(57)【要約】本発明は、緑茶種子由来の２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３成分を有効成分として含有する抗酸化又は皮膚美白用組成物に係り、更に詳しくは、酸、塩基、酵素、又は前記酵素を産生する微生物を用いた分解反応を通じて緑茶種子抽出物から得られた緑茶種子由来の２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３成分を有効成分として含有することにより、優れた抗酸化及び皮膚美白効能が奏される組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１で表わされる２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を有効成分として含有する抗酸化用皮膚外用剤組成物。
【化１】
2016528204.tif 000007
【請求項２】
下記化学式１で表わされる２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を有効成分として含有する皮膚美白用皮膚外用剤組成物。
【化２】
2016528204.tif 000008
【請求項３】
前記２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３は、組成物の総重量に対して０．０００１〜１０重量％含有される請求項１又は２に記載の皮膚外用剤組成物。
【請求項４】
前記２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３は、緑茶種子由来のものである請求項１又は２に記載の皮膚外用剤組成物。
【請求項５】
前記２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３は、緑茶種子抽出物を酸、塩基、酵素又は前記酵素を産生する微生物を用いて分解させて得られる請求項４に記載の皮膚外用剤組成物。
【請求項６】
下記化学式１で表わされる２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を有効成分として含有する皮膚外用剤組成物の抗酸化用としての用途。
【化３】
2016528204.tif 000009
【請求項７】
下記化学式１で表わされる２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を有効成分として含有する皮膚外用剤組成物の皮膚美白用としての用途。
【化４】
2016528204.tif 000010
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、緑茶種子由来の２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３成分を有効成分として含有する抗酸化又は皮膚美白用組成物に係り、更に詳しくは、酸、塩基、酵素、又は前記酵素を産生する微生物を用いた分解反応を通じて緑茶種子抽出物から得られた緑茶種子由来の２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３成分を有効成分として含有することにより、優れた抗酸化及び皮膚美白効能が奏される組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
人間の皮膚は、年をとるにつれて種々の内的・外的要因により変化を経る。すなわち、内的には新陳代謝を調節する各種のホルモンの分泌が減少して、免疫細胞の機能と細胞の活性が低下して生体に必要な免疫タンパク質及び生体構成タンパク質の生合成が減り、外的にはオゾン層の破壊により太陽光線のうち地表に達する紫外線の含量が増加して、環境汚染が一層激しくなることに伴い自由ラジカル及び活性有害酸素などが増加することにより、その結果、皮膚に種々の問題が生じる。安定した状態で存在していた酸素が酵素、還元代謝、化学薬品、公害物質、光化学反応などの環境的及び生化学的な要因などによりスーパーオキシド陰イオンラジカル（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ ｒａｄｉｃａｌ、Ｏ２−）、ヒドロキシルラジカル（ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｒａｄｉｃａｌ、ＯＨ・）、過酸化水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ、Ｈ２Ｏ２）、一重項酸素（ｓｉｎｇｌｅｔ ｏｘｙｇｅｎ、１Ｏ２）など反応性が大きな活性酸素（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ：ＲＯＳ）に切り換わると、人体の細胞構成成分であるタンパク質、脂質及びＤＮＡなどを非可逆的に破壊する。このような活性酸素の作用は、体内防御機構であるスーパーオキシドディスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ：ＳＯＤ）、カタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）、ペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）などの抗酸化性酵素、及びビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＥ（トコフェロール）などの抗酸化物質の作用により極力抑えられる。しかしながら、このような生体防御力に異常が生じたり、過度な活性酸素にさらされたりする場合には、残余又は過剰の活性酸素が生体に致命的な酸素毒性を引き起こし、細胞構成成分である脂質、タンパク質、糖、ＤＮＡなどに対して非選択的、非可逆的な破壊を誘導して老化はもとより、癌をはじめとして腦卒中、パーキンソン病などの脳疾患、心臓疾患、虚血、動脈硬化、皮膚疾患、消化器疾患、炎症、リウマチ関節炎、自己免疫疾患などの各種の疾病を引き起こすことが知られている（Ｃｒｏｓｓら、Ａｎｎ．  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｍｅｄ．，  １９８７，  １０７，  ５２６；  Ａｌｄｅｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９８８，８５，  ２７０６）。
【０００３】
