのため、本発明によれば、固相増幅培地（ペトリ皿）及び液体培地の両方を使用し、さらに培養培地を伴わない未処理のサンプルから、各バクテリア種について特有なライブラリを用いることが可能となる。
【００６３】
尿中に存在するバクテリア株によって、代謝生成物（ＭＬ）に固有なライブラリが示され、さらに異化産物（ＬＢ）に固有なライブラリが示される。
【００６４】
引き続くＧＣ／ＭＳ分析のためのバクテリアの力価の最適値を同定するために、尿サンプルの代謝ピーク（ＭＰＰ）、及び、尿サンプルの異化ピーク（ＣＰＰ）が、マクファーランド比濁法の異なるレベルで検出される。
【００６５】
本発明は、上述のとおり、増幅培地を伴わない未処理の尿サンプル中でのバクテリアの同定を行うことも可能となる。
【００６６】
＜分析手順＞：以上説明したように、本発明による方法は、培養バクテリアが収容された、例えば、瓶などの封止容器のヘッドスペースである上方にある気体中に存在する揮発性を有する代謝生成物／異化産物の分析に基づいている。その揮発性分子種は、ＳＨＳシステムを用いて採取されるか、又は、変法によれば、サンプルの何らの処理を要することなく、ＧＣ／ＭＳの手法による直接分析を可能とするＳＰＭＥを用いて採取される。
【００６７】
分析時間を劇的に減少させるには、ＳＨＳシステムの正確なパラメーター表現が行われ、高速度クロマトグラフ（Ｆａｓｔ ＧＣ）が使用される。ＳＰＭＥ／ＧＣ／ＭＳシステムのために、通常３０〜３５分間を要するクロマトグラフ分析時間が、７〜１０分間まで短縮された。
【００６８】
ブランクを得るために、培養液に関するサンプルが分析された第一ステップで、さらに、異なるマクファーランド値で、培地＋バクテリア株のサンプルが分析された。
【００６９】
全てのバクテリア株について固有なＧＣ／ＭＳプロットの分析によって、全ての単体のバクテリア（異化産物）の特徴的な分子種を同定することが可能となり、培養液（代謝生成物）に固有な、多数の種の中での相当な絞り込みを実現することが可能となる。
【００７０】
優先される溶液中では、精確なクロマトグラフ保持時間及び質量／負荷比率によって特徴づけられる、全ての単体のバクテリア（異化産物）に特徴的な種の検出が、「再構成イオンクロマトグラム」（ＲＩＣ）として知られている手法を用いて実行された。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
添付の図面は、限定されない例を示すものであり、いくつかの図表を示している：
【図１】図１は、バクテリア株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを含む液のＧＣ／ＭＳプロットと比較した液体増幅培地のＧＣ／ＭＳプロットを示すものである。
【図２】図２は、代謝栄養物の効果としての、栄養又は代謝ピークの減少を示す一連のＲＩＣプロットを示すものである。
【図３】図３は、異化作用の生産物としてのＡＴＣＣバクテリア株中に存在する特有な物質の異化ピークのプロットの例を示すものである。
【図４】図４は、異化作用の生産物としてのＡＴＣＣバクテリア株中に存在する特有な物質の異化ピークのプロットの例を示すものである。
【図５】図５は、異化作用の生産物としてのＡＴＣＣバクテリア株中に存在する特有な物質の異化ピークのプロットの例を示すものである。
【図６】図６は、異化作用の生産物としてのＡＴＣＣバクテリア株中に存在する特有な物質の異化ピークのプロットの例を示すものである。
【図７】図７は、ｍ／ｚ１０８（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに固有なもの）、ｍ／ｚ８８（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓに固有なもの）、ｍ／ｚ１６２（Ｅ．ｃｏｌｉに固有なもの）の種に関連するＲＩＣプロットを示すものである。
【図８】図８は、ｍ／ｚ１０８（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに固有なもの）、ｍ／ｚ８８（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓに固有なもの）、ｍ／ｚ１６２（Ｅ．ｃｏｌｉに固有なもの）の種に関連するＲＩＣプロットを示すものである。
【図９】図９は、ｍ／ｚ１０８（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに固有なもの）、ｍ／ｚ８８（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓに固有なもの）、ｍ／ｚ１６２（Ｅ．ｃｏｌｉに固有なもの）の種に関連するＲＩＣプロットを示すものである。
【図１０】図１０は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ及びＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの各バクテリア株にそれぞれ感染した未処理の尿について得られたプロットである。
