(57)【要約】  本発明は細胞透過性αヘリックスペプチド多量体、これの製造方法およびその用途に関し、具体的には複数の両親媒性ペプチドを含むペプチド多量体、前記ペプチド多量体の製造方法および前記ペプチド多量体を有効性分として含むＨＩＶ予防または治療用組成物または前記ペプチド多量体および生物学的活性物質を含む細胞内活性物質の伝達のための組成物に関する。
2016539922.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
同形または異形の両親媒性αヘリックスペプチドを複数含むペプチド多量体。
【請求項２】
ｉ、ｉ＋３、ｉ＋４、ｉ＋７、ｉ＋８、ｉ＋１０およびｉ＋１１（ｉは整数）で構成された群から選択された一つ以上のアミノ酸位置で連結部を含むことを特徴とする請求項１に記載のペプチド多量体。
【請求項３】
前記連結部は、ｉ、ｉ＋３、ｉ＋４、ｉ＋７、ｉ＋８、ｉ＋１０およびｉ＋１１（ｉは整数）で構成された群から選択された二つ以上のアミノ酸位置で位置されることを特徴とする請求項２に記載のペプチド多量体。
【請求項４】
前記αヘリックスペプチドは、アルギニン、リシンおよびヒスチジンで構成された群から選択された一つ以上の親水性アミノ酸を含むことを特徴とする請求項１に記載のペプチド多量体。
【請求項５】
前記αヘリックスペプチドは、ロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシンおよびイソロイシンで構成された群から選択された一つ以上の疎水性アミノ酸を含むことを特徴とする請求項１に記載のペプチド多量体。
【請求項６】
前記ペプチドは、５〜５０個のアミノ酸を含むことを特徴とする請求項１に記載のペプチド多量体。
【請求項７】
前記ペプチドは、７〜２３個のアミノ酸を含むことを特徴とする請求項１に記載のペプチド多量体。
【請求項８】
前記ペプチド中親水性および疎水性アミノ酸それぞれが一つ乃至三つずつ交代で配列されていることを特徴とする請求項１に記載のペプチド多量体。
【請求項９】
前記αヘリックスペプチドは、下記式で表示される７個のアミノ酸配列中一つ以上を含むことを特徴とする請求項１に記載のペプチド多量体：
ＸＹＸＸＹＹＸ  ＹＸＹＹＸＸＹ
ＸＹＹＸＹＹＸ  ＹＸＸＹＸＸＹ
ＸＹＹＸＸＹＸ  ＹＸＸＹＹＸＹ
ＸＹＹＸＸＹＹ  ＹＸＸＹＹＸＸ
ＸＸＹＸＸＹＹ  ＹＹＸＹＹＸＸ
ＸＸＹＹＸＹＹ  ＹＹＸＸＹＸＸ
ＸＸＹＹＸＸＹ  ＹＹＸＸＹＹＸ
（前記式で、Ｘは親水性アミノ酸で、Ｙは疎水性アミノ酸である）。
【請求項１０】
前記αヘリックスペプチドは、アルギニン、リシンおよびヒスチジンで構成された群から選択された一つ以上の正電荷を帯びる親水性アミノ酸残基を３３％以上含むことを特徴とする請求項１に記載のペプチド多量体。
【請求項１１】
前記αヘリックスペプチドは、ロイシン、トリプトファン、バリン、フェニルアラニン、チロシンおよびイソロイシンで構成された群から選択された一つ以上の疎水性アミノ酸残基を２５％以上含むことを特徴とする請求項１に記載のペプチド多量体。
【請求項１２】
前記αヘリックスペプチドは、下記配列番号１１で表される配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のペプチド多量体：
ＫＬＬＫＬＬＫ（配列番号１１）。
【請求項１３】
前記ペプチドは、下記式で表されるアミノ酸配列中一つ以上を持つことを特徴とする請求項１に記載のペプチド多量体：
ＣＹＹＸＸＹＸＣＹＹＸＸＹＸＺＷ（１）
ＸＹＹＣＸＹＸＸＹＹＣＸＹＸＺＷ（２）
ＸＹＹＸＣＹＸＸＹＹＸＣＹＸＺＷ（３）
ＸＹＹＸＸＹＣＸＹＹＸＸＹＣＺＷ（４）；および
ＸＹＹＸＸＹＸＣＹＹＸＸＹＸＣＷ（５）
（前記式で、Ｘ、ＺおよびＷは疎水性アミノ酸で、Ｙは親水性アミノ酸で、Ｃはシステインである）。
【請求項１４】
前記ペプチドは、配列番号１〜１０からなる群から選択された１種以上の配列を持つことを特徴とする請求項１３に記載のペプチド多量体。
【請求項１５】
前記ペプチドのαヘリックス度は、トリフルオロエタノール（Trifluoroethanol）およびバッファーが１：１と混合された細胞膜条件で８０％以上であることを特徴とする請求項１に記載のペプチド多量体。
【請求項１６】
前記連結部は、ペプチド間を連結する共有結合を含むことを特徴とする請求項１に記載のペプチド多量体。
【請求項１７】
前記共有結合は、システインの間の二硫化結合、マレイミド結合、エステル結合、チオエーテル結合およびクリック反応（click reaction）による結合で構成された群から選択された一つ以上であることを特徴とする請求項１６に記載のペプチド多量体。
【請求項１８】
前記多量体は、二量体、三量体または四量体であることを特徴とする請求項１に記載のペプチド多量体。
【請求項１９】
下記の工程を含むペプチド多量体の製造方法：
親水性および疎水性アミノ酸を含むαヘリックスペプチドを製作する工程；
同形または異形の複数のαヘリックスペプチドを選択する工程；および
前記選択された複数のαヘリックスペプチドをｉ、ｉ＋３、ｉ＋４、ｉ＋７、ｉ＋８、ｉ＋１０およびｉ＋１１（ｉは整数）で構成された群から選択された一つ以上のアミノ酸位置で連結する工程。
【請求項２０】
前記複数のαヘリックスペプチドは、ｉ、ｉ＋３、ｉ＋４、ｉ＋７、ｉ＋８、ｉ＋１０およびｉ＋１１（ｉは整数）で構成された群から選択された二つ以上のアミノ酸位置で連結されることを特徴とする請求項１９に記載の製造方法。
【請求項２１】
前記複数のαヘリックスペプチドは、ペプチドの間の共有結合を介して連結されることを特徴とする請求項１９に記載の製造方法。
【請求項２２】
前記共有結合は、システインの間の二硫化結合、マレイミド結合、エステル結合、チオエーテル結合およびクリック反応（click reaction）による結合で構成された群から選択された一つ以上であることを特徴とする請求項２１に記載の製造方法。
【請求項２３】
請求項１〜１８のいずれかに記載のペプチド多量体を有効成分として含むＨＩＶ予防または治療用組成物。
【請求項２４】
前記ペプチド多量体は、ＨＩＶのＴＡＲ（trans-activating region）に結合することを特徴とする請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項１〜１８のいずれかに記載のペプチド多量体および生物学的活性物質を含む細胞内活性物質の伝達のための組成物。
【請求項２６】
前記生物学的活性物質は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、タンパク質、抗体または低分子化合物であることを特徴とする請求項２４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞透過性αヘリックスペプチド多量体、これの製造方法およびその用途に関し、具体的には、複数の両親媒性ペプチドを含むペプチド多量体、前記ペプチド多量体の製造方法および前記ペプチド多量体を有効性分として含むＨＩＶ予防または治療用組成物、および前記ペプチド多量体および生物学的活性物質を含む細胞内活性物質の伝達のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗微生物ペプチド（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ；ａｍｐ）は、外部から侵入した病原菌に対抗して宿主を保存するために、宿主の一次免疫反応から生成される自然ペプチドである。これらは、主に侵入した病原菌の細胞膜を損傷させて、侵入した細菌を制圧する。しかし、近年このような抗微生物ペプチドが、細胞膜を損傷させる機序以外に他の機序で侵入した病原菌を制圧する可能性があることを示唆するいくつかの証拠が出てきている。すなわち、これらは病原菌内にある標的に結合してその機能を防ぐことによって細菌を制圧することができる。一般に抗微生物ペプチドは正電荷を帯びているが、この正電荷はＤＮＡまたＲＮＡが持っている負電荷と結合することによって、病原菌のＤＮＡまたはＲＮＡの標的としての可能性を提示している。病原菌内小器官であるミトコンドリアを抗微生物ペプチドが侵入して細胞死滅を誘導することによって、病原菌を制圧する機序も可能であることを示している。これは、ミトコンドリアの表面が陰イオンに荷電されているためである。
【０００３】
前記提示した例のように抗微生物ペプチドは、病原菌の膜を崩壊させて菌を殺すのではなく、細胞内の他の標的に結合して菌を殺すことができる。これは、細胞を透過できる性質を持つペプチド（ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ，ｃｐｐ）（以下、細胞透過ペプチドという）が病原菌を殺すことができる抗微生物ペプチドと区別されて存在するという事実としても証明されている。自然に存在する細胞透過ペプチドは、主にウイルスで発見されているが、これらは、宿主細胞の全ての機能をウイルスの生存のために利用しなければならないので、細胞を殺す能力とは異なる細胞を透過できる能力だけを持つペプチドである。代表的な例が、ＴＡＴペプチド、Ｒｅｖペプチドなどが挙げられ、宿主を殺さないながらも細胞内にウイルスが侵入するのに助けになっている。Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質から由来したｐｅｎｅｔｒａｔｉｎペプチドは１６個のアミノ酸を含むペプチドであり、優れた細胞透過能を有している代表的な細胞透過ペプチドの一つである（韓国登録特許第１０９５８４１号）。抗微生物ペプチドのように正電荷を帯びたアルギニン／リシンを多く含んでいる特徴を持つ（図１）。
