(57)【要約】  一般に、グリシン代謝又はミトコンドリア１炭素（１−Ｃ）経路酵素、例えば、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ１Ｌ又はＭＴＨＦＤ２のレベルを決定すること、及び任意選択で、抗葉酸薬又はミトコンドリア１炭素（１−Ｃ）経路酵素、例えば、ＳＨＭＴ２若しくはＭＴＨＦＤ２を阻害する薬剤を投与することを含む、がんを有する対象の処置、診断及び予後の決定の方法。
2016514136.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるがんを処置する方法であって、
前記対象から腫瘍細胞を含むサンプルを得ること；
前記サンプルにおけるグリシン消費の１つ又は複数のレベルを決定すること；
前記サンプルにおけるグリシン消費の前記レベルを、グリシン消費の参照レベルと比較すること；
前記参照レベルを上回るグリシン消費のレベルを有する対象を選択すること；及び
治療有効量の抗葉酸薬物を投与することによって、前記対象を処置すること
を含む方法。
【請求項２】
前記抗葉酸薬物が、メトトレキサートである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗葉酸薬物が、ミトコンドリア標的化部分に共有結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
グリシン消費の前記レベルが、標識基質、例えば１１Ｃ−グリシンを使用して生きている対象における腫瘍を画像化することによって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＰＥＴを使用して生きている対象における腫瘍を画像化することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
対象におけるがんを処置する方法であって、
前記対象から腫瘍細胞を含むサンプルを得ること；
前記サンプルにおけるＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性の１つ又は複数のレベルを決定すること；
前記サンプルにおけるＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性の前記レベルを、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性の参照レベルと比較すること；
前記参照レベルを上回るＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性のレベルを有する対象を選択すること；並びに、
治療有効量の、抗葉酸薬物及びミトコンドリア１炭素（１−Ｃ）経路酵素、例えば、ＳＨＭＴ２又はＭＴＨＦＤ２を阻害する薬剤のうちの一方又は両方を投与することによって、前記対象を処置すること
を含む方法。
【請求項７】
前記抗葉酸薬物が、メトトレキサートである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＭＴＨＦＤ２を阻害する前記薬剤が、６−ヒドロキシ−ＤＬ  ＤＯＰＡ、塩化カルミダゾリウム、ＣＤＯＯ、エブセレン、セレストロール、ＧＷ５０７４、ヨードアセトアミド、パラ−ベンゾキノン又はプロトポルフィリンＩＸ二ナトリウムである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ミトコンドリア１炭素（１−Ｃ）経路酵素を阻害する前記薬剤が、ＳＨＭＴ２又はＭＴＨＦＤ２、好ましくはＳＨＭＴ２を阻害する阻害核酸である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記阻害核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
対象におけるがんを処置する方法であって、前記対象に、治療有効量の、ＭＴＨＦＤ２を阻害する活性薬剤を含む組成物、又はその組成物を投与することを含む方法。
【請求項１２】
前記活性薬剤が、６−ヒドロキシ−ＤＬ  ＤＯＰＡ、塩化カルミダゾリウム、ＣＤＯＯ、エブセレン、セレストロール、ＧＷ５０７４、ヨードアセトアミド、パラ−ベンゾキノン、プロトポルフィリンＩＸ二ナトリウム、メトトレキサート、ペメトレキセド、又は５−フルオロウラシルからなる群から任意選択で選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記活性薬剤が、エブセレンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
阻害剤が、ＭＴＨＦＤ２を共有結合又は非共有結合によって改変する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記阻害剤が、ＭＴＨＦＤ２のＣｙｓ１４５又はＣｙｓ１６６のうちの一方又は両方、好ましくはＣｙｓ１４５を共有結合又は非共有結合によって改変する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記活性薬剤が、ミトコンドリア標的化部分に共有結合している、請求項３又は１２〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記ミトコンドリア標的化部分が、テトラフェニルホスホニウムである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象における前記がんを、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性の参照レベルを上回るＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性のレベルを有すると同定することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
がんを有する対象における生存の可能性を予測する方法であって、
前記対象から腫瘍細胞を含むサンプルを得ること；
前記サンプルにおけるＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性のレベルを決定すること；
前記サンプルにおけるＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性の前記レベルを、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性の参照レベルと比較すること；
前記参照レベルを上回るＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌのレベルを有する対象に対して、生存の予測可能性が高いと指定するか、又は
前記参照レベルを下回るＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌのレベルを有する対象に対して、生存の予測可能性が低いと指定すること
を含む方法。
【請求項２０】
対象におけるがんを診断する方法であって、
前記対象から腫瘍細胞を含むと疑われるサンプルを得ること；
前記サンプルにおけるＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性のレベルを決定すること；
前記サンプルにおけるＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性の前記レベルを、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性の参照レベルと比較すること；並びに、
前記参照レベルを上回るＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌのレベルを有する対象をがんを有すると診断すること
を含む方法。
【請求項２１】
前記ＭＴＨＦＤ２活性が、ＮＡＤ依存型メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ／シクロヒドロラーゼ活性である、請求項１〜２０に記載の方法。
【請求項２２】
がんの処置のための候補化合物を同定する方法であって、
ＭＴＨＦＤ２を発現する細胞、例えば腫瘍細胞を含むサンプルを用意すること；
前記サンプルを試験化合物と接触させること；
還元剤、例えばＤＴＴ又はメルカプトエタノールの非存在下の前記試験化合物の存在下で、前記サンプルにおけるＮＡＤ依存型メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ／シクロヒドロラーゼ活性のレベルを決定すること；
前記試験化合物の存在下での活性の前記レベルを、活性の参照レベルと比較すること；及び
活性の低減に関連する化合物を候補化合物として選択すること
を含む方法。
【請求項２３】
前記参照レベルが、前記試験化合物の非存在下、例えば対照サンプルにおける、ＮＡＤ依存型メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ／シクロヒドロラーゼ活性のレベルである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記試験化合物が、システイン改変剤である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
がん細胞を前記候補化合物と接触させること；
前記候補化合物の存在下での増殖速度又は生存率を決定すること；
前記候補化合物の存在下での前記増殖速度又は生存率を、参照増殖速度又は生存率と比較すること；及び
前記増殖速度又は生存率を低下させる候補化合物を候補治療化合物として選択すること
をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記参照増殖速度又は生存率が、前記候補化合物の非存在下、例えば対照サンプルにおける増殖速度又は生存率のレベルである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記候補治療化合物を、がんの動物モデル、例えば異種移植モデルに投与すること；
前記動物モデルにおける前記がんのパラメータに対する前記候補治療化合物の効果を決定すること；及び
前記動物モデルにおけるがんの１つ又は複数のパラメータを改善する候補治療化合物を治療化合物として選択すること
をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記パラメータが、腫瘍サイズ、腫瘍成長、腫瘍形成までの時間（又は腫瘍形成の平均齢）又は転移であり、改善が、腫瘍サイズ、腫瘍成長速度、若しくは転移の低減、又は腫瘍形成までの時間（又は腫瘍形成の平均齢）の延長である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
低グリシン食餌及び／又は安息香酸ナトリウムの投与による処置について対象を処置又は同定する方法であって、
前記対象由来のがん細胞を含むサンプルにおけるグリシン取り込みのレベルを決定すること、
グリシン取り込みの前記レベルをグリシン取り込みの参照レベルと比較すること、
前記参照レベルを上回るグリシン取り込みのレベルを有する対象を、低グリシン食餌又は安息香酸ナトリウムの投与による処置について選択すること、及び
任意選択で、前記対象に前記処置を施すこと
を含む方法。
【請求項３０】
対象における腫瘍の悪性度又は成長速度を予測する方法であって、
前記腫瘍由来の細胞を含むサンプルにおけるグリシン取り込みのレベルを決定すること；
前記サンプルにおけるグリシン取り込みの前記レベルを、グリシン取り込みの参照レベルと比較すること；
前記参照レベルを上回るグリシン取り込みのレベルを有する腫瘍を有する対象に対して、悪性度及び高成長速度の可能性が高いと指定するか、又は
前記参照レベルを下回るグリシン取り込みのレベルを有する腫瘍を有する対象に対して、悪性度及び高成長速度の可能性が低いと指定すること
を含む方法。
【請求項３１】
対象における腫瘍の悪性度又は成長速度を予測する方法であって、
前記腫瘍由来の細胞を含むサンプルにおける、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌ  ｍＲＮＡ、タンパク質又は活性の１つ又は複数のレベルを決定すること；
前記サンプルにおけるＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性の前記レベルを、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性の参照レベルと比較すること；
前記参照レベルを上回るＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌのレベルを有する腫瘍を有する対象に対して、悪性度及び高成長速度の可能性が高いと指定するか、又は、前記参照レベルを下回るＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌのレベルを有する腫瘍を有する対象に対して、悪性度及び高成長速度の可能性が低いと指定すること
を含む方法。
【請求項３２】
前記がんが、癌腫である、請求項１〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記癌腫が、神経膠腫、神経膠芽腫、乳がん、卵巣がん、腎細胞がん、肺がん、黒色腫、子宮頸がん、副腎がん、脳腫瘍、食道がん、胃がん、生殖細胞がん、頭／頸部がん、前立腺がん、黒色腫、肝臓がん、膵臓がん、精巣がん又は結腸がんである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記癌腫が、乳がんでも膀胱がんでもない、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
グリシン消費細胞の増殖を阻害する方法であって、前記細胞を抗葉酸剤と接触させることを含む方法。
【請求項３６】
グリシン消費細胞の増殖を阻害することによってがんを処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１３年３月１５日に提出された米国仮特許出願番号第６１／７９１，０８２号の利益を主張する。上記出願の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金援助を受けた研究又は開発
本発明は、国立衛生研究所により付与された、助成金番号第Ｒ０１ＤＫ０８１４５７号、同第５Ｒ０１ＧＭ０９９６８３号及び同第５Ｋ０８ＨＬ１０７４５１号の下で政府の援助により行われた。政府は、本発明に対し一定の権利を有する。
【０００３】
がんを有する対象の処置、診断、及び予後の決定の方法は、一般に、グリシン取り込み若しくはＭＴＨＦＤ２タンパク質、転写産物又は活性のレベルを決定すること、及び任意選択で、抗葉酸薬又はＭＴＨＦＤ２を標的とする薬剤を投与することを含む。
【背景技術】
【０００４】
悪性転換は、典型的に、細胞生理を変更して増殖優位性を付与する突然変異によって起こる（Nowell, Science 194, 23 (1976)；Hanahan and Weinberg, Cell 144, 646 (2011)）。がんの遺伝的異質性及び複雑性にもかかわらず（Stratton et al., Nature 458, 719 (2009)）、形質転換細胞は、栄養取り込み及び利用の変化として顕在化する代謝リプログラミングを含む、いくつかの提唱されている共通の特徴を示す（Hanahan and Weinberg, Cell 144, 646 (2011)；Hsu and Sabatini, Cell 134, 703 (2008)）。代謝リプログラミングは、迅速ながん細胞増殖に必須であると考えられているが、形質転換細胞において活性な代謝経路の系統的性質決定は存在せず、迅速ながん細胞増殖の促進におけるこれらの経路の寄与は、明らかになっていないままである（Hsu and Sabatini, Cell 134, 703 (2008)）。がん代謝の現行の研究は、比較的わずかな細胞株しか試験しておらず、そこから代謝経路活性を推測することは困難である細胞内代謝物プールの測定に主に焦点を当てており（Sreekumar et al., Nature 457, 910 (2009)）、又は同位体追跡を用いて限定数の反応を通した代謝フラックスを見積もってきた（DeBerardinis et al., Proc Natl Acad Sci U S A 104, 19345 (2007)）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書で実証される通り、ミトコンドリアグリシン（及び１炭素、すなわち１−Ｃ代謝）は、がん細胞代謝において重要である。グリシン消費は、いくつかのがんにおいて変更され、抗葉酸薬感受性並びにがん細胞増殖の独特の予測因子である。グリシン枯渇は、感受性がんの増殖を低減し得る。
【０００６】
加えて、ミトコンドリア１−Ｃ経路の一部であるＭＴＨＦＤ２は、最も強く示差的に発現される遺伝子の１つであり、本分析において、最も示差的に発現される代謝酵素である。ＭＴＨＦＤ２は、がんにおいて復活する胚性酵素であると考えられ、ＭＴＨＦＤ２は、正常組織と比較して、多くのがんにわたって高度に上方制御される。ＭＴＨＦＤ２の遺伝子サイレンシング及び低分子による阻害は、いくつかのがん細胞株にわたって、増殖を遅くする。
【０００７】
したがって、第１の態様において、本発明は、対象におけるがんを処置するための方法を提供する。本方法は、対象から腫瘍細胞を含むサンプルを得ること；サンプルにおけるグリシン消費の１つ又は複数のレベルを決定すること；サンプルにおけるグリシン消費のレベルを、グリシン消費の参照レベルと比較すること；参照レベルを上回るグリシン消費のレベルを有する対象を選択すること；及び治療有効量の抗葉酸薬物を投与することによって対象を処置することを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、抗葉酸薬物は、メトトレキサートである。
【０００９】
いくつかの実施形態において、抗葉酸薬物は、ミトコンドリア標的部分に共有結合している。
【００１０】
いくつかの実施形態において、グリシン消費のレベルは、標識基質、例えば、１１Ｃ−グリシンを用いて生きている対象における腫瘍を画像化すること、例えば、ＰＥＴを用いて生きている対象における腫瘍を画像化することによって決定される。
【００１１】
別の態様において、本発明は、対象におけるがんを処置するための方法を提供する。本方法は、対象から腫瘍細胞を含むサンプルを得ること、サンプルにおけるＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性の１つ又は複数のレベルを決定すること；サンプルにおけるＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性のレベルを、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性の参照レベルと比較すること；参照レベルを上回るＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性のレベルを有する対象を選択すること；並びに、治療有効量の、抗葉酸薬物及びミトコンドリア１炭素（１−Ｃ）経路酵素を阻害する薬剤、例えば、ＳＨＭＴ２又はＭＴＨＦＤ２を阻害する薬剤のうちの一方又は両方を投与することによって、対象を処置することを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、抗葉酸薬物は、メトトレキサートである。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ＭＴＨＦＤ２を阻害する薬剤は、６−ヒドロキシ−ＤＬ  ＤＯＰＡ、塩化カルミダゾリウム、ＣＤＯＯ、エブセレン、セレストロール、ＧＷ５０７４、ヨードアセトアミド、パラ−ベンゾキノン又はプロトポルフィリンＩＸ二ナトリウムである。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ミトコンドリア１炭素（１−Ｃ）経路酵素を阻害する薬剤は、ＳＨＭＴ２又はＭＴＨＦＤ２、好ましくはＳＨＭＴ２を阻害する阻害核酸である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、阻害核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００１６】
別の態様において、本発明は、対象におけるがんを処置するための方法を提供する。本方法は、対象に、治療有効量の、ＭＴＨＦＤ２を阻害する活性薬剤を含む組成物、又はその組成物を投与することを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、活性薬剤は、６−ヒドロキシ−ＤＬ  ＤＯＰＡ、塩化カルミダゾリウム、ＣＤＯＯ、エブセレン、セレストロール、ＧＷ５０７４、ヨードアセトアミド、パラ−ベンゾキノン、プロトポルフィリンＩＸ二ナトリウム、メトトレキサート、ペメトレキセド、又は５−フルオロウラシルからなる群から、任意選択で選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、活性薬剤は、エブセレンである。
【００１９】
いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＭＴＨＦＤ２を共有結合によって改変する。
【００２０】
いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＭＴＨＦＤ２のＣｙｓ１４５又はＣｙｓ１６６のうちの一方又は両方、好ましくはＣｙｓ１４５を、共有結合又は非共有結合によって改変する。
【００２１】
いくつかの実施形態において、活性薬剤は、ミトコンドリア標的化部分、例えば、テトラフェニルホスホニウムに共有結合している。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本方法は、対象におけるがんを、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性の参照レベルを上回る、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性のレベルを有すると同定することを含む。
【００２３】
別の態様において、本発明は、がんを有する対象における生存の可能性を予測するための方法を提供する。本方法は、対象から腫瘍細胞を含むサンプルを得ること；サンプルにおけるＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性のレベルを決定すること；サンプルにおけるＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性のレベルを、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性の参照レベルと比較すること；参照レベルを上回るＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌのレベルを有する対象に対して、生存の予測可能性が高いと指定するか、又は、参照レベルを下回る、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌのレベルを有する対象に対して、生存の予測可能性が低いと指定することを含む。
