(57)【要約】本発明は、式Ｉの化合物：2016519140.tif 000024（式中、Ｒは、ＨまたはＦである）または薬学的に許容可能なその塩を提供する。
2016519140.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2016519140.tif 000018
の化合物
（式中、Ｒは、ＨまたはＦである）
または薬学的に許容可能なその塩。
【請求項２】
【化２】
2016519140.tif 000019
である、請求項１に記載の化合物または塩。
【請求項３】
【化３】
2016519140.tif 000020
である、請求項１または請求項２に記載の化合物または塩。
【請求項４】
４−［（１Ｓ）−１−［［（３Ｒ）−２−（２−フェノキシエチル）−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−３−カルボニル］アミノ］エチル］安息香酸：
【化４】
2016519140.tif 000021
である、請求項３に記載の化合物または薬学的に許容可能なその塩。
【請求項５】
４−［（１Ｓ）−１−［［（３Ｒ）−２−（２−フェノキシエチル）−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−３−カルボニル］アミノ］エチル］安息香酸：
【化５】
2016519140.tif 000022
である、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
４−［（１Ｓ）−１−［［（３Ｒ）−２−（２−（４−フルオロフェノキシ）エチル）−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−３−カルボニル］アミノ］エチル］安息香酸：
【化６】
2016519140.tif 000023
である、請求項３に記載の化合物または薬学的に許容可能なその塩。
【請求項７】
有効量の請求項１に記載の化合物、または薬学的に許容可能なその塩を、こうした治療を必要とする患者に投与するステップを含む、患者における変形性関節炎を治療する方法。
【請求項８】
有効量の請求項１に記載の化合物、または薬学的に許容可能なその塩を、こうした治療を必要とする患者に投与するステップを含む、患者におけるリウマチ性関節炎を治療する方法。
【請求項９】
有効量の請求項１に記載の化合物、または薬学的に許容可能なその塩を、こうした治療を必要とする患者に投与するステップを含む、患者における変形性関節炎またはリウマチ性関節炎と関連した痛みを治療する方法。
【請求項１０】
療法において使用するための請求項１から６のいずれか一項に記載の化合物または薬学的に許容可能なその塩。
【請求項１１】
変形性関節炎の治療において使用するための請求項１から６のいずれか一項に記載の化合物または薬学的に許容可能なその塩。
【請求項１２】
リウマチ性関節炎の治療において使用するための請求項１から６のいずれか一項に記載の化合物または薬学的に許容可能なその塩。
【請求項１３】
変形性関節炎またはリウマチ性関節炎と関連した痛みの治療において使用するための請求項１から６のいずれか一項に記載の化合物または薬学的に許容可能なその塩。
【請求項１４】
１種または複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と共に請求項１から６のいずれか一項に記載の化合物または薬学的に許容可能なその塩を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のフェノキシエチルジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン化合物、化合物を含む医薬組成物、生理学的障害を治療するために化合物を用いる方法、および化合物の合成において有用な中間体およびプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、変形性関節炎およびリウマチ性関節炎を含めた、関節炎など、ならびにこれらの状態と関連した痛みをさらに含めた、炎症状態の治療の分野に属する。関節炎は、米国単独でも数百万の人々を冒しかつ身体障害の主要原因である。加えて、関節炎は、コンパニオン動物における身体障害の重大な原因と認識されている。治療は、患者において厄介な心血管性のおよび／または胃腸性の副作用を生じ得る、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド性抗炎症薬）またはＣＯＸ−２阻害剤をしばしば含む。したがって、ある種の患者は、ＮＳＡＩＤまたはＣＯＸ−２阻害剤を用いることから除外され得る。したがって、好ましくは現在の治療の副作用が無い、変形性関節炎およびリウマチ性関節炎の別の治療の必要性がある。
【０００３】
次のように４種のプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）受容体サブタイプが特定されている：ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３およびＥＰ４。ＥＰ４は、リウマチ性関節炎および変形性関節炎の齧歯類モデルにおける関節炎症性の痛みに関与する一次受容体であることが開示されている。したがって、選択的ＥＰ４アンタゴニストは、関節炎の痛みを含めた、関節炎を治療することにおいて有用で有り得る。加えて、ＥＰ４拮抗作用はプロスタノイド、例えばＰＧＩ２およびＴｘＡ２の生合成に干渉しないので、選択的ＥＰ４アンタゴニストは、ＮＳＡＩＤおよびＣＯＸ−２阻害剤で見られる潜在的な心血管性副作用を持たない可能性があることが示唆されている。
【０００４】
特許文献１は、ＥＰ４受容体アンタゴニストとして環状アミン誘導体を開示している。特許文献２は、鎮痛作用を有するＥＰ４受容体選択的アンタゴニストであるある種のオルト置換されたアリールおよびヘテロアリールアミド化合物を開示している。加えて、特許文献３は、ＩＬ−２３介在性疾患を治療することにおいて有用である選択的ＥＰ４アンタゴニストであるある種の化合物を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１３／００４２９０号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／０２５０８１８号
【特許文献３】国際公開第２０１１／１０２１４９号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＥＰ１、ＥＰ２、およびＥＰ３と比較してＥＰ４の選択的阻害剤である、ある種の新規の化合物を提供する。加えて、本発明は、従来のＮＳＡＩＤと比較すると減少した心血管性または胃腸性の副作用の可能性を有するある種の新規の化合物を提供する。
【０００７】
したがって、本発明は、式Ｉの化合物：
【化１】
2016519140.tif 000003
（式中、Ｒは、ＨまたはＦである）
または薬学的に許容可能なその塩を提供する。
【０００８】
本発明は、こうした治療を必要とする患者に有効量の式Ｉの化合物、または薬学的に許容可能なその塩を投与することを含む、患者における関節炎を治療する方法も提供する。本発明は、こうした治療を必要とする患者に有効量の式Ｉの化合物、または薬学的に許容可能なその塩を投与することを含む、患者における変形性関節炎を治療する方法をさらに提供する。加えて、本発明は、こうした治療を必要とする患者に有効量の式Ｉの化合物、または薬学的に許容可能なその塩を投与することを含む、患者におけるリウマチ性関節炎を治療する方法を提供する。本発明は、こうした治療を必要とする患者に有効量の式Ｉの化合物、または薬学的に許容可能なその塩を投与することを含む、患者における関節炎と関連した痛みを治療する方法も提供する。本発明は、こうした治療を必要とする患者に有効量の式Ｉの化合物、または薬学的に許容可能なその塩を投与することを含む、患者における変形性関節炎またはリウマチ性関節炎と関連した痛みを治療する方法をさらに提供する。
