(57)【要約】  昆虫メタロプロテイナーゼ阻害剤ＩＭＰＩαタンパク質の野生型を表す配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも７０％、特には８０％、９０％、又は９５％の相同性を有し、且つ、ＩＭＰＩαの前記アミノ酸配列の３５位、３６位、及び／又は３９に少なくとも１つの変異を有し、サーモリシンに対するＩＣ５０値がＩＭＰＩαのＩＣ５０値未満であり、ＩＭＰＩαの３５位にある無極性アミノ酸のイソロイシンがロイシン、メチオニン及びフェニルアラニンからなる群より選択される無極性アミノ酸、又はシステイン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン及びアルギニンからなる群より選択される極性アミノ酸、のどちらかによって置換され；及び／又は、ＩＭＰＩαの３６位にある無極性アミノ酸のイソロイシンがバリン、フェニルアラニン及びトリプトファンからなる群より選択される無極性アミノ酸、又はチロシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン及びアルギニンからなる群より選択される極性アミノ酸のどちらかによって置換され；及び／又は、ＩＭＰＩαの３９位の極性アミノ酸が無極性アミノ酸であるバリン、又は極性アミノ酸であるヒスチジン若しくはリシン、のどちらかによって置換されている、ポリペプチド。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫メタロプロテイナーゼ阻害剤ＩＭＰＩαタンパク質の野生型を表す配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも７０％、特には８０％、９０％、又は９５％、の相同性を有し、且つ、ＩＭＰＩαのアミノ酸配列の３５位、３６位及び／又は３９位に少なくとも１つの変異を有し、
サーモリシンに対するＩＣ５０値がＩＭＰＩαのＩＣ５０値未満であり、
ＩＭＰＩαの３５位にある無極性アミノ酸のイソロイシンが、ロイシン、メチオニン及びフェニルアラニンからなる群より選択される無極性アミノ酸、又はシステイン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン及びアルギニンからなる群より選択される極性アミノ酸、のどちらかによって置換され；及び／又は
ＩＭＰＩαの３６位にある無極性アミノ酸のイソロイシンが、バリン、フェニルアラニン及びトリプトファンからなる群より選択される無極性アミノ酸、又はチロシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン及びアルギニンからなる群より選択される極性アミノ酸、のどちらかによって置換され；及び／又は
ＩＭＰＩαの３９位の極性アミノ酸が、無極性アミノ酸であるバリン、又は極性アミノ酸であるヒスチジン若しくはリシン、のどちらかによって置換されている、
ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１０、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
バイオアベイラビリティ、安定性、有効性などの生物学的特性又は化学的特性を改善するために、又は検出可能標識を備えるために、側鎖に、又はＮ末端及び／又はＣ末端に化学修飾を有する請求項１又は請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
抗体又は抗体断片；リポカリン、アンキリン、フィブロネクチン、トランスフェリン、テトラネクチン、アドネクチン、アルブミン、ウテログロビン、又はプロテインＡなどのスキャフォルド；トランスフェリンなどの機能性ペプチド；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの診断用途に有用なペプチド；又は技術面への固定を可能にするヘキサヒスチジンなどのペプチドタグ；又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などのトランスフェラーゼ、からなる群より選択される生理学的機能を有する少なくとも１種類のポリペプチドと融合している、野生型ＩＭＰＩα、野生型ＩＭＰＩβ、及び／又は請求項１から請求項３の少なくとも１項に記載のポリペプチド、を含む融合ポリペプチド。
【請求項５】
１〜１００アミノ酸長のペプチドによって連結されている、請求項４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１から請求項３の少なくとも１項に記載のポリペプチドと前記生理学的機能を有する少なくとも１種類のポリペプチドとが化学結合基によって結合されている、請求項４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
請求項１又は請求項２の少なくとも１項に記載のポリペプチド又は請求項５又は請求項６に記載の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
異種性プロモーターに作動可能に連結されている、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項７又は請求項８に記載の組換え核酸を含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の宿主細胞の培養、前記宿主細胞における前記核酸の発現、及びポリペプチドの単離を含む、ポリペプチドの生産方法。
【請求項１１】
請求項３に記載のペプチド及び／又は請求項４から６のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドを含む診断用キット。
【請求項１２】
昆虫メタロプロテイナーゼ阻害剤ＩＭＰＩαタンパク質の野生型を表す配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも７０％、特には８０％、９０％、又は９５％の相同性を有し、特にＩＭＰＩαのアミノ酸配列の３５位、３６位及び／又は３９位に少なくとも１つの変異を有し、
ＩＭＰＩαの３５位にある無極性アミノ酸のイソロイシンがロイシン、メチオニン及びフェニルアラニンからなる群より選択される無極性アミノ酸、又はシステイン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン及びアルギニンからなる群より選択される極性アミノ酸、のどちらかによって置換され；及び／又は
ＩＭＰＩαの３６位にある無極性アミノ酸のイソロイシンがバリン、フェニルアラニン及びトリプトファンからなる群より選択される無極性アミノ酸、又はチロシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン及びアルギニンからなる群より選択される極性アミノ酸、のどちらかによって置換され；及び／又は
ＩＭＰＩαの３９位の極性アミノ酸が無極性アミノ酸であるバリン、又は極性アミノ酸であるヒスチジン若しくはリシン、のどちらかによって置換されている、ポリペプチド、及び／又は
請求項４から請求項６の少なくとも１項に記載の融合ポリペプチド、又は請求項１から請求項６に記載のポリペプチドのうちの少なくとも１つをコードする部分を含むポリヌクレオチド、
を含む医薬組成物。
【請求項１３】
Ｍ４又はメトジンシンファミリーのメタロプロテイナーゼ細菌毒素、特にサーモリシン、オーレオリシン、バシロリシン、シュードリシン、ビブリオリシン又は炭疽菌ｎｐｒ５９９、を分泌する微生物に感染した動物又はヒトの治療に使用される、
昆虫メタロプロテイナーゼ阻害剤ＩＭＰＩαタンパク質の野生型を表す配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも７０％、特には８０％、９０％、又は９５％の相同性を有し、且つ、ＩＭＰＩαのアミノ酸配列の３５位、３６位及び／又は３９位に少なくとも１つの変異を有し、
ＩＭＰＩαの３５位にある無極性アミノ酸のイソロイシンがロイシン、メチオニン及びフェニルアラニンからなる群より選択される無極性アミノ酸、又はシステイン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン及びアルギニンからなる群より選択される極性アミノ酸、のどちらかによって置換され；及び／又は
ＩＭＰＩαの３６位にある無極性アミノ酸のイソロイシンがバリン、フェニルアラニン及びトリプトファンからなる群より選択される無極性アミノ酸、又はチロシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン及びアルギニンからなる群より選択される極性アミノ酸、のどちらかによって置換され；及び／又は
ＩＭＰＩαの３９位の極性アミノ酸が無極性アミノ酸であるバリン、又は極性アミノ酸であるヒスチジン若しくはリシン、のどちらかによって置換されている、ポリペプチド、又は
請求項４から請求項６のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド、又は請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
試料中におけるＭ４ファミリーに属するプロテアーゼの存在又は活性を検出するための、請求項３に記載のポリペプチド及び／又は請求項４から請求項６のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロテアーゼ活性を阻害するペプチドとタンパク質に関する。より具体的には、本発明は、微生物起源又は真菌起源の様々なプロテアーゼに対する活性、特に、サーモリシン、炭疽菌（ａｎｔｈｒａｘ）中性プロテアーゼ５９９（ｎｐｒ５９９）、シュードリシン、及びオーレオリシンを含むメトジンシンファミリーに対する活性を示すペプチドに関する。本発明はさらにそれらのペプチドを生産するための方法、それらのペプチド又はタンパク質を含む医薬組成物、及び細菌又は真菌の感染症とそれらの症状を予防及び／又は治療するために、特に、オーレオリシン、バシロリシン、シュードリシン、ビブリオリシン、及び炭疽菌ｎｐｒ５９９などの分泌型又は膜結合型の細菌性プロアーゼの各タンパク質分解活性を阻害することによりそれらの毒性効果を低下させるために、それらのペプチド又はタンパク質を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗生物質は細菌感染症の実際の標準的な治療である。しかしながら、抗生物質が広く行きわたり、時には不適切に使用されてきたため、病原体が１又は複数の抗生物質に対しても耐性を持つようになってきた。多剤耐性細菌は感染症の患者にとってますます大きな、深刻な脅威になっている。したがって、過去数年の間に細菌の病毒性を弱める新規のコンパニオン化合物の検索が緊急に必要となっている。抗生物質又は代替的化合物が微生物を殺し得る前であっても、化合物が細菌感染の危険又は重篤な症状に対して即効性を有することが、これらの症状から患者を迅速に保護するために望ましい。
