(57)【要約】  本開示は、代謝疾患、例えば、肥満の治療のためのペグ化ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：
【化１】
2016512213.tif 000017
（Ｘ1は、Ｓ、Ｇ、α−アミノ−イソ−酪酸であり；
Ｘ2は、Ｑ又はＥであり；
Ｘ3は、Ｋ（ＰＥＧ４ｐａｌｍ）のＹであり；
Ｘ4は、Ｅ、Ｒ、Ｋ又はＫ（ＰＥＧ４ｐａｌｍ）であり；
Ｘ5は、Ｙ又はＫ（ＰＥＧ４ｐａｌｍ）であり；
Ｘ6は、Ｌ又はＫ（ＰＥＧ４ｐａｌｍ）であり；
Ｘ7は、Ｄ又はＥであり；
Ｘ8は、Ｓ、Ｅ又はＫ（ＰＥＧ４ｐａｌｍ）であり；
Ｘ9は、Ｒ、Ｅ、Ｓ、Ｋ（ｇＥｐａｌｍ）、Ｋ（ＰＥＧ２ｐａｌｍ）、Ｋ（ＰＥＧ３ｐａｌｍ）、Ｋ（ＰＥＧ４ｐａｌｍ）又はＫ（ＰＥＧ２−ＰＥＧ２−ｇＥｐａｌｍ）であり；
Ｘ10は、Ｒ、Ａ、又はＫ（ｇＥｐａｌｍ）、Ｋ（ＰＥＧ４ｐａｌｍ）であり；
Ｘ11は、Ｑ、Ｒ、Ａ、Ｅ又はＫ（ｇＥｐａｌｍ）、Ｋ（ＰＥＧ４ｐａｌｍ）であり；
Ｘ12は、Ｄ又はＫ（ｇＥｐａｌｍ）であり；
Ｘ13は、Ｑ、Ａ又はＥであり；
Ｘ14は、Ｌ又はＥであり；
Ｘ15は、Ｖ又はＥであり；
Ｘ16は、非存在であるか、又はＡであり；
分子あたり１以下のリシンが、パルミトイル化される）
を含む単離ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが、以下：
（ａ）
【化２】
2016512213.tif 000018
【化３】
2016512213.tif 000019
【化４】
2016512213.tif 000020
（Ｘ1は、α−アミノ−イソ−酪酸であり；
１０、１３、１４、１６、１７、１８、２０又は２１位のアミノ酸が、パルミトイル化リシンであるとき、１２位のリシンは、パルミトイル化されず；
１０、１３、１４、１６、１７、１８、２０及び２１位のアミノ酸が、パルミトイル化リシンではないとき、１２位のリシンは、任意選択でパルミトイル化され；また
前記ペプチドは、Ｃ末端アミノ酸で、（ＰＥＧ）ｘ2基によりペグ化されており、
ここで、ｘ2は、２〜１２である）
からなる群から選択されるアミノ酸配列
を含む、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項３】
前記リシンが、前記リシン残基のＮ（イプシロン）基で、パルミトイル基によりパルミトイル化されている、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記パルミトイル基が、リンカーを介して前記リシンに連結されている、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
前記リンカーが、γグルタミン酸塩である、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
前記リンカーが、ＰＥＧリンカーである、請求項４に記載のペプチド。
【請求項７】
前記ＰＥＧリンカーが、ＰＥＧ２、ＰＥＧ３、ＰＥＧ４、ＰＥＧ２−ｇＥ、ＰＥＧ４−ｇＥ、又はＰＥＧ２−ＰＥＧ２−ｇＥリンカーである、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドが、以下：
【化５】
2016512213.tif 000021
【化６】
2016512213.tif 000022
【化７】
2016512213.tif 000023
【化８】
2016512213.tif 000024
（Ｘ1は、α−アミノ−イソ−酪酸であり；
Ｂは、Ｋ（ｇＥ−ｐａｌｍ）であり；
Ｂ1は、Ｋ（ＰＥＧ４−ｐａｌｍ）であり；
Ｂ2は、Ｋ（ＰＥＧ３−ｐａｌｍ）であり；
Ｂ3は、Ｋ（ＰＥＧ２−ｐａｌｍ）であり；
Ｂ4は、Ｋ（ＰＥＧ４−ｇＥ−ｐａｌｍ）であり；
Ｂ5は、Ｋ（ＰＥＧ２−ｇＥ−ｐａｌｍ）であり；
Ｂ6は、Ｋ（ＰＥＧ２−ＰＥＧ２−ｇＥ−ｐａｌｍ）である）
のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドが、以下：
【化９】
2016512213.tif 000025
のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ペプチドが、Ｃ末端で、６−アミノヘキサン酸又は１１−アミノウンデカン酸のいずれかに結合している単離ペプチド。
【請求項１０】
ＧＬＰ−１活性及びグルカゴン活性を含む単離ペプチドであって、前記ペプチドが、前記ポリペプチドのＣ末端で、１〜１２ＰＥＧ基のＰＥＧ基を含み、前記ペプチドが、前記ＰＥＧ基を含まない同じペプチドより、増加した血清力価を有する単離ペプチド。
【請求項１１】
前記ＰＥＧ基が、（ＰＥＧ）ｘ基であり、ｘは、２〜１２である、請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１２】
前記ＰＥＧ基が、（ＰＥＧ）ｘ基であり、ｘは、２〜６である、請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１３】
前記ＰＥＧ基が、（ＰＥＧ）ｘ基であり、ｘは、２〜４である、請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１４】
前記ペプチドが、前記ＰＥＧ基を含まないペプチドと比較して、増大したＧＬＰ１活性及び／又は増大した安定性を有する、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１５】
前記ペプチドが、グルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体、又はグルカゴン受容体とＧＬＰ−１受容体の両方に結合する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１６】
前記ペプチドが、グルカゴン受容体に結合する、請求項１５に記載のペプチド。
【請求項１７】
前記グルカゴン受容体が、マウスグルカゴン受容体又はヒトグルカゴン受容体である、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項１８】
１０，０００ｐＭ未満、５０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満のｃＡＭＰアッセイにおけるＥＣ５０でヒトグルカゴン受容体に結合する、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項１９】
前記ペプチドが、ＧＬＰ−１受容体に結合する、請求項１５に記載のペプチド。
【請求項２０】
前記ＧＬＰ−１受容体が、マウスＧＬＰ−１受容体又はヒトＧＬＰ−１受容体である、請求項１９に記載のペプチド。
【請求項２１】
１０，０００ｐＭ未満、５０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満の前記ｃＡＭＰアッセイにおけるＥＣ５０でヒトＧＬＰ−１受容体に結合する、請求項２０に記載のペプチド。
【請求項２２】
ＧＬＰ−１活性のアゴニスト、グルカゴン活性のアゴニスト、又はＧＬＰ−１とグルカゴン活性の両方のアゴニストである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２３】
前記ペプチドが、グルカゴン受容体とＧＬＰ−１受容体の両方に結合し、前記グルカゴン受容体より、前記ＧＬＰ−１受容体で、天然リガンドと比較して少なくとも約２倍、５倍、又は１０倍大きい活性を呈示する、請求項１５に記載のペプチド。
【請求項２４】
前記ペプチドに結合した異種部分をさらに含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２５】
前記異種部分が、タンパク質、ペプチド、タンパク質ドメイン、リンカー、有機ポリマー、無機ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ビオチン、アルブミン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＨＳＡ  ＦｃＲｎ結合部分、抗体、抗体のドメイン、抗体断片、単鎖抗体、ドメイン抗体、アルブミン結合ドメイン、酵素、リガンド、受容体、結合ペプチド、非ＦｎＩＩＩスカフォールド、エピトープタグ、組換えポリペプチドポリマー、サイトカイン、又は列挙した部分の２つ以上の組み合わせである、請求項２４に記載のペプチド。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載のペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項２７】
請求項２６に記載の組成物を含むキット。
【請求項２８】
ＧＬＰ−１類似体の力価を増加する方法であって、ＰＥＧ基をＧＬＰ−１類似体に結合させるステップを含み、ここで、前記ＰＥＧ基が、２〜１２ＰＥＧ単位を含む方法。
【請求項２９】
前記ＰＥＧ基が、２〜８ＰＥＧ単位を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＰＥＧ基が、２〜６ＰＥＧ単位を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＰＥＧ基が、２〜４ＰＥＧ単位を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
過剰体重に起因する、又は過剰体重を特徴とする疾患若しくは病状を治療又は予防する方法であって、治療を必要とする被検者に、有効量の請求項１〜２５のいずれか一項に記載のペプチド、又は請求項２６に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項３３】
前記疾患又は病状が、肥満である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ペプチドを注射により投与する、請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記注射を皮下投与する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ペプチドを１日１回投与する、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ペプチドを週１回投与する、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記被検者が、ヒトである、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
被検者の体重を減少する方法であって、治療を必要とする被検者に、有効量の請求項１〜２５のいずれか一項に記載のペプチド、又は請求項２６に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項４０】
