(57)【要約】  本発明は、低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株に、特に低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株ＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０およびＥＶ７１：ＴＬＬαＰ２０に関する。本発明はまた、低温適応温度感受性ウイルス株を発展させるプロセスにも関する。
2016511634.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株。
【請求項２】
ＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０である、請求項１の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株。
【請求項３】
ＥＶ７１：ＴＬＬαＰ２０である、請求項１の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株を含む組成物。
【請求項５】
薬学的に許容されうるキャリアーをさらに含む、請求項４の組成物。
【請求項６】
アジュバントをさらに含む、請求項４または５の組成物。
【請求項７】
ワクチンである、請求項４〜７のいずれか一項の組成物。
【請求項８】
被験体において防御免疫反応を誘発する際に使用するための、請求項１〜３のいずれか一項の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株、または請求項４〜８のいずれか一項の組成物。
【請求項９】
被験体がエンテロウイルス７１関連疾患に罹患することを防止する際に使用するための、請求項１〜３のいずれか一項の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株、または請求項４〜８のいずれか一項の組成物。
【請求項１０】
エンテロウイルス７１感染被験体において、エンテロウイルス７１関連疾患の開始を遅らせるかまたはその速度を遅延させる際に使用するための、請求項１〜３のいずれか一項の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株、または請求項４〜８のいずれか一項の組成物。
【請求項１１】
被験体において防御免疫反応を誘発するための薬剤製造のための、請求項１〜３のいずれか一項の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株、または請求項４〜８のいずれか一項の組成物の使用。
【請求項１２】
被験体がエンテロウイルス７１関連疾患に罹患することを防止するための薬剤製造のための、請求項１〜３のいずれか一項の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株、または請求項４〜８のいずれか一項の組成物の使用。
【請求項１３】
エンテロウイルス７１感染被験体において、エンテロウイルス７１関連疾患の開始を遅らせるかまたはその速度を遅延させるための薬剤製造のための、請求項１〜３のいずれか一項の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株、または請求項４〜８のいずれか一項の組成物の使用。
【請求項１４】
被験体において防御免疫反応を誘発する方法であって、請求項１〜３のいずれか一項の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株、または請求項４〜８のいずれか一項の組成物の、予防的、療法的または免疫学的に有効な量を、被験体に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１５】
被験体が野生型エンテロウイルス７１に曝露されている、請求項１４の方法。
【請求項１６】
被験体がエンテロウイルス７１関連疾患に罹患することを防止するための方法であって、請求項１〜３のいずれか一項の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株、または請求項４〜８のいずれか一項の組成物の、予防的、療法的または免疫学的に有効な量を、被験体に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１７】
被験体が野生型エンテロウイルス７１に曝露されている、請求項１６の方法。
【請求項１８】
エンテロウイルス７１感染被験体において、エンテロウイルス７１関連疾患の開始を遅らせるかまたはその速度を遅延させる方法であって、請求項１〜３のいずれか一項の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株、または請求項４〜８のいずれか一項の組成物の、予防的、療法的または免疫学的に有効な量を、被験体に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１９】
被験体がヒト被験体である、請求項１４〜１８のいずれか一項の方法。
【請求項２０】
低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株で被験体を免疫するためのキットであって、請求項１〜３のいずれか一項の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株、または請求項４〜８のいずれか一項の組成物、薬学的に許容されうるキャリアー、およびその使用のための指示資料を含む、前記キット。
【請求項２１】
アプリケーターをさらに含む、請求項２０のキット。
【請求項２２】
低温適応温度感受性ウイルスを産生する方法であって、以下の工程：
（ｉ）親野生型ウイルスの参照ストックを調製し；
（ｉｉ）親野生型ウイルスの参照ストックに感染させた細胞の培養物を、より高い感染多重度（ＭＯＩ）および約３４℃〜約３６℃、好ましくは約３４℃のインキュベーション温度で５回またはそれより多い継代数分、より低いＭＯＩの接種物および完全ＣＰＥを得るための各継代のより短いインキュベーション期間を用いて、各継代で完全細胞変性効果（ＣＰＥ）が得られるまでインキュベーションし；
（ｉｉｉ）先の工程の結果生じたウイルスに感染させた細胞の培養物を、より高いＭＯＩおよび先の工程よりも約１℃〜約３℃低いインキュベーション温度で５回またはそれより多い継代数分、より低いＭＯＩの接種物および完全ＣＰＥを得るための各継代のより短いインキュベーション期間を用いて、各継代で完全細胞変性効果（ＣＰＥ）が得られるまでインキュベーションし；そして
（ｉｖ）ウイルスの最適複製のために選択されるターゲット温度が達成されるまで、インキュベーション温度を増分で低下させる体系的な段階的方式で、工程（ｉｉｉ）を反復する；
工程を含む、前記方法。
【請求項２３】
約３６℃〜約３８℃、好ましくは約３７℃の温度で、１回または２回の継代分、完全細胞変性効果（ＣＰＥ）が得られるまで、野生型ウイルスに感染した細胞の培養物をインキュベーションすることによって、親野生型ウイルスの参照ストックを調製する、請求項２２の方法。
【請求項２４】
ウイルスがピコルナウイルス科、好ましくはエンテロウイルス属のメンバーである、請求項２２または２３の方法。
【請求項２５】
ウイルスがエンテロウイルス７１またはコクサッキーウイルスＡ１６である、請求項２４の方法。
【請求項２６】
ターゲット温度が約２６℃〜約２９℃、好ましくは約２８℃である、請求項２２〜２５のいずれかの方法。
【請求項２７】
ウイルスが完全細胞変性効果（ＣＰＥ）を得たら直ちに、ウイルスを含有する清澄化された培養上清を得て、そして細胞の連続する新鮮な新規培養フラスコのそれぞれの中に、この上清を渡すことによって、ウイルスをプロセスの各工程で継代する、請求項２２〜２６のいずれかの方法。
【請求項２８】
より高いＭＯＩが２０である、請求項２２〜２７のいずれかの方法。
【請求項２９】
新鮮な集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）単層Ｖｅｒｏ細胞を含有する新規培養フラスコに、ウイルスが完全ＣＰＥを引き起こした後、さらに３回の継代に渡って、２０のＭＯＩのウイルスを接種する、請求項２８の方法。
【請求項３０】
より低いＭＯＩが５〜１０である、請求項２２〜２９のいずれかの方法。
【請求項３１】
新鮮な集密単層Ｖｅｒｏ細胞を含有する新規培養フラスコに、ウイルスが完全ＣＰＥを引き起こした後、少なくともさらに３回の継代に渡って、５〜１０のＭＯＩでウイルスを接種する、請求項３０の方法。
【請求項３２】
工程（ｉｉｉ）を、前記の少なくともさらに３回の継代の後、５〜１０のＭＯＩで、開始するかまたは反復する、請求項３１の方法。
【請求項３３】
完全ＣＰＥが接種後３日以内に起こる、請求項２７〜３２のいずれか一項の方法。
【請求項３４】
細胞がＶｅｒｏ細胞である、請求項２２〜３３のいずれかの方法。
【請求項３５】
Ｖｅｒｏ細胞を、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養する、請求項２２〜３４のいずれかの方法。
【請求項３６】
培地に１％ＦＣＳを補充する、請求項３５の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列提出
[0001]本出願は、電子形式の配列表とともに提出されている。配列表は、２５７７２２４ＰＣＴＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと題され、２０１３年１月１１日に作成され、そしてサイズは２１ｋｂである。配列表の電子形式での情報は、その全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
[0002]本発明は、低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株に、特に低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株ＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０およびＥＶ７１：ＴＬＬαＰ２０に関する。本発明はまた、低温適応温度感受性ウイルス株、特にＲＮＡウイルス株を発展させるプロセスにも関する。
【０００３】
[0003]本発明の背景を明らかにするため、または実施に関するさらなる詳細を提供するため、本明細書で用いる刊行物および他の資料は、本明細書に援用され、そして便宜上、それぞれ、参考文献一覧にグループ分けされる。
【０００４】
[0004]手足口病（ＨＦＭＤ）は、本質的にエンテロウイルスＡ種に属するヒト・エンテロウイルス群によって引き起こされる。これらのうち、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）およびコクサッキーウイルスＡ１６（ＣＡ１６）は、ＨＦＭＤ症例の９０％以上を引き起こす原因である。ＨＦＭＤを引き起こすのに加え、ＥＶ７１は、特に幼い小児において、死を伴う、重度の神経学的疾患を引き起こすことが知られてきている。
【０００５】
[0005]ヒト・エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）は、およそ３０ｎｍのサイズの小型の非エンベロープウイルスで、約７，４５０ヌクレオチドの一本鎖プラス鎖ＲＮＡゲノムを持つ。該ウイルスは、ピコルナウイルス科内のエンテロウイルス属のもと、ヒト・エンテロウイルスＡ種と分類される（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９９４；Ｍｅｌｎｉｃｋ、１９９６）。ＥＶ７１は、３つの主要なゲノグループ（Ａ、Ｂ、およびＣと示される）に分けられ、そしてゲノグループＢおよびＣは、主要カプシドタンパク質（ＶＰ１）遺伝子の系統発生分析に基づいて、さらに、サブゲノグループＢ１〜Ｂ５およびＣ１〜Ｃ５に細分割される（Ｂｉｂｌｅら、２００８）。ＥＶ７１は、主に、幼児および幼い小児における、手足口病（ＨＦＭＤ）、無菌性髄膜炎、脳炎およびポリオ様麻痺を含む、一連の臨床疾患に関連づけられてきている（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９９４；Ｍｅｌｎｉｃｋ、１９９６）。該ウイルスはまず、無菌性髄膜炎の小児から、米国カリフォルニア州で単離され、そして続いて、エンテロウイルス属の新規血清型として性質決定された（Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９７４）。最初の単離から数年で、該ウイルスによる、合併症を伴うＨＦＭＤの大流行が世界の多様な地域で報告された（Ｂｌｏｍｂｅｒｇら、１９７４；Ｋｅｎｎｅｔｔら、１９７４；Ｄｅｉｂｅｌら、１９７５；Ｈａｇｉｗａｒａら、１９７８）。
【０００６】