【０００３】
細菌がプロテアーゼを放出することは何十年にもわたって知られてきた（Ｄｕｔｈｉｅら、１９４９年）。後に病毒性因子としての微生物プロテアーゼの病因的役割が実験的に認識された（Ｓｎｅｌｌら、１９７８年）。病原体及び寄生生物が産生するタンパク質分解酵素はそれらの病原体及び寄生生物の宿主への感染成功にとって非常に重要である。タンパク質分解酵素の基質特異性に関係なく、個々の病原体由来プロテイナーゼの重要な機能は宿主タンパク質とペプチドの分解である（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、２００６年）。宿主タンパク質の細胞外消化により、例えば、宿主の物理的障壁を越えて浸透させることが容易になる。例えば、細胞外マトリックスの分解を顕著な例として挙げることができる。さらに、抗菌ペプチド（ＡＭＰ）（Ｏｔｔｏ、２００８年）をはじめとする宿主の免疫関連防御分子の分解と栄養物の獲得は病原体が生き残るために重要な機能である。しかしながら、対応する内在性宿主プロテイナーゼ阻害剤によって不活化され得ない、又は部分的にしか不活化され得ない病原体関連タンパク質分解酵素だけが、病毒性因子として機能し得る。感染中、宿主ペプチドとタンパク質の分解において、病毒性因子は通常は相互に補い合う。その結果、宿主内に対応する内在性阻害剤が無い病原体由来プロテイナーゼが進化的に選択される。そうでなければ病原体がそれらの限られたリソースを浪費してしまうからである（Ｖｉｌｃｉｎｓｋａｓ、２０１０年）。
【０００４】
哺乳類動物及び多くの無脊椎動物はＭ４又はメトジンシンファミリーのメタロプロテイナーゼのプロテアーゼに特異的な阻害剤を欠いている。それらのプロテアーゼのうち、バチルス・サーモプロテオリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）のサーモリシンは顕著な例である。サーモリシン様メタロプロテイナーゼはヒト病原体によって産生される、オーレオリシン、バシロリシン、シュードリシン、ビブリオリシン、及び炭疽菌ｎｐｒ５９９をはじめとする多くの著名な毒素を包含する。これらの毒素はおそらく敗血症、易出血性組織出血、壊死及び血管透過性の上昇などの深刻な感染症に関連する病理学的症状の発端にある（Ｃｈｕｎｇら、２００６年）。胃潰瘍及び消化性潰瘍及び胃癌のような深刻な疾患は少なくとも部分的には病原体のＭ４ファミリーのメタロプロテイナーゼの作用から生じる（Ｓｃｈｍｉｄｔｃｈｅｎら、２００３年、Ｓｍｉｔｈら、１９９４年）。
【０００５】
例えば、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）感染症の主な症状はその細菌からの病毒性因子の放出によって引き起こされる。よく知られた病毒性因子である炭疽菌毒素は宿主マクロファージの破壊を引き起こし、これによりこの細菌が宿主の防御に直面することなく宿主組織に広がることが可能になる。炭疽菌毒素は３種類の異なるタンパク質を含み、それらのタンパク質のそれぞれが複数コピーで存在するホロ酵素である。それらのタンパク質は防御抗原（ＰＡ）、浮腫因子（ＥＦ）、及び致死因子（ＬＦ）と呼ばれる。活性化されるには少なくともＰＡとＥＦ又はＰＡとＬＦが組み合わせられることが必要である。単一のタンパク質だけ、又はＰＡが無くＥＦとＬＦだけでは実験動物において不活性である。
【０００６】
ＰＡ、ＥＦ及びＬＦの活性を組み合わせただけでは観察される炭疽の全ての臨床症状に当てはまらないことが最近になって明らかになった。炭疽菌はタンパク質分解活性を示す分泌タンパク質をコードする他の遺伝子を有することが示された。それらのうち、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、ＢＡ）の遺伝子ＢＡ０５９９は中性プロテアーゼ５９９（ｎｐｒ５９９）と呼ばれるプロテアーゼをコードしている。このプロテアーゼはＭ４ファミリーのプロテアーゼに属しており、且つ、他のバチルス属の種のバシロリシンと高い相同性を示す（Ｐｏｐｏｖら、２００５年、Ｃｈｕｎｇら、２００６年、Ｃｈｕｎｇら、２００８年）。
【０００７】
現在のところ炭疽菌感染症には幾つかの治療選択肢が存在する。９０％を越える安全性で防御するワクチンは利用可能であるが、通常、ヒト集団において炭疽菌に対するワクチン接種の程度は低く、且つ、この程度が上昇することはこれまで予測されていない。急性感染症の場合、炭疽はさらには抗生物質で治療され得る。しかしながら、抗生物質によって細菌数が十分に減るまで、その細菌が放出する毒素が組織に不可逆的な損傷を引き起こし続ける。抗生物質への曝露により細菌が刺激され、増量した病毒性因子が一時的に放出され、加速した、且つ不可逆的な患者組織の損傷を引き起こす可能性さえある。さらに、細菌が存在していなくても、ヒトが天然細菌毒素を人為的に合成したもの又は組換えたものを吸入することがあり得、その場合には抗生物質は全く治癒効果を持たない。
【０００８】
そのため、細菌毒素を直接的に阻害又は拮抗させるという課題はチャレンジングであると認識され、阻害戦略が発表されてきた。緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）病毒性因子ＬａｓＢ（Ｃａｔｈｇａｒｔ  Ｇ．Ｒ．ら、２０１１年）の場合ではＮ−メルカプトアセチル−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−アミド（Ｋ（ｉ）＝４１ｎＭ）が阻害剤として示唆された。同様に、炭疽菌致死因子プロテアーゼ阻害剤、例えば、（２Ｒ）−２−［（４−フルオロ−３−メチルフェニル）スルホニルアミノ］−Ｎ−ヒドロキシ−２−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アセトアミド（Ｘｉｏｎｇ  Ｙ．ら、２００６年、米国特許第７５０４４２５（Ｂ２）号明細書）、並びにＮＳＣ１２１５５という名称の化合物（Ｐａｎｃｈａｌ  Ｒ．Ｇ．ら、２００４年）、及び最大で１ｎＭのＫｉを有する基質由来ヒドロキサメート（Ｉｎ−２−ＬＦ）（Ｔｏｎｅｌｌｏ  Ｆ．ら、２００２年）が過去に示唆された。基質に由来するペプチド（ＭＬＡＲＲＫＫＶＹＰＹＰＭＥＰＴＩＡＥＧ−アミド）も１ｎＭのＫｉでＬＦを阻害することが分かった（Ｔｕｒｋ  Ｂ．Ｅ．ら、２００２年）。これまでに臨床開発段階に達したＬＦの阻害剤は無い。幾つかの阻害剤の副作用が知られており、それらの副作用には例えばＬＦの阻害と並行した内在性フリンの阻害が含まれる。実験室においてはＥＤＴＡと１，１０−フェナントロリンでＮｒｐ５９９を阻害することができるが（Ｃｈｕｎｇら、２００６年）、さらに、今日に至るまで治療的に許容可能なＮｒｐ５９９阻害剤は発表されていない。
【０００９】
サーモリシンファミリーの他のメンバーの幾つかの阻害剤がこれまでに記載された。ホスフォラミドンは細菌ストレプトマイセス・タナシエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ  ｔａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）によって産生され、タロペプチンはこれに由来する。ＺＧＰＬＬ及びＺＦＰＬＡという名称のホスフォノマダイト（Ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｍａｄｉｔｅ）はサーモリシンに関して低ナノモル範囲の阻害定数を示す（Ｈｏｌｄｅｎら、１９８７年）。
【００１０】
Ｋｈａｎらは仮想的スクリーニングの実行において見つかった１２種類の阻害剤のセットのうち１β−ｄ−アラビノフラノシル−Ｎ４−ラウロイルシトシンをサーモリシンの強力な阻害剤として記載しており（Ｋｈａｎら、２００９年）、また、新規の３８種類のキナゾリン−４（３Ｈ）−オン類のセットのうち３−フェニル−２−（トリフルオロメチル）キナゾリン−４（３Ｈ）−オンを最も強力な阻害剤として記載している（Ｋｈａｎら、２０１０年）。
【００１１】
しかしながら、非特異的メタロプロテイナーゼ阻害剤の投与によるサーモリシン活性の治療的阻害は、宿主のマトリックスメタロプロテイナーゼなどの非常に重要な宿主酵素の二次的阻害によって引き起こされる好ましくない副作用のために偏見を持たれている。例えば、ホスフォラミドンは内在性タンパク質であるエンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）を阻害している。さらに、これらの化合物の中には有毒なものもあり、毒性が明らかに不明なものもある。その結果、１種類の微生物酵素を特異的に阻害することが可能である分子（Ａｄｅｋｏｙａら、２００９年）又は対応する酵素ファミリーを特異的に阻害することが可能である分子に対する強い要求が存続している。
【００１２】
ストレプトマイセスメタロプロテイナーゼ阻害剤（ＳＭＰＩ）（Ｏｄａら、１９７９年）はサーモリシンの公知のタンパク質性阻害剤である。ＳＭＰＩは１０２個のアミノ酸から構成され、２つのシステイン架橋を形成し、サーモリシンに対して０．６ｎＭのＩＣ５０を示す（Ｈｉｒａｇａら、１９９９年）。しかしながら、ＳＭＰＩは他の細菌性プロテアーゼによって分解されることが発見され（Ｔｓｕｒｕら、１９９２年）、細菌感染症を治療するための化合物として使用することについてＳＭＰＩは不適格とされた。さらに、約１２ｋＤというＳＭＰＩの低分子量は腎臓による濾過によって血流からＳＭＰＩが急速に取り除かれることを意味している。
【００１３】
サーモリシン様酵素を特異的に阻害する今日までに報告されている他の唯一のサーモリシンのペプチド阻害剤は、昆虫メタロプロテイナーゼ阻害剤ＩＭＰＩαである。ＩＭＰＩαは元々免疫されたハチノスツヅリガ（Ｇ．ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）の幼虫の血リンパにおいて発見され、それから精製された（Ｗｅｄｄｅら、１９９８年）。その活性部分は６９個のアミノ酸を含み、分子内システイン結合と７６６７．７Ｄａの分子量を含む。その分子は、いずれもＭ４プロテアーゼファミリーに属する酵素であるサーモリシン、バシロリシン及びシュードリシンに対してそれぞれ０．６２ｎＭ、０．８６ｎＭ、及び８１．６６ｎＭにすぎないＩＣ５０を有することが報告されている（Ｃｌｅｒｍｏｎｔら、２００４年）。ＩＭＰＩαはヒトメタロ−マトリックスプロテアーゼＭＭＰ１、２、３、７、８、及び９に対して試験され、それらのうちＭＭＰ１とＭＭＰ２だけが無視しうる程度の阻害を示した。ＩＭＰＩαはシュナイダー細胞（Ｃｌｅｒｍｏｎｔら、２００４年）及び後に大腸菌において組換え生産された。ＩＭＰＩの構造は最近まで不明であったが（Ｇｏｍｅｓ−Ｒｕｅｔｈ、２０１１年）、ＩＭＰＩαはメタロプロテアーゼを阻害し、セリンプロテアーゼを阻害しないという事実にもかかわらず、相同性検索により、ＩＭＰＩαはセリンプロテアーゼ阻害剤のＩ８又はアスカリス（Ａｓｃａｒｉｓ）ファミリーに属するはずであることが示唆された（Ｗｅｄｄｅら、２００７年）。さらに、この比較により、活性部位ループがＩＭＰＩα中３３位のアミノ酸〜４０位のアミノ酸の間に存在し、切断部位が３７位のアミノ酸（アスパラギン）と３８位のアミノ酸（イソロイシン）の間に含まれることが推測された。メタロプロテイナーゼの他の公知のタンパク質阻害剤はＭ４プロテアーゼファミリーのプロテイナーゼを阻害しない。