【図１１】図１１は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ及びＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの各バクテリア株にそれぞれ感染した未処理の尿について得られたプロットである。
【図１２】図１２は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ及びＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの各バクテリア株にそれぞれ感染した未処理の尿について得られたプロットである。
【図１３】図１３は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ及びＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの各バクテリア株にそれぞれ感染した未処理の尿について得られたプロットである。
【図１４】図１４は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ及びＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの各バクテリア株にそれぞれ感染した未処理の尿について得られたプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
以下、例示として、増幅培地中で増幅（予め接種）されたバクテリア株の分析の例を何点か挙げることにする。そして、図面では、得られた分析結果について示す。
【００７３】
ＡＴＣＣ株からの公知のバクテリア株が、バクテリアの複製を作成しうるペプトンの混合物を含む液状の培養培地において再編成及び培養された。
【００７４】
増幅のレベルを知るために、マクファーランド比濁のレベルを測定することでバクテリアの増幅が検査された。
【００７５】
濁りを計測することで、多様な適正なマクファーランドレベルを分類することが可能であった。
【００７６】
一旦、培養液中でバクテリアの増幅の進行が検出されると、バクテリア株を含む培養液の一定量が、試験対象の各バクテリア種ごとに採取された。
【００７７】
ヘッドスペース中に存在する揮発成分がＳＨＳによって採取され、ＧＣ／ＭＳ測定器中に自動的に注入された。
【００７８】
図１の上方部位に、液体増幅培地から得られたＧＣ／ＭＳプロットが示されている。この液体増幅培地から放出された揮発性物質は、ＧＣ／ＭＳを用いて分析され、その結果として得られたプロットから、特有な物質の多様なピークが明示された。それは、「増幅培地グラフ」、「液プロット」（ＢＰ）、又は「ブランクプロット」と定義される。下方部位には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（１ マクファーランド）の存在下、同じ試料液のヘッドスペース中で採取された物質から得られたプロットを示している。
【００７９】
＜代謝ピークのグラフ＞
公知のＡＴＣＣバクテリア株が、液体増幅培地中に注入され（播かれ）、多様なマクファーランド値で、ヘッドスペース中に存在する揮発性物質がＧＣ／ＭＳ測定器に注入された。
【００８０】
存在するバクテリアによって、代謝された物質の特有なピークを有するクロマトグラフプロットが示された。それは即ち、栄養源としての液体増幅培地から取り去った物質である。
【００８１】
上記プロット中で示された栄養又は代謝ピークによって、「液プロット」（ＢＰ）から、それらの代謝栄養物の効果としてピークが小さくなり、液から取り去った物質の特異性が明確に示された。このポイントで、図２に示す比較プロットを参照することが必要である。図２では、グラフの上部が培地培養培地だけに関係するプロットを示す一方、その下部が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株の培地で播かれた場合でのプロットを示している。
【００８２】
それらのピークは、培養液のみの場合に関するグラフと比較して、「バクテリアのメタボロミックなグラフ」と定義することも、例えば９．５０分から１０．００分までの時間間隔に示されているように、培養液中でのみ検出可能な多様なピークの、消費、又はむしろ減少を示す「液プロット」と定義することもできる。
【００８３】
換言すれば、ＧＣ／ＭＳで測定することで、特有なピークによって、上記バクテリアの代謝が示され、そして、培養液のみと比較することで、液のみに対する、特有なピークの相対的な減少によって、バクテリアの餌である物質の検出をも可能となる。
【００８４】
栄養バクテリアの代謝生成物の分析が、各バクテリア種に特徴的であることが示され、特有なピークの検出によって、各バクテリア種に関する「代謝ライブラリ」を記述することが可能となる。
【００８５】
＜異化ピークのグラフ＞
同じ分析及び比較が、ＡＴＣＣバクテリア株についても行われ、それにより、図３−８のプロットに見られるように、それらの異化作用の生産物である、特有な物質の異化ピークが得られた。