[0006]近年、ＥＶ７１感染は、神経毒性ＥＶ７１の流行性および散発性大流行の発生後、世界中で、特にアジア太平洋地方で、大きな公衆衛生上の負荷および懸念となってきている。ＥＶ７１の神経毒性は、７０５例のポリオ様疾患を引き起こし、４４人の死亡を生じた、１９７５年のブルガリアでの大流行中に、最初に大きな世界的注目を浴びた（Ｃｈｕｍａｋｏｖら、１９７９；Ｓｈｉｎｄａｒｏｖら、１９７９）。同様の性質の大流行が、１９７８年にハンガリーで起き、そしてポリオ様疾患の多くの症例および４７人の死亡を生じた（Ｎａｇｙら、１９８２）。続いて、ＥＶ７１に関連するいくつかのより穏やかなＣＮＳ疾患の流行が、ニューヨーク、香港、オーストリアおよびフィラデルフィアで報告されてきている（Ｃｈｏｍｎａｉｔｒｅｅら、１９５８；Ｓａｍｕｄａら、１９８７；Ｇｉｌｂｅｒｔら、１９８８；Ｈａｙｗａｒｄら、１９８９）。日本において、ＥＶ７１の２回の流行が起こり、大部分の症例はＨＦＭＤによって特徴付けられ、そしてＣＮＳ疾患の発生率は低かった（Ｔａｇａｙａら、１９８１；Ｉｓｈｉｍａｒｕら、１９８０；Ｈａｇｉｗａｒａら、１９８３）。１９９７年、マレーシアで非常に神経毒性が高いＥＶ７１によるＨＦＭＤの大規模大流行が起こり、そして４８人の死亡が引き起こされた。より大きな大流行が１９９８年、台湾で起こり、１０万例を超すＨＦＭＤ、４０５例の重症感染、ならびに神経原性心不全および肺浮腫を伴う急性脳幹脳脊髄炎による７８人の死亡があった（Ｌｕｍら、１９９８ａ；Ｌｕｍら、１９９８ｂ；Ｃｈａｎｇら、１９９８；Ｙａｎら、２００；Ｌｉｕら、２０００；Ｗａｎｇら、２０００）。２００８年、１２６人の死亡を伴う、総数４８８，９５５例のＨＦＭＤが、中華人民共和国本土で記録された（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｃｅｎｔｅｒ、２００８）。２００９年、ＨＦＭＤ症例の数は、１，１５５，５２５例に増え、３５３例の死亡者を伴ったと報告された（Ｙａｎｇら、２０１１）。２０１０年、中国は、過去最大の大流行を経験し、１７０万を超えるＨＦＭＤ症例、重度の神経学的合併症を伴う２７，０００人の患者、および９０５人の死亡が生じた。３回の大流行すべてにおいて、神経学的合併症および死亡を伴う重症例のほぼすべては、ＥＶ７１によるものであった（Ｚｅｎｇら、２０１２）。
【０００７】
[0007]現在、ＥＶ７１感染のウイルス毒性および発症の分子決定要因はなお完全には理解されていない。重度の感染および関連する神経学的合併症の臨床的治療に関して認可された抗ウイルス薬剤もなく、また再発性大流行を制御しそして防止するための使用に利用可能なワクチンもない。制御および防止戦略に関して、特に発展途上国で使用するための費用効率的なワクチンの開発が、最優先であり、そして非常に緊急性がある。研究および開発中の、ＥＶ７１に対する多様なタイプのワクチンは、齧歯類またはサルにおいて、免疫反応を誘発するようである（Ｗｕら、２００１；Ａｒｉｔａら、２００５；Ｃｈｉｕら、２００６；Ａｒｉｔａら、２００７；Ｔｕｎｇら、２００７；Ｃｈｕｎｇら、２００８；Ｃｈｅｎら、２００８；Ｏｎｇら、２０１０；Ｃｈｅｎら、２０１１；ＬｅｅおよびＣｈａｎｇ、２０１０；Ｘｈａｎｇら、２０１０）。ＶＰ１カプシドに基づくウイルス様粒子ワクチンおよびサブユニットペプチドワクチンは、さらなる研究および開発の価値がある、実行可能な潜在的ワクチン戦略であり続けているが、開発の非常に広範な過去の経験、ならびに不活化注射可能ソークおよび生弱毒化経口セービン・ポリオウイルスワクチンを使用して野生型ポリオウイルス感染が制御されそして根絶間近であることに基づいて、注射可能不活化および経口弱毒化ＥＶ７１ワクチンは、最も有望な候補のままである（Ｚｈａｎｇら、２０１０）。
【０００８】
[0008]現在、市場には、ＥＶ７１による感染および手足口病に対して小児を保護するために利用可能なワクチンがない。最近の情報に基づけば、注射可能不活化ＥＶ７１ワクチンを開発するプロセスにある、中華人民共和国の２施設、シンガポールの１施設および台湾の１施設がある（プレスリリースおよび個人的通信）。Ｈ．シミズ博士が率いる日本・東京の国立感染症研究所のエンテロウイルス部門は、１９８０年代から、サルにおけるＥＶ７１の発症および潜在的候補経口生弱毒化ＥＶ７１ワクチンとしてのＥＶ７１の温度感受性株に関して徹底的な研究を行ってきている（Ａｒｉｔａら、２００５；Ａｒｉｔａら、２００７）。そのサル研究におけるＥＶ７１の温度感受性株の潜在的なワクチン候補はすべて、静脈内接種後、野生型ウイルスに比較して、より低い度合いではあるが、なお、神経侵襲およびＣＮＳの組織病理学的病変を引き起こすことが可能であった。
【０００９】
[0009]生弱毒化ワクチンは、イギリスの医師、エドワード・ジェンナーが、天然痘の破壊的な疾患に対して、牛痘ウイルスを用いて小児にワクチン接種を始めた１８世紀にさかのぼる、ワクチン接種の最初の成功した方法の１つに相当する。生弱毒化ワクチンは、疾患を引き起こせないように弱毒化されているが、なお防御性免疫反応は誘導する、生きたウイルスまたは微生物を用いる。伝統的で、古典的、そして遺伝的な方法は、生弱毒化ワクチンとして使用するため、ウイルスおよび微生物を弱毒化する際に、ある程度成功してきた４４−４８。伝統的な方法は、ヒトにおいて非病原性である天然存在関連生物を用い、例えば牛痘またはワクシニアウイルスを用いる。古典的な方法は、組織培養または苛酷な（ｈａｒｓｈ）液体培地などの、弱毒化させる条件下で、病原性ウイルスまたは微生物を何周期か増殖させることを伴う。遺伝的方法は、現代の分子バイオテクノロジーを利用して、ゲノムを操作し、病原性を減少させる（Ｈｕｙｇｅｌｅｎ、１９９７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、２００８；Ｃｏｌｅｍａｎら、２００８；Ｌａｕｒｉｎｇら、２０１０；Ｋｅｎｎｅｙら、２０１１）。弱毒化のマーカーとしての温度感受性表現型ウイルスを得る古典的な方法において、より低い温度でインキュベーションされた適切な細胞においてウイルスを培養することによって、プラークアッセイ技術を通じて、野生型ウイルスをプラーク選択する。選択されたウイルス株を続いて、ターゲティングされるより低いインキュベーション温度で、反復継代する（Ｈａｇｉｗａｒａら、１９８２；ＨａｓｈｉｍｏｔｏおよびＨａｇｉｗａｒａ、１９８３；ＲｉｃｈｍａｎおよびＭｕｒｐｈｙ、１９９７）。
【００１０】
[0010]特定のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養条件において、表現型的および遺伝的安定性を保持し、そして静脈内接種後、サルにおいて神経毒性を示さない、ウイルス疾患を治療するために使用可能なウイルス株を発展させることが望ましい。細胞培養において、連続継代後に得られる、ＲＮＡウイルスを含むウイルスの低温適応温度感受性株を発展させることもまた望ましい。
【発明の概要】
【００１１】
[0011]本発明は、低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株に、特に、低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株ＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０およびＥＶ７１：ＴＬＬαＰ２０に関する。本発明はまた、低温適応温度感受性ウイルス株、特にＲＮＡウイルス株を発展させるプロセスにも関する。
【００１２】
[0012]したがって、１つの側面において、本発明は、低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株を提供する。１つの態様において、低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株は、本明細書に記載するようなＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０である。別の態様において、低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株は、本明細書に記載するようなＥＶ７１：ＴＬＬαＰ２０である。
【００１３】
[0013]本発明のエンテロウイルス７１株は、表現型マーカーとして温度感受性を用いて、エンテロウイルス７１を弱毒化する方法によって調製される。方法は、ウイルスの生物学的増殖特性を変化させて、３０℃未満のインキュベーション温度での最適な複製のために適応させるｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験室プロセスである。以下に詳細に記載する適応プロセスは、ウイルスの最適複製のために選択されるターゲット温度が達成されるまで、ウイルスを培養するインキュベーション温度を増分で低下させる体系的な段階的方式で行われる。
【００１４】
[0014]第二の側面において、本発明は、本明細書記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株を含む組成物を提供する。１つの態様において、組成物は、本明細書記載のウイルス株の有効量を含む。別の態様において、組成物は、１またはそれより多い生理学的または薬学的に許容されうるキャリアーを含む。さらなる態様において、組成物はワクチンである。当業者に周知の技術を用いて、本明細書記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株を含有するワクチンを調製する。こうしたワクチンは、当業者に周知の技術を用いて、ワクチンを被験体、例えばヒト被験体に投与することによって、親ウイルス株に対する免疫を提供するために有用である。
【００１５】
[0015]第三の側面において、本発明は、被験体、例えばヒト被験体において防御免疫反応を誘発する方法であって、予防的または療法的または免疫学的に有効な量の、本明細書記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１を、被験体に投与する工程を含む、前記方法を提供する。１つの態様において、防御免疫反応は、エンテロウイルス７１によって引き起こされる疾患に対して、被験体を防御する。１つの態様において、疾患は手足口病である。別の態様において、疾患は無菌性髄膜炎である。さらなる態様において、疾患は脳炎である。さらなる態様において、疾患はポリオ様麻痺である。１つの態様において、本明細書記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株を、ワクチンとして投与する。さらなる態様において、被験体は、野生型エンテロウイルス７１に曝露されている。別の態様において、本明細書記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株の投与は、被験体、例えばヒト被験体が、エンテロウイルス７１関連疾患に罹患することを防止する。さらなる態様において、被験体は、野生型エンテロウイルス７１株に曝露されている。さらなる態様において、本明細書記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株の投与は、ウイルス感染被験体、例えばヒト被験体における、エンテロウイルス７１関連疾患の開始を遅らせるかまたはその進行速度を遅延させる。
【００１６】
[0016]第四の側面において、本発明は、表現型マーカーとして温度感受性を用いて、ウイルスを弱毒化する方法を提供する。この側面にしたがって、該方法は、低温適応温度感受性ウイルス株を発展させる。本発明の方法は、ウイルスの生物学的増殖特性を変化させて、３０℃未満のインキュベーション温度での最適な複製のために適応させるｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験室プロセスである。適応プロセスは、ウイルスの最適複製のために選択されるターゲット温度が達成されるまで、ウイルスを培養するインキュベーション温度を増分で低下させる体系的な段階的方式で行われる。したがって、本発明にしたがって、方法は、以下の工程を含む：（ｉ）親野生型ウイルスの参照ストックを調製し、（ｉｉ）親野生型ウイルスの参照ストックに感染させた細胞の培養物を、より高い感染多重度（ＭＯＩ）および約３４℃〜約３６℃、好ましくは約３４℃のインキュベーション温度で５回またはそれより多い継代数分、より低いＭＯＩの接種物および完全ＣＰＥを得るための各継代のより短いインキュベーション期間を用いて、各継代で完全細胞変性効果（ＣＰＥ）が得られるまでインキュベーションし、（ｉｉｉ）先の工程の結果生じたウイルスに感染させた細胞の培養物を、より高いＭＯＩおよび先の工程よりも約１℃〜約３℃低いインキュベーション温度で５回またはそれより多い継代数分、より低いＭＯＩの接種物および完全ＣＰＥを得るための各継代のより短いインキュベーション期間を用いて、各継代で完全細胞変性効果（ＣＰＥ）が得られるまでインキュベーションし、そして（ｉｖ）ウイルスの最適複製のために選択されるターゲット温度が達成されるまで、インキュベーション温度を増分で低下させる体系的な段階的方式で、工程（ｉｉｉ）を反復する。１つの態様において、ターゲット温度は約２６℃〜約２９℃、好ましくは約２８℃である。１つの態様において、増分で低下するインキュベーション温度は、約１℃〜約２℃低下する温度である。
【００１７】
[0017]１つの態様において、親野生型ウイルスの参照ストックは、約３６℃〜約３８℃、好ましくは約３７℃の温度で、１回または２回の継代分、完全細胞変性効果（ＣＰＥ）が得られるまで、野生型ウイルスに感染した細胞の培養物をインキュベーションすることによって、調製される。産生されるウイルスを含有する培養上清アリコットをバイアルまたは他の適切な保存デバイス中に入れる。この培養上清は、親野生型ウイルスの参照ストックとして働く。参照親野生型ウイルスを続く弱毒化プロセスに用いる。別の態様において、親野生型ウイルスの参照ストックのアリコットは、適切な温度、例えば−８０℃で保存される。
【００１８】