【０００９】
さらには、本発明は、療法において使用するための、具体的には変形性関節炎の治療のための式Ｉの化合物または薬学的に許容可能なその塩を提供する。加えて、本発明は、リウマチ性関節炎の治療において使用するための式Ｉの化合物または薬学的に許容可能なその塩を提供する。本発明は、変形性関節炎またはリウマチ性関節炎と関連した痛みの治療において使用するための式Ｉの化合物、または薬学的に許容可能なその塩も提供する。さらには、本発明は、変形性関節炎の治療のための薬物の製造のための、式Ｉの化合物、または薬学的に許容可能なその塩の使用を提供する。本発明は、リウマチ性関節炎の治療のための薬物の製造のための、式Ｉの化合物、または薬学的に許容可能なその塩の使用を提供する。本発明は、変形性関節炎またはリウマチ性関節炎と関連した痛みの治療のための薬物の製造のための、式Ｉの化合物、または薬学的に許容可能なその塩の使用も提供する。
【００１０】
本発明は、１種または複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と共に、式Ｉの化合物、または薬学的に許容可能なその塩を含む医薬組成物をさらに提供する。特定の実施形態において、組成物は、１種または複数の他の療法剤をさらに含む。本発明は、式Ｉの化合物、または薬学的に許容可能なその塩を含む関節炎を治療するための医薬組成物も提供する。本発明は、式Ｉの化合物、または薬学的に許容可能なその塩の合成のための新規の中間体およびプロセスも包含する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書で使用する場合、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療するため（ｔｏ  ｔｒｅａｔ）」という語には、現在の症状または障害の進行または重症度を抑制する、遅らせる、停止する、または後退させることが含まれる。
【００１２】
本明細書で使用する場合、「患者」と言う語は、ヒト、コンパニオン動物、例えばネコまたはイヌ、あるいは家畜動物、例えばウマ、ウシ、またはブタを含めた哺乳動物を指す。ヒトおよびコンパニオン動物は、好ましい患者である。
【００１３】
本明細書で使用する場合、「有効量」と言う語は、患者への単回または多回投与で、診断または治療の下で患者における所望の効果を提供する本発明の化合物、または薬学的に許容可能なその塩の量または用量を指す。
【００１４】
有効量は、既知の技術を用いることによっておよび類似の状況下で取得された結果を観察することによって、当業者としての、担当診断医によって容易に決定され得る。患者のための有効量を決定することにおいて、これに限らないが、哺乳動物の種；そのサイズ、年齢、および全体的な健康；関与する特有の疾患または障害；疾患または障害の関与または重症度の程度；個別の患者の反応；投与された特定の化合物；投与方法；投与された調製物の生物学的利用能特性；選択された用法；併用薬の使用；および他の関連した状況を含めた、いくつかの要因が担当診断医によって考慮される。
【００１５】
本発明の化合物は、一般には幅広い投薬量範囲にわたって有効である。例えば、一日当たりの投薬量は、通常は体重の約０．０１から約５０ｍｇ／ｋｇの範囲内に入る。ある場合には前述の範囲の下限を下回る投薬量レベルが、十分よりも多い場合がある一方で、他の場合にはさらにより多い用量が許容可能な副作用を伴って採用される場合があり、したがって上記の投薬量範囲は、いかなる方法でも本発明の範囲を限定することは意図されない。
【００１６】
本発明の化合物は、好ましくは化合物を生物が利用可能にする任意の経路によって投与される医薬組成物として配合される。最も好ましくは、こうした組成物は、経口投与用である。こうした医薬組成物およびそれらを調製するためのプロセスは、当技術分野においてよく知られている。（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｄ．Ｂ．Ｔｒｏｙ、編集者、第２１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００６年を参照されたい。）
【００１７】
本発明の（ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｏｎ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）化合物は、本発明の治療方法において特に有用であるが、ある種の基、置換基、および構成は好ましい。以下の段落は、こうした好ましい基、置換基、および構成を記述する。これらの選択は、治療方法および新しい本発明の化合物のどちらにも当てはまることが理解されるであろう。
【００１８】
式Ｉの化合物ａ：
【化２】
2016519140.tif 000004
または薬学的に許容可能なその塩は、好ましい。
【００１９】
加えて、式Ｉｂの化合物：
【化３】
2016519140.tif 000005
または薬学的に許容可能なその塩は、好ましい。
【００２０】
特に好ましい化合物は、４−［（１Ｓ）−１−［［（３Ｒ）−２−（２−フェノキシエチル）−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−３−カルボニル］アミノ］エチル］安息香酸：
【化４】
2016519140.tif 000006
または薬学的に許容可能なその塩である。
【００２１】
４−［（１Ｓ）−１−［［（３Ｒ）−２−（２−フェノキシエチル）−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−３−カルボニル］アミノ］エチル］安息香酸は、最も好ましい。
【００２２】
ある種の立体化学中心は、不特定のまま残されておりかつ以下の方式においては明確性の目的である種の置換基が排除されかついかなる方法でも方式の教示を限定することは意図されない。さらには、個々の異性体、鏡像異性体、またはジアステレオ異性体は、当業者により式Ｉの化合物の合成において選択的結晶化技術、またはキラルクロマトグラフィーなどの方法によって任意の都合のよい点で分離または分解されてもよい（例えば、Ｊ．Ｊａｃｑｕｅｓら、「Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ，ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９８１年、ならびにＥ．Ｌ．ＥｌｉｅｌおよびＳ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ、「Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９９４年を参照されたい）。あるいは、適したかつ容易に利用可能なキラルの出発原料は、当業者によって理解されるようにも利用してよい。加えて、以下の方式に記載されている中間体は、窒素保護基を含有する。保護および脱保護状態は、当業者に良く知られておりかつ文献に記載されている（例えば「Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第４版、Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｍ．ＷｕｔｓおよびＴｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ著、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．２００７年を参照されたい）。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「ｋＰａｇ」はキロパスカルゲージを指し、「Ｐｇ」は適した保護基を指し、「ＤＭＥＭ」はダルベッコ変法イーグル培地を指し、「Ｂｏｃ」はｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル保護基を指し、「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指し、「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを指し、「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルを指し、「Ｅｔ２Ｏ」はジエチルエーテルを指し、「ＴＢＭＥ」はｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを指し、「ＢＯＰ」はベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファートを指し、「ＰＧＥ２」はプロスタグランジンＥ２を指し、「ＦＢＳ」はウシ胎児血清を指し、「ＩＢＭＸ」は（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）を指し、「ＭＥＳ」は（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸を指し、「ＨＥＰＥＳ」は（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸）を指し、「ＨＴＲＦ」は均一時間分解蛍光法を指し、「ＨＥＫ」はヒト胎児由来腎臓を指し、「ＨＢＳＳ」はハンクス平衡塩類溶液を指し、「ＥＣ８０」はその薬剤について可能な最大効力の８０％を生じる薬剤の濃度を指し、および「ＩＣ５０」はその薬剤について可能な最大阻害反応の５０％を生じる薬剤の濃度を指す。
【００２４】
本発明の化合物、または薬学的に許容可能なその塩は、その一部が下記の方式、調製、および実施例において例示される、当技術分野において既知の種々の手順によって調製され得る。記載された経路のそれぞれのための特有の合成ステップは、式Ｉの化合物、または薬学的に許容可能なその塩を調製するために、異なる方法において、または異なる方式からのステップと併用して組み合わせてよい。下記の方式におけるそれぞれのステップの生成物は、抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィー、ろ過、粉砕、および結晶化を含めた、従来型の方法によって回収してよい。試薬および出発原料は、当業者にとって容易に入手可能である。全ての置換基は、別段の指定がない限り、前に定義した通りである。これらの方式、調製、および実施例は、いかなる方法でも本発明の範囲を限定することは意図されないことが理解される。
【化５】
2016519140.tif 000007
【００２５】
方式１、ステップＡにおいて、Ｐｇが適した窒素保護基、例えばｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル保護基（ＢＯＣ））である、保護された３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−３−カルボン酸は、標準条件下で４−（１−アミノエチル）安息香酸メチルと結合して構造（１）の保護されたイソキノリンアミドを提供する。例えば、保護された３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−３−カルボン酸は、適した有機溶媒、例えばジクロロメタンに溶解され、約０℃に冷却されて、約１．１当量の適した有機塩基、例えばトリエチルアミンで処理される。次いで約１．１当量のクロロギ酸イソブチルが、撹拌しながら滴下して加えられる。混合物を、０℃で約２０分間撹拌し、その後約１．１当量の４−（１−アミノエチル）安息香酸メチルを追加してよい。反応混合物は、次いで室温で約１時間撹拌される。次いで保護されたイソキノリンアミド（１）が、当技術分野においてよく知られている方法、例えば抽出技術を用いて単離される。例えば、水が混合物に加えられ、層が分離されて有機相が硫酸水素カリウム水溶液、その後炭酸水素ナトリウム水溶液で洗われる。有機相は、次いで無水硫酸マグネシウム上で乾燥され、ろ過され減圧下で濃縮されて保護されたイソキノリンアミド（１）を提供する。
【化６】
2016519140.tif 000008
【００２６】
方式２、ステップＡにおいて、保護されたイソキノリンアミド（１）は、当技術分野においてよく知られている条件下で脱保護されて脱保護されたイソキノリンアミド（２）を提供する。例えば、約１０当量の塩化アセチルが、約０℃の適した有機溶媒、例えば酢酸エチルに溶解した約１１当量のエタノールに滴下で加えられる。混合物は、約３０分間撹拌され、室温に温められ次いで約１当量の保護されたイソキノリンアミド（１）の酢酸エチル溶液が反応混合物に撹拌しながら加えられる。反応混合物は、次いで約４０℃で約１２時間撹拌される。これは次いで室温に冷却されて当技術分野においてよく知られている技術を用いて脱保護されたイソキノリンが単離される。例えば、固体は、ろ過によって収集して減圧下で乾燥される。水が固体に加えられてその後混合物のｐＨが約１０に達するまで３２％アンモニア水が追加される。再びろ過によって固体が収集され減圧下で約４５℃で乾燥されて脱保護されたイソキノリンアミド（２）を与える。
【００２７】
あるいは、方式２、ステップＡにおいて、保護されたイソキノリンアミド（１）を、脱保護されたイソキノリンアミド（２）のＨＣｌ塩を提供するために当技術分野においてよく知られている条件下で脱保護してよい。例えば、保護されたイソキノリンアミド（１）は、１，４−ジオキサンにおける塩化水素の４Ｍ溶液に溶解される。反応は室温で約（ａｂｏｕｒ）１２時間撹拌される。次いで脱保護されたイソキノリンアミド（２）のＨＣｌ塩が、減圧下で反応混合物を濃縮することによって単離される。
【００２８】
方式２、ステップＢにおいて、保護されたイソキノリンアミド（２）は、適切に置換されたフェノキシ化合物と結合してフェノキシエチルイソキノリン（３）を提供する。例えば、シリカゲルは、約２２℃で適した有機溶媒、例えばジクロロメタンと混ぜ合わせられて、約２当量の過ヨウ素酸ナトリウムの水溶液が、撹拌しているシリカゲル混合物に滴下で加えられる。混合物は、約３０分間撹拌し、約１．５当量の３−フェノキシ−１，２−プロパンジオールが加えられる。混合物は、さらに約３０分間撹拌し、次いでろ過して固体が除去され、層が分離され、有機層が硫酸マグネシウム上で乾燥される。有機層は、再びろ過されて約１当量の脱保護されたイソキノリンアミド（２）に続いて約２当量の適した還元剤、例えばトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムが分割して加えられる。反応混合物は、次いで約１時間撹拌してよくその後過剰水が追加される。３２％アンモニアの水溶液が、水層のｐＨが約１０に達するまで混合物に加えられる。
【００２９】
