(57)【要約】  本発明は、ＭＬＬ１をコードする核酸における変異の存在もしくは非存在について、または低下したレベルのＭＬＬ１の存在についてのアッセイに基づいた選択的癌治療レジメンを部分的に対象とする。2016512812.tif 000003
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を有する対象を選択的に治療する方法であって、治療有効量の（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）、またはその薬学的に許容される塩を、前記対象のＭＬＬ１レベルが低下していることに基づいて、前記対象に選択的に投与するステップを含む、方法。
【請求項２】
癌を有する対象を選択的に治療する方法であって、
ａ）ＭＬＬ１のレベルについて前記対象由来の生体試料をアッセイするステップ、および
ｂ）治療有効量の（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）、またはその薬学的に許容される塩を、前記試料が低下したレベルのＭＬＬ１を有することに基づいて、前記対象に選択的に投与するステップ
を含む、方法。
【請求項３】
癌を有する対象を選択的に治療する方法であって、
ａ）治療有効量の（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）、またはその薬学的に許容される塩を、試料が低下したレベルのＭＬＬ１を有することに基づいて、前記対象に選択的に投与するステップ
を含む、方法。
【請求項４】
癌を有する対象を選択的に治療する方法であって、
ａ）ＭＬＬ１のレベルについて前記対象由来の生体試料をアッセイするステップ、
ｂ）その後、前記対象が低下したレベルのＭＬＬ１を有することに基づいて、（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）、またはその薬学的に許容される塩による治療のために、前記対象を選択するステップ、および
ｃ）その後、（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）またはその薬学的に許容される塩を、前記対象が低下したレベルのＭＬＬ１を有することに基づいて、前記対象に投与するステップ
を含む、方法。
【請求項５】
癌を有する対象を選択的に治療する方法であって、
ａ）前記対象由来の生体試料中のＭＬＬ１のレベルを判定するステップであって、低下したレベルのＭＬＬ１の存在は、前記対象が、ＨＳＰ９０阻害化合物（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）またはその薬学的に許容される塩による治療に反応する可能性が高いことを示す、ステップ、および
ｄ）その後、前記対象由来の前記試料が低下したレベルのＭＬＬ１を有することに基づいて、前記ＨＳＰ９０阻害化合物（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）による治療のために、前記対象を選択するステップ
を含む、方法。
【請求項６】
癌を有する治療対象を選択する方法であって、前記対象由来の生体試料中のＭＬＬ１のレベルを判定するステップであって、低下したレベルのＭＬＬ１の存在は、前記対象が、ＨＳＰ９０阻害化合物（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）またはその薬学的に許容される塩による治療に反応する可能性が高いことを示す、ステップを含む、方法。
【請求項７】
癌を有する治療対象を選択する方法であって、ＭＬＬ１のレベルについて癌を有する前記対象から得た核酸試料をアッセイするステップであって、低下したレベルのＭＬＬ１の存在は、前記対象が、ＨＳＰ９０阻害化合物（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）またはその薬学的に許容される塩による治療に反応する可能性が高いことを示す、ステップを含む、方法。
【請求項８】
個体の遺伝子型を決定する方法であって、ＰＩ３Ｋのコードされたｐ１１０α触媒サブユニットの８５９位にアミノ酸変異体を生じる遺伝的変異体を検出するステップであって、８５９位における変異体の欠失は、（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）が前記個体に投与されるべきであることを示す、ステップを含む、方法。
【請求項９】
個体の遺伝子型を決定する方法であって、前記個体から得たＰＩ３Ｋ遺伝子のｐ１１０α触媒サブユニットにおける２５７５〜２５７７位でのＣＡＡの有無を検出するステップであって、ＣＡＡの存在は、前記個体が、（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）に反応する可能性が高いことを示す、ステップを含む、方法。
【請求項１０】
癌を治療する際に使用するための、ＨＳＰ９０阻害化合物（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）、またはその薬学的に許容される塩であって、治療有効量の前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、以下の位置：
（ａ）ＦＭＲ１ゲノム遺伝子座の第Ｘ染色体上の１４６９８２０００〜１４６９８４５００、
（ｂ）ＦＭＲ１ゲノム遺伝子座の第Ｘ染色体上の１４６９９１５００〜１４６９９３６００、
（ｃ）ＦＭＲ１ゲノム遺伝子座の第Ｘ染色体上の１４６９９４３００〜１４７００５５００、または
（ｄ）ＦＭＲ１ゲノム遺伝子座の第Ｘ染色体上の１４７０２３８００〜１４７０２７４００
の１つまたは複数にて、対照と比較して個体のＭＬＬ１レベルが低下していることに基づいて、前記個体に投与されることを特徴とする、前記化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１１】
癌を治療する際に使用するための、ＨＳＰ９０阻害化合物（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）、またはその薬学的に許容される塩であって、治療有効量の前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、以下の位置：
（ａ）ＦＭＲ１ゲノム遺伝子座の第Ｘ染色体上の１４６９８２０００〜１４６９８４５００、
（ｂ）ＦＭＲ１ゲノム遺伝子座の第Ｘ染色体上の１４６９９１５００〜１４６９９３６００、
（ｃ）ＦＭＲ１ゲノム遺伝子座の第Ｘ染色体上の１４６９９４３００〜１４７００５５００、または
（ｄ）ＦＭＲ１ゲノム遺伝子座の第Ｘ染色体上の１４７０２３８００〜１４７０２７４００
の１つまたは複数にて、対照と比較して低下したレベルのＭＬＬ１を有すると判定されている個体由来の試料に基づいて、前記個体に投与されることを特徴とする、前記化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１２】
前記癌が、神経膠芽腫、黒色腫、卵巣癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、子宮内膜癌、前立腺癌、結腸癌および骨髄腫からなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料が腫瘍試料である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記腫瘍試料が、新鮮な凍結試料またはパラフィン包埋組織試料である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出するステップが、免疫学的検定、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、ＨＰＬＣ、および質量分析によって実施できる、請求項１から６および１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＩ３Ｋの前記ｐ１１０α触媒サブユニットをコードする核酸分子における変異の有無が、ノーザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＴａｑＭａｎベースのアッセイ、直接シークエンシング、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、高密度オリゴヌクレオチドＳＮＰアレイ、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）アッセイ、プライマー伸長アッセイ、オリゴヌクレオチドリガーゼアッセイ、一本鎖高次構造多型の分析、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、変性高速液体クロマトグラフィー、高解像度融解分析、ＤＮＡミスマッチ結合タンパク質アッセイ、ＳＮＰＬｅｘ（登録商標）、キャピラリー電気泳動、サザンブロットからなる群から選択される技術によって検出できる、請求項７から１３および１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出するステップが、ＰＩ３Ｋのｐ１１０α触媒サブユニット遺伝子またはその一部をシークエンシングすることを含む、請求項７から１２または１５に記載の方法。
【請求項１８】
（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）による治療に対する癌患者の反応性を予測するための伝達形式情報を生成する方法であって、
ａ）前記患者が、（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）による治療に反応する可能性の増加を対象が有するかどうかを判定するステップであって、前記対象が、低下したレベルのＭＬＬ１を有することに基づいて可能性の増加を有する、ステップと、
ｂ）伝達に使用するための有形または無形の表現媒体形式に、前記判定するステップの結果を記録するステップと
を含む、方法。
【請求項１９】
腫瘍が、ＨＳＰ９０阻害化合物（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）またはその薬学的に許容される塩による治療に反応するかどうかを判定するためのキットであって、ＰＩ３Ｋ遺伝子座（配列番号２の核酸２５７５〜２５７７）における変異の存在を検出するための１つまたは複数のプローブまたはプライマー、および使用説明書の提供を含む、キット。
【請求項２０】
癌を有する対象が、ＨＳＰ９０阻害化合物（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）またはその薬学的に許容される塩による治療から受益するかどうかを予測するためのキットであって、
ｅ）ＰＩ３Ｋのｐ１１０α触媒サブユニットの８５９位における、変異体をコードする変異の存在を判定するための複数の薬剤、および
ｆ）使用説明書
を含む、キット。
【請求項２１】
