(57)【要約】  本開示は、グラム陰性菌種から得ることができる、または得られるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む免疫原性組成物を提供する。該ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質は、宿主鉄結合タンパク質に結合することができないように修飾されている。これらの免疫原性位置を作製および使用して、動物およびヒトワクチンを調製する方法も提供される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドを含む免疫原性組成物であって、前記ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができないように修飾されている、免疫原性組成物。
【請求項２】
グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む免疫原性組成物であって、前記ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、免疫原性組成物。
【請求項３】
グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む免疫原性組成物であって、前記ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、免疫原性組成物。
【請求項４】
前記Ｃ−ローブドメインおよびＮ−ローブドメインが、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、前記複数のループドメインの少なくとも１つのループドメインが、修飾されている、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記Ｃ−ローブドメインおよびＮ−ローブドメインが、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、前記複数のループドメインの少なくとも２つのループドメインが、修飾されている、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドが、パスツレラ科、モラクセラ科またはナイセリア科に属する菌種から得ることができる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドが、アクチノバシラス属、ナイセリア属、ヘモフィルス属、マンヘミア属、ヒストフィルス属、パスツレラ属またはモラクセラ属に属する菌種から得ることができる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドが、ＴｂｐＢポリペプチドである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記Ｃ−ローブドメインが、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：５；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３３；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１９；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２５；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７９〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１９５；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１３〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３０；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３４〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２７８；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２８８〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２９２に示された群から選択されるＣ−ローブドメインである、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記Ｎ−ローブドメインが、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１０；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２１；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２２９；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３１；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３３に示された群から選択されるＮ−ローブドメインである、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
少なくとも２つのポリペプチドの混合物を含み、前記ポリペプチドのそれぞれがＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドのＣ−ローブドメインを含む、免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記Ｃ−ローブドメインが、少なくとも２つの異なる菌種から得ることができる、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記Ｃ−ローブドメインが、少なくとも２つの異なる菌株から得ることができる、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記２つの菌種または２つの菌株が、同じ脊椎動物種に感染することができる、請求項１２または１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記Ｃ−ローブが、抗原的に多様である、請求項１２または１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドが、アクチノバシラス・プルロニューモニエ、アクチノバシラス・スイス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘモフィルス・パラスイス、ヘモフィルス・ソムナス、マンヘミア・ヘモリティカ、モラクセラ・カタラーリス、モラクセラ・ボビス、ナイセリア・ゴノレア、ナイセリア・メニンギティディス、マンヘミア・グルコシダおよびビベルスティニア・トレハロシからなる細菌の群から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体から得ることができる、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
前記菌種が、アクチノバシラス・プルロニューモニエ、アクチノバシラス・スイス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘモフィルス・パラスイス、ヘモフィルス・ソムナス、マンヘミア・ヘモリティカ、モラクセラ・カタラーリス、モラクセラ・ボビス、ナイセリア・ゴノレア、ナイセリア・メニンギティディス、マンヘミア・グルコシダおよびビベルスティニア・トレハロシから選択される、請求項１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
前記菌株が、アクチノバシラス・プルロニューモニエ、アクチノバシラス・スイス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘモフィルス・パラスイス、ヘモフィルス・ソムナス、マンヘミア・ヘモリティカ、モラクセラ・カタラーリス、モラクセラ・ボビス、ナイセリア・ゴノレア、ナイセリア・メニンギティディス、マンヘミア・グルコシダおよびビベルスティニア・トレハロシから選択される、請求項１４に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
前記２つの種が、ナイセリア・ゴノレア、ナイセリア・メニンギティディスである、請求項１６に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
前記２つの種が、アクチノバシラス・プルロニューモニエ、アクチノバシラス・スイス、およびヘモフィルス・パラスイスからなる菌種の群から選択されるである、請求項１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
前記２つの種が、マンヘミア・ヘモリティカおよびビベルスティニア・トレハロシからなる菌種の群から選択されるである、請求項１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
前記修飾される少なくとも１つのループが、ループＬ１〜ループＬ３２のうちの任意の１つから選択される、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
前記修飾される少なくとも１つのループが、Ｌ１、Ｌ５、Ｌ８、Ｌ１２、Ｌ１８、Ｌ２１、Ｌ２３およびＬ２７からなるループのうちの任意の１つから選択される、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
前記修飾される少なくとも１つのループが、ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ４２；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ４４；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ４６；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ４８；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ５０；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ５２；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ５４；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ５６；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ５８；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ６０；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ６２；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ６４；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ６６；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ６８；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ７０；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ７２；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ７４；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ７６；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ７８；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ８０；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ８２；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ８４；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ８６；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ８８；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ９０；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ９２；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ９４；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ９６；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ９８；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ１００；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ１０２；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ１０４；およびＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ１０６からなるループのいずれかから選択される、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項２５】
前記少なくとの２つのループドメインが、表２に示されたループドメインの組み合わせである、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２６】
前記Ｃ−ローブドメインおよびＮ−ローブドメインが、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、前記複数のループドメインの少なくとも３つのループドメインが、修飾されており、前記３つのループドメインが、表３に示されたループドメインの組み合わせから選択される、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７】
ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７０；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２０；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３０；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３２からなる配列群から選択されるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質を含む免疫原性組成物。
【請求項２８】
ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２２；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：４０からなる配列群から選択されるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質を含む免疫原性組成物。
【請求項２９】
ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６６；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６８からなる配列群から選択されるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質を含む免疫原性組成物。
【請求項３０】
（ａ）動作可能に連結された成分として、
（ｉ）グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドをコードする核酸配列であって、前記ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができないように修飾されている、核酸配列と、
（ｉｉ）組換え宿主細胞内での発現を制御することが可能な核酸配列と、
を含むキメラ核酸配列を用意すること；
（ｂ）前記キメラ核酸配列を宿主細胞に導入し、前記宿主細胞を生育させて、前記Ｃ−ローブドメインまたは前記Ｎ−ローブドメインを含む前記ポリペプチドを生成させること；
（ｃ）前記宿主細胞から、Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含む前記ポリペプチドを回収すること；および
（ｄ）免疫原性組成物を調製すること、
を含む、免疫原性組成物を調製する方法。
【請求項３１】
前記Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインが、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、前記複数のループドメインの少なくとも１つのループドメインが、修飾されている、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
動作可能に連結された成分として、
（ｉ）宿主における発現を制御することが可能な核酸配列と；
（ｉｉ）グラム陰性菌種から得ることができる、または得られるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドをコードする核酸配列であって、前記ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができないように修飾されている、核酸配列と
を含む、組換え発現ベクター。
【請求項３３】
脊椎動物対象において免疫応答を誘発する方法であって、
（ａ）グラム陰性病原菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインもしくはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む免疫原であって、前記ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、免疫原；または
（ｂ）グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインもしくはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む免疫原をコードする核酸配列を含む発現ベクター、
を前記対象に投与することを含み、
前記免疫原が、前記脊椎動物対象における免疫応答を誘発するのに十分な量で投与または発現される、方法。
【請求項３４】
前記Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインが、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、前記複数のループドメインの少なくとも１つのループドメインが、修飾されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドを含むワクチン組成物であって、前記ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができないように修飾されている、ワクチン組成物。
【請求項３６】
グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含むワクチン組成物であって、前記ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、ワクチン組成物。
【請求項３７】
グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインを含むワクチン組成物であって、前記ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、ワクチン組成物。
【請求項３８】
前記Ｃ−ローブドメインおよびＮ−ローブドメインが、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、前記複数のループドメインの少なくとも１つのループドメインが、修飾されている、請求項３６に記載のワクチン組成物。
【請求項３９】
前記Ｃ−ローブドメインおよびＮ−ローブドメインが、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、前記複数のループドメインの少なくとも２つのループドメインが、修飾されている、請求項３６に記載のワクチン組成物。
【請求項４０】
前記ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドが、パスツレラ科、モラクセラ科またはナイセリア科に属する菌種から得ることができる、請求項３５に記載のワクチン組成物。
【請求項４１】
前記ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドが、アクチノバシラス属、ナイセリア属、ヘモフィルス属、マンヘミア属、ヒストフィルス属、パスツレラ属またはモラクセラ属に属する菌種から得ることができる、請求項３５に記載のワクチン組成物。
【請求項４２】
前記ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドが、ＴｂｐＢポリペプチドである、請求項３５に記載のワクチン組成物。
【請求項４３】
前記Ｃ−ローブドメインが、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：５；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３３；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１９；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２５；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７９〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１９５；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１３〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３０；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３４〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２７８；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２８８〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２９２に示された群から選択されるＣ−ローブドメインである、請求項３５に記載のワクチン組成物。
【請求項４４】
前記Ｎ−ローブドメインが、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１０；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２１；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２２９；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３１；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３３に示された群から選択されるＮ−ローブドメインである、請求項３６に記載のワクチン組成物。
【請求項４５】
少なくとも２つのポリペプチドの混合物を含み、前記ポリペプチドのそれぞれがＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドのＣ−ローブドメインを含む、ワクチン組成物。
【請求項４６】
前記Ｃ−ローブドメインが、少なくとも２つの異なる菌種から得ることができる、請求項４５に記載のワクチン組成物。
【請求項４７】
前記Ｃ−ローブドメインが、少なくとも２つの異なる菌株から得ることができる、請求項４５に記載のワクチン組成物。
【請求項４８】
前記２つの菌種または２つの菌株が、同じ脊椎動物種に感染することができる、請求項４６または４７に記載のワクチン組成物。
【請求項４９】
前記Ｃ−ローブが、抗原的に多様である、請求項４６または４７に記載の免疫原性組成物。
【請求項５０】
前記ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドが、アクチノバシラス・プルロニューモニエ、アクチノバシラス・スイス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘモフィルス・パラスイス、ヘモフィルス・ソムナス、マンヘミア・ヘモリティカ、モラクセラ・カタラーリス、モラクセラ・ボビス、ナイセリア・ゴノレア、ナイセリア・メニンギティディス、マンヘミア・グルコシダおよびビベルスティニア・トレハロシからなる細菌の群から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体から得ることができる、請求項４６に記載のワクチン組成物。
【請求項５１】
前記菌種が、アクチノバシラス・プルロニューモニエ、アクチノバシラス・スイス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘモフィルス・パラスイス、ヘモフィルス・ソムナス、マンヘミア・ヘモリティカ、モラクセラ・カタラーリス、モラクセラ・ボビス、ナイセリア・ゴノレア、ナイセリア・メニンギティディス、マンヘミア・グルコシダおよびビベルスティニア・トレハロシから選択される、請求項４６に記載のワクチン組成物。
【請求項５２】
前記菌株が、アクチノバシラス・プルロニューモニエ、アクチノバシラス・スイス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘモフィルス・パラスイス、ヘモフィルス・ソムナス、マンヘミア・ヘモリティカ、モラクセラ・カタラーリス、モラクセラ・ボビス、ナイセリア・ゴノレア、ナイセリア・メニンギティディス、マンヘミア・グルコシダおよびビベルスティニア・トレハロシから選択される、請求項４７に記載のワクチン組成物。
【請求項５３】
前記２つの種が、ナイセリア・ゴノレアおよびナイセリア・メニンギティディスである、請求項４６に記載のワクチン組成物。
【請求項５４】
前記２つの種が、アクチノバシラス・プルロニューモニエ、アクチノバシラス・スイス、およびヘモフィルス・パラスイスからなる菌種の群から選択されるである、請求項４６に記載のワクチン組成物。
【請求項５５】
前記２つの種が、マンヘミア・ヘモリティカおよびビベルスティニア・トレハロシからなる菌種の群から選択されるである、請求項４６に記載のワクチン組成物。
【請求項５６】
前記修飾される少なくとも１つのループが、ループＬ１〜ループＬ３２のうちの任意の１つから選択される、請求項３８に記載のワクチン組成物。
【請求項５７】
前記修飾される少なくとも１つのループが、Ｌ１、Ｌ５、Ｌ８、Ｌ１２、Ｌ１８、Ｌ２１、Ｌ２３およびＬ２７からなるループのうちの任意の１つから選択される、請求項３８に記載のワクチン組成物。
【請求項５８】
前記修飾される少なくとも１つのループが、ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ４２；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ４４；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ４６；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ４８；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ５０；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ５２；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ５４；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ５６；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ５８；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ６０；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ６２；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ６４；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ６６；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ６８；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ７０；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ７２；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ７４；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ７６；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ７８；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ８０；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ８２；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ８４；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ８６；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ８８；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ９０；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ９２；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ９４；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ９６；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ９８；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ１００；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ１０２；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ１０４；およびＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ１０６からなるループのいずれかから選択される、請求項３８に記載のワクチン組成物。
【請求項５９】
前記少なくとの２つのループドメインが、表２に示されたループドメインの組み合わせである、請求項３９に記載のワクチン組成物。
【請求項６０】
前記Ｃ−ローブドメインおよびＮ−ローブドメインが、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、前記複数のループドメインの少なくとも３つのループドメインが、修飾されており、前記３つのループドメインが、表３に示されたループドメインの組み合わせから選択される、請求項３６に記載のワクチン組成物。
【請求項６１】
ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７０；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２０；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３０；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３２からなる配列群から選択されるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質を含むワクチン組成物。
【請求項６２】
ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２２；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：４０からなる配列群から選択されるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質を含むワクチン組成物。
【請求項６３】
ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６６；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６８からなる配列群から選択されるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質を含むワクチン組成物。  
【請求項６４】
脊椎動物対象において免疫応答を誘発する方法であって、
（ａ）グラム陰性病原菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質の少なくとも２つのＣ−ローブドメインもしくは少なくとも２つのＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む免疫原であって、前記ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、免疫原；または
（ｂ）グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインもしくはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む免疫原をコードする核酸配列を含む発現ベクターであって、前記ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができないように修飾されている、発現ベクター、
を前記対象に投与することを含み、前記免疫原が、前記脊椎動物対象における免疫応答を誘発するのに十分な量で投与または発現される、方法。
【請求項６５】
前記Ｃ−ローブドメインの少なくとも１つまたはＮ−ローブドメインの１つが、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、前記複数のループドメインの少なくとも１つのループドメインが、修飾されている、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
脊椎動物対象における免疫応答を誘発するための、
（ａ）グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインもしくはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む免疫原であって、前記ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、免疫原；または
（ｂ）グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインもしくはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む免疫原をコードする核酸配列を含む発現ベクターであって、前記ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、発現ベクター、
の使用。
【請求項６７】
脊椎動物対象における免疫応答を誘発するための薬剤の製造における、
（ａ）グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインもしくはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む免疫原であって、前記ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、免疫原；または
（ｂ）グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインもしくはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む免疫原をコードする核酸配列を含む発現ベクターであって、前記ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、発現ベクター、
の使用。
【請求項６８】
脊椎動物対象における免疫応答を誘発するための、
（ａ）グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインもしくはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む免疫原であって、前記ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、免疫原；または
（ｂ）グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインもしくはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む免疫原をコードする核酸配列を含む発現ベクターであって、前記ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、発現ベクター、
の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本特許協力条約出願は、米国特許法３５ＵＳＣ  §１１９（ｅ）の下で、２０１３年１２月２日出願の米国特許仮出願第６１／９１０，８１７号、および２０１４年６月３日出願の米国特許仮出願第６２／００７，０６８号の利益を主張するものであり、それらの出願は両者とも、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
開示の分野
本開示は、免疫原性組成物およびワクチン、ならびにそれらを作製および評価する方法に関する。より詳細には本開示は、非限定的にパスツレラ科、ナイセリア科およびモラクセラ科に属する細菌生物体をはじめとするグラム陰性菌生物体に対する、細菌表面受容体タンパク質由来免疫原性組成物およびワクチンに関する。
【背景技術】
【０００３】
開示の背景
以下の節は、本開示の請求された主題に従うより詳細な説明を読み手に紹介するためのものであり、該主題を定義または限定するものではない。
【０００４】
効果的な免疫応答を媒介することが可能なワクチンは、微生物病原により誘発された疾患との格闘を目的とした健康戦略において重要である。宿主の体内に効果的免疫応答を導入するための２つの基本的戦略は、宿主の体内で複製することが可能な「生の」薬剤を対象（宿主）に投与すること、または宿主の体内での複製が可能でない材料もしくは物質を投与すること、のいずれかを含む。生ワクチンの投与は、もしその薬剤または混入する生物体が複製して免疫化対象に悪影響を及ぼす場合には、免疫無防備状態の個体にとって安全性リスクになり得る。これらのリスクは、一般にサブユニットワクチンと称される、殺傷された病原全体に基づくワクチン、病原からの抽出物に基づくワクチン、または精製成分に基づくワクチンには関連しない。サブユニットワクチンは、生ワクチンに関連する安全性問題を回避するが、精製成分は、単独では感染性微生物体に対し対象の体内で所望の防御作用を表すことができず、免疫応答を増強するアジュバントと呼ばれる適切な成分を必要とする。
【０００５】
グラム陰性細菌体に対するワクチン設計のアプローチは、一般に細菌の外膜に元々結合していて、細菌細胞の表面に露出したタンパク質を使用することが中心であった。ワクチン接種に関して特に魅力的なターゲットは、宿主の免疫応答を回避するためには損失または劇的改変ができないため、宿主の生存に不可欠と推定されるタンパク質である。これに関係して、宿主鉄結合タンパク質：トランスフェリンおよびラクトフェリンと相互作用してそれに結合することが可能な細菌表面受容体タンパク質が、ワクチンの調製における使用に適した成分と以前から見なされた時期もあった（１〜３）。本明細書で以後、「ＨＩＢＰ」（宿主鉄結合タンパク質）表面受容体タンパク質と称されるこの群の表面受容体タンパク質は、パスツレラ科、モラクセラ科およびナイセリア科に属するヒトおよび動物の病原中に存在する（４）。したがって、これらのタンパク質は、ヒトおよび食物生産動物の様々な異なる病原に対するワクチンを開発するための潜在的ターゲットとして認識されてきた（５）（６〜１０）。
【０００６】
ＨＩＢＰ表面受容体は、通常、２種のタンパク質：表面リポタンパク質、トランスフェリン結合Ｂ（ＴｂｐＢ）またはラクトフェリン結合タンパク質Ｂ（ＬｂｐＢ）と、ＴｏｎＢ依存性内在性膜タンパク質、トランスフェリン結合タンパク質Ａ（ＴｂｐＡ）またはラクトフェリン結合タンパク質Ａ（ＬｂｐＡ）と、で構成される（１１）。近年になり、アクチノバシラス・プルロニューモニエ、アクチノバシラス・スイス、およびナイセリア・メニンギティディスからのＴｂｐＢの詳細な三次元構造が、高解像度で決定された（１２〜１４）。ＴｂｐＢまたはＬｂｐＢタンパク質の生来の特性は、内在性外膜タンパク質：ＴｂｐＡおよびＬｂｐＡとは全く異なっており、ワクチン開発に用いられる方策に実質的な影響を及ぼす。例えば、サブユニットワクチンの作製のために、大腸菌細胞質からＴｂｐＢまたはＬｂｐＢを相対的に高収率で生成および精製することは可能である。しかしこれらのタンパク質は、抽出工程で除去されるため、選択的な界面活性剤抽出により調製された外膜小胞（ＯＭＶ）ワクチンには顕著なほど存在しないか、または欠如している。これに対して機能的なＴｂｐＡまたはＬｂｐＡは、外膜内でわずかしか生成することができず、サブユニットワクチン中で用いられる精製タンパク質を高収率で生成することへの限界となっている。大きな封入体に凝集するミスフィールディングタンパク質を生成し、次に濃縮された封入体調製物からタンパク質のリフォールディングを試みる別のアプローチもまた、商業的製造には問題がある。したがってＴｂｐＡまたはＬｂｐＡを基にしたワクチンのほとんどの方策は通常、ＯＭＶの製造または弱毒化株の開発を必要とする。
【０００７】
侵襲性細菌病原への使用に成功した別のアプローチは、細胞外莢膜多糖体を一次抗原として用いて、それにタンパク質キャリアを結合させてＴ細胞ヘルプを誘発することである。これらのコンジュゲート莢膜ワクチンは、特異的莢膜多糖体を発現する株による感染の防御をもたらすことにおいて非常に効果的であることが立証されているが、他の莢膜タイプへの交差防御はもたらさない。ヒト病原：Ｈ．インフルエンザ、Ｎ．メニンギティディスおよびストレプトコッカス・ニューモニエに対するコンジュゲート莢膜ワクチンは、元々、侵襲性感染を予防するために開発されたが、認可後の保菌試験から、全身投与されたこのワクチンが、特異的な標的多糖体を発現する病原による定着を排除することが実証された（１５〜１７）。これは、集団免疫を提供することで、集団での低い保因率による非免疫化個体に防御を提供する、というさらなる利益を有した。これらの初期ワクチンの当初の予定にはないが、集団免疫を付与する可能性が、新しい細菌ワクチンおよび今後の細菌ワクチンを評価するための重要な基準になった。しかし、新しいワクチンが定着（保菌）に影響を及ぼすことまたは予防することが可能であるかどうかを決定または予測することは、大きな難題である（１８）。
【０００８】
タンパク質抗原が、最終的に疾患単離物の多様な組み合わせに対して広範囲の防御をもたらし得るかどうかを評価する能力もまた、かなりの難題である（１９）。これらの能力をテストする際の最初の取り組みは、一般に、他の動物種（マウス、ウサギ）を免疫化し、その後得られた血清の交差反応性および交差防御性を分析することを含む。表面リポタンパク質などの可溶性形態で即座に生成され得るそれらの表面抗原の場合、第一のステップは、多くの場合、変異体タンパク質の組み合わせを生成および精製し、その後、標準的なＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）にそれを使用して、抗血清による変異体タンパク質を認識する能力を評価することである。これは、かなりの労力を要し、該変異体を広範囲で組み合わせる分析は高価な企画になり、ＥＬＩＳＡプレートへの抗原の結合がランダムであるため全てのタンパク質表面がプローブされ得る、という仮説に依存する。
【０００９】
抗原に対する抗血清の交差防御性および交差反応性の上昇を評価および予測するために用いられる様々なアッセイにある制約を考慮すれば、開発中のワクチンの最適化および改善が合理的根拠に基づいて開始され得るように、新しいタンパク質系ワクチンおよび改善されたタンパク質系ワクチンの選択および設計が、改善されたアッセイの開発と併せて追及されなければならない。
【００１０】
最初の発見から数年にわたり相当な労力が注がれたにもかかわらず（２０、２１）、ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質がグラム陰性菌病原に対する有効なワクチンを調製するのに用いられ得るかどうか、そしてその方法、特に広範囲に防御性のあるワクチンを開発し得るかどうか、そしてその方法は、依然として不明である。したがって、当該技術分野において、グラム陰性菌生物体に対するＨＩＢＰ表面受容体タンパク質に基づく免疫原性組成物およびワクチンを改善することが、求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
開発の概要
本開示は、新規な免疫原性組成物、詳細にはグラム陰性病原菌種からのＨＩＢＰ表面受容体タンパク質に基づく免疫原性組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって本開示は、少なくとも１つの実施形態において、グラム陰性病原菌種からのＨＩＢＰ表面受容体タンパク質由来の抗原を含む免疫原性組成物であって、該ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質由来のタンパク質が、宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができないように修飾されている、免疫原性組成物を提供する。
【００１３】
本開示は、少なくとも１つの実施形態において、グラム陰性菌種から得ることができる、または得られるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む免疫原性組成物であって、該ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、免疫原性組成物を提供する。好ましい実施形態において、本開示は、ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドのＣ−ローブドメインを含む免疫原性組成物であって、該ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、免疫原性組成物を提供する。さらに好ましい実施形態において、本開示は、少なくとも２つのポリペプチドの混合物を含み、該ポリペプチドがそれぞれＣ−ローブドメインを含む免疫原性組成物であって、該Ｃ−ローブドメインが、少なくとも２つのグラム陰性菌種または少なくとも２種のグラム陰性菌株から得ることができる、または得られる、免疫原性組成物を提供する。さらに好ましい実施形態において、該Ｃ−ローブドメインは、抗原的に多様なＨＩＢＰ表面受容体タンパク質から得られる。