被検者の２型糖尿病を治療する方法であって、治療を必要とする被検者に、有効量の請求項１〜２５のいずれか一項に記載のペプチド、又は請求項２６に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１４日に提出された米国仮特許出願第６１／７８３，６７５号明細書の利益を主張するものである。尚、この文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
電子データにて提出した配列表の参照
本出願と一緒に提出したＡＳＣＩＩテキストファイル（名称：ＧＬＰＧＧ１０１ＷＯ＿ＳＴ２５；サイズ：４４．６キロバイト；及び作成日：２０１４年３月１０日）で電子データにて提出したリストの内容は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。
【背景技術】
【０００３】
肥満は、世界規模で主要な、増大しつづける健康問題であり、心血管疾患、腎臓病、高血圧、発作、不妊、呼吸不全、及び２型糖尿病などの生命を脅かす多くの疾患に関連している。
【０００４】
グルコン及びグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、１５８アミノ酸前駆体ポリペプチドであるプレプログルカゴンに由来し、これは、様々な組織でプロセシングされて、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）及びオキシントモジュリン（ＯＸＭ）など、いくつかの異なるプログルカゴン由来のペプチドを形成するが、これらは、グルコースホメオスタシス、インスリン分泌、胃内容排出、及び腸成長、並びに食物摂取の制御などの多様な生理学的機能に関与する。グルカゴンは、プログルカゴンのアミノ酸３３〜６１（プレプログルカゴンの５３〜８１）に対応する２９アミノ酸ペプチドであるのに対し、ＧＬＰ−１は、プログルカゴンのアミノ酸７２〜１０８（プレプログルカゴンの９２〜１２８）に対応する３７アミノ酸ペプチドとして生成される。ＧＬＰ−１（７〜３６）アミド又はＧＬＰ−１（７〜３７）酸は、ＧＬＰ−１の生物学的に活性の形態であり、ＧＬＰ−１受容体で実質的に同等の活性を示す。
【０００５】
膵臓によりグルカゴンが生成され、グルカゴン受容体（「ｇｌｕｃＲ」）と相互作用する。グルカゴンは、肝臓内で作用して、糖新生とグリコーゲン分解によって血糖を高める。血糖が下がり始めると、グルカゴンは、グリコーゲンを分解し、グルコースを放出するように肝臓にシグナルを送り、血糖値を通常のレベルへと上昇させる。
【０００６】
ＧＬＰ−１は、グルカゴンと比較して異なる生物学的活性を有する。これは、消化管内Ｌ細胞（ｇｕｔ  Ｌ  ｃｅｌｌｓ）から分泌されて、ＧＬＰ−１受容体に結合する。その活性には、インスリン合成及び分泌の刺激、グルカゴン分泌の阻害、及び食物摂取の阻害が含まれる。
【０００７】
グルカゴン及びＧＬＰ−１のいずれも、それぞれの受容体でアゴニストとして作用し、減量に有効であることがわかっている。特定のＧＬＰ−１類似体は、販売されているか、又は肥満の治療のために開発中であり、例えば、Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ（Ｎｏｖｏ  ＮｏｒｄｉｓｋからのＶＩＣＴＯＺＡ（登録商標）及びＥｘｅｎａｔｉｄｅ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ／ＡｍｙｌｉｎからのＢｙｅｔｔａ（登録商標））などがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
有効な肥満治療のためにさらに多くの薬剤、例えば、可溶性、製剤化性（ｆｏｒｍｕｌａｔａｂｉｌｉｔｙ）、安定性、及び効力が改善されたＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドが依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示は、アミノ酸配列：
【化１】
2016512213.tif 000002
（Ｘ１は、Ｓ、Ｇ、α−アミノ−イソ−酪酸であり；Ｘ２は、Ｑ又はＥであり；Ｘ3は、Ｋ（ＰＥＧ４ｐａｌｍ）のＹであり；Ｘ4は、Ｅ、Ｒ又はＫ（ＰＥＧ４ｐａｌｍ）であり；Ｘ5は、Ｙ又はＫ（ＰＥＧ４ｐａｌｍ）であり；Ｘ6は、Ｌ又はＫ（ＰＥＧ４ｐａｌｍ）であり；Ｘ7は、Ｄ又はＥであり；Ｘ8は、Ｓ、Ｅ又はＫ（ＰＥＧ４ｐａｌｍ）であり；Ｘ9は、Ｒ、Ｅ、Ｓ、又はＫ（ｇＥｐａｌｍ）、Ｋ（ＰＥＧ２ｐａｌｍ）、Ｋ（ＰＥＧ３ｐａｌｍ）、Ｋ（ＰＥＧ４ｐａｌｍ）又はＫ（ＰＥＧ２−ＰＥＧ２−ｇＥｐａｌｍ）であり；Ｘ10は、Ｒ、Ａ、又はＫ（ｇＥｐａｌｍ）、Ｋ（ＰＥＧ４ｐａｌｍ）であり；Ｘ11は、Ｑ、Ｒ、Ａ、Ｅ又はＫ（ｇＥｐａｌｍ）、Ｋ（ＰＥＧ４ｐａｌｍ）であり；Ｘ12は、Ｄ又はＫ（ｇＥｐａｌｍ）であり；Ｘ13は、Ｑ、Ａ又はＥであり；Ｘ14は、Ｌ又はＥであり；Ｘ15は、Ｖ又はＥであり；Ｘ16は、非存在であるか、又はＡ（配列番号２）であり；分子あたりただ１つのアミノ酸が、パルミトイル化される）
を含むか、又はこれから構成される単離ペプチドを提供する。
【００１０】
前述したペプチドの特定の実施形態では、Ｘ15又はＸ16のカルボキシル基は、ペグ化されている。一部の実施形態では、ＰＥＧ基は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２単位のポリエチレングリコールオリゴマーである。一部の実施形態では、Ｘ15アミノ酸は、カルボキシル末端で、６−アミノヘキサン酸又は１１−アミノウンデカン酸に結合しており、Ｘ16は、非存在である。
【００１１】
特定の実施形態では、単離ペプチドは、以下：
【化２】
2016512213.tif 000003
【化３】
2016512213.tif 000004
（Ｘ1は、α−アミノ−イソ−酪酸であり；
１０、１３、１４、１６、１７、１８、２０又は２１位のアミノ酸が、パルミトイル化リシンであるとき、１２位のリシンは、パルミトイル化されず；
１０、１３、１４、１６、１７、１８、２０及び２１位のアミノ酸が、パルミトイル化リシンではないとき、１２位のリシンは、任意選択でパルミトイル化され；また
ペプチドは、Ｃ末端アミノ酸で（ＰＥＧ）ｘ2基によりペグ化されており、
ここで、ｘ2は、２〜１２である）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１２】
一部の実施形態では、ペプチドは、リシンを含み、これは、リシン残基のＮ（イプシロン（ε））基で、パルミトイル基によりパルミトイル化されている。一部の実施形態では、パルミトイル基は、リンカーを介してリシンに連結される。リンカーは、例えば、γグルタミン酸塩リンカー又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーであってよい。
【００１３】
一部の実施形態では、ＰＥＧリンカーは、例えば、ＰＥＧ2、ＰＥＧ3、ＰＥＧ4、（ＰＥＧ）2−ｇＥ、（ＰＥＧ）4−ｇＥ、又は（ＰＥＧ）2−（ＰＥＧ）2−ｇＥリンカーである。
【００１４】
一部の実施形態では、ペプチドは、以下：
【化４】
2016512213.tif 000005
【化５】
2016512213.tif 000006
【化６】
2016512213.tif 000007
（Ｘ1は、α−アミノ−イソ−酪酸であり；
Ｂは、Ｋ（ｇＥ−ｐａｌｍ）であり；
Ｂ1は、Ｋ（ＰＥＧ４−ｐａｌｍ）であり；
Ｂ2は、Ｋ（ＰＥＧ３−ｐａｌｍ）であり；
Ｂ3は、Ｋ（ＰＥＧ２−ｐａｌｍ）であり；
Ｂ4は、Ｋ（ＰＥＧ４−ｇＥ−ｐａｌｍ）であり；
Ｂ5は、Ｋ（ＰＥＧ２−ｇＥ−ｐａｌｍ）であり；
Ｂ6は、Ｋ（ＰＥＧ２−ＰＥＧ２−ｇＥ−ｐａｌｍ）である）
のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
ペプチドが、以下：
【化７】
2016512213.tif 000008
のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ペプチドが、Ｃ末端で、６−アミノヘキサン酸又は１１−アミノウンデカン酸のいずれかに結合している、単離ペプチド。
【００１６】
本発明はまた、ＧＬＰ−１活性及びグルカゴン活性を含む単離ペプチドも提供し、前記ペプチドは、ポリペプチドのＣ末端でＰＥＧ基を含み、このペプチドは、ＰＥＧ基を含まない同じペプチドより、増加した血清力価を有する。
【００１７】
一部の実施形態では、ペプチドは、Ｃ末端に結合した約２〜１２のＰＥＧ単位（省略形（ＰＥＧ）ｘ（ｘは、２〜１２である）、例えば、（ＰＥＧ）2、（ＰＥＧ）3、（ＰＥＧ）4、（ＰＥＧ）5、（ＰＥＧ）6、（ＰＥＧ）7、（ＰＥＧ）8、（ＰＥＧ）9、（ＰＥＧ）10、（ＰＥＧ）11、（ＰＥＧ）12）を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、ｘが２〜８の（ＰＥＧ）ｘ基であるＰＥＧ基を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、ｘが２〜６の（ＰＥＧ）ｘ基であるＰＥＧ基を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、ｘが２〜４の（ＰＥＧ）ｘ基であるＰＥＧ基を含む。
【００１８】
一部の実施形態では、本発明のペプチドは、ＰＥＧ基を含まないペプチドと比較して、増大したＧＬＰ１活性及び／又は増大した安定性を有する。
【００１９】
一部の実施形態では、ペプチドは、グルカゴン受容体に結合する。一部の実施形態では、ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に結合する。一部の実施形態では、ペプチドは、グルカゴン受容体とＧＬＰ−１受容体の両方に結合する。
【００２０】
一部の実施形態では、グルカゴン受容体は、マウスグルカゴン受容体又はヒトグルカゴン受容体である。一部の実施形態では、ペプチドは、１０，０００ｐＭ未満、５０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満のｃＡＭＰアッセイにおけるＥＣ５０でヒトグルカゴン受容体に結合する。
【００２１】
一部の実施形態では、ＧＬＰ−１受容体は、マウスＧＬＰ−１受容体又はヒトＧＬＰ−１受容体である。一部の実施形態では、ペプチドは、１０，０００ｐＭ未満、５０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満のｃＡＭＰアッセイにおけるＥＣ５０でヒトＧＬＰ−１受容体に結合する。
【００２２】