【０００４】
細胞透過ペプチドのアミノ酸組成の特性としては、断然アルギニンとリシンなど塩基性を持つアミノ酸が多いことが最初に目立つ点である。アルギニンは７個か９個連続的にアミド結合で連結されたペプチドも細胞透過ペプチドとして用いられているので、負電荷に荷電された細胞表面の認識のためには、このような正電荷が必須である。また、同じ正電荷を帯びているにも関わらずアルギニンがリシンより相対的に多いことは、グアニジノ基が単なるアミノ基に比べて負電荷によりよく対応する作用基であることが分かる。
【０００５】
このような細胞透過ペプチドは、抗微生物ペプチドに比べて少なくとも理論的には無視できる程低細胞毒性を有していなければならない。このような細胞透過ペプチドの低細胞毒性のために、細胞内伝達（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）を必要とする多くの物質をこの細胞透過ペプチドに付けて細胞内に導入できる方法を模索している。遺伝子（ＤＮＡ）やＲＮＡｉのようなオリゴ核酸や生物学的変化を起こすことができるまたは細胞毒性を起こす化合物（抗癌剤）、特定のタンパク質なども荷（ｃａｒｇｏ）として細胞透過ペプチドに連結して細胞中に投入することができる（図２）。
【０００６】
細胞透過ペプチドが細胞を透過する機序は、大きく二種類と見ており、その一つは直接的な浸透と熱を要するエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）を経る方法である。それぞれの細胞透過ペプチドの性質により機序が異なるか二種類の方法が混用されて細胞中に入ると知られている。
【０００７】
細胞を透過する能力を備えながらも細胞毒性があってはならないことは、相反する条件であるため、永遠に得られないものと見なされたりもする。多くの細胞透過ペプチドも抗微生物ペプチドの性質を持つのもこのためである。細胞透過ペプチドは、細胞を破壊せず中に入ることができる性質が最大化されたペプチドであるが、これらによって細胞膜に亀裂が生じることがあり、正電荷に荷電された細胞透過ペプチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡなど負に荷電された多くの細胞内物質と会って細胞毒性を与え得る。
【０００８】
細胞透過ペプチドが持つ形の特徴は、抗微生物ペプチドと似ている。細胞膜を透過するため、にまず負に荷電された細胞膜を認識するために陽イオンに荷電された親水性基を持つだけでなく、膜条件でαヘリックスの形を成しながら細胞膜に存在する疏水性の分子と認識できなければならない。このような理由から、細胞透過ペプチドと抗微生物ペプチドは両親媒性（疏水性および親水性）を持っている。したがって、細胞透過ペプチドは、多くの場合αヘリックスを持つペプチドが多く、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、ＨＩＶのＴａｔなどが代表的なαヘリックス形細胞透過ペプチドである。但し、このようなペプチドは、少なくともマイクロモル程度の濃度で使用しなければ目的とする細胞透過効果が期待できないため、ナノモル単位を濃度だけを使用しても目的とする細胞透過能を持つペプチドの開発が必要な実情である。
【０００９】
このような背景下、本出願の発明者等は、親水性および疏水性アミノ酸を含む両親媒性ペプチドが一つ以上の特定アミノ酸位置で連結部を含むことによって、細胞透過性が顕著に向上できることを確認して、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、細胞内への効率的な伝達が可能でありながらも、細胞内で細胞毒性が減少するαヘリックス形細胞透過両親媒性ペプチドを含むペプチド多量体、これの製造方法およびこれのＨＩＶ予防または治療用途および細胞内活性物質の伝達用途を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
そこで、本発明は、同形または異形の両親媒性αヘリックスペプチドを複数含むペプチド多量体を提供する。
【００１２】
本発明はまた、下記の工程を含むペプチド多量体の製造方法を提供する：
親水性および疏水性アミノ酸を含むαヘリックスペプチドを製作する工程；
同形または異形の複数のαヘリックスペプチドを選択する工程；および
前記選択された複数のαヘリックスペプチドをｉ、ｉ＋３、ｉ＋４、ｉ＋７、ｉ＋８、ｉ＋１０およびｉ＋１１（ｉは整数））で構成された群から選択された一つ以上のアミノ酸位置で連結する工程。
【００１３】
本発明はまた、前記αヘリックスペプチド多量体を有効性分として含むＨＩＶの予防または治療用組成物を提供する。
【００１４】
本発明はまた、前記αヘリックスペプチド多量体および生物学的活性物質を含む細胞内活性物質の伝達のための組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】アルギニンまたはリシンを多数含む公示の細胞透過ペプチドのリストである。
【図２】細胞透過ペプチドを細胞内に伝達する機序を示した模式図である。
【図３】本発明の一実施例に係る両親媒性αヘリックスペプチドの単量体および二量体でる。
【図４】本発明の一実施例に係るペプチドの細胞透過能を確認した結果を示したものである。それぞれの誤差棒は標準偏差（ｎ＝３）を示し、***およびｎ．ｓ．表示は、それぞれｐ＜０．００１で、対照群と比較して有意差がないことを示す：  ａ）は１２時間ＨｅＬａ細胞とインキュベーションした後様々なペプチド濃度でのＬＫ−１（▲）、ＬＫ−２（■）、ＬＫ−３（●）、ＬＫ−４（◆）、およびＲ９（▼）に対するＦＡＣＳ結果を示す；  ｂ）ＦＩＴＣ−ラベリングされたＬＫ−３（１０ｎＭ）を処理したＨｅＬａ細胞のＣＬＳＭ（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）イメージを示したもので、核はＨｏｅｃｈｓｔ ３３４４２（青色）で染色される；  ｃ）１０ｎＭ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ阻害条件で本発明に係るペプチドの相対的細胞透過能を示す；  ｄ）５００ｎＭ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ阻害条件で本発明に係るペプチドの相対的細胞透過能を示す−対照群（ｗｈｉｔｅ）、ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ（ｇｒａｙ）、ａｍｉｌｏｒｉｄｅ（ｄａｒｋ ｇｒａｙ）および４゜Ｃ（ｂｌａｃｋ）。
【図５】本発明の一実施例に係るペプチドを用いて細胞内に伝達したＲＮＡｉの量を測定した結果を示す。
【図６】本発明の一実施例に係るペプチドの細胞内伝達機序を確認した共焦点顕微鏡写真を示す（図６中Ａｃ＝Ａｃｅｔｙｌ基を意味する）。
【図６Ａ】５００ｎＭ  ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）ラベリングされた単量体ペプチド（３７℃、２４時間）（左側）および５００ｎＭ  ＦＩＴＣラベリングされた単量体ペプチド、５０μｇ／ｍＬ ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ処理（３７℃、２４時間）（右側）
【図６Ｂ】５００ｎＭ  Ａｃ−ＦＩＴＣ二量体（３７℃、２４時間）（左側）、５００ｎＭ  Ａｏ−ＦＩＴＣ二量体、５０μｇ／ｍＬ ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ処理（３７℃、２４時間）（右側）
【図６Ｃ】５００ｎＭ  ＦＩＴＣラベリングされた単量体ペプチド、１５μｇ／ｍＬ ａｍｉｌｏｒｉｄｅ処理（３７℃、２４時間）（左側）、５００ｎＭ  ＦＩＴＣ単量体ペプチド（４℃、２時間）（右側）
【図６Ｄ】５００ｎＭ  Ａｃ−ＦＩＴＣ二量体ペプチド、１５μｇ／ｍＬ ａｍｉｌｏｒｉｄｅ処理（３７℃、２４時間）（左側）、５００ｎＭ  Ａｃ−ＦＩＴＣ二量体ペプチド（４℃、２時間）（右側）
【図６Ｅ】５００ｎＭ  Ａｃ−ｄｉｍａｌ−ＦＩＴＣ二量体ペプチド（３７℃、２４時間）（左側）、５００ｎＭ  Ａｃ−ｄｉｍａｌ−ＦＩＴＣ二量体ペプチド、５０μｇ／ｍＬ ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ処理（３７℃、２４時間）（右側）
【図６Ｆ】５００ｎＭ  Ａｃ−ｄｉｍａｌ−ＦＩＴＣ二量体ペプチド、１５μｇ／ｍＬ ａｍｉｌｏｒｉｄｅ処理（３７℃、２４時間）（左側）、５００ｎＭ  Ａｃ−ｄｉｍａｌ−ＦＩＴＣ二量体ペプチド（４℃、２時間）（右側）
【図７】本発明の一実施例に係るペプチドの細胞毒性実験結果を示す。
【図８】ＨｅＬａ細胞で本発明に係るペプチドのＴａｔ−媒介転写延長阻害を示す結果で、１０ｎＭおよび１００ｎＭペプチド濃度で次を示す−対照群（ｗｈｉｔｅ）、１０ｎＭ（ｇｒａｙ）および１００ｎＭ（ｄａｒｋ ｇｒａｙ）：  ａ）ＴＡＲ−ｌｕｃ／β−ａｃｔｉｎの相対的ｍＲＮＡ発現  ｂ）ＴＡＲ−ｌｕｃ／１８Ｓ ｒＲＮＡの相対的ｍＲＮＡ発現  ｃ）ＴＡＲ−ｌｕｃ／ＴＡＲの相対的ｍＲＮＡ発現  それぞれの誤差棒は標準偏差（ｎ＝３）を示し、（*）、（**）、（***）およびｎ．ｓ．表示は、それぞれ０．０１≦ｐ＜０．１、０．００１≦ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１、対照群とそれぞれ比較して有意差がないことを示す。