フェノキシエチルイソキノリン（３）が、次いで当技術分野においてよく知られている技術によって単離および精製される。例えば、反応混合物の層は分離され、有機層は硫酸マグネシウム上で乾燥され、ろ過されて、減圧下で濃縮される。粗製油は、適した有機溶媒、例えばＴＢＭＥに溶解され、水、その後１Ｍ  ＨＣｌ水溶液が加えられる。得られる懸濁液は、約３０分間撹拌され次いで減圧下で濃縮されて有機溶媒が除去される。沈殿物は、次いでろ過によって収集されて水およびＴＢＭＥの混合物に加えられる。混合物は、約１０に達する水層のｐＨ下で３２％アンモニア水で処理され、層は分離され、有機層は飽和塩化ナトリウム水溶液で洗われ、硫酸マグネシウム上で乾燥され、ろ過されて、減圧下で濃縮される。得られる粗製材料は、適した溶離剤、例えば酢酸エチル／ヘキサンを用いてシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーにより精製されて精製フェノキシエチルイソキノリン（３）を提供する。
【００３０】
あるいは、方式２、ステップＢにおいて、脱保護されたイソキノリンアミド（２）のＨＣｌ塩を、フェノキシエチルイソキノリン（３）を与えるために適切に置換されたフェノキシ化合物と結合してよい。例えば、約１．５当量の２−フェノキシアセトアルデヒド、例えば２（４−フルオロフェノキシ）アセトアルデヒドは、適した有機溶媒、例えば１，２−ジクロロエタン中の約１当量の脱保護されたイソキノリンアミド（２）のＨＣｌ塩と混ぜ合わせられる。この混合物に約１．４当量の適した還元剤、例えばトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムが加えられて反応混合物が室温で約１２時間撹拌される。反応混合物に次いで飽和炭酸水素ナトリウム水溶液が加えられて当技術分野においてよく知られている技術によってフェノキシエチルイソキノリン（３）が単離および精製される。例えば、反応混合物は、適した有機溶媒、例えば酢酸エチルで抽出され、有機抽出物は、混ぜ合わせられ、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗われ、硫酸マグネシウム上で乾燥され、ろ過されて、減圧下で濃縮される。粗製材料は、次いで適した溶離剤、例えば酢酸エチル／ヘキサンを用いてシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーにより精製されて精製フェノキシエチルイソキノリン（３）を提供する。
【化７】
2016519140.tif 000009
【００３１】
方式３、ステップＡにおいて、フェノキシエチルイソキノリン（３）は、当技術分野においてよく知られている条件下で加水分解されて式Ｉの化合物を与える。例えば、フェノキシエチルイソキノリン（３）は、適した有機溶媒、例えばＴＨＦ、またはメタノール／ＴＨＦの混合物に溶解されて、次いで約２から４当量の適した塩基水溶液、例えば水酸化ナトリウム水溶液で処理される。反応は、次いで約２０℃から約４０℃の温度で約１２時間撹拌される。式Ｉの化合物は、次いで当技術分野においてよく知られている条件下で単離および精製される。例えば、反応混合物は、有機溶媒を除去するために減圧下で濃縮される。水が加えられて水層は適した有機溶媒、例えばＴＢＭＥで洗われる。水層は、次いで約５℃に冷却されてｐＨが約２に達するまで、撹拌と共に、適した酸性水溶液、例えば塩酸で処理される。反応は、次いで室温に温められてろ過によって固体が回収される。固体は、次いで水に加えられ、約８０℃に約１時間加熱され、室温に冷却され、ろ過によって回収されて、約４５℃で約（ａｂｏｕｒ）１２時間減圧下で乾燥される。乾燥した固体は、次いで適した有機溶媒、例えば酢酸イソプロピルに加えられて約５時間撹拌される。固体はろ過によって回収され減圧下で乾燥されて精製された式Ｉの化合物を提供する。
【００３２】
薬学的に許容可能な塩およびそれらを調製するための一般的な方法は、当技術分野においてよく知られている。例えば、Ｇｏｕｌｄ，  Ｐ．Ｌ．、「Ｓａｌｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｂａｓｉｃ  ｄｒｕｇｓ」、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、３３：２０１〜２１７（１９８６年）；Ｂａｓｔｉｎ，Ｒ．Ｊ．ら「Ｓａｌｔ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｎｅｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｔｉｔｉｅｓ」、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、４：４２７〜４３５（２０００年）；およびＢｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、６６：１〜１９、（１９７７年）を参照されたい。本発明の化合物は、当業者によく知られた技術および条件を用いて薬学的に許容可能な塩に変換してもよくかつ薬学的に許容可能な塩として単離してもよいことを、合成の当業者なら理解するであろう。
【実施例】
【００３３】
調製および実施例
以下の調製および実施例は、本発明をさらに例示する。それとは反対の注記がない限り、本明細書に例示される化合物は、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｄｒａｗ（ＩＵＰＡＣ名）を用いて命名および番号付けされる。
【００３４】
調製１
（３Ｒ）−３−［［（１Ｓ）−１−（４−メトキシカルボニルフェニル）エチル］カルバモイル］−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−２−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成。
【化８】
2016519140.tif 000010
【００３５】
方式１、ステップＡ：（３Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−３−カルボン酸（４０．０ｇ、１４１．４ｍｍｏｌ）とジクロロメタン（７８４ｍＬ）との０℃の混合物に、トリエチルアミン（２１．７ｍＬ、１５５．５ｍｍｏｌ）を加える。次いで滴下の方法でクロロギ酸イソブチル（２０．３ｍＬ、１５５．５ｍｍｏｌ）を加える。追加の終わりの後に、混合物を０℃で２０分間撹拌する。次いで、（Ｓ）−４−（１−アミノエチル）安息香酸メチル（２７．９ｇ、１５５．５ｍｍｏｌ）を加えて、混合物を室温で１時間撹拌する。水（４００ｍＬ）を加え、層を分離させて、有機層を１Ｍ  ＫＨＳＯ４水溶液（５００ｍＬ）、続いて飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５００ｍＬ）で洗う。有機相をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過して固体を除去し、ろ液を減圧下で濃縮して標記化合物を白色固体（６０ｇ、収率９７％）として与える。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：３３９（［Ｍ＋Ｈ−Ｂｏｃ］＋）、３８３（［Ｍ＋Ｈ−ｔ−Ｂｕ］＋）、４３９（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
調製２
【００３６】
４−［（１Ｓ）−１−［［（３Ｒ）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボニル］アミノ］エチル］安息香酸メチルの合成。
【化９】
2016519140.tif 000011
【００３７】