一部の実施形態では、ペプチドは、ＧＬＰ−１活性のアゴニスト、グルカゴン活性のアゴニスト、又はＧＬＰ−１とグルカゴン活性の両方のアゴニストである。一部の実施形態では、ペプチドは、グルカゴン受容体とＧＬＰ−１受容体の両方に結合し、グルカゴン受容体より、ＧＬＰ−１受容体で、天然リガンドと比較して少なくとも約２倍、５倍、又は１０倍大きい活性を呈示する。
【００２３】
一部の実施形態では、本発明のペプチドは、ペプチドに結合した異種部分をさらに含む。この異種部分は、タンパク質、ペプチド、タンパク質ドメイン、リンカー、有機ポリマー、無機ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ビオチン、アルブミン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＨＳＡ  ＦｃＲｎ結合部分、抗体、抗体のドメイン、抗体断片、単鎖抗体、ドメイン抗体、アルブミン結合ドメイン、酵素、リガンド、受容体、結合ペプチド、非ＦｎＩＩＩスカフォールド、エピトープタグ、組換えポリペプチドポリマー、サイトカイン、又は列挙した部分の２つ以上の組み合わせである。
【００２４】
本発明はまた、本明細書に記載する本発明のペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物、及びこのような組成物を含むキットも提供する。
【００２５】
さらに、本発明は、ＧＬＰ−１類似体の力価を増加する方法も提供し、これは、ＰＥＧ基をＧＬＰ−１類似体に結合させるステップを含み、ここで、前記ＰＥＧ基は、２〜１２ＰＥＧ単位を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ基は、２〜８ＰＥＧ単位を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ基は、２〜６ＰＥＧ単位を含む。ある実施形態では、ＰＥＧ基は、２〜４ＰＥＧ単位を含む。
【００２６】
本発明はまた、過剰体重に起因する、又は過剰体重を特徴とする疾患若しくは病状を治療又は予防する方法であって、治療を必要とする被検者に、有効量の本明細書に記載のペプチド、又は本明細書に記載の組成物を投与するステップを含む方法も提供する。
【００２７】
一部の実施形態では、疾患若しくは病状は、肥満である。
【００２８】
本発明の一部の実施形態では、ペプチドを注射により投与する。一部の実施形態では、注射を皮下投与する。一部の実施形態では、注射を１日１回投与する。一部の実施形態では、注射を週１回投与する。一部の実施形態では、被検者はヒトである。
【００２９】
本発明は、被検者の体重を減少する方法であって、治療を必要とする被検者に、有効量の本明細書に記載のペプチド、又は本明細書に記載の組成物を投与するステップを含む方法をさらに提供する。
【００３０】
本明細書に記載のペプチドのいずれかは、１つ又は複数の修飾アミノ酸、例えば、アシル部分の添加を含んでよく、例えば、修飾は、リシン残基のＮ（イプシロン（ε））基へのパルミトイル部分の付加であってよい。特定の実施形態では、パルミトイル基は、γグルタミン酸リンカーを介してリシン残基に連結される。βアラニン、６−アミノヘキサン酸及び１１−アミノウンデカン酸などの別のリンカーが用いられてきた。さらに別のリンカーも可能であり、ＰＥＧ部分を含む（例えば、２〜８ＰＥＧ単位を含む）リンカーなどがある。一部の実施形態では、リンカーは、例えば、２、３又は４ＰＥＧ単位などの短いＰＥＧ部分を含む。
【００３１】
様々な実施形態では、本明細書に記載する単離ペプチドは、グルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体、又はグルカゴンとＧＬＰ−１受容体の両方に結合することができる。特定の態様では、グルカゴン受容体は、ヒトグルカゴン受容体であり、及び又はＧＬＰ−１受容体は、ヒトＧＬＰ−１受容体である。特定の態様では、本明細書に記載する単離ペプチドは、１０，０００ｐＭ未満、５０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満のｃＡＭＰアッセイ（本明細書に記載の通り）におけるＥＣ５０でヒトグルカゴン受容体に結合する。特定の態様では、本明細書に記載する単離ペプチドは、１０，０００ｐＭ未満、５０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満のｃＡＭＰアッセイにおけるＥＣ５０でヒトＧＬＰ−１受容体に結合する。
【００３２】
特定の実施形態では、本明細書に記載する単離ペプチドは、ＧＬＰ−１活性のアゴニスト、グルカゴン活性のアゴニスト、又はＧＬＰ−１とグルカゴン活性の両方のアゴニストである。一部の実施形態では、本明細書に記載する単離ペプチドは、グルカゴン受容体とＧＬＰ−１受容体の両方に結合し、グルカゴン受容体より、ＧＬＰ−１受容体で、天然リガンドと比較して少なくとも約２倍大きい活性を呈示する。一実施形態では、ペプチドは、グルカゴンに対するグルカゴン受容体より、ＧＬＰ１と比較して、ＧＬＰ１Ｒで、５〜１０倍高い相対力価を呈示する。
【００３３】
特定の実施形態では、本発明に記載の単離ペプチドは、ペプチドに結合する異種部分をさらに含んでよい。一部の態様では、異種部分は、タンパク質、ペプチド、タンパク質ドメイン、リンカー、有機ポリマー、無機ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ビオチン、アルブミン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＨＳＡ  ＦｃＲｎ結合部分、抗体、抗体のドメイン、抗体断片、単鎖抗体、ドメイン抗体、アルブミン結合ドメイン、酵素、リガンド、受容体、結合ペプチド、非ＦｎＩＩＩスカフォールド、エピトープタグ、組換えポリペプチドポリマー、サイトカイン、又はこれらの部分の２つ以上の組み合わせである。
【００３４】
また、本明細書に記載する単離ペプチドと、担体とを含む医薬組成物も提供される。このような医薬組成物を含むキットもさらに提供される。
【００３５】
さらにまた、過剰体重に起因する、又は過剰体重を特徴とする疾患若しくは病状を治療又は予防する方法であって、治療を必要とする被検者に、有効量の本明細書に記載の単離ペプチド、又はこのようなペプチドを含有する組成物を投与するステップを含む方法も提供する。特定の態様では、疾患又は病状は、肥満、インスリン抵抗性、耐糖能障害、糖尿病前期、空腹時血糖値上昇、２型糖尿病、高血圧、脂質異常症（又はこれら代謝リスク因子の組み合わせ）、グルカゴン産生腫瘍、心血管疾患、例えば、うっ血性心不全、アテローム性動脈硬化（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｉｓ）、動脈硬化、冠動脈性心疾患、又は抹消動脈疾患；発作、呼吸不全、腎疾患、及びこれらのいずれかの併発であってよい。本方法によれば、本明細書に記載する単離ペプチドは、注射、例えば、皮下注射により投与することができる。本方法によれば、ペプチドは、１日１回投与することができる。一部の実施形態では、注射は、週１回投与することができる。特定の実施形態では、被検者は、ヒトである。
【００３６】
さらには、過剰体重に起因する、又は過剰体重を特徴とする疾患若しくは病状を治療又は予防する方法であって、治療を必要とする被検者に、有効量の本明細書に記載の単離ペプチド、又はこのようなペプチドを含有する組成物を投与するステップを含む方法も提供する。本方法によれば、本明細書に記載する単離ペプチドは、注射、例えば、皮下注射により投与することができる。本方法によれば、ペプチドは、１日１回投与することができる。一部の実施形態では、注射は、週１回投与することができる。特定の実施形態では、被検者は、ヒトである。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
定義
本開示全体を通して、用語「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」実体は、１つ又は複数の該実体を指し；例えば、「１つのポリヌクレオチド」は、１つ又は複数のポリヌクレオチドを示すと理解される。従って、用語「１つの（ａ）」（又は「１つの（ａｎ）」及び「少なくとも１つの」は、本明細書において置換え可能に用いることができる。
【００３８】
さらに、本明細書で用いる「及び／又は」は、２つの明示された特徴又は構成要素の各々を他のものと一緒に又はなしで、具体的に開示するものとして理解すべきである。従って、本明細書において、「Ａ及び／又はＢ」のようなフレーズに用いられる用語「及び／又は」は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）、並びに「Ｂ」（単独）を包含することが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」のようなフレーズに用いられる用語「及び／又は」は、以下の側面：Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；並びにＣ（単独）を包含することが意図される。
【００３９】
本明細書において、態様が、「含む」という表現と共に記載されている場合はいずれも、「から構成される」及び／又は「からほぼ構成される」の用語で記載される別の類似の態様も提供されることは理解されたい。
【００４０】
別に定義されない限り、本明細書で用いる技術及び科学用語は全て、本開示が関連する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，第２版，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；及びＯｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，改訂版，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓは、本開示に用いられる用語の多くの一般的辞書を当業者に提供する。
【００４１】
単位、接頭語、及び記号は、それぞれが国際単位系（ＳＩ）により容認される形態で表示する。数値の範囲は、範囲を定める数値を含む。別に指示のない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向で、左から右に記載する。本明細書に記載する見出しは、開示の様々な態様の限定ではなく、これらは、参照により全体を本明細書に組み込むことができる。従って、すぐ下に定義する用語は、本明細書の全体を参照することにより、より十全に定義される。
【００４２】