【００１４】
さらなる実施形態において、本開示はさらに、グラム陰性菌種から得ることができる、または得られるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＮ−ローブドメインおよび／またはＣ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む免疫原性組成物であって、該Ｎ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメインが、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、該Ｎ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメインの複数のループドメインの少なくとも１つのループドメインが、修飾されており、該ポリペプチドが、宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、免疫原性組成物を提供する。好ましい実施形態において、該修飾は、ループドメイン内の少なくとも１つのアミノ酸残基の修飾を含む。
【００１５】
さらなる実施形態において、ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインおよび／またはＮ−ローブドメイン内の複数のループドメインの少なくとも２つのループドメインが、修飾されている。
【００１６】
さらなる実施形態において、本開示は、（ｉ）グラム陰性病原菌種から得ることができる、または得られるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＮ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメインを含む第一のポリペプチドであって、該Ｎ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメインが、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、該Ｎ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメインの複数のループドメインの少なくとも１つのループドメインが、修飾されている、第一のポリペプチドと、（ｉｉ）該少なくとも１つのループドメインが連結し、ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質またはその一部を含み、グラム陰性菌種から得ることができる、第二のポリペプチドであって、該連結されたポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、第二のポリペプチドと、を提供する。好ましい実施形態において、該ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質の一部は、Ｎ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメインである。さらに好ましい実施形態において、該ＨＩＢＰ表面タンパク質の一部は、グラム陰性病原菌種から得ることができる、または得られるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＮ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメインであり、該Ｎ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメインは、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、該Ｎ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメインの複数のループドメインの少なくとも１つのループドメインが、修飾されている。
【００１７】
さらなる実施形態において、該Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインは、パスツレラ科、モラクセラ科またはナイセリア科に属する菌種から得ることができる、または得られるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインであり、さらに好ましい実施形態において、該Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインは、アクチノバシラス属、ナイセリア属、ヘモフィルス属、マンヘミア属、ヒストフィルス属、パスツレラ属またはモラクセラ属に属する菌種から得ることができる、または得られるＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドのＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインである。
【００１８】
さらに好ましい実施形態において、該ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質は、ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＮ末端結合ポリペプチドまたはその一部が、除去されるように修飾されており、該ポリペプチドが、宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない。
【００１９】
別の態様において、本開示は、免疫原性組成物を調製する方法を提供する、したがって本開示は、
（ａ）動作可能に連結された成分として：
（ｉ）グラム陰性菌種から得ることができる、または得られるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドをコードする核酸配列であって、該ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、核酸配列と、
（ｉｉ）組換え宿主細胞内での発現を制御することが可能な核酸配列と、
を含むキメラ核酸配列を用意すること；
（ｂ）該キメラ核酸配列を宿主細胞内に導入して該宿主細胞を生育させて、Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含む該ポリペプチドを生成させること；
（ｃ）該宿主細胞からＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含む該ポリペプチドを回収すること；および
（ｄ）免疫原性組成物を調製すること、
を含む、免疫原性組成物を調製する方法を提供する。
【００２０】
さらなる実施形態において、Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインは、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、該複数のループドメインの少なくとも１つのループドメインは、修飾されている。
【００２１】
さらなる態様において、脊椎動物対象において免疫応答を誘発する方法が、提供される。したがって本開示は、脊椎動物対象において免疫応答を誘発する方法であって、該対象に、
（ａ）グラム陰性菌種から得ることができる、または得られるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む免疫原であって、該ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、免疫原；または
（ｂ）グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む免疫原をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターであって、該免疫原が、該脊椎動物対象において免疫応答を誘発するのに十分な量で投与または発現される、発現ベクター、
を投与することを含む、方法をさらに提供する。
【００２２】
好ましい実施形態において、Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインは、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、該複数のループドメインの少なくとも１つのループドメインは、修飾されている。
【００２３】
本開示は、ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドのＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含む免疫原であって、該Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインが、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、該少なくとも１つのループドメインが修飾されている、免疫原を、医薬として使用するために含む。
【００２４】
本開示は、例えばアクチノバシラス属、ナイセリア属、ヘモフィルス属、マンヘミア属、ヒストフィルス属、パスツレラ属またはモラクセラ属に属する細菌をはじめとする感染性グラム陰性菌の、例えば定着を予防することによる感染の予防、または疾患の予防おいて用いられるＨＩＢＰ表面受容体のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含む免疫原をさらに含む。好ましい実施形態において、該Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインは、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、該複数のループドメインの少なくとも１つのループドメインは、修飾されている。
【００２５】
本開示は、アクチノバシラス属、ナイセリア属、ヘモフィルス属、マンヘミア属、ヒストフィルス属、パスツレラ属またはモラクセラ属に属する細菌をはじめとする感染性グラム陰性菌による感染または疾患の予防のための医薬の製造に使用するための、ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドのＣ−ローブドメインおよび／またはＮ−ローブドメインを含む免疫原をさらに含む。好ましい実施形態において、該Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインは、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、該複数のループドメインの少なくとも１つのループドメインは、修飾されている。
【００２６】
本開示の免疫原性組成物は、ワクチンを調製するために用いられ得る。したがって本開示は、グラム陰性病原菌種からのＨＩＢＰ表面受容体タンパク質由来の抗原を含むワクチン組成物であって、該ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質由来のタンパク質が、宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができないように修飾されている、ワクチン組成物をさらに提供する。
【００２７】
さらなる実施形態において、本開示はまた、グラム陰性病原菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含むワクチン組成物であって、該ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、ワクチン組成物をさらに含む。
【００２８】
さらなる実施形態において、該ワクチン組成物は、ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドのＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドであって、該Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインが、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、該少なくとも１つのループドメインが、修飾されており、該ポリペプチドが、宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、ポリペプチドを含む。
【００２９】
本開示は、脊椎動物対象にワクチンを投与する方法であって、該対象に、グラム陰性病原菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含むワクチンを投与することを含み、該ワクチンが、グラム陰性菌種により誘発される疾患を予防または処置するのに十分な量で投与される、方法をさらに提供する。
【００３０】
本開示は、アクチノバシラス属、ナイセリア属、ヘモフィルス属、マンヘミア属、ヒストフィルス属、パスツレラ属またはモラクセラ属に属する細菌をはじめとする感染性グラム陰性菌による感染または疾患の予防において使用するための、ＨＩＢＰ表面受容体のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含むワクチンをさらに含む。
【００３１】
好ましい実施形態において、該Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインは、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、該複数のループドメインの少なくとも１つのループドメインは、修飾されている。
【００３２】
本開示の他の特色および利点は、以下の詳細な記載から明白となろう。しかし、本開示の主旨および範囲内での様々な変更および修正が、詳細な記載から当業者に明白となるため、詳細な記載が本開示の好ましい実施形態を示すが例示に過ぎないことが、理解されなければならない。
【００３３】
本開示は、以後に示された節において、図に関連して記載される。本明細書に示された図は、例示を目的としており、本開示を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ブタＴｂｐＢ病原からの複数のＴｂｐＢｓ、特にＡｐＨ４９  ＴｂｐＢ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２）、ＡｐＨ８７  ＴｂｐＢ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１０）、およびＡｓＨ５７ＴｂｐＢ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２８）のポリペプチド配列のアライメント、ならびにそれらのタンパク質の構造モデル（それぞれｐｄｂ  ３ＨＯＬ、３ＰＱＳおよび３ＰＱＵ）を表す。これら３種のタンパク質は、ブタ病原からのＴｂｐＢの間の配列多様性の良好な表現を提供する（図４、大きな黒色の矢印）。上のパネルは、ポリペプチド配列アライメントを示し、下のパネルは、構造モデルを示す。それに応じて配列アライメントにおいて、ドメイン構造を、背景の陰影により境界を画定し、標識している。二次構造要素を示し、β鎖（「β１」〜「β３１」）およびループ（Ｌ１〜Ｌ３２）の命名およびナンバリングを、アライメントされた配列の直ぐ上に示している。この図のループ８（８ａ、８ｂおよび８ｃ）のサブ領域は、ループ８の大きなサイズにより、ＴｂｐＢ変異体と幾つかのループ変異体における二次構造要素との差を表す。さらに示されているのは、それぞれ「Ｃ−ローブキャップエリア」および「Ｎ−ローブキャップエリア」と標識されたＣ−ローブおよびＮ−ローブのキャップエリア、ならびにそれぞれ「Ｃ−ローブハンドル」および「Ｎ−ローブハンドル」エリアと標識されたＣ−ローブハンドルおよびＮ−ローブハンドルエリアである。上のパネルのアライメントの３つのＴｂｐＢの構造モデルが、下のパネルに表され、ドメインが、３番目の構造モデル（ＡｓＨ５７ＴｂｐＢ）について標識されており、それは他の２つのモデルと同一方向で表されている。
【図２】ＴｂｐＢポリペプチドのアミノ酸配列の特定の二次構造特性の略図と、この分類のタンパク質の推奨される命名を示す。該ポリペプチドのＮおよびＣ末端を示し、それぞれ「Ｎ」および「Ｃ」と標識している。β鎖は、矢印で示し、Ｎ末端の「β１」から出発して「β３１」まで連続して標識している。ループドメインを示し、「Ｌ１」〜「Ｌ３２」と標識している。Ａ．プルロニューモニエＨ４９株のＴｂｐＢ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２）からのＴｂｐＢポリペプチドのループの配列が、本特許出願に含まれる（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：４１〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１０６）。さらに示されるのは、それぞれＣ−ローブキャップエリアおよびＮ−ローブキャップエリアと標識されたＣ−ローブおよびＮ−ローブのキャップエリア、ならびに「Ｃ−ローブハンドル」および「Ｎ−ローブハンドル」エリアと標識されたＣ−ローブハンドルおよびＮ−ローブハンドルエリアである。
【図３Ａ】３３％Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ  Ｄをアジュバントとして用いた、異なる宿主種（マウス、ウサギまたはブタ）におけるヒト病原ナイセリア・メニンギティディス（Ｂ１６Ｂ６株−ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１７）からのインタクトＴｂｐＢタンパク質、またはブタ病原アクチノバシラス・プルロニューモニエ（Ｈ４９株−ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２）からのインタクトＴｂｐＢに対する抗体反応の規模の比較を表す。アクチノバシラス・プルロニューモニエからのＴｂｐＢに対する抗体力価（灰色の棒）は、マウスおよびウサギにおいては、ナイセリア・メニンギティディスからのＴｂｐＢ（黒色の棒）よりもわずかに高いが、ブタでは実質的に低い。これらの結果は、宿主トランスフェリンの結合が、抗体反応の発生に影響を及ぼし得ることを示唆している。
【図３Ｂ】ウシ病原マンヘミア・ヘモリティカ（Ｈ１９６株−ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２０６）からのインタクトＴｂｐＢ、またはブタ病原アクチノバシラス・プルロニューモニエ（Ｈ４９株）からのインタクトＴｂｐＢ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２）、ＴｂｐＢ  Ｎ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：８）もしくはＴｂｐＢ  Ｃ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：６）に対するブタの抗体反応の規模の比較を表す。棒のクラスタは、０日目（最初の免疫化前）、２１日目（最初の免疫化後）、４２日目（２回目の免疫化後）および５６日目（３回目の免疫化後）の免疫化された個々のブタから採取された血清試料を表す。Ｍ．ヘモリティカからのインタクトＴｂｐＢ（Ｍｈインタクト；Ｈ１９６株−ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２０６）で免疫化されたブタの血清を、ＥＬＩＳＡプレートに結合されたインタクトＭ．ヘモリティカ  ＴｂｐＢと共にテストした。Ａ．プルロニューモニエ  ＴｂｐＢ（Ａｐインタクト）、ＴｂｐＢ  Ｎ−ローブ（Ａｐ  Ｎローブ）またはＴｂｐＢ  Ｃ−ローブ（Ａｐ  Ｃローブ）で免疫化されたブタの血清を、ＥＬＩＳＡプレートに結合されたインタクトＡ．プルロニューモニエ  ＴｂｐＢと共に分析した。
【図３Ｃ】ブタ病原アクチノバシラス・プルロニューモニエ（Ｈ４９株）からのＴｂｐＢのＣ−ローブポリペプチドドメイン（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：６）、ＴｂｐＢのＮ−ローブポリペプチドドメイン（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：８）およびインタクトＴｂｐＢ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２）に対する抗血清の交差反応性の比較を表す。棒のクラスタは、抗原的に多様なＴｂｐＢ（図４）を表すように選択された３種の異なるブタ病原：アクチノバシラス・プルロニューモニエＨ４９株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２、黒色の棒）、ヘモフィルス・パラスイスＨＰ５株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１５、濃灰色の棒）およびアクチノバシラス・プルロニューモニエＨ８７株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２、淡灰色の棒）からのインタクトＴｂｐＢに対する血清の反応性を表す。結果は、インタクトＴｂｐＢ（左から１番目のクラスタ、「インタクト」と標識）、ＴｂｐＢ  Ｎ−ローブ（左から２番目のクラスタ、「Ｎローブ」と標識）、ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブ（左から３番目のクラスタ、「Ｃローブ」と標識）またはＮ−ローブとＣ−ローブとの混合物（左から４番目のクラスタ、「Ｎ＋Ｃローブ」と標識）で免疫化された血清の反応性を表す。平均の標準誤差（ＳＥＭ）の棒を示す。統計解析は、事後比較として実施されたＡＮＯＶＡおよびテューキーＨＳＤ（ｈｏｎｅｓｔ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）検定により実施した。図に示された星は、Ｈ４９に対してテストされたＣローブまたはＮ＋Ｃローブと有意に異なる特異的な免疫化／タンパク質対を表す。
【図４】北アメリカ、ヨーロッパおよびアジアのブタから単離されたブタ病原アクチノバシラス・プルロニューモニエ、Ａ．スイスおよびヘモフィルス・パラスイスからのＴｂｐＢの配列多様性を表す。最尤系統樹は、本発明者らの臨床単離物コレクションからの配列、または公的データベースから得られた配列に基づく５６のＴｂｐＢ間の関連性を示す。ＴｂｐＢ配列は、３つの主な群に分割され、代表的な単離物を矢印で示している（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２８およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１０７〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１５）。図３に示されたＥＬＩＳＡアッセイで用いられたＴｂｐＢ変異体を発現する菌株を、大きな黒色の星で示す；Ａ．プルロニューモニエＨ８７株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２）、Ａ．プルロニューモニエＨ４９株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２）およびＨ．パラスイスＨＰ５株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１５）。大きな黒色の矢印は、図１に示されたアライメント内で用いられた３種のＴｂｐＢを表す；Ａ．プルロニューモニエＨ８７株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２）、Ａ．プルロニューモニエＨ４９株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２）およびＡ．スイスＨ５７株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２８）。
【図５】融合タンパク質（即ち、ＴｂｐＢ  Ｎ−ローブに融合したマルトース結合タンパク質（Ｍｂｐ））の前駆体ではなくむしろ精製されたＴｂｐＢタンパク質を用いてＥＬＩＳＡプレートをコーティングした場合の、標識されたトランスフェリンの結合における実質的な減少により示されたＥＬＩＳＡプレートへのＡ．プルロニューモニエＨ４９からのＴｂｐＢ  Ｎ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：８）ノンランダムな結合を表す（パネルＡおよびパネルＢの左部分）。この図は、Ｎ末端ビオチン化ペプチドの使用でランダムな結合（パネルＡおよびパネルＢの右部分）をどう上回るかも表している。パネルＡの左部分は、標準のＥＬＩＳＡプレートに結合された精製Ｍｂｐ−ＴｂｐＢ  Ｎ−ローブまたはＴｂｐＢ  Ｎ−ローブを測定するために、標識されたトランスフェリン（Ｔｆ）を用いたアッセイの結果を表す。右部分は、組換えタンパク質がビオチン化Ｎ末端ペプチドタグを含み、それを用いてストレプトアビジン・コーティングＥＬＩＳＡプレートに付着した場合の結果を示す。パネルＢは、パネルＡ内の直ぐ上に示された対応する結果の異なるＥＬＩＳＡウェルで生じると考えられるものを示した描写である。
【図６】３種の異なるブタ病原からのＴｂｐＢ  Ｃ−ローブで構成された多量体の設計および生成を表す。パネルＡは、Ａ．プルロニューモニエＨ４９株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：６）、Ａ．スイスＨ５７株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３５）およびＡ．プルロニューモニエＨ８７株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２２）からのＣ−ローブの三量体（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３９；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：４０）のＤＮＡおよびタンパク質配列を順序通り示している。下線は、個々のＣ−ローブを接続した、または最初のＣ−ローブの前のペプチド配列を示す。パネルＢは、Ｎ．メニンギティディスＭ９８２株からのＮ−ローブおよびＣ−ローブの調製物と比較した、Ｃ−ローブ三量体の調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。試料１μｌをレーン１、４および７に加え、５μｌをレーン２、５および８に加え、１０μｌをレーン３、６および９に加えた。これらのゲルで観察されたタンパク質の分子量標準（ＭＷＳ）は、９３、７０、６３、４１、３０および２２である。
【図７】Ａ．プルロニューモニエＨ４９、Ａ．スイスＨ５７およびＡ．プルロニューモニエＨ８７からのＴｂｐＢ  Ｃ−ローブで構成された三量体（Ｃ−ローブ三量体、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：４０）に対する免疫応答と比較した、Ａ．プルロニューモニエからのＴｂｐＢ  Ｃ−ローブ（Ｈ４９  Ｃ−ローブ、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：６）に対する免疫応答を表す。図の左側の棒のクラスタは、Ｈ４９  Ｃ−ローブに対する免疫応答を表すが、図の左側の棒のクラスタは、Ｃ−ローブ三量体に対する免疫応答を表す。黒色の棒は、Ａ．プルロニューモニエＨ４９株からのＴｂｐＢ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２）に対する免疫応答を表し、濃灰色の棒は、Ｈ．パラスイスＨＰ５株からのＴｂｐＢ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１５）に対する免疫応答を表し、淡灰色の棒は、Ａ．プルロニューモニエＨ８７株からのＴｂｐＢ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２２）に対する免疫応答を表す。
【図８】ループ減少のターゲットとなったアクチノバシラス・プルロニューモニエＨ４９株  ＴｂｐＢ  Ｎ−ローブのループ領域（「ループ１」、「ループ５」、「ループ８ａ」、「ループ８ｃ」および「ループ１２」と標識）（それぞれＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：４１、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：４９、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：５５、およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：６３）と、本来のループおよび修飾されたループの配列を表す。ループ８ａおよびループ８ｃは、Ｈ４９株からのＴｂｐＢに存在するループ８の一部を指す。パネルＡは、（細胞表面の予測されるドミナント配列に対して）側部から見たアクチノバシラス・プルロニューモニエ  ＴｂｐＢ  Ｎ−ローブの構造モデルを、ターゲットの領域の標識と共に示す。パネルＢは、上から見た同じ構造モデルであり、ループ１および５とハンドルドメインとの会合、ならびにバレルドメインと会合するループ８ａ、８ｃおよび１２を示す。パネルＣは、ネイティブＴｂｐＢと、ターゲットのループ領域が減少したＴｂｐＢとのアライメントを示す。ループをコードする配列の領域が、灰色で強調され、ループ番号が標識されている。
【図９】Ａ．プルロニューモニエＨ４９株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１０）、Ａ．スイスＨ５７株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３８）およびＡ．プルロニューモニエＨ８７株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２６）のＴｂｐＢ  Ｎ−ローブのループ減少の改変が、それらの生成または安定性に悪影響を及ぼさず、ブタＴｆによる結合を排除したことを示す。上段のパネルは、インタクトＨ４９  ＴｂｐＢ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２）、ネイティブｈ４９  ＴｂｐＢ  Ｎ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：８）、およびＡ．プルロニューモニエＨ４９株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１０）、Ａ．スイスＨ５７株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３８）またはＡ．プルロニューモニエＨ８７株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２６）からの改変ＴｂｐＢ  Ｎ−ローブｓの生成を示す。それらは、ポリヒストジンタグを有するＮ末端マルトース結合タンパク質のとの融合タンパク質として発現され、Ｎｉ−ＮＴＡ上で捕捉された。結合したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液に遊離させて、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。中段のパネルは、セファロース（ｐＴｆ−セファロース）に結合されたブタトランスフェリンからなるアフィニティー樹脂で捕捉されて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液に溶出された同じ調製物を表す。下段のパネルは、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂から溶出されて、ニトロセルロース樹脂上にスポットされ、ブロッキングされて、ブロッキング溶液中の西洋ワサビペルオキシダーゼ・コンジュゲート・ブタトランスフェリン（ＨＲＰ−ｐＴｆ）に暴露された上段パネルの材料と、ＨＲＰ基質中でのインキュベートで検出された結合ＨＲＰとのドットアッセイを示す。
【図１０】ヒト病原ナイセリア・メニンギティディスからのＴｂｐＢの配列多様性を表す。ＢＩＧＳＤＢ公的データベース（ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｍｌｓｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｄａｔａｂａｓｅ／ｂｉｇｓｄｂ／  −  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｉｓｏｌａｔｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）において入手可能な大きな配列コレクションと組み合わせた、１００株を超えるコレクションから配列決定されたｔｂｐＢ遺伝子のサブセットが、この図に表されている。この配列コレクションは、ほぼ５０年もの長期間にわたる世界的な単離物コレクションを表し、つまりこれは、全体的なＴｂｐＢ多様性のかなり包括的な表現である。図１０Ａは、インタクトＴｂｐＢの配列多様性を示す。同定された群の代表的配列を示すために、矢印、両矢印、または線で示された、菌株からのＴｂｐＢに関する配列が添えられている（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３２〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１４７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７７；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７８）。群１および群２〜４により表された２つの主なクレードは、アイソタイプＩおよびＩＩ  ＴｂｐＢ系列に対応するこの系統樹内で同定される（２２）。主な枝のサポートバリューが表され、「＊」は、１００％サポートの枝を同定している。Ｂ１６Ｂ６株からのＴｂｐＢ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１７、黒色の矢印）由来の抗原を用いて、図１１で分析された抗血清を作製し、本発明者特製のＥＬＩＳＡアッセイ（図５）を用いて灰色の矢印（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２３；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３２〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３９）により示された株からのＴｂｐＢに対する反応性についてスクリーニングした。図１０Ｂは、ＴｂｐＢ配列に由来するＴｂｐＢ  Ｃ−ローブの配列多様性を表す。代表的配列を示すために、矢印または線で示された、菌株からのＴｂｐＢ  Ｃ−ローブに関する配列が添えられている（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１９；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２５；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７９〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１９５）。両矢印により示された２つの菌株は、Ｃ−ローブの多様性のより包括的な表現を示すために含まれているが、図１１に示された抗血清の分析では利用されていない。
【図１１】Ｎ．メニンギティディスの代表的アイソタイプＩ株であるＢ１６Ｂ６由来の切断されたインタクトＴｂｐＢ(ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１４８、ａａ４３−５７５）およびＴｂｐＢ  Ｃ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１９、ａａ３４２−５７５）に対する抗血清の反応性を表す。本発明者らの特製ＥＬＩＳＡアッセイ（図５）において、抗血清を、Ｎ．メニンギティディス内のＴｂｐＢの全体的配列多様性（図１０の矢印）を表すＴｂｐＢのパネルに対してテストした。ＴｂｐＢのパネルは、Ｎ．メニンギティディスのＢ１６Ｂ６株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１７）、Ｈ４４／７６株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３３）、Ｓ３１３１株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３２）、Ｍ９９０株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３４）、Ｍ９７８株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３５）、Ｍ９９２株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３８）、Ｐ３００６株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３９）、１２０Ｍ株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３７）、ＭＣ５８株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３６）およびＭ９８２株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２３）のものである。結果から、Ｃ−ローブ抗血清が、Ｂ１６Ｂ６およびＨ４４／７６からのＴｂｐＢを除く全てのＴｂｐＢに対し、ＴｂｐＢ抗血清よりも高い力価を有したことが実証される。
【図１２】ヒト病原ナイセリア・メニンギティディスの２つの異なる菌株からのＴｂｐＢ  Ｃ−ローブで構成された二量体（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１８）の設計および生成を表す。パネルＡは、Ｎ．メニンギティディス  Ｂ１６Ｂ６株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１８およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１９）およびＭ９８２株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２４およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２５）からのＣ−ローブの二量体に関するＤＮＡおよびタンパク質の配列を順序通り示している。下線は、個々のＣ−ローブを接続するペプチド領域のＤＮＡ配列を示す。パネルＢは、Ｎ．メニンギティディスＭ９８２およびＢ１６Ｂ６株からの個々のＣ−ローブの調製物と比較した、Ｃ−ローブ二量体調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１３】ヒト病原ナイセリア・メニンギティディスの２つの異なる菌株からのＴｂｐＢ  Ｃ−ローブで構成された二量体（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５０）に対する免疫応答の分析を表す。対になった棒は、アジュバントのみ（ナイーブ）、図１２に示されたＢ１６Ｂ６  Ｃ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１９）、Ｍ９８２  Ｃ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２５）もしくはＢ１６Ｂ６  Ｃ−ローブとＭ９８２  Ｃ−ローブとの二量体（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５０）で免疫化されたウサギから得られた血清を表す。白色の棒は、インタクトＭ９８２  ＴｂｐＢ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２３）で免疫化された新規な特製ＥＬＩＳＡアッセイの結果を表し、黒色の棒は、免疫化されたインタクトＢ１６Ｂ６タンパク質（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１７）での結果を表す。
【図１４】Ｎ．メニンギティディスＭ９８２のＴｂｐＢポリペプチドのＣ−ローブのループドメインの減少を表す。パネルＡにおいて、４つのループ（Ｌ１８、Ｌ２１、Ｌ２３およびＬ２７）の減少を表すために、ネイティブＣ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２５）および修飾Ｃ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２９）の構造モデルを示している。左側のモデル（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２５）において、減少のターゲットとなったループを、点線の黒色線で示している。中央のモデル（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２９）は、修飾ループドメインを示している。右側のモデルにおいて、２つの先行の構造を重ねることで、全体的なタンパク質構造に影響を及ぼさずに大きな可変性ループを除去した方法を示している。パネルＢは、ネイティブＣ−ローブと、１つのループが修飾されたＣ−ローブを有する改変Ｃ−ローブと、４つのループ（Ｌ１８、Ｌ２１、Ｌ２３およびＬ２７）全てが修飾されたＣ−ローブ（「ループレス」と標識された配列）とで配列を比較したポリペプチド配列アライメントである。ターゲットとなったループを含む配列の領域を灰色で強調し、ループ番号を灰色のフォントで示している。
【図１５】図１４に記載されたＮ．メニンギティディスＭ９８２の修飾Ｃ−ローブの微生物産生を表す。野生型（ＷＴ）Ｃ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２５）は、図１４のパネルＡの左側のモデルに対応する。他の試料は、ループＬ１８、Ｌ２１、Ｌ２３およびＬ２７内に切断部を有するタンパク質、ならびに４つのループ全てが除去されたタンパク質（全ループ）を表す。このタンパク質の構造モデル（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２９）は、図１４のパネルＡの中央に示している。このゲル上で観察されたタンパク質分子量標準（ＭＷＳ）は、９３、７０および４１ｋＤａである。
【図１６】Ｎ．メニンギティディスのＭ９８２およびＢ１６Ｂ６株からのネイティブＣ−ローブに対するＭ９８２株の修飾Ｃ−ローブの免疫原性を表す。マウス抗血清のエンドポイント力価を、本発明者らの特製ＥＬＳＩＡアッセイで測定した。マウスを、Ｍ９８２株からのＣ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２５、最初の棒）、Ｂ１６Ｂ６株からのＣ−ローブ  ＴｂｐＢ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１９、２番目の棒）または「ループレス」のＭ９８２  Ｃ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２９、最後の２つの棒）のいずれかで免疫化した。血清は、Ｍ９８２株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２３）（最初および３番目の棒）またはＢ１６Ｂ６株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１７）（２番目および４番目の棒）からの免疫化されたインタクトＴｂｐＢに対してテストした。結果から、修飾Ｃ−ローブが親Ｃ−ローブタンパク質よりもＭ９８２株からのインタクトＴｂｐＢに対して高い力価をもたらしたため（棒３と１との比較）、修飾Ｃ−ローブがより免疫原性であることが示される（棒３と１との比較）。驚くべきことに、修飾Ｃ−ローブであってもＢ１６Ｂ６からのＣ−ローブと同レベルの、異種Ｂ１６Ｂ６  ＴｂｐＢへの反応性を生じた（棒４と２との比較）。
【図１７】ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブスカフォールド上でＴｂｐＡの領域を提示するハイブリッドタンパク質の設計を表す。パネルＡは、ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブ上の「移植片」に対して選択された領域を強調したＴｂｐＡ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５２）の構造モデルである。ＴｂｐＡのループ３へリックス、ループ１０、ループ１１およびプラグループが、黒色の領域として示されている。パネルＢは、ネイティブＣ−ローブ（Ｃ−ローブ）（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２５）、ループレスＣ−ローブスカフォールド（ループレスＣ）（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２９）およびＴｂｐＡの領域全てが提示されたハイブリッドタンパク質（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３１）のアライメントを示している。該ハイブリッドタンパク質において、ＴｂｐＡループ３へリックスがＴｂｐＢ  Ｃ−ローブのループ１８の代わりに、ＴｂｐＡループ１０がＴｂｐＢ  Ｃ−ローブのループ２１の代わりに、ＴｂｐＡループ１１がＴｂｐＢ  Ｃ−ローブのループ２３の代わりに、ＴｂｐＡプラグループがＴｂｐＢ  Ｃ−ローブのループ２７の代わりに用いられている。
【図１８】図１７に記載された方策を利用して生成されたハイブリッドＴｂｐＡ−ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブの微生物産生を表す。パネルＡは、Ｎ末端マルトース結合タンパク質（Ｍｂｐ）融合パートナーとの組換え融合タンパク質の生成を示し、パネルＢは、ＴＥＶプロテアーゼでの切断後のタンパク質を示す。野生型（ＷＴ）タンパク質は、ネイティブＭ９８２  Ｃ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２５）であり、マイナスループは、ＴｂｐＡ領域を提示するためのスカフォールドとして効果的に働く、４つのループ全てが除去されたＣ−ローブである。ループ１０は、ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブループ２１（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５４）に挿入されたＴｂｐＡの細胞外ループ領域を有するタンパク質を指す。ループ１１は、ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブループ２３（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５６）に挿入されたＴｂｐＡの細胞外ループ領域を有するタンパク質を指す。へリックス３は、ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブループ２７（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５８）に挿入されたＴｂｐＡの細胞外ループ３のセグメントを指す。プラグループは、ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブループ１８（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６０）に挿入されたＴｂｐＡのプラグドメインからの領域を指す。このゲル上で観察されたタンパク質分子量標準（ＭＷＳ）は、９３、７０、５３、４１および２２である。