腫瘍が、ＨＳＰ９０阻害化合物（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）またはその薬学的に許容される塩による治療に反応するかどうかを判定するためのキットであって、ＰＩ３Ｋ遺伝子のｐ１１０α触媒サブユニットの８５９位における、変異体をコードする変異の有無を検出するための１つまたは複数のプローブまたはプライマーの提供を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、癌患者を治療する際に使用するための新規の個別療法、キット、伝達形式情報（transmittable form of information）および方法を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）は抗癌標的として認識されている。Ｈｓｐ９０は、クライアントタンパク質の立体配座の安定性、形状および機能を確実にする分子シャペロンとして機能する非常に豊富な必須タンパク質である。シャペロンのＨｓｐ９０ファミリーは、４種のメンバー：両方ともサイトゾル中に位置するＨｓｐ９０αおよびＨｓｐ９０β、小胞体中のＧＲＰ９４、およびミトコンドリア中のＴＲＡＰ１からなる。Ｈｓｐ９０は総タンパク質の約１％〜２％を構成する豊富な細胞シャペロンである。
【０００３】
ストレスタンパク質の中で、Ｈｓｐ９０は、大部分のポリペプチドの生合成に必要とされないため特有である。Ｈｓｐ９０は、成長制御、細胞生存および組織発達において決定的な役割を果たす立体配座的に不安定なシグナル伝達因子である、「クライアントタンパク質」と呼ばれる、発癌タンパク質との複合体を形成する。このような結合はこれらのクライアントタンパク質の分解を阻止する。Ｒａｆ、ＡＫＴ、ホスホ−ＡＫＴ、ＣＤＫ４およびＥｒｂＢ２を含むＥＧＦＲファミリーなどのＨｓｐ９０クライアントタンパク質のサブセットは、全て癌細胞において重要なプロセスである、細胞成長、分化およびアポトーシスに決定的に関与している発癌性シグナル伝達分子である。Ｈｓｐ９０の固有ＡＴＰアーゼ活性の阻害は、Ｈｓｐ９０−クライアントタンパク質の相互作用を混乱させ、ユビキチンプロテアソーム経路によるそれらの分解をもたらす。
【０００４】
それらのＮ末端ドメインにおいて保存されているＡＴＰ結合部位を有する、Ｈｓｐ９０シャペロンは、ＤＮＡギラーゼ、Ｈｓｐ９０、ヒスチジンキナーゼおよびＭｕｔＬ（ＧＨＫＬ）サブファミリーとして知られている小さなＡＴＰアーゼサブファミリーに属する。Ｈｓｐ９０のシャペロニング（chaperoning）（フォールディング）活性は、単離した酵素について弱いそのＡＴＰアーゼ活性に依存する。しかしながら、Ｈｓｐ９０のＡＴＰアーゼ活性は、コシャペロンとして知られているタンパク質とのその会合によって増強されることが示されている。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏで、Ｈｓｐ９０タンパク質は、大きな動的タンパク質複合体のサブユニットとして作用する。Ｈｓｐ９０は真核細胞生存に必須であり、多くの腫瘍において過剰発現している。
【０００５】
ＨＳＰ９０阻害剤は、新生ポリペプチドのフォールディングおよびタンパク質複合体の正確な構築または分解に役立つＨＳＰ９０の機能を阻止し、癌細胞成長、分化および生存を抑制する。ＡＵＹ９２２およびＨＳＰ９９０は、新規の非ゲルダナマイシン誘導体であるＨＳＰ９０阻害剤であり、広範囲の変異型および野生型のヒト癌において有意な抗腫瘍活性を示した。
【０００６】
しかしながら、ＨＳＰ９０阻害剤の有効性はＨＳＰ９０阻害に対する癌細胞反応によって減少する。本発明者らの以前の研究により、熱ショック転写因子１（ＨＳＦ１）依存性熱ショック反応は、ＨＳＰ９０阻害剤の有効性を制限する正のフィードバックループを媒介するのに重要であることが示されている。ＨＳＰ９０阻害剤と組み合わせたＨＳＦ１ノックダウンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖およびｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍成長に対して著しい阻害効果を引き起こした。ＨＳＦ１ノックダウンはまた、発癌タンパク質を分解し、癌細胞アポトーシスを誘導し、ＥＲＫ経路の活性を減少させるＨＳＰ９０阻害剤の能力を増強した。ＨＳＦ１発現はまた、ＨＣＣにおいて顕著に上方制御される。
【０００７】
ＨＳＦ１転写活性は、ＨＳＰ９０阻害剤によって誘導され、保護「熱ショック」反応および他の転写プログラムを上方制御することにより耐性機構を提供する。しかしながら、ＨＳＦ１は転写因子であり、現段階でアンドラッガブル（undruggable）である。これにより、本発明者らは、ＨＳＰ９０阻害剤により誘導されるＨＳＦ１転写活性に重要であるＨＳＦ１の決定的なドラッガブル（druggable）転写調節因子を同定することを促された。これらの新たに同定されたＨＳＦ１調節因子は、本発明者らが、ＨＳＦ１転写機能がどのように調節されているかを理解することに役立つ。
【０００８】
患者の遺伝子プロファイルが、治療的治療に対する患者の反応性に決定的であり得ることを示唆している証拠が増加している。癌を有する個体に利用可能な非常に多くの療法を考慮して、例えば、特定の薬物に対する反応に影響を与える遺伝因子の決定が、患者に個別治療レジメンを提供するために使用され得る。このような個別治療レジメンは、代替および効果の少ない治療レジメンと関係があり得る、関連する副作用を最小化しながら、患者に対する治療的有用性を最大化する可能性を与える。したがって、患者が特定の治療的療法に反応する可能性があるかどうかを予測するために使用され得る因子を同定する必要がある。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、癌細胞における酵素Ｈ３Ｋ４メチルトランスフェラーゼＭＬＬ１の発現レベルが、Ｈｓｐ９０の固有ＡＴＰアーゼ活性を標的化し、減少させ、もしくは阻害する、および／またはユビキチンプロテオソーム経路を介してＨｓｐ９０クライアントタンパク質を分解し、標的化し、減少させ、もしくは阻害する、治療有効量の少なくとも１つの化合物による治療に反応する可能性がある、癌を有する個体を選択するために使用できるという知見に基づく。このような化合物は、「熱ショックタンパク質９０阻害剤」または「Ｈｓｐ９０阻害剤と称される。本発明における使用に適したＨｓｐ９０阻害剤の例には、限定されないが、ゲルダナマイシン誘導体、タネスピマイシン（１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン）（ＫＯＳ−９５３および１７−ＡＡＧとしても知られている）；ラディシコール；６−クロロ−９−（４−メトキシ−３，５−ジメチルピリジン−２−イルメチル）−９Ｈ−プリン−２−アミンメタンスルホネート（ＣＮＦ２０２４としても知られている）；ＩＰＩ５０４；ＳＮＸ５４２２；５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）；および（Ｒ）−２−アミノ−７−［４−フルオロ−２−（６−メトキシ−ピリジン−２−イル）−フェニル］−４−メチル−７，８−ジヒドロ−６Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−５−オン（ＨＳＰ９９０）；またはそれらの薬学的に許容される塩が含まれる。
【００１０】
特に、癌を有する個体由来の試料中の低下したレベルのＭＬＬ１が、個体が、ＨＳＰ９０阻害化合物５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）、またはその薬学的に許容される塩による治療に反応するかどうかを選択するために使用できることが見出された。判定するステップは、目的の対象物（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質など）について個体由来の生体試料を直接アッセイすることによって実施できる。
【００１１】
一態様において、本発明は、癌を有する対象を選択的に治療する方法であって、治療有効量の（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）、またはその薬学的に許容される塩を、対象のＭＬＬ１レベルが低下していること基づいて、対象に選択的に投与するステップを含む、方法を含む。
【００１２】
別の態様において、本発明は、癌を有する対象を選択的に治療する方法であって、
ａ）ＭＬＬ１のレベルについて対象由来の生体試料をアッセイするステップ、および
ｂ）治療有効量の（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）、またはその薬学的に許容される塩を、試料が低下したレベルのＭＬＬ１を有することに基づいて、対象に選択的に投与するステップを含む、方法を含む。
【００１３】
さらに別の態様において、本発明は、癌を有する対象を選択的に治療する方法であって、
ａ）治療有効量の（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）、またはその薬学的に許容される塩を、試料が低下したレベルのＭＬＬ１を有することに基づいて、対象に選択的に投与するステップ
を含む、方法を含む。
【００１４】
さらに別の態様において、本発明は、癌を有する対象を選択的に治療する方法であって、
ａ）ＭＬＬ１のレベルについて対象由来の生体試料をアッセイするステップ、
ｂ）その後、対象が低下したレベルのＭＬＬ１を有することに基づいて、（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）、またはその薬学的に許容される塩による治療のために、対象を選択するステップ、および
ｃ）その後、（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）またはその薬学的に許容される塩を、対象が低下したレベルのＭＬＬ１を有することに基づいて、対象に投与するステップ
を含む、方法を含む。
【００１５】
別の態様において、本発明は、癌を有する対象を選択的に治療する方法であって、
ａ）対象由来の生体試料中のＭＬＬ１のレベルを判定するステップであって、低下したレベルのＭＬＬ１の存在は、対象が、ＨＳＰ９０阻害化合物（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）またはその薬学的に許容される塩による治療に反応する可能性が高いことを示す、ステップ、および
ｂ）その後、対象由来の試料が低下したレベルのＭＬＬ１を有することに基づいて、ＨＳＰ９０阻害化合物（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）による治療のために、対象を選択するステップ
を含む、方法を含む。
【００１６】
別の態様において、本発明は、癌を有する治療対象を選択する方法であって、対象由来の生体試料中のＭＬＬ１のレベルを判定するステップであって、低下したレベルのＭＬＬ１の存在は、対象が、ＨＳＰ９０阻害化合物（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）またはその薬学的に許容される塩による治療に反応する可能性が高いことを示す、ステップを含む、方法を含む。
【００１７】
別の態様において、本発明は、癌を有する治療対象を選択する方法であって、ＭＬＬ１のレベルについて癌を有する対象から得た核酸試料をアッセイするステップであって、低下したレベルのＭＬＬ１の存在は、対象が、ＨＳＰ９０阻害化合物（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）またはその薬学的に許容される塩による治療に反応する可能性が高いことを示す、ステップを含む、方法を含む。