【図９】ＨｅＬａ細胞で本発明係る下記ペプチドのルシフェラーゼ活性阻害を示し、それぞれの誤差棒は標準偏差（ｎ＝３）を示す：  ａ）ＬＫ−１のルシフェラーゼ活性阻害  ｂ）ＬＫ−２のルシフェラーゼ活性阻害  ｃ）ＬＫ−３のルシフェラーゼ活性阻害  ｄ）ＬＫ−４のルシフェラーゼ活性阻害。
【図１０】ＲＡＷ ２６４．７細胞でＬＫペプチドのＩＣ５０値測定結果を示す。
【図１１】Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ細胞（ＭＯＬＴ−４／ＣＣＲ５）で本発明係る下記ペプチドのＨＩＶ−１  ｐ２４抗原生成抑制を示し、それぞれの誤差棒は標準偏差（ｎ＝３）を示す：  ａ）ＬＫ−３の抗原生成抑制  ｂ）ＬＫ−４の抗原生成抑制。
【図１２】ＭＴＴ  ａｓｓａｙを介してペプチドの細胞毒性を確認した結果を示す：  ａ）ＨｅＬａ細胞  ｂ）ＲＡＷ  ２６４．７細胞。
【図１３】ＬＤＨ  ａｓｓａｙを介してペプチドが細胞膜をｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎする程度を確認した結果を示す：ａ）ＨｅＬａ細胞ｂ）ＲＡＷ  ２６４．７細胞。
【図１４】ｐＴａｔ発現程度に応じたＬＫペプチドの阻害能力減少実験結果を示す。
【図１５】ＨＰＬＣを介してｄｉｍｅｒ  Ｄ、ｍｏｎｏｍｅｒ  Ｄに対するペプチド安定性を測定した結果を示す：ａ）２０Ｍ  ｏｆ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｄｉｍｅｒ  Ｄ  ｉｎ  ２５％  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ／ＲＰＭＩ  １６４０、ｂ）２０Ｍ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ２  ｉｎ  ２５％  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ／ＲＰＭＩ  １６４０。
【図１６】ＨＰＬＣを介してＬＫ−４に対するペプチド安定性を測定した結果を示す：２０Ｍ  ｏｆ  ＬＫ−４  ｉｎ  ２５％  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ／ＲＰＭＩ  １６４０。
【図１７】ＨＰＬＣを介してＰｅｐｔｉｄｅ  ｄｉｍｅｒ  Ｄとｋｉｎｋ  Ｄの生体内還元条件である０．５ｍＭ  ＧＳＨ存在下でペプチド安定性を測定した結果を示す：ａ）２０Ｍ  ｏｆ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｄｉｍｅｒ  Ｄ  ｉｎ  ０．５ｍＭ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ／ＲＰＭＩ  １６４０、ｂ）２０Ｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｋｉｎｋ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ０．５ｍＭ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ／ＲＰＭＩ  １６４０．Ｂｌｕｅ（１）,０ｈ；ｒｅｄ（２）,５ｈ；ｇｒｅｅｎ（３）,１０ｈ；ｐｉｎｋ（４）,１５ｈ。
【図１８】平行または逆平行に連結されたペプチド二量体でＨｅｍｏｌｙｓｉｓ程度を測定した結果を示す。
【図１９】ＬＫダイマーでＬｅｕ一部をＡｌａに置き換えた構造をＨｅｌｉｃａｌ  ｗｈｅｅｌを介して図示したものである。
【図２０】図１９によるダイマーの細胞透過能を測定した結果を示したものである。
【図２１】ＬｙｓをＧｌｕに置換（Ｋ２、Ｋ４→Ｅ２、Ｅ４）ペプチド構造をＨｅｌｉｃａｌ  ｗｈｅｅｌを介して図示したものである。
【図２２】図２１によるペプチドでＨｅＬａ  ｃｅｌｌに対する細胞透過能を測定した結果を示したものである。
【図２３】配列番号１１を共通して含むペプチドでＨｅＬａ  ｃｅｌｌに対する細胞透過能を測定した結果を示したものである。
【図２４】ペプチドの長さによるＨｅＬａ  ｃｅｌｌに対する細胞透過能を測定した結果を示したものである。
【課題を達成するための形態】
【００１６】
一観点で、本発明は同形または異形の両親媒性αヘリックスペプチドを複数含むペプチド多量体に関する。
【００１７】
前記ペプチドは、細胞内伝達前後の形が異なり、細胞透過能力は優れながらも、細胞内で最小の細胞毒性を減らせるようにした新規細胞透過ペプチドであってもよい。このために、細胞透過ペプチドに存在するαヘリックス形を最大限増幅させることができる方法と、このようなαヘリックスが細胞質内では無くなりやすくなるように細胞質の特殊な環境を利用する方法を利用している。本発明により、人為的にαヘリックス度を増加させたペプチドを合成することによって、細胞に処理すると高いαヘリックス度によって細胞内透過率が向上して、細胞内ではαヘリックスが除去されて、ペプチドが持つ毒性を最小化する方法を樹立した。
【００１８】
従来、細胞透過ペプチドは、構造的特徴が抗微生物ペプチドと似ていて、細胞内に透過時細胞内標的に結合して細胞毒性を誘発する問題点がある。細胞透過ペプチドが細胞膜を通過する前と細胞内に透過した時の形が似ているためである。したがって、本出願の発明者等は、細胞内透過する前と透過後の形が大きく異なるペプチドを確認した。
【００１９】
αヘリックス形をしているペプチドも１００％水溶液で低αヘリックス度を維持する場合が多く、水溶液である細胞質で大多数のペプチドは、５０％以下の低αヘリックス度を持つ。本発明に係る両親媒性ペプチドまたはこれを含む二量体は、細胞の外では高αヘリックス度を維持するが、細胞質内で高αヘリックス度が崩れる条件になると、細胞外と細胞内でペプチド構造が変わり得る。すなわち、細胞外側や細胞膜条件でαヘリックススイッチがオンになり、細胞質ではオフになるｏｎ−ｏｆｆスイッチを作ることができる。こうなれば、ペプチドのαヘリックスのために想定できる様々な細胞毒性を細胞質内で最小化することができる。ペプチドは、αヘリックス度が高ければ、種々のペプチド分解酵素によって分解されず、αヘリックス形と平衡をなして無作為的な形が作られることになって、無作為的な形のペプチドが多数のタンパク質加水分解酵素から攻撃されて分解されやすいので、毒性が最小化できる。したがって、αヘリックス度を細胞外で最大化して細胞透過力を最大化して、細胞質内にある時αヘリックスを除去すると、αヘリックスペプチドから来る細胞毒性を最小化できることになる。このような条件を備えたペプチドは、細胞透過ペプチドとして最適な条件を持つことになる。
【００２０】
細胞透過力を高めるための一方法で、両親媒性を持つペプチドのαヘリックス度を増加させることができる。共有結合を介してαヘリックスの上と下の側枝を縛って劇的に向上させる方法を使用することができ、これにより細胞透過能力も向上することができる。これを考慮して、αヘリックス度を向上させるための複数の両親媒性ペプチドは、例えば、ｉ、ｉ＋３、ｉ＋４、ｉ＋７、ｉ＋８、ｉ＋１０およびｉ＋１１（ｉは整数）で構成された群から選択された一つ以上のアミノ酸位置で連結部を含むことができる。前記連結部は、好ましくは、ｉ、ｉ＋３、ｉ＋４、ｉ＋７、ｉ＋８、ｉ＋１０およびｉ＋１１（ｉは整数）で構成された群から選択された二つ以上のアミノ酸位置で位置されることができる。この時、各両親媒性ペプチドは、複数のペプチドがＮ末端でＣ末端方向を維持して平行に連結されたりまたは複数のペプチド中一部はＮ末端でＣ末端方向、他の一部はＣ末端でＮ末端方向に連結された逆平行に連結されることができる。平行または逆平行に連結されたペプチド多量体で同じ活性を示すことを確認した（図１８）。このような連結部を含むペプチド多量体を介してαヘリックス度が維持されるようにした。
【００２１】
これと関連して、従来韓国特許公開第２０１３−００５７０１２号および米国特許公開第２０１０−０２９２１６４号で二つのペプチド間連結時二硫化結合を利用したものが開示されている。しかし、本発明のように二つ以上のアミノ酸位置で連結部を位置させて、多量体形態で製造することによってαヘリックス度を増加させた例はなかった。本発明に係るペプチド多量体でαヘリックス度は、細胞透過前、例えば、トリフルオロエタノール（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈａｎｏｌ）およびバッファーが１：１と混合された細胞膜条件で８０％以上であってもよく、好ましくは８５％以上、最大１００％であってもよい。
【００２２】
一実施例で、前記ペプチドを構成するアミノ酸は、両親媒性を示しながらもαヘリックス形構造を維持できるようにするものであればその種類が制限されるのではないか、例えば、前記親水性アミノ酸は、アルギニン、リシンおよびヒスチジンで構成された群から選択された一つ以上であってもよく、前記疏水性アミノ酸は、ロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシンおよびイソロイシンで構成された群から選択された一つ以上であってもよい。
【００２３】
前記ペプチドは、例えば、５〜５０個のアミノ酸、好ましくは１０〜６０個、さらに好ましくは７〜２３個のアミノ酸を含んでもよく、これにより安定した二次構造であるαヘリックス構造を形成することができる。本発明に係るペプチドは、細胞透過能に長さ依存性を示すが、例えば、７個未満のアミノ酸を含むペプチドは、浸透能が非常に少ないのに比べて、７個以上のアミノ酸を含むペプチドは、ナノモルの濃度だけでも浸透能が非常に向上することが確認できて、特に１６個以上、最大２３個のアミノ酸を含むペプチドは、１０ｎＭ以下の濃度でいずれも細胞透過能を示すことを確認することができる（図２４）。