天然抗酸化剤の開発のために数多くの天然物由来の原料への取り組みが行われてきたが、ほとんどの天然物由来の原料は単なる抽出物の形として用いられ、これらの抽出物が示す効能が正確にどのような物質によるものであるかが判明されず、経験及び口伝により化粧料などに用いられているのが現状である。
【０００４】
一方、人間の皮膚色を決定するのに種々の要因が与るが、中でも、メラニン色素を作るメラノサイト（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）の活動性、血管の分布、皮膚の厚さ及びカロチノイド、ビリルビンなどの人体内外の色素含有の有無などの要因が重要である。
【０００５】
特に、最も重要な要因は、人体内のメラノサイトにおいてチロシナーゼなどの種々の酵素が働いて生成されるメラニンという黒色色素である。このメラニン色素の形成には、遺伝的要因、ホルモン分泌、ストレスなどに関する生理的な要因及び紫外線の照射などの環境的な要因などが影響を及ぼす。
【０００６】
身体皮膚のメラニン細胞において生成されるメラニン色素は、黒い色素とタンパク質との複合体の形を有するフェノール系高分子物質であり、太陽から照射される紫外線を遮断して真皮以下の皮膚器官を保護するとともに、皮膚生体内に生じた自由ラジカルなどを捕捉するなど、皮膚内のタンパク質及び遺伝子を保護する有用な役割を果たす。
【０００７】
このように皮膚の内外部のストレス的な刺激により生じたメラニンは、ストレスが消えても皮膚の角質化により外部に排出されるまでは消えない安定的な物質である。しかしながら、メラニンが過剰に生成されると、染みやそばかす、斑点などの過色素の沈着症を引き起こして、美容上によくない結果を来たしてしまう。
【０００８】
また、レジャー人口の増加に伴い外部において活動することを楽しむ人々が増え、これに伴い、紫外線によるメラニン色素の沈着を防ごうとするニーズが増えるようになった。
【０００９】
このようなニーズに応えるために、従来よりアスコルビン酸、麹酸、アルブチン、ヒドロキノン、グルタチオン若しくはこれらの誘導体、又はチロシナーゼ阻害活性を有する物質を化粧料や医薬品に配合して用いてきたが、これらの不十分な美白効果、皮膚に対する安全性の問題、化粧料に配合したときに現れる剤形及び安定性の問題などによりその使用が制限されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明者らは、前記問題を解決し、より優れた抗酸化及び皮膚美白効果を示す物質を発見するために鋭意努力したところ、緑茶種子抽出物から酸、塩基、酵素又は前記酵素を生成する微生物を用いた分解反応を通じて得られた２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３成分が優れた抗酸化及び皮膚美白効果を奏することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
したがって、本発明は、緑茶種子抽出物から得られた２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３成分を含有する抗酸化又は皮膚美白用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上述した目的を解決するために、本発明は、２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を有効成分として含有する抗酸化用皮膚外用剤組成物を提供する。
【００１３】
また、本発明は、２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を有効成分として含有する皮膚美白用皮膚外用剤組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明における２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３は、ＤＰＰＨ及びＲＯＳの生成の抑制などの抗酸化効果を示すとともに、メラニンの生成を抑え、紫外線（ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｒａｙｓ；ＵＶ）により生成された色素の沈着を改善する効果に起因する優れた皮膚美白効果を示す。したがって、本発明による２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３は、抗酸化、皮膚美白用化粧料組成物又は薬学組成物などの皮膚外用剤組成物、又は食品組成物として非常に有効に使用可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、下記化学式１で表わされる２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３（２１−Ｏ−ａｎｇｅｌｏｙｌｔｈｅａｓａｐｏｇｅｎｏｌ  Ｅ３）を有効成分として含有する組成物を提供する。
【００１６】
【化１】
2016528204.tif 000002
【００１７】
前記２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３は、好ましくは、緑茶種子由来のものである。
【００１８】
本発明において用いられる２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３は、植物から水又は有機溶媒を用いてサポニン粗抽出物を得る第１の段階、及び前記抽出物を酸、塩基、酵素又は前記酵素を産生する微生物を用いて加水分解して２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を分離する第２の段階を含む方法により製造することができる。
【００１９】
［第１の段階：サポニン粗抽出物の収得］
植物、特に、緑茶種子からサポニン粗抽出物を得る。このとき、抽出溶媒としては、水又は有機溶媒が使用可能であり、有機溶媒としては、エタノール、メタノール、ブタノール、エーテル、エチルアセテート及びクロロホルムよりなる群から選ばれるいずれか一種以上の有機溶媒、又はこれらと水との混合物、好ましくは、５０％のエタノールが使用可能である。
【００２０】