【図１９】修飾ループ部位にスプライシングされたＴｂｐＡからの外来ループ領域を有する修飾Ｃ−ローブと比較した、Ｎ．メニンギティディスＭ９８２株の修飾Ｃ−ローブの免疫原性を表す。マウス抗血清のエンドポイント力価を、本発明者らの特製ＥＬＳＩＡアッセイで測定した。マウスを、（ｉ）４つのループ全てが除去された「ループレス」Ｃ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２９）、（ｉｉ）ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブ  ループ２１に挿入されたＴｂｐＡ  ループ１０を有する「ループレス」Ｃ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５４）、（ｉｉｉ）ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブ  ループ２３に挿入されたＴｂｐＡ  ループ１１を有する「ループレス」Ｃ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５６）、（ｉｖ）ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブ  ループ２７に挿入されたＴｂｐＡ  ループ３へリックスを有する「ループレス」Ｃ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５８）、または（ｖ）ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブ  ループ１８に挿入されたＴｂｐＡ  プラグループを有する「ループレス」Ｃ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６０）のいずれかで免疫化された。血清は、「ループレス」Ｃ−ローブの４つ全てのＴｂｐＡループが挿入されているハイブリッドＴｂｐＡ−ＴｂｐＢ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３１）に対してテストした。結果から、ハイブリッド抗原の全てが免疫原性であり、少なくとも「ループレス」Ｃ−ローブと同等に免疫原性であったことが示される。
【図２０】ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブスカフォールド上でＬｂｐＡ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６２）の領域を提示するハイブリッドタンパク質の設計および生成を表す。パネルＡは、ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブ上の「移植片」に選択された領域を強調したＬｂｐＡの構造モデルである。ＬｂｐＡのループ３へリックスが、濃灰色に着色され、ループ２が黒色に着色されている。パネルＢは、ネイティブＣ−ローブ（Ｃ−ローブ、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２５）、ループレスＣ−ローブスカフォールド（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２９）およびＬｂｐＡの領域が提示されたハイブリッドタンパク質のアライメントを示す。ハイブリッドタンパク質において、ＬｂｐＡループ２へリックスが、ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブのループ２１（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６４）の代わりに用いられ、ＬｂｐＡループ３へリックスが、ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブのループ１８（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６６）の代わりに用いられている。これらのゲル上で観察されたタンパク質分子量標準（ＭＷＳ）は、１００、７５、６３および４８である。
【図２１】ヒト病原ヘモフィルス・インフルエンザからのＴｂｐＢ  Ｃ−ローブ内の「コンジュゲーションループ」の設計を表す。パネルＡは、より大きなフォントで示されたコンジュゲーションループ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６７）をコードするＤＮＡ領域を有するハイブリッド遺伝子をコードする遺伝子のＤＮＡおよびタンパク質配列を示す。アミノ酸は、一文字の記号で示され、リシンは文字Ｋにより表され、それらは、Ｃ−ローブ全体（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６８）の２４に比較してコンジュゲーションループには４２存在する。パネルＢは、Ｈ．インフルエンザＴｂｐＢ  Ｃ−ローブの構造モデルと、コンジュゲーションループが挿入される位置を示している。図示された通り、コンジュゲーションループは、Ｃ−ローブのループＬ２３（この開示全体で用いられるループの命名法を利用）（図２）の代わりにＣ−ローブのハンドルドメインに挿入されている。例示目的のため、モデルが実際のタンパク質中の９１の代わりに１１アミノ酸のコンジュゲーションループで作製されていることに留意されたい。
【図２２】Ａ．プルロニューモニエ、Ａ．スイスおよびＨ．パラスイスからの組換え切断ＴｂｐＢタンパク質に由来する部位特異的変異体ＴｂｐＢタンパク質のトランスフェリン結合特性を表す。組換え切断ＴｂｐＢタンパク質を融合タンパク質として発現させ、結合活性についてテストした。組換え融合タンパク質を最初、固相結合アッセイおよび親和性捕捉アッセイによりトランスフェリン結合についてスクリーニングした。その後、精製された突然変異タンパク質を、等温熱量測定、表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法（２３〜２５）のいずれかによりｐＴｆへの結合について評価した。変異体の幾つかは、Ａ．プルロニューモニエＨ４９株のＴｂｐＢのＦ１７１Ａ変異体、Ａ．プルロニューモニエのＨ４９株のＴｂｐＢのＹ１７４Ａ変異体、またはＨ．パラスイスＨＰ５株のＴｂｐＢのＹ１６７ＡまたはＷ１７６Ａ変異体など、親和性定数（Ｋｄ）の１００倍以上の増加をもたらした。これらの変異体が全てループ８に位置することは、注目すべき興味深いことである。
【図２３】ネイティブの宿主における防御的免疫応答を誘導する部位特異的突然変異タンパク質の能力の増強を表す。この図において、Ｈ．パラスイスＨＰ５株からの部位特異的Ｙ１６７Ａ  ＴｂｐＢ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７４）の能力を、野生型ＴｂｐＢ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１５）、ならびに市販のワクチン（Ｐｏｒｃｉｌｌｉｓ  Ｇｌａｓｓｅｒ）およびアジュバント単独をはじめとする対照と比較している。ブタに１０８コロニー形成単位（ｃｆｕ）のＨｐ５（Ｎａｇａｓａｋｉ）株を気管内接種することによりチャレンジして、実験期間全体の臨床兆候および症状についてモニタリングした。重度の症状を有する動物は、実験の終了前に安楽死させた。グラフは、２４〜１０８時間まで１２時間の増分で示した生存曲線を示し、その後は１４日目の最後のタイムポイントにつないでいる。
【図２４】ネイティブおよび変異体ＴｂｐＢ抗原により誘導された細胞内免疫応答を表す。パネルＡおよびパネルＢは、それぞれチャレンジ当日（２回のＩＭ免疫化後）およびチャレンジ後４日目（９６時間目）のＢ細胞の応答を示す。パネルＣおよびパネルＤは、チャレンジ当日およびチャレンジ後４日目のＴヘルパー細胞の応答を示す。菱形、三角形および正方形は、それぞれネイティブＴｂｐＢ、Ｙ１６７Ａ変異体ＴｂｐＢおよびＰｏｒｃｉｌｉｓ  Ｇｌaｓｓｅｒ（ＰＧ）ワクチンで免疫化されたブタを表す。チャレンジ後４日目のネイティブＴｂｐＢおよびＰＧワクチン処置のブタについては、少ない試料数である。末梢血単核細胞を用いたＦＡＣＳ分析により、分析を実施した。群間の有意差：＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１．
【図２５】Ｎ．メニンギティディスからの組換え切断ＴｂｐＢ、組換え切断ＴｂｐＢ  Ｎ−ローブまたは組換え切断ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブでの免疫化が、ヒト化トランスジェニックマウスモデルにおける定着からの防御をもたらすことを示す。パネルＡに示された実験において、ヒトＣＥＡＣＡＭ１受容体を発現するトランスジェニックＣ５７ブラックマウスを、１日目および２１日目にＮ．メニンギティディスＭ９８２株からの組換え切断ＴｂｐＢまたはアジュバント単独で免疫化した。マウスは、３５日目におよそ１×１０７ＣＦＵのＮ．メニンギティディスＭ９８２株の鼻内接種に供された。正方形および円は、チャレンジの３日後（３８日目）に個々のマウスから採取されたＣＦＵを表す。パネルＢは、マウスを１日目および２１日目に組換え切断ＴｂｐＢ、組換え切断ＴｂｐＢ  Ｎ−ローブ、組換え切断ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブ、組換えＨ因子結合タンパク質またはアジュバント単独のいずれかで免疫化させた追跡実験を示す。パネルＡと同様に、個々のマウスにおけるチャレンジの３日後のＮ．メニンギティディスＭ９８２株のＣＦＵ数を、グラフにプロットしている。
【図２６】ヒト病原ナイセリア・ゴノレアからのＴｂｐＢおよびＴｂｐＢ  Ｃ−ローブの配列多様性を示す。パネルＡ（図２６Ａ）は、インタクトＴｂｐＢの配列多様性を示し、パネルＡ（図２６Ｂ）は、ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブの配列多様性を表す。代表的なＮ．メニンギティディス  ＴｂｐＢおよびＴｂｐＢ  Ｃ−ローブの配列（図１０、矢印および両矢印）をこの分析に含めて、Ｎ．ゴノレアからのＴｂｐＢおよびＴｂｐＢ  Ｃ−ローブの配列がどの程度、Ｎ．メニンギティディス中に存在するそれの配列多様性のサブセットであるかを決定した。図１０と同様に、矢印により示された代表的なＮ．ゴノレアＴｂｐＢ配列（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２０７〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１２）およびＴｂｐＢ  Ｃ−ローブ配列（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１３〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１８）をアペンディックスに含めて、全体的な配列多様性の表現を提供している。パネルＡに示された通り、メニンゴコッカスアイソタイプ２  ＴｂｐＢの分派であるＮ．ゴノレアＴｂｐＢの２つのクラスタが存在する。メニンゴコッカスＨ４４／７６株からのＴｂｐＢに最も密接に関係する１つのより大きなクラスタと、Ｐ３３０６株からのＴｂｐＢに最も密接に関係するより小さなクラスタと、が存在する。パネルＢのＣ−ローブのツリーから、Ｎ．ゴノレアＴｂｐＢ  Ｃ−ローブが、メニンゴコッカスアイソタイプ２  ＴｂｐＢに最も密接に関係するメニンゴコッカスＴｂｐＢ  Ｃ−ローブと異なるクラスタを形成することが明らかである。
【図２７】ヒト病原ヘモフィルス・インフルエンザからのＴｂｐＢおよびＴｂｐＢ  Ｃ−ローブの配列多様性を表す。パネルＡ（図２７Ａ）は、インタクトＴｂｐＢの配列多様性を示し、パネルＢ（図２６Ｂ）は、ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブの配列多様性を表す。矢印により示された代表的なＨ．インフルエンザＴｂｐＢ配列（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１９６〜２０４）をアペンディックスに含めて、全体的な配列多様性の代表を示している。パネルＡに示された通り、入り混じったｂ型および分類不能なＨ．インフルエンザ株を含むＨ．インフルエンザＴｂｐＢの３つの主のクラスタ（群）が存在し、ＴｂｐＢの多様性がカプセルの存在など任意の他の属性に結びつかないことが示される。Ｃ−ローブの多様性にも３つの主な群が存在する。
【図２８】反芻動物の病原マンヘミア・ヘモリティカ、マンヘミア・グルコシダおよびビベルスティニア・トレハロシ（当該技術分野において、それぞれパスツレラ・ヘモリティカおよびＰ．トレハロシとしても知られる）の間のＴｂｐＢの配列多様性を表す。矢印は、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：の列挙に含まれる代表的な配列を示す。
【図２９】モラクセラ・カタラーリスからのＴｂｐＢの配列多様性を表す。矢印は、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：の列挙に含まれる３つの主なクラスタからのＴｂｐＢの代表的な配列を示す。
【図３０】例示的な系統樹を表す。
【００３５】
［表１〜３］本開示に従って修飾され得る、ＨＩＢＰポリペプチドのループドメインＬ１〜Ｌ３２から選択された、それぞれ１、２または３ループドメインの組み合わせを表す。
【数１】
2016539950.tif 000003
は、本開示の特定の実施形態により修飾され得るループドメイン、またはループドメインの組み合わせを表す。
【数２】
2016539950.tif 000004
は、本開示の特定の実施形態によるループドメインの非認可の組み合わせを表す。
□は、本開示の特定の実施形態による、認可されたループドメインの組み合わせを表すが、同じ表の他の箇所では
【数３】
2016539950.tif 000005
により示されている。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
開示の詳細な記載
各請求された主題の実施形態の例を与えるために、様々な組成物および方法を以下に記載する。以下に記載される実施形態は、任意の請求された主題を限定するものではなく、任意の請求された主題は、以下に記載されるものとは異なる方法、工程、組成物またはシステムを含み得る。請求された主題は、以下に記載される任意の１つの組成物、方法、システムもしくは工程の特色の全て、または以下に記載される組成物、システムもしくは方法の複数もしくは全てに共通する特色を有する組成物または方法に限定されない。以下に記載される組成物、システム、方法または工程が、任意の請求された主題の実施形態ではないことが可能である。この文書に請求されていない以下に記載の組成物、システム、方法または工程に開示された任意の主題は、別の保護手段、例えば連続する特許出願の主題であり得、本出願人、発明者または所有者は、この文書内の開示により公的な任意のそのような主題を廃棄する、否認する、またはそれに専念する意図はない。
【００３７】
本明細書で用いられる「実質的に」、「本質的に」、「約」および「およそ」などの程度の用語は、最終的な結果が大きく変動しないように修正される用語の合理的な変動量を意味する。この変動が修正する用語の意味をこの変動が否定しない場合に、これらの程度の用語は修正された用語の変動を含むと解釈されなければならない。
【００３８】
本明細書で用いられる言語「および／または」は、包含的論理和を表すものとする。即ち、例えば「Ｘおよび／またはＹ」は、ＸもしくはＹ、またはその両方を意味するものとする。更なる例として、「Ｘ、Ｙ、および／またはＺ」は、ＸもしくはＹもしくはＺ、またはそれらの任意の組み合わせを意味するものとする。
【００３９】
発行物、特許および特許出願の全ては、各個別の発行物と同程度に、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【００４０】
本明細書でこれまで言及された通り、本開示は、新規な免疫原性組成物、詳細にはナイセリア・メニンギティディスなどのグラム陰性病原菌種からのＨＩＢＰ表面受容体タンパク質に基づく特定の免疫原性組成物を提供する。本開示の免疫原性組成物は、新規なワクチン配合剤を調製するために用いられて感染性のある病原性グラム陰性菌種からヒトおよび動物を防御し得ることにおいて有用である。本開示によれば、本開示のＨＩＢＰ表面受容体タンパク質は、宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができないように修飾される。そのような修飾されたＨＩＢＰ表面受容体タンパク質は、予想外に強い免疫原性を呈する。さらに本開示の免疫原性組成物は、実質的に安定したポリペプチドであり、それゆえ即座に製造され得る。その上、そして重要なこととして、本開示の免疫原性組成物は、例えば交差反応性免疫応答を誘導し、それにより単一の有効なワクチン接種化合物の投与により複数の病原性細菌生物体からの防御を可能にすることにより、予想外に効果的になる。本開示に従って調製されるワクチンは、生存する生物体または粗抽出物を含まず、それにより非常に低い健康リスクを示す。
【００４１】
したがって本開示は、少なくとも１つの実施形態において、グラム陰性病原菌種からのＨＩＢＰ表面受容体タンパク質を含む免疫原性組成物であって、該ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質が、宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができないように修飾されている、免疫原性組成物を提供する。
【００４２】
本開示は、グラム陰性病原菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む免疫原性組成物であって、該ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、免疫原性組成物をさらに提供する。特定の実施形態において、該ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＮ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメインは、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、該複数のループドメインのより多くのループドメインの１つは、修飾されている。
【００４３】
用語および定義
他に定義されなければ、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に引用されたＧｅｎＢａｎｋ、ＳｗｉｓｓＰｒｏおよび他のデータベースからの核酸およびポリペプチド配列をはじめとする全ての特許、特許出願および他の発行物は、前または後にかかわらず、許容される限り、全体として参照により本明細書に組み込まれる。本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その内容が明らかに他の方法で規定しない限り、複数の対象を含む。したがって例えば「免疫原」の対象は、２種以上のそのような物質の混合物を含み、「ポリペプチド」の対象は、２種以上のそのようなポリペプチドの混合物の対象を含み、「細胞」の対象は、２種以上のそのような細胞を含む、などである。
【００４４】
本明細書で互換的に用いられる用語「免疫原」および「免疫原性組成物」は、細胞免疫原に特異的な免疫応答、および／または液性抗体反応を生成する宿主生物体内の免疫応答を刺激する１つまたは複数のエピトープを含む分子を指すために最も広い意味で用いられる。免疫原としては、核酸、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび免疫原性タンパク質断片が挙げられる。
【００４５】
本明細書で互換的に用いられる用語「ワクチン」および「ワクチン組成物」は、対象における疾患または疾病を予防または処置するために用いられ得る、免疫原を含む任意の医薬組成物を指す。したがって該用語は、サブユニットワクチン、即ち免疫原が本来、会合している全生物体から分割および分離された免疫原を含有するワクチン組成物を包含する。
【００４６】
用語「脊椎動物対象」は、脊索動物亜門、詳細には非限定的にヒトおよび他の霊長類をはじめとする哺乳動物の任意の構成員を指す。該用語は、特定の年齢を示していない。したがって新生仔、幼児、小児および成人個体の全てが、含まれるものとする。
【００４７】
本明細書で互換的に用いられる用語「ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質」、「ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチド」、「宿主鉄結合タンパク質表面受容体タンパク質」、または「宿主鉄結合タンパク質表面受容体ポリペプチド」は、宿主鉄結合タンパク質と相互作用することが可能なグラム陰性菌種から得ることができる任意の膜結合タンパク質またはポリペプチドを指す。該用語は、任意のＴｂｐＢおよびＬｂｐＢタンパク質を包含する。ネイティブの三次元構造でフォールディングされる場合のＨＩＢＰ表面受容体タンパク質は、Ｎ−ローブドメインおよびＣ−ローブドメインを含む二葉構造で構成され、そのＮ−ローブドメインおよびＣ−ローブドメインがそれぞれβバレル内で組み立てられた複数のβ鎖と、ハンドルドメインと称されるβバレルに隣接するβシート構造内で組み立てられた複数のβ鎖と、を含み、該β鎖は、複数のループドメインにより接続されている（図１にさらに示される）。該用語はさらに、非限定的にＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１０７〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２３；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３１〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１４７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１９６〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２０４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２０６〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１２；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１９〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２２８をはじめとする全ての細菌ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドを含むあらゆるＨＩＢＰ受容体ポリペプチド配列、ならびに（ｉ）本明細書に示された任意のＨＩＢＰ表面受容体タンパク質を構成するアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸残基の配列を含むもの；（ｉｉ）本明細書に示された任意のＨＩＢＰ表面受容体タンパク質をコードする任意の核酸配列に対して少なくとも適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸配列によりコードされたアミノ酸残基の配列、または本明細書に示された任意のＨＩＢＰ表面受容体タンパク質をコードする任意の核酸配列に対して少なくとも適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であるが同義コドンの使用のための核酸配列によりコードされたアミノ酸残基の配列を含むものを指す。該用語は、任意のＨＩＢＰ表面受容体タンパク質前駆体ポリペプチドをさらに含むか；または（ｉｉｉ）Ｐｈｙｒｅ２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｂｇ．ｂｉｏ．ｉｃ．ａｃ．ｕｋ／ｐｈｙｒｅ２／）もしくはＳｗｉｓｓ−Ｍｏｄｅｌ（ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）などの構造モデル化サーバに寄託された場合のテンプレートとして、後者が選択する自動モードにおいて、トランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質またはそれらのサブドメインを使用する。該用語は、成熟したＴｂｐＢポリペプチドに加え、任意のプレＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチド前駆体、またはＮ末端もしくは他のシグナル配列を含むＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチド前駆体をはじめとする、任意のＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチド前駆体をさらに含む。
【００４８】
本明細書で互換的に用いられる用語「内在性外膜タンパク質」および「ＩＯＭタンパク質」は、ネイティブ三次元構造でフォールディングされた場合に、２２鎖のＣ末端βバレルドメインと、該Ｃ末端βバレルドメイン内のチャネルを充填することが可能なＮ末端プラグまたはコルクドメインと、を含む、タンパク質のＴｏｎＢ依存性サブクラスに属する任意のタンパク質など、グラム陰性菌種からの任意の内在性外膜タンパク質を指す。該用語は、限定ではなく、ＴｂｐＡおよびＬｂｐＡタンパク質を包含する。該用語はさらに、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５２およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６２に示されたもの、ならびに（ｉ）本明細書に示された任意のＩＯＭタンパク質を構成するアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸残基の配列；（ｉｉ）本明細書に示された任意のＩＯＭタンパク質をコードする任意の核酸配列に対して少なくとも適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な、または本明細書に示された任意のＩＯＭタンパク質をコードする任意の核酸配列に対して少なくとも適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であるが同義コドンの使用のための、核酸配列によりコードされたアミノ酸残基の配列、を含むものをはじめとする全てを含むあらゆるＩＯＭポリペプチド配列を指す。該用語は、ＩＯＭタンパク質前駆体ポリペプチドをさらに含むか；または（ｉｉｉ）Ｐｈｙｒｅ２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｂｇ．ｂｉｏ．ｉｃ．ａｃ．ｕｋ／ｐｈｙｒｅ２／）もしくはＳｗｉｓｓ−Ｍｏｄｅｌ（ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）などの構造モデル化サーバに寄託された場合のテンプレートとして、後者が選択する自動モードにおいて、３Ｖ８Ｘまたはそれらのサブドメインを使用する。
【００４９】
本明細書で用いられる用語「Ｎ−ローブドメイン」は、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、そのβ鎖の一部がβバレルと、ハンドルドメインと称される隣接するβシート構造とを形成するように配置されている、ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＮ末端部分を指す（図１のアミノ酸残基４６〜アミノ酸残基３４２を参照）。用語Ｎ−ローブドメインは、非限定的にＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１０；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２１；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２２９；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３１；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３３に示された配列を有する全てのポリペプチドをさらに含む。
【００５０】
本明細書で用いられる用語「Ｃ−ローブドメイン」は、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、そのβ鎖の一部がβバレルと、ハンドルドメインと称される隣接するβシート構造とを形成するように配置されている、ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ末端部分を指す。さらに図１および図２を参照すると、Ｃ−ローブのハンドルドメインは、β鎖１６から前方へ、そしてβ鎖２３を含みそこまでの連続したポリペプチドドメインであり、図２に示されたＡｐＨ４９、ＡｐＨ５７およびＡｐＨ８７  ＴｂｐＢポリペプチドの場合には、アミノ酸残基３４４〜４３１；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸残基３１４〜アミノ酸残基４０１（ＡｐＨ４９）；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２７のアミノ酸残基３６３〜アミノ酸残基４５０（ＡｐＨ５７）；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２のアミノ酸残基３１５〜アミノ酸残基４０１（ＡｐＨ８７）からなる。Ｃ−ローブβバレルドメインは、β鎖２３から前方へポリペプチドのＣ末端までの連続したポリペプチドドメインであり、図２に示されたＡｐＨ４９、ＡｐＨ５７およびＡｐＨ８７  ＴｂｐＢポリペプチドの場合には、アミノ酸残基４４３から前方へＣ末端まで、そしてＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸残基４１３から前方（ＡｐＨ４９）；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２７のアミノ酸残基４６２から前方（ＡｐＨ５７）；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２のアミノ酸残基４１３から前方のポリペプチド鎖である。Ｃ−ローブのハンドルドメインとＣ−ローブのβバレルドメインが、短いループ（図１および図２において「Ｌ２４」と記載）により接続され得ることに留意されたい。さらに、本明細書で用いられる用語「Ｃ−ローブドメイン」が、具体的にはＣ−ローブβバレルドメインのみならず、典型的にはおよそ９０以上のアミノ酸残基で構成されて、Ｃ−ローブβバレル構造に関してＮ末端側に位置する、βシート構造を形成するハンドルドメインを含むものとすることに留意されたい。本明細書で用いられる用語Ｃ−ローブドメインは、限定ではなく、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：５；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３３；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１９；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２５；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７９〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１９５；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１３〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３０；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３４〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２７８；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２８８〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２９２に示された全てのポリペプチドをさらに含む。
【００５１】
用語「ループドメイン」は、２つのβ鎖を接続するＨＩＢＰ表面受容体タンパク質内のポリペプチド配列を指す。これらのポリペプチド配列は、複数のアミノ酸残基〜１５０以上のアミン酸残基の長さで大きく変動し得る。
【００５２】
本明細書で互換的に用いられる用語「ＴｂｐＢ」、「ＴｂｐＢタンパク質」、「ＴｂｐＢポリペプチド」は、全ての細菌ＴｂｐＢポリペプチド、および（ｉ）非限定的にＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１０７〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２３；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３１〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１４７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１９６〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２０４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２０６〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１２；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１９〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２２８をはじめとする、本明細書に示された任意のＴｂｐＢポリペプチドを構成するアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸残基の配列；または（ｉｉ）本明細書に示された任意のＴｂｐＢポリペプチドをコードする任意の核酸配列に対して少なくとも適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な、もしくは本明細書に示された任意のＴｂｐＢポリペプチドをコードする任意の核酸配列に対して少なくとも適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であるが同義コドンの使用のための、核酸配列によりコードされたアミノ酸残基の配列、を含むポリペプチドをはじめとするあらゆるトランスフェリン結合タンパク質Ｂ配列を指す。該用語はさらに、成熟したＴｂｐＢポリペプチドに加え、任意のプレＴｂｐＢをはじめとするＴｂｐＢ前駆体、またはＮ末端もしくは他のシグナル配列を含むＴｂｐＢも包含する。
【００５３】
本明細書で互換的に用いられる用語「ＬｂｐＢ」、「ＬｂｐＢタンパク質」、「ＬｂｐＢポリペプチド」は、全ての細菌性ＬｂｐＢポリペプチド、および（ｉ）非限定的にＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２８５をはじめとする、本明細書に示された任意のＬｂｐＢポリペプチドを構成するアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸残基の配列；または（ｉｉ）本明細書に示された任意のＬｂｐＢポリペプチドをコードする任意の核酸配列に対して少なくとも適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な、もしくは本明細書に示された任意のＬｂｐＢポリペプチドをコードする任意の核酸配列に対して少なくとも適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であるが同義コドンの使用のための、核酸配列によりコードされたアミノ酸残基の配列、を含むポリペプチドをはじめとするあらゆるラクトフェリン結合タンパク質Ｂ配列を指す。該用語は、プレ−ＬｂｐＢなどの任意のＬｂｐＢ前駆体をさらに包含する。
【００５４】
本明細書で互換的に用いられる用語「ＴｂｐＡ」、「ＴｂｐＡタンパク質」、「ＴｂｐＡポリペプチド」は、全ての細菌性ＴｂｐＡポリペプチド、および（ｉ）非限定的にＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５２をはじめとする、本明細書に示された任意のＴｂｐＡポリペプチドを構成するアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸残基の配列；または（ｉｉ）本明細書に示された任意のＴｂｐＡポリペプチドをコードする任意の核酸配列に対して少なくとも適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な、もしくは本明細書に示された任意のＴｂｐＡポリペプチドをコードする任意の核酸配列に対して少なくとも適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であるが同義コドンの使用のための、核酸配列によりコードされたアミノ酸残基の配列、を含むポリペプチドをはじめとするあらゆるトランスフェリン結合タンパク質Ａ配列を指す。該用語は、プレ−ＴｂｐＡなどの任意のＴｂｐＡ前駆体をさらに包含する。
【００５５】
本明細書で互換的に用いられる用語「ＬｂｐＡ」、「ＬｂｐＡタンパク質」、「ＬｂｐＡポリペプチド」は、全ての細菌性ＬｂｐＡポリペプチド、および（ｉ）非限定的にＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６２をはじめとする、本明細書に示された任意のＬｂｐＡポリペプチドを構成するアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸残基の配列；または（ｉｉ）本明細書に示された任意のＬｂｐＡポリペプチドをコードする任意の核酸配列に対して少なくとも適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な、もしくは本明細書に示された任意のＬｂｐＡポリペプチドをコードする任意の核酸配列に対して少なくとも適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であるが同義コドンの使用のための、核酸配列によりコードされたアミノ酸残基の配列、を含むポリペプチドをはじめとするあらゆるラクトフェリン結合タンパク質Ａ配列を指す。該用語は、プレ−ＬｂｐＡなどの任意のＬｂｐＡ前駆体をさらに包含する。
【００５６】
本明細書で用いられる用語「核酸配列」は、天然由来の塩基、糖および糖間（バックボーン）結合からなるヌクレオシドまたはヌクレオチド単量体の配列を指す。該用語はまた、非天然由来の単量体またはその一部を含む修飾または置換された配列を包含する。本開示の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）またはリボ核酸配列（ＲＮＡ）であり得、アデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシルなどの天然由来塩基を包含し得る。該配列は、修飾された塩基も含み得る。そのような修飾塩基の例としては、アザおよびデアザアデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシル、ならびにキサンチンおよびヒポキサンチンが挙げられる。
【００５７】
本明細書で互換的に用いられる用語「ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質をコードする核酸配列」および「ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドをコードする核酸配列」は、任意のＨＩＢＰ表面受容体タンパク質および非限定的にＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２２；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７３に示されたものなどＨＩＢＰ表面受容体タンパク質前駆体をコードする任意の核酸配列をはじめとし、ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質をコードするあらゆる核酸配列を指す。本明細書で用いられる「ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質前駆体」は、追加として形質膜を横切るポリペプチド鎖の輸送を促進するＮ末端シグナル配列を含む、ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質分子を指す。ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質をコードする核酸配列は、（ｉ）本明細書に示されたＨＩＢＰ表面受容体タンパク質と実質的に同一であるポリペプチドをコードする；または（ｉｉ）本明細書に示されたＨＩＢＰ表面受容体タンパク質の核酸配列に対して少なくとも適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な、もしくはそれに対して少なくとも適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であるが同義コドンの使用のための、あらゆる核酸配列をさらに包含する。
【００５８】
本明細書で互換的に用いられる用語「ＩＯＭタンパク質をコードする核酸配列」および「ＩＯＭポリペプチドをコードする核酸配列」は、任意のＩＯＭタンパク質、ならびに非限定的にＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５１；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６１に示されたものなどＩＯＭタンパク質前駆体をコードする任意の核酸配列をはじめとし、ＩＯＭタンパク質をコードするあらゆる核酸配列を指す。本明細書で用いられる「ＩＯＭタンパク質前駆体」は、追加として形質膜を横切るポリペプチド鎖の輸送を促進するＮ末端シグナル配列を含む、ＩＯＭタンパク質分子を指す。ＩＯＭタンパク質をコードする核酸配列は、（ｉ）本明細書に示されたＩＯＭタンパク質と実質的に同一であるポリペプチドをコードする；または（ｉｉ）本明細書に示されたＩＯＭタンパク質の核酸配列に対して少なくとも適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な、もしくはそれに対して少なくとも適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であるが同義コドンの使用のための、あらゆる核酸配列をさらに包含する。
【００５９】
本明細書で互換的に用いられる用語「ＴｂｐＢをコードする核酸配列」、「ＴｂｐＢポリペプチドをコードする核酸配列」は、非限定的にＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２２；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７３に示された配列と、さらにＴｂｐＢ前駆体をコードする任意の核酸配列をはじめとする、任意のＴｂｐＢポリペプチドを含むＴｂｐＢポリペプチドをコードするあらゆる核酸配列を指す。本明細書で用いられる「ＴｂｐＢ前駆体」は、追加として形質膜を横切るポリペプチド鎖の輸送を促進するＮ末端シグナル配列を含む、ＴｂｐＢ分子を指す。ＴｂｐＢポリペプチドをコードする核酸配列は、（ｉ）本明細書に示されたＴｂｐＢポリペプチドと実質的に同一であるポリペプチドをコードする；または（ｉｉ）本明細書に示された任意のＴｂｐＢの核酸配列に対して少なくとも適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な、もしくはそれに対して少なくとも適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であるが同義コドンの使用のための、あらゆる核酸配列をさらに包含する。
【００６０】
本明細書で互換的に用いられる用語「ＬｂｐＢをコードする核酸配列」、「ＬｂｐＢポリペプチドをコードする核酸配列」は、非限定的にＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２８４に示された配列と、ＬｂｐＢ前駆体をコードする任意の核酸配列をはじめとする、任意のＬｂｐＢポリペプチドを含むＬｂｐＢポリペプチドをコードするあらゆる核酸配列を指す。本明細書で用いられる「ＬｂｐＢ前駆体」は、追加として形質膜を横切るポリペプチド鎖の輸送を促進するＮ末端シグナル配列を含む、ＬｂｐＢ分子を指す。ＬｂｐＢポリペプチドをコードする核酸配列は、（ｉ）本明細書に示されたＬｂｐＢポリペプチドと実質的に同一であるポリペプチドをコードする；または（ｉｉ）本明細書に示された任意のＬｂｐＢの核酸配列に対して少なくとも適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な、もしくはそれに対して少なくとも適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であるが同義コドンの使用のための、あらゆる核酸配列をさらに包含する。
【００６１】
本明細書で互換的に用いられる用語「ＴｂｐＡをコードする核酸配列」、「ＴｂｐＡポリペプチドをコードする核酸配列」は、非限定的にＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５１に示された配列と、ＴｂｐＡ前駆体をコードする任意の核酸配列をはじめとする、任意のＴｂｐＡポリペプチドを含むＴｂｐＡポリペプチドをコードするあらゆる核酸配列を指す。本明細書で用いられる「ＴｂｐＡ前駆体」は、追加として形質膜を横切るポリペプチド鎖の輸送を促進するＮ末端シグナル配列を含む、ＴｂｐＡ分子を指す。ＴｂｐＡポリペプチドをコードする核酸配列は、（ｉ）本明細書に示されたＴｂｐＡポリペプチドと実質的に同一であるポリペプチドをコードする；または（ｉｉ）本明細書に示された任意のＴｂｐＡの核酸配列に対して少なくとも適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な、もしくはそれに対して少なくとも適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であるが同義コドンの使用のための、あらゆる核酸配列をさらに包含する。
【００６２】
本明細書で互換的に用いられる用語「ＬｂｐＡをコードする核酸配列」、「ＬｂｐＡポリペプチドをコードする核酸配列」は、非限定的にＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６１に示された配列と、ＬｂｐＡ前駆体をコードする任意の核酸配列をはじめとする、任意のＴｂｐＡポリペプチドを含むＬｂｐＡポリペプチドをコードするあらゆる核酸配列を指す。本明細書で用いられる「ＬｂｐＡ前駆体」は、追加として形質膜を横切るポリペプチド鎖の輸送を促進するＮ末端シグナル配列を含む、ＬｂｐＡ分子を指す。ＬｂｐＡポリペプチドをコードする核酸配列は、（ｉ）本明細書に示されたＬｂｐＡポリペプチドと実質的に同一であるポリペプチドをコードする；または（ｉｉ）本明細書に示された任意のＬｂｐＡの核酸配列に対して少なくとも適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な、もしくはそれに対して少なくとも適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であるが同義コドンの使用のための、あらゆる核酸配列をさらに包含する。