【００２４】
親水性アミノ酸のアミン基をαヘリックスペプチドの一面に集めるために、親水性アミノ酸が一つ乃至三つずつ交代で配列されてもよく、残りの配列は疏水性アミノ酸が一つ乃至三つずつ配列されてもよい。例えば、前記親水性および疏水性アミノ酸それぞれが一つ乃至三つずつ交代で配列されて、両親媒性ペプチド中ｉ＋３或いはｉ＋４位置に少なくとも一つはｉ位置と同じ極性を持つアミノ酸を持つ７個のアミノ酸を含むことができる。好ましくは、前記両親媒性ペプチドは、親水性および疏水性アミノ酸それぞれが一つ乃至二つずつ交代で配列されている７個のアミノ酸配列中一つ以上を含んでもよいが、この時ｉが親水性アミノ酸であれば、ｉ＋３およびｉ＋４位置中少なくとも一つは親水性アミノ酸であるべきで、ｉが疏水性アミノ酸であれば、ｉ＋３またはｉ＋４位置中少なくとも一つは疏水性アミノ酸でなければならない。
【００２５】
前記の７個のアミノ酸を持つ配列は、例えば、下記式で表示されるアミノ酸配列中一つ以上を含んでもよい：
ＸＹＸＸＹＹＸ  ＹＸＹＹＸＸＹ
ＸＹＹＸＹＹＸ  ＹＸＸＹＸＸＹ
ＸＹＹＸＸＹＸ  ＹＸＸＹＹＸＹ
ＸＹＹＸＸＹＹ  ＹＸＸＹＹＸＸ
ＸＸＹＸＸＹＹ  ＹＹＸＹＹＸＸ
ＸＸＹＹＸＹＹ  ＹＹＸＸＹＸＸ
ＸＸＹＹＸＸＹ  ＹＹＸＸＹＹＸ
前記式で、Ｘは親水性アミノ酸で、Ｙは疏水性アミノ酸である。
【００２６】
この時、前記両親媒性ペプチドの疏水性アミノ酸のうち最大の疏水性を示すことができるアミノ酸、例えば、ロイシン、トリプトファン、バリン、フェニルアラニン、チロシンおよびイソロイシンで構成された群から選択された一つ以上の残基を２５％以上含めて、これにより形成された疏水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ）によりペプチドが細胞を透過することができる。本出願の発明者等は、疏水性アミノ酸であるロイシン（Ｌ）をアラニン（Ａ）に置き換えた結果、疏水性アミノ酸のうち２５％以上に疏水性アミノ酸が位置しない場合、目的とする程度の細胞浸透効果を示すことができないことを確認した（図１９および図２０）。
【００２７】
また、前記両親媒性ペプチドの親水性アミノ酸のうち正電荷を帯びるアルギニン、リシンおよびヒスチジンで構成された群から選択された一つ以上の残基を３３％以上含むことができる。３３％％以上の正電荷を持つ場合、全般的に目的とする細胞浸透能を確保することができる。３３％（親水アミノ酸の約１／３）未満の正電荷を帯びる親水性アミノ酸を含むペプチド（正電荷を帯びるアミノ酸が少なくとも二つ以上の負電荷を帯びる親水性アミノ酸に変わる場合）の場合、細胞浸透に十分な電荷（ｎｅｔ ｃｈａｒｇｅ）が確保できなくて、１μＭの高濃度でも浸透が難しい。本出願の発明者等は、正電荷を帯びるリシン（Ｋ）中１、３番リシン（Ｋ）をグルタミン酸（Ｅ）に置き換えて３３％以下の正電荷を帯びる親水性アミノ酸を含むペプチドが１００ｎＭの濃度でも目的とする程度の細胞浸透効果を示すことができなかったが、これを二量体に作る場合、１００倍に近い浸透能力を向上させる可能性があることを確認した（図２１および図２２）。
【００２８】
一実施例で、前記両親媒性ペプチドは、下記配列番号１１で表される配列を含んでもよい：
ＫＬＬＫＬＬＫ（配列番号１１）。
【００２９】
この時、前記配列番号１１の前端に（ＬＫ）ｎまたは後端に（ＬＫ）ｍのアミノ酸が追加で結合することができ、前記ｎまたはｍは、それぞれ独立的に０〜２の整数であってもよい。具体的に、前記両親媒性ペプチドは、配列番号１２で表されるアミノ酸配列ＬＫＫＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬまたは配列番号１３で表されるアミノ酸配列ＫＬＬＫＬＬＫＫＬＬＫＬＬＫであってもよい。
【００３０】
前記連結部は、例えば、本発明により目的とする特性を示すようにペプチド間を連結させるいかなる形態の結合も含まれるが、例えば共有結合を含んでもよい。前記共有結合は、ペプチドの機能を阻害しないながら、αヘリックス度を向上させることができる形態の共有結合ならば特に制限されないが、例えば、システインの間の二硫化結合、マレイミド結合、エステル結合、チオエテル結合およびクリック反応（ｃｌｉｃｋ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）による結合で構成された群から選択された一つ以上であってもよい。
【００３１】
前記ペプチドが持つ安定したαヘリックスを維持するために共有結合を利用してペプチドのｉ−位置とｉ＋３、ｉ＋４、ｉ＋７、ｉ＋８、ｉ＋１０またはｉ＋１１位置を縛ることを試みて、多くの種類のリンカー化合物が活用できる。但し、このようなリンカー化合物を利用してαヘリックス度は増進させたが、リンカー化合物とペプチドはより安定した結合を形成するので、通常の細胞質条件で分解されにくい短所を有している。αヘリックスが崩れなければ、細胞毒性が強く現れ得るので、むやみにαヘリックスを高める技術は排除されなければならない。
【００３２】
本出願の発明者等はこれを考慮して、両親媒性αヘリックスペプチドを二つ以上のジスルフィド結合に連結したペプチド多量体は、１００％に近いαヘリックス形をすると共に、ｓｈＲＮＡに対してナノモル以下の強力な結合ができることを確認した。これは、単量体ペプチドの低αヘリック度（水中で１０％程度）とも比較されて、結合力も単量体の１００〜１０００倍程度で高い。このような高αヘリックス度を通して細胞透過能を向上させることができるだけでなく、ヘアピン形のＲＮＡｉやｓｈＲＮＡと強力に結合できるので、これに対するＲＮＡｉを細胞内に伝達する画期的な構造になり得る。
【００３３】
従来、人為的に合成したリンカー化合物を用いてαヘリックス度を向上させる方法を使用したが、本発明ではシステインから得られる二硫化結合を用いることによってαヘリックス度を向上させると共に、細胞毒性も最小化することができる。
【００３４】
本出願の発明者等は、ペプチド中ｉ位置およびｉ＋７位置の疏水性アミノ酸がシステインに置き換えられて二硫化結合を介して連結された多量体は、高いαヘリックス度を示すだけでなく、ヘアピンＲＮＡターゲットにナノモルに該当するｋｄ値に相応する強い親和度を示すことを確認した。
【００３５】
前記連結部が、二硫化結合を介して連結される場合、二硫化結合は、例えば両親媒性ペプチドのアミノ酸の間にシステインを含ませて、システインの間の二硫化結合を介して連結できる。
この時、前記ペプチドは下記式で表されるアミノ酸配列中一つ以上を持つことができる：
ＣＹＹＸＸＹＸＣＹＹＸＸＹＸＺＷ（１）
ＸＹＹＣＸＹＸＸＹＹＣＸＹＸＺＷ（２）
ＸＹＹＸＣＹＸＸＹＹＸＣＹＸＺＷ（３）
ＸＹＹＸＸＹＣＸＹＹＸＸＹＣＺＷ（４）；および
ＸＹＹＸＸＹＸＣＹＹＸＸＹＸＣＷ（５）
前記式で、Ｘ、ＺおよびＷは疏水性アミノ酸で、Ｙは親水性アミノ酸で、Ｃはシステインである。
【００３６】
具体的に、前記ペプチドは、下記の表１に記載された配列番号１〜１０からなる群から選択された１種以上の配列を持つことができる。
【００３７】
【表１】
2016539922.tif 000003
【００３８】
前記式（１）のアミノ酸配列を満足するペプチド中、本発明に係るペプチドは、例えば、配列番号３または８で表されたアミノ酸配列を持つことができる。
【００３９】
前記配列番号３または８で表されたアミノ酸配列を持つペプチドは、疏水性アミノ酸であるロイシンおよび親水性アミノ酸であるリシンまたはアルギニンがそれぞれ含まれたもので、これら親水性および疏水性アミノ酸によってペプチドは、両親媒性を示し、αヘリックス構造によって細胞透過能を持つ。
【００４０】
本発明に係るペプチド多量体は、同形または異形のαヘリックスペプチドを含むが、同形のαヘリックスペプチドを複数連結してホモペプチド多量体形態だけでなく、細胞内伝達力が優れた伝達者ペプチドと細胞内標的のリガンドとして作用できるペプチドが異形で含まれたヘテロペプチド多量体形態であってもよい。
【００４１】
前記多量体は、目的とするペプチドの機能を維持しながら必要に応じて複数の役割をするペプチドが結合した形態であってもよいが、例えば、二量体、三重合体、四重合体または五重合体であってもよく、好ましくは二量体である。
【００４２】
他の観点で、本発明は、下記の工程を含むペプチド多量体の製造方法に関する：親水性および疏水性アミノ酸を含むαヘリックスペプチドを製作する工程；同形または異形の複数のαヘリックスペプチドを選択する工程；および前記選択された複数のαヘリックスペプチドをｉ、ｉ＋３、ｉ＋４、ｉ＋７、ｉ＋８、ｉ＋１０およびｉ＋１１（ｉは整数））で構成された群から選択された一つ以上のアミノ酸位置で連結する工程。先述した本発明に係る各構成は、製造方法でも同様に適用できる。
【００４３】
さらに他の観点で、本発明は、前記αヘリックスペプチド多量体を有効性分として含むＨＩＶの予防または治療用組成物に関する。本出願の発明者等は、本発明に係るペプチド多量体が、特にＨＩＶ−１（Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ−１）中宿主に導入されたゲノムの効率的転写に参加するＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）に位置したＴＡＲ（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）と呼ばれるｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）に強い結合能を示すことを確認した。また、前記配列番号３の配列を持つペプチドが、これに含まれたシステイン−システインの間の共有結合を介して連結されて形成された二量体もＴＡＲと呼ばれるｓｈＲＮＡに非常に強い結合能を示すことを確認した。