植物から水又は有機溶媒を用いてサポニン粗抽出物を得るために、植物に約１〜６倍、好ましくは、約３倍の水又は有機溶媒を入れ、常温で１〜５回攪拌しながら抽出して脱脂させる。脱脂された植物に約１〜８倍、好ましくは、約４倍の水又は有機溶媒を入れ、１〜５回還流抽出した後、１０〜２０℃で１〜３日間浸漬させる。次いで、ろ過及び遠心分離を用いて残渣及びろ液を分離し、分離されたろ液を減圧濃縮して得たエキスを水に懸濁した後、エーテルなどを用いて色素を除去する。水層を有機溶媒を用いて１〜５回抽出した後、得られた有機溶媒層を減圧濃縮して有機溶媒エキスを得た後、これを少量のメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどに溶かす。次いで、大量のエチルアセテート、アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）などを追加して生成された沈殿物を乾燥させて、本発明のサポニン粗抽出物を得る。
【００２１】
［第２の段階：２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３の分離］
前記第１の段階において得たサポニン粗抽出物を加水分解して２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を分離し、加水分解は、酸、塩基、酵素又は前記酵素を産生する微生物を用いて行うことができる。
【００２２】
前記酸としては、塩酸、硫酸及び硝酸よりなる群から選ばれるいずれか一種以上の酸、又はこれらの酸とエタノール、メタノール及びブタノールよりなる群から選ばれるいずれか一種以上のアルコールとの混合溶媒、好ましくは、５０％エタノールとの混合溶媒が使用可能である。
【００２３】
酸を用いて加水分解を行う場合、サポニン粗抽出物に０．１〜２Ｎ、好ましくは、１Ｎの濃度の酸、又は酸とアルコールとの混合溶媒を１〜１０％の量で加えた後、５０〜１００℃、好ましくは、８０℃の水浴槽において０．５〜８時間、好ましくは、１時間加熱還流させる。
【００２４】
前記塩基としては、ナトリウムメトキシド、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムよりなる群から選ばれるいずれか一種以上の塩基、又はこれらの塩基とエタノール、メタノール及びブタノールよりなる群から選ばれるいずれか一種以上のアルコールとの混合溶媒、好ましくは、５０％ブタノールとの混合溶媒が使用可能である。
【００２５】
塩基を用いて加水分解を行う場合、サポニン粗抽出物を水又は水とエタノールとの混合溶媒に溶かした後、０．１〜２Ｎ、好ましくは、１Ｎの濃度の塩基、又は塩基とアルコールとの混合溶媒を１〜１０％の量で加えた後、５０〜１００℃、好ましくは、１００℃の水浴槽において０．５〜２４時間、好ましくは、１２時間加熱還流させる。
【００２６】
前記酵素は、糖結合を分解する酵素であり、緑茶サポニンの糖部分を除去して２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を生成することを特徴とする。この酵素としては、商業的に市販中のものを用いるか、又は必要に応じて製造して用い、特に、前記酵素を産生する微生物から得られる。
【００２７】
また、前記酵素としては、更に好ましくは、グルコシダーゼ（ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）、アラビノシダーゼ（ａｒａｂｉｎｏｓｉｄａｓｅ）、ラムノシダーゼ（ｒｈａｍｎｏｓｉｄａｓｅ）、キシロシダーゼ（ｘｙｌｏｓｉｄａｓｅ）、セルラーゼ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）、ヘスペリジナーゼ（ｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎａｓｅ）、ナリンギナーゼ（ｎａｒｉｎｇｉｎａｓｅ）、グルクロニダーゼ（ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）、ペクチナーゼ（ｐｅｃｔｉｎａｓｅ）、ガラクトシダーゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）及びアミログルコシダーゼ（ａｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）よりなる群から選ばれるいずれか一種以上が使用可能である。
【００２８】
更に、前記酵素を産生する微生物としては、アスペルギルス（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バチルス（ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、リゾプス（ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、リゾムコール（ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属、タラロマイセス（ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ビフィドバクテリウム（ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、モルティエレラ（ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、クリプトコッカス（ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、マイクロバクテリウム（ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、 リューコノストック（ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属及びラクトバチルス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属よりなる群から選ばれるいずれか一種以上が使用可能である。
【００２９】
酵素を用いて加水分解を行う場合、サポニン粗抽出物を５〜２０倍、好ましくは、約１０倍の酸性緩衝溶液に溶解させた後、酵素を０．００１〜１０％の量で添加する。これを約２５〜３７℃の水浴上において約４０〜５５時間、好ましくは、約４８時間攪拌しながら、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認して基質が完全に消失すると、熱水（８０〜１００℃）中において５〜１５分間加熱して反応を終える。
【００３０】