【００２４】
別の態様において、本発明は、対象におけるがんを診断するための方法を提供する。本方法は、対象から腫瘍細胞を含むと疑われるサンプルを得ること；サンプルにおけるＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性のレベルを決定すること；サンプルにおけるＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性のレベルを、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性の参照レベルと比較すること；並びに、参照レベルを上回るＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌのレベルを有する対象を、がんを有すると診断することを含む。
【００２５】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、ＭＴＨＦＤ２活性は、ＮＡＤ依存型メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ／シクロヒドロラーゼ活性である。
【００２６】
別の態様において、本発明は、がんの処置のための候補化合物を同定するための方法を提供する。本方法は、ＭＴＨＦＤ２を発現する細胞、例えば腫瘍細胞を含むサンプルを用意すること；サンプルを試験化合物と接触させること；還元剤、例えばＤＴＴ又はメルカプトエタノールの非存在下の試験化合物の存在下で、サンプルにおけるＮＡＤ依存型メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ／シクロヒドロラーゼ活性のレベルを決定すること；試験化合物の存在下での活性のレベルを、活性の参照レベルと比較すること；及び、活性の低減に関連する化合物を候補化合物として選択することを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、参照レベルは、試験化合物の非存在下、例えば対照サンプルにおける、ＮＡＤ依存型メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ／シクロヒドロラーゼ活性のレベルである。
【００２８】
いくつかの実施形態において、試験化合物は、システイン改変剤である。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本方法は、がん細胞を候補化合物と接触させること；候補化合物の存在下で増殖速度又は生存率を決定すること；候補化合物の存在下での増殖速度又は生存率を、参照増殖速度又は生存率と比較すること；及び増殖速度又は生存率を低下させる候補化合物を候補治療化合物として選択することを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態において、参照増殖速度又は生存率は、候補化合物の非存在下、例えば対照サンプルにおける、増殖速度又は生存率のレベルである。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本方法は、候補治療化合物を、がんの動物モデル、例えば異種移植モデルに投与すること；動物モデルにおけるがんのパラメータに対する候補治療化合物の効果を決定すること；及び動物モデルにおけるがんの１つ又は複数のパラメータを改善する候補治療化合物を治療化合物として選択することを含む。いくつかの実施形態において、パラメータは、腫瘍サイズ、腫瘍成長、腫瘍形成までの時間（又は腫瘍形成の平均齢）又は転移であり、改善は、腫瘍サイズ、腫瘍成長速度、若しくは転移の低減、又は腫瘍形成までの時間（又は腫瘍形成の平均齢）の延長である。
【００３２】
別の態様において、本発明は、低グリシン食餌及び／又は安息香酸ナトリウムの投与による処置について対象を処置又は同定するための方法を提供する。本方法は、対象由来のがん細胞を含むサンプルにおけるグリシン取り込みのレベルを決定すること、グリシン取り込みのレベルをグリシン取り込みの参照レベルと比較すること、参照レベルを上回るグリシン取り込みのレベルを有する対象を、低グリシン食餌又は安息香酸ナトリウムの投与による処置について選択すること；及び任意選択で、対象に処置を施すことを含む。
【００３３】
別の態様において、本発明は、対象における腫瘍の悪性度又は成長速度を予測するための方法を提供する。本方法は、腫瘍由来の細胞を含むサンプルにおけるグリシン取り込みのレベルを決定すること；サンプルにおけるグリシン取り込みのレベルを、グリシン取り込みの参照レベルと比較すること；参照レベルを上回るグリシン取り込みのレベルを有する腫瘍を有する対象に対して、悪性度及び高成長速度の可能性が高いと指定するか、又は、参照レベルを下回るグリシン取り込みのレベルを有する腫瘍を有する対象に対して、悪性度及び高成長速度の可能性が低いと指定することを含む。
【００３４】
別の態様において、本発明は、対象における腫瘍の悪性度又は成長速度を予測するための方法を提供する。本方法は、腫瘍由来の細胞を含むサンプルにおける、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌ  ｍＲＮＡ、タンパク質又は活性の１つ又は複数のレベルを決定すること；サンプルにおけるＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性のレベルを、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、ｍＲＮＡ又は活性の参照レベルと比較すること；参照レベルを上回るＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌのレベルを有する腫瘍を有する対象に対して、悪性度及び高成長速度の可能性が高いと指定するか、又は、参照レベルを下回るＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／若しくはＭＴＨＦＤ１Ｌのレベルを有する腫瘍を有する対象に対して、悪性度及び高成長速度を指定することを含む。
【００３５】
いくつかの実施形態において、本発明は、患者におけるがん、例えば癌腫を処置するための方法であって、患者にＭＴＨＦＤ２の阻害剤、又はその薬学的に許容される組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００３６】
本明細書で記載される方法のいくつかの実施形態において、がんは、癌腫、例えば、神経膠腫、神経膠芽腫、乳がん、卵巣がん、腎細胞がん、肺がん、黒色腫、子宮頸がん、副腎がん、脳腫瘍、食道がん、胃がん、生殖細胞がん、頭／頸部がん、前立腺がん、黒色腫、肝臓がん、膵臓がん、精巣がん又は結腸がんである。
【００３７】
いくつかの実施形態において、癌腫は、乳がんでも膀胱がんでもない。
【００３８】
別の態様において、本発明は、グリシン消費細胞の増殖を阻害するための方法であって、細胞を抗葉酸剤と接触させることを含む方法を提供する。
【００３９】
別の態様において、本発明は、グリシン消費細胞の増殖を阻害することによってがんを処置するための方法を提供する。
【００４０】
特定の実施形態において、本発明は、生物学的サンプルにおいてＭＴＨＦＤ２を阻害する方法であって、前記サンプルを、ＭＴＨＦＤ２を阻害する化合物と接触させることを含む方法を提供する。
【００４１】
特定の実施形態において、本発明は、患者においてＭＴＨＦＤ２を阻害する方法であって、患者に、ＭＴＨＦＤ２を阻害する化合物、又はその薬学的に許容される組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００４２】
別の態様において、本発明は、患者又は生物学的サンプルにおいて、ＭＴＨＦＤ２を阻害するための方法であって、患者にＭＴＨＦＤ２の阻害剤を投与するか、又は生物学的サンプルをＭＴＨＦＤ２の阻害剤と接触させることを含む方法を提供する。
【００４３】
別の態様において、本発明は、細胞において、グリシン代謝又はＮＡＤ依存型メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ活性を阻害するための方法であって、細胞を抗葉酸剤と接触させることを含む方法を提供する。
【００４４】
そうでないと定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。方法及び材料は、本発明における使用のために本明細書において記載される。当該分野で公知の他の好適な方法及び材料もまた、使用され得る。材料、方法及び実施例は、例示するのみであり、限定することを意図しない。全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー及び本明細書中で述べられる他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。
【００４５】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１Ａ】グリシン消費及び合成は、迅速ながん細胞増殖と相関することを示すグラフである。（１Ａ）１１１代謝物ＣＯＲＥプロファイルと６０のがん細胞株にわたる増殖速度との間のスピアマン相関の分布。赤で強調された代謝物のみが、ボンフェローニ補正したＰ＜０．０５にて有意である。
【図１Ｂ】グリシン消費及び合成は、迅速ながん細胞増殖と相関することを示すグラフである。（１Ｂ）グリシンＣＯＲＥ対６０のがん細胞株（左）及び選択された固形腫瘍型（右）にわたる増殖速度。追跡実験のために選択された細胞株を、赤で強調する。合わさったデータ点は、複製培養物を表す。Ｐ値は、１１１の試験した代謝物についてのボンフェローニ補正である。
【図１Ｃ】グリシン消費及び合成は、迅速ながん細胞増殖と相関することを示すグラフである。（１Ｃ）１４２５の代謝酵素の遺伝子発現と６０のがん細胞株にわたる増殖速度との間のスピアマン相関の分布。強調された点は、ミトコンドリア（ＭＴＨＦＤ２、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ１Ｌ）及び細胞質（ＭＴＨＦＤ１、ＳＨＭＴ１）のグリシン代謝酵素である。
【図１Ｄ】グリシン消費及び合成は、迅速ながん細胞増殖と相関することを示すグラフである。（１Ｄ）細胞質及びミトコンドリアのグリシン代謝の概略図。
【図１Ｅ】グリシン消費及び合成は、迅速ながん細胞増殖と相関することを示すグラフである。（１Ｅ）１００％細胞外（１３Ｃ）グリシンにおいて成長したＬＯＸ  ＩＭＶＩ細胞における未標識（０）及び標識（＋１）細胞内グリシン及びセリンの存在量。エラーバーは、ＳＤを表す。
【図１Ｆ】グリシン消費及び合成は、迅速ながん細胞増殖と相関することを示すグラフである。（１Ｆ）グリシン（ｇｌｙ）の非存在下（黒い棒グラフ）又は存在下（白い棒グラフ）で培養した、ＳＨＭＴ２（ｓｈ１〜４）又は対照ｓｈＲＮＡ（ｓｈＣｔｒｌ）を標的とするｓｈＲＮＡを発現するＡ４９８及びＬＯＸＩＭＶＩ細胞の成長。エラーバーは、ＳＤを表す。
【図１Ｇ】グリシン消費及び合成は、迅速ながん細胞増殖と相関することを示すグラフである。（１Ｇ）グリシンの非存在下（−ｇｌｙ、黒い棒グラフ）又は存在下（＋ｇｌｙ、白い棒グラフ）で培養した、３日後のＳＨＭＴ２（ｓｈ４）を標的とするｓｈＲＮＡを発現する１０のがん細胞株の成長。細胞数を、＋ｇｌｙ細胞に対する比で表す。エラーバーは、ＳＤを表す。
【図１Ｈ】グリシン消費及び合成は、迅速ながん細胞増殖と相関することを示すグラフである。（１Ｈ）図１Ｇにおけるものと同じ１０のがん細胞株における、ｓｈ４ヘアピンによるサイレンシング後の、ＳＨＭＴ２転写レベルのＲＴ−ＰＣＲ分析。
【図２Ａ】ミトコンドリアグリシン生合成経路の発現は、乳がん患者における死亡率と関連することを示すグラフである。（２Ａ）６人の独立した乳がん患者コホート（２２〜２７）のカプラン−マイヤー生存分析。患者を、ミトコンドリアグリシン代謝酵素（ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及びＭＴＨＦＤ１Ｌ、図１Ｄ）の発現中央値より上（下の線）及び発現中央値より下（上の線）に分けた。長線は、検閲された事象を示す。
【図２Ｂ】ミトコンドリアグリシン生合成経路の発現は、乳がん患者における死亡率と関連することを示すグラフである。（２Ｂ）６回の研究についてのＣｏｘハザード比のメタ分析。一本線は、９５％信頼区間を示す；四角は、結果に対する各研究の相対的な影響を示す（逆二乗ＳＥ）；菱形は、全体の９５％信頼区間を記す。
【図３】グリシン消費は、抗葉酸薬に対する細胞感受性に強く相関し、これを予測することを示すグラフである。グリシンを消費する細胞は、複数の抗葉酸剤に対し独特に感受性であった（灰色丸）が、５−フルオロウラシルを含む迅速に増殖するがん細胞を標的とする化学療法剤を含めて、他の化学療法剤に対しては感受性が低かった（黒丸）。
【図４】腫瘍遺伝子発現のメタ分析を示すグラフである。２０，４５０遺伝子についてのＺスコアの分布を、対応する正常組織に対するがんの発現変化の程度を示す２０の多様ながんの型にわたって示す。測定した２０，４５０の遺伝子の中で、最も一定して上方制御された遺伝子の上位５０の遺伝子（上方制御された遺伝子の上位５％以内に遺伝子が出現するデータセットの数で規定する）を、下の表２に示す。この遺伝子リストは、公知の薬物標的を含み、これらとしては、ＴＹＭＳ、ＲＲＭ２、ＴＯＰ２Ａ及びＡＵＲＫＡ、並びにより高いランキング遺伝子ＭＴＨＤＦ２（遺伝子ランク８）が挙げられる。対照的に、細胞質パラログであるＭＴＨＦＤ１（遺伝子ランク５４８）又は成体パラログであるＭＴＨＦＤ２Ｌ（ランクスコア１１９１２）は、正常な対照物と比較して、がんにおいて高度に上方制御されなかった。ＭＴＨＦＤ２が上方制御された遺伝子の上位５％に出現する（偽陽性率による）これらのがんデータセットを、図４における黒丸で示す。
【図５】ＭＴＨＦＤ２が免疫組織化学分析によって腫瘍細胞において強く発現され、周囲の正常間質において限定的に発現されることを示す一組の棒グラフである。
【図６】乳がん、腎がん、黒色腫及び結腸がんの研究において、ＭＴＨＦＤ２の中央値を上回る発現（下、灰色線）は、ＭＴＨＦＤ２の中央値を下回る発現（上、黒線）よりも悪い生存率に関連することを示す一連のグラフである。
【図７Ａ】１）正常、非増殖組織（灰色の棒グラフ）、２）結腸上皮及び白血球を含む正常な増殖組織（黒の棒グラフ）、並びに３）この組織図譜データセットに含まれるがん組織（白の棒グラフ）における、ＭＴＨＦＤ２、ＭＴＨＦＤ１、ＭＴＨＦＤ２Ｌ、ＲＲＭ２、ＤＨＦＲ、ＴＯＰ２Ａ及びＴＹＭＳの発現を示す、一連の７つのグラフである。
【図７Ｂ】評価した全２０，０００の遺伝子の中で、ＭＴＨＦＤ２が最も高い最小／最大比を有したことを示すグラフである
【図７Ｃ】ＤＨＦＲ、ＲＲＭ２及びＴＯＰ２Ａを含む公知の化学療法標的が、刺激されて増殖した場合の正常組織において強く誘導されたが、ＭＴＨＤ２は、正常な増殖細胞において誘導されなかったことを示す、一連の３つの線グラフである（図７Ｃ、左及び中央のパネルを参照されたい）。活性型Ｔ細胞は例外であり、これは、活性化された際に、ＭＴＨＦＤ２発現を上方制御した（図７Ｃ、右パネル）。
【図８】以下の細胞株における細胞増殖に対するｓｈＲＮＡを用いたＭＴＨＦＤ２の遺伝子ノックダウンの効果を示す一連のグラフである：
【表１】
2016514136.tif 000003
【図９Ａ】野生型ＭＴＨＦＤ２タンパク質又はＭＴＨＦＤ２  Ｃ１４５Ｓ、Ｃ１６６Ｓ又はＣ１４５Ｓ／Ｃ１６６Ｓの両方の突然変異体の、６−ヒドロキシ−ＤＬ−ＤＯＰＡの存在下での分析の結果を示す線グラフである。
【図９Ｂ】野生型ＭＴＨＦＤ２タンパク質又はＭＴＨＦＤ２  Ｃ１４５Ｓ、Ｃ１６６Ｓ又はＣ１４５Ｓ／Ｃ１６６Ｓの両方の突然変異体の、セラストロールの存在下での分析の結果を示す線グラフである。
【図９Ｃ】野生型ＭＴＨＦＤ２タンパク質又はＭＴＨＦＤ２  Ｃ１４５Ｓ、Ｃ１６６Ｓ又はＣ１４５Ｓ／Ｃ１６６Ｓの両方の突然変異体の、エブセレン（９Ｃ）の存在下での分析の結果を示す線グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析を使用して、中間代謝の主要経路にわたる２１９の代謝物の細胞消費及び放出（ＣＯＲＥ）をプロファイリングし、がん細胞における代謝と増殖の間の関係を突き止めた。この結果は、グリシン取り込み／消費、及びミトコンドリア１炭素代謝に関連する遺伝子が、多様な一連のがんにわたって増殖と相関していること、並びに増殖を変更するために標的され得ることを実証した。
【００４８】
グリシン消費
本明細書に記載の通り、迅速に増殖するがん細胞におけるグリシン代謝に対して予期せぬ増大した依存があり、これは、迅速に増殖する非形質転換細胞においては観察されない表現型であった。したがって、グリシン取り込みは、がん細胞増殖速度の予測因子として使用され得る（例えば、図１ａ、ｂを参照されたい）。細胞増殖速度は、がんの悪性度及び成長速度と関連するので、グリシン取り込み活性のモニタリングは、腫瘍が、いかに高悪性度であるか又はいかに迅速に増殖するかを決定するために使用され得る。グリシン取り込みはまた、治療利益のために標的され得る、迅速に増殖するがん細胞における独特の代謝脆弱性をも表す。
【００４９】
グリシンは、迅速に増殖するがん細胞におけるデノボのプリンヌクレオチド生合成のために利用され、グリシンに由来する１炭素群の細胞性メチル化反応のための利用を含む機構（Zhang et al., Cell 148, 259 (2012)）は、グリシンをがん増殖と結びつけるために決定的に重要であり得る。
【００５０】
グリシン消費についてのアッセイ
細胞、例えば対象由来の腫瘍細胞におけるグリシン取り込みを定量するためのいくつかのインビトロアッセイが、当該分野で公知である。従来型のアッセイは、放射性標識基質（例えば、［３Ｈ］グリシン）の細胞への取り込みを、代表的には、基質の存在下での細胞のインキュベーション後、細胞を洗浄して可溶化し、シンチレーション計測によって細胞へ取り込まれた放射活性の量を測定して、測定する（Morrow et al., FEBS Lett., 1998, 439(3), 334-340；Williams et al., Anal. Biochem., 2003, 321(1), 31-37）。他の方法、例えば、液体クロマトグラフィータンデム質量分析などの質量分析法、又はＨＰＬＣ、例えば親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）若しくは例えば本明細書に記載のＵＰＬＣ、並びに、当該分野で公知の他の方法、例えば、Allan et al., Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 9:9-14 (2006)において記載された方法（ＦＬＩＰＲ膜電位ブルー色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）及びＦＬＥＸステーションを用いた均一な細胞ベースのアッセイ）、並びにKopek et al., J Biomol Screen.14(10):1185-94 (2009)において記載された方法もまた、使用され得る。
【００５１】
インビボ、例えばがんを有する生きている対象におけるグリシン代謝を測定するために、当業者は、例えば、ＰＥＴ画像化及び標識グリシンを使用して、生きている対象における腫瘍におけるグリシン消費を非侵襲的にモニタリングすることができる（１１Ｃ標識グリシンＰＥＴプローブの合成及び腫瘍におけるその使用は、当該分野で公知であり、例えば、Bolster et al., Int J Rad Appl Instrum Part A, 37(9):985-7 (1986)及びJohnstrom et al., Int J Rad Appl Instrum A. 38(9):729-34 (1987)において報告されている通りである）。或いは、がんを有する患者におけるグリシン取り込みは、安定的な炭素−１３同位体で標識したグリシンの輸液を介してモニタリングされ得、がんの切除の際に、標識グリシンは、質量分析を介して腫瘍標本中で測定され得る。
【００５２】
ミトコンドリア１炭素代謝
細胞内ヌクレオチド代謝は、がん細胞増殖のために必須である。ヌクレオチドのデノボの生合成は、ミトコンドリア、細胞質及び核に及ぶいくつかの代謝酵素を含む。この経路におけるいくつかの代謝酵素は、実際に、メトトレキサート（ＤＨＦＲを標的とする）、５−フルオロウラシル（ＴＹＭＳを標的とする）、並びにいくつかの抗代謝化学療法剤を含む、現在使用されている化学療法剤の標的である。これらの薬物は、がんに対して非常に効果的であるが、迅速に増殖する正常細胞において起こるその正確な副作用によって、限定される。近年、ＤＨＦＲ及びＴＹＭＳを含むいくつかのこれらの薬物標的が、パラログＤＨＦＲＬ１（Anderson et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108:15163-15168；McEntee et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108:15157-15162）、若しくはミトコンドリア局在型ＴＹＭＳ（Samsonoff et al., The Journal of biological chemistry. 1997;272:13281-13285）を含む、ミトコンドリア中に存在する二重局在化又はパラログ酵素を有することが発見された。原則的に、例えば、当技術分野で公知の若しくは本明細書に記載のミトコンドリア標的化部分への連結によって、これらの薬剤をミトコンドリアに対して特異的に標的化することは、薬物有効性を維持するか又は増大しながら、正確な薬物毒性を限定し得る。加えて、この重要な経路の中でのいくつかのさらなる酵素反応のために、ミトコンドリア酵素及び細胞質酵素のパラログ、又はがん及び成体のアイソフォームのパラログが存在する。
【００５３】
ミトコンドリア１炭素経路酵素
パラログ酵素の１つの顕著な例としては、ミトコンドリア１炭素経路におけるメチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ／シクロヒドロラーゼ反応のために必要な酵素が挙げられる。この反応を触媒する３つの酵素、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ＋依存型）、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ２（ＭＴＨＦＤ２）、ＭＴＨＦＤ１及びＭＴＨＦＤ２Ｌが存在し、以下にさらに記載する：
【００５４】
ＭＴＨＦＤ２は、二官能性の酵素であり、ミトコンドリアに局在し、デヒドロゲナーゼ反応及びシクロヒドロラーゼ反応の両方を触媒する。ＭＴＨＦＤ２についてのコファクターとしては、ＮＡＤ＋、Ｍｇ２＋及び無機リン酸塩が挙げられる。ＭＴＨＦＤ２は、胚成長において、及び形質転換状態において、発現される（Mejia et al., The Journal of biological chemistry. 1985;260:14616-14620）。
【００５５】
ＭＴＨＦＤ１は、三官能性酵素であり、細胞質に局在し、デヒドロゲナーゼ反応、シクロヒドロラーゼ反応及びホルミル−ＴＨＦシンセターゼ反応を触媒する。ＭＴＨＦＤ１についてのコファクターとしては、ＮＡＤＰ＋が挙げられる。ＭＴＨＦＤ１は、ユビキタスに発現される（Tibbetts and Appling, Annu Rev Nutr. 2010;30:57-81）。
【００５６】
ＭＴＨＦＤ２Ｌは、二官能性酵素であり、ミトコンドリアに局在し、デヒドロゲナーゼ反応とシクロヒドロラーゼ反応との両方を触媒する。ＭＴＨＦＤ２Ｌについてのコファクターとしては、ＮＡＤＰ＋が挙げられる。ＭＴＨＦＤ２Ｌは、成体組織においてユビキタスに発現される；Bolusani et al., The Journal of biological chemistry. 2011;286:5166-5174を参照されたい。
【００５７】
述べたように、ＭＴＨＦＤ２は、その細胞質パラログであるＭＴＨＦＤ１及びその成体パラログであるＭＴＨＦＤ２Ｌに対して、示差的なコファクター要求性及び細胞内局在性を有する。ＭＴＨＦＤ２対ＭＴＨＦＤ１対ＭＴＨＦＤ２Ｌの異なる特性は、ＭＴＨＦＤ２を阻害する一方でＭＴＨＦＤ１及びＭＴＨＦＤ２Ｌを残しておくために潜在的に利用され得る。ＭＴＨＦＤ２を選択的に阻害する方法としては、テトラフェニルホスホニウム又は関連する化学部分とのコンジュゲーションを通した、及び／又はＮＡＤ＋対ＮＡＤＰ＋酵素ポケット内に特異的に結合し得る低分子薬剤の同定を通した、低分子薬剤のミトコンドリアへの特異的な送達が挙げられる。異なるコファクターカップリングは、パラログ酵素が、１つの酵素を選択的に阻害することが可能であるその生物学において、十分に異なっていることを示唆する。ＭＴＨＦＤ２とＭＴＨＦＤ１との間の生物学における１つのそのような相違は、本明細書で強調されており、すなわち、酵素活性のために必要な、ＭＴＨＦＤ２における非触媒性システイン残基である。
【００５８】
ヒトＭＴＨＦＤ２の配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ＮＭ＿００６６３６．３（核酸）及びＮＰ＿００６６２７．２（タンパク質）；ＭＴＨＦＤ１  ＮＭ＿００５９５６．３（核酸）及びＮＰ＿００５９４７．３（タンパク質）；ＭＴＨＦＤ２Ｌ  ＮＭ＿００１１４４９７８．１（核酸）及びＮＰ＿００１１３８４５０．１（タンパク質）の受託番号にて利用可能である。
【００５９】
ＭＴＨＦＤ１Ｌは、このファミリーの別のメンバーであり、他の二官能性及び三官能性のメンバーとは異なり、ＭＴＨＦＤ１Ｌのみが、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ活性を有する（Christensen et al., J. Biol. Chem. 280 (9): 7597-602 (2005)）。ヒトＭＴＨＦＤ１Ｌには、４種のアミノ酸配列が存在する：ＮＰ＿００１２２９６９６．１、ＮＰ＿００１２２９６９７．１、ＮＰ＿００１２２９６９８．１及びＮＰ＿０５６２５５．２、これらは、４つのオルタナティブな転写産物から発現される：ＮＭ＿００１２４２７６７．１、ＮＭ＿００１２４２７６８．１、ＮＭ＿００１２４２７６９．１及びＮＭ＿０１５４４０．４。
【００６０】
セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ２（ミトコンドリア）又はＳＨＭＴ２は、グリシン合成に関与する別の酵素である。ＳＨＭＴ２は、Ｌ−セリンをグリシンへ（レトロ−アルドール開裂）と、テトラヒドロ葉酸を５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸へ（加水分解）との、可逆的な同時変換を触媒することにより、細胞性１炭素経路において重要な役割を果たす（図１Ｄ及びAppaji Rao et al., Biochim Biophys Acta. 2003 Apr 11;1647(1-2):24-9）。この反応は、細胞に、利用可能な１炭素単位の多くを提供する（Stover et al., J. Biol. Chem. 265 (24):14227-33）。
【００６１】
ヒトＳＨＭＴ２には、以下の配列を有する５つのアイソフォームが存在する：ＮＰ＿００１１５９８２８．１、ＮＰ＿００１１５９８２９．１、ＮＰ＿００１１５９８３０．１、ＮＰ＿００１１５９８３１．１又はＮＰ＿００５４０３．２、これらは、５つのオルタナティブ転写産物によってコードされる：ＮＭ＿００１１６６３５６．１、ＮＭ＿００１１６６３５７．１、ＮＭ＿００１１６６３５８．１、ＮＭ＿００１１６６３５９．１又はＮＭ＿００５４１２．５。
【００６２】
ミトコンドリア１炭素酵素についてのアッセイ
本発明の目的のためにタンパク質、ｍＲＮＡ、又は酵素活性のレベルを検出するために、当該分野で公知のいくつかの方法が使用され得る。例えば、本明細書に記載の方法のいくつかにおいて、ミトコンドリアグリシン合成酵素ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／又はＭＴＨＦＤ１Ｌのうち１つ、２つ又は３つ全ての、タンパク質、ｍＲＮＡ、又は活性のレベル、存在又は非存在が、対象由来のサンプルにおいて決定される。
【００６３】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ（転写産物）のレベルは、当該分野で公知の方法、例えば、ノーザンブロット、ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション（ＲＮＡ−ＩＳＨ）、ＲＮＡ発現アッセイ、例えばマイクロアレイ分析、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ配列決定（例えば、ランダムプライマー又はオリゴＴプライマーを用いる）、ディープ配列決定、クローニング、ノーザンブロット、及び例えば、定量的実時間ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いる転写産物の増幅を用いて評価され得る。ＲＮＡ発現を決定する分析技術は、公知である。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)を参照されたい。
【００６４】
当該分野で公知の任意の方法が、タンパク質の存在を検出するために（例えば、本明細書に記載のバイオマーカーに特異的に結合する１種又は複数の抗体を用いて）使用され得る。例えば、サンプルは、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２又はＭＴＨＦＤ１Ｌに特異的に結合する１種若しくは複数の抗体又はその抗原性部分に接触させられ得、この１種又は複数の抗体のサンプル中に存在するタンパク質への結合は、当該分野で公知の方法を用いて検出され得る。ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２又はＭＴＨＦＤ１Ｌに特異的に結合する抗体は、当該分野で公知であり、例えば、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．；Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ；Ｂｉｏｒｂｙｔ；ＮｏｖａＴｅｉｎＢｉｏ；Ａｖｉｖａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ；Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍａｒｔ；Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ；Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；及びＡｂｃａｍから市販されている。
【００６５】
所望される場合、本明細書に記載の又は当該分野で公知の任意のタンパク質単離法が、サンプルを抗体又はその抗原性部分に接触させる前に使用され得る。
【００６６】
標的タンパク質への抗体の結合を検出するための方法は、当該分野で公知であり、二次抗体の使用を含み得る。二次抗体は、一般に、検出可能であるように改変されており、例えば、標識されている。用語「標識」は、二次抗体に検出可能な物質をカップリング（すなわち、物理的に結合）することによる直接標識、並びに、検出可能な物質との反応性による多量体抗原の間接標識を包含することを意図する。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、及び放射活性物質が挙げられる。好適な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸塩フルオレセイン、ローダミン、及び量子ドット、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、及びフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ、生物発光物質の例としては、緑色蛍光タンパク質及びそのバリアント、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられ、好適な放射活性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ又は３Ｈが挙げられる。このような標識抗体を産生するための方法は、当該分野で公知であり、多くは市販されている。
【００６７】
サンプル中に存在するタンパク質を検出する任意の方法が使用され得、これらとしては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロッティング、表面プラスモン共鳴、微小流体デバイス、タンパク質アレイ、タンパク質精製（例えば、アフィニティクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー）、質量分析、二次元ゲル電気泳動、又は当該分野で公知の他のアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、アッセイは、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２又はＭＴＨＦＤ１Ｌに特異的に結合する１種又は複数の抗体を提供すること、この抗体を対象由来の腫瘍細胞由来のタンパク質を含むサンプルと接触させることを含み、この抗体のサンプル中に存在するいずれかのＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２又はＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質への結合が、検出され得る。或いは、アッセイは、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２又はＭＴＨＦＤ１Ｌに特異的に結合する１種又は複数の核酸プローブを提供すること、この抗体を対象由来の腫瘍細胞由来の核酸を含むサンプルと接触させることを含むことができ、このプローブのサンプル中に存在するいずれかのＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２又はＭＴＨＦＤ１Ｌ  ｍＲＮＡへの結合が、検出され得る。
【００６９】
いくつかの実施形態において、高処理方法、例えば当該分野で公知のタンパク質チップ又は遺伝子チップ（例えば、Ch. 12, “Genomics,”in Griffiths et al., Eds. Modern genetic Analysis, 1999,W. H. Freeman and Company; Ekins and Chu, Trends in Biotechnology, 1999;17:217-218；MacBeath and Schreiber, Science 2000, 289(5485):1760-1763；Simpson, Proteins and Proteomics:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2002；Hardiman, Microarrays Methods and Applications: Nuts & Bolts, DNA Press, 2003を参照されたい）は、サテライト又はＳＣＧの存在及び／又はレベルを検出するために使用され得る。
【００７０】
いくつかの実施形態において、例えば腫瘍サンプル中の、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２又はＭＴＨＦＤ１Ｌ活性を検出するアッセイが、使用され得る。当該分野で公知、又は本明細書中に記載の任意のアッセイが、使用され得る。例えば、ＭＴＨＦＤ２活性をインビトロで測定するために、酵素免疫組織化学、例えば、当該分野で公知又は本明細書に記載の（例えば、実施例１２を参照されたい）ＮＡＤ依存型メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ活性のアッセイが、使用され得る。ＳＨＭＴ２活性を測定するために、Hebbring et alに記載されるアッセイ、例えば、Taylor and Weissbach（Anal. l Biochem. 1965;13:80-84）によって公開され、Zhang et al（Anal Biochem. 2008 Apr 15; 375(2):367-9）によって改変された変法が、使用され得る。
【００７１】
サンプル
本方法は、対象、例えば哺乳動物対象、好ましくはヒト対象由来のサンプルを用いて、実施され得る。サンプル（例えば、がん細胞若しくは腫瘍細胞、又はがん細胞若しくは腫瘍細胞であると疑われる細胞を含むサンプル）は、任意の時点で、例えば、ルーチンの年次健康診断の間、悪性病変の可能性を特異的に検出する評価の間、又は以前に同定された悪性病変の段階評価の間に、対象（例えば、がんを有するとわかっているか又は疑われる対象）から採集され得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、わかっている又は疑われる腫瘍細胞を含み、例えば、生検サンプル、例えば、微細針吸引物（ＦＮＡ）、内視鏡生検、又はコア針生検であり、いくつかの実施形態において、サンプルは、対象の膵臓腫瘍、肺腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、腎腫瘍、卵巣腫瘍又は結腸腫瘍由来の細胞を含む。いくつかの実施形態において、サンプルは、痰サンプルから得られたか、又はブラッシング、洗浄、気管支鏡検査生検、経気管支生検又はＦＮＡ、例えば、気管支鏡検査ＦＮＡ、蛍光顕微鏡ＦＮＡ、又はＣＴガイド下ＦＮＡ（このような方法はまた、他の組織からサンプルを得るためにも同様に使用され得る）により、対象の肺から得られた、肺細胞を含む。いくつかの実施形態において、サンプルは、凍結、固定及び／又は透過処理され、例えばホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルである。サンプルは、直ちに使用されても、又は使用前、例えば本明細書に記載の１種又は複数のバイオマーカー（例えば、ＭＴＨＦＤ２レベル又はグリシン消費レベル）の存在又は非存在を検出／決定する前に、一定の期間（例えば、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間又は数か月間）凍結されるか若しくは保存されてもよい。
【００７２】
がんの診断及び予後診断のバイオマーカー
本明細書に記載の通り、グリシン取り込みは、がん細胞増殖速度の予測因子であり（図１Ａ〜Ｂ）、インビボの対象又は対象由来の腫瘍細胞を含むサンプルにおけるグリシン取り込み活性を決定するか又はモニタリングすることは、いかに高悪性度であるか又はいかに迅速に腫瘍を増殖するかを決定するために使用され得る。対象の腫瘍が、高悪性度である又は迅速に成長する可能性が高いか否かを予測するために、グリシン取り込みレベルは、測定され、参照レベルと比較され、参照レベルを上回る取り込みレベルは、腫瘍が、高悪性度である可能性が高いことを示す。
【００７３】
加えて、ミトコンドリア１炭素（１−Ｃ）に対応する、３つの遺伝子発現署名（ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及びＭＴＨＦＤ１Ｌ）は、がん細胞増殖の予測因子である（図１Ｃ〜Ｄ）。例えば生検材料を含むサンプルにおける３つの遺伝子の発現の測定は、したがって、いかに高悪性度であるか又はいかに迅速に腫瘍を増殖するかを予測するために使用され得る。対象の腫瘍が、高悪性度である又は迅速に成長する可能性が高いか否かを予測するために、３つの遺伝子の発現レベルを測定し、参照レベルと比較して、参照レベルを上回る３つの遺伝子のレベルは、腫瘍が、高悪性度である可能性が高いことを示す。
【００７４】
３つの遺伝子発現署名（ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及びＭＴＨＦＤ１Ｌ）はまた、乳がん生存の予測因子でもある（図２Ａ〜Ｂ）。例えば生検材料を含むサンプルにおける３つの遺伝子の発現レベルの測定は、生存を予測するために使用され得る。対象が所定の期間、例えば６か月、又は１、２、３、４若しくは５年より長く生存しそうか否かを予測するために、３つの遺伝子の発現レベルを測定し、参照レベルと比較して、参照レベルを上回る３つの遺伝子のレベルは、参照レベル以下のレベルを有する対象よりも、対象が所定の期間よりも長く生存しそうにないことを示す。
【００７５】
加えて、本明細書中で実証されるように、ＭＴＨＦＤ２は、正常細胞に対して、がん細胞において非常に示差的に発現される。この異なる発現は、ＭＴＨＦＤ２を、それ自体優れたバイオマーカーにする。さらに、ＭＴＨＦＤ２の発現は、がん、例えば癌腫、例えば乳がん、結腸がん及び腎細胞がんにおける予後診断マーカーとして使用され得る。ＭＴＨＦＤ２  ＲＮＡレベル、タンパク質レベル又は酵素活性は、上で記載されるように、例えば、生検標本において、生存の予測因子とするために測定され得る。対象ががんを有するか否か、又はがんを発症する危険性があるか否かを決定するため、又は予後診断を提供するために、対象由来のサンプルにおけるＭＴＨＦＤ２の活性のレベル又は活性が、ＭＴＨＦＤ２の参照レベルと比較され得る。参照レベルを上回るＭＴＨＦＤ２のレベルの存在は、参照レベル以下のレベルを有する対象と比較して、対象ががんを有するか、又はがんを発症する危険性が高いこと、又は所定の期間を超えて生存する可能性が低いことを示す。
【００７６】
したがって、本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、この方法は、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／又はＭＴＨＦＤ１Ｌタンパク質、転写産物、又は活性の検出されたレベル（例えば、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及びＭＴＨＦＤ１Ｌ酵素活性又はグリシン取り込み活性）を参照レベルと比較することを含む。
【００７７】
いくつかの実施形態において、参照は、試験サンプルが採取された対象におけるものと同じ型の非がん性細胞におけるタンパク質、転写産物、又は活性のレベルを表す。いくつかの実施形態において、参照は、健康な対照、すなわち、がんを有すると診断されていないか、又はがんを発生する危険性がないか、又は所定の期間を超えて生存する可能性が高い対象におけるタンパク質、転写産物、又は活性のレベルを表す。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、参照レベルは、がん対照対象、すなわち、がん、例えば癌腫、腺癌、肺がん又は卵巣がんを有すると診断された対象におけるタンパク質、転写産物又は活性のレベルを表す。特定の実施形態において、がん対照は、肺がん又は卵巣がんを有する対象由来である。
【００７８】
いくつかの実施形態において、参照レベルは、がんを有し所定の生存可能性を有する対象における閾値レベルであり、この閾値を上回るレベルの存在は、対象が、所定の生存可能性、例えば６か月、１年、２年、５年又はそれ以上の生存に満たない生存可能性を有することを示す。
【００７９】
いくつかの実施形態において、参照レベルは、参照コホートにおける中央値又はカットオフレベル、例えば、統計的に有意に異なる群を規定するカットオフ、例えば、参照コホートの上位若しくは下位の三分位数、四分位数、五分位数、又は他の百分位数である。参照レベルを上回るレベルは、疾患の存在又は危険性が高いことを示す。
【００８０】
いくつかの実施形態において、参照レベルを上回るレベルは、統計学的に有意な増大であるか、又は少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％若しくは１０００％の増大である。増大は、本明細書で記載される場合、閾値若しくは基線値（例えば、タンパク質の存在若しくは非存在を決定するためのアッセイの閾値検出レベル）、又は参照対象（例えば、健康な参照又はがん、例えば段階がわかっているがんを有する対象）におけるタンパク質の参照レベルとの比較によって決定され得る。いくつかの実施形態において、参照レベルを下回るレベルは、統計学的に有意な減少であるか、又は少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％の減少である。減少は、本明細書で記載される場合、閾値若しくは基線値（例えば、タンパク質の存在若しくは非存在を決定するためのアッセイの閾値検出レベル）、又は参照対象（例えば、健康な参照対象又はがんを有していない対象、例えば肺がんも卵巣がんも有していない対象）におけるタンパク質のレベルとの比較によって決定され得る。
【００８１】
いくつかの実施形態において、この方法は、対象サンプルにおけるタンパク質、転写産物、又は活性のレベルの参照レベルに対する比を計算することを含み、この比が閾値比よりも高い場合、対象は本明細書に記載の癌腫、例えば腺癌、例えば肺がん又は卵巣がんを有するか、又は発症する危険性があることを決定する。いくつかの実施形態において、この比が正であるか又は負であるかが決定され、正の比の存在は、対象が本明細書に記載の癌腫、例えば腺癌、例えば肺がん又は卵巣がんを有するか、又は発症する危険性があることを示す。
【００８２】
薬物感受性の予測
本明細書中で実証されるように、ＭＴＨＦＤ２の発現／活性又はグリシン消費は、メトトレキサート又は他の抗葉酸薬からの毒性（したがって、効能）の予測因子として使用され得、これらの薬物による処置のための対象の選択を可能にする。したがって、本明細書に記載の方法は、グリシン消費レベル又はＭＴＨＦＤ２レベル若しくは活性を測定すること、及びこのレベルを上で記載した参照レベル又は閾値レベルと比較することを含み、そうすることによって、抗葉酸剤又はＭＴＨＦＤ２を阻害する薬剤による治療が有益である患者を同定することができる。これらの方法において、選択された参照レベル又は閾値レベルを上回るグリシン消費レベル又はＭＴＨＦＤ２発現及び／若しくは活性のレベルの存在は、対象が、抗葉酸剤又はＭＴＨＦＤ２を阻害する薬剤による治療が有益である可能性が高いことを示し、この方法は、処置を選択すること及び／又は対象に処置の治療有効用量を投与することをさらに含み得る。
【００８３】
したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、抗葉酸剤又はＭＴＨＦＤ２を阻害する薬剤の治療有効用量を投与することを含む。いくつかの抗葉酸剤は、当技術分野で公知であり、とりわけ、メトトレキサート、ペメトレキセド、プララトレキサート、ラルチトレキセドが挙げられるがこれらに限定されない（例えば、表１に列挙されるもの）。例えば、McGuire, Curr Pharm Des. 2003;9(31):2593-613；Gangjee et al., Anticancer Agents Med Chem. 2007 Sep;7(5):524-42；及びGonen and Assaraf, Drug Resist Updat. 2012 Aug;15(4):183-210を参照されたい。
【００８４】
がんを処置する方法
本明細書に記載の方法は、対象におけるがんの処置のための方法を含む。この文脈において使用される場合、「処置する」は、がんの少なくとも１つの症状又は臨床パラメータを緩和又は改善することを意味する。例えば、処置は、腫瘍サイズ又は成長速度における減少をもたらし得る。処置は、全ての対象においてがんを癒す必要も、常に寛解を生じさせる必要もない。
【００８５】
本明細書に記載の通り、薬剤、例えば、ＳＨＭＴ２又はＭＴＨＦＤ２を阻害する阻害核酸又は低分子の適用は、がん細胞増殖を低減し、したがって、対象におけるがんを処置する。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、ミトコンドリア１炭素（１−Ｃ）経路酵素、例えばＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／又はＭＴＨＦＤ１Ｌを阻害する１種又は複数の薬剤の治療有効用量を投与することを含む。このような薬物としては、本明細書で特定されるもの、例えば、本明細書に記載のＭＴＨＦＤ２を標的とする低分子、例えば、６−ヒドロキシ−ＤＬ  ＤＯＰＡ、塩化カルミダゾリウム、ＣＤＯＯ、エブセレン、セラストロール、ＧＷ５０７４、ヨードアセトアミド、パラ−ベンゾキノン、及びプロトポルフィリンＩＸ二ナトリウム、並びに、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／又はＭＴＨＦＤ１Ｌ、例えば、好ましくはＳＨＭＴ２又はＭＴＨＦＤ２を阻害する阻害核酸が挙げられる。
【００８６】
低分子阻害剤及びミトコンドリア区画の標的化
いくつかの実施形態において、薬物は、ミトコンドリアへの送達のために、例えば、ミトコンドリア透過性部分へのコンジュゲーションによって標的化される。このような部分は、当該分野で公知であり、ミトコンドリア透過性ペプチド、例えば、マイトフュージンペプチド、ミトコンドリア標的化シグナルペプチド、アンテナペディアへリックスＩＩＩホメオドメイン細胞透過性ペプチド（ＡＮＴ）、ＨＩＶ−１  Ｔａｔベーシックドメイン、ＶＰ２２ペプチド、又はＰｅｐ−１ペプチド、ＲＮＡミトコンドリア透過性シグナル、グアニジンリッチペプチド、グアニジンリッチポリカルバメート、ベータ−オリゴアルギニン、プロリンリッチデンドリマー、及びホスホニウム塩、例えば、メチルトリフェニルホスホニウム及びテトラフェニルホスホニウムが挙げられる。
【００８７】
したがって、ＭＴＨＦＤ２は、例えば、ミトコンドリア内に蓄積するようにコンジュゲートされた低分子などの薬物１３、例えば、近年報告されたテトラフェニルホスホニウムコンジュゲートエブセレン１４などを用いて、その細胞質対照物であるＭＴＨＦＤ１又はその成体ミトコンドリア対照物であるＭＴＨＦＤ２Ｌに対して選択的に阻害され得る。
【００８８】
がんを有する対象、例えば、参照レベルを上回るグリシン取り込みのレベル又はミトコンドリア１炭素（１−Ｃ）経路酵素（ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及びＭＴＨＦＤ１Ｌ）の発現のレベルを有する対象を処置するための他の方法は、ミトコンドリアを標的とするように改変されている他のミトコンドリア酵素に影響を及ぼす薬物の投与を含む。例えば、ＤＨＦＲの抗葉酸阻害剤（メトトレキサート、ペメトレキセドなど）又はチミジレートシンセターゼ（ＴＹＭＳ）阻害剤（５−フルオロウラシル）は、本明細書に記載の通り、例えば、ミトコンドリアがＤＨＦＲパラログであるＤＨＦＲＬ１又はミトコンドリア局在型ＴＹＭＳを含むことを考慮し、テトラフェニルホスホニウム又は関連の化学部分を含むミトコンドリア局在部分へのカップリングを通して、ミトコンドリアに対し標的化され得る。ミトコンドリアへの薬剤の局在をもたらすメトトレキサートのペプチドコンジュゲートは、前に記載されているが、抗微生物薬としての使用のための、Ｍｔｘのミトコンドリア特異的バージョン（ｍｔ−Ｍｔｘ）が、この薬物をシクロヘキシルアラニン及びｄ−アルギニンの３反復単位からなるペプチドのＮ末端にカップリングすることによって、産生された。Pereira et al., J Am Chem Soc. 133(10):3260-3 (2011)の図１Ｂを参照されたい。
【００８９】
或いは、ＭＴＨＦＤ２は、選択的ＮＡＤＨ、Ｍｇ若しくはＭＴＨＦＤ２のリン酸塩コファクター要求に拮抗するか、又は他の酵素阻害剤について記載されるように１５、１６、非触媒型システイン残基を選択的に改変する薬物を用いて、選択的に標的化され得る。薬物スクリーニングの努力は、現在、酵素の阻害剤、とりわけキナーゼ類を同定するために、非触媒型システインの可逆的及び非可逆的な共有結合阻害剤を通して、進行中である。２つの近年の刊行物１５、１６は、がん化学療法におけるこれらの努力を強調する。これらの２つの論文によって例示される方法は、システイン突然変異誘発研究及び本明細書に記載のシステイン改変剤の存在下での評価からの見識と組み合わせて、より高い力価及び特異性でＭＴＨＦＤ２を特異的に阻害する新規の薬物を設計するために利用され得る。
【００９０】
２種の非触媒型システイン残基は、ＭＴＨＦＤ２において同定されている：Ｃｙｓ１４５及びＣｙｓ１６６。本明細書に記載の実験は、１４５位におけるシステイン残基が重要なシステインであることを同定した。以前に示されているように（Ziegler et al., Biochemistry. 2007;46(10):2674-83；Parker et al., Mamm Genome. 2010; 21(11-12):565-76）、触媒型システイン残基により、システインからセリンへの突然変異は、酵素活性の完全な消失をもたらす。Ｃ１４５Ｓ  ＭＴＨＦＤ２突然変異体タンパク質において、活性は、わずかにより低い値であっても保持されており（Ｋｃａｔ：野生型ＭＴＨＦＤ２  ２．５７±０．０７；Ｃ１４５Ｓ突然変異体ＭＴＨＦＤ２  １．３１±０．０７  １／秒）、Ｃ１４５は非触媒型システインであることが確認される。加えて、Ｃ１４５Ｓ突然変異体タンパク質は、エブセレン及びセラストロールを含むシステイン改変剤による阻害に抵抗性であり（図９Ｂ〜９Ｃ）、この非触媒型システインは、ＭＴＨＦＤ２活性を阻害するための手段として標的され得ることを示唆する。非触媒型システイン残基は所与の酵素クラスの中の関連酵素の間で代表的には保存されず、実際、ＭＴＨＦＤ２とＭＴＨＦＤ１との間で保存されていないので、以前に記載されるように（Singh et al., Nature reviews. Drug discovery. 2011;10:307-317）これらの非触媒型システインを通して特定の酵素を選択的に標的化することを可能にするため、Ｃ１４５の非触媒型の性質は、薬物開発の視点から極めて有利である。
【００９１】
したがって、何らかの特定の理論に縛られることは望まないが、Ｃｙｓ１４５又はＣｙｓ１６６のうちの一方又は両方におけるＭＴＨＦＤ２の共有結合による改変は、他の関連酵素（例えば、ＭＴＨＦＤ１）と比較してＭＴＨＦＤ２の選択的阻害をもたらすと考えられる。したがって、特定の実施形態において、本発明は、ＭＴＨＦＤ２のＣｙｓ１４５又はＣｙｓ１６６のうちの一方又は両方に共有結合し、それによってＭＴＨＦＤ２を非可逆的に阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、ＭＴＨＦＤ２のＣｙｓ１４５又はＣｙｓ１６６のうちの一方又は両方に共有結合し、それによってＭＴＨＦＤ２を非可逆的に阻害することを含む、ＭＴＨＦＤ１と比較してＭＴＨＦＤ２を選択的に阻害する方法を提供する。例示的方法は、後述の実施例１３において記載する。
【００９２】
特定の実施形態において、本発明は、式Ａのコンジュゲートを提供する：
Ｃｙｓ１４５−改変剤−阻害部分
Ａ
式中、
Ｃｙｓ１４５は、ＭＴＨＦＤ２のＣｙｓ１４５であり；
阻害部分は、ＭＴＨＦＤ２の結合部位において結合する部分であり；
改変剤は、阻害部分と、ＭＴＨＦＤ２のＣｙｓ１４５との共有結合から生じる二価基であり；
阻害部分は、Ｃｙｓ１４５に共有結合又は非共有結合によって結合することができる官能基を含む。
【００９３】
特定の実施形態において、本発明は、式Ｂのコンジュゲートを提供する：
Ｃｙｓ１６６−改変剤−阻害部分
Ｂ
式中：
Ｃｙｓ１６６は、ＭＴＨＦＤ２のＣｙｓ１６６であり；
阻害部分は、ＭＴＨＦＤ２の結合部位において結合する部分であり；
改変剤は、阻害部分の、ＭＴＨＦＤ２のＣｙｓ１６６との共有結合又は非共有結合から生じる二価基であり；並びに
阻害部分は、Ｃｙｓ１６６に共有結合又は非共有結合によって結合することができる官能基を含む。
【００９４】
Ｃ１４５は、必須の非触媒型システイン残基であるので、このことは、ＭＴＨＦＤ２の標的化阻害剤の設計を可能にする。このような化合物は、ＭＴＨＦＤ２に非共有結合によって結合するように設計され得、このような結合としては、ＭＴＨＦＤ２のシステイン１４５残基との非共有結合又は共有結合による相互作用及び阻害複合体の形成のために非常に好ましくなる相互距離及び方向性で最適に配置される、中程度に反応性の求電子試薬を有する、天然のリガンドアナログを通した結合が挙げられる。ＭＴＨＦＤ２と相互作用する薬剤は、ＭＴＨＦＤ２若しくはその断片、又は試験化合物と結合したＭＴＨＦＤ２の複合体、又はこれらの複合体のいずれか１つの断片の表現を用いることを含む方法によって、同定され得るか又は設計され得る。
【００９５】
種々のソフトウェアプログラムが、一連の構造座標のグラフ表現により試験化合物に結合したＭＴＨＦＤ２の複合体の表現又はこれらの複合体の１つの断片を得ることを可能にする。一般に、このような表現は、（相対的に及び／又は絶対的に）構造座標、又は特徴間の距離若しくは角度などの構造座標から導かれた情報を正確に反映すべきである。いくつかの実施形態において、この表現は、二次元図、例えば立体二次元図である。特定の実施形態において、この表現は、相互作用型二次元表示、例えば相互作用型立体二次元表示である。相互作用型二次元表示は、例えば、回転してポリペプチド、ポリペプチドの断片、複合体及び／又は複合体の断片の異なる面を示すことができる、コンピューター表示であってもよい。いくつかの実施形態において、この表現は、三次元表現である。例として、三次元モデルは、分子構造の物理的モデル（例えば、球及び棒モデル）であってもよい。別の例として、三次元表現は、分子構造のグラフ表現（例えば、コンピューター表示上に表された描画又は図）であってもよい。二次元グラフ表現（例えば、描画）は、この二次元表現が、例えば透視図、陰影、又は視聴者により近い特徴によって視聴者からより遠い特徴が遮られることを通して、三次元情報を反映する場合、三次元表現に対応し得る。いくつかの実施形態において、表現は、複数のレベルでモデル化され得る。例として、三次元表現が、試験化合物に結合したＭＴＨＦＤ２の複合体などのポリペプチドを含む場合、ポリペプチドは、一次構造（アミノ酸配列）、二次構造（例えば、α−へリックス及びβ−シート）、三次構造（折り畳み全体）及び四次構造（オリゴマー化状態）などの、構造の１つ又は複数の異なるレベルにおいて表現され得る。表現は、詳細の異なるレベルを含み得る。例えば、表現は、タンパク質の二次構造特徴の相対位置を、原子の位置を特定することなく含み得る。より詳細な表現は、例えば、原子の位置を含み得る。
【００９６】
いくつかの実施形態において、表現は、試験化合物に結合したＭＴＨＦＤ２の複合体の原子の構造座標に加えて、情報を含み得る。例えば、表現は、溶媒アクセス可能表面の形状、モデルの原子のファンデルワールス半径、及び溶媒（例えば水）のファンデルワールス半径に関する情報を、提供し得る。表現から導き出され得る他の特徴としては、例えば、静電電位、巨大分子構造内の空隙若しくはポケットの位置、並びに水素結合及び塩架橋の位置が挙げられる。
【００９７】
ソフトウェアシステムは、これらのステップを容易にするように設計され得、且つ／又は実行され得る。表現を作成するか又は適合分析を実施するために使用されるソフトウェアシステム（例えば、コンピュータープログラム）としては、例えば、Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）製のＭＣＳＳ、Ｌｕｄｉ、ＱＵＡＮＴＡ、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ、Ｃｅｒｉｕｓ２、ＣＨａｒＭＭ及びＭｏｄｅｌｅｒ；ＴＲＩＰＯＳ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）製のＳＹＢＹＬ、Ｕｎｉｔｙ、ＦｌｅＸＸ及びＬＥＡＰＦＲＯＧ；ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）；ＧＲＩＤ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）；ＤＯＣＫ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）；並びにＦｌｏ＋及びＦｌｏ９９（Ｔｈｉｓｔｌｅｓｏｆｔ、Ｍｏｒｒｉｓ  Ｔｏｗｎｓｈｉｐ、ＮＪ）が挙げられる。他の有用なプログラムとしては、Ｏｐｅｎｅｙｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓａｎｔａ  Ｆｅ、ＮＭ）製のＲＯＣＳ、ＺＡＰ、ＦＲＥＤ、Ｖｉｄａ及びＳｚｙｂｋｉ；Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ）製のＭａｅｓｔｒｏ、Ｍａｃｒｏｍｏｄｅｌ及びＧｌｉｄｅ；ＭＯＥ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ）、Ａｌｌｅｇｒｏｗ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｄｅ  Ｎｏｖｏ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）並びにＧＯＬＤ（Jones et al., J. Mol. Biol. 245:43-53, 1995）が挙げられる。構造座標はまた、ＭＯＬＳＣＲＩＰＴ、ＲＡＳＴＥＲ３Ｄ又はＰＹＭＯＬＥ（Kraulis, J. Appl. Crystallogr. 24:946-950, 1991; Bacon and Anderson, J. Mol. Graph. 6:219-220, 1998; DeLano, The PyMOL Molecular Graphics System (2002) DeLano Scientific, San Carlos, CA）を用いてＥＲアルファポリペプチドの三次元構造を可視化するために使用され得る。
【００９８】
この薬剤は、例えば、適切なデータベースをスクリーニングすることによって選択され得、立体配置及び未結合ＭＴＨＦＤ２の帯電電位を、適切なソフトウェアシステムと組み合わせて分析することによって、デノボで設計され得るか、及び／又はプロゲステロンレセプター若しくは他のホルモンレセプターの既知のリガンドの性質を用いて設計され得る。この方法は、ＭＴＨＦＤ２のアゴニスト又はアンタゴニストを設計又は選択するために使用され得る。ソフトウェアシステムは、データベース検索、及び／又は薬剤選択及び設計を容易にするために、設計され得、且つ／又は実行され得る。
【００９９】
一旦、薬剤が設計されるか又は同定されると、これは、入手され得るか又は合成され得、ＭＴＨＦＤ２活性に対するその効果についてさらに評価され得る。例えば、この薬剤は、これをＭＴＨＦＤ２と接触させ、そしてこの薬剤のポリペプチド活性に対する効果を測定することによって、評価され得る。この薬剤を評価するための方法は、インビトロ又はインビボで実施される活性アッセイを含み得る。活性アッセイは、例えば、本明細書に記載の細胞ベースアッセイであってもよく、ＭＴＨＦＤ２を阻害する薬剤が、選択される。同定した薬剤に結合したＭＴＨＦＤ２を含む結晶が成長され得、構造は、Ｘ線結晶構造解析によって決定される。第２の薬剤は、第１の薬剤とＭＴＨＦＤ２との相互作用に基づいて、設計され得るか、又は同定され得る。
【０１００】
種々の分子分析及び合理的薬物設計技術が、例えば、米国特許第５，８３４，２２８号、同第５，９３９，５２８号及び同第５，８５６，１１６号、並びに、ＷＯ９９／０９１４８として公開されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１６８７９においてさらに開示される。
【０１０１】
或いは、ＭＴＨＦＤ２反応が非反応性リガンドを非常に反応性のリガンドに変換し、次いでこれがシステイン１４５残基を標的とし得る、機構ベースの阻害剤が、設計され得る。これらのアプローチは、パラログＭＴＨＦＤ１の拮抗作用を含まない、非常に強力且つ選択的な、ＭＴＨＦＤ２についての標的化阻害剤の開発を可能にする。このようなアプローチは、非常に強力且つ選択的な酵素阻害剤の開発をもたらすことが見出されている（Wissner et al., J Med Chem. 2003;46(1):49-63；Ahn et al., Chem Biol. 2009;16(4):411-20）。
【０１０２】
グリシンレベルの低減
加えて、非必須アミノ酸であるグリシンの枯渇は、迅速ながん細胞増殖を鈍らせる（図１Ｆ〜Ｇ）。したがって、本明細書に記載の方法は、例えば、がんを有する対象、例えば、参照レベルを上回るグリシン取り込みのレベル又はミトコンドリア１炭素（１−Ｃ）経路酵素（ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及びＭＴＨＦＤ１Ｌ）の発現のレベルを有する対象への、低グリシン食餌又は安息香酸案トリウムの投与を処方することを含み得る。この方法は、グリシン取り込みのレベル又はミトコンドリア１炭素（１−Ｃ）経路酵素（ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及びＭＴＨＦＤ１Ｌ）の発現のレベルを決定し、このレベルを参照レベルと比較し、参照レベルを上回るグリシン取り込みのレベル又はミトコンドリア１炭素（１−Ｃ）経路酵素（ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及びＭＴＨＦＤ１Ｌ）の発現のレベルを有する対象を選択し、任意選択でこの対象に処置を施すことにより、低グリシン食餌又は安息香酸ナトリウムの投与による処置について対象を処置又は同定することを含み得る。安息香酸ナトリウム又はその誘導体は、投与され得る。例えば、ＵＳ８１９８３２８；Sun and Hai Liu, Cancer Lett. 2006 Sep 8;241(1):124-34；又はNeto et al., Mol Nutr Food Res. 2008 Jun;52 Suppl 1:S18-27を参照されたい。
【０１０３】
阻害核酸
最後に、処置の方法は、標的ＲＮＡを阻害するように設計された阻害核酸分子、例えば、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、リボザイム及びアプタマーを含む組成物の投与を含み得る。この方法は、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及びＭＴＨＦＤ１Ｌのいずれか１つ又は複数を阻害することを含み得、好ましい実施形態において、阻害核酸は、ＳＨＭＴ２を阻害する。
【０１０４】
ｓｉＲＮＡ分子
ＲＮＡｉは、哺乳動物細胞において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が相同なｍＲＮＡの配列特異的分解を誘導するプロセスである。
【０１０５】
核酸分子又は構築物は、各鎖において１６〜３０、例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０のヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡ分子を含み得、ここで、鎖の１つは、ｍＲＮＡにおける標的領域と実質的に同一であり、例えば少なくとも８０％（又はそれ以上、例えば、８５％、９０％、９５％又は１００％）同一であり、例えば、３、２、１又は０の不適合ヌクレオチドを有し、他方の鎖は、第１の鎖に相補的である。ｄｓＲＮＡ分子は、化学的に合成され得るか、又はＤＮＡテンプレートからインビトロで、又は例えば小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）からインビボで、転写され得る。ｄｓＲＮＡ分子は、当該分野で公知の任意の方法を用いて設計され得る；いくつかのアルゴリズムが公知であり、市販されている。遺伝子歩行法が、ｓｉＲＮＡの阻害活性を最適化するために使用され得る。
【０１０６】
核酸組成物は、ｓｉＲＮＡと改変ｓｉＲＮＡ誘導体、例えば、組成物の薬物動態学などの特性を変えるように、例えば、体内における半減期を延長するように改変されているｓｉＲＮＡとの両方、並びに遺伝子操作されたＲＮＡｉ前駆体を、含み得る。
【０１０７】
ｓｉＲＮＡは、当該分野で公知の方法、例えば、カチオン性リポソームトランスフェクション及びエレクトロポレーションによって、細胞に送達され得る。ｓｉＲＮＡ二重鎖は、細胞内で、遺伝子操作されたＲＮＡｉ前駆体、例えば、哺乳動物Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター系（例えば、機能的二本鎖ｓｉＲＮＡの発現が可能であるＨ１又はＵ６／ｓｎＲＮＡプロモーター系（Tuschl (2002)、前出））を用いた組換えＤＮＡ構築物から発現され得る（Bagella et al., J. Cell. Physiol. 177:206-213 (1998)；Lee et al. (2002)、前出；Miyagishi et al. (2002)、前出；Paul et al. (2002)、前出；Yu et al. (2002)、前出；Sui et al. (2002)、前出）。ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩによる転写停止は、ＤＮＡテンプレートにおける４つの連続するＴ残基の方向で起こり、特定の配列においてｓｉＲＮＡ転写産物を終わらせる機構を提供する。ｓｉＲＮＡは、５’−３’と３’−５’との方向で標的遺伝子の配列に対し相補的であり、ｓｉＲＮＡの２本鎖は、同じ構築物中で発現されても、又は別個の構築物中で発現されてもよい。Ｈ１又はＵ６  ｓｎＲＮＡプロモーターによって駆動されて細胞中に発現されるヘアピンｓｉＲＮＡは、標的遺伝子発現を阻害し得る（Bagella (1998)、前出；Lee et al. (2002)、前出；Miyagishi et al. (2002)、前出；Paul et al. (2002)、前出；Yu et al. (2002)、前出；Sui et al. (2002)、前出）。Ｔ７プロモーターの制御下にｓｉＲＮＡ配列を含有する構築物はまた、ベクター発現Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと共に細胞内に同時トランスフェクトされた場合に、機能的ｓｉＲＮＡを作製する（Jacque (2002)、前出）。