[0018]１つの態様において、ウイルスは任意のウイルスである。別の態様において、ウイルスはＲＮＡウイルスである。さらなる態様において、ＲＮＡウイルスは、プラス鎖ＲＮＡウイルスである。さらなる態様において、ウイルスはピコルナウイルス科のメンバーである。別の態様において、ウイルスはエンテロウイルス属のメンバーである。１つの態様において、ウイルスはエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）である。別の態様において、ウイルスはコクサッキーウイルスＡ１６（ＣＡ１６）である。本発明の方法は、限定されるわけではないが、ＥＶ７１およびＣＡ１６の低温適応温度感受性株を含む、これらのウイルスいずれかの低温適応温度感受性ウイルス株を産生する際に有用である。
【００１９】
[0019]１つの態様において、ウイルスに感染させる細胞は、ウイルスの増殖を可能にする任意の細胞である。好ましい態様において、細胞はＶｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１）である。１つの態様において、細胞は、細胞の増殖に適した培地中での通常の継代によって維持される。細胞がＶｅｒｏ細胞である態様において、Ｖｅｒｏ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養される。１つの態様において、１％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中で維持されたＶｅｒｏ細胞を、親野生型ウイルスの産生、ウイルス培養、弱毒化、力価決定、および温度感受性表現型の評価のために用いる。別の態様において、インキュベーション温度を連続低下させる際に、複製のため、ウイルス株を適応させるために、ＤＭＥＭに１％ＦＣＳを補充する。
【００２０】
[0020]本発明はまた、本明細書記載の方法によって産生されるウイルスの低温適応温度感受性株にも関する。本明細書記載の方法によって産生される低温適応温度感受性ウイルスは、当業者に周知の技術を用いたワクチンの産生に有用である。こうしたワクチンは、当業者に周知の技術を用いて、被験体にワクチンを投与することによって、親ウイルス株に対する免疫を提供するために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】[0021]図１ａは、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０）の静脈内用量を投与した４日後にサルの血液から得られ、該ウイルスに特異的である商業的モノクローナル抗体を用いた間接的免疫蛍光アッセイによって、陽性に染色された、末梢血単核細胞（矢印）を示す。
【００２２】
[0022]図１ｂは、エンテロウイルス７１株の検出のために特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対を用いて、免疫４日後のサル（２２０２Ｆ、２８９１Ｆ）から得た組織の一工程ＲＴ−ＰＣＲ増幅産物。ＲＴ−ＰＣＲ増幅産物の予期されるサイズは４２７ｂｐである。２つのゲル中のレーンは以下の通りである。ゲル１：レーン１：１００ｂｐ  ＤＮＡラダー；レーン２：２２０２Ｆ−心臓；レーン３：２２０２Ｆ−脾臓；レーン４：２２０２Ｆ−リンパ節；レーン５：２２０２Ｆ−腎臓；レーン６：２２０２Ｆ−肝臓；レーン７：２８９１Ｆ−心臓；レーン８：２８９１Ｆ−脾臓；レーン９：２８９１Ｆ−リンパ節；レーン１０：２８９１Ｆ−腎臓；レーン１１：２８９１Ｆ−肝臓；レーン１２：２２０２Ｆ−脳幹（橋）；レーン１３：２２０２Ｆ−脳幹（延髄）；レーン１４：２２０２Ｆ−皮質（脳回）；レーン１５：２２０２Ｆ−脊髄（頸部）；レーン１６：２２０２Ｆ−脊髄（腰部）；レーン１７：２２０２Ｆ−脊髄（胸部）；レーン１８：２８９１Ｆ−脳幹（延髄）；レーン１９：２８９１Ｆ−脳幹（橋）；レーン２０：２８９１Ｆ−皮質（左小脳）。ゲル２：レーン２１：１００ｂｐ  ＤＮＡラダー；レーン２２：２８９１Ｆ−皮質（右小脳）；レーン２３：２８９１Ｆ−脊髄（頸部）；レーン２４：２８９１Ｆ−脊髄（腰部）；レーン２５：２８９１Ｆ−脊髄（胸部）；レーン２６：テンプレート不含対照；レーン２７：１００ｂｐ  ＤＮＡラダー。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
[0023]本発明は、低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株に、特に低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株ＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０およびＥＶ７１：ＴＬＬαＰ２０に関する。本発明はまた、低温適応温度感受性ウイルス株、特にＲＮＡウイルス株を発展させるプロセスにも関する。
【００２４】
[0024]したがって、１つの側面において、本発明は、低温適応温度感受性株を提供する。１つの態様において、低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株は、本明細書に記載するようなＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０である。別の態様において、低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株は、本明細書に記載するようなＥＶ７１：ＴＬＬαＰ２０である。ＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０は、ブダペスト条約の条項のもとに、２０１２年１０月２５日、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０，  ＵＳＡに位置するアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託され、そして寄託番号ＰＴＡ−１３２８５を割り当てられた。ＥＶ７１：ＴＬＬαＰ２０は、ブダペスト条約の条項のもとに、２０１２年１０月２５日、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託され、そして寄託番号ＰＴＡ−１３２８４を割り当てられた。
【００２５】
[0025]本発明のエンテロウイルス７１株は、表現型マーカーとして温度感受性を用いて、エンテロウイルス７１を弱毒化する方法によって調製される。該方法は、ウイルスの生物学的増殖特性を変化させて、３０℃未満のインキュベーション温度での最適な複製のために適応させるｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験室プロセスである。適応プロセスは、ウイルスの最適複製のために選択されるターゲット温度が達成されるまで、ウイルスを培養するインキュベーション温度を増分で低下させる体系的な段階的方式で行われる。本明細書に開示するように、（ｉ）親野生型ウイルスの参照ストックを調製し、（ｉｉ）親野生型ウイルスの参照ストックに感染させた細胞の培養物を、より高い感染多重度（ＭＯＩ）および約３４℃のインキュベーション温度で５回またはそれより多い継代数分、より低いＭＯＩの接種物および完全ＣＰＥを得るための各継代のより短いインキュベーション期間用いて、各継代で完全細胞変性効果（ＣＰＥ）が得られるまでインキュベーションし、（ｉｉｉ）先の工程の結果生じたウイルスに感染させた細胞の培養物を、より高いＭＯＩおよび先の工程よりも約１℃〜約３℃低いインキュベーション温度で５回またはそれより多い継代数分、より低いＭＯＩの接種物および完全ＣＰＥを得るための各継代のより短いインキュベーション期間を用いて、各継代で完全細胞変性効果（ＣＰＥ）が得られるまでインキュベーションし、そして（ｉｖ）ウイルスの最適複製のために選択されるターゲット温度が達成されるまで、インキュベーション温度を増分で低下させる体系的な段階的方式で、工程（ｉｉｉ）を反復する。１つの態様において、ターゲット温度は約２６℃〜約２９℃、好ましくは約２８℃である。
【００２６】
[0026]１つの態様において、親野生型ウイルスの参照ストックは、約３６℃〜約３８℃の温度で、好ましくは約３７℃で、１回または２回の継代分、野生型ウイルスに感染した細胞の培養物を、完全細胞変性効果（ＣＰＥ）が得られるまでインキュベーションすることによって、調製される。産生されるウイルスを含有する培養上清アリコットをバイアルまたは他の適切な保存デバイス中に入れる。この培養上清は、親野生型ウイルスの参照ストックとして働く。参照親野生型ウイルスを、続く弱毒化プロセスに用いる。別の態様において、親野生型ウイルスの参照ストックのアリコットは、適切な温度、例えば−８０℃で保存される。
【００２７】
[0027]１つの態様において、ウイルスに感染させる細胞は、ウイルスの増殖を可能にする任意の細胞である。好ましい態様において、細胞はＶｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１）である。１つの態様において、細胞は、細胞の増殖に適した培地中での通常の継代によって維持される。細胞がＶｅｒｏ細胞である態様において、Ｖｅｒｏ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養される。１つの態様において、１％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中で維持されたＶｅｒｏ細胞を、親野生型ウイルスの産生、ウイルス培養、弱毒化、力価決定、および温度感受性表現型の評価のために用いる。別の態様において、インキュベーション温度を連続低下させる際に、複製のため、ウイルス株を適応させるために、ＤＭＥＭに１％ＦＣＳを補充する。
【００２８】
[0028]１つの態様において、ウイルスが完全細胞変性効果（ＣＰＥ）を得たら直ちに、ウイルスを含有する清澄化された培養上清を得て、そして細胞、例えばＶｅｒｏ細胞の連続する新鮮な新規培養フラスコのそれぞれの中に、この上清を渡すことによって、ウイルスをプロセスの各工程で継代する。別の態様において、ウイルスを含有する培養上清を、より低いインキュベーション温度への各々連続した変化の開始時に、２０の、より高い感染多重度（ＭＯＩ）で渡す。接種後３日以内に、Ｖｅｒｏ細胞において、完全ＣＰＥを引き起こすことが可能であることが認識された後、続いて、より低い５〜１０のＭＯＩに減少させる前に、新鮮な集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）単層Ｖｅｒｏ細胞を含有する新規培養フラスコに、少なくともさらに３回の継代に渡って、同じＭＯＩでウイルスを接種する。５〜１０のより低いＭＯＩで接種後３日以内に、完全ＣＰＥを引き起こすことが可能であることが認識されたら、５〜１０のＭＯＩで少なくともさらに３回継代させた後、次いで、弱毒化プロセスは、続いてより低いインキュベーション温度の次の相に移る。各継代に必要な日数は、ウイルスがどれだけ迅速に増分で低下するインキュベーション温度の各相に適応するかに応じる。当業者は、完全ＣＰＥに到達したのがいつか、容易にわかるであろう。本発明の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株を調製するための方法のさらなる詳細を以下に記載する。
【００２９】
[0029]第二の側面において、本発明は、本明細書記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株を含む組成物を提供する。１つの態様において、組成物は、本明細書記載のウイルス株の有効量を含む。別の態様において、組成物は、１またはそれより多い生理学的または薬学的に許容されうるキャリアーを含む。さらなる態様において、組成物はワクチンである。当業者に周知の技術を用いて、本明細書記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株を含有するワクチンを調製する。こうしたワクチンは、当業者に周知の技術を用いて、ワクチンを被験体、例えばヒト被験体に投与することによって、親ウイルス株に対する免疫を提供するために有用である。
【００３０】
[0030]本明細書記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株を、被験体において防御免疫反応を誘発するか、または被験体がウイルス関連疾患に罹患することを防止するか、あるいはエンテロウイルス関連疾患の開始を遅らせるかまたはその進行速度を遅延させるために用いる場合、１またはそれより多い生理学的または薬学的に許容されうるキャリアーをさらに含む組成物の形で被験体に投与する。薬学的に許容されうるキャリアーは、当業者に周知であり、そして限定されるわけではないが、これには、１またはそれより多い０．０１Ｍ〜０．１Ｍおよび好ましくは０．０５Ｍリン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または０．９％生理食塩水が含まれる。こうしたキャリアーにはまた、水性または非水性溶液、懸濁物、およびエマルジョンも含まれる。水性キャリアーには、水、アルコール溶液/水溶液、エマルジョンまたは懸濁物、生理食塩水および緩衝媒体が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、および注射可能有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル溶液、および固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補充剤、電解質補充剤、例えば、リンゲルのデキストロースに基づくものなどが含まれる。固形組成物は、非毒性固形キャリアー、例えばグルコース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロースまたはセルロース誘導体、炭酸ナトリウムおよび炭酸マグネシウムを含むことも可能である。エアロゾル中での投与のため、例えば肺および／または鼻内送達のため、好ましくは、非毒性界面活性剤、例えばＣ６〜Ｃ２２脂肪酸または天然グリセリドのエステルまたは部分エステル、および噴霧剤とともに配合される。鼻内送達を容易にするため、レシチンなどのさらなるキャリアーが含まれてもよい。薬学的に許容されうるキャリアーは、さらに、活性成分の貯蔵期間および／または有効性を増進させる、微量の補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、保存剤および他の添加剤、例えば抗微生物剤、酸化防止剤、およびキレート剤を含んでもよい。本組成物は、当該技術分野に周知であるように、被験体への投与後、活性成分の迅速、持続または遅延放出を提供するように配合可能である。