微生物を用いて加水分解を行う場合、サポニン粗抽出物を５〜１０倍、好ましくは、約１０倍のイオン水に溶解させた後、１２１℃で３０分間滅菌して３０℃まで冷却させる。次いで、予め培養された微生物を液体量に対して５〜１０重量％接種し、２０〜３０℃で２〜５日間、好ましくは、５日間培養させた後、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認して基質が完全に消失すると、培養液を５，０００〜１０，０００ｒｐｍにて遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄した後に、遠心分離して沈殿物を得る。
【００３１】
上述したように、酸、塩基、酵素又は前記酵素を産生する微生物を用いて加水分解した後、反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にアルコールを加えて１〜５回攪拌する。次いで、沈殿した塩をろ過して除去し、ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得る。
【００３２】
本発明の組成物は、上述した方法を用いて製造可能な２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を組成物の総重量に対して０．０００１〜１０重量％の量で含有する。含有量が０．０００１重量％未満であれば、前記成分による抗酸化又は皮膚美白効果が得られず、含有量が１０重量％を超えても、含有量の増加に比べて効果の増加が大きくない。
【００３３】
本発明の組成物は、抗酸化組成物として使用可能であり、ＤＰＰＨ及びＲＯＳの生成の抑制効能に優れている
【００３４】
また、本発明の組成物は、皮膚美白用組成物として使用可能であり、メラニンの生成を抑え、紫外線により生成された色素の沈着を改善する効能に優れている。
【００３５】
本発明の組成物は、化粧品学又は皮膚科学的に許容可能な媒質又は基剤を含有して化粧料組成物又は薬学組成物に剤形化される。これは、局所適用に適したあらゆる剤形であり、例えば、溶液、ゲル、固体、練り物無水生成物、水相に油相を分散させて得た乳液、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、微細顆粒球又はイオン型（リポソーム）及び非イオン型の小嚢分散剤の形で、又はクリーム、スキン、ローション、パウダー、軟膏、スプレー又はコンシールスティックの形で提供される。なお、フォーム（ｆｏａｍ）の形で、又は圧縮された推進剤を更に含有するエアロゾル組成物の形で使用可能である。これらの組成物は、当該分野における通常の方法により製造される。
【００３６】
また、本発明の組成物は、脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤、ゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤（ｆｏａｍｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型若しくは非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤、キレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル、染料、顔料、親水性若しくは親油性活性剤、脂質小嚢又は化粧品に一般的に用いられる任意の他の成分などの化粧品学若しくは皮膚科学分野において一般的に用いられる補助剤を含有することができる。前記補助剤は、化粧品学又は皮膚科学分野において一般的に用いられる量で取り込まれる。
【００３７】
更に、本発明の組成物は、抗酸化又は皮膚美白効果を増大させるために、皮膚吸収促進物質を含有することができる。
【００３８】
更にまた、本発明の組成物は、食品組成物に剤形化され、例えば、各種の食品類、飲料、ガム、茶・ビタミン複合剤、健康機能性食品類及び様々な食品添加剤の形に剤形化され得る。
【００３９】
本発明の食品組成物は、指示された割合にて必須成分としての２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を含有する以外には、他の成分に特に制限はなく、通常の飲料のように種々の香味剤又は天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。上述した天然炭水化物の例としては、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖など；ジサッカライド、例えば、マルトース、スクロースなど；及びポリサッカライド、例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどの通常の糖及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールが挙げられる。上述したもの以外の香味剤として、天然香味剤〔タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシドＡ、グリチルリチンなど）〕及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）が好適に用いられる。前記天然炭水化物の割合は、これに限定されないが、本発明の組成物１００ｍｌ当たりに、一般的に、約１〜２０ｇ、好ましくは、約５〜１２ｇである。
【００４０】
また、本発明の食品組成物は、本発明が目的とする主効果を損なわない範囲内において主効果に相乗効果を与える他の成分などを含有することができる。例えば、物性の改善のために、香料、色素、殺菌剤、酸化防止剤、防腐剤、保湿剤、粘増剤、無機塩類、乳化剤及び合成高分子物質などの添加剤を更に含むことができる。これらに加えて、水溶性ビタミン、油溶性ビタミン、高分子ペプチド、高分子多糖及び海藻エキスなどの補助成分を更に含むこともできる。これらの成分は、剤形又は使用目的に応じて、当業者が手軽に選定して配合し、その添加量は、本発明の目的及び効果を損なわない範囲内において選ばれる。例えば、これらの成分の添加量は、組成物の総重量に対して０．０１〜５重量％、より具体的には０．０１〜３重量％の範囲である。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例及び試験例を挙げて本発明を詳述するが、本発明がこれらの例に限定されることはない。
［実施例１］緑茶種子抽出物の製造