【００６３】
用語「実質的に同一の」は、２つのポリペプチド配列が、好ましくは少なくとも５０％同一である、より好ましくは少なくとも８５％同一である、最も好ましくは少なくとも９５％同一である、例えば９６％、９７％、９８％、または９９％同一であることを意味する。２つのポリペプチド配列の間の同一性％を決定するために、そのような２つの配列のアミノ酸配列を、例えばＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（２７）により修正されたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（２６）のアライメント法を利用して、２つの配列間で最も高次のマッチが得られるようにアライメントして、同一アミノ酸の数を２つの配列の間で決定する。２つのポリペプチドを正確にアライメントするための、好ましく広範囲に適用可能な方法は、ギャップ開始ペナルティー１０およびギャップ伸長ペナルティー０．１を利用するＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（２９）と共に用いられるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズム（２８）を含む。これにより、２つの配列のうちの一方の全長の少なくとも５０％がアライメントに含まれるような、２つの配列間で高いスコアリングアライメントの同定が可能になる。２つのアライメントされたアミノ酸配列間の同一性％を計算する方法は、概ね当該技術分野で認識されており、例えばＣａｒｉｌｌｏおよびＬｉｐｔｏｎにより記載されたもの（３０）、ならびにＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，  ｅ．ｄ．  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８，  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓに記載されたものなどが挙げられる。一般にコンピュータプログラムが、そのような計算に用いられるであろう。これに関して用いられ得るコンピュータプログラムとしては、ＧＣＧ（３１）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（３２）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
「少なくとも適度にストリンジェントな条件」は、溶液中での２つの相補性核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションを促進する条件が選択されることを意味する。ハイブリダイゼーションは、核酸配列分子の全てまたは一部に起こり得る。ハイブリダイズする部分は、典型的には少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、４０または５０）ヌクレオチド長である。当業者は、核酸二本鎖またはハイブリッドの安定性がＴｍにより決定され、Ｔｍがナトリウム含有緩衝液中でナトリウムイオン濃度および温度の関数であることを、認識するであろう（Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（Ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％（Ｇ＋Ｃ）−６００／１）、または同様の式）。したがってハイブリッドの安定性を決定する洗浄条件のパラメータは、ナトリウムイオン濃度および温度である。公知の核酸分子と類似しているが同一ではない分子を同定するために、１％ミスマッチが、約１℃のＴｍ低下をもたらすと仮定することができ、例えば９５％を超える同一性を有する核酸分子が探索される場合、最終的な洗浄温度は約５℃低下することになる。これらの判断に基づけば、当業者は、適切なハイブリダイゼーション条件を即座に選択することができよう。好ましい実施形態において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が選択される。例として、以下の条件を用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを実現することができる：Ｔｍ（上の式に基づく）−５℃で、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）／５×デンハルト溶液／１．０％ＳＤＳでハイブリダイゼーションし、その後、６０℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄。適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４２℃で３×ＳＳＣでの洗浄ステップを含む。しかし、同等なストリンジェンシーが、別の緩衝液、塩および温度を用いて実現され得ることを理解されたい。ハイブリダイゼーション条件に関するさらなるガイダンスは、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０１２  （３３）に見出され得る。
【００６５】
本明細書の核酸配列の文脈で用いられる用語「キメラ」は、自然に連結していない少なくとも２つの連結した核酸配列を指す。キメラ核酸配列は、異なる天然起源の連結した核酸配列を含む。例えば、ＴｂｐＢポリペプチドまたはＨＩＢＰ表面受容体タンパク質の核酸配列に連結された細菌プロモータを構成する核酸配列は、キメラと見なされ、特定の部分が除去されて、ＴｂｐＡポリペプチドの一部と交換されているＴｂｐＢポリペプチドをコードする核酸配列は、キメラと見なされる。キメラ核酸配列はまた、それらが自然に連結されないことを条件に、同じ天然起源の核酸配列を含み得る。例えば特定の細胞型から得られたプロモータを構成する核酸配列は、同じ細胞型から得られたポリペプチドをコードする核酸配列に連結し得るが、通常はプロモータを構成する核酸配列には連結しない。キメラ核酸配列はまた、任意の非天然由来核酸配列に連結した任意の天然由来核酸配列を含む核酸配列を含む。
【００６６】
用語「宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない」は、ネイティブ宿主鉄結合タンパク質（即ち、宿主生物体内に存在する宿主鉄結合タンパク質）と修飾されたＨＩＢＰ表面受容体タンパク質との結合相互作用の結合定数（Ｋｄ）または解離定数の値が、ネイティブ宿主鉄結合タンパク質とその相補性ネイティブＨＩＢＰ表面受容体タンパク質との結合相互作用の結合定数の値よりも少なくとも１０倍高くなるように、ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質に結合する宿主鉄結合タンパク質の能力が減少することを意味する。言い換えれば、修飾タンパク質は、ネイティブ宿主鉄結合タンパク質に対して、ネイティブ受容体タンパク質よりも１０倍低い親和性を有する。好ましい実施形態において、修飾タンパク質によりネイティブ宿主鉄結合タンパク質に結合するための相対的親和性は、ネイティブＨＩＢＰ表面受容体タンパク質よりも３０倍低く、最も好ましい実施形態において、修飾タンパク質によりネイティブ宿主鉄結合タンパク質に結合するための相対的親和性は、ネイティブＨＩＢＰ表面受容体タンパク質よりも１００倍低い。さらに好ましい実施形態において、修飾ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質とネイティブ宿主鉄結合タンパク質との結合定数は、少なくとも３００ｎＭである。好ましくは該結合定数は、少なくとも５００ｎＭであり、最も好ましくは少なくとも１μＭである。
【００６７】
本明細書で用いられる用語「実質的に含まない」は、程度の用語であり、組成物に実質的に含まれないと言われた化合物を、該組成物が顕著な量で含まないことを意味する。組成物が化合物を実質的に含まない、例えばＮ−ローブドメインを実質的に含まない場合、そのような組成物は、好ましくは５．０％未満のそのような化合物、より好ましくは１．０％未満のそのような化合物、最も好ましくは０．１％未満のそのような化合物を含む。
【００６８】
免疫原性組成物
先に述べられた通り、本開示は、少なくとも１つの実施形態において、グラム陰性病原菌種からのＨＩＢＰ表面受容体タンパク質を含む免疫原性組成物であって、該ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質が、宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができないように修飾されている、免疫原性組成物を提供する。ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質と共に用いられる用語「修飾された」は、少なくとも１つのアミノ酸残基が除去されているか、もしくは少なくとも１つのアミノ酸残基が別のものと置換されている、非ネイティブＨＩＢＰ表面受容体タンパク質、または２つ以上の別のポリペプチドに分断されているＨＩＢＰ表面受容体タンパク質を指すものとする。したがって修飾されたＨＩＢＰ表面受容体タンパク質としては、切断されたＨＩＢＰ表面受容体タンパク質（例えば、ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＮ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメイン）；１つまたは複数のアミノ酸残基が除去されているＨＩＢＰ表面受容体タンパク質（例えば、Ｎ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメイン内のループドメインからの１つまたは複数のアミノ酸が除去されているＨＩＢＰ表面受容体タンパク質）；さらなるアミノ酸が挿入されているＨＩＢＰ表面受容体タンパク質（例えば、１つまたは複数のアミノ酸がＮ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメイン内のループドメインに付加されているＨＩＢＰ表面受容体タンパク質）；多量体または伸長ＨＩＢＰポリペプチド（例えば、二量体および三量体、ならびにＮ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメインの二量体および三量体）；１つまたは複数のアミノ酸を改変するために部位特異的突然変異誘発により修飾されたＨＩＢＰ表面受容体タンパク質；および２つ以上のＨＩＢＰ表面受容体タンパク質ポリペプチドの混合物（例えば、ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質の別のＮ−ローブドメインとＣ−ローブドメインとを含む混合物）が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の修飾ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質は、ネイティブ宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない。
【００６９】
本明細書のこれまでに言及された通り、本開示は、１つの態様において、グラム陰性菌種から得ることができる、または得られるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む、またはそれからなる免疫原性組成物であって、該ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、免疫原性組成物を提供する。さらなる態様において、本開示は、ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドであって、該Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインが、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、該複数のループドメインの少なくとも１つのループドメインが、修飾されており、該ポリペプチドが、宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、ポリペプチドを提供する。
【００７０】
本開示によれば、グラム陰性病原性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含む、またはそれからなる任意のポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードする核酸配列が、用いられ得る。
【００７１】
ネイティブＣ−ローブドメインが用いられる本開示の実施形態において、ネイティブＣ−ローブドメインを含むポリペプチドは、ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のネイティブＮ−ローブドメインを含まず、ペプチド結合を介して該ネイティブＮ−ローブドメインに化学的に連結しておらず、したがって単離されたネイティブＣ−ローブドメイン、即ちネイティブＮ−ローブドメインから離れたネイティブＣ−ローブドメインである。したがって特定の実施形態において、ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドまたはその一部のＮ−ローブドメインを含まない、または実質的に含まない、ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドのＣ−ローブドメインを含む調製物が、提供される。ネイディブＮ−ローブドメインが用いられる本開示の実施形態において、本明細書で用いられるネイティブＮ−ローブドメインを含むポリペプチドは、ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のネイティブＣ−ローブドメインを含まず、ペプチド結合を介して該ネイティブＣ−ローブドメインに化学的に連結しておらず、したがって単離されたネイティブＮ−ローブドメイン、即ちネイティブＣ−ローブドメインから離れたネイティブＮ−ローブドメインである。したがって特定の実施形態において、ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドまたはその一部のＣ−ローブドメインを含まない、または実質的に含まない、ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドのＮ−ローブドメインを含む調製物が、提供される。しかし特定の実施形態において、ネイティブＣ−ローブドメインまたはその一部と、Ｎ−ローブドメインまたはその一部との混合物が用いられ得るが、ただしＮ−ローブドメインとＣ−ローブドメインが、化学的に連結しておらず、即ちそれらがペプチド結合により化学的に接続していないことを条件とする。したがって本開示は、Ｎ−ローブドメインを含むポリペプチドと、Ｃ−ローブドメインを含むポリペプチドとの混合物を含む免疫原性組成物であって、該Ｎ−ローブドメインとＣ−ローブドメインが物理的に連結していない、免疫原性組成物を包含する。
【００７２】
本開示のポリペプチドを供給するために、非限定的に任意の病原菌種または菌株、および非限定的にパスツレラ科、モラクセラ（Ｍｏｘａｒｅｌｌａｃｅａｅ）科またはナイセリア科に属する任意の菌種、およびアクチノバシラス属、ナイセリア属、ヘモフィルス属、マンヘミア属、ヒストフィルス属、パスツレラ属またはモラクセラ属に属する菌種をはじめとする、任意のグラム陰性菌種から得ることができる、または得られる任意のＨＩＢＰ表面受容体タンパク質またはＴｂｐＢポリペプチドが用いられ得る。該ポリペプチドとしては、さらに、任意のＨＩＢＰ表面受容体タンパク質から得ることができる、もしくは得られる任意のポリペプチド、または以下の菌種：アクチノバシラス・プルロニューモニエ（１２、３４）、アクチノバシラス・スイス、ヘモフィルス・インフルエンザ（３５、３６）、ヘモフィルス・パラスイス（３７）、ヘモフィルス・ソムナス（当該技術分野でヒストフィルス・ソムナスとしても知られる）（３８）、マンヘミア・ヘモリティカ（当該技術分野でパスツレラ・ヘモリティカとしても知られる）（３９）、モラクセラ・カタラーリス（４０）、モラクセラ・ボビス、ナイセリア・ゴノレア、ナイセリア・メニンギティディス（４１、４２）、マンヘミア・グルコシダ（当該技術分野でパスツレラ・ヘモリティカとしても知られる）およびビベルスティニア・トレハロシ（当該技術分野でパスツレラ・トレハロシとしても知られる）から得ることができる、もしくは得られる任意のＴｂｐＢポリペプチドから得ることができる、もしくは得られる任意のポリペプチドが挙げられる。
【００７３】
本明細書に従って用いられ得る例示的なＣ−ローブドメインおよびＮ−ローブドメインとしては、さらにＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：５；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３３；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１９；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２５；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７９〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１９５；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１３〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３０；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３４〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２７８、およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２８８〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２９２に示された任意のＣ−ローブドメイン、ならびにＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１０；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２１；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２２９；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３１；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３３に示された任意のＮ−ローブドメインが挙げられ、さらに非限定的にＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１０７〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２３；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３１〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１４７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１９６〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２０４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２０６〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１２；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１９〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２２８に示されたポリペプチドをはじめとするＨＩＢＰポリペプチドもしくはＴｂｐＢポリペプチドから調製され得る、またはＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２２；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７３によりコードされる核酸配列を用いることにより調製され得る、任意のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインが挙げられる。これらの核酸配列およびポリペプチド配列を用いれば、さらなる新規ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質およびＴｂｐＢ配列、ならびにＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインが、当業者により即座に同定され得る。例えば発現ライブラリ、ｃＤＮＡライブラリおよびゲノムライブラリをスクリーニングすることができ、配列情報を含むデータベースを類似の配列について検索することができる。
【００７４】
本開示の免疫原性調製物は、脊椎動物対象へのその投与により、そのような脊椎動物対象における免疫応答を、脊椎動物対象による抗体産生の刺激の形態で誘発する。本明細書によれば、そのような抗体は、少なくとも１種のグラム陰性菌株に対して反応性がある。しかし好ましくは該抗体は、複数の菌株または菌種に対して交差反応性および／または交差防御性があり、好ましくはそのような交差反応性および／または交差防御性は、トランスフェリンまたはラクトフェリンなどの１種または複数の宿主鉄結合タンパク質を発現する宿主において実現される。本明細書で用いられる用語「交差反応性がある」は、１つの菌株から得られた免疫原性組成物により誘導された免疫応答が、異なる菌株または異なる菌種と追加的に反応することが可能な抗体の生成を刺激する能力を指す。本明細書で用いられる用語「交差防御性」は、１つの菌株から得られた免疫原性組成物により誘導された免疫応答が、少なくとも１つの追加的菌株または菌種による感染または疾患を予防または弱毒化する免疫応答の能力を指す。本開示の好ましい実施形態において、本開示の免疫原性組成物は、複数の菌株または菌種、例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０の菌種または菌株に対して、交差反応性および／または交差防御性がある。交差反応性は、交差防御性の指標になると思われる。本開示の前述の態様が、１種の免疫原性化合物、即ち１種のＨＩＢＰ表面受容体タンパク質から得ることができる免疫原性化合物の製造を可能にして、多重感染性菌株または菌種に対する防御を提示することによりワクチン製造を容易にすることは、当業者に即座位に理解されよう。
【００７５】
本開示の免疫原性調製物は、脊椎動物対象において、特にトランスフェリンおよびラクトフェリンなどの宿主鉄結合タンパク質を発現する脊椎動物対象において、ネイティブＨＩＢＰタンパク質を用いた免疫化調製物が用いられる場合に生成される免疫応答の効果を超える、予想外に効果的な免疫応答を生成する。効果的な免疫応答の一態様は、免疫応答の規模である。好ましくは本開示の免疫原性組成物を用いて得られた抗体力価は、ネイティブＨＩＢＰタンパク質の抗体力価よりも少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは少なくとも１０倍高い。
【００７６】
好ましい実施形態において、少なくとも２つのポリペプチドを含み、該ポリペプチドのぞれぞれがＣ−ローブドメインを含む、もしくはそれからなる混合物が用いられ；または少なくとも２つのポリペプチドを含み、該ポリペプチドのそれぞれがＮ−ローブドメインを含む、もしくはそれからなる混合物が用いられ；または少なくとも２つのＣ−ローブドメインおよび少なくとも１つのＮ−ローブドメインを含む、もしくはそれからなる、少なくとも３つのポリペプチドを含む混合物が用いられ；または少なくとも２つのＮ−ローブドメインおよび少なくとも１つのＣ−ローブドメインを含む、もしくはそれからなる、少なくとも３つのポリペプチドを含む混合物が用いられる。好ましい実施形態において、該少なくとも２つのポリペプチドは、同じ脊椎動物種に感染することが可能なグラム陰性菌属または菌種から得ることができる、または得られる。したがって該少なくとも２つのポリペプチドは、例えば両方のＣ−ローブドメインがブタに感染することが可能なアクチノバシラス株から得られる、もしくは得ることができるＴｂｐＢポリペプチドから得ることができる、もしくは得られる、ＴｂｐＢポリペプチドの２つのＣ−ローブドメインから選択されるか、または例えば両方のＣ−ローブドメインがウシに感染することが可能なヘモフィルス株から得られる、もしくは得ることができるＴｂｐＢポリペプチドから得ることができる、もしくは得られる、ＴｂｐＢポリペプチドの２つのＣ−ローブドメインから選択される。少なくとも２つのＣ−ローブドメインが用いられる実施形態において、該混合物は、好ましくはＮ−ローブドメインまたはその一部を含まないか、または実質的に含まない。少なくとも２つのＮ−ローブドメインが用いられる実施形態において、該混合物は、好ましくはＣ−ローブドメインまたはその一部を含まないか、または実質的に含まない。
【００７７】
本開示による特定の好ましい実施形態において、少なくとも２つのポリペプチドの混合物であって、各ポリペプチドがグラム陰性菌種から得ることができる、または得られるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインを含む、もしくはそれからなる混合物が用いられる。そのような実施形態において、該混合物は、好ましくはＮ−ローブドメインまたはその一部を含まない。特定の好ましい実施形態において、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１０７〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２３；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３１〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１４７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１９６〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２０４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２０６〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１２；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１９〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２２８に示されたＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドから得ることができる、もしくは得られる任意の２つのＣ−ローブドメインが用いられるか、またはＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２２；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７３に示される核酸配列から得ることができる、もしくは得られる任意の２つのＣ−ローブドメインが用いられる。さらに好ましい実施形態において、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：５；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３３；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１９；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２５；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７９〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１９５；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１３〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３０；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３４〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２７８；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２８８〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２９２に示されるＣ−ローブドメインから選択される任意の２つのＣ−ローブドメインが用いられる。
【００７８】
さらに特に好ましい実施形態において、ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質から得ることができる、または得られる少なくとも２つのＣ−ローブドメインが用いられ、少なくとも１つのＣ−ローブドメインが、アクチノバシラス属、ヘモフィルス属、ヒストフィルス属、マンヘミア属、モラクセラ属、ナイセリア属、パスツレラ属およびビベルスティニア属に属する菌種から得ることができる、または得られる。
【００７９】
さらに特に好ましい実施形態において、少なくとも２つのＣ−ローブドメインが用いられ、少なくとも１つのＣ−ローブドメインが、アクチノバシラス・プルロニューモニエから得ることができる、もしくは得られるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質から得ることができる、もしくは得られ、好ましくはＳＥＱ．ＩＤ．  ＮＯ：６もしくはＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２２に示されるＣ−ローブドメインであるか、または少なくとも１つのＣ−ローブドメインが、アクチノバシラス・スイスから得ることができる、もしくは得られるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質から得ることができる、もしくは得られ、好ましくはＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３４に示されるＣ−ローブドメインである。
【００８０】
さらに特に好ましい実施形態において、少なくとも２つのＣ−ローブドメインが用いられ、少なくとも１つのＣ−ローブドメインが、マンヘミア・ヘモリティカから得ることができる、もしくは得られるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質から得ることができる、もしくは得られ、好ましくはＳＥＱ．ＩＤ．  ＮＯ：２３２もしくはＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３４に示されるＣ−ローブドメインであるか、または少なくとも１つのＣ−ローブドメインが、マンヘミア・グルコシダから得ることができる、もしくは得られるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質から得ることができる、もしくは得られる。
【００８１】
さらに特に好ましい実施形態において、少なくとも２つのＣ−ローブドメインが用いられ、少なくとも１つのＣ−ローブドメインが、ナイセリア・ゴノレアから得ることができる、もしくは得られるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質から得ることができる、もしくは得られ、好ましくはＳＥＱ．ＩＤ．  ＮＯ：２１３〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１８に示されるＣ−ローブドメインのうちの１つであるか、または少なくとも１つのＣ−ローブドメインが、ナイセリア・メニンギティディスから得ることができる、もしくは得られるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質から得ることができる、もしくは得られ、好ましくはＳＥＱ．ＩＤ．  ＮＯ：  １１９；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２５；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２９；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３０；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３１；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６０；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７９〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１９５；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３５〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２７８に示されるＣ−ローブドメインのうちの１つである。
【００８２】
さらに特に好ましい実施形態において、少なくとも２つのＣ−ローブドメインが用いられ、少なくとも１つのＣ−ローブドメインが、ビベルスティニア・トレハロシから得ることができる、または得られるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質から得ることができる、または得られ、好ましくはＳＥＱ．ＩＤ．  ＮＯ：２９２に示されるＣ−ローブドメインである。
【００８３】
さらに好ましい実施形態において、ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドから得ることができる、または得られる少なくとも２つのＣ−ローブドメインが用いられ、該２つのＣ−ローブドメインの両方が、アクチノバシラス・プルロニューモニエ、好ましくはＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：６またはＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２２に示されるＣ−ローブドメイン、アクチノバシラス・スイス、好ましくはＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３４に示されるＣ−ローブドメイン、およびヘモフィルス・パラスイス、好ましくはＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２９４に示されるＣ−ローブドメインから選択される２つの菌種から得ることができる、または得られる。
【００８４】
さらに特に好ましい実施形態において、ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドから得ることができる、または得られる少なくとも２つのＣ−ローブドメインが用いられ、該２つのＣ−ローブドメインの一方が、ナイセリア・ゴノレアから得ることができる、または得られ、好ましくはＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１３〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１８に示されるＣ−ローブドメインの１つであり、他方のＣ−ローブドメインが、ナイセリア・メニンギティディスから得ることができ、好ましくはＳＥＱ．ＩＤ．  ＮＯ：１１９；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２５；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２９；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３０；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３１；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６０；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７９〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１９５；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３５〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２７８に示されるＣ−ローブドメインの１つである。
【００８５】
さらに好ましい実施形態において、ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドから得ることができる、または得られる少なくとも２つのＣ−ローブドメインが用いられ、該２つのＣ−ローブドメインの一方が、マンヘミア・ヘモリティカから得ることができる、または得られ、好ましくはＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３２；またはＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３４に示されるＣ−ローブドメインであり、他方のＣ−ローブドメインが、ビベルスティニア・トレハロシから得ることができるか、または得られ、好ましくはＳＥＱ．ＩＤ．  ＮＯ：２９２に示されるＣ−ローブドメインである。
【００８６】
さらに好ましい実施形態において、ＴｂｐＢポリペプチドから得ることができる、または得られる少なくとも２つのＣ−ローブドメインが用いられ、２つのＣ−ローブドメインの両方が、１種または２種の細菌種から得ることができる、または得られ、該ＴｂｐＢポリペプチドまたはそれから得られるＣ−ローブドメインが、抗原的に多様である。該ＴｂｐＢまたはＣ−ローブドメインは、好ましくはＴｂｐＢ変異体を交換することが可能な菌種または菌株から得られる。２つのＴｂｐＢポリペプチドまたはＴｂｐＢポリペプチドのＣ−ローブに関して本明細書で用いられる用語「抗原的に多様である」は、２つのＴｂｐＢポリペプチドまたはＣ−ローブの代表的数を用いて系統樹を構築するために用いられる場合に、２種のＴｂｐＢポリペプチドまたはＴｂｐＢポリペプチドのＣ−ローブドメインが系統樹の異なる枝または群に属することを意味する。本明細書によれば、任意の量のＴｂｐＢまたはＣ−ローブドメインポリペプチドを含む系統樹が構築され得るが、好ましくは系統樹は、少なくとも２５のＴｂｐＢポリペプチドまたはＣ−ローブドメインポリペプチド、より好ましくは少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０のＴｂｐＢポリペプチドまたはＣ−ローブドメインポリペプチドを用いて構築され、好ましくは系統樹は、根のレベルの上位に少なくとも２つの節位（ｎｏｄｅ  ｏｒｄｅｒｓ）を含み、より好ましくは系統樹は、根のレベルの上位に少なくとも３つ、４つ、または５つの節位を含み、最も好ましくは根のレベルの上位に少なくとも６つ、７つ、８つ、９つまたは１０の節位を含む（以下および図３０にさらに説明される）。抗原的に多様なＴｂｐＢポリペプチドまたはＣ−ローブドメインポリペプチドは、好ましくは（ｉ）系統樹の最も高位の節より下位で少なくとも２つの節位が分岐している（例えば、系統樹の最高位の節が、第９位の節であるなら、抗原的に多様なポリペプチドは、第七位の節、またはより下位の節、即ち第六、第五、第四、第三、第二、第一位の節で分岐したそれらのポリペプチドである）、そして／または（ｉｉ）系統樹の少なくとも第一、第二、もしくは第三位の節で分岐している、異なる枝に属する。（ｉ）Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅサーバーサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇ／）上で実行されるＭ−Ｃｏｆｆｅｅアライメントアルゴリズムを用いるプログラム（４３）など、配列アライメントを実施するコンピュータアルゴリズム；（ｉｉ）Ｇｅｎｅｉｏｕｓ  Ｐｒｏなどのアライメントを編集するコンピュータプログラム（４４）；（ｉｉｉ）ＧＢｌｏｃｋｓなどのアライメントを自動で掃除するコンピュータプログラム（４５）;（ｉｖ）ＰｒｏｔＴｅｓｔ  ｖ３．２（Ｄａｒｒｉｂａ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１１）などのアライメントと適合性のある進化モデルを選択するコンピュータプログラム、および（ｉｖ）一般時間逆転（ＧＴＲ）モデル（４７）（４８、４９）、またはＪＴＴ＋Ｉ＋Ｇ＋ＦモデルもしくはＷＡＧ＋Ｇ＝Ｆモデルなどの他のモデル、またはＰＨＹＬＩＰ  ａｎｄ  ＰＡＵＰ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）などのプログラムで実行する最尤法を用いるプログラムＰｈｙＭＬ（４６）などの系統樹を作成するコンピュータプログラムなど、複数のコンピュータプログラムを用いることにより、ＴｂｐＢポリペプチドまたはＣ−ローブドメインポリペプチドを用いた系統樹の構築を容易にすることができる。これらのプログラムのそれぞれは、好ましくは系統樹の枝が統計学的に有意であると思われるように構成される。しかし、より遠い枝が統計学的に有意性が低くなり得、したがって最も低位の節に基づく群に属する株の選択が好ましいことに、留意されたい。
【００８７】
ここで図３０を参照すると、例示目的で、根１２０、中間の枝（１３０、１３１、１４０、１４１、１４２および１４３により示される）および合計３８の遠位の枝（遠位枝１５０、１５１、１５２、１５３、１５４および１５５により示される）を有する系統樹１００が示されており、各遠位枝は１〜３８の菌株（株１〜３８（１１０））のうちの１つから得られた関係のポリペプチドを表す。示された各枝は、節（節１６１、１７１、１７２、１８１、１８２、１８３および１８４により示される）から発生している。したがって例えば枝１３０は、節１６１から発生し、枝１４３は、節１７２から発生している。系統樹の根（１２０）に最も近い節（１６１）は、より具体的には第一位の節１６１と称され；節１７１および１７２は、より具体的には第二位の節１７１および１７２と称され、節１８１、１８２、１８３および１８４は、より具体的には第三位の節１８１、１８２、１８３および１８４と称され、さらなる節は、必要な変更を加えて、第四位、第五位、第六位、第七位などの節と称することができる。図３０に、さらなる４つの群（群１（１０５）、菌株（１１０）１〜１７のポリペプチド；群２（１０６）、菌株（１１０）１８〜２４のポリペプチド；群３（１０７）、菌株（１１０）２５〜３０のポリペプチド；および群４（１０８）、菌株（１１０）２６〜３８のポリペプチド）が示される。群１（１０５）または群２（１０６）のいずれか、または両方に属する菌株のポリペプチドは、系統樹（１００）の第一位の節（１６１）で分岐している枝（１３１）に属する。同様に群３（１０５）または群４（１０６）のいずれか、または両方に属する菌株のポリペプチドは、系統樹（１００）の第一位の節（１６１）で分岐している枝（１３１）に属する。したがって群１（１０５）または群２（１０６）に属する菌株全てのポリペプチドは、群３（１０７）または群４（１０８）に属する菌株全てのポリペプチドとは抗原的に異なる。群１（１０５）または群２（１０６）に属する菌株のポリペプチドは、系統樹（１００）の第二位の節（１７２）で分岐した群に属する。群１（１０５）に属する菌株のポリペプチドは、本明細書によれば、群２（１０６）に属する菌株とは抗原的に異なる。該系統樹が異なる形式で、例えば図３０のように長方形形式で、または図１０のように円形式で表され得ることに留意されたい。ＴｂｐＢポリペプチドまたはＣ−ローブを用いて構築された例示的系統樹が、図４（アクチノバシラス・プルロニューモニエ、アクチノバシラス・スイスおよびヘモフィルス・パラスイスの菌株を含む）、図１０（ナイセリア・メニンギティディスの菌株を含む）、図２６（ナイセリア・メニンギティディスおよびナイセリア・ゴノレアの菌株を含む）、図２７（ヘモフィルス・インフルエンザの菌株を含む）、図２８（マンヘミア・ヘモリティカおよびビベルスティニア・トレハロシの菌株を含む）および図２９（モラクセラ・カタラーリスの菌株を含む）に示される。
【００８８】
さらに好ましい実施形態において、ＴｂｐＢポリペプチドから得ることができる、または得られる少なくとも２つのＣ−ローブドメインが用いられ、該２つのＣ−ローブドメインの両方が、アクチノバシラス・プルロニューモニエ、アクチノバシラス・スイスおよびヘモフィルス・パラスイスから得ることができる、または得られる。図４に示された系統樹を参照すると、好ましい実施形態において、少なくとも２つのＣ−ローブドメインが用いられ、第一のＣ−ローブが、図４に示される系統群１、系統群２または系統群３に属するアクチノバシラス・プルロニューモニエ、アクチノバシラス・スイスまたはヘモフィルス・パラスイス菌株から選択されるＣ−ローブドメインの任意の１つから得られ、第二のＣ−ローブドメインが、図４に示される、第一のＣ−ローブドメインが選択された系統群以外の系統群に属するアクチノバシラス・プルロニューモニエ、アクチノバシラス・スイスまたはヘモフィルス・パラスイス菌株から選択されるＣ−ローブドメインの任意の１つから得られる。さらに好ましい実施形態において、少なくとも３つのＣ−ローブドメインが用いられ、図４に示された系統群１に属するアクチノバシラス・プルロニューモニエ、アクチノバシラス・スイスまたはヘモフィルス・パラスイス菌株に属する第一のＣ−ローブドメインが用いられ、図４に示された系統群２に属するアクチノバシラス・プルロニューモニエ、アクチノバシラス・スイスまたはヘモフィルス・パラスイス菌株に属する第二のＣ−ローブドメインが用いられ、図４に示された系統群３に属するアクチノバシラス・プルロニューモニエ、アクチノバシラス・スイスまたはヘモフィルス・パラスイス菌株に属する第三のＣ−ローブドメインが用いられる。したがって具体的実施例により、アクチノバシラス・スイスＨ５７（系統群１；図４の黒色の矢印）からのＣ−ローブドメインは、アクチノバシラス・プルロニューモニエＨ８７（系統群２；図４の黒色の矢印）からのＣ−ローブドメインおよびアクチノバシラス・プルロニューモニエＨ４９（系統群３；図４の黒色の矢印）のＣ−ローブドメインと組み合わせることができる。
【００８９】
さらに好ましい実施形態において、ＴｂｐＢタンパク質から得ることができる、または得られる少なくとも２つのＣ−ローブドメインが用いられ、該２つのＣ−ローブドメインの両方が、ナイセリア・メニンギティディスから得ることができる、または得られる。図１０Ａに示された系統樹を参照すると、好ましい実施形態において、少なくとも２つのＣ−ローブドメインが用いられ、第一のＣ−ローブドメインは、図１０Ａに示される系統群１、系統群２、系統群３または系統群４に属するナイセリア・メニンギティディス菌株から選択されるＣ−ローブドメインの任意の１つから得られ、第二のＣ−ローブドメインは、図１０Ａに示される、第一のＣ−ローブドメインが選択された系統群以外の系統群に属するナイセリア・メニンギティディス株の任意の１つから得られる。あくまでも例として、ナイセリア・メニンギティディスＢ１６Ｂ６株（系統群１；図１０Ａの黒色の矢印）から得られたＴｂｐＢ  Ｃ−ローブドメインは、Ｍ９８２株（系統群４；図１０Ａの黒色の矢印）からのＴｂｐＢ  Ｃ−ローブドメインと組み合わされ得る。さらに好ましい実施形態において、少なくとも３つのＣ−ローブドメインが用いられ、該Ｃ−ローブドメインは、図１０Ａに示された３つの異なる群に属する菌株から選択される（例えば、各系統群１、系統群２および系統群３から選択されるＣ−ローブドメイン）。さらに好ましい実施形態において、少なくとも４つのＣ−ローブドメインが用いられ、図１０Ａに示される群１に属するナイセリア・メニンギティディス株に属する第一のＣ−ローブドメインが用いられ、図１０Ａに示される群２に属するナイセリア・メニンギティディス株に属する第二のＣ−ローブドメインが用いられ、図１０Ａに示される系統群３に属するナイセリア・メニンギティディス株に属する第三のＣ−ローブドメインが用いられ、図１０Ａに示される系統群４に属するナイセリア・メニンギティディス菌株に属する第四のＣ−ローブドメインが用いられる。したがってあくまでも例として、ナイセリア・メニンギティディスＢ１６Ｂ６株（系統群１；図１０Ａの黒色の矢印）、ＢＺ１６９（系統群２；図１０Ａの黒色の矢印）、Ｓ３１３１（系統群３；図１０Ａの黒色の矢印）およびＭ９８２（系統群４；図１０Ａの黒色の矢印）からのＴｂｐＢ  Ｃ−ローブドメインが、選択され得る。