方式２、ステップＡ：酢酸エチル（２１４ｍＬ）とエタノール（８７．６ｍＬ、１．５１ｍｏｌ）との混合物を０℃に冷却し、次いで塩化アセチル（９７．４ｍＬ、１．３７ｍｏｌ）を滴下の方法で加える。混合物を３０分間撹拌しながら室温に温まらせる。（３Ｒ）−３−［［（１Ｓ）−１−（４−メトキシカルボニルフェニル）エチル］カルバモイル］−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−２−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（６０ｇ、１３７ｍｍｏｌ）の酢酸エチル（４８０ｍＬ）溶液を加え、次いで得られる混合物を４０℃で一晩撹拌する。混合物を室温に冷却し、次いでろ過によって得られる沈殿物を単離して、減圧下で乾燥させる。水（３００ｍＬ）を固体に加え、次いで混合物のｐＨが１０に達するまで３２％アンモニア水溶液を加える。ろ過によって懸濁した固体を単離し、次いでそれらを真空オーブン内で４５℃で一晩乾燥させて標記化合物を白色固体（４４ｇ、収率９５％）として与える。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：３３９（［Ｍ＋Ｈ］＋）、６７７（［２Ｍ＋Ｈ］＋）、６９９（［２Ｍ＋Ｎａ］＋）。
【００３８】
調製３
４−［（１Ｓ）−１−［［（３Ｒ）−２−（２−フェノキシエチル）−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−３−カルボニル］アミノ］エチル］安息香酸メチルの合成。
【化１０】
2016519140.tif 000012
【００３９】
方式２、ステップＢ：２２℃の撹拌しているシリカゲル（２００ｇ、３．３３ｍｏｌ）とジクロロメタン（１１００ｍＬ）との混合物へ、過ヨウ素酸ナトリウム（５６．２ｇ、２６０ｍｍｏｌ）の水（３５２ｍＬ）溶液を滴下の方法で加える。追加の終わりの後に、混合物をさらに３０分間撹拌し、次いで３−フェノキシル−１，２−プロパンジオール（３４．５ｇ、１９５ｍｍｏｌ）を加え、わずかな発熱が生じる。混合物をさらに３０分間撹拌し、次いでろ過して固体を除去し、水層を破棄し、有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過して固体を除去し、ろ液を４−［（１Ｓ）−１−［［（３Ｒ）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボニル］アミノ］エチル］安息香酸メチル（４４ｇ、１３０ｍｍｏｌ）で処理する。次いで、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（５７．４ｇ、２６０ｍｍｏｌ）を少量に分割して加える。追加の完了後、混合物をさらに１時間撹拌し、次いで水（２００ｍＬ）を加える。３２％アンモニア水溶液を、水層のｐＨが１０に達するまで加える。層を分離して、有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過して固体を除去し、ろ液を減圧下で濃縮する。得られる粗製油をＴＢＭＥ（３００ｍＬ）に溶解させ、次いで水（２５０ｍＬ）および１Ｍ塩酸水溶液（２００ｍＬ）を加える。得られる懸濁液を３０分間撹拌し、減圧下で濃縮してＴＢＭＥを除去し、得られる白色沈殿物をろ過によって単離する。この沈殿物を、撹拌している水（４００ｍＬ）とＴＢＭＥ（４００ｍＬ）との混合物に注ぎいれ、水層のｐＨが１０に達するまで３２％アンモニア水溶液を加える。水層を除去し、有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液（２００ｍＬ）で洗う。有機層を単離して、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過して固体を除去し、減圧下で濃縮する。得られる粗製材料を、３０％から７０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配を用いてシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーにかける。生成物を含有する画分を一つにまとめ、それらを減圧下で濃縮して標記化合物を白色固体（４４ｇ、収率７４％）として与える。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：４５９（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
【００４０】
調製４
４−［（１Ｓ）−１−［［（３Ｒ）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボニル］アミノ］エチル］安息香酸メチル塩酸塩の合成。
【化１１】
2016519140.tif 000013
【００４１】
方式２、ステップＡ：（３Ｒ）−３−［［（１Ｓ）−１−（４−メトキシカルボニルフェニル）エチル］カルバモイル］−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−２−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（５．５ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）を、４Ｍの塩化水素の１，４−ジオキサン溶液（３０ｍＬ、１２０ｍｍｏｌ）に溶解する。混合物を室温で一晩撹拌し、次いで混合物を減圧下で濃縮して標記化合物を白色固体（４．７０ｇ、収率１００％）として与える。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：３３９（［Ｍ＋Ｈ］＋）、６７７（［２Ｍ＋Ｈ］＋）、６９９（［２Ｍ＋Ｎａ］＋）。
【００４２】
調製５
４−［（１Ｓ）−１−［［（３Ｒ）−２−（２−（４−フルオロフェノキシ）エチル）−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−３−カルボニル］アミノ］エチル］安息香酸メチルの合成。
【化１２】
2016519140.tif 000014
【００４３】
方式２、ステップＢ：１，２−ジクロロエタン（１０．７ｍＬ）中の４−［（１Ｓ）−１−［［（３Ｒ）−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボニル］アミノ］エチル］安息香酸メチル塩酸塩（８００ｍｇ、２．１３ｍｍｏｌ）と２−（４−フルオロフェノキシ）アセトアルデヒド（４９３ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ）との混合物に、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（６３３ｍｇ、２．９９ｍｍｏｌ）を加えて混合物を室温で一晩撹拌する。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２５ｍＬ）を加え、水層を酢酸エチル（２×２５ｍＬ）で抽出する。混ぜ合わせた有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液（２５ｍＬ）で洗い、有機相をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過して、ろ液を減圧下で濃縮する。得られる粗製材料を、０％から６０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配を用いてシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーにかける。生成物を含有する画分を一つにまとめ、それらを減圧下で濃縮して標記化合物を無色泡沫（５５０ｍｇ、収率５４％）として与える。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：４７７（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
