(57)【要約】  本発明は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過するポリペプチドを提供する。したがって、これらのポリペプチドは、ＢＢＢ輸送薬剤である。該ポリペプチドは、典型的には、単独で、または治療薬若しくは診断薬との併用により、治療的または診断的に有用な、または生理学的に有意な有効濃度でＢＢＢを通過することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液脳関門（ＢＢＢ）を通過するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２の配列の７個以上の連続するアミノ酸を含み、および、Ｋ４８およびＲ４９（配列番号１に対応して番号付け）を含む、５９アミノ酸長未満のレギュロンポリペプチド；
（ｂ）配列番号４の配列の少なくとも２０個の連続するアミノ酸を含む、１００アミノ酸長未満のＲＡＰポリペプチド；
（ｃ）フレキシブルループを含む、１００アミノ酸長未満のフレキシブルポリペプチドであって、該ポリペプチドは配列：
Ｘ１Ｘ２ＥＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥＸ１０Ｘ１１
または
ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥ、を含み、
ここで、Ｘ１＝Ａ、Ｆ、ＳまたはＴ、Ｘ２＝Ｇ、Ｋ、ＲまたはＳ、Ｘ３＝ＳまたはＴ、Ｘ４＝ＮまたはＳ、Ｘ５＝Ａ、ＩまたはＴ、Ｘ６＝Ｉ、ＴまたはＶ、Ｘ７＝Ｄ、ＥまたはＧ、Ｘ８＝Ｓ、ＴまたはＹ、Ｘ９＝Ｆ、ＴまたはＹ、Ｘ１０＝ＧまたはＮ、Ｘ１１＝ＫまたはＲである；または、
（ｄ）α−へリックスを含み、およびコンセンサス配列：
（Ｋ／Ｒ）Ａ（Ａ／Ｅ／Ｑ）ＫＡ（Ａ／Ｅ／Ｑ）Ａ（Ｋ／Ｒ）、場合により、
ＧＤ（Ａ／Ｅ）α（Ｋ／Ｒ）Ａ（Ａ／Ｅ／Ｑ）ＫＡ（Ａ／Ｅ／Ｑ）Ａ（Ｋ／Ｒ）ＡＸβＧＹを含み、
ここで、好ましくは、αは１〜１０であり、βは１〜２５である、１００アミノ酸長未満の剛直なポリペプチド、
である、前記ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１の（ａ）に記載のレギュロンポリペプチドであって、
（Ａ）（ｉ）Ｔ４３、Ｖ４４、Ｉ４５、Ｈ４６、Ｇ４７および／または（ｉｉ）Ｅ５０、Ｖ５１、Ｔ５２、Ｌ５３およびＨ５４（配列番号１に対応して番号付け）；および、場合により、
（Ｂ）Ｐ４３およびＬ５５（配列番号１に対応して番号付け）；および、場合により、
（Ｃ）（ｉ）Ｐ３７、Ｍ３８、Ａ３９、Ｒ４０、Ｅ４１および／または（ｉｉ）Ｈ５６、Ｐ５７、Ｄ５８およびＨ５９（配列番号１に対応して番号付け）、
を含む、前記レギュロンポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドであって、
ポリペプチド（ａ）が配列番号２または配列番号３の配列を含む、または、からなるレギュロンポリペプチドであり；
ポリペプチド（ｂ）が配列番号４、配列番号５または配列番号６の配列を含む、または、からなるＲＡＰポリペプチドであり；
ポリペプチド（ｃ）が配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０または配列番号１１の配列を含む、または、からなるフレキシブルポリペプチドであり；
ポリペプチド（ｄ）が配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５または配列番号１６の配列を含む、または、からなる剛直なポリペプチドである、
前記ポリペプチド。
【請求項４】
ポリペプチドが組換えにより作製される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ポリペプチドが化学的合成により作製される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して薬剤を輸送する複合体であって、
（ａ）請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド、および
（ｂ）薬剤、
を含み、
ＢＢＢを通過することができる、前記複合体。
【請求項７】
薬剤が薬物、ポリペプチド、酵素、抗生物質、抗がん剤、放射性薬剤、抗体、細胞毒素、検出可能な標識または抗血管新生化合物である、請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
薬剤が治療薬である、請求項６または７に記載の複合体。
【請求項９】
薬剤が小分子薬物である、請求項８に記載の複合体。
【請求項１０】
薬剤が診断薬であり、場合により、該診断薬は色素、化学発光色素、放射線造影剤、金属キレート錯体、蛍光標識、酵素基質標識、抗体またはその抗体断片である、請求項６または７に記載の複合体。
【請求項１１】
ポリペプチドがリンカーを介して薬剤に結合されている、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１２】
ポリペプチドが薬剤に直接結合されている、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１３】
ナノ粒子を含む、請求項６〜１２のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１４】
薬剤がＢＢＢの通過輸送後に、ポリペプチドから放出可能である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは複合体、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
治療に使用するための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のポリペプチド、複合体または医薬組成物。
【請求項１７】
神経疾患、場合により、脳腫瘍、脳転移、統合失調症、てんかん、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、脳卒中および／またはＢＢＢの機能不全に関連する疾患の治療に使用するための、請求項１６に記載のポリペプチド、複合体または医薬組成物。
【請求項１８】
診断法に使用するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のポリペプチド、複合体または医薬組成物。
【請求項１９】
神経疾患の診断に使用するための、請求項１８に記載のポリペプチド、複合体または医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤の脳への送達に関する。さらに詳しくは、血液脳関門（Blood Brain Barrier：ＢＢＢ）を通過することが可能なポリペプチド、および主として神経疾患の治療および／または診断においてＢＢＢを通過させて薬剤を輸送するための該ポリペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＢＢＢは、細菌や大分子または親水性分子などの微小物体が脳組織に侵入することを制限して、非常に効果的に脳を保護している。これは、中枢神経系を標的とする薬物を開発する際に考慮すべき重要課題である。脳組織内の標的細胞に達するためには、末梢投与された薬物は、それ自身がＢＢＢを通過できるか、輸送システムとしての担体の使用によってＢＢＢを通過できなければならない。診断薬および治療薬としての価値を有し得る多くの薬剤の脳への送達が、ＢＢＢにより妨げられることから、ＢＢＢは脳障害の診断および／または治療の主要な障壁となる。
【０００３】
ＢＢＢによる制限を克服する助けとして多数の方法が行われてきたが、それらの方法は大まかに次の３つに分けられる。１）侵襲的方法（例えば、外科的処置による薬物の脳室内直接投与）、２）薬理学的手法（例えば、ポリペプチドの脂質溶解度を高める）、３）担体に基づく手法（すなわち、ＢＢＢを通過させて薬物を輸送するために公知の輸送機構を利用または修正し、特異性の高い、有効な薬物送達を提供する）。
【０００４】
２００７年に、Ｄｅｍｅｕｌｅとその共同研究者らは、ＢＢＢを通過できる、一連の１９量体ポリペプチドを設計した［１］(非特許文献１)。これらのポリペプチドの中で、「ａｎｇｉｏｐｅｐ（アンジオペップ）−２」と称される最良のポリペプチドは、低密度リポタンパク質受容体（「ＬＤＬＲ」）ファミリーのメンバーであるＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ１）が関与する結合機構を介して、脳細胞内でトランスサイトーシス（細胞内部を通過する分子の輸送）を発現することが判明した［２］(非特許文献２)。
【０００５】
ＬＤＬＲは、主にエンドサイト−シスを介して、コレステロール運搬粒子の細胞内取り込みに関与している［３］(非特許文献３)。その主要なリガンドは、コレステロールを含む、異なる脂肪分子の輸送を可能にするリポタンパク質の５つの主要なグループの１つである、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）である。ヒトでは、血漿コレステロールの約６５％〜７０％がＬＤＬの形で循環している。各ＬＤＬ粒子は、脂肪酸を血流の水溶液環境下に可溶化し、脂肪酸の循環に関与しているアポリポタンパク質Ｂ−１００（アポＢ−１００）を１分子含む。また、ＬＤＬＲは、複数のアポリポタンパク質Ｅ（アポＥ）を含むβ−超低密度リポタンパク質（ｂ−ＶＬＤＬ）と強く結合する。
【０００６】
ＬＤＬＲは、通常ＬＤＬＲファミリーと称される受容体の全クラスを代表する、約８４０のアミノ酸からなるモジュール膜貫通タンパク質である。各ＬＤＬＲファミリーメンバーは、類似のパターンで配置されたドメイン、ＬＤＬ受容体型Ａ（「ＬＡ」、「ＣＲ」または「リガンド結合リピート」とも称される）および上皮増殖因子様（ＥＧＦ様）およびＹＷＴＤ（またはβ−プロペラ）モジュール（図１、［４］(非特許文献４)）、を１つ以上含む。ＬＤＬＲの外部ドメイン（図２、［４］(非特許文献４)）は機能的に２つの領域、すなわちＮ−末端の７つの連続するＬＤＬ−Ａモジュール（ＬＡ１〜ＬＡ７）からなるリガンド結合部位およびそれに続くＥＧＦ前駆体に相同性である領域に分割される。ＬＡ３〜ＬＡ７モジュールは、ＬＤＬに結合するために不可欠である［５］(非特許文献５)。２つのＥＧＦ様モジュール、β−プロペラドメインおよび第３ＥＧＦ様モジュールを含むＥＧＦ領域は、低エンドソームｐＨでのＬＤＬ粒子の放出および受容体の細胞表面へのリサイクルの両方に関与している。
【０００７】
この事実にもかかわらず、今のところＢＢＢを通過させて薬剤を輸送するための選択肢が限定されている。ＢＢＢを通過させて治療薬および診断薬を送達する、さらに改良した薬剤および方法が、当該技術分野でなお必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Demeule M., Regina A., Che C., Poirier J., Nguyen T., Gabathuler R., Castaigne J-P, Beliveau R., Journal of Pharmacology andl Experimental Therapeutics (2007) 324, 1046-1072.
【非特許文献２】Demeule M. Currie J-C, Bertrand Y., Che C., Nguyen T., Regina A., Gabathuler R., Castaigne J-P, Beliveau R., Journal of Neurochemistry (2008) 106, 1534-1544.
【非特許文献３】Brown M. S., Goldstein, J. L., Science (1986) 232, 34-47.
【非特許文献４】Lillis A.P., Van Duyn L.B., Murphy-Ullrich J.E., Strickland D.K., Physiol. Rev., (2008) Vol. 88., 887-918.
【非特許文献５】Russell D. W., Brown M. S., Goldstain J. L., J. Biol. Chem (1989) 264, 21682-21688.
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ＢＢＢを通過するポリペプチドを提供する。したがって、これらのポリペプチドは、ＢＢＢ輸送薬剤である。該ポリペプチドは、典型的には、単独で、または治療薬若しくは診断薬との併用により、治療的または診断的に有用な、または生理学的に有意な有効濃度でＢＢＢを通過することができる。
【００１０】
本発明は、理論に拘束されるものではないが、本発明のポリペプチドは、エンドサイトーシスにより本発明のポリペプチドを脳内部に移行させるＬＤＬＲのＬＡドメインに結合するように設計されている。これによりＢＢＢを通過することができるので、本発明のポリペプチドは、特に、ＢＢＢを通過して他の薬剤を脳に輸送する担体として、および薬剤、典型的には、薬物または診断薬を脳に送達する担体として、有用である。
【００１１】
本発明は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過させるためのポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは以下のポリペプチドであるか、含むか、本質的に以下のポリペプチドからなるか、あるいは以下のポリペプチドからなるものである。
（ａ）配列番号２の配列の７個以上の連続するアミノ酸を含み、および、Ｋ４８およびＲ４９（配列番号１に対応して番号付け）を含む、５９アミノ酸長未満のレギュロンポリペプチドであり、場合により、（ｉ）Ｔ４３、Ｖ４４、Ｉ４５、Ｈ４６、Ｇ４７および／または（ｉｉ）Ｅ５０、Ｖ５１、Ｔ５２、Ｌ５３およびＨ５４（配列番号１に対応して番号付け）；場合により、Ｐ４３およびＬ５５（配列番号１に対応して番号付け）；場合により、（ｉ）Ｐ３７、Ｍ３８、Ａ３９、Ｒ４０、Ｅ４１および／または（ｉｉ）Ｈ５６、Ｐ５７、Ｄ５８およびＨ５９（配列番号１に対応して番号付け）、を含む。
（ｂ）配列番号４の配列の少なくとも２０個の連続するアミノ酸を含む、１００アミノ酸長未満のＲＡＰ（受容体関連タンパク質）ポリペプチド。
（ｃ）フレキシブルループを含む、１００アミノ酸長未満のフレキシブルポリペプチドであって、該ポリペプチドは配列：Ｘ１Ｘ２ＥＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥＸ１０Ｘ１１またはＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥ（Ｘ１＝Ａ、Ｆ、ＳまたはＴ、Ｘ２＝Ｇ、Ｋ、ＲまたはＳ、Ｘ３＝ＳまたはＴ、Ｘ４＝ＮまたはＳ、Ｘ５＝Ａ、ＩまたはＴ、Ｘ６＝Ｉ、ＴまたはＶ、Ｘ７＝Ｄ、ＥまたはＧ、Ｘ８＝Ｓ、ＴまたはＹ、Ｘ９＝Ｆ、ＴまたはＹ、Ｘ１０＝ＧまたはＮ、Ｘ１１＝ＫまたはＲ）を含む。
（ｄ）α−へリックスを含み、およびコンセンサス配列（Ｋ／Ｒ）Ａ（Ａ／Ｅ／Ｑ）ＫＡ（Ａ／Ｅ／Ｑ）Ａ（Ｋ／Ｒ）を含み、場合により、ＧＤ（Ａ／Ｅ）α（Ｋ／Ｒ）Ａ（Ａ／Ｅ／Ｑ）ＫＡ（Ａ／Ｅ／Ｑ）Ａ（Ｋ／Ｒ）ＡＸβＧＹ（αは１〜１０、βは１〜２５であってよい）を含む、１００個アミノ酸長未満の剛直なポリペプチド。
【００１２】
レギュロンポリペプチドが、配列番号２または配列番号３の配列を含む、または、からなることが好ましい。
【００１３】
ＲＡＰポリペプチドが、配列番号４、配列番号５または配列番号６の配列を含む、または、からなることが好ましい。
【００１４】
フレキシブルポリペプチドが、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０または配列番号１１の配列を含む、または、からなることが好ましい。
【００１５】
剛直なポリペプチドが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５または配列番号１６の配列を含む、または、からなることが好ましい。
【００１６】
配列番号２〜１６の各配列に少なくとも８５％、９０％または９５％に同一性を有する配列を含む、または、からなるポリペプチドも提供する。
【００１７】
ある実施形態では、ポリペプチドは組換えにより作製される。他の実施形態では、ポリペプチドは化学的に合成される。
【００１８】
本発明はまた、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して薬剤を輸送する、（ａ）上述のポリペプチド、および（ｂ）薬剤、を含む複合体を提供する。該複合体は、ＢＢＢを通過することができる。
【００１９】
ある実施形態では、薬剤は診断薬または治療薬である。ある実施形態では、ポリペプチドが薬剤にリンカーを介して結合されている。ある実施形態では、ポリペプチドが薬剤に直接結合されている。ある実施形態では、複合体はナノ粒子を有する。ある実施形態では、薬剤はＢＢＢの通過輸送後に、ポリペプチドから放出可能である。
【００２０】
本発明はまた、前記実施形態のいずれか１つによるポリペプチドまたは複合体、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含有する医薬組成物を提供する。
【００２１】
本発明はまた、治療上の使用のための、上述のポリペプチド、複合体または医薬組成物を提供する。一実施形態では、治療上の使用は、神経疾患、場合により、脳腫瘍、脳転移、統合失調症、てんかん、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、脳卒中および／またはＢＢＢの機能不全に関連する疾患の処置である。
【００２２】
本発明はまた、診断法に使用するための、上述のポリペプチド、複合体または医薬組成物を提供する。一実施形態では、診断上の使用は、神経疾患の診断である。
【００２３】
本発明はまた、上述のポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチドを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
以下、本発明を図面によって説明する。
【図１】ＬＤＬＲファミリーメンバーを示す。
【図２】７つのリガンド結合リピート（ＬＡ／ＣＲ）、３つのＥＧＦ様モジュールおよび１つのβ−プロペラユニットからなるＬＤＬＲの外部ドメインを示す。
【図３】ＬＤＬＲ（ＰＤＢ：２ＦＣＷ）におけるＬＡドメインフォールディングを示す。
【図４Ａ】ＬＡ−ＲＡＰ（Ｄ３）インターフェース（Ａ−Ｄ）と他のＬＡモジュールインターフェースとの比較を示す。
【図４Ｂ】ＬＡ−ＲＡＰ（Ｄ３）インターフェース（Ａ−Ｄ）と他のＬＡモジュールインターフェースとの比較を示す。
【図４Ｃ】ＬＡ−ＲＡＰ（Ｄ３）インターフェース（Ａ−Ｄ）と他のＬＡモジュールインターフェースとの比較を示す。
【図４Ｄ】ＬＡ−ＲＡＰ（Ｄ３）インターフェース（Ａ−Ｄ）と他のＬＡモジュールインターフェースとの比較を示す。
【図５】各アミノ酸を構成するために定義された一連の１１３の物理化学的性質に基づくアンジオペップの階層的クラスター化を示す。
【図６】相同性モデリングにより得られたアンジオペップ−２の一般的なフォールディングを示す。
【図７】ＡＰ２構造のアブイニシオ（非経験的）予測を示す。
【図８】（単一ドメイン結合剤としての）ＡＰ２とＬＡモジュール間の可能な相互作用を示す。
【図９】（二重ドメイン結合剤としての）ＡＰ２とＬＡモジュール間の可能な相互作用を示す。
【図１０】レギュロンの相同性モデル（ＰＤＢコード：３Ｎ４０）によるレギュロンの一般的なフォールディングを示す。円は、フォールディングの構造化された部分を強調している。
【図１１】（単一ドメイン結合剤としての）レギュロンとＬＡモジュール間の可能な相互作用を示す。
【図１２】（二重ドメイン結合剤としての）レギュロンとＬＡモジュール間の可能な相互作用を示す。第２結合領域のみを示している。
【図１３】全レギュロンモデルに観察されるレギュロン構築物１の予測構造を示す。
【図１４】アブイニシオ法により計算されたレギュロン構築物１の予測構造を示す。
【図１５】相同性に基づくレギュロンモデルによるレギュロン構築物４の予測構造を示す。
【図１６】アブイニシオ法により計算されたモデルのよるレギュロン構築物４の予測構造を示す。
【図１７】ＲＡＰ  Ｄ３ドメインとＬＤＬＲ間の相互作用を示す。
【図１８】ＲＡＰ−ＬＤＬＲ錯体（２ＦＣＷ）の結晶構造に基づくＲＨ構築物１のモデルを示す。
【図１９】アブイニシオ法により計算されたＲＨ構築物１の予測構造を示す。
【図２０】ＲＡＰ−ＬＤＬＲ錯体（２ＦＣＷ）の結晶構造に基づくＲＨ構築物２のモデルを示す。
【図２１】ＲＡＰ−ＬＤＬＲ錯体（２ＦＣＷ）の結晶構造に基づくＲＨ構築物３のモデルを示す。
【図２２】ウシ脳内皮細胞と星状膠細胞の共培養に関する、ＢＢＢのインビトロモデルを模式的に表す。
【図２３】非装飾ナノ粒子はＢＢＢを通過できないが、レギュロン（配列番号１）で修飾したナノ粒子はＢＢＢを通過することを示す棒グラフ（グラフ中、ＮＰはナノ粒子）である。