【００９０】
さらに好ましい実施形態において、ＴｂｐＢポリペプチドから得ることができる、または得られる少なくとも２つのＣ−ローブドメインが用いられ、該２つのＣ−ローブドメインの１つが、ナイセリア・メニンギティディスから得ることができる、または得られ、Ｃ−ローブの他方が、ナイセリア・ゴノレアから得ることができる、または得られる。図２６Ｂに示される系統樹によれば、好ましい実施形態において、少なくとも２つのＣ−ローブドメインが用いられ、第一のＣ−ローブドメインが、図２６Ｂに示される系統群３に属するナイセリア・ゴノレア株から選択されるＣ−ローブドメインの任意の１つから選択され、第二のＣ−ローブドメインが、図２６Ｂに示される系統群１または２に属するナイセリア・メニンギティディス株から選択されるＣ−ローブドメインの任意の１つから選択される。より好ましくは、ＴｂｐＢポリペプチドから得ることができる、または得られる少なくとも３つのＣ−ローブドメインが用いられ、２つのＣ−ローブドメインは、ナイセリア・メニンギティディスから得ることができる、または得られ、他方のＣ−ローブドメインは、ナイセリア・ゴノレアから得ることができる、または得られる。好ましくはＣ−ローブドメインは、図２６Ｂに示される系統群３に属するナイセリア・ゴノレア株から選択され、第二のＣ−ローブドメインは、図２６Ｂに示される系統群２に属するナイセリア・メニンギティディス株から選択されるＣ−ローブドメインの任意の１つから得られ、第３のＣ−ローブドメインは、図２６Ｂに示される系統群１に属するナイセリア・メニンギティディス株から選択されるＣ−ローブドメインの任意の１つから得られる。さらに好ましい実施形態において、ＴｂｐＢポリペプチドから得ることができる、または得られる少なくとも４つのＣ−ローブドメインが用いられ、３つのＣ−ローブドメインが、ナイセリア・メニンギティディスから得ることができる、または得られ、その他のＣ−ローブドメインが、ナイセリア・ゴノレアから得ることができる、または得られる。好ましくはＣ−ローブドメインは、図２６Ｂに示される系統群３に属するナイセリア・ゴノレア株から選択され、第二および第三のＣ−ローブドメインは、図２６Ｂに示される系統群２の２つの異なる亜群（例えば、系統亜群２．１および系統亜群２．２）に属するナイセリア・メニンギティディス株から選択されるＣ−ローブドメインの任意の１つから得られ、第四のＣ−ローブドメインは、図２６Ｂに示される系統群１に属するナイセリア・メニンギティディス株から選択されるＣ−ローブドメインの任意の１つから得られる。さらに好ましい実施形態において、ＴｂｐＢポリペプチドから得ることができる、または得られる少なくとも４つのＣ−ローブドメインが用いられ、２つのＣ−ローブドメインは、ナイセリア・メニンギティディスから得ることができる、または得られ、その他の２つのＣ−ローブドメインは、ナイセリア・ゴノレアから得ることができる、または得られる。好ましくは該２つのＣ−ローブドメインは、図２６Ｂに示される系統群３の２つの異なる系統亜群（例えば、系統亜群３．１および系統亜群３．２）に属するナイセリア・ゴノレア株から選択され、該第三および第四のＣ−ローブドメインは、それぞれ系統群１および系統群２に属するナイセリア・メニンギティディス株から得られる。さらなる実施形態において、ＴｂｐＢポリペプチドから得ることができる、または得られる少なくとも５つのＣ−ローブドメインが用いられ、３つのＣ−ローブドメインは、ナイセリア・メニンギティディスから得ることができる、または得られ、他の２つのＣ−ローブドメインは、ナイセリア・ゴノレアから得ることができる、または得られる。好ましくはナイセリア・ゴノレア株から選択される２つのＣ−ローブドメインは、図２６Ｂに示される系統群３の２つの異なる系統亜群（例えば、系統亜群３．１および系統亜群３．２）に属し、第三および第四のＣ−ローブドメインは、図２６Ｂに示される系統群２の２つの異なる系統亜群（例えば、系統亜群２．１および系統亜群２．２）に属するナイセリア・メニンギティディス株から選択され、第五のＣ−ローブドメインは、図２６Ｂに示される系統群１に属するナイセリア・メニンギティディス株に属する。さらに好ましい実施形態において、ＴｂｐＢポリペプチドから得ることができる、または得られる少なくとも６つのＣ−ローブドメインが用いられる。この実施形態において、少なくとも１つのＣ−ローブドメインは、ナイセリア・メニンギティディスから得られる、または得ることができ、少なくとも１つのＣ−ローブドメインは、ナイセリア・ゴノレアから得られる、または得ることができ、その他は、図２６Ｂに従って抗原的に異なる菌株から得られる、または得ることができる。好ましい実施形態において、３つのＣ−ローブドメインが、ナイセリア・メニンギティディスから得ることができる、または得られ、他の３つのＣ−ローブドメインが、ナイセリア・ゴノレアから得ることができる、または得られる。図２６Ｂを参照すると、好ましくはナイセリア・ゴノレア株から得られる３つのＣ−ローブドメインは、３つの抗原的に異なる群に属し、ナイセリア・メニンギティディスから得られる３つのＣ−ローブドメインは、３つの抗原的に異なる菌株に属する。
【００９１】
さらに好ましい実施形態において、ＴｂｐＢポリペプチドから得ることができる、または得られる少なくとも２つのＣ−ローブドメインが用いられ、２つのＣ−ローブドメインの一方は、ナイセリア・メニンギティディスから得ることができる、または得られ、Ｃ−ローブドメインの他方は、ナイセリア・ゴノレアから得ることができる、または得られる。図２６Ａに示される系統樹を参照すると、好ましい実施形態において、少なくとも２つのＣ−ローブドメインが用いられ、第一のＣ−ローブドメインは、図２６Ａに示される系統群３または系統群１に属するナイセリア・ゴノレア菌株から選択されるＣ−ローブドメインの任意の１つから得られ、第二のＣ−ローブドメインは、図２６Ａに示される系統群２、系統群４または系統群５に属するナイセリア・メニンギティディス菌株から選択されるＣ−ローブドメインの任意の１つから得られる。
【００９２】
さらに好ましい実施形態において、ＴｂｐＢタンパク質から得ることができる、または得られる少なくとも２つのＣ−ローブドメインが用いられ、２つのＣ−ローブドメインの両方が、ヘモフィルス・インフルエンザから得ることができる、または得られる。図２７Ａおよび２７Ｂに示された系統樹を参照すると、好ましい実施形態において、少なくとも２つのＣ−ローブドメインが用いられ、第一のＣ−ローブドメインは、図２７Ａまたは２７Ｂに示された系統群１、系統群２、または系統群３に属するヘモフィルス・インフルエンザ菌株から選択されるＣ−ローブドメインの任意の１つから得られ、第二のＣ−ローブドメインは、図２７Ａまたは２７Ｂに示された、第一のＣ−ローブドメインが選択された系統群以外の系統群に属するヘモフィルス・インフルエンザ株の任意の１つから得られる。したがって、あくまでも例として、ヘモフィルス・インフルエンザＨ２１６株（系統群３；図２７Ｂの黒色の矢印）から得られたＴｂｐＢ  Ｃ−ローブドメインは、Ｈ２１４株（系統群１；図２７Ｂの黒色の矢印）からのＴｂｐＢ  Ｃ−ローブドメインと組み合わされ得る。さらに好ましい実施形態において、少なくとも３つのＣ−ローブドメインが用いられ、該Ｃ−ローブドメインは、図２７Ａおよび図２７Ｂに示された３つの異なる群に属する菌株から選択される（即ち、各系統群１、系統群２および系統群３から選択されるＣ−ローブドメイン）。したがってあくまでも例として、ヘモフィルス・インフルエンザＨ２１６株（系統群３；図２７Ｂの黒色の矢印）、Ｈ２１４株（系統群１；図２７Ｂの黒色の矢印）およびＨ０１１株（系統群２；図２７Ｂの黒色の矢印）からのＴｂｐＢＣ−ローブドメインが、選択され得る
【００９３】
さらに好ましい実施形態において、ＴｂｐＢタンパク質から得ることができる、または得られる少なくとも２つのＣ−ローブドメインが用いられ、該２つのＣ−ローブドメインの両方が、マンヘミア・ヘモリティカから得ることができる、または得られる。図２８に示された系統樹を参照すると、好ましい実施形態において、少なくとも２つのＣ−ローブドメインが用いられ、第一のＣ−ローブドメインは、図２８に示される系統群１に属するマンヘミア・ヘモリティカ菌株から選択されるＣ−ローブドメインの任意の１つから得られ、第二のＣ−ローブドメインは、系統群３に属するマンヘミア・ヘモリティカ株の任意の１つから得られる。
【００９４】
さらに好ましい実施形態において、ＴｂｐＢポリペプチドから得ることができる、または得られる少なくとも２つのＣ−ローブドメインが用いられ、該２つのＣ−ローブドメインのうちの一方は、ビベルスティニア・トレハロシから得ることができる、または得られ、Ｃ−ローブドメインの他方は、マンヘミア・ヘモリティカから得ることができる、または得られる。図２８を参照すると、好ましい実施形態において、少なくとも２つのＣ−ローブドメインが用いられ、第一のＣ−ローブドメインは、図２８に示される系統群２に属するビベルスティニア・トレハロシ菌株から選択されるＣ−ローブドメインの任意の１つから得られ、第二のＣ−ローブドメインは、図２８に示される系統群１または系統群３に属するマンヘミア・ヘモリティカ株から選択されるＣ−ローブドメインの任意の１つから得られる。
【００９５】
さらに好ましい実施形態において、ＴｂｐＢタンパク質から得ることができる、または得られる少なくとも２つのＣ−ローブドメインが用いられ、該２つのＣ−ローブドメインの両方が、モラクセラ・カタラーリスから得ることができる、または得られる。図２９に示された系統樹を参照すると、好ましい実施形態において、少なくとも２つのＣ−ローブドメインが用いられ、第一のＣ−ローブドメインは、図２９に示される系統群１、系統群２または系統群３に属するモラクセラ・カタラーリス菌株から選択されるＣ−ローブドメインの任意の１つから得られ、第二のＣ−ローブドメインは、図２９に示される、第一のＣ−ローブドメインが選択された系統群以外の系統群に属するモラクセラ・カタラーリス株の任意の１つから得られる。あくまでも例として、モラクセラ・カタラーリスＡＡＣ３４２７９．１株（系統群３；図２９の黒色の矢印）から得られたＴｂｐＢ  Ｃ−ローブドメインは、ＡＡＤ１２２６３．１株（系統群１；図２９の黒色の矢印）からのＴｂｐＢ  Ｃ−ローブドメインと組み合わされ得る。さらに好ましい実施形態において、少なくとも３つのＣ−ローブドメインが用いられ、該Ｃ−ローブドメインは、図２９に示された３つの異なる群に属する菌株から選択される（即ち、各系統群１、系統群２および系統群３から選択されるＣ−ローブドメイン）。したがってあくまでも例として、モラクセラ・カタラーリスＡＡＣ３４２７９．１株（系統群３；図２９の黒色の矢印）、ＡＡＤ１２２６３．１（系統群１；図２９の黒色の矢印）および００３６６４３９８．１（系統群２；図２９の黒色の矢印）からのＴｂｐＢＣ−ローブドメインが、選択され得る。
【００９６】
特に好ましい実施形態において、Ｃ−ローブドメインを含む、またはそれからなる前述のポリペプチド混合物は、非限定的にＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：５；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３３；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１９；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２５；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７９〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１９５；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１３〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３０；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３２；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３４〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２７８に示されるＣ−ローブドメインをはじめとする、ＴｂｐＢポリペプチドから得ることができる、または得られるＣ−ローブドメインである。
【００９７】
前述のＣ−ローブドメイン混合物は、個々のＣ−ローブドメインを含む調製物を混合することにより、または２つ以上のＣ−ローブドメインを含む融合ポリペプチドを組換え生成することにより、調製され得る。
【００９８】
本明細書でこれまで述べられた通り、本開示の免疫原性調製物は、好ましくは交差反応性および／または交差防御性がある。本明細書でこれまで述べられた通り、単一のＣ−ローブドメインを含む配合剤は、交差反応性および／または交差防御性があり得、より広範囲の菌株および／または菌種に対する交差反応性および／または交差防御性を実質的に拡大して、複数の細菌種または細菌株により伝播された感染または疾患からの防御を提供するワクチン配合剤の調製を可能にするために用いられ得るということにおいて、Ｃ−ローブドメインの混合物は特に好ましい。
【００９９】
他の実施形態によれば、Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメイン内で２つのβ鎖を連結しているループドメインが修飾され、該ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができないように、ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドのＣ−ローブドメインおよび／またはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドが調製され得る。ループドメインと共に本明細書で用いられる用語「修飾された」は、少なくとも１つのアミノ酸残基が除去または置換されているループを指す。したがってＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメイン内の得られたループは、切断され得るか、または他の実施形態においてアミノ酸残基であり得、残基は、１つまたは複数の交互のアミノ酸残基で置換され得る。図１および図２は、例示的なＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のループドメインを示す。図８および図１４は、それぞれＮ−ローブドメインおよびＣ−ローブドメイン内のループ減少の例を示す。本明細書によれば、ＨＩＢＰ結合膜受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメイン内の２つのβ鎖を接続させるループドメインの少なくとも１つが、ループドメインから少なくとも１つのアミノ酸残基を除去するように修飾されており、得られたポリペプチドは修飾されたＮ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメインを含み、宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない。別の実施形態において、より多くのアミノ酸残基が除去されており、例えば少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００のアミノ酸残基が、ループドメインから除去されている。別の実施形態において、該ループドメインは、全体が除去されている。ループドメインのいずれかを、本開示に従って修飾するように選択することができるが、ただしそのような修飾が、宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができないポリペプチドをもたらすことを条件とする。したがって図１の例示的なブタＴｂｐＢポリペプチドを参照すると、１つのループドメインが修飾された本開示の実施形態において、そのようなループドメインは、表１にさらに示される通り、ループドメインＬ１〜Ｌ３２（それぞれアクチノバシラス・プルロニューモニエのループＬ１〜Ｌ３２ポリペプチド配列:ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ４２；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ４４；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ４６；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ４８；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ５０；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ５２；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ５４；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ５６；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ５８；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ６０；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ６２；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ６４；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ６６；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ６８；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ７０；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ７２；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ７４；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ７６；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ７８；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ８０；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ８２；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ８４；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ８６；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ８８；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ９０；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ９２；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ９４；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ９６；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ９８；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ１００；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ１０２；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ１０４；およびＳＥＱ．ＩＤ：���Ｏ１０６に例示され、それぞれ核酸配列：ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ４１；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ４３；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ４５；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ４７；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ４９；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ５１；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ５３；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ５５；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ５７；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ５９；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ６１；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ６３；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ６５；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ６７；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ６９；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ７１；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ７３；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ７５；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ７７；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ７９；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ８１；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ８３；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ８５；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ８７；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ８９；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ９１；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ９３；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ９５；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ９７；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ９９；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ１０１；ＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ１０３；およびＳＥＱ．ＩＤ：ＮＯ１０５によりコードされる）の任意の１つであるように選択され得る。２つのスープドメインが修飾された本開示の実施形態において、そのような２つのループドメインは、表２にさらに示された通り、ループドメインＬ１〜Ｌ３２ドメインから選択される任意の２つのループドメインであり得る（同じく、図１の例示的なＴｂｐＢポリペプチドを参照する）。３つのループドメインが修飾された本開示の実施形態において、そのような３つのループドメインは、表３にさらに示された通り、ループドメインＬ１〜Ｌ３２ドメインから選択される任意の３つのループドメインであり得る（同じく、図１の例示的なＴｂｐＢポリペプチドを参照する）。４つのスープドメインが修飾された本開示の実施形態において、そのような４つのループドメインは、表３にさらに示されたループの組み合わせから選択される３つのループドメインに加えて、ループドメインＬ１〜Ｌ３２から選択される１つのさらなるループドメインであり得る（同じく、図１の例示的なＴｂｐＢポリペプチドを参照する）。別の実施形態において、総数で５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１または３２のループドメインが修飾され得る。修飾されたループドメインの厳密な数は様々であってもよく、２つまたは３つのループドメインが修飾された実施形態に関して記載されたループドメインの選択と類似の手法で、本開示のこれらの実施形態のそれぞれにおいて、ループＬ１〜Ｌ３２から選択される任意の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１または３２のループドメインになるように選択され得ることは、当業者に明白であろう。特定の好ましい実施形態において、Ｃ−ローブドメインのループＬ１８、Ｌ２１、Ｌ２３およびＬ２７（それぞれアクチノバシラス・プルロニューモニエＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：７６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：８２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：８６；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：９６に例示）の１つまたは全てが修飾されている。さらに特に好ましい実施��態において、Ｎ−ローブドメインのループＬ１、Ｌ５、Ｌ８およびＬ１２（それぞれアクチノバシラス・プルロニューモニエ  ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：４２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：５０；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：５６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：６４に例示）の１つまたは全てが修飾されている。修飾され得るループドメインは、Ｃ−ローブドメインもしくはＮ末端ローブドメインのβバレルもしくはハンドルドメインβシート内で組立てられた２つのβ鎖を接続するループドメイン、または２つの組立てられたβ鎖を接続するループドメイン、または前述のものの組み合わせである。Ｃ−ローブドメインまたはＮ末端ローブドメイン内のループドメインを切断するために、該ポリペプチドは、ループドメインが全体として除去され、場合により１つまたは複数の連結したアミノ酸と置換され、これにより２つのβ鎖の間に幾分かの直接的な接続をもたらするような手法で、またはループドメインの１つの部分もしくは複数の部分が除去されるような手法で、調製され得る。本明細書によれば、好ましくはＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインのループドメインの少なくとも１つからのアミノ酸残基の少なくとも半分が、除去されている。さらに好ましい実施形態において、該ループドメインの全てのアミノ酸残基の少なくとも半分が、除去されている。したがってループドメインが例えば４０のアミノ酸残基を含むそのような実施形態において、ループドメインの少なくとも２０のアミノ酸残基が、除去されていることになる。さらなる実施形態において、ループドメインのアミノ酸残基の少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％が除去されるように、ループドメインが修飾されている。他の実施形態において、切断の後に、ループドメインの最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のアミノ酸が保持され、さらに別の実施形態において、切断の後にループドメインの最大１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％が保持される。ループドメインの一部だけが除去されるようにループドメインが修飾されている実施形態において、除去されたアミノ酸残基は、ループドメインのＮ末端、ループドメインのＣ末端または該Ｎ末端とＣ末端の間に位置され得る。Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインの複数のループドメインが修飾されている実施形態において、そのようなループの減少は、各ループから同一数のアミノ酸残基の除去を含み、例えばＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメイン内の各ループから１０のアミノ酸残基が除去され得るか、またはループの除去は、各ループから異なる量のアミノ酸残基の除去、例えば１つのループの１０の残基と、別のループの２０の残基の除去を含み得る。
【０１００】
さらに好ましい実施形態において、Ｃ−ローブドメインおよび／またはＮ−ローブドメイン内のアミノ酸残基は、例えば部位特異的突然変異誘発により、他のもので置換されており、得られたポリペプチドは、修飾されたＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含み、宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない。図２２は、様々なＴｂｐＢポリペプチドのＮ−ローブドメインループ領域内の残基置換の例を提供しており、図２３は、これらの残基置換によるＴｆ結合の減少を示している。したがって例えば１つまたは複数のアミノ酸残基は、ループＬ１〜Ｌ３２の任意の１つが置換されていてもよい。特定の好ましい実施形態において、１つまたは複数のアミノ酸残基は、Ｎ−ローブドメインのループドメインＬ１、Ｌ３、Ｌ５またはＬ８（それぞれアクチノバシラス・プルロニューモニエＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：４２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：４６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：５０；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：５６により例示）が置換されている。好ましい実施形態において、ループドメインＬ８内の芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン）が、脂肪族アミノ酸（グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン）で置換されている。これらは、他の例では一般にカチオン性表面領域にある、表面への接近が可能な芳香族アミノ酸残基である。特に好ましい実施形態において、ヘモフィルス・パラスイスＴｂｐＢポリペプチドが選択され、以下の突然変異：Ｙ９３Ａ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７０；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７１）；Ｙ１１７Ａ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７３）；Ｙ１６７Ａ（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：  １７４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７５）またはＷ１７６Ａ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７７）の１つまたは複数がＴｂｐＢポリペプチド内に作製されて、修飾されたＴｂｐＢポリペプチドが得られ、さらに好ましい実施形態において、アクチノバシラス・プルロニューモニエＴｂｐＢポリペプチドが選択され、以下の突然変異の１つまたは複数：Ｆ１７１Ａ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：４）；Ｙ９５Ａ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１４）；Ｙ１２１Ａ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６）；Ｙ１７４Ａ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１８）；またはＲ１７９Ｅ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１９；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２０）が該ポリペプチド内に作製されて、修飾されたＴｂｐＢポリペプチドが得られ、さらに好ましい実施形態において、アクチノバシラス・スイスＴｂｐＢポリペプチドが選択され、以下の突然変異の１つまたは複数：Ｆ６３Ａ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２９；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３０）またはＦ１５２Ａ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３１；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３２）が該ポリペプチド内に作製されて、修飾されたＴｂｐＢポリペプチドが得られる。本開示は、前述の修飾されたポリペプチドのそれぞれ、およびこれらのポリペプチドをコードする核酸配列に加え、これらのポリペプチドを含む免疫原性組成物およびワクチンを含む。
【０１０１】
本開示によるＨＩＢＰポリペプチドの１つもしくは複数のループドメインのサイズ減少、またはループドメイン内のアミノ酸修飾は、好ましくは得られるポリペプチドがコンフォメーション的に安定するように生成される。用語「コンフォメーション的に安定した」は、ポリペプチドのコンフォメーション状態またはコンフォメーションが、ループのサイズ修飾またはアミノ酸残基置換の後に実質的に同一のままであることを意味する。修飾されるループドメインのコンフォメーション状態は、幾分か改変され得る。ポリペプチドのコンフォメーション状態またはコンフォメーションの決定事項としては、アミノ酸配列に反映されるポリペプチドの一次構造、ポリペプチドの二次構造（例えば、α−へリックス、β−シートなど）、ポリペプチドの三次構造（即ち、ポリペプチド鎖の三次元フォールディング）および四次構造（即ち、ポリペプチドと他のタンパク質サブユニットとの相互作用）がある。タンパク質のコンフォメーションは、ｐＨ、浸透圧、イオン強度および塩濃度などの環境因子によりさらに影響を受け得る。ループ減少の設計は、複数の異種配列のアライメントおよび比較、当該技術分野で知られる複数の異種ポリペプチドの三次元コンフォメーション構造の比較、および保存的アミノ酸置換の利用（例えば、ｇｌｙ、ａｌａ；ｖａｌ、ｉｌｅ；ｌｅｕ、ｍｅｔ；ａｓｐ、ｇｌｕ；ａｓｎ、ｇｌｎ；ｓｅｒ、ｔｈｒ；ｌｙｓ、ａｒｇ；ｃｙｓ、ｍｅｔ；およびｐｈｅ、ｔｒｐ、ｔｙｒなどの組み合わせ）により情報を与えられ得る。さらに、タンパク質のコンフォメーション状態は、機能的アッセイ（例えば、宿主鉄結合タンパク質の結合）、または物理的方法、例えばＸ線結晶測定もしくは核磁気共鳴（ＮＭＲ）によりアッセイされ得る。
【０１０２】
さらなる実施形態において、最長のループを含むＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインの少なくとも１つのループドメインが、修飾されるように選択される。そのようなループが全体として修飾された実施形態において、これは一般に、少なくとも２５のアミノ酸残基の除去を含み、１５０以上のアミン酸残基の除去をもたらす場合もある。
【０１０３】
好ましい実施形態において、Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインの最長の（即ち、ほとんどのアミノ酸残基を含む）ループを含むＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインの少なくとも１つのループドメインが、修飾されている。さらに好ましい実施形態において、Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインの最長のループを含むＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインの少なくとも１つのループドメインが修飾され、二番目に長いループを含むＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインの第二のループドメインが、修飾されるように選択される。さらに好ましい実施形態において、最長のループを含むＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインの少なくとも１つのループドメイン、および二番目に長いループを含むＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインの第二のループドメインが、修飾されるように選択され、三番目に長いループを含むＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインの第三のループドメインが、修飾されるように選択される。さらに好ましい実施形態において、最長のループを含むＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインの少なくとも１つのループドメイン、および二番目に長いループを含むＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインの第二のループドメインが、修飾されるように選択され、三番目に長いループを含むＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインの第三のループドメインが、修飾されるように選択され、四番目に長いループを含むＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインの第四のループドメインが、修飾されるように選択される。上述の実施形態は、本明細書の実施例３および４にさらに詳述される。
【０１０４】
驚くべきことに、本明細書により、例えば微生物産生系において、１つまたは複数のループドメインが修飾されて修飾されたポリペプチドが実質的にコンフォメーション的に安定していれば、実質的にＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインからなるポリペプチドが、即座に生成され得ることが見出された。
【０１０５】
本明細書によれば、修飾されたＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインポリペプチドは、それ自体が免疫原として用いられ得るか、または該ポリペプチドは、さらなる修飾を含むように調整され得る。本明細書により作製され得るポリペプチドの修飾されたＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインへの修飾は、ネイティブまたは修飾されたＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインポリペプチドのＮ末端またはＣ末端ポリペプチド伸長の調製を含む。そのようなＮ末端およびＣ末端ポリペプチド伸長には、Ｃ−ローブドメインに第二の全長Ｃ−ローブドメインを付加してそれによりＣ−ローブドメイン二量体を提供すること、Ｎ−ローブドメインに第二の全長Ｎ−ローブドメインを付加してそれによりＮ−ローブドメイン二量体を提供すること、またはＣ−ローブドメインポリペプチドの一部またはＮ−ローブドメインポリペプチドの一部を含む付加がある。多量体が、同じ単量体ポリペプチド（即ち、ホモ二量体、ホモ三量体）を用いて組み立てられてもよく、またはそれらが、異なるポリペプチド、例えば異なる変異体（即ち、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体など）から得られたＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを用いて組み立てられてもよい。好ましい実施形態において、異なる病原または病原性菌株を表すヘテロ多量体タンパク質が、組み立てられる。したがって１つの好ましい実施形態において、アクチノバシラス・プルロニューモニエ、アクチノバシラス・スイスおよびヘモフィルス・パラスイスのＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインからなる群から選択されるＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含むヘテロ多量体ポリペプチドが、調製される。特に好ましい実施形態において、Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインが、Ａ．プルロニューモニエＨ４９、Ａ．スイスＨ５７およびＡ．プルロニューモニエＨ８７のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインからなる群から選択される。更に好ましい実施形態において、ナイセリア・メニンギティディスの菌株から選択される少なくとも２つのＴｂｐＢＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインから選択されるＣ−ローブドメインを含むヘテロ多量体ポリペプチドが、調製される。特に好ましい実施形態において、該菌株は、Ｎ．メニンギティディスＭ９８２またはＮ．メニンギティディスＢ１６Ｂ６から選択される。ヘテロ多量体タンパク質は、異なる病原への免疫原性を運搬し得る。さらに好ましい実施形態において、本開示は、（ｉ）グラム陰性菌種から得ることができる、または得られるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＮ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメインを含む第一のポリペプチドであって、該Ｎ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメインが、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、該Ｎ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメインの複数のループドメインの少なくとも１つのループドメインが、修飾されている、第一のポリペプチドと、（ｉｉ）該少なくとも１つのループドメインが連結し、ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質またはその一部を含み、グラム陰性菌種から得ることができる、第二のポリペプチドと、を提供する。好ましい実施形態において、Ｈ���ＢＰ表面受容体タンパク質の一部は、Ｎ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメインである。さらに好ましい実施形態において、ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質の一部は、グラム陰性病原菌種から得ることができる、または得られるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＮ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメインであり、該Ｎ−ローブドメインまたはＣ−ローブは、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、該Ｎ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメインの複数のループドメインの少なくとも１つのループドメインは、修飾されている。
【０１０６】
さらなる実施形態において、多量体ポリペプチドが調製され、そのような多量体タンパク質は、Ｃ−ローブドメインに第二、第三、第四、第五、第六または第七の全長Ｃ−ローブドメインポリペプチドを付加し、それによりＣ−ローブドメイン多量体を提供するか、またはＮ−ローブドメインに第二、第三、第四、第五、第六または第七の全長Ｎ−ローブドメインを付加し、それによりＮ−ローブドメイン二量体を提供するか、またはＣ−ローブドメインポリペプチドの一部もしくはＮ−ローブドメインポリペプチドの一部を含む付加など、複数のＮおよびＣ末端伸長を含む。したがって例えば一実施形態において、該Ｃ−ローブドメインは、Ａ．プルロニューモニエ、Ａ．スイスおよびヘモフィルス・パラスイスから得ることができるＴｂｐＢポリペプチドから得ることができる少なくとも２つまたは少なくとも３つのＣ−ローブドメインである。そのような実施形態によれば、Ａ．プルロニューモニエＨ４９（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：５）、Ａ．スイス  Ｈ５７（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３３）およびＡ．プルロニューモニエＨ８７（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１）からのＴｂｐＢ  Ｃ−ローブドメインをコードする核酸配列が連結されて、３つのＣ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２２）を含む単一ポリペプチド（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：４０）をコードするキメラ核酸配列（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３９）を形成し得る。したがってさらなる実施形態において、本開示は、（ｉ）グラム陰性病原菌種から得ることができる、または得られるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＮ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメインを含む第一のポリペプチドであって、該Ｎ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメインが、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、該Ｎ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメインの複数のループドメインの少なくとも１つのループドメインが、修飾されている、第一のポリペプチドと、（ｉｉ）該少なくとも１つのループドメインが連結し、各ペプチドがＨＩＢＰ表面受容体タンパク質またはその一部を含み、グラム陰性菌種から得ることができる、複数のポリペプチドと、を提供する。好ましい実施形態において、ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質の一部が、Ｎ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメインである。さらに好ましい実施形態において、ＨＩＢＰ表面タンパク質の一部は、グラム陰性病原菌種から得ることができる、または得られるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＮ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメインであり、該Ｎ−ローブドメインまたはＣ−ローブは、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、該Ｎ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメインの複数のループドメインの少なくとも１つのループドメインは、修飾されている。