【００３１】
[0031]第三の側面において、本発明は、被験体、例えばヒト被験体において防御免疫反応を誘発する方法であって、予防的または療法的または免疫学的に有効な量の、本明細書記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株を、被験体に投与する工程を含む、前記方法を提供する。したがって、本発明はまた、被験体において防御免疫反応を誘発する際に使用するための、低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株または低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株を含む組成物も提供する。本発明はまた、被験体において防御免疫反応を誘発するための薬剤製造のための、低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株または低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株を含む組成物の使用も提供する。１つの態様において、防御免疫反応は、エンテロウイルス７１によって引き起こされる疾患に対して、被験体を防御する。１つの態様において、疾患は手足口病である。別の態様において、疾患は無菌性髄膜炎である。さらなる態様において、疾患は脳炎である。さらなる態様において、疾患はポリオ様麻痺である。１つの態様において、本明細書記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株を、ワクチンとして投与する。さらなる態様において、被験体は、野生型エンテロウイルス７１に曝露されている。エンテロウイルス７１に「曝露される」は、感染が生じうるような、エンテロウイルス７１との接触を意味する。別の態様において、本明細書記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株の投与は、被験体、例えばヒト被験体が、エンテロウイルス７１関連疾患に罹患することを防止する。したがって、本発明はまた、被験体、例えばヒト被験体が、エンテロウイルス７１関連疾患に罹患することを防止する際に使用するための、低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株または低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株を含む組成物も提供する。本発明はまた、被験体、例えばヒト被験体が、エンテロウイルス７１関連疾患に罹患することを防止するための薬剤製造のための、低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株または低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株を含む組成物も提供する。さらなる態様において、被験体は、野生型エンテロウイルス７１株に曝露されている。さらなる態様において、本明細書記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株の投与は、ウイルス感染被験体、例えばヒト被験体における、エンテロウイルス７１関連疾患の開始を遅らせるかまたはその進行速度を遅延させる。したがって、本発明はまた、ウイルス感染被験体、例えばヒト被験体において、エンテロウイルス７１関連疾患の開始を遅らせるかまたはその進行速度を遅延させる際に使用するための、低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株または低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株を含む組成物も提供する。本発明はまた、ウイルス感染被験体、例えばヒト被験体において、エンテロウイルス７１関連疾患の開始を遅らせるかまたはその進行速度を遅延させるための薬剤製造のための、低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株または低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株を含む組成物も提供する。
【００３２】
[0032]本明細書において、「投与する」は、当業者に知られる多様な方法および送達系のいずれかを用いて送達することを意味する。投与は、例えば、腹腔内、脳内、静脈内、経口、経粘膜、皮下、経皮、皮内、筋内、局所、非経口、移植を通じて、クモ膜下腔内、リンパ内、病変内、心臓周囲、または硬膜外で実行可能である。剤または組成物はまた、エアロゾル中で、例えば肺および／または鼻内送達のために投与可能である。投与は、例えば、１回、複数回、および／または１またはそれより多い延長された期間に実行可能である。
【００３３】
[0033]被験体における防御免疫反応誘発は、例えば、被験体に一次用量のワクチンを投与し、適切な期間の後、ワクチンの１またはそれより多い続く投与を続けることによって達成可能である。ワクチンの投与間の適切な期間は、当業者によって容易に決定可能であり、そして通常、約数週間から数ヶ月である。本発明は、しかし、投与の任意の特定の方法、経路または頻度には限定されない。
【００３４】
[0034]「予防的に有効な用量」または「免疫学的に有効な用量」は、ウイルス感染する傾向があるかまたはウイルス関連障害に罹患する傾向がある被験体に投与した際、被験体がウイルスに感染するかまたは障害に罹患することを防御する免疫反応を、被験体において誘導する、ワクチンの任意の量である。被験体を「防御する」ことは、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも１０倍、被験体がウイルスに感染する可能性を減少させるか、または被験体における障害開始の可能性を減少させることを意味する。例えば、被験体がウイルスに感染する１％の可能性を有する場合、被験体がウイルスに感染する可能性の２倍の減少は、ウイルスに感染する可能性が０．５％である被験体を生じるであろう。最も好ましくは、「予防的に有効な用量」は、被験体がウイルスに感染することを完全に防止するかまたは被験体において障害の開始を完全に防止する免疫反応を、被験体において誘導する。
【００３５】
[0035]任意の本免疫法および療法の特定の態様は、被験体に、少なくとも１つのアジュバントを投与することをさらに含むことも可能である。「アジュバント」は、抗原の免疫原性を増進させ、そして被験体において免疫反応をブーストするのに適した任意の剤を意味するものとする。タンパク質および核酸に基づくワクチンの両方で使用するために適した、特定のアジュバントを含む多くのアジュバント、ならびに抗原とアジュバントを組み合わせる方法が当業者に周知である。タンパク質免疫で使用するために適したアジュバントには、限定されるわけではないが、ミョウバン、フロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイントの不完全アジュバント（ＦＩＡ）、ミョウバンアジュバント、サポニンに基づくアジュバント、例えばＱｕｉｌ  ＡおよびＱＳ−２１等が含まれる。
【００３６】
[0036]本発明はまた、表現型マーカーとして温度感受性を用いて、ウイルスを弱毒化する方法も提供する。この側面にしたがって、方法は、低温適応温度感受性ウイルス株を発展させる。本発明の方法は、ウイルスの生物学的増殖特性を変化させて、３０℃未満のインキュベーション温度での最適な複製のために適応させるｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験室プロセスである。適応プロセスは、ウイルスの最適複製のために選択されるターゲット温度が達成されるまで、ウイルスを培養するインキュベーション温度を増分で低下させる体系的な段階的方式で行われる。
【００３７】
[0037]したがって、本発明にしたがって、方法は、以下の工程を含む：（ｉ）親野生型ウイルスの参照ストックを調製し、（ｉｉ）親野生型ウイルスの参照ストックに感染させた細胞の培養物を、より高い感染多重度（ＭＯＩ）および約３４℃〜約３６℃、好ましくは約３４℃のインキュベーション温度で５回またはそれより多い継代数分、より低いＭＯＩの接種物および完全ＣＰＥを得るための各継代のより短いインキュベーション期間を用いて、各継代で完全細胞変性効果（ＣＰＥ）が得られるまでインキュベーションし、（ｉｉｉ）先の工程の結果生じたウイルスに感染させた細胞培養を、より高いＭＯＩおよび先の工程よりも約１℃〜約３℃低いインキュベーション温度で５回またはそれより多い継代数分、より低いＭＯＩの接種物および完全ＣＰＥを得るための各継代のより短いインキュベーション期間を用いて、各継代で完全細胞変性効果（ＣＰＥ）が得られるまでインキュベーションし、そして（ｉｖ）ウイルスの最適複製のために選択されるターゲット温度が達成されるまで、インキュベーション温度を増分で低下させる体系的な段階的方式で、工程（ｉｉｉ）を反復する。１つの態様において、ターゲット温度は約２６℃〜約２９℃、好ましくは約２８℃である。１つの態様において、増分で低下するインキュベーション温度は、約１℃〜約２℃低下する温度である。
【００３８】
[0038]１つの態様において、親野生型ウイルスの参照ストックは、約３６℃〜約３８℃の温度で、好ましくは約３７℃で、１回または２回の継代分、野生型ウイルスに感染した細胞の培養物を、完全細胞変性効果（ＣＰＥ）が得られるまでインキュベーションすることによって、調製される。産生されるウイルスを含有する培養上清アリコットをバイアルまたは他の適切な保存デバイス中に入れる。この培養上清は、親野生型ウイルスの参照ストックとして働く。参照親野生型ウイルスを、続く弱毒化プロセスに用いる。別の態様において、親野生型ウイルスの参照ストックのアリコットは、適切な温度、例えば−８０℃で保存される。
【００３９】
[0039]１つの態様において、ウイルスが完全細胞変性効果（ＣＰＥ）を得たら直ちに、ウイルスを含有する清澄化された培養上清を得て、そして細胞、例えばＶｅｒｏ細胞の連続する新鮮な新規培養フラスコのそれぞれの中に、この上清を渡すことによって、ウイルスをプロセスの各工程で継代する。別の態様において、ウイルスを含有する培養上清を、より低い温度のインキュベーションへの各々連続した変化の開始時に、２０の、より高い感染多重度（ＭＯＩ）で渡す。接種後３日以内に、Ｖｅｒｏ細胞において、完全ＣＰＥを引き起こすことが可能であることが認識された後、続いて、より低い５〜１０のＭＯＩに減少させる前に、新鮮な集密単層Ｖｅｒｏ細胞を含有する新規培養フラスコに、少なくともさらに３回の継代に渡って、同じＭＯＩのウイルスを接種する。５〜１０のより低いＭＯＩで接種後３日以内に、完全ＣＰＥを引き起こすことが可能であることが認識されたら、５〜１０のＭＯＩで少なくともさらに３回継代させた後、次いで、弱毒化プロセスは、続いてより低いインキュベーション温度の次の相に移る。各継代に必要な日数は、ウイルスがどれだけ迅速に、増分で低下するインキュベーション温度の各相に適応するかに応じる。当業者は、完全ＣＰＥに到達したのがいつか、容易にわかるであろう。
【００４０】
[0040]１つの態様において、ウイルスは任意のウイルスである。別の態様において、ウイルスはＲＮＡウイルスである。さらなる態様において、ＲＮＡウイルスは、プラス鎖ＲＮＡウイルスである。さらなる態様において、ウイルスはピコルナウイルス科のメンバーである。別の態様において、ウイルスはエンテロウイルス属のメンバーである。１つの態様において、ウイルスはエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）である。別の態様において、ウイルスはコクサッキーウイルスＡ１６（ＣＡ１６）である。本発明の方法は、限定されるわけではないが、ＥＶ７１およびＣＡ１６の低温適応温度感受性株を含む、これらのウイルスいずれかの低温適応温度感受性ウイルス株を産生する際に有用である。
【００４１】