【０１０８】
アンチセンス
「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に対して相補的であるヌクレオチド配列を含み得、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるか、又は標的ｍＲＮＡ配列に相補的である。アンチセンス核酸は、標的配列の全コード鎖に相補的であっても、又はその一部分にのみ相補的であってもよい。別の実施形態において、アンチセンス核酸分子は、ヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」（例えば、５’及び３’の非翻訳領域）に対するアンチセンスである。
【０１０９】
アンチセンス核酸は、標的ｍＲＮＡのコード領域全体に対し相補的であるように設計されてもよいが、また、標的ｍＲＮＡのコード領域又は非コード領域の一部のみに対するアンチセンスであるオリゴヌクレオチドであってもよい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周りの領域、例えば、目的の標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０と＋１０との間の領域に対し相補的であってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０又はそれ以上のヌクレオチド長であってもよい。
【０１１０】
アンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用い、化学合成及び酵素的連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、又は分子の生物学的安定性を増大するか、又はアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成される二重鎖の物理的安定性を増大するように設計された、多様に改変されたヌクレオチドを用いて化学合成され得、例えば、チオリン酸誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチドが、使用され得る。アンチセンス核酸はまた、核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされた（すなわち、挿入核酸から転写されたＲＮＡが、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である、以下の小節にてさらに記載される）発現ベクターを用いて生物学的に産生されてもよい。
【０１１１】
本明細書で開示される配列に基づき、当業者は、本発明に従う使用のために、いくつかの適切なアンチセンス分子のいずれかを容易に選択し、合成し得る。例えば、標的核酸の１５〜３０ヌクレオチドの長さに及ぶ一連のオリゴヌクレオチドを含む「遺伝子歩行」は、調製された後、標的遺伝子発現の阻害について試験され得る。任意選択で、合成して試験されるオリゴヌクレオチドの数を減らすために、５〜１０ヌクレオチドのギャップが、オリゴヌクレオチド間に残され得る。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、アンチセンス核酸分子は、アルファ−アノマー核酸分子である。アルファ−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特定の二本鎖ハイブリッドを形成し、ここで、通常のβ−ユニットとは異なり、この鎖は、互いに平衡に伸びる（Gaultier et al., Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641 (1987)）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Inoue et al. Nucleic Acids Res. 15:6131-6148 (1987)）又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Inoue et al. FEBS Lett., 215:327-330 (1987)）を含んでもよい。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、アンチセンス核酸は、モルホリノオリゴヌクレオチドである（例えば、Heasman, Dev. Biol. 243:209-14 (2002)；Iversen, Curr. Opin. Mol. Ther. 3:235-8 (2001)；Summerton, Biochim. Biophys. Acta. 1489:141-58 (1999)を参照されたい）。
【０１１４】
標的遺伝子発現は、調節領域に相補的（例えば、プロモーター及び／又はエンハンサー）であるヌクレオチド配列を用い、三重らせん構造を形成して、細胞におけるＳｐｔ５遺伝子の転写を妨げることによって阻害され得る。一般に、Helene, C. Anticancer Drug Des. 6:569-84 (1991)；Helene, C. Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36 (1992)；及びMaher, Bioassays 14:807-15 (1992)を参照されたい。三重らせん形成のために標的化され得る潜在的配列は、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を作製することによって、増やされ得る。スイッチバック分子は、交互の５’−３’、３’−５’様式で、まず二重鎖のうち一本鎖と塩基対合し、次いで他方と塩基対合するように合成され、二重鎖の一本鎖上に存在するかなりの長さのプリン又はピリミジンのいずれかについての必要性をなくす。
【０１１５】
リボザイム
リボザイムは、酵素的に開裂して特異的な配列依存的様式で他のＲＮＡを不活性化するように遺伝子操作され得るＲＮＡの種類である。標的ＲＮＡの開裂により、リボザイムは、翻訳を阻害し、したがって、コードされた遺伝子の発現を妨げる。リボザイムは、研究室において化学合成され得、その安定性及び触媒活性を増大するために、当該分野で公知の方法によって、構造的に改変され得る。或いは、リボザイム遺伝子は、当該分野で公知の遺伝子送達機構を通して細胞内に導入され得る。標的核酸に対する特異性を有するリボザイムは、本明細書に記載のｃＤＮＡのヌクレオチド配列、及びｍＲＮＡ開裂を担う公知の触媒的配列（米国特許第５，０９３，２４６号又はHaselhoff and Gerlach Nature 334:585-591 (1988)を参照されたい）を有する配列に対し相補的である１つ又は複数の配列を含み得る。例えば、テトラヒメナ属（Tetrahymena）Ｌ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体は、活性部位のヌクレオチド配列が標的ｍＲＮＡにおいて開裂されるヌクレオチド配列に相補的であるように構築され得る。例えば、Ｃｅｃｈらの米国特許第４，９８７，０７１号及びＣｅｃｈらの米国特許第５，１１６，７４２号を参照されたい。或いは、標的ｍＲＮＡは、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒的ＲＮＡを、ＲＮＡ分子のプールから選択するために使用され得る。例えば、Bartel and Szostak, Science 261:1411-1418 (1993)を参照されたい。
【０１１６】
アプタマー
アプタマーは、特定のタンパク質に特異的に結合し得る、短いオリゴヌクレオチド配列である。種々のアプタマー配列が、種々のタンパク質に特異的に結合し得ることが証明されており、例えば、Ｎ＝グアノシン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデノシン（Ａ）又はチミジン（Ｔ）である配列ＧＧＮＮＧＧは、トロンビンに特異的に結合する（Bock et al (1992) Nature 355: 564 566及びＴｏｏｌｅらの米国特許第５，５８２，９８１号（１９９６年））。このようなＲＮＡアプタマーの選択及び調製のための方法は、当該分野で公知である（例えば、Famulok, Curr. Opin. Struct. Biol. 9:324 (1999)；Herman and Patel, J. Science 287:820-825 (2000))；Kelly et al., J. Mol. Biol. 256:417 (1996)；及びFeigon et al., Chem. Biol. 3: 611 (1996)を参照されたい）。
【０１１７】
阻害核酸分子の投与
本明細書に記載のＭＴＨＦＤ２又はＳＨＭＴ２に対して指向する阻害核酸分子は、ＭＴＨＦＤ２又はＳＨＭＴ２タンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡにハイブリダイズするか又は結合し、それによって、例えば、転写及び／又は翻訳を阻害することにより、タンパク質の発現を阻害するように、対象に（例えば、組織部位への直接注射によって）投与され得るか、又は、インサイチュで産生され得る。或いは、阻害核酸分子は、選択された細胞を標的とするように改変され得、その後、全身的に投与され得る。全身投与のために、阻害核酸分子は、選択された細胞表面上に発現されるレセプター又は抗原に、例えば阻害核酸分子を細胞表面レセプター又は抗原に結合するペプチド又は抗体に連結することにより、特異的に結合するように改変され得る。阻害核酸分子はまた、本明細書に記載のベクターを用いて細胞に送達され得る。阻害核酸分子の十分な細胞内濃度を達成するために、阻害核酸分子が強力なプロモーターの制御下に配置されるベクター構築物を、使用し得る。
【０１１８】
組合せ処置
本明細書に記載の方法はまた、本明細書に記載の処置の組合せ、例えば、低グリシン食餌又は安息香酸ナトリウム若しくはその誘導体などのグリシン低減処置と、本明細書に記載の阻害核酸、例えばミトコンドリア１炭素（１−Ｃ）経路酵素、例えばＳＨＭＴ２又はＭＴＨＦＤ２を阻害するｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与などの別の処置との組合せの投与も含み得る。
【０１１９】
がん
本明細書で使用される場合、用語「がん」は、自律的増殖の能力を有する、すなわち、迅速に増殖する細胞成長によって特徴づけられる異常な状況若しくは状態を有する細胞をいう。この用語は、全ての種類のがん性増殖又は発がん過程、転移組織又は悪性形質転換した細胞、組織若しくは器官を、病理組織学の型又は侵襲性の段階に関わりなく含むことを意味する。用語「腫瘍」は、本明細書で使用される場合、がん性細胞、例えば、がん細胞の塊をいう。
【０１２０】
本明細書に記載の方法を用いて処置され得るか又は診断され得るがんとしては、種々の器官系の悪性病変、例えば、罹患した肺、乳房、甲状腺、リンパ球、胃腸、及び尿生殖器管、並びに殆どの結腸がん、腎細胞癌、前立腺がん及び／又は精巣腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸のがん及び食道のがんなどの悪性病変を含む腺癌が、挙げられる。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、対象における癌腫を処置又は診断するために使用される。用語「癌腫」は、当該分野において認識されており、呼吸系癌、胃腸系癌、尿生殖器系癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌及び黒色腫を含む、上皮組織又は内分泌組織の悪性病変をいう。いくつかの実施形態において、がんは、腎癌又は黒色腫である。例示的な癌腫としては、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸及び卵巣の組織から形成されるものが挙げられる。この用語はまた、例えば、癌性組織及び肉腫性組織からなる悪性腫瘍を含む、癌肉腫をも含む。「腺癌」は、腺組織に由来する癌腫、又は、腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成する癌腫をいう。
【０１２２】
用語「肉腫」は、当該分野において認識されており、間充織に由来する悪性腫瘍をいう。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法によって処置されるがんは、正常組織又は同じ組織の他のがんと比較して、増大したグリシン取り込みのレベル、又はミトコンドリア１−ｃ酵素（例えば、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／又はＭＴＨＦＤ１Ｌ）の発現若しくは活性の増大を有するがんであり、当該分野で公知の方法及び本明細書に記載の方法が、これらのがんを同定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、この方法は、がんの細胞を含むサンプルを得ること、このサンプルにおけるグリシン取り込みのレベル又は１つ若しくは複数のミトコンドリア１−ｃ酵素（例えば、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及び／又はＭＴＨＦＤ１Ｌ）のタンパク質、ｍＲＮＡ若しくは活性のレベルを決定すること、及び本明細書に記載の処置（例えば、抗葉酸薬又はＭＴＨＦＤ２を阻害する薬剤、例えばエブセレン）を投与することを含む。いくつかの実施形態において、このがんは、グリシン取り込みの増大したレベルを有することが本明細書中で示されたがんである。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、このがんは、乳がんではないか、又は膀胱がんではない。
【０１２５】
製薬組成物
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の処置の方法は、抗葉酸薬又はミトコンドリア１炭素（１−Ｃ）経路酵素、例えば、ＳＨＭＴ２又はＭＴＨＦＤ２を阻害する薬剤を、製薬組成物中で投与することを含む。製薬組成物は、代表的に、活性薬剤に加えて薬学的に許容される担体を含む。本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」には、製薬的投与に適合した、生理食塩水、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。
【０１２６】
製薬組成物は、代表的に、その意図される投与の経路に適合するように処方される。投与の経路の例としては、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下）投与、経口（例えば、吸入）投与、経皮（局所）投与、経粘膜投与、及び直腸投与が挙げられる。
【０１２７】
好適な製薬組成物を処方する方法は、当該分野で公知であり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005；及びDrugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs (Dekker, NY)のシリーズの本を参照されたい。例えば、非経口、皮内、又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射のための水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミンテトラ酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などの緩衝剤、並びに塩化ナトリウム又はデキストロースなどの浸透圧の調整のための薬剤。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整され得る。非経口調製物は、ガラス又はプラスチックで作られたアンプル、使い捨てシリンジ、又は複数用量バイアル中に封入され得る。
【０１２８】
注射可能な用途のために好適な製薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性である場合）又は分散液、及び注射可能滅菌溶液又は分散液をその場で調製するための滅菌粉末を含み得る。静脈内投与のために好適なキャリアとしては、生理食塩水、滅菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌でなければならず、容易に注射器使用可能な存在である程度に流体であるべきである。これは、製造及び保存の条件下で安定であるべきであり、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びこれらの好適な混合物を含む、溶媒又は分散媒体であり得る。例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合における必要な粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により、適切な流動性が維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって、達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを、組成物中に含めることが好ましい。注射可能組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、一ステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを、組成物中に含めることによってもたらされ得る。
【０１２９】
滅菌注射可能溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて上に列挙した成分の１種又は組合せと共に、適切な溶媒中に組み込み、その後、濾過滅菌することによって、調製され得る。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的分散媒体及び上に列挙されたものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製され得る。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、これらは、活性成分に加えて、事前に濾過滅菌したその溶液に由来する何らかのさらなる所望の成分の粉末を生じる。
【０１３０】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤又は食用キャリアを含む。経口治療投与の目的のために、活性化合物が、賦形剤と共に組み込まれ、錠剤、トローチ剤又はカプセル剤、例えばゼラチンカプセルの形態で、使用され得る。経口組成物はまた、口内洗浄液としての使用のための流体キャリアを使用して調製され得る。薬学的に適合性の結合剤、及び／又はアジュバント材料が、組成物の一部として含まれてもよい。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分のいずれか、又は類似の性質の化合物を含み得る：微結晶セルロース、トラガカントガム若しくはゼラチンなどの結合剤；デンプン若しくは乳糖などの賦形剤；アルギニン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ又はトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム若しくはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの滑剤；ショ糖若しくはサッカリンなどの甘味付与剤；又はペパーミント、サリチル酸メチル若しくはオレンジ風味料などの風味付与剤。
【０１３１】
吸入による投与のために、化合物は、加圧容器若しくは好適な高圧ガス、例えば二酸化炭素などの気体を含むディスペンサー、又は噴霧器から、エアロゾルスプレー形態で送達され得る。このような方法としては、米国特許第６，４６８，７９８号に記載されるものが挙げられる。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、治療化合物は、治療化合物を体内からの迅速な排除から保護するキャリアと共に調製され、例えば、インプラント及び微小カプセル封入送達システムを含む、制御放出処方物などである。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生分解性の生物適合性ポリマーが、使用され得る。このような処方物は、標準的技術を用いて調製され得るか、又は、例えばＡｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から、商業的に入手され得る。リポソーム懸濁液（細胞性抗原に対するモノクローナル抗体によって、選択された細胞に標的化されるリポソームを含む）もまた、薬学的に許容される担体として使用され得る。これらは、当業者に公知の方法、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載される方法に従って、調製され得る。
【０１３３】
投薬量
本明細書に記載の方法は、有効量の抗葉酸薬又はＭＴＨＦＤ２を阻害する薬剤の投与を含み得る。「有効量」は、有益な又は所望の結果をもたらすために十分な量である。例えば、治療量は、所望の治療効果を達成する量である。この量は、疾患又は疾患症状の発症を予防するために必要な量である予防有効量と同じであっても異なっていてもよい。有効量は、１回又は複数回の投与、適用又は投薬量で、投与され得る。治療化合物の治療有効量（すなわち、有効投薬量）は、選択される治療化合物に依存する。組成物は、１日あたり１回又は複数回〜２日に１回を含めて１週間に１回又は複数回、投与され得る。当業者は、特定の要因が、対象を有効に処置するために必要な投薬量及びタイミングに影響を及ぼし得ることを理解する。これらとしては、疾患又は障害の重症度、以前の処置、対象の総合的な健康及び／又は年齢、並びに存在する他の疾患が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、治療有効量の本明細書に記載の治療化合物による対象の処置は、単回処置又は一連の処置を含み得る。
【０１３４】
治療化合物の投薬量、毒性及び治療有効性は、細胞培養物又は実験動物において、標準的製薬手順によって、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％が死ぬ用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）の決定について、決定され得る。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表現され得る。高い治療指数を示す化合物が、好ましい。毒性副作用を示す化合物が使用され得るが、感染していない細胞への潜在的な損傷を最小化するために罹患した組織の部位にこのような化合物を標的化する送達システムを設計することにより、副作用を減らすように注意を払うべきである。
【０１３５】