【００４４】
このような相関関係をさらに調べた結果、本発明に係るペプチド多量体は、特にＴａｔ−ＴＡＲ相互作用の阻害剤として作用してＨＩＶ−１複製を阻害することができる。また、細胞貫通能が優れてＨＩＶ−１転写に対する細胞内阻害剤として作用することができる。
【００４５】
これに基づいて、さらに他の観点で、本発明は、前記細胞透過性αヘリックスペプチド多量体を有効性分として含むＨＩＶ予防または治療用組成物に関する。
【００４６】
先述したＴＡＲ  ＲＮＡとウイルスのＴａｔタンパク質との間の相互作用は、ウイルス遺伝子の転写を活性化する。結果的に、このような相互作用は、ＨＩＶ−１による疾病の治療のための物質開発にターゲットになり得る。このような可能性が知られたにもかかわらず、ＴＡＲ  ＲＮＡにＴａｔが結合するのを阻害する薬学製剤は存在しない。これは、細胞透過可能な低分子化合物でもＴＡＲ  ＲＮＡに効果的に結合できなく、巨大分子はＴＡＲ  ＲＮＡとＴａｔの結合を阻害できても細胞透過自体が困難である。
【００４７】
これを考慮して、本出願の発明者等は、細胞透過性αヘリックスペプチド多量体が細胞を透過してＴＡＲ  ＲＮＡに結合することによって、ＴＡＲ  ＲＮＡとＴａｔとの間の結合を直接阻害してＨＩＶ−１遺伝子の転写が阻害されることを確認した。
【００４８】
本発明に係る組成物は、ＨＩＶ感染；ＨＩＶに対する実際にまたは潜在的に曝されている患者の治療用になれるが、これに制限されるのではない。例えば、本発明に係る組成物は、過去ＨＩＶに曝されたと推定された後、すなわち輸血、器官移植、体液の交換、噛まれ、偶発的な針刺され、または手術の間患者血液に曝されてた後ＨＩＶによる感染を治療するのに有用である。
【００４９】
また、細胞透過性αヘリックスペプチド多量体は、ミトコンドリアの表面にあるＢｃｌ２／Ｂａｘタンパク質認識が細胞死滅を阻害して癌細胞の細胞死滅を誘導するペプチドとして使用されてもよい。
【００５０】
本発明の組成物は、追加で薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで製造してもよい。薬剤学的に許容可能な担体は、本発明の有効性分と両立可能であるべきで、食塩水、滅菌数、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれらの成分のうち一つの成分または二つ以上の成分を混合して使用でき、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形で製剤化することができる。特に、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）された形態の剤形で製剤化して提供することが好ましい。凍結乾剤形燥製造のために本発明が属する技術分野で通常知られている方法が使用でき、凍結乾燥のための安定化剤が追加されてもよい。さらには、当分野の適正な方法でまたはレミントン薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）に開示されている方法を利用して、各疾病に応じてまたは成分に応じて好ましく製剤化することができる。
【００５１】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる有効性分などの含有量および投与方は、通常の患者の症候と疾病の深刻度に基づいて本技術分野の通常の専門家が決めることができる。また、液剤、注射剤などの様々な形態で製剤化することができて、単位投与量または多投与量容器、例えば密封されたアンプルおよびビンなどで提供されてもよい。
【００５２】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または、非経口投与が可能である。本発明に係る薬剤学的組成物の投与経路は、これらに限定されず、例えば、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、腸管、舌下または局所投与が可能である。本発明に係る組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食事、投与時間、方法、排泄率および疾病の重症度等によりその範囲が多様であり、本技術分野の通常の専門家が容易に決めることができる。また、臨床投与のために、公知の技術を利用して本発明の組成物を適した剤形で製剤化することができる。
【００５３】
本発明は、また、前記細胞透過性αヘリックスペプチド多量体を生物学的活性物質と結合させて、細胞内に活性物質を伝達するための組成物に関する。
【００５４】
本発明に係るペプチド多量体を介して、細胞透過力が既に存在する細胞透過ペプチドに比べて少なくとも１０倍増加することができる。これは、従来細胞透過ペプチドの場合、量を少なくともマイクロモル程度の濃度で用いて荷を細胞中に伝達するのに対して、本発明に係る細胞透過性ペプチド多量体は、従来細胞透過ペプチドの最小使用濃度に対して約１／１０以下を用いても目的とする細胞透過能を確保することができて、生物学的活性物質、例えば、ＲＮＡｉオリゴ核酸分子を細胞内に伝達しようづつ場合にもナノモル程度の濃度だけを用いても目的とする細胞透過能を持つことを確認した。
【００５５】
このように、非常に少ない濃度、特に数十ナノモルまたはその以下の濃度の細胞透過性ペプチド多量体を用いることによって生物学的活性物質、例えば、ＲＮＡｉオリゴ核酸分子も従来に比べて非常に少ない濃度で用いる場合にも目的とする効果を発揮することができる。少ない濃度の細胞透過ペプチドと少ない濃度の生物学的活性物質は、細胞毒性を最小化できる充分条件になれる。
【００５６】
本発明に係る細胞透過性ペプチド多量体は、還元条件である細胞質内に透過すると、多量体間の共有結合が崩れた単量体ペプチドになれる。仮に、細胞内で共有結合がずっと維持されて、ペプチド多量体として存在するならば、ペプチド多量体は、一般にＤＮＡまたはＲＮＡなどに結合能が優れた方であるため、細胞毒性が大きく現れることもある。しかし、細胞質で共有結合が崩れたペプチド単量体は、αヘリックス度も急激に減少すると共に化学的安定性が非常に低くなって、細胞内で多くのタンパク質分解酵素によって加水分解されやすくなり得る。
【００５７】
これにより、本発明に係る細胞透過性ペプチド多量体は、優れた細胞伝達能を示すだけでなく、低濃度の生物学的活性物質を用いても目的とする効果が得られて、細胞内で分解されることによって細胞毒性が最小化することができる。
【００５８】
前記生物学的活性物質は、一種の荷（ｃａｒｇｏ）であり、細胞膜透過ドメインに結合されて細胞内に伝達されることによって生体内のすべての生理現象を調節する生物学的活性または機能を調節する物質であってもよく、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、タンパク質、抗体または細胞毒性化合物であってもよいが、これらに制限されない。
【００５９】
本発明に係るペプチド多量体に追加的に生物学的活性または機能を調節する物質またはその他伝達体を結合させることができ、この時ペプチド多量体と生物学的活性または機能を調節する物質またはその他伝達体が複合体構造を形成してもよい。前記物質または伝達体は、例えば、多量体との非共有性結合または共有性結合を介して連結できる。前記非共有性結合は、例えば、水素結合、静電気的相互作用、疏水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、π−π相互作用および陽イオン−π相互作用からなる群から選択された１種以上であってもよい。前記共有結合は、非分解性結合または分解性結合であってもよく、前記分解性結合は、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、アンハイドライド結合、生分解性結合または酵素分解性結合であってもよく、前記非分解性結合としては、アミド結合またはリン酸化結合であってもよいが、これに限定されない。
【００６０】
前記細胞毒性化合物の場合、ペプチド多量体と静電気的結合またはｈｏｓｔ−ｇｕｅｓｔ結合など非共有性結合を形成して連結されて、例えば、ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ、Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ、ｔａｘｏｌ、ｂｅｒｂｅｒｉｎｅまたはｃｕｒｃｕｍｉｎであってもよが、これらに制限されるのではない。タンパク質または抗体の場合、細胞内特定ターゲットに特異的に結合するいかなる形態の薬物でも含むことができて、Ｎ−末端またはＣ−末端に融合する形態で多量体を導入することができる。
【００６１】