【図２４】蛍光標識ペプチドのインビトロＢＢＢモデル通過試験による通過率を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、ＢＢＢを通過できるポリペプチドの驚くべき同定に基づいている。ＢＢＢを通過できる新規ポリペプチドを同定する試みにおいて、本発明者らは、標的として低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）を選択し、ＬＤＬＲのリガンド結合（「ＬＡ」）ドメインと相互作用することが知られている全てのポリペプチドのデータベースを作り上げた。本発明者らは、これら全てのポリペプチドの構造および活性を評価した。ポリペプチドＬＤＬＲ相互作用の多くは、異なる実験条件により確認されたものであり、本発明者らは、ＬＤＬＲのＬＡドメインと相互作用することができ、それによりＢＢＢを通過することができるポリペプチドにとって重要な、構造的および薬理作用的特徴をさらに確認することができた。
【００２６】
構造的および薬理作用的モデルを開発、精製するために、本発明者らは、ＢＢＢを通過することが既に知られているペプチド、すなわち、アンジオペップ（Ｄｅｍｅｕｌｅら、上記を参照）およびレギュロンを分析した。アンジオペップは、ＬＤＬＲと相互作用することによりＢＢＢを通過することが知られているが、これらのポリペプチドについての構造情報はなく、本発明者らは構造的比較を行うことができるようにアンジオペップモデルを作成した。レギュロンもＢＢＢを通過することが知られており、かつその構造も公知であるが、レギュロンがＢＢＢを通過する機構は知られていなかった。ＢＢＢを通過するために必要となる重要な構造的および薬理作用的特徴を確認して、本発明者らは、これらの重要な特徴を含み、ＢＢＢを通過することができる本発明のポリペプチドを開発した。
【００２７】
本発明のポリペプチドは、共通の特徴を共有する。これらのポリペプチドは全て、ＢＢＢを通過することができ、同じ方法により同定することが可能で、ＬＤＬＲのＬＡドメインに結合するように設計されている。本発明のポリペプチドは、４つのグループ、「レギュロンポリペプチド」、「ＲＡＰポリペプチド」、「フレキシブルポリペプチド」および「剛直なポリペプチド」に細分化することができる。本発明のポリペプチドは、典型的には下記に説明する配列を含む、またはからなる。
【００２８】
レギュロンポリペプチド
ＨＫＫＷＱＦＮＳＰＦＶＰＲＡＤＥＰＡＲＫＧＫＶＨＩＰＦＰＬＤＮＩＴＣＲＶＰＭＡＲＥＰＴＶＩＨＧＫＲＥＶＴＬＨＬＨＰＤＨ（配列番号１）：レギュロン
レギュロンは、ＢＢＢを通過することができる。その構造および作用の機構は、今まで不明であった。
【００２９】
Ｐ６２外被糖タンパク質（下記実施例に記載）を用いるレギュロン配列の相同性モデリングにより、本発明者らは、レギュロンは、剛直なβ−ヘアピン構造と構造化されていない柔軟な長い鎖を有することを見出した。本発明者らは、ＬＤＬＲと相互作用するβ−ヘアピンを同定し、この相互作用には２つの重要な残基、Ｋ４８およびＲ４９（配列番号１に対応して番号付け）、がβ−ヘアピンのＵターン部に必要であることを見出した。したがって、本発明のレギュロンポリペプチドは、Ｋ４８およびＲ４９（配列番号１に対応して番号付け）を有する。本発明のレギュロンポリペプチドは、ＢＢＢを通過することができる。このことは、例えば、図２３に示されている。図２３は、レギュロン（配列番号１）で修飾されたナノ粒子がＢＢＢを通過できることを、図２２およびＣｅｃｃｈｅｌｌｉら（Adv. Drug Deliv. Rev., 1999 Apr. 5; 36(2-3): 165-178：参照文献６）の記載と同様に、ＢＢＥＣ／ラット星状膠細胞共培養インビトロモデルを使用して実証している。図２３により、非修飾ナノ粒子はＢＢＢを通過しないことも確認される。
【００３０】
全長レギュロンポリペプチドは、５９アミノ酸長（配列番号１）を有する。本発明のレギュロンポリペプチドは、全長レギュロンの断片であるので、その製造は簡単で経済的である。さらに、同等以上のＢＢＢ通過能力を有するより短いポリペプチドを使用することにより、患者へのポリペプチドの投与量を低減することが可能になる。したがって、本発明のレギュロンポリペプチドは、５９アミノ酸長より短く、配列番号１の連続する７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７または５８個のアミノ酸を有する。
【００３１】
Ｋ４８およびＲ４９に加えて、本発明のレギュロンポリペプチドは、（ａ）Ｔ４３、Ｖ４４、Ｉ４５、Ｈ４６およびＧ４７および／または（ｂ）Ｅ５０、Ｖ５１、Ｔ５２、Ｌ５３およびＨ５４（配列番号１に対応して番号付け）を有することが好ましい。これらのアミノ酸残基は、β−ヘアピンの形成に関与しているからである。Ｋ４８およびＲ４９に加えて、本発明のレギュロンポリペプチドは、（ａ）Ｐ４２、Ｔ４３、Ｖ４４、Ｉ４５、Ｈ４６およびＧ４７および／または（ｂ）Ｅ５０、Ｖ５１、Ｔ５２、Ｌ５３、Ｈ５４およびＬ５５（配列番号１に対応して番号付け）を有することがより好ましい。これらのアミノ酸残基は、ＬＤＬＲのＬＡドメインと相互作用する、より大きなβ−ヘアピンモチーフの形成を助けるからである。理論に拘束されるものではないが、本発明者らは、このより大きなβ−ヘアピンは、ＬＤＬＲとの相互作用をさらに向上させると考えている。
【００３２】
レギュロン構築物１
ＰＴＶＩＨＧＫＲＥＶＴＬＨＬ（配列番号２）：レギュロン構築物１
好ましい本発明のレギュロンポリペプチドは、「レギュロン構築物１」（配列番号２）である。レギュロン構築物１は、β−ヘアピンを形成する、配列番号１の配列の１４個のアミノ酸残基からなる断片である。
【００３３】
本発明はまた、配列番号２の配列の７つ以上の連続するアミノ酸、例えば、７、８、９、１０、１１、１２または１３個のアミノ酸残基を有するレギュロン構築物１の断片を提供し、該断片はＫ４８およびＲ４９（配列番号１に対応して番号付け）を含み、ＢＢＢを通過する能力を保持する。
【００３４】
その他の好ましい断片としては、ＢＢＢを通過する能力を保持しながら、配列番号２の配列のＣ−末端から１つ以上のアミノ酸、例えば、１、２、３、４、５または６個のアミノ酸を欠いたおよび／またはＮ−末端から１つ以上のアミノ酸、例えば、１、２、３、４、５または６個のアミノ酸を欠いた断片が挙げられ、該断片は、配列番号２の配列の連続する７つ以上のアミノ酸を含み、Ｋ４８およびＲ４９（配列番号１に対応して番号付け）を含む。したがって、レギュロン構築物１のアミノ酸の断片は、配列番号２の配列の７、８、９、１０、１１、１２または１３個の連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含んでもよい。
【００３５】
本発明のレギュロンポリペプチドはまた、配列番号２の配列の変異型を含む。レギュロン構築物１の変異型は、典型的には配列番号２との同一性が８５％以上である、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなる。
【００３６】
レギュロン構築物４
ＰＭＡＲＥＰＴＶＩＨＧＫＲＥＶＴＬＨＬＨＰＤＨ（配列番号３）：レギュロン構築物４
他の好ましい本発明のレギュロンポリペプチドは、「レギュロン構築物４」（配列番号３）である。レギュロン構築物４は、配列番号２の配列を含む配列番号１の２３アミノ酸残基の断片である。配列番号４の配列は、追加の残基（配列番号２に対応）がＬＤＬＲと相互作用することができるβ−シートを形成する平行ストランドを形成するので、特に好適なものとして同定される。
【００３７】
本発明はまた、レギュロン構築物４の断片を提供する。該断片は、配列番号３の配列の７個以上の連続するアミノ酸、典型的には７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のアミノ酸残基、を有し、Ｋ４８およびＲ４９（配列番号１に対応して番号付け）を含み、ＢＢＢを通過することができる。
【００３８】
好ましくは、本発明のレギュロン構築物４のポリペプチドは、Ｋ４８およびＲ４９に加えて、（ａ）Ｐ３７、Ｍ３８、Ａ３９、Ｒ４０、Ｅ４１、Ｐ４２、Ｔ４３、Ｖ４４、Ｉ４５、Ｈ４６およびＧ４７および／または（ｂ）Ｅ５０、Ｖ５１、Ｔ５２、Ｌ５３、Ｈ５４、Ｌ５５、Ｈ５６、Ｐ５７、Ｄ５８およびＨ５９（配列番号１に対応して番号付け）を含む。
【００３９】
その他の好ましい断片としては、ＢＢＢを通過する能力を保持しながら、配列番号３の配列のＣ−末端から１つ以上のアミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個のアミノ酸を欠いたおよび／またはＮ−末端から１つ以上のアミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸を欠いた断片が挙げられ、該断片は、配列番号３の配列の連続する７個以上のアミノ酸を有し、Ｋ４８およびＲ４９（配列番号１に対応して番号付け）を有する。したがって、レギュロン構築物４の断片は、配列番号３の配列の７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３個の連続するアミノ酸残基の配列を有する。
【００４０】
本発明のレギュロンポリペプチドは、配列番号３の配列の変異型も含む。レギュロン構築物４の変異型は、典型的には配列番号３の配列との同一性が８５％以上である、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなる。
【００４１】
ＲＡＰポリペプチド
ＭＡＰＲＲＶＲＳＦＬＲＧＬＰＡＬＬＬＬＬＬＦＬＧＰＷＰＡＡＳＨＧＧＫＹＳＲＥＫＮＱＰＫＰＳＰＫＲＥＳＧＥＥＦＲＭＥＫＬＮＱＬＷＥＫＡＱＲＬＨＬＰＰＶＲＬＡＥＬＨＡＤＬＫＩＱＥＲＤＥＬＡＷＫＫＬＫＬＤＧＬＤＥＤＧＥＫＥＡＲＬＩＲＮＬＮＶＩＬＡＫＹＧＬＤＧＫＫＤＡＲＱＶＴＳＮＳＬＳＧＴＱＥＤＧＬＤＤＰＲＬＥＫＬＷＨＫＡＫＴＳＧＫＦＳＧＥＥＬＤＫＬＷＲＥＦＬＨＨＫＥＫＶＨＥＹＮＶＬＬＥＴＬＳＲＴＥＥＩＨＥＮＶＩＳＰＳＤＬＳＤＩＫＧＳＶＬＨＳＲＨＴＥＬＫＥＫＬＲＳＩＮＱＧＬＤＲＬＲＲＶＳＨＱＧＹＳＴＥＡＥＦＥＥＰＲＶＩＤＬＷＤＬＡＱＳＡＮＬＴＤＫＥＬＥＡＦＲＥＥＬＫＨＦＥＡＫＩＥＫＨＮＨＹＱＫＱＬＥＩＡＨＥＫＬＲＨＡＥＳＶＧＤＧＥＲＶＳＲＳＲＥＫＨＡＬＬＥＧＲＴＫＥＬＧＹＴＶＫＫＨＬＱＤＬＳＧＲＩＳＲＡＲＨＮＥＬ（配列番号４８）：受容体関連タンパク質
受容体関連タンパク質（ここでは、ＲＡＰと称する。配列番号４８）は、そのＤ３ドメインを介してＬＤＬＲに結合できることが知られており、ＲＡＰタンパク質についての構造学的研究は、既に行われている。ＲＡＰとＬＤＬＲの間の相互作用は、２つのＬＤＬ受容体型Ａ（ＬＡ）モジュールと相互作用する２つのＲＡＰα−へリックスを介して起こることが知られている。一方のα−へリックスはＫ２５６を有する、相互作用に必要な残基を含んでおり、他方のへリックスは錯体を安定化すると考えられる。本発明者らは、３つの新規ＲＡＰポリペプチドを開発し、「ＲＨ構築物１」（配列番号４）、「ＲＨ構築物２」（配列番号５）、「ＲＨ構築物３」（配列番号６）と名付けた。本発明者らは、ＢＢＢを通過するためのコア断片としてＲＨ構築物１を同定した。したがって、「ＲＨ構築物２」および「ＲＨ構築物３」は、「ＲＨ構築物１」の配列を有する。「ＲＨ構築物３」は、「ＲＨ構築物２」も有する。
【００４２】
本発明のＲＡＰポリペプチドは、全長ＲＡＰの断片であるので、その製造は簡単で経済的である。さらに、同等以上のＢＢＢ通過能力を達成する、より短いポリペプチドを使用することにより、患者へのポリペプチドの投与量を低減することが可能になる。したがって、本発明のＲＡＰポリペプチドは、１００個のアミノ酸長より短く、典型的には９９、９８、９７、９６、９５、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６または１５個のアミノ酸の長さを有する。
【００４３】
本発明のＲＡＰポリペプチドは、α−へリックスを形成し、ＢＢＢを通過することができる。
【００４４】
ＲＨ構築物１
ＥＬＫＨＦＥＡＫＩＥＫＨＮＨＹＱＫＱＬＥ（配列番号４）：ＲＨ構築物１
「ＲＨ構築物１」（配列番号４）は、ＲＡＰの２０アミノ酸残基からなる断片であり、ＬＤＬＲと相互作用するためのＲＡＰ−Ｄ３の最小単位として同定された。
【００４５】
本発明のＲＡＰポリペプチドは、配列番号４の配列の変異型も含む。配列番号４の変異型は、好ましくは配列番号４との同一性が８５％以上である、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなる。
【００４６】
ＲＨ構築物２
ＤＫＥＬＥＡＦＲＥＥＬＫＨＦＥＡＫＩＥＫＨＮＨＹＱＫＱＬＥＩＡＨＥＫＬＲＨＡＥＳＶ（配列番号５）：ＲＨ構築物２
他の好ましい本発明のＲＡＰポリペプチドは、ＲＨ構築物２である。ＲＨ構築物２（配列番号５）は、配列番号４の配列を有するＲＡＰの４１アミノ酸残基からなる断片であり、α−へリックスの形成にさらに有利に働く。
【００４７】
本発明のＲＨ構築物２ポリペプチドは、配列番号４の配列の２０個以上の連続するアミノ酸、典型的には、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個のアミノ酸残基からなる。
【００４８】
その他の好ましい断片としては、ＢＢＢを通過する能力を保持しながら、配列番号５の配列のＣ−末端から１つ以上のアミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個のアミノ酸を欠いたおよび／またはＮ−末端から１つ以上のアミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７個のアミノ酸を欠いた断片が挙げられ、該断片は、配列番号４の配列の連続する２０個以上のアミノ酸を有する。
【００４９】
本発明のＲＡＰポリペプチドは、配列番号５の配列の変異型も含む。ＲＨ構築物２の変異型は、典型的には配列番号５との同一性が８５％以上である、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなる。
【００５０】
ＲＨ構築物３
ＤＫＥＬＥＡＦＲＥＥＬＫＨＦＥＡＫＩＥＫＨＮＨＹＱＫＱＬＥＩＡＨＥＫＬＲＨＡＥＳＶＧＤＧＥＲＶＳＲＳＲＥＫＨＡＬＬＥＧＲＴＫＥＬＧＹＴＶＫＫＨＬＱＤＬＳＧＲＩＳＲＡＲＨ（配列番号６）：ＲＨ構築物３
他の好ましい本発明のＲＡＰポリペプチドは、ＲＨ構築物３である。ＲＨ構築物３（配列番号６）は、配列番号５の配列を含む（したがって、配列番号４の配列も含む）ＲＡＰの８４個のアミノ酸の断片である。ＲＨ構築物３は、２つのα−へリックスを有するＲＡＰＤ３ドメインのほとんどを含んでいる。ＬＤＬＲと相互作用するために必要な残基を含む、ＲＨ構築物２ポリペプチドのα−へリックスに加えて、ＲＨ構築物３は、ＬＤＬＲと相互作用し、錯体を安定化するＲ２９６を含む第２のα−へリックスを含む。
【００５１】
本発明のＲＨ構築物３ポリペプチドは、配列番号４の配列の２０個以上の連続するアミノ酸、典型的には、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０または８１個のアミノ酸残基を含む。
【００５２】
その他の好ましい断片としては、ＢＢＢを通過する能力を保持しながら、配列番号６の配列のＣ−末端から１個以上のアミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個のアミノ酸を欠いたおよび／またはＮ−末端から１つ以上のアミノ酸残基、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９または６０個のアミノ酸残基を欠いた断片が挙げられ、該断片は、配列番号４の配列の連続する２０個以上のアミノ酸を有する。
【００５３】
本発明のＲＡＰポリペプチドは、配列番号６の配列の変異型も含む。ＲＨ構築物３の変異型は、典型的には配列番号６との同一性が８５％以上である、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなる。
【００５４】
フレキシブルポリペプチド
「フレキシブルポリペプチド」は、フレキシブルループを含む。本発明者らは、ＬＤＬＲのＬＡドメインと相互作用する「ＡＰ２二重結合剤モデル」の特徴を確認した（下記の実施例を参照のこと）。本発明のフレキシブルポリペプチドは、これらの特徴を有し、ＬＤＬＲのＬＡモジュールと相互作用する。
【００５５】
本発明者らは、ＬＤＬＲのＬＡドメインとの相互作用にとって「ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥ」モチーフが重要であることを確認し、本発明のフレキシブルポリペプチドは、アミノ酸配列
Ｘ１Ｘ２ＥＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥＸ１０Ｘ１１（配列番号２３）または
ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥ（配列番号２４）
を含み、ここで
Ｘ１は、好ましくは１４番目のアミノ酸と分子内疎水性相互作用を形成し、二重のクニッツ型（Kunitz-type）フォールディングを促進し、
Ｘ２は、好ましくは柔軟なループを形成する傾向が強く、
Ｅは、ＬＡモジュールのＲ１０３との分子間水素結合相互作用を促進し、
Ｘ３は、好ましくはフレキシブルループを形成する傾向が強い極性残基であり、
Ｘ４は、好ましくはフレキシブルループを形成する傾向が強い極性残基であり、
Ｘ５は、好ましくはＬＡモジュールのＶ１０６との分子間疎水性相互作用を促進し、
Ｘ６は、好ましくはＬＡモジュールのＴ１２６との分子間疎水性相互作用を促進し、
ＲＧＫＲは、ＬＡモジュールとの相互作用にとって不可欠であると考えられ、
Ｘ７は、好ましくはフレキシブルループを形成する傾向が強く、
Ｘ８は、好ましくはフレキシブルループを形成する傾向が強い極性残基であり、
Ｘ９は、好ましくはアミノ酸Ｘ１との分子内疎水性相互作用を促進して、二重のクニッツ型フォールディングを促し、
Ｋは、ＬＡモジュールとの相互作用に不可欠であると考えられるＡＰ２残基であり、
Ｄは、ＬＡモジュールのＱ１０４との分子間水素結合相互作用を促進し、
Ｅは、Ｎ−末端と分子内相互作用し、二重のクニッツ型フォールディングを促進するために不可欠であると考えられるＡＰ２残基であり、
Ｘ１０は、好ましくはフレキシブルループを形成する傾向が強い極性残基であり、
Ｘ１１は、好ましくはＬＡモジュールのＤ１１０と分子間水素結合相互作用を形成する極性残基であり、
好ましくは、Ｘ１＝Ａ、Ｆ、ＳまたはＴ、
Ｘ２＝Ｇ、Ｋ、ＲまたはＳ、
Ｘ３＝ＳまたはＴ、
Ｘ４＝ＮまたはＳ、
Ｘ５＝Ａ、ＩまたはＴ、
Ｘ６＝Ｉ、ＴまたはＶ、
Ｘ７＝Ｄ、ＥまたはＧ、
Ｘ８＝Ｓ、ＴまたはＹ、
Ｘ９＝Ｆ、ＴまたはＹ、
Ｘ１０＝ＧまたはＮ、
Ｘ１１＝ＫまたはＲである。
【００５６】
本発明のフレキシブルポリペプチドは、配列番号２４の配列および（配列番号２３の）Ｘ１Ｘ２ＥＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ１０および／またはＸ１１の１つ以上を含んでよい。本発明のフレキシブルポリペプチドは、
Ｘ２ＥＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥＸ１０Ｘ１１（配列番号２５）、
ＥＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥＸ１０Ｘ１１（配列番号２６）、
Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥＸ１０Ｘ１１（配列番号２７）
Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥＸ１０Ｘ１１（配列番号２８）
Ｘ５Ｘ６ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥＸ１０Ｘ１１（配列番号２９）
Ｘ６ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥＸ１０Ｘ１１（配列番号３０）
ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥＸ１０Ｘ１１（配列番号３１）
Ｘ１Ｘ２ＥＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥＸ１０（配列番号３２）
Ｘ２ＥＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥＸ１０（配列番号３３）
ＥＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥＸ１０（配列番号３４）
Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥＸ１０（配列番号３５）
Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥＸ１０（配列番号３６）
Ｘ５Ｘ６ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥＸ１０（配列番号３７）
Ｘ６ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥＸ１０（配列番号３８）
ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥＸ１０（配列番号３９）
Ｘ１Ｘ２ＥＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥ（配列番号４０）
Ｘ２ＥＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥ（配列番号４１）
ＥＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥ（配列番号４２）
Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥ（配列番号４３）
Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥ（配列番号４４）
Ｘ５Ｘ６ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥ（配列番号４５）
Ｘ６ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥ（配列番号４６）
ＲＧＫＲＸ７Ｘ８Ｘ９ＫＤＥ（配列番号４７）
を含んでよい。
【００５７】
より短いポリペプチドは、その製造がより経済的で簡単である。さらに、同等以上のＢＢＢ通過能力を達成する、より短いポリペプチドを使用することにより、患者へのポリペプチドの投与量を低減することが可能になる。
【００５８】
本発明のフレキシブルポリペプチドは、１００アミノ酸長より短く、典型的には９９、９８、９７、９６、９５、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１または１０アミノ酸長を有する。本発明のフレキシブルポリペプチドは、好ましくは１５〜２４、すなわち、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４アミノ酸長、より好ましくは１８〜２１アミノ酸長、すなわち、１８、１９、２０または２１アミノ酸長である。
【００５９】
最も好ましくは、本発明のフレキシブルポリペプチドは１９アミノ酸長である。
【００６０】
本発明のフレキシブルポリペプチドは、上記のフレキシブルポリペプチドの変異型も含む。本発明のフレキシブルポリペプチドは、典型的には上記のポリペプチドの１つ以上との同一性が８５％以上である、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなる。
【００６１】
好ましくは、本発明のフレキシブルポリペプチドは、配列番号７、８、９、１０または１１の配列またはその断片または変異型を含む、またはからなる。
【００６２】
好ましい本発明の剛直なポリペプチドは、配列番号７（「flex_１」）、配列番号８（「flex_２」）、配列番号９（「flex_３」）、配列番号１０（「flex_４」）または配列番号１１（「flex_５」）であり、同様にその断片および／または変異型である。
【００６３】
「flex_１」
ＴＧＥＳＮＴＶＲＧＫＲＧＳＹＫＤＥＮＲ（配列番号７）：flex_１
ある実施形態では、本発明のフレキシブルポリペプチドは、（ｉ）配列番号７の配列からなる、（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む、（ｉｉｉ）配列番号７の配列に少なくとも８５％、すなわち、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する、および／または（ｉｖ）配列番号７の配列の１０個以上の連続するアミノ酸 、すなわち、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９個の連続するアミノ酸を含む。本発明のflex_１ポリペプチドは、１００アミノ酸長より短い。
【００６４】
「flex_２」
ＦＲＥＳＮＴＩＲＧＫＲＥＴＴＫＤＥＮＲ（配列番号８）：flex_２
ある実施形態では、本発明のフレキシブルポリペプチドは、（ｉ）配列番号８の配列からなる、（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む、（ｉｉｉ）典型的には、配列番号８の配列に少なくとも８５％の同一性、好ましくは配列番号８の配列に少なくとも９１％、すなわち、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する、および／または（ｉｖ）配列番号８の配列の９個以上の連続するアミノ酸 、すなわち、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９個の連続するアミノ酸を含む。本発明のflex_２ポリペプチドは、１００アミノ酸長より短い。
【００６５】
「flex_３」
ＴＫＥＴＳＡＴＲＧＫＲＥＴＴＫＤＥＧＫ（配列番号９）：flex_３
ある実施形態では、本発明のフレキシブルポリペプチドは、（ｉ）配列番号９の配列からなる、（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む、（ｉｉｉ）典型的には、配列番号９の配列に少なくとも８５％の同一性、好ましくは配列番号９の配列に少なくとも９１％、すなわち、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する、および／または（ｉｖ）配列番号９の配列の９個以上の連続するアミノ酸 、すなわち、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９個の連続するアミノ酸を含む。本発明のflex_３ポリペプチドは、１００アミノ酸長より短い。
【００６６】
「flex_４」
ＡＲＥＴＳＩＶＲＧＫＲＤＹＦＫＤＥＧＫ（配列番号１０）：flex_４
ある実施形態では、本発明のフレキシブルポリペプチドは、（ｉ）配列番号１０の配列からなる、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む、（ｉｉｉ）配列番号７の配列に少なくとも８５％、すなわち、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する、および／または（ｉｖ）配列番号１０の配列の９個以上の連続するアミノ酸 、すなわち、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９個の連続するアミノ酸を含む。本発明のflex_４ポリペプチドは、１００アミノ酸長より短い。
【００６７】
「flex_５」
ＳＳＥＳＮＩＴＲＧＫＲＥＹＴＫＤＥＧＲ（配列番号１１）：flex_５
ある実施形態では、本発明のフレキシブルポリペプチドは、（ｉ）配列番号１１の配列からなる、（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む、（ｉｉｉ）典型的には、配列番号１１の配列に少なくとも８５％の同一性、好ましくは配列番号１１の配列に少なくとも９０％、すなわち、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する、および／または（ｉｖ）配列番号１１の配列の１０個以上の連続するアミノ酸 、すなわち、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９個の連続するアミノ酸を含む。本発明のflex_５ポリペプチドは、１００個のアミノ酸長より短い。
【００６８】
剛直なポリペプチド
本発明者らによりＢＢＢ輸送に好適であるとして同定された他のポリペプチド群も、「剛直なポリペプチド」と称する。本発明の「剛直なポリペプチド」は、その二次構造にα−へリックスを含むため、そのように命名し、その設計は共結晶化されたＲＡＰ−ＬＡ錯体に基づいて行った。本発明者らは、ＲＡＰの主要な相互作用モチーフを同定し（後述の実施例に記載）、次いで該モチーフを分析し、ＢＢＢを通過できるポリペプチドをさらに提供する。本発明の剛直なポリペプチドは、非常に短く、その製造がより経済的で簡単であるので、全長ＲＡＰに対する改良を意味する。さらに、同等以上のＢＢＢ通過能力を達成する、より短いポリペプチドを使用することにより、患者へのポリペプチドの投与量を低減することが可能になる。
【００６９】
本発明の剛直なポリペプチドは、コンセンサス配列
（Ｋ／Ｒ）Ａ（Ａ／Ｅ／Ｑ）ＫＡ（Ａ／Ｅ／Ｑ）Ａ（Ｋ／Ｒ）
を有するアミノ酸配列を含む、または、からなる。
【００７０】
好ましくは、本発明の剛直なポリペプチドは、コンセンサス配列
ＧＤ（Ａ／Ｅ）α（Ｋ／Ｒ）Ａ（Ａ／Ｅ／Ｑ）ＫＡ（Ａ／Ｅ／Ｑ）Ａ（Ｋ／Ｒ）ＡＸβＧＹ
を有するアミノ酸配列を含む、または、からなる。
ここで、好ましくは、αは１〜１０であり、βは１〜２５である。
【００７１】
本発明の剛直なポリペプチドは、１００アミノ酸長より短く、典型的には９９、９８、９７、９６、９５、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１または１０アミノ酸長である。本発明の剛直なポリペプチドは、好ましくは１０〜４５アミノ酸長、すなわち、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４または４５アミノ酸長である。
【００７２】
本発明の剛直なポリペプチド、上記の剛直なポリペプチドの変異型も含む。本発明の剛直なポリペプチドは、好ましくは上記の剛直なポリペプチドの１つ以上との同一性が９５％以上である、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなる。
【００７３】
好ましい本発明の剛直なポリペプチドは、配列番号１２（「rigid_ｌ」）、配列番号１３（「rigid_２」）、配列番号１４（「rigid_３」）、配列番号１５（「rigid_４」）、配列番号１６（「rigid_５」）、その断片および／または変異型からなる群から選択される。
【００７４】
「rigid_ｌ」
ＧＤＡＡＡＡＫＡＡＫＡＡＡＫＡＡＡＤＧＹ（配列番号１２）：rigid_ｌ
「rigid_ｌ」ポリペプチド（配列番号１２）は、単一ドメイン結合剤（すなわち、ＬＤＬＲの単一のＬＡモジュールと相互作用できる）として同定される。ある実施形態では、本発明の剛直なポリペプチドは、（ｉ）配列番号１２の配列からなる、（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む、（ｉｉｉ）典型的には、配列番号１２の配列に少なくとも８５％の同一性、好ましくは配列番号１２の配列に少なくとも９５％、すなわち、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する、および／または（ｉｖ）配列番号１２の配列の１６個以上の連続するアミノ酸、すなわち、１６、１７、１８、１９または２０個の連続するアミノ酸を含む。本発明のrigid_ｌポリペプチドは、１００アミノ酸長より短い（上述）。
【００７５】
「rigid_２」
ＧＤＡＡＡＡＲＡＡＫＡＡＡＲＡＡＡＤＧＹ（配列番号１３）：rigid_２
「rigid_２」ポリペプチド（配列番号１３）は、単一ドメイン結合剤として同定される。ある実施形態では、本発明の剛直なポリペプチドは、（ｉ）配列番号１３の配列からなる、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む、（ｉｉｉ）典型的には、配列番号１３の配列に少なくとも８５％の同一性、好ましくは配列番号１３の配列に少なくとも９５％、すなわち、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する、および／または（ｉｖ）配列番号１３の配列の１１個以上の連続するアミノ酸、すなわち、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の連続するアミノ酸を含む。本発明のrigid_２ポリペプチドは、１００アミノ酸長より短い（上述）。
【００７６】
「rigid_３」
ＧＤＡＡＡＡＫＡＡＫＡＡＡＫＡＡＡＡＡＡＫＡＡＫＡＡＡＫＡＡＡＤＧＹ（配列番号１４）：rigid_３
「rigid_３」ポリペプチド（配列番号１４）は、二重ドメイン結合剤（すなわち、ＬＤＬＲの２つのＬＡモジュールと同時に相互作用できる）として同定される。ある実施形態では、本発明の剛直なポリペプチドは、（ｉ）配列番号１４の配列からなる、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む、（ｉｉｉ）配列番号１４の配列に少なくとも８５％、すなわち、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する、および／または（ｉｖ）配列番号１４の配列の７個以上の連続するアミノ酸、すなわち、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４個の連続するアミノ酸を含む。本発明の剛直３ポリペプチドは、１００アミノ酸長より短い（上述）。
【００７７】
「rigid_４」
ＧＤＡＡＥＡＫＡＥＫＡＥＡＫＡＥＡＡＥＡＫＡＥＫＡＥＡＫＡＡＡＥＧＹ（配列番号１５）：rigid_４
「rigid_４」ポリペプチド（配列番号１５）は、二重ドメイン結合剤として同定される。ある実施形態では、発明の剛直なポリペプチドは、（ｉ）配列番号１５の配列からなる、（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む、（ｉｉｉ）配列番号１５の配列に少なくとも８５％、すなわち、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する、および／または（ｉｖ）配列番号１５の配列の７個以上の連続するアミノ酸、すなわち、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４個の連続するアミノ酸を含む。本発明のrigid_４ポリペプチドは、１００アミノ酸長より短い（上述）。
【００７８】
「rigid_５」
ＧＤＡＡＥＡＫＡＱＫＡＱＡＫＡＮＡＡＫＡＫＡＱＫＡＱＡＫＡＡＡＮＧＹ（配列番号１６）：rigid_５
「rigid_５」ポリペプチド（配列番号１６）は、二重ドメイン結合剤として同定される。ある実施形態では、発明の剛直なポリペプチドは、（ｉ）配列番号１６の配列からなる、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む、（ｉｉｉ）配列番号１６の配列に少なくとも８５％、すなわち、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する、および／または（ｉｖ）配列番号１６の配列の７個以上の連続するアミノ酸、すなわち、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４個の連続するアミノ酸を含む。本発明のrigid_５ポリペプチドは、１００アミノ酸長より短い（上述）。
【００７９】
血液脳関門通過アッセイ
本発明のポリペプチドおよび複合体はＢＢＢを通過することができる。ＢＢＢはインビボでもよく、または当技術分野で公知であるＢＢＢのエクスビボもしくはインビトロモデルでもよい。ポリペプチドまたは複合体がＢＢＢを通過できるかどうかを試験するためのアッセイもまた、当技術分野で周知である。
【００８０】
当業者には、脳由来の細胞を使用する適切なインビトロＢＢＢモデルには、例えば、（ｉ）単離脳毛細血管、（ｉｉ）一次または低継代脳毛細血管内皮細胞培養物、（ｉｉｉ）ウシ脳内皮細胞培養物（bovine brain endhothelical cell culture：ＢＢＥＣ）、および（ｉｖ）不死化脳内皮細胞、例えば、ＲＢＥ４細胞株、ＲＢＥＣ１細胞株またはＴＲ−ＢＢＢ１３細胞株、があることが十分に分かっているであろう。
【００８１】
ＢＢＢのモデルとして有用であることが本技術分野において知られている、脳以外の由来である細胞を使用するインビトロＢＢＢモデルには、例えば、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（Madin-Darby canine kidney：ＭＤＣＫ）細胞やＣａＣｏ−２細胞がある。
【００８２】
ＢＢＢのインビトロモデルには、（ｉ）動物の総頸動脈に試験化合物と放射標識した参照化合物とを注射し、注射から数秒後に脳を分析する、頸動脈注入技術、（ｉｉ）脳の頸動脈潅流を長い実験期間行った後、脳内の薬物濃度をサンプル抽出することを有する、インサイチュ潅流技術、（ｉｉｉ）カニューレを大腿静脈または尾静脈に挿入し、試験化合物と血漿量マーカーとを注入し、種々の時点で動脈血を採取する、静脈注射技術、および（ｉｖ）生理溶液を潅流する透析線維を脳に埋め込み、脳間質液を直接サンプル抽出することを有し、脳間質液に入った化合物が生理溶液中に浸透し、その化合物を適当な技術（ＨＰＬＣやキャピラリー電気泳動）により分析することを有する、脳内微小透析がある。
【００８３】
したがって、対象となる化合物が、診断に使用可能な、または生理学的に有意な量において血液脳関門を通過できるか否かを決定することは、当業者にとって単純明快な課題である。
【００８４】
ポリペプチドまたは複合体がＢＢＢを通過できることを確認するために好適に使用できるインビトロＢＢＢ輸送アッセイの例として、ウシ脳内皮細胞培養物（bovine brain endothelial cell culture：ＢＢＥＣ）がある。ＢＢＥＣモデルでは、ウシ脳灰白質から細胞を単離し、典型的にはラット尾部コラーゲンで予めコートした表面で培養する。モデルを改良するために、ＢＢＥＣは一次星状膠細胞（典型的には、新生仔ラット由来）またはＣ６ラットグリオーマ細胞と共培養することができる。図２２は、星状膠細胞とウシ脳毛細血管内皮細胞の共培養を示す。これらの共培養アッセイは、インビボでのＢＢＢに近い類似物を提供する。Ｃｅｃｃｈｅｌｌｉら（参照文献６）は、ウシ脳毛細血管内皮細胞とラット一次星状膠細胞との共培養を有する、好ましいＢＢＥＣアッセイを記載している。このアッセイは、インビボと強い相関関係を有するインビトロとして、ＢＢＢの合理的なインビトロモデルを提供するものである。このモデル（特に、参照文献６の１６８−１７２頁に記載）および図２２の記載のように、ウシ脳内皮細胞を膜上で培養し、ラット一次星状膠細胞は培養皿の底部上で培養している。
【００８５】
図２２に示したように、培養培地は、両細胞集団で共有されるので、細胞同士は直接接触することなく、液性交換が可能である。図２２は、コラーゲンで被覆したインサート（insert）（ミリセルＣＭ、細孔径：０．４ｍｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で培養されたコンフルエントなウシ脳内皮細胞の構造を図示している。ウシ脳毛細血管内皮細胞は、小さな、密集した、重なりのない、接触阻害された細胞の単分子層を形成する。これらの培養条件において、ウシ脳毛細血管内皮細胞は、内皮（因子ＩＩＩ関連抗原、アンギオテンシン変換酵素）およびＢＢＢ機能の両者を保持する。このＢＢＢ輸送アッセイを行うためのキット（「ＣＴウシ＠ＢＢＢパック）は、Ｃｅｌｌｉａｌ（Ｌｅｎｓ、フランス：www.cellial.com）から市販されている。
【００８６】
透過性および輸送の一般的な機構は、本技術分野で公知の方法により解明することができる。参照文献６では、例えば、リンガー−ＨＥＰＥＳ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５．２ｍＭのＫＣｌ、２．２ｍＭのＣａＣｌ、０．２ｍＭのＭｇＣｌ、６ｍＭのＮａＨＣＯ、２．８ｍＭのグルコース、５ｍＭのＨＥＰＥＳ）を６ウェル（各ウェル２．５ｍＬ）プレートの下段部に添加する。その後、１つのフィルターをリンガーが入っている６ウェルプレートの最初のウェルに移動し、標識または非標識薬物を含有するリンガーを上段部に加える。薬物の添加後複数回、フィルターを６ウェルプレートの別のウェルに移動し、下段部から上段部へ継代される可能性を最小にする。インキュベーションは、３７℃のロッキングプラットフォーム上で行う。振盪することにより、細胞の単分子層表面上の水性の境界層の厚みを最小にし、脂溶性の溶質の透過性を促進する。下段部および保存溶液のそれぞれから一定量を採取し、非標識薬物をＨＰＬＣにより測定するか、標識薬物を液体シンチレーション計数器により測定することによって各試料中の薬物量を求める。透過性の計算は、Ｓｉｆｌｉｎｇｅｒ−Ｂｉｒｎｂｏｉｍら（J. Cell. Physiol., 132: 111-117、参照文献４５）の記載に基づいて行うことができる。
【００８７】
上述のアッセイまたは本技術分野で公知の他の好適なアッセイを使用して、本発明のポリペプチドおよび複合体が血液脳関門を通過できることを確認することができる。
【００８８】
ＬＤＬＲへの結合のアッセイ