【００１８】
さらに別の態様において、本発明は、個体の遺伝子型を決定する方法であって、ＰＩ３Ｋのコードされたｐ１１０α触媒サブユニットの８５９位にアミノ酸変異体を生じる遺伝的変異体を検出するステップであって、８５９位における変異体の欠失は、（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）が個体に投与されるべきであることを示す、ステップを含む、方法を含む。
【００１９】
さらに別の態様において、本発明は、個体の遺伝子型を決定する方法であって、前記個体から得たＰＩ３Ｋ遺伝子のｐ１１０α触媒サブユニットにおける２５７５〜２５７７位でのＣＡＡの有無を検出するステップであって、ＣＡＡの存在は、個体が、（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）に反応する可能性が高いことを示す、ステップを含む、方法を含む。
【００２０】
別の態様において、本発明は、癌を治療する際に使用するための、ＨＳＰ９０阻害化合物（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）、またはその薬学的に許容される塩であって、治療有効量の前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、以下の位置：
（ａ）ＦＭＲ１ゲノム遺伝子座の第Ｘ染色体上の１４６９８２０００〜１４６９８４５００、
（ｂ）ＦＭＲ１ゲノム遺伝子座の第Ｘ染色体上の１４６９９１５００〜１４６９９３６００、
（ｃ）ＦＭＲ１ゲノム遺伝子座の第Ｘ染色体上の１４６９９４３００〜１４７００５５００、または
（ｄ）ＦＭＲ１ゲノム遺伝子座の第Ｘ染色体上の１４７０２３８００〜１４７０２７４００
の１つまたは複数にて、対照と比較して個体のＭＬＬ１レベルが低下していることに基づいて個体に投与されることを特徴とする、前記化合物またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００２１】
さらに別の態様において、本発明は、癌を治療する際に使用するための、ＨＳＰ９０阻害化合物（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）、またはその薬学的に許容される塩であって、治療有効量の前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、以下の位置：
（ａ）ＦＭＲ１ゲノム遺伝子座の第Ｘ染色体上の１４６９８２０００〜１４６９８４５００、
（ｂ）ＦＭＲ１ゲノム遺伝子座の第Ｘ染色体上の１４６９９１５００〜１４６９９３６００、
（ｃ）ＦＭＲ１ゲノム遺伝子座の第Ｘ染色体上の１４６９９４３００〜１４７００５５００、または
（ｄ）ＦＭＲ１ゲノム遺伝子座の第Ｘ染色体上の１４７０２３８００〜１４７０２７４００
の１つまたは複数にて、対照と比較して低下したレベルのＭＬＬ１を有すると判定されている個体由来の試料に基づいて、個体に投与されることを特徴とする、前記化合物またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００２２】
また、本明細書に記載されている本発明の方法において、癌は、神経膠芽腫、黒色腫、卵巣癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、子宮内膜癌、前立腺癌、結腸癌および骨髄腫を含む、任意の癌であってもよい。典型的に、試料は腫瘍試料であり、新鮮な凍結試料またはパラフィン包埋組織試料であってもよい。
【００２３】
本明細書に記載されている本発明の方法において、グルタミンまたは変異体アミノ酸を検出する方法は、免疫学的検定、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、ＨＰＬＣ、および質量分析などの当該分野において公知の任意の方法によって実施できる。加えて、本明細書に記載されている本発明の方法において、ＰＩ３Ｋのｐ１１０α触媒サブユニットをコードする核酸分子における変異を検出する方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＴａｑＭａｎベースのアッセイ、直接シークエンシング、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、高密度オリゴヌクレオチドＳＮＰアレイ、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）アッセイ、プライマー伸長アッセイ、オリゴヌクレオチドリガーゼアッセイ、一本鎖高次構造多型の分析、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、変性高速液体クロマトグラフィー、高解像度融解分析、ＤＮＡミスマッチ結合タンパク質アッセイ、ＳＮＰＬｅｘ（登録商標）、またはキャピラリー電気泳動を含む。
【００２４】
本発明は、（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）による治療に対する癌患者の反応性を予測するための伝達形式情報を生成する方法であって、
ａ）患者が、（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）による治療に反応する可能性の増加を対象が示すかどうかを判定するステップであって、対象が、低下したレベルのＭＬＬ１を有することに基づいて可能性の増加を示す、ステップ、および
ｂ）伝達に使用するための有形または無形の表現媒体形に、判定するステップの結果を記録するステップ
を含む、方法をさらに含む。
【００２５】
さらに別の態様において、本発明は、腫瘍が、ＨＳＰ９０阻害化合物（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）またはその薬学的に許容される塩による治療に反応するかどうかを判定するためのキットであって、ＰＩ３Ｋ遺伝子座（配列番号２の核酸２５７５〜２５７７）における変異の存在を検出するための１つまたは複数のプローブまたはプライマー、および使用説明書の提供を含む、キットを含む。
【００２６】
別の態様において、本発明は、癌を有する対象が、ＨＳＰ９０阻害化合物（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）またはその薬学的に許容される塩による治療から受益するかどうかを予測するためのキットであって、
ａ）ＰＩ３Ｋのｐ１１０α触媒サブユニットの８５９位に変異体をコードする変異の存在を判定するための複数の薬剤、および
ｂ）使用説明書
を含む、キットを含む。
【００２７】
本明細書に記載されている本発明の方法において、ＨＳＰ９０阻害剤は、Ｈｓｐ９０の固有ＡＴＰアーゼ活性を標的化し、減少させ、もしくは阻害する、および／またはユビキチンプロテオソーム経路を介してＨｓｐ９０クライアントタンパク質を分解し、標的化し、減少させ、もしくは阻害する任意の公知の化合物である。このような化合物は、「熱ショックタンパク質９０阻害剤」または「Ｈｓｐ９０阻害剤と称される。本発明における使用に適したＨｓｐ９０阻害剤の例には、限定されないが、ゲルダナマイシン誘導体、タネスピマイシン（１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン）（ＫＯＳ−９５３および１７−ＡＡＧとしても知られている）；ラディシコール；６−クロロ−９−（４−メトキシ−３，５−ジメチルピリジン−２−イルメチル）−９Ｈ−プリン−２−アミンメタンスルホネート（ＣＮＦ２０２４としても知られている）；ＩＰＩ５０４；ＳＮＸ５４２２；５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）；および（Ｒ）−２−アミノ−７−［４−フルオロ−２−（６−メトキシ−ピリジン−２−イル）−フェニル］−４−メチル−７，８−ジヒドロ−６Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−５−オン（ＨＳＰ９９０）が含まれる。特に、化合物は、５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）またはその薬学的に許容される塩であってもよく、以下の式（Ａ）
【００２８】
【化１】
2016512812.tif 000002
またはその薬学的に許容される塩としても示される。
【００２９】
別の態様において、本発明は、腫瘍が、ＨＳＰ９０阻害化合物（５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）またはその薬学的に許容される塩による治療に反応するかどうかを判定するためのキットであって、８５９位にＰＩ３Ｋ遺伝子のｐ１１０α触媒サブユニットにおける変異体をコードする変異の有無を検出するための１つまたは複数のプローブまたはプライマーの提供を含む、キットを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】ｓｉＲＮＡスクリーニングによる、ＨＳＰ９０阻害に反応するＨＳＦ１の新規共調節因子としてのＭＬＬ１の同定  Ａ．ｓｉＲＮＡスクリーニング実験設計の概略図。
【図１Ｂ】ｓｉＲＮＡスクリーニングによる、ＨＳＰ９０阻害に反応するＨＳＦ１の新規共調節因子としてのＭＬＬ１の同定  Ｂ．各ｓｉＲＮＡヒットの散布図は１００ｎＭのＡＵＹ９２２で処理した試料または対照ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）試料からの数を読み取った。プロットにおける各ドットは１つの個体のｓｉＲＮＡヒットを表す。カットオフラインはＨＳＰ９０阻害剤およびｓｉＲＮＡ処理後の７０％超のルシフェラーゼ活性の減少および３０％未満の細胞生存率の減少に基づいた。
【図１Ｃ】ｓｉＲＮＡスクリーニングによる、ＨＳＰ９０阻害に反応するＨＳＦ１の新規共調節因子としてのＭＬＬ１の同定  Ｃ．ＨＳＰ７０プロモーターまたはＨＳＰ７０（ｍＨＳＦ１）プロモーターにより駆動されるルシフェラーゼレポーターでトランスフェクトしたＡ３７５細胞を３日間ｓｉＲＮＡで処理し、次いでその後、ＡＵＹ９２２処理を１時間行い、次いでルシフェラーゼアッセイを実施するために収集した。
【図１Ｄ】ｓｉＲＮＡスクリーニングによる、ＨＳＰ９０阻害に反応するＨＳＦ１の新規共調節因子としてのＭＬＬ１の同定  Ｄ．ＨＳＰ７０プロモーターにより駆動されるルシフェラーゼレポーターでトランスフェクトしたＡ３７５細胞を３日間ｓｉＲＮＡで処理し、次いで細胞を熱ショックし（３０分間、４２℃）、１時間、３７℃に戻し、次いでルシフェラーゼアッセイを実施するために収集した。
【図１Ｅ】ｓｉＲＮＡスクリーニングによる、ＨＳＰ９０阻害に反応するＨＳＦ１の新規共調節因子としてのＭＬＬ１の同定  Ｅ．ＭＬＬ１は、ＨＳＦ１を過剰発現したＡ３７５細胞においてＨＳＦ１と相互作用する。ＨＳＦ１−ＨＡ過剰発現誘導性レンチウイルスで形質導入したＡ３７５細胞を３日間ドキシサイクリンで処理し、次いでその後、６時間、ＡＵＹ９２２で処理したまたは処理しなかった。Ａ３７５細胞からの核細胞抽出物を、ＭＬＬ１−Ｃ抗体または抗ＨＡ結合ビーズで免疫沈降した。沈降した免疫複合体を、ＨＳＦ１またはＭＬＬ１−Ｃに対する抗体を用いてＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングによって分画した。