場合によって、薬物耐性を持つ癌細胞（ＭＣＦ７）にｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅをペプチド多量体に連結して癌細胞を壊滅させることができる新しい物質として用いることができ、物性が疏水性である生理活性低分子（ｔａｘｏｌ、ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ、ｃｕｒｃｕｍｉｎなど）をペプチドに付けて細胞内伝達の濃度を高めることができる。また、抗体および抗体の一部であるタンパク質およびタンパク質薬物を二量体ペプチドに連結して細胞内伝達することができ、ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｒｕｇ（ｓｉＲＮＡ、ａｓＤＮＡ、ＤＮＡ、ａｐｔａｍｅｒ）を二量体ペプチドに連結して細胞内伝達することができる。
【実施例】
【００６２】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００６３】
実施例１：ペプチド単量体および二量体の合成
単量体ＬＫ(LKKLLKLLKKLLKLAG)、システインが二つ入った単量体Ａ(CKKLLKLCKKLLKLAG)、Ｂ(LKKCLKLLKKCLKLAG)、Ｃ(LKKLCKLLKKLCKLAG)、Ｄ(LKKLLKCLKKLLKCAG)、Ｅ(LKKLLKLCKKLLKLCG)、ＬＫアミノ酸配列で全てのＫをＲに置き換えた単量体ＡＲ(LRRLLRLLRRLLRLAG)、システインが二つずつ入った単量体ＲＡ(CRRLLRLCRRLLRLAG)、ＲＢ(LRRCLRLLRRCLRLAG)、ＲＣ(LRRLCRLLRRLCRLAG)、ＲＤ(LRRLLRCLRRLLRCAG)、ＲＥ(LRRLLRLCRRLLRLCG)などを固体相合成法とＦｍｏｃ化学を利用して作った。二硫化が付いている二量体ペプチドは、精製された単量体ペプチドを空気酸化条件で酸化させて得られた（二量体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＲＡ、ＲＢ、ＲＣ、ＲＤ、ＲＥ）。二量体ペプチド（ｄｉｍｅｒｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、図３に示された通り、スペーサーをマイケル反応を利用して合成した。
【００６４】
細胞内に透過する性質を観測するために、ペプチドのＮ−末端にＦＩＴＣをラベリングしたペプチドも製造した。合成されたペプチドは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器によって分子量を下記の通り確認した。
【００６５】
ＬＫ−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋：１８６１．３（ｃａｌｃｄ．），１８６２．３（ｆｏｕｎｄ）,ＦＩＴＣ−ｌａｂｅｌｅｄ  ＬＫ  −  ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋：２２０８．４（ｃａｌｃｄ．），２２０８．０（ｆｏｕｎｄ），Ｃ−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋：１８４１．２（ｃａｌｃｄ．），１８４０．８（ｆｏｕｎｄ），ＦＩＴＣ−ｌａｂｅｌｅｄ  Ｃ−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋：２１８８．２（ｃａｌｃｄ．），２１８８．５（ｆｏｕｎｄ）），二量体Ｃ−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋：３６７７．４（ｃａｌｃｄ．），３６７７．９（ｆｏｕｎｄ），ＦＩＴＣ−ｌａｂｅｌｅｄ二量体Ｃ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ＋）：４０２４．４（ｃａｌｃｄ．），４０２４．１（ｆｏｕｎｄ）），ダイマルＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋：２３８１．３（ｃａｌｃｄ．），２３８１．７（ｆｏｕｎｄ）），ＦＩＴＣ−ｌａｂｅｌｅｄダイマル−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋：４５１９．５（ｃａｌｃｄ．），４５２０．１（ｆｏｕｎｄ））．
【００６６】
実施例２：合成されたペプチドのＣＤ（Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）分析
単量体、二量体またはダイマルの二次構造をＣＤ（Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）を利用して観測した。特に、水溶液環境でも二量体はほぼ１００％に近いαヘリックス度を示した。これは、単量体（水溶液で３０％）とは非常に異なる様子を示している。
【００６７】
二硫化結合二つがαヘリックスの一方向にそれぞれｉ位置とｉ＋７位置に存在すると、この二つの共有結合がαヘリックス形を縛ることによって、高αヘリックス度を維持できると判断される。ダイマルペプチドも二量体ペプチドと同様に二つの共有結合形態で作られているので高αヘリックス度を有していた。しかし、分子の柔軟さによって二量体ペプチドよりは低αヘリックス度を有していた。
【００６８】
二量体／ダイマルペプチドに還元環境（細胞質の環境と似ている）のＤＴＴを処理して見た。これにより、還元環境である細胞質で二量体／ダイマルペプチドがどのように変わるかを確認することができる。二量体は単量体に分解され、単量体はαヘリックス構造の程度が大きく低下することを観測した。それに対して、ダイマルはＤＴＴ有無に関係なくαヘリックス構造を維持した。
【００６９】
実施例３：ペプチドの細胞透過実験
三つのそれぞれ異なるペプチドが細胞内にｕｐｔａｋｅされる程度をＦＩＴＣが取り付けられたペプチドの濃度によりＦＡＣＳ実験を介して比較した（図４）。高ペプチド濃度（５００ｎＭ）では二量体（ＬＫ−３）／単量体（ＬＫ−１、ＬＫ−２）が互いにほとんど差がなく高程度のｕｐｔａｋｅ効率（９０％以上）を示している、しかし、低濃度（１０ｎＭ）の場合には、二量体（ＬＫ−３）は引き続き高ｕｐｔａｋｅ効率を示すのに対して、単量体は効率が１０％未満と大きく減少したことを観測した。
【００７０】
特異になことにダイマル（ＬＫ−４）の場合には低濃度でもｕｐｔａｋｅされるが、効率は二量体（９０％以上）に比べて約１０〜１５％程度に低下することを確認した。低濃度と高濃度で共に二量体＞ダイマル＞単量体の順で細胞透過能を保持することを確認した。
【００７１】
実施例４：二量体を利用したｓｉＲＮＡ伝達
１０個の二量体ペプチド（二量体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＲＡ、ＲＢ、ＲＣ、ＲＤ、ＲＥ）と対照群ペプチドを利用してＲＮＡｉ（Ｄｙ５４７−ｌａｂｅｌｅｄ）が細胞内によく透過するか否かを確認する実験を行った。対照群ペプチドとしては、ＬＫ、Ｒｅｖ、単量体Ｃ、ｋｉｎｋＣ、ｋｉｎｋ  Ｄを利用した。Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔを０．８μＬ入れた陽性対照群を用いた。二量体ペプチドは、１００ｎＭ、単量体ペプチドは、２００ｎＭ、ＲＮＡｉ  ５０ｎＭを用いて、ペプチドとＲＮＡｉを混合して混合溶液を製造した。混合溶液をＨｅＬａ細胞株（２．０×１０３個／ｗｅｌｌ）に入れて２４時間培養した。ＰＢＳで１回洗浄した後、蛍光共焦点顕微鏡で細胞内に透過したＲＮＡｉの量を観察した。
【００７２】
図５に記載した通り、二量体ＲＥ＞二量体Ｃ＞二量体Ｄを用いた順にＲＮＡｉが細胞内によく伝達されたことが確認できて、これに対して単量体ペプチドを用いた時にはＲＮＡｉがほとんど伝達されなかったことを確認することができる。
【００７３】
実施例５：ペプチドの細胞内浸透機序の確認
各物質の吸収メカニズムを比較するために、ＦＩＴＣが取り付けられたペプチドとｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙを利用して確認した（図６）。
【００７４】
単量体は低い温度（ＡＴＰ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｕｐｔａｋｅ）またはマクロピノサイトーシス（ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）の抑制状況でも少しは投入されることを見ると、エネルギー独立的／依存的の二つの機序全てによって細胞内に浸透可能と見ている。二量体も二つの過程によって全て優れた細胞透過能を示し、単量体に比べてずっと優れた細胞透過能を持つことを克明に確認することができる。これに対して、ダイマルは低い温度では全く細胞透過能を持つことができなく、マクロピノサイトーシスの抑制状況でもほとんど入ることができないことから、ダイマルペプチドはエネルギー依存的経路にだけ入ると見られる。単量体／二量体が、エネルギー独立的経路である直接的な方法によって細胞中に入ることが確認でき、二量体の二硫化結合が切れることがエネルギー独立的経路に重要な役割を果たすと判断される。
【００７５】
実施例６：ペプチドの細胞毒性実験
ペプチドによる細胞毒性を癌細胞にペプチドを処理して細胞の活性をＭＴＴ方法で調べたが、単量体、二量体、ダイマルの三つのペプチド共に５μＭまでは毒性を示さなかった（図７）。
【００７６】
本発明に係る細胞透過能力があるαヘリックスペプチドのαヘリックス度を最大化させる方法と、これによって合成された伝達または透過能力が向上したペプチドを開示する。αヘリックス度を最大化するために、１）単量体ペプチドに二つのチオール（ｔｈｉｏｌ）を取り付けて２）これを空気中酸化条件を利用して二硫化結合が二つ入った二量体ペプチドを製造した。
【００７７】
実施例７：ＴＡＲ  ＲＮＡに対する結合親和度およびαヘリックス度測定