本発明のポリペプチドおよび複合体を、ＬＤＬＲにそのＬＡドメインを介して結合するように設計した。ポリペプチドがＬＤＬＲのＬＡドメインに結合するか否かは、当業者に周知の標準的な手法、例えば、ＥＬＩＳＡ法や放射性リガンド結合アッセイなどの免疫測定法、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ法などの表面プラズモン共鳴アッセイ、または試験ポリペプチドの存在、不存在の両方で構造解析（例えば、Ｘ線）することにより試験することができる。典型的には、本発明のポリペプチドは、少なくともマイクロモル、例えば、少なくとも１０−６Ｍの解離定数Ｋｄ、好ましくはナノモル、例えば、少なくとも１０−９ＭのＫｄでＬＤＬＲのＬＡドメインに結合する。
【００８９】
ポリペプチドまたは複合体がＬＤＬＲに結合することによってＢＢＢを通過するかどうかを試験する競合アッセイにおいては、抗−ＬＤＬＲ抗体を使用してもよい。抗−ＬＤＬＲ抗体は、ＬＤＬＲに結合するポリペプチドおよび複合体とＬＤＬＲへの結合を競合し、ＬＤＬＲに結合しＢＢＢを通過するポリペプチドまたは複合体の量を下げる。したがって、上述のように、（受容体への結合を妨げる）抗−ＬＤＬＲ抗体の存在または非存在下でＢＢＢ輸送アッセイを行い、そのＢＢＢの透過性をペプチドおよび複合体と比較することにより、ＬＤＬＲを介するＢＢＢの通過を決定することができる。抗−ＬＤＬＲ抗体の存在下にＢＢＢの通過が低減することは、該ポリペプチドまたは複合体がＬＤＬＲにより仲介されてＢＢＢを通過することを示す。
【００９０】
グリオーマ細胞は、その表面上にＬＲＰ１（ＬＤＬＲ）受容体を過剰発現することが報告されており、このことは、グリオーマ細胞（Ｕ８７ＭＧ）をアレクサ（Ａｌｅｘａ）４８８で標識したアブカム（ａｂｃａｍ）ＬＲＰ１抗体（５００倍希釈）に接触させることにより確認されている。コロケーションは、ＤＡＰＩを使用して写真を撮ることにより行った。これは共焦点顕微鏡およびウシ内皮細胞（ＢＢＢキット）を使用して再現することができる。したがって、グリオーマ細胞は、ＬＲＰ１を発現し、グリオーマ細胞を含むインビトロＢＢＢモデル、例えば、グリオーマ細胞と共培養されたＢＢＥＣを、（上述のように）競合アッセイに使用して、ポリペプチドまたは複合体がＬＤＬＲに結合してＢＢＢを通過するかどうかを確認してよい。
【００９１】
本発明のポリペプチド 
ポリペプチドは、ペプチド結合により結合している２つ以上のアミノ酸残基を含む。用語「ポリペプチド」は、用語「ペプチド」および「タンパク質」と同義に使用される。
【００９２】
本発明のポリペプチドは、天然型、融合型、グリコシル化型、非グリコシル化型、脂質付加型、非脂質付加型、リン酸化型、非リン酸化型、ミリストイル化型、非ミリストイル化型、単量体型、多量体型、粒子状、変性型など、種々の形をとることができる。
【００９３】
本発明のポリペプチドは、組換え発現、細胞培養物からの精製、化学的合成などの様々な方法により調製できる。特に、ハイブリッドおよび融合ポリペプチドには、組換え発現したポリペプチドが好ましい。
【００９４】
本発明のポリペプチドは、精製または実質的に精製された形、すなわち、他のポリペプチド、例えば、天然に存在するポリペプチド、特に宿主細胞由来の他のポリペプチドを実質的に含有しない形で提供することができ、一般的には少なくとも約５０％（重量）、通常は少なくとも約９０％の純度、すなわち、組成物の約５０％未満、より好ましくは約１０％未満（例えば、５％）が、他の発現リペプチドからなる。このように、組成物中のポリペプチドは、該ポリペプチド分子を発現する生物全体から分離される。
【００９５】
本発明のポリペプチドは、典型的には単離または精製される。
【００９６】
用語「ポリペプチド」は、あらゆる長さのアミノ酸重合体を指す。重合体は、鎖状でも分岐状でもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸により中断されてもよい。「ポリペプチド」という用語はまた、天然にまたは、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または標識成分の接合などのその他の操作や修飾などの介在により修飾されたアミノ酸重合体も包含する。さらに、本技術分野で公知の他の修飾物と同様に、例えば、（非天然型のアミノ酸などを含む）アミノ酸の１つ以上のアナログを含むポリペプチドも、上記ポリペプチドに含まれる。ポリペプチドは、単一の鎖または会合鎖として生じ得る。
【００９７】
本発明のポリペプチドの変異型は、好ましくはポリペプチ配列への個々の置換、欠失または付加を有し、アミノ酸を化学的に類似のアミノ酸で置換する結果となる。機能的に類似のアミノ酸を示す表は、本技術分野で周知である。
【００９８】
複合体
１つの側面において、本発明は、薬剤に結合した本発明のポリペプチド（すなわち、「レギュロンポリペプチド」、「ＲＡＰポリペプチド」、「フレキシブルポリペプチド」または「剛直なポリペプチド」、例えば、配列番号２〜１６のいずれかを含む）を提供する。この薬剤に結合したポリペプチドは、本技術分野における通例の用語である複合体と称される。本発明の複合体は、ＢＢＢを通過できる。典型的には、該薬剤は診断や治療に使用される薬剤のように、ＢＢＢを通って輸送される薬剤である。
【００９９】
上記薬剤は、典型的には治療薬または診断薬である。
【０１００】
上記薬剤は、薬物、ポリペプチド、酵素、抗生物質、抗がん剤、放射性薬剤、抗体、細胞毒素、検出可能な標識または抗血管新生化合物であってもよい。
【０１０１】
ある実施形態では、薬剤は異種ポリペプチドである。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドと他のポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。当業者には、本発明のポリペプチドがより長いポリペプチドの断片である場合、「異種タンパク質」は該長いポリペプチドの残りの部分の配列ではないことが分かっているであろう。
【０１０２】
ある実施形態では、薬剤は、治療薬および／または診断薬の媒介物として働くナノ粒子を含む、すなわちその一部である。本発明のポリペプチドは、典型的にはナノ粒子の表面に結合している。好ましくは、ナノ粒子は生分解性である。治療薬または診断薬は、典型的にはナノ粒子マトリックスに溶解、封入、カプセル化、または付着している。生分解性のナノ粒子、特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性重合体でコートされているナノ粒子は、長期にわたって循環するので、薬物送達手段として有用であり、送達のための特定の部位を標的にしてもよい（Mohanraj & Chen, Trop. J. Pharm. Res., 5, 561-573, 2006）。ナノ粒子を放出媒介物として使用する利点は、多種多様である。ナノ粒子の粒子サイズおよび表面特性を、浸透移行した治療または診断薬を受動的および能動的の両方の薬物標的化するように容易にコントロールできる。特に、ナノ粒子は輸送中および局在化部位で治療薬の放出を制御および維持し、治療薬の臓器分布および続く治療薬の排除を変更し、他の臓器との相互作用を最小にすることによって、治療効果を高め、副作用を低減する。制御された放出および粒子分解特性は、マトリックス成分の選択により容易に調節できる。治療薬または診断薬の仕事量は比較的高く、治療薬または診断薬は化学反応を要することなくシステムに組み込まれる。これは治療薬または診断薬の活性を留保するために非常に重要な因子である。
【０１０３】
一実施形態では、ナノ粒子は、同時係属中の出願ＰＣＴ／ＩＢ２０１２／０５２３２０に記載のようなナノ粒子であり、該ナノ粒子はブロック共重合体および任意の１つ以上の治療薬または診断薬を含む。ここで、
（ｉ）ブロック共重合体はブロックＡおよびＤを含み、
（ｉｉ）ブロックＡは、単量体ユニットＢおよびＣを含む第１の重合体からなり、ユニットＢは炭素数３０以下の脂肪族ジカルボン酸であり、ユニットＣはジヒドロキシまたはジアミノ単量体であり、
（ｉｉｉ）ブロックＤは、ヒドロキシル価１０以上のエステルまたはエーテル結合を有する炭化水素鎖を含む第２の重合体からなる。
【０１０４】
治療または診断薬は、ナノ粒子内またはナノ粒子の表面上に存在し得る。治療または診断薬とナノ粒子間の相互作用は、典型的には非共有、例えば、水素結合、静電相互作用または物理的カプセル化である。しかし、他の実施形態では、治療または診断薬とナノ粒子は共有結合またはリンカーにより結合されている。
【０１０５】
ある実施形態では、本発明は、１つ以上の薬剤に結合した本発明のポリペプチドの多量体を提供する。
【０１０６】
複合体は、典型的には、治療または診断に使用可能な、または生理学的に有意な量である有効濃度でＢＢＢを通過することができる。要求される治療薬または診断薬の濃度は、薬剤、診断または治療される対象および状態に依存し、当業者であれば容易に決定できる。
【０１０７】
典型的には、本発明の複合体は、本発明のポリペプチドのＢＢＢを通過する能力を保持する。すなわち、該複合体は、薬剤と結合する前の本発明のポリペプチドのＢＢＢを通過する能力の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％を有する。ＢＢＢを通過する能力は、上述のアッセイを含む、好適なＢＢＢ輸送アッセイのいずれを使って評価してもよい。
【０１０８】
薬剤が治療薬である複合体
一実施例では、本発明のポリペプチドを結合する薬剤は、治療薬である。該治療薬は、典型的には薬物である。
【０１０９】
治療薬は、特定の実施形態では、典型的には１０００ダルトン未満の分子量を有する小分子の薬物である。他の実施形態では、治療薬は、抗体または抗体断片、インターロイキン、インターフェロン、または他のタンパク質などの「生物製剤」である。
【０１１０】
一実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドおよび異種（治療）ポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。
【０１１１】
典型的な治療薬は、（ｉ）マイクロチューブリン阻害剤、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、またはＤＮＡ挿入剤として機能する、化学療法剤、（ｉｉ）酵素的に機能する、タンパク毒素、（ｉｉｉ）ラジオアイソトープ、（ｉｖ）抗生物質、（ｖ）鎮痛剤、（ｖｉ）抗精神病薬および（ｖｉｉ）抗うつ剤を含む。ＣＮＳ内、より好ましくは脳内で有効な治療薬が好ましい。これらの治療薬には、（ｉ）抗うつ剤、抗精神病薬、興奮剤、抗不安剤および抑制剤を含む、向精神剤、および（ｉｉ）脳新生物、例えば、脳腫瘍を治療するための抗腫瘍薬が含まれる。
【０１１２】
薬剤が診断薬である複合体
一実施形態では、本発明のポリペプチドが結合する薬剤は、診断薬である。診断薬は、疾患、障害、状態または病状の存在または程度の決定に使用できる、好ましくは神経疾患が診断される薬剤である。典型的な診断薬は、Ｘ線造影剤、放射性同位元素、標識および染料である。
【０１１３】
診断薬は、典型的には色素、化学発光色素、放射線造影剤、金属キレート錯体、蛍光標識や酵素基質標識などの標識、抗体またはその抗体断片を含む、または、からなる。
【０１１４】
ここで使用される用語「標識」は、本発明のポリペプチドに付着できる薬剤を指し、（ｉ）検出可能なシグナルを提供する、（ｉｉ）第２の標識と相互作用して、第１または第２の標識により提供された検出可能なシグナル、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer：ＦＲＥＴ）を変化させる、（ｉｉｉ）抗原またはリガンドとの相互作用を安定化するか、結合親和性を高める、（ｉｖ）電気泳動移動度などの移動性、または細胞透過性に、電荷、疎水性、形状または他の物理的パラメーターにより影響を及ぼす、または（ｖ）捕捉部分を提供して、リガンド親和性、抗体／抗原結合、またはイオン錯体生成を調節するように機能する。
【０１１５】
ある実施形態では、診断薬は異種ポリペプチドであり、例えば、本発明は、本発明のポリペプチドと異種の（診断）ポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。異種ポリペプチドは標識されていてよい。異種ポリペプチドは、疾患病状に特徴的な変化したタンパク質などの標的に選択的に結合できる抗体、抗体断片、受容体または他のポリペプチドであってよい。例えば、アミロイド斑に選択的に結合する標識抗体または断片は、アルツハイマー病の診断に使用することができ、腫瘍マーカーに選択的に結合する標識抗体または断片は、腫瘍の存在の診断に使用することができた。
【０１１６】
本発明のポリペプチドの薬剤への結合
本発明のポリペプチドは、本技術分野で公知の好適な方法により薬剤に結合、すなわち、複合体を形成することができる。典型的には、結合は化学的結合により形成するか、（薬剤がポリペプチドの場合）本発明のポリペプチドと薬剤とを含む融合タンパク質の発現により形成する。
【０１１７】
ある実施形態では、本発明のポリペプチドは「リンカー」を介して薬剤との複合体を形成する。リンカーは、少なくとも２つの反応部位を有する。リンカーの一方の反応部位がポリペプチドの残基に結合し、他方の反応部位が薬剤に結合する。リンカーは、１つ以上の薬剤を本発明のポリペプチドにつなぐために使用できる二官能性または多官能性成分であって、複合体を形成する。複合体は、薬剤および本発明のポリペプチドに結合するための反応機能性を有するリンカーを使用して簡便に調製することができる。ある実施形態では、例えば、複合体は本発明のポリペプチドと異種タンパク質（例えば、薬剤）を有し、リンカーは、本発明のポリペプチドのＣ−末端および薬剤のＮ−末端に位置する、またはその逆の末端に位置する別のポリペプチド配列であることもできる。そのような場合には、複合体は、本発明のポリペプチド、異種タンパク質（例えば、薬剤）およびポリペプチドリンカーをハイブリッドまたは融合タンパク質として発現させて容易に調製することができる。
【０１１８】
他の実施形態では、本発明のポリペプチドを、薬剤に直接結合させる（例えば、本発明のポリペプチドは、リンカーを介さずに薬剤に結合される）。
【０１１９】
ある実施形態では、薬剤は異種ポリペプチドである。そのような場合には、本発明のポリペプチドは、典型的にはペプチド結合により薬剤に結合される。ペプチド結合は、例えば、ポリペプチド化学の分野において周知である、液相合成法（E. Schroder and K. Luibke, "The polypeptides", volume 1, pp. 76-136, 1965, Academic Press参照）に従って、調製することができる。
【０１２０】
本発明のポリペプチドと異種ポリペプチド（および任意のポリペプチドリンカー）間のペプチド結合は、ハイブリッドまたは融合ポリペプチドとして複合体を発現することにより形成してもよい。
【０１２１】
本発明のポリペプチドおよび異種ポリペプチドである薬剤を有する複合体は、式：ＮＨ２−Ｆ−Ａ−｛−Ｘ−Ｌ−｝ｎ−Ｂ−Ｇ−ＣＯＯＨにより表される。式中、Ｘは本発明のポリペプチドのアミノ酸配列であり、Ｌは任意のリンカーアミノ酸配列であり、Ａは任意のアミノ酸配列であり、Ｂは任意のアミノ酸配列であり、Ｆは薬剤をコードしている任意のアミノ酸配列であり、Ｇは薬剤をコードしている任意のアミノ酸配列であり、ｎは１以上の整数（例えば、２、３、４、５、６）である。通常、ｎは１、２または３である。異種ポリペプチドである薬剤を含む本発明の複合体は、Ｆおよび／またはＧを有する。ＦおよびＧは同じ薬剤であることも異なる薬剤であることも可能である。
【０１２２】
各ｎの｛−Ｘ−Ｌ−｝の例に対して、リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は存在しても存在しなくてもよい。例えば、ｎが２の場合、ハイブリッドは、・・・Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２・・・、・・・Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２・・・、・・・Ｘ１−Ｘ２−Ｌ２・・・などでよい。リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、典型的には短い配列（例えば、２０個以下、すなわち、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個のアミノ酸）である。その例としては、クローニングを促進する短い配列のポリペプチド、ポリグリシンリンカー（すなわち、ｎが２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上であるＧｌｙｎを含む）およびヒスチジンタグ（すなわち、ｎが３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上であるＨｉｓｎ）が挙げられる。他の好適なリンカーアミノ酸配列は、当業者にとって明らかである。有用なリンカーは、ＧＳＧＧＧＧ（配列番号１７）またはＧＳＧＳＧＧＧＧ（配列番号１８）であり、Ｇｌｙ−ＳｅｒジペプチドをＢａｍＨＩ制限部位から形成してクローニングや操作を支援し、（Ｇｌｙ）４テトラペプチドは典型的なポリグリシンリンカーである。その他の好適なリンカー、特に最終Ｌｎとして使用されるリンカーは、Ｌｅｕ−Ｇｌｕジペプチドまたは配列番号１９の配列である。ある実施形態では、例えば、ペプチド結合のみにより、Ｘが別のＸおよび／またはＢに直接結合する場合には、Ｌは存在しない。
【０１２３】
−Ａ−は、任意のＮ−末端アミノ酸配列であり、典型的には短い配列（例えば、４０個以下、すなわち、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個のアミノ酸）である。その例としては、タンパク質輸送を指示するリーダー配列やクローニングや精製を促進する短い配列のポリペプチド（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、Ｈｉｓｎ（ｎが３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上であるＨｉｓｎ））が挙げられる。その他の好適なＮ−末端アミノ酸配列は、当業者にとって明らかである。Ｘ１がそのＮ−末端メチオニンを欠いている場合には、−Ａ−は、好ましくはＮ−末端メチオニン、例えばＭｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒまたは単一のＭｅｔ残基を有するオリゴペプチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８個のアミノ酸）である。
【０１２４】
−Ｂ−は、任意のＣ−末端アミノ酸配列であり、典型的には短い配列（例えば、４０個以下のアミノ酸、すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）である。その例としては、タンパク質輸送を指示する配列、クローニングや精製を促進する短い配列のポリペプチド（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、Ｈｉｓｎ（ｎが３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上であるＨｉｓｎ））、タンパク質安定性を促進する配列が挙げられる。その他の好適なＣ−末端アミノ酸配列は、当業者にとって明らかである。
【０１２５】
ある実施形態では、薬剤は、ＢＢＢを通過した後、本発明のポリペプチドから遊離される。遊離は、脳内で酵素活性、または脳内の生理化学的相違に応じて達成されてよい。
【０１２６】
本発明のポリペプチドの作製
一実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドおよび複合体を作製する方法を提供し、該方法は、本発明のポリペプチドおよび複合体をコードする核酸で形質転換された宿主細胞を、ポリペプチドの発現を誘導する条件下に培養する工程を有する。
【０１２７】
本発明は、発現に異種宿主を使用してもよい。異種宿主は、原核生物（例えば、バクテリア）または真核生物である。大腸菌でもよいが、他の好適な宿主、例えば、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Brevibacillus choshinensis）、枯草菌、コレラ菌、腸チフス菌、ネズミチフス菌、ナイセリア・ラクタミカ（Neisseria lactamica）、ナイセリア・シネレア（Neisseria cinerea）、抗酸菌（例えば、結核菌）、酵母であってもよい。コードされているアミノ酸に影響することなく、そのような宿主での発現効率を最適化するためにコドンを変えることは、有益なことが多い。
【０１２８】
用語「組換え宿主細胞」（または、単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入された細胞を指す。当然のことであるが、そのような用語は特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代も指している。用語「操作可能に結合」は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）部分間の機能的関係を意味する。典型的には、転写制御配列と転写配列との機能的関係を指す。例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列が、適当な宿主細胞または他の発現システムにおいてコード配列の転写を刺激または調整するならば、コード配列に操作可能に結合されている。一般的に、転写配列に操作可能に結合されたプロモーター転写制御配列は、転写配列に物理的に隣接する、すなわち、シス作用性である。しかし、エンハンサーなどのある種の転写制御配列は、その転写を促進するコード配列に物理的に隣接、またはごく接近して位置する必要がない。