【００１４】
まとめると、Ｍ４プロテアーゼファミリーのメンバーの大半の公知の阻害剤はあまりに有毒であり、非特異的であり、不安定であり、又は製造若しくは発現し難く、又はメタロプロテアーゼに対して異なる特異性プロファイルを必要とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、本発明の目的は、特定のＭ４プロテアーゼに対する有効性が上昇した、すなわち、改変されていないとしても選択された特異性プロファイルを有するＭ４プロテアーゼファミリーメンバーの阻害剤を提供することであり、広帯域メトジンシン阻害剤の潜在的な要求も含まれる。さらに、より高い安定性、より少ない毒性、又はより効率的な製造プロファイル若しくは発現プロファイルが求められる。
【００１６】
本発明の根底にある目的は請求項１及び他の独立請求項に記載のポリペプチドによって達成される。１つ以上の独立請求項に従属する請求項は本発明の特定の実施形態に関係している。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
前記ポリペプチドは、昆虫メタロプロテイナーゼ阻害剤ＩＭＰＩαタンパク質の野生型を表す配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも７０％、特には８０％、９０％、又は９５％の相同性を有し、且つ、ＩＭＰＩαの前記アミノ酸配列の３５位、３６位及び／又は３９位に少なくとも１つの変異を有し、
ＩＭＰＩαの３５位にある無極性アミノ酸のイソロイシンが、ロイシン、メチオニン及びフェニルアラニンからなる群より選択される無極性アミノ酸、又はシステイン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン及びアルギニンからなる群より選択される極性アミノ酸のどちらかによって置換され；及び／又は
ＩＭＰＩαの３６位にある無極性アミノ酸のイソロイシンが、バリン、フェニルアラニン及びトリプトファンからなる群より選択される無極性アミノ酸、又はチロシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン及びアルギニンからなる群より選択される極性アミノ酸のどちらかによって置換され；及び／又は
ＩＭＰＩαの３９位の極性アミノ酸が、無極性アミノ酸であるバリン、又は極性アミノ酸であるヒスチジン若しくはリシン、のどちらかによって置換されている、ポリペプチドである。
【００１８】
本発明のポリペプチドは特にＩＭＰＩαのＩＣ５０値未満のサーモリシンに対するＩＣ５０値を示す。
【００１９】
本発明の一実施形態において、本発明のポリペプチドは配列番号１０、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４のアミノ酸配列を有する。
【００２０】
本発明の別の実施形態において、本発明のポリペプチドはバイオアベイラビリティ、安定性、有効性などの生物学的特性又は化学的特性を改善するために、側鎖に、又はＮ末端及び／又はＣ末端に化学修飾を含み得る。その修飾によって、さらに、検出可能標識、例えば、化学発光構成要素、ポリペプチド中のアミノ酸の１又は２以上の側鎖の中にある１又は２種類以上の放射性同位元素、発色反応を行うことができる酵素等、を提供することもできる。
【００２１】
本発明の対象は、本発明のポリペプチドと、生理学的機能を有する少なくとも１種類のポリペプチド、特に抗体又は抗体断片；リポカリン、アンキリン、フィブロネクチン、トランスフェリン、テトラネクチン、アドネクチン、アルブミン、ウテログロビン、又はプロテインＡなどのスキャフォルド；トランスフェリンなどの機能性ペプチド；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの診断用途に有用なペプチド；技術面への固定を可能にするヘキサヒスチジンなどのペプチドタグ；又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、とを含む融合ポリペプチドでもある。
【００２２】
本発明の一実施形態において、本発明のポリペプチドは配列番号６、８、１２、８６、８８、９０、９２のアミノ酸配列を有する。
【００２３】
ＧＳＴには３つのスーパーファミリー（細胞質性、ミトコンドリア性、及びＭＡＰＥＧ）が存在する。ＧＳＴの細胞質性スーパーファミリークラスは４０％を超える配列相同性を有する一方、他のクラスのものの配列相同性は２５％未満であり得る。細胞質性ＧＳＴはそれらの構造に基づいて１３クラス、すなわち、α、β、δ、ε、ζ、θ、μ、ν、π、σ、τ、φ、及びωに分けられる。ミトコンドリア性ＧＳＴはクラスκに入る。ミクロソーム性ＧＳＴのＭＡＰＥＧスーパーファミリーはＩ〜ＩＶと指定されたサブグループから構成され、これらのサブグループ間のアミノ酸配列の同一性は２０％未満である。ヒト細胞質性ＧＳＴはα、ζ、θ、μ、π、σ、及びωのクラスに属し、一方でＭＡＰＥＧスーパーファミリーのクラスＩ、ＩＩ、及びＩＶに属する６種類のアイソザイムが存在することが知られている。
【００２４】
【数１】
2016525535.tif 000003
【００２５】
本発明のその他の実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは１〜１００アミノ酸長のペプチドによって本発明のポリペプチドに連結している。あるいは、本発明の融合ポリペプチドを得るために、生理学的機能を有するポリペプチドと本発明のポリペプチドとを化学結合基によって結合することができる。
【００２６】
固相合成などの化学的方法によって、又は適切な発現系においてポリヌクレオチドのコーディングを活用することによる遺伝子工学によってポリペプチド又はタンパク質を製造することができる。本発明の対象は本発明のポリペプチド又は本発明の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでもある。本発明のポリヌクレオチドは、異種性プロモーターに作動可能に連結されてもよい。
【００２７】
本発明の対象は本発明のポリペプチド及び／又は本発明の融合ポリペプチド又はそれらの誘導体、及び／又は本発明のポリペプチドをコードする部分を含む核酸を含む医薬組成物でもある。
【００２８】
本発明のポリペプチド又は本発明の融合ポリペプチドは、Ｍ４又はメトジンシンファミリーのメタロプロテイナーゼ細菌毒素、特にサーモリシン、オーレオリシン、バシロリシン、シュードリシン、ビブリオリシン又は炭疽菌ｎｐｒ５９９、を分泌する微生物が感染した動物又はヒトの治療において使用することができる。
【００２９】
本発明のポリペプチド及び／又は融合ポリペプチドは、試料中のＭ４ファミリーに属するプロテアーゼの存在又は活性を検出するために使用することができる。
【００３０】
本発明は、ＩＭＰＩαの３５位と３９位のアミノ酸の間の変異（配列番号１０、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４）を使用してサーモリシンＭ４プロテアーゼファミリーのメンバーの特異性プロファイル及び特異的阻害に関連した有効性を体系的に変えることができたという結果に基づいている。したがって、本発明のポリペプチドＩＭＰＩαはサーモリシンＭ４プロテアーゼファミリーのその他のプロテアーゼ、特定のサーモリシン、オーレオリシン、バシロリシン、シュードリシン、ビブリオリシン又は炭疽菌ｎｐｒ５９９を阻害し、ＩＭＰＩα変異タンパク質は種々のプロテアーゼに関して様々な阻害定数を示す。
【００３１】
さらに、細菌、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において同一の組換え過程を用いて、大量かつ高品質で、再フォールディングを必要とすることなく本発明の全てのポリペプチドと配列番号２からなる野生型ＩＭＰＩα（ｗｔＩＭＰＩα）の全てを非常に効率的に生産し得ることが分かった。ｗｔＩＭＰＩαの場合、ＤＮＡは配列番号１のオリゴヌクレオチドを含んでいる。ｗｔＩＭＰＩαと本発明の全てのポリペプチドはそれぞれ５つのシステイン架橋を含んでいるので、この発見は驚くべきものである。多数のシステイン架橋を含むタンパク質又はペプチドは通常は大腸菌を含むあらゆる細菌において発現し難い、又は発現不可能であると考えられており、公開されているプロトコルでは生産効率が低く冷却が必要であることが明らかにされている（例えば、Ｃｏｍｉｓ  Ｒｕｅｔｓ、２０１１年を参照されたい）。一方で、本発明の方法に従うと、タンパク質発現期の間に発酵槽の冷却を必要とすることなく、且つ、タンパク質産物を分解から保護するためにプロテアーゼ阻害剤を添加する必要なしに、ｗｔＩＭＰＩα及び本発明のポリペプチドを生産することができる。
【００３２】
本明細書において使用される場合、以下の用語は、そうではないことが明確に述べられない限り、以下の意味を有する。
【００３３】
「ｗｔＩＭＰＩα」という用語は、配列番号２のアミノ酸配列を有し、より大きな前駆体分子であるＩＭＰＩから内因的に切断される、全長ＩＭＰＩ分子のＮ末端断片から構成されるタンパク質を指す。
【００３４】
「ｗｔＩＭＰＩβ」という用語は、配列番号４のアミノ酸配列を有し、より大きな前駆体分子であるＩＭＰＩから内因的に切断される、全長ＩＭＰＩ分子のＣ末端断片から構成されるタンパク質を指す。
【００３５】
「ＩＭＰＩαループ変異タンパク質」という用語は、アミノ酸領域３５位〜３９位、特にアミノ酸領域３５位、３６位、又は３９位、において少なくとも１つのアミノ酸を置換、付加、又は欠失している以外は配列番号２（ｗｔＩＭＰＩα）と同一のアミノ酸配列を含む全てのタンパク質を含む。この定義によると、「ＩＭＰＩαループ変異タンパク質」には、例えば、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４において、３５位、３６位、又は３９位にある１つのアミノ酸が置換されているアミノ酸配列が含まれる。配列番号１０では３７位と３８位にある２つのアミノ酸がさらに置換されている。