[0041]１つの態様において、ウイルスに感染させる細胞は、ウイルスの増殖を可能にする任意の細胞である。好ましい態様において、細胞はＶｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１）である。１つの態様において、細胞は、細胞の増殖に適した培地中での通常の継代によって維持される。細胞がＶｅｒｏ細胞である態様において、Ｖｅｒｏ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養される。１つの態様において、１％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中で維持されたＶｅｒｏ細胞を、親野生型ウイルスの産生、ウイルス培養、弱毒化、力価決定、および温度感受性表現型の評価のために用いる。別の態様において、インキュベーション温度を連続低下させる際に、複製のため、ウイルス株を適応させるために、ＤＭＥＭに１％ＦＣＳを補充する。
【００４２】
[0042]本発明はまた、本明細書記載の方法によって産生されるウイルスの低温適応温度感受性株にも関する。本明細書記載の方法によって産生される低温適応温度感受性ウイルスは、当業者に周知の技術を用いたワクチンの産生に有用である。こうしたワクチンは、当業者に周知の技術を用いて、被験体にワクチンを投与することによって、親ウイルス株に対する免疫を提供するために有用である。
【００４３】
[0043]本発明の方法は、ピコルナウイルス科およびエンテロウイルス属の低温適応温度感受性ウイルスの産生に適用可能である。適用可能性は、本明細書において、増分で低下するインキュベーション温度で、細胞培養中の連続継代後に得られたＥＶ７１（ＴＬＬα）およびＥＶ７１（ＴＬＬβ）の低温適応温度感受性株の産生によって立証されてきている。ＥＶ７１（ＴＬＬβ）株は、特定のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養条件において、表現型的および遺伝的安定性を保持し、そして静脈内接種後、サルにおいて神経毒性を示さない。適用可能性はまた、増分で低下するインキュベーション温度で、細胞培養中の連続継代後に得られた低温適応温度感受性ＣＡ１６の産生によっても立証されてきている。
【００４４】
[0044]本発明はまた、本明細書記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株で、被験体を免疫するためのキットも提供する。該キットは、本明細書記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株、薬学的に許容されうるキャリアー、アプリケーター、および使用のための指示資料を含む。本発明には、当業者に知られるキットの他の態様も含まれる。指示は、本明細書記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス７１株の投与を指示するために有用な、任意の情報を提供可能である。
【００４５】
[0045]本発明の実施は、別に示さない限り、当該技術分野の技術範囲内である、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養およびトランスジェニック生物学の慣用技術を使用する。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，  １９８２，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  １９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）；  ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，  ２００１，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  第３版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）；  ＧｒｅｅｎおよびＳａｍｂｒｏｏｋ，  ２０１２，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  第４版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）；  Ａｕｓｕｂｅｌら，  １９９２，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  定期的改訂を含む）；  Ｇｌｏｖｅｒ，  １９８５，  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ）；  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  １９８４，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｐｌａｎｔｓ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｃｏｕｒｓｅ  ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）；  Ａｎａｎｄ，  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク，  １９９２）；  ＧｕｔｈｒｉｅおよびＦｉｎｋ，  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク，  １９９１）；  ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，  １９８８，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）；  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．  Ｄ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ監修  １９８４）；  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．  Ｄ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ監修  １９８４）；  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  １９８７）；  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８６）；  Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；論文、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎ．Ｙ．）；  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｓ．  １５４および１５５（Ｗｕら監修），  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ監修，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  １９８７）；  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．  Ｍ．  ＷｅｉｒおよびＣ．  Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ監修，  １９８６）；  Ｒｉｏｔｔ，  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  第６版，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  オックスフォード，  １９８８；  Ｆｉｒｅら，  ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｆｒｏｍ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｏ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ケンブリッジ，  ２００５；  Ｓｃｈｅｐｅｒｓ，  ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，  ２００５；  Ｅｎｇｅｌｋｅ，  ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）：  Ｔｈｅ  Ｎｕｔｓ  ＆  Ｂｏｌｔｓ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＤＮＡ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００３；  Ｇｏｔｔ，  ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，  Ｅｄｉｔｉｎｇ，  ａｎｄ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ニュージャージー州トトワ，  ２００４；  Ｓｏｈａｉｌ，  Ｇｅｎｅ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  ＣＲＣ，  ２００４を参照されたい。
【実施例】
【００４６】
[0046]本発明は、以下の実施例に言及することによって記載され、該実施例は、例示のために提供され、そしていかなる方式でも本発明を限定することを意図されない。当該技術分野に周知の標準的技術、または以下に特に記載する技術を利用した。
【００４７】
実施例１
ヒト・エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）の低温適応温度感受性株を発展させるための材料および方法
[0047]細胞、ウイルスおよび低温適応プロセス：１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中の定期的な継代によって維持されたＶｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１）を、ウイルス培養、弱毒化、力価決定および温度感受性表現型の評価に用いた。手足口病（ＨＦＭＤ）を提示した患者の、それぞれ、口腔分泌物、糞便および脳幹標本からＶｅｒｏ細胞において単離された遺伝子型Ｃ１、Ｂ３およびＢ４に属する３つのＥＶ７１単離体を、先に記載される技術にしたがって、１回プラーク精製した（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ、１９６４）。プラーク精製後、Ｖｅｒｏ細胞において３７℃で２回継代した後、それぞれ親野生型株と称されるウイルスストックを調製した。すべてのウイルスストックおよびそれぞれの継代株を、−８０℃フリーザー中で保存した。
【００４８】
[0048]１％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中の若い新鮮な集密単層Ｖｅｒｏ細胞を用いて、３４℃の最初の低いインキュベーション温度から始めて、連続して低下するインキュベーション温度中、複製に関してウイルス株を適応させた。ウイルスが完全細胞変性効果（ＣＰＥ）を達成したら直ちに、Ｖｅｒｏ細胞の連続する新鮮な新規培養フラスコのそれぞれの中に、ウイルスを含有する清澄化された培養上清を渡した。ウイルスを含有する培養上清を、より低い温度のインキュベーションへの各々連続した変化の開始時に、２０の、より高い感染多重度（ＭＯＩ）で渡した。接種後３日以内に、Ｖｅｒｏ細胞において、完全ＣＰＥを引き起こすことが可能であることが認識された後、続いて、より低い５〜１０のＭＯＩに減少させる前に、新鮮な集密単層Ｖｅｒｏ細胞を含有する新規培養フラスコに、さらに３回の継代に渡って、同じＭＯＩでウイルスを接種した。５〜１０のより低いＭＯＩで接種後３日以内に、完全ＣＰＥを引き起こすことが可能であることが認識されたら、少なくともさらに３回継代させた後、次いで、弱毒化プロセスは、次の続いてより低いインキュベーション温度に移った。本実施例において、エンテロウイルス７１の低温適応温度感受性株を発展させるための、連続して増分低下するインキュベーション温度は、３４℃、３２℃、３０℃、２９℃、および２８℃であった。
【００４９】
[0049]ウイルス力価決定：重要でない修飾を伴い、世界保健機構のポリオ実験室マニュアル２００４に記載される方法にしたがって、Ｖｅｒｏ細胞におけるマイクロ力価決定アッセイによって、ウイルス力価を決定し、そしてＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈ（１９３８）の方法にしたがって、ミリリットルあたり５０％細胞培養物感染用量（ＣＣＩＤ５０）としてウイルス力価を計算した。簡潔には、ウイルス凝集物を分散させるため、等体積のクロロホルムでの処理後、１％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中、清澄化ウイルス上清の１０倍連続希釈を作製した。９６ウェル平底組織培養プレート中のＶｅｒｏ細胞単層（ウェルあたり１０４細胞）に、各ウイルスストックの１００μｌの連続希釈を接種し、そして各それぞれのインキュベーション温度で、５％ＣＯ２の周囲環境中で５日間インキュベーションした後、ＣＰＥの存在に関して観察した。
【００５０】