【０１２９】
本発明はまた、本発明のポリペプチドまたは複合体を化学的に合成する工程を有する、該ポリペプチドまたは複合体を作製する方法を提供する。本発明のポリペプチドおよび複合体は、当業者に公知の有機化学反応、条件および試薬を使用して、いくつかの経路により調製されてよい。該経路は、（１）修飾ポリペプチドのシステイン基がリンカーと反応し、共有結合を介してポリペプチドリンカー中間体を形成した後、活性化薬剤と反応する、および（２）該薬剤の求核基がリンカーと反応し、共有結合を介して薬剤−リンカー中間体を形成した後、修飾ポリペプチドのシステイン基と反応する、ことを含む。結合法（１）および（２）は、本発明の複合体を調製するための種々の修飾ポリペプチド、薬剤およびリンカーとともに用いてもよい。
【０１３０】
ポリペプチドおよび複合体を含む医薬組成物
他の側面において、本発明は、本発明の１つ以上のポリペプチドおよび／または複合体を含み、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に製剤された組成物、例えば、医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、併用治療における投与、すなわち、他の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。例えば、併用治療は、少なくとも１つの他の薬物に結合した本発明の複合体を含んでよい。
【０１３１】
ここで使用されているように、「薬学的に許容される担体」には、生理学的に適合性のいかなる、そして全ての溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌抗かび剤、等張性吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、担体は、（例えば、注射または点滴による）静脈内、筋内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与に適している。
【０１３２】
医薬組成物は、製造および貯蔵条件下において無菌かつ安定であることが好ましい。
【０１３３】
組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソームまたはその他の高薬物濃度に適するように整えられた構造として製剤することができる。担体は、例えば、水、エタノール、多価アルコール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの好適な混合物を含む溶媒または分散媒であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤の使用、分散液の場合における必要とされる粒子サイズの維持、界面活性剤の使用により維持可能である。多くの場合、組成物は、等張剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール類、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩やゲラチンを組成物に含ませることによって実現できる。
【０１３４】
投与の経路によっては、ポリペプチドまたは複合体を、活性化、特に投与後に活性化することを防ぐための物質で被覆してもよい。
【０１３５】
本発明の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される塩を含んでいてよい。「薬学的に許容される塩」とは、親化合物の所望の生物活性を保持し、望ましくない毒性を与えない塩を指す（例えば、Berge, S.M.ら、(1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19参照）。そのような塩の例は、本技術分野において公知である。
【０１３６】
浸透圧を調整するために、ナトリウム塩などの生理学塩を含んでいてもよい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、１〜２０ｍｇ／ｍＬ、例えば、約１０±２ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌが存在してよい。存在してもよい他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが含まれる。
【０１３７】
組成物のモル浸透圧濃度は、一般的に２００ｍＯｓｍ／ｋｇから４００ｍＯｓｍ／ｋｇであり、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、より好ましくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内である。
【０１３８】
組成物は、１つ以上の緩衝液を含んでいてよい。典型的な緩衝液には、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液（特に、水酸化アルミニウム補助剤と併用）、クエン酸緩衝液がある。緩衝液は、典型的には５〜２０ｍＭの範囲で含まれる。
【０１３９】
組成物のｐＨは、一般的に５から８．１であり、より典型的には６から８、例えば６．５〜７．５または７．０〜７．８である。
【０１４０】
組成物は、典型的にはグルテンを含まない。
【０１４１】
本発明の医薬組成物はまた、薬学的に許容される抗酸化剤を含んでいてよい。薬学的に許容される抗酸化剤としては、（１）アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤、（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤、および（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤が挙げられる。
【０１４２】
組成物は、温度保護剤を含んでよい。組成物の氷点を下げるために、例えば、氷点を０℃より低くするために液体温度保護剤を添加してもよい。それにより、組成物を０℃未満かつ氷点より高い温度で貯蔵し、熱による化学変化を避けることができる。温度保護剤はまた、凍結融解後の無機塩補助剤を凝集または沈殿から保護しながら、組成物を凍結させることができる。さらに温度上昇、例えば、４０℃より高い温度でも組成物を保護することがある。好適な温度保護剤は、ヒトに投与しても安全であり、水に容易に混和または溶解し、組成物中の他の成分を損なわない必要がある。その例として、グリセリン、プロピレングリコールおよび／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。好ましいＰＥＧは、２００〜２００００Ｄａの範囲に平均分子量を有する。好ましい実施形態では、ポリエチレングリコールは、約３００Ｄａ（ＰＥＧ−３００）の平均分子量を有することができる。
【０１４３】
微生物の混入の防止は、殺菌処理および種々の抗菌抗かび剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸など、の添加の両方を行うことによって確かなものにしてもよい。また、糖類や塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に添加することが望ましい。
【０１４４】
ポリペプチドおよび複合体は、異なる種類の賦形剤の組合せを用いて製剤することにより安定化してもよい。異なる種類の賦形剤としては、例えば、（１）二糖類（例えば、ショ糖やトレハロース）または多価アルコール（例えば、ソルビトールやマンニトール）は、優先的な排除により安定化剤として機能するとともに、凍結乾燥中に抗凍結剤としても機能することができる、（２）表面活性剤（例えば、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔ８０やＰｏｌｙｓｏｒｂａｔ２０）は、液体／氷、液体／物質表面および／または液体／空気インターフェースなどのインターフェース上のタンパク質の相互作用を最小にするように機能し、（３）緩衝液（例えば、リン酸、クエン酸およびヒスチジン緩衝液）は、製剤ｐＨを制御および維持する。したがって、本発明の方法に加えて、二糖類、多価アルコール、界面活性剤および緩衝液を、本発明のポリペプチドおよび複合体をさらに安定化し、例えば、凝集を防止するために使用してもよい。
【０１４５】
無菌の注射可能な溶液は、必要な量の活性化合物を、ここに挙げた成分の１つまたはその組合せとともに適切な溶媒に添加し、必要に応じ、精密濾過を行うことにより調製することができる。一般的には、活性化合物を、塩基性分散媒および上記成分の中から選択される必要な成分を含有する無菌媒体に添加することにより、分散液を調製する。無菌の注射可能な溶液の調製に無菌の粉体を使用する場合には、予め無菌濾過した溶液から、活性成分とその他の所望により追加された成分の粉体を取得する、真空乾燥および冷凍乾燥（凍結乾燥）が、好ましい調製方法である。
【０１４６】
本発明のポリペプチドに結合でき、単回投与形態を作製する薬剤の量は、治療される対象者および投与の特定の状態によって異なるが、典型的には、治療効果をもたらす量である。一般的に、１００％の内、活性成分は約０．０１％から約９９％の範囲であり、好ましくは約０．１％から約７０％、特に好ましくは薬学的に許容される担体と結合したポリペプチドまたは複合体の約１％から約３０％である。
【０１４７】
医学的使用と治療方法
本発明のポリペプチドおよび複合体は、治療において有用である。特に、治療薬の脳への送達に有用である。治療すべき疾患は、本発明のポリペプチドにより輸送される治療薬に依存するが、脳の疾患が好ましい。したがって、治療できる疾患としては、神経疾患、すなわち、脳腫瘍、脳転移、統合失調症、てんかん、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、脳卒中および／またはＢＢＢの機能不全に関連する疾患が挙げられる。
【０１４８】
投与量および投与
投与計画は、最適な所望の反応（例えば、治療反応）が得られるように調整される。例えば、単回ボーラス投与でもよく、時間を掛けて複数回に分けて投与してもよく、投与量を治療的状況の緊急性の兆候に比例して減量または増量してもよい。投与の容易さおよび投薬量の均一性にとって、単位剤形の非経口組成物を製剤することは特に有利である。ここで使用される単位剤形は、治療対象に対する単一剤形に適した物理的に個々の単位を指し、各単位は必要とされる医薬用担体と共に、所望の治療効果を与える所定量のポリペプチドまたは複合体を含む。本発明の単位剤形の仕様は、（ａ）ポリペプチドまたは複合体の独特の特徴および達成される特定の治療効果、および（ｂ）個々の感受性において、治療のためのポリペプチドや複合体を調合する技術分野に固有の制限、により決定され、直接左右される。
【０１４９】
あるいは、本発明のポリペプチドまたは複合体は、徐放性製剤として投与することもできる。その場合には、投与回数を減らすことができる。投与量および投与回数は、患者の投与されるポリペプチドまたは複合体の半減期により変化する。投与量および投与回数は、処置が予防的なものか、治療的なものかによって変更することができる。予防的適用の場合には、比較的低用量を、比較的低頻度で、長期間にわたって投与される。患者によっては、生涯にわたって処置を受け続けることになる。治療的適法においては、比較的高用量を、比較的短い間隔で、疾患の進行が抑えられるか終了するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、投与することが求められる場合も時にはある。その後、患者は予防的な投薬計画による投与を受けることができる。
【０１５０】
本発明の医薬組成物におけるポリペプチドまたは複合体の実際の投与量レベルは、患者に対して毒性を持つことなく、特定の患者、組成物および投与方法によって、所望の治療的応答達成に有効な活性成分の量が得られるように変更してもよい。選択された投与量レベルは、様々な薬物動態学的要因に依存する。該要因としては、採用した本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、採用したポリペプチドまたは複合体（または薬剤）の排泄率、治療の継続期間、他の薬物、採用したポリペプチドまたは複合体と併用した化合物および／または物質、治療を受ける患者の年齢、性別、体重、状態、全身状態および以前の病歴、および医学分野で周知の同様の因子が挙げられる。
【０１５１】
本発明のポリペプチドまたは複合体の「治療的に有効な投与量」は、好ましくは疾患症状の重症度を低減するか、疾患症状が無い期間の頻度と持続期間を増加するか、疾患の苦痛による障害または能力低下を防止するものである。
【０１５２】
本発明の組成物は、本技術分野で公知の様々な方法の１つ以上を使用して、１つ以上の投与経路を介して投与することができる。当業者には自明であるように、投与の経路および／または方法は所望の結果により変更される。好ましい投与経路としては、頭蓋内、鼻腔内、眼球内、静脈内、筋内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄またはその他の非経口投与経路、例えば、注射または点滴、が挙げられる。ここで使用される表現「非経口投与」は、経腸および局所投与以外の投与の方法を意味し、通常は注射を意味する。注射の例としては、静脈内、筋内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨下注射および点滴が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１５３】
あるいは、本発明のポリペプチドまたは複合体は、非経口以外の経路、すなわち、局所、表皮または粘膜などの投与経路により、例えば、鼻腔内に、経口的に、経膣的に、直腸に、舌下でまたは局所的に投与することもできる。
【０１５４】
本発明のポリペプチドおよび複合体は、血液脳関門を通過することができる。したがって、ポリペプチドおよび複合体は、典型的にはＢＢＢを通過する必要がある経路を介しての投与、すなわち、末梢投与される。ＢＢＢを通過する必要がある投与に通常使用される経路は、静脈内、筋内、動脈内および腹腔内投与である。
【０１５５】
ポリペプチドまたは複合体は、急速に放出されることを防御する担体を使って、移植片、経皮パッチ、マイクロカプセル封入送達システムを含む、放出制御製剤などに調製することができる。生分解性の生体適合性重合体、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルまたはポリ乳酸を使用することができる。そのような製剤を調製する多くの方法が特許されているか、当業者に周知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson編、Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照。
【０１５６】
本発明のポリペプチド、複合体または医薬組成物は当技術分野で公知の医療用具を用いて投与できる。
【０１５７】
診断上の使用および診断方法
本発明のポリペプチドおよび複合体は診断に有用である。特に、診断薬の脳への送達に有用である。診断またはモニターすべき疾患は、本発明のポリペプチドにより輸送される診断薬に依存するが、脳の疾患が好ましい。したがって、診断またはモニターできる疾患としては、神経疾患、すなわち、脳腫瘍、脳転移、統合失調症、てんかん、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、脳卒中および／またはＢＢＢの機能不全に関連する疾患が挙げられる。
【０１５８】
核酸
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸（例えば、核酸、ベクターまたはベクター結合物の組合せ）を含む組成物を提供する。本発明はまた、本発明の複合体、特に薬剤がポリペプチドである複合体をコードする核酸（例えば、核酸、ベクターまたはベクター結合物の組合せ）を含む組成物を提供する。
【０１５９】
核酸は、発現を改良するために最適化されてよい。
【０１６０】
本発明のポリペプチドまたは複合体をコードしているヌクレオチド配列は、遺伝子コードに従って設計してもよい。したがって、本発明の構成では、そのような核酸は本明細書に開示されているポリペプチド配列の１つ以上をコードしていてよい。
【０１６１】
本発明はまた、これらの核酸とハイブリダイズできる核酸を提供する。ハイブリダイゼーション反応は、それぞれ異なる「ストリンジェント」な条件下で行うことができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを高める条件は、本技術分野において広く公知であり開示されている（例えば、［１３］の７．５２参照）。適切な条件としては、例えば、（ストリンジェンシーを高める順番で）インキュベーション時間：２５℃、３７℃、５０℃、５５℃および６８℃、緩衝液濃度：１０×ＳＳＣ、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ（ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸緩衝液）および同等の他の緩衝液システム、ホルムアミド濃度：０％、２５％、５０％および７５％、インキュベーション時間：５分から２４時間、洗浄工程：１、２回またはそれ以上、洗浄インキュベーション時間：１分、２分または１５分、および洗浄液：６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣまたは脱イオン水、が挙げられる。ハイブリダイゼーション法およびその最適化は、本技術分野において周知である［７、８、９など］。
【０１６２】
核酸は、低ストリンジェントな条件下に標的とハイブリダイズしてよく、他の実施形態では中程度のストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、好ましい実施形態では高ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする。低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の代表的な設定は、５０℃および１０×ＳＳＣである。中程度のストリンジェントな条件の代表的な設定は、５５℃および１×ＳＳＣである。高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の代表的な設定は、６８℃および０．１×ＳＳＣである。
【０１６３】
本発明には、本発明のポリペプチドまたは複合体をコードする核酸配列に相補的な配列を含む核酸も含まれる（例えば、アンチセンスまたはプローブ、またはプライマーとして使用するため）。
【０１６４】
本発明による核酸は、様々な形態をとることができる（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プライマー、プローブ、標識型など）。本発明の核酸は、環状や分枝状でもよいが、通常線状である。別に明示または要求されない限り、核酸を利用する本発明のいずれの実施形態も、二本鎖型および二本鎖を形成する２つの相補的な一本鎖型のそれぞれを利用してよい。プライマーおよびプローブは、アンチセンス核酸であるので、一般的に一本鎖である。
【０１６５】
本発明のポリペプチドまたは複合体をコードする核酸は、好ましくは精製または実質的に精製された形、すなわち、実質的に他の核酸（例えば、天然に存在する核酸）、特に宿主細胞の核酸を含有しない、一般的には少なくとも約５０％（重量）、通常は少なくとも約９０％の純度で提供される。
【０１６６】
本発明のポリペプチドまたは複合体をコードする核酸は、多くの方法、例えば、全体または部分的化学合成（例えば、ＤＮＡのアミド亜リン酸（ホスホラミダイト）合成）、核酸分解酵素（例えば、制限酵素）による長鎖核酸の消化、またはゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーからの単鎖核酸の結合（例えば、リガーゼまたはポリメラーゼを使用）、により調製されてよい。
【０１６７】
用語「核酸」は、一般的な意味において、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはそれらの類縁体を含む、任意の長さを有するヌクレオチドの多量体型を含む。核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが含まれる。また、修飾主鎖（例えば、ポリペプチド核酸（ＰＮＡ）またはホスホロチオエート（チオリン酸エステル））または修飾塩基を含むものなど、ＤＮＡまたはＲＮＡアナログを含む。したがって、本発明は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換え核酸、分枝核酸、プラスミド、ベクター、プローブ、プライマーなどを含む。本発明の核酸がＲＮＡの形をとる場合、５’キャップを有しても、有さなくてもよい。