【００８６】
以上と同様に、図には、質量／バクテリアの質量電荷比（ｍ／ｚ）（図３：ｍ／ｚ＝４５；図４：ｍ／ｚ＝６０；図５：ｍ／ｚ＝７０；図６：ｍ／ｚ＝１１２）の多様な値で、液のみ（上方部位）、及び、バクテリア株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が存在する液から得られたＧＣ／ＭＳプロットの進行状態が示されている。
【００８７】
このケースにおいてもまた、特有なピークの存在により、各バクテリア種に特有なバクテリアの異化産物の分析によって、各バクテリア種の「異化ライブラリ」を記述することが可能となった。
【００８８】
結論として、ＧＣ／ＭＳ測定器を使用することで、各バクテリア種について、「メタブロミックライブラリ」及び「カタブロミックライブラリ」の取得が可能となり、探索されるバクテリア種の同定に際して、比較用測定器として使用することができた。
【００８９】
本発明によれば、いずれせよ、２つのライブラリを個別に用いることをも可能となった。：例えば、それによればバクテリア株の明確な識別がなされ、かつ、未処理の尿又はペトリ皿から直接サンプルを採取することで使用できるので、「カタブロミックライブラリ」のみで、バクテリア種の同定が十分賄えるようになる。
【００９０】
この手法を有効にするために、例えば、３０の異なるバクテリア株が分析された。
【００９１】
特異的なグラフが得られたＧＣ／ＭＳで分析された各バクテリア種は、代謝ピーク及び異化ピークに関するプロットに特徴的である。
【００９２】
そのプロットによれば、上述したように、各バクテリア種に特有なライブラリを作成することが可能となる。
【００９３】
各バクテリア種に特有なピークの同定が終了し、分析時間が最終プロットに必要な時間まで減少され、特徴的なピークの検出が可能となった。このような方法で、ルーチンワークとなし得るほど短い分析時間が実現された。
【００９４】
以上から、本発明によれば、ＧＣ／ＭＳ計測ダイナミクスで、全ての独立した種の異化産物を参照するピークを有する特有なグラフを有し、それと同時に、培養液から取り除かれた物質を参照するピークを有する特有なグラフを有するバクテリア株のサンプルについて、各種の、及び、その異化作用のバクテリアの代謝の動的挙動によって、異なるバクテリア種の分析及び同定がどのようにして可能となったかが明らかである。
【００９５】
各バクテリア種に関するグラフプロットに、生産された代謝生成物と、増幅のためにバクテリアが予め播かれた培養液によって消費された物質との両方に特徴的なピークが含まれることが見出された。
【００９６】
消費された代謝生成物の検出と、生産された異化産物の検出との両方についての各バクテリア種のプロットは、各バクテリア種に特有なものである。そして、それにより、データに帰属されるべき相対的なグラフを分析すること、即ち、各バクテリア種のライブラリに含まれる参照データと比較すること、によって同定が可能となった。
【００９７】
「異化ライブラリ」を用いる独立したバクテリア種の動的分析を可能とするために、望ましいが、限定されない解決方法が、液体増幅培地を用いることである。
【００９８】
以上より、本発明は、ＧＣ／ＭＳ計測中でのその動的挙動において、バクテリア種が餌とする物質、即ち、バクテリアの代謝、その異化作用、及び、その特有な異化作用によって検出される物質のクロマトグラフを用いた比較及び検出を示すものである。
【００９９】
以上と同様な手法が、３０の異なるバクテリア株によって、感染した尿を含む液を分析するために用いられた。培養液のみが存在した場合に観察されたときと比較してやや異なるメタボロミック及びカタブロミックプロファイルが観察されたが、このケースにおいても、尿の存在下、バクテリアの異化作用に由来する分子種を同定することが可能であった。
【０１００】
それらの種には、各バクテリア株に特有なものが存在するため、尿を含む液中でのバクテリアの増幅に関するデータを含むライブラリを作成することが可能となる。このライブラリは、感染した尿サンプル中に存在する特有なバクテリア種を同定するために用いることができる。
【０１０１】
例えば、図７−図９は、非感染の尿を含む液サンプルから得られたものと比較して、ｍ／ｚ１０８（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに特有）、ｍ／ｚ８８（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓに特有）、ｍ／ｚ１６２（Ｅ．ｃｏｌｉに特有）を有する種に関連するＲＩＣプロットを示している。
【０１０２】
上記した方法の有効性が、培養培地が存在しない場合の未処理の尿サンプルでも試験された。
【０１０３】
得られた結果から、それら条件の下では、各バクテリア株に特有な揮発性を有する異化産物をもまた検出できることが示された。
【０１０４】
図１０−図１４には、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ及びＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのバクテリア株それぞれについて、感染した未処理の尿について得られたプロットの例が示されている。