【００３６】
「変異ＩＭＰＩα（ｍｔＩＭＰＩα）」又は「ＩＭＰＩα変異タンパク質」という用語は本発明のポリペプチドであり、配列番号２と少なくとも７０％、特に８０％、９０％、９５％相同であるが同一ではないアミノ酸配列を有し、且つ、１０００ｎＭ未満のＩＣ５０、特に１００ｎＭ未満のＩＣ５０でサーモリシン又はＭ４プロテアーゼファミリーの別のプロテアーゼを阻害する全ての組換えタンパク質又は合成タンパク質を含み、特に大腸菌において発現し得るものを含み、特にそれらには「ＩＭＰＩαループ変異タンパク質」及び「ＩＭＰＩαの構造変異体」のグループのタンパク質が含まれる。ｍｔＩＭＰＩαは、選択された変異がＩＭＰＩα変異タンパク質の生物活性を保存するという条件で、残基の挿入、置換又は欠失を含み、Ｎ末端欠失及びＣ末端欠失及び配列内欠失を含む。
【００３７】
「Ｍ４ファミリーのプロテアーゼ」という用語は、ＭＥＲＯＰＳペプチダーゼオンラインデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｒｏｐｓ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｆａｍｓｕｍ？ｆａｍｉｌｙ＝Ｍ４）において提供され、Ｂａｒｒｅｔら、（２００４年）によっても述べられている定義を有する。
【００３８】
本明細書において、「生物活性」があるという用語は、ｗｔＩＭＰＩα又は本発明のポリペプチドが１０００ｎＭ未満のＩＣ５０、特に１００ｎＭ未満又はこれより良いＩＣ５０でのサーモリシン又はＭ４プロテアーゼファミリーの別のプロテアーゼの阻害を示すことを指す。
【００３９】
「ＩＭＰＩαファミリー」という用語は、その用語単独で、生物活性が有るｍｔＩＭＰＩαとｗｔＩＭＰＩαを含むものとする。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ハイブリッドプラスミドｐＥＴ４１ＩＭＰＩαのベクターマップ。免疫的攻撃を受けたハチノスツヅリガから全ｍＲＮＡを単離し、後にＩＭＰＩαをコードするＤＮＡの増幅用鋳型として使用した。その後、ＰｓｈＡ１直線化したｐＥＴ−４１Ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にアンプリコンをクローニングしてＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）融合タンパク質を生じさせた。シーケンシングによりそのベクターへのＩＭＰＩαの正確なフレーム内クローニングを確認した。
【図２】Ｔ７発現系の誘導から３時間後のＲｏｓｅｔｔａ  ｇａｍｉ２の可溶性細胞質画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。過剰発現した融合タンパク質を矢印で示している。対応する対照（空ｐＥＴ−４１と非誘導Ｔ７発現系）は対応するバンドを示していない。
【図３】ＧＳＴタグ化ＩＭＰＩαの精製工程からのＨＰＬＣのＵＶ検出器データ。室温で、固定化グルタチオンを有する樹脂を使用したＨＰＬＣでのアフィニティークロマトグラフィーにより精製を行っている。室温で、固定化グルタチオンを有する樹脂を使用したＨＰＬＣでのアフィニティークロマトグラフィーにより精製を行っている。
【図４ａ】精製したＧＳＴタグ化ＩＭＰＩαのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。より大量の変異タンパク質にはＧＳＴバインド・フラクトゲル・カートリッジ（メルク社、ダルムシュタット）を使用し、４０ｍｇ未満の量にはグルタチオンスピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ；サーモ・サイエンティフィック社、ロックフォード）を配備した。
【図４ｂ】組換えエンテロキナーゼ（メルク社、ダルムシュタット）によるＮ末端ＧＳＴタグ化ＩＭＰＩαの特異的切断後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。切断は室温で１６時間行われた。非タグ化ＩＭＰＩαを矢印で示している。
【図５】ｍｉｃｒＯＴＯＦ−Ｑ質量分析装置（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社）での質量分光測定法により、下流の処理が成功したことを確認した。逆相カラム（Ａｃｃｌａｉｍ  １２０、Ｃ８、３μｍ、１２０Å、２．１×１５０ｍｍ；Ｄｉｏｎｅｘ社）上で、クロマトグラフィーを、ギ酸０．１％を含む水中のアセトニトリル１〜８０％（１．６３％／分）の濃度勾配を適用して行うことにより試料分析を達成した。副産物（１及び３で示されたピーク）と主産物（ピーク１）により７，６７７ｋＤａという正確な質量が示されている。
【図６】ハチノスツヅリガのＩＭＰＩαとＩＭＰＩβを含む全長ＩＭＰＩの野生型タンパク質構成。
【図７】ｗｔＩＭＰＩα及びフェナントロニン  対  炭疽菌タンパク質ｎｒｐ５９９及びＩｎｈＡの阻害プロット。
【図８ａ】ハチノスツヅリガのＩＭＰＩαホモログの多重アラインメント。
【図８ｂ】他の鱗翅目のトランスクリプトームにおいて発見されたＩＭＰＩ（配列非公表）の多重アラインメント。
【図８ｃ】バチルス・サーモプロテオリティカスのＭ４メタロプロテアーゼサーモリシンの炭疽菌（Ａ０２４８株）の、メタロプロテアーゼｎｐｒ５９９とのペアワイズアラインメント。
【図９】Ｍ４メタロプロテアーゼサーモリシン（バチルス・サーモプロテオリティカス）へのペプチド阻害剤ＩＭＰＩαの結合を示す図である。赤色の領域は阻害剤とプロテアーゼの間のファン・デル・ワールス接触領域を表している。イソロイシン（Ｐ１’）（紫色）がそのメタロプロテアーゼの特異性に寄与するＳ１’ポケットに完全に合致し、したがってこの阻害剤は鍵と鍵穴の様式で結合している。
【図１０】プロテアーゼ特異的活性を検出するためのラテラルフロー装置の模式図である。その原理は薄層クロマトグラフィーに基づいている。綿棒で収集した膿漿が装置中で溶離液により接線流を介して運ばれる。したがって、病原体が産生したＭ４メタロプロテアーゼも、様々なメタロプロテアーゼに対するある特定の特異性を示すＩＭＰＩ変異タンパク質と結合するまで装置中を移動する。異なる変異タンパク質がその装置の固相上で集中したスポットに結合し、それにより異なるメタロプロテアーゼを明確に特定することができる。後に移動相中に存在する検出抗体によりスポットを視覚化する。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
表１：アミノ酸置換と、サーモリシン及びシュードリシンに対するそれぞれの機能性、及びそれぞれのＩＣ５０値の比率のまとめ。これらの比率の変化は、異なるプロテアーゼに対して設計されたＩＣ５０の比率を有する阻害剤を作製し得ることを意味している。
【００４２】
表２：サーモリシンの阻害のための詳細な実験パラメーターと結果。
【００４３】
本発明の１つの態様において、Ｍ４プロテアーゼファミリーのメンバーの阻害についてｗｔＩＭＰＩαプロファイルと異なる特異性プロファイルを示す、本発明の生物活性が有るループポリペプチドが提供される。ループアミノ酸は、進化において特によく保存されてきたため、本発明のループポリペプチドに少しでも生物活性が有るという事実は驚くべきことである。さらに驚くべきことに、特定のループアミノ酸を変更することによって、サーモリシン又はシュードリシンに対する結合定数、又はこれら両方に対する結合定数をも増加させ得る。
【００４４】
ｗｔＩＭＰＩαのＩ３６（イソロイシン）を置換することによって阻害定数を改善する新しい方法が開発されており、このことは驚くべきことである。というのもこの３６位においてイソロイシンは既に前記ペプチダーゼのアミノ酸Ｈ１４６（ヒスチジン）及びＴ１５７（チロシン）とのＣ−Ｃ相互作用について完璧なプロファイルを示しており、したがって、この相互作用をさらに強力にすることを目標にしてＩＭＰＩ変異体又は小分子を設計する試みが報告されていなかったためである。しかしながら、発明者らは、この位置のアミノ酸又は修飾型アミノ酸が長鎖脂肪族側鎖を有し、好ましくは１２以上の高いｐＫａを有すると、阻害定数が顕著に改善されることを発見した。よく適合するアミノ酸の例にはＫ、Ｍ、Ｈ、及び特にＲが含まれる。
【００４５】
驚くべきことに、その他の置換、例えば、後続の段落において記載されている置換によって阻害剤の効力が増加し得ることが分かった（表１、２）。
サーモリシンの改善された阻害を示す本発明のループポリペプチド分子はＩ３５Ｌ、Ｉ３６Ｆ、Ｋ、Ｒ、Ｖ、Ｙ、Ｑ、Ｄ、Ｈ、Ｍ、Ｔ、又はＷ、Ｒ３９Ｋ又はＶを含む。
シュードリシンの改善された阻害を示す本発明のループポリペプチド分子はＩ３５Ｌ又はＦ、Ｍ、Ｗ又はＹ、Ｉ３６Ｒ、Ｑ、又はＭ、Ｒ３９Ｋ及びＡを含む。
サーモリシンとシュードリシンの両方の改善された阻害を並行して示す本発明のループポリペプチド分子はＩ３５Ｌ、Ｉ３６Ｒ、Ｑ、又はＭ、Ｒ３９Ｋを含む。
サーモリシンとシュードリシンの両方に対して同等の効力を示す本発明のループポリペプチドはＩ３５Ｌ、又はＷを含む。
【００４６】
この結果は驚くべきものである。なぜなら、各タンパク質の機能に関連する領域の近くで１つのアミノ酸が変更されると、成功への合理的な期待が無いからである。特に、酵素に対するペプチド系阻害剤はその酵素に結合する疎水性アミノ酸をその疎水性活性中心付近に含むはずであるという一般的な仮説（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、２０１３年、Ｂｉｅｌａら、２０１３年）を考慮すると、この結果は驚くべきものである。しかしながら、これらの結果は、本発明のポリペプチドにおいてアミノ酸の疎水性が阻害の主要な要因ではないことを示している。
【００４７】
単一部位変異の組合せによって本発明のポリペプチドの特性をさらに変更し、その阻害剤の効力をさらに増加させ得ると理解されている。
【００４８】
Ａｒｎｏｌｄら、２００３年ａとＡｒｎｏｌｄら、２００３年ｂに記載されているように進化工学（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）の公知の技術によって本発明のポリペプチドを得ることができる。また、米国特許第７７３２５８７号明細書及び第４５５４１０１号明細書に開示されている教示と原理によって当業者に知られるような、アミノ酸のサイズ、電荷、極性及び他の生化学的パラメーターを考慮しながら保存的又は非保存的アミノ酸置換のルールを適用することを含む、各アミノ酸配列のナレッジベーストエンジニアリングによって、又は変異ＩＭＰＩαと選択した標的プロテアーゼとの結合エネルギーを計算又は推定する適切なコンピュータープログラムを使用することによって、又は他のタンパク質に対する相同性又はタンパク質配列の抗原性を評価して、計算して改変した遺伝子配列を標準的な分子生物工学的方法により細菌ゲノムに導入することによって、本発明のポリペプチドをさらに得ることができる。どのＩＭＰＩα及びその変異タンパク質内のアミノ酸欠失も、ループ領域（配列番号２のアミノ酸３５〜３９）の外側の領域に行ってよく、その場合はそれらの欠失は標的プロテアーゼと直接的には相互作用しないと考えられる。ループ領域内でアミノ酸欠失を行ってもよく、その場合はそれらの欠失は生物活性を改変する可能性が高いと考えられる。