本明細書で用いる場合、用語「ポリペプチド」は、単数の「ポリペプチド」、さらには複数の「ポリペプチド」を包含することが意図され、２つ以上のアミノ酸の任意の１つ又は複数の鎖を含む。従って、本明細書で用いる場合、１つの「ペプチド」、１つの「ペプチドサブユニット」、１つの「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、「アミノ酸配列」、又は２つ以上のアミノ酸の任意の１つ又は複数の鎖を指すのに用いられるいずれか他の用語は、たとえこれら用語の各々が、より特有の意味を有し得るとしても、「ポリペプチド」の定義に含まれる。用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかに代わり、またはそのいずれかと置換え可能に用いることができる。この用語はさらに、翻訳後又は合成後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質切断、又は非天然アミノ酸による修飾を受けたポリペプチドも含む。
【００４３】
さらに具体的には、本明細書で用いる場合、用語「ペプチド」は、完全長ペプチド及び断片、その変異体若しくは誘導体、例えば、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチド（例えば、長さ２９、３０、若しくは３１アミノ酸）を包含する。本明細書に開示する「ペプチド」例えば、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、例えば、半減期を延長するために、Ｆｃドメイン又はアルブミンドメインなどの別の成分を含む融合ポリペプチドの一部であってよい。本明細書に記載するペプチドは、いくつかの異なる方法で誘導体化することもできる。
【００４４】
用語「断片」、「類似体」、「誘導体」、又は「変異体」は、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを指す場合、少なくとも一部の要望される活性、例えば、グルカゴン及び／又はＧＬＰ−１受容体への結合を保持する任意のペプチドを含む。本明細書に記載するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドの断片は、発現、精製、及び又は被験者への投与の際に、望ましい特性を呈示するタンパク質分解断片、欠失断片を含む。
【００４５】
本明細書で用いる場合、用語「変異体」は、アミノ酸置換、欠失、挿入、及び／又は修飾によって、記載したペプチドとは異なるペプチドを指す。当分野では公知の突然変異誘導技術を用いて、変異体を作製することができる。変異体はさらに、あるいは、これに代わり、他の修飾を含むことができ、例えば、半減期、可溶性、若しくは安定性を増大するために、ペプチドを異種アミノ酸配列若しくは他の部分に結合又はカップリング、例えば、融合させることができる。本明細書に記載のペプチドに結合又はカップリングさせる部分の例として、限定するものではないが、アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などが挙げられる。ペプチドはまた、ペプチド（例：６−Ｈｉｓ）の合成、精製若しくは同定を容易にするために、又は固体支持体とのポリペプチドの結合を増強するために、リンカー又は他の配列に結合させるか、又はカップリングして作製することもできる。
【００４６】
本明細書で用いる場合、用語「配列同一性」は、２つ以上のポリヌクレオチド配列同士、又は２つ以上のポリペプチド配列同士の関係を指す。１つの配列のある位置が、比較配列の対応位置と同じ核酸塩基又はアミノ酸によって占められているとき、配列は、その位置で「同一」であると言う。「配列同一性」の割合（％）は、両配列において同一の核酸塩基又はアミノ酸が存在する位置の数を決定して、「同一」位置の数を得ることにより計算する。次に、「同一」位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割ってから、１００を掛けることにより、「配列同一性」の割合（％）を取得する。「配列同一性」の割合（％）は、２つの最適にアラインメントした配列を、比較ウィンドウにわたって比較することにより決定する。比較のために配列を最適にアラインメントする目的で、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の部分は、ギャップと呼ばれる付加又は欠失を含んでもよいが、参照配列は、不変のまま維持する。最適なアラインメントは、ギャップがあっても、参照及び比較配列間で、考えられる最大の「同一」位置を生み出すアラインメントである。２つの配列同士の「配列同一性」の割合（％）は、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（２００４年９月１日現在）から入手可能なプログラム「ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」のバージョンを用いて決定することができ、このプログラムは、プログラムＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列の比較用）とＢＬＡＳＴＰ（ポリペプチド配列の比較用）を含み、これらのプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（１２）：５８７３−５８７７，１９９３）のアルゴリズムに基づく。「ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」を使用する場合、２００４年９月１日現在デフォルトパラメータであるパラメータを語長（３）、オープンギャップペナルティ（１１）、伸長ギャップペナルティ（１）、ギャップドロップオフ（５０）、期待値（１０）について用いることができ、また、限定はしないが、マトリクスオプションなどの任意の他の必要なパラメータを用いてもよい。
【００４７】
用語「組成物」又は「医薬組成物」は、治療を必要とする被検者、例えば、肥満を治療中のヒト被検者への投与のための、例えば、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤と一緒に、本明細書に記載のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを含有する組成物を指す。
【００４８】
用語「薬学的に許容される」は、正しい医学的判断の範囲内で、過剰な毒性又は他の合併症なしに、妥当な利益／リスク比で、ヒト及び動物の組織との接触に好適な組成物を指す。
【００４９】
「有効な量」は、単一用量又はシリーズの一部としてのいずれかで、被検者に投与した場合、治療、例えば、肥満の治療に有効な、本明細書に記載するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドの量である。ある量は、例えば、その投与により、減量又は体重維持（例えば、増量の予防）、体脂肪の減少、低血糖の予防若しくは調節、高血糖の予防若しくは調節、インスリン合成の促進、又は食物摂取の抑制のうち１つ又は複数が達成されるとき、有効である。この量は、治療を受ける全ての被検者について一定量であってもよいし、又は治療しようとする被検者の体重、健康状態、及び体調、要望される減量又は体重維持の程度、ペプチドの製剤化、医学的状況の専門家による評価、並びに他の関連因子に応じて変動し得る。
【００５０】
用語「被検者」は、本明細書に記載するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを用いた治療を必要とする任意の被検者、特に哺乳動物の被検者を意味する。哺乳動物の被検者として、限定はしないが、ヒト、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、クマ、乳牛、類人猿、サル、オランウータン、及びチンパンジーなどが挙げられる。一実施形態では、被検者は、ヒト被検者である。
【００５１】
本明細書で用いる場合、「それを必要とする被検者」は、治療することが望ましい個体、例えば、体重若しくは体脂肪減少、体重若しくは体脂肪維持を促進すること又は、指定された期間にわたって増量を予防若しくは最小限にすることが望ましい肥満の被検者又は肥満になりやすい被検者を指す。
【００５２】
本明細書で用いる場合、「ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチド」は、グルカゴン受容体において、ネイティブグルカゴンと比べ、少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又はそれを超える活性を呈示し、かつ、アッセイ１の条件下で、ＧＬＰ−１受容体において、ネイティブＧＬＰ−１と比べ、少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又はそれを超える活性を呈示するキメラペプチドである。
【００５３】
本明細書で用いる場合、用語「ネイティブグルカゴン」は、配列番号１の配列を含む、天然に存在するグルカゴン、例えば、ヒトグルカゴンを指す。用語「ネイティブＧＬＰ−１」は、天然に存在するＧＬＰ−１、例えば、ヒトＧＬＰ−１を指し、例えば、ＧＬＰ−１（７〜３６）アミド（配列番号２）、ＧＬＰ−１（７〜３７）酸（配列番号３）又はこれら２つの化合物の混合物を包含する総称である。本明細書で用いる場合、「グルカゴン」又は「ＧＬＰ−１」は、それ以上の呼称がない場合、ネイティブヒトグルカゴン又はネイティブＧＬＰ−１をそれぞれ意味するものとする。他に指示のない限り、「グルカゴン」は、ヒトグルカゴンを指し、また、「ＧＬＰ−１」は、ヒト「ＧＬＰ−１」を指す。
【００５４】
ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチド
本明細書には、グルカゴン受容体とＧＬＰ−１受容体の両方に結合するペプチドが記載される。特定の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、グルカゴン及びＧＬＰ−１活性のコアゴニストである。このようなペプチドは、本明細書において、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドと呼ぶ。本明細書に記載するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、減量を促進し、増量を予防するか、又は望ましい体重を維持する上で好都合な比でＧＬＰ−１及びグルカゴン活性を有し、かつ最適化された可溶性、製剤化性、及び安定性を備える。特定の実施形態では、本明細書に記載するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、ヒトＧＬＰ−１及びヒトグルカゴン受容体において活性であり、特定の実施形態では、ＧＬＰ−１受容体において天然リガンドと比較した相対活性は、グルカゴン受容体でのものより、少なくとも約１倍、２倍、５倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、又は２５倍高い。