[0050]温度感受性アッセイ：２つのアプローチを用いて、２８℃、３７℃および３９．５℃のインキュベーション温度でのＶｅｒｏ細胞におけるウイルス株の増殖特性を評価した。第一のアプローチは、ウイルス株が、感染細胞において、完全ＣＰＥを引き起こすために要する日数を評価し（複製動力学）、そして第二のアプローチは、各特定の試験温度でインキュベーションした細胞において、ウイルス株の力価を評価した。簡潔には、第一のアプローチにおいて、類似の日齢の集密単層Ｖｅｒｏ細胞を含有する３つのＴ−２５組織培養フラスコの増殖培地を維持培地（１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ）に置き換えた。次いで、それぞれのインキュベーターに１時間入れることによって、各フラスコ中の培地を、試験しようとする明記する温度に平衡化させ、そして続いて、１０感染多重度（ＭＯＩ）の用量のウイルス株を接種した。１０日間の培養終了時にＣＰＥが認められない場合、上清を単層Ｖｅｒｏ細胞の新規フラスコ内に渡し、そして同様にさらに１０日間インキュベーションした。第二の継代後にＣＰＥが認められない場合、ウイルス複製がないと解釈した。第二のアプローチにおいて、１００μｌあたり１０４細胞の密度のＶｅｒｏ細胞懸濁物を、３つの９６ウェル細胞培養プレートの各ウェル内に植え付け、そして３７℃で５％ＣＯ２の周囲環境中、インキュベーションした。次いで、１０時間インキュベーションした後、それぞれのインキュベーターに１時間入れることによって、各細胞培養プレートを、試験しようとする明記する温度に平衡化させた。続いて、各ウェル中の細胞にウイルス株の１０倍連続希釈１００μｌを接種した後、それぞれの温度のインキュベーターに移し、そして５日間インキュベーションした後、ＣＰＥの存在に関して観察した。
【００５１】
[0051]遺伝的安定性および温度感受性アッセイ：明記する培養環境および細胞タイプで培養したウイルス株の遺伝的安定性を評価するため、ウイルス株を、５  ＭＯＩのウイルス接種物で、細胞培養において、さらに２０回継代し、そして２８℃のインキュベーション温度でインキュベーションした。２０回の継代が終了した際、上述のように、２８℃、３７℃および３９．５℃のインキュベーション温度で培養することによって、温度感受性表現型特性に関してウイルス株を評価した。続いて、それぞれのゲノムの完全ヌクレオチド配列を配列決定し、そしてそれぞれの親野生型ウイルスの完全ゲノムに関して分析した。
【００５２】
[0052]安定低温適応温度感受性ウイルス株に対して、温度感受性アッセイの復帰を行った。選択した株を、３７℃の温度で５％ＣＯ２の周囲環境中、単層Ｖｅｒｏ細胞中で５回継代した。各継代で、１０  ＭＯＩのウイルス接種物を用いた。各継代で得たウイルス株を、温度感受性アッセイに関して上述したものと類似の方法によって、２８℃、３７℃および３９．５℃のインキュベーション温度で、Ｖｅｒｏ細胞において増殖特性に関して評価した。３７℃の培養温度の各連続継代でウイルス株の完全ゲノムを配列決定し、そして分析した。
【００５３】
[0053]ＲＮＡ抽出、ＲＴ−ＰＣＲおよび配列決定：商業的に入手可能なウイルスＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を用いて、完全ＣＰＥの感染細胞の培養液から、ウイルスゲノムＲＮＡを抽出した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を用いて、ＥＶ７１特異的プライマーで、第一鎖合成を行い、そして続いて、ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ混合物（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を用いて、１８の縮重プライマー対で、ＰＣＲを行った。ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ配列決定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を用いて、生成された断片を配列決定した。標準的Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、米国）を用いて、５’−コルジセピン・ブロッキング・アダプターＤＴ８８（５’−ＧＡＡ  ＧＡＧ  ＡＡＧ  ＧＴＧ  ＧＡＡ  ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＴＴＴ  ＴＴＧ  Ｇ−コルジセピン−３’；配列番号１）を、ＥＶ７１  ｃＤＮＡの５’端に連結することによって、５’ＲＡＣＥを行って、５’−ＵＴＲウイルス配列を決定し、そしてその後、ＤＴ８８相補的プライマー（５’−ＣＣＡ  ＡＡＡ  ＣＧＣ  ＣＡＴ  ＴＴＣ  ＣＡＣ  ＣＴＴ  ＣＴＣ  ＴＴＣ  ３’；配列番号２）およびＥＶ７１特異的プライマー（５’−ＡＴＴ  ＣＡＧ  ＧＧＧ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＴＡＣ−３’；配列番号３）を用いて、標準的ＰＣＲを行った。３’−ＲＡＣＥもまた行って、オリゴｄＴプライマーを用い、３’−ＵＴＲウイルス配列を決定した（Ｌｉら、２００５）。
【００５４】
[0054]分子クローニングおよびプラスミド精製：多義配列を持つ断片を、ｐＺｅｒｏ−２プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）にクローニングし、そしてＴＯＰ１０大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）内に形質転換した。商業的に入手可能なプラスミド・ミニプレップ・キット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を用いて、各形質転換体の少なくとも１０コロニーから、クローニングしたＥＶ７１断片を含有するプラスミドを抽出し、そして続いて、クローニングした断片の配列を決定した。
【００５５】
[0055]Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（ＥＭＢＯＳＳ；  ｈｔｔｐ：／／ｍｏｂｙｌｅ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｏｒｔａｌ．ｐｙ？＃ｆｏｒｍｓ：：ｍｅｒｇｅｒ）（Ｒｉｃｅら  ２０００）を用いて、得た断片配列を併合した。プログラム、ＢｉｏＥｄｉｔ配列整列エディタｖ．７．０．９．０（Ｈａｌｌ、１９９７）を用いて、併合した配列をＥＶ７１株３７９９−ＳＩＮ−９８の参照配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＤＱ３４１３５４．１）と整列させた。
【００５６】
[0056]サル研究：ＥＶ７１の選択した低温適応温度感受性株（ＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０）の安全性および免疫原性に関するサル研究を、ＤＵＫＥ−ＮＵＳ、シンガポールの動物施設を基盤とする研究者らが請け負った（ｃｏｎｔｒａｃｔｅｄ）。結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびサル免疫不全ウイルスに感染していない７匹のカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ）（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、雌３匹（２２０２Ｆ、２２０７Ｆ、２８９１Ｆ）および雄４匹（０７９１Ｍ、２２４７Ｍ、２８８９Ｍ、２８９０Ｍ）、平均体重３．２３ｋｇ（範囲２．４４〜４．１１、ＳＤ＝０．７）を用いて、安定低温適応温度感受性ＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０の安全性および免疫原性を研究した。ＥＶ７１に対する結合（間接的免疫蛍光）および中和抗体の非存在に関して、７匹のサルすべてをあらかじめスクリーニングした。研究およびすべての動物手技は、ＤＵＫＥ−ＮＵＳ、シンガポールのバイオセイフティおよび動物取り扱いおよび倫理委員会によって認可された。ウイルス接種および観察、動物飼育および剖検は、委員会の指針にしたがって行われた。
【００５７】
[0057]ケタミンでの軽い麻酔下で、１ｍｌのウイルス接種物を右伏在静脈内に静脈内接種した。３匹のサル（２８８９Ｍ、０７９１Ｍおよび２８９１Ｆ）には、サルあたり１０７  ＣＣＩＤ５０でＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０の静脈内用量を投与し、別の３匹（２８９０Ｍ、２２０２Ｆおよび２２４７Ｍ）には各１０８  ＣＣＩＤ５０を投与し、そして７番目のサルは陰性対照として働いた。臨床的疾病、特に神経学的徴候に関して、毎日２回サルを観察し、そして移植温度センサーによって体温を記録した。各サルから糞便を毎日収集し、そして後にウイルス単離するため、マイナス８０℃フリーザー中で保管した。各々異なるウイルス用量の接種物から１匹ずつ、２匹のサルを、接種４日後（ＰＩ）、深い麻酔下で屠殺した。剖検時、組織病理学的およびウイルス学的分析のために、中枢神経系（ＣＮＳ）、非神経組織および血液の多様な部分を収集した。８日ＰＩに、別の類似のセットの２匹のサルを屠殺し、そして剖検時、組織病理学的およびウイルス学的分析のために、同じタイプの組織および血液を収集した。１４日ＰＩ、抗ＥＶ７１抗体の評価のために血液試料を収集した後、残った２匹のサルに、それぞれ、同等のブースター用量のＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０を投与した。ブースター用量を投与した１６日後、これらを安楽死させ、そして剖検時に組織病理学的研究のためにＣＮＳ組織を収集した。
【００５８】
[0058]組織学および免疫組織化学：ＣＮＳ組織標本（大脳、小脳、基底核、脳幹および脊髄）および非神経組織（リンパ節、脾臓、肝臓、腎臓、肺および心臓）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１０％ホルマリンで固定し、そして固定後、パラフィン中に包埋した。脊髄を水平に、頸部で１０回、胸部で８回、そして腰部で１０回、それぞれ切片作製した。パラフィン切片、６μｍ厚を、パラフィン除去および再水和プロセス後、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）で、そしてＬｕｘｏｌ−ｆａｓｔブルー／クレシル・バイオレット（クリューバー−バレラ法）で染色した。
【００５９】
[0059]サルからの抗原検出およびウイルス単離：血液標本を単純およびヘパリン処理試験管の両方で収集した。Ｆｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＴＭ  ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）を用いて、ヘパリン処理血液から、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を採取した。無菌ＰＢＳで２回洗浄した後、商業的検出モノクローナル抗体（カタログ番号３３６０、Ｌｉｇｈｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、米国）を用いた間接的免疫蛍光アッセイによって、ＥＶ７１抗原の検出のため、テフロンコーティングスライドのウェル上に、ＰＢＭＣ懸濁物のアリコットを植え付けた。単層Ｖｅｒｏ細胞を含有する２４ウェル細胞培養プレートのウェル内に、ＰＢＭＣ懸濁物を接種することによって、ウイルス単離を行った。５０μｌおよび１００μｌの血清を、単層Ｖｅｒｏ細胞を含有する２４ウェル培養プレートの各ウェル内に接種することによって、各血清標本上でのウイルス単離を行った。無菌ＰＢＳを２回交換して、サル組織を軽く洗浄し、そしてクラスＩＩバイオセイフティキャビネット内で、乳鉢および乳棒を用いてすりつぶすことによって、組織をホモジナイズした。ＤＭＥＭ中で調製した組織ホモジネート（１０％、ｗ／ｖ）を１０００ｇで１０分間遠心分離することによって清澄化した。清澄化した上清を０．２２ミクロン・シリンジフィルターを通じて濾過し、そして濾液１００μｌおよび２００μｌを接種することによって、ウイルス単離を行った。１０％糞便懸濁物をＰＢＳ中で作製し、そして１０００ｇで１０分間遠心分離することによって清澄化した。０．２２ミクロン・シリンジフィルターを通して濾過した後、１００μｌおよび２００μｌ糞便濾液を接種することによって、ウイルス単離を行った。サル試料に対するすべてのウイルス単離作業を２つ組で行い、接種細胞培養物の１つのセットは２８℃でインキュベーションし、そして他方は３７℃でインキュベーションした。
【００６０】