細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のためのある範囲の投薬量を処方する際に使用され得る。このような化合物の投薬量は、わずかな毒性を有するか又は毒性を有さずにＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内であることが、好ましい。投薬量は、使用される投薬形態及び利用される投与の経路に依存して、この範囲内で変動し得る。本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療有効用量は、まず、細胞培養アッセイから見積もられ得る。用量は、細胞培養で決定される、ＩＣ５０を含む循環血漿濃度範囲（すなわち、症状の最大阻害の半分に到達する試験化合物の濃度）を達成するように、動物モデルにおいて策定することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿におけるレベルは、例えば、高処理液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【０１３６】
試験化合物をスクリーニングする方法
がん、例えばＭＴＨＦＤ２のレベルの増大を伴うがんの処置において有用な薬剤を同定するための、試験化合物、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、無機又は有機の高分子又は低分子の試験化合物をスクリーニングするための方法が、本明細書中に含まれる。
【０１３７】
本明細書中で使用される場合、「低分子」は、約３，０００ダルトンを下回る分子量の、有機又は無機の低分子をいう。一般に、本発明のために有用な低分子は、３，０００ダルトン（Ｄａ）未満の分子量を有する。低分子は、例えば、少なくとも約１００Ｄａ〜約３，０００Ｄａ（例えば、約１００〜約３，０００Ｄａ、約１００〜約２５００Ｄａ、約１００〜約２，０００Ｄａ、約１００〜約１，７５０Ｄａ、約１００〜約１，５００Ｄａ、約１００〜約１，２５０Ｄａ、約１００〜約１，０００Ｄａ、約１００〜約７５０Ｄａ、約１００〜約５００Ｄａ、約２００〜約１５００、約５００〜約１０００、約３００〜約１０００Ｄａ、又は約１００〜約２５０Ｄａの間）であってもよい。
【０１３８】
試験化合物は、例えば、天然産物であっても、又はコンビナトリアル化学ライブラリーのメンバーであってもよい。広範な一連の分子が、電荷、芳香族性、水素結合、可撓性、サイズ、側鎖の長さ、疎水性及び剛性などの種々の機能を網羅するために使用されるべきである。低分子を合成するのに好適なコンビナトリアル技術は、例えば、Obrecht and Villalgordo, Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries, Pergamon-Elsevier Science Limited (1998)によって例示されているように当該分野で公知であり、「スプリット・アンド・プール」又は「パラレル」合成技術、固相及び溶液相技術、並びにコード技術などのものを含む（例えば、Czarnik, Curr. Opin. Chem. Bio. 1:60-6 (1997)を参照されたい）。加えて、いくつかの低分子ライブラリーが、市販されている。いくつかの好適な低分子試験化合物が、米国特許第６，５０３，７１３号に列挙され、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３９】
本発明の方法を用いてスクリーニングされたライブラリーは、種々の型の試験化合物を含み得る。所与のライブラリーが、一連の構造的に関連するか又は関連しない試験化合物を含み得る。いくつかの実施形態において、試験化合物は、ペプチド又はペプチド模倣分子である。いくつかの実施形態において、試験化合物は、核酸である。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、試験化合物及びそのライブラリーは、第１の試験化合物、例えば標的ポリペプチドの既知の天然の結合パートナーに構造的に類似する第１試験化合物、又は、例えば当該分野で公知の方法又は本明細書に記載の方法を用いて標的ポリペプチドに結合可能であると同定される第１の低分子の構造を、体系的に変更し、この構造を、得られた生物学的活性と相関させること、例えば、構造−活性関係性研究によって、得られ得る。当業者が理解するように、このような構造−活性関係性を作製するための、種々の標準的方法が存在する。したがって、ある場合において、作業は、実験に大きく基づき得、他の場合において、内在性ポリペプチド又はその一部の三次元構造が、単数又は複数の低分子化合物の合理的設計のための開始点として使用され得る。例えば、１つの実施形態において、低分子の総合的ライブラリーが、例えば、本明細書に記載の方法を用いて、スクリーニングされる。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、試験化合物は、試験サンプル、例えばＭＴＨＦＤ２を発現する細胞、例えば正常細胞又はがん細胞に適用され、試験化合物の１つ又は複数の効果が、例えばグリシン代謝アッセイ又は好ましくは、ＮＡＤ依存型メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ／シクロヒドロラーゼ活性アッセイを用いて、システイン改変剤による阻害の検出を可能にするＤＴＴ又はメルカプトエタノールを含む還元剤の非存在下で評価される。
【０１４２】
本明細書に記載の方法によってスクリーニングされ、グリシン代謝又はＮＡＤ依存型メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させることが決定された試験化合物を、任意選択でさらに試験し、例えば、この化合物ががん細胞に対する（例えば、生存若しくは増殖に対する）効果を有するか否かを決定してもよく、がん細胞の増殖若しくは生存を低減する化合物を、候補化合物と考えてもよい。例えば、障害のインビボモデル、例えば腫瘍モデル（例えば、デノボ又は異種移植片腫瘍モデル）においてスクリーニングされ、障害、例えば障害の１つ又は複数の症状（例えば、腫瘍サイズ又は成長速度）に対し望ましい効果を有すると決定された候補化合物を、候補治療剤と考えてもよい。一旦臨床設定においてスクリーニングされた候補治療剤は、治療剤である。候補化合物、候補治療剤、及び治療剤は、任意選択で、最適化及び／又は誘導体化されてもよく、生理学的に許容可能な賦形剤と共に処方され、製薬組成物を形成してもよい。
【０１４３】
したがって、「ヒット」と同定された試験化合物（例えば、グリシン代謝又はＮＡＤ依存型メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させる試験化合物、及びがん細胞増殖又は生存を低減する試験化合物、及び任意選択で、インビボモデルにおける活性を有する試験化合物）は、選択されて、例えば合理的デザインを用いて、結合親和性、アビデイティ、特異性又は他のパラメータを最適化するように、体系的に変更され得る。このような最適化もまた、本明細書に記載の方法を用いてスクリーニングされてもよい。したがって、１つの実施形態において、本発明は、化合物の第１のライブラリーを、当該分野で公知の方法及び／又は本明細書に記載の方法を用いてスクリーニングし、１つ又は複数のヒットをこのライブラリーにおいて同定し、これらのヒットを、体系的構造の変更に供して、ヒットに構造的に関連する化合物の第２のライブラリーを作製して、この第２のライブラリーを、本明細書に記載の方法を用いてスクリーニングすることを含む。ヒットとして同定された試験化合物は、がん、例えば、ＭＴＨＦＤ２のレベルの増大に関連するがんの処置において有用な候補治療化合物であると考えてもよい。「ヒット」の構造を決定するのに有用な種々の技術、例えば、ＮＭＲ、質量分析法、電子捕獲検出器を備えたガスクロマトグラフィー、蛍光及び吸収分光学が、本明細書に記載の方法において使用され得る。
【実施例】
【０１４４】
本発明は、以下の実施例においてさらに記載され、これは、特許請求の範囲において記載される本発明の範囲を限定しない。
【０１４５】
材料及び方法
以下の材料及び方法が、以下に示す実施例において使用された。
【０１４６】
細胞培養
ＮＣＩ−６０低継代がん細胞株（Shoemaker, Nat Rev Cancer. 2006;6:813-823）を、以前の文献（Shoemaker, Nat Rev Cancer. 2006;6:813-823）に従い、標準的操作プロトコールの下で、生物学的複製において培養した。５０ｍＬの培地中で培養した非接着性の細胞株であるＳＲ、ＭＯＬＴ−４、ＨＬ−６０（ＴＢ）、Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６及びＣＣＲＦ−ＣＥＭ；並びにＴ−７５フラスコ内で２５ｍＬの培地によって増殖させた細胞株ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＨＣＣ−２９９８及びＳＷ６２０を除き、全６０の細胞株を、Ｔ−１６２培養フラスコ（Ｃｏｓｔａｒ）内にて、ＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢＣＯ）、並びに２ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び５％ウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含む３５ｍＬの完全培地中で増殖させた。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２、９５％大気及び１００％相対湿度にて４又は５日間維持し、指数関数増殖下で細胞を維持するように培養期間を選択して、約８０％のコンフルーエンシーに到達させた。
【０１４７】
各細胞株について、５ｍＬの使用済み培地を注意深くフラスコから吸引して細胞性物質の夾雑を避け、１２００ＲＰＭ×１０分間遠心分離し、上清をクリオバイアルに入れ、その後の代謝物分析のために、−８０℃にて迅速に凍結させた。新鮮な培地を、細胞の添加前に収集した。回収の時点での培地の吸引の後、細胞をトリプシン処理し、自動化セロメーターを用いて計数して、最終細胞数を得た。非接着性細胞株（ＳＲ、ＭＯＬＴ−４、ＨＬ−６０（ＴＢ）、Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６及びＣＣＲＦ−ＣＥＭ）培養細胞を、１５００ＲＰＭ×５分間で優しく遠心分離してペレット細胞にし、培地を上述のように吸引し、迅速に凍結した。その後、細胞を再懸濁させ、上述のセロメーターを用いて計数した。インビトロ倍増時間は、ＮＣＩによって各細胞株について報告されており（Shoemaker, Nat Rev Cancer. 2006;6:813-823）、独立した研究によって確認されている（O’Connor et al., Cancer Res. 1997;57:4285-4300）。全ての細胞株について、腫瘍型の注釈（起源の組織）は、ＮＣＩによって提供された（Shoemaker, Nat Rev Cancer. 2006;6:813-823）。
【０１４８】
倍増時間を確認するために、ＮＣＩ−６０パネル由来のＨＣＴ１１６、ＬＯＸ  ＩＭＶＩ、ＳＦ２９５、ＭＣＦ７、Ａ４９８及びＨＯＰ９２細胞を、上述のように培養し、９６ウェルマイクロタイタープレート中に、２００μＬの培地中ウェルあたり５，０００細胞のプレート培養密度にてプレート培養した。選択した時点において、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを用いて、室温で２０分間固定した。細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の仕様書に従って用いて染色し、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて画像化し、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）の「核計数」モジュールを用いて計数した。倍増時間を見積もるために、増殖曲線の指数関数段階を、細胞数の対数に対する線形回帰によって分析した。
【０１４９】
代謝物ＣＯＲＥプロファイリング
代謝物を、培地サンプル中で、タンデム質量分析と組み合わせた高処理液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いてプロファイリングした。２つの別個のＨＰＬＣ方法を用い、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）方法（Alpert, J Chromatogr. 1990;499:177-196）を、アミノ酸及び生物起源のアミンを含む陽イオンＭＳ条件下で代謝物を評価するために用い、改変型イオン対合クロマトグラフィー（ＩＰＲ）方法（Luo et al., J Chromatogr A. 2007;1147:153-164）を、中心代謝物及び有機酸を含む陰イオンＭＳ条件下で代謝物を評価するために用いた。ＨＩＬＩＣのために、培地サンプルを、９倍容量の７５％アセトニトリル、２５％メタノール及び０．２％ギ酸を含む抽出溶液（１／９  ｖ／ｖ）を用いて調製し、ボルテックスした。次いで、サンプルを、１０，０００ＲＰＭ×１０分間、４℃にて遠心分離し、上清を、以下で記載するＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために分離した。ＩＰＲ方法のために、培地サンプルを、３倍容量の１００％メタノール（１／３  ｖ／ｖ）を用いて調製し、ボルテックスした。次いで、サンプルを、１０，０００ＲＰＭ×１０分間、４℃にて遠心分離し、上清を分離し、窒素乾燥させ、そして水中で再懸濁させた（９／１  ｖ／ｖ）。再懸濁したサンプルを、ボルテックスし、１０，０００ＲＰＭ×１０分間、４℃にて遠心分離し、上清を、以下で記載するＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために分離した。
【０１５０】
ＭＳデータを、ＨＴＳ  ＰＡＬオートサンプラー（Ｌｅａｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｒｂｏｒｏ、ＮＣ）及びＡｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズ二分ＨＰＬＣポンプ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を備えた４０００  ＱＴＲＡＰ三連四重極型質量分析計（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて得た。ＨＩＬＩＣ分離を、Ａｔｌａｎｔｉｓ  ＨＩＬＩＣカラム（１５０×２．１ｍｍ；Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて達成し、これを、９５％移動相Ｂ（０．１％ギ酸を含むアセトニトリル、ｖ／ｖ）で開始し６０％移動相Ａ（１０ｍＭギ酸アンモニウム及び０．１％ギ酸、ｖ／ｖ）で終了する１０分間の線形勾配により２５０μＬ／分で溶出した。改変ＩＰＲ方法を、Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｔ３カラム（１５０×２．１ｍｍ；Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて実施した。１０ｍＭトリブチルアミン／１５ｍＭ酢酸（移動相Ａ）及びメタノール（移動相Ｂ）からなるＩＰＲ移動相、並びにカラムを、３００μＬ／分の流速で、以下のプログラムを用いて溶出した：開始時に１００％移動相Ａ、４．０分にて１００％Ａ、３４分にて２％Ａ、及び３９．０分まで２％移動相Ａで保った。多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を用いて、陽イオン様式（ＨＩＬＩＣ方法）及び陰イオン様式（ＩＰＲ方法）にて、特異的代謝物についての標的化ＭＳデータを得た。デクラスタリング電位及び衝突エネルギーを、サンプル分析の前の参照標準の注入により、各代謝物について最適化した。Ａｎａｌｙｓｔ  １．５ソフトウェア（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）においてスケジュールされたＭＲＭアルゴリズムを使用し、各遷移についての滞留時間を自動的に設定した。
【０１５１】
ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．１；ＡＢ  ＳＣＩＥＸ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を、クロマトグラム及びピーク領域統合の手動レビューのために使用した。定性測定のために、全てのピークを既知の標準と比較し、代謝物アイデンティティを確認した。ＨＩＬＩＣ及びＩＰＲ方法の両方の下で評価した代謝物について、最高のシグナル対ノイズ特性を有する方法からのデータのみを、我々の分析に使用した。細胞株を、無作為的順番で分析し、ピークを、盲検様式で統合した。ランの順番にわたるＭＳピーク領域における堆積物を、ロバスト回帰（残差のＬ１ノルムを最小化する）を用いて線形傾向線を新鮮培地サンプルに当てはめ（一定間隔にて分析した）、この傾向線を全てのデータ点から減算することにより、各代謝物について正規化した。全ての測定した代謝物にわたる変動の中央係数は、生物学的複製から見積もって、５．５％であった。グルコース及び乳酸の定量的測定を、校正した市販の血液ガスアナライザー（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ；モデルｐＨＯｘ  Ｐｌｕｓ  Ｌ）を用いて、全てのサンプルについて得た。全部で２１９の代謝物をモニタリングし（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ  Ｔａｂｌｅ  １）、そのうち１４０は、少なくとも１つのがん細胞株由来の新鮮培地又は使用済み培地において存在した。ここで、「存在する」は、バックグラウンドシグナル強度の３倍を超える強度として規定する。これらの１４０の代謝物のうち１１１は、６０の細胞株にわたって再現可能な変動を実証した。これは、
（全ての細胞株にわたる標準偏差）＞３＊（複製のプールした標準偏差）
と規定した。
【０１５２】
なるべく、正規化ＭＳデータを、標準分析物の既知の濃度における緩衝液中の連続希釈物に対して校正し、絶対濃度を決定した。この校正技術を確認するために、我々は、見積もった濃度を培地成分の既知の濃度と比較し、１０％未満の正中関係誤差であることを明らかにした。１１１の代謝物のうちの１４について、校正データは入手不能であった；これらは、測定の規模によって影響されない、代謝物クラスター形成及び相関分析の目的のために任意単位内に維持された。各使用済み培地サンプル及び各校正した代謝物について、測定濃度Ｃｓｐｅｎｔを、新鮮培地濃度Ｃｆｒｅｓｈを減算し、培養容積Ｖで乗算し、対応する細胞について増殖曲線下の面積Ａに正規化することにより、消費／放出（ＣＯＲＥ）データν（単位時間あたりの細胞あたりのモル量）に変換した。
【０１５３】
【数１】
2016514136.tif 000004
式中、増殖曲線下の面積Ａは、以下によって与えられる：
【０１５４】
【数２】
2016514136.tif 000005
ここで、培養時間Ｔ、最終細胞数Ｎ（Ｔ）、及び倍増時間τの関数として表される。炭素消費及び放出を、各代謝物について代謝物当たりの炭素の数掛けるその代謝物の消費／放出（モル量／時間／細胞）として計算した。
【０１５５】
全ＣＯＲＥプロファイリングデータセットは、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｄａｔａ（sciencemag.org/content/suppl/2012/05/23/336.6084.1040.DC1/1218595databases1_Corrected.xls）として並びにＮＣＩウェブサイト（dtp.nci.nih.gov/index.html）を通して入手可能である。
【０１５６】
ＣＯＲＥデータのクラスター分析
代謝物ＣＯＲＥデータの階層的凝集型クラスタリングを、平均連結法を用いたピアソン相関距離を用いて実施した（Luo et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95:14863-14868）。数的に大きなフラックスが相関係数を支配することを避けるため、代謝物データを、クラスタリングの前に位取りし、各代謝物についての最大絶対値を１とした。多次元尺度解析のために、ピアソン相関距離を、非線形ストレス最小化アルゴリズムをＲ  ｐａｃｋａｇｅ  ＳＭＡＣＯＦ（de Leeuw and Mair, Journal of Statistical Software. 2009;31）において実行して用いて、二次元平面に移した。
【０１５７】
同位体追跡
同位体追跡研究のために、１．５×１０６個のＬＯＸ  ＩＭＶＩ細胞を、６ｃｍ皿において、２ｍＭグルタミン、５％透析済みＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）及び１４０μＭ  １−１３Ｃ−グリシン又は２−１３Ｃ−グリシン（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地（未標識グリシン非含有）中で成長させた。１８時間目に、培地を迅速に除去し、−８０℃の１００％メタノールの添加により、細胞内代謝物を迅速に抽出した。アミノ酸の測定のために、サンプルを、１０，０００ＲＰＭ×１０分間、４℃にて遠心分離し、９倍容量の７５％アセトニトリル、２５％メタノール及び０．２％ギ酸を含む抽出溶液（１／９  ｖ／ｖ）を用いて上清を抽出し、１０，０００ＲＰＭ×１０分間、４℃にて再遠心分離し、上清を分離して、上述のようにＨＩＬＩＣ  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて分析した。標識ヌクレオチド及び葉酸の評価のために、代謝物を１００％メタノールで抽出し、サンプルを１０，０００ＲＰＭ×１０分間、４℃にて遠心分離し、上清をＬｕｎａ  ＮＨ２カラム（５μｍ、１５０×２ｍｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を備えたＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ）上に直接注入した。初期移動相組成は、１０％移動相Ａ（２０ｍＭ酢酸アンモニウム及び２０ｍＭ水酸化アンモニウム水溶液）及び９０％移動相Ｂ（２５％メタノール／７５％アセトニトリル中１０ｍＭ水酸化アンモニウム）であった。このカラムを、１００％移動相Ａまでの線形勾配を用いて０．４ｍＬ／分にて１０分間にわたって溶出し、その後、１００％移動相Ａの同一溶媒フローを２分間にわたって行った。ＭＳ／ＭＳ分析を、５５００  ＱＴＲＡＰ三連四重極型質量分析計を陰イオン様式で用い、エレクトロスプレーイオン化供給源（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を−４．５ｋＶのイオンスプレー電圧及び５００℃の供給源温度にて利用して実施した。デクラスタリング電位及び衝突エネルギーを、未標識標準を用いて調整し、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）スキャンを用いてデータを収集した。
【０１５８】