【００５５】
特定の実施形態では、本明細書に開示するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体において望ましい力価を有し、減量を促進する上で望ましい相対力価を有する。特定の実施形態では、開示するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、ｃＡＭＰアッセイ（実施例２を参照）でのＥＣ５０により示されるように、ＧＬＰ−１受容体において、１０，０００ｐＭ未満、５０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満のｉｎ  ｖｉｔｒｏ力価を呈示する。特定の実施形態では、本明細書に開示するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、ｃＡＭＰアッセイ（実施例２を参照）でのＥＣ５０により示されるように、グルカゴン受容体において、１０，０００ｐＭ未満、５０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満のｉｎ  ｖｉｔｒｏ力価を呈示する。特定の実施形態では、本明細書に開示するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、アッセイ２で用いる場合、ネイティブリガンドと比較して、約０．０１〜０．５０の範囲、例えば、約０．０２〜０．３０、例えば、約０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、又は０．３０の相対ＧＬＰ１−Ｒ／ｇｌｕｃＲ力価比を有する。
【００５６】
特定の実施形態では、開示するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、ｃＡＭＰアッセイ（実施例２を参照）でのＥＣ５０により示されるように、グルコース依存性インスリン分泌刺激ペプチド（胃抑制ペプチド）（ＧＩＰＲ：ｇａｓｔｒｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ）で、１０，０００ｐＭ未満、５０００ｐＭ未満、２５００ｐＭ未満、１０００ｐＭ未満、９００ｐＭ未満、８００ｐＭ未満、７００ｐＭ未満、６００ｐＭ未満、５００ｐＭ未満、４００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、２５ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１５ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、４ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は２ｐＭ未満のｉｎ  ｖｉｔｒｏ力価を呈示する。
【００５７】
特定の実施形態では、本明細書に開示するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、許容可能な可溶性、製剤化しやすさ、血漿安定性、及び改善された薬物動力学特性の１つ又は複数の基準を有する。特定の実施形態では、開示するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、広範なｐＨ範囲にわたって標準バッファー中に可溶性である。
【００５８】
特定の実施形態では、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、一般的バッファー溶液中に、最大０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、又はそれを超える濃度で、バッファー系に、例えば、０．２５〜１５０ｍＭのイオン強度の範囲で可溶性であり、限定はしないが、リン酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、グルタミン酸バッファー、酢酸バッファー、コハク酸バッファー、又はヒスチジンバッファーが挙げられる。例示的バッファーとしては、１００ｍＭグルタミン酸ｐＨ４．５バッファー、１００ｍＭ酢酸ｐＨ５バッファー、１００ｍＭコハク酸ｐＨ５バッファー、１００ｍＭリン酸ｐＨ６バッファー、１００ｍＭヒスチジンｐＨ６バッファー、１００ｍＭリン酸ｐＨ６．５バッファー、１００ｍＭリン酸ｐＨ７．０バッファー、１００ｍＭヒスチジンｐＨ７．０バッファー、１００ｍＭリン酸ｐＨ７．５バッファー、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５バッファー、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０バッファーが挙げられる。特定の実施形態では、開示するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、例えば、ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０のｐＨ範囲にわたって、例えば、ｐＨ４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、又は８．５で、０．８ｍｇ／ｍｌの標準的バッファーに可溶性である。特定の実施形態では、開示するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、ｐＨ４．５〜８．０、５．０〜８．０、５．５〜８．０、６．０〜８．０、６．５〜８．０、７．０〜８．０、４．５〜８．５、５．５〜８．５、５．５〜８．５、６．０〜８．５、６．５〜８．５、又は７．０〜８．５の標準的バッファーに可溶性である。
【００５９】
特定の実施形態では、開示するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、標準的医薬製剤中に製剤化可能である。例示的製剤として、限定はしないが、以下のものが挙げられる：０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  マンニトール、最終製剤ｐＨ＝７．２；０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  アルギニン／プロリン、最終製剤ｐＨ＝８．０；又はリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８）／１．８５％Ｗ／Ｖプロピレングリコール、最終製剤ｐＨ＝７．０。特定の実施形態では、開示するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、最大０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、又はそれを超える濃度で、上記又は他の製剤に可溶性である。
【００６０】
特定の実施形態では、開示するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、血清又は血漿中のプロテアーゼに対して許容可能に安定している。グルカゴン又はＧＬＰ−１の一般的分解産物としては、＋１産物（酸）及びＤＰＰ  ＩＶ−分解産物がある。＋１質量を有する産物は、グルタミンのアミド基又はＣ末端での脱アミド化から生じ得る。分解産物は、血漿中のプロテアーゼＤＰＰ  ＩＶの作用から生じ得る。特定の実施形態では、開示するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、３７℃の血漿中２４時間後、最大３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のレベルで血漿中に安定したままである。
【００６１】
本明細書において、アミノ酸配列：
【化８】
2016512213.tif 000009
（ここで、Ｘ1はＳ、Ｇ、α−アミノ−イソ−酪酸であり；Ｘ2は、Ｑ又はＥであり；Ｘ3は、Ｋ（ＰＥＧ４ｐａｌｍ）のＹであり；Ｘ4は、Ｅ、Ｒ又はＫ（ＰＥＧ４ｐａｌｍ）であり；Ｘ5は、Ｙ又はＫ（ＰＥＧ４ｐａｌｍ）であり；Ｘ6は、Ｌ又はＫ（ＰＥＧ４ｐａｌｍ）であり；Ｘ7は、Ｄ又はＥであり；Ｘ8は、Ｓ、Ｅ又はＫ（ＰＥＧ４ｐａｌｍ）であり；Ｘ9は、Ｒ、Ｅ、Ｓ、又はＫ（ｇＥｐａｌｍ）、Ｋ（ＰＥＧ２ｐａｌｍ）、Ｋ（ＰＥＧ３ｐａｌｍ）、Ｋ（ＰＥＧ４ｐａｌｍ）又はＫ（ＰＥＧ２−ＰＥＧ２−ｇＥｐａｌｍ）であり；Ｘ10は、Ｒ、Ａ、又はＫ（ｇＥｐａｌｍ）、Ｋ（ＰＥＧ４ｐａｌｍ）であり；Ｘ11は、Ｑ、Ｒ、Ａ、Ｅ又はＫ（ｇＥｐａｌｍ）、Ｋ（ＰＥＧ４ｐａｌｍ）であり；Ｘ12は、Ｄ又はＫ（ｇＥｐａｌｍ）であり；Ｘ13は、Ｑ、Ａ又はＥであり；Ｘ14は、Ｌ又はＥであり；Ｘ15は、Ｖ又はＥであり；Ｘ16は、非存在又はＡ（配列番号２）であり；分子あたり唯１つのアミノ酸が、パルミトイル化される）
を含むＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドが提供される。
【００６２】
前述したペプチドの特定の実施形態では、Ｘ15のカルボキシル基は、ペグ化されている。一部の実施形態では、ＰＥＧ基は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２単位のポリエチレングリコールオリゴマーである。一部の実施形態では、Ｘ15アミノ酸は、カルボキシル末端で、６−アミノヘキサン酸又は１１−アミノウンデカン酸に結合している。
【００６３】
特定の実施形態では、単離ペプチドは、以下：
【化９】
2016512213.tif 000010
【化１０】
2016512213.tif 000011
（Ｘ1は、α−アミノ−イソ−酪酸であり；
１０、１３、１４、１６、１７、１８、２０又は２１位のアミノ酸が、パルミトイル化リシンであるとき、１２位のリシンは、パルミトイル化されず；
１０、１３、１４、１６、１７、１８、２０及び２１位のアミノ酸が、パルミトイル化リシンではないとき、１２位のリシンは、任意選択でパルミトイル化され；また
ペプチドは、Ｃ末端アミノ酸で（ＰＥＧ）ｘ2基によりペグ化されており、
ここで、ｘ2は、２〜１２である）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６４】
本明細書に提供するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドとして、限定はしないが、表１に記載するペプチドが挙げられる（グルカゴンは、比較の目的で示すに過ぎず、本発明の一部を形成するわけではない）：
【００６５】
【表１】
2016512213.tif 000012
【００６６】
【表２】
2016512213.tif 000013
【００６７】
ここで、