[0060]分子検出および完全ゲノム配列決定：商業的ウイルスＲＮＡ抽出および精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を用いて、血清、ＰＢＭＣおよび清澄化組織ホモジネートからウイルスゲノムＲＮＡを抽出した。商業的一工程ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）およびすべてのＥＶ７１遺伝子型のＶＰ１遺伝子の近位３番目を増幅するコンセンサス・オリゴヌクレオチド・プライマー対（センス：５’−ＣＡＣＣＣＴＴＧＴＧＡＴＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＡＧ−３’（配列番号４）；アンチセンス：５’−ＧＴＧＡＡＴＴＡＡＧＡＡＣＲＣＡＹＣＧＴＧＴＹＴ−３’（配列番号５））を、組織からの抽出後の分子増幅およびＥＶ７１特異的ウイルスＲＮＡ検出に用いた。ＥＶ７１：ＴＬＬβの完全ゲノム配列に基づく配列特異的プライマー１８対を用いて、４日および８日ＰＩに得た２匹のサルの血清に存在するＥＶ７１の完全ゲノムを増幅し、そして配列決定した。直接配列決定による優れた配列読み取りを生じるのに失敗したＰＣＲ増幅断片は、いずれも、ｐＺｅｒｏ−２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）にクローニングされ、そしてＴＯＰ１０大腸菌に形質転換された。各形質転換体から少なくとも１０のコロニーを選択し、そして挿入物を所持する精製プラスミドに対して、配列決定を行った。
【００６１】
[0061]血清結合および中和抗体アッセイ：遺伝子型Ｂ３のＥＶ７１に感染したＶｅｒｏ細胞を、完全ＣＰＥに近い状態で採取し、そして無菌ＰＢＳで５回洗浄した。最後の洗浄後、感染細胞の懸濁物を、およそ４の感染細胞対１の非感染細胞の比率で、洗浄非感染Ｖｅｒｏ細胞懸濁物と混合した。２５０細胞を含有する１０マイクロリットルの混合細胞懸濁物を、１２ウェル・テフロンコーティングスライドの各ウェル上に注意深く重層し、そして温かいプレート上で乾燥させた。乾燥したスライドを冷アセトン中で１０分間固定し、そして社内抗原として用いて、間接的免疫蛍光アッセイにより、ＩｇＭに関して１：１０、およびＩｇＧに関して１：２０の初期希釈から始めて、ＥＶ７１結合抗体に関してアッセイした。抗ＥＶ７１  ＩｇＭ力価に関するアッセイにおいて、サル血清を適切な濃度のプロテインＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）で処理して、無菌ＰＢＳでの連続２倍希釈を実行する前に、ＩｇＧを除去した。
【００６２】
[0062]重要でない修飾を伴い、世界保健機構のポリオ実験室マニュアル２００４に記載される方法にしたがって、Ｖｅｒｏ細胞を用いたマイクロ中和アッセイによって、サルの中和抗体力価を決定した。中和に用いたＥＶ７１の各遺伝子型の濃度は、１００μｌあたり１００  ＣＣＩＤ５０であった。９６ウェル平底培養プレートを用いて、ウイルス中和アッセイを行った。１：１０希釈から開始して、１００μｌ  ＤＭＥＭ（１％ＦＣＳ）の体積で、各血清試料の連続２倍希釈を２つ組で調製した。１００  ＣＣＩＤ５０  ＥＶ７１を含有するＤＭＥＭ（１％ＦＣＳ）中のウイルス作業ストックの等体積（１００μｌ）を希釈血清の各ウェルに添加して、そして３７℃で２時間インキュベーションした。インキュベーション後、２５０細胞を含有するＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）中の１００μｌのＶｅｒｏ細胞懸濁物を、各ウェルに添加した。９６ウェル培養プレートを注意深く密封し、そして５％ＣＯ２の周囲環境中、３７℃でインキュベーションした。各ウェルにおいて、Ｖｅｒｏ細胞に影響を及ぼすＣＰＥの存在に関して、最長８日目まで、プレートを毎日読み取った。ＣＰＥを示さない最高希釈のウェルによって、各血清試料の中和抗体の力価を決定した。
【００６３】
実施例２
エンテロウイルス７１の低温適応温度感受性株（ＥＶ７１：ＴＬＬα、ＥＶ７１：ＴＬＬαＰ２０、ＥＶ７１：ＴＬＬβ、ＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０およびＥＶ７１：ＴＬＬβＰ４０）の表現型および遺伝子型特性に関する結果
[0063]低温適応株を得るために用いた元来の３つの親ＥＶ７１ウイルスは、１０  ＭＯＩのウイルス接種物および３７．５℃のインキュベーション温度で、接種後３日以内に、Ｖｅｒｏ細胞において、完全ＣＰＥを引き起こした。同じウイルス接種物で、元来の親ＥＶ７１ウイルスは、３９．５℃のインキュベーション温度で５日以内に、Ｖｅｒｏ細胞において、完全ＣＰＥを引き起こした。しかし、３７．５℃で培養したＶｅｒｏ細胞の最初の２回の継代から得られるすべての３つの元来の親ＥＶ７１ウイルスは、１０  ＭＯＩのウイルス接種物および２８℃のインキュベーション温度で、Ｖｅｒｏ細胞において、ＣＰＥを引き起こさなかった。また、２８℃で１０日間の培養終了時、ブラインド継代後に、ＣＰＥはまったく見られなかった。接種されたＶｅｒｏ細胞におけるウイルス複製の非存在は、さらに、間接的免疫蛍光アッセイによる、ＥＶ７１に対する商業的検出モノクローナル抗体を用いた１０日培養終了時に、培養上清液における懸濁された細胞存在の陰性染色によって、さらに裏付けられた。
【００６４】
[0064]インキュベーション温度を連続して低下させる９０回を超える継代の後、３つの継代ＥＶ７１株はすべて、≦５  ＭＯＩのウイルス接種物および２８℃のインキュベーション温度で、接種３日以内に、Ｖｅｒｏ細胞において、完全ＣＰＥを引き起こすことが可能であった。１００回の継代まで、２８℃のインキュベーション温度で、ウイルス株をさらに継代した。１００回の継代時、患者の口腔液、脳幹組織および糞便標本から単離した元来のＥＶ７１由来のウイルス株を、それぞれ、ＥＶ７１：ＴＬＬ、ＥＶ７１：ＴＬＬαおよびＥＶ７１：ＴＬＬβと称した。温度感受性アッセイにおいて、３つの低温適応株はすべて、１０  ＭＯＩのウイルス接種物を用いて、２８℃のインキュベーション温度で、２日以内に、Ｖｅｒｏ細胞において、完全ＣＰＥを引き起こしたが、３７℃のインキュベーション温度では、完全ＣＰＥを達成するのに４日間かかった。３９．５℃のインキュベーション温度で、培養１０日後、３つの株すべてに関して、ＣＰＥはまったく見られなかった。しかし、ＥＶ７１：ＴＬＬは、３９．５℃でインキュベーションしたＶｅｒｏ細胞の新鮮フラスコ内にブラインド継代した後、培養１０日目に、２＋  ＣＰＥを生じた。３９．５℃でインキュベーションしたＶｅｒｏ細胞の新鮮フラスコ内にさらに２回ブラインド継代した後でさえ、ＥＶ７１：ＴＬＬαおよびＥＶ７１：ＴＬＬβに関してＣＰＥはまったく見られなかった。ＥＶ７１：ＴＬＬαまたはＥＶ７１：ＴＬＬβのいずれかを接種され、培養上清から採取された懸濁細胞は、ブラインド継代から得られたものを含めて、各々、１０日間培養終了時に、ＥＶ７１検出モノクローナル抗体での陽性免疫蛍光染色を生じなかった。ＥＶ７１：ＴＬＬを接種した培養上清から採取されたおよそ１％の懸濁細胞は、陽性染色を生じたが、培養１０日後、ＣＰＥはまったく見られなかった。
【００６５】
[0065]２８℃および３７℃のインキュベーション温度を用いて、３つの低温適応株のウイルス複製力価をアッセイし、そしてアッセイを少なくとも４回反復した。ＥＶ７１：ＴＬＬの力価は、それぞれ、２８℃および３７℃で力価決定する培養をインキュベーションした際、１Ｘ１０８  ＣＣＩＤ５０／ｍｌおよび２〜３Ｘ１０７  ＣＣＩＤ５０／ｍｌであった。ＥＶ７１：ＴＬＬαは、２８℃のインキュベーション温度で、１Ｘ１０８  ＣＣＩＤ５０／ｍｌの力価を生じ、そして３７℃で、１〜２Ｘ１０５．５〜６  ＣＣＩＤ５０／ｍｌの力価を生じた。ＥＶ７１：ＴＬＬβは、２８℃のインキュベーション温度で、２〜５Ｘ１０８  ＣＣＩＤ５０／ｍｌの力価を生じ、そして３７℃で、１Ｘ１０７  ＣＣＩＤ５０／ｍｌの力価を生じた。
【００６６】
[0066]ＥＶ７１：ＴＬＬαおよびＥＶ７１：ＴＬＬβの低温適応の安定性を、２８℃のインキュベーション温度および１０  ＭＯＩのウイルス接種物で、Ｖｅｒｏ細胞において、さらに２０回の継代に渡って、両方のウイルス株を継代することによって、評価した。さらに２０回の継代の後、ＥＶ７１：ＴＬＬαは、２日ＰＩ以内に２８℃でインキュベーションした細胞において、完全ＣＰＥを引き起こしたが、２回のブラインド継代の後であっても、３７℃でインキュベーションした細胞において、ＣＰＥを引き起こすのに失敗した。２８℃のインキュベーション温度で、１Ｘ１０８  ＣＣＩＤ５０／ｍｌのウイルス力価を達成する能力を維持した。ＥＶ７１：ＴＬＬβは、さらなる２０回の継代後、２８℃および３７℃のインキュベーション温度両方で、増殖動力学およびウイルス力価に関して、同じ低温適応表現型を維持した。同じ培養条件下で、さらに２０回継代（１００回の継代からさらに４０回の継代）することによって、ＥＶ７１：ＴＬＬβの低温適応の安定性をさらに評価し、そして類似の低温適応温度感受性表現型を維持することが見出された。
【００６７】
[0067]各完全ＣＰＥで、３７℃でインキュベーションしたＶｅｒｏ細胞において、連続６回ウイルスを継代することによって、低温適応温度感受性表現型からの復帰の評価を行った。２８℃、３７℃および３９．５℃のインキュベーション温度での増殖動力学およびウイルス力価に関して、３７℃でインキュベーションしたそれぞれの培養各々から得られるウイルスの増殖特性を表１に示す。ウイルスは、３７℃でインキュベーションした細胞において、３回連続継代後、３９．５℃のインキュベーション温度で、Ｖｅｒｏ細胞において、生存感染粒子を産生することが不可能なままであり（陽性免疫蛍光染色細胞を欠き）、そして６回目の反復継代で、３９．５℃のインキュベーション温度で、細胞培養物において、完全ＣＰＥを引き起こすことが不可能なままであった。
【００６８】
表１
３７℃でインキュベーションしたＶｅｒｏ細胞を６回連続継代した後のＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０の低温適応温度感受性表現型からの復帰の評価
【００６９】
【表１】
2016511634.tif 000003
【００７０】
増殖特性および各継代でのウイルスの力価を、Ｖｅｒｏ細胞において、２８℃、３７℃および３９．５℃のインキュベーション温度で、培養するかまたは力価決定した。
【００７１】
Ｐ１：継代１
ＩＦＡ：間接的免疫蛍光アッセイ
[0068]ＥＶ７１：ＴＬＬαおよびＥＶ７１：ＴＬＬβ、さらに２０回継代した後のそれぞれの株（ＥＶ７１：ＴＬＬαＰ２０およびＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０）および元来の親野生型の完全ゲノムを配列決定し、そして分析した。ＥＶ７１：ＴＬＬαＰ２０のヌクレオチド配列を配列番号６に示す。ＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０のヌクレオチド配列を配列番号７に示す。ＥＶ７１：ＴＬＬα、ＥＶ７１：ＴＬＬαＰ２０および元来の親野生型の間の遺伝子各セグメントでのヌクレオチド変化の数を表２に示す。元来の親野生型、ＥＶ７１：ＴＬＬβ、ＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０およびＥＶ７１：ＴＬＬβＰ４０（さらなる４０継代）の間のヌクレオチド変化の数を表３に示す。３７℃のインキュベーション温度での６回の連続継代による温度感受性復帰研究から得られるウイルス株の完全ゲノムもまた配列決定し、そしてＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０のものに比較したヌクレオチド変化の数を表４に示す。
【００７２】
表２
元来の親野生型ウイルスの完全ゲノムと比較した、ＥＶ７１：ＴＬＬαおよびＥＶ７１：ＴＬＬαＰ２０のゲノムセグメント各々で生じる、ヌクレオチド（ＮＴ）および対応するアミノ酸（ＡＡ）突然変異の数
【００７３】
【表２】
2016511634.tif 000004
【００７４】
表３
元来の親野生型ウイルスのゲノムと比較した、ＥＶ７１：ＴＬＬβ、ＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０およびＥＶ７１：ＴＬＬβＰ４０のゲノムセグメント各々で生じる、ヌクレオチド（ＮＴ）および対応するアミノ酸（ＡＡ）突然変異の数
【００７５】
【表３】
2016511634.tif 000005
【００７６】
表４
ＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０のゲノムと比較した、温度感受性復帰研究由来のウイルス株のゲノムセグメント各々で生じる、ヌクレオチド（ＮＴ）および対応するアミノ酸（ＡＡ）突然変異の数
【００７７】
【表４】
2016511634.tif 000006
【００７８】
実施例３
ヒト・エンテロウイルス７１の低温適応温度感受性株（ＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０）のサル研究に関する結果
[0069]臨床的知見：研究したサルの臨床状態および体温測定に関する一般的な観察を１日２回、朝および夕方に行った。全体を通して、すべてのサルは、活発であり、そして正常に摂食しているとわかった。いずれのサルも、いかなるわずかな局所神経学的欠陥、例えば脚弱、振戦または異常な運動も発展させなかった。１Ｘ１０８  ＣＣＩＤ５０／ｍｌの静脈内用量を投与された１匹のサル（２２４７Ｍ）が接種３日後に一過性の低等級の発熱（３９．３℃）を示したことを除いて、こうした事例はなかった。サルが深い麻酔下で屠殺される時点まで、再体重測定に際して、体重喪失したサルはいなかった。
【００７９】
[0070]剖検および組織学的知見：全体の死後病変は、剖検時、すべてのサルに関して見られなかった。異常な組織学的知見は、組織病理検査のために収集したすべてのサル組織に関して見られなかった。
【００８０】