【図１Ｆ】ｓｉＲＮＡスクリーニングによる、ＨＳＰ９０阻害に反応するＨＳＦ１の新規共調節因子としてのＭＬＬ１の同定  Ｆ．ＭＬＬ１複合体の構成成分はＨＳＦ１と相互作用する。
【図１Ｇ】ｓｉＲＮＡスクリーニングによる、ＨＳＰ９０阻害に反応するＨＳＦ１の新規共調節因子としてのＭＬＬ１の同定  Ｇ．ＭＬＬ１はＡ３７５細胞においてＨＳＦ１と相互作用する。Ａ３７５細胞を６時間、ＡＵＹ９２２で処理したまたは処理しなかった。Ａ３７５細胞からの核細胞抽出物をＭＬＬ１−ＣまたはＨＳＦ１抗体で免疫沈降した。沈降した免疫複合体を、ＨＳＦ１またはＭＬＬ１−Ｃに対する抗体を用いてＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングにより分画した。
【図２Ａ】ＭＬＬ１は、ＨＳＦ−１依存性転写活性を調節し、ＨＳＰ９０阻害下でＨＳＦ１標的遺伝子プロモーターに結合する  Ａ．遺伝子がＡＵＹ９２２によって上方制御されたが、その上方制御はＭＬＬ１ノックダウンにより損なわれたことを示すヒートマップ。ｓｈＭＬＬ１形質導入Ａ３７５細胞を、３日間ドキシサイクリンを用いてまたは用いずに処理し、３時間、ＡＵＹ９２２  １００ｎＭでさらに処理した。全ＲＮＡを回収し、マイクロアレイを実施した。
【図２Ｂ】ＭＬＬ１は、ＨＳＦ−１依存性転写活性を調節し、ＨＳＰ９０阻害下でＨＳＦ１標的遺伝子プロモーターに結合する  Ｂ．ＭＬＬ１ノックダウンを用いたまたは用いていないＨＳＰ９０阻害剤処理の下での細胞中のＨＳＰ７０およびＢＡＧ３の発現のリアルタイムＰＣＲ分析。
【図２Ｃ】ＭＬＬ１は、ＨＳＦ−１依存性転写活性を調節し、ＨＳＰ９０阻害下でＨＳＦ１標的遺伝子プロモーターに結合する  細胞中にＭＬＬ１抗体を有するＣｈＩＰをＡＵＹ９２２で処理した。ｓｈＭＬＬ１形質導入Ａ３７５細胞を、３日間ドキシサイクリンを用いてまたは用いずに処理し、１時間、ＡＵＹ９２２  １００ｎＭでさらに処理した。クロマチンを抗ＭＬＬ１抗体で免疫沈降し（immunoprecipotated）、ＨＳＰ７０（Ｃ）またはＢＡＧ３（Ｄ）遺伝子プロモーターのＨＳＥエレメントならびにＭＥＳＩ１（Ｅ）プロモーターのＭＬＬ１結合部位周囲でプライマーを使用して定量的リアルタイムＰＣＲによって増幅した。クロマチンはまた、抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ２（Ｆ）、抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（Ｆ）および抗Ｈ４Ｋ１６ａｃ（Ｇ）抗体で免疫沈降し、ＢＡＧ３遺伝子プロモーターのＨＳＥエレメント周囲でプライマーを使用して定量的リアルタイムＰＣＲによって増幅した。
【図２Ｄ】ＭＬＬ１は、ＨＳＦ−１依存性転写活性を調節し、ＨＳＰ９０阻害下でＨＳＦ１標的遺伝子プロモーターに結合する  細胞中にＭＬＬ１抗体を有するＣｈＩＰをＡＵＹ９２２で処理した。ｓｈＭＬＬ１形質導入Ａ３７５細胞を、３日間ドキシサイクリンを用いてまたは用いずに処理し、１時間、ＡＵＹ９２２  １００ｎＭでさらに処理した。クロマチンを抗ＭＬＬ１抗体で免疫沈降し（immunoprecipotated）、ＨＳＰ７０（Ｃ）またはＢＡＧ３（Ｄ）遺伝子プロモーターのＨＳＥエレメントならびにＭＥＳＩ１（Ｅ）プロモーターのＭＬＬ１結合部位周囲でプライマーを使用して定量的リアルタイムＰＣＲによって増幅した。クロマチンはまた、抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ２（Ｆ）、抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（Ｆ）および抗Ｈ４Ｋ１６ａｃ（Ｇ）抗体で免疫沈降し、ＢＡＧ３遺伝子プロモーターのＨＳＥエレメント周囲でプライマーを使用して定量的リアルタイムＰＣＲによって増幅した。
【図２Ｅ】ＭＬＬ１は、ＨＳＦ−１依存性転写活性を調節し、ＨＳＰ９０阻害下でＨＳＦ１標的遺伝子プロモーターに結合する  細胞中にＭＬＬ１抗体を有するＣｈＩＰをＡＵＹ９２２で処理した。ｓｈＭＬＬ１形質導入Ａ３７５細胞を、３日間ドキシサイクリンを用いてまたは用いずに処理し、１時間、ＡＵＹ９２２  １００ｎＭでさらに処理した。クロマチンを抗ＭＬＬ１抗体で免疫沈降し（immunoprecipotated）、ＨＳＰ７０（Ｃ）またはＢＡＧ３（Ｄ）遺伝子プロモーターのＨＳＥエレメントならびにＭＥＳＩ１（Ｅ）プロモーターのＭＬＬ１結合部位周囲でプライマーを使用して定量的リアルタイムＰＣＲによって増幅した。クロマチンはまた、抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ２（Ｆ）、抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（Ｆ）および抗Ｈ４Ｋ１６ａｃ（Ｇ）抗体で免疫沈降し、ＢＡＧ３遺伝子プロモーターのＨＳＥエレメント周囲でプライマーを使用して定量的リアルタイムＰＣＲによって増幅した。
【図２Ｆ】ＭＬＬ１は、ＨＳＦ−１依存性転写活性を調節し、ＨＳＰ９０阻害下でＨＳＦ１標的遺伝子プロモーターに結合する  細胞中にＭＬＬ１抗体を有するＣｈＩＰをＡＵＹ９２２で処理した。ｓｈＭＬＬ１形質導入Ａ３７５細胞を、３日間ドキシサイクリンを用いてまたは用いずに処理し、１時間、ＡＵＹ９２２  １００ｎＭでさらに処理した。クロマチンを抗ＭＬＬ１抗体で免疫沈降し（immunoprecipotated）、ＨＳＰ７０（Ｃ）またはＢＡＧ３（Ｄ）遺伝子プロモーターのＨＳＥエレメントならびにＭＥＳＩ１（Ｅ）プロモーターのＭＬＬ１結合部位周囲でプライマーを使用して定量的リアルタイムＰＣＲによって増幅した。クロマチンはまた、抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ２（Ｆ）、抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（Ｆ）および抗Ｈ４Ｋ１６ａｃ（Ｇ）抗体で免疫沈降し、ＢＡＧ３遺伝子プロモーターのＨＳＥエレメント周囲でプライマーを使用して定量的リアルタイムＰＣＲによって増幅した。
【図２Ｇ】ＭＬＬ１は、ＨＳＦ−１依存性転写活性を調節し、ＨＳＰ９０阻害下でＨＳＦ１標的遺伝子プロモーターに結合する  細胞中にＭＬＬ１抗体を有するＣｈＩＰをＡＵＹ９２２で処理した。ｓｈＭＬＬ１形質導入Ａ３７５細胞を、３日間ドキシサイクリンを用いてまたは用いずに処理し、１時間、ＡＵＹ９２２  １００ｎＭでさらに処理した。クロマチンを抗ＭＬＬ１抗体で免疫沈降し（immunoprecipotated）、ＨＳＰ７０（Ｃ）またはＢＡＧ３（Ｄ）遺伝子プロモーターのＨＳＥエレメントならびにＭＥＳＩ１（Ｅ）プロモーターのＭＬＬ１結合部位周囲でプライマーを使用して定量的リアルタイムＰＣＲによって増幅した。クロマチンはまた、抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ２（Ｆ）、抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（Ｆ）および抗Ｈ４Ｋ１６ａｃ（Ｇ）抗体で免疫沈降し、ＢＡＧ３遺伝子プロモーターのＨＳＥエレメント周囲でプライマーを使用して定量的リアルタイムＰＣＲによって増幅した。
【図３Ａ】ＭＬＬ１欠損はＨＳＰ９０阻害に対するＨＳＦ１により媒介される細胞反応を損なう  Ａ．遺伝子がＡＵＹ９２２によって上方制御されたが、その上方制御はＭＬＬ１ノックアウトにより損なわれたことを示すヒートマップ。ＭＬＬ１＋／＋またはＭＬＬ１−／−ＭＥＦを、３時間、ＡＵＹ９２２  １００ｎＭで処理したまたは処理しなかった。全ＲＮＡを回収し、マイクロアレイを実施した。
【図３Ｂ】ＭＬＬ１欠損はＨＳＰ９０阻害に対するＨＳＦ１により媒介される細胞反応を損なう  Ｂ．ＭＬＬ１＋／＋とＭＬＬ１−／−ＭＥＦとの間のＨＳＰ９０阻害剤処理の下での細胞中のＨＳＰ７０およびＢＡＧ３の発現のリアルタイムＰＣＲ分析。ＭＬＬ１＋／＋またはＭＬＬ１−／−ＭＥＦを、３時間、ＡＵＹ９２２  １００ｎＭで処理したまたは処理しなかった。全ＲＮＡを回収し、リアルタイムＰＣＲを実施した。
【図３Ｃ】ＭＬＬ１欠損はＨＳＰ９０阻害に対するＨＳＦ１により媒介される細胞反応を損なう  Ｃ．異なる用量のＡＵＹ９２２を用いたＭＬＬ１＋／＋またはＭＬＬ１−／−ＭＥＦのウェスタンブロッティング分析。ＭＬＬ１＋／＋またはＭＬＬ１−／−ＭＥＦを異なる用量のＡＵＹ９２２を用いてまたは用いずに処理した。全タンパク質を回収し、ウェスタンブロッティングを示した抗体によって実施した。
【図３Ｄ】ＭＬＬ１欠損はＨＳＰ９０阻害に対するＨＳＦ１により媒介される細胞反応を損なう  Ｄ．ＨＳＰ９０阻害に対する細胞反応の間、ＨＳＦ１の補因子としてＭＬＬ１により調節された転写活性のモデル。ＭＬＬ１およびその複合体はＨＳＦ１に結合し、ＨＳＰ９０阻害の下で転写に役立つ。
【図４】ＭＬＬ１ノックダウンまたはノックアウトはＨＳＰ９０阻害に対して細胞を感作する  Ａ．Ａ３７５細胞におけるＡＵＹ９２２処理によるＭＬＬ１ノックダウンの細胞コロニー形成アッセイ。５０００個のｓｈＮＴＣまたはｓｈＭＬＬ１  Ａ３７５細胞を６個のウェルプレートに播種し、５日間ドキシサイクリンで処理しまたは処理せず、次いでその後、６日間化合物処理した。Ｂ．Ａ２０５８細胞におけるＡＵＹ９２２処理によるＭＬＬ１ノックダウンの細胞コロニー形成アッセイ。５０００個のｓｈＮＴＣまたはｓｈＭＬＬ１  Ａ２０５８細胞を６個のウェルプレートに播種し、５日間ドキシサイクリンで処理しまたは処理せず、次いでその後、６日間化合物処理した。Ｃ．腫瘍試料のウェスタンブロッティング分析。腫瘍試料を研究の終わりに回収し、ＭＬＬ１およびＧＡＰＤＨのウェスタンブロッティング分析を実施した。Ｄ．腫瘍試料のリアルタイムＰＣＲ分析。腫瘍試料を研究の終わりに回収し、全ｍＲＮＡを回収し、リアルタイムＰＣＲを実施した。Ｅ．Ａ３７５異種移植マウスモデルにおけるＭＬＬ１ノックダウンおよびＨＳＰ９０阻害剤の併用効果。ドキシサイクリンおよび／またはＨＳＰ９９０の下でＭＬＬ１に対して誘導性対照ｓｈＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを発現するＡ３７５細胞の腫瘍成長率を異なる時点にて比較した。Ｆ．ＭＬＬ１ノックダウンおよびＡＵＹ９２２処理によるＡ３７５細胞の細胞周期分析。ｓｈＭＬＬ１形質導入Ａ３７５細胞を、３日間ドキシサイクリンを用いてまたは用いずに処理し、４８時間、ＡＵＹ９２２  １００ｎＭでさらに処理した。Ｓ＋Ｇ２Ｍ細胞の百分率をＰＩ染色によって求めた。Ｇ．ＭＬＬ１ノックダウンおよびＡＵＹ９２２処理によるＡ３７５細胞の細胞アポトーシス分析。ｓｈＭＬＬ１形質導入Ａ３７５細胞を、３日間ドキシサイクリンを用いてまたは用いずに処理し、４８時間、ＡＵＹ９２２  １００ｎＭでさらに処理した。７ＡＡＤ＋ＡｎｎｅｘｉｎＶ＋によって表されたアポトーシス細胞をＦＡＣＳによって決定した。Ｈ．４８時間、ＡＵＹ９２２（２５ｎＭまたは１００ｎＭ）で処理したまたは処理しなかったＭＬＬ１＋／＋およびＭＬＬ１−／−ＭＥＦの顕微分析。Ｉ．ＭＬＬ１＋／＋またはＭＬＬ１−／−ＭＥＦにおけるＡＵＹ９２２の用量反応。ＭＬＬ１＋／＋またはＭＬＬ１−／−ＭＥＦを、２４時間および４８時間、ＤＭＳＯまたは連続希釈のＡＵＹ９２２で処理した。相対的細胞成長をＣＴＧによって測定した。Ｊ．ＡＵＹ９２２処理によるＭＬＬ１＋／＋またはＭＬＬ１−／−ＭＥＦの細胞アポトーシス分析。ＭＬＬ１＋／＋またはＭＬＬ１−／−ＭＥＦを、４８時間、ＡＵＹ９２２  １００ｎＭで処理したまたは処理しなかった。７ＡＡＤ＋ＡｎｎｅｘｉｎＶ＋によって表されたアポトーシス細胞をＦＡＣＳによって決定した。