【００４９】
ｗｔＩＭＰＩαと、他の種に由来する類似タンパク質、例えば、フシアリ属の配列番号９５、及び図９に示される２３種類の他の昆虫関連アミノ酸配列とを比較すると、３９位のアミノ酸（Ｒ）を除いてループ領域（配列番号２のアミノ酸３３位〜４１位、特に領域３５位〜３９位）が非常によく保存されていることが明らかである。そのため、ＩＭＰＩαループ変異タンパク質、例えば、配列番号１０、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４も強力な予期せぬサーモリシン阻害活性を示すことは驚くべきことである。
【００５０】
本発明の別の態様において、発明者らによって特定された条件下、特に室温及び最大３７℃で、発酵槽の冷却又は生産されたタンパク質の再フォールディングを必要としない条件下で、ｗｔＩＭＰＩαとＩＭＰＩα変異タンパク質、特に本発明のループポリペプチドを細菌細胞中で組換え生産し得ることが分かった。本発明による方法、使用される機器及び試薬が以下の実施例２に詳しく記載されている。しかしながら、正確に折り畳まれたタンパク質の産出量に影響することなく、使用する試薬の濃度の改変と生産生物（ｐｒｏｄｕｃｅｒ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）（大腸菌）の遺伝子構成の改変を行い得ることが理解されるべきである。例えば、生産宿主として大腸菌を他の細菌で置き換えることもでき、追加の機能を有する追加のプラスミド又は遺伝子領域を生産細菌に加えることもできる。さらに、培地成分を異なる順序又は濃度で提供することもでき、培養時間を変えることもできる。生物活性が有るＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαの生産効力に与えるマイナスの影響が５０％以下であるか、又はプラスの影響さえ与えるようなこれらの改変は本発明の範囲内と考えられることが理解されるべきである。
【００５１】
再フォールディングの必要なく、機能性ＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαの発現が実施例３及び４に開示される系と比較して少なくとも５０％まで維持されており、且つ、発酵槽の冷却が必要とされない限りにおいて、本発明は発現系の要素のその他の改変も想定している。例えば、ｐＥＴ−４１ａ（＋）以外の発現ベクターを使用してよく、それらの発現ベクターは融合タグに結合していなくてもよく、又はＧＳＴ、Ｈｉｓタグ以外の融合タグ、及びＴ７以外のプロモーターに結合していてもよく、その他の調節因子又は他の融合エレメントを含んでいてもよい。使用するオペロンに応じてＩＰＴＧ又は他の誘導物質を用いることができる。ＰｓｈＡＩ以外の制限部位、例えばＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨ１をｐＥＴ−４１ａ（＋）又は他のベクターにおいて使用することができる。Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２  ｐＬｙｓＳ以外の大腸菌株を使用してよく、これに追加のｔ−ＲＮＡ遺伝子又はａｈｐＣ変異を含んでいても含んでいなくてもよく、大腸菌以外の細菌を使用してもよい。
【００５２】
その他の改変は、限定されないが、培養時間、試薬とそれらの濃度、及び使用する消耗品、例えば、捕捉用樹脂及びクロマトグラフィー設備及び精製用分離媒体など、当業者に知られている下流の処理ステップに関連するものでもよい。
【００５３】
細菌におけるＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαの組換え生産はタンパク質の他の全ての生産方法と比較して非常に費用対効果が良い。クローニングとその後のペプチドを生産する細胞株の開発は、例えば哺乳類細胞又は昆虫細胞を用いるときと比べて細菌を用いるとより速く、より安価である。生産時に発酵培養液体積当たりの生産されるタンパク質の量は真核細胞培養物と比較してずっと多い。結果として、細菌はタンパク質生産にしばしば使用される実績のある宿主であることから、細菌、特に大腸菌において組換えタンパク質を生産する方法には大きな需要がある。ｗｔＩＭＰＩαは脱グリコシル化後にもその生物活性を保持することが知られており（Ｗｅｄｄｅら、１９９８年）、そのため、細菌により生産された、グリコシル化されないＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαは正確に折り畳まれれば生物活性を有する。
【００５４】
しかしながら当業者は、５つのシステイン架橋を形成するＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαのようなタンパク質は正確に折り畳まれず、したがって大腸菌宿主の封入体の中にほぼ完全に蓄積されると予期するであろう。封入体を単離及び溶解し、尿素又はグアニジルクロリドのようなカオトロピック塩を使用して封入体のタンパク質内容物を変性させ、後続のステップで透析等により塩を再び除去して動力学的に制御された方法でタンパク質の再フォールディングを可能にする、幾つかの処理法がこれまでに開発された。しかしながら、ＩＭＰＩαのような複数のシステイン架橋を有するタンパク質の再フォールディングの成功率は通常は低く、適切な再フォールディング条件を見つけるために時間と資源を費やす試行錯誤的方法が今日においても必要とされる。適切な再フォールディング条件を予測又は実験的に決定することは一般的に未だに不可能である。
【００５５】
そのため、知る限り例外なく、本発明の方法で、再フォールディングステップを必要とせずに複雑な三次構造を有するＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαのようなシステインを多く含むタンパク質ファミリーを細菌中で組換え生産し得ること、特に、細菌のタンパク質生産速度を低下させ、それによって正確に折り畳まれたタンパク質に対する不正確に折り畳まれたタンパク質の比率を低下させるための一般的な手法である発酵槽の冷却を行わずにその生産が起こり得ることは驚くべきことである。
【００５６】
本発明の別の態様において、ＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαの使用、特にｗｔＩＭＰＩαの使用が炭疽菌プロテアーゼｎｒｐ５９９の阻害のために提供された。炭疽を治療する現行のアプローチには疾患予防のためのＢｉｏＴｈｒａｘ（エマージェント・バイオソリューションズ社、ロックビル、メリーランド、米国）などのワクチン接種、又はシプロフロキサシン若しくはドキシサイクリンなどの抗生物質が含まれる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｉｏｎａｌｔｅｒｒｏｒａｌｅｒｔ．ｃｏｍ／ａｎｔｈｒａｘｔｒｅａｔｍｅｎｔ／）。ワクチンは予防用の使用にのみ認可されており、一方、細菌の病毒性因子による症状が軽減する程度にまで抗生物質が細菌に対して効果を発揮するまでには数日かかる。病毒性因子を中和する化合物が最近開発され、当技術分野の水準では一般によく知られており、炭疽菌に関してはこれまでに開発された病毒性因子を標的とする大半の化合物がＬＦを標的とする。しかしながら、最近の証拠によって、ｎｒｐ５９９は、例えば、線維素溶解系（Ｃｈｕｎｇら、２０１１年）を標的とすることにより易出血性出血を誘発する主要な炭疽菌病毒性因子のうちの１つであること（Ｃｈｕｎｇら、２００６年）、及び、ｎｒｐ５９９はヴァン・ヴィレブランド因子も分解し、それによって凝固カスケードを妨害すること（Ｃｈｕｎｇら、２００８年）が示されているにもかかわらず、ｎｒｐ５９９の特異的阻害剤はこれまで報告されなかった。
【００５７】
米国特許出願公開第２００４／０１８１９３号明細書は、特に炭疽菌に感染したヒトの治療のための、抗生物質と抗原性化合物の両方の同時投与又は時間差を設けた投与を教示する。著者らは仮説の抗体を含むプロテアーゼ阻害剤の幾つかの例を提供しているが、彼らは標的としてｎｒｐ５９９を開示していない。
【００５８】
驚くべきことに、炭疽菌が昆虫に感染することは知られていないという事実にもかかわらず、本発明のポリペプチド及び特にｗｔＩＭＰＩαはｎｒｐ５９９の強力で特異的な阻害剤であることが分かった。ｗｔＩＭＰＩαはナノモル代の濃度でｎｐｒ５９９を阻害することが分かった。
【００５９】
炭疽菌感染又は炭疽菌毒素により引き起こされる症状を治療するため、抗生物質、特にシプロフロキサシン又はドキシサイクリン；抗菌ペプチド；細菌性プロテアーゼの他の阻害剤；又は感染症の患者の生理学的状態を改善する化合物と、本発明のポリペプチド及び特にｗｔＩＭＰＩαとを組み合わせることができる。
【００６０】
哺乳類及び昆虫の発現系、植物及び細菌系を含む、組換え細胞株及び組換え組織において；又は、合成的に、本発明のポリペプチドを生産してもよい。
【００６１】
通常、他のタンパク質及びタンパク質断片を含まないようにＩＭＰＩα変異タンパク質及びｗｔＩＭＰＩαをそれぞれ単離及び精製することができる。ＩＭＰＩα変異タンパク質及びｗｔＩＭＰＩαに、製造過程に使用される生産技術に起因して存在し得る他のタンパク質の約８０％が除去されていることが好ましい。本発明のポリペプチド又はｗｔＩＭＰＩαに他のタンパク質の約９０％が除去されていることがより好ましく、他のタンパク質の約９５％が除去されていることが特に好ましく、他のタンパク質の約９８％超が含まれないことが最も好ましい。しかしながら、以下にさらに詳しく記載されているように、医薬品としての投与の前にその所望のタンパク質を他の有効成分、化学組成物及び／又は適切な医薬製剤物質と組み合わせてよいことが理解される。
【００６２】
ＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαの生物活性は、プラズモン共鳴分光法に使用される被覆済みガラス担体に固定化されたプロテアーゼへの本発明のポリペプチド又はｗｔＩＭＰＩαの結合の測定などのアッセイにより、インビトロで評価することができる。あるいは、本発明のポリペプチド又はｗｔＩＭＰＩαをそのガラス担体に固定化することができ、そのプロテアーゼを添加してそのアッセイを開始することができる。このアッセイにより各相互作用の結合速度と解離速度を測定することができる。