緑茶種子２ｋｇにヘキサン６ｌを入れ、常温で３回攪拌抽出して脱脂させた後、脱脂された緑茶種子１ｋｇに５０％のエタノール４ｌを入れ、３回還流抽出した後、１５℃で１日間浸漬させた。次いで、ろ過布を用いたろ過及び遠心分離を行って残渣及びろ液を分離し、分離されたろ液を減圧濃縮して得たエキスを水に懸濁した後、エーテル１ｌで５回抽出して色素を除去し、水層を１−ブタノール５００ｍｌで３回抽出した。これから得られた全体の１−ブタノール層を減圧濃縮して１−ブタノールエキスを得、これを少量のメタノールに溶かした後、大量のエチルアセテートに追加して、生成された沈殿物を乾燥させて、緑茶種子抽出物（サポニン粗抽出物）３００ｇを得た。
【００４２】
［実施例２］酸加水分解方法による２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３の製造
［２−１］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇに２０倍（ｖ／ｗ）の１Ｎ ＨＣｌ−５０％メタノール溶液（ｖ／ｖ）を加えて、８０℃の水浴槽において８時間加熱還流させて、緑茶種子粗サポニンに結合された糖を加水分解した。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌させた後、沈殿した塩をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝７：１〜３：１）で分離して、０．５５ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００４３】
［２−２］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇに２０倍（ｖ／ｗ）の１Ｍ Ｈ２ＳＯ４−３０％水溶液（ｖ／ｖ）を加えて、９０℃の水浴槽において８時間加熱還流させて、緑茶種子粗サポニンに結合された糖を加水分解した。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌した後、沈殿した塩をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝７：１〜３：１）で分離して、０．５９ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００４４】
［２−３］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇに２０倍（ｖ／ｗ）の１Ｍ ＨＮＯ３−１０％水溶液（ｖ／ｖ）を加えて、９０℃の水浴槽において８時間加熱還流させて、緑茶種子粗サポニンに結合された糖を加水分解した。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌した後、沈殿した塩をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝７：１〜３：１）で分離して、０．３９ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００４５】
［実施例３］塩基加水分解方法による２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３の製造
［３−１］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇを乾燥ピリジン（５００ｍｌ）に溶かし、ここにナトリウムメトキシド（ｓｏｄｉｕｍ  ｍｅｔｈｏｘｉｄｅ）粉末１０ｇを加えて、油浴上において８時間還流反応させて、緑茶種子サポニンに結合された糖を加水分解した。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、精製水で３回洗浄した後にろ過を用いてろ過物を得、残渣にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌した後、沈殿した塩をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、０．３５ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００４６】
［３−２］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇに２０倍（ｖ／ｗ）の１Ｍ ＮａＯＨ−２０％水溶液（ｖ／ｖ）を加えて８０℃で８時間還流反応させて、緑茶種子サポニンに結合された糖を加水分解した。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、精製水で３回洗浄した後にろ過を用いてろ過物を得、残渣にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌した後、沈殿した塩をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、０．３１ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００４７】
［３−３］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇに２０倍（ｖ／ｗ）の１Ｍ ＫＯＨ−２０％水溶液（ｖ／ｖ）を加えて８０℃で８時間還流反応させて、緑茶種子サポニンに結合された糖を加水分解した。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、精製水で３回洗浄した後にろ過を用いてろ過物を得、残渣にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌した後、沈殿した塩をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、０．２５ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００４８】
［実施例４］酵素分解方法による２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３の製造