【図５】ＭＬＬ１低発現ヒト白血病細胞はＨＳＰ９０阻害に対して感受性がある  Ａ．ＨＳＰ９０阻害剤処理の下での異なるヒト白血病細胞株のリアルタイムＰＣＲ分析。ヒト白血病細胞を培養し、４８時間、ＡＵＹ９２２で処理したまたは処理しなかった。次いで、全ｍＲＮＡを回収し、リアルタイムＰＣＲを実施した。Ｂ．ＡＵＹ９２２処理によるＭＬＬ１低発現またはＭＬＬ１高発現ヒト白血病細胞の細胞アポトーシス分析。ヒト白血病細胞を、４８時間、ＡＵＹ９２２  １００ｎＭで処理したまたは処理しなかった。７ＡＡＤ＋ＡｎｎｅｘｉｎＶ＋によって表されたアポトーシス細胞をＦＡＣＳによって決定した。Ｃ．ＳＥＭおよびＭＯＬＭ１３異種移植マウスモデルにおけるＨＳＰ９０阻害剤の効果。ＨＳＰ９９０処理の下でのＳＥＭおよびＭＯＬＭ１３の腫瘍成長率を異なる時点にて比較した。Ｄ．遺伝子が、ＭＯＬＭ１３細胞中ではなく、ＳＥＭ細胞中でＡＵＹ９２２によって上方制御されたことを示すヒートマップ。ＳＥＭおよびＭＯＬＭ１３細胞を、３時間、ＡＵＹ９２２  １００ｎＭで処理したまたは処理しなかった。全ＲＮＡを回収し、マイクロアレイを実施した。Ｅ．ベン図により、ＨＳＦ１活性化経路および他の４つのシグナル経路が、ヒト白血病細胞、黒色腫およびＭＥＦを含む３つの遺伝子プロファイルデータセットにより共有されたことが示された。
【図６】低いＭＬＬ１発現を有するヒト原発性Ｂ急性リンパ芽球性白血病細胞はＨＳＰ９０阻害に対して感受性がある  Ａ．ヒト原発性白血病細胞を移植したレシピエントマウスの骨髄におけるヒト白血病細胞の百分率。ヒトＣＤ４５＋によって表されるヒト細胞はＦＡＣＳによって決定した。Ｂ．異なるヒト原発性白血病細胞の間のＭＬＬ１発現のリアルタイムＰＣＲ分析。Ｃ．ヒト原発性ＢＡＬＬ細胞のＡＵＹ９２２の用量反応。ヒト原発性ＢＡＬＬ細胞を、４８時間、ＤＭＳＯまたは連続希釈のＡＵＹ９２２で処理した。相対的細胞成長をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏによって測定した。Ｄ．ＪＵＲＫＡＴ、ＳＥＭ、ＲＳ（４，１１）およびＭＯＬＭ１３を、７２時間、異なる用量のＡＵＹ９２２および／またはＮＶＰ−ＪＡＥ０６７で処理し、細胞生存の阻害を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイを使用して測定した。Ｅ．Ｃｈａｌｉｃｅソフトウェアを使用して、ＡＵＹ９２２およびＮＶＰ−ＪＡＥ０６７の各々の用量の組合せについてＬｏｅｗｅ相加性を超える過剰な阻害を算出した。
【図７】補足図１：誘導性ＭＬＬ１ノックダウンを有するＡ３７５細胞中のＭＬＬ１発現のリアルタイムＰＣＲおよびウェスタンブロッティング分析ｓｈＮＴＣまたはｓｈＭＬＬ１形質導入安定細胞株を、３日間ドキシサイクリンで処理し、細胞ペレットを回収し、リアルタイムＰＣＲおよびウェスタンブロッティングを実施した。
【図８】補足図２：ＭＬＬ１ノックダウンはｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方においてＨＳＦ１発現に影響を与えなかった補足図３：ＡＵＹ９２２で処理した細胞中にＨＳＦ１抗体を有するＣｈＩＰｓｈＨＳＦ１形質導入Ａ３７５細胞を、３日間ドキシサイクリンを用いてまたは用いずに処理し、１時間、ＡＵＹ９２２  １００ｎＭでさらに処理した。クロマチンを抗ＭＬＬ１抗体で免疫沈降し、ＨＳＰ７０（Ａ）またはＢＡＧ３（Ｂ）遺伝子プロモーターのＨＳＥエレメントならびにＭＥＳＩ１（Ｃ）プロモーターのＭＬＬ１結合部位周囲でプライマーを使用して定量的リアルタイムＰＣＲによって増幅させた。補足図４：ＨＣＴ１１６細胞におけるＡＵＹ９２２処理によるＭＬＬ１ノックダウンの細胞コロニー形成アッセイ５０００個のｓｈＮＴＣまたはｓｈＭＬＬ１  ＨＣＴ１１６細胞を６個のウェルプレートに播種し、５日間ドキシサイクリンで処理しまたは処理せず、次いでその後、６日間化合物処理した。補足図５：Ａ３７５細胞におけるＮＶＰ−ＬＧＸ８１８処理によるＨＳＦ１ノックダウンまたはＭＬＬ１ノックダウンの細胞コロニー形成アッセイ５０００個のｓｈＮＴＣ、ｓｈＨＳＦ１またはｓｈＭＬＬ１  Ａ３７５細胞を６個のウェルプレートに播種し、５日間ドキシサイクリンで処理しまたは処理せず、次いでその後、６日間化合物処理した。補足図６：異なる用量のＡＵＹ９２２で処理した誘導性ｓｈＭＬＬ１を発現するＡ３７５細胞のウェスタンブロッティング分析ｓｈＮＴＣまたはｓｈＭＬＬ１形質導入Ａ３７５細胞を、３日間ドキシサイクリンを用いてまたは用いずに処理し、４８時間、異なる用量のＡＵＹ９２２でさらに処理した。補足図７：ヒト白血病細胞の間のＭＬＬ１発現のリアルタイムＰＣＲ分析
【発明を実施するための形態】
【００３１】
発明の詳細な説明
「治療」は、予防的（防止的）および治療的治療ならびに疾患または障害の進行の遅延を含む。「予防的」という用語は、増殖性疾患に関与する疾患の発症または再発の防止を意味する。本明細書に使用されている「進行の遅延」という用語は、治療されるべき増殖性疾患の前段階または初期相にある患者であって、例えば対応する疾患の前形態であると診断されている患者または例えば医学的治療の間の状態もしくは対応する疾患が発生すると思われる偶発症候から生じる状態にある患者への組合せの投与を意味する。
【００３２】
「対象」は、動物を含むことを意図する。対象の例には、哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、およびトランスジェニック非ヒト動物が含まれる。特定の実施形態において、対象は、ヒト、例えば、脳腫瘍疾患を患っている、患うリスクのある、または潜在的に患う可能性がある、ヒトである。対象はヒトであることが、特に好ましい。
【００３３】
「医薬製剤」または「医薬組成物」とは、哺乳動物を冒す特定の疾患または状態を防止、治療または制御するために哺乳動物、例えばヒトに投与される少なくとも１種の治療化合物を含有する混合物または溶液を指す。
【００３４】
「同時投与する」、「同時投与」または「併用投与」などは、単一患者への選択された治療剤の投与を包含することを意味し、薬剤が同じ投与経路によりまたは同時に必ずしも投与されない治療レジメンを含むことを意図する。
【００３５】
「薬学的に許容される」とは、これらの化合物、物質、組成物および／または投薬形態を指し、それらは、正しい医学的判断の範囲内で、妥当な利点／リスク比が釣り合っており、過度の毒性、刺激、アレルギー反応および他の問題のある合併症を生じずに哺乳動物、特にヒトの組織との接触に適している。
【００３６】
「治療的に有効な」は、好ましくは、増殖性疾患の進行に対して治療的にまたは広範な意味においてまた、予防的に有効な量に関する。
【００３７】
「単一の医薬組成物」とは、両方の治療剤の有効量を患者に送達するために製剤化される単一の担体またはビヒクルを指す。単一のビヒクルは、任意の薬学的に許容される担体または賦形剤と共に、薬剤の各々の有効量を送達するように設計される。いくつかの実施形態において、ビヒクルは錠剤、カプセル剤、丸薬、またはパッチである。他の実施形態において、ビヒクルは液剤または懸濁剤である。
【００３８】
「用量範囲」とは、指定された薬剤量の許容される変動量の上限と下限を指す。典型的には、指定された範囲内の任意の量である１回投与量の薬剤を、治療を受ける患者に投与することができる。
【００３９】
「約」または「およそ」という用語は、通常、所与の値または範囲の２０％以内、より好ましくは１０％以内、最も好ましくはさらに５％以内を意味する。あるいは、特に生物学系において、「約」という用語は、所与の値の約１ｌｏｇ（すなわち１桁）以内、好ましくは２倍以内を意味する。
【００４０】
ここで、本発明者らは、ＨＳＰ７０プロモーターにより駆動されるルシフェラーゼレポーターが組み込まれたヒト黒色腫細胞の誘導体を確立し、ＨＳＦ１の共調節因子を探すためにゲノムドラッガブルｓｉＲＮＡスクリーニングを実施した。本発明者らは、Ｈ３Ｋ４メチルトランスフェラーゼＭＬＬ１がＨＳＰ９０阻害に反応する細胞中でＨＳＦ１の補因子として作用することを確認している。ＭＬＬ１はＨＳＦ１と相互作用し、ＨＳＦ１標的遺伝子のプロモーターに結合し、ＨＳＰ９０阻害下でＨＳＦ１依存性転写活性化を調節する。種々の細胞株および腫瘍マウスモデル中でＨＳＰ９０阻害と共にＭＬＬ１がノックダウンまたはノックアウトしている場合、著しい併用効果が観察された。本発明者らのデータは、ＭＬＬ１がＨＳＦ１の補因子であることを示し、ＨＳＰ９０阻害に対する細胞反応におけるＭＬＬ１の決定的な役割を確立する。
【００４１】
混合血統白血病タンパク質−１遺伝子（ＭＬＬ１、ＡＬＬ１、ＨＲＸ、Ｈｔｒｘ））を破壊する染色体転座は、急性リンパ芽球性または骨髄性白血病の特有のサブセットに関連している［１〜４］。ＭＬＬ１遺伝子の産生物は、造血および発生の間、Ｈｏｘ遺伝子発現パターンの維持に必要とされる転写コアクチベーターとして機能する巨大タンパク質である［５〜８］。ＭＬＬ１の転写コアクチベーター活性は、そのヒストンＨ３リシン４（Ｈ３Ｋ４）メチルトランスフェラーゼ活性により部分的に媒介され［６］、エピジェネティックマークはクロマチンの転写活性形態と相関した［９、１０］。ＭＬＬ１複合体はＨ３Ｋ４のモノ−、ジ−およびトリメチル化を触媒し、その調節は異なる機能的結果を有することができる。
【００４２】
本発明は、Ｈｓｐ９０の固有ＡＴＰアーゼ活性を標的化し、減少させ、もしくは阻害する、および／またはユビキチンプロテオソーム経路を介してＨｓｐ９０クライアントタンパク質を分解し、標的化し、減少させ、もしくは阻害する少なくとも１つの化合物を含む。このような化合物は、「熱ショックタンパク質９０阻害剤」または「Ｈｓｐ９０阻害剤と称される。本発明における使用に適したＨｓｐ９０阻害剤の例には、限定されないが、ゲルダナマイシン誘導体、タネスピマイシン（１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン）（ＫＯＳ−９５３および１７−ＡＡＧとしても知られている）；ラディシコール；６−クロロ−９−（４−メトキシ−３，５−ジメチルピリジン−２−イルメチル）−９Ｈ−プリン−２−アミンメタンスルホネート（ＣＮＦ２０２４としても知られている）；ＩＰＩ５０４；ＳＮＸ５４２２；５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−（４−モルホリン−４−イルメチル−フェニル）−イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルアミド（ＡＵＹ９２２）；および（Ｒ）−２−アミノ−７−［４−フルオロ−２−（６−メトキシ−ピリジン−２−イル）−フェニル］−４−メチル−７，８−ジヒドロ−６Ｈ−ピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−５−オン（ＨＳＰ９９０）が含まれる。
【００４３】
結果：ｓｉＲＮＡスクリーニングによる、ＨＳＰ９０阻害に反応するＨＳＦ１の共調節因子としてのＭＬＬ１の同定