[0071]ウイルス学的研究：サル血清、ＰＢＭＣ、糞便試料およびすべての剖検組織に対し、２８℃および３７℃のインキュベーション温度で、Ｖｅｒｏ細胞を用いて、ウイルス単離を行った。培養１０日後、ブラインド継代にもかかわらず、サル試料のいずれからもウイルスは単離されなかった。ＲＴ−ＰＣＲによってＥＶ７１に関して陽性の試験結果を得た血清、ＰＢＭＣ試料および組織ホモジネートに関して、Ｖｅｒｏ細胞においてさらに１回のブラインド継代を行った。ウイルス単離には失敗したが、商業的モノクローナル抗体を用いた間接的免疫蛍光アッセイ（図１ａ）によって、４日ＰＩに収集した、２匹のサル、２８９１Ｆ（ＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０の１Ｘ１０７  ＣＣＩＤ５０を投与）および２８９０Ｍ（ＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０の１Ｘ１０８  ＣＣＩＤ５０を投与）のヘパリン処理血液から得たいくつかのＰＢＭＣにおいて、ＥＶ７１抗原が検出された。８日ＰＩに収集したサルのヘパリン処理血液から採取したＰＢＭＣには、ウイルス抗原は検出されなかった。
【００８１】
[0072]ＲＴ−ＰＣＲによって、４日および８日ＰＩの両方に収集したすべてのサルの血清試料において、ＥＶ７１特異的ゲノム配列が検出された。非神経組織のうち、ＥＶ７１ゲノム配列が、２匹のサル（２２０２Ｆおよび２８９１Ｆ）の脾臓ホモジネート中にのみ検出された（図１ｂ）。神経組織ホモジネートのいずれにも、ＥＶ７１ゲノム配列は検出されなかった。４日および８日ＰＩの両方に収集した２匹のサル（２８８９Ｍおよび２８９０Ｍ）の血清試料に存在するＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０のゲノムを抽出し、そして完全に配列決定した。ＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０のゲノムと比較した、血清に存在するウイルス株のゲノムセグメント各々に生じるヌクレオチド（ＮＴ）および対応するアミノ酸（ＡＡ）突然変異または復帰の数を表５に示す。
【００８２】
表５
ＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０の完全ゲノムと比較した、４日および８日ＰＩに収集した２匹のサル（２８８９Ｍおよび２８９０Ｍ）の血清試料中に存在するＥＶ７１のゲノムセグメント各々で生じる、ヌクレオチド（ＮＴ）および対応するアミノ酸（ＡＡ）突然変異の数
【００８３】
【表５】
2016511634.tif 000007
【００８４】
[0073]サル体液性免疫反応：静脈内ＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０を投与されたサル血清における結合抗体（ＩｇＭおよびＩｇＧ）の存在に関するアッセイを、抗原として社内調製感染Ｖｅｒｏ細胞を用いた間接的免疫蛍光アッセイによって実行した。同等の静脈内ブースター用量を投与する前に、１４日ＰＩに、そして３０日ＰＩ（ブースターの１６日後）に収集した２匹の残りのサル（２８８９Ｍおよび２８９０Ｍ）の血液中に存在する抗ＥＶ７１  ＩｇＭおよびＩｇＧの力価を表６に示す。
【００８５】
表６
抗原として社内調製感染Ｖｅｒｏ細胞を用いた間接的免疫蛍光アッセイによって決定した際の、静脈内ＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０を投与した後のサルの結合抗体（ＩｇＭおよびＩｇＧ）の力価
【００８６】
【表６】
2016511634.tif 000008
【００８７】
[0074]マイクロ中和アッセイによって、ＥＶ７１遺伝子型Ａ（ＢｒＣｒ）、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｃ１およびＣ５に対する、１４日および３０日ＰＩに収集した２匹のサルの血清試料における中和抗体力価を決定した。ＥＶ７１遺伝子型各々に対するサル血清の中和抗体のそれぞれの力価を表７に示す。
【００８８】
表７
マイクロ中和アッセイによって決定した際の、静脈内ＥＶ７１：ＴＬＬβＰ２０を投与した後の、２匹のサルの血清におけるＥＶ７１のいくつかの遺伝子型（Ａ、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｃ１およびＣ５）に対する中和抗体の力価。
【００８９】
【表７】
2016511634.tif 000009
【００９０】
実施例４
ヒト・コクサッキーウイルスＡ１６の低温適応温度感受性株を発展させるための材料および方法
[0075]材料および方法：１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中の定期的な継代によって維持されたＶｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１）を、コクサッキーウイルスＡ１６のウイルス培養、弱毒化、力価決定および温度感受性の評価に用いた。弱毒化プロセスのための親野生型コクサッキーウイルスＡ１６（ＣＡ１６）は、手足口病（ＨＦＭＤ）を有する患者の口腔分泌物から得られる。該ウイルスは、先に記載する技術にしたがって、１回プラーク精製された。プラーク精製後、Ｖｅｒｏ細胞において３７℃で２回継代した後、それぞれ親野生型株と称されるウイルスストックを調製した。すべてのウイルスストックおよびそれぞれの継代株を、−８０℃フリーザー中で保存した。
【００９１】
[0076]１％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中の若い新鮮な集密単層Ｖｅｒｏ細胞を用いて、３４℃の最初のより低いインキュベーション温度から始めて、連続して低下する温度中、複製に関して元来の野生型ＣＡ１６を適応させた。完全細胞変性効果（ＣＰＥ）時に、Ｖｅｒｏ細胞各連続新規培養フラスコ内への継代を行った。連続してより低いインキュベーション温度に変化させる際に、２０の、より高い感染多重度（ＭＯＩ）で継代して、そして接種後３日以内に、完全ＣＰＥを引き起こすことが可能であることが認識された後、少なくともさらに３回継代した後、続いて、より低い５〜１０のＭＯＩに減少させた。５〜１０のＭＯＩで接種後３日以内に、完全ＣＰＥを引き起こすことが可能であることが認識されたら、少なくともさらに３回継代した後、続いて連続して低いインキュベーション温度に移った。各連続継代の培養上清を、後日、分析のため、マイナス８０℃フリーザー中に保存した。
【００９２】
[0077]ウイルス力価決定：重要でない修飾を伴い、世界保健機構のポリオ実験室マニュアル２００４に記載される方法にしたがって、Ｖｅｒｏ細胞におけるマイクロ力価決定アッセイによって、ウイルス力価を決定し、そしてＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈ（１９３８）の方法にしたがって、ミリリットルあたり５０％細胞培養物感染用量（ＣＣＩＤ５０）としてウイルス力価を計算した。簡潔には、ウイルス凝集物を分散させるため、等体積のクロロホルムでの処理後、１％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中、清澄化ウイルス上清の１０倍連続希釈を作製した。９６ウェル平底組織培養プレート中のＶｅｒｏ細胞単層（ウェルあたり１０４細胞）に、各ウイルスストックの１００μｌの連続希釈を接種し、そして各それぞれのインキュベーション温度で、５％ＣＯ２の周囲環境中で５日間インキュベーションした後、ＣＰＥの存在に関して観察した。
【００９３】
[0078]温度感受性アッセイ：２つのアプローチを用いて、２８℃、３７℃および３９．５℃のインキュベーション温度でのＶｅｒｏ細胞における低温適応ウイルス株の増殖特性を評価した。第一のアプローチは、ウイルス株が、感染細胞において、完全ＣＰＥを引き起こすために要する日数を評価し（複製動力学）、そして第二のアプローチは、各特定の試験温度でインキュベーションした細胞において、ウイルス株の力価を評価した。簡潔には、第一のアプローチにおいて、類似の日齢の集密単層Ｖｅｒｏ細胞を含有する３つのＴ−２５組織培養フラスコの増殖培地を維持培地（１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ）に置き換えた。次いで、それぞれのインキュベーターに１時間入れることによって、各フラスコ中の培地を、試験しようとする明記する温度に平衡化させ、そして続いて、１０感染多重度（ＭＯＩ）の用量のウイルス株を接種した。１０日間の培養終了時にＣＰＥが認められない場合、上清を単層Ｖｅｒｏ細胞の新規フラスコ内に渡し、そして同様にさらに１０日間インキュベーションした。第二の継代後にＣＰＥが認められない場合、ウイルス複製がないと解釈した。第二のアプローチにおいて、１００μｌあたり１０４細胞の密度のＶｅｒｏ細胞懸濁物を、３つの９６ウェル細胞培養プレートの各ウェル内に植え付け、そして３７℃で５％ＣＯ２の周囲環境中、インキュベーションした。次いで、１０時間インキュベーションした後、それぞれのインキュベーターに１時間入れることによって、各細胞培養プレートを、試験しようとする明記する温度に平衡化させた。続いて、各ウェル中の細胞にウイルス株の１０倍連続希釈１００μｌを接種した後、それぞれの温度のインキュベーターに移し、そして５日間インキュベーションした後、ＣＰＥの存在に関して観察した。
【００９４】
実施例５
ヒト・コクサッキーウイルスＡ１６の低温適応温度感受性株の細胞におけるウイルス特性に関する結果
[0079]インキュベーション温度を連続して低下させる１００回の継代時に、低温適応ＣＡ１６株は、≦５ＭＯＩのウイルス接種物および２８℃のインキュベーション温度で、接種３日以内に、Ｖｅｒｏ細胞において、完全ＣＰＥを引き起こすことが可能であったが、３７℃のインキュベーション温度では、完全ＣＰＥを達成するのに４日間かかった。３９．５℃のインキュベーション温度では、ＣＰＥはまったく見られなかった。
【００９５】
[0080]２８℃および３７℃のインキュベーション温度を用いて、ＣＡ１６の低温適応温度感受性株のウイルス複製力価をアッセイした。ＣＡ１６の低温適応温度感受性株の力価は、それぞれ、２８℃および３７℃で力価決定培養プレートをインキュベーションした際、１Ｘ１０８  ＣＣＩＤ５０／ｍｌおよび１Ｘ１０７  ＣＣＩＤ５０／ｍｌであった。
【００９６】
[0081]本発明を説明する背景において（特に、以下の請求項の背景において）、用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに類似の参照対照の使用は、本明細書に別に示されるか、または背景によって明らかに矛盾しているのでない限り、単数形および複数形の両方を含むと見なされるものとする。用語「含む」、「有する」、「含まれる」および「含有する」は、別に示さない限り、無制限の（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ）用語と見なされるものとする（すなわち「限定されるわけではないが含む」を意味する）。本明細書の値の範囲の列挙は、本明細書に別に示さない限り、範囲内に属する各別個の値に個々に言及する簡略化法として働くよう意図され、そして各別個の値は、本明細書に個々に言及されるかのように、本明細書内に取り込まれる。例えば、範囲１０〜１５が開示された場合、１１、１２、１３、および１４もまた開示される。本明細書記載のすべての方法は、本明細書に別に示さない限り、または背景によって明らかに矛盾しているのではない限り、任意の適切な順で、実行可能である。本明細書に提供するあらゆる例、または例示的な言い方（例えば「例えば」）の使用は、単に、本発明の理解をより容易にすることを意図し、そして別に請求しない限り、本発明の範囲に対して限定を課さない。本明細書における言い方のいずれも、任意の非請求要素が、本発明の実施に必須のものであることを示すとは見なされないものとする。
【００９７】
[0082]多様な態様の形で、本発明の方法および組成物を取り込み可能であり、わずかにいくつかのみが本明細書に開示されていることが認識されるであろう。本発明の態様を本明細書に記載し、これには、本発明を実行するため、本発明者らに知られる最適な様式が含まれる。これらの態様の変型は、前述の説明を読むと、一般の当業者には明らかとなりうる。本発明者らは、当業者が、こうした変型を適切に使用することを予期し、そして本明細書に特に記載するものとは異なって本発明が実施されることを意図する。したがって、本発明には、適用可能な法律によって許可されるような、付随する請求項に列挙される主題のすべての修飾および同等物が含まれる。さらに、本明細書に別に示さない限り、または背景によって明らかに矛盾しない限り、すべてのありうる変型における上述の要素の任意の組み合わせが本発明に含まれる。
【００９８】
参考文献一覧
【００９９】
【化１−１】
2016511634.tif 000010
【０１００】
【化１−２】
2016511634.tif 000011
【０１０１】
【化１−３】
2016511634.tif 000012
【０１０２】
【化１−４】
2016511634.tif 000013
【０１０３】
【化１−５】
2016511634.tif 000014
【図１ａ】
2016511634.tif 000015
【図１ｂ】
2016511634.tif 000016
【配列表】
2016511634000001.xml
【国際調査報告】
2016511634.tif 000026
2016511634.tif 000027
2016511634.tif 000028
2016511634.tif 000029
2016511634.tif 000030
2016511634.tif 000031