［４−１］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇを１００ｍｌの０．１Ｍの酢酸緩衝溶液（ｐＨ４．５）に溶解させ、ここに酵素２．５ｇ（ヘスペリジナーゼ０．５ｇ、ナリンギナーゼ０．５ｇ、セルラーゼ０．５ｇ、β−グルクロニダーゼ０．２ｇ、β−ガラクトシダーゼ０．５ｇ、アミログルコシダーゼ０．３ｇ；シグマ社製）を添加して３７℃の水浴上において４８時間攪拌させながら、薄層クロマトグラフィーで定期的に確認して、緑茶サポニンが消失すると、熱水（８０〜１００℃）中において１０分間加熱して反応を終えた。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌した後、沈殿物をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、１．０２ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００４９】
［４−２］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇを１００ｍｌの０．１Ｍの酢酸緩衝溶液（ｐＨ６．５）に溶解させ、ここに酵素３．５ｇ（グルコシダーゼ１ｇ、アラビノシダーゼ０．５ｇ、ラムノシダーゼ１ｇ、キシロシダーゼ０．５ｇ、ペクチナーゼ０．５ｇ）を添加して２７℃の水浴上において４８時間攪拌させながら、薄層クロマトグラフィーで定期的に確認して、緑茶サポニンが消失すると、熱水（８０〜１００℃）中において１０分間加熱して反応を終えた。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌した後、沈殿物をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、１．５３ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００５０】
［実施例５］微生物を活用した２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３の製造
［５−１］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇを１００ｍｌのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌して３０℃まで冷却した後に予め培養されたアスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＫＣＣＭ １１８８５を液体量に対して５〜１０％接種して３０℃で５日間培養した後、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認して基質が完全に消失したことを確認し、培養液を５，０００〜１０，０００ｒｐｍにて遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄した後に、遠心分離して沈殿物を得た。この沈殿物にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌した後、沈殿物をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、０．７２ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００５１】
［５−２］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇを１００ｍｌのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌して２７℃まで冷却した後、予め培養されたリゾプスオリーゼ（ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）を液体量に対して５〜１０％接種して２７℃で５日間培養した後、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認して基質が完全に消失したことを確認し、培養液を５，０００〜１０，０００ｒｐｍにて遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄した後に、遠心分離して沈殿物を得た。この沈殿物にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌した後、沈殿物をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、０．９２ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００５２】
［５−３］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇを１００ｍｌのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌して２７℃まで冷却した後、予め培養されたバチルスサブティリス（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を液体量に対して５〜１０％接種して２７℃で２日間培養した後、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認して基質が完全に消失したことを確認し、培養液を５，０００〜１０，０００ｒｐｍにて遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄した後に、遠心分離して沈殿物を得た。この沈殿物にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌した後、沈殿物をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、０．７２ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００５３】
［５−４］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇを１００ｍｌのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌して２７℃まで冷却した後、予め培養されたリューコノストックメゼンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）を液体量に対して５〜１０％接種して２７℃で２日間培養した後、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認して基質が完全に消失したことを確認し、培養液を５，０００〜１０，０００ｒｐｍにて遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄した後に、遠心分離して沈殿物を得た。この沈殿物にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌した後、沈殿物をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、０．５２ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００５４】