【０１６８】
本明細書で説明されるポリペプチドまたは複合体をコードしている核酸はベクターの一部であってもよい。
【０１６９】
核酸との関係で使用される用語「相補体」または「相補的な」は、ワトソン・クリック型塩基対を指す。したがって、Ｃの相補体はＧであり、Ｇの相補体はＣであり、Ａの相補体はＴ（またはＵ）であり、Ｔ（またはＵ）の相補体はＡである。また、例えば、相補体ピリミジン（ＣまたはＴ）に対して、Ｉ（プリン体イノシン）などの塩基を使用することも可能である。
【０１７０】
本発明のポリペプチドまたは複合体をコードする核酸は、例えば、ポリペプチドを作製するために、生体試料中の核酸の検出用のハイブリダイゼーションプローブとして、該核酸のコピーを生成するために、リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成するために、一本鎖ＤＮＡプライマーまたはプローブとして、または三本鎖形成オリゴヌクレオチドとして、使用することができる。
【０１７１】
本発明は、本発明のポリペプチドまたは複合体をコードする核酸を作製する方法を提供する。核酸は一部または全てが化学的手段を用いて合成される。
【０１７２】
本発明は、本発明の複合体のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、クローニングまたは発現ベクター）およびそのようなベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【０１７３】
本明細書中で使用されているように、用語「最適化」は、ヌクレオチド配列を、産生細胞または生物、一般的にはピチア属の細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはヒト細胞などの真核生物細胞が好むコドンを用いてアミノ酸配列をコードするように変更したことを意味する。最適化したヌクレオチド配列は、出発ヌクレオチド配列（「親」配列としても知られる）により本来コードされていたアミノ酸配列を完全にまたはできるだけ多く保持するように操作される。これらの配列を他の真核生物細胞中で最適化発現させることも想定される。最適化されたヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列もまた、最適化したものと見なされる。
【０１７４】
配列の同一性
配列の比較では、典型的には１つの配列を参照配列とし、その配列に対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験および参照配列をコンピューターに入力し、配列座標を指定し、必要に応じて配列アルゴリズムプログラムパラメーターを設計する。デフォルトプログラムパラメーターを用いることができるが、別のパラメーターも設計することができる。配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性の割合を計算する。２つの配列の同一性を比較する場合、配列が連続している必要はないが、ギャップは全体的な同一性の割合を下げるペナルティを伴う。ｂｌａｓｔｎでは、初期パラメーターは、ギャップ開始ペナルティが５、ギャップ伸長ペナルティが２である。ｂｌａｓｔｐでは、初期パラメーターは、ギャップ開始ペナルティが１１、ギャップ伸長ペナルティが１である。
【０１７５】
ここで引用される配列同一性割合は、Altschulら、Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977およびAltschulら, J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990に記載のＢＬＡＳＴアルゴリズムに従って決定される。ＢＬＡＳＴ分析を行うソフトウェアは、米国立バイオテクノロジー情報センター（the National Center for Biotechnology Information）から公的に入手可能である。（ヌクレオチド配列のための）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、初期値として、１１のワード長（Ｗ）、１０の予測（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列では、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期値として、３のワード長、１０の予測（Ｅ）、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（HenikoffおよびHenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915, 1989参照）の５０のアラインメント（Ｂ）、１０の予測（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を用いる。
【０１７６】
一般
用語「アミノ酸配列」は、本明細書中で使用されているように、ここで開示されている各配列の断片、ホモログ、誘導体および変異体と同様に、それらへの言及も含めるものとする。
【０１７７】
用語「含む」は、「含める」および「からなる」を包含する。例えば、Ｘを「含む」組成物はＸのみからなるものであっても、例えば、Ｘ＋Ｙのように追加の何かを含んでいてもよい。
【０１７８】
用語「からなる」は「含み、かつ限定される」ことを意味する。
【０１７９】
用語「本質的に、〜からなる」は、組成物、方法または構造が、追加の成分、工程および／または部分を含んでもよいが、その追加の成分、工程および／または部分は、主張する組成物、方法または構造の基本的および新規の特徴を実質的に変更しない場合に限られる、ことを意味する。
【０１８０】
数値ｘについての用語「約」は、ｘ±１０％を意味する。
【０１８１】
本発明の実施は、断りが無い限り、本技術分野における化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を用いる。そのような技術は、文献中に十分に記載されている。［１０］〜［１７］を参照のこと。
【０１８２】
本発明を、以下の非限定的実施例を参照してさらに説明する。
【実施例】
【０１８３】
ＬＡ−相互作用ポリペプチドデータベースの編集
ＬＡ−相互作用ポリペプチドデータベースを編集するために、本発明者らは、ＬＤＬＲファミリーメンバーのＬＡドメインと相互作用することが知られている全てのポリペプチドについての構造情報を収集した。
【０１８４】
これらの構造データから、本発明者らは、化学成分はＬＡドメインと相互作用しなければならない、という重要な特徴を推論した。以下のＬＤＬＲファミリーメンバーが考えられた（図１参照）。
【０１８５】
１．ＬＤＬＲ（低密度リポタンパク質受容体）：全てのファミリーメンバーの基本形である。
【０１８６】
２．ＶＬＤＬＲ（超低密度リポタンパク質受容体）
３．アポＥＲ２（アポリポタンパク質Ｅ−受容体２、ＬＲＰ８としても知られている）
４．ＭＥＧＦ７（上皮増殖因子様タンパク質７、ＬＲＰ４としても知られている）
５．ＬＲＰ１（ＬＤＬ受容体関連タンパク質１、ＬＲＰとしても知られている）
６．ＬＲＰ１Ｂ（ＬＤＬ受容体関連タンパク質１Ｂ）
７．ＬＲＰ２（ＬＤＬ受容体関連タンパク質２、メガリンとしても知られている）
【０１８７】
【表１】
2016539076.tif 000002
【０１８８】
表１：ＬＤＬＲファミリーＬＡドメインの相互作用のパートナー［参照文献１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０および３１］。＊単一結合剤または二重結合剤は、リガンドが同時に相互作用するＬＡモジュールの数を表す。
【０１８９】
表１に、文献から見つけ出した各ＬＤＬＲファミリーメンバーの全ての結合パートナー（リガンド）を報告している。ＬＤＬＲファミリーメンバーのＬＡモジュールと相互作用するリガンドのグループを、ここでは「ＬＡ−相互作用ポリペプチドデータベース」と名付ける。
【０１９０】
重要な相互作用パターンの合理的説明
ＬＤＬＲファミリーＬＡドメインの相互作用パートナーとして見出された情報は、２つの部分に分けられる。一方の部分は、活性データに関し、他方の部分は構造情報に関する。文献では、比較実験条件を用いて得た活性データセットは少ないので、これらのデータを用いて予測的なモデルを構築することは、一般的には推奨されない。それにもかかわらず、本発明者らは、これらの構造データから信頼できる重要な情報を抽出かつ活用することができた。
【０１９１】
本発明者らは、これらの構造データは非常に不均質であることを見出した。すなわち、
・あるリガンドは単一のＬＡドメインのみに結合するが、他のリガンドは（結合活性効果を利用する）２つのモジュールとの相互作用を確立する。
・あるリガンド（例えば、小アンジオペップポリペプチド）は一次構造に関して互いに近接している残基と相互作用するが、他のリガンドは互いに非常に離れている残基と相互作用し、アミノ酸配列の異なる部分を構築する。
・あるリガンドは柔軟な構造領域（例えば、ループ）と相互作用するが、他のリガンドは剛直な構造領域（例えば、α−へリックス）と相互作用する。
【０１９２】
ＬＡ−相互作用ポリペプチドデータベースのリガンドは非常に不均質であることを見出すと共に、本発明者らは、驚くべきことに、全てのＬＤＬＲファミリーメンバーの全てのＬＡモジュールのフォールディングは、高度に保存されていることを見出した。例えば、本発明者らは、Ｆｉｓｈｅｒと共同研究者らが記載したように［２１］、ＬＤＬＲの２つのＬＡドメインの錯体のＬＡ４モジュールと受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）とが共結晶したことを見出した（図３参照）。各ＬＡモジュールはＮ−末端の近くにある短いβ−ヘアピン、３つのジスルフィド結合および高度保存されているカルシウム−結合部位を有する。カルシウムイオンは、高度保存されている４つの酸性残基（Ｄ１４７、Ｄ１５１、Ｄ１５７、Ｅ１５８）の側鎖および２つの主鎖カルボニル基（Ｗ１４４およびＤ１４９）による八面体配置に配位している［３２］。これらの酸性基の全てが、芳香族残基（ＬＡ４条のＷ１４４およびＬＡ３上のＦ１０５）と共に、ＲＡＰと高い親和性で結合する全てのＬＲＰ１ＬＡモジュール対に広く存在する［３３］。研究された錯体の全ての構造において、結合の必須要素は強い静電相互作用であり、正に帯電しているリシン（リガンド）と保存された酸性基の間に複数の水素結合が形成され、カルシウムイオン（受容体）の周りに負に帯電しているクラウンを形成する。さらに、受容体に保存されている芳香族残基は、Ｂｌａｃｋｌｏｗによる総説［３４］にいくつかの相互作用タンパク質パートナーとして示されているように、リシン鎖の非極性領域内の疎水性相互作用により安定化される（図４参照）。
【０１９３】
ＬＡドメインと水素結合または疎水性相互作用を形成する全てのリガンド残基の一覧を表２に示す。２つの表項目を有する構造は、２つの相互作用ドメインを有する（例えば、２ＦＣＷはＲＡＰとＬＤＬＲのＬＡ４ドメインとの間の相互作用を表し、２ＦＣＷ２はＲＡＰと同じ受容体のＬＡ３ドメインとの間の相互作用を表す）。
【０１９４】
【表２】
2016539076.tif 000003
【０１９５】
表２：ＬＡドメインと水素結合または疎水性相互作用を形成するリガンドの残基。上付きの＊が付された残基は、ＬＡモジュールの高度保存されている酸性クラウンシステムと錯体を形成するために必須のリシンである。上付きの＊＊が付された残基は、長鎖水素結合供与残基である。上付きの＾が付された残基は、受容体のＷ１４４と疎水性相互作用を形成する。上付きの！が付された残基は、Ｌ１４３と疎水性相互作用を形成する。上付きの♯が付された残基は、Ｐ１５０と疎水性相互作用を形成する。「（ｂ）」で印付けされた疎水性相互作用は主鎖原子のみに関与している。
【０１９６】
表３は、観察された最も保存されている薬理作用的特徴を図式化している。
【０１９７】
【表３】
2016539076.tif 000004
【０１９８】
表３：最も保存されている薬理作用的特徴。＊これらの残基は、基準とした２ＦＣＷに関して僅かにずれている。
２．３．ＢＢＢを通過できる公知ポリペプチドのモデリング
相互作用ポリペプチドデータベースから収集した情報に加えて、本発明者らは、ＢＢＢを通過できることが既に知られているポリペプチドについても分析を行った。特に、本発明者らは、アンジオペップとレギュロンを研究対象に選んだ。これらのポリペプチドの構造情報は入手できないので、本発明者らは、これらのポリペプチドと共に働くモデルを作成した。
【０１９９】
２００７年にＤｅｍｅｕｌｅと共同研究者らにより紹介された［１および２］アンジオペップは、現在まで、ＬＤＬＲが関与する機構によりＢＢＢを通過できるポリペプチドであるということだけが知られていた。レギュロンポリペプチドはＢＢＢを通過することが知られている。
【０２００】
アンジオペップ
アプロチニンは、ＬＲＰおよびクニッツ型ドメインを含むＬＲＰ２の６５００−Ｄａプロテアーゼインヒビターリガンドである。アンジオペップは、アプロチニンよりもトランスサイトーシス能が高い、クニッツドメイン由来ポリペプチドのファミリーである。表４は、本発明者らが報告した異なるアンジオペップのトランスサイトーシスおよび体積分布の量を示す。本発明者らは、アンジオペップ−２（ＡＰ２）の良好なトランスサイトーシスレベルと高い実質／全脳体積分布比により、最も期待できるポリペプチドとして確認した。
【０２０１】
これらのポリペプチドの分析は、まず、それらを構成する各アミノ酸について、Ｃａｉと共同研究者ら［３５］により報告された１１３の物理化学的性質を考慮して行った。その後、ポリペプチドを、以下の方法により凝集型の階層的クラスター法を用いてクラスター化した。
・各アミノ酸間の相違点を１１３次元空間における標準化ユークリッド距離として算出する。
・各ポリペプチド間の距離を同じ位置にあるアミノ酸間の距離の合計として算出する。
【０２０２】
クラスター解析の結果を表５に示す。本発明者らは、これらのポリペプチドは、３つの主要なグループ：（Ａ）アンジオペップ５および８、（Ｂ）アンジオペップ７６、７８、７９、ＡＰ２、ＡＰ１、ＡＰ５およびＡＰ７、および（Ｃ）アンジオペップ９０および９１、に分割できることを見出した。アミノ酸の物理化学的性質だけを用いて得られた、このクラスター解析結果は、トランスサイトーシスの著しい変化を反映している。すなわち、グループ（Ａ）は低いトランスサイトーシスの比率を有し、グループ（Ｂ）は中程度の値（ＡＰ１を除く。ＡＰ５とＡＰ７のデータは不明）であり、グループ（Ｃ）はトランスサイトーシスの最高値を有する。
【０２０３】
【表４】
2016539076.tif 000005
【０２０４】
表４：アンジオペップポリペプチドに対する分布容積。＊これらの値は、元の刊行物のグラフから推定した。
【０２０５】
トランスサイトーシスに対する異なるアミノ酸の効果についての更なる見識は、従来は構造解析により取得しているが、アンジオペップに対して使用できる構造情報は現段階で存在しない。したがって、本発明者らは、アプロチニンの結晶化クニッツドメインを鋳型（ＰＤＢコード２ＺＪＸ）として用いる相同性モデル法に従って、アンジオペップの仮想的な構造を構築した。アンジオペップＡＰ２を用いるアラインメントを以下に示す。相同性モデリングプログラムの機能により、最後のアミノ酸（Ｙ）のみが抜けている。
【０２０６】
【化１】
2016539076.tif 000006
【０２０７】
本発明者らは、次の理由によりアプロチニンを鋳型として選択した。
【０２０８】
・７２％の配列同一性が得られ、これは相同性モデリングにおける通常の閾値３５％より非常に高い。
・（ＬＤＬＲとの相互作用に必須である可能性を有する）２つのリシンが存在する。
・ＬＤＬＲへの結合に必須である残基は、良好に配向され露出されている可能性がある。
相同性モデリングにより得られたＡＰ２の全体的なフォールディングを図６に示す。
【０２０９】
フォールディングの予測のためのアブイニシオ法［３６、３７、３８］を用いてＡＰ２の相同性モデルを確認した。本発明者らは、このアブイニシオモデルが相同性モデルに類似のフォールディングを与えることを見出した（図７参照）。
【０２１０】
ＡＰ２に加え、他のアンギオペップも相同性モデリングを使用した場合もクニッツ様フォールディングを示す。これらの結果に基づき、本発明者らは、アンジオペップがクニッツ様フォールディングを有することを提案する。
【０２１１】
ＡＰ２−ＬＤＬＲ相互作用のモデリング
次いで、本発明者らは、ＡＰ２とＬＤＬＲとの間の相互作用をモデリングした。２つの主要な仮説、すなわち、（Ａ）ＬＤＬＲの単一ドメイン結合剤としてのＡＰ２（すなわち、錯体２ＦＣＷ、１Ｎ７Ｄおよび２ＦＹＬにおいて観察されたように、単一ＬＡドメイン結合する）および（Ｂ）二重ドメイン結合剤としてのＡＰ２（すなわち、２ＫＮＹ、１Ｖ９Ｕ、２ＫＲＹおよび３Ａ７Ｑにおいて観察されたように、２つのＬＡドメインに結合する） を考察した。全てのアラインメントは、ＬＤＬＲ−ＲＡＰ錯体構造体（ＰＤＢ２ＦＣＷ）を鋳型として用いて行われた。本発明者らは、いくつかの理由によりこれが最良の構造であると考えている。すなわち、（ｉ）結晶構造である、（ｉｉ）良好な解像度（１．２６オングストローム）を有する、（ｉｉｉ）リガンドと受容体との相互作用数が他の実験的構造より多い。
【０２１２】
単一ドメイン結合剤としてのＡＰ２
ＡＰ２の相同構造を、いくつかの方法によりＲＡＰ−ＬＤＬＲ結晶錯体のＲＡＰの重要な残基（表３参照）と厳密に（並進および回転性の動きのみ）配列を比較した。モデル１は、重ね合せた同等の残基の数が最大になっており（表５）、最も適切であると考えられる。
【０２１３】
【表５】
2016539076.tif 000007
【０２１４】
表５：ＲＡＰ−ＬＤＬＲ錯体（ＰＤＢコード２ＦＣＷ）へのＡＰ２相同性モデルの重ね合せ。評価範囲：１（不良）〜５（とても良い）。
【０２１５】
モデル１は、ＲＡＰ−ＬＤＬＲ相互作用における３つの重要な残基、すなわち、リシンとの相互作用に不可欠であるＫ２５６およびＬＤＬＲの保存されている酸性残基の水素結合の供与体として作用するＫ２５３およびＲ２９６、の重ね合せを最適化している。（＊この構造体は、ＡＰ２のＫ１５からＲＡＰのＫ２５６までとＡＰ２のＫ１０からＲＡＰのＫ２７０（他方のＬＡモジュールのＫ２５６に相当する））を使用して、二重ドメイン結合剤としてのＡＰ２を結合することによって構築された。
【０２１６】
モデル１の最小化は、配位場ＭＭＦＦ９４によりなされる［３９］。最終的に最小化された構造を図８に示す。
【０２１７】
二重ドメイン結合剤としてのＡＰ２
いくつかの実験的観察は、あるポリペプチドは、単一のモジュールよりはむしろ一対のＬＡモジュールに結合することを示している［２２、３３］。このことは、結合活性効果がＬＤＬＲファミリータンパク質へのリガンドの結合において主要な役割を果たしているということで、合理的に説明される［２１］。Ｆｉｓｈｅｒと共同研究者らにより解明された結晶構造では、個々のＬＡモジュールとＲＡＰ間の接点インターフェースが小さい（＜４００Ａ２）ので、単一のモジュールは高親和性結合を提供するには不十分であることが示唆される。
【０２１８】
これらの理由のため、本発明者らも、ＡＰ２が二重ドメイン結合剤であるかどうかを考察した。Ｋ１５（ＡＰ２）をＫ２５６（ＲＡＰ）と重ね合せ、Ｋ１０（ＡＰ２）をＫ２７０（ＲＡＰ）と重ね合せることによりＡＰ２をＲＡＰと一直線に並べた（表５のモデル６）。モデルをＭＭＦＦ９４［３９］配位場を用いて最小化し、図９に示す最終構造を得る。
【０２１９】
ＡＰ２相互作用の特徴
両モデル（単一および二重ドメイン結合剤としてのＡＰ２）において、３つの重要な残基（Ｒ８、Ｋ１０およびＲ１１）は１つのＬＡモジュールと強く相互作用し、全てのＬＤＬＲファミリーメンバーに保存されている酸性受容体と水素結合を形成する。さらに、モデル６（ＡＰ２二重ドメイン結合剤）では、Ｋ１５は他のＬＡモジュールクラウン酸性残基と水素結合を形成する。全てのこれらの残基（リシンおよびアルギニン）はＬＡドメインの数個の公知リガンドに存在する（表２）。
【０２２０】
本発明者らは、分子内水素結合が、ポリペプチドのＮ−末端残基とＥ１７の側鎖との間に形成されているかもしれないということを見出した。この相互作用は、ポリペプチドの柔軟性を制限し、ＡＰ２−ＬＡ相互作用を促進できた。これにより、ＡＰ２に関してアンジオペップ−７９の非常に低いＰ／Ｂ体積分布比を説明できた。これらの２つのポリペプチドは実際、非常に類似しているが、アンジオペップ−７９はＣ−末端から離れている２つのグルタミン酸アミノ酸を欠いている（図５参照）。同様に、本発明者らは、０．５０より大きなＰ／Ｂ体積分布比を有する全てのポリペプチドが、Ｃ−末端に酸性残基を有することを見出した。唯一の例外は、Ｐ／Ｂ比が０．４９であるアンジオペップ−９１である。予測されたアンジオペップ−２構造とＢＢＢ浸透に変化を引き起こすアミノ酸の変化との間にその他の関係は、検出されなかった。