【００４４】
実施例１
４−［（１Ｓ）−１−［［（３Ｒ）−２−（２−フェノキシエチル）−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−３−カルボニル］アミノ］エチル］安息香酸の合成。
【化１３】
2016519140.tif 000015
【００４５】
方式３、ステップＡ：４−［（１Ｓ）−１−［［（３Ｒ）−２−（２−フェノキシエチル）−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−３−カルボニル］アミノ］エチル］安息香酸メチル（４１．５ｇ、９０．５ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（２９１ｍＬ）、および２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１８１ｍＬ、３６０ｍｍｏｌ）の混合物を４０℃で一晩撹拌する。減圧下で濃縮してＴＨＦを除去する。水（２００ｍＬ）を加え、次いで水層をＴＢＭＥ（２×２００ｍＬ）で洗う。水層を５℃に冷却して濃塩酸水溶液を（ｐＨ試験紙分析によって評価されるような）ｐＨが２に達するまで撹拌しながら加える。撹拌しながら、３０分間かけて混合物を室温まで温まらせ、次いで固体をろ過によって単離する。固体を水（５００ｍＬ）に加えて８０℃に１時間加熱する。混合物を室温に冷却し、固体をろ過によって単離し、真空オーブン内で４５℃で一晩固体を乾燥させる。固体を酢酸イソプロピル（３００ｍＬ）に加え勢いよく５時間撹拌する。固体をろ過によって単離して、減圧下で固体を乾燥させて標記化合物を白色固体（２６ｇ、収率６０％）として与える。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：４４５（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
【００４６】
実施例２
４−［（１Ｓ）−１−［［（３Ｒ）−２−（２−（４−フルオロフェノキシ）エチル）−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−３−カルボニル］アミノ］エチル］安息香酸塩酸塩の合成。
【化１４】
2016519140.tif 000016
【００４７】
方式３、ステップＡ：４−［（１Ｓ）−１−［［（３Ｒ）−２−（２−（４−フルオロフェノキシ）エチル）−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−３−カルボニル］アミノ］エチル］安息香酸メチル（５５０ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）を、メタノール（１０ｍＬ）とテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）との混合物に溶解させる。水酸化ナトリウムの５Ｎ水溶液（０．４６２ｍＬ、２．３１ｍｍｏｌ）を加え、次いで混合物を室温で一晩撹拌する。混合物を減圧下で濃縮して白色固体を与える。４Ｍの塩化水素の１，４−ジオキサン溶液（１０ｍＬ、４０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で１０分間撹拌する。懸濁した固体をろ過によって除去し、固体をＴＨＦ（５ｍＬ）ですすぐ。混ぜ合わせたろ液を減圧下で濃縮して白色固体を与える。熱ジエチルエーテル（１０ｍＬ）中で材料を粉砕し、ろ過して標記化合物を白色固体（５３５ｍｇ、収率９３％）として与える。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：４６３（［Ｍ＋Ｈ］＋）、４８５（［Ｍ＋Ｎａ］＋）。
【００４８】
Ｉｎ  ＶｉｔｒｏでのヒトＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３およびＥＰ４への結合
ｈＥＰ１およびｈＥＰ４膜を、ヒトＥＰ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ２７５４７０）またはＥＰ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ４２９１０９）受容体を安定発現する組み換えＨＥＫ２９３細胞から調製する。ｈＥＰ２およびｈＥＰ３膜を、ＥＰ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ２７５４７１）またはＥＰ３（ｉｓｏｆｏｒｍ  ＶＩ：Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ４２９１０８）受容体プラスミドで一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から調製する。凍結細胞ペレットを、テフロン（登録商標）／ガラスホモジナイザーを用いて均質化緩衝液中で均質化する。膜タンパク質を分取してドライアイス上で急速凍結し、その後−８０℃で貯蔵する。均質化緩衝液（例えば、Ｍａｕｂａｃｋ，Ｋ．Ａ．、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１５６：３１６〜３２７（２００９年）を参照）は、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２５０ｍＭスクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３ｍＭインドメタシンに加えてＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（カタログ番号１  ６９７  ４９８）から得られるＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）を、ＥＤＴＡと共に含有した。
【００４９】
それぞれの受容体に結合している［３Ｈ］−ＰＧＥ２のＫｄ値を、飽和結合の調査または相同性競争（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）によって決定する。化合物を、３倍希釈系列を用いて９６−ウェル構成において試験し、１０点曲線を生成する。希釈した化合物を、０．３から０．５ｎＭ［３Ｈ］−ＰＧＥ２（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、１１８から１８０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下で２０μｇ／ウェルのＥＰ１、１０μｇ／ウェルのＥＰ２、１ｕｇ／ウェルのＥＰ３または１０から２０μｇ／ウェルのＥＰ４膜で２５℃で９０分間インキュベーションする。結合反応は、０．５ｍＬポリスチレン９６−ウェルのディープウェルプレートを用いて２００μＬのＭＥＳ緩衝液（ＫＯＨ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．０）中で実行する。非特異的結合を、２μＭのＰＧＥ２有りおよび無しにおける結合と比較することにより計算する。膜を、ろ過（ＴｏｍＴｅｋ収獲機）によって採取し、冷緩衝液（ＫＯＨ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む１０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．０）で４回洗い、６０℃の炉で乾燥し、放射能をＴｏｐＣｏｕｎｔ（登録商標）検出器を用いてカウント毎分（ＣＰＭ）として定量化する。特異的な結合の百分率を、２μＭのＰＧＥ２の存在下での非特異的な結合に対して補正された、いかなる阻害剤も無い結合の百分率として計算する。データを、ｙ＝（Ａ＋（（Ｂ−Ａ）／（１＋（（Ｃ／ｘ）＾Ｄ）））））（式中、ｙ＝特異的阻害％、Ａ＝曲線の底、Ｂ＝曲線の頂点、Ｃ＝相対ＩＣ５０＝頂点から底までのデータの範囲に基づいて５０％阻害を生じる濃度、Ｄ＝ヒル勾配＝曲線の勾配である）で示される４パラメータ非線形ロジスティック方程式（ＡＢａｓｅ  Ｅｑｕａｔｉｏｎ  ２０５）を用いて分析する。Ｋｉ換算はＩＣ５０値から（Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋［Ｌ］／Ｋｄ）（式中、［Ｌ］はリガンド濃度である）である。