【０１０７】
さらなる実施形態において、ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブまたはＮ−ローブの１つまたは複数のループドメインからの１つまたは複数のアミノ酸の除去により、これらの残基は、１つまたは複数の交互のアミノ酸残基で置換される。一実施形態において、該交互のアミノ酸残基は、脊椎動物宿主生物体内の免疫応答を誘発し得る異種ポリペプチド抗原決定基を含む。さらなる実施形態において、該交互のアミノ酸残基は、脊椎動物宿主生物体内の免疫応答を誘発し得る異種ポリペプチド抗原決定基を２つ以上含む。該異種抗原決定基は、同じまたは異なる病原生物体に対して免疫交差反応性があり得る。したがって、本明細書によるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質の修飾されたＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインがスカフォールドとして用いられて、１つ以上の抗原決定基を生成および提示し得ることは、明白であろう。好ましい実施形態において、ＴｂｐＢのＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインの１つまたは複数のループ領域が、トランスフェリン結合タンパク質（「ＴｂｐＡ」）またはラクトフェリン結合タンパク質Ａ（「ＬｂｐＡ」）をはじめとするＩＯＭタンパク質から得ることができる、または得られる１つまたは複数のポリペプチド部分で置換されている。本明細書により用いられ得るＬｂｐＡおよびＴｂｐＡポリペプチドは、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６２およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５２に示されたものを包含する。本明細書により用いられ得るＬｂｐＡおよびＴｂｐＡポリペプチドの一部は、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２８６およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２８７に示されたものを包含する。これらの断片を用いて、ＳＥＱ．ＩＤ．  ＮＯ：１６３；ＳＥＱ．ＩＤ．  ＮＯ：１６４；ＳＥＱ．ＩＤ．  ＮＯ：１６５；ＳＥＱ．ＩＤ．  ＮＯ：１６６、ＳＥＱ．ＩＤ．  ＮＯ：１６７；およびＳＥＱ．ＩＤ．  ＮＯ：１６８にしめされたものをはじめとするキメラ核酸配列およびポリペプチドを構築することができる。本開示のこの実施形態は、本明細書の実施例７および８にさらに詳述される。さらに好ましい実施形態において、ＴｂｐＢのＣ−ローブまたはＮ−ローブの１つまたは複数のループドメインが、実施例９にさらに記載される通り、高リシンポリペプチド配列で置換されている。
【０１０８】
Ｎ−ローブドメインを含むＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドを含む本明細書の以前に記載された実施形態の全てにおいて、Ｎ末端アンカーポリペプチドまたはその実質的な部分がＮ−ローブドメインから除去されるようにＮ−ローブドメインが修飾されることが、好ましい。アンカーポリペプチドの長さは、ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドに応じて変動し得るが、典型的には４０〜７５アミノ酸長の範囲内であり、成熟したＨＩＢＰポリペプチドのＮ末端に位置する。したがって図１を参照すると、そこに描写された成熟したＴｂｐＢポリペプチドのアンカーポリペプチドは、４３アミノ酸長である。したがってＮ−ローブドメインを含むＨＩＢＰポリペプチドを含む本明細書の好ましい実施形態において、該アンカーポリペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、好ましくは少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０または７５残基、長さが減少している。アンカーポリペプチドの一部が長さの減少について選択される実施形態において、好ましくはアンカーポリペプチドのＮ末端の連続部分、例えばアンカーペプチドの１０末端アミノ酸残基が除去されているが、アンカーポリペプチドの他の部分もまた、除去されていてもよい。更に好ましい実施形態において、アンカーペプチドが切断されているＴｂｐＢポリペプチドが、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２７９〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２８３を含む。本開示の発明者らは、アンカーポリペプチドの除去が修飾されたＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドの凝集を減少させてポリペプチドをより容易に生成しながら、ポリペプチドの免疫原性に実質的に影響を及ぼさないことから、前述の実施形態が特に望ましいことを見出した。したがってＨＩＢＰポリペプチドのこの修飾は、修飾されたループドメインを含むＮ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメインを含む本明細書に記載されたＨＩＢＰポリペプチド、およびＨＩＢＰポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができないように単一アミノ酸が置換されたＮ−ローブまたはＣ−ローブドメインを含むＨＩＢＰポリペプチドなど、本明細書で示された宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない修飾ペプチドのいずれかと共に用いられ得る。
【０１０９】
前述の通り、本開示によれば、ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質は、宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができないように修飾されている。修飾されたＨＩＢＰ表面受容体タンパク質への宿主鉄結合タンパク質の結合は、例えば固相結合アッセイ、アフィニティー捕捉アッセイ、または生物物理学的アッセイなど、そのような結合を評価することが可能な任意の化学的または生化学的アッセイを利用して評価され得る。これらのアッセイを実施する一般的方法論は、当業者に知られており、例えば（１２、２３〜２５、５０、５１）に記載されている。これらのアッセイを実施することにより、ネイティブＨＩＢＰ表面受容体タンパク質とネイティブ宿主鉄結合タンパク質、および修飾ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質とネイティブ宿主鉄結合タンパク質、の結合特性の差が、即座に決定され得、一連の修飾されたＨＩＢＰ表面受容体タンパク質が、宿主鉄結合タンパク質に結合し得るかどうかを決定するために評価され得る。結合定数（Ｋｄ）をはじめとする異なる結合特性が、決定され得る。上述の通り、本開示の宿主鉄結合タンパク質と修飾されたＨＩＢＰ表面受容体タンパク質との結合を特徴づけるＫｄは、宿主鉄結合タンパク質とネイティブＨＩＢＰ表面受容体タンパク質との結合を特徴づけるＫｄよりも少なくとも２倍高い。宿主トランスフェリンを用いて結合定数を決定する１つの例示的なアッセイ方法が、本明細書の実施例１１にさらに記載される。
【０１１０】
本開示は、
（ｉ）修飾ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質とネイティブＨＩＢＰ表面受容体タンパク質を用意すること；
（ｉｉ）修飾ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質と宿主鉄結合タンパク質との結合特性を測定して、修飾ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質の結合特性を得ること；
（ｉｉｉ）ネイティブＨＩＢＰ表面受容体タンパク質と宿主鉄結合タンパク質との結合特性を測定して、ネイティブＨＩＢＰ表面受容体タンパク質の結合特性を得ること；
（ｉｖ）修飾ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質の特性と、ネイティブＨＩＢＰ表面受容体タンパク質の特性とで結合特性を比較すること；
（ｖ）ネイティブＨＩＢＰ表面受容体タンパク質の結合特性に対して実質的に調整された結合特性を示すＨＩＢＰ表面受容体タンパク質を同定すること、
を含む、修飾ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質を同定する方法をさらに含む。
【０１１１】
本明細書で用いられる「実質的に調整された」は、修飾ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質と宿主鉄結合タンパク質との結合相互作用力が、ネイティブＨＩＢＰ表面受容体タンパク質と該宿主鉄結合タンパク質との結合相互作用力よりも実質的に弱いことを意味する。好ましい実施形態において、用いられる結合特性は、ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質と宿主鉄結合タンパク質との結合相互作用に関するＫｄであり、該修飾ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質と宿主鉄結合タンパク質との結合相互作用のＫｄ値は、ネイティブＨＩＢＰ表面受容体タンパク質と該宿主鉄結合タンパク質との結合相互作用のＫｄよりも少なくとも２倍大きな値である。前述の方法を用いて、複数の異なる候補ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質を同時に、または連続してスクリーニングし、スクリーニングされた候補ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のうち、ネイティブＨＩＢＰ表面受容体タンパク質に対して結合特性が幾分か顕著な調整を示すものを同定することができることを、さらに留意されたい。
【０１１２】
本開示は、
（ｉ）修飾ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質とネイティブＨＩＢＰ表面受容体タンパク質を用意すること；
（ｉｉ）修飾ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質と宿主鉄結合タンパク質との結合特性を測定して、修飾ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質の結合特性を得ること；
（ｉｉｉ）ネイティブＨＩＢＰ表面受容体タンパク質と宿主鉄結合タンパク質との結合特性を測定して、ネイティブＨＩＢＰ表面受容体タンパク質の結合特性を得ること；
（ｉｖ）修飾ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質の結合特性と、ネイティブＨＩＢＰ表面受容体タンパク質の結合特性を比較すること；
（ｖ）ネイティブＨＩＢＰ表面受容体タンパク質の結合特性に対して実質的に調整された結合特性を示すＨＩＢＰ表面受容体タンパク質を同定すること、
（ｖｉ）ワクチンとしての使用のために、ネイティブＨＩＢＰ表面受容体タンパク質の結合特性に対して実質的に調整された結合特性を示す修飾ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質を調製すること、
を含む、ワクチンとしての使用のための修飾ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質を調製する方法をさらに含む。
【０１１３】
前述によれば、ネイティブＨＩＢＰ表面受容体タンパク質の結合特性に対して実質的に調整された結合特性を示す同定されたＨＩＢＰ表面受容体タンパク質を用いて、例えばＨＩＢＰ表面受容体タンパク質を組換え生成し、ＨＩＢＰ表面タンパク質を単離して、ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質を含むワクチン配合剤を調製することにより、免疫原性配合剤を調製することができる。
【０１１４】
さらなる実施形態において、本開示は、表面受容体タンパク質変異体に対する抗血清の交差反応性を評価する方法を含む。したがって本開示は、
（ｉ）表面受容体タンパク質をコードする複数の核酸配列を用意すること；
（ｉｉ）複数の表面受容体タンパク質のうちの核酸配列変異を決定すること；
（ｉｉｉ）表面受容体タンパク質の変異体部分を選択すること；
（ｉｖ）該変異体の表面受容体タンパク質のＮ末端またはＣ末端部分をコードする核酸配列を、ビオチン化を受け易いペプチドをコードする核酸配列、および宿主細胞内の発現を制御することが可能な核酸配列に連結して、キメラ核酸配列を形成させること；
（ｖ）該キメラ核酸配列を宿主細胞に導入して該キメラ核酸配列を発現させて、該ビオチン化を受け易いペプチドに融合された該変異体の表面受容体タンパク質のＮ末端またはＣ末端部分を含む融合ポリペプチドを生成させること；
（ｖｉ）宿主細胞から細胞溶解物を調製すること；
（ｖｉｉ）該細胞抽出物を、ストレプトアビジン・コーティング免疫アッセイ基質材料に塗布すること；ならびに
（ｖｉｉｉ）抗血清と表面受容体タンパク質の変異体部分との交差反応性を評価するために、抗血清を該免疫アッセイ基質材料に塗布し、該免疫アッセイ基質材料を洗浄して、標識された第二のコンジュゲートを塗布すること、
を含む、表面受容体タンパク質変異体に対する抗血清の交差反応性を評価する方法をさらに含む。
【０１１５】
ビオチン化を受けやすいペプチドをコードする核酸配列が、さらに、十分な長さの核酸配列を含むことができ、発現の際に、融合ポリペプチドのポリペプチド伸長が可能になるため、表面受容体タンパク質が免疫アッセイ基質材料から離れていて、それにより抗体の結合が完全に実行可能になる。ストレプトアビジン・コーティング免疫アッセイ基質材料は、例えばＥＬＩＳＡプレートなど、任意の基質材料であり得る。
【０１１６】
さらなる実施形態において、本開示は、
（ｉ）表面受容体タンパク質をコードする複数の核酸配列を用意すること；
（ｉｉ）複数の表面受容体タンパク質のうちの核酸配列変異を測定すること；
（ｉｉｉ）表面受容体タンパク質をコードする核酸配列を置換することが可能な逆選択マーカを含む宿主細胞を用意すること；
（ｉｖ）表面受容体タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸配列の複数の変異体部分をＰＣＲ増幅させて、表面受容体変異体をコードする複数のＰＣＲ産物を得るが、ここで、該ＰＣＲ増幅が逆選択マーカを含む宿主細胞にＰＣＲ産物を挿入することが可能になるように実施され、各ＰＣＲ産物の同定が可能なように該ＰＣＲ産物が特有の外来核酸配列を含むこと；
（ｖ）逆選択マーカを含む宿主細胞に複数のＰＣＲ産物を導入および発現させて、抗原性ＨＩＢＰ変異体のライブラリを提供すること；ならびに
（ｖｉ）該ライブラリの全てまたは一部をインビボまたはインビトロ免疫原性アッセイで使用して、該ライブラリまたはその一部の交差反応性または交差防御性を評価すること、
を含む、抗血清表面受容体タンパク質変異体の交差反応性または防御性を評価する方法を含む。
【０１１７】
インビボまたはインビトロ免疫アッセイは、任意のＥＬＩＳＡアッセイ、機能的免疫アッセイ、または動物感染モデルをはじめとする任意のアッセイであり得る。
【０１１８】
さらなる実施形態において、本開示は、
（ｉ）（ａ）ワクチンが対象とする宿主病原菌種からの哺乳動物ＣＥＡＣＡＭ受容体を発現するトランスジェニックマウス株と、（ｂ）該トランスジェニックマウス株と遺伝子的に同一であるがＣＥＡＣＡＭ受容体を発現しないマウス株と、を用意すること；
（ｉｉ）変異体表面受容体タンパク質を発現するグラム陰性菌株がトランスジェニックマウス株の上気道に定着することが可能であること、そしてＣＥＡＣＡＭ受容体を発現しないマウス株の上気道で定着することができないことを実証すること；
（ｉｉｉ）表面受容体タンパク質に由来する抗原での免疫化が、表面受容体タンパク質変異体を発現するグラム陰性菌株で感染されたトランスジェニックマウスの上気道での定着の非存在をもたらすかどうかを決定すること；
（ｉｖ）表面受容体タンパク質に由来する抗原で免疫化された動物からの抗血清の提供が、表面受容体タンパク質変異体を発現するグラム陰性菌株で感染された非トランスジェニック免疫化マウスの上気道での定着の非存在をもたらすかどうかを決定すること；
（ｖ）グラム陰性菌株からの表面受容体タンパク質の一部を含むライブラリを調製し、動物の上気道定着モデルにおいて該ライブラリを使用して、表面受容体変異体でチャレンジされた動物の上気道の定着を評価すること；
（ｖｉ）場合により、動物にチャレンジするために用いられたライブラリから得られたＤＮＡ、および／または暴露後の適切な時間にチャレンジされた動物から得られた試料から得られたＤＮＡを抽出および調製して、異なる受容体変異体を発現する株の割合を決定すること、
を含む、表面受容体タンパク質変異体を発現するグラム陰性菌株による哺乳動物上気道の定着予防のためのワクチンの有効性を評価する方法を含む。
【０１１９】
一般に、本開示を読めば、本開示により一連の異なる調整ポリペプチドを調製および獲得することができ、その全てが修飾ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質であり、該修飾ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質が宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができないように該修飾がなされることは、当業者に理解されよう。これらの調整ポリペプチドおよびそのような調整ポリペプチドを作製する方法は、全て本明細書に示された組成物および方法の範囲に含まれるものとする。
【０１２０】
修飾されたＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインポリペプチドは、従来からＨＩＢＰ表面受容体タンパク質をコードする核酸配列を用意すること、および修飾Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドが組換え宿主生物体、例えば微生物細胞において発現されるようにネイティブ核酸配列を調整すること、により調製されている。核酸配列への調整は、例えば部位特異的突然変異誘発、標的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、有機溶媒の添加、遺伝子シャッフル、または当業者に知られるこれらおよび他の技術の組み合わせなど、一般に当業者に知られる様々な核酸修飾技術を利用して実行することができ、各方法論は、内部のループドメインが修飾されるようにＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインのループドメインをターゲットにするように設計される。あるいはサイズ修飾されたＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインポリペプチドをコードする調整核酸配列は、最初から遺伝子合成技術を利用して調製され得る。核酸配列を調製および修飾するための一般的技術は、例えばＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０１２，  （３３）において、当業者に即座に利用できる。
【０１２１】
本開示の別の実施形態において、免疫原性組成物を調製する方法が提供される。したがって本開示は、
（ａ）動作可能に連結された成分として、
（ｉ）グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドをコードする核酸配列であって、該ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができないように修飾されている、核酸配列と、
（ｉｉ）組換え宿主細胞内での発現を制御することが可能な核酸配列と、
を含むキメラ核酸配列を用意すること；
（ｂ）該キメラ核酸配列を宿主細胞に導入し、該宿主細胞を生育させて、Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含む該ポリペプチドを生成させること；
（ｃ）該宿主細胞から、Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを回収すること；および
（ｄ）免疫原性組成物を調製すること、
を含む、免疫原性組成物を調製する方法を提供する。
【０１２２】
特定の実施形態において、該Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインは、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、該複数のループドメインの少なくとも１つのループドメインは修飾されており、該ポリペプチドは、宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができないように修飾されている。
【０１２３】
さらに好ましい実施形態において、本開示は、
（ａ）動作可能に連結された成分として、
（ｉ）グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質の第一のＣ−ローブドメインまたは第一のＮ−ローブドメインを含むポリペプチドをコードする第一の核酸配列と、
（ｉｉ）グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質の第二のＣ−ローブドメインまたは第二のＮ−ローブドメインを含むポリペプチドをコードする第二の核酸配列と、
（ｉｉｉ）組換え宿主細胞内での発現を制御することが可能な核酸配列と、
を含むキメラ核酸配列を用意すること；
（ｂ）該キメラ核酸配列を宿主細胞に導入し、該宿主細胞を生育させて、第一および第二のＣ−ローブドメインまたは第一および第二のＮ−ローブドメインを含む該ポリペプチドを生成させること；
（ｃ）該宿主細胞から、第一および第二のＣ−ローブドメインまたは第一および第二のＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを回収すること；および
（ｄ）免疫原性組成物を調製すること、
を含む、免疫原性組成物を調製する方法を提供する。
【０１２４】
好ましい実施形態において、第一の核酸と第二の核酸は、第一および第二のＣ−ローブドメインまたは第一および第二のＮ−ローブドメインを含むヘテロ多量体融合ポリペプチドが生成されるように動作可能に連結され、該ヘテロ多量体融合ポリペプチドは、宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない。
【０１２５】
本明細書によれば、ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質をコードする核酸配列は、宿主細胞におけるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質の発現を制御することが可能な核酸配列に連結されている。したがって本開示はまた、宿主細胞における発現を制御することが可能なプロモータに連結されたＨＩＢＰ表面受容体タンパク質をコードする核酸配列を提供する。本明細書で用いられ得る宿主における発現を制御することが可能な核酸配列は、宿主細胞におけるポリペプチドの発現を制御することが可能な任意の転写プロモータを含む。一般に、細菌細胞から得られたプロモータは、細菌宿主が本明細書に従って選択された場合に用いられ、真菌プロモータは、真菌宿主が選択された場合に用いられ、植物プロモータは、植物細胞が選択された場合に用いられる、などである。宿主細胞における発現を制御することが可能なさらなる核酸要素としては転写ターミネータ、エンハンサなどが挙げられ、それらは全て、本開示のキメラ核酸配列に含まれ得る。
【０１２６】
本開示によれば、グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドをコードする核酸配列に連結された、宿主における発現を制御することが可能なプロモータを含むキメラ核酸配列であって、該Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインが複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、該複数のループドメインの少なくとも１つのループドメインが修飾されている、キメラ核酸配列は、組換え発現ベクターに挿入されて、宿主細胞における良好な発現を確実にすることができる。したがって本開示は、動作可能に連結された成分として、
（ｉ）宿主における発現を制御することが可能な核酸配列と；
（ｉｉ）グラム陰性菌種から得ることができる、または得られるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドをコードする核酸配列であって、該ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができないように修飾されている、核酸配列と
を含み、宿主細胞における発現に適している、組換え発現ベクターを含む。用語「宿主細胞における発現に適する」は、組換え発現ベクターが、宿主細胞において発現を実現するのに必要な遺伝要素に連結された本開示のキメラ核酸配列を含むことを意味する。これに関して発現ベクター内に含まれ得る遺伝要素としては、転写終結領域、マーカ遺伝子をコードする１つまたは複数の核酸配列、１つまたは複数の複製起点などが挙げられる。遺伝要素は、典型的には当業者に知られる通り、例えばプロモータを５’から３’の転写方向でコード配列に連結することにより、動作可能に連結される。好ましい実施形態において、該発現ベクターは、宿主細胞のゲノムにおけるベクターまたはその一部の挿入に必要な遺伝要素をさらに含む。さらなる実施形態において、該Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインは、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、該複数のループドメインの少なくとも１つのループドメインは、修飾されている。
【０１２７】
本開示に従えば、該発現ベクターは、マーカ遺伝子をさらに含み得る。本開示に従って用いられ得るマーカ遺伝子は、選択およびスクリーニングが可能な全てのマーカ遺伝子をはじめとし、形質転換細胞と非形質転換細胞との識別を可能にする全ての遺伝子を包含する。該マーカ遺伝子は、例えばカナマイシンまたはアンピシリンに対して、抗生物質耐性マーカなどの耐性マーカになり得る。視覚的精査を通してトランスフォーマントを同定するのに用いられ得るスクリーニング可能なマーカとしては、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）（米国特許第５，２６８，４６３号および同第５，５９９，６７０号）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が挙げられる（５２）。
【０１２８】
特に簡便に用いられ得る宿主細胞の１つが、大腸菌である。大腸菌ベクターの調製は、制限消化、ライゲーション、ライゲーション非依存性クローニング、ゲル電気泳動、ＤＮＡ配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および他の方法論など、一般に知られる技術を用いて達成され得る。本発明者が開発した慣用ベクターをはじめとする組換え発現ベクターを調製するのに求められる必須のステップを実施するのに、非常に様々なクローニングベクターを利用できる。中でも、大腸菌において機能する複製系を有するベクターが、ｐＵＣまたはｐＥＴシリーズのベクターなどのベクターである。典型的にはこれらのクローニングベクターは、形質転換細胞の選択を可能にするマーカを含む。核酸配列をこれらのベクターに導入することができ、該ベクターは、競合する細胞の調製、電気穿孔、または当業者に周知の他の方法論の利用により、大腸菌に導入され得る。大腸菌は、ルリア・ブロス培地などの適切な培地で生育させ、回収することができる。組換え発現ベクターは、細胞の回収および溶解により、即座に採取され得る。さらに、組換えベクターの調製および組換え生物体の生育に関する一般的ガイダンスは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄ  （３３）に見出され得る。
【０１２９】
組換えタンパク質の生成は、好ましくは大きなバイオマスに達した生育期間の後に発現を誘導することにより、大腸菌株の生育期全体を通して行うことができる。これは、Ｃ−ローブドメインもしくはＮ−ローブドメイン、またはループが修飾されたＣ−ローブドメインもしくはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドの生成をもたらす。該ポリペプチドは、次に、例えば金属キレートクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過などの様々な異なるタンパク質精製技術により、他の宿主細胞成分から回収、単離および分離され得る。タンパク質精製に関するさらなる一般的ガイダンスは、例えばＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（５３）に見出すことができる。本明細書で用いられる用語「回収された」は、該ポリペプチドが幾分か純粋な形態で得られることを意味する。好ましい実施形態において、グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインを含む実質的に免疫原性のポリペプチドであって、該Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインが複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、該複数のループドメインの少なくとも１つのループドメインが修飾されている、ポリペプチドを、本明細書により得ることができる。したがって本明細書により得られたＨＩＢＰポリペプチドは、実質的に純粋な形態で調製され得る。「実質的に純粋な」は、該免疫原性タンパク質が、他の宿主細胞成分から分離されていることを意味する。本明細書によれば、該免疫原性タンパク質は、少なくとも９５％純粋であり、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％純粋である。あるいは該ＨＩＢＰポリペプチドを含む相対的に粗製の画分、例えば該ポリペプチドを含む細胞、該ポリペプチドを含む細胞溶解物、または該ポリペプチドを含む細胞画分を得ることができる。
【０１３０】
さらなる実施形態において、本開示は、脊椎動物対象において免疫応答を誘発する方法を提供する。該免疫応答は、該免疫原性タンパク質の送達により、または該免疫原性タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターの送達により、誘発され得る。したがって本開示は、脊椎動物対象において免疫応答を誘発する方法であって、
（ａ）グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインもしくはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む免疫原であって、該ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、免疫原；または
（ｂ）グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインもしくはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む免疫原をコードする核酸配列を含む発現ベクターであって、該ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、発現ベクター、
を該対象に投与することを含み、該免疫原が、該脊椎動物対象における免疫応答を誘発するのに十分な量で投与または発現される、方法をさらに提供する。
【０１３１】
本開示はまた、脊椎動物対象における免疫応答を誘発するための、
（ａ）グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインもしくはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む免疫原であって、該ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、免疫原；または
（ｂ）グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインもしくはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む免疫原をコードする核酸配列を含む発現ベクターであって、該ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、発現ベクター、
の使用を提供する。
【０１３２】
本開示は、脊椎動物対象における免疫応答を誘発するための薬剤の製造における、
（ａ）グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインもしくはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む免疫原であって、該ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、免疫原；または
（ｂ）グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインもしくはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む免疫原をコードする核酸配列を含む発現ベクターであって、該ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、発現ベクター、
の使用をさらに提供する。
【０１３３】
本開示はさらにまた、脊椎動物対象における免疫応答を誘発するための、
（ａ）グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインもしくはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む免疫原であって、該ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、免疫原；または
（ｂ）グラム陰性菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインもしくはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む免疫原をコードする核酸配列を含む発現ベクターであって、該ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができない、発現ベクター、
を提供する。
【０１３４】
好ましい実施形態において、該ポリペプチドは、少なくとも２つのＣ−ローブドメイン、または少なくとも２つのＮ−ローブドメインを含む。さらに好ましい実施形態において、該ポリペプチドは、少なくとも３つのＣ−ローブドメイン、または少なくとも３つのＮ−ローブドメインを含む。
【０１３５】
特定の実施形態において、該Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインは、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、該複数のループドメインの少なくとも１つのループドメインは、該Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができないように修飾されている。
【０１３６】
本開示は、ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドのＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含む免疫原であって、該Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインが、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、該少なくとも１つのループドメインが、薬剤としての使用のために修飾されている、免疫原をさらに含む。
【０１３７】
本開示は、ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドのＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含む免疫原であって、該Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインが、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、該少なくとも１つのループドメインが、アクチノバシラス属、ナイセリア属、ヘモフィルス属、マンヘミア属、ヒストフィルス属、パスツレラ属またはモラクセラ属に属する細菌をはじめとする感染性グラム陰性菌による感染または疾患の予防への使用のために修飾されている、免疫原をさらに含む。
【０１３８】
本開示は、ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドのＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含む免疫原であって、該Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインが、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、該少なくとも１つのループドメインが、アクチノバシラス属、ナイセリア属、ヘモフィルス属、マンヘミア属、ヒストフィルス属、パスツレラ属またはモラクセラ属に属する菌をはじめとする感染性グラム陰性菌による感染または疾患の予防のための薬剤の製造において使用するために修飾されている、免疫原をさらに含む。
【０１３９】
ワクチン調製物
本開示は、ワクチン調製物をさらに提供する。したがって本開示は、グラム陰性病原菌種からのＨＩＢＰ表面受容体タンパク質由来の抗原を含むワクチン組成物であって、該ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質由来のタンパク質が、宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができないように修飾されている、ワクチン組成物をさらに提供する。本開示のワクチン組成物は、好ましくはグラム陰性病原菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質、ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメイン、を含むポリペプチドを含むワクチンであって、該ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができないように修飾されている、ワクチンを含む。好ましい実施形態において、該ワクチン調製物は、２つの異なる細菌種または２つの異なる菌株に属するＣ−ローブドメインの混合物を含む。さらに好ましい実施形態において、該ポリペプチドは、少なくとも２つまたは少なくとも３つのＮ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメインを含む。さらに好ましい実施形態において、前記少なくとも２つまたは少なくとも３つのＮ−ローブドメインまたはＣ−ローブドメインは、ヘテロ多量体を形成する。さらなる実施形態において、該Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインは、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、該複数のループドメインの少なくとも１つのループドメインは、修飾されている。
【０１４０】
本開示のワクチン調製物は、幾分か純粋な形態の免疫原性ＨＩＢＰポリペプチドを含む。したがって本明細書によれば、実質的に純粋なＨＩＢＰポリペプチドを得ることができ、ワクチン配合剤を調製するのに用いることができる。他の実施形態において、より粗製のＨＩＢＰポリペプチド調製物を得ることができ、ワクチン配合剤を調製するのに用いることができる。したがって例えばそのような実施形態において、ＨＩＢＰポリペプチドを含む細胞、細胞溶解物または細胞画分を用いて、ワクチン配合剤を調製することができる。
【０１４１】
対象における免疫応答を増大させるために、本明細書で提供される組成物は、さらに好ましくは薬剤、サイトカインなどのアジュバントを含む。適切なアジュバントとしては、本開示の免疫原性ポリペプチドに対する対象の免疫応答を増強する任意の物質が挙げられる。アジュバントの非限定的例としては、サイトカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−６が挙げられ、さらに、Ｗｉｌｓｏｎ−Ｗｅｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（５４）に論評された通り、無機塩、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、およびリン酸カルシウム；油性エマルジョン、例えば鉱物油、ＭＦ５９、ＱＳ−２１、Ｍｏｎｔａｍｉｄｅ  ＩＳＡ５１およびＩＳＡ−７２０；Ｉｓｏｃｏｍ類、例えばＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ；微生物誘導体、例えばＭＰＬＡ、マクロファージ活性化タンパク質−２（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２）、ビロソーム、ＬＴ／ＣＴ、ＣｐＧ；天然ポリマー、例えば多糖類；ならびに合成ポリマー、例えばポリ酸無水物およびポリエステルが挙げられる。アジュバントは、例えばポリペプチド抗原の投与と同時に、その前に、またはその後にタンパク質または他の巨大分子として投与され得る。
【０１４２】
免疫原性タンパク質の用量は、ヒト対象の場合、一般に約０．１μｇ〜約２０ｍｇ、好ましくは１０μｇ〜約３ｍｇの範囲内である。しかし必要となる厳密な量は、処置されるレシピエント対象の年齢および一般的状態、処置される疾病の重症度、送達される特定の調製物、投与部位、および他の因子に応じて変動するであろう。適切な治療有効量は、当業者により即座に決定され得る。したがって本発明の組成物の「治療有効量」は、疾患もしくは疾病の症状の処置もしくは予防をもたらすのに、または病原菌による定着を予防するのに十分な量であり、日常的試験で決定され得る相対的に広い範囲に収まるであろう。
【０１４３】
本開示の免疫原性組成物を含むワクチン調製物は、好ましくはビヒクル、賦形剤および補助物質、例えば湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などをさらに含み、賦形剤またはビヒクル中に存在し得る。これらのビヒクル、賦形剤および補助物質は、一般にレシピエント対象において免疫応答を誘発しない医薬剤であり、過度の毒性をもたらさずに投与され得る。医薬的に許容し得る賦形剤としては、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロールおよびエタノールなどの液体が挙げられるが、これらに限定されない。医薬的に許容し得る塩、例えば塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの無機酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩を本明細書に含めることができる。特に本開示のポリペプチドを安定化させるために、該調製物が安定化剤として働く医薬的に許容し得る賦形剤を含むことも、必要ではないが好ましい。ペプチドの安定化剤としても働く適切な担体の例としては、医薬等級のデキストロース、スクロース、ラクトース、ソルビトール、イノシトール、デキストランなどが挙げられるが、これらに限定されない。他の適切な担体としては、デンプン、セルロース、リン酸ナトリウムまたはカルシウム、クエン酸、グリシン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、同じくこれらに限定されない。
【０１４４】
本開示のワクチン調製物を用いて、非限定的にアクチノバシラス・プルロニューモニエ、アクチノバシラス・スイス、ヘモフィルス・パラスイス、ナイセリア・メニンギティディスをはじめとする、非限定的にアクチノバシラス属、ナイセリア属、ヘモフィルス属、マンヘミア属、ヒストフィルス属、パスツレラ属またはモラクセラ属に属する菌などの感染性グラム陰性菌により誘発される感染または疾患を予防することができる。該ワクチン調製物を用いて、宿主鉄結合タンパク質を発現する任意の脊椎動物対象、および非限定的に任意の哺乳動物対象、例えば任意のヒト対象、ブタ対象、ウシ対象、ウマ対象、ヒツジ対象、ヤギ対象、イヌ対象、ネコ対象、ウサギ対象、およびさらに任意の反芻動物対象、およびネズミ対象を免疫化することができる。免疫化され得る他の脊椎動物対象としては、任意の鳥類対象および魚類対象が挙げられる。本開示のワクチン調製物は、レシピエント宿主生物体において高い交差反応性および交差防御性免疫反応を示す。さらに、本開示のワクチン調製物は、脊椎動物対象の呼吸管または生殖管の細菌定着など、感染性グラム陰性菌による感染および／または定着を予防し得ることに、留意されたい。
【０１４５】
本開示は、ＨＩＢＰ表面受容体タンパク質、ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドのＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含むワクチンであって、該Ｃ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインが、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、該少なくとも１つのループドメインが、アクチノバシラス属、ナイセリア属、ヘモフィルス属、マンヘミ属、ヒストフィルス属、パスツレラ属またはモラクセラ属に属する細菌をはじめとする感染性グラム陰性菌による感染または疾患の予防に使用するために修飾されている、ワクチンをさらに含む。
【０１４６】
ワクチン調製物のテスト