【００６３】
平行線定量法、例えばマイクロタイタープレート方式の平行線定量法により、及び発色作用の検出、又は適切な光源による励起に応じて放射される蛍光の変化の測定により、生物活性を検査することもできる。
【００６４】
アミノ酸配列の付加には、さらに、１残基長から１５０残基長以上の範囲のＮ末端融合又はＣ末端融合を含んでもよく、単数のアミノ酸残基又は複数のアミノ酸残基、典型的には約１アミノ酸から１０アミノ酸まで、より典型的には１アミノ酸から５アミノ酸まで、及び最も典型的には１アミノ酸から３アミノ酸までの範囲のアミノ酸残基のＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαへの配列内挿入をさらに含んでもよい。Ｎ末端付加にはメチオニン又は追加のアミノ酸残基若しくは配列の付加が含まれる。Ｎ末端付加の別の例には、配列番号９４のシグナル配列が配列番号２のｗｔＩＭＰＩαに直接的に（ｂｌｕｎｔｌｙ）付加されないことを条件として、シグナル配列の融合が含まれる。
【００６５】
ＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαに対する付加のその他の例は、抗体（Ａｂ）又は抗体断片との融合を含む。Ａｂ断片は例えばｓｃＦＡｂ、ｓｃＦｖ断片、若しくは単ドメイン抗体、又はラクダ科動物起源の抗体（ｈｃＩＧ）若しくはサメ起源の抗体（ＩｇＮＡＲ）、又はそれらの各ＶＨＨドメインを含み得る。その融合はＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαに融合しているターゲティング部分（ＣＤＲドメイン）を提供するのに役立つことができ、それによってその融合タンパク質はその抗体断片に特異的な抗原を提示する表面に蓄積及び濃縮され得る。ＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαを抗体に融合させる別の動機は、抗体定常領域の二量体化特性から利益を得て、２つのＴＮＦ受容体断片が抗体の定常ドメインに融合しているエタネルセプト（エンブレル）と同様に、ＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαの二価の形態を得ることであり得る。加えて、そのような二価抗体キメラは十分大きいため、およそ６５ｋＤａのサイズ排除障壁が存在する腎臓での急速なクリアランスを受けずにすみ、それにより患者の体におけるその融合タンパク質の存続時間が非常に長くなる。付加物は、例えばリポカリン、アンキリン、フィブロネクチン、トランスフェリン、テトラネクチン、アドネクチン、アルブミン、ウテログロビン、又はプロテインＡに由来する、他のスキャフォルドも含み得る。想定される他の付加物には機能性ペプチド、例えば、脳又は脊髄に蓄積した細菌毒素の阻害に有用な特性でありうる、融合タンパク質の血液脳関門の通過を可能にするトランスフェリン；診断用途に有用な付加物、例えば、蛍光検出を可能にする緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）；または技術面への固定を可能にするペプチドタグなどが含まれる。
【００６６】
具体的には、本明細書に記載される本発明のポリペプチドは、Ｎで連結された炭水化物又はＯで連結された炭水化物の付加によって改変されている前記タンパク質のＮ末端、Ｃ末端又はあらゆる部位における非天然アミノ酸の付加若しくは欠失、又は非天然アミノ酸との置換を含み得る。例えば、ポリエチレングリコールなどの水溶性ポリマーを結合させるためにシステインを付加することができ、又は前記ペプチドへのポリマーの結合のためにはリシン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、又はチロシンのような他のアミノ酸を使用することもできる。別の例として、トリペプチド配列ＮＸＴ若しくはＮＸＳ又はそれらの断片の挿入が挙げられ（ＸはＰ以外の任意のアミノ酸を指定している）、これらの配列はグリコシル化要素を付加する細胞内酵素によって認識され得る配列である。適切かつ臨床的に許容可能な水溶性ポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とポリサリチル酸（ＰＳＡ）が含まれる。
【００６７】
別の変異又は付加として、タグ、特にペプチドタグ、例えば精製カラムの部分等への結合を促進するために使用できるヘキサヒスチジンなど、が含まれ得る。これらのタグはプロテアーゼの基質として働くペプチド配列を含んでよく、それによってそのタグがこれ以上必要とされなくなったところでそのタグを故意に切断することができる。
【００６８】
さらに、化合物又はナノ粒子が付加されるＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαも想定される。この付加は、例えば、酵素Ｏ−６−アルキルグアニン−アルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）又はその誘導体をＩＭＰＩα変異タンパク質若しくはｗｔＩＭＰＩαに対して、又はペプチドタグに対して用いることにより達成できる。他の例として、変異によって導入されるシステインへの結合（Ｊａｇａｔｈら、２００８年）、又は炭水化物部分への結合（Ｆｉｓｃｈｅｒ−Ｄｕｒａｎｄら、２０１０年）が含まれる。化合物としては、例えば、標識部分、特にインビボのイメージング用途の標識部分；ターゲティング部分、例えば、特定の器官において複合体化ＩＭＰＩαファミリーメンバーを濃縮するための受容体リガンドなど、が含まれ得る。表面又は粒子上に複合体化ＩＭＰＩαファミリーメンバーを固定化するのに適した別の化合物として、例えば診断目的では、ビオチンが挙げられる。インビボ検出又はイメージング用途のために、量子ドットなどのナノ粒子を付加することができる。腎臓によって血流から複合体が急速に排除されることを防ぐために複合体のサイズを増加させるデンドリマー又は他の粒子を付加することができる。
【００６９】
βペプチドなど、ペプチド骨格に対する修飾も本発明の下で想定されている。βペプチドにおいて、アミノ基はα炭素の代わりに各アミノ酸のβ炭素に結合しており、プロテアーゼの攻撃を受けにくい。他のペプチド骨格の修飾、例えばアミド窒素のアルキル化及びアミド基の生物学的等価性置換、も可能である。
【００７０】
さらに、本発明はＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを、そのポリヌクレオチドが配列番号１の完全野生型配列、又は配列番号３が直ぐに続く配列番号１と同一ではないことを条件として、さらに提供する。ｗｔＩＭＰＩαをコードしていないオリゴヌクレオチド領域が挿入されているヌクレオチド配列がさらに考えられている。本明細書に基づき、且つ、普遍的コドン表を使用して、当業者はＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαをコードする核酸配列の全てを決定することができる。目下、好ましい核酸配列には配列番号９、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３をコードする核酸配列が含まれる。
【００７１】
ＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαの化学合成も想定されており、化学合成は非天然アミノ酸又は骨格修飾を含む修飾型ＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαを合成するための必須経路である。従来、化学合成は比較的大きなペプチドの場合は費用がかかりすぎると考えられていたが、マイクロウェーブ合成のような合成技術の最近の進歩により、この制約の対象はさらに大きなタンパク質にシフトしてきた。最近のアプローチにより、幾つかの異なる保護基を並行して使用することによって現在３つまでのシステイン架橋を正確に立体配置させるという問題も解決される。
【００７２】
本発明は高い品質及び効率でＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαを生産するために大腸菌の使用を想定しているが、ＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαを組換え生産するために他の宿主を使用してもよく、それらには、大腸菌の他の株；バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）のような他の細菌；酵母、ピキア、若しくはハンゼヌラのような真菌系；原生動物のような真核細胞；シュナイダーＴ７若しくはＳｆ９のような昆虫細胞株；ＣＨＯのような哺乳類動物細胞株；ＨＥＫ２９３のようなヒト細胞株；又はヤギのような遺伝子導入動物；又はタバコのような植物、が含まれる。
【００７３】
ＩＭＰＩα変異タンパク質若しくはｗｔＩＭＰＩα又はそれらの修飾型は、医薬組成物を形成するための成分と組み合わせてもよい。その医薬組成物は水と生理学的濃度の塩、溶解剤若しくは分散剤、抗酸化剤、又はリポソームなどの粒子形成性ミセルを含み得る。リポソームはｂａＩＭＰＩα又はその修飾型を内部に含んでもよい。ガラス製又はプラスチック製のバイアル瓶又はシリンジにこの医薬組成物を充填してよい。その医薬組成物はその医薬組成物の乾燥又は凍結乾燥を助ける添加剤、例えば、シクロデキストリン類又は多糖類、特に二糖類、を含んでもよい。
【００７４】
動物、特に哺乳類又若しくは類、又はヒトにおける疾患であって、Ｍ４ファミリーのプロテアーゼの活性に関連する疾患を治療するための医薬、特に非経口注射用医薬としてＩＭＰＩα変異タンパク質若しくはｗｔＩＭＰＩα又はそれらの修飾型を使用することができる。そのような疾患は、例えば、細菌感染症、特に、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、とりわけ多剤耐性黄色ブドウ球菌、炭疽菌、緑膿菌、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、又はレジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）による感染症であり得る。また、そのような疾患は全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、又は敗血症であり得る。
【００７５】
ＩＭＰＩα変異タンパク質若しくはｗｔＩＭＰＩα又はそれらの修飾型は、適切な医薬組成物を使用して、非経口投与、経口投与、又は局所投与することができる。あるいは、医薬が患者の創傷に溶出するように、パッチ又は創傷デブリドマンにＩＭＰＩα変異タンパク質若しくはｗｔＩＭＰＩα又はそれらの修飾型を接触させることもできる。