【０２２１】
結論として、本発明者らは、アンジオペップの新規な構造モデルを提供した。ＬＡモジュールとの相互作用に重要な５つの残基を同定し、さらにアンジオペップのフォールディングの安定化に対して他の残基を同定した。
【０２２２】
これらの新たなデータにより、本発明者らは、ＬＤＬＲに結合し、ＢＢＢを通過する新規ポリペプチドを開発した。これらのポリペプチドは２つの主要グループに分けられる。（１）一方はレギュロン配列に基づいており、β−ヘアピンフォールディングを有することが期待され、（２）他方はＲＡＰに基づいており、ＬＤＬＲと相互作用する。
【０２２３】
レギュロン
目的
レギュロンペプチド（配列番号１）の存在、不存在で、本発明者らのナノ粒子が、血液脳関門（ＢＢＢ）のインビトロモデルを通過するかについて分析する。
【０２２４】
物質および方法
ＢＢＢモデル
脳毛細血管機能を研究するためのインビトロシステムを用意するために、本発明者らは、脳毛細血管内皮細胞をインサートの一方の表面上で、神経膠細胞（星状膠細胞）を他方の表面上で培養することにより、インビボＢＢＢに非常に似せた共培養の工程を開発した。内皮細胞を６ウェルプレートのフィルター上の上段部で培養し、星状膠細胞を該プレートのプラスチックの下段部で培養する。
【０２２５】
これらの条件下で、内皮細胞は、内皮マーカー（第ＶＩＩＩ因子関連抗原、非血栓形成表面、プロスタサイクリンの作製、アンジオテンシン変換酵素活性）およびＢＢＢの特徴（密着結合の存在、少量の飲小胞など）を保持する。
【０２２６】
・星状膠細胞培養
新鮮な星状膠細胞の初代培養物をＩｎｎｏｐｒｏｔ（参照番号Ｐ１０２０２）から準備した。該培養物を最初のフラスコで４８時間維持した。細胞をプレートＰ１００のＡＭ−ａ培養溶媒（Ｉｎｎｏｐｒｏｔ、参照番号１８３１）に播種した。コンフルエンスが８０％〜９０％になったら、星状膠細胞を６ウェルプレートに播種（１２５０００細胞ウェル（２ｍＬ））し、共培養物を４８〜７２時間後に確立した。
【０２２７】
・ウシ脳微小血管内皮細胞（ＢＢＭＶＥＣ細胞）
Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．から入手した内皮細胞を窒素中で凍結した。細胞を解凍し、「被覆」工程（付着因子溶液（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）に３７℃で３０分、および１μｇ／ｍＬのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）に３７℃で１０分）後のプレートＰ１００中のＢＢＭＶＥＣ用培地（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）に播種した。細胞コンフルエンスが６０％〜７０％に達したら、細胞を被覆処理後のインサート（６ウェルプレート用１．０μｍ孔、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＰＩＲＰ３０Ｒ４８）に播種した（インサートに対して１５００００〜２０００００個の細胞）。共培養物を４８〜７２時間後に確立した。
【０２２８】
・ＢＢＢモデルの確立
星状膠細胞培地を吸引し、ＢＢＭＶＥＣ培地を星状膠細胞のウェルに加えた。インサートを星状膠細胞のウェルに移動した後、内皮細胞を上段部（管腔側）に、星状膠細胞を下段部（反管腔側）に得た。
【０２２９】
・経上皮電気抵抗（transepithelial electrical resistance：ＴＥＥＲ）の測定
共培養の樹立の７２時間後に管腔部と反管腔部との間の抵抗を測定した（各測定は三回行った）。
【０２３０】
良好なＢＢＢモデル（密着結合が形成されている）では、ＴＥＥＲ値が約１５０Ω×ｃｍ２であると思われる。
【０２３１】
トランスサイトーシス実験
トランスサイトーシス実験をＴＥＥＲ値が２３０Ω×ｃｍ２である２つのＢＢＢモデルにより行い、レギュロンペプチド（配列番号１）で修飾したナノ粒子、レギュロンペプチドで修飾されていないナノ粒子、およびブランクとして細胞無しのインサート（非修飾ナノ粒子）で試験した。
【０２３２】
サンプルは、リンガー液１ｍＬに対して２５０μｇのナノ粒子を調製した。全てのサンプルを１０分間超音波処理し、１．５ｍＬのサンプルを挿入物に添加し、２．５ｍＬのリンガー液を（６ウェルプレートの）各ウェルに加えた。
【０２３３】
結果
３７℃で６０分間攪拌した後、サンプルを上段部と下段部に集め、ＮＴＡ分析により測定した。
【０２３４】
【表Ａ】
2016539076.tif 000008
【０２３５】
これらのデータを図表方式によって図２３に示す。
【０２３６】
結論
ブランク（ＢＢＢを有さないインサート）を通って、全ての非修飾粒子が関門を通過したが、良好なＢＢＢモデル（ＴＥＥＲ：２３０Ω×ｃｍ２）では、関門を通過した非修飾ナノ粒子は非常に少なかった。
【０２３７】
ペプチドで修飾したナノ粒子の場合には、ほとんど全てのナノ粒子（９５％）がＢＢＢを通過する。したがって、レギュロンペプチドはＢＢＢを通過する機構で重要な役割を果たしている。
【０２３８】
レギュロン構造体
レギュロンはＢＢＢを通過することができる。上述したように、インビトロＢＢＢモデルとしてウシ脳毛細血管内皮細胞とラット一次星状膠細胞との共培養を用いて、本発明者らは、レギュロンで修飾したナノ粒子はＢＢＢを通過できるが、非修飾ナノ粒子はＢＢＢを通過できないということを見出した。陰性コントロールはＢＢＢを通過できず、修飾ナノ粒子がＢＢＢを通過する間、ＢＢＢが保全されていたことが確認された。これらの実験データを図２３に示す。したがって、図２３はレギュロン（配列番号１）がナノ粒子を、ＢＢＢを通過させて輸送できることを示している。
【０２３９】
レギュロンは、５９個のアミノ酸（配列番号１）でできており、（１９個のアミノ酸を含む）アンジオペップより大きい。アンジオペップとレギュロンとの間に（ＢＬＡＳＴ比較法による）配列の類似性はない。さらに、レギュロンについての構造情報は知られていない。ＬＤＬＲによるレギュロンのトランスサイトーシスの可能性を検討するために、本発明者らは構造的研究を行って、レギュロンの相同性モデルを作成した。
【０２４０】
本発明者らは、レギュロンのＰ６２外被糖タンパク質（ＰＤＢコード３Ｎ４０＿Ｐ）への相同性モデリングのための最良の鋳型を見出した。該鋳型は以下に示すように、６８％の高い配列同一性を有する。
【０２４１】
【化２】
2016539076.tif 000009
【０２４２】
レギュロン相同性モデルの全体的なフォールディングを図１０に示す。本発明者らが取得した相同性モデル構造は、２つの部分に分けることができる。すなわち、（１）剛直なβ−ヘアピン構造（図１０中、円で囲まれた部分）および（２）長い組織だっていない柔軟な鎖である。
【０２４３】
本発明者らは、ＬＤＬＲとの可能な相互作用に不可欠である２つの残基（Ｋ４８およびＲ４９）が丁度、β−ヘアピンのＵターン部あることを強調する。
【０２４４】
レギュロン−ＬＤＬＲ相互作用のモデリング
ＡＰ２に関しては、本発明者らは、レギュロンとＬＤＬＲとの間の相互作用をモデリングした。この場合、本発明者らは、レギュロンとＬＤＬＲＬＡモジュールとの間の相互作用に関する利用可能な証拠は未だ存在しない、ということを強調する。重ねて、２つの主要な仮説が考慮された。すなわち、（１）ＬＤＬＲの単一ドメイン結合剤としてのレギュロン、および（２）二重ドメイン結合剤としてのレギュロンである。レギュロンの相同性モデルおよび鋳型としてのＬＤＬＲ−ＲＡＰ錯体構造体（ＰＤＢ２ＦＣＷ）を用いて、全てのアラインメントを行った。
【０２４５】
単一ドメイン結合剤としてのレギュロン
レギュロンのＬＡモジュールとの結合に対する最初の仮定は、ポリペプチドがその構造化された部分（図１０中、円で囲まれた部分）と相互作用するというものである。上述のように、この領域はβ−ヘアピン（β−鎖、Ｕターン、β−鎖）に対応し、ＬＡモジュールに他の分子を結合させるために必須であるＵターンの２つのアミノ酸（リシンおよびアルギニン）を有する。これら２つの残基の側鎖は露出され、可能な相互作用ためによく配向されている。この理由のために、（１）レギュロンＵターンリシン（Ｋ４８）を相互作用に必須のリシンＲＡＰ（Ｋ２５６）に重ね、（２）Ｕターンアルギニン（Ｒ４９）をＲＡＰの２つの異なる残基、Ｒ２９６（モデル１）とＫ２５３（モデル２）、に重ねてモデルを作成した。
【０２４６】
２つのモデルは、Ｋ４８およびＲ４９の両方がＬＡモジュールの保存されている酸性残基と水素結合を形成するので、正確に評価された（表６参照）。
【０２４７】
【表６】
2016539076.tif 000010
【０２４８】
表６：ＲＡＰ−ＬＤＬＲ錯体（ＰＤＢコード２ＦＣＷ）へのレギュロン相同性モデルの重ね合せ。評価範囲：１（不良）〜５（とても良い）。
【０２４９】
レギュロンＫ４８およびＲ４９とＬＡモジュールの重要な残基との相互作用は非常に強く、構造的にも良く適合してはいるが、本発明者らは、これら２つの残基自身による相互作用は全レギュロン（５９残基）を結合するためには不十分であると考える。この仮定は、全レギュロン表面に比較してむしろ小さい相互作用表面積（図１１）に基づいている。本発明者らは、レギュロンの柔軟なループが結合に関わっており、そのためレギュロンは二重ドメイン結合剤とみなされる、と考える。
【０２５０】
二重ドメイン結合剤としてのレギュロン
レギュロンを剛直構造として扱うと、ＡＰ２のようには、２つのＬＡモジュールと同時に相互作用することはできない。鋳型は正しい距離にある２つの必須のリシンで二重結合モデルを樹立することはできない。可能な代わりのレギュロン−ＬＡモジュール相互作用パターンをモデリングするために、本発明者らは、レギュロンを異なる断片に「切断」し、それらで部分集合モジュールを築いた。
【０２５１】
Ｋ４８およびＲ４９を含む配列から離れて（上述のように）、本発明者らは、ＬＡモジュールと相互作用できる（常にリシン／アルギニンパターンに基づく）、２つの他の主要領域を同定した。すなわち、一方はＫ２−Ｋ３モチーフを含むものであり、他方はＲ１３、Ｒ１９、Ｋ２０、Ｋ２２残基を含む。後者は、前者よりも相互作用する表面が大きいので、最も有利なものは後者である。さらに、後者は、ＡＰ２の柔軟なクニッツドメインに似ている、残基組成物および形状を有している。前述のように、重ね合せをＬＤＬＲ−ＲＡＰ錯体との重畳法により行い、次いでシステムの最小化を行った。最小化された構造では、以下のレギュロン残基：Ｒ１３、Ｄ１５、Ｋ２０がＬＡモジュールと水素結合を形成した（図１２参照）。分子動力学シミュレーションを適用する場合、Ｒ１９およびＫ２２がＬＡモジュールと水素結合を形成し始める。
【０２５２】
レギュロンの柔軟性に基づいて、本発明者らは、Ｒ１３残基からＫ２０残基まで広がっている部分と同様にヘアピン領域を用いることによって、レギュロンが２ＬＡモジュールの結合剤として作用することを提案する。
【０２５３】
レギュロン構造の説明
上述の相同性モデリング手法から、本発明者らは、レギュロンの構造が長い柔軟なループであり、構造化された部分だけがＣ−末端領域の近くに局在するβ−ヘアピンであることを提案する（図１０）。ヘアピンは以下の残基によって形成される。
・ＴＶＩＨＧＫＲＥＶＴＬＨ（配列番号２０）
β−ヘアピンは２つのβ−鎖と１つのＵターンでできている。２つのβ−鎖は以下の領域に局在化している。
・ＴＶＩＨＧ（配列番号２１）
・ＥＶＴＬＨ（配列番号２２）
Ｕターンは２つの必須のアミノ酸でできている。
・ＫＲ
短いレギュロン配列
そこで、本発明者らは、レギュロンはそのヘアピン領域を使ってＬＤＬＲと相互作用することを提案する。本発明者らは、ＢＢＢを通過するために使用する、レギュロンのＣ−末端部を含んでいる２つの新規ポリペプチドを設計し、２つの構築物を設計した。
【０２５４】
レギュロン構築物１
配列：ＰＴＶＩＨＧＫＲＥＶＴＬＨＬ（配列番号２）
長さ：１４アミノ酸
「レギュロン構築物１」ポリペプチドは、レギュロンの最小の構造化領域を含む。その構造は、β−ヘアピン領域のみを有する（図１３参照）。この短いポリペプチドのβ−ヘアピンの保存を確認するために、本発明者らは、アブイニシオ法を使用してレギュロン構築物１の構造を予測し、β−ヘアピン構造を確認した（図１４）。
【０２５５】
レギュロン構築物４
配列：ＰＭＡＲＥＰＴＶＩＨＧＫＲＥＶＴＬＨＬＨＰＤＨ（配列番号３）
長さ：２３アミノ酸
「レギュロン構築物４」ポリペプチドは、レギュロン構築物１の全配列とβ−ヘアピンの両端に追加の配列を有する。レギュロンのＣ−末端の全てのアミノ酸を含む。追加の配列は、理論上、β−シートを形成できる平行なループを示すので、本発明者らは、レギュロン構築物４は特に好適なポリペプチドであることを提案する（図１５参照）。本発明者らは、アブイニシオ法を用いてレギュロン構築物４の構造を予測し、全ポリペプチドを得るために伸長したβ−ヘアピン構造を取得した（図１６参照）。
【０２５６】
ＲＡＰα−へリックス
上述のように、ＲＡＰのＤ３ドメインはＬＤＬＲに結合できることが知られている。相互作用は、ＲＡＰの２つのα−へリックスを介して、２つのＬＤＬ受容体型Ａ（ＬＡ）モジュールとの間に起こる。一方のα−へリックスは、ＬＹＳ２５６を含む、相互作用に必要な残基を含むが、他方のα−へリックスは錯体を安定化しているように見える。本発明者らは、ＲＡＰ−Ｄ３に基づいて３つの新規ポリペプチドを設計した。
【０２５７】
ＲＨ構築物１
配列：ＥＬＫＨＦＥＡＫＩＥＫＨＮＨＹＱＫＱＬＥ（配列番号４）
長さ：２０アミノ酸
ＲＨ構築物１ポリペプチドを、本発明者らは、ＬＤＬＲと相互作用ＲＡＰ−Ｄ３の最小単位として同定した（図１８参照）。本発明者らは、アブイニシオ法を用いてＲＨ構築物１の構造を予測し、端から端までの完全なα−へリックス構造を確認した（図１９参照）。
【０２５８】
ＲＨ構築物２
配列：ＤＫＥＬＥＡＦＲＥＥＬＫＨＦＥＡＫＩＥＫＨＮＨＹＱＫＱＬＥＩＡＨＥＫＬＲＨＡＥＳＶ（配列番号５）
長さ：４１アミノ酸
本発明者らによって同定されたＲＨ構築物２ポリペプチドは、ＬＤＬＲとの相互作用に必須の残基を含む、ＲＡＰの全α−へリックスに相当する。ここで、本発明者らは、ＲＨ構築物１に関して、α−へリックスの形成に有利に働き、ＢＢＢの輸送を促進するための追加の領域を含む、より長い部分を取得した。アブイニシオ予測法は、９〜３０残基の長さのポリペプチドに対して最適化されているので、４１残基を有するＲＨ構築物２に用いることはできなかった。α−へリックスの安定性を確認するために、本発明者らは、１００ｐｓの短時間分子動力学シミュレーションを行った。シミュレーションによれば、α−へリックスは比較的安定である（図２０参照）。
【０２５９】
ＲＨ構築物３
配列：ＤＫＥＬＥＡＦＲＥＥＬＫＨＦＥＡＫＩＥＫＨＮＨＹＱＫＱＬＥＩＡＨＥＫＬＲＨＡＥＳＶＧＤＧＥＲＶＳＲＳＲＥＫＨＡＬＬＥＧＲＴＫＥＬＧＹＴＶＫＫＨＬＱＤＬＳＧＲＩＳＲＡＲＨ（配列番号６）
長さ：８４アミノ酸
ＲＡＰＤ３ドメインのほとんどを含んでいるＲＨ構築物３ポリペプチドは、２つのα−へリックスにより形成される。この構築物は、ＲＨ構築物２ポリペプチドのα−へリックスに加え、ＬＤＬＲとの相互作用に必要な残基を含み、ＬＤＬＲと相互作用して錯体を安定化するＲ２９６を含む第２のα−へリックスでできている。
【０２６０】
重ねて、ＲＨ構築物３は３０を超える残基を含むので、アブイニシオ予測法をこのポリペプチドに適用することはできなかった。α−へリックスの安定性を確認するために、本発明者らは、１００ｐｓの短時間分子動力学シミュレーションを行った。シミュレーションによれば、α−へリックスは比較的安定であるように見える（図２１参照）。
他の新規なポリペプチドの設計
本発明者らは、ＡＰ２およびＲＡＰ鋳型配列とは異なる新規なポリペプチドをさらに設計した。
【０２６１】
集められた相互作用ポリペプチドデータベース（表２）から、本発明者らは、ＬＤＬＲメンバーとの相互作用を２種類に区別した。
１．あるポリペプチドは、異なるフレキシブル領域に位置する残基を用いてＬＤＬＲと相互作用する（例えば、１Ｖ９Ｕ、２ＫＲＩ、３Ａ７Ｑ、１Ｎ７Ｄ）。
２． 他のポリペプチドは、α−へリックスに位置する残基を用いてＬＤＬＲと相互作用する（例えば、２ＦＣＷ、２ＦＣＷ２、２ＫＮＹ、２ＦＹＬ、２ＦＹＬ２）。
【０２６２】
本発明者らは、相互作用の２種に対するポリペプチドを設計した。ここでは、これらを「フレキシブル」および「剛直な」ポリペプチドと称する。
フレキシブルポリペプチド
ＬＤＬＲのＬＡモジュールに結合できるフレキシブルポリペプチドを、主にＡＰ２二重結合剤モデルにおいて確認された重要な相互作用の特徴に基づいて設計した。以下のＡＰ２残基は、ＬＡドメイン：Ｒ８、Ｇ９、Ｋ１０、Ｒ１１、Ｋ１５またはＥ１７との相互作用を促進するように機能することが考えられるので、本発明者らのモデルに固定、保持した。
【０２６３】
「フレキシブル」ポリペプチドの全てが以下の設計基準を満たしている。
・必須なＡＰ２残基を保持し、ＬＡモジュール（Ｒ８、Ｇ９、Ｋ１０、Ｒ１１、Ｋ１５、Ｅ１７）との相互作用を維持する。
・ＡＰ２の非必須な残基を変更して、
分子間相互作用を最小化し、
分子内相互作用を最大化し、
フレキシブルループ二次構造を取り入れる傾向が強いポリペプチドを形成し、
水溶性である確率が高いポリペプチドを形成する。
【０２６４】
アミノ酸二次構造傾向性は、よく知られているＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ法［４１、４２］の改良法であるＣｏｓｔａｎｔｉｎｉと共同研究者［４０］により決定された基準に従って構築した。
【０２６５】
本発明者らが設計したフレキシブルポリペプチドの一覧を表７に示す。
【０２６６】
【表７】
2016539076.tif 000011
【０２６７】
表７：ＬＡモジュールの結合用のフレキシブルポリペプチド。ＡＰ２二重結合剤モデルから保存されているアミノ酸は、強調して表示している。flex_１は配列番号７の配列であり、flex_２は配列番号８の配列であり、flex_３は配列番号９の配列であり、flex_４は配列番号１０の配列であり、flex_５は配列番号１１の配列である。
【０２６８】
一例として、本発明者らはflex_１の全ての残基について詳述する。
・Ｔ１は、Ｙ１４との分子内疎水性相互作用を促進して二重のクニッツ型フォールディングを促進するために選択した。
・Ｇ２は、フレキシブルループを形成する傾向が強い残基であるとして選択した。
・Ｅ３は、ＬＡモジュールのＲ１０３との分子間水素結合相互作用を促進するために選択した。
・Ｓ４は、フレキシブルループを形成する傾向が強い極性残基であるとして選択した。
・Ｎ５は、フレキシブルループを形成する傾向が強い極性残基であるとして選択した。
・Ｔ６は、ＬＡモジュールのＶ１０６との分子間疎水性相互作用を促進するために選択した。
・Ｖ７は、ＬＡモジュールのＴ１２６との分子間疎水性相互作用を促進するために選択した。
・Ｒ８は、ＬＡモジュールとの相互作用に必須と思われるＡＰ２残基であった。
・Ｇ９は、ＬＡモジュールとの相互作用に必須と思われるＡＰ２残基であった。
・Ｋ１０は、ＬＡモジュールとの相互作用に必須と思われるＡＰ２残基であった。
・Ｒ１１は、ＬＡモジュールとの相互作用に必須と思われるＡＰ２残基であった。
・Ｇ１２は、フレキシブルループを形成する傾向が強い残基であるとして選択した。
・Ｓ１３は、フレキシブルループを形成する傾向が強い極性残基であるとして選択した。
・Ｙ１４は、Ｔ１との分子内疎水性相互作用を促進して二重のクニッツ型フォールディングを促進するために選択した。
・Ｋ１５は、ＬＡモジュールとの相互作用に必須と思われるＡＰ２残基であった。
・Ｄ１６は、ＬＡモジュールのＱ１０４との分子間水素結合相互作用を促進するために選択した。
・Ｅ１７は、Ｎ−末端と分子内相互作用し、二重のクニッツ型フォールディングを促すために不可欠であると考えられるＡＰ２残基であった。
・Ｎ１８は、フレキシブルループを形成する傾向が強い極性残基であるとして選択した。
・Ｒ１９は、ＬＡモジュールのＤ１１０と分子間水素結合相互作用を形成する極性残基であるとして選択した。
【０２６９】
剛直なポリペプチド
本発明者らは、「剛直な」ポリペプチドの設計をＡＰ２の代わりに共結晶化されたＲＡＰ−ＬＡ錯体に基づいて行った。ＲＡＰは、１０６個のアミノ酸からなる大きなポリペプチドであり、結合した３つの剛直なα−へリックスを形成する。ＲＡＰは、大きい方の２つのα−へリックスの残基を用いて２つのＬＡモジュールと相互作用する。
【０２７０】
本発明者らは、単一または二重ドメイン結合剤として作用する単一のα−へリックスを形成する、小さなポリペプチドを設計した。ＲＡＰの主たる相互作用モチーフを、「Ｋ＊＊Ｋ＊＊＊Ｙ」として同定した。第２のリシンは必須の残基であり、他の２つの残基は受容体の重要なカルボン酸塩およびカルボニル部分に対する水素結合供与基の役割を果たす。このように、本発明者らは、最初のリシンとチロシン残基を、水素結合供与体でもあり、正に帯電し、最適な方法で酸性受容体残基と相互作用できる、リシンまたはアルギニン残基と交換してもよいということを提案する。ＲＡＰ模倣体の他の残基は、α−へリックスを形成する傾向が高いアミノ酸であるべきである。
【０２７１】