本明細書に従って、本開示のワクチン調製物の有効性を、例えばワクチン調製物で免疫化された対象の血清中に存在する抗体力価を決定することにより、例えば酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）の実践により、評価することができる。したがって本開示は、グラム陰性病原菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含むワクチン調製物の有効性を評価する方法であって、該ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができないように修飾されていて、
（ａ）グラム陰性病原菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチド、ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドのＣ−ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含むワクチン調製物を、脊椎動物対象に投与し、該ポリペプチドが宿主鉄結合タンパク質に実質的に結合することができないように修飾されていること；
（ｂ）該脊椎動物対象から血清を得ること；および
（ｃ）該ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドに対する抗体の存在について該血清をアッセイすること、
を含む、方法をさらに含む。
【０１４７】
脊椎動物血清は、単一または複数の（例えば、２、３、または４）用量のワクチン調製物の投与の後にアッセイされ得る。ＥＬＩＳＡアッセイなどのアッセイを、単一または複数の微生物の異なる菌株または菌種からのＨＩＢＰ表面受容体タンパク質単離物を用いて実施することができる。ＥＬＩＳＡアッセイは、マルトース結合タンパク質などのキャリアタンパク質に、該ＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドを連結させることを含み得る。複数のＨＩＢＰ表面受容体タンパク質単離物に対する抗体の反応性がアッセイされれば、ワクチン調製物を交差反応性について評価することができる。
【０１４８】
ワクチン接種レジメン
本明細書の技術の観点から当業者に明白な通り、上記ポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードする核酸配列のワクチン接種（ＤＮＡワクチン）は、単一用量で、処置期間を通して連続または間欠的に実行され得る。最も効果的な手段および投与量を決定する方法は、当業者に周知であり、送達ベクター、組成物の性質、探索される具体的な予防または治療、標的細胞、および処置される対象に応じて変動するであろう。単回および反復投与が、適切な医療従事者により選択された投与レベルおよびパターンで実施され得る。
【０１４９】
上記医薬調製物の投与は、単一用量で、処置期間を通して連続または間欠的に実行され得る。送達は、最も典型的には液体組成物用および微粒子組成物を含む液体懸濁物用の従来の針およびシリンジを介する。加えて、様々な液体ジェットインジェクタが、当該技術分野で知られており、本発明の組成物を投与するのに用いられ得る。ワクチン送達経路は、様々であり得る。したがって本開示のワクチンは、静脈内、皮下、筋肉内、膣内、腹腔内、鼻内、経口または他の粘膜経路で送達され得る。最も効果的な投与手段および投与量を決定する方法は、当業者に周知であり、送達ビヒクル、治療の組成物、標的細胞、および処置される対象に応じて変動するであろう。単回および反復投与が、担当医師または獣医師により選択された投与レベルおよびパターンで実施され得る。
【０１５０】
実施例
以下は、本開示を実施するための具体的な実施形態の例である。該実施例は、例示を目的として示しているに過ぎず、本開示の範囲を限定するものではない。
【０１５１】
実施例１  −  ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブドメイン、ＴｂｐＢ  Ｎ−ローブドメインおよびそれらの混合物での免疫応答
この実施例は、より望ましい免疫応答を得るためにＴｂｐＢ受容体タンパク質のサブドメインを使用する価値の例を示している。本発明者らがより望ましい免疫応答により意味するものに関して、本発明者らは、抗体反応の規模、および抗体と変異体ＴｂｐＢタンパク質との交差反応性の両方を検討する。
【０１５２】
図３Ａは、異なる宿主種（マウス、ウサギおよびブタ）をヒト病原ナイセリア・メニンギティディス（Ｂ１６Ｂ６株−ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１７）から、またはブタ病原アクチノバシラス・プルロニューモニエ（Ｈ４９株−ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２）からのインタクトＴｂｐＢで免疫化させた、この実施例の第一の実験の結果を示している。免疫化された動物の血清を、本発明者ら特製のＥＬＩＳＡアッセイ（以下参照）において免疫化抗原に対してテストした。結果から、ブタ病原Ａ．プルロニューモニエ（灰色の棒）からのＴｂｐＢとのブタの抗体反応の規模（力価）がヒト病原Ｎ．メニンギティディス（黒色の棒）からのＴｂｐＢに比較して、他の宿主種よりも実質的に低かったことが示されており、宿主トランスフェリンの結合がＴｂｐＢに対する抗体反応の発達に影響を及ぼしていることが示唆される。
【０１５３】
第二の実験（図３Ｂ）は、ウシ病原マンヘミア・ヘモリティカ（Ｈ１９６株−ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２０６）からのインタクトＴｂｐＢ、またはブタ病原アクチノバシラス・プルロニューモニエ（Ｈ４９株）からのインタクトＴｂｐＢ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２）、ＴｂｐＢ  Ｎ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：８）もしくはＴｂｐＢ  Ｃ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：６）によるブタの免疫化を含む。図３Ｂは、免疫化前（白色の棒）、最初の免疫化後（淡灰色の棒）、２回目の免疫化後（濃灰色の棒）および３回目の免疫化後（黒色の棒）の個々のブタ（棒のクラスタ）における免疫応答を示している。力価を二進対数として表現して、力価を評価するのに用いられた２倍希釈を反映していることに留意されたい。ブタのほとんどが、３回目の免疫化後に高い抗体力価（２６，０００〜２５６，０００）を示したが、Ａ．プルロニューモニエからのインタクトＴｂｐＢまたはＴｂｐＢ  Ｎ−ローブで免疫化されたブタの数匹は、実質的に低い力価（５，３００〜８，０００）を示した。インタクトＴｂｐＢで免疫化されたブタ４匹中２匹と、ＴｂｐＢ  Ｎ−ローブで免疫化されたブタ３匹が実質的に低い力価を示したという観察は、宿主トランスフェリンの結合が、動物の部分集合のみで抗体反応の発達に影響を及ぼすことを示唆している。
【０１５４】
この実施例に示された第三の実験（図３Ｃ）は、抗血清の交差反応性を評価するために、インタクトＴｂｐＢおよびそのサブドメインに対する血清がブタ病原からの異なる代表的ＴｂｐＢと反応する能力を評価するように設計された。ブタを、インタクトＴｂｐＢ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２）、ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブドメイン（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：６）、ＴｂｐＢ  Ｎ−ローブドメイン（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：８）またはＴｂｐＢ  Ｎ−ローブとＴｂｐＢ  Ｃ−ローブとの混合物で免疫化した。該血清を、（ｉ）アクチノバシラス・プルロニューモニエＨ４９株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２）からのインタクトＴｂｐＢ、（ｉｉ）ヘモフィルス・パラスイスＨＰ５株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１５）からのインタクトＴｂｐＢ、または（ｉｉｉ）アクチノバシラス・プルロニューモニエＨ８７株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２）からのインタクトＴｂｐＢに対してテストした。
【０１５５】
図３Ｃの結果から、Ａ．プルロニューモニエＨ４９株からのＴｂｐＢ  Ｃ−ローブドメインが、インタクトＴｂｐＢ（Ｈ８７株からの異種ＴｂｐＢに対してより高い力価）またはＴｂｐＢ  Ｎ−ローブ（Ｈ８７株およびＨＰ５株に対してより高い力価）よりも交差反応性の高い免疫応答を誘導することが示される。このアッセイで用いられたＴｂｐＢは、世界中のブタからのＡ．プルロニューモニエ、Ａ．スイスおよびヘモフィルス・パラスイスの臨床疾患単離物中に存在する全体的な配列および構造多様性を表すように設計された（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２８；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１０７〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１５）（図４）。したがってこの実施例において、本発明者らは、分析を１つのブタ病原に限定せず、世界中のブタ業界で問題とされる３種の異なるブタ病原をターゲットにしている。これらの病原が宿主から鉄を獲得するための一般的メカニズムを共有するように生じるという事実は、共通の抗原であるＴｂｐＢから３種の病原をターゲットにするワクチンを開発するための特有の機会を与えている。これらの結果は、１つまたは複数のＣ−ローブドメインを抗原として用いることにより、世界中のブタ病原に対して広く交差反応性のある応答を生じることが実現可能であり、したがってこれらの病原の存在を地球規模で排除するワクチン接種が検討され得ることを示している。
【０１５６】
驚くべきことに、Ｃ−ローブドメインにより誘発された高い交差反応性は、Ｃ−ローブが免疫化混合物中でＮ−ローブと混合された場合でも保持された（図３Ｃ、「Ｎ＋Ｃローブ」）。これらの結果は、より小さな可変性ループ領域（図１、「Ｎ−ローブ」に比較した「Ｃ−ローブ」）を有する抗原がより交差反応性の高い抗体反応を誘発し得ること、および交差反応性免疫応答を誘発するこの高い能力がＣ−ローブを免疫化混合物中で他の抗原と混和した場合でも保持されることを、本発明者らに教示している。より具体的には、これらの結果から、Ｎ−ローブがより株特異性の高い免疫応答を生じる傾向が、Ｃ−ローブがＮ−ローブに物理的に連結した場合にＣ−ローブによる交差反応性免疫応答の誘導を効率的に阻害することのみを可能にすることが示される。言い換えれば、意外にも、Ｎ−ローブがより特異的な免疫応答を生じる性質は、Ｎ−ローブをＣ−ローブと混合した場合に実質的に低下する。本発明者らの知識の限りでは、この現象はこれまでに記載されていない。
【０１５７】
同じくこの結果から、Ｃ−ローブに比較して、インタクトＴｂｐＢおよびＴｂｐＢ  Ｎ−ローブに対して低い応答が存在することを示唆しており（図３Ｂ、３Ｃ）、インタクトＴｂｐＢおよびＴｂｐＢ  Ｎ−ローブのみに存在する特色である宿主トランスフェリンの結合が、ブタにおいて免疫応答を調整している可能性を示し得る。
【０１５８】
これまで発表された試験とは異なり、本発明者らが標準的ＥＬＩＳＡ法での主要な欠陥を認識したため、抗体レベルを測定するのに標準的ＥＬＩＳＡ法を利用しなかったことを述べるのは、重要なことである。本発明者らは、一般に推定されるものとは異なり、精製タンパク質がＥＬＩＳＡプレートに必ずしもランダムに結合せず、タンパク質表面のエピトープへの抗体結合を評価する上での潜在的に強い偏向または欠陥をもたらすことを観察した。特に本発明者らは、ＴｂｐＢ、特にＴｂｐＢのＮ−ローブが、本質的にＥＬＩＳＡプレートの固体表面に一方向に結合して、Ｎ−ローブのＣａｐ領域をマスキングすることで、トランスフェリンの結合が検出できなくなることに注目した（図５）。これに対して、精製されたＴｂｐＢ  Ｎ−ローブの前駆体であったＮ末端マルトース結合タンパク質（Ｍｂｐ）パートナーとの組換え融合タンパク質は、トランスフェリン結合に卓越していた（図５）。この現象は、ヒト、ブタおよびウシ病原からのＴｂｐＢ  Ｎ−ローブで観察され、より少ない程度にインタクトＴｂｐＢでも観察された。これらのタンパク質が、配列において全く異なることから（全体的配列同一性が３０％未満）、これが特異的タンパク質に特有の性質ではなく、ランダムでない結合が固相結合アッセイに影響を及ぼす程度が様々になり得ることが示される。
【０１５９】
この欠陥を克服するために、本発明者らは、細胞質中でのタンパク質発現の間にＮ末端に酵素的に付加されたビオチン残基により、ストレプトアビジン・コーティングＥＬＩＳＡプレートに組換えタンパク質を結合する方法を考案した。図５に示された通り、酵素的にビオチン化されたＮ末端ペプチドの付加は、ＴｂｐＢ  Ｎ−ローブがトランスフェリンに結合する能力を回復させた。このアプローチは、図の左および右側のＭｂｐに融合されたＴｂｐＢ  Ｎ−ローブによる結果の比較が示す通り、トランスフェリン結合領域を暴露するとより効率的になり得る。標的タンパク質上のエピトープ全てへの完全かつ均等な接近を確実にし、これにより交差反応性の程度を評価する際の真の比較を提供するため、この新しくかつ奇抜なＥＬＩＳＡアッセイ形式を、抗体反応性をモニタリングするためのＥＬＩＳＡアッセイ全てに用いた。
【０１６０】
免疫実験のための組換え抗原を、Ｎ末端ポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質およびタバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位をコードする慣用的Ｔ７発現ベクターを用いて大腸菌の細胞質で産生させた。組換え融合タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーにより単離し、該抗原を（ＴＥＶ）切断により遊離させて、Ｎｉ−ＮＴＡとＱ−セファロースクロマトグラフィーとの組み合わせにより精製した。
【０１６１】
ＦＶＢマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  ＲｉｖｅｒのアルビノＭＨＣハプロタイプＨ２ｑ）、３ヶ月齢ニュージーランド白ウサギおよび５１日齢ラージホワイトランドレースＦ１交雑ブタを、図３Ａの免疫化実験に用いた。精製された組換えタンパク質を、リン酸緩衝生理食塩水、および３３％（図３Ａ）または２０％（図３Ｂ、図３Ｃ）のいずれかのＥｍｕｌｓｉｇｅｎ  Ｄ（ＭＶＰ  Ｔｅｃｈｏｌｏｇｉｅｓ）と混合して、マウスでは０．１ｍｌ中２５μｇ、ウサギでは０．５ｍｌ中５０μｇ、ブタでは２ｍｌ中１００μｇの最終濃度にした。３種の注射液を、マウスおよびウサギには皮下投与し、ブタには皮下（図３Ａ）または筋肉内（図３Ｂ、図３Ｃ）投与した。動物を０、２１、４２日目に免疫化し、最後の血液を５６日目に採取した。
【０１６２】
８週目に採取された血清を、慣用的な固相ＥＬＩＳＡアッセイで代表的なタンパク質に対してテストした。ＥＬＩＳＡアッセイに用いられた組換え融合タンパク質は、Ｎ末端最適化ビオチン化配列、ポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質およびタバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位をコードする慣用的Ｔ７発現ベクターを使用して、大腸菌の細胞質で産生させた。これらのタンパク質を、Ｎ末端ビオチン化配列でインビボでビオチン化することで、それらをストレプトアビジン・コーティングＥＬＩＳＡプレートに塗布することができた。
【０１６３】
ビオチン化融合タンパク質用の発現ベクターを用いた小規模での一夜タンパク質発現実験からの粗抽出物は、これまでの最適化実験に基づくＥＬＩＳＡプレートを飽和させるのに十分であった。該当する抗血清の希釈物を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＴ）中の２．５％脱脂乳中で調製して、プレートに室温で１時間塗布した。除去および洗浄後に、一次抗体を、１：１００，０００（抗ブタでは１：２５，０００）希釈のＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス、抗ウサギまたは抗ブタＩｇＧにより、室温で１時間検出した。力価は、Ａ４５０が０．３を超える（血清を添加していないバックグランドのウェルの測定値の平均+３ＳＤよりも大きな）最後の希釈の逆数として表している。
【０１６４】
ＳＥＭ誤差の計算は、ＡＮＯＶＡおよび事後比較として実施されたテューキーＨＳＤ（ｈｏｎｅｓｔ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）検定により実施した。統計計算から、血清全てで、Ｈ４９がＨ８７と有意に異なること、およびＮローブがＣローブまたはＮ＋Ｃローブと有意に異なることを示した。図３Ｃに示された星は、Ｈ４９に対してテストされたＣローブまたはＮ＋Ｃローブと有意に異なる特異的免疫化／タンパク質対を表している。
【０１６５】
実施例２  −  ブタ病原ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブの三量体の生成
この実施例で本発明者らは、３つのブタ病原に存在するＴｂｐＢの広い多様性を表す３つの組換えＣ−ローブを互いに連結させて、抗原性を保持し得ることを実証する。本明細書で用いられた、改変Ｃ−ローブは、Ａ．プルロニューモニエ、Ａ．スイスおよびヘモフィルス・パラスイスから得られたものである（図４）。したがってＡ．プルロニューモニエＨ４９株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：６）、Ａ．スイスＨ５７株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３５）およびＡ．プルロニューモニエＨ８７株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２２）からのＴｂｐＢ  Ｃ−ローブをコードする遺伝子を連結させて、３つのＣ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：４０）を含む単一ポリペプチドをコードする遺伝子を形成させた（図６のパネルＡ）。このＣ−ローブ三量体中のＣ−ローブ（下線で示す）の二次構造要素に接続する相対的に短いペプチドがある。連結するペプチドは、個々のＣ−ローブドメインからの真のローブ間配列（ｉｎｔｅｒｌｏｂｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）からなる。図６のパネルＢは、Ｃ−ローブ三量体の生成を示しており、それをヒト病原Ｎ．メニンギティディスＭ９８２株からの組換えＴｂｐＢ  Ｎ−ローブおよびＣ−ローブの調製と比較している。結果から、Ｃ−ローブ三量体が良好な量で生成され、安定していることが示される。しかし図６に示された調製は、免疫化実験に用いる前に更なる精製を必要とする。
【０１６６】
安定したＣ−ローブ三量体の生成には大きな障害がなかったため、免疫実験のためにＣ−ローブ三量体を生成および精製し、それが免疫原性を保持しているかどうかを決定した。図７に示された通り、Ｃ−ローブ三量体は、３つの代表的ＴｂｐＢに対して免疫応答を誘導することができ、３つの個々のＣ−ローブを互いに連結させることにより免疫特性が実質的に改変されないことが示された。同じく結果から、単一タンパク質抗原が免疫応答を誘導して、ブタ病原であるプルロニューモニエ、Ａ．スイスおよびヘモフィルス・パラスイスの全てではないがほとんどの菌株と反応することが可能であり、広範囲の交差防御性ブタワクチンの開発への潜在的有望性を示すことが示唆される。
【０１６７】
実施例３  −  Ａ．プルロニューモニエＴｂｐＢのＮ−ローブにおけるループ領域の減少
この実施例では、交差反応性免疫応答の誘導への影響を測定するために、ブタ病原の３つの代表的なＴｂｐＢからのＮ−ローブドメインのループ領域を修飾した。３つの代表的ＴｂｐＢは、Ａ．スイスＨ５７株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２８）、Ａ．プルロニューモニエＨ８７株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２）およびＡ．プルロニューモニエＨ４９株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２）のものであった。配列多様性を表すことに加え、利用できる高解像度の構造データがあったため、これらの特定のＴｂｐＢを選択した；Ａ．スイスＨ５７株（３ＰＱＵ．ｐｄｂ）、Ａ．プルロニューモニエＨ８７株（３ＰＱＳ．ｐｄｂ）およびＡ．プルロニューモニエＨ４９株（３ＨＯＬ．ｐｄｂ）。ループ減少の工程は、Ａ．スイスＨ５７株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３６、３８）からのＴｂｐＢ  Ｎ−ローブの７４アミノ酸（２９７〜２２４）、Ａ．プルロニューモニエＨ８７株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２４、２６）からのＴｂｐＢ  Ｎ−ローブの４５アミノ酸（２４８〜２０３）およびＡ．プルロニューモニエＨ４９株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：８、１０）のＴｂｐＢ  Ｎ−ローブの２７アミノ酸（２７４〜２４７）という全体的欠失をもたらした。Ａ．プルロニューモニエＨ４９株のループ減少の設計は、例示目的で以下により詳細に記載される。
【０１６８】
ループ減少を設計するために、Ｈ４９株（３ＨＯＬ．ｐｄｂ）からのＴｂｐＢの構造を、Ｈ８７株（３ＰＱＳ．ｐｄｂ）からのＴｂｐＢの構造と重ね合わせ、ブタ病原からの代表的ＴｂｐＢの組み合わせから多重配列アライメントを同時に視覚化した。変異の構造および領域を検査することにより、Ｎ−ローブの全体的構造を撹乱（ｐｅｒｔｕｒｂ）しないと予測された潜在的ループ減少のための複数のエリアを同定した。これらは、標準的命名法によるループ１、５、８ａ、８ｃおよび１２（図２）を含み、図８にＴｂｐＢ  Ｎ−ローブの側面図（パネルＡ）および上面図（パネルＢ）の構造モデルで示されている。ループ減少は、アミノ酸の除去に加えて必要に応じて適切なアミノ酸置換を選択することにより、Ｎ−ローブの全体的フォールディングおよび構造への潜在的撹乱を最小限にするように設計された。本来のＮ−ローブの（上の配列）および修飾Ｎ−ローブ（下の配列）のアミノ酸配列を、図８のパネルＣの配列アライメントに示し、ここではループ領域を灰色で強調し、灰色のフォントで標識している。パネルＣに示されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を、大腸菌株における発現について最適化し、その後、合成した。
【０１６９】
Ａ．プルロニューモニエＨ８７株およびＡ．スイスＨ５７株からのＴｂｐＢ  Ｎ−ローブは、ブタ病原からのＴｂｐＢの相当な量の配列および構造多様性を表し（図４）、関連の構造を入手できるため（３ＰＱＳ．ｐｄｂおよび３ＰＱＵ．ｐｄｂ）、それらの株のＴｂｐＢ  Ｎ−ローブについてのループ減少を生成するために、類似の方策を採用した（１２）。全てではないがほとんどの臨床単離物のＮ−ローブ領域に対して交差反応性の応答を集団的に誘導することができた改変された抗原を産生する能力は、３つのブタ病原をターゲットにするワクチンの有効性を増大するための少なからぬ能力を有するであろう。
【０１７０】
得られた遺伝子を、クローニングされたＮ−ローブのコード配列の前で、Ｎ末端ポリヒスチジン領域、マルトース結合タンパク質およびＴＥＶ（タバコエッチ病ウイルス）切断部位をコードする慣用的発現ベクターにクローニングした。Ａ．プルロニューモニエＨ４９からのＴｂｐＢ  Ｎ−ローブの改変バージョンの発現プラスミドを、ｌａｃＺプロモータの下流に挿入されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含む大腸菌発現株ＥＲ２５６中に形質転換した。ｌａｃプロモータのグルコース抑制およびラクトース導入を利用する自動誘導培地（５５）を使用して、小規模な発現分析を実施した。したがって、培地中へのグルコース対ラクトースの特異的比率を利用することにより、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの発現を、生育の対数増殖期中期（ｍｉｄ−ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ）に最適に開始させる。ビードビーターを用いて細胞を一夜生育させた後に溶解して、組換えタンパク質をＮｉ−ＮＴＡ樹脂またはブタＴｆ−セファロース樹脂のいずれかで捕捉して洗浄し、結合したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液に溶出させた。
【０１７１】
図９に示される通り、Ａ．プルロニューモニエＨ４９株、Ａ．スイスＨ５７株またはＡ．プルロニューモニエＨ８７株からのＴｂｐＢ  Ｎ−ローブのループ減少は、安定したタンパク質の生成をもたらし、つまりＮ−ローブの全体的フォールディングを妨害せず、免疫化に適した材料を提供した。上のパネルは、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂で捕捉された小規模発現実験で生成された組換えタンパク質を、対照としての野生型インタクトＴｂｐＢおよびＴｂｐＢ  Ｎ−ローブと共に示している。結果から、変異体タンパク質が、野生型タンパク質とは異なりブタトランスフェリン（Ｔｆ）に実質的に結合できなくなったことが示される。したがって中のパネルにおいて、改変Ｎ−ローブは、ブタＴｆ−セファロースにより捕捉されなかった。下のパネルでは、上のパネルに示された材料を、ＨＲＰコンジュゲート化ブタトランスフェリンを使用した固相結合アッセイに用いたが、改変Ｎ−ローブは、対照と異なり結合活性を示さなかった。本発明者らは、ネイティブ宿主であるブタでこれらのタンパク質の免疫原性が増大するであろうと予測している。したがってこの実施例は、ＴｂｐＢタンパク質のＮ−ローブにおける抗原的に可変性の領域を除去するための方策が実現可能で、そのような除去が免疫原性の増大をもたらし得ることを示している。
【０１７２】
実施例４  −  Ｎ．メニンギティディスＴｂｐＢのＣ−ローブの交差反応性
この実施例は、本開示によるヒト病原ナイセリア・メニンギティディスからのＴｂｐＢの改変誘導体の使用を示している。最初のステップとして、本発明者らは、Ｎ．メニンギティディスからのＴｂｐＢの多様性を検査して、本発明者らが交差反応性の評価のためのＴｂｐＢの代表的組み合わせを有することを確実にした。図１０は、長期間かけて地球規模で回収されたＮ．メニンギティディスの菌株中のＴｂｐＢ、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｉｓｏｌａｔｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＢＩＧＳＤＢ  ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｍｌｓｔ．ｏｒｇ／ｎｅｉｓｅｒｉａ／）（５６）（４１）からのさらなる配列の全体的多様性を示している。図１０Ａの矢印、両矢印、または線で示された菌株のＴｂｐＢの代表的組み合わせの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２３；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３２〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１４７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７７；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７８）をこの適用に含めて、各群の配列多様性を定義している。Ｎ．メニンギティディスＴｂｐＢには４つの主要な系統群が存在した。群１は、アイソタイプＩ  ＴｂｐＢを有する菌株を含む。アイソタイプＩ  ＴｂｐＢは、特徴としてアイソタイプＩＩ  ＴｂｐＢ（８０〜８５ｋＤａ）に比較して小さなＴｂｐＢ（およそ６５〜７０ｋＤａ）を有する。多重配列アライメントによる配列の比較から、サイズの差が、アイソタイプＩＩ  ＴｂｐＢでＣ−ローブがより大きいことに起因することが明らかとなった。アイソタイプＩＩ  ＴｂｐＢを、３つの主要な系統群（群２〜群４、図１０Ａ）にクラスタ化した。
【０１７３】
ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブの配列多様性を示す系統樹（図１０Ｂ）は、Ｃ−ローブ配列が２つのＴｂｐＢアイソタイプの同定を大きく左右する結論を裏づけている。図１０Ａにおける群２の構成員は、互いにＣ−ローブ系統樹にクラスタ化せず、図１０Ｂの系統樹全体に分布しており、群２がＮ−ローブ配列により大きく定義されたことを示している。これは、免疫学的交差反応が、Ｃ−ローブに対する反応性により決定されることになれば、群２の特定の標本が必要とならないことを示している。これに対して、全体的なＴｂｐＢ多様性を表すためにＴｂｐＢ配列の組み合わせを同定するのに用いられた矢印および線は、全体的Ｃ−ローブ多様性を十分に表しておらず、したがって２つのさらなる菌株が、Ｃ−ローブ多様性のより包括的な表現を提供するために選択された。矢印、両矢印または線により同定された菌株からのＣ−ローブ配列をこの適用に含めて、配列多様性の代表的標本を提供した（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：  ９３；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１４７〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６３）。
【０１７４】
Ｎ．メニンギティディスからのＴｂｐＢをターゲットにするワクチンが、Ｎ．ゴノレアに対する免疫応答を誘導し得るかという問題に取り組むために、本発明者らは、Ｎ．ゴノレアからのＴｂｐＢおよびＴｂｐＢ  Ｃ−ローブの配列多様性の分析を実施した。Ｎ．メニンギティディス試験からの代表的なＴｂｐＢおよびＴｂｐＢ  Ｃ−ローブの配列（図１０；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１９；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２５；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７９〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１９５；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２３；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３２〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１４７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７７；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７８）が、分析に含まれた。図２６Ａに示された通り、Ｎ．ゴノレアＴｂｐＢは、アイソタイプ２ＴｂｐＢに最も密接に関連し、Ｎ．メニンギティディス・アイソタイプ２クラスタ内の２つの亜群を形成している。このことは、組換えＴｂｐＢの部位特異的変異体を好ましいワクチン抗原として用いる方策により、主としてメニンゴコッカスＴｂｐＢ由来の抗原と、広い交差防御を実現する可能性があることを示唆している。図２６Ｂは、Ｎ．ゴノレアＴｂｐＢ  Ｃ−ローブが、インタクトＴｂｐＢの状況とは異なり、Ｎ．メニンギティディスＣ−ローブからの異なる亜群であることを示している。したがってＣ−ローブを用いて広い交差防御をもたらす方策では、Ｎ．ゴノレア株からのＣ−ローブが必要となろう。
【０１７５】
切断されたＴｂｐＢおよびＴｂｐＢ  Ｃ−ローブが交差反応性抗体反応を誘導する能力を比較するために、Ｎ．メニンギティディスＢ１６Ｂ６株（図１０の黒色矢印により標識）由来の組換え切断ＴｂｐＢおよびＴｂｐＢ  Ｃ−ローブを、免疫分析用に選択した。Ｂ１６Ｂ６株からの組換え切断ＴｂｐＢおよびＴｂｐＢ  Ｃ−ローブを用いてウサギを免疫化し、新規なＥＬＩＳＡを用いて血清を交差反応性についてテストした（図５）。本出願に含まれるＣ−ローブの配列の多くは、Ｎ−ローブ上のバレルドメインの最後のβ鎖の終了直後から開始し、したがってＮ−ローブとＣ−ローブの間にリンカー領域を含む、と認識することが重要である（図２のＬ１５）。したがって免疫実験のために、安定していて機能的なＣ−ローブを、Ｌ１５領域（Ｂ１６Ｂ６  Ｃ−ローブにおける１４のアミノ酸）を除去するＮ末端切断により調製することが可能であろう。
【０１７６】
系統樹全体に分布した菌株由来のＴｂｐＢの代表的組み合わせ（図１０の黒色および灰色の矢印）を、血清の交差反応性を評価するために選択した。２つの両矢印により示された２つのさらなるＴｂｐＢが、より完全な範囲を提供するために分析に含める予定であったが、分析の際に利用できなかった。
【０１７７】
該タンパク質を、Ｎ末端ビオチン化配列を有する本発明者らの慣用的発現ベクター内で発現させ、ストレプトアビジン・コーティングＥＬＩＳＡプレートに塗布した。Ｂ１６Ｂ６株由来の改変Ｃ−ローブおよび切断ＴｂｐＢで免疫化されたウサギの血清を、ＴｂｐＢ変異体のパネルを認識する能力についてテストした。切断ＴｂｐＢに対する抗血清は、抗Ｃ−ローブ抗血清よりも同種ＴｂｐＢ（Ｂ１６Ｂ６）に対して高い力価を有し、異種菌株（Ｈ４４／７６）の１つからのＴｂｐＢに対してわずかに高いか、または同等の力価を有した。しかし、該抗Ｃ−ローブ抗血清は、その抗ＴｂｐＢ抗血清よりも、他の異種菌株全てからのＴｂｐＢに対して高い抗体力価を有した。したがって該Ｃ−ローブは、インタクトＴｂｐＢよりも交差反応性抗体を誘導する能力が優れている。
【０１７８】
この免疫化実験では、組換え抗原を先に記載された通り生成し、２０％Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ  Ｄ（ＶＳＡ）アジュバント中の精製抗原５０μｇを用いてウサギ（ニュージーランド白ウサギ、３ヶ月齢、雌）の後脚領域に皮下投与で免疫化するために用いた。０、３および６週目にウサギを免疫化した。
【０１７９】
８週目に採取された血清を、本発明者らの慣用的固相ＥＬＩＳＡプレートで代表的タンパク質に対しテストした。ＥＬＩＳＡアッセイで用いられる組換え誘導タンパク質は、先に記載された通り生成させた。慣用的ＥＬＩＳＡアッセイでテストされた組換えタンパク質は、Ｎ．メニンギティディスの菌株：（ｉ）Ｂ１６Ｂ６（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１７）、（ｉｉ）Ｈ４４／７６（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３３）、（ｉｉｉ）Ｓ３１３１（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３２）、（ｉｖ）Ｍ９９０（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３４）、（ｖ）Ｍ９７８  （ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３５）、（ｖｉ）Ｍ９９２（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３８）、（ｖｉｉ）Ｐ３００６（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３９）、（ｖｉｉｉ）１２０Ｍ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３７）、（ｉｘ）ＭＣ５８（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３６）および（ｘ）Ｍ９８２（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２３）からのインタクトＴｂｐＢの切断されたバージョン（最初の１９〜３６アミノ酸を欠失）であった。
【０１８０】
ビオチン化融合タンパク質の実験ベクターを用いた小規模での一夜タンパク質発現実験からの粗抽出物は、過去の最適化実験に基づくＥＬＩＳＡプレートを飽和させるのに十分であった。該当する抗血清の希釈物を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＴ）中の２．５％脱脂乳中に調製して、該プレートに室温で１時間適用した。一次抗体を、１：１００，０００希釈でＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ウサギＩｇＧにより室温で１時間検出し、力価をＡ４５０＞０．３となる最終希釈の逆数として表している。
【０１８１】
実施例５  −  Ｎ．メニンギティディスＴｂｐＢ  Ｃ−ローブの二量体の生成
図１１の結果から、ヒト病原Ｎ．メニンギティディスからのＴｂｐＢ  Ｃ−ローブドメインが、インタクトＴｂｐＢに比較して高い交差反応性を誘導し得ることが示される。この例において、本発明者らは、安定していて免疫原性がある２つのＣ−ローブを含む単一ポリペプチドを作製することが可能であることを実証する。この２つのＣ−ローブは、ＴｂｐＢの２つのアイソタイプを表す抗原的に異なる菌株ＴｂｐＢ  Ｂ１６Ｂ６株およびＭ９８２株のものである（図１０）。図１２のパネルＡは、実施例４に記載された免疫化実験で用いられた２つの代表的なＴｂｐＢ  Ｃ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５０）をコードするために構築された単一遺伝子を示している。図１２のパネルＢは、個々の構成員ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブの調製物に比較した、Ｃ−ローブ二量体の生成を示している。相対的に安定していると思われるＣ−ローブ二量体は合理的レベルで生成されるが、免疫化実験で使用する前にさらに精製する必要があろう。
【０１８２】
図１３は、Ｎ．メニンギティディスＭ９８２株およびＢ１６Ｂ６株からのＴｂｐＢ  Ｃ−ローブからなる二量体が、両方の種からのインタクトＴｂｐＢへの効果的免疫応答を誘導し得ることを示している。
【０１８３】
実施例６  −  Ｎ．メニンギティディスのＣ−ローブからのループ領域の減少
この実施例で本発明者らは、Ｎ．メニンギティディスのＣ−ローブからのループ領域を実質的に減少させ得ることを実証している。そのような減少は、他の抗原または他の病原からのエピトープを提示するための簡便な「スカフォールド」として用いられ得、さらに所望の免疫特性を提示し得る、大きなループ領域を欠如した誘導体を提供する上で有用である。
【０１８４】
この実施例では、Ｎ．メニンギティディスＭ９８２株のＣ−ローブドメインのループ領域を、大きなフレキシブルループ領域から合計で８２アミノ酸除去するように修飾している。ネイティブＣ−ローブ、および大きなフレキシブルループの４つが実質的に減少した改変Ｃ−ローブの構造モデルを、図１４のパネルＡに示している。減少のターゲットとなった４つのループは、タンパク質の結晶構造に解像されなかったことから（３ＶＥ２、ｐｄｂ）、ループのコンフォメーションに変異があることが示され、そのためパネルＡの左側のモデルで破線で表されている。
【０１８５】
選択されたＣ−ローブ配列アライメントにおける配列可変性を評価しながら、ループ除去のための方策を詳細な構造（３ＶＥ２、ｐｄｂ）の検査により開発した。しかし、構造を潜在的に破壊することなくループ間の最も効果的な架橋を提供することが、架橋したアミノ酸を選択するための第一の基準であった。ネイティブＣ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２５）、それぞれがターゲットのループを欠く改変誘導体、および４つのループ全てが除去された「ループレス」Ｃ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２９）の配列アライメントを、図１４のパネルＢに示している。
【０１８６】
オーバーラップエクステンションアプローチ（ＳＯＥｉｎｇ）（５７）によるスプライシングを利用して、個々のループ欠失および４つのループ全てが除去された「ループレス」Ｃ−ローブをコードする遺伝子を調製した。ＳＯＥｉｎｇアプローチは、Ｎ．メニンギティディスＭ９８２からの組換えＣ−ローブの生成に用いられる発現プラスミドで実施することで、得られた改変タンパク質の安定性を即座に評価することができた。該ベクターは、ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブをコードする挿入遺伝子の前で、Ｎ末端ポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質をコードする遺伝子、およびＴＥＶ（タバコエッチ病ウイルス）切断部位をコードしている。該発現プラスミドは、ｌａｃＺ遺伝子に挿入されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含む大腸菌ＥＲ２５６６株内に形質転換され、したがってｌａｃプロモータの制御下にある。自動誘導培地（５５）を利用して、小規模な発現分析を実施した。細胞を一夜生育後に回収および溶解して、遠心分離後の上清画分をＮｉ−ＮＴＡ樹脂にアプライし、洗浄して、結合したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液に溶出した。
【０１８７】
図１５に示された通り、ループ１８、ループ２１、ループ２３またはループ２７の実質的な減少を含む組換えＣ−ローブの収率は、ネイティブＣ−ローブタンパク質（ＷＴ）に匹敵し、個々のループの除去がタンパク質安定性に悪影響を及ぼさなかったことが示される。図１５はまた、４ループ全ての８１アミノ酸除去がタンパク質の生成レベルに影響を及ぼさなかったことを示しており、４ループ全ての除去がＣ−ローブの全体的フォールディングを妨害しないことが示された。「ループレス」Ｃ−ローブが即座に生成され、良好な量で精製されたこと、およびその結晶構造が精製「ループレス」Ｃ−ローブから得られたことを述べることが重要である。このことから、改変された抗原が実質的に安定した形態で、商業的適用に適した生成レベルで即座に生成され得ることが示される。したがってこの実施例は、抗原的に可変性のある領域を除去するための方策が実現可能であることだけでなく、コア構造のフォールディングがループのサイズおよび性質の変異に影響を及ぼされないことから、得られたタンパク質がスカフォールドを提示するエピトープとして適し得ることも示している。
【０１８８】
最後に、図１６に示された通り、「ループレス」Ｃ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２９、最後の２つの棒）は、免疫原性があり、インタクト（ネイティブ）ＴｂｐＢ抗原（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２３）に対する強い抗体反応を誘導することが可能である。この図は、ループレスＣ−ローブが、本来のＴｂｐＢ  Ｃ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２５）抗原よりもマウスにおいてＮ．メニンギティディスＭ９８２株からのＴｂｐＢに対して高い抗体力価を実際に誘導したことを示している（図の３番目の棒と１番目の棒を比較）。驚いたのは、「ループレス」Ｃ−ローブが、配列が極めて多様であるという事実にもかかわらず（図１０）、Ｂ１６Ｂ６株のネイティブＴｂｐＢ  Ｃ−ローブと同等の、Ｂ１６Ｂ６株からの異種ＴｂｐＢに対する抗体レベルを誘発した、という観察である。図１６の２番目の棒と４番目の棒を比較すると、これらの２種のタンパク質がＢ１６Ｂ６株からのインタクトＴｂｐＢに対して同等の抗体レベルを誘導することが示される。
【０１８９】
これら実験では、ＦｖＢ雌マウスを、０、２１および４２日目に２０％Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ  Ｄを含む精製タンパク質抗原２５μｇで免疫化し、５６日目に採取された血清で慣用的ＥＬＩＳＡアッセイを利用してエンドポイント力価を評価した。Ｂ１６Ｂ６  ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブ、Ｍ９８２  ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブ、または修飾Ｍ９８２  ＴｂｐＢ（「ループレス」）を用いて、４匹のマウスそれぞれを免疫化した。エンドポイント力価を、ビオチン化されたインタクトＭ９８２またはＢ１６Ｂ６  ＴｂｐＢタンパク質に対して評価した。力価は、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｈ＋Ｌペルオキシダーゼコンジュゲート化抗体の１：１００，０００で測定した。エンドポイント力価は、陽性シグナルが信頼性を持って検出され得た最後の希釈の逆数として決定した。各血清は三重測定され、結果は処置された全てのマウスの平均±ＳＥＭとして示されている。
【０１９０】
実施例７  −  ＴｂｐＢの改変Ｃ−ローブへのＴｂｐＡの一部の挿入
この実施例では、内在性外膜タンパク質トランスフェリン結合タンパク質Ａ（ＴｂｐＡ）の細胞外表面ループのＤＮＡコードセグメントを、Ｎ．メニンギティディスＭ９８２株からの修飾または「ループレス」ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブをコードする遺伝子にスプライシングして、様々なハイブリッドＴｂｐＡ−ＴｂｐＢタンパク質をコードする遺伝子を得た。ＴｂｐＡの選択された領域をＴｂｐＢ  Ｃ−ローブスカフォールドにスプライシングした理由は、それがインタクトＴｂｐＡタンパク質よりも効率的な生成手段を提供すること、および抗体の誘導のためにＴｂｐＡの表面領域を特異的に標的化する能力を提供することである。
【０１９１】
実施例６で調製されたＴｂｐＢポリペプチド（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：９７）の修飾されたＣ−ローブをコードする遺伝子を、出発点として用いた（さらに、図１４のパネルＡ（中のモデル）を参照）。ＴｂｐＡの異なる表面ループからのＤＮＡコードセグメント（図１７のパネルＡ）を、より大きなループがＴｂｐＢ  Ｃ−ローブポリペプチドから除去された部位（図１７のパネルＢ）にスプライシングした。ＴｂｐＡのβバレル細胞外ループ３、１０、および１１からの部分（５８）（パネルＡの黒い部分および標識された領域）を、改変ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブの修飾ループ領域１８、１２および２３（パネルＢ）に挿入した。同様に、ＴｂｐＡトランスフェリン構造（プラグループ、パネルＡ）内のヒトトランスフェリンのＣ１〜Ｃ２ドメインの挿入部を、修飾ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブの修飾ループ２７に挿入した。
【０１９２】
ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブ上でのＴｂｐＡループの組立てを、オーバーラップエクステンションアプローチ（ＳＯＥｉｎｇ）によるスプライシングを利用して実施した（５７）。ＳＯＥｉｎｇアプローチを、Ｎ．メニンギティディスＭ９８２からの組換えＣ−ローブの生成に用いられる発現プラスミドで実施することで、得られた改変タンパク質の安定性を即座に評価することができた。該ベクターは、ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブをコードする挿入遺伝子の前で、Ｎ末端ポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質をコードする遺伝子、およびＴＥＶ（タバコエッチ病ウイルス）切断部位をコードしている。発現プラスミドは、ｌａｃＺ遺伝子に挿入されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含む大腸菌ＥＲ２５６６株内に形質転換され、したがってｌａｃプロモータの制御下にある。自動誘導培地（５５）を利用して、小規模な発現分析を実施した。細胞を一夜生育後に回収および溶解して、遠心分離後の上清画分をＮｉ−ＮＴＡ樹脂にアプライし、洗浄して、結合したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液に溶出した。
【０１９３】
図１８のパネルＡに示された通り、修飾ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブのループへの外来ＴｂｐＡセグメント挿入は、安定した組換えタンパク質の生成をもたらした。図１８のパネルＡに示された組換えタンパク質は、Ｎ末端ポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質融合パートナー、およびＴＥＶ（タバコエッチ病ウイルス）プロテアーゼ切断部位を含んでいた。図１８のパネルＢから、ＴＥＶプロテアーゼでの切断による、組換えタンパク質融合パートナーからの野生型および変異体Ｃ−ローブの放出が示される。結果から、外来タンパク質セグメントの挿入が、改変Ｃ−ローブの安定性に実質的に影響しなかったことが実証され、その外来セグメントがＣ−ローブのコア構造要素の正常なフォールディングを妨害しないことが示唆される。これらの結果から示唆されることは、該Ｃ−ローブが、様々な抗原および抗原変異体からのエピトープの提示に最終的に用いられ得る外来エピトープの提示のための安定していて多目的のタンパク質スカフォールドになると思われ、広範な交差防御性がある免疫応答を生成する能力のある改変された抗原を作製するためのさらなる方策が提供される、ということである。
【０１９４】
最後に、図１９に示された通り、大きなループが減少または除去された領域にスプライシングされたＴｂｐＡの領域を含む修飾ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブは、免疫原性がある。この図から、ハイブリッドＴｂｐＡ−ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブタンパク質が親修飾（「ループレス」）Ｃ−ローブと等しいか、またはそれよりも高い抗体力価を誘導したことが示される。注目すべきこととして、ＴｂｐＡからのループ１０およびループ１１の領域を提示するタンパク質が、最高の力価を有した（図１９の２番目および３番目の棒）。
【０１９５】
この実験では、ＦｖＢ雌マウスを、０、２１および４２日目に２０％Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ  Ｄを含む精製タンパク質抗原２５μｇで免疫化し、５６日目に採取された血清で慣用的ＥＬＩＳＡアッセイを利用してエンドポイント力価を評価した。マウス３匹を、４つのループ全てが除去された「ループレス」Ｃ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：９７）で免疫化した。５匹を、４種の他のハイブリッド抗原：（ｉ）ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブループ２１に挿入されたＴｂｐＡループ１０を有する「ループレス」Ｃ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５４）、（ｉｉ）ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブループ２３に挿入されたＴｂｐＡループ１１を有する「ループレス」Ｃ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５６）、（ｉｉｉ）ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブループ２７に挿入されたＴｂｐＡループ３へリックスを有する「ループレス」Ｃ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５８）、または（ｉｖ）ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブループ１８に挿入されたＴｂｐＡプラグループを有する「ループレス」Ｃ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６０）のそれぞれでの免疫化に用いた。血清を、挿入されたＴｂｐＡループ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３１）の４つ全てを提示する修飾Ｍ９８２  Ｃ−ローブのビオチン化組換え形態に対してテストした。力価は、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｈ＋Ｌペルオキシダーゼコンジュゲート化抗体の１：１００，０００で測定した。エンドポイント力価は、陽性シグナルが信頼性を持って検出され得た最後の希釈の逆数として決定した。各血清は三重測定され、結果は処置された全てのマウスの平均±ＳＥＭとして示されている。
【０１９６】
実施例８  −  ＴｂｐＢの修飾されたＣ−ローブへのＬｂｐＡの一部の挿入
この実施例では、ＭＣ５８株からの内在性外膜タンパク質ラクトフェリン結合タンパク質Ａ（ＬｂｐＡ）の細胞外表面ループのセグメント（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６２）を、実施例６に記載されたＮ．メニンギティディスＭ９８２株（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２９）からの修飾ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブにスプライシングした。ＬｂｐＡの選択された領域をＴｂｐＢ  Ｃ−ローブスカフォールドにスプライシングした理由は、それがインタクトＬｂｐＡタンパク質よりも効率的な生成手段を提供すること、および抗体の誘導のためにＬｂｐＡの表面領域を特異的に標的化する能力を提供することである。本発明者らは、実施例７と併せて、ハイブリッドタンパク質の作製が、どのようにしてＮ．メニンギティディスの表面に存在する３種の異なるタンパク質に対する免疫応答を誘導する機会を提供し得るか、を示して、重要な標的タンパク質の抗原変異体がワクチン抗原に対して生成された免疫応答の影響を回避し得る潜在的「ワクチンエスケープ」に対して、より大きなバリアを提供することができた。
【０１９７】
ＬｂｐＡに関して入手できる構造が存在しなかったため、最も適切なモデルを実現する試みとして、３つのウェブによるタンパク質予測サーバ：ＳＷＩＳＳ  ＭＯＤＥＬ、Ｉ−ＴＡＳＳＥＲ、およびＰＨＹＲＥ２を利用して、ＬｂｐＡの構造モデリングを実施した。最初に、ＢＬＡＳＴサーチを実施して、既知のＴｂｐＡ構造（５８）を用いたモデリングに最も適したＬｂｐＡを見出し、ＭＣ５８株からのＬｂｐＡ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１３０）が最も適切であることを明らかにした。ＭＣ５８  ＬｂｐＡとＫ４５４  ＴｂｐＡとのアライメントを、ＣｌｕｓｔａｌＷにより生成し、ＳＷＩＳＳ  ＭＯＤＥＬでのアライメントモードの入力情報とした。ＰＨＹＲＥ２では、Ｋ４５４  ＴｂｐＡ構造のＰＤＢ  ＩＤおよびＭＣ５８  ＬｂｐＡのＦＡＳＴＡ配列を、それぞれテンプレートおよびターゲットとして供した。ＭＣ５８  ＬｂｐＡのＦＡＳＴＡ配列だけは、Ｉ−ＴＡＳＳＥＲに供した。平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）を用いて、Ｐｙｍｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ／）にそれらを重ね合わせた後、テンプレート構造で作成された異なるモデルの類似性を評価した。ＰＨＹＲＥ２により作成されたＬｂｐＡモデルを、最も適切なモデルとして選択して、ハイブリッドまたはキメラタンパク質（図２０、パネルＡ）を作製するためのループ領域を選択するために用いた。
【０１９８】
実施例６で調製されたＴｂｐＢポリペプチドの「ループレス」Ｃ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２９）を、出発点として用いた。ＬｂｐＡ細胞外ループ３およびループ２からのＤＮＡコード領域を、改変ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブのループ１８に隣接するβ鎖をコードするＤＮＡと、ループ２１に隣接するβ鎖をコードするＤＮＡの間に挿入した（図２０、パネルＢ）。ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブ内のループ領域および挿入のためのＬｂｐＡの対応するループを、Ｐｙｍｏｌを用いて距離について分析して、ＬｂｐＡ置換ループがループにより予測される距離パラメータ内でフィットするような構造を確実に作製した。ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブ上でのＬｂｐＡループの組立ては、実施例６および７と同様にＳＯＥ  ＰＣＲを利用して実施され、配列解析でループレスＭ９８２  ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブ内のＭＣ５８  ＬｂｐＡへリックス３およびループ２の挿入を確認した。ハイブリッドタンパク質の設計には、Ｍ９８２  Ｃ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６６）への、ＬｂｐＡへリックス３領域から１５アミノ酸（タンパク質配列：３８３−ＹＧＴＤＥＡＥＫＦＲＤＫＳＧＶ）の挿入、およびＭ９８２  Ｃ−ローブ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６４）のループ２１領域への、ＬｂｐＡ  ループ２領域から１１アミノ酸（タンパク質配列：ＬＮＲＷＶＫＥＲＩＥＱＬ）の挿入が含まれた（図２０＞、パネルＢ）。
【０１９９】
組換えプラスミドの形質転換および予備的発現試験の実施の方法は、実施例７に記載された通りである。予備的スクリーニングから、組換えタンパク質の収率が高く（図２０のパネルＢ、左下）、スカフォールドとして使用されたネイティブＣ−ローブまたはループレスＣ−ローブの結果と同等か、またはそれよりも良好である（図示しない）ことが実証された。明らかなこととして、その結果はさらに、外来タンパク質セグメントの挿入が改変Ｃ−ローブの安定性に実質的に影響を及ぼさなかったことを実証しており、外来セグメントがＣ−ローブのコア構造要素の正常なフォールディングを妨害しなかったことが示唆される。
【０２００】
実施例９  −  Ｈ．インフルエンザのＴｂｐＢ  Ｃ−ローブを用いてコンジュゲート莢膜ワクチンを適用するためのループの改変
今日まで開発されたコンジュゲート莢膜ワクチンの大部分は、毒素系ワクチン成分の１種を、多糖体莢膜材料をコンジュゲートするための担体として用いてきた。莢膜多糖体を破傷風またはジフテリア毒素または類毒素にコンジュゲートする方策には複数の欠点がある。１つは、日常的免疫化に用いられるワクチンにも存在する担体タンパク質に連続暴露することにより、効果的免疫応答の誘導に負の影響を及ぼす可能性、つまり免疫耐性の発達である。２番目は、担体が、病原への自然な暴露に関係しないこと、つまり病原に遭遇した時に最も関連するＴ細胞ヘルプを誘導することの利益を完全に享受しないことである。
【０２０１】
コンジュゲート莢膜ワクチンは、通常はセロタイプまたはセログループと称される特異的莢膜多糖体を発現する細菌病原による感染の予防、そして実際には定着の予防の際に非常に成功してきた。しかし、最終的にワクチンに含まれない多糖体を発現する菌株に誘発された疾患をもたらし得る他の多糖体莢膜タイプを発現する細菌では、本質的に交差防御性が全くない。結果として、コンジュゲート莢膜ワクチンに含まれる多糖体莢膜タイプの範囲を拡大するという要望が、範囲の広いワクチンを継続的に開発する見通し、および最終的な解決策が実質的に交差防御を提供することが可能なタンパク質系ワクチン次第であるという見解に至った。しかし、広範な交差防御性を誘発することが可能なタンパク質系ワクチンが開発された場合、既存のコンジュゲート莢膜ワクチンにとって代わることが受け入れられる可能性は低い。既に一般化された（ｃｒｏｗｅｄ）日常的免疫化計画にさらに別のワクチンを追加することが、タンパク質系ワクチン導入への潜在的障害として検討される可能性がある。
【０２０２】
活性化された炭水化物部分と反応するリシンのみが修飾されることになり、炭水化物とタンパク質との比率がコンジュゲーション工程の間に制御され得ることから、この実施例で本発明者らは、重要なエピトープ内のリシンの修飾を最小限にするために予測される、ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブのリシン残基の残り部分にあるリシンの総数を実質的に超える４２リシン残基を含むＨ．インフルエンザからのＴｂｐＢ  Ｃ−ローブにコンジュゲーションループを組み込んだ。
【０２０３】
Ｈ３６株からの改変Ｈ．インフルエンザＴｂｐＢ  Ｃ−ローブをコードする遺伝子の配列を、フォントの拡大（１４対１２）により示されたコンジュゲーションループをコードするＤＮＡ領域（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６７）と共に、図２１のパネルＡに示している。コンジュゲーションループの挿入部位および配列は、Ｎ．メニンギティディスＭＣ５８株からのＬｂｐＢ中の大きな負電荷ループをモデルとして用いて設計した（５９）。本質的に、ＬｂｐＢループの配列がテンプレートとして用いられ、リシンはループ内のアスパラギン酸またはグルタミン酸残基を交換するために用いられた。コンジュゲーションループは、ループ２３の位置にあるβ鎖２２と２３の間のＴｂｐＢ  Ｃ−ローブのハンドルドメイン上に組み入れた（図２）。ループの位置は、ループ２３の代わりにかなり小さなループ（１１アミノ酸で構成）で生成されたＨ．インフルエンザＣ−ローブの構造モデルと用いて、図２１のパネルＢに示している。挿入された残基は、黒い球として示されている。組み入れられたループは、全体的Ｃ−ローブのサイズ（３５２アミノ酸残基）の１／４を超えるサイズを構成する９１アミノ酸で構成され、ループは、全体的Ｃ−ローブ内の強調された残基として示され、組み込まれたループは、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２０５に示されている。これは、ループドメインが、多数のさらなるアミノ酸を収容し得ることを示している。
【０２０４】
コンジュゲーション領域の含有は、Ｎ−ローブまたはＣ−ローブのループ領域への挿入に制限されず、例えばインタクトＴｂｐＢまたはＴｂｐＢローブのＮ末端にリシン残基のクラスタを含むことにより提供され得る。
【０２０５】
実施例１０  −  ＴｂｐＢの表面結合ループ内のアミノ酸置換の生成およびそれらのＴｆ結合特性の評価
ＴｂｐＢタンパク質の表面ループ内で一連の部位特異的突然変異体を、機能的および免疫学的特性への影響を探索するために構築した。修飾のために表面が露出したアミノ酸をターゲットにするために、本発明者らがＸ線結晶学的に得た構造（１２、１３）を有するＴｂｐＢにおいて、部位特異的突然変異を作製した。オーバーラップエクステンションポリメラーゼ連鎖反応（ＳＯＥ  ＰＣＲ）アプローチによるスプライシングを利用して、ブタ病原Ａ．プルロニューモニエ、Ａ．スイスおよびＨ．パラスイスに由来する切断ＴｂｐＢタンパク質をコードする遺伝子に、突然変異を導入した。それらには、Ｈ４９株由来のＡ．プルロニューモニエＴｂｐＢ２０−５２８（アミノ酸２０〜５２８）（ＡｐＨ４９  ＴｂｐＢ、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２）およびＡｐＨ４９  ＴｂｐＢ２０−５２８のＦ１７１Ａ変異体（ＳＥＱ  ＩＤ．ＮＯ：４）が含まれた。同じく含まれたのは、Ｈ８７株由来のＡ．プルロニューモニエＴｂｐＢ２６−５２８（アミノ酸２６−５２８）（ＡｐＨ８７  ＴｂｐＢ、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２）、ならびにＹ９５Ａ変異体（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１４）、Ｙ１２１Ａ変異体（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６）、Ｙ１７４Ａ変異体（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１８）およびＲ１７９Ｅ変異体（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２０）であった。Ｈ５７株由来のＡ．スイスＴｂｐＢ２７−５７７（アミノ酸２７−５７７）（ＡｓＨ５７  ＴｂｐＢ、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２８）、Ｆ６３Ａ変異体（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３０）およびＦ１５２Ａ変異体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）も生成された。最後に、Ｎａｇａｓａｋｉ株Ｈｐ５由来のＨ．パラスイスＴｂｐＢ２７−５７７（アミノ酸２７−５７７）（Ｈｐ５  ＴｂｐＢ、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１５）、Ｙ９３Ａ変異体（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７０）、Ｙ１１７Ａ変異体（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７２）、Ｙ１６７Ａ変異体（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７４）、およびＷ１７６Ａ変異体（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７６）も調製された。
【０２０６】
最初に、該組換えタンパク質を、ポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質およびＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含むＮ末端融合パートナーを用いて生成した。これにより、本発明者らは、ニトロセルロース膜および酵素標識ブタトランスフェリンを用いて、またはブタ−セファロースアフィニティ樹脂を用いた粗抽出物からの組換え融合タンパク質の捕捉により、固相結合アッセイに適した組換えタンパク質を単離することができた（１３）。これらのアッセイを利用すると、ネイティブＴｂｐＢによる強固な結合が即座に観察されたが、部位特異的変異体の多くによる結合は低かった。
【０２０７】
これらの実験からブタＴｆの結合のための半定量的結合定数を得ることができるが、本発明者らは、様々な異なる生物物理学的および生化学的アプローチを利用して、より正確で定量的な結合親和性尺度を得ることを選択した。図２２に示された通り、等温熱量測定、表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法（２３−２５）を利用すると、結合速度が少し独特で１２０ｎＭの推定Ｋｄを有したアクチノバシラス・スイスのＴｂｐＢ以外では（１２）、ネイティブＴｂｐＢの親和性定数（Ｋｄ）は、概ね２０〜６０ｎＭの範囲であった。
【０２０８】
Ａ．プルロニューモニエＨ４９株のＴｂｐＢ内のＦ１７１Ａ突然変異、Ａ．プルロニューモニエＨ４９株からのＴｂｐＢ内のＹ１７４Ａ突然変異、またはＨ．パラスイスＨＰ５株からのＴｂｐＢ内のＹ１６７ＡもしくはＷ１７６Ａ二重突然変異など、突然変異の幾つかは、親和性定数（Ｋｄ）が１００倍以上増加した。これらの変異体の全てがループ８に位置することは、注目すべき興味深いことである。
【０２０９】
実施例１１  −  表面結合ループ内にアミノ酸置換を有するＴｂｐＢ誘導体の免疫特性の評価
Ｔｆへの結合を欠くＴｂｐＢ由来の突然変異タンパク質の免疫特性をテストするためには、ネイティブ宿主内でそれらをテストすること、好ましくは標的病原による感染から宿主を防御する能力を直接テストすることが重要であった。したがって、ヘモフィルス・パラスイスの確立された感染モデルで実験を開始し、そこで初乳を与えていない子ブタで出生後２８日目に免疫化を開始して、６３日目にヘモフィルス・パラスイスでチャレンジした（３７、６０）。この感染モデルにおいて、チャレンジ株（Ｐｏｒｃｉｌｌｉｓ  Ｇｌａｓｓｅｒ）由来の市販ワクチンは、死亡を完全に防御し、トランスフェリン受容体の組換え形態はこれまで、チャレンジの１５日後に２０〜３０％生存させた。
【０２１０】
ブタ５または６匹の群を、Ｈｐ５チャレンジ株、部位特異的Ｙ１６７Ａ  ＴｂｐＢタンパク質もしくはＰｏｒｃｉｌｌｉｓ  Ｇｌａｓｓｅｒワクチンの組換えインタクトＴｂｐＢ、またはアジュバント単独で免疫化した。Ｈ．パラスイスＨｐ５（Ｎａｇａｓａｋｉ）株の標準的な１０８個のチャレンジ用量でブタをチャレンジし、１５日間モニタリングした。図２３に示された通り、対照Ｐｏｒｃｉｌｌｉｓ  Ｇｌａｓｓｅｒで免疫化されたブタ５匹のうち１匹のみが、チャレンジで生き残り、Ｈｐ５株のより毒性のある変異体がこの実験で用いられたことが示唆された。感染したブタからの菌株単離物を用いた追跡実験は、より低い生存率を有し、この結論が裏づけられた。チャレンジ株の毒性の高さにもかかわらず、Ｙ１６７Ａ  ＴｂｐＢで免疫化されたブタ６匹全てが１５日目に生存し、６匹のうち５匹は、ほとんど、または全く症状を有さず、剖検では病態がほとんど、または全く観察されなかった。このレベルの防御は、３匹のみがチャレンジで生き残った野生型タンパク質で免疫化されたブタ６匹とは対照的であった。生き残ったブタ３匹は、チャレンジ後に有意な臨床症状を有し、剖検で顕著な病態を示した。要約すると、この実験から、Ｙ１６７Ａ  ＴｂｐＢ突然変異タンパク質が、野生型タンパク質に比較して優れた防御的免疫応答を誘導すること、および２種のタンパク質がトランスフェリン結合特性以外では事実上同一であるため（図２２）、ネイティブタンパク質による最適以下の免疫応答が、宿主トランスフェリンの結合に起因し得ることが示された。
【０２１１】
突然変異が免疫応答に及ぼす影響のさらなる証拠を提示するために、Ｂ細胞およびＴ細胞の応答を評価した。チャレンジ直前およびチャレンジ後９６時間目に採取された血液試料を、適応免疫応答について分析した。試料をＦＡＣＳ分析により、成熟Ｂ細胞（αＩｇＭ＋ＣＤ２１＋）およびＴヘルパー細胞（ＣＤ４＋ＣＤ８α−）サブセットについて評価した。図２４の結果から、チャレンジ前に、Ｙ１６７Ａ変異体ＴｂｐＢ抗原が、ネイティブＴｂｐＢ抗原または市販のＰｏｒｃｉｌｌｉｓ  Ｇｌａｓｓｅｒワクチンよりも強いＢ細胞応答（パネルＡ）およびＴヘルパー細胞応答（パネルＢ）を誘導したことが実証される。チャレンジ後９６時間目に、変異体ＴｂｐＢへの応答（５１．４８％±１．１８％）は、ネイティブＴｂｐＢ（４５．６５％±１．２０％）またはＰＧワクチン（４４．８３％±１．５９％）への応答よりも有意に高かった（図２４、パネルＣ）。類似の傾向が、Ｔヘルパー細胞の応答で観察されたが、３群間の差の割合は、それほど明白ではなかった（図２４、パネルＤ）。しかし９６時間後に、ネイティブＴｂｐＢまたはＰｏｒｃｉｌｌｉｓ  Ｇｌａｓｓｅｒワクチンで免疫化された群内の生き残ったブタは６匹中３匹および５匹中２匹のみであり、応答の低いブタは、より早期に死亡する傾向があったため、９６時間目に群間で観察された差は、実際には過小評価である。
【０２１２】
実施例１２  −  ＴｂｐＢ誘導体に対する免疫応答は定着の予防を可能にする
感染モデルは、ワクチンの潜在的効能を評価する機会を提供するが、通常、病原の伝染が感染確立前の宿主の上気道への定着を導く自然な感染工程を模倣することはほまれである。髄膜炎、肺炎および侵襲性感染を予防するように設計されたコンジュゲート莢膜ワクチンは、標的細菌を上気道から排除して（１７）、非免疫化個体を防御する集団免疫のさらなる利益をもたらすことが示されている。それ以来、定着を予防する能力は、ワクチン施行を決定するための重要な特色になった（１８）。したがって、感染予防によって疾患の原因病原の貯蔵庫を排除し得るように、定着を予防するワクチンを設計することが、賢明になり得る。
【０２１３】
本発明者らは、Ｎ．メニンギティディスとヒトＣＥＡＣＡＭ受容体の相互作用を特徴づける過去の試験（６１）の利益を享受することで、ナイセリア・メニンギティディスによる定着を補助することが可能なトランスジェニック・ヒト化マウスモデルを開発した（６２）。このモデルは、ナイセリア・メニンギティディスのＯｐａタンパク質とヒトＣＥＡＣＡＭ１受容体との特異的相互作用に基づいており、この相互作用を自然に、または人工的に発揮する他の病原にまで拡大し得る。メニンゴコッカスＣ群コンジュゲート莢膜ワクチンによるトランスジェニックマウスの免疫化は、該定着モデルにおいて粘膜完全排除免疫をもたらし、言い換えるとナイセリア・メニンギティディスＣ群による定着を予防するが、他の莢膜タイプの菌株は予防しなかった。
【０２１４】
このモデルを用いて、ＴｂｐＢおよびその誘導体がＮ．メニンギティディスの定着を予防する能力をテストした。免疫化段階ではこれらのマウスの体内に存在するヒトトランスフェリンがないため、実施例１１に記載された通り、改変された非結合ＴｂｐＢを用いる必要はなかった。図２５Ａに示された通り、組換え切断ＴｂｐＢで免疫化されたマウス９匹のうち８匹は、１×１０７ＣＦＵのＮ．メニンギティディスＭ９８２株での鼻内チャレンジ投与後３日間は、検出可能なレベルのＮ．メニンギティディスを有さなかった。アジュバント単独で処置された対照マウスでは、８匹のうち６匹に検出可能なレベルのＮ．メニンギティディスが存在した。これが定着を予防することが可能であることを示された最初のタンパク質抗原であることを述べることは重要であり、本発明者らによる関係するメカニズムの理解が少ないため、この特色が表面タンパク質抗原に共通すると推定することはできない。
【０２１５】
本発明者らは、追跡実験でＴｂｐＢを、別の表面リポタンパク質、２種のワクチン中の重要成分であるＨ因子結合タンパク質、および個々のＴｂｐＢサブドメインと比較した。図２５Ｂに示された通り、Ｃ−ローブは、インタクトＴｂｐＢまたはＴｂｐＢ  Ｎ−ローブと同じく、またはより良好に定着を予防することができ、一方でこの実験において完全排除免疫を誘導する際にＨ因子結合タンパク質と同程度、またはより効果的であった。Ｔｆ結合の欠如は、それがネイティブ宿主において等しく効果的であり、交差反応性免疫応答を誘発する能力の増強（図３、図１１）が広範囲に交差防御性があるワクチンの開発を促進することを意味するため、ＴｂｐＢ  Ｃ−ローブが全身免疫化での粘膜完全排除免疫を誘導する能力は、特に期待の持てる発見である。
【０２１６】
定着試験を、過去に記載された通り実施した（６２）。ヒトＣＥＡＣＡＭ−１導入遺伝子を発現する８匹以上のＣ５７／Ｂ１６の群（社内繁殖）が、指定の免疫化剤１００μｌを０および２１日目に皮下投与された。それらの群は、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）で注射あたり１００μｌ容量に希釈された２０％Ｅｍｉｌｓｉｇｅｎ  Ｄ（ＭＶＰ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を補助添加された、指定のタンパク質（２５μｇ）またはタンパク質不含対照のいずれかを投与された。
【０２１７】
３５日目、マウスはイソフルラン（Ｂａｘｔｅｒ）で麻酔され、２回動物体通過されたＮ．メニンギティディスＭ９８２株を鼻腔内滴下により摂取された。接種物を調製するために、感染させる菌株をＧＣアガー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で一夜生育させ；一夜生育菌叢を、ＭｇＣｌ２（ＰＢＳ／Ｍｇ）１ｍＭを含有するＰＢＳ  １ｍｌ中に回収し、ＯＤ６００を測定して細菌数を調整した。最終的な１０μｌ接種物それぞれがおよそ１×１０７コロニー形成単位を含むように、培養物を調整した。コロニー形成用量の密度を系列希釈物を通して確認し、ＧＣアガー上に播種した。
【０２１８】
感染の３日後（３８日目）、マウスを二酸化炭素窒息により安楽死させた。ＰＢＳ／Ｍｇ  ２５０μｌで気管洗浄し、その後、ポリエステルチップのアプリケータ（Ｐｕｒｉｔａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）により鼻腔内を直接スワビングしてＰＢＳ／Ｍｇ  ５００μｌで再懸濁させることにより、定着量を評価した。鼻内菌叢の生育を防ぐＶＣＮＴインヒビター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を補充されたＧＣアガーで試料を一夜生育させた後、計数した。動物実験は、Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｒｏｎｔｏを遵守して実施した。
【０２１９】
実施例１３  −  ＴｂｐＢまたはその一部の混合物を含むワクチン配合剤
ＴｂｐＢを有する病原は、専ら特異的宿主（ヒト、ブタ、ウシおよび／または関連の反芻動物）の体内に存在し、ＴｂｐＢは、定着を予防することができるため（図２５）、ＴｂｐＢをターゲットにした改変された抗原に基づく広範囲で交差防御性があるワクチンは、病原を排除する能力を有する。
【０２２０】
一定範囲のグラム陰性菌に対するワクチン配合剤の効能を拡大するために、異なる菌種または菌株から得られるＴｂｐＢ、またはその一部、例えばＣ−ローブドメインを組み合わせることができる。この実施形態で本発明者らは、ワクチン配合剤の調製に使用するためのＴｂｐＢポリペプチドまたはそれらの組み合わせの好ましい組み合わせを提供する。
【０２２１】
ＴｂｐＢポリペプチドの有効な組合せを同定する際の重要な判断材料の１つが、異なる株、種または属がｔｂｐＢ遺伝子を即座に交換し、それによりワクチンに含まれないＴｂｐＢ変異体の潜在的貯蔵庫として作用する程度である。ｔｂｐＢ遺伝子の水平交換（ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）に影響を及ぼす重要な因子の１つが、これらの自然に形質転換可能な種に生来、存在する取込みシグナル配列（ＵＳＳ）の性質である（６３、６４）。これらの細菌は、特異的ＵＳＳを含むＤＮＡを優先的に取り込み、それらのゲノムに組み込んで、表面抗原の抗原性変異体を組み込むための非常に効率的なメカニズムを提供する。
【０２２２】
ナイセリア・メニンギティディスの場合、本発明者らは、全体的な配列多様性（図１０Ａ）を適切に表した広範囲の菌株コレクションを有する。配列多様性の非常に幅広い理解を表すこの病原用の公的データベースについて入手できる世界中の特に大規模な配列コレクションが存在する。ＴｂｐＢを有し、通常はヒトの上気道に存在する他のヒト病原（ヘモフィルス・インフルエンザ、モラクセラ・カタラーリス）は、それらのゲノムＤＮＡ内のナイセリアに特異的なＵＳＳを含まないため、それらは、抗原変異のための即時的な貯蔵庫にならない。したがってこの実施例は、図１０Ａに示された２つの異なる系統学的クラスタから選択されたナイセリア・メニンギティディス株から得られた少なくとも２つのＴｂｐＢポリペプチドまたはその一部（例えば、Ｃ−ローブドメイン）を含む、改変ＴｂｐＢ抗原の組み合わせを含むワクチン配合剤を包含する。そのようなワクチン配合剤は、潜在的に交差反応性（図１１）および交差防御性抗体反応を誘導することができ、潜在的にヒト集団からＮ．メニンギティディスを排除するのに用いることができる。
【０２２３】
通常、ヒト泌尿生殖管に存在する関連の病原Ｎ．ゴノレアは、同じ粘膜表面にこれら２種が偶発的に存在するため、同じＵＳＳを共有し、したがって潜在的に抗原変異のための貯蔵庫として働き得る。しかし、Ｎ．メニンギティディス内の多様性に比較したゴノコッカスＴｂｐＢの配列多様性の分析（図２６Ａ）では、それらの大部分がＮ．メニンギティディスに存在する配列多様性のサブセットであり、本発明者らのアプローチのわずかな拡張により、改変された抗原を組み合わせていずれかの病原による定着を潜在的に排除し得るワクチンに用いられ得る、という見通しが得られることが示された。改変Ｃ−ローブ（図２６Ｂ）の場合、Ｎ．ゴノレアのＴｂｐＢ変異体を特異的に標的化するＣ−ローブドメインの含有を必要とするであろう。共生のナイセリア単離物の一部におけるＴｂｐＢの存在は、抗原変異体の別の潜在的貯蔵庫を表しており、したがって共生のナイセリアからの代表的変異体を含む本発明者らのアプローチを拡張して、疾患を誘発し得るナイセリア発現ＴｂｐＢを効果的に排除する必要があるかもしれない。したがってこの実施例は、ナイセリア・メニンギティディスＴｂｐＢポリペプチドまたはその一部（例えば、Ｃ−ローブドメイン）、およびナイセリア・ゴノレアＴｂｐＢポリペプチドまたはその一部（例えば、Ｃ−ローブドメイン）を含む改変ＴｂｐＢ抗原の組み合わせを含むワクチン配合剤を包含する。
【０２２４】
ブタ病原Ａ．プルロニューモニエ、Ａ．スイスおよびＨ．パラスイスは、同じＵＳＳを共有し、その結果、ＴｂｐＢ配列多様性がその３つの種の間に分布するため（図４）、主な系統学的クラスタが少なくとも２つの種からの代表物を有する。したがって、これらの病原に対するＴｂｐＢベースのワクチンを開発する際、３つの種全てにおける全体的ＴｂｐＢ配列変異を考慮することが重要になる。これは、１つよりも多い種からの抗原に対して免疫応答を誘発し得る改変された抗原を開発する、むしろ従来とは異なるアプローチの基礎であり（図６、図７）、ＴｂｐＢは定着を予防し得るため、ブタ宿主からの３つの病原全てを排除するために用いられ得るアプローチを使用することである。したがってこの実施例は、アクチノバシラス・プルロニューモニエ、アクチノバシラス・スイスおよびヘモフィルス・パラスイスから得られた少なくとも２つのＴｂｐＢポリペプチドまたはその一部（例えば、Ｃ−ローブドメイン）を含む、改変ＴｂｐＢ抗原の組み合わせを含むワクチン配合剤を包含する。
【０２２５】
ヘモフィルス・インフルエンザに関しては、ｂ型多糖体莢膜を有する菌株と、多糖体莢膜を欠く分類不能な菌株により誘発された明らかに異なる範囲の疾患により、各群を別々に標的化するワクチンに焦点があてられた。Ａ群多糖体莢膜を発現する菌株を原因とした侵襲性疾患が近年増加したことで、Ａ群株をターゲットにしたワクチンを開発する検討がなされた（６５）。Ｈ．インフルエンザの菌株におけるＴｂｐＢ多様性の評価から、分類不能な菌株が３つの群全てに分布した３つの主要な系統学的クラスタ（図２７Ａ）が存在することが示される。Ｈ．インフルエンザの菌株は全て、同じＵＳＳを共有するため、ＴｂｐＢ多様性の分泌は、莢膜の型による影響を受けないと思われ、ＴｂｐＢベースの改変された抗原に由来する交差防御性ワクチンの開発は、ｂ型菌株、分類不能な菌株および他の莢膜の型を発現する菌株を効果的に標的化するであろう。したがって本発明者らのアプローチは、無類のワクチンとして、またはコンジュゲート莢膜ワクチンの担体として（図２１）、Ｈ．インフルエンザの広範に防御性があるＴｂｐＢベースのワクチンの開発を促進するはずである。したがってこの実施例は、図２７Ａに示された２つの異なる系統学的クラスタから選択されたＨ．インフルエンザ株から得られた少なくとも２つのＴｂｐＢポリペプチドを含む、改変ＴｂｐＢ抗原の組み合わせを含むワクチン配合剤を包含する。
【０２２６】
ナイセリア・メニンギティディスおよびヘモフィルス・インフルエンザとは異なり、モラクセラ・カタラーリス株のゲノムに存在する明らかなＵＳＳはないが、それでもそれらは自然に形質転換可能であり、それはＭ．カタラーリスのＤＮＡにとって非常に好ましい。したがってＴｂｐＢを標的とする改変された抗原を用いたＭ．カタラーリスへの広範な交差防御性があるワクチンの開発は、Ｍ．カタラーリスからのＴｂｐＢ（図２９）の多様性のみを考慮する必要がある。３つの主要な群を構成する菌株に由来する抗原は、Ｍ．カタラーリスによる定着を予防することが可能な広範な交差防御性のあるワクチンを誘導するのに十分なはずである。したがってこの実施例は、図２９に示された２つの異なる系統学的クラスタから選択されるＭ．カタラーリスから得られた少なくとも２つのＴｂｐＢポリペプチドを含む、改変ＴｂｐＢ抗原の組み合わせを含むワクチン配合剤を包含する。
【０２２７】
正式にはパスツレラ・ヘモリティカとして知られる、ウシ病原マンヘミア・ヘモリティカは、ウシにおけるウシ呼吸器疾患（輸送熱）およびヒツジにおける呼吸器感染の主な原因である。２つの種マンヘミア・グルコシダおよびビベルスティニア・トレハロシに再分類されたヒツジ病原パスツレラ・トレハロシは、ＵＳＳをマンヘミア・ヘモリティカと共有している。これは、これらの種が共通の遺伝子プールを共有するという発見（６６）を大きく担う可能性がある。反対に、正式にはヘモフィルス・ソムナスとして知られるヒストフィルス・ソムニは、明確なＵＳＳを有し、したがってＭ．ヘモリティカの抗原変異体の貯蔵庫ではない。ヒツジおよびウシの病原を明らかに含み（６６）（図２８）、主にウシまたはヒツジに限定された変異体のクラスタを含むＭ．ヘモリティカ、Ｍ．グルコシダおよびＢ．トレハロシからのＴｂｐＢの３つの主な系統学的系列がある。したがってウシ、ヒツジまたはその両方の反芻動物種における疾患をターゲットにしたＴｂｐＢ由来の改変された抗原の開発を検討することが可能であろう。したがってこの実施例は、図２８に示された２種の異なる系統学的クラスタから選択されるマンヘミア・ヘモリティカ、マンヘミア・グルコシダおよびビベルスティニア・トレハロシ株から得られた少なくとも２つのＴｂｐＢポリペプチドを含む、改変ＴｂｐＢ抗原、またはその一部、例えばＣ−ローブドメインの組み合わせを含むワクチン配合剤を包含する。
【０２２８】
全ての発行物、特許および特許出願は、各個別の発行物、特許および特許出願が全体として参照により本明細書に組み入れられることを具体的かつ個別に示すのと同じ程度に、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年8月17日(2016.8.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラム陰性病原菌種から得ることができるＨＩＢＰ表面受容体ポリペプチドと、アジュバントとを含む免疫原性組成物であって、前記ポリペプチドが、天然の宿主鉄結合タンパク質と修飾されているＨＴＢＰ表面受容体タンパク質との間の結合定数の値が、前記天然の宿主結合タンパク質と前記天然のＨＩＢＰ受容体タンパク質との間の結合相互作用の結合定数よりも少なくとも１０倍大きいように修飾されている、免疫原性組成物。
【請求項２】
前記ＨＩＰＢ表面受容体タンパク質が、Ｃ−ローブドメインまたはＮローブドメインを含むＴｂｐＢタンパク質であり、前記Ｃ−ローブドメインおよびＮ−ローブドメインが、複数のループドメインにより接続された複数のβ鎖を含み、前記複数のループドメインの少なくとも１つのループドメインが、修飾されている、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記ループドメインが、前記ループドメイン中の１つのアミノ酸が置換されている点で修飾されている、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記ループドメインが、全体が除去されている点で修飾されている、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
ＩＯＭポリペプチドの一部による前記ループドメインの置換をさらに含む、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記ＩＯＭポリペプチドが、ＴｂｐＡポリペプチドまたはＬｂｐＡポリペプチドである、請求項５に記載の免疫原性ポリペプチド。
【請求項７】
前記修飾されているループが、ループＬ１〜ループＬ３２のいずれか１つから選択される、請求項２〜６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記修飾されているループが、ループＬ１、Ｌ５、Ｌ８、Ｌ１２、Ｌ１８、Ｌ２１、Ｌ２３、およびＬ２７からなる群から選択される、請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記ＴｂｐＢポリペプチドが、パスツレラ科、モラクセラ科またはナイセリア科に属する菌種から得ることができる、請求項２記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記ＴｂｐＢポリペプチドが、アクチノバシラス属、ナイセリア属、ヘモフィルス属、マンヘミア属、ヒストフィルス属、パスツレラ属またはモラクセラ属に属する菌種から得ることができる、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記Ｃ−ローブドメインが、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１１９；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２５；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７９〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１９５；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１３〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２１８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３０；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３４〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２７８；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２８８〜ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２９２に示された群から選択されるＣ−ローブドメインである、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記Ｎ−ローブドメインが、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１０；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２１；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１２７；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２２９；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３１；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２３３に示された群から選択されるＮ−ローブドメインである、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記免疫原性組成物が、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７０；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７２；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１７６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２０；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３０；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：３２に示されるいずれかのポリペプチドを含む、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記ＴｂｐＡおよびＬｂｐＡポリペプチドが、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５２；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６２から選択される、請求項６に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記免疫原性組成物が、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５４；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５６；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１５８；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６０；ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６４；およびＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１６６に示される配列を有するポリペプチドを含む、請求項６に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を含むワクチン組成物。
【請求項１７】
免疫原性組成物を調製する方法であって、
（ａ）作動可能に連結された成分として、
（ｉ）グラム陰性病原菌種から得ることのできるＴｂｐＢポリペプチドのＣ−ローブドメインまたはＮ―ローブドメインを含む修飾されているポリペプチドをコードする核酸配列であって、宿主鉄結合タンパク質と実質的に結合することができず、かつ、天然の宿主鉄結合タンパク質と修飾されているＴｂｐＢポリペプチドとの間の結合定数の値が、前記天然の宿主鉄結合タンパク質と前記天然のＴｂｐＢポリペプチドとの間の結合相互作用の結合定数の値よりも少なくとも１０倍大きいように前記ポリペプチドが修飾されている、核酸配列と、
（ｉｉ）組み換え宿主細胞での発現を制御できる核酸配列と
を含むキメラ核酸配列を準備することと、
（ｂ）宿主細胞へ前記キメラ核酸配列を導入し、前記宿主細胞を増殖させて前記ＴｂｐＢポリペプチドを産生することと、
（ｃ）前記ＴｂｐＢポリペプチドを含むポリペプチドを前記宿主細胞から回収することと、
（ｄ）免疫原性組成物を調製することと
を含む、方法。
【請求項１８】
前記修飾されているポリペプチドが、前記少なくとも１つのループドメイン全体が除去されているポリペプチドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
脊椎動物の対象の免疫応答を誘発する方法で使用するための組成物であって、
グラム陰性病原菌種由来のＨＩＢＰ表面受容体タンパク質の少なくとも２つのＣ―ローブドメインまたは少なくとも２つのＮ−ローブドメインを含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、宿主鉄結合タンパク質を実質的に結合することができない、ポリペプチドを含み、
前記組成物が、前記脊椎動物の対象の免疫応答を誘発するために十分な量で投与される、
組成物。
【請求項２０】
脊椎動物の対象の免疫応答を誘発する方法で使用するための組成物であって、
グラム陰性病原菌種由来のＨＩＢＰ表面受容体タンパク質のＣ―ローブドメインまたはＮ−ローブドメインを含むポリペプチドを含む免疫原をコードする核酸配列を含む発現ベクターであって、前記ポリペプチドが、宿主鉄結合タンパク質を実質的に結合することができないように修飾されている、発現ベクターを含み、
前記組成物が、前記発現ベクターが前記脊椎動物の対象の免疫応答を誘発するために十分な前記免疫原に向けて発現されるような量で投与される、
組成物。
【国際調査報告】
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