【００７６】
並行して、又は時間差で他の治療と組み合わせて、特に病毒性因子の他の阻害剤、抗生物質、又は抗菌ペプチドと組み合わせて、ＩＭＰＩα変異タンパク質若しくはｗｔＩＭＰＩα又はそれらの修飾型を投与することができる。
【００７７】
さらに、ＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαのＲＮＡ配列を含む配列、特に、配列番号１、５、９、１１、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１のような配列を有し、且つ、標的生物においてＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαタンパク質に転写され得るＲＮＡ分子、が想定されている。そのようなＲＮＡ分子はリポソーム又はＰＥＩのようなトランスフェクション剤と組み合わせて投与され得る。
【００７８】
本発明は診断目的の装置におけるＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαの適用も想定している。幾つかの事例では生体液中のプロテアーゼ活性を、特にそれらがいくつか存在する場合にはプロテアーゼ活性プロファイルを決定することが有益である。
【００７９】
細菌が汚染混入した体液について、プロテアーゼ活性の決定は細菌の存在についての情報だけでなく、それらの活性と相対的濃度についての情報も提供する。
【００８０】
創傷、特に治癒が遅い創傷又は慢性的な創傷において、創傷治癒の生理学的ステージは治癒中のプロテアーゼ活性の特異的発達によっても特徴づけられるので、プロテアーゼ活性プロファイルの決定も重要である。内在性宿主プロテアーゼの活性と細菌性プロテアーゼの活性を区別することはさらに重要である。
【００８１】
ＰＣＲアッセイ又はリアルタイムＰＣＲアッセイは、存在する特定の細菌を定量するものの、細菌の活性の検査に適していないので、これらの試験によっては十分な情報が得られない。
【００８２】
現在、切断されたプロテアーゼ基質が蛍光を発生するプロテアーゼ活性の検査室検査が存在する。これらの検査の多くがプロテアーゼの全体的な存在を判定し、それらの検査のうちにはプロテアーゼ濃度のプロファイルを決定することができるものが幾つかある（Ｃｈｅｎら、２０１３年）。現在のところプロテアーゼ活性の唯一のポイントオブケア検査であるＳｙｓｔａｇｅｎｉｘ社（ガトウィック、英国）製のＷｏｕｎｄｃｈｅｋ（登録商標）は全体的なプロテアーゼ活性を測定するが、各プロテアーゼ種の濃度を別々に定量することができない（Ｓｔｒｏｈａｌら、２０１２年）。
【００８３】
本発明による診断方法はこの問題を解決する。この診断方法において、ＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαがＭ４プロテアーゼを特異的に結合させるために使用される。複数種のＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαを使用すれば、異なるプロテアーゼ濃度を決定することができる。その時には本発明のポリペプチド又はｗｔＩＭＰＩαの間の結合強度の違いを用いてＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαの濃度の違いを計算する。
【００８４】
その診断方法の好ましい実施形態では、当技術分野の水準で知られているラテラルフロー検査と類似の装置を使用する。その装置ではメンブレンストリップ（吸収材）を使用して液体試料を吸収し、その試料は毛細管力によってメンブレン中を移動する。好ましい実施形態において、メンブレンはニトロセルロース又はナイロン繊維若しくはナイロン組織で裏打ちされたニトロセルロースから構成される。このストリップ上の特定の場所にＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαが固定されており、試料液の少なくとも一部が流動中にこの場所を通過する。その試料中に存在するプロテアーゼはその固定化されたＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαによって捕捉される。第２ステップにおいてそのプロテアーゼの異なる結合エピトープを標的とする検出捕捉分子を含むもう１つの溶液を添加する。直接標識又は酵素標識によって、検出シグナル、例えば、発色性、蛍光性、又は電気化学性でもよい検出シグナルを生じるように、これらの検出捕捉分子は調製されている。検出捕捉分子を標的とする二次捕捉分子によってシグナル強度を増加させることも可能である。好ましい実施形態において、少なくとも１種類の捕捉分子は抗体である。本発明による診断方法の特定の利点は、１種類だけの抗体が必要とされるのにもかかわらず、異なるＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩαが固定化されている特定の位置への特異的な結合によって数種類のプロテアーゼを区別し得ることである。さらに、試料中にプロテアーゼが存在していなくても検出捕捉分子又は二次捕捉分子が結合する対照領域が、メンブレンストリップ上の別の場所に存在する。好ましい実施形態において、その対照領域中の捕捉機能性は、固定化されたプロテアーゼ又は固定化された検出捕捉分子によってもたらされる。
【００８５】
異なる実施形態において、ＩＭＰＩα変異タンパク質又はｗｔＩＭＰＩα以外の捕捉分子、特に抗体がメンブレンストリップ上に固定化されており、プロテアーゼが、特に二次捕捉分子と組み合わせて、検出捕捉分子として添加される。この実施形態では固定化されたプロテアーゼ又はＩＭＰＩα変異タンパク質若しくはｗｔＩＭＰＩαを含む対照領域も必要とする。
【００８６】
プロテアーゼ含有量の評価は、目視検査又はＣＭＯＳベース画像化センサー若しくはスキャナーなどのセンサー装置によって行われる。センサーが使用される事例では、それぞれの結合定数又は他の結合パラメーターが分かっている場合、ソフトウェアを使用して、重複している可能性がある本発明のポリペプチド又はｗｔＩＭＰＩαの結合プロファイルからプロテアーゼの真の濃度比を計算することができる。特に、そのようなソフトウェアは個々の濃度を計算するために線形方程式系を使用してよい。
【００８７】
別の好ましい実施形態において、濃度をより正確に決定するために特に画像化センサーを使用することによって結合反応速度を抽出する。
【００８８】
例えば、ピペッティング装置、ペーパーストリップ、綿棒、又はニードルによって試料を添加することができる。前記装置はメンブレンストリップ中への制御されていない流動を防ぐシールを設けることができる。
【００８９】
本発明の理解を助けるために一連の実験の結果を説明する次の実施例が含まれる。本発明に関連する次の実施例は、もちろん、本発明を具体的に制限するものと解釈されるべきではなく、現在知られているにしても、後で開発されるにしても、当業者の視野範囲内である本発明のそのような変形例はこの後で請求されるように本発明の範囲内にあると考えられる。
【００９０】
【数２ａ】
2016525535.tif 000004
【００９１】
【数２ｂ】
2016525535.tif 000005
【００９２】
【数２ｃ】
2016525535.tif 000006
【００９３】
【数３】
2016525535.tif 000007
【実施例】
【００９４】
実施例１
全ＲＮＡ単離とｃＤＮＡ合成
次の溶液を使用して、免疫付与に終齢幼虫を使用した：（４．０５×１０４ｃｆｕ／ｍｌ）大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州）、及び（０．７×１０４ｃｆｕ／ｍｌ）ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）（ＤＭＳＺ参照番号４９５）。マイクロアプリケーターに装着した１ｍｌのディスポーザブルシリンジと０．４ｍｍの針を使用して各溶液の１０マイクロリットルの試料体積を血体腔の背外側に注射した。全ＲＮＡ単離のために注射から８時間後にＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ドイツ）を製造業者の指示に従って使用して幼虫をホモジナイズした。ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ）を製造業者の指示に従って使用してｃＤＮＡを合成した。
【００９５】
実施例２
ＩＭＰＩの調製（発現と精製）
１．異種性発現系の構築
組換えタンパク質の強力で再現性のある発現を得るために、大腸菌細胞のＴ７ポリメラーゼのＩＰＴＧによる誘導によりタンパク質発現を可能にする、Ｔ７ベースの発現系であるｐＥＴ−４１ａ（＋）を選択した。フォワードプライマー（５’−ＧＡＴＡＧＴＣＣＴＡＡＴＴＴＧＴＡＡＣＧＧＴＧＧＡＣＡＣ−３’）とリバースプライマー（５’−ＣＴＡＣＧＡＡＣＧＴＡＴＴＴＴＡＧＧＡＣＡＧＴＣＴＴＴＴＡＴＣＧ−３’）を使用して成熟ＩＭＰＩαの配列を増幅した。その断片をベクターｐＥＴ−４１ａ（＋）のＰｓｈＡＩ部位にクローニングし、そこでそれをｐ４１ＩＭＰＩαと名付け、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２  ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社、ドイツ）に形質転換した。結果生じたクローンをシーケンシング（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ社、ドイツ）により確認した。
【００９６】
２．組換えＩＭＰＩαの発現と生産
ｉ．前培養：１％（重量／体積）グルコース、Ｃｍ３４、Ｋａｎ５０及びＴｃ１２．５を含むＬＢ培地にコロニーに由来する細胞材料を接種し、回転シェーカー上で、３２℃でＯＤ６００が１になるまで培養した。その後、その前培養物を冷蔵庫の中に４℃で保存した。
ｉｉ．本培養：１％（重量／体積）グルコース、Ｃｍ３４、Ｋａｎ５０を含むＬＢ培地に前培養物を３％（体積／体積）で接種し、回転シェーカー上で、３２℃でＯＤ６００が１になるまで培養した。ＯＤ６００が１に達したところで１ｍＭのＩＰＴＧにより組換えタンパク質の発現を誘導した。その後、その本培養物を回転シェーカー上で３２℃でさらに３時間培養した。
ｉｉｉ．重量が既知の遠心管を使用して１０，０００ｇで１０分間の遠心分離により液体培養物から細胞を回収した。ペレットをデカントで排水し、最大限の量の液体を取り除いた後でペレットの湿重量を決定した。