ＨＳＰ９０阻害に反応するＨＳＦ１の新規共調節因子を同定するために、本発明者らは、ＨＳＰ９０阻害剤処理によって活性化されるＨＳＰ７０プロモーターにより駆動されるルシフェラーゼレポーターが組み込まれたＡ３７５細胞の誘導体を確立し、２ラウンドのｓｉＲＮＡスクリーニングを実施した（図１Ａ）。ハイスループット全ゲノムドラッガブル標的ｓｉＲＮＡスクリーニングを実施するために、ＨＳＦ１  ｓｉＲＮＡおよび陰性対照と同様に、７０００個の遺伝子を含有する全ｓｉＲＮＡライブラリーを３８４ウェルプレート中にスタンプアウトした。ｓｉＲＮＡスクリーニングを２ラウンドにわたって実施した。ルシフェラーゼ活性を使用して、第２ラウンドのスクリーニングについて遺伝子を選択した。第１ラウンドのスクリーニングからの２６４個の遺伝子について上位１０００個のｓｉＲＮＡを選択して、第２ラウンドのスクリーニングを実施した。第２ラウンドのスクリーニングについて、ルシフェラーゼ活性および細胞生存率の両方を測定した。例えば、上記のスクリーニングから選択した潜在的なＨＳＦ１調節因子のノックダウン後に内因性ＨＳＰ７０遺伝子発現を調べ、潜在的なＨＳＦ１調節因子遺伝子ノックダウンを試験する、カウンタースクリーニングアッセイもまた、実施した。カットオフラインは、ＨＳＰ９０阻害剤およびｓｉＲＮＡ処理後の７０％超のルシフェラーゼ活性の低下および３０％未満の細胞生存率の低下に基づいた。３５個の遺伝子が基準（補足表１）を満たすことが見出され、これらの遺伝子の中で、ＭＬＬ１、ＭＥＤ６、ＭＥＤ１９、ＭＥＤ２１、およびＳＭＡＲＣＤ３はクロマチン再構築因子として知られている。ＭＬＬ１は公知のＨ３Ｋ４メチルトランスフェラーゼであり、遺伝子転写活性に関与している。ＨＳＦ１ノックダウンは細胞増殖に影響を与えなかったが、１００％ルシフェラーゼ活性を阻害した。ＭＬＬ１ノックダウンは細胞増殖を３０％未満阻害したが、ルシフェラーゼ活性を９０％超低下させた（図１Ｂ）。ＭＬＬ１がＨＳＰ９０阻害に対する細胞反応の調節に関与し得ることを検証するために、本発明者らは、異なる配列の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用することによってＨＳＰ７０プロモーターレポーテッドプラスミド（reported plasmid）を有するＡ３７５細胞中でＭＬＬ１をノックダウンした。（配列はどのように異なっているか？）これは、ＭＬＬ１遺伝子のｍＲＮＡ転写産物と相補的な配列を有するｓｉＲＮＡ試薬での処理によってＭＬＬ１遺伝子の発現を低下させる。活性ＭＬＬ１遺伝子の転写産物に対するこのｓｉＲＮＡの結合はｍＲＮＡ転写産物の分解による減少した発現を生じる）。ＭＬＬ１ノックダウンはＨＳＰ９０阻害によって引き起こされるルシフェラーゼ活性を４０％超抑性したのに対して、ＨＳＦ１ノックダウンはルシフェラーゼ活性を約９０％抑性した（図１Ｃ）。本発明者らはさらに、ＭＬＬ１が、ＨＳＰ７０プロモーターにおけるＨＳＦ１結合部位を変異することによってＨＳＦ１によりＨＳＰ９０阻害に対する細胞反応を調節したかどうかを判定した。予想されるように、ＨＳＰ９０阻害により誘導されたルシフェラーゼ活性の７０％超の低下が、ＨＳＰ７０プロモーターにおける１つのＨＳＦ１結合部位を変異した場合に観察された。興味深いことに、ＨＳＦ１結合部位の変異を有するＭＬＬ１ノックダウンはルシフェラーゼ活性を８０％超抑性した（図１Ｃ）。これらの結果により、ＭＬＬ１がＨＳＰ９０阻害に対する細胞反応の調節に関与していることが示唆された。ＭＬＬ１が熱ショック反応を調節できるという考えもまた、熱ショック条件下で試験した。ＨＳＰ９０阻害と同様に、熱ショックはＨＳＰ７０プロモータールシフェラーゼ活性を誘導した。ＨＳＦ１ノックダウンは熱ショック反応を阻害するのに対して、ＭＬＬ１ノックダウンは熱ショックにより誘導されたルシフェラーゼ活性を４０％超低下させた（図１Ｄ）。ＭＬＬ１およびその複合体がＨＳＰ９０阻害下でＨＳＦ１に結合するかどうかを調べるために、本発明者らは、対照またはＨＳＦ１−ＨＡ構築物で形質導入した細胞を用いて免疫共沈降アッセイを実施した。ウェスタンブロッティングにより、ＨＳＰ９０阻害下でＨＳＦ１を有するＭＬＬ１の存在が示された。逆免疫共沈降アッセイにより、ＨＳＦ１エピトープもまた、ＭＬＬ１タンパク質を沈降させたことが示された（図１Ｅ）。加えて、ウェスタンブロッティングにより、ＭＬＬ１複合体構成成分：ＡＳＨ２ＬおよびＷＤＲ５もまた、ＨＳＦ１またはＭＬＬ１を沈降させたことが示された（図１Ｆ）。内因性ＨＳＦ１とＭＬＬ１との間のｉｎ  ｖｉｖｏ相互作用について試験するために、ＨＳＰ９０阻害剤を用いてまたは用いずに処理したＡ３７５細胞からの核タンパク質抽出物をＨＳＦ１またはＭＬＬ１抗体で免疫沈降させた。ウェスタンブロッティングにより、抗ＨＳＦ１または抗ＭＬＬ１免疫沈降物中のＭＬＬ１またはＨＳＦ１の存在が明らかになった（図１Ｇ）。
【００４４】
ＭＬＬ１はＨＳＦ１依存性転写活性を調節し、ＨＳＰ９０阻害下でＨＳＦ１標的遺伝子プロモーターに結合する
本発明者らはさらに、ＭＬＬ１ノックダウンがＨＳＦ１依存性転写活性に影響を与えるかどうかを試験した。本発明者らはｓｈＭＬＬ１をＡ３７５細胞内に導入し、次いで細胞をＨＳＰ９０阻害に曝露した。遺伝子プロファイル分析により、３８個の遺伝子の転写活性がＨＳＰ９０阻害により誘導されたことが示された。２２個の遺伝子／３８個の遺伝子の転写活性の誘導はＭＬＬ１ノックダウンによって様々な程度に抑性された（図２Ａ）。２２個の遺伝子の一部は、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｌ、ＨＳＰＢ８、ＤＥＤＤ２およびＤＮＡＪＢ１などの、ＨＳＦ１により調節される細胞ストレス経路に属する（図２Ａ）。遺伝子プロファイルの結果を検証するために、異なるＭＬＬ１配列を標的化することによる２つのＭＬＬ１誘導性ｓｈＲＮＡ構築物をＡ３７５癌細胞内に安定に導入し、ＭＬＬ１のノックダウンを確認した（補足図１）。ＨＳＰ９０阻害剤処理下で、ＭＬＬ１により調節されるＨＳＰ７０およびＢＡＧ３転写活性をリアルタイムＰＣＲによってさらに検証した。ＭＬＬ１ノックダウンはｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方においてＨＳＦ１発現に影響を与えなかったが（補足図２）、ＨＳＰ９０阻害剤処理下でＨＳＦ１標的遺伝子ＨＳＰ７０およびＢＡＧ３  ｍＲＮＡレベルを抑制した（図２Ｂ）。
【００４５】
ＨＳＦ１により調節される遺伝子プロモーターへのＭＬＬ１の動員を調べるために、本発明者らは、対照またはｓｈＭＬＬ１で形質導入し、１時間、ＡＵＹ９２２で処理したまたは処理していないＡ３７５細胞でクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を実施した。これらの細胞由来のクロマチンを超音波処理して、５００ｂｐ未満の断片を得、ＨＳＦ１およびＭＬＬ１に対するポリクローナルを使用して免疫沈降させた。定量的リアルタイムＰＣＲ分析を、ＨＳＥエレメントを包含するＨＳＰ７０およびＢＡＧ３に特異的なプライマーを用いて実施した。ＭＥＳＩ１のＭＬＬ１結合部位を対照として使用した。本発明者らは、ＭＥＳＩ１ではなく、ＨＳＰ７０またはＢＡＧ３プロモーターへのＨＳＦ１の結合が、１時間のＡＵＹ９２２処理で約１０倍増加したことを観察した（補足図３）。対照的に、誘導性ＨＳＦ１ノックダウンを有するＡ３７５細胞において結合は検出されなかった（補足図３）。ＨＳＰ７０およびＢＡＧ３遺伝子プロモーターの顕著なＭＬＬ１占有率もまた、１時間のＡＵＹ９２２処理で観察された（図２ＣおよびＤ）。対照的に、ＭＥＳＩプロモーターへのＭＬＬ１の結合は検出されなかった（図２Ｅ）。ＭＬＬ１結合はＭＬＬ１ノックダウンによって顕著に低下した（図２Ｃ、ＤおよびＥ）。ＭＬＬ１は、ヒストンＨ３（Ｈ３Ｋ４ｍｅ）のＬｙｓ−４のジ−およびトリ−メチル化ならびにヒストンＨ４（Ｈ４Ｋ１６ａｃ）のＬｙｓ−１６のアセチル化を媒介するので、本発明者らは次に、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ４Ｋ１６ａｃが、ＨＳＰ９０阻害下でＨＳＦ１により調節される遺伝子プロモーターに動員されるかどうかを調べた。本発明者らは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２およびＨ３Ｋ４ｍｅ３がＢＡＧ３プロモーターに結合し、これらの結合がＡＵＹ９２２処理によってさらに顕著に増強されたが、ＭＬＬ１ノックダウンによって減少したことを観察した（図２Ｆ）。同様に、Ｈ４Ｋ１６ａｃもまた、ＢＡＧ３プロモーターに結合し、これらの結合はＡＵＹ９２２処理によってさらに顕著に増強されたが、ＭＬＬ１ノックダウンによって減少した（図２Ｇ）。まとめると、これらのデータにより、ＭＬＬ１が、ＨＳＦ１依存性転写活性を調節し、ＨＳＰ９０阻害下でＨＳＦ１標的遺伝子プロモーターに結合することが示唆される。
【００４６】
ＭＬＬ１欠損はＨＳＰ９０阻害に対するＨＳＦ１により媒介される細胞反応を損なう
ｓｈＲＮＡの結果をさらに検証するために、本発明者らは次に、ＨＳＰ９０阻害に対するＭＬＬ１−／−マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）反応を調べた。遺伝子プロファイル分析により、６８個の遺伝子の転写活性がＨＳＰ９０阻害により誘導され、これらの遺伝子の上方制御が、様々な程度でＭＬＬ１欠損により損なわれたことが示された（図３Ａ）。これらの遺伝子の一部はまた、Ｄｎａｊａ１、Ｄｎａｊｂ４、ＤｎａＪ２およびＢａｇ３などの、ＨＳＦ１により調節される細胞ストレス経路に属する。２つのＨＳＦ１標的遺伝子の調節：ＭＥＦ中のＨＳＰ９０阻害剤によるＨｓｐａ１ｂおよびＢａｇ３を定量的リアルタイムＰＣＲによりさらに検証し、ＭＬＬ１の損失がＡＵＹ９２２処理下でＨｓｐａ１ｂまたはＢａｇ３発現の約５０％の低下を引き起こした（図３Ｂ）。加えて、ウェスタンブロッティングにより、ＨＳＰ９０阻害がＭＥＦにおいて熱ショック経路を誘導したことが示された。驚くべきことに、ＨＳＰ７０タンパク質レベルは劇的に抑制されたのに対して、ＨＳＣ７０タンパク質レベルはＭＬＬ１−／−ＭＥＦにおいて顕著に増加した（図３Ｃ）。ＭＬＬ１欠失と一致して、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２ではなく、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３の全体のレベルはＭＬＬ１−／−ＭＥＦにおいて減少した（図３Ｃ）。これらの結果により、ＭＬＬ１がＨＳＦ１の補因子であり、ＨＳＦ１により調節される遺伝子プロモーターに結合し、Ｈ３Ｋ４ｍｅのジ−およびトリ−メチル化を媒介し、ＨＳＰ９０阻害下でＨＳＦ１依存性転写活性を調節することが示される（図３Ｄ）。
【００４７】
ＭＬＬ１ノックダウンまたはノックアウトはＨＳＰ９０阻害に対して細胞を感作する