配列番号３の配列を持つペプチドを介して、表２のようにＬＫペプチドを製造した。
【００７８】
【表２】
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【００７９】
両親媒性ペプチド二量体であるＬＫ−３は、各鎖の中間に二つの二硫化結合を含み、ＴＡＲ  ＲＮＡに対してナノモル以下の親和度を持つ。ＬＫ−３中二硫化結合が細胞質条件で分解されるので、還元された単量体ペプチドＬＫ−２は対照群として用いた。非還元二量体であるＬＫ−４はペプチド鎖が二つのＮ，Ｎ’−（１，４−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ）ｄｉｍａｌｅｉｍｉｄｅによって連結された。ＬＫ−３で二硫化結合は点線で表示し、ＬＫ−４でＮ，Ｎ’−（１，４−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ）ｄｉｍａｌｅｉｍｉｄｅは実線で表示した。
【００８０】
（１）結合親和度
ペプチドのＴＡＲ  ＲＮＡ結合に対するＫｄ（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔｓ）を測定して、親和度は２０°Ｃでｒｈｏｄａｍｉｎｅ−Ｒｅｖペプチドをプローブとして使って蛍光異方法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ）で測定した。測定結果、単量体ペプチドであるＬＫ−１およびＬＫ−２と比較して、ＬＫ−３およびＬＫ−４は、１００〜１０００倍も強い親和度を示した。
【００８１】
（２）αヘリックス度
ＣＤ（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）を利用して一番目の値は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）の膜模倣条件中、二番目の値は同じバッファー中５０％  ＴＦＥでαヘリックス度を測定して、その結果二量体ペプチドが単量体ペプチドに比べて高いαヘリックス度を示した。実際、ＬＫ−３およびＬＫ−４は約９０％のαヘリックス度を示すことを確認した。
【００８２】
（３）細胞透過度
ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｏｃｙａｎａｔｅ）が標識されたＬＫペプチドを９個のアルギニンからなる公示の細胞透過ペプチドＲ９を対照群として、ＨｅＬａ細胞（ｈｕｍａｎ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）とインキュベーションした。ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）実験結果（図４）、ＦＩＴＣ陽性細胞の百分率は、分析に使用された全ての濃度で細胞透過能は下記順に増加することを示している（図４ａ））：Ｒ９＜ＬＫ−１およびＬＫ−２＜ＬＫ−４＜ＬＫ−３。
【００８３】
高濃度（＞５００ｎＭ）で単量体および二量体ペプチドはほぼ１００％の細胞透過率を示した。しかし、非常に低い濃度（１０ｎＭ）で単量体ペプチドは４０％の透過効率、１００ｎＭでは７０％の透過効率だけを示すのに対して、二量体ペプチドは７０〜９０％の細胞透過能を持つことを確認した。対照群であるＲ９は１０ｎＭで酷僅かな細胞透過能を示した。観察結果、ＬＫペプチドの細胞透過能は、二量体形成によって大きく向上することを確認することができる。また、ペプチド二量体の相当部分が細胞核に伝達されたことを確認した（図４ｂ））。
【００８４】
（４）細胞内浸透機序の確認
細胞浸透に用いられた機序を確認するために、様々なエンドサイトーシス阻害条件でＬＫペプチドをテストした。低濃度（１０ｎＭ）ですべてのＬＫペプチドの細胞透過は温度を約４°Ｃに下げたりエンドサイトーシス阻害剤（ウォルトマンニン（ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）またはアミロライド（ａｍｉｌｏｒｉｄｅ））処理によって、略全てが阻害された。したがって、低濃度のＬＫペプチドは、各ＬＫペプチドの活性がこれらの濃度と顕著に異なっても、エネルギー依存的エンドサイトーシス経路（ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ）を介して内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）されることが分かり、ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓまたはｃｌａｔｈｒｉｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓで浸透することを確認することができる（図４ｃ））。高濃度（５００ｎＭ）で、すべてのＬＫペプチドが＞８０％細胞ｕｐｔａｋｅを示すが、細胞浸透機序が様々である。ＬＫ−４（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｂｌｅ  ｄｉｍｅｒ）の場合には、低濃度と類似するメカニズムで入ることが分かり（図４ｄ））、例えば、ウォルトマンニンまたはアミロライドは、単量体ＬＫ−２および二量体ＬＫ−３によって細胞浸透がほとんど阻害されず、これらのペプチドの内在化効率は４°Ｃでも変わらなかった。したがって、ＬＫ−２およびＬＫ−３は、高濃度で受容体媒介エンドサイトーシス（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）でもなく、マクロピノサイトーシス（ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）でもない、他の形態のエネルギー依存的経路を介して細胞に浸透することが分かる。
【００８５】
非還元マレイミドリンカー（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ  ｌｉｎｋｅｒ）を含む５００ｎＭ  ＬＫ−４二量体は、温度を低くしたりまたはエンドサイトーシス阻害剤の二つにおいて完全に阻害された。この結果から、ペプチド二量体のαヘリックス度が高いほど低い濃度でエネルギー依存的細胞浸透が促進される反面、単量体形態は高濃度でエネルギー非依存的細胞浸透（例えば、ホールまたは、カーペット形成）することがわかる。
【００８６】
（５）Ｔａｔ−ＴＡＲ相互作用阻害効果確認
ナノモルの濃度で細胞に伝達できるので、ＬＫ二量体ペプチドが宿主細胞内のウイルスターゲットを阻害することができるか否かを確認した。ｐＬＴＲ−ｌｕｃ、ＨＩＶ−１  ＬＴＲプロモーターおよびホタルルシフェラーゼ遺伝子包含プラスミド、ｐＴａｔ、ＨＩＶ−１のＴａｔ遺伝子包含プラスミドと共に共同で形質感染して、ＨｅＬａ細胞でルシフェラーゼリポーターシステムを構築した。このシステムで、発現したＴａｔタンパク質は抗−終結因子でＬＴＲプロモーター下でＴＡＲ  ＲＮＡと相互作用して、ルシフェラーゼ遺伝子の転写を増進させる。ＬＫペプチドとリポーター細胞を１２時間インキュベーションした以後、ｍＲＮＡの相対的量をＲＴ−ＰＣＲを利用して決定した（図８）。結果によると、二うのハウスキーピング遺伝子（β−ａｃｔｉｎおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡ）と比較して、ルシフェラーゼ遺伝子中ｍＲＮＡの量はペプチド量に依存的な方式で減少する（図８ａ）、ｂ））。また、ＬＫペプチドが形質感染されたプラスミドＤＮＡに結合して転写することを妨害しないことを立証するために、転写した総ＴＡＲ  ＲＮＡを含む長いルシフェラーゼ遺伝子の転写量を測定した。ＴＡＲ−ｌｕｃ（ｌｏｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）およびＴＡＲ（ｔｏｔａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）の比率は、ＴＡＲ−ｌｕｃおよびハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡの比率と類似することを確認した。このような結果は、転写レベルでＬＫペプチドによってＴａｔ−ＴＡＲ相互作用が阻害されることを意味する（図８ｃ））。
【００８７】
Ｔａｔ媒介転写阻害能と関連して、単量体ＬＫ−１およびＬＫ−２は、１００ｎＭでも５０％未満の阻害効果を示す反面、ペプチド二量体ＬＫ−３およびＬＫ−４は、より高い細胞浸透能を持ちながらも１０ｎＭで約５０％の阻害能を示し、１００ｎＭでは８０％以上の阻害能を示した。ＬＫ−１およびＬＫ−２のＨｅＬａ細胞浸透能が類似するので（図４ａ））、ＬＫ−２のさらに強い阻害効果は、ＴＡＲ  ＲＮＡに対するさらに強い親和度の結果であると判断される。二硫化結合が、還元細胞質条件で容易に分解されるので、ＬＫ−３は内在化以後細胞基質で還元されて、ＴＡＲ  ＲＮＡと依然としてナノモルの親和度で結合する単量体ＬＫ−２を形成する。したがって、ＬＫ−３の向上した細胞浸透能は、転写レベルでＴａｔ−ＴＡＲ相互作用を阻害できる主な原因である。
【００８８】
（６）ＩＣ５０測定