観察された生同位体スペクトル（ＭＳ／ＭＳピーク領域）を、以前に記載されたように（Rantanen et al., Metab Eng. 2002;4:285-294）、ＭＳ／ＭＳ遷移についての理論的スペクトルを元素Ｃ、Ｈ、Ｎ及びＯの既知の天然存在量に基づいて計算し、未標識分子と標識分子との混合物として観察したスペクトルをモデリングし、このモデルを観察したＭＳ／ＭＳ強度に当てはめて標識分子及び未標識分子の割合を得ることにより、相対的同位体存在量にデコンボリューションした。セリンとグリシンとの間のフラックスを見積もるために、以下の図に図示したモデルを使用した。
【０１５９】
【化１】
2016514136.tif 000006
【０１６０】
フラックス比分析（Zamboni et al., Nat Protoc. 2009;4:878-892）を用い、このモデルは、以下の等式を生じた：
【０１６１】
【数３】
2016514136.tif 000007
【０１６２】
式中、χｇｌｙは、細胞内グリシンの＋１同位体の画分であり、χｓｅｒは、細胞内セリンの＋１同位体の画分である；νｓｅｒ→ｇｌｙは、セリンからグリシンへのフラックスである；νｇｌｙ→ｓｅｒは、グリシンからセリンへのフラックスである；ν→ｇｌｙは、グリシンの取り込み速度である；並びにν→ｓｅｒはセリンの内因性合成速度及び取り込み速度である。同位体データにより、我々は、セリンに由来するグリシンの画分についてこの等式を解き：
【０１６３】
【数４】
2016514136.tif 000008
及び逆に、グリシンに由来するセリンの画分についての等式を解く：
【０１６４】
【数５】
2016514136.tif 000009
【０１６５】
ＳＨＭＴ２のＲＮＡｉサイレンシング
細胞を、上述の標準的技術に従って培養した。ｓｈＲＮＡクローンを発現するレンチウイルスベクター（ｐＬＫＯ．１）を、以前に記載された（Moffatt et al., Cell. 2006;124:1283-1298）ように、Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＲＮＡｉプラットフォームによって作製した。４つの配列非依存的ｓｈＲＮＡを、以下の標的遺伝子配列（ＲＮＡｉプラットフォームＩＤ＃）を用いて、ヒトＳＨＭＴ２に対して作製した：
ｓｈ１（ＴＲＣＮ０００００３４８０８）：ＧＡＧＧＴＧＴＧＴＧＡＴＧＡＡＧＴＣＡＡＡ（配列番号５）
ｓｈ２（ＴＲＣＮ００００２３４６５６）：ＡＣＡＡＧＴＡＣＴＣＧＧＡＧＧＧＴＴＡＴＣ（配列番号６）
ｓｈ３（ＴＲＣＮ００００２３４６５７）：ＧＴＣＴＧＡＣＧＴＣＡＡＧＣＧＧＡＴＡＴＣ（配列番号７）
ｓｈ４（ＴＲＣＮ００００２３８７９５）：ＣＧＧＡＧＡＧＴＴＧＴＧＧＡＣＴＴＴＡＴＡ（配列番号８）
【０１６６】
対照ｓｈＲＮＡ（ｓｈＣｔｒｌ＝ＴＲＣＮ０００００７２１８１）を、何らヒト遺伝子と適合しない標的配列によって作製した：ＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＴＣＴＡＴＡ（配列番号９）
【０１６７】
レンチウイルス感染のために、１００，０００個の細胞を、６ウェル皿内にて８μｇ／ｍｌポリブレン含有の２ｍＬ培地中にまき、１００μｌウイルス上清を加えた。プレートを、８００×ｇにて３０分間にわたり３７℃にて遠心分離し、培地を取り換えた。２４時間後、細胞を、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンの添加によって、感染について選択した。未感染対照細胞は、ピューロマイシンにより、２４時間以内に１００％の細胞死を示した。細胞を、１０回を超える細胞分裂にわたって継代し、ｓｈＲＮＡ構築物の安定的発現を確実にした。ＳＨＭＴ２ノックダウンの評価のために、ｍＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて細胞から単離し、ＳＨＭＴ２及びＨＰＲＴ１についてのｑＲＴ−ＰＣＲを、Ｔａｑｍａｎアッセイを製造業者の指示に従って用いて実施した（それぞれ、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓアッセイＩＤ  Ｈｓ００１９３６５８＿ｍ１＊及びＨｓ０１００３２６７＿ｍ１＊）。Ａ４９８及びＬＯＸ  ＩＭＶＩを用いた実験のために、細胞をｓｈ１〜４又はｓｈＣｔｒｌのいずれかのレンチウイルスによって感染させ、安定的に発現する細胞を、上述のように選択した。ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＨＳ−５７８Ｔ、ＴＫ１０、ＥＫＶＸ、ＯＶＣＡＲ−８、Ｕ２５１、Ａ５４９、ＨＴ２９、ＮＣＩ−４６０及びＨＣＴ−１１６を利用する実験のために、細胞を、ｓｈ４又はｓｈＣｔｒｌのいずれかのレンチウイルスによって感染させ、安定的に発現する細胞を、上述のように選択した。１つのさらなる細胞株、ＨＣＴ−１５を、ＳＨＭＴ２の効果的なノックダウンが達成されなかったので、分析から除いた。安定的ノックダウン細胞株の作製後、細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレートにて、２００μＬの、２ｍＭグルタミン及び１４０μＭ（＋ｇｌｙ）又は０μＭ（−ｇｌｙ）のグリシンを含有し、５％透析済みＦＢＳを補ったＲＰＭＩ  １６４０培地中でプレート培養した。レスキュー実験（実施例４）のために、ｓｈ４を発現するＬＯＸ  ＩＭＶＩ細胞を、グリシンの非存在下で成長させ、ビヒクル（ＰＢＳ）、グリシン（１４０μＭ）、サルコシン（１４０μＭ）又はギ酸塩（１４０μＭ）によってレスキューを試みた。全ての実験について、細胞を計数し、細胞数を、経時的な倍数変化として表した。グリシンドロップアウト実験（実施例４）のために、Ａ４９８及びＬＯＸ  ＩＭＶＩ細胞を、２ｍＭグルタミン及び１４０μＭ（＋ｇｌｙ）又は０μＭ（−ｇｌｙ）のグリシンを含有し、５％透析済みＦＢＳを補ったＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。細胞を、上述のように一定時間間隔で計数した。全ての実験を、少なくとも１０回の独立した細胞培養物を用いて実施した。
【０１６８】
非形質転換細胞の培養
ヒト乳房上皮（ＣＣ−２５５１、Ｌｏｎｚａ）、ヒト肺気管支上皮細胞（ＣＣ−２５４０、Ｌｏｎｚａ）及びヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｌｏｎｚａ）を、製造業者の指示に従って、それぞれＭＥＧＭ、ＢＥＧＭ及びＥＧＭ２培地中で培養した。全ての細胞についての倍増時間を、上述のように細胞計数を用いて確認した。細胞を、５日間にわたって１０ｃｍ皿において培養し、新鮮培地及び使用済み培地を、上述のようにグリシンＣＯＲＥの測定のために収集した。ＣＤ４＋実験のために、末梢血リンパ球を、Ｆｉｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ）勾配遠心分離を用いて全血から単離し、静止ＣＤ４＋Ｔ細胞を、負磁気分離（Ｄｙｎａｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示に従って用いて精製した（９５％を超える純度）。精製した細胞を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ペニシリン−ストレプトマイシン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ビタミン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び５０ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを補い、２０Ｕ／ｍＬ組換えヒトＩＬ−２を補ったダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中にて、１×１０６細胞／ｍＬの濃度で、ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）で事前コーティングした１２ウェルプレート内でプレート培養した。細胞を、１μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＵＣＨＴ１）及び１μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ２８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＣＤ２８．２）で刺激した。４８時間後、刺激した細胞をＴＣＲシグナルから除去し、１×１０６細胞／ｍＬの濃度で再培養して、刺激細胞上清を、培養中で２４時間後に回収した。各条件について、三連のウェルを調製し、分析した。
【０１６９】
化合物感受性分析
グルタチオン生合成阻害剤及びデノボのプリン生合成阻害剤についての化合物感受性データを、ＮＣＩデータリポジトリ（２００９年１０月にリリース）から得た。化合物感受性を、細胞増殖を５０％阻害する化合物濃度として規定されるＧＩ５０測定値（Shoemaker, Nat Rev Cancer. 2006;6:813-823）を用いて定量した。異なる濃度範囲で多数の実験が可能であるこれらの化合物について、最低飽和度での実験を使用した。
【０１７０】
遺伝子発現分析
６０の細胞株についての遺伝子発現データが、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）により、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａ及びＵ１３３Ｂアレイ、及びＮＣＩデータリポジトリから得た正規化されたプローブセットレベルデータを用いて、以前に作成された。いくつかのプローブセットが目的の遺伝子に適合した場合、我々は、全ての細胞株にわたって最大の平均強度を有するプローブセットを選択した。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８及びＲＸＦ３９３の細胞株は、関連する遺伝子発現データを有さず、遺伝子発現分析の目的のために無視した。遺伝子発現についての富化分析を、ｐ＝１にてＧＳＥＡ−Ｐ統計（Subramanian et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102:15545-15550）を用い、根本的基準としてスピアマン相関を用いて評価した。Ｐ値及び偽陽性率を、以前に記載されたように無作為的に並べ替えた細胞株によって計算した（Subramanian et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102:15545-15550）。
【０１７１】
細胞周期分析
ＨｅＬａ細胞を、以前に記載されたようにｇｅｍｉｎｉｎレポーター構築物でトランスフェクトし（Sakaue-Sawano et al., Cell. 2008;132:487-498）、その後、上述のｓｈＳＨＭＴ２（ｓｈ４）ヘアピン又はｓｈＣｔｒｌヘアピンを含むレンチウイルスによって感染させ、ピューロマイシンを用いて選択した。細胞を、上述のＮＣＩ−６０細胞と同一の条件を用いて、１４０μＭ  グリシン存在下（＋ｇｌｙ）又はグリシン非存在下（−ｇｌｙ）で培養し、上述のように成長曲線から倍増時間を決定した。細胞周期分析のために、細胞を、１４０μＭ  グリシン存在下（＋ｇｌｙ）又はグリシン非存在下（−ｇｌｙ）で、カバーガラスが付着した１０ｃｍ皿内でプレート培養した。４８時間後、細胞を固定し、製造業者の指示に従って、ＤＮＡ含量を定量するためにＤＡＰＩで染色し、タンパク質含量を定量するためにスクシンイミジル連結Ａｌｅｘａ  ＳＥ−Ａ６４７色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。細胞を、Ｎｉｋｏｎ  Ｔｉ−Ｅ顕微鏡をＴｉ−ＮＤ６−ＰＦＳ  Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｆｏｃｕｓと共に用いて画像化し、画像分析を、カスタム作成されたソフトウェア（ＥｎｓｅｍｂｌｅＴｈｒｅｓｈｅｒ）で実施した。このアルゴリズムは、２つの相補的アプローチによって細胞境界を同定した：（ｉ）細胞を、元画像のＴｏｐ−Ｈａｔ変換を閾値処理することによってバックグラウンドから分離した。Ｔｏｐ−Ｈａｔ変換を、細胞径よりも空間的に幅広い傾向を取り除くために使用し；（ｉｉ）隣接の接触する細胞の間の境界を、シードベースの境界線引きによって同定した。シードを、ガウス平滑化画像の領域極大値として計算した。画像化分析は、細胞あたり単一の強度値をもたらした。ｇｅｍｉｎｉｎデータを対数変換し、５０×５０グリッドでのｂｉｎ計数によって密度プロットを作製した。ゲートを手動で設定し、Ｇ１集団と、Ｇ１／Ｓ集団と、Ｇ２集団とを最適に分離し、各段階における細胞の小部分を計算するために使用した。これらのデータから、各細胞周期の部分的な長さを、以前に記載されたように見積もり（Toettcher et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106:785-790）、それに各細胞株及び培養条件に関する測定された倍加時間を掛けて、絶対細胞周期長さを得た。
【０１７２】
生存分析
少なくとも１０年間にわたって生存データが取れる初期段階のがんを有する患者の６つの独立した大型コホートを、試験した。Chin et al.（Cancer Cell. 2006;10:529-541）及びvan de Vijver et al.（N Engl J Med. 2002;347:1999-2009）からのマイクロアレイデータを、それぞれ、Lawrence Berkeley National Laboratory（cancer.lbl.gov/breastcancer/list_data.php?id=9）及びＲｏｓｅｔｔａ  Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓ（rii.com/publications/2002/nejm.html）からダウンロードした。Desmedt et al.（Clin Cancer Res. 2007;13:3207-3214）、Pawitan et al.（Breast Cancer Res. 2005;7:R953-964）、Miller et al.（Proc Natl Acad Sci U S A 2005 Sep 20;102(38):13550-5）及びKao et al.（BMC Cancer. 2011;11:143）の研究からのマイクロアレイデータは、それぞれＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ、受託番号ＧＳＥ７３９０、ＧＳＥ１４５６、ＧＳＥ３４９４及びＧＳＥ２０６８５において利用可能である。生存データ及び臨床パラメータを、元の報告から得た。患者を、ミトコンドリアグリシン代謝経路（酵素ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及びＭＴＨＦＤ１Ｌからなる）の発現の重心ｔｉに基づいて「陽性」群又は「陰性」群に分けた。
【０１７３】
【数６】
2016514136.tif 000010
式中
【０１７４】
【数７】
2016514136.tif 000011
式中、ｉは、患者（アレイ）にわたって変動し、ｊは、グリシン経路Ｇにおける遺伝子にわたって変動する。その中央値を超えるｔｉにおける個々のｉを、「陽性」群に割り当て、これらの群についてカプラン−メイヤー曲線を描いた。ハザード比を、Ｃｏｘの集団ハザードモデル（Cox, Journal of the Royal Statistical Society. Series B. 1972;34:187-220）を、Ｒ  ｐａｃｋａｇｅ  「ｓｕｒｖｉｖａｌ」（cran.r-project.org/web/packages/survival/index.html）において実行して用いて、見積もった。群を、対数順位検定（Bland and Altman, BMJ. 2004;328:1073）を用いて、有意な相違について試験した。メタ分析を、ＤｅｒＳｉｍｏｎｉａｎ  ＆  Ｌａｉｒｄ’ｓ  ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｅｓｔｉｍａｔｏｒ（DerSimonian and Laird, Control Clin Trials. 1986;7:177-188）を、効果サイズ基準としてのＣｏｘハザード比と共に用いて実施した。研究間に有意な異質性は検出されなかった（Ｐ＝０．３４）。
【実施例１】
【０１７５】
がん細胞代謝
がん細胞代謝を系統的に性質決定するため、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析を使用して、ＮＣＩ−６０パネル（９つの一般的腫瘍型から確立された、６０の十分に性質決定された原発性ヒトがん細胞株の集合）における中間代謝の主要経路にわたる２１９の代謝物の細胞消費及び放出（ＣＯＲＥ）をプロファイリングした１７。ＣＯＲＥプロファイリングは、代謝フットプリンティング又はエキソメタボロミクス１８、１９に基づき、培養細胞由来の培地中の代謝物濃度を基線培地に関連付けて、対数増殖期にわたる細胞１つあたりの各代謝物についての時間平均消費及び放出（ＣＯＲＥ）プロファイルを得ることにより、細胞性代謝活性の系統的且つ定量的な評価を提供する。ＣＯＲＥプロファイリングを用いて、１４０の代謝物を、新鮮な培地中に存在するか、又は少なくとも１つのがん細胞株によって放出されるかのいずれであるかを同定した。そのうちの１１１の代謝物は、生物学的複製間の優れた再現性をもって、６０細胞株にまたがる明らかな変動を実証した。１１１の代謝物のおよそ３分の１は、全ての細胞株によって消費され、他方で、代謝物の残りの３分の２の殆どは、培地中に一貫して放出され、一握りの代謝物のみが、特定の細胞株における消費及び他の細胞株による放出を示した。
【０１７６】
がん代謝のこのＣＯＲＥ図譜は、がん細胞の代謝表現型を調査するため、及び代謝物間の関係性を発見するために使用され得る。例えば、オルニチンは、白血病細胞から放出され、アデノシン及びイノシンは、黒色腫細胞から放出され、これらのがんに独特であり得る代謝活性を反映している。代謝物ＣＯＲＥデータの無監督クラスター分析は、白血病細胞を異なる群として同定したが、腫瘍細胞株同士を、起源の組織に基づいてより一般的には識別しなかった。機能的に関連する代謝物は、６０の細胞株にまたがって、類似の消費及び放出のパターンを示した。例えば、グルコース、必須アミノ酸及びコリンを含む主要栄養素は、解糖系、クエン酸回路を代表する代謝物、ヌクレオチド及びポリアミンと同様に、単一のクラスターを形成した。主要な栄養素の消費はまた、それらの副産物の放出にも相関した：例えば、グルコース消費は、乳酸放出と相関し、このことは、形質転換細胞において十分に文書にされているワールブルク効果と一致する４。栄養素消費及び副産物放出の類似のパターンはまた、他の栄養素にも観察された。グルタミン消費は、アミノ酸の中で定量的に最大であるが、グルタミン酸塩放出によってぴったり反映された。全てのモニタリングした代謝物の分析は、測定した全炭素消費はまた、測定した全炭素放出にも密接に相関していることを明らかにし、このことは、形質転換細胞は、主要栄養素の不完全な異化、それに続く副産物放出の共通する代謝表現型を共有することを示唆する。
【実施例２】
【０１７７】
グリシンの代謝は、増殖と相関する
次の実験を、任意の代謝物ＣＯＲＥプロファイルが、がん細胞増殖と関連するか否かを決定するために実施した。６０のがん細胞株にまたがる以前に報告された倍増時間は、１７．０〜７９．５時間の範囲であり、非常に再現性があった２０。１１１の代謝物ＣＯＲＥプロファイルからの２つの代謝物、ホスホコリン及びグリシンは、６０の細胞株にまたがって、増殖速度と有意に（ボンフェローニ補正Ｐ＜０．０１）相関した（図１Ａ）。全ての細胞から放出されたホスホコリンは、必須栄養素コリンの消費に相関し、形質転換細胞においてリン脂質生合成の基質として蓄積することが報告されている２１。対照的に、グリシン消費と増殖速度との間の関係は、グリシンが内因的に合成され得る非必須アミノ酸であるので、予想されなかった。グリシンは、迅速に増殖する細胞によって消費され、ゆっくりと増殖する細胞によって放出される、普通でないＣＯＲＥプロファイルを示した（図１Ｂ）。このことは、グリシン要求は、迅速に増殖するがん細胞において、内因的合成能力を超え得るが、他方で、ゆっくりと増殖する細胞において、グリシン合成は要求を超え得ることを示唆する。より速い増殖速度を伴うグリシン消費の増大は、６０全ての細胞株にまたがって観察され（図１Ｂ）、卵巣細胞、結腸細胞及び黒色腫細胞を含む特定の腫瘍型においてなおより顕著であった（図２Ｂ）が、非接着性の白血病細胞においては明らかでなかった。グリシン消費が形質転換細胞に特異的であるか、又は迅速な増殖の一般的特徴であるかを決定するために、グリシン消費を、培養一次ヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）、ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥ）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及びヒト活性型ＣＤ４＋  Ｔリンパ球において測定した。これらの非形質転換細胞は、８〜１８時間の倍増時間を有し、最も迅速に分裂するがん細胞に匹敵するが、これらの細胞型のそれぞれは、グリシンを消費するよりもむしろ放出した（ＨＭＥＣ：３．５±０．８；ＨＢＥ：１７．５±３．２；ＨＵＶＥＣ：８．４±１．４；リンパ球１．９±０．３ｆｍｏｌ／細胞／時間）。したがって、グリシン消費は、迅速に増殖する形質転換細胞に特異的な特徴であると考えられる。
【実施例３】
【０１７８】
グリシン代謝酵素の発現
代謝物ＣＯＲＥ分析を補うために、１，４２５の代謝酵素２２の遺伝子発現を、これらの６０の細胞株にまたがる以前に作成されたマイクロアレイデータセット２３において試験した。この独立した分析は、グリシン生合成酵素は、迅速に増殖するがん細胞株においてより多く発現されていることを明らかにした（図１Ｃ）。細胞内グリシン合成は、細胞質とミトコンドリアとの間で区分され１１、２つの別個の酵素経路を提供する（図１Ｄ）。ミトコンドリアグリシン合成経路は、グリシン合成酵素であるセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ２（ＳＨＭＴ２）、発がん遺伝子ｃ−Ｍｙｃの標的２４、並びにメチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存型）２（ＭＴＨＦＤ２）及びメチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存型）１様（ＭＴＨＦＤ１Ｌ）（コファクターであるテトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）をＳＨＭＴ２反応のために再生する）からなる（図１Ｄ）。ミトコンドリア経路のみが、増殖と有意な相関を示したが、他方で、対応する細胞質酵素は示さなかった（図１Ｃ）。このことは、迅速ながん細胞増殖を支持するミトコンドリアの重要な役割を示唆する。グリシン消費対内因的合成の、細胞内グリシンプールへの相対的寄与を評価するため、１３Ｃ標識グリシンによる迅速に分裂するＬＯＸ  ＩＭＶＩ細胞におけるトレーサー分析を利用した。細胞内グリシン及びセリンプールの標識から、単純な定常状態のモデル２３を仮定すると、細胞内グリシンのおよそ３分の１が、細胞外消費に由来し、他方で、残りは、内因的に合成されていることが推定された。したがって、代謝物ＣＯＲＥプロファイリングと遺伝子発現分析との両方が、グリシン代謝を、がん細胞における迅速な増殖と密接に関連していると独立に同定する。