［５−５］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇを１００ｍｌのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌して２７℃まで冷却した後、予め培養されたビフィドバクテリウムロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）を液体量に対して５〜１０％接種して２７℃で２日間培養した後、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認して基質が完全に消失したことを確認し、培養液を５，０００〜１０，０００ｒｐｍにて遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄した後に、遠心分離して沈殿物を得た。この沈殿物にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌した後、沈殿物をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、０．５２ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００５５】
［５−６］前記実施例１において得た緑茶種子抽出物１０ｇを１００ｍｌのイオン水に溶解させ、１２１℃で３０分間滅菌して２７℃まで冷却した後、予め培養されたラクトバチルスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を液体量に対して５〜１０％接種して２７℃で２日間培養した後、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認して基質が完全に消失したことを確認し、培養液を５，０００〜１０，０００ｒｐｍにて遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄した後に、遠心分離して沈殿物を得た。この沈殿物にエタノール（２００ｍｌ）を加えて３回攪拌した後、沈殿物をろ過を用いて除去した。ろ過されたろ液を減圧濃縮して粗生成物を得た後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１〜４：１）で分離して、０．４２ｇの２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３を得た。
【００５６】
［試験例１］ＤＰＰＨ生成抑制試験（ＤＰＰＨテスト）
有機ラジカルであるＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル）の還元により（抗酸化剤は酸化される）発生する吸光度の変化を用いて、抗酸化能を評価する方法を用いた。抗酸化度は、ＤＰＰＨの酸化が抑えられて吸光度が対照群に比べて減少される度合いを測定して、対照群の吸光度に比べて５０％以下の吸光度を示す濃度（ＩＣ５０）を有効抗酸化濃度と評価した。
【００５７】
１００μＭ（エタノール中）のＤＰＰＨ溶液１９０μｌに、実施例１の緑茶種子抽出物、実施例２〜５の２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３及び対照試料をそれぞれ１０μｌずつ混合して反応液を準備した。混合された反応液を３７℃で３０分間反応した後、５４０ｎｍにおいて吸光度を測定した。対照試料としては、合成抗酸化剤として汎用されているトロロックス（Ｔｒｏｌｏｘ）を用いた。それぞれの場合に対するＤＰＰＨ分析結果は、下記表１に示す。
【００５８】
【表１】
2016528204.tif 000003
【００５９】
前記表１の結果から、２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３は非常に優れた抗酸化能を有し、公知の抗酸化剤であるトロロックスよりも抗酸化能に優れていることが分かる。
【００６０】
［試験例２］蛍光物質を用いた活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ；ＲＯＳ）生成抑制能試験
試験に供された細胞株は、人間角質形成細胞ＨａＣａＴ細胞株（Ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  ＨａＣａＴ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）であり、蛍光測定用９６ウェルブラックプレートに各プレート当たり２．０×１０４個分注し、ペニシリン／ストレプトマイシン入りダルベッコ変法イーグル培地〔ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｕｍ、牛胎児血清（ＦＢＳ）１０％〕を用いて、３７℃、５％のＣＯ２の条件下で１日間培養した後、試験試料を処理した。試験試料としては、実施例１の緑茶種子抽出物、実施例２〜５の２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３及び対照試料を５０ｐｐｍずつ用い、対照試料としては、合成抗酸化剤として広く用いられているトロロックス（Ｔｒｏｌｏｘ）を用いた。次いで、培地としてペニシリン／ストレプトマイシン入り無血清ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＦＢＳなし）を用いて、３７℃、５％のＣＯ２の条件下で１日間培養した。
【００６１】