ｉｖ．ピペット操作と穏やかなボルテックス混合により細胞ペレットをＢｕｇＢｕｓｔｅｒ試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ社、ドイツ）に室温で再懸濁した。湿潤細胞ペーストのグラム当たり５ｍｌの試薬を使用した。１ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ試薬当たり１μｌ（２５単位）のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ社、ドイツ）を添加した。
ｖ．このプロトコルのステップ（ｉｖ）において得られた懸濁液をゆっくりとした設定の振盪プラットフォーム上で室温で２０分間インキュベートした。インキュベーションの最後に抽出液に粘り気が無いように気をつけた。
ｖｉ．４℃、１６，０００×ｇで２０分間の遠心分離により不溶性細胞破片を取り除いた。
ｖｉｉ．上清を新しいチューブに移した。可溶性抽出液を直接的にＧＳＴ・Ｂｉｎｄ（商標）樹脂（Ｎｏｖａｇｅｎ社、ドイツ）に負荷した。
ｖｉｉｉ．製造業者（ＧＥヘルスケアライフサイエンス社）の指示に従ってアフィニティークロマトグラフィーを行った。
【００９７】
３．本培養：１％（重量／体積）グルコース、Ｃｍ３４、Ｋａｎ５０を含むＬＢ培地に前培養物を３％（体積／体積）で接種し、回転シェーカー上で、３２℃でＯＤ６００が１に達するまで培養した。ＯＤ１において１ｍＭのＩＰＴＧにより組換えタンパク質の発現を誘導した。その後、この本培養物を回転シェーカー上で３２℃でさらに３時間培養した。
【００９８】
実施例３
バイオインフォマティクス分析
ＳＭＡＲＴ（ｈｔｔｐ：／／ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／）とＮＣＢＩの保存ドメインデータベース（Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ、ｈｔｔｐ：／／ｎｃｂｉ：ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｗｒｐｓｂ．ｃｇｉ）を使用してタンパク質モチーフを特定した。ＳｉｇｎａｌＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を使用してシグナルペプチドを予測し、Ｃｏｍｐｕｔｅ  ｐＩ／ＭＷ（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ．ｈｔｍｌ）を使用して理論的等電点と分子量を予測した。ＤＩＳＵＬＦＩＮＤ（ｈｔｔｐ：／／ｄｉｓｕｌｆｉｎｄ．ｄｓｉ．ｕｎｉｆｉ．ｉｔ／）を使用してシステインジスルフィド結合状態と連結性の予測を行った。ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）により配列類似性を分析した。Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ９．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ドイツ）を使用して多重配列アラインメントを作製した。構造評価のため、Ｓｗｉｓｓ−Ｍｏｄｅｌサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）を使用してＣＰＨｍｏｄｅｌｓ３．０サーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＣＰＨｍｏｄｅｌｓ／）によって相同性モデリングを行った。ＧＲＯＭＯＳフォースフィールド（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒｏｍａｃｓ．ｏｒｇ／Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ／Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ／Ｆｏｒｃｅ＿Ｆｉｅｌｄｓ／ＧＲＯＭＯＳ）を使用することにより全てのモデルについてエネルギー極小化を行った。
【００９９】
後続の表は後続のシーケンスプロトコルに印刷されている配列を記載する。先導する番号はヌクレオチド配列の配列番号を表し、これに続く記載されない偶数番号は各ペプチド配列の配列番号を表す。
【０１００】
１  ＩＭＰＩα（野生型又はｗｔＩＭＰＩα）
３  ＩＭＰＩβ（野生型又はｗｔＩＭＰＩβ）
５  ＧＳＴ／ＩＭＰＩα
７  ＧＳＴ／ＩＭＰＩβ
９：ＩＭＰＩα  ３７位  ＮｎＧ  ３８位  ＩｎＬ  ３９位  ＲｎＡ
１１：ＧＳＴ／ＩＭＰＩα  ３７位  ＮｎＧ  ３８位  ＩｎＬ  ３９位  ＲｎＡ
１３：ＩＭＰＩα  ５２位  ＲｎＫ
１５：ＧＳＴ／ＩＭＰＩα  ５２位  ＲｎＫ
１７：ＩＭＰＩ  ３５位  ＩｎＬ  
１９：ＩＭＰＩ  ３５位  ＩｎＭ  
２１：ＩＭＰＩ  ３５位  ＩｎＦ
２３：ＩＭＰＩ  ３５位  ＩｎＣ
２５：ＩＭＰＩ  ３５位  ＩｎＮ  
２７：ＩＭＰＩ  ３５位  ＩｎＱ  
２９：ＩＭＰＩ  ３５位  ＩｎＨ  
３１：ＩＭＰＩ  ３５位  ＩｎＫ  
３３：ＩＭＰＩ  ３５位  ＩｎＲ  
３５：ＩＭＰＩ  ３６位  ＩｎＶ  
３７：ＩＭＰＩ  ３６位  ＩｎＭ  
３９：ＩＭＰＩ  ３６位  ＩｎＦ  
４１：ＩＭＰＩ  ３６位  ＩｎＷ  
４３：ＩＭＰＩ  ３６位  ＩｎＹ  
４５：ＩＭＰＩ  ３６位  ＩｎＳ  
４７：ＩＭＰＩ  ３６位  ＩｎＴ  
４９：ＩＭＰＩ  ３６位  ＩｎＮ  
５１：ＩＭＰＩ  ３６位  ＩｎＱ  
５３：ＩＭＰＩ  ３６位  ＩｎＨ  
５５：ＩＭＰＩ  ３６位  ＩｎＲ  
５７：ＩＭＰＩ  ３６位  ＩｎＫ  
５９：ＩＭＰＩ  ３９位  ＩｎＶ  
６１：ＩＭＰＩ  ３９位  ＩｎＫ  
６３：ＩＭＰＩ  ３５位  ＩｎＷ  
６５：ＩＭＰＩ  ３５位  ＩｎＹ  
６７：ＩＭＰＩ  ３９位  ＲｎＡ
６９：ＩＭＰＩ  ３５位  ＩｎＣ  
７１：ＩＭＰＩ  ３５位  ＩｎＫ  
７３：ＩＭＰＩ  ３５位  ＩｎＲ  
７５：ＩＭＰＩ  ３５位  ＩｎＬ  
７７：ＩＭＰＩ  ３５位  ＩｎＭ
７９：ＩＭＰＩ  ３５位  ＩｎＦ  
８１：ＩＭＰＩ  ３５位  ＩｎＱ
８３：ＩＭＰＩ  ３５位  ＩｎＨ  
８５：ＧＳＴ／ＩＭＰＩ  ３５位  ＩｎＮ  
８７：ＧＳＴ／ＩＭＰＩ  ３６位  ＩｎＳ  
８９：ＧＳＴ／ＩＭＰＩ  ３９位  ＩｎＫ  
９１：ＧＳＴ／ＩＭＰＩ  ３５位  ＩｎＣ  
９３：ＩＭＰＩシグナルペプチド
９５：ＩＭＰＩ様（ソレノプシス（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ）、ペプチドのみ、核酸配列は記載しない）
【０１０１】
【数４−１】
2016525535.tif 000008
【０１０２】
【数４−２】
2016525535.tif 000009
【０１０３】
【数４−３】
2016525535.tif 000010
【０１０４】
【数４−４】
2016525535.tif 000011
【０１０５】
【数４−５】
2016525535.tif 000012
【０１０６】
【数４−６】
2016525535.tif 000013
【０１０７】
【数４−７】
2016525535.tif 000014
【０１０８】
【数４−８】
2016525535.tif 000015
【０１０９】
【数４−９】
2016525535.tif 000016
【０１１０】
【数４−１０】
2016525535.tif 000017
【０１１１】
【数４−１１】
2016525535.tif 000018
【０１１２】
【数４−１２】
2016525535.tif 000019
【０１１３】
【数４−１３】
2016525535.tif 000020
【０１１４】
【数４−１４】
2016525535.tif 000021
【０１１５】
【数４−１５】
2016525535.tif 000022
【０１１６】
【数４−１６】
2016525535.tif 000023
【０１１７】
【数４−１７】
2016525535.tif 000024
【０１１８】
【数４−１８】
2016525535.tif 000025
【０１１９】
【数４−１９】
2016525535.tif 000026
【０１２０】
【数４−２０】
2016525535.tif 000027
【０１２１】
【数４−２１】
2016525535.tif 000028
【０１２２】
【数４−２２】
2016525535.tif 000029
【０１２３】
【数４−２３】
2016525535.tif 000030
【０１２４】
【数４−２４】
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【０１２５】
【数４−２５】
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【０１２９】
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【０１３０】
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【数４−３１】
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【０１３２】
【数４−３２】
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【０１３３】
【数４−３３】
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【０１３４】
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【数４−３７】
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【図１】
2016525535.tif 000046
【図２】
2016525535.tif 000047
【図３】
2016525535.tif 000048
【図４ａ】
2016525535.tif 000049
【図４ｂ】
2016525535.tif 000050
【図５】
2016525535.tif 000051
【図６】
2016525535.tif 000052
【図７】
2016525535.tif 000053
【図８ａ】
2016525535.tif 000054
【図８ｂ】
2016525535.tif 000055
【図８ｃ】
2016525535.tif 000056
【図９】
2016525535.tif 000057
【図１０】
2016525535.tif 000058
【配列表】
2016525535000001.app
【国際調査報告】
2016525535.tif 000059
2016525535.tif 000060