【表１】
2016519140.tif 000017
【００５０】
化合物を、本質的に上述の通りの手順に従って試験する。表１におけるデータは、実施例１および実施例２の化合物がｈＥＰ４にナノモル以下の濃度で結合することを実証する。表１におけるデータは、実施例１および実施例２の化合物が、ｈＥＰ４受容体に対する選択性を示してｈＥＰ４にｈＥＰ１、ｈＥＰ２、およびｈＥＰ３よりも強く結合することも実証する。
【００５１】
Ｉｎ  ＶｉｔｒｏでのヒトＥＰ４機能的アンタゴニスト活性
アッセイを、ヒトＥＰ４受容体を安定発現する組み換えＨＥＫ２９３細胞において行った。細胞株を、高グルコースならびに１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５００μｇ／ｍＬのジェネテシンおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補ったピリドキシン塩酸塩（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ中で培養することにより維持する。コンフルエント培養を、３７℃で５％ＣＯ２を含有する雰囲気中で成長させる。細胞を、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて採取し、凍結培地（６％ＤＭＳＯを含むＦＢＳ）中に１０７細胞／ｍＬで懸濁させ、アリコートを液体窒素中に貯蔵する。アッセイの直前に、細胞をＤＭＥＭ中で融解し、遠心分離し、ｃＡＭＰ緩衝液中に再懸濁させる。
【００５２】
ＥＰ４アンタゴニストによるＰＧＥ２誘発性ｃＡＭＰ生成の阻害を、ＨＴＲＦ（Ｃｉｓｂｉｏカタログ＃６２ＡＭ４ＰＥＢ）を用いて測定する。４０００細胞に相当するアリコートを、所定の濃度のＰＧＥ２を含有する５０μＬのｃＡＭＰアッセイ緩衝液で室温で２０分間インキュベーションしてＥＣ８０（Ｓｉｇｍａからの０．１８８ｎＭ  ＰＧＥ２、カタログ＃Ｐ５６４０−１０ｍｇ）およびＥＰ４アンタゴニストを産生する。ｃＡＭＰアッセイ緩衝液は、５００ｍＬ  ＨＢＳＳ、０．１％ＢＳＡ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび２００μＭ  ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ  Ｉ５８７９）を含有する。ＣＪ−０４２７９４は、陽性対照として働く（国際公開第２００５／０２１５０８号、実施例６８、４−｛（１Ｓ）−１−［（｛５−クロロ−２−［（４−フルオロフェニル）オキシ］フェニル｝カルボニル）アミノ］エチル｝安息香酸を参照、Ｍｕｒａｓｅ，Ａ．ら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、８２：２２６〜２３２（２００８年）も参照されたい）。ｃＡＭＰレベルを測定するために、溶解緩衝液中のｃＡＭＰ−ｄ２複合体および抗ｃＡＭＰ−クリプテート複合体を、処理した細胞と共に室温で１時間インキュベーションする。ＨＴＲＦシグナルを、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて検出して６２０ｎｍにおける蛍光発光に対する６６５ｎｍにおける蛍光発光の比率を計算する。生データを、それぞれの実験について生成したｃＡＭＰ標準曲線を用いてｃＡＭＰ量（ｐｍｏｌ／ウェル）に換算する。データを、ｙ＝（Ａ＋（（Ｂ−Ａ）／（１＋（（Ｃ／ｘ）＾Ｄ）））））（式中、ｙ＝特異的阻害％、Ａ＝曲線の底、Ｂ＝曲線の頂点、Ｃ＝相対ＩＣ５０＝頂点から底までのデータの範囲に基づいて５０％阻害を生じる濃度、Ｄ＝ヒル、勾配＝曲線の勾配である）で示される４パラメータ非線形ロジスティック方程式（ＡＢａｓｅ  Ｅｑｕａｔｉｏｎ  ２０５）を用いて分析する。
【００５３】
化合物を、本質的に上述の通りの手順に従って試験する。実施例１の化合物は、ヒトＥＰ４において測定される０．７５２±０．５３８ｎＭ（ｎ＝１２）のＩＣ５０を有し実施例２の化合物は０．４５０±０．２５６ｎＭ（ｎ＝４）のＩＣ５０を有する。これは、実施例１および実施例２の化合物が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトＥＰ４のアンタゴニストであることを実証する。
【００５４】
Ｉｎ  ＶｉｔｒｏでのラットＥＰ４機能的アンタゴニスト活性
ラットＥＰ４  ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受入＃ＮＭ＿０３２７６）を、ｐｃＤＮＡ  ３．１ベクター内にクローン化し、続いて受容体発現のためにＨＥＫ２９３細胞においてトランスフェクトした。ラットＥＰ４の安定クローンを拡大し次いで今後の化合物スクリーニングのための細胞バンクとして凍結する。ｒＥＰ４細胞においてＥＰ４アンタゴニスト化合物を試験するために、凍結細胞を融解し次いで細胞をｃＡＭＰアッセイ緩衝液中に再懸濁させる。ｃＡＭＰ緩衝液は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３０２３７）、０．１％ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ、１５２６０）および１２５μＭ  ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ、Ｉ５８７９）を補ったフェノールレッド（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３０２６８）を含まないＨＢＳＳから作られる（例えば、Ｍｕｒａｓｅ，Ａ．ら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、８２：２２６〜２３２（２００８年）を参照されたい）。細胞を、９６−ウェルハーフエリア平底ポリスチレン黒色プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６９４）内に平板化する。化合物を、ＤＭＳＯで段階希釈して１０点濃度反応曲線を与える。次いで希釈した化合物を、ＰＧＥ２（Ｃａｙｍａｎ  １４０１０、ＥＣ８０を生成するために予め定められた濃度）を含有するｃＡＭＰアッセイ緩衝液にＤＭＳＯ／緩衝液の比率１／１００で加える。細胞を、化合物でＰＧＥ２（ＥＣ８０濃度）の存在下で室温で３０分間処理する。細胞から発生したｃＡＭＰレベルを、ｃＡＭＰ  ＨＴＲＦアッセイキット（Ｃｉｓｂｉｏ  ６２ＡＭ４ＰＥＣ）によって定量化する。プレートを、ＨＴＲＦ最適化プロトコール（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いてＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー上で読み取る。ＩＣ５０を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ｖ．４）非線形回帰、シグモイド用量反応曲線適合を用いて計算する。