【０１０５】
それらの図面において、特有なイオン種のＲＩＣダイヤグラム（再構成イオンクロマトグラム）が、非感染の尿のＲＩＣダイヤグラムと比較されている。
【０１０６】
ｍ／ｚ１１７と２４．９０分の保持時間とを有する種は、Ｅ．ｃｏｌｉにのみ存在しており、それに対して、ｍ／ｚ６０と８．０７分の保持時間とを有する種は、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓに特徴的であった。これと同様に、ｍ／ｚ６０及び７．８０分の保持時間を有するイオンと、ｍ／ｚ４２及び５．６０分の保持時間を有するイオンとは、それぞれ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＰ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓに特徴的であった。７．４５分の保持時間を有するＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓについて特定されたｍ／ｚ７９を有するイオンは、その他の株中にも存在しているが、保持時間が異なっており、そのため、それが異なる種によるものであることが示されている。
【０１０７】
本発明には、特許請求の範囲で規定されるような、属する分野及び範囲から離れない限り、変形及び種々の変更が可能である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプル中のバクテリア種を特定する方法であって、
前記方法は、培養培地又は液中における生体サンプルに播くことと、特有なバクテリア種のグラフプロットでの特徴を同定するために、前記生体サンプル中の代謝生成物及び異化産物などの揮発成分のガスクロマトグラフ質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）による分析を実行することと、を提供するものであり、
前記代謝生成物及び異化産物の揮発成分をバクテリア培養培地又は液の上方にある気体中で採取するステップと、
前記ガスクロマトグラフ質量分析法を、各バクテリア種についての代謝ピーク（ＭＰＰ）及び異化ピーク（ＣＰＰ）の存在を同定するためと、前記ピークを同定することで、同定される各バクテリア種に関連する、特有なメタボロミックプロファイル、及び、特有なメタボロミックプロファイルを構成するためとに使用するステップと、
生体サンプル中に存在するバクテリア種を、ＧＣ／ＭＳ分析によって得られる特有なプロットを、生体サンプルのない特有な培養培地に関連するプロットと比較することで同定するステップと、を有する、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
分析される生体サンプルが、閉塞及び封止された試験管又は瓶中に挿入され、その後、その揮発成分が、生体サンプル上の空間又は静的ヘッドスペース（ＳＨＳ）から採取され、ＧＣ／ＭＳ分析が行われる、ことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記代謝ピークを、バクテリア種がその複製のための栄養として消費した培養培地中に存在する物質を同定する前記ＧＣ／ＭＳプロットによって決定し、前記異化ピークを、前記バクテリア種によって生産された物質を同定するＧＣ／ＭＳプロットのピークによって決定する、ことを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記生体サンプルの前記代謝ピーク（ＭＰＰ）の同定と、前記生体サンプルの異化ピーク（ＣＰＰ）の同定とを、引き続くＧＣ／ＭＳ分析のためのバクテリアの力価の最適値を同定するために、マクファーランド比濁法の異なるレベルによって実行する、ことを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記未処理の生体サンプルが、未処理の尿である、ことを特徴とする請求項１ないし４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記生体サンプルが、ペトリ皿から採取されたコロニー由来の生体サンプルである、ことを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項７】
前記特有なバクテリア種を、感染した未処理の尿サンプルと、非感染の未処理の尿サンプルとからそれぞれ得られた各ＧＣ／ＭＳデータを比較することで同定する、ことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルを、固相ミクロ抽出（ＳＰＭＥ）手法によって、ヘッドスペース中で採取する、ことを特徴とする請求項１記載の方法。
【国際調査報告】
2016513259.tif 000017
2016513259.tif 000018
2016513259.tif 000019
2016513259.tif 000020