【実施例４】
【０１７９】
グリシン代謝は、がん細胞において非常に重要である
グリシン代謝の迅速ながん細胞増殖への寄与を直接的に評価するために、遺伝子サイレンシング及び栄養素枯渇の組合せを使用した。グリシン合成酵素ＳＨＭＴ２の発現を、４つの異なるｓｈＲＮＡヘアピンにより、ゆっくりと増殖するＡ４９８細胞及び迅速に増殖するＬＯＸ  ＩＭＶＩ細胞において、安定的にサイレンシングした（図１Ｅ）。ＳＨＭＴ２におけるＣＨＯ株突然変異体は、グリシンの栄養要求性であることが、以前に示されている２５。細胞外グリシンの非存在下でのＳＨＭＴ２のサイレンシングは、ＬＯＸ  ＩＭＶＩ細胞の増殖を停止し（図２Ｆ）、培地中へのグリシンの添加によってレスキューされた。このことは、ＳＨＭＴ２反応（図１Ｄ）に由来する１炭素単位よりもむしろグリシン自体が、これらの細胞における増殖に重要であることを示す（図１Ｆ）。グリシン関連の代謝物であるサルコシン２６、又は細胞性１炭素単位の供給源であるギ酸塩２７による培地の補充は、ＬＯＸ  ＩＭＶＩ細胞のレスキューに失敗した。対照的に、ゆっくりと増殖するＡ４９８細胞（図２Ｆ）は、ＳＨＭＴ２枯渇及び細胞外グリシン枯渇によって損なわれず、このことは、グリシン合成の他の手段が、これらの細胞における要求性を満たし得ることを示す。細胞外グリシンのみの除去もまた、ＬＯＸ  ＩＭＶＩ細胞の増殖を低減し、Ａ４９８細胞の増殖を低減しなかったが、この効果はより判断がつけにくい。
【０１８０】
まとめると、このデータは、グリシンのミトコンドリア産生は、迅速に増殖するがん細胞において特異的に、重要であることを示唆する。
【０１８１】
迅速な増殖についてのグリシンへのこの依存は、他のがん細胞にも及ぶか否かを決定するために、ＳＨＭＴ２のサイレンシング（図１Ｈ）及び細胞外グリシン枯渇を、ＮＣＩ−６０パネルからの１０のさらなる原発性がん細胞株において試験した（図１Ｇ）。迅速に増殖するがん細胞は、グリシン代謝の拮抗作用により、よりゆっくりとした増殖を示し、細胞外グリシンの添加によってレスキューされたが、他方で、迅速に増殖する細胞に対して匹敵する数の細胞分裂が可能なより後の時点で評価した場合ですら、ゆっくりと増殖する細胞は、これらの攪乱に対し感受性がより低かった（図１Ｇ）。
【０１８２】
我々は次に、グリシン代謝が迅速ながん細胞増殖に寄与する潜在的な機構の探索を目指した。この結果は、消費されたグリシンはこれらの細胞において迅速に増殖する際にデノボのプリンヌクレオチド生合成に一部利用され、グリシン代謝の拮抗作用はＧ１の延長をもたらし、それによって増殖を遅くしたことを示唆した。
【実施例５】
【０１８３】
がん患者におけるグリシン合成酵素の発現
グリシン代謝のがんに対する潜在的関連性を探索するために、ミトコンドリアグリシン合成酵素、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ２及びＭＴＨＦＤ１Ｌ（図２Ｄ）の発現を、生存について追跡した初期の乳がんを有する全部で１３００人の患者にわたる６の独立した大型コホートにまたがる以前に作成されたマイクロアレイデータセット２８〜３３において試験した。２群の個体を、ミトコンドリアグリシン生合成経路の遺伝子発現中央値を上回る者、及び遺伝子発現中央値を下回る者と規定した。ミトコンドリアグリシン生合成経路の発現中央値を上回る者は、より高い死亡率に関連していた（図２Ａ〜Ｂ）。６つ全てのデータセットの正式なメタ分析は、１．８２の全体的ハザード比を示し（９５％  ＣＩ：１．４３〜２．３１、図２Ｂ）、リンパ節状態及び腫瘍等級などのがんの予後の悪さに寄与する他の確立した因子に匹敵した３１。ミトコンドリアグリシン合成酵素ＳＨＭＴ２のみが、死亡率とも有意に関連していて、他方で、細胞質性パラログＳＨＭＴ１は関連していなかった。これらのデータは、ヒト乳がんにおけるミトコンドリアグリシン代謝の潜在的重要性を強調する。
【実施例６】
【０１８４】
グリシン消費細胞は、抗葉酸薬物に感受性である
グリシン消費は迅速ながん細胞増殖と相関するという観察（上の実施例１〜５を参照されたい）を前提として、本発明者らは、グリシン消費は特定の化学療法剤に対する感受性を予測するか否かを決定することを目指した。グリシンアップデートと３８５１の注釈を付した低分子（ＮＣＩによって公表されたデータ）に対する感受性との間の関連を、６０の細胞株にわたり、バイオインフォマティックに試験した。
【０１８５】
この結果は、グリシンを消費する細胞は、一般的に使用される薬剤であるメトトレキサート（ＮＣＩ＃７４０）を含む、ＤＨＦＲを介してテトラヒドロ葉酸代謝を標的とする複数の抗葉酸剤（図３における灰色の点は、ＮＣＩ／ＮＳＣ識別子と共に以下に列挙した１５の抗葉酸剤である）に対し独特に感受性であることを示した。多くの化学療法剤が迅速に増殖するがん細胞を殺傷するが、グリシン消費細胞は、関連の代謝酵素ＴＹＭＳを標的とする５−フルオロウラシルを含む他の化学療法剤（黒い点）に対し感受性が低かったことは、注目に値する。したがって、グリシン消費は、メトトレキサートを含む抗葉酸薬に対する細胞感受性に強く相関し、これを予測するという事実は、自明ではない。
【０１８６】
【表２】
2016514136.tif 000012
【実施例７】
【０１８７】
ＭＴＨＦＤ２  ｍＲＮＡ及びタンパク質は、がん細胞において増大する
がん化学療法のための潜在的遺伝子標的を同定するために、腫瘍サンプル及び対応する正常な対照物の大型のデータセットを作成し（データセットは、３４に由来した）、分析して、正常な組織対照物と比較して２０の種々のがんにおいて一定して上方制御される遺伝子を同定した（図４）。測定した２０，４５０の遺伝子の中で、最も一定して上方制御された遺伝子の上位５０（上方制御された遺伝子の上位５％以内に遺伝子が出現するデータセットの数で規定する）を、下の表２に示す。この遺伝子リストは、公知の薬物標的を含み、これらとしては、ＴＹＭＳ、ＲＲＭ２、ＴＯＰ２Ａ及びＡＵＲＫＡ、並びにより高いランキング遺伝子ＭＴＨＤＦ２（遺伝子ランク８）が挙げられ、これらの全ては、表２において太字である。対照的に、細胞質パラログＭＴＨＦＤ１（遺伝子ランク５４８）又は成体パラログＭＴＨＦＤ２Ｌ（ランクスコア１１９１２）は、正常対照物と比較して、がんにおいて高度に上方制御されていなかった。
【０１８８】
【表３】
2016514136.tif 000013
2016514136.tif 000014
【０１８９】
腫瘍マイクロアレイの以前のメタ分析は、肺腺癌、小細胞肺がん、結腸がん、前立腺がん、唾液腺癌、神経膠腫、及び髄芽細胞腫３５、並びにヒト乳がん３６、３７を含む多数のヒト腫瘍型にまたがってＭＴＨＦＤ２  ｍＲＮＡが増大することを、同様に同定していた。さらに、ＭＴＨＦＤ２活性は、胚性組織において、並びに、マウスエールリッヒ肥満細胞腫腹水細胞、ＭＣＦ−７乳がん細胞、Ｍ４皮膚黒色腫細胞、ＥＬ４マウスＴ細胞リンパ腫細胞、Ｋ５６２  ＣＭＬ細胞、Ｒａｊｉバーキットリンパ腫細胞、Ｌマウス線維芽細胞、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ白血病細胞、ＭＧ−６３骨肉腫細胞、ＭＮＮＧ／ＨＯＳ骨肉腫細胞、ＹＡＣリンパ腫細胞、ＨＡ−Ｐｙ胚線維芽細胞、ＢｅＷｏ絨毛癌細胞、ＨＣＴ−８Ｒ腸癌細胞を含むいくつかの形質転換細胞株において、並びに形質転換されたヒト白血球、ＣＨＯ細胞及びマウス胚細胞において増大することが見出されているが、ＭＴＨＦＤ２活性は、成体骨髄を除き、成体組織においては存在しなかった１０、３８。
【０１９０】
しかし、全ての他の遺伝子に対し、がんにおけるＭＴＨＦＤ２上方制御の程度は、これらの先行研究において開示されておらず、詳細には、いかにしてＭＴＨＦＤ２が既知の化学療法薬物標的又はパラログ酵素（ＭＴＨＦＤ１及びＭＴＨＦＤ２Ｌ）を比較するかを示した先行研究は存在しない。さらに、ＭＴＨＦＤ２の上方制御が、がんの一般化可能な特徴であるか、又はいくつかのがんの型に特異的であるかは、明らかでなかった。本メタ分析は、ＭＴＨＦＤ２が、がんの一般化可能な特徴であり、多くのがんの型において存在することを示唆する。
【０１９１】
ＭＴＨＦＤ２タンパク質が、実際に種々のがんにおいて増大するかを決定するために、ＭＴＨＦＤ２タンパク質についての免疫組織化学分析を、１６のがんの型に及ぶ１００のがん生検にわたって、以前に記載された方法によって実施した３９。ＭＴＨＦＤ２は、腫瘍細胞において強く発現され、正常間質においては限定的な発現を有することが見出された（図５）。まとめると、このデータは、ＭＴＨＦＤ２が、正常な対照物と比較して種々のがんにおいて既存の薬物標的すら凌ぐほど高度に上方制御される、新規ながん薬物標的であることを示唆する。
【実施例８】
【０１９２】
ＭＴＨＦＤ２発現レベルは、生存を予測する
ＭＴＨＦＤ２の発現が患者におけるがん生存の予測因子として使用され得るか否かも試験した。マイクロアレイデータセット及び対応する生存データが公に入手可能である、乳がん、結腸がん及び腎がんを有する患者を選択した。
【０１９３】
図６に示されるように、３つのがんの型にまたがって、中央値を上回るＭＴＨＦＤ２の発現（灰色線）は、中央値を下回るＭＴＨＦＤ２の発現（黒線）よりも悪い生存率に関連した。これは、がん進行を駆動する際のＭＴＨＦＤ２の重要性を示唆するだけでなく、ＭＴＨＦＤ２の発現は、乳がん、結腸がん及び腎細胞がんにおける予後診断マーカーとして使用され得ることも示唆する。
【実施例９】
【０１９４】
ＭＴＨＦＤ２は、正常細胞に対し、がんにおいて示差的に発現される
上述のように、多くの現行の化学療法剤は、正常な増殖細胞における遺伝子に影響することをせき止める、正確な副作用を有する。マイクロアレイ組織図譜を用いて、１）正常な非増殖組織（図７Ａ、灰色の棒グラフ）、２）結腸上皮及び白血球を含む正常な増殖組織（図７Ａ、黒い棒グラフ）、及び３）この組織図譜データセットに含まれるがん組織（図７Ａ、白い棒グラフ）において種々の遺伝子の発現を試験した。全部で２０，０００を超える遺伝子の最小／最大比を、がんサンプルにおける最小発現対全ての正常組織における最大発現に基づいて計算した。理想的な抗がん剤は、高い最小／最大比を有し、全てのがんサンプルにおいて高く、正常組織において比較的低い。
【０１９５】
全２０，０００遺伝子の中で、ＭＴＨＦＤ２は、最高の最小／最大比を有した（図７Ｂ）。正常な非増殖サンプル、正常な増殖サンプル及びがんサンプルにおけるＭＴＨＦＤ２の発現を、上段左に示す。ＭＴＨＦＤ２とは対照的に、細胞質パラログＭＴＨＦＤ１は、いくつかの増殖する正常組織において増大し、多くの形質転換細胞において低かった。成体パラログＭＴＨＦＤ２Ｌは、がんにおいて上方制御されることなく、ユビキタスに発現した。ＭＴＨＦＤ１と同様に、多くの他の公知のがん化学療法薬物標的、例えばＲＲＭ２、ＤＨＦＲ、ＴＯＰ２Ａ、ＴＹＭＳは、増殖する正常組織において、がんに匹敵するレベルまで増大し、これは、これらの化学療法剤の使用に伴う副作用に寄与し得る。
【０１９６】
これらの遺伝子の誘導はまた、活性型及び増殖する正常細胞のさらなるデータセットにおいても評価した。ＤＨＦＲ、ＲＲＭ２及びＴＯＰ２Ａを含む多くの公知の化学療法薬物標的が、刺激されて増殖した場合の正常組織において強く誘導されたが、ＭＴＨＦＤ２は、正常な増殖細胞において誘導されなかった（図７Ｃ、左及び中央のパネルを参照されたい）。活性型Ｔ細胞は例外であり、これは、活性化された際に、ＭＴＨＦＤ２発現を上方制御した（図７Ｃ、右パネル）。まとめると、これらのデータは、ＭＴＨＦＤ２が、その非がん性組織における発現のレベルの低さ又は欠如ゆえに、優れた化学療法薬物標的であり得ることを示唆する。
【実施例１０】
【０１９７】
ＭＴＨＦＤ２のｓｈＲＮＡサイレンシングは、がん細胞増殖を遅くする
ＭＴＨＦＤ２が実際にがん細胞増殖において不可欠であるか否かを決定するために、ＭＴＨＦＤ２発現を、２つの配列非依存型ｓｈＲＮＡ試薬（ｓｈ５０配列：ＣＧＡＡＴＧＴＧＴＴＴＧＧＡＴＣＡＧＴＡＴ（配列番号１０）；ｓｈ５３配列：ＧＣＡＧＴＴＧＡＡＧＡＡＡＣＡＴＡＣＡＡＴ（配列番号１１））を用いて、１６のがん細胞株においてサイレンシングした。
【０１９８】
図８において示されるように、試験した１６の細胞株のうち１５において、ｓｈＲＮＡは、少なくとも１つのｓｈＲＮＡ試薬によってＭＴＨＦＤ２のサイレンシングを媒介し、がん細胞増殖を、７日間にわたり有意に遅くした。
【実施例１１】
【０１９９】
ヒトＭＴＨＦＤ２の細菌発現及び精製
以前の論文４０に基づき、大量のヒトＭＴＨＦＤ２の発現及び精製を可能にする構築物を設計した。完全長３５０アミノ酸配列で開始し、３５アミノ酸のミトコンドリア標的化配列（哺乳動物細胞において開裂して活性タンパク質を産生する）を除去し、翻訳を開始するためにメチオニンを付加した。タンパク質の未構築Ｃ末端から１２アミノ酸を除去し、精製を容易にするために、６−ヒスチジンタグを加えた。この構築物は、以下の改変を除き、文献において以前に報告されている：転写産物を、細菌発現のためにコドン最適化した（したがって、ヌクレオチド配列が、ヒトにおいて見出されるものと同一ではなくてもヒトタンパク質は産生された）。この構築物を合成し、そしてＧｅｎｅｗｉｚにより、細菌発現のためにｐＥＴ−３０ａ（＋）ベクター内にクローニングした。（大腸菌（Escherichia coli）における発現について）コドン最適化配列は、以下の通りである：開始コドン及び停止コドンに、下線を引いた：
配列番号１
2016514136.tif 000015
発現された構築物のアミノ酸配列は：
配列番号２
2016514136.tif 000016
であった。
ｐＥＴ−３０ａ（＋）における発現構築物コドン最適化ＭＴＨＦＤ２配列の全長ＤＮＡ配列は以下の通りであった：
配列番号３
2016514136.tif 000017
2016514136.tif 000018
2016514136.tif 000019
ＭＴＨＦＤ２を、細菌を、カナマイシンで補充したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス中で増殖させた改変を用いて、報告の通りに、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）化学的コンピテント大腸菌（E. coli）細胞（Christensen et al., The Journal of biological chemistry. 2005; 280:34316-34323）にて、発現させた。発現を、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、細胞を誘導後３時間にわたって３７℃にて増殖させて、回収した。細菌をソニケーターで溶解し、ＭＴＨＦＤ２をＧＥ  Ｎｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｒｅｓｉｎ及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎらから改変した緩衝液を用いて、ニッケル精製した。
【実施例１２】
【０２００】
阻害剤又はＭＴＨＦＤ２についてのアッセイ
このマイクロタイターウェルベースのスクリーニングにおいて利用したＮＡＤ依存型メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ／シクロヒドロラーゼ活性アッセイは、以前に公開された酵素学的アッセイに基づき、以下に列挙した改変を有する。このアッセイは、最初に、Scrimgeour and Huennekens, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1960, 2:230-233によって、その後、Mejia and MacKenzie, The Journal of biological chemistry. 1985; 260:14616-14620によって報告された。このアッセイを、記載のようにわずかな改変と共に実施した（Ｍｅｊｉａらのアッセイにおいて報告されたアッセイ濃度を、下で括弧内に示す）。改変アッセイは、３８４ウェル様式における１ウェルあたり実施例１１に記載のように産生した組換えＭＴＨＦＤ２タンパク質５０ｎｇを用いた。加えて、本アッセイは、３０μＭのリン酸カリウム緩衝液（Ｍｅｊｉａ：２５μＭのリン酸カリウム緩衝液）を、ｐＨ７．５（７．３）にて、１５０μＭホルムアルデヒド（２．５ｍＭ）、１５０μＭテトラヒドロ葉酸（２５０μＭ）及び６ｍＭ  ＭｇＣｌ（５ｍＭ）と共に用いた。２−メルカプトエタノールも還元剤も、本アッセイにおいては使用しなかった。これは、システインを改変する化合物の、潜在的酵素阻害剤としての検出のために、非常に重要である。化学的阻害剤についての高処理スクリーニングのために使用されたこのアッセイは、３４０ｎｍにおける分光学的吸光度による、５，１０−メテニルテトラヒドロ葉酸の形成の最終エンドポイント測定を使用した。
【０２０１】
マイクロタイター３８４ウェルプレート様式において、組換えタンパク質及び改変アッセイを用いると、ＭＴＨＦＤ２についての酵素動態学（ＮＡＤ及びＣＨ２−ＴＨＦについてのＫｍ）は、公開された値に匹敵した（公開された酵素値は、（Yang and MacKenzie Biochemistry. 1993;32:11118-11123）において提供される）。
【０２０２】
【表４】
2016514136.tif 000020
【実施例１３】
【０２０３】
高処理スクリーニングは、システイン改変剤を同定する
実施例１２に記載されるアッセイを使用し、Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋ化学ライブラリー、公知の生理活性ライブラリー及び薬理学的に活性な化合物のライブラリーにおける約５，１００の低分子薬剤のライブラリーを、生物学的に二連でスクリーニングした。いくつかの低分子薬剤が、この酵素を阻害することを見出した。これらとしては、６−ヒドロキシ−ＤＬ  ＤＯＰＡ、塩化カルミダゾリウム、ＣＤＯＯ、エブセレン、セラストロール、ＧＷ５０７４、ヨードアセトアミド、パラ−ベンゾキノン及びプロトポルフィリンＩＸ二ナトリウムが、挙げられる。いくつかの高いスコアの阻害剤は、システイン残基の改変により酵素活性を原則的に阻害できる、公知のシステイン改変剤である。
【０２０４】
二次試験において、最初のスクリーニングにおいて同定した化合物のうち９つ（６−ヒドロキシ−ＤＬ  ＤＯＰＡ、塩化カルミダゾリウム、ＣＤＯＯ＊、エブセレン＊、セレストロール＊、ＧＷ５０７４、ヨードアセトアミド＊、パラ−ベンゾキノン＊、及びプロトポルフィリンＩＸ二ナトリウムを含む）を、８の濃度用量応答アッセイにおいて試験した。システイン改変について既知の能力を有する化合物を、星印によって示す。ヒトＭＴＨＦＤ２の全長タンパク質配列は、３つのシステインアミノ酸を有する：
配列番号４
2016514136.tif 000021
第１のシステイン（Ｃ２１）は、ミトコンドリア標的化配列内にあり、タンパク質がミトコンドリアに輸送される際の成熟プロセスの間に開裂する。これは、本明細書中で同定される低分子薬剤によって改変され得る候補システインとして、Ｃ１４５及びＣ１６６における２つのシステインを残す。
【０２０５】
Ｃ１４５、Ｃ１６６又はＣ１４５／Ｃ１６６の両方におけるシステインからセリンへの突然変異を有する３つの突然変異体ＭＴＨＦＤ２構築物を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇを用いて作製した。これらの突然変異体を、二次スクリーニングにおいて同定した化合物のうち３つ（６−ヒドロキシ−ＤＬ−ＤＯＰＡ、セラストロール及びエブセレン）で再試験した。６−ヒドロキシ−ＤＬ−ＤＯＰＡは、公知のシステイン改変薬剤ではなく（陰性対照）、野生型、Ｃ１４５、Ｃ１６６及びＣ１４５／Ｃ１６６タンパク質を、同じ程度に阻害し、還元剤ＤＴＴの添加によって拮抗作用が起きなかった（図９Ａ）。システイン改変剤エブセレン（図９Ｃ）は、野生型ＭＴＨＦＤ２及びＣ１６６突然変異体を阻害したが、他方で、Ｃ１４５及びＣ１４５／Ｃ１６６突然変異体タンパク質、又は野生型ＭＴＨＦＤ２タンパク質への還元剤ＤＴＴの添加は、エブセレンに対して抵抗性であった。このことは、Ｃ１４５が、エブセレンについての重要なシステイン残基であることを示唆する。システイン改変剤セレストロールは、Ｃ１４５又はＣ１６６突然変異体タンパク質において、部分的阻害を示し、Ｃ１４５／Ｃ１６６二重突然変異体における又はＤＴＴの添加による阻害の欠損を有し、このことは、セレストロールが、Ｃ１４５及びＣ１６６を通して、ＭＴＨＦＤ２に相加的に拮抗し得ることを示唆する（図９Ｂ）。これらのシステイン残基の同定により、さらなる構造／医薬品化学が、これらのシステイン残基を利用しＭＴＨＦＤ２をより高い選択性で阻害する低分子を、特異的に設計するために使用され得る。
【０２０６】
実際、ＭＴＨＦＤ１に対するＭＴＨＦＤ２の間の配列アラインメントの試験は、同定した重要なシステイン残基（Ｃ１４５及びＣ１６６）が、ＭＴＨＦＤ２及びＭＴＨＦＤ２Ｌのみに存在し、ＭＴＨＦＤ１には存在しないことを明らかにし、このことは、ＭＴＨＦＤ２におけるこれらのシステイン残基が、新規な酵素阻害剤の開発において標的化され得ることを示唆する。
【０２０７】
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【０２０８】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と一緒に記載されているが、上記の説明は、例示を意図し、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定することを意図しないことが、理解される。他の態様、利点及び改変が、以下の特許請求の範囲内である。
【図１Ａ】
2016514136.tif 000022
【図１Ｂ】
2016514136.tif 000023
【図１Ｃ】
2016514136.tif 000024
【図１Ｄ】
2016514136.tif 000025
【図１Ｅ】
2016514136.tif 000026
【図１Ｆ】
2016514136.tif 000027
【図１Ｇ】
2016514136.tif 000028
【図１Ｈ】
2016514136.tif 000029
【図２Ａ】
2016514136.tif 000030
【図２Ｂ】
2016514136.tif 000031
【図３】
2016514136.tif 000032
【図４】
2016514136.tif 000033
【図５】
2016514136.tif 000034
【図６】
2016514136.tif 000035
【図７Ａ】
2016514136.tif 000036
【図７Ｂ】
2016514136.tif 000037
【図７Ｃ】
2016514136.tif 000038
【図８】
2016514136.tif 000039
【図９Ａ】
2016514136.tif 000040
【図９Ｂ】
2016514136.tif 000041
【図９Ｃ】
2016514136.tif 000042
【配列表】
2016514136000001.app
【国際調査報告】
2016514136.tif 000043
2016514136.tif 000044
2016514136.tif 000045