本発明者らの以前の研究により、ヒト癌においてＨＳＰ９０阻害剤に対する重要な感作物質としてＨＳＦ１が同定された。本発明者らは次に、ＭＬＬ１もまた、ＨＳＰ９０阻害剤に対する感作物質であるかどうかを調べた。ＭＬＬ１が実際にＨＳＰ９０阻害の感作物質であるかどうかを検証するために、ＭＬＬ１ノックダウンとＡＵＹ９２２との併用効果を３つの癌細胞株（Ａ３７５、Ａ２０５８およびＨＣＴ１１６）の間で試験した。異なるＭＬＬ１配列を標的化することによる２つのＭＬＬ１誘導性ｓｈＲＮＡ構築物を異なる癌細胞株に安定に導入した。これらの３つの癌細胞株において、ＭＬＬ１  ｓｈＲＮＡおよびＨＳＦ１  ｓｈＲＮＡ（ＮＴＣ  ｓｈＲＮＡではなく）の誘導は、コロニー形成アッセイによりＡＵＹ９２２に対する感受性を劇的にもたらした（図４Ａ、Ｂおよび補足図４）。対照的に、ＭＬＬ１ノックダウンはＢＲＡＦ阻害剤ＮＶＰ−ＬＧＸ８１８との併用効果を有さず（補足図５）、ＭＬＬ１ノックダウンがＨＳＰ９０阻害剤との選択的効果を有することが示唆される。これらの知見により、癌細胞においてＨＳＰ９０阻害に対する妥当な感作物質としてＭＬＬ１が示される。ＨＳＰ９０阻害剤の感作物質としてのＭＬＬ１をさらに検証するために、本発明者らはＡ３７５異種移植マウスモデルにおいてＨＳＰ９０阻害剤とのＭＬＬ１ノックダウンの併用効果を調べた。ＭＬＬ１  ｓｈＲＮＡ単独は腫瘍成長をわずかに阻害し、ノックダウンがタンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルで確認された（図４ＣおよびＤ）。耐性投薬量（１０ｍｇ／ｋｇ  ＰＯ、ｑｗ）でのＨＳＰ９９０単独は腫瘍成長を５０％Ｔ／Ｃ阻害した（図４Ｅ）。より顕著なことに、ＨＳＦ１ノックダウンとＨＳＰ９９０の組合せは腫瘍静止状態をもたらした（図４Ｅ）。これらの結果により、細胞ストレス反応の調節因子である、ＭＬＬ１もまた、ヒト癌細胞においてＨＳＰ９０阻害剤およびＭＬＬ１ノックダウンの組合せの有効性を制限するのに決定的であり、ＨＳＰ９０阻害剤は黒色腫成長の静止状態を引き起こすのに十分であることが示唆される。
【００４８】
ＭＬＬ１ノックダウンとＨＳＰ９０阻害の併用効果の機構を理解するために、本発明者らは、１）ＭＬＬ１ノックダウンがＢＲＡＦなどのＨＳＰ９０クライアントタンパク質の分解を促進できるかどうか、２）ＨＳＦ１欠損がマウスにおいてＭＡＰＫシグナル伝達を減衰するという最近の知見に基づいてＭＬＬ１ノックダウンがＭＡＰＫシグナル伝達を減衰できるかどうかをさらに試験した。本発明者らは、ＭＬＬ１  ｓｈＲＮＡおよびＨＳＰ９０阻害剤で処理した細胞においてウェスタンブロッティングを実施した。ＭＬＬ１ノックダウンおよびＨＳＰ９０阻害剤の組合せは、Ａ３７５細胞においてＢＲＡＦの分解ではなく、減少したレベルのｐ−ＥＲＫをもたらした（補足図６）。ＨＳＦ１ノックダウンがＨＳＰ９０阻害剤処理下で細胞増殖にどのように影響を与えるかを理解するために、本発明者らは、ＨＳＰ９０阻害剤処理下で細胞周期進行に対するＭＬＬ１ノックダウンの効果を試験するためにＤＮＡ含有量分析を実施した。ＨＳＦ１ノックダウンと同様に、ＭＬＬ１ノックダウンは細胞周期において癌細胞の百分率に影響を与えなかったのに対して、ＨＳＰ９０阻害剤はより多くの癌細胞をＳ＋Ｇ２Ｍ期にした（図４Ｆ）。対照的に、Ｓ＋Ｇ２Ｍ期における癌細胞の百分率は、ＨＳＰ９０阻害剤処理下で対照群においてよりＭＬＬ１ノックダウン群において顕著に低下し（図４Ｆ）、ＭＬＬ１のノックダウンは、癌細胞が細胞周期に入ることを阻止し、それにより癌細胞の増殖を減少させることが示される。さらに、本発明者らは、ＭＬＬ１ノックダウンが、７ＡＡＤおよびＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖで細胞を染色することによってＨＳＰ９０阻害剤処理下で癌細胞のアポトーシスを増強するかどうかを調べた。同様に、ＭＬＬ１ノックダウンは癌細胞のアポトーシスに影響を与えなかったのに対して、ＨＳＰ９０阻害剤は癌細胞のアポトーシスを誘導した（図４Ｇ）。ＭＬＬ１ノックダウンはＨＳＰ９０阻害剤処理下で癌細胞のアポトーシスの割合をさらに増加させた（図４Ｇ）。このように、ＭＬＬ１ノックダウンはＭＡＰＫ成長シグナル伝達を減衰し、細胞周期停止をもたらし、ＨＳＰ９０阻害剤処理下で細胞アポトーシスを誘導する。ｓｈＲＮＡの結果をさらに検証するために、本発明者らは次に、ＭＬＬ１の損失がＨＳＰ９０阻害に対して細胞を感作するかどうかを調べた。ＭＬＬ１＋／＋ＭＥＦにおいて、ＡＵＹ９２２はＭＥＦの増殖率を阻害するが、これらの細胞を殺傷しなかった。対照的に、ＭＬＬ１−／−ＭＥＦの９０％超は４８時間の処理後にＡＵＹ９２２によって殺傷された（図４ＨおよびＩ）。細胞アポトーシス分析により、３０％のＭＬＬ１＋／＋のみに対して８０％超のＭＬＬ１−／−ＭＥＦがＡＵＹ９２２処理下でアポトーシスを誘導されたことが示された（図４Ｊ）。これらのデータにより、ＭＬＬ１がＨＳＰ９０阻害に対してヒト癌細胞を感作するための潜在的な標的であることが示される。
【００４９】
ＭＬＬ１低発現ヒト白血病細胞はＨＳＰ９０阻害に感受性がある
ＭＬＬ１のノックダウンまたは損失が細胞増殖に対するＨＳＰ９０阻害剤の増加した有効性をもたらすので、本発明者らは、ＭＬＬ１低発現レベルを有するヒト癌細胞がＨＳＰ９０阻害に対して、より感受性があるはずであるという考えをさらに試験した。ヒト白血病において、ＭＬＬ−ＡＦ４、ＭＬＬ−ＡＦ９およびＭＬＬ−ＥＮＬを含むいくつかの融合遺伝子はＭＬＬ１転座により生じた。本発明者らは、ＭＬＬ１転座を有するまたは有さない９つの異なるヒト白血病細胞の中でＭＬＬ１  ｍＲＮＡレベルを最初に調べた。ＪＵＲＫＡＴ、６９７およびＲＥＨは高いＭＬＬ１発現を有する野生型白血病細胞であり、ＭＬＬ１−ＡＦ４を保有するＳＥＭ細胞もまた、高いＭＬＬ１発現を有する。ＦＬＴ３ＩＴＤ変異を保有するＰＬ２１細胞、ＭＬＬ１−ＡＦ４を保有するＲＳ（４，１１）細胞は比較的低いＭＬＬ１発現を有する。そしてＭＬＬ１−ＡＦ９を保有するＮＯＭＯ１細胞およびＭＬＬ１−ＡＦ９を保有するＮＯＭＯ１は最も低いＭＬＬ１発現を有する（補足図７）。本発明者らは次に、ＭＬＬ１発現がＨＳＰ９０阻害に対する細胞反応に関連するかどうかを調べた。ＨＳＰ９０阻害剤に対する細胞ストレス反応を表すＨＳＰ７０およびＢＡＧ３発現もまた、これらの白血病細胞の中で試験した。ＨＳＰ９０阻害に対する細胞ストレス反応はＲＳ（４，１１）およびＭＯＬＭ１３細胞において顕著に低下した（図５Ａ）。ＭＬＬ１低発現を有するＮＯＭＯ１はＨＳＰ９０阻害に対して低下した細胞ストレス反応を示さなかった（図５Ａ）。本発明者らは次にＨＳＰ９０阻害剤に対する各白血病細胞株の感受性を試験した。ＮＯＭＯ、ＭＯＬＭ１３およびＲＳ（４，１１）におけるＡＵＹ９２２のＩＣ９５は約１００ｎＭであるのに対して、他の白血病細胞株におけるＡＵＹ９２２のＩＣ９５は約１０００ｎＭである（表１）。これらの結果により、ＭＬＬ１発現が、ＨＳＰ９０阻害に対する細胞反応には関連しないが、ＨＳＰ９０阻害剤に対する細胞感受性に関連し得ることが示唆され、ＨＳＰ９０阻害に対するＨＳＦ１により活性化される細胞反応と独立して、いくつかのＭＬＬ１により媒介される機構が存在することが示唆された。細胞アポトーシス分析により、より高い細胞アポトーシス率が、ＪＵＲＫＡＴおよびＰＬ２１細胞においてよりＲＳ（４，１１）およびＭＯＬＭ１３細胞において誘導されたことが示された（図５Ｂ）。さらに、本発明者らは、ＳＥＭおよびＭＯＬＭ１３異種移植マウスモデルにおいてＨＳＰ９０阻害剤の効果を調べた。耐性投薬量（１０ｍｇ／ｋｇ  ＰＯ、ｑｗ）におけるＨＳＰ９９０はＳＥＭ腫瘍成長を３０％Ｔ／Ｃ阻害したのに対して、ＭＯＬＭ１３腫瘍成長を６０％Ｔ／Ｃ阻害した（図５Ｃ）。低いＭＬＬ１発現を有する白血病細胞が、ＨＳＰ９０阻害に対する低下したＨＳＦ１により調節される転写活性を示し得るという考えを試験するために、本発明者らは、ＨＳＰ９０阻害に対するＳＥＭおよびＭＯＬＭ１３白血病細胞反応の遺伝子プロファイルを比較した。遺伝子プロファイルアッセイにより、３２個の遺伝子発現が、様々な程度で、ＭＯＬＭ１３ではなく、ＳＥＭにおいてＨＳＰ９０阻害により高度に誘導されたことが示された（図５Ｄ）。ＭＬＬ１ノックダウンを有��るまたは有さない黒色腫、高いまたは低いＭＬＬ発現を有するヒト白血病細胞およびＭＬＬ１＋／＋またはＭＬＬ１−／−ＭＥＦを含むＨＳＰ９０阻害に対する異なる細胞反応における３つ全ての遺伝子プロファイルデータセットは経路分析を実施した。ＨＳＦ１経路活性化は３つの遺伝子プロファイルデータセットによって最も顕著に共有される経路である。ＰＲＤＭ２活性化、ＢＡＣＨ２阻害、ＢＬＶＲＡ活性化およびＰＥＳ１活性化もまた、３つの遺伝子プロファイルデータセットによって共有される。これらの結果により、ＭＬＬ１はＨＳＰ９０阻害剤処理において患者を階層化するための潜在的なバイオマーカーであり得ることが示される。
【００５０】
低いＭＬＬ１発現を有するヒト原発性Ｂ急性リンパ芽球性白血病細胞はＨＳＰ９０阻害に感受性がある
ＭＬＬ１発現が原発性ヒト癌細胞において異なるかどうかを調べるために、本発明者らは、ヒトＢ急性リンパ芽球性白血病試料においてＭＬＬ１の発現を調べた。原発性ヒトＢＡＬＬ細胞を免疫不全マウスに移植し、ＦＡＣＳ分析により血腫量が７０％より高くなるまで骨髄細胞をレシピエントマウスから採取した。骨髄細胞を培養し、ＦＡＣＳ分析により、９０％超の細胞がヒト白血病細胞であることが示された（図６Ａ）。リアルタイムＰＣＲにより、ＭＬＬ１発現がＰ４患者においてよりもＰ１患者において３倍高いことが示された（図６Ｂ）。本発明者らは次にこれらのヒト白血病細胞に対するＡＵＹ９２２の有効性を評価した。予想されるように、高いＭＬＬ１発現を有するＰ１白血病細胞はＡＵＹ９２２処理に対して反応しなかったのに対して、低いＭＬＬ１発現を有するＰ４白血病細胞はＡＵＹ９２２処理に対して良好な反応を示した。他の２つのヒト白血病試料もまた、ＡＵＹ９２２に対して特定の反応を示した（図６Ｃ）。ＭＬＬ１融合癌タンパク質は、下流のシグナル伝達経路を活性化するためにＤＯＴ１Ｌを動員することが知られており、ＭＬＬ１転座を保有する白血病細胞は、１つの野生型ＭＬＬ１対立遺伝子が損失しているので、低い野生型ＭＬＬ１発現を有しやすくなり得、これらの種類の白血病細胞がＨＳＰ９０阻害剤およびＤＯＴ１Ｌ阻害剤の組合せに対して感受性があり得ることが示唆された。本発明者らは次に、ヒト白血病細胞に対するＡＵＹ９２２およびＤＯＴ１Ｌ阻害剤ＮＶＰ−ＪＡＥ０６７の併用効果を試験した。ＡＵＹ９２２およびＮＶＰ−ＪＡＥ０６７は、ＭＬＬ１野生型白血病細胞：ＪＵＲＫＡＴ細胞ではなく、ＳＥＭ、ＲＳ（４，１１）およびＭＯＬＭ１３細胞を含むＭＬＬ１転座を保有する白血病細胞に対して顕著な併用効果を示した（図６Ｄ）。まとめると、これらの結果により、ＭＬＬ１低発現を有するヒト白血病細胞が、ＨＳＰ９０阻害に対して、より感受性があり得、ＨＳＰ９０阻害剤およびＤＯＴ１Ｌ阻害剤の組合せが、ＭＬＬ１転座を保有するヒト白血病細胞についての良好な戦略であり得ることが示された。
【００５１】
方法および材料：
細胞培養
Ａ３７５、Ａ２０５８、ＨＣＴ１１６、ＳＥＭ、６９７、ＪＵＲＫＡＴ、ＲＥＨ、ＰＬ２１、ＮＯＭＯ１、ＲＳ（４，１１）およびＭＯＬＭ１３細胞はアメリカンタイプカルチャーコレクションから得た。ＭＬＬ１＋／＋およびＭＬＬ１−／−マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）は、Ｊａｙ  Ｌ．  Ｈｅｓｓ’ｓ  ｌａｂ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎからのものである。全ての細胞株は、１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有するダルベッコ改変イーグル培地、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５ａ培地またはａｄｖａｎｃｅｄ  ＲＰＭＩ培地１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に維持した。感染細胞株は選択のために１μｇ／ｍＬのピューロマイシン（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）の下に維持した。
【００５２】
ｓｉＲＮＡスクリーニング