Ａｌｉａｓと共同研究者は、「Ａｃ−ＹＧＤＡＡＡＥ−Ｘ−ＥＡＡＡＡＧ−ＮＨ２」のパターンを用いてα−へリックスポリペプチドの取得に成功した［４３］。マルチアラニンモチーフはα−へリックス構造の形成を保証し、アスパラギン酸塩残基はポリペプチドの溶解性を上げることが提案され、チロシン残基はポリペプチド濃度の分光学的定量化を促進する［４４］。
【０２７２】
本発明者らが設計した二重ドメイン結合剤は、Ａｌｉａｓと共同研究者のポリペプチドよりも大きい。加えて、マルチアラニン残基がα−へリックス構造の形成を保証するとしても、アラニンは溶解度に問題のある極性残基であるので、そのような問題を回避するために、本発明者らは、α−へリックスの結合表面の反対側のアラニン残基をグルタミン酸塩残基に変異させることを選択した。グルタミン酸塩はその負電荷のために選択されたものであり、ポリペプチドの溶解度を増加し、ポリペプチドの正に帯電している側（リガンドの結合部位）の位置を受容体の負に帯電している表面に向けて配向する可能性を有する。さらに、グルタミン酸塩残基はα−へリックスを形成する傾向が強い。最後に、ＲＡＰα−へリックスに存在する残基も考慮される（rigid_５）。
【０２７３】
本発明者らが設計した剛直なポリペプチドを表８に示す。
【０２７４】
【表８】
2016539076.tif 000012
【０２７５】
表８：ＬＡモジュールの結合様に提案された剛直なポリペプチド。ＴＰＳＡは、算出された位相幾何学的極性表面積であり、ポリペプチドの極性についての見通しを与える。rigid_１は配列番号１２の配列であり、rigid_２は配列番号１３の配列であり、rigid_３は配列番号１４の配列であり、rigid_４は配列番号１５の配列であり、rigid_５は配列番号１６の配列である。
【０２７６】
本発明者らが設計した全ての剛直なポリペプチドの構造を、上述のアブイニシオ法［３６］を使用して予測した。アブイニシオモデルは、提案された全てのポリペプチドのα−へリックス構造を予測する。（同じ長さのポリペプチドを考察することにより）２つの傾向が確認された。
・アラニンの数が少なければ少ない程、ポリペプチドがα−へリックス構造を有する機会が少ない。
・アラニン残基が多い程、ポリペプチドが不溶性になる可能性が高い。
【０２７７】
蛍光標識ペプチドインビトロＢＢＢモデル通過試験
物質および機器
物質
リンガー−ＨＥＰＥＳ緩衝液（ＲＨ緩衝液）
１５０ｍＭのＮａＣｌ、５．２ｍＭのＫＣｌ、２．２ｍＭのＣａＣｌ２、０．２ｍＭのＭｇＣｌ２、６ｍＭのＮａＨＣＯ３、５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび２．８ｍＭのグルコース。ｐＨを７．２〜７．４に調整し、フィルター孔径が０．２２μｍのフィルターを通した。
ＤＭＥＭ／Ｆ１２
ルシファーイエロー−ＣＨ、Ｓｉｇｍａ、参照番号Ｌ０２５９
機器
細胞培養恒温槽（３７℃、加湿雰囲気、９５％空気および５％ＣＯ２）
無菌細胞培養キャビネット
蓋付きミリセル２４ウェル容器トレイ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、参照番号ＰＳＭＷ０１０Ｒ５
コーニング９６ウェルソリッド黒平底ポリスチレンＴＣ処理マイクロプレート
水浴、３７℃
アスピレーションシステム
自動マイクロピペッター
蛍光光度計
インビトロＢＢＢモデルの構築
図２２に示すように共培養法を行う。混合神経膠細胞のマウス初代培養物を２４ウェルプレート上に播種し、ウシ脳内皮細胞を別のプレートのコラーゲン被覆インサート上で培養する。３日後、インサートを星状膠細胞含有プレートに移動し、さらに３日間培養する。インビトロＢＢＢの完全性を評価するために、経内皮電気抵抗（transendothelial electrical resistance（ＴＥＥＲ））を実験の日に測定する。２００Ω／ｃｍ２より高いＴＥＥＲ値は許容範囲にあると判断する。
【０２７８】
フィルター試験
次に、ペプチドが上段部から下段部に通過するのを膜が阻止できるかどうかを試験するために、以下の手技を行う。ペプチドをインサートの管腔側に２０μｇ／ｍＬの蛍光体で添加し、リンガー−ＨＥＰＥＳ緩衝液（リンガー−ＨＥＰＥＳ緩衝液の成分は上述）で満たしたウェルに入れる。１時間インキュベーションした後、上段部および下段部からサンプルを集め、蛍光光度計で測定する。上段部および下段部でのペプチド濃度が等しい場合は、ペプチドの拡散が膜によって制限されていないことを示す。
【０２７９】
通過試験法
各試験ペプチド溶液をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、２０μｇ／ｍＬの最終蛍光体濃度で（各条件でそれぞれ３回試験を行うことを考慮して）調製する。蛍光標識したスクランブルペプチドサンプルを陰性コントロールとして使用する。２０μＭのルシファーイエロー（ＬＹ）を各サンプルに添加する。ＬＹは、脳浸透性が低い小さな親水性分子であるので、その内皮透過係数は、内皮細胞単分子層の完全性を示す。ＦＲＥＴ様事象を妨げるための試験ペプチドの蛍光標識のＥｍ／Ｅｘスペクトルと互換性がある分子トレーサーを選択することが重要である。
【０２８０】
インサートを、各ウェルが０．８ｍＬの培地を有し、３７℃に温められた新しい２４ウェルプレートに移動する。予熱したサンプル溶液の４００μＬを各インサートに添加する。各溶液の一定量を集め（ｔ＝０上昇）、培地および光への曝露を避けて４℃で貯蔵する（ｔ＝０下降）。３７℃で５％ＣＯ２中６０分間インキュベートした後、上昇および下降溶液を集める（ｔ＝６０上昇およびｔ＝６０下降）。
【０２８１】
各条件（試験ペプチドおよび陰性コントロール）の全サンプル（ｔ＝０上昇、ｔ＝０下降、ｔ＝６０上昇およびｔ＝６０下降）を黒９６ウェルマイクロプレートに蒔く。同様に、対応する検量線についても行う。蛍光をマルチウェルプレート読み取り機により測定する。
【０２８２】
次いで、ペプチドの質量収支を行い、吸着または蓄積現象を検査する。質量収支値は実験の最後に回収された化合物の割合を示し、以下のように算出される。
ＭＢ（％）＝｛［ペプチド量（管腔、ｔ６０）］＋［ペプチド量（反管腔、ｔ６０）］｝／［ペプチド量（管腔、ｔ０）］
透過性算出
さらに、ＬＹおよび試験ペプチドの内皮透過係数値を決定する。クリアランス原理を用いて、濃度非依存性輸送パラメーターを得る。輸送された化合物の量を供与体チャンバの濃度で割って、インキュベーション時間間の通過体積の増加を算出し、全通過体積を以下に示すように算出する。
クリアランス（μＬ）＝（［Ｃ］ａ×Ｖａ）／［Ｃ］Ｌ
［Ｃ］Ｌは、最初の管腔トレーサーまたはペプチド濃度を表し、［Ｃ］ａは反管腔トレーサーまたはペプチド濃度を表し、Ｖａはチャンバの体積を表す。実験の間、通過体積は時間と共に直線的に増加する。平均通過体積を時間に対してプロットし、線形回帰分析により傾きを見積もり、見積もりから平均値と標準偏差を求める。共培養のクリアランス曲線の傾斜をＰＳｔで示す。ＰＳは透過性と表面積の積（μＬ／分）を表す。コラーゲンで被覆したフィルターのみにおけるクリアランス曲線の傾斜をＰＳｆで示す。内皮単分子層のＰＳ値（ＰＳｅ）は、以下に示すように算出する。
１／ＰＳｅ＝（１／ＰＳｔ）−（１／ＰＳｆ）
ＰＳｅ値をフィルターの表面積（ミリセル２４：０．７ｃｍ２、細胞培養インサート）で割り、内皮透過係数（Ｐｅ、ｃｍ／分）を得る。
【０２８３】
ＬＹのＰｅ係数と試験ペプチドまたはスクランブルペプチドのＰｅ係数を各サンプルについて算出する。ＬＹのＰｅ係数の値が０．２×１０−３〜０．８×１０−３ｃｍ／分ならば、関門が実験後も不変であると考えられ、試験ペプチドとコントロールの透過性値は主に経細胞流動による。
【０２８４】
結果
この方法を用いた場合、蛍光性ペプチドは以下の割合でモデルＢＢＢを通過した。
【０２８５】
レギュロン 
ＨＫＫＷＱＦＮＳＰＦＶＰＲＡＤＥＰＡＲＫＧＫＶＨＩＰＦＰＬＤＮＩＴＣＲＶＰＭＡＲＥＰＴＶＩＨＧＫＲＥＶＴＬＨＬＨＰＤＨ（配列番号１）
ＢＢＢ通過百分率：３．７３％
レギュロンポリペプチド
配列：ＰＴＶＩＨＧＫＲＥＶＴＬＨＬ（配列番号２）
ＢＢＢ通過百分率：１１．４３％
ＲＡＰポリペプチド
配列：ＥＬＫＨＦＥＡＫＩＥＫＨＮＨＹＱＫＱＬＥ（配列番号４）
ＢＢＢ通過百分率：８．２７％
フレキシブルポリペプチド
配列：ＴＧＥＳＮＴＶＲＧＫＲＧＳＹＫＤＥＮＲ（配列番号７）
ＢＢＢ通過百分率：８．１７％
剛直なポリペプチド
配列：ＧＤＡＡＡＡＫＡＡＫＡＡＡＫＡＡＡＤＧＹ（配列番号１２）
ＢＢＢ通過百分率：７．５１％
これらのデータを図表方式によって図２４に示す。
【０２８６】
結論
本発明者らは、ＢＢＢの受容体介在トランスサイトーシスを受けるポリペプチドを開発した。本発明のポリペプチドを薬剤に結合することにより、他の方法ではＢＢＢにより遮断されるであろう薬剤を、ＢＢＢを通過して脳に輸送することができる。本発明のポリペプチドを治療薬および／または診断薬に結合することにより、治療薬および／または診断薬を脳に輸送することができ、それにより、新規および改良された治療および診断の可能性を提供する。
【０２８７】
【表９】
2016539076.tif 000013
【０２８８】
参考文献
[1] Demeule M., Regina A., Che C., Poirier J., Nguyen T., Gabathuler R., Castaigne J-P, Beliveau R., Journal of Pharmacology andl Experimental Therapeutics (2007) 324, 1046-1072.
[2] Demeule M. Currie J-C, Bertrand Y., Che C., Nguyen T., Regina A., Gabathuler R., Castaigne J-P, Beliveau R., Journal of Neurochemistry (2008) 106, 1534-1544.
[3] Brown M. S., Goldstein, J. L., Science (1986) 232, 34-47.
[4] Lillis A.P., Van Duyn L.B., Murphy-Ullrich J.E., Strickland D.K., Physiol. Rev., (2008) Vol. 88., 887-918.
[5] Russell D. W., Brown M. S., Goldstain J. L., J. Biol. Chem (1989) 264, 21682-21688.
[6] Cecchelli et al, Adv Drug Deliv Rev. 1999 Apr 5;36(2-3):165-178
[7] US patent 5,707,829
[8] Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al. eds., 1987) Supplement 30.
[9] Ausubel et al. (eds) (2002) Short protocols in molecular biology, 5th edition (Current Protocols).
[10] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472.
[11] Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.)
[12] Handbook of Experimental Immunology, Vols. I IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds, 1986, Blackwell Scientific Publications)
[13] Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press).
[14] Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K.S. ed., CRC Press, 1997)
[15] Ausubel et al. (eds) (2002) Short protocols in molecular biology, 5th edition (Current Protocols).
[16] Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, (Ream et al., eds., 1998, Academic Press)
[17] PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed. (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag)
[18] Guttman M., Prieto J.H., Handel T.M., Domaille P.J., Komives E.A., J. Mol. Biol. (2010) 398, 306-319.
[19] Guttman M., Prieto J.H., Croy J.E., and Komives E.A., Biochemistry (2010) 49, 1207-1216.
[20] Croy J.E., Brandon T., Komives E.A., Biochemistry (2004) 43, 7328-7335.
[21] Fisher C., Beglova N., Blacklow S. C., Mol. Cell. (2006) 22, 227-283.
[22] Rudenko G., Henry L., Henderson K., Ichtchenko K., Brown M.S., Goldstein J.L., Deisenhofer J., Science (2002)298 (5602): 2353-8.
[23] Verdaguer N.,Fita I., Reithmayer M., Moser R., Blaas D., Nature Struct. Mol. Biol. (2004) Vol. 11, Number 5, 429.
[24] Lee CJ, De Biasio A and Beglova N., Structure (2010) 18, 366-376.
[25] Beglov D., Lee C-J, De Biasio A., Kozakov D., Brenke R., Vajda S., Beglova N., Proteins (2009) 77 (4), 940-949.
[26] Pennings MT, van Lummel M, Derksen RH, Urbanus RT, Romijn RA, Lenting PJ, de Groot PG. J. Thromb. Haemost. 2006; 4(8):1680-1690
[27] Yasui N., Nogi T., Takagi J., Structure (2010) 10, 18(3): 320-331.
[28] Lee CJ, De Biasio A and Beglova N., Structure (2010) 18, 366-376 .
[29] Van Lummel M., Pennings M.T.T, Derksen R.H.W.M., Urbanus R.T., Lutters B.C.H., Kaldenhoven N., de Groot P.G., J. Biological Chem. (2005) vol. 280, 44, 36729-36736.
[30] Jensen G.A., Andersen O.M., Bonvin A.M., Bjerrum-Bohr I, Etzerodt M., Thogersen H.C., O'Shea C., Pulsen F.M., Kragelund B.B., J. Mol. Biol. (2006) 362, 700-716.
[31] Beglova N., Jeon H., Fisher C., Blacklow S.C., Mol Cell. (2004) 22, 16(2): 281-292.
[32] Fass D., Blacklow S., Kim P.S. Berger J.M., Nature (1997), 388, 691-693
[33] Andersen O.M., Christensen L.L., Christensen P.A., Sorensen E.S., Jacobsen C., Moestrup S.K., Etzerodt M., Thogersen H.C. J. Biol. Chem. (2000) 275, 21017-21024.
[34] Blacklow S.C., Curr. Opin. Struct. Biol. (2007) 17 (4), 419-426.
[35] Cai J., Ou R., Xu Y-S, Yang L., Linc Z. , Shu M., J. Pept. Sci. 2010, 16: 627-632.
[36] Maupetit J., Derreumaux P., Tuffery P., J Comput Chem. 2010, 31(4): 726-38.
[37] Maupetit J., Tuffery P., Derreumaux P., Proteins. 2007, 69, 394-408.
[38] Kaur H., Garg A., Raghava G.P.., Protein Pept Lett. 2007, 14, 626-31.
[39] Halgren T.A., J. Comp. Chem.; 1996, 490-519.
[40] Costantini S., Colonna G., Facchiano A.M., Biochemical and Biophysical Research Communications (2006) 342, 441-451.
[41] Chou P.Y., Fasman G.D., Biochemistry (1974) 13, 222-245.
[42] Chou P.Y., Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Plenum Press, New York: Fasman GD, 1989, p. 549
[43] Alias M., Ayuso-Tejeidor S., Fernandez-Recio J., Cativiela C., Sancho J., Org. Biomol. Chem. (2010) 8, 788- 792.
[44] Chakrabartty A., Kortemme Y., Padmanabhan S., Baldwin R.L., Biochemistry (1993) 32, 5560-5565.
[45] A. Siflinger-Birnboim, P.J. Del Becchio, J.A. Cooper, F.A. Blumenstock, J.N. Shepard, A.B. Malik, Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer, J. Cell. Physiol. 132 (1987) 111-117.
【図１】
2016539076.tif 000014
【図５】
2016539076.tif 000015
【図２２】
2016539076.tif 000016
【図２３】
2016539076.tif 000017
【図２４】
2016539076.tif 000018
【図２】
2016539076.tif 000019
【図３】
2016539076.tif 000020
【図４Ａ】
2016539076.tif 000021
【図４Ｂ】
2016539076.tif 000022
【図４Ｃ】
2016539076.tif 000023
【図４Ｄ】
2016539076.tif 000024
【図６】
2016539076.tif 000025
【図７】
2016539076.tif 000026
【図８】
2016539076.tif 000027
【図９】
2016539076.tif 000028
【図１０】
2016539076.tif 000029
【図１１】
2016539076.tif 000030
【図１２】
2016539076.tif 000031
【図１３】
2016539076.tif 000032
【図１４】
2016539076.tif 000033
【図１５】
2016539076.tif 000034
【図１６】
2016539076.tif 000035
【図１７】
2016539076.tif 000036
【図１８】
2016539076.tif 000037
【図１９】
2016539076.tif 000038
【図２０】
2016539076.tif 000039
【図２１】
2016539076.tif 000040
【配列表】
2016539076000001.xml
【国際調査報告】
2016539076.tif 000066
2016539076.tif 000067
2016539076.tif 000068
2016539076.tif 000069
2016539076.tif 000070
2016539076.tif 000071