【００５５】
化合物を、本質的に上述の通りの手順に従って試験する。実施例１の化合物は、ラットＥＰ４において測定される２．０ｎＭ（ｎ＝１）のＩＣ５０を有し実施例２の化合物は６．７ｎＭ（ｎ＝１）のＩＣ５０を有する。これは、実施例１および実施例２の化合物が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでラットＥＰ４のアンタゴニストであることを実証する。
【００５６】
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏでのヒト全血におけるアンタゴニスト活性
マクロファージ／単球からのＬＰＳ−誘導性ＴＮＦα産生へのＰＧＥ２の阻害効果は、ＥＰ４受容体によって仲介されると考えられている（Ｍｕｒａｓｅ，Ａ．ら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、８２：２２６〜２３２（２００８年）参照）。ヒト全血におけるＬＰＳ−誘導性ＴＮＦα産生へのＰＧＥ２の阻害効果を逆転させる実施例１の化合物の能力は、機能的活性の証拠である。
【００５７】
血液を、健常な有志ドナーからヘパリンナトリウムバキュテナーチューブに集める。ドナーは、血液提供の前に４８時間以内にＮＳＡＩＤまたはセレコキシブをあるいは２週間以内にグルココルチコイドを摂取していない。全てのチューブ／ドナーを５０ｍＬのＦａｌｃｏｎコニカル遠心管内に貯めて９８μＬ／ウェルを９６−ウェル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ  ３０７２）内に分配する。化合物を、ＤＭＳＯ中に１００Ｘ最終まで希釈して１μＬ／ウェルを３組で血液に加えて７点濃度反応曲線を与える。血液を、５％ＣＯ２の加湿雰囲気において、３０分間、化合物で３７℃で前処理し、その後１ｍＭ  ＰＧＥ２（Ｃａｙｍａｎ  １４０１０）を含むおよび含まない両方の１ｍｇ／ｍＬのリポ多糖（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ  ０１１１：Ｂ４）の０．２ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳ溶液の１μＬ／ウェルを加えて１０ｎＭ  ＰＧＥ２を含むおよび含まない両方の最終ＬＰＳ濃度１０μｇ／ｍＬを与える。プレートを、５％ＣＯ２、加湿雰囲気において３７℃で２０〜２４時間インキュベーションする。プレートを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８１０Ｒ遠心分離機内で１８００×ｇで２２℃で１０分間遠心分離する。血漿を、細胞層から取り出してＶ字底ポリプロピレンプレートに移す。２μＬの血漿におけるＴＮＦαレベルを、Ｉｍｍｕｌｏｎ  ４  ＨＢＸプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  ３８５５）および３，３’，５，５’テトラメチルビフェニル−４，４’−ジアミン基質（ＫＰＬ  ５０−７６−０３）を用いて、市販の酵素免疫アッセイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＹ２１０）によって定量化する。プレートを、ＳＯＦＴｍａｘＰＲＯ（ｖ．４．３．１）ソフトウェアを用いてプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｖｅｒｓａｍａｘ）上でＡ４５０〜Ａ６５０で読み取る。ＩＣ５０を、シグモイド用量反応曲線適合と共に、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ｖ．４）非線形回帰を用いて計算する。結果を、幾何平均±標準偏差として表わす（ｎ＝独立測定の回数）。
【００５８】
化合物を、本質的に上述の通りの手順に従って試験する。実施例１の化合物は、ヒトＥＰ４において測定される３９±２１ｎＭ（ｎ＝８）のＩＣ５０を有し実施例２は６１±５５ｎＭ（ｎ＝５）のＩＣ５０を有する。これは、実施例１および実施例２の化合物が、ヒト血液ＴＮＦα誘導アッセイにおけるＥＰ４アンタゴニストであることを実証する。
【手続補正書】
【提出日】平成27年11月6日(2015.11.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2016519140.tif 000025
（式中、Ｒは、ＨまたはＦである）
の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
【化２】
2016519140.tif 000026
である、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３】
【化３】
2016519140.tif 000027
である、請求項１または請求項２に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項４】
４−［（１Ｓ）−１−［［（３Ｒ）−２−（２−フェノキシエチル）−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−３−カルボニル］アミノ］エチル］安息香酸：
【化４】
2016519140.tif 000028
である、請求項３に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項５】
４−［（１Ｓ）−１−［［（３Ｒ）−２−（２−フェノキシエチル）−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−３−カルボニル］アミノ］エチル］安息香酸：
【化５】
2016519140.tif 000029
である、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
４−［（１Ｓ）−１−［［（３Ｒ）−２−（２−（４−フルオロフェノキシ）エチル）−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−３−カルボニル］アミノ］エチル］安息香酸：
【化６】
2016519140.tif 000030
である、請求項３に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項７】
治療において使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む医薬組成物。
【請求項８】
１種または複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と共に請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む医薬組成物。
【請求項９】
患者における変形性関節炎を治療するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む医薬組成物。
【請求項１０】
患者におけるリウマチ性関節炎を治療するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む医薬組成物。
【請求項１１】
患者における変形性関節炎またはリウマチ性関節炎と関連した痛みを治療するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む医薬組成物。
【国際調査報告】
2016519140.tif 000031
2016519140.tif 000032