Ｚｘは、ＰＥＧｘであり；Ｚ２は、ＰＥＧ２であり；Ｚ３は、ＰＥＧ３であり；Ｚ４は、ＰＥＧ４であり；Ｚ６は、ＰＥＧ６、Ｚ８は、ＰＥＧ８であり；Ｚ１２は、ＰＥＧ１２であり；
Ｘ１は、６−アミノヘキサン酸であり；Ｘ２は、１１−アミノウンデカン酸であり；Ｘ３は、α−アミノ−イソ−酪酸であり；Ｂは、Ｋ（ｇＥ−ｐａｌｍ）であり；Ｂ１は、Ｋ（ＰＥＧ４−ｐａｌｍ）であり；Ｂ２は、Ｋ（ＰＥＧ３−ｐａｌｍ）であり；Ｂ３は、Ｋ（ＰＥＧ２−ｐａｌｍ）であり；Ｂ４は、Ｋ（ＰＥＧ４−ｇＥ−ｐａｌｍ）であり；Ｂ５は、Ｋ（ＰＥＧ２−ｇＥ−ｐａｌｍ）であり；Ｂ６は、Ｋ（ＰＥＧ２−ＰＥＧ２−ｇＥ−ｐａｌｍ）である
「Ｋ（ｇＥ−Ｐａｌｍ）」は、γグルタミン酸リンカーを介してイプシロン（ε）窒素に結合したパルミトイル基を有するリシンを指す。
【００６８】
製造方法。本開示は、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドの製造方法を提供する。本明細書に記載するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、任意の好適な方法により製造することができる。例えば、特定の実施形態では、本明細書に記載するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、当業者には周知の方法、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）により記載される固相合成法により、化学的に合成される。例えば、標準的試薬（例えば、実施例１で説明するような）を用いる自動合成装置により、固相ペプチド合成を達成することができる。
【００６９】
あるいは、本明細書に記載するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、当業者には周知である好都合なベクター／宿主細胞の組み合わせを用いて、組換えにより生産することもできる。ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを組換えにより生産するための様々な方法が入手可能である。一般に、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を適切な発現ビヒクル、例えば、挿入されたコード配列の転写及び翻訳に必要なエレメントを含有するベクターに挿入する。ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドをコードする核酸を適正なリーディングフレーム内のベクターに挿入する。次に、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを発現する好適な宿主細胞に、発現ベクターをトランスフェクトする。好適な宿主細胞として、限定はしないが、細菌、酵母、又は哺乳動物細胞がある。市販の様々な宿主発現ベクター系を用いて、本明細書に記載のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを発現させ得る。
【００７０】
修飾、コンジュゲート、融合、及び誘導体化。特定の実施形態では、本明細書に記載のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、アミノ酸修飾により安定化される。特定の実施形態では、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基を、６−アミノヘキサン酸又は１１−アミノウンデカン酸との結合により修飾する。特定の実施形態では、１つ又は複数のアミノ酸残基がアシル化されているＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドが提供される。例えば、特定の実施形態では、本明細書に記載のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、１つ又は複数のリシン残基を含有するが、ここで、パルミトイル部分は、Ｎ（イプシロン（ε））基と結合している。特定の実施形態では、リシンとパルミトイル基との間に、リンカーが組み込まれる。このリンカーは、γグルタミン酸基、又は限定はしないが、βアラニン及びアミノヘキサン酸などの別のリンカー、あるいは、本明細書に記載するＰＥＧリンカーのいずれであってもよい。コレステロール又はミリストイル基の添加など、様々なアシル化方法を用いることができる。これ以外にも、リンカー−パルミトイル部分をシステインの側鎖に結合して、これを本明細書に記載する分子においてリシンの代わりに用いることができる。
【００７１】
上記に代わり、又はこれに加えて、例えば、半減期を延長するために、本明細書に記載のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを異種部分と結合することができる。異種部分は、タンパク質、ペプチド、タンパク質ドメイン、リンカー、有機ポリマー、無機ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ビオチン、アルブミン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＨＳＡ  ＦｃＲｎ結合部位、抗体、抗体のドメイン、抗体断片、単鎖抗体、ドメイン抗体、アルブミン結合ドメイン、酵素、リガンド、受容体、結合ペプチド、非ＦｎＩＩＩスカフォールド、エピトープタグ、組換えポリペプチドポリマー、サイトカイン、又はこれらの部分の２つ以上の組み合わせであってよい。
【００７２】
例えば、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを異種ポリペプチドと融合させることができる。組換え遺伝子融合及び発現又は化学結合のいずれかによって、本ペプチドをタンパク質と融合させることができる。融合するパートナーとして好適なタンパク質として、限定はしないが、ヒト血清アルブミン、抗体、及び抗体のＦｃ部分との融合を含む抗体断片がある。ＧＬＰ−１は、力価を保持しながら、これらのタンパク質と融合されている（Ｌ．Ｂａｇｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３  ２４９２−２５００（２００４）；Ｐ．Ｂａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  １３  ４２６−４３３（２０１１）；Ｐ．Ｐａｕｌｉｋ  ｅｔ  ａｌアメリカ糖尿病学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）２０１２，Ｐｏｓｔｅｒ  １９４６）。伸長された組換えペプチド配列は、ペプチドに高分子量を付与することも記載されている（Ｖ．Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２７  １１８６−１１９０（２００９）；ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（欧州特許出願公開第２１７３８９０号明細書））。特定の実施形態では、Ｃ末端での融合パートナー、例えば、アルブミン又はＦｃ部分と一緒に、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを融合タンパク質のＮ末端部分として組み込む。本明細書に記載のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、ヒト血清アルブミンに対する親和性を有する「Ａｌｂｕｄａｂｓ」などのペプチド又はタンパク質ドメインに融合することもできる（Ｍ．Ｓ．Ｄｅｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７  ３５０３５−３５０４３（２００２）；Ａ．Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ２３  ２７１−２７８（２０１０））。本明細書に開示するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを異種ポリペプチド、例えば、アルブミン又はＦｃ領域と融合させる方法は、当業者には周知である。
【００７３】
さらに安定化させるか、又は半減期を延長するために、他の異種部分をＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドと結合することもできる。化学的融合の場合、特定の実施形態は、遊離Ｎ末端の維持を特徴とするが、誘導体化のための別の地点を作製することもできる。さらに別の方法は、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの大きな化学物部分（ｌａｒｇｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｉｅｔｙ）とペプチドを誘導体化するものである。「ペグ化ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチド」は、これに共有結合したＰＥＧ鎖を有する。ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドの誘導体化、例えば、ペグ化を、パルミトイル化したリシン、あるいは、置換された、又は誘導体化を可能にするような伸長により組み込まれたシステインなどの残基において実施することができる。前述のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドフォーマットは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで、相対力価と、ＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体活性化の間の均衡とに関して特徴付けることができる。
【００７４】
一般的用語「ポリエチレングリコール鎖」又は「ＰＥＧ鎖」は、エチレンオキシドの縮合ポリマーと水の混合物を指し、これは、一般式Ｈ（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＨ（ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、又はそれを超える整数である）で表される分岐又は直鎖状である。ＰＥＧ鎖は、約５００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される平均総分子量を有するエチレングリコールのポリマーを含む。ＰＥＧ鎖の平均分子量は、数値により示され、例えば、ＰＥＧ−５，０００は、約５，０００の総平均分子量を有するポリエチレングリコール鎖を指す。
【００７５】