試験試料を入れて２４時間培養した後、ＨＣＳＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水）で洗浄し切れずに残留する培地を除去し、ＨＣＳＳに２０μＭで準備されたＤＣＦＨ−ＤＡ（２'，７'−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、モレキューラープローブ社製）を１００μｌ加えた後、３７℃、５％のＣＯ２の条件下で２０分間培養し、ＨＣＳＳで洗浄した。次いで、試料により処理されたＨＣＳＳを１００μｌ加えた後、初期に活性酸素種（ＲＯＳ）により酸化されたＤＣＦ（ジクロロフルオレセイン）の蛍光強度を蛍光プレートリーダー（Ｅｘ＝４８５ｎｍ、Ｅｍ＝５３０ｎｍ）を用いて測定した。次いで、紫外線Ｂ波（ＵＶＢ）（３０ｍＪ／ｃｍ２）を照射し、処理直後及び処理してから３時間後の蛍光強度を蛍光プレートリーダー（Ｅｘ＝４８５ｎｍ、Ｅｍ＝５３０ｎｍ）を用いて測定した。
【００６２】
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いた場合を対照群とし、これを基準として各試験物質の活性酸素種（ＲＯＳ）の生成抑制能を求め（対照群の％）、実験結果を下記表２に示す。
【００６３】
【表２】
2016528204.tif 000004
【００６４】
前記表２の結果から、２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３は、活性酸素種（ＲＯＳ）の生成抑制能が良好であり、公知の抗酸化剤であるトロロックスよりも活性酸素種（ＲＯＳ）の生成抑制能に優れていることが分かる。
【００６５】
［試験例３］ラットの色素細胞を用いたメラニン生成抑制効果の測定
Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のラットの色素細胞（Ｍｅｌ−Ａｂ ｃｅｌｌ）（Ｄｏｏｌｅｙ，  Ｔ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｋｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｏｌ，  ７，  ｐｐ  １８８−２００）を、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１０％の牛胎盤血清、１００ｎＭの２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アテート、１ｎＭのコレラトキシンを添加した培地において、３７℃、５％のＣＯ２の条件下で培養した。培養されたＭｅｌ−Ａｂ細胞を０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡを用いて分離し、２４ウェルプレートに１０５細胞／ウェル（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の濃度で細胞を培養し、２日目から３日間連続的に各試験試料を１０ｐｐｍずつ添加した。試験試料としては、実施例１の緑茶種子抽出物、実施例２〜５の２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３及び対照試料を用い、対照試料としては公知の美白剤であるヒドロキノンを用いて陽性対照群とし、試験試料を処理しなかったものを陰性対照群とした。試験試料を添加した後に３７℃、５％のＣＯ２の条件下で１日間培養した後、培養液を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて洗浄した後、１Ｎの水酸化ナトリウムを用いて細胞を溶かして４００ｎｍにおいて吸光度を測定した。測定された結果を下記の数式１によりメラニン生成抑制率を計算し、その結果を下記表３に示す〔ドゥーリー（Ｄｏｏｌｅｙ）の方法〕。
【００６６】
［数式１］
メラニンの生成抑制率（％）＝１００−（各試験物質の吸光度／陰性対照群の吸光度）×１００
【００６７】
【表３】
2016528204.tif 000005
【００６８】
上記表３の結果から、２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３は、優れたメラニンの生成抑制率を示し、公知の美白剤であるヒドロキノンよりも優れたメラニンの生成抑制率を示すことが確認される。
【００６９】
［試験例４］人体の皮膚に対する皮膚美白効果の試験
前記実施例４において得た２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３に対する人体の皮膚に対する皮膚美白効果を調べるために、下記の実験を行った。
【００７０】
まず、健康な１２名の男子を対象として被検者の上膊部位に直径１．５ｃｍの穴付き不透明テープを貼り付けた後、各被検者の最小紅斑量（Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｒｙｔｈｅｍａ  Ｄｏｓｅ）の約１．５〜２倍の紫外線Ｂ波（ＵＶＢ）を照射して皮膚の黒化を誘導した。
【００７１】
紫外線Ｂ波を照射した後、実施例４−１の２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３  １％（溶媒は、１，３−ブチレングリコール：エタノール＝７：３）、ヒドロキノン１％及び溶媒（ｖｅｈｉｃｌｅ、ビークル）（陰性対照群）１％をそれぞれ塗布し、一箇所には何も塗布しなかった状態で、１０週間に亘って状態の変化を観察した。１週おきに皮膚の色相を色差計ＣＲ２００２（日本、ミノルタ社製）を用いて測定した。
【００７２】
次いで、前記各試験物質の塗布開始時点及び塗布完了時点における皮膚色の差（ΔＬ＊）を下記の数式２により計算し、これを下記表４に示す。一方、美白効果は、試料塗布部位及び対照群部位のΔＬ＊を比較して判定し、ΔＬ＊値が約２である場合には、沈着された色素の美白化が顕著であり、約１．５以上であれば、美白効果があると判定される。
【００７３】
［数式２］
ΔＬ＊＝塗布完了時点におけるＬ＊値−塗布開始時点におけるＬ＊値
【００７４】
【表４】
2016528204.tif 000006
【００７５】
前記表４の結果から、２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３は、皮膚色を明るくし、公知の美白剤であるヒドロキノンと同じレベルの皮膚色の明るさ度を示すことが確認される。これは、本発明において用いられる２１−Ｏ−アンゲロイルテアサポゲノールＥ３が紫外線により生成された色素の沈着を改善して皮膚色を明るくするためであると認められる。
【国際調査報告】
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2016528204.tif 000012
2016528204.tif 000013
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