ＬＫペプチドのＩＣ５０値は、ルシフェラーゼアッセイを介して測定されて、ＬＫ−１（１０７ｎＭ）＞ＬＫ−２（４９．６ｎＭ）＞ＬＫ−４（３４．７ｎＭ）＞ＬＫ−３（１０．３ｎＭ）順に減少した（図１０）。二量体ＬＫ−３のＩＣ５０値は、単量体ＬＫ−１に比べて１０倍以上低く、これは向上した細胞透過能だけでなく、ＬＫ−３が細胞基質で分解される場合、単量体ペプチド濃度が２倍以上に増加した結果であると判断された。ＬＫ−３のＩＣ５０値は、ＬＫ−２（Ｋｄ＝９．６ｎＭ）の解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）と略同じであったが、これは細胞膜浸透がそれ以上細胞活性に対する障壁として作用していなかったことを意味して、他のペプチド薬物には存在しない特異的構成を介してＫｄおよびＩＣ５０値の間に大きい差を見せた。
【００８９】
類似する細胞基盤測定システムであるＲＡＷ  ２６４．７細胞（ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）でＩＣ５０値測定結果を図１０に示した。これを通じてＬＫペプチドのＩＣ５０値が１５〜１５０ｎＭであることを確認することができた。
【００９０】
（７）ＨＩＶ−１複製阻害および細胞毒性確認
急性感染したＴ−リンパ芽球様（Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ）細胞（ＭＯＬＴ−４／ＣＣＲ５）でＨＩＶ−１複製阻害の有無を確認した（図１１）。ＨＩＶ−１複製でＬＫ−３およびＬＫ−４のＩＣ５０値は、それぞれ５９０．１および２７８．５ｎＭであるのに対して、ＬＫ−１のＩＣ５０値は＞２μＭであった。ＨｅＬａまたはＲＡＷ  ２６４．７細胞と比較して、より大きいＩＣ５０値は、ペプチドがＴ−リンパ芽球様細胞で減少した浸透能を示すのに一部寄与した可能性がある。しかし、ＬＫ−３は２．５６μＭ以下の濃度で宿主細胞に対する大きい細胞毒性を示さず、これはＨＩＶ−１複製に対するＩＣ５０値よりはるかに大きい数値である。ＬＫ−４は、ＬＫ−３に比べてもう少し活性があると確認されたが、宿主細胞により毒性があった。これにより、ＬＫ二量体、特にＬＫ−３は、ＨＩＶ−１に対する治療的応用が可能であると判断される。
【００９１】
ペプチドの細胞毒性を、ＭＴＴ  ａｓｓａｙを介して確認した。その結果を図１２に示した。２４時間処理後、ＭＴＴ  ａｓｓａｙをした時、約１０μＭに至るまでＨｅｌａ細胞およびＲＡＷ  ２６４．７細胞共に毒性がないことを確認した。
【００９２】
（８）細胞膜ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
ＬＤＨ  ａｓｓａｙを介してペプチドが細胞膜をｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎする程度を確認した。その結果を図１３に示した。図１３を参照すると、１２時間ペプチド処理後、ＬＤＨ  ａｓｓａｙをした時、約２μＭに達するまでは、Ｈｅｌａ細胞およびＲＡＷ  ２６４．７細胞共にほとんど細胞膜をｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎしないことが分かる。
【００９３】
細胞膜透過が、略１０ｎＭレベルで起きるのを見ると、細胞内透過は細胞膜ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎと直接的な関連がないことが分かる。
ＬＫ−３（ｒｅｄｕｃｉｂｌｅ  ｄｉｍｅｒ）およびｍｏｎｏｍｅｒは８μＭでは若干のｄｅｓｔａbｉｌｉzａｔｉｏｎを見せることが分かるのに対して、ＬＫ−４（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｂｌｅ  ｄｉｍｅｒ）は、８μＭでもほとんどｄｅｓｔａbｉｌｉzａｔｉｏｎを見せないことを確認した。
【００９４】
（９）Ｔａｔ−ＴＡＲ相互作用阻害類型確認
ｐＴａｔ発現程度に応じたＬＫペプチドの阻害能力に対する減少実験を進行した。Ｈｅｌａ細胞基盤システムにｐＴａｔプラスミドの量を異なるように形質感染した後、ＬＫペプチドの阻害能力をｌｕｃｉｆｅｒａｓｅで測定した。その結果を図１４に示した。図１４中各グループに対する具体的説明は下記の表３のとおりである：
【００９５】
【表３】
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【００９６】
図１４を参照すると、ｐＴａｔ発現程度に従ってＬＫペプチドの阻害能力が徐々に減少することを確認できるが（９２．９％＞９２．３％＞７２．３％（１００ｎＭ  ＬＫ−３の場合）、これにより、ＴａｔとＬＫペプチドのｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｂｉｎｄｉｎｇがＴＡＲ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ発現に関連が深いことを間接的に知ることが出来る。
【００９７】
（１０）ペプチド安定性
３７℃でＨＰＬＣを用いてペプチド安定性を測定した。
ペプチドの半減期をｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｄｅｃａｙによって計算して、表４に示し、図１５〜図１７のように図示した（ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｐｌｏｔｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｉｍｅ  ｓｃａｌｅ）。ＤｉｓｕｌｆｉｄｅリンカーをＬＫ−３で点線で表示し、ＬＫ−４でＮ，Ｎ’−（１，４−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ）ｄｉｍａｌｅｉｍｉｄｅリンカーを実線で表示した。Ｋｉｎｋ  ｐｅｐｔｉｄｅおよびＬＫ−３は様々なセラムタンパク質と重なった。Ｌｉｆｅ  ｔｉｍｅが短くて、この条件で半減期は測定できなかった。全ての投入されたペプチドは１時間内に消えた。同様の結果がダイマーＤでも予想される。
【００９８】
【表４】
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【００９９】
Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｉｍｅｒ  Ｄとｍｏｎｏｍｅｒ  Ｄのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ存在下の安定性実験を進行して図１５に示した。図１５を参照すると、ＬＫ−３と類似のｄｉｍｅｒ Ｄの場合、２５％  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ存在下に半減期が約９時間程度で該当ｍｏｎｏｍｅｒの半減期（３時間）より３倍程長くなることを確認することができる。これは、ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｄｉｍｅｒを形成して、構造的な安定化がｓｅｒｕｍ内に存在するｐｒｏｔｅａｓｅによる分解を阻害する可能性があることを示すものである。
【０１００】
ＬＫ−４のｓｅｒｕｍ条件での安定性テスト結果を図１６に示した。Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅでない他の結合が導入されたＬＫ−４の場合は、同じ条件で半減期が２時間で測定された。Ｄｉｍｅｒ  Ｄとは同じ位置にジスルフィドド結合を持つｄｉｍｅｒではないので、直接比較はできないが、ｄｉｍｅｒを形成する位置によりｐｅｐｔｉｄｅの安定性が変わる可能性があることを意味する。
【０１０１】
Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｉｍｅｒ  Ｄとｋｉｎｋ  Ｄの生体内還元条件である０．５ｍＭ  ＧＳＨ存在下の安定性テスト結果を図１７に示した。ペプチドの安定性に構造的な影響を端的に見せる例として、ｄｉｍｅｒを形成してｄｉｓｕｌｆｉｄｅ結合が安定するように構造の内側に位置することになると、同じ還元条件下でも還元される時間が長くなることを示した。一方、分子内ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ結合を形成して相対的にｄｉｓｕｌｆｉｄｅ結合が露出される場合は、半減期が１時間以内であることを確認した。
【０１０２】
本発明が属した分野で通常の知識を有する者ならば、前記内容を基に本発明の範疇内で様々な応用および変形を行うことが可能であろう。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明に係る複数の両親媒性αヘリックスペプチド中一つ以上の特定アミノ酸位置で連結部を含むペプチド多量体はαヘリックス度が顕著に増加して高細胞透過能を保有することができる。このような優れた細胞透過能を介して、細胞内に様々な種類の生物学的活性物質を効果的に伝達できるだけでなく、細胞透過以後細胞毒性も最小化できるので、疾病の予防または治療剤として有用に使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2016539922.tif 000011
【図６Ａ】
2016539922.tif 000012
【図６Ｂ】
2016539922.tif 000013
【図６Ｃ】
2016539922.tif 000014
【図６Ｄ】
2016539922.tif 000015
【図６Ｅ】
2016539922.tif 000016
【図６Ｆ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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