ＰＥＧ化は、当分野では公知のＰＥＧ化反応のいずれかにより実施することができる。例えば、Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，３：４−１０，１９９２及び欧州特許出願公開第０  １５４  ３１６号明細書及び同第０  ４０１  ３８４号明細書を参照されたい。ＰＥＧ化は、反応性ポリエチレングリコール分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応を用いて実施することができる。
【００７６】
ＰＥＧ化ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを調製する方法は、一般に、小さなアミノＰＥＧを樹脂にカップリングすることにより調製した後、他のアミノ酸を順次カップリングして、ＰＥＧ化ペプチドを作出するものである。従って、上記ステップは、概して、（ａ）アミノポリエチレングリコールを樹脂支持体と反応させた後、（ｂ）ペプチド鎖伸長を実施することを含む。
【００７７】
医薬組成物
さらには、代謝疾患、例えば、肥満の治療のために製剤化される、有効量の本明細書に記載のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを含有する組成物、例えば、医薬組成物が提供される。
【００７８】
本開示の組成物は、公知の方法に従い製剤化することができる。好適な調製方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１９版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９５）に記載されており、この文献は、参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。組成物は、限定はしないが、水溶液、エマルジョン、ゲル、懸濁液、凍結乾燥形態、又は当分野で知られる任意の他の形態などの様々な形態であってよい。さらに、組成物は、例えば、希釈剤、結合剤、安定剤、及び防腐剤などの薬学的に許容される添加剤を含んでもよい。製剤化されたら、本発明の組成物を被検者に直接投与することができる。
【００７９】
本発明の組成物と一緒に用いることができる担体は、当分野では公知であり、限定はしないが、例えば、チログロブリン、ヒト血清アルブミンのようなアルブミン、破傷風トキソイド、及びポリＬ−リシン、ポリＬ−グルタミン酸のようなポリアミノ酸、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質などが挙げられる。様々な水性担体を用いることができ、例えば、水、緩衝水、０．８％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などがある。従来の公知の滅菌技術で組成物を滅菌することもできるし、又は濾過滅菌することもできる。得られた組成物をそのまま、又は凍結乾燥して、使用のためにパッケージングすることができ、凍結乾燥した調製物は、投与前に滅菌液と合わせる。組成物は、生理学的条件に近づけるのに必要な、ｐＨ調節及び緩衝剤、張性調節剤、湿潤剤などの薬学的に許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどを含有してもよい。
【００８０】
肥満を治療する方法、モデル系
ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、グルカゴンの作用、例えば、食物摂取の阻害又は血糖値の調節と、ＧＬＰ−１の作用、例えば、胃運動性の阻害、又はインスリン放出の促進を組み合わせることができる。従って、これらは、過剰な脂肪組織の排除を加速し、持続可能な減量を誘導すると共に、血糖コントロールを改善することができる。ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドはまた、高コレステロール、及び高ＬＤＬ−コレステロール又は異常なＨＤＬ／ＬＤＬ比などの心血管リスク因子を低減するように作用することもできる。
【００８１】
本開示は、肥満又は肥満関連疾患若しくは障害を治療する方法を提供し、この方法は、治療を必要とする被検者に、本明細書に開示するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを投与するステップを含む。さらに、肥満又は肥満関連疾患若しくは障害の治療のためのＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドも提供される。さらには、肥満又は肥満関連疾患若しくは障害の治療のための薬剤の製造における、本明細書に記載のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドの使用も提供される。
【００８２】
本明細書に記載するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、増量の予防、減量の促進、過剰体重の低減、又は病的肥満を含む肥満の治療（例えば、食欲、給餌、食物摂取、カロリー摂取、及び／又はエネルギー消費の管理により）のために投与することができる。さらに、本明細書に記載するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、他の肥満関連代謝障害の治療に用いることもできる。他の肥満関連障害の例を以下に挙げるが、これらに限定されるわけではない：インスリン抵抗性、耐糖能障害、糖尿病前期、空腹時血糖値上昇、２型糖尿病、高血圧、脂質異常症（又はこれら代謝リスク因子の組み合わせ）、グルカゴン産生腫瘍、心血管疾患、例えば、うっ血性心不全、アテローム性動脈硬化（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｉｓ）、動脈硬化、冠動脈性心疾患、又は抹消動脈疾患、発作、呼吸不全、又は腎疾患。
【００８３】
「治療」は、有益又は要望される臨床結果を取得するアプローチである。本明細書に記載するように、開示されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドからの有益又は要望される臨床結果としては、限定はしないが、体重減少、増量の低減、食欲抑制、血清グルコース及び血清インスリンレベルの低減若しくは安定化、肥満関連疾患の程度の改善、緩和、安定化、軽減、又は肥満関連疾患進行の遅延若しくは緩徐化が挙げられる。「治療」は、特定の実施形態では、治療的処置と、予防又は防止的措置との両方を指す。治療を必要とする者は、疾患をすでに有する者、及び疾患を予防しようとする者を含む。治療とは、治療が存在しない場合と比較して、肥満関連症状（例えば、増量）の増大を阻害又は抑制することを意味し、必ずしも関連病状の完全な停止を包含することを意味するわけではない。
【００８４】
本明細書に記載するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドの投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入又は局部であってよい。本明細書で用いる場合、用語「非経口」は、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋内、皮下、直腸、又は膣内投与を含む。投与のための別の形態例として、注射液、特に、静脈内又は動脈内注射又は滴注用の溶液がある。本明細書に記載するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、単回用量又は複数回用量として投与することができる。特定の実施形態では、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、皮下注射により投与する。
【００８５】
非経口製剤は、単回ボーラス用量、注入又は負荷ボーラス用量（ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｏｌｕｓ  ｄｏｓｅ）に続く維持用量であってよい。これらの組成物は、特定の一定又は変動間隔、例えば、１日１回、又は「必要に応じた」基準に基づき、投与することができる。また、要望される最適応答（例えば、治療又は予防応答）をもたらすように、投与レジメンを調節することもできる。
【００８６】
投与しようとするＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドの量は、本開示によれば、過度の実験なしで、当業者によって容易に決定することができる。ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドの投与方式及びそれぞれの量に影響を与える因子として、限定はしないが、疾患の重症度（例えば、肥満の程度）、被検者の病歴、並びに治療を受けている被験者の年齢、身長、体重、健康状態、及び体調が挙げられる。同様に、投与しようとするＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドの量は、投与方式及び被検者が、この薬剤の単回用量又は複数回用量のいずれを受けるかによって変わり得る。特定の実施形態では、本明細書に記載するＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドは、注射により、１日１回投与することができる。一部の実施形態では、注射は、週１回投与する。
【００８７】
キット
また別の実施形態では、本開示は、ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを含むキットを提供し、これは、本明細書に記載の方法を実施するために用いることができる。特定の実施形態では、キットは、１つ又は複数の容器に入った、本明細書に開示のＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを含む。当業者であれば、当分野では公知の確立されたキットフォーマットの１つに、開示されるＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを容易に組み込むことができることを容易に認識されよう。
【実施例】
【００８８】
実施例１：ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドの合成、修飾、及び特性決定
ＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドを以下のように合成した：
Ａ．略語のリスト：
Ａｈｘ：６アミノヘキサン酸
Ａｉｂ：α−アミノイソ−酪酸
Ａｕｄ：１１−アミノウンデカン酸
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニル
ｔｅｒｔ−Ｂｕ：ｔｅｒｔ−ブチル
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＩＣ：ジイソプロピルカルボジイミド
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ：高性能液体クロマトグラフィー
Ｍｔｔ：４−メチルトリチル
ＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリドン
ｐａｌｍ：パルミチン酸
Ｐｂｆ：２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＩＳ：トリイソプロピルシラン
Ｔｒｔ：トリフェニルメチル、トリチル
【００８９】
Ｂ．ペプチド合成、精製、及び特性決定
ＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧＲ又は予めロードしたＦｍｏｃ−Ｗａｎｇ樹脂（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ）上でのペプチド鎖の伸長を、Ｐｒｅｌｕｄｅ固相ペプチド合成装置（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ，ＵＳＡ）を用いて実施した。Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）でのアミノ酸のヒドロキシベンゾトリアゾールエステルのカップリングのために製造者供給のプロトコルを適用した。アミノポリエチレングリコールのアミノ基及びアミノ酸のαアミノ基の半永久的保護のために、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基を使用し、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシンについてはｔｅｒｔ−ブチル（ｔｅｒｔ−Ｂｕ）で、アルギニンについては２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）で、また、ヒスチジンについてはトリチル（Ｔｒｔ）で、側鎖を保護した。１位のヒスチジンのＮ末端アミノ基をｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニル基（Ｂｏｃ）で保護した。続いて側鎖の化学修飾が必要であれば、Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）をペプチド鎖に組み込んだ。
【００９０】
ペプチド鎖伸長が終了したら、２％ＴＦＡ及び５％ＴＩＳを含有するＤＣＭ（１０×７ｍｌ、各０．５分）で、ペプチド樹脂を処理することにより、Ｍｔｔ基を除去した。アミノ酸、及びＰＥＧリンカー及び脂質部分とＬｙｓの側鎖のカップリングを、ＨＯＢｔの存在下で、カップリング試薬としてＤＩＣを用い、Ｐｒｅｌｕｄｅペプチド合成装置で実施した。
【００９１】
ＴＦＡ：ＴＩＳ：水（９５：２．５：２．５）の混合物を用いて、樹脂からペプチドを切断した。室温で２時間後、ペプチジル樹脂を濾過し、ＴＦＡで洗浄した後、合わせた濾液を真空で乾燥まで蒸発させた。残留物をエーテルと一緒に粉砕し、形成された沈殿物を濾過し、エーテルで洗浄した後、乾燥させた。粗ペプチドを水中の５％酢酸に溶解させ、Ｖａｒｉａｎ  ９２０−ＬＣシステムに取り付けたＰｏｌａｒｉｓ  ３  Ｃ８−Ａカラム上の逆相高速液体クロマトグラフィーにより分析した。１５分間にわたる１０〜９０％バッファーＢの標準勾配システムを分析に用いた。バッファーＡは、水中０．１％ＴＦＡであり、バッファーＢは、アセトニトリル中０．１％ＴＦＡであった。ＨＰＬＣプロフィールを２１０ｎｍで記録した。半分取Ｃ１８  ＲＰ  ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｗａｔｅｒｓカラムを用いたＶａｒｉａｎ  ＰｒｏＳｔａｒシステムで分取を実施した。３０分間にわたる、３０〜７０％バッファーＢの勾配で、水及びアセトニトリルの前述した溶媒系を分離に用いた。クロマトグラフィーにより均質な産物（＞９７％純度）をエレクトロスプレー質量分析により分析した（ＭａｓｓＬｙｎｘ，Ｗａｔｅｒｓ）。
【００９２】
実施例２：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
細胞ｃＡＭＰ活性アッセイにおけるペプチドの生物学的活性
ペプチドは、生物学的に活性であり、１つ又は複数の細胞受容体応答を刺激し得る。実施例１の方法により合成したＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドの生物学的活性を、生物学的活性、例えば、１つ又は複数の細胞受容体応答の刺激について、下記の方法により試験した。ヒト、マウス、ラット、又はイヌＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）、グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）又はグルコース依存性インスリン分泌性ペプチド（胃抑制ポリペプチド）受容体（ＧＩＰＲ）を発現する安定な細胞株を、標準的方法によりＨＥＫ２９３又はＣＨＯ細胞において産生させた。これら各種受容体のペプチド活性化により、ｃＡＭＰセカンドメッセンジャーの下流生産が起こるが、これは、機能活性アッセイで測定することができる。
【００９３】
Ａ．アッセイ方法：
アッセイ培地：０．５ｍＭ  ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ＃Ｉ７０１８）を含有する、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ＃４１９６６）中の１０％ＦＢＳ。
代替アッセイバッファー：０．５ｍＭ  ＩＢＭＸを含む、ＨＢＳＳ（カルシウム及びマグネシウム含有）、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ＃１５６３０）中の０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ＃Ａ３０５９）、ｐＨ７．４。
【００９４】
低タンパク質結合３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃７８１２８０）を用いて、アッセイ培地で作製した試験サンプルの１１回の１：５連続希釈を実施した。サンプル希釈物は全て、２回反復して作製した。
【００９５】
目的の受容体を発現する細胞の凍結クライオバイアル（ｃｒｙｏ−ｖｉａｌ）を水浴中で急速に解凍し、予熱したアッセイ培地に移した後、２４０×ｇで５分旋回させた。最適化濃度（すなわち、１×１０5細胞／ｍｌのｈＧＣＧｒ細胞、０．５×１０5細胞／ｍｌのｈＧＬＰ−１ｒ及びｈＧＩＰｒ細胞）で、細胞をアッセイ培地に再懸濁させた。
【００９６】
希釈プレートから、５ｍｃＬレプリカを黒色浅型ウェル（ｓｈａｌｌｏｗ−ｗｅｌｌ）Ｕ底３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３６７６）にスタンプした。これに、５ｍｃＬ細胞懸濁液を添加して、プレートを室温で３０分インキュベートした。
【００９７】
市販のｃＡＭＰダイナミック２ＨＴＲＦキット（Ｃｉｓｂｉｏ、Ｃａｔ♯６２ＡＭ４ＰＥＪ）を用いて、ｃＡＭＰレベルを測定した後、製造業者の推奨事項に従い、２つのステッププロトコルを実施した。手短には、抗ｃＡＭＰクリプテート（ドナー発蛍光団）及びｃＡＭＰ−ｄ２（アクセプター発蛍光団）を、キットに備えられたコンジュゲート及び溶解バッファーで各々１／２０希釈することにより、個別に作製した。５ｍｃＬの抗ｃＡＭＰクリプテートをアッセイプレートの全てのウェルに添加し、５ｍｃＬのｃＡＭＰ−ｄ２を、非特異的結合（ＮＳＢ）ウェル以外の全てのウェルに添加し、これらにコンジュゲート及び溶解バッファーを添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした後、励起波長３２０ｎｍ及び発光波長６２０ｎｍ及び６６５ｎｍを用いて、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。
％デルタＦ値は、各ウェルについて以下の通りである：
【数１】
2016512213.tif 000014
【００９８】
培地のみのウェル（非特異的結合（ＮＳＢ））を％デルタＦ計算用のバックグラウンドとして用いた。次に、Ｄａｔａ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒソフトウエアを用いて、４パラメータロジスティック解析によりデータを解析し、％活性化プロットとしてグラフ化し；このグラフから、各サンプルについてのＥＣ５０値を取得した。アッセイウィンドウは、基底の細胞ｃＡＭＰレベルとしてのネガティブコントロール（全結合をもたらす細胞と両ＨＴＲＦ試薬）と、参照リガンドコントロール（例えば、細胞とリガンド（例えば、ＧＬＰ−１）及び両ＨＴＲＦ試薬）により生じた最大応答によって定義されるポジティブコントロールにより決定する。
【００９９】
ＥＣ50は、基底及び最大応答間の中間の応答を誘導する濃度として定義される、５０％効果濃度を指す。ペプチドサンプルの連続希釈により、用量応答曲線を得ることができ、この曲線から、ＥＣ50値を決定することができる。ＥＣ50が低いほど、試験サンプルの力価は優れている。
【０１００】
合成したＧＬＰ−１／グルカゴンアゴニストペプチドと、ｃＡＭＰアッセイで決定したＥＣ５０値を表２に示す。
【０１０１】
【表３】
2016512213.tif 000015
【０１０２】
【表４】
2016512213.tif 000016
【０１０３】
本開示は、本開示の個別の態様の単一の例示として意図される記載の具体的実施形態、並びに本開示の範囲内で機能的に均等であるあらゆる組成物又は方法によって範囲を限定されるわけではない。実際に、本明細書において図示及び記載するもの以外に、本開示の様々な改変形態が、以上の説明及び添付の図面から、当業者には明らかになるであろう。こうした改変形態は、添付する特許請求の範囲に含まれるものとする。
【０１０４】
本明細書で述べた全ての刊行物及び特許出願は、あたかも各刊行物又は特許出願が、具体的かつ個別に参照により組み込まれると示されているのと同じ範囲まで、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【配列表】
2016512213000001.app
【国際調査報告】
2016512213.tif 000026
2016512213.tif 000027
2016512213.tif 000028
2016512213.tif 000029
2016512213.tif 000030