ＨＳＰ９０阻害剤処理によって活性化されるＨＳＰ７０プロモーターにより駆動されるルシフェラーゼレポーターが組み込まれたＡ３７５細胞株を確立した。ハイスループット全ゲノムｓｉＲＮＡスクリーニングを実施するために、ＨＳＦ１  ｓｉＲＮＡおよび陰性対照と同様に、全ｓｉＲＮＡライブラリーを３８４ウェルプレート中にスタンプアウトした。ＲＮＡｉＭＡＸを各ウェルに加え、さらにインキュベートした。次いで、ＨＳＰ７０プロモーターにより駆動されるルシフェラーゼレポーターを有する癌細胞を播種し、７２時間インキュベートし、次いでＨＳＰ９９０を加え、６時間インキュベートした。最後に、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（ＢＧ）を加えてＨＳＰ７０レポーターの発光を測定した。第２ラウンドのスクリーニングにおいて、ｓｉＲＮＡスクリーニングデータをＢＧおよびＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（ＣＴＧ）アッセイの両方によって分析した；後者は全ての細胞の生存率を測定する。１）データを正規化し、可視化のためにスポットファイア（spotfire）ファイルにエクスポートした。２）ｓｉＲＮＡ複製によって平均を各アッセイについて算出した。３）この後、各ｓｉＲＮＡ平均についてＢＧとＣＴＧスコアとの差を得た。４）これらの差を各遺伝子ＩＤについて平均化し、次いでデルタにより分類した（このときにＣＴＧに影響を与えずにＢＧシグナルに影響を与える上位のヒットを検索したので、ＢＧとＣＴＧとの間の最大の差は最も強いヒットであるはずである）。上記のスクリーニングから選択される潜在的なＨＳＦ１調節因子のノックダウン後に内因性ＨＳＰ７０遺伝子発現を調べること、および潜在的なＨＳＦ１調節因子遺伝子ノックダウンを調べることなどのカウンタースクリーニングアッセイもまた、実施した。
【００５３】
低分子ヘアピン型ＲＮＡ構築物
対照の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＧＧＡＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＴＧＡＧＡＴＧＧ、ＭＬＬ１  ｓｈＲＮＡ＃１、ＧＣＡＣＴＧＴＴＡＡＡＣＡＴＴＣＣＡＣＴＴ、およびＭＬＬ１  ｓｈＲＮＡ＃２、ＣＧＣＣＴＡＡＡＧＣＡＧＣＴＣＴＣＡＴＴＴを、誘導性ｐＬＫＯ−Ｔｅｔ−Ｏｎピューロマイシンベクター内にクローニングした。
【００５４】
レンチウイルスおよび感染
本発明者らの以前に確立したプロトコルに従ってレンチウイルス上清を生成した。合計で１００μＬのレンチウイルスを使用して、８μｇ／ｍＬのポリブレン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）入りの６ウェルプレート中で３００，０００個の癌細胞を感染させた。培地を取り換え、２４時間後、細胞をピューロマイシン（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）により選択し、増殖させた。１００ｎｇ／ｍＬのドキシサイクリン（Doxycyclineycycline）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を培地に加えることによってｓｈＲＮＡの誘導を得た。
【００５５】
ＲＮＡ抽出および定量的逆転写ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを単離した。ＡＢＩ  ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイは、ＨＳＰ７０、ＢＡＧ３、ＨＳＣ７０、ＨＳＰ２７、ＨＳＦ１およびＭＬＬ１を含む。ＶＩＣＭＧＢプライマー／プローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を各反応において使用してＢ２Ｍ転写産物を共増幅させた（coamplify）。全ての実験は二連または三連のいずれかで実施し、示したようにＢ２Ｍレベルに正規化した。
【００５６】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイ
製造業者のプロトコル（クロマチン免疫沈降アッセイキット、カタログ番号１７−２９５、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）に従ってＣｈＩＰアッセイを実施した。抗ＨＳＦ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、４３５６）抗体、抗ＭＬＬ１（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａ３００−０８６Ａ）、抗Ｈ３Ｋ４Ｍｅ２（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ５１１１９６）、抗Ｈ３Ｋ４Ｍｅ３（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ５１１１９９）、および抗Ｈ４Ｋ１６Ａｃ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０７−３２９）を使用して免疫複合体を調製した。抗体の非存在下で実施した免疫沈降反応の上清を全投入ＤＮＡ対照とした。以下のプライマー：ＨＳＰ７０プロモーター、５’−ＧＧＣＧＡＡＡＣＣＣＣＴＧＧＡＡＴＡＴＴＣＣＣＧＡ−３’および５’−ＡＧＣＣＴＴＧＧＧＡＣＡＡＣＧＧＧＡＧ−３’；ＢＡＧ３プロモーター、５’−ＧＴＣＣＣＣＴＣＣＴＴＡＣＡＡＧＧＡＡＡ−３’および５’−ＣＡＡＴＴＧＣＡＣＴＴＧＴＡＡＣＣＴＧ−３’；ＭＥＩＳ１プロモーター、５’−ＣＧＧＣＧＴＴＧＡＴＴＣＣＣＡＡＴＴＴＡＴＴＴＣＡ−３’および５’−ＣＡＣＡＣＡＡＡＣＧＣＡＧＧＣＡＧＴＡＧ−３’を使用して１０μｌの各試料でＰＣＲを実施した。この後、２％アガロースゲル上で分析した。
【００５７】
遺伝子プロファイリング
Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニキットを使用してＲＮＡを単離した。標識化ｃＤＮＡの生成およびＨＧ−Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ２アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）とのハイブリダイゼーションを以前に記載されているように実施した（４５）。
【００５８】
ウェスタンブロッティング
ウェスタンブロッティングを以下のように実施した：全腫瘍溶解物をＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に電気転写した（electrotransferred）。膜を、室温にてシェーカー上で、ＰＢＳおよび０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）および４％（ｗｔ／ｖｏｌ）脱脂粉乳（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中で１時間、ブロッキングした。一次抗体を、１：１，０００（ＨＳＦ１；Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、４３５６）、１：１，０００（ＨＳＰ７０；Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、４８７６）、１：１，０００（ｐ−ＥＲＫ；Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、４３７０）、１：１，０００（ＥＲＫ；Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、４６９５）、１：１，０００（ＨＥＲ２；Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、４２９０）、１：１，０００（ＢＲＡＦ；Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９４３３）、１：１，０００（切断したＰＡＲＰ；Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、５６２５）、および１：１０，０００（ＧＡＰＤＨ；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１１８Ｓ）希釈にてブロッキング溶液に加え、一晩および４℃にてロッカーでインキュベートした。免疫ブロッティングを３回、各々、ＰＢＳ−Ｔで５分洗浄し、二次抗体を、室温にてシェーカー上で１時間、ＰＢＳ−Ｔミルク中に１：１０，０００希釈にて加えた。数回の洗浄後、増強した化学発光（ＥＣＬ）反応を製造業者の推奨（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って実施した。
【００５９】
腫瘍異種移植片
Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅのプロトコルおよび規則に従って、マウスを維持し、取り扱った。ＭＬＬ１に対するＴｅｔ誘導性ｓｈＲＮＡを有するＡ３７５を、１０％Ｔｅｔ−ａｐｐｒｏｖｅｄ  ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ中で培養した。右背面腋窩部においてマウス（６〜８週齢、ｎ＝８）に１×１０６細胞をｓ．ｃ．接種した。腫瘍体積を２次元でカリパスで測ることによって測定し、（長さ×幅２）／２として算出した。平均腫瘍体積が２００ｍｍ３になった場合に移植してから１１日後に薬物処理を開始した。研究期間の間、動物にビヒクル（５％ブドウ糖、１０ｍＬ／ｋｇ、経口、ｑｗ）またはＨＳＰ９９０（１０ｍｇ／ｋｇ、経口、ｑｗ）を与えた。研究の終わりに、腫瘍組織を切除し、バイオマーカーの免疫ブロッティング分析のために液体窒素中で即座に凍結させた。データは平均±ＳＥＭとして表し、差はスチューデントｔ検定によってＰ＜０．０５にて統計的に有意とみなした。
【００６０】
著者の貢献
ＹＣおよびＷＺが実験を設計した。ＹＣ、ＪＣ、ＡＬ、ＬＢ、ＤＲ、ＲＧおよびＭＭが実験を実施した。ＳＪ、ＪＹおよびＪＫがデータを分析した。ＦＣ、ＰＺ、ＦＳ、ＲＰおよびＤＰが実験を支援した。ＹＣおよびＷＺが論文を記載した。
【００６１】
図の凡例：
表１：８個のヒト白血病細胞の間のＡＵＹ９２２のＩＣ９５
ＭＬＬ１転座を有するまたは有さない８個のヒト白血病細胞を、７２時間、ＡＵＹ９２２で処理し、細胞増殖率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏにより測定した。ＩＣ９５を使用して、ＨＳＰ９０阻害に対する細胞反応を推定した。
【００６２】
補足表．Ｓ１：３５個の遺伝子をｓｉＲＮＡスクリーニングによってＨＳＰ９０阻害に対する細胞反応の調節因子として同定した
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2016512812.tif 000025
【図８】
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【国際調査報告】
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2016512812.tif 000029
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